(57)【要約】本発明の目的は、新規なイソペンテニル２リン酸イソメラーゼおよびそれをコード遺伝子を取得することである。本発明によれば、以下の理化学的性質を有するイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素タンパク質が提供される。（１）作用：イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を異性化してジメチルアリル２リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する。ＤＭＡＰＰを異性化してＩＰＰを生成する。（２）基質特異性：イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を基質とする。ＤＭＡＰＰも基質とする。（３）反応条件：イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）イソメラーゼ活性には、２価金属イオン、ＦＭＮ及びＮＡＤＰＨが必須である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の理化学的性質を有するイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素タンパク質。
（１）作用：
イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を異性化してジメチルアリル２リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する。ＤＭＡＰＰを異性化してＩＰＰを生成する。
（２）基質特異性：
イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を基質とする。ＤＭＡＰＰも基質とする。
（３）反応条件：
イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）イソメラーゼ活性には、２価金属イオン、ＦＭＮ及びＮＡＤＰＨが必須である。
【請求項２】
細菌または原虫由来のタンパク質である、請求項１に記載の酵素タンパク質。
【請求項３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約３７〜４１ｋＤａの分子量を示す、請求項１又は２に記載の酵素タンパク質。
【請求項４】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素タンパク質。
（Ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されているアミノ酸配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（Ｃ）配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【請求項５】
請求項１から４の何れかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
下記の何れかの塩基配列を有するイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４に記載の塩基配列；
（Ｂ）配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４において１から数個の塩基が欠失、置換、付加及び／または挿入されている塩基配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｃ）配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項７】
請求項５または６に記載のＤＮＡを含む組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項９】
請求項５または６に記載のＤＮＡを含むベクターを宿主に形質転換して作製した形質転換体を培養してイソペンテニル２リン酸イソメラーゼを生成させる工程、及び培養物からイソペンテニル２リン酸イソメラーゼを採取する工程を含む、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項１から４の何れかに記載のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素タンパク質を用いることを特徴とする、ジメチルアリル２リン酸（ＤＭＡＰＰ）とＩＰＰの製造方法。
【請求項１１】
イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を阻害する物質を探索することを含む、生物の生育を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
生物が細菌又は原虫である、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
イソペンテニル２リン酸イソメラーゼの阻害剤から成る、生物生育抑制剤。
【請求項１４】
生物が細菌又は原虫である、請求項１３に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なイソペンテニル２リン酸イソメラーゼに関する。より詳細には、本発明は、イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を異性化してジメチルアリル２リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する活性を有するイソペンテニル２リン酸イソメラーゼに関する。
背景技術
イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）の生体内での合成経路としては２つの経路（メバロン酸経路、及び非メバロン酸経路）がある。ヒトはメバロン酸経路のみを利用する。多くの真正細菌は非メバロン酸経路のみを利用するが、黄色ブドウ状球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓなどはメバロン酸経路を利用する。
ＤＭＡＰＰに順次ＩＰＰが複数個縮合した一連の化合物群は、イソプレノイドと称される。その一例として、カロテノイド、ステロイドなどが挙げられる。
原核生物においては、非メバロン酸経路の反応並びにそれに関与する酵素は未だ全ては解明されていない。原核生物において、非メバロン酸経路の反応並びにそれに関与する酵素を全て解明できれば、それを阻害する薬剤を探索することなどにより、新規かつ有用な抗菌剤などを開発できる可能性がある。
発明の開示
本発明者らは、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株よりメバロン酸経路の酵素群をコードする遺伝子クラスターを含むＤＮＡ断片をこれまでに取得している。それらの酵素群の具体名は、メバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼである。これらの５つの酵素により、体内物質アセトアセチルＣｏＡからＩＰＰが合成される（特願平１１−３４８３７５号）。しかし、その遺伝子クラスターを含むＤＮＡ断片には、さらに、機能未知の遺伝子が一つ存在していることが判明していた。
本発明が解決しようとする課題は、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株より単離されたメバロン酸経路の酵素群をコードする遺伝子クラスター中の上記の機能未知の遺伝子の機能を解明することである。
本発明が解決しようとする別の課題は、新規なイソペンテニル２リン酸イソメラーゼおよびそれをコード遺伝子を取得することである。
本発明が解決しようとするさらに別の課題は、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼをコード遺伝子を大量発現させて得られる酵素を用いてジメチルアリル２リン酸とＩＰＰを製造する新規な方法を提供することである。
本発明者らは、上記した機能未知の遺伝子の機能を明らかにするべく様々な検討を行った結果、この遺伝子が、下記に述べる性質を持った新規なＩＰＰイソメラーゼをコードしていることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
なお、本発明のＩＰＰイソメラーゼをコードする遺伝子配列は、既知のＩＰＰイソメラーゼの遺伝子配列とは全く相同性を示さない。また、本発明のＩＰＰイソメラーゼのアミノ酸配列も、既知のＩＰＰイソメラーゼのアミノ酸配列と全く相同性を示さない。また、本発明のＩＰＰイソメラーゼは、既知のＩＰＰイソメラーゼの反応条件では反応は進行せず、マグネシウムイオン等の２価金属イオンと、ＦＭＮとＮＡＤＰＨを含むバッファー中で、ＤＭＡＰＰを生成することが分かった。
即ち、本発明によれば、以下の理化学的性質を有するイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素タンパク質が提供される。
（１）作用：
イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を異性化してジメチルアリル２リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する。ＤＭＡＰＰを異性化してＩＰＰを生成する逆反応も触媒する。
（２）基質特異性：
イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を基質とする。ＤＭＡＰＰも基質とする。
（３）反応条件：
イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）イソメラーゼ活性には、２価金属イオン、ＦＭＮ及びＮＡＤＰＨが必須である。
好ましくは、本発明の酵素タンパク質は、細菌または原虫由来のタンパク質である。
好ましくは、本発明の酵素タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約３７〜４１ｋＤａの分子量を示す。また、好ましくは、本発明の酵素タンパク質の至適温度は３７℃であり、至適ｐＨは７．０である。
好ましくは、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素タンパク質が提供される。
（Ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されているアミノ酸配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（Ｃ）配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するアミノ酸配列。
本発明の別の側面によれば、上記したタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
好ましくは、下記の何れかの塩基配列を有するイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
（Ａ）配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４に記載の塩基配列；
（Ｂ）配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４において１から数個の塩基が欠失、置換、付加及び／または挿入されている塩基配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｃ）配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを含む組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを含むベクターを宿主に形質転換して作製した形質転換体を培養してイソペンテニル２リン酸イソメラーゼを生成させる工程、及び培養物からイソペンテニル２リン酸イソメラーゼを採取する工程を含む、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼの製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有する酵素タンパク質を用いることを特徴とする、ジメチルアリル２リン酸（ＤＭＡＰＰ）とＩＰＰの製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を阻害する物質を探索することを含む、生物の生育を抑制する物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼの阻害剤から成る、生物生育抑制剤が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施態様および実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明の実施態様の説明
本明細書において「１から数個の塩基が欠失、置換、付加及び／または挿入されている」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換、付加及び／または挿入されていることを意味する。
本明細書において「１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されている」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されていることを意味する。
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２０ｎＤ  ＥＤ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９．以後“モレキュラークローニング第２版”と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、相同性は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
本発明の一態様は、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するアミノ酸配列を有する酵素タンパク質に関する。配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列との相同性は６０％以上であれば特に制限はなく、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
本発明の一側面は、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有する新規な酵素タンパク質に関する。本明細書で言う「イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性」とは、基質としてのイソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を異性化してジメチルアリル２リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する反応とその逆反応を触媒する活性を広く意味する。
本発明はまた、（Ａ）配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４に記載の塩基配列；
（Ｂ）配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４において１から数個の塩基が欠失、置換、付加及び／または挿入されている塩基配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｃ）配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
の何れかの塩基配列を有するＤＮＡを、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして使用すること、例えば、上記ＤＮＡを用いてイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質を製造することにも関する。
（２）イソペンテニル２リン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡの取得方法
本発明者らはこれまでに、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株から、メバロン酸経路上の一つの反応を触媒する酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼをコードする遺伝子（ｈｍｇｒ）をクローニングしている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１２５６，１９９９）。本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡは、放線菌のメバロン酸経路の酵素群をコードする遺伝子クラスター中に存在するが、放線菌のメバロン酸経路の酵素群をコードする遺伝子クラスターは、上記したｈｍｇｒ遺伝子をプローブとして使用することによって取得することができる。具体的には以下の方法を挙げることができる。
放線菌、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株を適当な培地、例えばＧＰＹ培地（１％グルコース、０．４％ポリペプトン、０．４％イーストエクストラクト、０．５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４）で適当な温度（例えば、３０℃）で数日間培養する。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得し、菌体より、定法（モレキュラークローニング第２版）に従い染色体ＤＮＡを単離精製する。得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素（例えば、ＳｎａＢＩなど）で切断した後，ｈｍｇｒ遺伝子をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーション（モレキュラークローニング第２版）を行う。サザンハイブリダイゼーションの結果、特定の位置（例えば、染色体ＤＮＡの消化のための制限酵素としてＳｎａＢＩを使用した場合には、６．７ｋｂの位置）にプローブのシグナルが検出される。
次に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株の染色体ＤＮＡを上記と同じ制限酵素（例えば、ＳｎａＢＩ）で再度切断後、アガロースゲル電流泳動を行い、サザンハイブリダイゼーションの結果シグナルが検出された位置（制限酵素としてＳｎａＢＩを使用した場合には、６．７ｋｂの位置）に対応するＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出して回収する。この回収したＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造から購入）を用いて平滑末端にし、適当なプラスミド（例えば、ｐＵＣ１１８など）に挿入し、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。この染色体ＤＮＡライブラリーを用いて好適な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株など）を定法（モレキュラークローニング第２版）に従って形質転換し、形質転換体をｈｍｇｒ遺伝子をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーション法によりスクリーニングすることによりｈｍｇｒ遺伝子を含むプラスミドを持つ大腸菌の形質転換体を単離することができる。単離した形質転換体から、常法に従いプラスミドを抽出することにより、ｈｍｇｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片、即ち、放線菌のメバロン酸経路の酵素群をコードする遺伝子クラスターを含むＤＮＡ断片を単離することができる。
本発明のＤＮＡ（イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ遺伝子）は上記した方法により単離することができる放線菌のメバロン酸経路の酵素群をコードする遺伝子クラスターを含むＤＮＡ断片内に存在するものである。
本明細書の配列番号２に記載の塩基配列を与えられた場合、当業者であればＰＣＲ用のプライマーを適宜設計して、放線菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、放線菌のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ遺伝子を単離することができる。具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３（ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＣＡＡＣＧＣＡＡＧＧＡＣＧ）および配列番号４（ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＧＴＣＴＧＧ）に記載の塩基配列を有するプライマーおよびＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ遺伝子を増幅することができる。
ＰＣＲの条件は当業者ならば適宜設定することができるが、例えば、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして２５サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件などが挙げられる。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は下記の通り定法に従って適当なベクター中にクローニングすることができる。
同様に、本明細書の配列番号６に記載の塩基配列を与えられた場合、当業者であればＰＣＲ用のプライマーを適宜設計して、黄色ブドウ状球菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、黄色ブドウ状球菌のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ遺伝子を単離することができる。具体的には、黄色ブドウ状球菌の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１５（５’−ＧＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＧＡＧ−３’）および配列番号１６（５’−ＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＡＴＡＴＴＣＡＡＧＴＴＡＣＧ−３’）に記載の塩基配列を有するプライマーおよびＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ遺伝子を増幅することができる。ＰＣＲの条件等は上記と同様に適宜設定することができる。
なお、原虫由来のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ遺伝子も上記の方法に準じて単離することができる。
本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ遺伝子（以下、本発明のＤＮＡとも言う）は、適当な宿主（例えば、大腸菌）で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。クローニングは、常法、例えば、モレキュラークローニング第２版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ライフ・テクノロジーズ社製）やＺＡＰ−ｃ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ〔ストラタジーン（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕を用いて行なうことができる。
クローニングベクターとしては、宿主で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｌｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｎ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＭＷ２１８（和光純薬社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）等をあげることができる。
得られた形質転換株より、目的とするＤＮＡを含有したプラスミドを常法、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法により取得することができる。
本発明の放線菌のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ酵素のアミノ酸配列の一例を配列番号１に示し、該酵素をコードする本発明のＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号２に示す。また、本発明の黄色ブドウ状球菌のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼ酵素のアミノ酸配列の一例を配列番号５に示し、該酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号６に示す。
但し、これらは一例に過ぎず、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を保持する限り、これらの配列中に変異を有する変異酵素や変異ＤＮＡも本発明の範囲内に含まれる。このような変異酵素や変異ＤＮＡは、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。具体的には、配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。例えば、配列番号２又は配列番号６に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７，１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，９４４１，１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１，１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，８７４９，１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９，１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８，１９８５、Ｇｅｎｅ，３４，３１５，１９８５、Ｇｅｎｅ，１０２，６７，１９９１等に記載の方法に準じて行うことができる。
（３）イソペンテニル２リン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡを有する形質転換体の作製と上記酵素タンパク質の発現
上記のようにして得られたＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、目的とする該ＤＮＡ断片を、制限酵素あるいはＤＮＡ分解酵素で、該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する細菌、クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母や動物細胞、昆虫細胞等をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等を宿主細胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒＰ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ＰＬＳＡ１〔Ａｇｒｃ．Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔＩＩ  ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）等を例示することができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐ  ｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐ  ｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰ  ｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐ  ｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔｌプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｍｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
目的とするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属等に属する微生物をあげることができ、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属に属する微生物等をあげることができる。
該微生物の具体例として、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｏ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４２９７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｕｂｉ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａｄｏｌｉｏｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｆｌｏｓａｑｕａｅ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｂｕｄｅｒｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｗａｒｍｉｎｇｉｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｎａｎａｓ、Ｅｒｗｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｌａｓｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｉｎａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒａｍｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ｙｃｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロブラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，５１５３，１６３（１９８３）〕、あるいはＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラークローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にイソペンテニル２リン酸イソメラーゼを生成蓄積させ、該培養物より該酵素タンパク質を採取することにより、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼを単離することができる。
本発明のＤＮＡを保持する形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭ１１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製〕、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の形質転換体の培養物から、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼを単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の酵素タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該タンパク質を回収後、該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明の酵素タンパク質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該タンパク質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明の酵素タンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易（米国Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ社製）、パーキンェルマージャバン（米国Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）、ファルマシアバイオテク（スウェーデンＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、アロカ（米国Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）、クラボウ（米国Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社製〉、日本パーセプティブ・リミテッド（米国ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製）、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
（４）イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性の測定
イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性の測定は通常の酵素活性測定法に準じて行うことができる。
即ち、活性測定の反応液に用いる緩衝液のｐＨは、目的とする酵素活性を阻害しないｐＨ範囲であればよく、最適ｐＨを含む範囲のｐＨが好ましい。
例えば、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼの場合、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８、特に好ましくは７である。
緩衝液としては、酵素活性を阻害せず、上記ｐＨを達成できるものであればいずれの緩衝液も用いることができる。該緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、硼酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、炭酸水素緩衝液などを用いることができ、好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液である。
緩衝液の濃度は酵素活性を阻害しない限り任意の濃度で用いることができるが、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍである。
また、反応液には２価金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋など）を添加する。これらの金属イオンは金属塩として添加することができ、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩などとして添加することができる。金属イオンの濃度は、反応を阻害しない限り任意の濃度でよいが、一般的には０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭである。
また、反応液には、ＦＭＮおよびＮＡＤＰＨを添加する。反応液中におけるＦＭＮの濃度は、反応を阻害しない限り任意の濃度でよいが、一般的には０．１μＭ〜１ｍＭ、好ましくは１μＭから１００μＭである。また、反応液中におけるＮＡＤＰＨの濃度は、反応を阻害しない限り任意の濃度でよいが、一般的には０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭである。
反応液には、酵素の基質としてイソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を添加する。基質の濃度は反応に支障がない限りどのような濃度でも用いることができるが、好ましくは０．０１ｍＭ〜０．２Ｍである。
反応に用いる酵素濃度は特に限定されないが、通常０．０１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で反応を行う。用いる酵素は必ずしも単一にまで精製されていなくてもよく、反応を阻害しない程度の純度を有していればよい。イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を含む細胞抽出液あるいは該酵素活性を有する細胞を使用することもできる。
反応温度は、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を阻害しない温度範囲であればよく、最適温度を含む範囲の温度が好ましい。反応温度は通常１０℃〜６０℃であり、好ましくは３０〜４０℃であり、特に好ましくは３７℃である。
活性の検出は、反応に伴う基質の減少、あるいは反応生成物の増加を、基質あるいは反応生成物を測定できる方法を用いて行うことができる。
該方法として、例えば、必要に応じて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により目的物質を分離定量する方法を挙げることができる。
（５）イソペンテニル２リン酸イソメラーゼの阻害剤から成る生物生育抑制剤
本発明は、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を阻害する物質を探索することを含む、生物の生育を抑制する物質のスクリーニング方法、並びにイソペンテニル２リン酸イソメラーゼの阻害剤から成る生物生育抑制剤にも関する。
ここで言う生物とは好ましくは、細菌又は原虫であり、本発明の生物生育抑制剤は抗菌剤又は抗原虫剤として使用することができる。細菌としては、古細菌やグラム陽性細菌などが挙げられる。また、細菌の具体例としては、ブドウ状球菌（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌等）、腸球菌、肺炎双球菌、Ａ群溶血性連鎖球菌又はライム病菌などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。原虫の具体例としては、Ｌｅｉｓｈａｍａｎｉａ属が挙げられる。
イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性とは、イソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）を異性化してジメチルアリル２リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する反応、及びその逆反応を触媒する活性を意味し、この反応を阻害する物質を探索することにより、細菌や原虫等の生物の生育を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
なお、本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子に対応する遺伝子が、黄色ブドウ状球菌にも存在することは黄色ブドウ状球菌の遺伝子データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）を用いた検索から分かっている。黄色ブドウ状球菌のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号５及び配列番号６に示す。
また、本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼは腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）にも存在しており、そのアミノ酸配列とＤＮＡ配列を配列番号７及び配列番号８に示す。
さらに、本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼは肺炎双球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）にも存在しており、そのアミノ酸配列とＤＮＡ配列を配列番号９及び配列番号１０に示す。
さらに、本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼはＡ群溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）にも存在しており、そのアミノ酸配列とＤＮＡ配列を配列番号１１及び配列番号１２に示す。
さらに、本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼはライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）にも存在しており、そのアミノ酸配列とＤＮＡ配列を配列番号１３及び配列番号１４に示す。
上記に加えて、本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼのホモログは、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、及びＬｅｉｓｈｉｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒなどにも存在することが、ホモロジー検索の結果、判明している。
イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ活性を阻害する物質の探索は、本明細書中上記した酵素活性測定系に、被験物質を添加して同様に酵素反応を行わせ、被験物質を添加しなかった場合より基質の減少量を抑えるような物質、あるいは反応生成物の生成量を抑えるような物質をスクリーニングすることによって行うことができる。
スクリーニングの方法としては、基質の減少量あるいは反応生成物の増加量などを経時的に追跡する方法、一定時間反応させた後の基質の減少量あるいは反応生成物の増加量等を測定する方法等を挙げることができる。
基質の減少量あるいは反応生成物の増加量などを経時的に追跡する方法においては、反応中１５秒〜２０分程度の間隔で基質の減少量あるいは反応生成物の増加量を測定することが好ましく、１〜３分間隔で測定することが好ましい。
一定時間反応させた後の基質の減少量あるいは反応生成物の増加量などを測定する方法においては、反応時間は１５分〜１日が好ましく、より好ましくは３０分〜２時間である。
また、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼ（ＩＰＰイソメラーゼ）は、酵素の性質によって、ｔｙｐｅ１とｔｙｐｅ２の２種類に分けることができる。ヒトのＩＰＰイソメラーゼは、Ｍｇ２＋があればＩＰＰからＤＭＡＰＰを、及びＤＭＡＰＰからＩＰＰを生成することができるｔｙｐｅ１の酵素であるのに対し、枯草菌、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株及び黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＩＰＰイソメラーゼは、Ｍｇ２＋とＦＭＮとＮＡＤＰＨの存在下でＩＰＰからＤＭＡＰＰを、及びＤＭＡＰＰからＩＰＰを生成することができるｔｙｐｅ２の酵素である。
従って、ｔｙｐｅ２のＩＰＰイソメラーゼを阻害し、ｔｙｐｅ１のＩＰＰイソメラーゼを阻害しない物質は、枯草菌、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株及び黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの生育を選択的に阻害する物質となり得る。即ち、上記阻害剤は、ｔｙｐｅ２のＩＰＰイソメラーゼを利用する生物の成育を阻害することが可能である。
ｔｙｐｅ２のＩＰＰイソメラーゼを利用する生物は、枯草菌、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株、黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＩＰＰイソメラーゼのアミノ酸配列を基に相同検索などによって特定することができる。例えば、枯草菌、放線菌、及び黄色ブドウ球菌は、ｔｙｐｅ２のＩＰＰイソメラーゼを利用する。
本発明のスクリーニング方法の一実施態様によれば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を用いたｔｙｐｅ２のＩＰＰイソメラーゼの特異的阻害剤のスクリーニング方法が提供される。以下、このスクリーニング方法を説明する。
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）はｔｙｐｅ２  ＩＰＰイソメラーゼを利用する。ＩＰＰの合成経路には、メバロン酸経路と非メバロン酸経路の全く別の２つの経路がある。メバロン酸（ＭＶＡ）は、メバロン酸経路で、ＭＶＡ  ｋｉｎａｓｅとホスホメバロン酸（ＰＭＶＡ）ｋｉｎａｓｅとジホスホメバロン酸（ＤＰＭＶＡ）ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅによってＩＰＰに変換される。
そこで、先ず、枯草菌の野生株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株にメバロン酸キナーゼとジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとホスホメバロン酸キナーゼを含むプラスミドを導入することにより、メバロン酸経路を利用することができる組み換え枯草菌を作製する。この組み換え枯草菌は、ＩＰＴＧによって誘導されたメバロン酸キナーゼとジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとホスホメバロン酸キナーゼによって、培地に添加されたＭＶＡをＩＰＰに変換することができる。さらに枯草菌が本来持っているＩＰＰイソメラーゼによってＩＰＰからＤＭＡＰＰを生成するので、メバロン酸経路を利用して生育することができる。また、枯草菌の野生株は非メバロン酸経路を有しているので、非メバロン酸経路でもＩＰＰとＤＭＡＰＰを生成することができる。即ち、上記の組み換え枯草菌は、メバロン酸経路でも非メバロン酸経路でもＩＰＰを生成することができる。
次に、上記の組み換え枯草菌の非メバロン酸経路を破壊する。非メバロン酸経路を破壊は、該経路に関与する酵素の遺伝子（例えば、ＤＸＰ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子など）を破壊することにより行う。目的とする酵素遺伝子の破壊は、相同組み換えなど当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、枯草菌のｙｌｕＢ遺伝子は、ＤＸＰ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子をコードしている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５，９８７９，１９９８）。ｙｌｕＢ遺伝子特異的な下記プライマーを用いて、ｙｌｕＢ遺伝子の全長をＰＣＲで増幅し、ベクターにクローニングする。次に、エリスロマイシン耐性遺伝子を取得し、これを上記で得たｙｌｕＢ遺伝子を含むベクターのｙｌｕＢ遺伝子中に挿入する。これにより、ｙｌｕＢ遺伝子がエリスロマイシン耐性遺伝子によって分断されたプラスミドが得られる。このプラスミドを用いて、メバロン酸経路を有する組み換え枯草菌を形質転換し、エリスロマイシン耐性株を選別することにより、相同組み換えの結果としてゲノムのｙｌｕＢ遺伝子がエリスロマイシン耐性遺伝子によって破壊されている菌株を取得することができる。なお、取得したエリスロマイシン耐性株のｙｌｕＢ遺伝子が破壊されていることは、サザンハイブリダイゼーション等の常法により確認することができる。このＤＸＰ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子（ｙｌｕＢ）破壊株は、ＩＰＴＧによって誘導されたメバロン酸キナーゼとジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとホスホメバロン酸キナーゼによって、培地に添加されたＭＶＡをＩＰＰに変換することができ、さらに本来持っているＩＰＰイソメラーゼによってＩＰＰからＤＭＡＰＰを生成することができるので生育できる。即ち、この菌株は、ＭＶＡとＩＰＴＧ存在下でのみ、メバロン酸経路のみに依存して生育できる。
非メバロン酸経路が破壊され、メバロン酸経路のみを持つ枯草菌の生育を阻害するが、メバロン産経路と非メバロン酸経路を持つ枯草菌の生育は阻害しない物質は、メバロン酸経路のうち、メバロン酸キナーゼまたはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼまたはホスホメバロン酸キナーゼまたはＩＰＰイソメラーゼを阻害する化合物である。このようにして選択された候補物質について、さらにＩＰＰイソメラーゼ活性を阻害するかどうかを測定することにより、ｔｙｐｅ２のＩＰＰイソメラーゼ阻害剤をスクリーニングすることができる。ＩＰＰイソメラーゼ活性の測定は、本明細書中上述した通りであり、酵素活性測定系に、被験候補物質を添加して同様に酵素反応を行わせ、被験候補物質を添加しなかった場合より基質の減少量を抑えるような物質、あるいは反応生成物の生成量を抑えるような物質をスクリーニングすることによって行うことができる。
以下の実施例により本発明を具体的に示すが、本発明はこれらの実施例によって限定されることはない。
実施例
実施例１：ｏｒｆＤ遺伝子を含む発現ベクターの構築
メバロン酸経路の酵素群をコードする遺伝子クラスター中に存在する遺伝子であるｏｒｆＤを含む発現ベクターを以下の通り構築した。
配列番号３に示した配列を有するセンスプライマーおよび配列番号４に示した配列を有するアンチセンスプライマーを購入した（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）。
2002006491.tif 000002
該センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端にはそれぞれＢａｍＨＩの制限酵素サイトを付加させた。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、これらのプライマーおよびＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｇｅｒ社製）を用い、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）でＰＣＲを行うことによりｏｒｆＤを増幅した。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルと２５サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
増幅されたＤＮＡ断片およびｐＵＣ１１８（宝酒造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、各々のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。
これら精製された両断片を混合した後エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡがｏｒｆＤであることをＤＮＡ配列を決定することによって確認した後、該組換え体からプラスミドを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動を行いＢａｍＨＩ処理ｏｒｆＤ含有ＤＮＡ断片を取得した。
ｐＱＥ３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を制限酵素ＢｏｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いＢａｍＨＩ（宝酒造社製）処理ｐＱＥ３０断片を取得した。
上記で取得されたＢａｍＨＩ処理ｏｒｆＤ含有ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ消化ｐＱＥ３０断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得し、ｐＱＥＯＲＦＤと命名した。
実施例２：ｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質の活性測定
ｏｒｆＤはメバロン酸経路の酵素群をコードする遺伝子クラスター中に存在することから、ｏｒｆＤは、それらの酵素群の最終生成物であるＩＰＰを基質にする酵素をコードしていると予想した。そこで、ｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質を精製し、該蛋白質がＩＰＰを基質として利用する酵素であるか否かを調べた。
（１）ｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質の精製
実施例１で作成したｐＱＥＯＲＦＤを常法によりｐＲＥＰ４を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５株（ＱＩＡＧＥＮ社製）に導入し、アンピシリン２００μｇ／ｍｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍｌに耐性を示すＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５（ｐＲＥＰ４，ｐＱＥＯＲＦＤ）株を得た。
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５（ｐＲＥＰ４，ｐＱＥＯＲＦＤ）株をアンピシリン２００μｇ／ｍｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地１００ｍｌ中にて３７℃で培養し、６６０ｎｍの濁度が０．６に達した時点でＩＰＴＧを終濃度０．１１ｍＭになるように添加した。さらに１８℃で５時間培養した後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）によって培養上清を除いた。この菌体を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６ｍｌに懸濁し、超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて氷冷しつつ破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）にかけ、上清を回収した。この細胞抽出液遠心上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースレジンカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）に通し、２０ｍｌの洗浄緩衝液〔１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭイミダゾール、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０〕で洗浄した。ついで溶出緩衝液〔１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、２００ｍＭイミダゾール〕１０ｍＭを通塔し、溶出液を１ｍｌずつ分画した。
各分画についてタンパク量を、タンパク量定量キット（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて測定し、タンパクを含む画分を精製タンパク画分とした。
精製したｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質は黄緑色を有し、可視部３７４ｎｍと４５４ｎｍに吸収極大を持つことから典型的なフラビン含有蛋白質であった。
（２）ｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質の酵素活性測定
１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、１７．９ｎＭ  ＦＭＮ（シグマ社）、１４２．８ｎＭ  ＮＡＤＰＨ（シグマ社）と、上記したｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質を０．５μｇ含む反応液５０μｌに、０．４１ｍＭ  ＩＰＰと４０μＭ［１−１４Ｃ］ＩＰＰ（１．１１ｋＢｑ）（室町薬品株式会社）を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。反応後、２５％塩酸メタノール溶液０．２ｍｌと水０．５ｍｌを加えて３７℃でさらに１０分間インキュベートした。次いで、酵素反応液にＮａＣｌを加えて飽和させ、０．５ｍｌのトルエンを加えて、液相分配した。トルエン層（上層）を回収し、無水Ｎａ２ＳＯ４を加えた。３００μｌのトルエン層を１ｍｌ乳化カクテル（同仁化学研究所製）に加えて可溶化し、トルエン層内の放射活性量を液体シンチレーションカウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で測定した。この放射活性量は、酵素反応によって生成したＤＭＡＰＰ量を表している。
（３）反応産物の構造解析
反応産物の構造解析は以下の方法で行った。１００ｍＭ  リン酸バッファ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、１７．９μＭ  ＦＭＮ（シグマ）、１４２．８μＭ  ＮＡＤＰＨ（シグマ）と、上記ｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質を０．５μｇ含む反応液１０ｍｌに、０．５ｍＭ  ＩＰＰを加え、３７℃で１２時間インキュベートした。酵素反応液を凍結乾燥後、全量を重水０．５ｍｌに可溶化し、１Ｈ−核磁気共鳴分析装置（ＪＥＯＬ社製）を用いて構造解析を行った。対照としてｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質を含まない酵素反応液を調製し、同様に反応させた。対照と比較して、新たに現れるピークを反応生成物として解析した。
基質のＩＰＰ：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：３．８８（ｄｔ，Ｊ＝１．８，６．９Ｈｚ，Ｈ−１ａ），３．８７（ｄｔ，Ｊ＝１．５，６．４Ｈｚ，Ｈ−１ｂ），２．２１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｈ−２），４．６８（ｓ，Ｈ−４ａ），４．６５（ｓ，Ｈ−４ｂ），１．５８（ｓ，５−Ｍｅ）．
反応生成物：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：４．２７（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ−１ａ），４．２６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），５．２５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，７．６Ｈｚ，Ｈ−２），１．５７（ｓ，５−Ｍｅ）．
これらのスペクトルデーターから、反応産物の構造を、ジメチルアリル２リン酸（ＤＭＡＰＰ）と決定した。
以上により、ｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質は、既知のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼとは全く異なるタイプのＩＰＰイソメラーゼであると同定された。即ち、イソペンテニル２リン酸イソメラーゼはヒトにも存在するが、ヒトのイソペンテニル２リン酸イソメラーゼはＦＭＮとＮＡＤＰＨを必須とはしない。従って、本発明のｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質は、既知のヒトのイソペンテニル２リン酸イソメラーゼとは異なるものである。
なお、ＤＭＡＰＰを基質とした場合も、上記の反応条件で、ＩＰＰが生成することも確認した。
（４）酵素の性質
以下、本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼの性質を記載する。
（ｉ）  精製したＩＰＰイソメラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、４１ｋＤａの分子量を示した。Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥで１５０ｋＤａに単一のバンドが見られることから４量体を形成していることが分かった。
（ｉｉ）  このＩＰＰイソメラーゼの反応には、２価金属イオンは必須であり、中でもＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋で高い酵素活性を示した。Ｍｇ２＋を加えたときのＩＰＰイソメラーゼ活性を１００％とすると、Ｍｇ２＋の代わりにＭｎ２＋を加えた場合は、７１％であり、Ｍｇ２＋の代わりにＣａ２＋を加えた場合は、９１％であった。
また、ＩＰＰイソメラーゼの反応には、ＦＭＮとＮＡＤＰＨが必須である。
（ｉｉｉ）  酵素反応液中に加えるＦＭＮの濃度は、ＩＰＰイソメラーゼの１／８から１／４の濃度が至適であった。また、酵素反応中に加えるＮＡＤＰＨの濃度はＩＰＰイソメラーゼの２倍の濃度が至適であった。
（ｉｖ）  至適温度は３７度。至適ｐＨは７．０であった。
（ｖ）  基質であるＩＰＰと反応生成物のＤＭＡＰＰ比は生成するＤＭＡＰＰ量から計算した。本酵素は酵素反応が定常状態に達するのに２時間を必要とした。そこで、２時間後のＤＭＡＰＰ生成量からＩＰＰ：ＤＭＡＰＰ比を計算した場合、１．６：１であることを明らかにした。既知のＩＰＰイソメラーゼあるブタのＩＰＰイソメラーゼでは、ＩＰＰ：ＤＭＡＰＰ比は、１：１３．３ある（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５，３２６３，１９６０）。
実施例３：黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の組み換えＩＰＰイソメラーゼのクローニング、発現、精製、及び性状決定
実施例１で取得したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株のＩＰＰイソメラーゼのアミノ酸配列と相同性を示す配列を、ＦＡＳＴＡプログラムを使って、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのデーターベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｓ＿ａｕｒｅｕｓ／）から抽出した。この相同配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３株のＩＰＰイソメラーゼと考えられる。得られた配列を基に、ＢａｍＨＩ制限部位（下線部）を有する下記の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
2002006491.tif 000003
これらの２種類のプライマーとＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３由来の全ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ＩＰＰイソメラーゼ遺伝子を増幅した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来の組み換えＩＰＰイソメラーゼのクローニング、発現及び精製は、実施例１に記載したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株由来のｏｒｆＤ遺伝子を含む発現ベクターの構築、並びに実施例２（１）に記載したｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質の精製の場合と同様の方法で行った。即ち、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を発現ベクターｐＱＥ３０のＢａｍＨＩサイトに連結して、組み換え体ＤＮＡを取得し、ｐＱＳＡＵ３９と命名した。
上記で得たＳ．ａｕｒｅｕｓ由来の組み換えＩＰＰイソメラーゼの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した結果、３９ｋＤａのサブユニット分子量が示された。また、ネイティブＰＡＧＥゲルでは１５０ｋＤａに相当する移動度を有する単一のタンパク質バンドを示した。ゲルろ過（０．１５ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１．６×６０ｃｍ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を使用）で測定した場合は、見掛け分子量が１５５ｋＤａであった。これらの結果から、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＩＰＰイソメラーゼはテトラマーである可能性が高いことが分かった。
また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＩＰＰイソメラーゼの酵素活性を、実施例２（２）ｏｒｆＤ遺伝子がコードする蛋白質の酵素活性測定の場合と同様に測定した。その結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＩＰＰイソメラーゼも、ＦＭＮとＮＡＤＰＨの存在下においてＩＰＰを異性化してＤＭＡＰＰを生成する反応を触媒することが確認された。また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＩＰＰイソメラーゼの活性発現のためには２価金属イオンが必須であり、Ｍｇ２＋で最大活性を示した。
実施例４：各種ＩＰＰイソメラーゼの酵素活性の比較
実施例１で調製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のＩＰＰイソメラーゼ及び実施例３で調製したＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＩＰＰイソメラーゼの反応速度パラメーターを計算し、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びヒト由来のＦＭＮ−及びＮＡＤＰＨ−非依存性ＩＰＰイソメラーゼのパラメーターと比較した。結果を以下の表１に示す。
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表１の結果から分かるように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のＩＰＰイソメラーゼのＫｃａｔは０．７０であり、ヒトやＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＩＰＰイソメラーゼ（Ｋｃａｔはそれぞれ、１．８及び８．０）よりも活性が低かった。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のＩＰＰイソメラーゼの活性は、Ｅ．ｃｏｌｉのＩＰＰイソメラーゼとほぼ同等であった。しかし、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のＩＰＰイソメラーゼのＩＰＰに対するＫｍ値は４５０μＭであり、他のイソメラーゼよりも１０〜５０倍高かった。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＩＰＰイソメラーゼの触媒効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）は６．８×１０４Ｍ−１・ｓ−１であり、これは試験した３種類のＦＭＮ−及びＮＡＤＰＨ−非依存性ＩＰＰイソメラーゼの場合とほぼ同等であった。
実施例５：組み換え枯草菌を用いたＩＰＰイソメラーゼ阻害剤のスクリーニング（１）枯草菌野生株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株へのメバロン酸経路の導入  枯草菌野生株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株にメバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼとジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを含むプラスミドｐＢＭＶ５を導入した。
先ず、枯草菌内で機能するメバロン酸経路に関与するタンパクをコードするＤＮＡを、特願２０００−５６７５３号明細書に記載される通り取得した。なお、特願２０００−５６７５３号明細書に記載された内容は全て本明細書の開示として本明細書中に引用するものとする。
先ず、常法に従い、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株より染色体ＤＮＡを単離・精製した。配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、配列番号２３および２４の塩基配列の組み合わせを有するセンスプライマーおよびアンチセンスプレイマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。配列番号１７よび１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、配列番号２３および２４の塩基配列の組み合わせを有するセンスプライマーおよびアンチセンスプレイマーをそれぞれ用いて、ＣＬ１９０株の染色体ＤＮＡを鋳型に下記ＰＣＲを行うことにより、それぞれ、メバロン酸経路に関与する酵素をコードするＤＮＡ断片を増幅することができる。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらのプライマーとＥｘｐａｎｄ．Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９５℃で１分間の後、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
ＰＣＲにより増幅されたそれぞれのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により各々取得し、精製後、５μｌのＴＥバッファーに溶解した。
該溶液に、ｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）０．５μｌを各々加え、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、大腸菌ＪＭ１０９株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃で１晩振盪培養した。得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的の正しい塩基配列のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号２５に記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＧＥＭＭＶＫ１、配列番号２６に記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＧＥＭＭＤＣ、配列番号２７に記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＧＥＭＭＶＫ２、配列番号２８に記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＧＥＭＨＹＰと命名した。
ｐＧＥＭＭＶＫ２をＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩで処理し、配列番号２７に記載の塩基配列を有する断片をアガロースゲル電気泳動により取得後、発現ベクターｐＡＡ１０１（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に常法によりサブクローニングした。該サブクローニングにより得られたプラスミドをｐＢＭＶ１と命名した。
ｐＧＥＭＨＹＰをＣｌａＩおよびＳｐｈＩで処理し、配列番号２８に記載の塩基配列を有する断片をアガロースゲル電気泳動により取得後、ｐＢＭＶ１に常法に従いサブクローニングした。該サブクローニングにより得られたプラスミドをｐＢＭＶ２と命名した。
ｐＧＥＭＭＤＣをＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで処理し、配列番号２６に記載の塩基配列を有する断片をアガロースゲル電気泳動により取得後、ｐＢＭＶ２に常法に従いサブクローニングした。該サブクローニングにより得られたプラスミドをｐＢＭＶ３と命名した。
ｐＧＥＭＭＶＫ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで処理し、ｐＢＭＶ３に常法に従いサブクローニングした。該サブクローニングにより得られたプラスミドをｐＢＭＶ４と命名した。
ｐＢＭＶ４をＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩで消化し得られた２．１ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＢＭＶ１のＨｉｎｄＩＩＩサイトとＢｇｌＩＩサイトの間に挿入し、ｐＢＭＶ５と命名した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株にｐＢＭＶ５を導入し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（ｐＢＭＶ５）を得た。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（ｐＢＭＶ５）は、ＩＰＴＧによって誘導されたメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼによって、培地に添加されたＭＶＡをＩＰＰに変換することができる。さらにＩＰＰを、枯草菌が本来持っているＩＰＰイソメラーゼによってＤＭＡＰＰを作ることができるので、メバロン酸経路を利用して生育することができる。また、枯草菌の野生株は非メバロン酸経路も持っているので、非メバロン酸経路でもＩＰＰとＤＭＡＰＰを作ることができる。つまり、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（ｐＢＭＶ５）は、メバロン酸経路でも非メバロン酸経路でもＩＰＰを作ることができる。
（２）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（ｐＢＭＶ５）の非メバロン酸経路の酵素ＤＸＰ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子を破壊（非メバロン酸経路の破壊）
枯草菌のｙｌｕＢ遺伝子は、ＤＸＰ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子をコードしている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５，９８７９，１９９８）。
ｙｌｕＢ遺伝子特異的な下記プライマー：
2002006491.tif 000005
を用いて、ｙｌｕＢ遺伝子の全長をＰＣＲで増幅し、大腸菌用ベクターｐＵＣ１１８のＸｂａＩサイトにクローニングし、ｐＵＣｄｘｒと命名した。
次に、エリスロマイシン耐性遺伝子を下記プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲの鋳型には、エリスロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＭＵＴＩＮ２を用いた。なお、両末端にはＥｃｏＴ２２１サイトを付与した。
2002006491.tif 000006
次に、エリスロマイシン耐性遺伝子を含むこの増幅ＤＮＡ断片を、ｐＵＣｄｘｒのｙｌｕＢ遺伝子中に存在するＥｃｏＴ２２１サイトに挿入した。これにより、ｙｌｕＢ遺伝子がエリスロマイシン耐性遺伝子によって分断されたプラスミドｐＵＣｄｘｒ：：ｅｒｍが完成した。ｐＵＣｄｘｒ：：ｅｒｍでＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（ｐＢＭＶ５）を形質転換し、エリスロマイシン耐性クローンを選別した。なお、エリスロマイシン耐性クローンでは、相同組み換えの結果としてゲノムのｙｌｕＢ遺伝子がエリスロマイシン耐性遺伝子によって分断され破壊されていることが予測される。取得したエリスロマイシン耐性クローンのｙｌｕＢ遺伝子が破壊されていることは、サザンハイブリダイゼーションにより確認した。このＤＸＰ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子（ｙｌｕＢ）破壊株を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｄｅｌｙｌｕＢ（ｐＢＭＶ５）と命名した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｄｅｌｙｌｕＢ（ｐＢＭＶ５）は、ＩＰＴＧによって誘導されたＭＶＡ  ｋｉｎａｓｅ、ＰＭＶＡ  ｋｉｎａｓｅ、ＤＰＭＶＡ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅによって、培地に添加されたＭＶＡをＩＰＰに変換することができる。さらにＩＰＰを、本来持っているＩＰＰイソメラーゼによってＤＭＡＰＰを作ることができるので生育できる。従って、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｄｅｌｙｌｕＢ（ｐＢＭＶ５）は、ＭＶＡとＩＰＴＧ存在下でのみ、メバロン酸経路のみに依存して生育できる。
（３）ＩＰＰイソメラーゼの阻害剤のスクリーニング
メバロン酸経路のみを持つＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｄｅｌｙｌｕＢ（ｐＢＭＶ５）の生育を阻害するが、メバロン産経路と非メバロン酸経路を持つＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（ｐＢＭＶ５）の生育は阻害しない化合物は、メバロン酸経路のうち、メバロン酸キナーゼまたはホスホメバロン酸キナーゼまたはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼまたはＩＰＰイソメラーゼを阻害する化合物である。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｄｅｌｙｌｕＢ（ｐＢＭＶ５）を、３．４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと０．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７．Ｃで一晩振とう培養した。３．４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと０．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンと１ｍＭのＩＰＴＧと０．０２％のＭＶＡを含む普通ブイヨン培地（栄研化学社製）に上記培養液を１／１０００量添加した寒天培地を作成した。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（ｐＢＭＶ５）を、３．４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７．Ｃで一晩振とう培養した。３．４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと１ｍＭのＩＰＴＧと０．０２％のＭＶＡを含む普通ブイヨン培地（栄研化学社製）に上記培養液を１／１０００量添加した寒天培地を作成した。
ここで、ＩＰＴＧの存在下においてのみｐＢＭＶ５上の遺伝子は発現する。
被検体５０μｌをペーパーディスクに滴下し、上記２種類の寒天培地上にのせ３７℃で一晩培養した。
培養終了後、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（ｐＢＭＶ５）を添加した培地では被検体による生育阻止円が観察されず、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｄｅｌｙｌｕＢ（ｐＢＭＶ５）を添加した培地では被検体による生育阻止円が観察される場合には、該被検体中には、メバロン酸キナーゼまたはホスホメバロン酸キナーゼまたはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼまたはＩＰＰイソメラーゼを阻害する化合物が含まれていると予測される。得られた候補物質について、ＩＰＰイソメラーゼ活性を阻害するかどうか判別することにより、目的とするＩＰＰイソメラーゼ阻害剤を取得することができる。
産業上の利用の可能性
本発明により、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株より単離されたメバロン酸経路の酵素群をコードする遺伝子クラスター中の機能未知の遺伝子の機能が解明された。また、本発明により、新規なイソペンテニル２リン酸イソメラーゼおよびそれをコード遺伝子を提供することが可能になった。また、本発明のイソペンテニル２リン酸イソメラーゼの阻害剤を探索することにより、生物の生育を抑制する物質（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌などの黄色ブドウ状球菌、腸球菌、肺炎双球菌、Ａ群溶血性連鎖球菌又はライム病菌に対する抗菌剤や抗原虫剤）を開発することが可能になる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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