(57)【要約】本発明は、腫瘍特異免疫を発現させるためのＤＮＡワクチンに関する。より詳細には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、及び、ＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原をコードする発現ベクターを含むＤＮＡワクチンに関する。ここでＣＤ４により認識される抗原は好ましくは、ＳＥＲＥＸ法により同定された分子であり、ＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原は好ましくは、腫瘍抗原である。また、これに限定されるわけではないが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原は好ましくは同一の細胞で発現され、提示されることを可能とするように、該発現ベクターは同一の金粒子上に固定され、遺伝子銃により細胞内へ投与されるものである。する薬剤としても利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、及び、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞により認識される抗原をコードする発現ベクターを含む組成物。
【請求項２】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原がＳＥＲＥＸ法により同定される分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞により認識される抗原が腫瘍抗原である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原がＨＥＲ２である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原がＨＥＲ２およびＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２である、請求項３または４記載の組成物。
【請求項６】
両抗原をコードするポリヌクレオチドが各々、異なる発現ベクターに含まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
両発現ベクターが同一の担体粒子上に固定された、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を含むワクチン。
【請求項９】
遺伝子銃を用いて投与される、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
癌の予防及び／または治療のための請求項８または９に記載のワクチン。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物において腫瘍特異的免疫を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体内において腫瘍特異免疫を発現させるためのワクチンに関する。より詳細には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、及び、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原をコードする発現ベクターを含むポリヌクレオチドワクチンに関する。ここでＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原は好ましくは、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）法により見つけられた分子であり、ＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原は好ましくは、腫瘍抗原である。また、これに限定されるわけではないが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原をコードする発現ベクターは、好ましくは同じ細胞で発現され、提示されることを可能とするように同一の担体粒子等の上に固定され、細胞内へ投与されるものである。
背景技術
ここ１０余年来、日本における死亡原因では癌が第一位を占めており、手術、放射線及び化学療法と共に免疫療法も第４の治療法として期待されている。免疫療法は生体内の免疫応答のシステムを利用した治療法である。免疫応答の誘起と制御はＢリンパ球、Ｔリンパ球、抗体、及び、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の間の相互作用により行われる。まず、外来抗原はＡＰＣによるプロセシングを受け、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩ分子に結合され、ヘルパーＴ細胞に提示される。ヘルパーＴ細胞によりＭＨＣに結合した外来抗原が認識されることにより、Ｔ細胞の活性化が起こり、サイトカインが分泌され、抗原で刺激されたＢ細胞が抗体産生細胞へと分化するのを助けると共に、キラーＴ細胞の分化も促す。分泌された抗体及び活性化されたキラーＴ細胞により抗原を提示する細胞が排除され、外来抗原を排除する細胞性・体液性の反応が進行する。
抗原を発現する細胞のＴ細胞による排除は主に、１）体液性免疫（活性化ヘルパーＴ細胞により特異的Ｂ細胞クローンの増殖・分化が刺激され抗体が産生され、抗体が抗原の認識と排除に働く）、２）特異的細胞性免疫（活性化ヘルパーＴ細胞により抗原特異的に反応する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導され、直接標的に作用する）、及び、３）非特異的細胞性免疫（活性化ヘルパーＴ細胞により非特異的なナチュラルキラー細胞や活性化マクロファージ等が誘導されて働く）に分類することができる。以上のようにＴ細胞が中心的な役割を果たして、標的となる抗原を認識し免疫応答が動員される。
腫瘍拒絶においても、先天性及び自己由来の腫瘍細胞、または、その断片誘導体を用いた適当な免疫化により宿主細胞において抗腫瘍免疫応答が誘導されることが古くから知られている（Ｌ．Ｇｒｏｓｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：３２６−３３３（１９４３）；Ｅ．Ｊ．Ｆｏｌｅｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：８３５−８３７（１９５３）；Ｒ．Ｔ．Ｐｒｅｈｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｍａｌｎ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１８：７６９−７７８（１９５７）；Ｇ．Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０：１５６１−１５７２（１９８０年）；Ｌ．Ｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：８０−１０６（１９６２）；Ａ．Ｇｌｏｂｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．３２：１２２９−１２４３（１９６４））。このような抗腫瘍免疫システムにおけるＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の役割が注目されている（Ｒ．Ｊ．Ｎｏｒｔｈ，Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：８９−１５５（１９８４）；Ｐ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１−３５５（１９９１）；Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｄｏｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５８８−５９４（１９９８））。特異的に免疫化されたマウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて腫瘍標的細胞を破壊することができ（Ｈ．Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３１：７７−１２４（１９８０））、免疫化されたドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞の受身的な転移（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）は感受性マウスに腫瘍移植に対する抵抗性を与える（Ｒ．Ｊ．Ｎｏｒｔｈ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：８９−１５５（１９８４）；Ｐ．Ｄ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１−３５５（１９９１）；Ｃ．Ｊ．Ｍ．Ｍｅｌｉｅｆ，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１４３−１７５（１９９２））ことが報告されている。さらに、抗ＣＤ８＋抗体は予め免疫化されたマウスの腫瘍移植に対する抵抗性を消失させる（Ｅ．Ｎａｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ａ．Ｕｅｎａｋａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：３４５−３５５（１９８５）；Ｘ．Ｇ．Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：３３８５−３３９０（１９９８）；Ｙ．Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：２２１９−２２２３（１９９４））ことも知られている。ここ十年で、マウス及びヒトの腫瘍細胞由来でＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されるＭＨＣクラスＩ結合ペプチドが明らかにされてきた（Ｔ．Ｂｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７−３６８（１９９４）；Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１−２８７（１９９９））。
腫瘍抗原、即ち腫瘍細胞上の標的分子には、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される腫瘍ペプチドで細胞性免疫の主役であるＣＤ８＋ＣＴＬの標的である分子（腫瘍拒絶抗原）、及び、腫瘍細胞膜に発現する腫瘍関連抗原と呼ばれる体液性免疫（抗体）の標的となる分子の２つの形態が存在する。Ｔリンパ球に認識されるヒト腫瘍抗原が遺伝子レベルで明らかにされて以来、種々のヒト腫瘍拒絶抗原が見出されている。メラノーマにおいて、腫瘍拒絶抗原を用いた特異免疫療法としてのワクチン療法による明らかな抗腫瘍効果も認められている。更に、サイトカインを併用しての免疫療法効果の増強や、抗原ペプチドをパルスした樹状細胞、または、抗原遺伝子を導入した樹状細胞の応用も試みられており、最近ではＤＮＡワクチンも試みられている。
また、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるヘルパー作用を増大させる方法も多数、試みられている（Ｄ．Ｐａｒｄｏｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５８８−５９４（１９９８）；Ｒ．Ｆ．Ｗａｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２６９−２７６（２００１））。従来の方法は３つに分類することができる。１つは、例えば抗原のハプテン化（Ｙ．Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７４：１２６９−１２７３（１９８５））、または、抗原に異種免疫原性ペプチドを直接連結させる方法（Ｒ．Ｗ．Ｃｈｅｓｎｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｓｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｄｓ．Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ（Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ．８４７−８７４；Ｊ．Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１５５８−１５６５（２００１））等の免疫抗原自体の修飾である。第２の方法は、腫瘍抗原と、腫瘍抗原をコードするウイルスベクター（Ｍ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：４６８５−４６９２（１９９５））等の強いヘルパー決定基を持つ分子との共免疫化による方法である（Ｒ．Ｒｏｍｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．１６１：５１３３−５１３７（１９９８）；Ｎ．Ｃａｓａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．３１：１７８０−１７８９（２００１））。最後の方法は、ＣＤ４０リガンド（Ｊ．Ｐ．Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３９３：４７４−４７８（１９９８）；Ｓ．Ｒ．Ｍ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３９３：４７８−４８０（１９９８）；Ｓ．Ｐ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３９３：４８０−４８３（１９９８））、及び、ＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルパー機能及びＡＰＣのＣＤ４＋Ｔ細胞との相互反応を調節するその他の刺激性または共刺激性シグナル（Ａ．Ｐｏｒｇａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１０７５−１０８２（１９９８））等の分子シグナルにより、これらのシグナルの発見によりＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増大させる方法が提供されると考えられている。
一方、抗体は従来、抗腫瘍エフェクター機能に関しては大した役割を有さないと考えられていたが、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原（Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７）；Ｅ．Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６２５−６３０（２０００）；Ｅ．Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１２１９８−１２２０３（２０００））は、細胞性免疫及び体液性免疫の両方を含む強い完全な免疫応答を誘導する。腫瘍に対するワクチンとなり得る腫瘍関連抗原を同定する方法として、近年Ｍ．Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７））によりＳＥＲＥＸと呼ばれる方法が開発された。該方法は、ヒト血清を用いてヒト腫瘍のｃＤＮＡ発現ライブラリーの検索を行うものであり、インターネットには、ＳＥＲＥＸ法により同定された遺伝子がＳＥＲＥＸデータベースとして１８００種を超えて登録されている（ｗｗｗ．ｌｉｃｒ．ｏｒｇ／ＳＥＲＥＸ．ｈｔｍｌ）。
しかし、同定された抗原ペプチドやＤＮＡによりいかに効率良く腫瘍特異免疫を誘導し、腫瘍を完治させるためにどのようなアジュバントやＡＰＣを用いるべきか、腫瘍の免疫系からの逃避にどのように対処するかといった多数の問題についての解決は未だ為されていない。
ところで、ＣＴＬの定量的／定性的な増幅におけるヘルパーＴ細胞の必要性が良く報告されているが、それらにより認識される抗原分子の性質、及び、抗腫瘍免疫応答に対する機能的影響については未だにほとんど知られていない（Ｐ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１−３５５（１９９１）；Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｄｏｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５８８−５９４（１９９８）；Ｓ．Ｒ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６５−７０（１９９７）；Ｒ．Ｆ．Ｗａｎｇ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２６９−２７６（２００１）；Ｃ．Ｆａｙｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４０６９−４０７３（１９９１）；Ｍ．Ｓｈｉｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１５４９−１５５６（１９９４）；Ｋ．Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２３５７−２３６８（１９９８）；Ｆ．Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３−７０２（１９９８）；Ｙ．Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５００５−５０１１（１９９６）；Ｔ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：６１７−６２７（１９９９）；Ｄ．Ｒ．Ｓｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５６２−５６５（２０００）；Ａ．Ｆｒａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１４５−１５０（２０００）；Ｃ．Ｎ．Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３９０２−３９１２（２０００）；Ｆ．Ｆａｌｌａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５４９５−５５０１（２０００）；Ａ．Ｌ．Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１０７１−３３９０（１９９９）；Ａ．Ｌ．Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６０４７−６０５５（２０００））。最近提案されているヘルパーＴ細胞、ＣＴＬ及びＡＰＣ間の連続的な細胞間相互作用では、抗腫瘍免疫応答に関係するヘルパーＴ細胞が、広い範囲にわたる多様な抗原を認識する可能性が示唆されている（Ｊ．Ｐ．Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８（１９９８）；Ｓ．Ｒ．Ｍ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８−４８０（１９９８）；Ｓ．Ｐ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０−４８３（１９９８）；Ｚ．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：５４１−５５０（２０００））。
上記において述べたＳＥＲＥＸ法によりヒト及びマウス腫瘍における体液性免疫応答の分析が大幅に進められている（Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７）；Ｅ，Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６２５−６３０（２０００）；Ｅ．Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１２１９８−１２２０３（２０００）；Ｕ．Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）；Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１１６３−１１６７（１９９８）；Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ，（２０００）ｉｎ“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ”，ｅｄ．Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）ｐｐ．５５７−５７０；Ｔ．Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８８：８４５−８５１（２０００））。ＳＥＲＥＸ法により同定された遺伝子の多くが完全に配列決定した場合に野生型と同じ配列、即ちアミノ酸置換等を有さないことが報告されている（Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１１６３−１１６７（１９９８）；Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ，（２０００）ｉｎ“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ”，ｅｄ．Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）ｐｐ．５５７−５７０）。従って、これらの分子は変異により免疫原性を示すものではなく、また幾つかのＳＥＲＥＸ抗原は普通の組織において腫瘍における限定的な発現（例えば、癌／精巣抗原及びメラニン細胞分化抗原等）を示すが、ほとんどのＳＥＲＥＸ同定抗原は普遍的に発現されている。しかしながら、これらの野生型分子に対して高い力価を有する抗体が関連または非関連癌患者の血清試料中で、健常者と比べてより多く見つかっている。現在のところ、これらの腫瘍産物の増幅された発現が体液性免疫を誘起する免疫原刺激であるとされている。これらの分子の全てがＩｇＧクラスの抗体により検出されるので、これらの野生型分子のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞による認識が考えられる。上記知見を勘案し、発明者らは腫瘍細胞の免疫原性野生型分子がＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を活性化することにより腫瘍特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを増幅させることができるか、即ち抗腫瘍免疫応答に関与するかどうかを本発明において調べた。
ＤＮＡワクチンに関しては、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡの筋肉内投与により体液性及び細胞性免疫応答の両方が誘発されることが証明されている。ＤＮＡワクチンが免疫応答を誘発する正確な機構は現在のところ不明であるが（Ｐａｒｄｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：１６５−１６９（１９９５）参照）、その有効性は、体液性及び細胞性免疫の誘発により示される。この結果は、ＤＮＡワクチンの投与後にｎａｋｅｄ  ＤＮＡが発現され、そのペプチド産物がＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ蛋白質と共に抗原として提示されることを示す。
ＣＴＬ上のＴ細胞レセプターがＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩ分子と結合したウイルスまたは細菌等の由来の外来ペプチドを抗原として認識することにより、各種リンホカイン産生及び細胞増殖等の反応を促し、ペプチドが由来するウイルスまたは細菌等に感染した細胞を殺すことが知られている。これらの抗原ペプチドは、その病原体中での存在場所や機能に関係なくＡＰＣまたは他の細胞が細胞内に取込み、処理した断片である。人工的にＣＴＬ応答を生じさせるためには、細胞内で蛋白質抗原を産生させる複製ベクターを用いる（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１５３（１９９０）；Ｃ．Ｋ．Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６（１９９１）；Ａ．Ａｌｄｏｖｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４７９（１９９１）；Ｒ．Ｓｃｈｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：５３（１９９２）；Ｃ．Ｓ．Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６７９（１９９２））か、または、細胞質ゾル中にペプチドを導入する方法（Ｆ．Ｒ．Ｃａｒｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：６０３（１９８９）；Ｋ．Ｄｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１（１９８９）；Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：８７３（１９９０）；Ｄ．Ｓ．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３３３６（１９９２）；Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２３５７（１９９２））が知られている。
また、ｎａｋｅｄポリヌクレオチドをワクチンとして脊椎動物に摂取する方法が検討されている（ＷＯ９０／１１０９２（１９９０年１０月４日）。マウス腹腔内、静脈内または筋肉内に投与された塩化カルシウム沈殿ＤＮＡが発現され得ることが公知である（Ｎ．Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｌ．Ｒｅｓｈｅｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９５５１−９５５５（１９８６））。マウスにおいて、ＤＮＡ発現ベクターを筋肉内注射することにより筋肉細胞に該ベクターが取込まれ、細胞内で該ベクターの発現が起こることが示された（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：８１５（１９９１））。この場合、該ベクターはエピソームとして維持され、複製はされなかった。ラット、魚及び霊長類の骨格筋、並びに、ラット心筋への注射後には永続性の発現が観察された（Ｈ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２９０：７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３６３（１９９２））。また、ＡＰＣ表面のＢ７及びＭＨＣのエピトープの提示が、腫瘍除去の際のＣＴＬ活性化において同程度の役割を果たすことが報告されている（Ｅｄｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１１１７−１１１９（１９９３））。この際に、ＡＰＣ表面のＭＨＣ分子がＴ細胞レセプターにエピトープの提示を行うと、同じＡＰＣ表面上に発現されているＢ７がＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８に結合し、第２のシグナルとして作用する。その結果、ＡＰＣを壊すＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるシグナルを発するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が急速に分裂する。
ＤＮＡによる免疫化のためには、ＤＮＡの筋肉内投与の形態を必ずしも取る必要はなく、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆した金粒子をマウスの皮膚に投与することによりマウスで抗ＢＧＨ抗体が産生されることがＴａｎｇらにより示された（Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２−１５４（１９９２））。また、皮膚以外にもジェット注射器を使用して生きている動物の筋肉組織、脂肪組織及び乳腺組織等をトランスフェクトすることができることが報告されている（Ｆｕｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０５：３６５−３６８（１９９２））。核酸を生体内へ導入し得る種々の方法が総説（Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１（１９８９））としても発表されている。ＷＯ９３／１７７０６には、動物にウイルスに対するワクチン摂取する方法として、担体粒子を遺伝子構築物で被覆し、被覆した粒子を動物の細胞内に投与する方法が記載されている。ヘルペスウイルスに対するＤＮＡ免疫化（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５６６４−５６６７（１９９３））等が報告されている。また、ＤＮＡワクチン、並びに、その製造法及び投与法等のについては米国特許第４，９４５，０５０号、第５，０３６，００６号、第５，５８９，４６６号、及び、ＷＯ９４／１６７３７等にも記載されている。
発明の開示
本発明の目的は、腫瘍に対するより有効な免疫療法を提供することであり、早期癌の根治療法、術後の癌の再発または転移の抑制療法、及び、腫瘍が発見されながらも手術が不可能で放射線及び化学療法も有効でない患者に対する治療法を提供することである。
本発明は、腫瘍特異免疫を発現させるためのワクチンに関するものであり、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、及び、ＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原をコードする発現ベクターをポリヌクレオチドワクチンとして用いることにより腫瘍特異免疫を誘導することができるという発見に基づくものである。従って、本発明はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞より認識される抗原、及び、ＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原をコードする発現ベクターを含む組成物に関する。より詳細には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原は好ましくはＳＥＲＥＸ法により見つけられた分子であり、ＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原は好ましくは腫瘍抗原である。また、これに限定されるわけではないが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原は好ましくは同じ細胞で発現され、提示されることを可能とするように同一の担体粒子上に固定され、細胞内へ投与されるものである。
本明細書中に記載の「ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原」とは、成熟したヘルパーＴ細胞、及び、その前駆体細胞上に発現する糖タンパク質ＣＤ４のエピトープとなる部分を含むポリペプチドを指す。Ｔ細胞受容体がＭＨＣクラスＩＩにより提示された抗原を認識する際に、ＣＤ４はＭＨＣクラスＩＩのβ２ドメインに結合し、Ｔ細胞の抗原認識能を高め、細胞内にシグナル伝達し、増殖やサイトカインの分泌を促進する働きを持つ分子である。本発明では、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に認識される分子のうち特にＳＥＲＥＸ法により同定される分子である。これらに限定されるわけではないが、熱ショックタンパク質であるＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２、ＤＮＡリガーゼ１、ガレクチン１及び、ｐｏｌｙ（Ａ）結合タンパク質、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘキサメチレン−ビス−アストアミド誘導性（ＸＭ＿００８３４８）、ヒトレチノイン酸応答性蛋白質（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｕ５０３８３）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ肝炎デルタ抗原反応蛋白質Ａ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ；ＤＩＰＡ）（ＸＭ＿００６５０３）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ２０６４４  ｆｉｓクローンＫＡＴＯ２５８８（ＦＬＪ２０６４４ｆｉｓ）（ＡＫ０００６５１）等を挙げることができる。本明細書中の「ＳＥＲＥＸ同定分子」とは、ＳＥＲＥＸ法により同定されたこれらの分子を意味する。また、本明細書中の「免疫原性野生型細胞性分子」とは、上述のような特にＳＥＲＥＸ法で同定されたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に認識される分子を指す。
また、本明細書中の「ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原」とは、ＣＴＬとその前駆体細胞の細胞膜状に発現する膜貫通型の糖蛋白質ＣＤ８のエピトープとなる部分を含むポリペプチドを指す。Ｔ細胞受容体はＭＨＣクラスＩによって提示された抗原を認識する際に、ＭＨＣクラスＩのα３ドメインに結合し、それによりＴ細胞の抗原認識能が高められ、細胞内にシグナルが伝達される。本明細書中の「ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原」は、このような経路によるＴ細胞の増殖や細胞障害性活性を促進する働きを持つ分子である。特に好ましくは、腫瘍抗原を指し、腫瘍に関連した抗原、及び、特定の腫瘍細胞に特異的に発現している抗原を指す。これらに限定されるわけではないが、例えば、変異ＭＡＰキナーゼであるＥＲＫ２（ｍＥＲＫ２）、ＨＥＲ２およびＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２等のポリペプチドを挙げることができる。特にＨＥＲ２は、ヒトＨＥＲ２  ｃＤＮＡ（ｃ−ｅｒｂＢ−２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡ）によりトランスフェクトされ生じるＣＭＳ５ａ由来のセルラインである先天性肉腫ＣＭＳ１７ＨＥＲ２の腫瘍拒絶抗原であり（Ｙ．Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３３６−１３４３（１９９７）；Ｘ．Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３３８５−３３９０（１９９８）；Ｙ．Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：５５３−５５８（２０００）；Ｔ．Ｏｋｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３３３８−３３４６（２０００））、本発明におけるＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原として好ましい。ここで、ＨＥＲ２はその全長を利用しても良いし、免疫原性を示す断片であってもよい。ＣＭＳ１７ＨＥＲ２に対する腫瘍拒絶抗原、また、ＣＤ８＋Ｋｄ限定細胞毒性Ｔ細胞の標的として９ｍｅｒのペプチドＨＥＲ２  ｐ６３−７１（Ｔ）ペプチド（アミノ酸配列“ＴＹＬＰＴＮＡＳＬ”）が同定されている（Ｙ．Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３３６−１３４３（１９９７）；Ｘ．Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３３８５−３３９０（１９９８）；Ｙ．Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：５５３−５５８（２０００）；Ｔ．Ｏｋｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３３３８−３３４６（２０００））。このような抗原性部位を含む断片が特に好ましい。また、ＨＥＲ２とＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２との組み合わせは、本発明におけるＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原として特に好ましい。
本発明において抗原をコードするポリヌクレオチドは、本発明の方法により宿主動物に投与することにより所望の免疫応答を生じさせ得る限り、特に限定されるものではなく、ＤＮＡまたはＲＮＡ等であり得る。本発明の抗原をコードするポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが所望の免疫応答を宿主において生じさせることができる限り、そのヌクレオチド配列が配列部位特異的変異誘発法等の公知の手法により（ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５参照）人工的に１以上のアミノ酸配列を欠失・置換・挿入・付加されたものでもよい。また、所望の免疫応答を宿主動物において生じさせ得る限り、自然界に存在する変異を有したポリペプチドをコードするものであっても良い。このような天然に存在する変異体は、公知のハイブリダイゼーション技術（ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４参照）、及び、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４参照）を利用して単離することもできる。
また、抗原蛋白質をコードする遺伝子が知られている場合に、その蛋白質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性領域を解析し（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１２２（１９８２））、二次構造を解析し（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６（１９７８））アミノ酸配列中の抗原性領域を推定すること（例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：５４０−５４６（１９８５）参照）、そして、推定されたアミノ酸配列のペプチドを合成しその抗原性をＰＥＰＥＳＣＡＮ法（Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（１９８５）；特表昭６０−５００６８４号公報）等により決定することは当業者が容易に行い得ることである。従って、前記方法に基づき決定されたエピトープ部分を含むペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを化学合成等の手法により製造して本発明の抗原の発現ベクターとして用いることもできる。
本発明において用いられる発現ベクターは、本発明の抗原遺伝子を組込んだ組換えベクターであり、抗原遺伝子を挿入するベクターとしてはプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス、及び、当分野において従来用いられるその他のベクターを例示することができる。当業者であれば、例えば、ｅｄｉｔ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．）、及び、上述のＡｕｓｕｂｅｌらにより編集された文献に記載の技術により様々なプラスミド及びベクターを構築することが可能である。
ここで用いるプロモーター、ターミネーター等の宿主内における発現制御を行う因子は、当業者であれば宿主の種類及び目的に応じて公知の制御配列から適宜選択し、抗原遺伝子の上流及び／または下流に配置することが可能である。従って、抗原由来の制御配列を用いてもよいし、異種の制御配列を用いることも可能である。また必要であれば、抗生物質耐性マーカー等のマーカーを本発明の発現ベクター中で用いることも可能である。多数の市販のベクターを利用することができるが、本発明において必須ではないポリヌクレオチド配列を除去することが好ましい。また、本発明で用いるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原をコードするポリヌクレオチド、及び、ＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原をコードするポリヌクレオチドは、同一細胞内で発現されるよう調節されている限り、各々異なる発現ベクターに含まれていても、１つの発現ベクターから発現されるように構成されていてもよい。
本発明のワクチンは、動物組織内への導入により、本発明の抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を誘導し、所望の免疫応答を誘起するものである。核酸を生体内へ導入する種々の方法が知られており（Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１（１９８９））、本発明の抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を誘導し、所望の免疫応答を誘起するものである限り、どのような導入方法を採用することもできる。
本発明の組成物はワクチンとして有用であり、ｎａｋｅｄプラスミドとして使用でき、リポソーム内にパッケージングするか、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター及びＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターとして形成するか（例えば、Ｋ．Ａｄｏｌｐｈ“ウイルスゲノム法”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９６）参照）、または、コロイド金粒子等のビーズ（担体）に被覆して用いることができる。これに限定されるわけではないが、好ましくは遺伝子銃等により生体内に導入される金粒子等の担体粒子上に、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原及びＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原を発現させるベクターを付着させた形態のものである。ポリヌクレオチドで担体粒子をコートする技術は公知である（例えば、ＷＯ９３／１７７０６参照）。最終的にポリヌクレオチドは、生体への投与に適する生理的食塩水等の溶液中に調製することができる。また、免疫応答を増幅するために当分野において公知の蛋白質、または、他の担体等のアジュバントと一緒に本発明の組成物を用いてワクチンとしてもよい。その他、プラスミドの細胞内取り込みの助けとなるカルシウムイオン等の薬剤を併用することも可能である。その他、必要に応じトランスフェクションを容易にする医薬的に許容される薬剤を併せて用いることができる。
本発明のポリヌクレオチドワクチンは、投与された宿主動物中で免疫応答を引き起こす方法であれば、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、本発明の組成物は適当な非経口経路、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、または、ガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法等により宿主動物内において免疫応答を引き起こすのに十分な量で投与される。また、本組成物をｅｘ  ｖｉｖｏでリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法、または、ウイルス感染等を利用して血液細胞、及び、骨髄由来細胞（ＡＰＣ等）等に投与して、該細胞を動物に再導入することにより宿主動物を免疫化してもよい。前述の投与方法のうち、加速粒子による遺伝子形質転換技術は米国特許第４，９４５，０５０号にも記載されており、その改良法に基づく装置も市販されている（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
本発明の宿主動物の種類は、本発明の組成物により腫瘍免疫応答が増強される限り特に限定されるものではないが、特に、マウス、ラット、ウシ、ブタ、並びに、サル及びヒト等の霊長類を含む哺乳動物が挙げられる。特に霊長類、中でもヒトが本発明の好ましい宿主動物である。
本発明の組成物の投与量は組成物中の成分の宿主における免疫原性に依存するが、一定量の組成物を試験動物に投与し、ＥＬＩＳＡ等の検定法により抗体力価を測定するか、クロム放出測定法等によりＣＴＬ応答を検出するが、または、サイトカイン放出測定法を使用してＴｈ応答を検出して、免疫応答を観察することにより当業者であれば免疫化に必要な適当な量を決定することができる。組成物中の成分の免疫原性が、本発明の発現ベクターで用いる転写及び翻訳プロモーター等の制御配列の強さにも依存するものであることが当業者には理解される。そして当業者であれば、使用する発現ベクターの種類に応じ本発明の組成物の投与量を調節することも容易に行い得る。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、該実施例は本発明をいかなる意味でも限定することを意図したものではない。
［実施例１］  腫瘍由来免疫原性分子の同定
マウス腫瘍細胞中の免疫原性分子を同定するために、ＢＡＬＢ／ｃ起源の３−メチルコラトレン誘導肉腫ＣＭＳ５、ＣＭＳ２、ＣＭＳ８及びＣＭＳ１３ライン（Ａ．Ｂ．ＤｅＬｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６：７２０−７３４（１９７７））、並びに、ＣＭＳ５からサブクローン化したＣＭＳ５ａ及びＣＭＳ５ｍから調製したｃＤＮＡのλファージライブラリーを、同種の腫瘍ラインのマウス由来の血清試料（ＩｇＧ抗体）を用いてＳＥＲＥＸ法（Ｕ．Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１８１０−１１８１３（１９９５））によりスクリーニングした。検出された多数の遺伝子のうち、最も頻繁に検出された４つの遺伝子は、マウス熱ショック蛋白質であるＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２（ＡＦ０５５６６４）、マウスガレクチン−８（以下、ｇａｌｅｃｔｉｎ−８と記載する）（ＡＦ２１８０６９）、マウスＤＮＡリガーゼ１（Ｕ１９６０４）、及び、マウスｐｏｌｙＡ結合蛋白質サイトプラズミック１（以下、ｐｏｌｙ（Ａ）と記載する）（Ｘ６５５５３）であった。これらの遺伝子のコード配列を分析したところ、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列と比べて変異している塩基は見られなった（表１）。そして、これら４つの遺伝子を高度免疫原性腫瘍抗原の遺伝子として続いての試験に使用した。さらに、繰り返し行ったＳＥＲＥＸスクリーニングで常にネガティブであった３つのｃＤＮＡ、マウス分泌ネクシン１（ＡＢ０１９２１４）、マウスグルコース制御蛋白質（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｄ７８６４５）、及びシャペロン含有ＴＣＰ−１−ｚｅｔａ−１サブユニットのＭｕｓ  Ｃｃｔｚ−１遺伝子（ＡＢ０２２１５９）を腫瘍細胞由来の非免疫原性分子として以後の試験に使用した。
また、ＵＴ−７／ＴＰＯ（ヒト巨核芽球白血病セルライン）（Ｎ．Ｋｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８７：４５５２−４５６０（１９９６））の抗原をコードするｃＤＮＡを用い、特発性血小板減少性紫斑病患者からの血清により検出した。続いての研究のため、ＳＥＲＥＸ同定ヒト遺伝子として１）Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘキサメチレン−ビス−アストアミド誘導性（ＸＭ＿００８３４８）、２）ヒトレチノイン酸応答性蛋白質（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｕ５０３８３）、３）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ肝炎デルタ抗原反応蛋白質Ａ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ；ＤＩＰＡ）（ＸＭ＿００６５０３）、及び４）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ２０６４４  ｆｉｓクローンＫＡＴ０２５８８（ＦＬＪ２０６４４ｆｉｓ）（ＡＫ０００６５１）を選択した。
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［実施例２］  ＳＥＲＥＸ同定免疫原性野生型細胞分子による腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞産生の増幅
ｍＥＲＫ２の全蛋白質をコードするｃＤＮＡをＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉで消化し、ｐＣＡＧＧＳ−Ｎｅｗ（Ｈ．Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０６：１９３−２００（１９９１））のＥｃｏＲ  Ｉ及びＢｇｌ  ＩＩサイトへクローニングした。該ｍＥＲＫ２プラスミドをＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）中に維持し、ＱＩＡＧＥＮ  Ｅｎｄｆｒｅｅ  Ｍｅｇａキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。１）該ｍＥＲＫ２プラスミド単独、２）該ｍＥＲＫ２プラスミド、及び、マウスＳＥＲＥＸ同定分子であるＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２、ＤＮＡリガーゼ１、ガレクチン−８若しくはｐｏｌｙ（Ａ）、またはヒトＳＥＲＥＸ同定分子であるヘキサメチレン−ビス−アセトアミド（ＨＭＢＡ）誘導性、レチノイン酸応答蛋白質、デルタ抗原反応蛋白質Ａ（ＤＩＰＡ）若しくはＦＬＪ２０６４４ｆｉｓをコードするプラスミドとの混合物、３）該ｍＥＲＫ２プラスミド及びＳＥＲＥＸ法でネガティブであった分子（分泌ネクシン、グルコース制御蛋白質、またはＣｃｔｚ−１）をコードするプラスミドの混合物、または４）該ｍＥＲＫ２プラスミド及びニワトリ卵アルブミンをコードするプラスミドの混合物１μｇを、０．５ｍｇの１μｍの金粒子（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）と混合し、適量の０．０５Ｍスペルミジン（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を含む１．５ｍｌの遠心チューブに添加してプラスミドＤＮＡを金粒子に付着させた（Ｃ．Ｃｏｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１１２２−１１２８（１９９７）；Ａ．Ｐｏｒｇａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１０７５−１０８２（１９９８）；Ｄ．Ｋｌｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２３８８−２３９２（１９９８）；Ｃ．Ａ．Ｔ．Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５２９−４５３２（１９９７）；Ａ．Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１１−１４（１９９７）参照）。７〜９週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、Ｈｅｌｌｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）をヘリウム放出圧３５０〜４００ｐｓｉで用い、プラスミドでコートした金粒子を腹腔へ投与して行った。最初の免疫化から２週間の期間をおいて再度免疫化した。２回目の免疫から１週間後に、マウスの脾臓よりＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。
次に、３−メチルコラトレン誘導マウス肉腫ＣＭＳ５に特異的な抗原ペプチドとして同定され、ＣＭＳ５肉腫の腫瘍拒絶抗原であることが示唆されたｍＥＲＫ２由来の９ｍｅｒのペプチド９ｍ（アミノ酸配列”ＱＹＩＨＳＡＮＶＬ”；Ｈ．Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６３７５−６３７９（１９９７）参照）の製造を宝酒造（Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に依頼し、入手した。また、コントロールとして、ＣＭＳ１７ＨＥＲ２に対する腫瘍拒絶抗原、また、ＣＤ８＋Ｋｄ限定細胞毒性Ｔ細胞の標的として同定された９ｍｅｒのペプチドＨＥＲ２  ｐ６３−７１（Ｔ）ペプチド（アミノ酸配列“ＴＹＬＰＴＮＡＳＬ”；Ｙ．Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３３６−１３４３（１９９７）；Ｘ．Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３３８５−３３９０（１９９８）；Ｙ．Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：５５３−５５８（２０００）；Ｔ．Ｏｋｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３３３８−３３４６（２０００）参照；９ｍと同様に製造は宝酒造に依頼）（以下、ｐ６３と記載する）を用いることにより、酵素結合イムノスポット分析の特異性を確認した。
該９ｍペプチドをＤＢＡ／２起源の肥満細胞種セルラインであるＰ１．ＨＴＲ（Ａ．Ｖａｎ  Ｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：４６７−４７５（１９８５））に適用した。
上述の免疫化したマウスの脾臓より入手したＣＤ８＋Ｔ細胞について、９ｍペプチドまたはｐ６３−７１（Ｔ）で刺激したＰ１．ＨＴＲ細胞を用いＩＦＮγを分泌する細胞をＥＬＩＳＰＯＴ検定法により測定し、９ｍペプチドに対して特異的なＣＤ８＋細胞の存在を定量的に分析した。
ＥＬＩＳＰＯＴ検定は、Ｐｏｗｅｒらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２７：９９−１０７（１９９９））を改変して、次のように行った。９６ウェルニトロセルロースコートマイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）にラット抗マウスＩＦＮ．抗体（クローンＲ４−６Ａ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を４℃で一晩インキュベートし、洗浄した後、１〜２時間３７℃でブロックした。１×１０６のＣＤ８＋Ｔ細胞、及び、１×１０５のＰ１．ＨＴＲを各ウェルに添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、ウェルをよく洗浄し、ビオチン化抗マウスＩＦＮγ抗体（クローンＸＭＧ１．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（ＭＡＢＴＥＣＨ，Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を添加し、室温で１．５時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ結合基質キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の添加によりスポットを形成させた。プレートをよく洗浄し、乾燥した。解剖顕微鏡、及び、Ａｘｌｏｐｌａｎ２  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｉｌｂｅｒｇｍｏｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、形成されたスポット数をカウントした。
その結果、ｍＥＲＫ２  ｃＤＮＡのみで免疫化したマウスは、低レベルで９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を産生した（図１）。それに対して、ｍＥＲＫ２及びＳＥＲＥＸ同定抗原で免疫化したマウスでは、９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の顕著な増加が観察された（図１ａ）。これらのマウスにおける陽性のスポットは、ｍＥＲＫ２  ｃＤＮＡのみで免疫化されたマウスと比べ３〜１０倍であった。対照的に、ｍＥＲＫ２プラスミド、及び、繰り返し行われたＳＥＲＥＸ分析で検出されなかった分子、例えば、分泌ネクシン、グルコース制御蛋白質、またはＣｃｔｚ−１をコードするプラスミドで免疫化されたマウスでは、９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は見られなかった（図１ａ）。コントロールベクターとの共免疫化により９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は見られなかった（図２ａ）。ｐ６３を適用した標的細胞に対するスポット数は非常に少なく、本ＥＬＩＳＰＯＴ検定法の特異性が確認された。
ヒトＳＥＲＥＸ同定免疫原性異種分子をコードするｃＤＮＡもまた、ｍＥＲＫ２と共に提示された場合に、９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増加させた（図１ｂ）。対照的に、ニワトリ卵アルブミンによる共免疫化はペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応性をわずかしか増加しなかった（図１ｃ）。
ここで、図１のグラフ中の各棒は１０５ＣＤ８＋Ｔ細胞当たりＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を表す。標的細胞は９ｍにより刺激されたＰ１．ＨＴＲ（斜線の入った棒）、またはコントロールとしてｐ６３により刺激されたＰ１．ＨＴＲ（黒棒）であった。データは３連実験の平均±ＳＥＭとして表される。
［実施例３］  ＳＥＲＥＸ同定分子及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの共提示がＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増幅に必要であるかの確認
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとＳＥＲＥＸ同定分子が同じ金粒子上に提示されている必要があるかどうかを決定するために、以下１）または２）のいずれかの方法によりマウスを免疫化した：
１）ｍＥＲＫ２プラスミドのみでコートされた金粒子及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２プラスミドのみでコートされた金粒子の混合物を用いて免疫化（別々にコート）
２）ｍＥＲＫ２プラスミドのみでコートした粒子、及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２プラスミドのみでコートした粒子をマウスの腹部のそれぞれ異なる側に注射（別部位）
プラスミドでコートされた金粒子の製造、及び免疫化は実施例２記載の方法と同様に行い、また標的細胞も同じものを用いた。続いて、９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数を調べた。
ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識される抗原をコードするプラスミド、及び、ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される抗原をコードするプラスミドの両方で一緒にコートされた粒子で免疫された動物でのみ、９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増幅が観察された。９ｍペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は、上記１）、及び２）のどちらのグループでも観察されなかった（図２ａ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞はｍＥＲＫ２由来の９ｍＴ細胞エピトープを提示する細胞により提示されるＳＥＲＥＸ同定抗原ペプチドを認識することが確認された。データは３連実験の平均±ＳＥＭとして表される。
［実施例４］  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答増幅のＣＤ４＋Ｔ細胞依存性
次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＳＥＲＥＸ同定抗原による９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導の促進に関与しているかどうかを調べた。抗ＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）、または、コントロールとして抗Ｌｙｔ２．１抗体でＢＡＬＢ／ｃマウスを処理した。続いて、実施例２記載の方法に従って、前述の各抗体で処置したマウスをｍＥＲＫ２プラスミド、及び、Ｄｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２プラスミドで免疫化した。標的細胞は実施例２と同じものを用いた。
マウスをｍＥＲＫ２をコードするプラスミド及びＳＥＲＥＸ同定抗原Ｄｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２をコードするプラスミドの混合物を用いた免疫化の前に予め抗ＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）で処理した場合には、９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は観察されなかった。それに対し、コントロール抗体（Ｌｙｔ−２．１）ではそのような９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増加の阻害は起こらなかった（図２ｂ）。従って、ｍＥＲＫ２プラスミド及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２プラスミドを用いて免疫化することによるＣＤ８＋Ｔ細胞の増幅がＣＤ４＋Ｔ細胞に依存するものであることが示された。データは３連実験の平均±ＳＥＭとして表される。
［実施例５］  免疫原性ヘルパー野生型細胞性分子のＣＤ８＋Ｔ細胞の１次及び２次腫瘍特異的応答への関与
一次応答のモデルとしてナイーブマウス（図３ａ）、及び、二次応答のモデルとしてｍＥＲＫ２をコードするプラスミドで２回、前免疫化したマウス（図３ｂ）を、実施例２記載の方法に従って、ｍＥＲＫ２、または、ｍＥＲＫ２及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２をコードするプラスミドのどちらかで免疫化した。免疫化から１４日後に９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞について同じ方法により分析した。図３にその結果を示す。結果は３連実験の平均±ＳＥＭで表される。１次応答及び２次応答の両方のモデルにおいて、ｍＥＲＫ２及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２をコードするプラスミドで免疫化されたマウスでは９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数が明らかにｍＥＲＫ２をコードするプラスミドのみで免疫化されたものと比べて増加していた。
［実施例６］  免疫原性野生型分子によるＨＥＲ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導の増幅
ヒトＨＥＲ２のＮ末端の１４７個のアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡプラスミド（以下、１４７ＨＥＲ２と記載する）をＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２若しくはリガーゼ１をコードするプラスミドと共に、または、これらのＳＥＲＥＸ同定分子無しで用い、実施例２記載の方法に従ってマウスを免疫化した。実施例２と同じ標的細胞を用い、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞数を同様に計測した。どちらのＳＥＲＥＸ同定分子で共免疫化された場合でも、ＨＥＲ２  ｐ６３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増幅が観察された（図４ａ）。結果は３連実験の平均±ＳＥＭで表される。
実施例３のｍＥＲＫ２の場合と同様に、１）１４７ＨＥＲ２プラスミド及びＳＥＲＥＸ同定分子プラスミドを一緒にコートした金粒子で免疫化したマウス、２）別々にコートした金粒子で免疫化したマウス、及び、３）別々にコートした粒子をそれぞれ腹部の離れた部位に投与したマウスにおける、ＨＥＲ２  ｐ６３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増幅を調べた（図４ｂ）。結果は３連実験の平均±ＳＥＭで表される。ｐ６３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増幅は、２つの異なる分子のプラスミドで一緒にコートされた粒子で免疫化されたマウスでのみ観察された。
この結果をｍＥＲＫ２標的腫瘍特異的免疫の実験結果と合わせて考慮すると、免疫原性野生型細胞性分子に対する免疫応答が種々の腫瘍系において抗腫瘍免疫応答におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の発生を促進させる作用を有することが強く示唆された。
［実施例７］  Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍拒絶
ＣＭＳ５ｍ腫瘍細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ注射の後、肺転移を起こし、動物を５〜６週間以内に死に到らしめる。そこで、総量０．１ｍｌの１×１０６  ＣＭＳ５ｍ腫瘍細胞を側尾静脈よりＢＡＬＢ／ｃマウスへ投与し、肺転移についてのモデルとした。１）ｍＥＲＫ２をコードするプラスミド、２）ｍＥＲＫ２プラスミド及びコントロールベクターをコードするプラスミドの混合物、３）ｍＥＲＫ２プラスミド及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２プラスミドの混合物、により腫瘍投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の１４日前、７日前、腫瘍投与の日（同日）、または、腫瘍投与から５日後に実施例２記載の方法による隔週免疫化を開始した。腫瘍投与から２８日後にマウスを殺し、肺小瘤数を解剖顕微鏡で数えた。各グループについて５匹の動物を用い、結果はその平均±ＳＥＭとして表した。
腫瘍投与を始める１４日前にマウスをｍＥＲＫ２をコードするプラスミドで免疫化することにより肺転移を完全に予防することができた。この予防的な効果は、腫瘍投与の７日前に行った場合、または腫瘍投与後に行った場合には見られなった（図５ａ）。それに対して、ｍＥＲＫ２プラスミド及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２プラスミドを組合せての免疫化では、腫瘍投与から５日後までの免疫化でも転移が完全に予防された（図５ａ）。転移の有無は組織病理学的試験により確認した。図中の数値は各グループについて５匹のマウスの平均±ＳＥＭとして表される。
次に、ｍＥＲＫ２プラスミド及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２プラスミドを一緒にコートした金粒子、並びに別々にコートした金粒子の混合物を用いた以外は、上述の方法と同様に、マウスを腫瘍投与から５日後に免疫化し、その治療的効果を調べた。ｍＥＲＫ２及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２による治療的な効果は別々にコートした粒子の混合物を用いた場合には肺転移は完全には抑制されず、これら２分子が同じ金粒子上に共提示されることが必要であることが示された（図５ｂ）。図中の数値は各グループについて５匹のマウスの平均±ＳＥＭとして表される。
さらに、実施例４の方法に従いマウスを抗ＣＤ４ｍＡｂ（ＧＫ１．５）で処理し、上述の方法と同様に、ｍＥＲＫ２及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２で共コートした金粒子を用いて腫瘍投与から５日後に免疫化し、その治療的効果を調べた。その結果、抗ＣＤ４ｍＡｂ（ＧＫ１．５）処理によりｍＥＲＫ２及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２の治療的効果が失われた。ｍＥＲＫ２及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２の治療的効果がＣＤ４＋Ｔ細胞依存的であることが示された（図５ｃ）。図中の数値は各グループについて５匹のマウスの平均±ＳＥＭとして表される。
１４７ＨＥＲ２をコードするプラスミド、及び６）１４７ＨＥＲ２プラスミド及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２プラスミドの混合物を用い、マウスを腫瘍投与から５日後に免疫化し、その治療的効果を調べた。マウスを腫瘍投与から２０日後に殺した以外は、上述の方法に従って行った。その結果、ＣＭＳ５ｍＨＥに対する同様に増幅された治療的効果が示された（図５ｄ）。図中の数値は各グループについて５匹のマウスの平均±ＳＥＭとして表される。
以上のように、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、及び、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞により認識される抗原をコードする発現ベクターを同一粒子上にコートして免疫化を行うことにより、Ｔ細胞エピトープを単独で用いた場合の免疫化では達成することのできなかった腫瘍の肺転移を完全に阻害することができた。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明によりＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の免疫原性野生型細胞性分子のＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍特異的免疫応答を増幅する上での重要な役割が明らかにされた。マウスの腫瘍抗原に対するＳＥＲＥＸ同定抗原の共認識による高められたＣＤ８＋Ｔ細胞応答の現象は、ヒトにおいても同様な現象が存在することが考えられ、破壊された腫瘍細胞の複合的な抗原性混合物のＡＰＣによる同時の取り込みの結果起こる。ＳＥＲＥＸ抗原と腫瘍抗原の共免疫化によりマウスにおいて、腫瘍投与に対する耐性が高まる。これはヒトの癌免疫治療において、魅力的な手法であり、今後さらにＳＥＲＥＸ同定ヒト腫瘍抗原の情報が充実されれば、より容易な癌免疫治療の手法になると考えられる。
本発明の腫瘍特異免疫を発現させるためのワクチンにより、腫瘍に対するより有効な免疫療法を提供される。本発明のワクチンは予防的及び治療的な効果を示すものであり、これにより、早期癌の根治療法、術後の癌の再発または転移の抑制療法、及び、腫瘍が発見されながらも手術が不可能で放射線及び化学療法も有効でない患者に対しての治療を提供することが期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｍＥＲＫ２及びＳＥＲＥＸ同定分子を用いた免疫化により生じる９ｍペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加を示すグラフである。ａ．マウスＳＥＲＥＸ同定分子を免疫化に用いた場合の結果を示す。ｂ．ヒトＳＥＲＥＸ同定分子を用いた場合の結果を示す。
図２は、ＳＥＲＥＸ同定分子により誘導される９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増幅するのに９ｍペプチドと一緒に提示されることが必要であること（パネルａ）、及び、ＣＤ４＋Ｔ細胞が必要であること（パネルｂ）を示すグラフである。
図３は、ＳＥＲＥＸ同定抗原分子を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞によるヘルパー活性が一次、及び、二次応答の両方における９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増幅させることを示すグラフである。
図４は、ＨＥＲ２  ｐ６３ペプチドと共提示されたＳＥＲＥＸ同定分子を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞がＨＥＲ２  ｐ６３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増幅することを示すグラフである。
図５は、ｍＥＲＫ２または１４７ＨＥＲ２、及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２を用いた免疫化による肺転移に対するｉｎ  ｖｉｖｏの予防的、及び、治療的効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月23日(2003.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞により認識される抗原がＨＥＲ２である、請求項３記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原がＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ  ２であり、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞により認識される抗原がＨＥＲ２である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
定されたこれらの分子を意味する。また、本明細書中の「免疫原性野生型細胞性分子」とは、上述のような特にＳＥＲＥＸ法で同定されたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に認識される分子を指す。
また、本明細書中の「ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原」とは、ＣＴＬとその前駆体細胞の細胞膜状に発現する膜貫通型の糖蛋白質ＣＤ８のエピトープとなる部分を含むポリペプチドを指す。Ｔ細胞受容体はＭＨＣクラスＩによって提示された抗原を認識する際に、ＭＨＣクラスＩのα３ドメインに結合し、それによりＴ細胞の抗原認識能が高められ、細胞内にシグナルが伝達される。本明細書中の「ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原」は、このような経路によるＴ細胞の増殖や細胞障害性活性を促進する働きを持つ分子である。特に好ましくは、腫瘍抗原を指し、腫瘍に関連した抗原、及び、特定の腫瘍細胞に特異的に発現している抗原を指す。これらに限定されるわけではないが、例えば、変異ＭＡＰキナーゼであるＥＲＫ２（ｍＥＲＫ２）、ＨＥＲ２等のポリペプチドを挙げることができる。特にＨＥＲ２は、ヒトＨＥＲ２  ｃＤＮＡ（ｃ−ｅｒｂＢ−２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡ）によりトランスフェクトされ生じるＣＭＳ５ａ由来のセルラインである先天性肉腫ＣＭＳ１７ＨＥＲ２の腫瘍拒絶抗原であり（Ｙ．Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３３６−１３４３（１９９７）；Ｘ．Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３３８５−３３９０（１９９８）；Ｙ．Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：５５３−５５８（２０００）；Ｔ．Ｏｋｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３３３８−３３４６（２０００））、本発明におけるＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原として好ましい。ここで、ＨＥＲ２はその全長を利用しても良いし、免疫原性を示す断片であってもよい。ＣＭＳ１７ＨＥＲ２に対する腫瘍拒絶抗原、また、ＣＤ８＋  Ｋｄ限定細胞毒性Ｔ細胞の標的として９ｍｅｒのペプチドＨＥＲ２  ｐ６３−７１（Ｔ）ペプチド（アミノ酸配列“ＴＹＬＰＴＮＡＳＬ”）が同定されている（Ｙ．Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３３６−１３４３（１９９７）；Ｘ．Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３３８５−３３９０（１９９８）；Ｙ．Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：５５３−５５８（２０００）；Ｔ．Ｏｋｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３３３８−３３４６（２０００））。このような抗原性部位を含む断片が




【国際調査報告】
2003000894.tif 000042
2003000894.tif 000043
2003000894.tif 000044
2003000894.tif 000045
2003000894.tif 000046
2003000894.tif 000047