(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記に示される物性を有するとともに抗酸化性を示すＡＩＩ物質。
（Ａ）物質の色及び状態
白色粉末
（Ｂ）分子量
４１０
（Ｃ）等電点
２．３
（Ｄ）構成アミノ酸
ヒスチジンを含有する
（Ｅ）赤外線吸収スペクトル
0003746548.tif 000008
（Ｆ）由来
凍結乾燥肉
（Ｇ）製造方法
凍結乾燥肉を水蒸気加熱処理した後、脱脂し、得られた脱脂物を水で抽出し、得られた水抽出物を濃縮して製造する。
（Ｈ）抗酸化性
本物質は、すぐれた抗酸化性を示し、ｐＨ７．５で最大抗酸化活性を示し、その抗酸化活性はｐＨ３〜１０で安定であり、且つ、１００℃で５時間ならびに１２０℃で２時間加熱しても活性の低下を示さない。
【請求項２】
肉を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥肉を水蒸気加熱処理した後脱脂し、得られた脱脂物を水で抽出した後、濃縮し、更に精製すること、を特徴とする請求項１に記載のＡＩＩ物質の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＡＩＩ物質を有効成分とすること、を特徴とする抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＩＩ（エーツー）物質、その製法及び用途に関するものである。ＡＩＩ物質は、凍結乾燥肉由来の新規物質であり、すぐれた抗酸化性及び抗変異原性を示し、天然系抗酸化剤及び抗変異剤等として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
飲食品中の成分が酸化することにより、飲食品の風味品質の劣化がひき起され、使用に耐えなくなることもしばしばであるため、酸化を防止する技術が従来より希求されている。そしてこの点は、飲食品に限らず、医薬品、化粧品その他各種製品においても同様である。
【０００３】
また、近年、酸素の害作用が広く認識されるようになり、例えば、食品中に含まれるリノール酸、リノレン酸などの栄養学的に必須な不飽和脂肪酸は、空気中の酸素により容易に酸化されて過酸化脂肪酸や、反応性ラジカル（フリーラジカル）を生成すると共に、マロンジアルデヒドなどの発がん性物質を生成することが報告されている。また脂質中の不飽和脂肪酸分子が酸化されて生成する過酸化脂質は、化学反応により、生体中の蛋白や核酸を変質させるため、生体に発がん作用などの影響を与えることも報告されている。
【０００４】
このように、酸素の毒作用により動物生体内に生成する過酸化物や発がん物質などは、動物の細胞に悪い影響を与えることが考えられており、こうした酸素による生体成分の過酸化は、細胞の老化、ひいては、寿命に関係するものと考えられている（フリーラジカル老化説）。
【０００５】
したがって、安全性の高い、天然由来の抗酸化性物質は、生体内における抗酸化的な生体の防御機構を支援する物質として、食品、特に健康食品や栄養食品のほか、医薬品や化粧品の技術分野において、非常に期待されており、例えばゴマ油からすぐれた抗酸化剤が得られている（特開平７−９０２６９号）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酸素による重大な害作用に鑑み、食品や化粧品その他における酸化、あるいは生体内での過酸化を防止するために、安全性の高いすぐれた抗酸化剤を開発する目的でなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者らは、安全性の面から天然物に着目して各方面から検討した結果、凍結乾燥肉を水蒸気加熱した後、これを脱脂し、得られた脱脂物の水抽出物がすぐれた抗酸化性を示すことを発見した。そして更にこの物質についてその理化学的性質を詳細に研究したところ、従来未知の新規物質であることを確認し、この物質を新たにＡＩＩ（エーツー）物質と命名し、そして更に研究の結果、その工業的製法を確立し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明に係るＡＩＩ物質は、下記表２に示される理化学的性質を有している。
【０００９】
【表２】
0003746548.tif 000002
【００１０】
ＡＩＩ物質は、肉を原料とし、次のようにして製造される。先ず、肉を凍結乾燥する。肉としては、牛肉、豚肉、羊肉、馬肉等の畜肉、鶏肉等の鳥肉、各種魚肉等動物性の肉類が１種又はそれ以上適宜併合使用することができる。こ（れら）の肉類は、大きなブロックでもよいが、通常は、スライスしたり、破砕したり、ミンチしたり、混練したり、あるいはその他常法にしたがって細砕したりする。
【００１１】
こ（れら）の肉類は、凍結乾燥する。凍結乾燥は常法によって行えばよく、例えば、肉類を予じめ−２０℃以下に凍結しておき、比較的高真空（例えば５〜０．０５ｍｍＨｇ）で水分を除去すれば良いが、この場合、真空蒸発時間を短縮するために当初は５０〜７０℃程度に加温するのが好ましい。
【００１２】
凍結乾燥肉は水蒸気加熱処理する。水蒸気加熱処理としては、水蒸気を用いて適当な時間加熱処理すれば良いが、例えば８０〜１２０℃程度の水蒸気を用いて１０分〜３時間、好ましくは３０分〜９０分程度加熱処理すれば良い。
【００１３】
凍結乾燥肉の水蒸気加熱処理物は、次に、脱脂処理する。脱脂処理としては、水圧やエキスペラー等による圧搾法、遠心分離法、溶剤抽出法その他食品における脱脂方法を適宜使用することができる。溶剤としては、ヘキサン、ベンジン、ベンゼン、クロロホルム、四塩化炭素その他脂溶性有機溶媒が適宜使用される。
【００１４】
このようにして得た脱脂物は、０．５〜２０倍量、好ましくは１〜１０倍量の水で抽出した後、これを（減圧）濃縮して、ペースト状物〜乾燥粉末を得る。これらは、いずれの状態のものでもすぐれた抗酸化性を示すが、必要あれば更に精製処理する。
【００１５】
精製処理としては、既知の精製処理が適宜単用ないし併用できる。例えば、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー等が適宜使用できる。
【００１６】
このようにして、ＡＩＩ物質を分離、抽出する。ＡＩＩ物質は後記するようにすぐれた抗酸化性を示す新規物質であって、ｐＨ７．５で最大活性を示し、その抗酸化活性はｐＨ３〜１０で安定であり、且つ、１００℃で５時間ならびに１２０℃で２時間加熱しても活性の低下を示さず、したがって、各種飲食品、化粧品、医薬品その他の製品の酸化防止に広く使用することができる。また、ＡＩＩ物質は、上記のように耐熱性にすぐれｐＨ安定領域の広い抗酸化物質であるので、各種の飲食品に広範に添加使用でき、加熱調理飲食品等の酸化防止にも利用できる。
【００１７】
また、本抗酸化物質は、後記するところかも明らかなように、トリプトファンの加熱分解物由来の変異原物質（Ｔｒｐ−ｐ−１、Ｔｒｐ−ｐ−２）及び焼魚の加熱物由来の変異原物質（ＩＱ）の変異原活性を著しく抑制するとともに、スーパーオキサイド（Ｏ2-）の消去作用も有するものである。
【００１８】
以下、本発明の実施例について詳しく述べる。
【００１９】
【実施例１：ＡＩＩ物質の製造】
豚もも肉１，０００ｇを３回ミンチ処理した後、−２５℃に凍結し、次いで約６０℃に加温して０．５〜１．５ｍｍＨｇの範囲で水分を真空蒸発せしめた。３０分後に凍結乾燥肉を取り出し、これを１００℃の水蒸気で６０分間加熱処理して、凍結乾燥肉の水蒸気加熱処理物を得た。
【００２０】
水蒸気加熱処理物を室温のもとでヘキサンを用いて脱脂し、脱脂物に５倍量の水を加えて水抽出を行った。得られた水抽出物を真空濃縮して、粉末物を得た（凍結乾燥肉に対する収率５％）。
【００２１】
【実施例２：ＡＩＩ物質の精製】
実施例１で得た水抽出物を金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで分離、精製した。その結果を図１に示した。抗酸化活性は、未吸着画分のＦｒ．８〜１０（ＡＩ）および吸着画分のＦｒ．５８〜６２（ＡＩＩ）の２画分に活性が認められたが、ＡＩ画分に比べＡＩＩ画分は比活性も高く、また２倍以上の活性量を示したので、これを主要抗酸化活性画分として、クロマトフォーカシングなどにより精製を進めた。
【００２２】
得られたＡＩＩ画分をクロマトフォーカシングでさらに精製した。その結果、図２に示したように、ｐＨ３．３付近およびｐＨ２．５付近の２領域に活性画分を得た。そのうち活性の高いｐＨ２．５の画分をさらにＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５によりゲルロ過した結果、図３に示したように単一の活性画分が得られた。
【００２３】
これをさらに、高速液体クロマトグラフィーにより精製を行った。その結果（図４）、１つの活性画分を得、それを分取し、凍結乾燥して抗酸化性物質（ＡＩＩ物質）の精製白色粉末を得た。
【００２４】
これまでの精製段階の活性回収率の結果を、下記表３に示した。金属キレートアフィニティクロマトグラフィでの主要画分の回収率は４３．６％、またクロマトフォーカシングでは主要画分は２６．７％となり、最終的に凍結乾燥肉１００ｇよりの精製抗酸化物質は４ｍｇ得られ、その活性回収率は１５％であった。
【００２５】
【表３】
0003746548.tif 000003
【００２６】
等電点電気泳動による等電点の測定の結果、本物質の等電点はｐＨ２．３であった。レーザーイオン化質量分析計（日本電子ＪＭＳ−ＬＤ  １１７００）を用いて分子量の測定を行った結果（図５）、本物質の分子量は４１０と推定された。また、３４７５ｃｍ-1（ＯＨ基）、３３５０及び１２８８ｃｍ-1（ペプチド結合）、１３９５ｃｍ-1（イミダゾール基）に赤外線吸収スペクトル（図６）がみられ、これを加水分解してアミノ酸アナライザーにて構成アミノ酸の分析を行った結果、ヒスチジンが検出された。
【００２７】
【実施例３：抗酸化作用】
本物質の抗酸化活性をリノール酸を用いる常法にしたがって分析した。この方法は、リノール酸を反応基質とする方法であり、油脂の酸化の程度を測定するためによく用いられている。即ち油脂の自動酸化により生成する共役二重結合の特異的な吸収波長である２３３ｎｍの吸光度を測定することから、油脂の過酸化物の量を求める方法である。
【００２８】
その分析工程を下記表４に示し、得られた結果を下記表５に示す。
【００２９】
【表４】
0003746548.tif 000004
【００３０】
【表５】
0003746548.tif 000005
【００３１】
【実施例４：スーパーオキサイド消去作用】
本物質のスーパーオキサイド（Ｏ2-）消去作用について、ＮＡＤＰＨ−ＰＭＳ系でＯ2-を発生させ、これをＮＢＴ法で測定するＮＡＤＰＨ−ＰＭＳ−ＮＢＴシステムを利用して測定を行った。
【００３２】
その測定手順を下記表６に示し、得られた結果を図７に示した。併せて、抗酸化性に及ぼすモノヨード酢酸の影響も図８に示した。
【００３３】
【表６】
0003746548.tif 000006
【００３４】
【実施例５：変異原活性抑制作用】
本物質の抗変異原性を次のようにして測定した。
変異原性を測定する方法としては、今日、ＡｍｅｓテストやＵＶmutable(Ｕｍｕ）テストが用いられている。本物質は、その中にヒスチジンを含んでいるため、Ｕｍｕテストを行った。このＵｍｕテストは、大腸菌のＳＯＳ反応の一つである突然変異生成に直接関与するｕｍｕＣ遺伝子の発現を利用して、化学変異原を短期間に検出する方法である。
【００３５】
試料の内、菌株としては、ネズミチフス菌ＴＡ  １５３５／ｐ  ＳＫ１００２を用い、変異原物質としては、トリプトファンの加熱分解物より分離されたＴｒｐ−ｐ−１（３−amino−１，４−dimethyl−５Ｈ−pyrido｛４，３−ｂ｝indole）、Ｔｒｐ−ｐ−２（３−amino−１−methyl−５Ｈ−pyrido｛４，３−ｂ｝indole）、及び、焼魚の加熱物より単離されたＩＱ（２−amino−３−methylimidazo｛４，３−ｆ｝quinoline）を用いた。
【００３６】
ｕｍｕテスト検出法は、小田の方法にしたがって行った。
即ち、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ−Ｂｂｒｏｔｈで一夜、３７℃で前培養した試験菌液をＴＧＡ培地に１／５０容量加えて、さらに菌液が対数増殖期（Ａ600で０．２５−０．３）に達するまで振とう培養（約１−１．５時間）する。その菌液は氷中で保存する。試験管に抗酸化物質０．１ｍｌ、変異原物質０．１ｍｌ、Ｓ−９ｍｉｘ０．５ｍｌ、菌液２．３ｍｌを加えて混和し、１２０分間振とう培養する。培養後直ちに菌液の入った試験管を氷中に入れ、反応を停止した。菌液０．２ｍｌは、β−ガラクトシダーゼ活性の測定のために、残りの菌液は菌量（Ａ600）の測定に用いた。
【００３７】
得られた結果を下記表７に示す。なお、本抗酸化物質とともに、実施例１で得た水抽出物についても、その抗変異原性も測定し、その結果を併記した。その結果から明らかなように、両者はいずれもすぐれた抗変異原性を示し、特に精製して得たＡＩＩ物質は、Ｔｒｐ−ｐ−１、Ｔｒｐ−ｐ−２及びＩＱの変異原活性を著しく抑制した。
【００３８】
【表７】
0003746548.tif 000007
【００３９】
【発明の効果】
本発明に係る抗酸化剤は、天然物由来であって安全性が高いのみならず、すぐれた抗酸化性を示す。しかもその抗酸化性は、熱及びｐＨの変化に対して安定であるため、（加熱調理）飲食品の抗酸化剤として広範に利用できるだけでなく、医薬品、化粧品その他各種工業製品用抗酸化剤としてもきわめて有用である。
【００４０】
また、本発明に係る抗酸化剤は、スーパーオキサイド消去作用及び抗変異原性作用も有するため、癌の予防、治療剤として期待されるだけでなく、本抗酸化物質を添加した飲食品は、癌の予防、治療を視野に入れた特定保健用飲食品、健康飲食品等としても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】凍結乾燥肉の水蒸気加熱処理物中の水溶性抗酸化物質についての、キレートセファロース上でのアフィニティークロマトグラムである。
【図２】水溶性抗酸化物質についての、ＰＢＥ９４上でのフォーカシングクロマトグラムである。
【図３】水溶性抗酸化物質についての、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５上でのゲル濾過のパターンを示す。
【図４】ＴＳＫゲルＯＤＳ−８０ＴＭからの抗酸化物質のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】抗酸化物質のポジティブＭＡＬＤＩマススペクトルを示す。
【図６】抗酸化物質の赤外線吸収スペクトルを示す。
【図７】抗酸化物質のスーパーオキシドの消去を示す。
【図８】抗酸化活性に及ぼすモノヨード酢酸の影響を示す。
【図１】
0003746548.tif 000009
【図２】
0003746548.tif 000010
【図３】
0003746548.tif 000011
【図４】
0003746548.tif 000012
【図５】
0003746548.tif 000013
【図６】
0003746548.tif 000014
【図７】
0003746548.tif 000015
【図８】
0003746548.tif 000016