(57)【要約】インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質を有効成分とする、造血器腫瘍細胞におけるＨＭ１．２４抗原の発現の誘導又は増強剤、並びに該誘導剤又は増強剤とＨＭ１．２４に対する抗体との組合せから成る、造血器腫瘍に対する抗腫瘍剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質を有効成分とする、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質（ＨＭ１．２４抗原）の造血器腫瘍細胞における発現増強剤または発現誘導剤。
【請求項２】
前記造血器腫瘍が、白血病、リンパ腫または骨髄腫である請求項１から４のいずれか１項に記載の発現増強剤または発現誘導剤。
【請求項３】
前記白血病が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病である請求項２に記載の発現増強剤または発現誘導剤。
【請求項４】
前記リンパ腫がホジキン病、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫またはＢ細胞性非ホジキンリンパ腫である請求項２に記載の発現増強剤または発現誘導剤。
【請求項５】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項２に記載の発現増強剤または発現誘導剤。
【請求項６】
有効成分として、（１）インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質、および（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体、を含んでなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項７】
インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質と併用することを特徴とし、有効成分として配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を含んでなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項８】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体と併用することを特徴とし、有効成分として、インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質を含む造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項９】
前記造血器腫瘍が、白血病、リンパ腫または骨髄腫である請求項６から８のいずれか１項に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１０】
前記白血病が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病である請求項９に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１１】
前記リンパ腫がホジキン病、Ｔ細胞系非ホジキンリンパ腫またはＢ細胞系ホジキンリンパ腫である請求項９に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１２】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項９に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１３】
前記抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項６から８のいずれか１項に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１４】
前記細胞傷害活性がＡＤＣＣ活性である請求項１３に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項６から１４のいずれか１項に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である請求項１５に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗体が寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３であるハイブリドーマによって産生される抗ＨＭ１．２４抗体である請求項１５に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１８】
前記キメラ抗体またはヒト型化抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３であるハイブリドーマによって産生される抗ＨＭ１．２４抗体のキメラ抗体またはヒト型化抗体である請求項１６に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１９】
造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、
（１）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体；および
（２）上記抗体を、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を増強する薬剤と組み合わせて患者に投与することを指示する指示書；
を含むキット。
【請求項２０】
造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、
（１）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を増強する薬剤；および
（２）上記薬剤を、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて患者に投与することを指示する指示書；
を含むキット。
【請求項２１】
造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を増強する薬剤；
（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体；および
（３）上記薬剤および抗体を組み合わせて患者に投与することを指示する指示書；
を含むキット。
【請求項２２】
ＨＭ１．２４抗原の発現増強剤をスクリーニングする方法であって、（１）ＨＭ１．２４遺伝子プロモーター領域を有するレポーター遺伝子を有する細胞を調製する工程；
（２）前記細胞に被験物質を接触させる工程；並びに
（３）レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
を含む方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって選択されるＨＭ１．２４抗原の発現増強剤。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現増強剤を含み、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを特徴とする造血器腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項２５】
ＩＲＦ−２タンパク質の発現を増強する薬剤をスクリーニングする方法であって、
（１）細胞と被験物質とを接触させる工程；並びに
（２）前記細胞のＩＲＦ−２蛋白の発現量を測定する工程、
を含む方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法によって選択されるＩＲＦ−２タンパク質の発現増強剤。
【請求項２７】
請求項２６に記載の発現増強剤を含み、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを特徴とする造血器腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項２８】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質（ＨＭ１．２４抗原）の造血器腫瘍細胞における発現増強剤または発現誘導剤の製造のためのインターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質使用。
【請求項２９】
前記造血器腫瘍が、白血病、リンパ腫または骨髄腫である請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記白血病が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病である請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記リンパ腫がホジキン病、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫またはＢ細胞性非ホジキンリンパ腫である請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物の製造のための、（１）インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質、および（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体の使用。
【請求項３４】
インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質と併用される造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物の製造のための、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体の組合せ使用。
【請求項３５】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体と併用される、造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物の製造のためのインターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質の使用。
【請求項３６】
前記造血器腫瘍が、白血病、リンパ腫または骨髄腫である請求項３３から３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
前記白血病が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病である請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記リンパ腫がホジキン病、Ｔ細胞系非ホジキンリンパ腫またはＢ細胞系ホジキンリンパ腫である請求項３６に記載の使用。
【請求項３９】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項３６に記載の使用。
【請求項４０】
前記抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項３３から３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
前記細胞傷害活性がＡＤＣＣ活性である請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項３３から４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記抗体が寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３であるハイブリドーマによって産生される抗ＨＭ１．２４抗体である請求項４５に記載の使用。
【請求項４５】
前記キメラ抗体またはヒト型化抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３であるハイブリドーマによって産生される抗ＨＭ１．２４抗体のキメラ抗体またはヒト型化抗体である請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用する造血器腫瘍治療用医薬組成物の製造のための、請求項２３に記載の発現増強剤の使用。
【請求項４７】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用する造血器腫瘍治療用医薬組成物の製造のための請求項２６に記載の発現増強剤の使用。
【請求項４８】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質（ＨＭ１．２４抗原）の造血器腫瘍細胞における発現増強または発現誘の方法において、インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質を投与することを含んで成る方法。
【請求項４９】
前記造血器腫瘍が、白血病、リンパ腫または骨髄腫である請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記白血病が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記リンパ腫がホジキン病、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫またはＢ細胞性非ホジキンリンパ腫である請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
造血器腫瘍の治療方法において、（１）インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質、および（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を投与することを含んで成る方法。
【請求項５４】
前記造血器腫瘍が、白血病、リンパ腫または骨髄腫である請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記白血病が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病である請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記リンパ腫がホジキン病、Ｔ細胞系非ホジキンリンパ腫またはＢ細胞系ホジキンリンパ腫である請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞傷害活性がＡＤＣＣ活性である請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項５３から５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗体が寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３であるハイブリドーマによって産生される抗ＨＭ１．２４抗体である請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記キメラ抗体またはヒト型化抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３であるハイブリドーマによって産生される抗ＨＭ１．２４抗体のキメラ抗体またはヒト型化抗体である請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
造血器腫瘍の治療用方法において、請求項２３に記載の発現増強剤と、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを含んで成る方法。
【請求項６５】
造血器腫瘍の治療方法において、請求項２６に記載の発現増強剤と、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、骨髄腫におけるＨＭ１．２４抗原の発現増強剤としてのインターフェロンα及びインターフェロンγ並びにＩＲＦ−２蛋白質の使用に関する。
また、本発明は、リンパ球系腫瘍におけるＨＭ１．２４抗原の発現増強剤としてのインターフェロンαおよびインターフェロンγ並びにＩＲＦ−２蛋白質の使用に関する。さらに、本発明は、抗ＨＭ１．２４抗体とインターフェロンαまたはインターフェロンγとを用いて白血病を治療する方法に関する。
背景技術
正常ヒト末梢血中に存在する白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）には、顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）およびリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）があり、顆粒球はさらに細胞質内の特殊顆粒の染色性によって、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）に分けられる。これらの血球の産生は、共通の未分化な造血幹細胞から骨髄球系幹細胞およびリンパ球系幹細胞が分化し、さらにこれらの幹細胞から最終的に各系統の白血球が分化する。これら造血幹細胞を含めた血球系細胞は造血器細胞ともよばれている。造血器細胞の腫瘍（造血器腫瘍）には白血病、リンパ腫、骨髄腫等がある。
白血病は造血器細胞が腫瘍化した疾患であり、骨髄が白血病細胞により占拠され、正常造血機能が抑制されるために、正常血液細胞の産生が低下し、貧血、白血球減少症と血小板減少症が現れる。また、白血病細胞の発生源から骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）とリンパ球性白血病（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）に二大別され、さらにそれぞれ急性と慢性に分けられる。尚、亜型として、骨髄系とリンパ球系の二系統の細胞形質を有する系統混合白血病（ｍｉｘｅｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）も知られている。
腫瘍化は造血幹細胞レベルでおこり、分化、成熟のある一定の段階で分化が停止し、それより上流の細胞のみで腫瘍を構成している場合と、生体の調節能を逸脱し自律性増殖を示すものの、分化・成熟能を保持している場合がある。前者には急性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）が、後者には慢性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）や骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が含まれる。急性白血病は、増殖細胞の帰属から、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＭＬ）、急性単球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＭｏＬ）、急性赤白血病（ａｃｕｔｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ）、巨核芽球性白血病（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＬＬ）、に大別される。
また、亜型として急性前骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＰＬ）が知られている。尚、急性白血病と骨髄異形成症候群は、ＦＡＢ分類（Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により分類することができる。ＦＡＢ分類では、急性リンパ性白血病はＬ１、Ｌ２、Ｌ３に分類され、例えば、パーキットリンパ腫はＬ３に分類される。また、急性骨髄性白血病は、Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７に分類され、例えば、赤白血病はＭ６に、巨核芽球性白血病はＭ７に分類される。これらの分類方法、検査方法は周知であり、多くの成書に記載されている（例えば、新臨床内科学、高久史麿、尾形悦郎、医学書院、１９９９）。
慢性白血病も増殖細胞も帰属から、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）と慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＬＬ）に分類される。また、慢性骨髄性白血病の亜型として、慢性骨髄単球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）が知られ、慢性リンパ性白血病の亜型として前リンパ球性白血病（ｐｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）が知られている。
リンパ腫は、リンパ節などのリンパ組織を構成する細胞に由来する腫瘍の総称であり、主にリンパ球の腫瘍化によって引き起こされる造血器細胞腫瘍である。悪性リンパ腫（Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）は、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）と非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ；ＮＨＬ）に分けることができるが、いずれもリンパ球系細胞が腫瘍化したもので、Ｔ細胞系またはＢ細胞系に分けることができる。
非ホジキンリンパ腫には、Ｂ細胞系腫瘍である濾胞性リンパ腫、濾胞外套リンパ腫、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、ｐｒｅ−Ｂリンパ腫等がある。また、Ｔ細胞系腫瘍では、成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＴＬ）や非ＡＴＬ末梢性Ｔリンパ腫（ＰＮＴＬ）が知られている。また、Ｔ細胞とＢ細胞の２型のあるびまん性リンパ腫も非ホジキンリンパ腫に含まれる。さらに、亜型として、Ｂ細胞系腫瘍であるヘイリー細胞（有毛細胞）白血病（ｈａｉｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）が知られている。
リンパ球性白血病やリンパ腫は、リンパ球の主要構成細胞が腫瘍化したものであり、リンパ球系腫瘍とも呼ばれ、Ｂ細胞腫瘍とＴ細胞腫瘍に大別される。例えば、Ｂ細胞腫瘍には急性Ｂリンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性Ｂリンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、ｐｒｅ−Ｂリンパ腫、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、濾胞性リンパ腫、濾胞外套リンパ腫、びまん性リンパ腫等が含まれる。Ｔ細胞腫瘍には、急性Ｔリンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性Ｔリンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、非ＡＴＬ末梢性Ｔリンパ腫（ＰＮＴＬ）等が含まれる（図解臨床癌シリーズ、ＮＯ．１７  白血病・リンパ腫、杉村隆ら、ＭＥＤＩＣＡＬ  ＶＩＥＷ社、１９８７；Ｂ細胞腫瘍、高月清、西村書店  １９９１；新臨床内科学、高久史麿、尾形悦郎、医学書院、１９９９）。尚、骨髄腫もリンパ系腫瘍のひとつであるが、特徴的な臨床所見を呈する。
骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）は、形質細胞種（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ）、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）とも呼ばれ、モノクローナルな形質細胞の骨髄内集積を特徴とする腫瘍性疾患である。骨髄腫は、免疫グロブリンを産生し分泌する終末分化Ｂ細胞、すなわち形質細胞がモノクローナルに主として骨髄において増加する疾患で、この疾患の患者の血清中にはモノクローナルな免疫グロブリンもしくはその構成成分であるＬ鎖、Ｈ鎖などが検出される。
骨髄腫の治療としては、これまで化学療法剤等が使用されているが、完全寛解に導き、患者の生存期間を延長するような有効な治療剤は見いだされておらず、新たな作用メカニズムによる治療効果を有する薬剤の登場が待たれていた。また、リンパ腫や白血病では、ある程度有効な化学療法が開発されているが、副作用の点から新たな薬剤が望まれていた。
一方、Ｇｏｔｏ，Ｔ．らは、ヒト骨髄腫細胞をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体（マウス抗ＨＭ１．２４抗体）を報告している（Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４，１９２２−１９３０）。ヒト骨髄腫細胞を移植したマウスに抗ＨＭ１．２４抗体を投与すると、この抗体が腫瘍組織に特異的に集積したこと（小阪昌明ら、日本臨床（１９９５）５３，６２７−６３５）から、抗ＨＭ１．２４抗体はラジオアイソトープ標識による腫瘍局在の診断や、ラジオイムノセラピーなどのミサイル療法に応用することが可能であることが示唆されている。
また、上記Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４，１９２２−１９３０には、抗ＨＭ１．２４抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６に対して細胞傷害活性を有することが述べられている。また、マウス抗ＨＭ１．２４抗体をキメラ化したキメラ抗ＨＭ１．２４抗体、およびヒト型化した再構成抗ＨＭ１．２４抗体が、骨髄腫細胞に特異的に結合すること、さらには細胞傷害活性を有することが示されている（Ｂｌｏｏｄ（１９９９）９３，３９２２−３９３０）。
一方、リンパ球系腫瘍に関しても、抗ＨＭ１．２４抗体が認識する抗原タンパク質がリンパ球系腫瘍に発現していること、および抗ＨＭ１．２４抗体がリンパ球系腫瘍に対し、ＣＤＣ活性やＡＤＣＣ活性による細胞傷害活性を有し、抗腫瘍効果を発現することが示されている（ＷＯ９８／３５６９８）。このように、ＨＭ１．２４抗原は、終末分化Ｂ細胞である骨髄腫細胞のみならず、リンパ球系腫瘍においても高発現しており、ＨＭ１．２４抗原を認識する抗ＨＭ１．２４抗体は、リンパ球系腫瘍の治療剤として有用であることが示されている。
このように、ＨＭ１．２４抗原は、終末分化Ｂ細胞である骨髄腫細胞やリンパ球系腫瘍細胞に特異的に高発現しており、この抗原を認識する抗ＨＭ１．２４抗体は、細胞表面のＨＭ１．２４抗原分子数に比例して殺細胞活性を発揮することから、抗ＨＭ１．２４抗体を用いた免疫療法は多発性骨髄腫やリンパ球系腫瘍に有効な治療法と考えられる。従って、抗ＨＭ１．２４抗体の抗原であるＨＭ１．２４抗原の細胞表面上の発現量を増強することができれば、より少量の抗体投与により同等の細胞傷害活性が期待でき、副作用をより低下させることが可能となる。
さらに、ＨＭ１．２４抗原を発現していない造血器腫瘍細胞に対して、細胞表面上のＨＭ１．２４抗原の発現量を増強することができれば、通常は抗ＨＭ１．２４抗体単独では効果を示さない造血器腫瘍細胞に対しても、抗ＨＭ１．２４抗体によるＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を介した細胞傷害活性、殺細胞活性を期待することができる。
一方、ウイルス増殖抑制活性を示す物質として発見されたインターフェロンは、現在、ほ乳類においては、α，β，γ及びωの４種類に分類され、多彩な生理活性を有することが知られている（Ｐｅｓｔｋａ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）５６，７２７−７７７；Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８８）９，３９３−４００）。しかしながら、インターフェロンαおよびインターフェロンγが、骨髄腫細胞やリンパ球系腫瘍等の造血器腫瘍細胞において、ＨＭ１．２４抗原の発現量を増加させる作用を有することについては報告がなかった。
他方、インターフェロン調節因子（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）（ＩＲＦ）−１および２は、ＩＦＮ−β遺伝子の転写調節因子として同定された。ＩＲＦ−１および２は一般に同じ遺伝子制御配列に結合し、ＩＲＦ−１は転写活性化因子、ＩＲＦ−２は転写抑制因子として拮抗的に作用することが知られている。ＩＲＦ−２を高発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞は細胞飽和密度の上昇、メチルセルロースゲルでのコロニー形成、ヌードマウスでの造腫瘍性が認められ、ＩＲＦ−２は癌遺伝子として機能することが明らかになっている。
一方、最近の研究の進展により、ＩＲＦ−２が細胞周期の調節に働くヒストンＨ４の発現に必要であることが示されている。また、ＩＲＦ−２は筋肉細胞においてｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１）の発現を上昇させることが示され、ＶＣＡＭ−１の活性化にはＩＲＦ−２の酸性領域（１８２から２１８）が作用していることも明らかになっている。このことからＩＲＦ−２は転写抑制因子として働くばかりでなく、転写活性化因子として作用を示す場合も知られている。
しかしながら、ＩＲＦ−２蛋白質がＨＭ１．２４抗原遺伝子のプロモーター（ＨＭ１．２４プロモーター）に結合し、該プロモーターを活性化することは知られていなかった。
発明の開示
現在行われている骨髄腫の治療は、上記のごとく、未だ完全ではなく、骨髄腫を完全寛解に導き、患者の生存期間を延長させる画期的な治療剤あるいは治療法が待たれている。抗ＨＭ１．２４抗体による骨髄腫の治療は、特異性及び有効性の点で画期的な治療剤となる可能性があり、抗ＨＭ１．２４抗体の作用をより効果的に発揮させる方法が望まれている。
また、現在行われているリンパ球系腫瘍の治療には、種々の化学療法、Ｘ線療法、骨髄移植等が挙げられるが、いずれの治療方法も未だ完全ではなく、リンパ球系腫瘍を寛解に導き、患者の生存期間を延長させる画期的な治療剤あるいは治療法が待たれている。さらには、リンパ性白血病以外の白血病、すなわち、急性骨髄性白血病や慢性骨髄性白血病等の骨髄性白血病に効果のある治療法が待たれている。これら骨髄腫、リンパ球系腫瘍、骨髄性白血病を、寛解に導き、患者の生存期間を延長させることができる薬剤や治療方法は、造血器腫瘍全般の治療薬、治療方法となりうる。
従って、本発明の目的のひとつは、骨髄腫細胞において、ＨＭ１．２４抗原の発現量を増加させることで、抗ＨＭ１．２４抗体の骨髄腫抑制作用を増強させる手段を提供することである。
また、本発明のもうひとつの目的は、リンパ球系腫瘍において、ＨＭ１．２４抗原の発現量を増加させることで、抗ＨＭ１．２４抗体のリンパ球系腫瘍抑制作用を増強させる手段を提供することである。
さらに、本発明のさらなる目的は、骨髄性白血病において、ＨＭ１．２４抗原の発現を新たに誘導する手段を提供し、抗ＨＭ１．２４抗体による骨髄性白血病抑制作用を誘導する手段を提供することである。
これらは、ＨＭ１．２４抗原の発現量を増強するか、もしくは、新たにＨＭ１．２４抗原を誘導する手段を用いて、抗ＨＭ１．２４抗体により造血器腫瘍を治療する手段を提供するものである。
本発明者らは、かかる方法を提供すべく、ＨＭ１．２４抗原の発現量を増加させるまたは新たにＨＭ１．２４抗原を細胞表面上に発現させる薬剤を探索した結果、インターフェロンα、インターフェロンγおよびＩＲＦ−２蛋白質が所望の活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、インターフェロンα、インターフェロンγ、またはＩＲＦ−２蛋白質を有効成分とする、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質（ＨＭ１．２４抗原）の造血器腫瘍細胞における発現増強剤または発現誘導剤を提供する。
前記造血器腫瘍は、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫などであり、この白血病としては急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病などが挙げられ、前記リンパ腫としては、ホジキン病、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫などが挙げられ、前記骨髄腫としては多発性骨髄腫が挙げられる。
本発明者はまた、上記のＨＭ１．２４抗原発現増強剤または発現誘導剤によりＨＭ１．２４抗原が発現した造血器腫瘍細胞に、該ＨＭ１．２４抗原に特異的に結合する抗原を結合させることにより、該造血器腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を増強することができることを見出した。
従って本発明はまた、インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質と併用することを特徴とし、有効成分として配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を含んでなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物を提供する。
本発明はまた、有効成分として（１）インターフェロンα、インターフェロンγまたはＩＲＦ−２蛋白質、および（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体、を含んでなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物を提供する。
本発明はまた、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体と併用することを特徴とし、有効成分として、インターフェロンα、インターフェロンγ、またはＩＲＦ−２蛋白質を含む造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物を提供する。
前記の造血器腫瘍は、例えば、白血病、リンパ腫または骨髄腫である。上記白血病としては急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病などが挙げられ、上記リンパ腫としてはホジキン病、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫などが挙げられ、そして上記骨髄腫としては多発性骨髄腫等が挙げられる。
前記抗体は、好ましくは細胞傷害活性を有する抗体であり、この細胞傷害活性は例えばＡＤＣＣ活性である。抗体は好ましくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、またはヒト抗体である。モノクローナル抗体は、好ましくは寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３であるハイブリドーマによって産生される抗ＨＭ１．２４抗体であり、前記キメラ抗体またはヒト型化抗体は、好ましくは寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３であるハイブリドーマによって産生される抗ＨＭ１．２４抗体のキメラ抗体またはヒト型化抗体である。
本発明はさらに、造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、
（１）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体；および
（２）上記抗体を、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を増強する薬剤と組み合わせて患者に投与することを指示する指示書；
を含むキットを提供する。
本発明はまた、造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を増強する薬剤；および
（２）上記薬剤を、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて患者に投与することを指示する指示書；
を含むキットを提供する。
本発明はまた、造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を増強する薬剤；
（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体；および
（３）上記薬剤および抗体を組み合わせて患者に投与することを指示する指示書；
を含むキットを提供する。
本発明はまた、ＨＭ１．２４抗原の発現増強剤をスクリーニングする方法であって、
（１）ＨＭ１．２４遺伝子プロモーター領域を有するレポーター遺伝子を有する細胞を調製する工程；
（２）前記細胞に被験物質を接触させる工程；
（３）レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
を含む方法を提供する。
本発明はまた、上記の方法によって選択されるＨＭ１．２４抗原の発現増強剤を提供する。
本発明はまた、上記の発現増強剤を含み、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを特徴とする造血器腫瘍治療用医薬組成物を提供する。
本発明はまた、発現を増強する薬剤をスクリーニングする方法であって、
（１）細胞と被験物質を接触させる工程；
（２）前記細胞のＩＲＦ−２蛋白の発現量を測定する工程、
を含む方法を提供する。
本発明はまた、上記の方法によって選択されるＩＲＦ−２タンパク質の発現増強剤を提供する。
本発明はまた、上記の発現増強剤を含み、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを特徴とする造血器腫瘍治療用医薬組成物を提供する。
発明の実施の形態
インターフェロンα及びインターフェロンγ
インターフェロンは、ウイルス増殖抑制活性を示す物質として発見されたものであり、現在、哺乳類においてはα、β、γ、ωの４種類が知られている。これらは、ウイルス増殖抑制活性に加え、細胞増殖抑制活性や多彩な免疫調節作用を示すことが知られ、既に医薬品として使用されている（インターフェロン“サイトカイン”、大沢利昭編、（１９９０）１１５〜１３３、東京化学同人；Ｐｅｓｔｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）５６，７２７〜７７７；Ｌａｎｇｅｒ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８８）９，３９３〜４００）。
本発明で使用されるインターフェロンα及びインターフェロンγは、ＨＭ１．２４抗原の発現量を増加させる活性を有する限り変異体を用いることも可能である。ＨＭ１．２４抗原の発現量を測定するには、実施例に記載されたように、骨髄腫細胞株あるいは骨髄腫患者から採取した骨髄腫細胞を用いて、フローサイトメトリーにより検出することができる。変異体としては、例えば、１もしくは数個、あるいは複数個のアミノ酸残基が、欠失または置換または挿入または付加等により変異されたインターフェロンα及びインターフェロンγであってもよい。
欠失または置換または挿入を蛋白に導入する方法としては、対応する遺伝子を改変する部位特異的変異誘発法を用いることができる（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ（１９９５）１５２，２７１−２７５，Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）１００，４６８−５００，Ｋｒａｍｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４）１２，９４４１−８４５６，Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２，４８８−４９２、「新細胞工学実験プロトコール  東京大学医科学研究所  制癌研究部編（１９９３）ｐ２４１−２４８」）。
また、市販のＰＣＲを利用した「部位特異的変異誘発システム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）や「ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」（ストラタジーン社製）を利用することも可能である。また、蛋白質中のアミノ酸の変異は自然界においても生じることもある。また、この様に変異を導入された蛋白がもとの蛋白と同様の活性を有することは、Ｍａｒｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６に示されている。
アミノ酸残基の置換においては、性質の保存されたアミノ酸どうしで置換することが好ましい。例えば、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）どうしの置換が好ましい。
さらに、変異体としては、インターフェロンα又はインターフェロンγのペプチド断片を用いることも可能である。特に、インターフェロンα又はインターフェロンγ受容体との結合部位を有するペプチド断片が好ましい。好ましくは１００個以上、さらに好ましくは１３０個以上、さらに好ましくは１５０個、最も好ましくは１６０個以上の連続するアミノ酸残基から構成されるペプチド断片である。
ＩＲＦ−２蛋白質
インターフェロン調節因子（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）（ＩＲＦ）−１および２はＩＦＮ−β遺伝子の転写調節因子として同定された（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，８３７２  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８９）５８，７２９）。ＩＲＦ−１および２は一般に同じ遺伝子制御配列に結合し、ＩＲＦ−１は転写活性化因子、ＩＲＦ−２は転写抑制因子として拮抗的に作用することが知られている。ＩＲＦ−２を高発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞は細胞飽和密度の上昇、メチルセルロースゲルでのコロニー形成、ヌードマウスでの造腫瘍性が認められ、ＩＲＦ−２は癌遺伝子として機能することが明らかになっている。
一方、最近の研究の進展により、ＩＲＦ−２が細胞周期の調節に働くヒストンＨ４の発現に必要であることが示されている。また、ＩＲＦ−２は筋肉細胞においてｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１）の発現を上昇させることが示され、ＶＣＡＭ−１の活性化にはＩＲＦ−２の酸性領域（１８２から２１８）が作用していることも明らかになっている。このことからＩＲＦ−２は転写抑制因子として働くばかりでなく、転写活性化因子として作用を示す場合も知られている。
ハイブリドーマ
本発明で使用される抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＨＭ１．２４抗原蛋白質やＨＭ１．２４抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原であるＨＭ１．２４抗原発現細胞としては、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＫＰＭＭ２（特開平７−２３６４７５）やＫＰＣ−３２（Ｇｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９１）３２，１４００）を用いることができる。また、感作抗原として配列番号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいは抗ＨＭ１．２４抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを使用することができる。
なお、感作抗原として使用される、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質のｃＤＮＡはｐＵＣ１９ベクターのＸｂａＩ切断部位の間に挿入されて、プラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９として調製されている。このプラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、平成５年（１９９３年）１０月５日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９）として、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４３４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特開平７−１９６６９４参照）。このプラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９に含まれるｃＤＮＡ断片を用いて遺伝子工学的手法により、抗ＨＭ１．２４抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを作製することができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。
具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０），Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１：１−７），ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９），ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８：４０５−４１５），ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６：２６９−２７０），ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１），Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３），Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１３１−１３３）等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００−６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＭ１．２４抗原またはＨＭ１．２４抗原発現細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、ＨＭ１．２４抗原またはＨＭ１．２４抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＨＭ１．２４抗原またはＨＭ１．２４抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングにより所望のヒト抗体を単離することもできる。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体として（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、ＨＭ１．２４抗原を固定化したプレートを用いて、ＨＭ１．２４抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、ＨＭ１．２４抗原に結合する抗体の可変領域をコードする遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子配列を用いれば、抗ＨＭ１．２４ヒト抗体を作製することができる。これらの方法は既に周知の方法であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
モノクローナル抗体
具体的には、抗ＨＭ１．２４抗体産生ハイブリドーマの作製は、Ｇｏｔｏ，Ｔ．らの方法（Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４．１９２２−１９３０）により行うことができる。独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成７年４月２７日にＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３としてブダペスト条約に基づき国際寄託された抗ＨＭ１．２４抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア製）の腹腔内に注入して腹水を得、この腹水から抗ＨＭ１．２４抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、１０％ウシ胎児血清、５％ＢＭ−ＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地、ハイブリドーマＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）、ＰＦＨＭ−ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）等で培養し、その培養上清から抗ＨＭ１．２４抗体を精製する方法で行うことができる。
組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。
具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ら、（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５′−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシ法により確認する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
改変抗体
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
例えば、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖およびＨ鎖を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｌ−ｇκ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｈ−ｇγ１）として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成８年８月２９日に、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４６およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特願平８−２６４７５６参照）。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ−ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
例えば、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖およびＨ鎖を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇｋ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１）として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成８年８月２９日に、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４５およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４３としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特願平８−２６４７５６参照）。
キメラ抗体、ヒト型化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用され、細胞傷害活性を呈するヒト抗体Ｃ領域として、ヒトＣγ例えば、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を使用することができる。これらのうち、特にＣγ１，Ｃγ３を有する抗体が強力な細胞傷害活性、すなわち、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を有し、本発明に好適に使用される。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明に使用されるヒト型化抗体の好ましい具体例としては、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体が挙げられる（ＷＯ９８／１４５８０参照）。
発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ，ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにて抗体を産生してもよい。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，１９９３）。また、昆虫としては、カイコなどを用いることができる。
植物を使用する場合、タバコなどを用いることができる。
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばニコチニア・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
上述のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
上述のように得られた抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合させ抗体修飾物として使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
抗体の分離、精製
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．等が挙げられる。
その他、通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。
抗体の濃度測定
上記方法で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定またはＥＬＩＳＡ等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプルをＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５０Ｄとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ製）１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固層化する。
ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ製）１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
ＦＣＭ解析
骨髄腫細胞と本発明で使用される抗体との反応性は、ＦＣＭ（フローサイトメトリー）解析で行うことができる。細胞としては、樹立細胞株あるいは新鮮分離細胞を用いることができる。樹立細胞株としては、骨髄腫由来ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５５）、同Ｕ２６６（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  １９６）、同ＫＰＭＭ２、同ＫＰＣ−３２、形質細胞腫由来ＡＲＨ−７７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６２１）などを用いることができる。
上記細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ胎児血清、０．０５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ（−））で２５μｇ／ｍｌに希釈した抗体あるいはコントロール抗体１００μｌを加え、氷温化３０分インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、２５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）１００μｌを加え、氷温化３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、６００μｌあるいは１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）で各細胞の蛍光強度を測定すればよい。
スクリーニング方法
ＨＭ１．２４抗原の発現増強剤をスクリーニングするには、例えば、無刺激の状態でＨＭ１．２４抗原を発現していないか、あるいは少なく発現している細胞を用いてＦＣＭ解析にて測定することができる。例えば、実施例に記載の細胞を被検物質と１〜２日インキュベートし、ついで一次抗体としてマウス抗ヒトＨＭ１．２４抗体にて染色する。細胞を洗浄し、さらに二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体により染色する。最後に、細胞を洗浄したのち、フローサイトメータにより細胞のＦＩＴＣ蛍光強度を測定すればよい。
また、前記の間接法による染色ではなく、細胞を高濃度の免疫グロブリンで処理し、Ｆｃレセプターをブロックした後にＦＩＴＣ標識した抗ヒトＨＭ１．２４抗体を用いた直接法による染色によりＦＣＭ分析することもできる。
また、ＨＭ１．２４プロモーター配列を用いたレポーター遺伝子アッセイによりＨＭ１．２４抗原の発現増強剤をスクリーニングすることができる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼを用いることができる。ＨＭ１．２４プロモーター配列をレポーター遺伝子の上流に含むプラスミドを構築し、ついで、細胞に形質転換した後、得られた細胞を被検物質と１〜２日培養し、回収された細胞をルシフェラーゼアッセイすることで、ＨＭ１．２４抗原の発現を増強する薬剤をスクリーニングすることができる。
細胞傷害活性
ＡＤＣＣ活性の測定
本発明に使用される抗体は、細胞傷害活性として、例えば、ＡＤＣＣ活性を有する抗体である。
本発明において造血器腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ活性は、次のようにして測定することができる。まず、ヒトの末梢血や骨髄より比重遠心法で単核球を分離し、エフェクター細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ：Ｅ）として調製する。
また、標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ：Ｔ）としては、ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５５），Ｕ２６６（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  １９６），ＫＰＭＭ２，ＫＰＣ−３２，ＡＲＨ−７７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６２１）、ＨＥＬ、患者由来の細胞などを５１Ｃｒにより標識して、標的細胞として調製する。次いで、標識した標的細胞にＡＤＣＣ活性を測定する抗体を加えインキュベートし、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベートする。
インキュベートした後上清を取り、ガンマカウンターで放射活性を測定する。その際、最大遊離放射能測定用に、１％のＮＰ−４０を用いることができる。細胞傷害活性（％）は、（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００で計算することができる。なお、Ａは抗体存在下において遊離された放射活性（ｃｐｍ）、ＢはＮＰ−４０により遊離された放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（ｃｐｍ）である。
細胞傷害活性の増強
ＡＤＣＣ活性のような細胞傷害活性を発揮するには、ヒトにおいては抗体定常領域（Ｃ領域）としてＣγ、特にＣγ１，Ｃγ３を使用することが好ましい。さらに、抗体Ｃ領域のアミノ酸を一部付加、改変、修飾することにより、より強力なＡＤＣＣ活性、あるいはＣＤＣ活性を誘導することができる。
例えば、アミノ酸置換によるＩｇＧのＩｇＭ様ポリマー化（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｉ．Ｆ．＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９９４）１２，６８３−６８８）、アミノ酸付加によるＩｇＧのＩｇＭ様ポリマー化（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｉ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１５４，２２２６−２２３６）、Ｌ鎖をコードする遺伝子の直列連結での発現（Ｓｈｕｆｏｒｄ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２，７２４−７２７）、アミノ酸置換によるＩｇＧの二量体化（Ｃａｒｏｎ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６，１１９１−１１９５，Ｓｈｏｐｅｓ，Ｂ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１４８，２９１８−２９２２）、化学修飾によるＩｇＧの二量体化（Ｗｏｌｆｆ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，２５６０−２５６５）、および抗体ヒンジ領域のアミノ酸改変によるエフェクター機能の導入（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）２１，２３７９−２３８４）が挙げられる。
これらは、プライマーを利用したオリゴマー部位特異的変異導入法、制限酵素切断部位を利用した塩基配列の付加、共有結合をもたらす化学修飾剤を使用することによって達成される。
患者の治療
本発明の態様のひとつは、ＨＭ１．２４抗原の発現量を増強する薬剤、または、通常の状態では細胞表面上にＨＭ１．２４抗原を発現していない細胞に対してＨＭ１．２４抗原の発現を誘導する薬剤と、抗ＨＭ１．２４抗体を患者に投与することにより、造血器腫瘍を治療する方法に関する。造血器腫瘍としては、例えば、骨髄腫、好ましくは多発性骨髄腫、リンパ球系腫瘍、例えばリンパ腫、好ましくはホジキン病または非ホジキンリンパ腫、リンパ球性白血病、好ましくは、急性Ｔリンパ性白血病、慢性Ｔリンパ球性白血病、急性Ｂリンパ性白血病、慢性Ｂリンパ性白血病、および骨髄性白血病、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病である。さらに、ＦＡＢ分類でＬ１〜Ｌ３、Ｍ０〜Ｍ７の急性白血病も含まれる。
ＨＭ１．２４抗原の発現量を増強する薬剤、または、通常の状態では細胞表面上にＨＭ１．２４抗原を発現していない細胞に対してＨＭ１．２４抗原の発現を誘導する薬剤としては、インターフェロンα、インターフェロンγ、ＩＲＦ−２蛋白質あるいはＩＲＦ−２蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターであり、好ましくは、インターフェロンαまたはインターフェロンγである。インターフェロンαまたはインターフェロンγの投与量としては、人体に投与した際に、血中濃度最高値として１〜１００００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ（国際単位）、より好ましくは５〜１０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、さらに好ましくは５〜５００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、最も好ましくは５〜５０Ｉ．Ｕ．／ｍｌになる投与量である。
静脈内投与の場合、好ましくは１万〜１０００万Ｉ．Ｕ．、より好ましくは１０万〜１０００万Ｉ．Ｕ．、さらに好ましくは５０万〜５００万Ｉ．Ｕ．、最も好ましくは、１００万〜５００万Ｉ．Ｕ．を１回あたり投与することである。インターフェロンと抗ＨＭ１．２４抗体は、一緒に投与してもよいし、別個に投与してもよい。後者の場合には、まず、インターフェロンを投与し、９６時間以内に抗ＨＭ１．２４抗体を投与することが好ましい。インターフェロン投与と抗ＨＭ１．２４抗体投与の間隔は、インターフェロン投与によってＨＭ１．２４抗原の発現量が増強されている限り制限はないが、好ましくは９６時間以内であり、より好ましくは７２時間、さらに好ましくは４８時間以内である。
患者の臨床応答に応じてインターフェロンと抗ＨＭ１．２４抗体を複数回、交互に投与することも本発明の範囲内である。投与経路は、血流中に直接投与されることが望ましく、静脈内投与あるいは動脈内投与が好ましい。持続的に投与することも可能であり、点滴静脈内投与でもよい。また、皮下投与や筋肉投与でもよい。
本発明の他の態様は、インターフェロンαまたはインターフェロンγと抗ＨＭ１．２４抗体を含有する造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物に関わる。本発明の治療剤または医薬組成物は、従来、インターフェロンや抗体製剤に用いられてきた薬学的に許容しうるビヒクル、例えば、生理食塩水または５％デキストランを通常の安定化剤や賦形剤と一緒に含有することができる。
本発明の他の態様では、造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分として含有する医薬組成物と、インターフェロンαまたはインターフェロンγとの併用療法に関する記載を含む指示書とからなるキットを提供する。
本発明の他の態様では、抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分として含有する、造血器腫瘍を有する患者を治療するための医薬組成物であって、インターフェロンαまたはインターフェロンγと併用するための医薬組成物を提供する。
本発明の他の態様は、ＨＭ１．２４抗原の発現は増強する、または誘導する物質をコードする遺伝子を投与することに関わる。例えば、インターフェロンα、インターフェロンγ、ＩＲＦ−２のＤＮＡ配列は公知であり、所望のベクターに組み込んで患者に投与することができる。ベクターとしては、遺伝子治療に用いられるアデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘＬｅｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などに挿入して、生体内に投与する。投与方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏであってもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもよい。また、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡを投与することも可能である。
実施例
実施例１．インターフェロンαによる骨髄腫細胞におけるＨＭ１．２４抗原発現量の増強
ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  １９６）および多発性骨髄腫患者の骨髄由来の骨髄腫細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用い、５％炭酸ガス培養器中、３７℃で培養した。マウス抗ＨＭ１．２４抗体を生産するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３（寄託日１９９５年４月２７日）として寄託されている。
骨髄腫細胞（１×１０５／ｍｌ）を１０００Ｕ／ｍｌの天然型インターフェロン−α（大塚製薬、東京）存在下又は非存在下に４８時間培養し、ＨＭ１．２４抗原（それをコードする塩基配列を配列番号：１に示す）の変化をフローサイトメトリーで測定した。細胞を０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と０．０２％アジ化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で洗浄後、ヒト免疫グロブリン（３ｍｇ／ｍｌ、ミドリ十字、大阪）を加えたＰＢＳ（１００μｌ）に浮遊させ、４℃で１５分間、反応させた。
その後、２μｌのＦＩＴＣ−ヒトＩｇＧ１（１ｍｇ／ｍｌ）又はＦＩＴＣ−抗ＨＭ１．２４抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、４℃で６０分間、染色した。患者骨髄腫細胞を用いた場合、骨髄腫細胞の同定には２０μｌのＰＥ−ａｎｔｉ−ＣＤ３８（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を加え、二重染色を行った。染色後、細胞をＰＢＣで２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド（和光純薬、大阪）を含むＰＢＳ中で保存した。その後、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ，ＵＳＡ）を用い、ＨＭ１．２４抗原の発現を解析した。
その結果、骨髄腫細胞株Ｕ２６６（図１）および患者骨髄腫細胞（図２）は無刺激の状態でＨＭ１．２４抗原を発現しており、インターフェロン−αの刺激により、ＨＭ１．２４抗原の発現量はさらに増加した。
インターフェロン−αは骨髄腫細胞のＨＭ１．２４抗原の発現をさらに増強させ、骨髄腫細胞へ結合する抗ＨＭ１．２４抗体の数を増加させた。抗ＨＭ１．２４抗体による治療の抗腫瘍効果は、結合する抗体数に比例することから、骨髄腫患者において、インターフェロン−αを投与した後に抗ＨＭ１．２４抗体治療を行うことは、抗体による治療効果を増強し、より有効性を高める治療になると期待される。
実施例２．レポーター遺伝子解析によるＨＭ１．２４抗原の発現機能の解析
抗原の発現誘導がＨＭ１．２４プロモーター領域により調節されているかどうか調べるために、プロモーター領域でのレポーター遺伝子解析を行った。
ＨＭ１．２４プロモーター領域の遺伝子（配列番号：３）はＰＣＲクローニングにより得た。ヒト末梢血単核細胞よりＤＮＡｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）を用い、ゲノムＤＮＡを調製した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＨＭ２ｋ（ａａａｇｇｔａｃｃａｇｃｔｇｔｃｔｔｔｃｔｇｔｃｔｇｔｃｃ）（配列番号：４）、及びＢＳＴ２Ｂ（ａｔａｇｔｃａｔａｃｇａａｇｔａｇａｔｇｃｃａｔｃｃａｇ）（配列番号：５）を用い、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造、大津）を用いＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）にてＰＣＲ（９４℃  １ｍｉｎ、５５℃  １ｍｉｎ、７２℃  １ｍｉｎ、３０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。
得られた約２ｋｂの断片を制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｇＩＩＩ（宝酒造）にて処理し、レポータージーンプラスミドｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＫｐｎＩ−ＢｇＩＩＩサイトにＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．ＩＩ（宝酒造）を用いてクローニングし、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ニッポンジーン）を形質転換した。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地にて３７℃培養し、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にてプラスミドを調製した。
得られたプラスミドＨＭ−２ｋ／ＧＬ３を制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩにて処理し、ｋｉｌｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ用ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造）にてｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｅを作製し、転写開始点上流−４９３ｂｐまでを含むプラスミドＨＭ−４９３／ＧＬ３を得た。またＨＭ−２ｋ／ＧＬ３を制限酵素ＫｐｎＩ及びＡｆｌＩＩにて処理し、上記方法にてｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｅを作製し、転写開始点上流−１５１ｂｐ又は−７７ｂｐまでを含む、それぞれＨＭ−１５１／ＧＬ３及びＨＭ−７７／ＧＬ３を得た。
細胞へのプラスミド導入はＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｆ  ＰＥＩ−Ｋｉｔ）（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）、ルシフェラーゼアッセイはＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。細胞株を５０μＭ  Ｄｅｆｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ、１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０にて一晩培養した。導入するプラスミドをＴｆ−ＰＥＩとの複合体にするため、終濃度２０μｇ／ｍｌのレポータージーンプラスミド、０．４μｇ／ｍｌのｐＲＬ−ＳＶ４０、１μｇ／ｍｌ  Ｔｆ−ＰＥＩ試薬の混合液を作製し、室温で２０分間インキュベートした。５×１０５細胞／ｍｌの細胞をＴｆ−ＰＥＩ・プラスミド混合液の３倍容加え、４時間３７℃にてインキュベートし、培地にて洗浄後、２×１０５細胞／ｍｌの濃度で１ｗｅｌｌあたり１００μｌを９６ウイル平底プレートで培養した。
ＩＦＮ−αを終濃度０，１０，１００、又は１０００Ｕ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃２日間培養した。細胞をＰＢＳ（−）にて洗浄後、２０μｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒにて溶解し、６μｌをＣ９６  Ｗｈｉｔｅ  Ｐｏｌｙｓｏｒｐ  Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）にアプライした。Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）にて基質液３０μｌ、測定時間１０秒にてＦｉｒｅｆｌｙ及びＲｅｎｉｌａそれぞれの発光強度を測定した。測定値は、Ｆｉｒｅｆｌｙ／Ｒｅｎｉｌａにて補正後、コントロール（ｍｅｄｉｕｍ）を１として相対活性を求めた。
その結果、上流２ｋｂｐ及び４９３ｂｐともにＩＦＮ  α濃度依存的にレポーターのルシフェラーゼ活性が上昇しており、プロモーター領域の転写活性上昇が抗原の発現誘導を引き起こすことを確認した（図３）。
さらに、転写開始点上流１５１ｂｐ又は７７ｂｐのレポータープラスミドを用いた結果では、上流１５１ｂｐのレポータープラスミドではＩＦＮ  α刺激によりルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。一方上流７７ｂｐのレポータープラスミドではＩＦＮ  α刺激による活性の変化は認められなかった（図４）。７７〜１５１ｂｐの領域にはＧＡＳ  ｅｌｅｍｅｎｔ，ＩＳＲＥに相同性の高い配列が存在し、ＩＦＮ  α刺激に応答して活性化する転写調節因子であることから、ＩＲＦファミリーの転写調節因子が活性に関与していることが示された。
実施例３．インターフェロンγによる骨髄腫細胞におけるＨＭ１．２４抗原発現量の増強
実施例１に記載の方法により、１０００Ｕ／ｍｌの天然型インターフェロンγ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて解析した。その結果、骨髄腫細胞株Ｕ２６６（図５）および患者骨髄腫細胞（図６）において、インターフェロンαと同様に、ＨＭ１．２４抗原の発現量の増大が観察された。
実施例４．ＩＲＦ−２のＨＭ１．２４プロモーター領域への結合
ＨＭ１．２４プロモーター領域に結合する転写因子を同定するために、ＨＭ１．２４プロモーター領域をプローブとしたＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ）を次のように行い、結合因子としてＩＲＦ−２を同定した。
（１）核抽出物の調製
骨髄腫細胞Ｕ２６６−Ｂ１（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ１９６）を１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。インターフェロンα（ＩＦＮ−α）（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＥＣ）による細胞への刺激を行うため、培地中にＩＦＮ−αを終濃度１０００Ｕ／ｍｌとなるように添加し、添加後３０分、２時間、４時間及び８時間の細胞を回収した。細胞を冷ＰＢＳ（−）に懸濁、１，０００ｒｐｍにて遠心して上清を捨て、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ  ＮａＣｌ，６ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液に懸濁した。
氷中に５分間静置後に再度遠心し、上清を捨てた。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ  ＮａＣｌ，６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．４ｍＭ  ＰＭＳＦ，１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４に細胞を懸濁した。ガラス製ホモジェナイザーを用いて細胞を氷上でホモジェナイズし、６０００ｇ３分間遠心し、上清を捨てた。抽出緩衝液（２０％グリセロール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，４２０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，２ｍｇ／ｍｌアプロチニン、５ｍｇ／ｍｌロイペプチン）に細胞を懸濁し、氷中に２０分間静置した。１２０００ｇ１０分間遠心し、上清を回収した。
（２）標識プローブの調製
プローブとして、ＨＭ１．２４プロモーター領域においてＧＡＳ（ＩＦＮ−γ活性化部位：ＧＡＳコンセンサス配列はｔｔｎｃｎｎｎａａ（配列番号：８））、ＩＳＲＥ（ＩＦＮ−α刺激応答因子：ＩＳＲＥコンセンサス配列はｎｇａａａｎｎｇａａａｃｔ（配列番号：９））とホモロジーのある配列（ｔｔｃｃｃａｇａａ（配列番号：１０）およびｇｇａａａｃｔｇａａａｃｔ（配列番号：１１）を含むＩＳＲＥ２を作製した。すなわち、オリゴＤＮＡ  ＩＳＲＥ−Ｆ２（ａａｔｔｔｃｔｇｇｇａａａｃｔｇａａａｃｔｇａａａａｃｃｔ（配列番号：１２））及びＩＳＲＥ−Ｒ２（ａａｔｔａｇｇｔｔｔｔｃａｇｔｔｔｃａｇｔｔｔｃｃｃａｇａ（配列番号：１３））を混合し、アニールさせ２本鎖ＤＮＡプローブＩＳＲＥ２とした。
また、オリゴＤＮＡ  ａｄｐ−１（ｃａｔｇｇｃａｔｃｔａｃｔｔｃｇｔａｔｇａｃｔａｔｔｇｃａｇａｇｔｇｃｃ（配列番号：１４））及びａｄｐ−２（ｃａｔｇｇｇｃａｃｔｃｔｇｃａａｔａｇｔｃａｔａｃｇａａｇｔａｇａｔｇｃ（配列番号：１５））を混合し、アニールさせｕｎｒｅｌａｔｅｄプローブａｄｐとした。プローブの標識はＢａｎｄ  Ｓｈｉｆｔ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、その標準プロトコールに準じて行った。すなわち、上記にて作製した２本鎖ＤＮＡ５０ｎｇを［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（２０μＣｉ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む反応液中でＫｌｅｎｏｗ断片のポリメラーゼ反応を３７℃、１時間行った。反応終了した溶液を２倍に希釈後Ｎｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にかけ、１６００ｒｐｍ、４分間遠心して回収した溶液を標識プローブとした。
（３）ＩＦＮ−αによる刺激により産生された結合因子の経時変化
Ｂａｎｄ  Ｓｈｉｆｔ  Ｋｉｔ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）の標準プロトコールに従って以下の操作を行った。前記（１）において経時的に調製した抽出物５μｇにキット添付の１０ｘ結合緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭＤＴＴ）２μｌ，５０％グリセロール４μｌ，１％ＮＰ−４０  １μｌ、及び１μｌのｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）を加え、前記（２）で調製した３２Ｐ標識ＩＳＲＥ−２プローブ２μｌを添加し、水を加えて全量を２０ｕｌとした後、この反応混合物を室温にて２０分間インキュベートし、前記抽出物中に存在する可能性のある結合因子と前記３２Ｐ標識ＩＳＲＥ−２プローブとの結合を許容した。
反応液１８μｌに１０×染色液（Ｋｉｔに添付）２μｌを加え、１×Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９０ｍＭグリシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．１）中、７．５％アクリルアミドゲル上で電気泳動し、電気泳動後、ゲルを濾紙にはりつけて蛋白質を濾紙に移行させた。ゲルドライヤーにて乾燥した濾紙をＸ線フィルムに感光させ、シグナルを検出した。
比較のため、抽出物を添加しない反応液［（ＮＥＣ−）］、インターフェロンαにより刺激しないで培養した細胞培養物からの抽出物を添加した反応液［０ｈ］、８時間の培養液の抽出物に標識プローブの代りに未標識ＩＳＲＥ２プローブ５０ｎｇを添加した反応液［８ｈ（＋ｃｏｌｄ）］、及び８時間の培養後の抽出液にｕｎｒｅｌａｔｅｄプローブａｄｐを５０ｎｇ添加した反応液［８ｈ（＋ｃｏｌｄ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ）］を用意し、上記を同様に処理してシグナルの検出を行った。
結果を図７に示す。この図７から明らかな通り、ＨＭ１．２４プロモーターの一部に相当する２本鎖ＤＮＡと結合する物質が、インターフェロン刺激下で培養したＵ２６６−Ｂ１細胞中に経時的に増加した。
（４）各種抗体との反応による転写因子の同定
前記（１）に記載したようにして、骨髄腫細胞Ｕ２６６−Ｂ１（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ１９６）を１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロン−αの存在下で８時間培養し、抽出物を調製した。Ｂａｎｄ  Ｓｈｉｆｔ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の標準プロトコールに従って次の操作を行った。すなわち、５μｇの抽出物に抗体２μｇを添加し、室温にて１５分間インキュベートし、抽出液／抗体反応液を得た。前記キット添付の１０×結合緩衝液２μｌ、５０％グリセロール４μｌ、１％ＮＰ−４０  １μｌ及び１μｌのＰｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）に、前記抽出液／抗体反応液２μｌ及び前記（２）で調製した標識プローブ２μｌを添加し、水を加えて全量を２０μｌとした後、この反応混合物を室温にて２０分間インキュベートした。
この反応混合物を、前記（３）に記載したようにして電気泳動にかけ、シグナルの検出を行った。
上記の抗体として、次の抗体（いずれも、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより）を使用した。
抗−ヒトＳＴＡＴ１  ｐ８４／ｐ９１（Ｅ−２３）：（説明）ウサギポリクローナル抗体（ＳＣ−３４６Ｘ）
抗−ヒトＳＴＡＴ２（Ｃ−２０）：ウサギポリクローナル抗体（ＳＣ−４７６Ｘ）
抗−マウスＳＴＡＴ３（Ｋ−１５）：ウサギポリクローナル抗体（ＳＣ−４８３Ｘ）
抗−ヒトＩＳＧＦ−３γｐ４８（Ｃ−２０）：ウサギポリクローナル抗体（ＳＣ−４９６Ｘ）
抗−ヒトＩＲＦ−１（Ｃ−２０）：ウサギポリクローナル抗体（ＳＣ−４９７Ｘ）
抗−ヒトＩＲＦ−２（Ｃ−１９）：ウサギポリクローナル抗体（ＳＣ−４９８Ｘ）
抗−マウスＩＣＳＡＴ（Ｍ−１７）：ヤギポリクローナル抗体（ＳＣ−６０５９Ｘ）
また、対照として、インターフェロンの刺激なしに培養した細胞の抽出物を用いた反応液［０ｈ］；１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロン−α刺激下で８時間培養した細胞の抽出物を添加し、抗体を添加しない反応液［８ｈ］；標識ＩＳＲＥ２プローブの代りに未標識ＩＳＲＥ２プローブ５０ｎｇを添加した反応液［８ｈ（＋ｃｏｌｄ）］；及び標識ＩＳＲＥ２プローブの代りに未標識のｄｐプローブ５０ｎｇを添加した反応液［８ｈ（＋ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｌｄ）を用意し、上記の同様に処理した。
結果を図８に示す。図８から明らかな通り、インターフェロン−αの刺激下で培養した細胞のからの抽出物中の標識ＩＳＲＥ２プローブと結合する成分は抗−ＩＲＦ−２抗体とのみ結合し、ＨＭ１．２４プロモーターに結合してそれを活性化する因子は、転写因子ＩＲＦ−２であることが示された。
実施例５．ＩＲＦ−２によるＨＭ１．２４プロモーター活性化の確認
ＩＲＦ−２共発現によるＨＭ１．２４プロモーター活性への影響をＵ２６６細胞を用いたレポータージーンアッセイにより測定し、実際にＩＲＦ−２がＨＭ１．２４プロモーターの転写活性化作用を持つことを明らかにした。以下の実験では、骨髄種細胞株Ｕ２６６−Ｂ１（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ１９６）を用いた。細胞は、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）（以下ｍｅｄｉｕｍ）により、５％ＣＯ２ｉｎｃｕｂａｔｏｒにて培養した。
（１）ＨＭ１．２４プロモーター領域を含むプラスミドの構築
ＨＭ１．２４プロモーター領域の遺伝子はＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇにより得た。ヒト末梢血単核細胞よりＤＮＡｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）を用い、ゲノムＤＮＡを調製した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＨＭ２ｋ（ａａａｇｇｔａｃｃａｇｃｔｇｔｃｔｔｔｃｔｇｔｃｔｇｔｃｃ）（配列番号：１６）、ＢＳＴ２Ｂ（ａｔａｇｔｃａｔａｃｇａａｇｔａｇａｔｇｃｃａｔｃｃａｇ）（配列番号：１７）を用い、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造、大津）を用いＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）にてＰＣＲ（９４℃  １分間、５５℃  １分間、７２℃  １分間、３０サイクル）を行った。
得られた約２ｋｂの断片を制限酵素ＫｐｎＩ，ＢｇｌＩＩ（宝酒造）にて処理し、レポータージーンプラスミドｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＫｐｎＩ，ＢｇｌＩＩサイトにＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．ＩＩ（宝酒造）を用いてクローニングし、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ニッポンジーン）を形質転換した。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地にて３７℃培養し、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＬＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にてプラスミドを調製した。
得られたプラスミドＨＭ−２ｋ／ＧＬ３を制限酵素ＫｐｎＩ，ＸｈｏＩにて処理し、ｋｉｌｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ用ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造）にて欠失クローンを作製し、転写開始点上流−４９１ｂｐまでを含むプラスミドＨＭ−４９１／ＧＬ３を得た。またＨＭ−２ｋ／ＧＬ３を制限酵素ＫｐｎＩ，ＡｆｌＩＩにて処理し、上記方法にて欠失クローンを作製し、転写開始点上流−１５１ｂｐまでを含むＨＭ−１５１／ＧＬ３、を得た。
さらにＨＭ−２ｋ／ＧＬ３を鋳型としてプライマー１０Ｓ（ｔｔｔｃｇｇｔａｃｃｔａａｔｔａａｔｃｃｔｃｔｇｃｃｔｇ）（配列番号：１８）およびＧＬプライマー２（ｃｔｔｔａｔｇｔｔｔｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔｃｃａ）（配列番号：１９）を用い、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造、大津）を用いＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）にてＰＣＲ（９４℃  １分間、５５℃  １分間、７２℃  １分間、３０サイクル）を行った。得られた断片を制限酵素ＫｐｎＩ，ＢｇｌＩＩ（宝酒造）にて処理し、レポータージーンプラスミドｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＫｐｎＩ，ＢｇｌＩＩサイトにｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてクローニングし、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ニッポンジーン）をｔｒａｎｓｆｏｒｍした。
形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地にて３７℃培養し、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にてプラスミドを調製した。こうして転写開始点上流１２５ｂｐまでを含むＨＭ−１２５／ＧＬ３を得た。またＨＭ−２ｋ／ＧＬ３を鋳型としてプライマーＨＭＰ７００（ａａａｇｇｔａｃｃａｇａｇｔｔｔａｃｃｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｇ）（配列番号：２０）およびＧＬプライマー２を用い、同様の手順にてＰＣＲを行い、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃのＫｐｎＩ，ＢｇｌＩＩサイトに断片を導入することにより、転写開始点上流約７００ｂｐまでを含むＨＭ−７００／ＧＬ３を得た。
さらにＨＭ−２ｋ／ＧＬ３を鋳型としてプライマーＨＭＰ７００および１１Ａ’（ｃａｇａｇｇａｔｔａａｔｔａｇｇｔａｃｃｇａａａｇａｇａｇｇｔｇｇｇｃｔｔｔｔ）（配列番号：２１）を用い、ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡）を用いＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）にてＰＣＲ（９８℃  １５秒、６５℃  ２秒、７４℃  ３０秒、２５サイクル）を行った。得られた断片をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｖｅｒ．Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒに挿入した。得られたプラスミドを制限酵素ＫｐｎＩにて処理し、およそ５５０ｂｐの断片を回収し、ＨＭ−１２５／ＧＬ３のＫｐｎＩサイトにｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いて導入した。こうして転写開始点上流−１２５〜−１４５付近を欠失したｄＩＳＲＥ／ＧＬ３を得た。
（２）ＩＲＦ−２発現プラスミドの構築
ＩＲＦ−２発現プラスミドは以下のように作製した。ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α（１０００Ｕ／ｍｌ）にて刺激後８時間経過したＵ２６６細胞より、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、得られたＲＮＡを鋳型、ＮｏｔＩ−ｄ（Ｔ）１８をプライマーとして逆転写反応を３７℃１時間行った。得られたｃＤＮＡを鋳型、ＩＲＦ２−Ｆ２（ｔｔｇｔａｔｔｇｇｔａｇｃｇｔｇａａａａａａｇｃ）（配列番号：２２）、ＩＲＦ２−Ｒ２（ｃａｇｃｔａｇｔｔｃａｃａｔｔａｔｃｔｃｇｔｃｃ）（配列番号：２３）をプライマーとしてＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造）を用いてＰＣＲ（９４℃  ４５秒、６０℃  ４５秒、７２℃  ６０秒、４０サイクル）を行った。
得られたＰＣＲ反応液を鋳型、ＩＲＦ２−Ｆ１（ａｇａｇｇｇｔａｃｃａｔｇｃｃｇｇｔｇｇａａａｇｇａｔｇｃｇ）（配列番号：２４）、ＩＲＦ２−Ｒ１（ａｇｔｃｇｇｔａｃｃｔｔａａｃｔｇｃｔｃｔｔｇａｃｇｃｇｇｇ）（配列番号：２５）をプライマーとしてＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡）を用いて再度ＰＣＲ（９４℃  ４５秒、６０℃  ４５秒、７２℃  ６０秒、３０サイクル）を行った。得られた断片を制限酵素ＫｐｎＩにて処理し、発現プラスミドｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩサイトにｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて導入し、ＩＲＦ−２発現プラスミドｐＩＲＦ−２／Ｔｒａｃｅｒを得た。
（３）レポーター遺伝子活性の測定
細胞へのプラスミド導入はＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｆ  ＰＥＩ−Ｋｉｔ）（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を、ルシフェラーゼアッセイはＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。細胞株を５０μＭ  Ｄｅｆｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ，１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０にて一晩培養した。導入するプラスミドをＴｆ−ＰＥＩとの複合体にするため、終濃度２０μｇ／ｍｌのレポータージーンプラスミド、２０μｇ／ｍｌのｐＩＲＦ−２／ＴｒａｃｅｒまたはｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ，０．４μｇ／ｍｌのｐＲＬ−ＳＶ４０，１μｇ／ｍｌ  Ｔｆ−ＰＥＩ  ｒｅａｇｅｎｔの混合液を作製し、室温で２０分間インキュベートした。
５×１０５細胞／ｍｌの細胞をＴｆ−ＰＥＩ  ｐｌａｓｍｉｄ混合液の３倍容加え、４時間３７℃にてインキュベートし、培地にて洗浄後、２×１０５細胞／ｍｌの濃度で１ウェルあたり１００μｌを９６ウェル平底プレートで培養した。ＩＦＮ−αを終濃度０，１０００Ｕ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃２日間培養した。細胞をＰＢＳ（−）にて洗浄後、２０μｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒにて溶解し、６μｌをＣ９６  Ｗｈｉｔｅ  Ｐｏｌｙｓｏｒｐ  Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）にアプライした。Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）にて基質液３０μｌ、測定時間１０秒にてＦｉｒｅｆｌｙ，Ｒｅｎｉｌａそれぞれの発光強度を測定した。測定値はＦｉｒｅｆｌｙ／Ｒｅｎｉｌａにてトランスフェクション効率の補正を行い相対活性を求めた。
（４）結果
ＨＭ１．２４プロモーターレポータープラスミドとＩＲＦ−２発現プラスミドをＵ２６６細胞に導入し、レポーター活性を測定した（図９）。その結果、ＩＲＦ−２結合サイトであるＩＳＲＥモチーフ配列を含む−７００および−１５１で、ＩＲＦ−２共発現によりルシフェラーゼ活性が上昇した。一方ＩＳＲＥ配列を欠失したｄＩＳＲＥ／ＧＬ３ではＩＲＦ−２共発現によるルシフェラーゼ活性に変化は認められなかった。以上の結果よりＩＲＦ−２はＨＭ１．２４プロモーターのＩＳＲＥ領域に結合し、その転写活性を増強することが示された。
（５）ＩＲＦ−２の強制発現によるＨＭ１．２４抗原の発現増強の確認
ＩＲＦ−２によるＨＭ１．２４抗原の発現量の変化は、ＩＲＦ−２発現プラスミド（ｐＩＲＦ−２／Ｔｒａｃｅｒ）またはコントロールプラスミド（ｐＴｒａｃｅｒ／ＣＭＶ）をＵ２６６細胞に上記方法にて導入し、１〜２日間培養した後、細胞を回収し、一次抗体としてマウス抗ヒトＨＭ１．２４抗体にて染色する。細胞を洗浄し、さらに二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体により染色する。細胞を洗浄したのち、フローサイトメータにより細胞のＦＩＴＣ蛍光強度を測定する。ＩＲＦ−２発現プラスミド導入細胞では、コントロールプラスミド導入細胞に比較してＦＩＴＣ強度の高い細胞が多く存在することを確認する。
実施例６．インターフェロンαによるリンパ系腫瘍細胞におけるＨＭ１．２４抗原発現量の増強、および骨髄性白血病細胞におけるＨＭ１．２４抗原の発現誘導
ヒト骨髄性白血病細胞株ＨＥＬ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）および造血器腫瘍患者の骨髄やリンパ節由来の腫瘍細胞は、実施例１に記載の方法で培養した。また、インターフェロンαは実施例１と同一のものを用い、インターフェロンαによる刺激方法およびフローサイトメトリーの測定方法も実施例１と同様におこなった。尚、ＦＩＴＣ−抗ＨＭ１．２４抗体として、ＦＩＴＣ−ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を使用した（国際特許公開番号ＷＯ９８／１４５８０参照、軽鎖および重鎖可変領域のバージョンはＲＶＬａおよびＲＶＨｓ）。また、骨髄性白血病細胞の同定にはＰＥ−抗ＣＤ３３抗体、Ｂ細胞性リンパ腫の同定にはＰＥ−抗ＣＤ１９抗体、Ｔ細胞性リンパ腫の同定にはＰＥ−抗ＣＤ４抗体（全てＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を２０μｌ加え、二重染色を行った。
その結果、ＩＦＮ−α非刺激下では、ＨＥＬおよび急性骨髄性白血病患者由来の腫瘍細胞では、ＨＭ１．２４抗原の細胞表面上への発現は、殆ど認められないか、非常にわずかしか認められず、これらの腫瘍細胞では、ＩＦＮ−α非刺激下ではＨＭ１．２４抗原の発現は実質的に認められなかった。一方、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫患者由来の腫瘍細胞では、ＩＦＮ−α非刺激下においてもＨＭ１．２４抗原の細胞表面上での発現が認められた。これに対し、ＩＦＮ−αで刺激した場合、ＨＥＬおよび急性骨髄性白血病患者由来の腫瘍細胞ではＨＭ１．２４抗原の発現が誘導された。
実質的にＨＭ１．２４抗原を発現していないこれらの細胞においても、ＩＦＮ−αはＨＭ１．２４抗原を発現させることができた。また、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫患者由来の腫瘍細胞においても、ＨＭ１．２４抗原の発現量が増大した。これら５種の腫瘍細胞において、ＩＦＮ−α刺激によって発現したＨＭ１．２４抗原の量はほぼ同程度であった。これらの結果は、ＩＦＮ−αが造血器腫瘍細胞全般に対して、ＨＭ１．２４抗原の発現誘導作用または発現増強作用を有することを示す。
実施例７．インターフェロンαによる抗ＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性の増強
ヒト骨髄性白血病細胞株ＨＥＬを標的細胞として用いた。ＨＥＬ（１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ）に０．１ｍＣｉの５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を加え、３７℃で１時間放置した。その後、ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄し、１ｘ１０４個を円底９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分注した。
種々の濃度のヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体（国際特許公開番号ＷＯ９８／１４５８０参照、軽鎖および重鎖可変領域のバージョンはＲＶＬａおよびＲＶＨｓ）を加えた後、エフェクター細胞として、健常人の末梢血単核球（５ｘ１０５個）を加え、３７℃で４時間放置した。培養上清中の放射活性をガンマカウンターで測定し、ＡＤＣＣによる細胞傷害活性を以下の計算式により求めた。尚、最大値は、標的細胞に１％ＮＰ４０を加えることで細胞を破壊して測定した。また、最小値は、培養液であるＲＰＭＩ１６４０のみを添加して測定した。
ＡＤＣＣ活性（％）＝（測定値−最小値）／（最大値−最小値）
その結果、ＩＦＮ−αによる刺激を行わない場合には、いずれのヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体濃度においても顕著なＡＤＣＣ活性は認められなかったが、ＩＦＮ−αで刺激した場合には、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体による顕著なＡＤＣＣ活性が認められた。また、ＡＤＣＣ活性は抗体濃度依存性であり、細胞表面上のＨＭ１．２４抗原の発現によってＡＤＣＣ活性が誘導されたことが示された。
この結果は、ＩＦＮ−α等の刺激により腫瘍細胞表面上のＨＭ１．２４抗原の発現量が上昇すれば、抗ＨＭ１．２４抗体による細胞傷害活性、すなわち抗腫瘍効果が増強されることを示しており、ＩＦＮ−α等のＨＭ１．２４抗原発現増強剤と抗ＨＭ１．２４抗体を併用することで、より少量の抗ＨＭ１．２４抗体使用量で同等の効果を期待できることを示す。また、抗ＨＭ１．２４抗体単独では顕著な効果が期待できない造血器腫瘍細胞においても、ＩＦＮ−α等の発現誘導剤と抗ＨＭ１．２４抗体との併用により、抗腫瘍効果が期待できることを示す。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、インターフェロンαの非存在下（上）又は存在下（下）で培養した骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、標識としてヒトＩｇＧ（対照）又は抗ＨＭ１．２４抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。
図２は、インターフェロンαの非存在下（上）又は存在下（下）で培養した患者骨髄腫細胞を、標識としてヒトＩｇＧ（対照）又は抗ＨＭ１．２４抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。
図３は、ＨＭ１．２４抗原をコードする遺伝子のプロモーター領域を挿入したレポータープラスミドにより形質転換したＵ２６６細胞をインターフェロンαの非存在下又は種々の濃度での存在下で培養した後ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
図４は、ＨＭ１．２４抗原をコードする遺伝子のプロモーター領域の内、転写開始点から１５１ｂｐ上流まで、又は７７ｂｐ上流までを挿入したレポータープラスミドにより形質転換されたＵ２６６細胞又はＨＥＬ細胞を、インターフェロンα（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した後にルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
図５は、インターフェロンγの非存在下（上）は存在下（下）で培養した骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、標識としてヒトＩｇＧ（対照）又は抗ＨＭ１．２４抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。
図６は、インターフェロンγの非存在下（上）又は存在下（下）で培養した患者骨髄腫細胞を、標識としてヒトＩｇＧ（対照）又は抗ＨＭ１．２４抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。
図７は、Ｕ２６６培養細胞にＩＦＮ−αを添加することにより産生されＨＭ１．２４プロモーター領域に結合する転写因子の量の経時的変化を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。ＮＥ（−）は核抽出物添加せず。０ｈはＩＦＮ−α刺激なしの核抽出物を添加。０．５〜８ｈはＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍｌ）刺激後それぞれの時間経過した核抽出物を添加。＋ｃｏｌｄは未標識ＩＳＲＥ２プローブ５０ｎｇ添加、＋ｃｏｌｄ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄは未標識ａｄｐ配列５０ｎｇ添加。
図８は、ＨＭ１．２４プロモーターに結合する転写因子を、各種の抗体を用いて同定した結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。ＮＥ（−）は核抽出物添加せず。０ｈはＩＦＮ−α刺激なしの核抽出物を添加。８ｈはＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍｌ）刺激後８ｈの核抽出物を添加。＋ｃｏｌｄは未標識ＩＳＲＥ２プローブ５０ｎｇ添加。＋ｃｏｌｄ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄは未標識ａｄｐ配列５０ｎｇ添加。抗体はそれぞれ２μｇ添加。
図９は、ＨＭ１．２４プロモーターレポータープラスミドとＩＲＦ−２発現プラスミドとをＵ２６６細胞に導入し、レポーター活性を測定した場合の結果を示すグラフである。
図１０は、ヒト白血病細胞株ＨＥＬおよび急性骨髄性白血病患者から採取した細胞を、インターフェロンαの非存在下（左）または、存在下（右）で培養し、標識としてヒトＩｇＧ（対照）または抗ＨＭ１．２４抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。黒塗りが対照であり、白抜きが抗ＨＭ１．２４抗体による染色を示す。
図１１は、急性リンパ性白血病患者およびＢ細胞性非ホジキンリンパ腫患者から採取した細胞を、インターフェロンαの非存在下（左）または、存在下（右）で培養し、標識としてヒトＩｇＧ（対照）または抗ＨＭ１．２４抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。黒塗りが対照であり、白抜きが抗ＨＭ１．２４抗体による染色を示す。
図１２は、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫患者から採取した細胞を、インターフェロンαの非存在下（左）または、存在下（右）で培養し、標識としてヒトＩｇＧ（対照）または抗ＨＭ１．２４抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。黒塗りが対照であり、白抜きが抗ＨＭ１．２４抗体による染色を示す。
図１３は、ヒト白血病細胞株ＨＥＬを標準細胞とし、健常人の末梢血単核球をエフェクター細胞として用いた際の、種々のヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体によるＡＤＣＣ活性を測定した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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