(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つの単離されたブタサイトカインであって、ブタ幹細胞因子活性と配列識別番号４のアミノ酸１乃至アミノ酸１８０を含むアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とするブタサイトカイン。
【請求項２】
天然源の一つの精製タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のブタサイトカイン。
【請求項３】
一つの組み換えタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のブタサイトカイン。
【請求項４】
他のブタサイトカインの活性化を刺激することを特徴とする請求の範囲第１項記載のブタサイトカイン。
【請求項５】
ブタ骨髄前駆細胞の増殖を優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第１項記載のブタサイトカイン。
【請求項６】
ブタ骨髄造血細胞の増殖を優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第５項記載のブタサイトカイン。
【請求項７】
ブタ骨髄幹細胞の増殖を優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第６項記載のブタサイトカイン。
【請求項８】
ブタ造血幹細胞の増殖を優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第７項記載のブタサイトカイン。
【請求項９】
配列識別番号４で示されるポリペプチド配列を持つことを特徴とする請求の範囲第１項記載のブタサイトカイン。
【請求項１０】
一つの単離されたブタサイトカインであって、配列識別番号１１のポリペプチド配列に少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とするブタサイトカイン。
【請求項１１】
ブタ顆粒細胞およびブタマクロファージを優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第１０項記載のブタサイトカイン。
【請求項１２】
一つの単離されたブタサイトカインであって、配列識別番号２１のポリペプチド配列に少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とするブタサイトカイン。
【請求項１３】
請求の範囲第１項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのＤＮＡ。
【請求項１４】
請求の範囲第５項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのＤＮＡ。
【請求項１５】
請求の範囲第９項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのＤＮＡ。
【請求項１６】
請求の範囲第９項記載のブタサイトカインをコードし、配列識別番号３で示されるＤＮＡ配列を持つことを特徴とする一つのＤＮＡ。
【請求項１７】
請求の範囲第１０項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのＤＮＡ。
【請求項１８】
請求の範囲第１１項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのＤＮＡ。
【請求項１９】
請求の範囲第１１項記載のブタサイトカインをコードし、配列識別番号１０で示されるＤＮＡ配列を持つことを特徴とする一つのＤＮＡ。
【請求項２０】
請求の範囲第１２項記載のブタサイトカインをコードし、配列識別番号２０で示されるＤＮＡ配列を持つことを特徴とする一つのＤＮＡ。
【請求項２１】
請求の範囲第１５項記載のＤＮＡおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
【請求項２２】
請求の範囲第１６項記載のＤＮＡおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
【請求項２３】
請求の範囲第１７項記載のＤＮＡおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
【請求項２４】
請求の範囲第１９項記載のＤＮＡおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
【請求項２５】
請求の範囲第２０項記載のＤＮＡおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
【請求項２６】
請求の範囲第２３項記載の発現ベクターであって、更に少なくとも一つのブタサイトカインのコーディング配列およびその転写調節配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２７】
請求の範囲第１項記載の増量されたサイトカインを発現するために形質移入されることを特徴とするブタ骨髄細胞。
【請求項２８】
請求の範囲第５項記載の増量されたサイトカインを発現するために形質移入されることを特徴とするブタ骨髄細胞。
【請求項２９】
請求の範囲第１０項記載の増量されたサイトカインを発現するために形質移入されることを特徴とするブタ骨髄細胞。
【発明の詳細な説明】
この出願は、１９９２年１０月２７日に提出されたアメリカ合衆国出願番号０７／９６７，１８８を部分継承するものである。
この発明はブタ骨髄およびブタサイトカインを用いてブタ組織あるいは臓器の異種移植を増強する方法に関し、またブタサイトカインおよびそれらを含有する融合タンパク質発現のための組換えＤＮＡ分子に関する。ブタサイトカインは、異種移植において、組織とりわけ骨髄細胞の移植、安定化および増殖の改善に有用である。
発明の背景
臓器の調達は、移植を必要とする患者の数が利用できる臓器の数をはるかに上まわっているため、臓器移植で現在大きな問題の一つを提起している。異種移植はこの問題に解決を提供することが出来る。系統発生学的には、非ヒト霊長類はヒトにもっとも近接する種であり、従って供与体としての最初の選択を表わす。１９６９年、リーツマ他はチンパンジーからの最初の腎臓ヒト異種移植を成功裡に行った（リーツマ，ケイ．他１９６４年、「外科学年報」１６０巻、３８４ページ）。しかし霊長類供給者の潜在的利用は、不十分な数、法律および倫理的配慮および危険なウイルス疫病伝染の可能性により制約を受ける。ブタは数少ない大型動物種の一つでありその飼育特性が遺伝子実験を可能にすると共に、ミニチュアブタの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）同型接合ラインを作ることが出来る。ミニチュアブタは２００乃至３００ポンドの最大成体重量に留めることが出来、解剖学的生理学的にもヒトに近い。従って、ミニチュアブタの臓器は、あらゆる年代のヒトに対する異種移植片として使用することが適切であるように見える。
自己主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原に対する寛容は、胸腺においてＴ細胞成熟の間に発生する（マクダフィー他．「免疫学ジャーナル」１４１巻，１８４０ページ，１９８８年）。個体発生時にＭＨＣ抗原に対し免疫機構を曝すと、免疫機構のこれら抗原に対する反応性を失わせる原因となり、その結果動物が成体生命になっても特異的に寛容のままにしておく（ビリンガム他，１９５３「ネイチャー」１７２巻，６０３ページ）。移植免疫学者はリンパ球造血キメラの生産により、成体動物に寛容を誘導する手段を探究してきた。全身放射線照射（ＷＢＩ）および骨髄移植（ＢＭＴ）により成体マウスにＭＨＣバリアを横断する寛容を誘導する研究が、マウスモデルで広範に行われた（ヘイフィールド他，１９８３，「移植」３６巻、１８３ページ。真弓他、１９８９年、「実験医学ジャーナル」１６９巻、２１３ページ。サイクス他，１９８８年「今日の免疫学」９巻、２３ページ）。
臓器移植に寛容を誘導する手段として、ＭＨＣミスマッチＢＭＴを使用することは、いくつかの重要な不利益につながることがある。つまり予備養生は、その固有のリスクおよび毒性を持つ致死的照射を含む。また臨床適用の可能性はもっとも潜在的な受容体が適切なＭＨＣマッチ供与体を持たず、更にＢＭＴ横断ＭＨＣバリアが重い移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の原因になるという事実により制約される。ＧＶＨＤを予防するため、同種異系骨髄接種材料にあるＴリンパ球を除去（ロット他、１９７１年「ヨーロッパ免疫学ジャーナル」、４巻、２５ページ）すると、それが移植不全の割合増加に関連する（マーチン他、１９８８年「骨髄移植」３巻、４４５ページ。オライリー他．１９８５年「移植処置」１７巻、４５５ページ。ソーダリング他．１９８５年「免疫学ジャーナル」１３５巻、９４１ページ）。これらの欠点が他の致死性悪性疾病の治療には一般に受け入れられてはいるが、それは臓器移植の予備養生としてはＭＨＣミスマッチＢＭＴの適用をきびしく制限することにより、そこでは非特異的免疫抑制薬が主な合併症があっても有効である。
骨髄移植および特異的な移植寛容のための相対的に非毒性非骨髄剥離予備養生の使用が、調和性ラットからマウス種までの組合せに適用された（シャラバイ，ワイ．他、１９９０年「実験医学ジャーナル」１７２巻、１９５−２０２ページ）。この治療は成熟Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４およびＣＤ８）ならびにナチュラルカラー（ＮＫ）細胞（ＮＫ１．１）を除去するためのモノクローナル抗体の投与を含んでいた。これらのモノクローナル抗体は、亜致死線量（３００ラド）のＷＢＩ（全身放射線照射）および局所線量７００ラドの胸腺照射のみを行った後、異種骨髄の移植を可能にした。生成したリンパ球再構成物は、致死性放射線照射で用意され前もって混合された異種キメラによるもの、およびＴ細胞放血同系および異種の骨髄と混合物による再構成物よりも優れており（シャラバイ，ワイ．他．１９９０年「実験医学ジャーナル」１７２巻、１９５−２０２ページ。イルドシュタッド他、１９８４年「ネイチャー」３０７巻、１６８−２０２ページ）、それは受容体が予備養生によって毒性作用をこうむる事がなかったためであった。加えて、ウマ抗ヒト抗胸腺細胞血清グロブリン（ＡＴＧ）のポリクローナル製剤を静脈内に投与することにより、霊長類およびヒトの皮膚同種異系移植片の生存時間を延長する努力がなされた。ＡＴＧは移植と同時に、また移植の直後に注射された（コシミ，エイ．ビー．他、「外科学」６８巻、５４−６１ページ）。
ブタ臓器をヒトに対し異種移植として使用することは、ブタ骨髄を使用するブタ組織に対し寛容を誘導（すなわち移植に対する何らかの免疫応答の発病度を減少、およびもしくは免疫応答を除去）することにより促進されることが認識されてきた。ブタ骨髄細胞（ＢＭＣ）は受容体の骨髄に移植誘導され、そこで移植することが出来る。ここで使用される移植(engraftment）という用語は、ブタＢＭＣ（骨髄細胞）を異種受容体あるいは宿主に組織移植(implantation)あるいは移植(Transplantation）することを意味し、こうしてブタＢＭＣは増殖し、分化し、かつ受容体内で骨髄として機能することを意味する。ブタ骨髄は、ブタ臓器の移植前、臓器移植と同時に、あるいはその両方の場合に誘導される。このような状況において、同じ手術処置の間もしくは術前準備の一部として、同時期あるいは事実上同時期に誘導が意図される。
この発明に従って、ブタ骨髄の移植を促進することがきわめて望ましく、また骨髄移植に効果的であるサイトカインがその効果にきわめて特異的な種であることが発明者により認識された。この発明に従って、ブタ骨髄移植を促進するのに有効なブタサイトカインが、組換え方法などのような方法によりおよび前記および他の用途で使用するのにきわめて望ましいような形で確認され、分離され、特性付けられ、あるいは生産されてはいなかったという欠乏の事実を発明者は認識した。
従って、この発明の他の主要な見地はブタサイトカインであり、これは他の種の骨髄細胞の存在の下でのブタ骨髄細胞、そのＤＮＡ配列およびこれらブタサイトカインの発現のためのＤＮＡ分子の増殖および移植を選択的に増強するものである。より詳細には、この発明はブタキメラ増強因子（「ＣＨＥＦs」）を提供することであり、それはインターロイキン−１（以下「ＣＨＥＦ−１」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下「ＣＨＥＦ−２」）および幹細胞因子（以下「ＣＨＥＦ−３」）並びにこれら新規なブタサイトカイン相互の組合せ、およびそれとブタ白血病形成阻止因子（以下「ブタＬＩＦ」）などのような他のブタサイトカインとの組合せなどのブタ類似体である。この発明のブタサイトカインは、組換え法により発現される自然起点のものから精製されるかもしくは化学的に合成されるかを問わずタンパク質を包含するものと見做される。
以下でより詳細に説明されるように、受容体のブタサイトカインにより選択的に刺激されるブタ骨髄は、Ｂ細胞およびＴ細胞水準で寛容を誘導することにより、組織あるいは臓器移植を受容体に準備させる。望ましくは、骨髄細胞は未熟細胞（例えば未分化造血幹細胞。これらの細胞は投与に先立ち骨髄から分離される）、あるいはそのような細胞を使用出来ることを含む複合骨髄サンプルを含む。
望ましい実施例は、以下のようなものを含む：同一の免疫プロフィルを持つブタは移植される組織あるいは臓器および骨髄の供与体である；受容体哺乳類は霊長類であり、望ましくはヒトである；またブタは部分的あるいは完全に近交系、つまりミニチュアブタである；使用方法の望ましい実施例として、骨髄を誘導するのに先立ち低い線量で照射され、望ましくは１００ラド以上および４００ラド以下の線量で照射される。
図１は実施例１で報告された実験にもとづいて、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）で７日間連続して刺激された末梢血リンパ球を回転濾過した上澄みであるリンパ球馴化培地（ＬＣＭ）を使って、サル、ブタ、およびサル／ブタ細胞の混合比の各種骨髄細胞個体群において、ｍＬＣＭ（サルＬＤＭ），ｐＬＣＭ（ブタＬＤＭ）およびその組合せの誘導体によって生じるコロニー形成の範囲をグラフで説明する。
図２は、ブタ骨髄細胞増殖の線量依存性および例外種特異性をグラフで説明する。トリチウム化チミジン取り込み試験（０−４５，０００ｃｐｍ）が、実施例１で報告された実験において、ＩＭＤＭ培地（イスコーヴス修飾ダルベッコ培地）（％ＣＭ）内のＬＣＭの一連の濃度（Ｖ／Ｖ）にわたり、ブタ、サルおよびヒトＬＣＭを用いて測定された。
図３は、実施例２，３および４で記述されたＣＨＥＦ−３コーディング領域の核酸配列および誘導アミノ酸配列を示す。哺乳類細胞の発現は、最初のメチオニンで開始するが、シグナル・ペプチド分割はアミノ酸２６（太字で示されるグルタミン）で開始する哺乳類細胞から分泌されるタンパク質を生成することが予言されている。
図４は、実施例３に記述されたようにＧＳＴ−ＣＨＥＦ−３融合をコードするプラスミドｐＭＤＲ１０６９を保持する大腸菌溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＩＰＴＧの誘導前のサンプル（プレＰＲＥ）およびＩＰＴＧ誘導５時間後のサンプル（ポストＰＯＳＴ）が（キロダルトンで）表示されたタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導ＧＳＴ−ＣＨＥＦ−３融合たんぱく質は矢印で示される。
図５は、実施例４で記述されるｐＣＨＥＦ−３構築物で形質移入されたコス（ＣＯＳ）細胞からの上澄みにより提供される刺激に対するブタＢＭＣの増殖反応を示す。モック（偽）形質移入細胞からの材料は増殖を刺激しなかった。
図６は、実施例５で記述されるヒトＧＭ−ＣＳＦクローンｈｕＧＭ＃２３からのアンチセンスＲＮＡプローブに対し、低い緊縮応答の下で雑種形成されたブタ末梢血単核細胞から得る全ＲＮＡのノーザンブロットを示す。
図７は、更に実施例５で記述されるブタ骨髄増殖活性に対し、図６で示されるＲＮＡ分析で使用される細胞から採取された馴化培地の検定結果を示す。
図８は、クローン１ＮＣ１−１ＡおよびサブクローンｐＣＨＥＦ−２．ｐｃｄのｃＤＮＡ挿入断片を配列することで決定されるＣＨＥＦ−２のヌクレオチド配列および誘導アミノ酸配列を示す。ｃＤＮＡライブラリーの構築に使用されるリンカーから誘導される配列はアンダーラインを付してある。実施例５および６で記述されるように、哺乳類細胞の発現は最初のＡＴＧ（位置２３，太字）で出発し、典型的な哺乳類シグナル・ペプチド配列を開始し、ＴＡＡ終結コドン（位置４６２，太字）まで続く。
図９は、実施例６で記述されるように、チオレドキシン−ＣＨＥＦ−２融合たんぱく質をコードするプラスミドｐＤＡ１１０を持つ太陽菌溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＩＰＴＧ誘導前（プレＰＲＥ）およびＩＰＴＧ誘導５時間後（ポストＰＯＳＴ  ５ｈ）あるいは誘導１６時間後（ポストＰＯＳＴ  １６ｈ）の各サンプルが（キロダルトンで）示されたタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導されたチオレドキシン−ＣＨＥＦ−２融合タンパク質は矢印で示される。
図１０は、実施例７で記述されるように、ＣＨＥＦ−２発現プラスミドｐＣＨＥＦ−２ＥＸＰ．ｐｃｄ（ｐＧＭ−ＣＳＦ）、あるいはｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐのみ（モックＣＭ）で形質移入されたコス細胞のコス細胞上澄み内でのＧＭ−ＣＳＦ増殖活性の検出を示す。
図１１は、実施例８で記述されるように、ＣＨＥＦ−１のクローニングに対する段階を図式的に示す。分離されたゲノムＤＮＡの制限地図はキロベースのスケールで以下に示される（Ｓ：ＳｆｉＩ；Ｘ：ＸｂａＩ；Ｚ：ＸｈｏＩ）。下部にある線図は、ブタゲノムライブラリーの２個のスクリーニングで分離されたファージを示す。
図１２は、実施例８，９および１０で記述されるように、ｐＣＨＥＦ−１．ｐｃｄ１のヌクレオチド配列および誘導アミノ酸配列を示す。最初のＡＴＧ（太字）は位置２４で出発し、典型的な哺乳類シグナル・ペプチドを開始し位置４５６で始まるＴＡＡ終止コドン（太字）まで続く。アンダーラインを付した配列は、ＰＣＲによりＣＨＥＦ−１  ｃＤＮＡで分離するのに使用するため、ＰＣＲプライマーＩＬＰ−Ｆ（位置１−１５，アンダーライン）およびＩＬＰ−Ｒ（位置７４０−７６０，アンダーライン）を示す。
図１３は、実施例９で記述されるように、ＧＳＴ−ＣＨＥＦ−１融合タンパク質をコードするプラスミドｐＥＸＩＬ−４を持つ大腸菌から準備された溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＩＰＴＧ誘導前のサンプル（プレＰＲＥ）およびＩＰＴＧ誘導３．５時間後のサンプル（ポストＰＯＳＴ）が（キロダルトンで）示されるタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導ＧＳＴ−ＣＨＥＦ−１融合タンパク質は矢印で示される。
実施例１０から得られた結果を図示する図１４は、３日間の生物学的検定でＣＨＥＦ−１を含むコス細胞上澄みに対する増殖反応を示す。細胞活性の約１０倍の増加が０．０７８％線量の馴化培地で検出されたが、ＣＨＥＦ−１を更に増量する線量の増加は観察されなかった。
実施例１０から得られた結果を図示する図１５は、７日間の生物学的検定でＣＨＥＦ−１を含むコス細胞上澄みに対する増殖反応を示す。７日間の増殖から得られた結果は０．０７８％のみの馴化培地で同様の約１０倍の増加を示しているが、ＣＨＥＦ−１，１．２５％以上を含むコス細胞上澄みでＣＨＥＦ−１の線量増加により、約４０倍までの増加が検出された。
図１６−２３は、実施例１１で記述される結果を示している。
図１６は、骨髄細胞増殖検定の結果を図説する。ＬＩＦ（ｎ）あるいはＣＨＥＦ−３およびＬＩＦの組合せ（０）（ＣＨＥＦ，２０％）によるｐＢＭＣの刺激がこの図で図示される。ブタ骨髄細胞の増殖はブタＬＩＦのみの場合に比較して、ＣＨＥＦ−３およびブタＬＩＦの刺激により２−３倍増加する。
図１７は、コロニー形式検定において、ＣＨＥＦ−３およびＬＩＦのユニークな組合せ活性を図示しており、ここでコロニー形成はＬＩＦ単独（ｎ）あるいはＣＨＥＦ−３，１０％（０）もしくはＣＨＥＦ−３，２０％（ｕ）のいずれかとの組合せの存在下で検定される。
図１８および図１９。１週間の培養の後細胞および始原細胞の発育についてのＬＩＦおよび第一次同種異系（ａｌｌｏ−）あるいは異種（ｘｅｎｏ−）間質細胞の効果。ブタ間質細胞（ｎ）あるいは霊長類間質細胞（ｏ）もしくは間質細胞なし（＝）のいずれかの場合で培養７日目の終りにブタ骨髄細胞充実度（図１８）および始原細胞容量（図１９）に対するＬＩＦの効果。この結果は３個別個の実験の平均値である。
図２０および図２１。培養１週間後のＬＩＦ，ＣＨＥＦ−３および第一次異種あるいは同種異系間質細胞のいずれかの細胞充実度に対する効果（図２０Ａおよび図２０Ｂ）、および始原細胞発育に対する効果（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。培養は株立ちされた。この変数はＬＩＦ［５０ｎｇ／ｍｌ］，ＣＨＥＦ−３［コス細胞上澄み２０％］のいずれか、もしくはその双方を組合せたものを標準ＬＴＢＭＣ培地に追加することである。７日を終えた後、２個のウエルのすべての細胞が採取され、細胞数が測定され、細胞の一部分（アリコット）がコロニー形成検定で平板培養された。
図２２Ａ−図２２Ｄ。異種ＬＴＢＭＣにおける細胞および始原細胞発育に対する連続対２週間ＬＩＦ追加の長期比較効果。第一次霊長類間質細胞が前記の通り用意され、またブタＢＭＣ５００，０００個を接種された。細胞は標準ＬＴＢＭＣ培地あるいはＬＩＦ［５０ｎｇ／ｍｌ］で補足された培地のいずれかで平板培養された。２個のウエルのすべての細胞は、培養の発育を実証付けるために週毎の間隔で採取された。パネルＡおよびＢにおいて、細胞充実度に対する連続ＬＩＦ（０）の効果（図２２Ａ）および始原細胞発育に対する連続ＬＩＦの効果（図２２Ｂ）が培地（ｎ）単独のものと比較された。パネルＣおよびＤにおいては、ＬＩＦ（０）は最初の２週間だけ培養が続けられた。２週間後、培地は標準ＬＴＢＭＣ培地で代替された。これは全培養期間の培地のみ［ｎ］のものと比較された。
図２３。異種ＬＴＢＭＣ内での細胞および始原細胞に対する連続ＣＨＥＦ−３あるいはＣＨＥＦ−３＋ＬＩＦの長期効果。ＬＴＢＭＣは株立ちされ、前記の通り設定された。これらの実験において、標準ＬＴＢＭＣ培地の効果がＣＨＥＦ−３（コス細胞上澄み２０％；ｎ）あるいはＣＨＥＦ−３［２０％］およびＬＩＦ［５０ｎｇ／ｍｌ］（０）と比較された。ＬＴＢＭＣの発育についての文献は前記の通りであった。
この発明の主要な見地は、寛容誘導量のブタ骨髄細胞および、そのブタ骨髄細胞の増殖および移植を増強するのに十分な量の少くとも１個のブタサイトカインを受容者に投与することによって、異種受容体、とりわけヒトにおけるブタ移植の寛容を増強することに関する。ブタ骨髄細胞およびサイトカインは、異種受容体にブタ移植を誘導する前、およびもしくはそれと同時に異種受容体に誘導することが出来る。ブタ骨髄細胞は、望ましくは全身に、例えば静脈内に投与される。
ブタサイトカインは、他のブタサイトカインの活性化、ブタ骨髄始原細胞の増殖、ブタ骨髄造血細胞の増殖、骨髄幹細胞（とりわけ造血幹細胞）の増殖、あるいはブタ顆粒球細胞およびマクロファージ細胞の増殖などを選択的に増強するものを選択することが出来る。
これは、受容体に投与する前に、生理的許容液に少なくとも１個のブタサイトカインを含む組成物にブタ骨髄細胞を浸漬することで達成される。更に、ブタサイトカインは例えば静脈内注射あるいは注入で、ブタ骨髄細胞と混合してもしくは別個の医薬製剤として受容体に全身投与することが出来る。別個の製剤として調合された場合には、サイトカインは（前記定義の通り）ブタ骨髄細胞の少し前もしくは殆ど同時に投与される。
も一つの主要な見地において、これはブタサイトカインに関し、このブタサイトカインは他のブタタンパク質が事実上存在せず、他の種の骨髄細胞の存在の下でブタ骨髄細胞の増殖および移植を選択的に増強する。この見地の実施例は、ブタ組織抽出物などのような天然のブタ組織源から分離されたサイトカイン、ブタを起源とする他のタンパク質あるいは高分子から事実上遊離しているような培養細胞および同等のものが含まれる。他の実施例としては、発現システムを形成する原核あるいは真核宿主細胞において発現ベクターを使用するものを含む組換え技術により調製されたサイトカインを含む。発現ベクターは、ブタ細胞あるいは組織抽出物から分離されたｍＲＮＡに相補性であるように調製されたｃＤＮＡの断片であるサイトカインのための構造コーディング配列を含有することが出来る。その他の実施例は、同様のブタサイトカイン骨髄増殖および移植活性を示すような発現システムの融合タンパク質製品を含む。更に別の実施例は、化学的に合成されるようなタンパク質、およびそれと事実上相同であるいずれかのタンパク質あるいその断片を含む。
核酸およびアミノ酸配列両方で引用される「事実上相同」という用語は、主題配列例えば突然変異体配列が１個もしくはそれ以上の置換、欠失あるいは付加により参照配列から変化するが、その正味の効果は参照および主題配列の間で逆作用の非類似性を生じることはないということを意味する。この発明の目的のために、９０パーセント以上の相同性、同等の生物活性、および同等の発現特性を持つ配列は事実上相同であると見做される。相同を定義するために、成熟配列の截断は無視されねばならない。相同の度合の低いもので類似する生物活性、同等の発現特性を持つ配列は、等価物であると見做される。
ここで使用されるある種の追加用語の定義は、これらの用語の境界を考える手引きを提供する。ここで使用される「組換え体」は、タンパク質が組換え体（例えば微生物あるいは哺乳類）発現システムから誘導されることを意味する。「ｒＣＨＥＦ」は、組換えブタサイトカイン・キメラ増強因子を意味する。「微生物」は、微生物あるいは菌類（例えば酵母菌）発現システムを意味する。生成物として、「組換え微生物」は、基本的に天然の内因性物質から遊離し、関連する天然糖鎖形成を伴わないブタタンパク質と定義される。大抵の微生物の培養、例えば大腸菌で発現されるタンパク質は、糖鎖形成修飾から遊離しており、また酵母菌で発現されるタンパク質は、哺乳類細胞で発現されるものとは異なる糖鎖形成パターンを持つであろう。
「ＤＮＡ分接」（ＤＮＡ  segment）は分離断片の形態で、もしくはより大きなＤＮＡ構築物の一成分として、ＤＮＡポリマーに関し、それは事実上精製された形態、すなわち雑菌混入の内因性材質から遊離しており、標準の生化学方法、例えばクローニングベクターを使用する方法などにより断片およびその成分ヌクレオチドの確認、操作および回収を可能とする量および濃度で少なくとも一度は分離されたＤＮＡから誘導されてきた。このような分接は真核遺伝子に典型的に存在するイントロンによって分断されない読み取り枠の形で提供される。非翻訳ＤＮＡ配列は、それがコーディング領域の操作あるいは発現で干渉しない読み取り枠から下流で存在する。「ヌクレオチド配列」はデオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを意味する。一般にこの発明により提供されるタンパク質をコード化するＤＮＡ分接は、ｃＤＮＡ断片および短オリゴヌクレオチドリンカー、あるいは一連のオリゴヌクレオチドから、微生物あるいはウイルスオペロンから誘導される調節要素を含む組換え「転写単位」に発現することのできる合成遺伝子を提供するために組立てられる。
「組換え発現ベクター」は、（１）遺伝子発現、例えばプロモーターあるいはエンハンサーで調節役割を持つ一つの遺伝子要素あるいは要素群、（２）ｍＲＮＡに転写されおよびタンパク質に翻訳される構造あるいはコーディング配列、および（３）適切な転写開始および終結配列、の組立てを含む転写単位よりなるプラスミドあるいはファージを意味する。酵母菌あるいは真核発現システムに使用することを意図する構造単位は、望ましくは宿主細胞により翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。代替的に組換えタンパク質がリーダーあるは輸送配列なしで発現される場合には、それはＮ末端メチオニン残基を含む。この残基は最終製品を提供するために発現組換えタンパク質から分割されることもあるいは分割されない場合もある。
一般に組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製および選択マーカーの起点、例えば「大腸菌」のアンピシリン寛容遺伝子および「麦酒酵母菌」ＴＲＰ１遺伝子、更に下流構造配列の転写を誘導するための高度発現遺伝子から誘導されるプロモーターを含む。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ），ａ−因子，酸性ホスファターゼあるいは、その他のものの中でも熱ショックタンパク質などのような解糖酵素をコード化するオペロンから誘導することが出来る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、および望ましくは翻訳タンパク質の分泌を周辺腔および細胞外培地に向けることの可能なリーダー配列を用いて、適切な相で組立てられる。オプションとしては、異種配列は、望ましい特性、例えば発現された組換え製品の安定化および単純精製を付与するＮ−末端確認ペプチドを含む融合タンパク質をコード化することが出来る。
微生物用途に有用な発現ベクターは、ブタサイトカインをコード化する構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能プロモーターを有する操作可能読み取り相に挿入することで構築される。このベクターは１個もしくはそれ以上の表現型選択マーカーおよび宿主内での増幅を確実にするための複製起点を含むであろう。形質転換のための適切な原核宿主は、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス属、ストレプトミセス属、ぶどう球菌属などの属にある核種の種を含むが、他のものも選択の問題として採用することが出来る。
代表的な例として必ずしもそれに限定されないが、微生物用途のための有用な発現ベクターは、既知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝子要素を含む商業的に利用できるプラスミドから誘導される選択マーカーおよび微生物複製起点を含むことが出来る。このような商業的に利用できるベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（スエーデン，ウプサラ、ファルマチア・ファイン・ケミカルズ）、およびｐＧＥＭ１（アメリカ合衆国、ウイスコンシン州、マディスン，プロメガ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」切片は適切なプロモーターおよび発現さえる構造配列と組合せられる。融合タンパク質の一部としての組換えＣＨＥＦ−３タンパク質をグルタチオン−Ｓ−転移酵素と共に産出するための微生物発現システムの使用に関する追加的な詳細が後記実施例３で提供される。
適切な宿主菌株の形質転換および適切な細胞密度の成長に引き続き、選択されたプロモーターが適切な手段（例えば温度偏位あるいは化学誘導）により抑制解除され、細胞は更に一定期間培養される。細胞は遠心分離により典型的に採取され、物理的化学的方法により分断され、生成する粗抽出液は再に精製されるために保持された。
各種の哺乳類細胞培養システムも組換えタンパク質を発現するために使用することが出来る。哺乳類発現システムの例は、グラズマン「細胞」２３巻、１７５ページ（１９８１年）に記載されたサル腎臓繊維芽細胞のコス−７ライン、および適合性ベクターを発現することのできる他の細胞ライン、例えばＣ１２７，３Ｔ３，ＣＨＯ，ＨｅＬａおよびＢＨＫなどの細胞ラインを含む。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、更にまた必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体および受容体部位、転写終結配列、および５′フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位などから誘導されたＤＮＡ各配列は、必要とされる非転写遺伝子要素を提供するのに使用される。組換えＣＨＥＦタンパク質を生産するための哺乳類高発現ベクターの使用に関し追加的な詳細が実施例で提供される。
微生物培養で生産される組換えタンパク質は通常細胞ペレットからの初期抽出により分離され、次いで１個もしくはそれ以上の塩析、水性イオン交換あるいはサイズ排除クロマトグラフィー段階へと続く。成熟タンパク質の立体配置を完成させるのに必要なため、タンパク質の再ひだ形成段階を使用することが出来る。最後に最終精製段階として、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が使用される。ＣＨＥＦタンパク質の発現に採用される微生物細胞は凍結溶解サイクリング、音波処理、機械的分断、あるいは細胞溶解剤の使用など何らかの便利な方法を使って分断することが出来る。分泌タンパク質としてＣＨＥＦタンパク質を発現する発現システムの使用は精製を大幅に単純化させる。
「組換え発現システム」は、適切な宿主微生物、例えば大腸菌のようなバクテリアあるいは麦酒酵母菌などの酵母菌の事実上相同単一栽培を意味する。これらの宿主微生物は組換え転写単位を染色体ＤＮＡにしっかりと組み込み、あるいはその組換え転写単位をレジデントプラスミドの一成分として保持する。一般にシステムを構成する細胞は、単一祖先型形質転換細胞の後代である。ここで定義される組換え発現システムは、発現されるＤＮＡ分接あるいは合成遺伝子に結合する調節要素の誘導に伴い異種タンパク質を発現する。
成熟ブタサイトカインは、適切なプロモーターの制御の下で哺乳類細胞、酵母菌、バクテリア、あるいはその他の細胞に発現することが出来る。無細胞翻訳システムもまた、この発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡｓを使用してブタサイトカインを生産するのに使用することが出来る。原核および真核宿主を使用する適切なクローニングおよび発現ベクターは、マニエイタス、「分子クローニング：実験マニュアル」（コールドスプリング・ハーバー社、ニューヨーク，１９８５年）に記述されており、その開示内容は参考文献としてここに統合されている。
この見地の望ましい１実施例は、現在確認され分離され、用意されているブタサイトカインキメラ現象強化因子３（ＣＨＥＦ−３）に関する。ＣＨＥＦ−３のタンパク質およびＤＮＡ配列、更にその１個のコーディング配列は添付の図面で示されており、またこれらが確認された方法は実施例で記述される。この見地のＣＨＥＦ−３ブタサイトカインは、ブタ骨髄祖先細胞、より詳細にはブタ骨髄造血細胞、幹細胞および理想的にはブタ造血幹細胞の増殖を選択的に増強する。ここで「ＣＨＥＦ−３」として引用されるブタサイトカインは、配列識別番号４で示されるポリポプチド配列を持つ。
この見地のも一つの望ましい実施例は、ブタサイトカインキメラ現象増強因子（ＣＨＥＦｓ）、とりわけ現在確認され、分離され用意されているＣＨＥＦ−２に関する。ＣＨＥＦ−２のタンパク質およびＤＮＡ配列、更にその一つの可能なコーディング配列は添付図面で示されており、これらが確認された方法は実施例で記述される。この見地のブタサイトカインは、ブタ顆粒球細胞およびマクロファージ細胞の増殖を選択的に増強する。ここで「ＣＨＥＦ−２」として引用されるブタサイトカインは、配列識別番号１１で示されるポリペプチド配列を持つ。
この見地のも一つの望ましい実施例は、ブタサイトカインキメラ現象増強因子（ＣＨＥＦｓ）、とりわけ現在確認され、分離され用意されているＣＨＥＦ−１に関する。ＣＨＥＦ−１のタンパク質およびＤＮＡ配列、更にその１個の可能なコーディング配列が添付図面で示され、それが確認される方法が実施例で記述される。この見地のブタサイトカインは、ブタ顆粒球細胞およびマクロファージ細胞の増殖を選択的に高める。ここで「ＣＨＥＦ−１」として引用されるブタサイトカインは配列識別番号２１として示されるポリペプチド配列を持つ。
この発明のも一つの望ましい見地は、ＣＨＥＦ−３およびもしくはＣＨＥＦ−２およびもしくはＣＨＥＦ−１活性および少なくとも１個の追加タンパク質の活性、とりわけ造血ブタサイトカイン活性を含有する融合タンパク質に関するだけでなく、更に発現促進タンパク質、例えばＣＨＥＦタンパク質の分離のために例えばトロンビンなどにより分割出来る実施例２で示されるグルタチオンＳ転換酵素などのタンパク質に関する。
この発明のも一つの見地は、ＣＨＥＦ−３およびもしくはＣＨＥＦ−２およびもしくＣＨＥＦ−１と、この発明のＣＨＥＦ−３およびもしくはＣＨＥＦ−２およびもしくはＣＨＥＦ−１を除く他のブタ始原タンパク質あるいはブタ天然源高分子から事実上遊離する他のブタサイトカインとの組合せに関する。
も一つの見地において、この発明は、この発明のＣＨＥＦの一つ、例えばＣＨＥＦ−３，ＣＨＥＦ−２あるいはＣＨＥＦ−１と、も一つのブタサイトカイン、望ましくはそれがとりわけ造血分化、および異種ブタ骨髄移植を増強するためそれが共力して相互作用するブタサイトカインの双方を発現することができる一つの発現ベクターを提供する。望ましい実施例はＣＨＥＦ−３あるいはＣＨＥＦ−１とブタ白血病阻止因子（ＬＩＦ）との組合せを含む。
この発明のも一つの見地において、ブタ細胞、とりわけ骨髄および造血細胞の形質導入の効率は、この発明の１個もしくはそれ以上のブタサイトカインと共に誘導されるベクターを含む培地で形質導入が実行される時に著しく増強される。一般に骨髄細胞は、ＣＨＥＦ−１，２０ｎｇ／ｍｌおよびＣＨＥＦ−３，１００ｎｇ／ｍｌ，それに追加サイトカインと共にもしくはそれなしの存在の下で培養される。他の種で行われる形質導入実験から類推して、２００倍までの細胞増殖の増加が期待され、受容体への転移に先立ち幹細胞形質導入および複製の効果が著しく向上した。
この発明のも一つの見地は、この発明のサイトカインの量の上昇を発現するよう修飾された形質移入ブタ細胞あるいは組織を提供する。例えば骨髄間質細胞は、ブタにとってユニークでありかつブタ骨髄の生存および成長に基本的であるタンパク質であるＣＨＥＦ−１を発現するベクターで形質移入あるいは形質導入され得る。修飾された間質細胞は次いで他のブタ骨髄と共に共同移植され移植を改善する。
も一つの見地において、ブタサイトカインは始原生殖細胞および内細胞塊誘導細胞を含む全能性および多能性幹細胞の培養における生存力および維持量を増強する。これらの幹細胞は、必ずしもそれに限定されないが、移植抗原をコード化する遺伝子を含む対象となる遺伝子の発現のための培養で修飾されかつ選択され得る。このような幹細胞は、未分化細胞として培養内で成長するためのブタサイトカインを必要とするが、それは組織移植前段階で発育宿主胚芽と染色体再対合する際に、いずれかの体細胞あるいは胚芽細胞タイプに分化することが出来る。対象となる遺伝子を発現するため修飾された幹細胞からのルートによって創り出されるいくつかの動物は、修飾を保持する生殖体を生産し、修飾を適切に発現するラインを作り出すよう育種することができる。代替的に修飾幹細胞は核転移処理を用いて遺伝子導入動物を作り出すのに使用することが出来、この処理で幹細胞核が不受精除核卵母細胞に誘導され、修飾を保持する遺伝子的に均一な子孫のもとになる。マウス系から類推して、ブタにおいては少なくともいくつかのブタサイトカイン（例えばＣＨＥＦ−３およびＣＨＥＦ−３／ＬＩＦの組合せ）が生殖細胞発育を含む生理機能に役立つことが予測される。マウスでそうであるように、幹細胞因子ＣＨＥＦ−３のブタ相同体は、初期移植後胚胎（発情後期２３−３０日）の生殖隆起から誘導される胚胎生殖細胞の培養に決定的な成分であるかにみえる。ＣＨＥＦ−３は１ｎｇ／ｍｌから１ｕｇ／ｍｌまでの濃度の溶解因子として、あるいは支持細胞の膜結合成分としてこの目的のために提供される。最終結果は、形質あるいはタンパク質製品などのような一つの新規な表現形、すなわち相同受容体の臓器の免疫プロフィルに免疫的により近いものを与える異種移植供与を意図した特定の臓器の修飾免疫プロフィルである新規な表現形を発現するブタの遺伝子導入菌種を生産する能力である。
この発明のブタサイトカインは「誘導化合物」としても有用であり、これは修飾することが出来、あるいは受容体もしくは他の分子との構造／機能相互作用が低分子量の擬態あるいは拮抗質を合成あるいはスクリーンするために研究することが出来る。このような修飾はその標的細胞に対する化合物の活性を増加し、薬理学的半減期を増大し、種の特異性を増強し、あるいは化合物の抗原性を減少させるように設計されたものを含むことができる。
この発明のも一つの主要な見地は、ブタＣＨＥＦサイトカイン、その組合せあるいはそれと他のブタサイトカイン自身と組合せたもの、もしくは完全に分化しているかあるいは始原細胞の拡張された培養としてブタ骨髄あるいは造血細胞と組合せたサイトカインをブタ移植臓器の誘導の前に意図された受容体に誘導することによって、ヒト受容体のような異種移植宿主にブタ臓器の寛容を誘導する方法である。
組織あるいは臓器の異種移植の場合、移植の供与体および寛容誘導骨髄を供給する動物は、望ましくは同一の免疫プロフィルのものである。例えば非常に近交である供与体のコロニーから移植組織を得ることが望ましい。移植組織は肝臓，腎臓，心臓，骨あるいは骨格基質などの身体の部分、皮膚、腸、内分泌腺などの組織、あるいは各種の始原幹細胞などのような臓器よりなる。このような移植で最初に考えられたものは、肝臓、腎臓、心臓あるいは肺などのような固形で、形成され、より高度に機能分化した臓器である。
この発明のも一つの見地は、この発明の１個もしくはそれ以上のブタサイトカイン、あるいは１個もしくはそれ以上のブタサイトカインを含む組成物を、骨髄の回収の前に骨髄供与ブタに投与することによって、ブタ骨髄供与体における骨髄増殖により刺激を与えることである。例えば、移植および寛容の誘導にとっては、一つの改良された移植製品である特異な始原細胞個体群に富む骨髄を採取することが望ましい。この製品は移植および寛容の誘導を増強する。採取された骨髄は、一つの改良された移植製品である骨髄個体群を創り出すために各種のＣＨＥＦｓの存在の下で生体外で培養することか出来る。この製品は移植および寛容の誘導を増強するであろう。
この発明のも一つの見地は、前記細胞をこの発明のブタサイトカインに曝すことを含む異種受容体にあるブタ骨髄細胞の増殖を増強する方法に関する。関連する一つの見地は、組織の移植に先立ちあるいはそれと同時にブタサイトカインあるいはこの発明に従って他の事実上純水なブタサイトカインとの混合物を受容者に誘導することによって、受容体哺乳類にあるブタ骨髄細胞の移植を増強する方法を提供する。投与量の幅および投与ルート、養生、担体、その他は以下で検討される。サイトカインは望ましくは静脈内注射で全身投与される。
受容体に注入された供与体の骨髄細胞（ＢＭＣ）は受容体の適当な部位に向かい、宿主細胞を残しながら引き続き成長し、増殖してキメラリンパ球造血個体群を形成する。この過程により新しく形成されたＢ細胞（およびそれが生産する抗体）は供与体の抗原に曝され、かくして移植が自身として認識されるであろう。供与体に対する寛容もまたＢＭＣ（骨髄細胞）移植が行われた動物内でＴ細胞レベルで観察される。骨髄キメラ現象が誘導された後に臓器移植がそのような受容体に設定される時には、移植片は免疫機構の体液性および細胞性アームにより受容される。この発明に従ってブタサイトカインの使用はブタ骨髄細胞を選択的に刺激して受容体に移植を提供するものとなる。
骨髄細胞を誘導する方法は、とりわけ（１）骨髄の注入と組織の移植の間の時間を増大し、（２）注入するＢＭＣの量を増加もしくは減少させ、（３）ＢＭＣ注入の回数を変化させ、（４）ＢＭＣのデリバリ方法を変え、あるいは（５）ＢＭＣの源を変化させることにより変化する。組織供与体より誘導されるＢＭＣは望ましくはあるが、ＢＭＣは他の個体あるいは種から、もしくは遺伝子工学同系繁殖供与体菌種から、あるいは試験管内細胞培養から得ることが出来る。
この発明のも一つの見地において、新規なブタサイトカインはブタ個体群が罹患しやすい各種の感染や病気の予防あるいは治療に役立つことが認識されている。このような疾患の例は、ブタが回復のための顆粒球活性を特に当てにするもの（アフリカブタ熱など）、あるいは一般化された免疫抑制に導くことの出来るもの（例えばブタコレラ、偽狂犬病、ブタインフルエンザ）などである。
この発明のも一つの主要な見地において、ＣＨＥＦタンパク質、断片あるいは誘導体、もしくはその類似体、あるいはそれらを発現する細胞は、それに対する抗体を生産する免疫原として使用することが出来る。これらの抗体は、例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一連鎖、Ｆａｂ断片、あるいはＦａｂ発現ライブラリーなどである。先行技術の各処理方法はポリクローナル抗体の生産に使用することが出来る。モノクローナル抗体の調製のために、連続細胞ライン培養により生産される抗体を提供する何らかの手法が使用されている。この例はハイブリドーマ（融合雑種腫瘍細胞）手法（ケーラーおよびミルシュタイン，１９７５年，「ネイチュア」２５６巻４９５−４９７ページ）、トリオーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（コズボー他、１９８３年「今日の免疫学」４巻、７２ページ）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するＥＢＶハイブリドーマ手法（コール他、１９８５年「モノクローナル抗体および癌治療」アラン．Ｒ．リス社，７７−９６ページ）である。単一連鎖抗体の生産で記載される手法（アメリカ合衆国特許番号4,946,778）は、ＣＨＥＦ特異的単一連鎖抗体を生産するのに適合することが出来る。これら抗体はこの発明のタンパク質配列の局在化および活性に関連する方法、例えばこれらタンパク質をイメージし、適切な生理的サンプルその他でそのレベルを測定するなどの方法に使用することが出来る。
この発明は、更に薬剤組成物を提供する。このような組成物は治療に有効量のブタサイトカイン、および薬理的に許容出来る担体あるいは賦形剤よりなる。この担体は必ずしもそれに限定されないが、食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、これらを組合せたものを含む。この処方は投与方法に適合すべきものである。
望ましい実施例において、この組成物は人間に対する静脈投与に適した薬理組成物として従来の方法に従って処方される。典型的には、静脈投与のための組成物は無菌等張性水性緩衝液の溶液である。必要な場合には、組成物は注入部位の苦痛を和らげるために更に溶解補助剤および局所麻酔剤を含むこともある。一般にこの成分は、別個に、あるいはユニット処方形態、例えば活性剤の量を示すアンプルあるいはサッシェ（１回袋）のような密封容器での連結乾燥剤あるいは無水濃縮物として供給される。組成物が点滴で投与される場合には、それは無菌薬理標準水あるいは食塩水を含有する点滴ビンで調剤することが出来る。組成物が注射で投与される場合には、注射用水あるいは食塩水のアンプルが用意され、成分は投与の前に混合される。
この発明の治療薬は、中性あるいは塩の形態で処方される。薬理的に許容できる塩は、塩酸、りん酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される遊離アミノ基で形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどで形成される遊離カルボキシル基で形成される塩を含む。
ブタサイトカインの投与方式は必ずしもそれに限定されないが静脈内、筋肉内および皮下のルートである。化合物はいずれかのルート、例えば点滴あるいはボーラス注射により投与され、他の生物学的活性剤と一緒に投与することが出来る。投与は望ましくは全身的であり、例えば個別に静脈内点滴により、あるいはブタ骨髄細胞との組合せ（望ましくは混和物）で全身投与される。
この発明は更にこの発明の薬剤組成物の１個もしくはそれ以上の成分で充填される１個もしくはそれ以上の容器よりなる薬剤パックあるいはキットを提供する。薬剤あるいは生物学的製品の製造、使用あるいは販売を管轄する政府機関により規定された形の通知がこのような容器に添付されており、この通知は人への投与に対し、政府機関による製造、使用あるいは販売に関する許可を表している。
ブタサイトカインは受容体にブタ骨髄の移植を促進するのに有効な量で使用される。一般にこの量は体重キログラム当たり少なくとも５μｇであり、大抵は５００μｇ／ｋｇ以上は必要としない。望ましくはそれは少なくとも２０μｇ／Ｋｇであり、通常は約１００μｇ／Ｋｇを必要としない。サイトカインは少なくとも７日間で投与されるが、一般に３０日を越えることはなく、典型的な治療期間は７日から１４日間である。サイトカインは望ましくは、１日１乃至３回静脈内もしくは皮下に投与され、最適な効力および薬理学的処方に合致するよう調節されることになろう。
以下の実施例は、その範囲に限定することなく、いくつかの見地においてこの発明を説明する。以下に設定される実施例は下記の通りである。
実施例１．ブタサイトカインの造血に特異的な種
実施例２．ブタＣＨＥＦ−３ｃＣＤＮＡ遺伝子の分離および配列化
実施例３．大腸菌から発現されるＧＳＴ−ＣＨＥＦ−３融合タンパク質
実施例４．コス細胞内でのＣＨＥＦ−３の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
実施例５．ブタＣＨＥＦ−２ｃＤＮＡ遺伝子の分離および配列化
実施例６．大腸菌から発現されるチオレドキシン−ＣＨＥＦ−２融合タンパク質
実施例７．コス細胞内でのＣＨＥＦ−２の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
実施例８．ブタＣＨＥＦ−１ｃＤＮＡ遺伝子の分離および配列化
実施例９．大腸菌から発現されるＧＳＴ−ＣＨＥＦ−１融合タンパク質
実施例10．コス細胞内でのＣＨＥＦ−１の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
実施例11．ＣＨＥＦ−３とブタＬＩＦの共働作用組合せ
実施例１．
ブタサイトカインの造血に特異的な種
末梢血末梢血の源：ヒトボランティアが研究の主旨を知らされ、血液提供のため告知同意書（インホームドコンセント）に署名した。動物供与体（ブタおよびマカクザル［マカカ・ファスキュラリス］）より末梢血末梢血の調達は実験動物の取扱いおよび使用のための承認観察記録（プロトコール）にしたがって行われた。
末梢血末梢血単核細胞の分離：末梢血末梢血は静脈穿刺により供与体からヘパリン化ヴァキュテナー▲Ｒ▼管（ニュージャージー州、ラザフォード，ベクトン．ディキンソン）で得られた。末梢血末梢血は等量のリン酸塩緩衝食塩水で希釈され、ヒストパック（比重１．０７７ｇｍ／１，ミズリー州、セントルイス，シグマ）で層にされ、２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離された。低密度単核細胞（ＲＢＭＮＣ）が培地−ヒストパック・インターフェイスで分離され、イスコーヴス修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ，メリーランド州，ゲイザーズバーグ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で２回洗浄された。ＩＭＤＭは胎仔ウシ血清２０％（ＦＢＳ，メモリーランド州、ゲイザーズバーグ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、Ｌ−グルタミン１％（メリーランド州、ゲイザーズバーク，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ），ペニシリン−ストレプトマイシン１％（１０，０００単位／ｍｌの各抗生物質溶液、（メリーランド州、ゲイザーズバーグ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）および２−メルカプトエタノール１×１０-4Ｍ（ミズリー州、セントルイス，シグマ）を含んでいる。
リンパ球馴化培地（ＬＣＭ）の調製：分離ＰＢＭＮＣがイスコーヴス修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ，メリーランラド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で１×１０6/ｍｌの濃度に調節された。ＩＭＤＭは胎仔ウシ血清２０％（ＦＢＳ，メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ），１−グルタミン１％（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＯ  ＢＲＬ）、ペニシリン−ストレプトマイシン１％（１０，０００単位／ｍｌの各抗生物質溶液、メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、および２−メルカプトエタノール１×１０-4Ｍを含んでいた。植物性血球凝集素（ＰＨＡ）（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）がＰＢＭＮＣを含む１ｍｌ／１００ｍｌの濃度の培地で細胞に加えられた。ＰＢＭＮＣ１００ｍｌが組織培養フラスコ（１６２cm2、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、コスター）に置かれ、７日間３７℃、雰囲気炭酸ガス５％の下で保温された。７日目の終わりに、遠心分離（２０００ｒｐｍ，１０分間）により細胞をペレット化して上澄みが採取され、０．２２mmフィルター（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、コスター）を通して無菌濾過された。
骨髄細胞：骨髄はブタあるいはサルの骨から得られた。サルの大腿骨はテキサス霊長類センター（テキサス州、アリス、ヘーゼルトン・リサーチプロタクツ）から購入された。骨は供与体から採取され、一晩湿潤氷の上に置かれ、骨髄細胞は翌日分離された。ブタ骨髄細胞は同じ日に調達されたブタ腎臓供与体の肋骨（マサチューセッツ州、チャールズタウン，マサチューセッツ総合病院、移植生物学研究センター）から分離された。無菌状態の下で、骨はより小さな小片に切断され、骨髄は削られてダルベッコ・リン酸緩衝食塩水（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）の溶液を用いて洗浄された。この食塩水はクエン酸リン酸塩デキストロース溶液１０％（ミズリー州、センルトイス，シグマ）およびゲンタマイシン１００ｍｇ／ｍｌ（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含有する。骨髄細胞（ＢＭＣ）はリン酸緩衝食塩水溶液（前記使用）で数回洗浄され、ＲＰＭＩ−１６４０培地（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で再懸濁された。この培地はＦＢＳ１０％および組織培養フラスコで２×１０6／ｍｌの細胞濃度（７５cm2フラスコ当り１５ｍｌ）でのゲンタマイシンを含有する。ＢＭＣは一晩３７℃，炭酸ガス５％の下で保温され、その後非粘着細胞はフラスコから採取され、ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄された。これらの細胞はクローン原性検定に使用された。
クローン原性検定：サルＢＭＣ対ブタＢＭＣの滴定が続行され、ここでブタおよびサルＢＭＣの集合全体が検定培地の４８，０００−５０，０００細胞／ｍｌの濃度で平板培養された。この研究では４個の組合せが用いられた。サル５０×１０3：ブタ０×１０3，サル３２×１０3：ブタ１６×１０3，サル１６×１０3：ブタ３２×１０3，およびサル０×１０3：ブタ５０×１０3がそれである。加えてコロニー形成の線形性を確実にするために、サルおよびブタＢＭＣは１６および３２×１０3／ｍｌの濃度で個別に平板培養された。これらの検定に使用された培地は、ＦＢＳ３０％、ブタＬＣＭ５％あるいはサルＬＣＭ５％のいずれかもしくは両方のＬＣＭ５％、およびメチルセルメロース１．１５％のＩＭＤＭベースの培地（カナダ，ブリティッシュコロンビア州、バンクーバー，テリーフォックス研究所）であった。対照培養はいずれのＬＣＭ源も持たなかった。培養体は１ｍｌ量で３５mmの平板内で二重に平板培養された（イリノイ州、ネイパービル、ナンク）。培養は７日間、３７℃、炭酸ガス５％で保温され、（細胞数５０個もしくはそれ以上で構成される）コロニーは１個のコロニーとして計数された。
増殖検定：ブタＢＭＣの異なった種からのサイトカインに対する応答を比較するために、増殖検定が行われた。ブタＢＭＣ（２．５×１０４）は、培地２００ｍｌを含有する９６個のウエル「ｕ」底組織培養平板のそれぞれに平板培養された。培地ベースは無血清ＡＩＭ−Ｖ培地（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）であり、これに対しブタ、サルあるいはヒトから得た０，１，３，５，７，あるいは１０％のＬＣＭが加えられた。各ＬＣＭ濃度に対し３回の数値評価が求められたが。培養は６日間３７℃、炭酸ガス５％で保温された。その後トリチウム標識チミジン１ｍＣｉ［3Ｈ−Ｔｄｒ，（イリノイ州、アーリントンハイツ，アマーシャム・コーポレーション）］が加えられ、培養は更に１６時間保温された。培養平板はトムテック−ハーベスター（コネチカット州、オレンジ、トムテック  インコーポレーテッド）を用いて７日目にガラス繊維フィルターの上で採取された。放射性サンプルは、ベータプレート・リーダー（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて決定され、結果は１分間当りの計数で表現された。
サルおよびブタ骨髄の混合物内で、ブタ骨髄細胞に特異な成長の有利性を提供するブタ特異的分子の結果が図１で示される。この培地システムにおいて、ブタ細胞はブタ特異的馴化培地にのみ応答し、サル馴化培地には応答しなかった。サル細胞はブタ馴化培地には応答しなかったが、サル馴化培地の存在の下でも１０％のみの応答が観察された。従って、ブタ細胞の選択的成長がブタ特異的因子を使用して達成された。
ブタ骨髄細胞増殖の用量依存性および例外種特異性も更に図２で示される。ブタ骨髄細胞にトリチウム標識チミジン（Ｔ*）取込みは、ＩＭＤＭ培地（ＣＭ％）においてＬＣＭの一連の濃度（Ｖ／Ｖ）にわたり、ブタ、サルおよびヒトＬＣＭに曝された時に測定された。
実施例２．
ブタＣＨＥＦ−３ｃＤＮＡ遺伝子の分離および配列化
内皮細胞の分離および培養：内皮細胞はライアン他（「組織と細胞」１２巻、６１９−６３５ページ、１９８０年）が記述した通り、ミニチュアブタの大動脈から血管の管腔表面を削って取り出された。細胞は胎仔ウシ血清（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）２０％およびゲンタマイシンを補足したＭ１９９培地で再懸濁され、フィブロネクチン（５μｇ／cm2）およびラミニン（１μｇ／cm2）でプリコートされた２５cm2組織培養フラスコで平板培養された。１５０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長補足物（マサチューセッツ州、ベッドフォード、コラボレィティブ・リサーチ）が培養の最初の時点にのみ加えられた。培養は２−３日毎に半分が取り換え続けられた。継代培養は、単層が密集した時に２分間トリプシンＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）０．２５％で処理されることで進められた。培養は典型的な内皮細胞形態の相同細胞よりなっていた。この細胞はメッセンジャーＲＮＡ分離に使用される前に４回継代培養された。
オリゴタクレオチド：下記のオリゴヌクレオチドが、オリゴス・エトセトラ（オレゴン州ウイルソンビル）から購入された。
１．ｄＬ−１（配列識別番号１）５′−GCGCTGCCTT TCCTTATGAA G.
ｄＬ−１は５′未翻訳領域の１５個のヌクレオチドおよびヒト幹細胞因子のためのシグナルペプチドの最初の２個のコドンを含む５′末端プライマーである（マーチン，Ｆ．Ｈ．他、「細胞」６３巻、２０３−２１１ページ（１９９０年））。
２．ＦＣ−１（配列識別番号２）：５′−TTAGGCTTTC CTATTACTGC TACT.
ＦＣ−１は最初の３個のヌクレオチドが人工の停止コドンよりなり、残る２１個のヌクレオチドがマウスの幹細胞因子の分泌形態のアミノ酸１７３−１７９をコードする配列に相補性である３′末端プライマー（転写配列の逆転補体）である（アンダーソン，ディー．エッチ．他、「細胞」６３巻，２３５−２４３ページ（１９９０年））。
ＲＮＡ分離およびＲＮＡ  ＰＣＲ：ＲＮＡはブタ大動脈内皮細胞からグアニジン・イソチオシアネート４Ｍ内での溶解、および塩化セシウム５．７Ｍを経る超遠心分離により抽出された。ＲＮＡ全体はパーキン−エルマー・シータス（コネチカット州、ノーウォーク）から購入されたＲＮＡ  ＰＣＲキットを使用して逆転写された。アニーリングおよび逆転写酵素拡張条件は、２５℃５分間、３７℃５分間、４２℃２５分間であった。続く増幅はｄＬ−１，５′オリゴヌクレオチドプライマーの追加および９４℃１分間、５０℃１分間、最終拡張７２℃７分間のサイクル条件で行われた。断片はアガロース１％でゲル精製され、pBluscript  ＫＳＩＩ＋（カリフォルニア州、ラホーラ，ストラータジーン）のＥｃｏＲＶ部位に直接サブクローンされ、ｐＣＨＥＦ−３を生成した。
ＣＨＥＦ−３  ｃＤＮＡ遺伝子の配列は、シークエナーゼTMＴ７ポリメラーゼ・キット（オハイオ州、クリーブランド，ユーエス  バイオケミカル）を使用してジデオキシ鎖成長終結法により、ｄＬ−１／ＦＣ−１  ＰＣＲ製品の多重サブクローン配列化により決定された。すべての配列はｐＣＨＥＦ−３の挿入断片部で決定されたものと一致した。
ＤＮＡおよびタンパク質配列の比較がジーンワークス配列分析パッケージ（カリフォルニア州、マウンテンビュー，インテリジェネティクス）および下記の源から得た配列を使用して行われた。
１）ヒト幹細胞因子：マーチン，エフ．エッチ．他、「細胞」６３巻、２０３−２１１ページ（１９９０年）
ジェンバンク・アクセス番号Ｍ５９９６４
２）マウス幹細胞因子：アンダーソン，ディー．エッチ．他、「細胞う」６３巻、２５３−２４３ページ（１９９０年）
ジェンバンク・アクセス番号Ｍ３８４３６
３）ラット幹細胞因子：マーチン，エフ．エッチ．他、「細胞」６３巻、２０３−２１１ページ（１９９０年）
ジェンバンク・アクセス番号Ｍ５９９６６
図３はヌクレオチド（配列識別番号３）を示し、ＣＨＥＦ−３コード領域のアミノ酸（配列識別番号４）を予言した。ｐＣＨＥＦ−３の挿入断片は、ＦＣ−１配列の逆補体（ヌクレオチド６１０−６３３）に結合する真正のブタ配列に（ヌクレオチド２２−６０９）結合するｄＬ−１（ヌクレオチド１−２１）の配列よりなる。哺乳類細胞のタンパク質発現は、ヌクレオチド１−３によりコードされたメチオニンで開始し、ヌクレオチド６１３−６１５でコードされたアラニンで終結する。他の種で得られた幹細胞因子の研究に基づいて、哺乳類細胞は、シグナルポプチド切断による前記のものから誘導されるヌクレオチド７６−７８（太字）によりコードされるグルタミンでタンパク質開始を分泌することが予言される。比較出来る領域において、ヒト、マウスおよびラット種からの幹細胞で、ＣＨＥＦ−３  ｃＤＮＡ遺伝子はそれぞれ９１％，８７％および８６％の核酸相同性を持つ。ブタＣＨＥＦ−３遺伝子における３個のヌクレオチドの挿入断片を除けば、すべて単一ヌクレオチド置換である。アミノ酸レベルでＣＨＥＦ−３はラットおよびヒト幹細胞で８３％類似しており、一方ＣＨＥＦ−３とマウス幹細胞は８０％類似している。
実施例３．
大腸菌から発現されるＧＳＴ−ＣＨＥＦ−３融合タンパク質
この実施例はベクターｐＭＤＲ１０６９（グルタチオン−Ｓ−転移酵素遺伝子融合タンパク質発現ベクター）を構築する方法を記述する。
ＣＨＥＦ−３配列の３′末端での翻訳終結コドンに続き、ＥｃｏＲＩ部位挿入のためｐＣＨＥＦ−３は修飾された。ｐＣＨＥＦ−３はＨｉｎｄＩＩＩで切断され、末端はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（インディアナ州、インディアナポリス，ベーリンガーマンハイム・バイオケミカルズ）を使用して「充填」された。ＥｃｏＲＩリンカー（pCGGAATTCCG［配列識別番号５］マサチューセッツ州、ビバリー，ニューイングランド・バイオラブス・インコーポレーテッド）はＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＣＨＥＦ−３に連結された。大腸菌ＪＭ１０１の形質転換の前に、ＨｉｎｄＩＩＩが再回送されるｐＣＨＥＦ−３を線状化するために結合反応に加えられた。アンピシリン寛容コロニーは６５０塩基対ＥｃｏＲＩ断片の存在下でスクリーンされた。生成するベクターはｐＭＤＲ１０６８として記載される。ｐＭＤＲ１０６８はＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断され、約６５０塩基対断片がＬＭＡ（低融点アガロース）により分離された。
ｐＧＥＸ−２Ｔが０８８５４ニュージャージー州、ピスケータウェイ、ファーマシア・エルケイビー・バイオテクノロジーから購入された。このプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔは日本住血吸虫グルタチオン−Ｓ転移酵素（ＧＳＴ）との融合で遺伝子に高レベルの発現を誘導出来るものとして設計された。融合タンパク質からの２６キロダルトンＧＳＴ領域の切断は、多重クローニング部位からすぐ上流のトロンビンの認識配列の存在により促進される。ｐＧＥＸ−２ＴはＥｃｏＲＩで切断され、脱リン酸化され、ＢａｍＨＩで切断された。４．９キロベースの断片がＬＭＡにより分離された。
オレゴヌクレオチドＣＨＥＯ２およびＣＨＥＯ３が、アプライド・バオイシステムズ・インコーポレーテッド（カリフォルニア州、フォスター市）のオリゴヌクレオチド合成機で合成された。
ＣＨＥＯ２（配列識別番号６）：５′−GATCACAAGG GATCTGCA
ＣＨＥＯ３（配列識別番号７）：５′−GATCCCTTGT
ＤＮＡ断片およびオリゴヌクレオチドは連結され、この連結ミックスは大腸菌ＪＭ１０１を形質転換するために使用された。アンピシリン寛容コロニーは、１５００塩基対ＰｓｔＩ断片の存在の下でスクリーンされた。生成プラスミドはｐＭＤＲ１０６９として記載される。
ＧＳＴ−ＣＨＥＦ−３融合タンパク質のｐＭＤＲ１０６９からの発現：
大腸菌ＪＭ１０１にあるｐＭＤＲ１０６９の単一コロニーは５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むテリフィック肉汁（ＴＢ）で一晩成育された（サンブルック他、「分子クローニング：ラボラトリーマニュアル」コールドスプリング・ハーバー出版）。一晩おいた０．５ｍｌの培養は５０ｍｌのＴＢ＋５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを加えられ、培養が６００ｎｍで測定される最適密度１に達するまで（３５０ｒｐｍで）３７℃ではげしく震動させて成育された。アリコートが誘導前サンプルとして取り出され、次いでイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が１ｍＭの最終濃度のものに加えられた。誘導後１，３，５，および１６時間にアリコートが取り出された。細胞は遠心分離され、タンパク質ゲルの還元緩衝剤で再懸濁され、１０％のポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動による分析の前に１０分間煮沸された。ゲルはクーマシーブルーを使って染色された。プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔを含む細胞は負の対照として分析された。約４６キロダルトンにあるタンパク質帯は、ＧＳＴ−ＣＨＥＦ−３融合タンパク質の誘導を示している。
図４は前記の通り用意された溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析示す。ＩＰＴＧ（プレＰＲＥ）の導入に先立つサンプルおよび続くＩＰＴＧ（ポストＰＯＳＴ）の５時間の誘導は（キロダルトンで）示されたタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導されたＧＳＴ−ＣＨＥＦ−３融合タンパク質は矢印で示される。
実施例４．
コス細胞内でのＣＨＥＦ−３の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
ｐＣＨＥＦ−３ＥＸＰ．ｐｃｄ，ＣＨＥＦ−３タンパク質の分泌形態に対する真核発現ベクターの構築：
ｐＣＨＥＦ−３はＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩでのＣＨＥＦ−３挿入断片に隣接するポリクローニング部位内で切断され、５６０個塩基対断片は低融点アガロース（ＬＭＡ）から分離された。ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐはインヴァイトロゲン・コーポレイション（カリフォルニア州、サンディエゴ）から購入された。ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは真核細胞内の組換えタンパク質の高次元の遷移性発現を促進する。プラスミドはＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断され、子ウシアルカリホスファターゼを用いて脱リンされた。ベクター断片はＬＭＡから精製された。ＤＮＡ断片は結合され、結合ミックスは大腸菌ＪＭ１０１を形質転換するため使用された。アンピシリン寛容コロニーは５７０個塩基対断片の存在下でスクリーンされた。生成プラスミドｐＣＨＥＦ−３ＥＸＰ・ｐｃｄは図３で示されるｐＣＨＥＦ３（配列識別番号３）挿入断片の全配列を含む。
遷移形質移入コス細胞（ＣＯＳ  ｃｅｌｌｓ）からのＣＨＥＦ−３の発現：
コス７細胞はＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル）から得られＤＭＥＭ＋胎仔ウシ血清１０％（ＤＭＥＭ−１０）で成育する。コス７細胞はＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）内でＤＮＡ２ｍｇ／ｍｌおよびリポフェクチン試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）１５ｍｇ／ｍｌを用いて５時間にわたり形質移入され、その後培地はＤＭＥＭ−１０で取り替えられた。細胞は７２時間かけて成長し、上澄み培地は集められ、フィルターされ、ＣＨＥＦ−３の存在下で検定された。
形質移入コス細胞上澄み内でのＣＨＥＦ−３の検出：
ブタＢＭＣはウエル当り２．８×１０4細胞数の濃度で９６個のウエル「ｕ」底組織培養平板で平板培養された。培地基礎は修飾イーグル培地（ＭＥＭ−１９９，メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で、ＦＢＳ１３％を含んでいた。この培地はモック形質移入コス細胞もしくはｐＣＨＥＦ−３ＥＸＰ−ｐｃｄ形質移入コス細胞のどちらかの（１２倍）の上澄みの濃度で５％（Ｖ／Ｖ）に作られた。培養は５日間３７℃で５％炭酸ガスの下で保温された。各ウエルは１マイクロキューリー3Ｈ−Ｔｄｒでパルスされ、更に１６時間追加保温された。培養平板はトムテック・ハーベスター（コネチカット州、オレンジ、トムテック・インコーポレーテッド）を用いてガラス繊維フィルター上に採取された。サンプルの放射性容量はベータプレート・リーダー（メリーランド州、ゲイザーズバーク、ウォーレス・インコーポレーテッド）を用いて決定され、結果は１分当りの計数量で表された。
図５は追加試薬を入れないもの（対照）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐで形質移入された細胞からコス上澄み（モック・コス）あるいは、ｐＣＨＥＦ−３ＥＸＰ．ｐｃｄで形質移入された細胞からの上澄み（ＣＨＥＦコス）のブタ骨髄細胞の増殖反応が前記の通り検定されたことを示すものである。
実施例５．
ブタＣＨＥＦ−２ｃＤＮＡ遺伝子の分離および配列化
末梢血末梢血リンパ球からのＲＮＡ分離：
ヒトボランティアおよびミニチュアブタから末梢血末梢血単核細胞が実施例１で記述された通り分離された。全ＲＮＡはチャーグウィンの方法（「バイオケミストリー」１８巻、５２９４ページ，１９７９年）に従って分離された。ポリＡ＋ＲＮＡは製造業者の指示に従ってポリＵセファデックス・クロマトグラフィ（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて分離された。
ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡ分離：
ヒト末梢血末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）からの全ＲＮＡは、植物性血球凝集素（ＰＨＡ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）の１％の存在下で７２時間保温され、逆転写され、実施例２で示されるようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用された。下記のプライマーが使用された。
１）リバース転写プライマー：ＸＮ−２（配列識別番号１４）５′−TGGTTCCCAG CAGTCAAAGG G．ＸＮ−２はめん羊ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡ遺伝子のヌクレオチド４１６−４３６のリバース補体である（マッキネス，シー．ジェイ．およびヘイグ，ディー．エム．「遺伝子」１０５巻、２７５−２７９ページ（１９９１年）ジェンバンク・アクセス番号Ｚ１８２９１）。
２）フォワードＰＣＲプライマー：ＸＷ３（配列識別番号８），５′−TTGGGCACTG TGGCCTGCAG C．ＸＷ３はヒトＧＭ−ＣＦＳ  ｃＤＮＡ遺伝子のヌクレオチド５７−７７から誘導される（リー，エフ．他「全米科学アカデミー紀要」８２巻、４３６０−４３６８（１９８５年）。ジェンバンク・アクセス番号Ｍ１４７４３）。
３）リバースＰＣＲプライマー：ＸＷ４（配列識別番号９）５′−ACAGGAAGTT TCCGGGGTTG G．ＸＷ４はヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡ遺伝子のヌクレオチド３５１−３７１のリバース補体である（リー，エフ．他「全米科学アカデミー紀要」８２巻、４３６０−４３６８ページ（１９８５年）。ジェンバンク・アクセス番号Ｍ１４７４３）。
生成する３１５塩基対断片は標準の方法を用いてpBluescript ＫＳ＋（カリフォルニア州、ラホーラ，ストラータジーン）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローンされ、プラスミドｐｈｕＧＭ＃２３を創出した。任意に感作されたプローブ（Ｔ７  クイックプライム。ニュージャージー州、ピスケイタウェイ、ファーマシア）が低融合点アガロースゲルから分離されたクローン挿入断片を用いて準備された。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、アンチセンス転写物はリボプローブ転写キット（ウィンスコンシン州、マジスン，プロメガ）を使って形成された。
ブタリンパ球馴化培地およびリンパ球ＲＮＡ：
ブタ（ミニチュアブタ）ＰＢＭＣは基本的に実施例１に記載されたように培養された。細胞は植物性血球凝集素（ＰＨＡ）１％、ＰＨＡおよび１２ミリスチン酸塩１３アセテート・フォルボール（ＰＨＡ＋ＰＭＡ；ミズリー州、セントルイス、シグマ）５ｎｇ／ｍｌ、あるいは試薬を加えないもの（対照）のいずれかで２４時間処理された。第１日（処理の直後）に細胞は洗浄され追加の処理をせずに新しい培地の４個のアリコートに分割された。ＲＮＡは１アリコートの細胞から分離され、対応する馴化培地が第２日−第５日に集められた。
濾過された上澄みは下記に述べる増殖刺激活性の存在下で検定された。ウエル当り２５，０００個の細胞数のブタ骨髄細胞が９６個のウエル組織培養平板に置かれた。各ウエルは培地（イスコーヴズ修飾ダルベッコ培地，胎仔ウシ血清１０％および馴化培地１０％（Ｖ／Ｖ））２００μｌを含んでいた。培養は３重に平板培養され、３７℃７日間保温された。第６日に各ウエルは3Ｈ−Ｔｄｒ（ウエル当り１マイクロキューリー）を含む培地２０μｌでパルスを与えられた。細胞はハーベスター（トムテック）を使って採取され、組み込まれた3Ｈ−Ｔｄｒはベータ平板リーダーを使って検出された。数値は三個のウエルの平均値である。
ＲＮＡは（ティー．マニエイティス編「分子クローニング：ラボラトリーマニュアル」に記載されているアガロース・ホルムアルデヒドゲル上で分画され、製造業者の指示通りナイロン膜質（ジーンスクリーン；デュポン  エヌイーエヌ）に移された。ＲＮＡブロットは５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは塩化ナトリウム０．１５Ｍ，リン酸二水素ナトリウム０．０１Ｍ，ＥＤＴＡ０．００１Ｍ）のヒトＧＭ−ＣＳＦアンチセンスＲＮＡ５×１０5ｃｐｍ／ｍｌ、ホルムアルデビド緩衝液５０％，４２℃で雑種形成され、２×ＳＳＰＥ，ドデシル硫酸ナトリウム０．１％，６２℃で洗浄された。
ｃＤＮＡライブラリー構築およびスクリーニング：
ポリＡ＋ＲＮＡは前記記載のＰＨＡで１６時間処理した後５日目にブタ末梢血単核細胞から分離された。ＥｃｏＲＩアダプターを持つ二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）は、製造業者の指示に従って、タイムセイバーｃＤＮＡ合成キット（ファーマシア）を使用して調製された。ｄｓｃＤＮＡはラムダ置換ベクター１ｇｔ−１０（カリフォルニア州、ラホーラ，ストラータジーン）に結合され、パッケージーン・キット（プロメガ）を用いてパッケージングされた。生成ファージは大腸菌株ＮＭ５１４に増幅された。スクリーニングのために、増幅ファージ１×１０5が菌株ｃ６００Ｈｆｌ（プロメガ）を用いて１５０mm平板で平板培養された。独立クローン３×１０5から増幅されたファージを含む６個の二層フィルターセットは、５×ＳＳＰＥ緩衝液内で５０℃で任意に感作されたｐｈｕＧＭ＃２３プラスミド挿入断片に雑種形成され、２×ＳＳＰＥ緩衝液で５０℃で洗浄された。上述のように最初のスクリーンで推定上実在するものが第二ラウンドのスクリーンにかけられた。上記のものから選択されたクローン１ＮＣ１−１ＡからのＤＮＡは、配列化のため液状溶菌液培養から調製された。
ＣＨＥＦ−２ｃＤＮＡクローンの配列化：
クローン１ＮＣ１−１ＡからのＤＮＡが１ｇｔ−１０フォワードおよびリバース配列化プライマーおよびエフモル（ｆｍｏｌ）配列化キット（プロメガ）を使って挿入断片のいずれかの末端から配列された。他の種からのＧＭ−ＣＳＦ配列に事実上相同であることを確認した後、挿入断片はＮｏｔＩで１ＮＣ１−１Ａから取り除かれ、プラスミドｐｃＤＮＡＩ  Ａｍｐ（カリフォルニア州、サンディエゴ，インヴァイトロゲン）のＮｏｔＩ部位にサブクローンされた。ベクターＣＭＶプロモーターに関して適切な５′−３′配向を持つ１個のクローンはｐＣＨＥＦ−２と呼ばれた。ｐＣＨＥＦ−２・ｐｃｄからの挿入断片は実施例２で記載されるシークエナーゼ配列キット（オハイオ州、クリーブランド、ユーエス・バイオケミカル）を用いて両連鎖で完全に配列された。
ＤＮＡおよびタンパク質配列比較が、ジーンワーク配列分析パッケージ（カリフォルニア州，マウンテンヴュー，インテリジェネティクス）を使って行われ、配列は下記の源からのものが使われた。
１）ヒトＧＭ−ＣＳＦ：リー，エフ．他「全米科学アカデミー紀要」８２巻、４３６０−４３６８（１９８５年）。ジェンバンク・アクセス番号Ｍ１４７４３。
２）マウスＧＭ−ＣＳＦ：宮竹，エス．他。「ＥＭＢＯ  Ｊ。」４巻，２５６１−２５６８頁（１９８５年）。ジェンバンク・アクセス番号Ｋ０１８５０。
３）めん羊ＧＭ−ＣＳＦ  マッキネス，シー．ジェイ．およびヘイグ，ディー．エム．「遺伝子」１０５巻、２７５−２７９ページ（１９９１年）ジェンバンク・アクセス番号Ｚ１８２９１。
４）ウシＧＭ−ＣＳＦ：マリズースキー，シー．アール．他。「分子免疫学」２５巻８４３−８５０ページ（１９８８年）。
図６で示されるように、ブタ末梢血単核細胞からの全ＲＮＡのノーザンブロットは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡクローンｐｈｕＧＭ＃２３からのアンチセンスＲＮＡプローブに対し緊縮の低い状態で雑種形成された。細胞は１６時間ＰＨＡ，あるいはＰＨＡおよびＰＭＡで処理され、洗浄され、次いで処理の開始から２−５日に採取された。約８００ｎｔ（矢印）の相同転写物は４−５日のＰＨＡ処理で誘導される。数多くの構成要素として発現された転写物は低い緊縮条件下でプローブに対し雑種形成する。
図７で示されるように、図６で示されたＲＮＡ分析に使用される細胞から採取された馴化培地は、ブタ骨髄増殖活性を検定された。ヒトＧＭ−ＣＳＦに相同な転写物の誘導に続き、５日目のＰＨＡ処理細胞の培地には著しい活性の増加が見られた。
図８はヌクレオチド配列（配列識別番号１０）およびクローン１１ＮＣ１−１Ａ並びにサブクローンｐＣＨＥＦ−２．ｐｃｄの配列化により決定されたＣＨＥＦ−２  ｃＤＮＡ遺伝子の誘導アミノ酸配列（配列識別番号１１）を示す。哺乳類細胞の発現は、典型的な哺乳類シグナルペプチドを開始する最初のＡＴＧ（位置２３，太字）で出発し、ＴＡＡ終始コドン（位置４５５，太字）まで続く。ヌクレオチド１−７（アンダーライン部）および７８９−７９８（アンダーライン部）は、ｃＤＮＡライブラリー構築で使用されたＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩアダプターから誘導される。コーディング領域内で、ＣＨＥＦ−２は、マウス、めん羊、ヒトおよびウシの各種からのＧＭ−ＣＳＦでそれぞれ７０％，８８％，８１％および８１％の核酸相同性を持つ。シグナルペプチドを含めて、ＣＨＥＦ−２はマウスＧＭ−ＣＳＦの５４％，めん羊ＧＭ−ＣＳＦの８０％，またヒトおよびウシＧＭ−ＣＳＦの７２％のアミノ酸同一性を有する。
実施例６．
大腸菌から発現されるチオレドキシン−ＣＨＥＦ−２融合タンパク質
この実施例はベクターｐＤＡ１１０（チオレドキシ遺伝子融合タンパク質発現ベクター）の構築方法を記述する。
成熟ＣＨＥＦ−２配列の分離：
成熟ＣＨＥＦ−２（図８，ヌクレオチド８１−４６１）に対応する１２７アミノ酸をコードする３８１塩基対は、ＰＣＲ技術を用いてクローンされた。２個のヌクレオチドが遺伝子増幅のために合成された。この配列は、以下に示される。
ＤＡ１４（センスプライマー；配列識別番号１２）：
５′−CGACGGTACC GGCTCCCACC CGCCCACCC
ＤＡ１５（アンチセンスプライマー；配列識別番号１３）；
５′−AGGATCTAGA GGATCCTCAT CACTTTTTGA CTGGCCCCCA
オリゴヌクレオチドは、増幅断片の５′末端が完全ＫｐｎＩ部位（GGTACC）を持ち、また３′末端がＣＨＥＦ２遺伝子の停止コドンの下流に完全ＸｂａＩ部位(TCTAGA)を持つように設計された。ＫｐｎＩ部位はＣＨＥＦ−２断片のチオレドキシン配列に対し枠内連結反応するよう設計された。
クローン１ＮＣ１−ＡはＣＨＥＦ−２  ｃＤＮＡを含有する。このクローンから分離されたＤＮＡは、各ｄＮＴＰ２００μＭ，各プライマー０．５μＭ，塩化マグネシウム１．５ｍＭ，トリス（ｐＨ８．３）１０ｍＭ，塩化カリウム５０ｍＭ，ジメチルスルホキシド８％、およびアンプリタクＤＮＡポリメラーゼ０．２５ユニットを含む反応物５０μｌで増幅された（パーンエルマーＤＮＡサーマルサイクラー・モデル４８０）。反応物は３５サイクルで９４℃で０．５分、５５℃へ１分でランプ、５５℃で０．５分、７２℃へ０．５分でランプ、７２℃で、０．５分、９４℃へ１分でランプの形でサイクルされた。ＰＣＲ製品はポリアクリルアミドゲル１０％で分析された。主要製品帯は約４００塩基対であり、これは４１４塩基対の予想サイズによく合致した。製造業者のプロトコールに続いて、ＤＮＡはマジックＰＣＲプレップス（ウィスコンシン州，マジソン，プロメガ）を使って精製された。全サンプルはまずＫｐｎＩで消化され、次いでＸｂａＩで消化された。ＣＨＥＦ−２を含有するＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片は再びマジックＰＣＲプレップスの使用でより小さい断片（１０塩基対以下）から精製された。
プラスミドｐＴＲＸＦＵＳ（ラヴァリー他「バイオ／テクノロジー」１１巻、１８７−１９３ページ，１９９３年）はジェネティクス・インスティチュート（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から得られた。製造業者の指示に従って、ｐＴＲＸＦＵＳ  ＤＮＡはマジックマキシ・キット（ウィンスコンシン州、マジソン、プロメガ）を使って分離された。ＤＮＡの１アリコート（４μｇ）がまずＫｐｎＩで消化され、次いでＸｂａＩで消化された。両制限酵素がうまく切断されれば２０塩基対以下の断片だけがベクターから除去されるので、ＤＮＡは引き続きアルカリ性ホスファターゼ（子ウシの腸）で処理された。３５８０塩基対ＫｐｎＩ／ＸｂａＩベクター断片は次いでアガロースゲル０．８％で精製された。ベクター断片およびＰＣＲ断片は結合され、受容能大腸菌株ＧＩ６９８（ラヴァリー他，「バイオ／テクノロジー１１巻、１８７−１９３ページ、１９９３年）に形質転換された。推定上のクローンはＨｉｎｃＩＩ制限消化分析によりスクリーンされた。チオレドキシン−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む生成プラスミドはプラスミドｐＤＡ１１０として定義される。
チオレドキシン−ＣＨＥＦ−２の発現：
大腸菌ＧＩ６９８（ｐＤＡ１１０）の単一コロニーはラヴァリー他により記述された通り、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む修飾Ｍ９ＣＡＡ２ｍｌで一晩２３℃で成長した。一晩置かれた培養はアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む新鮮な修飾Ｍ９ＣＡＡ１０ｍｌに（１：５０で）希釈され、また２３℃で２時間成長した。１ｍｌの培養が誘導前サンプルとして除去され、またトリプトファン（最終濃度０．４９ｍＭ）がチオレドキシン−ＣＨＥＦ−２の発現を導入するために加えられた。１８時間後に培養１ｍｌは遠心分離された。誘導前（プレ）および誘導後（ポスト）細胞はＳＤＳ／還元緩衝液で再懸濁され、そのいずれもＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル１２％で分析された。プラスミドｐＴＲＸＦＵＳは発現のための正の対照として使用された。ゲルはクーマシーブルーで染色され、約２７．３キロダルトンで新しいタンパク質帯が誘導後サンプルで観察されたが、誘導前サンプルでは見られなかった。この新しいタンパク質帯のサイズは、チオレドキシン−ＣＨＥＦ−２融合タンパク質の予測されたサイズと合致する。
図９は前記の通り用意された溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＩＰＴＧ誘導前（プレＰＲＥ）およびＩＰＴＧ誘導後５時間（ポストＰＯＳＴ  ５ｈ）あるいは誘導後１６時間（ポストＰＯＳＴ  １６ｈ）の各サンプルは、（キロダルトン）で示されたタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導チオレドキシン−ＣＨＥＦ２融合タンパク質は矢印で示される。
実施例７．
コス細胞内でのＣＨＥＦ−２の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
ｐＣＨＥＦ−２ＥＸＰ．ｐｃｄ，真核発現ベクターの構築：
ｐＣＨＥＦ−２．ｐｃｄはＣＨＥＦ−２挿入領域（図８のヌクレオチド５７４）内のユニークＸｃｍＩ部位で、またＮｏｔＩ挿入部位の下流にあるｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐポリリンカー領域内のユニークＸｈｏＩ部位で消化された。突出末端はクレノウフラグメントで平滑にされ、ＤＮＡはＴ４ＤＮＡリガーゼで再循環された。クローンｐＣＨＥＦ−２ＥＸＰ．ｐｃｄは前記ＤＮＡの大腸菌形質転換細胞から分離され、図８のヌクレオチド５７４までのＣＨＥＦ−２配列３′の欠失によりｐＣＨＥＦ−２とは異なるＤＮＡ配列化により示された。この領域がそれまでの真核ｍＲＮＡ分子の不安定性と関連する配列ＡＴＴＴＡの多くの繰り返しを含んでいるため、この欠失はコス細胞にＣＨＥＦ−２ＲＮＡが高次元で累積することを可能にする。ヌクレオチド４８０はＣＨＥＦ−２の翻訳停止コドンまでの３′であるので、図８に示される予期されるアミノ酸配列の変更はない。
遷移形質移入コス細胞からのＣＨＥＦ−２の発現：
ＣＨＥＦ２は実施例４でＣＨＥＦ−３に対し記述されたように、コス細胞の遷移発現により発現された。
コス細胞上澄み内でのＧＭ−ＳＣＦ増殖活性の検出：
ブタ供与体１０７５８から得たブタ骨髄細胞（ＢＭＣ）は大腿骨から無菌で採取され、リン酸緩衝食塩水溶液で洗浄され、骨粒子を除去するため傾瀉（デカンテーション）された。ＢＭＣは続いて２０４０ｒｐｍのローター速度を使い、密度およびサイズを増加して細胞を溶離させるためのフローレートを５０および７０ｍｌ／ｍｉｎに増大する連続フロー遠心水簸により分離された。これらのフローレートで集められた画分は番号１および２である。画分２が集められた後、ローターおよび液状フローが停止し、チャンバに残っている細胞がペレット化することになった。これがチャンバから採取され、増殖検定に使用される画分３細胞となった。
イスコーヴズ修飾ダルベッコ培地および胎仔ウシ血清１０％内での分画されたブタ骨髄細胞（ウエル当り２５，０００個の細胞数）は９６個のウエル・マイクロタイタ平板に加えられ、これに濃度を増大したコス細胞上澄みが加えられて最終容量が２００μｌ／ウエルになるように調節された。細胞は３７℃で３日間保温され、２日間に細胞は3Ｈ−Ｔｄｒ（ウエル当り１マイクロキューリー）でパルスされ、ウエルはその２４時間後に採取された。計数はベータプレート・リーダーに基づいて測定され、３個のウエルの平均値で表現された。
図１０は、ＣＨＥＦ−２発現プラスミドｐＣＨＥＦ−２ＥＸＰ．ｐｃｄ（ｐＧＭ−ＣＳＦ）あるいはｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐのみ（モック−ＣＭ）により形質移入されたコス細胞のコス細胞上澄みにおけるＧＭ−ＣＳＦ増殖活性の検出を示すものである。
実施例８．
ブタＣＨＥＦ−１ｃＤＮＡ遺伝子の分離および配列化
ブタＩＬ−１（ＣＨＥＦ−１）遺伝子を含むゲノムクローンの分離：
１個のゲノムライブラリーが、ミニチュアブタ（遺伝子型ａ／ａ）末梢血末梢血単核細胞ＤＮＡのＳａｕ  ３ＡＩ部分消化を用いてベクター１ｇｅｍ−１２（ウイスコンシン州、マジソン，プロメガ）に構築された。このライブラリーはＧＭ−ＣＳＦ（図１１．クローン１Ｓ１−２，１Ｓ４−１および１Ｓ４−２）のブタゲノム配列の少なくとも一部を含む３オーバーラップクローンを分離するために、クローンｐＣＨＥＦ−２．ｐｃｄ（実施例５）のｃＤＮＡ挿入断片でスクリーンされた。ＣＨＥＦ−２遺伝子の転写の方向に関連するクローンの配向性は、ＣＨＥＦ−２遺伝子のエキソン１（ＸＮ１；（配列識別番号２４）：５′−AGGATGTGGC TGCAGAACCT G)あるいはエキソン４（Ｃ２Ｘ４；（配列識別番号１５）：ACATCTGCCA TTTCCCCTGC C)に特異的なオレゴヌクレオチドプローブでファージ制限消化物のサザンブロットを雑種形成することにより測定された。ＣＨＥＦ−２遺伝子の上流にある配列（ファージ｜Ｓ４−２からの１．７キロベースＸｂａＩ断片。図１１の座標２３−２５）はゲノムライブラリーを再スクリーンするために使用された。オーバーラップクローンが分離され、制限地図が描かれた。１個のクローン，｜Ｓ１Ｅ−３はＣＨＥＦ−２プロモーターの上流にある６−２２キロベースの配列を含むことが発見された。このクローンはオリゴヌクレオチドプローブＯＬ−２（配列識別番号１６；５′−CTATGGAGGT TCCATGTCAG ATAAAG）を雑種形成し、この配列は、霊長類、めん羊およびげっ歯類のそれぞれの種のプロモーター領域の間で保存される。このクローンは更にオリゴヌクレオチドプローブＩＬＸ５（配列識別番号１７；５′−ATGTTCATTT GTACCTC）に雑種形成し、この発明は同じ種の３′未翻訳領域の間で保存される。ゲノムＤＮＡ配列は同じ２個のプライマーを用いて得られ、この配列は、オリゴヌクレオチドＩＬＰ−Ｆ（配列識別番号１８；５′−AGACAGGATCCATCGTACCG)およびＩＬＰ−Ｒ（配列識別番号１９；５′−CTCATTCAGA AGGAGCAGGC)を設計するために使用され、これらのオリゴヌクレオチドは他の種にあるＩＬ−１遺伝子の転写出発およびポリアデニル化部位に関連するＯＬ−２およびＩＬＸ−５に相同な配列の位置に基づいて、ＣＨＥＦ−１遺伝子の推定上の５′および３′未翻訳領域からの配列を含んでた。
ＣＨＥＦ−１をコードするｃＤＮＡの分離：
プライマーＩＬＰ−ＦおよびＩＬＰ−Ｒは、実施例５で記述されたように調製されたＰＨＡで４日間処理したブタ末梢血末梢血単核細胞からのポリＡ＋ＲＮＡより誘導されるオリゴｄＴ感作ｃＤＮＡから約８００塩基対のＰＣＲ製品を創出するために使用された。この製品は（ＩＬＰ−Ｆ配列内で切断する）ＢａｍＨＩで消化され、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐのＢａｍＨＩ／Ｅｃｏ  ＲＶ部位にクローンされた。１個のクローンはｐＣＨＥＦ−１．ｐｃｄ１と名付けられ配列された。
ＣＨＥＦ−１遺伝子の配列化：
ジデオキシ配列化が、ｃＤＮＡクローンｐＣＨＥＦ−１．ｐｃｄ１から誘導されるＰＣＲおよびＣＨＥＦ−１ゲノム遺伝子（図１１の座標２９−３５）を含む｜Ｓ１Ｅ−３のＥｃｏ  ＲＩサブクローンであるＣ１Ｇ−２のエキソン領域で実施された。ゲノム配列は、すべてのタンパク質コーディングエキソン領域で得られ、またｃＤＮＡ配列はｐＣＨＥＦ−１．ｐｃｄ１挿入断片の全長に沿つて得られた。同時に、この配列は全体としてＣＨＥＦ−１タンパク質コーディング領域の両方の鎖よりなり立っていた。ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列はタンパク質コーディング領域を通じて完全に合致していた。
ＤＮＡおよびタンパク質配列比較がジーンワーク配列分析パパッケージ（カリフォルニア州、マウンテンヴュー，インテリジェネティクス）および下記の源からの配列を用いて行われていた。
１）ヒトＩＬ−１：ヤン，ワイ．−シー．他「細胞」４７巻、３−１０ページ（１９８６年）。ジェンバンク．アクセス番号Ｍ１４７４３。
２）マウスＩＬ−１：ファン，エム．シー．他．「ネイチャー」３０７巻，２３３−２３７（１９８４年）。ジェンバンク−アクセス番号Ｋ０１８５０。
３）めん羊ＩＬ−１：マッキネス，シー．ジェイ．他．未発刊。ジェンバンク・アクセス番号Ｚ１８２９１。
４）テナガザルＩＬ−１：ヤン，ワイ．−シー．他「細胞」４７巻、３−１０ページ（１９８６年）。ジェンバンク．アクセス番号Ｍ１４７４４。
図１１はＣＨＥＦ−１クローニング段階を図で表す。分離されたゲノムＤＮＡの制限地図がキロベースの尺度で下記に示される（Ｓ：ＳｆｉＩ；Ｘ：ＸｂａＩ；Ｚ：ＸｈｏＩ）。底部の線の図形はブタゲノムライブラリーの２回のスクリーニングで分離されたファージを表わす。ＧＭ−ＣＳＦ（ＣＨＥＦ−２）およびＩＬ−１（ＣＨＥＦ−１）オリゴヌクレオチドプローブに雑種形成する領域が示される。
図１２はｐＣＨＥＦ−１．ｐｃｄ１のヌクレオチド配列（配列識別番号２０）および誘導アミノ酸配列（配列識別番号２１）を示す。最初のＡＴＧ（太字）は、ヌクレオチド２４で出発し、典型的な哺乳類シグナルペプチドで開始し、ヌクレオチド４５６（太字）で始まるＴＡＡ終結コドンまで続くオープンリーディングフレーム（読みとり枠）の先頭に立つ。アンダーラインの配列は、ＰＣＲプライマーＩＬＰ−Ｆ（ヌクレオチド１−１５，アンダーライン付き）から誘導され、またＩＬＰ−Ｒのリバース補体（ヌクレオチド７４０−７６０，アンダーライン付き）は、ＣＨＥＦ−１ｃＤＮＡをＰＣＲにより分離するために使用される。遺伝子のコーディング領域の範囲内で、ＣＨＥＦ−１はめん羊、ヒト、マウスおよびテナガザル種のそれぞれの遺伝子に、６６％，４７％，４７％および５２％の核酸相同性を持つ。シグナルペプチドを含めて、ＣＨＥＦ−１はアミノ酸同一性をめん羊では４６％，ヒトは３４％，マウスは２６％，テナガザルＩＬ−１については３３％を持つ。
実施例９．
大腸菌から発現されるＧＳＴ−ＣＨＥＦ−１融合タンパク質
この実施例は大腸菌内の溶解性ＣＨＥＦ−１の発現のためのベクターｐＥＸＩＬ−４の構築方法を記述する。ホン．ハイイーネの方法（「核酸研究」１４巻，４６８３−４６９０．１９８６年）を使用して、推定上のシグナルペプチド切断部位が図１２のＭｅｔ1に先行して決定された。成熟物（哺乳類分泌形態）をコードするＣＨＥＦ−１ｃＤＮＡ遺伝子の一部は３６３ヌクレオチド（図１２−ヌクレオチド９３−４５５）であり、１３．８キロダルトンのタンパク質をコードする。
成熟ＣＨＥＦ−１配列のＰＣＲによる分類：
下記のオリゴヌクレオチドが成熟ＣＨＥＦ−１の３６３オリゴヌクレオチドを増幅するため合成された。
ＦＥ２Ｃｈｆ１：（配列識別番号２２）５′GGGGAATTCA TATGCCTACC ACAACACTC．ＦＥ２Ｃｈｆ１は成熟ＣＨＥＦ−１の最初の１８ヌクレオチド（アンダーライン部のヌクレオチド）を含むセンスＰＣＲプライマーである。Ｍｅｔ1（ＡＴＧ）コドンはＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）内に含まれる。加えてＭｅｔ1の上流部はＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）である。
ＲＥＣｈｆ１：（配列識別番号２３）５′CCCAAGCTTG GATCCTATTA GGGCTCTGTG ATCATGGG．ＲＥＣｈｆ１は縦列停止コドン（ＴＡＡ  ＴＧＡ）および成熟ＣＨＥＦ−１の最後の１８ヌクレオチドを含むアンチセンスＰＣＲプライマーである。停止コドンの下流はＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）部位である。
プライマーＦＥ２Ｃｈｆ１およびＲＥＣｈｆ１は、ｐＣＨＥＦ−１．ｐｃｄ１  ＤＮＡから約３９０塩基対を持ちＰＣＲ製品を創り出し、この製品は真核発現ベクター，ｐＣＮＤＡＩ／ＡＭＰにクローンするＣＨＥＦ−１  ｃＤＮＡを含む。ＤＮＡは、各ｄＮＴＰ２００μＭ，各プライマー０．５μＭ，塩化マグネシウム１．５ｍＭ，トリス（ｐＨ８．３）１０ｍＭ，塩化カリウム５０ｍＭ，ジメチルスルホキシド８％、およびアンプリタックＤＮＡポリメラーゼ０．２５ユニットを含む反応液５０μｌ中で増幅（パーキンエルマーＤＮＡサーマルシリンダーモデル４８０）された。この反応液は３５サイクルに対し０．５分９４℃，１分で５５℃にランプ、０．５分５５℃，０．５分で７２℃にランプ、０．５分７２℃，１分で９４℃にランプしてサイクルされた。
大腸菌内でＣＨＥＦ−１発現のためのｐＥＸＩＬ−４の構築：
ＰＣＲ製品はアガロースゲル１％で分析された。主要帯は約３９０塩基対の予想されたサイズで観察された。反応混合物はフェノール／クロロホルムで注出され、次いでエタノール沈殿された。断片およびプラスミドｐＧＥＸ−ＫＧ（ガンおよびディクソン「分析生化学」１９２巻，２６２−６７ページ、１９９１年）はいずれもＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ついで結合された。受容能大腸菌ＪＭ１０９細胞は連結混合物で形質転換された。正のクローンはＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで制限消化分析により確認された。ＧＳＴ−ＣＨＥＦ−１を含む生成プラスミドはｐＥＸＩＬ−４として表示される。
ＧＳＴ−ＣＨＥＦ−１の発現：
大腸菌ＪＭ１０９の単一コロニー（ｐＥＸＩＬ−４）は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むルリア肉汁（ＬＢ）２ｍｌで３７℃一晩培養された。一晩の培養は、アンピシリンを含む新鮮なＬＢ１０ｍｌで（１：５０）に希釈され、次いで２時間３７℃で成長した。培養物１ｍｌが誘導前サンプルとして取り出され、１ｍＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧが加えられた。３．５時間後、培養液１ｍｌが遠心分離された。誘導前、および誘導後細胞はＳＤＳ／還元緩衝液で再懸濁され両方ともＳＤＳポリアクリルアミドゲル１２％で分析された。プラスミドｐＧＥＸ−ＫＧは発現のための正の対照として使用された。ゲルはクーマシーブルーで染色され、約４０キロダルトンで新しいタンパク質帯が誘導後サンプルで観察されたが誘導前サンプルでは見られなかった。この新しいタンパク質帯のサイズは、ＧＳＴ−ＣＨＥＦ−１融合タンパク質の予想サイズに一致する。
図１３は前記の通り調製された溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＩＰＴＧ誘導前のサンプル（プレＰＲＥ）およびＩＰＴＧ誘導（ポストＰＯＳＴ）３．５時間後（ポストＰＯＳＴ）のサンプルが、（キロダルトンで）表示されるタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導ＧＳＴ−ＣＨＥＦ−１融合タンパク質は矢印で示される。
実施例１０．
コス細胞内でのＣＨＥＦ−１の発現およびブタ骨髄検定を用いる検出
ＣＨＥＦ−１ＥＸＰ．ｐｃｄ，真核発現ベクターの構築：
ｐＣＨＥＦ−１．ｐｃｄ１はＢａｍＨＩ（図１２のヌクレオチド２）およびＨｐａＩ（図１２のヌクレオチド５９３）で完全に消化され、生成する５９２塩基対断片はｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位に再クローンされた。生成した構築物ｐＣＨＥＦ−１ＥＸＰ．ｐｃｄはＣＨＥＦ−１に対するすべてのコーディング配列を含んでいたが、３′未翻訳領域に含まれる不安定配列ＡＴＴＴＡを欠失していた。適切な構築はＤＮＡ配列化により立証された。
遷移性形質移入コス細胞からのＣＨＥＦ−１の発現：
ＣＨＥＦ−１は実施例４でＣＨＥＦ−３について記述されたように、コス細胞の遷移性形質移入によりｐＣＨＥＦ−１ＥＸＰ．ｐｃｄで発現された。
コス細胞上澄みにおけるＣＨＥＦ−１増殖活性の検出：
ｐＣＨＥＦ−１ＥＸＰ．ｐｃｄあるいはｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐで形質移入されたコス細胞上澄みからの生物活性の検出は次のように検定された。ブタ骨髄細胞は、熱不活性化胎仔ウシ血清１０％を含むイスコーヴズ修飾ダルベッコ培地で、９６ウエル「Ｕ」底培養平板のウエル当り１０，０００細胞数の濃度で平板培養された。コス細胞上澄みがこの培地に適切なパーセント（Ｖ／Ｖ）で加えられた。３日間の検定で、培養は２日間保温された3Ｈ−Ｔｄｒ  １マイクロキューリーが加えられ、平板は３日目に採取された。７日間の検定では、培養は６日間保温され、3Ｈ−Ｔｄｒ１マイクロキューリーが加えられ、平板は７日目に採取された。結果は分あたりの計数（ｃｐｍ）であり、３個のウエルの平均値で表わされる。
図１４は３日間の生物学的検定においてＣＨＥＦ−１を含むコス細胞上澄みに対する増殖応答を示す。馴化培地０．０７８％の用量で細胞活性の約１０倍の増加が検出されたが、ＣＨＥＦ−１を更に増量してもそれ以上の増加は見られなかった。
図１５は７日間生物学的検定においてＣＨＥＦ−１を含むコス細胞上澄みに対する増殖応答を示す。７日間増殖からの結果は馴化培地０．０７８％のみで同じような１０倍までの増加を示したが、ＣＨＥＦ−１の用量を増加させると、１．２５％以上のＣＨＥＦ−１含有コス細胞上澄みは、約４０倍までの細胞活性の更なる増加を検出させた。
実施例１１．
ＣＨＥＦ−３とブタＬＩＦとの共働作用組合わせ
ブタ白血病阻止因子（ＬＩＦ）単独の場合と比較したＣＨＥＦ−３とブタＬＩＦとの組合せによる増殖の刺激およびコロニー形成が試験された。７日間の増殖検定におけるブタ骨髄細胞の増殖を刺激するＬＩＦの能力が、０−１００ｎｇ／ｍｌの用量範囲にわたりテストされ、その結果は図１６に示された。２−３倍の増殖が、５０ｎｇ／ｍｌで検出された最適刺激レベルで検出された。ＢＭＣがＣＨＥＦ−３の一定のレベル［コス細胞上澄み２０％］にしてＬＩＦ用量を増加させるように共培養された時には、１００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ用量が４倍以上の細胞増殖を刺激した。これらの結果は、ＬＩＦを単独で使用すると血清を含む増殖で軽い増殖の徴候が見られるが、それをＣＨＥＦ−３と組合せると各因子を加えた効果以上の大きなレベルにまで応答が高められたことを示している。
この観察を更に支援し、実証すると、ＬＩＦおよびＣＨＥＦ−３の組合せは増殖を刺激するだけでなく、コロニー形成検定においてコロニーの形成を刺激することになる。ＢＭＣはＣＨＥＦ−３［コス細胞上澄み１０％および２０％］の存在の下でＬＩＦの用量を増加して培養された。組合せてコロニーを形成するこれら２個の因子の潜在能力は図１７で示される。これらの結果が示す所では、ＬＩＦ単独では小さな刺激活性を有するだけであるが、ＣＨＥＦ−３と組合せると、ＣＨＥＦ−３，１０％が使用されたＬＩＦ用量が１００ｎｇ／ｍｌに増量された場合コロニー数は１１ＣＦＵから５７ＣＦＵに増加した。最大のコロニー数はＣＨＥＦ−３，２０％  ＬＩＦ５０ｎｇ／ｍｌの存在する場合に形成された。これらの結果はＬＩＦおよびＣＨＥＦ−３の組合せがＢＭＣ増殖を相乗強化し、コロニー形成と相関するという増殖検定からの観察を支持するものである。
ブタ骨髄細胞（ＢＭＣ）を霊長類骨髄間質細胞に移植することに関してＬＩＦおよびＬＩＦと組合せたＣＨＥＦ−３の短期の効果もまた研究された。増殖およびコロニー形成研究の結果は、ブタ［同種異系ａｌｌｏ］あるいは霊長類［異種ｘｅｎｏ］骨髄より得た前成間質細胞の一次培養を用いて長期骨髄培養（ＬＴＢＭＣ）で更に展開された。培養１週間後の細胞充実度に対するＬＩＦの作用が図１８で示される。ここでは培地単独で成長した細胞と比較すると、ＬＩＦが存在した場合異種間質細胞に成長するブタＢＭＣの細胞充実度は５０％以上増加した。同じようではあるが、それほど著しくない増加（２４％）が同種異系ＬＴＢＭＣで検出された。前成間質細胞が存在しない培養では、ＬＩＦの存在の下でも細胞充実度は減少した。７日後始原細胞数のほんの少しの増加がＬＩＦの存在下で同種異系ＬＴＢＭＣで検出された（図１９）。対照的に、ＬＩＦで刺激された異種ＬＴＢＭＣは始原細胞数は少し減少した。前成間質細胞のない培養は、始原細胞の成長については明白な効果を示さなかった。
最初の研究は、ＬＩＦと組み合わせたＣＨＥＦ−３が細胞増殖およびコロニー形成を増強したことを確認した。同種異系間質細胞について１週間後（図２０Ｂ）、ＣＨＥＦ−３単独の場合と、ＬＩＦと組合せたＣＨＥＦ−３の存在の下での培養を比較すると、それぞれ２６０，０００細胞数対７４０，０００細胞数と後者で著しい細胞充実度の増加が見られた。しかしＢＭＣが異種間質細胞で成長する場合（図２０Ａ）では、ＣＨＥＦ−３刺激培養とＣＨＥＦ−３＋ＬＩＦ刺激細胞の間の細胞充実度に大きな差異は見られなかった。対照的に、ＣＨＥＦ−３単独での培養で検出されたものと比べてＣＨＥＦ−３プラスＬＩＦで培養された同種異系ＬＴＢＭＣ（図２１Ｂ）および同種異系ＬＴＢＭＣ（図２１Ａ）で検出される始原細胞数がより多かった。更に、同種異系ＬＴＢＭＣからの細胞充実度は同種異系ＬＴＢＭＣで検出されるものの約３３％に過ぎなかった（図１９）としても、ＣＨＥＦ−３プラスＬＩＦの存在下で、異種ＬＴＢＭＣで検出される始原細胞数は同種異系ＬＴＢＭＣで検出される数と略々同じであった。これらの結果は、同種異系あるいは異種ＬＴＢＭＣのいずれかでＣＨＥＦ−３およびＬＩＦの組合せが始原細胞の発育を刺激し、異種骨髄間質細胞の成長を増強するための観察を拡張するというとを実証する。
異種間質細胞における原始骨髄細胞長期保存についてのＬＩＦおよびＣＨＥＦ−３プラスＬＩＦの効果
異種ＬＴＢＭＣにおける始原細胞の細胞充実度および世代ならびに保存に関するＬＩＦの長期の効果が図２２Ａ−２２Ｄで示される。ＬＩＦを７週間異種ＬＴＢＭＣで培養すると、培地対照物で観察されたものより高いレベルの細胞数保存が見られた（図２２Ａ）。培地培養およびＬＩＦ処理培養（図２２Ｂ）の間では始原細胞量に微妙な差異があり、ＬＩＦ処理培養には５週間および７週間でより大きな始原細胞数がみられた。これはＬＩＦが始原細胞の長期保存の持続を促進することを示していた。ＬＩＦの２週経過のものが７週経過のものと比較されたが、細胞充実度への著しい効果は観察されなかった（図２２ｃ）。代りに、培養培地からＬＩＦを除去した後の培養における動態および始原細胞量に著しい変化が見られた（図２２Ｄ）。始原細胞数はＬＩＦによる連続処理（図２２Ｂ）と比較して、３週間を通じて増加し、このレベルを５週間通じて維持した。これらの結果は原始細胞が始原細胞に成育あるいは応答することを制約する調節特性を持つことを示している。
ＣＨＥＦ−３およびＬＩＦの組合せの下で成育する異種ＬＴＢＭＣは、ＣＨＥＦ−３単独で処理されるＬＴＢＭＣで観察されたものよりも７週間の細胞および始原細胞生産量がより大きいものであった。これらの結果が示す著しい特徴は、ＣＨＥＦ−３＋ＬＩＦで刺激された培養で２週間および３週間経た後に、細胞数および始原細胞数がより高い数を示したことであった。４週目の細胞充実度および始原細胞量は減少したが、続く７週には、細胞充実度は、着実に増加し始原細胞は劇的に反騰した。これらの結果は、このＬＩＦプラスＣＨＥＦ−３の組合せの２個の価値ある局面を確認することになる。第一のものは細胞および始原細胞を増強する能力であり、第二は異種間質環境における長期移植を有利にすることである。この後者の解釈は、培養７週後に細胞充実度および始原細胞量の顕著な回復で支持される。ＣＨＥＦ−３＋ＬＩＦ培養で７週で見出される細胞は顆粒細胞系列の芽細胞および未熟細胞であり、これは増殖活性を示すものであったが、一方他の培養情報から得られた細胞は末端培養に特徴的な主としてマクロファージであった。
図１６．ブタＢＭＣの増殖に対するＬＩＦおよびＬＩＦプラスＣＨＥＦ−３の効果。ブタＢＭＣは、ウエル当たり１０，０００細胞数の濃度で、（ウエル当たり全量２００ｕｌの）胎仔ウシ血清［ＦＢＳ］１０％を含むイスコーヴス培地を入れた９６個のウエル円底組織培養平板で平板培養された。一組のウエルに対し、ＬＩＦが０−１００ｎｇ／ｍｌ（ｎ）の一連の希釈液に加えられた。第二組のウエルに対しては、培地はＣＨＥＦ−３を含むコス細胞上澄み２０％で作られ、ＬＩＦ希釈液が加えられた（０）。培養は３７℃，炭酸ガス５％で７日間成育された。培養の６日目に3Ｈ−Ｔｄｒ，１ｍＣｉが加えられた。平板の細胞はトムテック・ハーベスターを用いて７日目に採取され、ベータプレート・リーダーを用いて放射能が計数された。各データは３個のウエルの平均値である。
図１７．コロニー形成に対するＬＩＦおよびＣＨＥＦ−３の効果。ブタＢＭＣ（２５，０００細胞数／ｍｌ）が、ＦＢＳ３０％を含みメチメセルロースで１．１％に作られたイスコーヴス培地にＣＨＥＦ−３（用量０（ｎ），１０（０），および２０％（ｕ）のコス細胞上澄み）およびＬＩＦ（０，２５，５０および１００ｎｇ／ｍｌ）の用量滴定を含む培地におかれた。１ｍｌの量が２個平板に置かれ、１４日間３７℃炭酸ガス５％で培養された。コロニーは５０細胞数以上を有するものとして係数された。
図１８および図１９．培養１週間後の細胞充実度（図１８）および始原細胞発育（図１９）に対するＬＩＦおよび原始同種異系あるいは異種間質細胞のいずれかの効果。原始間質細胞は、ＦＢＳ１０％，ウマ血清１０％およびヒドロコルチゾン１０-6Ｍを含む培地１９９［標準ＬＴＢＭＣ培地］に細胞数２×１０6／ｍｌの濃度で２４個のウエル平板に播種された霊長類［異種ＳＣ］あるいはブタ［同種異系ＳＣ］ＢＭＣのずれかにより３週間培養された後に定着した。培地は各週に取り替えられ、非粘着細胞個体群は半分瀉出された。間質層の成育の後、原始細胞は１０Ｇｙで照射され、培地が取り替えられ、次いで各ウエルは５００，０００個のブタＢＭＣで播種された。対照培養［ＳＣ無し］は前成間質要素を含まなかった。変数は培地あるいはＬＩＦ５０ｎｇ／ｍｌを含む培地であった。７日が終わった後、粘着および非粘着細胞は３個のウエルから採取され、ウエル当りの細胞個数が測定された。各ウエルからの細胞のアリコートが、コロニー形成ユニットを測定するために、イスコーヴズ培地でＰＨＡ−ＬＣＭ１０％，エリスロポイエティン２Ｕ／ｍｌ，ＦＢＳ３０％を含むメチルセルロース培養で平板培養された。コロニーは前記の通りの基準で１４日間培養の後計数された。プロットされた結果は３個の個別の実験の平均値である。
図２０および図２１．１週間培養後の細胞充実度（図２０Ａおよび図２０Ｂ）および始原細胞発育（図２１Ａおよび図２１Ｂ）に対するＬＩＦ，ＣＨＥＦ−３，あるいはＬＩＦ＋ＣＨＥＦ−３および原始同種異系もしくは異種間質細胞のいずれかの効果。培養は図１８の凡例で詳細に記載されたように株立ちされた。変数は標準ＬＴＢＭＣ培地に対してＬＩＦ［５０ｎｇ／ｍｌ］，ＣＨＥＦ−３［コス細胞上澄み２０％］あるいはこの両者の組合せのいずれかを追加することである。７日後、２個のウエルのすべての細胞が採取され、細胞数が計測されまた細胞の１アリコートがコロニー形成検出で平板培養された。
図２２Ａ−２２Ｄ．異種ＬＴＢＭＣにおける細胞あるいは始原細胞成育に対する外因性ＬＩＦの連続対２週間の長期比較効果。原始霊長類間質細胞が前記の通り準備され、５００，０００個のブタＢＭＣで播種された。細胞は標準ＬＴＢＭＣ、あるいはＬＩＦ５０ｎｇ／ｍｌを含む培地のいずれかで平板培養された。ＬＴＢＭＣは適切な培地を使って各週に培養の栄養補給で維持された。２個のウエルからのすべての細胞は細胞培地の成育を実証するために週間隔で採取された。パネルＡおよびパネルＢでは、連続ＬＩＦ（ｏ）の細胞充実度および始原細胞成育に対する効果が培地（ｎ）単独のものと比較された。パネルＣおよびパネルＤでは、ＬＩＦ（ｏ）は最初の２週間のみ培養で維持された。２週間経過後、培地は標準ＬＴＢＭＣ培地で取替えられた。これは全培養期間にわたり培地単独（ｏ）のものと比較された。
図２３．連続ＣＨＥＦ−３あるいはＣＨＥＦ−３＋ＬＩＦの異種ＬＴＢＭＣにおける細胞および始原細胞の発育に対する長期効果の比較。ＬＴＢＭＣは株立ちされ、前述の通り設置された。これらの実験において、標準ＬＴＢＭＣ培地はＣＨＥＦ−３［コス細胞上澄み２０％］あるいはＣＨＥＦ３［２０％］およびＬＩＦ［５０ｎｇ／ｍｌ］で補足された。ＬＴＢＭＣ成育の参考文献は前記記載のとおりである。
配列リスト
（１）一般情報：
(i)出願人：ホーリー，ロバート  ジェイ．ポーナス，ポール  ディー．ローザ，マーガレット  ディー．モンロイ，ロドニー  エル．シャクター，バーニス  ゼッド．
(ii)発明の名称：異種移植寛容の増強およびブタサイトカン
(iii)配列の数：２４
(iv)連絡先：
(A)受信人：キャレラ，バーン，ベーン，ジルフィラン，セスキ，スチュワート  アンド  オルスタイン
(B)通：ベッカー  ファーム  ロード  ６
(C)市：ローズランド
(D)州：ニュージャージー
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：０７０６８
(v)コンピューター読取りフォーム：
(A)媒体型式：３．５インチ  ディスク
(B)ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチブル
(C)操作システム：ＭＳ−ＤＯＳ  ５．０
(D)ソフトウエア：ウインドー  ２．０言語
(viii)弁護士／代理人情報：
(A)氏名：ヘロン，チャールズ  ジェイ．
(B)登録番号：２８，０１９
(C)参照／ドケット番号：６１７５０−７９
(ix)通信情報：
(A)電話：２０１−９９４−１７００
(B)テレファックス：２０１−９９４−１７４４
配列識別番号１に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２１個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１
0003784063.tif 000002
配列識別番号２に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２４個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号２
0003784063.tif 000003
配列識別番号３に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基対  ６３３個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：二本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号３
0003784063.tif 000004
0003784063.tif 000005
0003784063.tif 000006
配列識別番号４に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：アミノ酸  １８０個
(B)タイプ：アミノ酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：有り
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号４
0003784063.tif 000007
0003784063.tif 000008
配列識別番号５に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  １０個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号５
0003784063.tif 000009
配列識別番号６に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  １８個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号６
0003784063.tif 000010
配列識別番号７に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  １０個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号７
0003784063.tif 000011
配列識別番号８に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２１個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号８
0003784063.tif 000012
配列識別番号９に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２１個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号９
0003784063.tif 000013
配列識別番号１０に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基対  ７９８個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：二本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１０
0003784063.tif 000014
0003784063.tif 000015
配列識別番号１１に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：アミノ酸  １２７個
(B)タイプ：アミノ酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：有り
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１１
0003784063.tif 000016
配列識別番号１２に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２９個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１２
0003784063.tif 000017
配列識別番号１３に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ４０個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号１３
0003784063.tif 000018
配列識別番号１４に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２１個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号１４
0003784063.tif 000019
配列識別番号１５に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２１個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号１５
0003784063.tif 000020
配列識別番号１６に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２６個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１６
0003784063.tif 000021
配列識別番号１７に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  １７個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１７
0003784063.tif 000022
配列識別番号１８に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２０個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１８
0003784063.tif 000023
配列識別番号１９に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２０個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号１９
0003784063.tif 000024
配列識別番号２０に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基対７６０個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：二本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号２０
0003784063.tif 000025
0003784063.tif 000026
0003784063.tif 000027
配列識別番号２１に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：アミノ酸  １２１個
(B)タイプ：アミノ酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：有り
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号２１
0003784063.tif 000028
配列識別番号２２に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２９個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号２２
0003784063.tif 000029
配列識別番号２３に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２８個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号２３
0003784063.tif 000030
配列識別番号２４に関する情報
(i)配列特性：
(A)長さ：塩基  ２１個
(B)タイプ：核酸
(C)連鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線型
(iii)仮説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号２４
0003784063.tif 000031
配列リスト
（１）一般情報
(i)出願人：ホーリー，ロバート  ジェイ．ポナス，ポール  ディー．ローザ，マーガレット  ディー．モンロイ，ロドニー  エル．シャクター，バーニス  ゼィー．
(ii)発明の名称：異種移植耐性の増強およびブタサイトカイン
(iii)配列数：２４個
(iv)通信アドレス：
(A)受信人：キャレラ，バーン，ベイン，ジルフィラン，セスキ，スチュワート  アンド  オルスタイン
(B)通り：ベッカー  ファーム  ロード  ６
(C)市：ローズランド
(D)州：ニュー  ジャージー
(E)国：アメリカ合衆国
(F)ジップコード：０７０６８
(v)コンピューター読取りフォーム
(A)媒体の型：３．５インチ  ディスク
(B)コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチブル
(C)作動システム：ＭＳ−ＤＯＳ  ５．０
(D)ソフトウェア：Ｗｏｒｄ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ２．０
(viii)弁護士／代理人情報
(A)氏名：ヘロン，チャールズ  ジェイ．
(B)登録番号：２８，０１９
(C)参照／ドケット番号：61750-79
(ix)遠距離通信情報：
(A)電話：２０１−９９４−１７００
(B)テレファックス：２０１−９９４−１７４４
配列識別番号１に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２１塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１
0003784063.tif 000032
配列識別番号２に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２４塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：あり
(xi)配列の記述：配列識別番号２
0003784063.tif 000033
配列識別番号３に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：６３３塩基対
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：２本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号３
0003784063.tif 000034
配列識別番号４に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：１８０アミノ酸
(B)タ  イ  プ：アミノ酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：有り
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号４
0003784063.tif 000035
配列識別番号５に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：１０塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号５
0003784063.tif 000036
配列識別番号６に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：１８塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号６
0003784063.tif 000037
配列識別番号７に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：１０塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号７
0003784063.tif 000038
配列識別番号８に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２１塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号８
0003784063.tif 000039
配列識別番号９に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２１塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号９
0003784063.tif 000040
配列識別番号１０に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：７９８塩基対
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：２本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１０
0003784063.tif 000041
0003784063.tif 000042
配列識別番号１１に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：１２７アミノ酸
(B)タ  イ  プ：アミノ酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：有り
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１１
0003784063.tif 000043
配列識別番号１２に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２９塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１２
0003784063.tif 000044
配列識別番号１３に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：４０塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号１３
0003784063.tif 000045
配列識別番号１４に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２１塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号１４
0003784063.tif 000046
配列識別番号１５に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２１塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号１５
0003784063.tif 000047
配列識別番号１６に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２６塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１６
0003784063.tif 000048
配列識別番号１７に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：１７塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１７
0003784063.tif 000049
配列識別番号１８に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２０塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号１８
0003784063.tif 000050
配列識別番号１９に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２０塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号１９
0003784063.tif 000051
配列識別番号２０に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：７６０塩基対
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：２本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号２０
0003784063.tif 000052
0003784063.tif 000053
配列識別番号２１に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：１２１アミノ酸
(B)タ  イ  プ：アミノ酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：有り
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号２１
0003784063.tif 000054
配列識別番号２２に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２９塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号２２
0003784063.tif 000055
配列識別番号２３に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２８塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：有り
(xi)配列の記述：配列識別番号２３
0003784063.tif 000056
配列識別番号２４に関する情報
(i)配列特性
(A)長      さ：２１塩基
(B)タ  イ  プ：核酸
(C)連      鎖：１本
(D)トポロジー：線形
(iii)仮       説：無し
(iv)アンチセンス：無し
(xi)配列の記述：配列識別番号２４
0003784063.tif 000057
【図１】
0003784063.tif 000058
【図２】
0003784063.tif 000059
【図３Ａ】
0003784063.tif 000060
【図３Ｂ】
0003784063.tif 000061
【図４】
0003784063.tif 000062
【図５】
0003784063.tif 000063
【図６】
0003784063.tif 000064
【図７】
0003784063.tif 000065
【図８Ａ】
0003784063.tif 000066
【図８Ｂ】
0003784063.tif 000067
【図９】
0003784063.tif 000068
【図１０】
0003784063.tif 000069
【図１１】
0003784063.tif 000070
【図１３】
0003784063.tif 000071
【図１２Ａ】
0003784063.tif 000072
【図１２Ｂ】
0003784063.tif 000073
【図１４】
0003784063.tif 000074
【図１５】
0003784063.tif 000075
【図１６】
0003784063.tif 000076
【図１７】
0003784063.tif 000077
【図１８】
0003784063.tif 000078
【図１９】
0003784063.tif 000079
【図２０Ａ】
0003784063.tif 000080
【図２０Ｂ】
0003784063.tif 000081
【図２１Ａ】
0003784063.tif 000082
【図２１Ｂ】
0003784063.tif 000083
【図２２Ａ】
0003784063.tif 000084
【図２２Ｂ】
0003784063.tif 000085
【図２２Ｃ】
0003784063.tif 000086
【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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