(57)【要約】（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニン、および、５−（フルオロベンジル）ヒダントインを、Ｒ体を選択的に加水分解する能力を有する酵素もしくは当該能力を有する微生物で処理することを特徴とする（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンの製造法。この化合物は医薬品などの原料として有用な光学活性（Ｒ）体フルオロフェニルアラニン誘導体の原料として利用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
2002022844.tif 000009
（式中、Ｘ１およびＸ２は水素原子またはフッ素原子）で表わされる（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニン。
【請求項２】
（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（２−フルオロフェニル）アラニン。
【請求項３】
（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（３−フルオロフェニル）アラニン。
【請求項４】
（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（４−フルオロフェニル）アラニン。
【請求項５】
（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（３，４−ジフルオロフェニル）アラニン。
【請求項６】
一般式（ＩＩ）：
2002022844.tif 000010
（式中、Ｘ１およびＸ２は水素原子またはフッ素原子）で表わされる５−（フルオロベンジル）ヒダントインに、（Ｒ）体を選択的に加水分解する酵素もしくは当該能力を有する微生物を作用させることを特徴とする一般式（Ｉ）：
2002022844.tif 000011
（式中、Ｘ１およびＸ２は前記と同じ）で表わされる（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンの製造法。
【請求項７】
酵素または微生物が、バチルス属、アルカリゲネス属もしくはシュードモナス属の微生物、またはこれら微生物由来の酵素である請求の範囲第６項記載の製造法。
【請求項８】
酵素または微生物が、バチルス・エスピー、アルカリゲネス・ファエカリスもしくはシュードモナス・プチダ、またはこれら当該微生物由来の酵素である請求の範囲第６項記載の製造法。
【請求項９】
酵素または微生物が、バチルス・エスピー　ＫＮＫ１０８（寄託機関　独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６、寄託日　１９８１年７月２日、受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−８８７）、アルカリゲネス・ファエカリス　ＩＦＯ１３１１１もしくはシュードモナス・プチダ　ＩＦＯ１２９９６、または当該微生物由来の酵素である請求の範囲第６項記載の製造法。
【請求項１０】
一般式（ＩＩ）：
2002022844.tif 000012
（式中、Ｘ１およびＸ２は水素原子またはフッ素原子）で表わされる化合物が、一般式（ＩＩＩ）：
2002022844.tif 000013
（式中、Ｘ１およびＸ２は前記と同じ）で表わされるフルオロベンズアルデヒドとヒダントインを塩基の存在下で反応させ、一般式（ＩＶ）：
2002022844.tif 000014
（式中、Ｘ１およびＸ２は前記と同じ）で表わされる５−（フルオロベンジリデン）ヒダントインを製造し、ついで、ラネーニッケルもしくはパラジウム炭素触媒の存在下で還元して得られたものである請求の範囲第６項記載の製造法。
【請求項１１】
一般式（ＩＩ）：
2002022844.tif 000015
（式中、Ｘ１およびＸ２は水素原子またはフッ素原子）で表わされる化合物が５−（２−フルオロベンジル）ヒダントイン、５−（３−フルオロベンジル）ヒダントイン、５−（４−フルオロベンジル）ヒダントインまたは５−（３，４−ジフルオロベンジル）ヒダントインである請求の範囲第６項、第７項、第８項、第９項または第１０項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は医薬品の製造中間体として有用な（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンおよびその製造法に関する。
背景技術
本願発明の（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンは、容易に対応する（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（フルオロフェニル）プロピオン酸に誘導することができると考えられる。これらの（Ｒ）体フルオロフェニルアラニン誘導体は、フッ素を含む医薬品の合成鍵中間体に容易に誘導可能な化合物として重要なアミノ酸誘導体である（たとえば、ジャーナル　オブ　メディシナル　ケミストリー、３８巻、５０２３頁、１９９５年および特開昭６１−２６００９９号公報および特開平９−２０８５４１号公報および国際公開第９７／３８００９号パンフレット参照）。
ここで、光学活性Ｎ−（アミノカルボニル）−フェニルアラニン誘導体、とくに（Ｒ）体の立体配置を有する化合物の製法としては、５−ベンジルヒダントイン、あるいは５−（置換ベンジル）ヒダントインを、（Ｒ）体を選択的に加水分解する能力を有する微生物で処理し、対応する（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フェニルアラニン誘導体を得る方法が知られている。例えば、
（１）５−ベンジルヒダントイン、および５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインをバチルス属の微生物で処理し、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フェニルアラニン、および（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−チロシンを得た例（特開昭５６−５８４９３号公報）
（２）５−ベンジルヒダントインをハンセニュラ属の微生物で処理し、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フェニルアラニンを得た例（特開昭６１−７１１９６号公報）、および
（３）５−ベンジルヒダントイン、および５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインをアグロマイセス属、クロモバクテリウム属、またはセルロモナス属の微生物で処理し、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フェニルアラニン、および（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−チロシンを得た例（特開平１−２２８４８９号公報）
などがある。
しかしながら、本発明の（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンについては製造、単離された報告はない。
本発明は、前記現状に鑑み、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニン、およびその製造法を提供することを目的とする。
発明の開示
前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、５−（フルオロベンジル）ヒダントインの（Ｒ）体を選択的に加水分解する能力を有する微生物を見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）：
2002022844.tif 000002
（式中、Ｘ１およびＸ２は水素原子またはフッ素原子）で表わされる（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンに関する。
本発明において、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンが（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（２−フルオロフェニル）アラニン、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（３−フルオロフェニル）アラニン、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（４−フルオロフェニル）アラニンまたは（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（３，４−ジフルオロフェニル）アラニンであることが好ましい。
また、本願発明は、一般式（ＩＩ）：
2002022844.tif 000003
（式中、Ｘ１およびＸ２は水素原子またはフッ素原子）で表わされる５−（フルオロベンジル）ヒダントインに、（Ｒ）体を選択的に加水分解する酵素もしくは当該能力を有する微生物を作用させることを特徴とする一般式（Ｉ）：
2002022844.tif 000004
（式中、Ｘ１およびＸ２は前記と同じ）で表わされる（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンの製造法に関する。
前記製造法において、酵素または微生物が、バチルス属、アルカリゲネス属もしくはシュードモナス属の微生物、またはこれら微生物由来の酵素であることが好ましい。
前記製造法において、酵素または微生物が、バチルス・エスピー、アルカリゲネス・ファエカリスもしくはシュードモナス・プチダ、またはこれら当該微生物由来の酵素であることがより好ましい。
前記製造法において、酵素または微生物が、バチルス・エスピー　ＫＮＫ１０８（寄託機関　独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６、寄託日　１９８１年７月２日、受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−８８７）、アルカリゲネス・ファエカリス　ＩＦＯ１３１１１もしくはシュードモナス・プチダ　ＩＦＯ１２９９６、または当該微生物由来の酵素であることがさらに好ましい。
また、前記製造法において、一般式（ＩＩ）：
2002022844.tif 000005
（式中、Ｘ１およびＸ２は水素原子またはフッ素原子）で表わされる化合物が、一般式（ＩＩＩ）：
2002022844.tif 000006
（式中、Ｘ１およびＸ２は前記と同じ）で表わされるフルオロベンズアルデヒドとヒダントインを塩基の存在下で反応させ、一般式（ＩＶ）：
2002022844.tif 000007
（式中、Ｘ１およびＸ２は前記と同じ）で表わされる５−（フルオロベンジリデン）ヒダントインを製造し、ついで、ラネーニッケルもしくはパラジウム炭素触媒の存在下で還元して得られたものであることが好ましい。
さらに、前記製造法において、一般式（ＩＩ）：
2002022844.tif 000008
（式中、Ｘ１およびＸ２は水素原子またはフッ素原子）で表わされる化合物が５−（２−フルオロベンジル）ヒダントイン、５−（３−フルオロベンジル）ヒダントイン、５−（４−フルオロベンジル）ヒダントインまたは５−（３，４−ジフルオロベンジル）ヒダントインであることが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明の一般式（Ｉ）で表わされる化合物としては、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（２−フルオロフェニル）アラニン、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（３−フルオロフェニル）アラニン、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（４−フルオロフェニル）アラニン、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（３，４−ジフルオロフェニル）アラニン、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（２，３−ジフルオロフェニル）アラニン、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（２，３，４−トリフルオロフェニル）アラニンなどがあげられる。
本発明の化合物（Ｉ）、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンは、医薬品などの原料として有用な光学活性（Ｒ）体フルオロフェニルアラニン誘導体の原料として利用可能な化合物である。
本発明の化合物（Ｉ）は、（ａ）一般式（ＩＩＩ）で表わされるフルオロベンズアルデヒドとヒダントインを塩基の存在下で反応させ、一般式（ＩＶ）で表わされる５−（フルオロベンジリデン）ヒダントインを製造し、（ｂ）ついで、ラネーニッケルもしくはパラジウム炭素触媒の存在下で還元することにより、一般式（ＩＩ）で表わされる５−（フルオロベンジル）ヒダントインを製造し、（ｃ）さらに、該５−（フルオロベンジル）ヒダントインに、（Ｒ）体を選択的に加水分解する酵素もしくは当該能力を有する微生物を作用させることにより製造することができる。
以下、前記工程を詳細に説明する。
工程（ａ）：一般式（ＩＩＩ）で表わされるフルオロベンズアルデヒドとヒダントインとの縮合反応であり、この反応により、一般式（ＩＶ）で表わされる５−（フルオロベンジリデン）ヒダントインを得る。この際、縮合のための塩基として、水性媒質中で酢酸／酢酸ナトリウムまたは重炭酸アンモニウム、エタノールアミンなどを用いることができる。縮合反応は、約１０〜約１２０℃で、好ましくは約７０℃〜約１２０℃で行なうことができる。フルオロベンズアルデヒドとヒダントインのモル比は０．８〜１．２が好適である。反応終了後は、温度を室温に移行させることにより、水性媒質に難溶な目的物である５−（フルオロベンジリデン）ヒダントインを析出させることができる。これをこのままつぎの工程の原料として使用することもできるし、再結晶やそのほかの精製操作を実施したのち使用してもよい。
工程（ｂ）：一般式（ＩＶ）で表わされる５−（フルオロベンジリデン）ヒダントインを一般式（ＩＩ）で表わされる５−（フルオロベンジル）ヒダントインに還元する工程である。該還元は、ヨウ化水素／赤リン、もしくは氷酢酸中ヨウ化水素を用いるか、または、接触還元水素添加により行なうことができるが、反応収率の観点からは後者の方法が好ましい。接触還元水素添加における触媒としては、ラネーニッケル、パラジウム炭素またはアルコール性媒質中酸化白金が使用できる。
工程（ｃ）：一般式（ＩＩ）で表わされる５−（フルオロベンジル）ヒダントインに、該化合物の（Ｒ）体を選択的に加水分解する酵素もしくは当該能力を有する微生物を作用させることにより、一般式（Ｉ）で表わされる（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンを製造する工程である。
一般式（ＩＩ）で表わされる５−（フルオロベンジル）ヒダントインを（Ｒ）体選択的に加水分解する微生物は、たとえば以下の方法で見い出すことができる。まず微生物の培養液５ｍｌから遠心分離によって菌体を集め、５−（４−フルオロベンジル）ヒダントインを０．０１〜１％含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．５ｍｌに懸濁し、試験管中で２〜３日間３０℃で振とうする。目的とする加水分解能力の判別は、振とう反応後の反応液を適宜テトラヒドロフランで希釈し、その液を遠心分離して菌体などの不溶物を除き、ＨＰＬＣ分析〔カラム：ワイエムシィ社製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝４／１、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１５ｎｍ、カラム温度：２５℃、溶出時間：５−（４−フルオロベンジル）ヒダントイン；９．７分、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（４−フルオロフェニル）アラニン；８．４分、なおこの条件は例示である〕により反応液中のＮ−（アミノカルボニル）−（４−フルオロフェニル）アラニンの生成量を求めることにより行なうことができる。
本発明で使用する微生物は、細菌、放線菌、かびおよび酵母の中から前記の検定に合格するものが選ばれる。たとえば、細菌に属するものとしては、アクロモバクター属、アエロバクター属、アエロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アルスロバクター属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エルウイニア属、エシェリヒア属、クレブシーラ属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、プロタミノバクター属、プロテウス属、スルシナ属、セラチア属、キサントモナス属など、放線菌に属するものとしては、アクチノミセス属、アクチノプラネス属、ミコバクテリウム属、ロードコッカス属、ストレプトミセス属など、かびに属するものとしては、アスペルギルス属、パエシロミセス属、ペニシリウム属など、酵母に属するものとしては、キャンディダ属、ハンゼヌラ属、ピヒア属、ロードトルラ属、トルロプシス属などがある。
なかでもバチルス属、アルカリゲネス属、シュードモナス属の微生物が好適に使用でき、好ましくは、バチルス・エスピー、アルカリゲネス・ファエカリス、シュードモナス・プチダであり、より好ましくは、バチルス・エスピー　ＫＮＫ１０８（受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−８８７）、アルカリゲネス・ファエカリス　ＩＦＯ１３１１１、シュードモナス・プチダ　ＩＦＯ１２９９６である。
これらの微生物の培養には、通常これらの微生物が資化し得る栄養源であればとくに制限なく使用し得る。たとえば、グルコース、シュークロース、マルトースなどの糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸などの有機酸類、エタノール、グリセリンなどのアルコール類、パラフィンなどの炭化水素類、大豆油、菜種油などの油脂類、またはこれらの混合物などの炭素源や、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカーなどの窒素源を混合することもできる。さらに、その他の無機塩、ビタミン類などの栄養源を適宜混合することもできる。さらに各種のピリミジン系核酸塩基類またはそれらの誘導体、あるいは各種のヒダントイン類を０．０５〜０．８％添加して所望の酵素を適応的に増強させることが望ましい。
酵素誘導効果の高いピリミジン系核酸塩基類としては、ウラシル、シトシンおよびチミンがあり、それらの誘導体としてはジヒドロウラシル、ジヒドロチミジンなどがある。また、ヒダントイン類の中では、ヒダントイン、ＤＬ−５−メチルヒダントインなどが望ましい。
微生物の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えばｐＨ４〜９、温度範囲２０℃〜５０℃の範囲で、好気的に１０〜９６時間培養する。
５−（フルオロベンジル）ヒダントインに微生物を反応させる場合においては、通常、前記微生物の培養液をそのまま反応に使用することもできるが、培養液の濃縮物も用いることができる。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離などにより処理して得られる菌体または菌体処理物を使用することが好ましい。
前記微生物の菌体処理物としてはとくに限定されず、例えば、アセトンや五酸化二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得られる乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出標品などをあげることができる。更に、培養物より加水分解反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。
加水分解反応の際には、基質である５−（フルオロベンジル）ヒダントインを反応の初期に一括して添加してもよく、反応の進行にあわせて分割して添加してもよい。
また、反応時の温度は通常１０〜７０℃、好ましくは、２０〜６５℃であり、反応時のｐＨは７〜１１、好ましくは、７〜１０である。
反応液中の微生物の濃度はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３０％である。
反応は通常、振とうまたは攪拌しながら行なう。反応時間は基質濃度、微生物の濃度およびその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。また、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
加水分解反応により生成した（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンは、反応液から遠心分離、濾過などにより微生物などの酵素源を除去したのち、反応液のｐＨを２〜５に調整することにより析出した結晶を濾取することにより採取することができる。さらに、再結晶操作などにより精製すればより高純度の（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンを得ることができる。
つぎに実施例をあげて本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
２５ｇ（０．２５モル）のヒダントイン、３４ｇ（０．２７モル）の４−フルオロベンズアルデヒドおよび水１２５ｍｌの混合液に、３９．５ｇ（０．５モル）の重炭酸アンモニウムを１０分間で加えた。得られた混合物を還流下４時間加熱攪拌した。反応液を室温まで冷却し生成物を濾別し、冷水で洗浄し乾燥したのち、５−（４−フルオロベンジリデン）ヒダントイン４３．５ｇ（収率８４％）を得た。
実施例２
４−フルオロベンズアルデヒドの代わりに同量の２−フルオロベンズアルデヒドを用いた以外は実施例１と同様の操作により、５−（２−フルオロベンジリデン）ヒダントイン４０ｇ（収率７７％）を得た。
実施例３
４−フルオロベンズアルデヒドの代わりに同量の３−フルオロベンズアルデヒドを用いた以外は実施例１と同様の操作により、５−（３−フルオロ−ベンジリデン）ヒダントイン４１ｇ（収率７９％）を得た。
実施例４
４−フルオロベンズアルデヒドの代わりに３８ｇ（０．２７モル）の３，４−ジフルオロベンズアルデヒドを用いた以外は実施例１と同様の操作により、５−（３，４−ジフルオロベンジリデン）ヒダントイン３８ｇ（収率６８％）を得た。
実施例５
重炭酸アンモニウムの代わりに、エタノールアミン２１ｇを用いた以外は実施例１と同様の操作により、５−（４−フルオロベンジリデン）ヒダントイン４０ｇ（収率７７％）を得た。
実施例６
２０ｇ（０．０９７モル）の５−（４−フルオロベンジリデン）ヒダントインを５００ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、１０％パラジウム炭素８ｇを添加した。混合物を２５℃で、大気圧下かつ１８時間攪拌しながら水素化した。触媒を濾別し、テトラヒドロフランで洗浄した。濾液を減圧下濃縮したところ固定物が析出した。これに水１３００ｍｌを加えて９０℃まで加熱して固形物を溶解させた。一晩かけて室温まで冷却し、析出した５−（４−フルオロベンジル）ヒダントイン１８ｇ（収率９０％）を濾取した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６　δ　ｐｐｍ）：１０．４８（ｓ、１Ｈ）、７．９１（ｓ、１Ｈ）、７．２２（ｍ、２Ｈ）、７．１０（ｍ、２Ｈ）、４．３２（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｍ、２Ｈ）
実施例７
５−（４−フルオロベンジリデン）ヒダントインの代わりに、５−（２−フルオロベンジリデン）ヒダントインを用いた以外は実施例６と同様の操作により、５−（２−フルオロベンジル）ヒダントイン１８ｇ（収率９０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６　δ　ｐｐｍ）：１０．５０（ｓ、１Ｈ）、７．９３（ｓ、１Ｈ）、７．３０（ｍ、２Ｈ）、７．１５（ｍ、２Ｈ）、４．３０（ｍ、１Ｈ）、３．０５（ｍ、１Ｈ）、２．８８（ｍ、１Ｈ）
実施例８
５−（４−フルオロベンジリデン）ヒダントインの代わりに、５−（３−フルオロベンジリデン）ヒダントインを用いた以外は実施例６と同様の操作により、５−（３−フルオロベンジル）ヒダントイン１８ｇ（収率９０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６　δ　ｐｐｍ）：１０．４８（ｓ、１Ｈ）、７．９２（２、１Ｈ）、７．３１（ｍ、１Ｈ）、７．００（ｍ、３Ｈ）、４．３５（ｍ、１Ｈ）、２．９５（ｍ、２Ｈ）
実施例９
５−（４−フルオロベンジリデン）ヒダントインの代わりに、２２ｇ（０．０９７モル）の５−（３，４−ジフルオロベンジリデン）ヒダントインを用いた以外は実施例６と同様の操作により、５−（３，４−ジフルオロベンジル）ヒダントイン２０ｇ（収率９１．５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６　δ　ｐｐｍ）：１０．５５（ｓ、１Ｈ）、７．９２（ｓ、１Ｈ）、７．３５（ｍ、１Ｈ）、７．２５（ｍ、１Ｈ）、７．０５（ｍ、１Ｈ）、４．３５（ｍ、１Ｈ）、２．９５（ｄｄ、２Ｈ）
実施例１０
（１）培地の調製
下記の組成からなる液体培地を調製し、５００ｍｌ容坂口フラスコに１００ｍｌずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行なった。
培地組成：
肉エキス　　　　　　　２．０％
プロエキス　　　　　　２．０％
ＮａＣｌ　　　　　　　０．３％
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ
ウラシル　　　　　　　０．２％
ｐＨ　　　　　　　　　７．５
（２）培養・集菌
（１）で調製した培地に、綿栓をした大型試験管にて同一組成培地１０ｍｌで３７℃にて１８時間培養したバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＮＫ１０８（受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−８８７）の培養液１ｍｌを接種し、３７℃で２４時間培養を行なった。得られた培養液を遠心分離して集菌し、生理食塩水１００ｍｌで洗浄したのち５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍｌに懸濁した。
（３）加水分解反応
得られた菌体懸濁液を２００ｍｌ容四つ口丸底フラスコに入れ、１ｇの５−（４−フルオロベンジル）ヒダントインを加え、３７℃で２０時間反応させた。反応中、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて反応液のｐＨを９．０に調整した。反応後、１Ｎ塩酸を用いて反応液のｐＨを７．０に調整したのち遠心分離により菌体などの不溶物を除去した。得られた上清のｐＨを１Ｎ塩酸を用いて４．０に調整し、析出した（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（４−フルオロフェニル）アラニン０．８７ｇ（収率８０％）を濾取した。
［α］Ｄ２０＝−３１．５（ｃ＝２、１Ｎ　ＮＨ４ＯＨ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６　δ　ｐｐｍ）：７．２０（ｍ、２Ｈ）、７．１５（ｍ、２Ｈ）、６．１８（ｄ、１Ｈ）、５．６０（ｓ、１Ｈ）、４．３０（ｍ、１Ｈ）、３．００〜２．８０（ｄｄ、２Ｈ）
得られた（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（４−フルオロフェニル）アラニンの一部（２０ｍｇ）を１Ｎ硫酸１ｍｌに溶解し、亜硝酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１時間反応させた。反応液をＨＰＬＣにより分析することにより、目的物の光学純度を求めたところ、９９％ｅｅ以上であった。
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：Ｃｒｏｗｎｐａｋ−ＣＲ（ダイセル化学工業株式会社製）
溶離液：ｐＨ１．５に調整した過塩素酸水溶液
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：０〜５℃；検出波長，２１０ｎｍ
実施例１１
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＮＫ１０８（受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−８８７）の代わりに、アルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ１３１１１を用いた以外は、実施例１０と全く同様の操作により、９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（４−フルオロフェニル）アラニン０．８５ｇ（収率７８％）を得た。
実施例１２
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＮＫ１０８（受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−８８７）の代わりに、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６を用いた以外は、実施例１０と全く同様の操作により、９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（４−フルオロフェニル）アラニン０．９ｇ（収率８３％）を得た。
実施例１３
基質５−（４−フルオロベンジル）ヒダントインの代わりに、５−（２−フルオロベンジル）ヒダントインを用いた以外は実施例１０と全く同様の操作により、９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（２−フルオロフェニル）アラニン０．８ｇ（収率７４％）を得た。
［α］Ｄ２０＝−２４．０（ｃ＝２、１Ｎ　ＮＨ４ＯＨ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６　δ　ｐｐｍ）：７．２３（ｍ、２Ｈ）、７．１０（ｍ、２Ｈ）、６．１８（ｄ、１Ｈ）、５．５５（ｓ、１Ｈ）、４．３５（ｍ、１Ｈ）、３．２０〜２．８０（ｄｄ、２Ｈ）
実施例１４
基質５−（４−フルオロベンジル）ヒダントインの代わりに、５−（３−フルオロベンジル）ヒダントインを用いた以外は実施例１０と全く同様の操作により、９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（３−フルオロフェニル）アラニン０．８５ｇ（収率７８％）を得た。
［α］Ｄ２０＝−２５．２（ｃ＝２、１Ｎ　ＮＨ４ＯＨ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６　δ　ｐｐｍ）：７．２０（ｍ、１Ｈ）、６．９５（ｍ、３Ｈ）、５．９５（ｄ、１Ｈ）、５．５５（ｓ、１Ｈ）、３．９５（ｍ、１Ｈ）、３．１０〜２．８５（ｄｄ、２Ｈ）
実施例１５
基質５−（４−フルオロベンジル）ヒダントインの代わりに、１ｇの５−（３，４−ジフルオロベンジル）ヒダントインを用いた以外は実施例１０と全く同様の操作により、９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−（３，４−ジフルオロフェニル）アラニン０．８ｇ（収率７４％）を得た。
［α］Ｄ２０＝−２８．２（ｃ＝２、１Ｎ　ＮＨ４ＯＨ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６　δ　ｐｐｍ）：１２．７０（ｂｒ、１Ｈ）、７．３１（ｍ、１Ｈ）、７．２０（ｍ、１Ｈ）、７．００（ｍ、１Ｈ）、６．２０（ｄ、１Ｈ）、５．５５（ｓ、１Ｈ）、４．３０（ｍ、１Ｈ）、３．１０〜２．７５（ｄｄ、２Ｈ）
産業上の利用可能性
本発明により、医薬品などの原料として有用な光学活性（Ｒ）体フルオロフェニルアラニン誘導体の原料として利用可能な化合物として、（Ｒ）−Ｎ−（アミノカルボニル）−フルオロフェニルアラニンを得ることができる。
【国際調査報告】
2002022844.tif 000016
2002022844.tif 000017
2002022844.tif 000018