(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式化１で示される制限酵素認識部位を有し、約１１．５ｋｂ長である、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３８７として寄託されたラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株(特許生物寄託センター)から分離したプラスミドｐＣＰ５３。
【化１】
0003746556.tif 000004
【請求項２】
請求項１記載のプラスミドｐＣＰ５３の複製開始領域、細菌由来の複製開始領域、及びマーカー遺伝子を含むプラスミドベクター。
【請求項３】
請求項１記載のプラスミドｐＣＰ５３のＨｉｎｄＩＩＩ断片に含まれる約２ｋｂ長の複製開始領域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域、及びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリン耐性遺伝子を含み、下記式化２に示される制限酵素認識部位を有し、約４．７ｋｂ長であるプラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄ。
【化２】
0003746556.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）由来に代表される新規なプラスミド、及びこの新規なプラスミドを用いて調製されるところの、微生物の形質転換に利用でき、例えばラクトバチルス・ヘルベティカスと他の宿主とのシャトルベクターとして使用することができる新規なプラスミドベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ラクトバチルス・ヘルベティカスは、古くから代表的な酪農用乳酸菌スターターとして発酵乳の製造に用いられている。ラクトバチルス・ヘルベティカスの特徴の１つとして、強い蛋白質分解活性が認められている（Yamamoto, N., et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 58, 776-778(1994)）。またラクトバチルス・ヘルベティカスの発酵乳中には、血圧上昇作用に主要な役割を果たすアンギオテンシン変換酵素に対して、阻害作用を示す生理活性ペプチドが含まれることが（Nakamura, Y. et al., J. Dairy Sci., 78, 777-783(1995)）、更にはこれらのペプチドに起因する強い血圧降下作用が認められることが報告されている（Nakamura, Y., et al., J. Dairy Sci., 78, 1253-1257(1995)）。このような菌株を有効利用する方法としては、従来から遺伝子組換え技術を応用して、分子育種する方法等が知られている。既に、乳酸菌について多くのプラスミドが報告されているが、乳酸桿菌ラクトバチルス・ヘルベティカスのプラスミドについての報告例は少ない。従って、ラクトバチルス・ヘルベティカスの宿主−ベクター系についての報告例も少ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
分子育種を遺伝子組換え技術に基づいて行うには、目的の菌株に合ったベクター、導入効率が高い形質転換法、及び安定にプラスミドを保持する宿主、即ち宿主−ベクター系の開発が重要課題である。特に、宿主当たりのコピー数が少ないと有効物質生産性も低くなり、実用性に問題が生じる。また、菌体自体を発酵乳として食する場合には、発酵に使用する微生物の安全性が問題となる。しかし、既に古くから発酵乳製造に用いられてきたラクトバチルス・ヘルベティカスの安全性については、これまで長年の食経験から実証されている。
【０００４】
従って、本発明の課題は、ラクトバチルス属乳酸菌、特にラクトバチルス・ヘルベティカス由来に代表され、高コピー数を有する新規なプラスミド及びその新規なプラスミドを改変したシャトルベクターとして使用できる新規なプラスミドベクターを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ラクトバチルス・ヘルベティカス等に属する菌株のプラスミドの有無及びその分子量を検討した結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株から、安定に保持され高コピー数である新規なプラスミドを見い出し、さらにこの新規なプラスミドを改変することにより、効率的に形質転換を行うことができる有用なプラスミドベクターを得、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明によれば、下記式化３で示される制限酵素認識部位を有し、約１１．５ｋｂ長である、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３８７として寄託されたラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株(特許生物寄託センター)から分離したプラスミドｐＣＰ５３が提供される。
【０００７】
【化３】
0003746556.tif 000002
【０００８】
また本発明によれば、前記プラスミドｐＣＰ５３の複製開始領域、細菌由来の複製開始領域、及びマーカー遺伝子を含むプラスミドベクターが提供される。
【０００９】
さらに本発明によれば、前記プラスミドｐＣＰ５３のＨｉｎｄＩＩＩ断片に含まれる約２ｋｂ長の複製開始領域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域、及びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリン耐性遺伝子を含み、下記式化４に示される制限酵素認識部位を有し、約４．７ｋｂ長であるプラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄが提供される。
【００１０】
【化４】
0003746556.tif 000003
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のプラスミドｐＣＰ５３は、前記式化３で表わされる約１１．５ｋｂ長のプラスミドであって、例えばラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株から分離することができる。このラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株は、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属し、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ−１５３８７として寄託されている。このＣＰ５３株は、本願出願人が保有する菌株コレクションの中から得たものであり、下記の菌学的性質を有する。
【００１２】
（形態学的性質）
１）細胞の形状：桿菌、２）運動性：無、３）胞子の有無：無、４）グラム染色性：陽性
（生理学的性質）
１）カタラーゼ：陰性、２）インドール生成：陰性、３）硝酸塩の還元：陰性、４）酸素に対する態度：通性嫌気性、５）グルコースからホモ乳酸発酵によりＤＬ乳酸を生成、ガス産生無し。
【００１３】
６）各種炭水化物の分解性
グルコース：      ＋        マルトース：    −
ラクトース：      ＋        セルビオース：  −
マンノース：      ＋        トレハロース：  −
フラクトース：    ＋        メルビオース：  −
ガラクトース：    ＋        ラフィノース：  −
シュークロース：  −        スタキオース：  −
マルトース：      ＋        マンニトール：  −
アラビノース：    −        ソルビトール：  −
キシロース：      −        ユースクリン：  −
ラムノース：      −        サリシン：      −
本発明のプラスミドｐＣＰ５３は、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体中で、高コピー数が産生され回収率が高い。例えば、ｐＣＰ５３を保有するラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株をＭＲＳ培地にて一晩培養した場合、１ｍｌの培養液から約１μｇのプラスミドを精製することができる。
【００１４】
本発明のプラスミドｐＣＰ５３は、例えば前記ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株を培養し、培養後菌体を回収し、アガロースゲル電気泳動方法等の公知な方法で分離することができる。前記培養は、通常この菌種に用いられる培地や培養条件により行うことができる。菌体の回収も公知の遠心分離法等により行うことができる。またプラスミドｐＣＰ５３は、制限酵素による切断、リガーゼによるライゲーションも公知のプラスミドと同様に行うことができる。
【００１５】
本発明のプラスミドベクターは、プラスミドｐＣＰ５３の複製開始領域に、細菌由来の複製開始領域及びマーカー遺伝子を連結したものであって、前記プラスミドｐＣＰ５３のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む約２ｋｂ長の複製開始領域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域、及びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリン耐性遺伝子を含み、前記式化４に示される制限酵素認識部位を有し、約４．７ｋｂ長であるプラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄ等を挙げることができる。
【００１６】
前記細菌由来のプラスミドとしては、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域の他に、公知のｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９等の複製開始領域を用いることが可能である。更に、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ２４、ｐＶＡ８３８等の、枯草菌や酵母由来ベクターの複製開始領域等の使用も可能である。
【００１７】
前記マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、あるいは乳酸菌又は枯草菌由来のβ−ガラクトシダーゼや菌体外プロテアーゼ等の酵素を産生する遺伝子等を挙げることができる。
【００１８】
前記プラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄは、図２に示す手順により、本発明のプラスミドｐＣＰ５３に、ｐＨＹ３００ＰＬＫプラスミド（宝酒造（株）製品）を利用し、大腸菌由来プラスミドｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域及びストレプトコッカス・フェカリス由来のプラスミドｐＡＭα１のテトラサイクリン耐性遺伝子を連結することにより得ることができる。図２に示す本発明以外のプラスミドは、公知であり、市場で購入することができる。このプラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄは、大腸菌及びラクトバチルス・ヘルベティカスやラクトバチルス・パラカゼイ等ラクトバチルス属乳酸菌へ導入できるシャトルベクターとして使用可能である。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のプラスミドｐＣＰ５３は、ラクトバチルス・ヘルベティカス中に安定に保持されかつ高コピー数を示す。また本発明のプラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄは、ラクトバチルス・ヘルベティカスの形質転換を効率的に行うことができる有用なシャトルベクターである。従って、これらは遺伝子組換え技術を用いたラクトバチルス・ヘルベティカスの分子育種等に有用である。
【００２０】
【実施例】
以下実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例１】
（プラスミドの分離）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株を、ＧＡＭ培地（ニッスイ（株）製）に植菌後、３７℃で一晩培養した。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分間）により集菌した。菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）で洗浄後、上記遠心分離条件にて菌体を回収した。
【００２２】
次に以下の方法でプラスミドの精製を行った。回収した菌体を１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ社製）、１ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−アセチルムラミダーゼ（生化学工業（株）製）を含む２５％シュークロース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液０．２ｍｌ（ｐＨ７．０）に懸濁後、３７℃で３０分間インキュベートした。次に３％ＳＤＳ−０．２Ｎ  ＮａＯＨ溶液０．４ｍｌを添加し室温にて約５分間放置した。次に、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）溶液を０．３ｍｌ添加し、氷上で５分間放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）により上清液を回収した。約２倍量のエタノールを上清液に添加し、−８０℃にて約２０分間放置した。続いて、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）にて沈殿物を回収し、７０％エタノールにて洗浄後、沈殿物を乾燥した。沈殿物を０．１ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に溶解し、プラスミドの粗精製物を得た。この粗精製プラスミドについて、１％アガロースゲル電気泳動によりプラスミドの有無及び分子サイズの確認を行った。比較のためプラスミドｐＢＲ３２２保有の大腸菌ＨＢ１０１株をＬＢ培地（バクトトリプトン１０ｇ、イ−ストイクストラクト５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ：ｐＨ７．５）で培養し、同様にプラスミドの回収量を比較した。その結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株は、極めて高い回収率でプラスミドの存在が確認され、これをｐＣＰ５３と命名した。ｐＣＰ５３の回収量は、大腸菌用プラスミドであるｐＢＲ３２２の約２０％程度（１μｇ／ｍｌ培養液）であり、ラクトバチルス・ヘルベティカスプラスミドとしては、極めて高い回収率であった。
【００２３】
ｐＣＰ５３の制限酵素認識部位を探る目的で、６塩基認識の制限酵素９種類について、切断断片を１％アガロース電気泳動により分析した。その結果、ｐＣＰ５３は分子量約１１．５ｋｂで、図１に示す制限酵素認識部位を有することが確認された。また、ＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ、あるいはＳａｌＩに対する認識部位は認められなかった。
【００２４】
【実施例２】
（プラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄの構築）
図２に示す操作手順に従って、プラスミドｐＣＰ５３の複製開始領域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域、及びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを構築した。
【００２５】
１）複製開始領域検索用ベクターの構築
図２に示される、大腸菌由来プラスミドｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域（Ori-177）、ストレプトコッカス・フェカリス由来のプラスミドｐＡＭα１の複製開始領域（Ori-pAMα1）、ならびにアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含んだプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造（株）製）１μｇを、ＨａｅＩＩＩで部分分解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションした。このＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１株にマニアチスの方法(Molecular Cloning)に従って形質転換し、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地で生育株を選択した。図２に示す通りｐＨＹ３００ＰＬＫのグラム陽性菌用複製開始点欠損株はアンピシリン感受性となるために、上記選択株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で生育性を調べた。アンピシリン感受性株数株から前述の方法に従いプラスミドを分離し、その制限酵素認識部位を調べたところ、図２記載のｐＨＹＤ（２．７ｋｂ）が構築されていることが確認された。
【００２６】
２）ｐＣＰ５３プラスミド複製開始領域のクローニング
前述のグラム陽性菌複製開始点検索用ベクターｐＨＹＤ  １μｇをＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断したものと、ｐＣＰ５３  １μｇをＨｉｎｄＩＩＩで切断したものとを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１に形質転換し、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地で生育株を選択した。得られた形質転換体から得られたＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動で分析した結果、ｐＣＰ５３由来と思われる様々の大きさのＨｉｎｄＩＩＩ断片がｐＨＹＤベクターに挿入されていることを確認した。
【００２７】
次に、これら各種のプラスミドをラクトバチルス・パラカゼイに導入し、４μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＧＡＭ培地で生育株をスクリーニングした。ラクトバチルス・パラカゼイＪＣＭ−８１３０を１．５ｍＭのグリシンを含むＧＡＭ培地で、３７℃、２０時間培養後、この培地をさらに新しい１．５ｍＭのグリシン含有ＧＡＭ培地で１０倍に希釈し、３７℃で濁度１．０になるまで培養した。菌体を集菌後、エレクトロポレーション用緩衝液（７ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２７２ｍＭシュークロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2：ｐＨ７．４）で洗浄し、１／２０容の同緩衝液に懸濁した。前記各種プラスミド０．１μｇと前記懸濁菌体０．１ｍｌを混合後、バイオラッド社製ジーンパルサー用キュベット（０．１ｃｍキュベット）に入れ氷上で３０分間インキュベートした。その後、ジーンパルサーで４．０ｋＶ／ｃｍ、２５μＦの条件でエレクトロポレーションした。菌体を１０倍量のＧＡＭ培地で希釈後、３７℃で１時間インキュベートし、４μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＧＡＭ寒天培地で陽性クローンを選択した。得られた形質転換体についてプラスミドを１％アガロースゲル電気泳動により分析したところｐＣＰ５３の約２ｋｂの断片を含む４．７ｋｂのプラスミドの存在が確認された。従って、ｐＣＰ５３の約２．０ｋｂＤＮＡ断片にｐＣＰ５３の複製開始領域（Ori-pCP53）が含まれることが明らかとなった。このベクターは大腸菌あるいはラクトバチルス属での複製可能なシャトルベクターとしての利用が可能であり、ｐＣＰ５３Ｄと命名した。一方、この２．０ｋｂＤＮＡ断片を含まないｐＨＹＤ（２．７ｋｂ）ベクターのみではテトラサイクリン形質転換体は得られなかった。
【００２８】
【実施例３】
（ラクトバチルス・ヘルベティカス株のｐＣＰ５３Ｄによる形質転換）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ６１１株（工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭ−１５４１８）へ前記ｐＣＰ５３Ｄを用いての形質転換を検討した。ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ６１１株を１．５ｍＭのグリシンを含むＧＡＭ培地で、３７℃、２０時間培養後、この培地をさらに新しい１．５ｍＭのグリシン含有ＧＡＭ培地で１０倍に希釈し、３７℃で濁度１．０になるまで培養した。菌体を集菌後、エレクトロポレーション用緩衝液（７ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２７２ｍＭシュークロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2：ｐＨ７．４）で洗浄し、１／２０容の同緩衝液に懸濁した。ｐＣＰ５３Ｄ  ０．１μｇと前記懸濁菌体０．１ｍｌとを混合後、前記と同様の条件にてエレクトロポレーションした。菌体を１０倍量のＧＡＭ培地で希釈して３７℃で１時間インキュベート後、４μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＧＡＭ寒天培地で陽性クローンを選択した。約６日後、５０００個／μｇＤＮＡの割合で形質転換体が得られた。この形質転換体は、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン濃度において、５０％生残性を示した。
【００２９】
得られた形質転換体について、プラスミドを１％アガロースゲル電気泳動により分析したところｐＣＰ５３の約２ｋｂの断片を含む４．７ｋｂのプラスミドの存在が確認された。さらに、ここで得られた形質転換体を繰り返し継代しても、プラスミドが安定に保持されることが確認された。従って、このベクターはラクトバチルス・ヘルベティカス種の形質転換において有用なシャトルベクターであり、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ６１１株を用いることで効率的形質転換が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のプラスミドｐＣＰ５３の制限酵素地図である。
【図２】図２は、本発明のプラスミドｐＣＰ５３Ｄの構築経路の説明図である。
【図１】
0003746556.tif 000006
【図２】
0003746556.tif 000007