(57)【要約】本発明は、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンを提供する。免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスをマカクサルに鼻腔内投与することにより、免疫不全ウイルスに対する防御免疫を効率的に誘発することに成功した。鼻腔内へのワクチン接種により、センダイウイルスベクターを介した抗原遺伝子の発現が鼻腔粘膜および局所リンパ節で検出され、有意なレベルの抗原特異的細胞性免疫応答が誘導された。ワクチネーションによる病理学的徴候は見られなかった。ワクチネーション後にサル免疫不全ウイルスを暴露させて効果を検討したところ、対照動物に比べ血漿中のウイルス量の有意な低下が認められた。本発明のワクチンは、ＡＩＤＳワクチンとして有望である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチン。
【請求項２】
ウイルス蛋白質がＧａｇ蛋白質またはその部分を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
センダイウイルスがＶ遺伝子欠損型である、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンを接種する工程を含むワクチンネーションの方法。
【請求項５】
接種が鼻腔内投与である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
複数回のワクチン接種において、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンの接種を少なくとも１回行う、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを抗原提示細胞に導入する工程、並びに（ｂ）該導入細胞とＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞とを接触させる工程、を含む、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質特異的細胞性免疫応答を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、センダイウイルスベクターを用いたＡＩＤＳウイルスワクチンに関する。また本発明は、センダイウイルスベクターを用いたワクチネーションの方法に関する。
背景技術
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の世界的な伝播を防ぐため、ＨＩＶの感染に対する効果的かつ安全なワクチンの開発が早急に求められている。これまで複数の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ワクチンの手法が霊長類のレンチウイルス感染モデルにおいて評価されてきたが、ＡＩＤＳに対して一貫して十分な抵抗性を示すワクチンは未だ知られていない（Ａｌｍｏｎｄ，Ｎ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．，１９９８，ＡＩＤＳ  １２（Ｓｕｐｐｌ．Ａ）：Ｓ１３３−１４０；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｐ．，１９９８，Ｎａｔ，Ｍｅｄ．４：４９５−４９８；Ｈｕｌｓｋｏｔｔｅ，Ｅ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：９０４−９１５；Ｌｅｔｖｉｎ，Ｎ．Ｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１８７５〜１８８０）。
生きたウイルスベクターを基にしたワクチンは、抗原の十分な発現が持続的に誘導されるため、有望な予防戦略の１つと見なされている（Ｃａｉｒｎｓ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓａｒｖｅｒ，Ｎ．，１９９８，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １４：１５０１−１５０８；Ｈｉｒｓｃｈ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：３７４１−３７５２；Ｂｕｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８５３１−８５４１）。最もよく使われてきたのはポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）であり、また、アデノウイルスなど他の選択肢も多数存在している。しかしながら、これらのベクターを用いた試みは、ＨＩＶに対する十分な防御免疫を誘発することに成功していない。十分な防御免疫の誘発には、抗原発現のレベルや期間、ベクターウイルスの複製のカイネティクス、およびベクターウイルスのトロピズムや病原性と言った多数の要因が影響しているものと考えられる。現在使用することができるウイルスベクターはいずれも、有利な側面と不利な側面の両面を持っている。最適なベクターを見つけ出すためには、それぞれのウイルスベクターの正確な評価と比較が必要である。
ウイルスベクターを基にしたワクチン戦略における決定的なデメリットの１つは、標的とすべき抗原よりもむしろ、ベクターウイルスに由来する抗原に対して強力な免疫応答が誘導されてしまうことである。この問題は、初回免疫と追加免疫のそれぞれにおいて、２つまたはそれ以上の異なる種類のウイルスベクターを用いることにより解決することができる。ＤＮＡワクチンを基にした初回免疫後にウイルスベクターを基にした追加免疫を行うことも、好ましい戦略の１つである（Ｈａｎｋｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７５２４−７５３２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：５２６−５３４）。このことから、新しいクラスのウイルスベクターの開発が、現在でも求められている。
発明の開示
本発明者らは以前、組み換えセンダイウイルス（ＳｅＶ）を用いて、効率的に抗原を発現させる系を確立させた（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）。マウスパラインフルエンザウイルス１型であるＳｅＶは非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡゲノムを持つエンベロープウイルスの１つで、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属す（Ｎａｇａｉ，Ｙ．１９９９．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ，９：８３−９９）。このウイルスはマウスに対しては致命的な呼吸器疾患を引き起こすが、非ヒト霊長類およびヒトには病原性がないとされている（Ｎａｇａｉ，Ｙ．１９９９．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．９：８３−９９；Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５３３−５４０，１９９７）。
ＳｅＶの複製は細胞質で行われ、核のフェーズは存在しないため、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、それにＥｎｖなどのレンチウイルスの構造蛋白であっても、組み換えＳｅＶを用いることにより、Ｒｅｖ非依存的に効率良く発現されることが期待される、より重要なことは、ＳｅＶベクターは非分裂細胞にも感染でき、外来遺伝子を強力に発現することである。例えば、組み換えＳｅＶベクター（Ｖ（−）ＳｅＶ）によるヒト免疫不全ウイルスｔｙｐｅ  １（ＨＩＶ−１）のＥｎｖ  ｇｐ１２０の発現量は培養上清において６μｇ／ｍｌ（１０６細胞あたり６μｇ相当）にも達するが、これは哺乳動物細胞で現在使用可能なベクター系の中では最も高い（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）。そこで本発明者らは、センダイウイルス（ＳｅＶ）の系を用いて、この系がサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のマカクサルへの感染に対して、防御的免疫を誘発できるかを検討し、組み換えＳｅＶベクターをＡＩＤＳワクチンとして用いることの有効性を評価した。このために、まず、ＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトした変異ＳｅＶであるＶ（−）ＳｅＶを構築した（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７）。マウスにおいて、このＶ（−）ＳｅＶは劇的に弱毒化されるが、その遺伝子発現はかえって増強される。安全および効率の両面から、本発明者らはこのＶ（−）型をベクターのバックボーンとして用いた。Ｖ（−）ＳｅＶを用いて、サル免疫不全ウイルスｍａｃ２３９株（ＳＩＶｍａｃ２３９）のＧａｇを発現する組み換えＶ（−）ＳｅＶであるＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを構築し、マカクサルにおいて抗ＳＩＶ免疫を誘導する効力について試験し、マカクサルのＡＩＤＳモデル（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．１９９６．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：５５４−５６０；Ａｌｍｏｎｄ，Ｎ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．１９９８．ＡＩＤＳ  １２：１３３−１４０）でのワクチネーションによる防御効果を評価した。
回収したＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを用いて、このベクターを介したＧａｇ発現により誘導されるＳＩＶＧａｇ特異的な細胞性免疫応答のｉｎｖｉｔｒｏ試験を行った。その結果、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイにより、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させた細胞がＧａｇ特異的ＣＴＬの標的として働くことが判明した。また、末梢血リンパ球の細胞培養では、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させた細胞はＧａｇ特異的ＣＴＬの細胞集団の増殖を誘導した。動物実験では、４個体のカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を用い、２個体はＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの鼻腔内接種によりワクチネーションを行い、１個体はコントロールＳｅＶを接種、残る１個体は非ワクチネーションコントロールとした。最初のワクチン接種から２２週後にこれらのマカクサルに１００  ＴＣＩＤ５０のＳＩＶｍａｃ２３９を静脈注射により暴露した。ＳＩＶに暴露させると、急性期の間は、全てのマカクサルにおいて血漿中のＳＩＶ量は同様に高値を示したが、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇでワクチネーションを行ったマカクサルでは、その後のウイルス量はコントロールのマカクサルの１０５ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ前後に比べはるかに低くなり、最終的に検出可能なレベル（１００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）を前後した。このように、ＳＩＶの構造蛋白質を発現するＳｅＶでワクチネーションを行うことによって、ＳＩＶ暴露後の慢性期（ｓｅｔ−ｐｏｉｎｔ）におけるウイルス量を顕著に減少させることが可能であることが示された。この結果は、センダイウイルスベクターは新しいＡＩＤＳワクチンとして有用であり、同時に細胞免疫応答の評価にも使用できることを示している。
本発明の目的の１つは、組み換えセンダイウイルスベクターの系を用いることにより効率的なＳＩＶＧａｇの発現が誘導されることを示し、この系をＡＩＤＳワクチンの開発に適用することの有効性を実証することにある。ＡＩＤＳワクチンの研究に広く使用されているポックスウイルスと比べ、ＳｅＶベクターは哺乳動物細胞における細胞傷害性が低く、抗原の発現レベルは明らかに高い（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）。また、実施例で用いられたＳｅＶベクターの特徴の１つは、挿入遺伝子がＳｅＶゲノムの３’端近くに収容されているため、その発現がベクターに由来する他のいずれのＳｅＶ特異的遺伝子よりも迅速で高率であることである（Ｎａｇａｉ，Ｙ．，１９９９，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．９：８３−９９）。このことは、標的抗原に特異的な免疫応答の効率的な誘導に有利なはずである。
ＣＴＬアッセイにおいて、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＢ−ＬＣＬはＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬの標的として良好に働いた。それに加え、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ；末梢血単核細胞）と正常ＰＢＭＣとの共培養はＩＦＮ−γの誘導およびＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬの増殖をもたらした。これらの結果は、ＳｅＶの系が抗原特異的な細胞性免疫応答のアッセイに有用であることを示している。ＳｅＶの不活性なエンベロープ蛋白質の前駆体から活性型へのプロセッシングにはトリプシン様プロテアーゼが必要であり（Ｎａｇａｉ，Ｙ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：８１−８７）、外から加えられるこのプロテアーゼが存在しなければＳｅＶは共培養細胞へ感染できないため、組み換えＳｅＶベクターを用いることによって、固定やＵＶ照射をすることなくＣＴＬ増殖のための共培養を容易に構築することが可能である。
最近の報告が示すように、ウイルス特異的な細胞性免疫応答の誘導は、ＨＩＶ−１感染に対する防御にとって有効となり得る（Ｇｅｒｅｔｔｉ，Ａ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：４１５−４２１；Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１６４−１６９；Ｏｇｇ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：２１０３−２１０６；Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１７５８−１７６５；Ｊｉｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：９９１−９９８；Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｊ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８５７−８６０）。ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＰＢＭＣはＳＩＶ  Ｇａｇ特異的ＣＴＬの増殖を誘導した。これは、この系が抗原特異的な細胞性免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導することを示唆している。
ＳＩＶｍａｃ２３９の暴露実験では、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇでワクチネーションを行ったカニクイザルの血漿ＳＩＶ量は、感染の急性期の間はコントロールに匹敵していた。しかしながら、その後ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇでワクチネーションを行ったカニクイザルは有意に低いＳＩＶ量を示した。特に目立ったのは、残存するウイルス量が検出可能なレベルまたはそれ以下であったことである。１つの抗原成分（Ｇａｇ）を用いるだけで顕著な感染防御作用が得られたことも注目に値する。慢性期（ｓｅｔ−ｐｏｉｎｔ）の血漿ウイルス量の減少は、高頻度のＳＩＶ  Ｇａｇ特異的なＴ細胞前駆細胞の活性化によるものと考えられる。Ｔ細胞前駆細胞の頻度は、ウイルス感染の自然経過において最初のバースト量（ｉｎｉｔｉａｌ  ｂｕｒｓｔ  ｓｉｚｅ）に大きく依存している。外来抗原の産生に関してＳｅＶが極めて高い性能を持っていることが、推定される高いＴ細胞前駆細胞の頻度に貢献し得るだろう。しかしながら、同じ組み換えウイルスを再度投与しても、追加的なＧａｇ特異的応答を引き起こすには不十分である可能性がある。従って、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇで初回免疫を行い、追加免疫に異なるウイルスベクターまたはＤＮＡワクチン等を用いるのが有効である。本明細書に示される実施例ではＧａｇ抗原のみを免疫に用いたが、組み換えＳｅＶベクターを用いて複数の抗原を発現させれば、防御の効力をより向上させることができるかも知れない。
ＳｅＶは自身の複製にエンベロープをプロセシングするプロテアーゼを必要とするため、複製のトロピズムは気道上皮などの特定に組織に限られる（Ｎａｇａｉ，Ｙ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：８１−８７）。気道を超えて他の組織に広がることが予想されないため、ＳｅＶベクターは例え複製型であっても安全面で利点を有することが示唆される。さらに、組み換えＳｅＶベクターの鼻腔内投与は全身の粘膜免疫の誘導も期待できる。これはＨＩＶ−１感染に対する予防においてＳｅＶベクターが有するもう１つの利点となり得る。
また、本発明は、霊長類におけるＳｅＶ初期複製の解析を初めて開示する。ウイルスベクターをベースにした遺伝子導入の効率は宿主に依存するため、臨床研究に先だって霊長類でその効率、有効性、および安全性を評価することは必須である。霊長類においては、アフリカミドリザルで鼻腔内へのＳｅＶの接種後の鼻腔拭い液試料の試験結果が報告されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５３３−５４０）ものの、ＳｅＶの複製はこれまで詳細には解析されていなかった。また本発明者らは、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ接種後１年以上経過したマカクサルの剖検で得られた鼻腔粘膜および肺を含む組織において、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの発現は検出されないことを見出した（データ省略）。そこで、本発明者らは、組み換えセンダイウイルスベクターでワクチネーションを行ったマカクサルにおける初期段階の抗原発現および細胞性免疫応答の解析を実施した。ＳＩＶ  Ｇａｇを発現する組み換えＳｅＶ（ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ）をマカクサルの鼻腔内に接種後、様々な組織におけるｇａｇ発現および細胞性免疫応答を調べた。ＳｅＶの複製は制御されており、Ｇａｇの発現は主に鼻腔粘膜およびその近傍リンパ節（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ；ＬＮ）に限定されていた。すなわち、ｇａｇの強い発現が鼻腔粘膜で観察され、それよりは低いが有意レベルのｇａｇの発現が局所の咽頭後リンパ節（ｒｅｔｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ＬＮ）および顎下リンパ節（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ＬＮ）で検出された。発現は免疫後１週間以内にピークに達し、少なくとも１３日まで持続した。ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇは４日目（ｄａｙ４）の鼻腔拭い液から確実に単離されたが、７日目（ｄａｙ７）では頻度が低下し、１３日目（ｄａｙ１３）では全く単離されなかった、。これに対し、胸腺、脾臓、および鼠径ＬＮなどの離れたリンパ組織では、検出可能な抗原の発現は見られなかった。本来の宿主であるマウスでは、ＳｅＶの全般的な感染は見られず、気道上皮に局在した急性の粘膜感染を示すが、サルでのＳｅＶ発現発現の組織の制限および発現の時間変化は、このマウスにおけるＳｅＶの複製パターンと一致していた。しかしながら、抗原は気管や肺にはほとんど存在していないことから、マカクサルではウイルスの伝播はマウスの場合より制限されていることが示された。７日目（ｄａｙ７）における細胞性免疫応答の解析では、ＳｅＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の迅速な出現が示された。免疫後に明白な臨床症状を示すサルはなかった。マカクサル鼻腔内へのＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの接種は、Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の効率的な誘導をもたらした。Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、咽頭後ＬＮ中だけでなく末梢血単核細胞でも有意な頻度で検出されたことから、ＳｅＶが持つ抗原特異的な細胞性免疫応答の誘導能力は、霊長類においても効率的に働くことが示された。このように、免疫後に全身および局所の両方で、Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が著しく高頻度で検出されることが判明した。これらの結果から、組み換えＳｅＶベクターをＡＩＤＳワクチンとして使用することの可能性がさらに強められた。
上記のように、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇでワクチネーションを行ったマカクサルにおいて、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇは効率的に発現し、鼻腔粘膜およびその局所ＬＮで強いことが示された。検出されるｇａｇ  ＲＮＡはゲノムＲＮＡとｍＲＮＡからなる可能性がある。そこで、以前確立した、ＳｅＶ  Ｎ  ｍＲＮＡだけを検出し、ＳｅＶゲノムのＮ  ＲＮＡを検出しない系（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）を利用して、ｍＲＮＡの発現を確認した。ｇａｇ  ＲＮＡレベルはＳｅＶ  Ｎ  ｍＲＮＡレベルよりも高く、これは前者がｍＲＮＡに加えゲノムＲＮＡも含んでいるからであろう。もう一つの説明としては、ゲノムにおいてｇａｇの位置はＮの位置よりも上流であるため、ｇａｇ  ｍＲＮＡレベルはＮ  ｍＲＮＡレベルよりも高いことが期待される（Ｎａｇａｉ，Ｙ．１９９９．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．９：８３−９９）。
鼻腔内接種は、粘膜免疫応答を誘導するという利点も持っている。咽頭後ＬＮ（ｒｅｔｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ＬＮ）および顎下ＬＮ（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ＬＮ）は鼻腔内からのリンパ球が最初に流入するＬＮである（Ｓｕｅｎ，Ｊ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ，Ｓ．Ｊ．１９９６．Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｃｋ．Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｅ．Ｎ．Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｙ．Ｓｕｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．４６２−４８４）。これらのＬＮは粘膜免疫応答に関与している可能性が高い。最近、マウスにおいてＮＡＬＴ（ｎａｓａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ；鼻関連リンパ系組織）が粘膜免疫応答に機能していることが示された（Ｙａｎａｇｉｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３５５９−３５６５）。マウスＮＡＬＴに対応するＷａｌｄｅｙｅｒ’ｓ  ｒｉｎｇから調製した細胞の解析により、この組織におけるＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの発現および免疫応答を確認することができる。咽頭後ＬＮ（ｒｅｔｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ＬＮ）および顎下ＬＮ（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ＬＮ）におけるＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの発現の検出では、両方の組織で有意なレベルのｇａｇＲＮＡが検出された。これらのＬＮにはＳｅＶ蛋白のプロセッシングに必須のプロテアーゼが存在しないことから（Ｎａｇａｉ，Ｙ．１９９３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：８１−８７）、ＬＮ内でＳｅＶの複製は起こらないと予想され、これらのＬＮのｇａｇ  ｍＲＮＡは、鼻腔内から流入したＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ感染リンパ球に由来するものであろう。ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの鼻腔内接種により、鼻腔粘膜のみならず局所ＬＮでも効率的な抗原の発現が見られたことから、ＳｅＶの粘膜免疫誘導能が示唆される（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ，Ｗ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｋ．Ｌ．１９９６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１８７９−９０）。
細胞性免疫応答は、ＨＩＶ−１やＳＩＶなどのヒトおよび非ヒト霊長類レンチウイルスの制御に重要な役割を果たしていることが示されている（Ｏｇｇ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：２１０３−２１０６；Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１７５８−１７６５；Ｂｒａｎｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｄ．１９９９．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４５１−４５９；Ｓｅｄｅｒ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．Ｓ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７９３−７９８）。マカクサルのＡＩＤＳモデルにおいて、抗ＣＤ８抗体を用いたｉｎ  ｖｉｖｏによるＣＤ８＋Ｔ細胞欠損実験により、ＣＤ８＋Ｔ細胞が初期感染および慢性感染の両方の制御に重要であることが示されている（Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７２：１６４−１６９；Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８５７−８６０；Ｊｉｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：９９１−９９８）。従って、ウイルス特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導はＨＩＶ−１感染に対する防御に非常に有効であり得る。フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン誘導の解析により検出された抗原特異的Ｔ細胞の頻度は、常に抗原特異的な細胞傷害活性と相関するわけではないものの、抗原特異的な細胞性免疫応答の指標と考えられている（Ｌａｖｉｎｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５；Ｂｕｔｚ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ，Ｍ．Ｊ．１９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：１６７−１７５；Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：１７７−１８７；Ｄｏｎａｈｏｅ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７２：３４７−３５６；Ａｐｐａｙ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：６３−７５）。この方法を用いた解析により、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇに感染した細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激できることが示された。また、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇでワクチネーションを行った３頭全てのマカクサルのＰＢＭＣで、高レベルのＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された。咽頭後ＬＮでも、Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の効率的な誘導が観察された。これらの結果は、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇワクチネーションにより、Ｇａｇ特異的な細胞性免疫応答が全身および局所の両方で誘導されることを示している。
鼻腔内へのＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇのワクチネーション後の観察では、明白な臨床症状を示すサルはいなかった。ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの発現はほとんど鼻腔内およびその局所ＬＮに局在しており、発現レベルはワクチネーションから１週間以内にピークに達した。このような発現パターンは天然の宿主であるマウスにおけるＳｅＶの性質に一致していた。しかしながら、気管および肺では抗原の発現がみられないことから、マカクサルにおいてはウイルスの伝播はより厳格に制限されていることが示される。抗原特異的ＩＦＮ−γ誘導の解析において、ＳｅＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は１週目（ｗｅｅｋ  １）で迅速に出現したことから、細胞性免疫応答がＳｅＶ複製を制御している可能性が示唆される。すなわち、マカクサルではＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの複製はよく局在化されており、またよく制御されている。これらの結果は、本発明の系が霊長類においても安全であることを支持している。また、複製能を欠損したＳｅＶを用いてより安全な系を構築することもできる。
すなわち本発明は、組み換えＳｅＶを介した免疫によるマカクサルの初期抗原発現および細胞性免疫応答を初めて開示する。本発明者らは、鼻腔内免疫したマカクサルの全てにおいて、効率的な抗原の発現のみならず、抗原特異的な細胞性免疫応答が効率的に誘導されることを示した。抗原の発現パターンは局在化され、またよく制御されており、霊長類におけるベクターの安全性が支持される。これらのことから、ＳｅＶの系はＡＩＤＳワクチンのためのツールとして有望であることがさらに裏付けられた。
本発明は、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンを提供することを課題とする。本発明のワクチンは、ＡＩＤＳワクチンとして、ＡＩＤＳの予防および治療に極めて有用である。また本発明は、本発明のワクチンを投与することによるワクチネーションの方法を提供することを課題とする。より具体的には、本発明は、
（１）免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチン、
（２）ウイルス蛋白質がＧａｇ蛋白質またはその部分を含む、（１）に記載のワクチン、
（３）センダイウイルスがＶ遺伝子欠損型である、（１）または（２）に記載のワクチン、
（４）免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンを接種する工程を含むワクチンネーションの方法、
（５）接種が鼻腔内投与である、（４）に記載の方法、
（６）複数回のワクチン接種において、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンの接種を少なくとも１回行う、（４）または（５）に記載の方法、
（７）（ａ）免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを抗原提示細胞に導入する工程、並びに（ｂ）該導入細胞とＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞とを接触させる工程、を含む、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質特異的細胞性免疫応答を誘導する方法、に関する。
本発明において「ワクチン」とは、伝染病の予防または治療のために使用される組成物を言う。ワクチンは抗原を含んでいるか、または抗原を発現可能であり、これにより抗原に対する免疫応答を誘導することができる。病原微生物の感染、伝播、および流行の予防または治療のために、本発明のセンダイウイルスベクターを含むワクチンは、所望の形態で用いることができる。
「ワクチネーション（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」とはワクチンの接種により生物の体内または培養系に能動的に免疫（体液性免疫・細胞性免疫、または両者）を作らせることを意味する。これにより病原体の感染、増殖、伝播、および／または流行等を阻止することができる。また、病原体感染後の症状の発症および／または進展を抑制することができる。
「抗原」とは、１つまたはそれ以上のエピトープを含む分子であり、宿主の免疫系を刺激して抗原特異的な免疫応答を誘導し得るものを言う。免疫応答は、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答であってよい。３個〜数個程度のアミノ酸でも１つのエピトープとなり得るが、通常、蛋白質中の１つのエピトープは、約７〜約１５アミノ酸、例えば８、９、１０、１２、または１４アミノ酸を含んでいる。抗原は免疫原とも言う。なお、抗原蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを用いて抗原を発現させる場合、本発明においては該ポリヌクレオチドおよびベクターも抗原と称し、これらはワクチン成分としても用いられ得る。
「免疫応答」および「免疫学的応答」とは、抗原またはワクチンに対する体液性および／または細胞性免疫応答を言う。体液性免疫応答とは、抗体分子により媒介される免疫応答を言う。細胞性免疫応答とは、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介される免疫応答を言う。細胞性免疫応答には、例えばＣＴＬ産生、あるいはヘルパーＴ細胞の産生または活性化等が含まれる。細胞性免疫応答は、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞などの活性化Ｔ細胞またはその他の白血球から産生されるサイトカインまたはケモカインを調べることにより検出することができる。また、公知のリンパ球増殖アッセイ、ＣＴＬアッセイ、または抗原特異的Ｔ細胞のアッセイ等により決定することもできる。
「組み換え」体とは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成した化合物または組成物を言う。組み換えポリヌクレオチドとは、自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。組み換え蛋白質は、組み換えポリヌクレオチドを発現させて得ることができる。また「組み換え」ウイルスベクターとは、遺伝子操作により組み換えポリヌクレオチドを介して構築されたウイルスベクターまたはそれを増幅して得られるウイルスベクターを言う。
本発明において「パラミクソウイルス」とはパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスを指す。パラミクソウイルスとしては、例えばセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。センダイウイルスは、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などが含まれる。ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウイルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も、本発明のワクチンを製造するための材料として使用することができる。
パラミクソウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子が含まれる。「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
2001072340.tif 000002
例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のレスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。
本発明において「遺伝子」とは遺伝物質を指し、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸が含まれる。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列を持つものであり得る。本発明で用いられるパラミクソウイルスベクターは、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質またはその部分をコードする外来遺伝子を有する。該外来遺伝子は、天然の免疫不全ウイルスが有する遺伝子またはその断片であってもよく、また、例えば、天然のウイルス蛋白質の欠失体、変異体、不活化蛋白質、他の蛋白質との融合蛋白質などをコードする核酸であってもよい。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。
本発明において免疫不全ウイルスとは、ヒトまたは動物に免疫不全症候群を引き起こすウイルスを言う。免疫不全症候群とは、免疫系を構成する細胞要素の一部あるいは幾つかの欠損あるいは機能不全によって、正常な免疫機構に障害を生じた病態を言う。免疫不全ウイルスによる病原性は、主にＣＤ４陽性Ｔ細胞を中心とする免疫担当細胞の破壊を伴う。免疫不全ウイルスとしては、特にレンチウイルス亜科に属するヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＳＩＶ）等が挙げられる。ＨＩＶはヒトの後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすウイルスである。ＨＩＶには、Ｉ型（ＨＩＶ−１）およびＩＩ型（ＨＩＶ−２）が存在する。本発明において免疫不全ウイルスには、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の全ての株およびサブタイプが含まれる。また本発明において免疫不全ウイルスとしては、ＳＩＶの全ての株およびサブタイプを含む。ＳＩＶの単離株には、ＳＩＶｍａｃ、ＳＩＶａｇｍ、およびＳＩＶｓｍなどを含む多数の株が知られている。その他、免疫不全ウイルスとしては、ネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＦＩＶ）等を例示できる。
ウイルス蛋白質とは、ウイルスに含まれる蛋白質を言う。ウイルス蛋白質としては、構造蛋白質、調節蛋白質、およびアクセサリー蛋白質が含まれる。例えば、レンチウイルスの主要な構造蛋白質としては、例えばＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖが挙げられ、調節蛋白質としては、例えばＴａｔおよびＲｅｖ、アクセサリー蛋白質としては、例えばＶｐｕ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、およびＮｅｆが挙げられる。本発明においては、これらの蛋白質のいずれか、その部分、あるいはそれらの組み合わせを発現するＳｅＶベクターが好適に用いられる。
本発明においてｎａｋｅｄ（ネイキッド）ＤＮＡとは、蛋白質に包装されていない裸のＤＮＡを言う。通常、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡは精製されている。「精製された」とは、天然における状態よりも純度が高いことを言い、好ましくはそれが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。ＤＮＡの精製は、フェノールおよび／またはクロロホルム抽出、エタノール沈澱、ＰＥＧ沈澱（ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈澱）などの他、電気泳動、塩化セシウム超遠心、逆相カラム、ゲル濾過、ＨＰＬＣ、シリカ吸着などの公知の方法を適宜組み合わせて行うことができる。ｎａｋｅｄ  ＤＮＡは直鎖状または環状であり得る。例えばプラスミド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、ウイルスや細胞等から抽出した精製または粗精製ＤＮＡ等であってよい。ｎａｋｅｄ  ＤＮＡは緩衝剤、塩、脂質、蛋白質等と組み合わされた人工的な複合物にできる。例えば、カチオン性脂質等のトランスフェクション試薬と組み合わせた組成物としてもよい。ＤＮＡワクチンとは、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡを成分として含むワクチンを言う。
本発明において「センダイウイルスベクター」とは、センダイウイルスに由来し遺伝子を宿主細胞に導入するベクター（担体）を指す。センダイウイルスベクターはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）であってもよく、また、感染力を持つウイルス粒子であってもよい。ここで「感染力」とは、組み換えセンダイウイルスベクターが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベクター内部の遺伝子を導入することのできる能力を言う。本発明におけるセンダイウイルスベクターは、抗原となる免疫不全ウイルス蛋白質をコードする外来遺伝子を発現することができるように保持する。センダイウイルスベクターは野生型と同等の複製能力を有していてもよく、また遺伝子変異により弱毒化されていてもよい。また、本発明におけるセンダイウイルスベクターは、複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
本発明は、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質またはその一部を発現可能に保持するセンダイウイルスベクターを含むワクチンを提供する。センダイウイルスにコードされる免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質としては、免疫原性を有する限り特に制限はない。免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質には、該ウイルスの構造蛋白質、調節蛋白質、およびアクセサリー蛋白質が含まれる。例えば、ＨＩＶ−１を含むレンチウイルスの主要な構造蛋白質としては、例えばＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖが挙げられ、調節蛋白質としては、例えばＴａｔおよびＲｅｖ、アクセサリー蛋白質としては、例えばＶｐｕ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、およびＮｅｆが挙げられる。ワクチンの製造には、これらの蛋白質またはその部分ペプチド等を用いる。上記の蛋白質またはその部分を発現するセンダイウイルスベクターを構築することにより、ワクチンの製造を行うことができる。これらのタンパク質は単独で用いても、また複数を組み合わせて用いてもよい。本発明においては、特に免疫不全ウイルスの構造蛋白質を発現するＳｅＶを用いることが好ましい。具体的には、Ｇａｇ蛋白質全長、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合蛋白質、またはそれらの断片などを発現するＳｅＶを用いることができる。
本発明者等により、鼻腔内接種でマカクサルに導入された組み換えＳｅＶベクターからの遺伝子の発現は、接種後１週間以内にピークに達し、少なくとも１３日まで持続することが示された。また、反復投与により発現を持続することも可能である。このことは、組み換えＳｅＶベクターを利用してワクチネーションを行った場合に、早急かつ持続的な治療効果を得ることができるという利点をもたらす。
また、安全性の面においても、ＳｅＶベクターはヒトへの臨床適用に好適に用いられうる可能性が示唆される。第一に、外来遺伝子の発現は、多くのベクター場合、導入したＤＮＡの核局在化が必要であることが、遺伝子導入の成功率を低下させる主要な障害になっている。しかし、例えばＳｅＶなどの場合、外来遺伝子の発現は、細胞質内において細胞性チューブリンおよび自身が持つＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ蛋白質）の両方によって駆動される。これは、ＳｅＶが宿主のゲノムと相互作用しないことを示しており、癌化などの安全面における問題が生じないと考えられる。第二に、ＳｅＶは齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人には病原性ではない。これはまた、野生型ＳｅＶの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５３３−５４０，１９９７）。ＳｅＶのこれらの特徴は、ＳｅＶベクターが、ヒトへの応用に際して高い安全性を有することを示唆し、ワクチネーションのための抗原蛋白の発現を目的としたベクターの有望な選択肢の一つとなることを支持するものである。実際、本発明においてＳｅＶを接種された霊長類マカクサルでは、抗原の有意な発現が検出された。またＳｅＶベクター接種自体による明確な病理学的症状は見られず、末梢のＣＤ４またはＣＤ８細胞数の有意な減少も観察されなかった。
本発明のワクチンは、特にＡＩＤＳウイルスを対象とするワクチネーションに好適に利用され得る。すなわち、本発明のワクチンを接種することにより、免疫不全ウイルスに対する免疫を誘導し、該ウイルスの感染および／または増殖を防止することが可能になる。本発明のワクチンは、免疫不全ウイルスの感染前に行う予防、および感染後に行う治療において好適に用いられる。
本発明においてワクチンに用いられるＳｅＶベクターとしては特に制限はない。好適なＳｅＶベクターとして、例えば、複製能を有し、自立的に増殖するようなベクターが挙げられる。例えば、一般に天然型ＳｅＶのゲノムは、３’の短いリーダー領域に続き、Ｎ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、Ｍ（マトリックス）、Ｆ（フュージョン）、ＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）、およびＬ（ラージ）蛋白質をコードする６つの遺伝子が並んでおり、短い５’トレイラー領域を他端に有する。これと同様の構造を有するゲノムを設計することにより、自律複製可能なベクターを製造することができる。ゲノム内に外来遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子を発現するベクターを製造することができる。なお、ＳｅＶベクターにおいては、ＳｅＶ遺伝子の配置は野生型ウイルスから改変されていてもよい。
また、本発明においてワクチンに用いられるＳｅＶベクターとしては、野生型ＳｅＶが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってもよい。例えば、ＳｅＶベクターを再構成し、遺伝子を発現させるためには、ＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ遺伝子から作られる蛋白質群が必要だと考えられているので、該蛋白質群をコードする遺伝子がＳｅＶベクターに含まれている必要がある。しかし、Ｍ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質はトランスに供給してＳｅｖベクターを再構成することができ、ベクターからの遺伝子発現が可能である。これらの蛋白質群をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、ＳｅＶベクターゲノムをコードする発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ベクターの再構成を行うことができる。また、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する宿主細胞にベクターゲノムをコードする発現ベクターを導入し、該宿主細胞から該蛋白質群を供給して再構成を行ってもよい。これらの蛋白質群のアミノ酸配列は、ウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、ＳｅＶベクターをＲＮＰとして調製する場合は、ＳｅＶベクターが細胞に伝播してゆくために必要と考えられているＭ、ＦおよびＨＮ遺伝子から作られる蛋白質は必要ない。ＲＮＰに含まれるゲノムに、Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子が含まれていれば、宿主に導入された時に、これらの遺伝子産物が生産され、感染性のあるウイルス粒子が形成される。感染性ウイルスを産生するＲＮＰベクターとしては、例えばＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子をコードするウイルスゲノムＲＮＡと、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質とを含むＲＮＰが挙げられる。このようなＲＮＰを細胞内に導入すると、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質の働きによりウイルスゲノムが発現、複製され、感染性ウイルスベクターが増幅する。
ＲＮＰを細胞に導入するには、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。複製型ウイルスの場合、産生されたウイルスは、培養細胞、鶏卵、個体（例えばマウスなどの哺乳動物）などに再感染させて増幅または継代することができる。
逆に、Ｍ、Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子が含まれていないＳｅＶベクターも、本発明のワクチンに用いるＳｅＶベクターとして好適である。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはこれらのいずれかの遺伝子を欠損しているため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子および／またはＨＮ遺伝子が挙げられる。例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０）。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いて製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をベクターのエンベロープに含むＳｅＶベクターを作製することもできる。このようなタンパク質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明のワクチンを構成するＳｅＶベクターとしては、ＶＳＶ−Ｇタンパク質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。
また、本発明のワクチンに用いられるＳｅＶベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラタンパク質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体などの遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また、本発明のワクチンに用いられるＳｅＶベクターは、例えばＳｅＶ蛋白質に対する免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウイルス遺伝子が改変されたものであってもよい。具体的には、例えば複製因子であるＮＰ遺伝子、Ｐ／Ｃ遺伝子およびＬ遺伝子の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、膜融合に関わるＦ蛋白質を改変することにより、膜融合リポソームの融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質やＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたＳｅＶを作製することもできる。
また、本発明のワクチンに用いられるＳｅＶは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく、マウスに対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．ＥＭＢＯ．Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、本発明のワクチンを構成するベクターとして特に好適である。
本発明のワクチンに用いられるウイルスベクターは、ゲノムＲＮＡ中に免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質またはその部分をコードする。このような外来遺伝子を発現する組み換えＳｅＶベクターは、上記のＳｅＶベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質またはその部分をコードする遺伝子断片を用いることができる。該遺伝子断片は、免疫不全ウイルス蛋白質をコードする天然由来の遺伝子断片であってもよく、また天然型蛋白質と少なくとも部分的に同等の抗原性を有する蛋白質をコードする限り、欠失、置換または挿入等により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。
ＨＩＶを含む免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質としては、構造蛋白質、調節蛋白質、およびアクセサリー蛋白質が含まれる。例えば、レンチウイルスの主要な構造蛋白質としては、例えばＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖが挙げられ、調節蛋白質としては、例えばＴａｔおよびＲｅｖ、アクセサリー蛋白質としては、例えばＶｐｕ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、およびＮｅｆが挙げられる。本発明においては、これらの蛋白質、その部分、あるいはそれらの組み合わせを発現するＳｅＶベクターが好適に用いられる。
例えばＨＩＶ−１においては、Ｇａｇはｐ５５と呼ばれる約５５ｋＤの前駆蛋白質として発現され、ｐｏｌ遺伝子がコードするプロテアーゼにより切断されＭＡ（ｍａｔｒｉｘ；マトリックス［ｐ１７］）、ＣＡ（ｃａｐｓｉｄ，キャプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ，ヌクレオキャプシド［ｐ９］）およびｐ６が生じる（Ｇｏｔｔｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８９；８６：５７８１−５７８５）。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルスのプロテアーゼ（Ｐｒｏ）、インテグラーゼ（ＩＮ）、ＲＮａｓｅＨおよび逆転写酵素（ＲＴ）をコードし、まずＧａｇ−Ｐｏｌ融合蛋白質として発現される（Ｊａｃｋｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３１：２８０−２８３）。Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体（ｐ１６０）は、リボソームによる翻訳時に約５％の頻度で生じるフレームシフトにより生成する。Ｐｏｌポリペプチドは、ウイルスがコードするプロテアーゼによりＧａｇから切断され、さらにプロテアーゼ（ｐ１０）、ＲＴ（ｐ５０）、ＲＮａｓｅＨ（ｐ１５）、およびインテグラーゼ（ｐ３１）に分断される。また、例えばＲＴ蛋白とＲＮａｓｅＨが繋がったポリペプチド（ｐ６５）などの、完全に分断されない断片も存在する。１６０ｋＤのＥｎｖ（ｇｐ１６０）は、細胞のプロテアーゼによりｇｐ４１およびｇｐ１２０に切断される。ｇｐ１２０はウイルス感染において、標的細胞表面に存在するレセブターＣＤ４およびコレセプターであるＣＣＲ５などと相互作用する（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１７：６５７−７００）。また、ｇｐ１２０にはＶ１〜Ｖ５と呼ばれるハイパーバリアブル領域があり、これらは単離株により比較的大きく異なっており、中でもＶ３  ｌｏｏｐと呼ばれる領域はウイルスのトロピズムに影響する（Ｈｗａｎｇ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；２５３：７１−７４）。Ｖ３  ｌｏｏｐは、ＨＩＶ感染を防ぐための中和抗体主要なターゲットでもある（Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８５：４４７８−４４８２）。
Ｔａｔはウイルス複製に必須の転写のトランスアクチベーターであり、長さに違う複数のペプチドが発現される（ＲｕｂＯ  ｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８９；６３：１−８）。Ｒｅｖは約１３ｋＤの配列特異的なＲＮＡ結合蛋白質であり（Ｚａｐｐ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９；３４２：７１４−７１６）、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）に結合しウイルス遺伝子発現のフェーズを制御する。これらの遺伝子に加え、ＨＩＶ−１にはアクセサリー蛋白質をコードするｎｅｆ、Ｖｉｆ、ｖｐｒ、およびｖｐｕの４つの遺伝子が存在する。ＨＩＶ−２には、ｖｐｕの代わりにｖｐｘを持つ。
ＳｅＶベクターは、これらのウイルス蛋白質（プロセシングを受けた蛋白質および受けていない蛋白質を含む）のいずれかの全長またはその部分、あるいはそれらの組み合わせを発現するように構築される。部分としては、抗原となる活性を有する限り長さや位置等に制限はない。例えば、１つまたはそれ以上のエピトープを含む部分ペプチドであってよい。このような部分ペプチドは、通常、ウイルス蛋白質のアミノ酸配列中、連続した少なくとも３個〜数個程度のアミノ酸を含むペプチドである。好ましくは、ウイルス蛋白質のアミノ酸配列中、連続した約７〜約１５アミノ酸、例えば８、９、１０、１２、または１４アミノ酸を含んでいる。
ワクチンは、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質のうち少なくとも１種類を用いる。本発明によれば、Ｇａｇ抗原のみを発現させた場合でも、効率的な免疫応答を誘導することが可能であった。また、複数のタイプの蛋白質を抗原として用いれば、より高い免疫を獲得させることが可能となる。
また、ワクチンは、免疫不全ウイルスのうち、１種類のウイルス由来のウイルス蛋白質を用いてもよいが、複数のタイプのウイルス由来のウイルス蛋白質を抗原として用いれば、より広い株またはサブタイプの免疫不全ウイルスに対する免疫を獲得させることができる。複数のタイプの免疫不全ウイルスを抗原として用いる場合、その組み合わせに特に制限はなく、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＳＩＶの各種単離株由来の遺伝子を用いてワクチンを製造することができる。複数の免疫不全ウイルスの遺伝子は、それぞれ別々のＳｅＶベクターゲノムに組み込んでＳｅＶを構築後、それらを組み合わせたり、混合したりしてワクチンを製造することもできれば、同じＳｅＶベクターゲノムに複数の遺伝子を組み込んで発現させることもできる。
例えば、ＨＩＶ−１としては、全てのメジャー（Ｍ）サブタイプ（ＡからＪを含む）、Ｎおよびｏｕｔｌｉｅｒ（Ｏ）が含まれる（Ｈｕ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  １９９６；２７５：２１０−２１６；Ｚｈｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，５；３９１（６６６７）：５９４−７；Ｓｉｍｏｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９８，４（９）：１０３２−７）。ＳＩＶ単離株としては、ＳＩＶａｇｍ、ＳＩＶｃｐｚ、ＳＩＶｍａｃ、ＳＩＶｍｎｄ、ＳＩＶｓｎｍ、ＳＩＶｓｙｋ等が例示できる。
本発明のワクチンに用いられるウイルス蛋白質が由来する免疫不全ウイルスとしては、特に霊長類を宿主とする免疫不全ウイルスが好ましい。このようなウイルスとしては、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶが挙げられる。
異なる株またはサブタイプのウイルスであっても、その蛋白質のアミノ酸配列が高い相同性を有していれば、ある株に属する１種の免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質を抗原としたワクチネーションにより、異なる株またはサブタイプに対する免疫もある程度獲得できる可能性が高い。
免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質を発現するＳｅＶを構築するには、例えば、ＳｅＶゲノムをコードするＤＮＡ（ＳｅＶベクターＤＮＡ）に目的の免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードする遺伝子を挿入する。ウイルスベクターＤＮＡに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、ＳｅＶベクターＤＮＡにおいては、転写終結（Ｅ）配列と転写開始（Ｓ）配列との間などに、６の倍数の塩基数を有する配列を挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，１９９３，ｐ．４８２２−４８３０）。外来遺伝子は、ＳｅＶの各遺伝子（ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子）の前および／または後ろに挿入することができる。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜Ｅ−Ｉ−Ｓ配列（転写終結配列−介在配列−転写開始配列）またはその部分を挿入し、各遺伝子の間にＥ−Ｉ−Ｓ配列を配置する、あるいは、ＩＲＥＳを挿入して外来遺伝子を発現し得る。
挿入した外来性遺伝子の発現量は、外来遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる。また、遺伝子挿入の位置、および遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、ＳｅＶにおいては、挿入位置がウイルスゲノムのネガティブ鎖ＲＮＡの３’端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、ＮＰ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、外来遺伝子をＮＰ遺伝子の上流（マイナス鎖においては３’側）またはＮＰ遺伝子とＰ遺伝子の間など、ネガティブ鎖ゲノムにおいて上流領域に挿入することが好ましい。逆に、挿入位置がネガティブ鎖ＲＮＡの５’端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、Ｌ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も５’側、すなわち野生型ウイルスゲノムにおいてはＬ遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の５’隣接部位）、またはＬ遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の３’隣接部位）に外来遺伝子を挿入する。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルスタンパク質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。例えば、高力価ウイルスベクターの投与による導入遺伝子の高発現が毒性を示す場合は、投与するウイルス力価を制限することができる他、例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖のなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、個々のＳｅＶベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるすることも可能である。
一般に、細胞毒性を示さない限りにおいて、抗原蛋白質の高い発現が得られれば、免疫獲得に有利と考えられるため、抗原蛋白質をコードする遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。好適なベクターの例としては、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質が、パラミクソウイルスベクターのネガティブ鎖ゲノムにおいて、該パラミクソウイルスのウイルス蛋白質のいずれよりも３’側にコードされているベクターが挙げられる。例えばＮ遺伝子の上流（ネガティブ鎖の３’側）に抗原遺伝子が挿入されたベクターが好ましい。あるいは、Ｎ遺伝子のすぐ下流に挿入してもよい。
外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。ゲノムをコードするベクターＤＮＡ中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。また、本発明のワクチンに用いられるベクターは、このように免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードする遺伝子を挿入した以外に位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。このような外来遺伝子としては制限はなく、免疫誘導に関与するサイトカインまたはケモカイン遺伝子等であってもよく、また、その他の遺伝子であってもよい。
外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスベクターは、例えば、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ　２：４５７−４６６の記載に準じて、次のようにして構築することができる。
まず、所望の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、外来遺伝子を、ＮｏｔＩ部位を利用してウイルスゲノムをコードするＤＮＡに挿入する場合を例にとって説明する。挿入したいｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から所望の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅回収する。増幅された断片の両端をＮｏｔＩ部位とし、さらに一端にセンダイウイルスの転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）（ＥＩＳ配列）のコピーを付加するために、ＮｏｔＩ制限酵素切断部位配列及び転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対として、フォワード側（センス鎖）合成ＤＮＡ配列及びリバース側（アンチセンス鎖）合成ＤＮＡ配列（プライマーセット）を作成する。
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、ＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを含め、ｃＤＮＡの相補鎖塩基配列と後述するセンダイウイルスに由来するセンダイウイルスゲノムのＥＩＳ塩基配列の合計が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ  ｏｆ  ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。さらに挿入断片の３’側にセンダイウイルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１）、Ｉ配列、好ましくは５’−ＡＡＧ−３’、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：２）、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終始コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とする。
ＰＣＲは、例えば、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくはＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて行い、増幅したＤＮＡ断片はＮｏｔＩで消化した後、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、パラミクソウイルスゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを介さずにＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６，１９９７；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７）。例えば、まずＮｏｔＩ制限部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）（配列番号：３）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮ−タンパク質をコードする配列の５’末端との間の隣接遺伝子座に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒａｎｄ）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）。ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組込まれた組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることができる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウイルスベクターＤＮＡを試験管内または細胞内で転写させ、ウイルスのＬ、Ｐ、およびＮＰタンパク質の共存下でＲＮＰを再構成させると、このＲＮＰを含むウイルスベクターを生成させることができる。本発明は、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするパラミクソウイルスベクターのゲノムＤＮＡを転写させる工程を含む、該ベクターを含むワクチンの製造方法を提供する。また本発明は、該ＤＮＡからなる、本発明のワクチンの成分として用いるパラミクソウイルスベクター製造用ＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のワクチンの成分となるパラミクソウイルスベクターを製造するための、該ベクターのゲノムをコードするＤＮＡの使用に関する。ウイルスベクターＤＮＡからのウイルスの再構成は公知の方法に従って行うことができる（国際公開９７／１６５３９号；国際公開９７／１６５３８号；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４：Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ，，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むパラミクソウイルスベクターをＤＮＡからウイルスを再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
例えば、ベクターＤＮＡを細胞内に導入する方法には、次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％  ＣＯ２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ−９８８５  Ｍ．Ｗ．５×１０５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼や▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのＤＮＡの細胞への導入にはトランスフェクション試薬が適している。好適には  Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ  Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられる。
ｃＤＮＡからの再構成は具体的には次のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿上で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２を７０〜８０％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ  ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下ＵＶ照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７ポリメラーゼを発現する組み換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）を２ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間が適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜５μｇの上記の組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを、全長センダイウイルスゲノムの生成に必須なトランスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミド（例えば２４−０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、１２−０．２５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および２４−０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｌ、より好ましくは例えば１μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションして培養する。培養３〜７日後に培養液を回収する。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞に重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。培養上清に含まれるウイルス力価は赤血球凝集活性（ＨＡ）を測定することにより決定することができる。ＨＡは「ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ希釈法」（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆  Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉ���ｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）により決定することができる。混入し得るワクシニアウイルスｖＴＦ７−３の除去は、得られた尿液試料を適宜希釈（例えば１０６倍）してｖＴＦ７−３を除去した後、ベクターウイルスを鶏卵で再増幅させることで可能である。再増幅は、例えば３回上繰り返すことができる。得られたウイルスストックは−８０℃で保存することができる。
ウイルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、ＬＬＣＭＫ２細胞、サル腎由来のＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。
例えば、Ｆ蛋白質を欠失したセンダイウイルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
〈１〉Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡおよびＦ発現プラスミドの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）全長ゲノムｃＤＮＡ、ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）（「ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）」は「ｐＳｅＶ１８＋」ともいう）のｃＤＮＡをＳｐｈＩ／ＫｐｎＩで消化してフラグメント（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ欠損部位の構築はこのｐＵＣ１８／ＫＳ上で行う。Ｆ遺伝子の欠損は、ＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（ＡＴＧ−ＴＧＡ＝１６９８ｂｐ）を除いてａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：４）で連結し、Ｆ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ）を構築する。ＰＣＲは、Ｆの上流には（ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ／配列番号：５，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ／配列番号：６）、Ｆ遺伝子の下流には（ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ／配列番号：７，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ／配列番号：８）のＰＣＲ産物をＥｃｏＴ２２Ｉで連結する。このように得られたプラスミドをＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、Ｆ欠損部位を含む領域の断片（４９３１ｂｐ）を回収してｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳとする。このｐＵＣ１８／ｄＦＳＳをＤｒａＩＩＩで消化して、断片を回収してｐＳｅＶ１８＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８＋ΔＦを得る。
外来遺伝子は、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ欠失部位にある制限酵素ＮｓｉＩおよびＮｇｏＭＩＶ部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、ＮｓｉＩ−ｔａｉｌｅｄプライマーおよびＮｇｏＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマーで増幅すればよい。
〈２〉ＳｅＶ−Ｆ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築のためには、ＳｅＶ−Ｆ遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，１９９８，ｐ１１１５−１１２１）のユニークサイトＳｗａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを構築する。
Ｆ欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％  ＣＯ２で培養する。ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼによりＦ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入を行う。
１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを導入後、１０ｍｌの１０％
ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ  １枚、２ｍｌ  ２枚、０．２ｍｌ  ２枚に蒔き、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％
ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
Ｆ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１（１９９５）；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））によりｍｏｉ＝３で感染させて行う。
〈３〉Ｆ欠失ＳｅＶウイルスの再構築及び増幅
上記ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦの外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍペトリ皿に蒔き、２４時間培養後、ソラレンと長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））に室温で１時間感染させる（ｍｏｉ＝２〜３、好適にはｍｏｉ＝２が用いられる）。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブを５本が装備されたＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），ストラタジーン社，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いる。細胞を３回洗浄してからプラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，及びｐＧＥＭ／Ｌ（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６））をそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（１μｇＤＮＡ／５μｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を入れて混合し、室温で１０分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉＭＥＭ３ｍｌに入れ、細胞に添加して培養する。３時間培養後、細胞を、血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド４０μｇ／ｍｌ（ＡｒａＣ，Ｓｉｇｍａ），トリプシン７．５μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）を含むＭＥＭで７０時間培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁する（１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。凍結融解を３回繰り返してｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）と混合し（１０６  ｃｅｌｌｓ／２５μｌ  ＤＯＳＰＥＲ）室温で１５分放置した後、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞の一つ、例えばＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞にトランスフェクション（１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  １２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ  ＡｒａＣ，７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で培養し、上清を回収する。混入し得るワクシニアウイルスは、得られた上清を希釈してＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞に感染させ、上清を回収する操作を数回繰り返すことで除去することができる。
欠損型ウイルスベクターを調製する場合、例えば、ウイルスゲノム上で欠損しているエンベロープ遺伝子が異なる２種のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するエンベロープタンパク質が、もう一方のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上のベクターを、エンベロープタンパク質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのエンベロープ遺伝子欠損型ウイルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、エンベロープ遺伝子が欠損しているため、エンベロープ遺伝子を欠損していないウイルスに比べゲノムサイズが小さくなり長い外来遺伝子を保持することができる。また、元々感染性のないこれらのウイルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
回収したパラミクソウイルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、単離した物質（化合物、ポリペプチド、またはウイルス等）が、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、試料中に存在する実質的に純粋な成分は、試料中の他の成分を合わせた全体の５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占める。割合は当業者に公知の手順により、例えば重量比率［ｗ／ｗ］等で算出される。当然溶媒、塩、添加化合物などを除いて算出されるべきである。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
回収されたＳｅＶベクターは、生組み換えワクチン（ｌｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）として使うことができる。本発明において生ワクチンとは、ウイルスベクターを投与された個体の細胞中でベクターゲノムが増幅し、抗原蛋白質を発現させ免疫を獲得させる組成物を言う。実施例に示すように、ＳｅＶベクターを用いたワクチネーションはマカクサルにおいて免疫を効率よく誘導し、有意な臨床症状を示さないことから、生ワクチンとして好適に用いられる。このような生ワクチンを接種する対象に制限はなく、ヒト、サル、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ等免疫不全ウイルスが感染しうるあらゆる動物が含まれる。また、前述の伝播力が欠損したＳｅＶベクターを用いれば、生ワクチンであってもベクターが伝播しないワクチンを製造することができる。
また、発現蛋白質がＳｅＶ粒子に取りこまれる場合には、ＳｅＶベクターを不活化全粒子ワクチンとして利用することもできる。あるいは、ＳｅＶベクターを導入した細胞から、または発現蛋白質がＳｅＶ粒子に取りこまれる場合にはＳｅＶベクターから、発現させた免疫不全ウイルス蛋白質を分離・精製してワクチンとすることもできる。ＳｅＶベクターには、限られた種類の蛋白質しか含まれないため、例えば発現ベクター等を用いて細胞内で発現させた免疫不全ウイルス蛋白質を細胞全抽出物から分離するのに比べ、格段に精製が容易である。蛋白質の精製には周知の分離技術を使用することができる。例えば、免疫不全ウイルス蛋白質に対する抗体を用いて、イムノアフィニティーカラム等により精製することも可能である。精製蛋白質をワクチンとして使うことで、生ワクチンや不活化ワクチンに比べ接種後の発熱や局所反応が起きる頻度が抑えられることが期待できる。
ＳｅＶベクターを含むワクチンは、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばＳｅＶベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈して組成物とすることができる。ＳｅＶベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またＳｅＶベクターを含むワクチン組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。また、免疫原性を高めるために、サイトカイン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。またワクチンには、ミョウバン、不完全Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント、ＭＦ５９（オイルエマルジョン）、ＭＴＰ−ＰＥ（マイコバクテリア細胞壁由来のｍｕｒａｍｙｌ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）、およびＱＳ−２１（ｓｏａｐｂａｒｋ  ｔｒｅｅ  Ｑｕｉｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ由来）などのアジュバントを組み合わせることもできる。
本発明のワクチンを用いたワクチネーションは、免疫不全ウイルスの感染の防止および／または感染後のウイルスの排除またはウイルス増殖の抑制のために用いられ得る。また、免疫不全症候群発症の予防または発症後の治療のために用いられ得る。また、免疫不全ウイルスの感染モデル等における予防および／または治療方法の開発または評価においても有用である。
本発明のワクチンは、有効量のベクターが対象組織の細胞に導入されるのに十分な量を投与される。「有効量」とは、所望の免疫応答を少なくとも部分的にもたらすように対象組織の細胞に遺伝子が導入される量を言う。所望の遺伝子を含むＳｅＶベクターの有効量が投与されることにより、ベクターが導入された細胞から導入遺伝子産物が産生される。好ましくは、所望の導入遺伝子を有するＳｅＶベクターの有効量が投与されることにより、投与された組織中または血中で有意なレベルの導入遺伝子の発現が検出される。「有意なレベル」とは、ＳｅＶベクターにより導入された遺伝子の発現（転写産物または翻訳産物の量）が検出可能であることを指す。但し、導入遺伝子の発現量は、その有効発現量レベルおよび中毒レベルを考慮して決められるべきである。
細胞に導入された遺伝子の発現量は、当業者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡプロテクションアッセイ等により検出・定量することができる。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ等による検出はｉｎ  ｓｉｔｕでも行い得る。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンブロット、免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、プルダウンアッセイ等により行うことができる。また、導入遺伝子発現の検出を容易にするため、発現させる蛋白質にタグを付加したり、レポーター遺伝子を発現するように組み込んでおくことも可能である。レポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、アルカリホスファターゼ、またはＧＦＰをコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに制限されない。
免疫応答の検出は、抗体や免疫細胞の検出により行うことができる。例えば免疫不全ウイルスに対する体液性免疫応答のアッセイは、公知の種々のアッセイ方法に従って行うことが可能であり、例えばウイルス蛋白質への結合（ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティング等によるアッセイ）、シンシチウム形成の阻害の検出、補体結合反応（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｉｘａｔｉｏｎ）、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；抗体依存性の細胞を介した細胞傷害）能、感染または細胞融合に対する中和能、およびＣＤ４とｇｐ１２０との相互作用の阻害などを試験することによりアッセイすることができる。
細胞性免疫応答の検出は、例えば抗原特異的ＣＴＬ活性、ＣＴＬ産生、あるいはヘルパーＴ細胞の産生または活性などを試験することによりアッセイすることができる。また、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞などの活性化Ｔ細胞またはその他の白血球から産生されるサイトカインまたはケモカインを調べることにより検出することができる。また、公知のリンパ球増殖アッセイ、ＣＴＬアッセイ、または抗原特異的Ｔ細胞のアッセイ等により決定することもできる。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、ワクチンの形態や投与方法等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。好ましくは、ワクチンに含有されるベクター量は約１０５  ｐｆｕ／ｍｌから約１０１１  ｐｆｕ／ｍｌの範囲内であるとよい。より好ましくは、ワクチンに含有されるベクターの量は約１０７  ｐｆｕ／ｍｌから約１０９  ｐｆｕ／ｍｌの範囲内であるとよい。最も好ましくは、約１×１０８  ｐｆｕ／ｍｌから約５×１０８  ｐｆｕ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。
ワクチンの接種は、経皮内、経皮下、鼻腔内、経気管支、筋内、静脈内、または経口的に行われうる。例えば上気道の周辺、すなわち鼻腔内粘膜や上気道へのワクチン接種により粘膜免疫を誘導することができる。そのためには、ＳｅＶワクチンを鼻内噴霧等により気道へ接種することが有効と考えられる。鼻腔内投与は、例えばカテーテルを介した投与などにより行うこともできる。また、ＳｅＶを細胞に導入し、この細胞をワクチンとして接種することも可能である。例えばワクチン接種の対象個体由来の細胞にＳｅＶを感染させ、ｅｘ  ｖｉｖｏ投与によりワクチネーションを行うこともできる。
また、ワクチンは単回投与（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のみならず、例えばワクチンの２回接種または複数回接種により十分な免疫を誘導することも有効であると考えられる。ヒトの場合、複数回接種の間隔は通常２〜４週間である。
複数回接種においては、ＳｅＶを含む本発明のワクチンを複数回投与することもできるが、ＳｅＶワクチンと他のワクチンとを組み合わせて用いることも好適である。上述のように、ウイルスベクターを基にしたワクチン戦略におけるデメリットの１つは、標的とすべき抗原よりもむしろ、ベクターウイルスに由来する抗原に対して強力な免疫応答が誘導されてしまうことである。この問題は、初回免疫と追加免疫のそれぞれにおいて、２つまたはそれ以上の異なる種類のウイルスベクターを用いることにより解決することができる。従って、先に述べたように、ＤＮＡワクチンを基にした初回免疫後にウイルスベクターを基にした追加免疫を行うことも、好ましい戦略の１つである。また、同じ組み換えウイルスを再度接種しても、追加的な抗原特異的応答を引き起こすには不十分である可能性がある。従って、まずＳｅＶベクターによるワクチンで初回免疫を行い、追加免疫に異なるウイルスベクターまたはＤＮＡワクチンを用いるのも有効である。また、組み換えＳｅＶベクターを用いて複数の抗原を発現させれば、防御の効力をより向上させ得る。
このように、異なる種類のワクチンを用いたプライム−ブーストプロトコルにおいてＳｅＶベクターによるワクチンと組み合わされるワクチンに特に制限はなく、所望のワクチンを用いることができる。例えば、組み換えサブユニットワクチン、ＳｅＶ以外のウイルスや微生物をベースにした生組み換えワクチン、全粒子の不活化免疫不全ウイルス、免疫不全ウイルスのシュードビリオンやウイルス様パーティクル、ペプチドワクチン、弱毒化免疫不全ウイルスの生ワクチン、ＤＮＡワクチンなどが挙げられるが、これらに制限されない。サブユニットワクチンとは、対象となる免疫不全ウイルス由来の抗原の全てを有さず、１つまたは複数の選択された蛋白抗原を含むワクチンを言う。このようなワクチンは、ウイルスの他の成分や感染細胞由来の成分から少なくとも部分的に切り離されている。サブユニットワクチンは免疫不全ウイルス蛋白質を少なくとも部分的に精製することにより調製することが可能である。また、組み換えによる生産または合成により作り出すことも可能である。生組み換えワクチンのベースとなるウイルスや微生物としては、例えばポックスウイルス、アデノウイルス、サルモネラ、ポリオウイルス、マイコバクテリア、インフルエンザウイルス、およびセムリキフォレストウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、免疫不全ウイルスとして、ｅｎｖ遺伝子の置換により複製能を限局させた限局的複製型ウイルス（Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：３３１０−３３１８）をワクチンとして用い、本発明のワクチンと組み合わせて追加免疫を行うことも可能である。ＳｅＶワクチンと、これら他のワクチンの接種の順番は特に制限はなく、ＳｅＶワクチンを接種した後に他のワクチンを接種することもできるし、逆に他のワクチンを接種した後にＳｅＶワクチンを接種することもできる。
一例を示せば、ＤＮＡワクチンによりプライミングした後、ＳｅＶワクチンによりブーストをかけることができる。このようなワクチネーションは、（ａ）ＤＮＡワクチンを投与する工程、およびその後（ｂ）免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするパラミクソウイルスベクターを投与する工程、を含む方法である。ＤＮＡワクチンとしては、例えば免疫不全ウイルスゲノムをコードするＤＮＡ等を用いることができる。ＤＮＡワクチンの接種は、例えば筋肉内投与および／またはジーンガンによる投与により行い得る。例えば、ＤＮＡワクチンの接種を数回行った後、本発明のＳｅＶベースのワクチンを接種することができる。接種の間隔は通常、数日から数週間で行う。
ワクチン接種が可能な動物としては、免疫系を有し、かつ免疫不全ウイルスに感染し得るあらゆる宿主が挙げられ、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリなどを含む、全ての哺乳動物等が含まれる。本発明のワクチンが接種される動物は、好ましくは霊長類があげられる。例えば、ヒト以外に本発明のワクチンの接種の対象となる霊長類（非ヒト霊長類）としてはレムール、ロリス、およびメガネザル等の原猿、広鼻猿類および狭鼻猿類を含む真猿、ならびにテナガザル、オランウータン、ゴリラ、チンパンジー、およびボノボなどを含む類人猿が挙げられる。狭鼻猿類の中では、特にオナガザル亜科、具体的にはニホンザル、カニクイザル、アカゲザル、ボンネットザル、ブタオザル、ベニガオザル、およびアッサムモンキー等を含むマカカ属などが挙げられる。非ヒト霊長類へのワクチン接種は、ヒトへの臨床適用に向けたＡＩＤＳワクチンの開発および評価に極めて有用である。
免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするＳｅＶベクターを含むワクチンは、宿主の免疫応答を局所および全身で誘導することができる。特に、該ベクターが導入された細胞は、抗原特異的な免疫応答のスティミュレーター（刺激細胞）として機能し、細胞性免疫応答を誘導する。本発明は、（ａ）免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを抗原提示細胞に導入する工程、（ｂ）該導入細胞とＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞とを接触させる工程、を含む、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質特異的細胞性免疫応答を誘導する方法を提供する。ここで細胞を「接触させる」とは細胞の接触を許すことも含む。すなわち、例えばベクターを導入した細胞を血中に注入したり（体内のＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞と接触し得る）、あるいは同一培地中にベクター導入細胞とＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞とを共培養するなど、細胞が接触し得るようにすることであってよい。また、抗原特異的な「細胞性免疫応答の誘導」とは、該細胞性免疫応答の過程の少なくとも一部の誘導を意味する。例えば、抗原特異的ＣＴＬの刺激、該ＣＴＬの頻度上昇または活性（例えば細胞傷害性）の上昇などであってよい。
抗原提示細胞とは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ｃｌａｓｓ  ＩまたはＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子が提示されている細胞で、抗原蛋白のペプチドを各分子に結合できる能力を有する細胞を言う。抗原提示細胞としては、例えば樹状細胞（ＤＣ）が挙げられる。ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ分子とは、抗原ペプチドに結合して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）に提示する分子である。ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子とは、抗原ペプチドに結合してＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋）に提示する分子である。Ｔヘルパー細胞とは、Ｔ細胞の系譜の一群であり、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子により提示された抗原を認識し、免疫応答のカスケードを組織化する細胞である。細胞傷害性Ｔ細胞とは、Ｔ細胞の系譜の一群であり、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ分子により提示された抗原を認識し、ウイルス感染細胞、癌、および移植片などの細胞を殺す細胞である（Ｘｕ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（４）：１６７−７２，２０００参照）。
例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などに免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするＳｅＶベクターを導入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＢＭＣと共培養することにより、ＩＦＭ−γ産生の誘導および免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質特異的ＣＴＬの増殖などの細胞性免疫応答を誘導することができる。またｉｎ　ｖｉｖｏで投与すれば、宿主における抗原特異的な細胞性免疫応答を誘導することができる。
細胞性免疫応答は、例えばＩＦＮ−γ量のアッセイやＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の頻度測定などにより確認することができる。また、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質を発現させた細胞を標的として、標的細胞のリシスを測定することによってＣＴＬ活性をアッセイすることもできる。このような標的細胞は、上記ＳｅＶベクターを導入することにより作製することができる。例えば自家Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｐａｐｉｏ不死化Ｂリンパ芽球細胞株（ＢＬＣ）などに免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質を発現するＳｅＶを導入し、ＣＴＬを含むことが予想される試料と共にインキュベートして、該ＢＬＣのリシスを５１Ｃｒ放出などを指標に測定することができる。また、不死化した細胞株Ｈ９（ヒトＴ細胞由来）なども例示することができる。
本発明は、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質特異的細胞性免疫応答を誘導または検出するための、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするＳｅＶベクターまたは該ベクターの導入細胞の使用に関する。また本発明は、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするＳｅＶベクターを導入した細胞を含む、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質特異的な細胞性免疫応答の刺激細胞に関する。さらに本発明は、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするＳｅＶベクターを導入した細胞を含む、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質特異的な細胞性免疫応答の標的細胞に関する。また本発明は、該刺激細胞または該標的細胞において免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質を発現させるための、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするＳｅＶベクターの使用に関する。
ＳｅＶベクターがコードする免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質に制限はなく、上記と同等にウイルスの構造蛋白質、調節蛋白質、アクセサリー蛋白質等であってよい。構造蛋白質としては、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ等が挙げられる。例えば、免疫不全ウイルスのＧａｇ蛋白質をコードするＳｅＶを用いて、Ｇａｇ特異的細胞性免疫応答の誘導を行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書全体を通じて引用された文献の内容はすべて、本明細書に組み込まれる。
［実施例１］  ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの回収
安全面でより優れているＶノックアウト型のＳｅＶ（Ｖ［−］ＳｅＶ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．ＥＭＢＯ，Ｊ．１６：５７８−５８７）を使用してＳＩＶＧａｇを発現する組み換えＳｅＶであるＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを構築した。ＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子を組み換えによりノックアウトすると、培養細胞におけるウイルス遺伝子の発現や複製は障害されることなく、マウスに対するＳｅＶの病原性が顕著に弱毒化される。弱毒化Ｖ欠損ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの全長を含むプラスミドｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）は以前記載されている（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０）。ＳＩＶｍａｃ２３９  Ｇａｇ（ヌクレオチド１３０６−２８４５［ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｍ３３２６２］（Ｋｅｓｔｌｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１１０９−１１１２））をコードする遺伝子断片はＰＣＲ増幅により調製し、ｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）に導入してｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）／ＳＩＶｇａｇを得た。ＰＣＲで用いたプライマーは５’−ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＣＧ−３’（配列番号：９）および５’−ＴＴＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＡＣＴ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＡ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＡＡＧ−３’（配列番号：１０）である。ｇａｇ遺伝子断片は、ｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）のＮのコード領域の直ぐ上流にあるＮｏｔＩ部位に挿入した（図１Ａ）。このプラスミドｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）／ＳＩＶｇａｇはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの存在下でＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇアンチゲノムＲＮＡの全長を生じる。組み換えＳｅＶ，ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ，は、ｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）／ＳＩＶｇａｇから以前記載したようにして回収した（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）。具体的には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する組み換えワクシニアウイルス（ＶＶ）ベクターであるｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８１２２−８１２６）をＬＬＣＭＫ２細胞に感染させ、ｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）／ＳＩＶｇａｇ、ｐＧＥＭ−Ｎ、ｐＧＥＭ−Ｐ、およびｐＧＥＭ−Ｌ（Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４）をコトランスフェクトした。トランスフェクションから４０時間後に、細胞を回収し鶏卵の尿膜腔に注入した。２回継代後、尿液を回収しＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇとした。同様にｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）からコントロールＳｅＶであるＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌを得た。ＳｅＶタイター（ＣＩＵ［ｃｅｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｕｎｉｔ］／ｍｌ）は、以前記載されたように（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ｖｉｒｏｌｏ��ｙ  １７７：６５−７４）、ＣＶ１細胞使って抗ＳｅＶ抗体を用いた免疫染色により測定した。
［実施例２］  ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＩＶ　Ｇａｇ発現
プラスミドｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）／ＳＩＶｇａｇ（図１Ａ）から、標準的なトランスフェクションプロトコルに従って感染性ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇをレスキューさせた（実施例１参照）。このＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを細胞に感染させ、発現した蛋白質の解析を以下のように行った。細胞ライセートを回収するため、６−ｗｅｌｌプレートの各ウェルに４×１０５細胞の密度でＣＶ−１細胞を撒き、一晩培養後、ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌまたはＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇをｍ．ｏ．ｉ．を５で感染させた。１日後、細胞を６００μｌのリシスバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０２％　ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ，０．１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ，０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１ｍｇ／ｍｌ  ｐｈｅｎｙｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１％　Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中でリシスさせた。各レーンに１０μｌの細胞ライセートをロードした。ウェスタンブロット解析はモノクローナルマウス抗ｐ２７抗体を用いて以前の記載に従って行った（Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２０２６−２０３３）。免疫染色は抗ｐ２７抗体およびフルオレセイン結合ヤギ抗マウスイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を用いて記載されたようにして行った（Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６７：２０２６−２０３３）。ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＣＶ１胞において、プロセッシングを受けていないＳＩＶＧａｇであるｐ５５の発現が、抗ＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２７モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングおよび免疫染色の両者において確認された（図１Ｂおよび１Ｃ）。組み換えウイルスは、ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌに比べ僅かに遅い増殖カイネティクスを示した（図１Ｄ）。この増殖の遅延はゲノム長の増加による可能性がある（ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌ，１５．４ｋｂ；ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ，１７．０ｋｂ）（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ２：４５７−４６６；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｇｅｎ，Ｖｉｒｏｌ，７８：２８１３−２８２０；Ｓａｋａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５６：２２１−２２６）。
［実施例３］  ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＩＶ  Ｇａｇ特異的細胞応答の誘導
ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを介したＧａｇ発現によりＳＩＶ  Ｇａｇ特異的応答が誘導されるかについて、１頭のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）から調製したＰＢＭＣを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞性免疫応答の試験を行った。このアカゲザルは別の実験において前もってＳＩＶ抗原を発現するｎａｋｅｄ
ＤＮＡ（Ｇａｇを含むＳＩＶ抗原を発現するプラスミドＤＮＡ）でワクチネーションを行い、ＳＩＶｍａｃ２３９を暴露した。ＳＩＶｍａｃ２３９暴露用ストックは以前に記載に従ってアカゲザルＰＢＭＣを用いて調製した（Ｋｅｓｔｌｅｒ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１１０９−１１１２；Ｓｈｉｂａｔａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：３６２−３７３）。ストックの感染力価はＭＴ−４細胞でアッセイした。なお、このアカゲザルは実験に用いる前にＳｅＶ、ＳＩＶ、およびサルｔｙｐｅ  Ｄレトロウイルスの陰性試験を行い、実験動物に関する研究所のガイダンスに従って維持した。採血、ワクチネーション、およびウイルス接種はケタミン麻酔下で行った。
ＳＩＶ暴露後３週目（ｗｅｅｋ３）にこのアカゲザルからＰＢＭＣを新たに調製し、このＣＴＬアッセイのエフェクターとして用いた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は全血試料から以前の記載に従って調製した（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：３６２−３７３）。ＰＢＭＣは１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。ＰＢＭＣにＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌまたはＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇをＭＯＩ  １０で感染させ、２時間インキュベート後、共培養に用いた。ＳＩＶ  Ｇａｇ特異的刺激を行う共培養では、Ｕ−ｂｏｔｔｏｍの９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり  ５×１０５  ＰＢＭＣと１×１０５  ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ感染ＰＢＭＣとを混ぜ合わせた。非特異的刺激を行う共培養では、５×１０５  ＰＢＭＣと１×１０５  ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌ感染ＰＢＭＣとを混ぜ合わせた。共培養を３日行った後、培養上清を回収し、細胞は１０  ｕｎｉｔ／ｍｌの組み換えヒトインターロイキン−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む培地中で培養した。上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）濃度は酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）で試験した。このアッセイの検出下限は１５ｐｇ／ｍｌである。ＳＩＶＧａｇ特異的刺激を行った共培養におけるＰＢＭＣを細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイにおけるエフェクター細胞として用いた。あるいは、別途調製したばかりのＰＢＭＣをエフェクターとして用いた。ＣＴＬアッセイ（５１Ｃｒ−放出アッセイ）は以前の記載に従って行った（Ｖｏｓｓ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３９：１８５−１９５；Ｖｏｓｓ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８：７７０−７７５）。ＳＩＶ  Ｇａｇを発現する組み換えワクシニアウイルス（ＶＶ）であるＶＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させた自家Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｐａｐｉｏ不死化Ｂリンパ芽球細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）をＳＩＶＧａｇ特異的リシスの標的として用いた。あるいは、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＢ−ＬＣＬを用いた。コントロールＶＶ（ＶＶ／ＷＲ）またはＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌを感染させたＢ−ＬＣＬを非特異的リシスの測定のために用いた。５１Ｃｒ−放出の割合を次のようにして計算した：％５１Ｃｒ放出＝（試験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００。その後、Ｇａｇ特異的５１Ｃｒ放出の割合を、Ｇａｇ特異的リシスにおける％５１Ｃｒ放出から非特異的リシスにおける放出を差し引くことによって算出した。Ｇａｇ特異的５１Ｃｒ放出が１０％を超えた場合、Ｇａｇ特異的ＣＴＬ活性を陽性とした。
ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇまたはＶＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させた自家Ｂ−ＬＣＬを標的として用いた。図２Ａに示したように、このアッセイでＧａｇ特異的リシスがＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＢ−ＬＣＬおよびＶＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＢ−ＬＣＬの両細胞で観察されたことから、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＢ−ＬＣＬはＳＩＶ  Ｇａｇ特異的ＣＴＬの標的として働くことが示された。
次に、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させた細胞がＳＩＶ  Ｇａｇ特異的ＣＴＬの増殖を誘導するかを調べた、１２週（ｗｅｅｋ１２）のアカゲザルＲｈ０１８から調製したＰＢＭＣをＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇに感染させたＰＢＭＣと共に共培養すると、Ｔｈ１サイトカインの一種であるＩＦＮ−γの産生が観察された（図２Ｂ）。これとは対照的に、ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌを感染させたＰＢＭＣとのＰＢＭＣ共培養では検出可能なＩＦＮ−γは誘導されなかった。前者（ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇに感染させたＰＢＭＣとの共培養）においてはＳＩＶ  Ｇａｇ特異的ＣＴＬ活性が見られたが、後者（ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌを感染させたＰＢＭＣとの共培養）の対照共培養では見られなかった（図２Ｃ）ことから、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ感染細胞によるＧａｇ特異的ＣＴＬの増殖が示された。
［実施例４］  カニクイザルにおけるＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇのワクチネーション
表１に概要を示したプロトコルに従って、４頭のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を用いてワクチネーション実験を行った。４頭のカニクイザルは実験に用いる前にＳｅＶ、ＳＩＶ、およびサルｔｙｐｅ  Ｄレトロウイルスの陰性試験を行い、実験動物に関する研究所のガイダンスに従って維持した。採血、鼻腔拭い液（ｎａｓａｌ  ｓｗａｂ）の採取、ワクチネーション、およびウイルス接種を行う場合はケタミン麻酔下で行った。カニクイザル１３２９６０５０２９（Ｃｙ０２９）はワクチネーションを行わず、未処理のコントロールとした。カニクイザル１４２９４０７００２（Ｃｙ００２）は、１０８
ＣＩＵのＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌを初回免疫（０週目）、その後４週目および１４週目の計３回、鼻腔内に接種してコントロールのワクチネーションを行った。同じスケジュールで２頭のカニクイザル１１２９３０７００１（Ｃｙ００１）および１１２８２０６１６２（Ｃｙ１６２）に１０８  ＣＩＵのＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを鼻腔内に３回のワクチネーションを行った。これらのカニクイザルはいずれも、ワクチネーション後に体重減少を含む病理学的兆候は見られなかった。また、末梢のＣＤ４またはＣＤ８細胞数の有意な減少はいずれも観察されなかった（図３Ａ）。
2001072340.tif 000003
気道におけるＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの複製および発現を鼻腔拭い液（ｎａｓａｌ  ｓｗａｂ）により調べた（表１）。鼻腔拭い液の採取は以前の記載に従って行った（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖａｃｃｉｎｅ　１５：５３３−５４０）。拭い液試料は培地で希釈し、ＳｅＶを回収するため鶏卵の尿膜腔に注入した。４８時間インキュベート後、尿液を回収し、ヘマグルチネーション（ＨＡ）アッセイに供しＳｅＶを検出した。ＳＩＶ  ｇａｇの発現を調べるためには、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて拭い液試料からＲＮＡを抽出した。ＳＩＶ  ｇａｇ特異的プライマーを用いてｎｅｓｔｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。最初のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは５’−ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＧＧ−３’（配列番号：１１）および５’−ＴＧＡ  ＴＡＡ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＴＡＧ  ＣＣＧ  Ｃ−３’（配列番号：１２）、２回目のＰＣＲに用いたプライマーは５’−ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＧ−３’（配列番号：１３）および５’−ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  Ｃ−３’（配列番号：１４）である。
カニクイザルＣｙ００２、Ｃｙ００１、およびＣｙ１６２では、拭い液を接種した鶏卵の尿液中に蓄積したＳｅＶ  ＨＡ活性から分かるように、１週目においてＳｅＶ（ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌまたはＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ）の複製が検出された（表１）。２週目では検出可能なＳｅＶは回収されなかった。２回目または３回目のワクチネーションではいずれも、拭い液中に検出可能なＳｅＶは見られなかった。ＳＩＶ  ｇａｇ異的プライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにより、ＳＩＶ  ｇａｇの発現がＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇによるワクチネーションを行ったカニクイザル（Ｃｙ００１およびＣｙ１６２）の両者の鼻拭い液で検出されたが、ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌによるワクチネーションを行ったカニクイザル（Ｃｙ００２）では検出されなかった（表１）。
これら３頭のカニクイザルのワクチネーション後の免疫応答を調べた。ＥＬＩＳＡによる体液性免疫応答試験の結果、３頭の全てのカニクイザルで血漿中に高いレベルで抗ＳｅＶ抗体が誘導されていることが示された（図３Ｂ）。２回目および３回目のワクチネーションはそれらのレベルの急速な上昇を誘導したことから、追加免疫の効果が示唆された。対照的に、血漿中の抗ＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２７抗体の有意な誘導は観察されなかった。なお、抗ＳｅＶ抗体ＥＬＩＳＡは不活化したＳｅＶを用いて行った。抗ＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２７抗体ＥＬＩＳＡは組み換えｐ２７抗原（ＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。抗ＳｅＶ抗体ＥＬＩＳＡでは血漿試料を１０００倍に、抗ｐ２７抗体ＥＬＩＳＡでは１００倍に希釈した。
未処理のカニクイザル（Ｃｙ０２９）、ＳｅＶ／ｃｏｎｔｏｒｏｌでワクチネーションを行ったカニクイザル（Ｃｙ００２）、およびＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇでワクチネーションを行ったカニクイザル（Ｃｙ００１およびＣｙ１６２）において、２２週目に多量（１００  ＴＣＩＤ５０）のＳＩＶｍａｃ２３９を静脈注射により暴露させた。具体的には、カニクイザル鼻腔内に１０８  ＣＩＵのＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇによる３回のワクチネーションを行い（０、４、および１４週目）、最初のワクチネーション後２２週目に、それらのカニクイザルに１００  ＴＣＩＤ５０のＳＩＶｍａｃ２３９を静脈注射により暴露させ、血漿中のＳＩＶＲＮＡを測定した。ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌを接種したカニクイザルおよびワクチネーションを行わないカニクイザルを対照とした。
これらのカニクイザルの血漿ＳＩＶ  ＲＮＡ量の測定を以下のようにして行った。Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｋｉｔを用いて血漿ＲＮＡを抽出した。ＳＩＶ  ｃｎｖ特異的プライマーを用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。最初のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは５’−ＡＴＧ  ＧＧＡ  ＴＧＴ　ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  Ｃ−３’（配列番号：１５）および５’−ＣＣＡ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＧ−３’（配列番号：１６）、２回目のＰＣＲに用いたプライマーは５’−ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＣＧ−３’（配列番号：１７）および５’−ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＧＣ−３’（配列番号：１８）である。５倍希釈したＲＮＡ試料を４連で増幅し、以前の記載にように定量した（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：３６２−３７３；Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．，１９３８，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．２７：４９３−４９７）。このアッセイの検出下限は１．０×１０２  ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌである。
これら４頭のカニクイザルは全て、暴露後２週目に同様のレベルで血漿ＳＩＶ量のピークを示した（図４）。その後、コントロールのカニクイザルでは２頭とも血漿ＳＩＶ  ＲＮＡレベルは減少したが、約１０５  ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌが残存した。これに対しＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇでワクチネーションを行ったカニクイザルでは、２頭とも初期のウイルス血症の後、ウイルス量は有意に低下した（１０２から１０３ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）。より重要なことは、コントロールのカニクイザルの血漿ウイルス量は１０５ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ周辺の高い値に留まったのに対し、免疫したカニクイザルの血漿ウイルス量は最終的に検出可能なレベル（１００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）を下回ったことである（図４）。
［実施例５］  カニクイザルの各組織におけるＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの発現
カニクイザルにおける組み換えＳｅＶの初期複製を調べるため、６頭のカニクイザルの鼻腔内にＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを接種した（表２、グループＩ）。カニクイザルは実験動物に関する研究所のガイドラインに従って維持した。実験に用いる前にＳｅＶおよびＳＩＶの陰性試験を行った。採血、鼻腔拭い液（ｎａｓａｌ  ｓｗａｂ）の採取、およびワクチネーションを行う場合はケタミン麻酔下で行った。これらのサルはいずれも、接種後に明白な臨床症状は示さなかった。接種後４日目（ｄａｙ４）にグループＩ−Ａ中の２頭（Ｃ３８８０およびＣ４３２５）を、７日目（ｄａｙ７）にグループＩ−Ｂ中の２頭（Ｃ３９９３およびＣ４２４０）を、１３日目（ｄａｙ１３）にグループＩ−Ｃ中の２頭（Ｃ３８８２およびＣ４３２４）をそれぞれ安楽死させた、剖検により採取した各組織から細胞を調製し、細胞からＲＮＡを抽出した。
具体的には、ＬＮ、胸腺、および脾臓から、組織をミンスして細胞を調製した。鼻腔粘膜、口蓋扁桃、気管、および肺からは、コラゲナーゼおよびディスパーゼ処理後に細胞を調製した。これらの細胞はＲＮＡ抽出前にＰＢＳで３回洗浄した、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は全血試料からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて文献（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：３６２−３７３）に従って調製した。ＲＮＡは細胞からＲＮＡ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ｎｅｓｔｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）はＳＩＶ  ｇａｇ特異的プライマーを用いて行い、ＲＮＡ試料を限界希釈し、文献（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：３６２−３７３）に従って希釈限界を決定することによりｇａｇＲＮＡレベルを定量した。ＳｅＶ　Ｎ  ｍＲＮＡレベルはＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）を用いた定量ＰＣＲにより定量した。
2001072340.tif 000004
５−１．カニクイザルの鼻腔粘膜におけるＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの発現
定量ＲＴ−ＰＣＲにより、６頭のカニクイザル全ての鼻腔粘膜から調製した細胞において、有意なレベルのＳＩＶ  ｇａｇＲＮＡが検出された（図５Ａ）。グループＩ−Ａの４日目（ｄａｙ４）においては、１０６細胞当たり約１．７×１０４または２．６×１０５コピーのｇａｇ  ＲＮＡが検出された。７日目（ｄａｙ７）および１３日目（ｄａｙ１３）の発現レベルは４日目（ｄａｙ４）に比べて低下した。さらに、定量ＲＴ−ＰＣＲにより鼻腔粘膜におけるＳｅＶ  Ｎ  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した（図５Ｂ）。ほとんどのカニクイザルにおいて、ＳｅＶ  Ｎ  ｍＲＮＡレベル（図５Ｂに示す）はｇａｇ  ＲＮＡレベル（図５Ａに示す）の１／４または１／３に相当した。これらの結果から、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを接種したカニクイザルの鼻腔粘膜において、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇが有意に発現することが確認された。
次に、鼻腔拭い液からＳｅＶが回収されるかを調べた。鼻腔拭い液の採取は上記と同様にして行った。拭い液試料はＲＰＭＩ−１６４０で希釈し、ＳｅＶを回収するため鶏卵の尿膜腔に注入した。鼻腔粘膜から調製した細胞からのＳｅＶの回収においては、細胞の凍結融解を２回行った後、ＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁させた１×１０５細胞を鶏卵の尿膜腔に注入した。４８時間インキュベート後、尿液を回収し、文献（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）に従ってヘマグルチネーション（ＨＡ）アッセイに供しＳｅＶを検出した。
表３に示すように、４日目（ｄａｙ４）において６頭全ての鼻腔拭い液からウイルスが回収された。７日目（ｄａｙ７）では、４頭のカニクイザルのうち２頭からウイルスが回収されたが、この２頭はいずれも、鼻腔粘膜においてより高いｇａｇ  ＲＮＡレベルを示していた。１３日目（ｄａｙ１３）では、両方のサルでウイルスは回収されなかった。さらに、鼻腔粘膜から調製した細胞１×１０５からウイルスが回収されるかを調べた（表３）。４日目（ｄａｙ４）の試料からはウイルスが回収されたが、７日目（ｄａｙ７）または１３日目（ｄａｙ１３）の試料からはウイルスは回収されなかった。これらの結果は、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの複製レベルは１週間以内にピークに達することを示している。
2001072340.tif 000005
５−２．カニクイザルの鼻腔の近傍リンパ節でのＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの発現
有意なレベルのｇａｇ  ＲＮＡが、咽頭後ＬＮ（ｒｅｔｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ＬＮ）および顎下ＬＮ（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ＬＮ）でも見出された（図５Ｃおよび図５Ｄ）。これらはいずれも鼻腔からのリンパ球が最初に流入するリンパ節である。７日目（ｄａｙ７）および１３日目（ｄａｙ１３）の各動物におけるＬＮでのｇａｇＲＮＡレベルは、鼻腔粘膜の場合の約１／２０であった。しかし４日目（ｄａｙ４）では、各動物における咽頭後ＬＮのｇａｇＲＮＡレベルは鼻腔粘膜の場合の１／５０以下であった。従って、４日目（ｄａｙ４）と７日目（ｄａｙ７）の間でこのＬＮ中のレベルの有意な違いは観察されなかった。
５−３．カニクイザルの他の組織でのＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの発現
ｇａｇの発現を表４に示すように他の組織においても調べた。口蓋扁桃では十分な細胞が得られなかったが、その発現レベルは咽頭後ＬＮの発現レベルよりも低いことが示された。気管での発現は２点、すなわち４日目（ｄａｙ４）のＣ３８８０および７日目（ｄａｙ７）のＣ４２４０で検出可能であった。前者の発現は後者の発現よりずっと高かった。肺での発現はＣ３８８０［４日目（ｄａｙ４）］でのみ検出された。胸腺または鼠径ＬＮでは発現は観察されなかった。脾臓では発現はほとんど検出されず、わずかな発現が１個体のみで検出された［７日目（ｄａｙ７）］。ＰＢＭＣにおいては、７日目（ｄａｙ７）において４頭のカニクイザル中２頭でｇａｇの発現が示されたが、４日目（ｄａｙ４）または１３日目（ｄａｙ１３）では発現は観察されなかった。表４で調べた全ての組織において、ｇａｇの発現は鼻腔粘膜、咽頭後ＬＮ、および顎下ＬＮに比べずっと低かった。
2001072340.tif 000006
［実施例６］  ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させた細胞によるＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激
ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させた細胞が、実際にＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激できるかを調べるため、抗原特異的な細胞内ＩＦＮ−γ誘導をフローサイトメトリーにより解析した。ＳＩＶに慢性的に感染したアカゲザル由来のＰＢＭＣを用いた。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）は、実験動物に関する研究所のガイドラインに従って維持した。実験に用いる前にＳｅＶおよびＳＩＶの陰性試験を行った。採血、鼻腔拭い液（ｎａｓａｌ　ｓｗａｂ）の採取、およびワクチネーションを行う場合はケタミン麻酔下で行った。文献（Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：３３１０−３３１８）に記載のように、この動物は予めプロウイルスＤＮＡワクチネーションを受け、その後ＳＩＶｍａｃ２３９（Ｋｅｓｔｌｅｒ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１１０９−１１１２）の暴露による感染を受けている。５１Ｃｒ−放出アッセイにより、ＳＩＶ感染の慢性期の間、ＳＩＶ−Ｇａｇ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性が確認された（データ省略）。
抗原特異的インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導のフローサイトメトリーによる検出は、以下のようにして行った。まず、自家Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｐａｐｉｏ不死化Ｂリンパ芽球細胞株（ＢＬＣ）（Ｖｏｓｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３９：１８５−１９５）にコントロールのワクシニアウイルスベクター（Ｖｖ−ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：７４１５−７４１９）、ＳＩＶ  Ｇａｇを発現する組み換えワクシニアウイルスベクター（Ｖｖ−Ｇａｇ）、またはコントロールＳｅＶベクター（ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌ）をｍ．ｏ．ｉ．を５で感染させ、１日後、文献に記載のように（Ｇｅａ−Ｂａｎａｃｌｏｃｈｅ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６５：１０８２−１０９２）、それぞれ対照の非特異的、Ｇａｇ特異的、またはＳｅＶ特異的スティミュレーター（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ；刺激細胞）として使用した。
培養管（Ｆａｌｃｏｎ＃３０３３）に１×１０６のＰＢＭＣを１×１０３の上記のスティミュレーター細胞と共に１０％ＦＢＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中で共培養した。１時間インキュベートした後、細胞に０．７５μｌ／ｍｌのＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ｍｏｎｅｓｉｎ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加え、さらに５時間インキュベートした。
ｐ２７による刺激（実施例７）の場合、１×１０６のＰＢＭＣは２μｇの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）および１０μｇの組み換えＳＩＶＧａｇ  ｐ２７蛋白質を含む、１０％ＦＢＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中で、培養管中でインキュベートした。３時間インキュベートした後、細胞に０．７５μｌ／ｍｌのＧｏｌｇｉＳｔｏｐを加え、さらに１５時間インキュベートした。
その後、Ｃｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、説明書に従って細胞内ＩＦＮ−γ染色を行った。具体的には、刺激した細胞を回収し、表面分子に対する抗体の混合液と共に室温で２０分染色した。抗体には、抗ヒトＣＤ８  ＰｅｒＣＰ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抗ヒトＣＤ３  ＡＰＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた。その後０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍにより固定、透過化処理を行い、抗ヒトＩＦＮ−γＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で４℃で３０分染色した。染色した試料をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで回収し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。各試料において、ＢＬＣによる刺激の場合の全事象（ｔｏｔａｌ  ｅｖｅｎｔｓ）は１００，０００から２００，０００であり、組み換え蛋白質による刺激の場合の全事象は５０，０００から１００，０００であった。ゲーティングは単核細胞において行い、その後ＣＤ３＋ＣＤ８＋のサブポピュレーションについて行った。単核細胞数に対するＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞数の比を評価し、１×１０６リンパ球当たりのＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞数として示した。
ＳＩＶＧａｇを発現する組み換えワクシニアウイルス（Ｖｖ−Ｇａｇ）を感染させた自家ＢＬＣとＰＢＭＣとの共培養では、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＳＩＶＧａｇ特異的細胞内ＩＦＮ−γ誘導が示された（図６Ｃ）。ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＢＬＣとＰＢＭＣとの共培養でも、ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞が同様の頻度で観察された（図６Ｂ）。ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌを感染させたＢＬＣとＰＢＭＣとの共培養では、ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の有意な誘導は見出されなかった（図６Ａ）。これらの結果は、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させたＢＬＣはＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を効率的に刺激することを示している。
［実施例７］  アカゲザルのＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度
ＳｅＶワクチネーション後の初期免疫応答を解析するため、５頭のアカゲザルを用いて別のの実験を行った（表２、グループＩＩ）。グループＩＩ−Ａのうち２頭（Ｒ００４およびＲ０１４）はＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌを鼻腔内に接種し、グループＩＩ−Ｂの３頭（Ｒ０１３、Ｒ０１５、およびＲ０１７）はＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを接種した。Ｒ０１０はＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌワクチネーションの１２週から６週間前に、他の実験のためにコントロールＤＮＡワクチネーション（筋肉内接種により８００μｇのｐＣＭＶＮ  ＤＮＡ［Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：３３１０−３３１８］およびｇｅｎｅ  ｇｕｎにより１０μｇのｐＣＭＶＮ  ＤＮＡを４回）を受けている。これらのサルはいずれも、接種後に明白な臨床症状は示さなかった。
３週目（ｗｅｅｋ３）に得たＰＢＭＣを、Ｖｖ−Ｇａｇに感染させた自家ＢＬＣと共培養し、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＦＮ−γ誘導を調べた。ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを接種したグループＩＩ−Ｂのアカゲザルは全て、Ｇａｇ特異的刺激後にＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞が有意な頻度で検出されたが、非特異的な刺激では検出されなかった（図７Ａ）。これに対し、ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌを接種したグループＩＩ−Ａのアカゲザルでは、Ｇａｇ特異的刺激後も、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γの有意な誘導は観察されなかった。これらの結果は、全身性免疫応答、すなわちＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇでワクチネーションを行ったアカゲザルで起こることを示している。
次に、鼻腔周囲の局所的な免疫応答を、グループＩ−Ｃの咽頭後ＬＮから調製した細胞を用いて調べた。グループＩのアカゲザルからの自家ＢＬＣの調製がうまく行われなかったため、組み換えＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２７蛋白質を用いてＧａｇ特異的刺激を行った。グループＩ−Ｃの両方のアカゲザルにおいて、ｐ２７と反応するＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞が有意な頻度で検出されたことから、このＬＮにおいてｐ２７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導されていることが示された、
［実施例８］  アカゲザルにおけるＳｅＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度
ＳｅＶ特異的な細胞性免疫応答を、ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌまたはＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを接種したアカゲザルで調べた。グループＩＩの全ての動物のＰＢＭＣにおいて、３週目（ｗｅｅｋ３）にＳｅＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が高い頻度で検出された（図８Ｂ）。また、これらの全てにおいて、１週目（ｗｅｅｋ１）で既にＳｅＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が有意な頻度で出現していることが示された（図８Ａ）。従って、大規模なＳｅＶ特異的細胞性免疫応答が、ワクチネーション後に迅速に誘導されることが判明した。
抗体ＥＬＩＳＡにより、血漿中の蛋白質レベルを評価した。抗ＳｅＶ抗体ＥＬＩＳＡは不活化したＳｅＶを用いて行った（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３６：１５１８−１５２２）。抗ＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２７抗体ＥＬＩＳＡは組み換えｐ２７蛋白質（ＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を用いて行った。抗ＳｅＶ抗体ＥＬＩＳＡでは血漿試料を１０００倍に、抗ｐ２７抗体ＥＬＩＳＡでは１００倍に希釈した。
グループＩＩの全てのアカゲザルにおいて、血漿中の抗ＳｅＶ抗体はワクチネーション後１週目（ｗｅｅｋ１）では検出されないが、２週目（ｗｅｅｋ２）では有意なレベルの抗体が出現していた（図９）。これに対して血漿中の抗Ｇａｇ抗体は、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを接種したグループＩＩ−Ｂのアカゲザルにおいても検出されなかった（データ省略）。
［実施例９］  ＤＮＡワクチンとの組み合わせによるプライム−ブースト効果
ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔによるワクチネーションにおいて、ＤＮＡワクチンとの組み合わせの効果を試験した。アカゲザルを用いた実験のプロトコルを表５に示した。ＤＮＡワクチネーションは文献（Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：３３１０−３３１８，２０００参照）に従って、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ；ｉ．ｍ．）接種およびジーンガン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により行った。ｉ．ｍ．接種では、ＰＢＳに溶解した０．２５μｇ／μｌのＤＮＡ溶液を各回２００μｌずつ、計８００μｌ四頭筋に注入した。また、ジーンガンによる接種は大腿の前部皮膚中への注入により行った（Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：３３１０−３３１８，２０００参照）。ｃｏｎｔｒｏｌ群４頭、ＤＮＡワクチン＋ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇワクチン投与群４頭とした。ＤＮＡワクチンの詳細は、文献（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８，１９９７；Ｌｕ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３９８７−３９９１，１９９６；Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：３３１０−３３１８，２０００）を参照、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ投与は、上記と同様で、１０８  ＣＩＵ鼻腔投与により行った。ワクチネーション開始の２６週目に１０
ＴＣＩＤ５０のサル−ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ  ８９．６−ＰＤ）（Ｌｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．１９（１）：６−１８，１９９８）を静脈注射により暴露した。ＤＮＡワクチン＋ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇワクチンにより、ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬの誘導が観察され、末梢血ＣＤ４  ｃｏｕｎｔの変化から、投与群４頭の全てで病原性ＳＨＩＶ暴露（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する感染防御が認められた（図１０および１１）。また、ＤＮＡワクチン＋ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇワクチン接種群の血漿中のＳＨＩＶ  ＲＮＡコピー数は、コントロール群と比較して、感染急性期より有意に低値を示した（図１２）。
2001072340.tif 000007
産業上の利用の可能性
本発明により、免疫不全ウイルスのウイルス蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンが提供された。センダイウイルスベクターは毒性が低く、また鶏卵を使って大量に製造できるため、安全で簡便な生組み換えワクチンの製造が可能である。本発明のワクチンにより、ＡＩＤＳウイルスの感染および／またはＡＩＤＳの発症・進行を抑制する有望なワクチン戦略が提供される。
【配列表】
2001072340.tif 000008
2001072340.tif 000009
2001072340.tif 000010
2001072340.tif 000011
2001072340.tif 000012
2001072340.tif 000013
2001072340.tif 000014
2001072340.tif 000015
2001072340.tif 000016
【図面の簡単な説明】
図１は、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを用いたＳＩＶ  Ｇａｇ発現を示す図および写真である。（Ａ）ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇアンチゲノムＲＮＡを生成する構築プラスミドであるｐＳｅＶ（＋）１８ｂＶ（−）／ＳＩＶｇａｇの構造。（Ｂ）モノクローナルマウス抗ｐ２７抗体を用いたウェスタンブロット解析。偽感染（レーン１）、ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌ感染（レーン２）、またはＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ感染（レーン３）の２４後にＣＶ１細胞を溶解した。（Ｃ）抗ｐ２７抗体およびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いた免疫染色。偽トランスフェクト（ａ）、またはＳＨＩＶＭＤ１４ＹＥＤＮＡ（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：３６２−３７３）をトランスフェクト（ｂ）、あるいはＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌ（ｃ）またはＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ（ｄ）を感染（ＭＯＩ＝０．０５）させたＣＶ１細胞。（Ｄ）トリプシン（７．５μｇ／ｍｌ）存在下の多サイクル増殖条件（Ｓａｋａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５６：２２１−２２６）でのＣＶ１細胞におけるＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌおよびＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇの複製カイネティクス。初期感染において、細胞にＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌまたはＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを、ｍ．ｏ．ｉを０．０５で感染させた。
図２は、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを介したＧａｇ発現により誘導されるＳＩＶ　Ｇａｇ特異的細胞性免疫応答を示す図である。（Ａ）ＶＶ／ＳＩＶｇａｇ（左パネル，黒四角）またはＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ（右パネル，黒丸）を感染させたＢ細胞をＳＩＶ  Ｇａｇ特異的リシスの標的として用いたＣＴＬアッセイ。ＶＶ／ＷＲ（左パネル，白四角）またはＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｉ（右パネル，白丸）を感染させたＢ細胞を非特異的リシスの測定のため用いた。ＳＩＶ感染の３週目に新たに調製したＲｈ０１８  ＰＢＭＣをエフェクターとして用いた。（Ｂ）ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ感染細胞と共培養したＰＢＭＣにおけるＩＥＮ−γ産生。１２週目に調製したＲｈ０１８  ＰＢＭＣを、ＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌ感染細胞による非特異的刺激共培養（左レーン）またはＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ感染細胞によるＧａｇ特異的刺激共培養（右レーン）に用いた  それらの培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡでアッセイした。（Ｃ）ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ感染細胞を用いたＰＢＭＣ共培養におけるＳＩＶ  Ｇａｇ特異的ＣＴＬの増殖。上記の非特異的（左レーン）またはＧａｇ特異的（右レーン）刺激共培養中のＰＢＭＣをエフェクターとして用いた。ＶＶ／ＳＩＶｇａｇ感染Ｂ細胞をＧａｇ特異的リシス（黒四角）の標的として、またＶＶ／ＷＲ感染Ｂ細胞を非特異的リシス（白四角）の標的として用いた。
図３は、ワクチネーション後の免疫応答を示す図である。矢印は初回、２回目、および３回目のワクチネーションの時点を示す。（Ａ）末梢血中のＣＤ４陽性（黒丸）またはＣＤ８陽性（白四角）リンパ球数（ｃｅｌｌｓ／μｌ）。（Ｂ）抗ＳｅＶ（黒丸）または抗ｐ２７（白四角）抗体ＥＬＩＳＡにおける４０５ｎｍの光学密度（ＯＤ）
図４は、ＳＩＶ暴露後の血漿ＳＴＶ  ＲＮＡコピー数（ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）を示す図である。カニクイザル鼻腔内に１０８  ＣＩＵのＳｅＶベクターによる３回のワクチネーションを行った。最初のワクチネーション後２２週目に、それらのカニクイザルに１００  ＴＣＩＤ５０のＳＩＶｍａｃ２３９を静脈注射により暴露させた。
図５は、グループＩカニクイザルのＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇＲＮＡ発現を示す図である。（Ａ）鼻腔粘膜から調製した細胞のＳＩＶｇａｇ  ＲＮＡレベル。（Ｂ）鼻腔粘膜から調製した細胞のＳｅＶ  Ｎ  ｍＲＮＡレベル。（Ｃ）咽頭後ＬＮから調製した細胞のＳＩＶ  ｇａｇ  ＲＮＡレベル。（Ｄ）顎下ＬＮから調製した細胞のＳＩＶ  ｇａｇ  ＲＮＡレベル。４日目（ｄａｙ  ４）におけるＣ３８８０またはＣ４３２５のレベルは未決定。
図６は、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇを感染させた細胞で刺激後の細胞内ＩＦＮ−γ誘導のフローサイトメトリーによる検出を示す図である。ＳＩＶを感染させたアカゲザルのＰＢＭＣを、それぞれＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａ）、ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ（Ｂ）、およびＶｖ−Ｇａｇ（Ｃ）を感染させた自家ＢＬＣと共に共培養した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋リンパ球をゲーティングしたドットプロットを示す。各ドットプロットにおいて、ゲーティングされた細胞数に対する、四角で囲んだ細胞数の割合（％ＩＦＮ−γ＋）を示した。
図７は、ワクチネーションを行ったアカゲザルにおけるＧａｇ特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞を頻度を示す図である。（Ａ）グループＩＩアカゲザルの３週目（ｗｅｅｋ３）のＰＢＭＣを、Ｖｖ−ｃｏｎｔｒｏｌ（白いボックス）またはＶｖ−Ｇａｇ（黒いボックス）を感染させたＢＬＣと共培養し、フローサイトメトリーによる解析を行った。ＮＤ，未決定。（Ｂ）２週目（ｗｅｅｋ２）のグループＩ−Ｃアカゲザルの咽頭後ＬＮ由来の細胞を、ＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２７の非存在下（白いボックス）または存在下（黒いボックス）でインキュベートし、フローサイトメトリーによる解析を行った。
図８は、ワクチネーションを行ったアカゲザルにおけるＳｅＶ特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の頻度を示す図である。グループＩＩアカゲザルの１週目（ｗｅｅｋ１）（Ａ）または３週目（ｗｅｅｋ３）（Ｂ）のＰＢＭＣを、Ｖｖ−ｃｏｎｔｒｏｌ（白いボックス）またはＳｅＶ／ｃｏｎｔｒｏｌ（黒いボックス）を感染させたＢＬＣと共培養し、フローサイトメトリーによる解析を行った。ＮＤ，未決定。
図９は、ワクチネーションを行ったアカゲザルにおける血漿中の抗ＳｅＶ抗体レベルのＥＬＩＳＡによる決定を示す図である。１：１０００に希釈した血漿で得られた吸収のカイネティクスを示す。ＯＤ，光学密度。
図１０は、ＤＮＡワクチン＋ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇワクチンによるＳＩＶ  Ｇａｇ特異的ＣＴＬの誘導を示す図である。ＳＩＶ  Ｇａｇ特異的５１Ｃｒ−放出（％）を示す。ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇ投与（ｗｅｅｋ１２）による追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）の効果を示している。１２週目と１４週目とを比較のこと。
図１１は、ＤＮＡワクチン−ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇワクチンによる病原性ＳＨＩＶ暴露（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する感染防御を示す図である。末梢血ＣＤ４  Ｔ細胞のｃｏｕｎｔの変化を示す。ｃｏｎｔｒｏｌ群４頭全てにおいて、ｃｈａｌｌｅｎｇｅ後２週目でＣＤ４−ｄｅｐｌｅｔｌｏｎが認められたが、ＤＮＡワクチン＋ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇワクチン投与群では、４頭全てにおいてＣＤ４−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎから保護された。
図１２は、ＤＮＡワクチン＋ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇワクチンによる病原性ＳＨＩＶ暴露に対する感染防御を示す図である。血漿中のＳＨＩＶ  ＲＮＡコピー数の変化を示す。コントロール群と比較して、ＤＮＡワクチン＋ＳｅＶ／ＳＩＶｇａｇワクチン投与群のＳＨＩＶ  ＲＮＡコピー数は、感染急性期より有意に低値を示した。
【図１】
2001072340.tif 000017
【図２】
2001072340.tif 000018
【図３】
2001072340.tif 000019
【図４】
2001072340.tif 000020
【図５】
2001072340.tif 000021
【図６】
2001072340.tif 000022
【図７】
2001072340.tif 000023
【図８】
2001072340.tif 000024
【図９】
2001072340.tif 000025
【図１０】
2001072340.tif 000026
【図１１】
2001072340.tif 000027
【図１２】
2001072340.tif 000028
【国際調査報告】
2001072340.tif 000029
2001072340.tif 000030
2001072340.tif 000031
2001072340.tif 000032
2001072340.tif 000033
2001072340.tif 000034