(57)【要約】本発明のスクリーニング系は、スクリーニングに供される被験核酸１６をキメラ分子２２の細胞内ドメイン２６として発現させ、このキメラ分子２２が細胞外ドメインのレセプター２４から導入されるシグナルを前記被験核酸産物から構成される細胞内ドメイン２６を介して細胞内シグナルとして伝達し得るかをレポーター遺伝子２０の発現を介して測定することにより行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外ドメインとして細胞外シグナルを細胞内に導入し得るレセプターおよび細胞内ドメインとして被験核酸産物を備えたキメラ分子を用いて、シグナル伝達に関与する核酸をスクリーニングする方法であって、
前記レセプターをコードした遺伝子と被験核酸とを連結させて発現ベクター内に担持させ、前記キメラ分子を発現し得るキメラ分子発現ベクターを調製する工程と、
細胞内でシグナルが伝達された際に発現が誘導されるレポーター遺伝子を保持した細胞に前記キメラ分子発現ベクターを導入する工程と、
前記キメラ分子発現ベクターが導入された細胞に細胞外シグナル因子を作用させる工程と、
前記細胞外シグナル因子を作用させた後に前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子の上流には、細胞内でシグナルが伝達された際に誘導される細胞内シグナル伝達因子が結合して前記レポーター遺伝子の発現を促進させ得るシグナル伝達因子結合部位が備えられている、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
レセプターがＣＤ８であり、前記細胞外シグナル因子が抗ＣＤ８抗体である、請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記シグナル伝達因子結合部位がＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）である、請求項２〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記発現ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１〜６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記レポーター遺伝子を保持した細胞には、複数種のレポーター遺伝子が保持され、
前記複数種のレポーター遺伝子は、細胞内での異なるシグナル伝達によりそれぞれ発現が誘導される、請求項１〜７のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞外ドメインとして細胞外シグナルを細胞内に導入し得るレセプターおよび細胞内ドメインとして被験核酸産物を備えたキメラ分子を用いて、シグナル伝達に関与し得る核酸をスクリーニングするためのキットであって、
前記レセプター遺伝子が担持され、前記レセプター遺伝子と被験核酸とを連結させて前記キメラ分子を発現させるための発現ベクターと、
細胞内シグナル伝達が活性化された際に発現が誘導されるレポーター遺伝子を保持した細胞と、
前記細胞表面に発現されるシグナル導入蛋白質に細胞外シグナルを導入するための細胞外シグナル因子とを含む、スクリーニングキット。
【請求項１０】
前記レポーター遺伝子の上流には、シグナル伝達が活性化された際に誘導される細胞内シグナル伝達因子が結合して前記レポーター遺伝子の発現を促進させ得るシグナル伝達因子結合部位が備えられている、請求項９記載のスクリーニングキット。
【請求項１１】
レセプターがＣＤ８であり、前記細胞外シグナル因子が抗ＣＤ８抗体である、請求項９又は１０記載のシグナル伝達調節核酸のスクリーニングキット。
【請求項１２】
レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である、請求項９〜１１のいずれかに記載のスクリーニングキット。
【請求項１３】
前記細胞がＴ細胞である、請求項９〜１２のいずれかに記載のスクリーニングキット。
【請求項１４】
前記シグナル伝達因子結合部位がＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）である、請求項１０〜１３のいずれかに記載のスクリーニングキット。
【請求項１５】
前記発現ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項９〜１４のいずれかに記載のスクリーニングキット。
【請求項１６】
前記発現ベクターが、前記シグナル導入遺伝子に種々の異なる被験遺伝子が連結されたキメラ分子発現ベクターライブラリーとして提供される、請求項９〜１５のいずれかに記載のスクリーニングキット。
【請求項１７】
前記レポーター遺伝子を保持した細胞には、複数種のレポーター遺伝子が保持され、
前記複数種のレポーター遺伝子は、細胞内での異なるシグナル伝達によりそれぞれ発現が誘導される、請求項９〜１６のいずれかに記載のスクリーニングキット。
【請求項１８】
細胞内シグナル伝達の調節をモニタするための細胞であって、
細胞内シグナル伝達が調節された際に発現が変化するレポーター遺伝子を保持し、
前記レポーター遺伝子の上流には、細胞内シグナル伝達因子が結合して前記レポーター遺伝子の発現を変化させ得るシグナル伝達因子結合部位が備えられている、細胞。
【請求項１９】
前記シグナル伝達因子結合部位がＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）である、請求項１８記載の細胞。
【請求項２０】
前記レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である、請求項１８又は１９記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１８〜２０のいずれかに記載の細胞。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれかに記載のスクリーニング方法または請求項９〜１７のいずれかに記載のスクリーニングキットにより選択されたシグナル伝達因子。
【請求項２３】
配列番号７、１２、１４のいずれかに記載されたアミノ酸配列、またはシグナル伝達活性を有する範囲で前記各アミノ酸配列に欠失、挿入、置換を有するアミノ酸配列からなる、請求項２２に記載のシグナル伝達因子。
【請求項２４】
シグナル伝達因子をコードしたＤＮＡであって、
配列番号６、１１、１３のいずれかに記載の塩基配列、または配列番号６、１１、１３のいずれかに記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる、ＤＮＡ。
【請求項２５】
細胞内シグナル伝達に関与する因子をスクリーニングするための細胞であって、
細胞外ドメインとして細胞外シグナルを細胞内に導入し得るレセプターおよび細胞内ドメインとしてシグナル伝達因子を有する細胞膜貫通キメラ分子と、
細胞内シグナル伝達が調節された際に発現が変化する細胞内レポーター遺伝子と、を備え、
前記シグナル伝達因子として、配列番号７、１２、１４のいずれかに記載のアミノ酸配列またはシグナル伝達活性を有する範囲で前記各アミノ酸配列に欠失、挿入、置換を有するアミノ酸配列が備えられ、
前記レポーター遺伝子の上流には、細胞内シグナル伝達因子が結合して前記レポーター遺伝子の発現を変化させ得るシグナル伝達因子結合部位が備えられている、細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はシグナル伝達に関与し得る核酸のスクリーニング方法およびそのキットに関する。また本発明は前記スクリーニング方法またはキットに使用し得る細胞に関する。さらには、本発明のスクリーニング方法等によりスクリーニングされたシグナル伝達因子に関する。
背景技術
近年の細胞内シグナル伝達の研究により、生物の様々な活動、例えば、細胞の増殖、生物の発生や分化、さらには外的因子やストレスからの防御機構などがシグナル伝達経路により制御されていることが明らかにされつつある。
例えば、Ｔリンパ球における免疫応答もシグナル伝達を介して行われる。すなわち抗原がＭＨＣ（主要組織適合遺伝子）と結合し、その複合体がＴ細胞表面のレセプターに結合し抗原認識が行われると、レセプターと結合する細胞内の構成因子（ＣＤ３分子）がリン酸化され、このＣＤ３分子のリン酸化が細胞内酵素（キナーゼ）やアダプターとなるシグナル伝達因子を活性化することによってＮＦＡＴ（転写因子）が活性化され核内に移行し、発現誘導された因子（ＡＰ−１）と共に活性化型ＮＦＡＴとしてサイトカインの発現を誘導することが明らかになっている。
また血球系細胞では、例えば、エリスロポエチンが細胞表面のエリスロポエチンレセプターに結合すると、このエリスロポエチンレセプターと細胞内で結合している細胞内酵素ＪＡＫが活性化される。このＪＡＫの活性化はＳＴＡＴの活性化を導き、このＳＴＡＴが核内に移行して遺伝子の転写を促進させ細胞増殖が誘導される。またこの他にもＦＡＳ、ＦＡＤＤ、ＣＡＳＰＡＣＥを介してアポトーシスを誘導するシグナル伝達経路なども知られている。
こうして明らかにされている種々のシグナル伝達経路は生理的条件において実際に活性化、制御されているものであり、まだ多くのシグナル伝達経路およびそれに関与する因子の解明が待たれている状況にある。また、既知のシグナル伝達経路であっても、この伝達を仲介するアダプター因子が未だ知られていないことも考えられる。
従来のシグナル伝達因子等の解明は何らかのリン酸化活性等を指標としてスクリーニングが行われ、あるいはシグナル伝達経路が活性化された際に生じる表現形（例えば、Ｔ細胞ではＩＬ−２産生）を指標としてスクリーニングが行われている。
一方、比較的解明が進んでいるシグナル伝達経路では、より詳細なシグナル伝達の各経路あるいは関与する因子を解析するための系が開発されている。その一つとして、Ｂｒｙａｎ  Ａ．ら（Ｃｅｌｌ  ６４：８９１−９０１（１９９１），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２７：２１０−２８，２０００））によるキメラ分子を用いた方法がある。
この方法はＴ細胞におけるシグナル伝達経路、特に、Ｔ細胞レセプターのＣＤ３ζ鎖のシグナル伝達経路における役割を解析するために開発されている。この方法ではＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインにＣＤ８の細胞外ドメインを連結させたキメラ分子を構築する。そして、このキメラ分子をＴ細胞レセプターとは別にＴ細胞で発現させ、抗ＣＤ８抗体で人為的に細胞外からＣＤ８を介してキメラ分子に刺激を加え、細胞内でシグナルが伝達されるかをＩＬ−２の産生を指標として解析した。この解析により、ＣＤ３ζ鎖とＣＤ８の細胞外ドメインとのキメラ分子はＴ細胞レセプターと同様のシグナル伝達を活性化し得ることが示され、ＣＤ３複合体の他の分子（γ、δ、εなど）とは独立して十分な活性化シグナルを伝達することが可能であることが明らかにされている。
このようにキメラ分子を用いた解析系が既知のシグナル伝達経路の詳細な解析、特に各シグナル伝達因子の役割などの解析に有効であることから、種々のシグナル伝達経路の解析において、こうしたキメラ分子が利用されている。
上述したキメラ分子を用いた解析系により、シグナル伝達経路の詳細な解析が進展しているが、このような有効な系が新たなシグナル伝達因子を同定するためのスクリーニング系が求められている。
特に、従来のスクリーニング系ではリン酸化活性などのシグナル伝達経路の中間活性やシグナル伝達経路の最終の表現形などを指標としてスクリーニングが行われている。そして、このスクリーニングにより得られた因子が真にシグナル伝達経路に関与することを確認するためには、その因子をノックアウトした系や、逆に高発現させた系などを構築してシグナル伝達経路への影響を確認する必要があった。また、こうした時間を要し、かつ煩雑な工程を経て解析を行ったとしても、スクリーニングにより得られた因子が後にシグナル伝達経路に関与しないことが判明することも多々あった。
そこで、本願発明は、上記課題に鑑み、キメラ分子を用いて迅速かつ確実にシグナル伝達に関与する核酸をスクリーニングし得るスクリーニング系等を開発し、新規なシグナル伝達因子を同定することを第一の目的とする。さらに、本発明は上記スクリーニング系により同定された新規シグナル伝達因子を提供すること、および該新規シグナル伝達因子を利用したシグナル伝達調節因子のスクリーニング用の細胞を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明におけるシグナル伝達因子スクリーニング系の原理は、スクリーニングに供される被験核酸をキメラ分子の細胞内ドメインとして発現させ、このキメラ分子が細胞外ドメインのレセプターから導入されるシグナルを細胞内シグナルとして伝達し得るか否かを、レポーター遺伝子の発現を介して測定することにより行う。
すなわち、本発明は、細胞外ドメインとして細胞外シグナルを細胞内に導入し得るレセプターおよび細胞内ドメインとして被験核酸産物とを備えた細胞膜貫通型のキメラ分子を用いてシグナル伝達を調節し得る核酸をスクリーニングする方法であって、次の（１）〜（４）工程が含まれる。（１）前記レセプター遺伝子と被験核酸とを連結させて発現ベクター内に担持させ、前記キメラ分子を発現し得るキメラ分子発現ベクターを調製する工程と、（２）細胞内シグナル伝達が活性化された際に発現が誘導されるレポーター遺伝子を保持した細胞に前記キメラ分子発現ベクターを導入する工程と、（３）前記キメラ分子発現ベクターが導入された細胞に細胞外シグナル因子を作用させる工程と、（４）前記細胞外シグナル因子を作用させた後に前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、が含まれる。
上記発明によれば、キメラ分子発現ベクターが導入された細胞内でキメラ分子が発現され、このキメラ分子中のレセプターは細胞外ドメインに、被験核酸産物は細胞内ドメインに発現される。そして、この状態で細胞外シグナル因子を作用させるとレセプターを介して細胞内ドメインにシグナルが伝達する。ここで、上記被験核酸産物がシグナル伝達に関与する因子であればこのシグナルを細胞内シグナルとして伝達される。そして、このシグナルは必要に応じて細胞内のアダプター因子などを介し、細胞内に保持されているレポーター遺伝子の発現が誘導される。従って、最終的なレポーター遺伝子の発現を検出することにより被験核酸産物がシグナル伝達因子として機能するか否かを判定することが可能となる。
なお、上記本発明において、レポーター遺伝子の上流に、細胞内でシグナルが伝達された際に誘導される細胞内シグナル伝達因子が結合して前記レポーター遺伝子の発現を促進させ得るシグナル伝達因子結合部位を備え、シグナル伝達誘導の検出効率を高めることができる。上記レセプターとしてＣＤ８を用い、その場合には前記細胞外シグナル因子として抗ＣＤ８抗体を用いることができる。上記レポーター遺伝子として、ＧＦＰ遺伝子を用い、蛍光発光を指標にシグナル伝達が誘導されたことを検出することができる。前記細胞としてＴ細胞を用いることができる。また、前記シグナル伝達因子結合部位にＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）を用いることができる。前記発現ベクターとして、導入効率が高いレトロウイルスベクターを用いることができる。さらに、前記細胞には、複数種のレポーター遺伝子を保持させ、前記複数種のレポーター遺伝子は、細胞内での異なるシグナル伝達因子によりそれぞれ発現が誘導されるように構成することもできる。
このように本発明によれば、被験核酸産物のシグナル伝達活性を指標にスクリーニングを行うため、従来のようなリン酸化などを指標とする従来の系に比べ、高効率かつ確実にシグナル伝達に関与する因子をスクリーニングすることが可能となる。
本発明はさらに上記と同様のスクリーニング方法の原理をキット化して提供する。すなわち、本発明のキットは、細胞外ドメインとして細胞外シグナルを細胞内に導入し得るレセプターおよび細胞内ドメインとして被験核酸産物を備えたキメラ分子を用いて、シグナル伝達に関与し得る核酸をスクリーニングするためのキットであって、以下の構成が含まれる。（１）前記レセプター遺伝子が担持され、前記レセプター遺伝子と被験核酸とを連結させて前記キメラ分子を発現させるための発現ベクターと、（２）細胞内シグナル伝達が活性化された際に発現が誘導されるレポーター遺伝子を保持した細胞と、（３）前記細胞表面に発現されるシグナル導入蛋白質に細胞外シグナルを導入するための細胞外シグナル因子とが含まれる。
上記スクリーニング系をキット化することにより、迅速にかつ簡便に上記スクリーニング系を実施することが可能となる。これにより新規のシグナル伝達因子の同定が促進され、新たなシグナル伝達経路の解明が期待される。
本発明は上記スクリーニングに利用し得る細胞を提供する。すなわち、細胞内シグナル伝達の調節をモニタするための細胞であって、細胞内シグナル伝達が調節された際に発現が変化するレポーター遺伝子を保持し、前記レポーター遺伝子の上流に細胞内シグナル伝達因子が結合し前記レポーター遺伝子の発現を変化させ得るシグナル伝達因子結合部位が備えられている。
さらに、本発明は、上記スクリーニング方法または上記スクリーニングキットを用いて得られたシグナル伝達因子およびこれをコードするＤＮＡを提供する。このシグナル伝達因子は、配列番号７、１２、１４のいずれかに記載されたアミノ酸配列、またはシグナル伝達活性を有する範囲で前記各アミノ酸配列に欠失、挿入、置換を有するアミノ酸配列からなる。また、上記シグナル伝達因子をコードしたＤＮＡは、配列番号６、１１、１３のいずれかに記載の塩基配列、または配列番号６、１１、１３のいずれかに記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる。
さらに、本発明は上記スクリーニング方法等により同定されたシグナル伝達因子を備え、該因子による細胞内シグナル伝達に関連する因子をスクリーニングするための細胞を提供する。本細胞は、（１）細胞外ドメインとして細胞外シグナルを細胞内に導入し得るレセプターおよび細胞内ドメインとしてシグナル伝達因子を有する細胞膜貫通キメラ分子と、（２）細胞内シグナル伝達が調節された際に発現が変化する細胞内レポーター遺伝子とを備え、ここで、前記細胞膜貫通キメラ分子におけるシグナル伝達因子としては、配列番号７、１２、１４のいずれかに記載のアミノ酸配列またはシグナル伝達活性を有する範囲で前記各アミノ酸配列に欠失、挿入、置換を有するアミノ酸配列が備えられ、また、前記レポーター遺伝子の上流には、細胞内シグナル伝達因子が結合して前記レポーター遺伝子の発現を変化させ得るシグナル伝達因子結合部位が備えられている。
上記細胞にさらに被験試料を作用させた際に、前記シグナル伝達因子によるレポーター遺伝子の発現を上昇または低下させ得る物質を同定することにより、前記シグナル伝達因子が関与する伝達経路の阻害因子、促進因子などのスクリーニングをすることも可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について図面に基づき詳細に説明する。
（１）シグナル伝達因子をコードする核酸のスクリーニング方法
本発明はシグナル伝達因子をコードする核酸のスクリーニング方法に関する。本実施形態のスクリーニング方法は、細胞内ドメインとして被験核酸産物と細胞外ドメインとしてレセプター分子とを備えたキメラ分子を細胞において発現させ、レセプター分子に細胞外のシグナル因子を作用させる。ここで、キメラ分子の被験核酸がシグナル伝達に関与するものである場合には、レセプターからシグナルを受取ることが可能となる。そして、このシグナルは細胞内で伝達され、最終的にレポーター遺伝子の発現を誘導する。よって、最終的なレポーター遺伝子の発現を指標としてシグナル伝達因子をコードする核酸をスクリーニングすることが可能となる。上記原理に基づいたスクリーニング方法は、具体的には、以下に示す一連の工程により実施することができる。
▲１▼  キメラ分子発現ベクターの調整
細胞においてキメラ分子を発現させるために、図１（Ａ）に示すように、キメラ分子をコードしたカセットを発現ベクター１０に担持させたキメラ分子発現ベクターを調製する。このカセットは、レセプターを細胞外ドメインとして、また被験核酸を細胞内ドメインとして発現させるために、膜貫通配列１２を挟んでレセプター遺伝子１４と被験核酸１６とを読み枠を合わせて連結させ、さらに被験核酸１６の下流にストップコドンを挿入することで構成される。
ここで上記発現ベクター１０は、その後の細胞への導入を効率よく実施し得るベクターであれば、特に限定はなく、ウイルス粒子として導入するベクター、プラスミドとして導入し得るベクターのいずれでもよい。例えば、レトロウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドＤＮＡ複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられる。
また、レセプター遺伝子１４は、受容体をコードした遺伝子以外にも細胞外シグナルを細胞内に導入し得る因子をコードした遺伝子を意味し、受容体をコードした遺伝子に限定されない。従って、本レセプター遺伝子１４としては、例えば、図１に示すＴ細胞の表面抗原であるＣＤ８、ＣＤ２５（Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ  Ｆら，Ｃｅｌｌ  ６９：１１４３−５７（１９９２））、ＣＤ１６（Ｋｏｌａｎｕｓ  Ｗら，Ｃｅｌｌ  ７４：１７１−８３（１９９３）、Ｒｏｍｅｏ  Ｃら，Ｃｅｌｌ  ６８：８８９−９７（１９９２））、ＣＤ２（Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｓら，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１５１−６０（１９９６））などをコードした遺伝子を用いることができる。また、増殖因子レセプターなどのＥＧＦ−Ｒ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ），ＰＤＧＦ−Ｒ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（Ｓｅｅｄｏｒｆ  Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２４２４−３１（１９９１）、Ａｄａｍ  Ｄ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９８８２−８（１９９３））、ＧＨ（成長ホルモン）レセプター（Ｂｅｈｎｃｋｅｎ  ＳＮ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７０００−７（２０００））、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ），Ｆａｓ（Ｂａｚｚｏｎｉ  Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：５３７６−８０（１９９５）、Ｉｓｈｉｗａｔａｒｉ−Ｈａｙａｓａｋａ  Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１２５８−６４（１９９９））などをコードした遺伝子なども用いることができる。
また、上記遺伝子は必ずしも全長を用いる必要はなく、上記遺伝子のうち細胞外のシグナルを受取り、細胞内ドメインにシグナルを伝達し得る領域をコードした配列部分だけであってもよい。
被験核酸１６は、シグナル伝達因子をコードしているか否かを調べる対象となる核酸である。この被験核酸１６としては、哺乳動物の種々の細胞由来のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを用いることができる。また、簡便には、例えば、図１（Ａ）に示すような既存のｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリーを用いて、キメラ分子発現ベクターライブラリーを構築してもよい。
▲２▼  レポーター遺伝子を保持した細胞へのキメラ分子発現ベクターの導入
先ず、本工程を実行する前に、図１（Ｂ）に示すレポーター遺伝子を保持した細胞を調製する。このレポーター遺伝子２０は細胞内にシグナルが伝達されたことを検知して発現が誘導されるように構成される。細胞内でシグナルが伝達されたことを検知可能とするために、例えばレポーター遺伝子２０の上流に転写を誘導し得るシグナル伝達因子が結合する部位（以下、「シグナル因子結合部位」という）を備えることができる。この転写を誘導するシグナル伝達因子としては、下流のレポーター遺伝子の転写を促進し得るシグナル伝達因子であればよく、例えば、ＮＦＡＴ（Ｈｏｅｙ，Ｔ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：４６１−４７２（１９９５））、ＮＦκＢ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．らＧｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：７７５−８７（１９９２））、ＳＴＡＴ（Ｅｌｉａｎａ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：６６９８−６７０３（１９９９））などを用いることができる。また、上記シグナル因子結合部位には、上記シグナル因子に対応したものを選択する。例えば、シグナル伝達因子としてＮＦＡＴを用いる場合には、シグナル伝達因子結合部位としてＮＦＡＴ結合配列を用いるように、それぞれの伝達因子に対応した結合配列が用いられることが好ましい。
また、レポーター遺伝子は、その発現により細胞の表現形が変化し得るものを選択することが好ましい。例えば、遺伝子が発現された際に蛍光を発光するような、クラゲＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（Ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などを好適に用いることができる。また、基質として反応させることにより蛍光を発光するレポーター遺伝子として、βガラクトシダーゼ遺伝子（Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒ．６３：６７３−６８６（２００１））、βラクタマーゼ遺伝子（Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒ．６３：６７３−６８６（２００１））などを用いることができる。また、その発現により細胞毒性を示し細胞の死滅により発現を検出し得るレポーター遺伝子として、チミジンキナーゼ遺伝子（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３２６６−３２７３（２０００））、ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：２３９−２５０（１９９５））などを用いることができる。また、レポーター遺伝子として、特異的抗体及び分離装置ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）を用いてその発現を検知し得る細胞表面抗原遺伝子、例えば、ＣＤ８遺伝子（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１４−１９（１９９８））、ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｒａｔＣＤ２（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．７１：６１−６６（２０００））、ＣＤ２４（Ｂｌｏｏｄ  ９４：２２７１−２２８６（２０００））なども用いることができる。また、この他にもＣａ２＋を検出して蛍光するＣａｍｅｌｅｏｎｓをコードする遺伝子（Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒ．６３：６７３−６８６（２００１））、構造変化により蛍光を発光するｃａｍｇａｒｏｏｓをコードする遺伝子（Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒ．６３：６７３−６８６（２００１））、ｐＨの変化を検出して蛍光を発するｐＨｌｕｏｒｉｎｓをコードする遺伝子（Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒ．６３：６７３−６８６（２００１））などもレポーター遺伝子として用いることができる。
また、このレポーター遺伝子は一種類に限られず、複数種を細胞に保持させてもよい。この場合、異なるシグナル伝達経路に関与する核酸を区別してスクリーニングし得るように構成することもできる。例えば、一方のレポーター遺伝子にＧＦＰ遺伝子を用い、その上流には、ＮＦＡＴ結合配列を配置する。他方のレポーター遺伝子にＲＦＰ遺伝子を用い、その上流にはＮＦκＢ結合配列を配置する。このような構成を用いれば、ＮＦＡＴが関与するシグナル伝達経路に関与する因子は緑色の蛍光を指標に同定することができ、ＮＦκＢが関与するシグナル伝達経路に関与する因子は赤色の蛍光を指標に同定することができる。このように複数種のレポーター遺伝子、シグナル伝達因子結合配列を用いることにより、同時に複数種のシグナル伝達因子のスクリーニングを行うことが可能となる。
一方、上記シグナル因子結合部位を備えたレポーター遺伝子が導入される細胞は、特に限定はなく、天然の状態でレセプターなどを備え、そのレセプターを介してシグナルが細胞内に伝達され得る細胞であることが好ましい。このような細胞であれば、後述するレポーター遺伝子の導入、更には該レポーター遺伝子の発現がシグナル伝達誘導の指標として機能し得るかを、該レセプターからのシグナル導入後におけるレポーター遺伝子の発現を介して確認することができる。このような細胞の例としては、リンパ球系の細胞、造血系の細胞などが挙げられる。
上記細胞へのレポーター遺伝子の導入方法は、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション法、カルシウムリン酸法などの細胞へ核酸を導入し得るあらゆる方法により実施することができる。また、導入されたレポーター遺伝子の細胞内での保持は、プラスミドなどにより染色体外に保持させる方法であっても、また染色体内にインテグレーションさせる方法であってもレポーター遺伝子が安定に保持されればよい。
また、レポーター遺伝子が導入された細胞の選択は、上記レポーター遺伝子の存在あるいは発現を指標として、ＰＣＲ、サザンブロッティング法、ウェスタンブロッティング法、さらにはレポーター遺伝子が発現した際の表現型を検出する方法などにより実施することができる他、たとえば薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を導入し、該マーカー遺伝子を指標に選択してもよい。なお、レポーター遺伝子が発現した際の表現型の検出は、上述した天然のレセプターからシグナルを導入してレポーター遺伝子を発現させることにより実施することができる。すなわち、細胞が天然にレセプターを有している場合には、そのレセプターに特異的な抗体などを作用させ、外部刺激（シグナル）を加えて、細胞内にシグナルを伝達させる。ここでレポーター遺伝子が導入されている細胞では、その細胞内のシグナルによりレポーター遺伝子が発現される。従って、レポーター遺伝子の発現を指標としてレポーター遺伝子が導入された細胞を選択することができる。このような場合には、レポーター遺伝子が導入された細胞の選択と同時に、レポーター遺伝子が細胞内シグナル伝達により応答して発現することを確認することができる。
上記レポーター遺伝子を保持する細胞を得た後、次にこの細胞にキメラ分子発現ベクターが導入される。この導入方法は、用いた発現ベクターに従って選択する必要がある。例えば、発現ベクターとして、レトロウイルスベクターなどのウイルス粒子を形成するウイルスベクターを用いた場合には、市販のパッケージングキットや通常のパッケージングプロトコルに従ってウイルス粒子を生成して、このウイルス粒子を上記細胞に感染させることにより導入することができる。またウイルス粒子を生成しないベクターを用いた場合には、当業者に公知のエレクトロポーレーション、リポフェクチン法、リピッド法、カルシウムリン酸法などにより細胞内にキメラ分子発現ベクターを導入することができる。
上記の通りキメラ分子発現ベクターが導入された細胞では、図１（Ｂ）に示すようにキメラ分子２２のレセプター２４が細胞外ドメインに発現され、細胞内ドメインにはｃＤＮＡライブラリーなどの被験核酸産物２６が発現される。従って、このような細胞の精製は、細胞外ドメインとして発現されているレセプター２４と特異的に反応する抗体を用いて選択することにより実施することができる。より具体的には、キメラ分子中のレセプターに特異的な抗体を結合させた固相に、目的のキメラ分子が発現している細胞を接触させて捕獲し回収することができる。さらに上記レセプターに特異的な抗体に対する二次抗体を固相（例えば、ビーズなど）に結合させたものを用いて得ることもできる。また、蛍光標識した特異抗体でレセプターが発現している細胞を蛍光染色し、染色された細胞をセルソーター（ＦＡＣＳやＭＡＣＳ）を用いて分離することもできる。
▲３▼  細胞外シグナル因子の作用
キメラ分子発現ベクターが導入された細胞に細胞外シグナル因子を作用させる。この細胞外シグナル因子は、キメラ分子内のレセプターより細胞内にシグナルを導入し得るものであればよく、レセプターに対する天然のリガンドを用いる他に、このレセプターに特異的な抗体などを用いてもよい。例えば、レセプターとして使用し得るものとして上述したＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ２などに対しては、それぞれ対応する特異的な抗体を用いることができる。また、増殖因子レセプターなどであるＥＧＦ−Ｒ，ＰＤＧＦ−Ｒ、ＧＨレセプター、ＴＮＦ，Ｆａｓを用いた場合には、対応するリガンドや特異的な抗体を細胞外シグナル因子として用いることができる。
また、上記細胞外シグナル因子を細胞で発現しているレセプターに作用させる場合には、細胞培養液中に直接、該細胞外シグナルを添加してもよく、また、細胞を培養するためのプレートに細胞外シグナル因子を予め固定化し、このプレート内で細胞を培養することによって実施してもよい。
▲４▼  レポーター遺伝子発現検出工程
上記の通り、細胞外シグナル因子を細胞に作用させることにより、細胞表面のレセプターにシグナルが導入される。このシグナルは、レセプターとともにキメラ分子を構成している細胞内ドメインの被験核酸産物に伝えられる。そして、この被験核酸産物が細胞外からのシグナルを細胞内に伝達し得る場合には、レセプターから導入されたシグナルが細胞内のアダプター因子等に伝達され、最終的にレポーター遺伝子の発現が誘導される。従って、細胞外シグナル因子作用後のレポーター遺伝子の発現を細胞の表現型の変化などから検出することにより被験核酸産物がシグナル伝達に関与する因子であるか否かを判定することができる。
例えば、レポーター遺伝子としてＧＦＰなどの蛍光を発する蛋白質をコードした遺伝子を用いた場合には、細胞外シグナル因子を作用させた後の細胞における蛍光発光という表現型を指標として、フローサイトメトリーなどで分画することによりシグナル伝達因子をコードした被験核酸を保持した細胞をスクリーニングすることができる。また、スクリーニングする際に蛍光を発する陽性細胞が少なく、検出が困難である場合には、陽性細胞と思われる細胞分画を培養等して増幅させるか又はこの分画を上記細胞外シグナル因子で刺激を加える工程から本工程までを再度繰り返して、目的細胞を増幅させてもよい。
▲５▼  クローニング
上記一連の工程によりスクリーニングされた細胞には、キメラ分子の細胞内ドメインとしてシグナル伝達に関与する因子が含まれる。ここで得られたシグナル伝達因子の作用の確認、またシグナル伝達活性の強さの確認は、上述した一連のスクリーニング方法を利用して行うことができる。すなわち、スクリーニングされた細胞からキメラ分子発現ベクターの細胞内ドメインを回収し、再度、キメラ分子構築に用いたベクターにサブクローニングする。サブクローニングされた細胞を、再び、レポーター遺伝子を保持した細胞に導入し、キメラ分子を発現させ、外部よりレセプターに刺激を加えてシグナルを導入する。その際の細胞内レポーター遺伝子の発現およびその強度により、得られたシグナル伝達因子の作用および相対的な強度などを測定することもできる。
また、上記細胞中のキメラ分子発現ベクターから細胞内ドメイン領域を回収し、定法に従って、クローニング、シークエンス決定を行うことにより、シグナル伝達因子の配列を決定することができる。そして、ここで決定されたシークエンスと従来のシグナル伝達に関与する遺伝子配列とを比較することにより、シグナル伝達因子として既知の遺伝子であるか新たな遺伝子であるかを判断することができる。
またスクリーニングされたシグナル伝達因子の活性部位の同定は次の操作により実施することができる。上記で回収されたキメラ分子発現ベクター中の細胞内ドメイン領域を当業者に公知の方法または市販のキットなどを用いて、段階的に欠失させたディリーションシリーズを作成する。これらを再度、上記発現ベクターに戻しキメラ分子発現ベクターを構成する。そして、これらを上述のスクリーニング方法と同様に上記レポーター遺伝子が保持されている細胞内に導入、発現させて、外部刺激を加えた際のレポーター遺伝子の発現を指標として、シグナル伝達活性が残存しているか否かを測定する。そして、ここで活性が残存しているクローンに保持しされている領域がシグナル伝達に必要な配列として同定することができる。
上述の通り、本発明のスクリーニング方法によれば、被験試料におけるシグナル伝達活性を直接指標としてスクリーニングが行われるため、高効率でシグナル伝達因子を得ることができる。また、本発明の方法は、新規なシグナル伝達因子の同定に使用し得るだけでなく、シグナル伝達活性の確認、活性部位の特定などにも利用することが可能となる。
（２）シグナル伝達を調節し得る核酸をスクリーニングするためのキット
本発明は、上記スクリーニング方法をより簡便に実行させるために上記原理に基づいたスクリーニングキットを提供する。このスクリーニングキットには、▲１▼
レセプター遺伝子が担持され前記レセプター遺伝子と被験核酸とを連結させて前記キメラ分子を発現させるための発現ベクターと、▲２▼  細胞内シグナル伝達が活性化された際に発現が誘導されるレポーター遺伝子を保持した細胞と、▲３▼  前記細胞表面に発現されるシグナル導入蛋白質に細胞外シグナルを導入するための細胞外シグナル因子とを含めることができる。
これらレポーター遺伝子を保持した細胞、細胞外シグナル因子は上述したスクリーニング方法に関する記載に従って調製することができる。また、上記発現ベクターについても、上述の方法に関する記載に従って調整することができるが、被験核酸として所望の核酸の挿入、切出しを容易にするために、次の通り構成してもよい。発現ベクターには、レセプター遺伝子、膜貫通領域、ストップコドンの順で連結して備えられ、この膜貫通領域とストップコドンとの間には、被験核酸として所望の核酸を挿入し得るようにマルチクリーニングサイトを設けることができる。また、膜貫通領域は、膜貫通領域を備えたシグナル伝達因子のスクリーニングを考慮すると必ずしも必須ではないが、本発明のスクリーニングでは、膜結合型のシグナル伝達因子だけでなく、細胞内でシグナル伝達を仲介するアダプター因子をもスクリーニングすることを目的とするため、このような因子をもスクリーニングし得るように、上記の通り発現ベクターに膜貫通領域を備えることが好ましい。なお、膜貫通領域としては、細胞外ドメインとして用いたレセプター分子、例えば、上述したＴ細胞の表面抗原であるＣＤ２５、ＣＤ１６、ＣＤ２など、増殖因子レセプターなどのＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＧＨレセプター、ＴＮＦ、Ｆａｓなどの固有の膜貫通領域を用いることができるほか、レセプターからのシグナルを細胞内ドメインに伝達し得るものであれば、レセプター分子とは異種の膜貫通領域を用いてもよい。
また、被験核酸としては、種々の細胞あるいは、組織由来のｃＤＮＡなどを用いることができる他、ゲノムＤＮＡを所望の長さに断片化した試料などを用いてもよい。これらｃＤＮＡ、ゲノム由来の核酸は、所望の細胞より当業者に周知の方法に従って調整することができる。また、発現ベクターに被験核酸として種々の生物あるいは組織由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを予め挿入し、キメラ分子発現ライブラリーなどとして提供してもよい。
上記構成の他、キットには必要な試薬や細胞培養用の培地などを含めることができる。また、上記第一の実施形態に従ったスクリーニング方法を示したプロトコールなども含めることができる。
また、上述したキットとして、スクリーニングに必要な試薬などをすべてパッケージングして提供してもよいが、必要に応じて、調整に時間を要するレポーター遺伝子を保持した細胞のみを提供してもよい。このような細胞が予め調整されて提供されることにより、上記スクリーニング方法を簡便に実施することが可能となる。
（３）シグナル伝達因子
上記スクリーニングにより得られた新規なシグナル伝達因子は、細胞内のシグナル伝達経路の解明に有用となる。得られたシグナル伝達因子が、どのような経路に関与しているかを解析するために、公知の相互作用を解析する手法、例えば、酵母で開発されたＴＷＯ−ハイブリッドシステム、免疫沈降法などを用いて、該シグナル伝達因子と相互作用する物質を検索し、該シグナル伝達因子が関与する伝達経路を解明もしくは同定することができる。上記ＴＷＯ−ハイブリッドシステムは、Ｔ．Ｄｕｒｆｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｅｓ  Ｄｅｖ．７：５５５（１９９３）に従い、あるいはＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用い添付のプロトコールに従って実施することができる。
また、上記のような相互作用の解析により、シグナル伝達因子に対する阻害剤、促進剤などを得ることもできる。シグナル伝達因子と相互作用する物質が阻害剤・促進剤であるかの判定に、上記シグナル伝達因子が上記スクリーニングされた細胞が有用となる。この細胞には、細胞外ドメインであるレセプターとこれに連結した細胞内ドメインであるシグナル伝達因子とを有するキメラ分子が備えられ、また、細胞内にはシグナル伝達により発現するレポーター遺伝子が備えられている。したがって、阻害剤または促進剤であるかを解析するために、これら候補物質存在下で、レセプターにシグナルを導入し、これら物質が存在していない場合に比して細胞内ドメインを介するシグナル伝達活性が減少するか、上昇するかをレポーター遺伝子の発現量を測定する。そして、この測定結果において、候補物質非存在下に比べシグナル伝達活性が上昇した場合には、候補物質がシグナル伝達因子に対する促進剤と判定でき、候補物質非存在下に比べシグナル伝達活性が減少した場合には阻害剤であると判定することができる。
また、上記シグナル伝達因子をコードしたＤＮＡは、同種生物または異種生物におけるシグナル伝達因子をコードした類似の核酸をスクリーニングするためのプローブ、プライマーなどとして用いることができる。すなわち、上記スクリーニングされた細胞より細胞内ドメインをコードするＤＮＡを回収し、そのＤＮＡをプローブ等としてハイブリッドを形成する核酸を選択することにより、同種生物、異種生物よりシグナル伝達因子をコードした核酸をさらにスクリーニングすることも可能となる。
このようなシグナル伝達因子として、具体的に用いることができるものとしては、配列番号７、１２、１４に記載のポリペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではなく、シグナル伝達活性を有する範囲で前記配列番号７、１２、１４に記載のアミノ酸配列に欠失、挿入、置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることもできる。なお、アミノ酸配列における「置換、欠失、挿入および／または付加」において、アミノ酸の変異数や変異部位はシグナル伝達活性が保持される限り制限はない。これらポリペプチドは、該シグナル伝達因子に対する特異抗体の作成、上記相互作用する物質の解析に有益となる。
また、シグナル伝達因子をコードした核酸としては、例えば、配列番号６、１１、１３に記載のＤＮＡが挙げられ、また上述した通り、配列番号６、１１、１３のいずれかに記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも用いることができる。なお、ＤＮＡを単離するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃で、より厳しい条件としては、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃で、さらに厳しい条件としては、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で実施することができる。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
実施例
［実施例１］モニタ細胞としてＮＦＡＴ−ＧＦＰ  Ｔ細胞ハイブリドーマ株の調製
先ず細胞に導入するためのｐＮＦＡＴ−ＧＦＰプラスミドの構築過程を図２に示す。ｐＮＦＡＴ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：６９５−６９７（１９９２））には、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｅ遺伝子の上流にＮＦＡＴ結合配列（ＴＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴ：配列番号８）の３回同方向繰返し配列とＩＬ−２プロモータの最小単位（配列番号９）が備えられている。このプラスミドを酵素で消化しＮＦＡＴ−ＩＬ−２プロモーターカセットを切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに挿入し、さらにその下流にｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）から切り出したＥＧＦＰフラグメント及びポリＡシグナルを含むフラグメントと連結させてｐＮＦＡＴ−ＧＦＰプラスミドを作成した。
このプラスミドをＳｃａＩで直鎖状とした。この直鎖状のｐＮＦＡＴ−ＧＦＰ（３０μｇ）をＴ細胞ハイブリドーマ細胞株２Ｂ４（Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ３０：１４１−１５２（１９８２））（１Ｘ１０７細胞）にエレクトロポーレションにより導入した。エレクトロポーレションはＧｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用い、３００Ｖ、９７５μＦの条件でＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて行った。
次に、抗Ｔ細胞レセプターモノクローナル抗体Ｈ５７．５９７（Ｒａｌｐｈ  Ｋｕｂｏ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２７３６−２７４２（１９８９）、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社より入手可能）を用いて、ＮＦＡＴ−ＧＦＰが導入された細胞をスクリーニングした。すなわち、前記モノクローナル抗体による刺激を受けることによりシグナル伝達経路が活性化され、ＮＦＡＴ−ＧＦＰカセットを保持した細胞は緑色の蛍光を発することとなる。従って、上記モノクローナル抗体を用いて刺激を加えた後、蛍光を発する細胞をセルソーター（ＦＡＣＳ）で選択することによりＮＦＡＴ−ＧＦＰカセットを保持した細胞を得ることができる。
より具体的には、上記抗体を用いた刺激は、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中１０μｇ／ｍｌに濃度に調製されたＨ５７．５９７抗体（０．３ｍｌ）を６穴プレートの各ウェルにあらかじめコーティングしておき、そこに上記条件でエレクトロポレーションを行った後２日目の細胞（総細胞数５Ｘ１０６）を５Ｘ１０５細胞づつ各ウェルに分注し、６時間インキュベートすることにより行った。その後、この抗体刺激により蛍光を発した細胞をＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、カルフォルニア州、米国）を用いて測定し、蛍光を発する細胞群を選択した。
上記モノクローナル抗体による刺激からＦＡＣＳによる選択までの操作を更に２回繰り返すことにより、最終的にスクリーニングされたほぼすべての細胞がＴ細胞レセプターを介した刺激導入に対してＧＦＰを発現した。
さらに、これら細胞を限界希釈することにより単一のクローンに分離した。これらクローンが抗Ｔ細胞レセプターモノクローナル抗体によるＴＣＲへの刺激付与に対して特異的にＧＦＰが発現することを確認するために、上記抗体の刺激操作を抗Ｔ細胞レセプターモノクローナル抗体以外の抗体を用いて行った。その結果、抗Ｔ細胞レセプターモノクローナル抗体以外の抗体ではＧＦＰは発現せず、バックグラウンドとして蛍光を発しないことが確認された。このうちクローニングされたクローンのうち代表的なものを、４３−１細胞株として樹立し、この細胞株をこれ以降の実施例に用いた。
［実施例２］ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡライブラリー構築の基礎となるｍＲＮＡはＮＫ細胞から調製した。
（１）ＮＫ細胞の調製：  ＮＫ細胞は６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から精製された。リンパ球は抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＧＫ１．５：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）または抗ＣＤ８モノクローナル抗体（５３．６．７：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）と混合し、ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体及びヒツジ抗ラットＩｇＧ抗体を結合させた磁気ビーズ（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｉｎｃ．）とインキュベートして表面Ｉｇ＋（ｓｕｅｆａｃｅ  Ｉｇ＋：ｓＩｇ＋）Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した。残りの細胞をＮＫ細胞が有する表面抗原ＤＸ５に特異的なモノクローナル抗体であるＦＩＴＣ標識抗ＤＸ５抗体（５μｇ／ｍｌ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州）と反応させＮＫ細胞を染色し、続いて、マイクロビーズ−抗ＦＩＴＣ抗体（２０倍希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．ドイツ）でインキュベートした。その後、ＤＸ５＋細胞であるＮＫ細胞を、Ｍｉｄｉカラムを用いたＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．）により精製した。ここで精製されたＮＫ細胞の一部は、１０％ＦＣＳ及び０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ−１６４０でヒト組換えＩＬ−２（シオノギおよびＧｅｎｚｙｍｅから入手可能）（１０，０００Ｕ／ｍｌ）存在下で７日間培養した。
（２）ＮＫ細胞からｍＲＮＡの精製とｃＤＮＡライブラリーの作製：  全脾臓細胞又はＩＬ−２に暴露されたＮＫ細胞のポリＡ＋ＲＮＡをｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージ州）を用いて精製した。精製されたｍＲＮＡからｃＤＮＡへの合成はランダムプライマーを用い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＭＬ）に従って実施した。
一方、上記ｃＤＮＡを導入するためのｐＭＸ−ＣＤ８ベクターは、図３に示す通り構築した。図３に示すように、ｐＭＸベクター（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．らＥｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：３２４−９（１９９６））のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイトの中にＥｃｏＲＩとＮｏｔＩとを末端に有するオリゴヌクレオチド（ｇａａｔｔｃＴＧＡＡＴＣＧＴＡＧＡＴＡＣＴＧＡｇｃｇｇｃｃｇｃ：配列番号１０）を用いてｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎを導入した（ｐＭＸ−ＳＴＯＰ）。次に、ＣＤ８遺伝子の開始コドンＡＴＧを含む５’プライマー（５’ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＣＣＧ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＣＧＣ  ＴＴＴ  ３’：配列番号４）と、膜貫通領域（ＴＭ）の直後にＥｃｏＲＩサイトをつけた３’プライマー（５’ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ３’：配列番号５）とを用いて、ＣＤ８ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎａｋａｕｃｈｉ  ＨらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：５１２６−３０（１９８５））を鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＤ８−ＴＭフラグメント（配列番号３）を増幅した。ここで得られたＣＤ８−ＴＭフラグメントをｐＭＸ−ＳＴＯＰのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングし、ｐＭＸ−ＣＤ８ベクターを構築した。
このＰＭＸ−ＣＤ８ベクターをＥｃｏＲＩで消化し、このＥｃｏＲＩサイトに上記において合成されたｃＤＮＡを連結させた。ベクターに連結させたｃＤＮＡはＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）へエレクロトポレーションにより導入した。ｃＤＮＡライブラリーの集合は６×１０６であった。これらｃＤＮＡインサートの平均サイズは約１Ｋｂであった。大腸菌はＳｅａＰｒｅｐアガロース中に塗りひろげプラスミドＤＮＡをＱｕｉａｇｅｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
［実施例３］レトロウイルスライブラリーの調製およびその感染
レトロウイルスライブラリーの調製は、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅパッケージング細胞（Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｄ  ａｎｄ  Ｓｈａｔｚｍａｎ  Ａ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４４７−４５０（１９９８））を用いて行った。
一回のライブラリーによる形質導入用として上記Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞（１×１０６）を６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の４つのウェル中に分注し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（５ｍｌ）を用いて培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用い、添付されたプロトコールに従って、ｃＤＮＡライブラリーをＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞に形質導入させた。翌日、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（５ｍｌ）を用いて培地を交換した。その二日後、培養上清をウイルス上清液として回収した。
一方、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ  １６４０（１００μｌ）中に懸濁させた４３−１細胞（１×１０５細胞数）を２４穴プレートに分注した。ここにＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）（１０μｇ／ｍｌ）存在下、上記ウイルス上清（１００μｌ）を添加してインキュベートした。一回の感染に４３−１細胞株を総数として５×１０７使用した。このときの感染効率はコントロールのベクター（ｐＭｘ−ＧＦＰ：Ｔｏｓｈｉｏ  Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６７：３５１−３５９（１９９８））を用いて測定した。感染効率はおよそ２０％であった。
上記ライブラリーが形質導入されＣＤ８が細胞表面に発現されている細胞（ＣＤ８＋細胞）を選択するために、次の操作を行った。すなわち、上記ウイルスライブラリーが感染したすべての細胞をＦＩＴＣ−抗ＣＤ８モノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ、５００μｌ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と反応させた。その後、抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体結合マイクロビーズ（２０倍希釈、５００μｌ）でインキュベートした。これによりＣＤ８が細胞表面に発現されている細胞（ＣＤ８＋細胞）をＭｉｄｉカラムを用いてＭＡＣＳにより精製した。
［実施例４］シグナル伝達が活性化された陽性クローンのスクリーニング
抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いて細胞外からシグナル導入を行った際に、シグナル伝達が活性化される細胞のスクリーニングを行った。
具体的には、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を用いて１００ｕｇ／ｍｌに希釈したＦＩＴＣ−抗ＣＤ８モノクローナル抗体（５３．６．７）を６穴プレートに注入し、４℃で一晩インキュベートすることにより固定化した。抗体でコーティングされたプレートをＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、実施例３のライブラリー感染細胞を各ウェルに５ｘ１０５細胞数づつ分注し、前記抗体で１２時間刺激した。その後、ＧＦＰ−陽性細胞をＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分画した。ＦＡＣＳの結果を図４（Ａ）に示す。このうち図４（Ａ）において矢印Ｌで示すＧＦＰ＋画分を回収した。
回収したＧＦＰ＋画分におけるＧＦＰ陽性細胞を増幅するために、最初の抗体刺激から２日後、回収した細胞を２回目の刺激として抗ＣＤ８モノクローナル抗体と接触させた。この２回目の刺激によりＧＦＰ陽性となった細胞を同様にＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓを用いて分画した。さらに７日間後にＧＦＰ活性が低下しＧＦＰ陰性となった細胞を分画し回収した。翌日、プレートに固定化した抗ＣＤ８モノクローナル抗体で再度刺激を加え、再びＧＦＰ陽性を示した細胞を上記と同様にＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓを用いて分画回収した。この最終のＦＡＣＳの結果を図４（Ｂ）に示す。この一連の増幅操作によりＦＡＣＳの分画パターンにおいてもＧＦＰ＋細胞が視覚的に検出可能となった。
最終的な抗体刺激後二日目に、細胞を限界希釈しクローニングを行った。ここでクローニングされた各クローンを抗モノクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ，５０μｌ／ウェル）が固定化された９６穴プレートに添加し、再度抗体刺激が加えられた。抗体刺激後、各クローンのＧＦＰ発現をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
［実施例５］シグナル伝達を活性化させる核酸の回収、配列決定
実施例４において抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた抗体刺激によりＧＦＰを発現したクローンからＤＮＡを回収した。回収方法は標準の方法であるフェノール／クロロホルム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を用いて実施した。これら各クローンにおいては、キメラ分子として細胞外ドメインであるＣＤ８とともに細胞内ではｃＤＮＡインサート産物が発現されていると考えられる。このインサート配列を確認するためにインサートをＰＣＲにより増幅し回収した。このＰＣＲでは、プライマーとしてｐＭｘ−ＣＤ８ベクターのインサート領域の両端の配列とそれぞれ相補する配列を有するプライマー５’−ＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号１）及び５’−ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴ−３’（配列番号２）を用いた。
同じプライマーを用いて細胞から直接ｃＤＮＡを増幅させ、この増幅断片をプラスミドベクターｐＰＣＲ  ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンニングを行った。このサブクローンのインサートを自動ＤＮＡシークエンサ（ＡＢＩ−ＰＲＩＺＭ３１０  ｏｒ  ３７７，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて配列を決定した。なおシークエンスサンプルはＡＢＩ，Ａｐｐｌｉｅｄｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのシークエンスキットを用いて行った。
上記配列決定によりシグナル伝達を活性化させる既知の核酸が含まれていた。ここで検出された既知の核酸には、脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリー由来の核酸としてＣＤ３ε、ＺＡＰ７０、Ｉｇα、Ｉｇβ、Ｓｙｋ、ＦｃＲγなどが、またＮＫ細胞ｃＤＮＡライブラリー由来の核酸としてはＤＡＰ１２、ＦｃＲγ、ＺＡＰ７０などが含まれていた。このことから本スクリーニング系により活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する分子、酵素、アダプター分子などのシグナル伝達に関与する核酸が検出できることが示された。
また既知の核酸と同時に、脾臓細胞又はＮＫ細胞のｃＤＮＡからシグナル伝達を活性化させる新規な核酸配列が４つ得られた。なお、ここで得られた核酸配列はＮＦＡＴを活性化することから「ＮＦＡＴ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＦＡＭ）」と総称し、それぞれＮＦＡＭ−１〜４と称した。
［実施例６］シグナル伝達活性化の確認
実施例５においてスクリーニングされたＮＦＡＭ−１〜４におけるシグナル伝達の活性化を確認するために、ｐＰＣＲベクター中にサブクローニングされた各配列をＥｃｏＲＩで消化してベクターから分離した。分離された断片をｐＭｘ−ＣＤ８ベクターのＥｃｏＲＩサイトに接続し、さらにサブクローニングを行った。得られたサブクローンをＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅパッケージング細胞に実施例３と同様の方法で形質導入した。このパッケージング細胞の培養上清を実施例３と同様の方法で４３−１細胞株に感染させた。
次に、実施例４と同様の方法で形質導入された細胞を抗ＣＤ８モノクローナル抗体で抗体刺激を加えＧＦＰが発現されるかＦＡＣＳを用いて解析した。その結果、ＮＦＡＭ−１、２および４がサブクリーニングされた細胞株では、抗体刺激により、ベクターのみの対照と比べて蛍光強度が高い分画にピークの移動が見られた（図５）。このことから細胞外のシグナルがＮＦＡＭ−１、２または４を介して細胞内に伝えられ、このシグナルが細胞内シグナルとして伝達されてＮＦＡＴを介したＧＦＰの発現が促進されたことが示された。
上記活性が確認されたＮＦＡＭ−１、２および４の配列を決定した。決定した核酸配列およびコードされる推定アミノ酸配列を配列表に示す。なお、ＮＦＡＭ−１は配列番号６、７に、ＮＦＡＭ−２は配列番号１１、１２に、およびＮＦＡＭ−４は配列番号１３、１４に示した。
また、配列決定の結果、ＮＦＡＭ−１は膜貫通領域を挟み一方に細胞外領域として１１６アミノ酸を有し、他方に細胞内領域として８３アミノ酸を有する細胞膜貫通型の蛋白質であった（図６）。また細胞内領域にはＹｘｘＬｘｘｘｘｘｘｘＹｘｘＭからなるＩＴＡＭ様構造を有していた。
このように本スクリーニング方法によれば、ｃＤＮＡライブラリーなどの大量の被験核酸からシグナル伝達に関与する核酸をスクリーニングすることができる。また、このスクリーニング方法は被験核酸産物が直接シグナル伝達活性を有するかを指標として選択されるため、確実にシグナル伝達に関与する核酸をスクリーニングすることが可能となる。
また、本スクリーニング方法において被験核酸は必ずしも膜結合型のシグナル伝達因子だけでなく、細胞内においてシグナル伝達を介在するアダプター因子などのスクリーニングにも利用することができる。
産業上の利用可能性
上記スクリーニング方法によれば、新規なシグナル伝達因子を効率良く選択することが可能となる。特に、本発明のスクリーニングでは、レセプターからのシナグルを細胞内に伝達して、最終的にレポーター遺伝子の発現を誘導し得るシグナル伝達因子であれば選択することができる。したがって、膜結合型のシグナル伝達因子に限らず、シグナル伝達を仲介し得るアダプター因子などをも選択することができる。そのため、多くの解明がされていないシグナル伝達因子の同定さらには新規なシグナル伝達経路の同定に寄与し得る。また、ここで得られたシグナル伝達因子を用い相互作用する物質のスクリーニングや該因子をコードした核酸とハイブリッドを形成するＤＮＡをスクリーニングすることにより、同種生物あるいは異種生物におけるシグナル伝達因子の更なる同定や、シグナル伝達因子に作用してその活性を調節し得る調節因子の同定をすることもできる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は第一の実施形態のスクリーニング方法を模式的に示す図である。（Ａ）はキメラ分子発現ベクター構築工程であり、図にはキメラ分子発現ベクターの構成を示す。（Ｂ）はモニタ細胞内へのキメラ分子の導入、発現工程であり、図にはキメラ分子をモニタ細胞内で発現させた際の細胞の状態を模式的に示す。（Ｃ）はレポーター遺伝子発現細胞の選択工程、（Ｄ）は前記選択細胞からの被験核酸クローニング工程を示す。
図２は、ｐＮＦＡＴ−ＧＦＰの構築を模式的に示す図である。
図３は、ｐＭＸ−ＣＤ８ベクターの構築を模式的に示す図である。
図４は、実施例４においてＧＦＰ−陽性細胞をフローサイトメトリーにより分画した結果を示すヒストグラムの図である。（Ａ）は分画前のフローサイトメトリーのヒストグラムを、（Ｂ）は３回分画後のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。
図５は、ＮＦＡＭ−１、２、４のシグナル伝達誘導活性を確認した際のＦＡＣＳ分画パターンを示す図である。ＮＦＡＭ−１、２、４を有する細胞では蛍光発光強度が高い方向に細胞ピークが移動し、とりわけ、ＮＦＡＭ−１において強い蛍光発光、すなわちシグナル伝達誘導が観察された。
図６は、シグナル伝達を強く誘導したＮＦＡＭ−１を他の既知のＩＴＡＭを有するシグナル伝達因子と比較して示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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