(57)【要約】本発明は、従来の培養方法と比較して顕著に多くの間葉系幹細胞を得ることができる、新規な間葉系幹細胞の培養方法を提供する。当該培養方法は、間葉系幹細胞の多分化能を維持しながらその増殖能を刺激し、さらに寿命を延長させる物質として、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を培地に添加することを特徴とし、間葉系幹細胞を３０世代以上培養しうるばかりでなく、従来の培養法と比較して細胞数にして約１０５〜１０６倍の細胞数を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の増殖能を刺激する物質を培地に添加することを特徴とする哺乳動物の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記物質が繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＧＦを０．０４〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＦＧＦを０．１〜１ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
間葉系幹細胞がヒト由来である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法により得られた、多分化能を保持する間葉系幹細胞。
【請求項７】
軟骨細胞への多分化能を有する、請求項６に記載の間葉系幹細胞。
【請求項８】
間葉系幹細胞の増殖能刺激物質としてのＦＧＦの使用。
【請求項９】
１５世代以上の継代培養において多分化能を保持する間葉系幹細胞。
【請求項１０】
１６日以上の継代培養において多分化能を保持する間葉系幹細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な間葉系幹細胞の培養方法およびかかる方法により得られた多分化能を有する間葉系幹細胞に関する。なお、本発明において、間葉系幹細胞は少なくとも軟骨細胞または骨芽細胞への分化能を有する未分化間葉系細胞（間充織幹細胞）を意味する。
背景技術
脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、細胞再生系、例えば傷害もしくは疾患、または加齢による細胞・組織の損失に対する再生系において、細胞・組織の再生能を有する幹細胞を含んでいる。故に、幹細胞は当該組織内または幹細胞の貯蔵場所として働く別の組織内において見出される。幹細胞の貯蔵場所の主要な例として骨髄および骨膜を挙げることができる。
骨髄は成体の造血幹細胞の主要な供給源であり、該造血幹細胞は多能性を有する未分化な細胞であり、全ての血液細胞（例えば、赤血球、白血球、リンパ球など）は該造血幹細胞から分化することが知られている。造血幹細胞の培養・分化については多くの研究がなされており、造血幹細胞の培養、各々の血液細胞（成分）への分化・誘導に有用な多くの物質（増殖因子）が知られている。
一方、骨髄や骨膜等には、造血幹細胞とは別の幹細胞、即ち間充織幹細胞が包含され、これらは、骨、軟骨、筋肉、靱帯、腱、脂肪および間質などの間充織組織系の再生に有用な役割を果たしている。間葉系幹細胞（間充織幹細胞）は、未分化な細胞として増殖し、そして例えば脂肪細胞、軟骨細胞または骨芽細胞などに分化しうる多能性を保持している。該幹細胞は、成体の骨髄および骨膜から容易に単離することができ、幹細胞として安定な表現型・細胞形態を示す。例えば骨髄由来の間葉系幹細胞はインビトロ培養では単層の性質を保持している（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ　Ｍ．Ｆ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４，１４３−１４７，１９９９年）。
このため、間葉系幹細胞を大量に培養して、得られた未分化細胞から軟骨組織または骨組織などを分化誘導し、これらを移植治療に用いることが提案された。その第１段階として骨髄由来の間葉系幹細胞の培養が試みられた。しかしながら、従来の培養方法では、１５世代前後で該幹細胞の増殖が停止するかまたは極度に遅くなるため、十分な数の間葉系幹細胞を得ることができないという問題がある。さらには軟骨細胞または骨芽細胞への分化能が消失してしまうという問題も生じている。間葉系幹細胞から軟骨または骨組織を誘導してこれらを移植治療に用いるためには、出発材料として該幹細胞が多数必要である。
発明の開示
本発明は、従来の培養方法と比較して顕著に多くの間葉系幹細胞を得ることができる新規な間葉系幹細胞の培養方法を提供することを目的とする。
本発明はまた、かかる方法により得られた多能性を有する間葉系幹細胞を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含有する培地中において間葉系幹細胞を培養すると、２５世代以上の継代培養が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
従って、本発明は、間葉系幹細胞の増殖能を刺激する物質を培地に添加することを特徴とする、哺乳動物の間葉系幹細胞の培養方法を提供する。当該培養方法において、間葉系幹細胞の増殖能を刺激する物質としてＦＧＦが有用である。培地中のＦＧＦの濃度は、通常は０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０４〜１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜１ｎｇ／ｍｌである。
本発明の方法において、ＦＧＦは、哺乳動物の間葉系幹細胞の増殖能を刺激する能力を有するものであれば、その由来には関係なく使用することができるが、哺乳動物由来のＦＧＦ、例えばＦＧＦ−１（ａＦＧＦ）またはＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）が好ましい。ｂＦＧＦではヒト由来、ウシ由来のｂＦＧＦは市販されており、容易に入手可能である。また、哺乳動物由来の他のＦＧＦも受容体が共通であることから、本発明において使用可能である。
ｂＦＧＦをはじめとする種々のＦＧＦは、他の増殖因子と同様に様々な細胞の培養に用いられており、例えば造血幹細胞（特開平１１−１０３８５６号公報）、軟骨細胞（Ｙ．Ｋａｔｏ　＆　Ｄ．Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ　１００，４７７−４８５，１９８５年）に用いられている。しかし、ＦＧＦが骨髄・骨膜由来の間葉系幹細胞多分化能の維持、インビトロでの寿命（Ｌｉｆｅ　Ｓｐａｎ）の延長および増殖回数の増加に顕著な効果を有することは知られていない。
間葉系幹細胞
本発明において、間葉系幹細胞は骨髄および／または骨膜由来であり、且つ間充織組織系の組織、例えば脂肪組織、軟骨組織または骨組織に分化しうる多能性を有する未分化な細胞である。間葉系幹細胞は、該細胞を有する任意の骨髄または骨膜から採取することができるが、多量の細胞が採取可能であること及び採取が容易であることから、大腿骨、脛骨および骨盤（腸骨）から採取するのが好ましい。ヒト以外の哺乳動物については、腸骨および脛骨などからも間葉系幹細胞を採取することができる。
骨髄由来の間葉系幹細胞の採取方法としては、公知の方法、例えば医療において用いられている任意の採取方法を用いることができる。ヒト以外の哺乳動物の骨髄から該幹細胞を採取する際には、実験室的方法として例えば骨（大腿骨、脛骨）の両端を切断し、間葉系幹細胞の培養に適する培地で骨内を洗浄して、洗い出された該培養液から間葉系幹細胞を得ることができる。具体的には、下記のように採取する：
（１）ウサギの大腿骨、脛骨の両端を切断する。次いで、培地（例えばＤＭＥＭ培地）、所望する場合には抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）およびヘパリンをさらに添加した培地で骨髄内を洗浄する。
ヒト腸骨の場合は、該腸骨の骨髄から骨髄液を採取する。
（２）洗い出された培地を３００×ｇ、３分程度遠心分離して、沈殿した骨髄細胞を回収する。得られた細胞を適当な培地（例えば１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）で適当な濃度に希釈して細胞培養皿に播種する。３日間培養して、培養皿に接着した細胞を骨髄由来の間葉系幹細胞とする。
また、骨膜から該幹細胞を採取するには、公知の方法を用いることができる［Ｍ．Ｉｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３２，１６０３−１６０８（１９９３）；Ｊ．Ｆａｎｇ　＆　Ｂ．Ｋ．Ｈａｌｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌ．１８０，７０１−７１２（１９９６）；Ｓ．Ｂａｈｒａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　ａｎａｔｏｍｉｃａｌ　Ｒｅｃｏｒｄ　２５９，１２４−１３０（２０００）］。例えば下記の方法により得ることができる：
（１）ウサギの大腿骨、脛骨において結合組織などの軟部組織等を剥離し、骨膜を露出させ、次いで適当な大きさに切除して採取する。採取した骨膜を細かく切り刻んだ後、３７℃にてコラゲナーゼで処理する。
（２）次いで、例えばピペッティング等により細胞を遊離させ、濾過または遠心分離によって細胞を収集する。得られた細胞を計測し、適当な培地（例えば１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）で適当な濃度に希釈して、細胞培養皿に播種する。３日間培養して、培養皿に接着した細胞を骨膜由来の間葉系幹細胞とする。
このような方法により、１０４〜１０５細胞個程度の間葉系幹細胞を得ることができる。単離された間葉系幹細胞は、そのまま播種して培養に供することができるが、通常は適当な培地中にて１０〜２０日程度培養してから使用する。また、該細胞を凍結保存することもできる。
間葉系幹細胞の培養方法
上述のようにして得られた幹細胞は、該細胞の培養に適する任意の培地にｂＦＧＦを０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．０４〜１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、例えば１ｎｇ／ｍｌの濃度で添加して培養する。培養は、哺乳動物の細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが、一般的には３７℃にて５％ＣＯ２存在下で行うのが好ましく、例えば下記のように培養することができる：
（３）上述のように培養皿に接着した間葉系幹細胞を、適当な培地（例えば１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）で、３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養する。
（４）培地は３日に１回交換する。ｂＦＧＦは例えば５日目より１ｎｇ／ｍｌで培地に添加する。
また、幹細胞の継代培養は、当該細胞培養の分野において公知の適する方法で行うことができる。例えば、集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）に近くなった初代培養のプレートから細胞を収集し、それを適当なｂＦＧＦ含有培地に播種し、初代培養と同様な条件下で培養し、そして細胞が集密的になる前に継代して培養する。具体的には、下記のように継代培養する：
（５）上記（４）の初代培養が１０日前後で集密的に近くなる。このプレートをトリプシン（例えば０．０５％）＋ＥＤＴＡ（例えば０．２ｍＭ）で処理して細胞をプレートから回収し、得られた細胞数を計測する。
（６）培養した幹細胞を、５×１０３細胞個／ｃｍ２の密度でｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地に播種して培養し、細胞が集密的になる前に継代する。（７）上記（６）の操作を繰り返し、継代培養を実施する。
本発明の培養方法では、間葉系幹細胞の増殖が１５世代、好ましくは２５世代、さらに好ましくは３０世代を越えても、または継代培養期間１６日以上、好ましくは２０日以上、より好ましくは３０日以上、さらに好ましくは４０日、最も好ましくは５０日以上においても停止することはなく、非常の多くの幹細胞を得ることができる。また、培養された該幹細胞は間充織系の種々の組織、例えば軟骨組織または骨組織に分化させることができる。
培養した間葉系幹細胞から軟骨細胞（組織）を得るためには、該幹細胞をトリプシン処理し、次いで遠心分離などにより単離した後、浮遊培養系、アガロース培養系またはアルギン酸培養系に移して、軟骨分化誘導に適する培地、例えばＭ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４，１４３−１４７，１９９９年に記載の培地を用いて軟骨細胞を誘導することができる。
また、間葉系幹細胞から骨細胞（組織）を得るためには、該幹細胞をトリプシン処理し、次いで遠心分離などにより単離した後、骨分化誘導に適する培地、例えば前記Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒらに記載の培地を用いて骨細胞を誘導することができる。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に制限されることはない。
発明を実施するための最良の形態
実施例
実施例１　間葉系幹細胞の培養
１）間葉系幹細胞の採取
１−１）骨髄からの幹細胞の採取
４週齢ウサギの大腿骨、脛骨から筋肉および靱帯などを除いてこれを切除し、その両端を切断する。次いで、ＤＭＥＭ培地（３２単位／ｍｌ　ペニシリン，５０μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、および６０００単位／ｍｌ　ヘパリンを含有）で骨髄内を洗浄した。洗い出された培地を遠心分離（３００×ｇ，３分間）して、沈殿した骨髄細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で希釈した後、２×１０８細胞個（赤血球を含む）／１０ｃｍ培養皿にて播種した。細胞は３７℃にて５％ＣＯ２存在下で３日間培養して、接着した細胞（約２０００細胞個／培養皿）を骨髄由来の間葉系幹細胞とした。
１−２）骨膜からの幹細胞の採取
４週齢ウサギの大腿骨、脛骨において結合組織などの軟部組織等を剥離し、骨膜を露出させ、約５×５ミリの大きさで骨膜を切除して採取する。骨膜に付着する軟部組織を除去した後、細かく切り刻み、これを３７℃で１２０分間、０．１％コラゲナーゼで処理した。次いで、ピペッティングにより細胞を遊離させ、これを濾過することによって細胞を採取し、ＰＢＳにて３回洗浄する。細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で希釈して細胞数を計測し、２×１０５細胞個／１０ｃｍ培養皿にて播種した。細胞は３日間培養して、接着した細胞を骨膜由来の間葉系幹細胞とした。
２）間葉系幹細胞の培養
骨髄から採取した間葉系幹細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養して、３日に１回培地を交換した。ｂＦＧＦは骨膜由来の細胞については２日目から、骨髄由来の細胞については５日目から１ｎｇ／ｍｌで培地に添加し、対照群には何も添加しなかった。両群ともに１０日前後でほぼ集密的になった。これらのプレートを０．０５％トリプシン＋０．２ｍＭ　ＥＤＴＡで５分間処理し、増殖した幹細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル，コールター社製）で計測し、そして５０００細胞個／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。ｂＦＧＦは継代培養においても１ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。ｂＦＧＦ添加群および対照群における間葉系幹細胞の培養の結果を図１（細胞数／培養日数）および図２（世代数／培養日数）のグラフで示す。
ｂＦＧＦを添加しない従来の培養法（対照群）では、培養後１０日（１５世代前後）までは盛んに増殖するが、その後細胞の増殖は停止した。これに対し、本発明の培養法では、２０日前後で幾らか増殖の速度の低下は見られるものの培養後３０日（約３０世代）以降でも増殖し続けることが示された。また、本発明の培養方法によって、培養後５０日後で対照群の１０５倍もの間葉系幹細胞が得られた（図１および２参照）。
実施例２　軟骨分化の誘導
実施例１で培養した間葉系幹細胞（培養後１６日のｂＦＧＦ添加群、対照群）を０．０５％トリプシン＋０．２ｍＭ　ＥＤＴＡで５分間処理して培養した間葉系幹細胞を単離した。次いで、２．５×１０５個の細胞を１５ｍｌ試験管（ポリプロピレン製）に移し、１０００×ｇで５分間遠心分離してＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を除去した。分離した細胞に下記の組成の軟骨分化誘導培地を添加し、遠心管培養を行った。
軟骨分化誘導培地
高グルコースαＭＥＭ培地
１０ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦβ１
１００ｎＭ　デキサメタゾン
５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸−２−リン酸
１００μｇ／ｍｌ　ピルビン酸ナトリウム
ＩＴＳ−プラス　　　６．２５μｇ／ｍｌ　トランスフェリン
６．２５μｇ／ｍｌ　インスリン
６．２５ｎｇ／ｍｌ　セレン酸
５．３３μｇ／ｍｌ　リノール酸
１．２５ｍｇ／ｍｌ　ウシ血漿アルブミン
間葉系幹細胞を、上記培地中において３７℃、５％ＣＯ２存在下にて培養した。培養開始から２４時間後には、細胞は球状のペレットを形成した。２日おきに培地を交換し、１４日間培養した。
培養前および培養後のペレットのプレパラートを調製し、トルイジンブルー染色を行った。その結果、ｂＦＧＦ添加群では、細胞塊の形態および細胞外基質であるプロテオグリカンの染色性から、誘導前は未分化の状態であったが（図３）、培養後では、軟骨組織が誘導されたことが示された（図４）。一方、対照群では軟骨細胞は観察されなかった。また、軟骨分化誘導前の間葉系幹細胞の細胞形態は、ｂＦＧＦ添加群では該幹細胞の形態が維持されていたが、対照群では繊維芽細胞様の細胞などが観察された。これらの結果を下記の表にまとめる。
2002022788.tif 000002
実施例３　骨化の誘導
実施例２と同様に培養後１６日の間葉系幹細胞（ｂＦＧＦ添加群、対照群）を収集し、そして下記組成の骨分化誘導培地に移した。
骨分化誘導培地
αＭＥＭ培地
１０％　ＦＢＳ
１００ｎＭ　デキサメタゾン
１０ｍＭ　βグリセロールリン酸
５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸−２−リン酸
幹細胞を、上記培地中において３７℃、５％ＣＯ２存在下にて培養した。２日おきに培地を交換し、１２日間培養した。
培養後の細胞をアリザリンレッドで染色して観察したところ、ｂＦＧＦ添加群では石灰化していることが示された。一方、対照群では石灰化は観察されるものの、そのレベルはｂＦＧＦ添加群と比較して顕著に低いものであった。これらの結果を下記の表にまとめる。
2002022788.tif 000003
実施例４　種々の間葉系幹細胞の増殖における作用
実施例１と同様にしてウサギから腸骨および脛骨の骨髄由来の間葉系幹細胞を得た。また、ヒト脛骨骨髄由来の間葉系幹細胞は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｉｎｃ．
（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ウサギ由来の間葉系幹細胞は２×１０８細胞個（赤血球を含む）／１０ｃｍ培養皿にて播種し、ヒト由来の間葉系幹細胞は１０３細胞個／ｃｍ２で播種し、ｂＦＧＦの存在下（１ｎｇ／ｍｌ）または不存在下にて培養した。継代はウサギ由来の間葉系幹細胞では５×１０３個／ｃｍ２、ヒト由来の間葉系幹細胞では１０３個／ｃｍ２で播種して行った。（実施例１を参照）。各間葉系幹細胞について培養は独立的に２回実施した。得られた結果を図５に示す。
図５において、ウサギ腸骨（Ｉ）および脛骨由来（Ｔ）の間葉系幹細胞は共にｂＦＧＦにより増殖率が増加し、寿命の延長が観察された（ＡおよびＢを参照）。ヒト脛骨由来の間葉系幹細胞では、ヒト血清含有培地（Ｃ）中において増殖率の増加および寿命の延長が観察された。
また、イヌ腸骨由来の間葉系幹細胞においても同様な結果が得られた（結果は示さない）。
実施例５　培養間葉系幹細胞の軟骨分化能の検証
１）組織化学的分析
４週齢のウサギから採取した間葉系幹細胞をＦＧＦ（ｂＦＧＦ）の存在下（ＦＧＦ（＋））または不存在下（ＦＧＦ（−））で増殖させ３回継代培養し、次いで実施例２にて用いた軟骨分化誘導培地に移して２、４、８日間培養し、トルイジンブルー染色を行った。その結果、ｂＦＧＦ軟骨分化誘導２日では未だ軟骨細胞の分化は観察されないが（図６−Ａ）、４日ではペレットの表面に球状細胞（軟骨細胞）が観察された（図６−Ｂ）。８日ではＦＧＦ（＋）の間葉系幹細胞の全てが球状になった（図６−Ｃ）。これに対し、ＦＧＦ（−）の間葉系幹細胞では、ＦＧＦ（＋）の細胞と比較して軟骨分化が顕著に遅れていた（図６−Ｄ）。
また、３、６、９および１２回継代したＦＧＦ（＋）の間葉系幹細胞を同様に軟骨分化誘導培地に移して１６日間培養し、トルイジンブルー染色を行った。その結果、３〜９継代培養ではほとんど全ての細胞において間接様組織が観察された（図６−Ｅ〜Ｇ）が、継代数が増加するにつれて、トルイジンブルー染色される軟骨プロテオグリカンの量も減少した。１２継代培養では、一部の細胞のみが軟骨細胞となっていた（図６−Ｈ）。
これらの結果から、ＦＧＦは間葉系幹細胞の軟骨分化を促進するが、当該分化能は継代するにつれて低下することが示される。
２）生化学的およびマーカー遺伝子による分析
ＦＧＦ（＋）またはＦＧＦ（−）において３、６、９および１２回継代した間葉系幹細胞について、グルコサミノグルカン含量およびアルカリホスファターゼ活性を測定すると共に、軟骨の分子マーカーであるＩＩ型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンのｍＲＮＡ量について分析した。
（１）方法
グルコサミノグルカン含量は、ＢｉｔｔｅｒとＭｕｉｒ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４（１９６２），３３０−３３４）の方法に従って測定した。また、培養細胞中のアルカリホスファターゼ活性の測定は、Ｂｅｓｓｅｙ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６４（１９４６），３２１−３２９）の方法に従って実施した。各ｍＲＮＡは、下記のようにＲＴ−ＰＣＲにより検出した。
ＲＴ−ＰＣＲ
培養細胞からの全ＲＮＡ抽出は、ＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて実施した。次いで、第１ストランドｃＤＮＡは、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ　ＩＩ　ＲＮａｓｅ　Ｈ−逆転写酵素（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して全ＲＮＡ　１μｇから合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、次のＰＣＲ条件：９４℃、３０秒にて変性、そして６５℃、１．５分間にてプライマー伸長を２５または３０サイクルにてＰＣＲ増幅を実施し、得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動およびエチジンプロミド染色により検出した。なお、ＰＣＲには次のプライマーのセットを用いた。
プライマー
ウサギＩＩ型コラーゲン：
2002022788.tif 000004
　ウサギＸ型コラーゲン：
2002022788.tif 000005
2002022788.tif 000006
　ＧＡＰＤＨ：
2002022788.tif 000007
（２）結果
軟骨基質であるグリコサミノグリカン含量は、ＦＧＦ（＋）およびＦＧＦ（−）の間葉系幹細胞培養物について、継代数の増加につれて減少した。しかし、ＦＧＦ（＋）の間葉系幹細胞培養物におけるグリコサミノグリカン含量は、ＦＧＦ（−）のものと比較して著しく多いものであった（図７−Ａ）。
同様に、アルカリホスファターゼ活性はＦＧＦ（＋）およびＦＧＦ（−）培養物について、継代数の増加につれて減少したが、ＦＧＦ（＋）培養物におけるアルカリホスファターゼ活性は、ＦＧＦ（−）のものと比較して著しく高レベルであった（図７−Ｂ）。
また、軟骨細胞の分子マーカーであるＩＩ型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンのｍＲＮＡ量は、ＦＧＦ（＋）およびＦＧＦ（−）共に継代につれて減少していたが、ＩＩ型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンのｍＲＮＡ量は、ＦＧＦ（＋）の方がＦＧＦ（−）より高レベルであった（図７−Ｃ）。
これらの結果から、ＦＧＦがインビトロにおける間葉系幹細胞の軟骨分化能を顕著に増強する共に継代による当該分化能の低下を抑制することが示された。
実施例６　培養間葉系幹細胞の骨分化能の検証
ＦＧＦ（＋）またはＦＧＦ（−）にて継代培養した間葉系幹細胞の骨分化能を検証した。
（１）方法
ヒト間葉系幹細胞を、高密度（５０００細胞個／ｃｍ２）または低密度（１０００細胞個／ｃｍ２）にて播種し、ＦＧＦ存在下または不存在下にて３、６および９回継代培養し、次いで実施例３に記載の骨誘導培地に移して培養した。これらの培養物において、カルシウム含量、アルカリホスファターゼ活性を測定すると共に、骨芽細胞に特徴的な遺伝子である骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）、オステオポンチンおよびオステオカルシンのｍＲＮＡ量について分析した。
細胞培養物中のアルカリホスファターゼ活性の測定は、実施例５と同様に実施した。カルシウム含量は、Ｇｉｔｅｌｍａｎ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８（１９６７），５２１−５３１）の方法に従って測定した。
骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）、オステオポンチンおよびオステオカルシンのｍＲＮＡ量は、下記のプライマーのセットを用いて実施例５に従ってＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
プライマー
ヒト　骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）：
2002022788.tif 000008
　ヒト　オステオポンチン：
2002022788.tif 000009
　ヒト　オステオカルシン：
2002022788.tif 000010
　ＧＡＰＤＨ：
2002022788.tif 000011
（２）結果
細胞を高密度で播種した場合、細胞のカルシウム含量およびアルカリホスファターゼ活性は、継代数またはＦＧＦ（＋）もしくはＦＧＦ（−）において顕著な差は観察されなかった（図８−Ａ，Ｃ）。しかし、細胞を低密度で播種した場合、カルシウム含量は、ＦＧＦ（＋）の方がＦＧＦ（−）より高く、そして継代につれて減少していた（図８−Ｂ）。
また、骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）、オステオポンチンおよびオステオカルシンのｍＲＮＡ量は、ＦＧＦ（＋）およびＦＧＦ（−）では３継代および６継代との間で顕著な変化は見られなかったが、９継代のＦＧＦ（−）間葉系幹細胞培養物ではこれらのｍＲＮＡレベルは減少していた（図８−Ｄ）。
これらの結果から、ＦＧＦがインビトロにおける間葉系幹細胞の骨分化能の低下を抑制することが示された。
比較例　培養間葉系幹細胞の脂肪細胞分化能の検証
ＦＧＦ（＋）またはＦＧＦ（−）にて継代培養した間葉系幹細胞の脂肪細胞分化能を検証した。
ＦＧＦ（＋）またはＦＧＦ（−）にて４、６、９継代した細胞を下記の脂肪細胞誘導培地に移して２５日間培養し、間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化誘導した。
脂肪分化誘導培地
αＭＥＭ培地（高グルコース）
１０％　ＦＢＳ
１μＭ　デキサメタゾン
０．２ｍＭ　３−イソブチル−１−メチル−キサンチン
脂肪細胞への分化は、オイルレッド染色により、および脂肪細胞分化の分子マーカーであるＰＰＡＲ−γ２のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより分析することにより実施した。ＲＴ−ＰＣＲは、下記のプライマーのセットを用いて実施例５に従って実施した。
プライマー
ヒトＰＰＡＲ−γ２：
2002022788.tif 000012
　ＧＡＰＤＨ：
2002022788.tif 000013
2002022788.tif 000014
ＦＧＦ（＋）およびＦＧＦ（−）にて継代培養した間葉系幹細胞は、同様にオイルレッド染色された（図９−Ａ，Ｂ）。また、脂肪細胞分化のマーカーであるＰＰＡＲ−γ２のｍＲＮＡにおいても９継代までほぼ同じレベルであった。
この結果から、ＦＧＦの有無が間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化には影響しないことを示している。
産業上の利用可能性
従来の培養方法では１５世代前後で細胞の増殖が停止していたものが、本発明の培養方法によれば、間葉系幹細胞を３０世代以上培養することが可能である。さらに、従来の培養法と比較して細胞数にして約１０５〜１０６倍の細胞数を得ることができる。また、継代を重ねるごとに低下する多分化能の低下を抑制することが出きる。本発明により培養された間葉系幹細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞への分化能を維持し、さらに寿命が延長されているため、軟骨組織または骨組織の移植用に多量の軟骨細胞または骨細胞を供給することが可能となる。このことは、軟骨や骨の移植治療に極めて重要である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＦＧＦ添加群における細胞増殖を［細胞数／培養日数］により示すグラフである。
図２は、ＦＧＦ添加群における細胞増殖を［世代数／培養日数］により示すグラフである。
図３は、ｂＦＧＦ添加による軟骨分化誘導前の組織の顕微鏡写真である。
図４は、ｂＦＧＦ添加による軟骨分化誘導後の組織の顕微鏡写真である。
図５は、ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）存在下または不存在下におけるウサギ間葉系幹細胞（腸骨由来（Ｉ），脛骨由来（Ｔ）細胞）（Ａ，Ｂ）およびヒト間葉系幹細胞（Ｃ）の細胞増殖を示す図である。
図６は、ＦＧＦによる間葉系幹細胞の軟骨分化能を示す図であり、ＦＧＦの存在下（Ａ−Ｃ）または不存在下（Ｄ）にて培養した間葉系幹細胞の軟骨分化誘導２日（Ａ）、４日（Ｂ）および８日（Ｃ，Ｄ）の間葉系幹細胞のペレット、並びにＦＧＦの存在下にて３，６，９，１２継代培養した細胞ペレットの顕微鏡写真である。
図７は、ＦＧＦ（＋）またはＦＧＦ（−）において継代培養した間葉系幹細胞の軟骨分化能を示す図であり、軟骨誘導した間葉系幹細胞のグリコサミノグリカン含量（Ａ）、アルカリホスファターゼ活性（Ｂ）および軟骨特異的遺伝子（ＩＩ型コラーゲン，Ｘ型コラーゲン）の発現（Ｃ）を示す。
図８は、ＦＧＦ（＋）またはＦＧＦ（−）において継代培養した間葉系幹細胞の骨分化能を示す図であり、高密度または低密度で播種した間葉系幹細胞のカルシウム含量（Ａ，Ｂ）、アルカリホスファターゼ活性（Ｃ）および骨特異的遺伝子（骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）、オステオポンチン（ＯＰ）およびオステオカルシン（ＯＣ））の発現（Ｄ）を示す。
図９は、ＦＧＦ（＋）またはＦＧＦ（−）において継代培養した間葉系幹細胞の脂肪細胞分化能を示す図であり、脂肪細胞への分化したＦＧＦ（＋）細胞（Ａ）、ＦＧＦ（−）（Ｂ）細胞の顕微鏡写真、および脂肪細胞特異的遺伝子（ＰＰＡＲ−γ２）の発現（Ｃ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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