(57)【要約】配列番号３（ＶｒａＳ）又は配列番号４（ＶｒａＲ）のポリペプチド、及びこれらのポリペブチドをコードするポリヌクレオチド（ｖｒａＳ、ｖｒａＲ）、該ポリペプチドのアンタゴニスト、及び前記のポリヌクレオチドを利用した検出方法である。本発明のＶｒａＳ及びＶｒａＲのアンタゴニストを用いるとバンコマイシン感受性を回復するため、バンコマイシン耐性ＭＲＳＡ感染症の治療薬として用いることができる。また、ｖｒａＲ及びｖｒａＳは新規に発見されたものであり、これを利用してバンコマイシン耐性菌の同定を行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２のポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
請求の範囲１又は２のポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ｄ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチド。
（ｅ）配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列のポリペプチド。
【請求項６】
請求の範囲４又は５のポリペプチドの活性又は発現を阻害するアンタゴニスト。
【請求項７】
請求の範囲１〜３のいずれかのポリヌクレオチドと反応するプライマー又は相補ポリヌクレオチドと検体とを用いて反応操作を行うことを特徴とするグリコペプチド耐性黄色ブドウ球菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、黄色ブドウ球菌のバンコマイシン耐性に関与する新規なポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの変種、それらのアンタゴニスト、および該ポリヌクレオチドを利用したバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法に関する。
背景技術
黄色ブドウ球菌は、ペニシリン，セフェム、カルバペネムなどのβーラクタム系抗菌薬に耐性を示すメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含み、ＭＲＳＡ感染治療は、もっぱらバンコマイシンなどのグリコペプチド系抗生物質に頼っている。しかし、１９９７年にグリコペプチドに低感受性を示すＭＲＳＡ（ＶＲＳＡ；ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓまたは、ＶＩＳＡ，ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ；ＧＩＳＡ，ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと呼ばれる）株が、本発明によって、日本の病院から検出された。さらに、同様の菌株が米国、韓国、ヨーロッパでも検出され、もはやＭＲＳＡ一般に有効な抗生物質は存在せず、ＭＲＳＡ感染症は、現代医療の大きな問題となっている。
黄色ブドウ球菌のグリコペプチド耐性をおこす遺伝子産物が同定されれば、その蛋白質に対する阻害薬を開発することにより、バンコマイシン感受性を回復し、バンコマイシンと併用することにより、治療効果を得ることができる。また、当該遺伝子産物の機能が黄色ブドウ球菌の生理に必須の機能を持っている場合には、阻害薬単独で治療効果を有する。
従って、本発明の目的は黄色ブドウ球菌のグリコペプチド耐性をおこす遺伝子、遺伝子産物及びそれらの阻害物質、および該遺伝子を利用したグリコペプチド耐性黄色ブドウ球菌の検出方法を提供することである。
発明の開示
上記本発明の目的は、下記のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニスト及び検出法により達成される。
（１）配列番号１又は２のポリヌクレオチド。
（２）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（３）前記（１）又は（２）のポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（４）配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（５）以下の（ｄ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチド。
（ｅ）配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列のポリペプチド。
（６）前記（４）又は（５）のポリペプチドの活性又は発現を阻害するアンタゴニスト。
（７）前記（１）〜（３）のいずれかのポリヌクレオチドと反応するプライマー又は相補ポリヌクレオチドと検体とを用いて反応操作を行うことを特徴とするグリコペプチド耐性黄色ブドウ球菌の検出方法。
発明を実施するための最良の形態
以下に示すように、黄色ブドウ球菌の染色体上にある配列番号２のポリヌクレオチド（ｖｒａＲ）の転写は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌の細胞内で増加している。さらに、このポリヌクレオチドをバンコマイシン感受性黄色ブドウ球菌に導入すると、後述の実施例に示すようにバンコマイシン耐性が発現する。したがって、このポリヌクレオチドｖｒａＲのコードする配列番号４のポリペプタイド（ＶｒａＲ）は、黄色ブドウ球菌のバンコマイシン耐性の原因となっていることが分かる。
配列番号１に示すポリヌクレオチド（ｖｒａＳ）は、配列番号２に示すポリヌクレオチド（ｖｒａＲ）と、染色体上で隣接して存在し、既存のデータベースを用いたホモロジー解析により、新規な２成分調節系である可能性が高い。したがって、配列番号１のポリヌクレオチド（ｖｒａＳ）のコードする配列番号３のポリペプチド（ＶｒａＳ）は、ＶｒａＲの転写発現調節を通じて、黄色ブドウ球菌のバンコマイシン耐性に関与していることが推定される。したがって、ＶｒａＳの作用を阻害することによっても、バンコマイシン耐性の発現を抑えることができる。
本発明においては配列番号３又は４のポリペプチドに限らず、このポリペプチド活性を有する１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列のポリペプチドをふくむ。また、配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上同一であり、配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチドも含む。
また、本発明は配列番号１及び２のポリヌクレオチドのみならず、前記の配列番号３及び４のポリペプチド又は配列番号３又は４のポリペプチド活性を有しこれらと５０％、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらと７０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドも含む。
本発明のポリペプチドは、配列番号１又は２のポリヌクレオチドを用いて公知の方法によって得ることができる。例えば、大腸菌の発現ベクタープラスミド上のプロモーターの下流に、本ヌクレオチドを挿入し、大腸菌に、形質転換法により導入し、本発明のポリペプチドを産生することができる。
本発明のもうひとつの形態は、これらのポリペプチドに対する阻害剤、即ちアンタゴニストである。アンタゴニストは、いくつかの公知の方法によって得ることができる。例えば、（１）まず、これらのポリペプチドに部位特異的なアミノ酸変異を導入したポリペプチドを発現する組換えプラスミドを複数作製し、バンコマイシン感受性黄色ブドウ球菌株に導入する。それぞれの形質転換株のバンコマイシン耐性を測定し、これらのポリペプチドの活性に必須の部位を推定することができる。次に、精製された本ポリペプチドの結晶を作製し、Ｘ線構造解析により３次元構造を決定する。その上で、活性部位に相当する部分の３次元構造に結合し得る化学物質の構造を推定し、合成する。あるいは、（２）精製された、これらポリペプチドとアンタゴニストの候補化学物質を反応させ、例えば、結合による蛍光のクエンチングを測定することにより、これらポリペプチドと高い親和性で結合する化学物質を得ることができる。この物質がこれらポリペプチドの持つ活性を阻害するかどうかは、ｖｒａＲ遺伝子を導入しバンコマイシンの耐性度が増強した形質転換株の耐性度が、当該物質を添加した培地を用いてバンコマイシン感受性テスト（例えばＭＩＣ測定）を行った場合に低下することを観察することにより、確認することができる。
本発明のアンタゴニストは、ＶｒａＳ又はＶｒａＲの活性発現を阻害するため、バンコマイシン感受性を回復させることができる。従って、バンコマイシンと併用することによりバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌による感染症の治療を行うことができる。
さらに、本発明のもうひとつの形態は、グリコペプチド耐性の遺伝子診断である。本発明の提供するポリヌクレオチドと反応するプライマーあるいは、相補ポリヌクレオチドを用いて、これらポリヌクレオチドの菌株における発現の有無、あるいはその定量を行うことにより、当該菌株のグリコペプチド感受性の有無、あるいは低感受性、耐性の度合いを予測することが可能であり、臨床における抗生物質治療に貢献する意義が高い。このような方法としては、例えば、配列番号１又は２のポリヌクレオチドの一部を利用してプライマーを作成し、これら遺伝子のｍＲＮＡの定量を行うＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡを用いてハイブリダイゼーションにより判定する方法、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）による方法、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）による方法等が例示できる。
以下に本発明を実施例で説明する。
実施例１
［ｖｒａＳ及びｖｒａＲ］
ｖｒａＳ及びｖｒａＲのポリヌクレオチドは、以下のようにして得られた。
ヘテロバンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３株の染色体ＤＮＡ２０μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１．５キロから７．５キロ塩基対のＤＮＡ断片を、１％のアガロースゲル電気泳動により分離・精製した。得られたＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＫＦ３に連結し、大腸菌ＴＨ２株へ形質転換した。この大腸菌を５０ｍｇ／ｌストレプトマイシンと１２．５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地で培養し、簡便アルカリ・ＳＤＳ法によってプラスミドＤＮＡを調製した。これをＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３遺伝子ライブラリーとした。このプラスミドＤＮＡ（５０ｎｇ）をナイロン膜にスポットした後、紫外線照射によりＤＮＡを固定し、これと同一のものを２枚作製した。ヘテロバンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３株と、バンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ５０株と、Ｍｕ５０株を得た患者から得られたバンコマイシン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ５０株の菌体から、それぞれ全ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡ１５μｇにＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を加え、４２℃で２時間以上反応してｃＤＮＡを調製し、これをプローブとし、上記ナイロン膜とハイブリダイゼーションを行った。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３株遺伝子ライブラリーの１，２７３個のクローンについて、ディファレンシャルハイブリダイゼーションを行ったところ、明らかにシグナル増強が認められたクローンが単離できた。得られたプラスミドをｐＭ３８６として解析した。プラスミドｐＭ３８６に挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列の決定により、６つの構造遺伝子の存在が示唆された。
これら遺伝子のｍＲＮＡ発現パターンをしらべるため、サザンハイブリダイゼーション解析を行ったところ、二成分制御系システムと相同性のみられる応答レギュレーター遺伝子の転写増強が、バンコマイシン耐性菌で認められた。この応答レギュレーターを、ｖｒａＲ（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ）と名付けた。また、ｖｒａＲ遺伝子の上流には、二成分制御系のセンサー遺伝子と相同性の高い遺伝子が存在し、ｖｒａＳと名付けた。
実施例２
［ｖｒａＲを含んだ組み替えプラスミドｐＶＲＡＲの作成］
ｖｒａＲのｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅを含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＭ３８６を鋳型ＤＮＡとし、２つの合成ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＴＴＣＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＡＡＡＧ−３’）（配列番号５）及び、５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣ−３’（配列番号６））をプライマーとしてＰＣＲを用いて増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨ１で切断し、シャトルベクタープラスミドｐＹＴ３のＢａｍＨ１部位に挿入した。
実施例３
［ｐＶＲＡＲのバンコマイシン感受性黄色ブドウ球菌株Ｎ３１５Ｐへの導入とＭＩＣ測定］
組み替えプラスミドｐＶＲＡＲを、バンコマイシン感受性黄色ブドウ球菌株Ｎ３１５Ｐにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにより導入し、テトラサイクリン１０ｍｇ／Ｌの存在下で選択を行い、形質転換株Ｎ３１５Ｐ（ｐＶＲＡＲ）を得た。ベクターのみによる形質転換株Ｎ３１５Ｐ（ｐＹＴ３）、及び、親株Ｎ３１５Ｐ、及びＮ３１５Ｐ（ｐＶＲＡＲ）のバンコマイシンおよびテイコプラニンＭＩＣを測定した。結果を表１に示す。表１に示すように、ｖｒａＲを含むポリヌクレオチドを導入した場合にのみ、明確なバンコマイシン、テイコプラニンの耐性度が上昇した。
2001055397.tif 000002
産業上の利用可能性
以上のように、本発明のＶｒａＲ及びＶｒａＳはバンコマイシンのようなグリコペプチド系の抗生物質に対する耐性遺伝子ｖｒａＲ及びｖｒａＳの産物である。従って、本発明のＶｒａＳ及びＶｒａＲのアンタゴニストを用いるとバンコマイシン感受性を回復するため、バンコマイシン耐性ＭＲＳＡ感染症の治療薬として用いることができる。また、ｖｒａＲ及びｖｒａＳは新規に発見されたものであり、これを利用してバンコマイシン耐性菌の同定を行うことができる。
【配列表】
2001055397.tif 000003
2001055397.tif 000004
2001055397.tif 000005
2001055397.tif 000006
2001055397.tif 000007
2001055397.tif 000008
【国際調査報告】
2001055397.tif 000009
2001055397.tif 000010
2001055397.tif 000011
2001055397.tif 000012
2001055397.tif 000013
2001055397.tif 000014