(57)【要約】ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子の、被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定すること、あるいは当該遺伝子のいずれかを含む遺伝子群の発現プロファイルを決定することにより慢性骨髄性白血病を検査することを特徴とする慢性骨髄性白血病の検査方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子の、被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定すること、あるいは当該遺伝子のいずれかを含む遺伝子群の発現プロファイルを決定することにより慢性骨髄性白血病を検査することを特徴とする慢性骨髄性白血病の検査方法。
【請求項２】
被検細胞が、骨髄細胞又は血液細胞であることを特徴とする請求項１に記載の慢性骨髄性白血病の検査方法。
【請求項３】
骨髄細胞又は血液細胞が、多能性造血幹細胞であることを特徴とする請求項２に記載の慢性骨髄性白血病の検査方法。
【請求項４】
多能性造血幹細胞が、ＡＣ１３３タンパク質陽性であることを特徴とする請求項３に記載の慢性骨髄性白血病の検査方法。
【請求項５】
遺伝子の発現レベルの測定又は遺伝子群の発現プロファイルの決定を、ｍＲＮＡレベルで行うことを特徴とする請求項１に記載の慢性骨髄性白血病の検査方法。
【請求項６】
ｍＲＮＡレベルでの、遺伝子の発現レベルの測定又は遺伝子群の発現プロファイルの決定を、遺伝子増幅法及び／又はＤＮＡマイクロアレイ法によって行うことを特徴とする請求項５に記載の慢性骨髄性白血病の検査方法。
【請求項７】
遺伝子の発現レベルの測定又は遺伝子群の発現プロファイルの決定を、タンパク質レベルで行うことを特徴とする請求項１に記載の慢性骨髄性白血病の検査方法。
【請求項８】
タンパク質レベルでの、遺伝子の発現レベルの測定又は遺伝子群の発現プロファイルの決定を、免疫学的方法及び／又はプロテインチップ法によって行うことを特徴とする請求項７に記載の慢性骨髄性白血病の検査方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載のいずれかの慢性骨髄性白血病の検査方法により、慢性骨髄性白血病の病期の決定を行うことを特徴とする慢性骨髄性白血病の病期の決定方法。
【請求項１０】
慢性骨髄性白血病の病期が、慢性期、移行期及び急性期からなる群から選択されるものである請求項９に記載の慢性骨髄性白血病の病期の決定方法。
【請求項１１】
以下の工程：
（ａ）試験化合物を、試験動物又は試験細胞に、投与又は接触させる工程、
（ｂ）試験化合物が、試験動物又は試験細胞中で、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程、
を包含する慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１２】
以下の工程：
（ａ）試験化合物を、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を含む試験動物又は試験細胞に接触させる工程、
（ｂ）試験化合物が、レポーター遺伝子の試験動物又は試験細胞中での発現レベルを測定する工程、
を包含する慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１３】
以下の工程：
（ａ）試験化合物を、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質に接触させる工程、
（ｂ）試験化合物が、前記タンパク質の活性を測定する工程、
を包含する慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１４】
以下の工程：
（ａ）試験化合物を、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子又はＰＩＡＳｘ−β遺伝子によってコードされるタンパク質により活性が阻害されるＳＴＡＴタンパク質に接触させる工程、
（ｂ）試験化合物が、前記ＳＴＡＴタンパク質の活性を測定する工程、
を包含する慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載の評価方法によって得られた化合物を有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤。
【請求項１６】
ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を有効成分として含有する研究用試薬、あるいは慢性骨髄性白血病の検査、治療又は予防剤。
【請求項１７】
ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子の発現レベルの異常をもたらす、遺伝的多型を検出することを特徴とする慢性骨髄性白血病易罹患性のリスク判定方法。
【請求項１８】
ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の異常をもたらす、遺伝的多型を検出することを特徴とする慢性骨髄性白血病易罹患性のリスク判定方法。
【請求項１９】
ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子及びＥＴＳ２遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸を含有する慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤。
【請求項２０】
ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子及びＥＴＳ２遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子のｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムを含有する慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、慢性骨髄性白血病の検査方法、慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法、該評価方法によって得られる治療又は予防に有効な化合物、該化合物を有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤、及び慢性骨髄性白血病易罹患性のリスク判定方法に関する。
背景技術
慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）は、多能性造血幹細胞のクローン性異常増殖に起因する悪性疾患である［Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ  ８２：６９１（１９９３）］。その発症の原因は、９番染色体と２２番染色体との相互転座の結果生じるＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質の産生にあり、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質は活性型チロシンキナーゼとして細胞の異常増殖を誘導すると考えられている［Ｅｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１７３７（２０００）］。その結果、未分化血液細胞だけでなく悪性クローン由来の分化血液細胞も増加し、末梢血において白血球増多症、血小板増多症などを呈する。
悪性クローンが分化能を失っていない時期は、慢性期（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｈａｓｅ：ＣＰ）と呼ばれ、患者の臨床症状は比較的緩やかである。慢性期にある患者の殆どにおいて、インターフェロン（ＩＦＮ）α又はハイドロキシウレア（ＨＵ）の投与によって末梢血血液細胞数をコントロールすることが可能である［Ｓｉｌｖｅｒ，Ｒ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ  ９４：１５１７（１９９９）］。しかし、数年後には、多くの慢性骨髄性白血病患者中の悪性芽球は分化能を失い、その結果、患者骨髄では未分化な白血病芽球のみが増殖し、成熟血球が減少する「急性白血病」様の病態へと変化する。このような病期は、急性転化（ｂｌａｓｔ  ｃｒｉｓｉｓ：ＢＣ）期と呼ばれ、また患者によっては慢性期から急性転化期へと変化する移行期（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｐｈａｓｅ：ＡＰ）がこれらの中間に観察される場合もある。
一旦、急性転化期に入ると、患者の５０％生存期間は一般的に約３ヶ月と、予後は極めて厳しい。一般的な急性骨髄性白血病細胞と比べて、急性転化期に入った患者の白血病芽球は化学療法抵抗性であり骨髄移植によっても予後を改善することは困難である。従って、慢性骨髄性白血病患者の予後を改善するためには、移行期あるいは急性転化期への移行メカニズムを分子レベルで明らかにしそれを阻止することが重要である。慢性骨髄性白血病の発症がＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子産物の産生によって規定されているのに比べ、移行期あるいは急性転化期への進展がどのような分子メカニズムによっているのかは未だ殆ど明らかにされていない。点突然変異に伴うＲＡＳ癌遺伝子産物の活性化［ＬｅＭａｉｓｔｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ  ７３：８８９（１９８９）；Ｃｏｇｓｗｅｌｌ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ  ７４：２６２９（１９８９）］、あるいはｐ５３癌抑制遺伝子産物の不活化［Ｇｕｒａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ  ２９：１８１（１９９８）；Ｐｅｌｌｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃａｎｃ．２１：２（１９９８）］が病期の進展に関与するとの報告もあるが、いずれの場合も患者検体における頻度は高くなく、一般的な慢性骨髄性白血病の病期進展メカニズムとは考えにくい。ｐ５３遺伝子が存在する１７番染色体の異常は慢性骨髄性白血病の後期においてしばしば認められるが、Ｆｉｏｒｅｔｏｓらはこれらの例においてｐ５３タンパク質のアミノ酸配列異常はむしろ少なく、同じ染色体上に別の未同定の癌抑制遺伝子が存在し、その遺伝子異常が慢性骨髄性白血病の病期進展に重要な役割を果たしているのではないかと推論している［Ｆｉｏｒｅｔｏｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ  ９４：２２５（１９９９）］。
ところで、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップともいわれる）は、近年開発された遺伝子発現解析システムであり、数回の実験で数千から数万におよぶ遺伝子の発現変化を巨視的に観察することが可能である。しかし、本システムにより、慢性骨髄性白血病患者の遺伝子発現プロファイルを解析したという報告は知られていない。
発明の開示
本発明は、慢性骨髄性白血病の検査方法、慢性骨髄性白血病危険因子の検出方法、慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法、該評価方法によって得られる治療効果又は予防効果を有する化合物、及び該化合物を有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、慢性骨髄性白血病患者のＡＣ１３３タンパク質陽性造血幹細胞中で病期特異的に発現レベルが変動する遺伝子を同定するすることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子の、被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定すること、あるいは当該遺伝子のいずれかを含む遺伝子群の発現プロファイルを決定することにより慢性骨髄性白血病を検査することを特徴とする慢性骨髄性白血病の検査方法である。ここで、ＩＦＩＴ−２遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列で表されるインターフェロン誘導タンパク質の遺伝子［Ｌｅｖｙ，Ｄｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８９２９（１９８６）］及びそのアレル変異遺伝子であり、ＬＡＧＥ−１遺伝子とは、配列番号３に示す塩基配列で表される遺伝子［Ｌｅｔｈｅ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６：９０３（１９９８）］及びそのアレル変異遺伝子であり、ＢＡＧＥ遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列で表される遺伝子［Ｂｏｅｌ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：１６７（１９９５）］及びそのアレル変異遺伝子であり、ＤＤＢ１遺伝子とは、配列番号７に示す塩基配列で表されるＤＮＡ損傷結合性タンパク質の遺伝子［Ｄｕａｌａｎ，Ｒ  ｅｔ  ａｌ．：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２９：６２（１９９５）］及びそのアレル変異遺伝子であり、ＥＴＳ２遺伝子とは、配列番号９に示す塩基配列で表される遺伝子［Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７８６２（１９８８）］及びそのアレル変異遺伝子であり、ＰＩＡＳｙ遺伝子とは、配列番号１１に示す塩基配列で表される遺伝子［Ｌｉｕ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０６２６（１９９８）］及びそのアレル変異遺伝子であり、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子とは、配列番号１３に示す塩基配列で表される遺伝子［Ｌｉｕ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０６２６（１９９８）］及びそのアレル変異遺伝子であり、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子とは、配列番号１５に示す塩基配列で表される遺伝子［Ｌｉｕ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０６２６（１９９８）］及びそのアレル変異遺伝子であり、ＤＡＰＫ３遺伝子とは、配列番号１７に示す塩基配列で表される遺伝子［Ｋａｗａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６４２（１９９８）］及びそのアレル変異遺伝子である。上記各遺伝子について表１にまとめた。
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また、被検細胞としては、骨髄細胞又は血液細胞、特に、慢性骨髄性白血病患者において増殖している未分化な幹細胞、つまり多能性造血幹細胞（特にＡＣ１３３タンパク質陽性の造血幹細胞）であり得る。前記遺伝子の発現レベルの測定又は遺伝子群の発現プロファイルの決定は、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで行うことができる。ｍＲＮＡレベルでの、前記遺伝子の発現レベルの測定又は遺伝子群の発現プロファイルの決定は、例えば、遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイ法等によって行うことができる。また、タンパク質レベルでの、前記遺伝子の発現レベルの測定又は遺伝子群の発現プロファイルの決定は、例えば、免疫学的方法、プロテインチップ法等によって行うことができる。
さらに、本発明は、前記のいずれかの慢性骨髄性白血病の検査方法により、慢性骨髄性白血病の病期の決定を行うことを特徴とする慢性骨髄性白血病の病期の決定方法である。前記病期は、慢性期、移行期及び急性期から選択され得る。
さらに、本発明は、以下の工程：
（ａ）試験化合物を、試験動物又は試験細胞に、投与又は接触させる工程、
（ｂ）試験化合物が、試験動物又は試験細胞中で、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節する否かを確認する工程、を包含する慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法である。
さらに、本発明は、以下の工程：
（ａ）試験化合物を、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を含む試験動物又は試験細胞に接触させる工程、
（ｂ）試験化合物が、レポーター遺伝子の試験動物又は試験細胞中での発現レベルを測定する工程、
を包含する慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法である。
さらに、本発明は、以下の工程：
（ａ）試験化合物を、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質に接触させる工程、
（ｂ）試験化合物が、前記タンパク質の活性を測定する工程、
を包含する慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法である。
さらに、本発明は、以下の工程：
（ａ）試験化合物を、ＰＩＡＳｙ遺伝子又はＰＩＡＳｘ−β遺伝子によってコードされるタンパク質により活性が阻害されるＳＴＡＴタンパク質に接触させる工程、
（ｂ）試験化合物が、前記ＳＴＡＴタンパク質の活性を測定する工程、
を包含する慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法である。
さらに、本発明は、前記のいずれかに記載の評価方法によって得られた化合物を有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤である。
さらに、本発明は、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の研究用試薬、あるいは検査、治療又は予防剤である。
さらに、本発明は、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子の発現レベルの異常をもたらす、遺伝的多型を検出することを特徴とする慢性骨髄性白血病易罹患性のリスク判定方法である。
さらに、本発明は、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の異常をもたらす、遺伝的多型を検出することを特徴とする慢性骨髄性白血病易罹患性のリスク判定方法である。
さらに、本発明は、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子及びＥＴＳ２遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸を含有する慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤である。
さらに、本発明は、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子及びＥＴＳ２遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子のｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムを含有する慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、従来の慢性骨髄性白血病の検査方法と異なり、被検組織又は被検細胞中の特定の遺伝子の発現レベル又は特定の遺伝子群の発現プロファイルを指標として、慢性骨髄性白血病を検査することを特徴とする慢性骨髄性白血病検査方法である。ここで、「発現レベル」とは、特定の遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量（以下、ｍＲＮＡレベルともいう）、あるいは特定の遺伝子の翻訳産物の絶対量又は相対量（以下、タンパク質レベルともいう）をいう。「発現プロファイル」とは、前記特定の遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルをパターン化したものをいう。
１．本発明の慢性骨髄性白血病の検査方法
本発明によって、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子が、慢性骨髄性白血病患者のＡＣ１３３陽性造血幹細胞中において特徴的に発現レベルの変動することが明らかにされた。よって、前記の各遺伝子は、慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子として有用であり、該遺伝子の、被検者由来の組織（被検組織ともいう）又は被検者由来の細胞（被検細胞ともいう）での発現レベルを測定すること、又は当該遺伝子を含む遺伝子群の発現プロファイルを決定することによって慢性骨髄性白血病を検査することができる。ここで、被検細胞としては、骨髄細胞又は血液細胞、好ましくは多能性造血幹細胞、最も好ましくＡＣ１３３陽性造血幹細胞、Ｆｌｔ３／Ｆｌｋ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＭ００７１７４）陽性造血幹細胞、ＫＤＲ／Ｆｌｋ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００２２５３）陽性造血幹細胞が挙げられる。なお、本発明の実施例においては、被検細胞として、骨髄由来のＡＣ１３３陽性造血幹細胞を用いたが、ＡＣ１３３陽性造血幹細胞は末梢血中にも存在することが知られており［Ｂｌｏｏｄ  ９５：３１０６−３１１２（２０００）］、本発明の検査方法においては血液細胞を検査対象とすることも可能である。
具体的には、被検組織又は被検細胞中での前記遺伝子の発現レベルが、本発明により明らかにされた慢性骨髄性白血病における発現レベルと同程度に、正あるいは負に変動していれば、被検者は慢性骨髄性白血病に罹患していると評価することができる。より具体的には、各病期において前記遺伝子は、以下のような変動を示す。
より具体的には、慢性期の慢性骨髄性白血病患者においては、ＩＦＩＴ−２遺伝子の発現レベルが、健常者に比べて約２〜５００倍に増大するが、移行期、急性転化期では再び減少する。ＬＡＧＥ−１遺伝子およびＢＡＧＥ遺伝子の発現レベルは、健常者では発現していないか、または発現していても非常に低いレベルであるのに対し、慢性期でのみ発現が認められ、移行期、急性転化期では再び発現レベルは低下する。従って、被検者由来の造血幹細胞中の前記各遺伝子の発現レベルが、それらと同程度に増大していれば、その被検者は慢性骨髄性白血病に罹患しており、さらに被検者の病期は慢性期であると評価することができる。
移行期又は急性転化期の慢性骨髄性白血病患者の造血幹細胞においては、健常者および慢性期の慢性骨髄性白血病患者に比べて、ＤＤＢ１遺伝子の発現レベルが約２〜５０倍、及び／又はＥＴＳ２遺伝子の発現レベルが、約２〜１０倍に特異的に増大し得る。従って、被検者由来の造血幹細胞中の前記各遺伝子の発現レベルが、それらの同程度に増大していれば、その被検者は慢性骨髄性白血病に罹患しており、さらに被検者の病期は移行期又は急性転化期であると評価することができる。
移行期又は急性転化期の慢性骨髄性白血病患者の造血幹細胞においては、健常者および慢性期の慢性骨髄性白血病患者に比べて、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α、β遺伝子、ＤＡＰＫ３遺伝子の発現レベルがそれぞれ約１／２〜１／５０に特異的に減少し得る。従って、被検者由来の造血幹細胞中の前記各遺伝子の発現レベルが、それらの同程度に減少していれば、その被検者は慢性骨髄性白血病に罹患しており、さらに被検者の病期は移行期又は急性転化期であると評価することができる。
なお、前記遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現レベルは、遺伝子増幅法（例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法、ドットハイブリダイゼーション、スロットハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション等により測定することができる。また、前記遺伝子のタンパク質レベルでの発現レベルは、プロテインチップを用いる方法、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）等により測定することができる。
さらに、上記慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子のいずれかを含む遺伝子群の被検者由来生体試料中での発現プロファイルを決定し、得られた発現プロファイルを、予め慢性骨髄性白血病の発現プロファイルとして特定された発現プロファイルと照合することによって、被検者が慢性骨髄性白血病であるか否かをより高い精度で検査することができる。すなわち、この方法においては、慢性骨髄性白血病において発現レベルの変動しないことが示された遺伝子についても、発現レベルを測定し、検査に活用することが可能であるため、検査結果の精度、信頼性をより高めることが可能である。発現プロファイルの決定には、簡便性、感度、再現性等の点からＤＮＡマイクロアレイを使用することが好ましい。
さらに、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子又はＤＡＰＫ３遺伝子の少なくとも一部を含むＤＮＡをプライマーまたはプローブとして用いることにより、前記遺伝子の解析又は前記遺伝子のｍＲＮＡをそれぞれ解析することができる。ここで、「少なくとも一部」とは、プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオチドが本発明のＤＮＡ配列をもとに少なくとも８個の対応する塩基配列からなり、好ましくは少なくとも１０個の塩基配列、さらに好ましくは少なくとも約１５〜２５個の塩基配列からなる対応するポリヌクレオチドを意味する。
２．慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価
慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子の発現レベル調節能を有する化合物、慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物の活性調節能を有する化合物、及び／又は慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物により活性が阻害されるＳＴＡＴタンパク質の活性調節能を有する化合物の中には、慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物の発現レベル又は活性レベルを正常化し、白血病細胞の正常細胞への分化や異常増殖の抑制をもたらす物質が見いだされることが期待できる。これに基づき、以下のようにして慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能である。ここで、「評価」とは、化合物のスクリーニング及びバリデーションを含むより広い概念を意味する。
（１）慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価
試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ）又は試験細胞（例えば、慢性骨髄性白血病ヒト株化細胞、ヒト血液細胞、ＡＣ１３３陽性造血幹細胞等）に、試験化合物を投与又は接触させ、試験化合物が、試験動物又は試験細胞中での、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節する否か（例えば、正常レベルに復帰させるか否か）を確認することによって、慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物を評価することができる。ここで、前記試験動物又は前記試験細胞としては、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞も用いることができる。レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子等が挙げられるがこれらに限定されない。
（２）慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物の活性調節能を指標とする評価
試験化合物を、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子、ＥＴＳ２遺伝子、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子、ＰＩＡＳｘ−β遺伝子及びＤＡＰＫ３遺伝子によってコードされるタンパク質に接触させ、試験化合物が、前記タンパク質の活性を調節するか否かを確認することによって、慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物を評価することができる。
（３）ＳＴＡＴタンパク質の活性調節能を指標とする評価
試験化合物を、ＰＩＡＳｙ遺伝子、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子又はＰＩＡＳｘ−β遺伝子によってコードされるタンパク質により活性が阻害されるＳＴＡＴタンパク質に接触させ、試験化合物が、前記ＳＴＡＴタンパク質の活性を調節するか否かを確認することによって、慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物を評価することができる。
３．慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物に対する抗体の用途
慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物に対する抗体は、以下のようにして作製することができる。ここで、「抗体」とは、抗原である慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物に結合し得る抗体分子全体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２断片）を意味する。慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物に対する抗体は、当該技術分野で公知のいずれかによって製造することができる。例えば、モノクローナル抗体は、慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、または該ハイブリドーマ投与マウス腹水から調製することができる。またモノクローナル抗体は、ファージディスプレイ法を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの系からも調製することができる。抗原として使用する慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物は、必ずしも全アミノ酸構造を有する必要はなく、部分構造を有するペプチド、その変異体、誘導体、あるいは他のペプチドとの融合ペプチドであってもよく、調製法は、遺伝子工学的手法、生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。これら抗体は、ヒト生体試料中の慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物の同定や定量のための研究用試薬として、さらには慢性骨髄性白血病の検査、治療又は予防剤の有効成分として使用することができる。本発明において使用する抗体は、必要に応じてＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等の断片及びそれらの誘導体として使用することが可能であり、さらにキメラ抗体、ヒト化抗体としての応用も可能で、これらすべてが本発明に含まれる。慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子産物の免疫学的測定法は、公知の方法に準ずればよく、例えば、蛍光抗体法、受身凝集反応法、酵素抗体法などいずれの方法においても実施できる。
４．慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス核酸及び該ｍＲＮＡを切断するリボザイムの用途
本発明において明らかにされた慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子のうち、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子及びＥＴＳ２遺伝子は、慢性骨髄性白血病患者のＡＣ１３３陽性造血幹細胞中で、そのｍＲＮＡレベルが増大する。特に、ＤＤＢ１遺伝子とＥＴＳ２遺伝子は、移行期、急性転化期と慢性骨髄性白血病が悪性化するのに伴い発現量が増大する。従って、これらの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることにより前記遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）又は該アンチセンス核酸を発現する遺伝子構築物、並びに前記ｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイム又は該リボザイムを発現する遺伝子構築物は、慢性骨髄性白血病の遺伝子治療用薬剤として期待できる。前記アンチセンス核酸、リボザイム及びこれらを発現する遺伝子構築物は、ＩＦＩＴ−２遺伝子、ＬＡＧＥ−１遺伝子、ＢＡＧＥ遺伝子、ＤＤＢ１遺伝子及びＥＴＳ２遺伝子の塩基配列に基づいて、当該技術分野で公知の方法により製造することができる。
５．慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤
慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子は、慢性骨髄性白血病患者の血液細胞において発現レベルが顕著に変動する遺伝子である。従って、慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子の血液細胞内での発現レベルを正常レベルへと調節する物質は、慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有用である。慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子の血液細胞内での発現レベルを正常レベルに調節する物質としては、上記２において評価される化合物、上記３において得られる抗体及び上記４において得られるアンチセンス核酸、リボザイム及びそれらを発現する遺伝子構築物が挙げられる。
上記物質を慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤として用いる場合、通常の担体とともに投与経路に応じた製剤とすることができる。例えば、経口投与では錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等の形態に調剤される。経口投与用固形製剤に調製するに当たり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、その他着色剤、崩壊剤等を用いることができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が挙げられ、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、シエラック、白糖等が挙げられ、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が挙げられる。その他、着色剤、崩壊剤も通常公知のものを用いることができる。なお錠剤は周知の方法によりコーティングしてもよい。また液状製剤は水性または油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤、その他であってよく、通常用いられる方法にて調製される。注射剤を調製する場合は上記物質にｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤を製造することができる。座剤を製造する際の基剤としては、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール等の油脂性基剤を用いることができる。
調製された製剤の投与量は、患者の症状、体重、年齢等によって異なり、一様に決定することは出来ないが、通常成人１日当たり本発明化合物を約０．１〜１０００ｍｇの範囲となる量とするのがよく、これは通常１日１〜４回に分けて投与されるのが好ましい。また場合により、投与は１回／１日〜数日あるいはそれ以上の間隔で投与することも可能である。
６．遺伝的多型による慢性骨髄性白血病易罹患性の判定
本発明において見出された慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子の発現異常又は当該遺伝子産物の活性異常をもたらす遺伝的多型を検出することによって、慢性骨髄性白血病への罹り易さ（易罹患性）を判定することが可能である。遺伝的多型としては、ミニサテライトＤＮＡ、マイクロサテライトＤＮＡ、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；一塩基多型）等が挙げられる。上記遺伝的多型の同定は以下のようにして行うことができる。すなわち、本発明において見出された慢性骨髄性白血病マーカー遺伝子領域及び当該遺伝子の発現レベルの増減に関連し得る領域を健常者集団および慢性関節リウマチ患者集団を対象としてシークエンシングし、多型部位を検出する。検出された多型部位の対立遺伝子頻度を算出し、患者集団において有意に増加している対立遺伝子を見いだすことにより、慢性骨髄性白血病と相関する多型を同定する。
検出された遺伝的多型の検出は、例えば、被検者由来のゲノムＤＮＡについて、多型部位の塩基配列の解析、多型部位に存在する塩基の種類に依存して変化するＤＮＡ試料の物理化学的性質の差や制限酵素サイトの相違を利用する方法（例えば、多型部位を含むＤＮＡ試料のゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動等の各種電気泳動手段等における挙動の差を利用する方法）、当該多型部位の検出に適当な検出用プローブを利用する方法、及び質量分析法を応用した方法等によって好適に実施することができる。しかし、前記方法以外にも、前記遺伝的多型を検出するものである限り、その手法等には何等の限定もなく、公知の各種の方法を広く採用することができる。なお、前記いずれの検査方法においても、測定対象であるＤＮＡ試料は、ヒト由来のサンプルであり、これを含むものであれば特に限定なく、例えば、血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液；肝臓等の組織細胞；毛髪等の体毛等を利用できる。ゲノムＤＮＡは、これらサンプルより常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
本発明の慢性骨髄性白血病危険因子の検出方法では、被検者から検出した多型が、慢性骨髄性白血病患者において有意に頻度の高い多型である場合、被験者は慢性骨髄性白血病に罹患する危険性が高いと判定され、そうでない場合には、被験者は慢性骨髄性白血病に罹患する危険性が低いと判定される。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕  ＡＣ１３３陽性細胞の調製
以下のようにして、被検者からＡＣ１３３陽性造血幹細胞を調製した。すなわち、まずインフォームドコンセントを受けた１４人の被検者（健常者：２人、慢性期：７人、移行期：２人、急性転化期：３人）から骨髄吸引物を得た。次いで、得られた骨髄吸引物からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により骨髄単核球（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ：ＭＮＣ）を精製しＰＢＳで洗浄した。骨髄単核球を３００μｌのＭＡＣＳバッファー［ＰＢＳ／３％牛胎児血清（ＦＣＳ）／２ｍＭ  ＥＤＴＡ］に懸濁後、ＡＣＣ１３３陽性細胞単離キット（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に含まれているＦｃＲブロッキング試薬及び磁気ビーズ結合抗ＡＣ１３３抗体溶液をそれぞれ１００μｌ添加し４℃で３０分間反応させることによって、骨髄単核球中のＡＣ１３３陽性細胞を抗ＡＣ１３３  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで標識した。骨髄単核球をＭＡＣＳバッファーで十分洗浄後、ｍｉｎｉＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用い、ＡＣ１３３陽性細胞を得た。得られたＡＣ１３３陽性細胞の純度を、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ溶液（武藤化学株式会社）を用いる染色法によって調べたところ、いずれの被検者由来のサンプルも幼若造血幹細胞が８０％以上を占めていた。
〔実施例２〕  ｃＲＮＡの調製
実施例１において得られた各被検者由来のＡＣ１３３陽性細胞を用いて、各遺伝子の発現の解析用にｃＲＮＡを調製した。すなわち、まず各ＡＣ１３３陽性細胞からＲＮＡｚｏｌＢ試薬（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ社，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを純化した。次いで、得られたｔｏｔａｌＲＮＡにＴ７−ｄＴプライマー：５’−ｔｃｔａｇｔｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｇａａｔｔｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’（配列番号１９）を加え、ｔｏｔａｌＲＮＡ中のｍＲＮＡにハイブリダイズさせた後、リバーストランスクリプターゼＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ鎖を合成した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｃｈｏｉｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成した。さらに、得られた二本鎖ｃＤＮＡから、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＭＩ）を用いて、ｃＲＮＡを合成した。以上の操作を計２回行うことで各被検者由来のＡＣ１３３陽性細胞から最終的に５〜７０μｇのｃＲＮＡを得た。
〔実施例３〕  ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現の解析
ＥｘｐｒｅｓｓＣｈｉｐ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｒｇｅｎ社，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）及び実施例２において得られたｃＲＮＡを用い、各被検者由来ＡＣ１３３陽性細胞の遺伝子発現を解析した。すなわち、１μｇのｃＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成し、得られた二本鎖ｃＤＮＡから、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＭＩ）及び基質としてビオチン−ＣＴＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてビオチン標識ｃＲＮＡを得た。次いで、それぞれ１１５２種類のヒト遺伝子由来のオリゴヌクレオチドをスポットした３種類のＤＮＡマイクロアレイ（ＨＯ−１、ＨＯ−２及びＨＯ−３；Ｍｅｒｇｅｎ社，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）に標識ｃＲＮＡをハイブリダイズさせた。従って、各被検者由来のＡＣ１３３陽性細胞に対して、合計３４５６種類の遺伝子の発現解析を行ったことになる。ハイブリダイズ反応させたＤＮＡマイクロアレイを、ストレプトアビジンと混和後、抗ストレプトアビジン一次抗体、次いでＣｙ３結合二次抗体と順に反応させた。なお、ストレプトアビジン、抗ストレプトアビジン一次抗体及びＣｙ３結合二次抗体は、いずれもＭｅｒｇｅｎ社（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）製のものを用い、実験手順はＥｘｐｒｅｓｓＣｈｉｐ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｒｇｅｎ社，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）に添付のプロトコルに従った。
次いで、各遺伝子スポットの蛍光強度をＧＭＳ４１８  ａｒｒａｙ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて測定し、ＩｍａＧｅｎｅ  ３．０（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ社，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）により数値化した。得られたデータの統計処理はＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ３．２（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社，Ｒｅｄｗｏｏｄ，ＣＡ）により行った。具体的には、各ハイブリダイゼーションにおいて、全てのスポットのシグナル強度をデジタル化し、平均スポット強度について正規化した。このデータをクラスター分析することにより、その発現プロファイルが類似している遺伝子同士を１つのツリーに近接して配置した遺伝子ツリー（またはデンドログラムともいう）を得た。これにより、ある特定の病期または病期のサブグループにおいてのみ活性な幾つかの遺伝子のクラスターを見出した。また、慢性骨髄性白血病における病期特異的遺伝子を視覚化するために、慢性期、移行期または急性転化期群の間で各遺伝子の平均発現強度を算出し、これらの値に基づいて遺伝子ツリーを再度描いた。この平均ツリーから、慢性期、移行期又は急性転化期に特異的に発現レベルの変動する遺伝子を見出した。それらの遺伝子を表２にまとめた。表２に記載の発現量は任意単位であり、０．６以下は検出限界以下である。数値は絶対的なものではなく患者の状態、ｍＲＮＡの調製、ＤＮＡマイクロアレイの状態により変動し得る。
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慢性期において特異的に発現する遺伝子として、３９個の遺伝子を見出した。特に、慢性期特異的遺伝子の中で最も注目すべきものとして、テトラトリコペプチドリピート２（ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ  ２）を有するインターフェロン誘導タンパク質（ＩＦＩＴ−２）遺伝子（配列番号１）があった。ＩＦＩＴ−２遺伝子の転写は、慢性期の７人の被検者由来のサンプル（ＣＰ−１〜ＣＰ−７）のうち、ＣＰ−３〜ＣＰ−７の５つのサンプルにおいて非常に活性であるが、健常者及び他の病期の慢性骨髄性白血病患者由来のサンプルでは非常に弱いか全く見られなかった。また、サンプルＣＰ−６及びＣＰ−７ではＬＡＧＥ−１遺伝子（配列番号３）およびＢ黒色腫抗原（ＢＡＧＥ）遺伝子（配列番号５）も特異的に発現していることを見出した。
さらに、前記の平均ツリーから、その発現が健常者および慢性期患者由来のＡＣ１３３陽性細胞においてはサイレントであるが、移行期患者又は急性転化期患者由来のＡＣ１３３陽性細胞においては誘導される遺伝子の同定を試みた。その結果、ＤＮＡ損傷結合性タンパク質１（ＤＤＢ１）遺伝子（配列番号７）およびＥＴＳ２転写因子遺伝子（配列番号９）を見出した。ＤＤＢ１はＤＮＡ修復機構に関与し、その活性の喪失は色素性乾皮症の相補群（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ）Ｅに関連付けられる。慢性骨髄性白血病の進行した病期にある患者由来の芽球では、ＤＮＡの安定性の低下および種々のタイプの染色体異常がしばしば見られる。従って、ここで見出されたＤＤＢＩ遺伝子の発現誘導は、移行期又は急性転化期患者の白血病細胞内に蓄積されているＤＮＡの損傷を反映していると考えられる。また、ＣＰ−１患者ではＤＤＢ１遺伝子及びＥＴＳ２遺伝子の両者が誘導されており、この患者が移行期又は急性転化期への移行の過程にある可能性も考えられた。
同様に、前記の平均ツリーから、発現が移行期又は急性転化期への移行に伴って低下する遺伝子の同定を試みた。その結果、健常個体または慢性期患者由来のＡＣ１３３陽性細胞内では高い発現量を示すが、移行期患者および急性転化期患者由来のＡＣ１３３陽性細胞内では低減している遺伝子として２１個の遺伝子を見出した。それらの低減の度合が、顕著なものとして、ＰＩＡＳｙ遺伝子（配列番号１１）、ＰＩＡＳｘ−α遺伝子（配列番号１３）及びＰＩＡＳｘ−β遺伝子（配列番号１５）があった。ＰＩＡＳ１およびＰＩＡＳ３はそれぞれＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３に結合してそれらの活性を抑制する。従って、ＰＩＡＳｙの正確な結合相手は未だ明らかにはなっていないが、ＰＩＡＳｙはＳＴＡＴタンパク質のメンバーを調節するように機能する可能性が考えられる。ＳＴＡＴタンパク質はしばしば、種々の白血病に罹患している個体からの細胞内で過剰にリン酸化されて活性化されることがわかっている。ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼが造血細胞系に導入されることによりＳＴＡＴタンパク質の活性化が起こり、このことは、ＳＴＡＴタンパク質がＢＣＲ−ＡＢＬシグナリングのメディエーターであることを示している。従って慢性期の白血病芽球では、ＰＩＡＳｙの豊富な発現がＣＭＬ芽球内の活性化ＳＴＡＴタンパク質の移行能を妨げ、ＰＩＡＳｙの消失により芽細胞の増殖が調節されないようになり、病期の進行が起こると考えられた。
〔実施例４〕  リアルタイムＰＣＲによる発現レベルの検証
実施例３において、慢性骨髄性白血病における病期特異的遺伝子として同定されたＩＦＩＴ−２遺伝子とＰＩＡＳｙ遺伝子について、健常者及び各病期の患者由来ＡＣ１３３陽性細胞中での発現レベルをリアルタイムＰＣＲによって検証した。すなわち、実施例１及び２と同様の手順により各患者由来のＡＣ１３３陽性細胞からｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーンＰＣＲコア試薬（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ；ＰＥ  ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いたＰＣＲに供試した。ここで、ＩＦＩＴ−２遺伝子増幅用のプライマーとして５’−ｃｔｇｃｇｇｔａｔｇｇｃａａｃｔｔｔｃａｇ−３’（配列番号２０）及び５’−ａｇｇａａｔｇｃｃａａｇａｃａｔｇｃａａ−３’（配列番号２１）を、ＰＩＡＳｙ遺伝子増幅用のプライマーとして５’−ａａｃｔａｃｇｇｃａａｇａｇｃｔａｃｔｃｇｇｔｇ−３’（配列番号２２）及び５’−ｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｇｇｔａｇａａｇａｃｇｇｃ−３’（配列番号２３）を用いた。また、コントロールとしては常法に従いβ−アクチン遺伝子を採用した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システム（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＰＣＲ産物へのＳＹＢＲグリーン染料の取り込みをリアルタイムでモニターすることにより、ＰＣＲ産物の指数関数的増幅が始まる検出限界サイクル数（ＣＴ値）を決定した。β−アクチン遺伝子及び標的遺伝子に対応するｃＤＮＡのＣＴ値から、β−アクチンｍＲＮＡ量に対する標的遺伝子ｍＲＮＡの量を算出した。その結果、各病期の患者由来のＡＣ１３３陽性細胞中でのＩＦＩＴ−２遺伝子及びＰＩＡＳｙ遺伝子の発現量は、実施例３のＤＮＡマイクロアレイにより測定した場合と同様な値を示し、当該遺伝子の発現量について再現性が確認された。
〔実施例５〕  ＰＩＡＳｙ遺伝子の導入による影響
実施例３において、慢性骨髄性白血病における病期特異的遺伝子として同定されたＰＩＡＳｙ遺伝子を急性転化期にある慢性骨髄性白血病患者に由来する細胞に導入し、ＰＩＡＳｙ遺伝子の発現が及ぼす影響について検討した。
ＰＩＡＳｙ遺伝子を含む発現ベクターは、以下のように構築した。すなわち、先ず、ｐＭＸレトロウィルスベクター（Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．：Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２４，：３２４−３２９（１９９６））に、ｔＴＡＥＲをコードするｃＤＮＡ、ｉｒｅｓ−ＢＳＲ及びｔｅｔＯ断片を挿入してなるｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦベクターを準備した。次に、ＰＩＡＳｙ  ｃＤＮＡ（ヘリックス研究所）を鋳型とするＰＣＲにより、Ｃ末端にＦＬＡＧエピトープタグ（イーストマンコダック社）を結合したＰＩＡＳｙ（ＰＩＡＳｙ−Ｆ）をコードするＰＩＡＳｙ−Ｆ遺伝子を増幅した。次に、ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦベクターにおけるｔｅｔＯ断片の下流にＰＩＡＳｙ−Ｆ遺伝子を連結して発現ベクター（ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆ）を構築した（図１）。得られた発現ベクターは、パッケージング細胞系であるＰＡ３１７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ社）に導入した。
また、本実施例では、急性転化期にある慢性骨髄性白血病患者に由来する細胞としてＫＣＬ２２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ社）を用いた。ＫＣＬ２２は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、レトロネクチン（宝酒造）の存在下で２４時間処理することによって、ＰＡ３１７の培養上清に含まれるｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆに感染させた。その後、回収したＫＣＬ２２を、５μｇ／ｍｌのブラスチシジン及び１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを更に添加した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。そして、２μＭの１７βエストラジオールを添加した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にてＫＣＬ２２を培養することによって、発現ベクターに含まれるＰＩＡＳｙ−Ｆ遺伝子を発現させた。
なお、図１に示した発現ベクター（ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆ）は、テトラサイクリンが存在し且つβエストラジオールが不存在の場合、ｔｅｔＯの下流の遺伝子（ＰＩＡＳｙ−Ｆ遺伝子）を発現させない。これに対して、発現ベクター（ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆ）は、テトラサイクリンが不存在で且つβエストラジオールが存在する場合、ｔｅｔＯの下流の遺伝子（ＰＩＡＳｙ−Ｆ遺伝子）を発現させる。ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆを導入したＫＣＬ２２の生育を検証し、ＰＩＡＳｙ遺伝子の発現が及ぼす影響について検証した。
具体的には、ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦを導入したＫＣＬ２２及びｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆを導入したＫＣＬ２２について、ｔｅｔＯ下流の遺伝子を発現させる条件或いはｔｅｔＯ下流の遺伝子を発現させない条件で生育させた際の細胞数及び生存率を測定した。なお、いずれのＫＣＬ２２も、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
細胞数及び生存率の測定結果を、それぞれ図２Ａ及びＢに示す。図２Ａ及びＢに示すように、ＰＩＡＳｙ遺伝子を発現させたＫＣＬ２２では、生育日数が増加するに従って細胞数及び生存率ともに減少していることが判る。これに対して、ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆを導入したがＰＩＡＳｙ遺伝子を発現させていないＫＣＬ２２（図２中「ＰＩＡＳｙ（−）」）では、生育日数が増加しても、ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦを導入したＫＣＬ２２と変わらない細胞数及び生存率を示した。
また、ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦを導入したＫＣＬ２２及びｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆを導入したＫＣＬ２２について、ｔｅｔＯ下流の遺伝子を発現させる条件で６日間培養したときの顕微鏡写真（４００倍）を図３Ａ及びＢに示す、図３ＡはｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦを導入したＫＣＬ２２（ＭＯＣＫ）を示し、図３ＢはｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆを導入したＫＣＬ２２（ＰＩＡＳｙ）を示す。なお、いずれのＫＣＬ２２もライト−ギムーザ溶液により染色した。図３Ａ及びＢに示すように、ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦを導入したＫＣＬ２２では通常の表現型（塩基好性の細胞質を有する中型サイズの細胞、細胞質における核の高比率、及び良好な核の構造）を示した。これに対して、ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆを導入したＫＣＬ２２（ＰＩＡＳｙ）では、アポトーシス的な変化（細胞の縮小、及び核の収縮及び断片化）を示した。
これら図２及び図３から、ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆを導入したＫＣＬ２２において、ＰＩＡＳｙ−Ｆ遺伝子を発現させることによって、当該ＫＣＬ２２にアポトーシスを誘導することが明らかとなった。近年、ＰＩＡＳｙタンパク質は、ＳＴＡＴ１の活性を阻害することが実証されているため、上記ＫＣＬ２２におけるＳＴＡＴ１の活性を阻害することによって上述したようなアポトーシスを誘導すると考えられる。また、正常人及び慢性期の患者におけるＡＣ１３３陽性細胞において、ＰＩＡＳｙ遺伝子の発現量が高いことから、急性転化期への進行が減少しているものと考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明により、慢性骨髄性白血病の検査方法、慢性骨髄性白血病の治療又は予防に有効な化合物の評価方法、該評価方法によって得られる治療又は予防に有効な化合物、該化合物を有効成分として含有する慢性骨髄性白血病の治療又は予防剤、及び慢性骨髄性白血病易罹患性のリスク判定方法が提供される。
配列表フリーテキスト
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例５で構築したｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆを概略的に示す構成図である。
図２は、Ａは生育日数とｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆ又はｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦを導入したＫＣＬ２２の細胞数との関係を示す特性図であり、Ｂは生育日数とｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆ又はｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦを導入したＫＣＬ２２の生存率との関係を示す特性図である。
図３は、ｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦ／ＰＩＡＳｙ−Ｆ又はｐＭＸ−ｔｅｔＯＦＦを導入したＫＣＬ２２の顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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