(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用物質として重合度２〜７及びエステル化度＜２０％を有する１種以上のガラクツロニドを場合により薬学的に常用の担体、希釈剤、助剤及び充填剤とともに含有することを特徴とする、哺乳類細胞への菌付着遮断用医薬調剤。
【請求項２】
ガラクツロニドのエステル化度が＜１０％である請求項１記載の医薬調剤。
【請求項３】
ガラクツロニドのエステル化度が＜５％である請求項１又は２記載の医薬調剤。
【請求項４】
ガラクツロニドの重合度が２〜６である請求項１から３までのいずれか１項記載の医薬調剤。
【請求項５】
ガラクツロニドの重合度が２〜５である請求項１から４までのいずれか１項記載の医薬調剤。
【請求項６】
ガラクツロニドの重合度が２〜４である請求項１から５までのいずれか１項記載の医薬調剤。
【請求項７】
ガラクツロニドの重合度が２〜３である請求項１から６までのいずれか１項記載の医薬調剤。
【請求項８】
ガラクツロニドの重合度が２である請求項１から７までのいずれか１項記載の医薬調剤。
【請求項９】
細菌の付着を遮断するための、請求項１から８までのいずれか１項記載の医薬調剤。
【請求項１０】
哺乳類細胞への菌の付着遮断用医薬調剤の製造において、作用物質として重合度２〜７及びエステル化度＜２０％を有する１種以上のガラクツロニドを使用することを特徴とする、哺乳類細胞への菌の付着遮断用医薬調剤の製法。
【請求項１１】
胃腸管、血液系、気道、泌尿生殖器官又は／及び鼻咽腔の感染治療用医薬調剤の製造において、作用物質として重合度２〜７及びエステル化度＜２０％を有する１種以上のガラクツロニドを使用することを特徴とする、胃腸管、血液系、気道、泌尿生殖器官又は／及び鼻咽腔の感染治療用医薬調剤の製法。
【請求項１２】
ガラクツロニドの重合度が２〜４である請求項１０または１１記載の製法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、作用物質としてガラクツロニドを含有する医薬調剤、及び哺乳類細胞への菌の付着を遮断するための該調剤の使用に関する。
ガラクツロン酸はハインリチョバ
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及びシモン（Ｓｉｍｏｎ）（Ｂｉｏｌｏｇｉａ、第４６巻、第１０８１〜１０８７頁、１９９１）に記載されているように、広い適用範囲を有する。公知の適用範囲は例えばガラクツロナナーゼ（Ｇａｌａｋｔｕｒｏｎａｎａｓｅｎ）及びペクテートリアーゼ（Ｐｅｋｔａｔｌｙａｓｅｎ）の部門別化及び分類化のための適用又は選別生物親和性クロマトグラフィー用の配位子としての適用を包含する。公知作用には高等植物の防御機構の惹起及び人胃腸管中の毒性カチオン、例えばＣＤ2+、Ｃｕ2+、Ｐｂ2+、の排除を挙げることができる。
種々の植物生産品からの水性エキス及び液汁は民間療法及び臨床医学において、腸管及び泌尿生殖器官における病原菌に起因する疾患に対するその作用に関して公知である。腸管におけるこの調剤の薬学的作用は従来植物生産品中に存在するペクチンによる水収支の調節で説明された。
菌の付着、例えば細胞への細菌性微生物の付着が全ての感染の開始における第１工程である。細胞表面の特異的レセプターに菌（例えばバクテリア又は／及びビールス）が付着した時、このことにより菌は非特異的な身体自体の防御、例えば蠕動、筋肉清掃率、分泌漏等をのがれ、初めて菌はそこで増殖し、身体中に侵入し、毒性作用を展開し、こうして病気の症状が現れる。
ＥＰ−Ａ−００８０４４２号明細書はオリゴサッカライド、例えばペクチンもしくはポリガラクツロン酸からのオリゴガラクトシドの製造のための多工程化学合成法を開示している。オリゴサッカライド及びそのアシル化誘導体の薬学的適用は、一定のガラクトシド、もしくはそのメチル誘導体及びｐ−ニトロフェニル誘導体の、ある一定の赤血球への尿病原菌大腸菌の付着に対する抑制作用を分からせる報告から予見される。
従って、抗菌治療の優れた方法は、主な菌力機構としての菌の付着を無効とし、これにより菌を細胞表面から洗い流すか、又はそこから排除することを身体に可能にすることである。こうして、本発明の課題は哺乳類の細胞、特に上皮細胞に菌が付着することを遮断する調剤を製造することである。
この課題は、作用物質として重合度≧２及びエステル化度＜２０％を有する１種以上のガラクツロニドを場合により薬学的に常用の担体、希釈剤、助剤及び充填剤とともに含有することを特徴とする医薬調剤により解決する。
本発明の更なる課題は重合度≧２を有するガラクツロニドを哺乳類細胞に菌が付着することを遮断するための医薬調剤を製造するために使用することである。
モロ（ＭＯＲＯ）による古来の調剤中の人参スープ、膀胱茶（例えば、スギナ、黄色セイヨウサクラソウ、イチゴの葉及びアイスランドゴケからの混合物）、ココナッツミルク、コケモモ等により病原菌、例えば大腸菌が細胞、特に胃腸管及び泌尿生殖器官の上皮細胞に付着することを著しく（９０％まで）減少させることができることが、意外にも見出された。この作用は植物生産品中に存在するペクチンに帰せられ、このペクチンとは１，４−α−グリコシド様に結合したガラクツロニドの連鎖からなり、その酸基は２０〜８０％までメタノールでエステル化されており、かつガラクツロン酸のほかに場合により更に他の糖成分、例えば、グルコース、ガラクトース、キシロース及びアラビノースを含有していてよい。
従来ゼリーの製造のために、増粘剤として又は繊維質として使用された、ペクチンもしくはガラクツロニドが哺乳類の細胞、かつ特にヒトの細胞に菌が付着することを遮断することを確認したことは意外なことであった。
菌の付着を遮断するために有効なガラクツロニドは一定の重合度及び有利に一定のエステル化度を示さなければならない。概念“重合度”とは、本発明においては１つのガラクツロニドが有する、ガラクツロン酸単位の数を表す。概念“エステル化度”とは、ガラクツロニドの（多くの場合メチル基により）エステル化ガラクツロン酸単位のガラクツロン酸単位の総数に対するパーセンテージを表す。哺乳類の細胞に菌が付着することを遮断するために重合度≧２が必要である、即ち、モノマーのガラクツロン酸は、多くの他のサッカライド（例えば、中性サッカライド、グルクロン酸、アラビノガラクタン、ガラクトース−１−リン酸、グルコース−１−リン酸）と同様に、菌の付着の遮断を全く示さない。
本発明による医薬調剤の有利な実施形においては、ガラクツロニドのエステル化度は＜２０％、特に有利に＜１０％及び、更に有利には＜５％である。最も有利であるのは、エステル基がほぼ存在しない（＜２％）。
エステル化度＜２０％のガラクツロニドは天然に存在するペクチンを完全に、又は部分的に、例えばアルカリでの鹸化により、脱メチル化することにより得られる。
本発明による医薬調剤中のガラクツロニドの重合度は≧２であり、即ち、ガラクツロニドは少なくともガラクツロン酸単位２を有する。ガラクツロニドの重合度が２〜７であるのが有利であり、２〜４であるのが更に有利であり、特に２〜３であるのが有利であり、２であるのが最も有利である。即ち、ジガラクツロニド、トリガラクツロニド、テトラガラクツロニド、ペンタガラクツロニド、ヘキサガラクツロニドヘプタガラクツロニド及びこれらの物質の混合物が本発明による調剤にとって有利なガラクツロニドであり、この際ジガラクツロニドもしくはジガラクツロン酸が最も有利である。しかしながら、もし作用からは最適である物質が医薬調剤の理由から特別な適用にあまり有利でない場合、この物質を含有しない調剤も適用の種類に依存して使用することができる。
重合度２〜４のガラクツロニドは天然に存在する高分子ペクチンを、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種又はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種のような菌から殆ど工業的に得られるペクチン切断酵素（例えば、ペクチナーゼ）の使用下に酵素的に加水分解することにより得られる。他方、例えばＨＣｌで酸性加水分解することによっても、高分子ペクチンを加水分解することができる。
本発明による医薬調剤は、菌、特にバクテリアの菌（例えば、大腸菌、ストレプトコッケン（Ｓｔｒｅｐｔｏｋｏｋｋｅｎ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、プノイモコッケン（Ｐｎｅｕｍｏｋｏｋｋｅｎ）等）の哺乳類細胞への付着を遮断し、もしくはすでに結合している菌を排除することができる。特に本発明による調剤は、胃腸管（下痢疾患における上部小腸の誤生息）、血液系（大腸菌０１５７に起因する溶血性尿毒症候群）、気道（例えば、吸入集中治療患者における上昇する感染）、泌尿生殖器（例えば、再発性尿管感染）又は／及び鼻咽腔の（ストレプトコッケン、Ｈ.インフルエンザエ、プノイモコッケンによる）感染の治療のために好適である。
本発明による医薬調剤は一方ではすでに存在する疾患において、かつ他方では予防のために投与することができる。例えば次の投与の可能性を考慮することができる：
ａ）胃腸管、尿管の治療のための、水分補給溶液のための添加物として、胃腸管等中の誤生息に対する予防薬として、人口呼吸の集中治療患者の際の経口投与、
ｂ）鼻咽腔、泌尿生殖器等の治療のための局所適用、及び
ｃ）腸管外適用。
ガラクツロニドは多糖類の部分構造として多数の食品及び食品補助物質中に存在し、こうして経口的に摂取される、即ちこれらは毒性でなく、医薬適用に著しく適している。
本発明による医薬調剤のために使用したガラクツロニドの獲得は、植物中に存在する多糖類から獲得することができ、例えば、人参、柑橘類の果実、リンゴ、マルメロ、サトウダイコン、ココナッツミルク及びその他の植物又は植物生産品から行われる。
ガラクツロニドの獲得のためには、有利に出発材料を小さく破砕し、熱湯で抽出した。この抽出液を、はじめに凍結乾燥するか、又は直接更に加工することができる。更なる加工は有利にガラクツロニドを抽出物の他の成分（例えば、他のサッカライド）から分離することを可能とするクロマトグラフ法で達せられる。有利なクロマトグラフ分離法は、ゲルクロマトグラフィー（例えば、ビオゲル（ＢｉｏＧｅｌ；登録商標）−分離剤、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ；登録商標）−分離剤）及び／又はアニオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ；商標）−分離剤）である。更に、得られたペクチンはエステル化度を下げるために部分的に又は完全に鹸化し、又は／かつ重合度を下げるために酸処理により、もしくは酵素的加水分解により加水分解することができる。
次に実施例につき、本発明を更に詳説する。
実施例１：
新鮮な人参を洗浄し、皮をむき、かつおろす。沸騰水で抽出し、かつ引き続き凍結乾燥することにより水溶性多糖類を獲得する。
次いで、１回目のゲルクロマトグラフィーによる分離工程をビオゲルＰ２を有するカラムを介し、かつ蒸留水を溶離剤として実施する。このカラムの排出容量で溶離された物質（ＳＦ  Ａ）を合し、２回目のゲルクロマトグラフィーにより分離する。分離剤としてはセファクリルＳ−３０００ＨＲを使用し、かつ溶離剤としてはもう１度蒸留水を使用する。この時点で現れる２つの物質ピークのうち後から溶離するものを集める。
第３の処理工程は溶離剤として傾斜緩衝液（リン酸塩緩衝液０．０１１Ｍ〜１Ｍ、ｐＨ６．４）を用い、ＤＥＡＥ−セファセルを介して実施するイオン交換クロマトグラフィーである。高いモル濃度で溶離されるフラクション（ＳＦ  ＩＩ）をプールし、更に処理する。次いで、ＨＣｌでの加水分解（ｐＨ１．００、３７℃、４５分）を実施し、アルコール沈殿によりサッカライドを回収する。
この加水分解物をゲルクロマトグラフィー工程（セファクリルＳ−２０００ＨＲ、溶離剤：蒸留水）で３つの物質群に分離し、この際最も小さい分子量を有する炭水化物（ＳＦ２／３）を集める。
このフラクションの抗付着活性はその都度生じる副生成物の活性を上回り、これを用いて更に作業する。
個々の物質の抑制強度は処理の過程において、０．７％溶液（ＳＦ  Ａ）における５０％から、０．００５％溶液（ＳＦ  ＩＩ）における８６．４％を越え、同様に０．００５％溶液（ＳＦ２／３）における完全抑制に上昇する。
このことは、一定の効果を達成するために必要な濃度は純度が上昇すると共に明らかに低下することを示す。このことは、同様な効果を達成するためには非常に高濃度で使用しなければならない市販のペクチンとは対照的である。
実施例２：
鹸化：
柑橘類ペクチン（Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄｔ社；物質Ａ0）１１．３ｇを蒸留水１２００ｍｌ中に溶かし、０．５Ｎ  ＮａＯＨ  ４８０ｍｌと混合し、室温で１５分間鹸化する。この溶液を濃ギ酸でｐＨ４．０に調節する。この鹸化したペクチンを２倍容量メタノールで沈殿させ、水２００ｍｌ中に溶かし、かつ更にこの沈殿を２回同じ方法で繰り返す。最後に得られた沈殿を５０℃で乾燥する（物質Ａ1）。
秤量：７．１５ｇ。
酵素による加水分解：
乾燥した沈殿を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液１００ｍｌで溶かし、ギ酸（１Ｍ）でｐＨ４．５に調節し、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ；Ｓｅｒｖａ社）からのペクチナーゼ５Ｓ  ２１ｍｇと混合し、かつ６０℃で６０分間恒温保持する。この配合物を酵素活性化のために短時間８０℃に加熱し、冷却し、かつ前記の方法でメタノールで沈殿させる。遠心分離により（２０分，４０００Ｕ／分）沈殿を獲得し、乾燥させる。
秤量：５ｇ（物質Ａ2）。
薄層クロマトグラフィー検査により、加水分解が所望のオリゴガラクツロニドに関して十分な量で生じたかどうか、調べる。
薄層クロマトグラフィー条件：
静止相：ＤＣ−完成プレート・キーゼルゲル（Ｆｅｒｔｉｇｐｌａｔｔｅｎ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）６０（Ｍｅｒｃｋ社）１０ｃｍ×２０ｃｍ、
流動剤：エタノール：２５ｍＭ水性酢酸（１：１）、
展開：３５℃で、
噴霧試薬：メタノール５０ｍｌ＋Ｈ2ＳＯ4（２０％ｇ／ｇ）５０ｍｌ中のナフタリン−１，３−ジオール２００ｍｇ、
クロマトグラフィー：
加水分解生成物１．５ｇを蒸留水１５ｍｌ中に溶かし、かつクロマトグラフィー分割を行う。
カラム：ビオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社のガラス管（２．５／４０ｃｍ）、床容量１５０ｍｌ
溶離剤：ギ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．７、段階傾斜溶液０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７Ｍ各１８２ｍｌ
静止相：ビオラッド社ＡＧＭＰ１アニオン交換樹脂（溶離剤で平衡とする）
流速：３ｍｌ／分
フラクションの容量：２２ｍｌ
個々のフラクションを薄層クロマトグラフィーにより（条件は前記参照）その組成に関し調べる。同じ組成のフラクションを合し、２倍容量のアセトンで沈殿させる。このようにして得られたオリゴガラクツロニドを遠心分離により（４０００Ｕ／分）獲得し、蒸留水２０ｍｌ中に取り込む。
この溶液中に、ビオラッドＡＧ  ５０  Ｗ  Ｘ−８カチオン交換体（Ｈ+）を混入撹拌し、ガラクツロニドを遊離酸の形にする。この樹脂を除去し、かつ濾液を凍結乾燥するとフレーク状の白色粉末が得られる。
この抑制の結果は次の表１中に示す。
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抑制効果の試験法：
付着テスト：
１）ヒトＯ＋赤血球の血液凝集：赤血球と菌とを合することにより、強力な血液凝集性菌株は２０秒以内に赤血球の凝集が生じ、この凝集は血液型非認容性の強度に相応する。
赤血球の濃度：１〜１．５％
菌懸濁液：４６２ｎｍにおいて混濁懸濁液ＯＤ１＝菌１０9／ｍｌ
凝集遮断の評価においては菌を赤血球に添加する前に２時間炭水化物溶液と共にその都度所望の濃度で恒温保持し、次いで、血液凝集を目で、半定量的に評価する。
２）ヒト泌尿器上皮への付着：朝尿からの泌尿器上皮を遠心分離により単離する。菌懸濁液を（上記と同様に）上皮細胞と合し、恒温保持し、その後８μのポリカーボネートフィルターで濾過し、複数回洗浄する。フィルターを取り除き、生理ＮａＣｌ−溶液中に導入し、かつ上皮細胞を揺すって落とす。このＮａＣｌ−懸濁液を再び遠心分離し、かつ沈積物をスライドガラス上に担持し、マイ・グリューンヴァルド及びジムザ（Ｍａｙ  Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ  ｕｎｄ  Ｇｉｅｍｓａ）により染色し、かつ上皮細胞５０個に付着する菌の数を数える（空試験値）。
対照：菌接触なしの上皮細胞。
付着遮断：同様の方法を行うが、上皮細胞懸濁液に添加する前に菌を１〜３時間の間種々の炭水化物の溶液中（０．５、０．１、０．０５、０．００１％）に入れる。
使用した菌：患者から単離した４種の大腸菌野生菌株及び２種の市販の菌株を一様に入れた。
結果：
微生物学的実験の範囲において、下に挙げた酸性オリゴサッカライド及び多糖類のほかに、全く付着遮断作用を示さない中性サッカライド（例えば、イヌリンのようなフルクタン、ラクトース及びラクツロースのようなジサッカライド等）も使用した。
天然の、即ち抽出によって得られたペクチンは付着遮断作用を示すが、この作用は更なる処理、例えば鹸化及び加水分解により上昇させることができた。
こうして、前記テスト配合物においてニンジンから水抽出により得られたペクチンは１％溶液においてテスト配合物中で４６％の抑制を示し、精製した製品は同じ配合物において０．１％の濃度で８０％の抑制を示した。
次の第２表には微生物学的実験の更なる結果を記載している：
選択した物質による上皮細胞へのバクテリアの付着の遮断（％）：
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第２表から明らかなように、効果の上昇はエステル化度及び分子の大きさ（重合度）に依存して誘導することができる。
有利な結果は重合度２〜７で得られる。
鹸化（即ち、エステル基の除去）により、同様に遮断の改善が見られる。