(57)【要約】本発明によれば、α１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体を提供することができ、さらに該形質転換体を用いたα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質およびフコース含有複合糖質の製造法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体。
【請求項８】
微生物、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を宿主細胞とする請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
微生物が、エシェリヒア・コリである請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１または２に記載の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質の製造法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、グアノシン−５’−二リン酸フコースおよび受容体複合糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でフコース含有複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からフコース含有複合糖質を採取することを特徴とするフコース含有複合糖質の製造法。
【請求項１２】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品である請求項１１に記載の製造法。
【請求項１３】
受容体複合糖質が、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖を含む複合糖質である請求項１１に記載の製造法。
【請求項１４】
非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖が、非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ルイスＸ、およびルイスａ構造からなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖である請求項１３に記載の製造法。
【請求項１５】
受容体複合糖質が、ラクトース、グロボトリオース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ルイスＸ、およびルイスａからなる群より選ばれる受容体複合糖質である請求項１１に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、α１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体、該形質転換体を用いたα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質の製造法およびフコース含有複合糖質の製造法に関する。
背景技術
α１，２−フコース転移酵素遺伝子に関しては、動物由来の遺伝子［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６６７４（１９９０）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４４，７６（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，８８４４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，４６４０（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１６９７５（１９９６）］が取得されているが、動物由来の該遺伝子をエシェリヒア・コリなどの微生物を用いて活性のある蛋白質として発現させた例はない。
一方、微生物においては、ヘリコバクター・ピロリに属する微生物からα１，２−フコース転移酵素遺伝子が取得されており［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１，１２６５（１９９９）］、該遺伝子を用いてエシェリヒア・コリでα１，２−フコース転移酵素を発現させたとの報告があるが、該遺伝子を強力なプロモーター支配下においても該酵素活性は微弱であることが報告されている［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４５，３２４５（１９９９）］。上記ヘリコバクター・ピロリ由来のα１，２−フコース転移酵素遺伝子の塩基配列を改変した該酵素遺伝子を大腸菌を宿主として発現させたとの報告もあるが（ＷＯ  ０１／４６４００）、より活性の高いα１，２−フコース転移酵素が望まれている。
フコース含有複合糖質の中には、血液型抗原として知られているものが存在し、それらは細胞の癌化に伴い、その構造が変化することが明らかにされ［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５１，８９（１９９７）］、腫瘍マーカーや医薬品としての応用が期待されている。また、人乳中にはオリゴ糖が豊富に含まれており、フコース含有複合糖質（２’−フコシルラクトースが主要成分のひとつ）は全オリゴ糖中７０％以上を占めている［Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，８，６１５（１９９８）］。人乳中のオリゴ糖にも含まれるＦｕｃα１−２Ｇａｌ構造を有する複合糖質は、カンジダ・アルビカンスの感染を阻害することが知られていることから［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９，１６５０（１９９１）］、フコース含有複合糖質は安全な感染予防薬の有力な候補と考えられる。
しかしながら、２’−フコシルラクトースなどのフコース含有複合糖質の製造に関しては、人乳からの抽出法［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２１１，１７０（１９８１）］、トランスジェニック動物を用いた生産法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２９５１５（１９９５）、ＵＳＰ  ５，７００，６７１］、酵素を用いた生産法（ＵＳＰ  ５，５８３，０４２）、微生物を用いた方法（ＷＯ  ０１／４６４００）が報告されているが、いずれもコストや生産性の面で十分なものとは言えず、効率のよいフコース含有複合糖質の製造方法が求められている。
発明の開示
本発明の目的は、α１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する形質転換体、該形質転換体を用いたα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質の製造法とフコース含有複合糖質の製造法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ヘリコバクター・ピロリの配列情報を利用して取得したヘリコバクター・ムステレ（ＡＴＣＣ４３７７２株）のＤＮＡ断片に含まれる遺伝子の産物について、その活性を詳細に調べた結果、これまで特定されていなかったα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを該微生物から初めて見い出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（２）  配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質。
（３）  （１）または（２）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（４）  配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（５）  配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（６）  （３）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
（７）  （６）に記載の組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体。
（８）  微生物、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を宿主細胞とする（７）に記載の形質転換体。
（９）  微生物が、エシェリヒア・コリである（８）に記載の形質転換体。
（１０）  （７）〜（９）のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１）または（２）に記載の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする（１）または（２）に記載の蛋白質の製造法。
（１１）  （７）〜（９）のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、グアノシン−５’−二リン酸フコースおよび受容体複合糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でフコース含有複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からフコース含有複合糖質を採取することを特徴とするフコース含有複合糖質の製造法。
（１２）  培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品である（１１）に記載の製造法。
（１３）  受容体複合糖質が、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖を含む複合糖質である（１１）に記載の製造法。
（１４）  非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖が、非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ルイスＸ、およびルイスａ構造からなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖である（１３）に記載の製造法。
（１５）  受容体複合糖質が、ラクトース、グロボトリオース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ルイスＸ、およびルイスａからなる群より選ばれる受容体複合糖質である（１１）に記載の製造法。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質である。
１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から５０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
本発明の蛋白質の有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がα１，２−フコース転移酵素活性を有するには、配列番号１記載のアミノ酸配列と、少なくとも７５％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の同一性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
本発明のＤＮＡとしては、上記本発明の蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。具体的には、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（２）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（４）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα１，２−フコース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも７５％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
［１］本発明のＤＮＡの調製
（ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、ヘリコバクター属に属する微生物より調製することができる。ヘリコバクター属に属する微生物としては、例えばヘリコバクター・ムステレをあげることができ、具体的にはヘリコバクター・ムステレＡＴＣＣ４３７７２株等をあげることができる。
ヘリコバクター・ムステレに属する微生物を公知の方法［例えば、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，８３３（１９９６）］により培養する。
培養後、公知の方法（例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、菌体から染色体ＤＮＡを単離精製する。
染色体ＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法などをあげることができる。
染色体ＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、λｚａｐ  ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）］、λ  ＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ストラタジーン社製、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、ｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ＤＮＡを組み込んだベクターを導入する大腸菌としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７（１９８３）］等を用いることができる。
（ｂ）本発明のＤＮＡの取得
上記で作製した染色体ＤＮＡライブラリーからの、目的とするクローンの選択は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等の実験書に記載されているコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡプローブとしては、既知のα１，２−フコース転移酵素遺伝子またはその一部、既知の該遺伝子の塩基配列をもとに合成したＤＮＡなどの他、既知の該遺伝子の塩基配列に基づき設計したＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲにより取得した遺伝子断片などをあげることができる。例えば、ヘリコバクター・ピロリ由来のα１，２−フコース転移酵素遺伝子の塩基配列に基づき設計した配列番号３および４記載の合成ＤＮＡをプライマーとして、ヘリコバクター・ムステレ染色体ＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲにより取得することができるＤＮＡ断片などを例示することができる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等を用いたジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４．，５４６３（１９７７）］により該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
また、上記により決定された塩基配列に基づいたプライマーを調製し、染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により目的とするＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得された新規な塩基配列を有するＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ  ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物としては、エシェリヒア・コリ等をあげることができる。
エシェリヒア・コリとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＥ８４１５等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを含有するエシェリヒア・コリとして、具体的にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＨＭＦＴ８０をあげることができる。
［２］本発明の蛋白質の調製
本発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記［１］に記載の方法により取得した本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８０Ｌ（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐＲＥＰ４（いずれもインビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）］等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ  ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ  ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ  Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明の蛋白質を製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６．０〜８．０、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６．０〜７．０、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５．０〜９．０、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含有する微生物、動物細胞、昆虫細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質を生産させる形態としては、本発明の蛋白質をそのままの構造で生産させる以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、シグナル配列を配した分泌タンパク質として、あるいは融合蛋白質として生産することができる。
融合させる蛋白質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合蛋白質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
本発明の蛋白質の分泌生産は、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより行うことができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まない、あるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０））。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
上記で取得された蛋白質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
［３］フコース含有複合糖質の製造
上記［２］の培養により得られた形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、グアノシン−５’−二リン酸フコースおよび受容体複合糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でフコース含有複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からフコース含有複合糖質を採取することによりフコース含有複合糖質を製造することができる。
受容体複合糖質としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖を含む複合糖質、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ルイスＸ、またはルイスａ構造等を有するオリゴ糖を含む複合糖質、より好ましくはラクトース、グロボトリオース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ルイスＸ、またはルイスａ等をあげることができる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
フコース含有複合糖質の生成において用いられる酵素源は、３７℃で１分間に１μｍｏｌのフコース含有複合糖質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌの濃度、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
フコース含有複合糖質の生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
フコース含有複合糖質の生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、フコース含有複合糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
フコース含有複合糖質の生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２等の無機塩等を添加することができる。
水性媒体中に生成したフコース含有複合糖質の定量はＤｉｏｎｅｘ社製の糖分析装置などを用いて行うことができる［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１（１９９０）］。
反応液中に生成したフコース含有複合糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  プローブの作成
ヘリコバクター・ムステレ  ＡＴＣＣ４３７７２株を公知の方法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，８３３（１９９６）］により培養した。
培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、菌体から染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した、配列番号３および４で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いて、ヘリコバクター・ムステレＡＴＣＣ４３７７２株の染色体ＤＮＡから、α１，２−フコース転移酵素遺伝子の部分断片を、ＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲは、上記合成ＤＮＡをプライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、ヘリコバクター・ムステレ  ＡＴＣＣ４３７７２株の染色体ＤＮＡ０．１μｇ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離して得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した後、該液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌの滅菌水に溶解した。
該ＤＮＡのラベル化は、ＤＩＧ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて行った。該ＤＮＡ溶解液２μｌを１００℃で１０分間処理した後、１３μｌの滅菌水、２μｌのヘキサヌクレオチド混合液、２μｌのｄＮＴＰ標識混合液および１μｌのＫｌｅｎｏｗ酵素溶液を加え、３７℃で１時間反応させた。該反応液に２μｌの０．２ｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を加えて反応を停止させ、さらに、２．５μｌの４ｍｏｌ／ｌ  ＬｉＣｌ溶液と７５μｌのエタノールを加えよく混ぜ、−８０℃に３０分間放置した。該液を遠心分離しラベル化ＤＮＡの沈殿を得た。
該ラベル化ＤＮＡの沈殿を５０μｌのＴＥに溶解し、プローブ溶液とした。
実施例２  サザンハイブリダイゼーション
実施例１で取得した染色体ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで完全消化した。制限酵素切断サンプル１μｇをアガロースゲル電気泳動に供し、泳動終了後、常法によりＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に移した。
ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて行った。ＤＮＡを転写したナイロンメンブランをプレハイブリダイゼーション溶液［０．７５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ，７５ｍｍｏｌ／ｌ  ｔｒｉ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ、１％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ、０．１％  Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ、０．０２％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）］をメンブレン１０ｃｍ２あたり２ｍｌ使用して６８℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に、プレハイブリダイゼーション溶液１ｍｌあたり５μｌの実施例１で調製したプローブを含む溶液をメンブレン１００ｃｍ２あたり２．５ｍｌ使用して、６８℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを室温で、１０ｃｍ２あたり５ｍｌの０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含む２倍濃度のＳＳＣ溶液で５分間洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。次に、６８℃で、１０ｃｍ２あたり５ｍｌの０．１％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含む０．１倍濃度のＳＳＣ溶液でメンブレンを１５分間洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。その後、洗浄Ｂｕｆｆｅｒ［０．１ｍｏｌ／ｌ  ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、０．３％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ｗ／ｖ）］を用いて室温で、１分間メンブレンを洗浄した。次にＤＩＧ  Ｂｕｆｆｅｒ２［０．１ｍｏｌ／ｌ  ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  、０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、１％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｗ／ｖ）］をメンブレン１０ｃｍ２あたり１０ｍｌ使用して室温で３０分間メンブレンを処理した。１５０ｍＵ／ｍｌ  Ａｎｔｉ  ＤＩＧ  ＡＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを含むＤＩＧ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２をメンブレン１０ｃｍ２あたり２ｍｌ使用して室温で３０分間メンブレンをインキュベーションした。さらに洗浄ｂｕｆｆｅｒをメンブレン１０ｃｍ２あたり１０ｍｌ使用して室温で１５分間メンブレンを洗浄する操作を２回行った後、メンブレンをＤＩＧ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３［１００ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５），１００ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ，５０ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ２］で２分間処理した。５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅとｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔを含むＤＩＧ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３をメンブレン１０ｃｍ２あたり１ｍｌ使用してメンブレンを冷暗所でインキュベーションし、発色反応を行った。
ハイブリダイゼーションの結果、ヘリコバクター・ムステレ染色体ＤＮＡの制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ切断断片の２．４ｋｂのＤＮＡに強いシグナルが得られた。
実施例３  コロニーハイブリダイゼーション
ヘリコバクター・ムステレ  ＡＴＣＣ４３７７２株の染色体ＤＮＡ  １μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで完全に消化し、該消化物をアガロースゲル電気泳動により分離し、２．４ｋｂ付近のＤＮＡ断片をジーンクリーンＩＩキット（フナコシ社より購入）により回収した。プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）０．１μｇをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで完全に消化した後、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）により脱リン酸化反応を行った。
上記で取得した２．４ｋｂ付近のＤＮＡ断片とＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断後ホスファターゼ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。得られた連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。生育してきたコロニーを公知の方法に従ってメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）に移植・溶菌させた後、ＤＮＡをメンブレン上に固定した。コロニーハイブリダイゼーションは実施例２のサザンハイブリダイゼーションと同様の方法で行った。
その結果、ヘリコバクター・ムステレ  ＡＴＣＣ４３７７２株の染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ切断断片の２．４ｋｂを含むプラスミドｐＢＳ２５を保有する菌株をポジティブクローンとして選択した。
実施例４  ＤＮＡ塩基配列の決定
実施例３で得られたプラスミドｐＢＳ２５の挿入ＤＮＡ断片について、そのＤＮＡ塩基配列をＡＢＩ  ３７７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより決定したところ、該挿入ＤＮＡ断片には配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする、配列番号２で表される塩基配列からなるオープン・リーディング・フレームが存在していた。
実施例５  ヘリコバクター・ムステレ由来のα１，２−フコース転移酵素遺伝子発現株の造成
ヘリコバクター・ムステレ  ＡＴＣＣ４３７７２株から実施例１に記載の方法により、染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機により合成した、配列番号５および６で表される塩基配列を有するＤＮＡを用い、実施例１記載の方法に従いＰＣＲを行い、ヘリコバクター・ムステレＡＴＣＣ４３７７２株の染色体ＤＮＡから、α１，２−フコース転移酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
該ＰＣＲ反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離して得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した後、該液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解し、ＤＮＡ溶液を得た。
該ＤＮＡ溶液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ社より購入）により０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＱＥ−８０Ｌ（キアゲン社製）０．２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、４．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該０．９ｋｂおよび４．８ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
得られた連結反応液を用いてエシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地［１０ｇ／ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、１０ｇ／ｌ酵母エキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／ｌアガロース］に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＨＭＦＴ８０を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）。以下、ｐＨＭＦＴ８０を保有するエシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株をエシェリヒア・コリ  ＤＨ５α／ｐＨＭＦＴ８０株と呼ぶ。
実施例６  Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃの生産
実施例５で得られたエシェリヒア・コリ  ＤＨ５α／ｐＨＭＦＴ８０株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地［バクトトリプトン（１０ｇ／ｌディフコ社製）、１０ｇ／ｌ酵母エキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム］８ｍｌの入った試験管に接種し３０℃で１２時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地８ｍｌの入った試験管に５％接種し３０℃で２時間培養後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを終濃度１ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加し、さらに３０℃で８時間培養した。該培養液１ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
培養液１ｍｌより調製したＤＨ５α／ｐＨＭＦＴ８０株湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｎＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／ｌラクトース、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＧＤＰ−フコース、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３２℃で９時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて以下の分析条件で分析し、反応液中に２．２５ｍｍｏｌ／ｌ（１０９９ｍｇ／ｌ）のＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃが生成蓄積していることを確認した。
分析条件：
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ  ＰＡ１０
溶離液：Ａ；Ｈ２Ｏ、Ｂ；５００ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ
グラジエント：Ｂの濃度を０分において８％に設定し、その後２１分かけて２０％になるように直線的に増加させた
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
参考例１  ヘリコバクター・ピロリ由来のα１，２−フコース転移酵素遺伝子発現株の造成
ＷＯ０１／４６４００に記載の方法にしたがって取得したエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＧＴ３５株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地を用いて培養した。
培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、菌体からプラスミドＤＮＡ  ｐＧＴ３５を単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した、配列番号７および８で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いて、エシェリヒア・コリ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ３５株のプラスミドＤＮＡを鋳型にして、α１，２−フコース転移酵素遺伝子の部分断片を、ＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲは、上記合成ＤＮＡをプライマーとして各０．５μｍｏｌ／ｌ、ｐＧＴ３５０．１μｇ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解し、ＤＮＡ溶液を得た。
該ＤＮＡ溶液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＱＥ−８０Ｌ  ０．２μｇを制限酵素ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該０．９ｋｂおよび４．８ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、アガロース１５ｇ／ｌ］に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、その構造を制限酵素消化により解析し、発現プラスミドであるｐＨＰＦＴ８０が取得できていることを確認した。以下、ｐＨＰＦＴ８０を保有するエシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株をエシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＨＰＦＴ８０株と呼ぶ。
実施例７  ヘリコバクター・ムステレ由来のα１，２−フコース転移酵素の性質（１）
実施例５で得られたエシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＨＭＦＴ８０株と参考例１で得られたエシェリヒア・コリ  ＤＨ５α／ｐＨＰＦＴ８０株を実施例６に記載した方法で培養し、それぞれの株の湿菌体を得た。なお、培養終了時の６６０ｎｍにおける培養物のＯＤは、いずれも２．０であった。
実施例６に記載と同様の方法により、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α／ｐＨＭＦＴ８０株またはエシェリヒア・コリ  ＤＨ５α／ｐＨＰＦＴ８０株の湿菌体を酵素源に用い、ラクトース（Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，３Ｇｌｃ）またはＬＮｎＴ（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）を受容体糖質としてフコース含有糖鎖を製造した。エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α／ｐＨＭＦＴ８０株の湿菌体を酵素源に用い、ラクトースを糖受容体としたときのフコシルラクトース（Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）の生産量を１００としたときの各フコース含有糖質の生産量を第１表に示す。なお表中では、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α／ｐＨＭＦＴ８０株の湿菌体、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α／ｐＨＰＦＴ８０の湿菌体を酵素源に用いた場合をそれぞれ単にｐＨＭＦＴ８０、ｐＨＰＦＴ８０と表す。
2003018794.tif 000002
ヘリコバクター・ムステレ由来のα１，２−フコース転移酵素は、ヘリコバクター・ピロリ由来の該酵素に比べ活性が高く、またラクトースへの基質特異性が高いことがわかった。
実施例８  ヘリコバクター・ムステレ由来のα１，２−フコース転移酵素の性質（２）
５ｍｍｏｌ／ｌのグアノシン  ５’−二リン酸（ＧＤＰ）存在下または非存在下、実施例７に記載した方法と同様な方法により、ラクトースを受容体糖質としてフコシルラクトースを製造した。ＧＤＰ非存在下、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α／ｐＨＭＦＴ８０株の湿菌体を酵素源に用いたときのフコシルラクトースの生産量を１００としたときのフコシルラクトースの生産量を第２表に示す。
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上記結果から、ヘリコバクター・ムステレ由来のα１，２−フコース転移酵素は、ヘリコバクター・ピロリ由来の該酵素に比べ、ＧＤＰによるフィードバック阻害を受けにくく、よってフコース含有複合糖質の製造により適していることがわかった。
産業上の利用可能性
本発明により、α１，２−フコース転移酵素を遺伝子組換え手法により大量に生産することが可能となる。また、該酵素を用いることにより効率的にフコース含有複合糖質を製造できる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図  第１図はα１，２−フコース転移酵素遺伝子発現プラスミドｐＨＭＦＴ８０の造成工程を示す。図中、Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子、Ｔ５  ｐｒｏ．は、Ｔ５プロモーター、ｌａｃＩｑはｌａｃリプレッサー遺伝子、ＨＭＦＴはヘリコバクター・ムステレ由来のα１，２−フコース転移酵素遺伝子を表す。
【図１】
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【国際調査報告】
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