(57)【要約】タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもつアクセプター部と、該アクセプター部とヌクレオチドリンカーを介して結合した、修飾物質を含む修飾部とを含む、タンパク質のＣ末端修飾剤の存在下で、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の５’側に位置する、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、ＯＲＦ領域の３’側に位置する、ポリＡ配列を含む３’末端領域とを含む翻訳テンプレートを翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせ、合成されたタンパク質を精製する。これにより、タンパク質のＣ末端修飾法における修飾タンパク質の収量を大幅に改善し、種々の分子間相互作用検定法によるタンパク質相互作用の検出を改善されたレベルで実現する。
2002046395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもつアクセプター部と、該アクセプター部とヌクレオチドリンカーを介して結合した、非放射性修飾物質を含む修飾部とを含む、タンパク質のＣ末端修飾剤。
【請求項２】
アクセプター部がピューロマイシン又はその誘導体の残基をもつ、請求項１に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤。
【請求項３】
ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸である、請求項１又は２に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤。
【請求項４】
ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシシチジル酸である、請求項１又は２に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤。
【請求項５】
ヌクレオチドリンカーがリボシチジル酸である、請求項１又は２に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤。
【請求項６】
ヌクレオチドリンカーがリボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸である、請求項１又は２に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤。
【請求項７】
修飾部が蛍光基をもつ、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤。
【請求項８】
修飾部が、タンパク質と結合する基をもつ、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤。
【請求項９】
修飾部が、タンパク質と結合する基および蛍光基の両方をもつ、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾剤がＣ末端に結合したタンパク質であるＣ末端修飾タンパク質。
【請求項１１】
修飾剤がＣ末端に結合するタンパク質が全長タンパク質である、請求項１０に記載のＣ末端修飾タンパク質。
【請求項１２】
タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の５’側に位置する、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、ＯＲＦ領域の３’側に位置する、ポリＡ配列を含む３’末端領域とを含む翻訳テンプレート。
【請求項１３】
転写プロモーターがＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含み、翻訳エンハンサーがタバコモザイクウイルスのオメガ配列の一部を含む、請求項１２に記載の翻訳テンプレート。
【請求項１４】
ＯＲＦ領域が、その下流部分に親和性タグ配列を含む、請求項１２又は１３に記載の翻訳テンプレート。
【請求項１５】
親和性タグ配列がＨｉｓ−ｔａｇ配列を含む、請求項１４に記載の翻訳テンプレート。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤存在下で、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の翻訳テンプレートを翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせることにより得られる、Ｃ末端が修飾されたタンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質のＣ末端修飾剤存在下で、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の翻訳テンプレートを翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせ、合成されたタンパク質を精製することを含む、Ｃ末端修飾タンパク質の製造方法。
【請求項１８】
精製が、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過、イオンクロマトグラフィー、電気泳動、沈殿、透析、および、それらの任意の組合せにより行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質と標的分子との間の相互作用を解析する方法であって、該タンパク質を含む、請求項１０又は１１に記載のＣ末端修飾タンパク質を用いることを特徴とする方法。
【請求項２０】
相互作用の解析が、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１０又は１１に記載のＣ末端修飾タンパク質を固定化することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
標的分子が固定されたアレイ上に請求項１０又は１１に記載のＣ末端修飾タンパク質を添加し、該標的分子と特異的に結合した該Ｃ末端修飾タンパク質を検出することを含む請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、タンパク質の修飾法、および、その修飾タンパク質を用いたタンパク質相互作用の検出法に関する。ゲノムプロジェクトの進展に伴い大量の遺伝子情報が蓄積されつつあり、今後はそれら遺伝子間の相互作用を網羅的に解析することが重要な課題となっている。大量の遺伝子間の相互作用に関して高速でハイスループットスクリーニング（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＴＳ）を行うためには、タンパク質相互作用をより迅速かつ簡便に検出できる系が必要である。本発明は、ゲノム機能解析・プロテオーム解析において、タンパク質と他の生体分子（タンパク質、核酸など）との相互作用を簡便に検出する有効な手段を提供する。
背景技術
分子間相互作用の検出方法として、これまで表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動法、蛍光偏光解消法、エバネッセント場イメージング法、蛍光相関分光法、蛍光イメージング法、固相酵素免疫検定法などが知られている。とりわけ、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）は、測定に必要な試料量が少なく（およそフェムトリットル）、測定時間が短く（およそ１０秒）、ＨＴＳのための自動化が容易である（実際にＥＶＯＴＥＣ社では１日で１０万検体以上のスクリーニングを行うウルトラＨＴＳを目指した装置の開発を行なっている）等の長所があり、検出系として優れている（金城政孝（１９９９）蛋白質核酸酵素４４：１４３１−１４３８）。さらに２種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＣＳ）では、１種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同程度の大きさをもつ分子間の相互作用も検出が可能であり、タンパク質相互作用のＨＴＳへの応用が期待されている。しかしこれまで、ＦＣＣＳを用いてタンパク質相互作用の検出に成功した例は知られていない。
一般に、タンパク質相互作用の検出系では、固定化のためのタグや蛍光色素等のプローブでタンパク質を修飾する必要がある。本発明者等は、ピューロマイシン等の核酸誘導体を用いて翻訳系中でタンパク質のＣ末端を修飾する方法を先に提案している（特開平１１−３２２７８１、特開２０００−１３９４６８）。この方法は、従来の化学修飾法や蛍光タンパク質融合法に比べて、タンパク質の機能を損ないにくい等の利点があるが、修飾タンパク質の収量が少なく、主に無細胞翻訳系を用いるため大量に修飾タンパク質を調製するためには費用がかかる等の、なお改善を要する点がある。特に、ＨＴＳの検出系として最も優れているＦＣＣＳに適用する場合、蛍光修飾したタンパク質の精製度が問題となるため、ゲノム機能解析等の実用化に向けての収量の改善は必須の条件である。
発明の開示
本発明の目的は、タンパク質のＣ末端修飾法における修飾タンパク質の収量を大幅に改善すること、および、この改善された修飾法をタンパク質の蛍光修飾に適用し、さらに適当な蛍光修飾タンパク質の精製法等を検討することによって、蛍光相互相関分光法をはじめ種々の分子間相互作用検定法によるタンパク質相互作用の検出を改善されたレベルで実現することである。
本発明者等は、上記課題を解決すべく研究した結果、蛍光色素等の非放射性修飾物質とピューロマイシンとの間にヌクレオチドリンカーを挿入した修飾剤を用いると、従来のヌクレオチドリンカーを含まない修飾剤を用いた場合に比べて、修飾タンパク質の収量が１００倍近く増大することを見出した。さらに、翻訳テンプレートを改良することにより従来の５〜６倍翻訳効率が上昇することも見出した。リンカーを介してフルオレセインやローダミングリーンやＣｙ５等の蛍光物質とピューロマイシンとを結合させた修飾剤と改良した翻訳テンプレートを用いてタンパク質のＣ末端を蛍光修飾すると、従来法の５００倍の収量でＣ末端蛍光修飾タンパク質が得られ、それを適当な方法で精製して蛍光相互相関分光法や蛍光イメージングアナライズ法で測定することにより、タンパク質間相互作用やタンパク質−核酸相互作用を簡便かつ迅速に、実用レベルで検出できることがわかった。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
本発明は、第１に、タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもつアクセプター部と、該アクセプター部とヌクレオチドリンカーを介して結合した、非放射性修飾物質を含む修飾部とを含む、タンパク質のＣ末端修飾剤（以下、本発明修飾剤ともいう）を提供する。
本発明修飾剤においては、アクセプター部がピューロマイシン又はその誘導体の残基をもつことが好ましい。
本発明修飾剤においては、ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシシチジル酸、リボシチジル酸、又は、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸であることが好ましい。
本発明修飾剤においては、修飾部が蛍光基、タンパク質と結合する基、または、その両方をもつことが好ましい。
本発明は、第２に、本発明修飾剤がＣ末端に結合したタンパク質であるＣ末端修飾タンパク質（以下、本発明修飾タンパク質ともいう）を提供する。
本発明修飾タンパク質において、本発明修飾剤がＣ末端に結合するタンパク質は、全長タンパク質であることが好ましい。
本発明は、第３に、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の５’側に位置する、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、ＯＲＦ領域の３’側に位置する、ポリＡ配列を含む３’末端領域とを含む翻訳テンプレート（以下、本発明翻訳テンプレートともいう）を提供する。
本発明翻訳テンプレートにおいては、転写プロモーターがＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含み、翻訳エンハンサーがタバコモザイクウイルスのオメガ配列の一部を含むことが好ましい。
本発明翻訳テンプレートにおいては、ＯＲＦ領域は、好ましくは、その下流部分に親和性タグ配列を含む。親和性タグ配列は好ましくはＨｉｓ−ｔａｇ配列を含む。
本発明は、第４に、本発明修飾剤存在下で、本発明翻訳テンプレートを翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせ、合成されたタンパク質を精製することを含む、Ｃ末端修飾タンパク質の製造方法（以下、本発明製造方法ともいう）、および、その製造方法により得られる、Ｃ末端が修飾されたタンパク質を提供する。
本発明製造方法において、精製は、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過、イオンクロマトグラフィー、電気泳動、沈殿、透析、および、それらの任意の組合せにより行われることが好ましい。
本発明は、第５に、本発明修飾タンパク質を利用したタンパク質と標的分子との間の相互作用の解析方法、すなわち、タンパク質と標的分子との間の相互作用を解析する方法であって、該タンパク質を含む本発明修飾タンパク質を用いることを特徴とする方法を提供する。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。また、この解析方法においては、本発明修飾タンパク質を固定化してもよい。あるいは、標的分子が固定されたアレイ上に本発明修飾タンパク質を添加し、該標的分子と特異的に結合した本発明修飾タンパク質を検出してもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）本発明修飾タンパク質および本発明製造方法、並びに、本発明製造方法に使用される本発明修飾剤および本発明翻訳テンプレート
（１−１）本発明修飾タンパク質
本発明修飾タンパク質は、Ｃ末端が修飾されたタンパク質であり、図１のＡに示すように、修飾剤がタンパク質のＣ末端に結合した構成をもっている。すなわち、本発明修飾タンパク質は、タンパク質と修飾剤とにより構成される。
本発明修飾タンパク質を構成する「タンパク質」とは、その機能が既知又は未知である相互作用の解析対象として用いるタンパク質を意味する。本発明のＣ末端修飾タンパク質は、このタンパク質と後述する標的分子との相互作用の有無の測定に使用できる。
このタンパク質は、天然タンパク質又はその変異体、および人工タンパク質又はその変異体の何れでもよい。天然タンパク質は、種々の生物の器官、組織又は細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから転写および翻訳される、多様性を有するタンパク質のライブラリーをも含むものである。人工タンパク質は、天然タンパク質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、又はランダムなアミノ酸配列を含むものである。
本発明修飾タンパク質を構成するタンパク質は、全長タンパク質であることが好ましい。本明細書において「全長タンパク質」とは、Ｃ末端が完全に翻訳されているタンパク質、すなわち、そのタンパク質をコードする塩基配列の終止コドンの一つ前までのコドンが翻訳されて得られたタンパク質を意味する。全長タンパク質のＮ末端は、シグナルペプチドの切断等何らかのプロセシングを受けていてもよい。
また、本発明修飾タンパク質を構成するタンパク質は親和性タグと融合したタンパク質であってもよい。親和性タグの例としては、ポリヒスチジンペプチドやエピトープペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、カルモジュリン結合ペプチド等が挙げられる。
（１−２）本発明修飾剤
本発明修飾剤は、図１のＢに示すように、タンパク質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基（残基を含む）をもつアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。この修飾剤の存在下でタンパク質合成を行い、得られるＣ末端修飾タンパク質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、タンパク質相互作用の検出が可能となる。
修飾部に含まれる非放射性修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性タンパク質がある。また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。
本発明修飾剤においては、修飾部が蛍光基、タンパク質と結合する基（例えばビオチニル基やイミノビオチニル基）、または、その両方をもつことが好ましい。特に、ビオチニル基やイミノビオチニル基を有することは、本発明修飾剤による修飾の効率が上昇するため、好ましい。
アクセプター部は、タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシン又はその誘導体の残基をもつ。
ピューロマイシンはアミノアシルｔＲＮＡと類似した構造をもち、タンパク質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度ではタンパク質のＣ末端に結合することが知られている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２）。本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、タンパク質のＣ末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。
修飾部とアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが１個ないし複数個つながった核酸または核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（−ｒＣ−）またはデオキシリボヌクレオチド（−ｄＣ−）が１個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。その他、修飾部とアクセプター部との間に挿入することによって修飾タンパク質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。
本発明修飾剤においては、ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシシチジル酸、リボシチジル酸、又は、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸であることが好ましい。
修飾剤は、上記修飾部とアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記アクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機等を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したヌクレオチドホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。上記各部の種類、あるいは結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあるいは両者を併用することもできる。また、修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。
（１−３）本発明翻訳テンプレート
本発明翻訳テンプレートは、本発明修飾タンパク質を製造する際に利用できる翻訳テンプレートであり、図１のＣに示すように、ポリＡ配列を含む３’末端領域、転写プロモーターを含んだ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および、タンパク質のコードされたＯＲＦ領域から構成される。翻訳テンプレートはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。
さらに詳細には、本発明の翻訳テンプレートは、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の５’側に位置する、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含んだ５’ＵＴＲと、ＯＲＦ領域の３’側に位置する、ポリＡ配列（ｐｏｌｙＡ）を含んだ３’末端領域から構成される。
さらに好ましい翻訳テンプレートは、５’ＵＴＲの転写プロモーターとしてＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含み、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のオメガ配列の一部（０２９）を含む。また、ＯＲＦ領域がその下流部分に親和性タグ配列を含むことが好ましい。親和性タグ配列は、上述の親和性タグをコードする配列であり、好ましくはＨｉｓ−ｔａｇ（ポリヒスチジンタグ）配列を含む。本発明翻訳テンプレートを用いて製造された本発明修飾タンパク質をポリヒスチジンタグを用いて製造する場合には、ポリヒスチジンタグは長い方が、ニッケルキレート樹脂による回収率が向上するため、好ましい。ポリヒスチジンタグの好ましい長さの範囲は、修飾されるタンパク質の種類や標識の種類により変化し得るが、通常には、８〜１２残基である。
なお、本明細書において「上流」および「下流」とは、転写または翻訳の方向におけるものを意味する。
本発明翻訳テンプレートは、ＤＮＡである場合、上記の領域を適当なＤＮＡベクター又はプラスミドに導入することにより得られたＤＮＡベクター又はプラスミドであってもよい。
また、本発明翻訳テンプレートは、ＲＮＡである場合、５’末端にＣａｐ構造があってもなくてもよい
（１−４）本発明製造方法
本発明製造方法、本発明修飾剤存在下で、本発明翻訳テンプレートを翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせ、合成されたタンパク質を精製することを含む。
本発明で用いられる翻訳系としては、無細胞タンパク質合成系や細胞発現系が挙げられる。無細胞タンパク質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液等が挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系の中に、上記翻訳テンプレートを加え、同時に１〜１００μＭの修飾剤を加え、２５〜３７℃で１〜数時間保温することによってＣ末端修飾タンパク質が合成される。合成された修飾タンパク質は、そのまま次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。一方、細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまで、遺伝子導入が可能な細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞の中に、上記本発明翻訳テンプレートを導入し、同時に１〜１００μＭの本発明修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾タンパク質が合成される。合成された修飾タンパク質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。翻訳テンプレートは、用いる翻訳系に合わせて適切なものを選択する。
本発明修飾タンパク質を精製する方法としては、アフィニティー、ゲルろ過、イオン交換等のクロマトグラフィーや、電気泳動、沈澱、透析等、一般にタンパク質の精製に用いられるあらゆる方法が利用可能である。好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、イオンクロマトグラフィー、電気泳動、沈殿、透析、および、それらの任意の組合せが挙げられる。特に好ましい例として、ポリヒスチジンペプチドやエピトープペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、カルモジュリン結合ペプチド等の親和性タグを融合した修飾タンパク質を親和性樹脂で精製し、さらに未反応の修飾剤を完全に除去するためにゲルろ過カラムに数回かける方法がある。
また、上記の親和性タグを融合した修飾タンパク質を親和性樹脂で予め精製した後、修飾部のビオチニル基あるいはイミノビオチニル基とアビジンあるいはストレプトアビジンの親和性を利用して、未修飾タンパク質を完全に除き、１００％修飾されたタンパク質を得る方法もある。
（２）相互作用の解析法
本発明は、本発明修飾タンパク質を利用したタンパク質と標的分子との間の相互作用の解析方法、すなわち、タンパク質と標的分子との間の相互作用を解析する方法であって、該タンパク質を含む本発明修飾タンパク質を用いることを特徴とする方法を提供する。
本発明の解析方法においては、通常には、上記で得られた本発明修飾タンパク質と標的分子を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せしめ、該本発明修飾タンパク質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析する。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。これらの方法の詳細については下記（３）で説明する。
「標的分子」とは、本発明修飾タンパク質と相互作用する分子を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられ、好ましくは、タンパク質又はＤＮＡである。
タンパク質としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、ＤＮＡあるいはＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、および塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
糖鎖としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はない。機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
これら標的分子が本発明修飾タンパク質と行う「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合および解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合および解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合および解離が挙げられる。
用いられる標的分子は、態様に応じて修飾物質により修飾して用いることができる。修飾物質は、通常、蛍光性物質などの非放射性修飾物質から選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基など）を持ち、タンパク質、核酸等の上記標的物質と連結可能な種々の蛍光色素、例えばフルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列などのいかなるものであってもよい。その他、色素など修飾可能な化合物であれば、その化合物の種類、大きさは問わない。
これらの修飾物質は、標的分子と本発明修飾タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。
上記修飾物質の標的分子への結合は、それ自体既知の適当な方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、標的分子がタンパク質の場合、上記（１−４）に記載したＣ末端を修飾する方法等を用いることができる。また標的分子が核酸の場合は、予め修飾物質を共有結合などで結合させたオリゴＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲを行う方法などによって簡便に修飾することができる。
また、本発明修飾タンパク質または本発明に用いられる標的分子は態様に応じて、固相に結合させる（即ち、固定化する）場合があるが、固相に結合させる方法としては、修飾物質を介して結合させるものと、それ以外の部分により結合させるものが挙げられる。
修飾物質を介して結合させる場合に用いられる修飾物質は、通常には、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（以下、「リガンド」と称することがある。）であり、固相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド（以下、「アダプタータンパク質」と称することがある）を結合させる。アダプタータンパク質には、結合タンパク質、受容体を構成する受容体タンパク質、抗体なども含まれる。
アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチンおよびイミノビオチン結合タンパク質／ビオチン又はイミノビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、アビジンおよびストレプトアビジンなどのビオチンおよびイミノビオチン結合タンパク質／ビオチン又はイミノビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）、などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチン又はイミノビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合タンパク質は、それ自体既知のものであり、該タンパク質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。
アダプタータンパク質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
修飾物質以外の部分により固相に結合させる場合は、通常タンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、具体的には例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
固相は、通常、タンパク質や核酸等を固定化するのに用いられるものでよく、その材質および形状は特に限定されない。例えば、ガラス板やニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレンやポリビニリデンフロライド膜、あるいはプラスチック製のマイクロプレート等を用いることができる。
（３）信号の変化の測定法
「測定」とは解析のために用いられる信号の変化を収集するための手段であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。用いられる測定法としては、例えば、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、蛍光イメージングアナライズ法、表面プラズモン共鳴法、固相酵素免疫検定法など、分子間相互作用を検出できるあらゆる系が利用可能である。
この測定法は、標的分子が固定されたアレイ上に本発明修飾タンパク質を添加し、該標的分子と特異的に結合した本発明修飾タンパク質を検出することを含む方法も含む。標的分子が固定されたアレイとは、標的分子がそれらの同定が可能な配置で固定化されている固相を意味する。該標的分子と特異的に結合した本発明修飾タンパク質の検出の方法は、該標的分子と特異的に結合した本発明修飾タンパク質が検出される限り、特に限定されず、通常には、本発明修飾タンパク質を添加したアレイから、標的分子に結合しない本発明修飾タンパク質を洗浄により除去し、残った本発明修飾タンパク質を検出する方法が挙げられる。
以下、測定法の例について説明する。
（３−１）蛍光相関分光法
蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））は、共焦点レーザー顕微鏡等の下で、粒子の流動速度、あるいは拡散率、容積収縮等を測定する方法であり、本発明においては、本発明修飾タンパク質（Ｃ末端修飾タンパク質）と標的分子間の相互作用により元の修飾分子１分子の並進ブラウン運動の変化を測定することにより、相互作用する分子を測定することができる。
具体的には試料粒子が励起光により励起されて、試料液容積の一部において蛍光を放射し、この放射光を測定し光子割合を得る。この値は、特定の時間に観測されている空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。上述した種々のパラメターは自己相関関数を使用してこの信号の変動から算出され得る。このＦＣＳを行う為の装置もカールツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社等から市販されており、本方法においてもこれらの装置を用いて解析を行うことができる。
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質あるいは標的分子のいずれも溶液として供することが必要である（液相法）。標的分子は修飾の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端修飾タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端修飾タンパク質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
しかし、２種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）は、１種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同じくらいの分子量をもつタンパク質間の相互作用も検出できる。２種類の蛍光色素を用いる他の方法としては蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法が知られているが、ＦＲＥＴが生じるためには２つの蛍光色素が４０〜５０Å以内に近接する必要があり、タンパク質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもＦＲＥＴが観測されない危険性がある。ＦＣＣＳ法では相互相関の検出は蛍光色素間の距離に依存しないので、そのような問題がない。一方、他の検出系である蛍光偏光解消法と比較すると、ＦＣＣＳ法は必要なサンプル量が少なく、検出時間が短く、ＨＴＳのための自動化が容易等の長所がある。さらにＦＣＣＳ法では蛍光標識された分子の大きさや数というきわめて基本的な情報が得られるので、表面プラズモン共鳴法のように汎用的な用途に利用できる可能性がある。両者の違いは、表面プラズモン共鳴法ではタンパク質が固定化された状態で相互作用を検出するのに対して、ＦＣＣＳ法ではより天然の状態に近い溶液中の相互作用を見ることができる点にある。ＦＣＣＳ法では、タンパク質の固定化が必要ないかわりに、タンパク質を蛍光色素で標識する必要があるが、本発明により、この課題を克服することが可能となった。
また、ＦＣＣＳ法では細胞内の環境に近い溶液状態でタンパク質・タンパク質相互作用やタンパク質・核酸相互作用を調べることができ、かつ解離定数（結合定数）を１回の測定で簡便に算出することができる。
本方法においてＣ末端修飾タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販のＦＣＳ用装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端修飾タンパク質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記ＦＣＳ用測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端修飾タンパク質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、あるいは特定のＣ末端修飾タンパク質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。
（３−２）蛍光イメージングアナライズ法
蛍光イメージングアナライズ法は、固定化された分子に、修飾分子を接触せしめ、両分子の相互作用により、固定化された分子上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定又は解析する方法である。
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質あるいは標的分子のいずれか一方は上記した方法により固定化されていることが必要である。標的分子は固定化して用いる場合には修飾されているものと、されていないもののどちらも利用可能である。また、固定化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。Ｃ末端修飾タンパク質は、修飾部を介して固定化されているものも、修飾部以外の部分で固定化されているものも用いることができる。
Ｃ末端修飾タンパク質、あるいは標的分子を固定化するための基板（固相）としては、通常、タンパク質や核酸等を固定化するのに用いられるガラス板やニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、あるいはプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。また、表面が種々の官能基（アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基等）や種々のリガンド（ビオチン、イミノビオチン、ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン、糖類、ヌクレオチド類、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、カルモジュリン、受容体タンパク質等）が結合した上記基板等も用いることができる。
本方法において修飾標的分子あるいはＣ末端修飾タンパク質を固定化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子あるいはＣ末端修飾タンパク質を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に接触させる方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する修飾標的分子あるいはＣ末端修飾タンパク質を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった標的分子あるいはＣ末端修飾タンパク質の修飾物質から発せられる蛍光信号、又は固定化されている修飾分子から発せられる蛍光と固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、市販のイメージングアナライザーを用いて測定あるいは解析することにより、固定化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記固相表面に、複数のＣ末端修飾タンパク質あるいは修飾又は非修飾標的分子を番地付けして固定化する方法、あるいは１種類のＣ末端修飾タンパク質あるいは修飾又は非修飾標的分子に固定化されていない複数種のＣ末端修飾タンパク質あるいは修飾標的分子を接触させる方法等が用いられる。複数種のＣ末端修飾タンパク質あるいは修飾標的分子を接触させる場合には、固相にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、これを既知の方法により分析することにより同定できる。
（３−３）蛍光共鳴エネルギー移動法
２種類の蛍光色素を用いる他の分子間相互作用検出法として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法がよく知られている。ＦＲＥＴとは、２種類の蛍光色素の一方（エネルギー供与体）の蛍光スペクトルと、もう一方（エネルギー受容体）の吸収スペクトルに重なりがあるとき、２つの蛍光色素間の距離が十分小さいと、供与体からの発光が起こらないうちに、その励起エネルギーが受容体を励起してしまう確率が高くなる現象をいう。したがって、相互作用を検出したい２つのタンパク質を、それぞれ供与体および受容体となる蛍光色素で標識しておき、供与体を励起すれば、２つのタンパク質が相互作用しない場合は、蛍光色素間の距離が大きいためＦＲＥＴは起こらず、供与体の蛍光スペクトルが観察されるが、２つのタンパク質が相互作用して蛍光色素間の距離が小さくなると、ＦＲＥＴにより受容体の蛍光スペクトルが観察されるので、蛍光スペクトルの波長の違いからタンパク質間相互作用の有無を判別することができる。蛍光色素としては、供与体がフルオレセイン、受容体がローダミンという組み合わせがよく用いられている。また最近では、蛍光緑色タンパク質（ＧＦＰ）の波長の異なる変異体の組み合わせにより、細胞の中でＦＲＥＴを観察し相互作用を検出する試みがなされている。この方法の欠点としては、ＦＲＥＴが生じるために２つの蛍光色素が４０〜５０Å以内に近接する必要があるため、タンパク質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもＦＲＥＴが観測されない危険性があるという点が挙げられる。
（３−４）エバネッセント場分子イメージング法
エバネッセント場分子イメージング法とは、Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５）等に記載されている方法で、ガラス等の透明体に固定化した分子に溶液として第２の分子を接触せしめ、これにエバネッセント場が発生する角度でレーザー光等の光源を照射し、発生したエバネッセント光を検出器によって測定又は解析する方法である。これらの操作は、それ自体既知のエバネッセント場蛍光顕微鏡装置を用いて行うことができる。
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質あるいは標的分子のいずれか一方は上記した方法により固定化されていることが必要である。標的分子は固定化する場合は修飾の必要はないが、固定化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。
Ｃ末端修飾タンパク質、あるいは標的分子を固定化するための基板としては、ガラス等の材質の基板が用いられ、好ましくは石英ガラスが用いられる。また、レーザー光の散乱等を防ぐために表面を超音波洗浄したものが好ましい。
本方法において固定化していないＣ末端修飾タンパク質あるいは修飾標的分子を固定化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは固定化していないＣ末端修飾タンパク質あるいは修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に滴下する方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、エバネッセント場照明により励起された蛍光をＣＣＤカメラ等の検出器を用いて測定することにより、固定化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記基板に、複数のＣ末端修飾タンパク質あるいは修飾標的分子を番地付けして固定化する方法等が用いられる。
（３−５）蛍光偏光解消法
蛍光偏光法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））は、蛍光偏光で励起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する方法である。分子の運動はその大きさに影響を受け、蛍光分子が高分子である場合には、励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、放射光は偏光を保ったままになっているのに対して、低分子の蛍光分子の場合は、運動速度が速いために放射光の偏光が解消される。そこで、平面偏光で励起された蛍光分子から放射される蛍光の強度を、元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、両平面の蛍光強度の割合からこの分子の運動性およびその存在状態に関する情報が得られるものである。この方法によれば、夾雑物があってもこれに影響されることなく、蛍光修飾された分子と相互作用する標的分子の挙動を追跡できる。これは蛍光修飾された分子と標的分子が相互作用するときにのみ、偏光度の変化として測定されるからである。
この方法を行うための装置としては例えばＢＥＣＯＮ（Ｐａｎｙｅｒａ社製）等が市販されており、本方法もこれらの装置を用いることにより行うことができる。
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質あるいは標的分子のいずれも溶液として供する必要がある。標的分子は修飾の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端修飾タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端修飾タンパク質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
本方法においてＣ末端修飾タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販の蛍光偏光解消装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端修飾タンパク質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
本方法において測定するＣ末端修飾タンパク質および標的分子との間の相互作用は、必ずしも抗原抗体反応ほど特異性は高くないことが考えられるため、最適の組み合わせを検出するためには、相互作用の程度を数値化することが有効である。相互作用の程度を示す指標としては、例えば一定濃度のＣ末端修飾タンパク質に対して、極大蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の値等を用いることができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記蛍光偏光解消法測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端修飾タンパク質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、あるいは特定のＣ末端修飾タンパク質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。
（３−６）表面プラズモン共鳴法
表面プラズモン共鳴法とは、金属／液体界面で相互作用する分子によって表面プラズモンが励起され、これを反射光の強度変化で測定する方法である（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））。この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾タンパク質は上記した方法により固定化されていることが必要であるが、標的分子の修飾は必要ない。
Ｃ末端修飾タンパク貿を固定化するための基板としては、ガラスの等の透明基板上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。透明基板としては、通常表面プラズモン共鳴装置用に用いられるものであればいかなるものであってもよく、レーザー光に対して透明な材料からなるものとして一般的にはガラス等からなるものであり、その厚さは０．１〜５ｍｍ程度のものが用いられる。また金属薄膜の膜厚は１００〜２０００Å程度が適当である。このような表面プラズモン共鳴装置用固基板として市販されているものも用いることができる。Ｃ末端修飾タンパク質の上記基板への固定化は前述した方法により行うことができる。
本方法において標的分子をＣ末端修飾タンパク質へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液に固定化されたＣ末端タンパク質を接触させる方法を用いることができる。
これらの行程は市販の表面プラズモン共鳴装置、例えばＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ社製）によってもよい。両分子を接触せしめた後、それ自体既知の表面プラズモン共鳴装置を用いて、それぞれの反射光の相対強度の時間的変化を測定することにより、固定化されたＣ末端修飾タンパク質と標的分子の相互作用が解析できる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記表面プラズモン共鳴装置に用いられる基板に、複数のＣ末端修飾タンパク質を番地付けして固定化するが、あるいは１種類の固定化されたＣ末端修飾タンパク質に複数種の標的分子を接触させる方法等が用いられる。
（３−７）固相酵素免疫検定法
固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２（１９９５））は、固相上に固定化した抗原に対し、抗体を含む溶液を接触せしめ、両分子の相互作用（抗原抗体反応）により、固定化された抗原上にとどまった抗体をこれと特異的に結合する修飾分子（ＩｇＧ等）から発せられる蛍光、あるいは修飾分子を基質とする色素から発せられる信号を、市販の検出器（ＥＬＩＳＡリーダー）を用いて測定又は解析する方法である。
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、抗原となるＣ末端修飾タンパク質は上記した方法により固定化されていることが必要である。また抗体となる標的分子は上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。
抗原となるＣ末端修飾タンパク質を固定化するための基板としては、通常ＥＬＩＳＡに用いられるプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。
本方法において抗体となる修飾標的分子を固相分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これをマイクロプレートに注入する方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する固定化分子に結合していない修飾分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販のＥＬＩＳＡリーダー等を用いて測定あるいは解析することにより、固定化された抗原分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記マイクロプレートの各穴にそれぞれ異なる複数の修飾標的分子を固定化する方法が用いられる。
（４）相互作用する分子の同定方法
上記（３）のそれぞれの方法により測定されＣ末端修飾タンパク質との間に相互作用が認められた標的分子は、該分子の一次構造が未知の場合、それ自体既知の適当な方法により、その一次構造を解析することができる。具体的には、相互作用を認められた標的分子がタンパク質の場合、アミノ酸分析装置等によりアミノ酸配列を解析し、一次構造を特定することができる。また、標的分子が核酸の場合には、塩基配列決定方法により、オートＤＮＡシーケンサーなどを用いれば塩基配列を決定することができる。
（５）Ｃ末端修飾タンパク質の固定化のための装置
上記（２）に記載したＣ末端修飾タンパク質の修飾部を介した固相への結合（固定化）方法を行うために、既知の適切な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。本装置における各手段自体はそれぞれ既知のものであり、これらの手段における、基板の保持、Ｃ末端修飾タンパク質溶液の添加、洗浄等の各操作は、それ自体既知の方法により行えばよい。これらの操作を組み合わせ、全自動又は半自動の、Ｃ末端修飾タンパク質の固定化のための装置を構築することができる。
（６）タンパク質−標的分子間相互作用測定のための装置
上記（３）に記載したタンパク質−標的分子間相互作用測定を行うために、既知の適切な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。本装置における各手段自体はそれぞれ既知のものであり、これらの手段における、基板の保持、標的分子の添加、洗浄、信号検出等の各操作は、それ自体既知の方法により行えばよい。これらの操作を組み合わせ、全自動又は半自動の、タンパク質−標的分子間相互作用測定のための装置を構築することができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１　タンパク質の蛍光修飾の高効率化と蛍光相互相関分光法によるタンパク質相互作用の検出
がん遺伝子産物であるｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎタンパク質は二量体を形成し、さらに特定の塩基配列をもつＤＮＡを認識して結合し転写因子として機能する。この系をモデルとして、ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎタンパク質を数種類の蛍光色素で修飾し、タンパク質間およびタンパク質−ＤＮＡ相互作用を蛍光相互相関分光法により検出した。
１）修飾剤の合成
ピューロマイシン残基を含む修飾剤は、図２（固相法１）あるいは図３（固相法２）にその概略を示す方法を用いて合成した。ここで化合物１はＩｋｅｄａらが報告した方法（Ｉｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３９：５９７５−５９７８）を用い合成した。ヌクレオチドホスホアミダイト、修飾物質ホスホアミダイト、および化合物２はグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より購入した。修飾物質スクシンイミドはモレキュラプローブ社（アメリカ合衆国、オレゴン州）より購入した。ＵＶ吸収はＢａｃｋｍａｎ　ＤＵ　６４０スペクトロフォトメーターを用いて測定した。マススペクトルはＦｉｎｎｉｇａｎ　ＭＡＴ社のＬａｓｅｒｍａｔ　２０００を用いて測定した。
１−１）固相法１を用いた修飾剤１〜１１の合成
化合物１（４００ｍｇ，ピューロマイシン残基１０μｍｏｌ含有）に対し、以下のＡ〜Ｄの処理を所定数のヌクレオチドが導入されるまで繰り返し行なった。
Ａ．３％トリクロロ酢酸−塩化メチレン溶液を１ｍＬ加え室温で３分間放置後、塩化メチレン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｂ．ヌクレオチドホスホアミダイト３０μｍｏｌ、０．４５７Ｍテトラゾール−無水アセトニトリル溶液１００ｍＬ、および無水アセトニトリル１ｍＬを加え、室温で１５分間振盪する。アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｃ．５０ｍＭヨウ素溶液（テトラヒドロフラン−ピリジン−水＝７５：２０：５（容量比））を１ｍＬ加え室温で３分間放置後、ピリジン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水ピリジン５ｍＬで５回洗浄する。
Ｄ．１０％無水酢酸−ピリジン溶液１ｍＬおよび触媒量の４，４−ジメチルアミノピリジンを加え室温で２０分間放置後、ピリジン５ｍＬで５回、塩化メチレン５ｍＬで５回洗浄する。
上記の処理をし所定数のヌクレオチドが導入された化合物１に対し、上記Ａの処理を行なった後、Ｂの処理をヌクレオチドホスホアミダイトに代え修飾物質ホスホアミダイト３０μｍｏｌを用いて行ない、その後Ｃの処理を行なった。ここで得られた、修飾剤および所定数のヌクレオチドが導入された化合物１に濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間振盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。図２中Ｙがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ基の場合は残査に１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド−テトラヒドロフラン溶液４００μＬを加え、室温で１４時間放置後減圧濃縮した。残査をＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ社（京都府）製　ＹＭＣ　ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ　ＳＨ−３４３−５，溶離液：１０〜６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ　７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分）で精製後、凍結乾燥し修飾剤１〜１１を得た。
修飾剤の物性は以下の通りであった。
修飾剤１：収率３１％、ＵＶ（０．１Ｍトリス塩酸水溶液ｐＨ　９．０）λｍａｘ　５００ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１２９８［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤２：収率２８％、ＵＶ（０．１Ｍトリス塩酸水溶液ｐＨ　９．０）λｍａｘ　４９８ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１５８６［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤３：収率１３％、ＵＶ（０．１Ｍトリス塩酸水溶液ｐＨ　９．０）λｍａｘ　５００ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１３１４［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤４：収率７％、ＵＶ（０．１Ｍトリス塩酸水溶液ｐＨ　９．０）λｍａｘ　４９９ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１６１９［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤５：収率４８％、ＵＶ（０．１Ｍトリス塩酸水溶液ｐＨ　９．０）λｍａｘ　５００ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１３１２［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤６：収率１７％、ＵＶ（０．１Ｍトリス塩酸水溶液ｐＨ　９．０）λｍａｘ　４９９ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１６１７［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤７：収率７９％、ＵＶ（０．１Ｍトリス塩酸水溶液ｐＨ　９．０）λｍａｘ　５００ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１３２０［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤８：収率７１％、ＵＶ（０．１Ｍトリス塩酸水溶液ｐＨ　９．０）λｍａｘ　４９９ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１３３６［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤９：収率１１％、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ　６４３ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１２９３［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤１０：収率８％、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ　６４５ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１５８２［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤１１：収率８１％、ＵＶ（水）λｍａｘ　２７３ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１１６４［Ｍ−Ｈ］−
合成された修飾剤の化学構造を第１表に示す。
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2002046395.tif 000004
2002046395.tif 000005
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１−２）固相法２を用いた修飾剤１２〜１８の合成
化合物１（４００ｍｇ，ピューロマイシン残基１０μｍｏｌ含有）に対し、上記Ａ〜Ｄの処理を所定数のヌクレオチドが導入されるまで繰り返し行なった。
上記の処理をし所定数のヌクレオチドが導入された化合物１に対し、上記Ａの処理を行なった後、Ｂの処理をヌクレオチドホスホアミダイトに代え化合物２（３０μｍｏｌ）を用い行ない、その後Ｃの処理を行なった。ここで得られた、化合物２および所定数のヌクレオチドが導入された化合物１に対し３％トリクロロ酢酸−塩化メチレン溶液１ｍＬを加え室温で１０分間放置後、塩化メチレン５ｍＬで３回洗浄した。再度同じ操作を繰り返した後、１０％ジイソプロピルエチルアミン−塩化メチレン溶液５ｍＬで３回、塩化メチレン５ｍＬで５回洗浄し、減圧下乾燥した。得られた固形物に修飾物質スクシンイミド１６ｍｍｏｌ、ジイソプロピルエチルアミン１６ｍＬ、およびジメチルホルムアミド１ｍＬを加え室温で４８時間振盪した。固形物をジメチルホルムアミド５ｍＬで５回、エタノール５ｍＬで５回洗浄した後、濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で４時間振盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。図１中Ｙがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ基の場合は残査に１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド−テトラヒドロフラン溶液４００μＬを加え、室温で１４時間放置後、減圧濃縮した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製　ＹＭＣ　ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ　ＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ　７．０）３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分）で精製後、凍結乾燥し、修飾剤１２〜１８を得た。
修飾剤の物性は以下の通りであった。
修飾剤１２：収率６％、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ　５０３ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１２９５［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤１３：収率６％、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ　５０４ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１５８５［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤１４：収率３％、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ　５０３ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１３１３［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤１５：収率２％、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ　５０４ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１６１８［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤１６：収率２％、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ　６２５ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１４８４［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤１７：収率４％、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ　６４６ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１４６７［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤１８：収率４％、ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ　５９０ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１６３９［Ｍ−Ｈ］−
図２の方法によって合成された修飾剤（修飾剤１２〜１８）の化学構造を第２表に示す。
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１−３）修飾剤１９および修飾剤２０の合成法
固相法１（図２）に従い、化合物１に対し所定数のヌクレオチドを導入後、修飾物質ホスホアミダイトを用い、修飾物質を所定の数導入した。次いで、脱保護および精製し、修飾剤１９および２０を得た。
修飾剤の物性は以下の通りであった。
修飾剤１９
収率５０％、ＵＶ（５０％　ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ）λｍａｘ　５５８ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１６３１［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤２０
収率４４％、ＵＶ（５０％　ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ）λｍａｘ　５５８ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　２０３７［Ｈ−Ｈ］−
化学合成された修飾剤１９および２０の化学構造を第３表に示す。
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２）ＤＮＡの調製
マウスｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ遺伝子を、マウスｔｅｓｔｉｓ　ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造社）から以下のようにクローニングした。まず、ｃ−Ｊｕｎのアミノ酸配列中ｃ−ＦｏｓおよびＤＮＡとの結合に必要な２１６〜３１８番目のアミノ酸残基（Ｒｙｄｅｒ，Ｋ．ａｎｄ　Ｎａｔｈａｎｓ，Ｄ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，８４６４−８４６７）に相当する遺伝子領域を、ＰＣＲ法により増幅し（用いたプライマーの塩基配列を配列番号１および２に示す）、愛媛大学・遠藤弥重太博士より供与されたプラスミドのＳＰ６プロモーター配列の下流にクローニングし、プラスミドｐＳＰ６−ｊｕｎを得た。同様に、ｃ−Ｆｏｓの１１８〜２１１番目のアミノ酸残基（Ｖａｎ　Ｂｅｖｅｒｅｎ，Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ　３２，１２４１−１２５５）に相当する領域を、プライマー（塩基配列を配列番号３および４に示す）を用いてｃＤＮＡライブラリーより増幅し、プラスミドｐＳＰ６−ｊｕｎのｃ−Ｊｕｎをコードする領域と入れ換え、プラスミドｐＳＰ６−ｆｏｓを得た。クローニングの基本操作（遺伝子操作、大腸菌の形質転換および培養、プラスミドの回収など）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．１９８９．ＣＳＨ　ｐｒｅｓｓ）にしたがった。
マウスｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ遺伝子を転写する際の鋳型となる直鎖状ＤＮＡ断片を以下のように調製した。プラスミドｐＳＰ６−ｊｕｎを鋳型として、ＳＰ６プロモーターの上流のプライマー（塩基配列を配列番号５に示す）およびｃ−ＪｕｎのＣ末端に６個のヒスチジンをコードする配列（Ｈｉｓタグ）を付加するためのプライマー（塩基配列を配列番号６に示す）を用いて、ＰＣＲ法により増幅した。同様に、プラスミドｐＳＰ６−ｆｏｓを鋳型として、プライマー（塩基配列を配列番号５に示す）およびｃ−ＦｏｓのＣ末端にＨｉｓタグを付加するためのプライマー（塩基配列を配列番号７に示す）を用いて、ＰＣＲ増幅した。これら２つのＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を用いて精製し、転写反応に用いた。
マウスｃ−Ｆｏｓ／ｃ−Ｊｕｎ二量体と特異的に結合するＤＮＡの蛍光修飾断片を以下のように調製した。蛍光色素Ｃｙ５で５’末端が修飾された互いに相補な一本鎖ＤＮＡ（塩基配列を配列番号８および９に示す）を等モル混合し、０．１Ｍ　ＮａＣｌ存在下で９５℃で保温した後、室温まで徐冷し、ＤＮＡをアニールさせ二本鎖ＤＮＡを得た。これをそのまま蛍光相互相関分光法の測定に用いた。
３）転写・翻訳
マウスｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの遺伝子ＤＮＡを、Ｒｉｂｏｍａｘ　ＲＮＡ合成システム（プロメガ社）を用いてＳＰ６　ＤＮＡポリメラーゼにより転写した（３７℃、６０分）。このとき反応液にＲＮＡキャップアナログ（ライフテックオリエンタル社）を加え、ＲＮＡの５’末端を修飾した。合成されたＲＮＡは、フェノール・クロロホルム処理後、エタノール沈澱により精製した。
さらにタンパク質に翻訳するため、得られたＲＮＡを小麦胚芽抽出液（プロメガ社）に加え、２５℃、６０分反応させた。このとき、蛍光色素（フルオレセイン、ローダミングリーン、Ｃｙ５）とピューロマイシンとの間に各種のリンカーを挿入した修飾剤（修飾剤１〜１８）をいろいろな濃度で加え、タンパク質のＣ末端を蛍光修飾した。修飾タンパク質の収率を比較するために、翻訳産物をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動し、蛍光修飾タンパク質のバンドを蛍光イメージング装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　ＦＸ、バイオラッド社）により検出・定量した。
図４に示すように、タンパク質ｃ−ＦｏｓのＣ末端修飾効率は、修飾剤のヌクレオチドリンカー構造によって大きく変化した。最も収率のよいリンカーは蛍光色素に依らず−ｄＣ−（修飾剤１、９、１２）であり、修飾タンパク質の収率はヌクレオチドリンカーがない場合に比べて、最大１００倍上昇した。これらの結果はｃ−Ｊｕｎタンパク質でも同様であった。ヌクレオチドリンカーが−ｄＣｄＣ−（修飾剤２、１０、１３）は−ｄＣ−に比べて修飾効率は低かった。また、蛍光基がフルオレセインの場合、−ｒＣ−（修飾剤３）は−ｄＣ−（修飾剤１）に比べて、修飾効率は非常に低かったが、反対に−ｒＣｒＣ−（修飾剤４）は−ｒＣ−（修飾剤３）に比べて高かった。ヌクレオチドリンカーが、−ｄＴ−（修飾剤５）、−ｄＴｄＴ−（修飾剤６）、−ｄＡ−（修飾剤７）、−ｄＧ−（修飾剤８）では、効果は顕著ではなかったが、デオキシシチジル酸あるいはリボシチジル酸の場合は顕著な効果を示した。また、蛍光基の種類により、修飾剤の至適濃度の違いが見られた。Ｃｙ５の場合（修飾剤９と１０）、フルオレセイン（修飾剤１と２）に比べてラベル化効率の至適濃度が半分程度低かった。蛍光基がローダミングリーン（ＲＧ）の場合（修飾剤１２と１３）は、至適濃度の傾向はＣｙ５の場合によく似ていた。
蛍光相関分光法の測定に用いる蛍光修飾タンパク質は、未反応の蛍光色素を除去するため、以下の手順で精製した。まず、翻訳反応液を平衡化したニッケルＮＴＡアガロース樹脂（キアゲン社）と混合し、蛍光修飾タンパク質のＣ末端のＨｉｓタグとニッケルイオンとの特異的な結合により樹脂と吸着させ、洗浄後、イミダゾールで溶出した。さらに、タンパク質を含む溶出画分をゲルろ過カラム（ＰＤ−１０、ファルマシア社）に２回かけ、溶出液をセントリコン（ミリポア社）で遠心濃縮した。
４）蛍光相互相関分光法
蛍光基にローダミングリーン（ＲＧ）を有する修飾剤（修飾剤１２）で修飾されたタンパク質ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−ＪｕｎとＣｙ５で修飾されたＤＮＡとを用いて、蛍光相互相関分光法の測定を行った。まず、精製されたタンパク質およびＤＮＡをそれぞれ最終濃度１０ｎＭとなるように混合し、３７℃で６０分保温した。この試料１０μＬを８連ガラスチェンバー（ヌンク社）にのせ、蛍光相関分光計ＣｏｎｆｏＣｏｒ２（カールツァイス社）を用いて蛍光相互相関を測定した。その結果、Ｆｏｓ、ＪｕｎおよびＤＮＡの３種類全てを加えた試料では相互相関が観測されたが（図５の１、２）、ＦｏｓまたはＪｕｎの一方が欠けている対照試料では相互相関は観測されなかった（図５の３、４）。観測された相互相関の数値解析の結果、全体の約３０％の分子が結合して複合体を形成していることが分かった。また、この結果から直接計算される解離定数は１０−８Ｍで、これは従来から知られていた別の方法によって求められた値とよく一致した。
以上の結果から、蛍光色素とピューロマイシンとの間にデオキシシチジル酸のリンカーを挿入した修飾剤を用いることによって、従来の約１００倍の収率でタンパク質のＣ末端を蛍光修飾できることが分かった。さらに、本発明の方法で修飾したタンパク質を用いることによって、初めて蛍光相互相関分光法でタンパク質相互作用を検出することが可能となり、実用化のメドが立った。
実施例２　小麦胚芽の無細胞翻訳系における翻訳テンプレートと蛍光修飾効率
マウス由来のｃ−ｊｕｎあるいはｃ−ｆｏｓの組み込まれているベクターやプラスミドの配列、あるいはそれらの配列を含むＤＮＡテンプレートをＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（宝酒造）をもちいてＰＣＲで増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。ＰＣＲのテンプレートは、ｃ−ｊｕｎ［ｐＳＰＡＭ］、ｃ−ｆｏｓ［ｐＳＰＡＭ］およびｃ−ｊｕｎ［Ｆ］（それぞれ塩基配列を配列番号１０〜１２に示す）を用い、プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ１（フォワードプライマー）としてＳＰ６Ｆと５’ＳＰ６−０２９（それぞれ塩基配列を配列番号１３および１４に示す）を、Ｐｒｉｍｅｒ２（リバースプライマー）としてＪｕｎＨｉｓ、ＪｕｎＨｉｓＡ、ＦｏｓＨｉｓ、ＦｏｓＨｉｓＡ、ＪｕｎＦｌａｇＡ、３’ＨｉｓＡおよび３’ＦｌａｇＡ（それぞれ塩基配列を配列番号１５〜２１に示す）を用いた。以上の方法により翻訳テンプレート（ＤＮＡテンプレート）を得た。これをＲｉｂｏＭＡＸＴＭ　Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　ＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、転写（３７℃，２ｈ）し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し翻訳テンプレート（ＲＮＡテンプレート）を得た。翻訳テンプレートの基本的構造および各要素のＤＮＡ塩基配列を図６に示す。以下、翻訳テンプレートを、増幅に用いたプライマーに従って「Ｐｒｉｍｅｒ１名−Ｐｒｉｍｅｒ２名」の形で呼ぶ。
翻訳テンプレートのポリＡ効果の実験と翻訳エンハンサーの０２９の効果をみるために２つの実験を行った。両実験ともＷｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて蛍光修飾剤（修飾剤１）の存在下、翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）を行い、翻訳と同時にタンパク質を修飾し、１７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）によってマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で確認した。分子量約２０〜２５ＫＤａのＪｕｎあるいはＦｏｓタンパク質を得た。各修飾効率の相対比の結果は以下のテンプレートについて図７にまとめた。図７の実験では、翻訳テンプレートとして、ポリＡの配列効果実験では、ＳＰ６Ｆ−ＪｕｎＨｉｓ、ＳＰ６Ｆ−ＪｕｎＨｉｓＡ、ＳＰ６Ｆ−ＦｏｓＨｉｓおよびＳＰ６Ｆ−ＦｏｓＨｉｓＡを、０２９効果実験では、ＳＰ６Ｆ−ＪｕｎＦｌａｇＡ、ＳＰ６−０２９Ｊｕｎ−ＦｌａｇＡ、ＳＰ６Ｆ−ＪｕｎＨｉｓＡおよびＳＰ６−０２９Ｊｕｎ−Ｈｉｓを用いた。ポリＡ効果の実験では、ＳＰ６Ｆ−ＦｏｓＨｉｓＡを、０２９効果の実験では５’ＳＰ６−０２９−ＪｕｎＨｉｓＡを１．０として換算している。
ポリＡ配列効果では、タンパク質によらず、ＪｕｎでもＦｏｓでもポリＡ配列がある方が、ないものに比べて修飾効率が３倍ほど高くなった（図７）。また、翻訳エンハンサーは０２９配列の方がＡＭＶ配列よりも修飾効率が高い傾向を示した。特に、親和性タグがＨｉｓ−ｔａｇである場合は、修飾効率が２倍に上昇した。タンパク質の修飾におけるポリＡ配列、０２９配列およびＨｉｓ−ｔａｇ配列の効果が確認された。実施例１では翻訳テンプレートの翻訳エンハンサーとしてＡＭＶが用いられ、また、ポリＡ配列は用いられなかった。本実施例で用いたＳＰ６−０２９Ｊｕｎ−ＨｉｓＡの翻訳テンプレートの翻訳効率は、実施例１のＡＭＶを用いた翻訳テンプレートに比べて５〜６倍ほど高かった。従って、ＳＰ６−０２９Ｊｕｎ−ＨｉｓＡの翻訳テンプレートとヌクレオチドリンカーを有する修飾剤を組み合わせて用いると、タンパク質のＣ末端修飾効率が従来の方法（特開平１１−３２２７８１、特開２０００−１３９４６８）に比べて、５００倍ほど高まることが明らかになった。
実施例３　タンパク質Ｃ末端のビオチン修飾およびストレプトアビジン膜への固定
マウスｃ−ＪｕｎをコードするＤＮＡの調製、転写・翻訳、およびｃ−Ｊｕｎタンパク質の精製は、実施例１と同様の方法で行なった。
ビオチンと蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）を同一分子内にもつ修飾剤（修飾剤２０）と、蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）のみをもつ修飾剤（修飾剤１９）でＣ末端を修飾したｃ−Ｊｕｎタンパク質を、ストレプトアビジン膜（ＳＡＭ　Ｂｉｏｔｉｎ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ；プロメガ社）上に５μＬスポットし、１分後、膜を２Ｍ　ＮａＣｌ溶液５０ｍＬで４回、蒸留水で２回洗浄し、イメージアナライザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　ＦＸ、バイオラッド社）でＴＡＭＲＡの蛍光を５３２ｎｍで検出した。その結果、図８に示すように、ビオチンと蛍光色素を同一分子内にもつ修飾剤（修飾剤２０）でＣ末端修飾されたｃ−Ｊｕｎタンパク質は、ストレプトアビジン膜上に固定化されることがわかった（図８；１）。しかし、ビオチンをもたず蛍光色素のみをもつ修飾剤（修飾剤１９）は、ストレプトアビジン膜上に固定化されなかった（図８；２）。対照実験として、モル比で１０００倍量の遊離ビオチンを同時に加えた場合、ビオチン化ｃ−Ｊｕｎタンパク質の膜への結合は競合阻害された（図８；３）ので、ｃ−Ｊｕｎの膜への吸着はビオチン特異的な結合であることがわかる。
実施例４　固定化法によるタンパク質相互作用の解析（１）
Ｆｏｓ／Ｊｕｎ二量体の結合領域を含むＤＮＡフラグメントを、Ｃｙ５で修飾したプライマーによるＰＣＲで増幅した。ＤＮＡの精製にはＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。標識したＤＮＡフラグメントを２００μｇ／ｍｌの濃度で含むスポッティング溶液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム／０．０１％ＳＤＳ、ｐＨ　８．５）を調製した。
マイクロアレイヤー（Ｍｉｃｒｏ　Ｇｒｉｄ、ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）にスライドグラス（ＤＮＡ−Ｒｅａｄｙ　ＴＭ　ＴｙｐｅＩＩ　Ｓｌｉｄｅｓ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をセットしてスポッティングを行った（スポッティングの条件：庫内温度　約２５〜２８℃前後、湿度３８〜４２％、ソリッドピン使用、０．７ｍｍ間隔）。
スポッティング後、８０℃で２時間インキュベートし、スポット面に水蒸気をあて、スポットに含水させた。１００℃のホットプレート上で水分をとばした後、ＵＶを照射して固定させた。スライドグラスをブロッキング溶液（コハク酸４ｇ、１−メチル−２−ピロリディノン２５２ｍｌ、１Ｍほう酸（ｐＨ　８）２８ｍｌ）に浸して最初１分間激しく振盪して、その後２０〜３０分間振盪した。９０℃の蒸留水で洗浄、次いで、９９．５％エタノールで洗浄後、乾燥させた。
ＤＮＡを固定したスライドグラスにハイブリダイゼーション溶液をのせ、パラフィルムでカバーして、スポット面全体に広げた。アルミホイルで遮光し、３７℃で３０分間インキュベートした（乾燥を防ぐために、スライドグラスを並べた台の下に水を張った）。１×バッファー中で５分間振盪し、液を交換して繰り返した。５０００ｒｐｍ、４℃で遠心した後、乾燥し、スライド上のスポットの蛍光をマイクロアレイスキャナー（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社Ｇｅｎｅ　Ｐｉｘ　４０００Ａ）を用い、５３２ｎｍと６３５ｎｍで検出した。
すなわち、スライドガラス上に、Ｃｙ５で修飾したＦｏｓとＪｕｎの結合領域のＤＮＡ（６３５ｎｍで蛍光を測定）を固定し、これにＦｏｓ存在下で、ローダミングリーンを蛍光基としてもつ修飾剤（修飾剤１２）でＣ末端が修飾されたＪｕｎとｐ５３タンパク質（５３２ｎｍで蛍光を測定）をそれぞれ振りかけ、ＤＮＡ−Ｆｏｓ−Ｊｕｎの間とＤＮＡ−Ｆｏｓ−ｐ５３の間の相互作用を調べた。結果は図９に示した通りである。左上の像ではローダミングリーンでＣ末端修飾されたＪｕｎがＦｏｓ存在下でＤＮＡと結合していることがわかる（５３２ｎｍでローダミングリーンの蛍光を検出することによりＪｕｎまたはｐ５３の存在が分かる）。また、同一試料に関する左下の像では、Ｃｙ５で修飾したＤＮＡが固定化され、存在していることがわかる（６３５ｎｍでＣｙ５の蛍光を検出することによりＤＮＡの存在が分かる）。一方、右上の像では、ローダミングリーンの蛍光が検出されないので、ｐ５３がＦｏｓ存在下でＤＮＡと結合していないことがわかる。同一の試料に関する右下の像では、Ｃｙ５の蛍光が検出されるので、ＤＮＡは存在していることが確認される。その結果、蛍光修飾されたＪｕｎが、Ｆｏｓ存在下で結合領域のＤＮＡと特異的に結合していることがわかる。本実施例では、タンパク質を修飾後、精製操作を行わず相互作用を調べた。それでも図９に示した程度の明確な相互作用の差異が見られたことは、翻訳効率と修飾効率が上昇し、相互作用可能な十分量のＣ末端修飾タンパク質がつくられたことを意味する。
実施例５　蛍光修飾タンパク質の高純度精製および蛍光相互相関分光法によるタンパク質間相互作用の解析
Ｃ末端標識タンパク質間での分子間相互作用の速度論的解析が可能となるよう、標識タンパク質の高純度精製を目的とした。翻訳鋳型および標識化合物にそれぞれ異なる親和性タグを導入した。翻訳産物を２段階で親和精製することにより、Ｃ末端が蛍光色素で標識されたタンパク質を高純度に精製することが可能となった。ローダミングリーン、Ｃｙ５で蛍光標識した癌遺伝子産物ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎタンパク質をそれぞれ２段階精製し高純度精製標品を得た。蛍光相互相関分光法によってＡＰ−１（ｃ−Ｆｏｓとｃ−Ｊｕｎの二量体の結合領域ＤＮＡ）／ローダミングリーン標識ｃ−ｆｏｓ／Ｃｙ５標識ｃ−Ｊｕｎ複合体形成を検出し、分子間相互作用の解析値から解離定数（Ｋｄ）を算出した。
１）修飾剤の合成
修飾剤２１〜２５は、図１０および図１１にその概略を示す方法を用いて合成した。図１０で化合物１’は化合物１と同様の方法を用いて合成した。各ホスホアミダイトはグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より、修飾物質１スクシンイミドはピアス社（アメリカ合衆国、イリノイ州）より、修飾物質２スクシンイミドはモレキュラープローブ社（アメリカ合衆国、オレゴン州）およびアマシャム・ファルマシアバイオテック社（スエーデン、ウプサラ）より、購入した。
化合物１’（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）に対し、固相法１に示したＡ〜Ｄの処理を所定数のヌクレオチドが導入されるまで繰り返し行なった。
上記の処理をし所定数のヌクレオチドが導入された化合物１’に対し、Ａの処理を行なった後、Ｂの処理をヌクレオチドホスホアミダイトに代え化合物２（３０μｍｏｌ）を用いて行ない、その後Ｃの処理を行なった。ここで得られた、化合物２および所定数のヌクレオチドが導入された化合物１’に対し修飾剤２１の場合は５０ｍＭ炭酸ナトリウム−メタノールを２ｍＬ、修飾剤２２〜２５の場合は濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を減圧濃縮した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製　ＹＭＣ　ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ　ＳＨ−３４３−５，溶離液１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ　７．０）３０分間の直線濃度勾配、流速１０ｍＬ／分］で精製後、凍結乾燥した。
修飾剤２１の場合、上記の残査を８０％酢酸−水２ｍＬに溶解させ、室温で４時間放置後、減圧濃縮した。残査を３０％アセトニトリル−水１ｍＬに溶解させ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム−水（ｐＨ　８．３）を０．１ｍＬ、および修飾物質１スクシンイミド０．１ｍｍｏｌをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解させた液を加え、室温で２時間放置した。その後、Ｐｏｌｙ−ＰａｋＩＩ（グレンリサーチ社）で脱塩し減圧濃縮した。
修飾剤２２〜２５の場合、上記の残査を３０％アセトニトリル−水１ｍＬに溶解させ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム−水（ｐＨ　８．３）を０．１ｍＬ、および修飾物質２スクシンイミド０．１ｍｍｏｌをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解させた液を加え、室温で２時間放置した。その後、Ｐｏｌｙ−ＰａｋＩＩで脱塩し減圧濃縮した。残査を８０％酢酸−水２ｍＬに溶解させ、室温で４時間放置後、減圧濃縮した。残査を３０％アセトニトリル−水１ｍＬに溶解させ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム−水（ｐＨ　８．３）を０．１ｍＬ、および修飾物質１スクシンイミド０．１ｍｍｏｌをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解させた液を加え、室温で２時間放置した。その後Ｐｏｌｙ−ＰａｋＩＩで脱塩し減圧濃縮した。
修飾剤２１の場合および修飾剤２２〜２５の場合、両方とも上記の残査に６０％トリフルオロ酢酸−水２ｍＬを加え、室温で３０分間放置後、減圧濃縮した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製　ＹＭＣ　ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ　ＳＨ−３４３−５，溶離液１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ　７．０）３０分間の直線濃度勾配、流速１０ｍＬ／分］で精製後、凍結乾燥し修飾剤２１〜２５を得た。
修飾剤２６は、化合物１より固相法１を用いて合成した。ここで、修飾物質１あるいは修飾物質２を含むホスホアミダイトはグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より購入した。
修飾剤の物性は以下の通りであった。
修飾剤２１：収率３２％、ＵＶ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ　５５８ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　２０３５［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤２２：収率８％、ＵＶ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ　５０６ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　２０９３［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤２３：収率８％、ＵＶ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ　５０６ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１９７９［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤２４：収率１３％、ＵＶ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ　６４９ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　２３７５［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤２５：収率１３％、ＵＶ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ　６４９ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　２２６１［Ｍ−Ｈ］−
修飾剤２６：収率２２％、ＵＶ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ　６４６ｎｍ；ＭＳ　ｍ／ｚ　１９７７［Ｍ−Ｈ］−
合成された修飾剤の化学構造を、第４表に示す。
2002046395.tif 000011
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2002046395.tif 000013
２）ＤＮＡの調製
鋳型ＤＮＡは実施例１のＤＮＡの調製の項で調製したマウスｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ遺伝子の載ったプラスミドを用いた。ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓはそれぞれＤＮＡとの結合に必要なドメインを含む領域を、ＳＰ６プロモーター、Ω配列、およびＴ７タグ（Ｔ７−ｔａｇ）を含むプライマー（配列番号２２）と、ヒスチジンタグ、終止コドン、ポリＡ配列を含むリバースプライマー（配列番号２３又は２４）によってＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ産物はトポＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）を用いてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターへサブクローニングした。方法の詳細はメーカー記載のプロトコールに従った。塩基配列を確認したプラスミドＤＮＡは、Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて精製した。
ＲＮＡ合成のための直鎖状鋳型ＤＮＡは、挿入部より上流のベクター配列の一部を用いたプライマー（配列番号２５）と、ヒスチジンタグ部分のリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で得た。翻訳タンパク質の回収を検討するために、ポリヒスチジン（長さ６〜１２残基）に相当するリバースプライマー（配列番号２６〜２９）を作成した。鋳型ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（キアゲン社）にて精製した。
３）転写、翻訳
鋳型ＤＮＡをキャップアナローグ（ライフテックオリエンタル酵母社）存在下でＳＰ６　ＲｉｂｏＭＡＸ　Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　ＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて転写した（３７℃、３時間）。詳細はメーカー記載のマニュアルに従った。転写後、キットに添付のデオキシリボヌクレアーゼで鋳型ＤＮＡを除去し、ＳＶ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製ＲＮＡを得た。
翻訳はメーカー記載のマニュアルに従い、精製ＲＮＡ　５ｍｇ、小麦胚芽抽出液（Ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔ、プロメガ社）１００μｌを用いた。同反応系にビオチンあるいはイミノビオチンと蛍光色素（ローダミングリーングリーン、Ｃｙ５）を同一分子内に導入した蛍光標識用化合物（修飾剤２２〜２６）を加えて、Ｃ末端が蛍光標識されたタンパク質を合成した（２５℃、１時間）。ビオチンを導入した蛍光色素の至適濃度はＣｙ５（修飾剤２４、２６）、ローダミングリーン（修飾剤２２）共およそ１２５μＭ、また、イミノビオチンを導入した蛍光色素の至適濃度は、Ｃｙ５（修飾剤２５）では３０μＭ、ローダミングリーン（修飾剤２３）は１２．５μＭであった。
４）蛍光標識タンパク質の精製
ニッケルキレート樹脂Ｎｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（キアゲン社）を用いた精製をメーカー添付のマニュアルに従って行った。反応液にプロテアーゼ阻害剤（ヒスチジンタグタンパク質精製用カクテル、シグマ社）０．１μｌおよび５倍容の結合緩衝液を加えた後、ニッケルキレート樹脂混濁液２０μｌを穏やかに混和した（４℃、１時間）。十分に樹脂を結合緩衝液で洗った後、０．５Ｍイミダゾールを含む緩衝液５０μｌでヒスチジンタグタンパク質を溶出した。
通常のヒスチジンタグタンパク質は長さ６残基のポリヒスチジンタグで十分にニッケルキレート樹脂に回収されるが（Ａｂａｔｅ，Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７，１０３２−１０３６）、本標識法の場合、長さ６残基のポリヒスチジンでは若干回収が低いので、ヒスチジンの数をさらに増やしてニッケルキレート樹脂による回収量を検討した。翻訳後上清、ニッケルキレート樹脂素通り、及び、イミダゾール溶出の各画分をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離し、蛍光画像解析装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　ＦＸ、バイオラッド社）で検出した。ポリヒスチジンの長さが増えるに従い、蛍光標識タンパク質の回収量が増加した（図１２）。ｃ−Ｆｏｓの場合も同様の結果であった。また、イミノビオチンを含む標識化合物（修飾剤２５）で蛍光標識した場合は、イミノビオチンを含まない標識化合物（修飾剤９）を用いた場合に比べて、およそ２倍の効率で標識された（図１３）。
イミノビオチンを含む標識タンパク質は、ストレプトアビジン固定樹脂Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（アマシャムファルマシア社）でさらに精製した。同樹脂による精製はメーカー記載のマニュアルに従って行った。上記イミダゾール溶出画分に対して、５倍容の結合緩衝液を加え、あらかじめ平衡化した１０μｌの樹脂を穏やかに混和した（４℃、３０分）。結合緩衝液で十分に樹脂を洗浄した後、５０μｌの５０ｍＭビオチンを含む緩衝液で溶出した。
ビオチンを含む標識タンパク質は、アビジン単量体固定樹脂ＵｌｔｒａＬｉｎｋ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ａｖｉｄｉｎ（ピアス社）で精製した。同樹脂による精製はメーカー記載のマニュアルに従って行った。上記イミダゾール溶出画分に対して、９倍容の結合緩衝液を加え、あらかじめ平衡化した１０μｌの樹脂を穏やかに混和した（４℃、３０分）。結合緩衝液で十分に樹脂を洗浄した後、５０μｌの５０ｍＭビオチンを含む緩衝液で溶出した。
イミノビオチンを含むＣｙ５標識されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、蛍光画像解析およびイムノブロットにて精製を確認した（図１４のＡおよびＢ）。イムノブロットは、電気泳動後のゲルをポリビニリデンフロライド膜（ポールゲルマンサイエンス社）に電気的に転写し、Ｎ末端に配したＴ７タグに対するマウスモノクローナル抗体（ノバジェン社）および西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（トランスダクション社）を反応させ、ＥＣＬキット（アマシャムファルマシア社）を用いて化学発光させた。このイムノブロット法は同キットのメーカー記載のマニュアルに依った。ニッケルキレート樹脂に結合したヒスチジンタグタンパク質のうち、ストレプトアビジン固定樹脂を素通りしたタンパク質は蛍光で検出されなかったが、ビオチン溶出画分は、抗体および蛍光の両方で検出された（図１４のＡおよびＢ、レーン２、３）。
精製した標識タンパク質の純度を検討した。蛍光標準液はそれぞれ、６５０ｎｍにおける分子吸光係数２５，０００で定量したＣｙ５色素および、５０５ｎｍにおける分子吸光係数６８，０００で定量したローダミングリーン色素とした。０．１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８に溶解した試料１００μｌを黒色３８４穴ポリスチレンプレート（ヌンク社）に供し、蛍光画像解析装置により定量した。精製画分に含まれるｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎ濃度は、Ｔ７タグリコンビナントタンパク質（ノバジェン社）を標準物質としてドットブロット法で定量した。試料１μｌをそれぞれニトロセルロース膜（シュライヤーシュルツ社）にスポットし、マウス抗Ｔ７タグ抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体を反応させた。ＥＣＬを用いた化学発光を化学発光解析装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　ＣｈｅｍｉＤｏｃ、バイオラッド社）で検出した。精製画分のＴ７タグタンパク質と蛍光のモル濃度の比は９０％以上であった（第５表）。精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、タンパク質染色したところ、ほぼ単一な成分であることが確認された（図１５）。
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５）蛍光相互相関分光法
蛍光標識ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−ＪｕｎならびにＡＰ−１配列２本鎖ＤＮＡを用いて、蛍光相互相関分光法にて分子間相互作用の解析を行った。ＤＮＡおよび標識タンパク質（それぞれ最終濃度１０ｎＭ）を混合した。この試料１０μｌを８連ガラスチェンバー（ヌンク社）に供し、蛍光相関分光計ＣｏｎｆｏＣｏｒ２（カールツァイス社）を用いて蛍光相互相関を測定した。その結果、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−ＪｕｎおよびＤＮＡの３種類全てを加えた試料では相互相関が確認されたが、ｃ−Ｊｕｎを含まない対照試料では相互相関は認められなかった（図１６）。相互相関の解析結果から下記計算式に従って算出された解離定数（Ｋｄ）は、約１×１０−８Ｍであった。他の手法によって得られた解離定数は、約１×１０−９Ｍから約１．１×１０−７Ｍ（Ｈｅｕｅｒ，Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５，９０６９−９０７５、Ｐｅｒｎｅｌｌｅ，Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３２，１１６８２−１１６８７）と報告されているが、本発明の蛍光標識タンパク質を用いた結果はこれに矛盾しない。以上から、本発明によって蛍光標識されたタンパク質は、蛍光相互相関分光法を用いてタンパク質相互作用を検出することができ、さらに、解離定数の簡便かつ迅速な測定に利用できることが確認された。
・計算式１
相互相関分析からＮａｃ，ｒ、Ｎａｃ，ｇ、Ｇｃ（０）が得られる。
ここで
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Ｃｙ５およびローダミンで蛍光標識された粒子の数；
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Ｃｙ５のみで標識された粒子の数；
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ローダミンのみで標識された粒子の数；
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以上から、解離定数は
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実施例６　固定化法によるタンパク質相互作用の解析（２）
１）修飾剤の合成
修飾剤１９は、実施例１で合成したものを用いた。
２）ＤＮＡの調製
２−▲１▼　ベイト（Ｂａｉｔ）タンパク質用
材料：放線菌ストレプトミセス・アビジニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉ）は理研より購入した。オリゴＤＮＡ（プライマー）はエスペックオリゴサービスで合成された。大腸菌、プラスミド、各種酵素・試薬などは市販のものを用いた：大腸菌ＪＭ１０９、プラスミドｐＵＣ１８（東洋紡）、ｐＥＴ２０ｂ（ノバジェン社）；制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡）；Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡）、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、レコチップ（宝酒造）；ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）。遺伝子工学の基本操作（クローニング、大腸菌の形質転換および培養、プラスミドの回収など）は、サンブルック等のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．１９８９．ＣＳＨ　ｐｒｅｓｓ）に従った。
プラスミドｐＳＰ６−ＳＴＡ−ＪｕｎおよびｐＳＰ６−ＳＴＡ−Ｆｏｓを以下の手順で構築した。まず、ストレプトアビジン遺伝子を、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉゲノムを鋳型として、ストレプトアビジン遺伝子の上流および下流に相補的なプライマー（配列番号３０および３１）を用いてＰＣＲで増幅し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ−ＳＴＡを得た。これを鋳型として、ストレプトアビジン遺伝子のＮ末端にＴ７タグを付加するためのプライマー（配列番号３２）およびストレプトアビジン遺伝子下流に相補的なプライマー（配列番号３３）を用いてＰＣＲを行い、Ｎ末端にＴ７タグ配列をもつストレプトアビジン遺伝子を得た。さらに、これを鋳型として、この上流にＳＰ６プロモーターとタバコモザイクウイルス由来のエンハンサー配列を含む非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）を付加するために、Ｔ７タグ配列をもつストレプトアビジン遺伝子の上流および下流に相補的なプライマー（配列番号３４および３３）を用いてＰＣＲ増幅した断片をＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＴ２０ｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。このとき、ストレプトアビジン遺伝子の挿入方向としてＢｇｌＩＩ側が遺伝子の上流になっているプラスミドをｐＳＰ６−ＳＴＡと名付けた。次に、実施例１で調製したｊｕｎおよびｆｏｓ遺伝子を、それぞれ２組のプライマー（配列番号３５および３６、配列番号３および３７）を用いてＰＣＲで増幅し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＳＰ６−ＳＴＡのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐＳＰ６−ＳＴＡ−ＪｕｎおよびｐＳＰ６−ＳＴＡ−Ｆｏｓを得た。
２−▲２▼　プレイ（Ｐｒｅｙ）タンパク質用
マウスｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの遺伝子ＤＮＡは、実施例５で調製されたＣ末端に長さ１２残基のポリヒスチジンタグがついたものを用いた。
３）転写、翻訳
マウスｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの遺伝子ＤＮＡは、Ｒｉｂｏｍａｘ　ＲＮＡ合成システム（プロメガ社）を用いてＳＰ６　ＤＮＡポリメラーゼにより転写された（３７℃、１２０分）。このとき２０μｌの反応液には、ＤＮＡ　６μｌ、１００ｍＭのｒＵＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＡＴＰそれぞれ１μｌ、３０ｍＭのｒＧＴＰ　１μｌ、ＳＰ６ポリメラーゼ２μｌが入っており、さらに４０ｍＭに調整したＲＮＡキャップアナログ（ライフテックオリエンタル社）を４μｌ加えてＲＮＡの５′末端を修飾した。合成されたＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
タンパク質に翻訳するため、得られたｍＲＮＡをＰｒｏｔｅｉｏｓＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ）の小麦胚芽抽出液を用いた無細胞翻訳系に加え、３７℃で５時間反応させた。翻訳系１００μｌに対しては２種類のバッファーのほかにクレアチンキナーゼ４μｌ、ＲＮａｓｅインヒビター１０μｌ、小麦胚芽２０μｌ、ｍＲＮＡ１０μｌと蛍光修飾剤を添加した。蛍光修飾剤には、蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）−ｄＣ−ピューロマイシン（修飾剤１９）を使用した。修飾タンパク質の収率を知るために、翻訳産物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動して、蛍光修飾タンパク質のバンドを蛍光イメージング装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　ＦＸ、バイオラッド社）により検出した。
マイクロアレイに固定するためのストレプトアビジンを融合したベイト側のＪｕｎおよびＦｏｓは、ｐＳＰ６−ＳＴＡ−ＪｕｎおよびｐＳＰ６−ＳＴＡ−Ｆｏｓを鋳型として、上記と同様の方法で転写し、ＰｒｏｔｅｉｏｓＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ）による重層法を用いてタンパク質合成を行った。
４）精製法
固定化法のプレイ側のタンパク質として用いる蛍光修飾タンパク質は、未反応の蛍光色素を除去する為、以下の手順で精製した。
Ｈｉｓタグ付きタンパク質の精製（Ｎｉカラム法）
Ｈｉｓタグ付きタンパク質のＣ末端蛍光修飾翻訳の反応液を、平衡化したニッケルＮＴＡアガロース樹脂（キアゲン社）と混合し、蛍光修飾タンパク質のＣ末端のＨｉｓタグとニッケルイオンの特異的な結合により樹脂と吸着させ、洗浄後、５００ｍＭのイミダゾールで溶出した。
５）プロテインマイクロアレイを用いた固定化法
５−▲１▼　スライドグラス上へのタンパク質の固定化
ＤＮＡマイクロアレイヤー（ＭｉｃｒｏＧｒｉｄＩＩ、バイオロボティクス社）にビオチンコートスライドグラス（ゼノポア社）をセットして、６０％ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝液＋１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ　７．４）／４０％グリセロールに溶解したＪｕｎとＦｏｓのストレプトアビジン融合タンパク質の翻訳液をスポットし、調湿環境下に１時間置いて、ストレプトアビジンとビオチンの結合によりスライドグラス表面に固定した（図１７の最上図）。固定後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１分間振とうしてリンスし、交換した１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液でさらに１時間振とうしてブロッキングを行った。ブロッキング後、１×ＰＢＳで洗浄して乾燥させた。スライド上のスポット領域にｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の枠状のシリコンシール（イージーシール、ハイベイド社）を貼り、その枠内に０．５ｍｇ／ｍｌのマウス由来の抗Ｆｏｓ一次抗体（ｃ−Ｆｏｓ（６−２Ｈ）：ｓｃ−４４７、サンタクルーズ社）と０．５ｍｇ／ｍｌのウサギ由来の抗Ｊｕｎ一次抗体（ｃ−Ｊｕｎ／ＡＰ１、オンコジーン社）を１×ＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸緩衝液＋１５０ｍＭ　ＮａＣｌ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０、ｐＨ　７．４）に溶解した反応液を充填し、上からシールカバーした。この状態で調湿環境下、室温で１時間反応させた。反応後、１×ＰＢＳＴで５分間の振とうを液の交換をして５回と、さらに１×ＰＢＳで３分間の振とうを３回、液を交換して行ってから、２０００ｒｐｍ、４℃で１分間の遠心をして乾燥させた。ここで再び、スライド上のスポット領域にｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の枠状のシリコンシール（イージーシール、ハイベイド社）を貼り、その枠内に０．５ｍｇ／ｍｌのＣｙ３標識の抗マウス抗体（ケミコン社）と０．５ｍｇ／ｍｌのＣｙ５標識の抗ウサギ抗体（ケミコン社）を１×ＰＢＳＴに溶解した反応液を充填して上からシールカバーした。この状態で調湿環境下、室温で１時間反応させた。反応後、１×ＰＢＳＴで液を交換しながら５分間ずつ５回の振とうをして、さらに１×ＰＢＳでこれも液を取り換えて３分間ずつの振とうを３回行ってから２０００ｒｐｍ、４℃で１分間の遠心をして乾燥させた。これを、ＤＮＡチップスキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ、アクソン社）でスキャンして、スライド上にスポットされたＪｕｎとＦｏｓタンパク質を検出したところ、ストレプトアビジン融合Ｆｏｓのスポット部位にはＣｙ３の蛍光が確認でき、さらにストレプトアビジン融合Ｊｕｎのスポット部位にはＣｙ５の蛍光が確認できた（図１７のＡ）。これらの結果より、ビオチンコートスライドグラス上へのストレプトアビジン融合タンパク質の固定化が確認された。
５−▲２▼　スライドグラス上に固定化されたベイトタンパク質とプレイタンパク質との相互作用の検出
ＤＮＡマイクロアレイヤー（ＭｉｃｒｏＧｒｉｄＩＩ、バイオロボティクス社）にビオチンコートスライドグラス（ゼノポア社）をセットして、６０％ＰＢＳ／４０％グリセロールに溶解したＪｕｎのストレプトアビジン融合タンパク質の翻訳液をスポットし、調湿環境下に１時間置いて、スライドグラス表面にストレプトアビジンとビオチンの結合により固定した。固定後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１分間振とうしてリンスし、交換した１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液でさらに１時間振とうしてブロッキングを行った。ＢＳＡによるブロッキング後、１×ＰＢＳで洗浄してから２０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心してスライドグラス上の溶液を飛ばした。次に、スライド上のスポット領域にｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の枠状のシリコンシール（イージーシール、ハイベイド社）を貼り、Ｃ末端をＴＡＭＲＡ−ｄＣ−ピューロマイシン（修飾剤１９）でラベル化した後に、ニッケルＮＴアガロース樹脂（キアゲン社）で精製したＨｉｓタグが１２個ついたＦｏｓタンパク質を含む反応液（１×ＰＢＳＴ／２００ｍＭ　ＮａＣｌ／２０％グリセロール）を充填して、上からシールカバーした。この状態で調湿環境下の室温で１時間反応させた。反応後、１×ＰＢＳＴでの振とうを５分間、液を交換して１０分間、再び液を交換して３０分間振とう洗浄して、さらに１×ＰＢＳで液の交換をしながら３分間の振とうを３回繰り返し、２０００ｒｐｍ、４℃の遠心を１分間行ってから乾燥させた。これを、ＤＮＡチップスキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ、アクソン社）でスキャンした結果、ＴＡＭＲＡ−ｄＣ−ピューロマイシン（修飾剤１９）でラベル化されたＦｏｓの、スライドグラス上に固定されたＪｕｎへの結合が検出された（図１７のＢ）。
産業上の利用の可能性
本発明のヌクレオチドリンカーを含む修飾剤によるタンパク質のＣ末端修飾法は、種々のタンパク質相互作用の検出に有効であり、ゲノムプロジェクトによって集積する遺伝子の機能解析において、タンパク質間相互作用やタンパク質−核酸相互作用を大量かつ高速にスクリーニングする上で極めて有効な手段を提供する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｃ末端修飾タンパク質（Ａ）、修飾剤（Ｂ）、および、翻訳テンプレート（Ｃ）の構成を示す図である。
図２は、修飾剤の化学合成法を示す図である。図中、ＣＰＧは固相担体、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｆｍｏｃはフルオレン−９−メトキシカルボニル基を示す。修飾剤１〜１１の構造については第１表を参照。
図３は、修飾剤の化学合成法を示す図である。図中、ＭＭＴｒは４−モノメトキシトリチル基を示す。修飾剤１２〜１８の構造については第２表を参照。
図４は、ヌクレオチドリンカーのｃ−Ｆｏｓタンパク質のＣ末端修飾効率に対する影響を示す図である。左図は蛍光基にフルオレセインを用いた。右図は蛍光基にＣｙ５を用いた。ピューロマイシン残基と蛍光基の間のヌクレオチドリンカーは、２’−デオキシシチジル酸（−ｄＣ−）、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシシチジル酸（−ｄＣｄＣ−）、リボシチジル酸（−ｒＣ−）、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸（−ｒＣｒＣ−）で、ヌクレオチドリンカーがないものは、（−ｎｏｎｅ−）で示してある。
図５は、蛍光相互相関分光法による特異的なタンパク質−核酸相互作用の検出の結果を示す図である。１：Ｃｙ５−ＤＮＡ＋ＲＧ−Ｊｕｎ＋Ｆｏｓ、２：Ｃｙ５−ＤＮＡ＋ＲＧ−Ｆｏｓ＋Ｊｕｎ、３：Ｃｙ５−ＤＮＡ＋ＲＧ−Ｊｕｎ＋Ｊｕｎ、４：Ｃｙ５−ＤＮＡ＋ＲＧ−Ｆｏｓ＋Ｆｏｓ。１および２は、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＤＮＡの３種類全てを加えた試料、３および４は、ＦｏｓまたはＪｕｎの一方が欠けている対照試料である。
図６は、翻訳テンプレートの一例の基本的構造および各要素のＤＮＡ塩基配列を示す図である。
図７は、翻訳テンプレートの蛍光修飾効率に及ぼす影響を示す図である。
Ａ：本発明の翻訳テンプレートの３’末端領域のポリＡ配列の効果を示す。
Ｂ：本発明の翻訳テンプレートの５’ＵＴＲの翻訳エンハンサーの効果を示す。
図８は、タンパク質Ｃ末端のビオチン修飾およびストレプトアビジン膜への固定の結果を示す図（写真）である。１はビオチニル基と蛍光基（ＴＡＭＲＡ）を同一分子に有する修飾剤でｃ−Ｊｕｎタンパク質のＣ末端を修飾した（ビオチン・蛍光修飾タンパク質（ｃ−Ｊｕｎ））。２は蛍光基（ＴＡＭＲＡ）のみを有する修飾剤でｃ−Ｊｕｎタンパク質のＣ末端を修飾した（蛍光修飾タンパク質（ｃ−Ｊｕｎ））。３は対照実験で、１の修飾剤とモル比で１０００倍量の遊離ビオチンを同時に加えた（ビオチン・蛍光修飾タンパク質（ｃ−Ｊｕｎ）＋遊離ビオチン）。
図９は、固相担体表面上でのタンパク質相互作用の検出結果及び結果の説明を示す図（写真）である。スライドガラス上に、Ｃｙ５（６３５ｎｍで蛍光を測定）で修飾したＦｏｓとＪｕｎの結合領域のＤＮＡを固定し、これに無修飾Ｆｏｓ存在下でローダミングリーン（５３２ｎｍで蛍光を測定）でＣ末端が修飾されたＪｕｎ（左）とｐ５３タンパク質（右）をそれぞれ作用させた。
図１０は、修飾剤の化学合成法を示す図である。図中Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示す。
図１１は、修飾剤の化学合成法を示す図である。修飾剤２１〜２５の構造については第４表を参照。
図１２は、Ｃｙ５標識ｃ−Ｊｕｎについて、ポリヒスチジンの長さとニッケルキレート樹脂による回収量を検討した結果を示す図（写真）である。２５μＭ　Ｃｙ５−ｄＣ−ピューロマイシン（修飾剤９）存在下、等濃度のｍＲＮＡを小麦胚芽抽出液で翻訳した。翻訳後上清（レーン１）、ニッケルキレート樹脂素通り（レーン２）、イミダゾール溶出（レーン３）の各画分を１２．５％−ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分離し、蛍光画像解析装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　ＦＸ、バイオラッド社）で検出した。Ｍは分子量マーカー（プレシジョンマーカー、バイオラッド社）である。ポリヒスチジンの長さが増えるに従い、蛍光標識タンパク質の回収が増加した。
図１３は、各種Ｃｙ５−ｄＣ−ピューロマイシンを用いてｃ−Ｆｏｓを標識し、ニッケルキレート樹脂での回収を検討した結果を示す。Ａは精製後、１７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、蛍光画像解析装置で検出した結果を示す図（写真）である。矢印は翻訳する時の各種ピューロマイシン濃度が増加する方向を示し、各レーンは１２．５、２５、５０、１００μＭに相当する。ＢはＡの各バンドの蛍光強度を示したグラフである。白丸はｄＣ−ピューロマイシン（修飾剤９）、黒三角はｄＣ−イミノビオチン（修飾剤２５）、黒四角はｄＣ−ビオチン（修飾剤２４）である。イミノビオチンを含む標識化合物（修飾剤２５）を用いた場合は、イミノビオチンを含まない標識化合物（修飾剤９）に比べて約２倍の効率で蛍光標識された。
図１４は、イミノビオチンを含むＣｙ５−ｄＣ−ピューロマイシン（修飾剤２５）で標識されたｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎタンパク質のストレプトアビジン樹脂による精製のの結果を示す図（写真）である。ニッケルキレート樹脂で粗精製した画分（レーン１）、ストレプトアビジン樹脂素通り画分（レーン２）、ビオチン溶出画分（レーン３）を１７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、蛍光画像解析（Ａ）、イムノブロット（Ｂ）にて検出した。イムノブロットは電気泳動で分離後ポリビニリデンフロライド膜（ポールゲルマンサイエンス社）に電気的に転写し、Ｔ７タグに対するマウスモノクローナル抗体（ノバジェン社）、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（トランスダクション社）を反応させ、ＥＣＬキット（アマシャムファルマシア社）を用いて化学発光させた。ニッケルキレート樹脂に結合したヒスチジンタグタンパク質のうち、ストレプトアビジン固定樹脂を素通りしたタンパク質は蛍光で検出されなかったが（レーン２）、ビオチン溶出画分は抗体、蛍光とも検出された（レーン３）。
図１５は、イミノビオチンを含むＣｙ５−ｄＣ−ピューロマイシン（修飾剤２５）で標識されたｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎの精製の結果を示す図（写真）である。ニッケルキレート樹脂精製画分（レーン１）およびストレプトアビジン固定樹脂精製画分（レーン２）をそれぞれ１７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ（モレキュラープローブス社）にてタンパク質を染色後、蛍光画像解析した。ストレプトアビジン固定樹脂を用いることによって、ほぼ単一な成分に精製できた。
図１６は、蛍光相互相関分光法によりタンパク質−タンパク質相互作用を測定した結果を示す。Ｃｙ５標識ｃ−Ｊｕｎ、ローダミングリーン標識ｃ−Ｆｏｓ、およびＡＰ−１配列をもつＤＮＡ各１０ｎＭを混合した場合（Ｃｙ５−Ｊｕｎ＋Ｒｈ−Ｆｏｓ＋ＡＰ１）、相互相関Ｇｃ（０）は約１．１で（黒丸）、この結果から算出された解離定数（Ｋｄ）は約１×１０−８Ｍであった。一方、Ｃｙ５標識ｃ−Ｆｏｓ、ローダミングリーン標識ｃ−Ｆｏｓ、およびＡＰ−１配列ＤＮＡの場合（Ｃｙ５−Ｆｏｓ＋Ｒｈ−Ｆｏｓ＋ＡＰ１）は相互相関が認められなかった（白丸）。
図１７は、プロテインマイクロアレイを用いたタンパク質間相互作用の検出の結果及び説明を示す図である。最上図は調製の説明図である。（Ａ）ＳＴＡ−Ｆｏｓ（Ｆ）およびＳＴＡ−Ｊｕｎ（Ｊ）のビオチンプレート上への固定化の蛍光標識抗体を用いた確認の結果を示す図（写真）及びその説明図を示す。（Ｂ）ＳＴＡ−Ｊｕｎ（Ｊ）とＳＴＡ−Ｆｏｓ（Ｆ）をビオチンプレート上へ固定化した後、Ｃ末端蛍光標識Ｆｏｓを作用させた結果を示す図（写真）およびその説明図を示す。Ｃ末端蛍光標識ＦｏｓはＳＴＡ−Ｊｕｎ（Ｊ）とは特異的に相互作用するが、ＳＴＡ−Ｆｏｓ（Ｆ）とは全く相互作用しないことが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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