(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
HBc抗原及びHBe抗原を同時に測定する方法であって、
（１）HBV粒子、HBc抗原及びHBｅ抗原を変性し；
（２）上記（１）で変性した、HBVを含む検体をSDSの存在下で結合する抗体と反応させ；そして
（３）前記抗体に捕捉されたHBc抗原及びHBe抗原を検出する；
工程を含む方法。
【請求項２】
HBVコア関連蛋白質に結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞HB44（FERM BP-7232）、HB50（FERM BP-7233）、 HB61（FERM BP-7234）、HB91（FERM BP-7235）、HB114（FERM BP-7236）、HB110（FERM BP-7624）。
【請求項３】
HBVコア関連蛋白質に対する結合特異性を有する請求項２に記載のハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体。
【請求項４】
HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号31-49の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
【請求項５】
HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号1-81の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
【請求項６】
HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号21-40の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
【請求項７】
HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号168-176の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
【請求項８】
HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号131-140の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
【請求項９】
HBVコアポリペプチドのアミノ酸番号1-19の配列に、SDSの存在下で結合する抗体。
【請求項１０】
SDSの存在下で結合する抗体が、請求項３から９いずれかに記載の抗体である請求項１に記載の測定方法。
【請求項１１】
請求項１又は請求項10に記載の測定方法に用いるための、請求項３から９いずれかに記載の抗体を含んでなる検体中のHBc抗原とHBe抗原とを同時に測定する診断キット。
【請求項１２】
請求項１又は10に記載の測定方法において使用できる、SDSの存在下で抗原と結合する抗体を取得する方法であって、
（１）SDSにて変性処理を行ったHBc抗原及びHBe抗原で動物を免疫する段階、および
（２）SDSを含む溶液中でHBc抗原及びHBe抗原の両者と反応する抗体を選択する段階、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の検出又は測定方法、並びにこれらの検出及び定量に用いられるモノクローナル抗体とそのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
背景技術
輸血後肝炎は、その名の通り輸血により引き起こされる肝炎を意味するが、この輸血後肝炎の原因ウイルスとして最初に同定されたのがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。ＨＢＶ抗原検査では、血液スクリーニングのためにＢ型肝炎ウイルス表面（ＨＢｓ）抗原検出法が利用されており、ＨＢＶの増殖マーカーとしてはＢ型肝炎ウイルスｅ（ＨＢｅ）抗原測定法が汎用されている。
ＨＢｅ抗原は、ＨＢＶ粒子を構成するＢ型肝炎ウイルスコア蛋白（ＨＢｃ抗原）と同じプロモーターにより発現されるプレコア蛋白である。この蛋白はＨＢＶの増殖時に積極的に分泌産生されることから、ＨＢｅ抗体のない状態では、血中のＨＢｅ抗原量はＨＢＶ量をほぼ反映すると考えられている。しかし、いったんＨＢｅ抗体産生が始まるとＨＢｅ抗原は免疫複合体を形成し、ＨＢｅ抗体だけが検出可能となるセロコンバージョンが確立される。このような検体においてはＨＢｅ抗原は検出されず、ＨＢＶ量を反映しない。
一方、Ｂ型肝炎の鎮静化を意味するセロコンバージョンの状態であっても、肝炎の活動性を示すＡｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）値が変動する例が報告され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＨＢＶ  ＤＮＡが検出されることにより、プレコア変異株の存在が確認された。プレコア変異株とは、プレプロＨＢｅ蛋白の２８番目のコドンがストップコドンに変異したために、ＨＢｅ抗原の産生及び分泌が不能となり、ＨＢｅ抗原が陰性化することである。つまり、ＨＢＶキャリアのモニタリングには、ＨＢｅ抗原抗体測定法だけでは不十分であることが明らかとなった。
また、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ（ＮＡＴ）検査の普及により、ＨＢＶ  ＤＮＡ量とＨＢＶキャリアの病態との関連が注目され、抗ウイルス剤による治療後のモニタリングにはＮＡＴ検査が主に利用されてきている。
しかし、ＰＣＲ法及びＴＭＡ法等のＮＡＴ検査法は、遺伝子断片を検出するには高感度な検出方法であるが、検体中からＨＢＶゲノムＤＮＡを抽出する際、用手法において処理時間が２時間も必要であり、複数回の操作工程を含むなど煩雑である。加えて、このように操作が複雑であるために、コンタミネーションの機会が増え、偽陽性検体の生じる可能性を増加させている。また、安定した定量値を得るたには熟練を要し、ＤＮＡのように生化学的に不安定な物質を検出するために、検体の保存に多大な注意をはらう必要がある。このようなことから、一度に大量の検体を処理することができにくい。近年、自動化機器の開発により、コンタミネーション対策やＤＮＡ抽出の処理時間の短縮がなされてきたが、依然として高価な機器を必要とするため、検体を多量処理する施設以外には一般に普及はしていない。さらに、ＤＮＡプライマーが標的遺伝子と一致しなければならないため、プライマーを数種類も使用する必要があり、検査あたりのコストが免疫測定法と比較して高くなるといった問題点がある。
上記のＨＢＶゲノムを検出する方法の代わりに、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃ抗原）を直接検出する方法も開発された。Ｕｓｕｄａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，７２，９５−１０３，１９９８）は、ＨＢＶコア（ＨＢｃ）抗原に対して特異性を有するモノクローナル抗体を用いて、血清中のＨＢｃ抗原を検出する方法を開発し、上記のウイルスゲノムを検出するＮＡＴ検査法と同様に臨床的有用性を持つことを示した。しかしながらこの方法にもいくつかの点で問題が残されている。
まず、ＮＡＴ検査法と比較すると感度が低く、ＨＢＶ  ＤＮＡ量として１０５コピー／ｍｌが検出限界であるため、血清スクリーニングやモニタリング検査に用いることが出来ないことである。
さらに、測定のための検体処理の工程が繁雑であり、かつ時間がかかることからスクリーニング及びモニタリングなどの用途に用いようとした際に問題となる。すなわち検体（血清）の処理のために、ウイルス粒子の濃縮と血清成分の除去のためにＨＢｓポリクローナル抗体処理（３７℃２時間）、遠心操作（１０分間）、上清の除去、界面活性剤処理、アルカリ処理（３５分間）、中和剤添加といった多段階処理工程を必要とする。このような工程は、非常に熟練を要する作業であるため、再現性を得るためには熟練度が必要であり、また最低約３時間の処理時間が必要である。さらに遠心操作、上清除去等の工程があるために、自動化が困難で、かつ同時大量処理を困難にしており操作面においても大量処理を必要とする用途に適していない。
このような問題から、臨床検査において実用とされるには到っていない。
一方、ＨＢｃ抗原検出系は、以下の点でＮＡＴ検査法と比較して優れている点がある。すなわち検出過程で増幅処理操作が加わらないため、コンタミネーションに対し比較的寛容である。またＤＮＡのように生化学的に不安定な物質を検出するのではなく、比較的安定な物質である抗原蛋白質を検出することから、検体の保存に過度の注意をはらう必要がなく、検体の輸送も容易になる。
これらの特長は例えば血液事業や健康診断の様に、多数の検体を測定する用途には重要な要件である。しかしながら、開示されているＨＢｃ抗原検出法は、前処理が繁雑で自動化に適さず、感度が低くいわゆるスクリーニングや治療モニタリング用途に用いることが出来ず、ＮＡＴ検査法に対して優れている点を活かすことが出来ていない。また、臨床的に有用性が高い測定方法は、常に感度、特異性、再現性、操作性、低コストを課題とし、これらを全て満たすように鋭意開発していく必要性がある。
これまでの文献では、ＨＢｃ抗原について以下の［  ］内に示すアミノ酸番号の配列領域を認識する抗体が報告されている。
［７３−８９］；Ａ．Ｓｅｍｉｌｅｔｏｖ  Ｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｋｈｉｍ  ２０（１１），１１７５−８５（１９９４）
［１２４−１３３］，［１３５−１４７］；Ｍ．Ｓａｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７４（Ｐｔ７），１３３５−４０（１９９３）
［Ｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌ］，［１３４−１４０］；Ｖ．Ｓｋｒｉｖｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７（６），６３７−４３（１９９３）
［２−１０］，［１３４−１４０］，［１３８−１５４］；Ｖ．Ｂｉｃｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０（３），２２１−３１（１９９３）
［１２６−１３５］；Ｍ．Ｓａｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８（７），７１９−２６（１９９１）
［７６−８５］；Ｍ．Ｓａｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  ３３（４），２４８−５２（１９９１）
［７３−８５］，［１０７−１１８］；Ｇ．Ｃｏｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４１（１２），４３７６−８０（１９８８）
［９−２０］，［７８−８３］，［１２７−１３３］，［１３３−１４５］；Ｐ．Ｐｕｓｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２（２），９１２−２０（１９９４）
これらの抗体を用い、検体前処理法と組み合わせて、ＨＢｃ抗原測定系を組み立てることが可能である。しかしながら、高感度高特異性の測定系には到っていない。
発明の開示
ＨＢＶのＮＡＴ検査には、現在ＰＣＲ法及びＴＭＡ法があるが、検査コストが高く付く上に操作が煩雑であることが問題点として挙げられる。また、遺伝子増幅法を用いているため、増幅用プライマーが標的ＤＮＡと一致しないと偽陰性を引き起こす。一方、免疫測定法は操作が簡便で安価に測定できるが、増殖マーカーとしての現行のＨＢｅ抗原測定法では、ＨＢｅ抗体の存在下では免疫複合体として存在するＨＢｅ抗原を測定できない。また、ＨＢｃ抗原測定法は、ＨＢＶ  ＤＮＡ量と相関はあるものの、前処理が繁雑で感度不足のため臨床応用されていない。
従って本発明の目的は、Ｂ型肝炎のスクリーニングやＢ型慢性肝炎患者の治療におけるモニタリングなどに用いるため、ＨＢＶコア関連抗体（ＨＢｅ及びＨＢｃ抗体）存在下においてもＨＢＶコア関連抗原（ＨＢｅ及びＨＢｃ抗原）を定量する測定法を提供することである。すなわちＮＡＴ検査と比較し同等の感度、特異度を持ち、簡便な前処理で、自動化などの大量処理システムに容易に適用可能なＨＢＶコア関連抗原検出系を提供することである。
本発明は、血中のＨＢＶ粒子及びＨＢＶ関連蛋白を変性することで、ＨＢＶコア関連抗原（ＨＢｅ及びＨＢｃ抗原）を十分に露出し、ＨＢｅ及びＨＢｃ抗原に対する抗体が存在する場合には該抗体を不活化して、ＨＢｅ及びＨＢｃ抗原を検出又は定量することによりＨＢＶを高感度に検出又は測定する手段を提供する。
従って本発明は、ＨＢＶを含む検体をＨＢｅ及びＨＢｃ抗原を特異的に認識するプローブに反応させることにより、ＨＢｅ及びＨＢｃ抗原を検出又は定量することを特徴とするＨＢＶの測定方法を提供する。
本発明はさらに、前記の免疫測定方法に用いるための、後記のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含んでなる検体中のＨＢＶの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供する。
本発明はさらに、上記のＨＢｅ及びＨＢｃ抗原の検出のためのプローブとして適するモノクローナル抗体を生産するＨＢ４４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３２）、ＨＢ５０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３３）、ＨＢ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３４）、ＨＢ９１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３５）またはＨＢ１１４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３６）から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株を提供する。
本発明はまた、ＨＢ４４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３２）、ＨＢ５０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３３）、ＨＢ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３４）、ＨＢ９１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３５）またはＨＢ１１４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３６）から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を提供する。
本発明はまた、これまでエピトープとして報告されていないＨＢＶコアポリペプチドのアミノ酸番号３１〜４９（配列番号１）またはアミノ酸番号１−８１（配列番号２）のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびその製造法を提供する。
これに加え本発明は、上記のＨＢｅ及びＨＢｃ抗原の検出のためのプローブとして適するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株ＨＢ１１０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６２４）、およびそれによって産生されるモノクローナル抗体を提供する。また、上記性質を持つ抗体および抗体を産生するハイブリドーマを作製、選択する方法を提供する。
さらに本発明はこれまでエピトープとして報告されていないＨＢＶコアポリペプチドのアミノ酸番号２１−４０（配列番号９）に記載のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびその製造法を提供する。
発明の実施の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明でいうＨＢＶコア関連抗原とは、ＨＢｅ及びＨＢｃ抗原であり、その融合タンパクや断片タンパク、ペプチドも含む。ＨＢｅ及びＨＢｃ抗原のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３及び４に記載される。１８３アミノ酸からなるＨＢｃ抗原（アミノ酸番号１〜１８３）のうちＮ端側の１４９アミノ酸配列がＨＢｅ抗原（アミノ酸番号−１０〜１４９）と同一であり、ＨＢｅ抗原はＨＢＶのプレコア蛋白と言われている。この共通領域を特異的に認識する抗体を取得し、検体前処理法と組み合わせて測定系を構築することにより、抗体存在下でもＨＢＶコア関連抗原を測定することが可能となる。
まず、ＨＢｃ抗原を取得するために、配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を発現ベクターにクローニングする必要がある。目的の遺伝子断片は、ＨＢＶ患者血清からウイルス遺伝子を分離して、ＰＣＲにより目的遺伝子を増幅することにより調製することができる。さらに、ＰＣＲ作製時に付加されたリンカー由来の制限酵素部位もしくはその遺伝子断片が挿入されたプラスミド由来の制限酵素部位などを利用し、発現ベクターにクローニングすることができる。
すなわち、宿主として例えば大腸菌、枯草菌もしくは放線菌などの原核生物を用いることができ、また、プロモーターとしては例えばトリプトファン合成酵素オペロン（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、λファージＰＬ及びＰＲプロモーターなどを用いることができる。
また、酵母、昆虫細胞、植物細胞もしくは動物細胞などの真核生物を宿主として用いることも可能である。この時のプロモーターとしては、酵母などに慣用のプロモーターである３−ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼなどの解糖系酵素に対するプロモーターやアルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、哺乳動物細胞で使用されるウイルスプロモーター、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルスサルウイルスＳＶ４０、ワクシニアウイルスもしくはサイトメガロウイルスなど由来のプロモーターが挙げられる。
ベクターはさらに、形質転換された細胞の表現型選択を可能にするマーカー配列、例えばアンピシリン、テトラサイクリン耐性遺伝子などや複製開始点、ターミネーター、リボソーム結合部位などを適宜含み得る。
つぎに、発現ベクターを宿主細胞内に形質転換し、その形質転換体を培養してＨＢｃ抗原を発現させ、回収する方法を宿主に大腸菌を用いる例として記載する。
形質転換の方法は、塩化カルシウム法などの通常の形質転換方法を適用すればよい。こうして発現ベクターｐＡＴｔｒｐ−ＨＢｃで適当な宿主大腸菌を形質転換することにより組換え大腸菌が得られる。
組換え大腸菌を培養する方法は、通常用いられるＬ培地、ＹＴ培地、Ｍ９−ＣＡ培地などの栄養豊富な大腸菌用培地で培養すればよい。上記のように作製された発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子を有しており、その形質転換大腸菌を培養する場合には、それに対応する薬剤を適当な濃度になるように添加しておくことが望ましい。例えば宿主大腸菌としてＨＢ１０１株を用いて発現ベクターｐＡＴｔｒｐ−ＨＢｃで形質転換することにより得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１［ｐＡＴｔｒｐ−ＨＢｃ］を培養する場合には、アンピシリンを２０〜２００μｇ／ｍｌの濃度になるように培地に添加しておけばよい。
目的遺伝子を発現させる場合には、その上流のプロモーターを適当な方法で働かせて発現誘導を行えばよい。例えば前述のベクターの場合には、適当な培地である程度の菌体量に達するまで培養した後、ＩＡＡ（インドールアクリル酸）を添加して、遺伝子発現を開始させる方法がとられる。効率的な遺伝子発現を行うためには、対数増殖期の初期ないしは中期にＩＡＡを添加することが望ましい。発現誘導後、さらに培養を継続して目的蛋白を菌体内に蓄積させる。例えば組換え大腸菌ＨＢ１０１［ｐＡＴｔｒｐ−ＨＢｃ］の場合には、アンピシリンを添加したＭ９−ＣＡ培地で、３７℃で１３〜１６時間培養することにより多くの菌体量が得られ、且つ目的蛋白を高収量で得ることができる。
培養によって得られた菌体から目的蛋白を採取精製する方法は慣用の技術、例えば細胞の超音波破壊、遠心分離、各種クロマトグラフィーなどの操作により達成し得る。すなわち、上記のような方法で目的蛋白を効率よく発現させた場合、多くの蛋白は菌体内で不溶性顆粒を形成するが、ＨＢｃ抗原は菌体内でＨＢｃ粒子を形成する。この特徴を利用して、菌体を生理食塩水などの生理的条件の緩衝液に懸濁した後、超音波処理により細胞を破砕し、菌体破砕物を遠心分離し、可溶性分画をさらに超遠心することによりＨＢｃ粒子が回収される。回収されたＨＢｃ粒子をゲルろ過、ショ糖密度勾配遠心法、透析により高純度のＨＢｃ抗原とした後、免疫原として利用することができる。
本発明のＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原並びに配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどのＨＢＶコア関連抗原に対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体類は、当業者により容易に作製することができる。
ポリクローナル抗体は、例えばラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの動物に、上記ＨＢｃ抗原もしくはポリペプチド（以下、本抗原）を単独あるいはＢＳＡ，ＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバントなどのアジュバントと混合して定期的に免疫し、血清を採取することで作製することができる。特定の認識部位を持つポリクローナル抗体を得るためには、目的とする領域の部分ペプチドを免疫源に用いる方法がある。
ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作製はよく知られている。例えばＢＡＬＢ／ｃマウスなどの腹腔内あるいは皮下に、上記ＨＢｃ抗原もしくはポリペプチド（以下、本抗原）を単独あるいはＢＳＡ，ＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバントなどのアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で、最終免疫として本抗原を尾静脈内に投与し、無菌的に脾臓を摘出した後、適当なマウス骨髄腫細胞株と細胞融合し、ハイブリドーマを得る。本方法は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って行なうことができる。
上記方法により得られたハイブリドーマを適当な培養液中で培養し、その後、本抗原に対して特異的な反応を示す抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択してクローン化する。抗体産生ハイブリドーマのクローニングには限界希釈法のほか軟寒天法（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６）などを利用することができる。このハイブリドーマを培地中またはマウス腹腔で培養し、培地中や腹水中にモノクローナル抗体を産生させることができる。
そして、血清中のポリクローナル抗体、培地中や腹水中に産生されたモノクローナル抗体はプロテインＡカラムクロマトグラフィーなどの方法により精製することができる。ポリクローナル抗体は、担体固定化抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの方法により、特定の抗原に反応する抗体のみを精製することが可能であり、同様にして特定の抗原に反応しない抗体を得ることもできる。
上記のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体以外にもプローブとして用いる分子は作製することが出来る。例えば組換え抗体については、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｎの総説などに詳しく記載されている（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：６２−７０，１９９７）。
本発明に従って調製されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、ＨＢＶコア関連抗原の検出および定量用に、エンザイム−リンクイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づいたアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノアッセイで検査試薬として用いることができる。また、検出に標識抗体が使用される場合は、標識としては例えば蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、酵素などが使用される。
例えば、検体中のＨＢＶコア関連抗原を検出するためにサンドイッチ反応系を原理とした方法を用いる場合、使用すべき診断キットは、固体支持体（例えばマイクロタイターウェルの内壁）に結合された本発明の１種類以上の抗体および標識物質と結合させた１種類以上の抗体またはそのフラグメントを含む。固体支持体に結合させる抗体および標識抗体の組み合わせは自由であり、高感度、高特異性の得られる組み合わせを選択できる。
使用できる固体支持体としてはポリスチレンやポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニール製のマイクロタイタープレート、試験管、キャピラリー、ビーズ（ラテックス粒子や赤血球、金属化合物など）、膜（リポソームなど）、フィルターなどが挙げられる。
本発明における検体には、全血、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液などの生物学的体液、および肝組織などの組織が含まれる。
本発明においては、検体を煩雑な操作なく、プローブ例えばモノクローナル抗体と結合反応させるのに適した状態に検体中のＨＢＶコア関連抗原を処理する方法が重要な要件である。すなわち、検体中に含まれるＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体を不活化し、ウイルス粒子中などに含まれるＨＢｃ抗原や、血清アルブミン等と結合したＨＢｅ抗原を効率よく遊離させることが重要になる。
つまり本発明の測定方法における前処理方法には、検体中に存在するＨＢＶコア関連抗原を効率よく遊離させることのみならず、同時に検体中に存在するＨＢＶコア関連抗原に結合する抗体をも失活させる必要がある。すなわち、検体にＳＤＳを含む溶液を加えて熱処理することで、ＨＢＶコア関連抗原を遊離させ、検体中のＨＢＶコア関連抗体の機能破壊をおこさせる。
また、本発明においては、上記のように変性された抗原に対し、特異的に結合するプローブを用いることが重要な要件である。プローブとして抗体を用いる場合、このような変性処理によってもＨＢＶコア関連抗原のエピトープが存続し、イムノアッセイにおける特異的な抗原抗体反応を起こすことができる抗体およびその組み合わせを見いだすことが重要である。本発明においては、こうした性質を満たす抗体を作製するため、あらかじめＳＤＳにて変性処理を行った抗原を免疫し、さらに抗体の選択にも工夫を凝らす必要がある。あらかじめ変性処理した固相化抗原に対し、ＳＤＳを含む溶液中で反応する抗体を選択することにより、本発明のイムノアッセイに適した抗体が得られる。このような観点から抗体を選択すると、これまで報告されていない領域を認識する抗体も必要となり得る。本発明ではこのような抗体認識部位として、ＨＢＶコアポリペプチドのアミノ酸番号３１−４９の領域（配列番号１）および、アミノ酸番号１−８１の領域（配列番号２）の２箇所の領域を提示する。さらに、このような認識部位としてアミノ酸番号２１−４０の領域（配列番号９）を提示する。
このエピトープを認識する抗体の有用性は実施例に示すが、同様のエピトープを有するモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用いることも可能である。このような抗体は、目的領域の部分ペプチドを単独あるいはＫＬＨ，ＢＳＡなどのキャリアタンパクと結合して免疫源に用いることで、容易に作製し得る。また、モノクローナル抗体のスクリーニングに目的領域の部分ペプチドを抗原に用いるなどの方法により、目的の領域に反応する抗体のみを選択することも可能である。ポリクローナル抗体は、目的とする抗原を固相化し、アフィニティークロマトグラフィーを行うことで特定の抗原に反応する抗体を精製することができる。
このようにして、検体前処理法、特異的プローブを測定に適した条件で組み合わせることにより、ＨＢＶコア関連抗体の存在下においてもＨＢＶコア関連抗原を簡便にかつ感度よく検出、及び定量することが可能となる。
また本発明によって示される測定方法を利用して、検体中のＨＢＶの有無を判別するキット、定量するキット及び診断薬を作製することが可能となる。また本発明の測定法は、ＨＢＶのスクリーニングおよび患者のモニタリングの手段を提供する。
実施例
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１． ＨＢＶコア関連抗原の発現および精製
（Ａ）ＨＢｃ抗原発現プラスミドの構築
ＨＢＶのコア領域に相当する発現プラスミドは以下の方法で構築した。ＨＢＶ患者血清１００μｌをＤＮＡ抽出液１００μｌ［１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）が１０μｌ，２５０ｍＭ  ＥＤＴＡが８μｌ，１０％ＳＤＳが４０μｌ，５Ｍ  ＮａＣｌが８μｌ，２０ｍｇ／ｍｌ  ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫが１０μｌ，ｔＲＮＡ（５μｇ／μｌ）が１μｌ，滅菌水が２３μｌ］と混合させ、５４℃、３０分間保温した。２００μｌのフェノール・クロロホルム（１：１）溶液を加えて混合し、１５Ｋｒｐｍで５分間の遠心分離の後、上清を取り出し１５０μｌのイソプロパノールと７μｌの５Ｍ  ＮａＣｌを加えて−２０℃１時間静置した。１５Ｋｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノールでリンスし、１５Ｋｒｐｍ、４℃で再度５分間遠心分離した。沈殿物を自然乾燥させ、２０μｌの滅菌水に溶解させてＨＢＶ  ＤＮＡ溶液とした。
このＨＢＶ  ＤＮＡ溶液の５μｌを２つのプライマー（５′−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴＡＴＡＡＡ−３′（配列番号：６），５′−ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡ−３′（配列番号：７）を用いＰＣＲを行なった。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐＴＭ（ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ製）のキットを用いＤＮＡ変性９５℃１分、アニーリング５５℃１分、ＤＮＡ合成７２℃１分の条件で行い、得られたＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、グラスパウダー法（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）で精製した。この増幅されたＨＢｃ遺伝子断片０．５μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、約５７０ｂｐのＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を精製した。
次に発現ベクターであるｐＡＴｔｒｐのＤＮＡ０．５μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃で１時間消化し、その反応液に水３９μｌを加え、７０℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）１μｌ（２５０単位／μｌ）を加えて３７℃で１時間保温した。
この反応液にフェノールを加えてフェノール抽出を行い、得られた水層をエタノール沈殿し、沈殿物を乾燥した。得られたＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ０．５μｇと上述のＨＢｃ５７０ｂｐ断片を１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１００ｍＭジチオスレトール、１ｍＭ  ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ１μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。発現プラスミドｐＡＴｔｒｐ−ＨＢｃを得るために、この連結反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。
形質転換に用いる感受性大腸菌株は塩化カルシウム法〔Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．とＨｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９−１６２（１９７０）〕により作られる。形質転換大腸菌を２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを１白金耳取り、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。
１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法〔Ｍａｎｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８２）〕により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃１時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって、約５７０ｂｐのＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるｐＡＴｔｒｐ−ＨＢｃ発現プラスミドを選別した。
（Ｂ）ＨＢｃ抗原をコードするポリペプチドの発現および精製
発現プラスミドｐＡＴｔｒｐ−ＨＢｃをもつ大腸菌ＨＢ１０１株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で９時間培養する。この培養液１ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９−ＣＡ培地（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４，０．５％ＫＨ２ＰＯ４，０．５％ＮａＣｌ，０．１％ＮＨ４Ｃｌ，０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２，２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０．５％カザミノ酸、０．２％グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終濃度４０ｍｇ／ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。この培養液を５Ｋｒｐｍ、１０分間遠心分離して菌体を集めた。
菌体に２０ｍｌの緩衝液Ａ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，３０ｍＭ  ＮａＣｌ〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現菌体２．６ｇを得た。得られた菌体を緩衝液Ａ  １０ｍｌ中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に１２Ｋｒｐｍ，４℃，３０分間遠心分離を行い、ＨＢｃ粒子を含む可溶性画分を得た。回収した上清を２３Ｋｒｐｍ、４℃にて２時間遠心し（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８．１ローター）、沈殿を得た。沈殿は５％ショ糖を含むＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。５％ショ糖を含むＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液にて平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）カラム（２．６ｃｍ×８５ｃｍ）にアプライし同緩衝液にて溶出させた。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、ＨＢｃ抗原の分子量２２ｋＤａのバンドが検出された分画を集めた。集めた分画を限外濾過（排除分子量５０ｋＤａ）により濃縮した後、６０％ショ糖、５０％ショ糖、４０％ショ糖を含むＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液を重層させたステップ密度勾配上に濃縮液を重層させ、３９Ｋｒｐｍ、４℃にて５時間遠心した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｙ６０Ｔｉローター）。遠心後底から順に分画し、分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ＨＢｃ抗原は高密度分画と低密度分画の２層に分画され、それぞれを集め、ＨＢｃ抗原精製品として用いた。
（Ｃ）ＨＢｅ−ＨＢｃ融合抗原の発現プラスミドの構築
次にＨＢｅ−ＨＢｃ融合抗原のプラスミドの構築を行った。前述のＨＢＶ患者血清より調整したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液の５μｌを２つのプライマー（５′−ＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴ−３′（配列番号：８），５′−ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡ−３′（配列番号：７）を用いＰＣＲを行なった。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐＴＭ（ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ製）のキットを用いＤＮＡ変性９５℃１分、アニーリング５５℃１分、ＤＮＡ合成７２℃１分の条件で行い、得られたＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、グラスパウダー法（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）で精製した。この増幅されたＨＢｅ−ＨＢｃ遺伝子断片０．５μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、約６００ｂｐのＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を精製した。
次に発現ベクターであるｐＡＴｔｒｐＥのＤＮＡ０．５μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃で１時間消化し、その反応液に水３９μｌを加え、７０℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）１μｌ（２５０単位／μｌ）を加えて３７℃で１時間保温した。
この反応液にフェノールを加えてフェノール抽出を行い、得られた水層をエタノール沈殿し、沈殿物を乾燥した。得られたＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ０．５μｇと前述のＨＢｃ−ＨＢｅ融合抗原をコードするＤＮＡ６００ｂｐ断片を１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１００ｍＭジチオスレトール、１ｍＭ  ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ  １μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。発現プラスミドｐＡＴｔｒｐＥ−ＨＢｅ−ＨＢｃを得るために、この連結反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。
形質転換に用いる感受性大腸菌株は塩化カルシウム法〔Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．とＨｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９−１６２（１９７０）〕により作られる。形質転換大腸菌を２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを１白金耳取り、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。
１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法〔Ｍａｎｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８２）〕により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃１時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって、約６００ｂｐのＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるｐＡＴｔｒｐＥ−ＨＢｅ−ＨＢｃ発現プラスミドを選別した。
（Ｄ）ＨＢｅ−ＨＢｃ融合抗原をコードするポリペプチドの発現および精製
発現プラスミドｐＡＴｔｒｐＥ−ＨＢｅ−ＨＢｃをもつ大腸菌ＨＢ１０１株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で９時間培養する。この培養液１ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９−ＣＡ培地（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４，０．５％ＫＨ２ＰＯ４，０．５％ＮａＣｌ，０．１％ＮＨ４Ｃｌ，０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２，２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０．５％カザミノ酸、０．２％グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終濃度４０ｍｇ／ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。この培養液を５Ｋｒｐｍ、１０分間遠心分離して菌体を集めた。
菌体に２０ｍｌの緩衝液Ａ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，３０ｍＭ  ＮａＣｌ〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現菌体２．６ｇを得た。得られた菌体を緩衝液Ａ１０ｍｌ中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に遠心分離を行い、ＨＢｅ−ＨＢｃ融合抗原を含む不溶性画分を得た。
この不溶性画分を８Ｍ尿素，１０ｍＭジチオスレイトール，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ３ｍｌに溶解し、６Ｍ尿素存在下セファクリルＳ３００ＨＲカラムにてゲルろ過を行った。目的物はボイドに溶出した。ボイド画分６ｍｌにＳＤＳを６０ｍｇ、ジチオスレイトールを９ｍｇ加え、０．１％ＳＤＳ存在下下セファクリルＳ３００ＨＲカラムにてゲルろ過を行い、ＨＢｅ−ＨＢｃ融合抗原をほぼ単一に精製した。
このＨＢｅ−ＨＢｃ融合抗原は、ＢＣＡ法によりタンパク定量を行い、実施例５の患者検体からのＨＢＶ関連抗原の検出において、標準物質として用いた。
実施例２． ハイブリドーマの作製
前記方法により調製したポリペプチド（ＨＢｃ）にＳＤＳを終濃度が１０％となるように加え１００℃５分間変性処理した。この変性ＨＢｃ抗原を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）に終濃度が０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、等量のフロイントアジュバントと混和し、４〜６週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０−２０μｇ腹腔内投与した。２−４週間ごとに計５回同様の追加免疫を行い、さらにＰＢＳに溶解したＨＢｃ  １０μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。
最終免疫後３日目にこのマウスより脾臓を無菌的に摘出し、ハサミおよび金属メッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／ＯＡｇ１４をＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄後、該細胞と脾臓細胞を１：５の細胞数比で混合した。２００×ｇ、５分間遠心分離後、上清を除去し、細胞隗を緩やかに混合しながら５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（メルク社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌをゆっくりと加え、さらにＲＰＭＩ−１６４０培地１０ｍｌを加えて細胞融合させた。
融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分間）によってＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清およびヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、９６ウエル細胞培養プレートに播種した。約１０日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた後、培養上清の一部をとり、あらかじめＳＤＳにより変性させたＨＢｃを固相化抗原に用いたＥＬＩＳＡ法により抗ＨＢｃ抗体を産生するウェルをスクリーニングし、変性ＨＢｃに対する反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。さらに、ＳＤＳ存在下で同様のスクリーニングを行い、ＳＤＳ存在下でも変性ＨＢｃに対する反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
得られたハイブリドーマについて、限界希釈法により単一クローン化を行い、抗体産生ハイブリドーマを樹立した。得られたハイブリドーマをＨＢ４４、ＨＢ５０、ＨＢ６１，ＨＢ９１、およびＨＢ１１４と命名した。該５種類のハイブリドーマに関しては、生命工学工業技術研究所に平成１２年７月１９日付で、それぞれ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３２，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３３，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３４，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３５及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３６として寄託された。
実施例３． モノクローナル抗体の作製および解析
実施例２に記載の方法により得られたハイブリドーマを、あらかじめプリスタンを腹腔投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔に移植し、７〜１４日後産生されたモノクローナル抗体を含む腹水を採取した。該モノクローナル抗体は、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧフラクションを分離精製した。
抗マウスＩｇ各アイソタイプ抗体を用いたアイソタイプタイピングキット（Ｚｙｍｅｄ社）により、それぞれのモノクローナル抗体の（サブ）クラスを同定した。その結果、ＨＢ４４，ＨＢ５０，ＨＢ６１，ＨＢ９１およびＨＢ１１４共にＩｇＧ１、κであった。
実施例１（ＨＢｃ（１−１８３））と同様にして、ＨＢｃ欠失変異体であるＴｒｘ−ＨＢｃ（１−４７），Ｔｒｘ−ＨＢｃ（１−８１），ＴｒｐＥ−ＨＢｃ（１−１０６），ＨＢｃ（１−１４９）を作製した。また、ＨＢＶコア関連抗原のアミノ酸配列に相当する２０アミノ酸前後の部分ペプチドＰＨＢ−１〜ＰＨＢ−１９をそれぞれ合成した。アミノ酸番号はＨＢｃ抗原のＮ末端を１とした。
各（ポリ）ペプチドをマイクロタイタープレートに固相化し、得られたモノクローナル抗体について、各（ポリ）ペプチドに対する反応性を調べ、エピトープ解析を行なった。
結果を表１に示す。この結果より、ＨＢ４４モノクローナル抗体はＰＨＢ−５ペプチドに反応し、その他の部分ペプチドには反応しないことから、アミノ酸番号３１−４９の領域を認識するモノクローナル抗体であることがわかった。同様にＨＢ９１モノクローナル抗体はＰＨＢ−２ペプチドに反応し、その他の部分ペプチドには反応しないことから、アミノ酸番号１−１９の領域を認識するモノクローナル抗体であることがわかった。ＨＢ６１モノクローナル抗体はＰＨＢ−１４およびＰＨＢ−１５ペプチドに反応し、その他の部分ペプチドには反応しないことから、共通部分であるアミノ酸番号１３１−１４０の領域を認識するモノクローナル抗体であることがわかった。ＨＢ５０モノクローナル抗体はＰＨＢ−１６，１７，１８，１９ペプチドに反応したが、この領域は類似した繰り返し配列となっていることから、より強い反応を示すアミノ酸番号１６８−１７６の領域を認識し、類似配列を含むＰＨＢ１６，１７にも交差反応すると推測された。ＨＢ１１４モノクローナル抗体はＰＨＢ−１〜１９の全ての部分ペプチドおよびＴｒｘ−ＨＢｃ（１−４７）には反応せず、Ｔｒｘ−ＨＢｃ（１−８１）およびそれより広い領域を含むポリペプチドに反応したことから、アミノ酸番号１−８１の領域に存在する構造エピトープを認識すると推測された。それぞれのモノクローナル抗体の認識部位を表２にまとめた。
本発明においてアミノ酸番号３１−４９の領域（配列番号１）および、アミノ酸番号１−８１の領域（配列番号２）の領域に存在する構造エピトープを認識する抗体はこれまで報告がなく、ＨＢ４４モノクローナル抗体およびＨＢ１１４モノクローナル抗体はそれぞれ新規のエピトープを認識している。
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実施例４． ＨＢＶコア抗原の検出および測定法
抗ＨＢＶコア抗原モノクローナル抗体ＨＢ４４，ＨＢ６１，ＨＢ１１４を終濃度がそれぞれ２，１，１μｇ／ｍｌになるように０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、黒色９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）につき１００μｌ／ウェル分注し、４℃で一晩静置した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）０．４ｍｌで２回洗浄し、ブロッキング液（０．５％カゼインナトリウム，３％スクロース，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））０．４ｍｌを添加し、さらに室温で２時間静置した。ブロッキング液を除去後、真空乾燥した。
血清５０μｌに、処理液（１５％ＳＤＳ、３％ＣＨＡＰＳ，１％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を２５μｌ添加し、５６℃３０分間処理をおこない、その５０μｌを測定試料とした。
上記ウェルに反応緩衝液１００μｌと測定試料５０μｌを加え、室温で一夜反応させた。
洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４））０．４ｍｌで５回洗浄後、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識モノクローナル抗体ＨＢ５０を０．５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェル添加し、室温２時間反応させた。洗浄液０．４ｍｌで６回洗浄後、発光基質としてＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（ＴＲＯＰＩＸ社）溶液１００μｌを加え室温２０分間反応させた後、発光強度を測定した。
ＢＢＩ社Ｂ型肝炎パネル血清２５例の測定結果を表３に示す。同時に測定した健常人血清１０例においては全て陰性であった。Ｂ型肝炎パネル血清２５例中１３例でＨＢＶコア抗原が陽性であった。また、ＰＨＪ２０１−０４，０５，０６，０７，０８，１２，１３，１７，２５の９例においてはＨＢｃ抗体が陽性であるにもかかわらず、ＨＢＶコア抗原を測定することができた。
本発明のモノクローナル抗体と検体処理法を組み合わせ、測定系を構築することにより、簡便にＨＢＶコア抗原を検出、定量できることが明らかとなった。
実施例５． ＨＢＶコア関連抗原の検出および測定法
抗ＨＢＶコア抗原モノクローナル抗体ＨＢ４４，ＨＢ６１，ＨＢ１１４を終濃度がそれぞれ２，１，１μｇ／ｍｌになるように０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、黒色９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）につき１００μｌ／ウェル分注し、４℃で一晩静置した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）０．４ｍｌで２回洗浄し、ブロッキング液（０．５％カゼインナトリウム，３％スクロース，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））０．４ｍｌを添加し、さらに室温で２時間静置した。ブロッキング液を除去後、真空乾燥した。
血清５０μｌに、処理液（１５％ＳＤＳ、２％Ｔｗｅｅｎ６０）を２５μｌ添加し、５６℃３０分間処理をおこない、その５０μｌを測定試料とした。
上記ウェルに反応緩衝液１００μｌと測定試料５０μｌを加え、室温で一夜反応させた。
洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４））０．４ｍｌで５回洗浄後、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識モノクローナル抗体ＨＢ９１を０．５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェル添加し、室温２時間反応させた。洗浄液０．４ｍｌで６回洗浄後、発光基質としてＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（ＴＲＯＰＩＸ社）溶液１００μｌを加え室温２０分間反応させた後、発光を測定した。
一部の検体については１０２〜１０７倍に段階希釈を行い、同様に測定すると共にＨＢｅ抗原およびＴＭＡ法によるＨＢＶ−ＤＮＡ量を測定した。
Ｂ型肝炎患者血清５０例の測定結果を表３に示す。同時に測定した健常人２７例においては全て陰性であった。ＨＢＶ−ＤＮＡ陽性の２９例中２８例でＨＢＶコア関連抗原を検出でき、ＨＢＶ−ＤＮＡ陰性の２１例中１０例でＨＢＶコア関連抗原を検出できた。すなわちＴＭＡ法より高感度にＨＢＶを検出できることが示された。また、ＨＢｅ抗体陽性の検体においてもＨＢＶコア抗原を検出できた。
ＢＢＩ社Ｂ型肝炎パネル血清２５例の測定結果を表３に示す。同時に測定した健常人血清１０例においては全て陰性であった。Ｂ型肝炎パネル血清２５例中１７例でＨＢＶコア関連抗原が陽性であった。また、ＰＨＪ２０１−１３，１５，１６，１８，２１，２５の６例においては、ＨＢｅ抗体陽性でＨＢｅ抗原陰性であるにもかかわらず、ＨＢＶコア関連抗原を測定することができた。
Ｂ型肝炎患者パネル血清４検体について１０２−１０７倍に段階希釈を行い、ＨＢＶコア関連抗原、ＨＢＶ−ＤＮＡおよびＨＢｅ抗原をそれぞれ測定し、感度を比較した。結果を表４に示す。ＰＨＪ２０１−０４，０７，０８，１３の各検体において、ＴＭＡ法によるＨＢＶ−ＤＮＡは１０５，１０４，１０３，１０４倍希釈まで、ＲＩＡ法によるＨＢｅ抗原は１０４，１０４，１０４，１０３倍希釈までそれぞれ検出できた。これに対しＨＢＶコア関連抗原は１０６，１０５，１０５，１０５倍まで希釈しても検出でき、４検体全てにおいてＨＢＶ−ＤＮＡおよびＨＢｅ抗原測定系より高感度であった。
本発明のモノクローナル抗体と検体処理法を組み合わせ、測定系を構築することにより、簡便かつ高感度にＨＢＶコア抗原を検出、定量できることが明らかとなった。
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実施例６．
実施例２と同様にして、ＨＢ１１０ハイブリドーマを樹立し、生命工学工業技術研究所に平成１３年６月７日付で、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６２４として寄託された。
実施例３と同様にモノクローナル抗体ＨＢ１１０を作製し、（サブ）クラスを同定した結果、ＩｇＧ１、κであった。
実施例３と同様にエピトープ解析を行なった結果を表５に示す。この結果より、ＨＢ１１０モノクローナル抗体はＰＨＢ−４ペプチドに反応し、その他の部分ペプチドには反応しないことから、アミノ酸番号２１−４０の領域を認識するモノクローナル抗体であることがわかった。認識部位を表６に示した。アミノ酸番号２１−４０の領域（配列番号９）を認識する抗体はこれまで報告がなく、本発明のＨＢ１１０モノクローナル抗体は新規のエピトープを認識している。
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実施例７． ＨＢＶコア関連抗原の検出および測定法
実施例５と同様にしてＨＢＶコア関連抗原測定を行った。ただし、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識モノクローナル抗体としてＨＢ９１に加えＨＢ１１０を用いた。ＢＢＩ社Ｂ型肝炎患者パネル血清４検体について１０２−１０７倍に段階希釈を行い、ＨＢＶコア関連抗原、ＨＢＶ−ＤＮＡおよびＨＢｅ抗原をそれぞれ測定し、感度を比較した。結果を表７に示す。ＰＨＪ２０１−０４，０７，０８，１３の各検体において、ＴＭＡ法によるＨＢＶ−ＤＮＡは１０５，１０４，１０３及び１０４倍希釈まで、ＲＩＡ法によるＨＢｅ抗原は１０４，１０４，１０４及び１０３倍希釈までそれぞれ検出できた。これに対しＨＢＶコア関連抗原は１０５，１０５，１０４及び１０５倍まで希釈しても検出でき、ＨＢＶ−ＤＮＡおよびＨＢｅ抗原測定系より高感度であった。
本発明のモノクローナル抗体と検体処理法を組み合わせ、測定系を構築することにより、簡便かつ高感度にＨＢＶコア抗原を検出、定量できることが明らかとなった。
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【配列表】
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