(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラビリンチュラ属スラウストキトリウム種に属するアスタキサンチン及びカンサキサンチン生産菌スラウストキトリウムエスピーＣＨＮ−３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５５６）。
【請求項２】
請求項１記載の微生物を培養し、菌体中にアスタキサンチン及びカンサキサンチンを蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒抽出処理によりアスタキサンチン及びカンサキサンチンを回収することを特徴とするアスタキサンチン及びカンサキサンチンの製造方法。
【請求項３】
培養をｐＨ４〜１２、酸素リッチの条件下で行う請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
培養を、栄養源として、ショ糖、グルコース及びフルクトースの中から選ばれる少なくとも１種の糖類を用いて行う請求項２又は３記載の製造方法。
【請求項５】
培養を光照射下で行う請求項２、３又は４記載の製造方法。
【請求項６】
ラビリンチュラ属スラウストキトリウム種に属するアスタキサンチン及びカンサキサンチン生産菌スラウストキトリウムエスピーＣＨＮ−３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５５６）の培養物、菌体又は菌体処理物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種に属する新規な微生物及びそれを用いて天然カロチノイドのアスタキサンチン及びカンサキサンチンを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アスタキサンチン及びカンサキサンチンは、微生物の菌体、藻類、微細藻類あるいは植物や動物に天然カロチノイドとして広く存在する色素であり、老化防止剤、解毒剤、ガン予防剤、養殖魚類の色調改善剤として利用されている。
これらの天然カロチノイド中のアスタキサンチンは、オキアミやズワイガニの殻から抽出されているが、これらにおける含有量が極めて低い上に、抽出条件がむずかしく、しかも海洋の限られたところにのみ生息する生物資源であることから、安定した原料供給を確保することが困難であるため、工業的生産には不向きである。
【０００３】
また、アスタキサンチンは赤色酵母（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）により生産されるが、この赤色酵母は増殖速度が遅く、生産量が少ない上に、強固な細胞壁を有するため、生産されたアスタキサンチンの抽出が困難な上に、（３Ｒ，３Ｒ´）体の含有率が高く、化学構造が天然のアスタキサンチンとは反対の配置をとる化合物を副生するため、生産効率が低くなるのを免れない。
【０００４】
そのほか、アスタキサンチンを生産する緑藻類（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ）も知られているが、これは増殖速度が遅く、細胞壁が強固であるため、生産効率が低い上に、雑菌の汚染を起しやすく、しかも特殊な培養装置を用いて強い光を照射しながら培養する必要があるなど、製造上種々の制約を伴うため、工業的に実施するには多くの問題がある。
【０００５】
一方、カンサキサンチンについては、ある種のキノコ、魚類、甲殻類中に存在し、またブレビバクテリウム属、ロドコッカス属に属する微生物により生産されることが知られており、化学合成により人工的に得る方法も開発されているが、いずれも生産効率が低いため、工業的な生産は行われていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、従来方法のもつ欠点を克服し、入手容易な原料から、簡単かつ効率よくアスタキサンチン及びカンサキサンチンを大量生産しうる方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、瀬戸内海で採取された海洋性微生物の生態について種々研究を重ねた結果、その中にアスタキサンチン及びカンサキサンチンの生産能力の高い新規な微生物が存在すること、したがってこの微生物を培養することにより、アスタキサンチン及びカンサキサンチンを効率よく製造しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ラビリンチュラ属スラウストキトリウム種に属するアスタキサンチン及びカンサキサンチン生産菌スラウストキトリウムエスピーＣＨＮ−３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５５６）、及びこの微生物を培養し、菌体中にアスタキサンチン及びカンサキサンチンを蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒抽出処理によりアスタキサンチン及びカンサキサンチンを回収することを特徴とするアスタキサンチン及びカンサキサンチンの製造方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の微生物の形態を示す顕微鏡写真である。この図から分るように、本発明の微生物は、ヤブレツボカビ類のスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の特徴である球形ないし長円球状の外質ネットをもつ細胞からなっており、かつサゲノジェネートソームが細胞体の１か所のみに存在し、そこから外質ネットを伸長させて基質に進入又は付着する性質を有している。これらの点を参考にして、このものがヤブレツボカビ類に属すると判断された。
【００１０】
また、図２に示す生活環が形成され、グルコースやフルクトースのような糖、酵母エキス、コーンスティープリカーのようなタンパク質などの有機物に富んだ培地では、アメーバ状細胞が現れるが、この点はウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属とは大きく異なっていること、及び２種類のべん毛を有する遊走子を形成する点でスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種と異なっていることから、スラウストキトリウムと同定される［生物研究社発行，「海洋と生物１３２」，第２３巻，第１号，第１５ページ（２００１）］。
また１８ＳｒＤＮＡに基づく分子系統樹においてもスラウストキトリウムであることの裏付けが得られた。
【００１１】
そして、本発明の微生物は、その栄養細胞が卵形ないしは球形である点で、紡錘形のラビリンチュラ種とは容易に区別されることから、ラビリンチュラ属のスラウストキトリウム種に分類されるものである。この種の菌は、海洋環境に広く存在し、従属栄養で増殖する、いわゆる海生菌として知られる。
【００１２】
本発明の微生物は、以下に示す菌学的性質から、容易に公知の微生物と区別することができる。
Ｉ．形態学的性質
（１）細胞の大きさは、１０μｍで卵形である。
（２）１０μｍの卵形の遊走子にヘテロコントな鞭毛を有し、運動をする。
ＩＩ．培養的性質
（１）糖質寒天培地で色はピンク、表面はツルツルで生育は早い。
（２）液体培養では、２４時間で混濁し、ピンクの色を呈する。
１リットル当り３０ｇ以上のバイオマスが得られる。
ＩＩＩ．生理的性質
（１）アスタキサンチンとカンサキサンチンを有して、ピンク色である。
（２）有機無機の窒素を利用して増殖する。
（３）ｐＨは５〜９、温度は１５〜３５℃が最適生育条件である。
（４）グルコースやフルクトースを利用してＤＨＡ，ＥＰＡを多量につくる。
これまでのラビリンチュラ属スラウストキトリウム種は、ＤＨＡを高含量有し色素を有していなかった。
また、細菌に関しての試験においては、いずれもマイナスであり、細菌の分類には該当しないことが確認された。
【００１３】
このようにして、新菌であることが確認された本発明の微生物、すなわちスラウストキトリウムエスピーＣＨＮ−３は、受託番号ＣＨＮ−３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５５６）として産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１４】
本発明の微生物は、海洋に生息する１０μｍ程度の単細胞であり、例えば瀬戸内海の海水中から容易に採取される。原体の採取は、海水中に黒松の花粉を懸濁させ、数日放置したのち、松の花粉を分別し、花粉表面に付着した微生物体を集めることにより行うことができる。
【００１５】
次に、このようにして採取した原体を、糖類培地、すなわち糖類とペプトンを豊富に含む培養液（例えば海水１リットル中にグルコース５０ｇとペプトン１ｇを含む培地）中で純粋培養する。本純粋培養は、一定温度において光を連続照射しながら、通気撹拌条件で行うのが好ましい。
【００１６】
このようにして、培養で得られたスラウストキトリウムの細胞を乳鉢で破砕し１００％アセトンで抽出し、ＯＤＳＣ１８のカラムを装着した高速液体クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー質量分析計で分離、同定した。このようにして得た液体クロマトグラムを図３に示した。その結果、色素はα‐、β‐カロテン、エキネノン、カンサキサンチン、フェノコキサンチン、アスタキサンチンからなっていることが分った。
【００１７】
本発明のスラウストキトリウムエスピーＣＨＮ−３は、このようなα‐、β‐カロテン、エキネノン、フェノコキサンチン、アスタキサンチンを生産し、特にアスタキサンチン及びカンサキサンチンを大量に細胞内に保有することにより赤色に着色するが、これまで知られているスラウストキトリウムが属するラビリンチュラ属の微生物では、このような能力を有していることは知られていなかった。
【００１８】
このラビリンチュラ属のスラウストキトリウム種に分類される微生物スラウストキトリウムエスピーＣＨＮ−３は、糖類、有機窒素、無機塩からなる培地（培養液）中で培養することができる。
この際の糖類の例としては、グルコース、ショ糖、フルクトースやそれらを含むもの、例えば水飴などを、有機窒素の例としては、ペプトン、酵母エキスなどを、無機塩の例としては、塩化ナトリウムや塩化カリ、無機リンなどを挙げることができる。
【００１９】
グルコース、有機窒素、光エネルギー、無機のリンで生育する微生物であるが、その生産機能を最大限に発揮させるためには光エネルギーとしての照度、温度、培地中の元素組成及び酸素供給量を適切に調整することが必要である。
【００２０】
例えば、純粋培養の条件としては、空気撹拌、光照射は１，０００ルックス以上、温度は２０〜３０℃、好ましくは２８℃前後である。培地中のリンの供給源は、ＫＨ2ＰＯ4が好ましく、その量としては０．１〜３ｇ／リットルの範囲が好ましい。また、ラビリンチュラが生育できる範囲（海水１リットルにグルコース６０ｇ、ペプトン１ｇ、ＫＨ2ＰＯ4１ｇ）の中で、生育が止まると、培地中の栄養元素が一定になるように調整することにより、アスタキサンチン及びカンサキサンチンのそれぞれの生産量を選択的に高めることができる。この培養は、ｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲で行われ、ｐＨが高くなるほど生産量は向上する。
【００２１】
さらに、前記したように培養条件、特に培地中の窒素源組成を変化させることにより、スラウストキトリウムへの刺激を強くすると、アスタキサンチン及びカンサキサンチンの生産をさらに増加させることができる。
【００２２】
したがって、アスタキサンチン及びカンサキサンチンを高収率で製造するには、スラウストキトリウムの生育環境条件を極限条件に保持して、アスタキサンチン及びカンサキサンチンの生産機能を最大限に引き出すのが有利である。それには、例えば酵母エキスを最初の培地から減少させるのが効果的である。
【００２３】
すなわち、培地から窒素源である酵母エキスを少なくすると、アスタキサンチンの含量が微生物体（乾物）１ｇ中に１、５３７ｍｇという高い値に増大する。その時点で酵母エキスを含有しない培養液に変えると、スラウストキトリウムの細胞に取り込まれる窒素が存在しないので、アスタキサンチン含量が微生物体（乾物）１ｇ中約２ｍｇに増大する。
【００２４】
また、本発明方法により、アスタキサンチンを製造する場合には、最初酵母エキスを添加した培地を用いて培養し、酵母エキスが消費された後は、窒素源を補給せずに、窒素源無添加条件下で培養するのがよい。このようにして窒素源無添加培地で培養することにより、通常のように窒素添加して行う場合に比べ、アスタキサンチンの収量はそれぞれ５倍以上になる。また、この際、酸素リッチの条件下で培養すると、アスタキサンチンの収量を上げることができる。
【００２５】
カンサキサンチンを製造する場合には、最初酵母エキスを添加した培地を用いて培養し、酵母エキスが消費された後は、窒素源を補給し、絶えず窒素源添加条件下で培養するのがよい。このようにして窒素源添加培地で培養することにより、窒素無添加して行う場合に比べ、カンサキサンチンの収量はそれぞれ４〜５倍以上になる。
【００２６】
次に、このようにして得られたアスタキサンチン及びカンサキサンチンを多量に含む微生物から効率的にアスタキサンチン及びカンサキサンチンを抽出するには、クロロホルム−メチルアルコール溶液を用いるのが好ましい。
【００２７】
このようにして、産生したアスタキサンチン及びカンサキサンチンが微生物体から分離される。そして、次にその溶液をシリカゲル充填カラムを通し、メチルアルコール混合溶液で展開することにより、１００％の収率でアスタキサンチン及びカンサキサンチンを回収することができる。通常、メチルアルコール混合溶媒としては、メチルアルコール９０〜９５体積％で残りがクロロホルムのものが用いられる。
【００２８】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
瀬戸内海長浜地区の海水にクロマツの花粉を懸濁して採取したスラウストキトリウムエスピーＣＨＮ−１を純化したスラウストキトリウムエスピーＣＨＮ−３を、海水中に、グルコース６０ｇ／リットル、ペプトン１ｇ／リットル、リン酸二水素カリウム１ｇ／リットル及びリン１ｇ／リットルを含む糖類に富んだ培地（ｐＨ５．０）に接種し、温度２８℃、１０００ルックスの光照射下、換気し、かき混ぜながら６日間培養した。次いで培養液を遠心分離して、微生物体を捕集した。このようにして得た顕微鏡写真を図１に示す。
【００３０】
次に、上記の微生物をアセトン、クロロホルム、メチルアルコールで抽出し、この抽出液をシリカゲル（和光純薬社製，商品名「ワコーゲル」）を充填したカラムに通し、吸着させたのち、ヘキサン−クロロホルム−メチルアルコールで展開することにより、海水１リットル当りアスタキサンチン及びカンサキサンチンをそれぞれ８．８ｍｇ、６．５ｍｇ得た。微生物の含有量（アスタキサンチン及びカンサキサンチンは微生物乾燥体中での濃度）は、乾燥微生物体１ｇ中にアスタキサンチン２．８ｍｇ、カンサキサンチン２．０ｍｇであった。実施例１で得られるカロチノイドの高速液体クロマトグラムを図３に示す。図中の符号は以下の化合物に対応するものである。１：アスタキサンチン、２：フェノコキサンチン、３：カンサキサンチン、４：エキネノン、５：α‐カロチン、６：β‐カロチン。
【００３１】
実施例２
海水中に、グルコース５０ｇ／リットル、ペプトン１ｇ／リットル及びリン酸二水素カリウム１ｇ／リットルを含む培地を用い、温度２３℃において、（イ）照度１０００ルックスで培地を１００ｒｐｍで振とう回転する培養、（ロ）暗所で培地を１００ｒｐｍで振とう回転する培養、（ハ）照度１０００ルックスで静置する培養、及び（ニ）照度１０００ルックスで空気を供給して撹拌する培養により、スラウストキトリウムエスピーＣＨＮ−３を６日間培養した。その結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
この表から分るように、静置培養ではほとんどアスタキサンチンを生産しない。また振とう回転培養では光を照射した方が多くのアスタキサンチンを得ることができる。さらに酸素供給を高めるために空気を供給する方法を用いることにより、アスタキサンチンの収量を１．８倍向上させることができた。このように培養における好気条件を変えることにより、アスタキサンチンの生成比を変えることができるし、培養液中の酸素濃度を高めることによりアスタキサンチンの生成比率を高めることができる。
【００３４】
実施例３
実施例１の糖類培地のｐＨを変化させた場合の実験を１４日間継続し、アスタキサンチンの生産量を求め、グラフとして図４に示す。この図から明らかなように、ｐＨの上昇とともにアスタキサンチンの生産量は増大する。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によると、特にアスタキサンチン、カンサキサンチンを高含量で含むスラウストキトリウムそのものを純粋に大量培養でき、かつこれからアスタキサンチン及びカンサキサンチンを簡単に抽出分離することができ、高収率で高純度のアスタキサンチン、カンサキサンチン又は所望に応じアスタキサンチン及びカンサキサンチンの組成の細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明微生物の電子顕微鏡写真。
【図２】  スラウストキトリウムの生活環を示す説明図。
【図３】  実施例１で得た培養物の高速液体クロマトグラム。
【図４】  アスタキサンチンの生産量とｐＨの関係を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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