(57)【要約】塩基の存在下にアミノ酸を、あるいはアミノ酸の塩を、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルと反応させることにより、Ｎ−ホルミルアミノ酸を効率良く工業上簡便に製造する方法を提供する。Ｎ−ホルミルアスパラギン酸と、フェニルアラニンメチルエステルとの酵素縮合反応において、Ｎ−ホルミルアスパラギン酸の濃度を特定することにより、あるいはトリアルキルリン酸エステルの存在下に行うことにより、アスパルテームの前駆体である、Ｎ−ホルミル−α−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルを効率良く工業上簡便に製造する方法を提供する。Ｎ−ホルミル−α−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルのフェニルアラニンメチルエステル付加物をｐＨ調整に付すことにより、高純度のＮ−ホルミル−α−アスパルチルフェニルアラニンメチルエステルを製造する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基の存在下にアスパラギン酸と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることを特徴とするＮ−ホルミルアスパラギン酸又はその塩の製造方法。
【請求項２】
アスパラギン酸の塩と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることを特徴とするＮ−ホルミルアスパラギン酸又はその塩の製造方法。
【請求項３】
請求の範囲１〜２記載の方法に従ってＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を得た後、当該Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩とＬ−フェニルアラニンメチルエステル又はその塩とを縮合しＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルに変換した後、ホルミル基を除去することを特徴とするアスパルテームの製造方法。
【請求項４】
Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、水溶液中のＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の濃度が１．２ｍｏｌ／Ｌ以上であることを特徴とするＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法。
Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルは、Ｌ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物の形態でもよい。
【請求項５】
請求の範囲１〜２記載の方法に従ってＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を得た後、該Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、水溶液中のＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の濃度が１．２ｍｏｌ／Ｌ以上であることを特徴とするＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法。
Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルは、Ｌ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステルの付加物の形態でもよい。
【請求項６】
Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、反応進行により反応溶液が固形状となる酵素縮合反応をトリアルキルリン酸エステルの存在下に行うことで反応溶液をスラリー状態とし、該スラリーからＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物の結晶を分離することを特徴とするＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物の製造方法。
【請求項７】
請求の範囲１〜２記載の方法に従ってＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を得た後、該Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、反応進行により反応溶液が固形状となる酵素縮合反応をトリアルキルリン酸エステルの存在下に行うことで反応溶液をスラリー状態とし、該スラリーからＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物の結晶を分離することを特徴とするＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物の製造方法。
【請求項８】
Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、水溶液中のＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の濃度を１．２ｍｏｌ／Ｌ以上とし、トリアルキルリン酸エステルの存在下に反応を行い、スラリー状態の反応溶液からＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物の結晶を分離することを特徴とするＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物の製造方法。
【請求項９】
請求の範囲１〜２記載の方法に従ってＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラキン酸又はその塩を得た後、該Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、水溶液中のＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の濃度が１．２ｍｏｌ／Ｌ以上とし、トリアルキルリン酸エステルの存在下に反応を行い、スラリー状態の反応溶液からＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物の結晶を分離することを特徴とするＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物の製造方法。
【請求項１０】
請求項４〜９記載の方法に従ってＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル又はＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物を得た後、これをアスパルテームに変換することを特徴とするアスパルテームの製造方法。
【請求項１１】
Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのフェニルアラニンメチルエステル付加物をｐＨＩ．０〜４．５の水溶液中に懸濁し、固体を分離することを特徴とするＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲４〜９何れか記載の方法によりＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのフェニルアラニンメチルエステル付加物を得た俊、これをｐＨ１．０〜４．５の水溶液中に懸濁し、固体を分離することを特徴とするＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法。
【請求項１３】
請求の範囲４〜１２記載の方法に従ってＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを得た後、ホルミル基を除去することを特徴とするアスパルテームの製造方法。
【請求項１４】
塩基の存在下に中性アミノ酸と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることを特徴とするＮ−ホルミル中性アミノ酸又はその塩の製造方法。
【請求項１５】
中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることを特徴とするＮ−ホルミル中性アミノ酸又はその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｎ−ホルミル中性アミノ酸及びＮ−ホルミルアスパラギン酸の新規製造方法に関し、更にアスパルテームの前駆体であるＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル及びアスパルテームの新規製造方法に関する。
背景技術
アミノ基がホルミル基で保護されたＮ−ホルミルアスパラギン酸、Ｎ−ホルミル中性アミノ酸等のＮ−ホルミルアミノ酸は、各種ペプチド化合物の合成中間体として、食品や医薬品の分野で重要な化合物である。
特に、Ｎ−ホルミルアスパラギン酸は、甘味料であるアスパルテームの中間体として重要な化合物である。アミノ酸のアミノ基保護基としてのホルミル基は比較的安価な試薬により導入することができ、例えば脱保護にパラジウム炭素による還元により脱保護されるベンジルオキシカルボニル基等に比べ、低コストで脱保護することができる。Ｎ−ホルミルアスパラギン酸の合成法としては、例えば下記反応工程１に示されるように、ギ酸及び無水酢酸を用いてアスパラギン酸をＮ−ホルミルアスパラギン酸無水物に変換した後に、加水分解する方法が知られている（例えば、ヨーロピアンジャーナル  オブ  バイオケミストリー、１９６９年、１０号、３１８−３２３頁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１０，３１８−３２３，１９６９）参照。）。
（反応工程１）
2002085840.tif 000002
しかしながら、本方法は多量の無水酢酸とギ酸を用いる上に多段階の反応を必要とするため、Ｎ−ホルミルアスパラギン酸の製法として満足できるものではない。
また、下記反応工程２に示されるようにホルムアミドを用いたＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の合成法が報告されている（米国第４，７８９，７５７号特許、実施例１参照。）。
（反応工程２）
2002085840.tif 000003
前記米国第４，７８９，７５７号特許の実施例１には、Ｌ−アスパラギン酸及び５倍モルのホルムアミド存在下、９５〜１００℃にて２時間加熱攪拌することによりＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が定量的に生成する旨が記載されている。
しかしながら、本発明者等が当該実施例１を追試した結果、生成するＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の収率は出発原料であるＬ−アスパラギン酸に対して約４０％程度であった。このように、Ｎ−ホルミルアスパラギン酸の工業的製造方法として十分に満足のいく方法が確立されているとは言い難い。
次に、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸（以下、「Ｆ−Ａｓｐ」と略記することがある。）から、アスパルテームの前駆体であるＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、「Ｆ−ＡＰＭ」と略記することがある。）を合成する方法としては、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、「Ｌ−ＰＭ」と略記することがある。）とＦ−Ａｓｐを有機溶媒中で反応させる方法が提案されている（例えば、米国第３，７８６，０３９号特許参照。）。
しかしながら、この方法は、α異性体とβ異性体の両方が生成し、不要なβ異性体を除去するための分離、精製操作が必要となるため工業的に有利な方法とは言い難い。
上記のような異性体を生じない方法としては、例えば特開昭６０−１６４４９５号公報（ＥＰ０１４９５９４）に、水溶液中、酵素としてサーモリシン存在下、Ｆ−ＡｓｐとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの縮合反応によりＦ−ＡＰＭを得る方法が報告されている。この実施例１によると、Ｆ−ＡｓｐとＬ−ＰＭを１：１のモル比で反応させ、スラリーを分離後、得られた固体（Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル及びＬ−フェニルアラニンメチルエステルの（１：１）付加物と同定。）を水に浮遊させ、ｐＨ値を１．６に調整し、酢酸エチルでＦ−ＡＰＭを抽出しているが、収率は、全体で１２％程度である。また、実施例３ではＦ−ＡｓｐとＬ−ＰＭを１：２のモル比で反応させているが、縮合収率はＦ−Ａｓｐに対して４１％と低い。実施例２ではＦ−ＡｓｐとＬ−ＰＭを５：１のモル比で反応させ、縮合収率はＬ−ＰＭに対しては９０％となっているが、Ｆ−Ａｓｐに対しては９％と低く、工業的に有利な方法とは言い難い。
また、特開平１０−１７４５９７号公報には、酵素による縮合反応によりＦ−ＡＰＭを合成する際に、Ｆ−ＡｓｐとＬ−ＰＭを溶解させた水非混和性有機溶媒を、酵素水溶液に連続的に供給し、生成したＦ−ＡＰＭを有機層に抽出し連続的に取り出す方法が開示されている。しかしながら、本方法で有機層からＦ−ＡＰＭを単離する方法については全く開示されておらず、最終的にＦ−ＡＰＭを効率良く製造することができるか不明である。
一方、Ｎ−ホルミル中性アミノ酸は、前述の如く各種ペプチド化合物の合成中間体として重要であり、例えば、中性アミノ酸であるロイシンのアミノ基がホルミル化されたＮ−ホルミルロイシンはロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社が上市した食欲調節剤、商品名「オーリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）」の側鎖として使用されている。Ｎ−ホルミルアミノ酸の合成法としては、ギ酸及び無水酢酸を用いてアミノ酸をホルミル化する方法（ジャーナル  オブ  アメリカンケミカルソサイティー、１９５８年、８０号、１１５４頁参照。）が知られているが、この方法は、例えばアミノ酸に対して前者を５６倍モル、後者を７倍モルというように大量のギ酸及び無水酢酸を使用するためＮ−ホルミルアミノ酸の工業的製法としては満足できるものとは言い難い。
また、ホルムアミドを用いたＮ−ホルミルアミノ酸の合成法が提案されており（米国第４，７８９，７５７号特許参照。）、この中でアミノ酸を５倍モルのホルムアミド中、９５〜１００℃にて２時間加熱攪拌することによりＮ−ホルミルアミノ酸が定量的に生成する旨報告されているが、本発明者等がこの方法を追試した結果では、生成するＮ−ホルミルアミノ酸の収率は僅かに４０％程度であった。従って、この方法でもＮ−ホルミルアミノ酸の工業的製法としては満足できるものと言い難い。
以上のような情況下に、Ｎ−ホルミルアスパラギン酸及びアスパルテームの前駆体であるＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、並びにＮ−ホルミル中性アミノ酸を効率良くかつ工業的に簡便に製造する方法が求められている。
発明が解決しようとする課題
本発明が解決しようとする課題は、甘味料アスパルテームの合成中間体として、重要なＮ−ホルミルアスパラギン酸（又はその塩）及びこれを出発物質とする甘味料アスパルテームの前駆体であるＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルやアスパルテームの効率的な製造方法、更にはペプチド化合物の合成中間体として重要なＮ−ホルミル中性アミノ酸（又はその塩）を効率的かつ簡便に製造する方法の開発にある。
発明の開示
本発明者等は前記多くの課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、下記のような多くの新知見を得、これ等の知見に基いて、下記のような各種の形態の発明を含む本発明を完成するに到った。
（新知見）
１．  塩基の存在下にアスパラギン酸と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることにより、Ｎ−ホルミルアスパラギン酸（又はその塩）を高収率で製造することができる。アスパラギン酸の塩と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることによりＮ−ホルミルアスパラギン酸（又はその塩）を高収率で製造することができる。
２．  Ｆ−Ａｓｐ及び／又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、「Ｌ／ＤＬ−ＰＭ」と称することがある。）との酵素縮合反応によりＦ−ＡＰＭを製造する方法において、Ｆ−Ａｓｐの濃度を特定することで、効率良くＦ−ＡＰＭを製造することができる。更に、特定のトリアルキルリン酸エステルを共存させることにより、目的化合物Ｆ−ＡＰＭがスラリー状態で得られこれを分離（濾過等）することにより容易に目的化合物を取得することができる。
３．  前記酵素縮合反応で得られるようなＦ−ＡＰＭとＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、「Ｌ／Ｄ−ＰＭ」と称することがある。）付加物を特定範囲のｐＨ値の水溶液中に懸濁させ、固体を分離することによりＦ−ＡＰＭを得ることができる。
４．  塩基の存在下に、中性アミノ酸と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることにより、Ｎ−ホルミル中性アミノ酸（又はその塩）を高収率で製造することができる。中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることにより、Ｎ−ホルミル中性アミノ酸（又はその塩）を高収率で製造することができる。
（本発明に包含される各種形態の発明）
上記新知見に基づいて、本発明に含まれる下記各種形態の発明が提供される。
１．  塩基の存在下にアスパラギン酸と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有するＮ−ホルミルアスパラギン酸又はその塩の製造方法；並びに
アスパラギン酸の塩と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有するＮ−ホルミルアスパラギン酸又はその塩の製造方法に特徴を有するＮ−ホルミルアスパラギン酸又はその塩の製造方法。
以上、併せて「本発明のホルミル化法１」と称することがある。
２．  Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸及び／又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの酵素縮合反応において、水溶液中のＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の濃度が１．２ｍｏｌ／Ｌ以上であることに特徴を有するＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｆ−ＡＰＭ）の製造方法（Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルは、フェニルアラニンメチルエステルとの付加物の形態でもよい。）；並びに
前記酵素縮合反応において、トリ−ｎ−ブチルリン酸エステル等のトリアルキルリン酸エステルを共存させ、スラリー状態で得られる目的生成物（当該付加物の形態で）を分離することによりＦ−ＡＰＭを製造する方法。
以上併せて、「本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；縮合反応」と称することがある。
３．  Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのフェニルアラニンメチルエステル付加物をｐＨ値１．０〜４．５の水溶液中に懸濁し、固体を分離することに特徴を有するＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法。
以上併せて、「本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；分離方法」と称することがある。
４．  塩基の存在下に中性アミノ酸と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有するＮ−ホルミル中性アミノ酸又はその塩の製造方法；並びに
中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有するＮ−ホルミル中性アミノ酸又はその塩の製造方法。
以上、併せて「本発明のホルミル化法２」と称することがある。
（本発明のホルミル化法１について）
この発明は前述の如く、塩基の存在下にアスパラギン酸とホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させるか；又は
アスパラギン酸の塩とホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させてＮ−ホルミルアスパラギン酸又はその塩を製造する方法に存する。
使用する塩基の種類には特に制限は無いが、塩基の例としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア等を挙げることができ、この中から１種又は複数種を選択し、使用することができる。
塩基の使用量に関しては特に制限は無いが、塩基をアスパラギン酸１当量に対して０．１５〜２．５当量程度使用することができる。
アスパラギン酸の光学活性体に関しては特に制限は無く、Ｌ−体、Ｄ−体、及びＤＬ−体何れも使用可能である。アスパルテームの前駆体用にはＬ−アスパラギン酸が好ましく使用される。
反応溶媒を使用することが好ましく、その際水、極性溶媒、又は水と極性溶媒との混合溶媒を使用することができる。
ホルムアミド及び／又はギ酸メチルの使用量に関しては特に制限は無いが、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルをアスパラギン酸に対して０．５〜６倍モル程度使用することができる。
この発明においては、Ｎ−ホルミルアスパラギン酸を遊離体又は塩の形態で製造し、取得することができる。例えば、遊離体を取得したい場合、生成するＮ−ホルミルアスパラギン酸の塩を通常の脱塩工程に付することでその遊離体を容易に製造し、取得することができ、これら全てこの発明に含まれる。
このようにして、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸（及び／又はその塩）を得た後、当該Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸（及び／又はその塩）とフェニルアラニンメチルエステル（Ｌ−体、ＤＬ−体等）とを縮合しＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとし、更にこれをアスパルテームに変換することによりアスパルテームを製造することができる。このようなＮ−ホルミルアスパルテーム（アスパルテーム前駆体）やアスパルテームの製造方法もこの発明に含まれる。
（本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；縮合反応について）
この発明は、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸及び／又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの酵素縮合反応において、水溶液中のＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の濃度が１．２ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは２．７〜２７ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３．５〜１７ｍｏｌ／Ｌで酵素反応を行いＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを製造する方法に存し、このときＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルは、フェニルアラニンメチルエステルとの付加物の形態でもよい。
酵素の反応系において、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸及び／又はその塩と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルとのモル比を、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸１に対して後者が好ましくは０．５〜３程度、より好ましくは１．７〜２．３程度になるように調整するとよい。
使用する酵素については、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルとで酵素縮合反応を行う酵素であれば特に制限は無いが、プロテアーゼが好ましく使用される。
ここで使用するＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸及び／又はその塩については、前記本発明のホルミル化法１で製造されたものを好ましく使用することができる。、従って，前記本発明のホルミル化法１に引き続き、この発明を実施するのが好適である。
トリアルキルリン酸エステルとしては水に対して非混和性の液状トリアルキルリン酸エステルが用いられ、好ましくは３つのアルキル基がそれぞれ相互に独立して炭素数４〜６のアルキル基であるトリアルキルリン酸エステルが用いられる。特にトリ−ｎ−ブチルリン酸エステルが好適である。
当該トリアルキルリン酸エステルの使用量については、好ましくは水溶媒１に対して重量比２〜３０程度、より好ましくは５〜２０程度トリアルキルリン酸エステルを使用することができる。
（本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；分離方法について）
この発明は、Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのフェニルアラニンメチルエステル付加物をｐＨ１．０〜４．５、好ましくは２〜３程度の水溶液中に懸濁し、固体を分離することによりＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを製造する方法に存する。
当該付加物は、本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；縮合反応で得られる付加物を使用することができる。従って、本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；縮合反応に引き続き、本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；分離方法を実施するのが好適である。
以上の如く、Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを得た後、ホルミル基を除去することによりα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（アスパルテーム）を製造することができ、このようなアスパルテームの製造方法もこの発明に含まれる。
（本発明のホルミル化法２について）
この発明は、塩基の存在下に中性アミノ酸と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させるか；又は
中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることによりＮ−ホルミル中性アミノ酸又はその塩を製造する方法に存する。
この発明に使用する塩基には特に制限は無く、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア等を挙げることができ、この中から１種又は複数種を選択、使用することができる。
当該反応において、中性アミノ酸に対し、塩基を０．１〜１０倍モル程度使用することができる。
この発明に使用する中性アミノ酸の塩には特に制限は無く、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができ、この中から１種又は複数種を選択、使用することができる。
使用する中性アミノ酸の種類等には特に制限は無く、例えば中性アミノ酸の例としてロイシン、イソロイシン及びバリンを挙げることができる。これらの何れか１種又は複数種をこの発明の出発物質に使用することができる。
当該反応においては、中性アミノ酸に対し、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルを０．５〜６倍モル程度使用することができる。
この発明においては、Ｎ−ホルミル中性アミノ酸を遊離体又は塩の形態で製造し、取得することができる。例えば、遊離体を取得したい場合、生成するＮ−ホルミル中性アミノ酸の塩を通常の脱塩工程に付することでその遊離体を容易に製造し、取得することができ、これら全てこの発明に含まれる。
出発物質に使用する中性アミノ酸の光学活性体には特に制限は無い。Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体何れも使用可能である。
実施の形態
以下に、本発明の実施の形態について詳細に説明する。好ましい代表例を中心に説明するので本発明がこれに制限されることはない。
（本発明のホルミル化法１）
この発明は、塩基の存在下にアスパラギン酸と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることによるＮ−ホルミルアスパラギン酸又はその塩の製造方法；及び
アスパラギン酸の塩と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることによるＮ−ホルミルアスパラギン酸又はその塩の製造方法に存する。
この発明に使用するアスパラギン酸の光学異性は特に限定されず、ＤＬ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸又はＤ−アスパラギン酸の何れを用いてもよい。本発明の製造方法においては、通常の反応条件に従えばラセミ化は起こり難く、光学活性なアスパラギン酸を用いることによりＮ−ホルミルアスパラギン酸又はその塩を光学活性体として得ることができる。
この発明における反応は溶媒中で行うのが好ましいが、溶媒を用いずに行うこともできる。溶媒を使用する場合、溶媒は反応に不活性なものであれば特に制限されないが、水、極性溶媒、又は水と極性溶媒との混合溶媒が好ましく用いられる。
極性溶媒としては水と混和する極性溶媒が好ましく、例えば、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。これらの極性溶媒は１種以上を混合して用いてもよい。
使用する塩基の種類は特に制限されないが、好ましいものとして、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニアを挙げることができる。特に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアが好ましい。これらの塩基は１種以上を混合して用いてもよい。
アスパラギン酸の塩には特に制限は無く、その例としてアスパラギン酸モノナトリウム塩、アスパラギン酸ジナトリウム塩、アスパラギン酸モノカリウム塩、アスパラギン酸ジカリウム塩、アスパラギン酸モノアンモニウム塩、アスパラギン酸ジアンモニウム塩等を挙げることができ、この中から１種又は複数種を選択して、使用することができる。
溶媒を使用する場合、使用する溶媒の量は特に限定されず、原料のアスパラギン酸又はその塩や塩基がこの発明の効果を妨げない程度に溶解できればよい。当業者であれば好ましい条件を適宜容易に設定することができる。
使用するホルムアミド又はギ酸メチルの使用量としては特に制限はないが、アスパラギン酸又はその塩に対して通常０．５〜６倍モル程度、好ましくは１．５〜３倍モル程度で使用することができる。尚、溶媒を用いずに反応を行う場合は通常２〜１０倍モル程度、好ましくは３〜５倍モル程度で使用することができる。
ギ酸メチルとホルムアミドを併用して使用することもでき、その場合ホルムアミド及びギ酸メチルの合計の使用量を上記範囲で使用することができる。
塩基を使用する場合、塩基の量としては、使用するアスパラギン酸１当量に対して通常０．２〜１０当量程度であり、好ましくは０．３〜５当量程度である。尚、ここで「当量」とは酸塩基の当量のことである。例えば、アスパラギン酸１当量に対して水酸化ナトリウムを１当量添加する場合、アスパラギン酸が１ｍｏｌ存在していれば水酸化ナトリウムを２ｍｏｌ添加することになる。
塩基の量が少な過ぎると反応速度が遅くなる傾向にあるため好ましくない。また塩基の量が多過ぎると副反応が進行する傾向にあるため好ましくない。
反応温度としては特に制限は無いが、通常３０〜１３０℃の範囲であり、好ましくは４０〜１００℃の範囲である。温度が高過ぎるとラセミ化等の副反応が進行する傾向にあり、低過ぎると反応速度が遅くなる傾向にあるため好ましくない。尚、反応は撹拌下に行うのが好ましい。
この発明において、塩基とアスパラギン酸は中和反応を起こして対応するアスパラギン酸の塩を生成する。従って本発明においては、アスパラギン酸の代わりにアスパラギン酸の塩を用いることで、塩基を添加せずに反応させることもできる。この場合、その他の反応条件は前記に記載したのと同様の条件を用いればよい。また、アスパラギン酸の塩の光学異性も前記と同様に特に限定されず、ＤＬ−アスパラギン酸塩、Ｌ−アスパラギン酸塩又はＤ−アスパラギン酸塩の何れを用いてもよい。
この発明により得られたＮ−ホルミルアスパラギン酸は、反応終了時には溶液中に対応する塩の形態で存在する。反応液溶液を常法に従って、中和、抽出、晶析等の操作を任意に行うことにより、また必要な脱塩工程や造塩工程を利用して製造すべき目的物質をＮ−ホルミルアスパラギン酸（遊離体）の形態で、或いはその塩の形態で単離精製することができる。
上記の如く調製製造したＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸は公知方法、例えば特公昭６０−１６４４９５号公報の実施例１に記載されているように、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルと酵素的に縮合させることでアスパルテームの重要中間体（前駆体）であるＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを調製することもできるが、本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法に従ってＬ−フェニルアラニンメチルエステルと酵素的に縮合させることで上記Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルをより効率的に得ることができる。
また、このようにして得られるＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルは、公知方法例えば、特開昭５８−１８５５４５実施例１０に記載されているように、塩酸存在下においてメタノール−水混合溶媒を用いてホルミル基を加水分解した後に、炭酸ナトリウムで中和することでアスパルテームに変換することができる。
この発明の方法において、特に低温で反応を行う場合、反応途中から結晶が析出してくることがある。この場合、反応溶液を比較的強く撹拌しながら反応を行えばよい。撹拌は、例えばニーダーやホモジナイザー等の撹拌装置により行うことができる。
（本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；縮合反応）
この発明は、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸及び／又はその塩（Ｆ−Ａｓｐ）と、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル及び／又はその塩（Ｌ／ＤＬ−ＰＭ）との酵素縮合反応において、水溶液中のＦ−Ａｓｐの濃度を１．２ｍｏｌ／Ｌ以上とすることに特徴を有するＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｆ−ＡＰＭ）の製造方法（Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルは、Ｌ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステルとの付加物〔以下、「Ｆ−ＡＰＭ・Ｌ／Ｄ−ＰＭ」と略記することがある。］の形態でもよい）に存する。
尚、本発明の酵素縮合反応におけるＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸は遊離体で用いてもよく、ナトリウム塩等の塩の形態で用いてもよい。同様にＬ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルは遊離体で用いてもよく塩酸塩等の塩の形態で用いてもよい。
水溶液中のＦ−Ａｓｐの濃度は好ましくは２．７〜２７ｍｏｌ／Ｌの範囲とするのがよく、より好ましくは３．５〜１７ｍｏｌ／Ｌの範囲とするのがよい。このように水溶液中のＦ−Ａｓｐの濃度を１．２ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは２．７〜２７ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３．５〜１７ｍｏｌ／Ｌとすることにより、酵素縮合反応が高い転化率で進行することにより、Ｆ−Ａｓｐに対するＦ−ＡＰＭの収率を５０％以上、好ましくは６０％以上とすることが可能となる。
酵素縮合反応の溶媒としては、通常、水が単独で用いられる。酵素縮合反応に支障が無い範囲でメタノール、エタノール等の水とよく混和する有機溶媒を水に混合することもできるが、通常その必要性はない。尚、本発明における「水溶液」には酵素縮合反応における溶媒が水のみである場合だけでなく、メタノール、エタノール等の水とよく混和する有機溶媒と水との混合溶媒である場合も含まれる。
酵素縮合反応における水溶液中のＦ−ＡｓｐとＬ／ＤＬ−ＰＭの比率はモル比で通常１：０．５〜１：３の範囲で設定される。本発明においては、通常、酵素縮合反応の進行と同時に反応生成物であるＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルがＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステルとの１：１の付加物の形態で析出してくる（該付加物はＨＰＬＣで分析した場合Ｆ−ＡｓｐとＬ／Ｄ−ＰＭのそれぞれのピークが観察される。）。従って、反応収率を上げるため、上記比率をモル比で１：１．７〜１：２．３の範囲とするのがより好ましい。実際には上記比率をモル比で約１：２として酵素縮合反応を行えばよい。このような比率で酵素縮合反応を行い未反応物を低減化することで、未反応物を除去するための複雑な精製工程を省略化することが可能となる。
尚、反応開始時に存在する水とは別に、縮合反応が進行すると副生物として水が生成する。酵素縮合反応をバッチ法で行う場合には反応開始時の水溶液中のＦ−Ａｓｐの濃度及びＦ−ＡｓｐとＬ／ＤＬ−ＰＭの比率を上記範囲に設定すればよく、また酵素縮合反応を連続式で行う場合には反応中の反応槽のＦ−Ａｓｐの濃度及びＦ−ＡｓｐとＬ／ＤＬ−ＰＭの比率を上記範囲に設定すればよい。
酵素は中性プロテアーゼが好ましく用いられる。例えば、「サモアーゼＰＳ１６０」（大和化成製）或いは「サモアーゼＣ１６０」（大和化成製）のような市販のサーモリシン様金属プロテアーゼが使用できる。このようなサモアーゼの至適ｐＨ値は通常の酵素縮合反応においては６〜８であるが、本発明の酵素縮合反応におけるｐＨ値は、通常５〜６の範囲、より好ましくは５．２〜５．８の範囲に設定される。この範囲外のｐＨ値で酵素縮合反応を行った場合、転化率が低下するため好ましくない。尚、ｐＨの調整は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等の塩基又は塩酸、硫酸等の酸を用いて行えばよい。
酵素の使用量はＦ−Ａｓｐを１とした場合に重量比で通常０．０２５〜４、好ましくは０．０５〜２の範囲とすることができる。これらの酵素は通常少量のカルシウムイオン（ＩＩ）の存在により酵素の安定化及び作用に有利な効果があることが知られており、この発明における酵素縮合反応においてもカルシウムイオン（ＩＩ）を存在させるのが好ましい。カルシウムイオン（ＩＩ）を反応溶液中（水溶液中）に存在させるための試薬としては、炭酸カルシウム、塩化カルシウム及び酢酸カルシウム等のカルシウム塩を用いることができる。水溶液中に存在させるカルシウムイオン（ＩＩ）の量は使用する酵素基に対し、重量比で通常０．１５〜０．５の範囲で設定される。
酵素による縮合反応は、通常１０〜６０℃の範囲で設定することができ、好ましくは３０〜５０℃の範囲で設定するのがよい。反応時間は特に限定されないが、通常３０分〜２４時間程度とすることができる。
本発明における酵素縮合反応では、反応基質が高濃度の状態で反応が行われるため、通常、反応が進行するにつれＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステルとの付加物の生成により反応容器内で反応溶液が流動性を失い固化した状態となる。しかしながら、水に非混和性である特定のトリアルキルリン酸エステルの存在下に酵素縮合反応を行うことにより反応溶液をスラリー状態とすることができ、該スラリーから固体（当該付加物の結晶）を濾過、遠心分離等の公知の分離方法により分離することで、効率的に当該付加物の結晶を取得することができる。この場合、スラリー状態とするために攪拌下で反応を行うのが好ましい。尚、酵素縮合反応は反応開始時に出発原料等が十分に均一に混合されていれば、反応系に何ら力学的作用が付加されない状態、例えば静置状態であっても反応は良好に進行するため、流動性が失われ攪拌が困難となった場合でも酵素反応の転化率の観点からは問題はない。
本発明で用いられるトリアルキルリン酸エステルとしては、水に非混和性の液状のアルキルリン酸エステルが用いられる。好ましくはトリアルキルリン酸エステルを構成する３つのアルキル基がそれぞれ相互に独立して炭素数４〜６のアルキル基であるものが用いられる。特に入手が容易であるトリ−ｎ−ブチルリン酸エステルが好ましい。トリメチルリン酸エステル、トリエチルリン酸エステル等の水と混和性のトリアルキルリン酸エステルは酵素を失活させる傾向にあるので好ましくない。
トリアルキルリン酸エステルの使用量は、酵素縮合反応の溶媒として用いる水１に対して重量比で２〜３０とするのが好ましく、更には５〜２０とするのが好ましい。溶媒として水とよく混和する有機溶媒と水との混合溶媒が用いられる場合、混合溶媒中の水の量を１として重量比で上記値に設定すればよい。
反応開始時に存在する水とは別に、縮合反応が進行すると副生物として水が生成するが、酵素縮合反応をバッチ法で行う場合には上記トリアルキルリン酸エステルの比は反応開始時の水の量を１として設定すればよく。また酵素縮合反応を連続式で行う場合には反応中の反応容器内の水の量を１として設定すればよい。
尚、酵素縮合反応中、Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルがトリアルキルリン酸エステル相に移動する傾向にあるため、酵素縮合反応の収率を上げる観点から、予め使用するトリアルキルリン酸エステルにＬ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル（遊離体）を溶解させておくのが好ましく、更には飽和状態で溶解させておくのが好ましい。また反応系中に存在させるトリアルキルリン酸エステルの基からトリアルキルリン酸エステル相に移動するＬ／ＤＬ−ＰＭの量を予測して、予めその分のＬ／ＤＬ−ＰＭを余分に水溶液中に溶解させておくこともできるが、水溶液中ではＬ／ＤＬ−ＰＭが加水分解される傾向にあり、またＬ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルの塩を用いる場合には、反応中に無機塩が蓄積し酵素反応に悪影響を及ぼすことがあるため、予めトリアルキルリン酸エステル中に溶解させておくのが、反応収率及びＬ／ＤＬ−ＰＭの回収、再利用の観点から好ましい。Ｌ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル（遊離体）が溶解或いは飽和したトリアルキルリン酸エステルは、例えばＬ／ＤＬ−ＰＭを水に溶解し、トリアルキルリン酸エステルを加えて抽出し有機層を分離することにより得ることができる。この際、抽出は実際に実施する酵素縮合反応の温度で行うのが好ましい。このように抽出操作をした場合など、トリアルキルリン酸エステルはある程度の水を含むことがあるが、上述したＦ−Ａｓｐの濃度計算において、このトリアルキルリン酸エステルに含まれる水は水溶液中の水の量には含めない。尚、トリアルキルリン酸エステル中に含まれる水の量は例えばカールフィッシャー法等により測定することができる。実際の反応温度において上記の抽出操作によりＬ及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル並びに水をトリアルキルリン酸エステル中に飽和させた場合に同じく飽和状態で含まれる水（並びにＬ及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステル）の量を測定し、予め実際に使用するトリアルキルリン酸エステルを飽和させる量の水を過剰に水溶液に添加しておくこともできる。この場合、過剰に添加された水は上述したＦ−Ａｓｐの濃度計算において水溶液中の水の量には含めない。
本発明においては、Ｆ−ＡＰＭは通常Ｌ−／Ｄ−ＰＭの１：１の付加物の形態で得られるが、公知の分離方法、或いは後述する本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法：分離方法）によりＦ−ＡＰＭの遊離体を得ることができる。また更に遊離体を任意の塩とすることもできる。
（本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法：分離方法）
この発明は、Ｎ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物、例えばその１：１の付加物をｐＨ値１．０〜４．５、好ましくは２〜３の水溶液中に懸濁し、固体を分離することに特徴を有するＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルテル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造方法に存する。尚、本発明に用いる当該付加物（即ちＦ−ＡＰＭ・Ｌ／Ｄ−ＰＭ）は前述した本発明における縮合反応で得られる当該付加物、好ましくは前述したトリアルキルリン酸エステル存在下に行う縮合反応により、結晶として得られた当該付加物を好適に用いることができる。
本発明の酵素縮合反応により得られるようなＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのＬ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステル付加物（通常はその１：１付加物）は、上述したようなｐＨ値の水溶液中に懸濁することにより、Ｌ−及び／又はＤ−フェニルアラニンメチルエステルが水溶液中に溶解するためＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを選択的に固体として分離することができる。水溶液のｐＨは当該付加物を懸濁させる前に予め上記値に調整していてもよく、また懸濁後にｐＨ調整を行ってもよい。水溶液の溶媒としては、通常、水が単独で用いられる。メタノール、エタノール等の水とよく混和する有機溶媒を水に混合することもできるが、通常その必要性はない。尚、ここでいう「水溶液」には溶媒が水のみである場合だけでなく、メタノール、エタノール等の水とよく混和する有機溶媒と水との混合溶媒である場合も含まれる。
水溶液の量は上記目的を達成すれば特に限定されず当業者は適宜好ましい条件を設定することができるが、例えば当該付加物１に対し重量比で７〜１０の範囲で行うことができる。温度も特に限定されず、通常は室温で行えばよい。なお更に純度を高めるため必要によりこの操作を繰り返してもよい。
このようにして得られるＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルは当業者に公知の方法、例えば塩酸存在下において、メタノール−水混合溶媒を用いてホルミル基を除去する方法等（例えば、特開昭５８−１８５５４５号公報、実施例１０参照）によりα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（アスパルテーム）とすることができる。
尚、アスパルテームの製造に当たり、「本発明のホルミル化法１」、「本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；縮合反応」（好ましくはトリアルキルリン酸エステル存在下に行う該方法）及び「本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；分離方法」の各プロセスを任意に組み合わせて、好ましくは全てのプロセスを組み合わせて用いることで、より効率的に、かつ工業的に簡便にアスパルテームを製造することができる。
（本発明のホルミル化法２）
この発明は、塩基の存在下に中性アミノ酸と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有するＮ−ホルミル中性アミノ酸又はその塩の製造方法；並びに
中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び／又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有するＮ−ホルミル中性アミノ酸又はその塩の製造方法
に存する。
この発明の出発物質には中性アミノ酸又は中性アミノ酸の塩を使用するが、反応の具体的な形態としては中性アミノ酸（遊離体）、中性アミノ酸の塩、これ等遊離体と塩の混合物を出発物質として使用することができる。更に、当該中性アミノ酸は１種類のアミノ酸でも複数種アミノ酸の混合物でもよく、また当該塩についても１種単独の塩でも複数種混合塩でもよいが、反応を工業的に制御する上から１種のアミノ酸或いはその塩（１種）を使用する方が望ましい。
前記の如く、本発明で使用する中性アミノ酸の光学異性については特に限定されず、Ｌ体、Ｄ体又はＤＬ体の何れを用いてもよい。本発明においてはＮ−ホルミル化反応中ラセミ化は起こり難く、光学活性な中性アミノ酸（又はその塩）を出発物質に用いることにより、当該反応後にＮ−ホルミル中性アミノ酸又はその塩を光学活性体として得ることができる。
この発明におけるＮ−ホルミル化反応については、前記本発明の特徴部分以外ではアミノ基のＮ−ホルミル化法としてそれ自体知られている従来法や今後開発される方法を利用することができる。
この発明におけるホルミル化反応は溶媒を使用せずに行うことができる。溶媒を使用する場合、溶媒は反応に不活性なものであれば特に制限されないが、水、極性溶媒、又は水と極性溶媒との混合溶媒が好適に使用される。
極性溶媒としては水と混和するものが好ましく、例えば、メタノール、エタノール等アルコールや、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。勿論、これ等の極性溶媒は１種以上混合してもよい。
使用する塩基の種類には特に制限は無いが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等炭酸塩、アンモニア、トリエチルアミン等アミン類が好適に用いられる。特に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等が好ましい。勿論、これらの塩基は混合して用いてもよい。
溶媒を使用する場合、使用する溶媒の量に特に制限は無く、出発物質の中性アミノ酸（或いはその塩）や塩基が本発明の効果を妨げない程度に溶解できればよい。当業者であれば好ましい条件を適宜選択して容易に設定することができる。
使用するホルムアミド、或いはギ酸メチルの使用量については特に制限は無いが、出発物質に使用する中性アミノ酸或いはその塩に対して、また遊離体と塩の混合物の形態で使用する場合この混合物に対し、好ましくは０．５〜６倍モル程度であり、より好ましくは１．５〜３倍モル程度である。尚、溶媒を用いずに反応を行なう場合、好ましくは２〜１０倍モル程度、より好ましくは３〜５倍モル程度使用することができる。前記したようにホルミル化剤としてホルムアミドとギ酸メチルの混合物を使用することもできるが、この場合この混合物を前記出発物質に対して好ましくは０．５〜６倍モル程度、より好ましくは１．５〜３倍モル程度使用することができるし、また溶媒を用いずに反応を行なう場合には、好ましくは２〜１０倍モル程度、より好ましくは３〜５倍モル程度使用することができる。
この発明において塩基の使用量に関しては、出発物質の中性アミノ酸に対し、塩基を好ましくは０．１〜１０倍モル程度、より好ましくは０．２〜５倍モル程度、更に好ましくは０．２〜２．５倍モル程度使用することができる。
塩基の量が少な過ぎると反応速度が遅くなる傾向にあるため好ましくはない。また、塩基の量は多過ぎると、副反応が進行する傾向にあるため好ましくはない。
この発明に使用する反応温度としては特に制限は無いが、高過ぎるとラセミ化等の副反応の問題があり、低過ぎると反応が遅くなる傾向にあるため、好ましくは３０〜１３０℃程度の範囲、より好ましくは４０〜１００℃程度の範囲から選択することができる。
この発明においては、出発物質として中性アミノ酸（遊離体）を使用することができるが、中性アミノ酸の塩を用いることもできる。反応の具体的な形態としてその混合物を使用することもできる。中性アミノ酸の塩を出発物質に使用する場合でも、反応条件等は前記同様であり前記説明から容易に実施することができる。尚、本発明において、出発物質に遊離体の中性アミノ酸を使用する場合、当該反応において塩基と中性アミノ酸は中和反応を起こして対応する塩を生成する。従って、このように生成した塩を出発物質の中性アミノ酸の塩と称することもできるし、別途出発物質用に調製、又は用意された中性アミノ酸の塩を前記中性アミノ酸の塩と称することもできる。
中性アミノ酸の塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
本発明により得られたＮ−ホルミル中性アミノ酸は、通常反応終了時に対応する塩の形態で存在する。反応液を定法に従って、中和、抽出、晶析等の操作を任意に行なうことにより、また必要な脱塩工程や造塩工程を利用して、製造すべき目的物質を、Ｎ−ホルミル中性アミノ酸（遊離体）或いはその塩の形態で得ることができる。
好適な実施の形態
以下、実施例、比較例及び参考例により本発明を詳細に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
（本発明のホルミル化法１）
＜実施例１＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１．０ｇ（７．５ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを０．３０ｍｌ（７．５ｍｍｏｌ）、水を０．２１ｍｌ順次加えた後に、水酸化ナトリウム水溶液を０．７８ｍｌ（９．６Ｍ、７．５ｍｍｏｌ）加えてｐＨを８．７に調整した。５０℃で２２時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が０．４５ｇ（３６．８％：対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例２＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１．０２ｇ（７．７ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを０．６１ｍｌ（１５．０ｍｍｏｌ）、水を０．１９ｍｌ順次加えた後に、水酸化ナトリウム水溶液を０．８０ｍｌ（９．６Ｍ、７．７ｍｍｏｌ）加えてｐＨを８．４に調節した。５０℃で２２時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が０．４２ｇ（３３．９％：対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例３＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１．００ｇ（７．５ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを０．９１ｍｌ（２２．５ｍｍｏｌ）、水を０．２１ｍｌ順次加えた後に、水酸化ナトリウム水溶液を０．７８ｍｌ（９．６Ｍ、７．５ｍｍｏｌ）加えてｐＨを８．７に調節した。５０℃で２２時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が０．５９ｇ（４８．７％：対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例４＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１．０３ｇ（７．７ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを０．３０ｍｌ（７．５ｍｍｏｌ）、水を０．７７ｍｌ順次加えた後に、ペレット状の水酸化ナトリウムを０．６１ｇ（１５．４ｍｍｏｌ）加えてｐＨを１１．１に調節した。５０℃で２２時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が０．７６ｇ（６１．６％  対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例５＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１．０１ｇ（７．６ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを０．６１ｍｌ（１５．０ｍｍｏｌ）、水を０．７７ｍｌ順次加えた後に、ペレット状の水酸化ナトリウムを０．５７ｇ（１５．１ｍｍｏｌ）加えてｐＨを１１．２に調節した。５０℃で２２時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が１．１ｇ（９０．６％  対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例６＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１．０２ｇ（７．７ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを０．９１ｍｌ（２２．５ｍｍｏｌ）、水を０．７７ｍｌ順次加えた後に、ペレット状の水酸化ナトリウムを０．６１ｇ（１５．４ｍｍｏｌ）加えてｐＨを１１．２に調節した。５０℃で２２時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が１．２ｇ（９４．４％  対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例７＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸モノカリウム塩を１．５０ｇ（８．８ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを１．２０ｇ（２６．３ｍｍｏｌ）加えた後に、１００℃で４．５時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が１．２０ｇ（８５．０％：対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例８＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１．０ｇ（７．６ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを０．７１ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）、２９％アンモニア水を１．１１ｇ（１９．０ｍｍｏｌ）順次加えた後に、５０℃で２７時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が１．１ｇ（８８．８％：対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例９＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１０．０ｇ（７５．１ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを７．０ｇ（１５０．３ｍｍｏｌ）、３０％メタノール−水を２１．４ｍｌ順次加えた後に、ペレット状水酸化ナトリウムを６．２６ｇ（１５０．３ｍｍｏｌ）加えてｐＨを１０．４に調節した。４０℃で２７時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が９．４ｇ（７７．７％：対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜比較例１＞
ＵＳ４７８９７５７の実施例１に従い、反応容器にＬ−アスパラギン酸を１．０ｇ（７．７ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを１．８ｇ（３８．４ｍｍｏｌ）加え、９５℃で２時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミルアスパラギン酸が０．４９ｇ（３９．８％：対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜比較例２＞
反応容器にＬ−アスパラギン酸を１．０ｇ（７．５ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを０．９１ｍｌ（２２．５ｍｍｏｌ）、水を１．０ｍｌ順次加えた後に、５０℃で２２時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が０．０１５ｇ（１．２％：対Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例１０＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１９．９ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ペレット状水酸化ナトリウムを１２．１ｇ（０．３０ｍｏｌ）、水を３０ｍｌ加えて０℃に冷却した。ギ酸メチル２７．３ｇ（０．４５ｍｏｌ）を９時間かけて滴下した後に、０℃にて更に１１時間強力に攪拌した。生成物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が１６．６ｇ（６８．９％：対  Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例１１＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１９．９ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ペレット状水酸化ナトリウムを１２．１ｇ（０．３０ｍｏｌ）、水を６０ｍｌ加えて０℃に冷却した。ギ酸メチル２７．３ｇ（０．４５ｍｏｌ）を９時間かけて滴下した後に、０℃にて更に１２時間強力に攪拌した。生成物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が１２．６ｇ（５２．１％：対  Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例１２＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１９．９ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ペレット状水酸化ナトリウムを１２．１ｇ（０．３０ｍｏｌ）、水を１５ｍｌ加えて０℃に冷却した。ギ酸メチル２７．８ｇ（０．４５ｍｏｌ）を９時間かけて滴下した後に、０℃にて更に１２時間強力に攪拌した。得られたスラリーを高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が１７．７ｇ（７３．２％：対  Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例１３＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１９．９ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ペレット状水酸化ナトリウムを１２．１ｇ（０．３０ｍｏｌ）、水を３０ｍｌ加えて２５℃に温度制御した。ギ酸メチル２７．３ｇ（０．４５ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した後に、２５℃にて更に１３時間強力に攪拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が１３．５ｇ（５６．０％：対  Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例１４＞
攪拌装置としてイリエ商会製ベンチニーダーを用いた。
ニーダーに、Ｌ−アスパラギン酸を９９．７ｇ（０．７５ｍｏｌ）、ペレット状水酸化ナトリウムを６０．４ｇ（１．４５ｍｏｌ）、水を１５１ｍｌ加えて０℃に温度制御した。ギ酸メチル１３６．４ｇ（２．２０ｍｏｌ）を９時間かけて滴下した後に、０℃にて更に２時間強力に攪拌した。得られたスラリーを高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が８４．２ｇ（６９．８％：対  Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例１５＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１９．９ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ペレット状水酸化カリウムを１９．８ｇ（含有量８５％、０．３０ｍｏｌ）、水を３０ｍｌ加えて２５℃に温度制御した。ギ酸メチル２７．３ｇ（０．４５ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した後に、２５℃にて更に１３時間強力に攪拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が９．９１ｇ（４１％：対  Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例１６＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１０．０ｇ（７５．１ｍｍｏｌ）、２９％アンモニア水を２８．４ｇ（４８０．８ｍｍｏｌ）加えて２５℃に温度制御した。ギ酸メチル９．２ｇ（１５０．３ｍｍｏｌ）を５分かけて加えた後に、５０℃にて更に２４時間攪拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が９．４ｇ（７７．９％  ：対  Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜実施例１７＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸を１９．９ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ペレット状水酸化ナトリウムを１２．１ｇ（０．３０ｍｏｌ）、２０％メタノール−水を４０ｍｌ加えて２５℃に温度制御した。ギ酸メチル２７．３ｇ（０．４５ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した後に、２５℃にて更に１３時間強力に攪拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が１０．２ｇ（４２．２％：対  Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
＜比較例３＞
反応容器に、Ｌ−アスパラギン酸１９．９ｇ（０．１５ｍｏｌ）及び水３０ｍｌを加えて２５℃に温度制御した。ギ酸メチル２７．３ｇ（０．４５ｍｏｌ）を加えた後に、４８時間そのまま攪拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸は全く生成していなかった。
＜比較例４＞
米国第４，７８９，７５７号特許に記載の実施例１に従い、  反応容器にＬ−アスパラギン酸を１．０１ｇ（７．７ｍｍｏｌ）、ホルムアミドを１．５５ｍｌ（３８．４ｍｍｏｌ）加えた後に、９５℃で２時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸が０．４９ｇ（３９．８％：対  Ｌ−アスパラギン酸）生成していた。
（本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；縮合反応）
酵素縮合反応の転化率については、いわゆる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、２１０ｎｍの紫外線分光検知器を用いて、オクタデシル基結合シリカゲルを充填したカラムで、０．１Ｍ燐酸二水素カリウム水溶液（ｐＨ＝２．８）／アセトニトリル溶媒を使用して定量した。
＜実施例１８＞
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩（２．１６ｇ：１０．０ｍｍｏｌ）、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩２．１１ｇ（Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパルギン酸０．８１ｇ：５．０ｍｍｏｌ含有）、塩化カルシウム二水和物６５ｍｇ及び水１．６ｇを２０ｍｌのナスフラスコで４０℃において混合し、溶解した。その後、混合水溶液を２５ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨ値を５．４５に調整した。減圧下、水を留去し、混合水溶液中の水含有量を１７．５ｗｔ％とした後（Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸濃度７．２ｍｏｌ／Ｌ）、残存している清浄な溶液に０．３０ｇの粗サーモリシン（大和化成社製粉末：商品名「サモアーゼＰＳ１６０」、約４０％のプロテアーゼ蛋白質及び約６０％の硫酸ナトリウムを含有する）と混合した。４０℃で２０時間反応の後、反応液は固形状になった。固体物を水に溶解し、ＨＰＬＣにより分析したところ、Ｆ−ＡＰＭへの最終転化率はＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸を基準にして８５％に達することが確認された。
＜実施例１９＞
実施例１８において水留去後の混合水溶液中の水含有量を３０ｗｔ％（Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸濃度３．６ｍｏｌ／Ｌ）とする以外実施例１８と同様の操作を行ったところ、Ｆ−ＡＰＭへの最終転化率はＦ−Ａｓｐを基準にして６２．９％に達することが確認された。
＜実施例２０＞
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩（１．０８ｇ：５．０ｍｍｏｌ）及びＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸（０．８１ｇ：５．０ｍｍｏｌ）に１０ｗｔ％塩化カルシウム水溶液０．６６ｇ及び水１．０ｇを加え、４０℃において溶解し、１５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ値を５．８に調整した。減圧下、水を留去し、混合水溶液中の水含有量を１７．５ｗｔ％（Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸濃度１０．８ｍｏｌ／Ｌ）とした後、これに０．３０ｇの粗サーモリシン（実施例１８において使用したものと同じ「サモアーゼＰＳ１６０」）を加え、反応液が均一になるように撹拌した。４０℃で２０時間反応の後、反応液は固形状となった。固形物を水に溶解し、ＨＰＬＣにより分析したところ、Ｌ−ＰＭの付加物の収率はＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸を基準にして４１．７％に達することが確認され、これは、Ｆ−ＡＰＭへの転化率として、８３．４％であることを示している。
＜実施例２１＞
実施例２０においてＬ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩を０．５４ｇ（２．５ｍｍｏｌ）とする以外、実施例２０と同様の縮合反応を行った。ＨＰＬＣにより分析したところ、Ｌ−ＰＭの付加物の収率は、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸を基準にして３４．８％に達することが確認され、これは、Ｆ−ＡＰＭへの転化率として、６９．６％であることを示している。
＜比較例５＞
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩２．１６ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）及びＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩２．１１ｇ（Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸０．８１ｇ：５．０ｍｍｏｌ含有）に１０ｗｔ％塩化カルシウム水溶液０．７１ｇ及び水１．０ｇを加え、２５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ値を５．５に調整し、更に水で全量を８．６２ｇとした（混合水溶液中の水含有率５９．０ｗｔ％）（Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸濃度１．０ｍｏｌ／Ｌ）。この溶液に０．３０ｇの粗サーモリシン（実施例１８において使用したものと同じ「サモアーゼＰＳ１６０」）と混合した。４０℃で２０時間反応の後、反応により析出した固体を水に溶解し、ＨＰＬＣにより分析したところＦ−ＡＰＭへの最終転化率はＦ−Ａｓｐを基準にして４５．７％であった。
＜参考例１＞
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩２．１５ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）及びＦ−Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩２．１１ｇ（Ｆ−Ａｓｐ  ０．８１ｇ：５．０ｍｍｏｌ含有）に１０ｗｔ％塩化カルシウム水溶液０．７ｇ及び水１．０ｇを加え、２５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ値を６．５に調整した。減圧下、水を留去し、混合水溶液中の水含有量を１８．７ｗｔ％とした後（Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸濃度６．６ｍｏｌ／Ｌ）、これに０．３０ｇの粗サーモリシン（実施例１８において使用したものと同じ「サモアーゼＰＳ１６０」）と混合した。４０℃で１８時間反応の後、反応液は固形状となった。固形物を水に溶解し、ＨＰＬＣにより分析したところ、Ｆ−ＡＰＭへの最終転化率はＦ−Ａｓｐを基準にして４３．０％であった。
＜参考例２＞
参考例１においてｐＨ値を７．５に調整した以外、参考例１と同様の縮合反応を実施した。Ｆ−ＡＰＭへの最終転化率はＦ−Ａｓｐを基準にして５．８％であった。
（本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；縮合反応：トリアルキルリン酸エステル共存）
＜実施例２２＞
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩（８．６１ｇ：４０ｍｍｏｌ）を水２０．０ｇに溶解させ、これにトリ−ｎ−ブチルリン酸エステル（以下、「ＴＢＰ」と略記する。）２０．０ｇを加え、激しく撹拌し、１５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ値を７．０に調整した。これを、更に４０℃で３０分間激しく撹拌、抽出後、水層と有機層を分離した。この有機層をＬ−ＰＭ／ＴＢＰ溶液（ＰＭ：１．０５ｍｍｏｌ／ｇ；７ｗｔ％）として以下の反応に用いた。
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩（２．１５ｇ：１０ｍｍｏｌ）及びＮ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸（０．８１ｇ：５．０ｍｍｏｌ）に１０ｗｔ％塩化カルシウム水溶液０．６６ｇ及び水１．０ｇを加え、４０℃において溶解し、１５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ値を５．８に調整した。減圧下、水を留去し、混合水溶液中の水含有量を２３．３％とした後（Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸濃度５．０５ｍｏｌ／Ｌ）、ＰＭ／ＴＢＰ溶液１２ｇ（ＴＢＰ８．９ｇ）及び粗サーモリシン（大和化成社製粉末：商品名「サモアーゼＰＳ１６０」、約４０％のプロテアーゼ蛋白質及び約６０％の硫酸ナトリウムを含有する。）を０．３ｇ加え、反応液が均一になるように撹拌した。４０℃で２０時間撹拌後、得られたスラリーを濾別し、Ｆ−ＡＰＭのＬ−ＰＭ付加物の結晶を得た。結晶と母液それぞれについてＨＰＬＣにより分析したところ、Ｆ−ＡＰＭへの最終転化率はＦ−Ａｓｐを基準にして７７．３％（結晶中に７３．３％、母液中に４．０％）に達することが確認された。
＜実施例２３＞
ＰＭ／ＴＢＰ溶液を６．０ｇ（ＴＢＰ４．４５ｇ）添加した以外は実施例２２と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液についてＨＰＬＣにより分析したところＦ−ＡＰＭへの最終転化率は７２．０％（結晶中に６８．４％、母液中に３．６％）であった。
＜実施例２４＞
ＰＭ／ＴＢＰ溶液を１６．６ｇ（ＴＢＰ１２．３２ｇ）添加した以外は実施例２２と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液についてＨＰＬＣにより分析したところＦ−ＡＰＭへの最終転化率は５４．１％（結晶中に４７．３％、母液中に６．８％）であった。
＜実施例２５＞
Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の濃度を６．２５ｍｏｌ／Ｌとした以外は実施例２２と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液についてＨＰＬＣにより分析したところＦ−ＡＰＭへの最終転化率は６５．１％（結晶中に６２．８％、母液中に２．３％）であった。
＜実施例２６＞
Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の濃度を３．５８ｍｏｌ／Ｌとした以外は実施例２２と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液についてＨＰＬＣにより分析したところＦ−ＡＰＭへの最終転化率は５８．２％（結晶中に５４．９％、母液中に３．３％）であった。
＜実施例２７＞
Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸の濃度を１．５３ｍｏｌ／Ｌとした以外は実施例２２と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液についてＨＰＬＣにより分析したところＦ−ＡＰＭへの最終転化率は５４．６％（結晶中に４９．０％、母液中に５．６％）であった。
（本発明のＦ−ＡＰＭの製造方法；分離方法）
＜実施例２８＞
実施例１８と同様の反応を行い、得られた反応液に水１０ｍｌを加え、析出した固体を分散させ、氷冷下、１時間撹拌後、固液分離した。更に、湿結晶を２ｍｌの水で洗浄した。得られた湿結晶２．７３ｇをＨＰＬＣで分析したところ、Ｆ−ＡＰＭが４２．４ｗｔ％（３．５９ｍｍｏｌ）及びＬ−ＰＭが２５．１ｗｔ％（３．８２ｍｍｏｌ）含有していた。また、結晶洗浄液を加えた母液１３．４ｇには、１．０ｗｔ％（０．４２ｍｍｏｌ）のＦ−ＡＰＭが含有していた。即ち、全反応収率は、８０％であり、分離後の収率は、７２％である。ここで得られた湿結晶を１０ｍｌの水に懸濁し、１Ｎ塩酸でｐＨ値を１．７に調整した。氷冷下、１時間撹拌後、この懸濁液を分離したところ、１．８６ｇの湿結晶が得られた。この湿結晶には、Ｆ−ＡＰＭが５４．０ｗｔ％（３．１１ｍｍｏｌ）及びＬ−ＰＭが２．９ｗｔ％（０．３ｍｍｏｌ）含まれていた。即ち、Ｆ−ＡＰＭの収率は、８６．８％であり、９１．４％のＬ−ＰＭが母液に淘汰されたことが確認された。
＜実施例２９＞
実施例２２と同様の操作を行い、Ｆ−ＡＰＭのＬ−ＰＭ付加物の湿結晶を４．９８ｇ得た（Ｆ−ＡＰＭ：３．６４ｍｍｏｌ）、Ｌ−ＰＭ：４．６２ｍｍｏｌ、反応収率：７７．４％、結晶中のＦ−ＡＰＭの収率７２．８％）。得られた湿結晶をを１０ｍｌの水に懸濁した後、氷冷した。これを１Ｎ塩酸でｐＨ値を１．８に調整した。氷冷下、１時間攪拌後、この懸濁液を濾過したところ、１．９２ｇの湿結晶が得られた。この湿結晶には、Ｆ−ＡＰＭが３．１７ｍｍｏｌ、Ｌ−ＰＭが０，４３ｍｍｏｌ含まれていた。即ち、Ｆ−ＡＰＭの収率は８７．１％であり、９３％のＬ−ＰＭが母液に淘汰されたことが確認された。
（本発明のホルミル化法２）
＜実施例３０＞
反応容器にＬ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１モル）、水酸化ナトリウム０．４０ｇ（０．０１モル）、ホルムアミド１．３５ｇ（０．０３モル）及び水１．２ｍｌを加え、５０℃で４８時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィーにて生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンが１．１８ｇ（７４．１％対Ｌ−ロイシン）生成していた。
＜実施例３１＞
反応容器にＬ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１モル）、２９％アンモニア水０．６４ｇ（０．０１１モル）、ホルムアミド１．３５ｇ（０．０３モル）及び水１．２ｍｌを加え、５０℃で４８時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィーにて生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンが１．１４ｇ（７１．６％対Ｌ−ロイシン）生成していた。
＜実施例３２＞
反応容器にＬ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１モル）、水酸化ナトリウム０．４０ｇ（０．０１モル）、ホルムアミド０．９０ｇ（０．０２モル）及び水１．２ｍｌを加え、８０℃で５時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィーにて生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンが１．１１ｇ（６９．７％対Ｌ−ロイシン）生成していた。
＜実施例３３＞
反応容器にＬ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１モル）、水酸化ナトリウム０．４０ｇ（０．０１モル）、ギ酸メチル１．８０ｇ（０．０３モル）及び水１．２ｍｌを加え、氷冷下２時間、その後室温で２２時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィーにて生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンが１．２７ｇ（７９．８％対Ｌ−ロイシン）生成していた。
＜実施例３４＞
反応容器にＬ−ロイシン１．３１ｇ（０．０１モル）、２９％アンモニア水０．６４ｇ（０．０１１モル）、ギ酸メチル１．８０ｇ（０．０３モル）及び水１．２ｍｌを加え、氷冷下２時間、その後室温で２２時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィーにて生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンが１．２１ｇ（７６．０％対Ｌ−ロイシン）生成していた。
＜実施例３５＞
反応容器にＬ−ロイシン１９．７ｇ（０．１５モル）、水酸化ナトリウム６．０ｇ（０．１５モル）を水３０ｍｌに加えて０℃に冷却した。ギ酸メチル２７．３ｇ（０．４５モル）を９時間かけて滴下した後に、室温にて１５時間強力に攪拌した。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィーにて生成物を分析したところ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシンが１９．２ｇ（８０．４％対Ｌ−ロイシン）生成していた。
以上から明らかな如く、Ｎ−ホルミルアスパラギン酸（又はその塩）を効率良く製造し、これとＬ−及び／又はＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルの酵素縮合反応、それに引き続く分離方法により、アスパルテーム前駆体であるＦ−ＡＰＭを高収率かつ高純度に製造することができる。このように製造されたＦ−ＡＰＭから、前記常法に基いて脱ホルミル化することによりアスパルテームを高収率で製造することができる。
更に、中性アミノ酸を極めて収率良くＮ−ホルミル化することができる。
尚、上記ホルミル化反応においては、反応中ラセミ化は起こり難く、光学活性なアスパラギン酸や中性アミノ酸（又はこれらの塩）を出発物質に用いることにより、当該Ｎ−ホルミル化反応後にＮ−ホルミルアミノ酸又はその塩を光学活性体として得ることができる。
発明の効果
本発明によれば、各種合成中間体、特にペプチド合成中間体等として重要なＮ−ホルミルアミノ酸、特にＮ−ホルミルアスパラギン酸（又はその塩）や、ロイシン等Ｎ−ホルミル中性アミノ酸（又はその塩）を効率良く工業上簡便に製造することができる。
更に、Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸から甘味料アスパルテームの前駆体であるＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル及び当該アスパルテームを効率良く工業上簡便に製造することができる。
従って、本発明は工業上、特に食品分野や医薬品分野で極めて有用である。
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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