(57)【要約】本発明は２本鎖核酸のセンス、またはアンチセンス鎖の一方を選択的かつ効率的に合成する方法に関する。本発明にかかる１本鎖核酸の合成方法は以下の工程からなる。１）標的配列よりも５’側に制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡを、ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なるように制限酵素で切断する工程。２）制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の１本鎖領域に、少なくとも３’末端にその領域に相補的な塩基配列を持つプライマーをアニールさせる工程。３）プライマーの３’末端を起点に鎖置換型ポリメラーゼにより核酸を合成する工程。さらに、前記制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡをＬＡＭＰ反応を利用して増幅することにより、より効率的な１本鎖核酸の合成が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程からなる１本鎖核酸の合成方法。
１）標的配列よりも５’側に制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡを、
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる
ように制限酵素で切断する工程。
２）制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の１本鎖領域に、少なくとも３’末端にその領域に相補的な塩基配列を持つプライマーをアニールさせる工程。
３）プライマーの３’末端を起点に鎖置換型ポリメラーゼにより核酸を合成する工程。
【請求項２】
前記制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡが、以下の工程を含む方法によって提供されることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。
１）該制限酵素認識配列をクローニングサイトの中に、あるいはクローニングサイトに隣接して有するベクターを用いて増幅すべきＤＮＡをクローニングする工程
２）該制限酵素認識配列上あるいはこれより３’側にアニールするプライマーを用いたＤＮＡ増幅法によって、該制限酵素認識配列及び増幅すべきＤＮＡを含む領域を増幅する工程。
【請求項３】
前記ＤＮＡ増幅法がＬＡＭＰ法である、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
前記制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡが、該制限酵素認識配列を含むプライマーを用いたＤＮＡ増幅法によって提供されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ増幅法が、以下のＡ）及びＢ）からなるプライマーを用いたＬＡＭＰ法である、請求の範囲第４項記載の方法。
２本鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖上にある標的配列の３’末端から該ＤＮＡ鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、また該標的配列の５’末端から該ＤＮＡ鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択したとき、
Ａ）前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー、又は　前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２、前記制限酵素認識配列及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー
Ｂ）前記Ｒ２と同一の配列、前記制限酵素認識配列及び前記Ｒ１に相補的な配列Ｒ１ｃを３’側から５’側にこの順で含むプライマー
【請求項６】
前記ＤＮＡ合成工程において、さらに前記インナープライマーよりも３’側にアニールするアウタープライマーを用いることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】
制限酵素による切断部位の１本鎖領域の長さが、少なくとも５塩基以上であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
制限酵素による切断部位の１本鎖領域の長さが、少なくとも７塩基以上であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
プライマーが検出可能な標識物質又は固相と結合しているか、あるいはこれらに結合可能なように修飾されていることを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
２本鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖上にある標的配列の３’末端から該ＤＮＡ鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、また該標的配列の５’末端から該ＤＮＡ鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択したとき、以下のＡ）及びＢ）からなるインナープライマー。
Ａ）前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー、又は　前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２、以下の制限酵素の認識配列及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる
ように切断可能な制限酵素
Ｂ）前記Ｒ２と同一の配列、前記制限酵素の認識配列及び前記Ｒ１に相補的な配列Ｒ１ｃを３’側から５’側にこの順で含むプライマー
【請求項１１】
クローニングサイトの中に、あるいはクローニングサイトに隣接して、以下の塩基配列を持つことを特徴とする、１本鎖核酸合成用ベクター。
制限酵素で切断した際に、
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる
ように切断される塩基配列
【請求項１２】
少なくとも以下の試薬を含む１本鎖核酸合成用試薬キット。
１）以下の特徴を持つ制限酵素
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）それぞれの断片の塩基配列が異なるように切断可能である
２）上記制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の１本鎖領域にアニール可能なプライマー
３）鎖置換型ポリメラーゼ
４）請求の範囲第１０項記載のインナープライマー又は請求の範囲第１１項記載の１本鎖核酸合成用ベクター
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は１本鎖ＤＮＡの合成方法に関する、更に詳しくは２本鎖ＤＮＡのうちセンス又はアンチセンス鎖の一方のみを選択的に合成する方法に関する。
背景技術
ハイブリダイゼーションアッセイのプローブに使用する１本鎖ＤＮＡの調製方法として最も一般的な方法は、熱又はアルカリによる２本鎖ＤＮＡの変性によるものである。しかしながら、この方法では生成物中に相補鎖が共存するため、２本鎖を形成する条件下におくと相補鎖同士が再結合し、ハイブリダイゼーションの効率が低下することがある。Ｍ１３等の１本鎖ファージを利用したクローニングによる１本鎖ＤＮＡの調製方法も知られているが、コストや時間がかかるという欠点がある。
数十ｂａｓｅ程度の短い１本鎖ＤＮＡであれば化学合成により容易に合成できるが、１００ｂａｓｅを超える長い１本鎖ＤＮＡを化学合成すると収率や塩基配列の正確さが低下する。また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡを鋳型に１本鎖ＲＮＡを合成できるが、鋳型ＤＮＡには該酵素が認識するプロモーター配列が必要である。
一方、ＷＯ９９／０９２１１には、２本鎖核酸の第１鎖上の標的配列を増幅する方法であって、第１鎖上の標的配列５’末端部を切断し、かつ該切断により第２鎖の３’末端領域が突出するように制限酵素を用いて２本鎖核酸を切断し、次いで前記第２鎖の３’末端に相補的なプライマーと鎖置換型ポリメラーゼを用いて、第２鎖を鋳型とした伸長反応を行わせ、前記標的配列を増幅する方法が開示されている。この方法では、プライマーによる標的領域の合成と同時に制限酵素切断部位も再生される原理になっているが、反応の開始時点で標的領域は該制限酵素切断部位を５’末端に有している必要があり、その認識部位の提供については十分な開示はされていない。またこの方法は、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６；１９９２］［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６；１９９２］の改良法であって、本来２本鎖ＤＮＡの増幅を目的としたものである。したがって、切断によって生じるそれぞれの３’側突出部の配列が同一（回文配列）の場合には、単一のプライマーのみを使用してもセンス鎖、アンチセンス鎖の両方が合成されてしまう。つまり、この方法は必ずしも１本鎖ＤＮＡを提供するものではない。
なお、ここでＳＤＡ法について若干の説明を加えておく。ＳＤＡ法は、ある塩基配列の３’側に相補的なプライマーを合成起点として相補鎖合成を行うときに、５’側に２本鎖の領域が有るとその鎖を置換しながら相補鎖の合成を行う特殊なＤＮＡポリメラーゼを利用する方法である。ＳＤＡ法では、プライマーとしてアニールさせた配列に予め制限酵素認識配列を挿入しておくことによって、ＰＣＲ法においては必須となっている温度変化工程の省略を実現できる。すなわち、制限酵素によってもたらされるニックが相補鎖合成の起点となる３’−ＯＨ基を与え、そこから鎖置換合成を行うことによって先に合成された相補鎖が１本鎖として遊離して次の相補鎖合成の鋳型として再利用される。このようにＳＤＡ法はＰＣＲ法で必須となっていた複雑な温度制御を不要とした。
発明の開示
本発明が解決すべき課題は、比較的長いセンス又はアンチセンス鎖の一方を選択的かつ効率的に合成する方法を提供することである。
本発明者らは鋭意検討した結果、ＬＡＭＰ法を応用したＤＮＡ増幅方法と「３’末端が突出した断片を形成し、かつ切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なるように切断可能な制限酵素」を用いることにより、１本鎖核酸を選択的かつ効率的に合成しうることを見出し本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）以下の工程からなる１本鎖核酸の合成方法。
１）標的配列よりも５’側に制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡを、
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる
ように制限酵素で切断する工程。
２）制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の１本鎖領域に、少なくとも３’末端にその領域に相補的な塩基配列を持つプライマーをアニールさせる工程。
３）プライマーの３’末端を起点に鎖置換型ポリメラーゼにより核酸を合成する工程。
（２）前記制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡが、以下の工程を含む方法によって提供されることを特徴とする、上記（１）記載の方法。
１）該制限酵素認識配列をクローニングサイトの中に、あるいはクローニングサイトに隣接して有するベクターを用いて増幅すべきＤＮＡをクローニングする工程
２）該制限酵素認識配列上あるいはこれより３’側にアニールするプライマーを用いたＤＮＡ増幅法によって、該制限酵素認識配列及び増幅すべきＤＮＡを含む領域を増幅する工程。
（３）前記ＤＮＡ増幅法がＬＡＭＰ法である、上記（２）記載の方法。
（４）前記制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡが、該制限酵素認識配列を含むプライマーを用いたＤＮＡ増幅法によって提供されることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（５）前記ＤＮＡ増幅法が、以下のＡ）及びＢ）からなるプライマーを用いたＬＡＭＰ法である、上記（４）記載の方法。
２本鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖上にある標的配列の３’末端から該ＤＮＡ鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、また該標的配列の５’末端から該ＤＮＡ鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択したとき、
Ａ）前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー、又は　前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２、前記制限酵素認識配列及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー
Ｂ）前記Ｒ２と同一の配列、前記制限酵素認識配列及び前記Ｒ１に相補的な配列Ｒ１ｃを３’側から５’側にこの順で含むプライマー
（６）前記ＤＮＡ合成工程において、さらに前記インナープライマーよりも３’側にアニールするアウタープライマーを用いることを特徴とする上記（５）記載の方法。
（７）制限酵素による切断部位の１本鎖領域の長さが、少なくとも５塩基以上であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の方法。
（８）制限酵素による切断部位の１本鎖領域の長さが、少なくとも７塩基以上であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の方法。
（９）プライマーが検出可能な標識物質又は固相と結合しているか、あるいはこれらに結合可能なように修飾されていることを特徴とする上記［１］〜［８］のいずれか１に記載の方法。
（１０）２本鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖上にある標的配列の３’末端から該ＤＮＡ鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、また該標的配列の５’末端から該ＤＮＡ鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択したとき、以下のＡ）及びＢ）からなるインナープライマー。
Ａ）前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー、又は　前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２、以下の制限酵素の認識配列及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる
ように切断可能な制限酵素
Ｂ）前記Ｒ２と同一の配列、前記制限酵素の認識配列及び前記Ｒ１に相補的な配列Ｒ１ｃを３’側から５’側にこの順で含むプライマー
（１１）クローニングサイトの中に、あるいはクローニングサイトに隣接して、以下の塩基配列を持つことを特徴とする、１本鎖核酸合成用ベクター。
制限酵素で切断した際に、
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる
ように切断される塩基配列
（１２）少なくとも以下の試薬を含む１本鎖核酸合成用試薬キット。
１）以下の特徴を持つ制限酵素
ａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつ
ｂ）それぞれの断片の塩基配列が異なるように切断可能である
２）上記制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の１本鎖領域にアニール可能なプライマー
３）鎖置換型ポリメラーゼ
４）上記（１０）記載のインナープライマー又は上記（１１）記載の１本鎖核酸合成用ベクター
本発明にかかる１本鎖核酸の合成方法において、「１本鎖核酸」とは２本鎖ＤＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のみからなるＤＮＡ、すなわち１本鎖ＤＮＡを意味する。また、「アニール」とは核酸がワトソン−クリックの法則に基づく塩基対結合によって２本鎖構造を形成することを意味する。したがって、１本鎖核酸が分子内でこのような塩基対結合を形成しても、アニールである。本発明において、アニールとハイブリダイズは、核酸が塩基対結合による２本鎖構造を構成する点で同義である。
本発明において、「標的配列（或いは領域）」知とは１本鎖核酸として合成すべき塩基配列（あるいは領域）を意味するものとする。また、鋳型となる２本鎖ＤＮＡのうち、該標的配列を含む方の鎖を第１鎖、これに相補的な鎖を第２鎖を意味するものとする。
本発明ではＬＡＭＰ法の技術が応用される。ＬＡＭＰ法は本発明者らが開発した核酸の増幅方法で、インナープライマーペア或いはこれにアウタープライマーペアを加えた、２種或いは４種の特異的プライマーと、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及び基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（６５℃前後）でＤＮＡ又はＲＮＡを迅速かつ安価に増幅する方法である。ＬＡＭＰ法の詳細についてはＮａｇａｍｉｎｅ　ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１），Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．９，１７４２−１７４３、Ｎｏｔｏｍｉ　ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００），Ｖｏｌ．２８，ｅ６３及び国際出願（国際公開番号：ＷＯ００／２８０８２、ＷＯ０１／３４８３８、ＷＯ０１／３４７９０等）等に記載されており、該記載は参照として本明細書中に取り入れるものとする。
本発明では、制限酵素切断部位をａ）３’末端が突出した断片を形成し、かつｂ）切断後のそれぞれの断片の１本鎖領域の塩基配列が異なる、という特徴を併せ持つ制限酵素を使用する。制限酵素の大半は切断後に５’末端が突出した断片か、平滑末端を持つ断片を形成する。しかし、少数ながら切断後に３’末端が突出した断片を形成する制限酵素が知られており、そのような酵素を用いて切断したＤＮＡ断片の一本鎖領域にプライマーをアニールさせ、ポリメラーゼにより核酸を合成することが可能である。ただし、突出した３’末端領域にプライマーをアニールさせ核酸の合成反芯を行うためには、塩基配列の特異性や結合の強度を考慮すると、１本鎖領域の長さが少なくとも５塩基以上、好ましくは７塩基以上必要である。
また、制限酵素の中には、認識部位に挟まれた、あるいは認識部位に隣接した任意の配列中に切断部位を持つものがある。たとえば、ＢｇｌＩはＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣという配列の７番目と８番目の塩基の間を切断する。このような制限酵素で切断した断片は、切断部位の塩基配列が異なる非対称な断片を生成する。すなわち、ＧＣＣＡＡＡＡＡＧＧＣという配列をＢｇｌＩで切断した場合、切断部位の塩基配列はＧＣＣＡＡＡＡとＧＣＣＴＴＴＴである。このような非対称な断片では一方に相補的な塩基配列を持つプライマー（プローブ）は他方には結合できない。
上に述べた特徴を併せ持つ制限酵素（以下、本発明の制限酵素という）としては例えばＴｓｐＲＩが挙げられる。ＴｓｐＲＩはＮＮＣＡ（Ｃ　ｏｒ　Ｇ）ＴＧＮＮという塩基配列を認識し、３’末端の任意の塩基と隣接する塩基の間を切断するので、切断後の１本鎖領域の長さは９塩基になる。
ＴｓｐＲ１を例として、本発明の１本鎖核酸合成方法の原理について説明する。上述の通り、ＴｓｐＲＩは３’側の切断面が９塩基の突出末端を持つ制限酵素である。さらに、認識配列ＮＮＣＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＧＮＮの両端の２塩基（ＮＮ）はＡＴＧＣのいずれでも良く、非対称な認識配列を形成することができる。これを利用することにより鎖特異的なＤＮＡ合成が可能となる。例えば、ＢａｍＨＩクローニングサイトの両端にＴｓｐＲＩサイトを持つ配列を作製する。これをＴｓｐＲＩで消化すると異なる塩基配列を持つ４つの３’突出末端が得られる。つぎに、このうちの１つを認識する配列（図１中［１］）でプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ：ＧＡＣＡＣＴＧＧＡ）を作製する。このプライマーは［２］［３］［４］とは完全に一致する配列でないためアニールする事が出来ない。したがって、プライマーが［１］にアニールして伸長反応が起こると、同一鎖のみを鋳型として合成反応が起こる。
上記合成反応に前記ＬＡＭＰ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００），Ｖｏｌ．２８，ｅ６３）の技術を応用することができる。例えば、
１）前記制限酵素認識配列をクローニングサイトの中に、あるいはクローニングサイトに隣接して有するベクターを用いて増幅すべきＤＮＡをクローニングする。
２）次いで、該制限酵素認識配列上、あるいはこれより３’側にアニールするＬＡＭＰ用プライマーを設計する。
３）そして、該プライマー及び鎖置換型ポリメラーゼを用いて、該制限酵素認識配列と増幅すべきＤＮＡを含む領域をＬＡＭＰ法により増幅する。
増幅した制限酵素認識配列を有する２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡを合成する過程は上述したとおりである。ＬＡＭＰ法は等温条件下、短時間で大量のＤＮＡを得ることができるため、上記合成方法と組み合わせることでより多くの鎖特異的一本鎖ＤＮＡを効率的に得ることができる。
なお、上記のＬＡＭＰ用プライマーとはＬＡＭＰ法で用いられる特異的プライマーで、前述したＮａｇａｍｉｎｅ　ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）等に基づいて容易に調整することができる。
前記１本鎖ＤＮＡの合成に使用するプライマーは、制限酵素で切断後の第２のＤＮＡ鎖上に存在する３’末端の突出した１本鎖部分に相補的に結合するものであれば特に制限はない。長さは前記１本鎖領域と完全に一致する必要はなく、相補的結合の特異性を損なわない範囲で５’側あるいは３’側が短くなっていてもかまわないし、５’側に任意の塩基配列が伸びていてもよい。
さらに、プライマーは検出可能な標識物質、又は固相と結合している、あるいは結合可能なように修飾されていてもよい。かかる１本鎖ＤＮＡ合成用プライマーの標識には、公知の標識物質、標識方法が利用できる。標識物質としては例えば、放射性物質、蛍光物質、ビオチン、及び酵素等が挙げられる。これらの標識物質を公知の方法によりプライマーに付加したり、プライマーを化学合成する際に予め標識されたヌクレオチドを取り込ませることにより、標識プライマーを作製することができる。また、上記の標識物質やラテックス粒子、磁性粒子、及び反応容器の内壁と結合可能なようにプライマーには適当な官能基を導入しても良い。
プライマーの標識部位は相補鎖とのアニーリングや、それに続く伸長反応を阻害しないように選択する必要がある。したがって、たとえば３’末端の標識は好ましくない。また、標識物質の分子量に応じて、立体障害が発生しないように５’側にリンカーとなる塩基配列を介した上で標識物質を結合させることも可能である。
本発明の１本鎖核酸の合成方法において、本発明の制限酵素認識配列をもたない２本鎖ＤＮＡへの該認識配列の挿入は、ＰＣＲ，ＬＣＲなど公知の遺伝子増幅法を利用して行うことができる。例えば、用いるプライマーに本発明の制限酵素認識配列を組み込んで、標的配列あるいはこれに相補的な配列を遺伝子増幅させれば、目的とする制限酵素認識配列を標的配列の３’側に挿入することができる。
また、前述したように、クローニングベクターのクローニングサイトの中に、あるいは該クローニングサイトに隣接して本発明の制限酵素認識配列を組み込んだベクターを用いてもよい。
本発明の好適な態様として、本発明の制限酵素認識配列をもたない２本鎖ＤＮＡに対し、ＬＡＭＰ法を利用して該制限酵素認識配列を導入することができる。すなわち、制限酵素認識配列を挿入したプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅反応を行うことにより、制限酵素認識配列を有する１本鎖核酸合成用の鋳型ＤＮＡ鎖を迅速かつ大量に調整することができる。
前記制限酵素認識配列は第１鎖上の標的配列の５’側に挿入される必要があり、特に３’側及び５’側の両方に挿入されるとより好適である。すなわち、第２鎖の３’側突出部にアニールするプライマーには制限酵素認識配列が必ず必要であるが、両方のプライマーに含まれるとより好適である。制限酵素切断部位が両側にあることにより、１種類の酵素により標的領域の両側を切断でき、必要な酵素の数を減らすことができるからである。なお、各プライマーから生じる伸長生成物を前記制限酵素で切断してできる断片の１本鎖領域の塩基配列は当然異なることが好ましい。
本発明においては、上記２種のプライマーをインナープライマーと呼ぶ。
具体的には、ＬＡＭＰ法を利用して２本鎖ＤＮＡに制限酵素認識配列を導入する方法は以下の工程からなる。
１）２本鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖上にある標的配列の３’末端から該ＤＮＡ鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、また該標的配列の５’末端から該ＤＮＡ鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択する工程。
２）以下のインナープライマーを調整する工程。
ａ）前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー、又は　前記Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２、前記制限酵素認識配列及び前記Ｆ１ｃと同一の配列を３’側から５’側にこの順で含むプライマー、並びに
ｂ）前記Ｒ２と同一の配列、前記制限酵素認識配列及び前記Ｒ１に相補的な配列Ｒ１ｃを３’側から５’側にこの順で含むプライマー
３）前記２本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖を鋳型として、前記プライマー及び鎖置換型ポリメラーゼを用いて、ＤＮＡ合成を行う工程。
なお、前記インナープライマーにおいて、Ｆ２と制限酵素認識配列、制限酵素認識配列とＦ１ｃはオーバーラップしていてもよく、また間に数個の塩基配列が挿入されていてもよい。同様にＲ２と制限酵素認識配列、制限酵素認識配列とＲ１ｃはオーバーラップしていてもよく、また間に数個の塩基配列が挿入されていてもよい。好ましくは、Ｆ２／Ｒ２、制限酵素認識配列、Ｆ１ｃ／Ｒ１ｃの各配列間の距離は１〜２０塩基、より好ましくは１〜１０塩基であると良い。
２本鎖ＤＮＡへのインナープライマーの最初のアニールは、熱又はアルカリ等の公知の方法により２本鎖ＤＮＡの一部又は全部を解離させて行うことができる。その後は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、基質ヌクレオチドの存在下、５５〜７０℃程度の等温条件下でＤＮＡ合成反応が繰り返されていく。
上記ＬＡＭＰ反応では、さらに前記インナープライマーとは異なる２種のプライマーを用いることもできる。かかるプライマーは、鋳型ＤＮＡ上において前記インナープライマーよりもさらに外側＝３’側にアニールするプライマーであり、本発明ではこれらをアウタープライマーと呼ぶ。該アウタープライマーは、以下のようにして調整することができる。
前述の第１のＤＮＡ鎖上において、Ｆ２ｃよりも３’側にある任意配列Ｆ３ｃ及び前記Ｒ２よりも５’側にある任意配列Ｒ３を選択し、
ａ）前記Ｆ３ｃに相補的な配列Ｆ３を含むプライマー、及び
ｂ）前記Ｒ３と同一の配列を含むプライマー
をそれぞれアウタープライマーとして調整する。
なお、前記アウタープライマーからのＤＮＡ合成は、インナープライマーからのＤＮＡ合成よりも後に開始される必要がある。これを達成するには、（ａ）インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも高く（例えば２〜５０倍、好ましくは４〜２５倍高く）設定設定する方法、及び（ｂ）インナープライマーの融解温度（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）をアウタープライマーの融解温度よりも高く設定する方法などが挙げられる。その他、ＬＡＭＰ法の実施条件については、前述の文献や特許を参照することにより適宜設定することができる。
さらに、上記ＬＡＭＰ反応では、増幅反応の結果生じる、ヘアピン構造を有する増幅産物のループ部分に特異的にアニールしうるプライマーを用いると、該増幅反応をより効率的に行うことができる。本発明においては、上記ループ特異的プライマーをループプライマーと呼ぶ。なお、このループプライマーのいずれか一方の３’末端に本発明の制限酵素認識配列を挿入すれば、ループプライマー自身が１本鎖核酸合成用プライマーとして機能しうる。
本発明はまた、本発明の方法を実施するための１本鎖核酸合成用試薬キットを提供する。該キットは、例えば特定配列のハイブリダイゼーションアッセイ用１本鎖核酸合成用試薬キットなどとして利用することができる。
前記キットは、本発明にかかる制限酵素、該制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の１本鎖領域にアニール可能なプライマー、鎖置換型ポリメラーゼ、本発明にかかるインナープライマーを少なくとも含み、さらに本発明にかかるアウタープライマー及び／又はループプライマーを含んでいても良い。
前記キットはさらに上記試薬の他、本発明にかかる合成方法を実施するために必要な他の試薬、例えば基質ヌクレオチド、緩衝液、融解温度調整剤等を含んでいてもよい。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０００−３２８２１９号の明細書に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
実施例１：
１．ベクターの調製
以下のプライマーを用い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩベクター（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＤＢ　Ｎｏ．Ｘ５２３２４）を鋳型として、ＰＣＲを行った。
2002034907.tif 000002
４０μｌの反応系に１　ｘ　ｂｕｆｆｅｒ［１６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ９．２、１．７５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．００１％（ｗ／ｖ）ｇｅｌａｔｉｎ］、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．４ＵのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼとＰｗｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＸｐａｎｄ　Ｌｏｎｇ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ，ロッシュ社）、０．５ｍＭの上記特異的プライマーペアを加え、１５サイクルのＰＣＲを９４℃　２０秒、６２℃　３０秒、６８℃　１２０秒の条件で行った。
増幅産物をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションを行った。これを大腸菌ＤＨ５αへ導入し、得られた形質転換体より目的とするベクターを得た（ｐＢＳＴｓｐＲＩと命名）。
このベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩベクターに存在したＳａｃＩからＫｐｎＩまでのマルチプルクローニングサイト（下線部）を欠失しているが、代わりにＴｓｐＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＴｓｐＲＩサイトを持ち、外来遺伝子をＢａｍＨＩサイトに挿入する事が出来る。
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・下線部の配列（配列番号１１）はマルチプルクローニングサイトを示す
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２．ＤＮＡのクローニング
ｐＵＣ１９ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ　ＤＢ　Ｎｏ．：Ｌ０９１３７）をＳａｕ３ＡＩで消化し、１０９ｂｐ及び８２ｂｐ　ＤＮＡ断片を単離した。この断片を前記ベクターのＢａｍＨＩサイトにそれぞれ挿入し、クローニングした。
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３．ＬＡＭＰ反応
Ｓａｕ３ＡＩ断片を組み込んだ前記ベクターを鋳型としてＬＡＭＰ反応（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００），Ｖｏｌ．２８，ｅ６３参照）により標的領域の増幅をおこなった。用いた反応液組成を表１に、またプライマーの配列と濃度を以下に示す。
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ターゲットＤＮＡは熱変性をしないものを用意し、反応液を６５℃で反応させた。これをＰＣＲ　ｐｕｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて２００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶出した。
３．ＴｓｐＲＩによる消化
ＬＡＭＰ産物２５μｌを５０ＵのＴｓｐＲＩ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ）で６５℃、９０分反応した。反応後、ＰＣＲ　ｐｕｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて１００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶出した。
４．プライマー伸長反応
上記ＴｓｐＲＩ断片に５’ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したプライマー（ＢＳＴｓｐＲＩ：５’−ＧＡＣＡＣＴＧＧＡ−３’）を加え、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ，３’→５’ｅｘｏ−（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ社）による伸長反応を行った。用いた反応液組成を表２に示す。
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このときプライマーＢＳＴｓｐＲＩはＴｓｐＲＩ消化断片の１つの粘着末端のみにしかアニールする事ができないため、伸長反応によって得られるＤＮＡ鎖は単一であるはずである。
５．ドットブロットハイブリダイゼーション
ナイロンメンブランフィルター（ＢｉｏｄｙｎｅＢ，Ｐａｌｌ）に１０９ｂｐ　Ｓａｕ３ＡＩ　ＤＮＡ断片の塩基配列から設計したセンスオリゴ（１０９Ａ　ｏｌｉｇｏ）あるいはアンチセンスオリゴ（１０９Ｂ　ｏｌｉｇｏ）をブロットした。各配列を以下に示す。
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このフィルターに対して上記伸長産物をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションにはＰｅｒｆｅｃｔＨｖｂ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、６０℃で終夜行った。シグナルの検出はＤＩＧ核酸検出キット（ロッシュ社）を使用した。この結果、アンチセンスオリゴをブロットしたところにのみシグナルが得られた（図２）。すなわち、単一の鎖特異的な一本鎖が得られたことを意味する。
実施例２：
鋳型を別のものに変えても同様な結果が得られるかを確認するために、前述８２ｂｐクローニング産物を使用して実験を行った。
実施例１で作製した８２ｂｐクローニングベクターを鋳型として前述と同様な反応条件でＬＡＭＰ反応を行った。今回ＬＡＭＰ反応にはループプライマーを使用せず、以下のインナープライマーおよび実施例１と同様のアウタープライマー（濃度も実施例１と同じ）を使用した。
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ＬＡＭＰ反応産物をＴｓｐＲＩ処理し、２％アガロースゲル電気泳動にて確認した（図３）。
電気泳動にて完全にＴｓｐＲＩで消化出来ていることを確認後、プライマーエクステンションを実施例１と同様な方法にて行った。プライマーエクステンションが行われていることを確認するために、この産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（ＢｉｏｄｙｎｅＢ，Ｐａｌｌ）にメンブラントランスファーした。このメンブランに対して、ＤＩＧ核酸検出キット（ロッシュ社）を使用し泳動産物に標識物が含まれているか検出した（図４）。この結果、ＴｓｐＲＩ産物中にＤＩＧラベルされたプライマーから伸長した産物が含まれることが確認できた。
標識されていることが確認できたのでこの産物をプローブとして、ドットブロットハイブリダイゼーションを行った（図５）。ブロットされているＤＮＡは以下の通りである。
１；８２ｂｐのアンチセンスオリゴＤＮＡ（配列番号１４）
２；８２ｂｐのセンスオリゴＤＮＡ（配列番号１３）
３；１０９Ａ　ｏｌｉｇｏ
４；１０９Ｂ　ｏｌｉｇｏ
５；８２ｂｐのＬＡＭＰ産物を熱変性したもの
６；無関係なＬＡＭＰ産物（λＤＮＡ増幅産物）を熱変性したもの
この結果、１と５にのみシグナルが得られた。すなわち、実施例１と同様に鋳型を変えても鎖特異的なＤＮＡのみが合成されたことが示された。また、ＬＡＭＰ産物を熱変性したものにもシグナルが見られたことから、ＬＡＭＰ産物そのものでもプローブの標的になることが分かった。ＬＡＭＰ産物は構造上、繰り返し配列を有しているためハイブリダイゼーションの効率は非常に悪いと考えられた。しかし、今回ＬＡＭＰ産物でもハイブリダイゼーションが行えたことから、ＤＮＡチップの基板上にＬＡＭＰ産物をスポットして使用することも可能であることが示唆された。
今回の検討ではプライマーの５’末端にＤＩＧ標識したものを使用した。これをアミノリンカーやビオチン標識したものを使用すると、標識されたＤＮＡ鎖を単離することも可能である。
実施例３：Ｂｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長反応
鎖置換型ＤＮＡ合成酵素であるＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応が行えるかどうかを検討した。用いた反応液組成を表３に示す。
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６０℃又は６５℃で１時間反応後、プライマーエクステンションが行われていることを確認するために、この産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（ＢｉｏｄｙｎｅＢ，Ｐａｌｌ）にメンブラントランスファーした。このメンブランに対して、ＤＩＧ核酸検出キット（ロッシュ社）を使用して泳動産物に標識物が含まれているかを検出した（図６）。その結果、Ｂｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼを用いてもＤＩＧラベルされたプライマーから伸長反応が起こることが確認できた。
実施例４：プライマー伸長産物のｌａｍｂｄａ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理
プライマーエクステンション後は、遊離した１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡが生成する。この２本鎖ＤＮＡのプライマーからの伸長鎖には５’末端にリン酸基が付いていない。そのため、ｌａｍｂｄａ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理すると、鋳型となったＤＮＡ鎖は５’側からＤＮＡの分解が起こるが、伸長鎖は分解されない。これにより、片側だけのＤＮＡ鎖だけが存在することになる。
前述（１０９ｂｐのプライマー伸長産物）のプライマー伸長産物に対してｌａｍｂｄａ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理を行った（３７℃、１時間反応）。用いた反応液組成を表４に示す。
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３７℃、１時間反応後、４％アガロースゲルにて電気泳動した。プライマー伸長産物をｌａｍｂｄａ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理して電気泳動した結果、約５０ｂｐ付近にバンドがシフトしているのが見られた（図７のレーン２）。１本鎖ＤＮＡは泳動度が速くなることが知られており、これが目的の産物であると考えられた。以上のことから、プライマー伸長産物をｌａｍｂｄａ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理することより、より多量の１本鎖ＤＮＡを得ることができることが確認できた。
実施例５：ＴｓｐＲＩのバッファーを用いたＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応
１．　Ｂｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼでの反応をＴｓｐＲＩのバッファーを用いて行った。
鋳型として用いたＬＡＭＰ産物は実施例２と同様である。このとき終濃度０，０．２５，０．５，１．０，２．０ｍＭのｄＮＴＰｓで検討した。用いた反応液組成を表５に示す。
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３７℃、１時間反応後プライマーエクステンションが行われていることを確認するために、反応産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（ＢｉｏｄｙｎｅＢ，Ｐａｌｌ）にメンブレントランスファーした。このメンブレンに対して、ＤＩＧ核酸検出キット（ロッシュ社）を使用し泳動産物に標識物が含まれているか検出した（図８）。この結果、ＴｓｐＲＩのバッファーを用いてもＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの伸長反応が起こることが確認できた。
以上より、本方法を用いれば、バッファーを共有することによりコスト低減が図れることがわかった。
２．　ＴｓｐＲＩのバッファーで伸長反応が起こることが確認できたので、次にＬＡＭＰ以降の反応を同時に行えるか検討した。用いた反応液組成を表６に示す。
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ＬＡＭＰ反応後の反応液（１／５０量）を上記反応系に添加し、３７℃、１時間反応させた。反応液中のＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ量は０．１６Ｕになる。前記実施例より０．１Ｕの酵素量があれば、反応が進むことは確認済みである。反応後、産物をプローブとして用いてドットブロットハイブリダイゼーションを行った（図９）。ブロットされているＤＮＡは以下の通りである。
１；８２ｂｐのアンチセンスオリゴＤＮＡ
２；８２ｂｐのセンスオリゴＤＮＡ
３；１０９Ａ　ｏｌｉｇｏ
４；１０９Ｂ　ｏｌｉｇｏ
この結果、８２ｂｐのアンチセンスオリゴをブロットした位置（１）に強いシグナルが見られた。センスオリゴ側（２）に見られた弱いシグナルは、ＴｓｐＲＩによる反応で切れ残りがあったためと考えられた。よって、特異的な増幅産物が出来ていることが確認できた。
以上の結果から、本方法を用いれば、コストの低減のみならず時間の短縮も可能であることが示された。
実施例６：ＬＡＭＰプライマーを用いた制限酵素認識配列の挿入
１．ＴｓｐＲＩ部位を持たない鋳型から鎖特異的１本鎖を得るために、以下のＴｓｐＲＩ認識配列を挿入したインナープライマー等を用い、ｐＵＣ１９プラスミド（配列番号１９）５ｎｇを鋳型としてＬＡＭＰ反応を行った。
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反応溶液組成は実施例１と同様の条件で６２．８℃、２時間のＬＡＭＰ反応を行ない、ついで、ＬＡＭＰ増幅産物を実施例１と同様にＴｓｐＲＩ消化した。ＬＡＭＰ産物およびＴｓｐＲＩ消化物を２％アガロースゲルにて電気泳動した結果、これらが目的のサイズに現れることが確認された（図１０）。
２．次に、プライマーエクステンションによりＤＩＧ標識し、ドットブロットハイブリダイゼーションを行った。ブロットされているＤＮＡは以下の通りである。
１；１０９Ａ　ｏｌｉｇｏ
２；１０９Ｂ　ｏｌｉｇｏ
この結果、目的のスポットのみにシグナルが得られることが確認された（図１１）。
以上より、ＴｓｐＲＩ部位を持たない鋳型にＬＡＭＰ反応を利用して制限酵素認識配列が挿入でき、これを鋳型として鎖特異的１本鎖を得られることが示された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明を用いれば、２本鎖核酸のセンス、又はアンチセンス鎖の一方を選択的に合成することができる。かかる１本鎖ＤＮＡはハイブリダイゼーションアッセイのプローブ等に使用することができ、本発明は該１本鎖ＤＮＡの効率的かつ安価な合成方法を提供する。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＴｓｐＲＩを用いた１本鎖核酸合成の原理を示す。
図２は、実施例１における伸長産物のハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す写真である。（Ａ：センスオリゴ、Ｂ：アンチセンスオリゴ）
図３は、実施例２におけるＬＡＭＰ反応産物とＴｓｐＲＩ処理したＬＡＭＰ反応産物の電気泳動結果を示す写真である。（Ｍ：サイズマーカー、１：ＬＡＭＰ産物，２：ＴｓｐＲＩ処理したＬＡＭＰ産物）
図４は、実施例２におけるプライマー伸長産物（ＤＩＧ標識）の検出結果を示す写真である。（１：ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ，２：プライマー伸長産物）
図５は、実施例２におけるプライマー伸長産物をドットブロットハイブリダイゼーションした結果を示す写真である。
図６は、実施例３におけるプライマー伸長産物（ＤＩＧ標識）の検出結果を示す写真である。（１：Ｋｌｅｎｏｗ（−），２：Ｋｌｅｎｏｗ（＋），３：Ｂｓｔ（−）６０℃，４：Ｂｓｔ（＋）６０℃，５：Ｂｓｔ（−）６５℃，６：Ｂｓｔ（＋）６５℃）
図７は、実施例４におけるｌａｍｂｄａ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理したプライマー伸長産物の電気泳動結果を示す写真である。（Ｍ：サイズマーカー，１：λ（−），２：λ（＋））
図８は、実施例５におけるプライマー伸長産物（ＤＩＧ標識）の検出結果を示す写真である。
図９は、実施例５におけるプライマー伸長産物をドットブロットハイブリダイゼーションした結果を示す写真である。
図１０は、実施例６におけるＬＡＭＰ反応産物とＴｓｐＲＩ処理したＬＡＭＰ反応産物の電気泳動結果を示す写真である。（Ｍ：サイズマーカー，１：ＬＡＭＰ産物，２：ＴｓｐＲＩ処理したＬＡＭＰ産物）
図１１は、実施例６におけるプライマー伸長産物をドットブロットハイブリダイゼーションした結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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