(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）
【化１】
0003792885.tif 000008
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、メチル基、エチル基又はプロピル基であり、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、いずれも水素原子である。Ｘは硝酸イオン又はハロゲン化物イオンであり、ｎは１である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、
下記の一般式（２）
【化２】
0003792885.tif 000009
（一般式（２）において、Ｒ1 は、水素原子、メチル基、エチル基又はプロピル基であり、Ｒ2 は、メチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は、メチル基、エチル基又はプロピル基である。また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、各々が結合しているアミド基の炭素原子及び窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において還元剤と接触処理させる際に、紫外線を照射することにより得られる反応生成物を含有する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
下記の一般式（１）
【化３】
0003792885.tif 000010
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、メチル基、エチル基又はプロピル基であり、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、いずれも水素原子である。Ｘは硝酸イオン又はハロゲン化物イオンであり、ｎは１である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、
下記の一般式（２）
【化４】
0003792885.tif 000011
（一般式（２）において、Ｒ1 は、水素原子、メチル基、エチル基又はプロピル基であり、Ｒ2 は、メチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は、メチル基、エチル基又はプロピル基である。また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、各々が結合しているアミド基の炭素原子及び窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において還元剤と接触処理させる際に、紫外線を照射することにより得られる反応生成物を含有する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１又は２のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項４】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン及びＮ−エチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１〜３のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項５】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド又はＮ−メチル−２−ピロリドンである請求項１〜３のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項６】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において前記還元剤と接触させる際に、更に、蟻酸が添加されてなる請求項１〜５のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項７】
前記還元剤が、水素化リチウムアルミニウムである請求項１〜６のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項８】
前記水素受容体が、過酸化水素である請求項１〜７のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項９】
前記発光増強剤が、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール及び６−ヒドロキシベンゾチアゾールからなる群より選択される少なくとも１種のフェノール性化合物である請求項２〜８のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光法を利用するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであり、更に、詳しくは、特定の化学発光試薬を用いる化学発光法を利用することにより、水素受容体の存在下におけるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは水素受容体の存在下において水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このような触媒活性は例えばヘモグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度で検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬として幅広い分野で利用されている。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる分析方法は、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他アビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異的な親和性を利用する分析系に用いられる。
【０００３】
また、このようなペルオキシダーゼ活性の測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で測定する比色法又は蛍光物質を生成させてその蛍光を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行なわれている。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性の測定に比色法を用いる場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に欠けると云う問題点があり、これを解決する目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発されている。化学発光法は、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量する方法であり、化学発光性物質にルミノールを、水素受容体として過酸化水素を、そして発光増強剤としてｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペルオキシダーゼ活性を高感度で定量することが可能になっている。
【０００４】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度領域での定量性を、更に、高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定の更なる高感度化が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、前記事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をより高感度で測定可能な化学発光法による新規な測定方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、前記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光試薬として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において還元剤と紫外線照射下に接触処理させることにより得られる反応生成物からなる化学発光試薬を用い、水素受容体として過酸化水素を、そして、更に、発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる化学発光系が、化学発光物質にルミノールを用いる系に比較して、更に、高感度でペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて、本発明に到達したものである。
【０００７】
従って、本発明の第一は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において還元剤と紫外線照射下に接触処理させることにより得られる反応生成物からなる化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において還元剤と紫外線照射下に接触処理させることにより得られる反応混合物からなる化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光性物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において還元剤と接触処理させることにより得られた反応生成物からなる化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において、更に、好ましくは、発光増強剤の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定するものである。その測定操作は任意であるが、一般に、化学発光性物質、発光増強剤及びペルオキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体溶液を添加して化学発光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が行なわれている。
【００１０】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において還元剤と紫外線照射下で接触処理させることにより得られる反応生成物である。
【００１１】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、下記の一般式（１）
【００１２】
【化２】
0003792885.tif 000002
で表すことができる。
【００１３】
上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜１４を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は、炭素数６〜１４のものが好ましく、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、更に、アルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１４】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、各々、互いに同一でも又は異なるものでもよい。これらの炭化水素基としては、炭素数が、例えば、１〜２０、特に、１〜１０のものが好ましい。
【００１５】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’ブスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’ビスアクリジニウム塩などが挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が好ましい。
【００１６】
また、一般式（Ｉ）において、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、特に限定されるものではなく、硝酸イオン（ＮＯ3-）、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン等）、（メタ）リン酸イオン（ＰＯ3-）等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【００１７】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法において用いられる化学発光試薬の製造に供されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物としては、例えば、次の一般式（２）
【００１８】
【化３】
0003792885.tif 000003
で表される化合物を挙げることができる。一般式（２）において、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基であり、アリール基はアルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、アミノ基等で置換されていてもよい。Ｒ２は、メチル基又はエチル基であり、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基であり、アリール基はアルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、アミノ基等で置換されていてもよい。また、Ｒ１及びＲ３は互いに結合して、各々が結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸化合物の具体例を例示すると、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン及びＮ−エチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。
【００１９】
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、本発明の化学発光試薬の製造には必須であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類と複合体を形成した後、アクリジニウム塩構造の還元反応に伴い、より発光収率の高い化合物へと変化するものと考えられ、本発明の化学発光試薬の製造反応に反応成分として関与し、反応生成物の水溶性の付与等に寄与しているものと考えられる。従って、その使用量は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対して１〜１０００当量、好ましくは１．５〜５００当量、特に好ましくは２〜３０００当量の割合でよい。
【００２０】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の製造において、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において還元剤と接触処理させる際に、更に、蟻酸を添加することができる。蟻酸は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対して０〜５０００当量、好ましくは、０．５〜１０００当量、特に好ましくは１〜５００当量の割合で用いられ、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応を促進し、化学発光試薬の反応収率を著しく高めることができる。
【００２１】
本発明の測定系における化学発光試薬の製造に用いられる還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムボロン、水素化ナトリウムボロン等が挙げられるが、水素化リチウムアルミニウムが特に好ましく用いられる。
【００２２】
前記の接触処理においては、反応溶媒、特に、有機溶媒を用いることが好ましい。有機溶媒としては、反応試薬に対して不活性であり、かつ、反応試薬に対する溶解性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の環状エーテル類等が好ましく用いられる。
【００２３】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられる紫外線の光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯等を非限定的に用いることができるが、高圧水銀灯が好ましく用いられる。この紫外線照射により得られる化学発光試薬は、紫外線を照射せずに製造した化学発光試薬に較べて同濃度で使用した場合に、非常に高い発光強度を示すことが認められることから、化学発光性化合物の形成反応を促進する作用を有するものと推定される。
【００２４】
反応温度は用いられる還元剤及び反応溶媒の種類によって異なるが、一般的に、−１０〜＋１５０℃、好ましくは、０〜１２０℃、特に好ましくは、２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは、１０分〜１２時間、特に好ましくは、３０分〜５時間の範囲で採用することができる。
【００２５】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において過剰の過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で反応してペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この反応は過酸化水素の検出及びペルオキシダーゼの定量等に利用することが可能であり、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、更に、種々の物質の定量に用いることが可能になる。
【００２６】
また、本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬による発光は、フェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
【００２７】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の濃度は、１０-8〜１Ｍ、好ましくは、１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度であり、その使用量は１０〜５００μｌ、特に、５０〜３００μｌの範囲で用いることが好ましい。また、発光増強剤の使用量は、化学発光試薬の量の０．０１〜１００倍モル、好ましくは、０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は１０-6〜１Ｍ、好ましくは、１０-4〜１０-2Ｍの範囲である。
【００２８】
また、化学発光反応に用いられる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではないが、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられ、過酸化水素が好ましく用いられる。この水素受容体の使用量は化学発光性物質に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光性物質に対して３〜１万倍モル、特に、１０〜１０００倍モルの範囲で用いることが好ましい。
【００２９】
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００３０】
化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時には界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例等に限定されるものではない。
【００３２】
［実施例１］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１５０μｌを加えて溶解させた後、攪拌下に１，４−ジオキサン１ｍｌ中へ加えてルシゲニンを１，４−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに蟻酸２０μｌを加えてよく攪拌してから、水素化リチウムアルミニウム粉末５ｍｇを添加して、１ＫＷの高圧水銀灯の照射下に２５℃で３０分間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水１ｍｌ中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調整することにより新規化学発光試薬を得た。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
複数の化学発光測定用ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH8.4)溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH8.4)溶液２０μｌを加えた後、これに１０００倍に希釈した前記化学発光試薬を２０μｌ及び０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを順次加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３３】
【表１】
0003792885.tif 000004
【００３４】
［実施例２］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させた後、攪拌下に１，４−ジオキサン１ｍｌ中へ加えてルシゲニンを１，４−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに蟻酸２０μｌを加えてよく攪拌してから、水素化リチウムアルミニウム粉末５ｍｇを添加して、１ＫＷの高圧水銀灯の照射下に２５℃で３０分間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水１ｍｌ中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調整することにより新規化学発光試薬を得た。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
複数の化学発光測定用ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH 8.4)溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH 8.4)溶液２０μｌを加えた後、これに１０００倍に希釈した上記化学発光試薬を２０μｌ及び０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを順次加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表２に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 mol/assay まで測定することが可能であった。
【００３５】
【表２】
0003792885.tif 000005
【００３６】
［実施例３］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ−メチル−２−ピロリドン１５０μｌを加えて溶解させた後、攪拌下に１ｍｌ中へ加えてルシゲニンを１，４−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに蟻酸２０μｌを加えてよく攪拌してから、水素化リチウムアルミニウム粉末５ｍｇを添加して、１ＫＷの高圧水銀灯の照射下に２５℃で３０分間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水１ｍｌ中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調整することにより新規化学発光試薬を得た。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
複数の化学発光測定用ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH 8.4)溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH 8.4)溶液２０μｌを加えた後、これに１０００倍に希釈した上記化学発光試薬を２０μｌ及び０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを順次加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 mol/assay まで測定することが可能であった。
【００３７】
【表３】
0003792885.tif 000006
【００３８】
［比較例１］
複数の化学発光測定用ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH 8.4)溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH 8.4)溶液２０μｌを加えた後、これにルミノールを５．６×１０-5Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH 8.4)１００μｌ及び０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを順次加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表４に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-17 mol/assay まで測定できることが可能であった。
【００３９】
【表４】
0003792885.tif 000007
【００４０】
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を従来から広く使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で測定することが可能になり、ペルオキシダーゼを標識物質に用いる酵素免疫測定法により抗原及び抗体類を、また、ハイブリダイゼーションアッセイ法により核酸類を、各々、より高感度で検出又は定量することができる。