(57)【要約】本発明は、天然のＭＴ４−ＭＭＰ、または可溶化ＭＴ４−ＭＭＰに対して反応するモノクローナル抗体に関する。天然のＭＴ４−ＭＭＰの触媒ドメインを特異的かつ効率的に認識できるモノクローナル抗体およびこれを含むヒト型キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化抗体と、これらを用いたＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質の検出および定量方法を提供する。さらに本発明は、これらの抗体を用いた、炎症、癌などのＭＴ４−ＭＭＰが関与する各種疾病の診断方法、診断薬および治療薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインが、配列番号６で示されるアミノ酸配列の１２８〜２９６番目からなるアミノ酸配列である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＫＭ２８９５、ハイブリドーマＫＭ２８９６、ハイブリドーマＫＭ２８９７およびハイブリドーマＫＭ２９０４からなる群から選ばれるハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体である、請求項１または２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項５】
ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ２８９５、ハイブリドーマＫＭ２８９６、ハイブリドーマＫＭ２８９７およびハイブリドーマＫＭ２９０４からなる群から選ばれるハイブリドーマである、請求項４記載のハイブリドーマ。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体、抗体断片から選ばれるモノクローナル抗体である、請求項６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ヒト化抗体がヒト型キメラ抗体である請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域と、ヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）およびＬ鎖Ｃ領域とからなる請求項８に記載されたヒト型キメラ抗体。
【請求項１０】
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、モノクローナル抗体ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４から選ばれるモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のヒト型キメラ抗体。
【請求項１１】
ヒト化抗体が相補性決定領域移植抗体（ＣＤＲ移植抗体）である請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域相補性決定領域と、ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＣ領域およびＶ領域フレームワーク領域とからなる請求項１１に記載のＣＤＲ移植抗体。
【請求項１３】
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、モノクローナル抗体ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４から選ばれるモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のＣＤＲ移植抗体。
【請求項１４】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体からなる群より選ばれる抗体である請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含む請求項１４記載の一本鎖抗体。
【請求項１６】
一本鎖抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、モノクローナル抗体ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４から選ばれるモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請求項１５記載の一本鎖抗体。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含む請求項１４記載のジスルフィド安定化抗体。
【請求項１８】
ジスルフィド安定化抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、モノクローナル抗体ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４から選ばれるモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、請求項１７記載のジスルフィド安定化抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体が、薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合させた融合抗体である、請求項１〜３、６〜１８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
請求項１〜３、６〜１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いてＭＴ４−ＭＭＰ触媒サブユニットを免疫学的に検出する方法。
【請求項２１】
免疫学的に検出する方法が、免疫学的測定法、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色法、免疫細胞染色法およびドットブロッティングからなる群から選ばれる方法である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜３、６〜１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒サブユニットを免疫学的に定量する方法。
【請求項２３】
免疫学的に定量する方法が、免疫学的測定法、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色法、免疫細胞染色法およびドットブロッティングからなる群から選ばれる方法である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜３、６〜１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患の診断方法。
【請求項２５】
ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患が、慢性関節リウマチである請求項２４記載の診断方法。
【請求項２６】
請求項１〜３、６〜１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む、ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患の診断薬。
【請求項２７】
ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患が、慢性関節リウマチである請求項２６記載の診断薬。
【請求項２８】
請求項１〜３、６〜１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む、ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患の治療薬。
【請求項２９】
ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患が、慢性関節リウマチである請求項２８記載の治療薬。
【請求項３０】
請求項１〜３、６〜１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む試薬。
【請求項３１】
請求項３０記載の試薬を含むＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患を検出するキット。
【請求項３２】
ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患が慢性関節リウマチである請求項３１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインに特異的に反応するモノクローナル抗体に関する。さらに、本発明は、該モノクローナル抗体を用いた、炎症、癌などのＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患の診断方法、診断薬、治療薬、試薬およびキットに関する。
背景技術
マトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）は結合組織性細胞、上皮細胞、白血球、癌細胞等の非常に多岐にわたる細胞から生産され、細胞外マトリックスの構成蛋白質を分解する酵素である。ＭＭＰは生理的条件下で発生、分化、組織形成、組織修復等の生命維持に重要な現象に関わっていると共に、関節炎、糸球体腎炎等の組織破壊を伴う様々な疾患や、癌細胞の転移浸潤にも関与していると考えられている。ＭＭＰは活性中心部にＺｎ２＋を有する、非活性な前駆体プロペプチドとして生産され、後に細胞外で活性化される等の特徴を示すプロテアーゼ群であり、これまでに２０種を超すＭＭＰが報告されている［Ｊ．Ｇｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１８，１１３５−１１４９（２０００）］。
膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ−ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＴ−ＭＭＰ）は最近相次いで発見されたＭＭＰ遺伝子ファミリーのメンバーであり、これまでに６種（ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＴ４−ＭＭＰ、ＭＴ５−ＭＭＰ、ＭＴ６−ＭＭＰ）の存在が報告されている。いずれもＭＭＰに共通のプロペプチドドメイン、活性ドメイン、ヘモペキシンドメイン構造を持ち、さらに、Ｃ末端側にＭＴ−ＭＭＰ以外のＭＭＰにはない細胞膜貫通ドメインと予想される疎水性領域を有する。機能については不明な点が多いが、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）、ＭＴ２−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１５）、ＭＴ３−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１６）、ＭＴ５−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２４）は比較的活性ドメインのアミノ酸配列でのホモロジーが高く、また、いずれも前駆体ＭＭＰ−２を成熟体ＭＭＰ−２に変換する活性を有することが報告されており［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１，６０２−６０８（１９９５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，８９２５−８９３２（１９９９）］、ＭＭＰカスケードの上流に位置することも考えられている。一方、ＭＴ４−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１７）、ＭＴ６−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２５）はアミノ酸配列での高い相同性を有するが、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＴ５−ＭＭＰとは相同性が低い。したがって、ＭＴ４−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１７）、ＭＴ６−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２５）は前駆体ＭＭＰ−２の活性化を引き起こさないと考えられている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１４０４６−１４０５５（２０００），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｃｓ．，６０，８７７−８８２（２０００）］。また、ＭＴ４−ＭＭＰおよびＭＴ６−ＭＭＰは膜貫通ドメインと予想された疎水性領域を持つにもかかわらず、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＴ５−ＭＭＰに認められる２０〜２３アミノ酸から構成される細胞質内ドメイン構造を欠いており、ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧＰＩ）アンカー型の存在様式を持つことも報告されている。したがって、ＭＴ４−ＭＭＰおよびＭＴ６−ＭＭＰは公知のＭＭＰまたはＭＴ−ＭＭＰとはアミノ酸配列だけではなく、存在様式も異なっていると考えられる［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，３４２６０−３４２６６（１９９９），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４８０，１４２−１４６（２０００）］。
ＭＴ４−ＭＭＰはこれまでにノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの発現解析により、ヒトでは白血球に多く発現が認められるが、他の組織では脳、結腸、卵巣、精巣に限局して発現していることが明らかになった［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，９４４−９４９（１９９６）］。また、様々な腫瘍細胞株、正常繊維芽細胞株にもｍＲＮＡの発現が認められることが報告されており［Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．，１８，１４５−１４８（１９９９）、ＷＯ００／１８８０５］、他のＭＭＰと同様に組織破壊を伴う様々な疾患や、癌細胞の転移浸潤にも関与していると考えられている。
細胞や組織における特定の蛋白質の機能や発現を調べる手段として、抗原特異性が高くアフィニティの高い抗体は蛋白質の機能解析においてきわめて重要である。ＭＴ４−ＭＭＰに対する抗体としては、配列番号６に記載されたアミノ酸配列の３３５番目から５２６番目に相当するヘモペキシンドメインを含む３２１番目から５５０番目のアミノ酸配列を免疫原として作製されたモノクローナル抗体が知られている［ＷＯ００／１８８０５］。該抗体は、ウェスタンブロッティングなどの蛋白質変性条件下での検出、ＭＴ４−ＭＭＰトランスフェクタントのように大量に蛋白質を発現している細胞への検出には有用である。しかしながら、該抗体は通常の細胞株あるいは白血球上に発現している天然のＭＴ４−ＭＭＰ、または可溶化ＭＴ４−ＭＭＰに対して反応性が非常に弱い。
発明の開示
本発明の目的は、細胞株あるいは白血球上に発現している天然のＭＴ４−ＭＭＰ、組織や血清中に存在する可溶化ＭＴ４−ＭＭＰに対して反応性を有するモノクローナル抗体を提供することにある。本発明のモノクローナル抗体は、ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患の診断または治療に有用である。
本発明は、以下の（１）〜（３２）に関する。
（１）  ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体。
（２）  ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインが、配列番号６で示されるアミノ酸配列の１２８〜２９６番目からなるアミノ酸配列である、上記（１）記載のモノクローナル抗体。
（３）  モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＫＭ２８９５、ハイブリドーマＫＭ２８９６、ハイブリドーマＫＭ２８９７およびハイブリドーマＫＭ２９０４からなる群から選ばれるハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体である、上記（１）または（２）記載のモノクローナル抗体。
（４）  上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
（５）  ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ２８９５、ハイブリドーマＫＭ２８９６、ハイブリドーマＫＭ２８９７およびハイブリドーマＫＭ２９０４からなる群から選ばれるハイブリドーマである、上記（４）記載のハイブリドーマ。
（６）  モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（７）  遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体、抗体断片から選ばれるモノクローナル抗体である、上記（６）に記載のモノクローナル抗体。
（８）  ヒト化抗体がヒト型キメラ抗体である上記（７）に記載のモノクローナル抗体。
（９）  上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域と、ヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）およびＬ鎖Ｃ領域とからなる上記（８）に記載のヒト型キメラ抗体。
（１０）  Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、モノクローナル抗体ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４から選ばれるモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、上記（９）に記載のヒト型キメラ抗体。
（１１）  ヒト化抗体が相補性決定領域移植抗体（ＣＤＲ移植抗体）である上記（７）に記載のモノクローナル抗体。
（１２）  上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域相補性決定領域と、ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＣ領域およびＶ領域フレームワーク領域とからなる上記（１１）に記載のＣＤＲ移植抗体。
（１３）  Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、モノクローナル抗体ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４から選ばれるモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、上記（１２）に記載のＣＤＲ移植抗体。
（１４）  抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体からなる群より選ばれる抗体である上記（７）に記載のモノクローナル抗体。
（１５）  上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含む上記（１４）記載の一本鎖抗体。
（１６）  一本鎖抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、モノクローナル抗体ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４から選ばれるモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、上記（１５）記載の一本鎖抗体。
（１７）  上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含む上記（１４）記載のジスルフィド安定化抗体。
（１８）  ジスルフィド安定化抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、モノクローナル抗体ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４から選ばれるモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、上記（１７）記載のジスルフィド安定化抗体。
（１９）  モノクローナル抗体が、薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合させた融合抗体である、上記（１）〜（３）、（６）〜（１８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（２０）  上記（１）〜（３）、（６）〜（１９）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いてＭＴ４−ＭＭＰ触媒サブユニットを免疫学的に検出する方法。
（２１）  免疫学的に検出する方法が、免疫学的測定法、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色法、免疫細胞染色法およびドットブロッティングからなる群から選ばれる方法である、上記（２０）記載の方法。
（２２）  上記（１）〜（３）、（６）〜（１９）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒サブユニットを免疫学的に定量する方法。
（２３）  免疫学的に定量する方法が、免疫学的測定法、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色法、免疫細胞染色法およびドットブロッティングからなる群から選ばれる方法である、上記（２２）記載の方法。
（２４）  上記（１）〜（３）、（６）〜（１９）のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患の診断方法。
（２５）  ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患が、慢性関節リウマチである上記（２４）記載の診断方法。
（２６）  上記（１）〜（３）、（６）〜（１９）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む、ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患の診断薬。
（２７）  ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患が、慢性関節リウマチである上記（２６）記載の診断薬。
（２８）  上記（１）〜（３）、（６）〜（１９）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む、ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患の治療薬。
（２９）  ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患が、慢性関節リウマチである上記（２８）記載の治療薬。
（３０）  上記（１）〜（３）、（６）〜（１９）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む試薬。
（３１）  上記（３０）記載の試薬を含むＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患を検出するキット。
（３２）  ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患が慢性関節リウマチである上記（３１）記載のキット。
本発明のＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体としては、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体であればいかなるものでもよい。好ましくは、配列番号６で示されるＭＴ４−ＭＭＰのアミノ酸配列の１２８〜２９６番目からなるＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体があげられる。
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、および抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体をあげることができる。
すなわち、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン蛋白質、あるいはＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン蛋白質のアミノ酸配列［ＷＯ００／１８８０５］に基づいて化学合成したペプチドなどを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性をもつ抗体生産細胞を誘導し、さらに、それと骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマを培養するか、あるいは該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインモノクローナル抗体を取得することができる。
本発明の遺伝子組換え抗体は、上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものである。遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体および抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。本発明におけるヒト化抗体とは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ；相補性決定領域；以下、ＣＤＲと記す）移植抗体を包含する。
本発明の抗体断片は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインに特異的に結合するＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇの略）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ；以下、ＳｃＦｖと称す）およびジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ；以下、ｄｓＦｖと称す）を包含する。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体可変領域重鎖（以下、ＶＨと称す）および可変領域軽鎖（以下、ＶＬと称す）とヒト抗体の定常領域重鎖（以下、ＣＨと称す）およびヒト抗体の定常領域軽鎖（以下、ＣＬと称す）とからなる抗体を意味する。
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターに、該ｃＤＮＡをそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、該宿主細胞に本発明のヒト型キメラ抗体を発現させることにより、製造することができる。
本発明のヒト型キメラ抗体のＣ領域の構造としては、いずれのイムノグロブリン（Ｉｇ）クラスに属するものでもよいが、ＩｇＧ型、さらにはＩｇＧ型に属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のイムノグロブリンのＣ領域が好ましい。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＣＤＲ配列でそれぞれ置換した抗体を意味する。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインに特異的に結合する、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列で任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列をそれぞれ置換したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにｃＤＮＡをそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、該宿主細胞に本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させることにより製造することができる。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣ領域の構造としては、いずれのイムノグロブリン（Ｉｇ）クラスに属するものでもよいが、ＩｇＧ型、さらにはＩｇＧ型に属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のイムノグロブリンのＣ領域が好ましい。
Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成された、分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明のＦａｂは、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合する抗体をパパイン処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ断片をコードするＤＮＡを宿主細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、該宿主細胞に本発明のＦａｂを発現させることにより製造することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ間のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明のＦａｂ’は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合する抗体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを宿主細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、該宿主細胞に本発明のＦａｂ’を発現させることにより製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を酵素トリプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合する抗体をトリプシン処理して得ることができる。または、該抗体のＦ（ａｂ’）２断片をコードするＤＮＡを宿主細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、該宿主細胞に本発明のＦ（ａｂ’）２を発現させることにより製造することができる。
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明のｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、本発明のモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
本発明のｓｃＦｖは、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合する抗体を生産するハイブリドーマまたは形質転換体よりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、一本鎖抗体発現ベクターを構築したのち該ｃＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入して発現させることにより、製造することができる。
ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）は、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のジスルフィド安定化抗体に含まれるＶＨあるいはＶＬはモノクローナル抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のいずれをも用いることができる。
本発明のジスルフィド安定化抗体は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合する抗体を生産するハイブリドーマまたは形質転換体よりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、該ｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入し発現させることにより、製造することができる。
融合抗体は、上述の抗体に薬剤を化学的あるいは遺伝子工学的に結合させたものをいう。
薬剤としては、放射線同位元素、蛋白質、低分子などいかなるものでもよい。融合抗体を診断薬として使用する場合の薬剤としては、免疫学的測定法で用いられる標識体があげられる。標識体としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル、ロフィンなどの発光物質、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどの蛍光物質などがあげられる。
本発明の融合抗体は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合する抗体を薬剤と化学的に結合させることにより製造することができる。また、薬剤が蛋白質であるときの融合抗体については、抗体をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、該ｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入して発現させることにより製造することができる。
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
１．抗ＭＴ４−ＭＭＰ（もしくはＭＭＰ−１７と表記する）触媒ドメインモノクローナル抗体の作製方法
（１）抗原の調製
抗原としては、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを細胞内に発現した細胞あるいはその画分、またはＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン蛋白質もしくはＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの部分蛋白質あるいは該蛋白質と抗体のＦｃ部分との融合蛋白質などがあげられる。
ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを発現した細胞としては、Ｕ９３７（ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＴＨＰ−１（ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、Ｊｕｒｋａｔ（ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）等などをあげることができる［ＷＯ００／１８８０５］。該細胞をそのまま抗原とすることもできるが、後述する通常の酵素の分離、精製法を用いて該細胞から分画したＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを抗原とすることもできる。
さらに、上述の細胞から、遺伝子工学的手法を用いて、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインをコードするＤＮＡを取得し、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン蛋白質、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン部分蛋白質、あるいは該蛋白質と抗体のＦｃ部分との融合蛋白質などを発現させて抗原とすることもできる。以下にその方法を述べる。
ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインをコードするＤＮＡを取得するために、ＷＯ００／１８８０５に記載されたｃＤＮＡ、あるいは上述したＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを発現した細胞より、常法［モレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプルメント１〜３８（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８；以下、カレント・プロトコールズと略す）］によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
すなわち、ｍＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡをクローニングベクターに組み込み宿主細胞に導入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより目的とするｃＤＮＡを含有する形質転換体を選択することによりＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインをコードするＤＮＡを取得することができる。
ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを発現した細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、グアニジン／セシウムクロライド法やグアニジンチオシアネート法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］などがあげられる。また、全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴｄＴセルロースなどを用いたカラム法またはバッチ法などがあげられる。また、ファーストトラック・ｍＲＮＡ・アイソレーション・キット（インビトロジェン社）、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ・ピュリフィケーション・キット（ファルマシア社）などのキットを用いてｍＲＮＡを調製することもできる。
上述で得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する方法としては、オカヤマバーグ法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１（１９８２）］やグブラーホフマン法［Ｇｅｎｅ，２５，２６３（１９８３）］等があげられる。また、スーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング（キブコＢＲＬ社）、ザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット（ストラタジーン社）などのキットを用いてｃＤＮＡを合成することもできる。
ｃＤＮＡを組み込むためのクローニングベクターとしては、宿主細胞内で自律複製可能で該ｃＤＮＡを安定保持できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクターなどいずれでもよい。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラタジーン社、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ  ＩＩ（ストラタジーン社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社）、λＥＸＣｅｌｌ（ファルマシア社）、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（ファルマシア社）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］、ｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＡＭｏ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３），別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）］等をあげることができる。
宿主微生物としては，大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラタジーン社，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＹＩＯ８８［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＹＩＯ９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４２７−４４８（１９８１）］，ＪＭ１０５［Ｇｅｎｃ，３８，２７５（１９８５）］，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＯＬＲＴＭＳｔｒａｉｎ［ストラタジーン社より市販］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２（モレキュラー・クローニング第２版）等が用いられる。
ｃＤＮＡを上述のクローニングベクターに組み込み、該クローニングベクターを宿主細胞に導入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
該クローニングベクターがプラスミドの場合には、エレクトロポレーション法あるいはカルシウムクロライド法などにより宿主細胞に導入する。該クローニングベクターがファージの場合には、インビトロパッケージング法などにより宿主細胞に導入する。
上述で取得されたｃＤＮＡライブラリーから、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインをコードするＤＮＡを含む形質転換株については、例えばＷＯ００／１８８０５に掲載されたＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインをコードするＤＮＡの塩基配列を基にプローブを作製して、蛍光物質、放射線、酵素などで該プローブをラベル化し、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションなどを行うことにより、ハイブリダイズする形質転換株を選択することができる。
上述で取得されたＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインをコードする全長あるいはその部分断片ｃＤＮＡを適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組み換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することにより得られたＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン発現細胞を、適当な培地中で培養することにより細胞内あるいは培養上清中にＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として生産することができる。
宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであれば、いずれでもよい。細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のエシェリヒア属、バチルス属等の細菌が例示される。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等が例示される。動物細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞等が例示される。昆虫細胞としては、Ｓｆ９、Ｓｆ２１（ファーミンジェン社）、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（インビトロジェン社）等が例示される。
本発明のＤＮＡを導入するベクターとしては、該ＤＮＡを組み込むことができ、宿主細胞で発現できるものであればいかなるベクターでも用いることができる。細菌、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、場合によってはプロモーターの制御配列より構成されているのが好ましいが、例えば、市販のｐＧＥＸ（ファルマシア社）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社）などが例示される。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）等、いずれの方法も用いられる。酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等が用いられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等、いずれの方法も用いられる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］，ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］等が用いられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいかなるものを用いてもよいが、例えば、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０あるいはメタロチオネインのプロモーター等があげられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターとともに用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等、いずれの方法も用いられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ（サプルメント１〜３４）、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。すなわち、以下に述べる組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得たのち、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質発現昆虫細胞を取得する。
遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社）等が用いられる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）などが用いられる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等が用いられる。
また、ファーミンジェン社バキュロゴールドスターターキットなどを用いて組み換えバキュロウィルスを作製したのち、前述したＳｆ９、Ｓｆ２１あるいはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ等の昆虫細胞に該組み換えウィルスを感染させることにより蛋白質を生産させることもできる［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）］。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産、融合蛋白質発現等が開発されており、いずれの方法も用いることができる。例えば、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて行うことができる。
融合させる蛋白質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合蛋白質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる［山川彰夫  実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）］。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい（モレキュラー・クローニング第２版）。培養は、通常振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下、１５〜４０℃で１６〜９６時間行う。培養期間中、ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養中は必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３５〜３７℃で３〜７日間行い、培養中は必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地［ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社］、Ｓｆ９００ＩＩＳＦＭ［ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃｓ）社］、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社］等が用いられる。培養は、２５〜３０℃で１〜４日間行い、培養中は必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記において、動物細胞および昆虫細胞の培地に血清を添加していない培地で培養が可能な場合には、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質の精製が容易になるため、血清無添加の培地を用いることが好ましい。
ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として宿主細胞内に蓄積された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離し、水系緩衝液にけん濁後、超音波法、フレンチプレス法などにより細胞を破砕し、その遠心分離上清に該蛋白質を回収する。
さらに、細胞内に不溶体を形成した場合には、不溶体を蛋白質変性剤で可溶化後、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、或いは透析し、蛋白質の立体構造を形成させることができる。
ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として細胞外に分泌された場合には、培養上清中に発現蛋白質を回収することができる。単離精製については、溶媒抽出、有機溶媒による分別沈殿、塩析、透析、遠心分離、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行うことができる。
あるいは、部分配列を有するポリペプチドは、５〜３０残基の蛋白質部分配列が選択される。天然の構造を有する該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上で蛋白質表面に存在する部分配列を抗原ペプチドとして選択する。立体構造上で蛋白質表面に存在する部分配列の予測方法としては、Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃなど市販の蛋白質配列解析ソフトなどがあげられる。一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多い。また、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドを、後述するキャリア蛋白質と架橋させるために、部分ペプチドの末端にシステインを付加する。蛋白質の内部配列を選択した場合には、必要に応じペプチドのＮ末端はアセチル化、Ｃ末端はアミド化する。
部分ペプチドは、一般的な液相ペプチド合成法、固相ペプチド合成法、およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる［ザ・ペプタイズ、アナリシス、シンセシス、バイオロジー、第１巻（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１）、エアハルト・グロス（Ｅｒｈａｒｄ  Ｇｒｏｓｓ）およびヨハン・マインホッファー（Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ）編、アカデック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９７９年、第２巻１９８０年、第３巻１９８１年；ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫ら、丸善、１９８５年；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、矢島治明監修、廣川書店、１９９１年；インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３５巻、１６１頁（１９９０年）参照］。
また、部分ペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アプライド・バイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、以後ＡＢＩ社と略称する）ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、以後ＡＣＴ社と略称する）ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮ  α−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮ  α−Ｂｏｃ−アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。
ここで、原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、ノバ・バイオケム社（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、渡辺化学（株）、ＡＧＴ社、またはペプチド研究所（株）等から入手することができる。また、部分ペプチドの原料となる保護アミノ酸、保護有機酸、保護有機アミンは報告されている合成法［ザ・ペプタイズ、アナリシス、シンセシス、バイオロジー、第１巻（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１）、エアハルト・グロス（Ｅｒｈａｒｄ  Ｇｒｏｓｓ）およびヨハン・マインホッファー（Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９７９年、第２巻１９８０年、第３巻１９８１年；ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫ら、丸善、１９８５年；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、矢島治明監修、廣川書店、１９９１年；インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３５巻、１６１頁（１９９０年）参照］に従って、あるいはそれに準じて合成することができる。
（２）動物の免疫と抗体生産細胞の調製
上記で得られた該蛋白質を抗原として免疫する。免疫する方法としては、動物の皮下、静脈内または腹腔内に抗原をそのまま投与してもよいが、抗原性の高いキャリア蛋白質を結合させて投与したり、あるいは適当なアジュバントとともに抗原を投与することが好ましい。
キャリア蛋白質としては、スカシガイヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等があげられ、アジュバンドとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。
免疫動物としては、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスターなどの非ヒト哺乳動物があげられる。
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間毎に３〜１０回行う。抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。各投与後、３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、該血清の抗原との反応性について、酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）］などで確認する。そして、該血清が十分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物を、血清または抗体生産細胞の供給源とする。
モノクローナル抗体は、該抗体生産細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該細胞を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。抗体生産細胞は、抗原投与された非ヒト哺乳動物脾細胞、リンパ節、末梢血などから採取する。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］など、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法［アンチボディズ−ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，１９８８）；以下、「アンチボディズ」と記す］に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合とモノクローナル抗体の選択
上記で得られた抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁させる。細胞の洗浄にはＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）などを用いる。また、融合細胞を懸濁させる培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地［正常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社、１０％）を加えた培地］にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地］を用いる。
培養後、培養上清の一部をとり、酵素免疫測定法により、抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体生産ハイブリドーマ株として選択する。
酵素免疫測定法
抗原蛋白質あるいは抗原蛋白質を発現した細胞などを９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。第二抗体とは、第一抗体のイムノグロブリンを認識できる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
本発明のハイブリドーマ株の具体例としては、ハイブリドーマ株ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４があげられる。ハイブリドーマ株ＫＭ２８９５およびＫＭ２９０４は、平成１３年５月２４日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６０１およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７６０２としてそれぞれ寄託されている。
（５）モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはプリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、モノクローナル抗体生産ハイブリドーマ細胞を腹腔内投与して腹水癌化させた腹水から、分離、精製することにより調製できる。
モノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ（またはＧ）カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて行う方法があげられる。この方法により、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体を取得することができる。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、モノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられる。マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびヒトＩｇＧ１タイプは、補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性）および抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性）を有し、治療への応用上、有用である。
２．組換え抗体の作製方法（Ｉ）−抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインヒト化抗体の作製方法（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発現用ベクターを構築する。ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣ領域であるＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれ挿入することにより構築されたものである。
ヒト抗体のＣ領域としては、例えば、ヒト抗体Ｈ鎖ではＣγ１やＣγ４、ヒト抗体Ｌ鎖ではＣκ等の任意のヒト抗体のＣ領域を用いることができる。ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンより成る染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。
例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７．，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）］、および免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築のしやすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。
抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインモノクローナル抗体を生産する細胞、例えば、マウスＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン抗体生産ハイブリドーマ等よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを、ファージあるいはプラスミドなどのベクターに挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミド、およびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とする抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよひＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
前記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、キメラ抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にあらかじめヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングするための制限酵素の認識配列を設けておき、このクローニングサイトにヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡを下記に述べる合成ＤＮＡを介して挿入することにより、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを製造することができる。合成ＤＮＡは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣ領域の５’末端側の塩基配列とからなるものであり、両端に適当な制限酵素部位を有するようにＤＮＡ合成機を用いて製造する。
（４）ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲ配列の同定
抗体の抗原結合部位を形成するＶＨ及びＶＬは、配列の比較的保存された４個のフレームワーク領域（以下、ＦＲ領域と称す）とそれらを連結する配列の変化に富んだ３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）から成っている［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９９１）；以下、シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレストと記す］。そして各ＣＤＲアミノ酸配列（ＣＤＲ配列）は、既知の抗体のＶ領域のアミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより同定することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のＣＤＲを移植するためのヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列をＶＨ、ＶＬそれぞれについて選択する。ヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列であればいかなるものでも用いることができる。
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに登録されているヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）があげられるが、充分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を創製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列と高い相同性、好ましくは６５％以上の相同性を有することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を連結させて、ＶＨ、ＶＬそれぞれのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。ＣＤＲ移植抗体可変領域遺伝子を構築するために設計したＤＮＡ配列を得るためには、全ＤＮＡ配列をカバーするように各鎖について数本の合成ＤＮＡを設計し、それらを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｇｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、ＰＣＲと記す）を行う。ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから各鎖について、好ましくは、６本の合成ＤＮＡを設計する。反応後、増幅断片を適当なベクターにサブクローニングし、その塩基配列を決定し、目的のヒト型ＣＤＲ移植抗体の各鎖のＶ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを取得する。また、約１００塩基よりなる合成ＤＮＡを用いてセンス、アンチセンスともに全配列を合成し、それらをアニーリング、連結することで、目的のヒト型ＣＤＲ移植抗体の各鎖のＶ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築することもできる。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体のＶ領域のＣＤＲのみをヒト抗体のＶ領域のＦＲ間に、単純に移植しただけでは、抗体の有する結合活性はもとのヒト以外の動物の抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られている［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６（１９９１）］。そこでヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列のうち、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用をしているアミノ酸残基、あるいは抗体の立体構造の維持に関与している等の可能性を有するアミノ酸残基をもとのヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、結合活性を上昇させることが行われている。そして、それらのアミノ酸残基を効率よく同定するため、Ｘ線結晶解析あるいはコンピューターモデリング等を用いた抗体の立体構造の構築および解析を行っている。しかし、いかなる抗体にも適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の製造法は未だ確立されておらず、現状では個々の抗体によって種々の試行錯誤が必要である。
選択したヒト抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸配列の改変は各種の変異導入プライマーを用いて前記２（５）に記載のＰＣＲを行うことにより達成できる。ＰＣＲ後の増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたｃＤＮＡを含むベクター（以下、アミノ酸配列改変ベクターと称す）を取得する。
また、狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、２０〜３５塩基からなる変異導入プライマーを用いたＰＣＲ変異導入法により行うことができる。具体的には、改変後のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を含む２０〜３５塩基からなるセンス変異プライマー及びアンチセンス変異プライマーを合成し、改変すべきＶ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として２段階のＰＣＲを行う。最終増幅断片を適当なベクターにサブクローニング後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたｃＤＮＡを含むアミノ酸配列改変ベクターを取得する。
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
前記２（１）のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子の上流に、前記２（５）および２（６）で取得したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ及ひＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築するためのＰＣＲの際に５’末端および３’末端の合成ＤＮＡの末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、所望のヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入することができる。
（８）ヒト化抗体の一過性（トランジェント）発現および活性評価
多種類のヒト化抗体の活性を効率的に評価するために、前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクター、および前記２（７）のヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターあるいはそれらの改変ベクターをＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣＣ  ＲＬ１６５１）に導入してヒト化抗体の一過性発現［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．２８３（１９９１）］を行い、その活性を測定することができる。
ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．２８３（１９９１）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等があげられる。
ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の活性は前記１（４）に記載の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等により測定することができる。
（９）ヒト化抗体の安定（ステーブル）発現および活性評価
前記２（３）のヒト型キメラ抗体発現ベクターおよび前記２（７）のヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ＤＨＦＲ遺伝子と称す）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７，４２１６（１９８０）］、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と称す）等があげられる。
ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８およびＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により選択する。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養液中のヒト化抗体の活性は前記１（４）に記載の方法などにより測定する。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ第８章）。また、通常の蛋白質で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組合せて行い、ヒト化抗体を精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ第１２章）等で測定する。
精製したヒト化抗体の反応性、また、ヒト化抗体のＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインに対する結合活性は、前記１（４）に記載の方法などにより測定することができる。
３．組換え抗体の作製方法（ＩＩ）
（１）抗体断片Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２の作製方法
上述した抗体を酵素で処理することにより、抗体断片を生成させる。酵素としては、パパイン、トリプシンなどをあげることができる。
または、該抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’あるいはＦ（ａｂ’）２断片をコードするＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを動物細胞へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’あるいはＦ（ａｂ’）２を製造することができる。
抗体断片は、ゲル濾過、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ第１２章）等で測定する。
精製したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２の反応性、また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２のＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインに対する結合活性の測定は前記１（４）に記載の方法などにより測定することができる。
（２）抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン一本鎖抗体の作製方法
前記２（２）、２（５）および２（６）に記載のヒト以外の動物の抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを一本鎖抗体発現用ベクターに挿入することによりヒト以外の動物の抗体の一本鎖抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体の一本鎖抗体の発現ベクターを構築することができる。ここで用いる一本鎖抗体発現用ベクターとしてはヒト以外の動物の抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを組込み発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができる。
例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３（１９９０）］等があげられる。一本鎖抗体を発現させるための宿主としては、大腸菌、酵母、動物細胞等の中から適切なものを選択することができるが、その場合の発現用ベクターとしては、それぞれの宿主に適切なものを選択すればよい。
また、適切なシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡを発現用ベクターに挿入することで一本鎖抗体を細胞外に分泌させる、ペリプラズマ領域に輸送させる、あるいは細胞内に留まらせることができる。
選択された発現用ベクターに、ＶＨ−Ｐ−ＶＬあるいはＶＬ−Ｐ−ＶＨ（Ｐはペプチドリンカー）からなる一本鎖抗体をコードするｃＤＮＡを適切なプロモーター、シグナルペプチドの下流に挿入することにより、目的の一本鎖抗体をコードするｃＤＮＡが挿入された一本鎖抗体発現ベクターを構築することができる。
一本鎖抗体をコードするｃＤＮＡは、ＶＨをコードするｃＤＮＡとＶＬをコードするｃＤＮＡとを、両端に適当な制限酵素の認識配列を有するペプチドリンカーをコードする合成ＤＮＡを用いて連結することにより得ることができる。リンカーペプチドは、リンカーペプチドの付加によりＶＨ、ＶＬの抗原に対する結合の妨害にならぬように最適化することが重要である。例えばＰａｎｔｏｌｉａｎｏらにより示されたもの［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１０１１７（１９９１）］あるいはそれを改変したものを用いることができる。
（３）抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインジスルフィド安定化抗体の作製方法
ジスルフィド安定化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡあるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡのそれぞれの適切な位置の１アミノ酸残基に相当するＤＮＡ配列をシステイン残基に相当するＤＮＡ配列に改変し、発現および精製したのち、ジスルフィド結合を形成させることで作製することができる。アミノ酸残基のシステイン残基への改変は前記２（５）のＰＣＲを用いた変異導入法により行うことができる。得られた改変ＶＨおよび改変ＶＬをコードするｃＤＮＡを適切な発現用ベクターに挿入することによりジスルフィド安定化抗体Ｈ鎖発現ベクターおよびジスルフィド安定化抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築することができる。ここで用いるジスルフィド安定化抗体発現用ベクターとしては改変ＶＨおよび改変ＶＬをコードするｃＤＮＡを組込み発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１β３ｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３（１９９０）］等があげられる。ジスルフィド安定化抗体を形成させるためにジスルフィド安定化抗体Ｌ鎖発現ベクターおよびジスルフィド安定化抗体Ｈ鎖発現ベクターを発現させるための宿主としては、大腸菌、酵母、動物細胞等の中から適切なものを選択することができるが、その場合の発現用ベクターとしては、それぞれの宿主に適切なものを選択すればよい。
また、適切なシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡを発現用ベクターに挿入することでジスルフィド安定化抗体を細胞外に分泌させる、ペリプラズマ領域に輸送させる、あるいは細胞内に留まらせることができる。
（４）各種抗体の発現および活性評価
前記３（１）〜（３）で構築された抗体断片発現ベクター、一本鎖抗体発現ベクター、ジスルフィド安定化抗体Ｈ鎖発現ベクターあるいはジスルフィド安定化抗体Ｌ鎖発現ベクターをエレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等の方法により宿主細胞へ導入することにより、目的の抗体断片、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化抗体Ｈ鎖あるいはジスルフィド安定化抗体Ｌ鎖を生産する形質転換株を取得することができる。発現ベクターの導入後、培養上清等に含まれる抗体断片、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化抗体Ｈ鎖あるいはジスルフィド安定化抗体Ｌ鎖の発現は前記１（４）に記載の方法等により確認することができる。
一本鎖抗体、ジスルフィド安定化抗体Ｈ鎖あるいはジスルフィド安定化抗体Ｌ鎖の回収および精製は公知の技術を組み合わせることにより達成することができる。例えば、抗体断片、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化抗体Ｈ鎖あるいはジスルフィド安定化抗体Ｌ鎖が培地中に分泌される場合は、限外濾過により濃縮し、次いで各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を行うことにより達成することができる。また、宿主細胞のペリプラズマ領域へと輸送される場合は、宿主細胞に浸透圧ショックを与えた後、限外濾過により濃縮し、次いで各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を実行することにより達成することができる。抗体断片、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化抗体Ｈ鎖あるいはジスルフィド安定化抗体Ｌ鎖が不溶性で、かつ顆粒（インクルージョン・ボディー）として存在している場合は、細胞の溶解、顆粒を単離するための遠心分離と洗浄を繰り返す、例えばグアニジン−塩酸による可溶化後、各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を行うことにより達成することができる。
精製された一本鎖抗体は、前記１（４）に記載の方法等により測定することができる。精製されたジスルフィド安定化抗体Ｈ鎖とジスルフィド安定化抗体Ｌ鎖は、各々を混合したのち、活性を有する構造へと導く操作［リフォールディング操作、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２，２４９（１９９５）］によりジスルフィド結合を形成させた後、抗原アフィニティークロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーまたはゲルろ過により活性を有するジスルフィド安定化抗体を精製することができる。ジスルフィド安定化抗体の活性は前記１（４）に記載の方法等により測定することができる。
４．融合抗体の作製方法
本発明で使用される抗体あるいは該抗体断片に、放射性同位元素、蛋白質、低分子の薬剤などを、化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた融合抗体も抗体の誘導体として使用することができる。
抗体と毒素蛋白質とを化学的に結合させた融合抗体は、文献［Ａｎｔｉｃａｎｃｃｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，２００３（１９９１）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３，３５０（１９９６）］記載の方法に従って作製することができる。
抗体と、毒素あるいはサイトカイン等の蛋白質とを遺伝子工学的に結合させた融合抗体は、文献［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９７４（１９９６）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，７８２６（１９９６）］記載の方法に従って作製することができる。
抗体と低分子の薬剤を化学的に結合させた融合抗体は、文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，２１２（１９９３）］記載の方法に従って作製することができる。抗体と放射性同位元素を化学的に結合させた融合抗体は、文献［Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，３，６０（１９９０）；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，２００３（１９９１）］記載の方法に従って作製することができる。
これらの誘導体は、抗体分子の特異性に従って放射性同位元素、蛋白質（サイトカイン、トキシン、酵素など）、低分子の薬剤などを標的組織周辺に集積させることで、より効果的で副作用の少ない診断あるいは治療を可能にすることが期待される。
５．抗体の使用方法（Ｉ）
上述した抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン抗体、該抗体断片あるいはそれらと他分子との融合抗体は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと結合し、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）等の抗体のエフェクター活性を介してＭＴ４−ＭＭＰを細胞表面に発現している細胞を破壊する。したがって、ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾患の治療に有用である。
ＭＴ４−ＭＭＰに関与する疾患としては、変形性関節症、慢性関節リウマチ、喘息、自己免疫疾患、アトピー性皮膚炎、乾せん、接触性皮膚炎、脱毛症、虚血性心疾患、臓器移植に伴う免疫反応、肝炎、腎炎、膵炎、動脈硬化、白血病、悪性腫瘍、創傷、角膜腫瘍、組織傷害または白血球の浸潤に伴う炎症疾患などがあげられる。
本発明の抗体を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
また、本発明で使用される抗体の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法および抗腫瘍実験は、文献［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３６，３７３，１９９３．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
６．抗体の使用方法（ＩＩ）
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を用いて、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインまたは該ドメインを細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞を免疫学的に検出および定量する方法に関する。
本発明のモノクローナル抗体を用いて、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞を、免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）などの免疫学的測定法、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法［単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７年）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人、１９８６年）］などがあげられる。
免疫学的測定法としては、任意の公知の免疫学的測定方法があげられる。
上述のように、免疫学的測定法は標識方法の違いにより、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、物理化学的検出法（ＴＩＡ，ＬＡＰＩＡ，ＰＣＩＡ）などがあげられるが、好ましくは酵素免疫測定法があげられる。
酵素免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識等を用いることができる。
発光免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知［今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；  臨床検査４２（１９９８）］の発光体標識を用いることができる。例えば、アクリジニウムエステル標識、ロフィン標識等を用いることができる。
蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社）の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ標識、ＲＩＴＣ標識等を用いることができる。
免疫学的測定法とは、上述した各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を測定する方法である。本発明の免疫学的測定法としては、抗原の検出または測定を行う方法であればいかなる方法でもよい。例えば、競合法、サンドイッチ法［免疫学イラストレイテッド  第５版（南光堂）］があげられるが、サンドイッチ法が好ましい。
サンドイッチ法は、固相に第一の抗体を結合させた後、測定したい抗原をトラップさせ、標識した第二の抗体を反応させる方法である。サンドイッチ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、上述したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントの組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントの組み合わせでもよい。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体であるＫＭ２８９５およびＫＭ２９０４の組み合わせがあげられる。
蛍光抗体法とは、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞に、本発明のモノクローナル抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質でラベルした抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）とは、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞に、本発明のモノクローナル抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞に、本発明のモノクローナル抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法とは、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞に、本発明のモノクローナル抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
ウェスタンブロッティング法とは、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８］で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明のモノクローナル抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、確認する方法である。
ドットブロッティング法とは、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の細胞抽出液をニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明のモノクローナル抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、確認する方法である。
免疫沈降法とは、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の細胞抽出液を本発明のモノクローナル抗体と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等のイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。
ＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾病の診断方法としては、各種ヒト腫瘍培養細胞またはバイオプシー等で患者より採取した細胞および該細胞より調製した細胞抽出液を用いて、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを、上述のように免疫学的に検出または定量する方法があげられる。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、上述のＭＴ４−ＭＭＰが関与する疾病の診断薬として用いることができる。
７．抗体の使用方法（ＩＩＩ）
また、本発明の抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインモノクローナル抗体は、ＭＴ４−ＭＭＰを精製するために使用することができる。具体的には、本発明の抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィを行う。
抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインモノクローナル抗体を、プロテインＧ−セファロース等のイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を用いて、あるいはアミノ基を介してイムノグロブリンを直接結合する種々のカップリングゲルを用いて担体に固定化し、抗体カラムを作製する。
サンプルとしてはＭＴ４−ＭＭＰを発現した動物細胞あるいは昆虫細胞の細胞抽出液、あるいは各種ヒト腫瘍培養細胞またはバイオプシー等により患者より採取した細胞から調製した細胞抽出液を用いることができる。
抗体カラムに上記ＭＴ４−ＭＭＰサンプルを通塔後、カラム容量の１０倍の０．５ＭのＮａＣｌを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．２）にて洗浄する。その後、抗原抗体反応を解離させる条件（高ｐＨ、低ｐＨ、高塩濃度、界面活性剤、変性剤等）のバッファーにて溶出し、精製ＭＴ４−ＭＭＰを得る。なお、溶出はＭＴ４−ＭＭＰの酵素活性を失活させない条件を用いる必要がある。
以下に実施例を用いて、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものでない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１  ヒトＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン蛋白質の発現
（１）ヒトＭＴ４−ＭＭＰ遺伝子の配列情報
ヒトＭＴ４−ＭＭＰ  ｃＤＮＡの情報は、遺伝子配列データベースの一つであるＧｅｎｂａｎｋに登録されている配列を使用した（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ８９５７６）。その塩基配列を配列番号５に示す。ヒトＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインをコードする塩基配列は、配列番号５の４８１〜９８７番目の塩基配列に相当する。
（２）ヒトＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの増幅に用いたプライマーの設計
遺伝子操作的手法は特に断らない限りモレキュラークローニング第２版に記載されている方法により行った。
ヒトＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの増幅に用いたプライマーの塩基配列を配列番号１および２に示す。
また、クローニング用ベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のクローニングサイトの両側に位置する配列より、塩基配列確認用のプライマーを設計した。塩基配列確認用のプライマーの塩基配列を配列番号３および４に示す。
（３）ＰＣＲ法によるヒトＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの増幅
ＰＣＲの鋳型にはプラスミドｈＭＴ４Δｔ／ｐＲＳＥＴ  Ｂ［ＷＯ００／１８８０５］１μＬを用いた。耐熱性酵素としてＰＬＡＴＩＮＵＭ  ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、全５０ｍＬの反応溶液［１×ｐｆｘ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４  １ｍＭ、各成分３００ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、上記（２）で得られたプライマーＭＴ４−ＭＭＰＣＤＦ１、ＭＴ４−ＭＭＰＣＤＲ１各々０．３ｍＭ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １．２５ｕｎｉｔｓ］にてＰＣＲを行った。サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用い、９４℃で２分間加熱後、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間の工程を１サイクルとして２５サイクル行い、更に６８℃で１０分間加熱した。このＰＣＲ反応液のうち５ｍＬをアガロース電気泳動にて解析し、予想される約０．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。
（４）増幅されたＤＮＡ断片の精製とベクターへの挿入
ＰＣＲ反応液の残りを全量アガロース電気泳動にて分離し、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片は、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キットに付属のマニュアルに従って精製した。ベクターＤＮＡはＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に付属のｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔを用いた。精製済みＰＣＲ産物約５０ｎｇおよびｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ約２５ｎｇを混ぜ、このＤＮＡ溶液と等量のＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を加えて、１６℃で１２時間結合反応を行った。この反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＴＯＰ１０株［遺伝子型：Ｆ，ｍｃｒＡ  Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０  ｌａｃＺ  ΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｄｅｏＲ  ｒｅｃＡ１  ａｒａＤ１３９  Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ］を形質転換し、プラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＭＴ４ＭＭＰＣＤを得た。
（５）ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＭＴ４ＭＭＰＣＤの塩基配列の確認
ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＭＴ４−ＭＭＰＣＤに組み込まれているｃＤＮＡの塩基配列の確認は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により行なった。シークエンス反応はＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、方法はキットの説明書に従った。シークエンス用のプライマーは上記（２）で得られたＦ１、Ｒ１プライマーを用い、両鎖の塩基配列を確認した。
シークエンスのデータ解析には、ＧＥＮＥＴＹＸ  ＷＩＮ  ｖｅｒ．３．２（ソフトウェア社製）を用いた。
クローニングした塩基配列を確認した結果、配列番号５に示す公知の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ８９５７６）の４８４〜１００５番目に一致した。これは、ヒトＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインおよびヒンジ領域に相当する。
（６）ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔから発現ベクターｐＥＴ２３ａ（＋）への組み換え
ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＭＴ４ＭＭＰＣＤ約６ｍｇを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）、３０ｕｎｉｔｓ  Ｎｄｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および１５ｕｎｉｔｓ  Ｎｏｔ  Ｉ（宝酒造社製）からなる反応液４０μＬ中で３７℃で１時間消化反応を行いＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを含むＤＮＡを切り出した。この反応液をアガロース電気泳動にて分離し、約０．５ｋｂのＮｄｅ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ  ＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片は、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
ｐＥＴ２３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）の５μｇを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、３０ｕｎｉｔｓ  Ｎｄｅｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および１５ｕｎｉｔｓ  Ｎｏｔ  Ｉ（宝酒造社製）からなる反応液４０μＬ中で３７℃にて２時間消化反応を行った。この反応液をアガロース電気泳動にて分離し、約３．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片は、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
上述のＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを含むＮｄｅ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ断片約５０ｎｇおよびｐＥＴ２３ａ（＋）のＮｄｅ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ処理済み断片約５０ｎｇを混ぜ、このＤＮＡ溶液と等量のＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を加えて、１６℃で２時間結合反応を行った。この反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株［遺伝子型：Δ（ｍｃｒＡ）１８３  Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３  ｅｎｄＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑ  ＺΔＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）］］を形質転換し、プラスミドｐＥＴ２３ａＭＴ４ＭＭＰＣＤを得た。同様に、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを含むＮｄｅ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ段片をｐＥＴ２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入してｐＥＴ２４ａＭＴ４−ＭＭＰＣＤを調製した。
（７）ｐＥＴ２３ａＭＴ４−ＭＭＰＣＤの大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３ｐＬｙｓＳ株への導入
大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３ｐＬｙｓＳ株［遺伝子型：Ｆ  ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ］はｌａｃＵＶ５プロモーター下流にＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子をもつｌファージ、ｌＤＥ３の溶原菌である。発現プラスミドを導入したＢＬ２１／ＤＥ３ｐＬｙｓＳを培養し、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）で誘導をかければ、まずＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが発現し、続いて目的遺伝子の強力な転写が始まる。そこでｐＥＴ２３ａＭＴ４−ＭＭＰＣＤをＢＬ２１／ＤＥ３ｐＬｙｓＳへ導入した。ＢＬ２１／ＤＥ３ｐＬｙｓＳ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）２０μＬに１μｇのｐＥＴ２３ａＭＴ４ＭＭＰＣＤを加え、氷上で１０分間放置した。４２℃、３０秒間のヒートショックをかけた後、氷上に２分間置き、８０μＬのＳＯＣ（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌのキットに付属）を加え３７℃に３０分間放置した。全量を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム塩（ナカライテスク社製）を含むＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）プレートへまき、３７℃でコロニーが直径１ｍｍ程度になるまで培養した。
（８）ヒト組換えＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの発現誘導
組換え大腸菌の培養は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム塩（ナカライテスク社製）を含むＬＢ液体培地で行った。
組換え大腸菌は２ｍＬの培地に植菌した後、恒温振とう培養器ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ（型式ＢＲ−４０ＬＦ，タイテック社製）を用いて３７℃、２００回転／分（ｒｐｍ）の条件で一晩振とう培養した。この前培養した培養液０．５ｍＬを７５ｍＬの培地に植菌し、本培養を開始した。３７℃、２００ｒｐｍで２時間振とう培養した後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（ナカライテスク社製）を加え、さらに３７℃、２００ｒｐｍで４時間振とう培養してヒトＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの発現を誘導した。
（９）ヒト組換えＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインの精製
７５ｍＬの培地を用いて発現誘導を行った菌体は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５０ｍＬで１回洗浄した。菌体に０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０μｇ／ｍＬ  Ｄｎａｓｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｃｈ社製）、０．１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｃｈ社製）、０．１μｇ／ｍＬ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（ペプチド研究所社製）、０．１μｇ／ｍＬ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ（ペプチド研究所社製）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）３００ｍＬを添加し、３７℃で２時間保温した。遠心分離による沈殿の回収後、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及び上述のｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて４回洗浄操作を行った。８Ｍ尿素を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を沈殿に２ｍＬ加えて溶解し、１．５ｍＬチューブに分注後、１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間の遠心分離を行い上清を回収した。上清は簡易ろ過カラムＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて脱塩し、−２０℃に保存した。
（１０）酵素活性の測定
１０μＭ蛍光基質ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２（ペプチド研究所社製）、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  Ｂｒｉｊ３５、６２．５ｎＭ  ＺｎＣｌ２からなるアッセイバッファー１９０μＬ中に、１６μｇ／ｍＬ酵素溶液（８Ｍ尿素を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で希釈）１０μＬを添加して（終濃度０．８μｇ／ｍＬ）、３０〜２４０分間反応後の蛍光強度を測定した。酵素量の定量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、ＢＳＡを標準として行った。また、標準蛍光基質としてＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（ペプチド研究所社製）を用いて蛍光値と基質分解量の関係を算出した（蛍光値＝基質分解量×６９４３．４＋１１６．４８）。測定はＡＲＶＯ（ベルトールド・ジャパン社製）を用いて、Ｅｘ．３２０、Ｅｍ．３９３、Ｅｎｅｒｇｙ  ２０００、１秒の条件にて行った。
ｐＥＴシステムを用いて発現誘導を行い、７５ｍＬの培養菌体から１６０μｇ／ｍＬの酵素溶液が２．５ｍＬ得られた。酵素活性の測定を行ったところ、ＭＴ４−ＭＭＰ活性が検出され、基質分解速度は１．２μｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／時間であった。
通常８Ｍ  Ｕｒｅａ（ナカライテスク社製）中に溶解し、４℃保存を行ったが、使用する際は上記バッファーで２０倍以上希釈し、２５℃９０分間静置してリフォールディングした後に適宜希釈して使用した。
実施例２  抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体の製造
（１）免疫原の調製
実施例１で得られたＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ＰＨ７，４）、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５００ｎＭ  ＺｎＣｌ２、０．００５％  Ｂｒｉｊ３５溶液にＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを加え、室温で１時間静置し、リフォールディングを行った後、免疫原として使用した。
（２）動物の免疫と抗体生産細胞の調製
実施例２（１）で調製したＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン５０μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに５週令雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）または週令ラット（ＳＤ）に投与し、２週間後より１００μｇのＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス一塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（３）酵素免疫測定法
アッセイ用の抗原には実施例２（１）で得られたＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインをリフォールディングしたものを用いた。９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製した１０μｇ／ｍＬのＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを５０μＬ／穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ）を１００μＬ／穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。１％ＢＳＮ／ＰＢＳを捨て、被免疫マウス抗血清、抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体を５０μＬ／穴で分注し、２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社製）またはペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ社製）を５０μＬ／穴で加えて室温、１時間反応させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後ＡＢＴＳ基質液［２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＮＪ  ２００１；日本インターメッド社製）にて測定した。
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（５）ハイブリドーマの作製
実施例２（２）で得られたマウス脾細胞と実施例２（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液０．２〜１ｍＬ／１０８マウス脾細胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍＬ中に懸濁した。
この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。この培養上清を実施例２（３）に記載した酵素免疫測定法で調べ、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメイン部分ペプチドに反応してコントロールペプチドに反応しない穴を選び、さらにＨＴ培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体生産ハイブリドーマを確立した。
以上の方法により、４個のマウスモノクローナル抗体ＫＭ２８９２、ＫＭ２８９３、ＫＭ２８９４、ＫＭ２８９５が選択された。また、同様の方法をラットに適用し、１１個のラットモノクローナル抗体ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７、ＫＭ２８９８、ＫＭ２８９９、ＫＭ２９００、ＫＭ２９０１、ＫＭ２９０３、ＫＭ２９０４、ＫＭ２９０６、ＫＭ２９０９、ＫＭ２９１０が選択された。
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に実施例２（５）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。注射して１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した。ＩｇＧは、カプリル酸沈殿法（アンチボディズ）により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行い決定した（表１）。
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（７）ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインとの反応性（酵素免疫測定法）
実施例２（５）で選択された抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体のＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインとの反応性を実施例２（３）に示した酵素免疫測定法にて調べた。コントロールとして大腸菌を超音波破砕して得られた蛋白質（大腸菌由来蛋白質）を用いた。
第１図に示すように、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを免疫して得られた抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体である、マウスモノクローナル抗体ＫＭ２８９２、ＫＭ２８９３、ＫＭ２８９４およびＫＭ２８９５、ならびにラットモノクローナル抗体ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７、ＫＭ２８９８、ＫＭ２８９９、ＫＭ２９００、ＫＭ２９０１、ＫＭ２９０３、ＫＭ２９０４、ＫＭ２９０６、ＫＭ２９０９およびＫＭ２９１０はＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインに特異的に結合した。
（８）ウェスタンブロッティング
実施例２（５）で得られた抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインモノクローナル抗体を用い、ＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質のウエスタンブロッティングによる検出を検討した。
蛋白質はＭＴ４−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ−１細胞膜画分及びコントロールとしてＭＴ５−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ−１細胞膜画分を用いた。各々の遺伝子導入細胞はＷＯ００／１８８０５に記した方法で作製した。
各々の細胞膜画分を１．２５×１０２ｃｅｌｌｓ／レーンでＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（アンチボディズ）にて分画後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングする。１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング後、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体の培養上清を室温で２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）もしくはペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳでよく洗浄した後、検出はＥＣＬ−ディテクションキット（アマシャム社製）を用いて行い、Ｘ線フィルム上に感光させた。その結果、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体である、マウスモノクローナル抗体ＫＭ２８９２、ＫＭ２８９３、ＫＭ２８９４およびＫＭ２８９５、ならびにラットモノクローナル抗体ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７、ＫＭ２８９８、ＫＭ２８９９、ＫＭ２９００、ＫＭ２９０１、ＫＭ２９０３、ＫＭ２９０４、ＫＭ２９０６、ＫＭ２９０９およびＫＭ２９１０により、ＭＴ４−ＭＭＰの分子量に相当する７０ＫＤａ（図中、矢印で表示）付近のバンドが検出された。またＭＴ５−ＭＭＰに対して、これらすべてのモノクローナル抗体は反応性を示さなかった。ＭＴ４−ＭＭＰ、ＭＴ５−ＭＭＰに反応しない抗ＰＥＧ化顆粒球コロニー刺激因子モノクローナル抗体ＫＭ５１１（特開平８−１６５３００；ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８８０）については、７０ＫＤａ付近のバンドに特異的に反応しなかった。
以上の結果より、抗ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインモノクローナル抗体は細胞上のＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質をウエスタンブロッティングにより検出することができ、炎症、癌などのＭＴ４−ＭＭＰが関与する各種疾病の診断に応用可能であることが示された。
（９）免疫細胞染色
実施例２（５）で選択された抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体を用い、細胞上に発現しているＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質の免疫細胞染色による検出を検討した。
細胞は、ＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５０）、ＭＴ４−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ１およびＭＴ５−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ１を用いた。ＭＴ４−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ１およびＭＴ５−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ１については、ＷＯ００／１８８０５に記載の方法で製造した。
これらの細胞をトリプシンとＥＤＴＡの混合液を用いて浮遊化し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞膜の抗体透過性を上げるため、１００％メタノール（氷冷）にて４℃で１０分間処理した。ＰＢＳで洗浄後、１０μｇ／ｍＬ  ヒトイムノグロブリン（カッペル社製）にて室温で３０分間ブロッキングした。細胞を１×１０５個／チューブで分注した後、遠心分離を行い、チューブの上清を除去し、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体の培養上清を加えて室温で３０分間反応させた。
ＰＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（和光純薬社製）を１００μＬ／チューブで分注し、４℃、３０分間遮光反応させた。よくＰＢＳで洗浄した後、セルアナライザー（コールター社；ＥＰＩＣＳ  ＸＬｓｙｓｔｅｍＩＩ）にて解析した。結果を表２に示す。
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ＣＯＳ１、ＭＴ４−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ１およびＭＴ５−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ１細胞について、本発明の各種モノクローナル抗体ＫＭ２８９２、ＫＭ２８９３、ＫＭ２８９４、ＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７、ＫＭ２８９８、ＫＭ２８９９、ＫＭ２９００、ＫＭ２９０１、ＫＭ２９０３、ＫＭ２９０４、ＫＭ２９０６、ＫＭ２９０９、ＫＭ２９１０、およびネガティブコントロールでマウスのＩｇＧ１クラスの抗ＰＥＧ化顆粒球コロニー刺激因子モノクローナル抗体ＫＭ５１１（特開平８−１６５３００；ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８８０）をそれぞれ反応させた結果を示している。
上述の抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体ＫＭ２８９４を除いていずれもＭＴ４−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ１細胞との反応性が認められた。また、コントロールであるＣＯＳ１細胞およびＭＴ５−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ１細胞との反応性が認められなかった。
したがって、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体は細胞上のＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質を免疫細胞染色により検出することができ、炎症、癌などＭＴ４−ＭＭＰが関与する各種疾病の診断に応用可能であることが示された。
実施例３  フローサイトメーターを用いた血球系細胞株細胞表面上のＭＴ４−ＭＭＰ解析
ヒト細胞株としてＵ９３７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３）を用い、下記の様に解析を行なった。
各種細胞２×１０５個をポリエチレンチューブ（日本ベクトンデッキンソン社製）に入れ、１５００ｒｐｍ（４００×ｇ）３分間遠心分離した。上清を捨てた後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した精製抗体抗ＭＴ４−ＭＭＰ抗体５０ｍＬを添加した。コントロール抗体には、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈したラットＩｇＧ２ｂ抗体もしくはマウスＩｇＧ２ａ抗体をそれぞれ用いた。
攪拌後、氷上で３０分間静置し、反応させ、冷却したＰＢＳを２ｍＬ加えて攪拌した後、１５００ｒｐｍ（４００×ｇ）３分間遠心分離し、上清を除去した（以下、この操作を遠心洗浄と記す）。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１００倍希釈したビオチン化抗マウスＩｇ抗体（ダコ社製）もしくはビオチン化抗ラットＩｇ抗体（ダコ社製）５０ｍＬを２次抗体として添加した。攪拌後、氷上で３０分間静置した。遠心洗浄後、蛍光標識であるアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２００倍に希釈し、アビジン希釈液５０ｍＬをさらに添加し、攪拌後、氷上で３０分間静置した。遠心洗浄後、ＰＢＳを５００ｍＬ添加し、攪拌した後、ＦＡＣＳｃａｎ（日本ベクトンデッキンソン社製）にて測定した。
Ｕ９３７細胞に対する抗体の反応性の結果を第２図に示す。第２図に示した通り、本発明のモノクローナル抗体であるＫＭ２８９５、ＫＭ２８９６、ＫＭ２８９７およびＫＭ２９０４は、Ｕ９３７細胞に対して強い反応性を示した。以上の結果は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを認識するモノクローナル抗体を用いることにより、細胞膜表面上の天然のＭＴ４−ＭＭＰを検出することが可能であると判断された。一方、ＷＯ００／１８８０５で開示されている抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体であるＫＭ２５６１およびＫＭ２５６２はＭＴ４−ＭＭＰの発現量が多いと考えられるＭＴ４−ＭＭＰトランスフェクタントには反応する［ＷＯ００／１８８０５］が、Ｕ９３７細胞に発現している細胞表面上のＭＴ４−ＭＭＰ対して反応しなかった。
従って、本発明のＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインに対するモノクローナル抗体は、細胞上のＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質を免疫細胞染色により検出することができる。従って、癌、炎症疾患などのＭＴ４−ＭＭＰが関与する各種疾病の診断に応用可能であることが示された。
実施例４  サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＭＴ４−ＭＭＰ定量系の検討
実施例２で製造された抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体のすべての組み合わせでサンドイッチＥＬＩＳＡを行ってＭＴ５−ＭＭＰに反応せず、ＭＴ４−ＭＭＰ特異的にかつ強く反応性を示すモノクローナル抗体の組み合わせを検討した。
９６穴平底プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、日本インターメッド社製）に、ＰＢＳで希釈した５ｍｇ／ｍＬの抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体５０ｍｌを加え４℃で一晩静置し、プレートにコーティングした（以下、この抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体をコーティング抗体と称す）。ＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを２００ｍＬ／穴加え、室温２〜４時間静置し、抗体をブロッキングした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ除去後、あらかじめリフォールディングしたＭＴ４−ＭＭＰ、トリプシンで活性化したＭＴ５−ＭＭＰ［ＷＯ００／１８８０５］または実施例５で得られた動物血清を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで種々の濃度に希釈し、５０ｍＬを穴に加え室温２時間反応した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した２ｍｇ／ｍＬのラット抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体を５０ｍＬ／穴加え、室温で１時間反応した（以下、このラット抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体を検出抗体と称す）。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したビオチン化抗ラットＩｇ（ＤＡＫＯ社製、１／４０００希釈）を５０ｍＬ／ウェル加え、室温で１時間反応した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・アビジンＤ（Ｖｅｃｔｅｒ社製、１／４０００希釈）を５０ｍＬ／ウェル加え、室温で２０分間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・アビジンＤの基質である、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）１００ｍＬ／穴加え室温で発色させ、１００ｍＬの１０ｖｏｌ％Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止した。オートマチックプレートリーダーＥＬ３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて、波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、Ｄｅｌｔａ  Ｓｏｆｔ（Ｂｉｏ  Ｍｅｔａｌｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｅｒ．３−１．３Ｂ）により算出した。スタンダードカーブは４−ｐａｒａｍｅｔｅｒを用いた。
第３図に示した様に、コーティング抗体としてはＫＭ２８９５、検出抗体としてはＫＭ２９０４の組み合わせにより、１０〜５０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲でＭＴ４−ＭＭＰを特異的に検出することができた。
また、本方法は、濃度既知のＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質を標準サンプルとして用いることにより、サンプル中のＭＴ４−ＭＭＰの定量も行うことができる。
実施例５  ラットコラーゲン誘発関節炎血清におけるＭＴ４−ＭＭＰの定量
（１）ラットコラーゲン誘発関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＣＩＡ）モデル
慢性関節リウマチモデルの一つであるＣＩＡモデルは以下のように作製した。
１２週令ＤＡラット（雌性、日本チャールスリバー社製）を実験に供した。ウシ関節由来タイプＩＩコラーゲン（コラーゲン技術研修会製）は、０．３ｖｏｌ％酢酸溶液に溶解して１ｍｇ／ｍＬとし、等量のｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ（以下ＩＦＡ，ＤＩＦＣＯ社製）と氷冷下でポリトロン（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いて混合し、エマルジョンを調製した。コラーゲンは、凍結乾燥品を用時に酢酸溶液に溶解して用いた。
ラットをエーテル麻酔下で尾根部を剃毛し、エマルジョン化したコラーゲン溶液を尾根部皮内に２７Ｇ注射針を用いて１００μＬ／ｓｉｔｅで投与して感作を行った（ｎ＝６）。同時に無処置群を設け、正常群（ｎ＝６）とした。
（２）血清の調整
血清は正常群、ＣＩＡ発症群から感作後３２日目に採血し、セパラピッドチューブミニＳ（積水化学社製）に採取し、毎分３０００回転（１５００×ｇ）、４℃で２０分間遠心分離（日立小型冷却遠心機ｈｉｍａｃ  ＣＦ７Ｄ、ローターＲＴ３Ｓ３、日立工機社製）を行い回収した。
（３）ＣＩＡモデル血清中のＭＴ４−ＭＭＰ定量
実施例４で構築したサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ＣＩＡモデル血清中のＭＴ４−ＭＭＰの発現を検出した。血清中ＭＴ４−ＭＭＰ検出の結果、ラットＣＩＡにおいて無処置群に比較し、有意な上昇が認められた（第４図、ｐ＝０．０１９５）。統計解析には統計解析ソフトＳＡＳ（Ｒｅｌｅａｓｅ６．１２、ＳＡＳ  Ｉｎｃ．）を使用し、Ｓｔｕｄｅｎｔｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより有意差検定を行なった。
また、サンドイッチＥＬＩＳＡは、濃度既知のＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質を標準サンプルとして用いることにより、血清中等のＭＴ４−ＭＭＰの定量も行うことができる。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ＭＴ４−ＭＭＰに特異的に反応し、免疫学的測定法によりＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質を特異的に検出または定量することが可能な抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体が提供される。本発明の抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体およびこれを用いた診断用キットは、ＭＴ４−ＭＭＰが関与する各種疾病の診断において、高感度で信頼性の高い検出を可能にする。また、細胞上のＭＴ４−ＭＭＰにも反応することから、本発明のモノクローナル抗体を含有する医薬品はＭＴ４−ＭＭＰが関与する各種疾病の治療において有用である。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインを抗原として用いて得られた本発明のモノクローナル抗体のＭＴ４−ＭＭＰ触媒ドメインまたは大腸菌蛋白に対する反応性を、酵素免疫測定法で調べた結果を示すグラフである。
第２図は、ＭＴ４−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ−１細胞膜上に存在するＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質を、本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫細胞染色により検出した測定結果を示すチャートである。ＣＯＳ−１、ＭＴ５−ＭＭＰ遺伝子導入ＣＯＳ−１をコントロール細胞として使用した。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数をそれぞれ表す。
第３図は、ＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質及びＭＴ５−ＭＭＰ蛋白質を、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系により検出した結果を示すグラフである。○はＭＴ４−ＭＭＰに対する反応性を、●はＭＴ５−ＭＭＰに対する反応性を示す。
第４図は、マウスコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデル血清中に存在するＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質を、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系により検出した結果を示すグラフである。正常ラット、関節炎発症ラット血清中のＭＴ４−ＭＭＰ蛋白質量を比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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