(57)【要約】慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染症の患者（肝細胞癌患者と肝細胞癌を有しない患者）、および健常対照者において、ＩＬ−１β遺伝子多型と肝細胞癌発生との関連を、他の臨床的な交絡因子の影響を補正して評価した。その結果、ＩＬ−１β遺伝子多型とＣ型肝炎ウイルス感染後の肝細胞癌の発生とが関連することが判明した。ＩＬ−１β遺伝子多型を検出することで、Ｃ型肝炎ウイルス感染による肝細胞癌の発生を予測することが可能となり、肝細胞癌の予防および治療のためのより経済的かつ効率的な戦略を立てることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型を検出する工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
【請求項２】
ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型が該遺伝子の発現を上昇させる多型である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型が該プロモーターの−３１領域に生じた多型である請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
多型が一塩基多型である請求項１〜３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
（ａ）（ｉ）被検者から調製したＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）ヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、ＩＬ−１β遺伝子多型を検出する工程
【請求項１１】
ＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定する工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１１に記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
（ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれるＩＬ−１βタンパク質をコードするＲＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたＩＬ−１βタンパク質をコードするＲＮＡの量を対照と比較する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１１に記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
（ａ）（ｉ）被検者から調製したｃＤＮＡ試料、および
（ｉｉ）ＩＬ−１β遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のｃＤＮＡ試料と工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれるＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定する工程
（ｄ）測定されたＩＬ−１β遺伝子の発現量を対照と比較する工程
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１１に記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法。
（ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれるＩＬ−１βタンパク質の量を測定する工程
（ｃ）測定されたＩＬ−１βタンパク質の量を対照と比較する工程
【請求項１５】
肝炎ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである請求項１〜１４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１６】
ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬。
【請求項１７】
ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板からなる肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬。
【請求項１８】
ＩＬ−１β遺伝子にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬。
【請求項１９】
ＩＬ−１β遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板からなる肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬。
【請求項２０】
ＩＬ−１βタンパク質に結合する抗体を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬。
【請求項２１】
肝炎ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである請求項１６〜２０のいずれかに記載の検査薬。
【請求項２２】
ＩＬ−１βタンパク質を阻害する化合物を有効成分とする、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための薬剤。
【請求項２３】
ＩＬ−１β遺伝子発現を阻害する化合物を有効成分とする、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための薬剤。
【請求項２４】
肝炎ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである請求項２２または２３に記載の薬剤。
【請求項２５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＩＬ−１βタンパク質と被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＩＬ−１βタンパク質と被験化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＩＬ−１βタンパク質と結合する被験化合物を選択する工程
【請求項２６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＩＬ−１β遺伝子を発現する細胞に、被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被験化合物を接触させない場合と比較して、該発現量を減少させる化合物を選択する工程
【請求項２７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）工程（ｂ）において測定したレポーター遺伝子の発現量を、被験化合物の非存在下において測定した場合と比較して、減少させる化合物を選択する工程
【請求項２８】
肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項２５〜２７のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、並びに該肝細胞癌の治療または予防のための薬剤に関する。
背景技術
世界の人口の約３％に当たる１億７千万人以上の人が、Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ；ＨＣＶ）に慢性的に感染している（ＷＨＯ  １９９８）。持続的に感染した人の大多数は慢性肝炎を発症し、これは肝硬変（Ｔｏｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３３２：１４６３−１４６６，１９９５、Ｐｏｙｎａｒｄ  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４９：８２５−８３２，１９９７）および／または肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＨＣＣ）（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：６５４７−６５４９，１９９０、Ｓｈｉｒａｔｏｒｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２２：１０２７−１０３３，１９９５、Ｔａｋａｎｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２１：６５０−６５５，１９９５）に進行する場合がある。また、最近の疫学的データから、先進諸国においてもＨＣＶの感染によりＨＣＣの発生率が有意に増加する傾向があることが明らかにされている（Ｔａｙｌｏｒ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５０：１１４２−１１４３，１９７９−１９９４、Ｄｅｕｆｆｉｃ  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：２１４−２１５，１９９８、Ｅｌ−Ｓｅｒａｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３４０：７４５−７５０，１９９９）。
これまでに、ＨＣＶ感染後の慢性肝炎からＨＣＣへの進行の経過は患者によって異なることが分かっている（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３２：２９６−３０５，２０００）。これらの知見は、ＨＣＶ感染後のＨＣＣ発生において、宿主側の遺伝的要因が関与していることを示唆している。しかしながら、このような要因についての報告は皆無であり、そのメカニズムに関しては全く解明されていない。
一方、ＨＣＣを発症するリスクは炎症および繊維症の重症度と共に増加することが分かっている（Ｔａｒａｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ８６：５８９−５９５，１９９９、Ｔａｋａｎｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２１：６５０−６５５，１９９５、Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１３１：１７４−１８１，１９９９）。これまでに、炎症反応および免疫における重要なサイトカインのインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８７：２０９５−２１４７，１９９６、Ｖａｓｓａｌｌｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４１１−４５２，１９９２）の血清濃度は、慢性Ｃ型肝炎患者では上昇していることが示されている（Ｔｉｌｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０３：２６４−２７４，１９９２、Ｋｉｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ．４１：３１５−３２１，１９９６）。このことから、ＨＣＶ感染後の肝炎において、両サイトカインが重要な役割を担っている可能性が考えられる。
また、これまでに、ＩＬ−１βプロモーターの−３１遺伝子多型を含め、ＩＬ−１β産生に影響を及ぼすと考えられているＩＬ−１β遺伝子についてのいくつかの多型が報告されている（Ｂｉｄｗｅｌｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ｏｎ−ｌｉｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｍ．ｂｒｉｓ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＧＡＩ／ｃｙｔｏｋｉｎｅ４．ｈｔｍ、Ｅｌ−Ｏｍａｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：３９８−４０２，２０００）。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に感染した白人では、ＩＬ−１β産生を増強する可能性があるＩＬ−１βプロモーターの−３１、およびＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子２（ＩＬ−１ＲＮ＊２）のＴ／Ｔ遺伝子型は、胃癌のリスクの増加に関連している（Ｅｌ−Ｏｍａｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：３９８−４０２，２０００）。ＩＬ−１ＲＮ＊２は、ＩＬ−１β産生の増強（Ｓａｎｔｔｉｌａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１９５−１９８，１９９８）、炎症性腸疾患（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０６：６３７−６４２，１９９４、Ｈｅｒｅｂａｃｈ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９２：１１６４−１１６９，１９９７）、自己免疫疾患（Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３７：１３８０−１３８５，１９９４、Ｐｅｒｒｉｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｉｍｍｎｏｐａｔｈｏｌ．８７：３０９−３１３，１９９８）に関連している。また、ＴＮＦ−αプロモーター領域において−３７６、−３０８、および２３８位で報告されている多型は、ＴＮＦ−α産生に影響を及ぼすと考えられている（Ｂｉｄｗｅｌｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ｏｎ−ｌｉｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｍ．ｂｒｉｓ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＧＡＩ／ｃｙｔｏｋｉｎｅ４．ｈｔｍ）。ＴＮＦ−α−３０８対立遺伝子との疾患の関連は、多様な感染症および炎症疾患について報告されている（Ｂｉｄｗｅｌｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ｏｎ−ｌｉｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｍ．ｂｒｉｓ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＧＡＩ／ｃｙｔｏｋｉｎｅ４．ｈｔｍ）。具体的には、肝臓移植のドナーにこの多型が存在すれば、移植片のＨＣＶ再感染に対する炎症反応に影響を及ぼし、移植片の損傷が加速される（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１８９８−１９０２，１９９９）。その上、ＴＮＦ−αプロモーター領域に対するＯＣＴ−１結合に影響を及ぼす−３７６対立遺伝子が、脳性マラリアに対する感受性の増加に関連していることが最近報告された（Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２２：１４５−１５０，１９９９）。
しかしながら、これまでのところＩＬ−１β等のサイトカインが、肝炎ウイルス感染後のＨＣＣの発生に関与するという報告例はなかった。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＩＬ−１β等のサイトカインが、肝炎ウイルス感染後のＨＣＣの発生に関与するか否かを見出し、肝炎ウイルス感染後のＨＣＣの発生の予防および治療のために有用な検査方法等を提供することにある。より詳しくは、ＩＬ−１βの遺伝子発現に関与する遺伝子多型と肝炎ウイルス感染後のＨＣＣの発生との関連を見出し、ＩＬ−１β遺伝子の発現および該遺伝子の多型を利用した肝炎ウイルス感染に起因するＨＣＣの予防および治療のための有用な検査方法、検査試薬、薬剤、および薬剤のスクリーニング方法を提供することにある。
上記の知見から、本発明者は、ＩＬ−１β等の遺伝子多型がＨＣＶ感染後のＨＣＣ発生に関与する宿主側の遺伝的要因である可能性を考え、ＩＬ−１β等の遺伝子多型が、ＨＣＶ感染後のＨＣＣ発生における個人差に影響しているものと想到した。そこで、本発明者は、ＩＬ−１ファミリー（ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ｒａ）およびＴＮＦ−αにおける遺伝子多型を、慢性ＨＣＶ感染症の日本人患者（ＨＣＣ患者とＨＣＣを有しない患者）、および、健常対照者において、標準的なポリメラーゼ連鎖反応に基づく遺伝子タイピング技術によって調査し、これらの多型とＨＣＣ発生との関連を、他の交絡臨床変数を制御しながら評価した。
その結果、ＨＣＣ患者におけるＩＬ−１βプロモーターの−３１遺伝子多型の比率は、ＨＣＣを有しない患者および健常対照者より有意に高かった。この結果は、ＩＬ−１β−３１の遺伝子多型とＨＣＶ感染後のＨＣＣ発生とが関連することを示唆していた。一方、ＩＬ−１β−３１の遺伝子多型は、ＩＬ−１β産生に影響を及ぼすことが知られている。よって、ＩＬ−１β産生とＨＣＶ感染後のＨＣＣ発生とが関連するものと考えられる。さらに、ＩＬ−１β−３１の遺伝子多型とＨＣＣとの関連は、ＨＣＶ感染者においてＨＣＣ発生の重要な影響因子であるとされる肝硬変の存在とは完全に無関係であることを示唆する知見を得た。
本発明によって、ＨＣＶ感染に起因するＨＣＣの発生を推定できる遺伝子マーカーを初めて同定できた。該遺伝子マーカーは、肝硬変を有しない慢性Ｃ型肝炎の初期段階の患者において、ＨＣＣのリスクがより高いサブグループを同定するための全く新しく強力なマーカーになりうる。ＩＬ−１β遺伝子の発現量または該遺伝子に生じた多型を検出することで、ＨＣＶ感染によるＨＣＣの発生を予測することが可能となり、ＨＣＣの予防および治療するためのより経済的かつ効率的な戦略を立てることができるものと大いに期待される。
即ち、本発明は、ＩＬ−１β遺伝子の発現および該遺伝子の多型を利用した肝炎ウイルス感染に起因するＨＣＣの予防および治療のために有用な検査方法、検査試薬、薬剤、および薬剤のスクリーニング方法に関し、より具体的には、
〔１〕  ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型を検出する工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
〔２〕  ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型が該遺伝子の発現を上昇させる多型である、〔１〕に記載の検査方法、
〔３〕  ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型が該プロモーターの−３１領域に生じた多型である〔１〕に記載の検査方法、
〔４〕  多型が一塩基多型である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の検査方法、
〔５〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
〔６〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔７〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔８〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔９〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１０〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
（ａ）（ｉ）被検者から調製したＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）ヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、ＩＬ−１β遺伝子多型を検出する工程
〔１１〕  ＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定する工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
〔１２〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１１〕に記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
（ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれるＩＬ−１βタンパク質をコードするＲＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたＩＬ−１βタンパク質をコードするＲＮＡの量を対照と比較する工程
〔１３〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１１〕に記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
（ａ）（ｉ）被検者から調製したｃＤＮＡ試料、および
（ｉｉ）ＩＬ−１β遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のｃＤＮＡ試料と工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれるＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定する工程
（ｄ）測定されたＩＬ−１β遺伝子の発現量を対照と比較する工程
〔１４〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１１〕に記載の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法、
（ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれるＩＬ−１βタンパク質の量を測定する工程
（ｃ）測定されたＩＬ−１βタンパク質の量を対照と比較する工程
〔１５〕  肝炎ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の検査方法、
〔１６〕  ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬、
〔１７〕  ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板からなる肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬、
〔１８〕  ＩＬ−１β遺伝子にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬、
〔１９〕  ＩＬ−１β遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板からなる肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬、
〔２０〕  ＩＬ−１βタンパク質に結合する抗体を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬、
〔２１〕  肝炎ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである〔１６〕〜〔２０〕のいずれかに記載の検査薬、
〔２２〕  ＩＬ〜１βタンパク質を阻害する化合物を有効成分とする、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための薬剤、
〔２３〕  ＩＬ−１β遺伝子発現を阻害する化合物を有効成分とする、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための薬剤、
〔２４〕  肝炎ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである〔２２〕または〔２３〕に記載の薬剤、
〔２５〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＩＬ−１βタンパク質と被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＩＬ−１βタンパク質と被験化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＩＬ−１βタンパク質と結合する被験化合物を選択する工程
〔２６〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＩＬ−１β遺伝子を発現する細胞に、被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被験化合物を接触させない場合と比較して、該発現量を減少させる化合物を選択する工程
〔２７〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）工程（ｂ）において測定したレポーター遺伝子の発現量を、被験化合物の非存在下において測定した場合と比較して、減少させる化合物を選択する工程
〔２８〕  肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、〔２５〕〜〔２７〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、を提供するものである。
本発明者によって、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ２６５４０）に生じた多型が、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌に関与することが明らかになった。このことから、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型は、ＩＬ−１β遺伝子の発現を上昇させることで、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌を発症させるものと考えられた。従って、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型、およびＩＬ−１β遺伝子の発現を指標することにより、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査、および該肝細胞癌の予防および治療のための薬剤、並びに該薬剤のスクリーニング方法の提供が可能となった。
多型とは、遺伝学的には、人口中１％以上の頻度で存在している１遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義されるが、本発明における「多型」は、この定義に制限されず、１％未満の塩基の変化も「多型」に含む。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が欠失あるいは挿入している多型等が挙げられるが、これらに制限はされない。さらに、多型部位の数も、１個に限定されず、複数個の多型を有していてもよい。また、本発明における「肝炎ウイルス」とは、肝細胞癌を引き起こすウイルスである。具体的には、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス等を例示することができるが、本発明において好ましくは、Ｃ型肝炎ウイルスである。「肝炎ウイルスに起因する肝細胞癌」とは、上記ウイルス感染によって引き起こされる肝細胞癌を意味する。
本発明の検査方法の一つの態様は、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域の多型を指標とする方法である。本発明は、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型を検出する工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法を提供する。
本発明において、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型は、その多型の種類、数、部位は特に限定されないが、好ましくは、ＩＬ−１β遺伝子の発現を上昇させるような多型であり、より好ましくは、ＩＬ−１β遺伝子プロモーターの−３１領域に生じた多型である。
本発明における「ＩＬ−１β遺伝子プロモーターの−３１領域に生じた多型」とは、少なくとも−３１位に多型を有すればよい。即ち、−３１位とそれ以外の部位に多型が存在していてもよく、−３１位を含むように一から数十塩基（数千塩基のこともある）の欠失あるいは挿入からなる多型であってもよい。
本発明において「肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査」とは、被検者が、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌を罹患しているか否かの判定のための検査（診察）の他、肝炎ウイルス感染した被検者が、肝細胞癌にかかりやすいか否かを判断するために予め行う検査（予診）も含まれる。
本発明の上記検査方法において、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域に生じた多型の検出は、例えば、被検者のＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を直接決定することによって行うことができる。この方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、肝生検や手術により採取あるいは切除した肝臓等の組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。
本方法においては、次いで、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことも可能である。
本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、正常な（野生型）ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの配列を言う。一般に健常人のＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの配列は正常であるものと考えられることから、上記工程の「対照と比較する」とは、通常、健常人のＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの配列と比較することを意味するが、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：Ｕ２６５４０）等に野生型として登録されているＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの配列と比較してもよい。このような比較の結果、被検者のＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの配列が対照と異なっていた場合には、肝炎ウイルスに未感染の被検者または感染後であっても肝細胞癌を発症していない被検者は、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌を発症する疑いがあるものと判定される。さらに、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌を罹患している被検者は、その原因が、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域の多型にあると判定される。
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
例えば、本発明における多型の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ａｌｕ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２  Ｊａｎ  １；１２（１）：１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１  Ａｕｇ  １；６（８）：１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ａｐｒ  １；４（５）：２７５−２８２．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
具体的には、まず、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
さらに別の方法は、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、ＩＬ−１β遺伝子プロモーターの領域を含むＤＮＡを本発明のプライマー等を用いたＰＣＲ法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
さらに別の方法は、まず、被検者から調製したＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ、および該ＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。次いで、該ＤＮＡと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたＤＮＡを検出することにより、ＩＬ−１β遺伝子多型を検出する。
このような方法としては、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５）が例示できる。被検者からのＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。該ＤＮＡ試料の調製の好ましい態様においては、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡを基に調製することができる。染色体ＤＮＡから本方法のＤＮＡ試料を調製するには、例えばＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によってＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを調製することも可能である。調製したＤＮＡ試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、野生型のＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域ＤＮＡ、あるいは多型を有するＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡと特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ、または多型を有するＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
本発明においては、次いで、該ｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
本発明においては、次いで、該ＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。また、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだＩＬ−１β  ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
本発明の上記検査方法の別つの態様は、ＩＬ−１β遺伝子の発現量を指標とすることによって検査を行う方法である。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳が含まれる。従って、「発現産物」には、ｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。
本発明は、ＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定する工程を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法を提供する。
本発明の上記検査方法においては、まず、被検者のＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれるＩＬ−１βタンパク質をコードするＲＮＡの量を測定する。次いで、測定されたＩＬ−１βタンパク質をコードするＲＮＡの量を対照と比較する。
このような方法としては、ＩＬ−１βタンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプローブを用いたノーザンブロッティング法、またはＩＬ−１βタンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法、等を例示することができる。
また、ＩＬ−１β遺伝子の発現量は、ＤＮＡアレイ法（新遺伝子工学ハンドブック、村松正實・山本雅、羊土社、ｐ２８０−２８４）によっても測定することができる。
具体的には、まず、被検者からｃＤＮＡ試料を調製し、上記ＩＬ−１β遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板と接触させ、該ｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する。
被検者からのｃＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。ｃＤＮＡ試料の調製の好ましい態様においては、まず被検者の組織あるいは細胞から全ＲＮＡの抽出を行う。該組織あるいは細胞としては、血液、皮膚、口腔粘膜などが例示できる。全ＲＮＡの抽出は、当業者にとって周知の方法、例えば次のようにして行うことができる。全ＲＮＡ抽出には純度の高い全ＲＮＡが調製できる方法であれば、既存の方法およびキット等を用いることが可能である。例えばＡｍｂｉｏｎ社“ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ”を用い前処理を行った後、ニッポンジーン社”Ｉｓｏｇｅｎ”を用いて全ＲＮＡの抽出を行う。具体的方法にはそれらの添付プロトコールに従えばよい。
次いで、抽出した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡの合成を行い、ｃＤＮＡ試料を調製する。全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、当業者に周知の方法で実施することができる。調製したｃＤＮＡ試料には、必要に応じて、検出のための標識を施す。標識物質としては、検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、蛍光物質、放射性元素等を挙げることができる。標識は、当業者によって一般的に行われる方法（Ｌ  Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄａｄｊａｃｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９９，１１７−１２２）で実施することができる。
本発明において「基板」は、上述のものを使用することができる。ＤＮＡアレイ技術の利点は、ハイブリダイゼーションの溶液量が非常に少なく、固定されたヌクレオチドプローブに、細胞の全ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含む非常に複雑なターゲットをハイブリダイズすることできることである。一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。ヌクレオチドの固定（アレイ）には２つのタイプがあり、一つはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイであり、もう一つは主としてＳｔａｎｆｏｒｄ大学で開発されたｃＤＮＡのアレイである。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ＩＬ−１β遺伝子と特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブであれば特に制限はない。本発明のヌクレオチドプローブには、オリゴヌクレオチド、またはｃＤＮＡが含まれる。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、ＩＬ−１β遺伝子と実質的にハイブリダイズし、ＩＬ−１β遺伝子以外の遺伝子とは実質的にハイブリダイズしないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するＩＬ−１β遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
本発明において使用する基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、通常ｃＤＮＡを固定する場合１００〜４０００ベースであり、好ましくは２００〜４０００ベースであり、さらに好ましくは５００〜４０００ベースである。オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１５〜５００ベースであり、好ましくは３０〜２００ベースであり、さらに好ましくは５０〜２００ベースである。
基板へのオリゴヌクレオチドの固定の工程は、一般に「プリント」とも呼ばれる。具体的には、例えば以下ようにプリントすることができるが、これに限定されるものではない。数種のオリゴヌクレオチドプローブを４．５ｍｍ  ｘ４．５ｍｍの一つの領域内にプリントする。その際、それぞれのアレイをプリントするのには一つのピンを用いて行うことが可能である。従って４８ピンのツールを用いた場合、４８回の繰り返したアレイを一つの標準的な顕微鏡用スライドにプリントすることが可能である。
本発明においては、次いで、該ｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる。本工程により、ＩＬ−１β遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な基板上のヌクレオチドプローブに対し、ｃＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
本発明においては、次いで、該ｃＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれるＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定する。さらに、測定されたＩＬ−１β遺伝子の発現量を対照と比較する。
本発明においては、ｃＤＮＡ試料中にＩＬ−１β遺伝子由来のｃＤＮＡが存在する場合、基板に固定されたヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとがハイブリダイズする。従って、ヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとのハイブリダイズの強度を検出することにより、ＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定することができる。ヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとのハイブリダイズの強度の検出は、ｃＤＮＡ試料を標識した物質の種類に応じて当業者においては適宜行うことができる。例えば、ｃＤＮＡが蛍光物質によって標識された場合、スキャナーによって蛍光シグナルを読み取ることによって検出することができる。
本発明の方法においては、被検者および対照（健常者）由来のｃＤＮＡ試料について、異なる蛍光物質で標識を施すことにより、１回の測定でそれぞれにおけるＩＬ−１β遺伝子の発現量を同時に測定することができる。例えば、上記それぞれのｃＤＮＡ試料の一方を蛍光物質であるＣｙ５で、他方をＣｙ３で標識することができる。それぞれの蛍光シグナルの相対強度は、被検者および対照でのＩＬ−１β遺伝子の発現量に応じた相対量を示す（Ｄｕｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１０−１４，１９９９）。
また、本発明の検査方法は、ＩＬ−１βタンパク質の発現量を測定することにより、下記の如く実施することができる。まず、被検者からタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料に含まれるＩＬ−１βタンパク質の量を測定する。次いで、測定されたＩＬ−１βタンパク質の量を対照と比較する。
このような方法としては、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びにＩＬ−１βタンパク質に結合する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法を例示することができる。
上記の方法において、対照と比較して、ＩＬ−１β遺伝子の発現量、またはＩＬ−１βタンパク質の発現量が有意に上昇していた場合、被検者は、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌を今後発症する疑いがある（危険性が高い）、もしくは既に肝細胞癌を罹患していると判定される。また、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌を既に罹患していることが判明している被検者においては、その原因が、ＩＬ−１β遺伝子の発現量の増加にあるものと判定される。
本発明はまた、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査方法に用いるための検査薬を提供する。
その一つの態様は、ＩＬ−１β遺伝子、またはＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬である。これらはそれぞれ遺伝子発現を指標とする検査、または遺伝子多型を指標とする検査に使用される。
該オリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１β遺伝子、またはＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出するＩＬ−１β遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、ＩＬ−１β遺伝子、あるいは、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＩＬ−１β遺伝子、あるいは、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
本発明の検査薬の他の一つの態様は、ＩＬ−１βタンパク質に結合する抗体を含む、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬である。抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が挙げられる。抗体は必要に応じて標識される。
ＩＬ−１βタンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。天然のＩＬ−１βタンパク質、あるいはＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントＩＬ−１βタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＩＬ−１βタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、ＩＬ−１βタンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどの試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ＩＬ−１βタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＩＬ−１βタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
また、本発明における検査薬の別の態様は、ＩＬ−１β遺伝子、またはＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板からなる肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の検査薬である。これらはそれぞれ遺伝子発現を指標とする検査、または遺伝子多型を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、上述の通りである。
さらに本発明は、ＩＬ−１βタンパク質を阻害する化合物、あるいは、ＩＬ−１β遺伝子発現を阻害する化合物を有効成分とする、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための薬剤を提供する。
本発明における「阻害」には、タンパク質の活性や遺伝子の発現が完全に阻害する意の他、タンパク質の活性や遺伝子の発現が減少することも意味する。
本発明におけるＩＬ−１βタンパク質を阻害する化合物、またはＩＬ−１β遺伝子発現を阻害する化合物は、天然の化合物であっても人工の化合物であってもよい。この化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
本発明の肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための薬剤となり得るものとして、ＩＬ−１βタンパク質またはＩＬ−１β遺伝子発現を阻害する既に公知の化合物を挙げることができる。ＩＬ−１βタンパク質を阻害することが知られている公知の化合物としては、ＩＬ−１βタンパク質と直接結合してＩＬ−１βタンパク質を阻害する可溶性ＩＬ−１レセプター（ＳＩＬ−１Ｒ）、ＩＬ−１レセプターに結合しＩＬ−１βタンパク質とＩＬ−１レセプターとの結合を特異的に阻害するＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）等を挙げることができる。また、後述のスクリーニングをすることにより単離される化合物は上記薬剤の候補化合物として期待される。
本発明のＩＬ−１βタンパク質またはＩＬ−１β遺伝子発現を阻害する化合物、あるいは後述する本発明のスクリーニングにより得られる化合物を、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための薬剤として使用する場合には、これら分子自体を被検者に投与することも可能であるが、一般的に公知の製剤学的方法により製剤化して投与することも可能である。例えば経口投与の場合、錠剤、散剤、カプセル剤、懸濁液剤等、経皮投与の場合、ハップ剤等を示すことができるが、これらに制限されない。投与方法として、投与方法は、治療効果や予防効果を示し得る限り特に制限はなく、例えば経口投与、経皮投与、注射による血中投与等が考えられる。ＩＬ−１βタンパク質発現またはＩＬ−１β遺伝子発現を阻害する化合物がＤＮＡである場合、該ＤＮＡを生体内に投与する際には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ法およびｅｘ  ｖｉｖｏ法を例示することができる。
また本発明は、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明の上記方法の一つの態様は、ＩＬ−１βタンパク質と被験化合物との結合を指標とする方法である。この方法においては、まず、ＩＬ−１βタンパク質と被験化合物を接触させる。ＩＬ−１βタンパク質は、被検化合物との結合を検出するための指標に応じて、例えば、精製された状態、細胞内または細胞表面に発現した状態、該細胞の細胞膜画分としての状態、あるいはアフィニティーカラムに結合した状態であってもよい。この方法に用いる被験化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
本方法においては、次いで、該ＩＬ−１βタンパク質と被験化合物との結合を検出する。ＩＬ−１βタンパク質と被験化合物との結合は、例えばＩＬ−１βタンパク質に結合した被験化合物に付された標識によって検出することができる。
本方法においては、次いで、該ＩＬ−１βタンパク質と結合する被験化合物を選択する。本方法により、ＩＬ−１βタンパク質に結合する化合物として単離される化合物には、ＩＬ−１βタンパク質の活性を阻害する化合物が含まれる。単離される化合物がＩＬ−１βタンパク質を阻害するか否かを評価するには、当業者に周知の方法で行うことができる。例えばＥＬＩＳＡ法、ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５の増殖抑制を検出する方法、マウス胸腺細胞の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを検出する方法等が挙げられるが、これに制限されない。
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、ＩＬ−１β遺伝子の発現を指標とする方法である。
本方法においては、まず、ＩＬ−１β遺伝子を発現する細胞に、被験化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「ＩＬ−１β遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のＩＬ−１β遺伝子を発現している細胞、または外因性のＩＬ−１β遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外因性のＩＬ−１β遺伝子が発現した細胞は、通常、ＩＬ−１β遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的外遺伝子工学技術によって作製することができる。
本方法に用いる被検化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
ＩＬ−１β遺伝子を発現する細胞への被験化合物の「接触」は、通常、ＩＬ−１β遺伝子を発現する細胞の培養液に被験化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被験化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
本方法においては、次いで、該ＩＬ−１β遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ＩＬ−１β遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の転写レベルを測定することも可能である。また、ＩＬ−１β遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、ＩＬ−１βタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、ＩＬ−１βタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＩＬ−１βタンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
本方法においては、次いで、被験化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該発現量を減少させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の予防または治療のための医薬品候補化合物となる。
本発明のスクリーニング方法のさらなる別の態様は、本発明のＩＬ−１β遺伝子の発現を阻害するような化合物を、レポーター遺伝子を利用して同定する方法に関する。本方法においては、まず、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡに転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡに転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、ＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびＧＦＰ遺伝子等が挙げられる。「ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのＤＮＡ構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
「ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを添加したものを挙げることができる。
本方法における「接触」は、「ＩＬ−１β遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」の培養液に被験化合物を添加する、または該ＤＮＡを含む上記の市販された細胞抽出液に被験化合物を添加することにより行うことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現量を測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現量を、被験化合物の非存在下において測定した場合と比較して、減少させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、肝炎ウイルス感染に起因する肝細胞癌の治療または予防のための医薬品候補化合物となる。本発明のスクリーニング方法により取得される化合物は、上述のように製剤化することが可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］患者の臨床パラメーターとＨＣＣ発生との関連
２０００年１１月から２００１年１月までに東京大学病院の外来診療を受けた慢性ＨＣＶ感染症の一連の日本人患者１０２人（男性７５人と女性２７人、年齢２８〜８１歳、年齢の中央値６６歳）、また、対照として、肝疾患の既往がない健常な日本人ボランティア４８人（男性４２人と女性６人、年齢２４〜５３歳、年齢の中央値３３歳）について臨床パラメーターを調べた。
第二世代酵素免疫アッセイ（オルソ・ディアグノスティックス社）を用いて調べたところ、患者は全員ＨＣＶ抗体陽性であり、アンプリコアＨＣＶアッセイ（ロシュ社）によってＨＣＶ  ＲＮＡが検出されたが、Ｂ型肝炎表面抗原（アボット・ラボラトリーズ）に関しては陰性であった。ＨＣＶ血清型は血清型タイピングアッセイ（ＳＲＬラボラトリー社）によって決定した。１０年以上にわたってエタノール摂取量が８０ｇ／日またはこれを超える患者は、アルコール乱用の既往が陽性であると見なした。全血の採取時に患者の年齢、性別、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル（正常範囲：４〜３６  ＩＵ／Ｌ）、血小板数、およびアンプリコアＨＣＶモニターアッセイ（ロシュ社）によって測定した血清ウイルス量の臨床パラメーターを得た。６ヶ月以内に患者５５人に肝生検を実施して、デスメ＆シェウアーら（Ｄｅｓｍｅｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｉｎ：Ｌｉａｗ，ｅｄ．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２７−４４，１９８６、Ｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １５：５６７−５７１，１９９２）の基準に従って肝組織学に基づき、肝硬変の診断を行った。生検標本がない患者では、肝硬変の診断は、臨床所見（例えば、水痘、脳症、腹水）、生化学データ異常（血清ビリルビンの上昇、血清アルブミンの低下、および／またはプロトロンビン時間の延長）、ならびに肝造影（例えば、超音波造影、コンピューター断層撮影、血管造影、および／または核磁気共鳴造影）によって検出される肝臓の明らかな形態学的変化の存在によって行った。ＨＣＣの診断は、いくつかの造影方法によって行い、患者６１人全員において超音波による細針生検標本によって組織学的に確認した。
上記臨床パラメーターとＨＣＣの存在との関連については、カイ二乗検定を用いて評価した。カイ二乗検定（Ｐ＜０．０５）によって検出した可能性がある交絡因子と共に、ＨＣＣの有無を従属変数とした際の遺伝子多型の独立した効果を、ロジスティック回帰モデルを用いて評価し、オッズ比および９５％信頼区間を計算した。ステップワイズ法を用い、尤度比検定で、Ｐ＜０．０５となるモデルを採用した。
検討の結果、ＨＣＣを有する患者と有しない患者のあいだで、性別、アルコールの乱用、ＡＬＴ値、ＨＣＶ遺伝子型および血清中ウイルス量に有意差を認めなかった。ＨＣＣ患者では肝硬変を有する患者の比率と年齢は、ＨＣＣを有しない患者より高かった。ＨＣＣ患者における血小板数は、ＨＣＣを有しない患者より低かったが、多変量ロジスティック回帰モデルには組み入れられなかった（表１）。
2003016570.tif 000002
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［実施例２］  遺伝子多型の検出
セパジーンキット（サンコウ純薬）を用いて、製造元の説明書に従ってゲノムＤＮＡを全血１００μｌから抽出した。抽出したＤＮＡを、１ｍＭＥＤＴＡを合むトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）２０μｌに溶解して、使用するまで−３０℃で保存した。ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αに関する多型は、各遺伝子の増幅された遺伝子断片の直接シークエンシングによって決定した。
（１）  ＩＬ−１βプロモーターの−３１Ｃ／Ｔ多型
ＩＬ−１βプロモーターの−３１Ｃ／Ｔ多型を調べるために、ＩＬ−１βプロモーターの２４０ｂｐ断片を、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲは、レディ・トウ・ゴーＰＣＲビーズ（アマシャムファルマシアバイオテック）およびプライマーＬ−１Ｂ−３１−Ｆ（５’−ＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＴＡＣＴＣ−３’／配列番号１；センスプライマー、ヌクレオチド−１３４〜−１１５位）、およびＬ−１Ｂ−３１−Ｒ（５’−ＡＧＣＡＣＣＴＡＧＴＴＧＴＡＡＧＧＡＡＧ−３’／配列番号２；アンチセンスプライマー、ヌクレオチド＋８５〜＋１０４位）を用いて実施した。熱サイクル条件は以下の通りであった。９４℃で１０分、次に９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で３０秒を５サイクル、次に９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で３０秒を３０サイクル、次に９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒を５サイクル。遺伝子多型決定に関して、ＱＩＡクイックスピン（キアゲン社）精製ＰＣＲ産物１０ｎｇ、センスまたはアンチセンスいずれかのＰＣＲプライマー、そしてビッグダイ・ターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）を用いて、直接シークエンシングを双方向に実施した後、既に記述されているように（Ｔｏｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｓｅ．５６：５６２０−５６２３，１９９６）、ＡＢＩ  ３１０自動シークエンサー（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）によって検出した。
（２）  ＩＬ−１βプロモーターの−５１１Ｃ／Ｔ多型
ＩＬ−１βプロモーターの−５１１Ｃ／Ｔ多型を調べるために、ＩＬ−１β−３１遺伝子多型を調べたプロトコールと同じプロトコールによって、ＩＬ−１βプロモーターの１５５ｂｐ断片を、以下のプライマーＬ−１Ｂ−５１１−Ｆ（５’−ＧＣＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＣＡＴＡＣＣＧＴ−３’／配列番号３；センスプライマー、ヌクレオチド−６００〜−５８１位）、および、Ｌ−１Ｂ−５１１−Ｒ（５’−ＧＣＣＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴ−３’／配列番号４；アンチセンスプライマー、ヌクレオチド−４６５〜−４４６位）を用いて増幅した。次に、遺伝子多型を上記のように決定した。
（３）  ＩＬ−１ＲＮのイントロン２における５対立遺伝子多型
ＩＬ−１ＲＮのイントロン２における５対立遺伝子多型を調べるために、この部位を、ＩＬ−１β−３１および−５１１多型を調べたものと同じプロトコールによって、以下のプライマー５（５’−ＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴＣＣ−３’／配列番号５；センスプライマー、ヌクレオチド＋１２４２７〜＋１２４８８位）、および６（５’−ＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡ−３’／配列番号６；アンチセンスプライマー、対立遺伝子１遺伝子多型におけるヌクレオチド＋１２８９７〜＋１２９１３位）を用いて増幅した。増幅後、アンプリコンを３％（ｗｔ／ｖｏｌ）アガロースゲル上で適当なサイズマーカーと共に可視化した。アンプリコンの大きさに基づいて対立遺伝子５個（対立遺伝子１（４リピート）４４２ｂｐ、対立遺伝子２（２リピート）２７２ｂｐ、対立遺伝子３（３リピート）３５７ｂｐ、対立遺伝子４（５リピート）５３２ｂｐ、および対立遺伝子５（６リピート）６２７ｂｐ）を割付した。
（４）  ＴＮＦ−αプロモーターの−２３８Ｇ／Ａ、−３０８Ｇ／Ａ、および３７６Ｇ／Ａ多型
ＴＮＦ−αプロモーターの−２３８Ｇ／Ａ、−３０８Ｇ／Ａ、および３７６Ｇ／Ａ多型を決定するために、以下のプライマーＴＮＦＡ−１（５’−ＧＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＡＣＣＣＧＣ−３’／配列番号７；センスプライマー、ヌクレオチド−５８４〜−５６６位）、およびＴＮＦＡ−２（５’−ＧＴＣＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣＧＴＣＴ−３’／配列番号８；アンチセンスプライマー、ヌクレオチド＋８８〜＋１０６位）を用いて、６９１ｂｐ断片を同様にＰＣＲによって増幅した。熱サイクル条件は以下の通りであった。９４℃で１０分、次に９４℃で１分、６０℃で１分、および７２℃で１分を３５サイクル、次に７２℃で１０分。遺伝子多型決定に関して、以下のシークエンシングプライマーＴＮＦ−フォワード−４７２／ＴＮＦ  ｓｅｑ−４５２（５’−ＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＴＴ−３’／配列番号９；センスプライマー、ヌクレオチド−４７２〜−４５２位）、およびＴＮＦ−リバース−１３８（５’−ＴＴＣＴＧＴＣＴＣＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣ−３’／配列番号１０；アンチセンスプライマー、ヌクレオチド−１３８〜−１５７位）を用いて、直接シークエンシングを双方向に実施した。
［実施例３］データ解析
（１）  ＩＬ−１およびＴＮＦ−α遺伝子の多型性
ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＮ、およびＴＮＦ−αの個々の遺伝子座での対立遺伝子のハーディ・ワインベルク平衡を、ＨＷＥプログラム（Ｏｔｔ、ロックフェラー大学、ニューヨーク）を用いて評価した。ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＮ、およびＴＮＦ−αの個々の遺伝子座での対立遺伝子は、患者および対照の双方において、ハーディ・ワインベルグ平衡からの乖離は認められなかった（Ｐ＞０．５０）。ＨＣＣを有しない患者における遺伝子型頻度は、健常対照者と類似であった。ＨＣＣ患者（４０％）におけるＩＬ−１β−３１のＴ／Ｔ遺伝子多型の比率は、ＨＣＣを有しない患者（２０％）および健常対照者（１７％）より高かった。ＩＬ−１  ＲＮおよびＴＮＦ−αプロモーター遺伝子の３つの多型部位を含む他の遺伝子座では、ＨＣＣを有する患者と有しない患者のあいだで有意差を認めなかった（表２）。
2003016570.tif 000004
2003016570.tif 000005
（２）  ＩＬ−１β遺伝子における推定されるハプロタイプ頻度と連鎖不均衡
対立遺伝子座の遺伝子ハプロタイプ頻度は、ＥＨソフト（Ｏｔｔ、ロックフェラー大学、ニューヨーク）を用いて推定した。連鎖不均衡係数Ｄ’＝Ｄ／Ｄｍｉｎまたはｍａｘは、２ＢＹ２プログラム（オット）を用いて計算した。ＩＬ−１β−３１と−５１１座とのあいだに限って有意な連鎖不均衡を認め、連鎖不均衡係数はほぼ１．００（ほぼ完全な連鎖不均衡）であった（表３）。
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患者と対照の双方において、ＩＬ−１β−３１と−５１１のほぼ全員の推定ハプロタイプはＣ−Ｔ、またはＴ−Ｃであった。ＩＬ−１  ＲＮおよびＴＮＦ−αプロモーター遺伝子の３つの座において、主要な対立遺伝子が症例の９０％以上を占め、本発明者は、ＨＣＣの存在との如何なる関連も発見できなかった。ＩＬ−１  ＲＮ＊２対立遺伝子は、日本人では白人と比較して頻度が低く（ヘテロ接合者、５〜６％、ホモ接合者０％）、ＩＬ−１β−３１遺伝子多型との有意な連鎖不均衡を認めなかった（Ｐ＝０．８５）。
（３）ＩＬ−１β−３１の遺伝子型とＨＣＣの存在との関連
ＩＬ−１β−３１遺伝子多型とＨＣＣの存在との関連をカイ二乗検定を用いて評価した。カイ二乗検定（Ｐ＜０．０５）によって検出した可能性がある交絡因子と共に、ＨＣＣの有無を従属変数とした際の遺伝子多型の独立した効果を、多変量ロジスティック回帰モデルを用いて評価し、オッズ比および９５％信頼区間を計算した。ステップワイズ法を用い、尤度比検定で、Ｐ＜０．０５となるモデルを採用した。ＩＬ−１β−３１の遺伝子多型（Ｃ／Ｃ対Ｔ／ＣおよびＣ／Ｃ対Ｔ／Ｔに関してＰ＝０．０３８および０．００２）、年齢６０歳以上（Ｐ＝０．０１３）、肝硬変の存在（Ｐ＝０．００１）、および血小板数（Ｐ＝０．００４）は、カイ二乗検定によって、ＨＣＣの存在との有意な関連を示した。ＨＣＣの存在に及ぼすＩＬ−１β−３１遺伝子多型の独立した効果を評価するために、これらの４つの変数を用いてステップワイズ法による多変量解析を実施した。尤度比検定によって有意（Ｐ＜０．０５）と判定されたモデルにおいては、その中で、３つの変数、すなわちＩＬ−１β−３１の遺伝子多型、年齢６０歳以上、肝硬変の存在が、それぞれオッズ比０．０３８（Ｃ／Ｔ対Ｃ／Ｃ）、０．００２（Ｔ／Ｔ対Ｃ／Ｃ）、０．０２６（年齢６０歳以上対６０歳未満）、および０．００１（肝硬変の存在対非存在）で、ＨＣＣの存在に独立して寄与することが判明した（表４）。これらのデータ解析には、ＳＰＳＳバージョン１０Ｊ（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ  Ｊａｐａｎ）およびＳプラスバージョン４．５（数理システム、マスソフト）を用いた。
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上記の結果から、ＩＬ−１β−３１の遺伝子多型は、ＨＣＶ感染後のＨＣＣ発生に関連する最も重要な因子であるという結論に達した。ＩＬ−１β−３１の遺伝子多型は、ＨＣＶ感染症に対する宿主反応を増強する可能性があり、そして肝細胞損傷を悪化させる可能性が考えられた。具体的には、ＩＬ−１β−３１における遺伝子多型は、肝臓におけるＩＬ−１βの産生を増強することによって、肝臓の慢性的炎症状態を生じ、肝細胞の代謝回転速度を増加させる可能性がある。これによって、ＤＮＡ損傷の機会が増加して、段階的に発癌に至る可能性が考えられた。
また、ＨＣＣは有しなく肝硬変を有する患者における遺伝子型頻度は、肝硬変およびＨＣＣを有しない患者と類似であった（これら２群におけるＴ／Ｔ遺伝子型の比率はそれぞれ、２０％および１９％であった）。このことを考慮に入れると、ＨＣＶ感染者におけるＨＣＣの発生に及ぼすＩＬ−１β−３１の遺伝子多型の効果は、肝硬変の存在とは完全に無関係であると考えられた。
産業上の利用の可能性
本発明らによって、ＩＬ−１β遺伝子の多型および該遺伝子の発現が肝炎ウイルス感染に起因するＨＣＣの発生を推定できる遺伝子マーカーになりうることが初めて見出された。この知見に基づき、ＩＬ−１β遺伝子の多型および該遺伝子の発現を利用した肝炎ウイルス感染に起因するＨＣＣの予測、予防および治療のために有用な検査方法、検査試薬、ＨＣＣの予防および治療のために有用な薬剤、および薬剤のスクリーニング方法が提供された。ＩＬ−１β遺伝子の多型および該遺伝子の発現を検出することで、肝炎ウイルス感染によるＨＣＣの発生を予測することが可能となり、ＨＣＣの予防および治療のためのより経済的かつ効率的な戦略を立てることができるものと大いに期待される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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