(57)【要約】下記一般式（Ｉ）2003018010.tif 000018記載の化合物または薬学上許容されるその塩を有効成分とする、虚血性心疾患、急性冠状動脈症候群等の動脈硬化作用に基づく疾患の予防及び／または治療薬。従来知られている薬剤よりも、強力で新規な動脈硬化作用に基づく疾患の予防及び／または治療薬を提供する。（式中、Ａはチアゾリジンジオン環等を表し、−Ｘ−は−Ｏ−または−Ｓ−を表し、＝Ｙ−は、＝Ｎ−または＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して水素原子等を表し、ｎは０〜３の整数を表し、点線は当該部分の結合が二重結合であってもよいことを表す。）
2003018010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）記載の化合物または薬学上許容されるその塩を有効成分とする動脈硬化作用に基づく疾患の予防及び／または治療薬。
2003018010.tif 000012
（上記一般式（Ｉ）中、
2003018010.tif 000013
を表し、−Ｘ−は、−Ｏ−または−Ｓ−を表し、＝Ｙ−は、＝Ｎ−または＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アルコキシアルコキシ基、アリールオキシ基、アルカノイルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、アルキルアミノカルボニル基、アリールアミノカルボニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アルカノイルアミノ基、アリールカルボニルアミノ基、エチレンジオキシメチル基、ホルミル基、シアノ基、ニトロ基またはトリハロメチル基を表し、Ｒ６は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、または置換されていてもよいアリール基を表し、ｎは、０〜３の整数を表し、点線は当該部位の結合が二重結合であってもよいことを表す。）
【請求項２】
請求項１の一般式（Ｉ）中、
2003018010.tif 000014
を表し、Ｘが−Ｏ−を表し、Ｙが＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子を表し、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子を表し、ｎが１を表し、点線の当該部位の結合が単結合であることを特徴とする請求項１記載の予防及び／または治療薬。
【請求項３】
請求項１記載の一般式（Ｉ）中、Ｒ１がフッ素原子であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素原子であることを特徴とする請求項２記載の予防及び／または治療薬。
【請求項４】
ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδ活性化作用を有することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の予防及び／または治療薬。
【請求項５】
動脈硬化作用に基づく疾患が、虚血性心疾患または急性冠状動脈症候群であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の予防及び／または治療薬。
【請求項６】
請求項１の一般式（Ｉ）で表される化合物または薬学上許容されるその塩を有効成分とするＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項７】
請求項１の一般式（Ｉ）中、
2003018010.tif 000015
を表し、Ｘが−Ｏ−を表し、Ｙが＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子を表し、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子を表し、ｎが１を表し、点線の当該部位の結合が単結合であることを特徴とする請求項６記載の活性化剤。
【請求項８】
請求項１の一般式（Ｉ）中、Ｒ１がフッ素原子であり、Ｒ２，Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素原子であることを特徴とする請求項７記載の活性化剤。
【請求項９】
ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγ活性化作用を有することを特徴とする請求項６から８のいずれかに記載の活性化剤。
【請求項１０】
請求項１の一般式（Ｉ）で表される化合物または薬学上許容されるその塩を有効成分とする血管内皮細胞における接着分子発現抑制剤。
【請求項１１】
請求項１の一般式（Ｉ）中、
2003018010.tif 000016
を表し、Ｘが−Ｏ−を表し、Ｙが＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子を表し、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子を表し、ｎが１を表し、点線の当該部位の結合が単結合であることを特徴とする請求項１０記載の活性化剤。
【請求項１２】
請求項１の一般式（Ｉ）中、Ｒ１がフッ素原子であり、Ｒ２，Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素原子であることを特徴とする請求項１１記載の抑制剤。
【請求項１３】
接着分子がＶＣＡＭ−１であることを特徴とする請求項１０から１２のいずれかに記載の活性化剤。
【請求項１４】
請求項１の一般式（Ｉ）で表される化合物または薬学上許容されるその塩を有効成分とする血管内皮細胞における単球の接着・遊走を起こす分子の分泌抑制剤。
【請求項１５】
請求項１の一般式（Ｉ）中、
2003018010.tif 000017
を表し、Ｘが−Ｏ−を表し、Ｙが＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子を表し、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子を表し、ｎが１を表し、点線の当該部位の結合が単結合であることを特徴とする請求項１４記載の抑制剤。
【請求項１６】
請求項１の一般式（Ｉ）中、Ｒ１がフッ素原子であり、Ｒ２，Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素原子であることを特徴とする請求項１５記載の抑制剤。
【請求項１７】
単球の接着・遊走を起こす分子がＭＣＰ−１であることを特徴とする請求項１４から１６のいずれかに記載の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は動脈硬化作用に基づく疾患の予防及び／または治療薬に関し、詳細には、特定のナフタレン誘導体を有効成分とする虚血性心疾患または急性冠状動脈症候群等の動脈硬化作用に基づく疾患の予防及び／または治療薬に関する。
背景技術
ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）には、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδの３サブタイプの存在が知られている。ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδの活性化剤として、それぞれフィブレート系抗高脂血症剤、チアゾリジンジオン系インスリン抵抗性改善薬及びＰＰＡＲδ選択的アゴニストＧＷ５０１５１６等が知られている。
ＰＰＡＲα活性化により、脂質代謝改善作用とともに、虚血性心疾患や脳血管障害などの動脈硬化に対して予防あるいは治療効果が得られることが知られている。すなわち、ヒトで抗動脈硬化作用が報告されているフィブレート系薬剤の作用機序として、ＰＰＡＲαの活性化による肝臓でのβ酸化亢進による脂質代謝改善作用に加えて、ＡｐｏＡ−Ｉ産生増強による血中高比重リポ蛋白（ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＤＬ）の増加作用、血管内皮細胞での細胞接着因子やエンドセリン−１の発現抑制作用、血管平滑筋での炎症性サイトカインの産生抑制による抗炎症作用、単球あるいはマクロファージでのＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ発現抑制作用及びコレステロール逆転送系の活性化作用が報告されている。
ＰＰＡＲγ活性化により、インスリン感受性増強による血糖・脂質低下作用に加えて、血管平滑筋の増殖抑制作用、ＭＭＰ産生抑制による血管平滑筋の遊走抑制作用、単球あるいはマクロファージにおけるＶＣＡＭ−１あるいはＩＣＡＭ−１など接着因子の発現抑制作用、マクロファージからのＴＮＦ−α、ＩＬ−１βあるいはＩＬ−６など炎症性サイトカインの産生抑制作用及びＭＭＰ−９の産生抑制作用が得られることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験結果から報告されている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２００１，２４：３９２）。これら血管に対する作用は抗動脈硬化として作用することが予想される。実際、最近ＰＰＡＲγアゴニストであるＴｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅを用いた、ＬＤＬ受容体ノックアウトマウスあるいはＡｐｏＥノックアウトマウスでの抗動脈硬化作用が報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００，１０６：５２３，Ａｒｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００１．２１：３６５，Ａｒｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００１．２１：３７２）。
ＰＰＡＲδの機能に関しては不明な点も多いが、ＰＰＡＲδアゴニストのＬ−１６５０４１あるいはＧＷ５０１５１６を用いた実験結果から、コレステロール代謝への関与が示唆されている。実際ＰＰＡＲδ活性化により、血中ＨＤＬの増加、血中ＡｐｏＡ−１の増加、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ａ１（ＡＢＣ−Ａ１）の発現上昇によるコレステロール逆転送系の亢進が報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００１，９８：５３０６）。
国際公開パンフレットＷＯ９８／０５３３１号には、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγアゴニストの単独投与よりも、それらのコンビネーション治療が、糖尿病及び動脈硬化に有効であることが示されている。また、国際公開パンフレットＷＯ９６／０１３１７号には、ＰＰＡＲγあるいはＰＰＡＲδを介する作用の動脈硬化への重要性が示されているが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδ活性化作用を同時に有する薬剤に関しては一切記載されておらず、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδ活性化作用を同時に有する化合物薬剤による動脈硬化の予防及び／または治療薬としての使用に関しても、記載は一切なされておらず、示唆すらなされていない。
一方、特開平６−２４７９４５号公報には、本願発明で有効成分とする化合物が、より強力で副作用の少ない糖尿病治療薬として使用できることが記載されているが、当該化合物と動脈硬化との関係に関しては、本発明者らが知る限りこれまで一切報告されておらず、また、ＰＰＡＲδに対する活性化作用並びにＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδすべてに対する活性化作用に関しても、本発明者らが知る限りこれまで一切報告されていない。また、前期公報には、本願発明で有効成分とする化合物が、血管内皮細胞における接着分子に対する発現抑制作用を有することや、血管内皮細胞における単球の接着・遊走を起こす分子の分泌抑制作用があることについても、一切記載されていないし、本発明者らが知る限り一切報告されていない。
本願発明は新規な動脈硬化作用に基づく疾患の予防及び／または治療薬を提供するものである。
発明の開示
本発明者らは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物が、ＰＰＡＲα、γ及びδ活性化作用を同時に有し、動脈硬化作用に基づく疾患の予防および／または治療薬として有望であることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明の要旨は、下記一般式（Ｉ）記載の化合物または薬学上許容されるその塩を有効成分とする動脈硬化作用に基づく疾患の予防及び／または治療薬に存する。
2003018010.tif 000003
（上記一般式（Ｉ）中、
2003018010.tif 000004
を表し、−Ｘ−は、−Ｏ−または−Ｓ−を表し、＝Ｙ−は、＝Ｎ−または＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アルコキシアルコキシ基、アリールオキシ基、アルカノイルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、アルキルアミノカルボニル基、アリールアミノカルボニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アルカノイルアミノ基、アリールカルボニルアミノ基、エチレンジオキシメチル基、ホルミル基、シアノ基、ニトロ基、またはトリハロメチル基を表し、Ｒ６は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、または置換されていてもよいアリール基を表し、ｎは、０〜３の整数を表し、点線は当該部位の結合が二重結合であってもよいことを表す。）
さらに本発明の好ましい態様としては、
2003018010.tif 000005
を表し、Ｘが−Ｏ−を表し、＝Ｙ−が＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子を表し、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子を表し、ｎが１を表し、点線の当該部位の結合が単結合であることを特徴とする上記動脈硬化に基づく疾患の予防及び／または治療薬が挙げられ、中でも、Ｒ１がフッ素原子であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ水素原子であることを特徴とする上記動脈硬化に基づく疾患の予防及び／または治療薬が挙げられる。なお、動脈硬化疾患に基づく疾患としては、虚血性心疾患または急性冠動脈症候群が好ましい態様として挙げられる。
また、本発明の第二の要旨として、上記一般式（Ｉ）記載の化合物または薬学上許容されるその塩を有効成分とするＰＰＡＲδ活性化剤が挙げられ、その好ましい態様としては、
2003018010.tif 000006
を表し、Ｘが−Ｏ−を表し、＝Ｙ−が＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子を表し、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子を表し、ｎが１を表し、点線の当該部位の結合が単結合であることを特徴とするＰＰＡＲδ活性化剤が挙げられ、中でも、Ｒ１がフッ素原子であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ水素原子であることが更に好ましい態様として挙げられる。また、ＰＰＡＲδだけでなく、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγに対する活性化作用を有することも好ましい態様として挙げられる。
本発明の第三の要旨として、上記一般式（Ｉ）記載の化合物または薬学上許容されるその塩を有効成分とする血管内皮細胞における接着分子発現抑制剤が挙げられ、その好ましい態様としては、
2003018010.tif 000007
を表し、Ｘが−Ｏ−を表し、＝Ｙ−が＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子を表し、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子を表し、ｎが１を表し、点線の当該部位の結合が単結合であることを特徴とするＰＰＡＲδ活性化剤が挙げられ、中でも、Ｒ１がフッ素原子であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ水素原子であることが更に好ましい態様として挙げられる。また、接着分子としては、ＶＣＡＭ−１が好ましい態様として挙げられる。
本発明の第四の要旨として、上記一般式（Ｉ）記載の化合物または薬学上許容されるその塩を有効成分とする血管内皮細胞における単球の接着・遊走を起こす分子の分泌抑制剤が挙げられ、その好ましい態様としては、
2003018010.tif 000008
を表し、Ｘが−Ｏ−を表し、＝Ｙ−が＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子を表し、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子を表し、ｎが１を表し、点線の当該部位の結合が単結合であることを特徴とするＰＰＡＲδ活性化剤が挙げられ、中でも、Ｒ１がフッ素原子であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ水素原子であることが更に好ましい態様として挙げられる。また、単球の接着・遊走を起こす分子としてはＭＣＰ−１が好ましい態様として挙げられる。
発明を実施するための最良の形態
以下本発明を詳細に説明するに、本発明の有効成分としての化合物は、上記一般式（Ｉ）に記載のようなナフタレン誘導体または薬学上許容されるその塩である。上記一般式（Ｉ）に記載の化合物の例としては特開平６−２４７９４５号公報に記載のものが挙げられる。本発明の化合物のうち好ましい化合物としては、上記一般式（Ｉ）中、
2003018010.tif 000009
を表し、Ｘが−Ｏ−を表し、＝Ｙ−が＝ＣＲ５−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子を表し、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子を表し、ｎが１を表し、点線の当該部位の結合が単結合である化合物が挙げられ、特に好ましい化合物としては、これらの化合物のうち、Ｒ１がフッ素原子であり、Ｒ２，Ｒ３及びＲ４がそれぞれ水素原子である化合物が挙げられる。これらの化合物の塩としては非毒性の塩基との塩が挙げられ、好適な塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩基塩およびアンモニウム塩、トリエチレンアミン等の有機塩基塩が挙げられる。
また、本発明の有効成分としての化合物は、不斉炭素を有する化合物を含んでおり、その場合は立体異性体の単離されたもの、あるいはその混合物も本願発明に含まれる。また、国際公開パンフレットＷＯ２０００／３１０５５号及びＷＯ２００１／３６４０１号に記載の結晶多型も本発明の有効成分として使用可能である。
本発明の化合物は公知化合物であり、例えば特開平６−２４７９４５号公報、国際公開パンフレットＷＯ２０００／３１０５５号及びＷＯ２００１／３６４０１号に記載の方法、あるいはそれに準じた方法により容易に得ることができる。
上記化合物は、これらが以下の実施例にあるようにＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδ活性化作用を示すことから、動脈硬化作用に基づく疾患の予防及び／または治療薬として用いることができる。動脈硬化作用に基づく疾患としては、例えば、虚血性心疾患や急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）等が挙げられる。
また、上記化合物は、以下の実施例に示すとおり、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδすべてに対する活性化作用を有すること、血管内皮細胞における接着分子であるＶＣＡＭ−１の発現抑制作用を有すること、並びに、血管内皮細胞における単球の接着・遊走を起こす分子であるＭＣＰ−１の分泌抑制作用を有する。従って、従来品と比較して、より強力な動脈硬化に基づく疾患に対する予防及び／または治療剤として有効である。
上記化合物は通常の担体とともに、投与経路に応じた製剤とすることができる。例えば、経口投与では錠剤、カプセル錠、顆粒剤、散剤、液剤等の形態に調剤される。経口投与用固形製剤に調整するにあたり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、その他着色剤、崩壊剤等を用いることができる。
賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が挙げられ、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、シエラック、白糖等が挙げられ、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が挙げられる。その他、着色剤、崩壊剤も通常公知のものを用いることができる。なお錠剤は周知の方法によりコーティングしてもよい。
また、液状製剤は水性または油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤、その他であってよく、通常用いられる方法にて調整される。注射剤を調整する場合は上記化合物にｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内用注射剤を製造することができる。
座剤を製造する際の基剤としては、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、ウイテプゾール（登録商標ダイナマイトノーベル社）等の油脂性機剤を用いることができる。
かくして調製される製剤の投与量は患者の症状、体重、年齢等によって異なり、一様に服用することはできないが、通常成人１日当たり上記化合物を約０．０１〜２０００ｍｇの範囲となる量とするのが好ましく、通常は１日１〜４回に分けて投与されるのが好ましい。
実施例
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の例に限定されるものではない。
実施例１
国際公開パンフレットＷＯ２０００／３１０５５号記載の方法に従って得られた５−［６−（２−フルオロベンジルオキシ）−２−ナフチル］−メチル−チアゾリジン−２，４−ジオンのＡ型結晶（以下ＭＣＣ−５５５と称することもある）のＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδ活性化作用を以下の方法で確認した。
ＰＰＡＲα、γおよびδの転写活性に対する作用の検討には、ヒトＰＰＡＲα、γあるいはδのリガンド結合領域とＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域を融合したベクター（以下、Ｇａｌ４−ｈＰＰＡＲα（ＬＢＤ）ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｌ４−ｈＰＰＡＲγ（ＬＢＤ）ｖｅｃｔｏｒ、あるいはＧａｌ４−ｈＰＰＡＲδ（ＬＢＤ）ｖｅｃｔｏｒと略することもある）、及び、ＧＡＬ４応答配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーター遺伝子（以下Ｇａｌ４−Ｌｕｃと略することもある）をそれぞれ導入した２９３Ｔ細胞を使用した。なお、２９３Ｔ細胞は、２９３細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５７３）にＤｕＢｒｉｄｇｅらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，ｖｏｌ７，３７９−３８７）に従ってＴ抗原を導入して作製した。
なお、２９３Ｔ細胞は、通常、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，３７℃）内で１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）含有ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）にて培養し、試験に用いる際にはチャコール及びイオン交換樹脂ＡＧ１−Ｘ８  Ｒｅｓｉｎ（ＢｉｏＲａｄ）で脱脂処理を行ったＦＢＳを１０％含有したＤＭＥＭ（以降ＤＭＥＭ（＋）と略することもある）で培養した。
１日目、ＤＭＥＭ（＋）に懸濁した２９３Ｔ細胞を６穴プレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し培養した。２日目、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ非含有）２００μＬにＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｔａｋａｒａ）９μＬ、Ｇａｌ４−ｈＰＰＡＲα（ＬＢＤ）ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｌ４−ｈＰＰＡＲγ（ＬＢＤ）ｖｅｃｔｏｒ、あるいはＧａｌ４−ｈＰＰＡＲδ（ＬＢＤ）ｖｅｃｔｏｒ  ２μｇ及びＧａｌ４−Ｌｕｃ  １μｇを添加したトランスフェクション溶液を調製し、６穴プレート１ｗｅｌｌあたり２００μＬずつ静かに添加した。一昼夜培養して細胞への遺伝子導入を行った。なお導入したＰＰＡＲ遺伝子に対する作用の特異性を検討するために、ＰＰＡＲリガンド結合領域を含まないベクター（以下、Ｇａｌ４−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒと略）を同様に遺伝子導入した。３日目、６穴プレート３ｗｅｌｌ分の細胞を１つにまとめ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、９６穴プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し培養した。４日目、培養液を、各濃度の被験薬物（０．０３〜３０μＭ）を含むＤＭＥＭ（＋）（ＤＭＳＯ終濃度：０．１％）５０μＬに交換して培養した。化合物暴露３２時間後、Ｌｕｃ−Ｓｃｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を５０μＬ添加した。各ｗｅｌｌの反応液を７０μＬずつ白色プレートに移した後、ルシフェラーゼが反応することによって放たれる発光をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＥＧ  ＆  Ｇ  ｂｅｒｔｈｏｌｄ，ＬＢ９６Ｐ）により計測し、得られた発光強度をルシフェラーゼ産生量の指標とした。
対照群（ＤＭＳＯ  ０．１％）に対する薬剤添加群の発光強度の比活性を求め、用量反応曲線からＥＣ５０値および９５％信頼区間を算出した。
結果を以下の表に示す。また、類似構造の既知化合物（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ：下記式（ＩＩ）、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ：下記式（ＩＩＩ））についてのデータも併記する。
2003018010.tif 000010
2003018010.tif 000011
上記の結果からも明らかなように、本発明化合物はＰＰＡＲγアゴニストであることが知られているＰｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ及びＲｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅと比較して、同程度のＥＣ５０でＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδすべてに対して活性化作用を有することがわかる。
従って、これらの結果より本発明化合物が従来品よりも強力な動脈硬化の予防および／または治療薬として有効であることが類推できる。
実施例２
実施例１と同様のＭＣＣ−５５５を用いて血管内皮細胞での接着分子ＶＣＡＭ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）発現に対する作用を以下の方法で確認した。
血管内皮細胞での接着分子発現に対する作用の検討には、ヒト大動脈血管内皮細胞（以下ＨＡＥＣ：Ｈｕｍａｎ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社，ＵＳＡ）を使用した。なお、ＨＡＥＣ細胞は、通常、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，３７℃）内で２％ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）含有ＥＧＭ−２培養液（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）にて培養した。１日目、２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２培養液に懸濁したＨＡＥＣ細胞を９６穴プレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し培養した。２日目、細胞をＰＢＳで洗浄後、各濃度の被験薬物（０．０３〜３０μＭ）を含む０．４％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２培養液（ＤＭＳＯ最終濃度：０．１％）２００μＬに交換して２４時間培養した。３日目、細胞をＰＢＳで洗浄後、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）および各濃度の被験薬物（０．０３〜３０μＭ）を含む０．４％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２培養液（ＤＭＳＯ終濃度：０．１％）２００μＬに交換して４時間刺激した。ＴＮＦ−α刺激終了後細胞をＰＢＳで洗浄し、抗ヒトＶＣＡＭ−１抗体溶液（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いた以下のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法によりＶＣＡＭ−１発現量を評価した。すなわち、細胞をパラホルムアルデヒドを用いて固定・ブロッキング処理後、一次抗体として抗ヒトＶＣＡＭ−１抗体溶液（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を２００μＬ添加して一晩一次抗体反応を実施した。翌日二次抗体としてＨＲＰ標識の翌日抗マウスＩｇＧ（γ＋Ｌ）ヤギＦ（Ａｂ７）２を２００μＬ添加して４時間二次抗体反応を実施した後、基質溶液（オルトフェニレンジアミンおよび過酸化水素）を添加した。反応後の吸光度をマイクロプレート分光光度計を用いて計測し、得られた吸光度をＶＣＡＭ−１発現量の指標とした。
結果を第１図に示す。また、類似構造の既知化合物（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ：前記式（ＩＩ）、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ：前記式（ＩＩＩ））についてのデータも併記する。
上記の結果からも明らかなように、ＰＰＡＲγアゴニストであることが知られているＰｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ及びＲｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅにはＴＮＦ−α刺激によるＶＣＡＭ−１発現に対して影響を示さなかったが、本発明化合物はＰＰＡＲαアゴニストであることが知られているＦｅｎｏｆｉｂｒａｔｅおよびＷｙ−１４６４３、あるいはＰＰＡＲδアゴニストであることが知られているＧＷ５０１５１６と同様にヒト血管内皮細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＶＣＡＭ−１発現を抑制した。
従って、これらの結果より本発明化合物が従来品よりも強力な動脈硬化の予防および／または治療薬として有効であることが類推できる。
実施例３
実施例１と同様のＭＣＣ−５５５を用いて血管内皮細胞からの単球の接着、遊走を起こす分子としてＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）を用い、ＭＣＰ−１分泌に対する作用を以下の方法で確認した。
血管内皮細胞からのＭＣＰ−１分泌に対する作用の検討には、ヒト大動脈血管内皮細胞（以下ＨＡＥＣ：Ｈｕｍａｎ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社，ＵＳＡ）を使用した。なお、ＨＡＥＣ細胞は、通常、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，３７℃）内で２％ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）含有ＥＧＭ−２培養液（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）にて培養した。１日目、２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２培養液に懸濁したＨＡＥＣ細胞を９６穴プレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し培養した。２日目、細胞をＰＢＳで洗浄後、各濃度の被験薬物（０．０３〜３０μＭ）を含む０．４％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２培養液（ＤＭＳＯ終濃度：０．１％）２００μＬに交換して２４時間培養した。３日目、細胞をＰＢＳで洗浄後、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）および各濃度の被験薬物（０．０３〜３０μＭ）を含む０．４％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２培養液（ＤＭＳＯ終濃度：０．１％）２００μＬに交換して４時間刺激した。ＴＮＦ−α刺激終了後の培養液を回収し、培養液中のＭＣＰ−１濃度をヒトＭＣＰ−１  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて測定した。
結果を第２図に示す。また、類似構造の既知化合物（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ：前記式（ＩＩ）、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ：前記式（ＩＩＩ））についてのデータも併記する。
上記の結果からも明らかなように、ＰＰＡＲγアゴニストであることが知られているＰｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ及びＲｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ、及びＰＰＡＲαアゴニストであることが知られているＦｅｎｏｆｉｂｒａｔｅおよびＷｙ−１４６４３にはＴＮＦ−α刺激によるＭＣＰ−１分泌に対して影響を示さなかったが、本発明化合物あるいはＰＰＡＲδアゴニストであることが知られているＧＷ５０１５１６は、ヒト血管内皮細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＭＣＰ−１分泌を抑制した。
従って、これらの結果より本発明化合物が従来品よりも強力な動脈硬化の予防および／または治療薬として有効であることが類推できる。
産業上の利用分野
本発明によれば、より強力で新規な動脈硬化作用に基づく疾患の予防及び／または治療薬が得られる。
なお、本出願は、日本特許出願  特願２００１−２５２３８８号を優先権主張して出願されたものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、血管内皮細胞での接着分子発現に対する作用を示す図である。
第２図は、血管内皮細胞からのＭＣＰ−１分泌に対する作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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