(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微細藻類、ピングイクリシス・ピリホルミス。
【請求項２】
EPA及びDHAを含む高度不飽和脂肪酸を生産する請求項１に記載の微細藻類。
【請求項３】
DHAよりEPAを多く含む高度不飽和脂肪酸を生産する請求項１に記載の微細藻類。
【請求項４】
高度不飽和脂肪酸生産能を有する微細藻類株、ピングイクリシス・ピリホルミス・カワチ・エト・チハラ・ゲン・エト・エスピー・ノヴ株。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の微細藻類を培地に培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規微細藻類ピングイクリシス・ピリホルミス、及び前記種に属する一藻類株ピングイクリシス・ピリホルミス・カワチ・エト・チハラ・ゲン・エト・エスピー・ノヴ（Pinguichrysis pyriformis Kawachi et Chihara gen.et sp.nov.）株、並びにそれらを用いた高度不飽和脂肪酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高度不飽和脂肪酸には様々な生理活性が認められることから、医薬、食品の製造業界などから注目されている。しかしそれらの有機合成は困難であり、魚類などの海産動物からの供給に頼っているのが現状である。高度不飽和脂肪酸の中でもＤＨＡとＥＰＡは、抗血液凝固作用、抗癌作用、脳疾患の改善作用を有し、多くの需要が見込まれている。現在それらは魚油から抽出されているが、不純物の混入や供給の安定性が問題となっている。これに代わる安定した生産技術、更に純度の高い生産の開発が求められている。
【０００３】
海産動物の多くは高度不飽和脂肪酸の合成能を欠くことから、動物に含まれるＥＰＡやＤＨＡの起源は合成能を備えた微細藻類に由来すると考えられている。つまり海産動物の高度不飽和脂肪酸は、微細藻類から動物プランクトンへ、そしてそれらを餌とする魚類、その他の海産動物に繋がる一連の食物連鎖を経て蓄積したものといえる。微細藻類は多様な系統群からなり、その脂肪組成は系統群によって大きく異なることが知られている。このような状況を踏まえて、多様な微細藻類をターゲットとし、高度不飽和脂肪酸の生産能の高い微細藻の探索を行い、生産能の高い新規微細藻を提供することを目的として研究をすすめた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高度不飽和脂肪酸生産能の高い新規微細藻類、及びそれらを用いた高度不飽和脂肪酸の生産手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、パラオ島沖の海水を採取し、その中から高度不飽和脂肪酸の高い生産能を有する新規微細藻類ピングイクリシス・ピリホルミス・カワチ・エト・チハラ・ゲン・エト・エスピー・ノヴ株（以下「本株」と略す）を見い出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、高度不飽和脂肪酸生産能を有する微細藻類、ピングイクリシス・ピリホルミスである。
また、本発明は、高度不飽和脂肪酸生産能を有する微細藻類株、ピングイクリシス・ピリホルミス・カワチ・エト・チハラ・ゲン・エト・エスピー・ノヴ株である。
【０００７】
更に、本発明は、ピングイクリシス属に属し、高度不飽和脂肪酸生産能を有する微細藻類を培地に培養し、培養物から高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の製造方法である。
【０００８】
なお、本株は（株）海洋バイオテクノロジー研究所において、保存番号PP301 として保存管理されている。
【０００９】
以下本発明を詳細に説明する。
１．本株の選抜手段
本発明者らは、太平洋南西海域（北緯８度１６分、東経１３４度３０分）において、表層海水を採取し、海水ベースの培地、ＥＳＭ培地に約１mlの採取海水を滴下して、光照射下25℃で集積培養を行った。その結果、増殖した本株をマイクロピペットによる分離法と希釈培養法を併用することで分離した。
【００１０】
２．本株の藻類学的性質
Ａ．形態的成城
（１）光学顕微鏡下で観察した栄養細胞は、球形から洋梨形の細胞形で、全長３−５μｍである。細胞の膨潤部分に黄色の葉緑体が１個存在する。光学顕微鏡下で観察された形状は、図１のＡおよびＢに示される。
【００１１】
（２）栄養細胞の細胞膜は、外界に対して露出した裸の細胞であり、鱗片や細胞壁のような細胞外被構造は認められない。
【００１２】
（３）電子顕微鏡で観察した栄養細胞には、核、葉緑体、ミトコンドリア、ゴジル体、１個の小胞が認められる。栄養細胞の細胞構造は図２のＡに示される。（４）葉緑体は４重膜構造からなり、外側の２重膜は核膜と融合する。また葉緑体のチラコイド膜は３重膜構造からなる。更に葉緑体の内側の２重膜に近接して、ガードルラメラと呼ばれるチラコイド膜が存在する。葉緑体の微細構造は図２のＢおよびＣに示される。
【００１３】
（５）葉緑体の中には埋没型のピレノイドが存在する。このピレノイドには葉緑体の内側の２重膜の陥入が認められる。葉緑体の中のピレノイドの形状は図２のＢに示される。
【００１４】
Ｂ．生殖様式
（１）本株は無性生殖で増殖する。有性生殖は観察されない。
（２）栄養細胞は２分裂により増殖する。細胞分裂に先立って、葉緑体は２個に分裂する。葉緑体の分裂過程は図１のＣおよびＤに示される。
【００１５】
Ｃ．生理的・生化学的性状
（１）培養：ＥＳＭ、Ｋ培地に代表される海水ベースの培地で培養できる
（２）光合成能：光独立栄養的に生育できる
（３）光合成色素：クロロフィルａ、クロロフィルｃ、フコキサンチンなどを含む
（４）生育温度域：17.5〜30℃（至適生育温度：25℃）
（５）生育pH域：pH7.０〜9.０（至適生育pH：8.０）
【００１６】
３．本株の分類上の位置決定
本株は光合成色素としてクロロフィルａとｃ、フコキサンチンなどを有する黄色の藻類である。細胞膜の外側には、炭酸カルシウムや珪酸質、あるいは多糖類などの有機質でできた細胞外被構造は存在せず、いわゆる裸細胞である。葉緑体は４重の膜構造からなり、その外側の２重膜は核膜と融合する。またミトコンドリアはチューブ状のクリステを有する。以上の特徴は黄色植物門の黄金色藻とハプト植物門に認められる特徴である。しかし葉緑体内に存在するガードルラメラと呼ばれるチラコイド膜構造はハプト植物では認められないことから、本株は黄色植物の黄金色藻綱に所属すると考えられる。
【００１７】
本株の細胞サイズは全長３〜５μｍと極めて小さく、過去に記載された黄金色藻の種とは明らかに区別できる。Aureococcus anophagefferens （Sieburth et al. (1988)）とPelagococcus subviridis （Lewin et al.(1977)）の２種だけが、細胞サイズと鞭毛を有する細胞が認められない点で、本株と共通の特徴を有する。しかしこれら２種の細胞は球形であり、洋梨形の細胞の本株とは形状が異なり、光学顕微鏡でも識別できる。また、A. anophagefferensとP. subviridis の２種では細胞膜の外側に外被構造が存在するが、本株には細胞外被構造は認められないこと、そして葉緑体中のピレノイドの有無と形状の点でも本株と２種の間には相違が認められた。以上の形態特徴に基づいて、本株を新属新種と判断し、ピングイクリシス・ピリホルミス（Pinguichrysis pyriformis）と命名した。属名は栄養のある、脂肪の多いという意味で、高度不飽和脂肪酸の含有率が高いという本株の特徴に由来する。種名は洋梨形の細胞の形状に由来する。
【００１８】
４．本株の脂肪酸組成
本株で検出された主要な脂肪酸の組成を表１に示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
表１が示すように、本株で検出される脂肪酸は、14：０、16：０、16：１、18：２、20：４、20：５（ＥＰＡ）、22：５（ＤＨＡ）の７種類で、既知の微細藻の脂肪酸組成と比較して単純な組成からなる。この脂肪酸組成は、培養温度を20〜30℃の範囲で変えても、ほとんど変化が認められない。本株の示す最大の特徴は、高度不飽和脂肪酸である20：４、20：５（ＥＰＡ）、22：５（ＤＨＡ）の比率が高く、全脂肪酸の61〜65％に達することである。高度不飽和脂肪酸の中でもＥＰＡの比率は特に高く、最大で全脂肪酸の54.5％に達する。また、14：０と20：４の間の脂肪酸の割合が低いことも特徴として挙げられる。
【００２１】
５．本株の培養条件、及び高度不飽和脂肪酸の採取手段
本株の培養には、黄金色藻綱に属する微細藻類に用いられる一般的培養手段を適用することができる。培地としては、海水をベースにこれに適当な栄養塩を添加した培地を用いることができる。栄養塩としては、例えば、窒素源としてＮａＮＯ3 、ＫＮＯ3 等、リン源としてＫ2 ＨＰＯ4 、ＫＨ2 ＰＯ4 、グリセロリン酸ナトリウム等を挙げることができる。好ましい培地としては、ＥＳＭ培地、Ｋ培地、ＰＥＳ培地、１／２ｆ培地等を例示することができる。培地中のｐＨは、本株の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はないが、７〜９に維持することが好ましい。培養時の温度は、本株の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はないが、２０〜３０℃に維持することが好ましい。光条件は、光合成可能な条件であれば特に制限はないが、連続光とすることが好ましく、照度は５０〜２５０μEm-2sec -1とするのが好ましい。通気は、必ずしも必要ではないが、増殖効率を考えると、行うことが望ましい。通気量は、特に限定されないが、０．０１〜０．１vol/min が好ましい。以上のような条件で培養すると、培養開始から５〜１０日程度で、高度不飽和脂肪酸を採取できる程度の量に本株が増殖する。
【００２２】
本株から高度不飽和脂肪酸を採取する方法は、常法に従って行うことができ、例えば、遠心分離等により藻体を分離した後、クロロホルムなどの適当な溶媒で抽出することにより本株由来の高度不飽和脂肪酸を採取することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
【００２４】
【実施例】
内径140mm 、高さ300mm の透明円筒形培養槽に天然海水をベースとした下記のＥＳＭ培地を4000ml入れ、オートクレーブで15分間の滅菌処理を行った後に、本株を植菌し、培養槽の外周からサークライン蛍光灯で連続照射下（約100μEm-2sec-1)、25℃、通気量（0.45μｍ孔径のフィルターを通した空気）0.05vol／min 、pH8.０の条件で制御を行い培養した。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
遠心分離によって本株の回収を行い、ペレットサンプルを５mlのクロロホルム−メタノール溶液（容積比１：１）で２回抽出し、上清液の回収とペレットの除去を行った。抽出サンプルに蒸留水−メタノール溶液（容積比１：１）を５ml加え、懸濁後、遠心を行い、クロロホルム溶液層（２層に分離した下側の層）を回収した。これに窒素ガスを吹き付け、溶媒を揮発させ、乾固させた。次に乾固した試料に５％塩化水素−メタノール溶液を１ml加え、更に内部標準物質として１mgのペンタデカン酸（15：０）を加え、ドライバス内で90℃、２時間反応させて、メタノリシスを行った。反応後、２mlのｎ−ヘキサンで２回抽出し、水で洗浄した後に、窒素ガスを吹き付け、濃縮してガスクロマトグラフィーの試料とした。メチルエステル試料の分離はシリカキャピラリーカラム（クロムバック社製、カタログNo.AG27488）を取り付けた島津ガスクロマトグラフィーGC-17Aを用いて行い、結果を島津クロマトパックC-R7A plusで解析した。分離条件は、カラム初期温度を70℃で１分、その後１分間に20℃の速度で 180℃まで昇温、 180℃から 220℃まで１分間に３℃の速度で昇温、試料気化室温度は 270℃、ＦＩＤ検出器温度は 300℃となるように設定して行った。内部標準物質のピーク面積との対比から、各脂肪酸を定量した。
【００２７】
前述した条件で７日間の培養を行い、乾燥重量にして約100mg/ｌの藻体を得た。この試料から、ガスクロマトグラフィーの試料を作成し、脂肪酸の定量を行った。また、対照として２種の餌料藻類（Nannochloropsis 、Isochrysis）についても同様に脂肪酸の定量を行った。結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】
本株と餌料藻類２種の脂肪酸含有量(乾燥藻体100mgあたりの重量(mg))
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【００２９】
表３が示すように、本株の細胞は、乾燥藻体100mg あたり、20：４が0.８mg、ＥＰＡが約7.３mg、ＤＨＡが約1.２mg含まれており、高度不飽和脂肪酸の総量は9.３mgに達した。
【００３０】
【発明の効果】
本発明は、様々な生理活性を有する高度不飽和脂肪酸を、効率的に生産し得る技術を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】栄養細胞の生物の形態を表す光学顕微鏡写真
【図２】栄養細胞の生物の形態を表す電子顕微鏡写真
【図３】本株の脂肪酸のガスクロマトグラフの結果を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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