(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列で示される新規ペプチド：
ＳｅｒＨｉｓＧｌｎＡｓｐＣｙｓＴｙｒＧｌｕＡｌａＬｅｕΗｉｓＬｙｓＣｙｓＭｅｔＡｌａＳｅｒ。
【請求項２】
海洋生物タツナミガイ（Dolabella auricularia）またはそ の類縁生物から抽出することにより得られる請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の新規ぺブチドを有効成分として含有する薬剤。
【請求項４】
海洋生物タツナミガイ（Dolabella auricularia）またはそ の類縁生物からの抽出物を有効成分とする請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
抗真菌剤である請求項３または４に記載の薬剤。
【請求項６】
抗バクテリア剤である請求項３または４に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、軟体動物後鰓類に属する海洋生物であるタツナミガイ（Dolabella auricularia）より抽出される抽出液、ならびにそれより分離、精製された新規 なペプチドに関する。
更に詳しくは、酸や熱、またはクロロホルムなどの有機溶媒に対して化学的に安定であり、強い抗真菌活性及び抗バクテリア活性を有する新規なペプチド、ならびにそのペプチドを有効成分とする薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
真菌の感染によって起こる真菌症は、皮膚真菌による浅在性真菌症（superficial mycosis)と、酵母または二相性真菌などによる深在性（内蔵性）真菌症（deep-seated mycosis）に大別され、免疫低下や免疫不全などにより全身性の真菌 症（systemic mycosis）を引き起こす。このような場合、敗血症、脳・肝・肺の腫瘍、膀胱炎、腟炎等の日和見感染を起こすことが知られているが、真菌由来の感染に対する有効な治療薬は未だ報告されていない。
また、近年、抗生物質、ステロイド剤、免疫抑制剤、抗癌剤などの使用による深在性真菌症が問題となっている。従来、真菌を阻害する医薬品としては、例えば抗生物質としてアムホテリシンＢ、グリセオフルビン、トリコマイシン、シッカニン等が、また合成医薬品としてはミコナゾール、エコナゾール、フルシトシン等が検討されている。しかし、これらの医薬品による治療法では必ずしも満足すべき効果が得られていないのが実状である。
【０００３】
近年、多様な微生物による汚染が問題になっており、例えば、大腸菌Ｏ−１５７に代表される有害菌により、死亡者を伴う集団食中毒が発生している。このような微生物による汚染は、生活環境の変化に関連していると考えられるが、今後もこのような問題が増えることが危惧されている。特に発生原因が不明な場合、一般社会に与える影響（不安感）は大きく、人々の関心が高まっているが、これらの微生物汚染に対する、汚染除去や治療、予防等に対する有用な手段は殆どないのが現状である。
【０００４】
一方、従来天然成分に関する抗真菌剤等の有効成分の検索対象は、植物や土壌微生物等が主体であったが、1980年代より海洋生物、例えばカイメン、ホヤ、アメフラシ、軟体サンゴなどの成分研究が進められ、陸上の植物ならびに微生物に由来するものとは全く異なるユニークな化合物が次々と見つかり始めた。さらに、それらの化合物には様々な生理活性が認められ、それらの中から医薬品のシーズ化合物や生理活性解明のためのケミカルツールが多数知られるようになっている。さらには、それらの中から抗癌剤、抗菌物質、抗エイズ薬として期待される化合物が見つかりつつある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、今後増えると予想される微生物汚染による疾病を治療または予防するのに有効な新たな成分を天然物、特に海洋生物から抽出し、その有効成分の本体の化学構造を解明することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的に鑑み、サッカロマイセス属（Saccharomyces sp.） ならびにカンジダ属（Candida sp.）などの真菌類に対して高い抗真菌活性を有 する物質を探索すべく海洋生物について鋭意研究を重ねた結果、タツナミガイ（Dolabella auricularia）抽出液に抗真菌活性を見出した。
更には、タツナミガイ抽出液を遠心分離、沈殿法、クロマトグラフィー、限外ろ過等により分画した画分が極めて優れた抗真菌活性を有することを見出し、さらにこの画分が、１５アミノ酸からなる化学的安定性の高い新規ペプチドであることを確認した。
また、そのペプチドは極めて優れた抗バクテリア作用を有してることも確認した。
【０００７】
以上の知見に基いて、本発明は、真菌による疾病、特に望ましくはカンジダ属（Candida sp.）による真菌症の治療薬として、また抗バクテリア剤として有用 な新規なペプチド、ならびにそのペプチドを有効成分とする医薬を提供する。
本発明によれば、真菌によって引き起こされる疾病の治療あるいは予防が可能であり、また大腸菌、グラム陰性桿菌、グラム陽性嫌気桿菌、ブドウ球菌、緑膿菌、サルモネラ等による食品汚染に対し殺菌、除菌により、その汚染を防ぐことが可能である。さらには、これらの菌類によって引き起こされる疾病、例えば、赤痢、腸チフス、コレラ、炭痘、ブルセラ症、結核などに対する治療薬としても用いることができる。
【０００８】
【発明の構成】
本発明は、
１）以下に記す配列１のアミノ酸配列で示されるペプチド：
ＳｅｒＨｉｓＧｌｎＡｓｐＣｙｓＴｙｒＧｌｕＡｌａＬｅｕΗｉｓＬｙｓＣｙｓＭｅｔＡｌａＳｅｒ、
２）海洋生物タツナミガイ（Dolabella auricularia）及び類縁生物から抽出す ることにより得られる前記１に記載のペプチド、
３）前記１に記載の新規ぺブチドを有効成分として含有する薬剤、
４）海洋生物タツナミガイ（Dolabella auricularia）及び類縁生物からの抽出 液を有効成分とする前記３に記載の薬剤、
５）抗真菌剤である前記３または４に記載の薬剤、
６）抗バクテリア剤である前記３または４に記載の薬剤、に関する。
【０００９】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明による新規ペプチドは、タツナミガイ（Dolabella auricularia）から 後述の方法により抽出単離され、その構造が確認されたものであるが、タツナミガイ（Dolabella auricularia）から抽出単離されたものに限定されず、化学合 成により製造されるもの、さらには他の天然物あるいは微生物生産等の手段によりそのペプチドを含有する系から抽出単離されるものをも含む。
【００１０】
本発明のペプチドの調製法の１例について説明する。
すなわち、まずタツナミガイ（Dolabella auricularia）の皮膚ならびに体壁 に緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）を加え、ホモジェネートしたのち、遠心分離後、沈殿を得る。抽出に用いられる溶媒は、ＰＢＳのほか、水、さらにはＰＢＳ以外の等張液などを用いてもかまわない。
得られた沈殿をアセトニトリル−トリフルオロ酢酸−水系で抽出後、遠心分離した後、上清から脂肪を除いたのち、逆相ΗＰＬＣ、イオン交換ΗＰＬＣに引き続き、限外ろ過により分画したのち、逆相ΗＰＬＣで再び精製し、本発明のペプチド化合物得ることができる。用いられる逆相ＨＰＬＣの担体は通常Ｃ１８鎖が結合したものが用いられるが、Ｃ８、Ｃ４、Ｃ１、フェニル等が結合したものを用いてもさしつかえない。
かくして得られた活性画分は、アミノ酸シークエンス解析の結果、下記式：
ＳｅｒＨｉｓＧｌｎＡｓｐＣｙｓＴｙｒＧｌｕＡｌａＬｅｕΗｉｓＬｙｓＣｙｓＭｅｔＡｌａＳｅｒ
に示される１５アミノ酸からなるペプチドであり、このペプチドは先行技術をペプチド・タンパク質配列データベースである「SWISS-PROT, EMBL」により検索の結果、新規なものであることが確認された、このペプチドを、本発明者はドラベラニンＢ２（Dolabellanin B2 ，以下ＤＡΒ２と略記する。）と命名した。
【００１１】
ＤＡΒ２の物理化学的性状は以下の通りである。
▲１▼元素分析
▲２▼分子量：1.72ＫＤａ
▲３▼紫外線吸収スペクトル
▲４▼赤外線吸収スペクトル
▲５▼溶剤に対する溶解度：アセトニトリル及び水に良く溶解する。
▲６▼安定性
熱安定性：１００℃で１０分間加熱しても安定である。
溶剤安定性：クロロホルムを加え５分間室温で放置しても安定である。
酸に対する安定性：トリフルオロ酢酸溶液（ｐＨ３以下）に溶解した状態で長期間の保存可能。
▲７▼阻害、活性化及び安定化
【００１２】
▲８▼抗菌活性
下記の実施例に示す通り、ＤＡＢ２は、真菌であるサッカロマイセス属（Saccharomyces sp.）ならびにカンジダ属（Candida sp.）に対して、また、グラム陰性細菌であるエシェリヒア属（Echerichia sp.）に対する抗菌試験において極めて優れた結果を示した。
【００１３】
従って、本発明により、海洋生物タツナミガイ（Dolabella auricularia）の 抽出物ならびにそれを分画することにより得られる、抗真菌活性及びに抗バクテリア活性を示すぺプチドは、真菌、バクテリアによって引き起こされる疾病に対する医薬品として利用できる。さらには、病原微生物の殺菌、除去を目的とした食品添加物、化粧品、医薬部外品等としても利用可能である。
【００１４】
医薬品への適用：
真菌によって引き起こされる疾病の治療あるいは予防の目的で、または大腸菌、グラム陰性桿菌、グラム陽性嫌気桿菌、ブドウ球菌、緑膿菌、サルモネラ等によって引き起こされる疾病、例えば、赤痢、腸チフス、コレラ、炭痘、ブルセラ症などの治療あるいは予防の目的で、本発明のペプチドは通常、全身的又は局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与され、また成人一人当り、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。
本発明化合物を投与するには、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
【００１５】
固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等がある。
液体組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、さらに一般に用いられる不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール等）を含んでもよい。さらに、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
注射剤は、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を含む。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、本発明のペプチドが不活性な希釈剤と混合される。注射剤は、さらに通常使用される防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤のような補助剤を含んでいてもよい。これらはバクテリア保留フィルターを通すろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化されて使用される。
非経口投与用の組成物には、本発明のペプチドを含み、常法により処方される外用液剤、軟膏、塗布剤、直腸内投与のための坐剤及びペッサリー等がある。
【００１６】
急性毒性：
本発明ペプチド化合物の毒性は、非常に低いものであり、医薬として使用するためには十分安全であると判断できる。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明する。
【００１８】
実施例
三浦半島沖の太平洋で採取したタツナミガイ（Dolabella auricularia）の皮 膚ならびに体表２００ｇ（wet weight）を等量のＰＢＳを加え、ホモジェナイズした。これを2000×ｇで２０分間遠心分離したのち、上清を取り除いた。得られた沈殿１８０ｇに等量のアセトニトリル−トリフルオロ酢酸−水（６０：１：３９）を加えホモジェナイズしたのち再び2000×ｇで２０分間遠心分離した。この上清をクロロホルムを用いて脱脂したのち凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸 を含む水に再溶解し、逆相ΗＰＬＣ（ゲル：Ｃ１８）で分取し４３分に溶出するフラクション５０ｍｇを得た。さらにこのフラクションをイオン交換ΗＰＬＣ（resource S）で分画し、６分付近に溶出するフラクシヨン１０ｍｇを分取した。この画分を分画分子量約10000の限外ろ過膜により分画し、膜通過部分をさらに 逆相ΗＰＬＣ（ゲル：Ｃ１８）により分画し、４３分付近に溶出する画分を２ｍｇ得た。得られた化合物はアミノ酸シークエンス解析の結果、１５アミノ酸からなるペプチド（ＤＡＢ２）であった。
【００１９】
その全配列は、
ＳｅｒＨｉｓＧｌｎＡｓｐＣｙｓＴｙｒＧｌｕＡｌａＬｅｕΗｉｓＬｙｓＣｙｓＭｅｔＡｌａＳｅｒ
である。
【００２０】
ＤＡΒ２の物理化学的性状を補充する場合は以下にその測定方法（手段）と共にその結果を記載して下さい。
（元素分析、分子量、紫外線吸収スペクトル、赤外線吸収スペクトル、溶剤に対する溶解度、阻害、活性化及び安定化等）
【００２１】
抗菌活性
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）A581A ならびにカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ΑTCC 36232を用いて、ＤＡＢ２の抗真菌活性を測定した。すなわち、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）A581Aならびにカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ATCC 36232をΡＹＤ  broth培地で前培養し、１×１０8cell／ｍｌとしこれをΡ ＹＤ  broth 培地で希釈して２×１０5cell／ｍｌに調製した。この１０μｌに ０〜１００μｇ／ｍｌに調製したＤＡＢ２（１０μｌ）を加え、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）A581Aについては３０℃で０及び １２０分振盪し、また、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ΑTCC 36232については、３７℃で０及び１２０分振盪培養したのち、それぞれ９８０μｌの氷冷水で培養を停止したのち、この５０μｌをＰＹＤ−ampicillin agar培地 で２日間培養し、得られたコロニー数を測定した。その結果を図１及び図２に示す。図中の縦軸はコロニー形成単位（ＣＦＵ）である。図中には、０分振盪培養のコロニー数（initial number）（図中の黒四角）のほか、ＤＡＢ２を入れずに菌体のみを培養した場合のコロニー数（図中の●のうち縦軸上のもの）をも示し、ＤＡＢ２処理による菌体数の相対的な減少が分かるようにしている。図１はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）A581Aに対するＤＡＢ２ の抗真菌活性を示し、図２はカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ATCC 36232に対するＤＡＢ２の抗真菌活性を示す。
【００２２】
これらの抗真菌活性測定の結果、本発明によるペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）A581Aに対しては、１００μｇ／ｍ ｌ以上の濃度でコロニーが現われなくなり、殺菌作用を示すことが認められた。一方、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ΑTCC 36232に対しては、２５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度でコロニー数が一定となり培養前の菌体数にほぼ等しいことから、静菌的な効果を示すことが分かる。
【００２３】
また、ＤＡＢ２の濃度３０μｇ／ｍｌ（２時間インキュベート後にコロニー数をコントロールの半分に減少させるＤＡΒ２の量）を１Ｕとして、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）A581Aに対する抗真菌活性を、 培養時間の継時変化で測定した結果を図３に示す。図３は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）A581Aに対するＤＡＢ２無処理（図中 の●）とＤＡＢ２（１０Ｕ）処理による菌体数（図中の黒四角）の継時変化をそれぞれ示した。図３から明らかなごとく、ＤＡＢ２（１０Ｕ）処理で培養１５分後にコロニーの減少が確認され、３０分後ではコロニーがほぼ認められなくなった。このことから、上記濃度のＤＡＢ２により、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）A581Aは約３０分で死滅することが明らかとなった。
【００２４】
抗バクテリア活性
抗バクテリア活性の測定は、エシェリヒア・コリ（Escerichia coli）JΜ109を用いて行った。
エシェリヒア・コリ（Escerichia coli）JΜ109 は、ＬＢ  broth培地を用いて３７℃で１日間培養した後、antibiotic medium ３培地で２時間培養した。これを、antibiotic medium ３培地で波長６５０ｎｍにおける吸収が0.005になるよ うに希釈し、ＤＡＢ２を０〜１００μｇ／ｍｌ加え、３７℃で８時間培養したのち、６５０ｎｍの吸収を測定した。その結果を図４に示す。図４は、エシェリヒア・コリ（Escerichia coli）JΜ109に対する、ＤＡＢ２（０〜１００μｇ／ｍｌ）処理による抗バクテリア活性を示す。図中の縦軸は、６５０ｎｍにおける吸収（図中の横軸「０時間」のデータ）を示す。また、図中にはコントロールとして３７℃で８時間培養する前の培地の吸収も示す。
図４から明らかなごとく、ＤＡＢ２を入れずに培養した場合に比較して、ＤＡＢ２（１０μｇ／ｍｌ）以上の濃度でエシェリシア・コリ（Escerichia coli）JΜ109の増殖を抑制していることが認められた。
【００２５】
熱安定性ならびにクロロホルムに対する安定性
ＤＡＢ２の熱安定性について調べた。すなわち、ＤＡＢ２を１００℃で１０分間加熱処理した後、抗真菌活性を指標として熱安定性を検討した。その結果を図５に示す。図５は、熱処理した場合（図中の黒四角）と熱処理しない場合（図中の●）のＤＡＢ２各濃度における、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）A581Aに対する抗真菌活性を示す。
【００２６】
図５より、加熱処理したＤＡＢ２を用いた抗真菌活性は、熱処理しない場合に比較してほぼ同様の用量依存性を示すことから、ＤＡＢ２は加熱処理に対して安定であることが分かる。
【００２７】
また、クロロホルム処理についてもその安定性を検討した。すなわち、ＤＡＢ２にクロロホルムを加え、撹拌し、５分間室温に放置したのちに乾燥した。この乾燥物について、抗真菌活性を調べた結果を図６に示す。
【００２８】
図６より、クロロホルム処理したＤＡＢ２を用いた抗真菌活性（図中の黒四角）は、クロロホルム処理しないＤＡＢ２を用いた抗真菌活性（図中の●）に比較してほぼ同様の用量依存性を示すことから、ＤＡＢ２はクロロホルム処理に対しても安定なペプチドであることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に対するＤＡＢ２の抗真菌活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２】  カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対するＤＡＢ２の抗真菌活性を測定した結果を示すグラフである。
【図３】  サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に対するＤＡＢ２の殺菌作用と培養時間との関係を示すグラフである。
【図４】  エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）対するＤＡΒ２の抗バクテリア活性を示すグラフである。
【図５】  サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に対する、熱処理したＤＡＢ２及び熱処理しないＤＡＢ２の抗真菌活性を測定した結果を示すグラフである。
【図６】  サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に対するクロロホルム処理したＤＡＢ２及びクロロホルム処理しないＤＡＢ２の抗真菌活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
0003777010.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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