(57)【要約】本発明は、ＴＰＯレセプターを架橋することにより細胞内にシグナル伝達してＴＰＯアゴニスト作用を奏しうる、モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体に関する。この改変抗体は、ＴＰＯによるシグナル伝達のアゴニストとして使用することができ、血小板減少が関与する血液疾患、癌や白血病等の化学治療後の血小板減少症などの予防及び／又は治療薬等として有用である【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体。
【請求項２】
Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域がリンカーを介して連結されている、請求項１記載の改変抗体。
【請求項３】
リンカーが、少なくとも１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーである、請求項２または３記載の改変抗体。
【請求項４】
改変抗体が、１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのマルチマーから構成される請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項５】
改変抗体が、一本鎖Ｆｖのテトラマー、トリマーまたはダイマーから構成される請求項４に記載の改変抗体。
【請求項６】
改変抗体が、一本鎖Ｆｖのダイマーから構成される請求項５に記載の改変抗体。
【請求項７】
同じ鎖上のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は互いに連合して１つの抗原結合部位を形成していない、請求項４〜６のいずれかに記載の改変抗体。
【請求項８】
改変抗体が、２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチドである請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項９】
改変抗体が、２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチドである請求項８に記載の改変抗体。
【請求項１０】
改変抗体が、さらにポリペプチド精製のためのアミノ酸配列を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項１１】
改変抗体が精製されたものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項１２】
Ｈ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項１３】
Ｈ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト型化されたＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項１４】
改変抗体が、単一特異性（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の改変抗体である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項１５】
改変抗体が、多価特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の改変抗体である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項１６】
改変抗体が、二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の改変抗体である請求項１５に記載の改変抗体。
【請求項１７】
Ｌ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域が、同一のモノクローナル抗体由来である、請求項１４に記載の改変抗体。
【請求項１８】
親抗体と比較して同等以上のアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示す、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項１９】
親抗体と比較して２倍以上のアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示す、請求項１８に記載の改変抗体。
【請求項２０】
親抗体と比較して１０倍以上のアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示す、請求項１９に記載の改変抗体。
【請求項２１】
親抗体がアゴニスト作用を実質的に有さない、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の改変抗体。
【請求項２２】
トロンボポエチン（ＴＰＯ）と比較して同等以上のＴＰＯアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む化合物。
【請求項２３】
ＴＰＯと比較して２倍以上のＴＰＯアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示す、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
ＴＰＯと比較して１０倍以上のＴＰＯアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示す、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
ＴＰＯアゴニスト作用のＥＤ５０値が２０ｐＭ以下である請求項１〜２４のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物。
【請求項２６】
ＴＰＯアゴニスト作用のＥＤ５０値が約１０ｐＭ以下である請求項２５に記載の改変抗体または化合物。
【請求項２７】
ＴＰＯアゴニスト作用のＥＤ５０値が約２ｐＭ以下である請求項２６に記載の改変抗体または化合物。
【請求項２８】
親抗体と比較して、１／１０以下の細胞間接着作用（ＥＤ５０値）を示す請求項１〜２７のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物。
【請求項２９】
細胞間接着作用を実質的に有さない請求項１〜２７のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物をコードするＤＮＡ。
【請求項３１】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物を産生する動物細胞。
【請求項３２】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物を産生する微生物。
【請求項３３】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物のＴＰＯアゴニストとしての使用。
【請求項３４】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物を用いてＴＰＯレセプターを架橋することにより細胞内にシグナル伝達を起し、該細胞にアゴニスト作用を生じさせる方法。
【請求項３５】
ＴＰＯアゴニスト作用が、巨核球の増殖、分化誘導または成長の刺激、血小板の産生またはＴＰＯレセプタータンパク質のリン酸化である請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物を有効成分として含む医薬。
【請求項３７】
医薬が、血小板減少症の治療剤である請求項３６記載の医薬。
【請求項３８】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の改変抗体または化合物の医薬としての使用。
【請求項３９】
ＴＰＯレセプターを架橋することによりアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体のスクリーニング方法であって、
（１）ＴＰＯレセプターに特異的に結合する抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体を作製し、
（２）ＴＰＯレセプターを発現している細胞と該改変抗体とを接触させ、
（３）ＴＰＯレセプターを架橋することにより該細胞に生ずるＴＰＯアゴニスト作用を測定する、
工程を含むスクリーニング方法。
【請求項４０】
ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体のＴＰＯアゴニスト活性の測定方法であって、
（１）ＴＰＯレセプターに特異的に結合する抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体を作製し、
（２）ＴＰＯレセプターを発現している細胞と該改変抗体とを接触させ、
（３）ＴＰＯレセプターを架橋することにより該細胞に生ずるＴＰＯアゴニスト作用を測定する、
工程を含むＴＰＯアゴニスト活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体に関する。当該改変抗体は、ＴＰＯレセプターを架橋することにより細胞内にシグナルを伝達しうるＴＰＯアゴニスト作用を有しており、種々の医薬として有用である。
背景技術
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、１９９４年に発見された血小板産生調節因子であり、主に肝臓で産生される分子量７万〜８万の糖タンパク質からなることが知られている。トロンボポエチンは、骨髄において血小板前駆体細胞の生存、増殖、分化および成熟、即ち巨核球の分化および増殖を促進するサイトカインである。一方、トロンボポエチン（ＴＰＯ）レセプターは、血小板産生を調節する特異的因子の受容体ｃ−Ｍｐ１としてＴＰＯより先に同定されていた（Ｍ．Ｓｏｕｙｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　６３：１１３７（１９９０））。ｃ−Ｍｐ１は、血小板前駆細胞、巨核球及び血小板に局在し、ｃ−Ｍｐ１の発現の抑制が巨核球形成を選択的に阻害することが報告された（Ｍ．Ｍｅｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　８２：１３９５（１９９３））。そして、ｃ−Ｍｐ１に対するリガンドは、ｃ−Ｍｐ１リガンド特異的細胞の増殖アッセイ及び精製手段としてのｃ−Ｍｐ１を用いたそのリガンドの精製からＴＰＯであることが報告され（Ｆ．ｄｅ　Ｓａｕｖａｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３６９：５３３（１９９４）；ＴＤ．Ｂａｒｔｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　７７：１１１７（１９９４））、現在、Ｍｐ１はＴＰＯレセプターと称されている。このため、ＴＰＯおよびＴＰＯレセプターのアゴニストは、種々の血小板減少症の治療薬として、例えば癌患者に対する骨髄抑制及び脊髄切断療法に付随する血小板減少症を緩和する医薬としての応用が期待されている。
一方、改変抗体、特に低分子化抗体、例えば一本鎖Ｆｖは、その低分子化により組織、腫瘍等への移行性を改善し、遺伝子工学的に調製する目的で開発されたものであるが、近年、一本鎖Ｆｖのダイマー、特に、二重特異性［ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ］のダイマーが細胞同士の架橋を目的として使用されている。このようなダイマーとしては、代表的には癌細胞抗原とＮＫ細胞や好中球など宿主細胞抗原を認識する一本鎖Ｆｖのヘテロダイマー等が知られている（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７，９７６３−９７７２，１９９８）。これらは、細胞間架橋を誘導させることにより癌を治療するためのより効率的な改変抗体として、一本鎖Ｆｖの構築技術から作成されたものである。このため、抗体およびその断片（例えばＦａｂ断片など）および二重特異性の改変抗体、さらには単一特異性である一本鎖Ｆｖのダイマーでも細胞間の架橋が誘導されると考えられていた。
また、細胞表面分子を架橋してシグナルを伝達しうるモノクローナル抗体として、例えば細胞の分化・増殖に関与するＥＰＯ受容体に対する抗体（特開２０００−９５８００号公報）、ＭｕＳＫ受容体に対する抗体（Ｘｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，７６８−７７１，１９９７）などが知られている。また、ＴＯＰレセプターに対するアゴニスト抗体、その断片および一本差Ｆｖなども知られている（ＷＯ９９／１７３６４）。しかし、アゴニスト作用を有する一本鎖Ｆｖのダイマーおよび一本鎖２価抗体等の改変抗体については報告はない。
そこで、先ず本発明者らは、ＩＡＰを有する細胞に対してアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体（ＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２抗体）を取得し、それをもとに作製した一本鎖Ｆｖのモノマーは細胞にアポトーシスを誘起せず、ダイマーが細胞に対してアポトーシスを誘導することに注目し、これらが細胞表面上のＩＡＰ受容体を架橋（２量体化）することにより当該細胞にシグナルが伝達されて、その結果アポトーシスが誘導されたことを突き止めた。即ち、これは、単一特異性の一本鎖Ｆｖダイマーが細胞表面上の分子（例えば受容体）を架橋することにより、リガンドと同様にシグナルを伝達し、これによりアゴニスト作用を示しうること示唆するものである。
次に細胞間の架橋形成に注目したところ、前記モノクローナル抗体は赤血球凝集を引き起こすが、前記一本鎖Ｆｖのダイマーは赤血球凝集を起こさないことを見出した。同様の結果は、一本鎖２価抗体（２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチド）でも観察された。即ち、これはモノクローナル抗体では細胞間で架橋が形成される可能性があるのに対して、一本鎖Ｆｖダイマーまたは一本鎖２価抗体等の改変抗体では、細胞表面上の分子を架橋するが、細胞間の架橋を形成しないことを示唆するものである。
本発明者は、これらの結果から、一本鎖Ｆｖダイマーや一本鎖２価抗体等の改変抗体が、従来知られていた細胞間の架橋だけでなく、同じ細胞の細胞表面分子あるいは細胞内分子を架橋する、当該分子に対するリガンド（特に天然のリガンドの作用を模倣するようなリガンド）として特に適していることを初めて見出した。
さらに、本発明者は、抗体分子（ｗｈｏｌｅ　ＩｇＧ）を一本鎖Ｆｖダイマーまたは一本鎖２価抗体などの改変抗体にすることにより、細胞間の架橋などによる副作用を軽減し、且つ細胞表面上の分子を架橋して、細胞に所望の作用のみを誘起しうる新規な医薬品を提供しうることを見出し、本発明を完成させた。また、本発明の改変抗体は、当該改変抗体と同じＶ領域を有するｗｈｏｌｅの抗体（ＩｇＧ）と比較して顕著に高い活性を有しており、さらに抗体分子に比べ分子量が小さく、定常領域を有しないという特徴から、組織移行性が向上しているという特徴を有している。
発明の開示
本発明の課題は、ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む低分子化アゴニスト改変抗体を提供することである。
従って、本発明は、ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上、好ましくは各々２〜６、さらに好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含む改変抗体に関する。
本明細書において「改変抗体」とは、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含み、これら各Ｖ領域を直接的あるいはリンカー等を介して共有結合および／または非共有結合により結合した任意の物質を意味する。具体的には、抗体の各Ｖ領域をペプチドリンカー、化学架橋剤等のリンカーで結合したポリペプチドまたは化合物等があげられる。なお、本発明の改変抗体において、抗体由来の２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は各々、同一または異なる抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域であってもよい。
本発明の改変抗体は、ＴＰＯレセプターを特異的に認識して当該レセプターを架橋し、これにより細胞内にシグナルを伝達しうるものであればいかなるものでもよく、さらには、該改変抗体のＶ領域のアミノ酸配列の一部を改変した改変抗体も包含される。
本発明の改変抗体は、好ましくは１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、トリマー、テトラマー等のマルチマーであるか、又は２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖ポリペプチドである。本発明の改変抗体が１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、トリマー、テトラマー等のマルチマーである場合、同じ鎖上のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は互いに連合して１つの抗原結合部位を形成していないものが好ましい。
特に好ましくは、１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、又は２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む一木鎖ポリペプチドである。該改変抗体中において、Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、好ましくはリンカーを介して連結されている。
前記一本鎖Ｆｖのマルチマーは、非共有結合によるマルチマー、架橋基を介した共有結合によるマルチマー、さらに前記一本鎖Ｆｖと結合しうる架橋剤（抗体、抗体断片、又は２価の改変抗体）を介したマルチマーが包含される。マルチマーを形成させる架橋基は、ペプチドの架橋に用いられている公知の架橋基を用いることができるが、例えばシステイン残基によるジスルフィド架橋、他の架橋基、例えばＣ４〜Ｃ１０アルキレン（例えば、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレンおよびオクタメチレンなど）またはＣ４〜Ｃ１０アルケニレン（ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ−３−ブテニレン、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ−２−ペンテニレン、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ−３−ペンテニレンおよびｃｉｓ／ｔｒａｎｓ−３−ヘキセニレンなど）である。
また、一本鎖Ｆｖと結合しうる架橋剤は、例えばＦｖ中に随意に導入しうるアミノ酸配列、例えばＦＬＡＧ配列等に対する抗体もしくはその断片、またはその抗体由来の改変抗体、例えば一本鎖Ｆｖである。
本明細書において「ＴＰＯアゴニスト作用」とは、ＴＰＯレセプターを架橋することにより細胞内にシグナルが伝達されて該細胞に生じる生物学的作用をいい、具体的には、巨核球の増殖、分化または成長の刺激、血小板の産生等の作用をいう。
本発明において、ＴＰＯアゴニスト作用のＥＤ５０値は、公知のＴＰＯアゴニスト作用の測定法より求めることができる。具体的には、ＢａＦ／ｍｐ１やＵＴ７／ＴＰＯなどのＴＰＯ反応性細胞株を用いた細胞増殖アッセイ、ＭＰＬタンパクのリン酸化測定、骨髄細胞からの分化による巨核球コロニーアッセイ、インビボでのマウス血小板回復合成アッセイ、ヒト白血病巨核芽球細胞株（ＣＭＫ）を用いた血小板抗原ＧＰＩＩｂＩＩＩａ（抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ）発現の誘導、巨核芽球細胞株（ＤＡＭＩ）における倍数化の誘導等により測定することができ、その反応容量曲線の最大活性を１００％とし、反応率５０％となる用量をＥＤ５０％値とする。
本発明の改変抗体は、当該改変抗体と同一の抗原結合領域を有する抗体、即ち、当該改変抗体の抗原結合領域を形成するＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域の対と同一のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域の対を有するＩｇＧ等のｗｈｏｌｅの抗体（以下、親抗体という）と比較して同等以上のＴＰＯアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示すものが好ましい。さらに、親抗体と比較して２倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上のＴＰＯアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示すものが好ましい。また、ＴＰＯレセプターには結合するが、ＴＰＯアゴニスト作用を実質的に有さない親抗体と同一の抗原結合領域を形成するＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域の対を有する改変抗体であって、当該改変抗体はアゴニスト作用を有するものも本発明に含まれる。
本発明の抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む化合物とは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と比較して同等以上のＴＰＯアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示し、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む化合物であればいかなるものでもよく、ＴＰＯと比較して２倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上のＴＰＯアゴニスト作用（ＥＤ５０値）を示す化合物が好ましい。
ここでいう「化合物」とは、本発明の改変抗体に限らず、ｗｈｏｌｅの抗体、Ｆ（ａｂ’）２等、２つ以上、好ましくは２〜６、さらに好ましくは２〜４、特に好ましくは２つの抗原結合部位を有するものであればいかなるものも含まれる。
本発明の抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体または化合物は、親抗体と比較して、１／１０以下の細胞間接着作用（ＥＤ５０値）を示すものが好ましく、細胞間接着作用を実質的に有さないものが特に好ましい。
ここでいう細胞間接着作用のＥＤ５０値とは、公知の細胞間接着作用の測定法、例えばＴＰＯレセプターを発現する細胞の凝集を指標にしてより求めることができる。
本発明は上記改変抗体をコードするＤＮＡに関する。
本発明は上記改変抗体を産生する動物細胞または微生物に関する。
本発明は上記改変抗体のＴＰＯアゴニストとしての使用に関する。
本発明は上記改変抗体を用いてＴＰＯレセプターを架橋することにより細胞内にシグナル伝達を起し、巨核球の増殖、分化誘導または成長の刺激、血小板の産生、ＴＰＯレセプタータンパク質のリン酸化等のＴＰＯアゴニスト作用を生じさせる方法に関する。
本発明は、上記改変抗体を有効成分として含む血小板減少症治療剤等の医薬に関する。
本発明は、上記改変抗体の医薬としての使用に関する。
本発明は、ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体のスクリーニング方法又は測定方法であって、１）ＴＰＯレセプターに特異的に結合する、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体を作製し、２）ＴＰＯレセプターを発現している細胞と該改変抗体とを接触させ、３）ＴＰＯレセプターを架橋することにより該細胞に生ずるＴＰＯアゴニスト作用を測定する、工程を含むスクリーニング方法又は測定方法に関する。本発明の測定方法は、本発明の改変抗体を医薬品として製造する場合の品質管理に用いることができる。
本発明の改変抗体は、単一特異性（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体でも、二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体等の多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体であってもよいが、好ましくは単一特異性（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体である。
本発明はまた、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及び／又はヒト抗体由来のＬ鎖Ｖ領域である改変抗体に関する。ヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、例えばＷＯ９９／１０４９４号公報に記載された方法のように、ヒトモノクローナル抗体のライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。また、トランスジェニックマウス等から作製されたヒトモノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域も包含される。
さらに本発明は、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及び／又はヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域である改変抗体に関する。詳細には、ヒトモノクローナル抗体Ｌ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）とヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）のモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲとする）を含むヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及び／又はヒトモノクローナル抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲとヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲを含むヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域から構成される。この場合、ＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列を一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。
本発明はまた、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリなど）のモノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域も包含される。この場合、ＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列を一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。
本発明はまた、前記種々の改変抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る組換えベクターを製造する遺伝子工学的方法に関する。
本発明はまた、該組換えベクターにより形質転換された宿主に関する。宿主は、例えばヒト細胞、マウス細胞などの動物細胞、又は大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物である。
本発明はまた、上記の宿主を培養し、培養物から改変抗体を採取することを特徴とする、改変抗体の製造方法に関する。
さらに本発明は、一本鎖Ｆｖを産生する宿主動物細胞を無血清培地で培養して該培地中に一本鎖Ｆｖを分泌させ、該培地中で形成された一本鎖Ｆｖのダイマーを含む該培地上清を精製することを特徴とする一本鎖Ｆｖのダイマーの製造方法に関する。
本発明はまた、改変抗体のＴＰＯアゴニストとしての使用に関する。即ち、前記得られた改変抗体を有効成分として含有するシグナル伝達アゴニストに関する。
故に、本発明のＴＰＯアゴニスト改変抗体を有効成分として含有する医薬製剤は、血小板減少が関与する血液疾患、癌や白血病等の化学治療後の血小板減少症などの治療及び／又は予防に有用である。
本発明の改変抗体は、抗体に由来するＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む。当該改変抗体の構成としては、好ましくは１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー又は２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドとすることができる。該改変抗体中において、Ｈ鎖およびＬ鎖のＶ領域は、１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーを介して連結されているのが好ましい。これらの改変抗体は、モノクローナル抗体の可変領域を含有し、もとのモノクローナル抗体と同一の特異性をもって抗原に結合する。
Ｈ鎖Ｖ領域
本発明において、抗体に由来するＨ鎖Ｖ領域には、ＴＰＯレセプターを認識し、且つ前記分子を架橋してオリゴマー化、例えば２量体化することにより、細胞内にシグナルを伝達しうる、抗体のＨ鎖Ｖ領域であって、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）に由来するＨ鎖Ｖ領域又は前記Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を一部改変したＨ鎖Ｖ領域も本発明におけるＨ鎖Ｖ領域に包含されるが、ヒトモノクローナル抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲとマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲを含むヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域が好ましい。さらに、組換え技術を使用して作成し得る、ヒト由来のアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域も好ましい。また、本発明のＨ鎖Ｖ領域には、前記Ｈ鎖Ｖ領域の断片であって、抗原結合性を保持する領域も包含される。
Ｌ鎖Ｖ領域
本発明におけるＬ鎖Ｖ領域には、ＴＰＯレセプターを認識し、且つ前記分子を架橋してオリゴマー化、例えば２量体化することにより、細胞内にシグナルを伝達しうる、抗体のＬ鎖Ｖ領域であって、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）に由来するＬ鎖Ｖ領域又は前記Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を一部改変したＬ鎖Ｖ領域も本発明におけるＬ鎖Ｖ領域に包含されるが、ヒトモノクローナル抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲとマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを含むヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域が好ましい。さらに、組換え技術を使用して作成し得る、ヒト由来のアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域も好ましい。また、本発明のＬ鎖Ｖ領域には、前記Ｌ鎖Ｖ領域の断片であって、抗原結合性を保持する領域も包含される。
相補性決定領域（ＣＤＲ）
Ｌ鎖及びＨ鎖の各Ｖ領域は抗原結合部位を形成し、Ｌ鎖及びＨ鎖上の可変領域は共通性のある比較的保存された４個のフレームワークと３個の超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。
前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の多くの部分はβ−シート構造をとり、その結果３個のＣＤＲはループを形成し、ＣＤＲは場合によりβ−シート構造の一部分を形成することもある。３個のＣＤＲはＦＲによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そして対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に寄与する。
これらのＣＤＲ領域は、得られた抗体のＶ領域のアミノ酸配列と既知抗体のＶ領域の既知アミノ酸配列とを照合することによって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」の経験則から見出すことができる。
一本鎖Ｆｖ
一本鎖Ｆｖは、抗体に由来する、連結したＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域を含むポリペプチドのモノマーであり、得られる一本鎖Ｆｖはもとの抗体の可変領域を含有し、相補性決定領域を保存するため、もとの抗体と同一の特異性をもって抗原に結合する（特願平１１−６３５５７号）。さらに、本発明の一本鎖Ｆｖにおいて、前記可変領域および／またはＣＤＲの一部またはそのアミノ酸配列の一部を改変（例えば、欠失、置換又は付加）することができる。本発明の一本鎖Ｆｖを構成するＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は上述したものであり、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を直接又はリンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結することができ、その構成としては、［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］、［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］のいずれでもよい。本発明においては、これら一本鎖Ｆｖはダイマー、トリマー又はテトラマーを形成させ、本発明の改変抗体とすることができる。
一本鎖改変抗体
本発明の２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域、好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含む一本鎖改変抗体は、上述のような２つ以上のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域をそれぞれ含有する。このポリペプチドにおいて各領域は、該一本鎖改変抗体が特定の立体構造、具体的には一本鎖Ｆｖのダイマーが構成する立体構造を模倣し得るよう配置させる必要があり、例えば
［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］
又は
［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］
の順序で各領域が配置され、これらの領域はリンカーを介して連結される。
リンカー
本発明において、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（３），２９９−３０５，１９９６に開示されるリンカーを用いることができる。これらのリンカーは同一分子内で同じ又は異なっていてもよい。ペプチドリンカーを所望する場合、各々のリンカーの例としては：
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ）ｎ
［ｎは１以上の整数である］を挙げることができる。好ましいリンカーペプチドの長さは抗原となる受容体によって異なるが、一本鎖Ｆｖにおいては通常１〜２０アミノ酸であるのが好ましい。２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖改変抗体においては、［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］（又は［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］）からなる同一の抗原結合部位を形成するもの同士を連結するためのペプチドリンカーの長さは１〜３０アミノ酸、好ましくは１〜２０アミノ酸、さらに好ましくは３〜１８アミノ酸である。また、［Ｈ鎖Ｖ領域］−［Ｌ鎖Ｖ領域］（又は［Ｌ鎖Ｖ領域］−［Ｈ鎖Ｖ領域］）からなる同一の抗原結合部位を形成しないもの同士を連結するためのペプチドリンカーの長さは１〜４０アミノ酸、好ましくは３〜３０アミノ酸、さらに好ましくは５〜２０アミノ酸である。これらのリンカーを導入する方法は本発明の改変抗体をコードするＤＮＡの構築方法の説明において述べる。
本発明における化学合成物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）などであり、これらの架橋剤は市販されている。また、化学合成物リンカーの長さは、上述のペプチドリンカーの長さに相当する長さであるのが好ましい。
特に、一本鎖Ｆｖのダイマーを形成させる場合、宿主細胞で産生された一本鎖モノマーを培地等の溶液中で、２０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上ダイマー化するのに適したリンカーを選択することが好ましく、具体的には２〜１２アミノ酸、より好ましくは３〜１０アミノ酸、またはこれに相当する他のリンカーが好ましい。
改変抗体の製造
改変抗体は、ＴＰＯレセプターに特異的に結合する既知または新規な抗体由来のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを前述のリンカーを介して連結することにより得られる。一本鎖Ｆｖの例として、ＷＯ９９／１０４９４に記載される１２Ｂ５抗体、１２Ｅ１０抗体に由来するＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を有するものが挙げられる。２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む本発明の改変抗体の例としては、前記モノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を有するｓｃ１２Ｂ５（リンカー：１５アミノ酸）、ｓｃ１２Ｅ１０（リンカー：１５アミノ酸）、ｄｂ１２Ｂ５ダイマー（リンカー：５アミノ酸）、ｄｂ１２Ｅ１０ダイマー（リンカー：５アミノ酸）が挙げられる。
本発明の改変抗体を作製するためには、該ポリペプチドが分泌性であることを所望する場合は、そのＮ−末端にシグナルペプチドを付加することができる。また、該ポリペプチドの効率的精製等のために、ポリペプチド精製において有用である公知の配列、例えばＦＬＡＧ配列などを挿入することができる。この場合、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてダイマー形成させることもできる。
本発明の改変を作製するためには、これをコードするＤＮＡ、即ち一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ又は再構成一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る必要がある。これらのＤＮＡは、例えばｓｃ１２Ｂ５、ｄｂ１２Ｂ５、ｓｃ１２Ｅ１０及び／又はｄｂ１２Ｅ１０の場合には前記Ｆｖ由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを用いて、又はこれらのＤＮＡを鋳型とし、その配列内の所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅することにより得ることができる。
各Ｖ領域について、アミノ酸配列の一部改変を所望する場合には、ＰＣＲ法を用いる公知の方法によって１又は数個のアミノ酸が改変された、即ち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するＶ領域を得ることができる。特定の抗原に対して十分に活性がある改変抗体を作製するために、ＰＣＲ法を用いる公知の方法によって前記Ｖ領域のアミノ酸配列の一部を改変することが望ましい。
ＰＣＲに用いるプライマーを決定するにあたり、モノクローナル抗体から出発する場合は、当該技術分野において知られた方法を用いて当該抗体由来のＨ鎖及びＬ鎖のタイピングをして両鎖の型を決定する。
次に、ＰＣＲ法を用いて１２Ｂ５抗体及び１２Ｅ１０抗体のＬ鎖Ｖ領域を増幅するため、５’−末端オリゴヌクレオチドプライマー及び３’−末端オリゴヌクレオチドプライマーを上述のように決定する。同様にして、１２Ｂ５抗体及び１２Ｅ１０抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のため、それぞれ５’−末端プライマー及び３’−末端プライマーを決定する。
その例として本発明においては、５’−末端プライマーはその５’−末端近傍に制限酵素ＨｉｎｆＩ切断部位を提供する配列ＧＡＮＴＣを含有し、そして３’−末端プライマーはその５’−末端近傍に制限酵素ＸｍａＩ切断部位を提供するヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有するものを使用している。これらの制限酵素切断部位は可変領域をコードする目的のＤＮＡ断片をクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる限り、他の制限酵素切断部位でもよい。
特に設計されたＰＣＲプライマーを用いて、１２Ｂ５抗体、１２Ｅ１０抗体の各Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをそれらの５’−及び３’−末端において適当な塩基配列を導入して、それらが発現ベクターに容易に挿入されるように、且つそれらが該発現ベクター中で適切に機能するようにした（例えば、本発明ではＫｏｚａｋ配列の導入により翻訳効率を上げるように工夫されている）。次に、これらのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得た１２Ｂ５抗体、１２Ｅ１０抗体の各Ｖ領域を、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨＥＦ発現ベクター（ＷＯ９２−１９７５９参照）に挿入した。クローン化されたＤＮＡの配列決定は任意の常法、例えば、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行うことができる。
本発明の改変抗体において、リンカー、例えばペプチドリンカーは次のように導入することができる。即ち、上述のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域のためのプライマーと一部相補的な配列を有し、且つ該リンカーのＮ−末端またはＣ−末端をコードするようにプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲを行うことによって所望のアミノ酸配列および長さを有するペプチドリンカーをコードするＤＮＡを作成することができる。そして、該ＤＮＡを介してＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを連結すれば、所望のペプチドリンカーを有する本発明の改変抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。さらに、１つの改変抗体をコードするＤＮＡを得ることができれば、前記ＤＮＡを鋳型にして、そして種々のリンカー用のプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲを実施すれば、所望のペプチドリンカーを有する改変抗体又はリンカーを有さない改変抗体をコードするＤＮＡは容易に得ることができる。
また、本発明における改変抗体の各鎖Ｖ領域は、従来の技術（例えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５３，１−６（１９９３）を参照のこと）を用いることによって、ヒト型化することが可能であり、また一旦ヒト型化された各鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡが作製されれば、ヒト型化一本鎖Ｆｖ、ヒト型化一本鎖Ｆｖ断片、ヒト型化モノクローナル抗体あるいはヒト型化モノクローナル抗体断片は、常法に従って容易に作出する事が可能である。さらに、必要な場合、これらのＶ領域のアミノ酸配列の一部を改変することも可能である。
さらに、遺伝子工学における慣用技術を用いて上述のマウス由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと同様に、これらに相当する他の哺乳動物由来のＤＮＡ、例えばヒト抗体由来の各鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡを用いて、他の哺乳動物、特にヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域、ヒト由来の一本鎖Ｆｖ及びその断片、並びにヒト由来のモノクローナル抗体及びその断片を得ることができる。
本発明の改変抗体が、二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体である場合、公知の方法（例えば、ＷＯ９４１３８０４号公報に記載の方法）により作製することができる。
以上のように、目的とする改変抗体の各鎖Ｖ領域、ヒト型化改変抗体の各鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができる。また、常法に従って宿主を培養し、産生した再構成一本鎖Ｆｖ、再構成ヒト型化一本鎖Ｆｖ、ヒト型化モノクローナル抗体及びヒト型化モノクローナル抗体断片は、細胞内又は細胞外から分離し均一にまで精製することができる。この場合、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法、例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組合せて、本発明の改変抗体を分離・精製することができるが、これらに限定されるものではない。
再構成一本鎖Ｆｖを動物細胞、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞などの動物培養細胞、好ましくはＣＨＯ細胞で産生する場合、無血清培地で該再構成一本鎖Ｆｖを産生させると、培地中で形成した該一本鎖Ｆｖのダイマーを安定的に高収率で回収・精製することができる。さらに、このようにして精製された該ダイマーは、長期間、安定してダイマーの状態で保存することができる。この場合に用いることができる無血清培地は、通常組み換えタンパク質の産生に用いられている培地であればいかなるものでもよく、特に限定されるものではない。
本発明の改変抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明の改変抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ７細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウイルス（Ｈｕｍａｎ　ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ−ｖｉｒｕｓ：ＨＣＭＶ）前期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣＹ１、ＨＣＭＶ−ＶＬ−ＨＣＫ等であって、ＰＳＶ２ｎｅｏに由来するプラスミドベクター（国際公開公報ＷＯ９２／１９７５９参照）が包含される。
また、その他に、本発明のために用いることのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチドチェーン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１０８−１１４，（１９７９））、また、ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，５３２２，（１９９０））に従えば容易に実施することができる。
複製起原（ｏｒｉ）としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のｏｒｉを用いることができ、さらに発現ベクターは選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３’）ＩＩあるいはＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むことができる。
上述のように作成した改変抗体の抗原結合活性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素標識固相免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または表面プラズモン共鳴等の既知の方法で測定することができる。また、元のモノクローナル抗体の結合阻害能を指標にして、具体的には該モノクローナル抗体のその抗原への濃度依存的阻害作用の有無を指標にして評価することができる。
詳細には、本発明の改変抗体をコードするＤＮＡを包含する発現ベクターで形質転換した動物細胞、例えばＣＯＳ７細胞又はＣＨＯ細胞を培養し、前記培養した細胞及び／又はその培養上清、又はこれらから精製した改変抗体を用いて抗原への結合を測定する。対照として発現ベクターのみで形質転換した細胞の培養上清などを用いる。抗原、例えば１２Ｂ５抗体、１２Ｅ１０抗体の場合にはヒトＭＰＬを強制発現させたＢａ／Ｆ３細胞に、本発明の改変抗体などの試験試料又は対照の培養上清を加え、例えばフローサイトメトリーを実施して抗原結合活性を評価する。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのシグナル伝達誘起作用（例えば、巨核球の増殖、分化誘導または成長の刺激、血小板の産生、ＴＰＯレセプタータンパク質のリン酸化等）は、抗原を発現する細胞又は該抗原遺伝子を導入した細胞に、前述の改変抗体の試験試料を添加し、当該細胞においてシグナル伝達による変化（例えば、ヒトＭＰＬ抗原特異的な増殖、タンパク質のリン酸化の測定、または血小板特異的な抗原の発現等）を既知の測定方法で評価することができる。
Ｉｎ　Ｖｉｖｏでの評価試験は例えばマウスにＭＰＬを認識するモノクローナル抗体、本発明の改変抗体、対照としてＰＢＳ等を投与する。そして、マウス血清中の血小板量の変化で活性の強さを評価する。
上述のように、ＴＯＰレセプターに特異的に結合する、Ｈ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む改変抗体を作製し、例えば上記のＩｎ　ｖｉｔｒｏまたはＩｎ　ｖｉｖｏでの評価試験により本発明の改変抗体をスクリーニングすることによって、本発明の改変抗体を取得することができる。
本発明の改変抗体は、２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域、好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含むものであり、１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、又は２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域を連結した一本鎖ポリペプチドである。このような構成をとることで、もとのモノクローナル抗体の抗原結合部位の立体構造を模倣して、優れた抗原結合性を保持するものと考えられる。
本発明の改変抗体は、親抗体分子（例えばＩｇＧ）と比較して顕著な低分子化が達成されているため、組織、腫瘍への移行性に優れており、さらに親抗体分子よりも高い活性を有する。このため、本発明の改変抗体を用いることにより、ＴＰＯのシグナルを細胞内に効率よく伝達することができる。故に、これを含有する医薬製剤は、血小板減少が関与する血液疾患、癌や白血病等の化学治療後の血小板減少症などの治療薬としての利用が期待される。また、ＲＩ標識による造影剤としての利用も期待され、ＲＩ化合物やトキシン等の他の化合物と結合させることにより、効力を増強させることも可能である。
発明を実施するための最良の形態
次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
本発明の改変抗体の製造方法を、下記の一本鎖Ｆｖの作製を例にして説明する。本発明の改変抗体の製造方法において用いる、ヒトＩＡＰに対するマウスＭＡＢＬ−１、ＭＡＢＬ−２抗体を産生するハイブリドーマ、ＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２は、公的微生物寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、１９９７年９月１１日に、受託番号それぞれＦＥＲＭ　ＢＰ−６１００、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０１として国際寄託されている。
実施例
実施例１　（ヒトＩＡＰに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローン化）
ヒトＩＡＰに対するマウスモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２の可変領域をコードするＤＮＡを次のようにしてクローン化した。
１．１　メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の調製
ハイブリドーマＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２からのｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて調製した。
１．２　二本鎖ｃＤＮＡの合成
約１μｇのｍＲＮＡよりＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、アダプターを連結した。
１．３　抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）を用いてＰＣＲ法を行った。
（１）ＭＡＢＬ−１Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅
ＰＣＲ法に使用するプライマーは、アダプターの部分配列とハイブリダイズする配列番号：１に示すアダプタープライマー１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、及びマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域配列とハイブリダイズする配列番号：２に示すＭＫＣ（Ｍｏｕｓｅ　Ｋａｐｐａ　Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を用いた。
ＰＣＲ溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１６ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（以上ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）、０．２μＭの配列番号：１に示すアダプタープライマーと０．２μＭの配列番号：２に示すＭＫＣプライマー及びＭＡＢＬ−１由来の二本鎖ｃＤＮＡ０．１μｇを含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて１分間、６０℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で１０分間加熱した。
（２）ＭＡＢＬ−１Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１に示すアダプタープライマー１、及び配列番号：３に示すＭＨＣ−Ｙ１（Ｍｏｕｓｅ　Ｈｅａｖｙ　Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を用いた。
ｃＤＮＡの増幅は、０．２μＭのＭＫＣプライマーの代わりに０．２μＭのＭＨＣ−Ｙ１プライマーを用いて増幅した点を除いて、前記１．３（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により行った。
（３）ＭＡＢＬ−２Ｌ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１に示すアダプタープライマー１、及び配列番号：２に示すＭＫＣプライマーを用いた。
ｃＤＮＡの増幅は、ＭＡＢＬ−１由来の二本鎖ｃＤＮＡ０．１μｇの代わりにＭＡＢＬ−２由来の二本鎖ｃＤＮＡ０．１μｇを用いて増幅した点を除いて、前記１．３（１）においてＭＡＢＬ−１Ｌ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により行った。
（４）ＭＡＢＬ−２Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１に示すアダプタープライマー１、及び配列番号：４に示すＭＨＣ−Ｙ２ａプライマー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を用いた。
ｃＤＮＡの増幅は、０．２μＭのＭＫＣプライマーの代わりに０．２μＭのＭＨＣ−Ｙ２ａプライマーを用いて増幅した点を除いて、前記１．３（３）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により行った。
１．４　ＰＣＲ生成物の精製
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。
１．５　連結及び形質転換
上記のようにして調製したＭＡＢＬ−１由来マウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片約１４０ｎｇをｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）５０ｎｇと、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ユニット　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含有する反応混合液中で、１５℃にて３時間反応させ連結した。
次に、１μｌの上記連結混合液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（東洋紡社製）５０μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び氷上で２分間静置した。次いで１００μｌのＳＯＣ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を加え、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ社製）を含有するＬＢ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）寒天培地上にこの大腸菌を塗布し、３７℃にて終夜培養して大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地３ｍｌ中で３７℃にて終夜培養し、そしてこの培養物からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
こうして得られた、ハイブリドーマＭＡＢＬ−１に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌと命名した。
上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＭＡＢＬ−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドを精製ＤＮＡ断片から作製し、ｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈと命名した。
また、ハイブリドーマＭＡＢＬ−２に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドを精製ＤＮＡ断片から作製し、ｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌと命名した。
また、ハイブリドーマＭＡＢＬ−２に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドを精製ＤＮＡ断片から作製し、ｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈと命名した。
実施例２　（ＤＮＡの塩基配列の決定）
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列の決定は、自動ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）及びＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて、メーカー指定のプロトコールに従って行った。
プラスミドｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌに含まれるマウスＭＡＢＬ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：５に示す。
また、プラスミドｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈに含まれるマウスＭＡＢＬ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：６に示す。
また、プラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌに含まれるマウスＭＡＢＬ−２抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：７に示す。
また、プラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈに含まれるマウスＭＡＢＬ−２抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：８に示す。
実施例３　（ＣＤＲの決定）
Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。
このような事実に基づき、ヒトＩＡＰに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作製された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめ、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表１に示す如く決定した。
2002033072.tif 000002
実施例４　（クローン化ｃＤＮＡの発現の確認（キメラＭＡＢＬ−１抗体及びキメラＭＡＢＬ−２抗体の作製））
４．１　キメラＭＡＢＬ−１抗体発現ベクターの作製
キメラＭＡＢＬ−１抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＭＡＢＬ−１Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ１ＨをＰＣＲ法により修飾した。そしてＨＥＦ発現ベクター（国際公開公報ＷＯ９２／１９７５９参照）に導入した。
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＬＳ（配列番号：９）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＨＳ（配列番号：１０）は、各々のＶ領域のリーダー配列の最初をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｊ．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ制限酵素部位を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＭＬＡＳ（配列番号：１１）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＭＨＡＳ（配列番号：１２）は、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を有するように設計した。
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１６ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ、０．４μＭずつの各プライマー、及び８ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈ）を含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて１分間、６０℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で１０分間加熱した。
ＰＣＲ生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＧＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、そしてＬ鎖Ｖ領域については、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−Ｋに、Ｈ鎖Ｖ領域についてはＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−Ｙにそれぞれクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−Ｍ１Ｌ、ＨＥＦ−Ｍ１Ｈと命名した。
４．２　キメラＭＡＢＬ−２抗体発現ベクターの作製
ｃＤＮＡの修飾及びクローニングは、ｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈの代わりにｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈを鋳型ＤＮＡに増幅した点を除いて、前記４．１において記載したのと同じ方法により増幅及びクローニングを行い、ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−Ｍ２Ｌ、ＨＥＦ−Ｍ２Ｈと命名した。
４．３　ＣＯＳ７細胞への遺伝子導入
キメラＭＡＢＬ−１抗体及びキメラＭＡＢＬ−２抗体の一過性発現を観察するため、前記発現ベクターをＣＯＳ７細胞において試験した。
（１）キメラＭＡＢＬ−１抗体の遺伝子導入
ＨＥＦ−Ｍ１ＬとＨＥＦ−Ｍ１Ｈベクターを、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ７細胞に同時形質転換した。各ＤＮＡ（１０μｇ）と、ＰＢＳ中１×１０７細胞／ｍｌの０．８ｍｌをキュベットに加え、１．５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のＹ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に加えた。７２時間培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。
（２）キメラＭＡＢＬ−２抗体の遺伝子導入
キメラＭＡＢＬ−２抗体遺伝子の導入は、ＨＥＦ−Ｍ１ＬとＨＥＦ−Ｍ１Ｈベクターの代わりにＨＥＦ−Ｍ２ＬとＨＥＦ−Ｍ２Ｈベクターを用いた点を除いて、前記４．３（１）に記載したのと同じ方法によりＣＯＳ７細胞に同時形質転換し、回収培養上清を得た。
４．４　フローサイトメトリー
抗原への結合を測定するため、前記ＣＯＳ７細胞培養上清を用いてフローサイトメトリーを行った。ヒトＩＡＰを発現するマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞４×１０５個に、キメラＭＡＢＬ−１抗体を発現させたＣＯＳ７細胞の培養上清あるいはキメラＭＡＢＬ−２抗体を発現させたＣＯＳ７細胞の培養上清あるいはコントロールとしてヒトＩｇＧ１抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を加え、氷上にてインキュベーション及び洗浄の後、ＦＩＴＣ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ＦＡＣＳｃａｎ装置（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）にて蛍光強度を測定した。
その結果、キメラＭＡＢＬ−１抗体及びキメラＭＡＢＬ−２抗体は、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞に特異的に結合したことにより、これらのキメラ抗体がマウスモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２のそれぞれのＶ領域の正しい構造を有することが明らかとなった（図１〜３）。
実施例５　（再構成ＭＡＢＬ−１抗体及び再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）領域の作製）
５．１　再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの作製
再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖを次の様にして作製した。再構成ＭＡＢＬ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域、リンカー領域、及び再構成ＭＡＢＬ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をそれぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより、再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖを作製した。この方法を図４に模式的に示す。再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの作製のために６個のＰＣＲプライマー（Ａ〜Ｆ）を使用した。プライマーＡ、Ｃ及びＥはセンス配列を有し、プライマーＢ、Ｄ及びＦはアンチセンス配列を有する。
Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＶＨＳ（プライマーＡ、配列番号：１３）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＮｃｏＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＶＨＡＳ（プライマーＢ、配列番号：１４）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つリンカーとオーバーラップするように設計した。
リンカーのための前方プライマーＬＳ（プライマーＣ、配列番号：１５）は、リンカーのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡとオーバーラップするように設計した。リンカーのための後方プライマーＬＡＳ（プライマーＤ、配列番号：１６）は、リンカーのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡとオーバーラップするように設計した。
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＶＬＳ（プライマーＥ、配列番号：１７）は、リンカーのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにオーバーラップするように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＶＬＡＳ−ＦＬＡＧ（プライマーＦ、配列番号：１８）は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＦＬＡＧペプチドをコードする配列（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１２０４−１２１０，１９８８）、２個の転写停止コドン及びＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。
第一ＰＣＲ段階において３つの反応Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ及びＥ−Ｆを行い、そして各ＰＣＲ生成物を精製した。第一ＰＣＲから得られた３つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブルさせた。次に、プライマーＡ及びＦを加えて、再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖをコードする全長ＤＮＡを増幅した（第二ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、再構成ＭＡＢＬ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈ（実施例２を参照）、Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ（配列番号：１９）からなるリンカー領域をコードするＤＮＡ配列（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）を含んで成るプラスミドｐＳＣ−ＤＰ１、及び再構成ＭＡＢＬ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌ（実施例２を参照）をそれぞれ鋳型として用いた。
第一ＰＣＲ段階の溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１６ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（以上ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）、０．４μＭずつの各プライマー及び５ｎｇの各鋳型ＤＮＡを含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて１分間、６５℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ（３７１ｂｐ）、Ｃ−Ｄ（６３ｂｐ）、及びＥ−Ｆ（３８４ｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、第二ＰＣＲでアッセンブルした。第二ＰＣＲにおいて、鋳型として１２０ｎｇの第一ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ、２０ｎｇのＰＣＲ生成物Ｃ−Ｄ及び１２０ｎｇのＰＣＲ生成物Ｅ−Ｆ、１０μｌの１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１６ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（以上ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）を含有する９８μｌのＰＣＲ混合液を、９４℃の初期温度にて８分間そして次に９４℃にて２分間、６５℃にて２分間及び７２℃にて２分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを２回反復した後、それぞれ０．４μＭのプライマーＡ及びＦを加えた。そして９４℃の初期温度にて１分間そして次に９４℃にて１分間、６５℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱し、この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を７２℃にて７分間加熱した。
第二ＰＣＲにより生じた８４３ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＣＦＶＴ７ベクターにクローニングした。なお、本発現ベクターｐＳＣＦＶＴ７は、大腸菌ペリプラズム分泌発現系に適するｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６９，４３７９−４３８３，１９８７）を含んでいる。ＤＮＡ配列決定の後、再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐｓｃＭ１と命名した（図５を参照）。本プラスミドｐｓｃＭ１に含まれる再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２０に示す。
次に、哺乳動物細胞にて再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖを発現するベクターを作製するため、ｐｓｃＭ１ベクターをＰＣＲ法により修飾した。そして得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１発現ベクターに導入した。なお、本発現ベクターｐＣＨＯ１は、ＤＨＦＲ−□Ｅ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ　Ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）を連結することにより構築したベクターである。
ＰＣＲに使用するプライマーは、前方プライマーとしてＨ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＳａｌＩ制限酵素認識部位を有する配列番号：２１に示すＳａｌ−ＶＨＳプライマー及び後方プライマーとして第一フレームワーク配列の最後をコードするＤＮＡにハイブリダイズする配列番号：２２に示すＦＲＨ１ａｎｔｉプライマーを用いた。
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１６ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ、０．４μＭずつの各プライマー、及び８ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐｓｃＭ１）を含有し、９５℃の初期温度にて９分間そして次に９５℃にて１分間、６０℃にて１分間及び７２℃にて１分２０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ＳａｌＩ及びＭｂｏＩＩで消化し、Ｎ末端側再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ断片を得た。また、ｐｓｃＭ１ベクターをＭｂｏＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、Ｃ末端側再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ断片を得た。そして、ＳａｌＩ−ＭｂｏＩＩＤＮＡ断片及びＭｂｏＩＩ−ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１−Ｉｇｓベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯＭ１と命名した（図６を参照）。なお、本発現ベクターｐＣＨＯ１−Ｉｇｓは、哺乳動物細胞分泌発現糸に適するマウスＩｇＧ１シグナル配列（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，１９８８）を含んでいる。本プラスミドｐＣＨＯＭ１に含まれる再構成ＭＡＢＬ−１抗体一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２３に示す。
５．２　再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの作製
再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖを前記５．１に従って作製した。第一ＰＣＲにおいては、ｐＧＥＭ−Ｍ１Ｈの代わりに再構成ＭＡＢＬ−２抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈ（実施例２を参照）、及びｐＧＥＭ−Ｍ１Ｌの代わりに再構成ＭＡＢＬ−２抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌ（実施例２を参照）を使用し、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドｐｓｃＭ２を得た。本プラスミドｐｓｃＭ２に含まれる再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２４に示す。
また、ｐｓｃＭ２ベクターの修飾により再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含む哺乳動物細胞発現用ｐＣＨＯＭ２ベクターを得た。本プラスミドｐＣＨＯＭ２に含まれる再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２５に示す。
５．３　ＣＯＳ７細胞への遺伝子導入
再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの一過性発現を観察するため、ｐＣＨＯＭ２ベクターをＣＯＳ７細胞において試験した。
ｐＣＨＯＭ２ベクターを、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ７細胞に形質転換した。ＤＮＡ（１０μｇ）と、ＰＢＳ中１×１０７細胞／ｍｌの０．８ｍｌをキュベットに加え、１．５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＩＭＤＭ培養液（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に加えた。７２時間培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。
５．４　ＣＯＳ７細胞培養上清中の再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの検出
ｐＣＨＯＭ２ベクターを遺伝子導入したＣＯＳ７細胞培養上清中における再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖをウェスタンブロッティング法により確認した。
ｐＣＨＯＭ２ベクターを遺伝子導入したＣＯＳ７細胞培養上清及びコントロールとしてｐＣＨＯ１ベクターを遺伝子導入したＣＯＳ７細胞培養上清についてＳＤＳ電気泳動を行い、ＲＥＩＮＦＯＲＣＥＤ　ＮＣ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に転写した。５％スキムミルク（森永乳業社製）にてブロッキングを行い、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて洗浄後、抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を加えた。室温にてインキュベーション及び洗浄の後、アルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、室温にてインキュベーション及び洗浄後、基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加し、発色させた（図７）。
その結果、ｐＣＨＯＭ２ベクター導入ＣＯＳ７細胞培養上清中にのみＦＬＡＧペプチド特異的なタンパク質が検出され、この培養上清中に再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖが分泌されていることが明らかとなった。
５．５　フローサイトメトリー
抗原への結合を測定するため、前記ＣＯＳ７細胞培養上清を用いてフローサイトメトリーを行った。ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を発現するマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞、あるいはコントロールとしてｐＣＯＳ１ベクターを形質転換したＬ１２１０細胞２×１０５個に、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖを発現させたＣＯＳ７細胞の培養上清あるいはコントロールとしてｐＣＨＯ１ベクターを形質転換したＣＯＳ７細胞の培養上清を加え、氷上にてインキュベーション及び洗浄の後、マウス抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を加えた。再度インキュベーション及び洗浄の後、ＦＡＣＳｃａｎ装置（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）にて蛍光強度を測定した。
その結果、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖは、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞に特異的に結合したことにより、この再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖ＦｖがヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎに対するアフィニティーを有することが明らかとなった（図８〜１１）。
５．６　Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＥＬＩＳＡ
マウスモノクローナル抗体の抗原結合に対する阻害活性を指標に、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖの抗原結合活性を測定した。
１μｇ／ｍｌに調整した抗ＦＬＡＧ抗体を９６ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃にて２時間インキュベートした。洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにてブロッキングを行った。室温にてインキュベート及び洗浄後、分泌型ヒトＩＡＰ抗原遺伝子（配列番号：２６）を導入したＣＯＳ７細胞培養上清をＰＢＳにて２倍希釈したものを各ウェルに加えた。室温にてインキュベート及び洗浄後、１００ｎｇ／ｍｌに調整したビオチン化ＭＡＢＬ−２抗体５０μｌ及び順次希釈した再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ発現ＣＯＳ７細胞培養上清５０μｌを混和したものを各ウェルに加えた。室温にてインキュベート及び洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ社製）を加えた。室温にてインキュベート及び洗浄後、基質溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
その結果、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ（ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ）は、コントロールのｐＣＨＯ１導入ＣＯＳ７細胞培養上清に比較して明らかに濃度依存的にマウスＭＡＢＬ−２抗体のヒトＩＡＰ抗原への結合を阻害した（図１２）。このことから、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖは、マウスモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２のそれぞれのＶ領域の正しい構造を有することが示唆された。
５．７　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのアポトーシス誘起効果
ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞、及びコントロールとしてｐＣＯＳ１ベクターを遺伝子導入したＬ１２１０細胞、及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を用い、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖのアポトーシス誘起作用をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ　ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製）染色により検討した。
各細胞１×１０５個に、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ発現ＣＯＳ７細胞培養上清あるいはコントロールとしてｐＣＨＯ１ベクター導入ＣＯＳ７細胞培養上清を終濃度５０％で添加し、２４時間培養した。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）にて蛍光強度を測定した。
Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色による解析の結果を図１３〜１８にそれぞれ示した。ここで、図の左下の領域にあるドットは生細胞を、右下の領域はアポトーシス初期の細胞を、右上の領域はアポトーシス後期の細胞を示す。その結果、再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ（ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ）はＬ１２１０細胞においてヒトＩＡＰ抗原特異的に著しい細胞死を誘導した（図１３〜１６）。また、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞においてもコントロールに比較して著しい細胞死を誘導した（図１７〜１８）。
５．８　ＣＨＯ細胞におけるＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの発現
ＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ポリペプチド）の恒常的発現ＣＨＯ細胞株を樹立するため、ｐＣＨＯＭ２ベクターをＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。
ｐＣＨＯＭ２ベクターを、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に形質転換した。ＤＮＡ（１０μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７ｍｌを混合したものをキュベットに加え、１．５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有する核酸不含α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に加え培養した。得られたクローンについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて目的とするタンパク質の発現を確認し、発現量の高いクローンをＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの産生細胞株として選択した。１０ｎＭ　ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を含む無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して回収培養上清を得た。
５．９　ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの精製
５．８で得た一本鎖Ｆｖ発現ＣＨＯ産生株の培養上清を人工透析用カートリッジ（ＰＡＮ１３０ＳＦ、旭メディカル）を用いて約２０倍まで濃縮した。濃縮液は−２０℃で保存し、精製時解凍して用いた。
ＣＨＯ細胞培養上清から一本鎖Ｆｖの精製は、Ｂｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ハイドロキシアパタイト及びゲル濾過の三種のクロマトグラフィーにより行った。
（１）Ｂｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー
培養上清の濃縮液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて１０倍希釈し、遠心分離（１００００ｒｐｍ×３０分）により不溶物を除去した。上清を同緩衝液で平衡化したＢｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２０ｍｌ）に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中ＮａＣｌ濃度を０．１、０．２、０．３、０．５及び１．０Ｍまで段階的に上げ、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで素通り及び各溶出画分を分析し、一本鎖Ｆｖが確認された画分（０．１〜０．３Ｍ　ＮａＣｌ溶出画分）をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（アミコン）を用いて約２０倍濃縮した。
（２）ハイドロキシアパタイト
（１）の濃縮液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１０倍希釈し、ハイドロキシアパタイトカラム（２０ｍｌ、ＢｉｏＲａｄ）に添加した。６０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄後、リン酸緩衝液濃度を２００ｍＭまで直線的に上げ、カラムに吸着した蛋白質を溶出した（図１９）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各画分を分析した結果、画分Ａ及び画分Ｂに一本鎖Ｆｖが確認された。
（３）ゲル濾過
（２）の画分Ａ及びＢをそれぞれＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０を用いて濃縮し、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＧカラム（２１．５×６００ｍｍ）に添加した。クロマトグラムを図２０に示す。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、いずれも主要ピーク（ＡＩ、ＢＩ）が目的の一本鎖Ｆｖであり、ゲル濾過で分析した結果、画分Ａでは見かけ上の分子量約３６ｋＤ、画分Ｂでは同７６ｋＤに溶出された。精製した一本鎖Ｆｖ（ＡＩ、ＢＩ）を１５％−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。サンプルを還元剤添加、非添加で処理し、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に準じて電気泳動を行い、泳動後蛋白質をクマシーブリリアントブルー染色した。図２１に示すように、ＡＩ、ＢＩいずれも還元剤の添加の有無に関わらず、見かけ上の分子量約３５ｋＤに単一バンドを与えた。以上の結果から、ＡＩは一本鎖Ｆｖのモノマーで、ＢＩは一本鎖Ｆｖの非共有結合性ダイマーと考えられる。画分ＡＩ及びＢＩをＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷカラム（７．５×６０ｍｍ）を用いたゲル濾過により分析した結果、画分ＡＩはモノマーのピークのみ、画分ＢＩはダイマーのピークのみ検出された（図２２を参照）。また、ダイマー画分（画分ＢＩ）は、全一本鎖Ｆｖの約４％であった。該ダイマー画分中のダイマーは、その９０％以上が４℃で１ヶ月以上安定的に維持された。
５．１０　大腸菌細胞でのＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチド発現ベクターの構築
ＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖを大腸菌菌体内にて効率的に発現するベクターを作製するため、ｐｓｃＭ２ベクターをＰＣＲ法により修飾した。得られたＤＮＡ断片をｐＳＣＦＶＴ７発現ベクターに導入した。
ＰＣＲに使用するプライマーは、前方プライマーとしてＨ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つ開始コドン及びＮｄｅＩ制限酵素認識部位を有する配列番号：２７に示すＮｄｅ−ＶＨＳｍ０２プライマー及び後方プライマーとしてＬ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つ２個の停止コドン及びＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を有する配列番号：２８に示すＶＬＡＳプライマーを用いた。なお、前方プライマーのＮｄｅ−ＶＨＳｍ０２は大腸菌菌体内にて効率的に発現するため、Ｈ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズする部分に５カ所の点変異を含んでいる。
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　＃１、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（以上東洋紡社製）、１μＭずつの各プライマー、及び１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐｓｃＭ２）を含有し、９８℃にて１５秒間、６５℃にて２秒間及び７４℃にて３０秒間、この順序で加熱した。この温度サイクルを２５回反復した。
ＰＣＲ生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＣＦＶＴ７ベクターにクローニングした。なお、本発現ベクターｐＳＣＦＶＴ７はＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化したことによりｐｅｌＢシグナル配列が削除されている。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐｓｃＭ２ＤＥｍ０２と命名した（図２３を参照のこと）。本プラスミドｐｓｃＭ２ＤＥｍ０２に含まれるＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２９に示す。
５．１１　大腸菌細胞におけるＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの発現
ＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドを発現する大腸菌株を得るため、ｐｓｃＭ２ＤＥｍ０２ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に形質転換した。得られたクローンについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて目的とするタンパク質の発現を検討し、発現量の高いクローンをＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの産生株として選択した。
５．１２　大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの精製
形質転換して得られた大腸菌のシングルコロニーをＬＢ培地３ｍｌにて２８℃で７時間培養し、これを７０ｍｌのＬＢ培地に植え継ぎ、２８℃にて一夜培養を行った。このｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅを７ＬのＬＢ培地に植え継ぎ、ジャーファーメンターを用いて２８℃、攪拌速度３００ｒｐｍにて培養した。Ｏ．Ｄ．＝１．５のときに１ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導をかけ、その後３時間培養を行った。
培養液を遠心分離（１００００×ｇ、１０分）し、沈殿として回収した菌体に５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、超音波（ｏｕｔ　ｐｕｔ：４、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ：７０％、１分×１０回）により菌体を破砕した。この懸濁液を遠心分離（１２０００×ｇ、１０分）にかけ、沈殿として回収した封入体に５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、４％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、再度超音波処理（ｏｕｔ　ｐｕｔ：４、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ：５０％、３０秒×２）を行い、遠心分離（１２０００×ｇ、１０分）により目的蛋白質を沈殿として回収し、上清にくる夾雑蛋白質を除去した。
目的蛋白質を含んだ封入体を６Ｍ　Ｕｒｅａ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、４Ｍ　Ｕｒｅａ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００（５×９０ｃｍ、ＡＭＥＲＳＨＡＭ　ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ社製）ゲル濾過カラムに、流速５ｍｌ／分で添加し、会合している高分子量の一本鎖Ｆｖを除去した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、純度の高い画分について、Ｏ．Ｄ２８０＝０．２５になるようにゲル濾過で用いた溶媒で希釈後、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、０．５Ｍ　Ａｒｇ、２ｍＭ　還元型グルタチオン、０．２ｍＭ　酸化型グルタチオンを含む５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析を３回行うことにより、巻き戻し操作を行った。さらに０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して３回透析し、溶媒交換を行った。
わずかに含まれる分子間でＳ−Ｓ結合で架橋された高分子を分離除去するため、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（２．６×６０ｃｍ、ＡＭＥＲＳＨＡＭ　ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ社製）ゲル濾過カラムに添加した。図２４に示すように、高分子量の会合体と考えられるブロードなピークのあと、主要ピークとサブピークの２つのピークが検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析（図２１参照）及びゲル濾過の溶出位置から、主要ピークは一本鎖Ｆｖポリペプチドのモノマーであり、サブピークは非共有結合性のダイマーと考えられる。なお、形成された非共有結合性のダイマーは、全一本鎖Ｆｖポリペプチドの約４％であった。
５．１３　ＭＡＢＬ−２抗体由来の精製一本鎖Ｆｖポリペプチドのｉｎ　ｖｉｔｒｏでのアポトーシス誘起効果
ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）を用い、ＣＨＯ細胞及び大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチド（ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ）のアポトーシス誘起作用を、次の２つのプロトコールにてＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ　ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製）染色により検討した。
第一のプロトコールは、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞５×１０４個に、抗体試料を終濃度３μｇ／ｍｌで添加し、２４時間培養した。抗体試料として、実施例５．９で得たＣＨＯ細胞由来ＭＡＢＬ２一本鎖Ｆｖのモノマー及びダイマー、さらに実施例５．１２で得た大腸菌細胞由来の同モノマー及びダイマー、そしてコントロールとしてマウスＩｇＧ抗体について検討した。培養後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）にて蛍光強度を測定した。
また、第二のプロトコールは、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞５×１０４個に、抗体試料を終濃度３μｇ／ｍｌで添加し、２時間培養後に抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を終濃度１５μｇ／ｍｌで添加し、更に２２時間培養した。抗体試料として、５．９で得たＣＨＯ細胞由来ＭＡＢＬ２一本鎖Ｆｖのモノマー及びコントロールとしてマウスＩｇＧ抗体について検討した。培養後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置にて蛍光強度を測定した。
Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色による解析の結果を図２５〜３１にそれぞれ示した。その結果、ＣＨＯ細胞及び大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来一本鎖Ｆｖポリペプチドのダイマーはコントロール（図２５）と比較して著しい細胞死を誘導した（図２６、２７）が、ＣＨＯ細胞及び大腸菌細胞産生の一本鎖Ｆｖポリペプチドのモノマーのアポトーシス誘導作用は認められなかった（図２８、２９）。また、抗ＦＬＡＧ抗体の添加により、ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来一本鎖Ｆｖポリペプチドのモノマーはコントロール（図３０）と比較して著しい細胞死を誘導した（図３１）。
５．１４　ｓｃＦｖ／ＣＨＯポリペプチドのモノマー及びダイマーのヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果
（１）マウス血清ヒトＩｇＧ定量法
マウス血清中における、ヒト骨髄腫細胞が産生するヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）の定量は、以下のＥＬＩＳＡで行った。０．１％重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製、Ｌｏｔ＃７９０２）１００μｌを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化した。ブロッキングの後、段階希釈したマウス血清あるいは標品としてヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製、Ｌｏｔ＃００９１５）１００μｌを添加し、室温にて２時間インキュベーションした。洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製、Ｌｏｔ＃６２０２）１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベーションした。洗浄後、基質溶液を加え、インキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ　ＲＥＡＤＥＲ　Ｍｏｄｅｌ　３５５０（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて４０５ｎｍの吸光度を測定し、標品のヒトＩｇＧの吸光度より得られた検量線から、マウス血清中のヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）濃度を算出した。
（２）投与抗体の調製
ｓｃＦｖ／ＣＨＯポリペプチドのモノマー及びダイマーは、投与当日、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて、それぞれ０．４ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌになるように調製し、投与試料とした。
（３）ヒト骨髄腫マウスモデルの作製
ヒト骨髄腫マウスモデルは以下のように作製した。ＳＣＩＤマウス（日本クレア）を用いてｉｎ　ｖｉｖｏ継代したＫＰＭＭ２細胞（特開平７−２３６４７５号公報）を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）で３×１０７個／ｍｌになるように調製した。あらかじめ前日抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬社製、１バイアルを５ｍｌで溶解）１００μｌを皮下投与したＳＣＩＤマウス（オス、６週齢）（日本クレア）に上記ＫＰＭＭ２細胞懸濁液２００μｌ（６×１０６個／マウス）を尾静脈より注入した。
（４）抗体投与
（３）で作製したヒト骨髄腫マウスモデルに対し、ＫＰＭＭ２細胞移植後３日目より、１日２回、３日間、上記（２）で調製した投与試料、モノマーは２５０μｌ、ダイマーは４００μｌを、尾静脈より投与した。対照として、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を同様に１日２回、３日間、２００μｌ、尾静脈より投与した。両群とも、１群７匹で行った。
（５）ｓｃＦｖ／ＣＨＯポリペプチドのモノマー及びダイマーのヒト骨髄腫移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の評価
ｓｃＦｖ／ＣＨＯポリペプチドのモノマー及びダイマーのヒト骨髄腫マウスモデルの抗腫瘍効果については、当該骨髄腫細胞が産生するヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）のマウス血清中の量の変化、及び生存期間で評価した。マウス血清中のヒトＩｇＧ量の変化については、ＫＰＭＭ２細胞移植後２４日目に血清を採取し、上記（１）で述べたＥＬＩＳＡを用いてヒトＩｇＧ量を測定した。その結果、ＰＢＳ（−）投与群では、血清ヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）量が約８５００μｇ／ｍｌまで上昇しているのに対し、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマー投与群では対照群の１／１０以下と顕著に低値であり、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマーがＫＰＭＭ２細胞の増殖を非常に強く抑制していることが示された（図３２）。一方、生存期間についても図３３に示すとおり、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマー投与群ではＰＢＳ（−）投与群と比較して顕著な生存期間の延長が認められた。
以上より、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマーがヒト骨髄腫マウスモデルに対して、抗腫瘍効果を有することが示された。本発明の改変抗体であるｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマーの抗腫瘍効果は、当該改変抗体が有するアポトーシス誘起作用に基づくと考えられる。
５．１５　赤血球凝集試験
赤血球凝集試験及び赤血球凝集の判定法は、続生化学実験講座の免疫生化学研究法（日本生化学会編、東京化学同人）に準じて実施した。
健常人の血液をヘパリン処理した注射筒により採血し、ＰＢＳ（−）により３回洗浄した後、ＰＢＳ（−）にて最終濃度が２％の赤血球浮遊液を作製した。検査サンプルは、対照としてマウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社製）を用い、ＭＡＢＬ−２抗体、ＣＨＯ細胞産生の一本鎖Ｆｖポリペプチドモノマー、ダイマー、大腸菌産生の一本鎖Ｆｖポリペプチドのモノマーとダイマーを使用した。赤血球の凝集作用を検討するために、ファルコン社製のＵ底の９６ウェルプレートを使用し、上記の抗体サンプルを５０μｌ／ウェル添加した中に、２％赤血球浮遊液をさらに５０μｌ添加、混和し、３７℃で２時間インキュベーション後、４℃で一昼夜保存し、凝集を判定した。また、対照として、ＰＢＳ（−）を５０μｌ／ウェル添加し、抗体サンプルと同様にして凝集試験を行った。抗体の最終濃度は、マウスＩｇＧ、ＭＡＢＬ−２抗体は、０．０１、０．１、１、１０、１００μｇ／ｍｌ、一本鎖Ｆｖは、０．００４、０．０４、０．４、４、４０、８０μｇ／ｍｌで大腸菌産生の一本鎖Ｆｖポリペプチドのダイマーのみさらに１６０μｇ／ｍｌの用量を設定した。その結果は、下記の表２に示す通り、ＭＡＢＬ−２抗体では、０．１μｇ／ｍｌ以上で赤血球凝集が見られたのに対し、一本鎖Ｆｖポリペプチドではモノマー、ダイマー共に赤血球凝集は認められなかった。
2002033072.tif 000003
実施例６　２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む改変抗体ｓｃ（Ｆｖ）２及び種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ−２抗体ｓｃＦｖ
６．１　ＭＡＢＬ−２抗体ｓｃ（Ｆｖ）２発現プラスミドの構築
ＭＡＢＬ−２抗体由来の２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む改変抗体［ｓｃ（Ｆｖ）２］を発現するプラスミドを作製するため、前述ｐＣＨＯＭ２（ＭＡＢＬ−２抗体由来のｓｃＦｖをコードするＤＮＡを含む）を以下に示す通りＰＣＲ法により修飾し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯＭ２に導入した。
ＰＣＲに使用するプライマーは、センスプライマーとしてＥＦ１αをコードするＤＮＡにハイブリダイズするＥＦ１プライマー（配列番号：３０）を使用し、アンチセンスプライマーとしてＬ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つリンカー領域をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１９）及びＳａｌＩ制限酵素認識部位を有するＶＬＬＡＳプライマー（配列番号：３１）を使用した。
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　＃１、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、５ユニットのＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（以上東洋紡社製）、１μＭの各プライマー、及び１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＣＨＯＭ２）を含有する。ＰＣＲ溶液を９４℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間及び７４℃にて１分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３０回反復した。
ＰＣＲ生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ＳａｌＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋ベクター（東洋紡社製）にクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをＳａｌＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をＳａｌＩで消化したｐＣＨＯＭ２にＲａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ　ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製）を用いて連結した。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯＭ２（Ｆｖ）２と命名した（図３４を参照）。本プラスミドｐＣＨＯＭ２（Ｆｖ）２に含まれるＭＡＢＬ−２抗体ｓｃ（Ｆｖ）２領域の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：３２に示す。
６．２　種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ−２抗体ｓｃＦｖ発現プラスミドの作製
種々の長さのペプチドリンカーを有し、そして［Ｈ鎖］−［Ｌ鎖］（以下ＨＬ）、［Ｌ鎖］−［Ｈ鎖］（以下ＬＨ）となるようにＶ領域を連結したｓｃＦｖを、ＭＡＢＬ−２由来のＨ鎖及びＬ鎖ｃＤＮＡを鋳型として以下の通りに作製した。
ＨＬタイプのｓｃＦｖを作製するために、まずｐＣＨＯＭ２（Ｆｖ）２を鋳型としてＣＦＨＬ−Ｆ１（配列番号：３３）及びＣＦＨＬ−Ｒ２（配列番号：３４）プライマー、ＣＦＨＬ−Ｆ２（配列番号：３５）及びＣＦＨＬ−Ｒ１プライマー（配列番号：０３６）によりＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行い、５’側にリーダー配列を含むＨ鎖、及び３’側にＦＬＡＧ配列を含むＬ鎖のｃＤＮＡ遺伝子を作製した。得られたＨ鎖及びＬ鎖ｃＤＮＡを鋳型として混合し、ＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を５回繰り返すＰＣＲ反応を行い、ＣＦＨＬ−Ｆ１及びＣＦＨＬ−Ｒ１プライマーを加えてさらに３０サイクル反応することによりリンカーを含まないＨＬ−０タイプのｃＤＮＡを作製した。
ＬＨタイプのｓｃＦｖを作製するために、まずＭＡＢＬ−２のＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｍ２Ｌ及びｐＧＥＭ−Ｍ２Ｈ（特願平１１−６３５５７参照）を鋳型として、それぞれＴ７（配列番号：３７）及びＣＦＬＨ−Ｒ２（配列番号：３８）プライマー、ＣＦＬＨ−Ｆ２（配列番号：３９）及びＣＦＬＨ−Ｒ１（配列番号：４０）プライマーを用いてＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡）にて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行い、５’側にリーダー配列を含むＬ鎖、及び３’側にＦＬＡＧ配列を含むＨ鎖のｃＤＮＡ遺伝子を作製した。得られたＬ鎖及びＨ鎖ｃＤＮＡを鋳型として混合し、ＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を５回繰り返すＰＣＲ反応を行い、Ｔ７及びＣＦＬＨ−Ｒ１プライマーを加えてさらに３０サイクル反応した。この反応産物を鋳型とし、ＣＦＬＨ−Ｆ４（配列番号：４１）及びＣＦＬＨ−Ｒ１プライマーを用いて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行うことによりリンカーを含まないＬＨ−０タイプのｃＤＮＡを作製した。
こうして作製したＬＨ−０、ＨＬ−０タイプのｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ（宝酒造）処理し、ＸｈｏＩ制限酵素切断部位を含まない哺乳動物発現プラスミドＩＮＰＥＰ４にＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて導入し、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ニッポンジーン）を形質転換した。形質転換した大腸菌よりＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてプラスミドを精製した。こうしてプラスミドｐＣＦ２ＬＨ−０及びｐＣＦ２ＨＬ−０を作製した。
次に、リンカーサイズの異なる発現プラスミドを作製するためにＨＬタイプではｐＣＦ２ＨＬ−０を鋳型としてＣＦＨＬ−Ｘ３（配列番号：４２）、ＣＦＨＬ−Ｘ４（配列番号：４３）、ＣＦＨＬ−Ｘ５（配列番号：４４）、ＣＦＨＬ−Ｘ６（配列番号：４５）、又はＣＦＨＬ−Ｘ７（配列番号：４６）のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてベクター配列に相補的なＢＧＨ−１（配列番号：４７）プライマーを用いてＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行い、得られた反応産物を制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ（宝酒造）にて処理した。得られた断片をｐＣＦ２ＨＬ−０のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトにＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて導入し、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換した大腸菌よりＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミドｐＣＦ２ＨＬ−３、ｐＣＦ２ＨＬ−４、ｐＣＦ２ＨＬ−５、ｐＣＦ２ＨＬ−６及びｐＣＦ２ＨＬ−７を作製した。更にＣＯＳ７細胞での一過的発現に用いる発現プラスミドを作製するために、ｐＣＦ２ＨＬ−０、ｐＣＦ２ＨＬ−３、ｐＣＦ２ＨＬ−４、ｐＣＦ２ＨＬ−５、ｐＣＦ２ＨＬ−６及びｐＣＦ２ＨＬ−７を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造）にて処理し、約８００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動によるゲルからの回収により精製した。得られた断片を哺乳動物細胞発現プラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩサイトにＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈを用いて導入し、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（東洋紡）を形質転換した。形質転換した大腸菌よりＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミドＣＦ２ＨＬ−０／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＨＬ−３／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＨＬ−４／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＨＬ−５／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＨＬ−６／ｐＣＯＳ１及びＣＦ２ＨＬ−７／ｐＣＯＳ１を作製した。代表的な例として、プラスミドＣＦ２ＨＬ−０／ｐＣＯＳ１の構造を図３５に示し、これに含まれるＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−０＞の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：４８に示す。また各プラスミドのリンカー部分の塩基配列及びアミノ酸配列を図３６に示す。
また、リンカーサイズの異なるＬＨタイプの発現プラスミドを作製するため、ｐＣＦ２ＬＨ−０を鋳型としてＣＦＬＨ−Ｘ３（配列番号：４９）、ＣＦＬＨ−Ｘ４（配列番号：５０）、ＣＦＬＨ−Ｘ５（配列番号：５１）、ＣＦＬＨ−Ｘ６（配列番号：５２）又はＣＦＬＨ−Ｘ７（配列番号：５３）のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてベクター配列に相補的なＢＧＨ−１プライマーを用いてＫＯＤポリメラーゼにて９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０回繰り返すＰＣＲ反応を行い、得られた反応産物を制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩにて処理した。得られた断片をｐＣＦ２ＬＨ−０のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトにＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈを用いて導入し、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（東洋紡）を形質転換した。形質転換した大腸菌よりＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミドｐＣＦ２ＬＨ−３、ｐＣＦ２ＬＨ−４、ｐＣＦ２ＬＨ−５、ｐＣＦ２ＬＨ−６及びｐＣＦ２ＬＨ−７を作製した。更にＣＯＳ７細胞での一過的発現に用いる発現プラスミドを作製するために、ｐＣＦ２ＬＨ−０、ｐＣＦ２ＬＨ−３、ｐＣＦ２ＬＨ−４、ｐＣＦ２ＬＨ−５、ｐＣＦ２ＬＨ−６及びｐＣＦ２ＬＨ−７を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造）にて処理し、約８００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動によるゲルからの回収により精製した。得られた断片を哺乳動物細胞発現プラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩサイトにＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈを用いて導入し、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（東洋紡）を形質転換した。形質転換した大腸菌よりＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔにてプラスミドを精製した。こうして、発現プラスミドＣＦ２ＬＨ−０／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＬＨ−３／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＬＨ−４／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＬＨ−５／ｐＣＯＳ１、ＣＦ２ＬＨ−６／ｐＣＯＳ１及びＣＦ２ＬＨ−７／ｐＣＯＳ１を作製した。代表的な例として、プラスミドＣＦ２ＬＨ−０／ｐＣＯＳ１の構造を図３７に示し、これに含まれるＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＬＨ−０＞の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：５４に示す。また各プラスミドのリンカー部分の塩基配列及びアミノ酸配列を図３８に示す。
６．３　ＣＯＳ７細胞におけるｓｃＦｖ及びｓｃ（Ｆｖ）２の発現
（１）有血清培地での培養上清の調製
ＨＬタイプ、ＬＨタイプｓｃＦｖ及びｓｃ（Ｆｖ）２の発現のために、ＣＯＳ７細胞（ＪＣＲＢ９１２７、ヒューマンサイエンス振興財団）での一過的発現を行った。ＣＯＳ７細胞は１０％牛胎児血清（ＩＩｙＣｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）にて、３７℃の炭酸ガス恒温槽中で経代培養した。
６．２で構築したＣＦ２ＨＬ−０，３〜７／ｐＣＯＳ１、もしくはＣＦ２ＬＨ−０，３〜７／ｐＣＯＳ１又はｐＣＨＯＭ２（Ｆｖ）２ベクターを、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした。
ＤＮＡ（１０μｇ）とＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，５ｍＭ　ＢＥＳ（ＳＩＧＭＡ社））培地中２×１０７細胞／ｍｌの０．２５ｍｌをキュベットに加え、１０分間静置の後に０．１７ｋＶ、９５０μＦの容量にてパルスを与えた。１０分間静置の後、エレクトロポレーションされた細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に混合し、７５ｃｍ３フラスコに加えた。７２時間培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、更に０．２２μｍボトルトップフィルター（ＦＡＬＣＯＮ）にて濾過し、これを培養上清（ＣＭ）とした。
（２）無血清培地での培養上清の調製
上記（１）と同様の方法でトランスフェクションした細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に加え７５ｃｍ３フラスコにて一夜培養した後、培養上清を捨て、ＰＢＳにて洗浄後、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を添加した。７２時間培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、更に０．２２μｍボトルトップフィルターにて濾過し、ＣＭを得た。
６．４　ＣＯＳ７　ＣＭ中のｓｃＦｖ及びｓｃ（Ｆｖ）２の検出
前記６．３（２）で調製したＣＯＳ７のＣＭ中における種々のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ（Ｆｖ）２のポリペプチドを下記の通りにウェスタンブロッティング法により検出した。
各ＣＯＳ７　ＣＭについてについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＲＥＩＮＦＯＲＣＥＤ　ＮＣ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に転写した。５％スキムミルク（森永乳業社製）にてブロッキングを行い、ＴＢＳにて洗浄後、抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を加えた。室温にてインキュベーション及び洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を加え、室温にてインキュベーション及び洗浄後、基質溶液を添加し、発色させた（図３９）。
６．５　フローサイトメトリー
ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ（Ｆｖ）２のヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ　Ａｓｓｏｓｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）抗原への結合を測定するため、前記６．３（１）にて調製したＣＯＳ７細胞培養上清を用いてフローサイトメトリーを行った。ヒトＩＡＰを発現するマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞２×１０５個に、実施例６．３（１）で得られた培養上清あるいは対照としてＣＯＳ７細胞の培養上清を加え、氷上にてインキュベーション及び洗浄の後、１０μｇ／ｍｌのマウス抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を加えた。再度インキュベーション及び洗浄の後、ＦＡＣＳｃａｎ装置（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、各ＣＯＳ７培養上清中の種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ（Ｆｖ）２は、ヒトＩＡＰに対して高い親和性を有することが示された（図４０ａ及びｂ）。
６．６　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのアポトーシス誘起効果
前記１．３（１）にて調製したＣＯＳ７細胞培養上清について、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）に対するアポトーシス誘導作用をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ　ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製）染色により検討した。
ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞５×１０４個に、各ベクターを形質転換したＣＯＳ７細胞培養上清あるいはコントロールとしてＣＯＳ７細胞培養上清を終濃度１０％で添加し、２４時間培養した。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ／ＰＩ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、ＣＯＳ７　ＣＭ中のｓｃＦｖ＜ＨＬ３，４，６，７、ＬＨ３，４，６，７＞及びｓｃ（Ｆｖ）２はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対して顕著な細胞死を誘導した。得られた結果を図４１にそれぞれ示す。
６．７　ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ（Ｆｖ）２のＣＨＯ細胞用発現ベクターの構築
前記ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ（Ｆｖ）２を培養上清から精製することを目的として、これらをＣＨＯ細胞にて発現させるための発現ベクターを以下のように構築した。
前記１．２にて調製したｐＣＦ２ＨＬ−０，３〜７及びｐＣＦ２ＬＨ−０，３〜７のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＣＨＯ細胞用発現ベクターｐＣＨＯ１のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位にＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈを用いて導入し、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを形質転換した。形質転換した大腸菌よりＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてプラスミドを精製した。このようにして発現プラスミドｐＣＨＯＭ２ＨＬ−０，３〜７及びｐＣＨＯＭ２ＬＨ−０，３〜７を作製した。
６．８　ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−０，３〜７＞、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＬＨ−０，３〜７＞及びｓｃ（Ｆｖ）２発現ＣＨＯ細胞の作製並びにその培養上清の調製
前記１．７にて構築した発現プラスミドｐＣＨＯＭ２ＨＬ−０，３〜７及びｐＣＨＯＭ２ＬＨ−０，３〜７並びにｐＣＨＯＭ２（Ｆｖ）２ベクターを以下の通りにＣＨＯ細胞に形質転換し、各改変抗体を恒常的に発現するＣＨＯ細胞を作製した。その代表的な例としてＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞、ｓｃ（Ｆｖ）２を恒常的に発現するＣＨＯ細胞の作製を下記に示す。
発現プラスミドｐＣＨＯＭ２ＨＬ−５及びｐＣＨＯＭ２（Ｆｖ）２を制限酵素ＰｖｕＩにて消化して直鎖状にし、これらをＧｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。ＤＮＡ（１０μｇ）と、ＰＢＳ中１×１０７細胞／ｍｌの０．７５ｍｌをキュベットに加え、１．５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有する核酸含有α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に加え培養した。一夜培養後、培養上清を除去し、ＰＢＳにてリンスした後、１０％のウシ胎児血清を含有する核酸不含α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を加え培養した。約２週間培養後、ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を終濃度１０ｎＭで含有する培地で更に培養し、その後５０ｎＭ、そして１００ｎＭと濃度を順次上げて培養を続けた。こうして得られた細胞をローラーボトル中で無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、更に０．２０μｍフィルターにて濾過し、それぞれのＣＭを得た。
同様にして、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−０，３，４，６，７＞及び＜ＬＨ−０，３，４，５，６，７＞を恒常的に発現するＣＨＯ細胞及びそれらのＣＭを得た。
６．９　ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２の精製
下記の２種類の精製法により前記６．８で得られたＣＭからＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞及びｓｃ（Ｆｖ）２の精製を行った。
＜精製法１＞　ＨＬ−５及びｓｃ（Ｆｖ）２を、そのポリペプチドのＣ末端のＦｌａｇ配列を利用した抗Ｆｌａｇ抗体アフィニティカラムクロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて精製した。１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）で平衡化した抗Ｆｌａｇ　Ｍ２　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ）で作成したカラム（７．９ｍｌ）に前記６．８で得られたＣＭ（１Ｌ）を添加し、ＴＢＳでカラムを洗浄後、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ３．５でｓｃＦｖをカラムから溶出させた。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、ｓｃＦｖの溶出を確認した。ｓｃＦｖ画分を終濃度が０．０１％となるようにＴｗｅｅｎ２０を加え、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で濃縮した。濃縮液を１５０ｍＭ　ＮａＣｌ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ　酢酸緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷカラム（７．５×６００ｍｍ）にかけた。流速０．４ｍｌ／ｍｉｎでｓｃＦｖは２８０ｎｍの吸収で検出した。ＨＬ−５は主要ピークとしてダイマーの位置に、ｓｃ（Ｆｖ）２はモノマーの位置にそれぞれ溶出された。
＜精製法２＞　ＨＬ−５及びｓｃ（Ｆｖ）２をイオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト及びゲル濾過の三工程で精製した。イオン交換クロマトグラフィーでは、ＨＬ−５ではＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗカラム（ファルマシア）をｓｃ（Ｆｖ）２ではＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗカラムを用い、第二工程以降はＨＬ−５とｓｃ（Ｆｖ）２で同じ条件を用いた。
（第一工程）ＨＬ−５
ＨＬ−５のＣＭは、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ９．０で２倍希釈した後に、１Ｍ　ＴｒｉｓでｐＨを９．０に調整した。この後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ８．５で平衡化したＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗカラムにかけ、同緩衝液中０．１Ｍから０．５５ＭまでのＮａＣｌの直線濃度勾配でカラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、ＨＬ−５を含む画分を集め、第二工程のハイドロキシアパタイトにかけた。
（第一工程）ｓｃ（Ｆｖ）２
ｓｃ（Ｆｖ）２のＣＭは、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ　酢酸緩衝液、ｐＨ５．５で２倍希釈した後に、１Ｍ酢酸でｐＨを５．５に調整した。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ　酢酸緩衝液、ｐＨ５．５で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐａｈｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗカラムにかけ、同緩衝液中、ＮａＣｌ濃度を０から０．５Ｍまで直線的に上げ、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、ｓｃ（Ｆｖ）２を含む画分を集め、第二工程のハイドロキシアパタイトにかけた。
（第二工程）ＨＬ−５及びｓｃ（Ｆｖ）２のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
第一工程で得られたＨＬ−５画分及びｓｃ（Ｆｖ）２画分をそれぞれ０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ、タイプＩ）に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、リン酸緩衝液濃度を０．５Ｍまで直線的に上げ、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した。各画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析し、所望のポリペプチドが含まれる画分を集めた。
（第三工程）ＨＬ−５及びｓｃ（Ｆｖ）２のゲル濾過
第二工程で得られた各画分をそれぞれＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で濃縮し、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　酢酸緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（２．６×６０ｃｍ、ファルマシア）にかけた。ＨＬ−５はダイマーに位置に、ｓｃ（Ｆｖ）ＨＬ−５及びｓｃ（Ｆｖ）２はモノマーの位置にそれぞれ主要ピークとして溶出された。
いずれの精製法においても、ＨＬ−５モノマーは殆ど検出されなかったことから、一本鎖Ｆｖのリンカーのアミノ酸残基数が５個程度であれば、効率的に一本鎖Ｆｖのダイマーが形成できることが判明した。ＨＬ−５ダイマーおよびｓｃ（Ｆｖ）２はいずれも精製された後も４℃で１ヶ月間安定的に維持された。
６．１０　精製ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２の抗原結合活性評価
精製されたＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２のヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ　Ａｓｓｏｓｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）抗原への結合を測定するため、フローサイトメトリーを行った。ヒトＩＡＰを発現するマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）又は対照としてｐＣＯＳ１ベクターをトランスフェクションしたＬ１２１０細胞（ｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０）２×１０５個に、１０μｇ／ｍｌの精製ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー、ＭＡＢＬ２−ｓｃ（Ｆｖ）２、陽性対照としてモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２、陰性対照としてマウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、氷上にてインキュベーション及び洗浄の後、１０μｇ／ｍｌのマウス抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を加えた。再度インキュベーション及び洗浄の後、ＦＡＣＳｃａｎ装置（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）にて蛍光強度を測定した。
その結果、精製ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びＭＡＢＬ２−ｓｃ（Ｆｖ）２はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に特異的に結合したことにより、ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２がヒトＩＡＰに対して高い親和性を有することが示された（図４２）。
６．１１　精製ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２のｉｎ　ｖｉｔｒｏアポトーシス誘起効果
精製したＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２について、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）及びヒト白血病細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭに対するアポトーシス誘導作用をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ　ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製）染色により検討した。
ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞５×１０４個あるいはＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞１×１０５個に、精製ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー、ＭＡＢＬ２−ｓｃ（Ｆｖ）２、陽性対照としてモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２、陰性対照としてマウスＩｇＧを様々な濃度で添加し、２４時間培養した。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎ装置（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びＭＡＢＬ２−ｓｃ（Ｆｖ）２はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭの両細胞に対して濃度依存的に細胞死を誘導した（図４３）。この結果、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びＭＡＢＬ２−ｓｃ（Ｆｖ）２は、もとのモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２と比較して改善されたアポトーシス誘導作用を有することが示された。
６．１２　精製ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２の赤血球凝集試験
実施例５．１５に従って、種々の濃度の精製したｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２の血液凝集試験を実施した。
モノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２（陽性対照）では血液凝集が起こるのに対して、一本鎖抗体のＭＡＢＬ２−ｓｃ（Ｆｖ）２及びＭＡＢＬ２−ｓｃ（Ｆｖ）＜ＨＬ５＞は凝集しなかった。また、ＭＡＢＬ−２抗体を用いた緩衝液の差もほとんどみられなかった。その結果を下記の表３に示す。
2002033072.tif 000004
６．１３　精製ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２のヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果
実施例６．８及び６．９にて作製、精製したｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２について、その抗腫瘍効果を試験した。具体的には実施例５．１４（３）で作製したヒト骨髄腫マウスモデルを用いて、マウス血清中における、ヒト骨髄腫細胞が産生するＭタンパク質をＥＬＩＳＡにより定量し、併せてマウスの生存日数を記録した。そして、血清中のＭタンパク質量の変化および生存日数により、ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２の抗腫瘍効果を評価した。
なお、本試験においてＨＬ−５及びｓｃ（Ｆｖ）２は、ｖｅｈｉｃｌｅ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．０２％Ｔｗｅｅｎ及び２０ｍＭ　酢酸緩衝液，ｐＨ６．０）中の０．０１、０．１又は１ｍｇ／ｍｌの溶液として、投与量が０．１、１または１０ｍｇ／ｋｇになるようにマウスに投与した。また、対照はｖｅｈｉｃｌｅのみを投与した。
ヒト骨髄腫細胞移植後２６日目に血清を採取し、血清中のＭタンパク質量をＥＬＩＳＡにより実施例５．１４に従って測定した。その結果、ＨＬ−５投与群及びダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２投与群共に、血清中のＭタンパク質量が投与量依存的に減少していた（図４４を参照）。また、その生存期間については、ＨＬ−５投与群（図４５）及びｓｃ（Ｆｖ）２投与群（図４６）共に対照（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）と比較して有意な生存期間の延長が観察された。これらの結果は、本発明のＨＬ−５及びｓｃ（Ｆｖ）２がインビボにおいても優れた抗腫瘍作用を有することを示している。
実施例７　ヒトＭＰＬに対するヒト抗体１２Ｂ５のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖ
ヒトＭＰＬに対するヒトモノクローナル抗体１２Ｂ５のＶ領域をコードするＤＮＡを次のようにして構築した。
７．１　１２Ｂ５Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の構築
ヒトＭＰＬに結合するヒト抗体１２Ｂ５Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子は、該遺伝子の塩基配列（配列番号５５）を用いて、その５’末端にヒト抗体遺伝子由来のリーダー配列（配列番号５６）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；２６：６３−６９）を連結させることで設計した。設計した塩基配列はそれぞれ１５ｂｐのオーバーラップ配列を持つように４本のオリゴヌクレオチド（１２Ｂ５ＶＨ−１、１２Ｂ５ＶＨ−２、１２Ｂ５ＶＨ−３、１２Ｂ５ＶＨ−４）に分割し、１２Ｂ５ＶＨ−１（配列番号５７）及び１２Ｂ５ＶＨ−３（配列番号：５９）はセンス方向で、１２Ｂ５ＶＨ−２（配列番号：５８）及び１２Ｂ５ＶＨ−４（配列番号：６０）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンブリさせた後、外側プライマー（１２Ｂ５ＶＨ−Ｓ及び１２Ｂ５ＶＨ−Ａ）を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、１２Ｂ５ＶＨ−Ｓ（配列番号：６１）は前方プライマーでリーダー配列の５’末端にハイブリダイズし、且つＨｉｎｄ　ＩＩＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また１２Ｂ５ＶＨ−Ａ（配列番号：６２）は後方プライマーでＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードする塩基配列にハイブリダイズし、且つスプライスドナー配列ならびにＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ　Ｇｏｌｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０８ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（以上ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）、２．５ピコモル［ｐ　ｍｏｌｅ］ずつの合成オリゴヌクレオチド１２Ｂ５ＶＨ−１〜４を含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間のサイクルを２回反復した後、１００ｐｍｏｌｅずつの外側プライマー１２Ｂ５ＶＨ−Ｓ及び１２Ｂ５ＶＨ−Ａを加え、さらに９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
ＰＣＲ生成物は１．５％低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ社製）を用い精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し、ヒトＨ鎖発現ベクターＨＥＦ−ｇＹ１にクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇＹ１と命名した。
さらに、ＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇＹ１を制限酵素ＥｃｏＲＩならびにＢａｍＨＩで消化し、１２Ｂ５ＶＨをコードする遺伝子を調製した後、ヒトＦａｂＨ鎖発現ベクターｐＣＯＳ−Ｆｄに挿入しｐＦｄ−１２Ｂ５Ｈを得た。なお、ヒトＦａｂＨ鎖発現ベクターはヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域と定常領域をコードする遺伝子間に存在するイントロン領域ならびにヒトＨ鎖定常領域の一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号６３）をＰＣＲ法を用い増幅した後、動物細胞発現ベクターｐＣＯＳ１に挿入することで構築したベクターである。ヒトＨ鎖定常領域はＨＥＦ−ｇＹ１を鋳型とし、上記と同様の条件下にて遺伝子の増幅を行い、前方プライマーとしてイントロン１の５’端の配列とハイブリダイズし、且つＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を有するように設計したＧ１ＣＨ１−Ｓ（配列番号６４）を、後方プライマーとしてヒトＨ鎖定常領域ＣＨ１ドメインの３’端のＤＮＡにハイブリダイズし、且つヒンジ領域の一部をコードする配列、二個の停止コドンおよびＢｇｌ　ＩＩ制限酵素認識部位を有するように設計したＧ１ＣＨ１−Ａ（配列番号６５）を用いた。
プラスミドＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇＹ１及びｐＦｄ−１２Ｂ５Ｈに含まれる再構成１２Ｂ５Ｈ鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：６６に示す。
７．２　１２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の構築
ヒトＭＰＬに結合するヒト抗体１２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子は、該遺伝子の塩基配列（配列番号６７）を用い、その５’末端にヒト抗体遺伝子３Ｄ６（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９９０：１８；４９２７）由来のリーダー配列（配列番号６８）を連結させることで設計した。設計した塩基配列は上記と同様にそれぞれ１５ｂｐのオーバーラップ配列を持つように４本のオリゴヌクレオチド（１２Ｂ５ＶＬ−１、１２Ｂ５ＶＬ−２、１２Ｂ５ＶＬ−３、１２Ｂ５ＶＬ−４）に分割し、それぞれ合成した。１２Ｂ５ＶＬ−１（配列番号：６９）及び１２Ｂ５ＶＬ−３（配列番号：７１）はセンス配列、１２Ｂ５ＶＬ−２（配列番号：７０）及び１２Ｂ５ＶＬ−４（配列番号：７２）はアンチセンス配列を有し、各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンブリさせた後、外側プライマー（１２Ｂ５ＶＬ−Ｓ及び１２Ｂ５ＶＬ−Ａ）を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、１２Ｂ５ＶＬ−Ｓ（配列番号：７３）は前方プライマーでリーダー配列の５’末端にハイブリダイズし、且つＨｉｎｄ　ＩＩＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また１２Ｂ５ＶＬ−Ａ（配列番号：７４）は後方プライマーでＬ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードする塩基配列にハイブリダイズし、且つスプライスドナー配列ならびにＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応は上記と同様に行い、ＰＣＲ生成物は１．５％低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ社製）を用い精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し、ヒトＬ鎖発現ベクターＨＥＦ−ｇＫにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇＫと命名した。本プラスミドＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇＫに含まれる再構成１２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：７５に示す。
７．３　再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の作製
再構成１２Ｂ５抗体一本鎖Ｆｖは１２Ｂ５ＶＨ−リンカー−１２Ｂ５ＶＬの順とし、そのＣ末端には検出及び精製を容易にするためにＦＬＡＧ配列（配列番号：７６）を付加することで設計した。さらに、リンカー配列は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３の１５アミノ酸からなるリンカー配列を用い、再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｂ５）を構築した。
（１）１５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの作製
１５アミノ酸からなるリンカーを用いた再構成１２Ｂ５抗体一本鎖Ｆｖをコードする遺伝子は１２Ｂ５Ｈ鎖Ｖ領域、リンカー領域、及び１２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域をそれぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。この方法を図４７に模式的に示す。再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの作製のために６個のＰＣＲプライマー（Ａ〜Ｆ）を使用した。プライマーＡ、Ｃ及びＥはセンス配列を有し、プライマーＢ、Ｄ及びＦはアンチセンス配列を有する。
Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマー１２Ｂ５−Ｓ（プライマーＡ、配列番号：７７）は、Ｈ鎖リーダー配列の５’末端にハイブリダイズし且つＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＨｕＶＨＪ３（プライマーＢ、配列番号：７８）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズするように設計した。
リンカーのための前方プライマーＲＨｕＪＨ３（プライマーＣ、配列番号：７９）は、リンカーのＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡとオーバーラップするように設計した。リンカーのための後方プライマーＲＨｕＶＫ１（プライマーＤ、配列番号：８０）は、リンカーのＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡとオーバーラップするように設計した。
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＨｕＶＫ１．２（プライマーＥ、配列番号：８１）はＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズするように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマー１２Ｂ５Ｆ−Ａ（プライマーＦ、配列番号：８２）は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＦＬＡＧペプチドをコードする配列（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１２０４−１２１０，１９８８）、２個の転写停止コドン及びＮｏｔＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。
第一ＰＣＲ段階において３つの反応Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ及びＥ−Ｆを行い、そして第一ＰＣＲから得られた３つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた。次に、プライマーＡ及びＦを加えて、１５アミノ酸からなるリンカーを用いた再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖをコードする全長ＤＮＡを増幅した（第二ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、再構成１２Ｂ５Ｈ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇＹ１（実施例７．１を参照）、Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒからなるリンカー領域をコードするＤＮＡ配列（配列番号：８３）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）を含んで成るプラスミドｐＳＣＦＶＴ７−ｈＭ２１（ヒト型化ＯＮＳ−Ｍ２１抗体）（Ｏｈｔｏｍｏ，Ｔ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１８（１９９８），４３１１−４３１６）、及び再構成１２Ｂ５Ｌ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇＫ（実施例７．２を参照）をそれぞれ鋳型として用いた。
第一ＰＣＲ段階の溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＰＣＲ　Ｇｏｌｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０８ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（以上ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）、１００ｐｍｏｌｅずつの各プライマー及び１００ｎｇの各鋳型ＤＮＡを含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ、及びＥ−Ｆは第二ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいて、鋳型として１μｌの第一ＰＣＲ反応物Ａ−Ｂ、０．５μｌのＰＣＲ反応物Ｃ−Ｄ及び１μｌのＰＣＲ反応物Ｅ−Ｆ、１０μｌの１０×ＰＣＲＧｏｌｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０８ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（以上ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）を含有する９８μｌのＰＣＲ混合液を、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて２分間、６５℃にて２分間及び７２℃にて２分間のサイクルを２回反復した後、それぞれ１００ｐｍｏｌｅずつのプライマーＡ及びＦを加えた。そして９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を７２℃にて５分間加熱した。
第二ＰＣＲにより生じたＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１ベクターおよびｐＣＯＳ１ベクター（特願平８−２５５１９６）にクローニングした。なお、本発現ベクターｐＣＨＯ１は、ＤＨＦＲ−ΔＥ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ　Ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）を連結することにより構築したベクターである。ＤＮＡ配列決定の後、再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｂ５及びｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｂ５と命名した。本プラスミドｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｂ５及びｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｂ５に含まれる再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：８４に示す。
７．４　動物細胞を用いた各１２Ｂ５抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ）及び一本鎖Ｆｖポリペプチドの発現
１２Ｂ５抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ）及び１２Ｂ５抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ポリペプチド）はＣＯＳ−７細胞又はＣＨＯ細胞を用い発現させた。
ＣＯＳ−７細胞を用いた一過的な発現は次のようにして行った。すなわち、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。１２Ｂ５抗体（ＩｇＧ）の発現には前述の発現ベクターＨＥＦ−１２Ｂ５Ｈ−ｇＹ１及びＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇＫ各１０μｇずつを、１２Ｂ５Ｆａｂ断片の発現にはｐＦｄ−１２Ｂ５ＨとＨＥＦ−１２Ｂ５Ｌ−ｇＫ各１０μｇずつを、一本鎖Ｆｖの発現にはｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｂ５（１０μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＯＳ−７細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）０．８ｍｌに混合し、キュベットに加え、１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に加え培養した。終夜培養後、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、さらに無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ培地を加え、さらに２日間培養した。培養上清を遠心し細胞破砕物を除去した後、０．２２μｍのフィルターを通すことで調製した。
また、１２Ｂ５抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ポリペプチド）の恒常的発現ＣＨＯ細胞株を樹立するため、ｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｂ５発現ベクターを下記のようにＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。
すなわち、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入した。制限酵素ＰｖｕＩで消化し直鎖状にしたＤＮＡ（１００μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．８ｍｌを混合したものをキュベットに加え氷中で１０分間静置した後、１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に加え培養した。培養２日後に５ｎＭ　メトトレキサート（ＳＩＧＭＡ社製）ならびに１０％ウシ胎児血清を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）にて培養した。得られたクローンについて発現量の高いクローンを１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの産生細胞株として選択した。５ｎＭメトトレキサート（ＳＩＧＭＡ社製）を含む無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去して培養上清を得た。
７．５　ＣＨＯ細胞産生の１２Ｂ５由来の一本鎖Ｆｖの精製
７．４で得られた１２Ｂ５一本鎖Ｆｖ発現ＣＨＯ産生株の培養上清からの精製は、抗ＦＬＡＧ抗体カラム及びゲル濾過カラムにより行った。
（１）抗ＦＬＡＧ抗体カラム
培養上清は、ＰＢＳで平衡化した抗ＦＬＡＧ　Ｍ２アフィニティーゲル（ＳＩＧＭＡ社製）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）でカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出画分は、溶出後直ちに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶出画分を分析し、一本鎖Ｆｖが確認された画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮した。
（２）ゲル濾過
（１）の濃縮液は、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（１０×３００ｍｍ、ＡＭＥＲＳＨＡＭ　ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ社製）に添加した。
ｓｃ１２Ｂ５は２つのピーク（Ａ、Ｂ）に分かれて溶出した（図４８を参照）。画分Ａ、Ｂを１４％−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。サンプルを還元剤添加、非添加で処理し、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に準じて電気泳動を行い、泳動後蛋白質をクマシーブリリアントブルー染色した。図４９に示すように、画分Ａ、Ｂいずれも還元剤の添加の有無に関わらず、見かけ上の分子量約３１ｋＤに単一バンドを与えた。画分Ａ及びＢをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００　ＰＣ３．２／３０（３．２×３００ｍｍ、ＡＭＥＲＳＨＡＭ　ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ社製）を用いたゲル濾過により分析した結果、画分Ａでは見かけ上の分子量約４４ｋＤ、画分Ｂでは同２２ｋＤに溶出された（図５０ａ及びｂを参照）。以上の結果から、画分Ａはｓｃ１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの非共有結合性ダイマーで、Ｂはモノマーである。
７．６　各種一本鎖ＦｖのＴＰＯ様アゴニスト活性の測定
ヒトＴＰＯ受容体（ＭＰＬ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞（ＢａＦ／ｍｐｌ）に対する増殖活性を測定することによって、抗ＭＰＬ一本鎖抗体のＴＰＯ様活性を評価した。ＢａＦ／Ｍｐｌ細胞を、１％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）で２回洗浄したのち、５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度になるように培地に懸濁した。抗ＭＰＬ一本鎖抗体またはヒトＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を培地で適当に希釈し、細胞懸濁液５０μｌに抗体またはヒトＴＰＯ希釈液５０μｌを加えて９６穴マイクロウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に分注し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度：５％）で２４時間培養した。培養後、ＷＳＴ−８試薬（生細胞数測定試薬ＳＦ：ナカライテスク社製）を１０μｌ加え、直後に蛍光吸光光度計ＳＰＥＣＴＲＡ　Ｆｌｕｏｒ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて測定波長４５０ｎｍ、対照波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度：５％）で２時間インキュベートした後、ＳＰＥＣＴＲＡ　Ｆｌｕｏｒを用いて再度測定波長４５０ｎｍ、対照波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。ＷＳＴ−８試薬は生細胞数に応じて波長４５０ｎｍの発色反応を呈することから、２時間の吸光度変化を指標にＢａＦ／Ｍｐｌ増殖活性を次のように算出したＥＤ５０値により評価した。先ず、縦軸を吸光度、横軸を抗体濃度とし、その増殖反応曲線がプラトーに達した吸光度を反応率１００％とした。反応率５０％付近の数値に基づく直線近似により近似式を得て、これから反応率５０％となる抗体濃度を算出し、これをＥＤ５０値とした。
各種１２Ｂ５抗体分子を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清を用い、ＭＰＬに対するアゴニスト活性を測定した結果、図５１に示すように抗原結合部位が二価である１２Ｂ５　ＩｇＧでは濃度依存的に吸光度の上昇が認められＴＰＯ様のアゴニスト活性を示したのに対し（ＥＤ５０；２９ｎＭ）、抗原結合部位が一価である１２Ｂ５Ｆａｂのアゴニスト活性は非常に弱いものであった（ＥＤ５０；３４，７２４ｎＭ）。それに対し、Ｆａｂと同様に抗原結合部位が一価である一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｂ５）においてはＥＤ５０値が７５ｎＭと強いアゴニスト活性が認められた。しかしながら、一本鎖ＦｖではＨ鎖、Ｌ鎖各可変領域は非共有結合で介合しているために、溶液中で各可変領域が解離し他の分子の可変領域と介合し二量体等の多量体を形成することが知られている。そこで、ゲル濾過を用い精製ｓｃ１２Ｂ５の分子量を測定した結果、確かに単量体（モノマー）と二量体（ダイマー）と考えられる分子が認められた（図４８を参照）。続いて、モノマーとダイマーのｓｃ１２Ｂ５をそれぞれ単離し（図５０を参照）、それらのＭＰＬに対するアゴニスト活性を測定した結果、図５１及び５２に示すようにｓｃ１２Ｂ５モノマーではＥＤ５０値が４４３８．７ｎＭとＣＯＳ−７細胞の培養上清を用いた結果に比べ、アゴニスト活性の減弱が確認された。それに対し、二価の抗原結合部位を持つ一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｂ５ダイマー）では一価のｓｃ１２Ｂ５に対し約４００倍強いアゴニスト活性を示した（ＥＤ５０；１０．１ｎＭ）。さらに、二価の一本鎖ＦｖではヒトＴＰＯならびに１２Ｂ５ＩｇＧのアゴニスト活性と同等もしくはそれ以上のアゴニスト活性を示した。
実施例８　（ヒトＭＰＬに対するヒト抗体１２Ｅ１０可変領域をコードする遺伝子の構築）
ヒトＭＰＬに対するヒトモノクローナル抗体１２Ｅ１０の可変領域をコードするＤＮＡを次のようにして構築した。
８．１　１２Ｅ１０Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子の構築
ヒトＭＰＬに結合するヒト抗体１２Ｅ１０Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子はＷＯ９９／１０４９４に記載のアミノ酸配列（配列番号８５）を基に配列番号８６に示す塩基配列を設計した。さらに、その５’端にヒト抗体遺伝子由来のリーダー配列（配列番号８７）（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０６２２５２）を連結させることで全長の塩基配列を設計した。設計した塩基配列はそれぞれ１５ｂｐのオーバーラップ配列を持つように４本のオリゴヌクレオチド（１２Ｅ１０ＶＨ１、１２Ｅ１０ＶＨ２、１２Ｅ１０ＶＨ３、１２Ｅ１０ＶＨ４）に分割し、１２Ｅ１０ＶＨ１（配列番号：８８）及び１２Ｅ１０ＶＨ３（配列番号：９０）はセンス方向で、１２Ｅ１０ＶＨ２（配列番号：８９）及び１２Ｅ１０ＶＨ４（配列番号：９１）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンブリさせた後、外側プライマー（１２Ｅ１０ＶＨＳ及び１２Ｅ１０ＶＨＡ）を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、１２Ｅ１０ＶＨＳ（配列番号：９２）は前方プライマーでリーダー配列の５’端にハイブリダイズし、且つＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また１２Ｅ１０ＶＨＡ（配列番号：９３）は後方プライマーでＨ鎖可変領域のＣ末端をコードする塩基配列にハイブリダイズし、且つスプライスドナー配列ならびにＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０μｌの１０×ＰＣＲ　Ｇｏｌｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０８ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（以上ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）、２．５ピコモルずつの合成オリゴヌクレオチド１２Ｂ５ＶＨ−１〜４を含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間のサイクルを２回反復した後、１００ｐｍｏｌｅずつの外側プライマー１２Ｅ１０ＶＨＳ及び１２Ｅ１０ＶＨＡを加え、さらに９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
ＰＣＲ生成物は１．５％低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ社製）を用い精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ヒトＨ鎖発現ベクターＨＥＦ−ｇＹ１にクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇＹ１と命名した。
さらに、ＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇＹ１を制限酵素ＥｃｏＲＩならびにＢａｍＨＩで消化し、１２Ｅ１０ＶＨをコードする遺伝子を調製した後、ヒトＦａｂＨ鎖発現ベクターｐＣＯＳ−Ｆｄに挿入しｐＦｄ−１２Ｅ１０Ｈを得た。なお、ヒトＦａｂＨ鎖発現ベクターはヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域と定常領域をコードする遺伝子間に存在するイントロン領域ならびにヒトＨ鎖定常領域の一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号６３）についてＰＣＲ法を用いて増幅した後、動物細胞発現用ベクターｐＣＯＳ１に挿入することで構築したベクターである。ヒトＨ鎖定常領域はＨＥＦ−ｇＹ１を鋳型とし、上記と同様の条件下にて遺伝子の増幅を行い、前方プライマーとしてイントロン１の５’端の配列とハイブリダイズし、且つＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を有するように設計したＧ１ＣＨ１−Ｓ（配列番号６４）を、後方プライマーとしてヒトＨ鎖定常領域ＣＨ１ドメインの３’端のＤＮＡにハイブリダイズし、且つヒンジ領域の一部をコードする配列、二個の停止コドンおよびＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を有するように設計したＧ１ＣＨ１−Ａ（配列番号６５）を用いた。
プラスミドＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇＹ１及びｐＦｄ−１２Ｅ１０Ｈに含まれる再構成１２Ｅ１０Ｈ鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：９４に示す。
８．２　１２Ｅ１０Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子の構築
ヒトＭＰＬに結合するヒト抗体１２Ｅ１０Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子はＷＯ９９／１０４９４に記載のアミノ酸配列（配列番号９５）を基に配列番号９６に示す塩基配列を設計した。さらに、その５’端にヒト抗体遺伝子由来のリーダー配列（配列番号９７）（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；２９：１５１５−１５１８）を連結させることで設計した。設計した塩基配列は上記と同様にそれぞれ１５ｂｐのオーバーラップ配列を持つように４本のオリゴヌクレオチド（１２Ｅ１０ＶＬ１、１２Ｅ１０ＶＬ２、１２Ｅ１０ＶＬ３、１２Ｅ１０ＶＬ４）に分割し、それぞれ合成した。１２Ｅ１０ＶＬ１（配列番号：９８）及び１２Ｅ１０ＶＬ３（配列番号：１００）はセンス配列、１２Ｅ１０ＶＬ２（配列番号：９９）及び１２Ｅ１０ＶＬ４（配列番号：１０１）はアンチセンス配列を有し、各合成オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補性によりアッセンブリさせた後、外側プライマー（１２Ｅ１０ＶＬＳ及び１２Ｅ１０ＶＬＡ）を加え、全長の遺伝子を増幅した。なお、１２Ｅ１０ＶＬＳ（配列番号：１０２）は前方プライマーでリーダー配列の５’端にハイブリダイズし、且つＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また１２Ｅ１０ＶＬＡ（配列番号：１０３）は後方プライマーでＬ鎖可変領域のＣ末端をコードする塩基配列にハイブリダイズし、且つＢｌｎＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応は上記と同様に行い、ＰＣＲ生成物は１．５％低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ社製）を用い精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢｌｎＩで消化し、ヒトラムダ鎖定常領域遺伝子を含有するｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、１２Ｅ１０Ｌ鎖可変領域及びヒトラムダ鎖定常領域をコードする遺伝子を調製し、さらに発現ベクターｐＣＯＳ１に挿入し、１２Ｅ１０Ｌ鎖遺伝子（配列番号：１０４）を持つプラスミドをｐＣＯＳ−１２Ｅ１０Ｌと命名した。
８．３　再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製
再構成１２Ｅ１０抗体一本鎖Ｆｖは１２Ｅ１０ＶＨ−リンカー−１２Ｅ１０ＶＬの順とし、そのＣ末端には検出及び精製を容易にするためにＦＬＡＧ配列（配列番号：１０５）を付加することで設計した。リンカー配列は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３の１５アミノ酸からなるリンカー配列、またはを（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１の５アミノ酸からなるリンカー配列用い、再構成１２Ｅ１０鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｅ１０およびｄｂ１２Ｅ１０）を構築した。
（１）　５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製
５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖをコードする遺伝子は１２Ｅ１０Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の３’端、及び１２Ｅ１０Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の５’端に（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１からなるリンカーをコードする塩基配列を付加させた遺伝子についてそれぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製のために４個のＰＣＲプライマー（Ａ〜Ｄ）を使用した。プライマーＡ及びＣはセンス配列を有し、プライマーＢおよびＤはアンチセンス配列を有する。
Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーは１２Ｅ１０Ｓ（プライマーＡ、配列番号：１０６）を用い、Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＤＢ２（プライマーＢ、配列番号：１０７）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１からなるリンカーをコードする塩基配列ならびにＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＤＢ１（プライマーＣ、配列番号：１０８）はＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１からなるリンカーをコードする塩基配列ならびにＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーは１２Ｅ１０ＦＡ（プライマーＤ、配列番号：１０９）はＬ鎖可変領域Ｃ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つＦＬＡＧをコードする塩基配列を有し、さらにＮｏｔＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。
第一ＰＣＲ段階において２つの反応Ａ−Ｂ及びＣ−Ｄを行い、そして第一ＰＣＲから得られた２つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた。次に、プライマーＡ及びＤを加えて、５アミノ酸からなるリンカーを用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖをコードする全長ＤＮＡを増幅した（第二ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、再構成１２Ｅ１０Ｈ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇＹ１（実施例８．１を参照）及び再構成１２Ｅ１０Ｌ鎖Ｖ領域をコードするプラスミドｐＣＯＳ−１２Ｅ１０Ｌ（実施例８．１を参照）をそれぞれ鋳型として用いた。
第一ＰＣＲ段階の溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＰＣＲ　Ｇｏｌｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０８ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（以上ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）、１００ピコモルずつの各プライマー及び１００ｎｇの各鋳型ＤＮＡを含有し、９４℃の初期温度にて９分間そして次に９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間及び７２℃にて１分間のサイクルを３５回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ（４２９ｂｐ）及びＣ−Ｄ（３９５ｂｐ）は第二ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいて、鋳型として１μＬずつの第一ＰＣＲ反応物Ａ−Ｂ及びＰＣＲ反応物Ｃ−Ｄ、１００ピコモルずつの各プライマー、１０μｌの１０×ＰＣＲ　Ｇｏｌｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０８ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（以上ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）を含有する９８μｌのＰＣＲ混合液を、上記と同様の条件下で反応させた。
第二ＰＣＲにより生じた７９５ｂｐのＤＮＡ断片について１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製した後、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１ベクターまたはｐＣＯＳ１ベクターにクローニングした。なお、本発現ベクターｐＣＨＯ１は、ＤＨＦＲ−ΔＥ−ＲＶＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ　Ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）を連結することにより構築したベクターである。ＤＮＡ配列決定の後、再構成１２Ｂ５一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯ−ｄｂ１２Ｅ１０、及びｐＣＯＳ−ｄｂ１２Ｅ１０と命名した。本プラスミドｐＣＨＯ−ｄｂ１２Ｅ１０及びｐＣＯＳ−ｄｂ１２Ｅ１０に含まれる再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：１１０に示す。
（２）１５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製
１５アミノ酸からなるリンカー配列を用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖをコードする遺伝子は１２Ｅ１０Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の３’端、及び１２Ｅ１０Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の５’端にそれぞれ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなるリンカーをコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれＰＣＲ法を用いて増幅し、連結することにより構築した。再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの作製のために４個のＰＣＲプライマー（Ａ〜Ｄ）を使用した。プライマーＡ及びＣはセンス配列を有し、プライマーＢおよびＤはアンチセンス配列を有する。
Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーは１２Ｅ１０Ｓ（プライマーＡ、配列番号：１０６）を用い、Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーｓｃ４．３（プライマーＢ、配列番号：１１１）は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなるリンカーをコードする塩基配列ならびにＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーｓｃ１．３（プライマーＣ、配列番号：１１２）はＬ鎖Ｖ領域のＮ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなるリンカーをコードする塩基配列ならびにＨ鎖Ｖ領域のＣ末端をコードする塩基配列を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーは１２Ｅ１０ＦＡ（プライマーＤ、配列番号：１０９）はＬ鎖可変領域Ｃ末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つＦＬＡＧをコードする塩基配列を有し、さらにＮｏｔＩ制限酵素認識部位を有するように設計した。
第一ＰＣＲ段階において２つの反応Ａ−Ｂ及びＣ−Ｄを行い、そして第一ＰＣＲから得られた２つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた。次に、プライマーＡ及びＤを加えて、１５アミノ酸からなるリンカーを用いた再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖをコードする全長ＤＮＡを増幅した（第二ＰＣＲ）。なお、第一ＰＣＲにおいては、再構成１２Ｅ１０一本鎖ＦｖをコードするプラスミドｐＣＯＳ−ｄｂ１２Ｅ１０（実施例８．１（１）を参照）を鋳型として用いた。
第一ＰＣＲ段階の溶液５０μｌは、５μｌの１０×ＥｘＴａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ、０．４ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ　ＥｘＴａｑ（以上宝酒造社製）、１００ピコモルずつの各プライマー及び１０ｎｇの各鋳型ＤＮＡを含有し、９４℃の初期温度にて３０秒間そして次に９４℃にて１５秒間及び７２℃にて２分間のサイクルを５回、９４℃にて１５秒間及び７０℃にて２分間のサイクルを５回、９４℃にて１５秒間及び６８℃にて２分間のサイクルを２８回反復した後、反応混合物を更に７２℃で５分間加熱した。
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｂ（４７７ｂｐ）及びＣ−Ｄ（４４７ｂｐ）は第二ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいて、鋳型として１μＬずつの第一ＰＣＲ反応物Ａ−Ｂ及びＰＣＲ反応物Ｃ−Ｄ、１００ピコモルずつのプライマーＡ及びＤ、５μｌの１０×ＥｘＴａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ、０．４ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＴａＫａＲａ　ＥｘＴａｑ（以上宝酒造社製）を混合し、上記と同様の条件下で反応させた。
第二ＰＣＲにより生じた８２５ｂｐのＤＮＡ断片について１．０％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＨＯ１ベクターまたはｐＣＯＳ１ベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｅ１０及びｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｅ１０と命名した。本プラスミドｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｅ１０及びｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｅ１０に含まれる再構成１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：１１３に示す。
８．４　動物細胞を用いた各１２Ｅ１０抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ）及び一本鎖Ｆｖポリペプチドの発現
１２Ｅ１０抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ）ならびに１２Ｅ１０抗体由来の一本鎖Ｆｖ（リンカー配列５アミノ酸、１５アミノ酸）はＣＯＳ−７細胞もしくはＣＨＯ細胞を用い発現させた。
ＣＯＳ−７細胞を用いた一過的な発現は次のようにして行った。すなわち、Ｇｅｎｅ　ＰｕｌｓｅｒＩＩ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。１２Ｅ１０抗体（ＩｇＧ）の発現には前述の発現ベクターＨＥＦ−１２Ｅ１０Ｈ−ｇＹ１及びｐＣＯＳ−１２Ｅ１０Ｌ各１０μｇずつを、１２Ｅ１０Ｆａｂ断片の発現にはｐＦｄ−１２Ｅ１０ＨとｐＣＯＳ−１２Ｅ１０Ｌ各１０μｇずつを、一本鎖Ｆｖの発現にはｐＣＯＳ−ｓｃ１２Ｅ１０（１０μｇ）またはｐＣＯＳ−ｄｂ１２Ｅ１０（１０μｇ）をＰＢＳに懸濁したＣＯＳ−７細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）０．８ｍｌに混合したものをキュベットに加え、１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に加え培養した。終夜培養後、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、さらに無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を加え、さらに３日間培養した。培養上清を遠心し細胞破砕物を除去した後、０．２２μｍのフィルターを通すことで調製した。
また、１２Ｅ１０抗体由来の一本鎖Ｆｖ（ポリペプチド）の恒常的発現ＣＨＯ細胞株を樹立するため、ｐＣＨＯ−ｓｃ１２Ｅ１０またはｐＣＨＯ−ｄｂ１２Ｅ１０発現ベクターをそれぞれＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。
各発現ベクターを、Ｇｅｎｅ　ＰｕｌｓｅｒＩＩ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法によりＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。ＰｖｕＩ消化により直鎖状にしたＤＮＡ（１００μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．８ｍｌを混合したものをキュベットに加え、氷中で１０分間静置した後、１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％の透析ウシ胎児血清ならびに核酸を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に加え培養した。培養２日後に１０％の透析ウシ胎児血清を含有する核酸不含ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）にて培養した。得られたクローンについて発現量の高いクローンを１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖの産生細胞株として選択した。この細胞株を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）にて培養後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去後に、０．２２μｍのフィルターを通すことで培養上清を調製した。
８．５　ＣＨＯ細胞産生の１２Ｅ１０由来の一本鎖Ｆｖの精製
実施例８．４で得た一本鎖Ｆｖ発現ＣＨＯ産生株（ｓｃ１２Ｅ１０，ｄｂ１２Ｅ１０）それぞれの培養上清から抗ＦＬＡＧ抗体カラム、及びゲルろ過カラムを用いて一本鎖Ｆｖを精製した
（１）抗ＦＬＡＧ抗体カラムを用いた精製
培養上清（ｓｃ１２Ｅ１０，ｄｂ１２Ｅ１０）を、それぞれ１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて平衡化した抗ＦＬＡＧ　Ｍ２　アフィニティゲル（ＳＩＧＭＡ社製）カラムに添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、１００ｍＭ　グリシン緩衝液（ｐＨ３．５）でカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出画分は直ちに１Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで各溶出画分を分析し、一本鎖Ｆｖが確認された画分を、それぞれプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（アミコン社製）を用いて約２０倍濃縮した。
（２）ゲル濾過
（１）の画分を、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含むＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラム（１０ｘ３００ｍｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に添加した。クロマトグラムを図５３および５４に示す。その結果、ｓｃ１２Ｅ１０においては２つのピーク（Ａ，Ｂ）が検出された（図５３）。また、ｄｂ１２Ｅ１０では、２つのピーク（Ｃ，Ｄ）が検出された（図５４）。それぞれのピーク画分を分取し、還元剤添加、非添加で処理し、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に準じて電気泳動を行い、泳動後蛋白質をクマシーブリリアントブルー染色した。図５５に示すように、画分Ａ、画分Ｂ、画分Ｃ、画分Ｄいずれも還元剤の添加の有無に関わらず、見かけ上の分子量約３１ｋＤに単一バンドを与えた。これらの画分を、前述のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過で分析した結果、画分Ａは見かけ上の分子量約２０ｋＤ、画分Ｂは同４２ｋＤに溶出された（図５６を参照）。一方、画分Ｃは見かけ上の分子量約６９ｋＤ、画分Ｄは同４１ｋＤに溶出された（図５７を参照）以上の結果から、ｓｃ１２Ｅ１０由来の画分Ａは一本鎖Ｆｖの非共有結合性ダイマーで、画分Ｂは一本鎖Ｆｖのモノマーであり、また、ｄｂ１２Ｅ１０由来の画分Ｃは一本鎖Ｆｖの非共有結合性トリマー、画分Ｄは一本鎖Ｆｖの非共有結合性ダイマーであることが示唆された。
８．６　各種一本鎖ＦｖのＴＰＯ様アゴニスト活性の測定
ヒトＴＰＯ受容体（ＭＰＬ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞（ＢａＦ／ｍｐｌ）に対する増殖活性を測定することによって、抗ｍｐｌ一本鎖抗体のＴＰＯ様活性の評価を行った。
ＢａＦ／ｍｐｌ細胞を、１％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）で２回洗浄したのち、５×１０５細胞／ｍＬの細胞密度になるように培地に懸濁した。抗ＭＰＬ一本鎖抗体またはヒトＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を培地で適当に希釈し、細胞懸濁液５０μＬに抗体またはヒトＴＰＯ希釈液５０μＬを加えて９６穴マイクロウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に分注し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度：５％）で２４時間培養した。培養後、ＷＳＴ−８試薬（生細胞数測定試薬ＳＦ：ナカライテスク社製）を１０μＬ加え、直後に吸光光度計Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ　Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて測定波長４５０ｎｍ、対照波長６５５ｎｍの吸光度を測定した。ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度：５％）で２時間インキュベートした後、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ　Ｐｌｕｓを用いて再度測定波長４５０ｎｍ、対照波長６５５ｎｍの吸光度を測定した。ＷＳＴ−８試薬は生細胞数に応じて波長４５０ｎｍの発色反応を呈することから、２時間の吸光度変化を指標にＢａＦ／ｍｐｌ細胞増殖活性を評価した。
各種１２Ｅ１０抗体分子を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清を用い、ＭＰＬに対するアゴニスト活性を測定した結果を図５８に示す。リンカー配列５アミノ酸（ｄｂ１２Ｅ１０）および１５アミノ酸（ｓｃ１２Ｅ１０）の一本鎖Ｆｖでは濃度依存的に吸光度の上昇が認められ、ＴＰＯ様のアゴニスト活性を示したのに対し（ＥＤ５０；それぞれ９ｐＭおよび５１ｐＭ）、１２Ｅ１０ＩｇＧおよび１２Ｅ１０Ｆａｂでは全く活性が認められなかった。
一本鎖Ｆｖはリンカー配列の長さによっては、Ｈ鎖とＬ鎖が分子内だけでなく、分子間でも介合することによって二量体等の多量体を形成することが知られている。そこで、１２Ｅ１０一本鎖Ｆｖを発現させたＣＨＯ細胞の培養上清をゲルろ過分画して、ＭＰＬに対するアゴニスト活性を測定した。その結果を図５９に示す。ｓｃ１２Ｅ１０中にわずかに含まれる二量体（ｓｃ１２Ｅ１０ダイマー、ＥＤ５０；１．９ｐＭ）は単量体（ｓｃ１２Ｅ１０モノマー、ＥＤ５０；＞１０ｎＭ）に比べて、５０００倍以上強いＴＰＯ様アゴニスト活性を示し、その活性はＴＰＯ（ＥＤ５０；２７ｐＭ）よりも強かった。また、ｄｂ１２Ｅ１０の二量体（ｄｂ１２Ｅ１０ダイマー、ＥＤ５０；２．０ｐＭ）はｓｃ１２Ｅ１０ダイマーとほぼ同等の強い活性を示した。ゲルろ過分子量から三量体と推定されたｄｂ１２Ｅ１０トリマー（ＥＤ５０；７．４ｐＭ）もｄｂ１２Ｅ１０ダイマーには劣るが高い活性を示した。以上の結果から、アゴニスト抗体１２Ｅ１０の活性には、抗原結合部位が二価（ダイマー）であることが重要と考えられるが、１２Ｅ１０　ＩｇＧには活性が見られなかったことから、単に二価であるだけでなく、抗原結合部位間の距離や角度といった要素も重要と推測される。
産業上の利用可能性
本発明の改変抗体は、細胞表面上の分子を架橋することにより該細胞内にシグナルを伝達しうるアゴニスト作用を有しており、また抗体分子（ｗｈｏｌｅ　ＩｇＧ）と比較して低分子化が達成されているため、組織、腫瘍への移行性に優れているという特徴を有している。さらに本発明によれは、ＴＰＯや親抗体（ｗｈｏｌｅ　ＩｇＧ）より顕著に高いアゴニスト活性を有する改変抗体が提供される。特に、親抗体分子でアゴニスト活性が認められない場合においてもＴＰＯより高いアゴニスト活性を有する改変抗体が提供できる。従って、当該改変抗体はシグナル伝達アゴニストとして使用することができ、そして抗体分子を本発明の改変抗体にすることにより、細胞間の架橋などによる副作用を軽減し、且つ細胞表面上の分子を架橋して所望の作用のみを誘起しうる新規な医薬品が提供される。本発明の改変抗体を有効成分とする医薬製剤は、血小板減少が関与する血液疾患、癌や白血病等の化学治療後の血小板減少症などの予防及び／又は治療薬として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１．　ヒトＩｇＧ１抗体が、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）に結合しないことを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
図２．　キメラＭＡＢＬ−１抗体が、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）に特異的に結合することを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
図３．　キメラＭＡＢＬ−２抗体が、ヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞（ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０）に特異的に結合することを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
図４．　本発明にかかる一本鎖Ｆｖの作成方法を模式的に示す図である。
図５．　本発明の一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡを、大腸菌にて発現させるために使用可能な発現プラスミドの一例の構造を示す。
図６．　本発明の一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡを、哺乳動物細胞にて発現させるために使用する発現プラスミドの一例の構造を示す。
図７．　実施例５．４で得られたウエスタンブロットの結果を示す図である。左側より、分子量マーカー（上から９７．４、６６、４５、３１、２１．５、１４．５ｋＤａを示す）、ｐＣＨＯ１導入ＣＯＳ７細胞培養上清、ｐＣＨＯＭ２導入細胞培養上清。ｐＣＨＯＭ２導入細胞培養上清に再構成ＭＡＢＬ−２抗体一本鎖Ｆｖ（矢印）が明らかに含まれていることを示す。
図８．　コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清の抗体は、コントロールとしてのｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０細胞には結合しないことを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
図９．　ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清の抗体は、コントロールとしてのｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０細胞には結合しないことを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
図１０．コントロールとしてのｐＣＯＳ１／ＣＯＳ７細胞培養上清の抗体は、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に結合しないことを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
図１１．ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清の抗体は、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に特異的に結合することを示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
図１２．実施例５．６で示すＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＥＬＩＳＡの結果を示す図であり、本発明の一本鎖Ｆｖ（ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ）の抗原結合活性を、コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清と比較して、マウスモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２の抗原結合に対する阻害を指標として示す図である。
図１３．実施例５．７のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、コントロールとしてのｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０細胞には、コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す。
図１４．実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、コントロールとしてのｐＣＯＳ１／Ｌ１２１０細胞には、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す。
図１５．実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す。
図１６．実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対し、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体が特異的にアポトーシスを誘起することを示す。
図１７．実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞には、コントロールとしてのｐＣＨＯ１／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す（最終濃度５０％）。
図１８．実施例５．７のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対し、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ／ＣＯＳ７細胞培養上清抗体が特異的にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度５０％）。
図１９．実施例５．９のＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの精製過程において、Ｂｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで得られた画分をハイドロキシアパタイトカラムを用いて精製した際のクロマトグラムを示す図であり、主要なピークとして画分Ａ、画分Ｂが得られたことを示す。
図２０．実施例５．９の（２）で得られた画分Ａ、画分Ｂについてゲル濾過により精製した結果を示す図であり、画分Ａでは見かけ上の分子量約３６ｋＤ、画分Ｂでは同７６ｋＤの位置に主要ピークが（それぞれＡＩ及びＢＩ）が溶出したことを示す。
図２１．実施例５．９のＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの精製過程において得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した図であり、何れも分子量約３５ｋＤに単一のバンドのみであることを示す。
図２２．ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖの精製において得られた画分ＡＩ及びＢＩをゲル濾過により分析した結果を示す図であり、画分ＡＩはモノマーからなり、画分ＢＩはダイマーからなることを示す。
図２３．本発明の一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡを、大腸菌の菌体内にて発現させるために使用可能な発現プラスミドの一例の構造を示す。
図２４．実施例５．１２の大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ−２抗体由来の一本鎖Ｆｖポリペプチドの精製において、得られた粗製物をゲル濾過カラムを用いて精製した結果を示す図であり、各ピークはそれぞれ大腸菌細胞産生の一本鎖Ｆｖのモノマー、ダイマーを示す。
図２５．実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、コントロールとしてのマウスＩｇＧ抗体はアポトーシスを誘起しないことを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
図２６．実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対し、ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖダイマーが顕著にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
図２７．実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対し、大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖダイマーが顕著にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
図２８．実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖモノマーのアポトーシス誘起作用がコントロールと同程度であることを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
図２９．実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、大腸菌細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖモノマーのアポトーシス誘起作用がコントロールと同程度であることを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
図３０．実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞には、コントロールとしてのマウスＩｇＧ抗体は抗ＦＬＡＧ抗体の添加によってもアポトーシスを誘起しないことを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
図３１．実施例５．１３のアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対し、ＣＨＯ細胞産生のＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖモノマーが抗ＦＬＡＧ抗体の添加によって顕著にアポトーシスを誘起することを示す（最終濃度３μｇ／ｍｌ）。
図３２．ヒト骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２を移植したマウスの血清中のヒトＩｇＧ量を定量したものであり、マウスにおけるヒト骨髄腫により産生されるヒトＩｇＧの量を測定した結果を示す図であり、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマーがＫＰＭＭ２細胞の増殖を非常に強く抑制していることを示す。
図３３．腫瘍移植後のマウスの生存日数を表しており、ｓｃＦｖ／ＣＨＯダイマー投与群において生存期間が顕著に延長されていることを示している。
図３４．ＭＡＢＬ−２抗体由来の２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む改変抗体［ｓｃ（Ｆｖ）２］を発現するプラスミドの一例の構造を示す。
図３５．［Ｈ鎖］−［Ｌ鎖］となるようにＶ領域を連結し、且つペプチドリンカーを含まないｓｃＦｖ（ＨＬタイプ）を発現するプラスミドの一例の構造を示す。
図３６．ＨＬタイプのポリペプチドの構造およびペプチドリンカーのアミノ酸配列を示す。
図３７．［Ｌ鎖］−［Ｈ鎖］となるようにＶ領域を連結し、且つペプチドリンカーを含まないｓｃＦｖ（ＬＨタイプ）を発現するプラスミドの一例の構造を示す。
図３８．ＬＨタイプのポリペプチドの構造およびペプチドリンカーのアミノ酸配列を示す。
図３９．実施例６．４におけるウェスタンブロッティングの結果を示す図であり、２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ領域を含む改変抗体ｓｃ（Ｆｖ）２及び種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ−２抗体ｓｃＦｖが発現していることを示す。
図４０ａ及びｂ．実施例６．３（１）にて調製したＣＯＳ７細胞培養上清を用いたフローサイトメトリーの結果を示す図であり、種々の長さのペプチドリンカーを有するＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ及びｓｃ（Ｆｖ）２は、ヒトＩＡＰに対して高い親和性を有することを示す。
図４１．実施例６．６のアポトーシス誘導効果の結果を示す図であり、ｓｃＦｖ＜ＨＬ３，４，６，７、ＬＨ３，４，６，７＞及びｓｃ（Ｆｖ）２はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０細胞に対して顕著な細胞死を誘導することを示す。
図４２．実施例６．１０の抗原結合評価の結果を示す図であり、ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びｓｃ（Ｆｖ）２がヒトＩＡＰに対して高い親和性を有すること示す。
図４３．実施例６．１１のｉｎ　ｖｉｔｒｏアポトーシス誘起効果の結果を示す図であり、ＭＡＢＬ２−ｓｃＦｖ＜ＨＬ５＞のダイマー及びＭＡＢＬ２−ｓｃ（Ｆｖ）２はｈＩＡＰ／Ｌ１２１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭの両細胞に対して濃度依存的に細胞死を誘導することを示す。
図４４．ヒト骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２を移植したマウスにおけるヒト骨髄腫により産生される血清中のＭタンパク質の量を測定した結果を示す図であり、ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞及びｓｃ（Ｆｖ）２がＫＰＭＭ２細胞の増殖を非常に強く抑制していることを示す。
図４５．腫瘍移植後のマウスの生存日数を表しており、ｓｃＦｖ＜ＨＬ−５＞投与群において生存期間が顕著に延長されていることを示している。
図４６．腫瘍移植後のマウスの生存日数を表しており、ｓｃ（Ｆｖ）２投与群において生存期間が顕著に延長されていることを示している。
図４７．１５アミノ酸からなるリンカー配列を含む再構成１２Ｂ５一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ断片の構築方法とその構造を概略的に示す。
図４８．実施例７．５（１）で得られた各１２Ｂ５一本鎖Ｆｖを、ゲル濾過により精製した結果を示す図であり、ｓｃ１２Ｂ５では２つのピーク（画分Ａ，Ｂ）に分かれた結果を示す。
図４９．実施例７．５（２）において、各画分ＡおよびＢをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果を示す。
図５０．実施例７．５（２）において、各画分ＡおよびＢをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにより分析した結果を示し、（ａ）画分Ａでは見かけ上の分子量約４４ｋＤに、（ｂ）画分Ｂでは同２２ｋＤの位置に主要ピークが溶出されたことを示す。
図５１．ｓｃ１２Ｂ５及び１２Ｂ５抗体（ＩｇＧ，Ｆａｂ）のＴＰＯ様アゴニスト活性の測定結果を示し、１２Ｂ５　ＩｇＧ及び一価一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｂ５）は、濃度依存的にＴＰＯ様のアゴニスト活性を有することを示す。
図５２．ｓｃ１２Ｂ５モノマー及びダイマーのＴＰＯ様アゴニスト活性の測定結果を示し、二価の抗原結合部位を持つ一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｂ５ダイマー）は一価のｓｃ１２Ｂ５より約４００倍以上強いアゴニスト活性を示し、その強さはヒトＴＰＯと同等もしくはそれ以上であることを示す。
図５３．得られたｓｃ１２Ｅ１０一本鎖抗体をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで精製した結果を示す図であり、１２Ｅ１０ｓｃ３では、２つのピーク（画分Ａ，Ｂ）に分かれた結果を示す。
図５４．得られたｄｂ１２Ｅ１０一本鎖抗体をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで精製した結果を示す図であり、１２Ｅ１０ｓｃ３では、２つのピーク（画分Ｃ，Ｄ）に分かれた結果を示す。
図５５．画分Ａ，Ｂ（ｓｃ１２Ｅ１０）および画分Ｃ、Ｄ（ｄｂ１２Ｅ１０）を還元、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す。
図５６．画分Ａ，Ｂを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで分析した結果を示す。（１）画分Ａでは、見かけ上の分子量４２ｋＤに（２）画分Ｂでは、同２０ｋＤの位置に、主要ピークが溶出されたことを示す。
図５７．画分Ｃ，Ｄを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで分析した結果を示す。（１）画分Ｃでは、見かけ上の分子量６９ｋＤに（２）画分Ｂでは、同４１ｋＤの位置に、主要ピークが溶出されたことを示す。
図５８．各種１２Ｅ１０抗体分子のＭＰＬに対するアゴニスト活性を示すグラフであり、一本鎖Ｆｖ（ｓｃ１２Ｅ１０，ｄｂ１２Ｅ１０）ではＴＰＯ様のアゴニスト活性を示したのに対し、１２Ｅ１０　ＩｇＧおよび１２Ｅ１０　Ｆａｂでは全く活性が認められなかったことを示す。
図５９．ｓｃ１２Ｅ１０モノマーおよびダイマー、並びにｄｂ１２Ｅ１０ダイマーおよびトリマーのＭＰＬに対するアゴニスト活性を示すグラフであり、ｓｃ１２Ｅ１０ダイマー、ｄｂ１２Ｅ１０ダイマーおよびトリマーのＴＰＯ様アゴニスト活性がＴＰＯよりも強力であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2002033072.tif 000089
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2002033072.tif 000092
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2002033072.tif 000109
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０ａ】
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【図４０ｂ】
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【図４１ａ】
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【図４１ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【手続補正書】
【提出日】平成13年12月20日(2001.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
ものであるが、近年、一本鎖Ｆｖのダイマー、特に、二重特異性［ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ］のダイマーが細胞同士の架橋を目的として使用されている。このようなダイマーとしては、代表的には癌細胞抗原とＮＫ細胞や好中球など宿主細胞抗原を認識する一本鎖Ｆｖのヘテロダイマー等が知られている（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７，９７６３−９７７２，１９９８）。これらは、細胞間架橋を誘導させることにより癌を治療するためのより効率的な改変抗体として、一本鎖Ｆｖの構築技術から作成されたものである。このため、抗体およびその断片（例えばＦａｂ断片など）および二重特異性の改変抗体、さらには単一特異性である一本鎖Ｆｖのダイマーでも細胞間の架橋が誘導されると考えられていた。
また、細胞表面分子を架橋してシグナルを伝達しうるモノクローナル抗体として、例えば細胞の分化・増殖に関与するＥＰＯ受容体に対する抗体（特開２０００−９５８００号公報）、ＭｕＳＫ受容体に対する抗体（Ｘｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，７６８−７７１，１９９７）などが知られている。また、ＴＰＯレセプターに対するアゴニスト抗体、その断片および一本差Ｆｖなども知られている（ＷＯ９９／１７３６４）。しかし、アゴニスト作用を有する一本鎖Ｆｖのダイマーおよび一本鎖２価抗体等の改変抗体については報告はない。
そこで、先ず本発明者らは、ＩＡＰを有する細胞に対してアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体（ＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２抗体）を取得し、それをもとに作製した一本鎖Ｆｖのモノマーは細胞にアポトーシスを誘起せず、ダイマーが細胞に対してアポトーシスを誘導することに注目し、これらが細胞表面上のＩＡＰ受容体を架橋（２量体化）することにより当該細胞にシグナルが伝達されて、その結果アポトーシスが誘導されたことを突き止めた。即ち、これは、単一特異性の一本鎖Ｆｖダイマーが細胞表面上の分子（例えば受容体）を架橋することにより、リガンドと同様にシグナルを伝達し、これによりアゴニスト作用を示しうること示唆するものである。
次に細胞間の架橋形成に注目したところ、前記モノクローナル抗体は赤血球凝集を引き起こすが、前記一本鎖Ｆｖのダイマーは赤血球凝集を起こさないことを見出した。同様の結果は、一本鎖２価抗体（２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
領域を含む一本鎖ポリペプチド）でも観察された。即ち、これはモノクローナル抗体では細胞間で架橋が形成される可能性があるのに対して、一本鎖Ｆｖダイマーまたは一本鎖２価抗体等の改変抗体では、細胞表面上の分子を架橋するが、細胞間の架橋を形成しないことを示唆するものである。
本発明者は、これらの結果から、一本鎖Ｆｖダイマーや一本鎖２価抗体等の改変抗体が、従来知られていた細胞間の架橋への使用に限らず、同じ細胞の細胞表面分子あるいは細胞内分子を架橋する、当該分子に対するリガンド（特に天然のリガンドの作用を模倣するようなリガンド）として特に適していることを初めて見出した。
さらに、本発明者は、抗体分子（ｗｈｏｌｅ　ＩｇＧ）を一本鎖Ｆｖダイマーまたは一本鎖２価抗体などの改変抗体にすることにより、細胞間の架橋などによる副作用を軽減し、且つ細胞表面上の分子を架橋して、細胞に所望の作用のみを誘起しうる新規な医薬品を提供しうることを見出し、本発明を完成させた。また、本発明の改変抗体は、当該改変抗体と同じＶ領域を有するｗｈｏｌｅの抗体（ＩｇＧ）と比較して顕著に高い活性を有しており、さらに抗体分子に比べ分子量が小さく、定常領域を有しないという特徴から、組織移行性が向上しているという特徴を有している。
発明の開示
本発明の課題は、ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む低分子化アゴニスト改変抗体を提供することである。
従って、本発明は、ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上、好ましくは各々２〜６、さらに好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含む改変抗体に関する。
本明細書において「改変抗体」とは、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含み、これら各Ｖ領域を直接的あるいはリンカー等を介して共有


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
測定する、工程を含むスクリーニング方法又は測定方法に関する。本発明の測定方法は、本発明の改変抗体を医薬品として製造する場合の品質管理等に用いることができる。
本発明の改変抗体は、単一特異性（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体でも、二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体等の多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体であってもよいが、好ましくは単一特異性（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体である。
本発明はまた、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及び／又はヒト抗体由来のＬ鎖Ｖ領域である改変抗体に関する。ヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、例えばＷＯ９９／１０４９４号公報に記載された方法のように、ヒトモノクローナル抗体のライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。また、トランスジェニックマウス等から作製されたヒトモノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域も包含される。
さらに本発明は、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及び／又はヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域である改変抗体に関する。詳細には、ヒトモノクローナル抗体Ｌ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）とヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）のモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲとする）を含むヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及び／又はヒトモノクローナル抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲとヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲを含むヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域から構成される。この場合、ＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列を一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。
本発明はまた、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリなど）のモノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域も包含される。この場合、ＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列を一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
前記モノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を有するｓｃ１２Ｂ５ダイマー（リンカー：１５アミノ酸）、ｓｃ１２Ｅ１０ダイマー（リンカー：１５アミノ酸）、ｄｂ１２Ｂ５ダイマー（リンカー：５アミノ酸）、ｄｂ１２Ｅ１０ダイマー（リンカー：５アミノ酸）、ｓｃ１２Ｂ５ｓｃ（ＦＶ）２及びｓｃ１２Ｅ１０ｓｃ（ＦＶ）２が挙げられる。
本発明の改変抗体を作製するためには、該ポリペプチドが分泌性であることを所望する場合は、そのＮ−末端にシグナルペプチドを付加することができる。また、該ポリペプチドの効率的精製等のために、ポリペプチド精製において有用である公知の配列、例えばＦＬＡＧ配列などを挿入することができる。この場合、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてダイマー形成させることもできる。
本発明の改変抗体を作製するためには、これをコードするＤＮＡ、即ち一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ又は再構成一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る必要がある。これらのＤＮＡは、例えばｓｃ１２Ｂ５、ｄｂ１２Ｂ５、ｓｃ１２Ｅ１０及び／又はｄｂ１２Ｅ１０の場合には前記Ｆｖ由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを用いて、又はこれらのＤＮＡを鋳型とし、その配列内の所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅することにより得ることができる。
各Ｖ領域について、アミノ酸配列の一部改変を所望する場合には、ＰＣＲ法を用いる公知の方法によって１又は数個のアミノ酸が改変された、即ち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するＶ領域を得ることができる。特定の抗原に対して十分に活性がある改変抗体を作製するために、ＰＣＲ法を用いる公知の方法によって前記Ｖ領域のアミノ酸配列の一部を改変することが望ましい。
ＰＣＲに用いるプライマーを決定するにあたり、モノクローナル抗体から出発する場合は、当該技術分野において知られた方法を用いて当該抗体由来のＨ鎖及びＬ鎖のタイピングをして両鎖の型を決定する。
次に、ＰＣＲ法を用いて１２Ｂ５抗体及び１２Ｅ１０抗体のＬ鎖Ｖ領域を増幅するため、５’−末端オリゴヌクレオチドプライマー及び３’−末端オリゴヌクレ


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
Ｉｎ　ｖｉｖｏでの評価試験により本発明の改変抗体をスクリーニングすることによって、本発明の改変抗体を取得することができる。
本発明の改変抗体は、２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域、好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含むものであり、１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、又は２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域を連結した一本鎖ポリペプチドである。このような構成をとることでＴＰＯの立体構造を模倣して、優れた抗原結合性及びＴＰＯアゴニスト活性を有するものと考えられる。
本発明の改変抗体は、親抗体分子（例えばＩｇＧ）と比較して顕著な低分子化が達成されているため、組織、腫瘍への移行性に優れており、さらに親抗体分子よりも高い活性を有する。このため、本発明の改変抗体を用いることにより、ＴＰＯのシグナルを細胞内に効率よく伝達することができる。故に、これを含有する医薬製剤は、血小板減少が関与する血液疾患、癌や白血病等の化学治療後の血小板減少症などの治療薬としての利用が期待される。また、ＲＩ標識による造影剤としての利用も期待され、ＲＩ化合物やトキシン等の他の化合物と結合させることにより、効力を増強させることも可能である。
発明を実施するための最良の形態
次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
本発明の改変抗体の製造方法を、下記の一本鎖Ｆｖの作製を例にして説明する。本発明の改変抗体の製造方法において用いる、ヒトＩＡＰに対するマウスＭＡＢＬ−１、ＭＡＢＬ−２抗体を産生するハイブリドーマ、ＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２は、公的微生物寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、１９９７年９月１１日に、受託番号それぞれＦＥＲＭ　ＢＰ−６１００、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０１として国際寄託されている。
実施例




【手続補正書】
【提出日】平成13年12月20日(2001.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
ものであるが、近年、一本鎖Ｆｖのダイマー、特に、二重特異性［ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ］のダイマーが細胞同士の架橋を目的として使用されている。このようなダイマーとしては、代表的には癌細胞抗原とＮＫ細胞や好中球など宿主細胞抗原を認識する一本鎖Ｆｖのヘテロダイマー等が知られている（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７，９７６３−９７７２，１９９８）。これらは、細胞間架橋を誘導させることにより癌を治療するためのより効率的な改変抗体として、一本鎖Ｆｖの構築技術から作成されたものである。このため、抗体およびその断片（例えばＦａｂ断片など）および二重特異性の改変抗体、さらには単一特異性である一本鎖Ｆｖのダイマーでも細胞間の架橋が誘導されると考えられていた。
また、細胞表面分子を架橋してシグナルを伝達しうるモノクローナル抗体として、例えば細胞の分化・増殖に関与するＥＰＯ受容体に対する抗体（特開２０００−９５８００号公報）、ＭｕＳＫ受容体に対する抗体（Ｘｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，７６８−７７１，１９９７）などが知られている。また、ＴＰＯレセプターに対するアゴニスト抗体、その断片および一本差Ｆｖなども知られている（ＷＯ９９／１７３６４）。しかし、アゴニスト作用を有する一本鎖Ｆｖのダイマーおよび一本鎖２価抗体等の改変抗体については報告はない。
そこで、先ず本発明者らは、ＩＡＰを有する細胞に対してアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体（ＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２抗体）を取得し、それをもとに作製した一本鎖Ｆｖのモノマーは細胞にアポトーシスを誘起せず、ダイマーが細胞に対してアポトーシスを誘導することに注目し、これらが細胞表面上のＩＡＰ受容体を架橋（２量体化）することにより当該細胞にシグナルが伝達されて、その結果アポトーシスが誘導されたことを突き止めた。即ち、これは、単一特異性の一本鎖Ｆｖダイマーが細胞表面上の分子（例えば受容体）を架橋することにより、リガンドと同様にシグナルを伝達し、これによりアゴニスト作用を示しうること示唆するものである。
次に細胞間の架橋形成に注目したところ、前記モノクローナル抗体は赤血球凝集を引き起こすが、前記一本鎖Ｆｖのダイマーは赤血球凝集を起こさないことを見出した。同様の結果は、一本鎖２価抗体（２つのＨ鎖Ｖ領域及び２つのＬ鎖Ｖ


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
領域を含む一本鎖ポリペプチド）でも観察された。即ち、これはモノクローナル抗体では細胞間で架橋が形成される可能性があるのに対して、一本鎖Ｆｖダイマーまたは一本鎖２価抗体等の改変抗体では、細胞表面上の分子を架橋するが、細胞間の架橋を形成しないことを示唆するものである。
本発明者は、これらの結果から、一本鎖Ｆｖダイマーや一本鎖２価抗体等の改変抗体が、従来知られていた細胞間の架橋への使用に限らず、同じ細胞の細胞表面分子あるいは細胞内分子を架橋する、当該分子に対するリガンド（特に天然のリガンドの作用を模倣するようなリガンド）として特に適していることを初めて見出した。
さらに、本発明者は、抗体分子（ｗｈｏｌｅ　ＩｇＧ）を一本鎖Ｆｖダイマーまたは一本鎖２価抗体などの改変抗体にすることにより、細胞間の架橋などによる副作用を軽減し、且つ細胞表面上の分子を架橋して、細胞に所望の作用のみを誘起しうる新規な医薬品を提供しうることを見出し、本発明を完成させた。また、本発明の改変抗体は、当該改変抗体と同じＶ領域を有するｗｈｏｌｅの抗体（ＩｇＧ）と比較して顕著に高い活性を有しており、さらに抗体分子に比べ分子量が小さく、定常領域を有しないという特徴から、組織移行性が向上しているという特徴を有している。
発明の開示
本発明の課題は、ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含む低分子化アゴニスト改変抗体を提供することである。
従って、本発明は、ＴＰＯレセプターを架橋することによりＴＰＯアゴニスト作用を示す、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上、好ましくは各々２〜６、さらに好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含む改変抗体に関する。
本明細書において「改変抗体」とは、抗体のＨ鎖Ｖ領域を２つ以上及びＬ鎖Ｖ領域を２つ以上含み、これら各Ｖ領域を直接的あるいはリンカー等を介して共有


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
測定する、工程を含むスクリーニング方法又は測定方法に関する。本発明の測定方法は、本発明の改変抗体を医薬品として製造する場合の品質管理等に用いることができる。
本発明の改変抗体は、単一特異性（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体でも、二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体等の多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体であってもよいが、好ましくは単一特異性（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）改変抗体である。
本発明はまた、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及び／又はヒト抗体由来のＬ鎖Ｖ領域である改変抗体に関する。ヒト抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、例えばＷＯ９９／１０４９４号公報に記載された方法のように、ヒトモノクローナル抗体のライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。また、トランスジェニックマウス等から作製されたヒトモノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域も包含される。
さらに本発明は、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及び／又はヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域である改変抗体に関する。詳細には、ヒトモノクローナル抗体Ｌ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）とヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）のモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲとする）を含むヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及び／又はヒトモノクローナル抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲとヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サルなど）モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲを含むヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域から構成される。この場合、ＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列を一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。
本発明はまた、改変抗体のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域が、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリなど）のモノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域及び／又はＬ鎖Ｖ領域も包含される。この場合、ＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列を一部改変（例えば、欠失、置換又は付加）してもよい。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
前記モノクローナル抗体由来のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を有するｓｃ１２Ｂ５ダイマー（リンカー：１５アミノ酸）、ｓｃ１２Ｅ１０ダイマー（リンカー：１５アミノ酸）、ｄｂ１２Ｂ５ダイマー（リンカー：５アミノ酸）、ｄｂ１２Ｅ１０ダイマー（リンカー：５アミノ酸）、ｓｃ１２Ｂ５ｓｃ（ＦＶ）２及びｓｃ１２Ｅ１０ｓｃ（ＦＶ）２が挙げられる。
本発明の改変抗体を作製するためには、該ポリペプチドが分泌性であることを所望する場合は、そのＮ−末端にシグナルペプチドを付加することができる。また、該ポリペプチドの効率的精製等のために、ポリペプチド精製において有用である公知の配列、例えばＦＬＡＧ配列などを挿入することができる。この場合、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてダイマー形成させることもできる。
本発明の改変抗体を作製するためには、これをコードするＤＮＡ、即ち一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ又は再構成一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る必要がある。これらのＤＮＡは、例えばｓｃ１２Ｂ５、ｄｂ１２Ｂ５、ｓｃ１２Ｅ１０及び／又はｄｂ１２Ｅ１０の場合には前記Ｆｖ由来のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを用いて、又はこれらのＤＮＡを鋳型とし、その配列内の所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅することにより得ることができる。
各Ｖ領域について、アミノ酸配列の一部改変を所望する場合には、ＰＣＲ法を用いる公知の方法によって１又は数個のアミノ酸が改変された、即ち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するＶ領域を得ることができる。特定の抗原に対して十分に活性がある改変抗体を作製するために、ＰＣＲ法を用いる公知の方法によって前記Ｖ領域のアミノ酸配列の一部を改変することが望ましい。
ＰＣＲに用いるプライマーを決定するにあたり、モノクローナル抗体から出発する場合は、当該技術分野において知られた方法を用いて当該抗体由来のＨ鎖及びＬ鎖のタイピングをして両鎖の型を決定する。
次に、ＰＣＲ法を用いて１２Ｂ５抗体及び１２Ｅ１０抗体のＬ鎖Ｖ領域を増幅するため、５’−末端オリゴヌクレオチドプライマー及び３’−末端オリゴヌクレ


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
Ｉｎ　ｖｉｖｏでの評価試験により本発明の改変抗体をスクリーニングすることによって、本発明の改変抗体を取得することができる。
本発明の改変抗体は、２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域、好ましくは各々２〜４、特に好ましくは各々２つ含むものであり、１つのＨ鎖Ｖ領域及び１つのＬ鎖Ｖ領域を含む一本鎖Ｆｖのダイマー、又は２つ以上のＨ鎖Ｖ領域及び２つ以上のＬ鎖Ｖ領域を連結した一本鎖ポリペプチドである。このような構成をとることでＴＰＯの立体構造を模倣して、優れた抗原結合性及びＴＰＯアゴニスト活性を有するものと考えられる。
本発明の改変抗体は、親抗体分子（例えばＩｇＧ）と比較して顕著な低分子化が達成されているため、組織、腫瘍への移行性に優れており、さらに親抗体分子よりも高い活性を有する。このため、本発明の改変抗体を用いることにより、ＴＰＯのシグナルを細胞内に効率よく伝達することができる。故に、これを含有する医薬製剤は、血小板減少が関与する血液疾患、癌や白血病等の化学治療後の血小板減少症などの治療薬としての利用が期待される。また、ＲＩ標識による造影剤としての利用も期待され、ＲＩ化合物やトキシン等の他の化合物と結合させることにより、効力を増強させることも可能である。
発明を実施するための最良の形態
次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
本発明の改変抗体の製造方法を、下記の一本鎖Ｆｖの作製を例にして説明する。本発明の改変抗体の製造方法において用いる、ヒトＩＡＰに対するマウスＭＡＢＬ−１、ＭＡＢＬ−２抗体を産生するハイブリドーマ、ＭＡＢＬ−１及びＭＡＢＬ−２は、公的微生物寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、１９９７年９月１１日に、受託番号それぞれＦＥＲＭ　ＢＰ−６１００、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０１として国際寄託されている。
実施例




【国際調査報告】
2002033072.tif 000140
2002033072.tif 000141
2002033072.tif 000142
2002033072.tif 000143