(57)【要約】本発明は、レプチン投与によって誘導される、新規なレプチン誘導遺伝子を提供する。本遺伝子はレプチンシグナルのすぐ下流に位置するため、本遺伝子の動きを追跡することにより、レプチン抵抗性を評価することができる。また、本発明の遺伝子を指標として、レプチン抵抗性を改善することができる薬剤のスクリーニングが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に見出される部分アミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質またはペプチドを回収する工程を含む、請求項２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項６】
請求項２に記載の蛋白質に結合する抗体。
【請求項７】
配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５塩基の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項８】
次の工程を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性の評価方法。
（ａ）被験化合物の存在下で請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞にレプチンを接触させる工程、および
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
【請求項９】
次の工程を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項８に記載の方法によって、被験化合物の請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する工程、および
（ｂ）被験化合物非存在下でレプチンを接触させた対照と比較して前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物を選択する工程
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２に記載の蛋白質、および請求項３に記載のベクターからなる群から選択された少なくとも１つの成分を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
次の工程を含む、生体試料中の請求項２に記載の蛋白質、および／またはその部分ペプチドの測定方法。
（１）生体試料を請求項６に記載の抗体と接触させる工程、および
（２）請求項２に記載の蛋白質、および／またはその部分ペプチドに結合する、請求項６に記載の抗体を検出する工程
【請求項１２】
請求項６に記載の抗体を含む、請求項２に記載の蛋白質、および／またはその部分ペプチドの測定用キット。
【請求項１３】
次の工程を含む、生体試料中の請求項１に記載のポリヌクレオチドの測定方法。
（１）生体試料を請求項７に記載のポリヌクレオチドと接触させる工程、および
（２）生体試料中に含まれる、請求項７に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出する工程
【請求項１４】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドの測定用キット。
【請求項１５】
請求項２に記載の蛋白質の発現が改変されるように操作された非ヒト脊椎動物。
【請求項１６】
ノックアウト動物またはトランスジェニック動物である、請求項１５に記載の非ヒト脊椎動物。
【請求項１７】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現が抑制されているマウス胚性幹細胞。
【請求項１８】
配列番号：１に記載された塩基配列を構成することができるエキソンにおいて、少なくとも開始コドンに変異を有する請求項１７に記載のマウス胚性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）によって誘導される遺伝子に関する。
背景技術
レプチンは肥満疾患モデルマウスであるｏｂ／ｏｂマウスからｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇによって単離されたサイトカインである。ｏｂ／ｏｂマウスはレプチン遺伝子の変異によって野生型のレプチンが産生されず、過食、肥満、ＩＩ型糖尿病などの表現型を呈する。このマウスにレプチンを投与するとこれらの症状は改善される。このことから、レプチンが生体内でエネルギーバランスの調節に働いていることが明らかである。
レプチンは成熟脂肪細胞より産生される。その血中量は絶食（空腹）において減少し、反対に摂食により増大する。他のサイトカインと同様に、レプチンはそのシグナルを固有の受容体を介して細胞内へと伝達している。レプチン受容体は生体内のさまざまな臓器に存在することが明らかにされている。その中で、特に食欲制御、エネルギーバランスの調節に直接関わっていると考えられる部位は、脳内視床下部である。
現在までにレプチン投与により、Ｓｔａｔ３と呼ばれる転写因子が視床下部において急速に活性化されるのが確認されている。しかし現在のところ、この活性化の生理的意義は定かではない。ｏｂ／ｏｂマウスにレプチンを投与して先の病的症状を改善させるのには、数週間に渡る投与が必要である。さらにレプチン投与により転写レベルで各種ニューロペプチドの発現レベルの変化が観察される。具体的には、レプチンの投与後数日してから、ｐｒｏ−ｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ（ＰＯＭＣ）の上昇、並びにｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ（ＮＰＹ）やａｇｏｕｔｉ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＧＲＰ）の減少が観察される。このことから、視床下部においてはレプチン投与により何らかの遺伝子が活性化もしくは不活性化されてＰＯＭＣ、ＮＰＹ、ＡＧＲＰなどの転写調節、ひいては肥満、ＩＩ型糖尿病などの解消へと導くカスケードが想定される。そこで、レプチン投与後に活性化または不活性化される遺伝子を同定できればＰＯＭＣ、ＮＰＹ、ＡＧＲＰなどへの転写のカスケードの解明につながる。更に、このカスケードを構成する因子は、肥満やＩＩ型糖尿病などの新たな創薬のターゲットとなることが考えられる。
発明の開示
本発明の課題は、レプチン投与に応答して発現レベルが変化する新規なレプチン応答性遺伝子、この遺伝子によってコードされる蛋白質、並びにそれらの製造方法および用途を提供することにある。
マウスなどの実験動物を用いてレプチンによって早期に誘導される遺伝子を取得する試みは、米国  Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  ｐｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌ社で行われたが成功に到らなかった。この原因として彼等は、視床下部に存在するｎｅｕｒｏｎが全てレプチン受容体を有するものでなく、レプチンに反応するものがあってもノイズに埋もれてしまうことを指摘している（Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ｗ．Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｓｔｒｉｃｋｅｒ−Ｋｒｏｎｇｒａｄ，Ａ．Ｇｅ，Ｐ．Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．Ｄｅｍｂｓｋｉ，Ｍ．Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．２０００．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｐｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９，ｐｐ  １４４３−１４５０）。
これに対して本発明者らは、受容体側のシグナル経路は正常であるが、リガンドであるレプチンの合成が正常にできないため肥満になっているｏｂ／ｏｂマウスを実験に用いた。ｏｂ／ｏｂマウスは外部から投与したレプチンに反応することから、レプチン投与の有無によってもたらされる遺伝子発現の差異を大きくできると考えた。また差異発現遺伝子を取得するため、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用して、ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｃＤＮＡを作成した。さらに真に発現差異のあるものをスクリーニングするため、ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｃＤＮＡのｉｎｓｅｒｔをＰＣＲによって増幅してこれをナイロン膜上に並べ、希少ｃＤＮＡを検出できるように、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したＤＮＡプローブを作成することによってレプチン誘導遺伝子をクローン化することに成功した。すなわち本発明は、以下のポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、並びにそれらを用いたスクリーニング方法に関する。
〔１〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に見出される部分アミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
〔２〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
〔３〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
〔４〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔３〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔５〕〔４〕に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質またはペプチドを回収する工程を含む、〔２〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔６〕〔２〕に記載の蛋白質に結合する抗体。
〔７〕配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５塩基の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
〔８〕次の工程を含む、〔１〕に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性の評価方法。
（ａ）被験化合物の存在下で〔１〕に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞にレプチンを接触させる工程、および
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
〔９〕次の工程を含む、〔１〕に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔８〕に記載の方法によって、被験化合物の〔１〕に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する工程、および
（ｂ）被験化合物非存在下でレプチンを接触させた対照と比較して前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物を選択する工程
〔１０〕〔１〕に記載のポリヌクレオチド、〔２〕に記載の蛋白質、および〔３〕に記載のベクターからなる群から選択された少なくとも１つの成分を含有する医薬組成物。
〔１１〕次の工程を含む、生体試料中の〔２〕に記載の蛋白質、および／またはその部分ペプチドの測定方法。
（１）生体試料を〔６〕に記載の抗体と接触させる工程、および
（２）〔２〕に記載の蛋白質、および／またはその部分ペプチドに結合する、〔６〕に記載の抗体を検出する工程
〔１２〕〔６〕に記載の抗体を含む、〔２〕に記載の蛋白質、および／またはその部分ペプチドの測定用キット。
〔１３〕次の工程を含む、生体試料中の〔１〕に記載のポリヌクレオチドの測定方法。
（１）生体試料を〔７〕に記載のポリヌクレオチドと接触させる工程、および
（２）生体試料中に含まれる、〔７〕に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出する工程
〔１４〕〔７〕に記載のポリヌクレオチドを含む、〔１〕に記載のポリヌクレオチドの測定用キット。
〔１５〕〔２〕に記載の蛋白質の発現が改変されるように操作された非ヒト脊椎動物。
〔１６〕ノックアウト動物またはトランスジェニック動物である、〔１５〕に記載の非ヒト脊椎動物。
〔１７〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現が抑制されているマウス胚性幹細胞。
〔１８〕配列番号：１に記載された塩基配列を構成することができるエキソンにおいて、少なくとも開始コドンに変異を有する〔１７〕に記載のマウス胚性幹細胞。
本発明は、新規なレプチン誘導遺伝子を提供する。本発明のレプチン誘導遺伝子の塩基配列配列番号：１（マウス）、および配列番号：３（ヒト）に、そして本発明のレプチン誘導遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２（マウス）、および配列番号：４（ヒト）に示す。本発明の遺伝子のＥＳＴｓ（ＡＫ００２５３５，Ｒｉｋｅｎ  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｐｒｏｊｅｃｔ，ｃＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｋｉｄｎｅｙ）、ならびにそのＯＲＦより予想されるアミノ酸配列は知られていた。しかし、遺伝子産物として実際に生体中に存在するか否かは不明であった。また塩基配列のホモロジー検索の結果、ホモロジーのある遺伝子としてはヒトのオーソログ（ＧｅｎＢ  ａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｚ８４４７９）が見出されるのみである。しかもホモロジーを示した塩基配列は、アンチセンス配列となっており、正しい塩基配列とアミノ酸配列を導き出すことはできない。更に、本発明のレプチン誘導遺伝子によってコードされるアミノ酸配列には、既知のモチーフなどは確認できなかった。したがって、これらの遺伝子がレプチンによって誘導されることは、本発明によってもたらされた新規な知見である。
加えて本遺伝子産物が実際に生体内に存在することをノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット、そして免疫化学染色によって証明した。ノーザンブロットおよび免疫化学染色解析の結果、本発明の遺伝子は脳にも発現がみられるが、腎、肝臓に強い発現が見られた。
本発明の遺伝子は、レプチンに応答して発現が誘導されることから、レプチン応答性の指標として有用である。すなわちレプチン受容体を発現する肝臓ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓにおけるレプチン依存的なグリコーゲンの貯蔵を変化させる薬剤のスクリーニングのための指標として使用できる。あるいは、免疫化学染色解析より睾丸の間細胞（Ｌｅｉｄｉｇ  ｃｅｌｌ）にこの遺伝子の発現が確認されたこと、そしてレプチンの投与によりテストステロンの産生が阻害されることなどから、これらの男性ホルモン産生経路を調節する化合物のスクリーニングの指標としても使用可能である。
ｏｂ／ｏｂマウスでは、レプチンの欠損が肥満の原因となっていた。一方ヒトにおいては、レプチンの欠損によって肥満になっている場合は非常に稀で、多くの肥満患者では血中のレプチン濃度が肥満の程度とともに上昇している。この事実は、肥満を有するヒトに単にレプチンを投与するだけでは、肥満を改善できないことを示している。このような状態は、レプチンのシグナルが正しく伝達できない状態、すなわちレプチン抵抗性の状態と言うことができる。ヒトの肥満においては、レプチンの投与ではなく、レプチンに対する反応性の低下、すなわちレプチン抵抗性を解除する必要がある。このように、本発明の遺伝子の発現レベルに基づいて、肥満の治療方針を選択することができる。本発明に基づいて、次の工程を含む、レプチン応答性を診断する方法が提供される。
（ａ）被検者から採取された生体試料における以下の指標ｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、および
ｉ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
ｉｖ）配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）（ａ）の測定値をレプチン応答性と関連付ける工程
上記診断方法において、各ポリヌクレオチドの発現レベルとは、ポリヌクレオチドの発現強度、および各ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の発現レベルのいずれかを測定することによって評価することができる。与えられた塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現強度は、ハイブリダイゼーションやＰＣＲを利用して測定することができる。また、与えられたアミノ酸配列を有する蛋白質の発現レベルは、イムノアッセイなどによって測定することができる。
本発明において前記発現レベルの測定値は、被検者のレプチン応答性を示している。たとえば測定値が低い場合には、レプチン応答性が低いと判断される。特に、血中のレプチン濃度に異常が無い場合、あるいは十分量のレプチンの投与を受けているのにもかかわらず、前記測定値が健常者に比較して低い場合には、レプチン応答性が低いと見なすことができる。本発明の診断方法は、血中のレプチン濃度を考慮することによって、より適切な結果が期待できる。あるいは本発明の診断方法は、レプチンの投与を受けている被検者における、レプチン応答性の評価に有用である。
本発明の診断方法を実施するために必要な要素を組み合せて、レプチン応答性の診断用キットを構成することができる。たとえば後に述べるような、本発明のポリヌクレオチドや蛋白質を測定するためのキットは、レプチン応答性の診断用キットとして有用である。
本発明の遺伝子は、レプチンによるシグナルの伝達経路の中で、レプチンの刺激に対して短時間のうちに応答する。ＰＯＭＣ、ＮＰＹ、あるいはＡＧＲＰなどの各種のニューロペプチド遺伝子の転写が、レプチンの投与によって影響を受けることは公知である。しかし、これらのニューロペプチドの転写レベルに変化が現れるのは、レプチン投与後数日してからである。他方、本発明の遺伝子は、レプチン投与に速やかに応答する。つまり、本発明の遺伝子は、レプチンのシグナル伝達経路において上記ニューロペプチドより上流において機能しているものと考えることができる。したがって、本遺伝子とこれらのニューロペプチドとの関連性の解明は、レプチンのシグナル伝達経路の全体像を明らかにすることにつながる。また本発明の遺伝子は、レプチンによって速やかに応答する遺伝子であることから、本遺伝子の動きを指標として、本遺伝子とレプチン抵抗性との関連を調べることができる。更に、肥満の程度に対応して本遺伝子の発現レベルに差異があれば、肥満の指標として用いることもできる。
加えて、これらの事実により、本発明の遺伝子は、抗肥満薬のスクリーニングに使用することができる。すなわち、本発明の遺伝子がレプチンに応答して発現が上昇することから、レプチンの存在下で本遺伝子の発現を増加させる化合物には、レプチン抵抗性を解除し、肥満を抑制する作用が期待できる。レプチン抵抗性は、ヒトにおける肥満の重要な原因の一つと考えられることから、本発明の遺伝子は、肥満の治療薬開発や肥満の分子生物学的解明において、重要な標的となる。
また本発明は、前記（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドによってコードされる実質的に純粋な蛋白質に関する。本発明において、実質的に純粋な蛋白質とは、当該蛋白質の他に生物に由来する大型分子を実質的に含まない状態にあることを言う。本発明における実質的に純粋な蛋白質は、少なくとも７０％以上、通常８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、たとえば９９％の純度を有する蛋白質を言う。蛋白質の純度を測定する手法は公知である。蛋白質の純度を知るための手法として、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動やＨＰＬＣ等を示すことができる。
本発明の蛋白質は、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として調製することが可能である。組み換え蛋白質は、例えば、後述するように本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現した蛋白質を精製することにより調製することが可能である。一方、天然の蛋白質は、例えば、後述する本発明の蛋白質に対する抗体を結合したアフィニティーカラムを利用して調製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １６．１−１６．１９）。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、インビトロトランスレーション（例えば、「Ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｄａｓｓｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３１２９−３１４４」参照）などにより本発明の蛋白質を調製することも可能である。
本発明には、本実施例において同定されたマウス、またはヒト由来の蛋白質と機能的に同等な蛋白質が含まれる。このような蛋白質には、例えば、配列番号：２（マウス）または配列番号：４（ヒト）に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の変異体、ホモログ、バリアントなどが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質がレプチンの投与によって生体内で発現誘導されることを言う。このような機能は、その発現の消失または低下により推測することができる。
これら本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者であれば、例えば、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法（例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５））を利用して調製することができる。また、このような蛋白質は、自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明には、このように本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、そのアミノ酸配列（配列番号：２または配列番号：４）において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加などにより異なる蛋白質が含まれる。
蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）である。置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能の保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。蛋白質を構成するアミノ酸を似た性質のアミノ酸に置換することは、保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）と呼ばれている。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４）、あるいは遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、本実施例において同定された蛋白質をコードするポリヌクレオチド（配列番号：１、または配列番号：３）またはその一部をプローブとして、あるいは該ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離することができる。さらに単離したポリヌクレオチドを基に、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を調製することができる。本発明には、本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、これら蛋白質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が含まれる。機能的に同等な蛋白質を単離するための生物としては、例えば、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ等の脊椎動物が挙げられるが、これらに制限されない。
機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、通常「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度であり、より厳しい条件としては「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度であり、ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するポリヌクレオチドの単離を期待しうる。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離される蛋白質は、配列番号：２または配列番号：４に記載の本発明の蛋白質と比較して、通常、そのアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＸによる相同性検索により決定することができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを提供する。本発明の蛋白質の部分ペプチドは、例えば、本発明の蛋白質に結合する抗体の調製に利用することができる。特に、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列から選択され、該アミノ酸配列に特異的に見出されるアミノ酸配列は、本発明の蛋白質に結合する抗体を得るための免疫原として有用である。特異的に見出されるアミノ酸配列とは、他の蛋白質を構成するアミノ酸配列とは異なる連続したアミノ酸配列を言う。なお他の蛋白質とは、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなる蛋白質を言う。したがって、配列番号：２および配列番号：４に記載のアミノ酸配列の間で共有されたアミノ酸配列は、本発明の部分ペプチドに含まれる。本発明の部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは９アミノ酸以上、より好ましくは１２アミノ酸以上、より好ましくは１５アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなる。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
また本発明は、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の蛋白質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＲＮＡなども含まれる。また、本発明の蛋白質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、上記のように、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列もしくはその一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法やこれら塩基配列の情報に基づき設計したプライマーを用いた遺伝子増幅法（ＰＣＲ）等の常法により単離することが可能である。
本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明において単離されたポリヌクレオチドとは、天然に存在するポリヌクレオチドやその断片とは構造的に異なるポリヌクレオチドを言う。単離されたポリヌクレオチドとして、具体的には、たとえば次のようなポリヌクレオチドを示すことができる。
ベクターやゲノムに人為的に組み込まれた状態にあるＤＮＡ
分離されたＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノム断片、制限酵素断片、あるいはＰＣＲの合成産物等を含む）
本発明の蛋白質に他の蛋白質を融合させた融合蛋白質、あるいはタグを付加した蛋白質などをコードするＤＮＡ
本発明は、また、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、挿入したポリヌクレオチドを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などが好ましい。本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、試験管内発現であればｐＢＥＳＴベクター（プロメガ社製）を、大腸菌における発現であればｐＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、培養細胞における発現であればｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）を、生物個体における発現であればｐＭＥ１８Ｓベクター（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：４６６＿４７２（１９８８））を、好適に用いることができる。本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドのベクターへの挿入は常法、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４＿１１．１１）により行うことができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを保持する形質転換体を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。宿主細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造のために使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。
また、本発明の宿主細胞には、レプチン誘導蛋白質の機能解析やレプチン誘導蛋白質を利用したその機能阻害剤や機能促進剤のスクリーニングのために用いる細胞も含まれる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．１−９．９）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、マイクロインジェクション法などの方法で行うことが可能である。形質転換体からのレプチン誘導蛋白質の調製は、当業者に公知の蛋白質の分離・精製法を利用して行なうことができる。
本発明はまた、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な、少なくとも１５塩基の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ−１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ−３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドには、本発明のレプチン誘導蛋白質の発現を抑制するためのアンチセンスが含まれる。アンチセンスは、アンチセンス効果を引き起こすために、少なくとも１５ｂｐ以上、好ましくは１００ｂｐ、さらに好ましくは５００ｂｐ以上の鎖長を有し、好ましくは２０００ｂｐ以内の鎖長を有する。このようなアンチセンスは、例えば、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列情報を基にホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ，１９８８  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６，３２０９−２１（１９８８））などにより調製することができる。
本発明のポリヌクレオチドには、例えば、遺伝子治療への応用が考えられる。本発明のポリヌクレオチドを利用した遺伝子治療の標的となる疾患としては、例えば、肥満や糖尿病が好適である。すなわち、本発明の遺伝子の変異や発現異常によって、レプチン抵抗性が形成されているときには、本発明の遺伝子を生体内で発現させることによって、レプチン抵抗性を解除できる可能性がある。これら分子を遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ法やｉｎ  ｖｉｖｏ法などにより患者へ投与すればよい。
また、本発明のポリヌクレオチドのアンチセンスは、レプチン抵抗性のモデルの構築に有用である。例えば、本発明のポリヌクレオチドのドミナントネガティブな変異により、本発明のポリヌクレオチドが肥満をもたらす場合には、本発明のポリヌクレオチドの発現の抑制によって、レプチン抵抗性モデルとすることができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質に結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には特に制限はなく、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体または抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。また、全てのクラスの抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。
本発明の抗体は、公知の方法によって得ることができる。たとえばポリクローナル抗体の場合には、常法に従い免疫原を家兎に免疫することにより得ることが可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２＿１１．１３）。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従い免疫原でマウスを免疫し、脾臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４＿１１．１１）。
免疫原には、本発明のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなるオリゴペプチドや、本発明の遺伝子を大腸菌などで発現し精製した組換え蛋白質を用いることができる。オリゴペプチドを構成するアミノ酸配列として、配列番号：２と配列番号：４の間で保存されたアミノ酸配列を用いれば、種を越えて本発明の蛋白質を認識することができる抗体を得ることができる。また、両配列の間で相違するアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを免疫原とすれば、種特異的な抗体とすることができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質の精製に加え、例えば、これら蛋白質の発現異常や構造異常の検査・診断に利用することも考えられる。具体的には、例えば組織、血液、または細胞などから蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ等の方法による本発明の蛋白質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検査・診断することができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質に関連した疾患の治療などの目的に利用することも考えられる。抗体を患者の治療目的で用いる場合には、ヒト抗体またはヒト化抗体が免疫原性の少ない点で好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス（例えば、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｏｆ  ｍｅｇａｂａｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｏｃｉ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６」参照）に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３，９９−１２１（１９９１））。
また本発明は、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する方法を提供する。この方法は、次の工程（ａ）および（ｂ）を含む。
（ａ）被験化合物の存在下で本発明ののポリヌクレオチドを発現する細胞にレプチンを接触させる工程、および
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する方法は、この活性を有する化合物のスクリーニング方法に有用である。すなわち本発明は、次の工程を含む、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
（ａ）前記評価方法によって、被験化合物の本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する工程、および
（ｂ）被験化合物非存在下でレプチンを接触させた対照と比較して前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法に用いる、本発明の遺伝子を発現する細胞には、たとえば腎臓の尿細管もしくは肝臓のｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ由来の細胞株などを用いることができる。スクリーニングの具体的な方法としては、被験化合物の存在下でレプチンと前記細胞とを接触させる。一定時間の培養の後に、本発明の遺伝子の発現レベルの変化を測定し、被験化合物非存在下でレプチンと接触させて培養した対照における発現レベルと比較する。
遺伝子の発現レベルは、遺伝子や発現産物である蛋白質の量を指標として測定することができる。遺伝子は定量的ＰＣＲ等の公知の手法により定量することができる。また蛋白質の量は、ＥＬＩＳＡなどの手法によって測定される。
スクリーニングに用いる被験試料には、あらゆる化合物を用いることができる。具体的には、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。
このスクリーニングにより単離される化合物は、レプチンに対する応答性を調節する化合物の候補となる。また、生体内において、本発明の蛋白質とこれと相互作用する分子との該相互作用を阻害する化合物の候補となる。
本発明の遺伝子、その蛋白質、該遺伝子の発現を制御する化合物、あるいは該蛋白質の活性を制御する化合物を医薬品として用いる場合には、それ自体を医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して用いることが考えられる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、ポリヌクレオチドを治療薬として使用する場合には、該ポリヌクレオチドを遺伝子治療用ベクターに組込み、患者に投与することも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能であろう。
遺伝子の発現レベルは、転写生成物であるｍＲＮＡや、翻訳産物である蛋白質、ならびにそれらの断片を測定することにより明らかにすることができる。本発明は、以下のポリヌクレオチドの測定方法、あるいは蛋白質および／またはその部分ペプチドの測定方法と、該測定方法のためのキットを提供する。
まず本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：１に示す塩基配列の相補配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションにより測定することができる。あるいは、配列番号：１に示す塩基配列およびその相補鎖に相補的な少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によって、本発明の遺伝子の発現レベルを測定することもできる。ｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法も公知である。
また本発明の遺伝子の翻訳生成物である蛋白質は、本発明の蛋白質を認識する抗体を使って、イムノアッセイの原理に基づいて測定することができる。本発明の蛋白質を認識する抗体を取得する方法は既に述べたとおりである。
上記測定方法に必要な成分を、予め組み合わせてキットとすることができる。たとえば、ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行うためのプライマー、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および反応に好適な緩衝液からなるキットを構成することができる。また、本発明の蛋白質を認識する標識抗体、標識を測定するための試薬、そして免疫反応に好適な緩衝液からなるキットを構成することもできる。
また、本発明は、本発明の蛋白質の発現が改変されるように操作された非ヒト脊椎動物を提供する。ここで「発現の改変」には、発現の増強および減弱が含まれる。また、「蛋白質の発現の改変」は、転写と翻訳のいずれのステップの改変も含まれる。このような非ヒト脊椎動物には、内因性の本発明の蛋白質の発現を停止または減少させるように操作された動物（ノックアウト動物）および外来性の本発明の蛋白質を発現するように該蛋白質をコードする遺伝子が導入された動物（トランスジェニック動物）が含まれる。このようなノックアウトおよびトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、文献「ニューロサイエンス・ラボマニュアル３、神経生物学のための胚と個体の遺伝子操作法（編集・近藤寿人、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社）」に従って作製することができる。
例えば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが染色体に組込まれたトランスジェニック動物を作製することにより、これらの蛋白質の発現を上昇させたり、発現パターンや分布の改変を行うことができる。また、これらの内因性遺伝子の発現制御領域に変異を導入したり、他の発現制御領域を付加または置換することなどにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して人工的に転写レベルを上昇、下降、または発現パターンや分布の改変を行うことができる。一方、エキソンの一部を欠損させたり、翻訳領域への点突然変異の導入により終止コドンへ置換することにより、タンパク質への翻訳を修飾することもできる。また、アンチセンスＲＮＡやリボザイムを発現させることで、本発明の遺伝子の発現を制御することも可能である。これらの変異の導入は、公知の方法により行うことができる。
このような非ヒト脊椎動物は、転写機能の研究、転写に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリーニング等に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
前に述べたように、本発明の遺伝子は、レプチンによるシグナル伝達経路の上流を構成する遺伝子と考えられる。したがって、本発明の遺伝子の発現を抑制した動物や細胞は、レプチン抵抗性を解除する薬剤のスクリーニングに有用である。中でも、本発明の遺伝子の発現を欠失させた胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）は、たとえば当該遺伝子の発現を抑制したノックアウト動物の作成に有用である。
非ヒト動物における、本発明の遺伝子の発現抑制には、公知の方法を応用することができる。たとえばマウスであれば、配列番号：１に示した塩基配列中、とくに蛋白質コード領域を構成するエキソンをゲノムの塩基配列上にマッピングし、その塩基配列の少なくとも一部に変異を導入して蛋白質への翻訳を正常に行えないようにする。具体的には、たとえばエキソンの一部の塩基配列の置換、欠失、付加、あるいは挿入などにより、エキソンの途中にストップコドンを生じるようにする。その結果、変異を導入された細胞においては、本発明の遺伝子の正常な発現が行えなくなる。ゲノムの塩基配列に変異をもたらすには、相同組み換えの技術が用いられる。
こうして構築された、本発明の遺伝子の発現を欠失させたＥＳ細胞によって、ノックアウトマウスを得ることができる。ノックアウトマウスを得るには、まずこのＥＳ細胞をマウスの胚盤胞期の卵子に注入し、仮親の子宮に移植する。ＥＳ細胞を注入した卵子からは、本来の受精卵とＥＳ細胞由来の細胞からなるキメラマウス（ファウンダー）が生まれる。ファウンダーと野生マウスの交配によって生まれてくる子孫にノックアウトされたゲノムが確認できれば、その子孫は、ノックアウトされた遺伝子をヘテロに持つノックアウト動物である。ヘテロの子孫を更に交配することによって、ノックアウトマウス（ホモ）を得ることができる。
本発明者らは、配列番号：１に示す塩基配列の蛋白質コード領域中、特に開始コドンを含む領域を欠失させることにより、マウスにおける本発明の遺伝子の発現を、ほぼ完全に抑制できることを確認した。したがって、本発明の遺伝子の発現を抑制した非ヒト動物として、本発明の遺伝子における開始コドンに変異を有するノックアウト動物は好ましい。あるいは本発明の遺伝子の発現を抑制した細胞として、本発明の遺伝子における開始コドンに変異を有する細胞は好ましい。開始コドンの変異は、塩基の置換、欠失、付加、あるいは挿入によってもたらされる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  マウスのレプチン誘導遺伝子の単離
ｏｂ／ｏｂマウスにおけるレプチン投与の有無によって発現レベルが変動する遺伝子を、マウスレプチン誘導遺伝子として単離した。ｏｂ／ｏｂマウスは、受容体側のシグナル経路は正常であるが、リガンドであるレプチン合成が正常にできないため肥満を呈する。このマウスにレプチンを投与すれば、レプチンによって誘導される遺伝子を見出すことができる。このような条件とすることにより、レプチン投与の有無によってもたらされる遺伝子発現の差異を大きくできると考えた。発現レベルの異なる遺伝子の取得には、サブトラクション法を利用した。具体的な操作は以下のとおりである。
まずｏｂ／ｏｂマウスにレプチンを投与した。ｏｂ／ｏｂマウスは米国ジャクソン研究所より購入した。体重１ｇにつき１μｇのマウスレプチン（Ｒ  ＆  Ｄ社）、もしくはＰＢＳを静脈注射によって投与し、１時間後に視床下部を採取し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをグアニジン−チオシアネート法によって抽出した。その後Ｒｏｃｈｅ社のｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎを用いてｍＲＮＡを精製した。このｍＲＮＡを用いてＰＣＲサブトラクション法を実施した。
ＰＣＲサブトラクション法には、市販のキット「ＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）を用いた。
まず各ｍＲＮＡ２μｇからＡＭＶ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。レプチン投与後のｃＤＮＡをテスター、ＰＢＳ投与後のｃＤＮＡをドライバーとした。ｃＤＮＡはＲｓａＩで消化し断片化した。ＲｓａＩによる断片は、平滑末端を有する。
次に、テスターｃＤＮＡを２群に分け、それぞれに異なるｃＤＮＡアダプター１、２Ｒを結合した。各アダプターの塩基配列は次のとおりである。なおドライバーｃＤＮＡにはアダプターを結合しない。
アダプター１
2002101034.tif 000002
アダプター２Ｒ
2002101034.tif 000003
次に、１ｓｔハイブリダイゼーションと２ｎｄハイブリダイゼーションの２回のハイブリダイゼーションを行った。１ｓｔハイブリダイゼーションでは、各テスターに過剰量ドライバーｃＤＮＡを加え、９８℃１．５分間の熱変性を行った後、６８℃で８時間インキュベーションした。２ｎｄハイブリダイゼーションでは、１ｓｔハイブリダイゼーションから得られたサンプルを変性せずに混合し、さらに変性ｃＤＮＡドライバーを加え、６８℃で一晩インキュベーションした。反応後のハイブリダイゼーション溶液を希釈用バッファーで希釈し、７５℃で５分インキュベートして１本鎖のアダプター部を２本鎖に伸長し、ＰＣＲの鋳型に用いた。アダプターに対応するプライマーであるＰＣＲプライマー１を用いたＰＣＲを行い、両端に異なるアダプターを持ったｃＤＮＡのみを選択的に増幅した。このとき、ドライバーｃＤＮＡの末端にはアダプターが結合していないので、ドライバーｃＤＮＡとハイブリダイズしたテスターｃＤＮＡは増幅されない。
2002101034.tif 000004
これの一部を鋳型とし、アダプタープライマー１、２Ｒの内側のプライマーであるＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲプライマー１と２Ｒを用いてＰＣＲを行い、さらに選択性を増した生成物を得た。
2002101034.tif 000005
この生成物をｐＴ−Ａｄｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）ベクターにクローニングし、ＢＲＬ社のＥｌｃｔｒｏＭａｘＤＨ１０Ｂセルを用いて形質転換を行い、サブトラクションライブラリーを作成した。
ライブラリーの各クローンｃＤＮＡのインサートをＰＣＲによって増幅し、ナイロンメンブレン上にスポットしてアレイを作製した。次に、レプチン投与およびＰＢＳ投与マウスｃＤＮＡから調製したジゴキゲニン標識プローブを用いて、ハイブリダイズを行った。検出にはＲｏｃｈｅ社の抗ジゴキゲニン抗体、ＣＤＰ−ｓｔａｒを用いた。ハイブリダイゼーションの結果、発現量に差が見られたクローンをスクリーニングした。
サブトラクションライブラリーのスクリーニング
レプチン、もしくはＰＢＳ投与後の視床下部より調整した各ｍＲＮＡ１μｇを使用して逆転写酵素反応によりＤＩＧ−ｄＵＴＰを取り込んだｃＤＮＡプローブを作成した。作成はＲｏｃｈｅ社‘Ｔｈｅ  ＤＩＧ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｆｉｌｔｅｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ｐｐ２０−２１，Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ’．に従った。生成物を５−１０ｎｇ／ｍｌの濃度でｓｔａｎｄａｒｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５ｘＳＳＣ，０．１％Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ，０．０２％ＳＤＳ，１％ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ｛Ｒｏｃｈｅ社Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ｝）に溶解し、ハイブリダイゼーションに用いた。ＰＢＳ−投与後のｍＲＮＡをドライバーとして得られたサブトラクションライブラリーより３８４ｗｅｌｌ，３枚分（計１１５２クローン）のコロニーを任意に選択した。
これらの大腸菌のストックよりｐＴ−Ａｄｖベクターに挿入されているｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  Ｎｙｌｏｎ膜上にｄｕｐｌｉｃａｔｅでスポットした（サブトラクションｃＤＮＡアレイ）。これらのアレイを４組作成し、それぞれＰＢＳ−，レプチン投与後のＤＩＧ標識ｃＤＮＡプローブで６８℃１晩ハイブリダイズした。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて室温で五分ずつ二回洗浄し、６８℃の０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で２０分ずつ二回洗浄した。その後アレイ上で発現量に差の見られたクローンのインサートをプローブとしてｃＲＮＡを作成し、ノーザンブロットを行い、実際に発現量に差異があるか否かを検討した。
次に発現量に差異があるポジティブクローンをマウスのレプチン誘導遺伝子として選択し、そのインサートの塩基配列を決定した。本サブトラクションライブラリーはＲｓａＩによる切断を経ているためこのライブラリーでは全長ｃＤＮＡが得られなかった。ノーザンブロット解析により本遺伝子は腎臓、肝臓にその発現が多く見られたことからマウス腎臓由来のｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを作成した。ｃＤＮＡライブラリーはＢＲＬ社（現Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して作成し、ｐＳＰＯＲＴ１ベクターにｃＤＮＡを挿入した。先に同定された遺伝子断片をプローブとしてライブラリーをスクリーニングして全長を取得した。マウスレプチン誘導遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、また、オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列を配列番号：２に記載する。
［実施例２］  レプチンによるｏｂ／ｏｂマウス視床下部における遺伝子誘導  ｏｂ／ｏｂマウスに体重１ｇ当たり１μｇのマウスレプチン（＋）、またはＰＢＳ（−）を静脈経由で投与し、１時間後に視床下部を摘出してＴｏｔａｌ  ＲＮＡおよびｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡ０．４μｇをアガロースゲル上で分離し、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  Ｎｙｌｏｎ膜上にキャピラリートランスファーした。本発明の遺伝子の全長ｃＤＮＡより調製したＤＩＧ標識ｃＲＮＡをプローブとしてハイブリダイズさせ、ストリンジェントな条件下（０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６８℃）で洗浄した。その後アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体、およびＣＤＰ−Ｓｔａｒを用いてシグナルを検出した。化学発光シグナルはＡＴＴＯ社のＣＣＤカメラで定量した。
その結果レプチン投与によりこの転写産物量は約２倍になることが明らかになった。さらにネガチィブコントロールとして同量のｍＲＮＡがのせられたメンブレンを別のプローブ（ＢＲＩ遺伝子，ＡＦ２７２０４４）でプロービングを行った。この場合にはレプチン、ＰＢＳ投与による遺伝子のｍＲＮＡレベルの差異は観察されなかった。以上の結果を図１に示した。この実験により、本発明の遺伝子（Ａ９）が、ｏｂ／ｏｂマウスの視床下部において、レプチンの投与１時間後に顕著に発現が増強することが裏付けられた。
［実施例３］  マウスレプチン誘導遺伝子の組織特異的発現
マウスレプチン誘導遺伝子の組織特異的発現をノーザンブロットにより解析した。
野生型マウス各組織よりＴｏｔａｌ  ＲＮＡをグアニジン−チオシアネート法によって抽出した。このＴｏｔａｌ  ＲＮＡを各８μｇずつ使用し、該遺伝子のＤＩＧ標識ｃＲＮＡをプローブとしてノーザンブロットを行った。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡはアガロースゲルによって分離した後Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  Ｎｙｌｏｎ膜上にキャピラリートランスファーによってブロッティングした。
本発明の遺伝子のＤＩＧ標識ｃＲＮＡをプローブとしてハイブリダイズさせた。洗浄は実施例２の場合と同様に非常にきつい条件で行い、シグナル検出も同様の方法で行った。結果を図２に示した。転写産物の大きさは８００−９００ｂｐと推定される。このサイズは、配列番号：１に示した塩基配列の長さ（８２７ｂ）と一致する。各臓器中で腎臓での発現が最も高く、次いで肝臓でも強い発現が見られた。本発明の遺伝子が野生型マウスにおいても発現していることが確認できた。
［実施例４］  マウスレプチン誘導遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体
配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質を認識する抗体の調製を試みた。該遺伝子のＯＲＦから予測される全長部分をＰＣＲ反応によって増幅し、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のｐＧＥＸ４Ｔ−１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩに組み込んだ。このベクターを大腸菌に形質転換し、ＩＰＴＧで誘導したところ約５０ｋＤａのタンパク質（ＧＳＴタンパク質との融合産物）の産生増幅が観察された。組み換えタンパク質は大腸菌を超音波によって破壊し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを用いて精製した。このタンパク質に対するポリクローナル抗体を作成するため精製組み換えタンパク質２ｍｇをウサギに３回に分けて免疫し、抗血清を得た。抗血清を更にＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムで精製して、抗Ａ９抗体として用いた。
抗Ａ９抗体の特異性と、本発明の遺伝子によってコードされる蛋白質の存在をウエスタンブロット法によって確認した。抗原としては、次の蛋白質、あるいは細胞抽出液を用いた。
・ＧＳＴと本発明の蛋白質の融合蛋白質
・マウス腎臓の全細胞抽出液
・本発明の遺伝子を過剰発現させたＣＯＳ７の細胞抽出液
本発明の遺伝子を過剰発現させたＣＯＳ７の細胞抽出液は、次のようにして調製した。すなわち、本発明の遺伝子をＳＲαのプロモーターを持つｐＭ１８Ｓに挿入し、ＣＯＳ７細胞にリポフェクタミン法でトランスフェクトした。遺伝子導入後３日目に細胞をＲＩＰＡバッファーで溶かして細胞抽出液とした。
これらの蛋白質、あるいは細胞抽出液を、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解し、熱処理後、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって分離した。分離した蛋白質をブロッティングしたメンブランに、抗Ａ９抗体を反応させた。抗Ａ９抗体はＴＢＳＴ−５％  ｎｏｎ−ｆａｔ  ｍｉｌｋで１／１０００に薄めて使用し、ＨＲＰ（ホースラデシユパーオキシダーゼ）標識二次抗体（抗ウサギＩｇＧ  １／３０００）でインキュベート後、ＮＥＢ社Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ試薬で検出した。結果を図３に示した。
その結果、抗Ａ９抗体は、融合タンパク質（約５０ｋＤａ）への反応性は確認されたが、ＧＳＴに対する反応性は検出できなかった。また本発明の遺伝子を過剰発現させたＣＯＳ７細胞の細胞抽出液（レーン５）では、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質に相当する約２３ｋＤａのバンドが確認された。以上の結果から、抗Ａ９抗体は、本発明の蛋白質に対し、高い特異性を有することが確認された。
更に、マウス腎臓の全細胞抽出液（レーン３−４、および６）において、レーン５と同じ約２３ｋＤａのバンドが確認された。このことは、マウスの腎臓において、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋白質が存在していることを示している。
［実施例５］  ヒトのレプチン誘導遺伝子
実施例１において決定したマウスに由来するレプチン誘導遺伝子の塩基配列（配列番号：１）をｑｕｅｒｙとして、ＧｅｎＢａｎｋのデータをホモロジーサーチした。その結果、あるヒトＥＳＴの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｚ８４４７９）が見出された。Ｚ８４４７９は、ヒト１６番染色体１６ｐ１３．３にマッピングされたＥＳＴである。公知の情報によれば、Ｚ８４４７９にいくつかのｒｅｐｅａｔ  ｒｅｇｉｏｎが見出されているが、ＯＲＦは明らかでない。両者の塩基配列を更に詳細に比較解析したところ、Ｚ８４４７９の塩基配列と、配列番号：１の塩基配列は、逆向き相補配列となっていた。そこで、Ｚ８４４７９の塩基配列に基づいて逆向き相補配列を導き、更にＯＲＦを解析した。
最終的に、Ｚ８４４７９の逆向き相補配列（配列番号：３）によって、配列番号：４に示すアミノ酸配列がコードされていることが明らかになった。そして配列番号：４のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列（マウス）と高い相同性を示した（図４）。これらの結果に基づいて、配列番号：３に示す塩基配列からなる遺伝子を、レプチン誘導遺伝子のヒトにおけるオーソログであると判断した。
念のため、Ｚ８４４７９に基づくプローブでａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｃＲＮＡのプローブを作成しノーザンブロット解析を行ったところ全くシグナルが検出できなかった。Ｚ８４４７９はアンチセンス配列となっているため、ｍＲＮＡの検出ができなかったためと考えられた。
［実施例６］  抗Ａ９抗体による免疫組織化学的な解析
抗Ａ９抗体を用いて、様々な組織を免疫組織化学的に解析した。配列番号：２（マウス）のアミノ酸配列と、配列番号：４（ヒトのアミノ酸配列）は、図４に示すように高いホモロジーを有する。したがって、マウスの蛋白質を免疫原として得た抗Ａ９抗体は、ヒトの蛋白質を認識する可能性が高い。
実施例４と同じ抗Ａ９抗体、および二次抗体を用いて、免疫組織化学的解析を行った。解析に用いたヒト組織は次のとおりである。これらの組織の切片を常法にしたがってスライドガラスに固定し解析に用いた。
肝臓（図５）                睾丸（図８）
腎臓皮質（図６）            胃上皮（図９）
副腎皮質（図７）
解析の結果を図５−図９に示す。抗Ａ９抗体は、ヒトのレプチン誘導遺伝子によってコードされるタンパク質を認識することが示された。またヒト組織における局在から、ヒトにおけるレプチン誘導遺伝子には、以下のような機能が推測された。
まず肝臓のヘパトサイトに、強いシグナルが見られた（図５）。レプチン依存的なグリコーゲンの貯蔵に本発明の蛋白質が関与する可能性が考えられた。また腎臓皮質においては尿細管への局在が見られた（図６）。副腎皮質の球状層にも本発明の蛋白質の局在が見られた（図７）。副腎皮質の球状層はステロイドホルモンの産生に関与する組織であることから、レプチンとステロイドホルモン産生系との関連が示唆された。また睾丸の間細胞（Ｌｅｉｄｉｇ  ｃｅｌｌ）における本発明の蛋白質の局在（図８）は、レプチン投与による男性ホルモン産生系の阻害作用を裏付ける結果と思われた。更に、胃上皮細胞におけるシグナル（図９）は、レプチンによる消化機能の制御を示唆していた。
［実施例７］  本発明の蛋白質の細胞内局在
本発明の蛋白質の細胞内における局在について、抗体を使用しコンフォーカル顕微鏡を用いて検討した。Ｈｅｌａ細胞に本発明の遺伝子を強発現させた細胞を固定化後、実施例４と同じ抗Ａ９抗体、および蛍光標識された二次抗体を用いて、細胞内局在を解析した。また同様に調製した標本について、小胞体のマーカータンパク質であるｃａｌｎｅｘｉｎの局在と比較した。その結果、本発明の蛋白質はｃａｌｎｅｘｉｎと同じ部分に局在していることが確認できた。この結果から、本発明の蛋白質は、細胞質の小胞体に多く存在することが明らかになった。
［実施例８］  本発明の蛋白質の発現を抑制したＥＳ細胞
先に述べたように本発明の遺伝子には既知のモチーフが存在せず、いかなる既知のタンパク質とも相同性を有しない。したがって、その生理機能を明らかにする上で、本発明の遺伝子の欠損マウス（ノックアウトマウス）が果たす役割は大きい。ノックアウトマウスを得ることができれば、このマウスにおける表現形の変化を観察することによって、本発明の遺伝子の生理機能を明らかにすることができる。
ノックアウトマウスを作成するため、まず本遺伝子のゲノミックＤＮＡを取得した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の１２９ＳｖＪ由来のゲノミックライブラリーを、本発明の遺伝子の塩基配列に基づいてデザインしたプローブを用いてスクリーニングした。プローブには２９ｍｅｒのＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを用いた。プローブの塩基配列を以下に示す。
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ポジティブクローンをｐＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｏｔＩ  ｓｉｔｅにサブクローン化し６塩基認識制限酵素を使用して本発明の遺伝子のゲノミックマッビングを行った。マッピングの結果は図１０の「ゲノミックＤＮＡ」として示したとおりである。次にマッピングの結果に基づいてターゲティングベクターを構築した。ターゲティングベクターの５’アームにはＳｐｅＩとＡｓｐ７１８の配列を用いた。また３’アームとしてはＮｏｔＩ−ＳｃａＩの部位を使用した。ｔｋ−Ｎｅｏ遺伝子（図１０の「ｎｅｏｇｅｎｅ」）をこれらの配列で挟み込み、ｔｋ−Ｎｅｏ遺伝子がＡＴＧを含むエキソン（Ａｓｐ７１８からＮｏｔＩ部位まで）と入れ替わるように設計した。ターゲティングベクターの構造とゲノミックＤＮＡとの関係を、図１０に示した。
ターゲティングベクターは、エレクトロポレーションによってＥＳ細胞に導入した。Ｇ４１８耐性クローンを１０００ヶ選択し、用いたベクターアームの外側の配列（３’側）をプローブとしサザンブロットを行った。ｔｋ−Ｎｅｏ遺伝子が本発明の遺伝子のゲノムＤＮＡ上に正確に組み込まれれば、ゲノミックＤＮＡは、開始コドンＡＴＧを含むＢａｍＨＩサイトを失う。その結果、ＢａｍＨＩによる制限酵素断片のパターンは変化する。つまり、図１０に示されるように、３’側のプローブを使用したとき４．２ｋｂｐと８ｋｂｐの二本のバンドが観察されれば、ターゲティングベクターによって正しく組み換えの起ったＥＳ細胞であることがわかる。１０００ヶのＧ４１８耐性クローンより４ヶの組み換えが起ったＥＳ細胞を取得することができた。またこれらのクローンはｔｋ−Ｎｅｏ遺伝子をプローブとしたサザンブロットで８ｋｂｐのバンドを与えることを確認している。
産業上の利用の可能性
本発明の遺伝子は、レプチン応答の指標として有用である。本発明の遺伝子は、レプチンの投与によって、速やかにその発現が誘導される。したがって、本発明の遺伝子を指標とすることにより、細胞や、生体のレプチン応答の程度を評価することができる。既に述べたように、ヒトにおいてはレプチンの発現レベルではなく、レプチンに対する応答性のレベルが、肥満と密接に関連していることが推測されている。したがって、レプチンに対する応答性の指標となる遺伝子は重要である。
また本発明の遺伝子は、レプチン抵抗性の診断指標として有用である。すなわち、本発明の遺伝子の発現レベルを測定し正常なレベルと比較することにより、レプチン抵抗性の程度を知ることができる。本発明の遺伝子は、レプチンに応答して短期間にその発現レベルが上昇するので、レプチン応答性の指標として望ましい。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、レプチン投与による、ｏｂ／ｏｂマウス視床下部における本発明の遺伝子の誘導をノーザンブロットによって調べた結果を示す写真。Ａ９が本発明の遺伝子、ＢＲＩが対照である。図中、レプチン（−）と示したレーンがＰＢＳを投与した場合、（＋）がマウスレプチンを投与した場合の結果である。
図２は、本発明の遺伝子の組織分布をノーザンブロットによって調べた結果を示す写真。各レーンは図中に示した組織に対応する。
図３は、本発明の蛋白質のウエスタンブロット解析の結果を示す写真。各レーンは、以下の蛋白質、または細胞抽出液に対応する。
レーン１：精製本発明の蛋白質−ＧＳＴ融合タンパク質（免疫原）５ｎｇ
レーン２：精製本発明の蛋白質−ＧＳＴ融合タンパク質（免疫原）１５ｎｇ
レーン３：１０μｇのマウス腎臓の全細胞抽出液
レーン４：３０μｇのマウス腎臓の全細胞抽出液
レーン５：本発明の遺伝子を過剰発現させたＣＯＳ７細胞（全細胞抽出液約５μｇ）
レーン６：３０μｇのマウス腎臓の全細胞抽出液（レーン４とは別のマウス）
図４は、マウスとヒトにおける本発明の蛋白質のアミノ酸配列を比較した結果を示す図。マウスのアミノ酸配列を上に、ヒトのアミノ酸配列を下に示した。
図５は、ヒト肝臓組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真。Ａ（上）が１５０倍、Ｂ（下）が３００倍。
図６は、ヒト腎臓皮質組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真。Ａ（上）が１５０倍、Ｂ（下）が３００倍。
図７は、ヒト副腎皮質組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真（３００倍）。
図８は、ヒト睾丸組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真（３００倍）。
図９は、ヒト胃上皮組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真（３００倍）。
図１０は、マウスにおける本発明のレプチン誘導遺伝子の発現を抑制したＥＳ細胞の構築工程を示す図と写真。ゲノミックＤＮＡにターゲティングベクターで「ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏｇｅｎｅ）」を導入することにより、レプチン誘導遺伝子の開始コドンを含むＢａｍＨＩサイトを失う（上）。その結果、サザンブロットで３’ｐｒｏｂｅによる８ｋｂのバンドが現れる（下）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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