(57)【要約】泡沫化マクロファージに起因する動脈硬化症に関与する遺伝子及び蛋白質と、該蛋白質に対する活性調節剤の効率的な評価方法を提供する。配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされるスカベンジャー受容体様蛋白質、該ＤＮＡ配列に対するアンチセンス核酸、該蛋白質の活性調節物質の評価方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号：１のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体様蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるスカベンジャー受容体様蛋白質。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
【請求項６】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸。
【請求項７】
塩基配列が、請求項１に記載のＤＮＡの核酸の全部または一部に相補する配列である、請求項６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項８】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドに対する抗体。
【請求項９】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と被験物質とを接触させることを特徴とする、該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の組換えベクターまたは請求項５に記載の形質転換細胞と披験物質とを接触させることを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡの発現調節作用を示す物質の検索方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、新規スカベンジャー受容体クラスＡサブタイプ及びその断片、該タンパクをコードするＤＮＡ及びその断片、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された形質転換細胞、該タンパク若しくはその断片に反応性を有する抗体に関する。
従来の技術
高脂血症に伴って見られる動脈硬化症の特徴として、コレステロールエステルを多量に蓄積した泡沫マクロファージの粥状硬化巣への集簇が挙げられる。このような泡沫細胞の起源は、末梢血中の単球由来のマクロファージおよび血管平滑筋細胞であるが、その初期病変においてはほとんどがマクロファージである。粥状動脈硬化は、血管内皮細胞の障害に始まるといわれる。これには多くの因子が関与するが、中でもＬＤＬとその変性は重要である。血中のＬＤＬは、内皮下に侵入し、種々の修飾を受けて変性ＬＤＬとなる。一方、変性ＬＤＬの影響をはじめとする原因によって障害された内皮細胞には接着因子が発現して、末梢血中の単球がこれを介して接着し内皮下に侵入する。侵入した単球はマクロファージに分化して内皮下に蓄積した変性ＬＤＬを貪食して泡沫細胞となり、粥状動脈硬化の初期病変を形成する。病変がさらに進行すると、過剰にコレステロールエステルを蓄積した泡沫細胞は破綻して、心血管イベントの原因となるリピッドコアを形成する。スカベンジャー受容体（ＳＲ）は、泡沫化の原因となる変性ＬＤＬと結合しあるいはこれを取り込む受容体蛋白質である。
これまでに、ウシ（Ｋｏｄａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４３，５３１−５３５，１９９０）やヒト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８７，９１３３−９１３７，１９９０）を含む多種の生体から多くのＳＲのｃＤＮＡがクローニングされた結果、ＳＲは主にクラスＡとクラスＢに分けられ、さらに各クラスには幾つかのサブタイプ蛋白質が存在することが明らかとなってきた。
マクロファージスカベンジャー受容体（ＭＳＲ）はクラスＡに分類され、さらにこのクラスＡにはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＭＡＲＣＯという４つのサブタイプが報告されている。これらサブタイプは、ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ型の三量体膜型糖蛋白質であり、特にサブタイプＩ〜ＩＩＩはともに６個のドメイン（Ｎ末端側から、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、スペーサードメイン、αヘリカルコイルドコイルドメイン、コラーゲン様ドメイン、及びＣ末端特異ドメイン）で構成されるという特徴を有している（第１図を参照されたい）。
細胞質ドメインの特徴は、ＬＤＬ受容体やインスリン受容体に見られるＮＰＸＹ配列並びにトランスフェリン受容体に見られるＹＸＲＦ配列と同様のエンドサイトーシスシグナルに見られる特徴的なタイトターン構造を有している点にある。事実これらの配列を欠失させると、エンドサイトーシスが抑制されると言われている。
αヘリカルコイルドコイルドメインの特徴は、蛋白一次構造としてのスカベンジャー受容体ポリペプチドの３本を会合させて活性受容体を形成させている点にある。このドメインは、７アミノ酸毎に２回転する右巻のヘプテッドリピート、即ち、ヘリカルコイルドコイル構造を取り、３本のポリペプチドは７アミノ酸毎に存在するロイシンやイソロイシンなどの疎水性アミノ酸を内側に向け、極性アミノ酸や糖鎖結合部位を外側にして、３量体を形成している。また、変性ＬＤＬなどのリガンドを結合して細胞内に入り、エンドゾーム内でのｐＨの低下に依存して受容体の高次構造を変化させてリガンドを解離させる役割を有する。特にこのドメインに続くコラーゲン様ドメイン側に存在するヒスチジンが、細胞内でのリガンドの解離において機能していることが実験的に証明されている。さらに、このコイルドコイルドメインのヒスチジンを中心とする１５アミノ酸領域を認識する抗体がマクロファージのカルシウム非依存性の細胞接着を阻害することから、このＭＳＲが細胞接着分子としての機能も有していることが示唆されている。
コラーゲン様ドメインの特徴は、コラーゲンに特有なグリシン（Ｇｌｙ）−Ｘ−Ｙの繰返し構造を有している点にある。そのＣ末端側には、負に架電したリガンドの結合に適した正に架電したアミノ酸が多く集まっている。このＣ末端側２２個のアミノ酸を欠失した変異体はリガンド結合性を失うことが確認されていることから、コラーゲン様ドメインはＭＲＳのリガンド結合部位であると推察されている。
Ｃ末端特異ドメインの特徴は、システインに富み、また補体因子１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  １）、ＣＤ５及びＣＤ６などと高い相同性を有している点にある。同じ型のサブタイプ、例えばＩ型サブタイプでは、６つのシステイン残基のアミノ酸配列上の間隔が由来動物種を超えて完全に保存されているという特徴を有する一方で、ＩＩ型あるいはＩＩＩ型サブタイプではこのドメインの全部あるいは一部を失っているなど、ドメイン構造全体での多様性は高い。
以上のような構造的特長を有するＭＳＲは、過剰の変性ＬＤＬを取込み、マクロファージを泡沫細胞化させる。このＭＳＲによる変性ＬＤＬの取り込みとそれによるマクロファージの泡沫化が、粥状動脈硬化症の発症に重要な役割を果たすことが指摘されている。事実、このＭＳＲとアポＥを遺伝子操作で不活性化したダブルノックアウトマウスでは、アポＥ単独のノックアウトマウスに比べ、動脈硬化病巣が縮小していることが確認されており、動脈硬化の発症にＭＳＲが深く関与していることが実証されている。さらに、このＭＳＲが、細菌感染防御や糖尿病性の血管障害惹起の原因である糖化産物（ＡＧＥ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）の取込みにも関与していることが明らかにされている（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３８６，２９２−２９６，１９９７）。
しかし、ＳＲクラスＡの各サブタイプ蛋白質の役割は依然明確ではなく、またこれまでに報告されているサブタイプ以外にもＳＲが存在するか、またその機能的役割は、などについては未知のままである。
発明が解決しようとする課題
本発明は、既知のＭＳＲとは異なる、新たな動脈硬化症関連蛋白質とその遺伝子を同定することにより、動脈硬化性疾患の予防並びに治療に有用な医薬及び方法を提供するものである。
課題を解決するための手段
本発明は、新規な遺伝子（ａｄｓｅとする）、当該遺伝子にコードされるＳＲ様蛋白質、特にクラスＡに属すると推測される新規サブタイプＡＤＳＥ（ＡＤＳＥとする）に関する。また、当該遺伝子を用いて形質転換した宿主細胞、該形質転換細胞を用いた組換ＡＤＳＥの生産方法を提供する。
（核酸）
本発明は、ＡＤＳＥ（後に詳しく述べる）をコードする遺伝子ａｄｓｅを提供する。遺伝子ａｄｓｅとは具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるスカベンジャー受容体様蛋白質をコードするＤＮＡのことであり、配列番号１や配列番号３に示すｃＤＮＡのほか該ｃＤＮＡの由来するゲノムＤＮＡも含まれる。該遺伝子はヒト脂肪組織から単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
また、ａｄｓｅの塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。本明細書中において、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と同義である。
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質がスカベンジャー受容体様蛋白質であれば、塩基配列のバリエーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体様蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号１に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するものであれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２１５；４０３−１０（１９９０））を用いることができる。また、ハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製  Ｃａｔ  Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス  Ｃａｔ  Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１に記載の核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片は、動脈硬化症等本発明の蛋白質が関与する疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。
本発明のＤＮＡは、ＡＤＳＥを大量に生産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質の発現量を、ｍＲＮＡ発現量を指標として確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連する疾患、特に動脈硬化症の診断を行うことも可能である。
また、本発明のＤＮＡの一部をプライマーとして使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法により、核酸配列上の異常あるいは多形を検査・診断することができる。
また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導入し、該細胞に変性ＬＤＬ取り込み活性を賦与することにより血中の変性ＬＤＬ濃度を低下させることを目的とした、動脈硬化症等の発症を予防するための遺伝子治療にも使用することが出来る。
本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換蛋白質ＡＤＳＥの生産方法、あるいはＡＤＳＥの発現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。
本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡを組み入れることが可能である。その際、遺伝子ａｄｓｅをプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ａｄｓｅの宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いたＡＤＳＥの生産において好適に用いられる他、遺伝子ａｄｓｅの発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能となる。
例えば、任意の被験物質と遺伝子ａｄｓｅを含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で接触させることで、被験物質の遺伝子ａｄｓｅの発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あるいは評価を行うことができる。
また、本発明であるＤＮＡと公知の方法とを組み合わせて、マウスまたはその他の適当な動物を基にトランスジェニック動物を調製することが出来る。かかるトランスジェニック動物は、これに高コレステロール食を摂取させることで、該動物に動脈硬化症に特徴的な粥状効果病変を誘発させることが可能となることから、動脈硬化症モデル動物として大変有用であり、ＡＤＳＥに起因する動脈硬化症に対して有効な薬物の開発の大幅な促進が期待される。
さらに、本発明の遺伝子ａｄｓｅを利用すれば、ヒト以外の動物からヒトａｄｓｅに相当する遺伝子を破壊したいわゆるノックアウト動物を作製することも可能である。このモデル動物の物理学的、生物学的、病理学的及び遺伝子的特徴を分析することにより、本発明に係る遺伝子及び蛋白質の機能を解明することが可能となる。さらに、そのようにして内在性遺伝子が破壊された該動物に本発明のヒトａｄｓｅを導入することにより、ヒトａｄｓｅのみを有するモデル動物を作製することも可能となる。このモデル動物は、該導入されたヒトａｄｓｅをターゲットとした薬剤の開発、評価に有用である。
（蛋白質ＡＤＳＥ）
ａｄｓｅにコードされる蛋白質ＡＤＳＥは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるスカベンジャー受容体様蛋白質である。特にそのアミノ酸配列に見られる構造的特長から、クラスＡに属する新規のサブタイプ蛋白質であると決定される。
ＡＤＳＥは、クラスＡに分類されるサブタイプ蛋白質、特にＩ型のサブタイプに存在する特徴的な構造ドメイン、Ｎ末端側から細胞質ドメイン（１〜５９ａ．ａ．）、膜貫通ドメイン（６０〜９１ａ．ａ．）、スペーサードメイン（９２〜１２６ａ．ａ．）、αヘリカルコイルドコイルドメイン（α−ｈｅｌｉｃａｌｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ）（１２７〜３０５ａ．ａ．）、コラーゲン様ドメイン（３０６〜３８４ａ．ａ．）、及びＣ末端特異ドメイン（３８５〜４９５ａ．ａ．）の６種を全て有している。従って、他のＳＲクラスＡサブクラス蛋白質と同様、ＡＤＳＥはｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ型の三量体膜型糖蛋白質であると認められる。また、他のＳＲクラスＡに分類されるサブタイプ蛋白質同様、リガンドとして変性ＬＤＬ；例えばアセチル化ＬＤＬ、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ、酸化ＬＤＬ、アセトアセチル化ＬＤＬ、マレイル化ＬＤＬ、サクシニル化ＬＤＬ等；や、マレイル化アルブミン、ＡＧＥ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、ＬＰＳ（ｌｙｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）等に結合すると考えられる。本発明のスカベンジャー受容体様蛋白質は、上述の様なリガンドに結合する活性を有する受容体蛋白質として理解される。更に好ましくは、変性ＬＤＬ等のリガンドに結合し、細胞への取り込み活性を有する蛋白質である。
この様に、ＡＤＳＥはドメイン構造レベルにおいてはスカベンジャー受容体クラスＡに認められる特徴を高度に保持している一方、そのアミノ酸配列レベルでの相同性は、最も相同性の高いサブタイプＩ（ヒト  ＳＲＡ  Ｉ）との全体比較で約４２．６％であり、かつ各ドメイン構造相互で比較しても、最も相同性の高いシステインリッチドメインで約７０％に留まる。このことから、ＡＤＳＥは、粥状動脈硬化症の発症あるいは進行において、他のサブクラスにはない特徴的な役割を果たしていることが強く推認される。従って、ＡＤＳＥを標的とした医薬化合物は、従来にはない特徴を備えた医薬となり得るものと期待される。
なお、スカベンジャー受容体様蛋白質である限り、配列番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においてはスカベンジャー受容体様蛋白質としての機能、を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
従って、配列番号２に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、それがスカベンジャー受容体様蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。
このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質がスカベンジャー受容体様蛋白質である限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは１もしくは数個以内である。
また本発明では、ＡＤＳＥを上述のような全てのドメイン構造を有する受容体全体として理解できるほか、特徴的なドメイン、特にリガンドとの結合能を担うドメインを保持した部分ペプチドとして理解することもできる。受容体蛋白質の中には、リガンド結合部位を含む部分断片が、特徴的な立体構造を保持したまま他のドメインから切り離されるなどして、遊離の（あるいは可溶化とも言われる）部分ペプチドとして存在し得るものがあることが、以前より報告されている。この様な部分ペプチドは、依然として特異的なリガンドとの結合能を保持していることから、これを用いて該受容体への結合能を有する化合物の探索が可能となる。ＡＤＳＥにおける部分ペプチドも、かかる意味においてそのリガンド結合能を有する限り、実質的には本発明と同等の物質であると理解すべきである。特に、ＡＤＳＥでは、αヘリカルコイルドコイルドメインを含むＣ末端側の部分ペプチドにおいてかかるリガンド結合機能が保持されるものと推定される。部分ペプチドの好ましい態様としては、例えばスペーサードメイン（９２〜１２６ａ．ａ．）、αヘリカルコイルドコイルドメイン（α−ｈｅｌｉｃａｌｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｄｏｍａｉｎ）（１２７〜３０５ａ．ａ．）、コラーゲン様ドメイン（３０６〜３８４ａ．ａ．）、またはＣ末端特異ドメイン（３８５〜４９５ａ．ａ．）のいずれかを含むペプチドが挙げられる。リガンド結合能を有するという観点では、少なくともコラーゲン様ドメイン（３０６〜３８４ａ．ａ．）を含むことが好ましい。少なくともコラーゲン様ドメイン（３０６〜３８４ａ．ａ．）を含む限り、他のドメインの全部または一部が連結していても良いし、他の蛋白質やペプチドとの融合蛋白質でも良い。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドは、該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用することが出来る。探索を通じて得られる化合物等は、本発明の蛋白質が関連する疾患、例えば動脈硬化症等に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
（抗体）
本発明はさらにＡＤＳＥに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、ＡＤＳＥ全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）２、パパインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。またＡＤＳＥあるいはその部分ペプチドを特異的に認識するのみでなく、ＡＤＳＥの活性を調節する機能を有する抗体も本発明に含まれる。ＡＤＳＥの活性を調節する機能を有する抗体とは、例えばＡＤＳＥとリガンドの結合を阻害する中和抗体が挙げられる。これらの抗体は、Ｃ−ＡＤＳＥの研究的あるいは臨床的な検出等に有用である。
（アンチセンス核酸）
本発明は、生体内において核酸レベルでのＡＤＳＥ生合成を抑制することのできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるアンチセンス核酸は、ＡＤＳＥをコードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ａｄｓｅの核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補する配列からなるものであってもよい。好ましくは、配列番号１または配列番号３に記載の核酸配列に相当あるいは相補する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造あるいは５’末端や３’末端に非翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有するものとなろう。
本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、ＡＤＳＥの活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限はない。
また本発明では、一般的には、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ましい。
この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなるものが好適である。
本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ  ｍａｘ  ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用する系のような本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で被験物質を系に添加し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより評価することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、生体内におけるａｄｓｅの発現を抑制することができるので、ＡＤＳＥが関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
発明の実施の最良の形態
（核酸）
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作成し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成するのに適した細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
本発明のＤＮＡを含む組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡの全部または一部（一部とは例えば本発明の蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡである）に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベクターである。
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、該蛋白質を発現している細胞や組織から調製することができ、またペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ  ジャパン株式会社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養については各種の成書（例、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年）があるので、それらを参考にして行うことができる。
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネースその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、スカベンジャー受容体様蛋白質として機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。
本発明の蛋白質は、抗体を作製するための抗原として使用し、あるいは該蛋白質に結合する物質や該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用することができ、有用である。
本発明のＡＤＳＥは、上述のような形質転換細胞、特に動物細胞を培養することにより、その細胞表面に目的分子を高発現させることが可能である。一方、ＡＤＳＥの細胞外領域タンパクフラグメントなどの適当な断片を可溶性タンパクとして製造する場合には、当該細胞外領域あるいは各ドメインをコードするＤＮＡを用いて上述のように形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞を培養することにより培養上清中に分泌させることにより製造することができる。
一方、ＡＤＳＥが形質転換細胞のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、適当な緩衝液に懸濁した細胞に対して、例えば超音波処理、凍結融解処理、あるいはリゾチーム処理などを行って細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で本発明の蛋白質を含有する膜画分を得、さらに該膜画分を適当な界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を調製する。そして、当該粗溶液から常法により目的蛋白質を単離、精製することができる。
（トランスジェニック動物）
本発明の遺伝子ａｄｓｅを用いれば、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。このトランスジェニック非ヒト哺乳動物も本願の発明に属する。該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような定法（例、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製することができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベクターを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。
具体的には、例えば、トランスジェニックマウスの場合には、正常Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６マウスから取得した前核期受精卵にａｄｓｅ遺伝子が発現可能なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的には、適切なプロモーターの下流にａｄｓｅ遺伝子を接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラス針を用いて直接注入する。該受精卵を仮親として別の偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウスと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティング法にてａｄｓｅ遺伝子の導入の有無を確認しトランスジェニックマウスを得る。
また、ａｄｓｅ（またはａｄｓｅのマウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノックアウトマウス」を作製することができる。本発明における「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由来の蛋白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２号公報、同５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製することができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一態様である。
または、最近中大動物においても核移植によるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本技術を用いたトランスジェニックおよびノックアウト動物の作出も実際に行われるようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の細胞に対しａｄｓｅ（または各動物におけるａｄｓｅの相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞から核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることができる。該動物はａｄｓｅ（または各動物におけるａｄｓｅの相同遺伝子）が失われたノックアウト動物である。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の細胞にａｄｓｅ（または各動物におけるａｄｓｅの相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン動物を得る事によりトランスジェニック動物を作製する事も可能である。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態様である。
（抗体）
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い、抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、それか抗体の作製に使用しうる精製度のものであれはいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れは良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製することができる。抗体を治療に使用する場合には、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５；１４６−１５６（１９９７））を免疫することにより調製することが出来る。また、モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３；９９−１２１（１９９１））。
（アンチセンス核酸）
アンチセンス核酸は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢｅｒｎａｌｄ  Ｌｅｂｌｅｕ編、ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成し、あるいはＡＤＳＥを鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成機（たとえばパーキンエルマージャパン（株）製、３９４型）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を、逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アンチセンス核酸を得ることができる。
本発明のＤＮＡやアンチセンス核酸を診断用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あるいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡもしくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被検物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中に、遺伝子ＡＤＳＥもしくはＲＮＡが含まれていれば、当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。
（スクリーニング方法）
本発明は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞または本発明のＤＮＡにより組換えたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とし、本発明の蛋白質の機能または発現を調節する物質をスクリーニング方法に関する。より具体的には、（１）被験物質の存在下／非存在下におけるリガンドとの結合能を評価する方法、（２）被験物質の存在下／非存在下における本発明の蛋白質または遺伝子の発現レベルを比較し、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。（１）の例としては、実施例３に示す系において、被験物質存在下／非存在下における変性ＬＤＬの結合・取り込み活性を測定すればよい。（２）の例としては、ａｄｓｅ遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポーター遺伝子の発現量を被験物質の存在下／非存在下で測定し、被験物質の転写促進活性または転写抑制活性を確認する方法が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞または本発明のＤＮＡにより組換えたトランスジェニック非ヒト哺乳動物と被験物質を接触させる工程；被験物質添加群と被験物質無添加群とにおける本発明の蛋白質の活性または本発明のＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを検出する工程；差が認められた被験物質を本発明の蛋白質の活性調節物質または本発明のＤＮＡの発現調節物質として選択する工程を含み得る。本発明の蛋白質の活性を調節する作用を示す物質とは、ＡＤＳＥ蛋白質の活性を増強（アゴニスト）あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を有する物質のいずれでも良いが、好ましくはアンタゴニストである。本発明のＤＮＡの発現調節作用を示す物質とは、遺伝子ａｄｓｅの発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよいが、好ましくは抑制する作用を有する物質である。被験物質が本発明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系に被験物質を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡの発現レベルとは、ａｄｓｅ遺伝子のｍＲＮＡの発現強度、蛋白質の発現強度のいずれにより検出しても良い。また、ａｄｓｅ遺伝子またはＡＤＳＥ蛋白質自体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子の発現レベルを検出しても良い。レポーターアッセイ系は、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する物質をスクリーニングするアッセイ系をいう。転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を利用することができる。本発明の遺伝子の発現制御領域や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可能である（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１９９３年）。阻害（または抑制）する作用を有する、あるいは増強（または促進）する作用を有するとは、蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、被験物質添加群と、被験物質無添加群との間に差があることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率＝（被験物質無添加群の測定値−被験物質添加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値＊１００
ここで、阻害または増強のどちらの活性であるかについて、および測定値については蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が実施例３に示す編成ＬＤＬの取り込み活性の測定系の場合には、測定値としては放射活性を用いることができ、被験物質添加群の測定値＜被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質にはＡＤＳＥ蛋白質活性阻害作用があるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。
本発明である蛋白質は、スカベンジャー受容体クラスＡ様蛋白質であることから、上述のスクリーニング方法あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、動脈硬化症等に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。被験物質としては蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
実施例
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
実施例１  遺伝子ａｄｓｅのクローニング
（１）オリゴキャップ法による完全長ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト脂肪組織よりＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．）に従い、オリゴｄＴセルロースを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。次に５−１０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む緩衝液中で、１．２ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＢＡＰと略する）（ＴａＫａＲａ）と３７℃で４０分間反応させ、キャップ構造を持たないポリ（Ａ）＋ＲＮＡの脱リン酸化を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをエタノール沈殿として回収した。回収したポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎを含む緩衝液中で２０Ｕの  Ｔｏｂａｃｃｏ  ａｃｉｄ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＴＡＰと略する）（Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ  ｖｏｌ．１３８，１７１−１７４）にて３７℃で４５分間処理し、キャップ構造の除去を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出して、エタノール沈殿を行い、ＢＡＰ−ＴＡＰ処理済ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを回収した。
この回収したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２−４μｇを０．４μｇの５’オリゴマー（５’−ＡＧＣ  ＡＵＣ  ＧＡＧ  ＵＣＧ  ＧＣＣ  ＵＵＧ  ＵＵＧ  ＧＣＣ  ＵＡＣ  ＵＧＧ−３’）とライゲーション反応を行った。この反応は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＡＴＰ、２５％のＰＥＧ８０００及び１００ＵのＲＮＡｓｉｎを含む緩衝液中で、２５０ＵのＲＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いて２０℃で３−１６時間行った。その後、未反応のオリゴマーを除去してｃＤＮＡ合成を行った。すなわち、２−４μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１０ｐｍｏｌのｄＴアダプタープライマー（５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−３’）と混合し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｎａｓｅ  Ｈ−  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、添付の緩衝液中で４２℃、１時間反応させた。
鋳型のＲＮＡを除去するために１５ｍＭのＮａＯＨを用いて６５℃で１時間反応させた後に、ｃＤＮＡの増幅操作を行った。１μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）＋ＲＮＡより合成されたｃＤＮＡを１６ｐｍｏｌのセンスプライマー１（５’−ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＴＴＧ−３’）及びアンチセンスプライマー１（５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＧＴ−３’）と混合し、ＸＬ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて増幅した。この際のＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１０分間のサイクルを５−１０回行った。ＰＣＲ産物をフェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて抽出し、エタノール沈殿として回収した。その後、回収物をＳｆｉ  Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動にて１０００ｂｐ以上のｃＤＮＡを分離し、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）のＤｒａ  ＩＩＩサイトに挿入した。尚、ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３のＤｒａ  ＩＩＩサイトは非対称性となっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉ  Ｉサイトとなっているため、挿入したｃＤＮＡ断片は一方向性に挿入されている。
（２）ｃＤＮＡクローン塩基配列及びその推定蛋白質情報の解析
（１）の方法で作製した  ｃＤＮＡライブラリーより、ＰＩ−１００ロボット（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドを調製し、各クローンの塩基配列を確認し、データベース化した。塩基配列決定は、ＡｕｔｏＣｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とＲ．Ｏ．Ｂ．ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い添付のプロトコールに従ってシークエンス反応を行い、ＡＬＦ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により行った。
（１）に記載の方法で取得したクローンＣ−ＡＤＳＥ０２０４５には、配列番号２で表される４９５個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする、配列番号１で表される１４８５塩基の塩基配列からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、全長３６４４塩基対の塩基配列（配列番号３）からなるｃＤＮＡが含まれていた。このプラスミドＣ−ＡＤＳＥ０２０４５は、国際微生物寄託機関である独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成１３年（２００１）２月１日付にて受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６７として寄託されている。
Ｃ−ＡＤＳＥ０２０４５に含まれているＯＲＦ部分の相同性の検索には、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．，３６，ｐｐ．２９０−３００（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，ｐｐ．４０３−４１０（１９９０））を用いて、アミノ酸配列における局部的な配列の一致を検索した。その結果、ヒトスカベンジャー受容体クラスＡタイプＩと、Ｎ末端側から細胞質ドメイン（１〜５９ａ．ａ．）において４２％、膜貫通ドメイン（６０〜９１ａ．ａ．）において５９％、スペーサードメイン（９２〜１２６ａ．ａ．）において２６％、αヘリカルコイルドコイルドメイン（α−ｈｅｌｉｃａｌｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ）（１２７〜３０５ａ．ａ．）において５１％、コラーゲン様ドメイン（３０６〜３８４ａ．ａ．）において５６％、及びＣ末端特異ドメイン（３８５〜４９５ａ．ａ．）において７０％、全体で４３％の相同性を示した。
推定された蛋白質配列と相同性検索から得られた異なる生物種由来のＳＲクラスＡサブタイプＩのアミノ酸配列とを、マルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＪ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，ｐｐ．４６７３−４６８０（１９９４））を用いて整列した結果を第２図に示す。
隠れマルコフモデルを用いた相同性検索プログラムであるＨＭＭＥＲ（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｋｒｏｇｈ，Ｇ．Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．，（１９９８））を用いてタンパク質ドメインデータベースであるＰｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｆａｍ／；Ｅ．Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，ａｎｄ  Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．，２８，ｐｐ．４０５−４２０（１９９７））に検索を実施した結果、ＭＳＲ  Ｉ型及びＩＩ型（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｓ０８２７８；Ｒｏｈｒｅｒ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４３，５７０−５７２，１９９０）と構造的類似性を有していた。
さらに、コンピュータソフトＰＲＯＳＩＴＥ、ＣＯＩＬ、ＴＭｐｒｅｄ及びＰＳＯＲＴ等を用い、ＡＤＳＥの２次構造を解析した。この結果、特に、ＳＲクラスＡサブタイプＩに認められる６種のドメイン構造である、（Ｎ末端側から）細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、スペーサードメイン、αヘリカルコイルドコイルドメイン（α−ｈｅｌｉｃａｌｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｄｏｍａｉｎ）、コラーゲン様ドメイン、及びＣ末端特異ドメインがすべて見出された。
上記の検索結果であるＡＤＳＥのドメイン構造と、ヒト由来ＳＲクラスＡサブタイプＩのドメイン構造との比較を第３図に示す。
また、ＡＤＳＥは、多くのリン酸化部位及び糖鎖結合部位、並びにヘム結合部位及びミクロボディー（ｍｉｃｒｏｂｏｄｙ；ペルオキシソーム（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ））Ｃ末端ターゲティングシグナルを有していることが確認された。この結果は、ＡＤＳＥが翻訳後修飾を受けるタンパクであることを示唆するものである。
実施例２  哺乳細胞での発現
Ｃ−ＡＤＳＥ０２０４５プラスミドを下記の方法でＣＯＳ−１細胞に導入し、蛋白質の発現を行った。
ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌを上記プラスミドＤＮＡ１２．５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ−１細胞に添加した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７２時間培養した後に、ＡＤＳＥ蛋白質発現細胞を回収し、実施例３に示す活性測定アッセイに供した。
実施例３  変性ＬＤＬ取り込み活性の検出
実施例２で作成したＡＤＳＥ蛋白発現細胞に酸化ＬＤＬあるいはアセチル化ＬＤＬを添加して一定時間インキュベートした。対照群として、ＡＤＳＥを発現しないベクターで組み換えた細胞を用意し、同様に処理した。インキュベート終了後、ヘキサン：イソプロパノール＝３：２で細胞の脂質を抽出・乾固し、イソプロパノールで再溶解させたもののコレステロールエステル量を酵素蛍光法で測定した。または、ＡＤＳＥ蛋白発現細胞に酸化ＬＤＬあるいはアセチル化ＬＤＬとともに［１４Ｃ］ラベルしたオレイン酸を添加し、一定時間インキュベートした。対照群として、ＡＤＳＥを発現しないベクターで組み換えた細胞を用意し、同様に処理した。インキュベート終了後、ヘキサン：イソプロパノール＝３：２で細胞の脂質を抽出・乾固した後、イソプロパノールで再溶解させたものをＴＬＣで展開し、コレステロールエステル画分を集めてその放射活性を測定した（細胞工学別冊  医学実験マニュアルシリーズ２  動脈硬化＋高脂血症研究ストラテジー  秀潤社  ｐ１４８−１５１、ｐ１５９−１６４）。その結果、ＡＤＳＥ蛋白質発現群では、対照群と比して、変性ＬＤＬ取り込み量の有意な増加が観察された。
実施例４  ノックアウトマウスの作製
（１）ターゲッティングベクターの構築
マウスＡＤＳＥタンパクをコードする内在性遺伝子を相同組換え（日経サイエンス、１９９４年５月号、第５２−６２頁）により不活性化（ノックアウト）するためのターゲティングベクターを構築した。ａｄｓｅのｃＤＮＡを３２Ｐで標識して常法に従ってハイブリダイゼーション用プローブを作製した。このプローブを用いて、マウスゲノムＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）が導入されたコスミドライスラリー（「ラボマニュアルヒトゲノムマッピング」、堀雅明及び中村祐輔編、丸善出版の方法と同様にして作製した。）をスクリーニングし、マウスＡＤＳＥをコードするエクソンを含むマウスゲノミックＤＮＡクローンを取得した。
該ゲノミックＤＮＡと適当な選択マーカー遺伝子を連結したプラスミドを線状化してターゲティングベクターとした。
（２）ターゲティングベクターのＥＳ細胞への導入
１５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地中で培養したマウス胚性幹細胞（（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６２，ｐ．２５５−２５８，１９９３及びＮａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２６，ｐ．２９２−２９５，１９８７）をトリプシンで処理して単一細胞とした後、リン酸緩衝液で３回洗浄して細胞濃度を１×１０７細胞／ｍｌに調製した。細胞懸濁液１ｍｌあたり２５μｇの前記ターゲティングベクターを加え、３５０Ｖ／ｃｍ（２５μＦ）の条件下で電気パルスを１回かけた。次いで、シャーレ（１０ｃｍ）に１×１０７細胞のＥＳ細胞を播種し維持培地中で１日培養した後、培地を選択培地（に交換した。以後２日毎に培地交換を行い培養した。ターゲティングベクター導入から１０日目に、マイクロピペットを用いて、顕微鏡下で数百個のネオマイシン耐性ＥＳ細胞クローンを取得した。得られたＥＳ細胞クローンを、Ｆｅｅｄｅｒ細胞を敷いた２４穴プレートで各々別々に培養することにより、ネオマイシン耐性ＥＳ細胞のレプリカを取得した。
（３）ノックアウトＥＳ細胞のスクリーニング
得られたネオマイシン耐性ＥＳ細胞の各々について、マウスＡＤＳＥをコードする内在性遺伝子の相同組換えによる破壊（ノックアウト）が起こっているか否かをゲノミックサザンブロッティングにより確認する。ゲノミックサザンブロッティングは、各々のネオマイシン耐性ＥＳ細胞から抽出したゲノミックＤＮＡのＥｃｏＲＩで切断断片について、マウスゲノミックＤＮＡの５’側及び３’側の配列を有する２つのプローブを用いて常法により行う。ＤＮＡの精製は、自動ＤＮＡ精製ロボット（クボタ製）を用いる。こうしてＥＳ細胞クローン中で、目的とするノックアウトが起こっていることが確認される。このＥＳ細胞クローンを下記に述べるノックアウトマウスの作製に用いる。
（４）ノックアウトマウスの作製
前記で得たマウスＡＤＳＥをコードする内在性遺伝子が相同組換えにより不活性化（ノックアウト）されたＥＳ細胞クローンの各々を、Ｃ５７ＢＬ６マウス（日本チャールズリバー製）の雄雌を交配して得た胚盤胞に１胚あたり１５個ずつ注入（マイクロインジェクション）する。注入直後に、偽妊娠処理してから２．５日目の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア製）の子宮に子宮の片側あたり約１０個ずつの胚盤胞を移植する。こうして、各々のＥＳ細胞クローンについて、ノックアウトキメラマウスを得る。次いで得られた各々のキメラマウスを正常Ｃ５７ＢＬ６マウスと交配し、ＥＳ細胞由来の毛色遺伝子によるアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）色のマウスを得る。
実施例５  ＡＴＡＣ−ＰＣＲを用いた発現プロファイルの解析
Ａｄａｐｔｏｒ−ｔａｇｇｅｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ（ＡＴＡＣ−ＰＣＲ）は外部機関へ委託し、Ｋａｔｏらの方法に従って行った（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，Ｖｏｌ．２５，４６９４−４６９６）。また解析に用いたヒトＲＮＡは以下の通りである。ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）及び、ヒト胎盤組織から定法によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。また、ヒト末梢血由来白血球を５０μｇ／ｍｌのＰＨＡ存在下で２４時間培養した後にｔｏｔａｌ  ＲＮＡを定法により調製した。さらにヒトの肺、腎臓、膵臓、小腸、胸腺、脾臓、心臓、子宮、精巣、前立腺、骨格筋のｔｏｔａｌ  ＲＮＡをクローンテック社より、肝臓、大腸、白血球、脳のｔｏｔａｌ  ＲＮＡについてはＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより購入した。次に、これら各ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ６μｇよりオリゴｄＴプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡの合成を定法に従って行った。逆転写酵素としてはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＮａｓｅ  Ｈ−  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。また、ＰＣＲに用いたａｄｓｅ特異的なプライマーの配列は５’−ＴＧＴ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＴＣＣ  ＴＡＴ  ＡＣＣ  ＴＧ−３’である。解析結果を第４図に示す。
発明の効果
本発明のＡＤＳＥは、動脈硬化症の発症あるいは進行に対してその原因となり得る蛋白質であり、これら疾患の予防あるいは治療のための医薬品の開発において、極めて有用である。また、ＳＲが細胞内に発生した種々ストレスに対して防御的に作用することからも、細胞内に生じたストレス、異物あるいは変性蛋白に起因する病的症状や疾患に対する医薬の開発にも有用であると期待される。
また、遺伝子ａｄｓｅは、アンチセンス医薬品として、また遺伝子治療において利用することができ、蛋白質ＡＤＳＥは、それ自体あるいはその可溶性断片（細胞外領域や各ドメイン）を作製することにより可溶性蛋白医薬品として有用である。さらに、ＡＤＳＥまたはその断片に反応性を有する抗体及びその抗体の一部は、生体内でのＡＤＳＥ機能を制御する抗体医薬品として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、クラスＡに属するスカベンジャー受容体蛋白質のドメイン構造図を示す。Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｍはサブタイプを表す。Ａは細胞質ドメイン、Ｂは膜貫通ドメイン、Ｃはスペーサードメイン、Ｄはαヘリカルコイルドコイルドメイン、Ｅはコラーゲン様ドメイン、ＦはＣ末端特異ドメインを表す。
第２図は、ＡＤＳＥと公知のスカベンジャー受容体とのアライメント結果を示す。
第３図は、ヒトスカベンジャー受容体クラスＡサブタイプＩとＡＤＳＥとのアミノ酸配列上の相同性を示す。Ａは細胞質ドメイン、Ｂは膜貫通ドメイン、Ｃはスペーサードメイン、Ｄはαヘリカルコイルドコイルドメイン、Ｅはコラーゲン様ドメイン、ＦはＣ末端特異ドメインを表す。
第４図は、ａｄｓｅ遺伝子のヒト臓器および各種細胞での発現プロファイルを示す。ＰＨＡとはＰＨＡ存在下培養ヒト末梢血由来白血球を表す。
【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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