(57)【要約】本発明は炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸を含有し、ω３系高度不飽和脂肪酸を含有しない原料油脂と中鎖脂肪酸類の混合物に、孔径が約１００オングストローム以上の多孔質イオン交換樹脂担体に固定化された、１，３位のエステル結合に特異的に作用するリパーゼを作用させることによる、トリグリセリドの１位及び３位に中鎖脂肪酸が、２位に該高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリオを含有する油脂の製造方法及びそれにより得られた油脂またはトリグリセリド並びにその食品、飼料及び医薬組成物への使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸を含有し、ω３系高度不飽和脂肪酸を含有しない原料油脂と中鎖脂肪酸類の混合物に、トリグリセリドの１，３位のエステル結合に特異的に作用するリパーゼを作用させて、トリグリセリドの１位及び３位に中鎖脂肪酸が、２位に該高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを含有する油脂を製造する方法において、多孔質であって、約１００オングストローム以上の孔径を有するイオン交換樹脂担体に固定化されたリパーゼを用いることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
原料油脂と中鎖脂肪酸類の混合物に固定化リパーゼを作用させて反応生成物を得た後、該生成物から固定化リパーゼを回収し、遊離脂肪酸を取り除いて反応油脂を得、次に該油脂に中鎖脂肪酸類を加え、これらに前回回収した固定化リパーゼを作用させて反応生成物を得る工程を繰り返して行うことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
固定化リパーゼを反応温度４０℃以上で作用させることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
原料油脂中に存在する炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸の全量が、該油脂中の全脂肪酸に対して３０質量％以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸が、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸が、６，９−オクタデカジエン酸、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
中鎖脂肪酸類が、遊離の中鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸の低級アルコールエステル又は中鎖脂肪酸を構成脂肪酸とする油脂である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
中鎖脂肪酸が、炭素数６〜１２個を有する脂肪酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
炭素数６〜１２個を有する中鎖脂肪酸が、カプリル酸及び／又はカプリン酸である請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
原料油脂が、該油脂中の全脂肪酸に対して同一の高度不飽和脂肪酸を１５質量％以上含有する油脂であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
原料油脂が、該油脂中の全脂肪酸に対してアラキドン酸を２５質量％以上含有する油脂であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
原料油脂が、微生物によって生産されるものであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
原料油脂が、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する微生物から抽出したものである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
上記モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する微生物が、モルティエレラ亜属（Ｓｕｂｇｅｎｕｓ  Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）に属する微生物であることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
トリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位に炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを３０〜９０ｍｏｌ％含有する油脂又はトリグリセリド。
【請求項１５】
２位に結合している高度不飽和脂肪酸が、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、６，９−オクタジエン酸、８，１１−エイコサジエン酸、及び５，８，１１−エイコサトリエン酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸である請求項１４記載の油脂又はトリグリセリド。
【請求項１６】
トリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位にアラキドン酸が結合したトリグリセリドを２５ｍｏｌ％以上含有する油脂又はトリグリセリド。
【請求項１７】
トリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位にジホモ−γ−リノレン酸が結合したトリグリセリドを５ｍｏｌ％以上含む油脂又はトリグリセリド。
【請求項１８】
トリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位に５，８，１１−エイコサトリエン酸が結合したトリグリセリドを５ｍｏｌ％以上含む油脂又はトリグリセリド。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の油脂又はトリグルセリドを特別な栄養需要に応じて配合してなる食品組成物。
【請求項２０】
前記食品組成物が、機能性食品、栄養補助食品、未熟児用調製乳、乳児用調製乳、乳児食品、妊産婦用食品又は老人用食品であることを特徴とする請求項１９記載の食品組成物。
【請求項２１】
請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の油脂又はトリグルセリドを配合してなる動物用飼料。
【請求項２２】
少なくとも１種の請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の油脂又はトリグリセリドを含有し、場合により経口、腸内又は非経口投与に適した中性の担体を配合した治療用栄養食品。
【請求項２３】
少なくとも１種の請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の油脂又はトリグリセリドを含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
トリグリセリドの１位及び３位に中鎖脂肪酸が、２位に炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを含有する油脂及びその製造方法、並びにこれらの油脂を含む組成物に関する。
背景技術
ω３系高度不飽和脂肪酸として、エイコサペンタエン酸（以下「ＥＰＡ」と称する）、ドコサヘキサエン酸（以下「ＤＨＡ」と称する）が、動脈硬化症、血栓症などの成人病の予防効果や抗ガン作用、学習能の増強作用など多くの生理機能を有していることが知られ、医薬品、特定保健用食品への利用で様々な試みがなされている。しかし、最近ではω３系以外の高度不飽和脂肪酸（ω６系及びω９系）の生理機能に関心が集っている。
ヒトの高度不飽和脂肪酸の生合成経路には、代表的な２つの系列、ω３系とω６系がある（ωとは、脂肪酸のメチル基末端から数えて最初の二重結合がある炭素までの数を示している）。そして、ω６系高度不飽和脂肪酸としてリノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸及びアラキドン酸が知られている。
アラキドン酸は、血液や肝臓などの重要な器官を構成する脂肪酸の約１０％程度を占めており（例えば、ヒト血液のリン脂質中の脂肪酸組成比では、アラキドン酸は１１％、エイコサペンタエン酸は１％、ドコサヘキサエン酸は３％を占めている）、細胞膜の主要構成成分として膜の流動性の調節に関与し、体内の代謝で様々な機能を示す一方、プロスタグランジン類の直接の前駆体として重要な役割を果たす。特に最近は、乳幼児栄養としてのアラキドン酸の役割、神経活性作用を示す内因性カンナビノイド（２−アラキドノイルモノグリセロール、アナンダミド）の構成脂肪酸として注目されている。ヒトはリノール酸を生合成することはできないが、植物性食品から摂取して、不飽和化と炭素鎖長の延長が繰り返され、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸へと変換される。したがって、通常はリノール酸を富む食品を摂取すればアラキドン酸は十分生合成される。しかし、成人病患者やその予備軍、乳児、老人では生合成に関与する酵素の働きが低下し、これらアラキドン酸は不足しがちとなり油脂（トリグリセリド）の構成脂肪酸として、直接に摂取することが望まれる。
一般に油脂（トリグリセリド）を摂取し、小腸の中に入ると膵リパーゼで加水分解されるが、この膵リパーゼが１，３−位特異性であり、トリグリセリドの１，３−位が切断されて２分子の遊離脂肪酸ができ、同時に１分子の２−モノアシルグリセロール（以下「２−ＭＧ」と称す）が生成する。この２−ＭＧは非常に胆汁酸溶解性が高く吸収性が良いため、一般に２−位脂肪酸の方が吸収が良いと言われる。また、２−ＭＧは胆汁酸に溶けると界面活性剤的な働きをして、遊離脂肪酸の吸収を高める働きをする。次に遊離脂肪酸と２−ＭＧはコレステロールやリン脂質等と一緒に胆汁酸複合ミセルを生成して小腸の上皮細胞に取り込まれ、トリアシルグリセロールの再合成が起こり、最終的にはカイロミクロンとしてリンパに放出されていく。
ところが、アラキドン酸を必要とする人は、同時に、油脂（トリグリセリド）吸収の第一段階である膵リパーゼも弱く（例えば加齢と共に膵リパーゼ活性が低下することも知られており）、アラキドン酸を含む食品・油脂（微生物発酵油脂であるアラキドン酸含有油脂も含む）からではアラキドン酸を十分量、吸収することができなかった。
そこで、膵リパーゼで加水分解されやすい中鎖脂肪酸をトリグリセリドの１，３−位に結合させて、２−位にアラキドン酸を結合させたトリグリセリドは、アラキドン酸を必要とするヒトに最適な油脂（トリグリセリド）となる。特開平８−２１４８９１号公報には、高度不飽和脂肪酸含有トリグリセリドを含む油脂の製造方法として、１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位に高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドの製造法が開示されているが、具体的にはＥＰＡあるいはＤＨＡが２−位に結合したトリグリセリドの製造法が記載されているだけであって、アラキドン酸が２−位に結合したトリグリセリドの具体的な製造法は何ら開示されていない。
特開２０００−２７０８８５号公報には、トリグリセリドの１，３位に特異的に作用するリパーゼを作用させて、目的物であるトリグリセリドの１位及び３位に結合する脂肪酸の炭素数が１２以下であり、かつ、２位に結合する脂肪酸の９０％以上が高度不飽和脂肪酸である構造脂質を製造する方法が開示されている。ここでリパーゼを作用させる油脂は、例えば、９８％以上がＥＰＡトリグリセリドのトリグリセリドであり、これはグリセリンおよび高度不飽和脂肪酸あるいはその低級アルコールエステルに、位置特異性のないリパーゼを作用させ、脱水しながら合成される。しかしながら上記方法では、混合物ではなく高純度の高度不飽和脂肪酸あるいはその低級アルコールエステルが必要であるが、未だこれらを安価に得ることは困難な状況であり、従って上記方法で目的物を製造することは現実的ではない。
一方、発酵法により高度不飽和脂肪酸を含有する油脂（トリグリセリド）を安価に製造する方法が知られている。この微生物油を利用してＹｕｊｉ  Ｓｈｉｍａｄａ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８３，３２１−３２７（１９９７）「Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ  Ｌｉｐｎａｓｅ  ｉｎ  Ａｃｉｄｏｌｙｓｉｓ」）には、当時入手可能であったアラキドン酸を２５質量％含有する微生物油を基質として、１，３位特異的リパーゼにより、１位及び３位にカプリル酸を結合させたトリグリセリドの製造方法が開示されている。しかしながらこの微生物油のトリグリセリドに結合するアラキドン酸の位置はランダムであり、１，３位の脂肪酸を酵素でほぼ完全にカプリル酸に置き換えたとしても、得られた油脂中に占める１，３−カプリロイル−２−アラキドノイル−グリセロール（以後「８Ａ８」とも称す）の割合は、最大でも原料油の２位に結合しているアラキドン酸の割合を越えることはない。この場合、２位に結合するアラキドン酸の割合は最大で２５質量％であり、実際にはアラキドン酸が複数個結合したトリグリセリドも存在しており、２位に結合するアラキドン酸の割合は２５質量％以下となる。島田らの報告（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８３，３２１−３２７（１９９７））では、得られたトリグリセリドを高速液体クロマトグラフィーで分析しているが８Ａ８と、１，３−カプリロイル−２−γ−リノレノイル−グリセロール（以後「８Ｇ８」と称す）及び１，３−カプリロイル−２−ジホモ−γ−リノレノイル−グリセロール（以後「８Ｄ８」と称す）の保持時間が同じであるため、トリグリセリド中の８Ａ８の割合を正確に求めるにはいたっていない。しかしながら、８Ａ８，８Ｇ８及び８Ｄ８の合計でも２０ｍｏｌ％前後であって、８Ａ８を２５ｍｏｌ％以上含むような満足できるトリグリセリドではなかった。
このように微生物油を原料とする場合、トリグリセリドに結合するアラキドン酸の位置がランダムであるため、目的とする８Ａ８の割合を高めるにはよりアラキドン酸含有の高いトリグリセリドを原料とする必要がある。
しかし、１，３位特異的リパーゼの、脂肪酸に対する反応性は、炭素鎖長が長いほど、二重結合が多いほど低くなる。またカルボキシル基から数えて何番目から二重結合が入るかという、二重結合の位置もリパーゼの反応性を議論する時に、重要な要素となる。たとえばリパーゼは、α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）に対し反応性は高いが、γ−リノレン酸（６，９，１２−オクタデカジエン酸）には反応性は非常に低く、またＤＰＡ  ω３（７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）には反応性は高いが、ＤＰＡ  ω６（４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸）には反応性は非常に低い。すなわちリパーゼは炭素数が１８以上で、ω６系不飽和脂肪酸の場合は二重結合が３以上、ω９系不飽和脂肪酸の場合は二重結合が２以上の不飽和脂肪酸に対して反応性が低いという問題点がある。従ってトリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位に炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸が結合した目的のトリグリセリドをより高濃度に含有する油脂を得るためには、原料油脂として炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸をより高濃度に含有する油脂を用いる必要があるが、その含量が高ければ高いほど、反応性が低くなり、反応収率が悪くなってしまう。そしてこの反応収率の低下は、多量の未反応トリグリセリド（原料トリグリセリド並びに１，３−位の脂肪酸のうち一方のみが中鎖脂肪酸となったトリグリセリド）を生じ、結果として目的とするトリグリセリドの割合を高めることはできない。従って目的とするトリグリセリドの割合を高めるための実用的な方法の開発が強く望まれている。
ω６系高度不飽和脂肪酸のジホモ−γ−リノレン酸は、その単独の生理作用として、プロスタグランジンＩ類の前駆体効果、抗血栓作用、血圧低下作用、抗運動障害作用、抗炎症作用、遅延型アレルギー抑制効果、皮膚保護作用、抗ガン作用などが期待される。したがって、同じく１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にジホモ−γ−リノレン酸が結合したトリグリセリドの開発が望まれていたが、ジホモ−γ−リノレン酸の含有率の高い油脂（トリグリセリド）の存在が知られておらず、目的とするトリグリセリドの製造に関する知見は全く知られていなかった。
ω９系高度不飽和脂肪酸の脂肪酸、例えば５，８，１１−エイコサトリエン酸（２０：３  ω９：以下「ミード酸」ともいう）及び８，１１−エイコサジエン酸（２０：２  ω９）は、必須脂肪酸欠乏に陥った動物組織に構成脂肪酸のひとつとして存在することが知られている。しかしながら、その含量はわずかであるため単離精製は非常に困難であった。これら高度不飽和脂肪酸は生体内でロイコトリエン３グループの前駆体になることが可能で、その生理活性が大いに期待されており、抗炎症、抗アレルギーおよび抗リウマチ作用が報告されている（特開平７−４１４２１号公報）。したがって、同じく１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にω９系高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドの開発が望まれていたが、ω９系高度不飽和脂肪酸の含有率の高い油脂（トリグリセリド）の存在が知られておらず、目的とするトリグルセリドの製造に関する知見は全く知られていなかった。
発明の開示
トリグリセリドの１位及び３位に中鎖脂肪酸が、２位に炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを含有する油脂及びその製造方法、並びにこれらの油脂を含む組成物を提供しようとするものである。
本発明者等は、１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にアラキドン酸が結合したトリグリセリドを２５ｍｏｌ以上含む油脂を製造する目標を達成するために、まず、アラキドン酸を４０質量％以上含有する油脂（トリグリセリド）の工業的な製造法を鋭意研究した結果、驚くべきことに、培地炭素源濃度を制御することでアラキドン酸を４５％質量以上含有する油脂（トリグリセリド）を得た；
さらに、１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にジホモ−γ−リノレン酸あるいはω９系高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを高含有率で含む油脂を製造する目標を達成するために、鋭意研究した結果、アラキドン酸生産菌の変異株によってジホモ−γ−リノレン酸、またはω９系高度不飽和脂肪酸を高含有する油脂（トリグリセリド）を得た；
さらに、酵素反応効率の向上を目指して鋭意研究した結果、驚くべきことに反応温度を高くすることで反応効率を高めることに成功した；
さらに、固定化担体を選択することで熱安定性の高い固定化酵素の取得に成功し、高い反応温度での使用を可能とし、実用化に適した酵素反応を完成した；ことにより、本発明を完成した。またこれらの方法は実験室での結果を容易にスケールアップすることが可能であり、上記油脂の商業的生産に適した方法を提供するものである。
従って、本発明は、トリグリセリドの１位及び３位に中鎖脂肪酸が、２位に炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを含有する油脂及びその製造方法、並びにこれらの油脂を含む組成物を提供する。
本発明により、例えば、１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にアラキドン酸が結合したトリグリセリドを２５ｍｏｌ％以上含む油脂、１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にジホモ−γ−リノレン酸が結合したトリグリセリドを含む油脂、あるいは１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にω９系高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを含む油脂を製造することができ、これらの油脂の多くの生理機能により、医薬品、特定保健用食品などに広く利用することができ、産業上極めて有用である。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂（トリグリセリド）の１，３−位を構成する長鎖脂肪酸を中鎖脂肪酸にエステル交換することで、１，３−位に中鎖脂肪酸、２−位に高度不飽和脂肪酸を結合せしめたトリグリセリドを含有する油脂を製造する方法並びに１，３−位に中鎖脂肪酸、２−位に高度不飽和脂肪酸を結合せしめたトリグリセリドを含有する油脂に関する。
本発明において、原料となる油脂（トリグリセリド）中の高度不飽和脂肪酸の割合の増加に伴う、未反応油脂（原料トリグリセリド並びに１，３−位の脂肪酸のうち一方のみが中鎖脂肪酸となったトリグリセリド）の増加による反応収率の低下を防ぐため、酵素反応温度は３０〜５０℃とし、好ましくは４０〜５０℃とする。
本発明で用いることのできるトリグリセリドの１，３位のエステル結合に特異的に作用するリパーゼとして、例えば、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属などの微生物が産生するもの、ブタ膵臓リパーゼなどを挙げることができる。かかるリパーゼについは、市販のものを用いることができる。例えば、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）のリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ）、リゾムコール・ミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のリパーゼ（ノボ・ノルディスク（株）製、リボザイムＩＭ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のリパーゼ（天野製薬（株）製、リパーゼＡ）等が挙げられるが、これら酵素に限定しているわけではなく、１，３−位特異的リパーゼであればすべて使用することができる。
上記リパーゼの使用形態は、反応収率を高める目的で反応温度を３０℃以上、好ましくは４０℃以上とするため、酵素に耐熱性を付加する目的で固定化担体に固定化したリパーゼを使用する。固定化担体として、セライト、セラミックが用いられていたが、本発明では耐熱性を付加するのに適した固定化担体を検討した結果、多孔質で、孔径が約１００オングストローム以上であるイオン交換樹脂が有効であることを確認した。
本発明者は、次のような過程により、上記固定化担体を選択した。すなわち、蛋白質の精製にはイオン交換樹脂が用いられており、その原理はイオン結合で蛋白質を吸脱着することにより、蛋白質を分画している。この原理を利用し、本発明者は、蛋白質である酵素をイオン交換樹脂に吸着して固定化できると考えた。蛋白質の精製には親水性の樹脂担体、すなわちセルロースやセファロース等の多糖型の担体が主流に使われている。しかしながら、油脂のエステル変換にはこの親水性は邪魔になる。そこで鋭意検討の結果、親油性に優れると考えられるポリマー型やセラミック型の樹脂がこの選択にあうものと考えた。これらのイオン交換樹脂は主に水処理に用いられていて酵素の吸着精製には用いられるものではなかった。次にイオン交換樹脂には陽イオン交換型と陰イオン交換型に分別される。目的のリパーゼの酵素群を両イオン交換体に吸着させたところ、陰イオン交換型に良く吸着されることが解った。さらに陰イオン交換型のポリマー樹脂に酵素吸着させたところ、ゲル型よりむしろポリマー型の陰イオン交換樹脂に多くの酵素が吸着され、高活性の酵素を固定することができた。これらポリマー型の樹脂は原料のスチレン、ビニルベンゼン、フェノール類、アクリル類、可塑剤等の組み合せにより、孔径（ポアサイズ）を変化させることが出来る。このような陰イオン交換樹脂には弱塩基性と強塩基性のものがあり、代表的な陰イオン交換樹脂を用いて行った検討結果を示す。
以下に示すアラキドン酸を４０質量％含有する微生物油脂（トリグリセリド９５％以上含有）とカプリル酸を酵素反応させ、２日間４０℃で反応後にトリグリセリド中に取り込まれたカプリル酸の量（ｍｏｌ％）で酵素活性の高低を比較した。反応条件は下記のとおりであった。
2003004667.tif 000002
（分析）
反応終了後、反応液と固定化酵素を分け、反応液をアルカリ性ヘキサン抽出した。抽出されたトリグリセリド画分の一部をナトリウムメチラートでメチル化し、脂肪酸メチルエステルを得た。得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析し、カプリル酸メチルの量を測定した。原料のアラキドン酸含有油脂にはカプリル酸が含まれていないので酵素活性で取り込まれたカプリル酸がこのＧＣで測定できる。このようにして、酵素活性は反応終了後のＧＣ分析値のカプリル酸の割合（ｍｏｌ％）で表示した。
2003004667.tif 000003
上記において、ダウケミカル社のイオン交換樹脂では、１００から１０００オングストロームの孔径のものをマクロポーラス型、１００オングストローム以下をゲル型と定義しており、三菱化学株式会社では、３００オングストローム以上の孔径のものをマクロポーラス型と定義している。したがって、Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ（商標、ダウケミカル）は、１００オングストローム以上の孔径を有するイオン交換樹脂である。
良好な結果を示したＤｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ（商標、ダウケミカル）の性質を確認してみると以下の点が有効であることが判明した。
１．孔径（ポアサイズ）が１００オングストローム以上の多孔性の樹脂である。
２．Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ（商標、ダウケミカル）とＤｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  Ａ（商標、ダウケミカル）との比較およびダイヤイオン  ＷＡ  １０（商標、三菱化学）とダイヤイオン  ＷＡ  ３０（商標、三菱化学）との比較から、多孔型の有利性がゲル型を上回る。
３．Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ（商標、ダウケミカル）とＤｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  Ａとの比較から、陰イオン交換基を持つことにより固定化酵素の調製は出来るが、より好ましい高活性体を製造するには強塩基性より弱塩基性の陰イオン交換基を持つ方が有利である。
４．Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ９０４（商標、ローム・アンド・ハース）はイオン交換容量がＤｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ（商標、ダウケミカル）に比して少ないため更に活性が低くなった。
これらから、好ましい固定化担体の性質はゲル型よりむしろ、１００オングストローム以上の多孔を有する多孔質（ハイポーラス）樹脂であり、好ましくは強塩基性より弱塩基性の陰イオン交換基を持つ担体で、高いイオン交換容量をもつ担体が好適である。
さらにこの担体は脂質の酵素変換に用いる性質上、親油性の性質を有することが望ましい。酵素反応が油脂中で起こるため、原料の油脂類が親油性の樹脂中に入ることで多孔中に固定化された酵素も反応に参加でき、反応の速度が速くなり、反応効率が良くなる。延いては、熱に対して不安定な酵素が反応中に熱にさらされる時間が短縮され、酵素の延命につながるとともに、生産性の上昇にもつながる好適な方法と言える。
上記のイオン交換樹脂は一例であり、樹脂は日々進化し、より良いものが市場に出回ってくる。この範疇の改良型が出回った場合、Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ（商標、ダウケミカル）等と同等もしくはそれ以上の活性を有することは明らかなものと考える。
本明細書においては、イオン交換樹脂として、Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ（商標、ダウケミカル）を用いているが、この固定化担体に限定しているわけではなく、これと同等またはそれ以上の耐熱性を付加できるイオン交換樹脂であればすべて使用することができる。
また本発明は、耐熱性を有する固定化酵素を使用し、１，３−位特異的リパーゼの反応性の低い高度不飽和脂肪酸を含有する油脂においても、反応効率を低下させることなく、かつ位置特異性を保持し、目的とする１，３−位に中鎖脂肪酸を、２−位に高度不飽和脂肪酸をエステル結合させたトリグリセリドを効率的に製造することを目指している。したがって、固定化担体の選択以外の耐熱性を付加する方法も併用することができ、例えば、固定化酵素に架橋剤、例えばゲニピン架橋剤を処理することにより、より高い耐熱性を付加することも可能である。
固定化担体１に対して、０．５〜２０質量倍の１，３−位特異的リパーゼの水溶液に固定化担体を懸濁し、懸濁液に対して２〜５倍量の冷アセトン（例えば−８０℃）を攪拌しながら徐々に加えて沈殿を形成させる。この沈殿物を減圧下で乾燥させて固定化酵素を調製することができる。さらに簡便な方法では、固定化担体１に対して、０．０５〜０．４倍量の１，３−位特異的リパーゼを最小限の水（酵素がぎりぎり溶ける量の水）に溶解し、撹拌しながら固定化担体を混ぜ合わせ、減圧下で乾燥させて固定化酵素を調製することができる。この操作により約９０％のリパーゼが担体に固定化されるが、このままではエステル交換活性は全く示さず、水１〜１０％を加えた基質（原料油脂と中鎖脂肪酸類）中で、好ましくは水１〜３％を加えた基質中で前処理することで固定化酵素は最も効率よく活性化することができ本発明に供することができる。
酵素の種類によっては、本反応系に加える水分量は極めて重要で、水を含まない場合はエステル交換が進行しにくくなり、また、水分量が多い場合には加水分解が起こり、グリセリドの回収率が低下する（加水分解が起こればジグリセリド、モノグリセリドをつくる）。しかし、この場合、前処理により活性した固定化酵素を使用することで、本反応系に加える水分量は重要ではなくなり、全く水を含まない系でも効率よくエステル交換反応を起こすことができる。さらに酵素剤の種類を選択することで水による固定化酵素の活性化処理を省略することも可能である。
本発明においてリパーゼの基質となる原料油脂とは、炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸を含有し、ω３系高度不飽和脂肪酸を含有しない油脂であり、該油脂としてはトリグリセリドを８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上、より好ましくは９５質量％以上含有する油脂を用いることができる。
本発明は、耐熱性を有する固定化酵素を使用し、酵素反応温度を上げることで、反応性の低い高度不飽和脂肪酸を含有する本発明の油脂においても、反応効率を低下させることなく、目的とするトリグリセリドを効率的に製造することができる。従って本発明において、油脂中の炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸の全量が、該油脂中の全脂肪酸に対して３０質量％以上あるいは４２質量％以上あるいは５０質量％以上である油脂であっても使用することができる。なお炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸としては、例えばアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸が、炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸としては、例えば６，９−オクタデカジエン酸、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸が挙げられる。
また原料油脂中、同一の高度不飽和脂肪酸の含量が高ければ高いほど、トリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位に該高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドをより高濃度で含有する油脂を得ることができる。具体的には油脂中の全脂肪酸質量に対して同一の高度不飽和脂肪酸を１５質量％以上、好ましくは２５質量％以上、より好ましくは３０質量％以上含有する油脂を使用することができる。より具体的には油脂中の全脂肪酸に対してアラキドン酸を２５質量％以上、好ましくは３０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、さらに好ましくは４５質量％以上、最も好ましくは５０質量％以上含有する油脂を使用することができる。
また本発明の原料油脂として、微生物によって生産される油脂を使用することができる。微生物としては炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸を主にトリグリセリドの構成脂肪酸として生産する微生物が好ましい。
アラキドン酸生産能を有する微生物としては、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ペニシリューム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クロドスポリューム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリューム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エントモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、エキノスポランジウム（Ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属、サプロレグニア（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）属に属する微生物を挙げることができる。モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）亜属に属する微生物では、例えばモルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）等を挙げることができる。具体的にはモルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等の菌株を挙げることができる。
これらの菌株はいずれも、大阪市の財団法人醗酵研究所（ＩＦＯ）、及び米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）及び、Ｃｅｎｔｒｒａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）からなんら制限なく入手することができる。また本発明の研究グループが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を使用することもできる。
本発明に使用される菌株を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた前培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、これらに限られるものではない。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる。この他必要に応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量栄養源として使用できる。これらの培地成分は微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。実用上一般に、炭素源は０．１〜４０質量％、好ましくは１〜２５質量％の濃度とするのが良い。初発の窒素源添加量は０．１〜１０質量％、好ましくは０．１〜６質量％として、培養途中に窒素源を流加しても構わない。
すでに、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する菌株を利用したアラキドン酸含有油脂の工業的製造法は確立している（「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｒｃｈｉｄｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４」：Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７５，ｐ．１５０１−１５０５（１９９８）、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｎｄ  Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４」：Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７５，ｐ．１８１５−１８１９（１９９８））。しかし、全脂肪酸に対するアラキドン酸の割合は最大４５質量％であり、本発明の８Ａ８を２５ｍｏｌ％以上含む油脂（トリグリセリド）、さらには３０ｍｏｌ％以上含む油脂（トリグリセリド）を酵素法で製造するには、原料油脂のアラキドン酸が４５質量％以上であることが望ましい。アラキドン酸の割合を高める有効な手段として、培地中の炭素源を枯渇させる方法がある。培地中の炭素源が枯渇すると菌は蓄積した油脂を資化し、しかも飽和脂肪酸から資化するため、結果としてトリグリセリド中のアラキドン酸の割合は高くなる。理屈ではこのようなことが考えられるが、実際にはトリグリセリドを資化するためアラキドン酸を高含有する油脂（トリグリセリド）の生産量はごくわずかとなり、反応基質を供給するための製造法としては全く実用的でなかった。そこで、培地炭素源濃度を制御することでアラキドン酸を４５質量％以上含有する油脂（トリグリセリド）を工業的に生産することに成功した。培養は、培養２〜４日目までが菌体増殖期、培養２〜４日目以降が油脂蓄積期となる。初発の炭素源濃度は１〜８質量％、好ましくは２〜４質量％の濃度とし、菌体増殖期および油脂蓄積期初期の間のみ炭素源を逐次添加し、逐次添加した炭素源の総和は２〜２０質量％、好ましくは５〜１５質量％とする。なお、菌体増殖期の炭素源の逐次添加量は、初発の窒素源濃度に応じて添加し、培養７日目以降、好ましくは培養６日目以降、より好ましくは培養４日目以降の培地中の炭素源濃度を０となるようにすることで、目的とするアラキドン酸を４５質量％以上含有する油脂（トリグリセリド）の工業的な生産法を確立した。
アラキドン酸生産菌の培養温度は使用する微生物によりことなるが、５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃とし、また２０〜３０℃にて培養して菌体を増殖せしめた後５〜２０℃にて培養を続けて不飽和脂肪酸を生産せしめることもできる。このような温度管理によっても、生成脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸の割合を上昇せしめることができる。培地のｐＨは４〜１０、好ましくは５〜９として通気攪拌培養、振盪培養、又は静置培養を行う。培養は通常２〜３０日間、好ましくは５〜２０日間、より好ましくは５〜１５日間行う。
アラキドン酸含有油脂中のアラキドン酸の割合を高める手だてとして、培地炭素源濃度を制御する以外に、アラキドン酸含有油脂に選択的加水分解を行ってアラキドン酸高含有油脂を得ることもできる。この選択的加水分解に用いられるリパーゼはトリグリセリドの位置特異性はなく、加水分解活性は二重結合の数に比例して低下するため、高度不飽和脂肪酸以外の脂肪酸のエステル結合が加水分解される。そして、生じた高度不飽和脂肪酸部分グリセリド間でエステル交換反応が起こるなどして、高度不飽和脂肪酸が高められたトリグリセリドとなる（「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｒｃｈｉｄｏｎｉｃ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｗｉｔｈ  Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ  Ｌｉｐａｓｅ」：Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７２，ｐ．１３２３−１３２７（１９９８））。このように、アラキドン酸含有油脂に選択的加水分解を行って得たアラキドン酸高含有油脂を本発明の原料油脂として使用することもできる。なお、アラキドン酸の含有率が２５質量％以上、好ましくは３０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、さらに好ましくは４５質量％以上、最も好ましくは５０質量％以上であれば、本発明の原料油脂として使用することができるのであって、明細書記載の方法で得たものに限定しているわけではない。
さらに、本発明は、ジホモ−γ−リノレン酸あるいはω９系高度不飽和脂肪酸を含有する油脂（トリグリセリド）も原料油脂として使用することができる。
すでに、ジホモ−γ−リノレン酸を含有する油脂（トリグリセリド）を効率よく製造する方法が本発明者らによって開発されている（特開平５−９１８８７号公報）。さらにω９系高度不飽和脂肪酸（６，９−オクタデカジエン酸（１８：２  ω９）、８，１１−エイコサジエン酸（２０：２  ω９）若しくは５，８，１１−エイコサトリエン酸（２０：３  ω９））を含有する油脂（トリグリセリド）を効率良く製造する方法についても、モルティエレラ属モルティエレラ亜属の属する微生物に変異処理を施して得られる、Δ１２不飽和化酵素が低下又は欠失している変異株を用いてω９系高度不飽和脂肪酸を含有する油脂を製造する方法が本発明者らによって開発されている（特開平５−９１８８８号公報、特開平１０−５７０８５号公報、特開平５−９１８８６号公報）。しかしながら、これら高度不飽和脂肪酸を含有する油脂を原料に、１，３−位に中鎖脂肪酸、２−位にジホモ−γ−リノレン酸あるいはω９系高度不飽和脂肪酸が結合した油脂（トリグリセリド）を製造することに関しては何らなされておらず、本発明において初めて製造することに成功した。なお、アラキドン酸含有油脂中のアラキドン酸の割合を高める手立てとして用いた、培地炭素源濃度を制御する方法並びにアラキドン酸含有油脂を選択的加水分解してアラキドン酸高含有油脂を得る方法で、ジホモ−γ−リノレン酸あるいはω９系高度不飽和脂肪酸の割合を高めた油脂を原料油脂として使用することもできる。
本発明に使用される中鎖脂肪酸は、炭素数６〜１２個を有する脂肪酸から選ばれたものが利用できる。炭素数６〜１２個を有する中鎖脂肪酸として、例えば、カプリル酸又はカプリン酸を挙げることができる。本発明の中鎖脂肪酸類には、遊離の中鎖脂肪酸、さらにその低級アルコールエステル、さらには炭素数６〜１２個の脂肪酸を構成脂肪酸とする油脂が含まれ、いずれの形態も使用することができる。
本発明は、活性の劣化が起こらない耐熱性を有する固定化酵素を使用することで、反応温度を上げることが可能となり反応収率を高めたが、上記エステル交換反応を繰り返し行うことにより反応収率をさらに高めることもできる。具体的には、原料油脂と中鎖脂肪酸類の混合物に固定化酵素を作用させて得られる反応生成物から固定化酵素（耐熱性が付加されたリパーゼ）を回収し、精密蒸留もしくはアルカリ性ヘキサン抽出等により遊離脂肪酸を取り除き、次に、得られた油脂に中鎖脂肪酸類を加え、前回回収した固定化酵素を作用させて反応生成物を得る。この方法により反応効率が上昇し、１，３−位に中鎖脂肪酸が結合したトリグルセリドを８０％以上含有する油脂を得ることができる。上記工程の反応回数に制限はなく、酵素が失活しないかぎり何回でも繰り返すことが可能である。
本発明の酵素反応は１，３−位に中鎖脂肪酸、２−位に高度不飽和脂肪酸を結合せしめたトリグリセリドが得られる限りバッチ式であっても、連続式であっても構わない。さらに、バッチ式では、固定化リパーゼは活性が失活しないかぎり、回収して何度でも使用することができる。
本発明の反応生成物から、目的とする１，３−位に中鎖脂肪酸、２−位に高度不飽和脂肪酸を結合せしめたトリグリセリドを含む油脂（トリグリセリド）を得るには、まず反応生成物から固定化酵素を分離し、次に、この反応油脂から、エステル交換のときに切り出された原料油脂（トリグリセリド）の１，３−位に結合していた脂肪酸、さらには過剰の反応基質である中鎖脂肪酸を取り除くことにより得られる。該脂肪酸や中鎖脂肪酸を取り除く方法としては、定法のアルカリ脱酸、水蒸気蒸留、真空精密蒸留、カラムクロマトグラフィー、溶剤抽出のいずれか又はこれらを組み合わせて用いることができる。なお生産スケールのような大量の油脂から、該脂肪酸や中鎖脂肪酸を取り除く場合には、精密蒸留で除くことが好ましい。
このようにして遊離脂肪酸を取り除いた後、得られる油脂は、９５％以上がトリグリセリドの油脂であり、油脂中に数％存在するジグリセリドやモノグリセリドを精密蒸留処理等によって取り除き、トリグリセリドの含量をさらに高めることもできる。また必要に応じ、例えば脱酸、脱ガム、脱色、脱臭等の通常の油脂の精製処理を施してもよい。
本発明の油脂は、トリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位に炭素数が１８以上で二重結合が３以上のω６系高度不飽和脂肪酸、及び炭素数が１８以上で二重結合が２以上のω９系高度不飽和脂肪酸の群から選ばれた少なくとも１種の高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを３０〜９０ｍｏｌ％、好ましくは３０〜８０ｍｏｌ％、より好ましくは４５〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは６０〜８０ｍｏｌ％含有する油脂が挙げられ、２位に結合している高度不飽和脂肪酸として、例えばアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、６，９−オクタジエン酸、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸が挙げられる。またより具体的には、トリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位にアラキドン酸が結合したトリグリセリドを２５ｍｏｌ％以上、好ましくは３０ｍｏｌ％以上、より好ましくは４０ｍｏｌ％以上含有する油脂や、トリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位にジホモ−γ−リノレン酸が結合したトリグリセリドを５ｍｏｌ％以上、好ましくは１０ｍｏｌ％以上、より好ましくは２０ｍｏｌ％以上含有する油脂、あるいはトリグリセリドの１，３位に中鎖脂肪酸が、２位に５，８，１１−エイコサトリエン酸が結合したトリグリセリドを５ｍｏｌ％以上、好ましくは１０ｍｏｌ％以上、より好ましくは２０ｍｏｌ％以上含有する油脂が挙げられる。
上記本発明の油脂、例えば、１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にアラキドン酸が結合したトリグリセリドを２５ｍｏｌ％以上含む油脂、１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にジホモ−γ−リノレン酸が結合したトリグリセリドを含む油脂、あるいは１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にω９系高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを含む油脂等の用途に関しては無限の可能性があり、食品、飲料、化粧品、医薬品の原料並びに添加物として使用することができる。そして、その使用目的、使用量に関して何ら制限を受けるものではない。
例えば、食品組成物としては、一般食品の他、機能性食品、栄養補助食品、未熟児用調製乳、乳児用調製乳、乳児用食品、妊産婦食品又は老人用食品等を挙げることができる。油脂を含む食品例として、肉、魚、またはナッツ等の本来油脂を含む天然食品、スープ等の調理時に油脂を加える食品、ドーナッツ等の熱媒体として油脂を用いる食品、バター等の油脂食品、クッキー等の加工時に油脂を加える加工食品、あるいはハードビスケット等の加工仕上げ時に油脂を噴霧または塗布する食品等が挙げられる。さらに、油脂を含まない、農産食品、醗酵食品、畜産食品、水産食品、または飲料に添加することができる。さらに、機能性食品・医薬品の形態であっても構わなく、例えば、経腸栄養剤、粉末、顆粒、トローチ、内服液、懸濁液、乳濁液、シロップ等の加工形態であってもよい。
次に、例により、本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、例に限定されない。
例１
（１，３−位特異的リパーゼの固定化による耐熱性の付加）
イオン交換樹脂担体（Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ：ダウケミカル）１００ｇを、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ１２．５％水溶液（タリパーゼ粉末：田辺製薬（株））８０ｍｌに懸濁し、減圧下で乾燥させて固定化リパーゼを得た。また別の固定化担体として、セラミック担体（ＳＭ−１０：日本ガイシ）２５ｇを、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ１０％水溶液（タリパーゼ粉末：田辺製薬（株））１００ｍｌに懸濁し、３００ｍｌの冷アセトン（−８０℃）を攪拌しながら徐々に加えて沈殿を形成させた。そして、この沈殿物を減圧下で乾燥させて固定化リパーゼを得た。
次に、アラキドン酸を４０質量％含有する微生物油（トリグリセリド９５％以上含有）（ＳＵＮＴＧＡ４０Ｓ：サントリー（株））４ｇ、カプリル酸８ｇ、上記固定化リパーゼ６００ｍｇ、水２４０μｌを３０℃で４８時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）しながら反応させた。反応終了後、反応液を取り除き、活性化された固定化リパーゼを得た。
以下、例２、３、４、５および７においては、上記活性化された固定化リパーゼを用いた。
例２
（固定化酵素の長期反応後の安定性）
アラキドン酸を２５質量％含有する微生物油（トリグリセリド９５％以上含有）ＳＵＮＴＧＡ２５（サントリー（株）製）４ｇとカプリル酸８ｇの混合物（基質）に、固定化酵素（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ、担体Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡあるいはＳＭ−１０）０．４８ｇを加え３０℃で４８あるいは７２時間、攪拌（１３０ｒｐｍ）して反応させ、反応生成物から反応油脂を取り除き、新たに基質を加え、前記と同様の反応させることを８０日間、繰り返し行った。この長期反応後、回収した固定化酵素に、先と同様の基質を加え３０℃で４８時間反応し、反応終了後に反応油脂からアルカリ性ヘキサン抽出によりトリグリセリドを抽出した。このトリグリセリドの中に取り込まれたカプリル酸（８：０）及びトリグリセリドの中に残存しているアラキドン酸（２０：４）をＧＣ分析により測定し、固定化酵素の活性を求めた。ＧＣ分析値のカプリル酸の割合（脂肪酸組成での割合：ｍｏｌ％）を反応性（酵素活性）として、またＧＣ分析値のアラキドン酸の割合（脂肪酸組成での割合：ｍｏｌ％）を特異性の残存として表１に示した。固定化したリパーゼはＳＵＮＴＧＡ２５の１，３位の脂肪酸をカプリル酸にエステル交換しているため、トリグリセリド中に残存しているアラキドン酸量はすなわちトリグリセリドの２位に結合したアラキドン酸量と考えられる。
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この結果からＤｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡの優位性が示された。すなわちＤｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡはＳＭ−１０に比べ、長期反応後であっても反応性の低下が少なく、しかも位置特異性はＳＭ−１０と同等の値を示した。従って熱安定性についてもＤｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡが有効であることが容易に推定される。
例３
（アラキドン酸を２５質量％含有する微生物油（トリグリセリド９５％以上含有）（ＳＵＮＴＧＡ２５：サントリー（株））とアラキドン酸を４０質量％含有する微生物油（トリグリセリド９５％以上含有）（ＳＵＮＴＧＡ４０Ｓ：サントリー（株））を原料油脂とした場合の８Ａ８の製造［酵素反応３回繰り返し処理］）
ＳＵＮＴＧＡ２５あるいはＳＵＮＴＧＡ４０Ｓ  ２８ｇ、カプリル酸  ５６ｇ、固定化リパーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ、担体：Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ）４．８ｇを３０℃で４８時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）して反応させた。固定化リパーゼを取り除いた反応油脂中には、エステル交換のときに切り出された原料油脂（トリグリセリド）の１，３−位に結合していた脂肪酸と過剰の反応基質である中鎖脂肪酸が存在しており、アルカリ性ヘキサン抽出によってこれら脂肪酸を取り除くことで１回処理油脂を得た。得られた１回処理油脂１２ｇ、カプリル酸２４ｇ、固定化酵素１．８ｇを３０℃で４８時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）して反応させた。先と同様の処理により中鎖脂肪酸などを取り除くことで２回処理油脂を得た。さらに、得られた２回処理油脂３ｇ、カプリル酸８ｇ、固定化酵素０．６ｇを３０℃で４８時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）して反応させた。先と同様の処理により中鎖脂肪酸などを取り除くことで３回処理油脂を得た。
ＳＵＮＴＧＡ２５あるいはＳＵＮＴＧＡ４０Ｓを原料油脂とした場合の反応液の脂肪酸組成（ｍｏｌ％）を表２、３に示す。
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トリグリセリドに結合する脂肪酸組成をｍｏｌ％で表しているため、原料油脂の１，３−位の脂肪酸がすべてカプリル酸にエステル交換されれば、カプリル酸のｍｏｌ％は６６．６％となる。したがって、反応を繰り返すことでカプリル酸の割合を６０％まで高めることができた。
例４
（８Ａ８の分析法）
１，３−位特異的リパーゼを利用し、原料油脂の１，３−位に結合する脂肪酸を中鎖脂肪酸にエステル交換する方法が魚油あるいはＴＧＡ−２５（ＳＵＮＴＧＡ２５：サントリー（株））を原料油脂とする反応が報告されている。しかし、いずれの報告においても例３に示した反応後得られた油脂（トリグリセリド）の脂肪酸組成（ｍｏｌ％）の変化で評価しており、目的とする１，３−位に中鎖脂肪酸、２−位に高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドを分析するには至っておらず、発明が実施されたのかどうかを判断することは不可能であった。本例においては、本発明を明らかにするために、本発明の目的化合物のひとつである８Ａ８を一例として、その分析法を示す。
８Ａ８の分析法は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）並びにガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を組み合わせて定量する。
［ＨＰＬＣ分析法］
カラム：逆相カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ４．６  ｘ  ２５０ｍｍ  ５Ｃ１８−ＭＳ）
溶媒：アセトン／アセトニトリル（１：１）１ｍｌ／ｍｉｎ
分析時間：５５分
カラムオーブン温度：４０℃
検出器：示差屈折計検出器（セル温度４０℃）
サンプル：油脂（トリグリセリド）をクロロホルムに溶解させた、５μｌの１０％溶液を注入
［ＧＣ分析法］
カラム：Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｕｌｔｒａ  ＡＬＬＯＹ  ＵＡ−１７−１５Ｍ−０．１Ｆ（１５ｍ  ｘ  ０．２５ｍｍ  ｘ  ０．１μｍ）
カラム温度：２６０℃−（１℃／分）−２９０℃−（１０℃／分）−３９０℃（５分）
分析時間：４５分
注入口温度：３１０℃
検出器温度：３７０℃（水素イオン化検出器）
キャリアガス：ヘリウム
線速度：４０ｃｍ／分
サンプル：油脂（トリグリセリド）をヘキサンに溶解させた、１μｌの１％溶液を注入
原料油脂のトリグリセリドを、１，２，３−位に任意の脂肪酸が結合したものとしてＸＸＸ（Ｘ＝任意の脂肪酸）で表すと、カプリル酸１個とエステル交換したトリグリセリドはＸＸ８となり、カプリル酸２個とエステル交換したトリグリセリドは８Ｘ８となる。分子内転移により８Ｘ８の２−位の脂肪酸が分子内転移して８８Ｘとなることもあり、その場合はさらにエステル交換が進行し、８８８となる。
ＨＰＬＣ分析の場合、トリグリセリドを分子種レベルで分離することができる（ただし、ＡＡＰ（１，２−位のアラキドン酸、３−位にパルミチン酸が結合したトリグリセリド）とＡＰＡ（１，３−位のアラキドン酸、２−位にパルミチン酸が結合したトリグリセリド）の区別はつかず同じ保持時間を示す）。このＨＰＬＣ分析により、８８８、８Ｘ８、ＸＸ８、ＸＸＸの割合を算出することができる。ただし、目的とする８Ａ８は８Ｘ８の分子種団に存在するが、残念ながら８Ａ８、８Ｄ８、８Ｇ８は同じ保持時間を示し分別することができない。
ＧＣ分析の場合、ＨＰＬＣ分析で分別できなかった８Ａ８、８Ｄ８、８Ｇ８を分別することができる（さらに、８Ａ８と８８Ａも分別することができる）。しかし、８８８、８Ｘ８、ＸＸ８は検出することができるが、ＸＸＸは分解により検出することができない。
したがって、ＨＬＰＣ分析法とＧＣ分析法を組み合わせることによりトリグリセリド中の８Ａ８の割合を算出することができる。
例３の３回処理油脂を分析すると、
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となる。
このように、８Ａ８の分析法を得て、初めて本発明の意義を見出すことができる。
例５
（原料油脂をＳＵＮＴＧＡ４０Ｓとし、酵素反応温度４０℃とした場合の８Ａ８の製造）
ＳＵＮＴＧＡ４０Ｓ  １ｇ、カプリル酸  ２ｇ、固定化酵素（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ、担体：Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ）０．２ｇを４０℃で４８時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）して反応させた。固定化リパーゼを取り除いた反応油脂中には、エステル交換のときに切り出された原料油脂（トリグリセリド）の１，３−位に結合していた脂肪酸と過剰の反応基質である中鎖脂肪酸が存在しており、例３と同様の方法によってこれら脂肪酸を取り除くことで処理油脂を得た。得られた処理油脂の脂肪酸（ｍｏｌ％）を表４に示す。なお、例３のＳＵＮＴＧＡ４０Ｓを原料油脂とする１回処理油脂を反応温度３０℃のコントロールとして示す。
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温度を３０℃から４０℃にすることで、カプリル酸の置換が４５．４６％から５１．７７％に上昇し、反応性が高められた。
例６
（アラキドン酸を４５質量％以上含有する油脂（トリグリセリド）の製造）
アラキドン酸生産菌としてモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＣＢＳ７５４．６８を用い、グルコース２％、食用大豆タンパク６％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３％、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０５％、大豆油０．１％を含む培地（ｐＨ６．０）１０００Ｌを２０００Ｌ通気撹拌培養槽に入れ、温度２６％、通気量１．０ｖｖｍ、撹拌８０ｒｐｍ、槽内圧１．０ｋｇ／ｃｍ２Ｇの条件で通気撹拌培養を開始した。培養１、２日目に５％グルコースを、培養３日目に４．５％グルコースを、培養４日目に１．５％グルコースを逐次添加した。さらに、培養３日目に温度を２１℃に下げて培養を継続した。グルコースは培養７日目に枯渇し、培養を１６日目まで継続した。１６日間の培養でアラキドン酸の割合は６１質量％に達し、生産量（アラキドン酸換算）も１２ｇ／Ｌを維持した。なお、培養１３日目にすでにアラキドン酸の割合は６０質量％に達しており、培養の短縮は十分可能である。得られた菌体を濾過により回収し油脂抽出を行い、アラキドン酸を５５質量％以上含有する油脂（トリグリセリド）（以後「ＳＵＮＴＧＡ５５」と称す）を得た。
例７
（原料油脂ＳＵＮＴＧＡ５５をとし、酵素反応温度４０〜４１℃とした場合の８Ａ８の製造［連続反応］）
固定化酵素（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ、担体：Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ）１０ｇをジャケット付きガラスカラム（１．８  ｘ  １２．５ｃｍ、容量３１．８ｍｌ）に充填し、ＳＵＮＴＧＡ５５とカプリル酸を１：２に混合した混合油脂を一定の流速でカラムに流し、連続反応を実施した。なお、カラム温度は４０〜４１℃とした。上記連続反応の流速と反応効率を得られた油脂中のカプリル酸とアラキドン酸のｍｏｌ％で示す（表５）。
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表５の結果より、流速を３．５〜５．５として９２日間の連続反応を試みた。結果を表６に示す。
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４０〜４１℃の温度条件においても、急激な酵素活性の低下もなく、９２日間の連続生産を達成した。
この連続反応で得た油脂を集めて９２日目に、反応で切り出された脂肪酸並びに反応基質である中鎖脂肪酸を精密分子蒸留で取り除き、例４の方法により油脂中の８Ａ８、８８８の割合を調べたところそれぞれ４０．１ｍｏｌ％、７．３ｌｍｏｌ％に達していた。
例１で調製した別の固定化担体を利用した固定化酵素（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ、担体：セラミックス担体（ＳＭ−１０））を使って同様の連続反応を実施したが、固定化酵素の熱耐性が弱く、反応開始３０日目で得られた油脂中のカプリル酸のｍｏｌ％は３２．４％となった。なお、例４の方法により油脂中の８８８の割合を調べたところ１１．６ｍｏｌ％に達していた。
したがって、高度不飽和脂肪酸の割合が高い油脂を反応原料として使用しても、耐熱性を有する本発明の固定化酵素を利用する限り、反応効率を下げることなく実用的な生産が可能となり、また、８８８の割合が明らかに低いことから、酵素の位置特異性も反応温度の上げたにも関わらず、十分に保持されていることが明らかとなった。
例８
（ジホモ−γ−リノレン酸あるいはω９系高度不飽和脂肪酸を含有する油脂（トリグリセリド）を原料油脂とし、酵素反応温度４０〜４１℃とした場合の１，３−位に中鎖脂肪酸が、２−位にジホモ−γ−リノレン酸あるいはω９系高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドの製造［バッチ反応］）
本発明者らは、ジホモ−γ−リノレン酸あるいはω９系高度不飽和脂肪酸を含有する油脂（トリグリセリド）の製造法を確立している。ジホモ−γ−リノレン酸を含有する油脂（トリグリセリド）については、特開平５−９１８８７号公報に記載の方法にしたがって、アラキドン酸生産能を有し、かつΔ５不飽和化活性が低下した微生物〔例えば、突然変異株モルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６０（微工研菌寄第３５８９号）〕を利用して、ω９系高度不飽和脂肪酸を含有する油脂（トリグリセリド）については、特開平５−９１８８８号公報に記載の方法にしたがって、ω９系高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物〔例えば、突然変異株モルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１（微工研菌寄第３５９０号）〕を培養して、ミード酸を含有する油脂（トリグリセリド）に関しては、特開平１０−５７０８５号公報に記載の方法にしたがって、アラキドン酸性産能を有する微生物に変異処理を施して得られる、Δ１２不飽和化活性が低下又は欠失し、かつΔ５不飽和化活性、Δ６不飽和化活性及び／又は鎖長延長活性の少なくとも一つが高められた変異株〔例えば、モルティエレラ・アルピナＳＡＭ２０８６（８生寄文第１２３５号、ＦＥＲＭＰ−１５７６６）］を培養することにより、８，１１−エイコサジエン酸を含有する油脂（トリグリセリド）に関しては、特開平５−９１８８６号公報に記載の方法にしたがって、ω９系高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を、Δ５不飽和化酵素阻害剤を添加した培地で培養するか、あるいは該微生物が培養されている培養液にΔ５不飽和化酵素阻害剤を添加してさらに培養することにより得ることができる。
上記方法によって製造した、ジホモ−γ−リノレン酸を４４質量％含有する油脂（以後「ＳＵＮＴＧＤ」と称す）１ｇ、８，１１−エイコサジエン酸を１６質量％含有する油脂（以後「ＳＵＮＴＧ２０：２」と称す）１ｇあるいは５，８，１１−エイコサトリエン酸を２４質量％含有する油脂（以後「ＳＵＮＴＧＭ」と称す）１ｇと、カプリル酸  ２ｇ、固定化酵素（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ、担体：Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ）０．２ｇとを混合し、４０℃で４８時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）して反応させた。固定化酵素を取り除いた反応油脂中には、エステル交換のときに切り出された原料油脂（トリグリセリド）の１，３−位に結合していた脂肪酸と過剰の反応基質である中鎖脂肪酸が存在しており、例３と同様の方法によってこれら脂肪酸を取り除くことで処理油脂を得た。得られた油脂中の１，３−カプリロイル−２−ジホモ−γ−リノレノイル−グリセロール、１，３−カプリロイル−２−８，１１−エイコサジエノイル−グリセロールあるいは１，３−カプリロイル−２−５，８，１１−エイコサトリエノイル−グリセロールの割合はそれぞれ３４％、１４％あるいは２６％に達した。
なお、本例においては、固定化酵素として、原料油脂４ｇ、カプリル酸８ｇ、上記固定化リパーゼ６００ｍｇ、水２４０μｌを用いて、例１と同様な方法で活性化したものを用いた。
例９
（粉ミルクへの使用）
粉ミルク１００ｇに、例７で得た８Ａ８を４０．１ｍｏｌ％含有するトリグリセリド０．３ｇ混合することにより、アラキドン酸の吸収を高めた粉ミルクを調製した。
例１０
（脂肪輸液剤への使用）
例７で得た８Ａ８を４０．１ｍｏｌ％含有するトリグリセリド４００ｇ、精製卵黄レシチン４８ｇ、オレイン酸２０ｇ、グリセリン１００ｇ及び０．１Ｎ苛性ソーダ４０ｍｌを加え、ホモジナイザーで分散させたのち、注射用蒸留水を加えて４リットルとする。これを高圧噴霧式乳化機にて乳化し、脂質乳液を調製した。該脂質乳液を２００ｍｌずつプラスチック製バッグに分注したのち、１２１℃、２０分間、高圧蒸気滅菌処理して脂肪輸液剤とする。
例１１
（１，３−位特異的リパーゼの固定化におけるゲニピン架橋剤の使用）
イオン交換樹脂担体（Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ：ダウケミカル）１００ｇを、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ１２．５％水溶液（タリパーゼ粉末：田辺製薬（株））８０ｍｌに懸濁、２時間穏やかに攪拌した後、５％ゲニピン水溶液８ｍｌを加え室温で６時間穏やかに攪拌を続けた。その後、２４０ｍｌの冷アセトン（−８０℃）を攪拌しながら徐々に加えて沈殿を形成させた。そして、この沈殿物を減圧下で乾燥させて固定化酵素を得た。
そして、ＳＵＮＴＧＡ４０Ｓ  ４ｇ、カプリル酸８ｇ、上記固定化リパーゼ６００ｍｇ、水２４０μｌの配合割合で、を３０℃で４８時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）しながら反応させた。反応終了後、反応液を取り除き、活性化された固定化酵素を得た。
例１２
（１，３−位特異的リパーゼの固定化におけるゲニピン架橋剤使用による耐熱性の強化）
例１と例１１で得た固定化酵素（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ、担体：Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ）４．８ｇ、ＳＵＮＴＧＡ４０Ｓ  ２８ｇ、カプリル酸  ５６ｇを３０℃で４８時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）して反応させた。反応生成物から反応油脂を取り除き、新たに上記と同じ基質を加え３０℃、４０℃、５０℃、６０℃で４８０時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）して反応させた。
その後、反応生成物から反応油脂を取り除き、新たに上記と同じ基質を加え３０℃で４８時間、撹拌（１３０ｒｐｍ）して反応させた。
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その結果驚くべきことに、ゲニピンで処理した固定化酵素は６０℃で４８０時間保持した後の活性は初期の８８％を保持していた。
例１３
例４での分析結果から、アラキドン酸を２５％含有するＳＵＮＴＧＡ２５（サントリー（株）製）を原料とした場合、酵素反応後の油脂中の８Ａ８の割合は１８．９％であった。さらにアラキドン酸を高濃度含有するＳＵＮＴＧＡ４０Ｓ（アラキドン酸４０％含有トリグリセリド、サントリー（株）製）を原料にすると２７．５％の８Ａ８油脂を得ている。
酵素反応後の油脂中の８Ａ８の割合を高める目的で、特に酵素の固定化について検討した。固定化に用いている担体はイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＲＡＴＨＯＮ  ＷＢＡ）の多孔質樹脂であるため、酵素の固定化時の負荷量をある程度の幅を持って変えることができる。そこで酵素を例１に準じて固定化する際、固定化する酵素の量を例１と同量、その２倍、その１／２量にして固定化酵素を調製した。そして各々の固定化酵素を使って、例２と同様に、ＳＵＮＴＧＡ４０Ｓを４ｇとカプリル酸８ｇとの混合油脂を原料にして固定化酵素を各々０．４８ｇ加え、３０℃で７２時間攪拌（１３０ｒｐｍ）して反応させた。
表９は固定化酵素中に含まれるリパーゼ含量と反応終了後の油脂中８Ａ８の割合の関係を示したものである。例４では同じ原料のＳＵＮＴＧＡ４０Ｓを使い酵素反応を３回も繰り返して行っても、油脂中の８Ａ８の割合は２７．５％でしかない。一方、表９に示した固定化酵素（２倍量）では単回反応にも関わらず、油脂中の８Ａ８の割合を３８．９％にまで高めることができた。
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【国際調査報告】
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