(57)【要約】骨格筋への遺伝子輸送のため、組換えセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを用いることが可能であるか否かを、ＬａｃＺレポーター遺伝子及びインスリン様増殖因子遺伝子を利用して検討した。その結果、トランスジーン発現は注射後最大１ヶ月間持続した。インスリン様増殖因子遺伝子の導入は、対照と比較して、再生筋繊維の有意な増加、及び肥大の指標である分裂筋繊維の有意な増加を示し、さらに筋繊維総数の増加も示した。センダイウイルスを含むパラミクソウイルスベクターが、骨格筋において高レベルのトランスジーン発現を達成すること、及びパラミクソウイルスベクターを用いたインスリン様増殖因子遺伝子の導入が、神経筋障害の治療における大きな可能性を有していることが示された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来遺伝子が挿入されたパラミクソウイルスベクターを骨格筋に投与することを含む、外来遺伝子を骨格筋に導入する方法。
【請求項２】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
外来遺伝子が治療用遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
外来遺伝子がインスリン様増殖因子をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
骨格筋に外来遺伝子を導入するために用いる、外来遺伝子が挿入されたパラミクソウイルスベクター。
【請求項６】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
外来遺伝子が治療用遺伝子である、請求項５または６に記載のベクター。
【請求項８】
外来遺伝子がインスリン様増殖因子をコードする遺伝子である、請求項５または６に記載のベクター。
【請求項９】
外来遺伝子が挿入されたパラミクソウイルスベクターを含む、骨格筋に外来遺伝子を導入するための組成物。
【請求項１０】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
外来遺伝子が治療用遺伝子である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
外来遺伝子がインスリン様増殖因子をコードする遺伝子である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳動物において再生筋繊維および／または分裂筋繊維を増加させるために用いられる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
神経筋障害の治療に用いられる、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、骨格筋へ外来遺伝子を導入するためのパラミクソウイルスベクターに関する。
背景技術
パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）には、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びフィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）という３種の属が含まれる。これらは、ｍＲＮＡ合成、及びアンチ鎖ゲノムの合成のための鋳型として機能する非分節型（−）鎖ＲＮＡゲノムを有する、エンベロープをもつウイルスである。センダイウイルス（ＳｅＶ）は、パラミクソウイルス属に属し、ウイルス学における初期の研究から、このヒト病原性は否定されている（ウイルス実験プロトコール　永井美之、石浜明、１９９５．４）。ＳｅＶは、哺乳動物細胞において厳密な細胞質生活環を有し、導入されたＲＮＡは宿主細胞の染色体と相互作用することなく細胞質状態で維持されるため、ＳｅＶはヒト遺伝子治療のために安全に使用されうる。ここで用いられるＳｅＶ　Ｚ株の全長ゲノム・ヌクレオチド配列は、１９８６年にＳｈｉｂｕｔａらにより決定された。さらに、形質転換されたＳｅＶ　ｃＤＮＡから感染ウイルスを回収することが成功したため、遺伝子操作が可能となった（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，Ｋ．Ｋ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３２，１２３−１６２（１９９８）；Ｙ．Ｎａｇａｉ，Ａ．Ｋａｔｏ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３，６１３−６２４（１９９９））。さらに、付加的な転写ユニットを有する多様な外来遺伝子が、適当なゲノム位置に挿入され、極めて高レベルにＳｅＶにおいて発現されている（Ｙｕ，Ｄ．，Ｔ．Ｓｈｉｏｄａ，Ａ．Ｋａｔｏ，Ｍ．Ｋ．Ｈａｓａｎ，Ｙ．Ｓａｋａｉ　ａｎｄ　Ｙ．Ｎａｇａｉ　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　２，４５７−４６６（１９９７））。
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）は、骨格筋の発達、維持、及び再生において重要な役割を果たす。筋原細胞に対するＩＧＦ−Ｉの効果には、筋芽細胞複製、筋原分化、及び筋管肥大の刺激が含まれる（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３，２０１−２１６（１９９１）、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１７，４８１−５１６（１９９６）、Ｃｅｌｌ．，７５，５９−７２（１９９３）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，７，２６０９−２６１７（１９９３））。筋肉再生には、筋肉前駆細胞の増殖、筋管への融合、及び再神経支配が含まれる。衛星細胞において産生されるＩＧＦ−Ｉは、筋肉前駆細胞の増殖及び分化のための強力な刺激因子として作用する（Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｓｃａｎｄ，１６７，３０１−３０５（１９９９））。骨格筋へのＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入は、既に、非ウイルス技術を用いた、除神経骨格筋萎縮の治療、ＡＡＶベクターを用いた、加齢に関連した骨格筋機能消失の治療に応用されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５，１５６０３−１５６０７（１９９８））。
発明の開示
本発明は、高い効率で骨格筋へ外来遺伝子を導入できるパラミクソウイルスベクターおよびその用途を提供することを課題とする。より詳しくは、本発明は、骨格筋へ外来遺伝子を導入するために用いるパラミクソウイルスベクター、該ベクターを含む骨格筋への外来遺伝子導入用組成物、および該ベクターを利用して骨格筋へ外来遺伝子を導入する方法を提供する。本発明の好ましい態様において、インスリン様増殖因子をコードする遺伝子が挿入されたパラミクソウイルスベクターおよび筋繊維形成のためのそれの利用を提供する。
骨格筋は、全身性疾患及び神経筋障害の治療のための治療用タンパク質をコードする外因性遺伝子の、輸送及び発現のための魅力的な部位である。本発明者等は、骨格筋への遺伝子輸送のため、ＬａｃＺレポーター遺伝子及びヒト・インスリン様増殖因子（ｈＩＧＦ−Ｉ）遺伝子を含有する組換えセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを用いることが可能であるか否かを検討した。
ＬａｃＺ／ＳｅＶの筋肉内注射の７日後、ブピバカイン処理動物／未処理動物において、多数のＸ−ｇａｌ標識筋繊維が認められ、トランスジーン発現は注射後最大１ヶ月間持続した。Ｌ６細胞の培養上清中に、主要なタンパク質種として、ＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶに由来する組換えｈＩＧＦ−Ｉが検出され、従って、誘導されたＬ６細胞は、多核組織及び肥大のような形態学的変化を受けていた。筋肉へのＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶの導入は、ＬａｃＺ／ＳｅＶ処理対照と比較して、再生筋繊維の有意な増加、及び肥大の指標である分裂筋繊維の有意な増加を示し、さらに筋繊維総数の増加も示した。これらの結果より、センダイウイルスを含むパラミクソウイルスベクターが、骨格筋において高レベルのトランスジーン発現を達成すること、及びパラミクソウイルスベクターを用いたＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入が、神経筋障害の治療における大きな可能性を有していることが示された。
即ち、本発明は、骨格筋へ外来遺伝子を導入するためのパラミクソウイルスベクターおよびそれを用いた外来遺伝子の骨格筋への導入方法、並びに外来遺伝子としてインスリン様増殖因子が挿入されたパラミクソウイルスベクターおよびその筋繊維の形成のための利用に関し、より具体的には、
〔１〕　外来遺伝子が挿入されたパラミクソウイルスベクターを骨格筋に投与することを含む、外来遺伝子を骨格筋に導入する方法、
〔２〕　パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１〕に記載の方法、
〔３〕　外来遺伝子が治療用遺伝子である、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕　外来遺伝子がインスリン様増殖因子をコードする遺伝子である、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔５〕　骨格筋に外来遺伝子を導入するために用いる、外来遺伝子が挿入されたパラミクソウイルスベクター、
〔６〕　パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔５〕に記載のベクター、
〔７〕　外来遺伝子が治療用遺伝子である、〔５〕または〔６〕に記載のベクター、
〔８〕　外来遺伝子がインスリン様増殖因子をコードする遺伝子である、〔５〕または〔６〕に記載のベクター、
〔９〕　外来遺伝子が挿入されたパラミクソウイルスベクターを含む、骨格筋に外来遺伝子を導入するための組成物、
〔１０〕　パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔９〕に記載の組成物、
〔１１〕　外来遺伝子が治療用遺伝子である、〔９〕または〔１０〕に記載の組成物、
〔１２〕　外来遺伝子がインスリン様増殖因子をコードする遺伝子である、〔９〕または〔１０〕に記載の組成物、
〔１３〕　哺乳動物において再生筋繊維および／または分裂筋繊維を増加させるために用いられる、〔１２〕に記載の組成物、
〔１４〕　神経筋障害の治療に用いられる、〔１２〕に記載の組成物、を提供するものである。
なお、本発明において「パラミクソウイルスベクター」とは、パラミクソウイルスに由来し遺伝子を宿主細胞に導入するベクター（担体）を指す。本発明のパラミクソウイルスベクターはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）であってもよく、また、感染力を持つウイルス粒子であってもよい。ここで「感染力」とは、組換えパラミクソウイルスベクターが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベクター内部の遺伝子を導入することのできる能力のことを言う。好ましい態様では、本発明のパラミクソウイルスベクターは、外来遺伝子を発現することができるように該遺伝子が遺伝子工学的に組み込まれている。本発明のパラミクソウイルスベクターは、複製能を有していてもよく、複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
本明細書において、「組換え」パラミクソウイルスベクターとは、遺伝子操作により構築されたパラミクソウイルスベクターまたはそれを増幅して得られるパラミクソウイルスベクターを言う。組換えパラミクソウイルスベクターは、例えば、組換えパラミクソウイルスｃＤＮＡから再構成して生成することができる（Ｙ．Ｎａｇａｉ，Ａ．Ｋａｔｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４３，６１３−６２４（１９９９））。
本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科に属するウイルスまたはその誘導体を指す。本発明を適用可能なパラミクソウイルスとしては、例えばパラミクソウイルス科の（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ　ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ　ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ　ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ　ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ　ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）に属するウイルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なパラミクソウイルス属ウイルスとしては、例えばセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ　ｖｉｒｕｓ）およびヒトＨＡ２などを含むパラインフルエンザウイルス１型、サルＳＶ５およびＳＶ４１並びにヒトＣＡなどを含むパラインフルエンザウイルス２型、ウシＳＦおよびヒトＨＡ１などを含むパラインフルエンザ３型、パラインフルエンザ４型（Ａ亜型およびＢ亜型を含む）、ムンプスウイルス、ニューカッスルウイルス、並びにその他の多くのパラミクソウイルス属ウイルスが含まれる。本発明のパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などであり得る。ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウイルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も、本発明のウイルスベクターを製造するための材料として使用することができる。
パラミクソウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子が含まれる。「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
パラミクソウイルス属　ＮＰ　Ｐ／Ｃ／Ｖ　Ｍ　Ｆ　ＨＮ−Ｌ
ルブラウイルス属　ＮＰ　Ｐ／Ｖ　Ｍ　Ｆ　ＨＮ（ＳＨ）Ｌ
モービリウイルス属　ＮＰ　Ｐ／Ｃ／Ｖ　Ｍ　Ｆ　Ｈ−Ｌ
例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のレスピロウイルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。
本発明において「遺伝子」とは遺伝物質を指し、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸が含まれる。遺伝子は蛋白質をコードしてもよく、また蛋白質をコードしていなくてもよい。遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。
本発明において「骨格筋」とは、横紋像を呈する筋肉を指し、本明細書においては心筋を含む。
本発明は、パラミクソウイルスベクターの骨格筋へ遺伝子導入用途を提供する。本発明者等は、パラミクソウイルスの一つであるセンダイウイルスが極めて高い効率で骨格筋へ遺伝子を導入することができることを見出した。骨格筋は、全身性疾患及び神経筋障害を治療するための標的として重要であり、本発明のベクターはこれら疾患の遺伝子治療に好適に用いられ得る。
また、本発明者等により、組換えセンダイウイルスベクターを利用して骨格筋に導入された遺伝子が１箇月にわたり持続的な発現を示すことが示された。このことは、組換えセンダイウイルスベクターを利用して骨格筋を標的とした遺伝子治療を行った場合に、持続的な治療効果を得ることができるという利点をもたらす。
また、安全性の面においてもヒト病原性が否定されているため、パラミクソウイルスベクターはヒトへの遺伝子治療の臨床試験に好適に用いられうることが示唆される。第一に、プラスミドＤＮＡによる外来遺伝子の発現は、導入したＤＮＡの核局在化又は核膜の消失が必要であることが、遺伝子発現の成功率を低下させる主要な障害になっている。しかし、例えばセンダイウイルスなどの場合、外来遺伝子の発現は、細胞質内において細胞性チューブリンおよび自身が持つＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ蛋白質）の両方によってウイルスゲノムの複製に伴って駆動される。これはまた、センダイウイルスが宿主の染色体と相互作用しないことを示しており、染色体異常による細胞の癌化および不死化などの安全面における問題が生じないと考えられる。第二に、センダイウイルスは齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ　１５：５３３−５４０，１９９７）。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスベクターが、ヒトの治療へ応用しうることを示唆し、センダイウイルスベクターが、骨格筋への遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを結論づけるものである。
このようにパラミクソウイルスベクターが骨格筋への遺伝子導入において有効であるという本発明により得られた知見は、特に、骨格筋を標的とした遺伝子治療などにおいて大きな進歩をもたらす可能性を示している。
本発明において骨格筋への遺伝子導入に用いるパラミクソウイルスベクターとしては、特に制限はない。好適なパラミクソウイルスベクターとして、例えば、複製能を有し、自立的に増殖するようなベクターが挙げられる。例えば、一般に天然型パラミクソウイルスのゲノムは、３’の短いリーダー領域に続き、Ｎ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、Ｍ（マトリックス）、Ｆ（フュージョン）、ＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）、およびＬ（ラージ）蛋白質をコードする６つの遺伝子が並んでおり、短い５’トレイラー領域を他端に有する。これと同様の構造を有するゲノムを設計することにより、自律複製可能な本発明のベクターを製造することができる。また、ゲノム内に外来遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子を発現するベクターを製造することができる。なお、本発明のパラミクソウイルスベクターにおいては、ウイルス遺伝子の配置は野生型ウイルスから改変されていてもよい。
また、本発明に用いるパラミクソウイルスベクターとしては、野生型パラミクソウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってもよい。例えば、センダイウイルスベクターを再構成させる場合、ＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ遺伝子から作られる蛋白質群がトランスに必要だと考えられているが、該蛋白質群をコードする遺伝子自体は、本発明のウイルスベクターに必ずしも含まれている必要なはい。例えば、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、ベクターゲノムをコードする発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、再構成を行うことができる。また、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する宿主細胞にベクターゲノムをコードする発現ベクターを導入し、該宿主細胞から該蛋白質群を供給して再構成を行ってもよい。これらの蛋白質群のアミノ酸配列は、ウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、パラミクソウイルスベクターが細胞に伝播してゆくためには、Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子から作られる蛋白質群が必要だと考えられているが、パラミクソウイルスベクターをＲＮＰとして調製する場合は、これらの蛋白質は必要ない。ＲＮＰに含まれるゲノムに、Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子が含まれていれば、宿主に導入された時に、これらの遺伝子産物が生産され、感染性のあるウイルス粒子が形成される。
ＲＮＰを細胞に導入するには、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ　＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：３０１５）。複製型ウイルスの場合、産生されたウイルスは、培養細胞、鶏卵、個体（例えばマウスなどの哺乳動物）などに再感染させて増幅または継代することができる。
逆に、Ｍ、Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子が含まれていないパラミクソウイルスベクターも、本発明のパラミクソウイルスベクターとして用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはこれらのいずれかの遺伝子を欠損しているため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子および／またはＨＮ遺伝子が挙げられる。例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ００／０３１９４およびＰＣＴ／ＪＰ００／０３１９５）。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組込まれた宿主細胞を用いて製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をベクターのエンベロープに含むベクターを作製することもできる。このようなタンパク質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明のパラミクソウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇタンパク質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。
また、本発明のパラミクソウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラタンパク質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体などの遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また、本発明のウイルスベクターは、例えば、免疫原性を低下させるために、または、ＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウイルス遺伝子が改変されたものであってもよい。具体的には、例えば複製因子であるＮＰ遺伝子、Ｐ／Ｃ遺伝子およびＬ遺伝子の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｌｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、膜融合に関わるＦ蛋白質を改変することにより、膜融合リポソームの融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質やＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用して抗原提示能を弱めたパラミクソウイルスを作製することもできる。
本発明のウイルスベクターは、ゲノムＲＮＡ中に外来遺伝子をコードし得る。外来遺伝子を含む組換えパラミクソウイルスベクターは、上記のパラミクソウイルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、標的とする骨格筋において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遣伝子であってもよく、また天然型蛋白質と同等の機能を有する蛋白質をコードする限り、欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、該ウイルスベクターＤＮＡに対象となる疾患の治療用遺伝子を挿入する。ウイルスベクターＤＮＡに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウイルスベクターＤＮＡにおいては、転写終結（Ｅ）配列と転写開始（Ｓ）配列との間などに、６の倍数の塩基数を有する配列を挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，１９９３，ｐ．４８２２−４８３０）。外来遺伝子は、ウイルスの各遺伝子（ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子）の前および／または後ろに挿入することができる。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜Ｅ−Ｉ−Ｓ配列（転写開始配列−介在配列−転写終結配列）またはその部分を挿入する。あるいは、ＩＲＥＳを介して外来遺伝子を挿入することもできる。挿入した外来性遺伝子の発現量は、外来遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる。また、遺伝子挿入の位置、また遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、センダイウイルスにおいては、挿入位置がウイルスゲノムのネガティブ鎖ＲＮＡの３’端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、ＮＰ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、外来遺伝子をＮＰ遺伝子の上流（マイナス鎖においては３’側）またはＮＰ遺伝子とＰ遺伝子の間など、ネガティブ鎖ゲノムにおいて上流領域に挿入することが好ましい。逆に、挿入位置がネガティブ鎖ＲＮＡの５’端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、Ｌ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も５’側、すなわち野生型ウイルスゲノムにおいてはＬ遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の５’隣接部位）、またはＬ遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の３’隣接部位）に外来遺伝子を挿入する。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルスタンパク質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。ゲノムをコードするベクターＤＮＡ中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。また、本発明のベクターは、このように挿入した以外に位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。
外来遺伝子を有する組換えセンダイウイルスベクターは、例えば、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　２：４５７−４６６の記載に準じて、次のようにして構築することができる。
まず、所望の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、外来遺伝子をＮｏｔＩ部位を利用してウイルスゲノムをコードするＤＮＡに挿入する場合を例にとって説明する。目的とするｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から所望の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅回収する。増幅された断片の両端がＮｏｔＩ部位とし、さらに一端にセンダイウイルスの転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）（ＥＩＳ配列）のコピーを付加するために、ＮｏｔＩ制限酵素切断部位配列及び転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対として、フォワード側合成ＤＮＡ配列及びリバース側合成ＤＮＡ配列（アンチセンス鎖）を作成する。
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧ、およびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧ、およびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、ＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを含め、ｃＤＮＡの相補鎖塩基配列と後述するセンダイウイルスに由来するセンダイウイルスゲノムのＥＩＳ塩基配列の合計が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ　ｏｆ　ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８）。さらに挿入断片の３’側にセンダイウイルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’、Ｉ配列、好ましくは５’−ＡＡＧ−３’、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終始コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とする。
ＰＣＲは、例えば、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくはＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて行い、増幅した目的断片はＮｏｔＩで消化した後、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、ゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを介さずにＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
ウイルスゲノムをコードするＤＮＡは、適当な転写プロモーターを連結してベクターＤＮＡを構築し、これを試験管内または細胞内で転写させ、ウイルスのＬ、Ｐ、およびＮＰタンパク質の共存下でＲＮＰを再構成させ、このＲＮＰを含むウイルスベクターを生成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡからのウイルスの再構成は公知の方法に従って行うことができる（国際公開９７／１６５３９号；国際公開９７／１６５３８号；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ　Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ　Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ　Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ　Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むパラミクソウイルスベクターをＤＮＡから再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
例えば、ベクターＤＮＡを細胞内に導入する方法には、次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ　＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ　Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ　１１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％ＣＯ２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ　＃Ｄ−９８８５　Ｍ．Ｗ．５×１０５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼や▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、本発明においては、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ　Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ　Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられる。
ｃＤＮＡからの再構成は具体的には次のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿上で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２を７０〜８０％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ　ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下ＵＶ照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９，１９９６）を２　ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間を適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜５μｇの上記の組換えセンダイウイルスｃＤＮＡを、全長センダイウイルスゲノムの生成に必須なトランスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミド（２４−０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、１２−０．２５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および２４−０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｌ、より好ましくは例えば１μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションして培養する。培養３〜７日後に培養液を回収する。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞に重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ００／０３１９４およびＰＣＴ／ＪＰ００／０３１９５参照）。培養上清に含まれるウイルス力価は赤血球凝集活性（ＨＡ）を測定することにより決定することができる。ＨＡは「ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ希釈法」（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９−５７９）により決定することができる。得られたウイルスストックは−８０℃で保存することができる。
ウイルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、ＬＬＣＭＫ２細胞、サル腎由来のＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを漿尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ漿尿液を回収する。漿尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３３（１９９５））。
欠損型ウイルスベクターを調製する場合、例えば、ゲノム上で欠損しているエンベロープ遺伝子が異なる２種のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するエンベロープタンパク質が、もう一方の複合体からの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、エンベロープタンパク質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのエンベロープ遺伝子欠損型ウイルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、エンベロープ遺伝子が欠損しているため、エンベロープ遺伝子を欠損していないウイルスに比べゲノムサイズが小さくなり長い外来遺伝子を保持することができる。また、元々感染性のないこれらのウイルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウイルスベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウイルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接（ｅｘ　ｖｉｖｏ）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。外来遺伝子としては特に制限はなく、蛋白質をコードする核酸に加え、例えば、アンチセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。
本発明のパラミクソウイルスベクターは、薬学的に許容される所望の媒体と共に組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を阻害しない材料である。例えば本発明のパラミクソウイルスベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈して組成物とすることができる。本発明のパラミクソウイルスベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては漿尿液を含んでよい。また本発明のパラミクソウイルスベクターを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。
上記のようにして得られたパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む組成物を骨格筋へ導入することで、パラミクソウイルスベクターが持つ外来遺伝子を骨格筋で発現させることができる。
さらに、ウイルスベクターの投与前に、筋肉の再製を誘発することによりトランスジーンの発現を増強することが知られているブピバカインを投与してもよい。
本発明のパラミクソウイルスにより導入する遺伝子としては、特に制限はないが、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナルや膜局在化シグナル、核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子は、骨格筋の細胞で発現していない遺伝子であってもよく、また骨格筋の細胞で発現している遺伝子を導入し、発現を増大させてもよい。また、アンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡ切断型リボザイムなどを発現させて骨格筋の細胞で発現する望ましくない遺伝子の機能を抑制することもできる。
本発明のベクターは、様々な疾患に対する遺伝子治療に適用することが期待される。このような遺伝子治療には、例えば、遺伝子欠損による細胞での発現の異常を補正するために、また、外来遺伝子を細胞に導入することにより新しい機能を付加させるために、あるいは、ある遺伝子に対して抑制的に働く遺伝子を導入することにより細胞における望ましくない作用を抑制するために行い得る。
遺伝子治療の対象となる疾患としては、例えば、筋ジストロフィー、筋炎、ミオパチー、並びに心筋梗塞後のミオパチー及び心筋症が挙げられる。筋ジストロフィーの治療に有効な遺伝子としては、例えば、ジストロフィンやＩＧＦ−Ｉが、筋炎の治療に有効な遺伝子としては、例えば、ＩＧＦ−ＩやＦＧＦが、ミオパチーの治療に有効な遺伝子としては、例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２やＩＬ−６が挙げられる。
本発明のパラミクソウイルスにより導入する遺伝子の好適な一例として、インスリン様増殖因子をコードする遺伝子が挙げられる。これにより再生筋繊維の有意な増加、及び肥大の指標である分裂筋繊維の有意な増加、さらに筋繊維総数の増加が期待できる。従って、インスリン様増殖因子をコードする遺伝子が導入されたパラミクソウイルスは、神経筋障害の治療への応用が期待される。神経筋障害としては、例えば、外傷による神経繊維切断、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症を例示することができる。
遺伝子治療は、骨格筋の内または外から、パラミクソウイルスベクター含有組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで投与し、外来遺伝子を骨格筋の細胞内で発現させることにより実施することができる。また、ｅｘ　ｖｉｖｏによる投与を行ってもよい。骨格筋へのベクターの導入は、例えば、経皮的に導入する方法や開皮して直接導入する方法が挙げられる。ベクターの導入の際には、筋上膜を破損しないように処置することに留意する必要がある。
骨格筋へのパラミクソウイルスベクターは、有効量のベクターが骨格筋の細胞に導入されるのに十分な量を投与される。「有効量」とは、本発明に方法において、所望の治療または予防効果を少なくとも部分的にもたらすように骨格筋の細胞に遺伝子が導入される量を言う。所望の遺伝子を含む本発明のパラミクソウイルスベクターの有効量が投与されることにより、ベクターが導入された細胞および／またはその周囲の細胞の表現型の変化が誘導される。好ましくは、所望の遺伝子を有する本発明のベクターの有効量が投与されることにより、投与された骨格筋中の有意な数の細胞に遺伝子が導入され、該細胞の表現型の変化が誘導される。「有意な数の細胞」とは、本発明のベクターが、投与部位における標的骨格筋細胞の少なくとも約０．１％、好ましくは約１％以上、より好ましくは約５％以上、より好ましくは約１０％以上、最も好ましくは約２０％以上の細胞で遺伝子が導入されることを言う。
細胞への遺伝子導入は、当業者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡプロテクションアッセイ等により検出することができる。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ等による検出はｉｎ　ｓｉｔｕでも行い得る。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンブロット、免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、プルダウンアッセイ等により行うことができる。また、遺伝子導入の検出を容易にするため、発現させる蛋白質にタグを付加したり、レポーター遺伝子を発現するように組み込んでおくことも可能である。レポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、アルカリホスファターゼ、またはＧＦＰをコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに制限されない。
ベクターの投与量、並びに投与経路は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。好ましくは、投与するベクター濃度は約１０５ｐｆｕ／ｍｌから約１０１１ｐｆｕ／ｍｌの範囲内であるとよい。より好ましくは、投与するベクターの濃度は約１０７ｐｆｕ／ｍｌから約１０９ｐｆｕ／ｍｌの範囲内であるとよい。最も好ましくは、約１×１０８ｐｆｕ／ｍｌから約１×１０９ｐｆｕ／ｍｌの範囲内の濃度を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。
本発明のウイルス含有組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　センダイウイルスベクターの構築
受託番号Ｘ００１７３のＤＮＡ配列に基づくプライマー５’−ＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣ−３’（配列番号：１）及び５’−ＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号：２）を用いたＰＣＲにより、ヒトｃＤＮＡライブラリー（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から、ヒトＩＧＦ−Ｉオープン・リーディング・フレームを増幅した（Ｎａｔｕｒｅ，３０６，６０９−６１１（１９８３））。得られたＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩのＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、次に配列決定した。ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子の正確な配列を有する産物を、ＳｅＶ特異的転写制御シグナル配列を含有するプライマー５’−ＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣ−３’（配列番号：３）及び５’−ＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号：４）を用いて再増幅し、１５４０２ヌクレオチドの正確なＳｅＶ全長アンチゲノム（＋）センスＲＮＡを作製するため構築された親ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ｐＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶを得た。得られたｐＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶを、Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスｖＴＦ７−３に感染したＬＬＣＭＫ２細胞に形質転換した。Ｔ７により制御される全長組換えＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ　ＲＮＡゲノムを、共形質転換された各プラスミドから乾燥させたＮタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質でカプセル化した。４０時間のインキュベーションの後、回収されたウイルスを増幅するため、胚を有するニワトリ卵に形質転換された細胞を注射した。
［実施例２］　ｉｎ　ｖｉｔｒｏのｈＩＧＦ−Ｉ発現
ＩＧＦ−Ｉは、ラット細胞系（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，６６５３−６６６２（１９９７）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３５，４３１−４４０（１９９６））及びマウス細胞系（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１３８１０−１３８１７（１９８９））の両方において、増殖、分化、及び肥大と密接に関連していることが示されている。本発明者らは、組換えヒトＩＧＦ−Ｉが、ＳｅＶ媒介遺伝子導入を介して、Ｌ６細胞（新生ラット筋芽細胞系）に対する形態学的変化を誘導することができるか否かを調べた。新たに構築された、組換えヒトＩＧＦ−Ｉ（ｈＩＧＦ−Ｉ）遺伝子を含むＳｅＶ（ｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶと名付けた）、及びβ−ガラクトシダーゼをコードするＳｅＶ（ＬａｃＺ／ＳｅＶ）を用い、以下の条件について調査した。（１）上清中のＩＧＦ−Ｉ発現（ウェスタンブロッティング解析）、（２）上清中のＩＧＦ−Ｉ発現の動態（ＥＬＩＳＡアッセイ）、及び（３）Ｌ６細胞における形態学的変化。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究
Ｌ６細胞を、２０％のＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で培養し、筋管細胞への分化を抑制した。無血清ＤＭＥＭ中、又は無血清下でウイルスを感染させ、細胞を分化条件下で培養した。イムノブロッティングのため、１００μｌの上清を２倍容量の冷アセトンで１０μｌに濃縮し、１５〜２５％分解ゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。次にポリビニリデン−ジフロリド・メンブレン（ＤＡＩＩＣＨＩ　ＰＵＲＥ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，Ｔｏｋｙｏ）に転写した。抗ヒトＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＴＸ）を用いて、一次抗体反応を行い、二次反応は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体を用いた。増強化学発光（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を用いて複合体を可視化した。培養上清中のＩＧＦ−Ｉレベルを測定するためにＥＬＩＳＡアッセイを行った。方法は基本的に製造業者（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の推奨に従い実施した。
その結果、（１）多重度０．１、３及び４日間という条件下でｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶを感染させたＬ６細胞培養上清中において、１２〜１３ｋＤａの分子量を有する反応バンドを検出した（図１Ａ、レーン３及び４）。この分子種はＬａｃＺ／ＳｅＶ感染上清には存在せず、ｈＩＧＦ−Ｉは組換えＳｅＶから産生され、培養上清中に分泌されたことが証明された。
（２）図１Ｂは、ウイルス感染後のＬ６細胞上清中のＩＧＦ−Ｉ発現量を示している。多重度０．０５の感染条件下において、上清のＩＧＦ−Ｉ濃度は、感染の４８時間後に、細胞に対するＣ．Ｐ．Ｅ．を誘導することなく、２０３ｎｇ／ｍｌに増加し、その後９６時間後に４３５ｎｇ／ｍｌに増加した。０．５の多重度では、４８時間後に５６６ｎｇ／ｍｌ、９６時間後に９３５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉが培地中へ分泌された。多重度２．５の感染条件下では、１２時間後に３９ｎｇ／ｍｌ、２４時間後に４６３ｎｇ／ｍｌが検出された。ＬａｃＺ／ＳｅＶ感染上清にはＩＧＦ−Ｉが観察されなかった。これらの結果より、ＳｅＶ媒介遺伝子導入を介して、遺伝子産物が培地上清に分泌されることが示された。
（３）Ｌ６細胞系は、ＩＧＦ−Ｉを発現せず、その受容体を発現しているために、外因性のＩＧＦ−Ｉに対して応答性であり、肥大の誘導をもたらすことが知られている（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３５：４３１−４４８（１９９６））。組換えＩＧＦ−ＩによるＬ６の分化誘導能を調べた。Ｌ６細胞を２０％ＦＣＳを含有する培地で増殖させ、８０％コンフルエント時に、ウイルス媒介遺伝子導入を行い、無血清培地に置換し、あるいは、一定濃度のｈＩＧＦ−Ｉタンパク質を有する無血清培地条件下で培養した。全ての試料に、ホルモンの細胞表面への吸着を抑制するために５００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを入れた。４日後、ウイルス感染ｍ．ｏ．ｉ．（多重度）依存的に、細胞形態学の明白な差異が観察された（図２）。生じた筋管を、胚サブユニットに対するミオシンＨ鎖（ＭｙＨＣ）抗体（ＭＡｂＢＦ４５）で処理した。結合した抗体を、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ（登録商標）５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）結合体により可視化した。細胞の核を、ヨウ化プロピジウム染色により可視化した。０．０５の感染多重度のｈＩＧＦ−Ｉ濃度（図２Ａ及びＥ）、０．２の感染多重度細胞（図２Ｂ及びＦ）は、ｈＩＧＦ−Ｉを含まない無血清培養下の細胞（図２Ｄ及びＨ）よりも、大きな筋管を有し、筋繊維の中央に複数の核、及び筋管肥大、即ち筋管のサイズ及び幅の増大（図２Ａ、Ｂ、Ｅ、及びＦ）を示した。さらに、ウイルス感染により誘導された形態学的変化は、ＩＧＦ−Ｉタンパク質により誘導された筋管と形体的に一致していた（図２Ｃ及びＧ）。これらの結果から、ＳｅＶからの組換えｈＩＧＦ−Ｉの効力がＩＧＦ−Ｉタンパク質と一致していること、組換えｈＩＧＦ−Ｉが、インビトロにおいても生物学的機能を有しており、新生ラット筋芽細胞Ｌ６細胞の筋生成を誘導することが示された。
［実施例３］　ｉｎ　ｖｉｖｏのｌａｃＺレポーター遺伝子発現
ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇ）により、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雄、６週齢、１６０〜１８０ｇ）を麻酔した。後肢の毛を剃り、エタノールで洗浄後、前脛骨筋を露出させるため、皮膚を１．５ｃｍ切開した。ＬａｃＺレポーター遺伝子導入実験のため、２００μｌのＬａｃＺ／ＳｅＶ（５×１０ｅ７ｐｆｕ）を左前脛骨筋の筋腹に投与した。導入遺伝子発現はｘ−ｇａｌ染色により行った。ブピバカイン投与は、ベクター投与３日前に、２００μｌの０．５％ブピバカイン溶液を前脛骨筋に投与した。
その結果、ＬａｃＺ／ＳｅＶ投与の１週間後の残料において、ブピバカイン前処理された筋肉組織は、未処理の筋肉と比較して（図３Ｇ及びＨ）、高レベルのｘ−ｇａｌ染色像（図３Ａ及びＢ）を示した。ブピバカイン前処理筋肉においては、壊死繊維、好中球及びマクロファージの浸潤細胞の周辺に小さな筋繊維にｘ−ｇａｌ陽性像が観察された（図３Ｂ）。小さな筋繊維は、成体ラットの前脛骨筋におけるブピバカイン筋肉内注射及び／又はウイルス注射により誘導された、未熟な再生繊維と見なされる。Ｖｉｔａｄｅｌｌｏら（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：１１−１８（１９９４））は、３日後のブピバカイン処理筋肉は、抗ＭｙＨＣモノクローナル抗体（ＢＦ−４５）に対して染色される単核細胞及び小さな筋管が見られることを示し、損傷の１日後又は７日後よりも、３日目の方が、ｎａｋｅｄ　ＤＮＡ導入により発現される酵素活性の量が高いことも示している。ＳｅＶがＬａｃＺ遺伝子を導入することができる小さい陽性繊維は、骨格筋成熟途中の細胞分裂活性を有する筋繊維又は未熟な筋管であると見なされた。非ブピバカイン処理動物においては、ウイルス感染により誘導された壊死筋繊維領域は、ブピバカイン及びウイルスで処理されたものよりも、はるかに小さかった。陽性繊維の数は、ブピバカイン処理筋繊維よりも少なかったが、Ｘ−ｇａｌ標識筋繊維は非ブピバカイン処理筋繊維にも認められた（図３Ｈ）。形質導入された筋繊維周辺の細胞は、中心核を有しておらず、また図３Ｂに示された再生筋繊維よりもサイズが大きかった。このことは、これらの細胞が成熟筋繊維であるかもしれないことを意味している。以上を考え合わせると、形質導入された筋繊維は、成熟筋繊維である可能性がある。従って、ＳｅＶは、タンパク質をコードする遺伝子を、ラット成熟筋繊維に形質導入することができた。ｘ−ｇａｌ発現はウイルス投与の２週間後も観察された。ブピバカイン処理／未処理動物における陽性繊維のプロフィールは、前記の７日後の試料と一致していたが、陽性繊維数は減少していた（図３Ｃ、Ｄ、Ｉ、及びＪ）。ウイルス注射の３０日後、ブピバカイン処理動物においてのみ、Ｘ−ｇａｌ標識繊維が観察された（図３Ｅ及びＦ）。他方、ブピバカイン未処理動物においては、筋繊維にはＸ−ｇａｌ標識繊維が観察されなかったが、間質細胞には観察された（図３Ｋ及びＬ）。これらの結果より、ＳｅＶは、細胞分裂中の筋芽細胞、細胞分裂後の未熟筋管細胞のみならず成熟筋管にも感染することができた。
［実施例４］　ｉｎ　ｖｉｖｏのＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入
ｉｎ　ｖｉｔｒｏの高レベルのｈＩＧＦ−Ｉ発現、及びｉｎ　ｖｉｖｏのＳｅＶ媒介遺伝子導入による、再生筋繊維及び成熟筋繊維へのＬａｃＺ遺伝子の導入を確認したので、次にＳｅＶ媒介遺伝子導入によりラット骨格筋に導入されたｈＩＧＦ−Ｉが、筋繊維数の増加及び筋管肥大のようなラット骨格筋の増殖を促進することができるか否かを調べた。まず、前脛骨筋におけるｈＩＧＦ−Ｉの発現を、ウェスタンブロッティング解析により決定した。２００μｌの尿液、２×１０ｅ８ｐｆｕ（以前の実験よりも４倍高いｐｆｕ）のｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶを含有するウイルス溶媒（２００μｌ）、及び２×１０ｅ８ｐｆｕのＬａｃＺ／ＳｅＶを含有するウイルス溶媒（２００μｌ）を、成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの前脛骨筋に投与した。
投与１週間、２週間、及び３０日間後に、致死量のペントバルビタールナトリウムにより動物を安楽死させた。前脛骨筋を切開し、組織染色及びウェスタンブロッティングに供した。ラット筋肉内のヒトＩＧＦ−Ｉはウェスタンブロッティングにより判定した。１００μｇの筋肉組織を液体窒素中で凍結し、次に乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した。５００ｍｌの１Ｍ冷酢酸を各組織に添加し、混合物をホモジナイズし、次に２時間氷上に放置した。３０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を回収した。次に沈殿物に１Ｍ酢酸を加え再抽出した。２つの上清を合わせ、−７０℃で凍結し、凍結乾燥させ、３００μｌの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁した。５０μｌから１０μｌに溶液を濃縮した後、ウェスタンブロッティングに供した。
再生筋繊維の免疫組織染色は、液体窒素で冷却したイソペンタン中で、切開した前脛骨筋を迅速に凍結試料を用いた。得られた試料を１０μｍ厚に切り、リジン・コートしたスライドに固定した。再生筋繊維の免疫組織染色は、マウス抗胚ミオシンＨ鎖モノクローナル抗体（ＢＦ−４５）で一次抗体処理の後、室温にて、二次ビオチン化抗マウスＩｇＧ（１：１００；Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に１時間切片をインキュベートし、次にストレプトアビジン−ビオチン複合体（１：２００希釈；Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に１時間インキュベートし発色させることにより行った。０．０５％の３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド及び０．０１％過酸化水素を含有する０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）により、アビジン−ビオチン複合体を可視化した。その後、エオシンにより切片を対比染色した。モノクローナル抗体ＢＦ−４５は、Ｄｒ．Ｄ．Ｓｃｈｉａｆｆｉｎｏ（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：１１−１８（１９９４）），Ｐａｄｏｖａ，Ｉｔａｌｙにより開発され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より得た。ｈＩＧＦ−Ｉによる再生効果を調べるため、投与７日後に、抗ＢＦ−４５免疫陽性繊維の数を調べた。さらに、ｈＩＧＦ−Ｉの肥大効果を評価するため、３０日後に、筋肉の分裂繊維を計数した。
その結果、投与の１週間後の、ＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶで処理前脛骨筋試料は、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体に対して約８〜９ｋＤａの分子量を有するバンドを示した。この値（図４、レーン４及び５）は、培養上清中に観察されたものとは一致しない（図１Ａ）。ｉｎ　ｖｉｖｏでは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験で見られたｈＩＧＦ−Ｉの前駆体をさらなるプロテアーゼ切断により、７．７ｋＤａと報告されている成熟型ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｂｉｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，サイトカイン増殖因子　羊土社ｐｐ．１０４−１０５）になると考えられる。
次に、正常成熟筋肉におけるｈＩＧＦ−Ｉの効果を調べた。成体ラット（６週齢）の左前脛骨筋にｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）、右前脛骨筋にＬａｃＺ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）を投与し（グループ１）、左前脛骨筋のみにｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）を投与するか（ｎ＝１２）（グループ２）、左前脛骨筋にＬａｃＺ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）のみを投与、（ｎ＝１２）（グループ３）、又は尿液のみを両前脛骨筋に投与した（ｎ＝３）（グループ４）。
グループ１のＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ及びＬａｃＺ／ＳｅＶ両方のウイルス投与７日後の残料切片の投与部位の筋繊維には、筋周膜の浮腫形成、並びに細胞外空間における多数の単核食作用性マクロファージ、リンパ球、及びいくつかの好中球の浸潤と共に、多量の壊死による繊維分解が認められた（図５ｄ及びｇ）。壊死領域内の残りの正常サイズの筋繊維は、多数の酸性ホスファターゼ陽性マクロファージにより侵襲されていた（図５ｃ及びｈ）。しかし、尿液のみで処理された筋肉には、損傷は観察されず、筋肉内にほんのわずかなマクロファージの出現が見られた（図５ａ及びｂ）。以上を考え合わせると、ＳｅＶ導入は、感染筋肉において、損傷を引き起こし、壊死を誘導し、その後、壊死筋肉を除去するマクロファージ、リンパ球などの浸潤が起こる。しかし、壊死組織が残存していると再生が阻害されるため、食作用は、筋肉再生のためには極めて重要である。食作用後、筋前駆細胞又は衛星細胞が活性化され、その後筋芽細胞が増殖を開始することが知られている（実験医学　羊土社，４４４−４４８，３／２０００）。さらに、ブピバカイン処理３日後には、再生筋繊維の指標である、抗ＭｙＨＣモノクローナル抗体（ＢＦ−４５）陽性単核細胞及び小さな筋管からなることが報告されている（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：１１−１８（１９９４））。浸潤マクロファージ群中に中心核を有する極めて小さな筋繊維が、散在しているのが見られ、これらの細胞のＢＦ−４５に対する免疫反応を調べた。ＬａｃＺ／ＳｅＶ投与右前脛骨筋と比較して（図５ｉ）、ｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ投与左前脛骨筋では、ＢＦ−４５陽性の多数の再生筋繊維が観察された（図５ｆ）。図６に示されるように、グループ１の動物において、ＢＦ−４５免疫陽性繊維の数の平均は、ＬａｃＺ／ＳｅＶ（右）の４４６（ｎ＝４）に対し、ＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（左）の１，７２２（ｎ＝４）であった。尿液で処理された動物においては、ＢＦ−４５免疫陽性筋繊維は存在しなかった（グループ４、図５ｃ）。
ウイルスベクター投与１４日後には、ｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ及びＬａｃＺ／ＳｅＶの両方で処理された筋肉中のマクロファージの数は劇的に減少していた（図７）（グループ１、２、及び３）。ＬａｃＺ／ＳｅＶ処理筋肉においては、中心核を有する中程度の同サイズの筋繊維が増加した（図７Ｃ）。他方、ＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ処理筋肉においては、散在するマクロファージと共にわずかな壊死繊維が残存しており（データは示していない）、小サイズの繊維を含む様々なサイズの筋繊維が観察された（図７Ｂ）。これは、継続的な新生繊維形成を示している。ｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ、ＬａｃＺ／ＳｅＶのいずれで処理された筋肉においても、繊維芽細胞の浸潤及びそれによる繊維化は観察されなかった。ウイルス導入７日後のマクロファージを中心とする間質細胞が占める空間は、再生した筋繊維に、ほぼ完全に置き換わっていることが見出された（図７Ｂ及びＣ）。
ウイルスベクター投与の３０日後、グループ１の動物の処理筋肉において、筋肉のサイズはほぼ正常かつ均一に戻った（図８及び９）。グループ１のｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ処理筋肉には、中サイズの筋繊維のクラスターが、正常サイズの筋繊維の中に散在していた（データは示していない）。グループ１の動物のｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ処理筋肉においては、ＬａｃＺ／ＳｅＶ処理筋肉と比較して、筋繊維総数が１７％増加していた（ｐ＜０．０３、ｎ＝４）（図９）。グループ３及び４においては、左右の筋肉の繊維数に、統計的有意差は存在しなかった（データは示していない）。さらに、肥大の結果としてよく見られる分裂繊維の数が増加していた。グループ１の動物のｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ処理筋肉においては、ＬａｃＺ／ＳｅＶ処理筋肉と比較して、分裂繊維数の平均が６．１倍増加していた（図９）。これらのデータは、この分裂現象が、ｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ処理筋繊維の総数の増加を誘導した可能性を示している。
成熟骨格筋に対するＩＧＦ−Ｉの効果を示した報告はいくつかなされており、Ａｄａｎｓ及びＭｃＣｕｅ（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４（５）；１７１６−１７２２（１９９８））は、正常ラット前脛骨筋におけるＩＧＦ−Ｉタンパク質の局所注入の効果を調べた。ＩＧＦ−Ｉ注入筋肉において、筋肉重量、全タンパク質、及び全ＤＮＡの有意な増加が見られた。しかし、彼らは、筋繊維の総数の増加は報告していない。Ｂａｒｔｏｎ−Ｄａｖｉｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：１５６０３−１５６０７（１９９８））は、ＡＡＶベクターを用いて、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を高齢ラットに導入した。繊維再生及び筋肉肥大を示したが、再生筋繊維数増加は見られなかった。本発明者らの研究においては、過剰発現したｈＩＧＦ−Ｉの効果により、正常成体筋肉において、再生繊維、筋肥大繊維、及び全筋繊維数の有意な増加が観察された。観察された新生筋繊維形成は、ＳｅＶベクターにより達成された高いＩＧＦ−Ｉ発現レベルによることが考えられる。
［実施例５］　精製ＬａｃＺ−ＳｅＶ／ｄＦ及びＬａｃＺ−ＳｅＶのマウス足筋肉における遺伝子発現の比較
発育鶏卵漿尿液由来の付加型センダイウイルスベクター（ＬａｃＺ−ＳｅＶ）、及びＬＬＣＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞由来の精製したＦ欠失型ＬａｃＺセンダイウイルスベクター（ＬａｃＺ−Ｓｅｖ／ｄＦ）の足筋肉内投与（投与量は４　ｘ　１０７ＣＩＵ／ｈｅａｄ）における遺伝子発現を、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて筋肉内投与法により比較検討した。
６週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス１８匹（日本チャールス・リバー株式会社）を実験に供した。動物は６週齢時に入荷、２日間の馴化期間の後、各群６匹として、（１）未処置、（２）ＬａｃＺ−ＳｅＶ（４ｘ１０７ＣＩＵ／ｈｅａｄ）、（３）ＬａｃＺ−ＳｅＶ／ｄＦ（４ｘ１０７ＣＩＵ／ｈｅａｄ）の３群に分けた。各ウイルス液は、エーテル麻酔下で、２９Ｇシリンジを用い、足を固定し、前脛骨筋両側に１匹あたり２ｘ１０８ＣＩＵ／ｍｌ、１００μｌ　ｘ２箇所を投与した。投与後、約１分筋肉を揉みほぐした。
投与３日後に、エーテル麻酔下で解剖し、投与（右）側足筋肉を採材、ＬａｃＺアッセイに供した。
ＬａｃＺの定量方法は下記の通り行った。まず、足筋肉を摘出（２．０ｍｌマイクロチューブ）し、液体窒素によって凍結した。次いで、５００μｌ　Ｌｙｓｉｓ　ｓｏｌ．を添加（筋肉重量約５００ｍｇ）し、氷冷中でホモジナイズ（ＭｕｌｔｉＰｒｏ）した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ　ｘ　１５分）し、測定用チューブに上清１０μｌ採取した。次に、７０μｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ　１μｌ＋Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　９９μｌ＝１００μｌ　Ｋｉｔ；Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ−Ｐｌｕｓ，ＴＲＯＰＩＸ，Ｃａｔ　ｎｏ．２５００６５）を加え、遮光し室温で３０〜６０分放置した。１００μｌ　Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを加えルミノメーターにて測定した。
投与３日後の足筋肉における遺伝子発現（定量）を比較した結果、ＬａｃＺ−ＳｅＶ／ｄＦおよびＬａｃＺ−ＳｅＶは未処理群に比べ明らかに強い発現を示した（図１０）。ＬａｃＺ−ＳｅＶ／ｄＦおよびＬａｃＺ−ＳｅＶを比較した場合、多少バラツキはあるもののほぼ同等の発現であることが分かった。これは筋肉内での二次感染の影響が低いためであると考えられる。筋肉疾患を遺伝子治療の対象とした場合、Ｆ欠失型と付加型とでは遺伝子発現に差がないことから同等の効果が期待できる。
産業上の利用の可能性
本発明により、パラミクソウイルスベクターを利用して極めて高い効率で骨格筋へ遺伝子を導入することが可能となった。これにより、骨格筋を標的とした遺伝子治療、特に、全身性疾患及び神経筋障害のための基盤技術が提供された。また、本発明のパラミクソウイルスベクターを利用した、インスリン様増殖因子をコードする遺伝子の骨格筋への導入は、筋繊維の萎縮、減少、及び変性の治療への応用が期待される。これにより神経筋障害のための現在の治療法が強化されるであろう。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのｈＩＧＦ−Ｉ発現を示す写真および図である。（Ａ）ウイルス感染Ｌ６細胞の培養上清中のｈＩＧＦ−Ｉの発現を示す写真。括弧内に記載された条件下での培養上清からの試料を、ウェスタンブロットで分析した（１＝ウイルスなし、２＝ＬａｃＺ／ＳｅＶ（ｍｏｉ＝０．１、３日間）、３＝ＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（ｍｏｉ＝０．１、３日間）、４＝ＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（ｍｏｉ＝０．１、４日間））。（Ｂ）ｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ感染Ｌ６細胞に由来するｈＩＧＦ−Ｉの時間及びｍｏｉに依存的な発現を示すグラフ。異なるｍｏｉで感染した細胞由来の上清を、異なる時間に採取し、ＥＬＩＳＡキットを用いてｈＩＧＦ−Ｉ量をアッセイした。
図２は、ＳｅＶ媒介ｈＩＧＦ−Ｉは、Ｌ６細胞の筋原分化及び肥大を増強することを示す写真である。
無血清培地（分化培地）で４日間培養された対照細胞。ウイルス感染細胞は、ｍｏｉ＝０．０５又は０．２のいずれかで行われ、無血清培地で４日間培養された。固定後、筋管をミオシンＨ鎖胚サブユニットに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ　ＢＦ−４５）で処理し、その他の細胞を核染色にかけた。ウイルス感染細胞は、ｍｏｉ＝０．０５では中程度の筋管肥大を示し、ｍｏｉ＝０．２では、血清除去のみの条件で培養された場合よりも、はるかに明確な筋管肥大を示す。ウイルス感染細胞には核組織が認められ、筋繊維の中央に集合していた。
図３は、ｉｎ　ｖｉｖｏの骨格筋へのＳｅＶの形質導入可能性を示す写真である。
筋壊死剤（ブピバカイン）による前処理の有／無の条件下で、成熟ラットの前脛骨筋に、ＬａｃＺレポーター遺伝子を含む組換えＳｅＶ（５×１０ｅ７ｐｆｕ）（ＬａｃＺ／ＳｅＶ）を２００μｌ注射した。以下のような日数の後、筋肉を切開し、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。Ａ及びＢ：ブピバカイン（７日）、Ｃ及びＤ：ブピバカイン（１４日）、Ｅ及びＦ：ブピバカイン（３０日）、Ｇ及びＨ：ブピバカインなし（７日）、Ｉ及びＪ：ブピバカインなし（１４日）、Ｋ及びＬ：ブピバカインなし（３０日）。
図４は、ウイルス注射の７日後の前脛骨筋におけるｈＩＧＦ−Ｉ発現を示す写真である。抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体によるウェスタンブロッティング解析。ＬａｃＺ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）又はｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）のいずれかをそれぞれ２００μｌ、前脛骨筋に注射した。７日後、切開された凍結筋組織１００μｇから、３００μｌの組織抽出溶液を得た。５０μｌ（１６．７μｇ組織等量）中のタンパク質を冷アセトンで沈殿させ、次に抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体によるウェスタンブロッティング解析にかけた。（Ｍ：マーカータンパク質、１：未処理、２：ＬａｃＺ／ＳｅＶ（＃１動物）、３：ＬａｃＺ／ＳｅＶ（＃２動物）、４：ｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（＃３動物）、５：ｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（＃４動物））。
図５は、ウイルス注射の７日後の前脛骨筋におけるｈＩＧＦ−Ｉ発現を示す写真である。前脛骨筋の再生。ＬａｃＺ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）及びｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）を各２００μｌ、それぞれ右又は左の前脛骨筋に注射した。切開された筋肉の横断切片を、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）（ａ、ｄ、及びｇ）、マクロファージを検出するための酸性ホスファターゼ活性（ｂ、ｅ、及びｈ）、及びＢＦ−４５（ｃ、ｆ、及びｉ）で処理した。白及び黒の矢印は、それぞれマクロファージ及びＢＦ−４５陽性細胞を示す。
図６は、ウイルス注射の７日後の前脛骨筋におけるｈＩＧＦ−Ｉ発現を示すグラフである。胚ＭｙＨＣを発現する筋繊維の数。胚ＭｙＨＣ陽性細胞の総数を計数し（ｎ＝４）、結果を平均±ＳＤとして表した（ｎ＝４）。アステリスクは、対比較に関するｐ＜０．０１を表す（スチューデントｔ検定）。
図７は、ウイルス注射の１４日後の前脛骨筋の再生を示す写真である。ＬａｃＺ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）及びｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（２×１０ｅ８ｐｆｕ）を各２００μｌ、それぞれ右又は左の前脛骨筋に注射した。切開された筋肉横断切片をヘマトキシリン・エオシンで染色した。（Ａ：尿膜腔液のみ、Ｂ：ＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ（左）、Ｃ：ＬａｃＺ／ＳｅＶ（右））。
図８は、ウイルス注射の３０日後の前脛骨筋の再生を示す写真である。切片中に炎症反応はほぼ全く見られなかった。ＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ処理された筋肉は、肥大による分裂現象を示した（図８ａ及びｂ）。分裂の位置は、矢印により示されている。ＬａｃＺ／ＳｅＶで処理された再生筋繊維は、ほぼ正常に回復した（図８ｃ）。
図９は、ウイルス注射の３０日後の前脛骨筋の再生を示すグラフである。筋繊維数（白カラム）及び分裂繊維数（黒カラム）に対するｈＩＧＦ−Ｉ発現の効果。グループ１の各動物のＬａｃＺ／ＳｅＶ処理前脛骨筋の繊維総数を、ｈＩＧＦ−Ｉ／ＳｅＶ処理に対する対照とした（値を１と定義）（対照の値に対する相対値で表されている）（白カラム）。相対値の平均（ｎ＝４）をプロットした（±ＳＤ）。単一のアステリスクは対比較に関するＰ＜０．０３を表す（スチューデントｔ検定）。分裂繊維を計数し、結果を平均±ＳＤ（ｎ＝４）で表した。二重のアステリスクは対比較に関するＰ＜０．０１を表す（スチューデントｔ検定）。
図１０は、マウス足筋肉における遺伝子導入の比較（３日後）を示す図である。タイターは、４ｘ１０７　ＣＩＵ／ｈｅａｄ（用量１００μｌ、回数２回）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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