(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜８の少なくともひとつの塩基配列で示されるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、プロモーター活性を持つＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１〜８の塩基配列で示されるアスペルギルス属由来のプロモーター。
【請求項４】
アスペルギルス属がアスペルギルス・オリゼである請求項３に記載のプロモーター。
【請求項５】
アスペルギルス・オリゼのマンガン・スーパーオキシドデスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）遺伝子、銅  亜鉛・スーパーオキシドデスムターゼ（Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ）遺伝子、チトクローム  Ｐ−４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０）遺伝子、カタラーゼＡ（ｃａｔａｌａｓｅ  Ａ）遺伝子、カタラーゼＢ（ｃａｔａｌａｓｅ  Ｂ）遺伝子、スモール  Ｖ−ＡＴＰａｓｅ（ｓｍａｌｌ−Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）遺伝子、アクチン（Ａｃｔｉｎ）遺伝子、ヒストンＨ２（Ｈｉｓｔｏｎｅ−Ｈ２）遺伝子の何れかより選ばれた請求項４記載のプロモーター。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のプロモーターを利用することを特徴とする有用蛋白質遺伝子の高発現方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の新規プロモーターに関する。更に詳細には、本発明はアスペルギルス・オリゼ由来の新規プロモーター配列をクローニングし、アスペルギルス属糸状菌等を宿主として有用蛋白質およびペプチドを発現させるために必要なＤＮＡ断片を有するプラスミドと、それを用いた有用蛋白質およびペプチドの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子組換え技術の発展とともに、ヒトの有用タンパク質が大腸菌や酵母を用いて生産することが可能となってきた。しかし大腸菌を宿主としてヒトなどの真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、正常なプロセッシングが行われない、糖鎖が付着しないなどの問題点が指摘されている。また酵母によって異種タンパクの分泌生産を行う場合は、糖鎖結合はされるものの、その分泌量が非常に少ないという欠点を有する。そこで高いタンパク分泌能を持つ糸状菌が、真核生物のタンパク発現の宿主として注目されてきた。なかでも黄麹菌Aspergillus oryzaeは、清酒や味噌など醸造産業上で長く使用された実績から、異種遺伝子発現への応用に積極的に利用されている。既にMucor mieheiの酸性プロテアーゼなどがA. oryzaeを宿主として、工業生産されている。
【０００３】
このような麹菌による異種タンパクの生産には、アミラーゼ遺伝子のプロモーターが多く用いられているのが現状である。その例としては、例えばアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター（Biotechnology, 5, 368(1983))、アスペルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（Biotechnology, 6, 1419(1987)）等が挙げられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
アミラーゼ系遺伝子、特にαアミラーゼの遺伝子プロモーターは、液体培養でも非常に高発現を示し、異種タンパク生産での有用性が認められているが（特開平７−５１０６７）、培地中にデンプンあるいはオリゴ糖などの誘導物質を添加する必要がある。また異種タンパクとしてグルコアミラーゼ、グルコシダーゼなどのようなグルコースを生産する蛋白を発現させる場合、発現した蛋白によりグルコースが大量に生成するため、グルコースレプレッションにより生産量が低下する現象が見られる。したがって麹菌を用いた組換えタンパク質の生産の可能性を広げるためには、アミラーゼ遺伝子の制御系以外で、高い発現能を有するプロモーターの検索が望ましい。
【０００５】
また、麹菌の異種タンパク生産を行うプロモーターとしては、主に麹菌の分泌酵素など生産量が多いタンパクの遺伝子にターゲットが当てられている。これは麹菌は菌体外に大量のタンパクを分泌するため、このようなタンパクの遺伝子プロモータは発現能も高いと考える発想である。しかし麹菌の全タンパクの発現を見た場合、必ずしも菌体外タンパクの遺伝子が高発現しているわけではなく、菌体内のタンパクの遺伝子であっても高い発現能を有するものも存在すると考えられる。従って、麹菌の高発現プロモーターを検索する場合、菌体内タンパク遺伝子も含めて、より広範囲なスクリーニング方法が求められる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した点に鑑みてなされたものであって、麹菌の高発現プロモータを探索し、液体培養で高い発現能を有するクローンを単離し、この発現系を用いて異種タンパクを製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
本発明は、以下の様にして上記目的を達成することに成功したものである。
【０００７】
菌体内タンパクの中で生産量が多いタンパクとしては、菌体成分を構成するタンパクが一応考えられる。しかしこれらのタンパクの発現は、培養条件、培養時間に係わらず一定の場合が多く、発現量を制御したい場合には適さない。一方、外的培養条件の変化（ストレス）に対応するタンパクは、発現誘導因子が明確で、かつ短時間に効率よく発現していることに改めて着目した。そこで発明者らは、これらの状況に鑑み、ストレスに対応するタンパクの遺伝子に、異種タンパク生産に有効な高発現プロモーターが存在するとの着想を得、麹菌アスペルギルス・オリゼ（ＲＩＢ−４０）（ＡＴＣＣ  ４２１４９）のＥＳＴライブラリーから、ストレスに対応する遺伝子のホモログを抽出し、そのプロモーター領域を単離した。
【０００８】
単離する方法の一例として、麹菌のゲノムＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲ法が挙げられる。麹菌からゲノムＤＮＡを抽出してEcoRV、ScaI、DraI、PvuIIあるいはSspI等の6bpを認識して平滑末端に切断するそれぞれの制限酵素で完全消化し、そのゲノムＤＮＡ断片の両端に適当なアダプターを連結する。この両端にアダプターが連結されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として、ｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマーおよびアダプターの一本鎖部分の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う。増幅産物を電気泳動で確認し１〜２ｋｂ程度の長さを有するＤＮＡ断片を電気泳動によって単離・精製する。この断片の塩基配列を決定し、ＥＳＴ配列から推定される開始コドンより上流をプロモーター配列とする。
【０００９】
更に、得られたプロモーター断片について、下記するプロモーター解析システムを用いて、その発現能を検討した。プロモーター解析を行うについては、検討しようとするプロモーターの下流域にレポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の活性をプロモーター発現の指標とする方法を採用した。そして各種遺伝子のプロモーターについて検討した結果、好適なプロモーターを発見し、更に研究の結果、遺伝子の高発現システムの創製に成功し、本発明の完成に至ったものである。
【００１０】
プロモーター解析システムとしては、例えば、ｐＮＧＵＳ（特開平１１−２４３９６５）のほか、図１に示すようなプロモーター解析用プラスミド（プロモーター活性測定用プラスミドｐＮＧＳ−１）等を使用する。このプラスミドは、形質転換用マーカーであるA. oryzaeのｎｉａＤ遺伝子（S.Unklesら、Mol. Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989）と、レポーター遺伝子である大腸菌のβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sci., p.8447-8451, 1986）を含むものであって、新規である。このプラスミドのｕｉｄＡ遺伝子の上流域（例えばＳａｌＩ、ＰｓｔＩサイト）に、検討しようとする種々の遺伝子プロモーターあるいはその一部分を挿入し、構築されたプロモーター解析用プラスミドを麹菌宿主、例えばA. oryzae(Aspergillus oryzae GLB-01：本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５８２６として既に寄託されている）のｎｉａＤ変異株（硝酸資化能欠損株、Nitrate Reductase欠損）に導入し、これをAspergillus oryzae 1013‐niaＤと命名した。本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−17707として寄託されている。導入プラスミドが宿主染色体上のｎｉａＤ  ｌｏｃｉで１コピーだけ導入された形質転換体（１コピーだけ相同組換えを起こした株）を選択する。そして、これらの形質転換体（遺伝子導入株）を種々の条件で培養し、菌体内のＧＵＳ活性を測定することにより、プロモーター発現能（プロモーター活性の指標）とした。
【００１１】
上記スクリーニング方法で種々検討した結果、以下に挙げる遺伝子のプロモーターが液体培養で強力に発現していることを見いだした。
マンガン・スーパーオキシドデスムターゼ（Mn-SOD）遺伝子、銅  亜鉛・スーパーオキシドデスムターゼ（Cu、Zn-SOD）遺伝子、チトクローム  Ｐ−４５０（cytochrome P-450）遺伝子、スモール  Ｖ−ＡＴＰａｓｅ（small-V-ATPase）遺伝子、アクチン（Actin）遺伝子、カタラーゼＡ（catalase A）遺伝子、カタラーゼＢ（catalase B）遺伝子、ヒトスンＨ２（Histone-H2）遺伝子。
【００１２】
本発明に係る上記遺伝子のプロモーターの塩基配列を、それぞれ、配列表の配列番号１〜８、及び図２〜９に示す。
【００１３】
本発明のプロモーターは、上述のようにして決定された塩基配列に対してストリンジェントな条件、例えば、０．１％  ＳＤＳ（６０℃、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ソーダ）でハイブリダイズする塩基配列をも包含する。
【００１４】
本発明のプロモーターは、その下流に、所望の有用タンパク質遺伝子を連結したベクターを構築し、該ベクターで宿主を形質転換し、それを培養することにより、有用タンパク質を著量生産させることができる。宿主としては、アスペルギルス・オリゼをはじめ、その他のアスペルギルス属、ノイロスポラ属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、リゾプス属などの微生物が使用できる。特に、発現効率の点から、宿主として、アスペルギルス・オリゼを用いることが好ましい。
【００１５】
得られたプロモーターへの有用タンパク質遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、それ自体公知の方法で行うことができる。有用タンパク質遺伝子としては、特に限定するものではない。また、ベクターとしては、アルギニン要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトアミド資化などの炭素、窒素源資化遺伝子、オリゴマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子などを包含するものが挙げられる。宿主の形質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該形質転換体の培養も常法に従って、所望のタンパク質に適した培地、培養条件を適宜選択することにより行うことができ、得られたタンパク質の採取、精製も公知の方法で行うことができる。
【００１６】
以下、実施例を参照しながら本発明を詳細に説明するが、実施例に使用したプラスミドなどは一例として挙げたものであり、本発明に使用できるものであればこれらに限定されるものではない。
【００１７】
【実施例１】
（有用遺伝子のプロモーター断片の単離方式）
クロンテック社製Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒを用いて、プロモーター断片取得用のテンプレートＤＮＡライブラリーを構築した。まずA. oryzaeゲノムＤＮＡを５種類の制限酵素（DraI, EcoRV, PvuII, ScaI, StuI）で切断し、各制限酵素で切断したゲノムＤＮＡに対してその両端に非対称アダプターを連結し、ＰＣＲ増幅用のゲノムテンプレートとする。次にＥＳＴ情報から得られる遺伝子のアンチセンス配列から設計したプライマーと、アダプターの非対称部分から設計したプライマーを用いて、先に作成したゲノムテンプレートに対してＰＣＲ反応を行う。反応条件の一例は、次のとおりである。
【００１８】
（ＰＣＲ条件）
・９５℃（１分）、１サイクル
・９４℃（５秒）、７２℃（３分）、７０℃（３分）、７サイクル
・９４℃（５秒）、６７℃（３分）、７０℃（３分）、３２サイクル
・６７℃（４分）、１サイクル
【００１９】
５種類のテンプレートそれぞれについてＰＣＲ反応後、１〜３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたものについて、電気泳動装置を用いて単離した。これらの断片の塩基配列を決定し、開始コドン上流をプロモーター部分とした。
【００２０】
【実施例２】
（有用遺伝子のプロモーター活性の測定方法）
まず目的とするプロモーター断片をプロモータ活性測定用プラスミドに挿入する。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒで単離したプロモーターＤＮＡ断片をテンプレートとして、プロモーター下流にＳａｌＩサイトが、上流にＰｓｔＩサイトが生じるようにデザインしたプライマーによりＰＣＲ反応を行う。次に増幅されたＤＮＡ断片をＳａｌＩ  ＰｓｔＩで消化した後、プロモーター活性測定用に開発したプラスミドｐＮＧＳ１（図１）のＧＵＳ遺伝子（つまり、ｕｄｉＡ遺伝子）上流に挿入する。この結果、挿入したプロモーターの支配下でレポーター遺伝子であるＧＵＳ遺伝子が発現し、プロモーターの発現能をＧＵＳ活性で測定することができる。このプラスミドでA. oryzaeを形質転換し、プラスミドが宿主ゲノムのｎｉａＤ  ｌｏｃｕｓに１コピーのみ導入された形質転換体を選択する。この形質転換体を様々な培養条件で培養し、ＧＵＳ生産能を測定し、それぞれのプロモータ発現能とした。プラスミドｐＮＧＳ１は、これを担持する微生物が寄託されているので、例えばAspergillus oryzae  1013−niaＤ（FERM P−17707）からこれを取り出し、このSalI、PstIサイトに目的とするプロモーターを挿入することにより（これらのプロモーターは、本発明によりその塩基配列が決定されているので、これを合成又は抽出等常法によって容易に得ることができる。）、発現用プラスミドを容易に構築することができ、このプラスミドをAspergillus oryzae niaＤ変異株に導入すれば形質転換体を容易に作製することができる。そこで、得られた形質転換体を培養する等常法によって処理することにより、ＧＵＳを大量に得ることができ、本発明を容易に実施することができる。また、ＧＵＳ遺伝子にかえて他の有用蛋白質遺伝子を導入すれば、この有用蛋白質を効率よく発現させることができる。
【００２１】
【実施例３】
(マンガン・スーパーオキシドデスムターゼ(Mn-SOD）遺伝子、銅・亜鉛・スーパーオキシドデムスターゼ（Cu、Zn-SOD）遺伝子のプロモーターの発現能の検討）表１に示すように、単離したプロモーターの支配下で大量のＧＵＳタンパクが生産され、このプロモーターの有効性が示された。またＭｎ−ＳＯＤ遺伝子プロモーター（１０３８塩基：配列番号１）に関しては、リノール酸やＨ２Ｏ２などによる酸化ストレスと培養温度、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ遺伝子プロモーター（９００塩基：配列番号２）に関しては培養温度で誘導を受けることが示された。
【００２２】
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【００２３】
【実施例４】
（スモール  Ｖ−ＡＴＰａｓｅ（small-V-ATPase）遺伝子、アクチン（Actin）遺伝子、ヒストンＨ２（Histone-H2）遺伝子のプロモーターの発現能の検討）
表２に示すように、スモール  Ｖ−ＡＴＰａｓｅ（small-V-ATPase）遺伝子（１１９６塩基：配列番号４）、アクチン（Actin）遺伝子（１００１塩基：配列番号５）、ヒストンＨ２（Histone-H2）遺伝子（６８５塩基：配列番号８）のいずれのプロモーターによっても、ＧＵＳタンパクを生産することが可能であった。またＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培養（ツァペック−ドックス培地での培養）とＤＲＹ培養（デキストリン−ペプトン−酵母エキス培地での培養）を比較した場合、アクチン（Actin）遺伝子、ヒストンＨ２（Histone-H2）遺伝子のプロモーターでは、ＤＲＹ培養の方が、またスモール  Ｖ−ＡＴＰａｓｅ（small-V-ATPase）遺伝子プロモーターの場合は、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培養のほうが発現能が高いことが示された。
【００２４】
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【００２５】
【実施例５】
（Ｐ−４５０遺伝子のプロモーターの発現能の検討）
表３に示すように、チトクロームＰ−４５０遺伝子のプロモーター（１２１４塩基：配列番号３）を利用してＧＵＳタンパクを生産することが可能であった。またＰ−４５０遺伝子プロモーターは、培地の窒素源の種類により、誘導や抑制を受けることが明らかとなった。硝酸や亜硝酸を単一窒素源とした場合、非常に高いＧＵＳ生産性が認められたが、アンモニアを窒素源とした場合は生産性の著しい低下が認められた。このように窒素源によってプロモーター活性が誘導、抑制を受けることは、発現能をコントロールできることになり、有効である。
【００２６】
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【００２７】
【実施例６】
（カタラーゼ（catalase）遺伝子のプロモーターの発現能の検討）
表４に示すように、カタラーゼ遺伝子のプロモーターを利用してもＧＵＳタンパクを生産することが可能であった。カタラーゼＡ、Ｂ遺伝子プロモータ（５５０塩基：配列番号６）、（６６３塩基：配列番号７）は過酸化水素や鉄イオンなどの添加により、さらに発現能が増加した。
【００２８】
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【００２９】
【発明の効果】
本発明によって、アスペルギルス・オリゼのマンガン・スーパーオキサイドデスムターゼ遺伝子その他７種類の遺伝子について、それぞれ、プロモーター領域及びその塩基配列が決定された。そして、これらの新規プロモーターは、レポーター遺伝子を利用するプロモーター解析の結果、強力なプロモーターであることがはじめて確認された。
【００３０】
このように本発明によって新たに開発された強力なプロモーターを利用することにより、タンパク質の新規高発現システムの構築が可能となった。この新規プロモーターを用いる新規高発現システムを利用することにより、麹菌その他の糸状菌、あるいはそれ以外の微生物を宿主菌として、同種のタンパク質はもとより異種のタンパク質も効率的に生産することができる。
【００３１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プロモーター活性測定用プラスミドｐＮＧＳ１を示す。
【図２】Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
【図３】Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
【図４】チトクローム  Ｐ−４５０遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
【図５】スモール−Ｖ−ＡＴＰａｓｅ遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
【図６】アクチン遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
【図７】カタラーゼＡ遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
【図８】カタラーゼＢ遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
【図９】ヒストン−Ｈ２遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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