(57)【要約】ＣＤ４０に対し、アゴニスティックに又はアンタゴニスティックに作用する抗体又はその機能的断片。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する、ヒトＣＤ４０に対する抗体又はその機能的断片。
（ａ）樹状細胞に作用し、ＬＰＳ及びＩＦＮγの存在下でＩＬ−１２を生産させる
（ｂ）樹状細胞に作用し、該樹状細胞を成熟させる活性がＧ２８−５抗体よりも高い
（ｃ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して、ＣＤ９５の発現を促進する活性がＧ２８−５抗体よりも高い
（ｄ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して増殖を抑制する活性がＧ２８−５抗体よりも高い
（ｅ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して細胞死を誘導する
（ｆ）ＣＤ４０リガンドのＣＤ４０に対する結合を阻害しない
【請求項２】
樹状細胞の成熟が、２０μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で行われるものである請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項３】
Ｂ細胞樹立細胞株に対してＣＤ９５の発現の促進が、２０μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で行われるものである請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項４】
Ｂ細胞樹立細胞株がＲａｍｏｓ又はＨＳ−Ｓｕｌｔｏｎである請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項５】
１ｘ１０６個／ｍｌの濃度の樹状細胞に、０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度の抗体が添加された場合に、１００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−１２の生産をもたらすものである、請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項６】
１ｘ１０６個／ｍｌの濃度の樹状細胞に、１μｇ／ｍｌ以上の濃度の抗体が添加された場合に、１０００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−１２の生産をもたらすものである、請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項７】
１ｘ１０６個／ｍｌの濃度の樹状細胞に、１μｇ／ｍｌ以上の濃度の抗体が添加された場合に、１００００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−１２の生産をもたらすものである、請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項８】
Ｂ細胞樹立細胞株（Ｒａｍｏｓ細胞）に対するＣＤ９５の発現促進が、抗体濃度０．０１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの範囲において、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から３倍以上である、請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項９】
Ｂ細胞樹立細胞株（Ｒａｍｏｓ細胞）に対するＣＤ９５の発現促進が、抗体濃度０．０１μｇ／ｍｌにおいて、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から６倍以上である、請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１０】
Ｂ細胞樹立細胞株（Ｒａｍｏｓ細胞）に対するＣＤ９５の発現促進が、抗体濃度０．１μｇ／ｍｌにおいて、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から７倍以上である、請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１１】
Ｂ細胞樹立細胞株（Ｒａｍｏｓ細胞）に対するＣＤ９５の発現促進が、抗体濃度１μｇ／ｍｌにおいて、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から７倍以上である、請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１２】
Ｂ細胞樹立細胞株（Ｒａｍｏｓ細胞）に対するＣＤ９５の発現促進が、抗体濃度１０μｇ／ｍｌにおいて、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から６倍以上である、請求項１記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１３】
ハイブリドーマＫＭ３０２−１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７８）、ＫＭ３４１−１−１９（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５９）、２１０５（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２４）またはＦ１−１０２（受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３３７）により生産される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
【請求項１４】
受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０２およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０３であるプラスミドＤＮＡにそれぞれコードされる、ハイブリドーマＦ２−１０３の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０４およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０５であるプラスミドＤＮＡにそれぞれコードされる、ハイブリドーマＦ５−７７の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０６およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０７であるプラスミドＤＮＡにそれぞれコードされる、ハイブリドーマＦ５−１５７の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
【請求項１５】
配列番号２８および３０にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３２および３４にそれぞれ示される、ハイブリドーマ２１０５の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３６および３８にそれぞれ示される、ハイブリドーマ１１０の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号４０および４２にそれぞれ示される、ハイブリドーマ１１５の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号５２および５４にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ６４３−４−１１の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号６０および６２にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ２−１０３の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または配列番号６４および６６にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ５−７７の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
【請求項１６】
配列番号２７および２９にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３１および３３にそれぞれ示される、ハイブリドーマ２１０５から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３５および３７にそれぞれ示される、ハイブリドーマ１１０から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３９および４１にそれぞれ示される、ハイブリドーマ１１５から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号５１および５３にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ６４３−４−１１から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号５９および６１にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ２−１０３から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または配列番号６３および６５にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ５−７７から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
【請求項１７】
以下の（ｇ）〜（ｊ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する、ヒトＣＤ４０に対する抗体又はその機能的断片。
（ｇ）ＣＤ４０に対するリガンドの作用を中和する
（ｈ）Ｂ細胞樹立細胞株上のＣＤ４０に対するリガンドがＣＤ４０発現細胞に与える影響の１つ以上を中和又は緩和し、かつ、抗免疫グロブリン抗体による架橋によって前記Ｂ細胞樹立細胞株上のＣＤ４０に対するアゴニスティックな作用が５Ｄ１２より弱い
（ｉ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して、ＣＤ４０リガンドが、ＣＤ９５の発現を増加させる作用を緩和又は中和する
（ｊ）樹状細胞に発現するＣＤ４０に対してアンタゴニスティックな作用を有する
【請求項１８】
飽和量のＣＤ４０Ｌ発現細胞を添加した１ｘ１０６個／ｍｌの濃度のＲａｍｏｓ細胞に、０．１μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合に、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤ９５の発現を対照の約１０％以下に抑制しうるものである、請求項１７記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１９】
飽和量のＣＤ４０Ｌ発現細胞を添加した１ｘ１０６個／ｍｌの濃度のＲａｍｏｓ細胞に、１μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合に、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤ９５の発現が陰性コントロールと同レベルまで抑制されるものである、請求項１７記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２０】
飽和量のＣＤ４０Ｌ発現細胞を添加した１ｘ１０６個／ｍｌの濃度のＲａｍｏｓ細胞に、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合に、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤ９５の発現が陰性コントロールと同レベルまで抑制されるものである、請求項１７記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２１】
インビトロにおいて、可溶性ＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加した１ｘ１０５個の扁桃腺Ｂ細胞に、０．００１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合に、扁桃腺Ｂ細胞の増殖が約８０から９５％以上抑制されるものである、請求項１７記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２２】
インビトロにおいて、可溶性ＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加した１ｘ１０５個の扁桃腺Ｂ細胞に、０．０１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合に、扁桃腺Ｂ細胞の増殖が約９５％以上抑制されるものである、請求項１７記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２３】
インビトロにおいて、可溶性ＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加した１ｘ１０５個の扁桃腺Ｂ細胞に、０．００１μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合に、扁桃腺Ｂ細胞の増殖が約８０％以上抑制されるものである、請求項１７記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２４】
ハイブリドーマＫＭ２８１−１−１０（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７９）、４Ｄ１１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８）またはＦ４−４６５（受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３３８）により生産される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
【請求項２５】
配列番号４４および４６にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ２８１−１−１０の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号４８および５０にそれぞれ示される、ハイブリドーマ４Ｄ１１の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または配列番号５６および５８にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ４−４６５の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
【請求項２６】
配列番号４３および４５にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ２８１−１−１０から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号４７および４９にそれぞれ示される、ハイブリドーマ４Ｄ１１の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または配列番号５５および５７にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ４−４６５から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
【請求項２７】
ヒト抗体である、請求項１〜２６のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、免疫賦活化剤、抗腫瘍剤又は自己免疫疾患治療剤。
【請求項３０】
請求項１７〜２６のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、免疫抑制剤、自己免疫疾患治療剤、アレルギー治療剤又は血液凝固第ＶＩＩＩ因子阻害症候群治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトのＢ細胞、樹状細胞（ＤＣ）等の表面に存在するヒトＣＤ４０抗原を認識する抗体又はその機能的断片に関する。具体的には、本発明は樹状細胞（ＤＣ）表面のヒトＣＤ４０抗原に対して実質的にアンタゴニスティックである抗ヒトＣＤ４０抗体又はその機能的断片、および従来の抗ヒトＣＤ４０抗体に比べてより治療効果の高いことが期待されるアゴニスティックな抗ヒトＣＤ４０抗体又はその機能的断片に関する。
背景技術
１．ＣＤ４０
ＣＤ４０は分子量５０ｋＤａの細胞膜表面に存在する抗原であり、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ある種の癌細胞、そして胸腺上皮細胞に発現している。ＣＤ４０はＢ細胞やＤＣの増殖、分化に重要な働きをしていることが知られている。ＣＤ４０は、ヒトＢ細胞表面に発現する抗原として同定され（Ｅ．Ａ．Ｃｌａｒｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４４９４，１９８６，Ｉ．Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１４０３，１９８９）、アミノ酸配列の相同性から、ＣＤ４０は、低親和性ＮＧＦレセプターやＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０などが属しているＴＮＦレセプターファミリーの１つのメンバーとして考えられている。ヒトおよびマウスのＣＤ４０に対するリガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、近年遺伝子クローニングされ、ＩＩ型膜蛋白質であること、及び活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞に発現していることが分かった。ＣＤ４０Ｌは、強力な活性化シグナルをヒトおよびマウスのＢ細胞に導入することも分かっている。
また、樹状細胞にはＢ細胞よりも多くのＣＤ４０発現が確認されており、重要な役割を担っていることが明らかとなってきた。ＣＤ４０がＣＤ４０Ｌと結合すると、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化、すなわちＣＤ８０（Ｂ７−１）やＣＤ８６（Ｂ７−２）などの補助刺激分子の発現、あるいはＩＬ−１２の産生が増強される（Ｃａｕｘ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＣＤ４０  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：１２６３，１９９４）、（Ｓｈｕ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｖｉａ  ＣＤ４０−ＣＤ４０  Ｉｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：１１２５，１９９５）。樹状細胞は強い抗原提示能を有し、強力なヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞活性化能を持っている。また、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔｈ細胞のＴｈ１又はＴｈ２細胞への分化を樹状細胞が制御していると考えられている。ミエロイド系樹状細胞である末梢血単球をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４とともに培養してＣＤ４０Ｌにより成熟させた樹状細胞（ＤＣ１）はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＩＬ−１２産生能を有し、異系ｎａｉｖｅ  Ｔｈ細胞を刺激活性化し、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を誘導する（すなわちＴｈ１への分化を促す）。この作用は抗ＩＬ−１２抗体により阻害されることから、ＩＬ−１２を介した反応と考えられる。一方リンパ組織Ｔ領域や、末梢血に存在するｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  Ｔ細胞をＩＬ−３、ＣＤ４０リガンドとともに培養したリンパ球系樹状細胞（ＤＣ２）は、ＩＬ−１２産生能は有さず、そして異系ｎａｉｖｅ  Ｔｈ細胞を刺激活性化し、ＩＬ−４産生Ｔ細胞を誘導し、Ｔｈ２への分化を促進することが示されている。Ｔｈ１細胞は細胞性免疫の活性化にかかわり、Ｔｈ２細胞は液性免疫能を高めると同時に細胞性免疫能の抑制に関与すると考えられている。Ｔｈ１細胞のヘルプで活性化された細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、細胞質内で増殖する病原体（多くのウィルス、リステリア菌、結核菌、およびトキソプラズマ原虫など）や腫瘍細胞を除去することができる。
膜表面に発現したＣＤ４０を認識する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、Ｂ細胞に対していろいろな生物活性を示すことは示されてきた。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用に対してアゴニスティックなものと、アンタゴニスティックなものとに大別される。
２．アゴニスティック抗体
アゴニスティック抗体の作用として、Ｂ細胞の活性化が知られている。たとえば、抗ＣＤ４０抗体が細胞接着を誘導する（Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１７２２，１９９１；Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５，１９８８）、細胞の大きさを増進する（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１４０：１４２５，１９８８；Ｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３，１９８９）、抗ＩｇＭ抗体、抗ＣＤ２０抗体またはｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒのみで活性化されたＢ細胞の分裂を誘導する（Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４４９４，１９８６；Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＬＥＵＣＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  ＩＩＩ．Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈｅａｌ  ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．４２６；Ｐａｕｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０，１９８９）、ＩＬ４存在下でＢ細胞の分裂を誘導する（Ｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３，１９８９；Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５，１９８７）、ＩＬ−４刺激、Ｔ細胞除去培養細胞のＩｇＥ（Ｊａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１，１９９０；Ｇａｓｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８，１９９１）、ＩｇＧ、ＩｇＭ（Ｇａｓｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８，１９９１）の発現を誘導する、ＩＬ−４によるＢ細胞からの可溶性ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩの分泌と（Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｇｕｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：３３９，１９８７；Ｃａｉｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３４９，１９８８）細胞上の発現増強（Ｃｈａｌｌａ  Ａ，Ａｌｌｅｒｇｙ，５４：５７６，１９９９）をする、ＩＬ−６の生産を促進する（Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｈｕ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１４００，１９９０）ことが報告されている。さらには、ＣＤｗ３２＋接着細胞存在下で、ＩＬ−４及び抗ＣＤ４０抗体を添加することにより、ヒト初代培養Ｂ細胞から、Ｂ細胞クローンを樹立することや（Ｂａｎｃｈｅｒａｕｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：７０，１９９１）、胚中心の中心細胞のアポトーシスが、抗原レセプターの働きにかかわらず、ＣＤ４０を介して阻害されること（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：９２９，１９８９）が報告されている。以上のようにＣＤ４０は、ヒトＢ細胞表面に発現する抗原として同定されたため、単離された抗体の多くは、主にヒトＢ細胞に対する増殖分化誘導機能、癌細胞における細胞死誘導活性を指標に評価されてきた（Ｋａｔｉｒａ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  Ｖ．Ｓ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏｓｓｏｓｓｍａｎ，ｅｔ．ａｌ．ｅｄｓ．ｐ．５４７．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗ．Ｃ．Ｆｌａｎｓｏｗ  ｅｔ．ａｌ．，ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  Ｖ．Ｓ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏｓｓｏｓｓｍａｎ，ｅｔ．ａｌ．ｅｄｓ．ｐ��５５５．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｊ．Ｄ．Ｐｏｕｎｄ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：１１，１９９９，）。
抗ＣＤ４０抗体がＤＣを成熟させることが示された（Ｚ．Ｈ．Ｚｈｏｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１８：４７１  １９９９）。さらに、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞プライミングにおけるＣＤ４Ｔ細胞の役割は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌシグナリングを介したＤＣの活性化にあることが報告され、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により、樹状細胞（ＤＣ）の活性化におけるＣＤ４ヘルパーＴ細胞の役割を代替できることが示された（Ｓｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．：Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４８０，１９９８）。また、マウスにおいて抗ＣＤ４０抗体の投与によりＣＤ４０を発現する腫瘍細胞のみならず非発現腫瘍細胞からも生体を防御可能であることが示された（Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．：ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｖｏｋｅｓ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｈａｔ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓｅｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，１９９９）。
今まで報告されてきた抗体はＤＣ細胞に対する効果を指標に単離されているものは少ない。しかしＤＣ細胞の機能修飾という点からは、Ｂ細胞に作用する抗体を選別したのでは、治療薬としては不充分である可能性が高い。マウスＣＤ４０に対する抗体のモノクローナル抗体では、抗体の認識するエピトープによって、ＤＣには反応するが血管内皮細胞には反応しないクローンと、逆にＤＣには反応しないが血管内皮細胞には反応するクローンとが存在すると報告されている（Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，ＴＫ，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８８：２９４，１９９６）。ヒトＣＤ４０抗体に関してもエピトープによってＤＣへの結合や作用の異なることが推測される。
抗ＣＤ４０抗体又はＣＤ４０リガンドによりＣＤ４０を発現するリンパ腫細胞株の増殖を抑制し、細胞死を誘導できることが分かっている（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８３：２７８２，１９９４）、（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，１９，９３，１９９６）、（Ｚ．Ｈ．Ｚｈｏｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１８：４７１  １９９９）、（Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：３２２５，２０００）。アゴニスティック抗体において興味深いことは、抗体の働きがＣＤ４０Ｌの機能と必ずしも一致しないことである。Ｂ細胞に対する活性化作用とＢ細胞腫瘍に対する増殖抑制作用も、必ずしも一致しない。ＤＣ活性化能と腫瘍細胞増殖抑制作用を併せ持つ抗体の開発が望ましい。また、アゴニスティック抗体の中には、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を、阻害するものも、しないものも存在する（Ｃｈａｌｌａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，５４：５７６，１９９９）。例えば、Ｇ２８−５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ−９１１０）の生産する抗体はＣＤ４０Ｌと競合するため、ＣＤ４０Ｌとの併用効果はない。抗体によってＣＤ４０発現細胞の活性化の程度にも差がある。単独で弱いアゴニスティック活性を示す抗体でも、ＣＤ４０リガンドと併用することによって、ＣＤ４０リガンド単独による活性よりも、抗体存在下で活性が著しく促進する場合がある。逆に、単独でアゴニスティック活性を示す抗体でも、ＣＤ４０リガンドを阻害することによって、ＣＤ４０リガンド単独による活性よりも、抗体存在下での活性を低下させてしまう場合がある（Ｐｏｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：１１，１９９９）。ＣＤ４０リガンドと競合しない抗体では、それ自身による腫瘍細胞の増殖抑制作用は弱くとも、ＣＤ４０リガンド存在下ではより強い増殖抑制ができることが示されている（Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ  ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：３２２５，２０００）。このことから、ＣＤ４０に結合し、それ自身で細胞増殖を抑制する抗体でありながら、ＣＤ４０リガンドのＣＤ４０に対する結合は阻害しないような抗体を開発することが望ましい。このような特徴を生かすことにより、可溶性ＣＤ４０Ｌよりも有効な治療薬を開発できる可能性がある。たとえば、可溶性ＣＤ４０ＬはＣＤ４０と結合し活性化するが、同時に生体内に存在しているＣＤ４０Ｌの働きを抑制する。ＣＤ４０Ｌと競合しない抗体ならば、このようなことは起こらず、相乗効果により、より良い治療効果が期待できる。
３．アンタゴニスティック抗体
一方、上記のように、ＣＤ４０が免疫反応において重要な役割を担っていることから、ＣＤ４０とそのリガンドの結合を阻害することで、臓器移植時の免疫抑制や自己免疫疾患の治療薬が開発できると期待される。Ｓａｗａｄａ−Ｈａｓｅらは、クローン病患者の末梢血中の単球ではＣＤ４０を強く発現する細胞の割合が上昇していることを報告している。しかしながら、ＣＤ４０とそのリガンドの結合を阻害する抗体については、まだ良く分かっていない。そのような阻害性抗体は、たとえば、ＣＤ４０の機能解析や、ＣＤ４０の活性化が必要な疾患の治療に有効である可能性がある。また、ＣＤ４０リガンドに対する阻害抗体も、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとの結合が関与する疾患薬として有効である可能性が示されている。しかしながら、ＣＤ４０Ｌは活性化した血小板に発現するという報告（Ｖ．Ｈｅｎｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：５９１，１９９８）があるため、抗ＣＤ４０Ｌ抗体を治療薬として使った場合、血栓を引き起こす危険性が存在することが報告されている（Ｔ．Ｋａｗａｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉ．６：１１４，２０００）。このような観点から、ＣＤ４０とそのリガンドの結合を阻害する抗体治療薬としては、抗ＣＤ４０Ｌ抗体よりも、むしろＣＤ４０に対する抗体の方が安全性に優れると期待できる。抗ＣＤ４０抗体としてはＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を抑制し、なおかつ、抗体自身がＣＤ４０を活性化しないことが必要とされる。
ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を抑制し、なおかつ、ＣＤ４０を活性化しない抗体についての報告は、過去に膨大な量の研究がなされてきたにもかかわらず、５Ｄ１２と命名されたマウス抗ヒトＣＤ４０抗体のわずか１例のみである（Ｊ．Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ  ｅｔ．Ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９：４３９，１９９３）。まして、Ｂ細胞に対して中和活性を示す抗体が、ＤＣ細胞に対しても同様に、ＣＤ４０リガンドの作用を中和できるかどうかは知られていなかった。さらに、ビオチン化した抗マウスＣＤ４０抗体の作用が、アビジンでの架橋によって増強されることが報告されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４，：１８３５，１９９４）。本発明者は可溶性リガンドに予め遺伝子工学的に付与された、タグ（ＦＬＡＧ）に対する抗体（Ｍ２）を用いて、可溶性ＣＤ４０リガンドのＢ細胞株（Ｒａｍｏｓ細胞）に対する作用を増強し、その中和活性を測定したところ、５Ｄ１２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ−１１３３９）がわずかにしか中和活性を示さないことを確認した。
本発明者は新たに、アンタゴニスト抗体である５Ｄ１２が架橋によって、ＣＤ４０Ｌの非存在下であっても、抗体単独でアゴニスト活性を持つことを見出した。従来、マウスＣＤ４０抗体の作用がビオチンとアビジン架橋によって増強されることが報告されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４，：１８３５，１９９４）。また、プレートに固相化した抗免疫グロブリン抗体を用いて、ＣＤ４０抗体を固相化することで、腫瘍細胞の増殖抑制活性が増加することが知られていたが、これは固相化による効果と考えられていた。しかし、培養液中に抗免疫グロブリン抗体を添加し、抗ＣＤ４０抗体を架橋することによって、アンタゴニスティック抗体であってもアゴニスティック活性を示す可能性があることは知られていなかった。治療に用いる抗体に抗原性があれば、ヒトの体内でＣＤ４０抗体に結合する抗体が生じ、ＣＤ４０抗体が架橋されることによって、あたかもＣＤ４０リガンドのような活性を生じる、全く逆の作用が懸念される。したがって治療薬の安全性の点から、抗体の抗原性を低く押さえることが非常に重要であると考えられる。マウス抗体の可変領域の配列をもとに、ヒト化技術により、治療薬として開発する場合、ヒト化抗体は免疫原性があることが知られているため、投与後に抗ヒト化抗ＣＤ４０抗体ができる可能性があり、アゴニスティック抗体となる危険がある。また抗原性が低くとも、抗体レセプター（ＦｃＲ）によって抗ＣＤ４０抗体が架橋される可能性もある。これらの点から、アンタゴニスティック抗体は、ＣＤ４０に特異的に結合し、ＣＤ４０Ｌの結合を抑制し、かつ、架橋によってもＣＤ４０を活性化しないヒト抗体であって、ＦｃＲへの結合が弱いことが望ましいと考えられる。
発明の開示
上述のように、近年ＤＣ細胞の機能解析が進み、ＣＤ４０はＤＣ細胞の働きを制御する、重要な遺伝子として認識され始めた。このような背景から、本発明は、ＤＣ細胞を用いた評価系を採用することにより、樹状細胞（ＤＣ）表面のヒトＣＤ４０抗原に対しても実質的にアンタゴニスティックである抗ヒトＣＤ４０抗体又はその機能的断片、および従来の抗ヒトＣＤ４０抗体に比べてより治療効果の高いことが期待されるアゴニスティックな抗ヒトＣＤ４０抗体又はその機能的断片を提供することを目的とする。
本発明者らは、ヒトＣＤ４０に対する抗体の作製に関して鋭意研究した結果、従来知られている抗ＣＤ４０抗体に比して、より疾患への治療効果が高いと考えられる新規なアゴニスティック抗体、及びアンタゴニスティック抗体を作製することに成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する、ヒトＣＤ４０に対する抗体又はその機能的断片。
（ａ）樹状細胞に作用し、ＬＰＳ及びＩＦＮγの存在下でＩＬ−１２を生産させる
（ｂ）樹状細胞に作用し、該樹状細胞を成熟させる活性がＧ２８−５抗体よりも高い
（ｃ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して、ＣＤ９５の発現を促進する活性がＧ２８−５抗体よりも高い
（ｄ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して増殖を抑制する活性がＧ２８−５抗体よりも高い
（ｅ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して細胞死を誘導する
（ｆ）ＣＤ４０リガンドのＣＤ４０に対する結合を阻害しない
（２）上記本発明の抗体又はその機能的断片は、樹状細胞の成熟が、２０μｇ／ｍｌ以下の濃度で行われるものである。また、Ｂ細胞樹立細胞株に対してＣＤ９５の発現の促進は、２０μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度で行われる。Ｂ細胞樹立細胞株としては、例えばＲａｍｏｓ又はＨＳ−Ｓｕｌｔｏｎが挙げられる。
（３）また、上記本発明の抗体又はその機能的断片は、１ｘ１０６個／ｍｌの濃度の樹状細胞に、０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度の抗体が添加された場合は、１００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−１２の生産をもたらすものであり、１μｇ／ｍｌ以上の濃度の抗体が添加された場合は、１０００ｐｇ／ｍｌ以上、好ましくは１００００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−１２の生産をもたらすものである。
（４）さらに、上記本発明の抗体又はその機能的断片は、Ｂ細胞樹立細胞株（Ｒａｍｏｓ細胞）に対するＣＤ９５の発現促進が、抗体濃度０．０１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの範囲において、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から３倍以上となるものである。例えば、抗体濃度０．０１μｇ／ｍｌでは、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から６倍以上であり、抗体濃度０．１μｇ／ｍｌでは、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から７倍以上であり、抗体濃度１μｇ／ｍｌでは、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から７倍以上であり、そして抗体濃度１０μｇ／ｍｌでは、対照であるＧ２８−５抗体の約２倍から６倍以上である。
（５）ハイブリドーマＫＭ３０２−１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７８）、ＫＭ３４１−１−１９（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５９）、２１０５（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２４）またはＦ１−１０２（受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３３７）により生産される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
2002088186.tif 000002
（６）受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０２およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０３であるプラスミドＤＮＡにそれぞれコードされる、ハイブリドーマＦ２−１０３の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０４およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０５であるプラスミドＤＮＡにそれぞれコードされる、ハイブリドーマＦ５−７７の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０６およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３０７であるプラスミドＤＮＡにそれぞれコードされる、ハイブリドーマＦ５−１５７の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
2002088186.tif 000003
（７）配列番号２８および３０にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３２および３４にそれぞれ示される、ハイブリドーマ２１０５の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３６および３８にそれぞれ示される、ハイブリドーマ１１０の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号４０および４２にそれぞれ示される、ハイブリドーマ１１５の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号５２および５４にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ６４３−４−１１の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号６０および６２にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ２−１０３の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または配列番号６４および６６にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ５−７７の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
（８）配列番号２７および２９にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３１および３３にそれぞれ示される、ハイブリドーマ２１０５から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３５および３７にそれぞれ示される、ハイブリドーマ１１０から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号３９および４１にそれぞれ示される、ハイブリドーマ１１５から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号５１および５３にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ６４３−４−１１から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号５９および６１にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ２−１０３から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または配列番号６３および６５にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ５−７７から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
（９）以下の（ｇ）〜（ｊ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する、ヒトＣＤ４０に対する抗体又はその機能的断片。
（ｇ）ＣＤ４０に対するリガンドの作用を中和する
（ｈ）Ｂ細胞樹立細胞株上のＣＤ４０に対するリガンドがＣＤ４０発現細胞に与える影響の１つ以上を中和又は緩和し、かつ、抗免疫グロブリン抗体による架橋によって前記Ｂ細胞樹立細胞株上のＣＤ４０に対するアゴニスティックな作用が５Ｄ１２より弱い
（ｉ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して、ＣＤ４０リガンドが、ＣＤ９５の発現を増加させる作用を緩和又は中和する
（ｊ）樹状細胞に発現するＣＤ４０に対してアンタゴニスティックな作用を有する
（１０）上記（９）の抗体又はその機能的断片は、飽和量のＣＤ４０Ｌ発現細胞を添加した１ｘ１０６個／ｍｌの濃度のＲａｍｏｓ細胞に、０．１μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合は、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤ９５の発現を対照の約１０％以下に抑制しうるものであり、１μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合は、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤ９５の発現が陰性コントロールと同レベルまで抑制されるものであり、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合は、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤ９５の発現が陰性コントロールと同レベルまで抑制されるものである。
（１１）上記（９）の抗体又はその機能的断片は、インビトロにおいて、可溶性ＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加した１ｘ１０５個の扁桃腺Ｂ細胞に、０．００１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合に、扁桃腺Ｂ細胞の増殖が約８０から９５％以上抑制されるものである。例えば、０．０１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合は、扁桃腺Ｂ細胞の増殖が約９５％以上抑制されるものであり、特に、０．００μｇ／ｍｌの濃度の抗体が添加された場合は、扁桃腺Ｂ細胞の増殖が約８０％以上抑制されるものである。
（１２）ハイブリドーマＫＭ２８１−１−１０（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７９）、４Ｄ１１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８）またはＦ４−４６５（受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３３８）により生産される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
2002088186.tif 000004
（１３）配列番号４４および４６にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ２８１−１−１０の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領城、配列番号４８および５０にそれぞれ示される、ハイブリドーマ４Ｄ１１の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または配列番号５６および５８にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ４−４６５の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
（１４）配列番号４３および４５にそれぞれ示される、ハイブリドーマＫＭ２８１−１−１０から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域、配列番号４７および４９にそれぞれ示される、ハイブリドーマ４Ｄ１１の産生する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または配列番号５５および５７にそれぞれ示される、ハイブリドーマＦ４−４６５から単離された核酸配列にコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、マチュア部分のアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片。
（１５）上記（１）〜（１４）の抗体又はその機能的断片としては、ヒト抗体のものが挙げられる。
（１６）上記（１）〜（１５）のいずれかの抗体又はその機能的断片を有効成分として含む医薬組成物。
（１７）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、免疫賦活化剤、抗腫瘍剤又は自己免疫疾患治療剤。
（１８）上記（９）〜（１４）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、免疫抑制剤、自己免疫疾患治療剤、アレルギー治療剤又は血液凝固第ＶＩＩＩ因子阻害症候群治療剤。
（１９）ここで、本発明のモノクローナル抗体の認識するヒトＣＤ４０のエピトープは、ヒトＣＤ４０の一次アミノ酸配列から得られたオーバーラップする合成オリゴペプチドへの結合を調べるなどの周知の方法によって決定することができる（例えばＥｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８８  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４７０８８７１）。ファージディスプレイによるペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をエピトープマッピングに用いることもできる。本発明は、上述した個々のハイブリドーマによって産生される抗体又はその機能的断片の認識するヒトＣＤ４０の新規なエピトープを認識する抗体又はその機能的断片をも包含する。
（２０）本発明はさらに、上述した個々のハイブリドーマから単離された、抗体の重鎖および／または軽鎖の少なくとも可変領域をコードする核酸（ＲＮＡまたはｃＤＮＡ）、該核酸を含むベクター、該核酸を保持する宿主細胞を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書は、本願の優先権の基礎であるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１３６７２（２００１年４月２７日出願）、日本国特許出願２００１−１４２４８２号（２００１年５月１１日出願）、日本国特許出願２００１−３１０５３５号（２００１年１０月５日出願）及び米国特許出願ＵＳＳＮ  １０／０４０，２４４（２００１年１０月２６日出願）の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
発明者らは、後述するように、Ｂ細胞上のＣＤ４０に対してアンタゴニスティックである公知のモノクローナル抗体５Ｄ１２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ−１１３３９）が、ＤＣ細胞上のＣＤ４０に対してはアンタゴニスティックではなかったという知見を得た。さらに発明者は、ＣＤ４０Ｌの作用をブロックするアンタゴニスティック抗体であっても、多くのモノクローナル抗体が抗免疫グロブリン抗体による架橋によって、それ自身がアゴニスティック活性を示してしまうことを見出した。
１．定義
本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
本発明でいう「ヒトＣＤ４０」とは、クラークら（Ｅ．Ａ．Ｃｌａｒｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４４９４，１９８６）又はスタメンコビックら（Ｉ．Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１４０３，１９８９）により示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、特にＢ細胞、ＤＣ、マクロファージ、内皮細胞、上皮細胞、あるいはそれらの腫瘍細胞表面に発現する抗原ポリペプチドである。
「抗ＣＤ４０モノクローナル抗体」とは、細胞発現ＣＤ４０、全長ＣＤ４０又は部分長ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体のいずれをも意味するが、より好ましくはＣＤ４０の細胞外部分に結合し、ＣＤ４０を発現している細胞にアゴニスティックまたはアンタゴニスティックな作用をもたらすモノクローナル抗体を意味する。
さらに、本発明で「抗体」とは、イムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに軽鎖の可変領域及び軽鎖の定常領域をコードする遺伝子（「抗体遺伝子」と総称する）に由来するものである。本発明の抗体には、いずれのイムノグロブリンクラス及びアイソタイプを有する抗体をも包含する。本発明における抗体の「機能的断片」とは、前記で定義した抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を１つ以上保持するものを意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合ＦＶ、一本鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）、およびこれらの重合体等が挙げられる（Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８  Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ）。
本発明で「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。
「アゴニスティック」とは、Ｂ細胞、腫瘍細胞又は樹状細胞などの細胞表面上に発現するＣＤ４０に、そのリガンドが結合することを促進する作用、あるいは、ＣＤ４０リガンドがＣＤ４０発現細胞に与える影響の１つ以上を、ＣＤ４０を発現する細胞に与える作用を意味し、「アゴニスティック抗体」とは、そのようなアゴニスティック作用を有する抗体を意味する。
「アンタゴニスティック」とは、Ｂ細胞、腫瘍細胞又は樹状細胞などの細胞表面上に発現するＣＤ４０にそのリガンドが結合することを阻害する作用、あるいは、ＣＤ４０リガンドがＣＤ４０発現細胞に与える影響の１つ以上を中和する作用を意味し、「アンタゴニスティック抗体」とはそのような作用を有する抗体を意味する。
本発明で言う「樹状細胞（ＤＣ）」とは、樹状白血球とも呼ばれ、強力な抗原提示機能を有する細胞の一群を指す。用いる樹状細胞は、例えば骨髄、さい帯血又は末梢血中に含まれるＣＤ３４陽性前駆細胞を培養することによって誘導される。あるいは、末梢血中のＣＤ１４陽性単球をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養することにより得られる。
「未熟なＤＣ」（Ｉｍｍｍａｔｕｒｅ  ＤＣ）とは、ＣＤ１４陰性、ＣＤ１ａ強陽性、ＣＤ８３，ＣＤ８６陽性、ＭＨＣクラスＩＩ陽性であるＤＣを意味する。
「成熟ＤＣ」とは、ＣＤ１４陰性、ＣＤ１ａ陽性でＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ強陽性となったものを意味する。
本発明で「ＤＣを活性化する」とは、ＣＤ４０による刺激に応答してＤＣが起こす変化を意味し、例えば未成熟ＤＣを成熟化させ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＣｌａｓｓＩＩを高発現させる、さらにはＩＬ−１２の産生を増強する、あるいはＴ細胞が共存する場合には、Ｔ細胞に刺激を与え、増殖を促すことを意味する。
本発明でＢ細胞、Ｂ細胞株を活性化するとは、ＣＤ４０による刺激に応答して細胞が起こす変化を意味し、例えばＤＮＡ合成を生じ、チミジン取り込みを促進し、ＣＤ９５の発現量を増加させることをいう。
２．抗体の取得
本件発明の抗体を取得するためには、抗原として組換え体で生産・精製した可溶性ヒトＣＤ４０、又はヒトＣＤ４０を発現する遺伝子組換えマウス細胞株をマウスに免疫することが好適である。免疫に使用するマウスはヒト抗体を産生するマウス（Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２０００  Ｖｏ１９７：７２２）であることが望ましい。組換え体で生産・精製した可溶性ヒトＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体を選別することで、Ｂ細胞特異的に反応するクローンを選抜するよりも、Ｂ細胞以外の細胞に発現するＣＤ４０にも反応する抗体を得やすいと考えられる。免疫したマウスのリンパ節の細胞や脾細胞を使用し、モノクローナル抗体の製造において慣用されているケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ．，１９７５Ｖｏｌ．２５６：４９５）を用いてハイブリドーマの作製を行うことができる。  また、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ビアコア社）などの表面プラズモン共鳴測定装置を用いて可溶性ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を解析し、ＣＤ４０Ｌと競合しない抗体を選別する。またＢリンパ腫の細胞増殖抑制を抗体単独で抑制する抗体を選別した。さらに抗体の選別をＤＣに作用するか否かを指標として行うことにより、ＣＤ４０Ｌと競合せず、樹状細胞又はＢ細胞に働き、かつＣＤ４０発現癌細胞の増殖を抑制するという利点を備えた抗体を作製・選別しうる。
本発明の抗体は、取得されたハイブリドーマを培養することによって得られる。また、Ｂ細胞やハイブリドーマ等の抗体産生細胞からヒトモノクローナル抗体又はその可変領域をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換型抗体を調製することができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）。さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地又は既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
３．スクリーニング
アゴニスティック抗体の選抜には、ヒトＢリンフォーマを用いた解析によって行い、ＣＤ９５発現を促進する抗体の選別が可能である。さらに純化したＤＣの培養液に抗体を添加し、成熟させる抗体を選ぶ。あるいは、未熟なＤＣ細胞を用いた混合リンパ球反応でＴ細胞増殖活性を示す抗体を選ぶ。さらに成熟したＤＣに添加しＩＬ−１２生産促進作用のある抗体を選ぶ。また、ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞の増殖を抑制もしくは細胞死誘導活性を持つ抗体を選ぶ。ＣＤ４０Ｌとの競合はＢＩＡＣｏｒｅのような表面プラズモン共鳴測定装置を用いて、可溶性ＣＤ４０と可溶性ＣＤ４０リガンドの結合を抗体が阻害するかどうかで判別できる。あるいは、Ｂ細胞株に対するＣＤ４０リガンドの作用を増強するかどうかで判別する。
アンタゴニスティック抗体の選抜には、ヒトＢリンフォーマを用いた解析によって行い、さらにＦＬＡＧをタグとして有する可溶性ＣＤ４０Ｌを抗ＦＬＡＧ抗体存在下で添加することで、可溶性ＣＤ４０Ｌの、ヒトＢリンフォーマ細胞上のＣＤ４０への結合をより強力に阻害する抗体の選別が可能である。可溶性ＣＤ４０Ｌの代りに、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子の導入により、細胞表面に多くのＣＤ４０Ｌを発現している組換え細胞を用いることも可能である。次いでヒト抗体を抗ヒトＩｇＧ抗体で架橋することで、架橋によってＢリンパ腫を活性化してしまうクローンを除外する。さらに純化し成熟させたＤＣ細胞を用いた混合リンパ球反応でＴ細胞増殖抑制活性を示す抗体や、あるいは成熟したＤＣにＣＤ４０リガンドを添加した場合にＩＬ−１２生産抑制作用のある抗体を選ぶ。
以上のようにして得られた抗体は、少なくとも以下のいずれかの治療効果上有用と考えられる性質を有するものである。
（１）アゴニスティック抗体の場合
（ａ）樹状細胞に作用し、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）及びＩＦＮγの存在化でＩＬ−１２を生産させる。この場合のＬＰＳ濃度は１０ｐｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＦＮγの濃度は１０−４Ｍから１０−２Ｍである。１μｇ／ｍｌ以上の抗体濃度、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上の抗体濃度において、公知のアゴニスティック抗ＣＤ４０抗体であるＧ２８−５抗体を対照とした試験よりもＩＬ−１２の生産量が多い。１ｘ１０６個／ｍｌの濃度の樹状細胞に抗体濃度０．１μｇ／ｍｌ以上が添加された場合に１００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−１２が生産され、あるいは１μｇ／ｍｌ以上が添加された場合に１０００ｐｇ／ｍｌ以上の、好ましくは１００００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−１２が生産される。（実施例９、実施例１３を参照のこと）
（ｂ）樹状細胞に結合し、樹状細胞を成熟させる作用を有する。しかも、２０μｇ／ｍｌ以下の濃度、好ましくは０．１〜１５μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５〜１５μｇ／ｍｌの濃度で抗体を樹状細胞とともに培養すると、その成熟させる活性はＧ２８−５抗体よりも高い結果が得られる。（実施例９を参照のこと）
（ｃ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して、ＣＤ９５の発現を促進する活性がＧ２８−５抗体よりも高い。この場合、１０μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ以上、最も好ましくは０．００１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度において、Ｇ２８−５抗体を対照とした試験よりもＣＤ９５の発現を促進する活性がＧ２８−５抗体よりも高い。ＣＤ９５の発現を促進する活性について、抗体濃度１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌにおいてＧ２８−５抗体を対照とした試験の倍率は以下の通りである（表１）。
2002088186.tif 000005
ＣＤ９５の発現が促進するということは、抗体がＢ細胞樹立細胞株を活性化したことを意味する。ここで、Ｂ細胞樹立細胞株としては、Ｒａｍｏｓ細胞、ＨＳ−Ｓｕｌｔｏｎ細胞が挙げられる。なお、Ｒａｍｏｓ細胞はバーキットリンパ腫であり、ヒトの胚中心のＢ細胞のモデル細胞である。ＨＳ−Ｓｕｌｔｏｎ細胞はバーキットリンパ腫である。（実施例６、実施例１２を参照のこと）
（ｄ）Ｂ細胞樹立細胞株（Ｒａｍｏｓ細胞又はＨＳ−Ｓｕｌｔｏｎ細胞）に対してＤＮＡ合成、チミジン取り込み、増殖を抑制する活性がＧ２８−５抗体よりも高い。この場合の抗体濃度は、少なくとも０．０５μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１５μｇ／ｍｌである。（実施例８を参照のこと）
（ｅ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して細胞死を誘導する。（実施例１６を参照のこと）
（ｆ）ＣＤ４０リガンドのＣＤ４０に対する結合を阻害しない。「阻害しない」とは、ＣＤ４０に予め抗体が結合した状態であっても（つまり抗体が存在する場合であっても）、該抗体が存在しない場合と同程度に、ＣＤ４０ＬがＣＤ４０に結合できることを意味する。ＣＤ４０リガンドとＣＤ４０はいずれかあるいは双方が膜発現型あるいは可溶性タンパクであっても良い。（実施例１１を参照のこと）
上記性質を有する抗体は、例えば、ハイブリドーマＫＭ３０２−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７８）、ハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５９）により産生される。
ハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９により産生されるモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）可変領域の塩基配列およびアミノ酸配列が決定された（実施例１７）。本発明はハイブリドーマＫＭ３４１−１−１９の生産するモノクローナル抗体の少なくとも重鎖可変領域、もしくは重鎖全長をコードするＤＮＡ、ならびに軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。当該ＤＮＡは実施例１７において記載されたものの他、コドン縮重により同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡをも包含する。また、本発明は、実施例１７において開示された少なくとも重鎖可変領域のアミノ酸配列、もしくは重鎖全長のアミノ酸配列と、軽鎖可変領域のアミノ酸配列によって規定されるモノクローナル抗体もしくはその機能的断片を提供する。
（２）アンタゴニスティック抗体の場合
（ｇ）ＣＤ４０に対するリガンドの作用を中和する。ここで、「リガンドの作用」とは、Ｔ細胞又は他の細胞上に発現するリガンドの作用、及びＣＤ４０に対する遊離のリガンドの作用のいずれをも意味する。（実施例７、実施例１４を参照のこと）
（ｈ）Ｂ細胞樹立細胞株上のＣＤ４０に対するリガンドがＣＤ４０発現細胞に与える影響の１つ以上を中和し、かつ、抗免疫グロブリン抗体による架橋によって前記Ｂ細胞樹立細胞株上のＣＤ４０に対するアゴニスティックな作用を示さない。その作用は５Ｄ１２よりも弱い。「ＣＤ４０発現細胞に与える影響」とは、発現細胞の活性化を意味し、Ｂ細胞においてはチミジン取り込み、増殖を、Ｂ細胞樹立細胞株においてはＣＤ９５の発現増強などを意味する。また、ＤＣにおいては成熟化、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ発現増強、共存するＴ細胞のチミジン取り込み、増殖の促進、ＩＬ−１２やＩＬ−１０の生産などを意味する。抗免疫グロブリン抗体による架橋は、培養液中に０．１μｇ／ｍｌ以上の抗免疫グロブリン抗体を存在させることにより行われる。（実施例７を参照のこと）
（ｉ）Ｂ細胞樹立細胞株に対して、架橋したＣＤ４０Ｌあるいは、細胞に発現させたＣＤ４０ＬがＣＤ９５の発現を増加させる活性を緩和又は中和する。タグに対する抗体などで架橋し、作用が増強されたＣＤ４０Ｌに対しても、活性を緩和あるいは中和する。ＣＤ４０に対するリガンド（遊離のリガンド、特定の細胞に発現するリガンドの両者を含む）が、ＣＤ４０発現細胞に結合すると、細胞内でシグナル伝達を起こして、最終的に細胞表面上にＣＤ９５（Ｆａｓ）を発現する。従って、本発明のアンタゴニスティック抗体は、ＣＤ４０に結合することにより、上記シグナル伝達を阻害してＣＤ９５の発現を中和する。この場合の抗体濃度は、１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上である。（実施例７、実施例１４を参照のこと）
（ｊ）ＤＣ上のＣＤ４０に対してアンタゴニスティックである。すなわち、ＣＤ４０ＬがＤＣを活性化する活性を緩和又は中和する。ＤＣが共存するＴ細胞上のリガンドによって刺激されると、Ｔ細胞を活性化し、チミジン取り込みなどを促進させる。異なった個体由来のＤＣとＴ細胞とを共存させる混合リンパ球反応では、ＤＣとＴ細胞が相互作用を起こすことで、Ｔ細胞の活性化が起こる。本発明のアンタゴニスティック抗体は、ＣＤ４０に結合することにより、上記相互作用を阻害し、結果としてチミジンの取り込みが抑制される。この場合の抗体濃度は、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌであり、好ましくは０．１〜１０μｇ／ｍｌである。（実施例１０を参照のこと）
上記アンタゴニスティック抗体は、例えば、ハイブリドーマＫＭ２８１−１−１０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７９、ＫＭ２８１−２−１０−１−２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８０）（２００１年５月９日付、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６））、４Ｄ１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８）により産生される。
（３）本発明の抗体は、当業者に周知である遺伝子工学的改変、すなわち抗体重鎖のサブクラスを規定する領域を他のサブクラスを規定する領域に置換することにより、異なるサブクラスのものに変換しうる（例えば、ＥＰ  ３１４１６１公報を参照のこと）。重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）の可変領域を、そのまま他のサブクラスの定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）につなげることができる。例えば、本件発明の抗体のサブクラスをＩｇＧ２あるいはＩｇＧ４に変換することにより、Ｆｃレセプターに対する結合度を低下させることが可能である。具体的には、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））による、ヒト抗体重鎖、ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  １１８（Ａｌａ），１１９（Ｓｅｒ）部位にＮｈｅＩ  ｓｉｔｅ（ＧＣＴＡＧＣ）を導入し、この制限酵素を使って消化することにより、アミノ酸を変えずに、他のサブクラスのＩｇＧとつなぎかえることができる。さらに、定常領域のアミノ酸配列を人為的に改変すること、あるいはそのような配列を有する定常領域配列と本発明の抗体の可変領域とを結合することにより、Ｆｃレセプターに対する結合度を低下させるこや（Ｌｕｎｄ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１  ｖｏｌ１４７：２６５７−２６６２）、ＣＤＣ活性を増加または減少することも可能である（Ｔａｏ  Ｍ．，ｅｔ．Ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９１  ｖｏｌ  １０２５−１０２８，Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  Ｅ  Ｅ．，ｅｔ．Ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  ｖｏｌ１６６：２５７１−５）。また、ＡＤＣＣやＣＤＣなどの作用を避けるために、予めサブクラスがＩｇＧ２やＩｇＧ４の抗体のみを選別することも可能である。また、本件発明の抗体に、放射性核種、細菌毒素、化学療法剤、プロドラッグなどを結合させることにより癌などの疾患の治療効果をさらに増強することも可能である。
４．医薬組成物
また、本発明の抗体の精製された製剤を含有する医薬組成物もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような医薬組成物は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、他の抗体または抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。投与経路は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的ルートである。
この場合、本発明の抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得るキャリアとの組合せとして投与される有効量は、１回につき体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇであり、２日から８週間間隔で投与される。
本発明の抗体を含む医薬組成物を使用する場合は、アゴニスティック抗体については、免疫賦活化剤（抗ウィルス剤、抗感染症剤）、抗腫瘍剤、自己免疫疾患治療剤であり、これらの疾患が複数併発してもよい。あるいは、ガン特異的ペプチドなどのワクチンとアジュバントとして併用することもできる。また、アンタゴニスティック抗体については、臓器移植時における免疫抑制剤（膵島移植や腎臓などの移植時における拒絶反応、ＧＶＨＤの予防又は治療剤）として、あるいは自己免疫疾患（例えば、リウマチ、動脈硬化治療薬、多発性硬化症、全身性エリトマトーデス、特発性血小板減少症、クローン病など）治療剤、喘息などアレルギー治療剤、血液凝固第ＶＩＩＩ因子阻害症候群の治療薬として有用であり、これらの疾患が複数併発してもよい。
ＣＤ４０が関与する疾患の治療手段として、抗ＣＤ４０抗体を用いる場合、ＤＣ細胞の機能を指標に、抗体を選択することにより、より良い治療効果をもたらす抗体が得られると期待できる。
アゴニスティック抗体では、よりＤＣの活性化ができる抗体を選抜することにより、免疫増強の作用の強い抗体が得られることが期待される。さらに成熟ＤＣのＩＬ−１２の生産促進を指標とすることで、ＣＴＬ誘導作用の強い抗体が得られる。ＣＴＬ誘導により、ウィルス感染細胞や腫瘍細胞を除去する効果の高い抗体が得られる。また、相乗効果が期待できることからＣＤ４０に結合する抗体でありながら、ＣＤ４０リガンドのＣＤ４０に対する結合は阻害しないような抗体が望ましい。癌治療を考えた場合、ＣＤ４０を発現する癌細胞に直接細胞死を誘導あるいは増殖を抑制し、かつＤＣ細胞を効率的に活性化する抗体があれば、相乗的な効果が期待され、ＣＤ４０を発現しない腫瘍にも使用可能な治療薬となると考えられる。この抗体はウィルス感染症の治療薬や抗腫瘍薬として有用と考えられる。
一方、ＣＤ４０に特異的に結合し、ＣＤ４０Ｌの結合を抑制し、なおかつ、ＣＤ４０を活性化しない抗体についても、Ｂ細胞に対するリガンドの作用を抑制するのみならず、ＤＣ細胞への作用を抑制できることが望まれる。しかし、今まで得られた、抗体はＢ細胞に対する効果を指標にとられてきたことから、樹状細胞にも強い抑制作用を持つ抗体を取得し、医薬品として開発することには大きな意義がある。さらに上述のように抗ＣＤ４０抗体は架橋によって、全く逆の作用が懸念されるため、架橋によってもＣＤ４０を活性化しない抗体が必要とされる。これまでに報告されたヒトＣＤ４０に対する、マウス等の非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体、およびマウスモノクローナル抗体の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域からなるキメラ抗体やＣＤＲグラフティングによるヒト型化抗体は、抗原性を持つことが懸念されるため、ＣＤ４０リガンドとの結合を阻害する抗体としてはヒト抗体が望ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕抗原の作製
（１）細胞
ＥＬ−４細胞は、マウス由来のＴ細胞樹立株であり、容易に入手することができる（ＡＴＣＣ  Ｎｏ、：ＴＩＢ−３９）。Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ−１５９６）並びにマウス抗ＣＤ４０抗体産生ハイブリドーマＧ２８−５（ＨＢ−９１１０）及び５Ｄ１２（ＨＢ−１１３３９）は、ＡＴＣＣから購入した。
（２）抗原の発現と精製
ヒトＣＤ４０ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００１２５０）を鋳型として、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲにより（９５℃５秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒）×２０サイクルの条件で細胞外領域を増幅した。
2002088186.tif 000006
増幅したｃＤＮＡは、ｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）の、メリチンシグナル配列の後、ヒトＩｇＧ１由来ＦＣ又はマウスＩｇＧ２ａ由来ＦＣ領域の前に挿入した。ＣＤ４０生産のため、組換えバキュロウィルスは、使用説明書にしたがって作成した。Ｔｎ５細胞を組替えウィルスで感染させた後、４日間培養した。上清は、０．２２ｎｍフィルターで処理した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加し、４℃で静かに振盪した。一晩後、ｓｅｐｈａｒｏｓｅをカラムに移し、２０倍容量のＰＢＳで洗浄した。ヒトＣＤ４０  ＦＣ蛋白質は、２０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出した。ＣＤ４０を細胞表面に発現させるためのベクターは、Ｒａｎｄｏｌｐｈ  Ｊ．Ｎｏｅｌｌｅから入手した（Ｉｎｕｉ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＪＩ，２０，１７４７−１７５３，１９９０）。全長ｃＤＮＡはＸｂａＩにより酵素切断し、ｐＣＤＮＡ３（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に挿入した。ベクターをＥＬ−４細胞に導入し、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）存在下で培養することにより安定発現株を得た。ＣＤ４０の発現は、ＦＩＴＣ−結合抗ヒトＣＤ４０抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使い、ＦＡＣＳ解析により確認した。
〔実施例２〕免疫用マウスの作製
免疫に用いたマウスは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスはヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統Ａのマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統Ｂのマウスとの交配により作製した。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告（Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２０００  Ｖｏｌ９７：７２２）に記載されている。Ａ系統マウスを免疫することによって、以下に示すハイブリドーマ、Ｆ２−１０３，Ｆ５−７７を取得した。また、系統Ｂは内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統（トランスジェニックマウス）であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６  Ｖｏｌ１４：８４５）に記載されている。
系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、あるいは系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られた、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される個体（Ｉｓｈｉｄａ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ，ＩＢＣ’ｓ  １１ｔｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２０００）を、以下の免疫実験に用いた。なお、前記ヒト抗体産生マウスは、契約を結ぶことによって、麒麟麦酒株式会社より入手可能である。前記マウスを免疫することによって、以下に示すハイブリドーマ、ＫＭ３０２−１、ＫＭ３４１−１−１９、ＫＭ６４３−４−１１、２０５３、２１０５、３８２１、３８２２、２８５、１１０、１１５、ＫＭ２８１−１−１０、ＫＭ２８１−２−１０−１−２、ＫＭ２８３−５、ＫＭ２９２−１−２４、ＫＭ２２５−２−５６、ＫＭ３４１−６−９、４Ｄ１１、５Ｈ１０、１１Ｅ１、５Ｇ３、３８１１、３４１１、３４１７を取得した。また、Ｋｕｒｏｉｗａらが報告しているヒト抗体Ｌａｍｂｄａ鎖を保持するキメラマウス（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ．Ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００  Ｖｏｌ  １８：１０８６）も以下の免疫実験に用いた。このマウスからはハイブリドーマＦ４−４６５を取得した。
〔実施例３〕ヒトＣＤ４０に対するヒトモノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行１９９１）に記載される一般的方法に従って調製した。免疫原としてのヒトＣＤ４０は、実施例１で調製したヒトＣＤ４０ヒトＦＣとＣＤ４０発現ＥＬ−４細胞を用いた。被免疫動物は、実施例２で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウスを用いた。
ヒト抗体産生マウスに、ＣＤ４０：ｈＦｃを１個体当たり２から１００μｇ／回で免疫した。抗原溶液は初回を除いて等量の不完全フロイントアジュバント（シグマ）と混合し、皮下に数カ所に分けて注入した。約１０日から３週間ごとに３−４回免疫を行った。初回は不完全フロイントアジュバント（シグマ）を用いた。マウスの尾から採血し、血清中のＣＤ４０に対するヒト抗体γおよびκを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。脾臓を摘出する３−４日前に尾静脈より、ＰＢＳに溶解したＣＤ４０：Ｆｃを２０μｇ注射し最終免疫した。
ヒト抗体産生マウスに、ヒトＣＤ４０を発現するマウスＥＬ−４細胞を免疫した。ＥＬ−４細胞１０８個／ｍｌでＰＢＳに懸濁し、予めＰＢＳでエマルジョン化した等量のＲＩＢＩアジュバントと緩やかに混合した。細胞は約１０日から３週間ごとに３−５回免疫を行った。アジュバントを用いない場合は、８０００ｒａｄでＸ線照射し用いた。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、回収した脾臓細胞をマウスミエローマＳＰ２／０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ１５８１）と５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて細胞融合させることにより多数のハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの選択は、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）とヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）を含有するＨＡＴ含有ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）中で培養することにより行った。さらに、ＨＴ含有ＤＭＥＭ培地を用いて限界希釈法によりシングルクローンにした。培養は、９６ウェルマイクロタイタープレート（ベクトンディッキンソン社製）中で行った。抗ヒトＣＤ４０ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの選択（スクリーニング）は、実施例４で後述する酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＨＳＡ）および蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により測定することにより行った。
ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、以下に述べる３種類のＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ解析により、ヒト免疫グロブリンγ鎖（ｈＩｇγ）及びヒト免疫グロブリン軽鎖κを有し、かつヒトＣＤ４０に特異的な反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する多数のハイブリドーマを得た。なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに実施例における試験結果として示した表または図中においては、各々の本発明のヒト抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは記号を用いて命名した。また、当該記号の次に「抗体」を付したものは、それぞれのハイブリドーマにより産生される抗体、または当該ハイブリドーマから単離された抗体遺伝子（全長あるいは可変領域）を保持する宿主細胞により生産された組換え抗体を意味する。また文脈上明らかな範囲において、ハイブリドーマクローンの名称が抗体の名称をあらわす場合がある。
以下のハイブリドーマクローンはシングルクローンを表わす。
アゴニスティック抗体：
ＫＭ３０２−１、ＫＭ３４１−１−１９、ＫＭ６４３−４−１１、２０５３、２１０５、３８２１、３８２２、２８５、１１０、１１５、Ｆ１−１０２、Ｆ２−１０３、Ｆ５−７７、Ｆ５−１５７
アンタゴニスティック抗体：
ＫＭ２８１−１−１０、ＫＭ２８１−２−１０−１−２、ＫＭ２８３−５、ＫＭ２９２−１−２４、ＫＭ２２５−２−５６、ＫＭ３４１−６−９、４Ｄ１１、５Ｈ１０、１１Ｅ１、５Ｇ３、３８１１、３４１１、３４１７、Ｆ４−４６５
それらの内３つのハイブリドーマクローンＫＭ３０２−１、ＫＭ２８１−１−１０およびＫＭ２８１−２−１０−１−２を平成１３年（２００１年）５月９日付で、クローンＫＭ３４１−１−１９および４Ｄ１１を平成１３年（２００１年）９月２７日付で、クローン２１０５を平成１４年（２００２年）４月１７日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。Ｆ２−１０３、Ｆ５−７７およびＦ５−１５７の重鎖および軽鎖の可変領域を有するプラスミドを２００１年４月１９日付で，ハイブリドーマクローンＦ１−１０２およびＦ４−４６５を２００１年４月２４日付でＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）（アメリカ国立菌培養収集所、アメリカ合衆国ヴァージニア州２０１１０−２２０９マナサス１０８０１ユニバーシティブルバード）にブダペスト条約に基づき国際寄託した（表２）。
2002088186.tif 000007
〔実施例４〕ハイブリドーマのスクリーニング
ヒト免疫グロブリンγ鎖を有するモノクローナル抗体の検出
実施例１で作製したヒトＣＤ４０マウスＦＣ（１μｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルを、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、４℃でインキュベートし、ヒトＣＤ４０マウスＦＣをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（ブロックエース、大日本製薬）を加え室温でインキュベートしブロックした。各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、反応させた後、各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した。次いで、過酸化酵素で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体（シグマ、Ａ０１７０）を１％ＦＢＳ含有ＰＢＳ−Ｔで５，０００倍に希釈した溶液（５０μｌ／ウェル）を、各ウェルに加え、インキュベートした。マイクロプレートを、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色基質液（ＴＭＢ、５０μｌ／ウェル、住友ベークライト社製）を各ウェルに加え、室温下で３０分間インキュベートした。各ウェルに、停止液（５０μｌ／ウェル）を加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。陽性ｗｅｌｌの培養上清をＦＡＣＳにて解析し，Ｒａｍｏｓ細胞を染色するｗｅｌｌを選び、その細胞を限界希釈法でクローニングし、１ｗｅｌｌについて１クローンの細胞を得た。ヒトＣＤ４０マウスＦＣを用いたＥＬＩＳＡでｈκ陽性を確認した。その結果、２０個体のマウスから１７３クローンの抗ヒトＣＤ４０抗体が取得できた。その一部を表３（アゴニスティック抗体）及び表４（アンタゴニスティック抗体）に示す。アゴニスティック抗体のうち、少なくともＫＭ３４１−１−１９と２１０５は、ＣＤ４０Ｌが発現している細胞、ＣＤ４０が発現している細胞および抗体を用いた競合試験でリガンドとの顕著な競合を示さなかった。
2002088186.tif 000008
2002088186.tif 000009
ヒト免疫グロブリン軽鎖κ（Ｉｇκ）を有するモノクローナル抗体の検出は、過酸化酵素で標識したヤギ抗ヒトＩｇκ抗体（１，０００倍希釈、５０μｌ／ウェル、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた他は、上述したヒト免疫グロブリンγ鎖のＥＬＩＳＡと同様に行った。
各モノクローナル抗体のサブクラス同定は、それぞれ過酸化酵素で標識したヒツジ抗ヒトＩｇＧ１抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ２抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ３抗体又はヒツジ抗ヒトＩｇＧ４抗体（各２，０００倍希釈、５０μｌ／ウェル、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ社製）を用いた他は、上述したヒト免疫グロブリンγ鎖のＥＬＩＳＡと同様に行った。
ヒトＣＤ４０発現細胞に対する各モノクローナル抗体の反応試験
ＣＤ４０が発現していると報告されているＲａｍｏｓ細胞株に対する各モノクローナル抗体の反応性の検討をＦＡＣＳ解析で行った。
２ｘ１０６／ｍｌの濃度でＲａｍｏｓ細胞株を０．１％ＮａＮ３、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳの染色バッファー（ＳＢ）に浮遊させた。細胞浮遊液（１００μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、氷温下３０分間インキュベートした。陰性コントロールとしてヒト血清アルブミンに対するヒトＩｇＧ１抗体を用い、ハイブリドーマ培養培地で２μｇ／ｍｌの濃度に調製し、５０μｌ添加後氷温下１５分間インキュベートした。ＳＢで洗浄した後、２５０倍希釈したＲ−ＰＥ蛍光標識抗ヒト抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）５０μｌを加え、氷温下１５分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、３００−５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｏｒｔ、ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。その結果、Ｒａｍｏｓ細胞株に結合活性を有する抗体を選別した。
〔実施例５〕各抗体の調製
モノクローナル抗体を含む培養上清の調製は以下の方法にて行った。
Ｇ２８−５抗体生産ハイブリドーマはＡＴＣＣより入手した（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ−９１１０）。抗ＣＤ４０抗体産生ハイブリドーマをウシインシュリン（５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、エタノールアミン（０．０１ｍＭ、シグマ社製）、亜セレン酸ナトリウム（２．５ｘ１０−５ｎＭ、シグマ社製）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）に馴化した。スピナ−フラスコにて培養し、ハイブリドーマの生細胞率が９０％になった時点で培養上清を回収した。回収した上清は、１０μｍと０．２μｍのフィルター（ゲルマンサイエンス社製）に供し、ハイブリドーマ等の雑排物を除去した。
上記培養上清からの抗ＣＤ４０抗体の精製は以下の方法で行った。抗ＣＤ４０抗体を含む培養上清をＨｙｐｅｒ  Ｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（日本ガイシ製）あるいはマウスＩｇＧ１の精製にはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（アマシャムファルマシアバイオテク）を用い、付属の説明書に従い吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）あるいはＮａ２ＨＰＯ４溶液を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（１００００カット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）あるいはＳＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いてＰＢＳ（−）に置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）でろ過滅菌した。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．４５ＯＤとして算出した。
〔実施例６〕Ｒａｍｏｓ細胞における抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体によるＣＤ９５発現促進
５．０ｘ１０５個／ｍｌのＲａｍｏｓ細胞懸濁液を９６ウエルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで播種した（１ウェルあたり５ｘ１０４個）。ハイブリドーマ培養上清又は精製抗体を２０μｇ／ｍｌに培地で希釈し、９６ウエルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌの濃度で添加した。一晩培養後、細胞を集めＲ−ＰＥ標識抗ＣＤ９５抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＮＪ）を用い、ＦＡＣＳＣａｎあるいはＦＡＣＳｓｏｒｔ（ベクトンデッキンソン）を使って解析した。図１に結果を示す。図中横軸はＣＤ９５の発現強度を示す。抗体添加を太線、未添加を細線により示した。ＫＭ３０２−１抗体は、公知の抗体であるＧ２８−５抗体に比して、ＣＤ９５発現をより促進することが示された。すなわち、より効果の高いアゴニスティックであることが示された。
〔実施例７〕Ｒａｍｏｓ細胞における抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体によるＣＤ９５発現抑制
１．０ｘ１０６個／ｍｌのＲａｍｏｓ細胞懸濁液を９６ウエルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌで播種した。ハイブリドーマ培養上清又は精製抗体を２μｇ／ｍｌに培地で調整し、９６ウエルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。可溶性ＣＤ４０リガンド（ＡＬＥＸＩＳ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を４μｇ／ｍｌと抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２、シグマ）４μｇ／ｍｌとを培地に添加し、９６ウエルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。一晩培養後、細胞を集めＲ−ＰＥ標識抗ＣＤ９５抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＮＪ）を用い、ＦＡＣＳを使って解析した。図２Ａ、図２Ｂ、図３に結果を示す。図中横軸はＣＤ９５の発現強度を示す。ＫＭ２８１−１−１０、ＫＭ２８１−２−１０−１−２、ＫＭ２８３−５、ＫＭ２９２−１−２４、ＫＭ２２５−２−５６の各ハイブリドーマが生産した抗体では陰性コントロールと同程度までＣＤ９５の発現を抑制した。
図３において、ＫＭ２８１−１−１０抗体（下パネル）は、公知の抗体である５Ｄ１２抗体（中央パネル）がわずかにしかＣＤ９５発現を抑制しなかったのに比して、ＣＤ９５発現をより抑制することが示された。すなわち、より効果の高いアンタゴニスティックであることが示された。これによってヒトモノクローナル抗体がアンタゴニスティック抗体であることが示された。
抗免疫グロブリン抗体による架橋の影響
１．０ｘ１０６個／ｍｌのＲａｍｏｓ細胞懸濁液を９６ウエルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌで播種した。ハイブリドーマ培養上清又は精製抗体を２μｇ／ｍｌに培地で調整し、９６ウエルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。抗ヒトＩｇＧ抗体（シグマ、Ｉ３３８２）あるいは抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＡＭＩ３４０１）を４μｇ／ｍｌとなるよう培地に添加し、９６ウエルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。一晩培養後、細胞を集めＲ−ＰＥ標識抗ＣＤ９５抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＮＪ）を用い、ＦＡＣＳを使って解析した。図４、図５に結果を示す。図中横軸はＣＤ９５の発現強度を示す。ＫＭ２８１−１−１０、ＫＭ２８１−２−１０−１−２の各ハイブリドーマが生産した抗体ではＣＤ９５の発現を抑制した。しかし、５Ｄ１２、ＫＭ２８３−５、ＫＭ２９２−１−２４、ＫＭ２２５−２−５６の各ハイブリドーマが生産した抗体ではＣＤ９５の発現を逆に増強した。
〔実施例８〕Ｒａｍｏｓ細胞における抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体による増殖抑制
１．０ｘ１０５個／ｍｌのＲａｍｏｓ細胞、ＨＳ−Ｓｕｌｔｏｎ懸濁液を９６ウエルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで播種した。精製抗体あるいは可溶性ＣＤ４０リガンドと抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）との等量混合物を培地に添加し、２日培養後、１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１０μｌ添加した。１８時間後、Ｍａｃｒｏ９６  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＳＫＡＴＲＯＮ）を用いて、Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  Ａ（Ｗａｌｌａｃ）にハーベストし、乾燥後Ｂｅｔａｐ；Ｓｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ）に良く浸し、パッケージング後、１２０５  ＢＥＴＡＰＬＡＴＥ液体シンチレーションカウンターで活性測定した。図６に結果を示す。図中、縦軸は細胞による３Ｈチミジンの取り込み量を、横軸は培養液中の抗体あるいはＣＤ４０Ｌ濃度を示す。Ｒａｍｏｓ細胞、ＨＳ−Ｓｕｌｔｏｎ細胞ともに、ＫＭ３０２−１抗体を添加した場合に、従来のＧ２８−５抗体やＣＤ４０Ｌと比較して、チミジンの取り込みが低く、ＫＭ３０２−１抗体が腫瘍細胞の増殖を効果的に抑えられるアゴニスティック抗体であることが示された。
〔実施例９〕ＣＤ４０アゴニスティック抗体による樹状細胞の活性化
（１）材料及び方法
組換え型ヒトＩＬ−４はＧｅｎｚｙｍｅ  ｔｅｃｈｎｅ社より購入した。抗ヒトＣＤ１４  ＭＡＣＳ  ｂｅａｄｓはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社より購入した。ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐはＮｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＳより購入した。培養に用いた培地は、ＤＣ誘導時にはＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に１０％ｈｅａｔｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＣＳ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ），５５μＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ），硫酸ストレプトマイシン（明治製菓）を加えて用いた。染色時の細胞洗浄には２％ＦＣＳ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），０．０２％Ａｚａｉｄ添加ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。細胞凍結時には日本全薬工業社製のセルバンカーを用いた。
（２）単球由来ＤＣの誘導
末梢血よりＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いた密度勾配遠心により単核球を調製した（ＰＢＭＣ）。これを抗ヒトＣＤ１４  ＭＡＣＳ  ｂｅａｄｓでポジティブセレクションすることによりＣＤ１４陽性画分と陰性画分に分離した。陽性画分に組換え型ヒトＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と組換え型ヒトＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加して、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地にて６ｗｅｌｌプレートで培養した。培養開始時の細胞濃度は１×１０６／ｍｌで１ｗｅｌｌに３ｍｌずつで行った。培養中は２日に１度の培地交換を行った。培地交換は培養液の１割を遠心チューブにとり遠心し、上清を除去後、とった培養液の２倍容量の新しい培養液（サイトカインなどを上記濃度で含む）で懸濁し、各ｗｅｌｌに戻した。培養６日目には細胞を回収し、細胞数を計算後、上記培地に１×１０６／ｍｌの濃度で懸濁し、抗ＣＤ４０抗体又はそのアイソタイプ対照を添加して２４ｗｅｌｌプレートでさらに４日間の培養を行った。この間培地交換は行わなかった（１ウェルあたりの細胞数１ｘ１０６個、細胞濃度１ｘ１０６個／ｍｌ）。
（３）細胞染色及びフローサイトメーターによる解析
染色には抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（アイソタイプ対照：ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ８６抗体（アイソタイプ対照：ラットＩｇＧ１）、抗ＣＤ８３抗体（アイソタイプ対照：ラットＩｇＧ２ｂ）を用いた。まず、抗体を加え３０分、４℃でインキュベートした後、３回の洗浄し、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いて解析を行った。
（４）Ｍａｔｕｒｅ  ＤＣに対するＩＬ−１２  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ能の亢進
上記のように未成熟ＤＣを得た後、ＬＰＳ（４００ｐｇ／ｍｌ）とＩＦＮγ（１０−３Ｍ）を加えさらに２日間の培養後成熟ＤＣを得た。これに抗ＣＤ４０抗体またはアイソタイプ対照を１０μｇ／ｍｌ加え、２４時間後の上清についてＩＬ−１２の産生をＥＬＩＳＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）法にて測定した。
（５）結果および考察
アゴニスティック抗体であるＫＭ３０２−１抗体が、ＤＣの成熟化に及ぼす抗体の影響を図７に、成熟ＤＣのＩＬ−１２生産に及ぼす影響を図８に示す。Ｇ２８−５抗体を対照として成熟の度合いを比べた。ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲの発現を見た結果、Ｇ２８−５抗体と比較して、ＫＭ３０２−１抗体ではさらに発現が上昇し、すなわち成熟度が亢進させることが示された。また、ＩＬ−１２の分泌については成熟ＤＣへのＫＭ３０２−１抗体の処理によって亢進することが示された。以上よりＫＭ３０２−１抗体が、ＤＣに対するアゴニスティック抗体として作用することが示された。
〔実施例１０〕ＤＣ−ＭＬＲ
正常ヒトから採取した血液（末梢血）を、２０００ｒｐｍ１０分遠心し、血清を吸い取った。血球分画をＰＢＳで再懸濁し、Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の上に静かに載せた。２０００ｒｐｍ３０分遠心し、中間層のＰＢＭＣ部分を回収する。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＭＡＣＳを用い特定の細胞分離に使用した。
ＤＣ培養のための単球の分離は、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を用い添付の説明書にしたがって行った。簡単に説明すると、ＰＢＭＣ  １ｘ１０８個に対して、ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  ８００μｌ，ＭＡＣＳ  ＣＤ１４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、５０２−０１）２００μｌを添加し、４℃で１５分処理した。ＭＡＣＳ  ＬＳカラムに細胞を吸着させ、洗浄した。カラムに吸着した細胞を単球として回収した。カラムに吸着しなかった細胞に、ＭＡＣＳ  ＨＬＡ−ＤＲ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、４６１−０１）を添加し、ＢＳカラムでＨＬＲ−ＤＲ陽性細胞を除去し、Ｔ細胞画分とした。ＦＡＣＳによりＣＤ３陽性細胞の比率を計測し、Ｔ細胞画分全体の細胞数より実質的なＴ細胞数を算出した。得られた単球は、６ウエル培養皿に、１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ），５０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ（ＫＩＲＩＮ），１０％のＦＣＳ（ＳＩＧＭＡ）を含むＲＯ培地（ＰＰＭＩ培地に、β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ），ＨＥＰＥＳ（ＳＩＧＭＡ）を添加したもの）で培養した。培養５日後に、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（ＤＩＦＣＯ）を添加し、成熟ＤＣに分化させた。
ＭＬＲは、異なるヒトから分離した、Ｔ細胞と成熟ＤＣを混合することにより行った。Ｔ細胞／ＤＣの細胞比をそれぞれ、１：８０とし、Ｔ細胞数は、２ｘ１０５細胞／ウエルとする。まず最初に、ＤＣに抗を加え３０分間反応させる。その後、Ｔ細胞を加え、４日培養した後に、１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１０μｌ添加した。１４時間後、Ｍａｃｒｏ９６  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＳＫＡＴＲＯＮ）を用いて、Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  Ａ（Ｗａｌｌａｃ）にハーベストし、乾燥後Ｂｅｔａｐ；Ｓｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ）に良く浸し、パッケージング後、１２０５  ＢＥＴＡＰＬＡＴＥ液体シンチレーションカウンターで活性測定した。また未成熟ＤＣを用いたＭＬＲは、異なるヒトから分離した、Ｔ細胞と成熟ＤＣを混合することにより行った。Ｔ細胞／ＤＣの細胞比をそれぞれ、１：４０として同様に行った。図９、図１０に結果を示す。ＫＭ２８１−１−１０抗体の添加によりチミジンの取り込みが低く、ＭＬＲが抑えられることが示された。また、図１０においてＫＭ２８３−５、５Ｄ１２抗体はＤＣ−ＭＬＲを抑制できず、すなわちＫＭ２８１−１−１０抗体のみがＤＣに対するＣＤ４０リガンドの働きを中和するアンタゴニスティック抗体であることが示された。さらに、アゴニスティック抗体であるＫＭ３０２−１抗体が、未成熟ＤＣを用いたＭＬＲに及ぼす抗体の影響を調べた結果を図１１に示す。ＤＣが活性化することにより、Ｔ細胞との相互作用が促進され、チミジンの取り込みが増加している。これによりＫＭ３０２−１は未成熟ＤＣに作用するアゴニスティック抗体であることが示された。
〔実施例１１〕ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合に及ぼす影響  ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ビアコア）を用いて、抗ＣＤ４０抗体を、固定化されたＣＤ４０ヒトＦＣに結合させた後、可溶性ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合量の変化を測定した。装置に付属した説明書に従い、可溶性ＣＤ４０ヒトＦＣをＣＭチップ（ＣＭ５，ビアコア）に固定化した。次いで２５（μｇ／ｍｌ）の抗ＣＤ４０抗体を添加し、ＣＤ４０に結合させた。さらに１０（μｇ／ｍｌ）の可溶性ＣＤ４０Ｌを添加し結合させた。ＣＤ４０Ｌ添加前後の結合量の差を測定した。コントロールＩｇＧを添加した場合、ＣＤ４０Ｌの結合量は１００ＲＵとなった。ＫＭ３０２−１抗体添加後では、ＣＤ４０Ｌの結合量は１１０ＲＵとなり、ＫＭ２８３−５抗体添加後では、１８ＲＵとなった。これにより、ＫＭ３０２−１抗体はＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻害しないことが示された。
〔実施例１２〕Ｒａｍｏｓ細胞における抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体によるＣＤ９５発現促進
実施例４で得られたハイブリドーマの精製抗体を実施例６の方法に従って解析し、アゴニスト抗体を生産するクローンを選別した（１ウェルあたりの細胞数５ｘ１０４個、細胞濃度２．５ｘ１０５個／ｍｌ）。図１２に結果を示す。図中横軸は培養液中の抗体濃度を、縦軸は平均蛍光強度、すなわちＣＤ９５発現強度を示す。ＫＭ３４１−１−１９，２１０５抗体は、０．０１μｇ／ｍｌ以上の濃度で公知のマウス抗体であるＧ２８−５抗体に比して、Ｒａｍｏｓ細胞に対してＣＤ９５発現をより促進することが示された。すなわち、より効果の高いアゴニスティックであることが示された。また、０．０１μｇ／ｍｌでＫＭ３４１−１−１９，２１０５抗体のＲａｍｏｓ細胞にＣＤ９５発現を増進するアゴニスト活性は１０μｇ／ｍｌのＧ２８−５抗体の活性より高かった（図１２）。それぞれの抗体濃度において、ＣＤ９５の発現がＧ２８−５抗体を添加した場合の何倍に相当するかを表５にまとめた。
2002088186.tif 000010
〔実施例１３〕ＣＤ４０アゴニスティック抗体による樹状細胞の活性化
実施例９の方法に従って、ＣＤ４０アゴニスティック抗体による成熟ＤＣのＩＬ−１２およびＩＬ−１０生産に及ぼす影響を調べた。ＩＬ−１０はＥＬＩＳＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）法にて測定した。図１３および図１４に結果を示す。ＫＭ３４１−１−１９抗体の処理によってＩＬ−１２の分泌が亢進することが示された。一方、５０００ｒａｄでＸ線照射した、ＣＤ４０リガンド発現組換えＬ細胞を２ｘ１０５個／ｍｌ共存させた場合でも、ＩＬ−１２とＩＬ−１０の培養液中濃度は２５４、５１ｐｇ／ｍｌであり、ＫＭ３４１−１−１９抗体を１μｇ／ｍｌ添加した場合より少なかった。
以上よりＫＭ３４１−１−１９抗体が、ＤＣに対して効果的なアゴニスティック抗体として作用することが示された。０．１μｇ／ｍｌでＫＭ３４１−１−１９抗体の成熟ＤＣにＩＬ−１２を分泌させるアゴニスト活性は１００μｇ／ｍｌのＧ２８−５抗体の活性より高く、１μｇ／ｍｌでＫＭ３４１−１−１９抗体の成熟ＤＣにＩＬ−１２を分泌させるアゴニスト活性は１００μｇ／ｍｌのＧ２８−５抗体の活性より１００倍以上高かった（図１３）。また、１μｇ／ｍｌでＫＭ３４１−１−１９抗体の成熟ＤＣにＩＬ−１０を分泌させるアゴニスト活性は１００μｇ／ｍｌのＧ２８−５抗体の活性より１０倍以上高かった（図１４）。また、ＫＭ３４１−１−１９抗体は、サブクラスがＩｇＧ２であり、ＩｇＧ１やＩｇＧ３よりＦｃレセプターへの結合性が低く、ＮＫ細胞のキラー活性の感作や補体系の活性化も弱い。このことから抗体によって、ＣＤ４０発現細胞の機能あるいは細胞そのものが減少してしまうという危険性が低いと考えられる。またＦｃレセプターによる架橋を受けにくいことから、体内でのアゴニスト活性が、架橋によって大きく変動することがなく、薬効を制御し易いと期待される。
〔実施例１４〕Ｒａｍｏｓ細胞における抗ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体によるＣＤ９５発現抑制
１．０ｘ１０６個／ｍｌのＲａｍｏｓ細胞懸濁液を平底９６ウェルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌで播種した（１ウェルあたり細胞数５ｘ１０４個）。培地で希釈した精製抗体を９６ウェルプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。ヒトＣＤ４０リガンドを発現する組換えマウスＬ細胞（Ｓｐｒｉｇｇｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１５４３，１９９２；Ｇａｒｒｏｎｅ，Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２：１２６５，１９９５などを参照のこと）を１．０ｘ１０５個／ｍｌに調製し、５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した（１ウェルあたりＲａｍｏｓ細胞の細胞数５ｘ１０４個、細胞濃度２．５ｘ１０５個／ｍｌ、１ウェルあたりマウスＬ細胞の細胞数５ｘ１０３個、細胞濃度２．５ｘ１０４個／ｍｌ）。一晩培養後、細胞を集めＲ−ＰＥ標識抗ＣＤ９５抗体を用い、ＦＡＣＳを用いて解析した。図１５に結果を示す。図中縦軸は平均蛍光強度、すなわちＣＤ９５の発現強度を示す。公知の抗体である５Ｄ１２抗体がわずかにしか抑制しなかったのに比較して、４Ｄ１１抗体では０．１μｇ／ｍｌの濃度でもＣＤ４０Ｌ発現細胞を添加しない陰性コントロールと同程度までＣＤ９５の発現を抑制した。また、１μｇ／ｍｌの濃度では，４Ｄ１１，Ｆ４−４６５，ＫＭ２８１−１−１０がＣＤ４０Ｌ発現細胞を添加しない陰性コントロールと同程度までＣＤ９５の発現を抑制した。これによって４Ｄ１１、Ｆ４−４６５，ＫＭ２８１−１−１０抗体が、より効果的なアンタゴニスティック抗体であることが示された。それぞれの抗体濃度において、アンタゴニスティック抗体無添加の対照を１００とした平均蛍光強度の相対値を表６に示す。
2002088186.tif 000011
〔実施例１５〕抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体によるＲａｍｏｓ細胞移植モデルにおける抗腫瘍効果
生後５週齢のＣ．Ｂ．１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄＪｃ１マウス（日本クレア）に抗アシアロＧＭ１抗体を静脈注射した。１日後に腫瘍細胞としてＲａｍｏｓ細胞をマウス１匹当たり５ｘ１０６個静脈注射した。１日後にＫＭ３０２−１抗体あるいは陰性対照として抗ヒトアルブミンヒトＩｇＧ抗体を静脈注射した。投与量はＫＭ３０２−１抗体をマウス１匹当たり１、１０、１００μｇ、陰性対照抗体１００μｇをそれぞれ５個体のマウスに１回投与した。結果を図１６に示す。陰性対照投与群は移植３４日後にすべて死亡したのに対して、ＫＭ３０２−１抗体１０μｇ、１００μｇを投与された群では５匹すべて生存しており、ＫＭ３０２−１抗体の抗腫瘍効果が確認された。ＫＭ３０２−１抗体はＩｇＧ４サブクラスであり、Ｆｃレセプターを介した抗体依存性細胞傷害機構（ＡＤＣＣ）や補体系の活性化が弱いにもかかわらず、１０μｇ単回投与で担ガンマウスの生存期間の延長が見られた。
〔実施例１６〕抗ＣＤ４０アゴニスティック抗体によるＲａｍｏｓ細胞の増殖抑制
１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で１ｘ１０４個／ｍｌに調製したＲａｍｏｓ細胞懸濁液１００μｌを９６ウェルプレートに分注し、２０μｇ／ｍｌに培地を用いて調製したＫＭ３４１−１−１９抗体あるいは可溶性リガンド溶液を添加した。可溶性リガンドにはリガンドと同濃度（反応溶液中の濃度が１０μｇ／ｍｌ）の抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）を共存させ活性を強めた。５日間培養後、各ウェルに２０μｌのＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え２から３時間反応させた。波長４９０ｎｍで細胞や抗体を含まない培地のみのウェルとの吸光度の差を測定し、生存している細胞数を測定した。また、同様に９６ウェルＵ底プレートを用いてＧ２８−５抗体と増殖抑制作用を比較した。２μｇ／ｍｌに培地を用いて調製したＫＭ３４１−１−１９抗体あるいはＧ２８−５抗体を添加した。結果を図１７に示す。ＫＭ３４１−１−１９抗体を添加したウェルでは死細胞が観察され、細胞数はＧ２８−５抗体やリガンド添加のウェルに比較して顕著に少なく、吸光度も低くなり、腫瘍細胞の増殖が抑制され、細胞死が誘導されることが示された。
〔実施例１７〕抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニング
ＫＭ３４１−１−１９，２１０５，１１０，１１５，ＫＭ２８１−１−１０，４Ｄ１１，ＫＭ６４３−４−１１，Ｆ４−４６５、Ｆ２−１０３，Ｆ５−７７抗体を生産するハイブリドーマを培養し、細胞を遠心によって集めた。これにＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加し、取扱説明書にしたがってＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付の説明書にしたがって行った。５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作製した。ＫＭ３４１−１−１９，２１０５，１１０，１１５，ＫＭ２８１−１−１０，４Ｄ１１，ＫＭ６４３−４−１１，Ｆ２−１０３，Ｆ５−７７重鎖（Ｈ鎖）の増幅には、Ｔａｋａｒａ社のＺ−Ｔａｑを用い，ＵＭＰとｈｈ６プライマーで、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返した。さらに、この反応液１μｌを鋳型とし、ＮＵＭＰとｈｈ３プライマーを用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。Ｆ４−４６５重鎖の増幅には、ＵＭＰとｈｈ２プライマーを用い、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ，ｃａｔ＃１９１０）を使って、９４℃５秒、７２℃３分  ５サイクル、９４℃５秒、７０℃０秒、７２℃３分、５サイクル、９４℃５秒、６８℃１０秒、７２℃３分、２５サイクルで行った。
2002088186.tif 000012
この後、増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、ｈｈ４をプライマーとして塩基配列の決定を行った。あるいは、ＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａｊｏｌｌａ，ＣＡ）又はＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングし配列を決定した。配列情報を基に、抗体重鎖特異的プライマーを合成した。ＫＭ３４１−１−１９の場合３４１Ｈプライマー、２１０５の場合は２１０５Ｈｓａｌプライマー，１１０，１１５の場合には１１０Ｈｓａｌプライマー，ＫＭ２８１−１−１０の場合には２８１Ｈｓａｌプライマー，４Ｄ１１の場合は４Ｄ１１Ｓａｌプライマー、ＫＭ６４３−４−１１の場合には６４３Ｈｓａｌプライマー，Ｆ４−４６５の場合はＨ１１−９  ５’プライマー、Ｆ２−１０３の場合はＦ２−１０３Ｈプライマー、Ｆ５−７７の場合はＦ５−７７Ｈプライマーを合成した。抗体重鎖特異的プライマーとｈｈ４を用いて、１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡからｃＤＮＡを増幅し、これを鋳型として抗体特異的プライマーを使って逆方向からの配列を決定した。
2002088186.tif 000013
2002088186.tif 000014
ＫＭ３４１−１−１９，２１０５，１１０，１１５，ＫＭ２８１−１−１０，４Ｄ１１，ＫＭ６４３−４−１１，Ｆ２−１０３，Ｆ５−７７の軽鎖（Ｌ鎖）は、ＵＭＰとｈｋ２プライマーを使って、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。Ｆ４−４６５の軽鎖は、ＵＭＰとｈＬ２プライマーを使って、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。増幅したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにより精製し、ｈｋ６もしくはｈＬ２プライマーを用いて塩基配列を決定した。この配列を基に、軽鎖特異的プライマーを合成した。ＫＭ３４１−１−１９の場合３４１Ｋプライマー、２１０５の場合は２０５３ＫＢｇｌプライマー，１１０，１１５の場合には１１０ＫＢｇｌプライマー，ＫＭ２８１−１−１０の場合には２８１ＫＢｇｌプライマー，４Ｄ１１の場合は４Ｄ１１ＫＢｇｌ、ＫＭ６４３−４−１１の場合には６４３ＫＢｇｌプライマー、Ｆ４−４６５の場合はＬａｍｄａ  ５’プライマー，Ｆ−１０３，Ｆ５−７７の場合はＦ２−１０３Ｋプライマーを合成した。
３４１−１−１９、１１０，１１５，ＫＭ６４３−４−１１，ＫＭ２８１−１−１０、４Ｄ１１、２１０５の場合は、軽鎖特異的プライマーとｈｋ６プライマーを使って１ｓｔＳｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡからｃＤＮＡを増幅し、これを鋳型として両方向からの配列を決定した。Ｆ４−４６５、Ｆ２−１０３，Ｆ５−７７については、ＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａｊｏｌｌａ，ＣＡ）又はＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングし配列を決定した。
2002088186.tif 000015
2002088186.tif 000016
３４１−１−１９のＨ鎖全長、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号２７の５’末端から５０番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、終止コドンは１４７２番目のチミン（Ｔ）からはじまるＴＧＡである。抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４９３番目のアデニン（Ａ）と４９４番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号２８のＮ末端から１４８番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４９番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号２８のＮ末端より２０番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号２８の２１番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号２９の５’末端から２９番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４００番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号３０のＮ末端から１２４番目のリジン（Ｋ）までである。精製されたＬ鎖蛋白質のＮ末端分析により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号３０のＮ末端より２０番目のグリシン（Ｇ）までであり、成熟体のＮ末端は配列番号３０の２１番目のグルタミン酸（Ｅ）であることが明らかとなった。
2002088186.tif 000017
2002088186.tif 000018
２１０５のＨ鎖可変領域、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号３１の５’末端から７０番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり，抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４９５番目のアデニン（Ａ）と４９６番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号３２のＮ末端から１４２番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４９番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号３２のＮ末端より１９番目のｃｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号３２の２０番目のＧｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ（Ｅ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号３３の５’末端から２８番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４０５番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号３４のＮ末端から１２６番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号３４のＮ末端より２０番目のＧｌｙｃｉｎｅ（Ｇ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号３４の２１番目のＧｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ（Ｅ）であるものと考えられる。
2002088186.tif 000019
2002088186.tif 000020
１１０のＨ鎖可変領域、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号３５の５’末端から６０番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４７９番目のアデニン（Ａ）と４８０番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号３６のＮ末端から１４０番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４１番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号３６のＮ末端より１９番目のＣｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号３６の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号３７の５’末端から３５番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４２１番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号３８のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号３８のＮ末端より２２番目のＣｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号３８の２３番目のｖａｌｉｎｅ（Ｖ）であるものと考えられる。
2002088186.tif 000021
2002088186.tif 000022
2002088186.tif 000023
１１５のＨ鎖可変領域、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号３９の５’末端から６０番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４７９番目のアデニン（Ａ）と４８０番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号４０のＮ末端から１４０番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４１番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号４０のＮ末端より１９番目のＣｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号４０の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号４１の５’末端から３５番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４２１番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号４２のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号４２のＮ末端より２２番目のＣｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号４２の２３番目のｖａｌｉｎｅ（Ｖ）であるものと考えられる。
2002088186.tif 000024
2002088186.tif 000025
２８１−１−１０のＨ鎖可変領域、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号４３の５’末端から５２番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４６８番目のアデニン（Ａ）と４６９番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号４４のＮ末端から１３９番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４０番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号４４のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号４４の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号４５の５’末端から４１番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４２４番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号４６のＮ末端から１２８番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号４６のＮ末端より２０番目のＧｌｙｃｉｎｅ（Ｇ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号４６の２１番目のＧｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ（Ｅ）であるものと考えられる。
2002088186.tif 000026
2002088186.tif 000027
４Ｄ１１のＨ鎖可変領域、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号４７の５’末端から１６番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４５６番目のアデニン（Ａ）と４５７番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号４８のＮ末端から１４７番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４８番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号４８のＮ末端より２６番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号４８の２７番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号４９の５’末端から５９番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４４２番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号５０のＮ末端から１２８番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号５０のＮ末端より２２番目のＣｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号５０の２１番目のＡｌａｎｉｎｅ（Ａ）であるものと考えられる。
2002088186.tif 000028
2002088186.tif 000029
ＫＭ６４３−４−１１のＨ鎖可変領域、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号５１の５’末端から１番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４４７番目のアデニン（Ａ）と４４８番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号５２のＮ末端から１４９番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１５０番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号５２のＮ末端より２０番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号５２の２１番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号５３の５’末端から３８番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４０９番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号５４のＮ末端から１２４番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号５４のＮ末端より２０番目のＧｌｙｃｉｎｅ（Ｇ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号５４の２１番目のＧｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ（Ｅ）であるものと考えられる。
2002088186.tif 000030
2002088186.tif 000031
Ｆ４−４６５のＨ鎖可変領域、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号５５の５’末端から４７番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４８４番目のアデニン（Ａ）と４４５番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号５６のＮ末端から１４６番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４７番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号５６のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号５６の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号５７の５’末端から８１番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４４０番目の（Ｃ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号５８のＮ末端から１２０番目のＴｈｒｅｏｎｉｎｅ（Ｔ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号５８のＮ末端より１９番目のＡｌａｎｉｎｅ（Ｇ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号５８の２０番目のＳｅｒｉｎｅ（Ｓ）であるものと考えられる。
2002088186.tif 000032
2002088186.tif 000033
Ｆ２−１０３のＨ鎖可変領域、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号５９の５’末端から３２番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４６３番目のアデニン（Ａ）と４６４番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号６０のＮ末端から１４４番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４５番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号６０のＮ末端より１９番目のＣｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号６０の２０番目のＧｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ（Ｅ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号６１の５’末端から２９番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４１５番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号６２のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号６２のＮ末端より２２番目のＣｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号６２の２３番目のＡｓｐ（Ｄ）であるものと考えられる。
2002088186.tif 000034
2002088186.tif 000035
Ｆ５−７７のＨ鎖可変領域、及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びにＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
Ｈ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号６３の５’末端から１００番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から５２８番目のアデニン（Ａ）と５２９番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。アミノ酸配列において、Ｈ鎖可変領域は配列番号６４のＮ末端から１４３番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４４番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｈ鎖のシグナル配列は配列番号６４のＮ末端より１９番目のＣｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号６４の２０番目のＧｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ（Ｅ）であるものと考えられる。
Ｌ鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号６５の５’末端から５９番目のＡからはじまるＡＴＧコドンであり、可変領域は５’末端から４４５番目のアデニン（Ａ）までである。アミノ酸配列において、可変領域は配列番号６６のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）までである。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、Ｌ鎖のシグナル配列は配列番号６６のＮ末端より２２番目のＣｙｓｔｅｉｎ（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号６６の２３番目のＡｓｐ（Ｄ）であるものと考えられる。
2002088186.tif 000036
2002088186.tif 000037
［実施例１８］抗体たんぱく質の動物細胞における発現
前記で取得した抗体の可変領域を含むＤＮＡ断片をＮ５ＫＧ１（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ６００１３５８）などの適当なベクターに組み込むことにより、抗体発現ベクターを作製する。発現のための宿主細胞には、例えばＣＨＯ−Ｒａｓ（Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１：１０３−１０９，１９９９）が好適に用いられる。宿主細胞へのベクターの導入は例えばエレクトロポレーションにより実施できる。抗体発現ベクター約２μｇを制限酵素で線状化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｅｒをもちいて３５０Ｖ、５００μＦの条件で、４ｘ１０７個のＣＨＯ−Ｒａｓ細胞に遺伝子を導入し、９６ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに播種する。発現ベクターの選択マーカーに対応した薬剤を添加して培養を継続する。コロニーが観察されたら、実施例４に示した方法によって、抗体発現株を選別する。選別した細胞からの抗体精製は、実施例５にしたがって行うことができる。
〔実施例１９〕ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体による抗原特異的抗体産生抑制作用
マウス内因性ＣＤ４０破壊についてホモ接合体の遺伝子背景を有し、かつ、ヒトＣＤ４０遺伝子のトランスジーンを有しているマウス（Ｙａｓｕｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｖｏｌ１４：３１９）に４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ｃｈｉｋｅｎ  γ−ｇｌｏｂｕｌｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＮＰ−ＣＧＧ：大阪大学微生物病研究所  菊谷  仁教授より分与）とアラム（ＡＲＡＭ：Ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）の複合体を１００μｇ（ＮＰ−ＣＧＧ量として）腹腔内注射することにより感作した。各モノクローナル抗体は抗原感作直前に３０または１００μｇの量を尾静脈内投与した。陰性対照として抗ヒトアルブミンヒトＩｇＧ４抗体１００μｇを投与した。感作７日後、眼窩静脈叢より採血し、血清中のＮＰ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＭ抗体量をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法はＮＰを結合した牛血清アルブミン（ＮＰ−ＢＳＡ：２．５μｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルを、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、４℃でインキュベートし、ＮＰ−ＢＳＡを吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（スーパーブロック、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加え室温でインキュベートしブロックした後、各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。次いで、各ウェルに１０％ブロックエース含有ＰＢＳ−Ｔで希釈した各血清（５０μｌ／ウェル）を加え、３７℃で２時間インキュベートし反応させた。マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＭ抗体（コスモバイオ、１０７０−０４または１０２０−０４）を１０％ブロックエース含有ＰＢＳ−Ｔで１，０００倍に希釈した溶液（５０μｌ／ウェル）を、各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色基質液（５０μｌ／ウェル、Ｓｉｇｍａ１０４、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を各ウェルに加え、波長４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。その結果を図１８、図１９に示す。図中縦軸はＮＰ−ＣＧＧをＣ５７ＢＬ／６マウスに２回注射した後採血してプールした血清について、ＩｇＧ１抗体の場合は１０，０００倍希釈したものを、ＩｇＭ抗体の場合は１００倍したものをそれぞれ１ユニットとして換算した値を示す。Ｆ４−４６５、４Ｄ１１およびＫＭ２８１−１−１０抗体は１００μｇの投与によりＮＰ特異的なＩｇＧ１およびＩｇＭ抗体産生を強く抑制した。
〔実施例２０〕ＣＤ４０アンタゴニスティック抗体による扁桃腺Ｂ細胞の増殖抑制
ヒト扁桃腺はチルドレンズ・ホスピタル（サン  ディエゴ、米国カリフォルニア州）より入手した。扁桃腺を小片に裁断し、細かく刻み、７０マイクロメーターのナイロンメッシュ細胞ストレーナーを通すことにより、細胞懸濁液を調製した。ＰＢＳにて数回洗浄の後、細胞数を計数し、９０％ヒト血清（ＩＣＮ）、１０％ＤＭＳＯで凍結保存した。細胞は融解の後、１０％ヒト血清、２．５マイクログラム／ｍｌのアンフォテリシン（ファンギゾン、ギブコ／ＢＲＬ）を添加した標準的ＲＰＭＩ培地に再懸濁して使用した。
１ｘ１０５個の細胞を９６穴ウェルに加え、抗ヒトＣＤ４０抗体を０．０１、０．１、１．０および１０マイクログラム／ｍｌの濃度で添加した。試験は各濃度につき三連で実施した。ｆｌａｇ標識したＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ）１マイクログラム／ｍｌ、ＣＤ４０Ｌエンハンサー抗体（Ａｌｅｘｉｓ）１マイクログラム／ｍｌを各ウェルに添加して３日間培養の後、１マイクロＣｉの［３Ｈ］チミジンを各ウェルに添加した。１２〜１５時間後に細胞を回収、液体シンチレーションカウンターにより扁桃腺Ｂ細胞の増殖を計測した。Ｂ細胞がＣＤ４０Ｌの刺激により増殖し、抗体を添加されなかった場合のカウントを１００、ＣＤ４０Ｌが添加されず、Ｂ細胞が刺激されなかった場合のカウントを０とした。例えば相対的なカウントの値として３０が計測された場合、本実験では、７０％の増殖阻害が起こったと表現することとした。
公知のアンタゴニスティック抗体である５Ｄ１２は、抗体濃度１００マイクログラム／ｍｌでも５０％を超える増殖抑制を示さなかった。
Ｆ４−４６５はわずか０．０１マイクログラム／ｍｌの濃度で約８０％の増殖抑制を示し、０．１〜１０マイクログラム／ｍｌの濃度で約９５％の増殖抑制を示した（図２０）。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明により、ＣＤ４０に対する抗体が提供される。本発明の抗体は、ＣＤ４０に対してアゴニスティックに作用するもの及びアンタゴニスティックに作用するものの両者が含まれるため、それぞれ、免疫賦活剤、免疫抑制剤等として有用である。
配列表フリーテキスト
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２６：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
図１は、ＫＭ３０２−１抗体が、ＣＤ９５発現を促進する結果を示す図である。
図２Ａは、アンタゴニスティック抗体がＲａｍｏｓ細胞に対するＣＤ４０リガンドの働きを中和することを示す図である。
図２Ｂは、アンタゴニスティック抗体がＲａｍｏｓ細胞に対するＣＤ４０リガンドの働きを中和することを示す図である。
図３は、ＫＭ２８１−１−１０抗体がＲａｍｏｓ細胞に対するＣＤ４０リガンドの働きを中和することを示す図である。
図４は、架橋されたＫＭ２８１−１−１０抗体がＣＤ９５発現を促進しない結果を示す図である。
図５は、架橋された５Ｄ１２抗体が、ＣＤ９５発現を促進する結果を示す図である。
図６は、ＫＭ３０２−１抗体による腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を示す図である。
図７は、ＫＭ３０２−１抗体が、ＤＣ細胞の成熟化を促進する結果を示す図である。
図８は、ＫＭ３０２−１抗体が、ＤＣ細胞にＩＬ−１２生産を促進する結果を示す図である。
図９は、ＫＭ２８１−１−１０抗体による、ＤＣに対するＣＤ４０リガンドの働きを中和することを示す図である。
図１０は、ＫＭ２８１−１−１０抗体による、ＤＣに対するＣＤ４０リガンドの働きを中和することを示す図である。
図１１は、ＫＭ３０２−１抗体による未成熟ＤＣ−ＭＬＲを活性化することを示す図である。
図１２は、ＫＭ３４１−１−１９抗体等が、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤ９５発現を促進する結果を示す図である。
図１３は、ＫＭ３４１−１−１９抗体が、成熟ＤＣ細胞のＩＬ−１２生産を促進する結果を示す図である。
図１４は、ＫＭ３４１−１−１９抗体が、成熟ＤＣ細胞のＩＬ−１０生産を促進する結果を示す図である。
図１５は、４Ｄ１１抗体等が、Ｒａｍｏｓ細胞に対するＣＤ４０リガンドの働きを中和することを示す図である。
図１６は、ＫＭ３０２−１抗体が、ヒト腫瘍細胞移植マウスモデルにおいて抗腫瘍効果を示す図である。
図１７は、ＫＭ３４１−１−１９抗体が、腫瘍細胞に対して増殖抑制効果を示す図である。
図１８は、Ｆ４−４６５，４Ｄ１１，ＫＭ２８１−１−１０が抗原特異的ＩｇＧの産生を抑制することを示す図である。
図１９は、Ｆ４−４６５，４Ｄ１１，ＫＭ２８１−１−１０が抗原特異的ＩｇＭの産生を抑制することを示す図である。
図２０は、Ｆ４−４６５が扁桃腺Ｂ細胞の増殖を抑制することを示す図である。
【図１】
2002088186.tif 000038
【図２Ａ】
2002088186.tif 000039
【図２Ｂ】
2002088186.tif 000040
【図３】
2002088186.tif 000041
【図４】
2002088186.tif 000042
【図５】
2002088186.tif 000043
【図６】
2002088186.tif 000044
【図７】
2002088186.tif 000045
【図８】
2002088186.tif 000046
【図９】
2002088186.tif 000047
【図１０】
2002088186.tif 000048
【図１１】
2002088186.tif 000049
【図１２】
2002088186.tif 000050
【図１３】
2002088186.tif 000051
【図１４】
2002088186.tif 000052
【図１５】
2002088186.tif 000053
【図１６】
2002088186.tif 000054
【図１７Ａ】
2002088186.tif 000055
【図１７Ｂ】
2002088186.tif 000056
【図１８】
2002088186.tif 000057
【図１９】
2002088186.tif 000058
【図２０】
2002088186.tif 000059
【国際調査報告】
2002088186.tif 000060
2002088186.tif 000061
2002088186.tif 000062
2002088186.tif 000063