(57)【要約】プロトロンビンを特異的に活性化する組換えエカリンタンパク質、及び当該蛋白質を、１）プロモーターの下流にエカリンをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより形質転換された微生物または動物細胞からなる形質転換体を培養し、培養液または形質転換体中にエカリンを生成蓄積せしめこれを採取する工程、２）採取・回収されたエカリン含有溶液を精製し、純化されたエカリンを得る精製工程を含む遺伝子組換え技術を用いて効率的に製造する。組換えエカリンタンパク質の工業レベルでの製造を実用化することが可能になった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｇ−Ｉｌｅ部位の切断を介してプレトロンビン−２からα−トロンビンまたはプロトロンビンからメイゾトロンビンへの変換を媒介し得る遺伝子組換えエカリン。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列もしくは当該アミノ酸配列の部分配列を有し、うち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列を含有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチド群である請求項１記載の遺伝子組換えエカリン。
【請求項３】
以下の工程を含む、遺伝子組換えエカリンの製造方法：
１）プロモーターの下流にエカリンをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより形質転換された微生物または動物細胞からなる形質転換体を培養し、培養液または形質転換体中にエカリンを生成蓄積せしめこれを採取する工程、
２）採取・回収されたエカリン含有溶液を精製し、純化されたエカリンを得る精製工程。
【請求項４】
プロモーターが、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター及びニワトリβ−アクチンプロモーターより選択される請求項３記載の遺伝子組換えエカリンの製造方法。
【請求項５】
プロモーターがニワトリβ−アクチンプロモーターである請求項４記載の遺伝子組換えエカリンの製造方法。
【請求項６】
発現ベクターが、エカリンをコードする遺伝子の上流にシグナル配列を有するものである請求項３から請求項５のいずれかに記載の遺伝子組換えエカリンの製造方法。
【請求項７】
シグナル配列がｐｅｌＢシグナル、αｆａｃｔｏｒのシグナル、イムノグロブリンのシグナルＳＧ−１及びＣ２５のシグナルより選択される請求項６記載の遺伝子組換えエカリンの製造方法。
【請求項８】
発現ベクターが、さらに遺伝子増幅遺伝子を有し、さらに形質転換体の培養を遺伝子増幅条件下に実施する請求項３から請求項７のいずれかに記載の遺伝子組換えエカリンの製造方法。
【請求項９】
遺伝子増幅遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子である請求項８記載の遺伝子組換えエカリンの製造方法。
【請求項１０】
エカリンをコードする遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列で示される遺伝子断片あるいは該エカリンタンパク質の一部のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする遺伝子断片である請求項３から請求項９のいずれかに記載の遺伝子組換えエカリンの製造方法。
【請求項１１】
形質転換体がチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ２１細胞、２９３細胞またはＣＯＳ細胞より選択される動物細胞である、請求項３から１０のいずれかに記載の遺伝子組換えエカリンの製造方法。
【請求項１２】
エカリンの精製工程が、陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを順次実施することより構成される請求項３記載の組換えエカリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は、新規なポリペプチドに関する。さらに詳細には、プロトロンビンを特異的に活性化する組換えエカリン並びに当該組換えエカリンの製造方法に関する。
背景技術
動物には、蛇毒を始めとしてクモ毒、サソリ毒、ハチ毒などのように強力な毒を有するものが存在し、その毒には神経毒や出血毒、血栓毒、生理活性ペプチド、細胞増殖因子活性など実用面で有用なものを含むことが明らかとなってきている。
エカリンはＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓより単離精製された（Ｔ．Ｍｏｒｉｔａ等：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３，５５９−５７０，１９７８）蛇毒由来のプロテアーゼで、プロトロンビンを特異的に活性化することが知られており、エカリンをコードするｃＤＮＡはＳ．Ｎｉｓｈｉｄａ等によりクローニングされ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１７７１−１７７８，１９９５）、その構造が明らかとなった。エカリンは糖タンパク質で、成熟型は総アミノ酸残基数４２６、Ｚｎ２＋キレートのほか、ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎドメインやＣｙｓ−ｒｉｃｈドメインを含み、ＲＶＶ−Ｘ（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ  ｖｉｐｅｒ  ｖｅｎｏｍ  Ｘ  アクチベーター）のＨ鎖との間に６１％の相同配列を持つモザイク構造からなる金属プロテアーゼである。また、その酵素活性はＥＤＴＡで失活し、ＤＦＰやアンチトロンビンＩＩＩで阻害を受けないことから、血液凝固第Ｘａ因子とは全く異なる酵素である。
ところで、エカリンによる活性化対象となり得るプロトロンビンは、血液凝固因子群の一つであるトロンビンの前駆物質であり、活性化されたトロンビンは、生体内においては様々な基質と相互作用し、凝固、抗凝固的に作用する多機能を有するセリンプロテアーゼである。ヒト血中においてはプロトロンビンの活性化は血液凝固第Ｘａ因子がプロトロンビンのＡｒｇ−Ｔｈｒ及びＡｒｇ−Ｉｌｅの２箇所を限定分解することにより起こるのに対し、エカリンはＡｒｇ−Ｉｌｅのみを加水分解し、プロトロンビンから分子量の大きいメイゾトロンビンを生成する。また、プレトロンビン−２（プロトロンビンのｇｌａドメイン、クリングルドメインが除かれたもの）から活性トロンビン（α−トロンビン）への変換（Ａｒｇ−Ｉｌｅの切断）はエカリンによってその基質特異性の高さから確実に行われる。Ａｒｇ−Ｉｌｅの切断は例えば同じセリンプロテアーゼに属するトリプシンによっても可能であるが、エカリンはその切断部位の特異性の高さから、トリプシンに観られるように他の部位を切断することはない。トリプシンを用いてプレトロンビン−２の活性化を行った場合、部分的にα−トロンビンへの活性化は認められるものの大部分は分解されてプレトロンビン−２すべてをα−トロンビンに変換することは不可能である。一方、プレトロンビン−２にエカリンを添加した場合、エカリンはプレトロンビン−２に１カ所しか存在しないＡｒｇ−Ｉｌｅのみを切断することから、プレトロンビン−２からα−トロンビンへの変換は分解産物を伴わず定量的に行うことが可能である。
生体内においてプロトロンビンがα−トロンビンに変化する過程においては、前述のメイゾトロンビンと呼ばれる中間体を経て活性化される。生体内では血液凝固第Ｘａ因子によりプロトロンビンのＡｒｇ−Ｉｌｅ部位が切断されメイゾトロンビンが生じ、続いてＡｒｇ−Ｔｈｒ部分の切断が血液凝固第Ｘａ因子により生じ、α−トロンビンへと活性化される。メイゾトロンビンは、蛋白分解酵素活性は有しているものの、α−トロンビンとは基質特異性が異なり、フィブリノーゲンに対する凝固活性は著しく低いが、プロテインＣの活性化能は保持していることが知られている。このようにユニークな基質特異性を示すメイゾトロンビンは、生体内では血液凝固第Ｘａ因子がプロトロンビンのＡｒｇ−Ｔｈｒ及びＡｒｇ−Ｉｌｅの２箇所を切断することから、安定な状態では存在せずα−トロンビンへと変換されてしまう。しかしながら、プロトロンビンに対してエカリンを用いて活性化を行った場合、エカリンはＡｒｇ−Ｉｌｅのみを切断することから、安定なメイゾトロンビンを調製することが可能である。また、エカリンはビタミンＫ非存在下で生合成される異常プロトロンビンに対しても作用することから、血中の異常プロトロンビン濃度の測定に利用されている。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
上述のように、エカリンは産業上有用な活性を有することが明らかとなっているが、現段階では、その原料をＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓにしか頼らざるを得ず、量的な制限から産業上利用されるには至っていない。現状では、エカリンは試薬メーカーが試薬として販売をしているが、高価であること及び供給量の少なさから、産業上有用である大量のプレトロンビン−２の活性化やメイゾトロンビンの調製を行うのは不可能である。さらにこれら原料となる野生のＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓは、常に安定に供給される保証もなく、そのヘビの持つ毒性から飼育・繁殖作業はその従事者の安全面などを考慮すると大量のエカリンを得ることは困難を極めるものである。これらエカリンをＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓより調製することに由来する危険性と限界を考慮すれば、より安全で安定な供給が可能な原料や方法が期待される。
このような状況下、本願発明の課題は、トロンビンの工業的規模での効率的製造方法を確立することを前提とし、その有力な手段として遺伝子組換え技術によるエカリンを提供することである。
（その解決方法）
そこで、本願発明者等は上述の諸問題に鑑み鋭意検討した結果、遺伝子組換え技術を用いて、効率的なエカリンの製造方法をもたらす本願発明を完成するに到った。
すなわち、本発明の目的は、Ａｒｇ−Ｉｌｅ部位の切断を介してプレトロンビン−２からα−トロンビンまたはプロトロンビンからメイゾトロンビンへの変換を媒介し得る遺伝子組換えエカリン（以下、「組換えエカリン」と称することがある）を提供することであり、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列によって特徴づけられる分子量約８０，０００のタンパク質、あるいは上記蛋白質の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列を含有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチド群をもたらすことによって達成される。
また、本発明は、上記の組換えエカリンをコードし配列番号２に記載の塩基配列で示される遺伝子断片あるいは該タンパク質の一部のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする遺伝子断片並びにこれらの遺伝子断片を含むプラスミドを包含する。さらに、上記プラスミドによって形質転換された組換え微生物および動物細胞を包含する。また、これらの形質転換体を用いて、目的とする組換えエカリンタンパク質またはその一部のアミノ酸配列を含むペプチドを製造する方法を包含する。
発明を実施するための最良の形態
エカリンのタンパク質をコードする遺伝子は、文献（Ｓ．Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１７７１−１７７８  ｐ．１９９５）に報告されている配列のものをテンプレートに用い、配列番号３及び配列番号４に記載の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲ法を用いて得ることが可能である。
完全長のエカリンタンパク質の構造領域の一部をコードするｃＤＮＡ断片を、適当な発現ベクターに組み込み、これを用いて適当な微生物又は動物細胞を形質転換し、形質転換体を培養することにより、エカリン又はその一部の蛋白質を生産することができる。エカリンタンパク質の一部を生産する場合は、ペプチド合成機を利用することもできる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの上流に、分泌のための微生物用又は動物細胞用の適当なシグナル配列を接続すれば、該タンパク質を培地中に分泌発現させることも可能である。このように分泌型に改変したＤＮＡは、培地中に分泌した該タンパク質を容易に回収できる点で有用である。シグナル配列としては、大腸菌用としてｐｅｌ  Ｂシグナル（Ｓ．Ｐ  Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１６９，４３７９−４３８３，１９８７）、酵母用としてαｆａｃｔｏｒのシグナル（Ａ．Ｊ．Ｂｒａｋｅ，Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐ２６９  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，１９８９）、動物細胞用としてイムノグロブリンのシグナルＳＧ−１（Ｈ．Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｖｏｌ．２，１２４−１３４，１９９１）、Ｃ２５のシグナル（特許、国際公開番号ＷＯ  ９４／２０６３２）などが挙げられる。
発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクター等を用いることができる。該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる微生物又は動物細胞との組み合わせにより、ＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期、サイトメガロウイルスプロモーター、ニワトリβアクチンなど、最終的に活性型のエカリンタンパク質が得られるのであればどのようなものでも良い。マーカー遺伝子として、微生物細胞用発現ベクターを用いる場合は、宿主として大腸菌を用いる場合はアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、宿主として酵母を用いる場合はＬｅｕ２遺伝子などが利用される。また、動物細胞用発現ベクターを用いる場合は、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、グルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子などを利用できる。そのような発現ベクターの一例としてｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを図１に示す。選択用添加物質としては、Ｇ４１８、ネオマイシン、メソトレキセート等が例示される。
動物細胞用の発現ベクターの場合、宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やＳＰ２／０等マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ２１細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞など様々な細胞が利用可能である。このようにして構築したエカリン発現ベクターを、例えば、ＣＯＳ７細胞（アフリカミドリザル由来）を宿主として一時的発現および、ＳＰ２／０細胞、ＣＨＯ細胞を宿主として安定的発現させることができる。
宿主細胞の形質転換は公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン等を用いる沈殿法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、用いる宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。
本発明の組換えエカリンタンパク質は、以下の方法により製造される。上記の安定的発現をさせた動物細胞を通常の培養条件、例えば、選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、４００μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌネオマイシン及び１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭアルファ培地等で培養し、ネオマイシン耐性細胞を得た後、培養上清中のエカリン酵素活性を測定する。該エカリン産生形質転換細胞をもとに無血清条件下で増殖するクローンを得た後大量培養し、回収したその培養上清から、エカリンによるプロトロンビンのα−トロンビンへの活性化を指標に精製を行い製造することができる。
本発明の組換えエカリンタンパク質の分離、精製は、前述のプロトロンビン活性化能を指標に、タンパク質化学において通常使用される方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー法、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー法等を適宜選択して行えばよい。組換えエカリンタンパク質の好ましい精製例として、実施例９以下に示すような条件で、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを順次行う方法が挙げられる。この方法により、組換えエカリンタンパク質を、プロトロンビン活性化能を指標にして、活性収率１３％で比活性で２，６００倍程度まで精製することができる。
かくして得られた精製画分を２−メルカプトエタノール存在下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を行うことにより、分子量約８０，０００のメインバンドを確認することができる（図２）。
かくして得られるエカリンは、プロトロンビンを活性化する活性を有するものである。本発明のエカリンは、プロトロンビンからのメイゾトロンビンの調製、プレトロンビン−２からα−トロンビンへの活性化、異常プロトロンビン検出試薬への利用などが可能である。
また、上述のエカリン及びその一部のアミノ配列を含むポリペプチドは、今や常法となっている方法により、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作製するための免疫抗原として使用される。かくして得られるエカリン及びその一部のアミノ配列を含むポリペプチドとの結合能を有する抗体並びに該タンパク質又はポリペプチドは、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの抗原検出系に利用することができ、診断薬を構築する材料となる。また、上記の抗体を適当な担体に結合させ、これを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、上記の抗原タンパク質を精製することができる。
以下に、実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらの例に何ら限定されるものではない。なお、以下に示す調製例及び実施例では、特に断りのない限り、ファルマシア、バイオラド、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製の試薬を使用した。
実施例１
（発現プラスミドの構築）
（１）発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）の構築
ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドｐＣＡＧＧ（特開平３−１６８０８７）を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、リン酸化Ｘｈｏ  Ｉリンカー存在下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ（Ｘｈｏ）を構築した。このｐＣＡＧＧ（Ｘｈｏ）を制限酵素Ｓａｌ  Ｉで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｐｖ２を構築した。このｐＣＡＧＧ−Ｐｖ２を制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化した後、Ｓ１ヌクレアーゼ処理を行うことでＸｈｏ  Ｉ認識配列近傍の塩基を若干削り込んだ。ヌクレアーゼ処理の後、ｄＮＴＰ存在下、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで一本鎖部位を修飾した後、リン酸化Ｓａｌ  Ｉリンカー存在下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）を構築した。
（２）発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒの構築
ＤＨＦＲ遺伝子を持つ発現プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，ｐ８５４−８６４，１９８１）を制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩで消化した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−Ｂｇｎを構築した。さらにこのｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−Ｂｇｎを制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩで消化した後、リン酸化Ｂｇｌ  ＩＩリンカー存在下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ＢｇＢを構築した。このｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ＢｇＢを制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ及びＢａｍＨ  Ｉで消化した後、アガロースゲル電気泳動により約１．７ｋｂｐの断片を取得した。上述のｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）を制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで消化した後、この１．７ｋｂｐ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧＳ１．ｄｈｆｒを構築した。
（３）発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏの構築
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）の発現プラスミドｐＭＣｌｎｅｏ−ｐｏｌｙＡ（Ｋ．Ｒ．Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５１，ｐ５０３−５１２，１９８７）を制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化した後、リン酸化ＢａｍＨ  Ｉリンカー存在下Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用い連結環状化したｐＭＣ１ｎｅｏ−２Ｂを構築した。このｐＭＣ１ｎｅｏ−２Ｂを制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動により約１．１ｋｂｐの断片を取得した。上述のｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒを制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで消化した後、この約１．１ｋｂｐの断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを構築した（図１）。
実施例２
（蛇毒エカリンｃＤＮＡの調製）
エカリンｃＤＮＡは文献（Ｓ．Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，ｐ１７７１−１７７８，１９９５）に報告されている配列のものをテンプレートとして用い、配列：ＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＴＧＧＴ（配列番号３）を有する合成ＤＮＡおよび配列：ＴＧＣＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＡＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＣＡ（配列番号４）を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを用いて、両端に制限酵素Ｘｈｏ  Ｉの認識部位を導入した。この遺伝子を制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化した後、ｐＵＣ１８にサブクローニングしたｐＵＣ．ＥＣを構築した。このプラスミドを常法によりエカリンｃＤＮＡ部分のＤＮＡ塩基配列を確認した、開始コドンから終止コドンまでが文献通りの配列を持ったエカリンｃＤＮＡを取得できた（配列番号２）。
ここで得られたエカリンｃＤＮＡは配列番号１に記載のポリペプチドをコードする。
実施例３
（エカリン発現プラスミドの構築）
実施例１にあげたｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏへ、実施例２で得られたエカリンｃＤＮＡを導入した。ｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを制限酵素Ｓａｌ  Ｉで消化した後、仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。前述のｐＵＣ．ＥＣを制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで消化し、エカリンｃＤＮＡをコードする約１．８ｋｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により精製した。脱リン酸化したプラスミドとエカリンｃＤＮＡをコードする断片とをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結環状化したｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＥＣ．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを構築した。
実施例４
（動物細胞を用いたエカリンの発現）
実施例３で記載したエカリン発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＥＣ．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを用いてＣＨＯ細胞及びＳＰ２／０  Ａｇ１４細胞を形質転換した。ＣＨＯ細胞はリン酸カルシウム法変法で、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞はＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法で形質転換を行った。
形質転換に用いた発現プラスミドは制限酵素Ｐｖｕ  Ｉで消化することであらかじめ線状化した。
（１）ＣＨＯ細胞を用いた産生能評価
ＣＨＯ細胞は以下のようにして形質転換から形質転換体の選択を行った。
形質転換の前日に細胞を１０ｃｍディッシュに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ディッシュの細胞密度で１０％ウシ胎児血清を含む核酸含有ＭＥＭアルファ培地を用い播種した。３７℃で一夜培養の後、２０μｇ／ｍＬの線状化した発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１．ＥＣ．ｄｈｆｒ．ｎｅｏを用い形質転換を行った。３５℃、３％ＣＯ２培養装置で一夜培養した後、ダルベッコＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した後、１０％透析ＦＣＳ及び５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地に培地交換した。３〜４日毎に培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２培養装置で培養を続けることで選択を行い、出現した形質転換体をプールし産生能の評価を行った。
形質転換細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で１０％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地で播種し、一夜培養した。翌日培地を、血清を含まないＹＭＭ培地（インシュリン・トランスフェリン・エタノールアミン・亜セレン酸ナトリウムを含むアミノ酸・ビタミンを強化した核酸不含ＭＥＭアルファ培地）に交換した。３５℃、５％ＣＯ２培養装置で約１４日間培養後、上清中のエカリン濃度を測定した。上清中に１０Ｕ／ｍＬのエカリンが確認できた。
（２）ＳＰ２／０細胞を用いた産生能評価
ＳＰ２／０細胞は以下のようにして形質転換体から形質転換体の選択を行った。
ＳＰ２／０細胞を冷却したダルベッコＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ＰＢＳ（−）０．８ｍＬに懸濁した１０７個の細胞をＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用キュベット（電極幅０．４ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に入れた。前述の線状化した発現プラスミド４０μｇを加えピペットで混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用い、０．２２ｋｖ、９７５μＦで１回パルスを加えた。キュベットを氷上１０分間冷却した後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む核酸含有ＭＥＭアルファ培地で約５，０００個／５０μＬとなるように希釈し、９６穴プレート５枚に５０μＬ／ｗｅｌｌずつ播種し、３５℃、３％ＣＯ２培養装置で一夜培養した。翌日１０％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加しさらに一夜培養した。翌日１ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ及び１０％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。１０日〜１４日間培養の後、出現した形質転換体をｗｅｌｌ毎に産生能評価を行った。細胞を約３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ及び２％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を用い播種した、約１４間培養後、上清中のエカリン濃度を測定した。各形質転換体は２〜１０Ｕ／ｍＬのエカリンを発現していた。この中で産生能が高かった形質転換体を、同じ培地を用いて９６ｗｅｌｌプレートに０．５個／ｗｅｌｌの濃度で２００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種することで限界希釈によるクローニングを行った。得られたクローンについてクローン毎に産生能評価を行った。各クローンを３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で２％透析ＦＣＳを含む核酸不含ＭＥＭアルファ培地を用い播種し、３５℃、５％ＣＯ２培養装置で約１４日間培養後、上清中のエカリン濃度を測定した。得られたクローンのうち、クローン＃１Ｈ−８は上清中に１５Ｕ／ｍＬのエカリンを発現していた。
このクローン＃１Ｈ−８について、ＹＭＭ培地を用い無血清培地への順応化を行った。ＹＭＭ培地に透析ＦＣＳを２％添加し増殖を確認した後、添加する血清濃度を０．５％−０．１％と低下させながら培養を行った。細胞の増殖性が良好であることを確認した後、血清を全く含まないＹＭＭ培地で培養を行い、増殖を確認したうえで、ＹＭＭ培地を用い上述の方法で産生能評価を行った。無血清培地に順応化したクローン＃１Ｈ−８は２０Ｕ／ｍＬの産生能を持っていた。
実施例５
（エカリン産生細胞の大量培養）
実施例４に示した、無血清培地に順応化したエカリン産生細胞＃１Ｈ−８をスピナーフラスコを用いて浮遊培養した。細胞を拡張の後、ＹＭＭ培地を用い２５０ｍＬスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ社製）に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で２５０ｍＬ培養した。細胞が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超える密度で細胞を１Ｌスピナーフラスコに拡張培養した。さらにこの細胞の増殖を確認した後、細胞を１Ｌスピナーフラスコ５本に拡張した。細胞を約７日間培養した後、上清に発現したエカリン濃度を測定した。約１８Ｕ／ｍＬのエカリンの発現が確認できた。
実施例６
（エカリン部分ペプチドに対する抗体の作製）
エカリンのｃＤＮＡのアミノ酸配列をホップとウッドの方法（Ｔ．Ｐ，Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．７８  ３８２４−３８２８，１９８１）に従って親水性及び疎水性の領域を明らかにした後、親水性の高い領域について配列表の配列番号５に示すＬｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓの配列を持つペプチドをペプチド合成機（アプライド社製）を用いて合成した。このペプチド５００μｇをフロイントの完全アジュバント存在下０日目、１４日目及び２８日目にフロイント不完全アジュバント存在下、ウサギの皮内に接種することで、エカリンペプチドに対するポリクローナル抗体を作製した。得られた抗体がエカリンを認識するかどうかをウエスタンブロット法により確認した。天然のエカリンを２−メルカプトエタノール非存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、泳動終了後、ゲルをトランスファーバッファー（１０ｍＭ  Ｎ−サイクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、１０％メタノール、ｐＨ１１）に５分間浸し、あらかじめ１００％メタノールおよびトランスファーバッファーの順に浸しておいたＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｖｉｌｏｎ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に重ね、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴＣＥＬＬ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて１６０ｍＡ、１６時間転写を行った。この膜を５％スキムミルクを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）でマスキングの後、ＴＢＳＴで５００倍希釈した合成ペプチド投与ウサギの血清を室温で１時間インキュベーション後ＴＢＳＴで膜を洗浄した。次にこの膜を２０００倍に希釈した抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ標識抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と室温で１時間反応させ、洗浄後コニカイムノステイニンＨＲＰ１０００（コニカ株式会社）キットを用いて染色を行った。その結果、この合成ペプチドを免役して得られた血清は、エカリンに対して特異的に反応することが確認できた。
実施例７
（エカリンの精製）
１）陽イオン交換クロマトグラフィー
エカリン産生ＳＰ２／０細胞の培養上清２０００ｍｌを２倍量の水で希釈後、１Ｍクエン酸でｐＨ５．０に合わせ０．４５μｍフィルター濾過したものを試料とする。２０ｍＭクエン酸（ｐＨ５．０）バッファーで平衡化したＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（２０ｍｌ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カラムに４ｍｌ／ｍｉｎ．の流速でアプライした。１５０ｍｌの上記バッファーでカラムを洗浄後、０ｍＭから１０００ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭクエン酸（ｐＨ５．０）２１０ｍｌの塩濃度勾配で４ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で溶出を行った。フラクションの一部を用いて、実施例６で得られた抗エカリン抗体を用いたウエスタンブロットによりエカリン溶出画分を同定、プール後，５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．０）バッファーに対して透析した。
２）陽イオン交換クロマトグラフィー
１）の陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた透析産物を、５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）で平衡化した硫酸セルロファイン（２ｍｌ：生化学工業株式会社）カラムに０．５ｍｌ／ｍｉｎ．の流速でアプライした。１４ｍｌの上記バッファーでカラムを洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．０）２０ｍｌの塩濃度勾配で０．５ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で溶出を行った。フラクションの一部を用いて、実施例６で得られた抗エカリン抗体を用いたウエスタンブロットによりエカリン溶出画分を同定後、プールした。
３）ゲル濾過
２）に示したクロマトグラフィーで得られた組換えエカリンを含むフラクションを、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）バッファーで平衡化したゲル濾過カラムＨｉＬｏａｄ  １６／６０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、０．５ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で分画を行った。分子量のスタンダードとしてＢｉｏ  Ｒａｄのゲル濾過用のマーカーを用いた。各フラクションのプロトロンビン活性化能を測定したところ、分子量８０，０００付近の画分に活性のピークが認められた。得られた精製エカリンを２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後クーマシーブリリアントブルーで染色したパターンを示す（図２）。
以上述べた３ステップの精製により、最終活性収率１３％で、比活性で培養上清と比べて２，６００倍の組換えエカリンを得た。
実施例８
（組換えエカリンによるプロトロンビンの活性化）
プロトロンビン（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍｌ）４０ｍｌにベンズアミジンを最終濃度５０ｍＭになるように加え、その混合物に組換えエカリンを最終濃度２Ｕ／ｍｌになるように添加する。この反応液を３７℃で１６時間インキュベートし、その反応液について、後述の方法に従ってトロンビンの酵素活性の測定を行った。その結果、図３に示すように、組換えエカリンを添加したプロトロンビンにＳ−２２３８切断活性が認められた。
実施例９
（組換えエカリンで活性化されたプロトロンビンＢ鎖のＮ末端アミノ酸配列）
エカリンは、プロトロンビンのＡｒｇ−Ｉｌｅ部分のペプチド結合を特異的に切断することにより、プロトロンビンをＡ鎖とＢ鎖に分けることが知られている。実施例８で得られた活性化されたトロンビンのＢ鎖について、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した。
試料を１５％ポリアクリルアミドを含むゲルを用いて２−メルカプトエタノール処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動終了後、ゲルをトランスファーバッファー（１０ｍＭＮ−サイクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、１０％メタノール、ｐＨ１１）に５分間浸し、あらかじめ１００％メタノールおよびトランスファーバッファーに順に浸しておいたＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｖｉｌｏｎ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に重ね、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴＣＥＬＬ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて１６０ｍＡ、１６時間転写を行った。転写後のＰＶＤＦ膜を水洗し、０．１％アミドブラック（含４０％メタノール、１％酢酸）で１分間染色後、蒸留水で脱色を行った。染色されたＢ鎖の分子量に相当するバンドの部分を切り出し、この膜断片を４７７Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。１０アミノ酸残基を解読した結果はＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙであった。この配列はヒトの血液由来のα−トロンビンのＢ鎖のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致し、本発明で得られた組換えエカリンが、蛇毒由来のエカリンと同様にプロトロンビンのＡｒｇ−Ｉｌｅ部分のペプチド結合を特異的に切断することを確認した。
なお、上記実施例で実施したトロンビン及びエカリンの活性測定は各々下記の記載に拠った。
１）トロンビンの活性測定
トロンビンの活性は以下の方法で測定した。
ファルコン社製２００８チューブに試料２０μｌと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー６０μｌ、０．１％ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８を２０μｌ加え、３７℃で３分間インキュベーションした。標準品としてヒトプラズマ由来精製α−トロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社から購入：ＨＣＴ−００２０）を同バッファーで５、２．５、１．２５、０．６２５、０３１２５μｇ／ｍｌに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ：第一化学薬品工業）を１００μｌ添加し攪拌混合し、３７℃で５分間の反応後０．１Ｍクエン酸溶液を８００μｌ加えて反応を停止した。反応液２００μｌを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。
２）エカリンの活性測定
エカリンの活性は以下の方法で測定した。
ファルコン社製２００８チューブに試料２０μｌと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０１％ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８バッファー（バッファー▲１▼）６０μｌを加え、更に０．０１％トリプシンを２μｌ添加して攪拌混合後、３７℃で１０分間インキュベートした。試料は濃度に応じてバッファー▲１▼で希釈を行った。その反応液に、０．４ｍｇ／ｍｌのプロトロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社から購入）を１０μｌ添加し３７℃で５分間反応させ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを１０μｌとテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ）を１００μｌ添加し攪拌混合し、３７℃で５分間の反応後０．１Ｍクエン酸溶液を８００μｌ加えて反応を停止した。反応液２００μｌを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。エカリンの活性を定量するために、シグマ社から市販されている蛇毒由来のエカリンをバッファー▲１▼で希釈し２５ｍＵ／ｍｌ、１２．５、６．２５、３．１２５ｍＵ／ｍｌを調製した。このスタンダード溶液を試料の代わりに２０μｌ加え（トリプシン溶液は加えない）、プロトロンビンを加える以降の操作は、上記と同様に行った。
（従来技術より有効な効果）
本発明によると、プロトロンビンを特異的に活性化する組換えエカリンタンパク質が提供される。今回、本発明者が見出した組換えエカリンタンパク質は未だ報告されていない新規タンパク質であり、このように、活性を持ったエカリンタンパク質を発現する、発現ベクター構築、安定発現細胞の作製、組換えエカリンタンパク質の精製など組換えエカリンタンパク質を実用化するための技術的な問題は本発明により解決され、工業レベルでの製造が可能になった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１（Ｓａｌ）．ｄｈｈｒ．ｎｅｏの模式図を示す。
図２は、エカリン産生ＳＰ２／０培養上清からエカリンの精製を行い、最終ステップのゲルろ過におけるフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク染色を行った図である。
図３は、プロトロンビンに組換えエカリンを添加した後のＳ−２２３８切断活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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