(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｉ）又は（II）：
【化１】
0003849001.tif 000007
（式中、Ｒは担体ポリペプチド又は蛋白質である）
により表される２'−デオキシシチジン抗原を免疫原として用いて得られる２'−デオキシシチジンに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項３】
検体中存在することが予想される２′−デオキシシチジンと請求項１に記載の抗体とを反応せしめ、反応が生じたか否か、又は反応の量を直接又は間接的に測定することを特徴とする検体中の２′−デオキシシチジンの測定方法。
【請求項４】
固相に固定化された２′−デオキシシチジンと検体中の２′−デオキシシチジンとを、請求項１に記載の抗体に対して競合せしめ、次に固相に固定化された２′−デオキシシチジンに結合した該抗体の量を測定することを特徴とする、試料中の２′−デオキシシチジンの測定方法。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体を含んで成る、２′−デオキシシチジン測定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２′−デオキシシチジン（ｄＣｙｄと略す場合がある）に対する抗体並びにその製造及び使用に関する。さらに詳しくは、本発明はｄＣｙｄに対する抗体（抗−２′−デオキシシチジン抗体又は抗−ｄＣｙｄ抗体と略す場合がある）、該抗体を製造するための抗原、該抗体の製造方法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるｄＣｙｄの測定方法、及び該抗体を含んで成るｄＣｙｄ測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｄＣｙｄは遺伝子ＤＮＡの構成成分であり、遊離のｄＣｙｄがＤＮＡの生合成又は代謝の中間体と考えられていた。吉岡ら〔Biol. Pharm Bull., 17 (2), 169〜172, 1994 〕は、ｄＣｙｄがエジプト人乳癌患者の手術後の化学療法中に血中に増加する患者は予後が悪く、死亡していたことを明らかにした。又逆に、増加しないで正常値を示す患者は予後が良いことがわかった。従って体液中のｄＣｙｄの濃度の測定は癌の予後や病態の解明に重要となってきた。
【０００３】
従来、ｄＣｙｄは、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等で分離、測定されているが、これらの方法は感度も低く、操作が繁雑であると共に、一度に多数の検体を測定できないという欠点があった。一方、免疫測定法は、一般に簡便迅速に多数の検体を測定できる方法として優れている。しかしこの方法を行なうためには、抗原および抗体を調製することが必要である。しかしながら、これまでｄＣｙｄの抗原及び抗体は調製されたことがない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、ｄＣｙｄの免疫測定法及びそのためのキットを提供しようとするものであり、その前提として、ｄＣｙｄ抗原、抗−ｄＣｙｄ抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ等を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者は、ｄＣｙｄの５′位又は３′位の水酸基をサクシニル化し、これらのカルボキシル基を介して、担体ポリペプチドのアミノ基に脱水縮合させた式（Ｉ）又は（II）で表されるｄＣｙｄ抗原を使用すれば、特異性の高い優れたｄＣｙｄに対する抗体が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
従って本発明は、次の式（Ｉ）又は（II）：
【化２】
0003849001.tif 000002
【０００７】
（式中、Ｒは担体ポリペプチド又は蛋白質である。）
により表わされる抗原を提供する。この抗原は、次の式（III)：
【化３】
0003849001.tif 000003
【０００８】
により表わされる２′−デオキシシチジン（ｄＣｙｄ）をＯ−サクシニル化し、次にこれと担体ポリペプチドとを、例えばカルボジイミドの存在下で結合させることにより製造することができる。
本発明はさらに、ｄＣｙｄに対する抗体、特に前記の式（Ｉ）又は（II）に対して生成される抗−ｄＣｙｄ抗体を提供する。この抗体はポリクローナル抗体すなわち抗血清、又はモノクローナル抗体である。ｄＣｙｄとの親和定数Ｋａが１×１０4 Ｍ-1以上であるものが特に好ましい。特に、ポリクローナル抗体（抗血清）では１０4 Ｍ-1以上、特に１０5 Ｍ-1以上、モノクローナル抗体では１０8 Ｍ-1以上、特に１０9 Ｍ-1以上であることが好ましい。
【０００９】
本発明はさらに、上記の抗−ｄＣｙｄを産生するハイブリドーマに関する。
本発明はまた、検体中に存在することが予想されるｄＣｙｄと前記抗−ｄＣｙｄ抗体とを反応せしめ、反応が生じたか否か、又は反応の量を直接的又は間接的に測定することを特徴とする検体中の２′−デオキシシチジンの測定方法を提供する。この方法の１つの態様によれば、検体中のｄＣｙｄと、標識されたｄＣｙｄ試薬とを、前記抗−ｄＣｙｄ抗体であって好ましくは固相担体に固定化されているものに対して競合せしめ、そして次に該抗体と反応した該標識されたｄＣｙｄを測定する。また他の態様によれば、固相に固定化されたｄＣｙｄ（好ましくは、前記抗原の形態で）と検体中のｄＣｙｄを前記の抗体に対して競合せしめ、そして固相に固定されたｄＣｙｄに結合したｄ−Ｃｙｄ抗体を測定する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、（Ｉ）式又は（II）式の抗原は、ｄＣｙｄを無水コハク酸でサクシニル化し、５′−位及び／又は３′−位のサクシニル化された誘導体を例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、次にこれを担体ポリペプチド又は蛋白質と結合せしめることにより調製する。担体ポリペプチド又は蛋白質としては、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グロブリン、牛サイログロブリン、牛グロブリン、ヘモシアニン（ＫＬＨ）、アスカリス等の蛋白質、並びにポリリジン、ポリリジルグルタミン酸等の合成ポリペプチドなどが使用される。
【００１１】
ｄＣｙｄのサクシニル化は、ｄＣｙｄに無水コハク酸を室温で数分間反応させ、反応液を減圧乾固して５′位誘導体（５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ）と３′位誘導体（３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ）を得ることにより行う。それぞれの分離は、例えばＯＤＳ−シリカゲルカラムを移動相として０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有０〜３０％アセトニトリルを用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行なう。ＨＰＬＣにより分取した５′位及び／又は３′位の誘導体の確認は、ＦＡＢ−質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）及びＮＭＲによって行なわれる。
【００１２】
担体ポリペプチド又は蛋白質、サクシニル化ｄＣｙｄ及び縮合剤ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を一昼夜反応させることによって行なわれた反応液を水で透析し、過剰の縮合剤及びサクシニル化ｄＣｙｄを除去し、内容液を凍結乾燥すれば、ｄＣｙｄ抗原Ｉ又はIIが得られる。このように得られたｄＣｙｄの抗原は２７０nm吸光度の増加から、担体ポリペプチドがＫＬＨの場合、ＫＬＨ１モルに対して、Ｉ式では３３６モル、II式では５８６モルが結合していることが確認された。又、担体ポリペプチドがＢＳＡの場合、ＢＳＡ１モルに対してＩ式では９モル、II式では８モルが結合していることが確認された。
【００１３】
ｄＣｙｄ抗原（Ｉ）又は（II）を動物に免疫すれば、ｄＣｙｄに対する抗体が得られる。この抗体の調製は、例えば、つぎのようにして行なわれる。すなわち抗原（Ｉ）又は（II）を、フロインド完全アジュバンドを用いてｗ／ｏエマルジョンを調製し、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の動物に投与し、約２週間毎にフロインド不完全アジュバンドを用いてｗ／ｏエマルジョンを調製し、追加投与を行なう。１回目免疫以降に血清中抗体価の上昇がみられる。抗体価の測定は、ＥＩＡ法で行なうことができ、この血清を採取すれば、ｄＣｙｄに対する抗体が得られる。
【００１４】
また、このようにして免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と細胞融合することによりハイブリドーマを作り、モノクローナル抗体を得ることもできる。
本発明においては、抗体とｄＣｙｄとの親和定数Ｋａが１×１０7 Ｍ-1以上であることが好ましい。Ｋａ値の測定は八木沢の方法（八木沢晧記、蛋白質核酸酵素別冊NO. 31, P219-226, 1987）により行うことができる。
本発明はまた、前記の抗−ｄＣｙｄ抗体を用いて検体中のｄＣｙｄを測定する方法を提供する。この方法は一般的には、検体中のｄＣｙｄと試薬としての抗−ｄＣｙｄ抗体とを反応せしめ、そしてその反応結果から検体中のｄＣｙｄの存在又は存在量を求める方法である。
【００１５】
この方法の１つの態様によれば、検体中のｄＣｙｄと試薬としての所定量の標識されたｄＣｙｄとを、抗−ｄＣｙｄ抗体に対して競合的に反応せしめる。この場合、検体中のｄＣｙｄ量が多くなるに従って検体中のｄＣｙｄの抗−ｄＣｙｄへの結合量が多くなり、逆に標識ｄＣｙｄの抗−ｄＣｙｄ抗体への結合が少なくなり、標識ｄＣｙｄの抗−ｄＣｙｄへの結合量又は結合しなかった標識ｄＣｙｄの量を測定することにより、検体中のｄＣｙｄの量を求めることができる。この態様において、抗−ｄＣｙｄ抗体を固相担体に固定化しておけば、反応後に固相担体を洗浄することにより、固体担体に固定化された抗−ｄＣｙｄ抗体に結合したｄＣｙｄを未結合のｄＣｙｄから単体に分離することができる。
【００１６】
上記の場合の固相担体としては、ポリスチレンビーズ、イムノアッセイ用ウエルプレート等、免疫測定において常用されている固相担体を用いることができる。抗−ｄＣｙｄ抗体の標識としては、放射性同位元素、蛍光物質、酵素等、免疫測定において常用されている標識を用いることができ、特に放射性同位元素が好ましい。放射性同位元素としては、例えば125 Ｉ、131 Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、3 Ｈ等、免疫測定において常用されているものを用いることができる。
【００１７】
検体及び試薬の希釈剤並びに反応媒体としては、水性緩衝液、例えばpH６〜８のリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等の常用の緩衝液が使用される。反応は好ましくは室温において１０〜６０分間行われる。
検体中のｄＣｙｄを測定するための他の態様によれば、固相担体に固定されたｄＣｙｄと検体中のｄＣｙｄとを、試薬としての抗−ｄＣｙｄに対して競合的に反応せしめる。検体中のｄＣｙｄ量が多くなるに従って、検体中のｄＣｙｄと結合する抗−ｄＣｙｄの量が多くなり、逆に固相担体に固定化されたｄＣｙｄに結合する抗−ｄＣｙｄの量が少なくなり、固相担体に固定されたｄＣｙｄに結合する抗−ｄＣｙｄの量を測定することにより、検体中のｄＣｙｄの量を求めることができる。
【００１８】
この場合、固相担体としては、前記のものを用いることができる。また、固相担体に固定するｄＣｙｄとしては、前記の抗原の形態で、すなわちｄＣｙｄと担体ポリペプチド又は蛋白質との結合体の形態で用いることが好ましい。固相担体へのｄＣｙｄの固定化は、常法により、例えばｄＣｙｄを含有する緩衝液を固相担体と接触せしめ、次にこれらを所定時間、例えば６０〜１８０分間、室温において、又は４℃で一晩インキュベートし、次に洗浄液により未固定のｄＣｙｄを洗浄除去すればよい。
【００１９】
固相担体に結合した抗−ｄＣｙｄと抗体の測定は、抗−ｄＣｙｄ抗体自体を標識しておくことにより、又は抗−ｄＣｙｄ抗体と結合する第二の抗体であって標識されているものを用いて行うことができる。第二抗体としては、抗−ｄＣｙｄ抗体を生産に用いた動物種により生産された免疫グロブリンに対する抗体、例えば抗−ｄＣｙｄ抗体がマウスの抗体であれば、マウスの抗体に対するマウス以外の動物種の抗体、例えばヤギの抗体を用いることができる。
【００２０】
前記のごとく、抗−ｄＣｙｄ抗体を直接標識する場合の標識としては、放射性同位元素、蛍光物質、酵素等を用いることができ好ましくは酵素標識を用いる。また、第二抗体の標識としては、酵素標識、蛍光物質、放射性同位元素等を用いることができ、好ましくは酵素標識を用いる。この場合の酵素としては、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウリカーゼ等の常用の酵素標識を用いることができ、酵素の種類に応じて常用の検出系を用いることができる。例えば、第二抗体の酵素標識としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用い、酵素反応により生成するｐ−ニトロフェノールを４０５nmにおける吸光度により測定することができる。
【００２１】
この測定における検体中試薬の希釈液、反応媒体、洗浄液等としては、前に記載したものを使用することができる。実施に当っては例えば、免疫測定用プレートのウエルに前記のｄＣｙｄ抗原の溶液を入れてインキュベートし、次に洗浄することによりｄＣｙｄ抗原をウエルに固定し、次にこのウエルに検体及び抗−ｄＣｙｄ抗体を加えて反応せしめた後ウエルの洗浄によって未結合の試薬等を除去し、次に抗−ｄＣｙｄ抗体に対する第二抗体を加えて反応せしめ、次に洗浄した後、アルカリホスファターゼのごとき標識酵素及び該酵素に対する基質例えばｐ−ニトロフェニルホスフェートを添加し、所定時間後に発色を測定すればよい。
【００２２】
【発明の効果】
本発明のｄＣｙｄの抗原を使用すれば、特異性のきわめて高いｄＣｙｄに対する抗体を得ることができ、この抗体を使用すれば体液などの検体中のｄＣｙｄ量を正確かつ簡便に定量することができる。
【００２３】
【実施例】
次に実施例を挙げて説明する。
実施例１． ｄＣｙｄのサクシニル化誘導体の調製
ｄＣｙｄ  ０．０５mmol／１mlの水溶液に、無水コハク酸０．４mmol／トリエチルアミン−ジオキサン（１：９，Ｖ／Ｖ）１mlを混合し、室温で１０分間放置した。反応液を減圧乾固し、誘導体を得た。これをＨＰＬＣで分離精製した。カラムは、ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫを１０×２５０mmに充填した市販品を用い、その温度は４０℃とした。
【００２４】
溶離は、０．１％ＴＦＡ含有０〜３０％アセトニトリルの直線濃度勾配溶出法により、３０分間で行なった。溶離液の流速は３ml／分とした。検出は２８０nmの吸光度により行ない、４つのピークが表われた。図１にその結果を示す。第２と第３のピークを分取した。第２のピークに５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが第３のピークに３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが含まれることが、ＦＡＢ−ＭＳ及び 1Ｈ−ＮＭＲにより判明した。ＦＡＢ−ＭＳの結果を図２に示す。
【００２５】
実施例２． ５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ又は３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄと担体ポリペプチドの縮合
５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ又は３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ１５μmol の１２．５mMリン酸緩衝液（pH５．２５）の溶液１mlに１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＡＣ・ＨＣｌ）７５μmol を加え、ＫＬＨ０．９５nmol又はＢＳＡ７８nmolの５０mMリン酸緩衝液（pH７．２）と０．１Ｍ  ＮａＣｌの溶液１mlをさらに加えてpH６．４に調整し、暗所で１昼夜反応させた。反応液を水で４８時間透析した。
【００２６】
その後、透析内液を凍結乾燥して、各抗原、５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ担体ポリペプチド及び３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ担体ポリペプチドを得、これを４℃で保存した。また、透析液の一部を希釈し、２７０nmの吸光度を測定することにより、ハプテン結合量を測定したところ、３３６モルの５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが１モルのＫＬＨに結合していた。又、５８６モルの３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが１モルのＫＬＨに結合していた。一方、１モルのＢＳＡに対して、９モルの５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが結合していた。８モルの３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄが同じく１モルのＢＳＡに対して結合していた。
【００２７】
実施例３． 抗体の調製
担体ポリペプチドとしてＫＬＨを用いた抗原１mgを水１mlに溶かし、フロインドの完全アジュバンド１mlとｗ／ｏエマルジョンを調製した。これを雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）の腹腔に０．１mlずつ注射し、その後２週間毎にブースターした。２回目の免疫から、フロインド不完全アジュバンドを使用し、同様にエマルジョンを調製し投与した。次に投与後３日後にマウスの尾を切断することにより採血した。この血清を４℃で一夜放置して、抗体を得た。これを−２０℃で保存した。
【００２８】
実施例４． 抗体価の測定
担体ポリペプチドとしてＢＳＡを用いた抗原又はＢＳＡ自身を０．６μｇ／mlとなるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）（pH７．０）に溶かした。その５０μｌをマイクロプレートの試料穴に分注した。さらに３７℃で２時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢ（ＴＰＢ）で試料穴を５回洗浄した。実施例３で得た抗血清をＴＰＢで希釈し、５０μｌずつ試料穴に分注した。
【００２９】
これを３７℃で１時間半振盪した。ＴＰＢで５回洗浄後、３μｇ／mlアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧのＴＰＢ溶液５０μｌを分注し、３７℃で１時間半振盪した。１mM  ＭｇＣｌ2 を含む２２．４mM−ニトロフェニルフォスフェートの１００mM  ＮａＨＣＯ3 溶液（pH９．８）を５０μｌずつ分注した。生成するｐ−ニトロフェノールの吸光度を４０５nmの波長のＥＩＡリーダーで測定した。その結果を図３及び４に示す。
【００３０】
実施例５． 抗体の特異性
担体ポリペプチドとしてＢＳＡを用いた抗原０．６μｇ／mlのＰＢ溶液５０μｌをマイクロプレートの試料穴に分注した。３７℃で２時間放置し、ＴＰＢで５回洗浄した。これにハプテンのＴＰＢ希釈液５０μｌずつさらに分注し、３７℃で１０分間放置した。これに１００００倍希釈抗血清液５０μｌずつ分注し、３７℃で１時間半放置した。次にＴＰＢで５回洗浄した後、以下実施例４と同様に操作した。その結果を図５及び６に示す。図５及び６より、この抗体はｄＣｙｄに対して親和定数Ｋａ＝１×１０5 Ｍ-1を有していた。
この結果は、本発明のポリクローナル抗体が他のヌクレオチド類の中でｄＣｙｄに対して特異的に結合することを示している。
【００３１】
実施例６． モノクローナル抗体の調製
実施例２における第５回目のブースター後、３日目に、マウスの脾細胞を取り出し、培養したマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とポリエチレングリコールを用いた常法により融合した。融合したハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養し、生成するコロニーをさらに１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ  １６４０培地などで液体培養し、限界希釈を３回行なうことによりクローニングをおこない、ハイブリドーマＤＣＹＤ−１を得た。
【００３２】
培養上清中のモノクローナル抗体を４℃で保存した。なお、これらのモノクローナル抗体はｄＣｙｄに対して１０9 Ｍ-1の親和定数Ｋａを有していた。
ハイブリドーマＤＣＹＤ−１は、Ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＤＣＹＤ−１と命名され、平成７年８月２４日に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１３２として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。
【００３３】
実施例７． モノクローナル抗体の特異性
実施例５で示した方法で、希釈抗血清の代わりに、実施例６で得たモノクローナル抗体含有培地を用いて、他の条件は同じにして行なった。その結果を第７図に示す。
図７から明らかな通り、本発明のモノクローナル抗体は他の種々のヌクレオチド類中でｄＣｙｄに対して特異的に反応する。
【００３４】
実施例８． ｄＣｙｄの測定
担体ポリペプチドとしてＢＳＡを用いた抗原０．６μｇ／mlのＰＢ溶液５０μｌをマイクロプレートの試料穴に分注した。３７℃で２時間放置し、ＴＰＢで５回洗浄した。ｄＣｙｄの標準物質（０．１〜１００μＭ）及び検体をＴＰＢでそれぞれ希釈し５０μｌずつ分注し３７℃、３０分放置した。次にモノクローナル抗体ＤＣＹＤ−１を加え３７℃１時間半放置した。
さらにＴＰＢで５回洗浄後、以下実施例４と同様に操作した。その結果を図８に示す。本曲線から０．１μＭのｄＣｙｄが測定できることが明らかになった。
実施例９．
実施例８と同様の方法で作製した２′デオキシシチジンＢＳＡコートプレートに検体２０μｌ、及びモノクローナル抗体ＤＣＹＤ−１培養上清希釈液２００μｌを加え、室温にて１時間放置した。プレートをＴＰＢで５回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson Immuno Research)を１％ＢＳＡ含有Ｔ−ＰＢＳで１万倍希釈し、その１００μｌを加え室温３０分放置した。ＴＰＢで５回洗浄後、ＯＰＤ基質液を１００μｌ加え２０分放置し、反応停止剤として２Ｎ硫酸１００μｌを加えた後、４９２nmの吸光度をＥＩＡプレートリーダーで測定した。その結果を表１及び表２に示す。検体は健常者１６例、癌患者１９例を１００倍希釈して測定した。
0003849001.tif 000004
各血清は夫々１００倍希釈にて測定。
【表１】
0003849001.tif 000005
【表２】
0003849001.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の抗原の合成中間体であるサクシニル化ｄＣｙｄのＨＰＬＣ溶出図である。
【図２】図２は、本発明の抗原の合成中間体である５′−Ｏ−サクシニル化ｄＣｙｄのマススペクトル図である。
【図３】図３は本発明の抗血清を５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ−ＫＬＨ抗原又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と反応させて抗体価を測定した場合の図である。
【図４】図４は、本発明の抗血清を３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ−ＫＬＨ抗原又はＢＳＡと反応させて抗体価を測定した場合の図である。
【図５】図５は、本発明の抗−５′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ−ＫＬＨ抗血清を種々のハプテンと反応させた場合の結合特異性を示す図である。図中、ハプテンの略号は、シトシン（Ｃｙｔ）、シチジン（Ｃｙｄ）、２′−デオキシシチジン（ｄＣｙｄ）、シチジン−５′−リン酸（ＣＭＰ）、２′−デオキシシチジン−５′−リン酸（ｄＣＭＰ）、２′−デオキシアデノシン（ｄＡｄｏ）、２′−デオキシグア（ｄＧｕｏ）、チミジン（Ｔｈｄ）である。
【図６】図６は、本発明の抗−３′−Ｏ−Ｓ−ｄＣｙｄ−ＫＬＨ抗血清を種々のハプテンと反応させた場合の結合特異性を示す図であり、図中ハプテンの略号は図５の通りである。
【図７】図７は本発明のモノクローナル抗体を種々のハプテンと反応させた場合の結合特異性を示す図であり、図中のハプテンの略号は図５の通りである。
【図８】図８は、モノクローナル抗体ＤＣＹＤ−１を用いてｄＣｙｄを測定する場合の標準曲線の１例である。
【図１】
0003849001.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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