(57)【要約】新規なＮＰＹ様ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程、及びペプチドを回収する工程を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチドの製造方法。
【請求項７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換真核生物細胞を培養する工程、及びペプチドを回収する工程を含む方法により製造されうるペプチド。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規のニューロペプチドＹ様ペプチドに関する。
背景技術
ニューロペプチドＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ；以下、ＮＰＹと略称する）ファミリーは、ＮＰＹ、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、及び膵臓ペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＰＰ）の３種類より構成される生理活性ペプチド群である（Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，６２，１−１１，１９９６）。いずれのペプチドも、アミノ酸３６個からなり、Ｃ末端がアミド化された直鎖ペプチドである。
ＮＰＹは、１９８２年にブタ脳から単離・精製され、その後の研究によって哺乳類の中枢及び末梢神経系で最も含有量が多い神経ペプチドであることが判明した（Ｎａｔｕｒｅ，２９６，６５９−６０，１９８２）。ＮＰＹの発現は、中枢神経系（特に、視床下部、海馬、大脳皮質、及び脳幹部）、副腎髄質、及び副交感神経に見られる。
ＰＹＹも、ＮＰＹと同じ１９８２年にブタ小腸から単離・精製された生理活性ペプチドである（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，２５１４−８，１９８２）。ＰＹＹは、ＮＰＹに対してアミノ酸一次配列で７０％の相同性があり、下部小腸、大腸、及び膵臓で発現が確認されている。
ＰＰは、１９７５年にニワトリのインスリン精製過程の副産物として、ＮＰＹファミリー中で最初の分子として同定された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，９３６９−７６，１９７５）。ＮＰＹ及びＰＹＹは全ての脊椎動物で存在が確認されているが、ＰＰは四肢動物への進化の初期に発生したと考えられている。ＰＰは、ＮＰＹに対して５０％のアミノ酸配列相同性を有しており、発現は主に膵臓で観察される。
ＮＰＹ遺伝子は、ヒトで第７染色体ｐ１５．１に存在している。ＰＹＹ遺伝子及びＰＰ遺伝子は、いずれもヒトの第１７染色体ｑ２１．１に、わずか１０ｋｂの距離に連座しており、分子進化学的解析からＰＰ遺伝子はＰＹＹ遺伝子のコピーとして遺伝子複製（ｇｅｎｅ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）されたものと考えられている。ＮＰＹは、既知の神経ペプチドの内で、分子進化上最も保存されている分子であり、既知オーソログでは３６アミノ酸中、２２アミノ酸が同一である。一方で、ＰＹＹは、それよりも少ない１５アミノ酸が種を超えて保存されているが、ＰＰについては、７アミノ酸が同一であるに過ぎない。こうしたことから、ＰＹＹはＮＰＹに比べ、進化速度の速い分子と考えられており、ＰＰ遺伝子がＰＹＹ遺伝子より遺伝子複製されたことが、ＰＹＹの進化速度を速める一因となったとの考察もある。
ＮＰＹファミリーでは、アミノ酸一次配列中で共通に保有する３つのプロリン残基と２つのチロシン残基とで（ポリプロリンヘリックス）−（βターン）−（αヘリックス）のＵ字構造と、自由度の高いＣ末端の４アミノ酸の立体構造とが形成される。この構造は「ＰＰ−ｆｏｌｄ」と呼ばれ、ＮＰＹファミリーの活性発現に重要な役割を担うと考えられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１１７０６−１２，１９９０）。
ＮＰＹファミリーの機能発現は、ＮＰＹ特異的受容体との結合を介して行われる（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，２９４−８，１９９７）。ＮＰＹファミリーの受容体としては、これまで５つの異なるサブタイプが存在することが知られており、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、及びＹ６が遺伝子レベルで同定されている。Ｙ１受容体は、Ｙ４受容体と４２％（アミノ酸配列に関して）と最も高い相同性があり、ヒトでは機能を持たない偽遺伝子のＹ６受容体と５１％の相同性がある。興味深いことに、Ｙ１受容体は、アミノ酸配列に関して、Ｙ５受容体及びＹ２受容体に対する相同性は、それぞれ３５％及び３１％しかない。こうした事実は、ＮＰＹ受容体が、ＧＰＣＲスーパーファミリーの内で最もサブタイプ間相同性の低い群であることを示している。５種類のＮＰＹ受容体は、いずれも百日咳毒素感受性のＧタンパク質の活性化を介して細胞内シグナル伝達系を活性化し、細胞内ｃＡＭＰ量の蓄積を抑制する。また、Ｙ１受容体及びＹ２受容体は、活性化により細胞内Ｃａ濃度上昇を引き起こすこと、そして、Ｙ２受容体は、更にＫチャネルの活性化を引き起こすことも報告されている。
ＮＰＹの生理活性としては、摂食、性行動、日周運動、及び血圧への関与が示唆されている。これらの生理機能のうち、最も良く研究されているのが、中枢投与時における摂食に関するもので、一連の研究よりＮＰＹは最も有効な摂食亢進物質であるとする報告がある（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７８，３７１−９２，２０００）。ＮＰＹをラット脳室内に投与すると、摂食量の増大が観察され、最終的には体重増加及び肥満が起こる。また、日常的な摂食前には、満腹中枢である視床下部室傍核にてＮＰＹの発現が増大する（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７０（４  Ｐｔ  １），Ｅ５８９−９５，１９９６）。飢餓状態では、視床下部でのＮＰＹ発現量が亢進するが、摂食によりその発現は減弱する（Ａｍ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６６（５  Ｐｔ  ２），Ｒ１６８７−９１，１９９４）。しかしながら、興味深いことに、ＮＰＹのノックアウトマウス（ＫＯマウス）では、摂食パターンに変化は起こらず（Ｎａｔｕｒｅ，３８１，４１５−２１，１９９６）、ｏｂ／ｏｂマウスとＮＰＹのＫＯマウスとを掛け合わせた場合に、摂食量減少及びエネルギー代謝量増加を伴う、強い体重減少が観察される（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１７０４−７，１９９６）。
ＰＹＹ及びＰＰも、摂食亢進を惹起することが知られている。ＰＹＹは、ラット脳室内投与により摂食量が著しく上昇し、その効果はＮＰＹよりも顕著であることが報告されている［Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５９（２  Ｐｔ  ２），Ｒ３１７−２３，１９９０、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，３４１，２００−３，１９８５、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，８０５，２０−８，１９９８、及びＰｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，５８，７３１−５，１９９５］。ＰＰは、脳室内投与により摂食が刺激されることが知られている［Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６９（５  Ｐｔ  ２），Ｒ９８３−７，１９９５］。また、ＰＹＹ及びＰＰは、消化管機能、及び膵臓外分泌等の末梢生理機能も調節すると考えられている。ＰＹＹは、多くの動物種において胃酸の分泌を抑制することが知られており、ラット小腸では抗分泌活性を示す。逆に、胃酸はＰＹＹのｍＲＮＡ転写量を増大させる。膵臓では、ＰＹＹはα細胞の分泌顆粒にグルカゴンと共に貯蔵されており、ＰＹＹはグルコース刺激によるインスリン分泌抑制活性を有する（Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，１５７，３０５−６，１９９６）。ＰＰは、胃酸分泌の制御に関与することが示唆されている［Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６９（５  Ｐｔ  ２），Ｒ９８３−７，１９９５］。
更に、ＮＰＹファミリー阻害剤である、１２２９Ｕ９１、ＢＭＳ−１９２５４８、Ｊ−１０４８７０、及びＢＩＢＰ３２２６等について、抗肥満薬の研究が進められている（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１２６１−６，１９９５、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４８，１０５５−９，１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６６，８８−９１，１９９９、及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１３６−４２，１９９５）。
上記の通り、ＮＰＹファミリーは新規医薬品ターゲットとして有用であることが知られている。
発明の開示
本発明の課題は、新規なＮＰＹ様ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの製造方法を提供することにある。
本発明者は、鋭意研究を行なった結果、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを取得し、本ポリヌクレオチドがコードするペプチドは、ＮＰＹファミリーに属するＰＹＹに最も高い相同性を有することを見出した。そして、本ペプチドは、ＰＹＹと同様に、摂食機能を司る視床下部、胃酸分泌を司る小腸、及びインスリン分泌抑制機能を司る脳下垂体で発現していることを解明し、ＰＹＹと同様の機能を有する新規なＮＰＹ様ペプチドであることを明らかにし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
［３］［１］又は［２］に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［４］［３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
［５］［３］に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体；
［６］［５］に記載の形質転換体を培養する工程、及びペプチドを回収する工程を含むことを特徴とする、［１］又は［２］に記載のペプチドの製造方法；並びに
［７］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換真核生物細胞を培養する工程、及びペプチドを回収する工程を含む方法により製造されうるペプチド
に関する。
なお、本願優先日後に公開されたＷＯ０１／６０８５０号公報には、単に、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列が記載されているのみで、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はこれをコードするポリヌクレオチドの具体的な取得方法、及び前記ペプチド又はポリヌクレオチドを取得したという実施例は存在せず、現実に前記ペプチド等を取得したことを裏付ける記載はない。また、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、開示も示唆もされていない。つまり、配列番号３又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及びこれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明者が初めて取得したものである。
発明の実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］本発明のポリペプチド
本発明のペプチドには、
（１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
が含まれる。
本発明のペプチドの１つである、「配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」は、４２個のアミノ酸残基からなるヒト由来のペプチドである。前記「配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」は、後述の実施例１で示すように、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」として翻訳された前駆体から、Ｎ末端側のシグナルペプチド（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番目〜２８番目のアミノ酸からなるペプチド）が切断除去された成熟体であると考えられる。
本発明のペプチドは、ＰＹＹと同様の機能、具体的には、摂食調節機能（好ましくは摂食亢進機能）、胃酸分泌抑制機能、又はインスリン分泌抑制機能を有する。
或るペプチドが「摂食調節機能」を示すか否かの確認方法は、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法により確認することができる。すなわち、被検ペプチドを適当量（例えば、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、及び１０ｍｇずつ）でラット脳室内に投与し、前記投与から所定時間経過後（例えば、３０分経過後、６０分経過後、９０分経過後、１２０分経過後、及び２４０分経過後）の摂食量を、総給餌量の減少分より算出する。この結果、被検ペプチド投与量依存的にラット摂食量の変化が観察されれば、被検ペプチドが摂食調節機能を有すると判定することができる。例えば、被検ペプチド投与量依存的にラット摂食量の亢進が観察されれば、被検ペプチドが摂食亢進機能を有すると判定することができる（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，３４１，２００−３，１９８５、及びＡｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５９，Ｒ３１７−２３，１９９０）。
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表される塩基配列における１１７番目〜２４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド、あるいは、配列番号１で表される塩基配列における３６番目〜２４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードし、後者のポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする。
本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた方法、（ｂ）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（ｃ）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
ＰＣＲを用いた方法［前記製造方法（ａ）］では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。反応条件（例えば、変性温度又は変性剤添加条件など）を適切に調整して、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
また、本発明のペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織から調製したｍＲＮＡから、逆転写酵素を用いて作製したｃＤＮＡ、あるいは、市販のヒト細胞又は組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを実施することによっても、本発明のペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。また、ゲノムＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法［前記製造方法（ｂ）］では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ  Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、又はＪＭ１０９株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。また、市販のコンピテント細胞を使用することもできる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法、又は（２）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法を用いる方法を採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法［前記選択方法（１）］では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法［前記選択方法（２）］では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
化学合成法を用いた方法［前記製造方法（ｃ）］では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
［３］本発明の発現ベクター、形質転換体、及びペプチド製造方法
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（真核生物及び原核生物の各宿主細胞を含む）を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ，，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、サイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
本発明の形質転換体は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞外に本発明のペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
本発明の形質転換体を培養することにより、前記形質転換体の細胞外に生産される本発明のペプチドは、前記ペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、本発明のペプチドを含む培養液を、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のペプチドを精製することができる。
本発明のペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のペプチドの発現の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。
本発明のペプチドは、これまで述べたような、本発明の形質転換体を用いる製造方法以外にも、例えば、ペプチド自動合成機による化学合成法によっても製造が可能である。ペプチド自動合成機には、例えば、アプライドバイオシステムズ社４３０Ａ型、ミリポア社９０５０型、又は島津製作所ＰＳＳＭ−８型等があり、いずれも樹脂に固定したアミノ酸誘導体に１アミノ酸ずつカルボキシル末端から結合させる固相合成を行なうことができる。この方法には、αアミノ基についている保護基（Ｂｏｃ基）のトリフルオロ酢酸による切断を用いるｔＢｏｃ法と、ピペリジンでＮα位のＦｍｏｃ基を外すＦｍｏｃ法とが公知であり、いずれも脱保護により樹脂から外した後、高速液体クロマトグラフィー等で精製することができる［大海・辻村・稲垣編，細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」ｐ２５−４６（１９９４）秀潤社］。
本発明のペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、例えば、各種動物に、本発明のペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のタンパク質単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、本発明のペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリーコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のタンパク質単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のタンパク質単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
更には、本発明のペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
本発明のペプチドを用いると、摂食障害、胃酸分泌障害、及び／又はインスリン分泌障害の治療に有効な物質をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングの手順は、特に限定されるものではないが、例えば、本発明のペプチドを用いて、本発明ペプチドの受容体をスクリーニングした後、その受容体を用いて、本発明ペプチドと前記受容体との結合を阻害する化合物（例えば、受容体アゴニスト又はアンタゴニスト）をスクリーニングすることにより、摂食障害治療に有効な物質を得ることができる。以下、本発明のペプチドを用いる、本発明ペプチドの受容体のスクリーニング（以下、受容体スクリーニングと称する）について説明し、続いて、得られた本発明ペプチドの受容体を用いる、本発明ペプチドと前記受容体との結合を阻害する化合物のスクリーニング（以下、リガンドスクリーニングと称する）について説明する。
本発明のペプチドを用いると、本発明ペプチドの受容体発現細胞の同定、あるいは、本発明ペプチドの受容体の単離が可能である。本発明ペプチドの受容体を単離するためのスクリーニングを行なう場合、被検試料としては、例えば、受容体が発現していることが予想される細胞の細胞抽出物、あるいは、前記細胞から調製したＲＮＡを基に作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いることが可能である。ＮＰＹファミリー分子は、それらの受容体としてＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合することが知られている。本発明のペプチドも、同様に、ＧＰＣＲに結合し、細胞内へシグナル伝達を行なっている可能性が高い。本発明ペプチドの受容体を単離することができれば、本発明ペプチドの受容体に関するアゴニスト又はアンタゴニストの候補化合物を単離することも可能である。
受容体スクリーニングは、例えば、以下の手順で実施することが可能である。まず、本発明のペプチドを遺伝子組換え技術により発現させるか、あるいは、化学合成することにより、その精製品を取得する。次いで、その精製ペプチドを標識し、各種細胞株又は初代培養細胞に対して結合アッセイを行ない、これにより受容体を発現している細胞を選定する［本庶・新井・谷口・村松編，「新生化学実験講座７  増殖分化因子とその受容体」ｐ２０３−２３６（１９９１）東京化学同人］。標識としては、例えば、ＲＩ標識（例えば、３Ｈ又は１２５Ｉなど）、又は酵素標識（例えば、アルカリホスファターゼ等）を使用することができる。また、本発明のペプチドを標識する代わりに、本発明のペプチドに対する抗体を標識し、本発明ペプチドと受容体との結合を前記標識抗体を用いて検出することも考えられる。
前記受容体スクリーニングにより、本発明ペプチドの受容体又は受容体発現細胞が得られると、前記受容体又は受容体発現細胞と本発明ペプチドとの結合活性を指標に、前記結合を阻害する化合物（例えば、受容体アゴニストやアンタゴニスト）のスクリーニング（リガンドスクリーニング）が可能となる。このリガンドスクリーニング方法にかける被検物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販されている種々の化合物、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物、ペプチド、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、微生物の培養上清、植物又は海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、ペプチドを化学的又は生物学的に修飾した化合物又はペプチドを用いることができる。
本発明ペプチドの活性に影響を与える物質は、本発明ペプチドの活性の変化を測定することにより、本発明ペプチドのアゴニスト活性を有する物質（すなわち、本発明ペプチドの活性と同等の活性を有するか、あるいは、活性を亢進する物質）と、本発明ペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（すなわち、本発明ペプチドの活性を阻害する物質）とに大別される。このスクリーニング方法は、本発明ペプチドのアゴニスト活性を有する物質、あるいは、本発明ペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質のいずれも選択することができる。本発明のスクリーニング方法は、本発明ペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質の選択に、より適している。
また、一次スクリーニングとして、本発明ペプチドに結合する物質をスクリーニングし、二次スクリーニングにおいて、本発明ペプチドの受容体の活性の変化を測定し、アゴニスト又はアンタゴニストを区別してスクリーニングすることもできる。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：本発明の新規ＮＰＹ様ペプチドをコードする遺伝子の単離
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のペプチドをコードする全長ｃＤＮＡは、ヒト精巣由来の市販のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型ｃＤＮＡとし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により以下の手順で取得した。
１回目のＰＣＲ用のフォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。１回目のＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用いて、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で、９４℃（１分間）の変性工程の後、９４℃（３０秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（１分間）とからなるサイクルを３５回繰り返すことにより実施した。
続いて、前記ＰＣＲにより得られた反応液を５０倍に希釈し、この希釈液を鋳型として２回目のＰＣＲを実施した。２回目のＰＣＲは、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用したこと、そして、サイクル数を３０回としたこと以外は、１回目のＰＣＲと同じ条件で実施した。
２回目のＰＣＲの結果、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片を、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析し、配列番号１で表される塩基配列が得られた。
配列番号１で表される塩基配列には、２１３塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列における３６番目〜２４８番目の塩基からなる配列）が存在した。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（７０アミノ酸）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列であった。得られた予想アミノ酸配列について、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４，４６８３−９０，１９８６）によりシグナルペプチド配列を予想すると、Ｎ末端から２８番目のアミノ酸（トレオニン）と２９番目のアミノ酸（システイン）との間にシグナルペプチド分断部位が存在することが判明した。このことから、本遺伝子が分泌ペプチドをコードする遺伝子であることが判明した。
実施例２：本発明の新規ＮＰＹ様ペプチドのアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ検索
実施例１で得られた「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」のアミノ酸配列について、データベースＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）検索を実施した。既知ペプチドの中には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一の配列は存在せず、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）前駆体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ１００８２、アミノ酸残基数＝９７個）に対して、５６％で最も高い相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を示した。このことから、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のペプチドが、ＮＰＹファミリーに属するＰＹＹに相同性の高い新規ペプチドであることが判明した。
実施例３：本発明の新規ＮＰＹ様ペプチドのアミノ酸配列での、既知ＮＰＹファミリーに属するＮＰＹ、ＰＹＹ、及びＰＰに対するアラインメント解析
実施例１で得られた「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」のアミノ酸配列について、ＮＰＹファミリーに属する既知ペプチド３種、すなわち、ヒトＮＰＹ（ＧｅｎＢａｎＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＸＰ００４９４１）、ヒトＰＹＹ（ＧｅｎＢａｎＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ１３８９９）、及びヒトＰＰ（ＧｅｎＢａｎＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＸＭ００８３５７）の各アミノ酸配列に対する相同性を解析するために、市販のソフトウェア（ＤＮＡＳＩＳ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｖｅｒ  ２．１；日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、アライメント解析を行なった。
結果を図１に示す。図１において、「ＸＰ」は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを表わす。また、「−」は、ギャップ部分（すなわち、相当するアミノ酸が存在しないこと）を表わす。アライメント解析の結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のペプチドは、ＮＰＹファミリーに属する既知ペプチドと高い相同性を有する新規ＮＰＹファミリーに属する新規ペプチドであり、特に、ＰＹＹに対して相同性が最も高いことが判明した。
実施例４：本発明の新規ＮＰＹ様ペプチドのｃＤＮＡでのヒトゲノムドラフト配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索
実施例１で得られたｃＤＮＡ配列について、ヒトゲノムドラフト配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索を実施した。その結果、配列番号１で表される塩基配列全部を、塩基配列の一部として含む公知の塩基配列として、ＧｅｎＢａｎＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９０３６６（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｘ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ１３−３７７Ｇ１，ＤＢ：２００１／０５／１９  Ｐｈａｓｅ１  Ｌｅｎｇｔｈ＝１９４７９９）及びＧｅｎＢａｎＫ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ２３９３２３（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｘ  ｃｌｏｎｅ  ＰＡＣ  ＲＰＣＩ−３  ５１９Ｎ１８  ｍａｐ  Ｘｐ１１．２，ＤＢ：２００１／０５／１９  Ｐｈａｓｅ２  Ｌｅｎｇｔｈ＝１０２８５３）が存在した。この結果から、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」は、Ｘ染色体に遺伝子がコードされるペプチドであり、第７染色体に存在するＮＰＹや、第１７染色体に存在するＰＹＹ及びＰＰとは、ゲノム上で遺伝子的に独立していることが判明した。
実施例５：ヒト組織における本発明遺伝子の発現分布の確認
実施例１で得られた「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」をコードする遺伝子の組織発現分布を解析するために、ヒト各組織由来ｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを以下の手順で実施した。
１回目のＰＣＲ用のフォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。１回目のＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用いて、５％ＤＭＳＯ存在下で、９４℃（１分間）の変性工程の後、９４℃（３０秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（４５秒間）とからなるサイクルを４０回繰り返すことにより実施した。
続いて、前記ＰＣＲにより得られた各反応液を５０倍に希釈し、この各希釈液を鋳型として２回目のＰＣＲを実施した。２回目のＰＣＲは、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用したこと、そして、サイクル数を３５回としたこと以外は、１回目のＰＣＲと同じ条件で実施した。
その結果、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が、摂食機能を司る視床下部に由来するｃＤＮＡで増幅されることが確認された。この結果は、実施例１で得られた遺伝子でコードされるペプチドの摂食機能を裏付ける結果となった。また、視床下部以外にも、ＰＹＹやＰＰと同じように、脳下垂体及び小腸に由来する各ｃＤＮＡでも増幅されることが確認された。従って、ＰＹＹやＰＰと同じように、胃酸の分泌抑制及びインスリン分泌抑制機能を併せ持つ可能性もある。
実施例６：動物細胞でのＦＬＡＧエピトープ付加ＸＰ発現系の構築
本実施例では、実施例１で得られた「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」をコードする遺伝子（以下、ＸＰ遺伝子と称する）を、マーカー配列ＦＬＡＧエピトープとの融合ペプチド（以下、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドと称する）として動物細胞で発現させるための発現ベクターを構築し、更に、動物細胞において前記ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドの発現を確認した。
具体的には、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープをインフレームで融合して発現されるＸＰ遺伝子（ＸＰ−ＦＬＡＧ）の増幅は、フォワードプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。配列番号９で表される塩基配列には、ＦＬＡＧ配列が含まれる。これにより、ＸＰペプチドの発現の検出を簡便化することができる。また、前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＫｐｎＩ認識配列又はＮｏｔＩ認識配列が付加してある。
ＰＣＲは、実施例１で得られたＸＰペプチドをコードするｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用い、９４℃（２分間）の変性工程の後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７２℃（３０秒間）とからなるサイクルを２０回繰り返すことにより実施した。その結果、約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片を、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列は、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で解析し、ＸＰ−ＦＬＡＧ遺伝子と合致したクローンを選択した。前記クローンを制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで消化し、動物細胞発現用ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。
６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ  ６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ；ＡＳＡＨＩ  ＴＥＣＨＮＯ  ＧＬＡＳＳ社）にＨＥＫ２９３細胞（１×１０５細胞／ウェル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を播種して２４時間培養した後、先に構築したＸＰ−ＦＬＡＧ発現プラスミド（１μｇ／ウェル）を、市販のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いて遺伝子導入した。前記遺伝子導入から７２時間経過後から、ハイグロマイシンＢ含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行ない、得られた薬剤耐性細胞をＸＰ−ＦＬＡＧ発現細胞として用いた。ＸＰ−ＦＬＡＧ発現細胞を１０ｃｍシャーレ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ；ＡＳＡＨＩ  ＴＥＣＨＮＯ  ＧＬＡＳＳ社）でコンフルエントになるまで培養した後、培地を廃棄し、０．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭ培地にて４日間培養した後、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチド含有培地を回収した。
ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドの発現確認は、ウエスタンブロット解析により行なった。具体的には、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ；ドデシル硫酸ナトリウム）レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液（第一化学薬品）を用いてサンプル調製した回収培地を、ＳＤＳ／１５％〜２５％アクリルアミドゲル（第一化学薬品）を用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行なった後、ニトロセルロース膜に転写した。得られた転写膜を、市販のブロッキング試薬（ブロックエース；大日本製薬）でブロッキングした後、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ社）とを順次反応させた。反応後、市販の検出試薬（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシア社）を用いて、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドの発現を確認した。抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２と反応するペプチドは、空ベクターｐＣＥＰ４を導入した細胞には存在しないが、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドを発現した培地では、約６ｋＤａのバンドとして検出された。ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドの推定分子量は、６１９１．４１Ｄａであり、ほぼ予測される分子量にバンドが存在した。
実施例７：ＸＰペプチドに対する内在性受容体のスクリーニング系の構築
本実施例では、ＸＰペプチドに対する内在性受容体のスクリーニング系を構築した。
具体的には、４８ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ  ４８  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ；ＡＳＡＨＩ  ＴＥＣＨＮＯ  ＧＬＡＳＳ社）にＨＥＫ２９３細胞（３×１０４細胞／ウェル）を播種して２４時間培養した後、オーファン受容体発現プラスミド（５０ｎｇ／ウェル）とルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ又はｐＣＲＥ−ｌｕｃ（１０ｎｇ／ウェル；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とを市販のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６）により遺伝子導入した。次の日に、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドを含む培地に交換し、５時間反応させた後、細胞内ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（ＭＬ３０００  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にて測定した。
この系において、前記オーファン受容体発現プラスミドとして、公知の各種オーファン受容体遺伝子を含む各種発現プラスミドを遺伝子導入することで、ＸＰペプチドに対する内在性受容体のスクリーニングが可能となる。
産業上の利用可能性
本発明のペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体は、摂食障害、胃酸分泌障害、及び／又はインスリン分泌障害の治療剤の製造に有用であり、また、摂食障害、胃酸分泌障害、及び／又はインスリン分泌障害の治療剤として有効な物質のスクリーニングにも有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号８及び９の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明ペプチドのアミノ酸配列と、ＮＰＹファミリーに属する公知ペプチド３種のアミノ酸配列とのアライメント解析の結果を示す説明図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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