(57)【要約】本発明は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞内情報伝達を遮断し、ＶＥＧＦによる細胞増殖を阻害する物質が提供する。さらに、本発明は、該物質を用いたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する方法、細胞増殖を阻害する方法、血管新生を阻害する方法、細胞増殖阻害剤のスクリーニング法、血管新生阻害剤のスクリーニング法、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する物質のスクリーニング法、被験物質がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害するか否かを判定する方法、組織での血管新生を検出する方法、およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質のスクリーニング法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する方法。
【請求項２】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、細胞増殖を阻害する方法。
【請求項３】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、血管新生を阻害する方法。
【請求項４】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、細胞増殖阻害剤のスクリーニング法。
【請求項５】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、血管新生阻害剤のスクリーニング法。
【請求項６】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する物質のスクリーニング法。
【請求項７】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、被験物質がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害するか否かを判定する方法。
【請求項８】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、組織での血管新生を検出する方法。
【請求項９】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質のスクリーニング法。
【請求項１０】
情報伝達分子がホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）である、請求の範囲１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体である、請求の範囲１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合し、かつＰＬＣ−γのリン酸化を阻害する抗体である、請求の範囲１１記載の方法。
【請求項１３】
抗体がモノクローナル抗体またはその抗体断片である、請求の範囲１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する方法。
【請求項１５】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、細胞増殖を阻害する方法。
【請求項１６】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、血管新生を阻害する方法。
【請求項１７】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、被験物質がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害するか否かを判定する方法。
【請求項１８】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、組織での血管新生を検出する方法。
【請求項１９】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を有効成分として含有する薬剤。
【請求項２０】
薬剤が、チロシンリン酸化阻害剤である請求の範囲１９に記載の薬剤。
【請求項２１】
薬剤が、細胞増殖阻害剤である請求の範囲１９に記載の薬剤。
【請求項２２】
薬剤が、血管新生阻害剤である請求の範囲１９に記載の薬剤。
【請求項２３】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体である、請求の範囲１９〜２２のいずれかに記載の薬剤。
【請求項２４】
抗体が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合し、かつホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）のリン酸化を阻害する抗体である、請求の範囲２３に記載の薬剤。
【請求項２５】
抗体がモノクローナル抗体またはその抗体断片である、請求の範囲２３または２４に記載の薬剤。
【請求項２６】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を有効成分として含有するＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のチロシンリン酸化阻害剤。
【請求項２７】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を有効成分として含有する細胞増殖阻害剤。
【請求項２８】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
【請求項２９】
請求の範囲４〜６および９のいずれかに記載の方法により得られる化合物。
【請求項３０】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を認識するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
【請求項３１】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合し、かつリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片である、請求の範囲３０記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
【請求項３２】
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合し、かつホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）のリン酸化を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片である、請求の範囲３０または３１記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
【請求項３３】
ハイブリドーマＫＭ３０３５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７７２９）が生産するモノクローナル抗体またはその抗体断片である、請求の範囲３０〜３２記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
【請求項３４】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化可変領域（Ｖ領域）断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求の範囲３０〜３３のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項３５】
請求の範囲３０〜３４のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体またはその抗体断片が、放射性同位元素、蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合しているモノクローナル抗体またはその抗体断片。
【請求項３６】
請求の範囲３０〜３５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項３７】
請求の範囲３６記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項３８】
請求の範囲３７記載の組換えベクターが宿主細胞に導入された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質に関する。さらに、本発明は、該物質を用いたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する方法、細胞増殖を阻害する方法、血管新生を阻害する方法、細胞増殖阻害剤のスクリーニング法、血管新生阻害剤のスクリーニング法、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する物質のスクリーニング法、被験物質がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害するか否かを判定する方法、組織での血管新生を検出する方法、およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質のスクリーニング法に関する。
背景技術
血管新生は、脊椎動物の個体の発生および組織の構築に重要な役割を果たすとともに、成熟個体（雌）の性周期における黄体形成、子宮内膜の一過性の増殖および胎盤形成などにも密接に関与している。さらに、病的状態としては、固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、糖尿病性網膜症および慢性関節リュウマチの病態形成あるいは促進に血管新生が深く関与している［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１０９３１（１９９２）］。血管新生は、血管新生因子の分泌が引き金となり、分泌された血管新生因子の近傍にある既存の血管の内皮細胞からのプロテアーゼ分泌による基底膜、間質の破壊、続いて起こる血管内皮細胞の遊走、増殖により、管腔が形成され、血管が新生される過程よりなる［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１０９３１（１９９２）］。血管新生を誘導する因子としては、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｆａｃｔｏｒ（以下、ＶＰＦと略記する）、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（以下、ＶＥＧＦと略記する）があり（以下、ＶＰＦ／ＶＥＧＦと記す）、これらは発生過程における血管新生および病的な状態における血管新生において最も重要な因子として知られている［Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６７，２８１（１９９５）］。ＶＰＦ／ＶＥＧＦはホモダイマーよりなる分子量約４万の蛋白質であり、１９８３年に血管透過性促進因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｆａｃｔｏｒ：ＶＰＦ）として［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，９８３（１９８３）］、１９８９年に血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）として［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６１，８５１（１９８９）］報告されたが、ｃＤＮＡクローニングの結果、両者は同一の物質であることが明らかとなった［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０６（１９８９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０９（１９８９）］（以下、ＶＰＦ／ＶＥＧＦはＶＥＧＦと記す）。ＶＥＧＦの活性としてはこれまでに、血管内皮細胞に対する、増殖促進活性［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６１，８５１（１９８９）］、遊走促進活性［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５２，４１４９（１９９４）］、メタロプロテアーゼ分泌促進活性［Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５３，５５７（１９９２）］、ウロキナーゼ、ｔＰＡ分泌促進活性［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８１，９０２（１９９１）］などが知られており、イン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）において血管新生促進活性［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９２，ｓｕｐｐｌ　ＩＩ，３６５　（１９９５）］、血管透過性促進活性［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，９８３（１９８３）］などがこれまでに知られている。ＶＥＧＦは血管内皮細胞に極めて特異性の高い増殖因子であり［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６１，８５１（１９８９）］、またｍＲＮＡのオルタナティブ・スプライシング（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ）により分子量の異なる４種類の蛋白質が存在することが報告されている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，６７，２６０３１（１９９１）］。
血管新生を伴う疾患の中で、固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、糖尿病性網膜症、慢性関節リュウマチの病態形成にＶＥＧＦが深く関与していることが報告されている。固形腫瘍については、これまでに腎癌［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，４２３３（１９９４）］、乳癌［Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２６，８６（１９９５）］、脳腫瘍［Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９１，１５３（１９９３）］、消化器癌［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３，４７２７（１９９３）］、卵巣癌［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，２７６（１９９４）］などの多くのヒト腫瘍組織におけるＶＥＧＦの産生が報告されている。また、乳癌患者の腫瘍におけるＶＥＧＦ発現量と患者の生存率との相関性を検討した結果、ＶＥＧＦ高発現腫瘍は、ＶＥＧＦ低発現腫瘍に比べて腫瘍血管新生が盛んであり、かつＶＥＧＦ高発現腫瘍の乳癌患者は、ＶＥＧＦ低発現腫瘍の乳癌患者に比べて生存率が低いことも明らかとなっている［Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８５，１０４５（１９９４）］。また、ヌードマウスにヒト腫瘍を皮下移植したゼノグラフトモデル実験系において、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は腫瘍増殖抑制効果を示すことが報告されている［Ｎａｔｕｒｅ，３６２，８４１（１９９３）］。さらに、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍の転移癌モデルにおいて、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は癌転移を抑制できることが報告されている［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，９２１（１９９６）］。また、ヒトの癌性胸水、腹水中に高濃度のＶＥＧＦが検出されることから、胸水、腹水貯留の主要な因子である可能性も示されている［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，１２２１，２１１（１９９４）］。
糖尿病網膜症においては、血管新生の異常により網膜剥離や硝子体出血をおこして失明にいたるが、糖尿病性網膜症における血管新生と患者眼球内のＶＥＧＦレベルが正相関することが報告されている［Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３１，１４８０（１９９４）］。また、サルの網膜症モデルにおいて抗ＶＥＧＦ中和モノクローナル抗体の眼内投与によりＶＥＧＦ活性を抑制すると血管新生が抑制されることが報告されている［Ａｒｃｈ　Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．，１１４，６６（１９９６）］。
慢性関節リュウマチの関節炎の病態の進展（骨、軟骨の破壊）には血管新生を伴うが、慢性関節リュウマチ患者の関節液中にはＶＥＧＦが高濃度で含まれていること、関節中のマクロファージがＶＥＧＦを産生することが報告されている［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５２，４１４９（１９９４）；Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８０，３４１（１９９４）］。
ＶＥＧＦの受容体として、Ｆｌｔ−１（ｆｍｓ−ｌｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ）［Ｓｈｉｂｕｙａ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５，５１９（１９９０）、ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，９８９（１９９２）］およびＫＤＲ（ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｓｅｒｔ　ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）［ＷＯ９２／１４７４８、Ｔｅｒｍａｎ　ＢＩ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８７，１５７９（１９９２）］が報告されている。ＫＤＲはマウスではＦｌｋ−１（ｆｅｔａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｋｉｎａｓｅ−１）として発見された［Ｗ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９０２６（１９９１）、ＷＯ９４／１１４９９、Ｍｉｌｌａｕｅｒ　Ｂ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７２，８３５（１９９３）］ので、ここではＫＤＲ／Ｆｌｋ−１と総称する。
Ｆｌｔ−１およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は両者とも、細胞外ドメインは７個のイムノグロブリン様ドメインからなり、細胞内ドメインにはチロシンキナーゼドメインを有する、分子量１８０〜２００ｋＤａの受容体型チロシンキナーゼファミリーに属する膜蛋白である。ＶＥＧＦはＦｌｔ−１およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１にはそれぞれＫ０値が２０ｐｍｏｌ／ｌおよび７５ｐｍｏｌ／ｌで特異的に結合する。Ｆｌｔ−１およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は血管内皮細胞に特異的に発現していると報告されている［Ｑｕｉｎｎ　ＴＰ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７５３３（１９９３）、Ｋｅｎｄａｌｌ　ＲＬ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８９１５（１９９３）］。
ヒト脳腫瘍組織の腫瘍血管内皮細胞［Ｈａｔｖａ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４６，３６８（１９９５）］、ヒト消化器癌組織の腫瘍血管内皮細胞［Ｂｒｏｗｎ　ＬＦ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５３，４７２７（１９９３）］において、正常組織の血管内皮細胞に比べＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のｍＲＮＡレベルの発現が上昇していることが報告されている。これらの結果は、腫瘍血管新生においてＶＥＧＦ−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１系が重要な役割を果たしていることを強く示唆するものである。さらに、慢性関節リウマチ患者の関節の血管内皮細胞においてもイン・サイチュ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションによりＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のｍＲＮＡの発現が認められることが報告されており［Ｆａｖａ　ＲＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０，３４１，（１９９４）］、慢性関節リウマチにおけるＶＥＧＦ−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１系の重要性を示唆している。
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の機能については、ブタ動脈の血管内皮細胞にＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現させるとＶＥＧＦに反応し増殖、遊走することから、ＶＥＧＦの多様な活性の中でＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は血管内皮細胞の増殖、遊走に関与すると報告されている［Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２６９８８（１９９４）］。また、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１遺伝子を破壊したノックアウトマウスでは血管内皮細胞の増殖や血管の形成が全く認められず、卵黄嚢の血島も形成されず、発生後８．５から９．５日の胎児期に死亡したことから、動物個体においてもＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は血管内皮細胞の増殖、分化に関与することが報告されている［Ｓｈａｌａｂｙ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，６２（１９９５）］。
一方、Ｆｌｔ−１遺伝子のノックアウトマウスも同じ胎児期に死亡するが、その原因は内皮細胞の過剰な増殖と正常な血管の構造が形成できないためであることから［Ｆｏｎｇ　Ｇ−Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，６６（１９９５）］、Ｆｌｔ−１は内皮細胞の増殖を抑制するネガティブな調節因子として血管内皮の正常な構造形成に関与していると考えられ、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＦｌｔ−１はＶＥＧＦがその作用を示すうえでそれぞれ別の役割を果たしていると考えられる。
ＶＥＧＦとＫＤＲ／Ｆｌｋ−１との結合を阻害できるようなＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで血管内皮細胞におけるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害し増殖を阻害すること［Ｒｏｃｋｗｅｌｌ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．，３，９１（１９９５）］、およびこの抗体が、マウスに移植した種々の癌細胞の血管新生や増殖、転移を抑制することが報告されている［Ｐｒｅｗｅｔｔ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５９，５２０９（１９９９）］。また、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のチロシンキナーゼに特異的な阻害剤ＳＵ５４１６が、マウスに移植した種々の癌細胞の血管新生や増殖、あるいは転移を抑制することが報告されている［Ａｎｎｉｅ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５９，９９（１９９９）、Ｓｈａｈｅｅｎ　ＲＭ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５９，５４１２　（１９９９）］。
一般にチロシンキナーゼ型受容体の情報伝達は、リガンドとの結合により自己のチロシンキナーゼが活性化され、自己および他の分子のチロシン残基をリン酸化することで情報伝達が開始されると考えられている。この場合、受容体の自己リン酸化チロシンにＳＨ２ドメインを介して別の蛋白質分子が結合し、この分子が他の分子と結合したり酵素反応をおこすことにより情報の伝達がなされていくと考えられている。ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の場合も、血管内皮細胞において、ＶＥＧＦとの結合により自己のチロシン残基がリン酸化を受けることが報告されている［Ｊ．Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２６９８８（１９９４）］。自己リン酸化されるチロシンの位置としては、これまで、大腸菌で発現させたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の中の９５１、９９６、１０５４、１０５９位のチロシンが自己リン酸化されること［Ｄｏｕｇｈｅｒ−Ｖｅｒｍａｚｅｎ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０５，７２８（１９９４）］、酵母を用いた系では、ホスホリパーゼＣ−γ（以下、ＰＬＣ−γと略記する）が結合するコンセンサス配列に類似した配列中にある８０１位と１１７５位のチロシンがリン酸化を受けること［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　ＳＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４０，６３５（１９９７）］が報告されている。動物細胞で発現させたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の主な自己リン酸化部位は１１７５位、１２１４位のチロシンであり、８０１位チロシンはほとんど自己リン酸化を受けないことが報告されている（高橋ら、第５回Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ学会２０００年）。また、酵母ツーハイブリッドシステムにより、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のチロシンにアダプター蛋白質ＳｃｋがそのＳＨ２ドメインを介して結合していることが見出されている［Ｉｇａｒａｓｈｉ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５１，７２（１９９８）］。
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の血管内皮細胞の増殖に至る情報伝達では、他のチロシンキナーゼ型受容体と異なりＲａｓやＰＩ３キナーゼの関与はほとんどなく、ＶＥＧＦの刺激により活性化し自己リン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に、ＰＬＣ−γが結合してリン酸化を受けて活性化し、さらにＰＫＣが活性化されその結果ＭＡＰキナーゼの活性化とＤＮＡ合成の誘導がおこるという、ＰＬＣ−γ−ＰＫＣ−ＭＡＰキナーゼの系が主に関与していると考えられている「Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｔ　＆　Ｓｈｉｂｕｙａ　Ｍ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４，２０７９（１９９７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２２１（１９９９）］。ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位、１２１４位のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異体を内皮細胞由来の細胞株に発現させることにより、１１７５位のチロシンのリン酸化がＰＬＣ−γのリン酸化やＭＡＰキナーゼの活性化と関与することが報告されている（高橋ら、第５８回日本癌学会総会１９９９年）。
また、内皮細胞内でＶＥＧＦ依存的に１１７５位チロシンがリン酸化されることが報告されている。さらに、リン酸化した１１７５位チロシンに対するポリクローナル抗体を作製し、この抗体が１１７５位のチロシンがリン酸化されたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識することも報告されている（高橋ら、第５回Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ学会２０００年）。しかし、このリン酸化した１１７５位チロシンに対する抗体と、細胞増殖の阻害との因果関係については知られていない。
発明の開示
ヒト型ＶＥＧＦ受容体ＫＤＲの情報伝達を阻害できれば、ヒトにおける固形腫瘍の増殖、転移形成、慢性関節リュウマチにおける関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾鮮等の異常な血管新生により病態が進行する疾患の治療に有用であることが期待される。
本発明の目的は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞内情報伝達を遮断し、ＶＥＧＦによる細胞増殖を阻害する物質を取得し、さらに該物質の利用方法を提供することである。
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達に重要な自己リン酸化部位である、１１７５位チロシンをリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する抗体を作製した。そして、この抗体が１１７５位チロシンがリン酸化されたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に検出できるのみならず、この抗体を内皮細胞に注入するとＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害し、ＶＥＧＦに依存的な細胞の増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は以下に示す（１）〜（３８）に関する。
（１）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する方法。
（２）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、細胞増殖を阻害する方法。
（３）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、血管新生を阻害する方法。
（４）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、細胞増殖阻害剤のスクリーニング法。
（５）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、血管新生阻害剤のスクリーニング法。
（６）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する物質のスクリーニング法。
（７）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、被験物質がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害するか否かを判定する方法。
（８）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、組織での血管新生を検出する方法。
（９）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を用いる、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質のスクリーニング法。
（１０）情報伝達分子がホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）である、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体である、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１２）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合し、かつＰＬＣ−γのリン酸化を阻害する抗体である、上記（１１）記載の方法。
（１３）抗体がモノクローナル抗体またはその抗体断片である、上記（１１）または（１２）記載の方法。
（１４）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する方法。
（１５）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、細胞増殖を阻害する方法。
（１６）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、血管新生を阻害する方法。
（１７）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、被験物質がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害するか否かを判定する方法。
（１８）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を用いる、組織での血管新生を検出する方法。
（１９）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質を有効成分として含有する薬剤。
（２０）薬剤が、チロシンリン酸化阻害剤である上記（１９）に記載の薬剤。
（２１）薬剤が、細胞増殖阻害剤である上記（１９）に記載の薬剤。
（２２）薬剤が、血管新生阻害剤である上記（１９）に記載の薬剤。
（２３）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体である、上記（１９）〜（２２）のいずれかに記載の薬剤。
（２４）抗体が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体が、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合し、かつホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）のリン酸化を阻害する抗体である、上記（２３）に記載の薬剤。
（２５）抗体がモノクローナル抗体またはその抗体断片である、上記（２３）または（２４）に記載の薬剤。
（２６）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を有効成分として含有するＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のチロシンリン酸化阻害剤。
（２７）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を有効成分として含有する細胞増殖阻害剤。
（２８）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
（２９）上記（４）〜（６）および（９）のいずれかに記載の方法により得られる化合物。
（３０）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を認識するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（３１）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合し、かつリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片である、上記（３０）記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（３２）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に結合し、かつホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）のリン酸化を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片である、上記（３０）または（３１）記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（３３）ハイブリドーマＫＭ３０３５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７７２９）が生産するモノクローナル抗体またはその抗体断片である、上記（３０）〜（３２）記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（３４）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化可変領域（Ｖ領域）断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドから選ばれる抗体断片である上記（３０）〜（３３）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（３５）上記（３０）〜（３４）のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体またはその抗体断片が、放射性同位元素、蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合しているモノクローナル抗体またはその抗体断片。
（３６）上記（３０）〜（３５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
（３７）上記（３６）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（３８）上記（３７）記載の組換えベクターが宿主細胞に導入された形質転換体。
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞内情報伝達を遮断し、ＶＥＧＦによる細胞増殖を阻害する物質としては、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質があげられる。
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質としては、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体またはその抗体断片、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１と情報伝達分子との結合を阻害する化合物などがあげられる。
本発明の１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識する抗体またはその抗体断片としては、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識して結合し、１１７５位チロシンがリン酸化を受けていないＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とは結合しない特異性を有する抗体（以下、「１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体」または「本発明の抗体」とも表記する）またはその抗体断片であれば、いずれでも用いられるが、好ましくはリン酸化されたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＰＬＣ−γとの結合を阻害する抗体またはその抗体断片があげられる。
本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などがあげられるが、好ましくはモノクローナル抗体があげられる。
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産された抗体および、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体をあげることができる。
遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体、ヒト抗体および抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものが好ましく用いられる。
ヒト化抗体は、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体を包含する。
抗体断片は、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に特異的に反応する抗体断片であるＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇの略）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ；以下、ｓｃＦｖと称す）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８））、２量体化可変領域（Ｖ領域とも称す）断片（以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する）（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，６２９（１９９７））、およびジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　Ｆｖ；以下、ｄｓＦｖと称す）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９（１９９５））を包含する。
また、抗体断片には、上記抗体の抗体Ｖ領域重鎖（Ｈ鎖とも称す）（以下、抗体可変領域重鎖をＶＨとも称す）および抗体Ｖ領域軽鎖（Ｌ鎖とも称す）（以下、抗体可変領域軽鎖をＶＬとも称す）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと称す）のアミノ酸配列を含むペプチド（以下、ＣＤＲを含むペプチドと称す）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９６６（１９９６））も包含する。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体可変領域重鎖および可変領域軽鎖とヒト抗体の定常領域重鎖（以下、ＣＨと称す）およびヒト抗体の定常領域軽鎖（以下、ＣＬと称す）とからなる抗体を意味する。
本発明のヒト型キメラ抗体は、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。
本発明のヒト型キメラ抗体の構造としては、いずれのイムノグロブリン（Ｉｇ）クラスに属するものでもよいが、ＩｇＧ型、さらにはＩｇＧ型に属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のイムノグロブリンのＣ領域が好ましい。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＣＤＲ配列でそれぞれ置換した抗体を意味する。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に特異的に反応する、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列で任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列をそれぞれ置換したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｃ領域の構造としては、いずれのイムノグロブリン（Ｉｇ）クラスに属するものでもよいが、ＩｇＧ型、さらにＩｇＧ型に属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のイムノグロブリンのＣ領域が好ましい。
Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られた、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成された、分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
本発明のＦａｂは、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体をパパイン処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ間のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明のＦａｂ’は、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を酵素トリプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体をトリプシン処理して得ることができる。または、該抗体のＦ（ａｂ’）２断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆ（ａｂ’）２を製造することができる。
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、本発明の１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体のいずれをも用いることができる。
本発明のｓｃＦｖは、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖ発現ベクターを構築したのち該ｃＤＮＡを挿入し、大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ該発現ベクターを導入することにより発現させ製造することができる。
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、本発明の１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、３〜１０残基のポリペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＤｉａｂｏｄｙを発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖに含まれるＶＨあるいはＶＬは１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体のいずれをも用いることができる。
本発明のｄｓＦｖは、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させることにより製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることにより製造することができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするｃＤＮＡを構築し、該ｃＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体またはその抗体断片は、該抗体またはその抗体断片に放射性同位元素、蛋白質または薬剤などを化学的にあるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の抗体の誘導体は、本発明の１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、抗体または抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、蛋白質あるいは薬剤などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、（株）地人書館（１９９４））により結合させることにより製造することができる。
または、本発明の１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入する。以上のような遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉ等があげられ、例えば、クロラミンＴ法等により、抗体に結合させることができる。
薬剤としては、低分子のものが好ましく、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社（１９９６））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２））などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＭ−ＣＳＦと表記する）、ヒトインターロイキン１２（ｈＩＬ−１２）等があげられる。また、癌細胞を直接障害するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体ついては、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１と情報伝達分子との結合を阻害する化合物としては、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対するアンチセンスＲＮＡあるいはＤＮＡ、情報伝達分子に対する抗体またはその抗体断片、情報伝達分子に対するアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、または後述するスクリーニング方法あるいはドラッグデザイン方法により得られた化合物などがあげられる。情報伝達分子としては、例えばＰＬＣ−γがあげられる。
また、本発明のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のチロシンのリン酸化を阻害する物質としては、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のチロシンのリン酸化を阻害する抗体またはその抗体断片、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のチロシンのリン酸化を阻害する作用を有するキナーゼ阻害剤、または後述するスクリーニング方法あるいはドラッグデザイン方法により得られた化合物などがあげられる。
以下に、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のチロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のチロシンのリン酸化を阻害する物質およびそれらの物質を含む医薬の用途について説明する。
１．１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質の取得方法
１−１．１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体の製造法
（１）抗原とするペプチドの調製
１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体は、配列番号７に示したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のアミノ酸配列のうちの、１１７５位のチロシンを含む連続した５〜２０残基のアミノ酸配列からなり、１１７５位チロシンに相当するアミノ酸がリン酸化チロシンになっているペプチドを化学合成し、このペプチドを抗原として動物を免疫することにより作製することができる。必要によってはペプチドのＮ末端またはＣ末端には、後述する担体蛋白質との結合に用いるためのシステイン残基を付加した配列にする。このような抗原のペプチドとして、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のアミノ酸配列の１１７１〜１１８０番めの配列のＮ末端にシステインを付加した配列を有し、１１７５位のチロシン残基に相当する４番目のアミノ酸がリン酸化チロシンである配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをあげることができる。チロシンがリン酸化されたペプチドは、文献の方法［Ｋｉｔａｓ　ＥＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７４，１３１４（１９９１）、Ｂａｎｎｗｏｒｔｈ　Ｗ　ａｎｄ　Ｋｉｔａｓ　ＥＡ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ，７５，７０７（１９９２）、Ｋｉｔａｓ　ＥＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，３０，６２２９（１９８９）、Ｋｉｔａｓ　ＥＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，２９，３５９１（１９８８）］に基づきペプチド合成機等を用いて固相合成を行うことにより化学合成することができる。
（２）１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲポリクローナル抗体の調製
上記のペプチドに対するポリクローナル抗体を含む抗血清は、文献［Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ．（１９８８）］（以下、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌと略記する）等に記載の一般的な方法により、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバントとともに抗原を１０日から４週間おきに数回投与して免疫を行うことにより調製することができる。抗原は（１）で調製したペプチドだけでは抗原として抗体を惹起する力が弱いので、ペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ，ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、破傷風毒素などの担体蛋白質に結合させたものを抗原とし、例えばウサギでは２００〜１０００μｇ、マウスで１０〜１００μｇを１回あたり投与する。ペプチドと担体蛋白質との結合はｍ−マレインイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ）、グルタルアルデヒドを用いて行うことができる。アジュバンドとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎ　ｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどがあげられる。各投与後３〜１０日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、抗原に用いたリン酸化ペプチドに対する反応性について、酵素免疫測定法で確認し、その血清が十分な抗体価を示した動物から採取した血清を抗血清とする。酵素免疫測定法は、抗原に用いたリン酸化ペプチドをプレートにコートし、サンプルである血清を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位体等で標識した抗イムノグロブリン抗体（免疫に用いた動物のイムノグロブリンに対する抗体）を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、抗原ペプチドを認識し結合する抗体を検出および定量する方法である［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）］。
（１）で調製した抗原用のペプチドを、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）により活性化したセファロース−４Ｂ［アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製］やその充填済カラムであるハイトラップＮＨＳ−活性化カラム（ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｏｌｕｍｎ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）等に固定化して作製したアフィニティーカラムを用いて、上記の抗血清に対してアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、容易に抗原ペプチドと結合するポリクローナル抗体を精製することができる。ペプチドの固定化やアフィニティークロマトグラフィーはメーカーのマニュアルに従って行うことができる。
このようにして精製したポリクローナル抗体中には、抗原としたペプチドの配列中のリン酸化チロシン以外の部分をエピトープとするために、抗原としたペプチドあるいは１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１と結合するばかりでなく、１１７５位チロシンがリン酸化されていないＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とも結合できるような抗体も含まれている。そこで、（１）で調製した抗原用のペプチドと同じアミノ酸配列において、リン酸化チロシンが（リン酸化されていない）チロシンになっているペプチドをペプチド合成機などで化学合成し、このペプチドを上記と同様にして固定化したアフィニティーカラムに、上記で精製したポリクローナル抗体を通すことにより、１１７５位チロシンがリン酸化を受けていないＫＤＲ／Ｆｌｋ−１も認識する抗体（このような抗体は、アフィニティーカラム上の非リン酸化チロシンペプチドとも結合する）をカラムに結合させて除き、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲポリクローナル抗体を精製することができる。
（３）モノクローナル抗体の調製
（２）と同様にして３〜２０週令のマウスまたはラットを免疫し、血清中に十分な抗体価を示した動物の脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。例えば脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｓｈｕｌｍａｎｅｔ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８６５３（６５３）［Ｋｅａｒｎｅｙ　ＪＦ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］など、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞と最小培地（ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＥＭ）あるいはＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）で洗浄したのち、ポリエチレングリコール−１０００などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させる。融合細胞をＨＡＴ培地［正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／ｌグルタミン、５×１０−５ｍｏｌ／ｌ　２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地）に１０−４ｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１．５×１０−５ｍｏｌ／ｌチミジンおよび４×１０−７ｍｏｌ／ｌアミノプテリンを加えた培地］に懸濁させ、９６穴プレートに分注して培養する。
培養後、各穴の培養上清の一部をとり酵素免疫測定法により、（２）の抗原のペプチドと同一の配列の非リン酸化ペプチドとは反応せずに、抗原としたリン酸化ペプチドと特異的に反応するものを選択する。選択した穴内の細胞から、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ、２、６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、上記で得られた１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０７〜５×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡカラムあるいはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラムなどを用いて、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、モノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法あるいは波長２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
１−２．１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質をスクリーニングする方法
上記１−１で得られた抗体とＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現する細胞を用いて、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質または１１７５位のチロシンリン酸化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。具体的には、該抗体、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現する細胞および／または被験試料とを接触させ、抗体とＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の結合や、リン酸化の誘導または抑制などを、定性的または定量的に調べることにより、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質または１１７５位のチロシンリン酸化を阻害する物質をが選択される。
被験物質としては、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現する細胞の培養系に加えることができるものであれば特に限定されず、例えば、低分子化合物、高分子化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、遺伝子、ウイルス、細胞などが挙げられる。遺伝子を除く被験物質は、培養培地中に直接添加すればよい。
遺伝子を効率的に培養系に導入する方法としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクターに乗せて培養系に添加する方法、またはリポソームなどの人工的なベジクル構造に封入して培養系に添加する方法などが挙げられる。その具体的例としては、組換えウイルスベクターを用いた遺伝子解析に関する報告［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３（１９９５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，３５８７，１９９０；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２３，３８１６（１９９５）］を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法としては、免疫学的測定法を利用したスクリーニング方法があげられる。免疫学的測定法としては、任意の公知の免疫学的測定方法があげられる。免疫学的測定法としては、例えば、競合法、サンドイッチ法［免疫学イラストレイテッド第５版（南光堂）］があげられるが、サンドイッチ法が好ましい。
サンドイッチ法を利用したスクリーニング方法とは、具体的には、固相に第一の抗体を結合させた後、被験物質と、ＶＥＧＦ含有培地で培養したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１発現細胞とを反応させた後、標識した第二の抗体を反応させる方法である。
サンドイッチ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、上述したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２などの抗体断片を用いてもよい。サンドイッチ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントの組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントの組み合わせでもよいが、高感度のサンドイッチＥＬＩＳＡを行うためには、特異的な結合活性を有するモノクローナル抗体が好ましい。例えば、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞外領域を認識する抗体またはその抗体断片と、前記１で製造された１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体またはその抗体断片との組み合わせがあげられる。固相に結合させる抗体および標識する抗体は、２つの抗体のいずれでもよい。
標識方法としては、放射性同位元素、酵素、蛍光、発光などがあげられるが、好ましくは酵素での標識があげられる。
以下にスクリーニング方法を具体的に説明する。
９６穴プレートに１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体を分注し、４℃で一晩放置して吸着させる。洗浄後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳを加えて、室温で１時間静置して非特異的吸着をブロックする。ＰＢＳで洗浄後、ＶＥＧＦを含まない培地で培養したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現する細胞の細胞抽出液を分注した後に、ＶＥＧＦおよび試験物質を添加してＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を活性化し反応させる。洗浄後にウェルに結合したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の量を、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体とは別のエピトープを認識する抗体例えばＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞外領域を認識する抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体を用いて酵素免疫測定法により測定する。試験物質を添加しない場合のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の結合量と試験物質を添加した場合の結合量を測定し比較することにより、１１７５位のチロシンリン酸化を阻害する物質、あるいは、１１７５位のチロシンリン酸とＰＬＣ−γなどのアダプター分子の結合を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
１−３．ドラックデザインによる１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質の取得方法
本発明の１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質は、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞内領域と情報伝達分子との構造を、Ｘ線結晶解析またはＮＭＲ解析などの構造解析により得られた数値をもとに、計算機上のシミュレーションを行ってＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞内領域と情報伝達分子との結合領域を推定し、かつそれらの分子間結合を阻害することが可能な化合物を既存のデータベースあるいはコンピューターソフトを用いた構築により、取得することができる。
また、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質は、１１７５位がリン酸化される際のチロシンキナーゼの構造を、Ｘ線結晶解析またはＮＭＲ解析などによる構造解析により得られた数値をもとに、計算機上のシミュレーションにより構造を推定し、新規化合物を既存のデータベースから選択するか、あるいはコンピューターソフトを用いた構築により、取得することができる。
ここで、（１）構造未知のタンパク質の立体構造を既知類似酵素の立体構造から自動構築する場合には、例えば、Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ／Ｍｏｄｅｌｅｒ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）が用いられる。（２）タンパク質の立体構造からリガンド結合部位を予測する場合には、例えば、Ｃｅｒｉｕｓ２／ＬｉｇａｎｄＦｉｔ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）が用いられる。（３）タンパク質の立体構造がわかっていて，リガンド結合部位がだいたい（領域として）わかっているときに、リガンドの結合様式を予測する場合、あるいは、任意の化合物が結合（阻害）するかどうか予測する場合には、例えば、Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ／Ａｆｆｉｎｉｔｙ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、ＧＯＬＤ（ＣＣＤＣ）、ＦｌｅｘＸ（Ｔｒｉｐｏｓ）、ＤＯＣＫ（Ｐｒｏｆ．Ｋｕｎｔｚ）が用いられる。（４）リガンド結合部位から、結合（阻害）すると予想される化合物を生成する場合には、例えば、Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ／Ｌｕｄｉ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）が用いられる。
上記で取得した化合物は、前記１−２のスクリーニング方法で示したアッセイ方法を用いることにより、阻害活性を有しているか否かを確認することができる。
２．１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体によるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達の阻害および細胞増殖の阻害
本発明で使用される１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質またはＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質が、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害すること、細胞増殖あるいは血管新生を阻害することは、以下の方法で確認することができる。
（１）ＰＬＣ−γとＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の結合の阻害
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１発現細胞、例えばＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲ［Ｓａｗａｎｏ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．，７，２１３（１９９６）］をＶＥＧＦで刺激してＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を活性化した後に細胞抽出液を調製する。ここにＰＬＣ−γあるいはＰＬＣ−γのＳＨ２ドメイン、例えばＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）とＰＬＣ−γＣ末端側ＳＨ２ドメイン融合蛋白質［サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．）製］を添加し結合させる。この系に該抗体を添加した場合と添加しない場合について、ＰＬＣ−γあるいはＰＬＣ−γのＳＨ２ドメインを免疫沈降やグルタチオン固定化ビーズ等により分離した後に、抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体を用いたイムノブロットを行い、免疫沈降物中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の量を比較する。該抗体を添加した場合に、非添加時と比較して免疫沈降物中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の量が減少していれば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで該抗体がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＰＬＣ−γの結合を阻害しているといえる。
また、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現している血管内皮細胞例えば、洞様血管内皮細胞やヒト臍帯静脈血管内皮細胞の中に該抗体をマイクロインジェクションにより注入した細胞と注入しない細胞について、ＶＥＧＦにより刺激した後に細胞抽出液を調製する。それぞれの細胞抽出液について上記と同様に抗ＰＬＣ−γ抗体によりＰＬＣ−γを免疫沈降した後に、免疫沈降物について抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体を用いたイムノブロットを行い、免疫沈降物中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の量を比較する。該抗体を注入した場合に、非注入時と比較して免疫沈降物中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の量が減少していれば、ｉｎ　ｖｉｖｏで該抗体がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＰＬＣ−γの結合を阻害しているといえる。免疫沈降やイムノブロットはＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ等の実験書に記載の方法で行うことができる。
（２）ＰＬＣ−γリン酸化の阻害
（１）と同様にして該抗体を細胞内に注入した血管内皮細胞と注入しない細胞からＶＥＧＦ刺激後に調製した細胞抽出液について、抗ＰＬＣ−γ抗体によりＰＬＣ−γを免疫沈降した後に、免疫沈降物について抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロットを行い、免疫沈降物中のリン酸化したＰＬＣ−γの量を比較する。該抗体を注入した場合に、非注入時と比較して免疫沈降物中のリン酸化したＰＬＣ−γの量が減少していれば、ｉｎ　ｖｉｖｏで該抗体がＰＬＣ−γのリン酸化すなわちＰＬＣ−γの活性化を阻害しているといえる。
（３）ＭＡＰキナーゼ活性化の阻害
（１）と同様にして該抗体を細胞内に注入した血管内皮細胞と注入しない細胞からＶＥＧＦ刺激後に調製した細胞抽出液について、リン酸化ＭＡＰキナーゼに特異的な抗体を用いたイムノブロットを行い、リン酸化したＭＡＰキナーゼの量を比較する。該抗体を注入した場合に、非注入時と比較して細胞内のリン酸化したＭＡＰキナーゼの量が減少していれば、ｉｎ　ｖｉｖｏで該抗体がＭＡＰキナーゼのリン酸化すなわちＭＡＰキナーゼの活性化を阻害しているといえる。
（４）細胞増殖の阻害
（１）と同様にして該抗体を細胞内に注入した血管内皮細胞と注入しない細胞について、ＶＥＧＦで刺激する際にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添加し、ＶＥＧＦ刺激により新たに合成されたＤＮＡを標識する。細胞を免疫組織染色用に固定化し、抗ＢｒｄＵ抗体で染色することにより、新たにＤＮＡが合成された細胞を検出する。該抗体を注入した場合に、非注入時と比較して染色された細胞数が減少していれば、ｉｎ　ｖｉｖｏで該抗体がＤＮＡの合成すなわち細胞増殖のシグナルを阻害しているといえる。あるいは、ＢｒｄＵのかわりに［３Ｈ］チミジンを添加して培養して新たに合成されたＤＮＡを標識した後、細胞をグラスフィルター等で回収して細胞の放射能を測定することにより、ＤＮＡ合成量を測定する。該抗体を注入した場合に、非注入時と比較して放射能が減少していれば、ｉｎ　ｖｉｖｏで該抗体がＤＮＡの合成すなわち細胞増殖のシグナルを阻害しているといえる。
３．１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質の用途
本発明の１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達分子の結合を阻害し、細胞増殖を阻害する活性または血管新生を阻害する活性を有している。これらの性質を有する物質は、以下の用途に使用することができる。
（１）本発明の１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質の使用方法
前記２より、本発明の１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達分子の結合を阻害し、細胞増殖または血管新生などを阻害するために用いることができる。
固形腫瘍の増殖など細胞増殖に関わる疾患、または転移形成、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症などの血管新生に関わる疾患の診断または治療に用いることができる。
また、血管内皮細胞などの細胞内における細胞増殖の情報伝達には、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が重要であるため、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を介した血管内皮の増殖を阻害するために用いることができる。従って、ヒト型ＶＥＧＦ受容体ＫＤＲの情報伝達を阻害できれば、ヒトにおける固形腫瘍の増殖、転移形成、慢性関節リュウマチにおける関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾鮮等の異常な血管新生により病態が進行する疾患の診断または治療に用いることができる。
（２）１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質またはＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質を有効成分として含有する薬剤
これまでに、このような阻害剤としては、１）細胞外ドメインに対する中和抗体、可溶性ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１などの、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＶＥＧＦとの結合を阻害する物質、２）キナーゼ阻害剤など細胞内のキナーゼを阻害することにより以降の情報伝達を阻害する物質が知られている。これらの物質に対し、前記２で確認される性質を有する、１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質またはＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質は、新規なメカニズムのＶＥＧＦ−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達の阻害剤、すなわち細胞増殖阻害剤および血管新生阻害剤として使用することができる。
１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質またはＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該化合物または抗体そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物または抗体を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物または抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、各化合物または抗体として０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日投与する。投与は、各化合物または抗体を同時に投与する場合は、１日１回（単回投与または連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、３週間に１回、別々に投与する場合は、各々の化合物または抗体を、適宜時間をおいて、１日１回（単回投与または連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、３週間に１回静脈注射により行う。
（３）血管新生の早期検出
前記１−１で製造された本発明の抗体が、リン酸化されたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、すなわち情報伝達を行っているＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のみを検出できることを利用して、臨床組織材料について、該抗体を用いた免疫組織染色を行うことができる。染色された部位は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が活性化していることを示すため、染色部位を観察することにより新生血管を検出するよりも早い時期に、血管新生の初期の段階またはこれから血管新生がおこる部位を検出することができる。免疫組織染色は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ等の実験書に記載する方法で行うことができる。
（４）ＶＥＧＦ−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の系での情報伝達を阻害するか否かの判定方法
被験物質が実際に、動物個体においてＶＥＧＦ−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の系の情報伝達の阻害効果があるかどうかを判定するには、非ヒト動物、例えばマウスに腫瘍を移植し、被験物質を投与した場合と非投与の場合で、移植した腫瘍の成長や腫瘍周辺の血管新生を観察し、比較する方法が用いられてきたため、効果を判定するまでに数週間を要した。
本発明は、本発明の抗体が、情報伝達を行っているＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のみを検出できることを利用し、以下の方法で短期間に被験物質がＶＥＧＦの阻害効果を有するか否かを判定することができる。被験物質としては、上記スクリーニング方法で例示された物質があげられる。
被験物質を投与したマウスおよび未投与マウス（コントロール）について、被験物質を投与した１〜２日後にそれぞれ血管内皮を採取し、１１７５位チロシンリン酸化特異的抗ＫＤＲ抗体による免疫組織染色を行う。該抗体による染色量は、リン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の量を示す。したがって、被験物質を投与したマウス血管内皮の染色量が未投与マウス血管内皮の染色量と比較して減少していれば、動物個体においてＶＥＧＦ−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の系の情報伝達が阻害されていると判定することができる。
以下に実施例により、本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１　１１７５位チロシンのリン酸化を検出できる抗体
（１）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のチロシンのリン酸化を特異的に検出できる抗体の作製
配列番号１に示す配列（ヒトＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のアミノ酸配列の１１７１〜１１８０番めの配列のＮ末端にシステインを付加した配列で、１１７５位に相当するチロシンがリン酸化されている配列）のペプチドＰＹ１１７５を化学合成した。このペプチドＰＹ１１７５をシステインを利用してＫＬＨとのコンジュゲートにしたものを抗原として、ウサギを免疫することにより抗血清を得た。ハイトラップＮＨＳ活性化カラム（ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｏｌｕｍｎ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）にペプチドＰＹ１１７５を固定化し、ＰＹ１１７５アフィニティーカラムを作製し、得られた抗血清を通すことによりＰＹ１１７５と結合する抗体を精製した。さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＰＹ１１７５と同じアミノ酸配列だが、チロシンがリン酸化されていない配列）を有するペプチドＹ１１７５を化学合成し、ハイトラップＮＨＳ活性化カラムに固定化してＹ１１７５アフィニティーカラムを作製し、上記のＰＹ１１７５アフィニティーカラムにより精製した抗体を通すことにより、リン酸化チロシン以外の部分をエピトープとする抗体をＹ１１７５アフィニティーカラムに結合させて除き、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のリン酸化チロシンに特異的な抗体（抗ＰＹ１１７５抗体）だけを精製した。なお、マウスＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ５９３９７）にはＰＹ１１７５の２〜１０番めと同じ配列（Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ）が１１６９〜１１７９番めに存在するので、上記のようにして調製した抗ＰＹ１１７５抗体は、ヒトＫＤＲ／Ｆｌｋ−１だけでなくリン酸化したマウスＫＤＲ／Ｆｌｋ−１も認識できると考えられる。
（２）抗ＰＹ１１７５抗体の特異性
マウスの内皮細胞系の細胞株であるＭＳＳ３１細胞［Ｙａｎａｉ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，１６，８７（１９９１）］は、上記文献の培養条件で培養した。この細胞に天然型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、１１７５位のチロシンをフェニルアラニンに置換したＹ１１７５Ｆ、１２１４位のチロシンをフェニルアラニンに置換したＹ１２１４Ｆ、８０１位のチロシンをフェニルアラニンに置換したＹ８０１Ｆの各変異型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１発現アデノウイルスベクター（参考例１参照）を３７℃で１時間感染させた。それぞれの細胞を感染後２日間培養した後、培地を０．１％ＦＣＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に交換して１２時間培養し、１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ［Ｃｏｈｅｎ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔ．，７，１３１（１９９２）の記載に従って、ＶＥＧＦ発現昆虫細胞Ｓｆ−９の培養上清からヘパリンカラムクロマトグラフィーにより精製した組換えヒトＶＥＧＦ］を添加して３７℃で５分間培養した。この細胞と、コントロールのＶＥＧＦを添加しなかった細胞について、細胞溶解用緩衝液［５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、５ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ、２％アプロチニン、１ｍｍｏｌ／ｌ　ＰＭＳＦ、５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＦ、１０ｍｍｏｌ／ｌピロリン酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌバナジン酸ナトリウム］を用いて細胞抽出液を調製した。それぞれの細胞抽出液について抗ＰＹ１１７５抗体を用いてイムノブロットを行った。以降のイムノブロットは、文献［Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｔ　＆　Ｓｈｉｂｕｙａ　Ｍ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４，２０７９（１９９７）］の方法で行った。また、同時に抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体［化学合成した配列番号６に示す配列のペプチド（ヒトＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のアミノ酸配列の９４７〜９６６番目に相当する）を抗原として、ウサギを免疫して作製したポリクローナルな抗血清］および抗リン酸化チロシン抗体［ＩＣＮバイオケミカルズ（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製］を用いたイムノブロットを行い、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（リン酸化の有無にかかわらない）、自己リン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を含むリン酸化蛋白質をそれぞれ検出した。その結果を第１Ａ図に示したが、１１７５位がフェニルアラニンのためリン酸化できないＹ１１７５ＦはＶＥＧＦ添加細胞でも検出されないのに対し、Ｙ１１７５Ｆ以外の各ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は、ＶＥＧＦを添加した細胞のみに抗ＰＹ１１７５抗体でバンドが検出され、内皮細胞の細胞内でもＶＥＧＦに依存して１１７５位チロシンがリン酸化を受けることが見出された。なお、抗ＰＹ１１７５抗体では、ＶＥＧＦを添加した細胞でのみバンドが検出できたことから、抗ＰＹ１１７５抗体はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンの自己リン酸化を特異的に検出できることが確認された。
また、他のチロシンキナーゼ型受容体であるｂＦＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ−１、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体を発現している細胞として、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を恒常的に発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞であるＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲ［天然型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の他に内在性のｂＦＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体を発現、Ｓａｗａｎｏ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．，７，２１３（１９９６）］、Ｆｌｔ−１を恒常的に発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞であるＮＩＨ３Ｔ３−Ｆｌｔ−１［Ｓａｗａｎｏ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．，７，２１３（１９９６）］、ＨｅＬａ細胞（内在性ＥＧＦ受容体を発現、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）を培養した。培養は、ＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲおよびＮＩＨ３Ｔ３−Ｆｌｔ−１は、１０％ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ｌ　Ｌ−グルタミン、４０μｇ／ｍｌカナマイシン、２００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を添加したＤＭＥＭで、ＨｅＬａ細胞は１０％ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ｌ　Ｌ−グルタミン、４０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＤＭＥＭを用いて行った。培地の血清濃度を０．１％に低下させて６〜７時間培養後、それぞれのリガンドであるＶＥＧＦ、ヒトｂＦＧＦ［オンコジーン・サイエンス社製（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．）］、ＰＤＧＦ　Ｂ／Ｂ［ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製］、ＥＧＦ（東洋紡社製）で刺激した細胞と刺激しない細胞の各細胞抽出液について、抗ＰＹ１１７５抗体および抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体、抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロットを行った。その結果を第１Ｂ図に示したが、抗リン酸化チロシン抗体では、全てのチロシンキナーゼ受容体のリガンド依存的な自己リン酸化が検出されたのに対し、抗ＰＹ１１７５抗体ではＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲをＶＥＧＦで刺激した場合にのみバンドが検出された。したがって、全てのリン酸化受容体を検出できる抗リン酸化チロシン抗体と異なり、抗ＰＹ１１７５抗体は、１１７５位のチロシンがリン酸化されたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を特異的に認識することが確認された。
実施例２　抗ＰＹ１１７５抗体を用いたイムノブロットによる内在性自己リン酸化ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の検出
内在性ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現しているヒト臍帯静脈内皮細胞（森永生化学研究所社製）を５％ＦＣＳおよび各種増殖因子を添加した完全培地（日水製薬社製）またはヒューメディア−ＥＧ２培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２、倉敷紡績社製）で培養した。また、同様に内在性ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現しているラット洞様血管内皮細胞をラット肝臓から文献［Ｙａｍａｎｅ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　９，２６８３（１９９４）］に記載の方法で単離し、１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦを含むヒューメディア−ＥＧ２培地で培養した。これらの細胞について、培地を０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに交換して６〜７時間培養後、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ［Ｒ　アンドＤ・システムズ社（Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）製］を添加して刺激した。ＶＥＧＦ等で刺激した細胞とコントロールの刺激しなかった細胞について細胞抽出液を調製し、抗ＰＹ１１７５抗体、抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体、抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロットを行った。その結果を第１Ｃ図に示したが、抗ＰＹ１１７５抗体ではヒト臍帯静脈血管内皮細胞およびラット洞様血管内皮細胞の両者とも、ＶＥＧＦで刺激した場合にのみ、２３０ｋＤａの１１７５位チロシンリン酸化ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のバンドが検出された。したがって、血管内皮細胞の内在性のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１についても、ＶＥＧＦ依存的に１１７５位チロシンが自己リン酸化を受けることが確認された。
実施例３　抗ＰＹ１１７５抗体を用いた免疫組織染色による自己リン酸化ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の検出
ヒト臍帯静脈内皮細胞を培養し、培地を０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに交換して６〜７時間培養後、１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦあるい５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦで刺激した。コントロールの刺激をしなかった細胞、ＶＥＧＦ刺激後５分後の細胞、ＶＥＧＦ刺激後３０分後の細胞、ｂＦＧＦ刺激後５分後の細胞をそれぞれアセトン／メタノールで２分間処理することにより固定した。固定した細胞を１％ヤギ血清を含むＰＢＳで３０分間ブロッキングした後、抗ＰＹ１１７５抗体を用いて免疫組織染色を行った。検出は１／１００に希釈したＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ抗体［カッペル（Ｃａｐｐｅｌ）社製］で３０分間処理後、蛍光顕微鏡観察により行った。その結果、ＶＥＧＦで刺激後５分後の細胞でのみ細胞膜および細胞質にＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化が検出されたが、ＶＥＧＦ刺激後３０分後の細胞ではもはや１１７５位チロシンのリン酸化は検出されなかった。したがってＶＥＧＦの刺激によりすぐに１１７５位チロシンのリン酸化がおこるが、このリン酸化は一過的なものであることがわかった。刺激をしなかった細胞、ｂＦＧＦで刺激をした細胞では染色はみられず、この１１７５位チロシンのリン酸化はＶＥＧＦ刺激特異的であった。またＶＥＧＦで刺激後５分後の細胞の免疫組織染色時に１μｇ／ｍｌのペプチドＰＹ１１７５を共存させた場合は、染色が阻害された。このように抗ＰＹ１１７５抗体はイムノブロットだけでなく、免疫組織染色によるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンリン酸化の検出にも有用であった。
実施例４　抗ＰＹ１１７５抗体によるＰＬＣ−γとＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の結合の阻害
（１）細胞内でのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＰＬＣ−γの結合
実施例１（２）と同様にしてアデノウイルスベクターを用いてＭＳＳ３１細胞に天然型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１またはＹ１１７５Ｆを発現させ、１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦで刺激した。この細胞およびコントロールのＶＥＧＦ刺激をしなかった細胞の細胞抽出液を調製し、抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体を用いて免疫沈降を文献［Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｔ　＆　Ｓｈｉｂｕｙａ　Ｍ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４，２０７９（１９９７）］に記載の方法で行った。免疫沈降物について抗ＰＬＣ−γ抗体［アップステート・バイオテクノロジー社（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．）製］を用いたイムノブロットを行った。その結果を第２図に示したが、天然型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１発現細胞では、ＶＥＧＦで刺激した場合にのみ免疫沈降物からＰＬＣ−γが検出され、ＶＥＧＦの刺激によりＫＤＲ／Ｆｌｋ−１にＰＬＣ−γが結合することが確認された。一方、Ｙ１１７５Ｆ発現細胞では、ＶＥＧＦ刺激した場合でもＰＬＣ−γは検出されず、Ｙ１１７５ＦにはＰＬＣ−γは結合しないことがわかった。したがって、１１７５位チロシンのリン酸化がＰＬＣ−γの結合に必須であることがわかった。
（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＰＬＣ−γのＳＨ２ドメインとの結合
実施例１（２）と同様にして、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで刺激したＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲとコントロールのＶＥＧＦで刺激しなかった細胞から細胞抽出液を調製した。１．５μｇのＧＳＴ、ＧＳＴとＰＬＣ−γのＳＨ２ドメイン（２個）の融合蛋白質（ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　ＳＨ２−ＳＨ２）、ＧＳＴとＰＬＣ−γのＮ末端側のＳＨ２ドメインの融合蛋白質（ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｎ−ＳＨ２）、ＧＳＴとＰＬＣ−γのＣ末端側のＳＨ２ドメインの融合蛋白質（ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２）［以上全てサンタ・クルズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．）製］を、それぞれグルタチオン−セファロース４Ｂ・ビーズ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に固定化し、細胞抽出液に添加して、４℃で２時間反応させた。ビーズを冷却した細胞抽出用緩衝液で３回洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファー中で加熱することにより、ビーズに結合した蛋白質を溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体を用いたイムノブロットによりそれぞれの添加した蛋白質に結合したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を検出した。その結果を第３図に示したが、ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　ＳＨ２−ＳＨ２およびＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２では、ＶＥＧＦで刺激した細胞でＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が検出されたのに対し、ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｎ−ＳＨ２ではＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が検出されなかった。したがって、ＰＬＣ−γの２つのＳＨ２ドメインのうちＣ末端側のＳＨ２ドメインが自己リン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１と結合していることがわかった。
上記と同じ実験をＧＳＴ、ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２、ＧＳＴとＧｒｂ２のＳＨ２ドメインの融合蛋白質（ＧＳＴ−Ｇｒｂ２　ＳＨ２）、ＧＳＴとＰＩ３キナーゼのＮ末端側のＳＨ２ドメインの融合蛋白質（ＧＳＴ−ＰＩ３Ｋ　Ｎ−ＳＨ２）（以上全てサンタ・クルズバイオテクノロジー社製）を用いて行ったところ、第４図に示すようにＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２のみ、ＶＥＧＦで刺激した細胞でＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が検出され、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２　ＳＨ２、ＧＳＴ−ＰＩ３Ｋ　Ｎ−ＳＨ２ではＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は検出されなかった。したがって自己リン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１はＰＬＣ−γのＳＨ２ドメインとは結合するが、Ｇｒｂ２やＰＩ３キナーゼのＳＨ２ドメインとは結合しないことが確認された。
（３）抗ＰＹ１１７５抗体によるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＰＬＣ−γの結合の阻害
（２）と同様の実験をＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２を固定化したビーズと細胞抽出液の反応時に抗ＰＹ１１７５抗体、ＰＹ１１７５ペプチドを共存させて行った。その結果、ＶＥＧＦ刺激した細胞でもＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が検出されず抗ＰＹ１１７５抗体、ＰＹ１１７５ペプチドにより自己リン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＰＬＣ−γの結合が阻害された。一方、コントロールのウサギＩｇＧあるいはＹ１１７５ペプチドを共存させた場合は、阻害はみられなかった（第５Ａ図、第５Ｂ図）。したがって、ＰＬＣ−γのＣ末端側のＳＨ２ドメインがＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の自己リン酸化した１１７５位のチロシンと直接結合していることが強く示唆された。
実施例５　抗ＰＹ１１７５抗体による細胞増殖シグナルの抑制
まず初代培養したラット洞様血管内皮細胞をコラーゲンでコートしたスライドグラス上にのせ、チミジンを除いたＤＭＥＭにヒューメディア−ＥＧ２調製用増殖添加剤（倉敷紡績社製）およびＶＥＧＦを添加した培地で２日間培養後、ＶＥＧＦ非添加の同じ培地で６〜７時間培養した。細胞に５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦを添加して刺激すると同時に、１００μｍｏｌ／ｌ　５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、シグマ・アルドリッチ社製）を添加して２０時間培養し、新たに合成されたＤＮＡに取り込ませた。コントロールとしてＶＥＧＦを添加しなかった細胞についても同様の処理を行った。次いでそれぞれの細胞を３．７％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定化し、メタノールで１０分間、２ｍｏｌ／ｌ塩酸で１０分間処理することにより、細胞の透過性を上げた。この細胞を１％のヤギ血清を含むＰＢＳで１／２００希釈した抗ＢｒｄＵ抗体（宝酒造社製）と６０分間反応させ免疫組織染色を行うことにより、ＢｒｄＵが取り込まれた細胞を検出した。その結果第６図に示すように、ＶＥＧＦで刺激しなかった細胞ではＢｒｄＵの取り込みがほとんど観察されなかったのに対し、ＶＥＧＦを添加した場合には、ＢｒｄＵが取り込まれた細胞が多数観察され、ラット洞様血管内皮細胞における細胞増殖のシグナルはＶＥＧＦの刺激に非常に依存していることが確認された。
そこで同様にスライドグラス上で培養したラット洞様血管内皮細胞について、ＶＥＧＦ非添加の培地で６〜７時間培養した後にＶＥＧＦで刺激する前にこの細胞の細胞質に自動マイクロインジェクター５２４６［エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）社製］およびマイクロマニュピレーター５１７１（エッペンドルフ社製）を用いて抗ＰＹ１１７５抗体あるいはコントロールのウサギＩｇＧを注入した。注入の１〜３時間後に細胞に上記と同様に５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦおよび１００μｍｏｌ／ｌ　ＢｒｄＵを添加して２０時間培養し、新たに合成されたＤＮＡに取り込ませた。上記と同様にして細胞を固定化およびメタノールおよび塩酸で処理し、１／２００希釈抗ＢｒｄＵ抗体（宝酒造社製）と６０分間反応させた後、１／２００希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（抗ＢｒｄＵ抗体と反応、カッペル社製）および１／１００希釈したＲＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（抗ＰＹ１１７５抗体、ウサギＩｇＧと反応、カッペル社製）の混合物と３０分間反応させ免疫組織染色を行うことにより、ＢｒｄＵが取り込まれた細胞および抗体（抗ＰＹ１１７５またはウサギＩｇＧ）が注入された細胞を検出した。その結果第６図に示すようにウサギＩｇＧを注入した細胞では、ＶＥＧＦの刺激により半数以上の細胞にＢｒｄＵが取り込まれ、ＶＥＧＦの刺激により細胞の増殖シグナルが伝わりＤＮＡの合成が行われたことが示された。一方、抗ＰＹ１１７５抗体を注入した細胞では１／４程度の細胞にしかＢｒｄＵが取り込まれておらず、ＶＥＧＦ刺激による細胞の増殖のシグナルが阻害されたことが示された。
実施例６　ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を特異的に検出できるモノクローナル抗体の作製
実施例１で取得したＰＹ１１７５に特異的な抗体は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のリン酸化チロシンに対するポリクローナル抗体を、Ｙ１１７５アフィニティーカラムに通塔させることにより得ることができるが、ポリクローナル抗体の中からＰＹ１１７５のみに反応する抗体を得るためには、大量なポリクローナル抗体が必要となる。そこで、ＰＹ１１７５に特異的なモノクローナル抗体を作製することとした。
（１）免疫原の調製
配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるペプチドＰＹ１１７５は、免疫原性を高める目的で以下の方法で調製した。
まず、ＫＬＨ（カルビオケム社製）をＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌに調製し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ　ＭＢＳ［Ｎ−（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ；ナカライテスク社製］を滴下して３０分間撹拌反応させた。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢＳ２．５ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した１ｍｇのペプチドＰＹ１１７５と混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、ＰＢＳで透析したものを免疫原として用いた。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調整
実施例６（１）で調製した化合物ＰＹ１１７５のＫＬＨコンジュゲート５０μｇを水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，ｐ９９）２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに４週令雌ＳＤラット３匹に投与した。投与２週間後より、ＫＬＨコンジュゲート５０μｇを１週間に１回、計４回投与した。該ラットの心臓より部分採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（３）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイ用の抗原には実施例１（１）で得られたＰＹ１１７５およびＹ１１７５をサイログロブリン（以下、ＴＨＹと略す）とそれぞれコンジュゲート（ＰＹ１１７５−ＴＨＹおよびＹ１１７５−ＴＨＹと称す）したものを用いた。作製方法は実施例６（１）に記した通りであるが、架橋剤にはＭＢＳの代わりにＳＭＣＣ［４−（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ　ｅｓｔｅｒ；シグマ社製］を用いた。９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上記のように調製したＰＹ１１７５−ＴＨＹまたはＹ１１７５−ＴＨＹを５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／穴でそれぞれ分注し、４度で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／ダルベッコりん酸バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）を１００μｌ／穴加え、室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。
放置後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫ラット抗血清またはハイブリドーマ培養上清を５０μｌ／穴分注し、２時間放置した。該プレートを０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ　２０相当品：和光純薬社製）］／ＰＢＳ（以下Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記）で洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリンを５０μｌ／穴加えて室温、１時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［１ｍｍｏｌ／ｌ　ＡＢＴＳを０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸バッファーに溶解（ｐＨ４．２）］を添加し、発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１：ＡＴＣＣより購入）を正常培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（５）ハイブリドーマの作製
実施例６（２）で得られたラット脾細胞と実施例６（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）１ｇ、ＭＥＭ培地１ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．３５ｍｌの混液を１０８個のマウス脾細胞あたり０．５ｍｌ加え、該懸濁液に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。
該懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかにＨＡＴ培地［１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地にＨＡＴ　Ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を加えた培地］１００ｍｌ中に懸濁した。該懸濁液を９６穴培養用プレートに２００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。
培養後、培養上清を実施例６（３）に記載した酵素免疫測定法で調べ、ペプチドＰＹ１１７５に反応してペプチドＹ１１７５に反応しない穴を選択した。しかしながら、大部分の細胞培養上清はＰＹ１１７５およびＹ１１７５のいずれにも反応していた。そのため、上記工程を繰り返し、ＰＹ１１７５に反応してＹ１１７５に反応しない穴を選択し、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、抗ＰＹ１１７５モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ３０３５およびＫＭ３０３６を確立した。ハイブリドーマＫＭ３０３５は、平成１３年９月１３日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）にＦＥＲＭ　ＢＰ−７７２９として寄託されている。
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に実施例６（５）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）した。
該腹水を遠心分離（１２００×ｇ、５分間）し、固形分を除去した。
精製ＩｇＧモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法により決定した。モノクローナル抗体ＫＭ３０３５およびモノクローナル抗体ＫＭ３０３６のサブクラスは共にＩｇＧ２ａであった。
実施例７　モノクローナル抗体の反応性の検討
（１）抗原固相系における抗原化合物との反応性（バインディングＥＬＩＳＡ）
実施例６で得られたモノクローナル抗体の抗原ペプチドとの反応性は、実施例６（３）に示した方法に準じて調べた。ＰＹ１１７５−ＴＨＹまたはＹ１１７５−ＴＨＹをそれぞれ吸着させたプレートに、１次抗体として実施例６（５）で得られたハイブリドーマＫＭ３０３５およびＫＭ３０３６の生産したモノクローナル抗体を含んだ培養上清、該上清を５１、５２、５３および５４倍希釈した希釈液を反応させ、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリンを反応させた。結果を第７図に示す。ハイブリドーマＫＭ３０３５およびＫＭ３０３６が生産したモノクローナル抗体はいずれも、ペプチドＰＹ１１７５にのみ反応し、ペプチドＹ１１７５には全く反応しなかった。
（２）抗原液相系における抗原化合物に対する反応性（インヒビションＥＬＩＳＡ）
実施例６（３）に示した方法に準じてＰＹ１１７５−ＴＨＹを固相化したプレートを作製し、２０μｇ／ｍｌより５倍希釈で段階的に希釈したペプチドＰＹ１１７５およびペプチドＹ１７５５を５０μｌ／穴でそれぞれ分注後、ハイブリドーマＫＭ３０３５またはＫＭ３０３６の生産したモノクローナル抗体を含む培養上清をそれぞれ希釈して（希釈倍率；ＫＭ３０３５：×１２０、ＫＭ３０３６：×１０００）５０μｌ／穴で分注し、室温で２時間反応させた。ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ社製）を５０μｌ／穴で加えて室温、１時間反応させ、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後ＡＢＴＳ基質液を用いて発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；和光純薬社製）にて測定した。
第８図に示すように、ハイブリドーマＫＭ３０３５およびＫＭ３０３６が生産したモノクローナル抗体はいずれも液相系においてペプチドＰＹ１１７５にのみに反応した。
実施例８　モノクローナル抗体ＫＭ３０３５を用いたイムノブロットによる自己リン酸化ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の検出
実施例１（２）と同様にして、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで刺激したＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲおよびコントロールのＶＥＧＦ未刺激細胞から細胞抽出液を調製し、抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１モノクローナル抗体を用いたイムノブロットを行った。
第９図に示すように、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の９４７〜９６６番目のアミノ酸配列からなるペプチドをウサギに免疫して得られたウサギポリクローナル抗体ではＶＥＧＦ刺激、無刺激に関係なく２３０ｋＤａのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のバンドが検出された。
一方、モノクローナル抗体ＫＭ３０３５ではＶＥＧＦで刺激した場合にのみ、２３０ｋＤａのリン酸化ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のバンドが検出された。したがって、ＫＭ３０３５はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンの自己リン酸化を特異的に検出できることが確認された。
参考例１　変異型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１発現アデノウイルスベクターの作製
変異型のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１であるＹ１１７５Ｆ（１１７５位のチロシンをフェニルアラニンに置換）、Ｙ１２１４Ｆ（１２１４位のチロシンをフェニルアラニンに置換）、Ｙ８０１Ｆ（８０１位のチロシンをフェニルアラニンに置換）を発現するアデノウイルスベクターを以下のように作製した。
Ｙ１１７５ＦをコードするＤＮＡは配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー用いて、天然型のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１　ｃＤＮＡ［Ｓａｗａｎｏ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．，７，２１３（１９９６）］を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより変異を導入した断片を、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１　ｃＤＮＡのＡｐａＩ／ＰｓｔＩサイト間に挿入することにより作製した。Ｙ１２１４ＦをコードするＤＮＡは配列番号４で表される塩基配列のプライマーを用いて同様にＰＣＲを行うことにより変異を導入した断片を、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１　ｃＤＮＡのＡｐａＩ／ＰｓｔＩサイト間に挿入することにより作製した。また、Ｙ８０１ＦをコードするＤＮＡは配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーを用いて同様にＰＣＲを行うことにより変異を導入した断片を、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１　ｃＤＮＡのＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩサイト間に挿入することにより作製した。これらの変異型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１をコードするＤＮＡは、塩基配列を決定して変異が導入されていることを確認した。これらの変異型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１をコードするＤＮＡについてアデノウイルス発現ベクターキット（宝酒造社製）を用いることにより、それぞれのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１発現アデノウイルスベクター（組換えアデノウイルス）を作製した。
産業上の利用可能性
本発明により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞内情報伝達を遮断し、ＶＥＧＦによる細胞増殖を阻害する物質が提供される。さらに、該物質を用いたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する方法、細胞増殖を阻害する方法、血管新生を阻害する方法、細胞増殖阻害剤のスクリーニング法、血管新生阻害剤のスクリーニング法、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害する物質のスクリーニング法、被験物質がＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の情報伝達を阻害するか否かを判定する方法、組織での血管新生を検出する方法、およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位チロシンのリン酸化を阻害する物質のスクリーニング法が提供される。
配列フリーテキスト
配列番号１−人工配列の説明：合成アミノ酸
配列番号２−人工配列の説明：合成アミノ酸
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の１１７５位のリン酸化チロシンに特異的な抗体（以下、抗ＰＹ１１７５抗体とする）を用いたイムノブロットによる、種々の細胞内の１１７５位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の検出を示す図である。第１Ａ図は左から天然型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（Ｗｔ）、Ｙ１１７５Ｆ、Ｙ１２１４Ｆ、Ｙ８０１Ｆの各変異型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現させた細胞株ＭＳＳ３１の細胞抽出液のイムノブロットを示す。各レーンの−はＶＥＧＦで刺激しなかった細胞、＋はＶＥＧＦで刺激した細胞の結果である。第１Ｂ図は左からＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲ、ＮＩＨ３Ｔ３−Ｆｌｔ−１、ＨｅＬａの各細胞の細胞抽出液のイムノブロットを示す。−は刺激しなかった細胞、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦはそれぞれで刺激した細胞の結果である。第１Ｃ図は左からヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびラット洞様血管内皮細胞（ｒａｔＳＥＣ）の細胞抽出液のイムノブロットを示す。−は刺激しなかった細胞、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦはそれぞれで刺激した細胞の結果である。第１Ａ〜Ｃ図ともに上段は抗ＰＹ１１７５抗体を用いたイムノブロット、中段は抗リン酸化チロシン抗体（抗ＰＹ抗体）を用いたイムノブロット、下段は抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体を用いたイムノブロットの結果を示す。矢印は上段および中段は自己リン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（ｐＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）のバンドの位置を示し、下段はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（自己リン酸化しているもの、していないもの両者を含む）のバンドの位置を示す。
第２図はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現させたＭＳＳ３１細胞におけるｉｎ　ｖｉｖｏでのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１とＰＬＣ−γの結合を示す図である。Ｗｔは天然型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、Ｙ１１７５ＦはＹ１１７５Ｆ変異型ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を発現させた細胞、−はＶＥＧＦで刺激しなかった細胞、＋はＶＥＧＦで刺激した細胞それぞれの抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体による免疫沈降物について、上段は抗ＰＬＣ−γ抗体、下段は抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体を用いたイムノブロットの結果を示す。矢印は上段はＰＬＣ−γ、下段はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のバンドの位置を示す。ＴＣＬは、ＭＳＳ３１細胞の細胞抽出液（免疫沈降なし）の抗ＰＬＣ−γ抗体によるイムノブロットの結果を示す。
第３図はＰＬＣ−γのＳＨ２ドメインとＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの結合を示す図である。ＧＳＴあるいはＧＳＴと種々の蛋白質のＳＨ２ドメインの融合蛋白質とＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲの細胞抽出液を反応させ、グルタチオンアフィニティーカラムにより単離したＧＳＴあるいはＧＳＴと各ＳＨ２ドメインの融合蛋白質について、上段は抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体、下段は抗ＧＳＴ抗体を用いたイムノブロットの結果を示す。−はＶＥＧＦで刺激しなかった細胞、＋はＶＥＧＦで刺激した細胞の細胞抽出液を用いた場合である。左からＧＳＴ、ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　ＳＨ２−ＳＨ２、ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｎ−ＳＨ２、ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２を用いた場合である。矢印は上段はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、下段はＧＳＴあるいはＧＳＴと各ＳＨ２ドメインの融合蛋白質のバンドの位置を示す。ＴＣＬは、ＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲの細胞抽出液のみ（アフィニティーカラムなし）のイムノブロットの結果を示す。
第４図はＰＬＣ−γのＳＨ２ドメインとＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの結合を示す図である。ＧＳＴあるいはＧＳＴと種々の蛋白質のＳＨ２ドメインの融合蛋白質とＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲの細胞抽出液を反応させ、グルタチオンアフィニティーカラムにより単離したＧＳＴあるいはＧＳＴと各ＳＨ２ドメインの融合蛋白質について、上段は抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体、下段は抗ＧＳＴ抗体を用いたイムノブロットの結果を示す。−はＶＥＧＦで刺激しなかった細胞、＋はＶＥＧＦで刺激した細胞の細胞抽出液を用いた場合である。左からＧＳＴ、ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２　ＳＨ２、ＧＳＴ−ＰＩ３Ｋ　Ｎ−ＳＨ２を用いた場合である。矢印は上段はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、下段はＧＳＴあるいはＧＳＴと各ＳＨ２ドメインの融合蛋白質のバンドの位置を示す。ＴＣＬは、ＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲの細胞抽出液のみ（アフィニティーカラムなし）のイムノブロットの結果を示す。
第５図は抗ＰＹ１１７５抗体およびＰＹ１１７５ペプチドによるＰＬＣ−γのＳＨ２ドメインとＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの結合の阻害を示す図である。ＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２とＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲの細胞抽出液および抗体／ペプチドを添加して反応させた後にＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２を単離したものについての、上段は抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体、下段は抗ＧＳＴ抗体を用いたイムノブロットの結果を示す。−はＶＥＧＦで刺激しなかった細胞、＋はＶＥＧＦで刺激した細胞の細胞抽出液を用いた場合である。第５Ａ図は左から、添加なし、ウサギＩｇＧ、抗ＰＹ１１７５抗体を添加した場合、第５Ｂ図は左から、添加なし、ＰＹ１１７５ペプチド、Ｙ１１７５ペプチドを添加した場合の結果である。矢印は上段はＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、下段はＧＳＴ−ＰＬＣ−γ　Ｃ−ＳＨ２のバンドの位置を示す。ＴＣＬは、ＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲの細胞抽出液のみ（アフィニティーカラムなし）のイムノブロットの結果を示す。
第６図は抗ＰＹ１１７５抗体を注入したラット洞様血管内皮細胞におけるＶＥＧＦによる細胞増殖シグナルの阻害を示す図である。左から抗体の注入なし（ＶＥＧＦ刺激なし）、抗体の注入なし（ＶＥＧＦ刺激）、ウサギＩｇＧ注入（ＶＥＧＦ刺激）、抗ＰＹ１１７５抗体注入（ＶＥＧＦ刺激）の場合の、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞の割合（％）を示すグラフである。
第７図はＰＹ１１７５−ＴＨＹまたはＹ１１７５−ＴＨＹをそれぞれ吸着させたプレートに、１次抗体として得られたハイブリドーマＫＭ３０３５およびＫＭ３０３６の生産したモノクローナル抗体を含んだ培養上清、該上清の希釈液を反応させ、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリンを反応させた結果を示すグラフである。
第８図は、ＰＹ１１７５−ＴＨＹを固相化したプレートを作製し、段階的に希釈したペプチドＰＹ１１７５およびペプチドＹ１１７５をそれぞれ分注後、実施例１で得られたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の９４７〜９６６位の合成ペプチドを免疫して得られたウサギポリクローナル抗体またはハイブリドーマＫＭ３０３５の生産したモノクローナル抗体を含む培養上清をそれぞれ希釈してで分注して反応させ、希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリンを加えて反応させた後に、ＡＢＴＳ［２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム］基質液を用いて発色させた結果を示すグラフである。
第９図は、ＶＥＧＦで刺激したＮＩＨ３Ｔ３−ＫＤＲおよびコントロールのＶＥＧＦ未刺激細胞から細胞抽出液を調製し、抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１モノクローナル抗体を用いたイムノブロットを行った結果を示す図である。第９Ａ図は抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１モノクローナル抗体を用いた結果で、第９Ｂ図は抗ＰＹ１１７５モノクローナル抗体を用いた結果である。各レーンの−はＶＥＧＦで刺激しなかった細胞、＋はＶＥＧＦで刺激した細胞の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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