(57)【要約】本発明は、ヒトＩＬ−１３α１鎖レセプター及びヒトＩＬ−１３α２鎖レセプターに対するリガンドであって、正常リガンドに比べて、ヒトＩＬ−１３α２鎖に対する解離定数（Ｋｄ）が高いこと及び／又は血漿中での半減期が長いことを特徴とするリガンドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１３α１鎖レセプター及びヒトＩＬ−１３α２鎖レセプターに対するリガンドであって、ヒトＩＬ−１３α２鎖に対する解離定数（Ｋｄ）が８０〜９０ｐＭであることを特徴とするリガンド。
【請求項２】
血漿中での半減期が１９〜３０時間であることを更に特徴とする、請求の範囲第１項記載のリガンド。
【請求項３】
請求の範囲第１項又は第２項記載のリガンドをコードする核酸。
【請求項４】
請求の範囲第１項又は第２項記載のリガンドを検索するためのヒトＩＬ−１３α１鎖レセプター及び／又はヒトＩＬ−１３α２鎖レセプターの使用。
【請求項５】
請求の範囲第１項又は第２項記載のリガンドを生体外で検出するための、該リガンドの使用。
【請求項６】
請求の範囲第１項又は第２項記載のリガンドを含む、該リガンドの生体外検出用キット。
【請求項７】
請求の範囲第１項又は第２項記載のリガンドを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、喘息又はアレルギー疾患の診断及び治療のために有用な、ヒトＩＬ−１３α１鎖レセプター及びヒトＩＬ−１３α２鎖レセプターに対する新規リガンドに関する。
背景技術
アレルギー疾患は多くの種類の細胞、又は仲介物質が関与する複雑な疾患であるが、アレルギー性疾患の病態形成にいわゆるヘルパーＴ（Ｔｈ）２型サイトカインが重要な役割を有していると考えられている。Ｔｈ２型サイトカインにはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３等が含まれるが、これらの中で、特にＩＬ−１３の重要性が最近注目されてきている。
ＩＬ−１３は、Ｔｈ細胞、マスト細胞、好塩基球などにより分泌される分子量が約１２ｋＤａのサイトカインである。ヒトＩＬ−１３は、ＩＬ−４と同様にマクロファージに対しては抗炎症作用を示す（Ｚｕｒａｗｓｋｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。しかし、ＩＬ−４とは異なり、Ｔ細胞への増殖作用、Ｔｈ２分化といった作用は示さない。
ＩＬ−１３は、様々なアレルギー反応に関与していることが知られており、ＩＬ−４とともに免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の産生やクラススイッチに関係していることが報告されている。
ＩＬ−１３が生物活性を発揮するためには、標的細胞表面上に存在するレセプターと結合する必要がある。ＩＬ−１３レセプターは、ＩＬ−１３レセプターα１鎖（ＩＬ−１３Ｒα１）とＩＬ−４レセプターα鎖（ＩＬ−４Ｒα）で構成されるヘテロダイマーよりなる（Ｚｕｒａｗｓｋｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。ＩＬ−１３Ｒα１とは別に、ＩＬ−１３と結合する分子としてＩＬ−１３レセプターα２鎖（ＩＬ−１３Ｒα２）が同定されている。しかし、このＩＬ−１３Ｒα２の細胞内ドメインは短いためシグナル伝達分子の会合は起こらず、このシグナル伝達を阻害することが知られている。
喘息患者の気道組織、あるいは気管支洗浄液（ＢＡＬ）中細胞においては、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３といったＴｈ２サイトカインの発現が恒常的に増強されているか、又はアレルゲンチャレンジによってこれらのサイトカイン発現が増強されることが示されている。特に、ＩＬ−１３はＩＬ−４に比べて有意に発現が強くなっている。このことから、喘息の病変部位においては、ＩＬ−１３が何らかの作用を示すことにより喘息の発症に関与していると考えられている。
抗原刺激したＴｈ２細胞をマウスに戻すと粘液産生、好酸球浸潤、気道過敏症が引き起こされるが、Ｔｈ１細胞を戻してもそのような病態が起こらないことから、抗原誘発モデルマウスにおける気管支喘息の発症においても、Ｔｈ２細胞が重要な役割を有していることが確かめられている。更に、クララ細胞のＣＣ１０プロモーターを用いることによって、ＩＬ−１３を気道上皮細胞に特異的に発現させたトランスジェニックマウスが作製され、単核球及び好酸球浸潤による粘液産生亢進、ゴブレット細胞過形成、気道粘膜下の線維化、気道過敏症亢進といった喘息病態が観察されることも示された（Ｚｈｕ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
このように、動物モデルにおける結果は、ＩＬ−１３の重要性を示すとともに、ＩＬ−１３が気道組織に直接作用して気管支喘息の発症を引き起こしていることを示唆している。
このような事実から、近年、ＩＬ−１３に関する研究が盛んとなったが、血液中のＩＬ−１３量と喘息の症状とが一致しないことが多く、従来公知のＩＬ−１３とはバインディング活性等が異なるものの存在は予想されていたが、物質として同定されたものは存在しなかった。
本発明の目的は、喘息又はアレルギー疾患の診断や原因究明、さらには治療薬の開発に応用できる、新規ヒトＩＬ−１３α１鎖レセプター及びヒトＩＬ−１３α２鎖レセプターに対するリガンドを提供することである。
本願発明者は、鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、天然のＩＬ−１３に比べてＩＬ−１３Ｒα２に対する結合力が弱く、そして血漿中での安定性に優れた、すなわちより血漿中におけるより長い半減期を有する新規ヒトＩＬ−１３α１鎖レセプター及びヒトＩＬ−１３α２鎖レセプターに対するリガンドを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
発明の開示
本発明は、ヒトＩＬ−１３α１鎖レセプター及びヒトＩＬ−１３α２鎖レセプターに対するリガンドであって、ヒトＩＬ−１３α２鎖に対する解離定数（Ｋｄ）が６０〜１００ｐＭ、好ましくは７０〜９５ｐＭ、より好ましくは８０〜９０ｐＭであることを特徴とするリガンドに関する。
また、本発明は、ヒトＩＬ−１３α１鎖レセプター及びヒトＩＬ−１３α２鎖レセプターに対するリガンドであって、血漿中での半減期が１９〜４０時間、好ましくは１９〜３０時間であることを特徴とするリガンドにも関する。
本発明においてリガンドとは、機能タンパク質に特異的に結合する物質をいい、代表的には、サイトカイン、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、レクチン等が挙げられる。
したがって、本発明は、上記リガンドをコードする核酸にも関する。
また、本発明は、上記リガンドを検索するためのヒトＩＬ−１３α１鎖レセプター及び／又はヒトＩＬ−１３α２鎖レセプターの使用にも関する。
本発明のリガンドを、ＰＣＲ、配列の検定、ＤＮＡ−ハイブリダイゼーションによって検出することができ、喘息やアレルギー疾患の罹病性を診断に用いることができる。このことによって、喘息発作のきっかけである汚染物質、抗原及び環境状態を回避するといった予防策を講じることも可能となる。したがって、本発明は、上記リガンドを検出するための診断キットにも関する。
引用文献
Ｚｈｕ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３  ｃａｕｓｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｍｕｃｕｓ  ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ｓｕｂｅｐｉｔｈｃｌｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｅｏｔａｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０３：７７９−７８８，１９９９  Ｚｕｒａｗｓｋｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １３，ａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４−ｌｉｋｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｔｈａｔ  ａｃｔｓ  ｏｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，Ｉｍｍｕｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １５：１９−２６，１９９４
発明を実施するための最良の形態
実施例１．ヒトＩＬ−１３組換えタンパク質を用いた結合実験。
結合実験は、ヒトβ細胞株であるＤＮＤ３９細胞にＩＬ−１３Ｒα１又はＩＬ−１３Ｒα２を強制発現させた細胞を用いて行った。
まず、Ｒ１１０型（正常ヒト成熟ＩＬ−１３）又はＱ１１０型（ヒト成熟ＩＬ−１３の１１０番目のアミノ酸がグルタミンである変異体型）のＩＬ−１３を放射性無機ヨードを用いてラベルした。さまざまな濃度のヨード化ＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１又はＩＬ−１３Ｒα２を発現しているＤＮＤ３９細胞とを４℃で２時間インキュベートした。その後、この混合液をオイルクッション（シリコンオイル及びパラフィン）を用いて遠心し（１０，０００ｒｐｍ、５分間）、細胞分画と上清分画とに分離させた。それぞれのサンプルの放射性活性を測定し、スキャッチャード法を用いて解析し、そしてＲ１１０型又はＱ１１０型それぞれのＩＬ−１３Ｒα１又はＩＬ−１３Ｒα２に対する親和性を得た。
実施例２．ヒト血漿中でのｈＩＬ−１３組換えタンパク質（Ｒ１１０、Ｑ１１０）の安定性
０．４ｎｇ／ｍｌのＲ１１０型又はＱ１１０型のＩＬ−１３と健常成人由来の血症とを混合し、３７℃でさまざまな時間インキュベートした。それをＩＬ−１３Ｒα１とレポーター遺伝子であるＩε−ルシフェラーゼ融合遺伝子とを強制発現させたＤＮＤ３９細胞と一緒に３７℃で２４時間インキュベートし、次いでこの細胞をルシフェラーゼアッセイに用いた。経過時間に対するルシフェラーゼ活性から、Ｒ１１０型又はＱ１１０型それぞれの半減期を求めた。
産業上の利用可能性
本発明のリガンドを有する人は、喘息を発症する危険性が高いことが考えられる。そこで、予めこのような人に本発明のリガンドのプロモーター活性や本発明のリガンドのｍＲＮＡの代謝を抑制する薬剤を投与することによって、喘息の発症を予防することが可能となる。
また、本発明のリガンドのアゴニスト又はアンタゴニストを治療に用いることが可能となり、本発明のリガンドの活性を抑制する薬剤を喘息発作の治療薬として開発することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトＩＬ−１３（ｈＩＬ−１３）組換えタンパク質を用いた結合実験の結果を示す。１２５ＩにてラベルしたｈＩＬ−１３．Ｒ１１０（Ｒ１１０）とｈＩＬ−１３．Ｑ１１０（Ｑ１１０）とを用いて結合実験を行った。
Ａ、Ｂ：Ｆｌａｇ−ｈＩＬ−１３Ｒα１を安定的に発現するＤＮＤ３９細胞（Ｄ３９Ｇε／α１）と、１２５Ｉ−Ｒ１１０（Ａ）又は１２５Ｉ−Ｑ１１０（Ｂ）との結合実験の結果をスキャッチャードプロットによって示した。ｘ軸は、細胞に結合したリガンド量を、ｙ軸は細胞に結合したリガンド量と結合していないリガンド量との比を表す。両者のＫｄは、それぞれ２１．０±２．７ｐＭ、２３．３±１．３ｐＭと算出された（独立した３回の実験結果の平均値を示した）。
Ｃ：ｈＩＬ−１３Ｒα２を安定的に発現するＤＮＤ３９細胞（Ｄ３９α２）と１２５Ｉ−Ｒ１１０（黒丸）、１２５Ｉ−Ｑ１１０（白丸）との結合実験の結果をスキャッチャードプロットによって同一グラフ上に示した。両者のＫｄは、それぞれ５４．７±１．６ｐＭ、８３．７±３．１ｐＭと算出された（独立した３回の実験結果の平均値を示した）。
図２は、ヒト血漿中でのｈＩＬ−１３組換えタンパク質（Ｒ１１０、Ｑ１１０）の安定性を示す。
組換えタンパク質Ｒ１１０、Ｑ１１０を健常人より採取・分離した血漿と３７℃で０〜９６時間培養した後、レポーター遺伝子としてＩε−ルシフェラーゼを有するＦｌａｇ−ｈＩＬ−１３α１発現ＤＮＤ３９細胞（Ｄ３９Ｇε／α１）と反応させることでレポーターアッセイを行った。刺激の際のＲ１１０、Ｑ１１０の最終濃度は、培養開始時において０．４ｎｇ／ｍｌとした。データは、培養開始時におけるリガンドによるルシフェラーゼ活性に対する割合（残存活性）で示した。血漿中での半減期は、Ｒ１１０が１３〜１９時間、Ｑ１１０が１９〜３０時間と算定された。異なるドナー由来の血漿を用いても同様の結果が得られた（データは示さず）。
【図１】
2003016346.tif 000002
【図２】
2003016346.tif 000003
【国際調査報告】
2003016346.tif 000004
2003016346.tif 000005
2003016346.tif 000006
2003016346.tif 000007
2003016346.tif 000008
2003016346.tif 000009