(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ細胞において外来遺伝子を安定に発現させるために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを該外来遺伝子の5’上流側及び3’下流側の両側に連結したベクター又はウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを該外来遺伝子の5’上流側のみに連結したベクターを作製し、該ベクターを用いて該インスレーターおよび該外来遺伝子を該タバコ細胞内に導入する工程を含む、遺伝子導入方法。
【請求項２】
請求項１記載の導入方法により、外来遺伝子を安定に発現させた、形質転換タバコ細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は植物細胞において、外来遺伝子を安定に発現させる導入方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物に種々の性質を付与する目的で、外来の遺伝子を導入した形質転換植物が作製されているが、その場合に個体間による導入遺伝子発現のばらつきが大きいことが問題となる。このばらつきは、導入された染色体上の位置によると考えられている。外来遺伝子が活性化クロマチン領域に挿入された場合には高い発現が得られ、反対に不活性化クロマチン領域に挿入された場合には十分な発現が得られないとされ（Galli,1:166-172,Current opinion in plant technology (1998) 1:166-172, Matzke et al.,Current opinion in plant technology (1998) 1:142-148 ）、このような現象はポジション効果と呼ばれている。このようなポジション効果のために植物に導入したトランスジーンは、しばしば全く発現しないか、発現しても弱いか、あるいは発現しても植物の成長や外環境により発現しなくなることがある。この現象は遺伝子組み換え植物の商業化に際し障害となっており、導入遺伝子の発現を安定化する手法の確立が必要とされる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、多様な遺伝子を導入した形質転換体の解析から、例外的に染色体上の導入位置に依存せずに発現する現象が見出され、その後の解析から、そのような現象は３つのケースに大別されている。すなわち、インスレーター、ＬＣＲ（ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ）およびＭＡＲ（ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）の関与が示唆され、これら三者は作用機構は異なるが染色体上の境界として機能し、周辺のクロマチンの影響を遮断すると考えられている。
【０００４】
インスレーターはエンハンサーとプロモーターの間に位置すると、エンハンサー効果を遮断する活性を持つ。高等真核植物では、エンハンサーやサイレンサーが、特定の一つのプロモーターだけではなく、複数のプロモーターの転写活性にも影響を与える場合があるため、染色体上では、複数のエレメントがランダムに影響を与える可能性がある。これは遺伝子発現に多様性を持たせる反面、無秩序ではない厳密な秩序ある制御のためには、エンハンサーやサイレンサーの影響を限定する機構が必要と想像される。現在では、インスレーターがこれらの影響力を限定していると考えられている。
【０００５】
一方、ＬＣＲはＤＮＡ分解酵素Ｉ（ＤＮａｓｅＩ）に高感受性の領域であり、活性化クロマチンを形成することにより、プロモーターと種々の転写因子の接近を物理的に容易にしていると考えられる。
ＭＡＲは、アデニン、チミン（ＡＴ）リッチな配列、トポイソメラーゼＩＩの認識配列を含むなどの特徴を持ち、インビトロで核膜結合活性を有する。染色体上では、１０〜１００ｋｂに一つは存在しているとされ、これらの領域を介して染色体は核膜と結合して高次構造を形成している。ＭＡＲは、染色体を限られたスペースである核内にコンパクトに収めるために必須の存在であるが、近年の研究により遺伝子発現制御にも関与している事実が蓄積している。例えば、マウスのカッパー軽鎖免疫グロブリンのＭＡＲの解析では、発生過程における発現にＭＡＲが必要なこと、ＭＡＲの欠失により高度なメチル化による遺伝子発現の不活性化が生じることなどが明らかとなった。また、ＭＡＲ間に形成されるクロマチンループ内には、一つの遺伝子または複数の転写ユニットが含まれる。ループ内にクラスターを形成しているベータグロビン遺伝子の解析では、各遺伝子が相互に影響を与えることが適切な制御および機能に必要であった。これらの事実から、ＭＡＲ間の一つのクロマチンループが独立したユニットを形成し、ユニット単位での遺伝子発現制御がなされているという説が提唱されている。
【０００６】
先に述べたように、実用的な形質転換体を得るために、動物、植物を問わず、導入遺伝子の安定発現が望まれている。これまでに述べたように安定発現を考える場合、導入位置の周辺の影響、すなわちポジション効果を回避することが必須である。このため、レポーター遺伝子の前後にＬＣＲ、ＭＡＲやインスレーターを付加し、ポジション効果を回避できるか検討されてきた。動物細胞においては、ＬＣＲおよびインスレーターは予想された機能を果たし、形質転換体間の発現のばらつきを減少させた（赤坂、細胞工学(1997) 16: 1476-1484、Yasue ら、JP6550/97 ）。ＭＡＲについては、動物細胞および植物細胞における異なるＭＡＲ、プロモーターおよびレポーター遺伝子による解析は統一性が見られず、結果として安定発現が得られない場合が多い。原因として多くのＭＡＲが発現を上昇させること、また複数コピー導入時にはポジション効果以外の特異的なＤＮＡのメチル化などによる発現の不活性化が生じることなどが挙げられる。このため、全てのＭＡＲが染色体上の境界としての機能を有していない可能性が示唆され(Galli,1:166-172,Current opinion in plant technology (1998) 1:166-172, Matzke et al.,Current opinion in plant technology (1998) 1: 142-148) 、手法として一般化されるには至っていない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは染色体上でエンハンサー機能を遮断するインスレーターに着目した。これまでインスレーターが植物でのトランスジーンの発現にどのような効果を与えるかを調べた例はなく、インスレーターの植物での有用性に関しては不明であった。本発明では、植物におけるトランスジーンのポジション効果を減少させるために、インスレーターの利用を行った。その結果、タバコ培養細胞において導入遺伝子の発現量が増大することなく安定化することを明らかとした。本発明により、ポジション効果に関わらず、植物においてトランスジーンを安定的に発現させる方法が開発された。
【０００８】
これまでにショウジョウバエを始めとして多様な生物からインスレーターが同定されており、その例として、ショウジョウバエ由来のｇｙｐｓｙインスレーター、ｈｓｐ７０ｓｃｓ−ｓｃｓ’インスレーターおよびＦａｂ−７インスレーター、ニワトリ由来のベータグロビンインスレーター、およびヒト由来のａｐｏＢインスレーターなどがある。関与しているタンパク質も同定され始め、特にｇｙｐｓｙインスレーター、ｈｓｐ７０ｓｃｓ−ｓｃｓ’インスレーターについて解析が進んでいる（赤坂、細胞工学(1997) 16: 1476-1484）。
【０００９】
【実施例】
（インスレーターを含むバイナリーベクターの作製）
インスレーターとしては、ウニアリルスルファターゼ（Ａｒｓ）遺伝子の上流配列−２６８６から−２１０９を用いた。この配列は、赤坂ら、Dev.Growth&Differ.(1994)36:633-636に記載されている。モデルプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターのコアプロモーター（９０ｂｐ）を用いた。汎用されているＣａＭＶ３５ＳコアプロモーターＧＵＳ融合遺伝子をＢＹ２細胞の染色体上に導入すると、高頻度で遺伝子発現の不活性化が生じる。この現象には、染色体上に導入されるイベントで生じるポジション効果に加えて、ｍＲＮＡの蓄積量には細胞内いき値が存在しており、いき値を超えるｍＲＮＡが特異的に分解するという機構が関与している可能性がいわれている。インスレーターは、染色体上の境界として機能することによりポジション効果を緩和する。しかし、ｍＲＮＡ蓄積量のいき値に由来するサイレンシングを緩和することはできないと思われる。このため本研究では、細胞内いき値を下回る活性発現と思われるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを利用した。
【００１０】
植物細胞へ導入する遺伝子ＤＮＡは、すべてバイナリーベクターｐＢＩ１０１に連結した。バイナリーベクター上に２個存在するボーダー配列にはさまれた領域のＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）領域には、形質転換細胞を選抜するためのカナマイシン耐性遺伝子が予め組み込まれている。作製したバイナリープラスミドを以下に列挙し、各プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域を図１に示した。
（Ａ）ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ：（ＣａＭＶ）３５Ｓコアプロモーターの下流にＧＵＳ遺伝子を連結
（Ｂ）ＩＮＳ（＋）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ：ｍｉｎｉ３５Ｓ−ＧＵＳの５’上流にウニアリルスルファターゼ（Ａｒｓ）遺伝子のインスレーター配列（−２６８６から−２１０９）を順方向に連結
（Ｃ）ＩＮＳ（−）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ：ｍｉｎｉ３５Ｓ−ＧＵＳの５’上流に同インスレーター配列を逆方向に連結
（Ｄ）ＩＮＳ−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ−ＩＮＳ：ｍｉｎｉ３５Ｓ−ＧＵＳの５’上流と３’下流に同インスレーター配列を順方向に連結（２つのインスレーターでＧＵＳ遺伝子を挟む）
（Ｅ）ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ−ＩＮＳ：ｍｉｎｉ３５Ｓ−ＧＵＳの３’下流に同インスレーター配列を順方向に連結
（Ｆ）５００−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ：ｍｉｎｉ３５Ｓ−ＧＵＳの５’上流にラムダファージゲノムＤＮＡの５００ｂｐＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片を連結（ネガティブコントロールとして使用）
【００１１】
（タバコ培養細胞への導入）
各バイナリープラスミド（上記Ａ−Ｆ）を、アグロバクテリウム感染法により、タバコ培養細胞（ＢＹ２）の染色体上に、Gynheung et al.,Plant.Physiol.(1985) 79:568-570)に記載されている方法により導入した。目的遺伝子が導入されたと考えられる形質転換候補細胞は、カナマイシン耐性の表現型によって選抜した。
０日目に継代培養７日目のＢＹ２を取り改変ＬＳ培地に継代し、２日目にＬＢ培地に目的の遺伝子を保持するアグロバクテリウムを植菌し、２８℃で２日間暗黒で震盪培養した。４日目にＢＹ２とアグロバクテリウムをシャーレに取って軽く揺すって混ぜ、パラフィルムを巻いて２５℃で２日間、暗黒で共存培養した。６日目に共存培養液を回収し、７００ｒｐｍで３分間遠心してアグロバクテリウムを含んだ上清を除いた。遠心を３〜５回繰り返して、改変ＬＳ培地によりＢＹ２を洗浄した。洗浄後、改変ＬＳ培地で適当に希釈し、改変ＬＳ培地に揺らして撒いた。パラフィルムを巻いて、２５℃・暗黒で培養した。２〜３週間後（実験開始から約１カ月目）、カルス化した細胞を新しい改変ＬＳプレートに移し、２５℃・暗黒で３〜４週間培養しながら形質転換体を選抜した。その３〜４週間後（実験開始から約２カ月目）、半円球に増殖した細胞を、カナマイシンとカルベニシリンを含む改変ＬＳ培地に移し、２６℃・暗黒で震盪培養した。さらに２〜３週間後（実験開始から約２カ月半目）、ＢＹ−２を取って、カナマイシンとカルベニシリンを含む改変ＬＳ培地に継代した。
【００１２】
（ベータグルクロニダーゼ活性測定）
各遺伝子について独立した形質転換体を５０クローンずつ取得し、ベータグルクロニダーゼ活性（ＧＵＳ活性）の測定を行った
１ｍｌの培養細胞を取り、４℃・１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を廃棄した。ＧＵＳ可溶化バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ2 ＰＯ4 ／Ｎａ2 ＨＰＯ4ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  トライトンＸ−１００、０．１％サルコシル、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を５００μｌ加えて、氷中でホモゲナイズした。４℃・１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清（粗酵素液）を採取して、１００μｌの粗酵素液に対して１ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルクロニド（４ＭＵＧ）を加えて、３７℃で３０分間反応させる。３ｍｌの停止溶液（０．２Ｍ  Ｎａ2 ＣＯ3 ）を加えて反応を止めて、分光蛍光光度計で蛍光を測定した。
ＧＵＳ活性の測定を行った際の発色パターンを図２から図７に、また、ＧＵＳ活性の結果を定量化してまとめたものを表１に示す。表１においてＧＵＳ活性の強弱を、＋＋＋：強い、＋＋：中程度、＋：弱い、−：検出限界以下、で示す。表中の数値は、それぞれのＧＵＳ活性を示す形質転換個体数を示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
（Ａｒｓトランスレーターによる、導入遺伝子発現の安定化）
ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ａ）導入細胞では、ＧＵＳ生成が検出できないか極めて低い個体（表１における＋または−）が、４２％存在した（図２）。これに対し、ＩＮＳ（＋）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ｂ）導入細胞では５０クローン全てが青色に染色された（表１の＋＋＋と＋＋，図３）。ＩＮＳ−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ−ＩＮＳ（図１Ｄ）においても、ほぼ全てのクローンについて青色染色が見られたが（図４）、ＧＵＳ生成の低いクローンが１個存在した。これに対して、ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ−ＩＮＳ（図１Ｅ）導入細胞では、対照と比べて発現のばらつきに差が認められなかった（図５）。ネガティブコントロールとして用いた５００−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ｆ）導入細胞では、ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ａ）導入細胞以上にＧＵＳ生成のばらつきが見られた（図６）。以上のことから、ウニインスレーターをトランスジーンの５’上流または５’上流と３’下流の二カ所に連結することによって、植物細胞の染色体に組み込まれたトランスジーンの発現を安定化できることが判った。これは、インスレーターによって染色体上の遺伝子発現に対するポジション効果が抑圧されたと考えられる。
【００１５】
インスレーターは、方向性のあるエンハンサー遮断効果を示す。ＢＹ２細胞においても、インスレーターの方向が発現に影響を与えるかどうかを調べるために、ＩＮＳ（−）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ｃ）をＢＹ２細胞に導入した。その結果、ＩＮＳ（＋）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ｂ）導入細胞のＧＵＳ活性値とＩＮＳ（−）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ｃ）導入細胞のＧＵＳ活性値との分布（各１０個体）には差が認められなかった（図７）。したがって、インシュレーター配列は、挿入方向とは関係なく安定発現に寄与することが明らかとなった。また、ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ａ）導入細胞におけるＧＵＳ活性の最高値は、ＩＮＳ（＋）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ｂ）導入細胞およびＩＮＳ（−）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ｃ）導入細胞のいずれのＧＵＳ活性をも上回っていた（図７）。これは、Ａｒｓインスレーターがエンハンサーとして下流遺伝子発現の増強に機能していないことを示している。
【００１６】
（導入遺伝子のコピー数）
ＭＡＲを用いた成功例のうち、導入されたコピー数が減少することにより安定発現が得られたとされる例がある。また、コピー数に依存した発現を示したという報告もある。このため、ＩＮＳ（＋）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ｂ）を導入した１１クローンについてＧＵＳ遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、コピー数は１〜５見られ、インスレーターの付加によるコピー数の減少は見られなかった（図８）。また、１コピーあたりのＧＵＳ活性も一定ではなく、コピー数に依存した発現を示していない。さらにバンドパターンから、インスレーターの付加によってＴ−ＤＮＡが染色体の特定（同じ）領域に導入された形跡は認められなかった。
【００１７】
植物に対する遺伝子導入技術は、実際には植物体を宿主に用いて行われるため、タバコ培養細胞のみならず、植物体にインスレーターを導入する事を試みた。ここで、導入する植物として、ゴマノハグサ科に属する植物であるトレニア（ｔｏｒｅｎｉａ  ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）を用いた。トレニアに導入するために、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターにＧＵＳ遺伝子を連結した遺伝子（ＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳ遺伝子）に、ウニアリルスルファターゼ（Ａｒｓ）遺伝子由来のインスレーターを連結したバイナリープラスミドを構築した。構築した各プラスミドの構造を、図９に示した。
（Ａ）対照として用いたＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳ：構築Ａ
（Ｂ）ＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳの５’上流にインスレーターを連結した融合遺伝子：構築Ｂ
（Ｃ）ＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳの５’上流と３’下流にインスレーターを連結した融合遺伝子：構築Ｃ
【００１８】
（トレニア植物体への導入）
これら３種のバイナリープラスドをアグロバクテリウム法によりトレニアに導入した。葉片テストによってカナマイシン抵抗性を示した形質転換個体について、４ＭＵＧを基質に用いてＧＵＳ活性の測定を行った。構築Ａを導入した植物体９個体、構築Ｂを導入した植物体１１個体、構築Ｃを導入した植物体１２個体を用いて、ＧＵＳ活性の平均値及びバラツキを検討した。なお、ＧＵＳ活性の測定は、２５℃、１６時間日長条件下で１−２カ月毎に植替えながら育成したトレニア植物体の葉を用い、形質転換個体が再分化してから約１カ月後と約６カ月後の２回測定した。
【００１９】
（形質転換トレニア植物体のＧＵＳ活性）
その結果、１回目、２回目の測定共に、個体間でのＧＵＳ活性値にバラツキが見られたが、インスレーターを有する融合遺伝子を導入した形質転換体の方が、対照遺伝子導入個体に比べて活性レベルが上昇する傾向が認められた。平均値でみると、再分化１カ月後の１回目の測定結果は以下の通りであった。
構築Ａ：５７（ｎｍｏｌｅｓ  ４ＭＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｍｉｎ）
構築Ｂ：１４１（ｎｍｏｌｅｓ  ４ＭＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｍｉｎ）
構築Ｃ：１８２（ｎｍｏｌｅｓ  ４ＭＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｍｉｎ）
また、再分化６カ月後の２回目の測定結果は以下の通りであった。
構築Ａ：９０（ｎｍｏｌｅｓ  ４ＭＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｍｉｎ）
構築Ｂ：１９３（ｎｍｏｌｅｓ  ４ＭＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｍｉｎ）
構築Ｃ：２８２（ｎｍｏｌｅｓ  ４ＭＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｍｉｎ）
【００２０】
更に、２回目の測定のＧＵＳ活性分布を図１０に示した。個体毎のＧＵＳ活性値の分布を検討したところ、対照実験である構築Ａでは５０〜１００（ｎｍｏｌｅｓ  ４ＭＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｍｉｎ）、５’上流にインスレーターが結合した構築Ｂでは１００〜２００（ｎｍｏｌｅｓ  ４ＭＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｍｉｎ）、５’上流及び３’下流にインスレーターが結合した構築Ｃでは２００〜５００（ｎｍｏｌｅｓ  ４ＭＵ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｍｉｎ）の範囲のＧＵＳ活性を示す個体が最も多かった。図１０より、インスレーターが連結している融合遺伝子においてはＧＵＳ活性値の高い個体の割合が大きい事が認められた。よって、ウニ由来のインスレーターが遺伝子発現を安定化していることが、形質転換トレニア植物体においても示された。
【００２１】
【発明の効果】
インスレーターは植物細胞内で機能して導入遺伝子の発現を安定化し、本発明によりトランスジーンを植物体の中で安定に発現させることができる。
【００２２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  タバコ培養細胞に導入したバイナリープラスミドのＴ−ＤＮＡの構造を、模式的に示した図である。
【図２】  ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳを導入したＢＹ２細胞（各５０個体）のＧＵＳ活性染色である。
【図３】  ＩＮＳ（＋）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳを導入したＢＹ２細胞（各５０個体）のＧＵＳ活性染色である。
【図４】  ＩＮＳ−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ−ＩＮＳを導入したＢＹ２細胞（各５０個体）のＧＵＳ活性染色である。
【図５】  ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ−ＩＮＳを導入したＢＹ２細胞（各５０個体）のＧＵＳ活性染色である。
【図６】  ５００−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳを導入したＢＹ２細胞（各５０個体）のＧＵＳ活性染色である。
【図７】  構築した各遺伝子ＤＮＡを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性の測定値である。
【図８】  ＩＮＳ（＋）−ｍｉｎｉｐ３５Ｓ−ＧＵＳ遺伝子を導入したＢＹ２細胞の、ＧＵＳ遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして用いた、サザンハイブリダイゼーションの結果である。
【図９】  トレニアに導入したバイナリープラスミドのＴ−ＤＮＡの構造を、模式的に示した図である。
【図１０】  形質転換トレニアにおけるＧＵＳ活性の分布を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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