(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒素部分と胃腸腫瘍に対して選択的な標的細胞結合部分とからなる複合体であって、上記標的細胞結合部分は実質的に下記のごとき配列:
Ｌ鎖
CDR1:  ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
CDR2:  ArgMetSerAsnLeuValSer
CDR3:  LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
Ｈ鎖
CDR1:  TyrThrGlyMetAsn
CDR2:  TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly
CDR3:  ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal
を有するCDR領域を含有する標的細胞結合部分からなり、該CDR領域は標的細胞結合部分がC242抗体と実質的に同一な細胞結合性を有するように配列されている、複合体。
【請求項２】
毒素部分は組換え体リシンＡからなる、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
3−メルカプト酪酸ジラジカル（−CO.CH2.CH(CH3)−S−）によって標的細胞結合部分上のアミノ基から、リシンＡ中のシステイン残基のチオール基に連結されている、該結合部分と組換え体リシンＡからなる請求項２記載の複合体。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一つに記載の複合体と薬学的に許容される希釈剤又は担体とからなる胃腸腫瘍の処置用医薬組成物。
【請求項５】
胃腸腫瘍の処置に使用する医薬を製造するための、請求項１〜３の何れか一つに記載の複合体の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は抗腫瘍治療(anti-tumour therapy) において使用するための免疫毒素(immunotoxin) のごとき複合体(conjugate) 、かかる複合体の製造方法及びかかる複合体を含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその解決すべき課題】
リシン(ricin) 及びリシン型分子、例えばアブリン(abrin) 、モデシン(modecin) 及びビスクミン(viscumin)は植物細胞内で産生されるかつ細胞毒性( 細胞障害性) (cytotoxic property)を有する既知化合物である。この種の毒素はジスルフィド架橋によって連結されている２個のポリペプチド鎖からなる。ポリペプチド鎖の一方（"A鎖")は主として毒素分子が細胞毒性を示す原因となるものであり、ポリペプチド鎖の他方（"B鎖")は毒素分子を細胞表面に結合させるものである。
【０００３】
リシン型分子の毒性は３つの段階を経て作動する：
(a) B 鎖上のガラクトース結合部位と、細胞表面に暴露されている糖タンパク質又は糖脂質との相互作用による、細胞表面への毒素の結合；
(b) 少なくとも A鎖の、細胞の細胞質ゾル（シトソール）中への浸透；及び
(c) リボソーム 60Sサブユニットの活性を破壊する A鎖によるタンパク合成の抑制。
【０００４】
B鎖は、また、毒素分子を細胞表面に結合させるというその一次的な機能の他に、毒素の細胞内への吸収を促進するという点で重要な二次的な機能を有すると考えられている。従って、 A鎖は、B 鎖が存在しない場合には、細胞表面に結合しかつ細胞の細胞質ゾル中に浸透する能力に欠けており、、一方、B 鎖は細胞毒性を有していないので、分離された A鎖及び B鎖は本質的に無毒性である。
【０００５】
前記したごとく、リシン及びリシン型毒素分子は植物によって産生される。リシンそれ自体の場合には、その産生はヒマシ油植物(caster oil plant)としても知られているヒマ( Ricinus  communis）内で生起する。リーダー配列、A 鎖、連結配列(connecting sequence) 及び B鎖からなる先駆体ポリペプチド［プレプロリシン(preproricin) として知られている］が最初に生成すると考えられている。植物細胞内でのこの先駆体（プレプロリシン）の輸送（transport)の際に、リーダー配列が除去されてプロリシン（proricin) が生ずると考えられる。ついで、A 鎖と B鎖の間にジスルフィド架橋が形成されそして連結配列が除去されることによって、プロリシンから成熟リシン（mature ricin) が生成される。
【０００６】
リシンのごとき毒素の A鎖の毒性は、無差別に(indiscriminately)結合している B鎖を正常細胞よりも腫瘍細胞に結合する能力を有する別のキャリヤーによって置換することができる場合には、抗腫瘍治療に有用であり得ることがすでに示唆されている。かくして、種々の成熟リシン又はリシンの A鎖及び腫瘍特異性抗体を含有する種々の複合体が示唆されかつ製造されている。しかしながら、かかる複合体、免疫複合体(immunoconjugate) 又は免疫毒素は多くの不利益を有する。  既知の複合体についての問題の一つは天然リシンの A鎖の構造的特徴から生じる。植物細胞内でリシンが合成される際に、N-グリコシル化（N-glycosylation)が生起し、その結果、生成した糖部分が細胞表面と非特異的相互作用を行い得るものと考えられる。
【０００７】
また、
（a)全リシン−免疫複合体（whole ricin-immunoconjugate)の場合、 B鎖上のガラクトース結合部位が細胞表面と非特異的に相互作用を行う；か又は、
(b)植物リシン A−免疫複合体の場合、植物リシン A上で発現されたグリカン側側鎖(glycan side side chain ）と細胞表面のガラクトース及びマンノースレセプターとが結合すること；
により、植物リシン−免疫複合体についての選択性の低下が生ずると考えられる。  別の問題は、前記したごとく、B 鎖は毒素分子の細胞内への吸収を促進すると考えられることである。例えば、B 鎖が存在しない複合体、即ち、A 鎖と抗体とからなる複合体は、天然毒素より特異的であるが、これらの複合体は天然毒素の効力（potency)に欠けると報告されている(Moolten等、Immun Rev,62,47-72,   1982  参照）。この効力の損失は毒素の細胞内への効果的な吸収の減少によるものと考えられる。従って、従来報告されている抗体の比較的小数のものが毒素の効果的なインターナリゼーション（internalisation)を促進し、その結果、効力に欠ける免疫毒素を生じる。
【０００８】
従来、多数の異なる組織の腫瘍を処置するのに有用な複合体が製造されている。例えば、PCT 特許出願第 WO85/003508号にはスペーサー分子を介して乳房腫瘍(breast tumour) に対して特異的な抗体に連結されているリシン A又はジフテリア毒素 Aからなる複合体の製造が記載されている。
【０００９】
結腸直腸（colorectal) 腫瘍細胞を認識する抗体も報告されているが、これらの抗体を含有する複合体は正常細胞と結合するという欠点及び/ 又は効力が低いという欠点を有する。従って、結腸直腸腫瘍細胞を認識する既知の抗体は実際の治療的興味を有する複合体の調製においては利用性のないものであった。従って、結腸直腸腫瘍の治療において価値のある複合体が求められていた。
【００１０】
かくして、種々の複合体が提案され、製造されているが、改善された複合体が求められていた。かかる改善された複合体は既知の複合体の欠点の一つ又はそれ以上を改善し得るものである。また、胃腸腫瘍に対して選択的である複合体も求められている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、毒素部分（Toxin moiety）と胃腸腫瘍に対して選択的な標的細胞結合部分（target cell binding moiety）とからなる複合体であって、上記標的細胞結合部分は実質的に下記のごとき配列：
Ｌ鎖
CDR1:  ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
CDR2:  ArgMetSerAsnLeuValSer
CDR3:  LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
Ｈ鎖
CDR1:  TyrThrGlyMetAsn
CDR2:  TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly
CDR3:  ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal
を有するCDR領域を含有する標的細胞結合部分からなり、該CDR領域は標的細胞結合部分がC242抗体と実質的に同一な細胞結合性を有するように配列されている、複合体が提供される。
【００１２】
特に、標的細胞結合部分（及び従って複合体）は結腸直腸腫瘍細胞及び膵臓腫瘍細胞（pancreatic tumour cell) 、特に、結腸直腸腫瘍細胞に対して選択的である。
【００１３】
標的細胞結合部分は、例えば、通常、抗体、抗体フラグメント又は抗体又は抗体フラグメントの誘導体からなるであろう。
【００１４】
標的細胞結合部分は正常細胞よりも胃腸腫瘍細胞（特に結腸直腸腫瘍細胞）に結合するということにおいて、かかる細胞に対して選択的である。例えば、標的細胞結合部分は胃腸腫瘍細胞には結合するが、正常細胞に対しては結合親和性（bonding affinity）を示さないか又は僅かしか示さないであろう。特に、標的細胞結合部分は胃腸腫瘍に対して、C242抗体によって示される選択性と実質的に同一の選択性を示すであろう。結腸直腸腫瘍のごとき胃腸腫瘍に対するC242抗体の選択性は後記する免疫組織化学的（immunohistochemical）データによって例示される。例えば、特に、C242抗体のごとき標的細胞結合部分は胃腸腫瘍細胞中には存在するが正常細胞中には存在しないか又は極めて弱く発現される抗原に結合するであろう。かかる標的細胞結合部分の特定の例はC242抗体又は実質的に同一の細胞結合性を有する標的細胞結合部分である。
【００１５】
本明細書中で述べるごとく、複合体は胃腸腫瘍細胞を死滅させることができる。即ち、複合体［又は" 免疫毒素" ("immunotoxin") ］は、毒素部分がその細胞毒性を発揮し得るように、毒素部分を腫瘍細胞に移行させる(deliver) ことができる。従って、複合体は、通常、（標的細胞結合部分が腫瘍細胞に結合することにより）腫瘍細胞に結合し、毒素部分を腫瘍細胞内に送入することができる；即ち、複合体は毒素部分を "インターナライズ"("internalise")させる（内在させる）ことができる。特に効果的な複合体は、通常、下記のごとき性質を有するであろう：
1.標的細胞結合部分は腫瘍細胞表面抗原に結合することができるものであるべきである。
【００１６】
2．腫瘍細胞表面抗原は腫瘍細胞上に高いコピー数、例えば、細胞１個当り、少なくとも10000のコピー数で存在すべきである。
【００１７】
3.腫瘍細胞表面抗原は正常細胞上では高いコピー数で発現されるべきではない。  4.抗体：抗原複合物 (antibody: antigen complex)は毒素部分が細胞内でその細胞毒性を発揮できるように効果的にインターナライズさせる（内在させる）  (internalise) べきである。
【００１８】
5.複合体は毒素部分を腫瘍細胞に移行させるのに十分な時間、血液内で変化しない程度の安定性を有するように構成されていることそして毒素部分が一旦細胞内に移行した後に毒素部分を放出するために十分に解裂し得るように構成されていることが好ましい。
【００１９】
抗体C242はIgGクラスのマウス抗体であり、ヒト結腸腺癌細胞系（colonic adenocarcinoma cell line）で感作されたマウスからの脾細胞とマウス骨髄腫（myeloma）細胞系Sp2/0とを融合させることによって得られるハイブリドーマ細胞系を適当な媒体中で培養したときに生成する。C242:II抗体（本明細書では、単に、C242抗体とも称する）を生成するハィブリドーマ細胞系（242．II）はブタペスト条約に従ってEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)、PHLS Centre for Applied Microbiology and Research (英国、ウイルトシャー州、ソールズベリー、ポートンダウン所在) に1990年1月26日に寄託受理番号90012601で寄託されている。
【００２０】
" 実質的に同一の細胞結合性を有する標的細胞結合部分 "という用語は寄託されているECACC 細胞系 90012601 によって生成されるものと実質的に同一の免疫学的特異性(immunological specifity) を有する標的細胞結合部分、即ち、同一の抗原決定基又はエピトープに結合しかつその部位に結合するためのC242抗体と競合する標的細胞結合部分を包含する。
【００２１】
" 標的細胞結合部分 "という表現は、また、抗体フラグメント、特に、抗体C242及び無傷抗体(intact antibody) のフラグメントを包含する。抗体フラグメントは非フラグメント化(unfragmented)免疫グロブリンの結合能力と特異性とを保有しており、例えば抗体をペプシンのごときタンパク分解酵素で分解することによって得られる抗体フラグメントを包含する。フラグメントの特定の例としては  F(ab')及びF(ab')２フラグメントが挙げられる。
【００２２】
標的細胞結合部分は遺伝子工学操作によって調製し得ること及び従って標的細胞結合フラグメントという用語はかかる操作によって生ずる抗体及び抗体フラグメントを包含することは理解されるであろう。特に、標的細胞結合部分という用語は遺伝子工学操作の生成物である C242 抗体又はそのフラグメントを包含する。
【００２３】
抗体フラグメント及び特に人間化された(humanised) 抗体フラグメントの調製は、例えば、Carter等により Biotechnology,Vol.10(1992年 2月号）に記載されている。
【００２４】
標的細胞結合部分は誘導体の形の抗体又は抗体フラグメント、特に、ヒト以外の供給源から誘導された、人間化された形の抗体又は抗体フラグメント、例えば、人間化された形のマウス抗体を包含する。
【００２５】
抗体C242は腫瘍を伴った抗原（本明細書においてはCA-242と称する）に向けられる。例えば、特に、標的細胞結合部分は抗原CA-242に結合することのできる抗体又は抗体フラグメントからなる。かかる抗体の特定の例は抗体C242それ自体である。腫瘍随伴抗原 CA-242 は大部分の結腸−直腸腫瘍において発現され、正常な結腸組織においては僅かしか発現されないか又は存在しない。
【００２６】
前記したごとき遺伝子工学操作について、C242:II モノクロナール抗体のL 鎖及びH 鎖の可変領域(variable region) のcDNAを以下に述べるごとくクローンした。これを検討する前に、基本的な免疫グロブリン構造単位について簡単に概説する必要がある；以下においては、抗体、即ち、免疫グロブリン又はクラス Gの一般的構造が記載されている図18を参照する。
【００２７】
図18において、免疫グロブリンは２本の同一の軽（L)ポリペプチド鎖と２本の同一の重（H)ポリペプチド鎖とからなる；４本のポリペプチド鎖はジスルフィド結合と種々の非共有結合力(non-covalent force)により対称な"Y" 字型に連結されている。各 H鎖はその端部に可変部(variable domain)( VＨ) を有し、これに続いて多数の不変部(constant domain)( CＨ )を有しており、各 L鎖は一方の端部に可変部（ VＬ）を有し、他方の端部に不変部（ CＬ )を有する。それぞれ、カッパー及びラムダで示される２種の L鎖が存在する。 L鎖の可変部は H鎖の可変部と並んでおり、 L鎖の不変部は H鎖の第１の不変部と並んでおり、 L鎖及び H鎖の可変部は抗原結合部位を形成している。
【００２８】
L鎖及び H鎖の可変部は同一の一般的構造を有しており、各々、相補性決定領域(complementarity determining region)、即ち CDRと呼ばれる３つの超可変部(hypervariable region)を有する；これらの超可変部は４つのフレーム構造領域(framework region)、即ち、FRの間に挿入されている。各可変部のCDR はフレーム構造領域によって接近して保持されており、２組のCDR によって抗体の特異性が提供される。
【００２９】
C242:II抗体のＬ鎖及びＨ鎖の可変部のcDNAをクローンするために、最初、C242:IIハイブリドーマからそれ自体既知の方法によってcDNAファージライブラリーを調製した。ついで、ポリメラーゼ鎖反応（Polymerase chain reaction）(PCR)と適当なプライマー（primer）を使用して、それぞれ、Ｈ鎖及びＬ鎖（カッパー）の不変部をカバーするハイブリダイゼーションプローブ(hybridization probe)をマウスゲノムDNAから調製した。得られたプローブを使用して、C242:IIの抗体のH鎖及びカッパー鎖をエンコードするDNA塩基配列を含有するcDNAクローンについてのcDNAライブラリーをスクリーンした。正にハイブリダイズするファージクローン（positively hybridizing phage clone）を伸長させ（expanded）、cDNAをプラスミドの形で切り出した（excise）。このプラスミドの特徴を制限酵素マッピングにより調べ、所期のサイズのインサート(insert) を含有するプラスミドについて配列決定を行った。CDR領域を決定するために、例えば、Kabat 等（1987）によりSequence of Proteins of Immunological Interest, 第４版, U.S. Department of Helth and Human Service, National Institutes of Healthに定義されているごときCDRの基本的な位置を考慮しながら、シークエンスインサート（Sequence insert）によってエンコードされるアミノ酸配列を、従来から既知のマウスカッパー鎖及びＨ鎖のアミノ酸配列と比較した。それぞれの鎖のCDRは下記のごとき（及び図19及び20に示すごとき）アミノ酸配列を有することが認められた(SEQ I.D.No.21及び22も参照)：
Ｌ鎖
CDR1(SEQ. ID. NO 1): ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
CDR2(SEQ. ID. NO 2): ArgMetSerAsnLeuValSer
CDR3(SEQ. ID. NO 3): LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
Ｈ鎖
CDR1(SEQ. ID. NO 4): TyrThrGlyMetAsn
CDR2(SEQ. ID. NO 5): TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly
CDR3(SEQ. ID. NO 6): ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal
【００３０】
これらのCDR アミノ酸及び/ 又はDNA 塩基配列についての知識を使用して、それ自体既知の、特定部位の突然変異誘発(site-directd mutagenesis)により、  C242:II 抗体のCDR 領域を他の抗体又は抗体フラグメントのクローンされた可変部に導入し得る。かかる方法は、一般的に、"CDRグラフテイング"("CDR grafting") として知られており（例えば、公開欧州特許出願 EP 239,400 号に記載されている）、受容体抗体(recipient antibody)又はフラグメントのCDR エンコード配列をDNA レベルでC242:II 抗体のCDR エンコード配列で置換し、対応する特異性を有する抗体又は抗体フラグメントをC242:II モノクロナール抗体として得ることからなる。標的細胞結合部分の範囲内には、勿論、上記で定義したごときCDR （又は実質的に上記で定義したごときCDR ）の少なくとも一つを有する抗体又は抗体フラグメントからなる任意のかかる部分が包含される；抗体又は抗体フラグメント上のCDR の数及びその配列は標的細胞結合部分がC242抗体と実質的に同一の細胞結合性を有するようなものである。標的細胞結合部分が上記で定義したごとき（又は実質的に上記で定義したごとき） CDR( 即ち、L 鎖のCDR1,CDR2 及びCDR3及び H鎖のCDR1,CDR2 及びCDR3) の全てを含有していることが一般的に好ましい。実質的に上記で定義したごとき CDRとしては下記のごとき伸長した配列が挙げられる：
L鎖
0003735379.tif 000002
H鎖
0003735379.tif 000003
【００３１】
CDR グラフテイングにより調製される抗体又は抗体フラグメントは、相同性及びCDR サイズの両者においてC242に近似するように選択されたフレーム構造上にC242 CDRをグラフテイングすることにより調製することが好ましい。
【００３２】
本発明よれば、更に、毒素部分と、C242抗体からなる標的細胞結合部分又は同一の細胞結合性を有する標的細胞結合部分とからなる複合体が挙げられる。
【００３３】
本発明の複合体は必ずしも１個の毒素分子と１個の抗体分子から構成されるものでないことは理解されるであろう。例えば、複合体は抗体分子１個当り１個以上の毒素分子を含有し得る。
【００３４】
毒素部分は、通常、細胞毒性を有し従ってインターナリゼーションの後に細胞を死滅させることのできる成分からなる。
【００３５】
標的細胞結合部分は、通常、特定の抗原決定基又は標的細胞を認識できる標的細胞結合部分からなる。
【００３６】
毒素部分と標的細胞結合部分はその一方を、直接、他方に連結させるか又はこれらを間接的に連結させ得る。毒素部分と標的細胞結合部分は、通常、複合体の形状(geometry)が標的細胞結合部分のその標的細胞への結合を許容するように連結される。毒素部分と標的細胞結合部分は、複合体が細胞外では(extracellularly) 安定であり、細胞内では(intracellularly) 不安定であり従って毒素部分と標的細胞結合部分が標的細胞の外部では連結されたままであるが、インターナリゼーションの後に毒素部分が放出されるように連結されていることが有利である。即ち、複合体は細胞内では解裂性(cleavable) であり、細胞外では安定である部位を有することが有利である。
【００３７】
毒素部分が標的細胞結合部分に直接結合している複合体の例としては、毒素部分と標的細胞結合部分が毒素部分上のチオール基と標的細胞結合部分上のチオール基との間に形成されたジスルフィド架橋によって連結されているものが挙げられる。
【００３８】
標的細胞結合部分は毒素部分を認識し従って毒素部分と標的細胞結合部分とに連結する部分を含有し得る。かかる部分を含有する場合の例は標的細胞結合部分が毒素部分に連結する抗体又は抗体フラグメントを含有する場合である。
【００３９】
標的細胞結合部分と毒素部分は単一のポリペプチドからなることができる；このポリペプチドは細胞内で解裂性の部位を含有し、その結果、毒素部分が細胞内で放出されるようなものであることが好ましい。かかるポリペプチドにおいては毒素部分と標的細胞結合部分はポリペプチドリンカーによって連結し得る。
【００４０】
毒素部分が標的細胞結合部分に間接的に結合している複合体の例としては、毒素部分が二官能性リンカー、特にヘテロ−二官能性リンカー(heterobi-functional linker)によって標的細胞結合部分に連結されているものが挙げられる。
【００４１】
適当なリンカーとしては、例えば、PCT 特許出願 WO85/003508号に記載されているごときポリペプチドからなるリンカー及び公開欧州特許出願第 169,111号に記載されているごとき結合基（chemical moiety)からなるリンカーが挙げられる。  毒素部分と標的細胞結合部分はジスルフィド結合又はチオエーテル結合によって連結させることが好ましい。一般的には、毒素部分と標的細胞結合部分は、これらの部分を細胞内で解裂性のジスルフィド結合又はチオエーテル結合により連結させるリンカーによって連結されることが好ましい。かかるリンカー及び免疫毒素を調製する際のその使用は公開欧州特許出願第 169,111号; Methods in Enzymology,112,207-225,1985,(Cumber,A.J.,Forrester,J.A.,Foxweel,B.M.J.,Ross,W.C.J.,Thorpe,P.E.-Preparation of antibody-toxin conjugates);及びVogel,Immunoconjugates: Antibody conjugates in radioimaging and theory of cancer,pp28-55,(Wawrzynczak ,E.J. 及びThorpe,P.E.-Mehtods for preparing immunotoxins:effects of the linkage on activity and stability)に記載されている。
【００４２】
特定のリンカーとしては毒素部分と標的細胞結合部分の一方の上でチオール基とジスルフィド結合を形成し、毒素部分と標的細胞結合部分の他方の上でアミノ基とアミド結合を形成することのできるものを挙げることができる。
【００４３】
リンカーの特定の例としては、式：
-S-X-CO-
( X はスペーサー基である) で表されるものを挙げることができる。
【００４４】
X は（1-6 C)アルキル基、フェニル基及び（1-4 C)アルキルフェニル基から選ばれた１個又は２個の置換基によって置換されていてもよい直鎖アルキル基であるか、又は、アルキル部分が（1-6 C)アルキル基、フェニル基及び（1-4 C)アルキルフェニル基から選ばれた１個又は２個の置換基によって置換されていてもよくそしてフェニル環がハロゲン、(1-4 C) アルキル基及び(1-4 C) アルコキシ基から選ばれた置換基を有し得る、(1-4 C) アルキルフェニル基からなり得る。
【００４５】
一般的には、X は上記した置換基から選ばれた置換基を有するアルキル基であることが好ましい。
【００４６】
例えば、X は（1-4C) アルキル基及びフェニル基から選ばれた１個又は２個の置換基によって置換されていてもよい（1-6 C)アルキル基からなり得る。X の特定の例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基及びブチル基から選ばれた置換基の１個又は２個の置換基によって置換されていてもよい（特にメチル基、エチル基、プロピル基及びブチル基によって置換されている）メチレン基、エチレン基、プロピレン基及びブチレン基が挙げられる。
【００４７】
好ましいX の特定の例としては Xが前記した置換基の１個又は２個により置換されていてもよいメチレン基又はエチレン基からなるものが挙げられる。
【００４８】
X は１個又は２個のメチル基によって置換されているか又は置換されていないエチレン基、特に、１個のメチル基によって置換されているエチレン基であることが好ましい。
【００４９】
本発明の好ましい複合体としては、式:
A−S1−S2−X−CONH−B
［式中、Ａは毒素部分及び標的細胞結合部分の一方からなり、Ｂは毒素部分及び標的細胞結合部分の他方からなり;標的細胞結合部分は１個又はそれ以上の毒素部分を担持することができ;S1はＡ上に存在する硫黄原子であり、NHはＢ上にあり;−S2−X−CO−（S2は硫黄原子であり、Ｘは前記したものである）はリンヵーである］で表される複合体が挙げられる。
S1がＡ上のチオール基から誘導されることは理解されるであろう。
【００５０】
リンカーが不斉中心（chiral centre)を含有する場合には、リンカーは光学活性体又はラセミ体の形で存在しかつこの形で単離され得ることは理解されるであろう。本発明は光学活性体又はラセミ体の形のリンカーの使用も包含する。光学活性体の形のリンカーの調製は当業者に周知の有機化学の技術によって行い得る。
【００５１】
Ａは毒素部分からなり、Ｂは標的細胞結合部分からなることが好ましい。
前記したごとく、毒素成分は細胞毒性を有する任意の成分からなり得る。かかる成分の例としてはリボソームを不活性化することができる従ってタンパク質合成を抑制することができるポリペプチドが挙げられる。その特定の例としては天然に産生するポリペプチド及びかかるポリペプチドの成分が挙げられる。かかるポリペプチドが毒素成分と実質的に無毒成分とからなる場合には、毒素部分は毒素成分からなることが好都合である。例えば、毒素部分はリシンからなり得るが、毒素部分はリシンのＡ鎖からなることが好都合である。毒素部分は細胞毒性を有する、天然に産生するポリペプチドの部分（portion）又は同族体（analogue）からなり得る。毒素部分のために適当なポリペプチド及びその調製はRibosome inactivating protein up to date-Stripe F及びBarbieri, L, FEBS3269及びその参照文献に記載されている。毒素部分のために特に適当なポリペプチドとしてはリシン（リシンＡ）のＡ鎖、レストリクトシン（restrictocin）及びシガトキシン（Shiga toxin）が挙げられる。毒素部分のために適当な他のポリペプチドとしてはアブリン（abrin）、ビスクミン（viscumin）、モデッシン（modeccin）、ボルケンシン（volkensin）、ゲロニン（gelonin）、ポークウイード抗菌性タンパク質（pokeweed antiviral protein）、サポリン（saporin）、ルフィン（ruffin）、トリコサンシン（tricosanthin）、大麦リボソーム不活性化タンパク質、ジアシンス(diathins)、ビオジン（biodine）、モモルジン（momordin）、トリチン(tritin)、ドデカンドリン(dodecandrin)、α−サルシン(α-sarcin)、ミトゲリン(mitogellin)、ジフテリアトキシン、シュウドモナスエキソトキシン(pseudomonas exotoxin)Ａ及びシガ状'（'Shiga-like）トキシン、VT1及びVT2が挙げられる。
【００５２】
天然に産生するポリペプチドの同族体としては、細胞毒性活性の損失を生ずることのない一つ又はそれ以上のアミノ酸の変更(alteration)（削除、付加、置換）により異なるという点で天然に産生するポリペプチドに関連する一次構造を有するポリペプチドが挙げられる。かかる同族体の例としては一つ又はそれ以上の変更によって標的細胞結合部分への連結が促進されているものが挙げられる。
【００５３】
毒素部分が天然に産生するポリペプチド又はその一部分からなる場合には、毒素部分は天然供給源からポリペプチドを単離することにより調製することができ、また、天然に産生するポリペプチドの一部分が必要な場合には単離されたポリペプチドを化学的な手段によって変性することにより、例えば、酵素で処理することにより(enzymatically) 調製することができる。ポリペプチド又はその一部分は遺伝子工学技術によっても調製し得る。かかる技術としては組換え体DNA 技術が挙げられ、この場合、所望のポリペプチドをエンコードする DNA配列が、通常、適当なベクター又はプラスミド中に組み込まれる。ベクター又はプラスミドを用いて形質転換させた宿主細胞を適当な条件下で培養して DNA配列を発現させ、ポリペプチドを製造する。
【００５４】
毒素部分はリシン A、その部分又はその同族体からなることが好ましい。毒素部分がリシン Aからなる場合には、リシン Aはヒマ(Ricinus Communis 即ち"Castor bean"plant) の種子から取得し得る。しかしながら、A 鎖又はリシンは遺伝子工学技術によって調製することが好ましい。即ち、組換え体リシン A又はリシンが好ましい。
【００５５】
組換え体DNA技術によって得られるリシンＡは、通常、天然の供給源から得られるものより好ましいが、これは組換え体DNA技術によればリシンのＢ鎖が混入していないリシンＡの調製が可能であり従ってこの方法で得られるリシンＡはグリコシル化（glycosylate）されていないという理由に基づくものである。従って、組換え体DNAリンンＡを使用した場合には、無差別に（indiscrimately）結合しているＢ鎖が存在せず、また、細胞表面と非特異的相互作用を行うことができる糖部分が存在しないため、より選択的な複合体が得られる。
【００５６】
好ましい態様においては、本発明の複合体は結腸直腸腫瘍細胞について選択的な標的細胞結合部分を含有している。
【００５７】
標的細胞結合部分はC242抗体又はそのフラグメント、特に、C242抗体からなるのが好ましい。
【００５８】
毒素部分と標的細胞結合部分は3−メルカプト酪酸基−CO.CH2.CH(CH3)−S−を介して連結されていることが好ましい。この基は標的細胞結合部分上のNH基、例えば、リシル（lysyl）残基のNH基と、毒素部分上のチオール基、例えば、リシンＡ中のシステイン残基上のチオール基とのジスルフィド架橋との間の共有結合によって標的細胞結合部分に連結されていることが好都合である。
【００５９】
従って、本発明によれば、特に、3−メルカプト酪酸基−CO.CH2.CH(CH3)−S−によってC242上のアミノ残基から、リシンＡ中のシステイン残基のチオールに連結されている、C242抗体と組換え体リシンＡとからなる免疫毒素が提供される。
【００６０】
好ましい免疫毒素は3−メルカプト酪酸基によって、C242中のリシル残基の末端アミノ基から、リシンＡ中のシステイン残基の末端チオール基に連結されている、CZ42抗体と組換え体リシンＡとからなる免疫毒素である。
【００６１】
各抗体単位は、通常、少なくとも１個のリシン A単位を担持しているであろう。抗体単位が、それぞれのリンカー部分を介して２個以上の組換え体リシン A部分を担持し得ることは理解されるであろう。抗体がリシン Aに連結しているものの他に１個又はそれ以上のリンカー部分を含有しうることも理解されるであろう。これらの追加的なリンカー部分は無毒性分子、例えば、システインを担持し得る。従ってかかるリンカーは無毒性分子によって "キャップ"("capped)され得る。
【００６２】
本発明の免疫毒素は胃腸腫瘍、特に、結腸直腸腫瘍又は膵臓腫瘍の処置において重要な用途を有する。従って、本発明によれば、有効な量の複合体( 前記で定義したもの）をヒトのごとき温血動物に投与することを特徴する胃腸腫瘍の処置方法も提供される。
【００６３】
投与量と投与方法は、使用される特定の毒素部分、標的細胞の集団(population)及び患者の病歴によって変動することは理解されるであろう。複合体の投与量は典型的には患者の体重１kg当り0.1 〜 1mgであろう。
【００６４】
本発明の複合体は、通常、医薬組成物の形で投与されるであろう。従って、本発明によれば、更に、複合体（前記で定義したもの）と薬学的に許容される稀釈剤又は担体とからなる胃腸腫瘍の処置用医薬組成物が提供される。
【００６５】
本発明の医薬組成物は種々の投与形態に製剤し得る。一般的には、本発明の複合体は非経口的に、好ましくは、静脈内に投与され得るであろう。特定の非経口的医薬組成物は注射によって投与するのに適当な単位投与形態に製剤されたものである。従って、特に適当な組成物は薬学的に許容される担体又は稀釈剤と組合わされた免疫毒素の溶液、エマルジョン又は懸濁液からなる。適当な担体又は稀釈剤としては水性ビヒクル、例えば、水又は食塩水及び非水性ビヒクル、例えば、不揮発油又はリポソームが挙げられる。医薬組成物は該組成物中での複合体の安定性を増大させる薬剤を含有し得る。例えば、組成物は緩衝剤、例えば、ツイーン(Tween) を含有し得る。複合体の濃度は変動させ得るが、一般的には、複合体は１投与当り約 1〜10mgの濃度に製剤されるであろう。
【００６６】
抗体 C242 は結腸直腸腫瘍細胞について選択的であり、そして、この抗体を組込まれている複合体は結腸直腸腫瘍細胞について選択的である、重要な免疫毒素であることが認められた。
【００６７】
特に、本発明の好ましい複合体は、結腸直腸腫瘍細胞について選択的でありかつこの細胞に対して効果的であることにおいて、驚くべきほどに効果的な免疫毒素であることが認められた。この複合体は、また、比較的低い血液排除率(bloodclearance)と細胞外開裂性(cleavage)及び破壊性(destruction) を有しており、従って、改善された血漿遺存性(plasma persistence)がもたらされることが認められた。このことは免疫毒素に、排除(clearance) と破壊が生起する前にその標的細胞と十分な時間、相互作用を行わせるという重要な利点を有する。
【００６８】
本発明によれば、更に、前記で定義したごとき複合体の製造方法が提供される：  (a) 標的細胞結合部分が、直接、毒素部分に連結されている複合体については、毒素部分と標的細胞結合部分とを反応させる。
【００６９】
例えば、標的細胞結合部分がジスルフィド架橋を介して毒素部分に連結されている場合には、標的細胞結合部分と毒素部分の一方を、例えばジチオトレイトールを使用して還元しついで標的細胞結合部分と毒素部分の他方と反応させる。
【００７０】
(b) 標的細胞結合部分がリンカーによって毒素部分に連結されている複合体については、リンカーを結合させることにより誘導された標的細胞結合部分と毒素部分とを反応させるか又はリンカーを結合させることにより誘導された毒素部分と標的細胞結合部分とを反応させる。
【００７１】
適当な部分( 毒素部分と標的細胞結合部分) は連結剤(linking agent) と反応させて該部分にリンカーを結合させることにより誘導される。誘導体化標的細胞結合部分を毒素部分と反応させることが好都合である。
【００７２】
誘導体化(derivatised) 標的細胞結合部分（リンカーを結合させた標的細胞結合部分）又は誘導体化毒素部分（リンカーを結合させた毒素部分）の調製は、例えば、該部分を適当な緩衝液( 例えば、酢酸塩、燐酸塩又は硼酸塩緩衝液) に溶解しついでpHを連結剤と両立し得る値に調整しついで反応混合物に連結剤を添加することにより行い得る。連結剤が反応混合物に不溶性である場合には、標的細胞結合部分又は毒素部分の溶液を、少量の有機溶剤、例えば、ジメチルスルホキシド又はジメチルホルムアミド中の連結剤の溶液に添加し得る。連結剤との反応の後、誘導体化生成物をゲル濾過、透析又はカラムクロマトグラフィーのごとき標準的な方法で分離し得る。ついで誘導体化生成物（誘導体化標的細胞結合部分又は誘導体化毒素部分）を他方の部分と反応させて最終複合体を得ることができる。
【００７３】
使用される連結剤の正確な種類は、複合体化(conjugation) を行うために利用し得る標的細胞結合部分及び毒素部分上の基( 例えばチオール、カルボキシ又はアミノ基) の種類に依存することは理解されるであろう。
【００７４】
毒素部分は天然供給源から調製し得る。毒素部分を組換え体 DNA技術によって調製することが好ましい。この技術は当業者に周知の技術を使用するものであり、mRNAを抽出し、cDNAライブラリー(library) を調製し、ベクターを構成し、細胞を形質転換させついで形質転換宿主細胞を培養して毒素ポリペプチドを発現させる技術を包含している。所望の毒素部分を発現させるのに適当な宿主としては原核生物、例えば、大腸菌 (E.Coli) 及び真核生物、例えば、酵母菌が挙げられる。これらの工程は後記する複合体の調製に例示されている。
【００７５】
標的細胞結合部分は、通常、抗体又は抗体フラグメント又は誘導体からなる。抗体はモノクロナール抗体からなることが好ましい。抗体は既知の方法によって調製し得る。抗体は血清、脾臓及び抗体分泌ハイブリドーマから単離し得る。
【００７６】
抗体の調製は、例えば、Methods in Enzymology; Vol.178;Antibodies,Antigens and Molecular Mimicry;J.Langone編;Academic Press Inc （特に、Section II,Engineered Antibodies  参照）；及びMethod in Enzymology; Vol.73;Immunochemical Techniques PartB;J.Langone及びH van Vunakis 編;Academic Press Inc （特に、Section I:Production of Antibodies参照）に記載されている。
【００７７】
リンカーが基 -S-X-CO- からなる場合には、抗体（又は毒素部分）は式：
L１-S-X-CO-L ２（式中、 L１及び L２は置換可能な基である）の化合物との反応により誘導体化し得る。例えば、CO-L２はカルボン酸基、好ましくは、活性化されたカルボン酸基からなり得る。例えば、基CO-L２はエステル基又は無水物基からなり得る。 L２についての特定の例としてはイミダゾリル基又はスクシンイミヂルエステル(succinimidyl ester)基が挙げられる。 L１はチオ基の酸化の際に置換される基からなり得る；例えば L１はピリジン基からなり得る。リンカーは、通常、抗体又は毒素部分（好ましくは毒素部分）上の還元されたチオール基と反応させる。
【００７８】
他のリンカーが使用される場合には、これらのリンカーを当業者に既知の方法により抗体及び毒素部分と反応させる。通常、リンカーを標的細胞結合部分及び毒素部分上の利用し得るそれぞれの官能基と反応させる。しかしながら、標的細胞結合部分と毒素部分は共有結合、例えば、ジスルフィド結合を形成させることにより、直接、連結させ得る。
【００７９】
毒素部分がスルフィドリル(sulphydryl)基、例えば、システイン残基のスルフィドリル基を有する場合には、この基を複合体形成に利用し得る。例えば、この基は標的細胞結合部分上又はリンカー上のスルフィドリル基とのジスルフィド結合を形成させるのに利用し得る。スルフィドリル基が毒素部分上に存在しない場合には、毒素部分をかかる基を提供するように誘導体化して複合体の形成を促進し得る。毒素部分についてのこの誘導体化は例えばイミノチオランを使用して行い得る。
【００８０】
ポリペプチドリンカーを使用する場合には、このリンカーを毒素部分上又は標的細胞結合部分上の遊離のカルボキシル基又はアミノ基と反応させ得る。
【００８１】
毒素部分がリシンの A鎖からなり、リンカーがジラジカル -COCH２CH (CH３)-S-からなる場合には、適当な連結剤はN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ）ブチレートである。かかる免疫毒素を調製するのに好ましい方法は誘導体化された標的細胞結合部分と還元されたリシン Aとを反応させることからなる。
【００８２】
標的細胞結合部分の誘導体化（リンカーの導入）はN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ）ブチレートのごときカップリング剤との反応によって行うことができ、リシンの A鎖の還元は適当な還元剤で処理して、例えばジチオトレイトールを使用して、遊離システイン基上のチオール基を還元することにより行い得る。
【００８３】
過剰の連結剤を使用して誘導体化標的細胞結合部分に２個以上のリンカーを結合させることが好都合である。リシン Aとの反応の後、リシン Aに結合していない連結剤はブロッキング基(blocking group)、例えば、システイン基と反応させることによりキャップする(capped)ことが好都合である。
【００８４】
本発明の複合体は腫瘍の処置において有用であり得る。このことは生体外での腫瘍細胞におけるタンパク質合成を抑制する複合体の能力及び/ 又は生体内での腫瘍の大きさ又は生長を抑制する複合体の能力によって示される。適当な試験方法は後記する。
【００８５】
本発明を次の実施例により説明するが、これに限定されるものではない。但し書きがない場合には：
(ｉ) 蒸発は真空中で回転蒸発により実施した；
(ii) 操作は室温で即ち１８〜２６℃の範囲で実施した；
(iii) 収量は単に説明のためにのみ与えてあり、必らずしも勤勉な処理発現により達成し得る最大値ではない；
(iv)  プロトンＮＭＲスペクトルは内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いて、溶剤としてジューテロ化したジメチルスルホキシド中で２００ＭＨｚで通常測定され、しかも主要ピークを表示する慣用の略号を用いてＴＭＳに関してｐｐｍでの化学シフト（△値）として表わされる；ｓ，一重項；ｍ，多重項；ｔ，三重項；ｂｒ，ブロード；ｄ，二重項；及び
（ｖ）次の略号を使用する：
ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ−リン酸緩衝溶液
ＩＰＴＧ−イソプロピルチオ−β−ガラクトシド
ＥｔＯＨ−エタノール
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
リシンＡ／Ｃ２４２免疫毒素（イムノトキシン）の製造
４．４ｍｇ／ｍｌでリン酸緩衝溶液（リン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．２）中のモノクローナル抗体Ｃ２４２（２００ｍｇ）の溶液を４℃で膜濾過（アミコンＹＭ１０メンブラン）により１２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。該濃厚液を０．５容量のホウ酸塩緩衝液（１００ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ９．１）で希釈した。タンパク質の濃度は２８０ｎｍで吸光度を監視することにより測定し、混合溶液のｐＨは８．８＋／−０．１であると認められた。
【００８６】
Ｎ−サクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（“リンカー”）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で乾燥、再蒸留したジメチルホルムアミド又はアセトニトリルに溶解した。３．５２ｍｇのＮ−サクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）ブチレートを含有するこの溶液の一部分（０．３５２ｍｌ）を濃縮済みの抗体溶液に直ちに添加した。得られる溶液を混合し、次いで２０℃で１時間放置させた。次いで該溶液を脱塩カラム（Ｇ２５セファデックス−ファルマシア社製、２．６×５８ｃｍ、流速２ｍｌ／分、５０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０で平衝した）に添加して過剰の試薬を除去し、緩衝剤は誘導化した抗体を交替させる。別の場合には、反応生成物は直交流（crossflow)濾過により取出し得る。脱塩した且つ誘導化した抗体をプールし、タンパク質の濃度は２８０ｎｍでの吸光度を監視することにより測定した。リンカーを用いての誘導化の程度は過剰のジチオトレイトールを添加し、３４３ｎｍでの遊離チオピリジル基の放出を監視することにより測定した。誘導化の程度は１モルの抗体当り４〜６個のリンカー基であると見出された。
【００８７】
組換えリシンＡはｐＨ８のリン酸緩衝液中のリシンＡの溶液を過剰のジチオトレイトールで処理することにより還元され、直交流濾過により濃縮された。過剰の反応剤はカラムクロマトグラフィー（Ｇ２５セファデックス−ファルマシア社製、２．６×５８ｃｍ、流速２ｍｌ／分、５０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、ｐＨ８．０）により除去された。
【００８８】
組換えリシンＡは、生産した組換えリシンＡ（１９０ｍｇ）と誘導化した抗体（１９０ｍｇ）溶液とを１：１（重量／重量）のリシンＡ／誘導化抗体比で混合することにより誘導化抗体に複合させた。グリセロールを２０容量／容量％まで添加し、容器をアルゴンで掃気した。得られる溶液を４０〜６５時間１５℃に維持した。
【００８９】
抗体上の過剰のリンカー基をキャップするために次いでシステインを０．２ｍＭの最終濃度にまで添加し且つ抗体上のリンカー基に対して少なくとも１０倍のモル過剰量で添加した。該溶液を混合し２０℃で２〜３時間維持した。システインでキャップ形成したのに続いて、得られる免疫毒素の試料は過剰のジチオトレイトールで処理することにより分析し、反応の完了を定量するのに３４３ｎｍで監視した。
【００９０】
次いで複合体含有溶液は膜濾過（アミコンＹＭ１０メンブラン）により濃縮し、クロマトグラフィーカラム（ＨＲ３００セファクリル−ファルマシア社製、２．６×５０ｃｍ、流速３ｍｌ／分、緩衝液５０ｍＭリン酸ナトリウム／２５ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に施用し、これにより非複合リシンＡから免疫毒素及び非複合抗体が分離される。免疫毒素と抗体との混合物を含有するピークをプールし、タンパク質濃度は２８０ｎｍでの吸光度を監視することにより測定した。
【００９１】
かくして非複合抗体と免疫毒素との両方を含有して得られる溶液は１Ｍ  ＨＣｌの添加によりｐＨ６．３に調節し、これを、トリアジン染料基質を含有するカラム（マイメチックＡ６×Ｌ、ＡＣＬ社、英国、８×２６ｃｍカラム、流速１．５ｍｌ／分）に施用した。カラムは非複合抗体を溶離する原料緩衝液１００ｍｌで洗浄し、免疫毒素は０．５Ｍの塩化ナトリウムを含有する原料緩衝液で溶離した。免疫毒素溶液はリン酸緩衝溶液に対して透析し、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過し、４℃で貯蔵した。
【００９２】
免疫毒素の純度はＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により測定し、次の組成を有する免疫毒素を全部で４５ｍｇ含有した：５０〜６０％のモノリシンＡ誘導体、１０〜３０％のジリシンＡ誘導体、５〜１５％のトリリシンＡ誘導体及び＜１０％の非誘導化抗体。
【００９３】
あるいは別法として、ゲル濾過工程（残留ｒ−リシンＡの除去）及び染料アフィニティークロマトグラフィー工程（残留Ｃ−２４２抗体の除去）は精製順列に移行し得る。この方法の変更例では、未反応のリンカー部分を前記の如くシステインでブロックした直後に、複合混合物を蒸留水で５ｍＳ以下の導電率にまで希釈する。次いで１Ｍ酢酸でｐＨを６．０に調節し、該溶液は膜濾過により清澄化した。次いで該溶液を染料リガンドカラム（２．５ｍｇゲル／複合混合物で用いたｒ−リシンＡｍｇ）に施用した。次いで非複合Ｃ２４２抗体がカラムを通して洗い出されてしまうまで０．６８％酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）でカラムを洗浄した。次いで免疫毒素及び残留ｒ−リシンＡはｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウムの緩衝液中で塩化ナトリウム濃度に関して０．５Ｍでカラムから溶離し得る。次いでこの溶離液は螺旋状カートリッジの限外濾過系を用いて直交流濾過により濃縮させ、セファクリルＳ３００ＨＲのカラム（最初の複合反応で用いた抗体の各ｍｇ毎につき２．５ｍｌのゲルしかもカラムの全容量の＜５％の容量で）に施用した。カラムはリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）の如き何れか適当な組成の緩衝液で平衝させ得る。
【００９４】
リンカー部分の製造
前記で用いたN−サクシンイミジル(R)−3−(2−ピリジルジチオ)ブチレートは次の方法を用いて製造したが、但し書きがなければ:
(i）蒸留は真空中で回転蒸発により実施した；
(ii)操作は室温で即ち18〜26℃の範囲で実施した；
(iii)収量は単に説明のためにのみ与えてあり、必らずしも勤勉な処理発現により達成し得る最大値ではない；
(iv)プロトンNMRスペクトルは内部標準としてテトラメチルシラン（TMS）を用いて溶剤としてジューテロ化したクロロホルム中で270MHzで通常測定されしかも主要ピークを表わす慣用の略号を用いてTMSに関してppmでの化学シフト（△値）として表わされる：ｓ，一重項：ｍ，多重項；ｔ，三重項；br，ブロード；ｄ，二重項。
【００９５】
Ｎ−サクシンイミジル  （Ｒ）−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート
室温で攪拌しながら（Ｒ）−３−（２−ピリジルジチオ）酪酸（９０．０ｇ，０．３９３モル）をジクロロメタン（６３０ｍｌ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（４５．２ｇ、０．３９３モル、１．０モル当量）を添加し、ジクロロメタン（９０ｍｌ）で該混合物中を洗浄した。該混合物を−２℃に冷却しながら３０分間攪拌した。反応温度を０℃±２℃に維持しながらジクロロメタン（５４０ｍｌ）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（８１．０８ｇ、０．３９３モル、１．０モル当量）の溶液を３５分間に亘って添加し、ジクロロメタン（９０ｍｌ）で該混合物中を洗浄した。該溶液を０〜１０℃の温度で３時間１５分攪拌し、次いで室温まで昇温させた。該溶液を濾過して固体のジシクロヘキシル尿素を取出しこれをジクロロメタン（１８０ｍｌ×２）で洗浄した。濾液を減圧下に２０〜２２℃で蒸発させると褐色油（１５０ｇ）が得られた。この油状物をトルエン／酢酸エチル８０：２０（容量／容量）で調製したキーゼルゲル６０シリカゲル２３０〜４００メッシュ（１１８０ｇ）のカラム上でクロマトグラフィーにより精製した。トルエン／酢酸エチル（８０：２０容量／容量）で溶離すると２８℃で真空（０．２５ｍｂａｒ）下に蒸発させた後に淡黄色ゴム状物としてＮ−サクシンイミジル  （Ｒ）−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（５２ｇ）が得られた。
【００９６】
ＮＭＲ：
１．５（ｄ，３Ｈ），２．８５（ｍ，４Ｈ），２．８（ｄｄ，１Ｈ），３．２（ｄｄ，１Ｈ），３．５（ｍ，１Ｈ），７．１（ｍ，１Ｈ），７．７（ｍ，２Ｈ），８．５（ｄ，１Ｈ）。
【００９７】
電子衝撃質量分光分析法により該化合物が３２６の分子量を有することを示し、その際細片部はＮ−サクシンイミジル  （Ｒ）−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレートの構造と合致するものである。
【００９８】
原料は次の如く調製された：
ａ．（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸
メチル（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（１．６７０ｋｇ、１４．１５２モル）を氷／エタノール浴中で冷却した。水（４６９８ｍｌ）を添加し、続いて４７重量／重量％の水酸化ナトリウム（９６５ｍｌ、１６．９８モル、１．２モル当量）を０℃±２℃の温度を維持するような割合で添加した。反応混合物を０℃で更に１時間３０分攪拌した。温度を５℃又はそれ以下に維持しながら濃塩酸（１４９０ｍｌ、１７．２８モル、１．２２モル当量）を３５分の期間に亘って反応混合物に添加して１．５の最終ｐＨを得た。次いで塩化ナトリウム（１０６１ｇ）を反応混合物に添加し、水性混合物をメチルtert−ブチルエーテル（１０×３．５ｌ）で抽出した。抽出液を合し、溶剤を真空下に室温で蒸留することにより除去すると残渣を得た。トルエン（７．５ｌ）を残渣と混合し、揮発性物質を真空下での蒸留により除去すると油状物として（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（１１８９ｇ、８１％）を得た。この油状物を４℃に冷却し、結晶させて固体を得た。
【００９９】
ｂ．（Ｓ）−β−ブチロラクトン
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（５３０ｇ、５．０９６モル）をトリエチル  オルトアセテート（１３２２．８ｇ、１４８８ｍｌ、８．１５４モル、１．６モル当量）と２５〜３０℃で混合すると白濁した溶液を得た（この白濁は前段階からの残留塩化ナトリウムによるものであると考えられる）。該溶液を高真空下（１．０ｍｍ）に３０℃で蒸発させて揮発性物質を除去した。（２Ｓ，６Ｒ）−２−エトキシ−２，６−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−オンを含有する残留液体（１００１ｇ）を８０℃で２時間加熱し次いで４０℃に冷却した。粗製物を、ガラス製のラシッヒ（Raschig)環を詰めたガラスカラム（５０ｃｍ×３．５ｃｍ直径）に通して蒸留すると（Ｓ）−β−ブチロラクトン（５７．３ｇ）を得た、１０〜１２ｍバールでの沸点５９〜６２℃。
【０１００】
ｃ．（Ｒ）−３−メルカプト酪酸
（Ｓ）−β−ブチロラクトン（９１．１２ｇ、１．０５８モル）を窒素下に攪拌しながら５℃に冷却した。温度を５℃に維持しながらチオール酢酸（８０．５７ｇ、７５．６５ｍｌ、１．０５８モル、１．０モル当量）を添加した。次いで反応温度を−５〜＋５℃に維持しながらトリエチルアミン（１４６．７ｍｌ、１．０５８モル、１．０モル当量）を４５分間に亘って添加した。冷却浴を取去り、温度を６５℃に昇温させると黄色／橙色溶液を得た。反応混合物を１０℃に冷却し、室温で一夜攪拌した。該溶液を０℃に冷却し、水（９３ｍｌ）を添加した。該混合物を更に−１０℃に冷却し、次いで水酸化ナトリウム溶液（４７重量／重量％の水酸化ナトリウムの１８５ｍｌ及び水９２ｍｌ）で処理し、添加の割合は温度を−１０〜＋１０℃に維持するようなものである。次いで該混合物を−５℃で１．５時間攪拌し、次いで室温にまで加温させた。該混合物をメチル  tert−ブチルエーテル（２６５ｍｌ）で洗浄した。水性相を水（１８５ｍｌ）で希釈し、０℃に冷却し、ｐＨが１〜２となるまで濃塩酸（２７０ｍｌ）で０〜１０℃で処理した。次いで水性混合物をメチル  tert−ブチルエーテル（２×２６５ｍｌ）で抽出した。有機抽出液を合し、水（２６５ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、３０℃で減圧下に蒸発させると橙色油（１３２．８ｇ）を得た。この油状物を真空蒸留により精製すると（Ｒ）−３−メルカプト酪酸（８６．６ｇ）を得た、２ｍバールで沸点９６〜１００℃。
【０１０１】
ｄ．ピリジン−２−スルフェニル  クロライド
２，２′−ジピリジルジスルフィド（１１０．０ｇ，０．５モル）を室温でジクロロメタン（８００ｍｌ）に溶解させて淡黄色溶液を得、これを０℃に冷却した。塩素ガスを該溶液中で泡出させ、これを０〜５℃に維持した。３時間２５分後に該溶液は塩素で飽和され、金褐色となった。該溶液を０〜５℃で減圧下に濃縮して過剰の塩素を除去し、黄色の固体としてピリジン−２−スルフェニルクロライドを沈殿させた。この固体（１１．８ｇ）を濾過により収集し、ジクロロメタンで洗浄した。ジクロロメタン濾液（１６２４ｇ）は別量１３３ｇのピリジン−２−スルフェニルクロライドを含有した。
【０１０２】
ｅ．（Ｒ）−３−（２−ピリジルジチオ）酪酸
ピリジン−２−スルフェニルクロライド（黄色固体１１．８ｇ及び前記で調製したジクロロメタン中の溶液の１０３５ｇ、全部で０．６６７モル、１．０モル当量）をジクロロメタン（５０ｍｌ）で希釈した。該混合物を室温で５〜１０分攪拌し次いで−５℃に冷却した。温度を−５℃〜０℃に維持しながらジクロロメタン（４００ｍｌ）中の（Ｒ）−３−メルカプト酪酸（８０．０ｇ、０．６６７モル）の溶液を添加した。該混合物を室温で一夜攪拌させると褐色油と黄色上層とを得た。水（４８５ｍｌ）を該混合物に添加し、次いでこれを５℃に冷却し、ｐＨが４．５５となるまで２Ｎ水酸化ナトリウム溶液（３８５ｍｌ）で処理した。ジクロロメタン相を分離し、残留水性相をジクロロメタン（２００ｍｌ）で抽出した。ジクロロメタン抽出液を合し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下に蒸発させると淡褐色の油状物を得た。この油状物をヘキサン（３２５ｍｌ）と共に激しく攪拌し、固体が生成されるまで氷浴中で冷却した。該混合物を３時間攪拌し、次いで褐色の結晶質固体を濾過により収集し、ヘキサン（２×１６２ｍｌ）で洗浄し、真空中室温で一夜乾燥させると（Ｒ）−３−（２−ピリジルジチオ）酪酸（１４０ｇ）を得た。
【０１０３】
ＮＭＲ；
１．４５（ｄ，３Ｈ），２．６（ｄｄ，１Ｈ），２．８（ｄｄ，１Ｈ），３．４（ｍ，１Ｈ），７．１（ｍ，１Ｈ），７．７（ｍ，２Ｈ），８．５（ｍ，１Ｈ）。
【０１０４】
C242抗体（C242:II）の産生
ハイブリドーマ細胞系の樹立及びC242:IIの産生
樹立脾臓細胞の産生
受理番号No.CCL222号としてアメリカン  タイプ  カルチュア  コレクション(Amrican Type Culture Collection: ATCC）から工業的に入手し得るヒトの結腸直腸ガン腫細胞系、COL0205を、10％の子ウシ胎児血清（FCS）を補足したイスコーブ（Iscove）のMEM中で定常的に培養した。継代培養してから通常２日〜３日後に、融合前に細胞を取出し、免疫のためリン酸緩衝溶液（PBS）で３回洗浄した。
【０１０５】
４〜６周令のＢＡＬＢ／ｃマイスを、０．１ｍｌのリン酸緩衝塩溶液に懸濁させた基本投与量の３×１０7 ＣＯＬＯ２０５細胞で腹腔内免疫にした。次いでマイスを３×１０7 ＣＯＬＯ２０５細胞の別量０．１ｍｌの懸濁液で効能増強させ、４日後に屠殺し、脾臓を取出した。次いで脾臓を解離して単一の細胞懸濁物にした。
【０１０６】
ハイブリドーマの産生
前記した細胞懸濁物からの１．２×１０8 脾臓細胞を２本の試験管の間に分配した。各々の管に、受理番号ＣＲＬ１５８１としてＡＴＣＣの寄託物から入手し得るマウスの骨髄腫細胞系からの１０8 個の骨髄腫細胞を追加的に添加した。２本の試験管を遠心分離し、全ての液体を傾シャした。次いで各々の管に１分間に亘ってしかも絶えず攪拌しながら２ｍｌの３７℃ＰＥＧ溶液（１０ｇのＰＥＧ  分子量４０００，１ｍｌのＤＭＳＯ及び１０ｍｌのモノクローナル塩水）を徐々に添加した。これらの管を温和に攪拌しながら９０秒間３７℃の水浴に変化させた。細胞の融合は次の計画予定：最初の３０秒間は２ｍｌ、続いての３０秒間は６ｍｌ及び１分間に亘って別量３２ｍｌにより生理緩衝溶液を各々の試験管に添加することにより中断した。培地中の細胞懸濁物の洗浄後に、該細胞懸濁物を全部で１００ｍｌのハイポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）補足培地に懸濁した。培地は１０％のＦＣＳとＬ−アスパラギン（３６ｍｇ／ｌ）とＬ−アルギニン−ＨＣｌ（１１６ｍｇ／ｌ）と葉酸（１０ｍｇ／ｌ）とＬ−グルタミン（２９２．３ｍｇ／ｌ）とピルビン酸ナトリウム（１１０．１ｍｇ／ｌ）とメルカプトエタノール（３．４９μｌ／ｌ）とを補足したイスコーブのＭＥＭであった。５０μｌの分量を９６個の溜り部（well) の組織培養皿の溜り部に分配した。溜り部はＨＡＴ補足した培地中のＢＡＬＢ／ｃマイス（２×１０4 細胞／ｍｌ）からのマクロファージ懸濁物２５０μｌで予備被覆しておいた。培地は融合してから６日後に変化した。
【０１０７】
抗体ハイブリドーマのスクリーニング
前記６日目からの消費培地をH.R. Kennettの“ポリ塩化ビニルプレートに結合した細胞での酵素結合した抗体の評価”モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、生物学的分析の新規次元（１９８０）により記載の如くＣＯＬＯ２０５陽性抗体について試験した。要約すると、ヌンク（Nunc) イムノプレート型IIＦの溜り部を２×１０5 細胞／ＣＯＬＯ２０５細胞の溜り部（１ｍｇ／１００ｍｌＰＢＳ）で被覆した：被覆容量５０μｌ。次いで前記の６日目からの消費培地を被覆済み溜り部に添加した、５０μｌ／たまり部。室温で一夜培養反応した後に、１％のＢＳＡ−ＰＢＳに希釈した（１／５００）ペルオキシダーゼ複合アンチマウスＩｇ（Dakopatts ｐ２６０、Dakopatts 社、デンマーク）を１００μｇ／溜り部で添加し、室温で一夜反応させた。次いで１２ｍｌのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０＋５μｌの３０％過酸化水素に溶かした４ＯＰＤ−タブレットＤａｋｏ  Ｓ２０００の形の基質を１００μｌ／たまり部で添加し、反応に続いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１０８】
約６００個のハイブリドーマクローンを試験した。最初はこれらのうち１９０個がＣＯＬＯ２５０細胞と反応した。これらのうち１７７個がまたNyegaard社（ノルウェー）からのリンホプレプ上に生産した正常なヒトのリンパ球と反応し、これらを廃棄した。残りのクローンのうちの１つから樹立したクローンをハイブリドーマＣ２４２と呼び、ＩｇＧ１クラスとイソタイプした。次いでＣ２４２ハイブリドーマを多数のサブクローン化工程にかけて、Ｃ２４２：IIと呼ばれるクローンを産生する最終的に安全なモノクローナル抗体を結局産生した。
【０１０９】
即ち、Ｃ２４２ハイブリドーマを先ずクローン化してＣ２４２：５と呼ばれるクローンを得た。このクローンを次いでクローン化してクローンＣ２４２：５：２を形成した。これらの両方のクローン化において、ハイブリドーマ懸濁物をハイポキサンチン／チミジン（ＨＴ）補充した培地中に希釈して４個の細胞／ｍｌの密度にした。５０μｌ（０．２個の細胞）を、ＨＴ補足した培地中のＢａｌｂ／ｃマイス  マクロファージ懸濁物（５×１０3 マクロファージ／たまり部）の２５０μｌで予備被覆した９６個の溜り部の培養皿中の各々の溜り部に分散させた。２〜５日後に、単一の細胞クローンは顕微鏡での肉眼検査により検出された。６日目に、培地は変化し、消費培地の或る分量は、前記の如くＥＬＩＳＡにより正常なヒトの細胞にでなくてＣＯＬＯ２０５細胞に結合する抗体の量について分析した。正常な細胞はＥＬＩＳＡにおける陰性反応を保留しながらＣＯＬＯ２０５ＥＬＩＳＡにおける陽性反応により最良のクローンを選択し、更なる発現のため液体窒素で小ビン中に凍結させた。
【０１１０】
第３のクローン化を行なうため、前記細胞を解凍し、ＤＭＥＭ（ダルベッコーの改質イーグル培地）（５％ＦＣＳ）中で培養した。次いで細胞を１個の溜り部当り３個の細胞の平均密度で９６個の溜り部の組織培養プレートの溜り部中に播種した。クローン化は５％のＦＣＳを有するＤＭＥＭ中で行ない、マウスのマクロファージを支持細胞として使用した。このプレート上に、３０個のクローンが生起し、そのうち１６個は、前記した如くＥＬＩＳＡにより比濁法及び抗体の特異性によってＩｇＧの生産を試験した。これらのクローンのうち１２個がＩｇＧを生産することが見出された。次いで１０個のクローンを２４溜り部の組織培養プレート上に展開させ、該プレートから消費培地はＩｇＧの生産と特異性とを試験した。この選択により比較的高い生産率で４個のクローンが節約された。これら４個のクローンの最終的な生産率試験は重複組織培養フラスコ中で行なった。最高の生産率を示すクローンを選抜しＣ２４２／ＣＬ５１０Ａ１と呼称した。これを更なる使用のため液体窒素中で凍結させた。
【０１１１】
クローンＣ２４２／ＣＬ５１０Ａ１の第１のクローン化が示す所によれば細胞の１／３は一般のマウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ中の１：１０００の希釈率で０．１より小さい吸光度により判断される通りＩｇＧを生産しなかった。５個の陽性サブクローンをプールしてＣ２４２：Ｉと呼ばれるクローンを生成した。このクローンからの生産率を一般的なＨＰＬＣ−基質の評価により定量化すると１５０μｇのマウスＩｇＧ／ｍｌであった。
【０１１２】
続いてクローンＣ２４２：Ｉを９６溜り部の培養皿中でクローン化すると３３個のクローンが得られ、全てマウスＩｇＧの生産に陽性であった。これらのクローンのうち５個は全て１５０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧを生成するものであり、これらをプールしてＩｇＧの安定な生産率を有するＣ２４２：IIと呼称される最終クローンを生成した。ＨＰＬＣ分析によればＣ２４２：IIの生産率は１９６μｇのマウスＩｇＧ／ｍｌであることを示した。これらのクローン細胞を液体窒素で凍結させ小ビン中に貯蔵した。生産したＣ２４２：IIハイブリドーマの１試料を前記の如く受理番号９００１２６０１としてＥＣＡＣＣに寄託した。
【０１１３】
Ｃ２４２モノクローナル抗体の生産
前記で生成したハイブリドーマの原料細胞懸濁物を凍結した小ビンから得た。これらの細胞を２×１０4 細胞／ｍｌの密度でヌンクＡ／Ｓから６０００ｃｍ2 の全面積で組織培養室中に播種した（Ｃ２４２：IIハイブリドーマ）。次いでイスコーブ（Iscove N,N及びＭelchers F.,J.Exp.Med. １４７巻、９２３頁、１９７８）により改質されしかも１％のゲンタマイシンと１％のアミノ酸補体と５％の子ウシ胎児血清とを補充したＤＭＥＭ中で、これらの細胞を培養した。次いでこれらの細胞を８％のＣＯ2 含有加湿雰囲気中で３７℃で４日又は５日間培養反応させた。培養の終了時に、細胞を計数し、モノクローナル抗体濃度の測定のため試料を取出した。細胞培養物の上澄み液を傾シャし、セルロースフィルターに通して濾過して懸濁した細胞を除去した。次いで３０，０００分子量の遮断膜を用いてミリポアペリカン限外濾過セル(Millipore Pellican Ultrafiltration cell) 中で限外濾過により上澄み液を２０〜３０倍濃縮した。濃厚液からの１試料をＣ２４２：IIモノクローナル抗体濃度及び抗原反応性の分析のため取出し、しかる後にモノクローナル抗体濃厚物を精製まで−７０℃で貯蔵した。
【０１１４】
Ｃ２４２モノクローナル抗体の精製
プロテイン−Ａ−セファローズ４Ｂ（ファルマシア社の商標名）をゲルの膨潤及び洗浄に関する生産者の指示により製造し、しかる後に前記で生成したＣ２４２：II（またこゝでは簡単にＣ２４２抗体と記載する）濃厚物を、結合用緩衝液として１．５グリシン−ＮａＯＨ、３Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．９を用いてプロテイン−Ａ−セファローズ４Ｂに結合させた。同じ緩衝液を用いて最初の洗浄後に、アフィニティーカラムを０．１Ｍクエン酸−ＮａＯＨ、ｐＨ５．０で溶離させ、Ｃ２４２モノクローナル抗体を１モル／ｌのTris−ＨＣｌ，ｐＨ８．０含有試験管中に収集した。次いで得られた抗体を０．０２Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２、０．２ｇ／ｌ  ＮａＮ3 に対して透析した。次いで３０，０００分子量の遮断膜を用いて限外濾過により透析済みＣ２４２抗体を濃縮した。濃度及び特性の対照分析のため試料を取出した後に、Ｃ２４２モノクローナル抗体を−２０℃で貯蔵した。
【０１１５】
リシンＡの製造
リシンＡは、リシンＡをコードするDNA配列を用いて組換えDNA技法により製造し得る。かかる塩基配列はEP145.111; O'HareらのFEBS Letts、216、p73〜78、1987; 及びLordらのEur.J. Biochem, 148、p265〜270、1985に記載されている。リシンＡをコードするDNA配列はプロモーター（例えばtrpプロモーター）、リボソーム結合部位及び転写ターミネーターの如き適当な制御配列の調節下に置かれるものである。組換えリシンＡの製造及び精製は公表されたPCT特許出願WO 85/03508及び公表された欧州特許No.237,676号に記載されている。
【０１１６】
次に組換えプラスミドの構成を説明するが、該プラスミドにおいてリシン−Ａ連鎖のコード化配列は原核プロモーターエレメントの転写的及びホン訳的制御下に置かれる。転写はメッセージの３′末端に天然終結成分の組込みにより終結する。ホン訳開始はメッセージ５′末端でリボソーム結合部位（ＲＢＳ）でＤＮＡ配列により調節する。構成方法は天然の成熟リシンＡタンパク質の２個のＮ−末端アミノ酸残基の置換を必要とする。
【０１１７】
組換えリシンＡを製造するのに用いたベクターを誘導するのに幾つかの中間段階を記載する。
【０１１８】
実験方法
１．合成オリゴヌクレオチド
合成オリゴヌクレオチドを使用してリシン遺伝子（ジーン）中に特異なＤＮＡ改変物を導入した。以下に記載した全てのオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社によって供給された記録書により、０．２マイクロモルスケール上の調節済み細孔のガラス支持体に結合した５′−ジメトキシトリチル塩基保護したヌクレオチド−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミジト及び保護ヌクレオチドからアプライドバイオシステムズ３８０Ａ  ＤＮＡ合成機により製造された。
【０１１９】
固体支持体から脱離し且つ全ての保護基を除去した後の各々のオリゴヌクレオチドを水（１ｍｌ）に溶解させ、２６０ｎｍでの吸光度の測定を行なって濃度を測定した。
【０１２０】
２．酵素及び宿主菌株
種々の制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ修飾陽酵素を以下に記載した操作で使用した。これらは多数の供給元（アメルシャム  インターナショナル、ベテスダ  リサーチ  ラボラトリーズ、ベーリンガー  マンハイム又はニューイングランド  バイオラブ）の１つから購入されしかも反応条件に関して生産者の指示により使用された。
【０１２１】
本明細書に記載した宿主菌株は多数の供給源から一般に入手し得る。例えば大腸菌（E.coli）Ｃ６００は受理番号ＧＣＳＣ３００４として米国のE.coliゼネティック  ストックセンターの如き多数の培養物収集機関を含めて多数の供給源から自由に入手できる。E.coliＣ６００の遺伝子型はＫ１２ｔｈｒ−１  ｌｅｕＢ６ ｔｈｉ−１  ｌａｃＹ１ ｔｏｎＡ２１  λ- ｓｕｐＥ４４であり；E.coliＨＢ１０１及びＤＨ５αはベテスダリサーチ  ラボラトリーズ（ＢＲＬ）から入手でき；E.coliＴＧ１及びＫ１９はアングリアバイオテクノロジーから入手できる。
【０１２２】
３．ゼネクリーン(Geneclean) （ＴＭ）
反応容器は１）６Ｍヨウ化ナトリウムと２）塩化ナトリウム／エタノール／水洗液を形成するため塩化ナトリウムとＴｒｉｓとＥＤＴＡとの濃厚溶液と３）ガラスミルク(Glassmilk) （ＴＭ）−水中のシリカ母材の懸濁物の１．２５ｍｌを含有する１．５ｍｌの小ビンとを収容する。
【０１２３】
これはプロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス(Proceedings of the National Academy of Sciences) （１９７９）７６巻６１５頁に発表されたVogelstein及びGillespie の方法に基づいたＤＮＡ精製用の技術である。
【０１２４】
別法として“Molecular Cloning - a laboratory manual ”第２版、Sambrook、Fritsch 及びManiatis（１９８９）（以下では“Maniatis”と記載する）に記載された方法の何れかを使用できる。
【０１２５】
４．セクエナーゼ(Sequenase) （ＴＭ）
化学的に修飾したＴ７ＤＮＡポリメラーゼ
“Proceedings of the National Academy of Sciences （１９８７）８４巻４７６７〜４７７１頁に発表された Tabor及びRichardsonの方法に基づいた。
【０１２６】
５．ｐＩＣＩ発現ベクターの構成
５ａ）ｐＩＣＩ００２０
プラスミドベクターｐＩＣＩ００２０は、６５１ｂｐＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ領域が
（１）合成E.coli ｔｒｐ  プロモーター及びｔｒｐリーダーリボソーム結合部位、
（２）ホン訳開始コドン
（３）ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄIII 用の部位を含有するＭ１３ｍｐ１８から誘導された多数の制限酵素認識配列：
よりなる１６７ｂｐＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩフラグメントによって置換されたｐＡＴ１５３基質のプラスミドである。
【０１２７】
この領域のＤＮＡ配列は図１２に示してある。
【０１２８】
合成ｔｒｐプロモーター配列を含有するプラスミドベクターの構成は発表されている（Windass らのNuc.Acids Res ．１０  ｐ６６３９〜６６５７、１９８２）。プロモーターフラグメントは酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｐａＩで消化し且つ電気溶離によりアガロースゲルから特定なバンドを精製した後にかゝるベクターから単離された (“Molecular Cloning −A laboratory Manual ”Maniatis、Fritsch 及びSambrook、第２版１９８９）。
【０１２９】
一対の相補性の合成オリゴヌクレオチドを製造し、これは天然のｔｒｐリーダーリボソーム結合部位とホン訳開始コドンと３′ＫｐｕＩクローニング部位とを与えるプロモーターフラグメントのＨｐａＩ末端に連結するものである。これらのオリゴヌクレオチドを当モル濃度で混合し且つ１００℃に加熱し続いて室温に徐々に冷却することによりアニールさせた。
【０１３０】
次いでプロモーターフラグメント及びアニールしたオリゴヌクレオチドを連結させしかも適当なバンドを電気溶離によりポリアミドゲルから単離した。次いでこのフラグメントを、ＨｉｎｄIII 部位にクローン化したｔｒｐアテニュエーター配列（合成オリゴヌクレオチドから生成した）を含有し且つ該アテニュエーターに追加のＣｌａＩ制限部位３′を導入するＭ１３ｍｐ１８ベクター誘導体と連結させた。連結したＤＮＡを、ＣａＣｌ2 法（Maniatis、１章、８２頁）により有能とさせたE.coli菌株ＪＭ１０９(Yanisch−Perronらの遺伝子、３３、１０３頁、１９８５）に感染させた。平板を被覆し且つ培養反応させた後に、プラークは前もって単離したE.coliＲＩ−ＨｐａＩプロモーターフラグメントのニックホン訳により生成した32Ｐ標識のプローブを用いてBenton及びDaviesの方法（Maniatis、４章、４１頁）により篩分した。標準法（Maniatis、４章、２９頁）により陽性的にハイブリッド化しているプラークから一本鎖ＤＮＡを製造し、多数の供給剤例えばセクエナーゼ（米国Bioscience）により組立て形で与えられる如きＭ１３ユニバーサルプライマー及びサンガー(Sanger)ジデオキシ連鎖終結法を用いて配列した。
【０１３１】
ＲＦ  ＤＮＡをプロモーター／リボソーム結合部位／アテニュエーター配列が確認された１つの単離品から製造した。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩで消化させ、特定のフラグメントを前記の如くポリアクリルアミドから単離した。プラスミドｐＡＴ１５３を酵素ＥｃｏＲＩ及びＡｃｃＩで消化させ且つ単離したプロモーターフラグメントと連結させた。連結したＤＮＡを有能なE.coliＨＢ１０１（Boyer,H.W.及びRoulland-Dussoix,D；１９６９，J.Mol.Biol.,４４  ｐ４５９）(Bethesda Research Laboratories)に形質転換させアンピシリン耐性コロニーを選択した。
【０１３２】
幾つかのクローンからプラスミドDNAを製造し、DNA配列をEcoRIとCla部位との間の領域から誘導した。１つのクローンは正確なプロモーター／アテニュエーター領域を含有していると確認されこれをpICI1O020と呼称した。
【０１３３】
この構成を図１に概説する。
【０１３４】
３ｂ）ｐＩＣＩ１００４２
ｐＩＣＩ１００４２（図１３）はｐＡＴ１５３の抗生物質耐性マーカーがプラスミドＲＲ４（遺伝子ｔｅｔＡによりエンコードされしかもｔｅｔＲ遺伝子の生産品により調節された）からの単一の誘導性テトラサイクリン耐性遺伝子によって置換されているプラスミドである。これらの遺伝子はKlock ら（J.Bacteriol.１６１  ｐ３２６〜３３２、１９８５）によって特徴付けられていた。新規な耐性マーカーは抗生物質の存在下でのみ発現される故に、ｔｅｔＡ遺伝子生成物はプラスミドがテトラサイクリンの不在下に安定に維持される培養物中で組換えリシンＡの潜在的な汚染物ではないものである。プラスミド安定性機能（ｃｅｒ）もまた組入れられた。
【０１３５】
このベクターを生成する最初の段階は、テトラサイクリン耐性をエンコードする遺伝子が完全に除去されたｐＡＴ１５３の誘導体を製造するものである。相補対の合成オリゴヌクレオチドはｐＡＴ１５３からのＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩを次後のクローニングのため幾つかの特異な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する短かい配列で置換するように意図される。
【０１３６】
ｐＡＴ１５３プラスミドＤＮＡを酵素ＥｃｏＲＩ及びＡｖａＩで消化させ、生産者の指図によりゼネクリーン（Ｂｉｏ１０１、カリホルニア）を用いて０．７％アガロースゲルから２．１７５ＫｂｐプラスミドＤＮＡフラグメントを単離した。かくしてテトラサイクリン耐性遺伝子を含有する１．４２５Ｋｂｐフラグメントを除去した。
【０１３７】
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤの１３及び１４）をホスホリル化し、当モル量を互いにアニールした。次いでアニールしたオリゴヌクレオチドの１試料をｐＡＴ１５３からのプラスミドフラグメントと連結反応させた。連結したＤＮＡをE.coliＨＢ１０１（ＢＲＬ）に形質転換させ、アンピシリン耐性コロニーを選択した。
【０１３８】
幾つかのコロニーを小規模のプラスミドＤＮＡの製造（Maniatis、１章、２５頁に明記した如きBirnboin及びDolyの方法）のため選択し、所望の構造は適当な酵素、例えばＥｃｏＲＩ、ＡｖａＩ及びＢａｍＨＩでの制限分析により同定した。正確な制限パターンを有すると同定した３つの単離物の構造はｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ部位の時計方向のプライマー(New England Biolabs) を用いてＤＮＡ配列分析により確認された。１つの単離物はｐＩＣＩ００１９と呼称した。
【０１３９】
ＲＰ４プラスミドＤＮＡはHolmes及びQuigley の方法（Maniatis、１章、２９頁）により現存のストックから単離した。ｔｅｔＲ及びｔｅｔＡを含有する２．４５Ｋｂｐフラグメントが明白に同定し得るまで種々の時点で試料を取出しながらこのＤＮＡを切出してＢｇｌII及び次いで部分的にＸｍａＩで完成させる（２５℃で３５分以下）。ｐＵＣ８  ＤＮＡ(Amersham International)をＢａｍＨＩ及びＸｍａＩで完成するまで消化した。連結はテトラサイクリン耐性遺伝子をｐＵＣ８中に挿入するのに実施した。連結したＤＮＡは、ＣａＣｌ2 法（Maniatis、１章、８２頁）により有能とさせたE.coliＣ６００（Appleyard,R.K.Genetics３９  ｐ４４０，１９５４）に形質転換させ、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを８個のクローンから製造し（Holmes及びQuigley ）、ＲＰ４ｔｅｔＲ及びＡ遺伝子の存在は制限分析により確認した。これらの単離物の１つをｐＴＢ３４４と呼称した。
【０１４０】
次いでｐＩＣＩ００１９からのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩフラグメントをｐＴＢ３４４からの対応のフラグメントで置換することによりテトラサイクリン耐性遺伝子をｐＩＣＩ００１９（前記した）に挿入した。これによりｐＩＣＩ００１９中のアンピシリン耐性遺伝子の大部分がテトラサイクリン耐性遺伝子で置換される。消化し、プラスミドＤＮＡを連結し、続いてE.coliＣ６００に形質転換した後に、コロニーを表現型に基づいて選択し、即ちＴｃR 及びＡｐS を選択した。プラスミドＤＮＡはかゝる４つのクローンから製造し、これを酵素の組合せ例えばＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ／ＳｓｔＩ，ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＳｔｙＩ／ＳａｌＩ及びＡｖａＩ／ＰｓｔＩで消化した。全ての４つのクローンは所望の構成に合致する制限パターンを生じた。これらのクローンのうちの１つをｐＴＢ３５１と呼称した。
【０１４１】
Summers 及びSherratt（Cell  ３６  ｐ１０９７〜１１０３、１９８４）が示す処によればＣｏｌＥＩ（例えばｐＡＴ１５３）から誘導されるプラスミドの不安定性は親プラスミドに存在する２８３ｂｐ配列、ｃｅｒの欠損によるものである。この配列はプラスミドオリゴマーの形成を防止するのに役立ち、プラスミドオリゴマーは或る仕方で但し尚未確定の仕方でプラスミドの分配を破壊すると思われる。ｃｅｒ配列（Summers らのMol. and Gen. Genetics  ２０１、ｐ３３４〜３３８、１９８５；及びCell、３６、１０９７〜１１０３、１９８４）をｐＵＣ１８（ｐＫＳ４９２）にクローン化したフラグメントから単離した。ｐＫＳ４９２プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＴａｑＩで消化させて２８９ｂｐｃｅｒ含有フラグメントを離脱した。プラスミドｐＴＢ３５１ＤＮＡ（Ｄａｍ- 宿主E.coliＧＭ４８から単離した−Arraj,J.A.及びMarinus,M.G.J.Bact. １５３  ｐ５６２〜５６５、１９８３）をＢａｍＨＩ及びＣｌａＩで完成するまで消化させしかも消化したｐＫＳ４９２ＤＮＡと連結させた。連結したＤＮＡの有能なE.coliＣ６００への形質転換後に、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。酵素ＡｖａＩ、ＭｌｕＩ及びＰｖｕＩで推定クローンからのプラスミドＤＮＡの制限分析を使用してｃｅｒ．の存在を確認した。正確な構造を有する１つの単離物をｐＩＣＩ００４２と呼称した。
【０１４２】
これらのプラスミドの構成を図２及び３に概説する。
【０１４３】
５ｃ）ｐＩＣＩ１０７９
プラスミドベクターｐＩＣＩ１０７９はＥｃｏＲＩ及びＳｔｙＩ制限部位の間に次の成分を含有するアンピシリン耐性のｐＡＴ１５３誘導プラスミドである：
（ｉ）λファージからのＣＩ８５７遺伝子；
（ii）λＰL プロモーター；
(iii) 合成リボソーム結合用部位；
(iv) 合成インターフェロンα２遺伝子配列；
（ｖ）ＳａｌＩ及びＳｔｙＩ制限部位の間でファージＴ４から誘導された合成転写ターミネーター配列。
【０１４４】
この転写ターミネーターのＤＮＡ配列は図１４に示してある。ｐＩＣＩ１０７９は図１５に示してある。ｐＩＣＩ１０７９はブダペスト条約により１９９１年２月１９日にＮＣＩＭＢに寄託されており、ＮＣＩＭＢ受理番号Ｎｏ．４０３７０が付与されている。
【０１４５】
プラスミドｐＩＣＩ１０７９を使用して、リシンＡ発現性のクローンｐＩＣＩ１１８５を生成するＴ４転写ターミネーターの供給源を与えた（以下の７．ｄ参照）。プラスミドｐＩＣＩ１０７９を生成する開始点はｐＩＣＩ１０４３である。ｐＩＣＩ１０４３は、λＰL プロモーター及びインターフェロンα２遺伝子（EdgeらのNuc.Acids Res.  １１  ｐ６４１９〜６４３５、１９８３）を含有する表現カセットがＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位の間に存在するｐＩＣＩ００２０（前記３．ａ参照）に基づいたプラスミドである。
【０１４６】
オリゴヌクレオチドの相補対を合成して、５′ＳａｌＩ及び３′ＳｐｈＩ付着端を有するバクテリオファージＴ４の遺伝子３２から転写ターミネーターを生成した。このフラグメントを、ＳａｌＩ及びＳｐｈＩで完成するまで消化させておいたｐＩＣＩ１０４３から単離したプラスミドフラグメントと連結させた。かくして産生した中間体プラスミド（ｐＩＣＩ１０７８）は直列にＴ４ターミネーターとｔｒｐアテニュエーターとの両方の配列を含有した。
【０１４７】
別の一対の相補性オリゴヌクレオチドを次いで使用して、ｐＩＣＩ１０７８のＳｐｈＩ及びＳｔｙＩ部位の間に挿入することによりｔｒｐアテニュエーター配列（及びテトラサイクリン耐性遺伝子の残りの部分）を置換した。特異なＢａｍＨＩ部位をこの合成フラグメント内に導入した。
【０１４８】
これらの操作を図４に概説する。
【０１４９】
6.リシン A発現クローンの生成
6.a) pUC8RA プラスミドDNA の調製
リシン AについてのcDNAを含有するクローン(pUC8RA)を生成させた。このクローンはプラスミドpUC8(Vieira,J 及び Messing,J. Gene, 19 ,p259,1982)中に、リーダー配列中の塩基番号-74 から公表されているcDNA配列 (Lamb,I.F.,Roberts,L.M.,Lord,J.M. Eur.J.Biochem,1985, 148 ,p265-270) に従った、 B鎖内の BamHI部位（塩基番号857)までの A鎖 cDNA を含有している。更に、特定部位の突然変異誘発を使用して、（O'Hare,M等,FEBS Letts,1987, 216 ,p73-78 に報告されるごとき）成熟リシン A(mature ricin A)の最終コドンに 3' で隣接する翻訳停止コドンを生成させた。全 A鎖コード領域はこのクローンからの BamHIフラグメント中に包含されている。
【０１５０】
少量のpUC8RAプラスミドDNA を上記のごとくして得た。別のストックを調製するために、このDNA の稀釈物(dilution)を使用してE.Coli DH5αコンピテント細胞(Hanahan,D,;1983,J.Mol.Biol., 166 ,p557)(Betheda Research Laboratories) を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を選択した。このクローンからのプラスミド DNAをBirnboim-Doly 法(Maniatis,chapter 1,p25)の変法によって調製した。このDNA の試料を BamHIと BanI を使用して別個に消化しついで、アガロースゲル上での電気泳動を行った後、Lord等によって報告されている元のDNA の対応する消化物と比較した。制限パターンに差異は認められず、これに基づいて、２つのDNA 試料は同一であると推定された。
【０１５１】
6.b) M13中へのサブ−クローニング
pUC8RAプラスミドDNA の BamHI消化物(digest)とファージ M13株 K19（Anglian Biotechnology)からのRF( 複製型）DNA を標準的な条件(Maniatis, chapter 1,p68) を使用して" ショットガン" 連結した。対照の連結も行った。連結されたDNA を使用して、CaCl2 法(Maniatis, chapter 1,p82) によってコンピテント(compitent) にせしめたE.Coli株TG1 (Gibson,1984/Anglian) を形質転換させた。
【０１５２】
形質転換頻度(transformation frequence)は効率的な連結が行われたことを示し、組換え体ファージが後代において期待された。組換え体ファージは、lacZ( β−ガラクトシダーゼ）遺伝子の分裂(disruption)のために、IPTG+X-gal(BRL) 含有プレート上に透明プラークを生成させると断定された。野生型(wild type) ファージはβ−ガラクトシダーゼによるX-gal 加水分解のために青色プラークを生成する。
【０１５３】
一本鎖DNA を調製するために種々の透明プラークを採取した。溶解(lysed) ファージ懸濁液の直接ゲル電気泳動により、１個のファージクローンが、配列決定によりリシン A鎖コード配列であると確認されたかなり大きい挿入断片(insert)を含有していることが示された。成熟リシン Aコード配列の182 塩基だけが確認されたが、これは全リシン A遺伝子の存在を示す十分な証拠として採用された。このクローンをM13K19RAと命名した。
【０１５４】
6.c)M13K19RAの突然変異誘発
成熟リシン Aの開始時にpICI発現ベクターと両立し得る KpnI 部位を生成させるためには、下記の変化（下線を付した部分）即ち、配列番号15の配列番号16への変化が必要である：
配列番号 15
0003735379.tif 000004
配列番号 16
0003735379.tif 000005
その結果、 KpnI 部位と重複するATG コドンが得られる。リシンA を含有する   KpnI 部位フラグメントを突然変異体から切取り、ICI 発現ベクター系列に挿入し得る。二つのN-末端アミノ酸修飾が行われる（ ile−phe から met−val への変化）。
【０１５５】
M13K19RAから調製した一本鎖DNA を各突然変異方法(mutation strategy) についての突然変異誘発のための鋳型とした。この突然変異方法についての全ての突然変異的変化(mutational change) を誘導する一本鎖オリゴヌクレオチド、    DTR16 を合成した。
【０１５６】
0003735379.tif 000006
特定部位の突然変異誘発により特定のDNA 配列の変化を誘導するためには種々のプロトコールが存在する。以下で概説する手順は、キットフォーム(kit form)(Amersham International)で提供されるかつ製造業者の指示書に従って使用されるEckstein等の方法(Nuc.Acid Res.,1985,13 ,p 8749-8764 及び1986, 14 ,p 9679-9698)を使用して行った。
【０１５７】
この方法の原理は一本鎖 DNA鋳型を突然変異原性の(mutagenic) オリゴヌクレオチドを用いて初回免疫し(prime) 、dATPの代わりにdATPαS を組込む相補的鎖(complementary strand)を合成することである。このヌクレオチドを使用することにより、ある種の制限酵素 (例えば NciI)によって開裂(cleave)されないホスホロチオエート結合が形成される。第２の鎖の合成の後、 NciI を使用して、親鎖(parent strand) と、突然変異点(mutation point)を越えて消化復帰 (digest back)を行うために添加されたエキソヌクレアーゼ IIIとに切れ目を付ける(nick)。ついで DNAポリメラーゼ Iにより親鎖を再合成する。従って、突然変異原性オリゴヌクレオチドは再合成のための鋳型としての働きを行い、突然変異は形質転換の前に両者の鎖中に導入される。全後代の96 %までの突然変異頻度(mutation frequency)が認められ、スクリーニングは単に配列分析(sequence analysis) のために無作為的にプラークを採取することによって行った。
【０１５８】
本発明者等の行った実験においては、採取された４個のプラークからの４個が正しく突然変異を生じた(mutate)。
【０１５９】
１個の突然変異体を選択して、RF DNAを調製し、新たに生じた制限フラグメント、即ち、 KpnI の存在を検査した。
【０１６０】
6.d)クローニング、発現及び初期特性表示(initial characterisation)
pICI系列の発現ベクター（前記 3) 参照）は Trpプロモーターに隣接するユニーク(unique) Kpn I制限部位中にクローンされたDNA フラグメントを受容し得る。 Kpn I制限部位は Trpプロモーターのシャイン−ダルガルノ部位(Shine-Dalgarno site) (AGGA)から 8bp下流に位置する翻訳開始コドン(ATG) と重複する。
【０１６１】
MRA16 の配列を確認した後、大規模の(5μg RF DNA以上)  Kpn Iによる消化を行い、適切な(relevant)リシン Aコード DNAフラグメントを、製造業者のプロトコールに従って切徐ゲルスライス(excised gel slice) のフェノール抽出を行うことによって、アガロースゲル(Nu-sieve GTG アガロース、Bio-product)から単離した。
【０１６２】
pICI10020（3）参照）をKpn Iにより消化しついでウシ腸内アルカリ性ホスファターゼ（CIP−Boehringor Mannheim）を使用して脱リン酸（dephosphorylate）を行った。後者の処理を行うことによって、連結（ligation）の際に形質転換後代（transformation progeny）中に高い割合の親（parental）をもたらすベクターの再環化（recircularisation）が防止される。
連結は種々の方法について8:1〜1:3（v／v）のプラスミドベクター: 単離フラグメントの比率を使用して開始した。ホスファターゼ処理の効率、リガーゼ活性等を試験するために対照連結試験も行った。連結条件は使用したT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs又はAmersham）の供給源について適当なものであった。反応混合物は、通常、15℃で一夜インキュベートした。
【０１６３】
各連結混合物(5μl)の50% を 1xTNE(50mM Tris,50mM NaCl,1mM EDTA)により
100 μl に稀釈し、200 μl のコンピテントE.coli DS410を添加した。標準的な形質転換プロトコール(Maniatis, chapter 1,p74) を行った後、細胞をストレプトマイシン(25 μg/ml) 及びアンピシリン(100μg/ml) を含有する Lアガー上に載せそして37℃で一夜インキュベートした。
【０１６４】
インキュベーションを行った後、形質転換プレートを試験した。一般的には、リガーゼを使用しない対照と比較して、5 〜10倍多いコロニーが連結物中に認められた。ある場合には、リガーゼを存在させた場合と存在させない場合とでは、生成したコロニーの数に僅かな差異が生じ、これはベクターの消化が不完全なこと又はリガーゼの活性が不良なことを示している。
【０１６５】
形質転換細胞と関連対照物とを Lアガー上に載せたニトロセルロースフィルター上に載せ、(Maniatis,chapter 1 ,p98に記載される Grunstein及びHogness の方法に従って) ハイブリダイゼーションスクリーニング(hybridisation screening) を行った。インキュベーションの後、10% SDS 及び1M NaOH を使用してその場で溶解し(lyse), 1M Tris (pH 7.5)を使用して中和しついで80℃で2 時間、真空下で乾燥した。
【０１６６】
T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して突然変異オリゴヌクレオチドを32P 標識する( 32P labelling)ことによりハイブリダイゼーションプローブを形成した。フィルターを室温でプローブし、55〜65℃まで数段階で洗浄して、非特異的に結合した連結物(count) を除去しついでオートラジオグラフィーで測定した。特定のハイブリダイゼーションはリシン A DNAを含有する想定的(putative)クローン（リシン A DNAを含有するクローン考えられるもの）を示した。
【０１６７】
正に（positively）ハイブリダイズしているクローンから、（Maniatis, chapter 1, p25に記載されるHolmes及びQuigleyの方法又はBirnboim-Dolyの方法によって）少規模のDNAを調製した。このDNAを適切な制限酵素、例えば、KpnI及びRcoRI/BglIIを使用して消化しついでアガロースゲル上での電気泳動により分析した。ベクターDNAと突然変異RF DNAを同一の制限酵素で切断して、適正なクローンについて期待されるフラグメントサイズを示した。
【０１６８】
各クローンについての、より大規模のプラスミド DNAを調製し(Birnboim-Doly) 、制限酵素、例えば ClaI,Hind III,    BamHI,  RcoRI/ BglII 、 KpnI 及び ScaI を使用して、より詳細な制限分析を行った。アガロースゲル上では、これらの消化物は挿入されたフラグメントのサイズ、その配列（orientation)の指示(indication)及びリシン A鎖遺伝子に対して特有の制限酵素部位の増加（gain) を示した。
【０１６９】
6.e)発現試験 (expression study) 
ハイブリダイゼーションと制限スクリーニングにより正に同定されたクローンを全細胞ライゼート(lysate)のSDS-PAGE分析によりリシン Aの発現について試験した。発現試験についての標準的な条件は下記の通りであった：
1)L-ブロス(L-broth)10ml+抗生物質に単一コロニーを接種し、穏やかに振盪しながら37℃で一夜生長させる。
【０１７０】
2)750 μl のL-ブロスを採取し、マイクロフュージ(microfuge) 内でペレット化する( 6500rpm で1 分間）。
【０１７１】
3)ペレットを300 μl の M9 メジウム(Maniatis,補遺( appendix) A.3)+0.02%のカゼイン加水分解物+0.2% のグルコース+ 50μg/mlのチアミン中に再懸濁させそして上記のもの10ml中に接種する。
【０１７２】
4)穏やかに振盪しながら37℃で 7時間又は一夜インキュベートする。
【０１７３】
5)インキュベートした後、OD540 を測定し、細胞をペレット化しついで、水に懸濁させた場合には10のOD540 を与える容量(Maniatis,chapter 18,p53) に均等な、ある容量のラエミリ試料緩衝液(Laemmili sample buffer)中に再懸濁させる。15分間沸騰させる。
【０１７４】
6)SDS ポリアクリルアミドゲル上に 20 μl の全細胞ライゼートを載せ、電気泳動させ、クーマシーブルーで染色し、再度、脱色し(destain) 、可視状態にする。
【０１７５】
SDS-PAGEにより分析したクローンの内、１個のクローンだけが( 非グリコシル化成熟リシン Aについて評価されたものに等しい）29KD以上の近似等量分子量（approximate equivalent molecular weight)についての追加的なバンドを示した。ゲルスキャン(gel scan)は蓄積水準(accumulation level)が全細胞タンパク質の5 〜10% の範囲にあることを示した。このクローン中のプラスミドをpIC I1102 と命名した。
【０１７６】
pICI 1102 の構造は図 5に示されている。発現試験の結果は図 6及び 7に示されている。
【０１７７】
6.f)組換え体リシン Aのウエスタンブロッテイング(western transfer)及び免疫検出(immunodetection) 
SDS-ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色することによって当初に観察される組換え体リシン Aプロテインの信頼性(authenticity)を、ウエスタンブロッテイングにより確認した。プロテインバンド(protein band)をニトロセルロースフィルターに移し、ついでリシン A特異的抗体およびついでペルオキシダーゼ標識抗グロブリン(peroxidase labelled antigulobulin) を使用して検出した。
【０１７８】
15% SDS-PAGEゲルを一夜 8mAで操作しついで少なくとも30分間トランスファー緩衝液(transfer buffer) 中で平衡化した。
【０１７９】
ついで、ゲル上のプロテインバンドをビオ−ラド  トランス  ブロット装置
(Bio-Rad Trans Blot apparatus)中で、70V で 3時間、電気泳動的にニトロセルロース膜(Hybond-C,Amersham) に移行させた。フィルターは、乾燥後、密閉したプラスチック袋内に-20 ℃で貯蔵することができた。
【０１８０】
リシン A.1はリシン Aの合成ペプチドフラグメントに対してウサギ中で生ずるポリクロナール抗体である。予備的試験においてはリシン Aに対して良好な親和性を有するが、E.Coliプロテインとのかなりの交差反応性を有することが示された。この交差反応性によって生ずる重大な問題を解決するために、この抗体を
E.Coliライゼートと共にプレ−インキュベート(pre-incubate)した。
【０１８１】
即ち、L-ブロス内で一夜培養したE.Coli株 DS410 10ml を4000rpm で10分間遠心分離して細胞をペレット化した。このペレットを 5mlの細菌緩衝液(bacterial buffer)に再懸濁させついで氷上での30秒間の冷却を行いながら、4 〜6 μで10秒間の超音波処理(sonicate)を6 回行った。
【０１８２】
ついで 0.5mlの超音波処理液(sonicate)を0.5ml のリシン A.1抗血清と混合し、室温で 90 分間インキュベートした。細胞破壊物 (cell debris)を1300rpm で 5分間遠心分離し、上澄液を-20 ℃で貯蔵した。
【０１８３】
ウエスタンブロッテイングからのニトロセルロースフィルターを 5% BSA-PBS/ツイーン(tween) 中で室温で一夜インクベーションすることによりブロックした。( PBS/ツイーン＝PBS 1 リッター当り、ツイーン 5ml) 。
【０１８４】
PBS/ツイーン中で、3 回、各々、3 分間洗浄した。
【０１８５】
" ブロックされた" リシン A.1抗体を、0.5% BSA-PBS/ ツイーンにより1/4000にした稀釈物と共に 2時間（又は一夜）インキュベートした。
【０１８６】
" ブロックされた" リシン A.1抗体を0.5% BSA-PBS/ ツイーンにより稀釈した。
PBS/ツイーン中で、3 回、各々、3 分間洗浄した。
【０１８７】
ヤギ抗ウサギ血清(goat anti rabbit serum)を、0.5% BSA-PBS/ ツイーンにより1/1000に稀釈した稀釈物と共に室温で 1時間，インキュベートした。
【０１８８】
PBS/ツイーン中で、3 回、各々、3 分間洗浄した。
【０１８９】
ウサギペルオキシダーゼ  抗ペルオキシダーゼ血清を、0.5% BSA-PBS/ ツイーンにより 1/5000 に稀釈した稀釈物と共に室温で 1時間、インキュベートした。
PBS/ツイーン中で、3 回、各々、3 分間洗浄した。
【０１９０】
4-クロルナフトール(60mg)のメタノール20ml中の溶液をPBS で 120mlにしたかつ12μl の過酸化水素を含有する溶液に浸漬して展開(develop) させた。バンドが見えるようになった直後に膜を取出し、乾燥しついで写真を撮影した。
【０１９１】
典型的なウェスタン・ブロット分析を図８に示す。
【０１９２】
6.g)組換え(recombinant) リシンＡ蛋白質の生物学的検定
この目的は、無細胞(cell-free) 試験管内蛋白質合成の検定における生物学的活性についてr-リシンＡを試験する実験系を確立することであった。
【０１９３】
ウサギの網状赤血球溶解物(lysates) を、Allen とSchweet の方法〔J. Biol. Chem.,237,760-767(1962)〕に従って調製した。この検定は、無細胞系における蛋白質合成阻害を、新たに合成された蛋白質中に14Ｃ- 標識したロイシンの取り込みがないことにより例証するものである。
【０１９４】
6.g.i)検定方法
貯蔵溶液：ロイシン以外のアミノ酸混合１mM
ロイシン以外の全てのL-アミノ酸1mM を含有する溶液（NaOHを用いてpH7.4 に調整し、−70℃で保存した）
溶液Ａ：酢酸マグネシウム40mM；酢酸アンモニウム２M ；トリス(Tris)緩衝液0.2M(HClでpH7.4 に調整し、４℃で保存した）
溶液Ｂ：ATP(Sigma A5394) 246mg/ml; GTP(Sigma G8752) 24.4mg/ml
検定混合物：アミノ酸混合物１ml；溶液Ａ 1 ml ；溶液Ｂ 0.1ml；燐酸クレアチン 103mg；クレアチンキナーゼ１mg；水 510μリットル；L-14C-ロイシン(New England Nuclear、NEC-279E)  600μリットル（60μCi)
反応混合物；供試試料25μリットル；検定混合物12.5μリットル；ウサギ網状赤血球溶解物25μリットル
ブランク(blank) 溶液はPBS に溶解したBSA 2mg/mlであった。
【０１９５】
検定は全て二重反復して(in duplicate)行った。
検定混合物12.5μリットルを滅菌ガラス管にいれ、その最初のガラス管４本それぞれにはブランク用としてPBS に溶解したBSA 25μリットルを加え、残りのガラス管には供試試料25μリットルを加え、その最初のガラス管２本に0.1M KOH   1mlを加えた（バックグランド・ブランク）。これらのガラス管を水浴中で28℃に平衡化し、各々のガラス管にウサギ網状赤血球溶解物（液体窒素温度からそのままにして溶かしたもの）25μリットルを20秒間隔で加えた。その最初のガラス管１本を12分間インキュベートした際に、各ガラス管に0.1M KOH 1mlを再度20秒間隔で加えてガラス管全部をそのまま12分間インキュベートした。各ガラス管に20％過酸化水素２滴を加え、次いで20％TCA １mlを加えた。これらのガラス管を混合し、次いで４℃で少なくとも１時間又は１夜放置しておいた。得られた沈殿物を2.5cm GFC(ゲル濾過クロマトグラフィー）ディスク(disc)上で濾過し、５％TCA ４mlで３回洗浄し、シンチレーション用バイアル管(vial)に移し、次いでシンチラント(scintillant)(Ready-Solv.MP 、Beckman 製）10mlを加えた。１時間後に、上記バイアル管を振盪し、シンチレーションを数えた。
【０１９６】
6.g.ii) 大腸菌溶解物と共に使用する方法の確立
10ml L- ブロス培養菌液(culture) を、37℃で１夜増殖させた。その部分試料(aliquot) 400 μリットルを13000rpmで30秒間ペレット化し、上清の大部分を廃棄した。
【０１９７】
得られたペレットを、ドライアイス／エタノール中で急速凍結し次いで37℃で溶解させ、このサイクルをもう一度繰り返した。トリスHCl 緩衝液(pH8.0) 50mMに溶解した25％蔗糖液12μリットルを加え、次いでリゾチームの10mg/ml 溶液４μリットルを加えた。
【０１９８】
氷上で15分間インキュベートした後に、0.25M EDTA 8μリットルを加え、インキュベーションを15分間続けた。該試料を水で 400μリットルまで希釈することにより、溶菌を浸透的に(osmotically) 生じさせた。この操作により１ml当たりの80〜100 個の生存細胞数が得られた。
【０１９９】
この溶菌液の部分試料25μリットルを前記の検定用反応混合物に加えた場合には、新たに合成された蛋白質中に取り込まれた14C-ロイシンの量(level) は、溶菌液が存在しない場合の上記ブランクの10％以上であった。これはリシンＡ 8ng/ml により生成されたものと同様の合成阻害(inhibition)のレベルであった。次いで、大腸菌溶菌液の希釈液を調製し、検定を反復した。得られた結果により、該大腸菌溶菌液の効果を、上記ブランクの同等の効果まで低下させるには最少限度16倍希釈が必要であることが明確に示された。
【０２００】
大腸菌の溶菌及び大腸菌溶菌液がリシンＡの毒性を低下させない(not compromise)ことをできる限り確信することを目的として、２つの対照検定を行った。最初の検定は、細胞溶解後の検定混合物において8ng/mlの最終濃度が得られるように、16倍希釈した大腸菌ペレットに植物由来のリシンＡを加えた。これらの両方の対照試験(controls)により、リシンＡの阻害作用に対して溶菌液又は溶菌操作により悪い影響を受けないことが明らかにされた。
【０２０１】
これらの方法を使用してプラスミドpICI 1102 及び後記のクローンからの生物学的に活性な組換えリシンＡの合成を実証した。
【０２０２】
6.h) DNA配列分析
プラスミドDNA 配列決定法を使用してプラスミドpICI 1102 を分析した。選択した方法はZagurskyらの方法(Gene Analysis Techniques,Vol.2,No.5) を改変したものであり、二本鎖プラスミドDNA をアルカリ変成し、その後に標準的方法例えばいくつかの供給者からキット(kit) の形態で提供されている方法例えばSequenase(United States Bioscience製）によりアニリーニングを開始させ、次いで配列決定することを伴うものである。オリゴヌクレチドを使用してβ- ラクタマーゼ(lactamase) 及びいくつかのＡ- 鎖内部プライマーの３´末端で開始させることにより、プロモーター及びリシンＡ遺伝子の両方の鎖の配列決定が可能であった。
【０２０３】
最初の配列決定データにより、付加的 KpnＩ断片がプロモーターとリシンＡコード配列、すなわち下記の配列（配列番号20）：
0003735379.tif 000007
との間に存在するという予期しない結果を示された。
【０２０４】
付加的 KpnＩ断片は、M13K19RAから生じており、しかも制限酵素部位とプラスミドpUC8RAからクローン化されたリシン・リーダー配列の部分とを含む。リシンＡ鎖の５´領域は突然変異誘発中に誘導された塩基変化を含む。
【０２０５】
この配列についての研究により、最初の翻訳開始コドン(ATG) は、リシンＡコドン領域をもつ枠の範囲外である(out of frame with that the ricin A coding region)。また、リシンＡ翻訳開始コドンと、２番目のATG から翻訳を再開できるシャイン・ダルガノ配列(AGGA)と考えられる配列との前に、枠内終始コドン(TAG) が存在する。
【０２０６】
次後の(subsequent)研究により、意外にもこの付加的DNA 断片が、該断片が切除されているクローンと比較した場合に、大腸菌中のリシンＡ鎖の蓄積の量(level) について有益な利点を与えることが明らかにされた。
【０２０７】
プラスミドpICI 1102 中に含まれているリシンＡの完全なDNA 配列を図９と図10とにわたって一つの配列（配列番号18）として示す。
【０２０８】
7. 次後のリシンＡ発現クローンの生成
7.a）サブクローニングを可能にするリシンＡクローンpICI 1102の突然変異
リシンＡの発現に関する正しい配向（Orientation）をもって偶然に生成したプラスミドpICI 1102から、前記の２個のKpnI断片をサブクローン化することは困難である。従って、本発明者らは、配列内のKpn I認識部位を、１個の塩基を置換する（ＡをＴに）ことにより改変することを意図した。この改変により、この部位でのKpn Iによる切断が防がれ、しかも１個のKpnI断片をpICI発現ベクターの領域中にサブクローニングすることが可能になる。上記のKpnI認識部位のアデニン（GGTACC）をチミンで置換する（すなわちGGTTCCに）ことにより、リシンＡの第１の残基（residue）は改変されない（GTA／GTT＝Val）。
【０２０９】
すなわち、下記の配列：
0003735379.tif 000008
を下記の配列：
0003735379.tif 000009
に改変した。
【０２１０】
この変化を生じさせるために合成したオリゴヌクレオチドは下記の配列〔配列番号(SEQ. ID. NO.)19〕
0003735379.tif 000010
を有する。
上記配列中の下線を付した塩基は突然変異(mutational)変化を表わす。
【０２１１】
本発明者らは、上記の突然変異させたリシンＡ断片を発現の比較研究を目的としてtrp 発現ベクターの領域中にクローン化することを意図した。プラスミド  pICI 0020 中にクローン化することによって、プラスミドpICI 1102 と比較して、もしあるならば上記の１個の塩基置換による発現に対する影響を決定することができる。
【０２１２】
7.b)突然変異誘発
突然変異誘発用の鋳型はMRA 16であり、これはプラスミドpICI 1102 中に存在する２個の KpnＩ断片を含有するＭ13クローンである。突然変異誘発後に、所望の突然変異を保持している分離体(isolates)を、無作為標本抽出し（ランダムサンプリング）し、突然変異原性オリゴヌクレオチドが特異的に結合する領域についてDNA 配列を決定することにより同定した。
【０２１３】
突然変異させた鋳型をMRA 22と命名した。これを、さらにリシンＡコード配列(coding sequence) 全体のDNA 配列を決定することにより分析して、非特異的な突然変異が存在しないことが正しいことを確認した。
【０２１４】
7.c)サブクローニング
突然変異させた複数個の一本鎖DNA をコンピテント大腸菌TG１細胞中に形質転換させて単一の(single)プラークを生成させた。次いで、個々のプラークを選び取り、複製型（RFという, 二本鎖)DNAを塩化セシウム／エチジウムブロミド浮遊密度勾配法でバンドを作らせること(banding) により精製した。精製したRF DNAを制限酵素 KpnＩで完全に消化した。クローニングは、消化したRF DNAと、 KpnＩ切断しホスファターゼ化した(phosphatased)適当な発現ベクターとの“ショットガン(shotgun) ”連結反応によるか、又はアガロースゲルから精製した後のリシンＡ断片の特異的連結反応により達成された。連結したDNA を大腸菌TG 1又はHB 101中に形質転換させた。
【０２１５】
リシンＡ含有クローン類を、別のリシンＡ含有クローン(pICI 1121) から単離した１個の KpnＩ断片をランダム・ヘキサヌクレオチドプライミング（priming)することによって生成させた32Ｐ標識リシンＡプローブを使用してハイブリダイゼーションスクリーニングにより同定した。陽性のハイブリッド形成を示すコロニーを、制限酵素 KpnＩ単一消化と、制限酵素EcoRＩ／Bgl IIによる二重消化とを使用してプラスミドDNA を制限分析することによってさらに選別した。挿入された断片の大きさ(size)は KpnＩにより同定され、断片の配向(orientation) はEcoRＩ／Bgl IIにより決定される。
【０２１６】
発現に関する正しい配向をもったリシンＡ断片を有することが確認された複数のクローンを、SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム- ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により分析し、次いで二重反復(duplicate）ゲルのクーマシー染色及びウェスタン・ブロッティングにより分析した。これらのクローン類のリシンＡ蓄積の量(level）は、プラスミドpICI 1102 から検出された量に相当する。
【０２１７】
１つの分離体(isolate）を選別し、このプラスミドをpICI 1131 と命名した。
【０２１８】
7.d)別の転写ターミネーター要素の使用
転写ターミネーター要素(element) は、RNA ポリメラーゼ活性を停止させるのに関連する(involve in halting)mRNAの３´末端において二次構造を生成する。この二次構造の安定性は、mRNAを３´末端におけるエキソヌクレアーゼの攻撃から保護することにより蛋白質の蓄積を改善できる。Ｔ4 転写ターミネーターは、先のリシンＡ組立て体の全てに存在する trpアテニュエーター(attenuator)の構造よりも強い二次構造をもつと考えられる。
【０２１９】
これらの実験においては、プラスミドpICI 1131 から trpプロモーターとリシンＡ断片とを、制限酵素EcoRＩと SalＩとで消化することにより切り取った(excised) 。制限酵素 SalＩは、リシンＡコード配列の３´末端とtrp A 転写ターミネーターとの間を切断する。得られた断片を、アガロースゲル（2% NuSieve GTG Agarose、FMC Bioproducts 製）から切り取り、フェノール抽出し、次いでクロロホルム抽出し、その後にエタノール沈殿させることにより精製した。精製した断片を、制限酵素EcoRＩと SalＩとを用いて切断したプラスミドpICI 1079 に連結した。このプラスミドpICI 1079 は、唯一の SalＩ認識部位と SphＩ認識部位との間にＴ4 転写ターミネーターを含む（5.c 参照）。
【０２２０】
連結したDNA をコンピテント大腸菌HB 101(BRL) 中に形質転換し、先の実験におけるようにハイブリダイゼーションスクリーニングを使用してリシンＡの存在を検出した。陽性のハイブリッドを形成する(positively hybridising)クローンを、プラスミドDNA の調製、次後の適当な大きさに分けた断片の存在を明らかにするために制限酵素EcoRＩとSal Ｉとを一緒に用いる制限分析用に選択した。
【０２２１】
正しい組み立て(construction)をもつ１つの分離体を同定し、プラスミドpICI 1185 と命名した。
【０２２２】
7.e)別のプラスミド・バックグランド(background)の使用
プラスミドpICI 1185 を使用して、発現カセットをプラスミドpICI 0042 中にサブクローニングすることにより、別の組立て体を生成させた。プラスミドDNA をプラスミドpICI 1185 から調製し、制限酵素EcoRＩと SalＩとを一緒に用いて消化して trpプロモーター／RBS 1 ／リシンＡ(MRA 22)断片／Ｔ4 ターミネーターを含む発現カセットを切り取った。この断片を4.d に概説した方法で単離し、EcoRＩと SphＩとを用いて切断したプラスミドpICI 0042 に連結した。
【０２２３】
連結したDNA をコンピテント大腸菌HB 101中に形質転換し、37℃で１夜インキュベートした。HB 101形質転換体を、テトラサイクリンを加えたＬ寒天上に置いて、32Ｐ標識したリシンＡ DNAプローブを用いてハイブリダイゼーションすることによりコロニーを選別した。
【０２２４】
上記両方の場合において、陽性と同定されたコロニーを、制限酵素EcoRＩ／   SphＩ消化と制限酵素EcoRＩ／Bgl II消化とを使用してプラスミドDNA を制限分析することにより確認した。
【０２２５】
図11にプラスミドpICI 1185 とpICI 1187 の組み立てを概説する。
【０２２６】
7.f)クローンの選別
単離した上記の複数のプラスミドを大腸菌71.18 〔Gronenborn, B.の論文；「Mol. Gen. Genet.」,148,243-259(1976)〕中に形質転換し、単一のコロニーをクローン選別研究用に選び取った。得られた細胞溶解液全部を二重反復(duplicate)SDS-PAGE ゲル上で電気泳動させ、そのうちの１枚をクーマシー・ブルーで染色し、他の１枚をウェスタン・ブロット分析に使用した。
【０２２７】
染色したゲルにより、大腸菌71.18 から一緒に移入する(co-migrating)蛋白質の存在に基づいて(due to)リシンＡ発現に関する最小限度のデータが得られた。ウェスタン・ブロッティングにより、陽性対照試料及び陰性対照試料との比較においてリシンＡの発現が明確に示された。１つの単離体を方法スケールアップ用の発酵研究群に提供した。
【０２２８】
r-リシンＡ発酵
(a) プラスミドpICI 1187 を大腸菌株DS410(本明細書ではMSD68 ともいう）中に形質転換し、次いで得られた組換え体(MSD 1051)を精製し、−80℃でグリセロール貯蔵庫(stocks)に保存した。
【０２２９】
培養液の部分試料を貯蔵物から取り出し、L-テトラサイクリンの寒天板上に画線し、37℃で１夜増殖させた後に単一のコロニーを分離した。組換え体MSD 1051の単一コロニーを取り出し、L-テトラサイクリン・ブロス10mlに再懸濁し、直ちにその100 μリットルを、L-テトラサイクリン・ブロス75mlを入れた 250mlエルレンマイヤーフラスコ10個の各々に接種した。往復振盪機上で37℃で16時間増殖させた後に、各フラスコの内容物をプールし、これを使用して、下記の組成をもつ改良(modified)LCM 50増殖培地20リットルを入れた発酵槽に接種した。
【０２３０】
改良LCM 50増殖培地の組成は次の通りである。
0003735379.tif 000011
【０２３１】
次いで、発酵を温度37℃、pH6.7(6M  水酸化ナトリウム溶液を自動添加することにより調整した）で行った。溶存酸素電圧(tension)(dOT)設定値は、50％空気飽和であり、発酵槽攪拌速度を自動調整することにより制御した。発酵槽への通気量は、最初は20リットル／分〔１分当たりの容量当たり１容量(VVM) に相当する〕であり、発酵槽攪拌速度がその最大値の80〜90％に近くなった時に該通気量を45リットル／分に増加させた。
【０２３２】
発酵中は、光学濃度（OD550 ）、細胞乾燥重量及び細胞中のリシンＡの蓄積量の測定用として試料を採取した。リシンＡの蓄積量は、当業者に周知であるように、試料採取した細菌の細胞溶解物全部のクーマシー・ブルー染色したSDS-PAGEゲルを走査する(scanning)ことにより測定した。
【０２３３】
接種後4.5 時間から、発酵槽に酵母エキス(Difco社製）溶液(225g/リットル) を1.7g／リットル／時間の量でポンプで供給した。
【０２３４】
12時間後すなわちOD550 値が約50に達した後で、しかも発酵が酸素がわずかになる(become oxygen-limited) 前に、細菌をSorval RC3B 遠心分離機（7000g 、30分、４゜）で収穫し、次いで該細菌から蓄積した蛋白質を回収した。
【０２３５】
(b) プラスミドpICI 1187 を大腸菌株DS410(本明細書ではMSD68 ともいう）中に形質転換し、次いで得られた組換え体(MSD 1051)を精製し、−80℃でグリセロール貯蔵庫上で保存した。
【０２３６】
培養液の部分試料(100μリットル）を取り出し、直ちにL-テトラサイクリン・ブロス 600mlを入れた２リットル容エルレンマイヤーフラスコに接種した。往復振盪機で37℃で16時間増殖させた後に、各フラスコの内容物を使用して下記の組成をもつ増殖培地を入れた発酵槽に接種した。
【０２３７】
増殖培地の組成は次の通りである。
0003735379.tif 000012
【０２３８】
発酵は温度37℃で行った。pHが接種後10時間まではpH6.7 に、その後はpH6.0 に制御されるように2M  硫酸と 6M 水酸化ナトリウム溶液を自動添加することにより、pHを制御した。
【０２３９】
溶存酸素電圧(dOT) 設定値は、50％空気飽和であり、最初は発酵槽攪拌速度を自動調整することにより制御した。発酵槽への通気量は最初は、20リットル／分〔１分当たりの容量当たり１容量(VVM) に相当する〕であり、これを発酵槽攪拌速度がその最大値（１分当たり1000回転）に達した時に手動で45リットル／分に増加させた。発酵槽への通気量は、発酵の終りの段階(the later stages)近くに攪拌速度が１分当たり約500 回転まで自動的に低下してしまった時には、手動で20リットル／分に戻した。発酵を23時間行いその間中、光学濃度（OD550 ）、細胞乾燥重量並びに細胞中のリシンＡの蓄積量及び割合(partitioning)について測定するために試料を採取した。リシンＡの蓄積量は、当業者に周知のようにして試料採取した細菌の細胞溶解物全部のクーマシー・ブルー染色したSDS-PAGEゲルを走査することにより測定した。細胞の細胞質体（可溶性）画分及び封入体（不溶性）画分におけるリシンＡの割合(partitioning)は、当業者に周知のようにして試料採取した細菌を超音波処理溶解に供することにより測定した。
【０２４０】
接種後4.5 時間から、発酵槽に酵母エキス溶液(225g/リットル) を1.7g／リットル／時間の量でポンプ供給した。
【０２４１】
発酵において炭素源が消費された（すなわちdOT 値が50％空気飽和から急速な上昇をもたらす）場合には、グリセロール(714g/リットル) と硫酸アンモニウム(143g/リットル) を含有する供給材料を、細菌の最大炭素要求量を満たすのに十分な量で発酵槽にポンプ供給した。次いで、炭素源及び硫酸アンモニウムの供給速度は、その後の発酵(the rest of fermentation)の間は変化させないでそのままにしておいた。
【０２４２】
23時間後に、発酵により発酵ブロス 1リットル当たり可溶性リシンＡ約1500mgが得られた。
【０２４３】
注：１．大腸菌DS410(本明細書ではMSD68 ともいう）は周知である〔DouganとSherrattの論文「Molecular and Genaral Genetics」,151,151-160(1977)〕。この菌株は、公的に自由に入手でき、さらに本出願人により1985年６月７日付けでブダペスト条約のもとにスコットランド、アバディーン(Aberdeen)のザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド(the National Collections of Industrial & Marine Bacteria Ltd)に寄託番号12100 として寄託されてある。
【０２４４】
注２．微量元素溶液(TES) 
TES は下記の組成をもつ。
0003735379.tif 000013
【０２４５】
大腸菌からのr-リシンＡの精製
最適培養条件下では、r-リシンＡは可溶性の細胞質蛋白質として蓄積する。この蛋白質は、r-リシンＡの安定性を助長する緩衝液中で細胞を破壊する（ホモジナイゼーション）ことによって回収される。この単一操作は、生成物の溶液安定性を確実にするために収穫時の生細胞について行われる。r-リシンＡは、ホモジネートから固形物（細胞砕片）を遠心分離により除去することによって回収される。この操作をスケールアップするために、抽出物中に存在する核酸の塊(bulk)をも沈殿させる薬剤〔ポリテン(polythene) イミン〕を用いて、細胞砕片を凝集させた。次いで遠心分離上清を滅菌濾過し、十字流(cross flow)濾過により濃縮し、硫酸アンモニウムを用いて蛋白質を沈殿させた。硫酸アンモニウム沈殿物を−70℃で冷凍保存した。
【０２４６】
r-リシンＡは、多くの他の大腸菌蛋白質の等電点よりも十分に高い7.3 の等電点をもつ。従って、生成物はイオン交換クロマトグラフィーにより都合よく精製し得る。回収工程及びクロマトグラフィー工程の全ては、r-リシンＡ安定性を助長する条件下：すなわち温度＜15℃、還元状態で遊離のチオールを保持するためのジチオトレイトールと、空気酸化及び蛋白質分解を低減させるためのEDTAとの存在下で行った。
【０２４７】
r-リシンＡの回収
連続的にディスクを積み重ねた間欠吐出式分離機(continuous disc stack intermittent discharge separator)を使用して発酵ブロスから細胞を回収した。このブロス(25 リットル発酵を２回行うことにより得た50リットル）を最初に発酵槽から50リットル容トランドル(trundle) タンクに移し、分離機及び高圧ホモジナイザーに連結された多数の保持(holding) タンクからなる収容系（contained system) に移送した。この収容系にトランドルタンクを連結し、上記ブロスを40リットル／時間の流量で遠心分離機にポンプで通送した。吐出速度は、上清吐出管(line)における覗きガラス(an eyeglass) の目視検査により遠心分離上清が透明であるように調整した。遠心分離機からの固体排出物（細胞類）を適当な容器に集め、緩衝液Ａら〔オルト燐酸二水素ナトリウム50mM；エチレンジアミン四酢酸25mM；ベンズアミジン５mM；ジチオトレイトール２mM；pH6.3(５N 水酸化ナトリウムによる）〕 40 リットル中に再懸濁し、次いで固体受器中で８℃まで予備冷却した。次いで、懸濁した細胞を作動圧 600バールに調整されたホモジナイザーを経由してトランドルタンクに戻した。得られたホモジネート（60リットル）を＜20℃に冷却し、次いでポリテンイミンについて10％（容量／容量）溶液 2.5リットルを添加することにより0.5 ％濃度に調整した。この懸濁液をそのまま10分間凝集させた後に、遠心分離機を経由させて保持タンクに移送した。次いで、透明な上清を集め、厚い濾紙(depth filter)及び正に荷電した 0.2μの濾過膜を通して精製することにより滅菌した。
【０２４８】
硫安沈殿
滅菌清澄化した上清をスパイラルカートリッジ式(spiral cartridge)十字流濾過装置を使用して容量12リットルまで濃縮し、得られた溶液を固体硫酸アンモニウムの結晶2.9kg を加えることにより40％飽和にした。この溶液を、15℃で１夜穏やかに攪拌することにより凝集させ、次いで遠心分離した。放出されたスラリーを集め、他の操作に必要とするまで−70℃で保存した。
【０２４９】
再可溶化及び脱塩
上記の硫安沈殿物を緩衝液Ｂ〔オルト燐酸二水素ナトリウム50mM；エチレンジアミン四酢酸25mM；ジチオトレイトール２mM；pH6.3(５N 水酸化ナトリウムで調整した）〕14リットルの存在下で溶解させた。30分後に、得られた懸濁物を遠心分離することにより清澄化し、緩衝液Ｂ 70 リットルに対してダイアフィルトレーション(diafiltration) により脱塩し、その導電率を導電率が３mS/cm まで低下していることを調べて確認した。脱塩した溶液を遠心分離によりさらに清澄化し、直ちに加工処理した（processed)。
【０２５０】
陰イオン交換クロマトグラフィー
上記の脱塩溶液を、緩衝液Ｂ 60 リットルで予め平衡化させてあるDEAE- セルロース２kgを入れたバッチ（batch ）クロマトグラフィータンクに、徐々に加えた。6.5 時間攪拌した後に、未結合r-リシンＡを上記タンクの底から、DEAE- セルロースを充填し平衡化したカラム（直径11.3cm×10cm）に80ml／分の流量でポンプ供給した。r-リシンＡの本体〔バルク(bulk)ともいう〕は結合せず、ステンレススチール製容器に集められた。
【０２５１】
陽イオン交換クロマトグラフィー
得られたr-リシンＡ溶液を１M オルト燐酸を用いてpH5.5 に調整し、緩衝液Ｃ〔オルト燐酸二水素ナトリウム25mM；エチレンジアミン四酢酸５mM；ジチオトレイトール２mM；pH5.5(５N 水酸化ナトリウムで調整した）〕 10 リットルで平衡化したカルボキシメチルアガロースのカラム（直径10cm×10cm）に供給した。このカラムに結合したr-リシンＡを、緩衝液Ｃ 10 リットルで洗浄した後に、緩衝液Ｄ〔オルト燐酸二水素ナトリウム25mM；エチレンジアミン四酢酸５mM；ジチオトレイトール２mM；塩化ナトリウム100mM ；pH5.5(５N 水酸化ナトリウムで調整した）〕で溶出した。単一ピークとして溶離された純粋なr-リシンＡを採取し、他の操作に必要とするまで凍結滅菌溶液として−70℃で保存した。r-リシンＡはこれらの条件下では最大１年間は安定である。
【０２５２】
使用した装置は下記の通りである。
陰イオン交換体：DE-52 、DEAE- セルロース（Whatman Biochemicals製）
陽イオン交換体：CM／セファロース（Pharmacia 製）
遠心分離機：Westphalia CSA-1ディスクスタック(disc stack)遠心分離機(Westp            halia 製）
ホモジナイザー：APV-Schorder Lab 60/60ホモジナイザー(APV製）
濾過機：AMI 0057P Depth 濾過機、ABI NFZP-posidyne 濾過膜（Pall製）
回分処理タンク：701 Pharmacia Batch Chromatography Tank(Pharmacia 製）
DE- カラム：Bioprocess 113（Pharmacia 製）
DM- カラム：K100/50 (Pharmacia製）
【０２５３】
C242抗体及び免疫毒素の生物学的性質
結腸直腸癌及び正常組織におけるC242（C242.II）抗体の免疫組織化学的評価
初期の結腸−直腸癌腫（colo-rectal carcinoma）及び種々の正常組織からの試料を、外科摘出手術を受けた患者から得た。得られた組織を氷の上で保管し、摘出後１時間以内に、液体窒素で予備冷却したイソペンテン中で凍結させた。この組織を切片化するまで−70℃で保存した。凍結させた生検試料（biopsies）を５μmの切片に切断し、50％アセトン中で＋4℃で30秒間固定し、次いで100％アセトン中で＋4℃で５分間固定した。得られた切片を風乾し、次いでPBS中で10分間洗浄した（rinsed）。
【０２５４】
次いで、切片全部を、PBSに溶解した0.3％過酸化水素中で５分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼを遮断し、PBS中で２回洗浄した。その後に、得られた切片を標準ブタ（swine）血清で処理し、次いでPBS-4％BSA（ウシ血清アルブミン）中に＋4℃で５分間1:10希釈して抗体の非特異的結合を遮断した。
【０２５５】
抗体とのインキュベーションは全て湿潤雰囲気中で室温で30分間行った。得られた切片を先ずPBS-４％BSA 中で、前記実施例１で得たモノクロナール抗体C242(C242:II) と共にインキュベートし、その後に２％ブタ抗ウサギ免疫グロブリンを用いてPBS-４％BSA 中に1 : 400 に希釈したビオチニル化(biotinylated)ウマ抗マウスIgG 〔Vectastain（商標）、Vector Laboratories(米国カリフォルニア州バーリンゲーム所在）製〕と共にインキュベートし、最後にAvidin DH/ビオチニル化セイヨウワサビペルオキシダーゼＨ複合体〔Dakopatts A/S(デンマーク国コペンハーゲン所在の会社）製〕と共にインキュベートした。各インキュベーションの後に、スライド(slides)をPBS 中で15分間洗浄した。次いで、切片を15分間基質で処理し、PBS 中で洗浄し、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、その後にグリセロールゼラチン〔Merck(ドイツ国Darmstadt 所在の会社）製〕を用いて固定した。使用した基質は、ジメチルスルホキシド６mlに溶解し、30％Ｈ２Ｏ2 ４μリットルを含有する0.02M 酢酸ナトリウム(pH5.5) 50mlで希釈した3-アミノ-9- エチルカルバゾール〔Sigma(米国ミズリー州セントルイス所在の会社）製〕10mgであった。基質溶液は濾過してから使用した。次いで、各切片を調べ、得られた結果を下記の表１に示す。
【０２５６】
0003735379.tif 000014
【０２５７】
表１から明らかなように、調べた結腸−直腸腫瘍から得た生検試料うちの60％は、モノクロナール抗体C242:II で正の染色を示した。正常な結腸組織における抗原CA242 の発現は、腫瘍組織よりも一般的に弱いことが認められ、染色は円柱上皮及び杯状細胞に完全に限定される。非結腸正常組織はモノクロナール抗体C242:II との反応性がほとんどなかったが、これに対し正常な乳管(breast ducts)、大膵管、胆管及び汗腺においては反応性は陽性であることが認められるが染色の強さは弱かった。
【０２５８】
死後に採取した正常なヒト組織におけるC242(C242:II) の免疫組織化学的評価
広範囲にわたる正常なヒト組織を全体で21人の死体から採取した。組織試料のうちの最もよい５組(set) を、モノクロナール抗体C242:II 免疫反応性の評価用として選択した。
【０２５９】
死後に、組織を取り出し、抗生物質を加えた基礎(basic) 培地を入れた予備冷却した管に直ちに入れた。次いで、組織を入れた管を実験室に移し（氷上で）、培養液を除去し、組織を 0.5cm3 の立方体に揃えた(trimmed) 。得られた組織立方体を濾紙片上に置き、液体窒素中で素早く凍結させた。凍結組織を薄片化するまで−80℃で保存した。薄片に切り分ける際には、冷凍組織試料を６μｍの切片に切断し、それを顕微鏡用ガラススライドに付着させた。該スライドを 100％アセトン中に室温で２分間浸すことにより、切片を固定した。次いで、スライドをアセトンから取り出し、そのまま風乾し、−20℃で保存した後に使用した。
【０２６０】
インキュベーションは全て湿潤雰囲気中で室温で30分間行った。切片を先ず、トリス緩衝塩溶液(TBS) に溶解したモノクロナール抗体C242:II と共にインキュベートし、その後に20％ヒト血清〔Sigman Chemical Company Ltd(英国ドーセットシャー州Poole 所在の会社）製〕を含有するTBS に1 : 50に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合化ウサギ抗マウスIgG 〔Dako Ltd（英国バッキンガムシャー州High Wycombe所在の会社）製〕と共にインキュベートし、最後に20％ヒト血清を含有するTBS に1 : 50に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合化ブタ抗ウサギIgG (Dako Ltd 製）と共にインキュベートした。各インキュベーションの後に、スライドをTBS 中で２回洗浄した。次いで、切片を３〜５分間基質で処理し、TBS 中で洗浄し、マイエル(Mayers)ヘマトキシリンで対比染色し、次いで合成封入剤(Synthetic Mounting Medium）〔Shandon Scientific Ltd (英国チェシャー州Runcorn 所在の会社）製〕を用いて封入した。使用した基質は、30％Ｈ２Ｏ2 17μリットルを含有するTBS 17ml中に溶解したジアミノベンジジン(Sigma製）10mgであった。基質溶液は濾過してから使用した。切片を調べ、得られた結果を下記の表２に示す。
【０２６１】
0003735379.tif 000015
【０２６２】
表２から明らかなように、調べた正常な死後(P.M) 組織の72％は、モノクロナール抗体C242:II 反応性を持たなかった。陽性と評点した28％のうちの大部分の染色は、主として組織内の管構造に対してはっきりと限定されずに散在しているか又は局部的に集中しているかいずれかであった。胃腸上皮に対しては、より以上に不均質であるが、さらに最小限の結合は認められなかった。皮膚試料の２／４は、偏平上皮及び汗腺に対して反応性をもって陽性に染色された。モノクロナール抗体C242:II を用いて選抜した扁桃腺試料４個についても偏平上皮が陽性に染色された。
【０２６３】
ヒト結腸癌腫COLO 205に対して結合するC242:II のエンドサイトーシス
エンドサイトーシス(endocytosis) 検定を下記のようにして行った。
単層培養物として増殖させたCOLO 205細胞（前記のC242抗体の調製参照）から単一の細胞懸濁液を調製した。上記細胞をトリプシン処理し、広範囲にわたって(extensively) 洗浄し、次いで培養液に再懸濁した。上記由来の沃素標識したC242:II 抗体(200,000cpm はモノクロナール抗体の50ngに相当する）を、５ml試験管中のCOLO 205細胞（106 個）の単一細胞懸濁液に加えた。最終的容量は200 μリットル／試験管であった。
【０２６４】
細胞を 125I-C 242 の存在下に氷上で（０℃）１時間インキュベートした。次いで、この細胞懸濁液を遠心分離し、細胞を洗浄して未結合モノクロナール抗体を除いた。前インキュベートした細胞を、37℃で10分間隔で１時間さらにインキュベートし、細胞を再冷却し、次いで各時間ごとにペレット化した。培養液に放出された放射能標識を上清から測定した〔LKB γ計数管、Pharmacia AB（スウェーデン国Uppsala 所在の会社）製〕。また上記の上清をTCA 沈殿に供し、沈殿物の放射能を測定した。 125I-C 242 を結合した表面を、パパイン(papain)2.5mg/mlを含有する0.2Mグリシン-HCl緩衝液(pH1.5) で酸洗いし、放射能（ 125I-C 242 が取り込まれたことを示す）を測定した。37℃でインキュベートした各時間後の表面に結合した抗体の量を、表面に結合したモノクロナール抗体の全体量から、放出され且つ取り込まれたモノクロナール抗体を減じることによって計算した。放出された抗体の分解(degradation) を、培養液上清のTCA 沈殿から測定した。
【０２６５】
得られた結果を添付図面の図16に示す。図16にはCOLO 205細胞による 125Ｉ-C 242のエンドサイトーシスを示し、細胞表面の放射能（“Sur ”として示した）、取り込まれた放射能（“Int ”として示した）及び分解し放出された放射能（“Deg.Re”として示した）を、細胞表面に対する最初の放射能全体の％として示した。図16により、前インキュベートした細胞を37℃でインキュベートした場合には、１時間以内に20％を越えるモノクロナール抗体C242:II のインターナリゼーション(internalizaton)が得られたことが認められる。培養液上清をTCA 沈殿させた場合には酸可溶性の放射能の量は少量であり、それはインキュベート１時間後には放出された活性のフラグメント化(fragmentation) がほとんどないことを示す。
【０２６６】
リシンＡ／C242抗体免疫毒素の細胞毒性
この試験はヒト結腸−直腸腫瘍細胞系統(Colo 205-ATCC No.CCL 222)に対する免疫毒素の生体外(in vitro)細胞毒性を明らかにするものである。
【０２６７】
Colo 205細胞を、RPM 1640培地中で重炭酸ナトリウム2.0g／リットルと、グルタミンなしで、５％の加熱不活性化した胎児性子ウシ血清、L-グルタミン 2mM及びゲンタマイシン（gentamicin) 50μg/mlと共に懸濁状態で増殖させた。細胞の個数を血球計数器ブロック(blocks)を使用して数えた。蛋白質合成阻害を検定(assay) するために、容量 100μリットルの96ウェル(well)プレート中に細胞を２×104 個／ウェルで移植した。免疫毒素試料を３連制(replicate) のウェルに加えた。免疫毒素を2,000 ng/ml から 0.98 ng/ml までの12倍加希釈液(doubling dilutions)で加えた。培養液 100μリットルを幾つかのウェルに対照(control) として加えた。各プレートを37℃で24時間インキュベートして、その後に各ウェルに 3H-L-ロイシン２μCiを加えた。プレートを37℃でさらに24時間インキュベートした。各ウェルにトリプシン50μリットルを加え、プレートをさらに15〜20分間インキュベートした。細胞を各プレートの各ウェルからガラス繊維マット上に収穫し、その放射能をLKB ベータープレート(betaplate) シンチレーションカウンターを使用して測定した。蛋白質合成阻害曲線を作成し、IC50値を求めた。好ましい免疫毒素（前記で調製したもの）について得られた結果を図17に示す。
【０２６８】
生体内細胞毒性
この試験は、無胸腺マウスにおいて皮下異種移植片として増殖させたヒト腫瘍細胞系統COLO 205に対する前記免疫毒素の生体内(in vivo) 細胞毒性を明らかにするものである。対照群として抗体単独又は燐酸塩緩衝食塩水を使用して試験した。
【０２６９】
COLO 205細胞の５×106 個を無胸腺マウスの脇腹の１カ所の皮下部位に注射した。腫瘍を増殖させ、３〜４日ごとにカリパス(calipers)を用いて長さと幅(two dimension) について測定した。供試物質の投与は、腫瘍が0.7 〜1.0cm 平方に達するまで行わなかった。この段階を０日とし、０日、１日及び２日目にマウス尾静脈に供試物質を静脈内(i.v.)投与した。腫瘍の大きさを長さと幅について連続的に測定し、相対腫瘍容積(relative tumor volume) として示した。腫瘍の測定は、３〜４日ごとに実験を終えるまで行った。
【０２７０】
この試験は、腫瘍増殖に対する効果を燐酸塩緩衝食塩水、C 242 抗体単独(1.2mg/kg)及び好ましい免疫毒素（前記で調製したもの）(2.0mg/kg)の相対腫瘍容積により比較し、得られた結果を以下の表に示す。
【０２７１】
第１群：燐酸塩緩衝食塩水 0.1ml/10g/ i.v.投与/ １日３回投与
0003735379.tif 000016
【０２７２】
第２群：C 242 抗体 1.2mg/kg / i.v.投与/ １日３回投与
0003735379.tif 000017
【０２７３】
第３群：免疫毒素 2.0mg/kg / i.v.投与/ １日３回投与
0003735379.tif 000018
【０２７４】
上記の表に示したように、本発明の免疫毒素は、燐酸塩緩衝食塩水(PBSA)対照群及び抗体単独群と比べて腫瘍の大きさ（上記各表にその相対腫瘍容積を示す）の減少を生じる。
【０２７５】
ヒト膵臓腫瘍組織に対する抗体C242:II の反応性
この試験は、ヒト膵臓腫瘍組織に対するモノクロナール抗体C242:II の反応性を明らかにするものである。
【０２７６】
前記のヒト正常組織反応性について記載の方法と同じ免疫組織学的方法を用いて、ヒト膵臓腫瘍組織に対するモノクロナール抗体C242:II の反応性を調べた。新鮮な凍結膵臓腫瘍組織を、微細針状生体組織検査材料から得、ホルマリン固定／パラフィン包埋した組織を腫瘍摘出物から得た。膵臓腫瘍の13／16は陽性として染色された。一般に、結合の範囲及び様式は結腸−直腸腫瘍組織の試料について認められたものと同等か又はそれよりも良いものであった。
【０２７７】
ヒト膵臓腫瘍細胞系統における免疫毒素の生体外効果
この試験は、ヒト膵臓腫瘍細胞系統に対する免疫毒素の生体外細胞毒性を明らかにするものである。
【０２７８】
膵臓腺癌(adenocarcinoma)由来の細胞系統Pan 1 を使用して免疫毒素の生体外(in vitro)細胞毒性効果を定量し、FACS（蛍光発色式細胞分取器）分析により標的抗原が発現することを明らかにした。効果を定量するために、種々の濃度の免疫毒素を培養液中のPan 1 細胞に加え、IC50値を求めた。MOPC 21 とリシンＡの複合体と、リシンＡ単独とを陰性対照(negative control)として使用した。バイオアッセイを３回行い、40±18ng／mlの平均効果を得た。上記の陰性対照は、最大1,000ng/mlまでの濃度で細胞毒性を示さなかった。このデータは、標的抗原が膵臓腫瘍細胞に存在すること及び抗原陽性腫瘍細胞が免疫毒素による致死感受性であることを説明する。
【０２７９】
モノクロナール抗体C242:II の軽鎖（すなわちＬ鎖）と重鎖（すなわちＨ鎖）のcDNAのコード化部分の分子クローニング
Ａ．全RNA の調製
108 個の細胞からRNA 全部を本質的には、Chomezynksi, P. とSacchi, N.〔Anal. Biochem.,162,156-159(1987)〕により改良されたようなCirgwin, J.M. らの方法〔Biochemistry, 18,5294-5299(1979)〕に従って調製した。  簡潔に述べると、グアニジニウムチオシアネート４M ；クエン酸ナトリウム(pH7) 25mM；0.5%N-ラウロイルザルコシン；2-メルカプトエタノール 0.1M からなる変成剤溶液15mlの冷却溶液に、前記の細胞ペレットを溶解した。細胞材料を溶解した後に、２M クエン酸ナトリウム（pH4.0) 1.2mlを加え、得られた混合物をフェノール- クロロホルム- イソアミルアルコール(250:49:1)混合物で抽出した。遠心分離した後に、等量のイソプロパノールを加えることによってRNA を水層から沈殿させ、次いで−20℃で１夜インキュベートしてRNA 全部を沈殿させた。RNA を遠心分離し再懸濁した後に、沈殿を繰り返し、さらにまた遠心分離し再懸濁した後に、吸光度測定することにより、得られたRNA 全部は 960μg であると算出された。
【０２８０】
Ｂ．mRNAの単離
前記で調製した全RNA からポリアデニル化されたmRNAを単離するするために、PolyATract〔登録商標；Promega Corporation(米国ウィスコンシン州Madison 所在の会社）製のmRNA単離系〕を製造元の指示書（Promega Technical Bulletin,No.090:1990参照) に従って使用した。簡潔に述べると、RNA 全部 960μg を水に溶解し、0.4 ×SSC(標準食塩−クエン酸塩緩衝液)(１×SSC=pH7.0 の水１リットル当たりNaCl 8.77g、クエン酸ナトリウム 4.41gを含む) 中でビオシチニル化(biotinylated)したオリゴ(dT)プローブ(50pモル) を用いてアニール化した。Streptavidin被覆された常磁性ビーズ〔Streptavidin Magnesphere（登録商標）〕を加え、10分間インキュベートした後に上記磁性粒子を取り除き、0.1 ×SSC で数回洗浄した。ポリアデニル化されたmRNAを、水中でインキュベートすることにより上記磁性球から溶離させてmRNA 5μg を得た。
【０２８１】
Ｃ．大腸菌中でのcDNAファージライブラリーの調製
二重鎖cDNAの非方向性の(undirectional) クローニングを可能にするベクターであるUni-ZAP(登録商標）〔Stratagne Inc.（米国カリフォルニア州La Jolla所在の会社）製〕を部分改変した Gubler, U. とHoffman, B.J. の方法〔Gene ,25,263-269(1983)〕に本質的に従って、前記工程のポリアデニル化mRNAから  cDNAを調製した。簡潔に述べると、ポリアデニル化mRNA５μg を、上記Uni-ZAP リンカープライマー(linker primer)(56ng/ml)を用いて開始し(priming) 、デオキシヌクレオチドdATP、dGTP、dTTP及び5-メチル-dCTP の0.6mM と、モロニー(Moloney) マウス白血病ウイルス逆転写酵素の45Ｕとを加えることにより一本鎖cDNAに変えた。得られた混合物を37℃で１時間インキュベートした。最終濃度0.15mMまでのデオキシヌクレオチドdATP、dGTP、dTTP及びdCTPと、リボヌクレアーゼＨ 3.2Ｕと、DNA ポリメラーゼ 6.5Ｕとを加え、次いで16℃で2.5 時間インキュベートすることにより、第二の鎖cDNA合成を行った。得られた混合物をフェノール−クロロホルム(1:1) で抽出し、エタノール沈殿させた。上記cDNAの両方の末端を、dNTP 0.16mM とＴ4 DNA ポリメラーゼ10Ｕと共に37℃で30分間インキュベートすることにより平滑にした。フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った後に、得られた平滑末端化cDNAをＴ4 DNA リガーゼ３Weiss ＵとATP 1mM とを加え、次いで８℃で１夜インキュベートすることによりEcoRＩアダプターに連結した。連結反応後に、EcoRＩ付着末端を、ATP 1mM の存在下でＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ10Ｕを加え、次いで30℃で30分間インキュベートすることによりキナーゼ化した。Uni-ZAP リンカープライマーによりコード化された配列から XhoＩ付着末端を作ることを目的として、得られた燐酸化されたEcoRＩ付着末端をもつcDNAを、制限酵素 XhoＩ 90Uで消化した。次いで、得られたcDNAを、 Uni-ZAP XR EcoRＩと XhoＩとで調製したアーム(arm) １μg に、Ｔ4 DNA リガーゼ２Weiss ＵとATP 1mM との存在下で連結し、次いで12℃で１夜インキュベートした。得られた連結反応混合物を、製造元の指示書に従ってGigapack II Gold（登録商標）パッケージング抽出(packaging extract) を使用してλ- ファージ粒子中に試験管内パッケージング(in vitro packaging)し、次いで得られたファージを使用して大腸菌PLK-F'に感染させた。得られた独立(independent) クローン  8.5 ×104 個のcDNAライブラリーを１度増幅させてファージ力価7.5 ×108 pfu/mlを得た。得られたcDNAライブラリーを以下に記載のようにして宿主菌株として大腸菌XL 1- ブルー〔Bullock, W. の論文「Biotechniques 」,5,4(1978)参照〕を使用して選別した。
【０２８２】
Ｄ．ハイブリダイゼーションプローブの調製
C242:II 抗体のIgG 1 重鎖とκ鎖とをコードするcDNAを検出するために、該重鎖の第一の定常部ドメイン(constant domain) すなわちCH 1とκ鎖の定常部ドメインすなわちCKとを覆うハイブリダイゼーションプローブを、Saiki. R.H. らの論文〔Science, 239,487-491(1988)〕によるポリメラーゼ連鎖反応により、マウス遺伝子DNA から調製した。簡潔に述べると、前記免疫グロブリンをコードするエキソンの5'領域と3'領域に対してハイブリド形成するオリゴヌクレオチド・プライマーの対をマウス遺伝子DNA の増幅(amplification) に使用した。アガロースゲル電気泳動により精製した後に、得られたDNA プローブ断片をFeinberg, A.P.とVogelstein,B. によるランダムプライマー伸長法〔Anal. Biochem.,132,6(1983)〕により32Ｐで標識した。
【０２８３】
Ｅ．配列をコード化するIgG 1 重鎖及びκ鎖のスクリーニング並びにプラスミド中への挿入
Sambrook, J.らの方法〔「Molecular Cloning 」第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press 発行、1989年〕に従って、前記Ｄで得た免疫グロブリンIgG 1 プローブ及びκプローブそれぞれを使用して、前記Ｃで得たcDNAを選別した。２つの別々のハイブリダイゼーションから陽性的にハイブリド形成しているファージクローン類をさらに、最初のスクリーニングにおけるプローブと同じプローブを使用して再びスクリーニングすることにより精製した。陽性的にハイブリド形成しているファージクローン類を大腸菌CL 1- ブルーの培養株中に拡張させ(expand)、得られたファージストック(stocks)を使用してShort, J.M. らの方法〔Nucleic Acids REes.,16,7583-7600(1988)〕に本質的に従ってファージミド(phargemid) を切除し繁殖させることにより、cDNAを含有するpBluescript SK(-) プラスミドを調製した。
【０２８４】
Ｆ．クローンをハイブリド形成させることによるプラスミドcDNAの特定
得られたcDNA含有プラスミドを、制限酵素マッピングにより特定し、所定の大きさの挿入断片を含有するプラスミドを、Sanger, F.らのジデオキシDNA 配列決定法〔「Proc. Natl. Acad. Sci.USA 」74,5463-5467(1977)〕に供した。Ig  κプローブとハイブリド形成するプラスミド（pKGE 761と命名する）はcDNA挿入断片を含んでいた。該cDNA挿入断片の配列は、既に知られているマウスκ軽鎖配列(Kabat,E.A. らの著作「Sequences of Protein of Immunological Interest」、第４版、U.S. Department of Health and Human Services, Natinal Institutes of Health参照) に近似した読み取り枠(open reading frame)をコード化する。κ軽鎖の可変部領域すなわちVK及びその翻訳された蛋白質配列をコード化する部分的cDNA配列を図19に示した。CDR 1 〜CDR 3 として示した３つのCDR 配列を下線を付すことにより示した。VKセグメントのアミノ末端の先にあるシグナルペプチド(signal peptide)を、VK配列のカルボキシメチル末端の後ろに続く定常部領域を示す記号(S.)CKにより示さす。
【０２８５】
IgG 1プローブとハイブリッド形成するプラスミド（pKGE 762という）はDNA挿入断片を含んでいた。該cDNA挿入断片の配列は、既に知られているマウスIgG 1重鎖配列（Kabat,E.A. らの上記著作参照）に近似した読み取り枠をコード化する。IgG 1重鎖可変部領域すなわちVH及びその翻訳された蛋白質配列をコード化する部分的cDNA配列を図20に示した。CDR 1〜CDR 3として示した３つのCDR配列を下線を付すことにより示した。VHセグメントのアミノ末端の先にあるシグナルペプチドを、VH配列のカルボキシメチル末端の後ろに続く定常部領域を示す記号（S.）CH 1により示す。
【０２８６】
組成物
人の治療用に使用し得る本発明の免疫毒素を含有する代表的な医薬製剤を下記に示す。
【０２８７】
0003735379.tif 000019
【０２８８】
【配列表】
(1) 一般情報
(i) 出願人：インペリアル・ケミカル・インダストリーズ・ピーエルシー    及びカビ・ファルマシア・エイビー(Kabi Pharmacia AB)
(ii)発明の名称：複合体
(iii) 配列の数：22
(ix)通信先住所：
(A) 名宛人：法務部(Legal Deparatment):特許(Patents)
(B) 市街名：ベッセマー・ロード
(C) 市名：ウェルウィン・ガーデン・シティー
(D) 州名：ハートフォードシャー
(E) 国名：英国
(F) 郵便番号：GB-AL7 1HD
(v) コンピューター読み取り様式：
(A) 媒体型式：ディスケット、3.50インチ、記憶容量1.2Mb
(B) コンピューター：18 M PS/2
(C) オペレーティングシステム：PC-DOS 3.20
(D) ソフトウエア：WPS-PLUSからのASCII
(vi)本出願のデータ：
(A) 出願番号
(B) 出願日：
(C) 分類：
(vii) 優先権データ：
(A) 出願番号：No.9114399.0
(B) 出願日：1991年７月３日
【０２８９】
(2) 配列番号１に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸16個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号(SEQ ID NO) １
0003735379.tif 000020
【０２９０】
(2) 配列番号２に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸７個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号２
0003735379.tif 000021
【０２９１】
(2) 配列番号３に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸９個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号３
0003735379.tif 000022
【０２９２】
(2) 配列番号４に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸５個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号４
0003735379.tif 000023
【０２９３】
(2) 配列番号５に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸17個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号５
0003735379.tif 000024
【０２９４】
(2) 配列番号６に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸10個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号６
0003735379.tif 000025
【０２９５】
(2) 配列番号７に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸18個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号７
0003735379.tif 000026
【０２９６】
(2) 配列番号８に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸11個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号８
0003735379.tif 000027
【０２９７】
(2) 配列番号９に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸11個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号９
0003735379.tif 000028
【０２９８】
(2) 配列番号10に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸７個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号10
0003735379.tif 000029
【０２９９】
(2) 配列番号11に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸21個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号11
0003735379.tif 000030
【０３００】
(2) 配列番号12に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：アミノ酸14個
(B) 型：アミノ酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号12
0003735379.tif 000031
【０３０１】
(2) 配列番号13に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：25
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号13
0003735379.tif 000032
【０３０２】
(2) 配列番号14に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：25
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号14
0003735379.tif 000033
【０３０３】
(2) 配列番号15に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：21
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号15
0003735379.tif 000034
【０３０４】
(2) 配列番号16に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：23
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号16
0003735379.tif 000035
【０３０５】
(2) 配列番号17に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：23
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号17
0003735379.tif 000036
【０３０６】
(2) 配列番号18に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：1140
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号18
0003735379.tif 000037
【０３０７】
(2) 配列番号19に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：26
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号19
0003735379.tif 000038
【０３０８】
(2) 配列番号20に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：86
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号20
0003735379.tif 000039
【０３０９】
(2) 配列番号21に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：463
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号21
0003735379.tif 000040
【０３１０】
(2) 配列番号22に関する情報
(i) 配列の特徴：
(A) 長さ：483
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号22
0003735379.tif 000041
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpICI 0020 の組み立てを説明する図である。
【図２】プラスミドpTB 344 の組み立てを説明する図である。
【図３】プラスミドpICI 0042 の組み立てを説明する図である。
【図４】プラスミドpICI 1079 の組み立てを説明する図である。
【図５】プラスミドpICI 1102 の組み立てを説明する図である。
【図６】大腸菌溶解物のクーマシー・ブルー染色したSDS ゲルを説明する図であり、トラックＡはプラスミドpICI 1102 であり、トラックＢはプラスミドpICI 0020 であり、トラックＣは分子量標識である。
【図７】プラスミドpICI 1102 のゲル・プロフィルを説明する図であり、ピークＲはリシンＡを示す。
【図８】プラスミドpICI 1102 により生成されたリシンＡのウェスタン・ブロットを示す図であり、トラック１は分子量標識であり、トラック２及び３はリシンを生成しないクローンであり、トラック４はプラスミドpICI 1102 であり、トラック５はプラスミドpICI 0020(対照プラスミド- 非リシンＡ配列）である。
【図９】プラスミドpICI 1102 の部分配列を示す図である。
【図１０】図９に示したプラスミドpICI 1102 の部分配列の続きを示す図である。
【図１１】プラスミドpICI 1187 の組み立てを説明する図である。
【図１２】プラスミドの調製に使用した断片を説明する図である。
【図１３】プラスミドpICI 0042 のプラスミド地図を示す図である。
【図１４】転写ターミネーターの配列を説明する図である。
【図１５】プラスミドpICI 1079 のプラスミド地図を示す図である。
【図１６】  COLO 205細胞による 125Ｉ-C242 のエンドサイトーシスを説明する図である。
【図１７】  COLO 205細胞に対するC242／リシンＡ免疫毒素の生体外(in vitro)細胞毒性を説明する図である。
【図１８】抗体を説明する図である。
【図１９】抗体C242のκ鎖、すなわち可変部領域（プラスミドpKGE 761中のcDNA）のcDNA配列を説明する図である。
【図２０】抗体C242の重鎖、すなわち可変部領域（プラスミドpKGE 762中のcDNA）のcDNA配列を説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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