(57)【要約】自家骨を採取することなく、骨又は歯周組織欠損部の修復、再生を効果的に行うことができ、かつ操作性、安全性の高い骨又は歯周組織形成用組成物を提供する。ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ　Ｐｌａｓｍａ）と、平均粒子径１μｍ〜５μｍのβ−ＴＣＰとを混合し、これへトロンビン、塩化カルシウム溶液を加えて攪拌することによりゲル状の組成物を構成する。
2002040071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＲＰと、無機系生体吸収性材料とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項２】
血小板と、フィブリノーゲンと、無機系生体吸収性材料とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項３】
血小板と、フィブリンと、無機系生体吸収性材料とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項４】
血小板と、無機系生体吸収性材料とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項５】
前記無機系生体吸収性材料は、β−リン酸三カルシウム、α−リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、及び非結晶質リン酸カルシウムからなる群から選択される一又は二以上の無機系生体吸収性材料である、ことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項６】
前記無機系生体吸収性材料は、平均粒子径が０．５μｍ〜５０μｍである、ことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項７】
前記無機系生体吸収性材料は、３０重量％〜７５重量％含有される、ことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項８】
骨形成能を有する細胞をさらに含んで調製される、ことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の骨又は歯周組織形成用組生物。
【請求項９】
ＰＲＰと、骨形成能を有する細胞とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１０】
血小板と、フィブリノーゲンと、骨形成能を有する細胞とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１１】
血小板と、フィブリンと、骨形成能を有する細胞とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１２】
血小板と、骨形成能を有する細胞とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１３】
フィブリノーゲンと、無機系生体吸収性材料と、骨形成能を有する細胞とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１４】
前記無機系生体吸収性材料は、β−リン酸三カルシウム、α−リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、及び非結晶質リン酸カルシウムからなる群から選択される一又は二以上の無機系生体吸収性材料である、ことを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１５】
ＰＲＰと、アルギン酸塩と、骨形成能を有する細胞とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１６】
使用時において注射容器を用いて注入可能な流動性を有する、ことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１５項のいずれかに記載の骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１７】
ゲル化材料をさらに含んで調製される、ことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１６項のいずれかに記載の骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１８】
前記ゲル化材料は、トロンビン及び塩化カルシウムである、ことを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項１９】
使用時に凍結状態から解凍されて使用される、ことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１８項のいずれかに記載の骨又は歯周組織形成用組成物。
【請求項２０】
請求の範囲第１項ないし第１９項のいずれかに記載の骨又は歯周組織形成用組成物を注射容器に封入してなる骨又は歯周組織形成用注射剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、骨組織又は歯周組織の修復、再生に利用できる骨又は歯周組織形成用組成物に関する。
背景技術
骨組織、歯周組織の損傷、欠損等を修復し又は再生することを目的とした様々な手法の開発が行われている。その一つとして、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ　Ｐｌａｓｍａ（ＰＲＰ）を用いた手法が試みられている。ＰＲＰは、血小板を多く含む血漿であり、採取した血液を所定の条件にて遠心することにより調製される（Ｄｅａｎ　Ｈ．Ｗｈｉｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．：Ｊ　Ｏｒａｌ　Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ　Ｓｕｒｇ，５５，１２９４−１２９９（１９９７））。従来、外科手術後の治癒促進剤としてフィブリン糊（Ｆｉｂｌｉｎ　Ｇｌｕｅ）が広く使用されているが（Ｒｅｎａｔｏ　Ｓａｌｔｚ　ｅｔ　ａｌ．：Ｐｌａｓｔｉｃ　Ａｎｄ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８，１００５−１０１５（１９９１））、ＰＲＰをフィブリン糊の代替として使用することにより、創傷部の治癒促進、また骨移植等の効果の向上等を図る研究が行われている（Ｄｅａｎ　Ｈ．Ｗｈｉｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．：Ｊ　Ｏｒａｌ　Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ　Ｓｕｒｇ，５５，１２９４−１２９９（１９９７））。
ＰＲＰの適用分野は広く、例えば、耳鼻咽喉科、口腔外科、顎顔面外科等の分野において骨の再建等に応用されている（Ｅｄｕａｒｄｏ　Ａｎｉｔｕａ：Ｉｎｔ　Ｏｒａｌ　Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ　Ｉｎｐｌａｎｔｓ，１４，５２９−５３５（１９９９）、Ｄｅａｎ　Ｈ．Ｗｈｉｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．：Ｊ　Ｏｒａｌ　Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ　Ｓｕｒｇ，５５，１２９４−１２９９（１９９７））。ＰＲＰには、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β１（ＴＧＦ−β１）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β２（ＴＧＦ−β２）等の成長因子を豊富に含んでおり、これらの成長因子が複合的に作用することにより、骨組織の再生等を促すものと考えられている（Ｍａｒｘ　ＲＥ．ｅｔ　ａｌ．：Ｏｒａｌ　Ｓｕｒｇ　Ｏｒａｌ　Ｍｅｄ　Ｏｒａｌ　Ｐａｔｈｏｌ，８５，６３８−６４６（１９９８））。ＰＤＧＦに関していえば、ＰＤＧＦは約３０ｋＤの分子量の糖タンパクであり、創傷治癒を促進させる効果を有することが確認されている。ＰＤＧＦは、細胞の有糸分裂の促進、毛細血管の新生を促すことによる血行の改善、或いは他の増殖因子の効果を高めることによる繊維芽細胞、骨芽細胞等の分化、増殖の促進等を介して創傷治癒を促進するものと考えられている。
一方、近年において、歯槽堤萎縮症に対してインプラント治療が行われているが、高度歯槽堤萎縮症例では骨移植が必要となる場合がある。一例を示せば、上顎高度歯槽堤萎縮症例の治療には、骨移植を伴う上顎洞底挙上術が行われる。しかしながら、上顎洞底挙上術の治癒期間が長期に渡るため、インプラント治療の治療期間を長期化しているのが現状である。最近、顎骨欠損に対する骨移植においてＰＲＰを用い、これによりその治癒期間が短縮されたとの報告がなされ（Ｍａｒｘ　ＲＥ．ｅｔ　ａｌ．：Ｏｒａｌ　Ｓｕｒｇ　Ｏｒａｌ　Ｍｅｄ　Ｏｒａｌ　Ｐａｔｈｏｌ，８５，６３８−６４６（１９９８））、インプラント治療においてもＰＲＰを用いることの有用性が示されている。
発明の開示
以上のように、ＰＲＰを用いた臨床的な研究がなされているものの、臨床応用が先行し、基礎的研究による骨動態についての報告がないこともあって、ＰＲＰの作用についての知見が十分でなく、実際の臨床に応用できる骨又は歯周組織の再生方法の開発が切望されているのが現状である。かかる再生方法には、骨又は歯周組織の再生効果が高いことは勿論のこと、操作性及び安全性の高いことが要求される。
そこで、本発明は、臨床に応用し得る新規な骨又は歯周組織の再生方法を提供すべく、当該方法に使用される骨又は歯周組織形成用組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、以上の課題に鑑み鋭意検討を行った。第一に、ＰＲＰと無機系生体吸収性材料とを組み合わせて移植材料を構成しこれを用いた骨再生の検討を行ったところ、適用箇所において適応部に存在する細胞に対する骨誘導能を増幅させることができ、高い骨再生効果が認められることを見出した。また、ＰＲＰに粒子状の無機系生体吸収性材料を含有することにより、適度な可塑性ならびに形態の保持を有することが容易になることも示唆された。
一方、ＰＲＰと骨形成能を有する細胞とを混合しこれをゲル化したものを移植材料として用いて骨再生を試みたところ、良好な骨再生効果が認められた。
更に、フィブリノーゲンと、無機系生体吸収性材料と、骨形成能を有する細胞とを混和した移植材料を用いて骨再生を試みたところ、高い骨再生効果が認められた。また、ＰＲＰと、アルギン酸塩（アルジネート）と、骨形成能を有する細胞とを混和した移植材料を用いて骨形成を試みたところ、良好な骨再生効果が認められた。
本発明は以上の検討の結果に基づくものであり、次の構成からなる。即ち、本発明の第１の局面は、ＰＲＰと、無機系生体吸収性材料とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物である。また、本発明の第２の局面は、ＰＲＰと骨形成能を有する細胞とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物である。
更に本発明の他の局面は、フィブリノーゲンと、無機系生体吸収性材料と、骨形成能を有する細胞とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物である。本発明の更なる他の局面は、ＰＲＰと、アルギン酸塩（アルジネート）と、骨形成能を有する細胞とを含んでなり、使用時において流動性を有する骨又は歯周組織形成用組成物である。
ここで、骨又は歯周組織形成用組成物の流動性は、使用時において注射容器を用いて注入可能な流動性を有することが好ましい。
本発明の骨又は歯周組織形成用組成物は、ゲル化材料をさらに含んで調製することができる。ゲル化材料としてはトロンビン及び塩化カルシウムを用いることができる。
本発明の骨又は歯周組織形成用組成物は、一旦凍結状態にした後、使用時に凍結状態から解凍して使用することができる。
一方、上記の骨又は歯周組織形成用組成物を注射容器に封入して骨又は歯周組織形成用注射剤を構成することができる。
本発明における無機系生体吸収性材料としては、β−リン酸三カルシウム、α−リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、及び非結晶質リン酸カルシウムからなる群から選択される一又は二以上の無機系生体吸収性材料を用いることができる。無機系生体吸収性材料としては、平均粒子径が０．５μｍ〜５０μｍのものを用いることができる。また、無機系生体吸収性材料の含有量としては、例えば、３０重量％〜７５重量％とすることができる。
以上のような本発明の構成によれば、骨形成系の細胞の増殖、分化促進効果を有する成長因子を豊富に含むＰＲＰを含有するため、これらの成長因子により、適用部位（移植部）において効果的な骨組織又は歯周組織の再生が期待できる。
また、使用時において流動性を有することにより、骨又は歯周組織欠損部の形状に合わせて予め成型する必要がないため汎用的であり、また、その取り扱いも容易である。
さらに、自家のＰＲＰを用いれば毒性がなく、しかも免疫非活性な成長因子を適用することができその安全性は高い。
加えて、無機系生体吸収性材料を併せて用いることにより、これが適用部位における骨細胞等の足場となり、骨組織等の再生をより促進させることができる。また、無機系生体吸収性材料は将来骨組織への置き換えが行われるものであってその安全性が高い。
他方、骨形成能を有する細胞を含むことにより、それ自体による直接的な骨組織の再生が期待できる。
このように、本発明の構成によれば、自家骨を採取することなく、骨又は歯周組織欠損部の修復、再生を効果的に行うことができ、かつ操作性、安全性の高い骨又は歯周組織形成用組成物が提供される。
発明を実施するための最良の形態
ＰＲＰとは、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ　Ｐｌａｓｍａのことをいい、即ち血小板を豊富に含む血漿である。換言すれば、血小板が濃縮された血漿のことをいう。ＰＲＰは、例えば、Ｗｈｉｔｍａｎらの方法（Ｄｅａｎ　Ｈ．Ｗｈｉｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．：Ｊ　Ｏｒａｌ　Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ　Ｓｕｒｇ，５５，１２９４−１２９９（１９９７））に準じて、採取した血液を遠心分離処理に供することにより調製することができる。ＰＲＰは、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β１（ＴＧＦ−β１）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β２（ＴＧＦ−β２）等の成長因子を豊富に含むことが知られている（Ｊａｒｒｙ　Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ：Ｏｒａｌ　ｓｕｒｇ　Ｏｒａｌ　Ｍｅｄ　Ｏｒａｌ　Ｐａｔｈｏｌ　Ｏｒａｌ　Ｒａｄｉｏｌ　Ｅｎｄｏｄ，８５，６３８−６４６（１９９８））。
ここで、ＰＲＰの調製方法の一例を示せば、まず、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置する。その後、血球及び軟膜が分離する条件（例えば約５，４００ｒｐｍ）で遠心処理する。これにより、２層（上層はＰｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ　Ｐｌａｓｍａと呼ばれる。下層には、血球及び軟膜が含まれる）に分離される。上層を取り除いた後、更に、赤血球が分離される条件（例えば、約２，４００ｒｐｍ）で遠心処理する。その結果得られた赤血球を実質的に含まない画分（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ　Ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）を採取する。ＰＲＰの調製方法は当該方法に限定されるものではなく、必要に応じて修正を加えた方法により調製することができる。
ＰＲＰに含まれる血小板の量についての一般的な定義はないが、採取した血液に比較して約５倍〜約２０倍の血小板を含有する血漿を本発明におけるＰＲＰとして用いることができる。尚、その調製が可能であり、かつ調製に際して非現実的な負担のない限りにおいて、血小板の含有量ができるだけ豊富なものを用いることが好ましい。
好ましくは、自己血のＰＲＰを用いる。これにより、毒性ないし免疫拒絶反応の恐れがなくなる。
ＰＲＰは血小板、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２等の成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）、及びフィブリノーゲンを豊富に含む。そこで、血小板、ＴＧＦ−β１等の成長因子、及びフィブリノーゲンをそれぞれ用意し、これらを混合したものを本発明におけるＰＲＰとして用いることもできる。血小板、各種の成長因子、及びフィブリノーゲンは公知の方法により調製したもの、又は市販のものを用いることができる。
一方、ＰＲＰは特に血小板を豊富に含み、フィブリノーゲンの含有量も多いことから、ＰＲＰに代えて、血小板、フィブリノーゲン、又は血小板及びフィブリノーゲンを用いて骨又は歯周組織形成用組成物を構成した場合においても骨再生効果が得られるものと予測される。このことから、ＰＲＰの代わりに、血小板、フィブリノーゲン、又は血小板及びフィブリノーゲンを用いて本発明の骨又は歯周組織形成用組成物を構成することも可能である。また、ここでのフィブリノーゲンの代わりにフィブリンを用いることもできる。即ち、例えばＰＲＰの代わりにフィブリン糊を含有させて本発明の組成物を構成できる。
本発明組成物の使用時における流動性の程度は特に限定されず、ゲル状、スラリー状、ペースト状、粘土状、高粘度流動体状等とすることができる。好ましくは、ゲル状又はペースト状である。ゲル状又はペースト状とすることにより、可塑性に優れた骨又は歯周組織形成用組成物となる。したがって、予め適用部の形状に成型することなく適用できる。即ち、適用部への適用が容易に行える。また、適用部において定着性の良い骨又は歯周組織形成用組成物となる。
また、使用時において注射容器を用いて注入可能な程度の流動性であることが好ましい。かかる流動性とすることにより、適用部への適用が一層容易となる。
尚、適用部に応じて所望の流動性とすることができる。例えば、骨膜下に注入する場合には、より流動性を有する状態（粘度の低い状態）にすることが好ましい。
本発明の組成物は、少なくとも使用時において流動性を有しておればよく、使用前においては粉状ないし固形状であっても良い。したがって、凍結した状態をもって本発明の組成物とすることができる。また、凍結乾燥した状態をもって本発明の組成物とすることもできる。使用前において凍結状態又は凍結乾燥状態とすることにより長期の保存が可能となり、また、使用前の取り扱いも容易となる。さらには、凍結処理又は凍結乾燥処理により抗原性の低下が期待できるため、自家のＰＲＰではなく同種の他家のＰＲＰを用いた場合の安全性が向上される。
本発明における無機系生体吸収性材料の種類は特に限定されないが、β−リン酸三カルシウム（以下、「β−ＴＣＰ」という）、α−リン酸三カルシウム（以下、「α−ＴＣＰ」という）、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、及び非結晶質リン酸カルシウムからなる群から選択される材料を用いることができる。これらの材料は単独で用いることができることはもちろんのこと、任意に選択した２種以上を組み合わせて用いても良い。好ましくは、β−ＴＣＰ又はα−ＴＣＰのいずれか、又はこれらを任意の割合で組み合わせて用いる。さらに好ましくはβ−ＴＣＰを無機系生体吸収性材料として用いる。
無機系生体吸収性材料は公知の方法により得ることができる。また、市販される無機系生体吸収性材料を用いることもできる。β−ＴＣＰとしては、例えば、オリンパス光学工業株式会社製のものを利用できる。
無機系生体吸収性材料は、本発明の骨又は歯周組織形成用組成物（以下、「本発明組成物」という）が使用時において流動性となるような粒子径を有する粉末状であることが好ましい。
粉末状の無機系生体吸収性材料は、適当な大きさに加工された無機系生体吸収性材料を、所望の粒子径となるまで破砕、粉砕することにより調製することができる。無機系生体吸収性材料の平均粒子径を、０．５μｍ〜５０μｍとすることが好ましい。さらに好ましくは、平均粒子径０．５μｍ〜１０μｍの無機系生体吸収性材料を用いる。さらにさらに好ましくは、平均粒子径１μｍ〜５μｍの無機系生体吸収性材料を用いる。粒子径の異なる複数種類の無機系生体吸収性材料を組み合わせて用いることも可能である。
無機系生体吸収性材料は本発明組成物全体に対して３０重量％〜７５重量％含有することが好ましい。
尚、本発明組成物の流動性は、無機系生体吸収性材料の粒子径、及び含有率で調整することができ、両者を適宜調整することにより所望の流動性を得ることができる。また、後述のゲル化材料、及び又は増粘剤を添加する場合には、これらの添加量によっても流動性の調整を行うことができる。
ゲル化材料をさらに含有させて本発明組成物を構成することもできる。例えば、トロンビンと塩化カルシウムを添加して本発明組成物を構成することができる。これらを添加することにより、トロンビンがＰＲＰ中のフィブリノーゲンに作用しフィブリンが生ずる。そして、フィブリンの凝集作用により粘性が増加する。ゲル化剤の種類は特に限定されず、上記のようにＰＲＰ中の成分に作用して粘性を増加させるもの、又はそれ自身により増粘効果を奏するものを適宜選択して用いることができる。
また、上記のゲル化材料に加えて、適用後（移植後）に作用して本発明組成物の流動性（粘度）を変化させる第２のゲル化材料を併用することもできる。このような構成とすれば、使用時には適度な流動性を有するために移植が容易であり、かつ、適用後にはより粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨又は歯周組織の修復又は再生を効果的に行うことができる。また、予め適用部位の形状に成型する必要がなく、汎用性が高い。
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、上記の例の他、コラーゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、本発明組成物の適用目的（適用組織）に適したものを採用することが好ましい。骨組織の再生を目的とする場合には、例えば、Ｉ型コラーゲンを用いることができる。用いるコラーゲンは可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）であることが好ましい。
増粘剤を添加することにより、本発明組成物の流動性を調整することもできる。増粘剤としては、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等を用いることができるが、安全性及び／又は骨形成能の観点から、生体親和性が高く、かつ生体吸収性又は生体分解性のものを用いることが好ましい。グリセリン等を添加することにより、凍害防止の効果も得られる。
例えば、アルギン酸塩（アルジネート）を採用することにより、アルギン酸塩と、骨形成能を有する細胞と、ＰＲＰとを含有させてなる組成物を構成することができる。この組合せによる組成物を用いることにより、良好な骨再生効果が認められる（後述の実施例を参照）。
本発明組成物は、水系の溶媒を含むものであってもよい。即ち、本発明の第１の局面では、水系の溶媒中において少なくともＰＲＰと無機系生体吸収性材料とが混合されて構成されるものであってもよい。本発明の第２の局面においては、水系の溶媒中において少なくともＰＲＰと骨形成能を有する細胞とが混合されて構成されるものであってもよい。水系の溶媒としては、滅菌水、生理食塩水、リン酸塩溶液等の緩衝液等を用いることができる。
本発明組成物は、上記の成分の他、安定化剤、保存剤、ｐＨ調整剤等を含んでいても良い。また、成長因子、特に骨誘導因子（ＢＭＰ）を含有させることもできる。
骨形成能を有する細胞とは骨組織を形成し得る細胞をいい、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞等が含まる。これらの細胞を任意に組み合わせて用いてもよい。好ましくは、骨形成能を有する細胞として、骨系細胞への分化能を獲得した細胞を用いる。ここで、「骨系細胞への分化能を獲得した」とは、未分化の状態であったものが骨系細胞へ分化すべく方向づけられた状態をいう。
骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞として、自家細胞に限らず、同種由来の他家細胞を用いることができる。特に、人の間葉系幹細胞由来の細胞を用いることができる。
骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞（以下、「骨系分化能獲得細胞」という）は、未分化の間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣｓ）を骨系細胞への分化を誘導する条件下で培養することにより調製することができる。例えば、β−グリセロリン酸（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ）、Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ）を含む培地で未分化の間葉系細胞を培養することにより、骨系細胞への分化を誘導することができる。もちろん、培養条件はこれに限定されるものではなく、骨系細胞への分化を誘導する条件として公知のものを採用することができる。
未分化の間葉系幹細胞源としては、骨髄、骨膜、歯髄、さい帯血を挙げることができる。これらを常法に従い採取した後、未分化の間葉系細胞を接着性の有無により選択する。即ち、骨髄等に含まれる細胞の中で接着性を有するものを選択することにより、未分化の間葉系幹細胞が得られる。
骨系分化能獲得細胞を含有させる場合に、該細胞の細胞外基質をも加えて本発明組成物を構成することができる。本発明組成物を適用した部位において、細胞外基質が骨分化能獲得細胞の足場となることが期待され、適用部位において骨分化能獲得細胞が定着し易くなると考えられるからである。また、適用部位周囲に存在する骨系細胞の足場ともなり、高い骨誘導能が期待できるからである。さらに、細胞外基質に含まれるＢＭＰ等の因子が本願組成物に含有される骨系分化能獲得細胞自体、及び適用部周囲の骨系細胞ないしは骨系細胞への分化能を備えた幹細胞の成長、増殖、分化を促進することが期待できるからである。ここでの細胞外基質とは、骨系分化能獲得細胞を取り巻いて存在する基質（マトリックス）である。
自家細胞の細胞外基質に限らず、同種の他家細胞の細胞外基質を用いることもできる。かかる細胞外基質に含まれるＢＭＰ等が同種であるため、他家細胞を用いた場合においても同様の効果が期待できるからである。このように、自家細胞の細胞外基質のみならず同種細胞の細胞外基質をも用いることができることは、骨系分化能獲得細胞の細胞外基質の調製を容易とするものである。
細胞外基質を加える場合には、同時に加えられる骨系分化能獲得細胞は生細胞でなくても良い。このことは骨系分化能獲得細胞を生細胞の状態で取り扱わなくても良いことを意味し、取り扱いの観点から望ましいものといえる。例えば、骨系分化能獲得細胞を得た後、凍結乾燥処理等をしたものを用意し、これを骨系分化能獲得細胞及びその細胞外基質として用いることができる。
本発明の組成物における骨系分化能獲得細胞の含有量は、組成物１ｍｌ中に１×１０５個以上の細胞が存在することが好ましく、さらに好ましくは１×１０６〜１×１０７個の細胞が存在することが好ましい。かかる細胞含有量とすることにより、効果的に骨形成を誘導できるからである。
本発明の第１の局面においても、上記骨形成能を有する細胞を含有させて骨又は歯周組織形成用組成物を構成することができる。この場合には、骨系分化能獲得細胞の細胞外基質（細胞外マトリックス）をも加えて組成物を構成してもよい。
本発明の組成物は上記の各成分を混合することにより調製される。本発明の第１の局面として、ＰＲＰ、β−ＴＣＰ（無機系生体吸収性材料）、及びトロンビン及び塩化カルシウム（ゲル化材料）を混合してゲル状の組成物を調製する場合の調製方法の一例を示す。まず、ＰＲＰを上記の方法により調製し、これへβ−ＴＣＰを添加して混合する。その後、塩化カルシウム溶液とトロンビンとの混合液を加え、シリンジ内で空気とともによく攪拌する。
本発明の組成物を凍結した状態又は凍結乾燥した状態として調製した場合には使用時に所望の流動性を有する状態にする。凍結状態の場合には、解凍することにより凍結前の状態に戻される。このとき、生理食塩水等を加えて所望の流動性に調整することもできる。他方、凍結乾燥状態の場合には、生理食塩水等の溶媒を加えることにより凍結乾燥処理前の流動性又は所望の流動性を有する状態にする。
本発明の組成物を注射容器に封入することにより骨又は歯周組織形成用注射剤（以下、「本願注射剤」という）とすることができる。例えば、流動性を有する状態で調製した本願組成物を注射容器に封入し、その後凍結又は凍結乾燥させて本願注射剤とする。このような注射剤とすることにより取り扱いが一層容易となる。すなわち、適用時に従来のごとく皮膚又は粘膜に切開を加えることなく経皮的又は経粘膜的に本願注射剤を注入することで所望の効果を期待できる。このような本願注射剤は、その中に封入される骨又は歯周組織形成用組成物を上記同様に所望の流動性を有する状態にした後、使用されるものである。注射容器の種類は特に限定されず、例えば市販の注射器を用いることができる。
以下、本発明の第１の局面における実施例を説明する。
［実施例１］ＰＲＰの採取
（１−１）ウサギからの血液採取
体重３．１−３．３ｋｇの日本白色ウサギ２４匹の耳介静脈からペントバルビタールを投与して全身麻酔を行った後、耳介から９ｍｌの血液を２０ｃｃの滅菌シリンジ（テルモ株式会社製）により採取した。次に、３．８％クエン酸ナトリウム溶液０．５ｍｌを真空採血管（４．５ｃｃ、テルモ株式会社製）２本にそれぞれ入れた後、採取した血液９ｍｌを４．５ｍｌずつに分けて注入し、室温にて保存した。このようにして、各ウサギについての血液サンプルを得た。
（１−２）ＰＲＰの分離
保存した各血液サンプルを１０ｍｌの遠沈管に移し、遠心分離器を用いて５，４００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。遠心分離された血液は、密度の違いにより三つの層に分かれた。上層から順に、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ　Ｐｌａｓｍａ（無血小板血漿、ＰＰＰ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ　Ｐｒａｓｍａ（ＰＲＰ）、赤血球の３層である。最上層のＰＰＰ（約５．５ｍｌ）をマイクロピペットを用いて除去した。次に、ＰＰＰ以外の残り（約３．５ｍｌ）の血液成分に対して遠心分離器を用いて２，４００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。この操作により、赤血球とＰＲＰが分離された。上層がＰＲＰであり、これをマイクロピペットを用いて採取した。各血液サンプル（９ｍｌ）から最終的にそれぞれ約０．３５ｍｌのＰＲＰが採取された。
［実施例２］ＰＲＰ中の血小板数の測定
体重３．１−３．３ｋｇの日本白色ウサギ２４匹の耳介静脈からペントバルビタールを投与して全身麻酔を行った後、耳介から各々９ｍｌの血液２０ｃｃの滅菌シリンジ（テルモ株式会社製）により採取した。２４匹のうち１２匹から採取した血液に含まれる血小板数を測定したところ、平均４３．４×１０４／ｍｍ３であった。また、残りの１２匹から採取した血液を用いて実施例１と同様にＰＲＰを調製し、ＰＲＰ中の血小板数を測定したところ平均４５７．５×１０４／ｍｍ３であった。この結果から、ウサギの末梢血液中に比べて実施例１で調製したＰＲＰの中にはかなり多くの血小板が含まれていることが確認された。
［実施例３］骨形成用組成物（β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲル）の調製
（３−１）β−ＴＣＰ粉末の調製
β−ＴＣＰ（オリンパス光学工業株式会社製、気孔率９０％）を機械的に粉砕し、粒子径を平均２μｍ程に調整した。このようにして調製したβ−ＴＣＰ粉末をオートクレーブ滅菌した。
（３−２）β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルの調製
０．１７５ｇのβ−ＴＣＰ粉末を２．５ｍｌのシリンジ（テルモ株式会社製）の中に入れた。実施例１で調製したＰＲＰ０．３５ｍｌをマイクロピペットにて吸引し、β−ＴＣＰ粉末の入ったシリンジ内へ注入してβ−ＴＣＰ粉末と混和した。シリンジ内でよく撹拌し、β−ＴＣＰをＰＲＰに溶解させた。一方、１０％塩化カルシウム溶液１０ｍｌと局所用牛トロンビン（ＧＥＮ−ＴＲＡＣ）１００００単位の混和液を調製し、この混和液のうち０．０３５ｍｌをβ−ＴＣＰとＰＲＰが入ったシリンジに加え、シリンジ内で０．１ｃｃの空気とともに混和した。これにより凝固が開始され、β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルが形成された。
［実施例４］β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルを用いた骨形成
（４−１）β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルを移植するスペースの形成
実施例１で血液の採取を行った日本白色ウサギ２４匹の両側頬部の剃毛を行った。剃毛後、除毛クリームで剃毛部における残りの毛を完全に除去した。次に、ウサギを腹ばいの状態で固定し、術野をグルコン酸クロルヘキシジン綿球で消毒した。その後、頬部に１０ｍｍの長さで皮膚切開を加え、粘膜および骨膜を剥離して上顎洞前壁の骨面を露出させた。そして、歯科用ダイヤモンドバーを用いて上顎洞前壁の骨を約７ｍｍ径の大きさで削除した。最後に、剥離子を用いて、上顎洞粘膜を注意しながら上方へ剥離し、β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルを移植するスペースを形成した。
（４−２）β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルの移植
実施例３で得られたβ−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルの０．１７５ｍｌを、５ｍｍ×５ｍｍ×７ｍｍの自家製スペースメーカーを用いることにより計量、採取し、直前に作製した右側の上顎洞のスペースへ移植した。また、左側には生理食塩水を用いてβ−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルと同程度の粘性をもたせたβ−ＴＣＰペーストを移植した。粘膜および骨膜を元の位置に戻した後、創を縫合閉鎖しβ−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルの移植術を終了した。
（４−３）骨形成の評価
所定期間後の移植部を肉眼的に観察することにより骨形成評価を行った。まず、移植後２週及び４週に（４−２）で移植を行ったウサギを屠殺し、上顎と鼻部とを一塊に摘出した。摘出物を１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液で固定し、１０％蟻酸水溶液で脱灰した。その後、パラフィン包埋を行い、厚さ４μｍの前頭断切片を作製し、ヘマトキシリンエオジンで染色して光学顕微鏡下で観察を行った。
１）ＰＲＰ群（β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルを移植した上顎洞右側）
移植後２週
図１に移植後２週における移植部の様子が示される。β−ＴＣＰは移植骨内に集積して充満しており、その周囲を多数の骨芽細胞が取り囲んでいるのが観察された。また、集積したβ−ＴＣＰ内にも骨芽細胞が観察された。一部のβ−ＴＣＰの周囲には幼弱な新生骨が認められた。移植骨内にはところどころに血小板が観察された。このように、コントロール群に比較して骨形成が進行していることが観察された。
移植後４週
図２に移植後４週における移植部の様子が示される。β−ＴＣＰは移植後２週に比べて減少している。β−ＴＣＰの周囲を全周にわたって骨芽細胞が被包しているのが観察された。またβ−ＴＣＰの周囲には新生骨の形成が認められ、移植後２週よりも増加していた。新生骨周囲にも多数の骨芽細胞が存在していた。また、新生骨内にはセメントラインが認められた。このように、コントロール群に比較して、顕著な骨形成が観察された。
２）コントロール群（β−ＴＣＰのみを移植した上顎洞左側）
移植後２週
図３に移植後２週における移植部の様子が示される。β−ＴＣＰが四角形を呈して移植骨内に存在しており、β−ＴＣＰの周囲に骨芽細胞が認められた。また、新生骨の形成がわずかに認められた。
移植後４週
図４に移植後４週における移植部の様子が示される。移植部にはまだ多くのβ−ＴＣＰがブロック状に観察され、その周囲には新生骨の形成が認めらた。新生骨の骨梁内にはセメントラインが認められた。
（４−４）移植後８週における骨形成の評価
β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲル移植後８週において、骨形成の評価を再び行った。評価方法は上記の移植後２週及び４週の場合と同様とした。
１）ＰＲＰ群（β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルを移植した上顎洞右側）
移植後８週
図５に移植後８週におけるβ−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲル移植部の様子が示される。図５は、ヘマトキシリンエオジン染色像（脱灰Ｈ．Ｅ．染色組織像）を示したものである。移植部及びその周囲で骨量が増加しているのが認められる。
図６及び図７に図５の一部を拡大（１６倍）した図を示す。β−ＴＣＰ含有ＰＲＰ移植部（Ａ）に接するように新生骨（Ｂ）の形成が認められる。即ち、移植部と新生骨との間に繊維性結合組織が介在しない状態で、新生骨の形成が認められる。このことから、移植したβ−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルに含まれる成分により、明らかに骨形成が強く誘導されていると考えられる。このように、β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルを移植することにより積極的に新生骨の形成、即ち骨誘導が行われることが示された。
２）コントロール群（β−ＴＣＰのみを移植した上顎洞左側）
移植後８週
図８に移植後８週におけるβ−ＴＣＰゲル移植部の様子が示される。図８はヘマトキシリンエオジン染色像（脱灰Ｈ．Ｅ．染色組織像）を示したものである。移植後４週と比較してほとんど骨量の増加は認められない。
図９に、図８の一部を拡大（１６倍）した図を示す。β−ＴＣＰゲル移植部（ａ）を繊維性結合組織（ｃ）が取り囲んで存在する様子が観察される。即ち、移植部（ａ）と骨（ｂ）との間に繊維性結合組織（ｃ）が介在する。したがって、この写真において観察される骨は、移植されたβ−ＴＣＰにより誘導されて形成された新生骨ではなく、生体が本来有する骨代謝により形成されたものであると考えられる。
以上のように、移植後８週の観察ではＰＲＰ群とコントロール群との間の骨形成の状態は一層顕著に異なるものとなった。また、ＰＲＰ群では強い骨誘導が行われていることが明らかとなった。
図１０は移植部全体に対する骨化した部分の割合（％）をまとめたグラフであり、移植後２週、４週、及び８週における新生骨（Ｎｅｗｌｙ　ｆｏｒｍｅｄ　ｂｏｎｅ）の量、及びβ−ＴＣＰの残存量が示される。図中（＋）はＰＲＰ群、（−）はコントロール群の結果である。移植後８週において、ＰＲＰ群における新生骨量がコントロール群に比較して有意に多いことが分る。また、ＰＲＰ群の方がβ−ＴＣＰの吸収が良好に行われていることが認められる。
次に、本発明の第２の局面における実施例について説明する。
［実施例５］ＰＲＰの採取
移植前に体重１５−１７ｋｇのイヌ２匹より採血を行い、実施例１と同様の方法でＰＲＰを分離、精製した。各血液サンプル（５０ｍｌ）から、最終的にそれぞれ約５ｍｌのＰＲＰが得られた。尚、実施例２と同様にＰＲＰ中の血小板数をカウントし、血小板が豊富に含まれていることを確認した。
［実施例６］骨髄細胞の調製
（６−１）イヌ腸骨のからの骨髄液の摘出
１０ｃｃ用のシリンジ（テルモ株式会社製）に、イヌ腸骨より骨髄穿刺針を用いて腸骨骨髄液を採取し、ヘパリン含有基本培地の入った遠心菅に注入した。
（６−２）骨髄細胞の播種
遠沈管に回収された骨髄液の懸濁液に基本培地を適量（濃度３０％）加え、フラスコ（８０ｃｍ２、Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ　Ｇｅｒｍａｎｙ）に骨髄液の懸濁液を播種した。
（６−３）接着性細胞（未分化間葉系幹細胞）の選択、及び培養
骨髄液を播種したフラスコをインキュベータ内に移し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。培養液中に含まれる血球系の細胞を除去し、接着性の細胞を選択して培養するために、骨髄細胞の播種から２４時間後に培地交換を行った。その後、培養液中で、サブコンフルエントになるまで約７日間培養を続けた。その間、培地交換を３日に一回の頻度で行った。
（６−４）接着性細胞（未分化間葉系幹細胞）の選択、及び培養
骨髄液を播種したフラスコをインキュベータ内に移し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。培養液中に含まれる血球系の細胞を除去し、接着性の細胞を選択して培養するために、骨髄細胞の播種から２４時間後に培地交換を行った。その後、培養液中でサブコンフルエントになるまで約７日間培養を続けた。その間、培地交換を３日に一回の頻度で行った。尚、培養液中には、ＭＳＣＧＭ、５０Ｕ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ，５０μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ社製）を添加した。
続いて、０．０５％トリプシンを用いて細胞を剥離し、面積比にして２〜４倍となるように播種して継代培養した。
（６−５）未分化間葉系幹細胞の分化誘導
まず、継代から約６日間培養し、サブコンフルエントに達したのを確認して培養液にβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳ）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、及びＶｉｔａｍｉｎＣ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｎ−ｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を、それぞれ、１０ｍＭ、１０−８Ｍ、及び０．０５ｍＭとなるように添加して（骨誘導培地）培養を続けた。培地交換は３日毎に行い、そのつど上記と同様にβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、及びＶｉｔａｍｉｎＣ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅを培養液に添加した。
（６−６）細胞成分の回収
少量の培地を残して、培地をフラスコ内から除去した。そして、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを用いて細胞をフラスコから剥離した。剥離した細胞を培地とともに遠沈管（ＦＡＬＣＯＮ　ＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ　ＵＳＡ）に移し、遠沈処理（１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）に供した。上清を吸引し、細胞成分を回収した。
［実施例７］骨形成用組成物（ＰＲＰ−細胞含有ゲル）の調製
実施例６で回収された細胞成分を少量のＰＲＰに懸濁して細胞懸濁液を調製した。実施例５で得られたＰＲＰ３．５ｍｌ、１０％塩化カルシウム溶液０．５ｍｌ、及び局所用牛トロンビン（ＧＥＮ−ＴＲＡＣ）１００００単位をシリンジ内で混和し、ＰＲＰ−細胞含有ゲルを形成した。
一方、対照用として、ＰＲＰ、１０％塩化カルシウム溶液、及び局所用牛トロンビンを混和したゲル（ＰＲＰゲル）を調製した。
［実施例８］ＰＲＰ−細胞含有ゲルを用いた骨形成
（８−１）移植スペースの形成
実施例５で血液の採取を行ったイヌを腹ばいの状態で固定し、術野をグルコン酸クロルヘキシジン綿球で消毒した。その後、１ヶ月前にあらかじめ抜歯しておいた顎部に約１００ｍｍの長さで皮膚切開を加え、粘膜および骨膜を剥離して顎骨の骨面を露出させた。そして、トレフインバーを用いて、顎骨欠損部を約φ１０ｍｍの大きさで作製した。
（８−２）ＰＲＰ−細胞含有ゲルの移植
実施例７で調製したＰＲＰ−細胞含有ゲル約４ｍｌを、顎骨欠損部に注入した。対照として、ＰＣＢＭを移植（自家骨移植）した群、実施例７で得られたＰＲＰゲルを移植した群、欠損のみ（移植なし）の群を用意した。
（８−３）骨再生能力（骨形成）の評価
所定期間後の移植部を肉眼的に観察することにより、各群の骨再生能力を組織学的に評価、比較した。
まず、移植後２週、４週、及び８週に、（８−２）で移植を行ったイヌより移植部を摘出した。摘出物を１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液で固定し、１０％蟻酸水溶液で脱灰した。その後パラフィン包埋を行い組織染色切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジンで染色して光学顕微鏡下で観察を行った。
１）ＰＣＢＭ群（自家骨移植）
図１１にＰＣＢＭ移植部の移植後２週（２Ｗ）、４週（４Ｗ）、及び８週（８Ｗ）の様子を示す。移植後２週において骨再生が既に行われていることが観察される。同時に移植ＰＣＢＭの吸収も観察される。移植後８週では、欠損辺縁部（図中矢印Ｅ）まで良好な骨再生が得られている。
２）ＰＲＰ−細胞群（ＰＲＰ−細胞含有ゲルを移植した群）
図１２にＰＲＰ−細胞含有ゲル移植部の移植後２週（２Ｗ）、４週（４Ｗ）、及び８週（８Ｗ）の様子を示す。移植後時間が経過するに従って新生骨（図中矢印Ｆ）の量が増加しているのが観察され、移植後８週では欠損辺縁部（図中矢印Ｇ）まで良好な骨再生が行われているのが分る。また、緻密な骨再生が行われていることが観察される。さらに、豊富な血管新生（図中矢印Ｈ）が観察され、積極的に新生骨の形成が誘導されていることが分る。尚、移植後４週、及び８週における骨再生の程度は、ＰＣＢＭ群（図１１）のそれと同等である。
３）ＰＲＰ群（ＰＲＰゲルを移植した群）
図１３にＰＲＰゲル移植部の移植後２週（２Ｗ）、４週（４Ｗ）、及び８週（８Ｗ）の様子を示す。移植後、欠損底部（図中矢印Ｉ）より徐々に骨新生が起きているのが観察されるが、骨再生の程度は低い。移植後８週においても欠損辺縁部（図中矢印Ｊ）までは骨再生がされていない。
４）欠損のみ（移植なし）
図１４に移植を行わずに放置した欠損部の２週後（２Ｗ）、４週後（４Ｗ）、８週後（８Ｗ）の様子を示す。ＰＲＰゲル群と同様に欠損底部（図中矢印Ｋ）より徐々に骨新生がおきているのが観察される。骨再生の程度は極めて低く、８週後においても欠損部辺縁にはほとんど骨再生はされておらず、繊維性細胞が凝集しているのが観察される（図中矢印Ｌ）。
以上のように、ＰＲＰ−細胞含有ゲルを用いることによりＰＣＢＭと同等の良好な骨再生が得られることが分った。即ち、自家骨移植（ＰＣＢＭ）と比較しても、注入型によるＰＲＰと骨形成能を有する細胞との組合せにより十分な骨再生効果が得られることが示された。
次に、フィブリノーゲン、β−ＴＣＰ、骨形成能を有する細胞を組み合わせてなる組成物を用いた骨形成能評価試験（実施例９〜実施例１２）について説明する。
［実施例９］多孔性β−ＴＣＰブロックの作製
まず、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムと水とを混合して、機械的に衝撃を加え粉砕し、メカノケミカル的に合成した。その後、乾燥、焼成（９００℃、５時間）を行い、造粒後、流動性のある泥状混合物を調製した。さらに可燃性スポンジに含漬し、乾燥させた後、再度焼成（１１２５℃、３時間）を行った。
完成した多孔性β−ＴＣＰブロックは全ての気孔が連続する三次元的な多孔質構造となった。これを用いて、直径を約５ｍｍ、高さを約４ｍｍの円柱状ブロックを作製し、気孔径は２００〜４００μｍ、気孔率は約９０％に調整した。
［実施例１０］細胞の採取および培養
フィッシャー系７週令雄性ラットの大腿骨より骨髄細胞の採取を行った。採取した骨髄細胞は、１５％牛胎仔血清および抗生剤（ペニシリン１０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢ０．２５μｇ／ｍｌ）を添加したＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ培地）中にて１０日間初代培養を行った。培養は３７℃、５％ＣＯ２下にて行った。その後、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞懸濁液を作製し、細胞濃度は１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。
［実施例１１］移植用組成物の調製
上記の細胞懸濁液にβ−ＴＣＰブロックを浸漬することにより細胞／β−ＴＣＰ複合体を作製した。細胞／β−ＴＣＰ複合体は、上記培地に１０−８Ｍ　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、１０ｍＭ　β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳ）、５０μｇ／ｍｌ　ＶｉｔａｍｉｎＣ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｎ−ｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を加え、２０日間継代培養を行った。培養中、培地交換は週に３回行い、そのつど上記と同様にβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、及びＶｉｔａｍｉｎＣ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅを培養液に添加した。
培養が終了した細胞β−ＴＣＰ複合体をピンセットで破砕し、培養液中に懸濁させた。この懸濁液を、フィブリノーゲン（８０ｍｇ）とフィブリン安定化因子ＸＩＩＩ（７５ｕｎｉｔｓ）をプラスミンインヒビター、アプロチニン（１０００ｋＩＥ／ｍｌ）溶液１ｍｌに溶解したものからなるＡ液（財団法人化学及血清療法研究所、熊本、日本）に再び懸濁した。このようにして得られたＭＳＣｓ／β−ＴＣＰ複合体を含む懸濁液と、１ｍｌの５３ｍＭ　ＣａＣｌ２溶液に溶解させたトロンビン（２５０ｕｎｉｔｓ）を含むＢ液（財団法人化学及血清療法研究所、熊本、日本）とを滅菌済みシリンジ（５ｍｌ）内で混和し、移植用組成物（フィブリノーゲン−β−ＴＣＰ−細胞含有組成物）を形成した（Ａ液：Ｂ液＝１：１（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ））。この混和物内のＭＳＣｓ濃度は約１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。尚、Ａ液とＢ液とを室温で混和することにより、凝固作用が生じて半剛性三次元組織からなるフィブリン糊（ｆｉｂｌｉｎ　ｇｌｕｅ）が形成される。
［実施例１２］移植用組成物（フィブリノーゲン−β−ＴＣＰ−細胞含有組成物）を用いた骨形成
（１２−１）移植用組成物の移植
移植用組成物約１．５ｍｌを同系ラットの背部皮下に移植した。コントロールとして、骨髄細胞を含まない多孔性β−ＴＣＰブロックを破砕し、フィブリノーゲンと混ぜてゲル状にしたものを同系ラットの背部皮下に移植した（コントロール群）。
（１２−２）骨再生能力（骨形成能）の評価
移植後２週、４週、８週に移植部を組織学的に観察することにより、骨再生能力を評価した。移植部を摘出し、１０％リン酸緩衝液ホルマリンにて固定後、１０％蟻酸水溶液で脱灰した。その後、パラフィン包埋を行い組織染色切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ．Ｅ．）で染色して光学顕微鏡下で観察を行った。
１）移植用組成物（フィブリノーゲン−β−ＴＣＰ−細胞含有組成物）を移植した群
図１５は、移植後８週における移植部を直接観察した写真を示した図である。移植部（矢印）に白い塊状物が観察される。
図１６に移植部の移植後２週（２Ｗ）、４週（４Ｗ）、８週（８Ｗ）のＨ．Ｅ．染色組織像を示す。移植後２週では、骨芽細胞によるライニングが見られ（矢印）、骨形成が行われつつあることが認められる。移植後４週では、骨細胞が見られるようになり（矢印）、活発な骨形成が進行していることがわかる。移植後８週では、一部に層板構造が見られ（矢印）、骨の成熟が観察できる。
２）コントロール群
図１７は、コントロール群の移植後８週におけるＨ．Ｅ．染色組織像である。図１７に示されるように、コントロール群では移植後８週において若干の骨形成が認められるに過ぎない。
以上の結果から、移植用組成物（フィブリノーゲン−β−ＴＣＰ−細胞含有組成物）を移植した群では、コントロール群に比較して有意な骨再生が認められた。
次に、ＰＲＰ、アルギン酸塩（アルジネート）、骨形成能を有する細胞を組み合わせてなる組成物を用いた骨形成能評価試験（実施例１３〜実施例１６）について説明する。
［実施例１３］ＰＲＰの採取
ラット末梢血から、実施例１と同様の方法でＰＲＰを分離、精製した。各血液サンプル（５０ｍｌ）から、最終的にそれぞれ約５ｍｌのＰＲＰが得られた。
［実施例１４］骨髄細胞の調製
（１４−１）ヒト腸骨からの骨髄液の摘出
１０ｃｃ用のシリンジ（テルモ株式会社製）に、ヒト腸骨より骨髄穿刺針を用いて腸骨骨髄液を採取し、ヘパリン含有基本培地の入った遠心菅に注入した。
（１４−２）骨髄細胞の播種
遠沈管に回収された骨髄液の懸濁液に基本培地を適量（濃度３０％）加え、フラスコ（８０ｃｍ２、Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ　Ｇｅｒｍａｎｙ）に骨髄液の懸濁液を播種した。
（１４−３）接着性細胞（未分化間葉系幹細胞）の選択、及び培養
骨髄液を播種したフラスコをインキュベータ内に移し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。培養液中に含まれる血球系の細胞を除去し、接着性の細胞を選択して培養するために、骨髄細胞の播種から２４時間後に培地交換を行った。その後、培養液中で、サブコンフルエントになるまで約７日間培養を続けた。その間、培地交換を３日に一回の頻度で行った。
（１４−４）接着性細胞（未分化間葉系幹細胞）の選択、及び培養
骨髄液を播種したフラスコをインキュベータ内に移し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。培養液中に含まれる血球系の細胞を除去し、接着性の細胞を選択して培養するために、骨髄細胞の播種から２４時間後に培地交換を行った。その後、培養液中でサブコンフルエントになるまで約７日間培養を続けた。その間、培地交換を３日に一回の頻度で行った。尚、培養液中には、ＭＳＣＧＭ、５０Ｕ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧ，５０μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ社製）を添加した。
続いて、０．０５％トリプシンを用いて細胞を剥離し、面積比にして２〜４倍となるように播種して継代培養した。
（１４−５）未分化間葉系幹細胞の分化誘導
まず、継代から約６日間培養し、サブコンフルエントに達したのを確認して培養液にβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳ）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、及びＶｉｔａｍｉｎＣ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｎ−ｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を、それぞれ、１０ｍＭ、１０−８Ｍ、及び０．０５ｍＭとなるように添加して（骨誘導培地）培養を続けた。培地交換は３日毎に行い、そのつど上記と同様にβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、及びＶｉｔａｍｉｎＣ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅを培養液に添加した。
（１４−６）細胞成分の回収
骨誘導培地で約６日間培養した後、少量の培地を残して、培地をフラスコ内から除去した。そして、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを用いて細胞をフラスコから剥離した。剥離した細胞を培地とともに遠沈管（ＦＡＬＣＯＮ　ＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ　ＵＳＡ）に移し、遠沈処理（１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）に供した。上清を吸引し、細胞成分を回収した。
［実施例１５］移植用組成物（ＰＲＰ−アルジネート−細胞含有組成物）の調製
実施例１４で回収された細胞成分を少量のＰＲＰに懸濁して細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液とアルジネート（シグマ社製）約１．５ｍｌ、実施例１３で得られたＰＲＰ約０．１５ｍｌをシリンジ内で混和し、移植用組成物（ＰＲＰ−アルジネート−細胞含有組成物）を形成した。
［実施例１６］移植用組成物（ＰＲＰ−アルジネート−細胞含有組成物）を用いた骨形成
（１６−１）移植用組成物の移植
移植用組成物約１．５ｍｌを４週令のＫＳＮヌードマウスの背部皮下に移植した。一方、移植用組成物の代わりにアルジネートを移植したものをコントロール群とした。
（１６−２）骨再生能力（骨形成能）の評価
移植後１６週に移植部を組織学的に観察し、骨再生能力を評価した。まず、移植部を摘出し、１０％リン酸緩衝液ホルマリンにて固定後、１０％蟻酸水溶液で脱灰した。その後、パラフィン包埋を行い組織染色切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ．Ｅ．）で染色して光学顕微鏡下で観察を行った。図１８に移植後１６週のＨ．Ｅ．染色組織像を示す（（Ａ）は移植用組成物を移植した群、（Ｂ）はコントロール群）。移植用組成物を移植した群（Ａ）では、新生骨が観察され（矢印）、骨の再生が行われていることが認められる。一方、コントロール群（Ｂ）では、移植したアルジネートが染色されて観察されるが（矢印）、新生骨の形成は認められない。以上より、移植用組成物（ＰＲＰ−アルジネート−細胞含有組成物）を移植した群では、コントロール群に比較して有意に骨の再生が行われることが示された。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
産業上の利用の可能性
本発明の骨又は歯周組織形成用組成物は、骨組織又は歯周組織の修復、再生が必要とされる各種の分野に適用することができるものである。例えば、高度な骨吸収が認められる顎堤に人工歯根の植立を行う場合の骨増生に適用することができる。また、外傷、各種骨疾患により生ずる骨欠損部における骨組織の再生、骨の補強又は補填に適用することができる。また、歯周病等による歯槽骨の欠損部における歯槽骨、歯周組織の再生に適用することができるものである。適用方法としては、ゲル状、ペースト状等の骨形成組成物を適用部位に填入、注入、又は塗布等する。
本発明の骨又は歯周組織形成用組成物には、骨形成系の細胞の増殖或いは分化を促進させる能力をもつ成長因子が数多く含まれる。従って、適用部（移植部）において骨形成系の細胞を効率的に増殖或いは分化させ、骨組織又は歯周組織の形成を促進することができる。自家のＰＲＰを用いることにより、毒性がなく、しかも免疫非活性である上記の成長因子により、骨組織又は歯周組織の再生は、質、量ともに向上するものと考えられる。また、本発明の第１の局面では骨形成系細胞の足場となる無機系生体吸収性材料を含むため、適用部における骨形成系細胞の増殖が促進されるとともに、適度な可塑性が付与され、形態の保持も図ることができる。また、ゲル状等の流動性であるため、注射針等を用いて適用部に容易に填入でき（創部を開放することなく適用することも可能である）、また、骨欠損部の形状に合わせて予め成型することを要せず、その汎用性が高い。このように、本発明の骨又は歯周組織形成用組成物を用いることにより、自家骨を採取して移植に供する必要がなくなり、容易に骨又は歯周組織の増生を図ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例４におけるＰＲＰ群（β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルを移植した上顎洞右側）の移植後２週の結果の写真を示した図であり、移植後２週における移植部の脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリンエオジン）染色組織像が示される。β−ＴＣＰが移植骨内に集積して充満しており、その周囲を多数の骨芽細胞が取り囲んでいるのが観察される。また、β−ＴＣＰ内にも骨芽細胞が観察される。一部のβ−ＴＣＰの周囲には幼若な新生骨が認められる。
図２は、実施例４におけるＰＲＰ群（β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルを移植した上顎洞右側）の移植後４週の結果の写真を示した図であり、移植後４週における移植部の脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリンエオジン）染色組織像が示される。β−ＴＣＰは移植後２週に比べて減少している。β−ＴＣＰの周囲を全周にわたって骨芽細胞が被包しているのが観察される。また、β−ＴＣＰの周囲には新生骨の形成が認められる。新生骨周囲にも多数の骨芽細胞が存在しているのが観察される。新生骨内にはセメントラインが認められる。
図３は、実施例４におけるコントロール群（β−ＴＣＰのみを移植した上顎洞左側）の移植後２週の結果の写真を示す図であり、移植後２週における移植部の脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリンエオジン）染色組織像が示される。β−ＴＣＰが四角形を呈して移植骨内に存在しており、β−ＴＣＰの周囲に骨芽細胞が認められる。また、新生骨の形成がわずかに認められる。
図４は、実施例４におけるコントロール群（β−ＴＣＰのみを移植した上顎洞左側）の移植後４週の結果の写真を示す図であり、移植後４週における移植部の脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリンエオジン）染色組織像が示される。移植部には、多くのβ−ＴＣＰがブロック状に観察され、その周囲には新生骨の形成が認められる。新生骨の骨梁内にはセメントラインが認められる。
図５は、実施例４におけるＰＲＰ群（β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲルを移植した上顎洞右側）の移植後８週の結果の写真を示す図であり、移植後８週における移植部の脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリンエオジン）染色組織像が示される。移植部及びその周囲で骨量の増加が認められる。
図６は、図５の一部を拡大（１６倍）した図である。β−ＴＣＰ含有ＰＲＰゲル移植部（Ａ）に接するように新生骨（Ｂ）の形成が認められる。
図７は、図６と同様に図５の一部を拡大（１６倍）した図である。図６と同様に、β−ＴＣＰ含有ＰＲＰ移植部（Ａ）に接するように新生骨（Ｂ）の形成が認められる。
図８は、実施例４におけるコントロール群（β−ＴＣＰのみを移植した上顎洞左側）の移植後８週の結果の写真を示す図であり、移植後８週における移植部の脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリンエオジン）染色組織像が示される。移植後４週と比較してほとんど骨量の増加は認められない。
図９は、図８の一部を拡大（１６倍）した図である。β−ＴＣＰゲル移植部（ａ）を繊維性結合組織（ｃ）が取り囲んで存在する様子が観察される。骨（ｂ）は繊維性結合組織（ｃ）の外側に存在している。
図１０は、実施例４の結果をまとめたグラフ図であり、移植部全体に対する骨化した部分の割合（％）が示される。移植後２週、４週、及び８週における新生骨（Ｎｅｗｌｙ　ｆｏｒｍｅｄ　ｂｏｎｅ）の量、及びβ−ＴＣＰの残存量が示される。図中（＋）はＰＲＰ群、（−）はコントロール群の結果である。移植後８週において、ＰＲＰ群における新生骨量がコントロール群に比較して有意に多いことが分る。また、ＰＲＰ群の方がβ−ＴＣＰの吸収が良好に行われていることが認められる。
図１１は、実施例８におけるＰＣＢＭ移植部の移植後２週（２Ｗ）、４週（４Ｗ）、及び８週（８Ｗ）の写真を示す図であり、移植部の脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリンエオジン）染色組織像が示される。
図１２は、実施例８におけるＰＲＰ−細胞ゲル移植部の移植後２週（２Ｗ）、４週（４Ｗ）、及び８週（８Ｗ）の写真を示す図であり、移植部の脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリンエオジン）染色組織像が示される。
図１３は、実施例８におけるＰＲＰゲル移植部の移植後２週（２Ｗ）、４週（４Ｗ）、及び８週（８Ｗ）の結果の写真を示す図であり、移植部の脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリンエオジン）染色組織像が示される。
図１４は、実施例８における対照群の結果の写真を示す図である。移植を行わずに放置した欠損部の２週後（２Ｗ）、４週後（４Ｗ）、及び８週後（８Ｗ）の写真であり、脱灰Ｈ．Ｅ．（ヘマトキシリン・エオジン）染色組織像が示される。
図１５は、移植用組成物（フィブリノーゲン−β−ＴＣＰ−細胞含有組成物）を移植後８週における移植部を直接観察した写真を示す図である。移植部（矢印）に白い塊状物が観察される。
図１６は、移植用組成物（フィブリノーゲン−β−ＴＣＰ−細胞含有組成物）を移植後２週（２Ｗ）、４週（４Ｗ）、８週（８Ｗ）のＨ．Ｅ．染色組織像を示した図である。移植後２週（２Ｗ）では、骨芽細胞によるライニングが見られ（矢印）、骨形成が行われつつあることが認められる。移植後４週（４Ｗ）では、骨細胞が見られるようになり（矢印）、活発な骨形成が進行していることがわかる。移植後８週（８Ｗ）では一部に層板構造が見られ（矢印）、骨の成熟が観察できる。
図１７は、移植用組成物（フィブリノーゲン−β−ＴＣＰ−細胞含有組成物）に対するコントロール群の移植後８週におけるＨ．Ｅ．染色組織像を示す図である。若干の骨形成が認められる。
図１８（Ａ）は、（ＰＲＰ−アルジネート−細胞含有組成物）を移植後１６週における移植部のＨ．Ｅ．染色組織像を示す図である。図１８（Ｂ）は、コントロール群（アルジネートを移植）の移植後１６週における移植部のＨ．Ｅ．染色組織像を示す図である。移植用組成物を移植した群（Ａ）では、新生骨が観察され（矢印）、骨の再生が行われていることが認められる。一方、コントロール群（Ｂ）では、移植したアルジネートが染色して観察されるが（矢印）、新生骨の形成は認められない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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