(57)【要約】本発明は、配列番号１に記載のヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域は他の蛋白質と相互作用可能な部位であるとの知見に基づいた該領域の一部を含むエピトープを特異的に認識する抗体を提供する。該抗体は、ヒトＣＤ１４と他の蛋白質との相互作用を阻害し、細胞活性化を抑制することができる。本発明は、また該抗体または断片を産生するハイブリドーマ、該特定領域のアミノ酸を含むペプチド、該ペプチドを免疫源とする抗体の作成方法、ないしＣＤ１４、ＴＬＲおよび被検物質との接触工程を含む敗血症治療薬のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗ＣＤ１４抗体。
【請求項２】
ＣＤ１４とＴｏｌｌ　Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）との結合阻害剤である請求の範囲１に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である請求の範囲１または２に記載の抗体。
【請求項４】
請求の範囲３に記載の抗体の生物学的に活性のあるＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２である断片。
【請求項５】
ハイブリドーマＦ１０２４−１−３（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５１１）により産生されるＦ１０２４−１−３モノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号３、４、５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち少なくとも一つを有する抗ＣＤ１４モノクローナル抗体。
【請求項７】
配列番号３、４、５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも一つを有するヒト化抗体またはキメラ抗体。
【請求項８】
配列番号３、４、５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも一つを有するペプチド。
【請求項９】
請求の範囲３〜５のいずれかに１つに記載の抗体若しくは抗体の断片を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
配列番号１に記載のヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むペプチド。
【請求項１１】
請求の範囲７に記載のペプチドを免疫原として用いる、ＣＤ１４とＴＬＲの結合阻害剤である抗体の作成方法。
【請求項１２】
配列番号３、４、５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲをエンコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗ＣＤ１４ヒト化抗体の遺伝子を産生させることを特徴とする抗ＣＤ１４ヒト化抗体の作成方法。
【請求項１３】
請求の範囲１〜８のいずれか１つに記載の抗体若しくはペプチドを有効成分として含む敗血症用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗ＣＤ１４抗体及びその断片、該抗体または断片を産生するハイブリドーマ、ペプチド、抗体の作成方法、および敗血症用医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗ＣＤ１４抗体、ＣＤ１２とＴｏｌｌ　Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）との結合阻害剤である該抗体、配列番号３、４、５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列をＣＤＲとして有する抗ＣＤ１４モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、該アミノ酸配列を有するペプチドおよび敗血症用医薬組成物に関する。
背景技術
ＣＤ１４は、３５６個のアミノ酸からなる糖蛋白であり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ：ＧＰＩ）によりマクロファージ、単球、クッパー細胞、好中球および一部Ｂ細胞の膜上にアンカリングされて存在する。
ヒトＣＤ１４は、膜結合型ＣＤ１４（以下ｍＣＤ１４ともいう）のほかに可溶型ＣＤ１４（以下ｓＣＤ１４または可溶性ＣＤ１４ともいう）がある。そして血中には分子量の異なる複数のｓＣＤ１４が存在することが報告されている（Ｌａｂｅｔａ　ＭＯ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：２１４４，１９９３）。
ヒトＣＤ１４は、グラム陰性桿菌内毒素のＬＰＳ受容体として知られており（Ｗｒｉｇｈｔら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１４３１，１９９０）、血中のＬＢＰ（ＬＰＳ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）からＬＰＳを受け取り、複合体を形成する。
ｍＣＤ１４を発現しているマクロファージ等は、ＬＰＳとｓＣＤ１４の複合体により活性化され、炎症性サイトカインの産生を誘導する（Ｈａｉｌｍａｎｎ　Ｅら：Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，１５６：４３８４，１９９６）。
ｍＣＤ１４を発現していないといわれている血管内皮細胞や血管平滑筋細胞は、ｓＣＤ１４とＬＰＳの複合体（以下ｓＣＤ１４／ＬＰＳともいう）により炎症性サイトカインの産生が誘導される（Ｌｏｐｐｎｏｗ　Ｈら：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　＆　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６３：１０２０，１９９５）。
また、グラム陰性菌ばかりでなくグラム陽性菌の菌体成分やマイコバクテリアにも反応し、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、ペプチドグリカン（ＰｅｐＧ）等の受容体として機能し、細胞の炎症性サイトカインの産生を誘導する（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　ＭＧら：Ｉｎｆｅｃｔ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６４：１９０６，１９９６）。
ＬＰＳまたはＬＴＡ等のＣＤ１４を介する細胞のサイトカイン産生は、生体に障害的な作用を及ぼし、敗血症を引き起こす。一般に、敗血症の初期症状には悪寒、多汗、発熱、衰弱等がみられ、引き続いてショックを起こす低血圧、好中球減少症、汎発性血管内血液凝固症候群、成人性呼吸窮迫症候群、呼吸不全、多臓器不全等、重篤な臨床症状が生じる。
ヒトＣＤ１４のＬＰＳのシグナルを細胞に伝達する機能は、その領域が一部明らかになっている。Ｎ末端１〜１５２番目がＣＤ１４の機能発現に必須な領域であり（Ｊｕａｎ　ＴＳら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１３８２，１９９５）、また７〜１４番目および５７〜６４番目がＬＰＳとの結合に必須な部分である（Ｊｕａｎ　ＴＳ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２９：１７２３７（１９９５）およびＪｕａｎ　ＴＳ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１０：５２１９（１９９５））。
しかし、ヒトＣＤ１４のＮ末端１５３番以降の有する機能については、まったく明らかになっていない。
また、ＣＤ１４／ＬＰＳの細胞へのシグナル伝達におけるＴｏｌｌ　ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）の関与が近年研究されている。現在までにヒトＴＬＲ１、２、３、４及び５（Ｆｅｒｎａｎｄ　Ｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：５８８，１９９８）並びにＴＬＲ６（Ｔａｋｅｕｃｈｉ　Ｏ：Ｇｅｎｅ，２３１：５９，１９９９）がクローニングされている。
ＴＬＲ２若しくはＴＬＲ４を欠損したマウスによる研究により、ＴＬＲ４がグラム陰性菌菌体成分の細胞へのシグナル伝達を、ＴＬＲ２がグラム陽性菌菌体成分の細胞へのシグナル伝達を担っている可能性があることが報告されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ　Ｏら：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１：４４３，１９９９）。またＴＬＲ２がＬＰＳの細胞内へのシグナル伝達に関与すること、さらにＴＬＲ２が細胞表面上でＬＰＳに直接反応すること、ＣＤ１４存在下では反応が増強されることが報告されている（Ｒｕｅｙ−Ｂｉｎｇ　Ｙ：Ｎａｔｕｒｅ，３９５：２８４，１９９８）。
しかしながらＣＤ１４とＴＬＲとの相互作用において、ＣＤ１４がＴＬＲもしくはＴＬＲと他の機能の解明されていない低分子物質であるアクセサリー分子の複合体と直接結合するか否かは明らかになっておらず、さらにＴＬＲとＣＤ１４の結合領域もまったく未知である。
ＬＰＳのヒトＣＤ１４を介するシグナル伝達を制御するヒト抗ＣＤ１４抗体として、ヒトＣＤ１４の７〜１４番目に結合する３Ｃ１０抗体（Ｓｔｅｉｎｍａｎ：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２６（１９８３）およびＪｕａｎ　ＴＳ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：２９，１７２３７（１９９５））および５７〜６４番目に結合するＭＥＭ−１８抗体（Ｂａｚｉｌ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１５８３（１９８６）およびＪｕａｎ　ＴＳ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１０，５２１９（１９９５））が知られており、敗血症治療薬への応用が開示されている。
さらに、ＬＰＳの結合を抑制し、サイトカインの放出を抑制する２８Ｃ５抗体および２３Ｇ４抗体、並びにＬＰＳの結合は一部しか抑制せず、サイトカインの放出を抑制する１８Ｅ１２抗体（特表平８−５１０９０９号）が開示されている。
また、グラム陽性細菌及びマイコバクテリアとの作用に対する抗ＣＤ１４抗体も開示されている（特表平１０−５０５８３９号）。
しかし敗血症治療薬として用いる場合、ＬＰＳの結合領域を認識する抗体、またはＬＰＳの結合を抑制する抗体は、形成したＬＰＳ／ＣＤ１４のシグナル伝達を抑制する効果は期待できない。また、ＬＰＳのＣＤ１４への結合を特異的に阻害するため、グラム陽性菌の菌体成分及びマイコプラズマ等によるシグナル伝達を抑制する効果も期待できない。また、１８Ｅ１２抗体はＣＤ１４の認識部位が明らかになっておらず、サイトカインの放出を抑制する機序も不明である。
また上記のとおり、ＣＤ１４／ＬＰＳの細胞へのシグナル伝達におけるＴＬＲの関与が知られているが、この関与を阻害する物質が、シグナル伝達を調節することが可能か否かは定かではなく、また阻害する物質はまったく知られていない。
発明の開示
本発明は、形成されたＣＤ１４／ＬＰＳであっても細胞内へのシグナル伝達を調節しうる抗ＣＤ１４抗体、及びその生物学的に活性のある断片、特定のアミノ酸配列をＣＤＲとして有する抗体、該抗体または断片を産生するハイブリドーマ、ヒトＣＤ１４の特定領域のアミノ酸を含むペプチド、該ペプチドを免疫源とする抗体の作成方法、敗血症用医薬組成物を提供することを目的とする。
発明者らは、上記のような従来の問題点を克服するため鋭意検討を行い、ヒトＣＤ１４を介する細胞活性化を抑制する抗体であって、形成されたＣＤ１４／ＬＰＳであっても細胞内へのシグナル伝達を調節しうる抗ＣＤ１４抗体を提供する。また特定のアミノ酸配列をＣＤＲとして有するモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体を提供する。さらにはＴＬＲとの結合を抑制する抗体を提供する。
また抗ヒトＣＤ１４抗体が該作用をするために必要な認識領域のＣＤ１４における特定により、その特定領域を用いた抗体の作成方法、及びＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する物質を有効成分とする敗血症用医療組成物を提供する。
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１１）の抗ＣＤ１４抗体、（１２）の抗ＣＤ１４ヒト化抗体の作成方法、および（１３）の医薬組成物を提供する。
（１）配列番号１に記載のヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗ＣＤ１４抗体。
（２）ＣＤ１４とＴｏｌｌ　Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）との結合阻害剤である上記（１）の抗体。
（３）モノクローナル抗体である上記（１）または（２）に記載の抗体。
（４）上記（３）の抗体の生物学的に活性のあるＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２である断片。
（５）ハイブリドーマＦ１０２４−１−３（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５１１）により産生されるＦ１０２４−１−３モノクローナル抗体。
（６）配列番号３、４、５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち少なくとも一つを有する抗ＣＤ１４モノクローナル抗体。
（７）配列番号３、４、５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも一つを有するヒト化抗体またはキメラ抗体。
（８）配列番号３、４、５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも一つを含むペプチド。
（９）上記（３）〜（５）のいずれかの抗体若しくは抗体の断片を産生するハイブリドーマ。
（１０）配列番号１に記載のヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むペプチド。
（１１）上記（１０）のペプチドを免疫原として用いる、ＣＤ１４とＴＬＲの結合阻害剤である抗体の作成方法。
（１２）配列番号３、４、５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲをエンコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗ＣＤ１４ヒト化抗体を産生させることを特徴とする抗ＣＤ１４ヒト化抗体の作成方法。
（１３）上記（１）〜（８）に記載の抗体若しくはペプチドのいずれかを有効成分として含む敗血症用医薬組成物。
本発明は、さらに下記（１４）〜（１７）のモノクローナル抗体を提供する。
（１４）ラットモノクロナール抗体である上記（３）のモノクロナール抗体。
（１５）ヒトモノクロナール抗体である上記（３）のモノクロナール抗体。
（１６）ウサギ、イヌ、サルのＣＤ１４と交差反応性を有する上記（３）、（１３）または（１４）のモノクロナール抗体。
（１７）ヒト抗体である上記（３）、（１５）または（１６）のモノクロナール抗体。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について、添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、配列番号１に記載のヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗ＣＤ１４抗体である。
配列番号１に記載のアミノ酸配列はヒトＣＤ１４のアミノ酸配列である。また配列番号１に記載される３５６アミノ酸からなる蛋白質はヒトＣＤ１４の全長である。
ここでエピトープとは抗原決定基であり、抗体と特異的に結合する構造部位をいう。
抗体が認識する領域は一次配列上連続したアミノ酸残基を認識するものとは限らず、蛋白質のとる立体構造を認識するエピトープを有する抗体もある（抗体の蛋白工学、１〜４頁　三木敬三郎等編　講談社サイエンティフィック１９９１年）。例えば、一次配列上不連続なアミノ酸残基を認識している抗体は、該不連続なアミノ酸残基が立体構造的には、抗体が認識するのに十分近い距離に存在するために、該不連続なアミノ酸残基をエピトープとする場合がある。
例えばエピトープとして、該領域の一部の連続したアミノ酸が挙げられるが、上記したように、該領域の不連続なアミノ酸も含まれる。すなわちヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域に存在する限り、連続若しくは不連続なアミノ酸の集合または連続若しくは不連続なアミノ酸が点在した２ケ所以上のアミノ酸の集合も「ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域のエピトープ」に含まれる。好ましくは連続した８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗ＣＤ１４抗体である。
また本発明の抗体は、２６９番から３１５番以外の領域を含むエピトープを認識する抗体も含まれる。例えば、ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８以上のアミノ酸残基と、ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番まで以外の領域の数アミノ酸残基により形成されるエピトープを特異的に認識する抗体も含まれる。
本発明の抗体は、ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識し、ヒトＣＤ１４と結合する。ヒトＣＤ１４とはｓＣＤ１４またはｍＣＤ１４を問わない。また、どちらか一方のＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗体も含まれる。例えばｓＣＤ１４は、血中に存在し、ｍＣＤ１４はマクロファージに存在する。
ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識するとは、例えば、後述する実施例１１の方法と同様に、ヒトＣＤ１４のＮ末端１〜３１５番目のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド（ｓＣＤ１４（１−３１５））とは結合するがｓＣＤ１４（１−２６８）と結合しないことにより、判断できる。
本発明の抗体は、ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識することにより、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する。
ＣＤ１４は細菌菌体成分と結合し、その結合したＣＤ１４／細菌菌体成分複合体がＴＬＲと結合し、シグナルを細胞に伝達し、細胞を活性化する。これらのシグナル伝達機構により細胞が活性化されると、細胞から炎症性サイトカインが放出され、細胞障害、敗血症等の炎症が惹起される。
本発明の抗体は、菌体成分による細胞活性化をＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有することにより抑制し、細胞障害、敗血症等の炎症を抑制する。
「ＣＤ１４とＴＬＲとの結合」を詳細に説明すると、ＣＤ１４と細菌菌体成分とが結合したＣＤ１４／細菌菌体成分複合体とＴＬＲとの結合である。細菌菌体成分には、ＬＰＳ、ＬＴＡ若しくはペプチドグリカン（ＰＧＮ）若しくはリポアラビノマンナン等、マイコプラズマ等が挙げられる。例えばＬＰＳとＣＤ１４が結合した複合体であるＬＰＳ／ＣＤ１４はＴＬＲ、特にＴＬＲ２若しくはＴＬＲ４、と会合することにより、細胞へシグナルを伝達する。ＴＬＲにより細胞内へシグナルが伝達されると、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ及びＮＩＫを経由してＮＦ−κＢが活性化される等により、細胞の活性化が起こる。本発明の抗体はこの過程において、ＬＰＳ／ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する。
「ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する」とは、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する限り限定はされないが、例えば後述する実施例２、または４の系により測定し判断することができる。
また、本発明の抗体は、ＴＬＲ発現細胞の細胞活性化を３０％以上抑制する抗体が好ましい。
より具体的なアッセイ系においては、抗体の濃度が１０μｇ／ｍｌ以下で、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ、０．５μｇ／ｍｌの外因性のＣＤ１４存在下でのＴＬＲ発現細胞のＮＦ−κＢの活性化若しくはＩＬ−８産生を３０％以上抑制する抗体が好ましい。より好ましくは、４０％以上抑制する抗体である。さらに好ましくは５０％以上抑制する抗体である。特に好ましくは７０％以上抑制する抗体である。
また、本発明の抗体は、外因性のＬＰＳ／ＣＤ１４による内皮細胞のサイトカインの産生を６０％以下に抑制する抗体が好ましい。より具体的には、抗体の濃度が１μｇ／ｍｌ以上で、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、３００ｎｇ／ｍｌの外因性のＣＤ１４存在下での内皮細胞のＩＬ−６産生を６０％以下に抑制する抗体が好ましい。より好ましくは、４０％以下に抑制する抗体である。
また、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合には、直接的な結合、他の因子を介する結合または他の因子により活性化される結合が挙げられる。血中若しくはｉｎ　ｖｉｔｒｏでは動物由来の血清存在下で結合する場合が挙げられる。例えば、ＭＤ２存在下で、ＴＬＲ４若しくはＴＬＲ４の２量体の構造が安定した時に結合する場合が挙げられる。本発明の抗体は、いずれかの場合の結合を阻害する機能を有していればよい。例えば血中若しくはｉｎ　ｖｉｔｒｏでは動物由来の血清存在下で、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する抗ＣＤ１４抗体が挙げられる。
本発明の抗体がＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有するのは、該領域がＣＤ１４とＴＬＲとの結合に関連がある領域であるからである。このためヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の一部を含むエピトープを特異的に認識する抗体は、該領域の機能を変化させることによりＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する。
また、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合に関連がある領域として、エピトープとする領域が、ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までに完全に含まれる抗体が好ましい。より好ましいエピトープとする領域は、実施例のＦ１０２４−１−３抗体と同様のエピトープを持つという面において、ヒトＣＤ１４の２８５番から３１５番までの領域である。また好ましくは、ヒトＣＤ１４の２６９番から３０７番までの領域である。さらに好ましくは、連続したアミノ酸をエピトープとして特異的に認識する抗体が好ましい。
また、本発明の抗体は、実施例のＦ１０２４−１−３抗体と同様のエピトープを持つという面において、ヒトＣＤ１４の２８５番から３１５番までの領域の８個以上のアミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する抗体が好ましい。該抗体はＣＤ１４の２９４番目のアミノ酸がＰｒｏであることによって生じ得る立体構造の２８５番目のアミノ酸より３１５番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識する。
Ｐｒｏは他のアミノ酸と異なりα炭素に結合したＮ原子が環構造に組み込まれ＞ＮＨ基になっているため、ポリペプチドはＰｒｏ骨格により１次構造が制限され、蛋白質の立体構造に影響を与える。すなわち、ＰｒｏはＮＨ基がないため水素結合を形成できず、α−ヘリックスを形成できない（プロテインバイオテクノロジー、Ｆ．フランク編、培風館）。該抗体がＣＤ１４の２９４番目のＰｒｏをポイントミューテーションすることにより結合しなくなるが、これはＣＤ１４の立体構造が変化したことが原因である。すなわち、該抗体は、２９４番目のアミノ酸がＰｒｏであることによって生じ得る立体構造の２８５番目のアミノ酸より３１５番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識する。
また、本発明の抗体は抗ヒトＣＤ１４抗体であるが、該領域と同等のヒト以外の哺乳動物のＣＤ１４の領域に対する抗体であっても、後述する抗ヒトＣＤ抗体と同等の効果を示す抗体であれば、本発明に含まれる。
配列番号２に記載のアミノ酸配列は、ヒトＣＤ１４の２６９番目から３１５番目のアミノ酸配列である。
この配列番号２に記載のアミノ酸配列の領域の一部若しくは全部からなり、連続した８以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成される抗体は、本発明の抗体に含まれる。好ましくはヒトＣＤ１４の２８５番目から３０７番目までの領域のアミノ酸配列の一部若しくは全部からなり、連続した８以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成された抗体である。またペプチドが立体構造をとることを考慮すると、好ましくは連続した１０以上、より好ましくは連続した１５以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成される抗体である。
本発明の抗体は、ＣＤ１４と特異的に結合することにより、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する。ＣＤ１４とはｓＣＤ１４またはｍＣＤ１４を問わない。また、どちらか一方のＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する抗体も含まれる。例えば、血中に存在するｓＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する抗体若しくはマクロファージ等に存在するｍＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する抗体が挙げられる。
本発明の抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。抗体の有する機能を明確にするため、若しくは明確に発揮させるためには、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明の抗体が由来する動物種は特に限定されない。抗体作成の容易さの面では、ラットが好ましい。医薬品組成物の構成物の面では、ヒト抗体が好ましい。ヒト抗体には、ヒト抗体産生マウスに免疫して作製したヒト抗体も含まれる。この他にもヒト化抗体、ファージ抗体若しくはキメラ抗体等も本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体は、定常領域と、フレームワーク領域がヒト由来で、相補性決定領域が非ヒト由来である抗体である。ファージ抗体は繊維状ファージのコート蛋白質に抗体を融合させることによってファージ粒子表面上に抗体を提示させ、作製する抗体であり、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フォームあるいはＦａｂフォームが主に使用される。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域とからなる抗体である。
本発明の抗体はその分子種は特に限定されない。いずれのクラス、サブクラス及びイソタイプに分類される抗体であってもよい。また、生物学的に活性のあるＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２等の抗体断片も、本発明に含まれる。
本発明の抗体は公知技術を用いることにより作製できる。例えば、モノクローナル抗体は下記の方法で作製できる。
配列番号１に示されるアミノ酸の配列の全部の蛋白質または２６９番から３１５番までの領域の連続した８個以上からなるペプチドを免疫原として免疫した哺乳動物の免疫細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマの中から、後述する本発明の第五の態様のスクリーニング方法により、クローンを選択することにより、本発明の抗体を作製することができる。また、ｓＣＤ１４（１−３１５）と結合し、ｓＣＤ１４（１−２６８）とは結合しないクローンを選択しても、本発明の抗体を作成することができる。好ましくは、２８５番から３０７番までの領域の連続した８個以上からなるペプチドを免疫原とすることである。より好ましくは連続した１０個以上、特に好ましくは連続した１５個以上のアミノ酸からなるペプチドを免疫原とすることである。
免疫する哺乳動物は、特に限定されないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましい。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。これにはＰ３、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／Ｏ、ＮＳ−１、ＹＢ２／０及びＹ３−Ａｇ１，２，３等の骨髄種細胞が含まれる。
免疫は公知の方法により行なうことができる。例えば、抗原を腹腔内、皮下、静脈内またはフットパッド内に投与して行なう。この抗原の投与はアジュバントを併用してもよく、また複数回投与することが好ましい。免疫細胞は抗原の最終投与の数日後、例えば３日後、に摘出した脾細胞またはリンパ節由来の細胞が好ましい。
免疫細胞とミエローマ細胞との融合は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３巻３頁）等の公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、融合剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する方法または電気融合法等が挙げられる。
免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、それらが融合できる比率であれば限定されないが、免疫細胞に対し、ミエローマ細胞を１／１０量ないし等量を使用することが好ましい。
細胞融合をＰＥＧ（平均分子量１，０００〜４，０００）を使用して行なう方法ではＰＥＧ濃度は特に限定されないが５０％で行なうことが好ましい。また、融合効率促進剤としてジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等の補助剤を添加してもよい。
融合は３７℃に加温したＰＥＧ溶液を混合した細胞に添加することにより開始し、１〜５分間反応後、培地を添加することにより終了する。
この融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日〜７日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は公知の方法を使用することができる。例えばＥＬＩＳＡ法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
樹立したハイブリドーマを公知の方法で培養し、その培養上清よりモノクロナール抗体を得ることができる。また、ハイブリーマをこれと適合性を有する哺乳動物に投与して増殖し、その腹水より得ることができる。
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。
また、ヒト抗体は石田らが開発した方法（ＰＮＡＳ，９７：７２２，２０００）を用いて作製できる。すなわち、まず、Ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）（Ｔｃ）マウスは石田らの方法に従い、ヒト２番染色体断片（Ｉｇ軽鎖κ）と１４番染色体断片（Ｉｇ重鎖）をミクロセル融合法によりマウスＥＳ細胞に導入し、Ｊｏｙｎｅｒらの方法（ジーン　ターゲティング、実験法シリーズ、メディカル・サイエンス・インターナショナル）にしたがい、それぞれの染色体断片を有するキメラマウスを作製する。次に、作製した２種類のキメラマウスを交配することによりヒト２番染色体断片（Ｉｇ軽鎖κ）と１４番染色体断片（Ｉｇ重鎖）の両者を有するキメラマウスを作製する。マウス由来の内因性のマウス抗体の産生を失わせる為、Ｃａｐｅｃｃｈｉらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２９１９−２９２３、１９９２）に従い内因性のＩｇ重鎖とκ鎖をノックアウトしたダブルＫＯマウスを作製し、ヒト染色体断片を導入したキメラマウスと交配させ、ヒト２番染色体断片（Ｉｇ軽鎖κ）と１４番染色体断片（Ｉｇ重鎖）を含み、内因性のＩｇ重鎖とκ鎖をノックアウトしたトランスクロモソームマウスを作製する。作製したＴｃマウスは血中にヒト由来の抗体を産生し、一部マウスγ鎖を有する抗体も存在するが、マウスＩｇ（κ）は検出されない。得られたＴｃマウスは数代経っても染色体は維持され、その子孫を以下の抗ＣＤ１４ヒトモノクローナル抗体の作製に使用できる。
Ｔｃマウスに精製したＣＤ１４抗原５０μｇを、タイターマックスゴールド（Ｔｉｔｅｒ　Ｍａｘ　Ｇｏｌｄ，　ＣｙｔＲｘ　社）と混合後、皮下に投与し、３週間後同様に追加投与を行う。抗体価の上昇は、抗原を固相化したプレートに希釈した抗血清を反応させ、続いて抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて結合した血清中のヒト抗体を検出する。細胞融合は、抗体価の上昇したマウスの腹腔に抗原を５０μｇ投与し、３日後に行う。具体的には、採取した脾細胞をマウスミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４）と混合後、ＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ）により融合し、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択する。出現したハイブリドーマを抗ヒトＩｇＧκ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＧ２抗体、抗ＩｇＧ３抗体または抗ＩｇＧ４抗体を２次抗体としてスクリーニングし、ＣＤ１４と結合するヒト抗体を産生するハイブリドーマを選択する。さらに実施例２に記載のスクリーニング方法により、本発明のヒトＣＤ１４抗体を得ることができる。
また、ヒト化抗体は公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２，１９８６）を用いて、ファージ抗体は公知の方法（Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２：４３３，１９９４）を用いて、キメラ抗体は公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６４３，１９８４）を用いて作製できる。
また、ヒト化抗体及びキメラ抗体の作成方法の詳細は後述する。
本発明の抗体の断片であるＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２等も公知の方法（石川栄治、超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター）で作製できる。
ポリペプチドは、ヒト血清中の可溶型ＣＤ１４を公知の方法により精製して調製することができる。また、一般的に使用されるペプチド合成機（ペプチドシンセサイザー４３２Ａ型、パーキンーエルマージャパン）等を用いた方法、遺伝子組換え法（東京大学医科学研究所　制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社）等が挙げられる。
例えば、２６９番から３１５番までの領域の連続した８個以上のアミノ酸からなるペプチドは４３２Ａ型ペプチド合成機を用いてＦｍｏｃ法により合成でき、ＴＦＡによる脱保護、樹脂からの切断の後、Ｃ１８　ＨＰＬＣカラム（Ｃａｐｃｅｌｌ−ｐａｋ、資生堂）を用いて精製し、目的のペプチドを調製することができる。
本発明の抗体の好適な例として、ラットにヒト血清中より精製したＣＤ１４蛋白質を抗原として免疫した免疫細胞とミエローマ細胞を細胞融合して取得したハイブリドーマＦ１０２４−１−３が産生するＦ１０２４−１−３抗体が挙げられる。ハイブリドーマＦ１０２４−１−３は平成１２年９月２９日付けで日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託し（受託番号Ｐ−１８０６１）、さらに平成１３年３月１６日付で原寄託から国際寄託に移管した（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５１１）。
また、Ｆ１０２４−１−３抗体のＣＤＲをＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＨＬ−ＣＤＲ１、ＨＬ−ＣＤＲ２及びＨＬ−ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号３、４、５、６、７及び８として図１６に示す。本発明のモノクローナル抗体には、配列番号３、４、５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも一つは有する抗ＣＤ１４モノクローナル抗体が含まれる。好ましくは、ＶＬ−ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のうちの一つ以上が対応する配列番号３〜５に記載のアミノ酸配列のいずれかを有し、ＨＬ−ＣＤＲ１〜ＣＤ３のうちの一つ以上が対応する配列番号６〜８に記載のアミノ酸配列のいずれかを有する抗ＣＤ１４モノクローナル抗体である。さらに好ましくは、ＶＬ−ＣＤＲ１〜ＨＬ−ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３〜８に記載のアミノ酸配列を有する抗ＣＤ１４モノクローナル抗体である。
該抗ＣＤ１４モノクローナル抗体は、そのサブタイプは限定されない。Ｆ１０２４−１−３抗体のサブタイプのＩｇＧだけでなく、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ及びＩｇＭも含まれる。これらはＦ１０２４−１−３抗体の超可変部位（ＣＤＲ）の配列を維持し、抗体の重鎖をκ鎖からλ鎖へ、または軽鎖をγ鎖からα鎖、δ鎖、ε鎖若しくはμ鎖へ、置換して遺伝子工学的手法により、作成することができる。
本発明には、配列番号３、４、５、６、７、または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも一つは有する抗ＣＤ１４キメラ抗体または抗ＣＤ１４ヒト化抗体が含まれる。好ましくは、ＶＬ−ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のうちの一つ以上が対応する配列番号３〜５に記載のアミノ酸配列のいずれかを有し、ＨＬ−ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のうちの一つ以上が対応する配列番号６〜８に記載のアミノ酸配列のいずれかを有する抗ＣＤ１４キメラ抗体または抗ＣＤ１４ヒト化抗体である。さらに好ましくは、ＶＬ−ＣＤＲ１〜ＨＬ−ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３〜８に記載のアミノ酸配列を有する抗ＣＤ１４キメラ抗体または抗ＣＤ１４ヒト化抗体である。
また、配列番号３〜８に記載のアミノ酸配列を少なくとも一つ含むペプチドも本発明に含まれる。好ましくは、配列番号３〜８にいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。またＮ末端からＣ末端に向かって配列番号３から順に配列番号８までのアミノ酸配列を含むペプチドも好ましい。また６つのアミノ酸配列の間に適当なリンカーが入っても良い。
上記のモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体はペプチドのＣＤ１４／ＴＬＲ結合阻害作用は、後述する実施例２のスクリーニングにより判定できる。
具体的なキメラ抗体、ヒト化抗体の作成法を説明する。ヒト定常領域および再編成した可変領域ＤＮＡは、公知の操作法に従って種々のヒト細胞、好ましくは不死化Ｂ細胞から単離しうる。同様な方法により非ヒト材料から非ヒト抗体配列を単離することができる。ＤＮＡ配列のための材料の細胞ならびに発現および分泌のための宿主細胞は、種々の材料、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（セルライン及びハイブリドーマのカタログ、第５版（１９８５）、ロックビル、ＭＤ、本引例をもって本明細書の一部と成す）から得ることができる。
これらの「天然に存在する形態」の抗体鎖に加えて、他の「実質的に同一な」修飾された抗体重鎖および軽鎖が当業者に周知の種々の組み換えＤＮＡ技術を利用して容易にデザインされそして製造されうる。例えば、鎖は、いくつかのアミノ酸の置換、末端及び中間での付加や欠失等によって、その１次構造レベルにて天然の配列から変化することができる。或いは、１又はそれ以上の抗体活性（例えば、結合活性）を有するような、一次の抗体構造の部分のみを含むポリペプチドフラグメントを製造することができよう。特に、多くの遺伝子と同様に、抗体遺伝子も分離した機能的領域を含有し、各領域は異なる生物活性を有することが注目される。一般に、所望のエピトープ結合成分をコードする遺伝子の修飾は、種々の良く知られた技術、例えば、特定部位の突然変異誘発（ギルマンアンドスミス、Ｇｅｎｅ８：８１−９７（１９７９）及びロバーツら、ネーチャー３２８：７３１−７３４（１９８７）、本引例を持って本明細書の一部と成す、参照）によって、容易に達成できる。
より好ましい本発明の態様において、エピトープ結合成分は、「キメラ」または「ヒト化」された抗体遺伝子によってコードされる（ＣｏおよびＱｕｅｅｎＮａｔｕｒｅ、３５１巻、５０１頁、１９９１年）。
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学により、異なった種に属する抗体遺伝子セグメントから構成されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒト定常（Ｃ）セグメント、例えば、γ１及びγ４と連結されうる。従って、他の哺乳動物種も用いられ得るけれども、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体からのＶ又は抗原結合ドメイン及びヒト抗体からのＣ又はエフェクタードメインから成るハイブリッド蛋白質である。
「フレームワーク領域」とは、Ｋａｂａｔ等による定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ　ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の如く、単一種中の種々の抗体の内で、比較的保存されている（即ち、ＣＤＲ以外の）抗体軽鎖及び重鎖可変領域の部分を云う。本明細書において、「ヒトフレームワーク　領域」とは、自然に生じるヒト抗体のフレームワーク領域と又はいくつかのこのような抗体の共通配列と実質的に同一（約８５％又はそれ以上）であるところのフレームワーク領域である。
「ヒト化抗体」とは、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体からの少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体を云い、その中に存在する何らかの定常領域は、ヒト抗体定常領域と実質的に同一である、即ち少なくとも約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である。従って、恐らくＣＤＲを除く、ヒト化抗体の全ての部分は、１以上の天然のヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化抗体は、キメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を含まない。
これらの抗体は、より特異的には、本発明は、複数の、好ましくは一つのヒト受容体（アクセプター）抗体からのフレームワーク領域（ＦＲ）の少なくとも一つ、好ましくは一方の鎖の全て（４つ）、より好ましくはすべて（各鎖について４つ）を含有し、そして、Ｆ１０２４−１−３抗体からの１以上、好ましくはすべて（各鎖について３つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有するヒト化抗体である。該抗体は、軽鎖／重鎖複合体の２つのペアを有することができ、少なくとも一つの鎖、特に重鎖は、ヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結された、１以上、好ましくは全て（３つ）の供与体（ラット）抗体の相補性決定領域を含む。例えば、供与体（ラット）相補性決定領域は、追加の自然に随伴する供与体（ラット）アミノ酸残基と共に又はなしで、ヒトフレームワーク領域中に導入する。さらに明確な例としては、本発明のヒト化抗体は、各々、配列表の配列番号３、４、５、６、７または８のいずれかのアミノ酸配列を含有するまたは該アミノ酸配列からなるＣＤＲの少なくとも一つ、好ましくはすべて（各鎖３つ）を含有するものである。ヒト化抗体における各ＣＤＲおよびフレームワークの位置は元の供与体抗体における位置と対応していることが望ましい。
一般に、本発明のヒト化抗体は、ヒト化抗体重鎖可変領域フレームワーク及び供与体抗体重鎖可変領域フレームワーク間において、６５％以上９５％以下、好ましくは７０％以上９０％以下の相同性（即ち、配列同一のパーセント）が好ましい。標準的には、同じヒト抗体からの重鎖及び軽鎖が、フレームワーク配列を提供するために選択されて、２つの鎖の集合における非適合性の可能性を減少させるが、異なる２以上のヒト抗体から由来してもよい。
ヒトフレームワーク領域に関しては、ＣＤＲを得る非ヒト抗体のフレームワークまたは可変領域アミノ酸配列をヒト抗体配列コレクション中の対応する配列と比較し相同性の高い配列を選び用いる。好ましくは、フレームワークアミノ酸配列の相同性は６０％以上、より好ましくは６５％以上である。また、好ましくは、受容体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列は、供与体抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列と最も相同なヒト抗体重鎖可変領域配列の代表的コレクション中の５つ、より好ましくは３つの中にある。ヒト化抗体の設計は、以下のように行うことができる。
１）アミノ酸が以下の（ａ）〜（ｃ）のカテゴリーに該当する場合は、用いられるヒト抗体（受容体抗体）のフレームワークアミノ酸はＣＤＲを供与する非ヒト抗体（供与体抗体）由来のアミノ酸で置換される。
（ａ）受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸がヒト抗体のその位置に稀であり、そして供与体抗体中の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に典型的である；
（ｂ）該アミノ酸がＣＤＲの１つに一次配列上近接もしくは隣接している；または、（ｃ）該アミノ酸が供与体もしくはヒト化抗体の三次元モデルにおいてＣＤＲの約５、好ましくは４、より好ましくは３オングストローム以内に原子を有する（Ｃｏ等Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８、２８６９、１９９１）。
２）受容体抗体のヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸および供与体抗体の対応するアミノ酸がヒト抗体中のその位置に稀である場合、ヒトフレームワークのその位置に典型的であるアミノ酸に置換する。
ヒト化抗体の製造の詳細な説明については、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９（１９８９）、ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９２／１１０１８、Ｃｏ等Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９（１９９１）、ＣｏおよびＱｕｅｅｎＮａｔｕｒｅ、３５１巻、５０１頁、１９９１年、ならびに、Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）（これらの引例をもって本明細書の一部と成す）が参照される。
一般に、全ての又は殆どのアミノ酸の置換が上記基準を満たしているのが望ましい。しかしながら、個々のアミノ酸が上記基準にあっているかどうかについては曖昧であることもあり、そして、代わりの様々な抗体が製造され、その内の一つはその特定の置換を有するものもあるが、有さないものもある。このため、コンピューターモデリングによるＣＤＲとＦＲの最適化を行えばよい。
相同性の高いヒト抗体Ｖ領域が見出された後、そのフレームワーク部分にＦ１０２４−１−３抗体のＣＤＲ配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシミュレーションする。このときに使用するプログラムとしてはＡＢＭＯＤやＥＮＣＡＤ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１００３２、１９９０）が用いられる。この立体構造のシミュレーションにより、ＣＤＲ領域のアミノ酸の配置がＣＤ１４との結合活性を最適に有するように、ＣＤＲ近傍のＦＲのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、最適化が行える。
また、ＣＤＲとＦＲの最適化には、Ｆ１０２４−１−３抗体のＦＲの一部のアミノ酸配列をそのまま用いて、ヒト抗体Ｖ領域に移植する方法も可能である。Ｆ１０２４−１−３抗体のＦＲ領域は図１５に示す。ヒト抗体Ｖ領域にＦ１０２４−１−３抗体のＣＤＲとＦＲの一部の配列を移植し、コンピューター分子モデリングで立体構造をシュミレーションする。このときに使用するプログラムとしては、ＭｏｄｅｌｅｒおよびＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｕｍｉｌａｔｉｏｎｓ社）が用いられる。軽鎖では３〜４箇所を、重鎖では７〜８箇所をラット由来のアミノ酸に変更することによりＦＲがラット抗体の構造に近くなり、ＣＤＲ領域のアミノ酸の配置がＣＤ１４との結合活性を最適にすることが容易になる場合がある。
また、抗ＣＤ１４抗体としての結合活性が維持されていれば、ＣＤＲ領域のアミノ酸の１または２以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入若しくは付加をしてもよい。この場合、例えばＧｌｙとＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕとＩｌｅ、ＡｓｎとＧｌｎ、ＣｙｓとＭｅｔまたはＬｙｓとＡｒｇ等、同族に分類されるアミノ酸同士の置換は、抗ＣＤ１４抗体としての結合活性が維持されていやすいと理解される。また、フレームワーク領域中のいくつかの位置のアミノ酸は抗原と直接相互作用、例えば非共有結合的に接触することができ、これらの位置も上記置換の対象となるが、特に、重鎖の２６から３０の位置のアミノ酸は立体構造上超可変ループに含まれるとされており（チョチアおよびレスク、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７（１９８７））、その意味ではＣＤＲと同様に移植することも可能である。
得られたアミノ酸配列に基づき、ヒト化抗体を作成する。例えば、上記より決定したアミノ酸配列より、ヒト化抗体遺伝子配列を決定し、ヒト化モノクローナル抗体をコードする遺伝子を作製する。具体的にはヒトＶ領域の遺伝子よりＣＤＲをエンコードするＤＮＡを削除し、変わりにラット由来のＣＤＲをエンコードするＤＮＡを挿入する。さらに、分子モデリングにより変更するアミノ酸に応じて、対応するＤＮＡ配列をＰＣＲを用いた部位特異的突然変異導入法等により改変し、組み替えヒトＶ領域遺伝子を作製する。これをヒト抗体の重鎖、軽鎖のＣ領域を含むベクターにクローニングし発現ベクターを得る。このとき使用するヒト由来の配列を変更することにより、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３等の抗体のサブクラスを得ることができる。発現ベクターはマウスミエローマ細胞Ｓｐ２−Ｏ−ａｇ１４（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）やハムスター卵巣細胞ＣＨＯに遺伝子導入し、発現を行う。
ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用のために、ラット抗体に比べ、そしていくつかの場合にはキメラ抗体に比べ、少なくとも３つの潜在的な利点を有する。
１）エフェクター部分がヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用しうる（例えば、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）による、より効率的な標的細胞の破壊）。
２）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワーク又はＣ領域を異物として認識せず、従って、このような注入された抗体に対する抗体応答は、全部が異物であるマウス抗体又は一部分が異物であるキメラ抗体より少ない。
３）注入されたマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりも非常に短い、ヒト体内での循環における半減期を有すると報告されている（ショー、Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７））。注入されたヒト化抗体は、恐らく、自然に生じるヒト抗体の半減期とより近い半減期を有し、より少量、又はより少ない頻度の投与量を与えることができる。
本発明の抗体は、ヒトＣＤ１４と特異的に結合し、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害すること、すなわちＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤であることにより、ヒトＣＤ１４を介する細胞活性化を抑制するという機能を有するので、細菌の感染と関連する疾患の治療または予防に用いることができる。例えば、敗血症などの疾患に伴う炎症性サイトカイン、特に血中のＴＮＦ濃度の上昇に伴う症状の治療または予防に有用であり、より具体的には発熱、低血圧、白血球減少症、血小板減少症、ショック及び多臓器不全などの症状の治療または予防に有用である。また、本発明の抗体が抑制する細胞活性化の原因物質はＬＰＳのみとは限定されない。例えば、ＬＴＡ、ＰＧＮ若しくはマイコプラズマ等と複合体を形成したＣＤ１４の細胞活性化を抑制する。すなわち、これらを原因とする疾患においても、上記に記載のとおり、治療または予防に有用である。
本発明の抗体は、ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域の一部を含むエピトープを特異的に認識するという機能を有するので、ヒトＣＤ１４の定性若しくは定量するツールとして有用である。例えば、検体と本発明の抗体を接触させ、抗原抗体複合体を形成させた後、該複合体を検出または定量する測定方法である。検体は血清、尿、体液または培養上清等が例示される。抗原抗体複合体の検出または定量法はＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法等が例示される。
本発明の第二の態様は、本発明のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマである。本発明のハイブリドーマは本発明の第一の態様に記載した方法により作製することができる。
本発明のハイブリドーマの好ましい例は、本発明の抗体の好ましい例であるＦ１０２４−１−３抗体を産生するハイブリドーマＦ１０２４−１−３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５１１）である。
本発明の第三の態様は、配列番号１に記載のＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域のアミノ酸を連続８個以上含むペプチドである。好ましくは２８５番から３０７番までの領域のアミノ酸を連続８個以上含むペプチドである。また、好ましくは連続１０個以上、特に好ましくは連続１５個以上のアミノ酸からなるペプチドである。
本発明のペプチドは本発明の第一の態様に記載した方法により作製することができる。
本発明の第四の態様は、本発明の第三の態様のペプチドを免疫原として用いることを特徴とするＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤である抗体の作成方法である。免疫原として用いるペプチドの好ましい例は、本発明の第三の態様の好ましいペプチドの例である。
本発明の方法の詳細は、本発明の第一の態様に記載したとおりである。
作成された抗体がＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤であるとの確認は、例えば実施例２に記載した方法で行うことができる。
本発明の第五の態様は、配列番号３、４、５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲをエンコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗ＣＤ１４ヒト化抗体を産生させることを特徴とする抗ＣＤ１４ヒト化抗体の作成方法である。本発明の抗ＣＤ１４ヒト化抗体の作成方法は、配列番号３、４、５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲをエンコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗ＣＤ１４ヒト化抗体を産生させることを特徴とする。好ましくは、配列番号３、４、５、６、７及び８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲをエンコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ヒト抗体の遺伝子を含むベクターに組み込み、宿主細胞に抗ＣＤ１４ヒト化抗体を産生させることである。
本発明の方法の詳細は、本発明の第一の態様に記載したとおりである。
さらに本発明の方法を実施するために、配列番号３、４、５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲをヒト抗体可変領域に移植した分子をモデル化し、コンピュータ上でＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）の立体構造をシミュレーションしてＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を最適化して、抗ＣＤ１４ヒト化抗体のアミノ酸配列を決定することが好ましい。このようにして決定した抗ＣＤ１４ヒト化抗体のアミノ酸配列の少なくとも重鎖または軽鎖の定常領域をエンコードするヒト抗体の遺伝子を含むベクターに、配列番号３、４、５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ及び最適化して変化させたＦＲ若しくはＦＲの一部をエンコードするＤＮＡを組み込めばよい。ＦＲの一部とは、ＦＲの一部の連続したアミノ酸配列のみならず、最適化するために置換する不連続のアミノ酸配列をも含む。このようにアミノ酸配列を最適化して抗ＣＤ１４ヒト化抗体を作成する方法も、配列番号３、４、５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲをヒト抗体可変領域に移植した分子をモデル化して最適化する限り、本発明に含まれる。
好ましくは、配列番号３、４、５、６、７及び８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲをヒト抗体可変領域に移植した分子をモデル化することである。
なお、宿主細胞に抗ＣＤ１４ヒト化抗体を産生させることを特徴とする。好ましくは、配列番号３、４、５、６、７及び８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲをエンコードする塩基配列の一例は図１８に示した。ＦＲを含む重鎖及び軽鎖をエンコードする塩基配列の一例は図１７に示されている。
作成されたヒト化抗体がＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤であるとの確認は、例えば実施例２に記載した方法で行うことができる。
本発明の第六の態様は、ＣＤ１４、ＴＬＲおよび被検物質を接触させる工程を含む敗血症用治療薬のスクリーニング方法である。敗血症用治療薬のスクリーニング方法とは、被検物質が敗血症用治療薬若しくは敗血症用治療薬候補物質であるか否かを検討する方法である。また、複数の被検物質から敗血症用治療薬若しくは敗血症用治療薬候補物質を選択する方法である。
本発明のスクリーニング方法は、ＣＤ１４、ＴＬＲおよび被検物質を接触させる工程を含む。
本発明のスクリーニング方法のＣＤ１４原としては、細胞に発現しているＣＤ１４、血中等に存在するｓＣＤ１４、または遺伝子組換え法により作成されるｓＣＤ１４が挙げられる。細胞に発現しているＣＤ１４は、遺伝子組換え法により細胞に発現させてもよい。またｓＣＤ１４は、少なくともヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番を含むｓＣＤ１４であれば、改変体であってもよい。ＣＤ１４の立体構造の維持の点で、好ましくはＣＤ１４全長である。
ＴＬＲ原としては、ＴＬＲを発現する細胞、遺伝子組換え法により作成されるＴＬＲ等が挙げられる。細胞に発現しているＴＬＲは、遺伝子組換え法により細胞に発現させてもよい。またＣＤ１４原とＴＬＲ原は同一の細胞であってもよい。
また、ＣＤ１４、ＴＬＲおよび被検物質を接触させる工程において、同時にＣＤ１４活性化物質も接触させることが好ましい。ＣＤ１４活性化物質により、活性化されたＣＤ１４がＴＬＲに結合しやすいからである。
ＣＤ１４活性化物質は、ＣＤ１４と結合することにより、複合体を形成し、ＣＤ１４を活性化する機能を有する物質であれば特に限定されない。例えばＬＰＳ若しくはＬＴＡ等の菌体成分、マイコプラズマ等が挙げられる。
ＣＤ１４、ＴＬＲおよび被検物質を接触させる工程は、これらが接触される工程であれば特に限定されない。例えば溶液中において直接接触させる、ＣＤ１４若しくはＴＬＲをプレート等に固定して、他を溶液中に混合しプレートに添加する、またはＣＤ１４若しくはＴＬＲを発現する細胞の培養液中に他を添加する等が挙げられる。
ＣＤ１４、ＴＬＲおよび被検物質、並びにＣＤ１４活性化物質を接触させる順番も特に限定されない。例えばこれらを同時に接触させる、ＣＤ１４活性化物質およびＣＤ１４を先に接触させる、ＣＤ１４活性化物質およびＣＤ１４をＴＬＲと接触させる前に、ＣＤ１４活性化物質およびＣＤ１４と被検物質を接触させる等の順番が挙げられる。
被検物質が敗血症用治療薬であるか否かの判定は、特に限定されない。例えば、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を直接観察し、被検物質が結合を阻害していれば、若しくはその結合阻害の程度に応じて、敗血症用治療薬であると判定若しくは選択する、またはＣＤ１４若しくはＴＬＲを発現する細胞の活性化を測定することにより判定若しくは選択する等が挙げられる。
被検物質は特に限定されない。例えば、抗ＣＤ１４抗体等の抗体、ＣＤ１４改変ポリペプチド等のポリペプチド、低分子化合物等が例示される。
本発明のスクリーニング方法により、簡便に敗血症用治療薬が選択できる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、簡便に、敗血症用医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法として有用である。
本発明の第七の態様は、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤を有効成分として含む敗血症用医薬組成物である。
本発明の医薬組成物に含まれるＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤は、ＣＤ１４が直接ＴＬＲに結合することを阻害する剤、若しくはＣＤ１４が第三物質を介してＴＬＲに結合し複合体等を形成すること等を阻害する剤であれば特に限定されない。また、その阻害機構も限定されない。
本発明の医薬組成物に含まれるＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤はその阻害する能力として、ＴＬＲ発現細胞の細胞活性化を３０％以上抑制する阻害剤が好ましい。より具体的なアッセイ系においては、抗体の濃度が３μｇ／ｍｌ以上で、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ、０．５μｇ／ｍｌの外因性のＣＤ１４存在下でのＴＬＲ発現細胞のＮＦ−κＢの活性化を３０％以上抑制する阻害剤が好ましい。より好ましくは、４０％以上抑制する阻害剤である。
好ましくは、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤として本発明の抗体若しくは抗体の断片を有効成分として含む敗血症用医薬組成物である。
本発明の医薬組成物に含まれるＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤若しくは本発明のスクリーニング方法で得られた物質は、その力価として、ＴＬＲ発現細胞の細胞活性化を３０％以上抑制する力価が好ましい。より具体的なアッセイ系においては、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ、０．５μｇ／ｍｌの外因性のＣＤ１４存在下でのＴＬＲ発現細胞のＮＦ−κＢの活性化を３０％以上抑制する力価が好ましい。より好ましくは、４０％以上抑制する力価である。
ヒトＣＤ１４を介した細胞活性化による敗血症の経路において、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤はＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害することにより、ＣＤ１４からＴＬＲへのシグナル伝達が阻害されるため、ＴＬＲ以降のシグナル伝達が遮断され、細胞活性化を抑制し、敗血症の治療効果を示す。
すなわち、本発明の医薬組成物は、細菌の感染と関連する疾患の治療または予防に有用である。例えば、敗血症、関節リウマチ、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患、溶血性貧血、腫瘍、アトピー性疾患、アレルギー疾患、サルコイドーシス、マラリア、乾癬、発熱、低血圧、白血球減少症、血小板減少症、ショック及び多臓器不全などに有用である。特に、これらの疾患に伴う炎症性サイトカイン、特に血中のＴＮＦ濃度の上昇に伴う症状の治療または予防に有用である。これらの疾患の中でも、ＬＰＳが関与するグラム陰性細菌感染、ＬＴＡ若しくはペプチドグリカン等が関与するグラム陽性細菌感染、またはマイコプラズマに伴う敗血症の治療または予防に有用である。すなわち、これらの疾患の症状が表れたとき若しくは進行したときの治療効果のみならず、血中にＬＰＳ、ＬＴＡ若しくはマイコプラズマ等が高値である患者またはそのような状況に置かれることが予想される細菌感染者に予防効果が期待できる。
また、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合阻害剤を有効成分として含んでいれば、製剤学的に許容される各種添加物を含んでいてもよい。例えば、担体、賦形剤、安定剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、干渉剤、保存剤、懸濁化剤、乳化剤、一般的に用いられる適当な溶媒の類（滅菌水や植物油等）、さらには生理学的に許容しえる溶解補助剤などを適宜含んでいてもよい。
また、本発明の医薬組成物は、抗生物質、ステロイド、各種サイトカイン抗体若しくは抗凝固因子等を含んでいてもよい。これらは、有効成分である本発明の抗体と相加効果若しくは相乗効果を示し、より有効な医薬組成物と成ることができる。
本発明の医薬組成物を薬剤として投与するときの投与量は、特に限定されないが、例えば、本発明の抗体を有効成分とするときには、０．１ｍｇ／ｋｇ以上が好ましい。より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量である。本発明の医薬組成物を薬剤として用いるときの剤形は、坐剤、吸入剤、特に注射剤等が好適である。また種々の投与経路が可能であるが、非経口投与が好ましい。非経口投与としては例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与等の注射が一般的であり、その他に直腸内投与、経皮吸収、経粘膜吸収等が挙げられる。また、投与時期若しくは回数は、患者の状態にも依存するが、予防投与、単回投与若しくは連続投与等が例示される。
また本発明は、ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有し、以下▲１▼または▲２▼のいずれかであるＣＤ１４改変体ポリペプチドを開示する。
▲１▼配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端が１〜６番目のいずれかであり、Ｃ末端が２４６〜３０６番目のいずれかのアミノ酸配列を有する、
▲２▼配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端が１〜６番目のいずれかであり、Ｃ末端が２６９〜３５６番目のいずれかであり、かつ２６９〜３０７番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
以下には、ヒトＣＤ１４ポリペプチドのアミノ酸配列を主として説明し、ヒトＣＤ１４のアミノ酸配列を単にＣＤ１４のアミノ酸配列と称することもあるが、ヒト以外の哺乳動物のＣＤ１４であってヒトＣＤ１４の２６９番目から３０７番目のアミノ酸に相当する機能を有する部位が同様に改変され、本発明の改変体と同等の効果を示す範囲であれば、ＣＤ１４はヒト以外の種のＣＤ１４ポリペプチドであってもよい。
「ＣＤ１４改変体ポリペプチド」とは、ＣＤ１４ポリペプチドの一部が欠失したポリペプチド、ＣＤ１４ポリペプチドのアミノ酸の一部が置換したポリペプチド及びＣＤ１４ポリペプチドにアミノ酸を付加したポリペプチドが含まれる。また、これらの改変が組み合わさった改変体ポリペプチドも含まれる。
本発明のポリペプチドはＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能を有する。ＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する機能についての詳細は、本発明の第一の態様に記載したとおりである。
また、本発明のポリペプチドは、ＴＬＲ発現細胞の細胞活性化を３０％以上抑制するポリペプチドが好ましい。
より具体的なアッセイ系においては、ポリペプチドの濃度が１０μｇ／ｍｌ以下で、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ、０．５μｇ／ｍｌの外因性のＣＤ１４存在下でのＴＬＲ発現細胞のＮＦ−κＢの活性化若しくはＩＬ−８産生を３０％以上抑制するポリペプチドが好ましい。より好ましくは、４０％以上抑制するポリペプチドである。さらに好ましくは５０％以上抑制するポリペプチドである。特に好ましくは７０％以上抑制するポリペプチドである。
また、本発明のＣＤ１４改変体ポリペプチドは、該ポリペプチド自身ではＬＰＳ存在下で内皮細胞のサイトカインを誘導しないポリペプチドが好ましい。より具体的なアッセイ系においては、このポリペプチドの濃度が３００ｎｇ／ｍｌ以下で、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ存在下での内皮細胞のＩＬ−６産生を誘導しないポリペプチドが好ましい。
「誘導しない」とは、そのアッセイ系において、測定されるＩＬ−６が検出限界以下であることである。たとえば、ＩＬ−６産生の測定において、ｈｕｍａｎ　ＩＬ−６　ＥＩＡ　ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用する場合は、検出限界以下とは５０ｐｇ／ｍｌ以下である。
また、本発明のＣＤ１４改変体ポリペプチドは、外因性のＬＰＳ／ＣＤ１４による内皮細胞のサイトカインの産生を６０％以下に抑制するポリペプチドが好ましい。
より具体的なアッセイ系においては、ポリペプチドの濃度が３００ｎｇ／ｍｌ以上で、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、３００ｎｇ／ｍｌの外因性のＣＤ１４存在下での内皮細胞のＩＬ−６産生を６０％以下に抑制するポリペプチドが好ましい。より好ましくは、４０％以下に抑制するポリペプチドである。
「ＬＰＳ／ＣＤ１４」とは、ＬＰＳとＣＤ１４とが結合した複合体である。
この活性の点においては、前記▲１▼のポリペプチドのうちでも、Ｃ末端が２４６番目〜２８５番目のいずれかであるＣＤ１４改変体ポリペプチドが好ましい。さらに好ましくは、Ｃ末端が２４６番目または２８５番目であるポリペプチドである。
またこの活性の点においては、前記▲２▼のポリペプチドのうちでも、Ｃ末端が２６９〜３５６番目のいずれかであり、かつ２６９〜２８６番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が、他のアミノ酸であるＬｅｕ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＧｌｙに置換されたＣＤ１４改変体ポリペプチドが好ましい。より好ましくは、Ｃ末端が２８４〜３５６番目のいずれかであり、かつ２８４〜２８６番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が、他のアミノ酸であるＬｅｕ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＧｌｙに置換されたＣＤ１４改変体ポリペプチドである。さらにはＣ末端が３０７番であり、かつ２８４〜２８６番目のアミノ酸のいずれか一つ以上がＬｅｕ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＧｌｙに置換されたＣＤ１４改変体ポリペプチドが好ましい。
また、細菌菌体成分をポリペプチド自身が除去するという面で、本発明のポリペプチドは細菌菌体成分と結合することが好ましい。例えば、ＬＰＳのＣＤ１４の結合部位は７〜１４番目及び５７〜６４番目であり、その部位の配列はは本発明のポリペプチドは維持されている。
本発明のポリペプチドは機能を維持していれば、Ｎ末端のアミノ酸１〜６個が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。例えばＮ末端にさらにＭｅｔが付加されたポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。また、途中のアミノ酸配列は、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。
本発明のポリペプチドは、その特徴を失わない限り、いかなる修飾を受けてもよい。修飾としては、その蛋白質が動物細胞または酵母等の真核細胞の培養により産生される過程で受ける可能性のあるポリペプチドの翻訳過程または翻訳後の修飾及び化学的修飾等がある。
本発明のポリペプチドの製造方法を開示する。
形質転換体を作成し、培養し、必要に応じて遺伝子の増幅や発現誘導を行う。次いで培養混合物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種のクロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせて、本発明のポリペプチドの精製を行う「培養混合物」とは、形質転換体、形質転換体を含む培地、もしくは培養上清または細胞のライセートを意味する。本発明の製造方法において、産生された本発明のポリペプチドが細胞培養上清中に分泌される場合は、培養上清から該ポリペプチドを精製できる。一方、該ポリペプチドが形質転換体内に蓄積される場合には、リゾチーム処理、界面活性剤処理、凍結融解、加圧、超音波処理その他の方法から宿主細胞に適したものを適宜選択して細胞を溶解または破砕した後、遠心分離、濾過等の方法により可溶性画分または不溶性画分として該ポリペプチドを回収し、精製する。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号９〜１１に示す。組換えベクターは、該ＤＮＡを任意の塩基配列を有する他のＤＮＡ断片とライゲーションする方法、または任意のベクターに導入する方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８９参照）等で得ることができる。具体的には、ＤＮＡとベクターとをそれぞれ適当な制限酵素で消化して、得られた各断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等いかなるものでもよく、市販品を利用してもよい。ベクターの代表的なものとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ＰＨＩＬ−Ｓ１、λＺａｐＩＩ、λｇｔ１０、ｐＡｃ７００、ＹＲＰ１７、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＦＮ−ＩＩ等が挙げられる。
形質転換体は、上記組換えベクターを、宿主となる細胞や微生物に導入する事によって得ることができる。
本発明の形質転換体は、原核細胞、真核細胞のいずれを形質転換したものであってもよい。原核細胞としては、大腸菌、枯草菌などを挙げることができる。真核細胞としてはＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞等の哺乳動物細胞の他、Ｓｆ細胞等の昆虫細胞や酵母を挙げることができる。このうち、大腸菌、哺乳動物細胞、酵母を形質転換して得られた形質転換体は扱いやすく、高発現量が期待できるので好ましい。
哺乳動物細胞の中では、遺伝子のコピー数を増加させることができるため、ＣＨＯ細胞のｄｈｆｒ欠損株を宿主とすることが好ましい。また、酵母の中では、外来タンパク質の分泌生産量が多いために、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母や付加糖鎖が哺乳類と類似しているＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅを宿主とすることが好ましい。
形質転換体の培養は、各種の成書を参考にして、一般的な手法で行うことができる（例えば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２、参照）。
遺伝子の発現誘導を行う場合には、組み込まれたプロモーターによって適当な薬剤を選択して使用する。例えば、ｔｒｐプロモーターが組み込まれている場合には３β−インドールアクリル酸を用い、ＭＭＴＶプロモーターの場合にはデキサメタゾンを、またＡＯＸ１プロモーターの場合にはメタノールをそれぞれ使用するとよい。
遺伝子の増幅方法の代表的な例としては、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞を宿主とし、ｄｈｆｒを有するベクターを使用した際にメトトレキセートを用いる方法等が挙げられる。
当該製造方法で使用する形質転換体は、本発明の形質転換体であれば、限定されないが、好ましくは、ＣＯＳ細胞および、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞もしくは酵母、もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とした形質転換体であることが好ましい。
ＥＦ１αのプロモーターを有する組換えベクターでＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を形質転換して得られた形質転換体は、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で培養する。細胞は、約１〜１０×１０４細胞／ｍｌの濃度で植え込み、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気の条件で培養を行う。通常、２〜３日後にコンフルエントな状態になるので、その時点で培地を、血清不含のＤ−ＭＥＭに交換する。さらに引き続き、２〜３日間の培養を行うことにより目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。前述したようにメトトレキセートにより遺伝子を増幅し、産生量を増加させることが好ましい。さらに好ましくはｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞を宿主とし、ｄｈｆｒを有するベクターを使用することである。
上述の培養混合物から本発明のポリペプチドを精製する方法としては、通常ポリペプチドの精製に使用されている方法のなかから適当な方法を適宜選択して行う。
（実施例）
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。
実施例１　抗ヒトＣＤ１４の作製
［投与抗原の調製］
精製抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体３Ｃ１０（ＡＴＣＣより購入し、通常の方法により調製し、精製したもの）５ｍｇを、ハイトラップＮＨＳ活性化樹脂（Ｈｉｔｒａｐ　ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）（アマシャム−ファルマシア）のマニュアルにしたがい樹脂に結合し、３Ｃ１０結合アフニティーカラムを調製した。
可溶型ＣＤ１４は、ヒト血清（日本バイオテストより購入）１００ｍＬを調製したカラムに添加し、続けてリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳと記載する）にて洗浄した。
波長２８０ｎｍの吸光度が低下したのを確認した後、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用いてカラムから溶出し、ダイアフロー（グレースジャパン）を用いて濃縮した。
ＰＢＳで透析後、タンパク濃度を波長２８０ｎｍの吸光度（係数１Ｏ．Ｄ．＝１ｍｇ／ｍｌ）より算出した。その結果、精製可溶型ＣＤ１４約２００μｇを得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により約５５ｋＤのバンドを確認した。
［抗ＣＤ１４モノクローナル抗体の調製］
Ｗｉｓｔａｒラット（ＳＬＣより購入）メス８週令のフットパッドに１００μｇの精製可溶型ＣＤ１４とフロインド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）とを１対１で混合したものを投与し、３週間後腸骨リンパ節を摘出し、無菌的にリンパ球を採取した。
得られたリンパ球をマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）と５対１で混合しポリエチレングリコール１５００（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞融合を行った。融合後、細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む１０％胎児血清／ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に播種した。
５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養し、増殖してくるハイブリドーマが確認できた段階でアミノプテリンを除いた培地に交換した。
細胞融合から１週間後に培養上清をサンプリングし、精製可溶型ＣＤ１４を固相化したプレートでＣＤ１４に結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。すなわち、精製可溶型ＣＤ１４を１μｇ／ｍＬでプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に固相化し、０．１％ウシアルブミンを含むＰＢＳでブロッキングした。次に培養上清を添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．９％生理食塩水で洗浄した。
各ウエルにペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を添加し、３７℃で１時間反応させ、洗浄後０．０２％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン発色液を添加し、１０分間反応後０．５Ｍ硫酸で反応を停止した。
プレートの吸光度を４５０ｎｍの波長で測定し、吸光度が０．２以上のウエルを抗ＣＤ１４抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
選択したハイブリドーマは限界希釈法（単クローン抗体実験操作法入門、安東民衛・千葉丈／著、講談社）によりクローニングし、１０日後に同様にスクリーニングを行い、抗ＣＤ１４抗体産生ハイブリドーマを１７クローン得た。
次にハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０で培養した後、細胞を回収しＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）で抗体産生を行い、モノクローナル抗体を含む培養上清を得た。培養上清からろ紙で細胞を除いた後、プロテインＧカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇ、ミリポア）で精製し、１７種類の精製ヒトＣＤ１４抗体を得た。
実施例２　ヒトＣＤ１４抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニング
１）［スクリーニング系の作成」
▲１▼ヒトＴＬＲ４発現プラスミドの構築
ヒトＴＬＲ４　ｃＤＮＡは翻訳領域が約２．５ｋｂよりなるため（Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮＯ．ＡＦ１７７６５）、ＴＬＲ４　ｃＤＮＡのクローニングは５’端側１．１ｋｂおよび３’端側２．３ｋｂを別々に行った。
５’端側のクローニングにはセンスプライマー１（ｔｃｇａｇｇａａｇａｇａａｇａｃａｃｃａ）、アンチセンスプライマー１（ｃｃａｔｃｃｇａａａｔｔａｔａａｇａａａａｇｔｃ）を設計し、ヒト肺（ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ）ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲを行った。３’端側のクローニングにはセンスプライマー２（ｃｃｃａｔｃｃａｇａｇｔｔｔａｇｃｃｃｔ）、アンチセンスプライマー２（ｃｃｃａａｇｃｔｔｔｇｇａａｔｔａｃｔｃａｃｃｃｔｔａｇｃ）を設計し、ヒト脾（ｈｕｍａｎ　ｓｐｌｅｅｎ）ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型に同様にＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入して、得られたＴＬＲ４　ｃＤＮＡの塩基配列を確認した。
次に、これらプラスミドを用いて、翻訳開始コドンの８５６ｂｐ下流にあるＥｃｏＲＩサイトにてＴＬＲ４　ｃＤＮＡの５’端側及び３’端側を結合し、ホニュウ細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込み、ヒトＴＬＲ４発現プラスミドｐｃＤＮＡＴ４を作製した。
▲２▼ヒトＴＬＲ４発現形質転換株の樹立
▲１▼で作製したプラスミドｐｃＤＮＡＴ４を、ヒト胎児腎臓由来細胞株であるＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）に下記の方法で導入した。すなわちＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）２５μｌを６．３（ｇのｐｃＤＮＡＴ４と添付プロトコールに従い混合し、７５ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＨＥＫ２９３細胞に添加した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後に細胞を剥離し、１．２ｍｇのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）及び１０％非働化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に再懸濁した。その後、週に２回培地交換を行い、２０日間培養を続け、Ｇ４１８耐性株Ｔ４−１４を得た。
２）［ヒトＣＤ１４抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニング］
Ｔ４−１４細胞を１０％非働化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、１×１０５細胞／ウェル（ｗｅｌｌ）で２４ウェル−プレートに播き込み、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した。その後、ＦｕＧＥＮＥ６を用いて、リポータージーンｐＮＦκＢ−Ｌｕｃ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を１００ｎｇ／ウェル導入し、さらに２４時間培養を続けた。終濃度１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ　０５５：Ｂ５、Ｄｉｆｃｏ社）、終濃度０．５μｇ／ｍｌのｓＣＤ１４（１−３５６）さらに抗ＣＤ１４抗体３Ｃ１０あるいは実施例１で得られた抗ＣＤ１４抗体を終濃度１〜１０μｇ／ｍｌ添加し、６時間培養を続けた後に、細胞をＰａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、ルチフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて添付のプロトコールにしたがって測定した。その結果、活性を有する抗体として、図１に示すように、１０μｇ／ｍｌの抗体添加系で、ＮＦ−κＢの活性化を約５０％阻止したＦ１０２４−１−３抗体を得た。
またＦ１０２４−１−３抗体のアイソタイプをＲａｔ　ＭｏｎｏＡＢ　ＩＤ／ＳＰキット（ＺＹＭＥＤ）を用いてタイピングしたところ、ＩｇＧ１／κであった。
実施例３　Ｆ１０２４−１−３抗体の交差反応性の確認
敗血症動物モデルにおけるＦ１０２４−１−３抗体の有用性を明らかにする目的でＦ１０２４−１−３抗体の各種動物由来ＣＤ１４との交差反応性を検討した。まず、ヒトＣＤ１４（１−３５６）を５０ｎｇ／ウェルでプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に固相化し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
イヌ（ビーグル）、サル（カニクイ、アカゲ）、ウサギ（ニュージランド白色種）、ヒト（ポジティブコントロール）及びラット（ネガティブコントロール）の各血清をＰＢＳで希釈したものを、ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０２４−１−３抗体１μｇ／ｍＬと混合し、ブロッキング液を除去したプレートに添加した。プレートを３７℃で１時間反応し、洗浄液で５回洗浄後、０．０２％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン発色液を添加し、１０分間反応後０．５Ｍ硫酸で反応を停止した。プレートの吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。４倍希釈血清の結果を図２に示す。
その結果、Ｆ１０２４−１−３抗体のヒトＣＤ１４への結合はウサギで５２％、イヌで３０％、アカゲで４４％、カニクイで５７％、ヒトで８３％阻害され、Ｆ１０２４−１−３抗体はウサギ、イヌ、サルのＣＤ１４と交差反応性を示すことが示された。
次に、ウサギのＣＤ１４との結合をフローサイトメトリー法を用いて検討した。
ウサギ（ニュージランド白色種、北山ラベス）オス、２．２ｋｇの耳動脈よりウサギ全血１ｍＬをヘパリンで濡らしたシリンジで採血した。１００μＬに１０ｍＬのＴｒｉｓ／ＮＨ４Ｃｌ溶液を加え、溶血させ、残った細胞分画を遠心して回収した。集めた細胞を５％牛血清／０．１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ−でブロッキングし、再度遠心し、細胞を回収した。
次に細胞を１ｍＬの５％牛血清／０．１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ−に懸濁しＦ１０２４−１−３抗体、ヒトＣＤ１４（１−３５６）２７５ｎｇでプレインキュベーションしたＦ１０２４−１−３抗体、ラットＩｇＧをそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加し、４℃で１時間反応した。細胞懸濁液を０．２５％牛血清／ＰＢＳ−で３回洗浄後、１０００倍に希釈したＦＩＴＣ標識抗ラット抗体（ＤＡＫＯ）に再懸濁し、４℃で３０分間反応した。再度、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ解析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社）で行い、蛍光強度を測定した。
図３に示すように、ウサギ単球はＦ１０２４−１−３抗体で染色され、ヒトＣＤ１４で前処理することにより、染色が阻害された。また、コントロール抗体（ラットＩｇＧ）では染色されなかった。したがって、Ｆ１０２４−１−３抗体は単球上のウサギＣＤ１４と結合することが確認された。
実施例４　Ｆ１０２４−１−３抗体のＩＬ−６産生阻害活性
ヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ（三光純薬社）を０．０５％　トリプシン０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ−で剥離後、健常人ヒト血清より抗ＣＤ１４抗体を用いて可溶型ＣＤ１４を除去した血清を２％含むＲＰＭＩ１６４０培地（旭テクノガラス社）（以下２％ＣＤ１４ｗ／ｏＨＳ／ＲＰＭＩと表記）にて懸濁し、５×１０４細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）で９６ウェルプレートに植え込み３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
可溶型ＣＤ１４を除去したヒト血清を１４％含むＲＰＭＩ１６４０培地を１０μｌ、１２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ　０５５：Ｂ５、Ｄｉｆｃｏ社）１０μｌ、３．６μｇ／ｍｌの血清由来可溶型ＣＤ１４を１０μｌ、及び９００ｎｇ／ｍｌのＦ１０２４−１−３抗体または３Ｃ１０抗体４０μｌを加えて細胞に添加した。この混合液を２０時間培養を行った後、培養上清中のＩＬ−６をヒトＩＬ−６　ＥＩＡキット（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で測定した。
ＩＬ−６の測定はヒトＩＬ−６　ＥＩＡキット添付のプロトコールに従い、行った。即ち、培養上清１００μｌをＩＬ−６抗体固相化プレートに移し、３７℃で６０分間インキュベーションした。その後、反応液を除去し４００μｌ／ウェルのＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　２で４回洗浄し、１００μｌ／ウェルで抗ヒトＩＬ−６抗体を添加し３７℃、３０分間インキュベーションを行った。反応液を除去、４００μｌ／ウェルのＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　２で４回洗浄した後にペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジン溶液を１００μｌ／ウェル加え、さらに３７℃、３０分間インキュベーションを行った。
洗浄後発色基質（ＴＭＢ）を１００μｌ／ウェル添加し室温で１５分間反応させた後に、停止液１００μｌ／ウェルを加え反応を停止した。４５０ｎｍの波長の吸光度を測定し、サンプル中のＩＬ−６の産生量を算出した。なお、コントロール抗体のラットＩｇＧおよび３Ｃ１０抗体は精製標品を使用した。
その結果を図４に示す。抗体を加えないときのＩＬ−６産生量を１００％とした。Ｆ１０２４−１−３抗体及び３Ｃ１０抗体にＩＬ−６産生阻害活性が認められたが、Ｆ１０２４−１−３抗体は０．３μｇ／ｍＬで６０％以上産生を阻害した。３Ｃ１０抗体はＦ１０２４−１−３抗体より、阻害が弱かった。Ｆ１０２４−１−３抗体は内皮細胞の炎症性サイトカイン産生阻害効果が３Ｃ１０抗体よりも優れていることが明らかとなった。
また、実施例１のスクリーニングで選択された物質が、実際に細胞のサイトカインを抑制することが明らかとなった。
実施例５　Ｆ１０２４−１−３抗体のＬＰＳ／ＣＤ１４複合体系形成後のＩＬ−６産生抑制測定
実施例４と同様にヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ（三光純薬社）を懸濁し、５×１０４細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）で９６ウェルプレートに植え込み３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。可溶型ＣＤ１４を除去したヒト血清を１４％含むＲＰＭＩ１６４０培地を１０μｌ、１２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ　０５５：Ｂ５、Ｄｉｆｃｏ社）１０μｌ、３．６μｇ／ｍｌの血清由来可溶型ＣＤ１４を１０μｌ混合し、３７℃下１時間インキュベーションしてＬＰＳ／ＣＤ１４複合体を形成させた。その後ＬＰＳ／ＣＤ１４混合液に９００ｎｇ／ｍｌのＦ１０２４−１−３抗体または３Ｃ１０抗体４０μｌを加えて細胞に添加した。さらに２０時間培養を行った後、培養上清中のＩＬ−６をヒトＩＬ−６ＥＩＡキット（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で測定した。
ＩＬ−６の測定はヒトＩＬ−６　ＥＩＡキット添付のプロトコールに従い、行った。なお、コントロール抗体のラットＩｇＧおよび３Ｃ１０抗体は精製標品を使用した。
その結果を図５に示す。抗体を加えないときのＩＬ−６産生量を１００％とした。Ｆ１０２４−１−３抗体はＩＬ−６産生阻害活性が認められたが、３Ｃ１０抗体はコントロール抗体と同程度であり、ＬＰＳ／ＣＤ１４複合体形成後ではＩＬ−６の産生抑制効果が認められなかった。以上の点より、Ｆ１０２４−１−３抗体は内皮細胞のＬＰＳ／ＣＤ１４複合体形成後でも炎症性サイトカイン産生阻害効果があり、したがってすでにＬＰＳが体内に進入した後の患者、すなわち敗血症と判断された後の患者でも症状の改善効果が期待できることが明らかとなった。
実施例６　Ｆ１０２４−１−３抗体のＬＰＳ／ＣＤ１４複合体への結合試験
細胞膜上のＣＤ１４とＬＰＳの結合に対する抗ＣＤ１４抗体の影響について、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）法により解析を行った。ヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１を４０ｎｇ／ｍｌの１α，２５−ジヒドロキシビタミン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ）Ｄ３（フナコシ社）で４８時間培養し、分化誘導させた後に、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１４抗体（３Ｃ１０あるいはＦ１０２４−１−３抗体）を含むかまたは含まない培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中にて３７℃、３０分間インキュベーションした。その後に、ＦＩＴＣ標識ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）を終濃度１ｎｇ／ｍｌで添加し、３７℃でさらに１５分間インキュベーションした。その後、直ちに等容量の氷冷したＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社）を用い蛍光強度を測定した。
結果を図６に示す。図６に示すように、ＬＰＳのＣＤ１４結合によって観察される特異的蛍光が、３Ｃ１０抗体により完全に抑制されたが、Ｆ１０２４−１−３では部分的にしか抑制されず、Ｆ１０２４−１−３抗体はＬＰＳのＣＤ１４への結合を抑制していないことが示された。
実施例７　グラム陽性菌菌体成分に誘導されるＩＬ−６産生阻害活性
ヒト腎由来細胞株Ｕ−３７３ＭＧ（ＡＴＣＣ）を０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ，０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ−で剥離後、ＲＰＭＩ１６４０培地（旭テクノガラス社）にて懸濁し、３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００μｌ／ｗｅｌｌ）で９６ウェルプレートに植え込み３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。ＲＰＭＩ１６４０培地を７０μｌ、１μｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｄｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社）１０μｌ、５μｇ／ｍｌのｓＣＤ１４（１−３５６）を１０μｌ及び１０μｇ／ｍｌのＦ１０２４−１−３抗体１０μｌをウェルに添加し、さらに２０時間培養を行った後、培養上清中のＩＬ−６をｈｕｍａｎ　ＩＬ−６　ＥＩＡ　ｋｉｔ（ＩＬ−６　Ｅｌｉ−ｐａｉｒ：ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社）で測定した。コントロールとして、ＣＤ１４改変体ポリペプチド、Ｆ１０２４−１−３抗体の代わりにｓＣＤ１４（１−３５６）を添加した。
ＩＬ−６の測定はｈｕｍａｎ　ＩＬ−６　ＥＩＡ　ｋｉｔ添付のプロトコールに従い、行った。すなわち、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）にて４倍希釈した培養上清５０μｌをＩＬ−６抗体固相化プレートに移し、ビオチン化抗ヒトＩＬ−６抗体５０μｌを加え３７℃で６０分間インキュベーションした。その後、反応液を除去し４００μｌ／ｗｅｌｌの０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジン溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、さらに３７℃、２０分間インキュベーションを行った。洗浄後発色基質（ＴＭＢ）を１００μｌ／ｗｅｌｌを添加し室温で１５分間反応させた後に、停止液（１Ｍ　ＨＣｌ）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え反応を停止した。４５０ｎｍの波長の吸光度を測定し、サンプル中のＩＬ−６の産生量を算出した。Ｆ１０２４−１−３抗体のＩＬ−６産生阻害活性は５５．２％であった。
この結果より，Ｆ１０２４−１−３がグラム陽性菌菌体成分に誘導されるサイトカイン産生を抑制することが示された。
実施例８　ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおけるＦ１０２４−１−３抗体の有効性
敗血症モデルにおけるＦ１０４−１−３抗体の有効性を確認する目的で、ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルを作製し、Ｆ１０２４−１−３抗体の有効性を抗体前投与及び後投与の２種類のプロトコールにより検討した。
［Ｆ１０２４−１−３抗体の前投与効果］
（１）ＬＰＳ前投与
ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルは、Ｓｃｈｉｍｋｅらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１３８７５，１９９８）に準じ、ＬＰＳ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　Ｒｅ５９５、Ｓｉｇｍａ社）をニュージランド白色種（２．１−２．４ｋｇ、北山ラベス）に０、５、２４時間毎に５μｇ／ｋｇを耳静脈より投与することにより作製した。前投与群のプロトコールはＦ１０２４−１−３抗体を−１、４、２３時間毎に２．５ｍｇ／ｋｇを耳静脈より投与し、コントロール群は抗体の変わりに生食を投与した。まず、体重により群れ分けを行い、各群５羽を選択し、−１時間に前採血を行なった。次に、１、３、５、７、２３、２５、２８、４８時間毎に採血を行い、体重、白血球数、血清ＧＰＴ値、血清クレアチニン値、血清ＴＮＦα値を測定した。なお、白血球数はＳｙｓｍｅｘ　Ｆ−２８０（東亜医用電子）により、血清ＧＰＴ値、血清クレアチニン値はＤＲＩ−ＣＨＥＭ５０００（ＦＵＪＩ　ＦＩＬＭ）により測定した。
また、ＴＮＦαはＤａｖｉｄらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，６８：１６７，１９８４）に準じて、Ｌ９２９細胞（ＡＴＣＣ）を０．２５％トリプシン／ＰＢＳ−で剥離後、５．５×１０５細胞／ｍＬに再懸濁し、５．５×１０４細胞／ウェルでプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養後、上清を除きＴＮＦ標準品（ヒトＴＮＦ、持田）または希釈した検体１００μＬを添加し、続けて最終濃度５μｇ／ｍＬとなるようにアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で２０時間培養した。
ＴＮＦ量はプレートの培養上清を１００μＬ除いた後、ＷＳＴ−１溶液（同仁化学）を１０μＬ添加して、３７℃で４０〜９０分間インキュベーション後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、産生された血清中のＴＮＦ量を吸光度の相対値として表示した。さらに、４８時間後の生存率をもって、Ｆ１０２４−１−３抗体の有効性を判定した。
まとめを、表１に示す。その結果、Ｆ１４０２４−１−３抗体投与群では４８時間後の生存率は１００％（５／５）であったのに対して、生食投与群では４０％（２／５）であり、Ｆ１０２４−１−３抗体投与により生存率は有意に改善された。また、２８時間後の各パラメータの値もＦ１０２４−１−３抗体投与群で生食投与群に比較して前値に近い値を示した。
さらに、図７に示すように血清中のＴＮＦの産生量はＦ１０２４−１−３抗体投与により抑制され、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてもｉｎ　ｖｉｔｒｏ同様、炎症性サイトカインの産生をＦ１０２４−１−３抗体が抑制することが明らかとなった。
表１はＦ１０２４−１−３抗体のＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおける前投与での死亡率の改善、各種パラメータの改善を示している。
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さらに、グラム陽性菌に対する効果を確認する目的で、ＬＰＳの変わりにＬＴＡ／ＰｅｐＧを投与し、Ｆ１０２４−１−３抗体の白血球減少症の改善効果を検討した。すなわち、Ｆ１０２４−１−３抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）または生食をニュージランド白色種（２．１−２．４ｋｇ、北山ラベス）に投与し、１時間後ＬＴＡ（Ｓｉｇｍａ）及びＰｅｐＧ（Ｆｌｕｋａ）１６０μｇ／ｍＬを耳静脈より投与した。
ＬＴＡ／ＰｅｐＧ投与直前を０時間として、毎時間採血し白血球数を測定したところ、図８に示すように、生食投与群では白血球数の減少が観察されたのに対して、Ｆ１０２４−１−３抗体投与群では白血球数の減少が観察されず、Ｆ１０２４−１−３抗体がＬＴＡ／ＰｅｐＧに由来する白血球減少症に対しても効果を示し、グラム陽性菌に由来する敗血症に対しても有効性が確認された。
（２）［Ｆ１０２４−１−３抗体の後投与効果］
（１）の方法にしたがって、ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルを作製した。後投与群のプロトコールはＦ１０２４−１−３抗体を４、２３時間毎に２．５ｍｇ／ｋｇを耳静脈より投与し、コントロール群は抗体の変わりに生食を投与した。
まず、同様に群れ分けを行なったウサギ、各群５羽をより、−１時間に前採血を行なった。次に、プロトコールにしたがってＬＰＳを投与し、さらに１、３、５、７、２４、２６、２８、４８時間毎に採血を行い、体重、白血球数、血清ＧＰＴ値、血清クレアチニン値を同様に測定した。
まとめを、表２に示した。その結果、Ｆ１４０２４−１−３抗体投与群では４８時間後の生存率は１００％（５／５）であったのに対して、生食投与群では８０％（４／５）と有意な差が認めれなかったが、２８時間後の各種パラメータではＦ１０２４−１−３抗体投与群は正常値に近い値であり、一方、生食投与群は細胞が傷害されたことを示す異常値であった。また、図９に示すように血清中のクレアチニン値は経過観察中に大きな変動は認められず、Ｆ１０２４−１−３抗体にＬＰＳ負荷により惹起される組織傷害を抑制する効果があることが確認された。
表２はＦ１０２４−１−３抗体のＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおける後投与での各種パラメータの改善を示している。
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実施例９　蛋白質相互作用解析装置を用いた阻害機構の解析
（１）［４９ｋＤａ高分子量のＣＤ１４蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製］
▲１▼４９ｋＤａ高分子量のＣＤ１４蛋白質に特異的なペプチドの作製
配列番号１に記載の３１６番目から３２８番目の配列を、免疫に使用する４９ｋＤａ高分子量のＣＤ１４特異的なペプチド（以下、ペプチド１３と記載）として選択した。
なお、選択したペプチドをＣ末端でＳＨ基を介してキャリア蛋白質と結合させるため、Ｃ末端にシステインを挿入した。ペプチドの合成はＡＢＩ４３２Ａペプチド合成機（アプライド）を用いて行った。定法により樹脂よりペプチドを切り出し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＣＡＰＣＥＬＬ−ＰＡＫ、資生堂）を用いてペプチドを精製した。
▲２▼合成ペプチドを用いたペプチドキャリア抗原の作製
▲１▼で作製したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合した。室温で２時間反応後、ＮＡＰ−１０カラム（ファルマシア）で脱塩しペプチド１３キャリア抗原（以下、ペプチド１３−ＫＬＨと記載）を得た。蛋白質濃度は使用したＫＬＨ量を液量で割ったものを用いた。
▲３▼４９ｋＤａ高分子量のＣＤ１４蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製
ペプチド１３−ＫＬＨ１００μｇを免疫源とし、実施例１（１）に記載の方法と同様に細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（ＧＩＢＣＯ）によりハイブリドーマを選択し、１週間後、組換えヒトＣＤ１４蛋白質と反応する抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。
まず０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）により精製した組換えヒトＣＤ１４蛋白質を１μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。次に選択したハイブリドーマからサンプリングした培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄し０．０１％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、高分子量のＣＤ１４蛋白質と反応したハイブリドーマを含むウエル（Ｆ１０２５−４−１）を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。
選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で培養し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇカラム（Ｂｉｏｐｒｏｓｓｅｓｉｎｇ）を用いて抗体を精製した。精製したＦ１０２５−４−１抗体のサブタイプはラットＩｇＧ１／κであった。
▲４▼ＨＲＰ標識抗体の作製
０．５ｍｇのペルオキシダーゼ（東洋紡）を蒸留水に溶解し、蒸留水で溶解した１００ｍＭの過ヨウ素酸を添加し２５℃で２０分間反応した。反応終了後１．５％エチレングリコールを添加し２５℃で１０分間反応後１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）に対して透析した。精製Ｆ１０２５−４−１抗体を１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で透析し、０．５ｍｇに対して１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を添加して活性化した０．５ｍｇのペルオキシダーゼをそれぞれの抗体と等量に混合し２５℃で２時間反応した。４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウムを添加しさらに２時間４℃で反応した。反応液をＰＢＳに透析しペルオキシダーゼ標識抗体を得た。液量を測定し使用した抗体量より抗体濃度を算出した。
（２）［Ｆ１０２４−１−３抗体の阻害機構の解析］
▲１▼組み換えＴＬＲ４の発現
ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１１５０）を３×１０５ｃｅｌｌｓ／７５ｃｍ２のフラスコに接種し、３７℃５％ＣＯ２下で一昼夜培養した。翌日、実施例２（１）記載のプラスミドｐＣＤＮＡＴ４を用いてＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）記載のプロトコールにしたがって６．２５μｇ　ＤＮＡ：２５μｌ　ＦｕＧＥＮＥ６の比率で混合し、１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ、高グルコース）を１５ｍＬ添加したフラスコに加え、３７℃５％ＣＯ２下で４８時間培養した。また、プラスミドを含まないで同様に操作したＣＯＳ−１細胞をネガティブコントロールとした。ＴＬＲ４分子を細胞膜上に発現したＣＯＳ−１細胞（以下、ＴＬＲ４−ＣＯＳと記載する）、及び発現していないＣＯＳ−１細胞の上清を廃棄し、ＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ）で２回細胞を洗浄した。次に１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ−溶液を５ｍｌ添加し、軽く攪拌後、セルスクレイパー（ＣＯＳＴＡＲ）を用いて細胞を培養フラスコより剥がし、５０ｍＬの遠沈管に回収した。フラスコをさらに５ｍＬのＰＢＳ−で洗浄し、５０ｍＬ遠沈管に加え、１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞を沈殿させた後上清を廃棄し、さらに２回ＰＢＳ−で細胞を洗浄した。次に洗浄した細胞を４０μｍのセルストレイナー（ＦＡＬＣＯＮ）でろ過し、細胞数をカウントした。一度遠心し、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＳ−で希釈し４℃で保存した。
▲２▼抗ＦＩＴＣ抗体固定化チップの調製
ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）の解析に使用するチップ上のセルに抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体（ＯＥＭｃｏｎｃｅｐｔ社）を固定化するため、ビアコア社マニュアルに従い、ＮＨＳ／ＥＤＣ溶液（ＢＩＡＣＯＲＥ社）によりセルを７分間活性化後、ｐＨ６．０の酢酸緩衝液で５０μｇ／ｍＬに希釈した抗体をマニュアルインジェクション法により添加し抗体を固定化後、エタナールアミンによりブロッキングを行った。リファレンスは未処理セルを使用した。▲３▼ＦＩＴＣ−ＬＰＳ／ＣＤ１４複合体の調製
ＰＢＳ−（ｐＨ７．４）で６μｇ／ｍＬに希釈したＦＩＴＣ−ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｅｒｏｔｙｐｅ０１１１：Ｂ４）と上記で調製した組み換えｓＣＤ１４（１−３５６）３００μｇ／ｍＬを１：１混合し、３７℃で３０分間静置することにより複合体を形成した。複合体の形成は抗ＦＩＴＣ抗体固相化プレートと（１）で調製したペルオキシダーゼ標識抗ＣＤ１４抗体（Ｆ１０２５−４−１）を用いたＥＬＩＳＡ系で確認した。すなわち、抗ＦＩＴＣ抗体を１０μｇ／ｍＬでプレートに固相化し、０．５％牛血清アルブミン／ＰＢＳ−でブロッキングした。次に調製したＦＩＴＣ−ＬＰＳ／ＣＤ１４複合体、ＦＩＴＣ−ＬＰＳ、ｓＣＤ１４の３種類のサンプルを抗体固相化ウエルに添加し、３７℃で１時間反応した。各ウエルを洗浄後、１μｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ標識坑ＣＤ１４抗体と反応させ、洗浄後ＴＭＢ発色基質溶液（ＢｉｏＦｉｘ、フナコシ）により反応させ、適度な発色が得られた段階で、硫酸で反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＦＩＴＣ−ＬＰＳ、ｓＣＤ１４単独では吸光度の上昇が見られないのに対してＦＩＴＣ−ＬＰＳ／ＣＤ１４複合体でのみ吸光度が上昇し、複合体が形成されていることが確認された。
▲４▼阻害機構の解析
調製したＦＩＴＣ−ＬＰＳ／ＣＤ１４複合体をチップ上に結合し、次にＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１３０μｇ／ｍＬに希釈したＦ１０２４−１−３抗体をインジェクとし固定化したＣＤ１４に抗体を結合した。次にＴＬＲ４−ＣＯＳ細胞、コントロールとしてＣＯＳ細胞を添加し、ＴＬＲ４−ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ細胞の結合量を測定した。図１０に結果を示したが、棒グラフの高さはセル上に結合した量を示している。すなわち、セルにＬＰＳ／ＣＤ１４複合体が結合することによりレスポンスの上昇が観察された。次にＣＯＳ細胞ではレスポンスが観察されなかったことから結合が認められなかった。一方、ＴＯＬＬ４−ＣＯＳ細胞ではレスポンスの上昇（２００ＲＵ）が観察され、結合が確認された。ＬＰＳ／ＣＤ１４に抗体を反応させると同様にレスポンスの上昇が観察され、結合が確認された。さらにＣＯＳ細胞、ＴＯＬＬ４−ＣＯＳ細胞を反応させると、それぞれにレスポンスの上昇（ＴＯＬＬ４−ＣＯＳ細胞で１３６ＲＵ、ＣＯＳ細胞で１１５ＲＵ）が観察された。ＣＯＳ細胞のレスポンスの上昇は細胞と抗体の非特異的な結合に由来するため、以下の式を用いて阻害率を算出したところ、阻害率は９０％であった。このことはＦ１０２４−１−３抗体がＣＤ１４に結合することにより、ＴＬＲ４とＣＤ１４の結合が阻害されたことを示しており、Ｆ１０２４−１−３抗体の抑制機構がＴＬＲ４のＣＤ１４への結合阻害によることが明らかとなった。阻害率の算出は（Ｆ１０２４−１−３抗体なしでのＴＬＲ４−ＣＯＳ（ＴＯＬＬ４−ＣＯＳ）細胞のレスポンス）−｛（Ｆ１０２４−１−３抗体結合時のＴＯＬＬ４−ＣＯＳ細胞のレスポンス）−（Ｆ１０２４−１−３抗体結合時のＣＯＳ細胞のレスポンス）｝／（Ｆ１０２４−１−３抗体なしでのＴＯＬＬ４−ＣＯＳ細胞のレスポンス）×１００（％）により算出した。
実施例１０　ヒトＴＬＲ４発現形質転換株におけるサイトカイン産生阻害試験
実施例２（１）で得たＨＥＫＴ４−１４を２４ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅへ０．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで植え込み、実施例２（２）と同様にＦ１０２４−１−３あるいは後述する実施例１１で作成したｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃの存在下もしくは非存在下でＬＰＳ／ｓＣＤ１４で刺激した。２０時間後に培養上清を回収し、上清中のＩＬ−８産生量をＥＩＡによって確認した。その結果、Ｆ１０２４−１−３、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ共に、添加濃度依存的に抑制活性を示した。（図１１）
（実施例１１）
Ｆ１０２４−１−３抗体の認識領域の解析
Ｆ１０２４−１−３抗体が認識する領域を明らかにするため、ペプチドによる阻害実験、ＣＤ１４Ｃ欠失改変体による結合実験、ＣＤ１４アミノ酸置換改変体による結合実験を行なった。
（１）［ＣＤ１４ペプチドの調製］
配列番号１に記載のＣＤ１４アミノ酸配列に基づき、ペプチドＡ（配列番号１２）、ペプチドＢ（配列番号１３）、ペプチドＣ（配列番号１４）及びペプチドＤ（配列番号１５）の４種類のペプチド及びコントロールとしてペプチドＥ（配列番号１６）を合成した。すなわち、ペプチド合成機（４３２Ａ、アプライドバイオシステムズ）を用いて、使用法に従いペプチドを合成し、定法に従って脱保護、切り出しを行い、Ｃ１８カラム（ＣＡＰＣＥＬＬ−ＰＡＫ、資生堂）を用いてＨＰＬＣにより精製した。精製分画を回収し、凍結乾燥後、重量を測定し、蒸留水で１０ｍｇ／ｍｌに溶解した。
（２）ヒトＣＤ１４のアミノ酸を欠失したＣＤ１４改変体（ヒト可溶型ＣＤ１４欠失改変体）の調製
▲１▼［全長型ｓＣＤ１４発現プラスミド（ｐＭ１６５６）の構築］
まず、ｍＣＤ１４を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドｐＭ１６５０を構築した。ＷＯ９８／３９４３８に記載のプラスミドｐＵＣＨ１４Ｐ−４より、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによりヒトＣＤ１４　ｃＤＮＡを含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（ＪＭ１０９細胞、ＴａＫａＲａ社）を添付のプロトコールに従い形質転換した後、生じたコロニーをＰＣＲにより確認し、目的のｍＣＤ１４を発現するプラスミド（ｐＭ１６５０）を得た。
次にヒトＣＤ１４を可溶型タンパクとして発現させるため、ＧＰＩアンカーリングに必要なサイトであるＮ末端から３２６番目のＡｓｎと３２８番目のＧｌｙ（配列番号１参照）をそれぞれＧｌｎ、Ｖａｌに置換した組換え体発現プラスミドｐＭ１６５６の構築を行った。すなわち、センスプライマー３（配列番号１７）とアンチセンスプライマー３（配列番号１８）を用い、上記ｐＭ１６５０を鋳型とし、ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社）により９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返しＰＣＲ反応を行った。増幅したＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＡｐａＬＩによりｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎし、ｐＭ１６５０のＸｈｏＩ／ＡｐａＬＩサイトに挿入した。ＪＭ１０９細胞を形質転換した後、生じたコロニーをＰＣＲにより確認し、目的のｓＣＤ１４を発現するプラスミド（ｐＭ１６５６）を得た。
▲２▼［ヒト可溶型ＣＤ１４Ｃ末端欠失改変体ポリペプチド発現プラスミド（ｐＭ１６５８〜ｐＭ１６６２およびｐＭ１６７４〜ｐＭ１６７６）の構築］
ヒトＣＤ１４のＣ末端よりそれぞれ４９、５６、６１、６６、７１、１１０、１７３、２０４アミノ酸を欠失させた組換え体（以下ｓＣＤ１４（１−３０７）、ｓＣＤ１４（１−３００）、ｓＣＤ１４（１−２９５）、ｓＣＤ１４（１−２９０）、ｓＣＤ１４（１−２８５）、ｓＣＤ１４（１−２４６）、ｓＣＤ１４（１−１８３）、ｓＣＤ１４（１−１５２））を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドｐＭ１６５８、ｐＭ１６７４、ｐＭ１６７５、ｐＭ１６７６、ｐＭ１６５９、ｐＭ１６６０、ｐＭ１６６２及びｐＭ１６６１は以下の方法で構築した。
まず、センスプライマー３とアンチセンスプライマー４、５、６、７、８、９、１０及び１１（配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５及び２６）を用い、（１）で作製したプラスミドｐＭ１６５６を鋳型とし、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返しＰＣＲ反応を行った。
次に増幅したＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩによりｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎし、１％アガロースゲル電気泳動により分離精製した。またｐＭ１６５６を同様にＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化、精製し、得られた約５．８ｋｂのＤＮＡ断片と上記ＰＣＲ断片をｌｉｇａｔｉｏｎした。ＪＭ１０９細胞を形質転換した後、生じたコロニーをＰＣＲにより確認し、目的のＣＤ１４改変体ポリペプチドを発現するプラスミド（ｐＭ１６５８、ｐＭ１６７４、ｐＭ１６７５、ｐＭ１６７６、ｐＭ１６５９、ｐＭ１６６０、ｐＭ１６６２及びｐＭ１６６１）を得た。
▲３▼［ＣＯＳ−１細胞での発現］
（１）及び（２）で作製したプラスミドｐＭ１６５６、ｐＭ１６５８〜ｐＭ１６６２及びｐＭ１６７４〜ｐＭ１６７６をＣＯＳ−１細胞に下記の方法で導入し、ｓＣＤ１４（１−３５６）、ｓＣＤ１４（１−３０７）、ｓＣＤ１４（１−３００）、ｓＣＤ１４（１−２９５）、ｓＣＤ１４（１−２９０）、ｓＣＤ１４（１−２８５）、ｓＣＤ１４（１−２４６）、ｓＣＤ１４（１−１８３）及びｓＣＤ１４（１−１５２）を発現させた。すなわちＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌを上記プラスミドＤＮＡ各１２．５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ−１細胞に添加した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７２時間培養した後に、培養上清を回収し目的のＣＤ１４改変体ポリペプチドを得た。
ＣＤ１４改変体ポリペプチドの発現量を、抗ヒトＣＤ１４抗体を用いたＥＩＡにて測定した。すなわち、ｐＨ８．３の１０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３緩衝液にて２００倍希釈した抗ＣＤ１４抗体ＭＥＭ−１８（ＭＯＮＯＳＡＮ社）を９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ社）に５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４℃にて一昼夜静置した。その後、純水にて洗浄し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ−にてブロッキングを行った（室温で６０分間静置）。
次にｗｅｌｌ中の液を除去し、トランスフェクションしたＣＯＳ−１の培養上清を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、２５℃で６０分間インキュベーションした後に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ−で３回洗浄後、１．０μｇ／ｍｌのＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　３Ｃ１０抗体５０μｌ／ｗｅｌｌを添加し、２５℃で６０分間インキュベーションを行った。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ−で５回洗浄後、発色基質（ＴＭＢ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し室温で３０分反応させた後に、停止液（１Ｎ塩酸）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え反応を停止した。
４５０ｎｍの波長の吸光度を測定し、サンプルのＣＤ１４改変体ポリペプチドの産生量を算出した。
▲４▼［ｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸欠失体の調製］
また、ｓＣＤ１４（１−３０７）のアミノ酸配列より一部のアミノ酸を欠失させた各種ヒト可溶型ＣＤ１４欠失改変体（以下、欠失部分をΔで示す）Δ７−１１、Δ５７−６４、Δ１８０−２３４、Δ２３５−２８２、Δ１８０−２８２を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドは▲１▼及び▲２▼と同様に行った。但し、使用したプライマーは、Δ７−１１についてはセンスプライマー４（配列番号２７）とアンチセンスプライマー１２（配列番号２８）及びセンスプライマー５（配列番号２９）とアンチセンスプライマー１２（配列番号３０）を、Δ５７−６４についてはセンスプライマー４とアンチセンスプライマー１４（配列番号３１）及びセンスプライマー６（配列番号３２）とアンチセンスプライマー１３を、Δ１８０−２３４についてはセンスプライマー４とアンチセンスプライマー１５（配列番号３３）及びセンスプライマー７（配列番号３４）とアンチセンスプライマー１３を、Δ２３５−２８２についてはセンスプライマー４とアンチセンスプライマー１６（配列番号３５）及びセンスプライマー８（配列番号３６）とアンチセンスプライマー１３を、Δ１８０−２８２についてはセンスプライマー４とアンチセンスプライマー１７（配列番号３７）及びセンスプライマー９（配列番号３８）とアンチセンスプライマー１３をそれぞれ用いた。次に得られたプラスミドを▲３▼に従い、ＣＯＳ−１細胞に導入し、ヒト可溶型ＣＤ１４欠失改変体を得た。
ＣＤ１４改変体の発現量を、抗ヒトＣＤ１４抗体を用いたＥＩＡにて測定した。すなわち、ｐＨ８．３の１０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３緩衝液にて２００倍希釈した抗ＣＤ１４抗体ＭＥＭ−１８（ＭＯＮＯＳＡＮ　社）を９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ社）に５０μｌ／Ｗｅｌｌ添加し、４℃にて一昼夜静置した。その後、純水にて洗浄し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ−にてブロッキングを行った（室温で６０分間静置）。
次にウェル中の液を除去し、トランスフェクションしたＣＯＳ−１の培養上清を５０μｌ／Ｗｅｌｌ添加し、２５℃で６０分間インキュベーションした後に、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ−で３回洗浄後、１．０μｇ／ｍｌのＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　３Ｃ１０抗体５０μｌ／Ｗｅｌｌを添加し、２５℃で６０分間インキュベーションを行った。０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ−で５回洗浄後、発色基質（ＴＭＢ）を５０μｌ／Ｗｅｌｌ添加し室温で３０分反応させた後に、停止液（１Ｎ硫酸）５０μｌ／Ｗｅｌｌを加え反応を停止した。
４５０ｎｍの波長の吸光度を測定し、サンプルのＣＤ１４改変体ポリペプチドの産生量を算出した。
次に、ヒト可溶型ＣＤ１４Ｃ末端欠失改変体が目的の長さであるかを確認するため、ＣＤ１４改変体の分子量を抗ヒトＣＤ１４抗体（３Ｃ１０およびＭＥＭ−１８）を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。すなわち各ＣＤ１４改変体３０ｎｇ／レーンをＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ（５−２０％　ＡＴＴＯ社）で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（日本ミリポア社）にタンパクを転写した後、０．５％　スキムミルクを含むＰＢＳ　３０ｍｌにて室温で１時間ブロッキング反応を行い、１０μｇ／ｍｌの３Ｃ１０および１００倍希釈のＭＥＭ−１８を添加して室温で１時間反応させた。さらにＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗マウスＩｇ抗体と室温で３０分間反応させた後、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用い、検出した。その結果、各ＣＤ１４改変体ポリペプチドの計算上の大きさにバンドが検出された。
▲５▼［ヒトＣＤ１４アミノ酸置換改変体の調製］
本明細書中においてｓＣＤ１４（１−３０７）のＮ末端から２８３番目のアミノ酸ＬｅｕをＡｌａに置換したヒトｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体ポリペプチドを「ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｌ２８３Ａ」と記載し、他のヒトｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体ポリペプチドも同様に記載した。
ヒトＣＤ１４（１−３０７）の種々の場所に１あるいは２アミノ酸変異を導入したヒトｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体ポリペプチドを作製するために、以下の方法で哺乳動物細胞発現プラスミドを作製した。
ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｋ２７９Ａを発現するプラスミドｐＭ１６７３は、センスプライマー４とアンチセンスプライマー１８（配列番号３８）あるいはセンスプライマー１０（配列番号３９）とアンチセンスプライマー１３を用い、▲２▼で作製したプラスミドｐＭ１６５８を鋳型とし、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返しＰＣＲ反応を行った。
アンチセンスプライマー１８とセンスプライマー１０にはＬｙｓをコードする配列の代わりにＡｌａをコードする配列ＧＣＴ（アンチセンスプライマーはＡＧＣ）を用いた。これらのＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動によって分離回収し、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いてＤＮＡ断片の末端を平滑化した。
次にこれらの断片のｍｉｘｔｕｒｅを鋳型に、センスプライマー５とアンチセンスプライマー６を用い、上記と同様の条件で再度ＰＣＲ反応を行った。２度目のＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩによりｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎし、ｐＭ１６５６をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより得られる約５．８ｋｂのＤＮＡ断片とｌｉｇａｔｉｏｎした。ＪＭ１０９細胞を形質転換した後、生じたコロニーをＰＣＲにより確認し、目的のＣＤ１４改変体ポリペプチドを発現するプラスミド（ｐＭ１６７３）を得た。
また同様に、Ｎ末端から２８２番目のＶａｌ、２８３番目のＬｅｕ、２８４番目のＡｓｐ、２８５番目のＬｅｕ、２８６番目のＳｅｒ、２８７番目のＣｙｓ、２８９番目のＡｒｇ、２９４番目のＰｒｏ、２９６番目のＰｒｏ、２９４番目及び２９６番目のＰｒｏあるいは３００番目のＰｒｏをそれぞれＡｌａへ置換したｓＣＤ１４（１−３０７）Ｖ２８２Ａ、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｌ２８３Ａ、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｄ２８４Ａ、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｌ２８５Ａ、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ａ、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｃ２８７Ａ、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｒ２８９Ａ、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｐ２９４Ａ、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｐ２９６Ａ、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｐ２９４／２９６ＡあるいはｓＣＤ１４（１−３０７）Ｐ３００Ａを発現するプラスミド（ｐＭ１６６３、ｐＭ１６７７、ｐＭ１６６４、ｐＭ１６７８、ｐＭ１６６５、ｐＭ１６６６、ｐＭ１６６７、ｐＭ１６６９、ｐＭ１６７０、ｐＭ１６７１あるいはｐＭ１６７２）は、それぞれ置換を導入するアミノ酸のコドン配列をＡｌａのコドン配列ＧＣＴあるいはＧＣＧ（アンチセンスプライマーはＡＧＣあるいはＣＧＣ配列）に変えたアンチセンスプライマー１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８及び２９（配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１）とセンスプライマー１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１（配列番号５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１及び６２）を用い、ｐＭ１６７３と同様の方法で作製した。
さらにｓＣＤ１４（１−３０７）Ｒ２８９Ｄを発現させるプラスミド（ｐＭ１６６８）も同様に構築した。この際、Ａｓｐへの置換のためＡｒｇのコドン配列（ＡＧＡ）をＡｓｐのコドン配列ＧＡＴ（アンチセンスプライマーはＡＴＣ）に変えたセンスプライマー２２（配列番号６３）及びアンチセンスプライマー３０（配列番号６４）を用いた。
さらに、２８６番目のＳｅｒをＣｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕにそれぞれ置換した改変体を発現するプラスミドを作製した。構築方法はｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ａ発現プラスミドの構築と同様で、Ｃｙｓ置換の場合はセンスプライマー２３（配列番号６５）及びアンチセンスプライマー３１（配列番号６６）を用いた。Ｇｌｙ置換の場合はセンスプライマー２４（配列番号６７）及びアンチセンスプライマー３２（配列番号６８）を、Ｔｈｒ置換の場合はセンスプライマー２５（配列番号６９）及びアンチセンスプライマー３３（配列番号７０）を、Ｌｅｕ置換の場合はセンスプライマー２６（配列番号７１）及びアンチセンスプライマー３５（配列番号７２）を用いて構築を行った。
次に得られたプラスミドを▲３▼に従い、ＣＯＳ−１細胞に導入し、ヒトｓＣＤ１４（１−３０７）アミノ酸置換改変体を得た。
得られたＣＤ１４改変体を含む培養上清は、必要に応じて精製した。すなわち、抗ヒトＣＤ１４抗体（３Ｃ１０）を結合したアフィニティー精製用カラム（ＨｉＴｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社））に供して選択的に吸着させ、ｐＨ勾配にて溶出した。得られた溶出画分はただちにｐＨ８．０の１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液にて中和し、ｐＨを中性とした。各画分はＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　３Ｃ１０を用いたＥＩＡ法により検定し、ＣＤ１４改変体ポリペプチドの含まれる画分を選択した。
（４）［ペプチドによる阻害実験］
精製ｓＣＤ１４（１−３５６）１μｇ／ｍｌを炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に希釈し、プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に３７℃、１時間で固相化した後、プレートを洗浄し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。ブロッキング液を除去し、（１）で調製した各ペプチドをＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈し、添加した。続けて、中根ら（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２２：１０８４，１９７４）の方法によりペルオキシダーゼで標識したＦ１０２４−１−３抗体を１μｇ／ｍＬで添加し、３７℃で１時間反応させた。
０．９％ＮａＣｌ／０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、Ｈ２Ｏ２／ＴＭＢ溶液を用いて発色させた後０．５Ｍ硫酸で反応を停止し、結合したＦ１０２４−１−３抗体の量を測定した。
その結果、図１２に示すように、Ｆ１０２４−１−３抗体はペプチドＡ、Ｂでは弱いながら阻止されたが、ペプチドＣ、Ｄ及びコントロールに用いた無関係なペプチドＥでは阻止されず、Ｆ１０２４−１−３抗体の認識する領域は２８３番目のアミノ酸より３１８番目のアミノ酸の間にあることが推定された。
（５）［ＣＤ１４欠失改変体による抗体との結合実験］
プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に、１０μｇ／ｍｌで３Ｃ１０抗体または１００倍希釈したＭＥＭ−１８抗体を固相化し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。次に、ブロッキング液を除去し、濃度を測定した各ＣＤ１４欠失改変体を添加して室温で１時間反応した。洗浄後、１０％ＲＳ／０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳに１μｇ／ｍｌの濃度で希釈したペルオキシダーゼ標識Ｆ１０２４−１−３抗体またはペルオキシダーゼ標識３Ｃ１０抗体を添加し、同様に室温で１時間半反応させた。洗浄後、Ｈ２Ｏ２／ＴＭＢ溶液を用いて発色させた後０．５Ｍ硫酸で反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍの波長によりＮＪ−２１００（日本インターメッド）プレート吸光度計で測定した。
固相に使用した３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８抗体はそれぞれの結合サイトが７−１１番目のアミノ酸、５７−６４番目のアミノ酸であることが明らかであるため、今回用いたＣＤ１４欠失体のうちＣＤ１４（Δ７−１１）は３Ｃ１０と結合せず、またＣＤ１４（Δ５７−６４）はＭＥＭ−１８と結合しないが、他のＣＤ１４欠失体とは結合する。したがって、３Ｃ１０／Ｆ１０２４−１−３系、ＭＥＭ−１８／Ｆ１０２４−１−３系、ＭＥＭ−１８／３Ｃ１０系の３種類のサンドイッチＥＬＩＳＡ系の結果を解析することにより、それぞれの抗体の結合活性を解析できる。
得られた結果を解析したところ、図１３に示すように、Ｆ１０２４−１−３抗体はｓＣＤ１４（１−３５６）からｓＣＤ１４（１−３０７）までは結合活性が認められ、また、３Ｃ１０の結合サイトを欠失したＣＤ１４（Δ７−１１）、ＭＥＭ−１８の結合サイトを欠失したＣＤ１４（Δ５７−６４）とも結合し、さらにｓＣＤ１４（１−３０７）の１８０番目のアミノ酸より２８２番目のアミノ酸を欠失したＣＤ１４（Δ１８０−２８２）とも結合活性が認められた。このことから、Ｆ１０２４−１−３抗体は３Ｃ１０、ＭＥＭ−１８抗体とは異なる抗体であり、また、結合領域は２８５番目よりＣ末端側であることが明らかになった。なお、ｓＣＤ１４（１−３０７）結合活性は他のＣＤ１４欠失体に比較して弱いため、表示を（＋）で示した。
（６）［ＣＤ１４アミノ酸置換改変体による結合実験］
上記と同様な測定系を用いてＣＤ１４アミノ酸置換改変体の結合活性を測定した。その結果、図１４に示すように２９４番目のアミノ酸をＰｒｏからＡｌａに置換することによりＦ１０２４−１−３抗体の結合活性が失われ、このような現象は３Ｃ１０、ＭＥＭ−１８抗体には認められなかった。Ｆ１０２４−１−３抗体がＣＤ１４の２９４番目のプロリンをポイントミューテーションすることにより結合しなくなることは、ＣＤ１４の立体構造が変化したことが原因である。したがってＦ１０２４−１−３抗体は２９４番目のアミノ酸がＰｒｏであることによって生じ得る立体構造を認識していることが明らかとなった。
（７）［ペプチドマッピングによる結合実験］
Ｆ１０２４−１−３抗体が認識するエピトープをさらに詳細に解析する目的で、ＳＰＯＴｓ（ＧＥＮＯＳＹＳ）を用いて配列番号１に記載のＣＤ１４のアミノ酸番号２４６番目から３４５番目までの間のアミノ酸配列に基づき、２アミノ酸ずつＣ末側に配列をずらした１０アミノ酸残基のペプチド４６種類をメンブレン上に合成した。次にプロトコールに基づき、メンブレンをブロッキングし、一次抗体としてＦ１０２４−１−３抗体を反応させ、洗浄後二次抗体としてβガラクトシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と反応させた。洗浄後、発色液を添加し青色のスポットが出現するのを確認したところ、Ｆ１０２４−１−３抗体由来のスポットは検出されず、ペプチドマッピングにより抗体のエピトープを決定することができなかった。このことはＦ１０２４−１−３抗体が１０アミノ酸により構成されるリニアーなペプチドをエピトープとはせず、立体的な構造に起因するエピトープを認識することを示唆している。
これらのことから、Ｆ１０２４−１−３抗体の結合領域は配列番号１のＣＤ１４の２８５番目のアミノ酸より３１５番目のアミノ酸に存在し、２９４番目のアミノ酸がＰｒｏであることによって生じ得る立体構造を認識していることが明らかとなった。すなわち、該抗体はＣＤ１４の２９４番目のアミノ酸がＰｒｏであることによって生じ得る立体構造の２８５番目のアミノ酸より３１５番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識することが明らかとなった。
実施例１２　抗ＣＤ１４抗体のエピトープの範囲の解析
抗ＣＤ１４抗体がＦ１０２４−１−３抗体と同じ機能を有するために必要な、抗ＣＤ１４抗体のＣＤ１４上の認識部位の範囲を、実施例１１で解析したＦ１０２４−１−３抗体のエピトープの周辺を中心に解析した。
モチーフを揃えるように多重整列した上で、あらためてその周囲の残基を含めて類似性スコアを計算し、挿入、欠失なく保存度の高い領域のみを抽出したデータベースであるＢＬＯＣＫＳデータベースを、ヒトＣＤ１４を対象として、プロファイル検索した。さらに、各種二次構造予測法（Ｌｅｖ，　ＧＯＲ　ＩＶ，　ＰＲＥＤＡＴＯＲ）により解析した。
その結果、ＢＬＯＣＫＳデータベースのプロファイル検索より、ＩＬ−１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮＯ．　ＢＬ００５２５３Ｃ）とその受容体の結合領域と類似性がある領域を、２６９番目から３０７番までの３９アミノ酸残基と特定した。保存度が高いと推測されたアミノ酸残基（残基番号）は、Ｑ（２７１）Ｖ（２７２）Ｐ（２７３）Ｌ（２７６）Ｋ（２７９）Ｌ（２８３）Ｌ（２８５）Ｓ（２８６）Ｃ（２８７）Ｐ（２９４）Ｅ（２９８）Ｌ（２９９）Ｐ（３００）Ｅ（３０１）Ｎ（３０４）Ｌ（３０５）Ｔ（３０６）であった。
さらに、この領域の２８７番からＣ末端側の配列は、ＬＲＲ（ＰＤＢ−ＩＤ：１Ａ４Ｙ：Ａ）との相同性が高くなかった。
また各種二次構造予測法（Ｌｅｖ，　ＧＯＲ　ＩＶ，　ＰＲＥＤＡＴＯＲ）からは、α−ヘリックス構造及びβ−シート構造ともに一致した予測結果が得られないこと、一般的にプロリンが多く存在する場合ヘリックス構造やシート構造をとりにくいこと、３０４番アスパラギンはモチーフデータベースの糖鎖結合モチーフと一致し、糖鎖結合可能部位であることから、この領域は蛋白質の表面に露出していることがわかった。
これらの解析より、該領域は、生理学的条件下では、ループが形成可能な領域であり、他の蛋白質と相互作用可能な部位であった。
すなわち、実施例１１のＦ１０２４−１−３抗体のエピトープ及び、上記解析より、ヒトＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害することができる抗ＣＤ１４抗体のエピトープの範囲は、ヒトＣＤ１４の２６９番から３１５番までの領域であった。
実施例１３　ラットＦ１０２４−１−３抗体可変領域の配列決定
ラットＦ１０２４−１−３抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を以下に示す方法により解析し、相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を決定した。
（１）精製Ｆ１０２４−１−３抗体のアミノ酸配列の解析
まず、実施例２に記載の方法により精製したＦ１０２４−１−３抗体をピリジルエチル化（以下ＰＥ化と略す）し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより脱塩精製した。ＰＥ化軽鎖はＰｒｏｃｉｓｅ４９４ｃＬＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）により直接アミノ酸配列分析を行った。重鎖のアミノ末端のペプチド配列はアミノ末端がブロキングされていたことより、決定することが出来なかった。そこで、ＰＥ化重鎖はＣＮＢｒ分解後、ＲＰ−ＨＰＬＣによりペプチド゛断片を分離精製し、ペプチドシークエンサーＰｒｏｃｉｓｅ４９４ｃＬＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）によりアミノ酸配列分析を行った。同様にＰＥ化軽鎖についてもペプチド断片のアミノ酸配列分析を行った。得られた配列をＥＭＢＬデーターベース記載のラットＩｇＧ配列の重鎖及び軽鎖の配列と比較することにより配列上のペプチド断片の位置を決定した。重鎖のアミノ末端の配列は決定できなかったため、Ｃｏｈｅｎ，Ｈ（Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｖｉｅ　３１７（４），２９３−２９８，１９９４）、Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｊ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　９（７），６２３−６２８，１９９６）及びＬｕｔｚ　Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（Ｎａｔｕｒｅ　３３２，３２３−３２７，１９８８）等の報告に基づき推定し、アミノ末端の配列を決定した。
（２）Ｆ１０２４−１−３抗体のｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、シークエンシング
（１）で決定したアミノ酸配列データに基づき配列番号７３から８２までのプライマーを合成した。また、軽鎖のプライマーとして５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ領域に由来する配列番号８３及び８４のプライマーを合成した。プライマーの塩基配列とそれに対応する図１５（後述）上のアミノ酸配列の位置を表３に示す。
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まず、Ｆ１０２４−１−３抗体産生ハイブリドーマＦ１０２４−１−３の凍結アンプルを１本解凍後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。次に、培養細胞を回収しＰＢＳ−（ｐＨ７．４）で細胞を洗浄後、Ｙ．Ｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，１４（２），１９９−２０５（１９９９）に基づいてｃＤＮＡの解析を以下のように行った。まず、ＩＳＯＧＥＮＥ（日本ジーン）によりｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。次に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマニュアルに従ってオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型としてセンスプライマー、アンチセンスプライマーによりＰＣＲを行った。ＰＣＲはＥｘＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を用いて９４℃、６０秒、５５℃３０秒、７２℃、１２０秒３５サイクルの条件で行い、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　２４００（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用した。ゲルでバンドを確認後、ＰＣＲ産物を切出し精製し、ＡＢＩ　Ｄｙｅ　ｄｅｏｘｙ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）のマニュアルに従いＡＢＩ３７３Ａ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）でシークエンシングを行った。得られた重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を図１５に、ＣＤＲのアミノ酸配列を図１６（配列番号３〜８）に示した。また、得られた重鎖及び軽鎖の塩基配列を図１７に、ＣＤＲを図１８に示した。
実施例１４　Ｆ１０２４−１−３ラット─ヒトキメラ抗体の作製
抗原結合活性を有するＶ領域がＦ１０２４−１−３抗体由来、すなわちラット抗体由来であり、Ｃ領域をヒト由来の抗体（キメラ抗体）を作製することにより、ヒトへの抗原性が少ない抗体を得ることが出来る。キメラ抗体は１９８４年のＭｏｒｒｉｓｏｎら（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１，１９８４）の報告以来多くのものが開発されている。
（１）抗体遺伝子のクローニング
Ｆ１０２４−１−３抗体を産生する細胞株Ｆ１０２４−１−３を培養し、細胞を調製する。得られた細胞をＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ）で洗浄後、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎｅ（日本ジーン）を用いて単離精製する。次にＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成する。重鎖及び軽鎖のアミノ末端のアミノ酸配列に基づきセンスプライマーを合成する。また、重鎖アンチセンスプライマーはフレームワーク４の配列に基づき、軽鎖アンチセンスプライマーはＶ　κ配列に基づき作製する。ＰＣＲ後、ＤＮＡ断片をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、シークエンスを解析する。
（２）ラット─ヒト重鎖及び軽鎖発現ベクターの構築
まず、ヒトイムノグロブリンＧ１のＣＨ１領域のＮ末端側をコードする塩基配列をセンスプライマーとして合成し、アンチセンスプライマーはヒトイムノグロブリンＧ１の３’非翻訳領域の配列を含む領域を合成する。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて、ＨｕｍａｎＳｐｌｅｅｎ５’−ＳｔｒｅｔｃｈｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ（クローンテック社製）よりＰＣＲ反応によりヒトイムノグロブリンＣＨ領域を増幅する。また、重鎖センスプライマーは実施例１−１の重鎖領域をコードする塩基配列とヒトイムノグロブリンＧ１のＣＨ１領域のＮ末端側をコードするアミノ酸配列にＥｃｏＲＩサイトをコードする配列を含むように作製する。アンチセンスプライマーはヒトイムノグロブリンＧ１のＣＨ３領域のＣ末端側に位置するアミノ酸配列をコードする塩基配列とＢａｍＨＩサイトを含むように作製する。これらキメラのプライマーを組み合わせて、ラットＶＨ領域にオリエンテーションが一致するようにヒトイムノグロブリンＣＨ領域を組み込む。得られたＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、ＤＮＡ断片を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、ラット─ヒト重鎖発現プラスミドを作製する。同様にヒトのＣＬ領域とラット由来の軽鎖領域を有するキメラ抗体遺伝子を含む発現プラスミドを構築する。
（３）キメラ抗体の作製
形質転換体を作製するため、それぞれの発現プラスミドを制限酵素で切断し、直線化する。次に、ジーンパルサー（ＢＩＯＲＡＤ）等を用いて遺伝子をＳＰ２／Ｏ−ａｇ１４（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）に導入し、培養後上清に産生されるラット─ヒトキメラ抗体の有無により目的の抗体を産生する細胞を選択する。具体的には直線化したＤＮＡ断片約２０μｇを１×１０７細胞に３６０Ｖ、２５μＦＤのキャパシタンスでエレクトポレーションを行う。次に細胞を９６穴プレートに植え込み、２日間培養後、プラスミド断片が組み込まれた細胞を選択するため、１０％ＦＣＳ、１×ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２ｍｇ／ｍｌＧ−４１８を含むＤ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、更に２週間培養する。細胞がコンフルエントになった段階で無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｔｅｃ）で培養し、培養上清をプロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）で精製し、精製キメラ抗体を得る。
得られたキメラ抗体は実施例２の方法により、ＣＤ１４／ＴＬＲ結合阻害活性が確認される。
実施例１５　ヒト化Ｆ１０２４−１−３抗体の作製（１）
（１）ヒト化Ｆ１０２４−１−３抗体可変領域のコンピューターモデリング
ヒト化抗体で高い親和性を保持するために、クイーンらの一般的な方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１００２９，１９８９）に準じてフレームワーク残基の選択を行う。ヒト配列はＫａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ　ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）のカッパ軽鎖及び重鎖配列データベースに基づきラットＦ１０２４−１−３抗体に高いフレームワーク相同性を有する配列を選択する。さらに、コンピューター解析により最も適したフレームワーク中のアミノ酸の改変を行う。具体的にはコンピュータープログラムＥＮＣＡＤ（レビット、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．１６８，５９５（１９８３）を用いてＦ１０２４−１−３抗体可変領域の分子モデルの構築を行う。抗体データーベースより得られたヒトＥｕ抗体分子モデル（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８５（４），６６８−６７４（１９９５）にＦ１０２４−１−３抗体のＣＤＲ配列をＦＲ中に移植する。コンピューターモデル上でＣＤＲとＦＲが本来のヒト抗体モデルとは異なり、有意な接触を示すＦＲ領域で、アミノ酸置換を行うことによりＣＤＲとＦＲとの接触が改善されると予想される位置についてラット抗体由来のアミノ酸への置換を行う。また、ヒト抗体のデーターベース中でその位置においてまれにしか現れないＦＲ中のアミノ酸残基はそれらの位置におけるヒトコンセンサンスアミノ酸に置換する。アミノ酸置換の良否は実際の活性により確認することになるため、アミノ酸置換の異なるタイプの抗体を数種類作製する。
（２）ヒト化Ｆ１０２４−１−３抗体の構築
（１）で選択された配列を基に、シグナルペプチド、スプライス供与シグナル及び制限サイト（例えばＸｂａＩ）を含むアミノ酸配列をコードする遺伝子を構築する。構築した遺伝子は合成ヌクレオチド（８０塩基長程度）のものを数種類オーバーラップするように調製する。すなわち、オリゴを対にしてアニールし、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で伸長し、２本鎖断片を得る。この断片を変性し１本鎖にした後、同様にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で伸長し、全長の遺伝子をコードする２本鎖断片を得る。得られる断片をＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲで増幅し、精製後に制限酵素（例えばＸｂａＩ）で切断し精製する。精製した断片をヒトγ１遺伝子のＣＨ１エクソンからＣＨ３エクソンまでを含む定常領域遺伝子をＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片を有するプラスミドｐＶｇ１（Ｃｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）のＸｂａＩサイトに挿入する。同様な操作によりγ４の定常領域遺伝子を含むプラスミドにも挿入可能である。また、置換するアミノ酸の数が少ない場合は部位特異的突然変異導入により作製し、発現プラスミドに導入することも可能である。軽鎖可変領域配列は上記と同様に構築可能である。この場合ｐＶｋベクターにはヒトＣκ領域を含むものを使用する。
抗体を産生する形質転換体を作製するため、重鎖及び軽鎖プラスミドを制限酵素（ｐＶｋプラスミドの場合はＢａｍＨＩ及びＦｓｐＩ）で切断し直線化後、マウスミエローマ細胞Ｓｐ−Ｏ−ａｇ１４（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）中へジーンパルサー（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて導入する。具体的には直線化したＤＮＡ断片約２０μｇを１×１０７細胞に３６０Ｖ、２５μＦＤのキャパシタンスでエレクトポレーションを行う。次に細胞を９６穴プレートに植え込み、２日間培養後、プラスミド断片が組み込まれた細胞を選択するため、１０％ＦＣＳ、１×ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５ｍｇ／ｍｌＸａｎｔｈｉｎｅ、１μｇ／ｍｌＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄを含むＤ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、更に２週間培養する。培養後上清にでる抗体により目的とするヒト化Ｆ１０２４−１−３抗体産生株を選択する。すなわち、上清中の抗体が固相化したＣＤ１４抗原と結合し、結合する抗体をペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体で検出する。選択した株はコンフルエントになるまで１０％ＦＣＳを含む培地で培養し、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換する。培養上清を回収し、プロテインＡ（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）に結合させ、０．１Ｍ　グリシン塩酸（ｐＨ３．０）で溶出する。精製抗体をＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ）で透析し、２８０ｎｍの吸光度より抗体濃度を算出する（ヒト抗体１ｍｇ／ｍＬは１．３の吸光度を示す）。
（３）ヒト化抗体の評価
ヒト化抗体が元のラット抗体と同様な活性を有していることを確認するため、ＣＤ１４／ＴＬＲ結合抑制活性、及び結合のアフィニティーを比較する。ＣＤ１４／ＴＬＲ結合抑制活性は実施例２の記載にしたがって行い、Ｆ１０２４−１−３抗体との比較を行う。アフィニティーの測定はＢＩＡＣＯＲＥシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて測定する。すなわち、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００を使用し、マニュアルにしたがってＣＭ５チップ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）に精製ＣＤ１４を固定化する。次にＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＢＩＡＣＯＲＥ社）で希釈した抗体希釈列を作製し、各サンプルをインジェクトし解析を行う。抗原抗体結合を１００ｍＭ　塩酸溶液で解離し、次のサンプルをインジェクトする。得られたデータをＢＩＡＣＯＲＥの解析プログラム（ＢＩＡ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、ＢＩＡＣＯＲＥ）により解析し、アフィニティー（Ｋｄ）を算出する。
実施例１６　ヒト化Ｆ１０２４−１−３抗体の作製（２）
（１）ヒト化抗体遺伝子の作製
ヒト化抗体において移植するＣＤＲ配列が活性を有する適切なドメイン構造を維持させるために元のＦＲ領域の配列も合わせて移植する。ＣＤＲドメイン構造の維持にどのアミノ酸が関与しいているかは、ＦＲ中のアミノ酸の性質（疎水性、親水性、酸性、塩基性、分子サイズ等）から解析し、またコンピューターを用いたモデリングにより行う。すなわち、シリコーングラフィック上で起動するソフトウエアーＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭｍあるいはＭｏｄｅｌｅｒ（モレキュラー・シュミレーションズ）を用いてモデリングを行う。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に登録されているヒト抗体配列よりＦ１０２４−１−３抗体のＶＨ及びＶＬ領域と相同性の高い抗体の三次元構造を検索し、それに基づきＦ１０２４−１−３抗体の三次元構造を推定する。推定三次元構造上で重鎖及び軽鎖のＣＤＲに水素結合しているＦＲ領域中のアミノ酸群（第１群）を選出し、更にそれらに水素結合しているＦＲ領域中のアミノ酸群（第２群）を選出する。同様に、ＣＤＲに静電的相互作用やファンデルワルツ力等のエネルギー結合により結合していると推定されるＦＲ領域中のアミノ酸群（第１群）と更にそれらに結合していると推定されるＦＲ領域中のアミノ酸群（第２群）を選択する。このようにして選択したＦＲ領域中のアミノ酸群をＣＤＲアミノ酸と併せてヒト抗体配列上に移植するが、Ｋａｂａｔ等の分類（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ　ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）やＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等より得られるヒト抗体配列の可変領域アミノ酸には存在しないような配列が生じる場合は、そのアミノ酸は移植しない。このようにして得られた情報に基づきヒト抗体配列ＶＨ及びＶＬに移植する配列を決定し、ヒト化抗体作製に用いる遺伝子を構築する。
構築した遺伝子はアマシャムのキット（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２）とＰＣＲ法を組み合わせる方法、また数種類の長鎖合成ヌクレオチドを組み合わせて増幅する方法、キメラ抗体のＶＨあるいはＶＬ遺伝子を鋳型に数種類のプライマーを用いて増幅後、さらにそれら増幅遺伝子断片を鋳型として全長遺伝子断片を得る方法により作製する。得られた増幅遺伝子断片を実施例１５記載のプラスミドｐＶｇ１あるいはＶκを含むプラスミドｐＶｋの制限酵素サイトに導入することにより発現プラスミドを調製する。作製したプラスミドは実施例１５記載の方法により細胞に導入し、形質転換体を得、同様に精製抗体を作製する。また、同様に抗体の評価を行う。
実施例１７　ＣＤＲペプチドの調製
実施例１３で決定したＣＤＲ配列に基づき、ペプチド合成機（４３３Ａ、アプライドバイオシステムズ）により各ペプチドを合成する。合成ペプチドは定法により切出し後、ＨＰＬＣにより精製し凍結乾燥品を得る。得られたペプチドは実施例２の方法により、ＣＤ１４／ＴＬＲ結合阻害活性が確認される。
実施例１８　ＣＤ１４改変体ポリペプチド高発現細胞株の樹立
（１）［ＣＤ１４改変体ポリペプチド発現プラスミドの構築］
実施例１１で得られたｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃを発現させるプラスミドをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩでｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎし、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６ＣをコードするＤＮＡ断片を切り出し、一方で、アンピシリン耐性遺伝子、ヒトＥＦｐｒｏｍｏｔｅｒおよびＳＶ４０　ｌａｔｅ　ｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　ｐｏｌｙＡの上流に葉酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子をコードした発現ベクター（ｐＭ１１０３）を、ＥＦｐｒｏｍｏｔｅｒ下流でＳＶ４０　ｌａｔｅ　ｐｏｌｙＡの上流にあるＸｂａＩとＮｏｔＩにてｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎした。ｐＭ１１０３のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトに先ほど得られたｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６ＣをコードするＤＮＡ断片を挿入し、コンピテントセルＪＭ１０９（ＴａＫａＲａ社）を用い、定法に従ってＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎしてヒトｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃをホニュウ細胞で発現させるプラスミド（ｐＭ１６７５）を得た
（２）ＣＤ１４改変体ポリペプチド生産用ＣＨＯ形質転換株の樹立
ＣＤ１４改変体ポリペプチド生産用ＣＨＯ形質転換株を樹立するために、（１）で作製した発現プラスミドｐＭ１６７５をＤＨＦＲ遺伝子欠失チャイニーズハムスター子宮腫細胞株ＣＨＯ　ＤｘＢ１１に下記の方法にてＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。即ち、５０μｌのＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）と１２．５μｇのｐＭ１６７５を添付プロトコールに従って混合した後に、１５０ｃｍ２のルーフラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＨＯ　ＤｘＢ１１細胞へ添加した。翌日、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ処理を行って回収し、１０ｃｍ２ディッシュに１０％非働化透析ＦＢＳおよび２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを含むＭＥＭαｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ核酸欠失培地にて１ディッシュあたり２×１０４個の細胞を播種した。以降３〜４日毎に１０％非働化透析ＦＢＳおよび２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを含むＭＥＭαｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ核酸欠失培地で培地交換を行い、１８日間選択培養を行った結果、核酸欠失培地中で増殖する２４個のクローンを得た。次に、得られたクローン２４株について、培養上清中のＣＤ１４改変体ポリペプチドの産生量を実施例１１と同様の方法で測定した。その結果、生産量が２μｇ／ｍＬを超える９クローンを得た。このうち、ＴｆＳ２８６Ｃ−９９株は最も産生量が高く、５．７μｇ／ｍＬであった。
（３）ＣＤ１４改変体ポリペプチド高生産形質転換株の樹立
ＣＤ１４改変体ポリペプチド高生産形質転換株の樹立するために、以下に示す方法による選択培養を行った。（２）にて樹立したクローンの内、最も生産量の高いクローン（ＴｆＳ２８６Ｃ−９９）を１０ｃｍ２ディッシュに３０００個の細胞数で終濃度１５０ｎＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）、１０％非働化透析ＦＢＳおよび２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを含むＭＥＭαｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ核酸欠失培地中に植え込んだ。３日後、終濃度１５０ｎＭのＭＴＸ、１０％非働化透析ＦＢＳおよび２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを含むＭＥＭαｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ核酸欠失培地にて培地交換を行い、５日間選択培養を行った。その結果、１５０ｎＭのＭＴＸを含む培地中で増殖した１５クローンを得た。得られたクローン１５株について、次にＣＤ１４改変体ポリペプチドの産生量を調べた。１５種の各クローンの培養上清中のＣＤ１４改変体ポリペプチド濃度を、実施例１１と同様の方法で測定した。その結果、それぞれ生産量が１４７μｇ／ｍＬ、１４４μｇ／ｍＬおよび１５４μｇ／ｍＬとなるクローンＴｆＳ２８６Ｃ−９９−１５０−３、ＴｆＳ２８６Ｃ−９９−１５０−８、ＴｆＳ２８６Ｃ−９９−１５０−９を得た。
それぞれのクローンより得られたｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃは、実施例２の方法により、ＣＤ１４／ＴＬＲ結合阻害活性が確認された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ヒトＣＤ１４を介する細胞活性化を抑制する抗体であって、形成されたＣＤ１４／ＬＰＳであっても細胞内へのシグナル伝達を調節しうる抗ＣＤ１４抗体を提供する。また特定のアミノ酸配列をＣＤＲとして有するモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体を提供する。さらにはＴＬＲとの結合を抑制する抗体を提供する。
また抗ヒトＣＤ１４抗体が該作用をするために必要な認識領域のＣＤ１４における特定により、その特定領域を用いた抗体の作成方法、及びＣＤ１４とＴＬＲとの結合を阻害する物質を有効成分とする敗血症用医療組成物を提供する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトＣＤ１４抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニングで、ＬＰＳ／ＣＤ１４によるＴｏｌｌ４を介するＮＦ−κＢの活性化の抑制を示したＦ１０２４−１−３抗体の測定結果を示す図である。
図２は、Ｆ１０２４−１−３抗体のイヌ、アカゲサル、カニクイサル、ウサギ、ヒトの可溶型ＣＤ１４との交差反応性を示す図である。
図３（ａ）〜（ｃ）は、Ｆ１０２４−１−３抗体のウサギＣＤ１４との結合をＦｌｕｏｒｏｃｙｔｏｍｔｒｙ法で検討した結果を示す図である。
図４は、Ｆ１０２４−１−３抗体のＬＰＳ／ＣＤ１４による内皮細胞でのＩＬ−６産生抑制効果を示す図である。ｃｏｎＡｂはコントロールのラットＩｇＧを示す。
図５は、Ｆ１０２４−１−３抗体のＬＰＳ／ＣＤ１４複合体形成後の内皮細胞におけるＩＬ−６産生抑制効果を示す図である。
図６（ａ）〜（ｃ）は、ＣＤ１４発現細胞へのＦＩＴＣ−ＬＰＳの結合試験の結果、Ｆ１０２４−１−３抗体が阻害しないことを示す図である。
図７は、ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおけるＦ１０２４−１−３抗体前投与によりＴＮＦの産生が抑制されることを示す図である。
図８は、ＬＴＡ／ＰｅｐＧ投与ウサギ敗血症モデルにおけるＦ１０２４−１−３抗体前投与により白血球減少症が改善されることを示す図である。
図９は、ＬＰＳ負荷ウサギ敗血症モデルにおけるＦ１０２４−１−３抗体後投与によりＡＬＴ、クレアチニンの数値が改善されることを示す図である。黒印は抗体投与群、白丸印は生食投与群を示す。
図１０は、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００を用いてＬＰＳ／ＣＤ１４／ＴＬＲ４−ＣＯＳ複合体を形成させたときの結合量、Ｆ１０２４−１−３抗体を結合したときのＴＬＲ４−ＣＯＳの結合抑制効果を示す図である。レスポンスはビアコア社の指標であり、１０００ＲＵが１．２ｎｇの結合量を示す。
図１１は、ＨＥＫＴ４−１４におけるＩＬ−８の誘導産生に対するＦ１０２４−１−３及びｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃの抑制効果を示すグラフである。
尚、阻害活性は下記により算出した。
（抗体あるいは組換え体未添加時のＩＬ−８産生量─抗体あるいは組換え体添加時のＩＬ−８産生量）／抗体あるいは組換え体未添加時のＩＬ−８産生量×１００
図１２は、Ｆ１０２４−１−３抗体のＣＤ１４（１−３５６）への結合を阻止する活性をもつペプチドを示す図である。
図１３は、Ｆ１０２４−１−３抗体の各種ＣＤ１４欠失改変体との結合活性を示す図である。
図１４は、Ｆ１０２４−１−３抗体の各種ＣＤ１４アミノ酸置換改変体との結合活性を示す図である。
図１５は、Ｆ１０２４−１−３抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の決定したアミノ酸配列を示す図である。
図１６は、Ｆ１０２４−１−３抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列を示す図である。
図１７は、Ｆ１０２４−１−３抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の決定したアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡの一例を示す図である。
図１８は、Ｆ１０２４−１−３抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列をエンコードするＤＮＡの一例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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