(57)【要約】下記の一般式2003025173.tif 000022［式中、Ｂはピリミジンもしくはプリン核酸塩基又はそれらの類縁体である］で表される糖部修飾ヌクレオチド類縁体ユニットを１又は２以上含む、ＨＣＶに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体が提供される。本発明の誘導体は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）遺伝子に対するアンチセンスであって、細胞内において、ＨＣＶ−ＲＮＡに対して高い親和力で結合して、その遺伝子の発現を効率良く制御、阻止でき、かつヌクレアーゼに対して高い耐性を示す。また、本発明のＢＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、対象ＲＮＡ核酸におけるループやステム等の二次構造のいかんに関わらず、ＨＣＶを標的とするアンチセンス法に有効である。
2003025173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖部を修飾したヌクレオチド類縁体ユニットを１つ以上含有する、Ｃ型肝炎ウイルスに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項２】
糖部を修飾したヌクレオチド類縁体ユニットが下記の一般式
2003025173.tif 000020
［式中、Ｂはピリミジンもしくはプリン核酸塩基又はそれらの類縁体である］で表される構造を有する請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの５’非翻訳領域を標的とする請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項４】
前記５’非翻訳領域がインターナル・リボソーマル・エントリーサイト（ＩＲＥＳ）である請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡのステム領域を標的とする請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項６】
次の塩基配列：
2003025173.tif 000021
を含む請求項１〜５の何れかの項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項７】
請求項６記載の何れかの塩基配列と相補的な配列のＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド誘導体を含む請求項１〜５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかの項に記載のＣ型肝炎ウイルスＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する抗Ｃ型肝炎ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する新規なアンチセンスに関し、更に詳細には、本発明は糖部を修飾したヌクレオチド類縁体ユニットを１つ以上含有するオリゴヌクレオチド誘導体からなるＨＣＶに対する新規なアンチセンスに関する。
［背景技術］
１９７８年にアンチセンス分子がインフルエンザウィルスの感染を阻害したとの報告が初めて成された。以後、ガン遺伝子発現やＡＩＤＳ感染を阻害したとの報告もなされている。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、望ましくない遺伝子の発現を特異的に制御することから、近年、医薬品として最も期待されている分野の一つである。
アンチセンス法とは、ＤＮＡ→ｍＲＮＡ→タンパク質という、いわゆるセントラルドグマの一連の流れの中でｍＲＮＡからタンパク質への翻訳過程を、ｍＲＮＡと相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて阻害し、結果としてそのＤＮＡの機能を制御しようという概念に基づいている。アンチセンス法は、外部から導入するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、疾病の原因となっている一本鎖ｍＲＮＡと二重鎖を形成させ、そのタンパク質への翻訳を阻害する方法である。
しかしながら、天然型オリゴヌクレオチドをアンチセンス分子としてこの方法に適用した場合、生体内の各種ヌクレアーゼにより分解を受けたり、細胞膜透過性が高くないなどの問題が生じた。そのため、様々な核酸誘導体や類縁体が数多く合成され、研究が重ねられてきた。例えば、リン原子上の酸素原子をイオウ原子に置換したホスホロチオエート、メチル基に置換したメチルホスホネート、また最近になっては、リン原子も炭素原子で置換したもの、さらには糖部の構造を変換したもの、核酸塩基を修飾したものなども合成されている。しかし、いずれの場合も、細胞内での安定性、合成の容易さ、配列の結合特異性（特定の遺伝子発現のみを選択的に制御する）などの点で十分に満足のいく誘導体や類縁体が得られていないのが現状である。
特開平１０−３０４８８９号公報には、アンチセンスを構成するオリゴヌクレオチドの糖部分を修飾したヌクレオチド類縁体ユニットが開示されている。このヌクレオチド類縁体ユニットは、糖部コンホメーションをＮ型に固定化した下記の式１で表される構造を有するものである。
2003025173.tif 000003
この公報では、上記構造の糖部を有するヌクレオチド類縁体ユニットを１以上組み込んだオリゴヌクレオチド誘導体を合成し、そのオリゴヌクレオチド誘導体の基本的物性を細胞外で測定している。すなわち、当該オリゴヌクレオチド誘導体と天然ＤＮＡあるいはＲＮＡからなるセンス鎖とをアニーリング処理したものの融解温度を測定して、二重鎖形成能を検討している。また、このオリゴヌクレオチド誘導体のヌクレアーゼ酵素に対する耐性をインビトロで測定している。
しかしながら、この公報には当該オリゴヌクレオチド誘導体が、細胞内においても、細胞外の実験結果と同ようにヌクレアーゼ耐性を示してアンチセンスとして安定に作用するのか否か、また、当該オリゴヌクレオチド誘導体が、天然に存在する遺伝子と特に細胞内で結合して二重鎖、三重鎖を形成し、実際に特定遺伝子の発現を阻止できるのか否かについては開示されていない。
一方、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の発見は比較的新しく、１９８８年にＨＣＶとして遺伝子が単離された（Ｃｈｏｏ，Ｑ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９−３６２，（１９８９）。また、ＨＣＶについては全長塩基配列及びアミノ酸配列、５’非翻訳領域、インターナル・リボソーマル・エントリー・サイト（ＩＲＥＳ）、ステム領域等について多数報告されている（Ｋａｔｏ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８７，９５２４−９５２８，（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８，２４５１−２４５５，（１９９１）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，１１０５−１１１３，（１９９１）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２６９７−２７０４，（１９９１）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８８，３３１−３４１，（１９９２）、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ．Ｋｏｈａｒａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４７６−１４８３，（１９９２）、Ｓ．Ｔａｎｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，２３５９−２３６４，（１９９９）、Ｈｏｎｄａ  Ｍａｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，１１６５−１１７４，（１９９９）、Ｈｏｎｄａ  Ｍａｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ．，２（１０），９５５−９６８，（１９９６）、Ｓａｓａｎｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆ．Ｓｅｒ．，９，３９５−３９６，（１９９８）、Ｉｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，８７８９−８７９６，（１９９８）、Ｋａｍｏｓｈｉｔａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．，２３３，９−１８，（１９９７）、など）。これまでＨＣＶに対しては、インターフェロン（ＩＦＮ）が唯一の治療法と云われてきた。しかし、このＩＦＮを用いた治療における大きな問題点として、その副作用の強さと共に著効率が低いといったことが挙られ、２０％の患者にしか有効でないといった報告もある。その有効性を向上させるため、リバビリンとの併用療法などが応用されてきたが、未まだ満足のいくものとはなっていないのが現状である。
これに対して、遺伝子治療を目指しては、アンチセンス法、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ等を用いたものについて研究が行われており、アンチセンス法、リボザイムについては現在インビボでの研究も進められている。特にアンチセンスに関する技術は広く普及しており、ＨＣＶに対するアンチセンスについては多数の報告がされている（ＷＯ９９／２９３５０、ＷＯ９９／２９３５０、ＷＯ９５／３０７４６、ＷＯ９４／０８００２、Ｗａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４２０５−１４２１０，（１９９４）、ＷＯ９４／２４８６４）。しかしながら、酵素耐性、親和力、細胞毒性などの点で満足のいくアンチセンスはほとんど得られていなかった。
このようなアンチセンス法において使用する目的で、細胞内でヌクレアーゼによる分解を受けにくく、高い親和力で標的のＨＣＶに結合してその遺伝子の発現を効率良く制御、阻止できるアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体、特にＨＣＶに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の創製が望まれている。
［発明の開示］
本発明の発明者らは、アンチセンス法において有用と考えられる、核酸における糖部のコンホメーションの固定化を施したした核酸類縁体を設計し、その単位構造となるヌクレオチド類縁体ユニットの合成を行い、これを用いて調製したオリゴヌクレオチド誘導体がＨＣＶアンチセンス分子として極めて有用であることを確認した。
ＨＣＶは一本鎖のＲＮＡウィルスで、そのゲノムは全長約９５００塩基であり、内部には１つのオープンリーディングフレームを持っている（図４）。このＨＣＶ−ＲＮＡは、キャップ非依存的に翻訳を開始するという特徴を持っており、それには５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内のＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）にリボソームが結合することが必要となる。このＨＣＶ−ＩＲＥＳは図２のような二次構造をした高度に保存された領域であり、その重要な機能もあり、アンチセンス法のターゲットの１つ本発明において選択した領域である。
したがって、本発明者等は、ＨＣＶに対するアンチセンス法のターゲットとして選択した５’非翻訳領域を含むＩＲＥＳ内の開始コドン近傍を実際のターゲットとして、アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を合成し、その誘導体について非常に優れた結合親和性及び配列特異的な大変優れたアンチセンス効果を確認して本発明を完成した。
また、本発明者等は、これまで天然型オリゴヌクレオチドではアンチセンス効果の見られなかった、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ内の複数のステム領域をターゲットとした本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を合成し、その結合親和性及びアンチセンス効果を確認して本発明を完成した。
［発明の実施の形態］
本発明のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は下記の一般式
2003025173.tif 000004
［式中、Ｂはピリミジン核酸塩基もしくはプリン核酸塩基又はそれらの類縁体である］で表わされる、糖部のコンホメーションを固定した構造を有するヌクレオチド類縁体ユニットを１又は２以上有する。以下、このようなオリゴヌクレオチド誘導体又はポリヌクレオチド誘導体をＢＮＡオリゴヌクレオチドという。
本発明のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は一般式
2003025173.tif 000005
［式中、Ｂ１、Ｂ２は同一または異なり、ピリミジン核酸塩基もしくはプリン核酸塩基又はそれらの類縁体であり、Ｒは水素、水酸基、ハロゲン、またはアルコキシ基であり、Ｗ１、Ｗ２は同一または異なり、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、シリル基またはリン酸残基もしくはリン酸ジエステル結合を介した天然型ヌクレオチド、合成ヌクレオチドまたはこれらヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドであり、ｎ１またはｎ２は同一または異なり、０〜５０の整数である（ただし、ｎ１またはｎ２が同時にゼロになることはない。また、ｎ２の全てが同時にゼロになることはない。）、ｎ３は１〜５０の整数である、ただし、ｎ１および／またはｎ２が２以上の場合にはＢ１とＢは同一でなくてもよく、Ｒも同一でなくてもよい］で表されるオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド誘導体である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の塩基の数は特に制限はないが、通常５〜５０、好ましくは９〜３０個である。
本発明における、ピリミジン核酸塩基もしくはプリン核酸塩基またはその類縁体とは、チミン、ウラシル、シトシン、アデニン、グアニン及びそれらの類縁体である。これらの類縁体としてはプリン核酸塩基類縁体及びピリミジン核酸塩基類縁体を挙ることができる。
プリン核酸塩基類縁体としては、好ましくは下記の化合物から選択することができる。
即ち、グアノシンジフォスフェート、８−オキソ−アデノシン、８−オキソ−グアノシン、８−フロロ−アデノシン、８−フロロ−グアノシン、８−メトキシ−アデノシン、８−メトキシ−グアノシン、８−アザ−アデノシン、８−アザ−グアノシン、アザシチヂン、フルダラビンフォスフェート、６−ＭＰ、６−ＴＧ、アザチプリン、アロプリノール、アシクロビア、ガンシクロビア、デオキシホルミシン、アラビノシラジエニン（ａｒａ−Ａ）、グアノシンジフォスフェートフコース、グアノシンジフォスフェート−２−フロロフコース、グアノシンジフォスフェート−βＬ−２−アミノフコース、グアノシンジフォスフェート−Ｄ−アラビノース及び２−アミノアデシン等である。
一方、ピリジン核酸塩基類縁体としては、好ましくは下記の化合物から選択することができる。即ち、
５−フロロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、５−プロピニルチミン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−フロロシトシン、フロキシウリジン、ウリジン、チミン、３’−アジド−デオキシチミジン、２−フロロデオキシシチジン、３−フロロ−３’−デオキシチミジン、３’−ジデオキシシチジン−２’−エン、３’−デオキシ−３’−デオキシチミジン−２’−エン、及びシトシンアラビノース等である。
本発明でアンチセンスとして使用できるヌクレオチド類縁体ユニット、及びそのヌクレオチド類縁体ユニットを含有するオリゴヌクレオチド誘導体の合成は、前記特開平１０−３０４８８９号公報に詳細に記載されている。この説明は本明細書に含まれるものとする。
本発明のＨＣＶに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体としては、ＨＣＶに結合して、その遺伝子の発現を阻止又は抑制できるものであればどのようなオリゴ又はポリヌクレオチドであってもよく、構成単位であるヌクレオチドの１つ又は２以上が本発明のヌクレオチド類縁体ユニットで置換されていればよい。ＨＣＶに結合するアンチセンスの配列の例としては、例えば、ＨＣＶの塩基配列と相補的な配列、ＨＣＶの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列などが挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の例としては、ＨＣＶ−ＲＮＡの５’非翻訳領域を含むＩＲＥＳ内の開始コドン近傍に対するもの、及びステム領域に対するものが挙られるが、その他に、本発明の目的を達成できる種々の領域をターゲットとすることこができる。例えば、エクソンに対するもの又はイントロンに対するものなどが挙げられる。更に具体的には、下記のようなＨＣＶに対するアンチセンス塩基配列が含まれる。
（ＩＲＥＳ内の翻訳開始コドン近傍をターゲットとする配列）
2003025173.tif 000006
（ＩＲＥＳ内のステム領域をターゲットとする配列）
2003025173.tif 000007
本発明のＨＣＶに対するアンチセンスとしては、上記配列で表されるＨＣＶに対するアンチセンス配列の１又は２以上の塩基が、本発明のヌクレオチド類縁体ユニットで置換されている配列及びその配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体、及び上記アンチセンス配列に対して相補的な配列であるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド誘導体を挙ることができる。ハイブリダイゼーションは既に良く知られた技術である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９等）。
本発明でいうストリンジェントな条件は、当業者であれば、適宜選択することが可能であるが、例えば、低ストリンジェントな条件である。低ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。さらに好ましいストリンジェントな条件としては高ストリンジェントな条件がある。高ストリンジェントの条件としては、６５℃、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。
また、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、同一の塩基配列を有する天然型オリゴヌクレオチドに比較して優れたヌクレアーゼ耐性を示すことも確認されている。したがって、細胞内に投与された場合にも安定であり、その優れたアンチセンス効果が持続するという利点がある（Ｔ．Ｉｍａｎｉｓｈｉ，Ｓ．Ｏｂｉｋａ，Ｊ．Ｓｙｎｔｈ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１１，９６９（１９９９））。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体としては、糖部のみを修飾したヌクレオチド類縁体ユニットの使用が必須であるが、糖部の修飾に加えてさらに他の部分、例えば、ホスホロチオエートのようにリン酸ジエステル部を修飾したヌクレオチド類縁体ユニットを使用しても良い。また、本発明の糖部を修飾したヌクレオチド類縁体ユニットと他の公知のアンチセンス構成単位であるヌクレオチド類縁体ユニットとを組み合わせてオリゴヌクレオチド誘導体アンチセンスを作成することもできる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤などの外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法に従って調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、または血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらに持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポゾーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの類縁体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態、年齢、性別、体重などに応じて適宜調整し好ましい量を用いることができる。また、その投与方法は、患者の状態、薬剤形態などに応じ、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、脈内投与、直腸投与などの種々の投与方法から適宜好ましい方法を用いることができる。
本発明のＨＣＶに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、アンチセンスＤＮＡとして優れた種々の特性を示すことを以下の実施例によって詳しく説明する。
実施例１：本発明のヌクレオチド類縁体ユニットを含むオリゴヌクレオチド
誘導体の融解温度の測定による二重鎖の形成能
（１）  ＨＣＶ−ＩＲＥＳ内の開始コドン（３４２ｎｔ−３４４ｎｔ）近傍をターゲットとして考え、下記の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、作成した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さとアンチセンス効果との関係について検討を行うため、オリゴヌクレオチドＡ−３６７を５’末端側から、それぞれ、５塩基及び１０塩基削ったＡ３６２及びＡ３５７も合成した。
2003025173.tif 000008
更に、これら種々の長さのオリゴヌクレオチドについて、天然型オリゴヌクレオチド（Ｄ−ｏｌｉｇｏ）に加えて、ＢＮＡオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ−ｏｌｉｇｏ）及びホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド（Ｓ−ｏｌｉｇｏ）を作成した。例えば、Ａ３６７については、Ｄ−Ａ３６７（天然型）、ＢＮＡ−Ａ３６７（ＢＮＡ型）及びＳ−Ａ３６７（ホスホロチオエート型）を作成した。
合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記のとおりであった。
2003025173.tif 000009
（２）  これら合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドの相補鎖ＲＮＡとの結合親和性を調べるために、Ｔｍ値（融解温度）の測定を行った。
上記の合成した天然型オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド誘導体をアンチセンス鎖とし、天然のＤＮＡあるいはＲＮＡからなるセンス鎖とアニーリング処理したものの融解温度（Ｔｍ値）を測定することにより、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の相補ＤＮＡおよびＲＮＡに対するハイブリッド形成能を調べた。
終濃度をそれぞれ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、アンチセンス鎖１μＭ、センス鎖１μＭとしたサンプル溶液（５００μｌ）を沸騰水中に浴し、１０時間をかけてゆっくり室温まで冷却した。分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６５０）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０分間５℃に保った後、測定を開始した。サンプル温度は９５℃まで毎分０．５℃ずつ上昇させ、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける紫外線吸収を測定した。ある解く的の温度で紫外部吸収強度が大きく増加する。この遷移の中点における温度が融解温度、Ｔｍ値である。なお、結合親和性が高いほど、このＴｍ値も高くなる。
結果は、下記の表に示した。ヌクレオチド配列のうち、下線を引いたものが本発明のヌクレオチド類縁体ユニットである。
2003025173.tif 000010
（３）  ＨＣＶ−ＩＲＥＳ内のステム領域をターゲットとする下記の配列の天然型アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｄ−ｏｌｉｇｏ）及び本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（ＢＮＡ−ｏｌｉｇｏ）も上記（１）と同様な方法で合成した。式中、ヌクレオチド配列のうち、下線を引いたものが本発明のヌクレオチド類縁体ユニットである。
2003025173.tif 000011
上記のＨＣＶ−ＩＲＥＳをターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の条件でＴｍ値を測定した。
結果を下記の表２に示す。
2003025173.tif 000012
表１、表２から明らかなように、Ｓ−ｏｌｉｇｏがＤ−ｏｌｉｇｏと比較してＴｍ値の減少、即ち結合親和性の低下を見せているのに対し、ＢＮＡ−ｏｌｉｇｏは大幅なＴｍ値の上昇が見られた。これによって、ＢＮＡ−ｏｌｉｇｏがＳ−ｏｌｉｇｏやＤ−ｏｌｉｇｏに比べて、相補鎖ＲＮＡに対して極めて高い結合親和性を有していることが確認できた。このことは開始コドンターゲット及びステム領域ターゲットの何れにおいても確認された。また、開始コドンターゲットにおいては、オリゴヌクレオチドの長さを短くしたものにおいても同様の結果が確認された。
実施例２：オリゴヌクレオチド誘導体の非細胞系におけるＨＣＶ遺伝子翻訳
阻害効果
この実施例では、非細胞系でのＨＣＶ遺伝子に対するアンチセンス効果を確認した。Ｃ型肝炎ウィルスの５’非翻訳領域内のＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を含むターゲットプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＩＥＳ／Ｌｕｃを設計、作成し、これを用いて、オリゴヌクレオチド誘導体のアンチセンス効果の確認に使用した。
（プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＩＥＳ／Ｌｕｃの構築）
ケーセルマンの方法（Ｃａｓｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２２，７０７（１９９５））に従い、ＨＣＶのクローンＤＮＡであるＢＫ１５７（Ａ．Ｔａｋａｍｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，１１０５（１９９１））をＫｐｎＩ及びＡａｔＩＩで切断することにより、ターゲット部位を含むフラグメントＡを作製した（図３参照）。
次いで、レポーター遺伝子として用いるルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）を含むフラグメントＢを作製した（図４参照）。これは、ｐＴＲＥ−ＬｕｃをプライマーＡとプライマーＢを用いてＰＣＲを行うことによりＬｕｃを増幅させ、更に、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断することにより行った。
これらフラグメントＡ及びＢをｐｃＤＮＡ３ベクターに組み込む際の問題点としてｐｃＤＮＡにはＡａｔＩＩの認識配列が数多く存在するためフラグメントＢの組み込みが行えないことが考えられた。そこで、まずｐＣＲＩＩベクターに両者を組み込んだ後、最終段階でベクターをｐｃＤＮＡ３に変えることにより目的とするプラスミドを得るこにした（図９参照）。
まず、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断した後に、ルシフェラーゼ遺伝子を含むフラグメントＢとライゲーションすることで、ｐＣＲＩＩ−Ｌｕｃを得た。このようにして得られたｐＣＲＩＩ−ＬｕｃをＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切断し、ターゲット部位を含むフラグメントＡとライゲーションを行い、ｐＣＲＩＩ−ＩＲＥＳ／Ｌｕｃを作製した。
最後に、ｐＣＲＩＩ−ＩＲＥＳ／Ｌｕｃのベクターを非細胞系、及び細胞系のどちらの系でも作用するプロモーター（プロモーターＣＭＶ及びＴ７）を有するｐｃＤＮＡ３に変えるため、このｐＣＲＩＩ−ＩＲＥＳ／ＬｕｃとｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）両者ををＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切断した後、ライゲーションを行い、目的としたターゲットプラスミドをｐｃＤＮＡ３−ＩＲＥＳ／Ｌｕｃの作製に成功した。このプラスミドを用いて、以下の実験によりＨＣＶに対するアンチセンス効果を評価した。
（非細胞系におけるＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果）
（１）  Ｃ型肝炎ウィルスの５’非翻訳領域内のＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を含むターゲットプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＩＥＳ／Ｌｕｃをインビボで転写反応させる際の効率の向上を考え、制限酵素ＸｈｏＩを使用して直鎖化した。得られた直鎖ＤＮＡを用いてインビトロ転写反応させて、ｍＲＮＡを合成した。このｍＲＮＡを、オリゴヌクレオチドと共にウサギ網状赤血球溶解液（ＲＲＬ）を用いたインビトロ翻訳反応によってタンパク質にした後、ルシフェラーゼアッセイを行った。
最初に、開始コドン近傍をターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて検討を行った。ここではＤ−ｏｌｉｇｏ及びＢＮＡ−ｏｌｉｇｏを用いた。Ｄ−ｏｌｉｇｏ，ＢＮＡ−ｏｌｉｇｏそれぞれのアンチセンスオリゴ（Ｄ−Ａ３６７，ＢＮＡ−Ａ３６７）、及びネガティブコントロールとしてのランダムオリゴ（Ｄ−Ｒ３６７，ＢＮＡ−Ｒ３６７）をｍＲＮＡとの濃度の比が、２．５：１、５：１、１０：１となるように加えて、翻訳反応を行った。得られたタンパク質を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。オリゴヌクレオチドを加えずに翻訳反応を行った場合を１００％とい、結果を図６に示した。
結果から明らかなように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを加えることでルシフェラーゼの発現は抑えられおり、この発現抑制は加えるオリゴヌクレオチドの濃度を上昇させるに連れて強くなっており、濃度依存的なアンチセンス効果を示すことが確認できた。
Ｄ−Ａ３６７，ＢＮＡ−Ａ３６７のどちらにおいてもアンチセンス効果が見られるが、どの濃度においてもＢＮＡ−Ａ３６７がより優れた遺伝子発現抑制効果を示しており、より優れたアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが確認された。更に、対照として用いたランダムオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ−Ｒ３６７）においては遺伝子発現抑制効果は見られず、このアンチセンス効果が配列特異的なものであることも確認できた。
（２）  次いで、オリゴヌクレオチドの長さを短くすることによる、アンチセンス効果の変化を調べるため、Ａ−３６７の５’側から５塩基削ったＡ３６２、及び１０塩基削ったＡ３５７のＤ−ｏｌｉｇｏ及びＢＮＡ−ｏｌｉｇｏを用いて上記と同様の試験を行った。
オリゴヌクレオチドを加えずに翻訳反応させた場合を１００％として各オリゴヌクレオチドについての結果を図７、図８に示した。
図７、図８に示した結果から明らかなように、オリゴヌクレオチドの長さ短くした場合においても、ＢＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは優れた遺伝子発現抑制効果を示すことが確認された。特に、Ｄ−ｏｌｉｇｏにおいてあまりアンチセンス効果の見られない低濃度でも、ＢＮＡ−ｏｌｉｇｏ有意なアンチセンス効果を示すことが確認された。また、ＢＮＡ−Ｒ３６２、ＢＮＡ−Ｒ３５７のいずれも遺伝子発現抑制効果は見られず、配列特異的なアンチセンス効果であることが確認できた。
（３）  同様の試験をＨＣＶ−ＲＮＡ内部のステム領域をターゲットとするＤ−Ａ１５９及びＢＮＡ−Ａ１５９について行った。ｍＲＮＡとの濃度比を５：１、１０：１、２０：１となるようにオリゴヌクレオチドを加えて翻訳反応を行った。ルシフェラーゼアッセイの結果を、オリゴヌクレオチドを加えずに翻訳反応させた場合を１００％として図９に示した。
Ｄ−Ａ１５９を用いた場合、どの濃度においても遺伝子発現抑制効果は見られなかった。これは、Ｄ−ｏｌｉｇｏの結合力が弱いため、ステム領域の分子内水素結合を剥がしてまで結合することができなかったためと考えられる。
一方、ＢＮＡ−Ａ１９５を用いた場合、ｍＲＮＡとの比が１０：１、２０：１のときに約５０％の遺伝子発現抑制効果を示した。これは本発明のＢＮＡオリゴヌクレオチドの強い結合親和性が効果を発揮したためと考えられる。
実施例３  細胞系におけるＢＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドのＨＣＶ
遺伝子翻訳阻害効果
肝ガン由来の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞（大阪大学薬学部より供与）を用いてＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果を細胞系において検討した。
（１）  まず、ＨｅｐＧ２細胞を各ウェル上に５×１０４づつ同数蒔き、２４時間培養した。次いで、血清非存在下オリゴヌクレオチド、ターゲットプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＩＲＥＳ／Ｌｕｃ及びｐＲＬ−ＴＫをリポフェクトアミンを用いてトランスフェクトした。このときターゲットプラスミドと共にトランスフェクションしたｐＲＬ−ＴＫはターゲット部位であるＨＣＶ−ＩＲＥＳを含んでいないプラスミドであり、加えたオリゴヌクレオチドの毒性、即ち非特異的な発現抑制効果を調べるために用いた。このｐＲＬ−ＴＫは、レポーター遺伝子としてウミシイタケのルシフェラーゼ遺伝子を含んでおり、デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイ（ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ）を行うことでターゲットプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＩＲＥＳ／Ｌｕｃのレポーター遺伝子であるホタルのルシフェラーゼ遺伝子と別々に定量を行うことができる（図１０）。即ち、ターゲットを含んでいないウミシイタケルシフェラーゼの発現を抑制するものは、非特異的な遺伝子発現抑制効果を示すものである。
血清非存在下Ｏｐｔｉ−ＭＥＭでのトランスフェクションを４時間行った後、培地を血清の存在するＤＭＥＭに培地交換した。その後２０時間培養し、細胞を回収し、デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイを行った。
（２）  まず開始コドンをターゲットとしたアンチセンスオリゴヌクレオチドについて検討を行った。試験に使用したオリゴヌクレオチドは、Ｄ−ｏｌｉｇｏ、ＢＮＡ−ｏｌｉｇｏ、Ｓ−ｏｌｉｇｏそれぞれの２７ｍｅｒアンチセンス並びにランダムオリゴヌクレオチドで、終濃度１２０ｎＭとなるように加えた。
オリゴヌクレオチドを加えずに、プラスミドのみをトランスフェクションした場合を１００％として結果を図１１に示した。
図１１の結果から明らかなように、非細胞系ではアンチセンス効果を示したＤ−ｏｌｉｇｏであるＤ−Ａ３６７において、この細胞系の試験では遺伝子発現抑制効果は全く見られなかった。これは、細胞内に存在するヌクレアーゼによって、Ｄ−ｏｌｉｇｏが分解を受けたためと考えられる。また、酵素耐性能が極めて優れていると評価されているＳ−ｏｌｉｇｏの場合、Ｓ−Ａ３６７によってホタルルシフェラーゼの発現がされているＳ−ｏｌｉｇｏの場合、Ｓ−Ａ３６７によってホタルルシフェラーゼの発現が大幅に抑制されている。しかしながら、Ｓ−ｏｌｉｇｏの場合は毒性が問題となっており、そのため非特異的な発現抑制効果があることが示された。即ち、発現を抑制しないはずのランダムオリゴヌクレオチドＳ−Ｒ３６７においてもホタルルシフェラーゼの発現抑制が見られた。更に、Ｓ−Ａ３６７及びＳ−Ｒ３６７はターゲット配列を含んでいないのウミシイタケルシフェラーゼの発現も抑制しているからである。
一方、ＢＮＡオリゴヌクレオチドの場合、ＢＮＡ−Ａ３６７において、非常に優れたホタルルシフェラーゼの遺伝子発現抑制効果を示し、また、ウミシイタケルシフェラーゼの発現に影響を与えていない。また、ランダムオリゴヌクレオチドＢＮＡ−Ｒ３６７は遺伝子発現抑制効果を見せていない。これらの結果からみて、ＢＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、配列特異的な効果であり、これはＢＮＡオリゴヌクレオチドの極めて優れた結合親和性及び酵素耐性能によるものであると考えられ、ＢＮＡオリゴヌクレオチドのみが細胞内においても優れたアンチセンス効果を示すことが明らかになった。
（３）  次に、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ内のステム領域をターゲットとしたＢＮＡ−Ａ１５９の細胞内でのアンチセンス効果について検討した。オリゴヌクレオチドとしては、Ｄ−Ａ１５９及びＢＮＡ−Ａ１５９を用いて、終濃度で６０ｎＭ並びに１２０ｎＭとなるようにトランスフェクションした。結果は、オリゴヌクレオチドを加えずにトランスフェクションした場合を１００％として図１２に示した。
図１２の結果から明らかなように、Ｄ−Ａ１５９では、非細胞系の場合と同じく発現抑制効果が見られずアンチセンス効果を示さないことが確認された。
一方、ＢＮＡ−Ａ１５９では、６０ｎＭにおいて約５０％の、１２０ｎＭにおいてはほぼ完全にルシフェラーゼの発現を抑制しており、極めて優れたアンチセンス効果を示すことが確認された。
（４）  ＨＣＶ−ＩＲＥＳ内のステム領域をターゲットとする下記の配列の天然型アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｄ−ｏｌｉｇｏ）及び本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（ＢＮＡ−ｏｌｉｇｏ）をＤ−Ａ１５９及びＢＮＡ−Ａ１５９と同様の方法で合成した。式中、ヌクレオチド配列のうち、下線を引いたものが本発明のヌクレオチド類縁体ユニットである。
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ＢＮＡ−Ａ１５９と同様にして、ＢＮＡ−Ａ１９１の細胞内でのアンチセンス効果について検討した。Ｄ−Ａ１９１及びＢＮＡ−Ａ１９１を用いて、終濃度で６０ｎＭ、１２０ｎＭ、２４０ｎＭとなるようにトランスフェクションした。結果はオリゴヌクレオチドを加えずにトランスフェクションした場合を１００％として図１３に示した。
図１３の結果から明らかなように、Ｄ−１９１では発現抑制効果が見られずアンチセンス効果を示さないことが確認された。
一方、ＢＮＡ−Ａ１９１では極めて優れたアンチセンス効果を示すことが確認された。
このように、ＢＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、非細胞系に比べて細胞系における効果の方が顕著なのは、優れた酵素耐性能と共に、細胞内に高いリボヌクレアーゼ濃度によるものと考えられる。
［産業上の利用可能性］
本発明のＢＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶ−ＲＮＡに対して優れた結合親和性を有し、高い酵素耐性能を示し、さらに細胞毒性が低いため、非細胞系及び細胞系の両者において、特異的なＨＣＶ遺伝子発現抑制効果を示す。また、本発明のＢＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、対象ＲＮＡ核酸におけるループやステム等の二次構造のいかんに関わらず、ＨＣＶを標的とするアンチセンス法に有効である。したがって、本発明のＢＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来、インターフェロン以外に有力な治療薬がなかったＨＣＶの遺伝子治療用の治療薬として有望である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＣＶゲノムの構造を示す図である。
図２は、ＨＣＶ−ＩＲＥＳの二次構造を示す図解図である。
図３は、ＨＣＶ−ＩＲＥＳを含むターゲットプラスミドの構築方法を示す説明図である。
図４は、ＨＣＶ−ＩＲＥＳを含むターゲットプラスミドの構築方法を示す説明図である。
図５は、ＨＣＶ−ＩＲＥＳを含むターゲットプラスミドの構築方法を示す説明図である。
図６は、非細胞系における、ＨＣＶ−ＩＲＥＳの開始コドン近傍をターゲットとする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体と天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドとのＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果を示すグラフである。
図７は、非細胞系における、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体と天然型アンチセンスオリゴヌクレオチド（図６のものと長さが異なる）とのＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果を示すグラフである。
図８は、非細胞系における、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体と天然型アンチセンスオリゴヌクレオチド（図６、図７のものと長さが異なる）とのＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果を示すグラフである。
図９は、非細胞系における、ＨＣＶ−ＩＲＥＳのステム領域をターゲットとする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体と天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドとのＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果を示すグラフである。
図１０は、実施例３の細胞系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果を検討する試験に使用したプラスミドの構造を示す図である。
図１１は、細胞系における、ＨＣＶ−ＩＲＥＳの開始コドン近傍をターゲットとする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体、天然型アンチセンスオリゴヌクレオチド等のＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果を示すグラフである。
図１２は、細胞系における、ＨＣＶ−ＩＲＥＳのステム領域をターゲットとする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体（Ｄ−Ａ１５９）と天然型アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ−Ａ１５９）とのＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果を示すグラフである。
図１３は、細胞系における、ＨＣＶ−ＩＲＥＳのステム領域をターゲットとする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体（ＢＮＡ−Ａ１９１）と天然型アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｄ−Ａ１９１）とのＨＣＶ遺伝子翻訳阻害効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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