(57)【要約】動脈硬化症に対する治療および／または予防効果を有する新規アディボネクチン様蛋白質および当該蛋白質をコードする遺伝子を提供する。（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質または（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、血管平滑筋細胞の増殖抑制活性を有する蛋白質もしくはその塩および当該蛋白質をコードするＤＮＡを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
（ａ）  配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）  配列番号１のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ血管平滑筋細胞の増殖抑制活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質またはその塩。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質またはその塩；
（ａ）  配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）  配列番号３のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管平滑筋細胞の増殖抑制活性を有する蛋白質。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
【請求項６】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体。
【請求項７】
請求項２又は請求項３に記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している請求項５に記載の形質転換細胞と候補物質とを接触させ、該蛋白質の活性の変化を検出することを特徴とする、候補物質からの該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。
【請求項８】
請求項４に記載のベクターまたは請求項５に記載の形質転換細胞と候補物質とを接触させ、請求項１に記載のＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、候補物質からの請求項１に記載のＤＮＡの発現調節作用を示す物質の検索方法。
【請求項９】
請求項２または３に記載の蛋白質またはその塩を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項２または請求項項３に記載の蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸。
【請求項１１】
塩基配列が、請求項１に記載のＤＮＡの全部または一部に相補する配列である、請求項１０に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１２】
請求項６に記載の抗体を用いることを特徴とする、被検試料中の請求項２または請求項項３に記載の蛋白質の測定方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の抗体を含有すること特徴とする、被検試料中の請求項２または請求項項３に記載の蛋白質を測定するための試薬またはキット。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、抗動脈硬化作用を有する蛋白質であるアディポネクチンと類似の活性を有する新規な蛋白質および当該蛋白質をコードする遺伝子に関する。
従来の技術
虚血性心疾患や脳梗塞などの動脈硬化性疾患は、依然死因の上位を占めており、その克服は高齢化社会の課題となっている。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤に代表される血中コレステロール低下剤がその治療に有効であることはいくつかの大規模臨床試験で証明されたが、それらの薬剤によるリスクの低減率は、全体から見れば数％であり、治療法としては不十分なものといわざるを得ない。冠動脈疾患では、各種の冠動脈血管拡張術も試みられているが、術後に高率で起こる再狭窄が問題となっており、いまだ根本的な解決方法は確立されていない。
動脈硬化の発症・進展には、流血中の単球の血管内皮細胞への接着とそれに引き続くマクロファージへの分化と泡沫化、さらには血管中膜平滑筋細胞の内皮下への遊走・増殖が関与している。また、血管拡張術後の再狭窄においても平滑筋細胞の増殖が主な原因の一つとなっている。
アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）は脂肪細胞に特異的に高発現する分泌蛋白質として発見されたが、その後の研究で単球の血管内皮細胞への接着や、平滑筋細胞の増殖を抑制するなど、抗動脈硬化的な作用を持つことが明らかとなった。糖尿病との関係については、動物モデルにおいて、ＩＩ型糖尿病サルにおいて、インスリン抵抗性の進行に伴いアディポネクチンが低値になること、グルコースクランプにおける糖取り込み指標（Ｍ値）に相関して、血中アディポネクチンが上昇することが示されている（ＤＩＡＢＥＴＥＳ  Ｖｏｌ．５０：１１２６−１１３３（２００１））。さらに、ＩＩ型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス、ＫＫＡｙマウス）への生理的濃度のアディポネクチン投与により、インスリン抵抗性が改善すること、脂肪欠損マウスでのインスリン抵抗性をアディポネクチン投与が改善することも示されている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．７：９４１−９４６（２００１））。また、冠動脈疾患患者や肥満患者では健常人に比べてアディポネクチンの血中濃度が低値を示すことが報告されている。
発明が解決しようとする課題
本発明は、新規なアディポネクチン様蛋白質および当該蛋白質をコードする遺伝子を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
本発明者らは、ヒト大腸組織由来のｍＲＮＡから、オリゴキャップ法により複数の完全長ｃＤＮＡをクローニングした。これらｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した結果、５５１個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする新規遺伝子（Ｃ−ＣＯＬ０１１９１）をクローニングするに至った。
当該遺伝子にコードされる蛋白質（以下「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質と称する）は、血管平滑筋細胞の増殖を抑制するというアディポネクチンと同様の活性を有することが明らかになった。このことから、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質は、抗動脈硬化作用を有するアディポネクチン様蛋白質であると考えられる。すなわち、本発明は、動脈硬化治療用または予防用医薬組成物の製造に使用し得る新規蛋白質「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質および当該蛋白質をコードする遺伝子を提供する。
遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１
本発明は、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質をコードする遺伝子を提供する。該遺伝子は上記の様にｃＤＮＡライブラリーから単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーションなどの遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのほか、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。
本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
また、Ｃ−ＣＯＬ０１１９１の塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。本明細書中において、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と同義である。
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質が血管内皮細胞への単球接着抑制活性または血管平滑筋細胞の増殖抑制活性を保持する範囲内において、塩基配列のバリエーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管内皮細胞への単球接着抑制活性または血管平滑筋細胞の増殖抑制活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号１に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
上記のＤＮＡの変異の程度は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するものであれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２１５；４０３−１０（１９９０））を用いることができる。また、ハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１に記載の核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、脳、肺、胎盤等においてその発現変化が確認されていることから、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片は、特定臓器疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。
本発明のＤＮＡは、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を大量に生産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質の発現量をｍＲＮＡ発現量を指標として確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連する疾患の診断を行うことも可能である。
また、本発明のＤＮＡの一部をプライマーとして使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法により、核酸配列上の異常あるいは多型を検査・診断することができる。
また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導入し、本発明の蛋白質の発現または活性が損なわれていることによる疾患の遺伝子治療にも使用する事ができる。
本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換蛋白質の産生方法、あるいは蛋白質の発現を特異的に亢進する物質等の探索に大いに有用である。
本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡを組み入れることが可能である。その際、遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１の宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いた「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の生産において好適に用いられる他、遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能となる。
例えば、任意の候補物質と遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で接触させることで、候補物質の遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１の発現を促進する作用を有する物質を探索し、あるいは評価を行うことができる。
また、本発明であるＤＮＡと公知の方法とを組み合わせてマウスまたはその他の適当な動物を基にトランスジェニック動物を作製することが出来る。かかるトランスジェニック動物を用いても、上記の形質転換細胞と同様の探索あるいは評価を行うことができる。特に本発明である遺伝子あるいは蛋白質は動脈硬化症、冠動脈疾患、糖尿病、卵巣がん、自己免疫性肝炎、骨粗しょう症、Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、慢性関節リウマチ等に関連することから、上述の形質転換細胞あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、動脈硬化症等本発明の蛋白質が関与する疾患に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
また、本発明の遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１は、動脈硬化症の診断用のプローブとして、またはこれらの研究、予防および治療に役立つ。
「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質
遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１にコードされる「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の推定アミノ酸配列は配列番号３に示されるとおりである。この蛋白質は、アディポネクチンと同様、血管平滑筋細胞の増殖抑制活性を有することから抗動脈硬化作用を持つ蛋白質であると推定される。また、実施例９に示すように、各種患者血清中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の測定から、冠動脈疾患、糖尿病患者等では健常人と比較して低値傾向を、卵巣がん、自己免疫性肝炎、骨粗しょう症、Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、慢性関節リウマチにおいては高値を示す例があり、これらの症例において「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質がこれらの疾患と関係していることが明らかになった。循環器系疾患において低値を示すのは、アディポネクチンと類似している。しかしアディポネクチンにおいては高値を示す疾患は知られておらず、卵巣がん、自己免疫性肝炎、骨粗しょう症、Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、慢性関節リウマチにおいては高値を示すことは「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質に特有の性質であると言える。「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質が高値を示す疾患は、骨代謝に関連する疾患が多く含まれる。よって、本発明の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質は骨代謝関連疾患において健常人よりも高い血中濃度を示す蛋白質と定義することもできる。本発明は、当該蛋白質を活性成分として含む医薬組成物をも提供する。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
従って、配列番号３に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失、および／若しくは付加した変異蛋白質であっても、その変異が「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質と機能的に同等、中でも血管内皮細胞への単球接着抑制または血管平滑筋細胞の増殖抑制などの機能を有する蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。
このようなアミノ酸の変化は、異なる生物種間に認められる配列の多様性あるいはいわゆる遺伝子多型などの様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に発生させることができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質が転写調節活性を保持する限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは１もしくは数個以内である。
上記に述べた蛋白質は、いわゆる当業者における通常の認識の範囲にある塩の形態であっても差し支えないことは言うまでもない。またシグナル配列を有する蛋白質ではシグナル配列が切断されたものが成熟蛋白質として機能している場合もある。よって本発明の蛋白質からシグナル配列が除かれた成熟ペプチドも、実質的には本発明の蛋白質と同等の物質であると理解すべきである。
本発明の蛋白質は、該蛋白質に結合する物質や該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用することができる。探索を通じて得られる化合物等および本発明の蛋白質またはその部分ペプチドまたはそれらの塩は、本発明の蛋白質が関連する動脈硬化症等の有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
＜抗体＞
本発明はさらに、本発明の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質全体あるいはその部分ペプチドまたはそれらの塩を抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）２、パパインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体であってもよい。これらの抗体は、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の研究的あるいは臨床的な検出、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質が関与する疾患の臨床治療等に有用である。また、本発明の蛋白質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明の蛋白質を検出するために使用することができる。
＜アンチセンス核酸＞
本発明は生体内において核酸レベルでの「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質生合成を抑制することのできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるアンチセンス核酸は、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質をコードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１の塩基配列の全体あるいはいずれかの部分に相補する配列からなるものであってもよい。好ましくは配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に相当あるいは相補する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造あるいは５’末端や３’末端に非翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有するものとなろう。
本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限はない。
また本発明では、一般的には、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ましい。
この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなるものが好適である。
本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果は、公知の手法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ  ｍａｘ  ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用した翻訳段階の阻害活性、あるいは５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域、５’翻訳領域を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを用いたレポーター遺伝子の発現量などを測定して評価することができる。
本発明のアンチセンス核酸は「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の活性発現を抑制し得る機能を有するので、本発明の蛋白質が関与する動脈硬化症等本発明の蛋白質が関与する疾患に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。特に、卵巣がん、自己免疫性肝炎、骨粗しょう症、Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、慢性関節リウマチにおいては本発明の蛋白質の血中濃度の増大が観察されているので、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の活性発現を抑制するアンチセンス核酸はこれらの疾患に有効であると考えられる。
発明の実施の最良の形態
＜核酸＞
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作製し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作製するのに適した細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
本発明のＤＮＡを有する組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベクターである。
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進する物質の探索がより有利に行える。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合には  ＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
＜蛋白質＞
本発明の蛋白質は、天然に発現している各種臓器から調製することができるが、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ  ジャパン株式会社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養については各種の成書（たとえは、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年を参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネースその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質と機能的に同等な蛋白質である限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。
本発明の蛋白質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基などの塩が用いられる。この様な塩としては、当業界で周知の方法により調製される塩、例えば、無機酸（塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）あるいは有機酸（酢酸、蟻酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩、または無毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属（ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウムなど）およびアンモニウムとの塩などが包含される。
＜トランスジェニック動物＞
本発明の遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１を用いれば、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。このトランスジェニック非ヒト哺乳動物も本願の発明に属する。該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような定法（例、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製することができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベクターを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。
具体的には、例えば、トランスジェニックマウスの場合には、正常Ｃ５７ＢＬａｃｋ／６マウスから取得した前核期受精卵にＣ−ＣＯＬ０１１９１遺伝子が発現可能なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的には、適切なプロモーターの下流にＣ−ＣＯＬ０１１９１遺伝子を接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラス針を用いて直接注入する。
該受精卵を仮親として別の偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウスと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティング法にてＣ−ＣＯＬ０１１９１遺伝子の導入の有無を確認しトランスジェニックマウスを得る。
また、Ｃ−ＣＯＬ０１１９１（またはＣ−ＣＯＬ０１１９１のマウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノックアウトマウス」を作製することができる。本発明における「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由来の蛋白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２号公報、同５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製することができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一態様である。
または、最近中大動物においても核移植によるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本技術を用いたトランスジェニックおよびノックアウト動物の作出も実際に行われるようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の細胞に対しＣ−ＣＯＬ０１１９１（または各動物におけるＣ−ＣＯＬ０１１９１の相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞から核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることができる。該動物はＣ−ＣＯＬ０１１９１（または各動物におけるＣ−ＣＯＬ０１１９１の相同遺伝子）が失われたノックアウト動物である。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の細胞にＣ−ＣＯＬ０１１９１（または各動物におけるＣ−ＣＯＬ０１１９１の相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン動物を得る事によりトランスジェニック動物を作製する事も可能である。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態様である。
＜抗体＞
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、抗体の作製に使用しうる精製度のものであればいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者が免疫学的な実験に使用するラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得ることができる。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行う。
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作製する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製することができる。抗体を治療に使用する場合には、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５；１４６−１５６（１９９７））を免疫することにより調製することが出来る。また、モノクローナル抗体の超可変領域を用いてヒト化抗体を遺伝子工学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３；９９−１２１（１９９１））。
＜アンチセンス核酸＞
アンチセンス核酸は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢｅｒｎａｌｄ  Ｌｅｂｌｅｕ編、ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成したり、Ｃ−ＣＯＬ０１１９１を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成機（たとえばアプライドバイオシステムズ  ジャパン株式会社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アンチセンス核酸を得ることができる。
本発明のＤＮＡの一部またはアンチセンス核酸を診断や検査用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あるいは発光物質等で標識する。次に、検体試料からＤＮＡもしくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被検物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中に、遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１もしくはＲＮＡが含まれていれば、当該プローブはそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リボソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、皮膚炎、特にアトピー性皮膚炎を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。
＜スクリーニング方法＞
本発明は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞または本発明のＤＮＡにより組換えたトランスジェニック非ヒト哺乳動物のいずれかを用いることを特徴とし、本発明の蛋白質の機能または発現を調節する物質をスクリーニングする方法に関する。より具体的には、（１）候補物質の存在下／非存在下における「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の血管内皮細胞への単球接着抑制活性または血管平滑筋細胞の増殖抑制活性を評価する方法、（２）候補物質の存在下／非存在下における本発明の蛋白質または遺伝子の発現レベルを比較し、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。（１）の例としては、実施例４に示す系において、被験物質存在下／非存在下における「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の活性を測定すればよい。（２）の例としては、本発明の遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または５’翻訳領域等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下でレポーター遺伝子の発現量を候補物質の存在下／非存在下で測定し、候補物質の転写促進活性または転写抑制活性を確認する方法が挙げられる。本発明の蛋白質の活性を調節する作用を示す物質とは、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の活性を増強（アゴニスト）あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を有する物質のいずれでも良い。本発明のＤＮＡの発現調節作用を示す物質とは、遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよく、好ましくは発現を抑制する物質である。候補物質が本発明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系に候補物質を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡの発現レベルとは、Ｃ−ＣＯＬ０１１９１遺伝子のｍＲＮＡの発現強度、蛋白質の発現強度のいづれにより検出しても良い。また、Ｃ−ＣＯＬ０１１９１遺伝子または「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質自体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子の発現レベルを検出しても良い。レポーターアッセイ系は、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する物質をスクリーニングするアッセイ系をいう。転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β―ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を利用することができる。本発明の遺伝子の発現制御領域や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可能である（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１９９３年）。阻害（または抑制）する作用を有する、あるいは増強（または促進）する作用を有するとは、蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、候補物質添加群と、候補物質無添加群との間に差があることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
阻害（抑制）率あるいは増強（促進）率＝（候補物質無添加群の測定値―候補物質添加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値×１００
ここで、阻害・増強どちらの作用であるかについて、および測定値については蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が実施例４に示す血管平滑筋細胞増殖抑制活性の測定系の場合には、測定値としては放射活性を用いることができ、候補物質添加群の測定値＞候補物質無添加群の測定値となる場合、候補物質には「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質活性阻害作用があるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。
本発明である蛋白質は、アディポネクチン様蛋白質であることから、上述のスクリーニング方法あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、動脈硬化症に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。候補物質としては蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物とは、前記で定義される本発明の蛋白質またはその塩と薬学的に許容され得る担体とからなる医薬組成物である。ここで、薬学的に許容され得る担体とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤などが挙げられる。また、通常の蛋白質製剤などに使用され得る各種の添加剤成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤なども適宜使用して調製され得る。
投与単位形態としては、錠剤、丸剤、散在、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤などの各種形態が選択し得る。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することが可能である。
投与量は、特に限定されず、患者の年齢、性別、体重及び症状、所望の治療効果、投与方法その他の条件によって適宜選択し得る。
＜本発明の抗体を用いる測定法、試薬、キット＞
本発明は、（１）本発明の抗体を用いることを特徴とする、被検試料中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の測定方法、（２）本発明の抗体を含有すること特徴とする、被検試料中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を測定するための試薬またはキット、（３）ヒト体液中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質量の増加または減少を測定し、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の機能異常、それらを伴う疾患または該疾患に付随する病態の予知、検出または診断に用いる（１）に記載の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の測定方法、（４）前記疾患が冠動脈疾患（狭心症、急性心筋梗塞）、糖尿病Ｔｙｐｅ２、肺腫瘍、心不全、心臓病、高血圧症、肝不全、肝硬変、胆石、膵炎、急性白血病、慢性白血病、脳梗塞、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ型老年痴呆症、痴呆、シェーグレン症候群、卵巣がん、自己免疫性肝炎、骨粗しょう症、Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群および慢性関節リウマチより選ばれる少なくとも１つの疾患である（３）に記載の測定方法を提供する。
本発明の測定方法は、本発明の抗体を用いるステップを含むが、該ステップは、対象試料中の被検物質である「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質と、本発明の抗体との抗原抗体反応による、対象試料中の被検物質をトラップする工程であることが好ましい。本発明の測定方法における被検物質の検出原理は特に限定されないが、凝集法、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法等が例示される。この内、サンドイッチ法及び競合法が好ましく、特にサンドイッチ法が好ましい。凝集法では、抗体を粒子、例えばラテックス粒子や赤血球（例えば羊赤血球）の表面に結合させて、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質が存在すると粒子の凝集が生じるようにし、この粒子の凝集の程度を指標として「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を測定する。
なお、この凝集法では、ラテックスや赤血球以外にも、ゼラチンやマイクロビーズ、カーボン粒子等、一般に用いられている粒子を使用することができる。また、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法では、標識された抗体や抗原を使用し、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ケミルミネッセンスイムノアッセイ（化学発光免疫測定法）、フルオロイムノアッセイ（蛍光免疫測定法）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲ−ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィーアッセイ（ＩＣＡ）等の原理で測定を行なうことができる。
以下に、本発明の測定方法の好適例の１つである、ＥＩＡの原理に基づく、サンドイッチ法、固相直接法、競合法を説明する。ＥＩＡによるサンドイッチ法では、まず、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素で標識した、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を認識する抗体または二次抗体を準備する。特にポリペルオキシダーゼ標識した抗体は好ましい例である。また、使用する固相には、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を認識する抗体を吸着させておく。サンプル（試料）もしくはスタンダードを添加後、上述の酵素標識抗体を添加し、抗原抗体反応を行なわしめる。過剰の酵素標識抗体を洗浄操作で除去した後、使用する酵素に応じた発色基質、例えばオルトフェニレンジアミンとＨ２Ｏ２、ｐ−ニトロフェニルリン酸、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド等を加えて酵素と反応させる。基質の発色は、酵素量、ひいてはサンプル中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質に依存するので、発色最終産物の量を測定することにより「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を定量することができる。
固相直接法では、サンプル（試料）を直接固相に吸着させ、固相の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質非吸着面を、その測定系には影響しないタンパク質、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などでブロッキング処理し、次いで「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を認識する酵素標識抗体を添加し、反応させる。以降は、サンドイッチ法と同様の操作を行ない、サンプル中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の有無を判定するか定量を行う。
競合法では、使用する抗体が認識する一定量の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を直接固相に吸着させ、次いでブロッキング処理した後、ここに、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を認識する酵素標識抗体とサンプル（試料）とを添加する。一定時間反応させた後、洗浄して固相に非結合の物質を除去し、発色基質を加えて酵素と反応させる。反応後、サンプル添加による、酵素標識抗体の固相「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質への結合阻害度を測定することにより、サンプル中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を定量する。
なお、はじめに抗体を固相に吸着させ、酵素標識した「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質をサンプルと同時に添加し、サンプル添加による標識物の固相化抗体への結合阻害度を測定することにより、サンプル中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を定量してもよい。
上記以外の方法として、抗原抗体反応を液相中で行ない、後に、抗体を用いた凝集沈降法もしくは物理化学的な手法によって、標識抗体と結合した「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質と結合しなかった「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を分離し定量する方法もある。また、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を認識する抗体を標識するのではなく、その抗体を認識する二次抗体を得、それを標識し、抗原抗体反応を行なわせて、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を測定することも可能である。
サンドイッチ法、固相直接法、競合法のいずれにおいても、標識酵素−発色基質の組合せを、標識酵素−生物発光基質または化学発光基質、標識酵素−蛍光基質等の組合せに変えることが可能である。この場合の、酵素−発光基質の代表的な組合せは、アルカリフォスファターゼ−ＡＭＰＰＤ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ルミノール、ルシフェラーゼ−ルシフェリン等があり、酵素−蛍光基質の代表的な組合せは、アルカリフォスファターゼ−ウンベリフェリルフォスフェート、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ｐ−ハイドロキシフェニルプロピオン酸等がある。
さらに、上記３種の測定方法において、酵素に代わって、放射性物質や化学発光物質あるいは蛍光物質で直接あるいは間接的に標識された抗体や抗原を用い、放射能や発光、蛍光の強度を測定することにより、サンプル中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を測定することも可能である。
放射性物質としては、１２５Ｉや１３１Ｉ等が一般に使用されており、化学発光物質の代表的な物には、アクリジニウムエステル等がある。また、蛍光強度を測定する場合には、より高感度な方法として、抗体あるいは抗原にキレート剤を直接あるいは間接的に結合させ、励起光照射後にそのキレート剤に結合する希土類金属から発せられる蛍光の強度を時間分解的に測定することにより、試料中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を測定する方法（時間分解蛍光免疫測定法）も有用である。なお、代表的な希土類金属の例として、ユーロピウムがあげられる。
本発明の測定方法は、以上説明したように、試料中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を検出または測定することを目的としている。この場合、被検試料は動物、特にヒトの体液あるいは、組織、細胞および菌体ならびにそれらの抽出液、培養上清、塗末標本および切片があげられるが、体液であることが好ましい。より好ましくは、血液、血漿、血清、尿、髄液、リンパ液、唾液、腹水、胸水より選ばれる試料である。
本発明の測定方法を用いて健常人及び種々の疾患を有する患者の体液中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を測定することができる。また、初めて体液中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質濃度が明らかとなり、特定の疾患において「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質濃度が変動することも明らかとなった。健常人及び種々の疾患を有する患者の体液中の「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の濃度を比較する際には、当業者が通常用い得る統計学的手法を用いて両者の測定値に差があるか否かを判断すればよい。
なお、本発明の測定試薬及びキットは、上記した測定方法の構成等に準拠することができる。
実施例
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
実施例１  Ｃ−ＣＯＬ０１１９１遺伝子のクローニング
（１）オリゴキャップ法による完全長ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト大腸組織よりＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．）に従い、オリゴｄＴセルロースを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。次に５−１０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む緩衝液中で、１．２ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＢＡＰと略する）（ＴａＫａＲａ）と３７℃で４０分間反応させ、キャップ構造を持たないポリ（Ａ）＋ＲＮＡの脱リン酸化を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをエタノール沈殿として回収した。回収したポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎを含む緩衝液中で２０ＵのＴｏｂａｃｃｏ  ａｃｉｄ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＴＡＰと略する）（Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ  ｖｏｌ．１３８，１７１−１７４）にて３７℃で４５分間処理し、キャップ構造の除去を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出して、エタノール沈殿を行い、ＢＡＰ−ＴＡＰ処理済ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを回収した。
この回収したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ  ２−４μｇを０．４μｇの５’オリゴマー（５’−ＡＧＣ  ＡＵＣ  ＧＡＧ  ＵＣＧ  ＧＣＣ  ＵＵＧ  ＵＵＧ  ＧＣＣ  ＵＡＣ  ＵＧＧ−３’）とライゲーション反応を行った。この反応は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＡＴＰ、２５％のＰＥＧ８０００及び１００ＵのＲＮａｓｉｎを含む緩衝液中で、２５０ＵのＲＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いて２０℃で３−１６時間行った。その後、未反応のオリゴマーを除去してｃＤＮＡ合成を行った。すなわち、２−４μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１０ｐｍｏｌのｄＴアダプタープライマー（５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−３’）と混合し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、添付の緩衝液中で４２℃、１時間反応させた。
鋳型のＲＮＡを除去するために１５ｍＭのＮａＯＨを用いて６５℃で１時間反応させた後に、ｃＤＮＡの増幅操作を行った。１μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）＋ＲＮＡより合成されたｃＤＮＡを１６ｐｍｏｌのセンスプライマー１（５’−ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＴＴＧ−３’）及びアンチセンスプライマー１（５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＧＴ−３’）と混合し、ＸＬ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて増幅した。この際のＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１０分間のサイクルを５−１０回行った。ＰＣＲ産物をフェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて抽出し、エタノール沈殿として回収した。その後、回収物を  ＳｆｉＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて１０００ｂｐ以上のｃＤＮＡを分離し、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）のＤｒａＩＩＩサイトに挿入した。尚、ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３のＤｒａＩＩＩサイトは非対称性となっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩサイトとなっているため、挿入したｃＤＮＡ断片は一方向性に挿入されている。
（２）ｃＤＮＡクローン塩基配列及びその推定蛋白質情報の解析
（１）の方法で作製したｃＤＮＡライブラリーより、ＰＩ−１００ロボット（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドを調製し、各クローンの塩基配列を確認し、データベース化した。塩基配列決定は、ＡｕｔｏＣｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とＲ．Ｏ．Ｂ．ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い添付のプロトコールに従ってシークエンス反応を行い、ＡＬＦ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により行った。
（１）に記載の方法で取得したプラスミドＣ−ＣＯＬ０１１９１には、配列番号３で表される５５１個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする、配列番号１で表される１６５３塩基対の塩基配列からなるオープンリーディングフレームを含む配列番号２で表される２９５４塩基対の塩基配列からなるｃＤＮＡが含まれていた。プラスミドＣ−ＣＯＬ０１１９１は、国際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に２００１年１月２４日付にて受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８６０として寄託されている。
「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質のアミノ酸配列（５５１アミノ酸）とアディポネクチン（２４４アミノ酸）のアミノ酸配列に対する相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．，３６，ｐｐ．２９０−３００（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，ｐｐ．４０３−１０（１９９０））を用いて、局部的な配列の一致を検索した。その結果、アディポネクチンの３３から１０６番目の７４残基および４２から１０５番目の６４残基に対してそれぞれ４２％の同一性を有する領域が「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質に認められた。また、ｓｉｇｃｌａｖｅによるシグナルペプチド予測では、配列番号３に示されるアミノ酸配列中の１９〜３２番目のアミノ酸配列にシグナル配列が存在することが明らかになった。このことから「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質はアディポネクチンと同様、分泌性の蛋白質であることが示唆された。
実施例２  ＰＣＲ法による各種臓器における発現解析
遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１の各種臓器における発現を調べるために、市販のｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ及びＩＩ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型としてＣ−ＣＯＬ０１１９１遺伝子配列の３’非翻訳領域の配列より作製した特異的センスプライマー（５’−ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＣＴ−３’）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＧＴＡ  ＣＴ−３’）を用い、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）によりＰＣＲを行った。また、ＰＣＲのサイクルは、反応液を９４℃で２分間反応した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返した。その結果、脳、肺、胎盤で遺伝子Ｃ−ＣＯＬ０１１９１の発現が確認され、胎盤において特に強い発現が認められた。また、胸腺、脾臓、末梢血リンパ球、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、大腸、小腸、骨格筋、前立腺、精巣、卵巣では発現は認められなかった。
実施例３  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎによる蛋白質発現
Ｃ−ＣＯＬ０１１９１クローンをｉｎ  ｖｉｔｒｏにて発現させるために、下記の方法でプラスミド構築を行った。まず、プラスミドＣ−ＣＯＬ０１１９１より制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩにて消化を行い、約１．１ｋｂと約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＥｃｏＲＩとＸｂａＩにて消化した後に、約２．０ｋｂのＣ−ＣＯＬ０１１９１制限酵素消化断片を挿入した。このｌｉｇａｔｉｏｎ液をＪＭ１０９にてｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎし、プラスミドを得た。次にこのプラスミドを再度ＥｃｏＲＩにて消化した後に、約１．１ｋｂのＣ−ＣＯＬ０１１９１の制限酵素消化断片を挿入し、ＪＭ１０９にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎした。得られたプラスミドをｐＩＶＣＯＬ１９として以下の反応に用いた。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎはプロメガ社のＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｔＲＮＡを用い、添付のプロトコールに従って行った。即ち、ＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２０μＬ、１ｍＭのＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ０．５μＬ、ＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｔＲＮＡ  １．０μＬ、ｐＩＶＣＯＬ１９  ０．５μｇを混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒにて最終体積を２５μＬにして、３０℃で９０分間反応した。その後、ＥｌｅｃｔｒｏＰｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５０ｍＬ  ２×Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（第一化学薬品）を３０μＬ添加し、反応を停止した。次に反応液１７μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ＰＶＤＦ膜に電気的にｔｒａｎｓｆｅｒした後に、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ロッシュ・ダイアグノスティック社）と反応を行い、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）を用いて検出を行った。その結果、約６０ｋＤａの位置に目的の蛋白の発現が確認できた。
実施例４  活性測定
単球の血管内皮細胞への接着抑制活性
プレートに播種した血管内皮細胞を、培地中で培養（５％ＣＯ２下、３７℃）する。コンフルエントになるまで培養し、組換え「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を添加し、更に培養し、その後、ヒト組換えＴＮＦ−αを添加し更に培養する。また、対照群として、上記組換え「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質無添加群（ＴＮＦ−α刺激のみ）を設ける。上記の処理をした血管内皮細胞に蛍光標識したＴＨＰ−１細胞を添加して３７℃で孵置した後、遠心分離して非接着細胞を除く。ウェルに細胞融解液を添加して細胞を融解し、励起波長４８５ｎｍ、測定波長５３５ｎｍにおける蛍光強度を測定する。「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質添加群では対照群と比較して蛍光強度が有意に低いことを確認することで、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質は血管内皮細胞に対する単球の接着抑制活性を有することを示すことができる。
血管平滑筋細胞増殖抑制活性
動脈平滑筋細胞を、プラスチック製プレートに播種し、ＦＢＳを添加した培地を用い、３７℃で５％ＣＯ２及び９５％空気中でサブコンフルエントになるまで培養した。動脈平滑筋細胞によるＤＮＡ合成を、［３Ｈ］−チミジン取り込み量にて測定した。即ち、プラスチック製プレートに播種した細胞を、培地中で「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質及び／又は対照のためＨＢ−ＥＧＦ等の細胞増殖因子を用いて２４時間処理した。次いで、［３Ｈ］−チミジンを添加して培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷冷したトリクロロ酢酸溶液で処理した後、細胞融解液を添加して細胞を融解し、細胞融解液の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質添加群では対照群と比較して細胞融解液の放射活性が有意に低く、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質は血管平滑筋細胞に対する増殖抑制活性を有することが明らかになった。
実施例５  可溶型「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の調製
抗体作製用の投与抗原として用いるため、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の５４６番目のＳｅｒ（配列番号３参照）のＣ端にヘキサヒスチジンタグを融合したキメラ蛋白質（以下ＣＯＬ０１１９１−Ｈｉｓと称する）を生産した。尚、ＣＯＬ０１１９１−Ｈｉｓ発現プラスミドは以下の方法にて構築した。即ち、プラスミドＣ−ＣＯＬ０１１９１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｃＩＩで消化し、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて回収した。また、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、前述のＤＮＡ断片をライゲーションした。コンピテントセルＪＭ１０９を形質転換して定法に従いＣＯＬ０１１９１−Ｈｉｓ発現プラスミドを調製した。得られた発現プラスミドは、以下の方法でＣＯＳ細胞に導入した。即ち、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌと上記各プラスミドＤＮＡ１２．５μｇとを添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ細胞に添加した。５％ＣＯ２存在下、３７℃で  ３日間培養した後に培養上清を回収した。培養上清中に含まれるＣＯＬ０１１９１−ＨｉｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後、抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ・Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＱＩＡＧＥＮおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体；ＤＡＫＯ）を用いてウエスタンブロッティングにて検出を行った。投与抗原及び測定に使用する標準品として可溶型「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を大量に調製し、ニッケルカラム（Ｈｉｔｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム、アマシャムバイオテクノロジー）を用いて培養上清より可溶型「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を精製した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと記載する、シグマ）で透析後、精製した可溶型「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の濃度を２８０ｎｍの吸光度より算出した（吸光係数：１ｍｇ／ｍＬ）。
実施例６  「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質特異的ポリクローナル抗体の作製  実施例５で作製した「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質（ＣＯＬ０１１９１−Ｈｉｓ）を用いてウサギに免疫を行い、ポリクローナル抗体を作製した。すなわち、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質２０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、ニュージランド白色ウサギ（北山ラベス）メス、２．０−２．４９ｋｇの背部皮内に１ｍＬ投与した。２週間後、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質２０μｇをフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、同様に投与し、さらに１週間後、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質２０μｇを耳静脈より投与した。投与開始２ヵ月後、耳静脈より採血後、定法にしたがい抗血清を分離し、抗体を精製した。まず、抗血清に最終濃度３３％となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で１時間攪拌後、析出した沈殿を遠心分離した。次に沈殿をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶解し、透析後プロセップＡカラム（ミリポア）によりＩｇＧ画分のみを精製した（以下、本精製抗体をＡＤ１抗体と記載する）。溶出液のｐＨを中性に戻し、ＰＢＳで透析後、２８０ｎｍの吸光度より蛋白濃度を算出した（吸光係数：０．５３３ｍｇ／ｍＬ）。
実施例７  「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製  「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質（ＣＯＬ０１１９１−Ｈｉｓ）１００μｇを１００μＬの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、Ｗｉｓｔａｒラット８週齢メスの各後足フットパッドに１００μＬづつ投与した。２週間後、腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行った。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）と混合後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。
スクリーニングは「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質（ＣＯＬ０１１９１−Ｈｉｓ）を直接プレートに固相化するＥＬＩＳＡ法で行った。まず、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ヌンク）にＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質及び異なるＨｉｓタグ蛋白質を各ウエルに５０μＬ添加し、４℃で一夜静置した。次にプレートをイオン交換水で５回洗浄後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加し、室温で１時間静置させブロッキングを行った。得られたハイブリドーマからサンプリングした培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈した溶液を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ．ＢｉｏＦＸ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定し、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質と反応し、異なるＨｉｓタグ蛋白質とは反応しない抗体を産生しているハイブリドーマを含むウエルを選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質と結合する抗体を産生するハイブリドーマを同様にスクリーニングした。その結果、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質とのみ結合するモノクローナル抗体Ｆ１１１２−３−１抗体を得た。ハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で培養し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇカラム（Ｂｉｏｐｒｏｓｓｅｓｉｎｇ）を用いて抗体を精製した。
実施例８  サンドイッチＥＬＩＳＡ系の作製
ＡＤ１抗体固相／ペルオキシダーゼ標識ＡＤ１抗体を用いて以下のようにサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製した。まず、中根らの方法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，２２，１０８４，１９７４）に従い０．５ｍｇのペルオキシダーゼ（東洋紡）を蒸留水に溶解し、蒸留水で溶解した１００ｍＭの過ヨウ素酸を添加し２５℃で２０分間反応した。反応終了後１．５％エチレングリコールを添加し２５℃で１０分間反応後１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）に対して透析した。精製ＡＤ１抗体を１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で透析し、０．５ｍｇに対して１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を添加して活性化した０．５ｍｇのペルオキシダーゼをそれぞれの抗体と等量に混合し２５℃で２時間反応した。４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウムを添加しさらに２時間４℃で反応した。反応液をＰＢＳに透析しペルオキシダーゼ標識ＡＤ１抗体を得た。ＡＤ１抗体固相プレートはＡＤ１抗体をＳＣＢ（ｐＨ９．５）で２０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。５６℃で３０分間反応後、イオン交換水で５回洗浄し、２０％ブロックエース（雪印乳業）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各ウエルに１００μＬ添加することにより作製した。標準品は精製「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質を、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１５．６、３１．３、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌに希釈し調製した。ブランクは０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用した。測定は、まずプレートのブロッキング剤を廃棄し、調製した標準品及びブランクを５０μｌ分注し、４℃で一晩反応させた。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄し、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）により０．５μｇ／ｍｌに希釈したペルオキシダーゼ標識ＡＤ１を５０μｌ分注し、３７℃で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ．ＢｉｏＦＸ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線を作成した。図２に作成した標準曲線を示した。
実施例９  各種患者血清中「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の測定
健常人２０例（男性１０例、女性１０例）及び各種疾患患者（３４疾患、１００例）を実施例８に記載の測定系を用いて測定した。図３に示すように、健常人の測定値は１．５〜２．５μｇ／ｍＬであった。男女差は認められなかった。低値傾向を示した疾患は、冠動脈疾患（狭心症、・急性心筋梗塞）、糖尿病Ｔｙｐｅ２、肺腫瘍、心不全、心臓病、高血圧症、肝不全、肝硬変、胆石、膵炎、急性白血病、慢性白血病、脳梗塞、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ型老年痴呆症、痴呆、シェーグレン症候群であった。循環器疾患が低値を示すのは、アディポネクチンと類似していた。一方、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質は卵巣がん、自己免疫性肝炎、骨粗しょう症、Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、慢性関節リウマチで高値を示すことが明らかとなった。アデイポネクチンにおいては高値を示す症例は報告されておらず、このような疾患で高値を示すのは「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質に特有の性質であると言える。
「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質は健常人血中で１．５〜２．５μｇ／ｍＬオーダーと高濃度で検出される蛋白質であり、冠動脈疾患、糖尿病患者等では健常人と比較して低値傾向を、卵巣がん、自己免疫性肝炎、骨粗しょう症、Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、慢性関節リウマチにおいては高値を示す例があり、「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質がこれらの疾患と関係していることが明らかになった。
下表は「Ｃ−ＣＯＬ０１１９１」蛋白質の測定値が高値及び低値傾向を示した疾患をまとめたものである。
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発明の効果
当該遺伝子はアディポネクチン様蛋白質をコードする遺伝子であり、当該蛋白質は、動脈硬化症等本発明の蛋白質が関与する疾患の治療薬となり得る。また当該遺伝子の核酸あるいは該核酸を発現するベクターも、同様に動脈硬化症等本発明の蛋白質が関与する疾患の治療剤となり得る。さらに当該遺伝子は、診断用のプローブとして用いることができる。すなわち、動脈硬化症等本発明の蛋白質が関与する疾患の研究、予防および治療に役立つ。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例３における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。右レーンは分子量マーカーを示し、左レーンはプラスミドｐＩＶＣＯＬ１９を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎにより発現させたＣ−ＣＯＬ０１１９１蛋白質を示す。
第２図は、ＡＤ１抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系の標準曲線を示したものである。
第３図は、ＡＤ１抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて正常人、各種疾患患者（３４疾患）の血清測定を行った結果を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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