(57)【要約】プロスタグランジンＥ２受容体のサブタイプであるＥＰ１受容体に対して作働する化合物（ＥＰ１アゴニスト）を有効成分として含有する心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）の治療および／または予防剤。（１３Ｅ）−（１１α，１５Ｓ，１７Ｓ）−２，５−エタノ−６，９−ジオキソ−１１，１５−ジヒドロキシ−１７，２０−ジメチルプロスタ−１３−エン酸、ＰＧＥ１およびＰＧＥ２などのＥＰ１アゴニストは、心的外傷後ストレス傷害（ＰＴＳＤ）の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＰ１アゴニストを有効成分として含有する心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）の治療および／または予防剤。
【請求項２】
ＥＰ１アゴニストが（１３Ｅ）−（１１α，１５Ｓ，１７Ｓ）−２，５−エタノ−６，９−ジオキソ−１１，１５−ジヒドロキシ−１７，２０−ジメチルプロスタ−１３−エン酸、ＰＧＥ１またはＰＧＥ２である請求の範囲１の治療および／または予防剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＥＰ１アゴニストを有効成分として含有する心的外傷後ストレス障害の治療および／または予防剤に関する。
背景技術
心的外傷ストレス障害は、ＰＴＳＤ（Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ）とも言われ、戦争、自然災害、家庭内暴力、性的虐待の体験など、通常の対処能力を超えた体験により、心理的な傷を受けることにより引き起こされる不安神経症と位置付けられている。心理的な側面だけではなく、中枢神経画像検査により、海馬の萎縮、前頭前野皮質の機能不全が起こっていること、ベンゾジアゼピン受容体が減少していることなどが分かっている。
また、生理学的な研究では、脳内の神経伝達物質の調節傷害が起こっていることが報告されている（Ｓｅｍｉｎ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，４（４），２４２−２４８（１９９９））。
一方、プロスタグランジンＥ２（以下、ＰＧＥ２と略記する。）は、アラキドン酸カスケード中の代謝産物として知られており、細胞保護作用、子宮収縮、発痛作用、消化管の蠕動運動促進、覚醒作用、胃酸分泌抑制作用、血圧降下作用、利尿作用等を有していることが知られている。
近年の研究の中で、ＰＧＥ２受容体には、それぞれ役割の異なったサブタイプが存在することが分かってきた。現時点で知られているサブタイプは、大別して４つあり、それぞれ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４と呼ばれている（Ｎｅｇｉｓｈｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１２，３７９−３９１（１９９５））。
ＰＧＥ２は、その生理活性が多岐にわたるため、目的とする作用以外の作用が副作用となってしまう欠点を有しているが、それぞれのサブタイプの役割を調べ、そのサブタイプのみに有効な化合物を得ることによって、この欠点を克服する研究が続けられている。
これらのサブタイプのうち、ＥＰ１受容体は、発痛、発熱、利尿に関与していることが知られている（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９４，１１２，７３５−４０、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５２（１９８８）２７３−２７９、Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，Ｓｅｐ  １９９２，２３（５）ｐ８０５−８０９参照。）。そのため、この受容体に拮抗することは、鎮痛剤、解熱剤、頻尿の治療剤として有効であると考えられている。
最近、ＥＰ１受容体を欠損させたマウスが作成され、種々の検討が行なわれている。その中で、例えば、ＥＰ１受容体を欠損させたマウスは、化学発がん物質（アゾキシメタン）によって誘起される大腸粘膜異常腺窩および腸内ポリープ形成が部分的に減弱していることが知られている（ＷＯ  ００／６９４６５号参照）。
発明の開示
本発明者らは、ＥＰ１受容体欠損マウスを用いた種々の実験を行ない、ＥＰ１受容体の働きを解明すべく鋭意研究を行なった結果、ＥＰ１受容体欠損マウスが、ＰＴＳＤの診断基準（Ｐｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｏｖｅｒｖｉｅｗｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｈｅｍｅｓ  ｉｎ  ＰＴＳＤ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２１，１−９，１９９７）と共通した特徴を有していることを見出した。また、正常マウスにＥＰ１アンタゴニストを投与するとＥＰ１受容体欠損マウスと同様の結果が得られ、ＰＴＳＤにＥＰ１受容体が関与していることが分かった。
これらのことから、ＥＰ１アゴニストが、ＰＴＳＤの治療および／または予防に有用であることが明らかとなり、本発明者らは本発明を完成した。
以下に、実験から得られた事実を簡単にまとめるが、ＥＰ１受容体欠損マウスは、正常マウスと比べ、以下の症状を呈した。
１）リポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって惹起されるＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）産生が、有意に減少していた。
２）ＬＰＳによって惹起される自発運動量の低下の程度が少なかった。
３）音響驚愕反応が亢進していた。
４）電気ショックによる攻撃誘発で、攻撃性が亢進していた。
５）他の若いマウスに対し、嗅ぐ、なめる、追尾、相手の身繕い、上に乗る、下にもぐる行為をほとんど見せず、無関心であった。
６）高いプラットフォームからの跳び降り行動が見られた。
７）大脳皮質前頭野や線条体においてドーパミンの代謝が亢進していた。
ＥＰ１アンタゴニストを投与した正常マウスにおいて、少なくとも１）、２）、５）および６）について同様の症状を示すことが確認された。これらのことより、アンタゴニストと反対の作用を示すＥＰ１アゴニストが、ＰＴＳＤに有用であることは明らかである。
一方、不安や記憶などにおけるＥＰ１受容体の影響についても検討したが、これらにはＥＰ１受容体は影響しないことが確認された。つまり、不安作用を、明暗箱テスト（暗い場所から明るい場所に移動する頻度と時間を不安の指標とする方法）やオープンフィールドテスト（Ｈ．Ｍｉｙａｇａｗａら；Ｂｅｈｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，９１，７３−８１  １９９８）および高所十字迷路テスト（Ｋ．Ｙａｍａｄａら；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１，１３１−１３８，２０００）で検討したが、ＥＰ１受容体欠損マウスは正常マウスとほとんど同様の応答を示した。また、探索行動や短期記憶に及ぼす影響を、Ｙ迷路法（Ｋ．Ｙａｍａｄａら；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４９，１５−２２，１９９８）で検討したが、ＥＰ１受容体欠損マウスの行動は正常マウスと同様であった。このように、ＥＰ１受容体は不安や記憶には悪影響を及ぼさないことが確認された。
本発明でいうＥＰ１アゴニストとは、ＥＰ１受容体に結合し作働するものを指す。例えば、（１３Ｅ）−（１１α，１５Ｓ，１７Ｓ）−２，５−エタノ−６，９−ジオキソ−１１，１５−ジヒドロキシ−１７，２０−ジメチルプロスタ−１３−エン酸（特開平１１−３２２７０９号）等が、選択的なＥＰ１アゴニストとして知られており、本発明の範囲に属する。
また、ＥＰ１受容体に選択的な化合物ではないが、ＥＰ１およびＥＰ３両受容体に選択的な化合物として、サルプロストン（ＣＡＳ  Ｎｏ．６０３２５−４６−４）があり、本発明の範囲に属する。
またＰＧＥ１、ＰＧＥ２などは、ＥＰ１受容体に選択的ではないものの、ＥＰ１受容体作働活性を有しているので、ＰＴＳＤの治療に使用することができると考えられる。
［毒性］
上記に示した化合物は、医薬品として使用するために十分安全であることが確認されている。
産業上の利用の可能性
［医薬品への適用］
本発明化合物であるＥＰ１アゴニストまたはその非毒性塩をＰＴＳＤの治療および／または予防の目的で用いるには、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人当たり、一回につき、１ｍｇから１００ｍｇの範囲で一日一回から数回経口投与されるか、または成人一人当たり、一回につき、０．１ｍｇから１０ｍｇの範囲で一日一回から数回非経口投与（好ましくは、静脈内投与）されるか、または一日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与される。
もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。
本発明化合物を投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。
このような固体組成物においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えばラクトース、マンニトール、マンニット、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混和される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解補助剤を含有してもよい。錠剤または丸剤は必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースフタレートなどの胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよいし、また２以上の層で被膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液体組成物においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール）に含有される。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有してもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第２，８６８，６９１号および同第３，０９５，３５５号明細書に詳しく記載されている。
本発明による非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらはバクテリア保留フィルターを通すろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟膏、塗布剤、直腸内投与のための坐剤および腟内投与のためのペッサリー等が含まれる。
発明を実施するための最良の形態
ＥＰ１アンタゴニストが、ＰＴＳＤと同様の症状を示すことは、例えば、以下の実験により、示された。
実験例１：ＬＰＳ惹起ＡＣＴＨ産生に対するＥＰ１アンタゴニストの効果
［実験方法］
Ｃ５７ＢＬ／６系マウスに感染性ストレスとしてＬＰＳ（リポポリサッカライド）を０．１ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与した。これによって惹起されるストレス反応、すなわち、視床下部−下垂体−副腎系の活性化を、ＬＰＳ投与６０分後に血液を採取し、血漿中のＡＣＴＨをマーカーとして測定した。ＡＣＴＨの測定はＡＣＴＨ  ＩＲＭＡキット（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｙｕｋａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行なった。ＥＰ１アンタゴニスト（４−［２−（Ｎ−イソブチル−２−フラニルスルフォニルアミノ）−５−トリフルオロメチルフェノキシメチル］桂皮酸（ＷＯ９８／２７０５３号、実施例１８（９４）記載の化合物を用いた。）は、ＬＰＳ投与１時間前に処置した。
［実験結果］
実験結果を表１、図１および図２に示す。図中、縦軸はＡＣＴＨ産生量を表わす。図１から野生型（ＢＬ６）マウスにＬＰＳを投与すると（ＢＬ６＋）、ＡＣＴＨ産生が増強され、ＥＰ１欠損（ＥＰ１−／−）マウスでは、その産生が有意に少ないこと、また図２から野生型マウスにＥＰ１アンタゴニストを投与するとＬＰＳ惹起のＡＣＴＨ産生量が有意に減少することが明らかである。
すなわち、ＬＰＳによって惹起されるＡＣＴＨ産生は、ＥＰ１アンタゴニスト投与群で有意に減少した。この程度は、ＥＰ１受容体欠損マウスと同程度であった。感染性刺激によるストレス性応答がＥＰ１受容体を介して起こることが示唆された。ＬＰＳは上記のＡＣＴＨ放出のほかに、発熱、運動量低下、食欲不振および睡眠量増加などの病的な行動を誘発することが知られている。そこで、ＬＰＳ投与により誘発される行動量減少に対するＥＰ１受容体の影響を検討した（下記実験例２）。
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実験例２：ＬＰＳ惹起の自発運動量低下に対するＥＰ１アンタゴニストの影響
［実験方法］
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＬＰＳを０．１ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与し、アクリル製のケージ（３０×４５×３５ｃｍ（高さ））に入れ、夜８時から翌朝８時までの１２時間の行動量をマウス行動計、Ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｈｏｔｏ  ｂｅａｍｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で測定した。ＥＰ１アンタゴニスト（実験例１と同じものを用いた。）は０．１％（Ｗ／Ｗ）で餌にまぜて与えた。同様に、野生マウス（ＷＴ）とＥＰ１受容体欠損マウスを用いて、ＬＰＳによる行動量の違いを比較した。
［実験結果］
実験結果を図３および図４に示す。図中、縦軸は自発運動量を野生型（ＷＴ）マウスのＬＰＳ非投与群を基準（１００）とする相対評価値を表わす。野生型マウスにＬＰＳを投与すると、自発運動量が減少するが、ＥＰ１欠損マウスでは、自発運動量の低下の割合が少ないことを示す。
ＥＰ１受容体欠損マウスにＬＰＳを投与すると、野生マウス（ＷＴ）に比べて自発運動量の低下はあまり認められなかった（図３）。また野生マウスにＥＰ１アンタゴニストを処置した場合でも、ＬＰＳによって惹起される自発運動量の低下が減弱した（図４）。これらのことから、ＬＰＳなどの感染性ストレスによる行動学的反応にもＥＰ１受容体が関与することが示唆された。
実験例３：ＥＰ１アンタゴニストによるプラットフォームからの跳び降り行動
［実験方法］
野生マウス（ＷＴ）、ＥＰ１またはＥＰ３受容体欠損マウスまたはＥＰ１アンタゴニスト（実験例１と同じものを用いた。）を１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内に投与されたＷＴマウスを約２０ｃｍの高さのプラットホーム（ビーカー）にのせて、飛び降り行動の有無を観察した。
［実験結果］
実験結果を図５に示す。図中、横軸は経過時間、縦軸は跳び下りたマウスの割合を表わし、▲印は野生型（Ｗｉｌｄ）マウス（ＷＴ）およびＥＰ３受容体欠損マウス（ＥＰ３−／−）、○印はＥＰ１受容体欠損マウス、●印はＥＰ１アンタゴニスト投与野生型マウスのデータを示す。
野生マウスは７分間放置しても、プラットフォームに留まっているのに対し、ＥＰ１受容体欠損マウスでは、１分後から跳び降りるマウスが見られ、７分後には、全てのマウスが跳び降りた。ＥＰ１アンタゴニスト投与群も、ＥＰ１受容体欠損マウスと同様、７分後には全てのマウスがプラットフォームから跳び降りた。
実験例４：音響刺激に対する驚愕反応におけるＥＰ１受容体欠損の影響
［実験方法］
音響刺激に対する驚愕反応はＫ．Ｎａｋａｍｕｒａらにより報告されている方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３，１７９−１８９，２００１）と同様にＳＲ−Ｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行なった。つまり、野生マウス（ＷＴ）またはＥＰ１受容体欠損マウスをチャンバー内に入れ、７０ｄＢの音に１０分間馴らした後、８０、９０、１０、１１０または１２０ｄＢの音響刺激（４０ミリ秒で６回）を与え、２００ミリ秒間の驚愕反応の有無を観察した。驚愕の有無はチャンバー床に設置した電極からマウスの筋収縮を測定することで判定した。
［実験結果］
実験結果を図６に示す。図中、横軸は音響刺激の大きさ（ｄＢ）、縦軸は音響刺激に対する反応（ｓｔａｒｔｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を表わし、●印はＥＰ１受容体欠損マウス、○は野生型マウス（Ｗｉｌｄ）のデータを示す。
ＥＰ１受容体欠損マウスでは野生マウスに比べ音響刺激に対する反応が亢進していたが、この音響刺激に対する反応の亢進は、ＰＴＳＤや脳内のドパミンの代謝が亢進しているときに認められることが知られている。
実験例５：電撃刺激誘発マウスの攻撃的行動におけるＥＰ１受容体欠損の影響
［実験方法］
２匹の雄マウス（野生マウス（ＷＴ）またはＥＰ１受容体を欠損したマウス）を３Ｌのガラス容器に入れ、電撃刺激（１Ｈｚ、２００ｍ秒、０．３ｍＡで３分間）を加えたのち、攻撃的行動をビデオ録画した。１回目の攻撃行動にいたるまでの時間（ｌａｔｅｎｃｙ；秒）と攻撃回数および総攻撃時間を比較した。
［実験結果］
実験結果を図７に示す。図中、左から「１回目の攻撃を仕掛けるまでの時間（ｌａｔｅｎｃｙ  ｏｆ  １ｓｔ  ｆｉｇｈｔｉｎｇ）」  、「攻撃回数（ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｆｉｇｈｔｓ）」、および「総攻撃時間（ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｇｈｔｉｎｇ）」を表わす。ＥＰ１受容体欠損マウス（黒色）は野生型（ＷＴ）マウス（灰色）と比較して、１回目の攻撃を仕掛けるまでの時間が短く、攻撃回数が多く、総攻撃時間も明らかに長かった。
実験例６：マウスの社会的行動におけるＥＰ１受容体欠損の影響
［実験方法］
野生マウス（ＷＴ）またはＥＰ１受容体欠損マウスを、若い雄マウス（５週齢）と同居させた場合に認められる行動を観察した。攻撃的行動の総時間（観察時間の％）と嗅ぐ行動（関心を示す社会的行動と考えられる）の総時間を測定し、比較した。
［実験結果］
実験結果を図８に示す。図中、縦軸は嗅ぐ行動時間の総時間に対する割合（Ｃｕｍｕｒａｔｉｖｅ）（％）を表わす。野生（ＷＴ）マウス（○印）では若い雄と同居した場合、嗅ぐ行為を示し、ほとんど攻撃的な行動は示さない。この行動は、見知らぬ若い雄に対し関心を示す自然な社会的行動と理解されている。ＥＰ１受容体欠損マウスでは嗅ぐ行動時間が短く、ある程度の間隔をおいて頻繁に攻撃的行動を示した。また野生マウスにＥＰ１アンタゴニストを投与することによっても嗅ぐ行動時間が短縮されることが確認された。
これらのことから、ＥＰ１受容体を欠損することで、社会的行動が損なわれ、突然攻撃的になることが示唆された。また、ＥＰ１受容体欠損マウスにＬＰＳを投与した場合、攻撃性がさらに亢進することが確認された。つまり、ＬＰＳ投与によって衰弱した病的状態に陥った時、ＥＰ１受容体を欠損することで招来され得る社会性行動の異常は、より顕在化することが示唆された。
実験例７：脳内モノアミン代謝におけるＥＰ１受容体欠損の影響
［実験方法］
野生（ＷＴ）マウスまたはＥＰ１受容体欠損マウスを、マイクロウェーブ処理した後、脳を摘出し、種々の領域に分画した。モノアミンとその代謝物は０．２Ｍの過ヨウ素酸で抽出し、ＨＰＬＣにて定量した。
［実験結果］
実験結果を図９および図１０に示す。図中、縦軸は、ＥＰ１受容体欠損マウスでの大脳皮質のドパミン（ＤＡ）およびセロトニン（５−ＨＴ）に対するその代謝物の比（ドパミンまたはセロトニンを１００とする）を示す。また、ＤＯＰＡＣは３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、ＨＶＡは３−メトキシ−４−ヒドロキシ−フェニル酢酸を表わし、これらはいずれもＤＡ（ドパミン）の代謝物である。５−ＨＩＡＡは５−ヒドロキシインドール酢酸を表わし、これは５−ＨＴ（セロトニン）の代謝物である。
ＥＰ１受容体欠損マウスでは大脳皮質においてドパミンに対するその代謝物の比が上昇し、ドパミン代謝が亢進していたが、セロトニン代謝はあまり亢進していない（図９）。また、ＥＰ１受容体欠損マウスでは線状体においてもドパミンに対するその代謝物の比が上昇し、ドパミン代謝が亢進していたが、セロトニン代謝はあまり亢進していない（図１０）。これらのことが、攻撃性や行動量の増加に関係していると考えられる。
実験例８：ハロペリドール（ドパミン拮抗薬）投与による影響
ハロペリドールを投与したＥＰ１受容体欠損マウスに実験例６と同様の実験を行なった結果、１回目の攻撃を仕掛けるまでの時間が延長し、攻撃回数が減少し、総攻撃時間が短縮することが確認された。
なお、ＥＰ１受容体欠損マウスにハロペリドールを投与すると、自発運動が低下することも確認された。
このことから、ドパミンに拮抗することによって攻撃性が減弱することが示唆される。
実験例９：脳内ニューロンにおけるｃ−Ｆｏｓ発現並びにＥＰ１の局在に関する実験
［実験方法］
ｃ−Ｆｏｓの発現（ｃ−ＦｏｓＩＲ）を免疫学的に検出するため、２時間前にＬＰＳ投与したマウスをペントバルビタールで麻酔処置して、氷冷した生理食塩水を血管内灌流し、その後ザンボニ溶液（０．２１％、２，４，６−トリニトロフェノールおよび２％パラホルムアルデヒドの０．１Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．３））で処置した。
マウスの脳と下垂体を摘出し、４％パラホルムアルデヒド（０．１Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．３，リン酸緩衝液））に１０時間固定した後、２５％スクロース液中による保冷下でインキュベートした。３０μｍの厚さで切片を作製し標本として用いた。
次いで、標本を０．９％塩化ナトリウムおよび０．３％トリトンＸ−１００（ＰＢＳ−トリトン）を含有する１．５％正常ヤギ血清の０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）溶液を２時間室温で前処置した後、その部分を最初に抗ｃ−Ｆｏｓウサギポリクローナル抗体（２０００倍希釈；Ａｂ−５，オンコゲンサイエンス）で、まず、１２時間インキュベートした。引き続き、ウサギＩｇＧに対するビオチン化したヤギ抗体（２００倍希釈；ベクター研究所）で２時間インキュベートし、最後にアビジン−ビオチン複合体（１００倍希釈）（ベクタステインＡＢＣ−ＰＯキット；ベクター研究所）で室温で１時間インキュベートした。リン酸緩衝液で洗浄後、標本は０．０２％ジアミノベンジジン四塩酸塩と、０．０１％過酸化水素を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）で処置した。定量分析のため、最も大きい核（ＣｅＡ、ＰＶＮ、ＮＴＳ）または下垂体前葉について、ｃ−Ｆｏｓ−ＩＲ染色細胞の数を計数した。これら二つの部分の平均値をそれぞれのマウスの代表スコアとした。
ＥＰ１およびチロシン水酸化酵素（ＴＨ）を免疫染色（Ｃ）するために、十分に麻酔したマウスをプロテアーゼ阻害剤（１０μＭ  ｐ−アミジノフェニル−メタンスルホニルフルオラリドおよび１μｇ／ｍｌのロイペプチン）を含有した氷冷ＰＢＳで５分間灌流した。
脳を液体窒素で凍らせ、１０μｍの厚さの切片を作製した。その標本を最初９５％エタノールで−２０℃で３０分間処置し、その後１００％アセトンで３分間室温で処置し、抗ＥＰ１ウサギポリクローナル抗体（４００倍希釈）および１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈した抗ＴＨマウスモノクローナル抗体（１００倍希釈）でインキュベートし、最後にそれぞれフルオレセイン（蛍光分子）およびテキサスレッド（アマシャム社）でラベルした抗ウサギまたは抗マウス二次抗体でインキュベートした。
抗ＥＰ１抗体の特異性をチェックするため、一過的にＥＰ１、ＥＰ３またはＬａｃＺタンパクのいずれかを発現したＣＯＳ−７細胞は脳切片標本と同様の方法に沿って固定した。そして抗ＥＰ１抗体を用いて免疫染色に付した。蛍光画像は共焦点レーザー操作顕微鏡（ＢｉｏＲａｄＭＲＣ−１０２４）で得た。
［実験結果］
（Ａ）ネイティブなＣＯＳ細胞（Ｍｏｃｋ）、またはＥＰ１もしくはＥＰ３受容体を発現させたＣＯＳ細胞と抗ＥＰ１抗体との免疫蛍光染色の結果、抗ＥＰ１抗体は培養細胞において発現したＥＰ１受容体を特異的に染色し、ＭｏｃｋおよびＥＰ３発現細胞は染色しなかった。
（Ｂ）ＷＴまたはＥＰ１受容体欠損マウスから調製した脳部位を用いて抗ＥＰ１抗体による免疫蛍光染色に付した結果、ＷＴマウスの線条体（ＣＰｕ）、室傍核（ＰＶＮ）および扁桃核（ＣｅＡ）ニューロンにおいて抗ＥＰ１抗体との特異的な免疫反応が観察された。一方、ＥＰ１受容体欠損マウスではほとんど反応が見られなかったことから、検出された免疫反応はＥＰ１受容体を表わすと示唆される。
（Ｃ）ＷＴマウスの黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ；ＳＮ）をＥＰ１とＴＨとで二重免疫蛍光染色した結果、ＥＰ１シグナルはＴＨ含有ニューロンの約５０％の表面に見られた。ニューロンの一部分にＥＰ１とＴＨが共存することから、ＥＰ１シグナリングがＴＨ含有ニューロンにおいてＴＨ発現に影響を与えるのではないかと考えられる。
（Ｄ）ＷＴマウスとＥＰ１受容体欠損マウスから脳ホモジネートを調製し、抗ＴＨ抗体を用いてウエスタンブロット解析に付した。ＴＨ免疫反応性の大きさはＥＰ１受容体欠損マウスではＷＴマウスに比して約２倍に上昇していた。
製剤例１：
以下の各成分を常法により混合したのち、打錠して、１錠中に０．５ｍｇの活性成分を含有する錠剤１００錠を得た。
・（１３Ｅ）−（１１α，１５Ｓ，１７Ｓ）−２，５−エタノ−６，９−ジ
オキソ−１１，１５−ジヒドロキシ−１７，２０−ジメチルプロスタ−１３
−エン酸・α−シクロデキストリン    ……２５０ｍｇ（含有量５０ｍｇ）
・カルボキシメチルセルロースカルシウム              ……２００ｍｇ
・ステアリン酸マグネシウム                          ……１００ｍｇ
・微結晶セルロース                                    ……９．２ｇ
製剤例２：
以下の各成分を常法により混合したのち、溶液を常法により滅菌し、１ｍｌづつバイアルに充填し、常法により凍結乾燥し、１バイアル中０．２ｍｇの活性成分を含有するバイアル１００本を得た。
・（１３Ｅ）−（１１α，１５Ｓ，１７Ｓ）−２，５−エタノ−６，９−ジ
オキソ−１１，１５−ジヒドロキシ−１７，２０−ジメチルプロスタ−１３
−エン酸・α−シクロデキストリン    ……１００ｍｇ（含有量２０ｍｇ）
・マンニット                                              ……５ｇ
・蒸留水                                            ……１００ｍｌ
【図面の簡単な説明】
図１は、野生型（ＢＬ６）マウスおよびＥＰ１受容体欠損（ＥＰ１−／−）マウスを用いて行ったＬＰＳ惹起ＡＣＴＨ産生量を示すグラフである。
図２は、野生型マウスにＥＰ１アンタゴニストを投与して産生されるＬＰＳ惹起ＡＣＴＨ量を示すグラフである。
図３は、野生マウス（ＷＴ）、ＥＰ１受容体欠損マウスを用いて行ったＬＰＳ惹起の自発運動量低下を示すグラフである。
図４は、野生型（ＷＴ）マウスにおけるＬＰＳ惹起自動運動量低下に対するＥＰ１アンタゴニストの影響を示すグラフである。
図５は、野生マウス（ＷＴ）、ＥＰ１またはＥＰ３受容体欠損マウス、ＥＰ１アンタゴニスト投与ＷＴマウスによるプラットフォームからの跳び降り行動を示すグラフである。
図６は、ＥＰ１受容体欠損マウス（●）、野生型マウス（○印）を用いて行った音響刺激に対する驚愕反応におけるＥＰ１受容体欠損の影響を示すグラフである。
図７は、ＥＰ１受容体欠損マウス（黒色）および野生型（ＷＴ）マウス（灰色）を用いて行った電撃刺激誘発マウスの攻撃的行動におけるＥＰ１受容体欠損の影響を示すグラフである。
図８は、ＥＰ１受容体欠損マウスおよび野生（ＷＴ）マウスを用いて行ったマウスの社会的行動におけるＥＰ１受容体欠損の影響を示すグラフである。
図９は、野生（ＷＴ）マウス（白色）およびＥＰ１受容体欠損マウス（黒色）での大脳皮質のドパミン（ＤＡ）およびセロトニン（５−ＨＴ）に対するその代謝物の比（ドパミンまたはセロトニンを１００とする）を示すグラフである。
図１０は、野生（ＷＴ）マウス（白色）およびＥＰ１受容体欠損マウス（黒色）での線条体のドパミン（ＤＡ）およびセロトニン（５−ＨＴ）に対するその代謝物の比（ドパミンまたはセロトニンを１００とする）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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