(57)【要約】生体高分子であるリガンドを２つ以上ゲル中に結合させることを特徴とするゲル、該ゲルの製造方法、該ゲルを用いることを特徴とする検体中の特定分子の測定方法、該ゲルを含む装置、測定キットおよび薬剤、および該測定キットを用いる、各種疾病の診断方法。
2002090990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子であるリガンドを２つ以上ゲル中に結合させることを特徴とするゲル。
【請求項２】
ゲルが、リガンドに結合する特定分子の結合により構造変化が誘起されるゲルである請求の範囲１記載のゲル。
【請求項３】
ゲルが、特定分子を鋳型とする分子インプリント法により製造されるゲルであり、該特定分子に対する２つ以上のリガンドが結合し、かつ、該特定分子を含有しないゲルである請求の範囲１または２記載のゲル。
【請求項４】
ゲルが、特定分子を鋳型とする分子インプリント法により製造されるゲルであり、該特定分子に対する２つ以上のリガンドが結合し、かつ、該特定分子を含有するゲルである請求の範囲１または２記載のゲル。
【請求項５】
ゲルが、特定分子を鋳型とする分子インプリント法を利用せずに製造されるゲルであり、該特定分子に対する２つ以上のリガンドが結合したゲルである請求の範囲１または２記載のゲル。
【請求項６】
ゲルが、特定分子を作用させることにより収縮するゲルである請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載のゲル。
【請求項７】
ゲルが、特定分子を作用させることにより膨潤するゲルである請求の範囲１、２、４および５のいずれか１項に記載のゲル。
【請求項８】
生体高分子が、タンパク質、抗原、抗体、抗体の相補性決定領域、レクチン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂肪、多糖類およびそれらの複合体からなる群より選ばれる生体高分子である請求の範囲１〜７のいずれか１項に記載のゲル。
【請求項９】
特定分子を鋳型として、該特定分子に対する２つ以上のリガンドを該特定分子に結合した状態で化学的にゲルに固定化する工程、および、該ゲルから該特定分子を除去する工程を含有することを特徴とする請求の範囲３記載のゲルの製造方法。
【請求項１０】
特定分子を鋳型として、該特定分子に対する２つ以上のリガンドを該特定分子に結合した状態で化学的にゲルに固定化する工程を含有することを特徴とする請求の範囲４記載のゲルの製造方法。
【請求項１１】
特定分子を鋳型とせずに、該特定分子に対する２つ以上のリガンドのみを化学的にゲルに固定化する工程を含有することを特徴とする請求の範囲５記載のゲルの製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載のゲルを用いることを特徴とする検体中の特定分子の測定方法。
【請求項１３】
請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載のゲルを含む装置。
【請求項１４】
請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載のゲルを含む測定キット。
【請求項１５】
請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載のゲルを含む薬剤。
【請求項１６】
請求の範囲１４記載の測定キットを用いる、各種疾病の診断方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、タンパク質、ＤＮＡ、多糖類等の生体高分子を特異的に認識し、それにより構造変化が誘起されるゲル、該ゲルの製造方法および該ゲルの使用に関する。
背景技術
ゲルは物理化学的な外部環境、例えばｐＨ、温度、溶媒組成等の変化により相転移現象を示し、その結果、膨潤率が変化し、大きな体積変化が誘起される。
これまで報告されているゲルは、ゲルを構成する高分子鎖と溶媒との親和性の変化、高分子鎖中の荷電基の変化等により、体積変化が誘起されている［Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，４０，８２０（１９７８）、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，４５，１６３６（１９８０）、Ｓｃｉ．Ａｍ．，２４４，１２３（１９８１）、Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｇｅｌｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  Ｉ  ＆  ＩＩ、Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，１０９  ＆  １１０，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）］。以上のように、ゲルは物理化学的な外部環境変化により体積変化が誘起される場合がほとんどである。特定の分子を認識して構造変化するゲルとしてはグルコース応答性ゲル［Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９７，１１３５（１９９６）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，１２６９４（１９９８）］が知られている。
一方、特定の分子を認識するゲルの製造方法としては、該特定分子を鋳型とし、それと相互作用する物質を化学的にゲルに固定化する分子インプリント法［Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３４，１８１２（１９９５）］が知られている。これまでに、ゲルに固定化するものであって特定分子と相互作用する物質（以下、該相互作用する物質をリガンドと称す）としては、低分子化合物が知られている。
大きな分子量を有するタンパク質等の生体高分子を厳密に認識するゲルを製造する場合、特定分子をゲル中に結合させるために、生体高分子の異なる部分を認識する低分子化合物のリガンドをゲル内に厳密に並べることは困難であった。また、米国特許第５８０１２２１号には、抗体の分子認識能を利用したリガンドを導入したゲルが開示されているが、抗体分子そのものをゲルに導入したものではない。該特許には、外部刺激による体積相転移現象を利用して分子認識能あるいは結合能を変化させることが可能な分子インプリンティングゲルについて開示されている。
これまでに、抗体を導入したゲルは知られている［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３２，２０８２（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ，３９９，７６６（１９９９）］。このゲルは、抗原と抗体とをそれぞれ化学的に修飾した後に、それらの抗原と抗体とを結合させた状態で他の親水性モノマーと共にゲル網目を形成させることにより製造された、架橋点が抗原抗体結合であるゲルである。該ゲルは、内部で抗原および抗体が結合しているため、ゲル中に抗原または抗体が入ったとき、ゲルは膨潤し、収縮はみられない。また、該ゲルは、架橋点以外の部分の分子の構造変化に対しては対応できない。
混合物中に微量に存在する物質を選択的かつ感度よく検出または測定する方法としては、例えば抗原抗体反応を利用した放射免疫測定（ＲＩＡ）や酵素免疫測定（ＥＩＡ）等の免疫学的測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）］等が知られている。
免疫学的測定法とは、酵素、放射性同位元素等各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を測定する方法で、例えば競合法、サンドイッチ法［免疫学イラストレイテッド  第５版（南光堂）］等が知られている。
サンドイッチ法は、固相に第一の抗体を結合させた後、測定したい抗原をトラップさせ、標識した第二の抗体を反応させる方法である。
また、最近では糖タンパク質を測定する方法として抗体−レクチン酵素免疫測定法も報告されている［生物物理化学、３５，４５（１９９１）］。この方法は、標識抗体のかわりにレクチンを用いる方法であり、肝細胞癌の悪性度を反映するマーカーのα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を検出する方法として期待されている。
しかしながら、サンドイッチ法は、第一抗体と抗原、第二抗体あるいはレクチンと抗原との結合定数が、それぞれ大きく異なる場合およびその結合の最適条件が異なる場合の検出が困難であること、また、免疫学的測定法では固定化担体へのタンパク質の非特異吸着が測定の精度を低下させることおよび測定工程が２ステップ以上に及ぶこと等、問題点がある。
生体分子を認識するゲルは、診断等の医療分野を始めとして多方面での利用が期待でき、その開発が待ち望まれている。
また、現在の医療分野で用いられている酵素免疫測定法よりも感度、精度、特異性が高く、かつ安価で簡便な方法が求められている。
発明の開示
本発明の目的は、感度、精度、特異性が高く、簡便な方法で繰り返し使用可能な生体分子を認識できるゲルを提供することにある。また、本発明の目的は、感度、精度、特異性が高く、簡便な方法で繰り返し使用可能な生体分子を認識できるゲルの製造方法、該ゲルを用いる検体中の特定分子の測定方法、該ゲルを含む装置、該ゲルを含む測定キットおよび該測定キットを用いる各種疾病の診断方法、ならびに、該ゲルを含む薬剤を提供することにある。
本発明は（１）〜（１５）に関する。
（１）生体高分子であるリガンドを２つ以上ゲル中に結合させることを特徴とするゲル。
（２）ゲルが、リガンドに結合する特定分子の結合により構造変化が誘起されるゲルである上記（１）記載のゲル。
（３）ゲルが、特定分子を鋳型とする分子インプリント法により製造されるゲルであり、該特定分子に対する２つ以上のリガンドが結合し、かつ、該特定分子を含有しないゲル（以下、分子インプリントゲルという）である上記（１）または（２）記載のゲル。
（４）ゲルが、特定分子を鋳型とする分子インプリント法により製造されるゲルであり、該特定分子に対する２つ以上のリガンドが結合し、かつ、該特定分子を含有するゲル（以下、インプリント分子非除去ゲルという）である上記（１）または（２）記載のゲル。
（５）ゲルが、特定分子を鋳型とする分子インプリント法を利用せずに製造されるゲルであり、該特定分子に対する２つ以上のリガンドが結合したゲル（以下、ノンインプリントゲルという）である上記（１）または（２）記載のゲル。
（６）ゲルが、特定分子を作用させることにより収縮するゲルである上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のゲル。
（７）ゲルが、特定分子を作用させることにより膨潤するゲルである上記（１）、（２）、（４）および（５）のいずれか１項に記載のゲル。
（８）生体高分子が、タンパク質、抗原、抗体、抗体の相補性決定領域、レクチン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂肪、多糖類およびそれらの複合体からなる群より選ばれる生体高分子である上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載のゲル。
（９）特定分子を鋳型として、該特定分子に対する２つ以上のリガンドを該特定分子に結合した状態で化学的にゲルに固定化する工程、および、該ゲルから該特定分子を除去する工程を含有することを特徴とする分子インプリントゲルの製造方法。
（１０）特定分子を鋳型として、該特定分子に対する２つ以上のリガンドを該特定分子に結合した状態で化学的にゲルに固定化する工程を含有することを特徴とするインプリント分子非除去ゲルの製造方法。
（１１）特定分子を鋳型とせずに、該特定分子に対する２つ以上のリガンドのみを化学的にゲルに固定化する工程を含有することを特徴とするノンインプリントゲルの製造方法。
（１２）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のゲルを用いることを特徴とする検体中の特定分子の測定方法。
（１３）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のゲルを含む装置。
（１４）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のゲルを含む測定キット。
（１５）上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のゲルを含む薬剤。
（１６）上記（１４）記載の測定キットを用いる、各種疾病の診断方法。
１．分子インプリントゲル、インプリント分子非除去ゲルおよびノンインプリントゲルの製造方法
本発明の分子インプリントゲルは、分子インプリント法により製造されるゲルであり、２つ以上のリガンドが結合し、かつ、該リガンドと相互作用する特定分子を含有しないゲルである。すなわち、特定分子を鋳型として、該特定分子に対する２つ以上のリガンドを該特定分子に結合した状態で化学的にゲルに固定化した後に、該特定分子を除去したゲルである。
本発明のインプリント分子非除去ゲルは、分子インプリント法により製造されるゲルであり、２つ以上のリガンドが結合し、かつ、該リガンドと相互作用する特定分子を含有するゲルである。すなわち、特定分子を鋳型として、該特定分子に対する２つ以上のリガンドを該特定分子に結合した状態で化学的にゲルに固定化したゲルであり、該特定分子を除去していないゲルである。
本発明のノンインプリントゲルは、分子インプリント法を利用せずに製造されるゲルであり、２つ以上のリガンドが結合しているゲルを表す。すなわち、特定分子を鋳型として用いずに、該特定分子に対する２つ以上のリガンドのみを化学的にゲルに固定化したゲルである。
本発明の分子インプリントゲルおよびインプリント分子非除去ゲルは、例えば特定分子を鋳型として、特定分子に対するリガンドを化学的にゲルに固定化する分子インプリント法［Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３４，１８１２（１９９５）］により製造することができる。
特定分子としてはタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体、多糖類等の高分子、金属イオン等の低分子等、特に制限はないが、分子構造の変化した分子でもよい。分子構造の変化した分子としては、例えば糖タンパク質の糖鎖の一部が変化した変異体分子、タンパク質とタンパク質、タンパク質とＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡ、金属錯体等の相互作用した状態にある複合分子等があげられる。糖タンパク質の糖鎖の一部が変化した変異体分子としては、例えば肝疾患マーカーとして知られているα−フェトプロテイン（以下、ＡＦＰと称す）等があげられる。特定分子の分子量は特に限定されず、いずれの分子量のものを用いてもよい。
本発明のリガンドとしては、特定分子に対して相互作用する生体高分子であればいかなるものでもよいが、例えばタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、レクチン、脂肪、多糖類またはそれらの複合体等があげられる。複合体としては、例えば異なるタンパク質の融合タンパク質、タンパク質と抗体との融合抗体、異なる２つの結合領域を有し、異なる２つの標的分子を認識することができるバイスペシフィック抗体等があげられる。リガンドの分子量は特に限定されず、いずれの分子量のものを用いてもよい。
また、特定分子の構造変化を調べるためには少なくとも２つのリガンドの組み合わせを用いればよい。複数のリガンドの組み合わせとしては、上述のリガンドを組みあわせてもよいし、リガンドの複合体を単独で用いることもできる。複数のリガンドとしては、単独の生体高分子に対する異種のリガンドの組み合わせでもよいし、複数の生体高分子に対するリガンドの組み合わせでもいかなるものでもよい。
具体的には、特定分子が糖タンパク質であるＡＦＰの場合、ＡＦＰの複数のリガンドの組合わせとしては、ＡＦＰを認識する抗体と糖鎖に結合するレクチンであるコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ．Ａ）の組み合わせがあげられる。
本発明の分子インプリントゲルは、分子インプリント法を用いて製造することができ、例えば（１）特定分子を鋳型として、該特定分子に対する２つ以上のリガンドを該特定分子に結合した状態で化学的にゲルに固定化する工程、および、（２）該ゲルから該特定分子を除去する工程を含有する方法により製造することができる。ここで、（１）の工程により、インプリント分子非除去ゲルが製造される。本発明の分子インプリントゲルは、具体的には、例えば以下の方法で製造することができる。
まず、特定分子を認識する生体高分子であるリガンドと、ゲルの原料となるモノマーまたはあらかじめモノマーを重合した合成高分子（以下、重合体と称す）とを反応させて、リガンド導入モノマーまたはリガンド導入重合体を作製する。次いで、リガンド導入モノマーに、特定分子をリガンドに結合させた状態で、リガンド導入モノマーを重合および架橋させることにより、または、リガンド導入重合体に、特定分子をリガンドに結合させた状態で、リガンド導入重合体を架橋させて、高分子ネットワークを形成させることによりインプリント分子非除去ゲルを製造後、特定分子を該ゲルから除去することにより分子インプリントゲルを製造することができる。
リガンド導入モノマーまたはリガンド導入重合体は、モノマーまたは重合体に存在する反応性官能基と、リガンドである生体高分子に存在する反応性官能基とを反応させて作製することができる。
モノマーとしては、リガンドと反応する反応性官能基を有し、かつ重合反応により三次元構造をとるものであればいかなるものでもよいが、例えばリガンドと反応する反応性官能基およびゲルを合成するための反応性官能基を有するモノマー等があげられる。リガンドと反応する反応性官能基とゲルを合成するための反応性官能基は同一であっても異なっていてもよい。モノマーの分子量は特に限定されず、いずれの分子量のものを用いてもよい。
反応性官能基を有するモノマーの中でも、反応性官能基を有するビニルモノマーが好ましい。反応性官能基としては、例えばビニル基、エポキシ基、アリル基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、リン酸基、シアノ基、スルフヒドリル基等があげられる。
反応性官能基を有するビニルモノマーの具体例としては、例えばアクリル酸、メタクリル酸、酢酸ビニル、ビニルアミンおよびそれらの誘導体、メタクリル酸  ２−ヒドロキシエチル、アクリロニトリル等があげられる。
また、反応性官能基がカルボキシル基である場合、そのエステルを使用してもよく、その具体例としては、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、Ｎ−スクシンイミジルアクリレート、Ｎ−スクシンイミジルメタクリレート等があげられ、中でも、Ｎ−スクシンイミジルアクリレート、Ｎ−スクシンイミジルメタクリレートが好ましく使用される。
重合体としては、リガンドと反応するための反応性官能基を有し、重合体の架橋反応により高分子ネットワークを形成するものであればいかなるものでもよいが、リガンドと反応する反応性官能基およびゲルを合成するための反応性官能基を有する重合体が好ましい。リガンドと反応するための反応性官能基とゲルを合成するための反応性官能基とは同一であっても異なっていてもよい。好適なものとしては、反応性官能基を有するビニル重合体があげられる。重合体の分子量は特に限定されず、いずれの分子量のものを用いてもよい。
具体的には、例えば上述したモノマーの重合体、ポリエステル系等の縮合高分子、セルロース、キチン等の天然高分子およびその誘導体、ポリスチレン樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂等があげられる。また、種類の異なる重合体で高分子ネットワークを形成させてもよい。
反応性官能基を有するビニル重合体としては、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、リン酸基等の反応性官能基を有するビニル重合体であればいかなるものでもよいが、例えば水酸基を有するポリビニルアルコールおよびポリ（メタクリル酸  ２−ヒドロキシエチル）、カルボキシル基を有するポリアクリル酸およびポリメタクリル酸、アミノ基を有するポリビニルアミン、ならびに、これらの重合体の誘導体等があげられる。また、反応性官能基がカルボキシル基である場合、そのエステルを使用してもよく、そのエステルの具体例として、例えばメチルエステル、エチルエステル、活性エステル（Ｎ−スクシンイミジルエステル等）等があげられる。
また、反応性の低い官能基を有するモノマーまたは重合体を用いる場合には、該官能基を化学的に修飾して上述した反応性官能基に変換した後、生体高分子であるリガンドと反応させる方法を用いることができる。
リガンドが導入されたビニルモノマーの製造法の一例を以下に説明する。アミノ基を２個以上有する化合物であるジアミノ化合物の一方のアミノ基と、リガンドであるＤＮＡのリン酸基とを反応させた後、ジアミノ化合物のもう一方のアミノ基をカルボキシル基を有するビニルモノマーまたはスクシンイミジルアクリレート等のエステル基を有するビニルモノマーとを反応させることにより、リガンドであるＤＮＡを反応性官能基を有するビニルモノマーに導入することができる。
本発明のインプリント分子非除去ゲルは、リガンドに対する特定分子を、上記リガンド導入モノマーまたはリガンド導入重合体に結合させた後、架橋剤および反応開始剤、あるいは、架橋剤、反応開始剤および反応促進剤の存在下、高分子ネットワークを形成させることにより製造することができる。
リガンド導入モノマーの架橋剤としては、多官能性モノマーであればいかなるものでもよいが、例えばジビニル架橋剤、好ましくはジアクリレート架橋剤等があげられる。
リガンド導入重合体の架橋剤としては、反応性官能基を２つ以上有する多官能性化合物であればいかなるものでもよいが、例えばジアルコール、トリアルコール、ジカルボン酸、トリカルボン酸、ジアミン、トリアミン、ジイソシアネート、トリイソシアネート、ジグリシジル、トリグリシジル、ジアルデヒド、トリアルデヒド、ジビニル、トリビニル、ジチオール、トリチオール等があげられる。
また、リガンド導入モノマーを重合してゲルを製造する際には、リガンド導入モノマーと架橋剤との重合だけでなく、リガンド導入モノマー、少なくとも１種類のモノマーおよび架橋剤の３成分以上の重合によりゲルを製造することもできる。モノマーとしては、上述したモノマーであればいかなるものでもよく、好ましくはビニルモノマーがあげられる。
反応開始剤としては、ビニル基を活性化させてラジカルを生じるラジカル重合開始剤であればいかなるものでもよいが、例えば過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、アゾビスイソブチロニトリル等があげられる。反応促進剤としては、高分子ネットワークの形成を促進するものであればいかなるものでもよいが、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）等があげられる。
上記反応後、未反応モノマーあるいは未反応重合体をゲルから除去し、本発明のインプリント分子非除去ゲルを取得することができる。
未反応モノマーまたは未反応重合体をゲルから除去する方法としては、中性付近の緩衝液中で洗浄する方法等があげられる。緩衝液としては、リン酸緩衝液等があげられる。
本発明の分子インプリントゲルは、上記で取得したインプリント分子非除去ゲルから特定分子を除去することにより取得することができる。特定分子をゲルから除去する方法としては、例えばリガンドと特定分子との分子間結合が切断される条件のｐＨを有する緩衝液で洗浄する方法、超音波を用いる方法、中性付近の緩衝液中で超音波を用いる方法等があげられる。該緩衝液としては、例えばリン酸−クエン酸緩衝液等があげられる。
本発明のノンインプリントゲルは、分子インプリント法を利用せずに、２つ以上のリガンドをゲルに結合させる工程、すなわち、特定分子を鋳型として用いずに、該特定分子に対する２つ以上のリガンドのみを化学的にゲルに固定化させる工程を含む方法によって、製造することができる。
このようにして作製されたインプリント分子非除去ゲル、分子インプリントゲルおよびノンインプリントゲルは、後述する検体中の特定成分の測定方法、装置、測定キット、薬剤、各種疾病の診断方法に使用することができる。
以下に、肝疾患のマーカーとして知られているＡＦＰを特定分子とした分子インプリントゲルおよびノンインプリントゲルの製造方法を示す。
ＡＦＰを認識する分子インプリントゲルの製造方法
ＡＦＰは糖タンパク質である。ＡＦＰを認識する分子インプリントゲルにおいては、ＡＦＰに対する抗体（以下、抗ＡＦＰ抗体と称す）と糖鎖に結合するレクチンであるコンカナバリンＡ（以下、Ｃｏｎ．Ａと称す）とをリガンドとして用いることができる。
まず、抗ＡＦＰ抗体およびＣｏｎ．Ａを化学修飾する。すなわち、Ｎ−スクシンイミジルアクリレートと抗ＡＦＰ抗体またはＣｏｎ．Ａのアミノ基とを反応させることによって、抗体導入ビニルモノマーおよびＣｏｎ．Ａ導入ビニルモノマーを合成する。
次に、特定分子であるＡＦＰを、抗体導入ビニルモノマーおよびＣｏｎ．Ａ導入ビニルモノマーではさんだ状態で、反応開始剤の存在下、例えばアクリルアミド等の親水性のビニルモノマーおよびジビニル架橋剤とガラス管中で反応させることにより、高分子ネットワークを形成させる。
反応後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液でゲルを洗浄することにより、未反応モノマーを除去する。続いて、ｐＨ４．０リン酸−クエン酸緩衝液でゲルを洗浄することにより、特定分子のＡＦＰを除去する。
以上の方法により、ＡＦＰを認識する分子インプリントゲル（以下、ＡＦＰインプリントゲルと称す）を製造することができる。上記ＡＦＰインプリントゲルは、多点で生体高分子を認識する。ＡＦＰインプリントゲルは、該ゲルとの反応に供される物質により応答が異なる。該物質が、Ｃｏｎ．Ａと抗ＡＦＰ抗体の両方を認識する物質（例えば、ＡＦＰ等）である場合には、ゲルは収縮する。該物質が、Ｃｏｎ．Ａと抗ＡＦＰ抗体のいずれか一方のみを認識する物質［例えば、糖鎖変異ＡＦＰ（ＡＦＰの糖鎖の一部のみが変異した変異ＡＦＰ）、ニワトリ卵白アルブミン（ニワトリＯｖａｌｂｕｍｉｎ）等］である場合には、ゲルは膨潤する。該物質が、Ｃｏｎ．Ａと抗ＡＦＰ抗体のいずれをも認識しない物質［例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等］である場合には、ゲルは収縮も膨潤もせず、体積変化は起こらない。
ＡＦＰノンインプリントゲルの製造方法
ＡＦＰノンインプリントゲルとは、ＡＦＰに対するリガンドが２つ以上結合しており、分子インプリント法を利用せずに製造されるゲルである。ＡＦＰに対するリガンドとしては、例えば抗ＡＦＰ抗体とＣｏｎ．Ａとを組み合わせて使用することができる。
ＡＦＰインプリントゲルの製造の場合と同様に、抗ＡＦＰ抗体およびＣｏｎ．Ａを化学修飾し、抗体導入ビニルモノマーおよびＣｏｎ．Ａ導入ビニルモノマーを合成する。
次いで、特定分子であるＡＦＰを共存させないで、抗体導入ビニルモノマー、Ｃｏｎ．Ａ導入ビニルモノマーを、反応開始剤の存在下、アクリルアミド等の親水性のビニルモノマーおよびジビニル架橋剤とガラス管中で反応させることにより高分子ネットワークを形成させた後、生成したゲルをリン酸緩衝液等で洗浄する。
２．本発明のゲルを用いる検体中の特定分子の測定方法
分子インプリントゲルに特定分子を含有する検体を作用させると、特定分子とリガンドとからなる結合体が生成し、ゲルは収縮する。
インプリント分子非除去ゲルに特定分子を含有する検体を作用させると、予めゲル内に生成していた特定分子とリガンドとからなる結合体が（一部）消失し、ゲルは膨潤する。
ノンインプリントゲルに特定分子を含有する検体を作用させると、ゲル内に結合された特定分子が増加し、ゲルは膨潤する。
したがって、検体を反応させた後にゲルを観察することにより、検体に含まれる物質を定性分析することができる。ゲルの体積変化は、顕微鏡等で直接観察することも可能であるが、好ましくは収縮または膨潤したゲルにレーザー光線、赤外線、可視光線、紫外線等を照射し、吸収スペクトルの変化により分析することができる。また、ゲルの収縮または膨潤によるゲルの体積変化は、検体中の特定分子の量に依存する。したがって、ゲルの収縮または膨潤による体積変化を後述４に開示した装置を用いて測定することにより検体中の特定分子を定量することもできる。
特定分子を含有する検体としては、本発明のゲルを用いた特定分子の測定を可能とする検体であれば特に制限はないが、例えば血液、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等があげられる。
さらに、分子インプリントゲル、インプリント分子非除去ゲルまたはノンインプリントゲルを用いて特定分子を定量する場合に、上述のようにゲルの収縮または膨潤による体積変化を測定する方法のほかに、ゲル内に標識物質を共有結合、静電相互作用、水素結合、疎水相互作用、あるいはその他の吸着等によって担持し、ゲルが膨潤したときには標識物質をゲルから脱離させて、ゲルから脱離した標識物質量を測定することにより、特定分子の量を定量することもできる。
標識物質としては、１２５Ｉ、３２Ｐ等の放射性同位元素、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等の酵素、アクリジニウムエステル、ロフィン等の発光物質、メチレンブルー等の色素物質、オルトフェニレンジアミン等の発色剤、フルオレッセイン  イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）等の蛍光物質等があげられる。
３．本発明のゲルを含んだ測定キットおよびそれを用いた診断方法
本発明の分子インプリントゲル、インプリント分子非除去ゲルおよびノンインプリントゲルは、後述するように各種疾患の診断方法を行うことが可能な測定キットを構成する。これまでの測定キットは、複数の試薬で構成されているが、本発明の測定キットは、上記１の方法で製造された分子インプリントゲル、インプリント分子非除去ゲルまたはノンインプリントゲルのみで構成され得る。本発明の分子インプリントゲルは、ゲル内でのリガンドと特定分子との結合が可逆反応であるので、何回でも使用することが可能である。
本発明の分子インプリントゲル、インプリント分子非除去ゲルまたはノンインプリントゲルは、リガンドに相互作用する特定分子を認識することにより、該特定分子が関与する疾患の診断に使用することができる。
前述のように、分子インプリントゲルにおいて、インプリントされた特定分子と同一の分子が検体中に存在する場合には、ゲルは収縮する。インプリント分子非除去ゲルにおいて、ゲル内に結合された特定分子と同一の物質が検体中に含まれている場合には、ゲルは膨潤する。ノンインプリントゲルにおいて、特定分子が検体内に含まれている場合には、ゲルは膨潤する。
本発明のゲルを用いる診断法では、特定分子の構造変化を認識することができる。
特定分子の構造変化としては、特定分子の立体構造の変化、分子中の異常部位による部分構造の変化等があげられる。
種々のＤＮＡの転写、翻訳は複数のタンパク質が複合体を形成し、ＤＮＡに結合あるいは解離することにより制御されている。
本発明のゲルを用いることにより、ＤＮＡとタンパク質複合体との結合の有無、複合体を形成する複数のタンパク質の立体構造あるいは部分構造の異常等を１ステップで簡便に測定することができる。特に複合体を形成する複数のタンパク質の立体構造あるいは部分構造の異常を正確かつ簡便に測定することができる。
具体的には、複合体を形成する複数のタンパク質をそれぞれ抗原として、抗原の立体構造を認識する抗体または複合体の外側に位置する部分アミノ酸配列を認識する抗体等をリガンドとして製造されたゲルを用いることにより、複合体を形成している一部のタンパク質に異常が生じていることを検出することができる。
また、生体内のタンパク質の立体構造あるいは部分構造の変化を指標として、各種疾患の診断をすることもできる。
生体内のタンパク質としては、疾患と関連のあるタンパク質あるいはその複合体であればいかなるものでもよいが、肝癌、肝硬変等の肝疾患マーカーとして知られている、糖タンパク質であるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルツハイマーの原因因子とされるプリオンタンパクおよびβアミロイド等があげられる。これらの生体内の立体構造あるいは部分構造の変化を検出することにより、肝癌、肝硬変、アルツハイマー等の疾患の診断を行うことができる。
ＡＦＰ等の糖タンパク質を測定する場合のリガンドとしては、例えば抗糖タンパク抗体（例えば、抗ＡＦＰ抗体）、レクチン等があげられる。
プリオンタンパク、βアミロイド等はアミノ酸配列は変化しないが立体構造に変化が生じることにより、疾患を引き起こすといわれている。したがって、このようなタンパク質を測定する場合のリガンドとしては、立体構造を認識する抗体や、タンパク質の表面抗原を認識する抗体等が用いられる。
４．本発明のゲルを含んだ装置および薬剤
前述のような本発明のゲルの性質、すなわち、検体中の特定分子によるゲルの収縮または膨潤という性質を利用して、本発明のゲルを装置に使用することができる。
具体的には、本発明のゲルを微細なセンサーチップ表面に固定化し、それが重量計と連結されてセンサーチップ表面のゲルの収縮または膨潤による体積変化を重量変化として表示できる装置があげられる。センサーチップ表面に検体を接触させると、特定分子が検体中に存在する場合には、ゲル内に特定分子が取り込まれるためゲルの重量は増加するが、一方で、ゲルは収縮または膨潤する。ゲルの重量変化は、ゲルの収縮または膨潤による体積変化に依存する。このゲルの収縮または膨潤による体積変化は、ゲル内に取り込まれた特定分子の量に依存し、ゲル内に取り込まれた特定分子の量は検体中の特定分子の量に依存する。従って、ゲルの体積変化に起因する重量変化を測定することにより、検体中の特定分子を定量することができる。また、同様に、重量計の代わりに膜厚測定装置等をセンサーチップと連結させた装置によっても、検体中の特定分子を定量することができる。この場合には、検体中の特定分子の濃度に応答した膜厚変化を検知することにより、検体中の特定分子を定量することができる。さらに、本発明のゲルを伸縮可能なキャピラリーと連結させた装置によっても、検体中の特定分子を定量することができる。この場合には、検体中の特定分子の濃度に応答したキャピラリー長の変化を検知することにより、検体中の特定分子を定量することができる。
装置としては、上記３に述べた各種疾患の診断を行うための装置のほか、本発明のゲルをセンサー部分として構成することができる装置であればいかなるものにも用いることができる。
本発明のゲルをセンサー部分として構成することができる装置としては、例えばバルブ、人工臓器、触媒反応システム等があげられる。
バルブの具体例としては、例えば水道水の供給バルブ、工場の製造ラインや廃液処理のバルブ等があげられる。
例えば、水道水の供給バルブ中に本発明のインプリント分子非除去ゲルをセンサーとしてはめ込んでおく。特定分子としては、水道水中に含まれる身体に有害な重金属、微生物等いかなる物質でもよい。リガンドとしては、特定分子に対する抗体等があげられる。リガンドおよび特定分子を用いて上記１の方法でインプリント分子非除去ゲルを作製する。得られたゲルを水道水の供給バルブに組み込むことで、特定分子の濃度が一定量越えるとゲルが膨潤して供給バルブが閉まるため、有害な物質が含有された水は供給されない。
また、本発明のゲルは、生体内の組織として、すなわち人工臓器として使用することもできる。例えば、後述するインシュリン含有分子インプリントゲルを含有する人工膵臓は、グルコースが血中に過剰にある場合は、ゲルが収縮してインシュリンが放出されるので、膵臓の一部の機能を担う人工膵臓として用いることができる。
また、本発明の分子インプリントゲルに特定分子の反応に関与する触媒などを固定化することによって、ゲルが特定分子を結合して収縮する際に、ゲル内の触媒によって特定分子の反応を特異的に促進するような、新しい触媒反応システムの構築も可能になる。
さらに、本発明の分子インプリントゲルは特定分子を結合させる性質から、特定分子を精製するためのゲル、生体分子間相互作用を測定するための分析用ゲルとしても用いることもできる。
本発明のゲルは、各種疾病の治療剤、予防剤、診断剤等の薬剤に使用することができる。
本発明の薬剤は、原因物質の増加がその原因となる疾患において好適に使用される。薬剤の形態としては、例えば原因物質を特定分子として、該特定分子と該特定分子に対するリガンドとを用いて作製した分子インプリントゲルに薬効成分を担持させた薬効成分含有分子インプリントゲル等があげられる。薬効成分の分子インプリントゲルへの担持は、例えば物理吸着や化学吸着等により行うことができる。物理吸着としては、例えば静電相互作用、水素結合、疎水相互作用による吸着等があげられる。化学吸着としては、例えば共有結合による吸着等があげられる。
生体内に薬効成分含有分子インプリントゲルを投与すると、特定分子が過剰にある患部ではゲルが収縮することになるので、薬効成分を有する物質はゲルから脱離し、局所的に患部に作用させることができる。
本発明の薬剤の具体例としては、例えば糖尿病治療薬としてのインシュリン含有分子インプリントゲル等があげられる。糖尿病の原因物質であるグルコースを認識する抗体、糖鎖を認識するレクチン等をリガンドとして分子インプリントゲルを作製し、ゲル内にインシュリンを担持させ、インシュリン含有分子インプリントゲルを作製する。これを生体内に投与すると、グルコースが過剰にある患部ではゲルが収縮することになるので、インシュリンはゲルから脱離する。
薬剤、人工臓器としての分子インプリントゲルの使用に際しては、生体内での拒絶反応を誘発させないゲルの成分を用いることが好ましい。
本発明のゲルを含む治療剤、予防剤等の薬剤は、単独でヒトまたは動物に投与することも可能ではあるが、薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供されてもよい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、薬剤中の有効成分の量が、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
実施例１  ＡＦＰインプリントゲルの製造方法
（１）Ｃｏｎ．Ａ導入ビニルモノマーの合成（第１図）
ｐＨ７．４、２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（２５℃）１ｍＬに、Ｃｏｎ．Ａ２０．４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を溶解し、２ｍｇ／ｍＬのＮ−スクシンイミジルアクリレート（ＮＳＡ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液０．０３ｍＬ（０．４ｍｍｏｌ）を加えて、３６℃で１時間攪拌した。
得られた反応混合物を、脱塩したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ファルマシアバイオテク社製）が充填されたカラムＰＤ−１０（ファルマシアバイオテク社製）を用いて精製し、Ｃｏｎ．Ａ導入ビニルモノマー含有溶液を得た。得られたＣｏｎ．Ａ導入ビニルモノマー含有溶液の紫外部吸収スペクトルを分光光度計［（株）島津製作所製：ＵＶ−２５００ＰＣ型］により測定し、Ｃｏｎ．Ａ導入ビニルモノマー含有溶液が天然のＣｏｎ．Ａと同じ２８０ｎｍに特性吸収波長を有することを確認した。次いで、天然のＣｏｎ．Ａを用いてあらかじめ作成した検量線から、Ｃｏｎ．Ａ導入ビニルモノマー含有溶液中のＣｏｎ．Ａ導入ビニルモノマーの濃度を求めたところ、４．３ｍｇ／ｍＬであった。
（２）Ｃｏｎ．Ａ導入ビニルモノマーのポリマー化（第２図）
上記（１）で調製した４．３ｍｇ／ｍＬのＣｏｎ．Ａ導入ビニルモノマー溶液２ｍＬに、アクリルアミド（ＡＡｍ）１２ｍｇ、０．１ｍｏｌ／Ｌの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）の水溶液０．０２ｍＬおよび０．８ｍｏｌ／ＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）の水溶液０．０２ｍＬを加え、２５℃で３時間反応を行い、Ｃｏｎ．Ａ導入ビニルポリマー含有溶液を得た。
（３）抗ＡＦＰ抗体導入ビニルモノマーの合成（第３図）
上記（１）と同様の方法で、抗ＡＦＰ抗体導入ビニルモノマーを合成した。
２．２ｍｇ／ｍＬの抗ヒトＡＦＰ・ウサギポリクローナル抗体溶液（ダコ・ジャパン社製）１ｍＬに０．５ｍｇ／ｍＬのＮＳＡのＤＭＳＯ溶液０．０１ｍＬを加え、３６℃で１時間撹拌した。得られた反応混合物を、脱塩したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ファルマシアバイオテク社製）が充填されたカラムＰＤ−１０（ファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。抗ＡＦＰ抗体導入ビニルモノマーを含有する画分を集め、プールされた抗ＡＦＰ抗体導入ビニルモノマー含有水溶液を凍結乾燥器（東京理化機械社製：ＦＤ−ＳＮ型）を用いて濃縮し、１８５ｍｇ／ｍＬの抗ＡＦＰ抗体導入ビニルモノマーのリン酸緩衝液溶液を得た。
（４）ＡＦＰインプリントゲルの調製（第４図）
ＡＦＰインプリントゲルを第４図に従って、次のようにして調製した。まず、上記（２）で調製したＣｏｎ．Ａ導入ビニルポリマーのリン酸緩衝液溶液０．０１２ｍＬと、上記（３）で調製した１８５ｍｇ／ｍＬの抗ＡＦＰ抗体導入ビニルモノマーのリン酸緩衝液溶液０．２ｍＬとの混合液に、０．１１ｍｇ／ｍＬのＡＦＰの水溶液０．３７ｍＬを加えた。次に、ＡＡｍ  １２０ｍｇ、１ｍｇ／ｍＬのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの水溶液０．０６ｍＬ、０．１ｍｏｌ／ＬのＡＰＳの水溶液０．０２ｍＬおよび０．８ｍｏｌ／ＬのＴＥＭＥＤの水溶液０．０２ｍＬを加えた。この溶液を片方を塞いだガラス管（内径３ｍｍ）に流し込み、２５℃で６時間反応を行った後、得られたゲルをｐＨ７．４のリン酸緩衝液で洗浄し、未反応物を除去した。さらに、ｐＨ４．０のリン酸−クエン酸緩衝液でゲルを洗浄しＡＦＰを除去し、ＡＦＰインプリントゲルを得た。
実施例２  ＡＦＰノンインプリントゲルの製造方法
実施例１の（４）に記載の方法に準じて、分子インプリント法を利用しないノンインプリントゲルを次のようにして調製した。まず、実施例１の（２）で調製したＣｏｎ．Ａ導入ビニルポリマーのリン酸緩衝液溶液０．０１２ｍＬと、実施例１の（３）で調製した１８５ｍｇ／ｍＬの抗ＡＦＰ抗体導入ビニルモノマーのリン酸緩衝液溶液０．２ｍＬとの混合液に、ＡＦＰの代わりにＰＢＳを０．４０ｍＬを加えた。該溶液に、ＡＡｍ  １２０ｍｇ、１ｍｇ／ｍＬのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの水溶液０．０６ｍＬ、０．１ｍｏｌ／ＬのＡＰＳの水溶液０．０２ｍＬおよび０．８ｍｏｌ／ＬのＴＥＭＥＤの水溶液０．０２ｍＬを加えた。この溶液を片方を塞いだガラス管（内径３ｍｍ）に流し込み、２５℃で３時間反応を行った後、得られたゲルをｐＨ７．４のリン酸緩衝液で洗浄し、ＡＦＰノンインプリントゲルを得た。
比較例  ＰＡＡｍゲルの調製
実施例１の（４）に記載の方法に準じてＰＡＡｍゲルを次のようにして調製した。まず、ＰＢＳ  ０．６２ｍＬに、ＡＡｍ  １２０ｍｇ、１ｍｇ／ｍＬのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの水溶液０．０６ｍＬ、０．１ｍｏｌ／ＬのＡＰＳの水溶液０．０２ｍＬおよび０．８ｍｏｌ／ＬのＴＥＭＥＤの水溶液０．０２ｍＬを加えた。この溶液を片方を塞いだガラス管（内径３ｍｍ）に流し込み、２５℃で３時間反応を行うことにより、ＰＡＡｍゲルを調製した。
実施例３  ゲルの膨潤率測定による検体中のＡＦＰの測定（１）
実施例１で作製したＡＦＰインプリントゲル、実施例２で作製したＡＦＰノンインプリントゲルおよび比較例で作製したＰＡＡｍゲルを用いて、ＡＦＰとの反応における各ゲルの膨潤率の経時変化を検討した（第５図）。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２ｍｏｌ／Ｌ）中で十分に平衡膨潤させたＡＦＰインプリントゲル、ＡＦＰノンインプリントゲル、ＰＡＡｍゲルそれぞれを４０μｇ／ｍＬのＡＦＰのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２ｍｏｌ／Ｌ）溶液へ加えてＡＦＰと各ゲルとの反応を行った後、ゲルの体積変化をゲルの膨潤率として評価した。ゲルの膨潤率は、次式により算出した。
膨潤率＝（ｄ／ｄ０）３
ここで、ｄ０はリン酸緩衝液中でのゲルの直径、ｄはＡＦＰ溶液中のゲルの直径である。膨潤率が１よりも大きい値の場合には、ゲルは膨潤したことを意味し、膨潤率が１よりも小さい値の場合には、ゲルは収縮したことを意味する。
その結果、ＰＡＡｍゲルは、ＡＦＰ溶液中でも膨潤率はほとんど変化しなかったが、ＡＦＰノンインプリントゲルは膨潤し、ＡＦＰインプリントゲルでは収縮した。このように、本発明のＡＦＰインプリントゲルおよびＡＦＰノンインプリントゲルを用いることにより、検体中のＡＦＰの定性分析が可能であることが判明した。
実施例４  ゲルの膨潤率測定による検体中のＡＦＰの測定（２）
実施例１で作製したＡＦＰインプリントゲル、実施例２で作製したＡＦＰノンインプリントゲルおよび比較例で作製したＰＡＡｍゲルを用いて、ＡＦＰ濃度の各ゲルの膨潤率への影響を検討した（第６図）。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２ｍｏｌ／Ｌ）中で十分に平衡膨潤させたＡＦＰインプリントゲル、ＡＦＰノンインプリントゲル、ＰＡＡｍゲルそれぞれを様々な濃度のＡＦＰのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２ｍｏｌ／Ｌ）溶液に加え、再び平衡膨潤に達した後、各ゲルの膨潤率を測定した。
その結果、ＰＡＡｍゲルはＡＦＰ濃度に依らずほとんど一定の膨潤率を示したが、ＡＦＰノンインプリントゲルはＡＦＰ濃度に依存して膨潤し、ＡＦＰインプリントゲルはＡＦＰ濃度に依存して収縮した。第６図に示すようなＡＦＰインプリントゲルおよびＡＦＰノンインプリントゲルについての溶液中のＡＦＰの濃度とゲルの膨潤率との間の関係を検量線として用いることにより、ＡＦＰインプリントゲルまたはＡＦＰノンインプリントゲルを用いて、検体中のＡＦＰの濃度を定量することができる。
参考例１  ＡＦＰインプリントゲルの特異的応答性（１）（第７図）
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２ｍｏｌ／Ｌ）中で十分に平衡膨潤させたＡＦＰインプリントゲルを用いて、ＡＦＰインプリントゲルの特異的反応性を検討した。ＡＦＰインプリントゲルとの反応に供される物質として、ＢＳＡを用いた。ＢＳＡは、Ｃｏｎ．Ａにも抗ＡＦＰ抗体にも認識されない物質である。
４０μｇ／ｍＬのＢＳＡのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２ｍｏｌ／Ｌ）溶液にＡＦＰインプリントゲルを加えたところ、第７図に示すようにゲルは収縮も膨潤もしなかった。ＡＦＰのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２ｍｏｌ／Ｌ）溶液にＡＦＰインプリントゲルを加えた場合には、ゲルは収縮したことから、ＡＦＰインプリントゲルは、糖鎖と抗ＡＦＰ抗体の両方を認識するＡＦＰにより収縮するが、糖鎖と抗ＡＦＰ抗体のいずれをも認識しないＢＳＡによっては体積変化しないことが判明した。
参考例２  ＡＦＰインプリントゲルの特異的応答性（２）（第８図）
参考例１のＢＳＡの代わりにニワトリＯｖａｌｂｕｍｉｎを用いて、ＡＦＰインプリントゲルの特異的反応性を検討した。ニワトリＯｖａｌｂｕｍｉｎは、Ｃｏｎ．Ａには認識されるが抗ＡＦＰ抗体には認識されない物質である。
４０μｇ／ｍＬのニワトリＯｖａｌｂｕｍｉｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２ｍｏｌ／Ｌ）溶液にＡＦＰインプリントゲルを加えたところ、第８図に示すようにゲルは膨潤した。ＡＦＰのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２ｍｏｌ／Ｌ）溶液にＡＦＰインプリントゲルを加えた場合には、ゲルは収縮したことから、ＡＦＰインプリントゲルは、糖鎖と抗ＡＦＰ抗体の両方を認識するＡＦＰにより収縮するが、糖鎖のみを認識するニワトリＯｖａｌｂｕｍｉｎによっては収縮ではなく膨潤することが判明した。
産業上の利用可能性
本発明により、生体高分子であるリガンドを２つ以上ゲル中に結合させた分子インプリントゲル、インプリント分子非除去ゲルおよびノンインプリントゲルが提供され、これらのゲルの高い特異性（＝特定分子認識能）により、検体中の特定分子の簡便な測定が可能となり、各種疾患の簡便な診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｃｏｎ．Ａ導入ビニルモノマーの合成方法を示した模式図である。
第２図は、Ｃｏｎ．Ａ導入ビニルポリマーの合成方法を示した模式図である。
第３図は、抗ＡＦＰ抗体導入ビニルモノマーの合成方法を示した模式図である。
第４図は、ＡＦＰインプリントゲルの合成方法を示した模式図である。
第５図は、リン酸緩衝液中でそれぞれ平衡膨潤させたＡＦＰインプリントゲル、ＡＦＰノンインプリントゲルおよびポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルのＡＦＰ含有リン酸緩衝液中での膨潤率の経時変化を示したグラフである。○、●および□がそれぞれＡＦＰインプリントゲル、ＡＦＰノンインプリントゲルおよびＰＡＡｍゲルを用いた結果を示す。
第６図は、リン酸緩衝液中でそれぞれ平衡膨潤させたＡＦＰインプリントゲル、ＡＦＰノンインプリントゲルおよびＰＡＡｍゲルのＡＦＰ含有リン酸緩衝液中での膨潤率とＡＦＰ濃度との関係を示したグラフである。○、●および□がそれぞれＡＦＰインプリントゲル、ＡＦＰノンインプリントゲルおよびＰＡＡｍゲルを用いた結果を示す。
第７図は、ＡＦＰインプリントゲルの特異的応答性を、ＡＦＰインプリントゲルのＢＳＡ、ＡＦＰに対する反応性により示したグラフである。○および●がそれぞれＡＦＰおよびＢＳＡを用いた結果を示す。
第８図は、ＡＦＰインプリントゲルの特異的応答性を、ＡＦＰインプリントゲルのニワトリＯｖａｌｂｕｍｉｎ、ＡＦＰに対する反応性により示したグラフである。○および●がそれぞれＡＦＰおよびニワトリＯｖａｌｂｕｍｉｎを用いた結果を示す。
【図１】
2002090990.tif 000003
【図２】
2002090990.tif 000004
【図３】
2002090990.tif 000005
【図４】
2002090990.tif 000006
【図５】
2002090990.tif 000007
【図６】
2002090990.tif 000008
【図７】
2002090990.tif 000009
【図８】
2002090990.tif 000010
【国際調査報告】
2002090990.tif 000011
2002090990.tif 000012
2002090990.tif 000013
2002090990.tif 000014
2002090990.tif 000015