(57)【要約】細胞死を誘導するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモータＤＮＡ、およびそれを用いたアポトーシス抑制剤のスクリーニング方法。本発明によれば、ＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡを組み込んだベクターにより形質転換された宿主細胞を用いて、細胞死過程で細胞死を誘導するＧＡＰＤＨ蛋白を特異的に発現するＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモータ活性を測定することにより、アポトーシス抑制剤のスクリーニングを行なうことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離精製されたラットのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモータＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１、３、５または６で示される配列を有する請求の範囲１記載のプロモータＤＮＡ、またはその相補配列を有するＤＮＡ。
【請求項３】
請求の範囲１または２記載のＤＮＡを導入されたベクター。
【請求項４】
請求の範囲３記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
請求の範囲１記載のラットのＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡを用いることを特徴とするアポトーシス抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求の範囲３記載のベクターを用いることを特徴とするアポトーシス抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求の範囲４記載の宿主細胞を用いることを特徴とするアポトーシス抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
（１）ラットＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡをベクターに組み込み、（２）そのベクターで宿主細胞を形質転換し、
（３）被験化合物を添加し、
（４）宿主細胞の生存率を測定することからなるアポトーシス抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ラットの細胞死を誘導するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨと省略することがある。）のプロモータＤＮＡ、およびその用途に関する。
背景技術
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素として、グリセルアルデヒド−３−リン酸をリン酸化する、解糖系の主要な酵素のひとつとして知られており、Ｇ３ＰＤとも略記される。
一方、Ｋｅｒｒ、Ｗｙｌｌｉｅらによって提唱されたアポトーシス（計画的細胞死、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２６，２３９（１９７２））に、ＧＡＰＤＨが深く関与していることが本発明者らにより見出された。本発明者らは、新たな培養液への交換やグルコースの補充なしに、ラット小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）をＫＣｌ（２５ｍＭ）存在下で継続培養すると、培養開始より２週間以上経過後、突然にアポトーシスが生じることを報告している（特開平８−９２１２７号）。
このＣＧＣのａｇｅ−誘発性アポトーシスは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート（Ｎ−ｍｅｔｈｙ１−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＮＭＤＡ）受容体拮抗剤や抗酸化剤によって抑制されることから、内因性に遊離されたグルタミン酸によるＮＭＤＡ受容体の過剰刺激や、その後に形成される活性酸素種によるものと考えられている。
さらに、このＣＧＣのａｇｅ−誘発性アポトーシスには、ＧＡＰＤＨの過剰発現が、密接に関与していることも明らかになっている。
ＧＡＰＤＨアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡの発現を抑制すると、ＧＡＰＤＨ蛋白質の過剰発現が抑制され、ａｇｅ−誘発性神経細胞アポトーシスは抑制される。従って、ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ蛋白質の発現を抑制することによって、アポトーシスを抑制することができる。
ＧＡＰＤＨ蛋白質の過剰発現は該蛋白質の核移行を招き、神経細胞のみならず末梢組織由来の株化細胞においてもアポトーシスを著明に亢進した（ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，１０，２０２９−２０３３（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５３，７０１−７０７（１９９８））。
また、ＧＡＰＤＨは、他の神経変性疾患における原因蛋白である遺伝子産物（特にトリプレットリピート蛋白）と選択的に結合することが知られている（Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；Ｋｏｓｈｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。その遺伝子産物とは、ハンチントン病のハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２，３４７−３５０（１９９６）））、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）のアトロフィン（ａｔｒｏｐｈｉｎ）（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５，１３１１−１３１８（１９９６））、遺伝性脊髄小脳変性症（ＳＣＡ−１）のアタキシン（ａｔａｘｉｎ）、マシャドジョセフ病のアタキシン−３（ａｔａｘｉｎ−３）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）のアンドロジェン受容体などである。そのため、ＧＡＰＤＨはこれら疾患の発症に何らかの役割を果たしていると考えられる。
一方、ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモータＤＮＡは、蛋白質（ＧＡＰＤＨ）をコードする領域の上流に位置し、遺伝子の発現開始反応における調節領域のことである。基本転写装置である、ＲＮＡポリメラーゼを成分とする転写複合体との相互作用によって、該遺伝子ｍＲＮＡへの転写開始を規定している。
ＧＡＰＤＨのプロモータＤＮＡとしては、酵母のＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡが知られている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ１５８９５）。しかしながら、他の種、特に高等動物について、プロモータＤＮＡの同定に関する報告は過去になかった。更に、細胞死過程で活性化するプロモータに関しては、全く知られていない。
発明の開示
本発明は、単離精製されたラットの細胞死を誘導する（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）ＧＡＰＤＨプロモータおよびそれらを用いたアポトーシス抑制剤のスクリーニング方法に関する。
すなわち、本発明は
（１）単離精製されたラットのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモータＤＮＡ、
（２）ラットＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡを導入されたベクター、
（３）ラットＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡを導入されたベクターで形質転換された宿主細胞、
（４）ラットＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡを用いたアポトーシス抑制剤のスクリーニング方法、
（５）ラットＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡを導入されたベクターを用いたアポトーシス抑制剤のスクリーニング方法、
（６）ラットＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡを導入されたベクターで形質転換された宿主細胞を用いたアポトーシス抑制剤のスクリーニング方法に関する。
発明の詳細な説明
本発明に係るラットＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡは、配列番号１、３、５および配列番号６に示される配列を有する。
本発明には、配列番号１、３、５および６に示されるＤＮＡ配列の相補配列を有するもＤＮＡ含まれる。相補配列ＤＮＡは、アンチセンス鎖として、プロモータＤＮＡを強力に阻害する作用を有する。
さらに、本発明には、上記ＤＮＡを導入されたベクターが含まれる。本発明で用いられるベクターとしては、ウイルス、ファージ由来のベクターが挙げられ、例えば、ｐＧＬ３（プロメガ社）を挙げることが出来る。ここで言うベクターには、スクリーニングのための指標遺伝子を含んでいることが好ましい。
指標遺伝子としては、発光遺伝子（Ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ等）を用いることができる。
本発明には、上記のベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。本発明で用いられる宿主細胞としては、遺伝子導入に適したＣＯＳ細胞、ＰＣ１２細胞といった動物細胞株の他、生理的にアポトーシスを生じる細胞が好ましく、特にラット小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）が好ましい。
ＧＡＰＤＨは、先に述べたようにアポトーシスに関与している。ＧＡＰＤＨプロモータは、ＧＡＰＤＨタンパクの発現を促進する。そのため、ＧＡＰＤＨプロモータを抑制することにより、ＧＡＰＤＨの過剰発現が関与していると考えられる疾患、特に神経細胞の欠落を特徴とする神経変性疾患等の治療に用いることができる。
本発明のスクリーニング方法により、ＧＡＰＤＨプロモータ抑制作用を有する化合物のスクリーニングを行なうことができる。
本発明プロモータの取得方法
本発明のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモータ以下の方法により取得することができる。
すなわち、
（１）ラットゲノムＤＮＡライブラリーを用いて、
（２）ラットＧＡＰＤＨの翻訳領域の上流配列に相補的なプライマーとライブラリーに付加されているアダプターに相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行ない、
（３）特異増幅されたＤＮＡ断片を選び、
（４）得られたＤＮＡをベクターに組み込み、
（５）宿主細胞をこのベクターにより形質転換して培養し、
（６）得られたコロニーを、ラットＧＡＰＤＨ断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを行ない、
（７）ポジティブコロニーからプラスミドを抽出、精製することにより取得することができる。
ＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡ
本発明のラット細胞死を誘導する（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）ＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡは、高等動物からはじめて単離された新規配列である。また、既に知られている酵母ＧＡＰＤＨのプロモータＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ１５８９５）と比べたところホモロジーは５０％以下と低かった。
配列番号１で示される配列（ｐ１０４）の塩基配列番号９６０部位から下流と配列番号３で示される配列（ｐ３０２）の塩基配列番号２４０１から下流とは、相同性が非常に高いが、それより上流域の相同性は、ほとんど見られない。
アポトーシス抑制剤のスクリーニング方法
ＧＡＰＤＨプロモーターを用いることにより、細胞死を誘発するｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ＧＡＰＤＨ蛋白質の発現を抑制することのできる化合物を選択することができる。特に、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター活性化を抑制する化合物を「アポトーシス阻害剤」として容易に見出すことができる。
より具体的には、
（１）ラットＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡをベクターに組み込み、
（２）そのベクターで宿主細胞を形質転換し、
（３）被験化合物を添加し、
（４）宿主細胞の生存率を測定することにより、アポトーシス阻害剤をスクリーニングすることができる。
ここで言う、ラットＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡとは、配列番号１、３、５および６で示される配列、好ましくは、配列番号５または６で示される配列である。
配列番号１および３は、ラットＧＡＰＤＨのタンパク翻訳部分を３’−末端に一部含むが、本発明のスクリーニングに用いることができる。
配列番号２および４は、各々の３’−末端の翻訳されたタンパクを表わす。
ベクターは、汎用されているレポーターベクターであるものであればよく、好ましくは、ｐ１０４−ｐＧＬ３−エンハンサーベクターである。
スクリーニングのための宿主細胞は、動物細胞株の他、生理的条件でアポトーシスを起こすものであればよいが、好ましくはＣＧＣである。
測定は、ベクターに組み込まれたＧＡＰＤＨプロモータによって、宿主細胞のアポトーシスが進行する過程で、該プロモータが活性化し下流の遺伝子にコードされる蛋白質の発現が促進されることを利用して行う。コントロールとして、ＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡを組み込んでいないベクターにより形質転換された宿主細胞を用いることが好ましい。
測定の際、例えば、ＧＡＰＤＨプロモータＤＮＡの下流に、ルシフェラーゼ等の指標を組み込んでおき、その活性を測ることにより、プロモータ活性の測定をすることができる。また、下流に直にＧＡＰＤＨ遺伝子を組み込んだ場合は、生存細胞数を数えることで、抑制の指標としても良い。
被験化合物は、細胞死誘発剤添加直前、または同時に加えてもよく、ＤＮＡ導入による細胞障害を増強しない場合は、化合物の添加タイミングを変更してもよい。
細胞死誘発の条件として、例えば、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）の添加、ａｇｅ−誘導性アポトーシスも利用できる。
また、ＤＮＡ導入の条件によるバイアスを除去するために、内部標準酵素をもちいて、ノーマライズした酵素活性比から、プロモータ活性化度を算出してもよい。その際、内部標準の酵素活性を極端に低下させる化合物は、宿主細胞に対する毒性が懸念されるため、内部標準酵素活性を低下させずに、プロモーター下流の指標酵素活性を低下させる化合物を選択することが望ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１：ラットＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーター領域のクローニング
ラットゲノムＤＮＡ由来の、プロモーターファインダーＤＮＡウォーキングキット（クローンテック社）を用いて行なった。ライブラリーとして、ＥｃｏＲＶおよびＤｒａＩ消化を施したゲノムＤＮＡ断片を含むライブラリーを用いた。このライブラリーには、５’末端に以下のアダプター（配列番号７）が付加されているため、以下のプライマー（アダプタープライマー（ＡＰ１）およびネステッドアダプタープライマー（ＡＰ２））によりＰＣＲが可能である。
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ラットのＧＡＰＤＨ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１７８０１）のｃＤＮＡの５’−末端側、開始コドン近傍の配列から、以下のアンチセンスプライマー１（ＧＡＰ１）およびネステッドアンチセンスプライマー（ＧＡＰ２）を化学合成した。（下線の数字は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｍ１７７０１、ＲＡＴＧＡＰＤＨＡ中の塩基配列番号を示す。）
2002014509.tif 000003
プロモーターを単離するために、前述の２つのライブラリーに対して、それぞれ以下の二種のＤＮＡポリメラーゼを用いたネステッドＰＣＲを行なった。
（１）アドバンテージＴｔｈポリメラーゼ・ミックス（＃８４１８−１；クローンテック社）
反応液あたり、５−６ユニット／５０μｌになるように調製して用いた。
（２）Ｔａｑプラスロングポリメラーゼ・ミクスチュア（＃６００２０３；ストラタジン社）
反応液あたり、５ユニット／５０μｌになるように調製し、Ｔａｑスタート抗体（＃５４００１；クロンテック社）を１．１μｌ／５０μｌ加えた。
ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲシステム２４００（パーキン−エルマー社）を用いて、ＧＡＰ１、ＧＡＰ２を用いた連続ネステッドＰＣＲにより行なった。
一次反応：プライマーＡＰ１およびＧＡＰ１を用いて、９４℃で２秒、７１℃で３分間を７サイクル、９４℃で２秒、６６℃で３分間を３２サイクル、６６℃で４分間。
二次反応：プライマーＡＰ２およびＧＡＰ２を用いて、９４℃で２秒、７３℃で３分間を５サイクル、９４℃で２秒、６８℃で３分間を２０サイクル、６８℃で４分間。
ＰＣＲにより、ＤｒａＩライブラリーからは、５．３ｋｂの特異増幅した断片が得られ、これにはＥｃｏＲＶ（２．５ｋｂ）、ＳｃａＩ（１．９ｋｂ）およびＰｖｕＩＩ（０．７ｋｂ）の制限酵素認識部位が存在していた。ＥｃｏＲＶ消化により、２．５ｋｂ断片を切り出し、プロモータ３０２（ｐ３０２）と命名した。
一方、ＥｃｏＲＶライブラリーからは、１．２ｋｂの特異増幅断片が得られ、上記のｐ３０２と制限酵素地図が異なっていたため、プロモータ１０４（ｐ１０４）と命名した。
得られたｐ３０２およびｐ１０４を、各々プラスミド（ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）；ストラタジン社）のＳｒｆＩ部位に挿入し、大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’；ストラタジン社）を用いて形質転換し、培養した。得られたコロニーを、ラットＧＡＰＤＨのｃＤＮＡの５’−末端部分の合成オリゴヌクレオチド：
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（下線の数字は、ＡＴＧ翻訳開始点を１とした、ラットＧＡＰＤＨ中の塩基配列番号を示す。）をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションから、ポジティブコロニーを選択した。ポジティブコロニーから抽出したプラスミドを精製し、ｐ１０４およびｐ３０２の塩基配列を常法により決定した。各々の配列を、配列番号１（ｐ１０４）および配列番号２（ｐ３０２）に示す。
実施例２：細胞死を誘発するＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーターの同定
実施例１で得られたプロモーター領域を含む断片から、細胞死過程を誘発するプロモータ部分を決定するために、以下の実験を行なった。
プロモーター配列を挿入したプラスミド（ｐ１０４−ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）およびｐ３０２−ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋））を、ＧＡＰＤＨタンパクの翻訳開始点の直上流にある、ＢｓｍＢＩサイトで切断し、末端を平滑化した。さらに、５’−末端のＭｌｕＩサイトで切断し、プロモータ配列を含む配列を切り出した。
ｐＧＬ３−エンハンサーベクター（プロメガ社）をＭｌｕＩ−ＳｍａＩサイトで切断し、ここに、切り出した各々の配列を挿入した。
各ベクターを、以下のようにレポーターアッセイに供した。レポーターアッセイは、ラット小脳由来顆粒細胞の初代培養細胞（ＣＧＣ）を使用した。ＣＧＣは、既報（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６６，９２８−９３５（１９９６））に従い調製した。播種１６時間後に、以下のものを混合し、無血清培養系に添加した。なお、Ａ）とＢ）の比率は５：１とし、終濃度が２μｇ／ｍＬとなるよう、Ｃ）は１μＬ／μｇ　ＤＮＡ、Ｄ）は６μＬ／μｇ　ＤＮＡとなるように予め混合して培養系に添加した。
Ａ）ｐ１０４−ｐＧＬ３−エンハンサーベクター、またはｐ３０２−ｐＧＬ３−エンハンサーベクター、共にプロモーター下流にホタル・ルシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子を含む。
Ｂ）ｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター（恒常的に活性化しているＳＶ４０プロモーター下流に内部標準酵素ウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子を含む）、
Ｃ）リポフェクトアミン（ギブコ−ＢＲＬ社）、
Ｄ）リポフェクトアミンプラスリージェント（ギブコ−ＢＲＬ社）。
播種２０時間後、細胞を洗浄し、さらに４時間通常の培養を続けた。次に、シトシンアラビノシド（細胞死惹起剤；ＡｒａＣ）を終濃度５００μＭとなるように加え、さらに１４ないし２４時間培養した。
ＡｒａＣ（５００μＭ）処理したＣＧＣの生存率は、１４時間で６８％、２４時間で４４％であった。一方、ＡｒａＣ（１０μＭ）処理したＣＧＣは、１４、２４時間培養ともに生存率９０％以上であり、有意な細胞死は生じなかった（コントロール）。
ＡｒａＣ（５００μＭ）処置後、１４時間および２４時間培養した細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を表１および表２に示す（プロモーターを含まないｐＧＬ３エンハンサーベクターを導入した細胞のルシフェラーゼ活性を１．０とした。）。
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ｐ１０４−ｐＧＬ３−エンハンサーベクターで形質転換したＣＧＣ群では、培養時間に依存的にプロモータ（ｐ１０４）が活性化され、ＡｒａＣ添加後２４時間で１．７倍のルシフェラーゼの誘導が見られた。ｐ３０２−ｐＧＬ３−エンハンサーベクターで形質転換したＣＧＣ群では、プロモータ（ｐ３０２）の活性化は認められず、むしろ抑制傾向を示した（表１）。
ＡｒａＣ（１０μＭ）処置では、有意な細胞死を惹起することができず、その際には、いずれのプロモータ（ｐ１０４およびｐ３０２）も有意な活性化を示さなかった（表２）。
このことから、ｐ１０４で示される配列が、細胞死過程を誘発するプロモータ活性を有することが解った。
実施例３：Ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ＧＡＰＤＨプロモータ活性抑制化合物のスクリーニング
実施例２と同様にして、ＤＮＡを導入したプラスミド（ｐ１０４−ｐＧＬ３−エンハンサーベクター）をＣＧＣ培養系に添加し、形質転換した。播種２０時間後、細胞を洗浄し、更に４時間培養を続けた。次に、ＡｒａＣ（細胞死惹起剤）を終濃度５００μＭとなるように加え、１４ないし２４時間培養した。なお、ＡｒａＣ曝射１時間前に被験化合物を終濃度０．００１〜１０μＭとなるように添加した。培養後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定し、被験化合物のＧＡＰＤＨプロモータ活性阻害率を算出した。
阻害率は、溶媒のみを添加した場合を０％とし、有意なホタル・ルシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性の上昇がないレベルを１００％阻害とした。
【配列表】
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2002014509.tif 000015
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【国際調査報告】
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