(57)【要約】高度に純化したレタスビッグベインウイルスからその外被タンパク質を精製し、その部分アミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列の情報を基に設計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、レタスビッグベインウイルス外被タンパク質をコードするＲＮＡをクローニングし、その一次構造を解明した。得られた配列情報を基に設計したプライマーを用いた３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥを実施することにより、更に、レタスビッグベインウイルスがコードする複数のタンパク質のＲＮＡ分子を単離するとともに、その一次構造を決定することに成功した。同様に、レタスビッグベインウイルスのポリメラーゼをコードするＲＮＡも単離することに成功し、その一次構造を決定した。これらを利用してレタスビッグベインウイルス抵抗性レタスの作出およびレタスビッグベインウイルスの感染の診断を行なうことが可能であることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レタスビッグベインウイルスのタンパク質をコードする下記（ａ）または（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号：２から６、または１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号：１または１２に記載の塩基配列のコード領域を含む、（ａ）に記載の核酸。
【請求項２】
ＲＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ＤＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸の相補鎖に相補的なセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２に記載の核酸と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２に記載の核酸を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項３に記載の核酸または請求項７に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸によりコードされるタンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項１１】
請求項８に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項９に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
請求項４から６のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１に記載の核酸、請求項４から６のいずれかに記載のＤＮＡ、または請求項７もしくは１２に記載のベクターを保持する形質転換レタス細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換レタス細胞を含む形質転換レタス植物体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換レタス植物体の子孫またはクローンである、形質転換レタス植物体。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の形質転換レタス植物体の繁殖材料。
【請求項１７】
レタスビッグベインウイルスの感染を診断する方法であって、レタス細胞またはレタスビックベインウイルスの媒介菌であるＯｌｐｉｄｕｍにおける、請求項１に記載の核酸または請求項９に記載のタンパク質を検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、レタスビッグベインウイルスタンパク質をコードする核酸および該核酸によりコードされるタンパク質、並びにそれらの製造および用途に関する。
背景技術
レタスビッグベインウイルス（ＬＢＶＶ）はＶａｒｉｃｏｓａｖｉｒｕｓに属するウイルスで、７．０ｋｂと６．５ｋｂの２本のＲＮＡからなり、４８ｋＤａの外被タンパクを保持している。レタスビッグベインウイルスは、Ｏｌｐｉｄｕｍ　ｂｒａｓｓｉｃａｅによって土壌伝搬する土壌伝搬性ウイルスで、アメリカ、オーストラリア、ニュージーランド、日本、ヨーロッパで発生している。該ウイルスはレタスに感染して、その品質および収量を著しく低下させるため、レタスの生産において大きな問題となっている。
残念ながら現在までにレタスの該ウイルスに対する抵抗性遺伝子の存在は報告されていない。アントレー、シーグリーンおよびパシフィックなど数品種はＬＢＶＶ抵抗性品種として市販されているものの、その抵抗性は低い。従って、レタスビッグベインウイルスによる病害に対しては、根本的な解決策が見出されていないのが現状である。
レタスビッグベインウイルスによる病害を防止するためには、その遺伝子情報の解明が重要なステップとなる。しかしながら、レタスビッグベインウイルスは、ウイルス粒子が不安定である、ウイルス粒子同士が容易にアグリゲーションを起こす、植物体中でのウイルス濃度が極めて低いなどの理由から純化精製が極めて困難である。現在まで、該ウイルスに対する純化の成功例は２例（Ｓ．Ｋｕｗａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８３），日植病報，４９，２４６−２５１、Ｈ．Ｊ．Ｖｅｔｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７），Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１２０，５３−５９）報告されているものの、再現性が低く純化量も極めて低い。このため、レタスビッグベインウイルスに関しては遺伝子情報の解明は全く行われていない。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、レタスビッグベインウイルスタンパク質および該タンパク質をコードする核酸を単離し、その構造を解明することを目的とする。また、本発明は、レタスにおける該核酸またはそのアンチセンスの発現を通じて、レタスにレタスビッグベインウイルスに対する抵抗性を付与することを目的とする。さらに、本発明は、該核酸あるいは該核酸によりコードされるタンパク質を検出することによるレタスビッグベインウイルスの感染を診断する方法を提供することも目的とする。
レタスビッグベインウイルスはＲＮＡウイルスであり、該ウイルスのタンパク質をコードするＤＮＡまたはそのアンチセンスＤＮＡを植物体内で発現させれば、転写レベルあるいは翻訳レベルでレタスビッグベインウイルスタンパク質の産生や機能を阻害することができると考えられる（Ｐ．Ｆ．Ｔｅｎｎａｎｔ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４），Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，８４，１３５９−１３６６、Ｃ．Ｃ．Ｈｕｎｔｌｅｙ　＆　Ｔ．Ｃ．Ｈａｌｌ，（１９９３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９２，２９０−２９７）、Ｄ．Ｃ．Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，（１９９６），Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，８，１８３３−１８４４）。
本発明者等は、このような発想に着目してレタスビッグベインウイルスに対する抵抗性レタスを作製するため、レタスビッグベインウイルスタンパク質をコードする遺伝子の単離を行なった。
具体的には、本発明者らは、まず、レタスビッグベインウイルスを高度に純化し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、該ウイルスを構成する外被タンパク質を検出した。この検出された外被タンパク質を精製し、ペプチドに分解後エドマン法によりその部分のアミノ酸配列を決定した。さらに、決定したアミノ酸配列の情報を基に設計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、レタスビッグベインウイルス外被タンパク質をコードするＲＮＡをクローニングし、その塩基配列を決定した。
次いで、レタスビッグベインウイルスの全外被タンパク質をコードする遺伝子を決定するために、純化ウイルスおよび該ウイルスが感染し明瞭な感染症状を示した葉からＲＮＡを調製し、このＲＮＡ分子を用いて３’ＲＡＣＥあるいは５’ＲＡＣＥを実施した。その結果、レタスビッグベインウイルス外被タンパク質をコードするＲＮＡ分子を単離するとともに、その一次構造を決定することに成功した。さらに、ゲノムウォーキング法により、他の４種のレタスビッグベインウイルスタンパク質をコードするＲＮＡ分子を単離するとともに、その一次構造を決定することにも成功した。
同様に、本発明者らは、高度に純化したレタスビッグベインウイルスからポリメラーゼタンパク質をコードするＲＮＡ分子を単離することにも成功した。
単離したＲＮＡ分子またはそのアンチセンス分子は、その発現によりレタス植物体にレタスビッグベインウイルス抵抗性を付与することが可能であり、これによりレタスの生産性の向上を図ることができる。また、単離したＲＮＡ分子の配列情報を基にレタスビッグベインウイルス特異的プライマーを設計し、これを利用することによりレタスビッグベインウイルスの遺伝診断を行うことも可能である。また、得られた配列情報を基に、レタスビッグベインウイルスタンパク質に結合する抗血清を作製して、これをレタスビッグベインウイルスの血清学的診断法に利用することも可能である。
本発明は、以上のような知見を基に完成されたものであり、レタスビッグベインウイルスタンパク質および該タンパク質をコードする核酸、並びにそれらの製造および用途を提供する。
より詳しくは、本発明は、
（１）　レタスビッグベインウイルスのタンパク質をコードする下記（ａ）または（ｂ）の核酸、
（ａ）配列番号：２から６、または１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号：１または１２に記載の塩基配列のコード領域を含む、（ａ）に記載の核酸。
（２）　ＲＮＡである、（１）に記載の核酸、
（３）　ＤＮＡである、（１）に記載の核酸、
（４）　（２）に記載の核酸の相補鎖に相補的なセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（５）　（２）に記載の核酸と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（６）　（２）に記載の核酸を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（７）　（３）に記載の核酸を含むベクター、
（８）　（３）に記載の核酸または（７）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
（９）　（１）に記載の核酸によりコードされるタンパク質、
（１０）　（９）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（１１）　（８）に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（９）に記載のタンパク質の製造方法、
（１２）　（４）から（６）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター、
（１３）　（１）に記載の核酸、（４）から（６）のいずれかに記載のＤＮＡ、または（７）もしくは（１２）に記載のベクターを保持する形質転換レタス細胞、
（１４）　（１３）に記載の形質転換レタス細胞を含む形質転換レタス植物体、
（１５）　（１４）に記載の形質転換レタス植物体の子孫またはクローンである、形質転換レタス植物体、
（１６）　（１４）または（１５）に記載の形質転換レタス植物体の繁殖材料、および
（１７）　レタスビッグベインウイルスの感染を診断する方法であって、レタス細胞またはレタスビックベインウイルスの媒介菌であるＯｌｐｉｄｕｍ　ｂｒａｓｓｉｃａｅあるいは本媒介菌を含む土壌における、（１）に記載の核酸または（９）に記載のタンパク質を検出することを特徴とする方法、を提供するものである。
本発明は、レタスビッグベインウイルスのタンパク質および該タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明に含まれる、本発明者らにより単離されたレタスビッグベインウイルスのタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２から６に示した。単離したｃＤＮＡは、６０７８ｂｐの塩基配列からなり、５つのタンパクをコードした。タンパク１（外被タンパク質；実施例１）は２０９塩基より翻訳がスタートして３９７のアミノ酸をコードし（単離したクローンを「ＬＢＶＶ−ｃｐ」と命名した／配列番号：２）、タンパク２（実施例３）は１４９２塩基より翻訳がスタートして３３３のアミノ酸をコードし（配列番号：３）、タンパク３（実施例３）は２６１６塩基より翻訳がスタートして２９０のアミノ酸をコードし（配列番号：４）、タンパク４（実施例３）は３８４２塩基より翻訳がスタートして１６４のアミノ酸をコードし（配列番号：５）、タンパク５（実施例３）は４５２９塩基より翻訳がスタートして３６８のアミノ酸をコードしていた（配列番号：６）。
また、同じく本発明に含まれる、本発明者らにより単離されたレタスビッグベインウイルスのポリメラーゼをコードするｃＤＮＡの塩基配列（実施例４）を配列番号：１２に、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１３に示した（単離したクローンを「ＬＢＶＶ−Ｌ」と命名した）。単離したｃＤＮＡは６７９３ｂｐの塩基配列からなり、３３７塩基目より翻訳がスタートして２０４０のアミノ酸をコードしていた。
本発明者らは、さらに、レタスビッグベインウイルスが、−鎖のＲＮＡウイルスであり、粒子内に多少の＋鎖も含むことを明らかにした。
これはレタスビッグベインウイルスの遺伝子およびタンパク質の一次構造を示した初めての例である。
本発明のＬＢＶＶ−ｃｐタンパク質（ＬＢＶＶタンパク１）、ＬＢＶＶタンパク２〜５タンパク質、またはＬＢＶＶ−Ｌタンパク質をコードする核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。このＤＮＡにはｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれ、また、ＲＮＡにはウイルスゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡが含まれる。本発明の核酸は、当業者にとって常套手段を利用して調製することが可能である。具体的には、純化ウイルスをＳＤＳ−フェノール法などの方法で除タンパク質して調製したＲＮＡ、あるいはＣＴＡＢ法などでウイルス感染葉から抽出した全核酸を鋳型として、本発明の核酸の配列から設計したプライマーあるいはランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なうことで第一鎖ＤＮＡを合成できる。この方法で作製した第一鎖ＤＮＡから、Ｇｕｂｌｅｒ　＆　Ｈｏｆｆｍａｎ法（Ｕ．Ｇｕｌｂｅｒ　＆　Ｂ．Ｊ．Ｈｏｆｆｍａｎ，（１９８３），Ｇｅｎｅ　２５，２６３−２６９）により第二鎖ＤＮＡを合成し、市販の数々のプラスミドあるいはファージミドベクターにクローニングできる。あるいは、第一鎖ＤＮＡを鋳型とし、本発明の核酸の配列から設計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により該ウイルスのＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅し、ｐＧＥＭ登録商標−Ｔベクターなどを用いたＴＡクローニング、あるいはプライマーに制限酵素サイトを付けることにより市販の数々のプラスミドベクターにクローニングできる。
本発明の核酸は、組換えタンパク質の調製やレタスビッグベインウイルス抵抗性レタスの作出に利用することもできる。
組換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社発売のベクターｐＭＡＬシリーズ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として調製する方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社発売のベクターｐＧＥＸシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、発現ベクターを変えることにより、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Ｍ．Ｍａｎｄｅｌ，＆　Ａ．Ｈｉｇａ，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５８−１６２、Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ，（１９８３），Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，５５７−５８０）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することができる。組換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去した血清より調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明の抗体には、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびこれら抗体の断片が含まれる。
レタスビッグベインウイルス抵抗性レタスの作出する場合には、レタスビッグベインウイルスタンパク質の産生や機能を抑制するＤＮＡをレタス細胞に導入し、これにより得られた形質転換レタス細胞を再生させればよい。
レタスビッグベインウイルスタンパク質の産生や機能を抑制するＤＮＡとしては、レタスビッグベインウイルスタンパク質をコードするＲＮＡのいずれかの鎖（センス鎖またはその相補鎖）にハイブリダイズするＲＮＡをコードするＤＮＡを用いることができる。
ウイルスゲノムのセンス鎖およびｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、本発明者らにより単離された配列番号：２から６、または１３のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ（好ましくは配列番号：１または１２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ）の転写産物に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡが挙げられる。ここで「相補的」とは、レタスビッグベインウイルスタンパク質の産生を有効に阻害できる限り、完全に相補的でない場合も含まれる。転写されたＲＮＡは、標的とするレタスビッグベインウイルスタンパク質をコードするＲＮＡに対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。ここで「相補性」とは、２つの配列の対応する領域を、相補的塩基対の数が最大となるように整列させた場合における、該領域における全塩基数に対する相補的塩基対を形成した塩基数の％である。
ウイルスゲノムＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズするＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、本発明者らにより単離された配列番号：２から６、または１３のいずれかに記載のタンパク質をコードするＲＮＡ（好ましくは配列番号：１または１２に記載の塩基配列のコード領域を含むＲＮＡ）の相補鎖に相補的なセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを用いることができる。ここで「相補的」とは、レタスビッグベインウイルスタンパク質の産生を有効に阻害できる限り、完全に相補的でない場合も含まれる。転写されたセンスＲＮＡは、標的とするレタスビッグベインウイルスタンパク質をコードするＲＮＡ（相補鎖）に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。
効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、上記アンチセンスＲＮＡやセンスＲＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上であり、通常、５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
また、レタスビッグベインウイルスタンパク質の産生を抑制するＤＮＡとしては、レタスビッグベインウイルスタンパク質をコードするＲＮＡの少なくとも一方の鎖を切断するリボザイムをコードするＤＮＡを用いることも可能であると考えられる。
リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，（１９９０），蛋白質核酸酵素，３５，２１９１−２２００）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡまたはＵでも切断されることが示されている（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８８），ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２８，２２８−２３０）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８８），ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２３９，２８５、小泉誠および大塚栄子，（１９９０），蛋白質核酸酵素，３５，２１９１−２２００、Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８９），Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，７０５９−７０７１）。例えば、ＬＢＶＶ−ｃｐ遺伝子、ＬＢＶＶタンパク２〜５遺伝子、またはＬＢＶＶ−Ｌ遺伝子（配列番号：１または１２）中には標的となりうる部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｊ．Ｍ．Ｂｕｚａｙａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ，３２３，３４９−３５３）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｙ．Ｋｉｋｕｃｈｉ　＆　Ｎ．Ｓａｓａｋｉ，（１９９２），Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，６７５１−６７７５、菊池洋，（１９９２），化学と生物，３０，１１２−１１８）。
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたＲＮＡの５’末端や３’末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｋ．Ｔａｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０），Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．，３，７３３−７３８、Ａ．Ｍ．Ｄｚｉａｎｏｔｔ　＆　Ｊ．Ｊ．Ｂｕｊａｒｓｋｉ，（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８６，４８２３−４８２７、Ｃ．Ａ．Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ　＆　Ｒ．Ｔ．Ｃｅｃｈ，（１９９１），Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，３８７５−３８８０、Ｋ．Ｔａｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９１），Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，５１２５−５１３０）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる（Ｎ．Ｙｕｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９２），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８６，１２７１−１２７９）。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
レタス細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入されたＤＮＡを発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、レタス細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。好適なベクターとしては、例えば、ｐＢＩバイナリーベクターが挙げられる。ベクターの導入される「レタス細胞」には、種々の形態のレタス細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
レタス細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、ポリカチオン法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例えば、文献（Ｓ．Ｚ．Ｐａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６），Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，９，８９９−９０９）に記載の方法は好適な方法の一例である。
形質転換レタス細胞からのレタス植物体の再生は、レタス細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。好適な再生の方法としては、例えば、文献（Ｓ．Ｅｎｏｍｏｔｏ，ｅｔ　ａｌ．，（１９９０），Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，９，６−９）に記載の方法が挙げられる。
一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換レタス植物体が得られれば、該植物体から有性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
また、本発明は、レタスビッグベインウイルスの感染を診断する方法を提供する。本発明の診断方法の一つの態様は、プライマーあるいはプローブを利用したレタスビッグベインウイルスＲＮＡあるいは該ウイルスタンパク質をコードするＲＮＡを検出することを特徴とする方法である。このようなプローブやプライマーとしては、配列番号：２から６、または１３のいずれかに記載のレタスビッグベインウイルスタンパク質をコードするＤＮＡに相同的または相補的な少なくとも１５ヌクレオチドからなる核酸を用いることができる。該核酸は、好ましくは配列番号：２から６、または１３のいずれかに記載のレタスビッグベインウイルスタンパク質をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸である。
プライマーやプローブは必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、放射標識等が挙げられる。
この診断においては、例えば、レタスビッグベインウイルスに感染したことが疑われるレタス、該ウイルスを保毒していると疑われるＯｌｐｉｄｕｍ、あるいは本菌を含む土壌から被検試料を調製し、該試料に対し、上記のプライマーを用いたＰＣＲ法あるいは上記のプローブを利用したノーザンブロッティング法を実施すればよい。
本発明の診断方法の他の一つの態様は、抗体を利用したレタスビッグベインウイルスタンパク質を検出することを特徴とする方法である。この診断に用いる抗体の調製は、例えば、得られたアミノ酸配列（配列番号：２から６、または１３のいずれか）から抗原領域を推定してペプチドを合成し、ＫＬＨあるいはＢＳＡなどのキャリアタンパクに結合させ、これをウサギに免疫することにより調製することができる。また、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ　Ｔｙｐｅ　ＩＶ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、大腸菌で発現させたレタスビッグベインウイルスのタンパク質をヒスチジンでタッギングし、得られたタンパク質をウサギに免疫することにより調製することもできる。抗体は、必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、酵素標識等が挙げられる。また、抗体自体を直接標識しなくとも、抗体に結合する物質、例えば、プロテインＡなどを介して標識して、目的のタンパク質を検出してもよい。
この診断においては、例えば、レタスビッグベインウイルスに感染したことが疑われるレタス、該ウイルスを保毒していると疑われるＯｌｐｉｄｕｍ、あるいは本菌を含む土壌から被検試料を調製し、該試料に対し、上記の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法あるいはウエスタンブロット法を実施すればよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　レタスビッグベインウイルスの外被タンパク質遺伝子のクローニング
１９９７年に香川県のビッグベイン症を示したレタス（品種；シスコ）圃場より汚染土を採集し、乾燥状態で室温で保存した。ウイルス純化にはレタスの品種シスコを用い、ウイルス接種は土壌接種によった。
ウイルス純化はＫｕｗａｔａら（Ｓ．Ｋｕｗａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８３），日植病報，４９，２４６−２５１）の方法を改変して行った。まず、最初の低速遠心をやめ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ処置、１％　Ｂｒｉｊｉ−３５処理後、Ｃｓ２ＳＯ４の密度勾配遠心をし、ウイルス画分を得た。本純化法で得られた純化ウイルスをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動すると、４８ｋＤａの一本のバンドのみが検出された。また、電子顕微鏡観察ではＬＢＶＶの粒子の集塊のみが観察され他の不純物が観察されなかったことより、かなり高純度の純化ウイルスが得られていると推定された。
ウイルス核酸の抽出は、純化ウイルスをＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ−ＳＤＳ処理後、フェノール／クロロホルム、エタノール沈殿で行った。また、第一鎖ｃＤＮＡの作製には精製ウイルス核酸をＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ変性して用いた。ＬＢＶＶ感染葉からのＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの抽出は、ＬＢＶＶ感染し明瞭なビッグベイン症状を示したレタス葉からＤｙｎａｂｅａｄｓ登録商標　ｍＲＮＡ　ＤＩＲＥＣＴＴＭ　Ｋｉｔ（ＤＹＮＡＬ登録商標社）を用いて行った。第一鎖ｃＤＮＡの作製にはランダムプライマーあるいはＯｌｉｇｏ−ｄＴ−Ｂａｍ　ＨＩプライマーを用い、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ　ＩＩ　ＲＮａｓｅ　Ｈ−　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社）で逆転写反応を行った。
ＬＢＶＶ外被タンパク質の内部アミノ酸配列の決定は以下のようにして行った。純化ＬＢＶＶを１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写し、目的のバンドを切り出し、カルボキシメチル化後、リジルエンドペプチターゼ処理した。処理後、逆相ＨＰＬＣにより３８本のバンドパターンを得た。それらのバンドのうち数バンドについてアミノ酸の配列を決定した。
得られた数種のアミノ酸配列のうち、ＥＳＷＤＤＥＳＴＩＡＭＰおよびＮＬＥＶＰＧＶＤＹＩＤＡを基に５ＬＢ１１１プライマー（ＧＡＲＷＳＩＴＧＧＧＡＹＧＡＹＧＡＲＷＳＩＡＣ／配列番号：７）および３ＬＢ１７１プライマー（ＧＣＲＴＣＤＡＴＲＴＡＲＴＣＩＡＣＩＣＣＩＧＧ／配列番号：８）を設計し、ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ（タカラ社）を用いてＰＣＲを行ったところ、２７４ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ登録商標−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてクローニングし、塩基配列を決定した。
ＬＢＶＶの全外被タンパク質遺伝子を決定するために、純化ウイルスからのＲＮＡあるいはＬＢＶＶ感染葉からのＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて３’ＲＡＣＥあるいは５’ＲＡＣＥを試みた。３’ＲＡＣＥでは、ＲＮＡはＬＢＶＶ感染葉からのＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを、ＰＣＲはＯｌｉｇｏ−ｄＴ−Ｂａｍ　ＨＩプライマーおよび５ＬＢ１７１プライマー（ＡＡＹＹＴＩＧＡＲＧＴＩＣＣＩＧＧＩＧＴＩＧＡ／配列番号：９）を用い、８９１ｂｐのＰＣＲ産物を得た。５’ＲＡＣＥでは、ＲＮＡは純化ウイルスからのＲＮＡあるいはＬＢＶＶ感染葉からのＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを、プライマーには３ＬＢ５Ｒ４プライマー（ＧＴＴＴＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＡＧ／配列番号：１０）と３ＬＢ５Ｒ５プライマー（ＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＣＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧＴＧ／配列番号：１１）を用い、５’ＲＡＣＥ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）によって７６０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ登録商標−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてクローニングし、少なくとも６クローン以上の塩基配列を決定した。また、互いに重なるようにデザインしたプライマーで５００〜７００ｂｐの外被タンパク質近傍の遺伝子のＰＣＲ産物をクローニングし、少なくとも３クローンの塩基配列を決定し、外被タンパク質遺伝子の塩基配列を確認した。
以上の方法により、１４２５ｂｐの塩基配列を決定した。本遺伝子は２０９塩基より翻訳がスタートし、３９７のアミノ酸をコードしていた（配列番号：１参照）。
［実施例２］　形質転換レタスの作製
（１）レタス種子の殺菌および培養
レタス種子を７０％エタノールに数秒間浸漬後、殺菌液（１０％次亜塩素酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に入れ１５分間処理した。次に、種子を殺菌水ですすぎ、ハイポネックス寒天培地（１リットルの蒸留水に対し、ハイポネックス粉末を３．０ｇ、ショ糖を１０．０ｇ、寒天を８．０ｇ溶かし、１Ｎ　ＮａＯＨでｐＨを５．８に調整）の入ったプラントボックスに植え、明所２５〜２８℃で約２週間、本葉が５ｃｍ程度になるまで生育させた。
（２）アグロバクテリウムの培養と接種
２５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５μｇ／ｍｌリファンピシン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＹＥＢ液体培地（１リットルの蒸留水に、Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔを１．０ｇ、Ｂｅｅｆ　ｅｘｔｒａｃｔを５．０ｇ、Ｐｅｐｔｏｎｅを５．０ｇ、ショ糖を５．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ溶かし、１Ｎ　ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整）にアグロバクテリウムを接種し、２８℃で一晩振とう培養した。アグロバクテリウム培養液をさらに新しいＹＥＢ培地（前述の抗生物質を含む）に植え継ぎ、さらに２８℃で一日振とう培養した。
本葉が５ｃｍ程度になったレタスの幼植物をプラスチックシャーレに取り出し、本葉を５ｍｍ程度に刻み、１０倍希釈のアグロバクテリウム培養液に１分間浸漬した。次に，切片を３％ショ糖、０．５ｐｐｍベンジルアデニン（ＢＡＰ）、０．１ｐｐｍナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．８％寒天を含むＭＳ培地（ｐＨ５．８）に１５〜２０個／プレートになるように並べ、２５℃、２０００ルクス、２日間共存培養した。共存培養後、３％ショ糖、０．５ｐｐｍ　ＢＡＰ、０．１ｐｐｍ　ＮＡＡ、２５０μｇ／ｍｌカルベニシリン、０．８％寒天を含むＭＳ培地（ｐＨ５．８）で７日間除菌培養した。
（３）形質転換体の選抜と培養
除菌培養後、３％ショ糖、０．５ｐｐｍ　ＢＡＰ、０．１ｐｐｍ　ＮＡＡ、２５０μｇ／ｍｌカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、０．８％寒天を含むＭＳ培地（ｐＨ５．８）に移し、２５℃、２０００ルクスで培養を行った。約２週間ごとに植え継ぎを行い、２〜３カ月でアグロバクテリウムを接種したものから再分化するものが現れた。
再分化した個体を３％ショ糖、０．３ｐｐｍ　ＢＡＰ、５００μｇ／ｍｌカルベニシリン、０．８％寒天を含むＭＳ培地（ｐＨ５．８）に移し、約２週間ごとに植え継ぎを行った。再分化個体が３ｃｍ程度の大きさになったら、５００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む１／２倍ＭＳ寒天培地に茎葉を挿して植え発根させた。
（４）レタスの順化と採種
再分化個体が発根してシュートが１〜２ｃｍ伸びてきた状態で、ハイポネクスの５００倍希釈水溶液を浸したバーミキュライトにシュートを切って挿し木し発根させた。プラントボックスのふたを徐々に開けて換気し順化させた。十分順化したところで、閉鎖系温室内（最高気温３０℃以下、自然日長）でポリポット（クレハ園芸培土）に定植して、そのまま抽苔・開花させて採種した。
［実施例３］　ＬＢＶＶのＲＮＡ２遺伝子のクローニング
１９９７年に香川県のビッグベイン症を示したレタス（品種；シスコ）圃場より汚染土を採集し、乾燥状態で室温で保存した。ウイルス純化にはレタスの品種シスコを用い、ウイルス接種は土壌接種によった。
ウイルスの純化およびＲＮＡの精製は実施例１にしたがって行った。ｃＤＮＡの合成および塩基配列の決定は、Ｃ．Ｆ．Ｆａｚｅｌｉ　＆　Ｍ．Ａ．Ｒｅｚａｉａｎ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１，６０５−６１５）の方法にしたがい、下流方向にプライマーを合成して配列を伸ばして行くゲノムウォーキングの方法でおこなった。まず、実施例１を基にウイルス特異的な５ＬＢ５Ｒ３プライマー（ＡＧＣＴＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＧ／配列番号：１６）を作製し、精製ＬＢＶＶＲＮＡを鋳型としてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ　ＩＩ　ＲＮａｓｅ　Ｈ−　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅで１ｓｔｃＤＮＡを合成した。次ぎに、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒ−ｄＮ６（５’−ＧＣＣＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＮＮＮＮＮＮ−３’／配列番号：１４）を用いクレノーフラグメント（タカラ社）で２ｎｄｃＤＮＡを合成した。ＧＬＡＳＳＭＡＸ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｉｎ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社）で余分なプライマーを除去後、ウイルス特異的なプライマーとＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＣＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣ−３’／配列番号：１５）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ登録商標−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓを用いてクローニングし、塩基配列を決定した。同様な方法を４回繰り返し、５１７７塩基までを決定した。ＲＮＡ２の３’末端は５’ＲＡＣＥで行い（注；精製ＬＢＶＶのＲＮＡには＋鎖と−鎖の両鎖が含まれているので５’ＲＡＣＥで５’末端のみならず３’末端も決めることができる）、ＬＢＶＶがコードする５つのタンパク質遺伝子を含む６０７８ｂｐの塩基配列決定した（配列番号：１）。なお、互いに重なるようにデザインしたプライマーで５００〜７００ｂｐのＲＮＡ２のＰＣＲ産物をクローニングし、少なくとも３クローンの塩基配列を決定し、ＲＮＡ２の塩基配列を確認した。
以上の方法により、６０７８ｂｐの塩基配列を決定した。本遺伝子は５つのタンパクをコードした。タンパク１（外被タンパク質；実施例１）は２０９塩基より翻訳がスタートして３９７のアミノ酸をコードし（配列番号：２）、タンパク２は１４９２塩基より翻訳がスタートして３３３のアミノ酸をコードし（配列番号：３）、タンパク３は２６１６塩基より翻訳がスタートして２９０のアミノ酸をコードし（配列番号：４）、タンパク４は３８４２塩基より翻訳がスタートして１６４のアミノ酸をコードし（配列番号：５）、タンパク５は４５２９塩基より翻訳がスタートして３６８のアミノ酸をコードしていた（配列番号：６）。アミノ酸配列の相同性を他のウイルスと比較したところ、タンパク１（外被タンパク質）のみがＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するウイルスのヌクレオカプシドタンパク（外被タンパク質）と相同性が認められた。
［実施例４］　ＬＢＶＶポリメラーゼ遺伝子のクローニング
１９９７年に香川県のビッグベイン症を示したレタス（品種；シスコ）圃場より汚染土を採集し、乾燥状態で室温で保存した。ウイルス純化にはレタスの品種シスコを用い、ウイルス接種は土壌接種によった。
ウイルス純化は、実施例１のウイルス純化の手順と同様にして行った。高純度のウイルス核酸の抽出は以下のようにして行った。純化ウイルスをＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ−ＳＤＳ処理後、フェノール／クロロホルム抽出しエタノール沈殿した。次ぎに、ＤＮａｓｅ処理しＴｈｅ　ＲＮａｉｄ登録商標　Ｋｉｔ（ＢＩＯ　１０１社）でウイルス核酸を更に精製後、１％アガロースゲル（ＳＥＡ　ＰＬＡＱＵＥ　ＧＴＧ；ＦＭＣ社）電気泳動で２本あるＬＢＶＶ核酸のうち７．３ｋｂのバンドを分取し、ｃＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡの合成はＰ．Ｆｒｏｕｓｓａｒｄ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０，２９００）の方法にしたがって行った。即ち、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒ−ｄＮ６（５’−ＧＣＣＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＮＮＮＮＮＮ−３’／配列番号：１４）を用いＳＵＰＥＲ　ＳＣＲＩＰＴＴＭ　ＩＩ　ＲＮａｓｅ　Ｈ−　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅで１ｓｔｃＤＮＡを合成した。次ぎに、クレノーフラグメントで２ｎｄｃＤＮＡを合成し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＣＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣ−３’／配列番号：１５）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ登録商標−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓを用いてクローニングし，塩基配列を決定した。
５００ｂｐ前後のＬＢＶＶのポリメラーゼ遺伝子断片を８個得た。ポリメラーゼ遺伝子の両末端は５’ＲＡＣＥで、その断片間はＰＣＲで埋め、全ポリメラーゼ遺伝子を含む６７９３ｂｐの塩基配列を決定した（配列番号：１２）。なお、互いに重なるようにデザインしたプライマーで５００〜７００ｂｐのポリメラーゼ遺伝子のＰＣＲ産物をクローニングし、少なくとも３クローンの塩基配列を決定し、ポリメラーゼ遺伝子の塩基配列を確認した。
本遺伝子は３３７塩基より翻訳がスタートし、２０４０のアミノ酸をコードしていた（配列番号：１３）。アミノ酸配列の相同性を他のウイルスと比較したところ、Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ目に属するウイルスのポリメラーゼとの相同性が確認され、特に、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するウイルスのポリメラーゼと高い相同性があり、ポリメラーゼ活性を担うとされる４つのモチーフも保存されていた。
産業上の利用の可能性
本発明により、レタスビッグベインウイルスのタンパク質をコードする核酸が単離され、その一次構造が解明された。該核酸あるいはそのアンチセンス核酸をレタスで発現させることにより、該ウイルスに対する抵抗性を有するレタス植物体の作出が可能となった。また、該核酸やそれにコードされるタンパク質を検出することにより、レタスビッグベインウイルスの感染を診断することが可能となった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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