(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸球菌が発育可能な培地成分に、バンコマイシンを３２〜２５６μｇ／ｍｌ、D-サイクロセリンを１〜６４μｇ／ｍｌ、 DL-乳酸ナトリウムを０．０２５〜０．８ｍｏｌ／ｌの濃度で添加してある「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」検出用培地。
【請求項２】
請求項１に記載の「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」検出用培地を用いて、被検菌又は検査材料から「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」を選択的に検出する方法。
【請求項３】
被検菌の菌浮遊液を、請求項１に記載の「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」検出用培地に接種して、３５〜３７℃で２４〜４８時間培養し、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」を選択的に検出する方法。
【請求項４】
検査材料を、請求項１に記載の「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」検出用培地に接種して、３５〜３７℃で２４〜４８時間培養し、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」を選択的に検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」検出用培地及びその培地を使用して「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」を検出する方法に関する。さらに詳しくは、特定組成の「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」検出用培地及びその培地を使用して被検菌又は検査材料から臨床的に重要である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型バンコマイシン耐性腸球菌」を選択的に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腸球菌は、その名が示すように、腸管の常在菌叢の一部を形成するカタラーゼ陰性グラム陽性球菌で、約２０種が含まれている。従来は、Streptococcus属の一部とされていたが、ＤＮＡ相同性、１６Ｓ ribosomal ＲＮＡ配列解析などから Enterococcus属として独立して分類されるようになった。臨床では主に尿路系、胆道系から分離され、しばしば敗血症、感染性心内膜炎の起因菌となっている。分離される頻度の最も高いものはEnterococcus faecalisで、Enterococcus faecium、Enterococcus aviumがこれに次ぎ、その他の菌種はまれである。病原性因子として溶血毒素、プロテアーゼなどがEnterococcus faecalisを中心に知られているが、基本的には弱毒菌と考えられている。
【０００３】
腸球菌はセフェム系抗生物質に対し自然耐性を示し、アミノグリコシド系、マクロライド系、テトラサイクリン系、クロラムフェニコール系、ペニシリン系、リンコマイシン系抗生物質などに対して多くの耐性を持つものがみられ、第三世代セフェム剤の導入された１９８０年代に入ってから多剤耐性菌による院内感染が報告されるようになった。腸球菌は腸内の常在菌であるため、これらの院内感染は糞便を感染源とする例が多く、医療従事者の手や汚染された病院環境の関与も指摘されている。また、腸球菌は多くの家畜、ペット動物の腸管にも常在し、下水道やその処理施設からも検出されるため、耐性菌が出現した場合には急速に市中に広がることが予想される。
【０００４】
バンコマイシン耐性腸球菌（vancomycin resistant enterococci：以下、ＶＲＥという。）は、１９８０年代後半にヨーロッパで報告されて以来、欧米を中心に急速に全世界に広まり、最も治療が難しい院内感染原因菌として注目されている。ＶＲＥとは、バンコマイシンに対して耐性を獲得した腸球菌のことであり、その結果、現存するほとんどの抗菌薬に対して耐性傾向を示す。したがって、ＶＲＥ感染症に対しては現在開発中のいくつかの薬剤を除いて臨床効果の確実な抗菌物質は見あたらず、敗血症などの重症感染症では死亡する例も散見される。また、このバンコマイシン耐性遺伝子は、プラスミドや染色体を介して各種のグラム陽性菌に伝播することが認められ、バンコマイシンが唯一有効な治療薬であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus：以下、ＭＲＳＡという。）に伝播する危険性が懸念されている。
【０００５】
ＣＤＣ(Center for Diseases Contorol and Prevention：米国防疫センター) では、近年臨床からのＶＲＥの分離率が上昇していることを報告し、「個々の医療機関はＶＲＥの感染症・定着を検索、防止、制御するための包括的かつ施設に合った戦略的計画を立てなければならない。」として詳細な対応策を提示した。そのなかで「細菌検査室は病院におけるＶＲＥの伝播防止のための第一線に位置する。ＶＲＥ感染症・定着を発見し、問題発見が遅れた場合に必要となる複雑で費用のかかる封じ込めのための労力を避けるために、腸球菌を迅速・正確に同定し、バンコマイシン耐性を検出しうる能力が要求される。」と述べたうえで、ＶＲＥ検出検査の詳細を提示すると共に、その検出検査の重要性を明示した。
【０００６】
ＶＲＥは、近年日本国内においても医療機関からの検出報告が相次ぎ、食肉などからの検出報告もあることからその広がりが懸念されている。また、平成１２年４月から従来の伝染病予防法が大幅に改定され、「感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律」が施行された。そのなかでＶＲＥ感染症は４類感染症に指定され、全数報告が義務づけられた。
【０００７】
現在、ＶＲＥは、保有する耐性遺伝子の種類によって「ＶａｎＡ型ＶＲＥ」、「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」、「ＶａｎＤ型ＶＲＥ」、「ＶａｎＥ型ＶＲＥ」、「ＶａｎＧ型ＶＲＥ」の６つの型に分類されている。これらのＶＲＥは、保有する耐性遺伝子の違いによって、バンコマイシンと、バンコマイシン類似体のグリコペプチド系抗生物質であるテイコプラニンに対して、それぞれ異なった耐性パターンを示す。これらの耐性パターンを以下に記す。
【０００８】
「ＶａｎＡ型ＶＲＥ」は、耐性に関与する遺伝子としてｖａｎＡを保有し、バンコマイシンの最小発育阻止濃度(minimum inhibitory concentration:以下、ＭＩＣという。) は６４〜＞１０００μｇ／ｍｌ、テイコプラニンのＭＩＣは１６〜５１２μｇ／ｍｌである。
「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、耐性に関与する遺伝子としてｖａｎＢを保有し、バンコマイシンのＭＩＣは４〜＞１０００μｇ／ｍｌ、テイコプラニンのＭＩＣは０．５〜１μｇ／ｍｌである。
「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」は、耐性に関与する遺伝子としてｖａｎＣを保有し、バンコマイシンのＭＩＣは２〜３２μｇ／ｍｌ、テイコプラニンのＭＩＣは０．５〜１μｇ／ｍｌである。
「ＶａｎＤ型ＶＲＥ」は、耐性に関与する遺伝子としてｖａｎＤを保有し、バンコマイシンのＭＩＣは６４〜１０２４μｇ／ｍｌ、テイコプラニンのＭＩＣは４〜１０２４μｇ／ｍｌである。
「ＶａｎＥ型ＶＲＥ」は、耐性に関与する遺伝子としてｖａｎＥを保有し、バンコマイシンのＭＩＣは１６μｇ／ｍｌ、テイコプラニンのＭＩＣは０．５μｇ／ｍｌである。
「ＶａｎＧ型ＶＲＥ」は、耐性に関与する遺伝子としてｖａｎＧを保有し、バンコマイシンのＭＩＣは１２〜１６μｇ／ｍｌ、テイコプラニンのＭＩＣは０．５μｇ／ｍｌである。
【０００９】
このうち「ＶａｎＡ型ＶＲＥ」と「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、その耐性遺伝子がプラスミドや染色体を介して、他の各種グラム陽性菌へ伝播することや、現存する多くの抗菌薬に対して耐性傾向を示すことから、臨床的意義がきわめて高い。
なお、本発明の全説明において、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」とは、「ＶａｎＡ型ＶＲＥ」と「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」の両方を併せた表記である。
【００１０】
これに対して、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」に関しては、Enterococcus casseliflavus、Enterococcus gallinarum、Enterococcus flavescensといった菌種が元来持っている自然耐性であり、その耐性遺伝子に伝播性がないことや、各種抗菌薬の耐性度も比較的低いことから臨床的意義は低い。
【００１１】
「ＶａｎＤ型ＶＲＥ」、「ＶａｎＥ型ＶＲＥ」、「ＶａｎＧ型ＶＲＥ」の検出例は、世界でごく数例であり、また、これらの耐性遺伝子にも伝播性がないことから臨床的意義は低い。
【００１２】
前記のように、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、一旦感染を起こすと有効な治療法がないばかりか、病院内外の環境の広範な汚染や重大な院内感染などを引き起こす危険性があり、臨床的な意義がきわめて高い。そのため、各医療機関などで「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」の検出を目的とした、ＶＲＥのスクリーニング検査の実施が推奨されている。また、これらの検査に際しては、迅速性や正確性も要求される。現在、実際のＶＲＥのスクリーニング検査では、以下のような検査法がおこなわれている。
【００１３】
腸球菌は腸管の常在細菌叢の一部を構成しているため、ＶＲＥの保菌部位としては腸管が注目される。そのためＶＲＥスクリーニング検査には主として糞便又は直腸スワブ検体が用いられる。これらの検査材料からＶＲＥをスクリーニング検査する場合、バンコマイシンを６〜８μｇ／ｍｌ添加した腸球菌選択培地に検査材料を直接接種し、３５〜３７℃で２４時間〜４８時間培養後、発育してきた菌について菌種同定検査、バンコマイシン感受性検査、耐性遺伝子検出検査をおこない、ＶＲＥを検出する。ここで使用される「バンコマイシンが６〜８μｇ／ｍｌの濃度で添加された腸球菌選択培地」は、現在「ＶＲＥ選択培地」として数社の培地メーカーから市販されている。
【００１４】
しかしながら、現在の検査法で用いられているＶＲＥ選択培地は、臨床的に重要である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」と、臨床的に重要ではない「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」の、両方の菌の発育を認めてしまう。
【００１５】
また、現在の検査法で用いられているＶＲＥ選択培地に発育してきたＶＲＥが「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」なのか、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」なのかを、同培地上で判別することは不可能である。
【００１６】
そのため、現在の検査法で用いられているＶＲＥ選択培地を使用してＶＲＥのスクリーニング検査をおこなった場合、発育してきたＶＲＥが、臨床的に重要である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」であるのか、それとも、臨床的に重要ではない「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」であるのか、さらに追加試験をおこない、判断する必要がある。
【００１７】
「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」は健常者の腸管内に常在している。このため、現在の検査法で用いられているＶＲＥ選択培地を用いて糞便等の検査材料からＶＲＥのスクリーニング検査をおこなった場合、莫大な数の「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」を検出してしまう。したがって、現在の検査法では、前記の追加試験の必要性から、検査手技の煩雑化が認められる。
【００１８】
また、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」と「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」とが検査材料に混在していた場合、臨床的に重要である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を見落としてしまう危険性がきわめて高い。
【００１９】
さらに、「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」のなかには、現在の検査法で用いられているＶＲＥ選択培地では発育がきわめて悪いものが存在する。これらの菌株は同培地上では全く発育しないことがあり、このような菌株が検査材料に存在した場合、検出ができない危険性がきわめて高い。
【００２０】
すなわち、ＶＲＥスクリーニング検査で用いる選択培地が、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」の発育を抑制し、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」のみを良好に発育させることができるならば、現在の検査法にみられる検出洩れや検査手技の煩雑化を、飛躍的に改善することができる。
【００２１】
本発明者らはこのような状況に鑑み、臨床的に重要ではない「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」の発育を阻害し、臨床的に重要である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に発育させることが可能な、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地の開発を志した。そして、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」のバンコマイシン耐性機序に着目し、種々研究の結果、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」の細胞壁合成系をサポートする物質を究明するに至り、これらの物質を培地に添加することにより、臨床的に重要ではない「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」の発育を阻害し、臨床的に重要である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に発育させることが可能な検出用培地を完成することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＶＲＥのなかでも、臨床的に重要である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に発育させることが可能な「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地と、その培地を用いて被検菌又は検査材料から「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法を提供し、もって現在の検査法にみられる検出洩れや、検査手技の煩雑化を改善することを目的とする。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明のうち請求項１に記載する発明は、腸球菌が発育可能な培地成分に、バンコマイシンを３２〜２５６μｇ／ｍｌ、D-サイクロセリンを１〜６４μｇ／ｍｌ、 DL-乳酸ナトリウムを０．０２５〜０．８ｍｏｌ／ｌの濃度で添加してある「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地である。
【００２５】
また、本発明のうち請求項２に記載する発明は、請求項１に記載の「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地を用いて、被検菌又は検査材料から「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法である。
【００２６】
さらに、本発明のうち請求項３に記載する発明は、被検菌の菌浮遊液を、請求項１に記載の「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地に接種して、３５〜３７℃で２４〜４８時間培養し、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法である。
【００２７】
さらに、本発明のうち請求項４に記載する発明は、検査材料を、請求項１に記載の「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地に接種して、３５〜３７℃で２４〜４８時間培養し、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法である。
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
【００２８】
まず、本発明において使用するバンコマイシン、D-サイクロセリン、D-乳酸について説明する。
バンコマイシンは、１９５４年に発見、１９５８年に臨床使用導入されたグラム陽性菌に広域なスペクトラムを示すAmycolatopsis orientalisの産生する殺菌性のグリコペプチド系抗生物質である。この薬剤は、腎、腸毒性などの副作用の点もあって、主にβ−ラクタム剤の使用不能例などのグラム陽性菌感染症に対し細々と用いられてきた。その後、ペニシリン耐性腸球菌感染症、C.difficileによる偽膜性腸炎、そして1970年代後半から急速に全世界に広まったＭＲＳＡの治療薬として脚光を浴びるようになり、急速に使用頻度が高まるようになった。しかし、１９８５年以後、従来は非病原性と考えられてきたバンコマイシンに自然耐性を示す乳酸菌の一種、Pediococcus、Leuconostocによる免疫不全患者の感染症が相次いで報告されるようになり、バンコマイシン耐性菌の出現が危惧されるようになってきた。通常、バンコマイシンは、その塩酸塩が経口剤として使用されている。塩酸バンコマイシンは、白色ないし淡黄色の結晶性粉末である。本発明では、この塩酸バンコマイシンを使用するのが好ましい。
【００２９】
D-サイクロセリンは、Streptomyses garyphalusから得られる白色ないし淡黄白色の結晶性粉末で、抗結核用抗生物質として知られ、臨床においては、経口投与によって肺結核の治療などに使用されている。D-サイクロセリンは、細菌の細胞壁合成に際して、細胞壁の構成ブロックの一部である「D-アラニル-D-アラニン」を合成するリガーゼに直接作用し、その合成を阻害する働きをする。
【００３０】
本発明において、D-乳酸は市販のものを使用して差し支えない。市販品の乳酸は、通常ラセミ体やその化合物であり、酸味剤ないし防腐剤として飲料や菓子などの製造に広く使用されている。本発明では、D-乳酸の化合物である DL-乳酸ナトリウムを使用するのが好ましい。 DL-乳酸ナトリウムは、ＶＲＥの細胞壁構成ブロックの「D-アラニル-D-乳酸」を構築する際に、D-乳酸を補給する働きをする。
【００３１】
次に、本発明の理論について説明する。
「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」のバンコマイシンのＭＩＣは２〜３２μｇ／ｍｌであるから、その発育を抑制するには、培地に添加するバンコマイシンの濃度を３２μｇ／ｍｌ以上にすればよいことが推察できる。しかし、「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」のなかには、バンコマイシンのＭＩＣが３２μｇ／ｍｌ以下の「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」も存在する。そのため、単純に、培地に添加するバンコマイシンの濃度を３２μｇ／ｍｌ以上にした場合、これら「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」の発育も阻止してしまうことになる。その結果、「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」の検出洩れが発生する。
以上のことから、現在使用されているＶＲＥ選択培地のバンコマイシン添加濃度は６〜８μｇ／ｍｌであり、これ以上バンコマイシン添加濃度を上げることができないのが実情であった。
【００３２】
そこで、本発明者らは、「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」のＭＩＣを３２μｇ／ｍｌ以上に上昇させることが可能であれば、バンコマイシンを３２μｇ／ｍｌ以上添加した培地での発育の有無により、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」と「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」とを分別することができるのではないかと考えた。そこで、本発明者らは、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」のバンコマイシン耐性機序に着目した。
【００３３】
「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、バンコマイシンの作用点である細胞壁ペンタペプチド末端のD-アラニル-D-アラニンの部分を、D-アラニル-D-乳酸に置き換えることにより、バンコマイシン耐性を獲得している。
【００３４】
バンコマイシン高度耐性を示す「ＶａｎＡ型ＶＲＥ」では、バンコマイシン耐性に関与する遺伝子として、ｖａｎＲ、ｖａｎＳ、ｖａｎＨ、ｖａｎＡ、ｖａｎＸ、ｖａｎＹ、ｖａｎＺの８つの遺伝子が知られている。ｖａｎＨ遺伝子は、デハイドロゲナーゼを産生し、細胞内のピルビン酸をD-乳酸に変換する。ｖａｎＡ遺伝子は、そのD-乳酸を、細胞内にあるD-アラニンに結合させ、D-アラニル-D-乳酸を生成する。こうして生成されたD-アラニル-D-乳酸は、細胞壁構成ブロックに組み込まれ、バンコマイシン耐性を示す細胞壁を構成していく。
【００３５】
しかし、腸球菌が本来持っているリガーゼによって、バンコマイシンの作用点となるD-アラニル-D-アラニンは生成され続けている。これらの、生成されてしまったD-アラニル-D-アラニンは、ｖａｎＸ遺伝子の産生する D,D-ジペプチダーゼや、ｖａｎＹ遺伝子の産生する D,D-カルボキシペプチダーゼによって分解され、D-アラニル-D-乳酸に再構築される。これらの一連の作用によって、バンコマイシンの作用点であるD-アラニル-D-アラニンは皆無となり、「ＶａｎＡ型ＶＲＥ」は高度耐性を獲得している。
【００３６】
しかし、「ＶａｎＡ型ＶＲＥ」がバンコマイシン高度耐性を示すのに対して、「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」ではバンコマイシンのＭＩＣが低い菌株も存在する。
本発明者らは、この理由として、次に示す２つの要因があるのではないかと考えた。
【００３７】
その要因の一つは、「D-アラニル-D-アラニンの残存」である。
すなわち、「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、腸球菌が本来持っているリガーゼによって生成されてしまった  D-アラニル-D-アラニンを、D-アラニル-D-乳酸に再構築する働きが弱い。このため、バンコマイシンの作用点となるD-アラニル-D-アラニンが残存してしまい、バンコマイシンのＭＩＣが低下しているのではないか、と考えられる。
【００３８】
もう一つの要因は、「D-乳酸の産生量の不足」である。
すなわち、「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、D-アラニル-D-乳酸を生成するのに十分なD-乳酸の産生量が不足している。このため、D-アラニル-D-乳酸が十分に生成されず、相対的にバンコマイシンのＭＩＣが低下しているのではないか、と考えられる。
【００３９】
本発明者らは、「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、上記２つの要因のいずれか又は両方の要因によるものではないかと考えた。
そこで、本発明者らは、上記２つの要因の両方を同時に解消することができれば、「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」のバンコマイシンのＭＩＣが上昇するのではないかと考えた。そして、これら各要因の解消手段として次の方法を用いた。
【００４０】
まず、要因１の「D-アラニル-D-アラニンの残存」を解消する手段として、D-アラニル-D-アラニンの産生自体を抑えるために、D-サイクロセリンを培地に添加した。
前記のとおり、D-サイクロセリンは、D-アラニル-D-アラニンを合成するリガーゼに直接作用して、その合成を阻害する働きをする。その結果、バンコマイシンの作用点となるD-アラニル-D-アラニンの生成自体が抑制されるため、相対的にD-アラニル-D-乳酸の生成量が増加し、バンコマイシンのＭＩＣは上昇するのではないかと考えた。
すなわち、D-サイクロセリンは、前記のｖａｎＸ遺伝子及びｖａｎＹ遺伝子による「D-アラニル-D-アラニンからD-アラニル-D-乳酸への再構築」と同様の作用を有するものと推定される。そこで、以下の試験をおこなった。
【００４１】
【試験例１】
《D-サイクロセリンの添加によるバンコマイシンＭＩＣの変化の測定》
各種Enterococcus株の、バンコマイシンＭＩＣがD-サイクロセリンを添加することにより、どのように変化するかを調べた。
【００４２】
＜供試菌株＞
この試験において使用した菌株は、以下のとおりである。
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalisＡＴＣＣ２９２１２株：１株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis：３株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecium：３株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus avium：３株、
ＶａｎＣ型Enterococcus casseliflavus：５株、
ＶａｎＣ型Enterococcus gallinarum：５株、
ＶａｎＡ型ＶＲＥ：５株、
ＶａｎＢ型ＶＲＥ：４５株、
以上、合計７０株を用いて試験をおこなった。
【００４３】
＜試験方法＞
測定には、９６穴のマイクロプレートを用い、バンコマイシン最終濃度０．５μｇ／ｍｌ〜５１２μｇ／ｍｌの１１系列、D-サイクロセリン最終濃度１μｇ／ｍｌ〜６４μｇ／ｍｌの７系列からなる微量液体希釈法によるチェッカーボード法によっておこなった。
培地は、Brain heart infusion brothを用いた。
各Enterococcus株は、Brain heart infusion brothにおいて３５℃で１８時間好気培養したものを、同じくBrain heart infusion brothで１００倍に希釈し、各ウエルに１００μｌづつ接種した。これを３５℃で４８時間好気培養後、バンコマイシンＭＩＣを判定した。その試験データを表１に示す。
【００４４】
＜試験結果＞
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis ＡＴＣＣ２９２１２株（１株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis（３株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しない  Enterococcus faecium（３株）、及びバンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus avium（３株）は、D-サイクロセリンの添加によるバンコマイシンＭＩＣの変化は認められず、バンコマイシンＭＩＣはすべて２μｇ／ｍｌ以下であった。
また、ＶａｎＣ型Enterococcus casseliflavus（５株）、ＶａｎＣ型Enterococcus gallinarum（５株）も、D-サイクロセリンの添加によるバンコマイシンＭＩＣの変化は認められず、バンコマイシンＭＩＣはすべて１６μｇ／ｍｌ以下であった。
これに対して、ＶａｎＡ型ＶＲＥ（５株）、ＶａｎＢ型ＶＲＥ（４５株）は、D-サイクロセリンの添加により、すべての株で、バンコマイシンＭＩＣの上昇又はバンコマイシンＭＩＣ５１２μｇ／ｍｌ以上の高度耐性の維持を示した。
【００４５】
＜考察＞
以上の試験結果から、D-サイクロセリンの添加によって、「バンコマイシンのＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」のバンコマイシンのＭＩＣが上昇することが確認できた。このD-サイクロセリンの添加によるバンコマイシンＭＩＣの上昇は、D-サイクロセリン添加濃度１〜６４μｇ／ｍｌで認められ、さらに、その効果が最も大きい最適添加濃度は、３２μｇ／ｍｌであることが確認できた。
【００４６】
次に、要因２の「D-乳酸の産生量不足」を解消する手段として、D-アラニル-D -乳酸を生成するのに十分なD-乳酸を補給するため、培地にD-乳酸の化合物である DL-乳酸ナトリウムを添加した。これにより、D-アラニル-D-乳酸が十分に生成され、相対的にD-アラニル-D-乳酸の生成量が増加し、バンコマイシンのＭＩＣは上昇するのではないかと考えた。
D-乳酸は、前記のｖａｎＨ遺伝子による「D-乳酸の産生」と同様の作用を有するものと推定される。そこで、以下の試験をおこなった。
【００４７】
【試験例２】
《D-乳酸の添加によるバンコマイシンＭＩＣの変化の測定》
各種Enterococcus株の、バンコマイシンＭＩＣが DL-乳酸ナトリウムを添加することにより、どのように変化するかを調べた。
【００４８】
＜供試菌株＞
この試験において使用した菌株は、以下のとおりである。
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis ＡＴＣＣ２９２１２株：１株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis：３株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecium：３株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus avium：３株、
ＶａｎＣ型Enterococcus casseliflavus：５株、
ＶａｎＣ型Enterococcus gallinarum：５株、
ＶａｎＡ型ＶＲＥ：５株、
ＶａｎＢ型ＶＲＥ：４５株、
以上、合計７０株を用いて試験をおこなった。
【００４９】
＜試験方法＞
測定は、９６穴のマイクロプレートを用い、バンコマイシン最終濃度０．５μｇ／ｍｌ〜５１２μｇ／ｍｌの１１系列、 DL-乳酸ナトリウム最終濃度０．０２５ｍｏｌ／ｌ〜１．６ｍｏｌ／ｌの７系列からなる微量液体希釈法によるチェッカーボード法によっておこなった。
培地は、Brain heart infusion brothを用いた。
各Enterococcus株は、Brain heart infusion brothにおいて３５℃で１８時間好気培養したものを、同じくBrain heart infusion brothで１００倍に希釈し、各ウエルに１００μｌづつ接種した。これを３５℃で４８時間好気培養後、バンコマイシンＭＩＣを測定した。その試験データを表２に示す。
【００５０】
＜試験結果＞
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis ＡＴＣＣ２９２１２株（１株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しない Enterococcus faecalis（３株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しない Enterococcus faecium（３株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しない Enterococcus avium  （３株）は、DL- 乳酸ナトリウムの添加によるバンコマイシンＭＩＣの変化は認められず、バンコマイシンＭＩＣはすべて２μｇ／ｍｌ以下であった。
また、ＶａｎＣ型 Enterococcus casseliflavus（５株）、ＶａｎＣ型 Enterococcus gallinarum（５株）も、 DL-乳酸ナトリウムの添加によるバンコマイシンＭＩＣの変化は認められず、バンコマイシンＭＩＣはすべて１６μｇ／ｍｌ以下であった。
これに対して、ＶａｎＡ型ＶＲＥ（５株）、ＶａｎＢ型ＶＲＥ（４５株）は、 DL-乳酸ナトリウムの添加により、すべての株で、バンコマイシンＭＩＣが上昇するか、又はバンコマイシンＭＩＣ５１２μｇ／ｍｌ以上の高度耐性の維持を示した。
【００５１】
＜考察＞
以上の試験結果から、 DL-乳酸ナトリウムの添加によって「バンコマイシンＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」のバンコマイシンのＭＩＣが上昇することが確認できた。この DL-乳酸ナトリウムの添加によるバンコマイシンＭＩＣの上昇は、DL- 乳酸ナトリウムの添加濃度０．０２５〜０．８ｍｏｌ／ｌで認められた。
ただし、 DL-乳酸ナトリウム添加濃度０．４ｍｏｌ／ｌ以上では、添加量増加に伴い、発育が不良になる傾向が認められたため、最適添加濃度は、０．２ｍｏｌ／ｌであると判断した。
【００５２】
以上、試験例１及び試験例２の結果から、「バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus株」及び「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」は、D-サイクロセリン及びDL -乳酸ナトリウムの添加によるバンコマイシンＭＩＣの変化は認められず、バンコマイシンＭＩＣは、すべて３２μｇ／ｍｌ以下であることが確認された。
これに対して「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、D-サイクロセリン及び DL-乳酸ナトリウムの添加により、すべての株で、バンコマイシンＭＩＣの上昇が認められ、バンコマイシンＭＩＣが３２μｇ／ｍｌ以上になることが確認された。
【００５３】
上記の結果から、「バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus株」及び「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」は、D-サイクロセリン及び DL-乳酸ナトリウムを添加しても、バンコマイシンを３２μｇ／ｍｌ添加した培地では、すべての株が発育しないことが予想された。
これに対して、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、D-サイクロセリンとDL-乳酸ナトリウムを添加することにより、バンコマイシンを３２μｇ／ｍｌ添加した培地でも、すべての株が発育可能であることが予想された。そこで、さらに、以下の試験をおこなった。
【００５４】
【試験例３】
《D-サイクロセリン、D-乳酸を添加した培地でのＶＲＥの発育状況の測定》
D-サイクロセリン、 DL-乳酸ナトリウム、バンコマイシンを添加した培地での各種Enterococcus株の発育を、希釈回収試験法を用いて調べた。
【００５５】
＜供試菌株＞
この試験において使用した菌株は、以下のとおりである。
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis ＡＴＣＣ２９２１２株：１株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis：３株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecium：３株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus avium：３株、
ＶａｎＣ型Enterococcus casseliflavus：５株、
ＶａｎＣ型Enterococcus gallinarum：５株、
ＶａｎＡ型ＶＲＥ：５株、
ＶａｎＢ型ＶＲＥ：４５株、
以上、合計７０株を用いて試験をおこなった。
【００５６】
＜試験方法＞
培地は、「５％ヒツジ血液寒天培地」、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ添加ＢＨＩアガー」の３種類を用いた。
各種Enterococcus株は、マックファーランドＮｏ．０．５の濁度の菌液を調整し、これを原液として×１０-1〜×１０-6までの希釈系列を作製した。この希釈系列の各菌液を、上記３種類の各培地に１０μｌづつスポット接種し、３５℃で４８時間好気培養後、発育してきたコロニーをカウントし、発育対照である「５％ヒツジ血液寒天培地」での発育と比較した。その試験データを表３、表４及び表５に示す。
【００５７】
＜試験結果＞
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis ＡＴＣＣ２９２１２株（１株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis（３株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しない  Enterococcus faecium（３株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus avium（３株）及びＶａｎＣ型Enterococcus casseliflavus（５株）、ＶａｎＣ型Enterococcusgallinarum（５株）は、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」と「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ添加ＢＨＩアガー」の両培地において、すべての株が発育を認めなかった。これに対して、ＶａｎＡ型ＶＲＥ（５株）は、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」及び「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ添加ＢＨＩアガー」の両培地において、すべての株が対照の「５％ヒツジ血液寒天培地」と同等の良好な発育を認めた。
ＶａｎＢ型ＶＲＥ（４５株）は、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」で全く発育しないものが１株、対照の「５％ヒツジ血液寒天培地」と比較して発育がいちじるしく悪いものが１２株認められた。これは、これらの「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」のバンコマイシンＭＩＣが低いため、バンコマイシンを３２μｇ／ｍｌ添加した培地では発育が阻害されるためであると考えられる。
これに対して、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ添加ＢＨＩアガー」では、すべての「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」株で、対照の「５％ヒツジ血液寒天培地」と同等の良好な発育を認めた。これは、D-サイクロセリンと DL-乳酸ナトリウムを添加したことにより、「バンコマイシンＭＩＣが低いＶａｎＢ型ＶＲＥ」のバンコマイシンＭＩＣが上昇し、バンコマイシンを３２μｇ／ｍｌ添加した培地でも発育可能となったためであると考えられる。
【００５８】
＜考察＞
以上の試験結果から、「バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus株」及び「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」と、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」とは、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ添加ＢＨＩアガー」での発育の有無によって、明確に分別できることが確認された。
【００５９】
【発明の実施の形態】
次に、本発明者らは、上記の試験結果に基づいて、具体的な「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地の作製を試みた。
バンコマイシン添加濃度は、前記試験例より、３２〜２５６μｇ／ｍｌであることが望ましく、さらに、最適濃度は３２μｇ／ｍｌであると判断した。
D-サイクロセリン添加濃度は、前記試験例より、１〜６４μｇ／ｍｌであることが望ましく、さらに、最適濃度は３２μｇ／ｍｌであると判断した。
DL-乳酸ナトリウム添加濃度は、前記試験例より、０．０２５〜０．８ｍｏｌ／ｌであることが望ましく、さらに、最適濃度は０．２ｍｏｌ／ｌであると判断した。
【００６０】
ＶＲＥが発育可能な培地成分として、「ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド（以下、ＴＴＣという。）５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」を使用した。ポリミキシンＢとアズトレオナムは、グラム陰性桿菌の発育を抑制、アンホテリシンＢは、真菌の発育抑制を目的として添加し、ＴＴＣは、発育するＶＲＥのコロニーを着色して見やすくすることを目的として、それぞれ添加してある。
尚、この「ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」は、腸球菌が発育可能な培地成分の一例であり、本発明に係る培地成分の必須要件ではない。本発明では、腸球菌が発育可能な成分を含有している培地であれば、どのような培地でも使用して差し支えない。
【００６１】
以上のとおり、本発明者らは、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地として、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」を代表例とする検出用培地を完成するに至った。
【００６２】
次に、本発明者らは、今回開発した「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地の代表例として、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」を用いて、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出することを試みた。
【００６３】
さらに具体的には、以下のような検査法を用いて「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出することとした。
その一つは、臨床材料から「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」ではないかと疑われる菌が検出された場合の具体的な検査法として、これらの被検菌を菌浮遊液とし、これを今回開発した「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地に接種し、３５〜３７℃で２４〜４８時間培養し、その発育の有無から「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法である。
他の一つは、検査材料から直接「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を検出する場合の具体的な検査法として、今回開発した「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地に検査材料を直接接種し、３５〜３７℃で２４〜４８時間培養し、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法である。以下、これらの具体的な方法を、実施例をもって、さらに詳細に説明する。
【００６４】
【実施例１】
《被検菌の菌浮遊液を培地に接種して「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法》
現在の検査法で用いられている「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」と今回開発した「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」の２種類の培地を用いて、各種Enterococcus株の発育を希釈回収試験法を用いて検査した。
【００６５】
＜供試菌株＞
本実施例の検査において使用した菌株は、以下のとおりである。
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis ＡＴＣＣ２９２１２株：１株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis：３株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecium：３株、
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus avium：３株、
ＶａｎＣ型Enterococcus casseliflavus：５株、
ＶａｎＣ型Enterococcus gallinarum：５株、
ＶａｎＡ型ＶＲＥ：５株、
ＶａｎＢ型ＶＲＥ：４５株、
以上、合計７０株を用いて検査をおこなった。
【００６６】
＜検査方法＞
培地は、発育対照として「５％ヒツジ血液寒天培地」、現在の検査法で用いられている「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」及び今回開発した、本発明に係る培地の代表例である「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」の３種類を用いた。各種Entercoccus株は、マックファーランドＮｏ．０．５の濁度の菌液を調整してこれを原液とし、×１０-1〜×１０-6までの希釈系列を作製した。この希釈系列の各菌液を上記３種類の各培地に１０μｌづつスポット接種し、３５℃で４８時間好気培養後、発育してきたコロニーをカウントし、発育対照である「５％ヒツジ血液寒天培地」と比較した。その検査データを表６、表７及び表８に示す。
【００６７】
＜検査結果＞
バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus faecalis ＡＴＣＣ２９２１２株（１株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しない Enterococcus faecalis（３株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しない Enterococcus faecium（３株）、バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus avium（３株）は、「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」と、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」の両培地において、すべての株が発育を認めなかった。
ＶａｎＣ型Enterococcus casselifflavus（５株）、ＶａｎＣ型Enterococcusgallinarum（５株）は、「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」では、すべての株が発育を認めたのに対して、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」では、すべての株が発育を認めなかった。
ＶａｎＡ型ＶＲＥ（５株）は、「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」と、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」の両培地において、すべての株が対照の「５％ヒツジ血液寒天培地」と同等の良好な発育を認めた。
ＶａｎＢ型ＶＲＥ（４５株）は、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」で、接種菌量が少なくなると発育が不良となるものが８株認められた。これに対し、今回開発した「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」では、接種菌量が少なくなっても、対照の「５％ヒツジ血液寒天培地」と同等の良好な発育を認めた。
【００６８】
＜考察＞
上記実施例１の結果から、「バンコマイシン耐性遺伝子を保有しないEnterococcus株」及び「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」と、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」とは、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」における発育の有無によって、明確に分別できることが確認された。
【００６９】
すなわち、被検菌から「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を検出する場合として、これらの被検菌を菌浮遊液とし、これを今回開発した「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地、具体的には「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」を代表例とする「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地に接種し、３５〜３７℃で２４〜４８時間培養し、発育の有無によって「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出することが可能となった。
【００７０】
【実施例２】
《検査材料を直接培地に接種して「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法》
現在の検査法で用いられている「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」と今回開発した「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」の２種類の培地を用いて、実際の患者糞便検体からＶＲＥスクリーニング検査をおこない、比較した。
本実施例の検査では、被検検体として、実際の患者糞便検体４９件を用いた。
【００７１】
＜検査方法＞
患者糞便検体に滅菌生理食塩水を等量程度加え、よく混和し、ペースト状にしたものを１白金耳とり、各培地に接種する。これを３５℃で４８時間培養後、発育してきたコロニーについて精査をおこなった。その検査データを表９に示す。
【００７２】
＜検査結果＞
「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」では、４９検体中１３検体（２６．５％）で「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」計１６株が検出された。  これに対して、「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」では、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」は全く検出されなかった。
また、今回のスクリーニング検査では、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」は、いずれの培地からも検出されなかった。
【００７３】
＜考察＞
実施例２の結果から、実際の患者糞便検体においても、今回開発した「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」を代表例とする「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地では、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」の発育を抑制していることが確認できた。
【００７４】
次に、実施例２のスクリーニング検査において「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」が検出されなかったため、実際の患者糞便検体に、既知の「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」を添加して、それらが各培地で添加量とほぼ同数検出できるか、以下の試験をおこなって確認した。
【００７５】
【試験例４】
《「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」を添加した検体を接種してＶＲＥ検出状況の確認試験》被検検体は、事前の検査にて「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」が存在しないことが確認されている２種類の患者糞便検体「サンプル１」と「サンプル２」に、既知の「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」３種をそれぞれ添加したものを使用した。
「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」の添加量は、１０μｌ中に１０〜２０個程度になるように調整した。
【００７６】
＜試験方法＞
現在の検査法で用いられている「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」と今回開発した「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」の２種類の培地を用いた。「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」を添加した被検検体１０μｌを、各培地に塗布し、３５℃で４８時間培養後、発育してきたコロニーについて精査をおこなった。その試験データを表１０に示す。
【００７７】
＜試験結果＞
患者糞便検体「サンプル１」は、１０μｌ中に「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」が１０7 個程度存在していた。このため、現在の検査法で用いられている「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」では、これらの「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」が発育してしまい、添加した「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」３種すべての株が、検出不可能となった。
これに対して、今回開発した「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレオナム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」では、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」の発育を完全に抑制しており、添加した「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」３種は、いずれも添加された菌量とほぼ同数の検出が確認できた。
また、患者糞便検体「サンプル２」は、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」が発育することはなかった。しかし、現在の検査法で用いられている「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」では、添加した「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」３種のうち１種が全く検出されなかった。
【００７８】
＜考察＞
患者糞便検体「サンプル１」の例で確認できたように、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」が多数存在している検体の場合、現在の検査法で用いられている「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」では、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」が存在していたとしても、見落としてしまう危険性があることが明らかとなった。
これに対して、今回開発した「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレオナム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」を代表例とする「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地では、「ＶａｎＣ型ＶＲＥ」の発育を完全に抑制できるため、目的菌である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」がごく少量であったとしても、検出が可能であることが確認できた。
【００７９】
また、患者糞便検体「サンプル２」の例では、現在の検査法で用いられている「バンコマイシン８μｇ／ｍｌ添加エンテロコッコセルアガー」では、菌量が少ないと検出できない「ＶａｎＢ型ＶＲＥ」が存在することが明らかとなった。  これに対して、今回開発した「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」では、これらの株でも発育は良好であり、菌量が少量であっても、検出が可能であることが確認できた。
【００８０】
以上、本発明は、すべての試験例と実施例から、今回開発した「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地、具体的には「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・ DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」を代表例とする「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地は、臨床的に重要である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出することが可能であることが証明された。
【００８１】
以上、詳しく説明したとおり、臨床材料から「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」が疑われる菌が検出された場合の具体的な検査法として、これらの被検菌を菌浮遊液とし、これを今回開発した「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ検出用培地」に接種し、３５〜３７℃で２４〜４８時間培養し、その発育の有無から「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出することが可能である。
【００８２】
また、検査材料から直接「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を検出する場合の具体的な検査法として、今回開発した「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地に検査材料を直接接種し、３５〜３７℃で２４〜４８時間培養し、「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出することが可能である。
【００８３】
【発明の効果】
今回開発した、本発明の「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地、具体的には「バンコマイシン３２μｇ／ｍｌ・D-サイクロセリン３２μｇ／ｍｌ・DL-乳酸ナトリウム０．２ｍｏｌ／ｌ・ポリミキシンＢ２０μｇ／ｍｌ・アズトレナオム２０μｇ／ｍｌ・アンホテリシンＢ２μｇ／ｍｌ・ＴＴＣ５０μｇ／ｍｌ添加ＢＨＩアガー」を代表例とする「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地を用いて、被検菌又は検査材料から、臨床的に重要である「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法は、現在の検出方法に比べ、飛躍的な手技の簡略化と、検出精度の向上が可能である。
以上、説明のとおり、本発明に係る「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」検出用培地及びその培地を使用して「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」を選択的に検出する方法は、ＶＲＥ、特に「ＶａｎＡ型及びＶａｎＢ型ＶＲＥ」の早期検出や拡散防止対策などが強く求められる現在の医療界において、きわめて有益である。
【表１】
0003732428.tif 000002
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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