(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対向するガラス板の間にゲル板とその上端の固定化等電点泳動用ゲル板とを配置した二次元電気泳動装置における第二次元目方向標準線形成装置であって、第二次元目方向の貫通穴部に縦方向溝をラッチ面としてその内面に対向して配設したセッティングラッチと、このセッティングラッチに位置選択自在に装着されるマーカーカップとを有し、マーカーカップは、内空間に第二次元目泳動用外挿標準物質を入れるカップ本体と、これに連通する最下端の毛細管と、両者の間にあって、セッティングラッチのラッチ面縦方向溝に着脱自在に挿着されるガイドレール部とを備え、第二次元目の電気泳動の際に、すでに第一次元目の展開を行っている固定化等電点泳動用ゲル板の所定位置に前記マーカーカップを配置し、そのカップ本体内の第二次元目泳動用外挿標準物質を毛細管を通じて連続的に添加し、試料と共泳動させることによって、第二次元目の方向に所要間隔で線状の標準線を形成することを特徴とする第二次元目方向標準線形成装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、第二次元目標準線形成装置に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、生物工学、医薬工業分野におけるタンパク質の分離・同定や、分子量、等電点の測定、タンパク質名の決定、さらにはタンパク質の純度を決定する手段等として用いられている二次元電気泳動法に有用な、第二次元目標準線形成装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
従来より、混合タンパク質を個々の成分タンパク質に分離・同定する手段として、高分子ゲル板等において、まず試料を等電点について一方向（Ｘ方向）に展開し、次いで分子量について別方向（Ｙ方向）に展開する二次元電気泳動法（２−ＤＥ）が知られている。この二次元電気泳動法では、たとえば二次元用ゲル板が２０ｃｍ×２０ｃｍの場合、約５０００種類のタンパク質が分離できるが、その大きさが３０ｃｍ×３０ｃｍの場合には、その約３倍の１５０００種類のタンパク質を分離することが可能であるとされている。
【０００３】
また、最近では、第一次元目の等電点電気泳動に固定されたグラジェントゲルが市販され、等電点分離の再現性が高まり、０．１ｐＨ単位の再現性が確保されつつある。さらにまた、二次元に展開されたゲル板上のスポットをＰＶＤＦ膜上に電気的にプロットし、各々のタンパク質のアミノ（Ｎ）末端配列を分析する手法においては、ｐｍｏｌ（ピコモル）レベルの高感度な分析が可能になり、この分析手法によって得られた分析結果をタンパク質のアミノ酸配列情報を蓄積したデータベースで検索・照合することによって、タンパク質を同定することも可能になってきている。
【０００４】
一方、画像解析装置やコンピュータの性能が飛躍的に向上したことによって、二次元電気泳動法による解析は、最近流行してきている遺伝子のゲノム解析に対抗もしくは相補的に行われるプロジェクトとして取り上げられ、この二次元電気泳動法プロジェクトがＰｒｏｔｅｏｍｅプロジェクトとして実行に移されるに至っており、生体内で発現した結果を解析するためのほぼ唯一の手段として脚光をあびつつある。
【０００５】
しかしながら、従来の二次元電気泳動法においては、標準タンパク質は各自の系で持ち合わせているタンパク質が多くの場合に用いられてきたが、二次元電気泳動法の規模や形態は、用いる装置によって異なることが多いため、異なる系の二次元電気泳動法データを相互に交換することが困難であった。さらに、同一の生物の全タンパク質を統合し解析するために、異なる組織の多様化しているタンパク質、もしくは時間的に変化するタンパク質を解析する場合に、一連の標準タンパク質を用いてそれらの各二次元電気泳動画面を標準化して統合する必要性が生じてきた。
【０００６】
そこで、この発明の発明者らは、多くの二次元電気泳動の画面を統合したり標準化するために、二次元電気泳動画面上にほどよく分布する外挿タンパク質群を予め選択し、これらを試料タンパク質と共泳動させる方法を提案してきた。
しかしながら、これら従来の二次元電気泳動法においては、数個ないし数十個の少数の標準タンパク質が形成するスポットを基準に標準化が行われていたため、二次元電気泳動に用いられるポリアクリルアミド・ゲルプレートそのものの歪みや、さらには塩、変性剤、共存の有機、無機物質等の試料側に混在する物質による歪みに起因する泳動の局所的な乱れの影響を受けやすい等の問題点があった。
【０００７】
この発明は、以上の通りの事情を鑑みてなされたものであり、従来の諸問題を解消し、二次元電気泳動法の分解能と信頼性を高めることが可能な、二次元電気泳動法に係わる新しい技術手段を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、対向するガラス板の間にゲル板とその上端の固定化等電点泳動用ゲル板とを配置した二次元電気泳動装置における第二次元目方向標準線形成装置であって、第二次元目方向の貫通穴部に縦方向溝をラッチ面としてその内面に対向して配設したセッティングラッチと、このセッティングラッチに位置選択自在に装着されるマーカーカップとを有し、マーカーカップは、内空間に第二次元目泳動用外挿標準物質を入れるカップ本体と、これに連通する最下端の毛細管と、両者の間にあって、セッティングラッチのラッチ面縦方向溝に着脱自在に挿着されるガイドレール部とを備え、第二次元目（Ｙ方向）の電気泳動の際に、すでに第一次元目（Ｘ方向）の展開が完了しているＩＰＧ（固定化等電点泳動用ゲル板）の所定位置に前記マーカーカップを配置し、そのカップ本体内の第二次元目（Ｙ方向）泳動用の外挿標準物質を毛細管を通じて連続的に添加し、試料と共泳動させることによって、第二次元目の方向（Ｙ方向）に所要の間隔で線状の標準線を形成することを特徴とする第二次元目方向標準線形成装置を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
従来、二次元電気泳動法において第一次元目（Ｘ方向）の標準線を導入する手段は、如何なる特別の装置も必要とせず、Ｘ方向上端に入れるＩＰＧ（固定化等電点泳動用ゲル板）をＸ方向標準線に用いる標準化物質の混合溶液に均等に浸すかそれを均等に付加すればよい。しかしながら、第二次元目（Ｙ方向）の標準線を形成するには、手動では電気泳動中、長時間にわたり添加し続けることは不可能に近く、できたとしても軸線の数が限られるか、動いて失敗する例が多かった。
【００１０】
これに対して、この発明においては、標準タンパク質と同数もしくはそれ以下のＹ方向泳動用の外挿標準物質を第一次元目（Ｘ方向）の展開が完了しているＩＰＧ（固定化等電点泳動用ゲル板）の所定位置に添加することで、第二次元目（Ｙ方向）の標準線を連続的に形成することが可能になり、第一次元目（Ｘ方向）及び第二次元目（Ｙ方向）に、分子量および等電点を読みとるための線状の基準である標準線を導入することができる。
【００１１】
さらに、この発明においては、それらを線状の標準線として示すことができるため、二次元電気泳動法の局所的もしくは全体的な乱れを標準化するための情報量が大幅に増加する。
以下、実施例を示し、このような優れた作用が得られるこの発明について、さらに詳しく発明の実施の形態について説明する。
【００１２】
【実施例】
添付した図面の図１、図２および図３は、この発明の第二次元目標準線形成装置を示した斜視図と、平面図およびそのＡ−Ａ断面図である。
これらの図面に示したように、この装置は、主としてマーカーカップ（１）とセッティングラッチ（２）によって構成される。
【００１３】
マーカーカップ（１）は、内空間を持つカップ本体（１１）と、その内空間に連通する毛細管（１２）、ガイドレール部（１３）を有し、カップ本体（１１）の中央下端には、その外周にシリコンゴム等のガスケット（１４）を装着した毛細管（１２）が取り付けられており、これは上下方向に±５ｍｍ程度の調整が可能とされている。また、カップ本体（１１）の直下に配設されているガイドレール部（１３）によって、マーカーカップ（１）は、セッティングラッチ（２）の貫通穴部（２１）の内面に対向して設けられたラッチ面（２２）の縦方向溝（２３）の任意の位置に、着脱自在に、ガイドされて挿着される。この際に、たとえばセッティングラッチ（２）の縦方向溝（２３）の間隔から、１ｍｍごとの移動設置が可能であるが、この溝の間隔を縮めることにより、移動間隔を限りなく小さくすることが可能である。
【００１４】
また、セッティングラッチ（２）上に複数のマーカーカップ（１）を設置することができ、この場合、カップ本体（１１）間の設置間隔は通常１４ｍｍ程度であるが、カップ本体（１１）の形状（矩形）と材質の選択により、たとえばその間隔を５ｍｍまで接近させることができる。さらに、第二次元目の電気泳動幅、たとえば２００ｍｍ（泳動幅の長さに応じて１００〜５００ｍｍにすることができる）のセッティングラッチ（２）に沿って設置が可能である。
【００１５】
なお、以上の装置では、２枚の対向ガラス板（３）によって挟まれているＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル板（４）の上端にＩＰＧゲル板（５）が設置される。
具体的な操作としては、たとえば、第二次元目の泳動距離が２０ｃｍの場合には、２００μｌの電気泳動用の緩衝液（５％グリセリンを含有）に溶かしたＹ方向泳動用外挿標準物質、たとえばインシュリンを入れる。この場合、インシュリンはアミノ基をイミノ化し、水酸基を蛍光標識したものを用いる。カップ本体（１１）直下に配設された毛細管（１２）が第一次目の泳動が完了したＩＰＧゲル板（５）（１８ｃｍ）の表面上部に接触するように調整して設置する。さらに、全てを緩衝液で覆い、通電を可能にする。カップ内の電気泳動用の緩衝液にグリセリンを入れるのは、上記緩衝液と混合しないためである。
【００１６】
この装置のマーカーカップ（１）は、セッティングラッチ（２）に対して、数ヶ所ないし１０〜３０組を設置する。通電によって、Ｙ方向の標準線が数本ないし１０〜３０本引けることになる。その間隔は、上記の設置に従って等間隔であるか、もしくは一次元の等電点電気泳動のＸ方向に標準物質群の等電点、ＰＩに従って等電点電気泳動した場所で実験的に示された所定の間隔に形成することが可能である。
【００１７】
添加の方式としては、図４に例示したように、上端に等間隔に加える場合、標準たんぱく質のｐＩに対応する間隔で不均一に分布させて図５のようにする場合がある。等間隔の場合には、全く間隔一定の等間隔に添加すればよく、一方、ｐＩに従った間隔にＹ軸を作る場合には一次元のＩＰＧの等電点電気泳動をＸ軸用の蛍光修飾標準たんぱく質を少量加えた試料たんぱく質と共泳動させ、標準たんぱく質のｐＩ値を蛍光たんぱく質の移動点から観察して、ちょうどその泳動距離の上のところにＹ軸用アプリケーターとしてのマーカーカップ（１）を置いて二次元電気泳動を行う。
【００１８】
実際、図４および図５において、第二次元目（Ｙ方向）の標準線の直線性は、電気泳動の様子を示すものである。すなわち、垂直な直線の場合には、電気泳動の結果に歪みや局所的な偏りのないことを示し、歪みはＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル板（４）と試料タンパク質中に含有していた塩分等によって起こる電気泳動状態の歪みを示している。従って、このＹ方向の標準線を検出器でグラフィック上に取り込み、かつそれによってスポットの泳動の結果を標準化することができる。
【００１９】
図４および図５は、得られた標準線を例示しているものである。
【００２０】
【発明の効果】
この発明により、以上詳しく説明したとおり、第二次元目（Ｙ方向）の泳動用の外挿標準物質を第一次元目（Ｘ方向）の展開が完了しているＩＰＧ（固定化等電点泳動用ゲル板）の所定位置に添加することで、第二次元目（Ｙ方向）の標準線を連続的に形成することが可能になり、第一次元目（Ｘ方向）及び第二次元目（Ｙ方向）に、分子量および等電点を読みとるための線状の基準である標準線を導入することができる。さらに、それらを線状の標準線として示すことができるため、二次元電気泳動の局所的もしくは全体的な乱れを標準化するための正確な情報が得られ、その情報量が大幅に増加する。
【００２１】
これにより、二次元電気泳動法の分解能と信頼性を高めることが可能になるため、タンパク質の分離・同定を必要とする生物工学、医薬工業分野に幅広く貢献するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の第二次元目標準線形成装置を示した斜視図である。
【図２】図１に対応する平面図である。
【図３】図２のＡ−Ａ断面図である。
【図４】等間隔に添加した場合に得られた標準線を例示した図である。
【図５】標準たんぱく質のｐＩに対応する間隔で不均一に分布させた場合に得られた標準線を例示した図である。
【符号の説明】
１  マーカーカップ
１１  カップ本体
１２  毛細管
１３  ガイドレール
１４  ガスケット
２  セッティングラッチ
２１  貫通穴部
２２  ラッチ面
２３  縦方向溝
３  ガラス板
４  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル板
５  ＩＰＧゲル板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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