(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板表面のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいは両方に金属微粒子標識を修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいは両方の金属微粒子標識を検出する工程を有する生化学検体の検出方法。
【請求項２】
検体ＤＮＡに金属微粒子標識を修飾する工程、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板表面のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成した検体ＤＮＡの金属微粒子標識を検出する工程を有する生化学検体の検出方法。
【請求項３】
金属が、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏのいずれかである請求項１又は請求項２に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項４】
プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である請求項１又は請求項２に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項５】
基板表面に貴金属薄膜を有する請求項１又は請求項２に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項６】
金属微粒子を検出する方法が、ＳＰＲ分光法又は光散乱法である請求項１又は請求項２に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項７】
金属微粒子を検出する方法が、カメラ又は顕微鏡画像をスキャニングして画像処理するイメージング処理法である請求項１又は請求項２に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項８】
表面に貴金属薄膜を成膜した基板からなり、該薄膜上に配列されたプローブＤＮＡを有し、かつ各プローブＤＮＡがループ構造を形成して金属微粒子が修飾可能な部位が基板側にある生化学検体の検出チップ。
【請求項９】
プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である請求項８に記載の生化学検体の検出チップ。
【請求項１０】
基板がガラスまたは半導体シリコンからなり、表面に金薄膜を有する請求項８に記載の生化学検体の検出チップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分光法などを用いた生化学検体の検出方法の改良に係り、ＳＰＲ分光法の本来の利点を損なうことなくＳＰＲ応答を増幅して検出精度を高精度化でき、また顕微鏡等で容易に観察可能で、生化学検体の検出工程を再現性よく簡素化できる生化学検体の検出方法とその検出チップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップの基本原理は、ＤＮＡが相補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものである。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴＴＡＣのＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プローブとしてＴＣＣＡＡＴＧの配列を持つＤＮＡを作成し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在すると、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺旋構造を取るため、これを検出することで目的ＤＮＡを容易に選別できることになる。
【０００３】
二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標識の修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発する物を検出する、蛍光法が知られている。
【０００４】
かかる蛍光法を用いたＤＮＡハイブリダイゼーション検出には、蛍光標識の修飾操作が煩雑であること、蛍光色素の光消失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されている。
【０００５】
そこで、検体ＤＮＡに蛍光色素の修飾を行わずに二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、屈折率の変化を検出するＳＰＲ分光法を用いた方法が提案されている。
【０００６】
詳述すると、ガラス基板に金属薄膜を形成してこの薄膜上にプローブＤＮＡを固定しておき、これとサンプリング遺伝子をハイブリダイゼーション操作させることにより二重螺旋構造のＤＮＡを形成させ、基板裏面側からの金属薄膜への反射光強度の測定を行い、ハイブリダイゼーション前の金属薄膜の屈折率と二重螺旋構造のＤＮＡを有する場合の屈折率との変化を測定する。すなわち、かかる共鳴角度の変化は、ハイブリダイゼーションした二重螺旋構造のＤＮＡの量に対応するものであるから、反射光強度の測定で蛍光色素の修飾を行わずに二重螺旋構造のＤＮＡを定量的に検出できることになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＳＰＲ分光法を用いた検出方法は、蛍光法に対して光退色が懸念される蛍光修飾の必要性がないこと、またシンプルな光学系で得られる感度が高く、感度低下を招くことなく検出部位のダウンサイジングが可能であるなどの種々の利点を有している。
【０００８】
このＳＰＲ分光法において、前述したハイブリダイゼーション前後の金属薄膜の屈折率の変化を測定するが、基板裏面側からの金属薄膜への入射角度と反射率との関係として解析する際に、当該変化が僅かであるため、さらに高精度に検体ＤＮＡを検出するには、ＳＰＲ応答の増幅を図るなどの改良を施す必要がある。
【０００９】
この発明は、ＳＰＲ分光法を用いた生化学検体、すなわち二重螺旋構造のＤＮＡの検出方法において、ＳＰＲ分光法の本来の利点を損なうことなくＳＰＲ応答を増幅可能として、検出精度を高精度化すること、さらにＳＰＲ分光法以外の顕微鏡観察法などの方法でも当該生化学検体の検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがない、簡単な工程からなる生化学検体の検出方法と検出チップの提供を目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、ＳＰＲ応答の増幅を目的に種々検討した結果、基板の金属薄膜に金を用い、プローブＤＮＡに貴金属コロイドを修飾することで末端に金微粒子修飾を行うと、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション後に金微粒子と金薄膜間の光学的相互作用が変化することでＳＰＲ応答の増幅を実現できることを知見した。
【００１１】
また、発明者らは、ＳＰＲ応答の増幅、安定した検出チップの構成を目的にプローブＤＮＡへの金微粒子修飾の有効性、最適化を検討した結果、金薄膜表面に対するプローブＤＮＡの吸着固定量は、ＤＮＡ塩基数（鎖長）によらずほぼ一定であること、金微粒子の修飾部位であるビオチンへの修飾に際してアビジンコート金微粒子の直径に最適値があり、またその修飾量はＤＮＡ塩基数に依存することを知見し、従って、金薄膜表面において、プローブＤＮＡ塩基数の違いによってプローブＤＮＡの立体的構造が変化していることを知見した。
【００１２】
そこで、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討を行い、プローブＤＮＡの塩基数の違いによるＳＰＲ応答、すなわち金微粒子修飾を行ったプローブＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを施し、その後のＳＰＲ角度のシフト量についての変化や挙動を検討したところ、塩基数１０では金微粒子修飾量が少なく、塩基数３０では修飾量が増大するが、いずれも該シフト量の増大効果が少ないこと、塩基数６０では金微粒子修飾ができないことを知見した。
【００１３】
さらに、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討、特に塩基数６０以上の長いプローブＤＮＡにおけるＳＰＲ応答の増幅を目的に種々検討した結果、前述のごとく検出チップに吸着固定したプローブＤＮＡに先に金微粒子修飾するのではなく、まず先にサンプルとのハイブリダイゼーションを施すと、検出チップの薄膜上でループ状となって配列していたプローブＤＮＡが伸びて金微粒子修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後に金微粒子修飾を行う工程にて、長いプローブＤＮＡにも修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ金微粒子修飾できることから、ＳＰＲ角度のシフト量が増大して二重螺旋構造のＤＮＡの検出精度を著しく高精度にすることが可能であることを知見した。
【００１４】
さらに、発明者らは、先の金微粒子修飾に換えてハイブリダイゼーション後のプローブＤＮＡにＦｅ粒子コロイドを用いてＦｅ粒子標識の修飾を行ったところ、金微粒子修飾同様にハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみＦｅ粒子標識を設けることが可能であり、従来のような検体ＤＮＡに標識を修飾する必要がなく工程が簡素化されるとともに、目的ＤＮＡと結合したプローブＤＮＡのみを検出できるように構成できることからＳＰＲ分光法、光散乱法、顕微鏡観察法、磁気検出法などにて簡単に高精度な検出が可能であることを知見し、この発明を完成した。
【００１５】
すなわち、この発明は、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、標識修飾が可能な部位が基板側に位置するようループ構造を形成している基板表面のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいはその両方に金属微粒子修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいはその両方の金属微粒子を検出する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。また、この発明は、予め金属微粒子修飾を行った検体ＤＮＡを用いて実施することができる。
【００１６】
さらに、この発明は、表面に貴金属薄膜を成膜した基板からなり、該薄膜上に配列されたプローブＤＮＡを有し、かつ各プローブＤＮＡがループ構造を形成して金属微粒子修飾可能にした部位が薄膜側にあることを特徴とする生化学検体の検出チップである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下にこの発明の特徴である各プローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端が基板表面側にあるように構成した検出チップ並びにループ構造について説明する。
【００１８】
まず、検出チップの作製について説明すると、ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。
その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００１９】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、プローブの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチンで修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ  ７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。なお、プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。
【００２０】
金コロイド修飾方法は、上記の検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４）で洗浄後、窒素ガスでおだやかに乾燥させ、表面にアビジンをコートした金コロイド（粒径１０ｎｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時間、飽和水蒸気中で放置することで、ビオチンとアビジンの特異的結合を利用して修飾させた。
【００２１】
ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６時間放置して実施した。
【００２２】
ＳＰＲ測定は、検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄後に窒素ガスで乾燥し速やかにＳＰＲ測定を行なった。
【００２３】
上記方法で、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製した。この時、プローブＤＮＡの金薄膜への吸着量をＳＰＲ測定により評価した。プローブＤＮＡの塩基数が大きくなるにつれ、ＳＰＲ角度のシフトが大きくなった。また、ＳＰＲ角度シフトを分子量で割った値は、吸着量に比例するため、これを求めたところ、プローブＤＮＡの吸着効率は、塩基数１０が最もよく、３０、６０では、大きな変化がないこと、さらに塩基数による吸着効率の変化は、１０、１００倍と大きく変化するものではなく、塩基長によらずオーダーとしてほぼ一定であることを確認した。なお、ここでは基板への被覆率約２５％を達成した。
【００２４】
また、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製し、それぞれ上記金コロイド修飾方法により修飾を行い、塩基数による金コロイド修飾量の変化をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で観察し、修飾された金コロイド粒子数を計測したところ、塩基長１０では、約４００個／μｍ2、塩基長３０では、約７００個／μｍ2の金コロイドの修飾が観察されたが、塩基長６０では、金コロイドの修飾が全く観察されなかった。
【００２５】
これを確認するため、ＳＰＲ法を用いｉｎ−ｓｉｔｕでのＤＮＡプローブに対する金コロイド修飾の挙動を観察した。すなわち、検出チップをプリズム上に接着し、基板表面を上述のＲ−ＢＦＲ溶液で満たし、これに、金コロイド溶液を滴下し、ある一定入射角での反射光強度を継時的に観測したところ、金コロイド修飾が行なわれた場合にはＳＰＲ角度がシフトし、反射光強度の上昇が観察されるが、塩基数６０のＤＮＡでは、反射強度の変化が無くＡＦＭでの観察と同様、金コロイドの修飾が行なわれないことを確認した。
【００２６】
検出チップ金薄膜へのプローブＤＮＡの吸着は、プローブＤＮＡの鎖長に依らずオーダー的にほぼ一定であるのに対し、金薄膜に固定化されたプローブＤＮＡに対する金コロイドの修飾効率は、プローブＤＮＡの鎖長に大きく依存することが判明し、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、まったく金コロイド修飾が起こらないことを確認した。
【００２７】
前述の合成によるプローブＤＮＡに換えて、実際のＯ−１９  ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これと相補的に結合する末端３０塩基、中央３０塩基、中央６０塩基の３種類をプローブＤＮＡとし、前述と同様の方法で検出チップを作製した。
【００２８】
上記の３種のプローブＤＮＡに対して前述した金コロイド修飾方法を行い、その後実際の長いＤＮＡ鎖を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００２９】
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化を示す表に明らかなように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、末端、中央、共に、ハイブリダイゼーションによる有意差が小さく、また、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、全く金コロイドが修飾されず、実際の長い遺伝子を目的遺伝子とした場合、上記の条件では、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出は困難であることを確認した。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化から、８５６ｂｐの長いＤＮＡを目的遺伝子とした場合、プローブ鎖と比べて、目的遺伝子が約１４〜２８倍長いため、立体的な制約によりプローブＤＮＡと反応する確率が低いと考えられる。従って、ハイブリダイゼーションしたプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合と、ハイブリダイゼーションしていないプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合とでＳＰＲ角度のシフトにバラツキがみられると推測される。
【００３２】
そこで先の工程、すなわち金コロイド修飾方法を行い、その後ハイブリダイゼーションを実施する工程とは逆に、上記と同じプローブＤＮＡの検出チップに対してハイブリダイゼーションを実施した後、金コロイド修飾方法を行い、その後ＳＰＲ法による前記ハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００３３】
すなわち、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が行なわれないと推測される。ループ構造をとっている長い１本鎖ＤＮＡはハイブリダイゼーションによりそのループ構造が解消された後に、金コロイド修飾を行なえば金コロイド修飾が可能であると推測される。そこで６０塩基のＤＮＡプローブにおいても同様の手法を用いれば金コロイド修飾が可能であると考えた。図１Ａ，Ｂ参照。
【００３４】
換言すれば、目的遺伝子がない場合には、ハイブリダイゼーションは起こらずかつ金コロイド修飾が行なわれない。これに対して、目的遺伝子がある場合には、ハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されることににより、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡプローブにのみ選択的に金コロイド修飾が起こり、ＳＰＲ測定でハイブリダイゼーションによるシフトに金コロイド修飾によるシフトが加わった大きなＳＰＲ角度シフトの差が得られると考えた。
【００３５】
そこで、実際の長いＤＮＡ鎖を目的遺伝子とした検出チップを用い、前述の各工程で、プローブＤＮＡの基板への付着、ハイブリダイゼーション、金コロイド修飾を実施し、水溶液中でのＳＰＲ角度シフト並びに空気中でのＳＰＲ角度シフトを測定した。
【００３６】
プローブＤＮＡのみの場合には、金コロイド修飾を行なってもＳＰＲ角度シフトが見られないが、プローブＤＮＡにハイブリダイゼーションが起こった場合には、ＳＰＲ角度が大きくシフトして金コロイド修飾が行われていることが明らかになった。
【００３７】
すなわち、空気中でのＳＰＲ角度シフトの測定結果を表２に示すように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトの増幅作用が小さく、また、サンプル間における偏差も大きかった。それに対して、６０塩基のプローブＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾した場合には、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトが約４〜５倍増幅され、かつサンプル間における偏差も小さかった。
【００３８】
要するに、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾を行うことにより、溶液中、空気中ともに、６０塩基プローブＤＮＡの金コロイド修飾が可能となった。すなわち、６０塩基プローブＤＮＡの立体構造（ループ構造）を利用することにより、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に金コロイド修飾させることが可能であり、その結果、大きなＳＰＲ角度シフトの増幅が可能で、サンプル間の偏差を小さくすることが可能であることを確認した。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
この発明は、以上の知見に基づきなされたもので、前記の金コロイド修飾に換えて、Ｆｅ微粒子などの金属微粒子を修飾することで、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的にＦｅ微粒子標識の修飾が可能であり、ＳＰＲ分光法、光散乱法、磁気検出法、微分干渉顕微鏡を用いた顕微鏡画像解析装置などの公知の方法で測定することで、バックグランドノイズを大幅に低減して目的ＤＮＡを検出できるのである。また、検体ＤＮＡに金属微粒子標識の修飾を行うことも可能であり、予め検体ＤＮＡに金属微粒子標識を設けておき、プローブＤＮＡにこの検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションすることができる。また、ハイブリダイゼーション工程の実行中又は実行後に検体ＤＮＡに金属微粒子標識を修飾することができ、この際同時にプローブＤＮＡにも修飾することもでき、これらに修飾された金属微粒子標識を目的に検知できる。
【００４１】
この発明において、基板には、ガラス基板、樹脂基板、シリコン基板等のプローブＤＮＡの配列が実施可能な基板であればいずれの材質も採用できる。また、基板に貴金属薄膜を成膜する場合は、その表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。洗浄、乾燥方法としては、実施例に示すごとく、半導体ウエーハや各種デバイスを製造する際に採用される、各種溶剤による洗浄、純水中の超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、ブロー乾燥、スピン乾燥など公知の基板の洗浄、乾燥方法を適宜選択、組合せて採用できる。
ガラス基板としては、公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚いほうが取り扱いやすいが、いずれの厚みのものも利用できる。
【００４２】
この発明において、プローブＤＮＡの配列を容易にするため、基板上に金、白金、銀などの貴金属薄膜を設けることができる。成膜方法としては膜厚みを一定に制御するため、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ等の公知の気相成長による方法が好ましい。なお、基板と薄膜との密着性を向上させるために下地層を適宜成膜することができる。例えば、ガラス基板、石英基板にＣｒ層を設けたり、シラン化合物によって表面改質するなどの手段を採用できる。
【００４３】
この発明において、基板上、あるいはさらに貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば薄膜上を酸や純水で洗浄後、プローブＤＮＡと緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができる。
【００４４】
また、緩衝液としては、例えばＫＨ2ＰＯ4とＫ2ＨＰＯ4を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。他には、ＰＳＢや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用できる。
【００４５】
この発明において、プローブＤＮＡは、その末端を一方は基板表面あるいは基板上の貴金属薄膜に固定し、他方端あるいはその近傍には金属微粒子標識を修飾するために、各々の前記末端を前記基板表面あるいは金属微粒子標識と接合可能な物質で修飾しておくことが望ましい。
【００４６】
この発明において、基板表面に配列したプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に検体ＤＮＡと緩衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることができる。
緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。
また、ガラス基板に金薄膜を設ける場合では、ハイブリダイゼーション時の温度を３０〜４０℃に保持することが好ましい。
【００４７】
この発明において、金属微粒子標識は、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏなどの各種金属の微粒子を用いるもので、特に微粒子の形状や粒径寸法や均一性は任意に適宜選択でき、特に必須条件ではないが、ＤＮＡの所要部位に修飾可能とすること、微粒子表面に成膜可能なことなどから、１μｍ以下が好ましく、数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られる微粒子が好ましい。
【００４８】
この発明において、金属微粒子標識をプローブＤＮＡに修飾する方法としては、例えば金属微粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識を修飾する方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾するなど、公知のいずれの方法も採用できる。また、中性のコロイダル液のごとく、金属微粒子を均一分散させた溶液の形態を利用することで修飾が容易になる。
【００４９】
また、プローブＤＮＡの末端にビオチンを修飾しておき、ストレプトアビジンをコートした金属微粒子をビオチン−アビジンの高い結合能力を利用して標識となすことができる。さらに、プローブＤＮＡの末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加することで、タンパクをコートした金属微粒子を抗原−抗体反応を利用して修飾させることが可能である。
【００５０】
この発明において、ハイブリダイゼーション後のプローブＤＮＡに設けられた金属微粒子標識を検出する方法としては、ＳＰＲ分光法、光散乱法、磁気検出法、顕微鏡観察法、微分干渉顕微鏡を用いた顕微鏡画像解析装置などが利用できる。
【００５１】
ＳＰＲ分光法は、貴金属薄膜表面おける屈折率変化を検出するもので、例えばガラス基板上に金薄膜を形成し、金薄膜上にプローブＤＮＡを固定化し、プローブＤＮＡが検体ＤＮＡ中の目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成すると、金薄膜上の屈折率が変化するためにＳＰＲ角（反射率が最小となる入射角度）がシフトするが、ＳＰＲ角のシフトはハイブリダイゼ一ションした目的ＤＮＡの量と対応するために、ＳＰＲ測定によってＤＮＡハイブリダイゼーションの定量的な解析が可能となる。
【００５２】
ＳＰＲ法の測定システムとしては、公知のいずれの構成も採用可能である。例えば実施例では、光源としＨｅ−Ｎｅレーザー（波長６３２．８ｎｍ）を用い、偏光子によってｐ−偏光としプリズムを介して全反射条件で貴金属薄膜基板に照射し、基板からの反射光をフォトダイオードにより検出し、得られた信号は、光チョッパー、ロックインアンプを用いて外部ノイズを取り除き増幅を行うことができる。なお基板は、屈折率整合剤を介してプリズム上に付着させ回転ステージ上に固定し、この回転ステージを回転させて入射角の変化を得ることができ、また、その際、フォトダイオードも基板を固定した回転ステージと同調させ回転、移動させることができる。
【００５３】
この発明において、顕微鏡観察法は、公知の蛍光や散乱光の検出システムとして、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せたイメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム、金属顕微鏡等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されているが、これらをそのまま利用することが可能である。
【００５４】
この発明において、プローブＤＮＡの塩基数は特に限定しないが、ハイブリダイゼーション後に、目的ＤＮＡと２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ標識を修飾するには、チップ基板上にあるプローブＤＮＡはハイブリダイゼーション前にループ構造を形成して解放末端側あるいは修飾可能な部位が薄膜側にある必要がある。
【００５５】
この発明において、プローブＤＮＡは、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、方法も採用できる。例えば、図２Ａ，Ｂに示すごとく、相補的な二重螺旋構造を形成可能な対をなすＤＮＡの配列を予め形成しておき、ループ構造を形成し得るように構成することが可能であり、塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するものが望ましく、好ましくは塩基数が６０以上である。さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適用できる。
【００５６】
この発明による生化学検体の検出チップの好ましい構成は、表面に金などの貴金属薄膜を成膜したガラスなどの基板からなり、該薄膜上に配列された塩基数が６０以上のプローブＤＮＡを有し、かつ各プローブＤＮＡがループ構造を形成して金属微粒子標識を修飾可能にした部位が薄膜側にある構成である。
【００５７】
【実施例】
実施例１
ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。
その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００５８】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、３０塩基、６０塩基のプローブＤＮＡの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチン修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ  ７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。
【００５９】
プローブＤＮＡの金属微粒子修飾は、５’端側とビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートした平均粒径が１μｍ程度のＦｅ微粒子を用いて、ｐＨ  ７．４のコロイダル液となして実施した。
【００６０】
プローブＤＮＡと完全に相補的な６０塩基の目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６時間放置して実施した。
【００６１】
また、比較のために同様の検出チップを作製した後、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートしたＦｅ微粒子標識の修飾処理を行った。
【００６２】
ＳＰＲ測定は、検出チップを超純水で洗浄後に窒素ガスで乾燥し速やかにＳＰＲ測定を行なった。ＳＰＲ測定はイメージングシステムを用いて行った。その結果、３０塩基のプローブＤＮＡの検出チップでは、全てのプローブＤＮＡにＦｅ微粒子標識がされているようでハイブリダイゼーション前後で差が見られなかった。
【００６３】
塩基数６０のプローブＤＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション前ではＦｅ微粒子標識の修飾が全く実施できず、ハイブリダイゼーション後ではＦｅ微粒子標識の修飾が行われたことから、ハイブリダイゼーション前後で明らかな差が見られた。
【００６４】
実施例２
実施例１の合成による目的ＤＮＡに換えて、実際のＯ−１９  ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これらと相補的に結合する末端３０塩基、中央３０塩基、中央６０塩基の３種類をプローブＤＮＡとし、実施例１と同様の方法で検出チップを作製した。
【００６５】
上記の３種のプローブＤＮＡに対して実際の長いＤＮＡ鎖を用いて実施例１と同様にハイブリダイゼーションを実施した後、実施例１に示すごとくＦｅ微粒子コロイダル修飾方法を行い、その後実施例１と同方法でＦｅ微粒子の検出を実施した。その結果、実施例１と同様の結果を得た。
【００６６】
また、上記のハイブリダイゼーションを実施する際に、目的遺伝子がある場合と、ない場合を設定して、Ｆｅ微粒子コロイダル修飾を行い、その後、微分干渉顕微鏡にて観察を行った。その結果を図３に示す。図３に明らかなように、目的遺伝子がある場合には、Ｆｅ微粒子を多数観察されたが、目的遺伝子がない場合には、Ｆｅ微粒子はほとんど観察されなかった。
【００６７】
【発明の効果】
この発明は、Ｆｅ微粒子などの金属微粒子標識を用いてハイブリダイゼーションを検出する方法であり、プローブＤＮＡの解放末端側が基板側に向くようにループ構造を取る構成を採用することで、目的検体がある場合にはハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されるため、金属微粒子標識を解放末端に修飾することが可能になり、この標識を検知することでバックグランドノイズが少なく、検出精度を高精度化できる利点がある。また、工程全体の簡素化を図ることが可能である。
【００６８】
また、この発明による検出チップは、ループ構造を取っているプローブＤＮＡに検体ＤＮＡが結合するには強い結合力を必要とするため、プローブＤＮＡと検体ＤＮＡとの非特異的結合が少なくなり、よって目的ＤＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、その結果、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡにのみ金属微粒子標識を設けることが可能で、金属微粒子の有無だけを観測して目的遺伝子の存在を確認できる利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ハイブリダイゼーションによるループ構造の解消と金コロイド修飾の状況を示す模式図であり、Ａは目的遺伝子がない場合、Ｂは目的遺伝子が有る場合を示す。
【図２】Ａ、Ｂはこの発明におけるプローブＤＮＡのループ構造の概念を示す説明図である。
【図３】Ａ、Ｂはこの発明による検出チップを微分干渉顕微鏡にて観察を行った際の顕微鏡写真の模写図であり、Ａは目的遺伝子がある場合、Ｂは目的遺伝子がない場合である。
【図１】
0003847623.tif 000004
【図２】
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【図３】
0003847623.tif 000006