(57)【要約】ＡＧＥ受容体細胞質ドメインと直接的に、又は、間接的に結合し、リガンドとＡＧＥ受容体への結合からＮＦκＢの活性化に至るシグナル伝達を抑制するポリペプチドを提供する。配列表の配列番号１から３２、配列番号６７から配列番号７９及び配列番号８０から配列番号８６のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するか、又は、当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドが代表例として挙げられる。後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体のシグナル伝達に関連するポリペプチドを提供する。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた遺伝子治療用医薬を提供する。さらに、これらのポリペプチドを用いて、有用な医薬をスクリーニングする方法と、それにより得られる医薬組成物、診断薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋なポリペプチドであって、以下の特徴を有するポリペプチド。
（ａ）  後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体細胞質ドメインと直接的に、又は、間接的に結合する。
（ｂ）  リガンドの後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体への結合からＮＦκＢの活性化に至るシグナル伝達を抑制する。
【請求項２】
配列表の配列番号１から配列番号３２及び配列番号６７から配列番号７９のいずれかから選ばれるアミノ酸配列を有するか、あるいは、当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１１、１２、２９及び３０から選ばれるアミノ酸配列を有するか、あるいは、当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号８０から配列番号８６のいずれかから選ばれるアミノ酸配列を有するか、あるいは、当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列表の配列番号３３から６３のいずれかで示される塩基配列、又は、当該塩基配列で示されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなることを特徴とする請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列表の配列番号４３、４４、６１及び６２のいずれかで示される塩基配列、又は、当該塩基配列で示されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなることを特徴とする請求項５又は６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列表の配列番号８７から９３のいずれかで示される塩基配列、又は、当該塩基配列で示されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなることを特徴とする請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項５から８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬。
【請求項１０】
糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌及び歯周病並びに老化に関連する疾患から選ばれる疾患の治療のための請求項９に記載の遺伝子治療用医薬。
【請求項１１】
請求項５から８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターにより形質転換された微生物又は細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の微生物又は細胞を培養し、当該培養物から請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドを単離することを含む、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
スクリーニングの対象を、後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体細胞質ドメインと請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドとを含むスクリーニング系に存在させ、当該後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体細胞質ドメインと請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドとの結合の阻害又は増強の程度を測定することを含む、後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体細胞質ドメインと請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドとの結合を阻害又は増強させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
スクリーニングの対象を、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドを含むスクリーニング系に存在させ、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドの機能の亢進あるいは阻害の程度、又は、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドの量的増減の程度を測定することを含む、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドの機能を亢進あるいは阻害させる物質、又は、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドを量的に増減させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載のスクリーニング方法により得られる化合物。
【請求項１７】
化合物が以下の特徴を有する請求項１６記載の化合物。
（ａ）  後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体細胞質ドメインと直接的に、又は、間接的に結合する。
（ｂ）  リガンドの後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体への結合からＮＦκＢの活性化に至るシグナル伝達を抑制する。
【請求項１８】
請求項１６又は１７記載の化合物及びその塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物からなる群から選ばれる物質を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１９】
糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌及び歯周病並びに老化に関連する疾患から選ばれる疾患の治療のための請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドと特異的に結合し得る抗体。
【請求項２１】
配列表の配列番号３３から６３のいずれかの配列中、連続した少なくとも２０塩基を含む塩基配列、及びそれに相補的な配列、並びに、当該塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列で示されるポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列表の配列番号４３、４４、６１及び６２のいずれかの配列中、連続した少なくとも２０塩基を含む塩基配列、及びそれに相補的な配列、並びに、当該塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列で示されるポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列表の配列番号８７から９３のいずれかの配列中、連続した少なくとも２０塩基を含む塩基配列、及びそれに相補的な配列、並びに、当該塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列で示されるポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２１から２３のいずれかに記載のポリヌクレオチドと標識を含むプローブ。
【請求項２５】
請求項２４に記載のプローブを含む診断薬。
【請求項２６】
糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌及び歯周病並びに老化に関連する疾患の診断に用いられる、請求項２５に記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なポリペプチドに関し、詳細には、後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体（以下「ＲＡＧＥ」と称することもある）のシグナル伝達に関与する新規なポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
背景技術
グルコースやその他の還元糖が非酵素的にタンパク質や脂質のアミノ基と反応すると、シフ塩基を生じ、さらに非可逆的な反応により、ＡＧＥｓ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ：後期糖化産物）を形成する。ＡＧＥの生成と蓄積は、老化や高血糖によって起こり、タンパク質の変性、活性酸素の産生、細胞の活性化や炎症を引き起こす。ＡＧＥの蓄積は、糖尿病、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、自然な老化等、様々な病気で示唆されている。
ＡＧＥの作用メカニズムの一つと考えられているのが、特異的受容体との結合である。ＡＧＥの受容体はいくつか知られているが、その中で中心的に考えられているのがＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ：ＡＧＥ受容体）である。ＲＡＧＥは１９９２年にクローニングされた、細胞外に三つの免疫グロブリンドメインを持つ、一回膜貫通型受容体である。リガンドとしては、ＡＧＥ、アンフォテリン、β−アミロイド等が挙げられる。
ＡＧＥがＲＡＧＥと結合すると、ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓを介しＮＦκＢの活性化を引き起こすことが知られている。しかしＲＡＧＥからＮＦκＢまでのシグナル伝達経路は現在のところ不明である。
この経路に関与する分子が同定できれば、（１）その分子の外部からの導入、（２）低分子によるその分子の発現抑制、（３）低分子によるその分子の機能阻害、等を行うことにより、ＲＡＧＥのシグナル伝達を遮断し、糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌、歯周病等の疾病や老化等を抑制できる可能性がある。
発明の開示
すなわち本発明の目的は、ＲＡＧＥのシグナル伝達に関与する分子を取得し、上記で挙げたような疾患治療や医薬品のスクリーニングに利用する点にある。具体的には、（１）取得遺伝子をヒトに導入し、遺伝子治療を行う、（２）取得遺伝子を細胞に導入し、医薬品のスクリーニング、評価を行う等が挙げられる。
本発明者は、ＲＡＧＥ細胞質ドメインと相互作用するタンパク質を探索するために、酵母・ツー・ハイブリッド系を用い、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、ＲＡＧＥ細胞質ドメインと結合すると予想される３１ポリヌクレオチドを取得した。さらに、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った結果、７ポリヌクレオチドを取得し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の要旨は、実質的に純粋なポリペプチドであって、以下の特徴を有するポリペプチドに存する。
（ａ）  後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体細胞質ドメインと、直接的に、又は、間接的に結合する。
（ｂ）  リガンドの後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体への結合からＮＦκＢの活性化に至るシグナル伝達を抑制する。
上記の好ましい態様としては、配列表の配列番号１から３２、配列番号６７から７９及び配列番号８０から８６のいずれかから選ばれるアミノ酸配列を有するか、又は、当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることが挙げられる。さらに好ましい態様として、配列表の配列番号１１、１２、２９及び３０のいずれかから選ばれるアミノ酸配列を有するか、又は、当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることが挙げられる。
本発明の第二の要旨として、前記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられ、その好ましい態様として、配列表の配列番号３３から６３及び配列番号８７から９３のいずれかで示される塩基配列、又は、当該塩基配列で示されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で  ハイブリダイズする塩基配列からなることが挙げられる。さらに好ましい様態として、配列表の配列番号４３、４４、６１及び６２のいずれかで示される塩基配列、又は、当該塩基配列で示されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなることが挙げられる。
また、本発明においては、前記ポリヌクレオチドを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬が第三の要旨として挙げられ、糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌及び歯周病並びに老化に関する疾患の治療に用いることが好ましい態様として挙げられる。
さらに、本発明においては、前記ポリヌクレオチドを含むベクター；当該ベクターにより形質転換された微生物又は細胞；当該微生物又は細胞を培養し、当該培養物から前記ポリペプチドを単離することを含む、前記ポリペプチドの製造方法もその要旨として挙げられる。
本発明の第四の要旨として、スクリーニングの対象を、ＡＧＥ受容体細胞質ドメインと前記ポリペプチドとを含むスクリーニング系に存在させ、当該ＡＧＥ受容体細胞質ドメインと前記ポリペプチドとの結合の阻害又は増強の程度を測定することを含む、ＡＧＥ受容体細胞質ドメインと前記ポリペプチドとの結合を阻害又は増強させる物質のスクリーニング方法が挙げられる。
スクリーニング方法としては、スクリーニングの対象を、前記ポリペプチドを含むスクリーニング系に存在させ、前記ポリペプチドの機能の亢進あるいは阻害の程度、又は、前記ポリペプチドの量的増減の程度を測定することを含む、前記ポリペプチドの機能を亢進あるいは阻害する物質、又は、前記ポリペプチドを量的に増減させる物質のスクリーニング方法も要旨として挙げられる。
本発明の第五の要旨として、上記のスクリーニング方法で得られる化合物が挙げられ、以下の特徴を有する化合物が好ましい態様として挙げられる。
（ａ）  後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体細胞質ドメインと、直接的に、又は、間接的に結合する。
（ｂ）  リガンドの後期糖化産物（ＡＧＥ）受容体への結合からＮＦκＢの活性化に至るシグナル伝達を抑制する。
また、上記の化合物及びその塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物からなる群から選ばれる物質を有効成分として含む医薬組成物もその要旨として挙げられ、医薬組成物としては糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌及び歯周病並びに老化に関する疾患から選ばれる疾患の治療のために用いられることが好ましい態様として挙げられる。
また、本発明においては、前記ポリペプチドと特異的に結合し得る抗体；配列表の配列番号３３から６３及び配列番号８７から９３のいずれか、好ましくは配列番号４３、４４、６１及び６２のいずれかが挙げられ、これらの配列中、連続した少なくとも２０塩基を含む塩基配列、及びそれに相補的な配列、並びに、当該塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列で示されるポリヌクレオチド；当該ポリヌクレオチドと標識を含むプローブ；当該プローブを含む診断薬もその要旨として挙げられ、診断薬としては、糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌及び歯周病並びに老化に関連する疾患の診断に用いられることが好ましい態様として挙げられる。
発明を実施するための最良の形態
以下本発明について具体的に説明する。本発明のポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドであって、ＲＡＧＥ細胞質ドメインと直接的に、又は、間接的に結合し、リガンドのＲＡＧＥへの結合からＮＦκＢの活性化に至るシグナル伝達を抑制する。
ここで「直接的な結合」とは、ＲＡＧＥ細胞質ドメインと本発明のポリペプチドとの直接的な結合をいい、「間接的な結合」とは、本発明のポリペプチドとＲＡＧＥ細胞質ドメインとが結合する環境（アッセイ系内又はヒトの体内等）において元から存在するようなタンパク質等を介在してＲＡＧＥ細胞質ドメインと本発明のポリペプチドとが結合することをいう。また、「リガンド」とは、ＡＧＥ、アンフォテリン、β−アミロイド等が挙げられ、例えば、後述する医薬品のスクリーニング方法や遺伝子治療で本発明のポリペプチドを使用する場合は、目的とする疾患により適宜このリガンドを選択することが可能である。例えば糖尿病や糖尿病合併症を対象とする場合はＡＧＥを、癌を対象とする場合にはアンフォテリンを、アルツハイマー病を対象とする場合はβ−アミロイドを、適宜選択することが可能である。
本発明において「ポリペプチド」とは、一般的に当該技術分野においてペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質等として理解されているものも含む。従って、天然のタンパク質や、化学合成又は組換え技術等によって得られたポリペプチドやペプチドも含まれており、ポリペプチドは糖鎖やリン酸化等の翻訳後修飾は受けていても良いし、受けていなくても良い。
本発明のポリペプチドの前駆体も、上記した生理活性を有する限り本発明のポリペプチドに包含される。このような前駆体としては、本発明のペプチドのＮ末端側及び（又は）Ｃ末端側に、１以上のアミノ酸が付加したもの等が挙げられる。
さらに、本発明のポリペプチドは、半減期を延長させるためにポリエチレングリコールに結合させたり、分泌のために分泌配列あるいはリーダー配列に結合させたり、さらには精製の目的で融合ペプチドとして産生させることができる。
本発明のポリペプチドの構造的又は機能的特性によって特徴づけられるフラグメントも有用である。
本発明のポリペプチドあるいはその前駆体の生理学的に許容される酸付加塩も本発明に包含される。このような酸付加塩としては、塩酸、リン酸、硫酸等の無機酸との塩、酢酸、ギ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩が挙げられる。
本発明の「１又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列」とは、自然界において見出される対立遺伝変異もしくは自然突然変異、さらには人為的な突然変異体や組換え技術を用いて得られる変異体のアミノ酸配列を意味する。本発明に含有されるアミノ酸配列は、すべて本発明の新規なポリペプチド分子の活性を有するポリペプチドである。なお、たとえひとつのアミノ酸残基の改変であっても、その活性を損失させるような変化を含むアミノ酸配列は、本発明には含まれない。
本発明の「ポリヌクレオチド」とは、上記で述べた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドとして具体的には、配列表の配列番号１から３２、配列番号６７から７９及び配列番号８０から８６のいずれか、好ましくは配列番号１１、１２、２９及び３０のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列表の配列番号３３から６３及び配列番号８７から９３のいずれか、好ましくは配列番号４３、４４、６１及び６２のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられるが、同一のアミノ酸配列をコードする限り、個々のコドンは等価の他のコドンに置換されていてもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１から３２、配列番号６７から７９及び配列番号８０から８６のいずれか、好ましくは配列番号１１、１２、２９及び３０のいずれかに記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするものであってもよい。そのようなポリヌクレオチドとしては、配列番号３３から６３及び配列番号８７から９３のいずれか、好ましくは配列番号４３、４４、６１及び６２のいずれかに記載の塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有するもの及びそれに相補的なものが好ましい。更に、９０％の同一性を有するポリヌクレオチドが好ましく、特に９５％以上の同一性を有するものが最も好ましい。９５％以上、好ましくは９７％以上同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でも上記配列番号３３から６３及び配列番号８７から９３のいずれか、好ましくは配列番号４３、４４、６１又は６２のいずれかが挙げられこれらに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド又は該ＤＮＡから調製され得るプローブとハイブリダイズする。
さらに本発明は、本発明のポリペプチドの構造的又は機能的特性によって特徴づけられるフラグメントをコードするポリヌクレオチドを包含する。このようなポリヌクレオチドフラグメント及び該フラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ＰＣＲ用のプライマーとしてあるいは本発明のペプチドをコードするＤＮＡを検出するためのプローブとしても有用である。
以下、本発明に包含される特徴を、後述する実施例を代表例として説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
ＡＧＥのＲＡＧＥへの結合からＮＦκＢの活性化に至るシグナル伝達に関与する新規な分子を取得する目的で、後述の実施例１に示すように、まずＲＡＧＥの細胞質ドメイン遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。そのＲＡＧＥ細胞質ドメイン遺伝子を使用して、ＬｅｘＡのシステムを用いた酵素・ツー・ハイブリッド法でヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー及び脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、本発明者の知る限り、これまで報告されているどのタンパク質とも相同性の見られない新規なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得るに至った。
このようにしてＲＡＧＥ細胞質ドメインと結合すると予想される３１ポリヌクレオチド及び７ポリヌクレオチドを取得したが、これらの塩基配列は配列表の配列番号３３から６３及び配列番号８７から９３に記載の塩基配列で表され、好ましくは配列番号４３、４４、６１又は６２のいずれかが挙げられる。
上記のようにしてクローニングされたポリヌクレオチドの塩基配列は、プロモーター、オペレーター、エンハンサーのような転写制御活性や、終始配列やＲＡＧＥの発現を制御する他の調節配列を含む宿主細胞内で発現可能なベクターに連結させることができる。
本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターは、本発明のポリペプチドの産生に使用される。本発明のベクターとしては、宿主細胞中でのポリヌクレオチドの維持、増殖又は発現に適したものが使用される。本発明のポリペプチドをコードするクローン化されたポリヌクレオチドは、そのまま、あるいは制限酵素で消化したり、リンカーに付加してベクター中に挿入される。該ＤＮＡは、その５‘末端側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を有し、また３’末端側に翻訳終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ）を有する。該ＤＮＡは、発現ベクター中のプロモーターの下流に位置する。
このようなベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４）、ストレプトミセス属菌由来のプラスミド、サルモネラ属菌由来のプラスミド等のプラスミド、酵母エピソームや宿体染色体エレメント由来のプラスミド（ＹＣｐ型プラスミド、ｐＹＡＣ型プラスミド等）、λファージ等のバクテリオファージ、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス等のウイルス由来のベクター等が使用されるが、これらのベクターの多くは市販されている。
組換えベクター中のＤＮＡ配列は、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可能なように連結される。このようなプロモーターとしては、ファージλＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ及びｃプロモーター、バチルス属菌のＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、酵母のＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＳＵＣ２プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、Ｍｆαプロモーター、昆虫細胞の多角体プロモーター、Ｐ１０プロモーター、動物細胞用のＳＶ４０初期及び後期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、メタロチオネインプロモーター等が挙げられる。
一般に、発現ベクターは、リプレッサー結合部位及びエンハンサー等により作動する発現制御領域を含む。その他、発現ベクターは、選択マーカを含有する。好適なマーカーは真核細胞用のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、細菌用のテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子等である。ｄｈｆｒ遺伝子は、メソトレキセート耐性を形質転換細胞に付与し、また、ネオマイシン耐性遺伝子は、Ｇ４１８耐性を形質転換細胞に付与する。ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞を宿主とし、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとする場合には、チミジンを含まない培地中で形質転換体を選択できる。この場合、メソトレキセート（ＭＴＸ）濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子と同時に本発明のペプチドをコードするＤＮＡが細胞内で増幅され、高発現のＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞が得られる。
本発明の組換えベクターは、必要に応じて、シグナル配列をペプチドのＮ末端側に付加するように構築される。このようなシグナル配列は、大腸菌宿主の場合には、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ等のシグナル配列であり、酵母宿主の場合には、Ｍｆα、ＳＵＣ２シグナル配列等であり、動物細胞宿主の場合には、α−インターフェロンシグナル配列等である。
本発明は、また上記組換えベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、アスペルギウス属菌等の真核細胞、細菌細胞等の原核細胞である。リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染その他の方法により本発明の組換えベクターは宿主細胞に導入される。
上記したプロモーターの制御下、上記した哺乳動物細胞、酵母、細菌等の宿主において本発明のペプチドを発現できる。
原核宿主の例は、大腸菌、枯草菌、サルモネラ菌、シュードモナス、ストレプトミセス、スタフィロコッカス等である。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ピキア・パストリス等が挙げられる。
形質転換した原核宿主は増殖され、誘導可能なプロモーターを含むベクターの場合には、温度あるいは化学誘導物質により誘導し、該細胞を炭素源（グルコース、デキストラン、可溶性澱粉等）、窒素源（アンモニウム塩、硝酸塩類、、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕等）及び無機物（塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等）を含有する液体培地中、適当なｐＨ（ｐＨ約５−８）で適当な時間（約３−２４時間）培養する。適当な培養温度は、大腸菌については、約１４−４３℃、バチルス属菌の場合には、約３０−４０℃である。培養後、細胞を物理的あるいは化学的方法で破壊し、得られる粗抽質物から、本発明のペプチドが精製される。
形質転換された酵母は、最小培地等の培地中で、ｐＨ約５−８、温度約２０−３５℃で約２４−７２時間培養される。
昆虫細胞としては、ＡｃＮＰＶ（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮＰＶ）をウイルスとする場合には、Ｓｆ細胞、ＭＧ１細胞等が使用され、またカイコ多核体病ウイルス（ＢｍＰＶ）をウイルスとする場合には、カイコ幼虫及びカイコ培養細胞（ＢＭ−Ｎ細胞）等が使用される。カイコ細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含むＴＣ−１０培地等を用い、約２７℃でコンフルエントにした後、継代培養される。
哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ−７細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、ラットＧＨ３細胞、ラットＭｔＴ細胞、マウスＭＩＮ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、２９３細胞、ボウズ黒色腫細胞等である。
哺乳動物細胞発現ベクターは、複製起点、プロモーター（上記ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）、エンハンサー（ＳＶ４０エンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターー等）、選択マーカー（上記ｄｈｆｒ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位（ＳＶ４０ポリアデニル化部位等）、スプライスドナー及びアクセプター部位（ＳＶ４０スプライス部位由来のＤＮＡ配列）、転写終結配列及び５’非転写配列を含む。
このようなベクターとして、プラスミドベクター、１本鎖もしくは２本鎖ファージベクター、１本鎖もしくは２本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクター等が使用される。形質転換哺乳動物細胞の培養には、約５−２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等が使用され、ｐＨ約６−８、温度約３０−４０℃で約１５−７２時間培養が行われる。
哺乳動物細胞を宿主とした場合、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ等により本発明のポリペプチドを組換え細胞培養物から回収、精製できる。
本発明のポリペプチドはグリコシル化されていなくてもよい。また、宿主次第では、Ｎ末端にメチオニンを有するポリペプチドが得られる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌、歯周病等の疾病や、老化に関連する疾患の治療を目的とした遺伝子治療にも有用である。遺伝子治療とは、疾病の治療を目的として、遺伝子又は遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与することを意味する。なお、医薬用途を目的としては、精製されたポリヌクレオチド、組み換え体、さらには形質転換体の培養液、分離形質転換体、形質転換体処理物、固定化形質転換体、粗酵素液、酵素処理物等のいずれであっても構わない。
また、本発明のポリヌクレオチドを遺伝子治療に用いる場合は、通常、遺伝子治療に用いられる種々の技術を採用することができる。具体的には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ヘルペスウイルスベクター等のウイルスベクターあるいは、膜融合リポソーム法等により得られた本発明ポリヌクレオチド発現ベクターを特表平９−５０１０４６号公報等に記載の方法又はそれに準じた方法等により、糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌、歯周病等の疾病や、老化に関連する疾患（以下、「該疾患」と称することもある）の患者の骨髄細胞に移植することによる方法、特表平９−５０５０８４号公報等に記載の方法又はそれに準じた方法等により該疾患の患者の筋肉組織、血管系、腸、肺等に投与する方法、又は、特表平９−５０５５６１号公報等に記載の方法又はそれに準じた方法等により該疾患の患者の脳脊髄液に投与する方法等により本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子を体内で発現させることを可能とする。また、該疾患の患者の卵細胞に上記の方法により本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入することにより、患者の子孫における該疾患を予防することが可能である。
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、リガンドのＲＡＧＥへの結合からＮＦκＢの活性化に至るシグナル伝達を調節する化合物の同定に有用である。すなわち、本発明においては、スクリーニングの対象を、ＲＡＧＥ細胞質ドメインと本発明のポリペプチドとを含むスクリーニング系に存在させ、当該ＲＡＧＥと本発明のポリペプチドとの結合の阻害又は増強の程度を測定することを含む、ＲＡＧＥ細胞質ドメインと本発明のポリペプチドとの結合を阻害又は増強させる物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明において、「スクリーニングの対象」とは、スクリーニングに使用できる物質であれば特に制限はされず、高分子であっても低分子であっても良い。例えば、ペプチド、ペプチドのアナログ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられる。なお、本発明において、「スクリーニング」とは、アッセイを含む意味で用いられる。
スクリーニング系としては、通常使用される方法であれば制限はされないが、例えば、酵母・ツー・ハイブリッド系の実験系が使用できる。すなわち、本発明のポリペプチドとＲＡＧＥ細胞質ドメインとの相互作用を酵母・ツー・ハイブリッド活性でモニターし、そのレポーター活性を阻害あるいは促進する物質をスクリーニングすれば良い。別の方法として、ＢＩＡｃｏｒｅ（ビアコア（株）社製）を用いて、両者の相互作用の変化をスクリーニングの対象となる物質の存在下で確認することにより、その物質が両者の相互作用に与える影響を確認することができる。なお、ここでいうスクリーニングは、配列表の配列番号１から３２、配列番号６７から７９及び配列番号８０から８６のいずれかから選ばれるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドの全長を有するポリペプチドのみでなく、上記の方法で対象とする物質をスクリーニングできる限りにおいては少なくとも５アミノ酸残基からなる部分ペプチドを用いて行うことも可能である。好ましくは配列番号１１、１２、２９及び３０のいずれかから選ばれるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドの全長を有するポリペプチドのみでなく、上記の方法で対象とする物質をスクリーニングできる限りにおいては少なくとも５アミノ酸残基からなる部分ペプチドを用いて行うことも可能である。
なお、本発明において、「結合の阻害の程度を測定する」とは、結合の有無の測定を含む意味で使用される。
上記は、ＲＡＧＥ細胞質ドメインをスクリーニング系に共存させる方法であるが、本発明においては、ＲＡＧＥ細胞質ドメインを共存させない方法も可能である。すなわち、スクリーニングの対象を、本発明のポリペプチドを含むスクリーニング系に存在させ、本発明のポリペプチドの機能の亢進あるいは阻害の程度、又は、本発明のポリペプチドの量的増減の程度を測定することを含む、本発明のポリペプチドの機能を亢進あるいは阻害させる物質、又は、本発明のポリペプチドを量的に増減させる物質のスクリーニング方法が提供される。
スクリーニングの対象、スクリーニングの定義、スクリーニング系に関しては前述のとおりである。「機能の亢進あるいは阻害の程度を測定する」、「量的増減の程度を測定する」とは、それぞれ機能の亢進あるいは阻害の有無の測定、量的増減の有無の測定を含む意味で使用される。
スクリーニング系としては、通常使用される方法であれば制限はされないが、例えば、ｐＮＦｋ−ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を導入した細胞に、本発明のポリペプチドを含むベクターを、導入しＮＦｋＢ活性を増強もしくは阻害する物質をスクリーニングすれば良い。
前述のように、本発明のポリペプチドはＲＡＧＥからＮＦκＢまでのシグナル伝達経路に関与するため、本発明のスクリーニング方法は、糖尿病、糖尿病合併症、アルツハイマー病、透析性アミロイドーシス、癌、歯周病等の疾病や、老化に関連する疾患の予防及び／又は治療薬として有用な物質のスクリーニング方法として使用することが可能である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物及びその塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物は、本発明のポリペプチドとＲＡＧＥ細胞質ドメインとの結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物や、本発明のポリペプチドとＲＡＧＥ細胞質ドメインとの相互作用により生じる細胞刺激活性を有する化合物である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、発酵生産物、非ペプチド性化合物、合成化合物等が挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっても良い。
医薬組成物は、例えば、それ自体を単独で投与してもよいが、薬学的に許容され得る製剤用添加物を用いて上記化合物を有効成分として含む医薬組成物を製造して投与するのが好適である。医薬組成物の組成は、本発明化合物を製剤上許容しうる担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、希釈剤、溶解補助剤等）と混合して得られる医薬組成物あるいは製剤（錠剤、ピル剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エマルジョン剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶解剤、注射剤、点滴剤あるいは坐剤等）の形態で経口的又は非経口的に投与することができる。医薬組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。本明細書において、非経口とは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射あるいは点滴法等を含むものである。注射用調剤は当該分野で知られた方法で調製することができる。直腸投与用の坐剤はその薬物と適当な補形剤等と混合して製造することができる。経口投与用の固形投与剤型としては、粉剤、顆粒剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤等の上記したものが挙げられる。経口投与用の液剤は、医薬として許容されるエマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤等が挙げられる。
なお、上記各製剤の調製は、常法に従って行うことができる。本発明の医薬の臨床投与量は、有効成分として用いる物質、年齢、病状、症状、同時投与の有無等により適宜増減して決定する。前記１日投与量を１日に１回、又は適当な間隔をおいて１日に２〜数回に分けて投与しても良いし、数日毎に間欠投与しても良い。
また、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列情報をもとに、その配列と相補的なポリヌクレオチドに特異的なアンチセンスを得ることが可能である。ここでいうアンチセンスとは、本発明のポリヌクレオチドをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡの少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドであり、本発明のポリヌクレオチドの転写及び翻訳を阻害するものをいう。更に、本発明の形質転換体を用いて、そのアンチセンスの効果を確認することもできる。このアンチセンスには、一般的なＤＮＡ、ＲＮＡだけでなく、他のヌクレオチド類似の配列特異的なアンチセンス効果を有するとされる分子すべてに対して利用できる。
本発明のポリヌクレオチドやポリペプチドは、上記疾患に対する診断目的としても使用可能である。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された細胞を使用して本発明のポリペプチドを大量に生産し、そのタンパク質を使用して本発明のポリペプチドに特異的な抗体を得ることが可能である。免疫抗原としては、本発明のポリペプチドの全長を使用しても、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも連続した５アミノ酸残基からなるペプチド断片を用いても良い。抗体には、完全な抗体のほか、抗原結合部位を含んだ断片であるＦａｂ、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等、本来の抗体をもとに製造された抗体効果を有するとされるすべての分子も本発明においては含まれる。
上記のような抗体を使用すれば、細胞や組織中の本発明のポリペプチドの検出を目的としたＥＬＩＳＡやＲＩＡ、ウェスタンブロット系を構築することが可能である。このような検出系は、例えば上述のスクリーニング方法の際に述べたような疾患等の診断目的に使用可能である。
また、本発明においては、配列表の配列番号３３から６３及び配列番号８７から９３のいずれか、好ましくは配列番号４３、４４、６１及び６２が挙げられ、これらの配列中、連続した少なくとも２０塩基を含む塩基配列、及びそれに相補的な配列、並びに、当該塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列で示されるポリヌクレオチドと適当な標識を含むプローブを使用して、細胞や組織の本発明のポリペプチドの発現を検出することもできるので、このようなプローブも診断目的のアッセイで使用可能である。この場合の標識とは通常の診断目的のアッセイで使用できるものであれば、特に制限はされないが、例えば、アビジンやビオチン、ペルオキシダーゼ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質、抗原等が使用できる。これらを用いて蒸気塩基配列を通常用いられる方法により標識し、それぞれに適した方法で標識を検出することが可能である。
実施例
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
酵母・ツー・ハイブリッド法によるＲＡＧＥ細胞質ドメインと相互作用するタンパク質のクローニング
ＲＡＧＥの細胞質ドメイン遺伝子（配列表の配列番号６４）（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９２  Ｊｕｌ  ２５；２６７（２１）：１４９９８−５００４）を、合成オリゴヌクレオチド５’  ＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧ  ３’（配列表の配列番号６５）５’  ＣＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＴＣ  ３’（配列表の配列番号６６）を用いて増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化した。ベクターのｐＨｙｂＬｅｘ／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）も制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、この両者をＴａｋａｒａ  Ｌｉ  ｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２（宝酒造社製）を用いて１４時間ライゲーション反応を行い、大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造社製）に形質転換し、コロニーを取得することにより、ｐＨｙｂＬｅｘ／ＺｅｏにＲＡＧＥの細胞質ドメインを組込んだベクター（ｐＨｙｂＬｅｘ／Ｚｅｏ−ＲＡＧＥＣＤ）を得た。ＲＡＧＥ細胞質ドメインの配列が正しいことをＤＮＡシーケンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて確認した。
上記で得られたベクターｐＨｙｂＬｅｘ／Ｚｅｏ−ＲＡＧＥＣＤを後述のＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲのキットに付属のＹｅａｓｔ  Ｌ４０株に導入し、ｐＨｙｂＬｅｘ／Ｚｅｏ−ＲＡＧＥＣＤが導入されたクローンを選択した。
上記導入株にＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ＬｅｘＡライブラリーＨｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を導入し、１０６個のコロニーのスクリーニングを行った。一次スクリーニングでは、ヒスチジン欠損培地を用い、相互作用のレポーターであるヒスチジン遺伝子の発現を指標に約２００コロニーを選択した。二次スクリーニングでは、相互作用のレポーターであるＬａｃＺの発現を指標に３１コロニーを取得した。最終的に確実に２種類のレポーター活性を持つと確認されたクローンを３１個選択した。なお、これらの実施は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社及びＣｌｏｎｔｅｃｈ社の酵母・ツー・ハイブリッド法のプロトコルに準じて行った。
上記で取得した酵母コロニーから、ライブラリーベクターを回収し、ＤＮＡシーケンサー（同上）で塩基配列を調べた。これらの塩基配列を配列表の配列番号３３から６３に示す。
このようにして取得したポリペプチド（スクリーニングによりｐＢ４２ＡＤベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入されている状態）をベクターより、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩによって切り出した。この断片を、あらかじめ、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断したｐＧＢＫＴ７ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２（宝酒造社製）を用いてライゲーション反応を行い、ポリペプチドの入ったｐＧＢＫＴ７ベクターを得た。同様に前述のｐＨｙｂＬｅｘ／ｚｅｏ−ＲＡＧＥＣＤベクターより制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩを用いて、ＲＡＧＥＣＤ断片を切り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断したｐＧＡＤＧＨベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）とライゲーションさせて、ｐＧＢＫＴ７−ＲＡＧＥＣＤベクターを得た。
酢酸リチウム法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社キットに付属のＹｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ２０頁を参照）を用いて、ｐＧＢＫＴ７−ポリペプチドベクターを酵母ＡＨ１０９株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に、ｐＧＡＤＴ７−ＲＡＧＥＣＤベクターを酵母Ｙ１８７株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に導入した。
プラスミドの導入された酵母を、トリプトファン欠乏ＳＤ培地、ロイシン欠乏ＳＤ培地で選択し、下記の組み合わせで接合させ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社キットに付属のＹｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ４４頁を参照）、二種類のプラスミドの導入された酵母を、トリプトファン−ロイシン欠乏ＳＤ培地で選択した。
１．ｐＧＢＫＴ７−配列番号４３のポリヌクレオチド＋ｐＧＡＤＴ７−空ベクター
２．ｐＧＢＫＴ７−配列番号４４のポリヌクレオチド＋ｐＧＡＤＴ７−空ベクター
３．ｐＧＢＫＴ７−配列番号６１のポリヌクレオチド＋ｐＧＡＤＴ７−空ベクター
４．ｐＧＢＫＴ７−配列番号６２のポリヌクレオチド＋ｐＧＡＤＴ７−空ベクター
５．ｐＧＢＫＴ７−配列番号４３のポリヌクレオチド＋ｐＧＡＤＴ７−ＲＡＧＥＣＤベクター
６．ｐＧＢＫＴ７−配列番号４４のポリヌクレオチド＋ｐＧＡＤＴ７−ＲＡＧＥＣＤベクター
７．ｐＧＢＫＴ７−配列番号６１のポリヌクレオチド＋ｐＧＡＤＴ７−ＲＡＧＥＣＤベクター
８．ｐＧＢＫＴ７−配列番号６２のポリヌクレオチド＋ｐＧＡＤＴ７−ＲＡＧＥＣＤベクター
上記酵母のトリプトファン−ロイシン−ヒスチジン−アデニン欠乏ＳＤ培地での生育実験の結果、１、２、３、４は生育せず、５、６、７、８は生育した。
よって、配列番号４３、４４、６１、６２のそれぞれのポリヌクレオチドは、ＲＡＧＥＣＤ断片と特異的に結合していることが示された。
即ち、これらのポリヌクレオチドから翻訳されるポリペプチドは、ＲＡＧＥの細胞質ドメインと結合することがわかる。
なお、これらの実施はＭＡＴＣＨ  ＭＡＫＥＲ  ＧＡＬ４  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のプロトコルに準じて行った。
実施例２
酵母・ツー・ハイブリッド法によるＲＡＧＥ細胞質ドメインと相互作用するタンパク質のクローニング
ＲＡＧＥの細胞質ドメイン遺伝子（配列表の配列番号６５）（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９２  Ｊｕｌ  ２５；２６７（２１）：１４９９８−５００４）を、合成オリゴヌクレオチド５’  ＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧ  ３’（配列表の配列番号６６）５’  ＣＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＣＴＣ  ３’（配列表の配列番号６７）を用いて増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化した。ベクターのｐＧＢＫＴ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）も制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、この両者をＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２（宝酒造社製）を用いて１４時間ライゲーション反応を行い、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、コロニーを取得することにより、ｐＧＢＫＴ７にＲＡＧＥの細胞質ドメインを組込んだベクター（ｐＧＢＫＴ７−ＲＡＧＥＣＤ）を得た。ＲＡＧＥ細胞質ドメインの配列が正しいことをＤＮＡシーケンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて確認した。
上記で得られたベクターｐＧＢＫＴ７−ＲＡＧＥＣＤを後述のＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲのキットに付属のＹｅａｓｔ  ＡＨ１０９株に導入し、ｐＧＢＫＴ７−ＲＡＧＥＣＤが導入されたクローンを選択した。
上記導入株とｐｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲライブラリーＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を接合させ，１０６個のコロニーのスクリーニングを行った。一次スクリーニングでは，ヒスチジン欠損培地を用い，相互作用のレポーターであるヒスチジン遺伝子の発現を指標に約１４０コロニーを選択した。二次スクリーニングでは，アデニン欠損培地を用い，相互作用のレポーターであるアデニンの発現を指標に４０コロニーを取得した。
最終的に確実に２種類のレポーター活性を持つと確認されたクローンを７個選択し、ライブラリーベクターを回収し、ＤＮＡシーケンサー（同上）で塩基配列を調べた。これらの塩基配列を配列表の配列番号８７から９３に示す。
なお、これらの実施は，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社の，酵母・ツー・ハイブリッド法のプロトコルに準じて行った。
実施例３
クローニングしたポリペプチドの機能解析
配列番号６２のポリヌクレオチドはＰＫＣ  ｚｅｔａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｚｅｔａ）の一部であることより、ＰＫＣ  ｚｅｔａ全長をＰＣＲ法を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＫＣｚｅｔａベクターを得た。
ｒａｔ  Ｃ６  ｇｌｉｏｍａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０７）にＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（宝酒造社製）を用いてｐＮＦｋＢ−ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を遺伝子導入した。ジェネティシン（ナカライテスク社製）添加培地で生育させて、薬剤耐性細胞を取得し、安定発現細胞を得た。
上記細胞に、ＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（宝酒造社製）を用いてｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＫＣ  ｚｅｔａ各プラスミドを導入し、４８時間後に無血清ＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）に置換し、さらに１２時間後に、ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）１．７６ｇとグリオキシル酸（ＯＨＳＩＧＭＡ社製）０．３６ｇをシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社製）触媒存在下、３６℃で２４時間インキュベートして調整したカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）で６時間の刺激を行った。刺激後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）を用いてルシフェラーゼアッセイを行い、ＡＲＶＯｓｘプレートリーダー（ｗａｌｌａｃ社製）を用いて測定した。その結果、空ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）の導入に比べ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＫＣｚｅｔａの導入により、ＮＦｋＢ活性が有意に上昇していることがわかった（図１）。
糖尿病合併症等、ＲＡＧＥが関与すると考えられる疾患においては、ＡＧＥによるＮＦｋＢの活性化が寄与していることが知られていたが、その途中経路は不明であった。
この実験により、ＲＡＧＥ細胞内ドメインと相互作用するポリペプチドが、ＡＧＥ刺激によるＮＦｋＢ活性を上昇させることが分かり、配列番号６２のポリヌクレオチドが、ＲＡＧＥの下流シグナルを仲介していることが示唆された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ＲＡＧＥのシグナル伝達に関連する新規なポリペプチドが得られる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子治療に用いられる遺伝子ソースとして利用可能である。さらに、本発明のポリペプチドは、ＲＡＧＥからＮＦκＢの活性化に至るシグナル伝達に関与する疾患の治療等に有用な物質のスクリーニング方法、このスクリーニング方法より得られる医薬組成物、それらの疾患の診断薬を提供することが可能である。
なお、本出願は、日本特許出願特願２００１−２１９１２２号を優先権主張して出願されたものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、クローニングしたポリペプチドの機能を示す図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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