(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有する、ヒト子宮体癌組織由来のヒアルロニダーゼ。
（i）ヒアルロン酸を基質とするドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において測定した分子量が９４キロダルトンである
（ii）基質特異性：ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてヒアルロン酸を分解し、ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてコンドロイチン硫酸を分解しない
（iii）ヒアルロン酸を基質とするドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、ｐＨ３．５、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０及びｐＨ７．５におけるヒアルロン酸分解活性を測定し、前記の各ｐＨにおける当該活性の強度を比較することにより決定される至適ｐＨが、ｐＨ５．０である
（iv）等電点がｐＨ８．８である（等電点電気泳動法）
（v）３７℃においてヒアルロン酸分解活性を有する（ｐＨ５．０、緩衝液：クエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝液）
【請求項２】
ヒト子宮体癌組織の培養上清由来であることを特徴とする、請求項１に記載のヒアルロニダーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なヒアルロニダーゼに関し、詳細には医薬品、医薬部外品、またはこれらのスクリーニング等のために有用な新規ヒアルロニダーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ヒアルロニダーゼ（以下、「ＨＡａｓｅ」と略記する）は、ヒアルロン酸を低分子化する酵素に与えられた総称で、（１）ヒアルロン酸・コンドロイチン・コンドロイチン硫酸のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニド結合を加水分解するエンドヘキソサミニダーゼ型酵素（ＥＣ  ３．２．１．３５）、（２）ヒアルロン酸のβ−Ｄ−グルクロニド結合を加水分解するエンドグルクロニダーゼ型酵素（ＥＣ  ３．２．１．３６）、（３）ヒアルロン酸のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド結合を脱離的に分解するエンドグルコサミン開裂型酵素（ＥＣ  ４．２．２．１）、（４）ヒアルロン酸・コンドロイチン・コンドロイチン硫酸のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニド結合を脱離的に分解するエンドヘキソサミン開裂型の酵素等の異なる型のものが知られている。これらはそれぞれ反応の最終産物も異なっているが、いずれもムコ多糖の構造研究や、同定・定量の試薬として広く利用されてきた。
【０００３】
一方、ＨＡａｓｅは、脳水腫、心筋梗塞等の急性期の処置に医薬品として使用され、また皮下投与用もしくは胸膜滲出の局所療法用の薬剤の添加剤としても用いられてきた。
さらにＨＡａｓｅは、ＨＡａｓｅの活性を阻害する作用を有する物質の探索上においても有用である。ヒアルロン酸は、人体の細胞間隙に水分を保持し、また組織内にゼリー状のマトリックスを形成して細胞を保持したり、皮膚の潤滑性と柔軟性を保ち、機械的障害による外力や細菌の感染を防止する働きがある。ところが、ＨＡａｓｅはかかるヒアルロン酸を分解する活性を有する。従ってヒアルロン酸を分解するＨＡａｓｅの活性を抑制する物質は、皮膚の肌荒れ、小ジワ、かさつきなどを防ぎ、しっとり感を保つ薬剤、化粧品となり得る可能性がある。
このようにＨＡａｓｅには様々な利用法が提案されているが、その全ての機能が解明されたわけではなく、またさらに新しいＨＡａｓｅの出現も待ち望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、新規ＨＡａｓｅを見出すべく探索を進めてきた結果、ヒト子宮体癌組織の培養上清に新規なＨＡａｓｅが産生されることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の要旨は、下記の理化学的性質を有するヒト子宮体癌組織由来のヒアルロニダーゼに存する。
基質特異性：ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてヒアルロン酸を分解し、ｐＨ３．５〜７．５の範囲においてコンドロイチン硫酸を分解しない
至適ｐＨ：ｐＨ５．０付近
等電点：８．８
また、本発明のヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を基質とするドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において測定した分子量が約９４キロダルトンであることが確認された。
以下、本発明につき詳細に説明する。
【０００５】
本発明の新規ＨＡａｓｅは、ヒト子宮体癌組織から、目的とするＨＡａｓｅの物理的、化学的性質を利用した各種の処理操作に従い分離・精製することができる。すなわち、通常の蛋白沈殿剤による処理、塩析、限外ろ過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、遠心分離、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、透析法、これらの組合わせ等の処理操作が挙げられる。具体的には、ヒト子宮体癌組織の培養上清から、ヒアルロン酸、下記参考例記載の修飾−コンドロイチン硫酸等を基質とするゲル電気泳動等を用いてＭＡＲＫＵＳＷ  ＧＵＮＴＥＮＨＯＮＥＲ他、Ｍａｔｒｉｘ  Ｖｏｌ．１２，３８８〜３９６（１９９２）の方法に従って分離することができる。
【０００６】
ゲル電気泳動用担体の合成は、従来のポリアクリルアミドゲルを調製する方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））に準じて行うことができる。即ち、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含む水溶液にヒアルロン酸又は修飾−コンドロイチン硫酸を加えて、例えば冷暗所に一昼夜置くなどして均一に混合し、これを重合開始剤、例えば過硫酸塩、過酸化ベンゾイル等の過酸化物、アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物や酸化剤と還元剤よりなるレドックス開始剤を用いて重合する。また、重合促進剤として、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを添加してもよい。アクリルアミドに対するＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの使用量は、一般のポリアクリルアミドゲルに使用されている程度であり、ヒアルロン酸又は修飾−コンドロイチン硫酸の使用量は、通常１〜２０μｇ／ｍｌの範囲から選ばれる。また、重合反応は、所望の大きさの担体に適したセル中で行う。
【０００７】
このようにして調製したヒアルロン酸混合又は修飾−コンドロイチン硫酸結合ポリアクリルアミドゲルを担体として使用し、ヒト子宮体癌組織の培養上清を該培養上清中に含まれる酵素が基質を分解しない条件で電気泳動する。次いで、泳動後の担体を必要に応じて緩衝液等で洗浄した後、通常の酵素反応条件下に置き、酵素反応後の担体を、アルシャンブルーやトルイジンブルー等の発色試薬で発色させる。培養上清中に含まれる酵素がポリアクリルアミドゲルに固定した基質を分解すると、分解された部分のみが発色せず白く抜けて検出されるので、これにより該酵素の活性及び分子量を同定することができる。かくして得られた酵素が本発明のＨＡａｓｅである。また、酵素反応時のｐＨを種々変化させてＨＡａｓｅ活性を測定することによって、本発明酵素の至適ｐＨを確認することができる。
【０００８】
【発明の効果】
本発明のＨＡａｓｅは新規な酵素であり、従来のＨＡａｓｅと同様、脳水腫、心筋梗塞等に対する医薬品として、薬物の添加剤として、またＨＡａｓｅの活性を阻害する物質の探索上有用である。
【０００９】
【実施例】
以下、本発明につき具体的な実施例を挙げて説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定されるものではない。
参考例
サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（Ｉ）（分子量４０，０００〜４８，０００；４−硫酸：６−硫酸＝１：５）の還元末端を、Ｒ．Ｈ．Ｒａｊａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３９，１６８−１７７（１９８４））の方法に従ってＮａＢＨ4で還元し、ＮａＩＯ4で部分酸化し、エチレンジアミンを用いてアミノ化して反応物を得た。反応物は４℃の透析で精製した。精製した還元末端アミノ化コンドロイチン硫酸（IV）  １００ｍｇを２ｍｌの蒸留水に溶かし、１ｍｌのエタノールを加えた。混合物は、４０℃で２時間、アリルグリシジルエーテル  １ｍｌとインキュベートし、４℃で蒸留水に対して透析を行った後、凍結乾燥した。こうして修飾−コンドロイチン硫酸（Ｖ）を得た。以上の合成経路を図１に示す。
【００１０】
実施例１
１ｍｍ厚の８％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルを調製した。このゲルの作成時に、４℃で一昼夜保存したヒアルロン酸（鶏冠由来，分子量８２４，０００）１ｍｇ／ｍｌを、最終濃度が１７μｇ／ｍｌとなるように加えた。
一方、ヒト子宮体癌組織の培養上清（名古屋大学の玉腰浩司博士より分譲）１５μｌにＳＤＳおよびＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））を加え、上記ゲルに供した。
【００１１】
電気泳動は、室温で行った。泳動後、ゲルは室温で１時間、２．５％  トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）  Ｘ−１００で洗浄した。ゲルは新鮮なバッファー（５０ｍＭ  クエン酸−Ｎａ2ＨＰＯ4および０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．０，６．０，７．５）、あるいは０．１Ｍ  ＨＣＯＯＨ−ＨＣＯＯＮａおよび０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ３．５））を用いて、３７℃、１６時間インキュベートした後、３７℃で２時間、０．１ｍｇ／ｍｌ  プロナーゼ溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、プロナーゼはストレプトマイセス  グライセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のもので、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ社より購入）で処理した。インキュベートしたゲルは、２０％  エタノール−１０％  酢酸で２０分間洗浄し、０．５％  アルシャンブルー（Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ）を含む２０％  エタノール−１０％  酢酸で１時間染色した後、２０％  エタノール−１０％  酢酸で洗浄した。
結果を図２（ａ）に示す。ｐＨ３．５〜７．５の範囲内において、９４キロダルトン付近に明瞭なバンドが観測された。そして同バンドは、特にｐＨ５．０付近において高いヒアルロン酸分解活性を有することも確認された。
【００１２】
実施例２
実施例１において、ヒアルロン酸の代わりに参考例で調製した修飾−コンドロイチン硫酸を用い、ゲル中の最終濃度が８．５μｇ／ｍｌとなるように加えたこと以外は同様にして、ヒト子宮体癌組織の培養上清の電気泳動を行った。
結果を図２（ｂ）に示す。ｐＨ３．５〜７．５の範囲内においては、特に特徴的なバンドは何ら認められなかった。
以上の結果から、９４キロダルトンのタンパクはヒアルロン酸に対して作用し、コンドロイチン硫酸に対しては全く作用しない、ヒアルロニダーゼ活性を有していることが判明した。
【００１３】
実施例３
以下の条件による２次元電気泳動にて、９４キロダルトンタンパク質の等電点を求めた。
【００１４】
【表１】
0003732258.tif 000002
【００１５】
【表２】
サンプルバッファー
等電点電気泳動ゲル溶液：
３０％アクリルアミド−０．８％ビスアクリルアミド    ２．０  ｍｌ
４０％グリセリン                                    ２．０  ｍｌ
蒸留水                                              ５．５  ｍｌ
アンフォライン（ＬＫＢ社），ｐＨ３．５〜１０        ０．５  ｍｌ
に、さらに４０％グリセリンを等量加えたもの
サンプル
子宮体癌組織培養上清  １０μｌ
マーカー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）  ５μｌ
泳動条件
４００Ｖ、２時間３０分、０℃
【００１６】
【表３】
0003732258.tif 000003
【００１７】
洗浄
２．５％  トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）  Ｘ−１００で１時間
インキュベーション
３７℃で１６時間（ｐＨ５．０）
プロテアーゼ処理
０．１ｍｇ／ｍｌ  プロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ社）で、３７℃、２時間
固定
２０％  エタノール−１０％  酢酸で２０分間
染色
２０％  エタノール−１０％  酢酸に溶かした０．５％  アルシャンブルー（Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ）で１時間
脱色
２０％  エタノール−１０％  酢酸で１時間を２回
この結果、本発明のＨＡａｓｅの等電点は、８．８であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】修飾−コンドロイチン硫酸の合成経路を示す図面である。
【図２】（ａ）本発明のＨＡａｓｅを、ヒアルロン酸を基質とするＳＤＳ−ＰＡＧＥにて検出した結果を示す図面である。図中、レーン１、２、３、４は、それぞれｐＨ３．５、５．０、６．０、７．５における電気泳動パターンを表す。（ｂ）本発明のＨＡａｓｅを、修飾−コンドロイチン硫酸を基質とするＳＤＳ−ＰＡＧＥにて検出した結果を示す図面である。図中、レーン１、２、３、４は、それぞれｐＨ３．５、５．０、６．０、７．５における電気泳動パターンを表す。
【図１】
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【図２】
0003732258.tif 000005