(57)【要約】オリゴキャップ法により調製したヒト胎盤由来の完全長ｃＤＮＡライブラリーから、Ｇタンパク質共役型受容体に特徴的な構造を有するクローンＰＬＡＣＥ６００２３１２を見出した。データベース検索を行なった結果、ＰＬＡＣＥ６００２３１２は、ＨＩＳＴＡＭＩＮＥ  Ｈ２  ＲＥＣＥＰＴＯＲに対して最も高い相同性を示した。ヒト組織におけるＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子の発現分布を解析した結果、心臓、肝臓、卵巣など多くの組織で発現が認められた。また、リガンド結合アッセイにより、ヒスタミンがＰＬＡＣＥ６００２３１２のリガンドの一つであることが判明した。さらに、ＰＬＡＣＥ６００２３１２のマウスホモログの全長ｃＤＮＡを単離し、予想アミノ酸配列にＧタンパク質共役型受容体に特徴的な構造を見出した。ＰＬＡＣＥ６００２３１２には、医薬品として有用なアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングや、その活性や発現の異常に基づく各種疾患の診断などへの応用が期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型の受容体をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項２】
配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
ヒスタミンと結合する活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項７】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたポリペプチドを回収する工程を含む、請求項６に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
宿主細胞が適当な培養条件下で請求項６に記載のポリペプチドを産生するように、請求項４に記載のベクターを用いて宿主細胞を形質転換することを含む、請求項６に記載のポリペプチドを産生する細胞の作製方法。
【請求項９】
請求項６に記載のポリペプチドを細胞表面に発現している請求項５に記載の宿主細胞またはその細胞膜。
【請求項１０】
請求項６に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項１１】
請求項６に記載のポリペプチドに対するリガンドの同定方法であって、
（ａ）請求項６に記載のポリペプチドと候補化合物とを接触させる工程、および
（ｂ）候補化合物が請求項６に記載のポリペプチドに結合するか否かを検出する工程、を含む方法。
【請求項１２】
請求項６に記載のポリペプチドに対するアゴニストの同定方法であって、
（ａ）請求項６に記載のポリペプチドを発現している細胞と候補化合物とを接触させる工程、および
（ｂ）候補化合物が請求項６に記載のポリペプチドの活性化の指標となるシグナルを発生させるか否かを検出する工程、を含む方法。
【請求項１３】
請求項６に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストの同定方法であって、
（ａ）候補化合物の存在下で請求項６に記載のポリペプチドを発現している細胞と請求項６に記載のポリペプチドに対するアゴニストとを接触させる工程、および
（ｂ）候補化合物の非存在下で検出した場合と比較して、請求項６に記載のポリペプチドの活性化の指標となるシグナルが減少するか否かを検出する工程、を含む方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法により同定されたリガンド。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法により同定されたアゴニスト。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法により同定されたアンタゴニスト。
【請求項１７】
請求項１１から１３に記載の方法に用いるためのキットであって、下記（ａ）から（ｃ）に記載の少なくとも一つの分子を含むキット。
（ａ）請求項６に記載のポリペプチド
（ｂ）請求項９に記載の宿主細胞またはその細胞膜
（ｃ）請求項１０に記載の抗体
【請求項１８】
請求項６に記載のポリペプチドの増大した活性または発現を必要としている患者を治療するための医薬組成物であって、下記（ａ）または（ｂ）に記載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。
（ａ）請求項６に記載のポリペプチドに対するアゴニスト
（ｂ）生体内で発現可能な形態の請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチド
【請求項１９】
請求項６に記載のポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療するための医薬組成物であって、下記（ａ）または（ｂ）に記載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。
（ａ）請求項６に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト
（ｂ）生体内において、内因性の請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド
【請求項２０】
請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現または該ポリペプチドの活性と関連した疾患の診断方法であって、下記（ａ）または（ｂ）に記載の検出を行なうことを含む方法。
（ａ）被験者から得られた試料を用いた、被検者のゲノムにおける、請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の変異の検出
（ｂ）被験者から得られた試料を用いた、請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の検出
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法に用いるためのキットであって、下記（ａ）から（ｃ）に記載の少なくとも一つの分子を含むキット。
（ａ）請求項１または２に記載のポリヌクレオチド
（ｂ）請求項６に記載のポリペプチド
（ｃ）請求項１０に記載の抗体
【請求項２２】
下記（ａ）または（ｂ）の分子を含む、哺乳動物において請求項６に記載のポリペプチドに対する免疫応答を誘導するための組成物。
（ａ）請求項１または２に記載のポリヌクレオチド
（ｂ）請求項６に記載のポリペプチド
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーに属する新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれら分子の製造および用途に関する。
背景技術
多くの医学的に重要な生物学的プロセスは、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝達経路に関与しているタンパク質および／または第二メッセンジャー（例えばｃＡＭＰにより媒介されるということはよく知られている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５１：３５３−３５４））によって行われている（本明細書中では、これらのタンパク質はＧタンパク質またはＧタンパク質を含む経路に関与しているタンパク質と称される）。これらのタンパク質のいくつかの例としては、アドレナリン作動薬やドーパミンの受容体（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４：４６−５０；Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３８：６５０−６５６；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３６：７８３−７８７）のようなＧタンパク質共役型受容体、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質（例えばホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ）、アクチュエータータンパク質（例えばプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５２：８０２−８）などが挙げられる。
例えば、シグナル伝達の一つの形態においては、ホルモンが結合することにより細胞内で酵素アデニル酸シクラーゼが活性化される。ホルモンによるこの酵素の活性化はヌクレチドＧＴＰの存在に依存する。ＧＴＰもまたホルモンの結合に影響を及ぼす。Ｇタンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結びつけている。Ｇタンパク質はホルモン受容体により活性化されると、結合していたＧＤＰをＧＴＰと交換する。このＧＴＰ担持形態は次に活性化されたアデニル酸シクラーゼに結合する。ＧＴＰからＧＤＰへの加水分解はＧタンパク質自身によって触媒され、Ｇタンパク質はその不活性な基礎状態に戻る。従って、Ｇタンパク質は、シグナルを受容体からエフェクターへ引き継ぐ中間物質として、およびシグナルの持続時間を制御する時計として機能し、２つの役割を果たしている。
Ｇタンパク質共役型受容体の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは７つの推定上の膜貫通ドメインを有すると特徴付けられた。これらのドメインは細胞外、または細胞質ループにより接続された膜貫通α−ヘリックスに相当すると考えられる。Ｇタンパク質共役型受容体には、ホルモンやウイルス、増殖因子および神経の受容体といった多くの生物学的に活性な受容体が含まれる。
Ｇタンパク質共役型受容体（他には７回膜貫通型受容体としても知られている）は、少なくとも８つの異なる親水性ループをつなぐ、約２０〜３０アミノ酸からなる７つの保存された疎水性の領域を含むと特徴付けられてきた。Ｇタンパク質共役型受容体のファミリーには、精神病および神経障害の治療に用いる神経弛緩薬と結合するドーパミン受容体を含む。このファミリーのメンバーの他の例としてはカルシトニン、アドレナリン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、濾胞刺激ホルモン、オプシン、内皮細胞分化遺伝子−１、ロドプシン、におい物質、およびサイトメガロウイルス受容体が含まれるが、これらに限らない。
大部分のＧタンパク質共役型受容体は、機能性タンパク質の構造を安定化させていると考えられるジスルフィド結合を形成する保存されたシステイン残基を、最初の２つの細胞外ループの各々において１個有する。７つの膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と称される。ＴＭ３はシグナル伝達に関与している。
システイン残基のリン酸化およびリピド化（パルミトイル化またはファルネシル化）は、いくつかのＧタンパク質共役型受容体のシグナル伝達に影響を及ぼすことができる。大部分のＧタンパク質共役型受容体はその３番目の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内にリン酸化部位を含むことが多い。β−アドレナリン受容体のような数種のＧタンパク質共役型受容体では、プロテインキナーゼＡおよび／または特異的な受容体キナーゼによるリン酸化が受容体の脱感作を媒介する。
いくつかの受容体では、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンド結合部位は数個のＧタンパク質共役型受容体膜貫通ドメインにより形成される親水性のソケット（ｓｏｃｋｅｔ）を含み、このソケットはＧタンパク質共役型受容体の疎水性残基に囲まれていると考えられている。各々のＧタンパク質共役型受容体膜貫通ヘリックスの親水性の側は内部に面し、極性を持つリガンド結合部位を形成していると仮定されている。ＴＭ３はＴＭ３アスパラギン酸残基のようなリガンド結合部位を有するため、一部のＧタンパク質共役型受容体におけるリガンドの結合に関与してきた。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギンおよびＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンもまたリガンド結合に関与している。
Ｇタンパク質共役型受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質により種々の細胞内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃ．Ｒｅｖ．，１９８９，１０：３１７−３３１参照）。個々のＧタンパク質のαサブユニットは特定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞内の種々の生物学的機能を修飾する。Ｇタンパク質共役型受容体の細胞質側の残基のリン酸化は、一部のＧタンパク質共役型受容体のＧタンパク質の共役を調節するために重要な機構であるとして同定された。Ｇタンパク質共役型受容体は、哺乳動物宿主の非常に多くの部位で見つかっている。
これまでに世界の製薬企業により創られてきた薬剤は、その９割以上が細胞外空間での相互作用を標的としており、その中でもＧ蛋白質共役型受容体を標的とする薬剤が大部分を占めており、市場に出回り成功してきた。こうしたことは、これらの受容体に治療用ターゲットとしての確立され実証された歴史があることを示している。
Ｇ蛋白質共役型受容体の中でも注目を集めているものの１つにヒスタミン受容体がある。ヒスタミンは、全末梢組織中のマスト細胞に存在しており、炎症・免疫・アレルギーの主要なメディエーターの一つである。ヒスタミンは、また胃粘膜の胃酸分泌にも重要な役割を担っている。脳に於けるヒスタミンの分布は、神経細胞および非神経細胞にある。ヒスタミン陽性の神経細胞形質は視床下部後葉に限局しているが、同細胞は脊髄、大脳皮質を含む脳のほぼ全領域に投射している。ヒスタミンは、覚醒反応、性行動、痛覚脱失症等の中枢神経機能に関わると考えられている。これらヒスタミンの生理活性は、３種類の特異的受容体を介して発現すると考えられており、それぞれＨ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれている（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９７）４９：２５３）。そして、最近Ｈ４の存在も報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５：３６７８１）。
Ｈ１受容体（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ１４４３６）は、脳、気道の筋肉、胃腸・消化器、排尿・生殖器、循環器、副腎髄質、その他内皮細胞、リンパ球等に発現している。Ｈ１受容体の研究では、血管及び、平滑筋がその対象となることが多い。平滑筋に於いてヒスタミンは筋収縮を惹起する。この反応はヒスタミンによるｉｎｏｓｉｔｏ１１，４，５−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを介した、細胞内Ｃａ濃度の上昇を伴うと考えられている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８７）１３５：６９）。血管内皮細胞では、ヒスタミンにより１）内皮細胞収縮の結果としての血管透過性の変化、２）プロスタサイクリン生合成、３）ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＡＦ）の生成、４）Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  Ｆａｃｔｏｒ（ＶＷＦ）の遊離、そして５）Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）合成等が観察される。Ｈ１受容体はＴリンパ球でも存在が確認されている（Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９６）２７：２８９）。その他、Ｈ１受容体の生理機能は、副腎髄質でのカテコールアミン放出（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８８）３７：２２１）、心筋での心拍に対する抑制効果（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９９０）１：７１）、また中枢神経（Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ（１９９０）３０：１３）などで報告されている。Ｈ１受容体の機能は百日咳毒素非感受性のＧｑ／１１ファミリーに所属するＧタンパク質により、媒介されて細胞内イノシトールリン酸やカルシウムイオン濃度の上昇を介する（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９４）１１２：８４７）。
Ｈ２受容体（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＢ０２３４８６）は、脳では基底神経節、扁桃核、大脳皮質などで高頻度に発現している一方、小脳、視床下部でも低濃度で発現が確認されている（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（１９９２）５９：２９０）。Ｈ２受容体はその他、胃や心臓で発現している。胃に於けるＨ２受容体の働きとしては、胃酸分泌に重要な役割を担っている事が、Ｈ２受容体特異的アンタゴニストを用いた研究から明らかとなっている（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８５）８６：５７１）。心臓では、Ｈ２受容体を介したヒスタミン活性により変周期効果、変力効果が心房や心室に及ぼされる事が報告されている（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９８８）２４６：３７７）。その他、気道、子宮、血管平滑筋での平滑筋弛緩（Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８９）２７：１３９）や免疫系での機能が知られている（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９０）４２：４５）。これらＨ２受容体を介した細胞内情報伝達ではｃＡＭＰ量の蓄積やアデニリルシクラーゼの活性上昇が確認されている（Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８７）９１：２１３）。
Ｈ３受容体は、元来ヒスタミン含有ニューロンに存在し、ヒスタミンの放出・生成を司るプレ・シナプティック受容体として存在が示唆された（Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０２：８３２）。哺乳類の脳ではヒスタミン含有ニューロンが大脳皮質全領域に投射している事から、Ｈ３受容体は脳機能に重要な役割を担うと想定されていた（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．（１９９８）１９：１７７）。その上、Ｈ３受容体はヒスタミン放出に関与するのみならず、プレ・シナプスに於いて、アセチルコリン、ドパミン、ガンマアミノ酪酸、グルタミン酸、ノルアドレナリン、セロトニンなど各種神経伝達物質の放出制御を行っている。その他、消化器系、心血管系、そして気道で末梢神経伝達に関与している（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９７）４９：２５３）。Ｈ３受容体の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭＯ０７２３２）は１９９９年に同定された（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９９）５５：１１０１）。この受容体は、分子全体ではＨ１受容体やＨ２受容体には、それぞれ２２％と２０％程度の相同性しか有していないが、膜貫通領域では２７％と３３％の相同性であった（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．（２０００）２１：１１）。Ｈ３受容体は、実験的な性状の違いから、Ｈ３ａとＨ３ｂという２種類の受容体サブタイプの存在が示唆されている（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９０）３８：６１０）。さらに、以上３種のヒスタミン受容体とは性状の異なる受容体が好酸球に存在しており、Ｈ３受容体特異的なアゴニストに作用するとの報告もある（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．（１９９４）１４９：１５０６）。
Ｈ４受容体は、Ｈ３受容体と約３０％のアミノ酸配列の相同性を持つ。しかしその発現はＨ３受容体とは異なり、Ｈ４受容体は脳での発現が認められなく、末梢血リンパ球、脾臓、胸腺、小腸で発現していることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５：３６７８１）。
発明の開示
細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染といった感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、過食、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、閉尿、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性の前立腺肥大、および不安、精神分裂病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害を含む機能障害または疾病を予防し、改善し、治療する上で、その標的となる新たな受容体を同定し、特徴付ける必要性が、明らかに存在する。本発明は、このような受容体を提供するものである。本発明は、特に、ヒスタミンに結合する新規なＧタンパク質共役型受容体、およびその遺伝子、並びにそれらの製造方法及び用途を提供する。
本発明者らは、オリゴキャップ法により、ヒト胎盤由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡから完全長ｃＤＮＡライブラリーを調製し、このｃＤＮＡライブラリーに含まれるクローンの構造の解析を行った。その結果、ＰＬＡＣＥ６００２３１２と命名されたクローンが、Ｇタンパク質共役型受容体の特徴である７個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を保持していることを見出した。ＰＬＡＣＥ６００２３１２の構造には、また、第一膜貫通ドメイン直後のアスパラギン酸、第三膜貫通ドメイン直後のＤＲＹ（またはＥＲＹ）配列、第四膜貫通ドメインのトリプトファン、第四と第五膜貫通ドメイン間のシステイン、第六膜貫通ドメインのＷＸＰ配列など、モノアミン、あるいはヒスタミンをリガンドとするＧ蛋白共役型受容体の特徴とされるアミノ酸残基が認められた。このことから、ＰＬＡＣＥ６００２３１２がＧタンパク質共役型受容体をコードすることが判明した。データベース検索を行なった結果、ＰＬＡＣＥ６００２３１２は、ＨＩＳＴＡＭＩＮＥ  Ｈ２  ＲＥＣＥＰＴＯＲに対して最も高い相同性を示した。ヒト組織におけるＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子の発現分布を解析した結果、心臓、肝臓、卵巣など多くの組織で発現が認められた。また、リガンド結合アッセイにより、ヒスタミンがＰＬＡＣＥ６００２３１２のリガンドの一つであることが判明した。このリガンド結合測定系を用いれば、医薬品としての有用性が期待されるＰＬＡＣＥ６００２３１２のアンタゴニストやアゴニストをスクリーニングすることができる。また、ヒスタミンとの結合が明らかとなったことから、ＰＬＡＣＥ６００２３１２はヒスタミンの精製に利用することも考えられる。
また、本発明者らはＰＬＡＣＥ６００２３１２のマウスホモログの全長ｃＤＮＡを単離し、オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列に、Ｇタンパク質共役型受容体の特徴である７個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を保持していることを見出した。
ＰＬＡＣＥ６００２３１２は、生体内で重要な機能を有すると考えられ、その変異や発現異常は、種々の疾患の原因となり得る。このような疾患には、例えば、細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染といった感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、過食、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、閉尿、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性の前立腺肥大、および不安、精神分裂病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害の治療が挙げられる。ＰＬＡＣＥ６００２３１２の不適当な活性または発現レベルは、このような疾患の診断を行なう上での重要な指標となろう。
本発明は、ヒスタミンと結合する新規なＧタンパク質共役型受容体、およびその遺伝子、並びにそれらの製造方法及び用途に関し、より詳しくは、以下の（１）から（２２）を提供するものである。
（１）  グアノシン三リン酸結合タンパク質共役型の受容体をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（２）  配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチド。
（３）  ヒスタミンと結合する活性を有するポリペプチドをコードする、（１）または（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）  （１）から（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（５）  （１）から（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは（４）に記載のベクターを保持する宿主細胞。
（６）  （１）から（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
（７）  （５）に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたポリペプチドを回収する工程を含む、（６）に記載のポリペプチドの製造方法。
（８）  宿主細胞が適当な培養条件下で（６）に記載のポリペプチドを産生するように、（４）に記載のベクターを用いて宿主細胞を形質転換することを含む、（６）に記載のポリペプチドを産生する細胞の作製方法。
（９）  （６）に記載のポリペプチドを細胞表面に発現している（５）に記載の宿主細胞またはその細胞膜。
（１０）  （６）に記載のポリペプチドに結合する抗体。
（１１）  （６）に記載のポリペプチドに対するリガンドの同定方法であって、
（ａ）（６）に記載のポリペプチドと候補化合物とを接触させる工程、および
（ｂ）候補化合物が（６）に記載のポリペプチドに結合するか否かを検出する工程、を含む方法。
（１２）  （６）に記載のポリペプチドに対するアゴニストの同定方法であって、
（ａ）（６）に記載のポリペプチドを発現している細胞と候補化合物とを接触させる工程、および
（ｂ）候補化合物が（６）に記載のポリペプチドの活性化の指標となるシグナルを発生させるか否かを検出する工程、を含む方法。
（１３）  （６）に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストの同定方法であって、
（ａ）候補化合物の存在下で（６）に記載のポリペプチドを発現している細胞と（６）に記載のポリペプチドに対するアゴニストとを接触させる工程、および
（ｂ）候補化合物の非存在下で検出した場合と比較して、（６）に記載のポリペプチドの活性化の指標となるシグナルが減少するか否かを検出する工程、を含む方法。
（１４）  （１１）に記載の方法により同定されたリガンド。
（１５）  （１２）に記載の方法により同定されたアゴニスト。
（１６）  （１３）に記載の方法により同定されたアンタゴニスト。
（１７）  （１１）から（１３）に記載の方法に用いるためのキットであって、下記（ａ）から（ｃ）に記載の少なくとも一つの分子を含むキット。
（ａ）（６）に記載のポリペプチド
（ｂ）（９）に記載の宿主細胞またはその細胞膜
（ｃ）（１０）に記載の抗体
（１８）  （６）に記載のポリペプチドの増大した活性または発現を必要としている患者を治療するための医薬組成物であって、下記（ａ）または（ｂ）に記載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。
（ａ）（６）に記載のポリペプチドに対するアゴニスト
（ｂ）生体内で発現可能な形態の（１）から（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチド
（１９）  （６）に記載のポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療するための医薬組成物であって、下記（ａ）または（ｂ）に記載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。
（ａ）（６）に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト
（ｂ）生体内において、内因性の（６）に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド
（２０）  （６）に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現または該ポリペプチドの活性と関連した疾患の診断方法であって、下記（ａ）または（ｂ）に記載の検出を行なうことを含む方法。
（ａ）被験者から得られた試料を用いた、被検者のゲノムにおける、（６）に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の変異の検出
（ｂ）被験者から得られた試料を用いた、（６）に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の検出
（２１）  （２０）に記載の方法に用いるためのキットであって、下記（ａ）から（ｃ）に記載の少なくとも一つの分子を含むキット。
（ａ）（１）または（２）に記載のポリヌクレオチド
（ｂ）（６）に記載のポリペプチド
（ｃ）（１０）に記載の抗体
（２２）  下記（ａ）または（ｂ）の分子を含む、哺乳動物において（６）に記載のポリペプチドに対する免疫応答を誘導するための組成物。
（ａ）（１）または（２）に記載のポリヌクレオチド
（ｂ）（６）に記載のポリペプチド
なお、本発明を明確にするために以下に定義を示すが、下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理解しやすくするためのもので、本発明を限定するために用いられるべきではない。
本発明において、「ＰＬＡＣＥ６００２３１２」とは、一般には、配列番号：２または配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのアレリック変異体を意味する。
「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」とは、類似の活性、向上した活性、または望ましくない副作用が低下したこれらの活性を含めて、ＰＬＡＣＥ６００２３１２の代謝的または生理的機能を意味する。さらに、前記ＰＬＡＣＥ６００２３１２の抗原的および免疫原的活性も含まれる。
「ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子」とは、配列番号：１または配列番号：１９で表されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド若しくはそのアレリック変異体、および／またはそれらの相補体を意味する。
「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それはそのもとの環境から変化しているか移動しており、またはその両方である。例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単離された」ものである。
「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、またはより一般的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が行われてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソスター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質という）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の受容体コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法によって製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３中のＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ＰｒｏｔｅｉｎＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２；Ｓｅｉｆｔｅｒら，”Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”，ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６；およびＲａｔｔａｎら，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ”，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８−６２を参照のこと。
「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことである典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配列によりコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端切断（トランケーション）を生じさせることができる。典型的なポリペプチドの変異体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるような相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体はアレリック変異体のように天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または直接合成により調製することができる。
「同一性」はヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最大級の整合（一致）が得られるように配列を並べる。「同一性」それ自体は当技術分野で認識された意味をもち、発表された技法を使って計算することができる。例えば、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥＰＲＯＪＥＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳＰＲＩＭＥＲ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１を参照のこと。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を決定する方法は多数存在していると同時に、「同一性」なる用語は当業者には公知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭＪ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ（１９８８）４８：１０７３）。
２つの配列間の同一性または類似性を決定するために汎用される方法としては、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９４およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ（１９８８）４８：１０７３に記載される方法があるが、これらに限らない。同一性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムに集成されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好適なコンピュータプログラム法としては、ＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３）があるが、これらに限らない。
一例として、配列番号：１または配列番号：１９の基準ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：１または配列番号：１９の基準ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチドにつき最高で５つの点突然変異を含みうることを除けば、基準配列と同一であることを意図している。言い換えると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、基準配列中の５％までのヌクレオチドを欠失させるか、他のヌクレオチドで置換するか、または基準配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの突然変異は、基準ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして配置することができる。
同様に、配列番号：２または配列番号：２０の基準アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペプチド配列が配列番号：２または配列番号：２０の基準アミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸につき最高で５つのアミノ酸変更を含みうることを除けば、基準配列と同一であることを意図している。言い換えると、基準アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、基準配列中の５％までのアミノ酸残基を欠失させるか、他のアミノ酸で置換するか、または基準配列中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基準配列中のアミノ酸残基の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして配置することができる。
「リガンド」とは、本発明のポリペプチドに結合する分子を意味する。リガンドには、天然リガンドおよび合成リガンドが含まれる。「アゴニスト」とは、本発明のポリペプチドに結合し、それを活性化する分子を意味する。一方、「アンタゴニスト」とは、本発明のポリペプチドの活性化を阻害する分子を意味する。
＜ポリペプチド＞
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーに属する新規なポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドには、配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。配列番号：１に記載の塩基配列で示されるヒトＰＬＡＣＥ６００２３１２タンパク質をコードするｃＤＮＡは、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーの他のタンパク質と構造的に関連している。配列番号：１のｃＤＮＡは、配列番号：２の３３０個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド番号７３５〜１７２４）を含んでいる。配列番号：２に記載のアミノ酸配列は３３０個のアミノ酸残基においてヒトヒスタミンＨ２受容体（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｐ９７２９２）と約２７％同一である（ＢＬＡＳＴ使用）。また、配列番号：１９に記載の塩基配列で示されるＰＬＡＣＥ６００２３１２マウスホモログタンパク質をコードするｃＤＮＡは、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーの他のタンパク質と構造的に関連している。配列番号：１９のｃＤＮＡは、配列番号：２０の３２９個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド番号１３１〜１１２０）を含んでいる。
従って、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／特性をもつことが予測され、それらの有用性は当業者には自明である。
本発明のポリペプチドには、その全長において配列番号：２または配列番号：２０のアミノ酸配列と少なくとも８７％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば、９７〜９９％）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。このようなポリペプチドは、後述するハイブリダイゼーション技術、遺伝子増幅技術、あるいは変異導入技術などを利用して単離した、配列番号：１または配列番号：１９のヌクレオチド配列と高い相同性を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから調製することができる。
本発明のポリペプチドは、配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有する少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好ましい。このような生物学的活性としては、Ｇタンパク質共役型受容体が示す受容体活性、例えば、リガンドとの結合活性、受容体の活性化により生じる細胞外のｐＨ濃度の変化、細胞内カルシウム濃度の変化、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化、あるいはアデニル酸シクラーゼ濃度の変化などが挙げられる。本発明のポリペプチドに結合するリガンドとしては、ヒスタミンを例示することができるが、これに制限されない。
本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。本発明のポリペプチドには、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などが含まれていてもよい。
＜ポリペプチドの断片＞
本発明は、また、本発明のポリペプチドの断片を提供する。こうした断片は全体的に前記本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドと同様に、断片は「フリースタンディング」（それ自体で独立）していても、より大きいポリペプチド内に含まれていてもよい。即ち、その大きいポリペプチドの一部または一領域、最も好ましくは一つの連続領域、を断片が構成していてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表的な例として、およその見当で、アミノ酸番号１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、および１０１からポリペプチドの末端までの断片が挙げられる。ここで、「およそ」とは、上記の範囲の一端または両端で数個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が増加または減少した範囲を含むものである。
好適な断片としては、例えば、アミノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠失、またはアミノ末端を含む一連の残基とカルボキシル末端を含む一連の残基の二連の残基の欠失したアミノ酸配列を有するトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）ポリペプチドが含まれる。また、αヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減少した断片を含めて、本発明のポリペプチドの活性を媒介するものである。例えば、リガンドが結合して細胞内へシグナル伝達を行なう活性を有する断片が挙げられる。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。
これらのポリペプチド断片は、抗原活性を含めた本発明のポリペプチドの生物学的活性を保持することが好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されているものである。典型的なこうした置換は、Ａｌａ，Ｖａｌ，ＬｅｕとＩｌｅの間、ＳｅｒとＴｈｒの間、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの間、ＡｓｎとＧｌｎの間、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの間、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間で起こる。特に、数個、５〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失または付加されている変異型が好適である。また、リガンドに結合して細胞内にシグナル伝達を行なわない断片は、本発明のポリペプチドの競合阻害剤になり得るため有用であり、このような断片も本発明に含まれる。本発明の断片は、通常、８アミノ酸残基以上、好ましくは１２アミノ酸残基以上（例えば、１５アミノ酸残基以上）である。
本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドの製造のための手段は当業界でよく理解されている。組み換え的なポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現したポリペプチドを精製することにより調製することが可能である。一方、天然由来のポリペプチドは、例えば、後述する本発明のポリペプチドに対する抗体を結合したアフィニティーカラムを利用して調製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １６．１−１６．１９）。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、インビトロトランスレーション（例えば、「Ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｄａｓｓｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９８９）ＮＡＲ  １７：３１２９−３１４４」参照）などにより本発明のポリペプチドを調製することも可能である。
＜ポリヌクレオチド＞
本発明は、また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドには、配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、遺伝コードの縮重により配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列と異なる塩基配列からなるが配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、さらに、配列番号：１または配列番号：１９に記載のヌクレオチド配列とその全長において少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％（例えば、９８〜９９％）同一である塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。塩基配列の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。本発明のポリヌクレオチドには、上記のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニングにより、例えば、細胞（例えば、胎盤細胞）中のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ることができ、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成することもできる。
配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列と有意な相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４）や遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）を利用して調製することができる。即ち、ハイブリダイゼーション技術を利用して、ＰＬＡＣＥ６００２３１２タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１または配列番号：１９）またはその一部をもとに同種または異種生物由来のＤＮＡ試料から、これと相同性の高いＤＮＡを単離することができる。また、遺伝子増幅技術を用いて、ＰＬＡＣＥ６００２３１２タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１または配列番号：１９）の一部を基にプライマーを設計し、ＰＬＡＣＥ６００２３１２タンパク質をコードするＤＮＡ配列と相同性の高いＤＮＡ断片を単離することができる。従って、本発明には、配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。
本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」とは、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性があるときだけハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。ストリンジェントな条件としては、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストラン硫酸および２０μｇ／ｍｌの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で６５℃で一夜インキュベートし、次いでフィルターを０．１×ＳＳＣ中約６５℃で洗浄する条件を例示できる。
配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列と有意な相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列に変異を導入する方法（例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５））を利用して調製することもできる。また、このようなポリヌクレオチドは、自然界における変異により生じることもある。本発明には、配列番号：２または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加などされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
このようなポリペプチドにおけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その活性が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）である。置換されるアミノ酸は、ポリペプチドの機能の保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
配列番号：１または配列番号：１９中に含まれるヌクレオチド配列またはその断片と同一であるか実質的に同一である本発明のポリヌクレオチドは、ＰＬＡＣＥ６００２３１２ポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、また、ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子との配列類似性が高い他の遺伝子（ヒト、マウス以外の種に由来する相同体およびオーソログ体（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。一般的に、プローブのヌクレオチド配列は対象物のヌクレオチド配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一である。プローブは通常、１５個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。
本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え生産のために用いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列またはその断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列またはその断片が含まれる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー配列は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により提供されかつＧｅｎｔｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：８２１−８２４に記載されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＭｙｃタグである。また、このポリヌクレオチドは５’および３’非コード配列、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、後述するように、例えば、動物およびヒトの疾病に対する治療薬および診断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利用することができる。
＜ポリペプチドの発現系＞
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産方法を提供する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いて、この種のタンパク質を生産するための無細胞翻訳系も使用することができる。
組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系を組み入れるために、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、Ｄａｖｉｓら，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または感染により行うことができる。
適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳＦ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。
多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、特に、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適した系またはベクターはどれも使用することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（前掲）に記載されるような、日常的に用いられる公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入することができる。
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
スクリーニングアッセイで使用するため本発明のポリペプチドを発現させようとする場合、そのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適である。この場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する。本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製するために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する必要がある。
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性されるときは、タンパク質を再生させるための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを復元することが可能である。
＜診断アッセイ＞
本発明はまた、診断薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。機能障害と関連した、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の変異型の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現、または変化した発現により生ずる疾病またはその罹病性の診断のための有用な手段となると考えられる。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に変異がある個体を、さまざまな技法によりＤＮＡレベル、ＲＮＡレベルあるいはタンパク質レベルで見つけ出すことができる。
診断用のポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ることができる。診断用のポリヌクレオチドとしては、検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用しても、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを標識した本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより同定することができる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはＲＮａｓｅによる消化により、または融解温度の差異により区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用いるもしくは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化により、または直接的なＤＮＡ配列の決定によっても検出できる（例えば、Ｍｙｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確認できる（Ｃｏｔｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１を参照のこと）。
別の実施態様では、例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを行うため、本発明のポリヌクレオチドまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用いられている（例えば、Ｍ．Ｃｈｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７４，ｐｐ．６１０−６１３（１９９６）を参照のこと）。
診断アッセイは、前記の方法により本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出することで、細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染といった感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、過食、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、閉尿、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性の前立腺肥大、および不安、精神分裂病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害への罹りやすさを診断または判定する方法を提供する。
さらに、被験者から得られたサンプルから本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現（ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを含む）の異常な低下または増加を測定する方法により、上記した疾患の診断を下すことができる。発現の低下または増加は、当技術分野で公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクション、ノーザンブロット、その他のハイブリダイゼーション法によりＲＮＡレベルで測定することができる。
宿主から得られたサンプル中の本発明のポリペプチドのようなタンパク質のレベルを測定するためのアッセイ法は当業者によく知られている。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。
かくして、もう一つの態様において、本発明は、上記した疾患またはこのような疾患の罹りやすさを診断するためのキットを提供する。このキットは、（ａ）本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号：１または配列番号：１９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、その断片、それらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド）、（ｂ）本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号：２または配列番号：２０のポリペプチドもしくはその断片）、または（ｃ）本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号：２または配列番号：２０のポリペプチド）に対する抗体、を含んでなる。このようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）が実質的な構成成分であることが理解されよう。
＜染色体アッセイ＞
本発明のヌクレオチド配列はまた、ヒト染色体上に正確にマッピングすることに有用である。これは本発明によるヌクレオチド配列と遺伝子関連疾患とを相関させる上で重要な第一段階であり、その染色体上のその配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種のデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能）中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係は、連鎖分析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により同定することができる。
患者と正常個体とのｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も調べることができる。患者の一部または全部に変異が観察されるが、どの正常個体にも観察されない場合は、その変異が疾病の原因である可能性がある。
＜抗体＞
本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するための免疫原としても使用することができる。抗体は、好ましくは、本発明のポリペプチドに免疫特異的である。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における他の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い親和性を有することを意味する。
本発明のポリペプチドに結合する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることができる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）などがある。
本発明のポリペプチドに対するヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができる。前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本発明のポリペプチドに結合する抗体は、とりわけ、細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染といった感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、過食、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、閉尿、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性の前立腺肥大、および不安、精神分裂病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害の治療に使用できる可能性がある。
＜ワクチン＞
本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法を提供する。この方法は、特に細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染といった感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、過食、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、閉尿、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性の前立腺肥大、および不安、精神分裂病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害から前記動物を防御するための抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに十分な本発明のポリペプチドまたはその断片を哺乳動物に接種することを含む。
本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生させるような免疫学的応答を引き出すために、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明のポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して本発明のポリペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において本発明のポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤（組成物）を提供する。この組成物は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ＰＬＡＣＥ６００２３１２ポリペプチドは胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内などへの注射を含む）に投与することが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供することができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当技術分野で公知の他のアジュバント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性で変化し、ルーチンな実験操作により簡単に決定できる。
＜スクリーニングアッセイ＞
本発明のポリペプチドは、このポリペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）またはその活性を阻害する化合物（アンタゴニスト、または阻害剤ともいう）のスクリーニング法において使用することができる。本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産物の混合物中の小分子基質およびリガンドの結合を評価するためにも用いられる。これらの基質およびリガンドは天然の基質またはリガンドであっても、構造的または機能的な模擬物であってもよい（Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ  ５（１９９１）を参照のこと）。
本発明のポリペプチドは多くの病理を含めて多数の生物学的機能に関与している。従って、一方では本発明のポリペプチドを刺激し、他方では本発明のポリペプチドの機能を阻害し得る化合物および薬物を見つけ出すことが望まれる。一般的に、アゴニストおよびアンタゴニストは、細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染といった感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、過食、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、閉尿、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性の前立腺肥大、および不安、精神分裂病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害のような症状の治療および予防目的で用いられる。
一般に、こうしたスクリーニング法は本発明のポリペプチドをその表面に発現する適当な細胞を用いるものである。この種の細胞には哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ由来の細胞または大腸菌細胞が含まれる。次いで、この受容体を発現する細胞（もしくは発現された本発明のポリペプチドを含む細胞膜）を試験化合物と接触させて、その結合または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。
あるスクリーニング技術では、受容体の活性化により生じる細胞外のｐＨ変化や細胞内カルシウムの変化を測定する系で、本発明の受容体を発現する細胞（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）を使用することを含む。この技法では、化合物を本発明のポリペプチドを発現する細胞に接触させることができる。次に、第二メッセンジャーの応答（例えば、シグナル伝達、ｐＨ変化、またはカルシウムレベルの変化）を測定し、候補化合物が受容体を活性化するかまたは阻害するかどうかを決定する。
他の方法は、受容体−媒介ｃＡＭＰおよび／またはアデニル酸シクラーゼの蓄積の阻害または刺激を測定することにより受容体インヒビターのスクリーニングするものである。こうした方法では、本発明のポリペプチドを用いて真核細胞をトランスフェクトして、その細胞表面に受容体を発現させることを含む。次いでこの細胞を本発明の受容体の存在下で候補アンタゴニストにさらし、ｃＡＭＰの蓄積量を測定する。候補アンタゴニストが該受容体に結合し、これにより受容体の結合を阻害する場合は、受容体−媒介ｃＡＭＰ、またはアデニル酸シクラーゼの活性レベルは低下するかまたは増加するだろう。
また、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）、ポリペプチドまたはこのポリペプチドに対する抗体を用いて、細胞内での本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質の生産）に及ぼす添加化合物の作用を検出するためのアッセイを組み立てることができる。例えば、当技術分野で公知の標準方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、本発明のポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのＥＬＩＳＡを構築することができ、これは適切に操作された細胞または組織からの本発明のポリペプチドの生産を抑制または増強する物質の探索に用いることができる。スクリーニングアッセイを行うための標準的な方法は当技術分野でよく理解されている。
本発明のポリペプチドの潜在的なアンタゴニストの例としては、抗体、ある場合には、リガンドと密接な関係があるオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガンドの断片）、または本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない（それゆえ該受容体の活性を妨げる）小分子などがある。
かくして、他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、または本発明のポリペプチドの生産を低下または増加させる化合物を同定するためのスクリーニングキットを提供する。このキットは、（ａ）本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号：２または配列番号：２０のポリペプチド）、（ｂ）本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号：２または配列番号：２０のポリペプチド）を発現する組換え細胞またはその細胞膜、（ｃ）本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号：２または配列番号：２０のポリペプチド）に対する抗体、を含んでなる。このようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）が実質的な構成成分であることが理解されよう。
＜予防および治療法＞
本発明は、本発明のポリペプチドの活性の過剰量と不足量のどちらにも関係した細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染といった感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、過食、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、閉尿、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性の前立腺肥大、および不安、精神分裂病、躁鬱病、譫妄、痴呆、ハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような深刻な精神薄弱およびジスキネジアを含む精神及び神経障害などの異常な状態の治療法を提供する。本発明のポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能である。一つのアプローチは、本発明のポリペプチドに対するリガンドの結合をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑制することで異常な状態を軽減することにより、活性を阻害するのに有効な量で、前記のアンタゴニストを製剤学上許容される担体とともに患者に投与することを含む。アンタゴニストには、内因性の本発明のポリペプチドとの競合状態でリガンドと結合する能力がある可溶性形態の本発明のポリペプチドが含まれる。このような競合物質の典型的な例は本発明のポリペプチドの断片である。
さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制することを含む。こうした公知技術は、体内で生成されるか別個に投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする。例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）中のＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（１９９１）５６：５６０を参照のこと。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給することもできる。例えば、Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０を参照のこと。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することもできるし、関連オリゴマーをｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることもできる。
本発明のポリペプチドの活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療上有効な量の、本発明のポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、前記のアゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを含む。別法として、患者の関連細胞において本発明のポリペプチドを内因的に産生させるための遺伝子治療を用いることができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞に導入する。その結果、パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性のウイルス粒子を産生するようになる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞処理およびｉｎ  ｖｉｖｏでのポリペプチド発現のために、これらの産生細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に関しては、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ  Ｓｔｒａｃｈａｎａｎｄ  Ａ  Ｐ  Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ（１９９６）中のＣｈａｐｔｅｒ  ２０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびその中の引用文献）を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量の本発明のポリペプチドを適当な製剤学上の担体とともに投与することである。
製剤および投与可溶性形態の本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニスト、または小分子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化することができる。このような製剤は治療上有効な量のポリペプチドまたは化合物と、製剤学上許容される担体または賦形剤を含有する。この種の担体としては、食塩水、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これらに限らない。製剤は投与様式に適合させるべきであり、これは当技術分野の技量の範囲内である。
本発明はさらに、前記の本発明の組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬用パックおよびキットを提供する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使用してもよい。
医薬組成物を全身投与するときの好ましい形態は、注入（注射）、一般的には静注である。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能である。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよい。
必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、一般的には、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり０．１〜１００μｇの範囲である。利用可能な化合物が多種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるため、必要とされる投与量は広範に変動することを予想すべきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏでポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に操作する。その後、この細胞を患者に導入する。
発明を実施するための最良の形態
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、本実施例における実験は、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）：”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）に従って実施可能である。
［実施例１］  Ｇタンパク質共役型受容体ＰＬＡＣＥ６００２３１２の単離
Ｇタンパク質共役型受容体ＰＬＡＣＥ６００２３１２の単離には、ヒト胎盤由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を試料にして、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。即ち、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料をバクテリアアルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理したのち、さらにバクテリアアルカリ性ホスファターゼ（ＴＡＰ）処理を行って完全長ｍＲＮＡの５’末端のＣＡＰ構造をリン酸基に変換し、これと合成オリゴＲＮＡリンカー（配列５’−ＡＧＣ  ＡＵＣ  ＧＡＧ  ＵＣＧ  ＧＣＣ  ＵＵＧ  ＵＵＧ  ＧＣＣ  ＵＡＣ  ＵＧＧ  −３’／配列番号：３）をＲＮＡリガーゼを用いて連結させた。このｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴアダプタープライマー（配列５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  −３’／配列番号：４）を用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成した後、フォワードプライマーとして５’−ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＴＴＧ  −３’（配列番号：５）、リバースプライマーとして５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  −３’（配列番号：６）を用いて、ジーンアンプＸＬ  ＰＣＲキット（パーキンエルマー社）を用いて、９５℃（５分）の後、９５℃（１分）／５８℃（１分）／７２℃（１０分）のサイクルを１５回繰り返した。このＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳｆｉＩで処理した後、ＤＮＡライゲーションキットバージョン１（宝酒造）を用いて、あらかじめ制限酵素ＤｒａＩＩＩで切断したクローニングベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３と連結させた。クローン化したｃＤＮＡの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析した。明らかになった配列を配列番号：１に示す。
同配列は１８６９塩基配列からなり、９９０塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号：７）を持っている。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（３３０アミノ酸）を配列番号：２に示す。予想アミノ酸配列は、Ｇタンパク質共役型受容体の特徴である７個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を保持している。また、第一膜貫通ドメイン直後のアスパラギン酸、第三膜貫通ドメイン直後のＤＲＹ（またはＥＲＹ）配列、第四膜貫通ドメインのトリプトファン、第四と第五膜貫通ドメイン間のシステイン、第六膜貫通ドメインのＷＸＰ配列など、モノアミン、あるいはヒスタミンをリガンドとするＧ蛋白共役型受容体の特徴（Ｌｅｕｒｓ，Ｉ．，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｉ．，Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｉ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：１１）とされるアミノ酸残基が認められ、本遺伝子がＧタンパク質共役型受容体であることが判明した。
［実施例２］  Ｇタンパク質共役型受容体ＰＬＡＣＥ６００２３１２のアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ検索
ＰＬＡＣＥ６００２３１２のアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））検索を行った。その結果を図１に示した。同一のものは存在せず、ＨＩＳＴＡＭＩＮＥ  Ｈ２  ＲＥＣＥＰＴＯＲ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｐ９７２９２）に対して２７％で最も高い相同性を示した。これらのことから、ＰＬＡＣＥ６００２３１２が新規Ｇタンパク質共役型受容体であることが判明した。
［実施例３］  Ｇタンパク質共役型受容体ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子のＧｅｎＢａｎｋに対するＢＬＡＳＴ検索
ＰＬＡＣＥ６００２３１２の塩基配列での、ＧｅｎＢａｎｋに対するＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果を図２から４に示した。ヒトゲノムドラフト配列のクローン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＣ０２１０１６，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｃｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ１１−３７８Ａ１３，ＷＯＲＫＩＮＧ  ＤＲＡＦＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ，７  ｕｎｏｒｄｅｒｅｄ  ｐｉｅｃｅｓ）と９９％で最も高い相同性を示した。このことから、Ｇタンパク質共役型受容体ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子はヒト第２染色体に存在し、２つのｅｘｏｎからなる遺伝子であることが判明した。さらに、ＡＣ０２１０１６に示される塩基配列において、ＰＬＡＣＥ６００２３１２の５’領域の塩基配列と相同性を示した塩基配列よりも５’上流側の塩基配列は、ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子の転写調節領域であることが判明した。また、同一性を示さない塩基配列は、遺伝的多型である可能性が判明した。
［実施例４］  ヒト組織におけるＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子の発現分布
ＰＬＡＣＥ６００２３１２の組織分布をＭＴＣ  ｐａｎｅｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて検討した。プライマーとしては、本クローンのＯＲＦの中で約６００ｂｐの断片が産生される領域を挟むようにプライマーを選択し、次のように設定した。プライマー１：５’−ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＣ  −３’（配列番号：８），プライマー２：５’−ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡ  −３’（配列番号：９）を作成し、ＰＣＲはＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いて、９４℃（５分）の後、９８℃（２０秒）／６８℃（５分）のサイクルを３３回繰り返した。その結果、肺、心臓、卵巣、精巣、肝臓、結腸、そして特に胎盤に由来するｃＤＮＡで約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅され、その他の臓器由来のｃＤＮＡ（前立腺、胸腺、脳、膵臓、白血球、骨格筋、腎臓、脾臓）では増幅が確認されなかった（図５）。また、ノーザンブロット解析による発現分布解析も行った。ＰＬＡＣＥ６００２３１２を制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩで処理して得られる５２８ｂｐの断片配列（配列番号：１０）を、ＤＮＡラベリングキットＢｃａＢＥＳＴ（宝酒造）を用いて標識プローブを作製し、ＭＴＮ  ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてハイブリダイゼーションの検討を行った。その結果、ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子は約１．７ｋｂのｍＲＮＡとして転写され、心臓、胎盤、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球の組織・細胞で転写物のバンドが確認された。その他の臓器由来のｍＲＮＡ（脳、肺、骨格筋、胸腺、前立腺、精巣）では転写物が確認されなかった（図６）。
［実施例５］  ＰＬＡＣＥ６００２３１２発現プラスミドの構築
ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子のコードするポリペプチドの発現を最大にするために、ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子を発現ベクターへ挿入する前に、全ての５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲｓ）の塩基配列をｃＤＮＡから取り除いた。すなわちＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子の、該ポリペプチドをコードする塩基配列のみを含むＤＮＡ断片を得るために、制限酵素サイトＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩをそれぞれ付加したプライマー（プライマー３：５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＣＧＡ  ＴＡＧ  ＧＣＡ  ＴＧ  −３’（配列番号：１１）、プライマー４：５’−ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＡ  −３’（配列番号：１２））を作製し、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３に連結されたＰＬＡＣＥ６００２３１２を鋳型ＤＮＡにして、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いてＰＣＲを行った。９４℃（５分）の後、９８℃（２０秒）／６８℃（５分）のサイクルを３０回繰り返した結果、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。この断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理し、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に、ＤＮＡライゲーションキットバージョン１（宝酒造）を用いて連結した。連結したＤＮＡ断片の塩基配列は、ジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解析し、塩基配列が正しいことを確認した上で、造成したプラスミドをｐｃＤＮＡ  ３．１（−）−ＰＬＡＣＥ６００２３１２と命名した。
［実施例６］  ＰＬＡＣＥ６００２３１２タンパク質発現２９３細胞のヒスタミンとの特異的結合
リガンド結合アッセイは受容体薬理学をつきとめるための直接的な方法を提供し、また高処理量方式にも適用が可能である。以下の実験によりＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子のコードするポリペプチドが、ヒスタミンとの結合活性を有することを示した。まず、ヒト胚腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、１０ｃｍ径細胞培養シャーレに１ｘ１０６細胞／ディッシュの細胞濃度でプレーティングして、加湿した５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で２４時間培養した後、１ディッシュあたり１０μｇのｐｃＤＮＡ  ３．１（−）−ＰＬＡＣＥ６００２３１２プラスミドをリン酸カルシウム法（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．（１９９７）５１：１７１）により導入した。１４時間培養後、新しい１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭに交換し、さらに２日間培養した。培養後、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、ＦＢＳ不添加のＤ−ＭＥＭに１ｘ１０６細胞／ｍｌになるよう懸濁し、シリコナイズＬ−２５（富士システムズ社）によりシリコナイズした平底の９６ウェルプレート（住友ベークライト）に、１ウェルあたり５０μｌずつ分注した。さらにＤ−ＭＥＭを５０μｌずつ添加後、放射性同位元素標識された［３Ｈ］−ヒスタミンを最終濃度がそれぞれ０，４０，８０，１６０ｎＭになるように加え、室温で１時間反応させた。なお、［３Ｈ］−ヒスタミンの非特異的結合を測定するためには、非標識のヒスタミンを最終濃度が１ｘ１０−５Ｍになるようにあらかじめ添加したＤ−ＭＥＭを使用した。
反応終了した細胞懸濁液は、９６ウェルフィルターで吸引濾過した。尚９６ウェルフィルターは、ｗｈｉｔｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｂｏｎｄｅｄ  ＧＦ／Ｂ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ社）を用い、各ウェルは、あらかじめ１５０μｌの０．３％ポリエチレンイミンで濾過処理して使用した。次に氷冷した洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４），５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で、１ウェルあたり１５０μｌで７回洗浄した後、フィルターを４７℃にて約１４時間乾燥させた。結合した［３Ｈ］−ヒスタミンの放射活性は、１ウェルあたり４０μｌのＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−４０（Ｐａｃｋａｒｄ社）を加え、トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ社）を用いて測定した。［３Ｈ］−ヒスタミンの特異的結合活性は、全結合活性（非標識のヒスタミンを添加しないとき）と非特異的結合活性（非標識のヒスタミンを添加したとき）の値から解析した。その結果、ｐｃＤＮＡ  ３．１（−）−ＰＬＡＣＥ６００２３１２導入ＨＥＫ２９３細胞では、［３Ｈ］−ヒスタミンの特異的結合が観察された。一方、ｐｃＤＮＡ  ３．１（−）導入ＨＥＫ２９３細胞（Ｍｏｃｋ）では、［３Ｈ］−ヒスタミンの特異的結合は観察されず、非特異的な結合が観察された（図７）。従って、ＰＬＡＣＥ６００２３１２はヒスタミンと特異的に結合するポリペプチドをコードすることが示された。このリガンド結合測定系を用いて、Ｇタンパク質共役型受容体ＰＬＡＣＥ６００２３１２のアンタゴニストやアゴニストをスクリーニングすることができる。
［実施例７］  ＰＬＡＣＥ６００２３１２のマウスホモログｃＤＮＡの単離
ＰＬＡＣＥ６００２３１２のマウスホモログｃＤＮＡの単離には、Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）法によって行った。鋳型のｃＤＮＡとしてはマウス肝臓由来のＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ（クローンテック社製）を使用した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてＰＣＲを行った。すなわち、ＰＬＡＣＥ６００２３１２のオープンリーディングフレームにある特定の塩基配列を利用して作製した、３’増幅用プライマー（配列  ５’−ＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣ−３’／配列番号：１３）とアダプタープライマー２（配列  ５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’／配列番号：１４）を用いて、９５℃（５分）の後、９５℃（３０秒）／６０℃（３０秒）／７２℃（３分）のＰＣＲサイクルを３０回繰り返し、更に７２℃（１０分）反応させ、ＰＬＡＣＥ６００２３１２のマウスホモログｃＤＮＡの３’断片を単離した。ＰＬＡＣＥ６００２３１２のマウスホモログｃＤＮＡの５’断片を単離には、５’増幅用プライマー（配列  ５’−ＧＣＡＣＴＣＧＴＡＧＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＣＡＧＣ−３’／配列番号：１５）とアダプタープライマー１（配列  ５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’／配列番号：１６）を用いて、９４℃（５分）の後、９５℃（３０秒）／６５℃（３０秒）／７２℃（３分）のＰＣＲサイクルを３０回繰り返し、更に７２℃（１０分）反応させ、ＰＬＡＣＥ６００２３１２のマウスホモログｃＤＮＡの５’断片を単離した。これらのｃＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ登録商標２．１−ＴＯＰＯに連結させ、クローン化したｃＤＮＡの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析した。これらのマウスｃＤＮＡの塩基配列を元にしてマウス全長ｃＤＮＡクローニング用の全長クローニングプライマー１（配列  ５’−ＡＴＧＧＣＣＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＴＧ−３’／配列番号：１７）と全長クローニングプライマー２（配列  ５’−ＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＧＧＧＴＡＧＧＴ−３’／配列番号：１８）を作製し、再度９５℃（４分）の後、９５℃（３０秒）／６０℃（３０秒）／７２℃（３分）のＰＣＲサイクルを３０回繰り返し、更に７２℃（１０分）反応させ、ＰＬＡＣＥ６００２３１２のマウスホモログの全長ｃＤＮＡを単離した。これをクローニングベクターｐＣＲ登録商標２．１−ＴＯＰＯに連結させ、ジデオキシターミネーター法により全長の塩基配列を解析した。明らかになった配列を配列番号：１９に示す。
同配列は１２３７塩基配列からなり、９９０塩基のオープンリーディングフレームを持っている。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（３２９アミノ酸）を配列番号：２０に示す。予想アミノ酸配列は、Ｇタンパク質共役型受容体の特徴である７個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を保持している。ＰＬＡＣＥ６００２３とのホモロジーは、塩基配列レベルで８２％、アミノ酸配列レベルで８２％であった。ＰＬＡＣＥ６００２３１２のアミノ酸とのアライメントを図８に示す。これらの結果から、本遺伝子がＰＬＡＣＥ６００２３１２のマウスホモログであることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、ヒスタミンに結合する新規なＧタンパク質共役型受容体、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該ポリペプチドの製造方法が提供された。さらに、該ポリペプチドの活性を修飾する化合物のスクリーニング方法が提供された。本発明のポリペプチドやポリヌクレオチド、または本発明のポリペプチドの活性を修飾する化合物は、本発明のヒスタミン受容体が関与する疾患の新しい予防薬や治療薬の開発への利用が期待される。さらに本発明によって、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の変異や、該遺伝子のマップされるゲノム配列の周辺領域の変異が、疾病の原因である可能性を調べる方法が提供され、遺伝子診断への利用が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＬＡＣＥ６００２３１２アミノ酸配列を「Ｑｕｅｒｙ」にして、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ全配列に対するＢＬＡＳＴ検索を行った結果を示す図である。ＨＩＳＴＡＭＩＮＥ  Ｈ２  ＲＥＣＥＰＴＯＲ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｐ９７２９２）に対して２７％で最も高い相同性を示した。
図２は、ＰＬＡＣＥ６００２３１２塩基配列を「Ｑｕｅｒｙ」にして、ＧｅｎＢａｎｋに対するＢＬＡＳＴ検索を行った結果を示す図である。ヒトゲノムドラフト配列のクローン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＣ０２１０１６，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｃｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ１１−３７８Ａ１３，ＷＯＲＫＩＮＧ  ＤＲＡＦＴ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ，７ｕｎｏｒｄｅｒｅｄ  ｐｉｅｃｅｓ）に対して９９％で最も高い相同性を示した。さらに、ＰＬＡＣＥ６００２３１２塩基配列は、２つの断片配列に分断された形で、連続するゲノム配列の異なる領域と相同性を示した。同一性を示さない塩基配列は遺伝的多型である可能性を示した。
図３は、図２の続きの図である。
図４は、図３の続きの図である。
図５は、ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子の発現分布をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す写真である。約６００ｂｐのＤＮＡ断片が肺、心臓、卵巣、精巣、肝臓、結腸、胎盤で増幅された。
図６は、ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子の発現分布をノーザン法により解析した結果を示す写真である。ＰＬＡＣＥ６００２３１２のｍＲＮＡとして約１．７ｋｂのＲＮＡ断片が、心臓、胎盤、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球で観察された。
図７は、ＰＬＡＣＥ６００２３１２ポリペプチドが、ヒスタミンと容量依存的に結合することを示した図である。鎖培養細胞を用いたヒスタミンの特異的結合を、［３Ｈ］−ヒスタミンの全結合活性と非特異的結合活性の差から解析した結果（各データポイントはｎ＝６で測定し、標準偏差を表記した）、ＰＬＡＣＥ６００２３１２ポリペプチドを発現する発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞では、ヒスタミンの特異的結合が観察された。一方、ＰＬＡＣＥ６００２３１２ポリペプチドを発現しないプラスミドを導入したＨＥＫ２９３細胞では、ヒスタミンの特異的な結合は観察されなかった。従って、ＰＬＡＣＥ６００２３１２遺伝子はヒスタミンと特異的に結合するポリペプチドをコードすることが示された。
図８は、ＰＬＡＣＥ６００２３１２のアミノ酸配列とマウスホモログのアライメントを示す図である。上段がＰＬＡＣＥ６００２３１２で、下段がマウスホモログである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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