(57)【要約】本発明は、小動物にＣ型肝炎ウイルスを効率的に感染させる方法に関する。すなわち、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡを含むＲＮＡを肝臓内へ投与する工程、又はＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むベクターを導入した動物細胞の培養上清を小動物に投与する工程を含む、小動物へのＣ型肝炎ウイルス感染方法、並びにこれらの方法でＣ型肝炎ウイルスを感染させた小動物に関する。また、本発明は、ウイルス産生量を指標としたＣ型肝炎ウイルス関連疾患治療剤又はＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質のスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む小動物へのＣ型肝炎ウイルス感染方法。
１）Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡを含むＲＮＡを調製する工程
２）上記ＲＮＡを小動物の肝臓内へ投与する工程
【請求項２】
小動物が、ツパイである請求の範囲第１項記載のＣ型肝炎ウイルス感染方法。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、Ｃ型肝炎ウイルスの完全長のゲノムＲＮＡである請求の範囲第１項又は第２項記載のＣ型肝炎ウイルス感染方法。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡを含むＲＮＡの調製を、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺを用いて行う請求の範囲第１項〜第３項のいずれか一項に記載されたＣ型肝炎ウイルス感染方法。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡを含むＲＮＡの調製を、細胞外で行う請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一項に記載されたＣ型肝炎ウイルス感染方法。
【請求項６】
請求の範囲第１項〜第５項のいずれか一項に記載の方法でＣ型肝炎ウイルスを感染させた小動物。
【請求項７】
以下の工程を含む小動物へのＣ型肝炎ウイルス感染方法。
１）Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むベクターを動物細胞に導入する工程
２）上記細胞を培養する工程
３）上記細胞の培養上清を小動物に投与する工程
【請求項８】
小動物が、ツパイである請求の範囲第７項記載のＣ型肝炎ウイルス感染方法。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、Ｃ型肝炎ウイルスの完全長のゲノムＲＮＡである請求の範囲第７項又は第８項記載のＣ型肝炎ウイルス感染方法。
【請求項１０】
ベクターが、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺである請求の範囲第７項〜第９項のいずれか一項に記載のＣ型肝炎ウイルス感染方法
【請求項１１】
請求の範囲第７項〜第１０項のいずれか一項に記載の方法でＣ型肝炎ウイルスを感染させた小動物。
【請求項１２】
以下の工程を含むＣ型肝炎ウイルス関連疾患治療剤又はＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
１）請求の範囲第６項又は第１１項記載の小動物に被験物質を投与する工程
２）上記小動物のＣ型肝炎ウイルス量を測定する工程
３）被験物質を投与しない場合と比較して、Ｃ型肝炎ウイルス量を減少させる物質を選択する工程
【請求項１３】
以下の工程を含むＣ型肝炎ウイルス関連疾患治療剤又はＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
１）Ｃ型肝炎ウイルスを産生可能な動物細胞に被験物質を接触させる工程
２）上記細胞を培養する工程
３）上記細胞の培養上清中のＣ型肝炎ウイルス量を測定する工程
４）被験物質を接触させない場合と比較して、Ｃ型肝炎ウイルス量を減少させる物質を選択する工程
【請求項１４】
以下の工程を含むＣ型肝炎ウイルス関連疾患治療剤又はＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制する物質のスクリーニング方法。
１）Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むベクターが導入された動物細胞に被験物質を接触させる工程
２）上記細胞を培養する工程
３）上記細胞の培養上清中のＣ型肝炎ウイルス量を測定する工程
４）被験物質を接触させない場合と比較して、Ｃ型肝炎ウイルス量を減少させる物質を選択する工程
【請求項１５】
Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むベクターがＨＣＶの完全長ＲＮＡを発現するベクターである請求の範囲第１４項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ベクターがｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺである請求の範囲第１４項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、小動物へＣ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」という）を効率的に感染させる方法に関する。本発明の感染方法は、ＨＣＶの感染率を向上させることができるので、Ｃ型肝炎の疾患モデル動物の作製に有用である。また、本発明はＨＣＶ関連疾患治療剤又はＨＣＶの増殖を抑制する物質の検索に有用な新規スクリーニング方法にも関する。
背景技術
ＨＣＶは、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎の主な原因ウイルスであり（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６５４７−６５４９（１９９０））、このウイルスに起因する肝炎は慢性化率が高く、肝硬変や肝がんに移行する率も高いことから、確実な治療手段の発見が急がれている疾患のひとつである。このウイルスのｃＤＮＡは１９８９年にＣｈｏｏらによりクローニングされ（Ｃｈｏｏ，Ｑ．−Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９−３６２（１９８９））、フラビウイルス科に属する一本鎖ＲＮＡウイルスであることも知られている（Ｋａｔｏ，Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７，９５２４−９５２８（１９９０））。これまでにいくつかの研究グループにより全塩基配列およびアミノ酸配列の解明がなされいる（Ｋａｔｏ，Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７，９５２４−９５２８（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８，２４５１−２４５５（１９９１）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，１１０５−１１１３（１９９１）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２６９７−２７０４（１９９１）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８８，３３１−３４１（１９９２））。
このようにＨＣＶに関する報告は数多いが、未だ明らかになっていない点も多い。例えば、ＨＣＶの感染、複製、細胞外への放出といった機構についてはほとんどわかっていないのが現状である。これらの機構の解明が遅れている原因として、ＨＣＶに感染する動物の種類が限られており、適当な疾患モデル動物の作製が困難であるということ、及び抗ＨＣＶ作用を検討するための簡易なスクリーニング系が確立されていないことが挙げられる。
ＨＣＶに感染するヒト以外の動物としては、チンパンジーが知られている（Ａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，（１９７８）Ｌａｎｃｅｔ　１，４５９−４６３、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ　ａｌ．，（１９７９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３，２５３−２６９）。しかし、チンパンジーは、数が少なく、高価であり、飼育も困難であるといった問題があることから、モデル動物として適当ではない。
Ｘｉｅらは、東南アジア産の小型の哺乳類であるツパイがＨＣＶに感染することを報告している（Ｚｈｉ−Ｃｈｕｎ　Ｘｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｏｌｏｇｙ　２４４，５１３−５２０（１９９８））。ツパイは、チンパンジーよりもはるかに飼育が容易であるため、新たなモデル動物としての利用が期待されている。しかし、Ｘｉｅらの報告によれば、ツパイへのＨＣＶの感染率は３０％程度であり、必ずしも高くない。
発明の開示
本発明の目的は、ツパイをはじめとした各種小動物へのＨＣＶの感染率を向上させ、より効率的にＨＣＶのモデル動物を作製する手段を提供することにある。また、本発明の別な目的は、抗ＨＣＶ作用を検討するための簡易なスクリーニング方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＨＣＶゲノムＲＮＡ（以下、単に「ＨＣＶ　ＲＮＡ」という場合がある）を小動物の肝臓に投与すること、及びＨＣＶゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（以下、単に「ＨＣＶ　ｃＤＮＡ」という場合がある）を含むベクターを動物細胞に導入し、その細胞を培養して得られる培養上清を小動物に投与することにより、小動物へのＨＣＶの感染率が飛躍的に向上することを見出した。また、上記ＨＣＶ　ｃＤＮＡ導入細胞の培養上清又は上記ＨＣＶ感染小動物を利用すれば、ウイルスの産生量を指標とした簡易なスクリーニング系が確立できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の工程を含む小動物へのＨＣＶ感染方法である（以下、これを「第一の感染方法」という）。
１）ＨＣＶのゲノムＲＮＡを含むＲＮＡを調製する工程
２）上記ＲＮＡを小動物の肝臓内へ投与する工程
また、本発明は、以下の工程を含む小動物へのＨＣＶ感染方法である（以下、これを「第二の感染方法」という）。
１）ＨＣＶのゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むベクターを動物細胞に導入する工程
２）上記細胞を培養する工程
３）上記培養細胞の培養上清を小動物に投与する工程
更に、本発明は、上記方法でＨＣＶを感染させた小動物である
更に、本発明は、ウィルス産生量を指標としたＨＣＶ関連疾患治療剤又はＨＣＶの増殖を抑制する物質のスクリーニング方法である。
前記スクリーニング方法は、
１）上記ＨＣＶ感染小動物に被験物質を投与する工程を含む方法であってもよく、また、
２）ＨＣＶを産生可能な動物細胞に被験物質を接触させる工程を含む方法であってもよく、さらに、
３）ＨＣＶのゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むベクターが導入された動物細胞に被験物質を接触させる工程を含む方法であってもよい。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０００−３０３３７４号の明細書に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
第一の感染方法は、ＨＣＶ　ＲＮＡを含むＲＮＡを調製する工程、及び上記ＲＮＡを小動物の肝臓内へ投与する工程を含むものである。
小動物としては、本発明の感染方法によってＨＣＶを感染させることのできるものであればどのようなものでもよいが、好ましくは、ネズミ目、ハネジネズミ目、ウサギ目、ツパイ目の小動物を挙げることができ、特に好ましくはツパイ（Ｔｕｐａｉａ　ｂｅｌａｎｇｅｒｉ）を挙げることができる。
調製するＲＮＡは、ＨＣＶ　ＲＮＡの一部を含むＲＮＡであってもよいが、完全長のＨＣＶ　ＲＮＡを含むものが好ましい。完全長のＨＣＶ　ＲＮＡは、例えば、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺを用いて調製することができる。ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺは、図１に示すように、完全長のＨＣＶ　ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとその両端にリボザイムに対応する配列を含む。ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺの転写産物は、この二つのリボザイムのセルフプロセッシングにより、ＨＣＶの完全長のＨＣＶ　ＲＮＡになる。
ＲＮＡの調製は、細胞内で行ってもよく、細胞外で行ってもよい。細胞外での調製は、例えば、ＨＣＶ　ｃＤＮＡを含むベクターと市販のｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写キットとを用いて行うことができる。なお、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺの転写反応を細胞外で行った場合、セルフプロッシングが完全に起きず、完全長のＨＣＶ　ＲＮＡに余分な配列が付加したＲＮＡが得られることがあるが、このようなＲＮＡも上述の「ＨＣＶ　ＲＮＡを含むＲＮＡ」に包含される。
肝臓へのＲＮＡの投与は、ポリヌクレオチドを真核細胞へ導入する一般的な方法を採用して行うことができる。そのような方法としては、リポソーム法、リポフェクション法などを例示することができる。投与量は特に限定されないが、１〜１０００μｇ程度投与するのが好ましい。
第二の感染方法は、ＨＣＶ　ｃＤＮＡを含むベクターを動物細胞に導入する工程、上記細胞を培養する工程、及び上記細胞の培養上清を小動物に投与する工程を含むものである。
ベクター中に含まれるｃＤＮＡは、ＨＣＶ　ＲＮＡの一部と対応するものであってもよいが、完全長のＨＣＶ　ＲＮＡに対応するものが好ましい。完全長のＨＣＶ　ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むベクターとしては、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺを例示することができる。
動物細胞としては、導入したベクターからＨＣＶウイルス粒子が複製され得るものであればどのようなものでもよく、例えば、ＩＭＹ細胞、ＨｕＨ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、ＭＴ−２細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、肝プライマリー細胞、その他の肝細胞、血球系由来の細胞、または細胞株などを使用することができる。
ｃＤＮＡを含むベクターを動物細胞へ導入する方法は、ポリヌクレオチドを真核細胞へ導入する一般的な方法を採用して行うことができる。そのような方法としては、リポソーム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などを例示することができる。導入するベクターの量は特に限定されないが、１ｎｇ〜１ｍｇ程度導入するのが好ましい。
ＨＣＶウイルス粒子の産生量を増大させる目的で、動物細胞にＲＮＡポリメラーゼを発現するベクターを導入してもよい。例えば、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺでは、ＨＣＶ　ｃＤＮＡの上流にＴ７プロモーターが配置されているので（図１）、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現するベクターを導入することにより、ＨＣＶウイルス粒子の産生量を増大させることができる。
動物細胞の培養は、使用した動物細胞に応じて決めればよく、例えば、ＩＭＹ細胞を使用する場合、Ｄ−ＭＥＭ培地中で、３７℃で、１２〜７２時間培養を行うのが好ましい。
培養上清の投与量は特に限定されず、例えば、１０〜１０１０コピー程度投与することが好ましい。培養上清は、そのまま投与してもよいが、ＤＮａｓｅＩ及び／又はＲＮａｓｅで処理した後投与してもよい。投与方法も特に限定されず、例えば、経静脈的に投与してよい。
本発明のスクリーニング方法は、ウィルス産生量を指標としたＨＣＶ関連疾患治療剤又はＨＣＶの増殖を抑制する物質のスクリーニング方法である。
第１のスクリーニング方法は、本発明の小動物に被験物質を投与する工程、該小動物のＨＣＶ量を測定する工程、被験物質を投与しない場合と比較して、ＨＣＶ量を減少させる物質を選択する工程を含む。
小動物としては、本発明の感染方法によってＨＣＶを感染させることのできるものであればどのようなものでもよいが、好ましくは、ネズミ目、ハネジネズミ目、ウサギ目、ツパイ目の小動物を挙げることができ、特に好ましくはツパイを挙げることができる。
また、第２のスクリーニング方法は、ＨＣＶを産生可能な動物細胞に被験物質を接触させる工程、該細胞を培養する工程、該細胞の培養上清のＨＣＶ量を測定する工程、被験物質を接触させない場合と比較して、ＨＣＶ量を減少させる物質を選択する工程を含む。
前記ＨＣＶを産生可能な動物細胞としては、本発明の感染方法にかかる、ＨＣＶのゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むベクターが導入された動物細胞が好ましい。したがって、ベクター中に含まれるｃＤＮＡは、ＨＣＶ　ＲＮＡの一部と対応するものであってもよいが、完全長のＨＣＶ　ＲＮＡに対応するものが好ましい。完全長のＨＣＶ　ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含むベクターとしては、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺを例示することができる。その他、用いる動物細胞、ｃＤＮＡを含むベクターを動物細胞へ導入する方法、動物細胞の培養方法については、前述した本発明の感染方法に準じる。
本発明のスクリーニング方法において、ＨＣＶ量は、ＨＣＶそのもののみならずＨＣＶ量を直接あるいは間接的に示すものであれば何を測定してもよいが、ＨＣＶのＲＮＡ量を測定することが簡便で好ましい。また、測定方法は吸光度測定、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴＭＡ−ＨＰＡ、ＰＣＲ−ＨＰＡ、ＥＬＩＳＡなど公知のいずれの方法を用いてもよい。
〔実施例１〕
ＨＣＶ　ＲＮＡの肝臓内投与によるＨＣＶ感染
ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺからＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いてＨＣＶ　ＲＮＡを合成した。ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺは、完全長のＨＣＶ　ＲＮＡを合成することのできるベクターであり（特開２０００−１５２７９３号公報）、このベクターを含む大腸菌は日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６　独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−６７６３、受託日：平成９年１０月３１日）。
ＨＣＶ　ＲＮＡ及びｃａｔｉｏｎｉｃ　ｌｉｐｉｄ（ＤＭＲＩＥ−Ｃ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）をＰＢＳ（−）に懸濁し、この懸濁液を塩酸ケタミン（ケタラール；三共製）で麻酔されたツパイ（個体番号：Ｎｏ．１２９及びＮｏ．１３１）の肝臓に接種した。接種したＲＮＡ及びｃａｔｉｏｎｉｃ　ｌｉｐｉｄの量は、それぞれ１５μｇ及び１５μｌである。ＲＮＡ接種後のツパイは通常の条件で飼育し、経時的に血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量を測定した。ツパイの血清は、塩酸ケタミン麻酔下でツパイの大腿静脈叢より採血し、これを遠心分離することにより得た。血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量は、グアニジンチオシアネート及びフェノール／クロロホルム法によりＲＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＰＣＲ（ＲＴＤ−ＰＣＲ）法（Ｔ．Ｔａｋｅｕｃｈｉら、ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ　１１６，６３６−６４２（１９９９））により測定した。この結果を図２（Ｎｏ．１２９）及び図３（Ｎｏ．１３１）に示す。
これらの図に示すように、両個体とも血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量の増加が観察され、感染の成立が確認された。
〔実施例２〕
ＨＣＶ　ｃＤＮＡ導入細胞の培養上清投与によるＨＣＶ感染
１５μｇのｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺ及び４０μｇのｃａｔｉｏｎｉｃ　ｌｉｐｉｄ（ＤＭＲＩＥ−Ｃ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）に懸濁した後、室温で１５分間放置した。この懸濁液７．８ｍｌを、１０ｃｍ　ｄｉｓｈ中で培養しているＩＭＹ−Ｎ９細胞（Ｉｔｏ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３４（２），２００１）と混合した後、３７℃で５時間インキュベートし、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺをＩＭＹ−Ｎ９細胞にトランスフェクトした。次に、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現するアデノウイルス（Ａｏｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，２５０：１４０−１５０）をＩＭＹ細胞に加えて、１時間放置し、アデノウイルスをＩＭＹ細胞に感染させた（ＭＯＩ＝２０）。ＨＣＶ　ｃＤＮＡは、Ｔ７プロモータの下流に配置されているので、このアデノウイルスを感染させることにより、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺ中のＨＣＶ　ｃＤＮＡが発現する。
上記処理後のＩＭＹ細胞を３７℃で１２時間培養した後、ディッシュから培養上清を採取した。この培養上清にＤＮａｓｅＩ（１０ｕｎｉｔ／０．１ｍｌ）を加えて３７℃で１０分反応させ、次いで、ＲＮａｓｅ（５μｇ／０．１ｍｌ）を加えて３７℃で１０分反応させた。酵素処理後の培養上清（ＨＣＶウイルス粒子を１０７コピー含む）を２匹のツパイ（個体番号：Ｎｏ．１３５及びＮｏ．１４３）の伏在静脈より静脈内投与した。培養上清投与後のツパイは通常の条件で飼育し、実施例１と同様にして経時的に血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量を測定した。この結果を図４（Ｎｏ．１３５）及び図５（Ｎｏ．１４３）に示す。
これらの図に示すように、両個体とも血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量の増加が観察され、感染の成立が確認された。
〔比較例１〕
ＨＣＶ患者血清投与によるＨＣＶ感染
ＨＣＶ患者から採取した血清にＤＮａｓｅＩ（１０ｕｎｉｔ／０．１ｍｌ）を加えて３７℃で１０分反応させ、次いで、ＲＮａｓｅ（５μｇ／０．１ｍｌ）を加えて３７℃で１０分反応させた。酵素処理後の血清（ＨＣＶウイルス粒子を１０６コピー含む）を２匹のツパイ（個体番号：Ｎｏ．１１７及びＮｏ．１６５）の伏在静脈より静脈内投与した。ＲＮＡ接種後のツパイは通常の条件で飼育し、実施例１及び２と同様にして経時的に血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量を測定した。この結果を図６（Ｎｏ．１１７）及び図７（Ｎｏ．１６５）に示す。
これらの図に示すように、一方の個体（Ｎｏ．１６５）では血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量の増加が観察されたが、もう一方の個体（Ｎｏ．１１７）ではＨＣＶ　ＲＮＡ量の増加は観察されなかった。即ち、２個体中１個体においてのみ、ＨＣＶ感染の成立が確認された。
〔実施例３〕
ＨＣＶ　ｃＤＮＡ導入細胞の培養上清におけるウイルス産生量の経時的変化
ＩＭＹ−Ｎ９細胞にｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺとタモキシフェン添加によって活性型Ｃｒｅ組み換え酵素を発現するＣＡＧ−Ｍｅｒ−Ｃｒｅ−Ｍｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１９９６，２４（４），５４３−５４８）を恒常的に共発現させた細胞（ＩＭＹ４２−５細胞）を作製した。この細胞にタモキシフェンを作用させることによりｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺのスタッファー領域がループアウトされ、ＨＣＶ　ｃＤＮＡが発現する。
ＩＭＹ４２−５細胞２．５×１０５／ｍｌを９６穴プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、一晩３７℃５％ＣＯ２環境下で培養後、４−ｈｙｄｒｏｘｉ−ｔａｍｏｘｉｆｅｎ（Ｔａｍ）を１００ｎＭの濃度で添加した。Ｔａｍ添加の翌日ならびに３日後の培養上清を回収した。培養上清中のＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（和光純薬（株））で抽出し、ＨＣＶ　ＲＮＡ量をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ　Ｔ．ら；Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　１９９９；１１６：６３６−６４２）法により定量した。その結果、図８に示すようにＴａｍ添加３日後に４０００コピー／ｍｌ前後のＨＣＶ　ＲＮＡが検出された。
以上の結果からＨＣＶ　ｃＤＮＡ導入細胞の培養上清中にはウイルス粒子が分泌されており、培養細胞をプレート化した本実験系は、多検体についてウイルス産生量の変化を簡便に測定できることが確認された。すなわち、本方法は抗ウイルス剤等のスクリーニングに有効に利用しうることが示唆された。
〔実施例４〕
ＨＣＶ産生量を指標とした薬剤の抗ＨＣＶ作用の検討（１）
次に、実施例３の方法を用いて、臨床においてＩＦＮとの併用で、またｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＨＣＶ感染系において抗ＨＣＶ作用があると報告されている（Ｉｎｏｕｅ　Ｋ．ら；日本臨床２００１　Ｊｕｌ；５９（７）：１３２６−３０）サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の抗ＨＣＶ作用を検討した。
ＩＭＹ４２−５細胞にＴａｍ添加と同時にＣｓＡ（１００，１０，１，０ｎＭ）を添加し、３日間培養後、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。図９に示すとおり、ＣｓＡ添加により濃度依存的にＨＣＶ　ＲＮＡ量の低下が認められた。
〔実施例５〕
ＨＣＶ産生量を指標とした薬剤の抗ＨＣＶ作用の検討（２）
現在抗ＨＣＶ治療薬としてインターフェロンとの併用で治験中のリバビリン（単剤では抗ＨＣＶ作用はないとされている。）の効果を検討した。
ＩＭＹ４２−５細胞にＴａｍ添加と同時にリバビリン（０，２５，５０，１００，２００μＭ）を添加し、２日間培養後、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量を測定した。図１０に示すとおり、リバビリンによるウイルス産生量の低下は観察されなかった。
以上のとおり、本発明のスクリーニング方法はウイルス産生量を指標としたＨＣＶ関連疾患治療剤又はＨＣＶの増殖を抑制する物質のスクリーニングに有用であることが確認された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明は、新規なＨＣＶ感染方法を提供する。この方法は、小動物へのＨＣＶの感染率を向上させることができるので、Ｃ型肝炎の疾患モデル動物の作製に有用である。また、本発明はウイルス産生量を指標とした新規なスクリーニング方法を提供する。この方法は、ＨＣＶ関連疾患治療剤又はＨＣＶの増殖を抑制する物質のスクリーニングに有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＣＡＬＮ／ＨＣＶ　ＲＢＺの構造を示す。
図２は、ＨＣＶ　ＲＮＡをツパイの肝臓に投与した場合の血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量の経時的変化を示す（個体番号：Ｎｏ．１２９）。
図３は、ＨＣＶ　ＲＮＡをツパイの肝臓に投与した場合の血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量の経時的変化を示す（個体番号：Ｎｏ．１３１）。
図４は、ＨＣＶ　ｃＤＮＡを含むベクターを発現させた細胞の上清をツパイに投与した場合の血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量の経時的変化を示す（個体番号：Ｎｏ．１３５）。
図５は、ＨＣＶ　ｃＤＮＡを含むベクターを発現させた細胞の上清をツパイに投与した場合の血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量の経時的変化を示す（個体番号：Ｎｏ．１４３）。
図６は、ＨＣＶ　ＲＮＡを含む血清を投与した場合の血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量の経時的変化を示す（個体番号：Ｎｏ．１１７）。
図７は、ＨＣＶ　ＲＮＡを含む血清を投与した場合の血清中のＨＣＶ　ＲＮＡ量の経時的変化を示す（個体番号：Ｎｏ．１６５）。
図８は、ＨＣＶ　ｃＤＮＡ導入細胞（ＩＭＹ４２−５）の培養上清における、Ｔａｍ添加後のＨＣＶ　ＲＮＡ量の経時的変化（●：１００ｎＭ　Ｔａｍ添加、○：ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔａｍ無添加））を示す。
図９は、ＨＣＶ　ｃＤＮＡ導入細胞（ＩＭＹ４２−５）の培養上清に、Ｔａｍ及び各種濃度のサイクロスポリンＡを添加した後のＨＣＶ　ＲＮＡ量を示す。
図１０は、ＨＣＶ　ｃＤＮＡ導入細胞（ＩＭＹ４２−５）の培養上清に、Ｔａｍ及び各種濃度のリバビリンを添加した後のＨＣＶ　ＲＮＡ量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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