(57)【要約】本発明は、式（１）：2003018001.tif 000015で表される化合物を含んでなる、アポＥの分泌を促進し、急性冠症候群の発生頻度を低減または症状を軽減し、そして細胞内脂質含量を低下させるための医薬組成物および方法を提供する。本発明は、そのような医薬組成物の製造における式（１）で表される化合物の使用も提供する。
2003018001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポタンパク質Ｅの分泌を促進するための医薬組成物であって、式（１）：
2003018001.tif 000006
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物を含んでなる組成物。
【請求項２】
アポリポタンパク質Ｅの分泌が、血中あるいは臓器局所においてアポリポタンパク質Ｅの濃度を増加させる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アポリポタンパク質Ｅの濃度の増加により細胞内脂質が除去される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
細胞内脂質が粥状動脈硬化プラークの脂質である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
細胞内脂質の除去が、粥状動脈硬化プラークを安定化させて前記粥状動脈硬化プラークの破綻を防止する、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
細胞内脂質が遊離コレステロールまたはコレステロールエステルである、請求項３記載の組成物。
【請求項７】
粥状動脈硬化プラークの破綻防止が、急性冠症候群の発生頻度の低減または症状の軽減をもたらす、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
急性冠症候群が、急性心筋梗塞または不安定狭心症である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
式（１）で表される化合物が４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
急性冠症候群の発生頻度を低減または症状を軽減するための医薬組成物であって、式（１）：
2003018001.tif 000007
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物を含んでなる組成物。
【請求項１１】
急性冠症候群が、急性心筋梗塞または不安定狭心症である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
式（１）で表される化合物が４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
細胞内脂質含量を低下させるための医薬組成物であって、式（１）：
2003018001.tif 000008
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物を含んでなる組成物。
【請求項１４】
細胞内脂質が粥状動脈硬化プラークの脂質である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
細胞内脂質が遊離コレステロールまたはコレステロールエステルである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
細胞内脂質含量の低下が、粥状動脈硬化プラークの破綻を防止する、請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
粥状動脈硬化プラークの破綻防止が、急性冠症候群の発生頻度の低減または症状の軽減をもたらす、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
式（１）で表される化合物が４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１９】
アポリポタンパク質Ｅの分泌を促進する方法であって、そのような促進を必要とする患者に促進有効量の式（１）：
2003018001.tif 000009
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項２０】
アポリポタンパク質Ｅの分泌が、血中あるいは臓器局所においてアポリポタンパク質Ｅの濃度を増加させる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
アポリポタンパク質Ｅの濃度の増加により細胞内脂質が除去される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
細胞内脂質が粥状動脈硬化プラークの脂質である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
細胞内脂質の除去が、粥状動脈硬化プラークを安定化させて前記粥状動脈硬化プラークの破綻を防止する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
細胞内脂質が遊離コレステロールまたはコレステロールエステルである、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
粥状動脈硬化プラークの破綻防止が、急性冠症候群の発生頻度の低減または症状の軽減をもたらす、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
急性冠症候群が、急性心筋梗塞または不安定狭心症である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
式（１）で表される化合物が４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである、請求項１９記載の方法。
【請求項２８】
急性冠症候群の発生頻度を低減または症状を軽減する方法であって、そのような治療を必要とする患者に治療有効量の式（１）：
2003018001.tif 000010
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項２９】
急性冠症候群が、急性心筋梗塞または不安定狭心症である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
式（１）で表される化合物が４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
細胞内脂質含量を低下させる方法であって、そのような治療を必要とする患者に治療有効量の式（１）：
2003018001.tif 000011
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるが、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項３２】
細胞内脂質が粥状動脈硬化プラークの脂質である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
細胞内脂質が遊離コレステロールまたはコレステロールエステルである、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
細胞内脂質含量の低下が、粥状動脈硬化プラークの破綻を防止する、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
粥状動脈硬化プラークの破綻防止が、急性冠症候群の発生頻度の低減または症状の軽減をもたらす、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
式（１）で表される化合物が４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
アポリポタンパク質Ｅの分泌を促進するための医薬組成物の製造における、式（１）：
2003018001.tif 000012
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物の使用。
【請求項３８】
アポリポタンパク質Ｅの分泌が、血中あるいは臓器局所においてアポリポタンパク質Ｅの濃度を増加させる、請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
アポリポタンパク質Ｅの濃度の増加により細胞内脂質が除去される、請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
細胞内脂質が粥状動脈硬化プラークの脂質である、請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
細胞内脂質の除去が、粥状動脈硬化プラークを安定化させて前記粥状動脈硬化プラークの破綻を防止する、請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
細胞内脂質が遊離コレステロールまたはコレステロールエステルである、請求項３９記載の使用。
【請求項４３】
粥状動脈硬化プラークの破綻防止が、急性冠症候群の発生頻度の低減または症状の軽減をもたらす、請求項４１記載の使用。
【請求項４４】
急性冠症候群が、急性心筋梗塞または不安定狭心症である、請求項４３記載の使用。
【請求項４５】
式（１）で表される化合物が４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである、請求項３７記載の使用。
【請求項４６】
急性冠症候群の発生頻度を低減または症状を軽減するための医薬組成物の製造における、式（１）：
2003018001.tif 000013
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物の使用。
【請求項４７】
急性冠症候群が、急性心筋梗塞または不安定狭心症である、請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
式（１）で表される化合物が４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである、請求項４６に記載の使用。
【請求項４９】
細胞内脂質含量を低下させるための医薬組成物の製造における、式（１）：
2003018001.tif 000014
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物の使用。
【請求項５０】
細胞内脂質が粥状動脈硬化プラークの脂質である、請求項４９記載の使用。
【請求項５１】
細胞内脂質が遊離コレステロールまたはコレステロールエステルである、請求項４９記載の使用。
【請求項５２】
細胞内脂質含量の低下が、粥状動脈硬化プラークの破綻を防止する、請求項４９記載の使用。
【請求項５３】
粥状動脈硬化プラークの破綻防止が、急性冠症候群の発生頻度の低減または症状の軽減をもたらす、請求項５２記載の使用。
【請求項５４】
式（１）で表される化合物が４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである、請求項４９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アポリポタンパク質Ｅ（以下、アポＥと略記する）の分泌を促進するための医薬組成物および方法、ならびにそのような医薬組成物の製造における化合物の使用に関する。より具体的には、一定の４，６−ジ−ｔ−ブチルジヒドロベンゾフラン誘導体を含んでなる、アポＥの分泌を促進するための医薬組成物および方法、ならびにそのような医薬組成物の製造における一定の４，６−ジ−ｔ−ブチルジヒドロベンゾフラン誘導体の使用に関する。
背景技術
アポＥは、カイロミクロン、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）のようなリポタンパク質が有する主要なアポリポタンパク質成分の一つであり、２９９のアミノ酸残基とシアル酸を含む糖鎖とからなる約３４，０００の分子量を有する糖タンパク質である。その発現は、主に肝臓で行なわれるが、腎臓、脳およびマクロファージなどでも行なわれる。
リポタンパク質に含まれるアポリポタンパク質は、各種受容体との結合に重要と考えられており、アポＥも生体内の至るところで細胞表面に存在する低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ＶＬＤＬ受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質、およびアポＥ受容体２のような種々の受容体に結合する。このため、アポＥを含有するカイロミクロン、ＶＬＤＬおよびＨＤＬは、このアポＥとこれら受容体との相互作用の結果として全身の臓器に運搬され、そこでその成分であるトリグリセリドやコレステロール（以下、単にコレステロールというときは、遊離コレステロールおよびコレステロールエステルの両方を包含するものとする）のような脂質に分解されることになる（Ｄａｖｉｇｎｏｎ  Ｊ，Ｃｏｈｎ  ＪＳ，Ｍａｂｉｌｅ  Ｌ，Ｂｅｒｎｉｅｒ  Ｌ，“Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｉｎｓｉｇｈｔ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ．２８６（１−２）：１１５−４３（１９９９）；Ｒｕｂｉｎ．Ｅ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐｌｕｍｐ．Ａ．Ｓ．，ｐ．１９９  ｉｎ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｅｄ．Ｂｅｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ．ａｎｄ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ．Ｊ．（１９９９）Ａｒｎｏｌｄ）。
アポＥは、マクロファージにおいても正常な脂質代謝に必須であることが知られている。また、アポＥは、末梢組織から肝臓へのコレステロール逆転送に重要な役割を果たすとされる。マクロファージあるいは肝細胞で産生されたアポＥは糖化を受けることが知られており、従ってそのほとんどが分泌されずに細胞に結合して存在していると考えられている（Ｓｃｈｍｉｔｔ  Ｍ，Ｇｒａｎｄ−Ｐｅｒｒｅｔ  Ｔ，“Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｏｌ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４０（１）：３９−４９（１９９９）；Ｚｈａｏ  Ｙ，Ｍａｚｚｏｎｅ  Ｔ，“Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＡｐｏＥ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５（７）：４７５９−６５（２０００））。
近年、発生工学的手法の進歩により様々な遺伝子転換マウスが作出され、アポＥ欠損マウスもその一つである。マウスは、本来動脈硬化発症が極めて稀な動物であるが、アポＥ欠損マウスは単一遺伝子の欠損のみで典型的なＩＩＩ型高脂血症を示すようになり、やがて動脈壁への脂質沈着を特徴とする粥状動脈硬化を自然発症することで知られる。
このマウスに対して、野生型マウスからの骨髄移植によりアポＥ産生マクロファージを導入すると動脈壁への脂質沈着を抑制することが認められている（Ｌｉｎｔｏｎ  ＭＦ，Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＪＢ，Ｆａｚｉｏ  Ｓ．“Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１０３４−１０３７（１９９５）；Ｂｏｉｓｖｅｒｔ  Ｗ．Ａ．，Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｊ．＆  Ｃｕｒｔｉｓｓ  Ｌ．Ｋ．，”Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６，１１１８−１１２４（１９９５）；Ｂｅｌｌｏｓｔａ  Ｓ，Ｍａｈｌｅｙ  ＲＷ，Ｓａｎａｎ  ＤＡ，Ｍｕｒａｔａ  Ｊ，Ｎｅｗｌａｎｄ  ＤＬ，Ｔａｙｌｏｒ  ＪＭ，Ｐｉｔａｓ  ＲＥ．，“Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ．”，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９６：２１７０−２１７９（１９９５））。
逆に、野生型マウスにアポＥ欠損マウスの骨髄を移植することにより動脈壁への脂質沈着の亢進が認められている（Ｆａｚｉｏ  Ｓ，Ｂａｂａｅｖ  Ｖ  Ｒ，Ｍｕｒｒａｙ，Ａ  Ｂ，Ｈａｓｔｙ  Ａ  Ｈ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｋ  Ｊ，Ｇｌｅａｖｅｓ  Ｌ  Ａ，Ａｔｋｉｎｓｏｎ  Ｊ  Ｂ  ＆  Ｌｉｎｔｏｎ  Ｍ  Ｆ，“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｎｕｌｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，４６４７−４６５２（１９９７））。
これらの結果は、高脂血症状態への影響が認められない場合にも生じていることから、血清リポタンパク質の分布よりも、マクロファージからのアポＥの分泌こそが直接的な動脈壁への脂質沈着抑制作用に重要である可能性が示唆される。
マクロファージでの微量のアポＥ発現によってアポＥ欠損により失われた血清のコレステロール排出能力が回復することや（Ｙｅｎｈｏｎｇ  Ｚｈｕ，Ｓｔｅｆａｎｏ  Ｂｅｌｌｏｓｔａ，Ｃｌａｕｓ  Ｌａｎｇｅｒ，Ｆｒａｎｃｏ  Ｂｅｒｎｉｎｉ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｐｉｔａｓ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ，Ｇｅｒｄ  Ａｓｓｍａｎｎ，ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ  ｖｏｎ  Ｅｃｋａｒｄｓｔｅｉｎ，“Ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｐｌａｓｍａ”ＰＮＡＳ  ９５：７５８５−７５９０（１９９８））、コレステロール搬出の促進にマクロファージからアポＥが分泌されることが重要であること（Ｌｉｎ  ＣＹ，Ｄｕａｎ  Ｈ，Ｍａｚｚｏｎｅ  Ｔ，“Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｆｒｏｍ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４０（９）：１６１８−２７（１９９９））からも、上記の脂質沈着抑制作用において、マクロファージから分泌されるアポＥが重要な役割を果たしていると考えられている。
コレステロール、特に遊離コレステロールは細胞において形質膜の構成成分として重要なほか、各種細胞内オルガネラの膜構成成分として重要な役割を果たしている。しかし、細胞内の過剰量の遊離コレステロールは、細胞機能を障害するため、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ａｃｙｌ  ＣｏＡ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によりエステル化されコレステロールエステルとして細胞内に蓄積される。特に細胞がマクロファージであるときは、ステロール調節エレメント結合タンパク質（Ｓｔｅｒｏｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）による発現制御を受けないスカベンジャーレセプター（Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）を発現するため、大過剰のコレステロールエステルをその内部に蓄積して泡沫細胞となる。蓄積されたコレステロールエステルは必要に応じて中性コレステロールエステラーゼ（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｃｈｏｅｌｓｔｅｒｏｌ  Ｅｓｔｅｒａｓｅ）によって遊離コレステロールに加水分解される。
すなわち、アポＥが細胞からコレステロールを排出する場合、排出されるのは主として細胞膜上の遊離コレステロールと考えられるが、その遊離コレステロールの量を細胞膜上で一定に保とうとするために、細胞内のコレステロールエステルが加水分解を受けることになり、結果として、細胞全体のコレステロール含量が減少する。
急性心筋梗塞発症は、これまで、責任冠動脈での狭窄によって起こると考えられてきたが、最近の研究から、急性心筋梗塞発症前の責任冠動脈が有意な基質的狭窄を示す例は１５％以下にすぎず、多くの症例において、急性心筋梗塞発症の原因は、いわゆる粥状動脈硬化プラークの破綻により生じる血栓形成の結果としての冠動脈閉塞であることが明らかになってきた。さらに、そのプラークの破綻による血栓形成が一過性で心筋梗塞まで至らないものが、不安定狭心症であることが明らかになった。
これら粥状動脈硬化プラークの破綻が原因で生じる血栓性の冠動脈閉塞により生じる一連の病態は、急性冠症候群（Ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＣＳ）と呼ばれる（Ｄａｖｉｅｓ  ＭＪ．，“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｔｗｏ  ｆａｃｅｓ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．，９４：２０１３−２０２０（１９９６）；Ｌｉｂｂｙ  Ｐ，“Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ”，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．，９１：２８４４−２８５０（１９９５）；Ｆａｌｋ  Ｅ，Ｓｈａｈ  Ｐ，Ｆｕｓｔｅｒ  Ｖ，“Ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｐｌａｑｕｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ”，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．，９２：６５７６７１（１９９５））。このＡＣＳは、その原因から、粥状動脈硬化プラークを破綻しにくくできれば確実に抑制できる。
粥状動脈硬化プラークの破綻しやすさは、プラークの大きさや狭窄度とは関係なく、プラークの構成に密接な関係があることが明らかになってきた。破綻しやすい粥状動脈硬化プラークの最大の特徴の一つは、コレステロールエステルを大量に含んだマクロファージ由来の泡沫細胞からなる脂質コア（ｌｉｐｉｄ−ｒｉｃｈ  ｃｏｒｅ）の存在である（Ｌｉｂｂｙ  Ｐ，Ｃｌｉｎｔｏｎ  ＳＫ．，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．”，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ．４：３５５−３６３（１９９３））ので、脂質コア、すなわち泡沫細胞からコレステロールエステルを除去できれば、粥状動脈硬化プラークを破綻しにくくできると考えられる。また、脂質コアでは細胞間隙にもコレステロールをはじめとした脂質の沈着が認められるが、これら脂質は、通常はマクロファージによって処理されるため、マクロファージ細胞内のコレステロール除去により、細胞間隙に沈着したコレステロールの除去が可能である。したがって、マクロファージの細胞内コレステロールの除去により、脂質コアからの効率のよい脂質除去が可能となる。
最近、この脂質コアに含まれる脂質の含量を低下させることで、実際に、粥状動脈硬化プラークを安定化させて破綻しにくくできることが示された。Ａｉｋａｗａ  Ｍらは、食餌中の脂質含量を低下させることにより、粥状動脈硬化プラークを安定化させて破綻しにくくした（Ａｉｋａｗａ  Ｍ，Ｒａｂｋｉｎ  Ｅ，Ｏｋａｄａ  Ｙ，Ｖｏｇｌｉｃ  ＳＪ，Ｃｌｉｎｔｏｎ  ＳＫ，Ｂｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ  ＣＥ，Ｓｕｋｈｏｖａ  ＧＫ，Ｌｉｂｂｙ  Ｐ，“Ｌｉｐｉｄ  ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｅｔ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔ  ａｔｈｅｒｏｍａ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｌｅｓｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ”，９７（２４）：２４３３−４４（１９９８））。また、Ｃｒｉｓｂｙらは、高脂血症治療剤であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を投与して血清コレステロールを強力に低下させることにより粥状動脈硬化プラークを安定化させて破綻しにくくした（Ｃｒｉｓｂｙ  Ｍ，Ｎｏｒｄｉｎ−Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ  Ｇ，Ｓｈａｈ  Ｐ．Ｋ．，Ｙａｎｏ  Ｊ．，Ｚｈｕ  Ｊ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｊ．（２００１），“Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｔｅｎｔ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ｐｌａｑｕｅｓ”：”Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｑｕｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ”，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１０３：９２６−９３３；Ｆｕｋｕｍｏｔｏ  Ｙ．，Ｌｉｂｂｙ  Ｐ．，Ｒａｂｋｉｎ  Ｅ．，Ｈｉｌｌ  Ｃ．Ｃ．，Ｅｎｏｍｏｔｏ  Ｍ．，Ｈｉｒｏｕｃｈｉ  Ｙ．，Ｓｈｉｏｍｉ  Ｍ．，Ａｉｋａｗａ  Ｍ，“Ｓｔａｔｉｎｓ  Ａｌｔｅｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ａｔｈｅｒｏｍａ  ｏｆ  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ  Ｒａｂｂｉｔｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：９９３−９９９（２００１））。
アポＥの分泌を促進させることができ、かつ上記のアポＥによる血清のコレステロール排出促進作用を粥状動脈硬化プラークからのコレステロールの除去、即ち、粥状動脈硬化プラークの安定化に利用できれば、急性心筋梗塞や不安定狭心症などのＡＣＳの予防および治療が可能になると考えられる。
従来の技術
これまで、アポＥの分泌を促進させる作用がある物質として、ＬｉｖｅｒＸ受容体（ＬＸＲ）リガンドが報告されているが、臨床応用には至っていない。このため、局所でのアポＥ量の増加または血中アポＥ濃度の増加作用を有する、更なる薬剤の開発が望まれている。
一方、特開平６−２０６８４２号公報、その対応米国特許第５，５７４，１７８号および対応ヨーロッパ特許第０６６５２０８号には、式：
2003018001.tif 000003
で表される化合物が抗酸化作用を有する化合物として開示されている。
また、特開平１１−２１２３８号公報、その対応米国特許第６，１５６，７９３号および対応ヨーロッパ特許出願第９８９１７６３８．３号には、同化合物が動脈硬化症の予防および治療のための医薬組成物の有効成分として開示されている。
しかし、これら公報または特許には、同化合物が、アポＥの分泌促進作用やそれによって細胞内脂質、特に細胞内コレステロール含量を低下させる作用を有することは開示されていない。
発明の開示
本発明は、アポＥの分泌を促進させることにより細胞内脂質を除去することができる医薬組成物を提供する。
本発明者らは、一定の４，６−ジ−ｔ−ブチルジヒドロベンゾフラン誘導体が、細胞からのアポＥの分泌を促進してアポＥの血中あるいは臓器局所の濃度を増加させ、それにより細胞内脂質、特に細胞内コレステロール含量を低下させるということを発見した。
従って、本発明は、アポＥの分泌を促進させるための医薬組成物であって、式（１）：
2003018001.tif 000004
（式中、
Ｒ１は、水素原子、アシル基、またはアリールアルコキシカルボニル基であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基であるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよい。）
で表される化合物を含んでなる組成物を提供する。
一つの態様においては、アポＥの分泌により血中あるいは臓器局所においてアポＥの濃度が増加され、それにより体内の細胞内脂質が除去される。
好ましい態様において、細胞内脂質は粥状動脈硬化プラークの脂質であり、より好ましくは、粥状動脈硬化プラークの脂質はコレステロールである。
より好ましい態様においては、粥状動脈硬化プラークの細胞内コレステロールを除去することで、粥状動脈硬化プラークが安定化されて粥状動脈硬化プラークの破綻が防止され、それにより急性心筋梗塞または不安定狭心症のような急性冠症候群の発生頻度が低減または症状が軽減される。
また、本発明は、式（１）で表される化合物を含んでなる、急性冠症候群の発生頻度を低減または症状を軽減するための医薬組成物も提供する。
更に、本発明は、式（１）で表される化合物を含んでなる、細胞内脂質含量を低下させるための医薬組成物も提供する。
更には、本発明は、アポリポタンパク質Ｅの分泌を促進する方法であって、そのような促進を必要とする患者に促進有効量の式（１）で表される化合物を投与することを含んでなる方法を提供する。
また、本発明は、急性冠症候群の発生頻度を低減または症状を軽減する方法であって、そのような治療を必要とする患者に治療有効量の式（１）で表される化合物を投与することを含んでなる方法を提供する。
また、本発明は、細胞内脂質含量を低下させる方法であって、そのような治療を必要とする患者に治療有効量の式（１）で表される化合物を投与することを含んでなる方法を提供する。
更には、本発明は、上記の医薬組成物の製造における式（１）で表される化合物の使用も提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の式（１）の化合物のＲ１は、水素原子、アシル基またはアリールアルコキシカルボニル基である。好ましいアシル基は、１〜１０の炭素原子を有するアシル基であり、その例としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、およびベンゾイル基が挙げらる。また、好ましいアリールアルコキシカルボニル基は、７〜１１の炭素原子を有するアリールアルコキシカルボニル基であり、その例として、ベンジルオキシカルボニルおよびナフチルメトキシカルボニル基が挙げられる。
好ましいＲ１は、水素原子およびアシル基であり、水素原子およびアセチル基がより好ましく、特に水素原子が好ましい。
式（１）の化合物のＲ２およびＲ３は、独立して、置換若しくは未置換のアルキル基、置換若しくは未置換のアルケニル基、または置換若しくは未置換のアルキニル基である。
好ましいアルキル基は、１〜２０の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖状のアルキル基であり、その例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、エチルブチル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、エチルペンチル、ｎ−オクチル、エチルヘキシル、プロピルペンチル、ノニル、デシル、ペンタデシル、およびステアリル基が挙げられる。より好ましくは１〜１０の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖状のアルキル基であり、特に３〜８の炭素原子を有する直鎖状のアルキル基が好ましい。
好ましいアルケニル基は、２〜２０の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖状のアルキル基であり、その例として、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、イソヘキセニル、エチルブテニル、ヘプテニル、イソヘプテニル、エチルペンテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、およびペンタデセニル基が挙げられる。より好ましくは２〜１０の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖状のアルケニル基であり、特に３〜８の炭素原子を有する直鎖状のアルケニル基が好ましい。
好ましいアルキニル基は、２〜２０、好ましくは２〜１０の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖状のアルキニル基であり、特に３〜８の炭素原子を有する直鎖状のアルキニル基が好ましい。その例は、アルケニル基について挙げた例に対応する。
Ｒ２とＲ３は、一緒になって、５〜１０の炭素原子を有するシクロアルキル基を形成してもよい。好ましいシクロアルキル基の例として、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、およびシクロデシルが挙げられる。
Ｒ２およびＲ３がアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基である場合に有することができる置換基の例として、ハロゲン、低級アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、およびトリフルオロメチル基が挙げられる。
好ましいＲ２およびＲ３は、３〜８の炭素原子を有する直鎖状の未置換アルキル基であり、Ｒ２およびＲ３の双方がｎ−ペンチル基である場合が最も好ましい。
好ましい式（１）の化合物は：
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジエチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−プロピル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−イソプロピル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ブチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｓ−ブチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｔ−ブチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｔ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−イソペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ネオペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ヘキシル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ヘプチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−オクチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ノニル−２，３−ジヒドロベンゾフラン；および
４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−デシル−２，３−ジヒドロベンゾフラン
である。特に好ましい式（１）の化合物は、４，６−ジ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ−２，２−ジ−ｎ−ペンチル−２，３−ジヒドロベンゾフランである。
本発明で用いられる式（１）で表される化合物は、たとえば、特開平６−２０６８４２号公報、その対応米国特許第５，５７４，１７８号または対応ヨーロッパ特許第０６６５２０８号に記載の方法によって合成することができる。
本発明において、アポＥの濃度が局所的に増加される臓器として、血管内膜が挙げられる。特にマクロファージが多く局在する血管内膜においてアポＥの濃度が局所的に増加する。血中のアポＥの濃度は、アポＥ抗体を使用する免疫学的方法により測定することができる。一方、臓器局所におけるアポＥの濃度は、アポＥ抗体を使用する免疫学的方法あるいはアポＥ遺伝子やその断片を用いたＦＩＳＨ法などの分子生物学的方法により測定することができる。
本発明における細胞内脂質とは、リン脂質、トリグリセリド、コレステロールエステルおよび遊離コレステロールのことで、特にコレステロールエステルと遊離コレステロールが主要な細胞内脂質である。これら脂質が蓄積される細胞は、典型的には、血管平滑筋細胞およびマクロファージ、特にマクロファージである。また、細胞内脂質の除去とは、アポＥが、細胞内あるいは細胞膜の脂質と幼若リポタンパク質を形成することにより、その脂質が細胞外に排除されることをいう。
本発明において粥状動脈硬化プラークとは、マクロファージ由来泡沫細胞および脂質コアを覆う平滑筋細胞からなる線維性被膜により形成される血管病変である。
粥状動脈硬化プラークの破綻とは、脂質コアを覆う平滑筋細胞からなる線維性被膜が破れることを意味する。破綻により泡沫細胞の表面に発現する組織因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ）が血中に露出して血栓が形成される。この血栓形成が冠動脈で起こると、急性心筋梗塞や不安定狭心症が発症する。
本発明における粥状動脈硬化プラークの安定化とは、粥状動脈硬化プラーク中の脂質コアの脂質含量を低下させることにより粥状動脈硬化プラークを破綻し難くすることをいう。
本発明の医薬組成物は、有効成分である式（１）で表される化合物に、投与経路に応じて、生理的に許容される固体または液体の製剤担体を配合し、各種の剤形に調製することができる。投与経路には、経口投与、静脈注射などの非経口投与、徐放性製剤による徐放性投与、および局所投与カテーテルなどによる局所投与がある。製剤担体には、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、安定化剤、油脂および溶剤がある。剤形には、錠剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、水剤、シロップ剤、懸濁剤、乳濁剤および注射剤がある。
本発明の式（１）で表される化合物の投与量は、患者の年齢、症状の重篤度、投与経路などによって適宜選択されるが、一日あたり成人で、例えば１〜１０００ｍｇ、好ましくは５０〜４００ｍｇである。この量は、１回に纏めて投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。
以下に、実施例を示すが、それらは、本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
実  施  例
試験例１：アポＥ分泌促進作用と細胞内コレステロール低下作用
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびアポＥ欠損マウスそれぞれから４．０５ｗ／ｖ％チオグリコレート刺激腹腔滲出細胞を調製した。これを１．０×１０６細胞／ウェルで１２−ウェルプレートに播いた。５容量％のＣＯ２の存在下で３７℃で培養した。培養３時間後に培地を交換することにより非接着細胞を除去して、各ウェル中にマウス腹腔マクロファージを得た。翌日、このマウス腹腔マクロファージを５０μｇプロテイン／ｍＬアセチル化ＬＤＬ含有培地で２４時間培養して泡沫化させた。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の泡沫化マクロファージの各ウェルに４，６−ジ−ｔ−ブチル−２，２−ジペンチル−５−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロベンゾフラン（ＢＯ−６５３）をそれぞれ最終濃度が０、３および１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。２４時間培養した後、培地を回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料を調製した。
このＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料を１０ｗ／ｖ％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してから、セミドライ法によりニトロセルロース紙に転写し、ブロッキング（１０ｗ／ｖ％スキムミルク，０．１容量％Ｔｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）した。１次抗体としてウサギ抗マウスアポＥ抗体（＃Ｋ２３１００Ｒ，ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ）を用い、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（＃７０７１−１，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）を用い、化学発光法（ＰＩＥＲＣＥ）でアポＥを検出した。結果を図１に示す。
図１から分かるように、ＢＯ−６５３を添加した試料では、培地中の糖化型アポＥの増加が認められた。なお、糖化型アポＥのバンドはアポＥ欠損マウス由来のマクロファージでは認められなかった。
一方、培地と同時に回収したＢＯ−６５３処理後の泡沫化マクロファージから、ヘキサン／２−プロパノール（容量比３：２）の混合溶媒を用いて脂質を抽出した。酵素法（Ｙｏｓｈｉｋｉ  Ｋａｗａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  Ａｚｏ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３１０，４８９−４９６（１９９４））により、この脂質中の総コレステロールを測定し、その値を細胞内コレステロール含量とした。表１に、ＢＯ−６５３処理による細胞内コレステロール含量の減少率を、使用したビヒクルに対するパーセントで示す。ＢＯ−６５３を添加した試料では、細胞内コレステロール含量が低下している。
2003018001.tif 000005
試験例２：マウス血清アポＥ増加作用
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを３匹と４匹からなる第１および第２グループに分け、第１グループにはＢＯ−６５３を含有しない高脂肪食を与え、第２グループにはＢＯ−６５３を０．６５％含有する高脂肪食を与えた。５週間飼育した時点でエーテル麻酔下に下行大静脈より採血した。各個体の血液から血清を調製し、その１００μＬを超遠心用試験管に入れた。比重１．２５６の臭化ナトリウム水溶液９００μＬを加え、卓上型超遠心機ＴＬ−１００でＴＬＡ−１００．２ローターを用いて１００，０００ｒｐｍで２０時間遠心した。得られたリポタンパク質画分を１０ｗ／ｖ％トリクロロ酢酸水溶液で処理し、生成した沈殿で８０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料を調製した。このうち１０μＬを１５ｗ／ｖ％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、クマシーブルー染色を行った。分子量からアポＥを同定した。結果を図２に示す。
図２から分かるように、第２グループのアポＥは第１グループに比べ増加している。
上記のように、特開平１１−２１２３８号公報およびその対応外国特許には、式（１）の化合物が動脈硬化症の予防および治療のための医薬組成物の有効成分として開示されている。しかし、その公報には、その試験例から分かるように、式（１）の化合物は、動脈硬化病変の形成を直接抑制する化合物として記載されている。これに対し、本発明では、式（１）の化合物は、アポＥの分泌→アポＥによるコレステロール除去→末端の疾患の抑制という作用機序により末端の疾患に作用する。その結果、急性心筋梗塞または不安定狭心症という動脈硬化症とは異なる疾患の抑制が期待される。従って、本発明における式（１）の化合物の薬理作用は、上記公報に開示されたものとは明らかに異なるものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＢＯ−６５３処理および未処理のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来泡沫化マクロファージおよびＢＯ−６５３未処理のアポＥ欠損マウスマクロファージの培養培地についての抗マウスアポＥ抗体を用いたウェスタンブロッティングを示す。
図２は、ＢＯ−６５３を含有しない高脂肪食を与えたマウスおよびＢＯ−６５３を０．６５％含有する高脂肪食を与えたマウスの各個体のリポタンパク質画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。各レーンにおいて１２．５μＬの血清に相当するリポタンパク質画分を泳動した。
【図１】
2003018001.tif 000016
【図２】
2003018001.tif 000017
【国際調査報告】
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2003018001.tif 000019
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