(57)【要約】簡単な操作および試薬を用い、感度並びに精度良く、迅速にＭＴ１−ＭＭＰを定量したり、ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を測定できるようにする。抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を用いたＭＴ１−ＭＭＰの免疫学的定量法およびそれに用いる試薬、さらには（ｉ）界面活性剤及び／又は還元剤を用いて細胞膜から遊離し及び／又は可溶化したＭＴ１−ＭＭＰおよび（ｉｉ）自律的に可溶化したＭＴ１−ＭＭＰから成る群から選ばれたものを免疫学的に定量する方法およびそれに用いる試薬、さらには固相化ＭＴ１−ＭＭＰなどを用いることにより、ＭＴ１−ＭＭＰを定量したり、ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を測定でき、さらにはＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物やＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングでき、有用な医薬の開発研究が容易になる。また癌または癌転移検査薬としても有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ類（ＭＴ−ＭＭＰｓ）から成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰに対する抗体を用いることを特徴とするＭＴ−ＭＭＰの免疫学的定量法。
【請求項２】
ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）に対する抗体，ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）に対する抗体，ＭＭＰ−１６（ＭＴ３−ＭＭＰ）に対する抗体，ＭＭＰ−１７（ＭＴ４−ＭＭＰ）に対する抗体，ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）に対する抗体及びＭＭＰ−２５（ＭＴ６−ＭＭＰ）に対する抗体から成る群から選ばれた抗体を用いることを特徴とする請求項１記載の免疫学的定量法。
【請求項３】
ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体を用い且つＭＴ１−ＭＭＰの免疫学的定量をすることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫学的定量法。
【請求項４】
界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一記載の免疫学的定量法。
【請求項５】
抗体が、（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものの存在下で免疫反応性を維持できること及び（ｉｉ）人為的に変性してエピトープを露出させたＭＴ−ＭＭＰを免疫抗原として得られることから成る群から選ばれた特徴の少なくとも一つを持つものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一記載の免疫学的定量法。
【請求項６】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一記載の免疫学的定量法。
【請求項７】
免疫学的に定量できるＭＴ−ＭＭＰが、（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて細胞膜から遊離及び／又は可溶化させた分子及び（ｉｉ）自律的に細胞膜から遊離及び／又は可溶化した分子から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一記載の免疫学的定量法。
【請求項８】
（ａ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いてＭＴ−ＭＭＰを細胞膜から遊離及び／又は可溶化させる工程及び（ｂ）ＭＴ−ＭＭＰを免疫学的に定量する工程を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一記載の免疫学的定量法。
【請求項９】
界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であることを特徴とする請求項４〜８のいずれか一記載の免疫学的定量法。
【請求項１０】
還元剤が２−メルカプトエタノールであることを特徴とする請求項４〜８のいずれか一記載の免疫学的定量法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一記載の免疫学的定量法に使用するためのＭＴ−ＭＭＰの免疫学的測定用試薬。
【請求項１２】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項１１記載の試薬。
【請求項１３】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする請求項１１記載の試薬。
【請求項１４】
界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを含有していることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一記載の試薬。
【請求項１５】
界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて、ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものを、細胞膜から遊離及び／又は可溶化させることを特徴とするＭＴ−ＭＭＰの遊離及び／又は可溶化方法。
【請求項１６】
界面活性剤がＳＤＳであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
還元剤が２−メルカプトエタノールであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか一記載の方法。
【請求項１９】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか一記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一記載の免疫学的定量法あるいは（ｂ）請求項１５〜１９のいずれか一記載の方法に使用するためのものであることを特徴とするＭＴ−ＭＭＰを遊離及び／又は可溶化する試薬。
【請求項２１】
界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを含有していることを特徴とする請求項２０記載の試薬。
【請求項２２】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項２０又は２１記載の試薬。
【請求項２３】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする請求項２０又は２１記載の試薬。
【請求項２４】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一記載の免疫学的定量法、（ｂ）請求項１１〜１４のいずれか一記載の試薬、（ｃ）請求項１５〜１９のいずれか一記載の方法及び（ｄ）請求項２０〜２３のいずれか一記載の試薬から成る群から選ばれたものを用い、且つＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２５】
被検化合物の存在下及び非存在下にスクリーニングを行い、被検化合物の存在下及び非存在下での各結果を比較することを特徴とする請求項２４記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることを特徴とする請求項２４又は２５記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
ＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることを特徴とする請求項２４又は２５記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれか一記載のスクリーニング方法に使用するための、ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物のスクリーニングキット。
【請求項２９】
（ａ）ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰに対する抗体、（ｂ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたもの及び（ｃ）免疫学的方法で固相化されたＭＴ−ＭＭＰから成る群から選ばれたものを含有することを特徴とする請求項２８記載のキット。
【請求項３０】
ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物のスクリーニングのためのものであることを特徴とする請求項２８又は２９記載のキット。
【請求項３１】
ＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物のスクリーニングのためのものであることを特徴とする請求項２８又は２９記載のキット。
【請求項３２】
免疫学的方法で固相化されたＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を測定することを特徴とする測定方法。
【請求項３３】
ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を定量的に測定することを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
固相化されたＭＴ−ＭＭＰが、抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体を介して選択的に固相化されたものであることを特徴とする請求項３２又は３３記載の方法。
【請求項３５】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項３２〜３４のいずれか一記載の方法。
【請求項３６】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする請求項３２〜３４のいずれか一記載の方法。
【請求項３７】
ＭＴ−ＭＭＰが、（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて細胞膜から遊離及び／又は可溶化させた分子及び（ｉｉ）自律的に細胞膜から遊離及び／又は可溶化した分子から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つであることを特徴とする請求項３２〜３６のいずれか一記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いてＭＴ−ＭＭＰを細胞膜から遊離及び／又は可溶化させる工程及び（ｂ）ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を測定する工程を含むことを特徴とする請求項３２〜３７のいずれか一記載の方法。
【請求項３９】
免疫学的方法で固相化されたＭＴ−ＭＭＰ。
【請求項４０】
抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体を介して選択的に固相化されたものであることを特徴とする請求項３９記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰ。
【請求項４１】
抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体が、ＭＴ−ＭＭＰのヘモペキシン様ドメインを認識する抗体であることを特徴とする請求項４０記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰ。
【請求項４２】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項３９〜４１のいずれか一記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰ。
【請求項４３】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする請求項３９〜４１のいずれか一記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰ。
【請求項４４】
（ｉ）請求項３２〜３８のいずれか一記載の方法、あるいは（ｉｉ）請求項３９〜４３のいずれか一記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰを用いた、ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項４５】
被検化合物の存在下及び非存在下にスクリーニングを行い、被検化合物の存在下及び非存在下での各結果を比較することを特徴とする請求項４４記載のスクリーニング方法。
【請求項４６】
請求項３２〜３８のいずれか一記載の方法に使用するための、ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物のスクリーニングキット。
【請求項４７】
請求項３９〜４３のいずれか一記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰを含有していることを特徴とする請求項４６記載のキット。
【請求項４８】
（ａ）請求項２４〜２７のいずれか一記載の方法で得られ且つＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物、（ｂ）請求項２８〜３１のいずれか一記載のキットを使用して得られ且つＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物、（ｃ）請求項４４又は４５記載の方法で得られたＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物及び（ｄ）請求項４６又は４７記載のキットを使用して得られたＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物から成る群から選ばれたものを含有していることを特徴とする医薬。
【請求項４９】
ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物又は該ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物を含有していることを特徴とする請求項４８記載の医薬。
【請求項５０】
ＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物又はＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物を含有していることを特徴とする請求項４８記載の医薬。
【請求項５１】
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか一記載の免疫学的定量法又は（ｉｉ）請求項３２〜３８のいずれか一記載の方法により、ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものを測定するものであることを特徴とする癌検査または癌転移検査薬。
【請求項５２】
（Ａ）（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて、細胞膜から遊離及び／又は可溶化させた分子及び（ｉｉ）自律的に細胞膜から遊離及び／又は可溶化した分子から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つであるＭＴ−ＭＭＰの量を指標として使用し、癌の悪性度を評価する又は癌転移能を評価するか、あるいは（Ｂ）（ｉｉｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて細胞膜から遊離及び／又は可溶化させた分子及び（ｉｖ）自律的に細胞膜から遊離及び／又は可溶化した分子から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つであるＭＴ−ＭＭＰの酵素活性の量を指標として使用し、癌の悪性度を評価する又は癌転移能を評価することを特徴とする請求項５１記載の検査薬。
【請求項５３】
ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰを測定するものであることを特徴とする請求項５１又は５２記載の検査薬。
【請求項５４】
ＭＴ１−ＭＭＰを測定するものであることを特徴とする請求項５１又は５２記載の検査薬。
【請求項５５】
ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ２−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ３−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ４−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ５−ＭＭＰに対する抗体及びＭＴ６−ＭＭＰに対する抗体から成る群から選ばれた抗体を含有していることを特徴とする請求項５１〜５３のいずれか一記載の検査薬。
【請求項５６】
ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体を含有していることを特徴とする請求項５１，５２又は５４記載の検査薬。
【請求項５７】
ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を測定するものであることを特徴とする請求項５１、５２、５４又は５６記載の検査薬。
【請求項５８】
ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰに対する抗体であって、且つ（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものの存在下で免疫反応性を維持できること及び（ｉｉ）人為的に変性してエピトープを露出させたＭＴ−ＭＭＰを免疫抗原として得られることから成る群から選ばれた特徴の少なくとも一つを持つものであることを特徴とする抗体。
【請求項５９】
ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ２−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ３−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ４−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ５−ＭＭＰに対する抗体及びＭＴ６−ＭＭＰに対する抗体から成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項５８記載の抗体。
【請求項６０】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５８又は５９記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）に対する抗体（抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体）を用いた免疫学的定量法およびそれに用いる試薬に関する。また、本発明は、（ｉ）界面活性剤及び／又は還元剤を用いて細胞膜から遊離し及び／又は可溶化したＭＴ−ＭＭＰおよび（ｉｉ）自律的に可溶化したＭＴ−ＭＭＰから成る群から選ばれたものを免疫学的に定量する方法およびそれに用いる試薬に関する。特には、本発明は、（ａ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて細胞膜から遊離し及び／又は可溶化したＭＴ−ＭＭＰあるいは（ｂ）自律的に可溶化したＭＴ−ＭＭＰを、ＭＴ−ＭＭＰに対する抗体（例えば、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体）を用いて免疫学的に定量する方法に関する。そして、本発明は、（Ａ）ＭＴ−ＭＭＰの発現を変化させる因子及び（Ｂ）ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を変化させる因子の検索方法およびその因子を含有する医薬に関する。一方では、本発明は、界面活性剤及び／又は還元剤を用いてＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰｓを細胞膜から遊離し可溶化する方法に関する。また、本発明は、ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を測定する方法およびそれに用いる試薬に関する。
背景技術
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）は、プロペプチド、酵素活性部位、ヒンジおよびヘモペキシン様部位を基本ドメインとした構造を有する可溶型酵素である。一方、ＭＭＰｓの中で一群のサブファミリーを形成する膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰｓ）は、膜貫通ドメインをＣ−末端側に有し、細胞膜上に埋め込まれた形で局在する膜結合型酵素である。現在、可溶型ＭＭＰとしてＭＭＰ−１，２，３，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２６が、膜結合型ＭＭＰとしてＭＭＰ−１４，１５，１６，１７，２４，２５（それぞれＭＴ１−，ＭＴ２−，ＭＴ３−，ＭＴ４−，ＭＴ５−，ＭＴ６−ＭＭＰ）の遺伝子がクローニング、同定されている。
〔ＭＴ１−ＭＭＰによるプロＭＭＰ−２の活性化〕
ＭＭＰ−２は、ゼラチンや基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンなどを分解する酵素で、その活性は多くのヒト癌組織の浸潤・転移とよく相関することが知られている。ＭＭＰ−２以外のプロＭＭＰｓ（ＭＭＰ−１，３，７，８，９，１０，１１，１３）は、内因性のセリンプロテアーゼや活性型ＭＭＰｓ相互によって活性化するカスケードを持つが、プロＭＭＰ−２はこれらとは異なる活性化機構を有する点で特徴的である。即ち、プロＭＭＰ−２は、細胞膜上でＴＩＭＰ−２を介してＭＴ１−ＭＭＰと結合、近接するもう一分子のＭＴ１−ＭＭＰがプロＭＭＰ−２のプロペプチドを切断し、活性型に変換される。
〔ＭＴ１−ＭＭＰとヒト癌組織の浸潤・転移〕
ＭＴ１−ＭＭＰは、ヒト癌組織の浸潤・転移とよく相関して発現するＭＭＰ−２の活性化機構に深く関与し、またＭＴ１−ＭＭＰ自身も細胞外マトリックス分解活性を有することから、癌の浸潤・転移において重要な働きを持つと考えられている。ＭＴ１−ＭＭＰは、乳癌、大腸癌、胃癌、頭頚部癌など多くの癌細胞で広く発現することが報告されており、ＭＴ１−ＭＭＰの存在と癌の悪性度即ち浸潤・転移能の関連性が注目されている。
〔ＭＴ１−ＭＭＰと慢性関節リウマチ〕
慢性関節リウマチ（ＲＡ）の早期病理像として、血管新生と滑膜組織の増生が観察される。過形成となった滑膜表層細胞は、ＭＭＰ−１，３，ＭＴ１−ＭＭＰおよびＴＩＭＰ−１を、下層の線維芽細胞はＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−２を産生する。また滑膜や関節腔に浸潤した好中球はＭＭＰ−８，９を産生、これらのＭＭＰｓとＴＩＭＰｓは関節液中に分泌する。ＲＡ関節液中のＭＭＰ−１，２，３，８，９レベルは、変形性関節症（ＯＡ）関節液より有意に高値で、ＴＩＭＰｓの分子数を上回りＭＭＰｓ優位の状態にある。これらに加えて、軟骨細胞自身が発現するＭＭＰ−１，２，３，７，８，１３によってＲＡの関節軟骨破壊が進行する。ＲＡの発症、進行とＭＴ１−ＭＭＰの関連は知られていないが、プロＭＭＰ−２の活性化やＭＴ１−ＭＭＰ自身のＥＣＭ分解活性による関節軟骨破壊がＲＡの発症と進行に関与する可能性がある。
〔ＭＴ１−ＭＭＰの分子種〕
ＭＴ−ＭＭＰｓは、疎水性の膜貫通ドメインをＣ−末端側に有しこれを介して細胞膜上に埋め込まれた形で存在するため、他の可溶型ＭＭＰｓとは異なり不溶性を示す。実際、ＭＴ１−ＭＭＰは、細胞膜に局在することが報告されている。最近、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ　Ａ）で処理した乳癌細胞株において、その培養上清に、Ｃ−末端側の疎水性膜貫通ドメインを失ったＭＴ１−ＭＭＰが可溶化（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）して存在することが見出された。これは、コンカナバリンＡで誘導されたアポトーシスの過程で膜結合型ＭＴ１−ＭＭＰが何らかの機構により、Ｃ−末端側で切断され、膜から離脱したものとされている。可溶化ＭＴ１−ＭＭＰの生理的機能は未知であるが、可溶型ＭＭＰｓと同様、種々の生理的機能が予想される。かくして、ＭＴ１−ＭＭＰの測定には、これら膜結合型ＭＴ１−ＭＭＰと可溶型ＭＴ１−ＭＭＰの両方に適応できる方法が適当であると考えられる。
ヒト癌組織の浸潤・転移、慢性関節リウマチ（ＲＡ）の病態にＭＴ１−ＭＭＰがどの様に関与しているか調べるためには、ヒト体液、例えば血中、関節液、腹水、胸水、尿など、またはヒト組織、培養細胞などに含まれるＭＴ１−ＭＭＰ量および酵素活性を知ることは重要である。ところで、ＭＴ１−ＭＭＰの測定には、ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット法で半定量的に検出する方法、ＲＴ−ＰＣＲで半定量的に検出する方法などがあるが、いずれも遺伝子の発現レベルを反映する方法であり、機能的なＭＴ１−ＭＭＰの量を示すものではない。またこれらの方法は、被検試料が限定されるうえ、ｍＲＮＡの抽出など技術的に繁雑であり、再現性の確保は困難である。
また、ＭＴ１−ＭＭＰの検出には、プロＭＭＰ−２の活性化を指標にして評価する方法がある。被検試料をゼラチンザイモグラフィーで分析することで、活性化したＭＭＰ−２を検出し、その活性化因子であるＭＴ１−ＭＭＰの存在を想定することができる。しかし、この方法は、ＭＴ１−ＭＭＰの存在を間接的に観察しているにすぎないうえ、血液成分などの高タンパク質濃度の検体は、直接ゼラチンザイモグラフィーに供することは不可能である。
また、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を用いたウエスタンブロット法でもＭＴ１−ＭＭＰの検出が可能であるが、ザイモグラフィーと同様、血液成分などの高タンパク質濃度の検体には適応できないうえ、定量性、再現性に乏しい。さらに、生体タンパク質を定量する方法として免疫学的手法が知られているが、被検試料は可溶性物質に限定され、ＭＴ１−ＭＭＰの様な細胞膜に存在する不溶性物質の定量には馴染まない。
ＭＴ１−ＭＭＰを免疫学的に定量する方法が、Ｈａｒａｙａｍａら（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，９０：９４２−９５０（１９９９））により報告されているが、この方法では被検試料の可溶性ＭＴ１−ＭＭＰを測定できるが、膜に結合しているＭＴ１−ＭＭＰは測定できない。また、測定限界が高いため、微量に存在する可溶性ＭＴ１−ＭＭＰを測定するのは困難である。
ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を測定する方法としては、ゼラチンザイモグラフィーが知られている。ゼラチンザイモグラフィーは、電気泳動上でＭＴ１−ＭＭＰの分画と活性検出を同時に行うことができる点で、非精製検体に含まれるＭＴ１−ＭＭＰの活性検出に優れた方法であるが、操作が繁雑である上、測定結果は半定量的な判定にとどまる。
以上のように、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、ザイモグラフィーおよびウエスタンブロット法などでＭＴ１−ＭＭＰの検出や半定量的な測定は可能ではあるが、いずれも操作が複雑で、再現性に乏しく、簡便なＭＴ１−ＭＭＰの定量方法および活性測定方法は得られていない。
発明の開示
本発明の目的は、簡単な操作および試薬を用い、感度並びに精度良く、迅速にＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰを定量する方法、ＭＴ１−ＭＭＰを含めた各ＭＴ−ＭＭＰ酵素活性を測定する方法およびそのための試薬キット、さらにはそうした方法や試薬などを使用することにより、同定された活性物質などを含有する、ＭＴ１−ＭＭＰなどの各ＭＴ−ＭＭＰの発現や酵素活性を抑制する医薬を提供することにある。
本発明は、
（１）免疫学的方法を用いて、被検試料中のＭＴ−ＭＭＰ、例えばＭＴ１−ＭＭＰ、を定量すること（免疫学的ＭＴ−ＭＭＰ定量方法）、特には被検試料中の可溶型ＭＴ−ＭＭＰを定量すること；
（２）被検試料中の膜結合型ＭＴ１−ＭＭＰなどの膜結合型ＭＴ−ＭＭＰを可溶化し、免疫学的測定法に適応する検体の調製方法を提供すること；
（３）上記（２）の方法で可溶型ＭＴ−ＭＭＰに変換させた被検試料中の膜結合型ＭＴ−ＭＭＰを免疫学的方法で定量すること、あるいは上記（１）の方法において、可溶型ＭＴ−ＭＭＰに変換させた被検試料中の膜結合型ＭＴ−ＭＭＰを免疫学的方法で定量すること；
（４）ＭＴ−ＭＭＰの免疫学的測定法を用いて、ＭＴ−ＭＭＰの発現量を変化させる因子・薬剤などを検索する方法、およびそれらの因子・薬剤を含有する医薬；
（５）免疫学的方法を用いて、ＭＴ−ＭＭＰを選択的に固定化し、固定化されたＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を特異的に測定すること（ＭＴ−ＭＭＰ酵素活性測定法）；及び
（６）上記（５）のＭＴ−ＭＭＰ酵素活性測定法を用いて、ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を変化させる因子・薬剤などを検索する方法、およびそれらの因子・薬剤を含有する医薬を提供する。
本発明は、
〔１〕　ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰに対する抗体を用いることを特徴とするＭＴ−ＭＭＰの免疫学的定量法；
〔２〕　ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）に対する抗体，ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）に対する抗体，ＭＭＰ−１６（ＭＴ３−ＭＭＰ）に対する抗体，ＭＭＰ−１７（ＭＴ４−ＭＭＰ）に対する抗体，ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）に対する抗体及びＭＭＰ−２５（ＭＴ６−ＭＭＰ）に対する抗体から成る群から選ばれた抗体を用いることを特徴とする上記〔１〕記載の免疫学的定量法；
〔３〕　ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体を用い且つＭＴ１−ＭＭＰの免疫学的定量をすることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の免疫学的定量法；
〔４〕　界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載の免疫学的定量法；
〔５〕　抗体が、（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものの存在下で免疫反応性を維持できること及び（ｉｉ）人為的に変性してエピトープを露出させたＭＴ−ＭＭＰを免疫抗原として得られることから成る群から選ばれた特徴の少なくとも一つを持つものであることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれか一記載の免疫学的定量法；
〔６〕　免疫抗原が、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔５〕記載の免疫学的定量法；
〔７〕　免疫抗原が、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする上記〔５〕記載の免疫学的定量法；
〔８〕　抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一記載の免疫学的定量法；
〔９〕　免疫学的に定量できるＭＴ−ＭＭＰが、（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて細胞膜から遊離及び／又は可溶化させた分子及び（ｉｉ）自律的に細胞膜から遊離及び／又は可溶化した分子から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つであることを特徴とする上記〔１〕〜〔８〕のいずれか一記載の免疫学的定量法；
〔１０〕　（ａ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて、ＭＴ−ＭＭＰを細胞膜から遊離及び／又は可溶化させる工程及び（ｂ）ＭＴ−ＭＭＰを免疫学的に定量する工程を含むことを特徴とする上記〔１〕〜〔９〕のいずれか一記載の免疫学的定量法；
〔１１〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔１〕、〔２〕、〔４〕〜〔６〕及び〔８〕〜〔１０〕のいずれか一記載の免疫学的定量法；
〔１２〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする上記〔１〕〜〔１１〕のいずれか一記載の免疫学的定量法；
〔１３〕　界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であることを特徴とする上記〔４〕〜〔１２〕のいずれか一記載の免疫学的定量法；
〔１４〕　還元剤が２−メルカプトエタノールであることを特徴とする上記〔４〕〜〔１２〕のいずれか一記載の免疫学的定量法；
〔１５〕　上記〔１〕〜〔１４〕のいずれか一記載の免疫学的定量法に使用するためのＭＴ−ＭＭＰの免疫学的測定用試薬；
〔１６〕　ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰに対する抗体を含有していることを特徴とする上記〔１５〕記載の試薬；
〔１７〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔１５〕記載の試薬；
〔１８〕　ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ２−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ３−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ４−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ５−ＭＭＰに対する抗体及びＭＴ６−ＭＭＰに対する抗体から成る群から選ばれた抗体を含有していることを特徴とする上記〔１５〕記載の試薬；
〔１９〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする上記〔１５〕記載の試薬；
〔２０〕　ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体を含有していることを特徴とする上記〔１５〕記載の試薬；
〔２１〕　界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを含有していることを特徴とする上記〔１５〕〜〔２０〕のいずれか一記載の試薬；
〔２２〕　界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて、ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものを、細胞膜から遊離及び／又は可溶化させることを特徴とするＭＴ−ＭＭＰの遊離及び／又は可溶化方法；
〔２３〕　界面活性剤がＳＤＳであることを特徴とする上記〔２２〕記載の方法；
〔２４〕　還元剤が２−メルカプトエタノールであることを特徴とする上記〔２２〕記載の方法；
〔２５〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔２２〕〜〔２４〕のいずれか一記載の方法；
〔２６〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする上記〔２２〕〜〔２４〕のいずれか一記載の方法；
〔２７〕　（ａ）上記〔１〕〜〔１４〕のいずれか一記載の免疫学的定量法あるいは（ｂ）上記〔２２〕〜〔２６〕のいずれか一記載の方法に使用するためのものであることを特徴とするＭＴ−ＭＭＰを遊離及び／又は可溶化する試薬；
〔２８〕　界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを含有していることを特徴とする上記〔２７〕記載の試薬；
〔２９〕　界面活性剤がＳＤＳであることを特徴とすることを特徴とする上記〔２８〕記載の試薬；
〔３０〕　還元剤が２−メルカプトエタノールであることを特徴とすることを特徴とする上記〔２８〕記載の試薬；
〔３１〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔２７〕〜〔３０〕のいずれか一記載の試薬；
〔３２〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする上記〔２７〕〜〔３０〕のいずれか一記載の試薬；
〔３３〕　（ａ）上記〔１〕〜〔１４〕のいずれか一記載の免疫学的定量法、（ｂ）上記〔１５〕〜〔２１〕のいずれか一記載の試薬、（ｃ）上記〔２２〕〜〔２６〕のいずれか一記載の方法及び（ｄ）上記〔２７〕〜〔３２〕のいずれか一記載の試薬から成る群から選ばれたものを用い、且つＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法；
〔３４〕　被検化合物の存在下及び非存在下にスクリーニングを行い、被検化合物の存在下及び非存在下での各結果を比較することを特徴とする上記〔３３〕記載のスクリーニング方法；
〔３５〕　ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることを特徴とする上記〔３３〕又は〔３４〕記載のスクリーニング方法；
〔３６〕　ＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることを特徴とする上記〔３３〕又は〔３４〕記載のスクリーニング方法；
〔３７〕　上記〔３３〕〜〔３６〕のいずれか一記載のスクリーニング方法に使用するための、ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物のスクリーニングキット；
〔３８〕　（ａ）ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰに対する抗体、（ｂ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたもの及び（ｃ）免疫学的方法で固相化されたＭＴ−ＭＭＰから成る群から選ばれたものを含有することを特徴とする上記〔３７〕記載のキット；
〔３９〕　ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物のスクリーニングのためのものであることを特徴とする上記〔３７〕又は〔３８〕記載のキット；
〔４０〕　ＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物のスクリーニングのためのものであることを特徴とする上記〔３７〕又は〔３８〕記載のキット；
〔４１〕　免疫学的方法で固相化されたＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を測定することを特徴とする測定方法；
〔４２〕　ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を定量的に測定することを特徴とする上記〔４１〕記載の方法；
〔４３〕　固相化されたＭＴ−ＭＭＰが、抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体を介して選択的に固相化されたものであることを特徴とする上記〔４１〕又は〔４２〕記載の方法；
〔４４〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔４１〕〜〔４３〕のいずれか一記載の方法；
〔４５〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする上記〔４１〕〜〔４３〕のいずれか一記載の方法；
〔４６〕　ＭＴ−ＭＭＰが、（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて細胞膜から遊離及び／又は可溶化させた分子及び（ｉｉ）自律的に細胞膜から遊離及び／又は可溶化した分子から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つであることを特徴とする上記〔４１〕〜〔４５〕のいずれか一記載の方法；
〔４７〕　（ａ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いてＭＴ−ＭＭＰを細胞膜から遊離及び／又は可溶化させる工程及び（ｂ）ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を測定する工程を含むことを特徴とする上記〔４１〕〜〔４６〕のいずれか一記載の方法；
〔４８〕　免疫学的方法で固相化されたＭＴ−ＭＭＰ；
〔４９〕　抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体を介して選択的に固相化されたものであることを特徴とする上記〔４８〕記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰ；
〔５０〕　抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体が、ＭＴ−ＭＭＰのヘモペキシン様ドメインを認識する抗体であることを特徴とする上記〔４９〕記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰ；
〔５１〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔４８〕〜〔５０〕のいずれか一記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰ；
〔５２〕　ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＴ１−ＭＭＰであることを特徴とする上記〔４８〕〜〔５０〕のいずれか一記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰ；
〔５３〕　（ｉ）上記〔４１〕〜〔４７〕のいずれか一記載の方法あるいは（ｉｉ）上記〔４８〕〜〔５２〕のいずれか一記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰを用いた、ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法；
〔５４〕　被検化合物の存在下及び非存在下にスクリーニングを行い、被検化合物の存在下及び非存在下での各結果を比較することを特徴とする上記〔５３〕記載のスクリーニング方法；
〔５５〕　上記〔４１〕〜〔４７〕のいずれか一記載の方法に使用するための、ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物のスクリーニングキット；
〔５６〕　上記〔４８〕〜〔５２〕のいずれか一記載の固相化されたＭＴ−ＭＭＰを含有していることを特徴とする上記〔５５〕記載のキット；
〔５７〕　（ａ）上記〔３３〕〜〔３６〕のいずれか一記載の方法で得られ且つＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物、（ｂ）上記〔３７〕〜〔４０〕のいずれか一記載のキットを使用して得られ且つＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物、（ｃ）上記〔５３〕又は〔５４〕記載の方法で得られたＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物及び（ｄ）上記〔５５〕又は〔５６〕記載のキットを使用して得られたＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物から成る群から選ばれたものを含有していることを特徴とする医薬；
〔５８〕　ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物又は該ＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物を含有していることを特徴とする上記〔５７〕記載の医薬；
〔５９〕　ＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物又はＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物を含有していることを特徴とする上記〔５７〕記載の医薬；
〔６０〕　（ｉ）上記〔１〕〜〔１４〕のいずれか一記載の免疫学的定量法又は（ｉｉ）上記〔４１〕〜〔４７〕のいずれか一記載の方法により、ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものを測定するものであることを特徴とする癌検査または癌転移検査薬あるいはリウマチ性関節炎またはアルツハイマーの進行度検査薬；
〔６１〕　（Ａ）（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて細胞膜から遊離及び／又は可溶化させた分子及び（ｉｉ）自律的に細胞膜から遊離及び／又は可溶化した分子から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つであるＭＴ−ＭＭＰの量を指標として使用し、癌の悪性度を評価する又は癌転移能を評価するかあるいはリウマチ性関節炎またはアルツハイマーの進行度を評価するか、あるいは（Ｂ）（ｉｉｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて細胞膜から遊離及び／又は可溶化させた分子及び（ｉｖ）自律的に細胞膜から遊離及び／又は可溶化した分子から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つであるＭＴ−ＭＭＰの酵素活性の量を指標として使用し、癌の悪性度を評価する又は癌転移能を評価するかあるいはリウマチ性関節炎またはアルツハイマーの進行度を評価することを特徴とする上記〔６０〕記載の検査薬；
〔６２〕　ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ及びＭＴ６−ＭＭＰから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰを測定するものであることを特徴とする上記〔６０〕又は〔６１〕記載の検査薬；
〔６３〕　ＭＴ１−ＭＭＰを測定するものであることを特徴とする上記〔６０〕又は〔６１〕記載の検査薬；
〔６４〕　ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ２−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ３−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ４−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ５−ＭＭＰに対する抗体及びＭＴ６−ＭＭＰに対する抗体から成る群から選ばれた抗体を含有していることを特徴とする上記〔６０〕〜〔６２〕のいずれか一記載の検査薬；
〔６５〕　ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体を含有していることを特徴とする上記〔６０〕〜〔６４〕のいずれか一記載の検査薬；
〔６６〕　ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を測定するものであることを特徴とする上記〔６０〕〜〔６５〕のいずれか一記載の検査薬；及び
〔６７〕　上記〔１〕〜〔６６〕のいずれか一記載の中で抗体が、ＭＴ−ＭＭＰのヘモペキシン様ドメインを認識するものであることを特徴とする、免疫学的定量法、免疫学的測定用試薬、スクリーニング方法、スクリーニングキット、酵素活性測定方法、免疫学的方法で固相化されたＭＴ−ＭＭＰ、医薬、検査薬などを提供する。
本発明では、好適に、可溶型ＭＴ１−ＭＭＰについての免疫学的定量法、免疫学的測定用試薬、スクリーニング方法、スクリーニングキット、酵素活性測定方法、免疫学的方法で固相化されたＭＴ−ＭＭＰ、医薬、検査薬などが提供される。
本発明は、
〔６８〕　ＭＴ−ＭＭＰｓから成る群から選ばれたＭＴ−ＭＭＰに対する抗体であって、且つ（ｉ）界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものの存在下で免疫反応性を維持できること及び（ｉｉ）人為的に変性してエピトープを露出させたＭＴ−ＭＭＰを免疫抗原として得られることから成る群から選ばれた特徴の少なくとも一つを持つものであることを特徴とする抗体；
〔６９〕　ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ２−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ３−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ４−ＭＭＰに対する抗体，ＭＴ５−ＭＭＰに対する抗体及びＭＴ６−ＭＭＰに対する抗体から成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔６８〕記載の抗体；
〔７０〕　抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記〔６８〕又は〔６９〕記載の抗体；
〔７１〕　抗体がＭＴ−ＭＭＰのヘモペキシン様ドメインを認識するものであることを特徴とする上記〔６８〕〜〔７０〕のいずれか一記載の抗体；
〔７２〕　抗体が固相化抗体であることを特徴とする上記〔６８〕〜〔７１〕のいずれか一記載の抗体；及び
〔７３〕　抗体が標識抗体であることを特徴とする上記〔６８〕〜〔７１〕のいずれか一記載の抗体を提供する。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体を用いた免疫学的定量法を含めた各種ＭＴ−ＭＭＰに対する抗体を用いた免疫学的定量法を提供している。そして、特には、界面活性剤及び／又は還元剤を用いることを特徴とするＭＴ−ＭＭＰの免疫学的定量法を提供する。また、本発明では、界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを少なくとも用いて、ＭＴ−ＭＭＰを細胞膜から遊離及び／又は可溶化させる工程を含むことを特徴とする該ＭＴ−ＭＭＰの免疫学的定量法が提供される。特には、本発明では、ＭＴ１−，ＭＴ２−，ＭＴ３−，ＭＴ４−，ＭＴ５−，ＭＴ６−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰｓをその測定対象とする免疫学的定量法が提供される。該ＭＴ−ＭＭＰに対し特異的に反応する抗体としては、（ｉ）界面活性剤及び／又は還元剤の存在下で免疫反応性を維持できること、（ｉｉ）人為的に変性し、エピトープを露出させたＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰを免疫抗原として得られることから成る群から選ばれた特徴を有している。好適には、ＭＴ−ＭＭＰとしては、ＭＴ１−ＭＭＰが挙げられる。以下、ＭＴ１−，ＭＴ２−，ＭＴ３−，ＭＴ４−，ＭＴ５−，ＭＴ６−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰｓのうち、ＭＴ１−ＭＭＰについてより詳しくその態様を説明するが、他のＭＴ−ＭＭＰ、例えばＭＴ２−，ＭＴ３−，ＭＴ４−，ＭＴ５−，ＭＴ６−ＭＭＰなどについても同様にしてそれを適用できることは理解できよう。
一つの態様では、本発明では、免疫学的に定量できるＭＴ１−ＭＭＰが以下のいずれか一つの分子種：
（ｉ）界面活性剤及び／又は還元剤を用いて、細胞膜から遊離・可溶化させた分子
（ｉｉ）自律的に細胞膜から遊離・可溶化した分子
であることを特徴とするＭＴ１−ＭＭＰの免疫学的定量法が提供できる。
本発明の該ＭＴ１−ＭＭＰの免疫学的定量を用いると、ＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法およびスクリーニングキットが提供できる。かくして、本発明に従い、該スクリーニング方法あるいはスクリーニングキットにより得られたＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物を含有していることを特徴とする医薬も提供できる。また、本発明の該ＭＴ１−ＭＭＰの免疫学的定量法により、癌または癌転移検査薬、さらにはリウマチ性関節炎またはアルツハイマーの進行度検査薬が提供できる。一つの具体的態様では、本発明では、免疫学的方法で反応容器に固相化されたＭＴ１−ＭＭＰを使用することを特徴としたＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性の測定方法及びそのための試薬も提供できる。特には、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を介して選択的に反応容器に固相化されたＭＴ１−ＭＭＰを使用することを特徴としたＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を測定する方法及びそのための試薬が提供できる。こうして、本発明では、さらに、該ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を測定する方法あるいはそのための試薬を用いた、ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法およびスクリーニングキットが提供でき、さらには、該ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物を含有していることを特徴とする医薬が提供される。同様に、ＭＴ１−ＭＭＰに置き換えて、他のＭＴ−ＭＭＰについても上記した方法、試薬、キットなどが提供できる。
本明細書中、「膜型マトリックスメタロプロテアーゼ−１」（“ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ　１ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ”）あるいは「ＭＴ１−ＭＭＰ」は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１４（ＭＭＰ−１４）とも呼ばれる酵素（ＭＥＲＯＰＳ　ＩＤ：Ｍ１０．０１４）で、ヒトにおいてはその染色体遺伝子座１４ｑ１１−ｑ１２を占める遺伝子（Ｃ．Ｍｉｇｎｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｍｏｍｉｃｓ，２８：ｐｐ．３６０−３６１（１９９５））の産物であると報告されているものであり、ＤＮＡクローニング並びに組換えタンパク質の発現に成功して、その存在が確認されるとともに詳細な構造及び特性が明らかにされたものである（Ｈ．Ｓａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：ｐｐ．６１−６５（１９９４）；Ｔ．Ｔａｋｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５５：ｐｐ．２９３−２９８（１９９５）；ＧｅｎＢａｎｋＴＭ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：Ｄ２６５１２）。ＭＴ１−ＭＭＰは、ヒトの他、イヌ、ヤギ、ウサギ、イノシシ、ネズミなどでもその存在が確認されている。ヒトＭＴ１−ＭＭＰのｃＤＮＡは、５８２個のアミノ酸残基をコードし（ＥＭＢＬ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｄ２６５１２，Ｅ０９７２０　＆　Ｅ　１０２９７；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ５０２８１）、その構造はシグナルペプチドに続くプロペプチドドメイン、ストロメリシン−３（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−３）に類似した特異な１０個のアミノ酸残基からなる挿入配列（フューリン（ｆｕｒｉｎ）−様酵素認識部位の可能性のある配列）、亜鉛結合サイトの可能性を持つ部位を有するコア酵素ドメイン、ヒンジドメイン、そしてトランスメンブレンドメインを抱えるヘモペキシン様ドメイン、そしてＣ−末端側の疎水性膜貫通ドメインからなっている。ＭＴ１−ＭＭＰは、何らかの機構により、Ｃ−末端側で切断され、膜から離脱したもの（遊離したもの）、すなわち、可溶化されたＭＴ１−ＭＭＰ（可溶型ＭＴ１−ＭＭＰ）としても存在しうる。同様に、他のＭＴ２−，ＭＴ３−，ＭＴ４−，ＭＴ５−，ＭＴ６−ＭＭＰなどについても、それらは公知であり、適宜、文献を参照することで、当業者には明らかである。
本明細書中、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、そして特に、それらが所望の生物学的活性を示す限りは、単一のモノクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、並びに抗体フラグメント（例えば、Ｆｖなど）、ダイアボディ型抗体などを含んでよい。抗体としては、特にモノクローナル抗体が好ましい。本発明では、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を好適に利用できる。他の抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体も利用できることは明らかである。
本明細書中、「モノクローナル抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のＭＴ１−ＭＭＰなどのタンパク質断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つモノクローナル抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体を含むものであり、さらに天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’及びＦａｂといったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原又はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、クワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ），トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、ＤＮＡ組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含していてよい。
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（エピトープ）に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来やイムノグロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり（例えば、ヒト化抗体）、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７など）。
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，ｐｐ．４９５−４９７（１９７５））；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ，４，ｐｐ．７２−７９（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，ｐｐ．３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）；トリオーマ法；ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））（ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法）；米国特許第４９４６７７８号（単鎖抗体の産生のための技術）が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙げられる：Ｓ．Ｂｉｏｃｃａ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ，９，ｐｐ．１０１−１０８（１９９０）；Ｒ．Ｅ．Ｂｉｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，ｐｐ．４２３−４２６（１９８８）；Ｍ．Ａ．Ｂｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，ｐｐ．３７９１−３８０６（１９８４）；Ｊ．Ｂｕｋｏｖｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，ｐｐ．２１９−２２８（１９８７）；Ｍ．ＤＡＩＮＯ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，ｐｐ．２２３−２２９（１９８７）；Ｊ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，ｐｐ．５８７９−５８８３（１９８８）；Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｓ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４）；Ｖ．Ｔ．Ｏｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，ｐｐ．２１４−２２１（１９８６）；Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３−３２７（１９８８）；Ａ．Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，ｐｐ．６７３６−６７４０（１９８６）；Ｃ．Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，ｐｐ．４４６−４４９（１９８５）；Ｎａｔｕｒｅ，３１４，ｐｐ．４５２−４５４（１９８５）あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
本発明に係るモノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモローガスである、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を包含するものであってもよい（米国特許第４８１６５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４））。
以下、モノクローナル抗体の作製につき詳しく説明する。
本発明のモノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）などにより開示された細胞融合技術）を利用して得られたモノクローナル抗体であってよく、例えば次のような工程で作製できる。
１．免疫原性抗原の調製
２．免疫原性抗原による動物の免疫
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
６．モノクローナル抗体の製造
１．免疫原性抗原の調製
抗原としては、上記で記載してあるように、ＭＴ−ＭＭＰｓ、例えばＭＴ１−ＭＭＰの可溶性タンパク質断片又はそれから誘導された断片を用いることができる。例えば、決定されたＭＴ１−ＭＭＰタンパク質の配列情報を基に、適当なオリゴペプチドを化学合成しそれを抗原として利用することもできる。あるいは、該情報を基に、適切な遺伝子ライブラリーを構築したり、あるいは公知又は容易に入手できる遺伝子ライブラリーを選択使用し、組換えＤＮＡ技術を含む遺伝子工学的操作を適用して、例えば、ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシンドメイン、亜鉛結合サイトの可能性を持つ部位を有するコア酵素ドメイン、組換えＭＴ１−ＭＭＰの可溶性タンパク質などを取得してそれを利用することができる。抗原としては、好ましくは、人為的に変性し、エピトープを露出させたＭＴ１−ＭＭＰを用いることが出来る。上記手法は、他のＭＴ−ＭＭＰについても同様に行い得る。
遺伝子組換え技術（組換えＤＮＡ技術を含む）は、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ　ｅｄ．，Ｖｏｌ．１ｔｏ４，（Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ　ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｂ）＆１０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｅ）＆１５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｒ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２１８，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．３０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９９）；Ｊ．Ｃ．Ｇｌｏｒｉｏｓｏ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．３０６，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９９）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
抗原は、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できるが、免疫原性コンジュゲートなどにしてもよい。例えば、免疫原として用いる抗原は、ＭＴ−ＭＭＰ（例えばＭＴ１−ＭＭＰ）を断片化したもの、あるいはそのアミノ酸配列に基づぎ特徴的な配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成して得られた合成ポリペプチド断片であってもよい。また、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみと反応できる（あるいは特定の配列のみを認識できる）モノクローナル抗体をデザインするのに用いることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにしておくことができる。担体タンパク質類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず活性化されることができる。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入することが挙げられる。
活性化結合基としては、（１）活性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシンイミドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば２−ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク質類としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。
２．免疫原性抗原による動物の免疫
免疫は、当業者に知られた方法により行うことができ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体・補体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じて行うことができる。免疫化剤を（必要に応じアジュバントと共に）一回又はそれ以上の回数哺乳動物に注射することにより免疫化される。代表的には、該免疫化剤及び／又はアジュバントを哺乳動物に複数回皮下注射あるいは腹腔内注射することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原ペプチドあるいはＭＭＰｓ、例えばＭＴ１−ＭＭＰタンパク質あるいはその断片を含むものが挙げられる。免疫化剤は、免疫処理される哺乳動物において免疫原性であることの知られているタンパク質（例えば上記担体タンパク質類など）とコンジュゲートを形成せしめて使用してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどのマウス、ハムスター、その他の適当な動物を使用して行われる。抗原の投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウスとのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫の程度を確認できる。本発明の抗体は、こうして得られ免疫された動物から得られたものであってよく、例えば、抗血清、ポリクローナル抗体等を包含する。
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）としては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶことができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ−２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２，Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９〜２７０，１９７８）、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Ｃｕｒｒ．ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１−７，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３（６５３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８−１５５０，１９７９）などを用いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例えばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例えば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよい。
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それから脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該分野で知られたものを用いることができ、この様なものとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　Ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ）なども挙げられる。好ましくは、例えば３０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００のポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコールがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるようにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもできる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが挙げられるが、より好ましくは４：１〜７：１とすることができる。
融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培地に移す。
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレートに分注した容量と等容量を翌日加え、その後１〜３日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというように処理することができるが、適宜これに変更を加えて行うこともできる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリンを除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をすることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺細胞を使用することもでき、それが好ましい場合がある。
ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）、発光免疫分析（ＬＩＡ）、ウェスタンブロティングなどの測定系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）などで、所定の断片ペプチドを抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりする。
目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされうる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。クローニングは複数回行うことが好ましい。
６．モノクローナル抗体の製造
得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいは例えばヌード・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収して得ることが出来る。動物はハイブリドーマの移植に先立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与しておくことができ、その処理後、ハイブリドーマを増殖させ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製してモノクローナル抗体として用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ・カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など）を固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
また、トランスジェニックマウス又はその他の生物、例えば、その他の哺乳動物は、本発明の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化抗体等の抗体を発現するのに用いることができる。
またこうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。当該モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの慣用の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたＤＮＡは、上記したようにして発現ベクターに入れ、ＣＨＯ，ＣＯＳなどの宿主細胞に入れることができる。該ＤＮＡは、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ヒトの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６５８１，１９８４）。かくして所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。また、抗体は、下記するような縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。
ヒト化抗体は、当該分野で知られた技術により行うことが可能である（例えば、Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：ｐｐ．５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：ｐｐ．３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：ｐｐ．１５３４−１５３６（１９８８））。ヒトモノクローナル抗体も、当該分野で知られた技術により行うことが可能で、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒトミエローマ細胞やヒト・マウスヘテロミエローマ細胞は当該分野で知られている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，ｐｐ．３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７））。バイスペシフィックな抗体を製造する方法も当該分野で知られている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：ｐｐ．５３７−５３９（１９８３）；ＷＯ９３／０８８２９；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１０：ｐｐ．３６５５−３６５９（１９９１）；Ｓｕｒｅｓｈ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１，ｐｐ．２１０（１９８６））。
さらにこれら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２といった抗体フラグメントにして使用してもよい。
抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、及び免疫沈降検定に使用することができる（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、当分野で知られる任意の方法を使用することができ、例えば、Ｄａｖｉｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３巻，１０１４−１０２１頁（１９７４）；Ｐａｉｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：ｐｐ．２１９−２３１（１９８１）；及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ”，Ｖｏｌ．１８４，ｐｐ．１３８−１６３（１９９０）により記載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆａｂ’を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがある。
本発明の抗体、特にはモノクローナル抗体を使用しての検知・測定は、イムノ染色、例えば組織あるいは細胞染色、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うこともでき、ＦＩＡ，ＬＩＡ，ＲＩＡ，ＥＬＩＳＡなどを用いることもでき、Ｂ−Ｆ分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うこともできる。好ましくは放射免疫測定法や酵素免疫測定法を採用することができ、さらにサンドイッチ型アッセイを好ましく適用できる。例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明のＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシンドメインに対する抗体などのＭＴ−ＭＭＰのヘモペキシンドメインに対する抗体とし、他方を通常のＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体などの抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体とし、そして一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、ここで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわち可溶性ＭＴ−ＭＭＰ抗原の量（可溶性ＭＴ１−ＭＭＰ抗原の量）と比例する。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行うことが出来る。
抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々知られており、本発明においても勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例えば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたもの、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。
さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられる。
これら担体へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明で得られる抗原に対し特異的に反応する抗体、特にはモノクローナル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。
標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。
代表的な放射性物質の標識用同位体元素としては、［３２Ｐ］，［１２５Ｉ］，［１３１Ｉ］，［３Ｈ］，［１４Ｃ］，［３５Ｓ］などが挙げられる。
代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエート・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼなどのアルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
アルカリホスファターゼを用いた場合、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウンベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その酸素を電極などで検知することもできる。電極としてはガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分子膜電極などであることもできる。
酵素標識は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
本発明においては、信号の形成に４−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニルガラクトシドなどとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働きで形成しうるものが使用できる。
蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。
標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。また上記免疫原性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用されることのできる縮合剤などを用いることができる。
縮合剤としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル　４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル　４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル　４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識した抗体、特には標識モノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることができるし、同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識した抗体、特には標識モノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用することができる。
測定にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ約４〜９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０℃〜６０℃の間の温度で行うことが好ましい。
酵素などで標識されたモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。
抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。
当該分野で普通に採用されていたりあるいは当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定されず用いることが出来る。
特に、本発明の抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を使用しての酵素免疫測定法においては、例えば、当該分野で広く知られた酵素免疫測定技術を制限すること無く適用できるが、該酵素免疫測定法としては、例えば、石川栄治監訳、Ｐ．ＴＩＪＳＳＥＮ著、生化学実験法・エンザイムイムノアッセイ、１９８９年、株式会社東京化学同人などに記載の方法などが挙げられる。例えば、第一抗体固相法、二抗体法、エミット法（Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；ＥＭＩＴ）、エンザイムチャンネリングイムノアッセイ法、酵素活性修飾物質イムノアッセイ法、リポソーム膜−酵素イムノアッセイ法、サンドイッチ法、イムノエンザイムメトリックアッセイ法、酵素活性増強イムノアッセイ法などが挙げられ、それらは競合法であっても、非競合法であってもよい。
本発明の測定方法で測定される試料としては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、例えば胸腺、睾丸、腸、腎臓、脳、乳房、卵巣、子宮、肺、肝、胃、膵、皮膚、食道などの臓器、器官、それらの腫瘍、例えば乳癌、卵巣癌、肺癌、子宮癌、結腸・直腸癌、各種肉腫、血液、血清、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられる。
本発明に従って、ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）の免疫学的定量を行うことにより、ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）を膜から遊離及び／又は可溶化された分子種（可溶型ＭＴ−ＭＭＰ）として測定できることを見いだした。そして、試料を、例えば界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたもので適切に処理すると、何らかの機構により、膜から離脱したもの（遊離したもの）及び／又は可溶化したものが得られ、ＭＴ１−ＭＭＰといったＭＴ−ＭＭＰの定量などの測定が効果的に行うことができる。かくして、界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて、ＭＴ１−ＭＭＰ、その他のＭＴ−ＭＭＰを細胞膜から遊離及び／又は可溶化させる技術が提供される。さらに、界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて、ＭＴ−ＭＭＰｓ、例えば、ＭＴ１−，ＭＴ２−，ＭＴ３−，ＭＴ４−，ＭＴ５−，ＭＴ６−ＭＭＰなどを、膜から遊離及び／又は可溶化せしめる技術が提供できる。該遊離及び／又は可溶化技術を利用すれば、ＭＴ−ＭＭＰに対する抗体、特にはモノクローナル抗体（例えば、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体，ＭＴ２−ＭＭＰ抗体，ＭＴ３−ＭＭＰ抗体，ＭＴ４−ＭＭＰ抗体，ＭＴ５−ＭＭＰ抗体，ＭＴ６−ＭＭＰ抗体など）などを用いて、ＭＴ−ＭＭＰ、特には遊離及び／又は可溶化されたＭＴ−ＭＭＰを免疫学的定量に付すことができる。
該界面活性剤としては、膜からＭＴ−ＭＭＰを遊離及び／又は可溶化せしめる働きを有するものであれば如何なるものも使用できるが、好ましくはＭＴ−ＭＭＰの免疫学的な定量に悪影響を及ぼさないものが挙げられる。該界面活性剤としては、例えば陰イオン界面活性剤などが挙げられ、代表的なものとしては、高級アルキル硫酸のアルカリ金属塩などである。好ましい界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などが挙げられる。該還元剤としては、膜からＭＴ−ＭＭＰを遊離及び／又は可溶化せしめる働きを有するものあるいはＭＴ−ＭＭＰ分子中にある酸化還元反応に感受性の基（例えば、−Ｓ−Ｓ−結合など）に作用するものが挙げられるが、好ましくはＭＴ−ＭＭＰの免疫学的な定量に悪影響を及ぼさないものが挙げられる。該還元剤としては、例えば２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどのチオアルコール類、グルタチオンなどの硫黄含有有機化合物などが挙げられる。
好ましくは、界面活性剤及び還元剤の両方を使用して、膜からＭＴ−ＭＭＰを遊離及び／又は可溶化せしめることができるし、ＭＴ−ＭＭＰに対する抗体などを用いて、ＭＴ−ＭＭＰ、特には遊離及び／又は可溶化されたＭＴ−ＭＭＰを免疫学的に測定（定量を含む）することができる。かくして、遊離及び／又は可溶化ＭＴ−ＭＭＰと膜に結合しているＭＴ−ＭＭＰとを区別することが可能となったり、膜に結合して検知あるいは測定が困難である場合にもＭＴ−ＭＭＰを検知あるいは測定することが可能となる。特に、界面活性剤としてＳＤＳ、還元剤として２−メルカプトエタノールを用いて、ＭＴ１−ＭＭＰを遊離及び／又は可溶化せしめることができる。また、ＭＴ１−ＭＭＰに対する抗体、特にはモノクローナル抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を使用して該遊離及び／又は可溶化されたＭＴ１−ＭＭＰを免疫学的に定量できる。
これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析・定量法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の当該対象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測定系を構築すればよい。
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江　寛編，「ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和４９年発行；入江　寛編，「続ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和５４年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」，医学書院，昭和５３年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第２版），医学書院，昭和５７年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第３版），医学書院，昭和６２年発行；石川栄治著、「超高感度酵素免疫測定法」，学会出版センター，１９９３年１２月発行；Ｈ．Ｖ．Ｖｕｎａｋｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ａ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｂ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１７８（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｍｉｃｒｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｔ　Ｂ：Ａｎｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ａｎｄ　Ｄｒｕｇｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９１）などあるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）〕。
本発明では、ＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰの免疫学的定量法を利用して、ＭＴ１−ＭＭＰの発現などのＭＴ−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法が提供される。該スクリーニング方法では、例えば、ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）を発現する培養細胞、形質転換されたＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）発現細胞、あるいはトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物を、任意の生理活性因子、薬剤、化合物などの存在下に維持し、無処理の場合と対照させ、該ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）の免疫学的定量法により試料中のＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）の量につき測定を行うことにより、ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）産生量などの増減を比較して各添加物の効果を評価する。該スクリーニング方法に付される添加物としては、ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）の発現を促進または阻害する機能をもつ候補のものであれば何らの制限もなくいかなるものであってもよく、それらは公知のものでも新規のものでもよい。該添加物としては、遺伝子の発現制御に関わるもの、ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）のアンチセンスＲＮＡなどのアンチセンス核酸、ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）のｍＲＮＡを配列依存的に切断するリボザイムなどが考えられる。添加物は、培養液中に直接あるいはハプテン化して添加しても良いし、それぞれを発現する遺伝子を細胞内に導入しても良い。ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）の発現を強力に、かつ特異的に抑制するアンチセンスＲＮＡなどの核酸やリボザイムの設計および選択にＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）免疫学的定量法は有用である。ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）発現抑制剤は、癌転移抑制に対する医薬として有用である。
また、本発明のＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）の免疫学的定量法は、癌検査または癌転移検査、さらにはリウマチ性関節炎またはアルツハイマーの進行度検査に有用であり、癌検査または癌転移検査用薬、さらにはリウマチ性関節炎またはアルツハイマーの進行度検査薬も提供される。特に、ＭＴ−ＭＭＰ（例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ）免疫学的定量試薬は、癌検査または癌転移検査用薬、さらにはリウマチ性関節炎またはアルツハイマーの進行度検査薬として有用である。
本発明では、固相化された抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体などの固相化抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体、特には固相化されたモノクローナル抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体などの固相化されたモノクローナル抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体が提供される。該固相化された抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体（例えば、固相化されたモノクローナル抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体）などの固相化抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体を使用して、試料中のＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性をスクリーニングすることが可能である。該スクリーニング法では、例えば反応容器などに固相化された抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体（例えば、固相化されたモノクローナル抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体）などの抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体に、ＭＴ１−ＭＭＰを含む試料などのＭＴ−ＭＭＰを含む試料を接触せしめ、抗原抗体反応を介して、該固相化された抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体にＭＴ１−ＭＭＰを捕捉させるなど固相化抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体にＭＴ−ＭＭＰを捕捉させ、次にＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性などＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を測定することなどにより行われる。酵素活性の測定には、例えばＭＴ１−ＭＭＰの基質などＭＴ−ＭＭＰの基質を使用し、酵素反応の結果生ずるシグナルを検知あるいは測定することなどにより行うことができる。特に、可溶型ＭＴ−ＭＭＰを定量でき、その量と腫瘍の悪性度及び癌の転移能との相関関係を求めることを可能にする。別の面では、本発明では、固相化されたＭＴ１−ＭＭＰなどの固相化されたＭＴ−ＭＭＰが提供される。特には、免疫学的方法で固相化されたＭＴ１−ＭＭＰが提供される。該固相化されたＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰは、例えばＭＴ１−ＭＭＰ活性阻害剤、その他のＭＴ−ＭＭＰ活性阻害剤などの試料の存在下あるいは非存在下にＭＴ１−ＭＭＰの基質などのＭＴ−ＭＭＰの基質と接触せしめ、酵素反応の結果生ずるシグナルを検知あるいは測定することなどによりスクリーニングに使用できる。代表的な固相化ＭＴ−ＭＭＰとしては、例えば反応容器などに固相化されたものが挙げられる。
ＭＴ１−ＭＭＰに代えて、ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ，ＭＴ６−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰについても、同様に、行うことができることは明らかである。
かくして、本発明では、ＭＴ−ＭＭＰの活性測定およびＭＴ−ＭＭＰ活性阻害剤の検索が可能である。特に、本発明では、ＭＴ１−ＭＭＰの活性測定およびＭＴ１−ＭＭＰ活性阻害剤の検索が可能である。上記の方法において、試料のＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰを特異的に固相化し、その活性を検出することができ、さらにそのためのスクリーニング試薬が提供される。また、得られたＭＴ１−ＭＭＰ活性などのＭＴ−ＭＭＰ活性から癌の浸潤能あるいは転移能を評価できる。したがって、検体癌組織の浸潤能を想定することができ、またそのための試薬が提供される。また、治療を施した癌組織の浸潤能の変動を想定したり、ＭＴ１−ＭＭＰの産生を抑制し浸潤能を低下あるいは消失させる医薬の選択や薬剤の検索などに有用である。また、一方では、上記の方法において、一定の活性レベルを有する標準ＭＴ１−ＭＭＰを用い、これに対して各種の酵素活性阻害剤、ＭＭＰｓ阻害剤あるいは任意の化合物を添加せしめ、ＭＴ１−ＭＭＰに対する阻害活性を測定することができる。この方法を用いれば、未知のＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤の検索やＢａｔｉｍａｓｔａｔ、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ、Ｒｏ３２−３５５５、ＡＧ３３４０、Ｂａｙ１２−９５６６、ＣＧＳ２７０２３Ａなど既存のＭＭＰ活性阻害剤（ヒドロキサム酸、カルボン酸、ホスホン酸、チオールの誘導体などを包含していてよく、例えば、国際公開第ＷＯ　９７／２７１７４号（ＷＯ　９７／２７１７４），ＷＯ　９７／２０８２４，英国特許公開明細書第２２６８９３４号（ＧＢ　２２６８９３４　Ａ又は米国特許明細書第５３１０７６３号（ＵＳ　５３１０７６３）），ＵＳ　５２６８３８４，ＵＳ　５４５５２５８，ＷＯ　９６／１１２０９，ＷＯ　９７／１８２０７，ＷＯ　９７／３２８４６，ＷＯ　９８／１７６４３，特開平７−１０１９２５号公報，ＵＳ　５６１４６２５，ＷＯ　９８／３０５５１，ＷＯ　９８／４３９６３，ＷＯ　９６／１５０９６，ＷＯ　９６／３３１７４，ＷＯ　９６／３３９６８，ＷＯ　９９／３１０５２，国際出願ＰＣＴ／ＪＰ００／０３１６６号などに開示されている）が持つＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤能を知ることができる。ＭＴ１−ＭＭＰに代えて、ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ，ＭＴ６−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰについても、同様に、行うことができることは明らかである。
酵素活性あるいは酵素阻害活性の測定は、通常の測定法に準じて実施することができる。また、各種標識、緩衝液系その他適当な試薬等を使用したりすることもできる。方法を行うにあたっては、ＭＴ−ＭＭＰｓをアミノフェニル酢酸水銀などの活性化剤で処理したり、その前駆体あるいは潜在型のものを活性型のものに予め変換しておくこともできる。個々の測定にあたっては、それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、適切な測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１＆２（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９５５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６２）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９５７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４（Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｓｔ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９５７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４５（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｂ）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８０（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｃ）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｌｌｏ　Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９５）などあるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）〕。
本発明の測定法及びスクリーニング法で有用な試薬あるいは試薬セット、さらにはキット（スクリーニングキットなど）も有用である。該キットは、組成物用の有効な成分を１又はそれ以上を充填した１又はそれ以上の容器を含む、例えば免疫測定などの測定分野あるいは医薬分野で許容されるパック及びキットである。代表的には、このような（単一あるいは複数の）容器と一緒に、臨床検査あるいは医薬又は生物学的産物の製造、使用又は販売を規制する政府機関により指示された形態の注意書（文書）であって、ヒトなどに関連した製品の製造、使用又は販売に関する該政府機関の承認を示している注意書（添付文書）が添付されていてよいものである。
本発明のスクリーニング法で得られた活性成分〔例えば、（ａ）ＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物あるいはその塩など、（ｂ）ＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物あるいはその塩など〕を医薬として用いる場合、それらは、通常単独或いは薬理的に許容される各種製剤補助剤と混合して、医薬組成物又は医薬調製物などとして投与することができる。好ましくは、経口投与、局所投与、または非経口投与等の使用に適した製剤調製物の形態で投与され、目的に応じていずれの投与形態（吸入法、あるいは直腸投与も包含される）によってもよい。
また、本発明の活性成分は、抗腫瘍剤（抗癌剤）、腫瘍転移阻害剤、消炎剤及び／又は免疫抑制剤と配合して使用することもできる。抗腫瘍剤（抗癌剤）、腫瘍転移阻害剤、消炎剤や免疫抑制剤としては、有利な働きを持つものであれば制限なく使用でき、例えば当該分野で知られたものの中から選択することができる。医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。例えば、適宜必要に応じて、生理学的に認められる担体、医薬として許容される担体、アジュバント剤、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤などを単独もしくは組合わせて用い、それとともに本発明の活性成分等を混和することによって、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態にして製造することができる。
本発明の活性成分は、その投与量を広範囲にわたって選択して投与できるが、その投与量及び投与回数などは、処置患者の性別、年齢、体重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
医薬品製造にあたっては、その添加剤等や調製法などは、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十四改正　日本薬局方解説書、平成１３年６月２７日発行、株式会社廣川書店；一番ヶ瀬　尚　他編　医薬品の開発１２巻（製剤素剤〔Ｉ〕）、平成２年１０月１５日発行、株式会社廣川書店；同、医薬品の開発１２巻（製剤素材〔ＩＩ〕）平成２年１０月２８日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して適用することができる。
明細書及び図面において、用語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。代表的な用語の意味を以下に示す。
ｂｐ：ｂａｓｅ　ｐａｉｒ（ｓ）；
ＩＰＴＧ：ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；
ＳＤＳ：ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ；
ＬＢ：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ
ＴＡＢ：３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ
ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ
ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ
ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
ＰＡＧＥ：ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ
後述の実施例２（表１）に記載のモノクローナル抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を産生するハイブリドーマ：２２２−１Ｄ８は、平成１２年１０月２６日（原寄託日）から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｏｒｇａｎｉｓｍ　Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ：ＩＰＯＤ：旧住所は茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）で、旧名称は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託されており（受託番号　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８０８５）、平成１３年１１月１２日に原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託への移管請求がなされ、受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−７７９５としてＩＰＯＤに保管されている。同様に、後述の実施例２（表１）に記載のモノクローナル抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を産生するハイブリドーマ：２２２−２Ｄ１２は、平成１２年１０月２６日（原寄託日）からＩＰＯＤに寄託されており（受託番号　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８０８６）、平成１３年１１月１２日に原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託への移管請求がなされ、受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−７７９６としてＩＰＯＤに保管されている。
実施例
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。なお、ベクター、制限酵素などは、宝酒造（株）などから入手したものを使用した。
実施例１　組換えＭＴ１−ＭＭＰの調製
各種組換えＭＴ１−ＭＭＰを調製し、免疫、モノクローナル抗体のスクリーニング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどに用いた。
▲１▼　大腸菌由来組換えΔＭＴ１−ＭＭＰ（免疫抗原）
ａ）発現ベクターの構築
Ｊ．Ｃａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：８０１−８０５（１９９５）記載の方法により作製した動物細胞用発現ベクターｐＳＧΔＭＴ１−ＭＭＰよりΔＭＴ１−ＭＭＰ遺伝子を制限酵素ＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩで切り出し、制限酵素ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１８のβ−ガラクトシダーゼにインフレームで連結し、発現ベクターｐＵＣΔＭＴ１−ＭＭＰを構築した。この発現ベクターにより、β−ガラクトシダーゼの１１アミノ酸残基とシグナルペプチドおよびプロペプチド領域の一部（４７アミノ酸残基）を欠損したΔＭＴ１−ＭＭＰ（Ｇ４８−Ｇ５３５）の４８８アミノ酸残基、計４９９アミノ酸残基からなる分子量約５５ｋＤａの融合タンパク質を発現せしめた。なお、ＭＴ１−ＭＭＰをコードしているＤＮＡは、例えばＪ．Ｃａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：　８０１−８０５（１９９５）；Ｋ．Ｉｍａｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６：２７０７−２７１０（１９９６）などに記載があり、それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる。
ｂ）融合タンパク質の発現
ｐＵＣΔＭＴ１−ＭＭＰを含む大腸菌ＤＨ５αを４ｍＬの５０μｇ／ｍＬ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培地に接種、３７℃で１６時間培養し、１次カルチャーを調製した。これを４００ｍＬの５０μｇ／ｍＬ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培地に再接種、３７℃でおよそ３時間、対数増殖期中期まで培養した。ＩＰＴＧ（最終濃度０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間培養を継続し、組換え融合タンパク質の発現を誘導した。
ｃ）組換え体の精製−１（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙの回収と可溶化）
培養液を直ちに氷冷し、遠心（５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で菌体を回収、２０ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ含有２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し１５分間、氷中に置いて細胞壁を破壊した。菌体懸濁液を氷冷下で超音波破砕（３０秒、１０回）、遠心（１８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）してｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙを回収した。Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙを１ｍＬの０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁し、洗浄、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して沈殿を回収、これを１ｍＬの８Ｍ　ｕｒｅａ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。
ｄ）組換え体の精製−２（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび電気溶出）
前項で調製した溶解画分に１／５体積の６×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（還元）を加え、３７℃で１時間置いた後、ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。９０×７０×１ｍｍのゲルに対し０．６ｍＬのサンプルを展開した。泳動終了後、ゲルを３Ｍ　ＫＣｌに浸し、タンパク質バンドを可視化し、組換えΔＭＴ１−ＭＭＰのバンドを切り出した。切り出したゲルを細断、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファーで洗浄した後、電気溶出用カラムに入れ、２００Ｖ（定電圧）で４時間通電して組換えタンパク質を回収した。これに最終濃度１０ｍＭとなるようにデオキシコール酸（ＤＯＣ）を加え、１６時間低温室に置き、ＳＤＳをＤＯＣで置換、さらに０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析して過剰のＳＤＳおよびＤＯＣを除去した。透析中に発生した沈殿物を遠心で除き、上清を限外濾過で濃縮した。４００ｍＬの大腸菌培養から得られた可溶性組換えΔＭＴ１−ＭＭＰ（Ｌｏｔ　ＧＶ０１）は２．６ｍｇ（２ｍｇ／ｍＬ×１．３ｍＬ）であった。
▲２▼ＣＯＳ−７由来組換えＭＴ−ＭＭＰｓ
ｐＳＧ５に挿入されたＭＴ１−ＭＭＰのｃＤＮＡをリン酸カルシウム法でＣＯＳ−７に導入し、４８時間の発現の後、細胞を回収した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、超音波破砕した。得られた細胞破砕物に１／５体積の６×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（還元剤含有）を加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングの抗原検体とした。同様にして、ｐＳＧ５に挿入されたＭＴ２−ＭＭＰ（マウス）のｃＤＮＡおよびｐＳＧ５に挿入されたＭＴ３−ＭＭＰのｃＤＮＡを用い、それぞれ同様に処理し、抗原検体を得た。これらは、モノクローナル抗体の交叉反応性の検討に用いた。
▲３▼　大腸菌由来リフォールド組換えΔＭＴ１−ＭＭＰ（ΔＭＴ１−ＭＭＰＲＦ）
実施例１で構築したｐＵＣΔＭＴ１−ＭＭＰよりΔＭＴ１−ＭＭＰ遺伝子を制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、ｐＴｒｃＨｉｓにインフレームで連結した発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓΔＭＴ１−ＭＭＰを構築した。この発現ベクターで大腸菌を形質転換し、組換えタンパク質を発現させた。
上記の組換え大腸菌（４００ｍＬ培養）より調製した不溶性封入体を８Ｍ　ｕｒｅａ、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で可溶化し、Ｎｉ＋＋Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲルカラムに供した。洗浄後、８Ｍ　ｕｒｅａ、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．５Ｍ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ含有５０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出、得られた精製画分を８Ｍ　ｕｒｅａ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ含有２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）で平衡化したＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲルカラムに供し緩衝液を交換した。これに５０μＭ　ＺｎＳＯ４および１ｍＭ　ＤＴＴを添加した後、Ａ２８０を測定し、８Ｍ　ｕｒｅａ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、５０μＭ　ＺｎＳＯ４、１ｍＭ　ＤＴＴ含有２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を用いてＡ２８０が０．１となる様に希釈した。これに２０ｍＭ　ｃｙｓｔｅａｍｉｎを添加し、リフォールディング用サンプル（５０ｍＬ）とした。これを５Ｌの０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００μＭ　ＺｎＳＯ４、５ｍＭ　２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１ｍＭ　ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ、０．０２％　ＮａＮ３含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）で１６時間透析、さらに０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＣａＣｌ２、５０μＭ　ＺｎＳＯ４、０．０２％　ＮａＮ３含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）で透析し（４時間、３回）、リフォールディングした。
透析後のサンプルを遠心し、不溶化したタンパク質を除去、Ａ２８０を測定しタンパク質量を見積った。得られたΔＭＴ１−ＭＭＰＲＦの量はおよそ１．６ｍｇであった。さらに一部をとって、０．１μｇ／ｍＬのトリプシンと３７℃で１時間処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、ΔＭＴ１−ＭＭＰ（５８ｋＤａ）、ヘモペキシンドメイン（３０、３４ｋＤａ）、触媒ドメイン（２１ｋＤａ）のバンドが検出された。これを濃縮しエピトープマッピングおよびＥＬＩＳＡ評価用抗原として使用した。
実施例２　抗体の作製と選択
▲１▼　免疫スケジュール
免疫動物：６週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌、２匹
精製抗原：２ｍｇ／ｍｌ　ΔＭＴ１−ＭＭＰ（実施例１▲１▼−ｄ）で得られたもの）０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有５０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
初回免疫：５８μｇ／２９０μｌ／マウス（完全フロイントアジュバント）腹
腔内投与
追加免疫：２０日後　６４μｇ／１６０μｌ／マウス　腹腔内投与
追加免疫：３５日後　５４μｇ／１６０μｌ／マウス　腹腔内投与
最終免疫：６９日後　７３．３μｇ／１６０μｌ／マウス　静脈内投与
最終免疫の３日後（７２日後）に細胞融合
すなわち、上記精製ΔＭＴ１−ＭＭＰ抗原（５８μｇ／２９０μｌ）を完全フロイントアジュバントと共に６週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫した。２０日後上記精製抗原（６４μｇ／１６０μｌ）を初回免疫したマウスに腹腔内投与し、追加免疫した。さらに３５日後上記精製抗原（５４μｇ／１６０μｌ）を腹腔内投与し、追加免疫し、次に、６９日後上記精製抗原（７３．３μｇ／１６０μｌ）を静脈内投与し、最終免疫とした。その３日後（全体で７２日後）に免疫したマウスから脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を調製した。
▲２▼　細胞融合とハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合には、以下の材料および方法を用いた。
ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＲＰＭＩ−１６４０（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌ろ過した。ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過したウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加えた。
ＰＥＧ−４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエチレングリコール−４０００（ＰＥＧ−４０００，Ｍｅｒｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／ｗ）になるように加えた無血清培地を調製した。
８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ−２（ＳＰ−２／０−Ａｇ１４）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｐ３５１〜３７２（ｅｄ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓ．Ｎ．Ｓｈｉｉｇｉ），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）に記載のＯｉ　＆　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇらの方法を若干改変して行った。
前記で調製した有核脾細胞（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５：１〜１０：１の比率で以下の手順で融合した。それぞれの精製ΔＭＴ１−ＭＭＰ抗原免疫脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に同じ培地に懸濁し、融合させるために有核脾細胞とミエローマ細胞を混合した。
次に、それぞれの細胞混合液を遠心分離により細胞を沈殿させ、上清を完全に吸引除去した。沈殿した細胞に３７℃に加温した５０％　ＰＥＧ−４０００含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ミエローマ細胞がおおよそ１０７個／ｍＬとなるよう体積を決定する）を１分間で滴下し、１分間撹拌し、細胞を再懸濁、分散させた。次に添加した５０％　ＰＥＧ−４０００含有ＲＰＭＩ−１６４０培地の２倍体積の３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地を２分間で滴下した。さらに添加した５０％　ＰＥＧ−４０００含有ＲＰＭＩ−１６４０培地の７倍体積のＲＰＭＩ−１６４０培地を２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し、細胞を分散させた。これを遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次に、ミエローマ細胞がおおよそ１０６個／ｍＬとなるように３７℃に加温したＮＳ−１培地を沈殿した細胞に速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピペッティングで分散した。さらに同培地を加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウエルにウエル当りのミエローマ細胞の数を調整して接種した。それぞれの細胞を加えた上記マイクロウエルを７％炭酸ガス／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％で培養した。
次に、選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖を行った。
（１）使用する培地は以下の通りである。
ＨＡＴ培地：前記で述べたＮＳ−１培地に更にヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ培地と同一組成のものである。
（２）前記の培養開始後翌日（１日目）、細胞にパスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８日目に培地の半分（約０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１０日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換えた。１１日目以降にハイブリドーマの生育が肉眼にて認められた全ウエルについて固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウエルを調べた。まず、１００ｎｇ／ウエルで免疫抗原をコートしたポリスチレン製９６穴プレート（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳを用いて洗浄して未吸着の抗原タンパク質を除いてある）の各ウエルにハイブリドーマの生育が確認されたウエルの培養上清を添加し、室温で約１時間静置した。洗浄後、２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ）を加え、さらに室温で約１時間静置した。洗浄後、基質である過酸化水素と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加え、発色の程度をマイクロプレート用吸光度測定機（ＭＲＰ−Ａ４、東ソー）を用いて４５０ｎｍの吸光度で測定した。１５クローンを選択できた。
▲３▼　ハイブリドーマのクローニング
上記で得られた免疫抗原に対し陽性のウエル中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクローン化した。すなわち、ＮＳ−１培地中にフィーダーとしてマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルにハイブリドーマを、ウエル当り５個、１個、０．５個になるように希釈し、それぞれ３６穴、３６穴、２４穴に加えた。３〜７日目、８〜１５日目に全ウエルにＮＳ−１培地を追加した。クローニング開始後約１〜３週間で、肉眼的に十分なハイブリドーマの生育を認めたら、コロニー形成陰性ウエルが５０％以上である群について上記スクリーニング法（ＥＬＩＳＡ）を行った。調べた全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が１個のウエルを４〜６個選択し、再クローニングを行った。最終的に免疫抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。１５クローンを選抜した。
▲４▼　モノクローナル抗体のサブクラスアッセイ
１５クローンについてサブクラスを決定した。前述したＥＬＩＳＡに従い、それぞれ免疫抗原をコートしたポリスチレン製９６穴プレートに、上記で得られたハイブリドーマの上清を加えた。次にＰＢＳで洗浄後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂ．）を加えた。ＰＢＳにより洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加え、基質として過酸化水素および２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン酸）を用いてクラス、サブクラスを決定した。
▲５▼イムノブロッティングによる選択
反応性試験−１：
免疫抗原を１２％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開、ナイロンメンブレンに転写、各ハイブリドーマ培養上清を１次抗体として添加、抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）−ＨＲＰを２次抗体として使用、染色した。全１５クローンのうち８クローンを陽性と判定し、２次選択に供した。これら８クローンのサブクラスは、４クローンがＩｇＧ１／κ、１クローンがＩｇＧ３／κ、３クローンがＩｇＭであった。
反応性試験−２：
前項で陽性と判定した８クローンについて、組換えＭＴ１−ＭＭＰを発現するＣＯＳ−７の細胞破砕物を抗原としたウエスタンブロッティングでさらに選択を行い、反応性の弱い３クローン（表１中の（＋））を除外した。これらはいずれもＩｇＭであった。最終的に得られたクローンは５種で、サブクラスはＩｇＧ１／κが４種、ＩｇＧ３／κが１種であった。
▲６▼　ハイブリドーマの培養とモノクローナル抗体の精製
得られたハイブリドーマ細胞をＮＳ−１培地で培養し、その上清から濃度１０〜１００μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を得ることができる。また、得られたハイブリドーマ１０７個を予め１週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ系、雌、６週齢）に同じく腹腔内投与し、１〜２週間後、腹水中からも４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得ることができる。得られた腹水を４０％飽和硫酸アンモニウムで塩析後、ＩｇＧクラスの抗体をプロテインＡアフィゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に吸着させ、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出することにより精製する。
本発明では、上記で得られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞（５クローン）をマウス腹腔に投与し、それぞれの抗体を含有する腹水を調製した。得られた腹水を硫安分画、アフィゲル　プロテインＡゲルカラムに供し、精製モノクローナル抗体を得た。
サブクラスアッセイ、反応試験−１および２の結果を表１にまとめた。
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実施例３　抗体の反応性
▲１▼エピトープマッピング
実施例１−▲３▼で調製したΔＭＴ１−ＭＭＰ（５８ｋＤａ）およびヘモペキシンドメイン（３０ｋＤａ，３４ｋＤａ）、触媒ドメイン（２１ｋＤａ）の断片を抗原としたウエスタンブロッティングでエピトープマッピングを実施した。実施例２で選択した５クローンを１次抗体として添加、抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）−ＨＲＰを２次抗体として使用、染色した。いずれのクローンもヘモペキシンドメインと強く反応し、これらのエピトープがヘモペキシンにあることが確認された（図１参照）。
▲２▼交叉反応性
実施例１−▲２▼で調製したＭＴ１−ＭＭＰ発現ＣＯＳ−７の細胞破砕物、ＭＴ２−ＭＭＰ（マウス）発現ＣＯＳ−７の細胞破砕物およびＭＴ３−ＭＭＰ発現ＣＯＳ−７の細胞破砕物を抗原として用い、ウエスタンブロッティングで交叉反応試験を実施した。実施例２で選択した５クローンを１次抗体として添加、抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）−ＨＲＰを２次抗体として使用、染色した。いずれのクローンもＭＴ１−ＭＭＰとのみ反応し、ＭＴ２−ＭＭＰ（マウス）およびＭＴ３−ＭＭＰとは反応せず、ＭＴ１−ＭＭＰに特異性を持つことが確認された（図２参照）。
実施例４　ＭＴ１−ＭＭＰの測定
各抗体を固相化した９６穴マイクロウエル中で、標準抗原（組換えΔＭＴ１−ＭＭＰ）を反応させた。洗浄後、各抗体のＩｇＧ−ＨＲＰと反応させ、続いて未反応のＩｇＧ−ＨＲＰを洗浄除去した。抗原を介して結合したＩｇＧ−ＨＲＰの残存活性を、ＴＭＢを基質として測定した。最も抗原を良く検出した固相抗体２２２−２Ｄ１２と標識抗体２２２−１Ｄ８の組み合わせを見出し、さらに、使用する抗体の濃度、反応時間、反応温度、反応緩衝液の組成など詳細に検討した。標識抗体はＩｇＧ−ＨＲＰにかえて、Ｆａｂ’−ＨＲＰを新たに作製し用いた。その結果、以下に示す方法において最も効率良くＭＴ１−ＭＭＰが測定できた。
▲１▼　標識抗体
標識抗体Ｆａｂ’−ＨＲＰは次のようにして調製できる。例えば、モノクローナル抗体を０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ　酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４．２）に抗体量の２％（Ｗ／Ｗ）のペプシンを加え、３７℃で２０時間消化した。消化物に３Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、反応を停止した。０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムによるゲルろ過でＦ（ａｂ’）２画分を分取した。このＦ（ａｂ’）２画分に最終濃度０．０１Ｍとなるようにシステアミン塩酸塩を添加し、３７℃、１．５時間還元し、５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムによるゲルろ過でＦａｂ’画分を分取した。
上記の操作とは別にＨＲＰを０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解、ＨＲＰの２５倍モル量のＢＭＣＳをＤＭＦ溶液として加え、３０℃、３０分間反応させた。これを０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＮＩＣＫ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過しマレイミド標識ＨＲＰ画分を分取した。
Ｆａｂ’画分とマレイミド標識ＨＲＰを等モルとなるように両画分を混合し、４℃、２０時間反応させた後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレイミドで未反応のチオール基をブロックした。これを０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムでゲルろ過し、Ｆａｂ’−ＨＲＰ標識抗体を分取した。これに０．１％　ＢＳＡおよび０．００１％クロルヘキシジンを添加して４℃で保存した。
▲２▼　抗体固相化プレート：
モノクローナル抗体（例えば、２２２−２Ｄ１２（ＩｇＧ））を０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２５μｇ／ｍＬに調製し、９６穴マイクロウエル（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ　ＭＯＤＵＬＥ）あたり１００μＬずつ加え、４℃、２４時間静置した。次に抗体溶液を除去し、洗浄液（０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で３回洗浄後、ブロッキング液（１％　ＢＳＡ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有３０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））を９６穴マイクロウエルあたり０．３ｍＬずつ加え、４℃で保存した。
▲３▼　標準抗原：
実施例１で精製したΔＭＴ１−ＭＭＰを希釈用緩衝液（０．４５％　ＳＤＳ，０．４％　２−メルカプトエタノール，３％　ウマ血清，１％　ＢＳＡ，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有３０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１６０ｎｇ／ｍＬに調製した。これを希釈用緩衝液で段階希釈して８０，４０，２０，１０，５および２．５ｎｇ／ｍＬの標準抗原溶液を調製した。
▲４▼　測定検体：
測定検体は、必要に応じて希釈用緩衝液で希釈した。
▲５▼　１次反応：
標準抗原あるいは測定検体を９６穴ビニルプレートに２５μＬずつ加えた。これに希釈用緩衝液１００μＬを加え混和、これより１００μＬとって、予めブロッキング液を除去・洗浄した抗体固相化プレートに入れ、４℃で１６時間静置した。
▲６▼　２次反応：
標識抗体２２２−１Ｄ８（Ｆａｂ’−ＨＲＰ）をブロッキング液で０．４μｇ／ｍＬに調製した。１次反応が終了した抗体固相化プレートから反応液を除去し洗浄液で３回洗浄後、標識抗体液をウエルあたり１００μＬずつ加え、室温で１時間静置した。
▲７▼　発色：
反応終了後、標識抗体液を除去、洗浄液で３回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）をウエルあたり１００μＬずつ加え、室温で２０分間反応した。これに２Ｎ硫酸をウエルあたり１００μＬずつ加え反応を停止した。この反応混液のＡ４５０をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東ソー）を用いて測定した。
上記の方法で得られた標準曲線の例を図３に示した。ＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡの感度は、０．３２ｎｇ／ｍＬ（６．４ｐｇ／ウエル）、また０．６３−１６０ｎｇ／ｍＬ（０．０１３−３．２ｎｇ／ウエル）の範囲で直線性が認められた。
実施例５　ＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡの性能
▲１▼　希釈試験による検体量の決定
血清、関節液それぞれに標準抗原を添加して作成した検体を希釈、実施例４に記載した方法に従って測定した。血清検体を１０、２０、３０μＬ／ｗｅｌｌとなるように希釈し測定した。検体量を２０μＬ／ｗｅｌｌ以下にした場合、加えた標準抗原の９０％以上が回収されたことから、血清検体の測定は２０μＬ／ｗｅｌｌで設定した。関節液検体を０．６２５，１．２５，２．５，５μＬ／ｗｅｌｌとなるように希釈し測定した。検体量を２．５μＬ／ｗｅｌｌ以下にした場合、加えた標準抗原の８０％以上が回収されたことから、関節液検体の測定は２．５μＬ／ｗｅｌｌで設定した（表２）。
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▲２▼添加回収試験
血清、関節液、培養上清（Ｃｏｎ　Ａ処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、細胞抽出画分（Ｃｏｎ　Ａ処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１）のそれぞれに標準抗原を添加し、実施例４に記載した方法に従って測定し添加した標準抗原の回収率を調べた。測定結果例を表３に示した。血清、培養上清、細胞抽出画分では９０％以上、関節液では８０％以上の回収率が確保された。
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▲３▼同時再現性
ａ）血清に標準抗原を添加して調製した検体（３種）について、実施例４に記載した方法に従い、同時に測定した（ｎ＝８）。ＣＶ値は２．５〜３．４％を示した（表４）。
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ｂ）Ｃｏｎ　Ａ処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養上清および細胞抽出画分について、実施例４に記載した方法に従い、同時に測定した（ｎ＝６）。ＣＶ値は６．９％及び９．５％を示した（表５）。
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▲４▼測定間差
ａ）血清に標準抗原を添加して調製した検体（３種）について、実施例４に記載した方法に従って、８回測定した。ＣＶ値は３．１〜５．０％を示した（表６）。
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ｂ）Ｃｏｎ　Ａ処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養上清および細胞抽出画分について、実施例４に記載した方法に従って、６回測定した。ＣＶ値は７．１％および１０．２％を示した（表７）。
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▲５▼特異性試験
ＭＭＰ−１，２，３，７，８，９，１３，１９，２０をそれぞれ１μｇ／ｍＬに調製し、ＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡに供しＡ４５０を測定した結果を表８に示した。ＭＴ１−ＭＭＰを０．１６μｇ／ｍＬでサンドイッチＥＩＡに供した場合、２．２０６の吸光値を示したのに対しこれらのＭＭＰは、０．０２４〜０．０７１程度の吸光値しか示さなかった。従って、ＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡは、ＭＴ１−ＭＭＰと特異的に反応することが確認された。
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本発明のモノクローナル抗体を少なくとも１種含む抗体の組み合わせによってＭＴ１−ＭＭＰを特異的に検出・測定するサンドイッチＥＩＡ系が構成できる。ＥＩＡ系は１ステップ法、２ステップ法のいずれも可能であり、標識抗体はＦａｂ’−ＨＲＰに限定されない。各反応緩衝液の組成や反応条件は測定の目的に応じて、短縮、延長など調整できる。標準品となるＭＴ１−ＭＭＰは、組織培養上清、細胞培養上清または実施例１記載の方法あるいはそれ以外の方法で発現した組換え体から精製することができる。精製にはイオン交換、ゲルろ過、モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーまたそれ以外の各種アフィニティークロマトグラフィーの組み合わせによって達成される。
測定検体は、ヒト血液、血清、血漿、関節液、尿、唾液、脳脊髄液および羊水などヒトに由来する体液成分、各種ヒト組織（各種腫瘍・癌組織を含む）の抽出液、ヒト由来あるいは組換え体など各種培養細胞の細胞抽出液、培養上清などから調製される。
実施例６　ＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡにおける界面活性剤と還元剤の意義
実施例１に記載の方法でΔＭＴ１−ＭＭＰ遺伝子を導入したΔＭＴ１−ＭＭＰ発現ＣＯＳ−７を調製した。このＣＯＳ−７細胞を培養し、４８時間後に培養上清を回収した。培養上清細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングに供し、ΔＭＴ１−ＭＭＰが可溶性分子として存在することを確認した。この培養上清をＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡに供したところ、十分なシグナル（Ａ４５０＝１．８０７）が検出された。一方、同じ培養上清をＳＤＳと２−メルカプトエタノールを除いた希釈用緩衝液（３％　ウマ血清、１％　ＢＳＡ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０））を用いてＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡに供したところ、シグナルはおよそ１／１４（Ａ４５０＝０．１３８、表９の上段の表）に低下した。ＳＤＳと２−メルカプトエタノールは検体中の抗原に作用し、抗原の高次構造をＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡで検出可能な構造変化をもたらしたと考えられる。この構造変換にはＳＤＳと２−メルカプトエタノールの共存が必須であった（表９の下段の表）。
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実施例７　ＭＴ１−ＭＭＰを産生する培養細胞株の検索
ＭＴ１−ＭＭＰを産生するヒト培養細胞株の検索をＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡで行った。細胞株は、バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ，Ｎａｍａｌｗａ，Ｒａｊｉ）、急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−細胞）（ＭＯＬＴ−４）、慢性骨髄性白血病（Ｋ−５６２）、前骨髄性白血病（ＨＬ−６０）、繊維肉腫（ＨＴ−１０８０）、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＳＫ−ＢＲ−３，ＭＣＦ　７）、肺癌（Ａ５４９）、直腸腺癌（ＳＷ　８３７）、骨肉腫（ＭＧ−６３）、舌、扁平細胞癌（ＳＳＣ−２５）、子宮頸部癌（ＨｅＬａ）、頸部表皮癌（ＣａＳｋｉ）、前立腺癌（ＰＣ−３）、悪性黒色腫（Ａ−３７５）を用いた。各種癌細胞株を直径１０ｃｍのプレートでコンフルエントまで培養、無血清培地あるいはＣｏｎ　Ａ含有無血清培地に交換し４８時間後に培養上清および細胞を回収した。細胞は０．５ｍＬの希釈用緩衝液中で超音波破砕し、遠心して得られた上清を細胞抽出画分としてＥＩＡに供した。培養上清はそのままＥＩＡに供した。
測定結果例を表１０に示した。
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ＭＴ１−ＭＭＰは、繊維肉腫（ＨＴ１０８０）、乳癌の一部（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、直腸腺癌（ＳＷ　８３７）、骨肉腫（ＭＧ−６３）、舌、扁平細胞癌（ＳＳＣ−２５）、頚部表皮癌（ＣａＳｋｉ）などで検出された。
実施例８　ＭＴ１−ＭＭＰの発現量を変化させる因子・薬剤などの検索
ＭＴ１−ＭＭＰを発現する培養細胞を任意の生理活性因子や薬剤、化合物を添加して培養した後、培養上清あるいは細胞抽出画分を回収し、ＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡに供する。測定は、無処理の培養細胞から調製したものを対照とし、ＭＴ１−ＭＭＰ産生量の増減を比較して各添加物の効果を評価する。添加物の濃度は、適宜調製する必要がある。添加物としては、遺伝子の発現制御に関わるもの、ＭＴ１−ＭＭＰのアンチセンスＲＮＡ、ＭＴ１−ＭＭＰのｍＲＮＡを配列依存的に切断するリボザイムなどが考えられる。添加物は、培養液中に直接あるいはハプテン化して添加しても良いし、それぞれを発現する遺伝子を細胞内に導入しても良い。ＭＴ１−ＭＭＰの発現を強力に、かつ特異的に抑制するアンチセンスＲＮＡやリボザイムの設計および選択にＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡは有用である。ＭＴ１−ＭＭＰ発現抑制剤は、癌転移抑制に対する医薬として有用である。
実施例９　ＭＴ１−ＭＭＰの活性測定およびＭＴ１−ＭＭＰ活性阻害剤の検索
抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）で２５μｇ／ｍＬに調製し、９６穴マイクロウエルあたり１００μＬずつ加え、４℃、２４時間静置する。次に抗体溶液を除去し、洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０，０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で３回洗浄後、ブロッキング液（１％　ＢＳＡ，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））を９６穴マイクロウエルあたり０．３ｍＬずつ加え、４℃で１６時間以上静置し保存する。０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０，０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）で洗浄後、１％　ＢＳＡ，０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有３０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）で希釈したＭＴ１−ＭＭＰを含む検体を加え、４℃で１６時間静置する。０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０，０．１５Ｍ　ＮａＣｌ含有２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　７．４）で洗浄、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．０５％　Ｂｒｉｊ３５，０．０２％　ＮａＮ３含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で１μＭに調製したＭｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２を１００μＬ加え、３７℃で１時間静置する。反応液を５００μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を分注した試験管に採り、反応を停止する。ＭＴ１−ＭＭＰの蛍光基質分解活性を蛍光強度（ＦＩ，Ｅｘ：３２８ｎｍ，Ｅｍ：３９３ｎｍ）として、島津分光蛍光強度計ＲＦ−５０００で測定する。上記の抗体濃度、蛍光基質の種類と濃度、各種反応液の組成、反応時間、反応温度、反応液量などは必要に応じて適宜変更できる。
▲１▼　ＭＴ１−ＭＭＰの活性測定
上記の方法において、添加する検体として各種癌組織抽出画分を用いると、各種のＭＭＰｓを含有する組織抽出画分からＭＴ１−ＭＭＰを特異的に固相化し、その活性を検出することができる。得られたＭＴ１−ＭＭＰ活性から検体癌組織の浸潤能を想定することができる。また、治療を施した癌組織の浸潤能の変動を想定したり、ＭＴ１−ＭＭＰの産生を抑制し浸潤能を低下あるいは消失させる医薬の選択や薬剤の検索などに有用である。
▲２▼　ＭＴ１−ＭＭＰ活性阻害剤の検索
上記の方法において、添加する検体を一定の活性レベルを有する標準ＭＴ１−ＭＭＰを用い、これに対して各種の酵素活性阻害剤、ＭＭＰｓ阻害剤あるいは任意の化合物を添加すれば、それぞれのＭＴ１−ＭＭＰに対する阻害活性を測定することができる。この方法を用いれば、未知のＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤の検索やＢａｔｉｍａｓｔａｔ、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ、Ｒｏ３２−３５５５、ＡＧ３３４０、Ｂａｙ１２−９５６６、ＣＧＳ２７０２３Ａなど既存のＭＭＰ活性阻害剤が持つＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤能を知ることができる。
標準ＭＴ１−ＭＭＰとしては、実施例１に記載したｐＵＣΔＭＴ１−ＭＭＰ，ｐＴｒｃＨｉｓΔＭＴ１−ＭＭＰを導入した大腸菌から発現される組換えタンパク質、ｐＳＧΔＭＴ１−ＭＭＰを導入したＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，ＣＨＯ細胞から発現される組換えタンパク質を用いることができる。
ｐＵＣΔＭＴ１−ＭＭＰ，ｐＴｒｃＨｉｓΔＭＴ１−ＭＭＰにはＭＴ１−ＭＭＰのプロドメインが含まれており、活性測定用の標準ＭＴ１−ＭＭＰとして用いる場合にはフューリンによってプロドメインを切断、除去し、活性型ＭＴ１−ＭＭＰに変換する必要がある。活性型ＭＴ１−ＭＭＰを直接、大腸菌発現で発現させるため、以下の組換え体を作成した。
ＭＴ１−ＭＭＰのｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー
2002041000.tif 000012
と
2002041000.tif 000013
によって増幅される遺伝子を制限酵素ＢｇｌＩＩとＫｐｎＩで切断、予めＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断したｐＱＥ−３２（Ｑｉａｇｅｎ）と連結し、ｐＱＥ　ＭＴ１ＡＣＴＲ１を作成した。
さらに、ＭＴ１−ＭＭＰのｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー
2002041000.tif 000014
と
2002041000.tif 000015
によって増幅される遺伝子を制限酵素ＢｇｌＩＩとＫｐｎＩで切断、予めＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断したｐＱＥ−３２（Ｑｉａｇｅｎ）と連結し、ｐＱＥ　ＭＴ１ＡＣＴＲ２を作成した。
ｐＱＥ　ＭＴ１ＡＣＴＲ１およびｐＱＥ　ＭＴ１ＡＣＴＲ２でコードされるＭＴ１−ＭＭＰは、それぞれＹ１１２−Ｇ５０７およびＹ１１２−Ｇ５３５であり、いずれもプロドメインを欠き、活性型ＭＴ１−ＭＭＰを発現する。
また、ｐＱＥ　ＭＴ１ＡＣＴＲ１は疎水性の高い膜貫通ドメインの全体、ｐＱＥ　ＭＴ１ＡＣＴＲ２は膜貫通ドメインの一部を欠くため、発現する組換えタンパク質の可溶性が向上し、活性測定用の標準ＭＴ１−ＭＭＰとしてより好ましい性質を有する。
活性型組換えＭＴ１−ＭＭＰは、実施例１の▲３▼項に記載の方法などで精製し、活性測定用標準ＭＴ１−ＭＭＰとして供することができる。
▲３▼　活性型ＭＴ１−ＭＭＰの調製と活性測定
ｐＱＥ　ＭＴ１ＡＣＴＲ１を導入した組換え大腸菌（４００ｍＬ培養）より調製した不溶性封入体を８Ｍ尿素（ｕｒｅａ），０．５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で可溶化し、Ｎｉ＋＋Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルカラムに供した。洗浄後、８Ｍ尿素，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，０．５Ｍイミダゾール含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、得られた精製画分を８Ｍ尿素，０．３Ｍ　ＮａＣｌ含有２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）で平衡化したＰＤ−１０ゲルカラムに供し緩衝液を交換した。これに５０μＭ　ＺｎＳＯ４および１ｍＭ　ＤＴＴを添加した後、Ａ２８０を測定し、８Ｍ尿素，０．３Ｍ　ＮａＣｌ，５０μＭ　ＺｎＳＯ４，１ｍＭ　ＤＴＴ含有２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を用いてＡ２８０が０．１となる様に希釈した。これに２０ｍＭシステアミン（ｃｙｓｔｅａｍｉｎ）を添加し、リフォールディング用サンプル（５０ｍＬ）とした。これを５Ｌの０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２，１００μＭ　ＺｎＳＯ４，５ｍＭ　２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ），１ｍＭ　ヒドロキシエチルジスルフィド（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ），０．０２％　ＮａＮ３含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）で１６時間透析、さらに０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２，５０μＭ　ＺｎＳＯ４，０．０２％　ＮａＮ３含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）で透析し（４時間、３回）、リフォールディングした。透析後のサンプルを遠心し、不溶化したタンパク質を除去、限外濾過で約１ｍＬに濃縮した。これを０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００ゲルカラムに供した。溶出フラクションをＡ２８０でモニターし、タンパク質溶出画分を検出した。溶出タンパク質は２つのピークを示し、前半が２量体以上の重合体、後半がモノマーであった。後半のタンパク質ピークを活性型ＭＴ１−ＭＭＰ精製画分としてプールし、限外濾過で１ｍＬに濃縮した。ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）によるタンパク質濃度は０．１１ｍｇ／ｍＬであった。
得られた活性型ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を検討した。
酵素画分５０μＬに０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．０５％　Ｂｒｉｊ３５，０．０２％　ＮａＮ３含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で１μＭに調製したメタロプロテアーゼ用合成基質Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２を１００μＬ加え、３７℃で１時間静置した。同時に、上記反応系に２０ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したものを調製し、同様に３７℃で１時間静置した。反応液を５００μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を分注した試験管に採り、反応を停止した。ＭＴ１−ＭＭＰの蛍光基質分解活性を蛍光強度（ＦＩ，Ｅｘ：３２８ｎｍ，Ｅｍ：３９３ｎｍ）として島津分光蛍光強度計ＲＦ−５０００で測定した。得られた蛍光強度はそれぞれ１２１．６、６．３を示し、調製した活性型ＭＴ１−ＭＭＰがＥＤＴＡで阻害されるメタロプロテアーゼ活性を有することを確認した。上記の酵素濃度、蛍光基質の種類と濃度、各種反応液の組成、反応時間、反応温度、反応液量などは必要に応じて適宜変更できる。
▲４▼　固相化抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体用いたＭＴ１−ＭＭＰの活性測定
実施例４の▲２▼項に記載した方法に従って、抗体固相化プレートを作成した。使用した各種の抗体濃度は５０μｇ／ｍＬ、ブロッキング液は１％スキムミルク、０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有３０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にそれぞれ変更して用いた。予めブロッキング液を除去、洗浄液（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で３回洗浄した抗体固相化プレートに、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２．０．０５％　Ｂｒｉｊ３５，０．０２％　ＮａＮ３含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で５μＬ／１００μＬに希釈した酵素画分を入れ、４℃で１６時間静置した。反応液を除去し洗浄液で３回洗浄後、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．０５％　Ｂｒｉｊ３５，０．０２％　ＮａＮ３含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で１μＭに調製したメタロプロテアーゼ用合成基質Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２を１００μＬ加え、３７℃で８時間静置した。反応液を５００μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を分注した試験管に採り、反応を停止した。固相化抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体に捕捉され、マイクロウェルに残存したＭＴ１−ＭＭＰに由来する蛍光基質分解活性を蛍光強度（ＦＩ，Ｅｘ：３２８ｎｍ，Ｅｍ：３９３ｎｍ）として島津分光蛍光強度計ＲＦ−５０００で測定した。
固相抗体に本明細書記載の抗体２２２−１Ｄ８，２２２−２Ｄ１２，２２２−３Ｅ１２，２２２−４Ｇ５および２２２−９Ａ３を用い、蛍光基質分解活性を測定した場合、市販のＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインに対するモノクローナル抗体（１１３−５Ｂ７、第一ファインケミカル）を用いた場合の９．２から１７．１倍の蛍光強度を得た（図４）。抗体を添加せず同様に調製したものからは、酵素活性は検出されなかった。これより抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を固相化したマイクロウェルを用いることにより、選択的にＭＴ１−ＭＭＰを捕捉し、その活性レベルを定量的に、検出し得ることが確認された。使用する抗体の種類や濃度、蛍光基質の種類と濃度、各種反応液の組成、反応時間、反応温度、反応液量などは必要に応じて適宜変更できる。
固相化する抗体は、認識領域がヘモペキシンドメインにある抗体、たとえば２２２−１Ｄ８，２２２−２Ｄ１２，２２２−３Ｅ１２，２２２−４Ｇ５および２２２−９Ａ３が好適であるが、これら以外の抗体でも可能である一方、１１３−５Ｂ７のような不適当な抗体も存在する。認識領域が触媒ドメインにあるような抗体は、ＭＴ１−ＭＭＰの活性を阻害する可能性があり、本用途には不適当である場合がある。認識領域がプロペプチドドメインにあるような抗体は、プロペプチドを失った活性型ＭＴ１−ＭＭＰを捕捉できないことから、本用途には不適当である場合がある。
認識領域がヘモペキシンドメインにある抗体を固相化したマイクロウェルには、プロペプチドドメインを有する不活性型ＭＴ１−ＭＭＰ、プロペプチドを失った活性型ＭＴ１−ＭＭＰのいずれもが捕捉される。この状態で活性を測定すれば、検体中の活性型ＭＴ１−ＭＭＰを選択的に測定できるし、フューリンやその他の適切なプロテアーゼ、界面活性剤などで活性化処理した後に測定し、活性化処理前に存在した活性型ＭＴ１−ＭＭＰを差し引くことで検体中の不活性型ＭＴ１−ＭＭＰを選択的に測定できる。
実施例１０　　臨床検体の測定
（１）滑膜抽出画分の測定
滑膜組織を０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．０５％　Ｂｒｉｊ３５含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中でホモジェナイズ、遠心して組織抽出画分を調製した。これらの検体のＭＴ１−ＭＭＰ濃度を実施例４に記載した方法に従って測定した。６３検体を測定した結果、ＭＴ１−ＭＭＰ濃度は１．３ｎｇ／ｍＬ（実用検出限界）以下から１１８．９ｎｇ／ｍＬまで分布し、その平均値は、２３．９ｎｇ／ｍＬであった。
（２）癌組織および癌組織近傍の正常組織抽出画分の測定
癌組織および癌組織近傍の正常組織を０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．０５％　Ｂｒｉｊ３５含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中でホモジェナイズ、遠心して組織抽出画分を調製した。これらの検体のＭＴ１−ＭＭＰ濃度を実施例４に記載した方法に従って測定した。４４検体の癌組織抽出画分の平均値は、１７．２ｎｇ／ｍＬを示した一方、１７検体の正常組織抽出画分の平均値は、１．３ｎｇ／ｍＬ（実用検出限界）以下を示し、ＭＴ１−ＭＭＰの存在が癌組織で多く産生されていることを本発明サンドイッチＥＩＡで確認した。
実施例１１　臨床検体の測定（肺癌組織）
▲１▼　癌組織および癌組織近傍の正常組織抽出画分の測定
およそ５０ｍｇの肺癌組織および癌組織近傍の正常組織を０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．０５％　Ｂｒｉｊ３５含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中でホモジェナイズ、遠心して組織抽出画分を調製した。これらの検体のＭＴ１−ＭＭＰ濃度を実施例４に記載した方法に従って測定した。さらに、各組織抽出画分のタンパク質濃度をＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定し、ＭＴ１−ＭＭＰ濃度をタンパク質濃度で除して検体タンパク質量あたりのＭＴ１−ＭＭＰ量を算出した。
５１組の検体について、平均値と標準偏差を得た。正常組織、癌組織のＭＴ１−ＭＭＰ量は、それぞれ０．４１±０．７６ｎｇ／ｍｇ、２．４３±１．８５ｎｇ／ｍｇを示し、癌組織と正常組織で有意差（ｐ＜０．００１）を確認した（Ｓｔｕｄｅｎｔの有意差検定、図５）。
同様にして、口腔癌および大腸癌についても、正常組織、癌組織のＭＴ１−ＭＭＰ量を測定した。口腔癌組織からは近接する正常組織のおよそ３．６倍、大腸癌組織からは近接する正常組織のおよそ２．４倍のＭＴ１−ＭＭＰが検出された。いずれの癌種においても正常組織、癌組織間でＭＴ１−ＭＭＰ量に有意差が確認された。
▲２▼　転移との相関関係
前項▲１▼で測定した癌組織をリンパ節転移の有無を指標として分類し、転移の有無とＭＴ１−ＭＭＰ量について相関を調べた。リンパ節転移が認められない癌組織のＭＴ１−ＭＭＰ量（平均値±標準偏差）は１．６３±１．７７ｎｇ／ｍｇ、リンパ節転移が認められる癌組織では２．４９±１．７８ｎｇ／ｍｇを示し、両群に有意差（ｐ＜０．０５）を確認した（Ｓｔｕｄｅｎｔの有意差検定、図６）。
図６においてリンパ節転移が認められていないにもかかわらず、高いＭＴ１−ＭＭＰ値を示した特異的な検体が存在する（リンパ節転移・なし、最高値７．４ｎｇ／ｍｇを示したもの）。この症例は、リンパ節転移は認められなかったが静脈に強い浸襲があり、悪性度の高いものであった。この検体を含め、高いＭＴ１−ＭＭＰ値を示した検体のほとんどがリンパ節あるいは脈管浸襲を起こしていることから、臨床的に転移が見られなくてもＭＴ１−ＭＭＰレベルが高値を示した場合には、すでに微小転移を起こしているか将来転移するリスクが高いと推定し得る。
実施例１２　動物細胞株のＭＴ１−ＭＭＰ測定
ＭＴ１−ＭＭＰを産生するマウス、ラットおよびラビット培養細胞株の検索を行った。マウス８株、ラット４株、ラビット１株について実施例７と同様にして、各培養上清を調製した。得られた培養上清を２０倍に濃縮してＥＩＡに供した。検討した動物細胞株のうち、マウスＣ１２７、ラットＦＲ、ラビットＨＩＧ−８２で、高いＭＴ１−ＭＭＰの産生が認められた。濃縮した培養上清を段階希釈し、ＭＴ１−ＭＭＰを産生するヒト細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とその反応性について比較した。いずれの種とも同様な傾きを有する希釈曲線（表１１および図７）を得たことから、ヒトとマウス、ラットおよびラビット細胞株に由来する各ＭＴ１−ＭＭＰが、同等な免疫反応性を有することが示された。
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これより本ＥＩＡ系は、ヒトの他に、マウス、ラットおよびラビット各種動物由来のＭＴ１−ＭＭＰも測定できることが確認された。本ＥＩＡ系によって認識されるＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシンドメインのアミノ酸配列をヒト〔配列番号：４〕と、マウス〔配列番号：５〕、ラット〔配列番号：６〕およびラビット〔配列番号：７〕で比較した（図９）。１８９アミノ酸残基のうちヒト／マウス間では１残基、ヒト／ラット間では１残基、ヒト／ラビット間では３残基のミスマッチが認められたのみで、ヘモペキシンドメインは、種間で良く保存されていることが確認された。
実施例１３　界面活性剤および還元剤存在下における抗体の免疫反応性の変動
界面活性剤および還元剤存在下における抗体の反応性をウエスタンブロッティングで検討した。本明細書記載のＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡの標準抗原を５００ｎｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に転写した。１％　ＢＳＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でブロッキングした後、本明細書記載のＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡの希釈用緩衝液およびＳＤＳと２−メルカプトエタノール不含の希釈用緩衝液を用いて１０μｇ／ｍＬとなるように調製した抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体溶液（２２２−１Ｄ８、２２２−２Ｄ１２、２２２−３Ｅ１２、２２２−４Ｇ５および２２２−９Ａ３）に浸漬し、１６時間インキュベートした。洗浄後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを反応させ染色した。
本明細書記載のＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡの固相抗体として用いた抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体２２２−２Ｄ１２は、ＳＤＳと２−メルカプトエタノールの含有・不含有にかかわらずＭＴ１−ＭＭＰとの反応性を維持していた（図８）。一方、２２２−９Ａ３は、ＳＤＳと２−メルカプトエタノール不含有では２２２−２Ｄ１２同等の反応性を示したにもかかわらず、含有下ではほとんど反応性を失った（図８）。２２２−１Ｄ８やその他の抗体もＭＴ１−ＭＭＰとの反応性を著しく低下させたり、膜全体が着色するなど特異性を失う傾向が認められた。ＳＤＳと２−メルカプトエタノールのような界面活性剤、還元剤を含有する希釈用緩衝液中で免疫学的反応を進行させるためには、固相抗体として用いた２２２−２Ｄ１２のような安定した反応性を有する抗体の選択が必要である。
ヒトＩｇＧのＨ鎖およびＬ鎖は鎖内にそれぞれ４ヶ所、２ヶ所のＳ−Ｓ結合を有し、１ヶ所のＳ−Ｓ結合で互いに結合している。ＩｇＧ１では、この二量体がＨ鎖間の２ヶ所のＳ−Ｓ結合で結合し４本鎖構造を安定化している。ＩｇＧ３にはＨ鎖間のＳ−Ｓ結合が１５ヶ所ある。抗体に還元剤を充分に作用させた場合、鎖内・鎖間のＳ−Ｓ結合が切れ、抗体の高次構造とともに免疫反応性が失われる。Ｓ−Ｓ結合の多いＩｇＧ３は、ＩｇＧ１に比べ還元剤による変性効果が大きく免疫反応性の低下が著しいものと予想される。ＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡ希釈用緩衝液中でＭＴ１−ＭＭＰに対する反応性を失った２２２−９Ａ３は、ＩｇＧ３である。ＩｇＧ１においても還元剤によるＳ−Ｓ結合の切断は著しい免疫反応性の低下をまねくが、Ｈ鎖とＬ鎖は、非共有結合による相互作用でも高次構造を保持しているため、還元剤存在下で免疫反応性を維持するクローンも存在し得る。
実施例１４　　可溶型ＭＴ−ＭＭＰの作製とその利用
ＭＴ２−ＭＭＰ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．０５４７３２；マウス）の触媒ドメイン、ヒンジドメインおよびヘモペキシンドメイン（Ｙ１２８−Ｃ５５５）を増幅するためのＰＣＲプライマーを作製した。５’側プライマーにはＳｍａＩサイト、３’側プライマーには終止コドンとＢｇｌＩＩサイトを付加した。ＳｍａＩサイトはｐＵＣ１８のβ−ガラクトシダーゼにインフレームで連結できるように設計した。ＭＴ２−ＭＭＰの全長を含む遺伝子をクローン化したｐＳＧＭＴ２−ＭＭＰを鋳型とし、９３℃３０秒、４５℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクルのＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の両末端をＳｍａＩとＢｇｌＩＩで切断し、予めＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１８に挿入した。この発現ベクターによりβ−ガラクトシダーゼの１１アミノ酸残基と、シグナルペプチド、プロペプチド領域、膜貫通領域および細胞内ドメインを欠損したΔＭＴ２−ＭＭＰ（Ｙ１２８−Ｃ５５５）の４２８アミノ酸残基、計４３９アミノ酸残基からなる分子量約４８ｋＤａの融合タンパク質を発現した。
ＭＴ３−ＭＭＰ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｐ５１５１２）の触媒ドメイン、ヒンジドメインおよびヘモペキシンドメイン（Ｙ１２０−Ｃ５３２）を増幅するためのＰＣＲプライマーを作製した。５’側プライマーにはＳｍａＩサイト、３’側プライマーには終止コドンとＢｇｌＩＩサイトを付加した。ＳｍａＩサイトはｐＵＣ１８のβ−ガラクトシダーゼにインフレームで連結できるように設計した。ＭＴ３−ＭＭＰの全長を含む遺伝子をクローン化したｐＳＧＭＴ３−ＭＭＰを鋳型とし、９３℃　３０秒、４５℃　３０秒、７２℃　６０秒で３０サイクルのＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の両末端をＳｍａＩとＢｇｌＩＩで切断し、予めＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１８に挿入した。この発現ベクターによりβ−ガラクトシダーゼの１１アミノ酸残基と、シグナルペプチド、プロペプチド領域、膜貫通領域および細胞内ドメインを欠損したΔＭＴ３−ＭＭＰ（Ｙ１２０−Ｃ５３２）の４１３アミノ酸残基、計４３９アミノ酸残基からなる分子量約４７ｋＤａの融合タンパク質を発現した。
ＭＴ４−ＭＭＰ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｑ９ＵＬＺ９）の触媒ドメイン、ヒンジドメインおよびヘモペキシンドメイン（Ｑ１２９−Ｃ５２５）を増幅するためのＰＣＲプライマーが設計できる。５’側プライマーにはＳｍａＩサイト、３’側プライマーには終止コドンとＢｇｌＩＩサイトを付加する。ＳｍａＩサイトはｐＵＣ１８のβ−ガラクトシダーゼにインフレームで連結できるように設計する。ＭＴ４−ＭＭＰの全長を含む遺伝子をクローン化したベクターあるいは乳癌ｃＤＮＡライブラリーなどを鋳型とし、９３℃　３０秒、４５℃　３０秒、７２℃　６０秒で３０サイクルのＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物の両末端をＳｍａＩとＢｇｌＩＩで切断し、予めＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１８に挿入する。この発現ベクターによりβ−ガラクトシダーゼの１１アミノ酸残基と、シグナルペプチド、プロペプチド領域、膜貫通領域および細胞内ドメインを欠損したΔＭＴ４−ＭＭＰ（Ｑ１２９−Ｃ５２５）の３９７アミノ酸残基、計４０８アミノ酸残基からなる分子量約４５ｋＤａの融合タンパク質を発現する。
ＭＴ５−ＭＭＰ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｑ９Ｙ５Ｒ２）の触媒ドメイン、ヒンジドメインおよびヘモペキシンドメイン（Ｙ１５６−Ｃ５６９）を増幅するためのＰＣＲプライマーを作製した。５’側プライマーにはＳｍａＩサイト、３’側プライマーには終止コドンとＢｇｌＩＩサイトを付加した。ＳｍａＩサイトはｐＵＣ１８のβ−ガラクトシダーゼにインフレームで連結できるように設計した。脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、９３℃　３０秒、４５℃　３０秒、７２℃　６０秒で３０サイクルのＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物の両末端をＳｍａＩとＢｇｌＩＩで切断し、予めＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１８に挿入する。この発現ベクターによりβ−ガラクトシダーゼの１１アミノ酸残基と、シグナルペプチド、プロペプチド領域、膜貫通領域および細胞内ドメインを欠損したΔＭＴ５−ＭＭＰ（Ｙ１５６−Ｃ５６９）の４１４アミノ酸残基、計４２５アミノ酸残基からなる分子量約４７ｋＤａの融合タンパク質を発現する。
ＭＴ６−ＭＭＰ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｑ９ＮＰＡ２）の触媒ドメイン、ヒンジドメインおよびヘモペキシンドメイン（Ｙ１０８−Ｃ５０８）を増幅するためのＰＣＲプライマーが設計できる。５’側プライマーにはＳｍａＩサイト、３’側プライマーには終止コドンとＢｇｌＩＩサイトを付加する。ＳｍａＩサイトはｐＵＣ１８のβ−ガラクトシダーゼにインフレームで連結できるように設計する。ＭＴ６−ＭＭＰの全長を含む遺伝子をクローン化したベクターあるいは白血球、肺、脾臓ｃＤＮＡライブラリーなどを鋳型とし、９３℃　３０秒、４５℃　３０秒、７２℃　６０秒で３０サイクルのＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物の両末端をＳｍａＩとＢｇｌＩＩで切断し、予めＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１８に挿入する。この発現ベクターによりβ−ガラクトシダーゼの１１アミノ酸残基と、シグナルペプチド、プロペプチド領域、膜貫通領域および細胞内ドメインを欠損したΔＭＴ６−ＭＭＰ（Ｙ１０８−Ｃ５０８）の４０１アミノ酸残基、計４１２アミノ酸残基からなる分子量約４５ｋＤａの融合タンパク質を発現する。
触媒ドメイン、ヒンジドメインおよびヘモペキシンドメインからなる組換えタンパク質ΔＭＴ２−ＭＭＰ、ΔＭＴ３−ＭＭＰ、ΔＭＴ４−ＭＭＰ、ΔＭＴ５−ＭＭＰおよびΔＭＴ６−ＭＭＰは、実施例１記載の方法と同様にしてｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙとして回収、８Ｍ　ｕｒｅａ，０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で可溶化し、ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび電気溶出で精製、分取することができる。あるいは穏やかなリフォールディングを行いＭＭＰ活性を有するＭＴ−ＭＭＰを作成することができる。
得られた組換えタンパク質を免疫原として使用することにより、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を作製することができる。たとえば得られたモノクローナル抗体とそれぞれの組換えタンパク質（標準抗原）の組み合わせによってＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰおよびＭＴ６−ＭＭＰを特異的に測定できるサンドイッチＥＩＡ系が得られる。膜結合型のＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰおよびＭＴ６−ＭＭＰを測定するＥＩＡの固相には界面活性剤および還元剤に耐性を示す抗体を選択することが望ましい。なお、測定対象の膜結合型ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰおよびＭＴ６−ＭＭＰは、界面活性剤および還元剤を含有する緩衝液中で抽出することができる。
また、得られたモノクローナル抗体を介してＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰおよびＭＴ６−ＭＭＰを固相化し、それぞれのＭＭＰ活性を測定することができる。
ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰおよびＭＴ６−ＭＭＰのサンドイッチＥＩＡや活性測定系は、癌の悪性度の評価、癌種の特定、臓器特異的な癌の検出、リウマチ性関節炎やアルツハイマーの進行度の推定など種々の臨床分野に応用できる外、ＭＴ−ＭＭＰ活性阻害剤などの医薬、その開発研究手段として利用できる。
産業上の利用可能性
本発明により、簡単な操作および試薬を用い、感度並びに精度良く、迅速にＭＴ１−ＭＭＰを定量することができる。特に、本発明では、被検試料中の可溶型ＭＴ１−ＭＭＰを定量できる。さらに、ＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進または阻害する化合物や因子、ＭＴ１−ＭＭＰの酵素活性を促進または阻害する化合物や因子を効率よくスクリーニングすることが可能である。また、本発明で、細胞膜からＭＴ−ＭＭＰｓを遊離及び／又は可溶化せしめ、該ＭＴ−ＭＭＰｓを定量できる。本発明では、これら測定に有用な試薬、試薬セット、スクリーニングキット、そして癌または癌転移検査薬、リウマチ性関節炎やアルツハイマーの進行度検査薬、さらにはＭＴ１−ＭＭＰ活性阻害剤などの医薬、その開発研究手段などが提供される。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。本件は特願２０００−３５２４９１号（出願日：平成１２年１１月２０日）を優先権主張の基礎とする出願であって、当該出願に添付の明細書の内容はそれを参照することにより本明細書に含めて解釈されるべきものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のＭＴ１−ＭＭＰに対するモノクローナル抗体を使用し、実施例１−▲３▼で調製したΔＭＴ１−ＭＭＰ（５８ｋＤａ）およびヘモペキシンドメイン（３０ｋＤａ，３４ｋＤａ）、触媒ドメイン（２１ｋＤａ）の断片を抗原としたエピトープマッピングの結果を模式的に示す。
図２は、本発明のＭＴ１−ＭＭＰに対するモノクローナル抗体を使用し、実施例１−▲２▼で調製したＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ（マウス）及びＭＴ３−ＭＭＰのそれぞれを発現するＣＯＳ−７の細胞破砕物を抗原としたウエスタンブロッティングによる交叉反応性試験の結果を模式的に示す。
図３は、ＭＴ１−ＭＭＰサンドイッチＥＩＡにより得られた標準曲線の例を示す。
図４は、各種固相化抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を用いたＭＴ１−ＭＭＰの活性測定の結果を示す。
図５は、癌組織及びその近傍正常組織につき、それらから調製された抽出液中のＭＴ１−ＭＭＰ量を測定した結果を各試料毎に示したものである。
図６は、癌組織から調製された抽出液中のＭＴ１−ＭＭＰ量と当該癌組織のリンパ節転移の有無を指標として分類されたものとの間の相関を示すものである。
図７は、ヒト、マウス、ラット及びラビット培養細胞株より調製された培養上清について、その中のＭＴ１−ＭＭＰ量を測定し、その結果得られた希釈曲線を示す。
図８は、界面活性剤及び還元剤存在下及び非存在下における抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体のＭＴ１−ＭＭＰに対する免疫反応性を試験した結果を示している。ＭＴ１−ＭＭＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた後、膜に転写後各抗体と反応せしめられた。
図９は、ヒト、マウス、ラット及びラビット由来ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシンドメインのアミノ酸配列をそれぞれ比較して示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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