(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0003757005.tif 000005
で表されるLK6-A 化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫抑制作用を有する化合物LK6-A に関する。
【０００２】
【従来の技術】
低分子免疫抑制剤としてはシクロスポリンＡ［ネイチャー(nature), 280 , 148(1978) ］、ＦＫ５０６［イムノロジィー・トゥディ(Immunol. Today), 10 ,6(1989) ］、ミゾリビン［トランスプランテーション・プロシーディングス(Transplantation Proceed.), 11 ,865(1979) ］、アザチオプリン［ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(New Eng. J. Med.), 268 ,1315(1963) ］、15- デオキシスパーガリン［トランスプランテーション・プロシーディングス(Transplantation Proceed.), 22 ,1606(1990)］などが知られており、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、臓器移植などの治療薬として用いられている。しかしながら、有効性、副作用などの点で必ずしも満足のいくものではない。
【０００３】
また、本発明化合物と類似した骨格を有する化合物としては、プラキニディンＡ、プラキニディンＢおよびプラキニディンＣがあり、それらの化合物のＬ１２１０に対する細胞毒性活性が報告されている［テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters ），31，3271(1990)］。また、プラキニディンＡおよびプラキニディンＢの寄生虫Nippostrongylus brasiliensisに対する活性、および、プラキニディンＡの逆転写酵素阻害活性が報告されている［米国特許第4959370 号；ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J.Am.Chem.Soc.）, 112 ,1(1990)］。しかしながら、これらの化合物の免疫抑制作用についてはこれまで報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、優れた免疫抑制作用を有する化合物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物培養物中に免疫抑制作用を有する物質が生産されることを見いだし、この物質を単離、精製し、その理化学的性質を調べた結果、新規物質であることが判明し、LK6-A と命名した。本発明によれば、式（Ｉ）
【０００６】
【化２】
0003757005.tif 000002
【０００７】
で表され、免疫抑制作用を有するLK6-A 化合物またはその薬理学的に許容される塩が提供される。該化合物はストレプトマイセス属に属する微生物を培養することによって得られる。
LK6-A 化合物の薬理学的に許容される塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩などがあげられる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。LK6-A 化合物の理化学的性質は、以下に示すとおりである。
なお、以下のデータは下記の機器により測定した。
0003757005.tif 000003
0003757005.tif 000004
次に、LK6-A化合物の生物活性について以下の試験例で説明する。
【０００９】
試験例  マウスリンパ球混合反応におけるＴ細胞増殖抑制試験
無菌的にB10.BRマウス[日本エス・エル・シー（株）]のリンパ節を摘出し、ハンクスの平衡塩溶液(HBSS、ギブコ社製)中に2.5%の牛胎児血清(FCS、ギブコ社製)を加えた溶液(HBSS-FCS)を用い洗浄後、10% FCS、1% 200mmol/L L-グルタミン、1% ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、5% NCTC-109、1% 1mol/L HEPES（以上、ギブコ社製）、7.5% NaHCO3（シグマ社製）および0.1% 50mmol/L 2-メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）を含むRPMI1640培養液（以下、RPMI1640-FCSと称す）を用いて、単細胞浮遊液3 ×106 cells/mlを調製した。
【００１０】
一方、無菌的にAKRマウス [日本エス. エル. シー（株)]より脾臓を摘出し、HBSS-FCSを用い単細胞浮遊液とし、この浮遊液にマイトマイシンC (MMC)[協和発酵工業 (株)]を添加し（終濃度50μg/ml）、37℃で30分間培養した。培養後、HBSS-FCSで3回洗浄を行なった後、RPMI1640-FCSを用い単細胞浮遊液1 ×107 cells/mlを調製した。
【００１１】
96穴マイクロタイタープレートの各ウェルにB10.BRマウスのリンパ節細胞浮遊液 50 μl（1.5 x 105cells含有）、AKRマウスの脾臓細胞浮遊液 50μl（5 x 105 cells含有）、およびRPMI1640-FCSで調製した各試験濃度のLK6-A溶液100μlを添加し、37℃のCO2インキュベーター内で72時間培養した。LK6-A溶液は、最終濃度が7 ×10-10〜7 ×10-6mol/L となるように調製した。尚、培養終了18時間前に[3H]-チミジン1.0μCiを添加した。培養終了後、セルハーベスターで濾紙上に細胞を捕集し、乾燥後トルエン系シンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで細胞に取り込まれた[3H]-チミジンの放射能量を測定した（試験群）。
【００１２】
対照群として、LK6-Ａ溶液の代わりにLK6-Ａを含まないRPMI1640-FCS培養液100 μl を添加し、以下上記と同様に培養を行い細胞に取り込まれた[3H]-チミジンの放射能量を測定した。B10.BRマウスのリンパ節細胞浮遊液 50 μl （1.5 x 105 cells含有）あるいはAKRマウスの脾臓細胞浮遊液 50μl にRPMI1640-FCS培養液150 mlを添加し、以下上記と同様に培養を行い細胞に取り込まれた[3H]-チミジンの放射能量を測定した。
【００１３】
Ｔ細胞増殖抑制率は、次式に従って算出した。
Ｔ細胞増殖抑制率（％）＝（Ｃ−Ｔ）／｛Ｃ−（Ａ＋Ｂ）｝×１００
Ｃ：対照群の放射能
Ｔ：試験群の放射能
Ａ：対照群のMMC 処置AKR マウス放射能
Ｂ：対照群のB10.BRマウス放射能
（式中、MMC 処置AKR マウス放射能量は、MMC 処理したAKR マウスの脾臓細胞に取り込まれた[3H]チミジンの放射能量を、またB10. BRマウス放射能量は、B10.BRマウスのリンパ節細胞に取り込まれた[3H]チミジンの放射能量を表す。）
上記の結果を図１に示す。LK6-A によるマウス混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖の50 %抑制濃度（IC50値）は9 ×10-9M であった。
【００１４】
次に、LK6-A 化合物の製造法について説明する。
LK6 株はストレプトマイセス属に属し、LK6-A 生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にLK6-A を生成蓄積させ、該培養物からLK6-A を採取することによって製造される。
LK6-A 生産能を有する微生物としては、ストレプトマイセス属に属し、LK6-A 生産能を有する菌株であればいずれの菌株でも用いることができる。またこれらの菌株を人工的変異方法、例えば紫外線照射、X 線照射、変異誘起剤処理などによって変異させた変異株あるいは自然的に変異した変異株でもLK6-A 生産能を有するものであれば本発明に用いることができる。具体的に好適な例として、本発明者らが土壌より新たに分離したストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）LK6 株があげられる。
【００１５】
放線菌LK6 株の形態的、培養的、生理学的、化学分類学的性質を記述する。
1.形態的性質
1)菌糸
気菌糸形成；有
気菌糸の分断および運動性；無
基生菌糸の分断および運動性；無
2)胞子
胞子の形成の有無および着生位置；気菌糸に形成
胞子嚢の形成の有無および着生位置；無
胞子柄上で連鎖する胞子の数；10個以上
多数の胞子が連鎖する場合の形状；曲状、螺旋状および塊状
胞子の特徴
表面構造；平滑
形状および大きさ；短桿形、約0.5 〜0.7 μm × 0.7〜1.0 μm
運動性および鞭毛の存在；無
3)その他
厚膜胞子；無
集束菌糸；無
疑似胞子嚢；有
菌糸の分裂様式；単純分枝
【００１６】
2.培養的性質
LK6 株は、一般に使用されている合成および天然培地で普通もしくは旺盛な成育を示し、基生菌糸は白色から茶色系を示す。培地により茶色系の可溶性色素が産生されることもある。
各種培地上で28℃、14日間培養した時の生育および色の特徴を下記に示す。なお、色の表示はカラーハーモニーマニュアル［Color Harmony Manual、Container Corporation of America  第４版、1958年］による色の分類に従った。
【００１７】
1)シュクロース・硝酸塩寒天培地
生育状態；貧弱
基生菌糸の色調；ホワイト(a)
気菌糸の着生状態とその色調；貧弱、オックスフォードグレー(l)
可溶性色素；無
2)グルコース・アスパラギン寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調；ローズベージュ(4ge) 〜ダークブラウン(5nl)
気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ホワイト(a)
可溶性色素；無
3)グリセリン・アスパラギン寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調；ライトタン(3gc) 〜ビーバー(3li)
気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ホワイト(a) 〜シルバーグレー(3fe)
可溶性色素；わずかに産生（黄土色）
【００１８】
4)スターチ・無機塩寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調；ライトローズベージュ(4ec) 〜ダークブラウン(4pn)
気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、シルバーグレー(3fe) 〜オックスフォードグレー(l)
可溶性色素；産生（茶褐色）
5)チロシン寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調；ライトタン(3gc) 〜クローブブラウン(3ni)
気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ホワイト(a) 〜シトロングレー(1ge)
可溶性色素；無
6)栄養寒天培地
生育状態；普通
基生菌糸の色調；キャメル(3ie) 〜ライトブラウン(3lg)
気菌糸の着生状態とその色調；普通、ホワイト(a)
可溶性色素；産生（茶色）
7)イースト・麦芽寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調；キャメル(3ie) 〜ダークブラウン(4pn)
気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ホワイト(a) 〜グレー(f)
可溶性色素；産生（茶色）
8)オートミール寒天培地
生育状態；普通
基生菌糸の色調；ローズベージュ(4gc) 〜ディープブラウン(4pl)
気菌糸の着生状態とその色調；普通、ホワイト(a) 〜グレー(g)
可溶性色素；産生（茶褐色）
【００１９】
3.生理学的性質
LK6 株の生理学的諸性質を以下に示す。1)については14日間培養後、2)〜6)については28℃、2 〜3 週間培養後の結果を記述する。
1)生育温度範囲；10〜40℃
2)ゼラチンの液化；無
3)スターチの加水分解；有
4)脱脂粉乳の凝固およびペプトン化；無
5)メラニン様色素の生成
(1) ペプトン・イースト・鉄寒天培地；有
(2) チロシン寒天培地；無
【００２０】
6)炭素源の利用性
基礎培地はプリードハム・ゴトリーブ寒天培地を使用した。以下、＋は利用することを、−は利用しないことを、Ｗは疑わしいことを示す。
L-アラビノース  ；−
D-キシロース  ；−
D-グルコース  ；＋
シュクロース  ；−
ラフィノース  ；−
D-フルクトース  ；Ｗ
ラムノース    ；−
イノシトール  ；−
D-マンニトール  ；−
【００２１】
4.化学分類学的性質
1)菌体中のジアミノピメリン酸の光学異性体；LL型
2)菌体脂質の主要キノン；MK-9(H6),MK-9(H8)
以上、形態的には気中菌糸に胞子鎖が形成されること、化学分類学的には細胞壁が I型（LL−ジアミノピメリン酸、グリシン）であること、および、主要キノンがメナキノン９の3 飽和型(MK-9(H6))、4 飽和型(MK-9(H8))であることから、本菌株は放線菌の中でストレプトマイセス属に分類される。従って、本菌株をストレプトマイセス・エスピー LK6 (Streptomyces sp. LK6) と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にFERM BP-5202として寄託した。
【００２２】
本発明のLK6-A 化合物生産菌の培養に際しては、通常の放線菌の培養法が適用される。培地としては、微生物の資化し得る炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質などを程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用できる。
炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フルクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが単独または組合せて用いられる。さらに、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。
【００２３】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組合せて用いられる。
そのほか、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える。さらに、使用菌の生育やLK6-A の生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。
【００２４】
培養法としては、液体培養法、特に深部攪拌培養法が適している。培養は、16〜37℃、好ましくは 25 〜32℃の温度で、pH 4〜10、好ましくは pH6〜8 で行われ、通常１〜７日で完了し、LK6-A が培養液中および菌体中に生成蓄積される。
培地の pH 調整にはアンモニア水や炭酸アンモニウム溶液などが用いられる。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００２５】
培養物中に蓄積したLK6-A を培養物から単離精製するに際しては、通常の微生物代謝産物を培養物から単離精製するために常用される方法に従って行われる。
例えば、培養物を濾過により培養濾液と菌体とに分け、菌体をクロロホルム、アセトンなどの溶剤で抽出する。ついで、抽出液と培養濾液とを併せて、ポリスチレン系吸着剤、例えばダイヤイオン HP20(三菱化学社製）などに通塔して活性成分を吸着させ、ついで酢酸エチル、アセトンなどの溶剤で菌体成分を溶出する。溶出液を濃縮し、シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどにより、LK6-A は単離される。なお、培養、単離精製操作中のLK6-A の検出は、シリカゲル薄層クロマトグラフイーにより行うことができる。
【００２６】
LK6-A 化合物の塩を取得したいとき、LK6-A 化合物が塩の形で得られる場合にはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られる場合には、適当な有機溶媒に溶解もしくは懸濁させ、酸を加えて通常の方法により塩を形成させればよい。また、LK6-A 化合物またはその薬理学的に許容される塩は、水あるいは各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これら付加物も本発明に包含される。
【００２７】
以下に実施例を示す。
【００２８】
【実施例】
実施例１．
種菌としてストレプトマイセス・エスピーＬＫ６株を用いた。
該菌株を 2 L容量の三角フラスコ中のシュクロース 30g/l、可溶性澱粉 20g/l、コーン・スチープ・リカー30g/l 、乾燥酵母 5g/l 、炭酸カルシウム 2g/l の組成からなる種培地（殺菌前 pH 7.0 ）300 mlに植菌し、30℃で48時間振盪培養（回転数 200 rpm）した。得られた種培養液を 30L容量のジャーファーメンター中の下記組成の発酵培地 18Lに 5％（容量）の割合で移し、28℃で通気攪拌培養（回転数 300 rpm、通気量 18 リットル/ 分）を行った。
【００２９】
発酵培地組成：可溶性澱粉40g/l 、大豆粉 10g/l、コーン・スチープ・リカー5g/l、乾燥酵母 5g/l 、KH2PO4 0.5g/l 、 Mg3(PO4)2・8H2O  0.5g/l、ZnSO4   ・7H2O 0.01g/l、CoCl2 ・6H2O 0.001g/l 、NiSO4 0.001g/l（殺菌前 pH 7.0 、NaOHで調整）
培養中、培地の pH は特に制御せずに、96時間培養を行った。
【００３０】
培養物を濾過により培養濾液と菌体とに分け、菌体をアセトンで抽出した。抽出液を濃縮後、HP20吸着カラム（三菱化学社製）を用い、水、５０％メタノールで洗浄後、メタノールで溶出した。溶出画分を濃縮後、酢酸エチルで抽出した。
酢酸エチル層を濃縮し、シリカゲルカラム(Lichroprep Si60 Merck社製）を用い、トルエン−酢酸エチル−メタノール(10:20:0.45 v/v/v)混合溶液で展開、分画した。溶出された活性画分を濃縮し、さらに、シリカゲルカラム(Lichroprep Si60 Merck社製）を用い、クロロホルム−メタノール(95:5 v/v)混合溶液で展開、分画した。溶出された活性画分を濃縮し、下記の条件下で高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を行った。メタノール−アセトニトリル−10 mM酢酸アンモニウム (1:1:2 v/v/v)混合溶液で展開し、LK6-A を含む画分（保持時間：40.66 min)を分取した。この画分を凍結乾燥することによりLK6-A の赤橙色粉末24mgを得た。
【００３１】
HPLC分取条件
カラム：CAPCELL PAK C18 SG120（資生堂社製）
溶出液：メタノール−アセトニトリル−10 mmol/L 酢酸アンモニウム（1：1：2 v/v/v）
流速：8 ml/ 分
検出：220nm, 460nm
保持時間：40.66 分
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫抑制作用を有するLK6-A 化合物またはその薬理学的に許容される塩を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、ＬＫ６−ＡによるＴ細胞増殖抑制活性を示すグラフである。
【図１】
0003757005.tif 000006