(57)【要約】本発明は造血幹細胞の効果的な製造法の提供をその目的とする。本発明による造血幹細胞の製造法は、ｇｐ１３０刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなるもの、である。
2003014336.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇｐ１３０刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなる、造血幹細胞の製造法。
【請求項２】
ｇｐ１３０刺激因子が、インターロイキン−６（ＩＬ−６）またはその変異体とＩＬ−６受容体のα鎖（ＩＬ−６Ｒ）またはその変異体との融合タンパク質、ＩＬ−６Ｒまたはその変異体とＩＬ−６またはその変異体との組み合わせ、ｇｐ１３０に対してアゴニストとして作用するｇｐ１３０に対する抗体、ＩＬ−１１、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、またはカルジオトロピンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｇｐ１３０刺激因子がＩＬ−６またはその変異体とＩＬ−６Ｒまたはその変異体との融合タンパク質である、請求項１の方法。
【請求項４】
融合タンパク質が、ＩＬ−６Ｒの１１２番から３３３番までの断片のＣ末端と、ＩＬ−６の３８番から２１２番までの断片のＮ末端とを直接連結してなるタンパク質（ＦＰ６）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
サイトカイン類が、造血幹細胞を増殖させるおよび／または維持する因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サイトカイン類が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）もしくはその変異体またはそれらの誘導体、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
サイトカイン類が、少なくともトロンボポエチン（ＴＰＯ）もしくはその変異体またはそれらの誘導体を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ストローマ細胞が、ＡＧＭ領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、胎児肝臓由来細胞、または前脂肪細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
造血幹細胞の培養工程の前に、ストローマ細胞を培養する工程を更に含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｇｐ１３０刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなる、造血幹細胞の培養法。
【請求項１１】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）とＩＬ−６受容体のα鎖（ＩＬ−６Ｒ）との融合タンパク質と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、ＡＧＭ領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞から選択されるストローマ細胞と、場合によっては幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦｌｔ−３リガンド（ＦＬ）との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなる、造血幹細胞の製造法。
【請求項１２】
ｇｐ１３０刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞とを含んでなる、造血幹細胞の培養に用いられる培地。
【請求項１３】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）とＩＬ−６受容体のα鎖（ＩＬ−６Ｒ）との融合タンパク質と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、ＡＧＭ領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞から選択されるストローマ細胞と、場合によっては幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦｌｔ−３リガンド（ＦＬ）とを含んでなる、造血幹細胞の培養に用いられる培地。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、造血幹細胞の製造法および造血幹細胞の培養に用いられる培地に関する。
背景技術
生体中の成熟血液細胞の寿命は短期間であり、絶えず造血前駆細胞の分化により成熟血液細胞が供給されることにより、血液の恒常性が保たれている。造血前駆細胞は、さらに未分化な造血幹細胞の分化により生成する。造血幹細胞は、各種の分化系列に分化できる能力（分化多能性）を有しているとともに、分化多能性を保持したまま自己複製することで生涯にわたり、造血細胞を供給する。つまり、自己複製をすることで分化多能性を持つ幹細胞を生じるとともに、一部は造血前駆細胞を経て各種の成熟血液細胞に分化することが知られている。
このような血液細胞の分化は種々のサイトカインにより調節されている。エリスロポエチン（ＥＰＯ）は赤血球系の細胞の分化を、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は好中球系の分化を、トロンボポエチン（ＴＰＯ）は巨核球および血小板産生細胞の分化を、それぞれ促進することが知られている。しかしながら、造血幹細胞が分化多能性を保持したまま自己複製するに際し、どのような因子が必要とされるかは分かっていない。造血幹細胞の増殖因子として、ＳＣＦ／ＭＧＦ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｅｌｌ，６３：１６７−１７４，１９９０；Ｚｓｅｂｏ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ，６３：２１３−２２４，１９９０）や、ＳＣＧＦ（ＷＯ９８／０８８６９号）などいくつかの報告があるが、いずれも造血幹細胞の分化多能性を十分に維持する作用を有していない。また、既知のサイトカインを複数組み合わせて添加することにより造血幹細胞を培養する試みがなされている（Ｍｉｌｌｅｒ  ＣＬ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１３６４８−１３６５３，１９９７；Ｙａｇｉ  Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：８１２６−８１３１，１９９９；Ｓｈｉｈ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌｏｏｄ，９４：５  １６２３−１６３６  １９９９）。
一方、造血細胞の維持および増殖に適した環境を提供するストローマ細胞を利用して造血幹細胞を分化させずに維持および増殖させる試みがなされている（Ｍｏｏｒｅ  Ｋ．Ａ．，Ｂｌｏｏｄ，８９：１２  ４３３７−４３４７  １９９７、Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｌｙｍｐｈｏ−ｍｙｅｌｏｉｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ，Ｃｉｎｄｙ  Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｎｉｅ  Ｊ．Ｅａｖｅｓ，ＰＮＡＳ  ９４：１３６４８−１３６５３）。また、ＷＯ９９／０３９８０号には、マウス胎児のＡＧＭ（Ａｏｒｔａ−Ｇｏｎａｄ−Ｍｅｓｏｎｅｐｈｒｏｓ）領域から株化された、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得るストローマ細胞株が開示されている。更に、Ｒａｐｐｏｌｄ  Ｉ，Ｗａｔｔ  ＳＭ，Ｋｕｓａｄａｓｉ  Ｎ，Ｒｏｓｅ−Ｊｏｈｎ  Ｓ，Ｈａｔｚｆｅｌｄ  Ｊ，Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ  ＲＥ．Ｇｐ１３０−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ＦＬ  ａｎｄ  ＴＰＯ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９  Ｄｅｃ；１３（１２）：２０３６−４８にはＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ｓＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−６融合タンパク質（Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６）およびストローマ細胞を用いて培養を行っている。
しかし、Ｒａｐｐｏｌｄらの培養系は造血前駆細胞の培養系であり、造血幹細胞の培養系とは全く異なる。また、Ｋｕｓａｄａｓｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０００；１１：１９４４−１９５３には、ＩＬ−６、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、およびＴＰＯの培養系ではストローマ細胞の機能はＦＬ＋ＴＰＯで代償され、ストローマ細胞は幹細胞維持機能を増強する作用をほとんど有していないことが報告されている。
発明の概要
発明者らは今般、ｇｐ１３０刺激因子と、サイトカインカクテルと、ストローマ細胞との存在下で造血幹細胞を培養することにより、造血幹細胞を効率的に増殖させ、その生存を支持できることを見出した。
本発明は、造血幹細胞の効果的な製造法、造血幹細胞の効果的な培養法、並びに造血幹細胞の培養に用いられる培地の提供をその目的とする。
本発明による造血幹細胞の製造法は、ｇｐ１３０刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなるもの、である。
本発明による造血幹細胞の培養法は、ｇｐ１３０刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなるもの、である。
本発明による造血幹細胞の培養に用いられる培地は、ｇｐ１３０刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞とを含んでなるもの、である。
末梢血幹細胞移植や臍帯血幹細胞移植などの造血幹細胞移植療法では、移植する造血幹細胞数が十分量取得できず移植が実施できないことがある。本発明によれば、造血幹細胞を試験管内で効率的に増幅し、また安定に維持することが可能である。従って、十分な量の造血幹細胞が患者から取得できない場合でも、必要量の造血幹細胞を培養し、患者に移植することができる。すなわち本発明は、血液細胞の移植療法および移植療法を必要とする治療の実用化に途を開くものである。
本発明の培養系により増幅した造血幹細胞はまた、血液以外の組織に分化する細胞として利用することも可能である。従って本発明により得られた造血幹細胞は、肝不全、筋ジストロフィー、心筋梗塞などによる心筋の壊死、糖尿病による血管壊死、あるいは腸管膜細胞の壊死から正常な細胞を再生させる治療や、神経細胞を再生させる治療に用いることができる。
発明の具体的説明
造血幹細胞
本発明において「造血幹細胞」とは、血球のすべての分化系列に分化し得る能力（多分化能）を有し、かつその多分化能を維持したまま自己複製することが可能な細胞をいう。
造血幹細胞は、ヒトおよびマウス等の哺乳動物の胎児肝臓、骨髄、胎児骨髄、末梢血、サイトカインおよび／または抗癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、および臍帯血等から採取することができる。
マウスでは、移植実験により造血幹細胞と造血前駆細胞とを区別することができる。すなわち、試験細胞を放射線照射マウスに移植し移植後３ヶ月以上にわたりドナー由来の骨髄球、リンパ球の双方の分化系列の造血細胞が移植先個体（レシピエント）に見いだされれば多分化能を有しレシピエント個体で自己複製可能な造血幹細胞が移植細胞集団に存在していたことを示す。
赤血球前駆細胞は、試験管内の培養環境で維持増幅させることは困難であり急速に消失してしまう。赤血球前駆細胞の維持、増殖が確認される場合は、より未分化な造血幹細胞あるいは造血前駆細胞が維持、増殖されることで、赤血球前駆細胞が継続的に産生されていることと考えられる。従って、ヒト造血幹細胞の評価系では、赤血球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）あるいは顆粒球、マクロファージの二つの細胞系列に分化可能な前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）が維持、増殖されているかを指標とすることで造血幹細胞あるいは未分化な造血前駆細胞が増殖していることを確認することができる。また、免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへヒト造血細胞を移植し、移植後のヒト造血細胞の存在頻度から造血幹細胞あるいは造血前駆細胞が移植細胞集団に存在していたか確認することができる。
ｇｐ１３０刺激因子
本発明において「ｇｐ１３０刺激因子」とは、ヒトｇｐ１３０を介してシグナルを伝達する分子を意味し、ＩＬ−６およびＩＬ−６受容体のα鎖（以下「ＩＬ−６Ｒ」と言うことがある）の複合体のように、ｇｐ１３０と会合することによりｇｐ１３０を活性化し、次いでＪＡＫキナーゼの活性化、ＳＴＡＴ３のリン酸化、ＳＴＡＴ３によるＪｕｎＢ、ＪＡＢ、ＳＡＡ３、Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎなどの遺伝子の転写促進を引き起こし、結果として、細胞増殖、細胞分化調節等を生じさせる分子をいう。ヒトｇｐ１３０を本来発現しないマウスＩＬ−３依存性細胞株であるＢａ／Ｆ３細胞にヒトｇｐ１３０をコードする遺伝子を発現させた形質転換細胞はｇｐ１３０シグナルにより増殖するので、この形質転換細胞の増殖を検出することにより、ｇｐ１３０刺激因子か否かを評価できる。形質転換細胞の増殖はアイソトープ標識した核酸を細胞に取り込ませること、ミトコンドリアの活性を評価すること、細胞数を直接計測すること等により確認でき、例えば、特開２００１−８６９０号公報の実施例５の記載に従って実施できる。また、上述のようにｇｐ１３０刺激は細胞内シグナル伝達分子であるＳＴＡＴ３の活性化も行うことから、ｇｐ１３０刺激因子かどうかは上記Ｂａ／Ｆ３細胞のＳＴＡＴ３の活性化を検出することにより評価することも可能である。ＳＴＡＴ３の活性化は、細胞内のＳＴＡＴ３がリン酸化されることを検出することにより、また、ＳＴＡＴ３により転写が促進される遺伝子群についてはその転写促進をノーザン解析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により検出することでも可能である。
ｇｐ１３０刺激因子としては、ＩＬ−６またはその変異体とＩＬ−６Ｒまたはその変異体との融合タンパク質、ＩＬ−６Ｒ（好ましくは、可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ））またはその変異体とＩＬ−６またはその変異体との組み合わせ（特表平１０−５０９０４０号）、ｇｐ１３０に対してアゴニストとして作用するｇｐ１３０に対する抗体（Ｇｕ  ＺＪ，Ｖｏｓ  ＪＤ，Ｒｅｂｏｕｉｓｓｏｕ  Ｃ，Ｊｏｕｒｄａｎ  Ｍ，Ｚｈａｎｇ  ＸＧ，Ｒｏｓｓｉ  ＪＦ，Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  Ｊ，Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．，Ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｔｉ−ｇｐ１３０  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｒｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０００  Ｊａｎ；１４（１）：１８８−９７）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、およびカルジオトロピンが挙げられる。
本発明において「ＩＬ−６」とは、４つのヘリックスから構成される全長２１２アミノ酸残基のタンパク質（Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３１（１９８６））を意味する。また本発明において「ＩＬ−６の変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつｇｐ１３０刺激活性を有するＩＬ−６の変異体を意味する。ＩＬ−６については、シグナルペプチドであるＮ末端から２８番目のアラニン残基までが欠失してもｇｐ１３０刺激活性を維持することが知られている（ＷＯ００／０１７３１）。またＩＬ−６の３７番目のリジン残基のＣ末端側がプロテアーゼの消化作用を受けること、および２８番目のアラニン残基から３７番目のリジン残基までの１０アミノ酸残基が欠失してもＩＬ−６活性に支障はないことが知られている（ＷＯ００／０１７３１）。従って、本発明においてはＮ末端が欠失し、かつｇｐ１３０刺激活性を有する改変ＩＬ−６をＩＬ−６変異体として用いてもよい。このようなＩＬ−６変異体としては、２８番目までのＮ末端配列が欠失したＩＬ−６、３７番までのＮ末端配列が欠失したＩＬ−６が挙げられる。
本発明において「ＩＬ−６Ｒ」とは、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域から構成される全長４６８アミノ酸残基のタンパク質（Ｙａｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，ｐ８２５（１９８８））を意味する。また本発明において「ＩＬ−６Ｒの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつｇｐ１３０刺激活性を有するＩＬ−６Ｒの変異体を意味する。ＩＬ−６Ｒについては、細胞外領域中に存在するサイトカインレセプター領域（１１２番目のバリン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までの領域）がＩＬ−６との結合に必要十分であることが知られている（Ｙａｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，ｐ１７０５（１９９３））。従って、本発明においてはＩＬ−６Ｒの１１２番目のバリン残基付近から３３３番目のアラニン残基付近までの領域を含んでなる改変ＩＬ−６ＲをＩＬ−６Ｒ変異体として用いてもよい。
融合タンパク質はＩＬ−６またはその変異体とＩＬ−６Ｒまたはその変異体とを直接あるいはリンカーを介して連結してなるタンパク質である。融合タンパク質は、例えば、ＷＯ００／０１７３１、ＷＯ９９／０２５５２、特表２０００−５０６０１４号、またはＦｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５，ｐ１４２（１９９７）に記載の方法に従って製造できる。
融合タンパク質は、ＩＬ−６Ｒの１１２番のバリン残基から３３３番目のアラニン残基までの断片のＣ末端と、ＩＬ−６の３８番のアスパラギン酸残基から２１２番のメチオニン残基までの断片のＮ末端とを直接連結してなるタンパク質（ＦＰ６）であることができる。この場合、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を宿主において発現可能なように連結したベクターを適当な宿主に導入し、形質転換された宿主を培養し、培養物からＦＰ６を採取することにより融合タンパク質ＦＰ６を製造できる（ＷＯ００／０１７３１参照）。
サイトカイン類
本発明において使用される「サイトカイン類」は、造血幹細胞を増殖させ、造血幹細胞を維持することができる。
このようなサイトカイン類としては、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体およびそれらの誘導体、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）およびその誘導体、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、ＩＬ−３（インターロイキン−３）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、およびＭＩＰ−１α（Ｄａｖａｔｅｌｉｓ，Ｇ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１９３９，１９８８）のような増殖因子；エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような造血ホルモン；ケモカイン、Ｗｎｔ遺伝子産物、およびノッチリガンドのような分化増殖調節因子；発生調節因子；およびこれらの組み合わせが挙げられる。
本発明において「トロンボポエチン（ＴＰＯ）」とは全長３３２アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる、血小板産生を特異的に刺激または増大させる活性を有するタンパク質である（ＷＯ９５／２１９１９）。また本発明において「ＴＰＯの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつ血小板産生を特異的に刺激または増大させるＴＰＯの変異体を意味する。ＴＰＯの変異体としては、例えば、ＷＯ９５／１８８５８、特許第２９９１６４０号、特許第２９９１６３０号、および特許第２９９６７２９号等に記載されているものが挙げられ、好ましくは、アミノ酸残基１番から１６３番までのアミノ酸配列からなるＴＰＯの変異体が挙げられる。
本発明において「ＴＰＯおよびその変異体の誘導体」とは、水溶性ポリマーを連結してなるＴＰＯおよびその変異体を意味する。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、好ましくは平均分子量が約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであるポリエチレングリコール、が挙げられる。ＴＰＯおよびその変異体のポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）は周知の方法に従って実施できる（例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３（２）：４−１０（１９９２）参照）。水溶性ポリマー対ｃ−ｍｐｌリガンドタンパク質のモル比は１：１〜１００：１であることができ、ポリＰＥＧ化の場合には１：１〜２０：１、モノＰＥＧ化の場合には１：１〜５：１であることができる。
本発明において「ｃ−ｍｐｌリガンド」とは、ｍｐｌレセプターに結合可能なペプチド性リガンド、タンパク質性リガンド、および非ペプチド性リガンドを意味する。タンパク質性ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）としては、巨核球の刺激剤としてのアゴニスト抗体（ＷＯ９９／０３４９５、ＷＯ９９／１０４９４）や造血レセプターアゴニストなどの他のタンパク質（ＷＯ９６／２３８８８、ＷＯ９７／１２９７８、ＷＯ９７／１２９８５、ＷＯ９８／１７８１０、ＷＯ９６／３４０１６、ＷＯ００／２４７７０）が挙げられる。ペプチド性ｃ−ｍｐｌリガンドとしては、ＷＯ９６／４０１８９、ＷＯ９６／４０７５０、ＷＯ９８／２５９６５、特開平１０−７２４９２号、ＷＯ９９／４２１２７、ＷＯ００／２４７７０に記載されているものが挙げられる。非ペプチド性ｃ−ｍｐｌリガンドとしては、ベンゾジアゼピン誘導体（特開平１１−１４７７号、特開平１１−１５２２７６号）や他の低分子リガンド（ＷＯ９９／１１２６２、ＷＯ９９／２２７３３、ＷＯ９９／２２７３４、ＷＯ００／３５４４６、ＷＯ００／２８９８７）が挙げられる。
本発明において、好ましいサイトカイン類としては、幹細胞因子（ＳＣＦ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体およびそれらの誘導体；Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）；またはこれらの組み合わせが挙げられる。
本発明において、好ましいサイトカイン類としては、トロンボポエチン（ＴＰＯ）もしくはその変異体またはそれらの誘導体を少なくとも含むものが挙げられる。
ストローマ細胞
本発明において「ストローマ細胞」とは、生体内の造血環境と同等の、あるいは類似した造血環境をインビトロにて提供できる細胞をいい、試験管内で造血細胞と共培養できる細胞であればその由来は問わない。
ストローマ細胞の例としては、ＡＧＭ（Ａｏｒｔａ−Ｇｏｎａｄ−Ｍｅｓｏｎｅｐｈｒｏｓ）領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、線維芽細胞、血管内皮細胞、胎児肝臓由来細胞、および前脂肪細胞が挙げられ、好ましくはＡＧＭ領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞であり、特に好ましくはＡＧＭ領域由来の細胞および間葉系幹細胞である。
人為的に発現を調節できるプロモーターの下流に自殺遺伝子などが挿入された組換えベクターをストローマ細胞に導入し、造血幹細胞と培養後にストローマ細胞だけを死滅させ、移植時にストローマ細胞を除去することも可能である。自殺遺伝子の導入および発現は下記のようにして実施できる。すなわち、自殺遺伝子の発現による手法、より具体的には、ジフテリア毒素の利用（Ｌｉｄｏｒ  ＹＪ，Ｌｅｅ  ＷＥ，Ｎｉｌｓｏｎ  ＪＨ，Ｍａｘｗｅｌｌ  ＩＨ，Ｓｕ  ＬＪ，Ｂｒａｎｄ  Ｅ，Ｇｌｏｄｅ  ＬＭ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  Ａ−ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｏ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９９７  Ｓｅｐ；１７７（３）：５７９−８５．）、ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳｔｋ）の利用（Ｌｉｎｋ  ＣＪ，Ｓｅｒｅｇｉｎａ  Ｔ，Ｔｒａｙｎｏｒ  Ａ，Ｂｕｒｔ  ＲＫ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２０００；５（１）：６８−７４．）、アポプトーシス関連の遺伝子の発現により、自殺遺伝子を発現させることができる。アポプトーシス関連遺伝子としては、デス領域を持つ受容体遺伝子、例えば、Ｆａｓ（Ｉｏｔｈ  Ｎ，Ｃｅｌｌ，６６：２３３−２４３，１９９１），ＴＮＦｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩ（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  Ｈ．，Ｃｅｌｌ  ６１（２）：３５１−３５９，１９９０），Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３（Ｋｉｔｏｓｏｎ  Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８４：３７２−３７５，１９９６），Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４（Ｐａｎ  Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１１−１１３，１９９７）や、上記受容体の信号伝達分子であるＦｌｉｃｅや、信号伝達系に属する蛋白質分解酵素であるＩＣＥ（ＩＬ−１  ｂ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）（Ｃｅｒｒｅｔｔｉ  Ｄ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：９７−１００，１９９２）、さらには、Ｃａｓｐａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ（Ｐａｔｅｌ  Ｔ，ＦＡＳＥＢ．Ｊ．，１０：５８７−５９７，１９９６）、例えばＣＰＰ３２（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ  Ｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３０７６１−３０７６４，１９９４）などが利用できる。また、これらの遺伝子の発現を人為的に制御するには、テトラサイクリンを用いた発現誘導系（Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９２）が利用できる。これらの遺伝子をストローマ細胞株に導入するには、宿主にストローマ細胞株を用いる以外は、通常動物細胞への遺伝子導入に用いられる方法、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５，７９３（１９９４））、単純ヘルペスウイルスベクター等の���イルス由来の動物細胞用ベクターを用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。ストローマ細胞の自殺関連遺伝子を導入する際に、該遺伝子に加えて薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を用いると、目的遺伝子が導入されたストローマ細胞株の選択が容易となる。
培養
本発明によれば、造血幹細胞を増幅する培養系が提供される。培養系の利用により、造血幹細胞の増殖、生存を効率的に維持することが可能となる。
本発明による培養系は、造血幹細胞を含み、さらに他の造血細胞を含むものであってもよい。さらには、造血幹細胞を含む分画であってもよい。すなわち、造血幹細胞を特異的に認識する抗体で臍帯血、末梢血、骨髄などの造血幹細胞を含む組織から造血幹細胞を分離したものを培養することが可能である。赤血球などの各種細胞を特異的に除去する方法はこれまでの血液細胞分画法により実施することが可能である。また、分画せずに培養を行ってもよい。
造血幹細胞を培養するにあたっては、いわゆる培養用のシャーレ、フラスコ、培養バッグを用いた培養が可能であるが、培地組成、ｐＨなどを機械的に制御し、高密度での培養が可能なバイオリアクターによって、その培養系を改善することもできる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：６７６０，１９９１；Ｋｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：３５８，１９９３；Ｋｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｂｌｏｏｄ，８２：３７８，１９９３；Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｂ．Ｏ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：３６８，１９９３）。
ストローマ細胞と造血細胞の共培養は、骨髄を採取したのち、そのまま培養を行うことで可能である。また、骨髄を採取した上でストローマ細胞、造血細胞、その他の細胞群などを分離し、骨髄を採取した個人以外のストローマ細胞、造血細胞の組み合わせで共培養を実施することも可能である。また、ストローマ細胞のみを培養し増殖させた後にサイトカインカクテルと造血細胞を添加し共培養を実施することも可能である。ストローマ細胞を培養する際に、より有効に増殖、生存を支持するために、細胞刺激因子を培養系に添加することができる。このような細胞刺激因子としては、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体およびそれらの誘導体、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）およびその誘導体、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、ＭＩＰ−１α（Ｄａｖａｔｅｌｉｓ，Ｇ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１９３９，１９８８）、などのサイトカインに代表される増殖因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような造血ホルモン、ケモカイン、Ｗｎｔ遺伝子産物、ノッチリガンドのような分化増殖調節因子、発生調節因子などが挙げられる。これらサイトカインはストローマ細胞に産生させてもよい。またサイトカインと同様なシグナルをサイトカイン受容体を介して伝達する物質であれば、これらサイトカインと同様に使用することもできる。
培養に用いる培地としては、造血幹細胞の増殖および生存が害されない限り特に制限されないが、例えばＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ＳＦ−０２培地（三光純薬）、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ＰＲＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、が好ましいものとして挙げられる。培養温度は、通常２５〜３９℃、好ましくは３３〜３９℃である。また、培地に添加する物質としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸が挙げられる。ＣＯ２は、通常４〜６％であり、５％が好ましい。
造血幹細胞は、すべての造血系の分化系列へ分化が可能なので、試験管内で造血幹細胞を増幅後種々の細胞種に分化させ移植することが可能である。例えば、赤血球が必要であれば、患者の幹細胞を培養し増幅した後、ＥＰＯなどの赤血球分化誘導を促進する因子を利用して赤血球を主成分とする造血細胞を人為的に産生することが可能である。
本発明による方法においては造血幹細胞を培養した後、培養物から造血幹細胞を採取する工程を含んでいてもよい。
本発明による方法によって培養した造血幹細胞は、ＥＤＴＡ単独、ＥＤＴＡを含むトリプシン液など細胞分散溶液として使われる物質を利用して培養器から剥離し、人体に投与できる細胞懸濁液とすることができる。
本発明による方法によって培養した造血幹細胞は、造血幹細胞とストローマ細胞を分離して患者に移入することも可能である。更にストローマ細胞と造血幹細胞を同時に移植することも可能である。
本発明による製造法のうち好ましいものとしては、インターロイキン−６（ＩＬ−６）とＩＬ−６受容体のα鎖（ＩＬ−６Ｒ）との融合タンパク質と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、ＡＧＭ領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞から選択されるストローマ細胞と、場合によっては幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦｌｔ−３リガンド（ＦＬ）との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなる製造法が挙げられる。
本発明による培地のうち好ましいものとしては、インターロイキン−６（ＩＬ−６）とＩＬ−６受容体のα鎖（ＩＬ−６Ｒ）との融合タンパク質と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、ＡＧＭ領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞から選択されるストローマ細胞と、場合によっては幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦｌｔ−３リガンド（ＦＬ）とを含んでなる培地が挙げられる。
造血幹細胞の用途
本発明による培養系を用いて培養された造血幹細胞は、従来の骨髄移植や臍帯血移植に代わる血液細胞移植用の移植片として用いることができる。造血幹細胞の移植は、移植片を半永久的に生着させられることから、従来の血液細胞移植治療を改善することができる。
造血幹細胞の移植は、白血病に対する全身Ｘ線放射療法や高度化学療法を行う際に実施できる。例えば、固形癌患者の化学療法、放射線療法等の骨髄抑制が副作用として生じる治療を実施する際に、施術前に骨髄を採取しておき、造血幹細胞を試験管内で増幅し、施術後に患者に戻すことで、副作用による造血系の障害から早期に回復させることができ、より強力な化学療法を行えるようになり、化学療法の治療効果を改善する事ができる。また、本発明により得られる造血幹細胞を各種血液細胞に分化させ、それらを患者の体内に移入することにより、各種血液細胞の低形成により不全な状況を呈している患者の改善を図ることができる。また、再生不良性貧血などの貧血を呈する骨髄低形成に起因する造血不全症を改善することができる。その他、本発明の方法による造血幹細胞の移植が有効な疾患としては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマグロブリン血症、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の免疫不全症候群、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Ｇａｕｃｈｅｒ病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。
造血幹細胞の移植は、用いる細胞以外は、従来行われている骨髄移植や臍帯血移植と同様に行えばよい。
上記のような造血幹細胞移植に用いられる可能性のある造血幹細胞の由来は、骨髄に限られず、前述したような胎児肝臓、胎児骨髄、末梢血、サイトカインおよび／または抗癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、および臍帯血等を用いることができる。
移植片は、本発明の方法によって産生した造血幹細胞の他に、緩衝液等を含む組成物としてもよい。
また、本発明により産生される造血幹細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療に用いることができる。造血幹細胞に対する遺伝子治療は、幹細胞が静止期にあり染色体との組換え率が低いこと、また培養中に幹細胞が分化してしまうこと等から困難であった。本発明を利用することによって、幹細胞を分化させずに増幅でき、遺伝子導入効率を大幅に改善できる。この遺伝子治療は、造血幹細胞に外来遺伝子（治療用遺伝子）を導入し、得られる遺伝子導入細胞を用いて行われる。導入される外来遺伝子は、疾患によって適宜選択される。血液細胞を標的細胞とする遺伝子治療の対象となる疾患としては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマグロブリン血症、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の免疫不全症候群、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Ｇａｕｃｈｅｒ病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。
造血幹細胞に治療用遺伝子を導入するには、通常動物細胞の遺伝子導入に用いられる方法、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶベクターやネコ内在性ウィルスベクターＲＤ１１４（Ｋｅｌｌｙ  ＰＦ，Ｖａｎｄｅｒｇｒｉｆｆ  Ｊ，Ｎａｔｈｗａｎｉ  Ａ，Ｎｉｅｎｈｕｉｓ  ＡＷ，Ｖａｎｉｎ  ＥＦ．，Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｎｏｎｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｆｅｌｉｎｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ（ＲＤ１１４）ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｌｏｏｄ．２０００  Ａｕｇ  １５；９６（４）：１２０６−１４）等のウイルス由来の遺伝子治療に用いられる動物細胞用ベクター（遺伝子治療用ベクターについては、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８９：２３９，１９９７参照）を用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。これらの中では、標的細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれて恒久的に遺伝子の発現が期待できるという点から、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＨＩＶベクターが好ましい。
例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、次のようにして作製することができる。まず、野生型アデノ随伴ウイルスＤＮＡの両端のＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）の間に治療用遺伝子を挿入したベクタープラスミドと、ウイルスタンパク質を補うためのヘルパープラスミドを２９３細胞にトランスフェクションする。続いてヘルパーウイルスのアデノウイルスを感染させると、ＡＡＶベクターを含むウイルス粒子が産生される。あるいは、アデノウイルスの代わりに、ヘルパー機能を担うアデノウイルス遺伝子を発現するプラスミドをトランスフェクションしてもよい。次に、得られるウイルス粒子を造血幹細胞に感染させる。ベクターＤＮＡ中において、目的遺伝子の上流には、適当なプロモーターを挿入し、下流に適当なターミネーターを挿入し、また、エンハンサーを適宜上流あるいは下流に挿入し、これらによって遺伝子の発現を調節することが好ましい。また、サイレンシングを防止するために、インシュレーターを目的遺伝子の上流および下流に連結してもよい。更に、治療用遺伝子が導入された細胞の選択が容易になるように、治療用遺伝子に加えて薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を連結してもよい。治療用遺伝子は、センス遺伝子であってもアンチセンス遺伝子であってもよい。
遺伝子治療用組成物は、本発明による方法によって産生された造血幹細胞の他に、緩衝液や新規の活性物質等を更に含む組成物としてもよい。
更に、本発明による培養系により増幅した造血幹細胞を血液以外の組織に分化する細胞として利用することも可能である。従来、生体に存在する各種組織の幹細胞はその組織の幹細胞としか機能し得ないと考えられてきたが、近年になり、他臓器の幹細胞として機能することが示されてきた。造血幹細胞あるいは造血幹細胞を含む細胞集団が肝臓細胞（Ｌａｇａｓｓｅ  Ｅ，Ｃｏｎｎｏｒｓ  Ｈ，Ａｌ−Ｄｈａｌｉｍｙ  Ｍ，Ｒｅｉｔｓｍａ  Ｍ，Ｄｏｈｓｅ  Ｍ，Ｏｓｂｏｒｎｅ  Ｌ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｆｉｎｅｇｏｌｄ  Ｍ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ，Ｇｒｏｍｐｅ  Ｍ．，Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０００  Ｎｏｖ；６（１１）：１２２９−３４．、［２１２７］ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＨＵＭＡＮ  ＨＥＰＡＴＯＣＹＴＥＳ  ＢＹ  ＨＵＭＡＮ  ＬＩＮ−，ＣＤ３４＋／−ＣＥＬＬＳ  ＩＮ  ＶＩＶＯ．，Ｅｓｍａｉｌ  Ｄ．Ｚａｎｊａｎｉ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄ．Ｐｏｒａｄａ，Ｋｉｒｓｔｅｎ  Ｂ．Ｃｒａｐｎｅｌｌ，Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｔｈｅｉｓｅ，Ｄｉａｎｎｅ  Ｓ．Ｋｒａｕｓｅ，Ｆ．Ｒ．ＭａｃＫｉｎｔｏｓｈ，Ｊｏａｏ  Ｌ．Ａｓｃｅｎｓａｏ，Ｇｒａｃａ  Ａｌｍｅｉｄａ−Ｐｏｒａｄａ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ，ＵＳＡ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｖａｄａ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ，ＵＳＡ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ；Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ．Ｂｌｏｏｄ  ２０００  ９６（１１）；４９４ａ）、骨格筋細胞（Ｇｕｓｓｏｎｉ  Ｅ，Ｓｏｎｅｏｋａ  Ｙ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ  ＣＤ，Ｂｕｚｎｅｙ  ＥＡ，Ｋｈａｎ  ＭＫ，Ｆｌｉｎｔ  ＡＦ，Ｋｕｎｋｅｌ  ＬＭ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ．，Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｓｔｏｒｅｄ  ｂｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９９  Ｓｅｐ  ２３；４０１（６７５１）：３９０−４）、心筋細胞（Ｏｒｌｉｃ  Ｄ，Ｋａｊｓｔｕｒａ  Ｊ，Ｃｈｉｍｅｎｔｉ  Ｓ，Ｊａｋｏｎｉｕｋ  Ｉ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＳＭ，Ｌｉ  Ｂ，Ｐｉｃｋｅｌ  Ｊ，ＭｃＫａｙ  Ｒ，Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ  Ｂ，Ｂｏｄｉｎｅ  ＤＭ，Ｌｅｒｉ  Ａ，Ａｎｖｅｒｓａ  Ｐ．，Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１  Ａｐｒ  ５；４１０：７０１−５）、血管内皮細胞、腸管粘膜細胞（Ｋｒａｕｓｅ  ＤＳ，Ｔｈｅｉｓｅ  ＮＤ，Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ  ＭＩ，Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ  Ｏ，Ｈｗａｎｇ  Ｓ，Ｇａｒｄｎｅｒ  Ｒ，Ｎｅｕｔｚｅｌ  Ｓ，Ｓｈａｒｋｉｓ  ＳＪ．，Ｍｕｌｔｉ−ｏｒｇａｎ，ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．Ｃｅｌｌ．２００１  Ｍａｙ  ��；１０５（３）：３６９−７７）などに分化する能力を有することが示されている。従って本発明による培養法により製造された造血幹細胞を、肝不全、筋ジストロフィー、心筋梗塞などによる心筋の壊死、糖尿病による血管壊死、あるいは腸管膜細胞の壊死から正常な細胞を再生する治療に用いることができる。本発明による培養法により製造された造血幹細胞はまた、神経細胞の再生治療に用いることができる。
実      施      例
実施例１：マウス骨髄からの造血幹細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１  ｐｅｐ（８〜１０週齢、雄）（筑波大学  中内啓光教授より供与）の大腿骨内の骨髄を採取し、ＰＢＳに懸濁した。定法に従い（高津聖志、免疫研究の基礎技術、羊土社、１９９５年）、マウス骨髄単核球細胞画分を比重遠心法により濃縮した後、染色バッファー（５％  ＦＣＳ，０．０５％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ）に懸濁し、Ｏｓａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：２４２−２４５，１９９６に従って以下の方法で造血幹細胞分画を取得した。
ＦＩＴＣ結合ＣＤ３４抗体、フィコエリスリン結合Ｓｃａ−１抗体、アロフィコシアニンｃ−Ｋｉｔ（すべてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、および分化マーカー（Ｌｉｎ）として以下の６種類のビオチン化した分化抗原特異的な抗体、ＣＤ４５Ｒ，ＣＤ４，ＣＤ８，Ｇｒ−１，Ｔｅｒ１１９，ＣＤ１１ｃ（すべてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、骨髄単核球細胞懸濁液に添加し、氷中で２０分間放置し反応させた。染色バッファーで２回洗浄した後に、セルソーター（ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により、ＣＤ３４陰性、かつＳｃａ−１陽性、かつｃ−Ｋｉｔ陽性、かつＬｉｎ陰性の細胞を分取した。
実施例２：サイトカインカクテルとマウス造血幹細胞の液体培養
実施例１に従って調製したマウス造血幹細胞をＵ底９６穴プレートに５０個／ｗｅｌｌで蒔き、培養を行った。培養に用いた培地はエスクロンＳＦ０３（三光純薬社）に０．１％ＢＳＡを添加したものを用いた。サイトカインカクテルとして、マウスＳＣＦ（キリンビール社）、ヒトＩＬ−６（キリンビール社）、マウスＩＬ−１１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ），Ｆｌｔ−３リガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ、あるいは、マウスＳＣＦ（キリンビール社）、ＦＰ６（東ソー社）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）それぞれ５０ｎｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２で７日間培養を行った。７日間の培養後、造血幹細胞／前駆細胞増幅の割合を調べるために、実施例３に示す競合的長期造血再構築アッセイを行った。
実施例３：放射線照射したマウスへの造血細胞移植
実施例２および実施例３にて培養を行った細胞を、２０万個の全骨髄細胞（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２マウス由来、チャールスリバー社）と共に、８．５ＧｙのＸ線を照射したＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２マウス（チャールスリバー社、８週齢、雄）各５匹ずつに尾静脈注より移植した。移植後、経時的に眼窩より末梢血を回収し、ＦＡＣＳによりＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１  ｐｅｐマウス由来の細胞数の割合を算定した。定法に従い（高津聖志、免疫研究の基礎技術、羊土社、１９９５年）、末梢血の解析を行った。末梢血５０μｌに蒸留水を３５０μｌ加え、３０秒間放置し、赤血球を溶血させた後に、２倍濃度のＰＢＳを加えて遠心し、白血球を回収した。細胞を染色バッファー（５％  ＦＣＳ、０．０５％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で１回洗浄した後に、抗ＣＤ１６抗体、ＦＩＴＣ結合抗Ｌｙ５．１（ＣＤ４５．１）抗体、フィコエリスリン結合抗Ｇｒ−１およびＣＤ１１ｃ抗体、およびアロフィコシアニン結合ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）およびＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）抗体（すべて、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社より購入）を添加し、氷中で３０分放置して反応させた。次いで、染色バッファーで洗浄後、ＦＡＣＳ解析を行った。移植後経時的に、末梢血中の、Ｇｒ−１またはＣＤ１１ｃ陽性細胞中（骨髄球系）のＬｙ５．１陽性の割合と、ＣＤ９０またはＣＤ４５Ｒ陽性細胞中（リンパ球系）のＬｙ５．１陽性の割合を、それぞれ算定することにより、造血幹細胞培養期間中の再構築を行うことが可能な細胞数の増減を推定した。
図１に示した通り、サイトカインを添加し培養を行うことで移植後２週間に高いキメリズムを示す短期骨髄再構築能を有する造血前駆細胞を有意に増加させることが可能である。しかし、サイトカイン存在下に培養した細胞のキメリズムは１ヶ月以降急速に低下し、培養をせずに移植した幹細胞のキメリズムよりも低下して来ており、培養期間に造血幹細胞が分化し造血幹細胞の性質である長期再構築能を消失したことがわかる。一方、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＦＬのサイトカインコンビネーションとＳＣＦ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−１１＋ＦＬのサイトカインコンビネーションを比較すると、前者の方が長期に亘りキメリズムを高値に保っている。この結果は、ＦＰ６を用いた培養系では、同様にｇｐ１３０受容体シグナルを伝達するＩＬ−６、ＩＬ−１１を添加した場合と異なる造血細胞の増幅が行われていることがわかる。前者においては移植後３ヶ月においても後者より高いキメリズムが観察され、ＦＰ６を入れたサイトカインコンビネーションはより未分化な造血細胞を増幅することが可能であることを示す。
実施例４：マウスストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９と造血幹細胞の共培養
ＷＯ９９／０３９８０または特開２００１−３７４７１に従ってストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３を調製し、得られたＡＧＭ−Ｓ３をサブクローニングすることにより、ヒト臍帯血由来造血幹細胞に対する支持活性が高いサブクローン、すなわちＢＦＵ−Ｅを増幅あるいは維持する活性が高いサブクローンとしてＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９細胞を得た。ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９細胞（１０％ＦＣＳを含むＭＥＭα培地にて培養）を、１×１０５個ずつ２４ウエルの培養皿に蒔き、１日培養し、細胞が培養皿の底一面を覆うまで増殖させた。その後、ＳＣＦ（キリンビール社）、ＴＰＯ（キリンビール社）（各２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＰ６（東ソー社）（各２０ｎｇ／ｍｌあるいは５０ｎｇ／ｍｌ）を含む１ｍｌの新鮮な培地（１０％  ＦＣＳを含むＭＥＭα培地）に交換し、実施例１で得たマウス造血幹細胞（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１由来）１００個をこれらの細胞上に重層し、培養を開始した。培養７日目に、細胞をトリプシン処理（０．０５％  トリプシン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで３７℃、２〜５分間放置）し、培養皿のストローマ細胞を含むすべての細胞を回収し、培養系の２分の１相当を１匹のマウスに移植した。対照としてサイトカインカクテルのみ（各サイトカイン濃度は２０ｎｇ／ｍｌ）の培養系（１０％  ＦＣＳを含むＭＥＭα培地）を実施例２にしたがい同時に準備し回収した。回収した細胞を用いて、実施例３に示す方法により造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の増殖の状況を解析した（図２）。
ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＰ６のみの液体培養では、実施例３と同様に移植後２週で高いキメリズムは認められるが、移植後２ヶ月にかけてキメリズムは減少する。一方、ストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９とＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＰ６の共培養では、移植後２週においてサイトカインのみの培養条件と同様に高いキメリズムが認められるとともに、移植後２ヶ月を経過してもｉｎｐｕｔを越える高いキメリズムが維持されている。ｉｎｐｕｔのキメリズムを遙かに越えるこのキメリズムの上昇は、ストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９とＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＰ６の共培養終了時に培養開始時の造血幹細胞よりも多くの造血幹細胞が存在していることを示し、造血幹細胞がこの培養系で自己複製し増殖していたことを示す。この結果はＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９ストローマ細胞とＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＰ６の存在下造血幹細胞を培養すると造血前駆細胞だけでなく、造血幹細胞も増幅できることを示す。
実施例５：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）と造血幹細胞との共培養
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（ＣＡＭＢＲＥＸ社、ｃａｔ．＃ＰＴ−２５０１：Ｌｏｔ＃：０Ｆ０５５８、専用培地；ｈＭＳＣ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔにて培養）を、１×１０５個ずつ２４ウエルの培養皿に蒔き、１日培養し、細胞が培養皿の底一面を覆うまで増殖させた。その後、ＳＣＦ（キリンビール社）、ＴＰＯ（キリンビール社）、ＦＰ６（東ソー社）（各２０ｎｇ／ｍｌ）を含む１ｍｌの新鮮な培地（１０％  ＦＣＳを含むＭＥＭα培地）に交換し、実施例１で得たマウス造血幹細胞（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１由来）５０個をこれらの細胞上に重層し、培養を開始した。培養７日目に、細胞をトリプシン処理（０．０５％  トリプシン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで３７℃、２〜５分間放置）し、培養皿のストローマ細胞を含むすべての細胞を回収した。対照としてサイトカインカクテルを添加しないｈＭＳＣとの共培養系を準備し、同時に回収した。回収した細胞を用いて、実施例３に示す方法により造血幹細胞の増殖の状況を解析した（図３）。
ｈＭＳＣのみとの共培養を行った場合キメリズムの上昇は観察されず、造血前駆細胞、造血幹細胞ともに培養期間中に失われていった。一方、ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＰ６のサイトカインカクテル存在下にｈＭＳＣ細胞と造血幹細胞を共培養すると、移植後２週において高いキメリズムが認められると同時に移植後２ヶ月を経過してもｉｎｐｕｔを越える高いキメリズムが維持されている。ｉｎｐｕｔのキメリズムを遙かに越えるこのキメリズムの上昇は、ｈＭＳＣ細胞とＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＰ６の共培養終了時に培養開始時の造血幹細胞よりも多くの造血幹細胞が存在していることを示し、造血幹細胞がこの培養系で自己複製し増殖していたことを示す。この結果はｈＭＳＣ細胞とＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＰ６の存在下造血幹細胞を培養すると造血前駆細胞だけでなく、造血幹細胞も増幅できることを示す。
実施例６：ヒト造血幹細胞および造血前駆細胞の支持活性の評価
（１）ヒト臍帯血ＣＤ３４陽性幹細胞の分離
ヒト臍帯血は、キリンビール医薬探索研究所研究倫理委員会の基準に準拠し、正常分娩時に採取した。臍帯血は凝固しないようにヘパリン（ノボノルディスク社）を添加したシリンジを用いて採取した。ヘパリン処理臍帯血をＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（Ｐｈｒａｍａｃｉａ社）に重層し、比重遠心（４００×Ｇ、室温、３０分間）により単核細胞を分離した。単核細胞に混入した赤血球は、赤血球溶血剤（ＰｈａｒｍＬｙｓｅＴＭ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）で室温５分間処理して溶血させた。１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで単核細胞を洗浄後、ＣＤ３４抗体結合磁性体ビーズ（Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を添加し氷冷下、３０分間放置した。細胞を洗浄後、ＣＤ３４を発現する細胞を磁気カラム（ＭｉｄｉＭＡＣＳ，Ｈｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて分離した。この細胞集団をヒト臍帯血由来造血幹細胞集団とした。
（２）ヒト造血幹細胞とＡＧＭ−Ｓ３サブクローン（ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９）との共培養
前日にＡ９を２×１０５個／ｗｅｌｌ（６ウェル培養皿）（Ｆａｌｃｏｎ社）に播種し、１０％  ＦＣＳを含むＭＥＭα培地１ｍｌで培養し、細胞がウェルの底一面を覆うまで増殖させた。上記ストローマ細胞上にＣＤ３４陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞を１０，０００個／ウェルで重層し、４ｍｌの１０％  ＦＣＳを含むＭＥＭα培地にＦＰ６  ２０ｎｇ／ｍｌ、ヒトＳＣＦ  ２０ｎｇ／ｍｌ、ヒトＴＰＯ（キリンビール社）２０ｎｇ／ｍｌ、およびヒトＦＬ  １００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号３０８−ＦＫ）を含むサイトカインカクテル（ＳＴＦ＋ＦＰ６）を添加し共培養した。増殖活性比較のために、対照群はサイトカインを添加せずＡ９のみの共培養、あるいはＡ９非存在下、１２穴プレートにて２ｍｌの上述のサイトカインカクテルを含む培地にて培養した。共培養開始１週間後に半分の培地を除去し、新たに培地１ｍｌを添加した。共培養開始２週間目にトリプシン処理（０．０５％  トリプシン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）で３７℃、５〜１０分間放置）によりストローマ細胞とヒト血液細胞を同時に培養皿より剥がし、コロニーアッセイに付し造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の増殖を解析した。
（３）コロニーアッセイによる造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況の評価
上記共培養系にて増殖した細胞は、適宜稀釈して１ｍｌメチルセルロース培養系に付し、４連で解析を行なった。また増幅効果を比較するために対照として共培養前のＣＤ３４陽性細胞についても同様のコロニーアッセイを実施した。メチルセルロース培養系は、０．８９％メチルセルロース（信越化学）を含むＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）に１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（和光化学）、０．５μＭ  ２−メルカプトエタノールおよび抗生物質（最終濃度はペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ  ２５０ｎｇ／ｍｌ；Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（×１００），ｌｉｑｕｉｄ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を添加したものにサイトカインとして１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、ヒトＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＴＰＯ、４ＩＵ／ｍｌＥＰＯ（すべてキリンビール社）を添加し、３５ｍｍ培養皿（Ｎｕｎｃ社）にて実施した。上記で用いた各種造血因子は、いずれもリコンビナント体であり、純粋なものである。２週間の培養の後、出現してきたコロニーを顕微鏡下で観察し、ＣＦＵ−ＧＭ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）、ＢＦＵ−Ｅ（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｂｕｒｓｔ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）、ＣＦＵ−Ｅ  ｍｉｘ（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｉｘｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）の数を計測した。
図４にＣＤ３４陽性造血幹細胞とＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９ストローマ細胞存在下、あるいはストローマ細胞非存在下２週間培養後の造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の増幅状況を検討した結果を示す。ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９ストローマ細胞とサイトカインカクテル培地により共培養前に比べＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ  ｍｉｘすべての分化系列細胞の増殖が支持された。また、サイトカイン単独の培養系と比べて、ストローマ細胞が存在することでサイトカインカクテルのみ存在した場合と比較してすべてのコロニーの増幅が確認できた。特に赤血球糸の前駆細胞であるＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ  ｍｉｘを維持することは通常困難であるが、サイトカインカクテル存在下でのストローマ細胞との共培養系ではサイトカイン単独よりもその増殖が認められた。従って、ヒト造血細胞に対してもストローマ細胞存在下にｓＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−６融合タンパクを含むサイトカインカクテルを添加することで造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の増幅を促進することが可能となった。
（４）Ａ９とサイトカインカクテルによる造血幹細胞支持活性におけるＦＰ６の効果
本造血幹細胞増殖培養系におけるＦＰ６の活性について評価した。ＦＰ６を含むサイトカインカクテル（ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬ＋ＦＰ６）あるいはＦＰ６を含まないサイトカインカクテル（ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬ）を添加した場合のＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９共培養系、または非共培養系について、ＣＤ３４陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞に対する幹細胞支持能の比較をＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ  ｍｉｘを指標に、上記（２）および（３）の評価系を用いて実施した。図５に２週間共培養の結果を示す。何れのサイトカインカクテルを用いた場合でもストローマ細胞の存在により、すべてのコロニー形成細胞を増幅させることができた。ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬ＋ＦＰ６とＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬのサイトカインの組み合わせでは、ＦＰ６が存在する方がより多くのコロニー形成細胞の増加が確認された。
これまでにストローマ細胞非存在下にＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬにｓＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−６融合タンパク、あるいはＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬにｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６を添加し培養することでＳＣＩＤ再構築細胞を効率的に増幅させることができる報告がなされている（Ｋｏｌｌｅｔ  Ｏ，Ａｖｉｒａｍ  Ｒ，Ｃｈｅｂａｔｈ  Ｊ，ｂｅｎ−Ｈｕｒ  Ｈ，Ｎａｇｌｅｒ  Ａ，Ｓｈｕｌｔｚ  Ｌ，Ｒｅｖｅｌ  Ｍ，Ｌａｐｉｄｏｔ  Ｔ．，ｓＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−６：Ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＩＬ−６  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４（＋）ＣＤ３８（−／ｌｏｗ）ｃｅｌｌｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍｉｃｅ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９９  Ａｕｇ  １  ９４：３９２３−３１、Ｕｅｄａ  Ｔ，Ｔｓｕｊｉ  Ｋ，Ｙｏｓｈｉｎｏ  Ｈ，Ｅｂｉｈａｒａ  Ｙ，Ｙａｇａｓａｋｉ  Ｈ，Ｈｉｓａｋａｗａ  Ｈ，Ｍｉｔｓｕｉ  Ｔ，Ｍａｎａｂｅ  Ａ，ＴＡｎａｋａ  Ｒ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｋ，Ｉｔｏ  Ｍ，Ｙａｓｕｋａｗａ  Ｋ，Ｎａｋａｈａｔａ  Ｔ．，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｅｒ，Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ，ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＩＬ−６，ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＩＬ−６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００  Ａｐｒ；１０５（７）：１０１３−２１．）が、本実施例ではストローマ細胞を上記サイトカインの組み合わせに加えることでサイトカインカクテル単独をしのぐコロニー形成細胞の増幅が確認された。本実施例の結果はサイトカインカクテル単独に比べてストローマ細胞を培養系に存在させることでよりコロニー形成細胞を増加させることが可能であることを示しておりヒト造血幹細胞が増幅していることを示すものである。
本造血幹細胞培養系におけるＴＰＯの活性について検討した。ＴＰＯを含むサイトカインカクテル（ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬ＋ＦＰ６）あるいはＴＰＯを含まないサイトカインカクテル（ＳＣＦ＋ＦＬ＋ＦＰ６）を添加した場合のＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９共培養系について、ＣＤ３４陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞に対する幹細胞支持能の比較をＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ  ｍｉｘを指標に、上記（２）および（３）の評価系を用いて実施した。図６に結果を示す。ＴＰＯが存在する場合（ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬ＋ＦＰ６）とＴＰＯが存在しない（ＳＣＦ＋ＦＬ＋ＦＰ６）場合とで比較するとＢＦＵ−Ｅで３．８倍、ＣＦＵ−Ｅ  ｍｉｘで３３倍の増幅効果の差が認められた。この結果は、本造血幹細胞培養系に添加すべきサイトカインとしてＴＰＯが選択されることを示す。また、このような検討を行うことで、本培養系に適したサイトカインの選択を行えることを示す。
【図面の簡単な説明】
図１は、サイトカインカクテルの造血幹細胞の増殖に与える影響を、マウス造血幹細胞を移植した個体の末梢血におけるドナー由来血球細胞のキメリズムの経時的な変化により示した図である。「ｉｎｐｕｔ」（□）は、マウス造血幹細胞を採取後直ちに放射線照射マウスに移植した場合を示す。「Ｓ＋ＩＬ６＋ＩＬ１１＋ＦＬ」（黒四角）は、マウス造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−１１＋ＦＬのサイトカイン存在下で培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。「Ｓ＋ＦＰ６＋ＦＬ」（○）は、マウス造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＦＬのサイトカイン存在下で培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。
図２は、サイトカインカクテルの造血幹細胞の増殖に与える影響を、マウス造血幹細胞を移植した個体の末梢血におけるドナー由来血球細胞のキメリズムの経時的な変化により示した図である。「ｉｎｐｕｔ」（×）は、マウス造血幹細胞を採取後直ちに放射線照射マウスに移植した場合を示す。「Ｌｉｑｕｉｄ  ＳＴＦ」（□）は、マウス造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＴＰＯのサイトカインで培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。「Ａ９＋ＳＴＦ」（黒四角および◆）は、マウス造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＴＰＯのサイトカインの存在下、ストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９と共培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。「Ａ９＋ＳＴＦ（２０）」（黒四角）はＦＰ６の濃度が２０ｎｇ／ｍｌの時の結果を示す。「Ａ９＋ＳＴＦ（５０）」（◆）はＦＰ６の濃度が５０ｎｇ／ｍｌの時の結果を示す。
図３は、ヒト間葉系幹細胞およびサイトカインカクテルの造血幹細胞の増殖に与える影響を示した図である。具体的には、マウス造血幹細胞を移植した個体の末梢血におけるドナー由来血球細胞のキメリズムの経時的な変化を示した。「ｉｎｐｕｔ」（×）は、マウス造血幹細胞を採取後直ちに放射線照射マウスに移植した場合を示す。「ＭＳＣ」（○）は、マウス造血幹細胞を採取後、ヒト間葉系幹細肪と共培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。「ＭＳＣ＋ＳＴＦ」（△）は、マウス造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＴＰＯのサイトカインの存在下、ヒト間葉系幹細胞と共培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。
図４は、ストローマ細胞およびサイトカインカクテルの造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖に与える影響を示した図である。「ｉｎｐｕｔ」は、ヒト造血幹細胞を採取後直ちにコロニーアッセイに供した場合を示す。「Ａ」は、ヒト造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＴＰＯ＋ＦＬのサイトカインの存在下、ストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「Ｂ」は、ヒト造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＴＰＯ＋ＦＬのサイトカインの存在下培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「ＢＦＵ−Ｅ」：ＢＦＵ−Ｅ（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｂｕｒｓｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）、「ＣＦＵ−ＧＭ」：ＣＦＵ−ＧＭ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）、「ＣＦＵ−Ｅｍｉｘ」：ＣＦＵ−Ｅｍｉｘ（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｉｘｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）。
図５は、ストローマ細胞およびサイトカインカクテルの造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖に与える影響を示した図である。「ｉｎｐｕｔ」は、ヒト造血幹細胞を採取後直ちにコロニーアッセイに供した場合を示す。「Ａ」は、ヒト造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＴＰＯ＋ＦＬのサイトカインの存在下、ストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「Ｂ」は、ヒト造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬのサイトカインの存在下、ストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「Ｃ」は、ヒト造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＴＰＯ＋ＦＬのサイトカインの存在下に培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「Ｄ」は、ヒト造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＦＬサイトカインの存在下に培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「ＢＦＵ−Ｅ」：ＢＦＵ−Ｅ（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｂｕｒｓｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）、「ＣＦＵ−ＧＭ」：ＣＦＵ−ＧＭ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）、「ＣＦＵ−Ｅｍｉｘ」：ＣＦＵ−Ｅ  ｍｉｘ（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｉｘｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）。
図６は、ストローマ細胞およびサイトカインカクテルの造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖に与える影響を示した図である。「ｉｎｐｕｔ」は、ヒト造血幹細胞を採取後直ちにコロニーアッセイに供した場合を示す。「Ａ」は、ヒト造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＴＰＯ＋ＦＬのサイトカインの存在下、ストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「Ｂ」は、ヒト造血幹細胞を採取後、ＳＣＦ＋ＦＰ６＋ＦＬのサイトカインの存在下、ストローマ細胞ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「ＢＦＵ−Ｅ」：ＢＦＵ−Ｅ（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｂｕｒｓｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）、「ＣＦＵ−ＧＭ」：ＣＦＵ−ＧＭ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）、「ＣＦＵ−Ｅｍｉｘ」：ＣＦＵ−Ｅｍｉｘ（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｉｘｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）。
【図１】
2003014336.tif 000003
【図２】
2003014336.tif 000004
【図３】
2003014336.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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