(57)【要約】ディファレンシャルディスプレイ法により、アトピー性皮膚炎患者の好酸球において発現に差の見られる遺伝子を探索した。その結果、軽症の患者の好酸球において、有意に発現が上昇している遺伝子としてインターセクチン２が同定された。本発明者らは、この遺伝子をアレルギー性疾患の検査、および治療薬候補化合物のスクリーニングに使用できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法
ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）健常者の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程
【請求項２】
アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項５】
生体試料が末梢血好酸球細胞を含む試料である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
インターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
【請求項７】
インターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬
【請求項８】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項９】
細胞が好酸球細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項１１】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項１２】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項１３】
請求項８、請求項１０、請求項１１、および請求項１２のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
【請求項１４】
指標遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
【請求項１５】
指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
【請求項１６】
指標遺伝子の好酸球細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である使用。
【請求項１７】
指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子であるキット。
【請求項１８】
指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子であるキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アレルギー性疾患の検査方法に関する。
背景技術
アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難である。
またアレルギー性疾患には、変異や欠陥を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
近年の遺伝子発現の解析技術の発達により、多くの臨床試料で、遺伝子の発現を解析・比較することが可能となった。このような方法としては、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）法が有用である。ディファレンシャルディスプレイ法は、ライアンおよびパディー（Ｌｉａｎｇ　ａｎｄ　Ｐａｒｄｅｅ）によって１９９２年に最初に開発された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５７：９６７−９７１）。この方法を用いることによって、１回に数十種類以上のサンプルをスクリーニングすることができ、それらのサンプル中で発現が変化した遺伝子を検出することが可能である。このような方法を用いて、変異が生じた遺伝子や、時間や環境とともに発現が変わるような遺伝子を調べることによって、病因遺伝子の解明のために重要な情報がもたらされることが期待される。これらの遺伝子には、環境要因によって発現に影響を受けるような遺伝子も含まれる。
さて、現在アレルギー疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ　ｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。ブリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であると言うことができる。
この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
好酸球数とＥＣＰ値は、Ｉ型アレルギーに引き続いて起きる遅延型反応や、アレルギー性炎症反応に関連する診断項目である。好酸球の数は、アレルギー症状の進展を反映するとされている。また、好酸球の顆粒に含まれる蛋白質であるＥＣＰ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）も、喘息患者の発作に伴って強く活性化される。これらの診断項目は、確かにアレルギー症状を反映するものではある。しかし現実には、好酸球の増多はアレルギー症状の進行にともなって顕著に表れてくるのが一般的な所見である。したがって好酸球の明らかな増多が見られる時期には、顕著なアレルギー症状を伴っているケースが多い。そのため、初期のアレルギー性疾患の指標として好酸球数を用いることはできない。
したがって、患者に対する危険が少なく、しかも早期の診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このようなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与していると考えられるので、診断のみならず、アレルギー症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能性がある。
発明の開示
本発明は、特に初期アレルギー性疾患の指標とすることができる新たな遺伝子の提供を課題とする。さらに、本発明は該指標に基づく、初期アレルギー性疾患の検査方法およびアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
初期アレルギー性疾患に関与する遺伝子は、アレルギー症状の、より上流にあって、他の遺伝子の発現を誘導していく役割を果たしていると考えられる。本発明者らは、このような遺伝子を特定することができれば、その発現状態を調べることによって初期アレルギー性疾患の診断が可能となると考えた。
また本発明者らは、このような遺伝子が、アレルギー性疾患の治療においても、重要な標的となりうると考えた。初期アレルギー性疾患に有効な薬剤は、アレルギーの初期の段階のみならず、重症化した後においても、病態の本質的な原因に対して有効な治療薬となる可能性がある。このような治療薬には、単なる対症療法ではなく、アレルギーの根治につながる薬理作用を期待できる。
まず本発明者らは、健常者とアトピー性皮膚炎の患者から得られた末梢血好酸球において発現に差の見られる遺伝子を単離した。発現レベルの違いに基づいて遺伝子を取得する方法としては、本発明者らが開発したＤＤシステム（ＷＯ　００／６５０４６）を応用した。この方法は、既に確立された「蛍光ＤＤ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ＤＤ）法」（Ｔ．Ｉｔｏら，１９９４，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３５１：２３１−２３６）の手順に基づき、複数のヒトの血液から調製した白血球細胞ＲＮＡサンプルを解析できるＤＤシステムである。一方、遺伝子の発現状態を比較する対象としては、好酸球を選択した。好酸球は、アレルギー症状の重要な指標とされている。したがって、好酸球細胞において、発現レベルに差を生じる遺伝子は、アレルギー症状と密接に関連していると考えられる。
続いて本発明者らは、ＤＤシステムによって取得した遺伝子について、進行度の異なるアレルギー性疾患患者と健常者でその発現レベルを比較した。進行度の異なる患者と健常者との比較によって、初期アレルギー性疾患患者と健常者とで好酸球における発現レベルに差がある遺伝子を選択すれば、初期アレルギー性疾患に関連する遺伝子を見出すことができると考えた。
このような戦略に基づいて末梢血好酸球における遺伝子の発現状態を解析した結果、本発明者らは、配列番号：１に記載された塩基配列を含む遺伝子が初期のアレルギー性疾患患者の好酸球において、有意に発現が増加していることを確認した。
なおこの塩基配列についてデータベース検索を行ったところ、配列番号：１に記載の１８３５−１７断片の塩基配列が、ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ２をコードすると予測される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＦ２４８５４０）にほぼ一致した。この遺伝子とアレルギー性疾患との関連性は示唆されていない。したがって、本発明の知見は新規である。さらに本発明者らは、この遺伝子の発現量を指標として、アレルギー性疾患の検査、およびアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、初期アレルギー性疾患において高い発現を示す遺伝子のアレルギー性疾患の指標遺伝子としての応用に関する。より具体的には、該遺伝子の発現を指標としたアレルギー性疾患の検査方法、および候補化合物の該遺伝子の発現に与える影響を検出する方法、更にこの検出方法に基づくアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法。
ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）健常者の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程
〔２〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕生体試料が末梢血好酸球細胞を含む試料である〔１〕に記載の方法。
〔６〕インターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔７〕インターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔８〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔９〕細胞が好酸球細胞である〔８〕に記載の方法。
〔１０〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１２〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１３〕〔８〕、〔１０〕、〔１１〕、および〔１２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１４〕指標遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１５〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１６〕指標遺伝子の好酸球細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である使用。
〔１７〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子であるキット。
〔１８〕指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子であるキット。
本発明において指標遺伝子とするインターセクチン２遺伝子の構造は既に明らかにされている。すなわち、本発明者らがＤＤ法に基づいて単離した断片１８３５−１７の塩基配列（配列番号：１）は、インターセクチン２（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ２）をコードすると予測される塩基配列（ＫＩＡＡ１２５６；ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＢ０３３０８２）にほぼ一致した。したがってインターセクチン２遺伝子は、本発明における指標遺伝子として用いることができる。更にＳｅｉｆｅｒｔ，Ｍ．は、インターセクチン２遺伝子によってコードされる全長アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＦ２４８５４０）を明らかにした。本発明におけるインターセクチン２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＦ２４８５４０）の塩基配列を配列番号：１５に、この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：１６に示した。
インターセクチン２遺伝子（ＫＩＡＡ１２５６遺伝子）は、ヒト脳に由来するライブラリーから新規な遺伝子として単離され、Ｏｈａｒａ，Ｏ　ｅｔ．，ａｌ．によってＤＮＡデータベースに登録された（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＢ０３３０８２）。先に登録されているマウスのインターセクチン２（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ２；ＥＭＢＯ　Ｊ．１８（５），１１５９−１１７１（１９９９））の塩基配列、およびアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ　ＡＦ１３２４８０）のホモロジーから、ヒトのインターセクチン２と推測されている。なおＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ　ＡＦ１３２４８０は、マウスＥＳＥ２と言う名称で登録されている。ヒトのインターセクチン２遺伝子とマウスのインターセクチン２は、高いホモロジーを有している（塩基配列８９％、アミノ酸配列９４％）。実施例において確認したように、マウスのインターセクチン２は、アレルギー性皮膚炎モデルにおいて発現の上昇が確認された。したがって、配列番号：１５に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドは、本発明における指標遺伝子として用いることができる。あるいは配列番号：１６に示すアミノ酸配列に対して、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、本発明における指標遺伝子として用いることができる。
本発明は、インターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子のアレルギー性疾患の指標としての使用に関する。本発明において、インターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子を、指標遺伝子と言う。また指標遺伝子によってコードされる蛋白質を、指標蛋白質と言う。インターセクチン２遺伝子の構造は、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ２４８５４０として公知である。
本発明において、ある蛋白質が初期のアレルギー性疾患患者、あるいは初期のアレルギー疾患動物の好酸球において発現が増加するとき、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と機能的に同等と言う。ある蛋白質が、好酸球において発現が増加することは、採取された好酸球における当該蛋白質をコードする遺伝子の発現レベルを比較することによって確認することができる。
本発明において、機能的に同等な遺伝子には、配列番号：１５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号：１５に記載の塩基配列に基づいて、ハイブリダイズやＰＣＲなどの公知の手法によって取得することができる。たとえば、配列番号：１５に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ストリンジェントな条件下で、白血球細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、配列番号：１５に記載の塩基配列と同一性の高い塩基配列からなるｃＤＮＡを取得することができる。あるポリヌクレオチドがストリンジェントな条件下で配列番号：１５に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、このポリヌクレオチドがコードする蛋白質は指標蛋白質と類似した活性を持つものが多いと考えられる。
ストリンジェントな条件とは、一般的には以下のような条件を示すことができる。すなわち、４×ＳＳＣ、６５℃でハイブリダイゼーションさせ、０．１×ＳＳＣを用いて６５℃で１時間洗浄する。ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーションや洗浄の温度条件は、融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、ハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度、ホルムアミドやドデシル硫酸ナトリウム濃度）によって変動する。したがって、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を経験的に設定することができる。
同一性の高い塩基配列からなるｃＤＮＡによってコードされる蛋白質は、本発明における機能的に同等な蛋白質である可能性が高い。本発明において、同一性が高い塩基配列とは、一般的に７０％以上、通常は８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を示す塩基配列を言う。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴＮ等の公知のアルゴリズムによって計算することができる。
あるいはインターセクチン２蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：１６）に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、インターセクチン２遺伝子と機能的に同等な遺伝子として示すことができる。
あるいは、配列番号：１５に記載の塩基配列から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、やはり白血球細胞のｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、同一性の高いｃＤＮＡを取得することもできる。ｃＤＮＡのソースとしてヒトの細胞を用いれば、ヒトのｃＤＮＡを取得することができる。またヒト以外の、脊椎動物細胞を利用すれば、異種動物におけるカウンターパートを取得することができる。このような非ヒト動物としては、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギなどの多くの実験動物を例示することができる。たとえばマウスのインターセクチン２は公知である。実験動物における本発明の指標遺伝子は、各動物種におけるアレルギーモデル動物の作成や、アレルギーの治療薬の開発におけるマーカーとして有用である。
また、配列番号：１５に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅することができる遺伝子であって、初期のアレルギー性疾患患者の好酸球において有意に発現が増加する蛋白質をコードする遺伝子も、機能的に同等な遺伝子である。
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。
本発明における指標遺伝子は、健常者との比較において、軽症のアトピー性皮膚炎患者の好酸球で発現量の増加を示した。従って、本発明の指標遺伝子の発現レベルを指標として、アレルギー性疾患の検査を行うことができる。本発明の検査方法においては、本発明の指標遺伝子のみならず他のアレルギー疾患の指標を組み合わせることもできる。複数の指標に基づいて検査を行うことにより、より正確な判断を行うことができる。アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患患者は、ヘテロジーニアス（不均一）な集団なので、複数の遺伝子を指標とすることにより、より確実な診断を行うことができる。
本発明におけるアレルギー疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。すなわち、アレルギー性疾患が疑われる初期症状を示す患者における本発明の指標遺伝子の発現の上昇は、その患者の初期症状の原因がアレルギー性疾患であることを裏付けている。
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、この遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。したがって本発明によるアレルギー疾患の検査方法は、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは前記遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、たとえばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または指標遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーとしては、配列番号：１５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、指標蛋白質をコードするポリヌクレオチドを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノ−フラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ　ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ　ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ　ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ　ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ　Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ　ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ　ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ，Ｚｉｎｎ　Ｋ，Ｇｒｅｅｎ　ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ　ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、指標遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、指標遺伝子によりコードされる蛋白質（指標蛋白質）を検出することにより行うこともできる。このような検査方法としては、例えば、この遺伝子でコードされる蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いる指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ　３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えばこの遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、この遺伝子によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：１６）、またはその部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、各蛋白質が備える生物学的な活性を言う。前記指標蛋白質の活性の検出は、公知の方法に基づいて行うことができる。
たとえばマウスのインターセクチン２（ＥＳＥ２）は、白血球やその他の細胞におけるリセプターを介した異物の細胞内への取り込みに関与する蛋白であることが分かってきた。この作用は、一般にＣｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓといわれる。たとえば貪食（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）や飲作用（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって、細胞が異物を取り込むときに、ＥＳＥ２は少なくとも１４個以上の他の蛋白と会合してコンプレックスを作る。ＥＳＥ２のＥＨとＳＨ３というドメインには、ｅｐｓｉｎやｄｙｎａｍｉｎ等が結合し、細胞膜を陥入させて空胞を形成するための情報を仲介すると考えられる。ｅｐｓｉｎやｄｙｎａｍｉｎ等は、貪食時に必須な蛋白であるとされている。ＥＳＥを過剰発現すると、貪食能がかえって抑えられるが、これはコンプレックスがうまく形成できなくなるためである。
本発明においては、被検者の好酸球細胞を試料とする。好酸球細胞は、末梢血から公知の方法によって調製することができる。すなわち、たとえばヘパリン採血した血液を遠心分離によって分画し、白血球細胞を分離する。次に白血球細胞から、フィコールによる遠心分離等によって顆粒球細胞を分取し、更にＣＤ１６抗体を用いた好中球のディプリーション等によって好酸球細胞を分離することができる。分離された好酸球を破壊してライセートとすれば、前記蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。好酸球のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。
あるいは、好酸球の分離を行わず、全血や、末梢血白血球集団を対象として、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルを測定しても良い。この場合には、測定値の補正を行うことによって、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を求めることができる。たとえば好酸球に特異的に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することができる。
また検出すべき蛋白質が分泌型の蛋白質である場合には、被検者の血液や血清などの体液試料に含まれる目的とする蛋白質の量を測定することによって、それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。
本発明によるアレルギー性疾患の検査方法においては、軽症のアレルギー性疾患で発現の上昇するこの遺伝子がアレルギー性疾患の初期症状の指標となる。
本発明による各種の検査方法に必要な、指標遺伝子の発現レベルを測定するためのポリヌクレオチドや抗体は、アレルギー性疾患の検査用試薬として有用である。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば指標遺伝子の塩基配列（配列番号：１５）を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。あるいは、指標蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：１６）を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。
上記オリゴヌクレオチドとして、配列番号：１５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１５塩基の長さを持つオリゴヌクレオチドを用いることができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡにおいてはＴをＵに読みかえる）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等の公知のアルゴリズムにより決定することができる。
これらの検査用試薬は、標識の検出に用いられる基質化合物、試料を希釈するための緩衝液、あるいは陽性や陰性の標準試料等を組み合せてアレルギー性疾患の検査用キットとすることができる。更には本発明の検査用キットに、当該キットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
本発明によって、前記指標遺伝子の好酸球細胞における発現レベルが、初期のアトピー性皮膚炎患者の好酸球において上昇することが明らかとなった。したがって、好酸球細胞においてこの遺伝子、またはこの遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、初期アレルギー性疾患のモデル動物として利用することができる。なお好酸球における発現レベルの上昇とは、白血球集団全体における標的遺伝子の発現レベルの上昇を含む。すなわち、前記遺伝子の発現レベルを上昇させるのは好酸球のみである場合のみならず、白血球集団全体において前記遺伝子の発現レベルが上昇している場合を含む。本発明において機能的に同等な遺伝子とは、各指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、トランスジェニック動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
初期アレルギー性疾患において発現が増加する遺伝子は、アレルギー性疾患の病態を上流で制御している遺伝子と言うことができる。言いかえれば、初期アレルギー性疾患において発動を開始する遺伝子の影響下に、下流に位置する様々な遺伝子の発現や抑制が起きることにより、アレルギーの病態が形成されると考えられる。つまり、初期アレルギー性疾患において発現が増加する遺伝子は、アレルギーの病態形成において重要な役割を果たす遺伝子と言える。したがって、この遺伝子の発現を抑制したり、あるいは活性を阻害する薬剤は、アレルギーの治療において、単にアレルギー症状を改善するのみならず、アレルギーの病態形成の本質的な原因を取り除く作用が期待できる。
以上のように、初期アレルギー性疾患において発現が増加する遺伝子には重要な意味がある。そのため、この遺伝子の発現レベルを上昇させることによって得ることができるトランスジェニック動物を初期アレルギー性疾患モデル動物として使用し、遺伝子の役割や、遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。
また本発明による初期アレルギー性疾患み動物は、後に述べる初期アレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、初期アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。
たとえば本発明による初期アレルギー疾患モデル動物が皮膚炎を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは宿主が備える遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すような定量的なＰＣＲにより確認することができる。また翻訳産物である蛋白質の活性は、正常なインターセクチン２の活性と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、目的とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この他のトランスジェニック動物には、たとえば遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、指標遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．ＬａｖｉｔｒａｎｏｅｔらＣｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
本発明の初期アレルギー性疾患モデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
更に本発明は、アレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明において、指標遺伝子は、軽症のアトピー性皮膚炎患者の好酸球において有意に発現レベルが上昇している。したがって、この遺伝子の発現レベルに与える影響を検出する方法に基づいて、その発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アレルギー疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、蛋白質の活性発現のいずれかのステップを阻害する作用を持つ化合物である。
本発明のアレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏで行なうこともｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の好酸球細胞における前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。生体試料としては、全血、ＰＢＭＣ、あるいは好酸球細胞等を利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。
たとえば人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このマウスの耳介にダニ抗原（５μｇ／耳）を２−３日間隔で計８回投与すると、２週間以降にはヒトのアトピー性皮膚炎に酷似した症状を誘発することができる。この系に候補化合物を投与し、指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによって本発明によるスクリーニングを実施することができる。
このようにして指標遺伝子を発現するモデル動物に薬剤候補化合物を投与し、モデル動物の好酸球における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出することができる。更にこの検出の結果に基づいて、対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用点を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の抑制、
指標遺伝子の転写活性の抑制、
指標遺伝子の転写産物の分解の促進等、
また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明において、工程（１）に用いるための細胞は、指標遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、指標遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ　ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
前記スクリーニング方法においては、指標遺伝子を発現する細胞として、株化白血球細胞を用いることもできる。株化白血球細胞としては、Ｅｏｌ、ＹＹ−１、ＨＬ−６０、ＴＦ−１、およびＡＭＬ１４．３Ｄ１０など白血球由来の株化細胞を例示できる。白血球細胞株の中でも、好酸球に由来する細胞株は、本発明のスクリーニング方法に好適である。好酸球に由来する細胞株は以下に示すとおりである。
Ｅｏｌ
ＹＹ−１
ＡＭＬ１４．３Ｄ１０
Ｅｏｌ（Ｅｏｌ−１：Ｓａｉｔｏ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｈｕｍａｎ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ．Ｂｌｏｏｄ　６６，１２３３−１２４０，１９８５）は、林原研究所より入手することができる。同様にＹＹ−１（Ｏｇａｔａ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｓ　ｃｏｍｍｏｎｌｙ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＩＬ−５　ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｓｕｐｐｌ　１，２４−２７，１９９７）は、サイトシグナル研究所より分与される。またＡＭＬ１４．３Ｄ１０（Ｂａｕｍａｎｎ　ＭＡ　ｅｔ　ａｌ，Ｔｈｅ　ＡＭＬ１４　ａｎｄ　ＡＭＬ１４．３Ｄ１０　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ：ａ　ｌｏｎｇ−ｏｖｅｒｄｕｅ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，１６，１６−２４，１９９８）は、米国オハイオ州、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＶＡ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ＤａｙｔｏｎのＰａｕｌ　ＣＣより、商業的に入手可能である。
その他、未分化白血球細胞株であるＨＬ−６０クローン１５（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１９６４）は、酪酸存在下で１週間程度培養すれば、好酸球に分化し好酸球細胞株とすることができる。好酸球であることは、形態的に、多形核で好酸球顆粒が認められることにより判別することができる。形態的な観察は、ギムザ染色やディフクイック染色によって行われる。一般に、好酸球を含むヒト白血球細胞株は、白血病の患者サンプルから不死化した細胞をクローニングすることにより樹立することができる。したがって、当業者は、必要に応じて好酸球細胞株を公知の方法によって得ることもできる。
本発明のスクリーニング方法は、まず前記株化白血球細胞に候補化合物を添加する。その後、該株化白血球細胞における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、この遺伝子がコードする蛋白質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルを比較するには、蛋白質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡや蛋白質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
更に指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流にこの転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、インターセクチン２、またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較してレポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
指標遺伝子の転写調節領域は、次のようにして取得することができる。すなわち、まず指標遺伝子の塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、指標遺伝子の転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を検出することによって、転写調節領域に対する候補化合物の作用を評価することができる。
指標遺伝子の発現レベルに与える影響を検出する方法に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを変化させる化合物のスクリーニングを行うことができる。本発明は、次の工程を含む指標遺伝子の発現レベルを変化させる化合物のスクリーニング方法に関する。
すなわち本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、候補化合物が指標遺伝子の発現レベルに与える影響を検出し、対照と比較して前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程を含む、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物のスクリーニング方法に関する。
あるいは本発明は、指標遺伝子の転写調節領域を利用するレポーターアッセイによる、転写調節領域に作用する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明によるレポーターアッセイの結果に基づいて、対象と比較してレポーター遺伝子の発現を低下させる化合物を選択することにより、指標遺伝子の発現を抑制する化合物を取得することができる。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がインターセクチン２またはインターセクチン２と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
本発明における指標蛋白質であるインターセクチン２は、ＥＳＥとしての活性を有する。これらの活性を指標として、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。
ＥＳＥとしての活性は、たとえばＣｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓを測定することで評価することができる。細胞の生物学的な応答を指標として、Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓを測定する方法（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，８，２００３−２０１５，１９９７）等が公知である。ＥＳＥとしての活性を評価するための公知の方法として、トランスフェリン吸収試験（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　Ｕｐｔａｋｅ　Ａｓｓａｙ）のプロトコルを以下に示す。
まず被験蛋白質を発現するベクターで形質転換した細胞を用意する。細胞にはＣＯＳ７細胞等が用いられる。形質転換したＣＯＳ７細胞は、血清を含まないＤＭＥＭで３６時間程度インキュベートする。次いで、ビオチン標識トランスフェリン（２５μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭで１時間程度培養する。培養後の細胞のトランスフェリンの取り込みレベルを、アビチン標識イソチオシアネートなどでビオチンを可視化することにより評価する。被験蛋白質をＭＹＣタグなどとの融合蛋白質として発現させれば、被験蛋白質の局在も評価することができる。被験蛋白質とビオチン標識トランスフェリンが同じ部分に局在していれば、被験蛋白質がフェリチンの取り込みを促進していることが証明される。つまり、ＥＳＥ活性を有すると評価することができる。
上記の評価方法を利用して、本発明のスクリーニングを行うためには、ビオチン標識トランスフェリンを与える前に細胞を候補物質に接触させるか、または候補物質の存在下でビオチン標識トランスフェリンを細胞に接触させる。候補物質との接触によって、トランスフェリンの取り込みレベルが変化すれば、その候補物質は蛋白質の活性を変化させる活性を有すると判定される。候補物質と接触させない対照と比較して、トランスフェリンの取り込みを低下させる化合物を選択することにより、本発明のスクリーニング方法を行うことができる。
このようにして得ることができる化合物は、インターセクチン２の働きを抑制する。その結果、好酸球細胞において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、アレルギー性の免疫応答を制御することができる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。より具体的には、たとえば指標遺伝子を発現する細胞と、この遺伝子の発現レベルを測定するための試薬とで構成される。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも１つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。あるいは、少なくとも１つの指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。
これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。本発明に基づく候補化合物の指標遺伝子の発現レベルに与える影響を検出するためのキットは、指標遺伝子の発現レベルを修飾する化合物のスクリーニング用キットとして利用することができる。
これらの方法に用いる被験候補化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。本発明における指標遺伝子は、初期のアレルギー性疾患患者の好酸球において発現が増加する。したがって、この遺伝子の発現を抑制することができる化合物には、アトピー性皮膚炎の症状を抑える作用が期待できる。本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき化合物が蛋白質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらす蛋白質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
あるいはアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー疾患患者の好酸球細胞へ導入すれば、この遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。好酸球細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎ　ｖｉｖｏ、あるいはｅｘ　ｖｉｖｏで行う方法が公知である。
更に、本発明の指標遺伝子の発現産物である蛋白質（すなわち指標蛋白質）の活性を阻害する化合物にも、アレルギーの治療効果が期待できる。たとえば、本発明の指標蛋白質を認識し、その活性を抑制する抗体は、アレルギー性疾患の治療のための薬剤として有用である。蛋白質の活性を抑制する抗体の調製方法は公知である。抗体をヒトに投与する場合には、キメラ抗体やヒト化抗体、あるいはヒト型抗体とすることにより、安全性の高い薬剤とすることができる。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　ディファレンシャルディスプレイ解析
健常者とアトピー性皮膚炎患者の末梢血より単離した血球細胞を比較して、発現変動している新しい治療関連遺伝子あるいは診断に有用な遺伝子を見出すことを目的としてスクリーニングを行った。
（１）被検者
健常者（レーン１〜６）およびアトピー性皮膚炎（レーン８〜２９）の症状、病態、喘息の有無、ダニ特異的ＩｇＥ値、好酸球数、全ＩｇＥ値を表１に示す。アレルゲン非特異的（Ｔｏｔａｌ　ＩｇＥ）、ダニおよびスギ特異的ＩｇＥはＥＩＡ法により測定した。すなわち、抗ヒトＩｇＥ抗体を結合させたキャップに被検血清を反応させ、血清中のアレルゲン非特異的ＩｇＥ抗体、またはダニ、スギ特異的ＩｇＥ抗体を結合させた。次に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体と基質液（４−メチルウンベルフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を加え、反応させて蛍光物質を生成させた。反応停止液を加えて反応を停止させ、同時測定の標準ＩｇＥの蛍光強度より抗体濃度を決定した。ＬＤＨの測定は、ＵＶ法（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ−Ｌａ　Ｄｕｅ法）により、ピルビン酸とＮＡＤＨの反応によるＮＡＤＨの減少速度を吸光度の減少から算出した。ＬＤＨ値の測定には、ＬタイプワコーＬＤＨ（和光純薬）と７１７０型自動分析装置（日立）を用いた。好酸球数は、ＥＤＴＡ添加血液２ｍｌを試料として鏡検法と自動血球分析装置ＳＥ−９０００（ＲＦ／ＤＣインピーダンス方式、Ｓｙｓｍｅｘ製造）により測定した。
2002033122.tif 000002
表中、病態の「○」は寛解期、「●」は増悪期であることを示す。特異的ＩｇＥ（Ｓ　ＩｇＥ）は抗ダニＩｇＥにおいてＣｌａｓｓ　０〜２を「−」、Ｃｌａｓｓ　３〜６を「＋」とした。全ＩｇＥ（Ｔ　ＩｇＥ）は１０００ＩＵ／ｍｌ以下を「Ｌｏｗ（Ｌ）」、１０００ＩＵ／ｍｌより大きい場合を「Ｈｉｇｈ（Ｈ）」とした。好酸球は３％未満を「Ａ」、３〜７％を「Ｂ」、７％より大きい場合を「Ｃ」とした。
（２）ディファレンシャルディスプレイ解析
健常者、および患者から採取した全血に３％デキストラン溶液を加えて３０分室温放置し、赤血球を沈降させた。上層の白血球画分を回収し、フィコール溶液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ；アマシャムファルマシアバイオテク）の上に載せて１５００ｒｐｍ、３０分室温で遠心した。下層に回収された顆粒球画分をＣＤ１６抗体磁気ビーズと４℃で３０分反応させ、ＭＡＣＳを用いた分離でトラップさせずに溶出する細胞を好酸球として実験に用いた。
上記のように調製した好酸球をＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に溶解し、この溶液から、Ｉｓｏｇｅｎに添付されているプロトコルに従ってＲＮＡを分離した。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全ＲＮＡを回収した。回収した全ＲＮＡは、ＤＮａｓｅ（日本ジーン；和光純薬）を加えて３７℃１５分反応させ、フェノール−クロロホルム抽出してエタノール沈殿でＲＮＡを回収した。
このように調製した全ＲＮＡを用いて蛍光ディファレンシャルディスプレイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ，「ＤＤ」と略記する）解析を行った。ＤＤ解析は文献（Ｔ．Ｉｔｏら，１９９４，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３５１：２３１−２３６）に記載の方法に準じて行った。まず全ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得た。第一次ＤＤ−ＰＣＲ反応用には３種のアンカープライマーの各々について全ＲＮＡの各０．２μｇを用いてｃＤＮＡを調製した。第二次ＤＤ−ＰＣＲ反応用には、３種のアンカープライマーの各々についてＲＮＡ０．４μｇを用いてｃＤＮＡを調製した。いずれのｃＤＮＡも、０．４ｎｇ／μｌＲＮＡ相当の最終濃度に希釈し、実験に用いた。１反応あたり１ｎｇ　ＲＮＡ相当のｃＤＮＡを用いてＤＤ−ＰＣＲ反応を行った。反応液の組成は表２の通りである。
2002033122.tif 000003
ＰＣＲの反応条件は、「９５℃３分、４０℃５分、７２℃５分」を１サイクル、続いて、「９４℃１５秒、４０℃２分、７２℃１分」を３０サイクルの後、７２℃５分、その後連続的に４℃にした。
使用したプライマー対はアンカープライマーであるＧＴ１５Ａ（配列番号：２）、ＧＴ１５Ｃ（配列番号：３）、およびＧＴ１５Ｇ（配列番号：４）に対して任意プライマーをそれぞれＡＧ１〜１１０、ＡＧ１１１〜１９９、およびＡＧ２００〜２８７を組み合わせ、計２８７組の反応をおこなった。なお、任意プライマーとしてはＧＣ含量５０％の１０ヌクレオチドからなるオリゴマーを設計し、合成して用いた。
ゲル電気泳動は、６％変性ポリアクリルアミドゲルを作製し、２．５μｌの試料をアプライし、４０Ｗで２１０分間泳動した。その後、日立製蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯ　ＩＩを用いてゲル板をスキャンし、蛍光検出によって泳動画像を得た。
健常者と患者の両サンプルを並べて泳動し、各試料間で発現の変動するバンドを分離した。目視判定により選抜され、重要検定にて０．１以下のバンドについて配列を決定した。更に画像解析ソフトＢｉｏ−Ｉｍａｇｅを用いて選抜されたバンドについても配列を決定した。各バンドにおける同配列クローンをグループ化しコンセンサス配列とした。この結果、配列決定したバンドのうち一意的に「ｄｏｍｉｎａｎｔ配列」が定義できるバンドを選別した。
選別されたコンセンサス配列をｑｕｅｒｙとしてＧＣＧ上でｇｅｎｅｍｂｌ、ｄｂＥＳＴに対しＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。ここでｉｄｅｎｔｉｔｙ９５％以上を「有意な相同性有り」と判断した。
このような解析の結果、患者で特異的に発現が上昇するバンドを同定した。同定された「１８３５−１７」のバンドの増幅に用いたプライマーセットを表３に示す。任意プライマーの配列に付けた（）内の番号は、配列番号である。また「１８３５−１７」のバンドの塩基配列は配列番号：１に示す。
2002033122.tif 000004
更に、断片「１８３５−１７」の塩基配列（配列番号：１）をｑｕｅｒｙとして、ＧｅｎＢａｎｋに対しＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。その結果、配列番号：１の塩基配列が、ヒトのインターセクチン２の塩基配列とほぼ一致した。このことから、先に同定された断片「１８３５−１７」の塩基配列は、ヒト・インターセクチン２の部分配列であることを確認した。ヒトのインターセクチン２がアレルギー性疾患の好酸球において発現が上昇することは本発明者らによって見出された新規な知見である。この知見に基づいて、ヒト・インターセクチン２がアレルギー性疾患の指標遺伝子として有用であることが裏付けられた。
［実施例２］　ＡＢＩ７７００による発現定量
実施例１で同定された遺伝子の発現を、ＡＢＩ７７００を用いたＴａｑＭａｎ法により解析した。新たに健常者、アトピー性皮膚炎患者の軽症、中症、重症各１０検体から好酸球を収集し、実施例１と同じようにＲＮＡを調製した。健常者、患者の検査値ｐｒｏｆｉｌｅを表４に示す。実施例１で同定したバンド、並びに補正用内部標準として既知遺伝子であるβ−アクチン（ａｃｔｉｎ）について発現レベルを定量した。
2002033122.tif 000005
健常者、アトピー性皮膚炎患者の軽症、中症、重症各１０検体の検査値プロファイルを基に、各群の検査値をプロットしたのが図１（好酸球数）および図２（全ＩｇＥ）である。アトピー性皮膚炎患者の好酸球数の評価ランクはＢ〜Ｃとなっているが、実際の測定値で比較すると、重症者の測定値のみが突出していることが図１から明らかである。このことは、好酸球数は、軽症、あるいは中症のアトピー性皮膚炎の診断指標としては利用しにくいことを示している。
全ＩｇＥの測定値（図２）についても同様の傾向が見られる。すなわち全ＩｇＥ値の顕著な上昇が見られるのは、重症患者であり、軽症〜中症の患者においては健常者と大きな違いは見られない。したがって全ＩｇＥ値も、軽症のアレルギー性疾患の指標としにくいことがわかる。
ＡＢＩ７７００による測定に用いたプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、遺伝子の配列情報に基づいてＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥバイオシステムズ）により設計した。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識されている。実験に用いたプライマー、およびＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅの塩基配列は、表５に記載の配列番号に示すとおりである。βアクチン測定用のプライマーとプローブには、ＴａｑＭａｎ　β−ａｃｔｉｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥバイオシステムズ）に添付のものを用いた。測定結果を図３に示す。また、臨床サンプルでの遺伝子発現量の平均（ＡＶＥＲＡＧＥ：ｃｏｐｙ／ｎｇ（補正値））を表６にまとめた。
2002033122.tif 000006
2002033122.tif 000007
上記のデータを利用して、パラメトリック多重比較検定、およびノンパラメトリック多重比較検定を行った。統計解析は、Ｔｈｅ　ＳＡＳ　ＳＹＳＴＥＭのＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｓｉｏｎ４．０（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．）を用いて行った。結果を表７に示す。
表７から明らかなように、本発明で同定された遺伝子はアトピー性皮膚炎（軽症）により発現が有意に上昇している。つまり、この遺伝子の発現を測定することが、アトピー性皮膚炎において診断的価値を持つことを裏付けている。
2002033122.tif 000008
［実施例３］　各種血液細胞での指標遺伝子の発現
５人の健常者の未梢血から分離した細胞での遺伝子の発現を調べた。好酸球（Ｅ）の分離は上記の通り行った。好中球（Ｎ）は好酸球を溶出させた後、ＣＤ１６抗体磁気ビーズでトラップされた細胞を磁界から外して溶出、回収して調製した。一方、フィコール遠心分離で中間層に回収される単球画分を、ＭＡＣＳ　ＣＤ３抗体磁気ビーズにより溶出画分（Ｍ：ｍｏｎｏｃｙｔｅとＢ　ｃｅｌｌの混合物）とトラップされる画分（Ｔ　ｃｅｌｌ画分）に分離した。次に、溶出画分をＭＡＣＳ　ＣＤ１４抗体磁気ビーズにより、溶出画分（Ｂ　ｃｅｌｌ画分）とトラップされる画分（ｍｏｏｃｙｔｅ画分）に分け、それぞれを精製Ｔ細胞、精製Ｂ細胞、そして精製単球とした。
好酸球はＩｓｏｇｅｎ、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、そして単球はＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて可溶化し、全ＲＮＡ抽出、ＤＮａｓｅ処理後（方法は前述の通り）遺伝子発現解析に供した。用いたプライマー、プローブ等は上記と同一である。これらの血球細胞での平均発現量（ＡＶＥＲＡＧＥ：ｃｏｐｙ／ｎｇ（補正値））は表８に示す通りであった。
2002033122.tif 000009
［実施例４］ヒト末梢血好酸球のサイトカイン刺激による遺伝子の発現変化
好酸球はアレルギー性炎症における中心的な炎症細胞と考えられているので、その増殖、分化、局所への遊走・集積、及び活性化に関するサイトカインの遺伝子発現への影響を検討した。
健常者の末梢血１００ｍｌから分離した好酸球でのサイトカイン刺激による遺伝子発現の変化を調べた。好酸球の分離は上記の通りに行った。２４穴シャーレ上に好酸球を１×１０５ｍＬまいた。シャーレは、好酸球の吸着による活性化を防ぐことを目的として、予め１％ＢＳＡ（非動化ブロッキングバッファー）により室温で２時間かけてコートした。サイトカインとしてインターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）並びにエオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）を、各々、０．１、１、及び１０ｎｇ／ｍｌずつシャーレの各ウェルに添加し、１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ中で３時間培養した。これらのサイトカイン類は、いずれも好酸球の活性化やアレルギーの発症に関わるとされるサイトカイン類である。
各処理を行った好酸球について、実施例１と同じようにＲＮＡを調製し、遺伝子発現解析に供した。用いたプライマー、プローブ等は上記と同一である。培養３時間後の結果を図４（ＲＮＡ１ｎｇ当たりのコピー数をＧＡＰＤＨで補正した値）に示す。
実験に用いたサイトカイン類のうち、ＩＬ−５は好酸球を活性化し好酸球の寿命を延ばす。そのためＩＬ−５処理は、好酸球において抗アポトーシス遺伝子のｂｃｌ−２やｂａｘの発現レベルの上昇をもたらす。図４に示すように「１８３５−１７」（インターセクチン２遺伝子）も同様に上昇しているので、好酸球の寿命延長と相関して発現すると考えられ、アレルギーの病態の誘導や増悪との関連性が示唆された。
また「１８３５−１７」（インターセクチン２遺伝子）は、ＩＦＮγやＩＬ−４によっても発現が誘導された。これらのサイトカイン類については、好酸球における遺伝子発現に関する知見はこれまであまりない。しかし、いずれもアレルギーの発症にとって重要な因子であることから、これらのサイトカインで好酸球において発現が誘導される遺伝子であるということは、「１８３５−１７」（インターセクチン２遺伝子）が、アレルギー性疾患の病態や増悪に関連している可能性を示唆するものと考えられた。
［実施例５］
アレルギー反応のモデルとして、２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＤＮＦＢ）塗布マウスを用い、マウスにおけるインターセクチン２遺伝子の発現レベルの変化を観察した。ＤＮＦＢは、マウス等の実験動物において、アレルギー性の皮膚炎反応をもたらすハプテンとして用いられる物質である。
次の組成からなる感作液を調製した。
アセトン：オリーブ油＝４：１（＝２ｍＬ：５００μＬ）、
ＤＮＦＢ　０．４％（＝１０μｌ）
またＣｈａｌｌｅｎｇｅ液は、次の組成のとおりとした。
アセトン：オリーブ油＝４：１（＝２ｍＬ：５００μＬ）、
ＤＮＦＢ　０．２％（＝５μｌ）
投与スケジュールは、以下のとおりである。
０日目：腹部の毛をバリカンで刈って、感作液２５μＬを腹部に塗る。
１日目：前日と同様に感作液２５μＬを腹部に塗る。
５日目：両耳にＣｈａｌｌｅｎｇｅ液を５μＬ／片耳塗る。
６日目：耳の肥厚を確認して、ＴＲＩＺＯＬ　ＲｅａｇｅｎｔのプロトコールにしたがってＲＮＡを抽出する。
対照として、ＤＮＦＢを除いた溶媒のみを塗布したコントロールマウス（ＣＯＮＴ．マウス）を用意した。またＤＮＦＢ塗布前にステロイドを経口投与したマウス（ＤＳマウス）についてもインターセクチン２遺伝子の発現を観察した。具体的には、０日目から６日目までの毎日、ＤＮＦＢを塗布する場合は塗布前３０分にステロイドを経口投与した。ステロイド剤としては、プレドニゾロンを１ｍｇ／ｍＬにメチルセルロースで調整したものを、０．１ｍＬ／１０ｇマウスで経口投与した。同時に、ＤＮＦＢを塗布しないでステロイド（プレドニゾロン）のみを経口投与したマウス（Ｓマウス）についても、インターセクチン２遺伝子の発現を観察した。
インターセクチン２遺伝子の発現レベルは、マウス耳組織から抽出したｍＲＮＡをサンプルとして、ＡＢＩ７７００を利用したＴａｑＭａｎ法（前述）によって定量した。ＴａｑＭａｎ法に用いたプライマーとプローブの塩基配列を以下に示す。この実験に用いたプライマーとプローブは、マウスのインターセクチン２遺伝子（ＥＭＢＯ　Ｊ．１８（５），１１５９−１１７１（１９９９））をコードすると予測される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ　ＡＦ１３２４８０）に基づいてデザインした。
プライマー
2002033122.tif 000010
ＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅ
2002033122.tif 000011
ＰＣＲは、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｘ２　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ＵＮＧを２５μＬ、ｘ４０　ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ　ａｎｄ　Ｒｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｍｉｘを１．２５μＬ、１０μＭ　ｐｒｉｍｅｒ　０．２５μＬ、４μＭ　ＴａｑＭａｎ　Ｐｒｏｂｅを０．６２５μＬ、これにＲＮＡ（２ｎｇ）＋ＤＥＰＣで５０μＬとする。サイクルは、９４度５分、「９４度３０秒・５５度３０秒・７２度１分」を４０回行った。検量線用には５０ｎｇ、１０ｎｇ、２ｎｇ、０．４ｎｇ、および０．０８ｎｇの５倍の段階希釈を用意した。試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、１８Ｓ遺伝子について同様の定量解析を行い、目的とする遺伝子の値を１８Ｓの値で割り、ＣＯＮＴ．の値を１として表示した。
ＣＯＮＴ．：コントロールマウス、ＤＮＦＢ．：ＤＮＦＢ塗布マウス、Ｄ／Ｓ：ＤＮＦＢ塗布マウスにステロイド投与マウス、およびＳ：ステロイド投与マウスを、各４匹づつ用い、得られた結果をｔ−検定（等分散を仮定した２標本による検定）で検定した。結果は、表９のとおりである。更にこの結果を図５に示した。
2002033122.tif 000012
対照であるＣＯＮＴ．とＤＮＦＢ塗布群、および対照とステロイドを投与したＤＮＦＢ塗布群（Ｄ／Ｓ）との間でｐ＜０．０５で有意差が認められた。マウスのインターセクチン２遺伝子は、炎症性アレルギーモデルで上昇することが確認できた。このことは、インターセクチン２遺伝子とアレルギー反応との密接な関連を裏付けている。特にステロイドを投与したモデルにおいてもインターセクチン２遺伝子の有意な発現上昇が見られたことは、この遺伝子がアレルギー反応の原因と関連していることを強く示唆する。つまり、インターセクチン２遺伝子はアレルギー性の反応の結果として誘導されたものではない。したがって、インターセクチン２遺伝子は、アレルギー性疾患の治療や予防における標的分子として有用である。
産業上の利用の可能性
本発明により、初期アトピー性皮膚炎患者の好酸球において発現が増加する遺伝子が提供された。好酸球の増加に先だって発現が高まる遺伝子は、アレルギー症状の、きわめて鋭敏な指標として利用することができる。好酸球の増加が見られない段階でアレルギー症状を診断することは、通常は困難である。しかし本発明によって提供された指標は、これまでの診断指標では困難な早期の診断を可能とする。早期の診断が可能となったことにより、初期アレルギー性疾患であっても、的確な治療方法を選択することができる。
好酸球の増加はアレルギー反応の重要なステップである。したがって、好酸球の増加に先だって、好酸球において発現が増加する遺伝子は、アレルギー性疾患の、特に初期の段階において重要な役割を果たしていると考えられる。したがって本発明における指標遺伝子の発現や活性を抑えることがアレルギー性疾患の治療戦略のターゲットとなるとともに、そのような新しい治療法におけるモニタリングのための新しい臨床診断指標としての有用性が期待できる。
本発明によって提供された指標遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。したがって、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明によるアレルギーの検査方法は、末梢血好酸球を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、たとえばＥＣＰなどの蛋白質測定と異なって、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。したがって本発明によるアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味でこれらの病態関連遺伝子の診断的価値は高い。
【配列表】
2002033122.tif 000013
2002033122.tif 000014
2002033122.tif 000015
2002033122.tif 000016
2002033122.tif 000017
2002033122.tif 000018
2002033122.tif 000019
2002033122.tif 000020
2002033122.tif 000021
2002033122.tif 000022
2002033122.tif 000023
2002033122.tif 000024
2002033122.tif 000025
2002033122.tif 000026
2002033122.tif 000027
2002033122.tif 000028
2002033122.tif 000029
2002033122.tif 000030
2002033122.tif 000031
2002033122.tif 000032
2002033122.tif 000033
2002033122.tif 000034
2002033122.tif 000035
2002033122.tif 000036
2002033122.tif 000037
2002033122.tif 000038
2002033122.tif 000039
2002033122.tif 000040
2002033122.tif 000041
2002033122.tif 000042
2002033122.tif 000043
2002033122.tif 000044
2002033122.tif 000045
2002033122.tif 000046
2002033122.tif 000047
2002033122.tif 000048
【図面の簡単な説明】
図１は、健常者および症状別アトピー性皮膚炎患者における末梢血好酸球数（ｃｅｌｌｓ／μＬ）の分布を示す図。
図２は、健常者および症状別アトピー性皮膚炎患者における全ＩｇＥ濃度（ＵＡ／ｍＬ）の分布を示す図。
図３は、健常者および症状別アトピー性皮膚炎患者における１８３５−１７（インターセクチン２）遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／ｎｇ　ＲＮＡ）の分布を示す図。
図４は、横軸に示した各種サイトカイン存在下で、健常者の末梢血好酸球中で発現される１８３５−１７（インターセクチン２）遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／ｎｇ　ＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ補正値）を示す図。
図５は、ＤＮＦＢ投与による炎症性アレルギー反応モデルにおける１８３５−１７（インターセクチン２）遺伝子の発現量を比較した図である。縦軸は、対照（ＣＯＮＴ．）における１８ｓ遺伝子で補正したｍＲＮＡの定量値を１とする、相対発現量（Ｒｌａｔｉｖｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す。また、横軸には実験に用いたモデルの種類を示した。
【図１】
2002033122.tif 000049
【図２】
2002033122.tif 000050
【図３】
2002033122.tif 000051
【図４】
2002033122.tif 000052
【図５】
2002033122.tif 000053
【国際調査報告】
2002033122.tif 000054
2002033122.tif 000055
2002033122.tif 000056
2002033122.tif 000057