(57)【要約】本発明は、新規なβ−カテニン核局在化蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡを提供し、さらにβ−カテニン核局在化蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡを利用することにより、癌などのβ−カテニン核局在化と関連する疾患の診断薬および治療薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２９２〜４３９で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項２】
蛋白質が、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項４】
配列番号１０および配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質の有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質の有するアミノ酸配列と、６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質。
【請求項７】
蛋白質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質である請求項３または４に記載の蛋白質。
【請求項８】
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質の有するアミノ酸配列中の連続した５〜６０アミノ酸残基を有するポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
配列番号１で表される塩基配列の塩基番号８７４〜１３１７で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項１２】
ＤＮＡが、配列番号１または配列番号３で表される塩基配列を有する請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
以下の［１］または［２］に記載の塩基配列を含み、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［１］配列番号９で表される塩基配列
［２］配列番号９および１１で表される塩基配列
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
ＤＮＡが、配列番号９および１１で表される塩基配列を含むＤＮＡであり、かつ配列番号２で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の形質転換体を培養液中で培養し、請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛋白質またはポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該蛋白質またはポリペプチドを採取することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛋白質またはポリペプチドの製造法。
【請求項２０】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した１０〜６０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらオリゴヌクレオチドの誘導体。
【請求項２１】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡあるいは請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはそれらオリゴヌクレオチドの誘導体を用いて、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量をｍＲＮＡレベルで検出または定量する方法。
【請求項２２】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡあるいは請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはそれらオリゴヌクレオチドの誘導体を用いて、健常人と被験者が有する請求項３〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量をｍＲＮＡレベルで測定・比較し、健常人に比べ該蛋白質の発現量が増加または減少している疾患を判定する方法。
【請求項２３】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡあるいは請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を含有する、請求項３〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量をｍＲＮＡレベルで測定・比較し、健常人に比べ該蛋白質の発現量が増加または減少している疾患の診断薬。
【請求項２４】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡあるいは請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を用いて、請求項３〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の遺伝子の変異を検出する方法。
【請求項２５】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡあるいは請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を用いて、請求項３〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の遺伝子に変異を有する疾患を判定する方法。
【請求項２６】
請求項１０〜１６のいずれかの１項に記載のＤＮＡあるいは請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を含有する、請求項３〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の遺伝子に変異を有する疾患の診断薬。
【請求項２７】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡあるいは請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を用いて、請求項３〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の発現を転写段階で抑制する方法。
【請求項２８】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡ、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体、ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡ、ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１０〜６０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらオリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡを用いて、β−カテニンの核局在化を阻害する方法。
【請求項２９】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡ、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体、ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡ、またはｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列の連続した１０〜６０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、またはそれらオリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡを含有する癌の治療薬。
【請求項３０】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載したＤＮＡを含有する遺伝子治療用ベクター。
【請求項３１】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡを導入することにより作製した非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の非ヒトトランスジェニック動物またはｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡを導入することにより作製した非ヒトトランスジェニック動物を発癌モデル動物として用いる方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載のトランスジェニック動物またはｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡを導入することにより作製したトランスジェニック動物を用いて癌の治療薬を評価する方法。
【請求項３４】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡの全部または一部が欠損し、β−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる活性を有する蛋白質の機能が喪失または低下した遺伝子欠損非ヒト動物。
【請求項３５】
［１］被験試料非存在下でのｂｃｌ９蛋白質とβ−カテニンとの結合と、［２］被検試料存在下でのｂｃｌ９蛋白質とβ−カテニンとの結合を比較し、被験試料より、ｂｃｌ９蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害する物質を選択することを特徴とする、ｂｃｌ９蛋白質とβ−カテニンとの結合を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項３６】
［１］被験試料非存在下での請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質とβ−カテニンとの結合と、［２］被験試料存在下での請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質とβ−カテニンとの結合を比較し、被験試料より、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質とβ−カテニンとの結合を阻害する物質を選択することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載のスクリーニング方法によって得られる化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項３８】
請求項３７に記載した化合物、またはその薬理学的に許容される塩を含有する癌の治療薬。
【請求項３９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛋白質またはポリペプチドを認識する抗体。
【請求項４０】
請求項３９に記載の抗体を用いた、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質を免疫学的に検出または定量する方法。
【請求項４１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質と結合し、該蛋白質の有するβ−カテニンと結合しβ−カテニンを核内に局在させる作用を阻害する中和抗体。
【請求項４２】
ｂｃｌ９蛋白質と結合し、ｂｃｌ９蛋白質の有するβ−カテニンと結合しβ−カテニンを核内に局在させる作用を阻害する中和抗体。
【請求項４３】
請求項３９に記載の抗体を用いて、健常人と被験者が有する請求項３〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量を定量・比較し、健常人に比べ該蛋白質量が増加または減少している疾患を判別する方法。
【請求項４４】
請求項３９に記載の抗体を含有する、請求項３〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量が、健常人と比較して増加または減少している疾患の診断薬。
【請求項４５】
請求項４１に記載の抗体を用いて、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質の機能を阻害することにより、β−カテニンとＬｅｆ／Ｔｃｆファミリーに属する転写因子との複合体による転写の活性化を阻害する方法。
【請求項４６】
請求項４２に記載の抗体を用いて、ｂｃｌ９蛋白質の機能を阻害することにより、β−カテニンとＬｅｆ／Ｔｃｆファミリーに属する転写因子との複合体による転写の活性化を阻害する方法。
【請求項４７】
請求項４１または４２に記載の抗体を含有する癌の治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核に局在させる作用を有する新規蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質を認識する抗体、該蛋白質、該ＤＮＡまたは該抗体を含有する治療薬、および該抗体を含有する診断薬に関する。
背景技術
大腸腺腫症（ＡＰＣ）遺伝子は、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）の原因遺伝子として単離された遺伝子である［Ｋｉｎｚｌｅｒ　Ｋ．Ｗ．＆　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　Ｂ．，Ｃｅｌｌ，８７，１５９（１９９６）］が、ＦＡＰだけでなく散発性大腸癌の７０〜８０％の症例にＡＰＣ遺伝子の異常を起こしていることが報告されている。大腸癌はＡＰＣだけでなく、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３、ＤＣＣなどの多数の遺伝子に段階的に変異が起きることにより発症すると考えられているが、ＡＰＣ遺伝子はこれらの遺伝子の中で最も早期から変異が見られることから、大腸癌の発症にはまずＡＰＣ遺伝子の異常が起こる必要があると考えられている。
ＡＰＣ遺伝子の異常から癌の発症に結び付く機構を解明するには、遺伝子産物であるＡＰＣの機能を解明する必要がある。ＡＰＣは約３００ｋＤａの蛋白質であり、細胞内でβ−カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）、ＤＬＧと結合していることが報告されている［Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ　Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１７３１（１９９３）、Ｓｕ　Ｌ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１７３４（１９９３）、Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ　Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１０２３（１９９６）、Ｍａｔｓｕｍｉｎｅ　Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１０２０（１９９６）］。ＡＰＣの機能については、ＡＰＣ遺伝子に変異をもつ大腸癌細胞株ＳＷ４８０に正常なＡＰＣを発現させると、細胞内のβ−カテニンの量が急激に低下することが報告されている［Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ　Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，３０４６（１９９５）］。このＡＰＣが機能するにはＡＰＣ内の中央部にある７回繰り返し構造の領域が必要であるが、この領域は、多くの大腸癌で変異が見出されている領域と一致しており、また、これらの大腸癌細胞では、細胞内のβ−カテニンの量が増大していることも報告されている［Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ　Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，３０４６（１９９５）、Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ　Ｂ．ら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５７，４６２４（１９９７）］。
β−カテニンは細胞接着分子カドヘリンの裏打ち蛋白質としても知られる蛋白質であるが、以下に示すＷｎｔ蛋白質の情報伝達系に関わってることが報告されている［Ｃａｄｉｇａｎ　Ｋ．Ｍ．＆　Ｎｕｓｓｅ　Ｒ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，１１，３２８６（１９９７）］。Ｗｎｔ遺伝子は動物の初期発生や形態形成過程で多様な機能を持って関与している大きな遺伝子ファミリーであり、マウスで約２０種類のファミリーを形成する他、アフリカツメガエルやショウジョウバエ、線虫等広い動物種で保存されている遺伝子である。ＷｎｔがリセプターであるＦｒｉｚｚｌｅｄと結合すると、細胞内情報伝達分子Ｄｉｓｈｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）を介してグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の活性が抑制される。ＧＳＫ−３βはβ−カテニンをリン酸化することにより、β−カテニンの分解を引き起こしているので、ＧＳＫ−３βの活性が抑制されることによりβ−カテニンは細胞内に蓄積する。β−カテニンはＬｅｆ／Ｔｃｆファミリーに属する転写因子（以下ＴＣＦと略す）と結合して複合体を形成して、ＴＣＦを転写因子として活性化する性質を持っているので、β−カテニンの蓄積により、β−カテニン／ＴＣＦ複合体が形成され、核内に移行してターゲット遺伝子の転写が促進される。Ｔｃｆの中で、Ｔｃｆ−４は大腸上皮に特異的に発現していることから、大腸癌では、主にβ−カテニンはＴｃｆ−４と複合体を形成していると考えられている［Ｋｏｒｉｎｅｋ　Ｖ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１７８４（１９９７）］。また、ＡＰＣ遺伝子は正常であるが、ＧＳＫ−３βによる制御をうけないようなβ−カテニン遺伝子の変異をもつ、大腸癌やメラノーマの細胞も報告されている［Ｍｏｒｉｎ　Ｐ．Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１７８７（１９９７）、Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ　Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１７９０（１９９７）］。これらの細胞ではβ−カテニンは常に細胞内に蓄積しβ−カテニン／ＴＣＦ複合体による転写の活性化がおきていると考えられる。
以上のことからβ−カテニンは大腸癌の発症に大きく関与していると考えられるので、β−カテニンと結合しその機能を抑制する物質は、大腸癌の発症に関与し、その治療や診断等に有用と考えられる。β−カテニンと結合する分子としては、Ｗｎｔ蛋白質の情報伝達系を負に制御する蛋白質Ａｘｉｎ［Ｚｅｎｇ　Ｌ．ら，Ｃｅｌｌ，９０，１８１（１９９７）］が報告されている。ＡｘｉｎはＧＳＫ−３βと結合してβ−カテニンのリン酸化を促進する［Ｉｋｅｄａ　Ｓ．ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１７，１３７１（１９９８）］だけでなく、さらにＡＰＣおよびβ−カテニンとも結合しており、β−カテニンの分解を促進することにより細胞内のβ−カテニンの量を低下させる作用を持つことが報告されている［Ｋｉｓｈｉｄａ　Ｓ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１０８２３（１９９８）、Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ　Ｂ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，８，５７３（１９９８）、Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ．ら，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，３，３９５（１９９８）］。しかしながら、β−カテニンと結合し、β−カテニンを核に局在させる機能を有する蛋白質は知られていない。
ｂｃｌ９蛋白質［Ｗｉｌｌｉｓ　Ｔ．Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９１，１８７１（１９９８）］は、Ｂ細胞前駆体の急性リンパ芽球性白血病患者から樹立された細胞株ＣＥＭＯ−１の第１染色体の染色体転座部位からクローニングされた遺伝子であり、ＣＥＭＯ−１で異常に高い発現がみられる遺伝子であるが、β−カテニンとの結合などβ−カテニンとの関連性は知られていない。
β−カテニンと結合し、その機能を制御する蛋白質およびその遺伝子を解析することにより、大腸癌をはじめとするβ−カテニンが関与する癌の発症機構を解明し、癌の治療や診断に有用な蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡを単離し構造を明らかにすることが求められていた。
発明の開示
本発明は、癌の治療や診断に有用な、β−カテニンと結合しβ−カテニンを核内へ局在させる作用をもつ蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質を認識する抗体、該蛋白質または該ＤＮＡを含有する治療薬、該抗体を含有する診断薬を提供することを目的とする。
本発明は、以下の（１）〜（４７）に関する。
（１）　配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２９２〜４３９で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（２）　蛋白質が、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を有する上記（１）の蛋白質。
（３）　配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（４）　配列番号１０および配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（５）　上記（１）〜（４）のいずれか１つの蛋白質が有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質。
（６）　上記（１）〜（４）のいずれか１つの蛋白質の有するアミノ酸配列と、６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質。
（７）　蛋白質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質である上記（３）または（４）の蛋白質。
（８）　配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（９）　上記（１）〜（８）のいずれか１つの蛋白質が有するアミノ酸配列中の連続した５〜６０アミノ酸残基を有するポリペプチド。
（１０）　上記（１）〜（９）のいずれか１つの蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１１）　配列番号１で表される塩基配列の塩基番号８７４〜１３１７で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（１２）　ＤＮＡが、配列番号１または配列番号３で表される塩基配列を有する上記（１１）のＤＮＡ。
（１３）　以下の［１］または［２］の塩基配列を含み、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［１］配列番号９で表される塩基配列
［２］配列番号９および１１で表される塩基配列
（１４）　上記（１０）〜（１３）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１５）　ＤＮＡが、配列番号９および１１で表される塩基配列を含むＤＮＡであり、かつ配列番号１で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１６）　配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（１７）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１８）　上記（１７）の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（１９）　上記（１８）の形質転換体を培養液中で培養し、上記（１）〜（９）のいずれか１つの蛋白質またはポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該蛋白質またはポリベプチドを採取することを特徴とする該蛋白質またはポリペプチドの製造法。
（２０）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡの塩基配列中の連続した１０〜６０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらオリゴヌクレオチドの誘導体。
（２１）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡあるいは上記（２０）のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を用いて、上記（１）〜（７）のいずれか１つの蛋白質の発現量をｍＲＮＡレベルで検出または定量する方法。
（２２）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡあるいは上記（２０）のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を用いて、健常人と被験者が有する上記（３）〜（７）のいずれか１つの蛋白質の発現量をｍＲＮＡレベルで測定・比較し、健常人に比べ該蛋白質の発現量が増加または減少している疾患を判別する方法。
（２３）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡあるいは上記（２０）のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を含有する、上記（３）〜（７）のいずれか１つの蛋白質の発現量をｍＲＮＡレベルで測定・比較し、健常人に比べ該蛋白質の発現量が増加または減少している疾患の診断薬。
（２４）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡあるいは上記（２０）のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を用いて、上記（３）〜（７）のいずれか１つの蛋白質の遺伝子の変異を検出する方法。
（２５）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡあるいは上記（２０）のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を用いて、上記（３）〜（７）のいずれか１つの蛋白質の遺伝子に変異を有する疾患を判別する方法。
（２６）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡあるいは上記（２０）のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体を含有する、上記（３）〜（７）から選ばれる蛋白質の遺伝子に変異を有する疾患の診断薬。
（２７）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡあるいは上記（２０）のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、上記（３）〜（７）のいずれか１つの蛋白質の発現を転写段階で抑制する方法。
（２８）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡ、上記（２０）のオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドの誘導体、ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡ、ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１０〜６０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡを用いて、β−カテニンの核局在化を阻害する方法。
（２９）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡ、（２０）に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの誘導体、ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡ、ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１０〜６０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそれらオリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡを含有する癌の治療薬。
（３０）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡを含有する遺伝子治療用ベクター。
（３１）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡを導入することにより作製した非ヒトトランスジェニック動物。
（３２）　上記（３１）の非ヒトトランスジェニック動物またはｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡを導入することにより作製した非ヒトトランスジェニック動物を発癌モデル動物として用いる方法。
（３３）　上記（３１）のトランスジェニック動物またはｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡを導入することにより作製したトランスジェニック動物を用いて癌の治療薬を評価する方法。
（３４）　上記（１０）〜（１６）のいずれか１つのＤＮＡの全部または一部が欠損し、β−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる活性を有する蛋白質の機能が喪失または低下した遺伝子欠損非ヒト動物。
（３５）　［１］被験試料非存在下でのｂｃｌ９蛋白質とβ−カテニンとの結合と、［２］被験試料存在下でのｂｃｌ９蛋白質とβ−カテニンとの結合を比較し、被検試料より、ｂｃｌ９蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害する物質を選択することを特徴とする、ｂｃｌ９蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害する物質のスクリーニング方法。
（３６）　［１］上記（１）〜（７）のいずれか１つの蛋白質とβ−カテニンを接触させた場合と、［２］上記（１）〜（７）のいずれか１つの蛋白質、β−カテニンおよび被検試料を接触させた場合を比較し、被検試料より、上記（１）〜（７）のいずれか１つの蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害する物質を選択することを特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれか１つの蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害する物質のスクリーニング方法。
（３７）　上記（３５）または（３６）のスクリーニング方法によって得られる化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
（３８）　上記（３７）の化合物、またはその薬理学的に許容される塩を含有する癌の治療薬。
（３９）　上記（１）〜（９）のいずれか１つの蛋白質またはポリペプチドを認識する抗体。
（４０）　上記（３９）の抗体を用いた、上記（１）〜（７）のいずれか１つの蛋白質を免疫学的に検出または定量する方法。
（４１）　上記（１）〜（７）のいずれか１つの蛋白質と結合し、該蛋白質の有するβ−カテニンと結合しβ−カテニンを核内に局在させる作用を阻害する中和抗体。
（４２）　ｂｃｌ９蛋白質と結合し、ｂｃｌ９蛋白質の有するβ−カテニンと結合しβ−カテニンを核内に局在させる作用を阻害する中和抗体。
（４３）　上記（３９）の抗体を用いて、健常人と被験者が有する上記（３）〜（７）のいずれか１つの蛋白質の発現量を定量・比較し、健常人に比べ該蛋白質量が増加または減少している疾患を判別する方法。
（４４）　上記（３９）の抗体を含有する、上記（３）〜（７）のいずれか１つの蛋白質の発現量が、健常人と比較して増加または減少している疾患の診断薬。
（４５）　上記（４１）の抗体を用いて、上記（１）〜（７）のいずれか１つの蛋白質の機能を阻害することにより、β−カテニンとＬｅｆ／Ｔｃｆファミリーに属する転写因子との複合体による転写の活性化を阻害する方法。
（４６）　上記（４２）の抗体を用いて、ｂｃｌ９蛋白質の機能を阻害することにより、β−カテニンとＬｅｆ／Ｔｃｆファミリーに属する転写因子との複合体による転写の活性化を阻害する方法。
（４７）　（４１）または（４２）の抗体を含有する癌の治療薬。
本発明の蛋白質またはポリペプチドとしては、
（ａ）　配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２９２〜４３９で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）　蛋白質が、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を有する上記（ａ）の蛋白質、
（ｃ）　配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｄ）　配列番号１０および配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｅ）　上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの蛋白質の有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質、
（ｆ）　上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの蛋白質の有するアミノ酸配列と、６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質、
（ｇ）　蛋白質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質である上記（ｃ）または（ｄ）に記載の蛋白質、
（ｈ）　配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｉ）　上記（ａ）〜（ｈ）のいずれか１つの蛋白質の有するアミノ酸配列中の連続した５〜６０アミノ酸残基を有するポリペプチド、をあげることができる。　上記のアミノ酸の付加、欠失、あるいは置換は、Ｚｏｌｌｅｒ　Ｍ．Ｊ．＆　Ｓｍｉｔｈ　Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ　Ｇ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｗｅｌｌｓ　Ｊ．Ａ．ら，Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｃａｒｔｅｒ　Ｐ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ　Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、配列番号２記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより行うことができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
目的の変異（欠失、置換、付加）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Ｈｏ　Ｓ．Ｎ．ら，Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入することができる。すなわち、まず該ＤＮＡの５’端に対応するセンスプライマーと、５’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（５’側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの５’端から変異導入部位までの断片Ａ（３’端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、５’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（３’側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの３’端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、５’端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から３’端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入された該ＤＮＡが増幅する。
また欠失変異体の一種であるβ−カテニン核局在化蛋白質の部分断片をコードするＤＮＡは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの任意のＤＮＡ断片の両端の塩基配列に対応したプライマーを用い、該ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより取得することができる。
また、本発明の蛋白質がβ−カテニンを核に局在化させる機能を有するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が付加、欠失あるいは置換したアミノ酸配列からなり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質として、配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２４５〜５６４番目に相当する部分断片である配列番号４のアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
本発明のＤＮＡとしては、
（ｊ）　上記本発明の蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｋ）　配列番号１で表される塩基配列の塩基番号８７４〜１３１７で表される塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｌ）　ＤＮＡが、配列番号１または３で表される塩基配列を有する上記（ｋ）のＤＮＡ、
（ｍ）　以下の［１］または［２］に記載の塩基配列を含み、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１］配列番号９で表される塩基配列
［２］配列番号９および１１で表される塩基配列
（ｎ）　上記（ｊ）〜（ｍ）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｏ）　ＤＮＡが、配列番号９および１１で表される塩基配列を含むＤＮＡであり、かつ配列番号２で表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、かつβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または
（ｐ）　配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、をあげることができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡなどの本発明のＤＮＡまたはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１〜３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列中の１０〜６０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。ただし、公知の塩基配列、すなわちＥＳＴやゲノムドラフトシーケンスとしてその配列が公開されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドから除く。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、以下の説明において、β−カテニンと結合し、β−カテニンを核内へ局在させる作用をもつ蛋白質を「β−カテニン核局在化蛋白質」と総称し、本発明の新規なアミノ酸配列を有するβ−カテニン核局在化蛋白質を、アミノ酸配列がｂｃｌ９と相同性をもつことからｂｃｌ９類似蛋白質（ｂｃｌ９　ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、Ｂ９Ｌ蛋白質と略す）と称する。
１．β−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡの部分配列からなるオリゴヌクレオチド
１）Ｂ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡの取得
本発明のＢ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡと略記する）として、Ｂ９Ｌ全長ｃＤＮＡ、Ｂ９Ｌ全長ｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡ、Ｂ９Ｌ全長ｃＤＮＡのＢ９Ｌ蛋白質をコードしている領域（配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡをあげることができる。
Ｂ９Ｌ　ｃＤＮＡは、酵母ツーハイブリッド法［Ｆｉｅｌｄｓ　Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４０，２４５（１９８９）］により取得することができる。
酵母ツーハイブリッド法とは、ＧＡＬ４のようなＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）と転写活性化ドメイン（ＡＤ）が別々に存在するような酵母の転写因子Ｚを利用して、目的蛋白質［この方法では、一般にベイト（ｂａｉｔ）と呼ばれる］Ｘと被検蛋白質Ｙの結合を検出する方法である。まず、宿主酵母内でＸを転写因子ＺのＤＮＡ結合ドメインとの融合蛋白（以下、ＢＤ−Ｘと称する）として発現できるプラスミド（ベイト・プラスミド）を作製する。一方、宿主酵母内でＹと転写因子Ｚの転写活性化ドメインとの融合蛋白（以下、ＡＤ−Ｙと称する）として発現できるプラスミドを作製する。両プラスミドを宿主の酵母に導入し、ＢＤ−ＸとＡＤ−Ｙを同時に発現させる。この宿主酵母には、転写因子Ｚが結合して転写を活性化するプロモーターの制御下で、リポーター遺伝子を発現できるような遺伝子型のものを用いる。蛋白質ＹがＸと結合する性質を持っている場合は、ＢＤ−ＸとＡＤ−Ｙが結合して複合体を形成するため、ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）を介してプロモーターに結合した複合体が転写活性化ドメイン（ＡＤ）を介して転写を活性化しリポーター遺伝子が発現する。したがって、リポーター遺伝子の発現を指標として、蛋白質ＹがＸと結合することを検出することができる。ここで、被検蛋白質Ｙとして、ｃＤＮＡライブラリー由来の蛋白質を用いて、リポーター遺伝子の発現を指標にして形質転換体をスクリーニングすることにより、Ｘと結合する蛋白質ＹをコードするｃＤＮＡを含む形質転換体を単離することができる。該形質転換体からプラスミドを単離することにより目的とするｃＤＮＡをクローン化することができる。
以下、上記方法によるＢ９Ｌ　ｃＤＮＡのクローニングを、ベイトとしてマウスβ−カテニンのアルマジロ・ドメイン（以下、β−カテニンａｒｍと略記する）を、転写因子Ｚとしては酵母ＧＡＬ４をそれぞれ用いた場合を例にして具体的に説明する。
（１）　ベイト・プラスミドの作製
本発明においては、ベイトとしてｍβ−カテニンａｒｍ（マウスβ−カテニンのアミノ酸配列のアミノ酸番号１２８〜６８３番目に相当する）を用いた。ベイト・プラスミドの作製のためには、ベイトとなるｍβ−カテニンａｒｍをコードするＤＮＡ（以下、ｍβ−カテニンａｒｍ　ＤＮＡと略記する）が必要である。マウスβ−カテニンのｃＤＮＡの全塩基配列は公知［ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：Ｍ９０３６４、Ｂｕｔｚ　Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，１１４２（１９９２）］であるので、ｍβ−カテニンａｒｍ　ＤＮＡに相当する塩基配列は容易に見出すことができる。したがって、以下に示すＲＴ−ＰＣＲ［ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ　Ｍ．Ｊ．ら，ＰＣＲ：Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９１）］によりｍβ−カテニンａｒｍ　ＤＮＡを増幅し、単離することができる。
具体的には、β−カテニンを発現しているマウスの組織あるいは細胞からＲＮＡを単離し、該ＲＮＡを材料にしてｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを鋳型にしてｍβ−カテニンａｒｍ　ＤＮＡの５’端部分の塩基配列を含むセンスプライマーと３’端部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含むアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行なう。増幅用プライマーのそれぞれの５’端に、後述するベイト・プラスミド用ベクターのクローニング用制限酵素サイトの認識配列を存在させることにより、後述するベイト・プラスミド作製用のベクターに増幅断片を組み込む際に制限酵素サイトを利用して効率よく組み込むことが可能となる。なおクローニング用制限酵素サイトの認識配列をプライマーに存在させる場合は、ベクターに組み込んだときに、転写因子の転写活性化ドメインとｍβ−カテニンａｒｍのコドンのフレームが合うようにデザインする。
上記の方法で調製したｍβ−カテニンａｒｍ　ＤＮＡを組み込むベクターとしては、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで複製可能であり、適当な形質転換マーカー遺伝子、例えばＴＲＰ１、ＬＥＵ２等のアミノ酸合成系遺伝子等をもち、酵母で発現するプロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーターの制御下で、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（以下、ＧＡＬ４　ＢＤと略記する）を発現できるようなベクターが好ましい。この場合ｍβ−カテニンａｒｍ　ＤＮＡ挿入のため、ＧＡＬ４　ＢＤのＣ末側に相当する部分に適当な制限酵素サイトがあり、また、ベクターＤＮＡの精製等の取扱い上の容易さから、大腸菌でも複製でき、アンピシリン耐性遺伝子等の大腸菌で検出可能な形質転換マーカーをもつものが望ましい。このようなベクターとしてはｐＧＢＴ９［クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社］、ｐＡＳ１［Ｄｕｒｆｅｅ　Ｔ．ら，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，７，５５５（１９９３）］、ｐＡＳ２−１（クローンテック社製）等が挙げられる。
上記で調製したｍβ−カテニンａｒｍ　ＤＮＡを単離し、ベクター中のＧＡＬ４　ＢＤのＣ末側の制限酵素サイトにコドンのフレームが合うように挿入する。
（２）　ツーハイブリッド法用ｃＤＮＡライブラリーの作製
ＧＡＬ４の転写活性化ドメインとの融合蛋白質を発現するｃＤＮＡライブラリーを作製するためのベクターとしては、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅで複製可能であり、適当な形質転換マーカー遺伝子、例えばＴＲＩＰ１、ＬＥＵ２等の酵母のアミノ酸合成系遺伝子等をもち、酵母で発現するプロモーター、例えばＡＤＨプロモーターの制御下で、ＧＡＬ４の転写活性化ドメイン（以下、ＧＡＬ４　ＡＤと略記する）を発現できるようなベクターが好ましい。この場合、ＧＡＬ４　ＡＤのＣ末側に相当する部分に適当な制限酵素サイトがあり、また、ベクターＤＮＡの精製等の取扱い上の容易さから、大腸菌でも複製でき、アンピシリン耐性遺伝子等の大腸菌で検出可能な形質転換マーカーをもつものが好ましい。このようなベクターとしてはｐＧＡＤ［Ｃｈｉｅｎ　Ｃ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９５７８（１９９１）］、ｐＧＡＤ４２４（クローンテック社製）やｐＡＣＴ［Ｄｕｒｆｅｅ　Ｔ．ら，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，７，５５５（１９９３）］、ｐＡＣＴ２−１（クローンテック社製）等が挙げられる。
細胞内でβ−カテニンと相互作用する蛋白質は、β−カテニンと同じ細胞や組織で発現していると考えられる。β−カテニンは成体や胎児の組織で広く発現していることが報告されているが、β−カテニンが発現していると考えられるマウスの組織や細胞からｃＤＮＡを調製し、前述の融合蛋白質発現用ベクターのＧＡＬ４　ＡＤのＣ末側の制限酵素サイトに挿入することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。この場合、ｃＤＮＡとＧＡＬ４　ＡＤの方向およびフレームがあっていれば、ＧＡＬ４　ＡＤと該ｃＤＮＡがコードする蛋白質との融合蛋白質が発現する。あるいは酵母ツーハイブリッド法に使用できる市販のライブラリー、例えばマッチメーカー（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ）ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社製）を用いることもできる。
（３）酵母ツーハイブリッド法によるｃＤＮＡのスクリーニング
（１）で作製したベイト・プラスミドと（２）で作製したｃＤＮＡライブラリーを導入する酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅに属する酵母であって、上述のベイト・プラスミドとｃＤＮＡライブラリーを導入でき、さらに（ａ）導入するプラスミドの形質転換マーカーの遺伝子、およびツーハイブリッド法に用いた転写因子ＧＡＬ４の遺伝子が欠失や変異により発現できないこと、（ｂ）適当なリポーター遺伝子のプロモーター部位に、ＧＡＬ４　ＢＤが結合する塩基配列が挿入してあることが必要である。この場合のリポーター遺伝子としては、ベイトとの結合により転写が開始された場合に検出が容易なもの、例えばＨＩＳ３等のアミノ酸合成系遺伝子（この場合、ベイト・プラスミドの形質転換マーカーとは異なるものを用いる）、酵母でも検出可能である大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子ｌａｃＺ等が好ましく用いられる。例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ　ＣＧ１９４５株（クローンテック社製）、ＨＦ７Ｃ株（クローンテック社製）、Ｙ１５３株［Ｄｕｒｆｅｅ　Ｔ．ら，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，７，５５５（１９９３）］、ＣＧＹ１：：１７１株［Ｇｉｌｌ　Ｇ．＆　Ｐｔａｓｈｎｅ　Ｍ．，Ｃｅｌｌ，５１，１２１（１９８７）］等があげられる。
この宿主酵母に（１）で作製したベイト・プラスミドと（２）で作製したｃＤＮＡライブラリーとを導入し、リポーター遺伝子の発現を指標にしてｍβ−カテニンａｒｍと結合する蛋白質をコードするｃＤＮＡを含む形質転換体を選択する。例えば、ヒスチジン生合成系遺伝子ＨＩＳ３遺伝子をリポーター遺伝子とした場合は、ヒスチジンを含まない最小培地で培養したときに生育するコロニーを、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子をリポーター遺伝子とした場合はＸ−ｇａｌを作用させ青く発色するコロニーを選択する。
選択した形質転換体コロニーにはベイト・プラスミドとｃＤＮＡライブラリーのプラスミドの２種類のプラスミドが含まれているので、ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドをだけを、文献［Ｇｌｏｖｅｒ　Ｄ．Ｍ．＆　Ｈａｍｅｓ　Ｂ．Ｄ．，ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ　１４９）Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、Ｃｈｉｅｎ　Ｃ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９５７８（１９９１）］記載の方法により単離する。すなわち、コロニーからプラスミドを含むＤＮＡ全体を単離し、大腸菌を形質転換する。この際の宿主大腸菌は、ｃＤＮＡライブラリーのマーカー遺伝子に対応する遺伝子を発現せず、該マーカー遺伝子が導入された形質転換体が該マーカー遺伝子を発現した際に検出可能な株を用いる。該形質転換体より、ｃＤＮＡライブラリー由来のマーカー遺伝子を発現している形質転換体を選択し、選択した形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡクローンとする。
（４）ｃＤＮＡクローンの塩基配列の解析
（３）で得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列は、得られたｃＤＮＡクローンをそのまま、あるいはｃＤＮＡ部分を適当な制限酵素によって切り出してｐＵＣ１１８等の適当なクローニングベクターにサブクローニングした後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばＳａｎｇｅｒらのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいはパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）社等のＤＮＡシークエンサーを用いることにより決定することができる。
得られたｃＤＮＡの塩基配列が新規な配列かどうかは、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪ等の塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の既存の遺伝子の塩基配列と一致すると考えられるような明らかな相同性を示す塩基配列がないことにより確認できる。
新規な塩基配列である場合、（３）で得られたｃＤＮＡクローンは（２）で述べたように、ＧＡＬ４　ＡＤのＣ末にＢ９Ｌ蛋白質が同一フレームでつながっている融合蛋白質をコードしているはずである。したがって、ここで解明されたｃＤＮＡの塩基配列をＧＡＬ４　ＡＤの翻訳フレームと同じフレームでアミノ酸に変換することにより、このｃＤＮＡがコードしている蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。
また、このアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＦｒａｍｅＳｅａｒｃｈ等の相同性検索プログラムを用いて、Ｇｅｎｐｅｐｔ、ＰＩＲ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ等のアミノ酸配列データベースを検索することにより、ｃＤＮＡがコードする蛋白質と相同性をもつ既存の遺伝子を検索することができる。
以上のようにして得られる新規な塩基配列を有するｃＤＮＡとして配列番号３で表される塩基配列を有するｃＤＮＡをあげることができる。該ｃＤＮＡは配列番号４で表される新規なアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。
ただしこのようにして得られたｃＤＮＡは、目的とする蛋白質全体をコードしていない非完全長のｃＤＮＡであることが多い。この場合は、下記（５）に示す方法で全長のｃＤＮＡを得た後、上記で取得したｃＤＮＡをアミノ酸へ翻訳したときと同一のフレームでアミノ酸配列に翻訳することにより、目的とする蛋白質全体のアミノ酸配列を明らかすることができる。なお、Ｂ９Ｌ蛋白質全体のアミノ酸配列をコードしていれば、Ｂ９Ｌ蛋白質をコードしている領域の各コドンの塩基配列はｃＤＮＡで用いられているコドンに限られるものではなく、同じアミノ酸をコードするあらゆるコドンの塩基配列を用いることができる。
（５）Ｂ９Ｌ全長ｃＤＮＡのクローン化
（４）の塩基配列の解析や後述するノーザンブロットハイブリダイゼーションで得られたｍＲＮＡの長さの情報から、（３）で得られたＢ９Ｌ　ｃＤＮＡが全長ではないと予測される場合は、以下に示す方法でＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡを調製することができる。
（５−１）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
（２）で調製した融合蛋白する発現ｃＤＮＡライブラリー、あるいはβ−カテニンが発現しているためＢ９Ｌ蛋白質も同時に発現していると考えられる組織または細胞、または、後述するノーザンブロッティングでβ−カテニンのｍＲＮＡが検出された細胞等から調製したｃＤＮＡライブラリーに対して、（３）で得られたｃＤＮＡの全体あるいは一部をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローンの中から全長と考えられる長さのｃＤＮＡクローンを選択する。ｃＤＮＡライブラリーの作製やハイブリダイゼーションはモレキュラー・クローニング　第２版に記載の方法で行なうことができる。また、クローンテック社等から市販されているｃＤＮＡライブラリーを利用することもできる。得られたｃＤＮＡクローンについて（４）と同様にして塩基配列を決定することにより、マウスＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡの塩基配列および、マウスＢ９Ｌ蛋白質全体のアミノ酸配列を明らかにすることができる。
（５−２）ＲＡＣＥ法
Ｂ９Ｌ蛋白質が発現していると考えられる組織あるいは細胞からｃＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡの両端にアダプターオリゴヌクレオチドを付加し、このアダプターの塩基配列と（３）で得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列に基づいたプライマーでＰＣＲを行う５’−ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）法および３’−ＲＡＣＥ法［Ｆｒｏｈｍａｎ　Ｍ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８（１９８８）］により、（３）で得られたｃＤＮＡよりも５’側および３’側のｃＤＮＡ断片を得ることができる。得られたｃＤＮＡの塩基配列を（４）と同様にして決定することによりＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡの塩基配列を明らかにすることができる。
（５−３）ＥＳＴの塩基配列の利用
（４）で決定したＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの塩基配列を公知の塩基配列データベースと相同性解析を行なった際に、既知の遺伝子の塩基配列とは一致が見られないが、ランダムなｃＤＮＡクローンの部分塩基配列であるＥＳＴと一致が見られる場合がある。この場合はこれらのＥＳＴおよび該ＥＳＴの塩基配列と一致する塩基配列をもつＥＳＴ、該ＥＳＴと同一クローン由来のＥＳＴを同一遺伝子由来のＥＳＴとして集める。これらのＢ９Ｌ　ｃＤＮＡ由来と考えられるＥＳＴの塩基配列をつなぎ合わせると、（４）で得られたｃＤＮＡよりも、５’側あるいは３’側に延長した部分の塩基配列が見出されることがある。この場合、これらのＥＳＴをつなぎ合わせて得られた塩基配列の最も５’端の塩基配列を有するセンスプライマーあるいは３’端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンスプライマーを用いて、Ｂ９Ｌ蛋白質が発現していると考えられるマウス組織あるいは細胞由来のｃＤＮＡまたは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行なうことにより、（４）で得られたｃＤＮＡの塩基配列よりも５’側あるいは３’側の配列を含むｃＤＮＡ断片を得ることができる。これらのｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、これらがＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡの５’端あるいは３’端に相当していると考えられる場合は、（４）で得られたｃＤＮＡの塩基配列とつなぎあわせることによりマウスＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡの塩基配列を明らかにすることができる。マウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡ由来と考えられるＥＳＴが公知の塩基配列データベースより多数得られた場合は、ＲＴ−ＰＣＲを行なわなくても、集めたＥＳＴの塩基配列をつなぎ合わせることによりマウスＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡの塩基配列を明らかにすることもできる場合もある。
（５−４）Ｂ９Ｌ全長ｃＤＮＡの調製
明らかになったＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡの５’末端および３’末端の塩基配列に基づいたプライマーを用いて、Ｂ９Ｌ蛋白質を発現していると考えられるマウス組織あるいは細胞から（３）と同様にして調製したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことによりＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡを増幅し、調製することができる。
また（５−１）で得られたＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡクローン、あるいは（５−２）や（５−３）で得られた５’側や３’側の部分ｃＤＮＡと最初に得られたＢ９Ｌ　ｃＤＮＡをｃＤＮＡ内の制限酵素サイトを利用してつなぎあわせることにより作製したＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡクローン、または上記のＰＣＲで調製したＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡを、適当なクローニングベクターにクローン化したＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡクローンで、大腸菌を形質転換して培養し、そこからプラスミドＤＮＡを調製することにより、Ｂ９Ｌ全長ｃＤＮＡを調製することができる。
このようにして得られた配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡであるｐＥＧＦＰ−Ｃ２Ｂ９Ｌを含有する形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＥＧＦＰ−Ｃ２Ｂ９Ｌは、平成１２年９月６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所　特許性物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１　中央６（郵便番号３０５−８５６６）（旧称　工業技術院生命工学工業技術研究所、旧住所　日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ　ＢＰ−７２９１として寄託されている。
またＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡをその塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することもできる。ＤＮＡ合成機としては、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ　３９２等をあげることができる。
（６）ヒトＢ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡの取得
ヒトの大腸癌の発症機構の解析やその治療や診断のためには、マウスよりもヒトのＢ９Ｌ蛋白質あるいは該蛋白質をコードするＤＮＡを取得することが重要である。一般に同じ機能を持つ蛋白質は、生物種が異なった場合、同一ではないが相同性を示すアミノ酸配列を有する場合が多い。したがってその蛋白質をコードするＤＮＡも同様に相同性を示すと考えられる。また、生物の進化に伴い遺伝子の変異も進むため、その生物種が系統的に近いほど、その相同性は高いと考えられる。従って、（３）で得られたマウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡあるいはその塩基配列情報を用いることにより、以下に示す方法で、他の哺乳類、例えばヒトのＢ９Ｌ　ｃＤＮＡを取得することができる。このｃＤＮＡが完全長ｃＤＮＡでない場合は、（５）と同様の方法を用いることによりヒトＢ９Ｌ　ＤＮＡを得ることができる。
なお、マウスＢ９Ｌ　ＤＮＡを取得せずに、ヒトβ−カテニン［Ｈｕｌｓｋｅｎ　Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１２７，２６０１（１９９４）、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ８７８３８］のアルマジロドメインをベイトとしたベイト・プラスミドとヒトｃＤＮＡライブラリーを用いた酵母ツーハイブリッド法で（１）〜（５）と同様の操作行なうことにより、直接ヒトＢ９Ｌ　ｃＤＮＡを取得することも可能である。
（６−１）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ヒトＢ９Ｌ蛋白質のｃＤＮＡクローンは、マウスＢ９Ｌ蛋白質が発現しているマウス組織と同じヒト組織あるいはそのような組織由来のヒト細胞から（５−１）と同様にしてｃＤＮＡライブラリーを作製するか、そのようなヒト組織や細胞由来の市販のヒトｃＤＮＡライブラリーを購入し、当該ｃＤＮＡライブラリーから、マウスＢ９Ｌ　ＤＮＡを放射性同位体やジギキシゲニン等で標識したものをプローブにして、ややストリンジェントな条件でコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、取得することができる。
ここでいう、ややストリンジェントな条件とは、ヒトＢ９Ｌ　ｃＤＮＡとマウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの相同性の程度によって異なるが、制限酵素切断したヒト染色体ＤＮＡに対してマウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡをプローブにして、ストリンジェントな度合いが異なるいくつかのハイブリダイズ条件でサザンブロットハイブリダイゼーションを行い、明確なバンドが見える条件のうち最もストリンジェントな条件を用いる。例えばホルムアミドを含まないハイブリダイズ液の場合、ハイブリダイズ液の組成は塩濃度を１ｍｏｌ／ｌに固定し、ハイブリダイズ温度を６８℃〜４２℃で段階的に変えたいくつかの条件下でハイブリダイズを行い、ハイブリダイズと同じ温度で０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで洗浄を行ってみて決める。あるいはホルムアミドを含むハイブリダイズ液の場合、温度（４２℃）と塩濃度（６×ＳＳＣ）を固定し、ホルムアミド濃度を５０〜０％で段階的に変えたいくつかの条件下でハイブリダイズを行い、５０℃で０．５％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣで洗浄を行ってみて決める。
（６−２）ＥＳＴおよびヒトゲノム塩基配列を利用したヒトＢ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡの取得
（４）で得られたマウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの塩基配列、特に蛋白質をコードしている領域と高い（具体的には８０％以上の）相同性をもつヒトＤＮＡの塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースからＢＬＡＳＴ等の相同性プログラムを用いて検索することにより、ヒトＢ９Ｌ　ｃＤＮＡ由来と推定されるＥＳＴあるいはヒトＢ９Ｌゲノム遺伝子のエキソン部分を含むヒトゲノムＤＮＡの塩基配列を見出すことができる。このような塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ４６３６５やＲ２４７６２のヒトＥＳＴ、あるいはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＰ０００８７７、ＡＰ００２３５７、ＡＰ０００９０９のヒトゲノムＤＮＡのワーキング・ドラフト・シークエンスをあげることができる。
このようなヒトゲノムＤＮＡの配列とマウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡおよびヒトＥＳＴの塩基配列を比較することにより、ヒトＢ９Ｌ蛋白質をコードするエキソン部分すなわちヒトＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの配列を得ることができる。このようなヒトＢ９ＬゲノムＤＮＡのエキソンの塩基配列として配列番号５〜８で表される塩基配列をあげることができる。該ＥＳＴクローンは、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）のＥＳＴクローンをＡＴＣＣから入手するか、または相同性をもつヒトＥＳＴあるいはヒトゲノムＤＮＡのエキソンの配列に基づいたプライマーを作製し、Ｂ９Ｌ蛋白質が発現していると考えられるヒトの組織あるいは細胞から調製したｍＲＮＡを鋳型にして（３）と同様のＲＴ−ＰＣＲを行いＤＮＡ断片を増幅することにより、ヒトＢ９Ｌ　ｃＤＮＡを得ることができる。
（７）Ｂ９ＬゲノムＤＮＡの取得
モレキュラー・クローニング第２版に記載の方法により、マウスあるいはヒトの細胞や組織から単離した染色体ＤＮＡを用いて作製したゲノムＤＮＡライブラリーに対して、（３）あるいは（６）で得られたマウスあるいはヒトＢ９Ｌ　ｃＤＮＡをプローブにして、プラークハイブリダイゼーション等の方法でスクリーニングすることにより、Ｂ９Ｌ遺伝子のマウスあるいはヒトのゲノムＤＮＡを得ることができる。Ｂ９ＬのゲノムＤＮＡの塩基配列とｃＤＮＡの塩基配列を比較することによりＢ９Ｌ遺伝子のエキソン／イントロン構造を明らかにすることができる。また、特にｃＤＮＡの５’側の部分をプローブにすることにより、Ｂ９Ｌ遺伝子のプロモーターなど転写を制御する領域のゲノム遺伝子の塩基配列を明らかにすることができる。この配列はＢ９Ｌ遺伝子の転写の制御機構を解析するのに役立つ。また、相同性組換えの手法［Ｋｕｅｈｎ　Ｍ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）、Ｔｈｏｍａｓ　Ｋ．Ｒ．＆　Ｃａｐｅｃｃｈｉ　Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，５１，５０３（１９８７）］により、染色体上のＢ９Ｌ遺伝子を不活化または任意の配列と置換したクローンを作製することができる。
（８）　Ｂ９Ｌオリゴヌクレオチドの調製
上記（５）のＤＮＡ合成機により、本発明のＢ９Ｌ　ＤＮＡの一部の配列を有するオリゴヌクレオチドあるいはこれと相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（以下、Ｂ９Ｌオリゴヌクレオチドと略記する）を調製することができる。
Ｂ９Ｌオリゴヌクレオチドとしては、具体的には、配列番号１で表される塩基配列中の連続した１０〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。これらのＤＮＡをセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーとして用いる場合には、融解温度および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドが好ましい。
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる［横山和尚，細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
２）ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡの部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの取得
ｂｃｌ９蛋白質は上記の方法で得られるマウスＢ９Ｌ蛋白質とアミノ酸配列レベルで全体に渡って約３７％の相同性を有する蛋白質であるが、本発明により、β−カテニンと結合することが見出されたことから、β−カテニン核局在化蛋白質であると考えられる蛋白質である。ヒトｂｃｌ９蛋白質をコードする全長ｃＤＮＡの塩基配列および該ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列は公知である［Ｗｉｌｌｉｓ　Ｔ．Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９１，１８７１（１９９８）］。ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡやオリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡやゲノムＤＮＡから上記（５−４）、（７）、（８）の方法で得ることができる。また、上記（６）の方法と同様にしてヒト以外の動物、たとえばマウスのｂｃｌ９　ＤＮＡを得ることができる。
２．β−カテニン核局在化蛋白質または該蛋白質の部分ポリペプチドの製造法およびその活性の測定法
本発明のβ−カテニン核局在化蛋白質であるＢ９Ｌ蛋白質やｂｃｌ９蛋白質および該蛋白質の部分ポリペプチドは、モレキュラー・クローニング　第２版、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ　ａｎｄ　Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法を用いて、１．で調製したβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡまたは該蛋白質の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより製造することができる。以下にＢ９Ｌ蛋白質を例にして記載するが、ｂｃｌ９蛋白質または該蛋白質の部分ポリペプチドも同様にして製造することができる。
すなわち、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、Ｂ９Ｌ蛋白質を発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、本発明のＢ９Ｌ蛋白質を製造することができる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、宿主細胞中でＢ９Ｌ　ＤＮＡからｍＲＮＡを転写できるプロモーターを含有しているものが用いられる。
宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、発現ベクターは宿主原核生物中で自律複製可能であり、リボソーム結合配列を有するプロモーターの下流にＢ９Ｌ　ＤＮＡが配置されたものを用いる。リボソーム結合配列と開始コドンとの間は適当な距離（例えば、大腸菌宿主のベクターの場合６〜１８塩基）に調節されていることが好ましい。必ずしも必要ではないが、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡの直下に転写終結配列を配置する方が好ましい。また、形質転換体の選択のため、薬剤耐性遺伝子等のマーカーとなる遺伝子を発現する配列を含むようにする。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌を宿主とした場合は、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。枯草菌を宿主とした場合は、枯草菌のファージであるＳＰＯ１やＳＰＯ２のプロモーター、ＰｅｎＰプロモーター等をあげることができる。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＫＫ２２３−３（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＥＴ１４（ノバジェン社製）等を例示することができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｄｏｗｅｒ　Ｗ．Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］、カルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ　Ｓ．Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）、Ｒｅｉｄ　Ｊ．Ｄ．ら，Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）］、プロトプラスト法［特開昭６３−２４８３９４、Ｃｈａｎ　Ｓ．＆　Ｃｏｈｅｎ　Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主酵母で転写を行なうプロモーター、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡ、転写の終止配列および酵母での形質転換マーカーとなる遺伝子、たとえば薬剤耐性遺伝子やＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２等のアミノ酸合成系の遺伝子を発現できる配列を含有しているものが用いられる。また、発現ベクターの作製や維持を容易にするため、大腸菌内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが好ましい。
プロモーターとしては、酵母中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＡＤＨ１、ガラクトース代謝系遺伝子ＧＡＬ１やＧＡＬ１０等のプロモーター、酸性フォスファターゼ遺伝子ＰＨＯ５プロモーター、フォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子ＰＧＫプロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＡＰプロモーター、ヒートショック蛋白質遺伝子プロモーター、α接合因子遺伝子ＭＦα１プロモーター、銅メタロチオネイン遺伝子ＣＵＰ１プロモーター、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓのアルコールオキシダーゼ遺伝子ＡＯＸ１のプロモーター等が用いられる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピヒア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ　Ｄ．Ｍ．＆　Ｇｕａｒｅｎｔｅ　Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９１）］、スフェロプラスト法［Ｓｈｏｒｔｌｅ　Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏ　Ｈ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主動物細胞で転写を行なうプロモーター、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡ、転写の終止と転写物のポリアデニル化のシグナルの配列を含有しているものが用いられる。またベクターの作製や維持を容易にするため、大腸菌内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが望ましい。プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができるが、ＳＶ４０の初期プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスのＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー、ラウス肉腫ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルスのＬＴＲ等のウイルス由来の配列、あるいはメタロチオネイン遺伝子やβ−アクチン遺伝子、伸長因子−１などの動物細胞由来の遺伝子のプロモーター等をあげることができる。またＳＶ４０の初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルスＩのＬＴＲを組み合わせたＳＲαプロモーター等これらのプロモーターを人為的に組み合わせたプロモーターも用いられる。
宿主染色体ＤＮＡにＢ９Ｌ　ＤＮＡが組み込まれた恒常的なＢ９Ｌ蛋白質発現細胞は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン等の薬剤に対する耐性遺伝子を発現できる配列を含むＢ９Ｌ発現ベクターを宿主細胞に導入し、薬剤の存在下で培養することにより選択することができる。また、宿主細胞中でのＢ９Ｌ蛋白質の生産量を上昇させるために、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を発現できるような配列を含むＢ９Ｌ蛋白質の恒常的発現ベクターを宿主細胞に導入し、ｄｈｆｒ阻害剤であるメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）の濃度を段階的に上げながら培養することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともにＢ９Ｌ　ＤＮＡのコピー数を増幅させることもできる。このｄｈｆｒ遺伝子を用いた遺伝子増幅を行なう場合の宿主細胞としては、ｄｈｆｒ遺伝子が機能していない細胞、例えばＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９０９６）などを用いる。
上記のＢ９Ｌ蛋白質発現ベクターの作製に用いられる具体的なベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クローンテック社製）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９、Ｍｉｙａｊｉ　Ｈ．ら，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｓｅｅｄ　Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＡＭｏ［Ｓａｓａｋｉ　Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）］等があげられる。
Ｂ９Ｌ蛋白質の動物細胞発現ベクターとしては、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ２のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩサイト間にマウスＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡを挿入したｐＥＧＦＰ−Ｃ２Ｂ９Ｌをあげることができる。ｐＥＧＦＰ−Ｃ２Ｂ９Ｌを含む形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＥＧＦＰ−Ｃ２Ｂ９Ｌは、平成１２年９月６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）（旧称　工業技術院生命工学工業技術研究所、旧住所　日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ　ＢＰ−７２９１として寄託されている。
宿主細胞としては、ヒト細胞であるＨｅＬａ、ナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）、２９３、アフリカミドリザル腎臓細胞であるＣＯＳ−１やＣＯＳ−７、ハムスターの細胞であるＣＨＯやＢＨＫ、マウス胎児細胞であるＮＨＩ３Ｔ３、マウス・ミエローマ細胞であるＳＰ２／０やＮＳＯ、ラット・ミエローマ細胞であるＹＢ２／０等の細胞株をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｉｙａｊｉ　Ｈ．ら，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｆｅｌｇｎｅｒ　Ｐ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合は、バキュロウイルス発現系［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ　Ｄ．Ｒ．ら，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｌｕｃｋｏｗ　Ｖ．Ａ．＆　Ｓｕｍｍｅｒｓ　Ｍ．Ｄ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）］が用いられる。即ち、トランスファーベクターと呼ばれるベクターにＢ９Ｌ　ＤＮＡを挿入した後、該ベクターとバキュロウイルスを昆虫細胞に同時に導入し、強力なプロモーターであるポリヘドリン遺伝子プロモーター下にＢ９Ｌ　ＤＮＡが挿入された組換えバキュロウイルスを相同組換えによって作製した後、この組換えバキュロウイルスを再度昆虫細胞に感染させることにより、Ｂ９Ｌ蛋白質を発現することができる。
バキュロウイルスとしてはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス、カイコ核多角体病ウイルス等が用いられる。昆虫細胞としてはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞であるＳｆ９およびＳｆ２１［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ　Ｄ．Ｒ．ら，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。また、カイコ幼虫体をそのまま用いることもできる。トランスファーベクターには、ポリヘドリンプロモーターおよび相同組換えを起こさせるためのバキュロウイルス由来の配列、ベクターの維持・増殖や外来遺伝子の組み込み等の遺伝子操作を大腸菌内で行なうための配列（大腸菌での自律複製可能な配列および薬剤耐性遺伝子）が含まれており、具体的にはｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅｂａｃ４（ともにインビトロジェン社製）等があげられる。
動物個体を用いてＢ９Ｌ蛋白質を生産することもできる。例えば、公知の方法［Ｃｏｌｍａｎ　Ａ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ｒｏｓｅｎ　Ｊ．Ｍ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｗｒｉｇｈｔ　Ｇ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡを導入した動物中にＢ９Ｌ蛋白質を生産することができる。
プロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法［井沢毅，組織培養，２０，６（１９９４）、橋本隆，組織培養，２１，１４（１９９５）、Ｍｉｅｌｅ　Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じてＢ９Ｌ蛋白質を生産することができる。
Ｂ９Ｌ　ＤＮＡの発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させるＢ９Ｌ　ＤＮＡとの間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡの発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エレクトロポレーション法［Ｍｉｙａｊｉ　Ｈ．ら，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法等をあげることができる。
Ｂ９Ｌ　ＤＮＡを導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡが導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成することもできる。
本発明のＢ９Ｌ　ＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、Ｂ９Ｌ蛋白質を生成蓄積させ、該培養物よりＢ９Ｌ蛋白質を採取することにより、Ｂ９Ｌ蛋白質を製造することができる。
動物細胞を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｅａｇｌｅ　Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、Ｄａｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地［Ｄａｌｂｅｃｃｏ　Ｒ．＆　Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｇ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。必要に応じてペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地［ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製］、Ｓｆ−９００　ＩＩ　ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ［Ｇｒａｃｅ　Ｔ．Ｄ．Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。培養条件は、ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、Ｂ９Ｌ蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体よりＢ９Ｌ蛋白質を採取することにより、Ｂ９Ｌ蛋白質を製造することができる。
すなわち、動物個体の場合、例えば、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードするＢ９Ｌ蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中よりＢ９Ｌ蛋白質を採取することにより、Ｂ９Ｌ蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
植物個体の場合、例えば、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、Ｂ９Ｌ蛋白質を該植物中に生成蓄積させ、該植物中よりＢ９Ｌ蛋白質を採取することにより、Ｂ９Ｌ蛋白質を製造することができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養期間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。必要に応じて、培養期間中にアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはＩＰＴＧ等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
上記形質転換体の培養物中に蓄積したＢ９Ｌ蛋白質を単離精製するには、以下のような通常の蛋白質の単離精製法を用いればよい。
Ｂ９Ｌ蛋白質が細胞外に分泌される場合には、培地中にＢ９Ｌ蛋白質が蓄積する。従って培養終了後、遠心分離等の手法により細胞を含まない培地のみを回収する。該培地から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ＤＥＡＥセファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）、Ｍｏｎｏ−Ｑ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰセファロース（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。。
Ｂ９Ｌ蛋白質が、形質転換体の細胞内に蓄積する場合には、培養終了後の培養物から、形質転換体の細胞を遠心分離等の手法により回収し、緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
Ｂ９Ｌ蛋白質が細胞内で溶解状態で存在する場合には、該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、上記の培地からの精製単離と同様にして精製標品を得ることができる。また、Ｂ９Ｌ蛋白質が細胞内に不溶体を形成して存在する場合は、該無細胞抽出液を遠心分離後、沈殿画分としてＢ９Ｌ蛋白質の不溶体を回収する。このＢ９Ｌ蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化した後、該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈あるいは透析し、Ｂ９Ｌ蛋白質を正常な立体構造に復元させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、公知の方法［Ｋｉｇａｗａ　Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，６，１２９（１９９８）、Ｓｐｉｒｉｎ　Ａ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）、Ｋｉｇａｗａ　Ｔ．＆　Ｙｏｋｏｙａｍａ　Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）］に準じて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてＢ９Ｌ蛋白質を生産することができる。すなわち、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより大量のＢ９Ｌ　ＲＮＡをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばウサギ網状赤血球ライセートやコムギ胚芽抽出液を用いた翻訳系を利用して、Ｂ９Ｌ蛋白質を生産することができる。
精製したＢ９Ｌ蛋白質の構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば「遺伝子クローニングのための蛋白質構造解析」（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
Ｂ９Ｌ蛋白質あるいはｂｃｌ９蛋白質、およびこれらの蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸の置換、欠失あるいは付加がなされた誘導体や部分断片、あるいはこれらの蛋白質とアミノ酸配列で相同性を有する蛋白質（以下これらを「Ｂ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体」と総称する）が、β−カテニンと結合するかどうかは、１．に示した酵母ツーハイブリッド法において、転写活性化ドメインとこれらの蛋白質をコードするＤＮＡの融合蛋白質発現ベクターとβ−カテニンのベイト・プラスミドを用いて、リポーター遺伝子の転写が検出されるかどうかで調べられる。
また、インビトロで直接Ｂ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体とβ−カテニンを混合し結合反応をさせた後、あるいは細胞内でＢ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体を発現させることにより細胞内で結合させた後、反応液あるいは細胞抽出液に対してβ−カテニンに対する抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降物中に該Ｂ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体が存在するかどうかをウェスタンブロット等により検出することで、調べられる。また抗体を用いずに、Ｂ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体をＧＳＴ等の精製が容易な蛋白質あるいはペプチドとの融合蛋白質を作製した後、３５Ｓ等で標識したβ−カテニンと結合反応を行い、Ｂ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体の融合蛋白質を精製した後、精製物中に標識されたβ−カテニンが存在するかどうかをオートラジオグラフ等により検出することによっても調べることができる。
また、Ｂ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体が、β−カテニンを核へ局在させる作用を有するかどうかは、β−カテニンおよびＢ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体の両者を強制発現させた細胞とβ−カテニンのみを強制発現させた細胞で、細胞を固定化しそれぞれ抗β−カテニン抗体を用いた免疫染色によってβ−カテニンを検出することにより調べることができる。この場合、通常のβ−カテニンでは細胞内でＧＳＫ−３βによる分解制御を受けるので、分解を受けずに蓄積するリン酸化部位の変異体例えば、３３位セリンをチロシンに置換したβ−カテニン変異体を用いることにより、細胞内に存在するβ−カテニンの量が多くなり、細胞内でのβ−カテニンの検出が容易になる。β−カテニンには細胞内局在性はなく、β−カテニンのみを強制発現させた細胞では細胞全体に一様に分布するが、Ｂ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体にβ−カテニンを核へ局在させる作用がある場合は、細胞質に比較して核により多くのβ−カテニンが検出される。このようなβ−カテニンを核に局在化させる活性を有するＢ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体として、Ｂ９Ｌ蛋白質、本発明でツーハイブリッド法により得られたｃＤＮＡクローンがコードするＢ９Ｌ蛋白質部分断片（マウスＢ９Ｌ蛋白質のアミノ酸配列の２４５〜５６４番目の部分に相当する。配列番号４にアミノ酸配列を示した。）をあげることができる。
Ｂ９Ｌ蛋白質あるいはｂｃｌ９蛋白質は、核内に移行するβ−カテニンを増加させることから、β−カテニン／ＴＣＦによる転写活性化を促進すると考えられる。
Ｂ９Ｌ蛋白質およびｂｃｌ９蛋白質自体も含めＢ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体が、Ｗｎｔのシグナル伝達の結果おこるβ−カテニン／ＴＣＦによる転写活性化にどのような影響を及ぼすかは、ＴＣＦと結合する配列をもち、β−カテニン／ＴＣＦに属する蛋白質との複合体により転写の活性化を受けるようなプロモーターの下流にルシフェラーゼやクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等のレポーター遺伝子を接続させたプラスミド、例えばｐＴＯＰＦＬＡＳＨ、ｐＴＯＰＣＡＴ［両者ともＫｏｒｉｎｅｋ　Ｖ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１７８４（１９９７）］を利用して調べることができる。上記のレポーター遺伝子発現プラスミドと、恒常的にＴＣＦ／Ｌｅｆファミリーに属する蛋白質と結合して転写活性化を行えるような変異型β−カテニン、例えば３３番目めのセリン残基をチロシンに置換したβ−カテニンの発現プラスミドを動物細胞に導入し、そこにＢ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体の発現プラスミドをさらに導入した場合としない場合で、レポーター遺伝子の発現量を測定し比較ことにより、該Ｂ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体がβ−カテニン／ＴＣＦによる転写活性化をさらに促進できるかどうかを調べることができる。
３．β−カテニン核局在化蛋白質を認識する抗体の調製
（１）ポリクローナル抗体の調製
上記２．に記載の方法により取得したβ−カテニン核局在化蛋白質の全長または部分断片蛋白質、あるいはペプチド合成機による化学合成法等により製造したβ−カテニン核局在化蛋白質の部分ペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
部分ペプチドを抗原として用いる場合は、該部分ペプチドをＫＬＨや牛チログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法［石川栄治，酵素免疫測定法医学書院（１９７８）、Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．＆　Ｌａｎｅ　Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿［Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．＆　Ｌａｎｅ　Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（２）モノクローナル抗体の調製
（２−１）抗体産生細胞の調製
上記（１）において、免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ中で細断し、ピンセットでほぐし、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をＴｒｉｓ−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（２−２）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ　Ｄ．Ｅ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ．＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｓｈｕｌｍａｎ　Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−８６５３（６５３）［Ｓｅｅｇｅｒ　Ｒ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ（Ｘ６３）［Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ．＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ１６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／ｌグルタミン、５×１０−５ｍｍｏｌ／ｌ　２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌジェンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＣＳＬ社製）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに１５μｇ／ｍｌ８−アザグアニンを加えた培地］で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（２−３）ハイブリドーマの作製
（２−１）で取得した抗体産生細胞と（２−２）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、塩化ナトリウム７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ＰＥＧ−１０００　２ｇ、ＭＥＭ　２ｍｌおよびＤＭＳＯ　０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地［正常培地に１０−４ｍｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１．５×１０−５ｍｍｏｌ／ｌチミジンおよび４×１０−７ｍｍｏｌ／ｌアミノプテリンを加えた培地］１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりＨａｒｌｏｗ　Ｅ．＆　Ｌａｎｅ　Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）Ｃｈａｐｔｅｒ１４等に述べられている酵素免疫測定法により、上記抗体産生細胞を取得するために、免疫に用いた抗原に特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明の蛋白質の全長または部分断片精製標品を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（２−４）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明の蛋白質に特異的に反応するものを本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株として選択する。
（２−４）モノクローナル抗体の調製
プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ；２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（２−３）で取得した本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
４．β−カテニン核局在化蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出・定量法および該蛋白質の発現量がｍＲＮＡレベルで変動している疾患の診断方法
β−カテニン核局在化蛋白質のＤＮＡ、例えば配列番号１で表される塩基配列を有するＢ９Ｌ　ＤＮＡやｂｃｌ９　ＤＮＡ、該ＤＮＡの部分断片例えば配列番号１で表される塩基配列の連続する２００ｂｐ以上の連続した塩基配列を有する断片やβ−カテニン核局在化蛋白質のオリゴヌクレオチドを用いて、β−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡを検出することができる。
β−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡを検出する方法としては、例えばノーザンブロット法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、定量的ＰＣＲ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡチップ法、ＲＮａｓｅ保護アッセイ法などの方法等があげられる。これらの方法により組織や細胞におけるＢ９Ｌ蛋白質のｍＲＮＡレベルでの発現量を調べることができる。
これらの方法によって、β−カテニン核局在化蛋白質がどのような組織や細胞で発現しているかという情報や、細胞がどのような刺激を受けたときにその発現量が変化するかという情報を得ることができる。
これらの方法に用いる試料としてはヒトや動物から採取した臓器や生体組織、血液等の生体試料、あるいはこれらの生体試料から樹立した初代培養細胞、細胞株が用いられる。
ノーザンブロット法は、試料から抽出した全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡ（以下「試料由来ＲＮＡ」という）をゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の膜に転写し、β−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡあるいはその部分配列を有するＤＮＡ、β−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡの部分配列を有するオリゴヌクレオチドを放射性同位体やジゴキシゲニン、ビオチン等で標識して調製したプローブを用いて、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行い、β−カテニン核局在化蛋白質をコードするｍＲＮＡを、標識プローブが特異的に結合したバンドとして検出する方法のことでありモレキュラー・クローニング第２版に記載の方法および条件に基づいて行うことができる。バンドの強度すなわち結合した標識プローブの量はβ−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡの量を反映しているので、組織や病態により発現量がほとんど変化せず、常に構成的に発現しているアクチンやＧ３ＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）等のｍＲＮＡのバンドを同一のフィルター上で検出し、その強度によって標準化を行うことによりβ−カテニン核局在化蛋白質を、ｍＲＮＡレベルでの発現量を定量することができる。また、試料由来ＲＮＡを電気泳動する際に標識したＲＮＡ分子量マーカーを同時に電気泳動し、バンドの泳動位置を分子量マーカーの位置と比較するすることにより、β−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡの長さを測定することができる。
ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、試料である臓器や生体組織からパラフィン包埋切片あるいはクリオスタット切片を作製し、該切片に対してβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの部分配列を有するＤＮＡ、あるいはβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドより調製した標識プローブとハイブリダイゼーションならびに洗浄の工程を行い、組織内のβ−カテニン核局在化蛋白質発現細胞や発現部位を詳細に検出する方法で、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法および条件により行うことができる。
定量的ＰＣＲ法［Ｄｅｌｉｄｏｗ　Ｂ．Ｃ．ら，Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．，６，１２０（１９８９）］は、試料由来ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いて合成したｃＤＮＡ（以下「試料由来ｃＤＮＡ」という）を鋳型としてβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、β−カテニン核局在化蛋白質をコードするｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片を特異的に増幅する方法である。該増幅ＤＮＡ断片の量は試料中のβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするｍＲＮＡの量を反映することから、組織や病態で発現量の変化しないアクチンやＧ３ＰＤＨ等のｃＤＮＡに対するＰＣＲをコントロールとすることでβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするｍＲＮＡを定量することが可能である。オリゴヌクレオチドプライマーは、プライマー間あるいはプライマー内でのハイブリダイゼーションを起こさないアニーリング温度でβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするｃＤＮＡと特異的に結合して、変性温度ではずれるように設計する。該増幅ＤＮＡ断片の定量は増幅産物が指数関数的に増加しているＰＣＲ回数の内に行うことが必要である。このようなＰＣＲ回数は、一つの試料に関して増幅回数を変えてＰＣＲを行い、各回数ごとに増加する該増幅ＤＮＡ断片の量をゲル電気泳動で分析することで知ることができる。
ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法［Ｌｅｎｎｏｎ　Ｇ．Ｇ．＆　Ｌｅｈｒａｃｈ　Ｈ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．，７，３１４（１９９１）］やＤＮＡチップ法［Ｓｈａｌｏｎ　Ｄ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，６，６３９（１９９６）］は、β−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、あるいはβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基盤に対して、試料由来ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーと、標識ｄＮＴＰおよび逆転写酵素を用いて合成した標識ｃＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行うことで、測定の対照となる検体のβ−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡレベルでの発現量の変動を検出する方法である。いずれの方法もフィルターあるいは基盤上にアクチンやＧ３ＰＤＨのＤＮＡを固定化し内部コントロールとすることにより、測定検体と対照検体の間でのβ−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡレベルでの発現の差を検出することができる。また測定検体と対照検体から標識ｃＤＮＡプローブを作製する際、両者で異なる標識ｄＮＴＰを用いて作製し、１枚のフィルターあるいは１枚の基盤に二つの標識ｃＤＮＡプローブを同時にハイブリダイズさせることで正確な定量を行うことができる。
リボヌクレアーゼ保護アッセイ［Ｐａｐｅ　Ｍ．Ｅ．ら，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８，２０６（１９９１）］では、まずβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡの３’端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、標識ＮＴＰおよびプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロの転写系により標識したβ−カテニン核局在化蛋白質のアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチセンスＲＮＡを検体から調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイゼーションさせ、検体中のβ−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、リボヌクレアーゼで消化し、ハイブリッドの形成によりリボヌクレアーゼによる消化から保護されたバンドをゲル電気泳動で検出する。保護されたバンドを定量することで、β−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡレベルでの発現を定量することができる。
以上のような方法により、被検者およびコントロールとなる健常者から生検等により採取した臓器や生体組織、血液等の生体試料、あるいはこれから培養した初代培養細胞を検体として用い、両者のβ−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡレベルでの発現の定量を行い比較することにより、β−カテニン核局在化蛋白質のｍＲＮＡレベルの発現量が健常者と比べて増加あるいは減少している疾患を診断することができる。
該疾患としては、例えば大腸癌等の癌があげられる。大腸癌等の癌では、β−カテニン核局在化蛋白質の発現量が増加し、β−カテニンの核内への移行およびβ−カテニン／ＴＣＦによる転写活性化が促進されることが、細胞の癌化の原因の一つとなりうる。したがって大腸癌等の癌細胞の中には、通常の細胞に比べてβ−カテニン核局在化蛋白質の発現量が増加しているものがあると考えられ、上記方法により、β−カテニン核局在化蛋白質の発現量が増加していると診断された場合、癌を患っている可能性が考えられる。
５．β−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子の変異検出法および該遺伝子に変異を有する疾患の診断方法
β−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡあるいはβ−カテニン核局在化蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、１０〜１００人からなる大腸癌等の疾患を有する患者集団と健常人等の対照集団におけるβ−カテニン核局在化蛋白質のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較し、該疾患とβ−カテニン核局在化蛋白質遺伝子等の変異の有無の関係を評価することができる。
検体としてはヒトから採取した臓器や生体組織、血液等の生体試料あるいはこれらから樹立した初代培養細胞から抽出したゲノムＤＮＡあるいはからこれらから抽出した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いることができる（以下これらを「検体ＤＮＡ」と称す）。
また、検体ＤＮＡを鋳型に、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、正常なＢ９Ｌ　ＤＮＡの塩基配列と比較することにより、変異の有無を見出すこともできる。
Ｂ９Ｌ遺伝子のＤＮＡに疾患と関連する変異があるかどうかを選別する方法として、一本鎖コンフォメーション多型（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＳＣＰ）解析［Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｖ．Ｃ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６，３２５（１９９３）］、ミスマッチ切断、変性ゲル電気泳動等の方法があげられる。
ＳＳＣＰ解析はＢ９Ｌ　ＤＮＡの２００ｂｐよりも小さい断片を増幅できるようなプライマーを、Ｂ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計し、該プライマーを用いて検体由来ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片を変性後、未変性のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行う方法である。ＰＣＲを行う際にプライマーを放射性同位体や蛍光色素で標識するか、または増幅したＤＮＡ断片を銀染色することにより、増幅したＤＮＡ断片をバンドとして検出できる。未変性ゲル中では、塩基配列の違いにより移動度が変化するので、正常な塩基配列を有するＢ９Ｌ　ＤＮＡ断片との移動度を比較することにより変異を検出できる。
ミスマッチ切断法は、検体ＤＮＡを鋳型に、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーでＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片を放射性同位体や蛍光色素で標識した正常な塩基配列を有するＢ９Ｌ　ＤＮＡとハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムあるいはＴ４ファージエンドヌクレアーゼＶＩＩ［Ｄｅａｎ　Ｍ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，９，１０３（１９９５）］で処理することにより、ミスマッチ部位でＤＮＡを切断する方法である。最も感度の高い検出法の１つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。
変性ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法［Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓ．Ｇ．＆　Ｌｅｒｍａｎ　Ｌ．Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，１５７９（１９８３）、Ｃａｒｉｅｌｌｏ　Ｎ．Ｆ．＆　Ｓｋｏｐｅｋ　Ｔ．Ｒ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，２８８，１０３（１９９３）］］は、検体ＤＮＡを鋳型に、Ｂ９Ｌ　ＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したＤＮＡ断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する方法である。塩基配列の変異によりＤＮＡ断片の変性がおこる温度あるいは変性剤濃度が変化するため、移動度が変化することから、変異の存在を検出することができる。プライマーにポリ（Ｇ：Ｃ）端末を付けることにより検出感度を上げることができる［Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｖ．Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，２３２（１９８９）］。
以上のような方法で見い出された突然変異は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｌｉｎｋａｇｅ，Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）に記載された方法に従い統計処理を行うことで、疾患との連鎖がある一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ；ＳＮＰｓ）として同定することができる。
癌等の疾患と連鎖のある突然変異が見出された場合は、この変異部位とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブにより染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション解析することや、３’端が一致しないとＰＣＲによる増幅がおこらないことを利用した、疾患では変異がおきている部位に対応する正常配列を３’端にもつようなＢ９Ｌ蛋白質のオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲ、Ｂ９Ｌのオリゴヌクレオチドシークエンスプライマーによる変異部位の塩基配列解析等により疾患の診断を行なうことができる。
また、Ｂ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡあるいは該ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブにして、適当な制限酵素で切断した染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーションすることにより、Ｂ９Ｌ遺伝子の欠失、コピー数の変化、染色体転座等の異常を検出することができる。
ＤＮＡに変異があるかどうかを選別する別の方法として、蛋白質短縮試験（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ：ＰＴＴ）法［ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｌｕｉｊｔ　Ｒ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０，１（１９９４）］がある。この方法は変異の結果、翻訳フレームの途中でストップコドンが生じ蛋白質の欠失を生み出すようなフレームシフト突然変異、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異等を特異的に検出できる方法である。ＰＴＴ法では、Ｂ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列の５’末端にＴ７プロモーター配列と真核生物翻訳開始配列をつないだ特殊なプライマーを設計し、該プライマーを用いて検体由来ＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を増幅させる。該ｃＤＮＡについてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含むインビトロ転写系を用いてｍＲＮＡの転写を行わせ、このｍＲＮＡについてインビトロ翻訳系を用いて蛋白質を生産させる。該蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、正常なＢ９Ｌ蛋白質のｍＲＮＡから翻訳されたＢ９Ｌ蛋白質と分子量を比較することにより、蛋白質の欠損を生み出す変異を検出できる。
６．β−カテニン核局在化蛋白質遺伝子の染色体位置の決定
β−カテニン核局在化蛋白質のＤＮＡを用いて、ラジエーション・ハイブリッド法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，２４５（１９９０）］やｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法［Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４５，１３５（１９８１）、Ｃｅｌｌ，５２，５１（１９８８）］により、β−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子の染色体上の位置を決定することができる。
ラジエーション・ハイブリッド法とは、Ｇｅｎｅ−Ｂｒｉｄｇｅ４などのヒト染色体断片をもつ多数のパネル（どの部分の染色体断片が含まれているかが染色体マーカーにより解析されているもの）ＤＮＡに対し、β−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子を特異的に増幅させるＰＣＲを行い、増幅結果を解析することにより詳細な染色体の位置を特定する方法である。
ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法では、まず、ヒト染色体の標本に対し、ヒトＢ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡをプローブとしてハイブリダイズしたシグナルを検出し、標本上のシグナルの位置を特定する。これにより、β−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子の存在する染色体の番号だけでなく、その染色体上での物理的な位置を特定することができる。プローブは、放射性同位体３Ｈやビオチンにより標識し、３Ｈ標識ではオートラジオグラフにより、ビオチン標識では蛍光色素ＦＩＴＣで標識したアビジンを用いてシグナルを検出することができる。
また、上記のように直接β−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子の染色体位置を検出する方法ではないが、ＳＴＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ　ｓｉｔｅ：種々のＥＳＴの塩基配列に由来するプライマーとそのプライマーによって増幅される染色体ＤＮＡ断片およびその断片の染色体上の位置についての情報を有する）のデータベースに対してＢ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列と相同性を検索することにより、β−カテニン核局在化蛋白質のＤＮＡの一部と同一の塩基配列を持つＳＴＳが見出された場合は、そのＳＴＳは染色体上のβ−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子と対応するものと考えられるので、そのＳＴＳの染色体上の位置がβ−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子の染色体上の位置であると推定できる。
また、データベース上のヒトゲノムＤＮＡの配列には通常、その配列の染色体の位置についての情報が記載されている。例えば、上記１．（６−２）で得られたヒトＢ９Ｌゲノム遺伝子のエキソンを含むヒトゲノムＤＮＡの配列である、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＰ０００８７７、ＡＰ０００９０９についてはヒト染色体１１ｑ２３に位置することがデータベース上に記載されている。したがってヒトＢ９Ｌ遺伝子はヒト染色体１１ｑ２３に位置するということができる。
なお、ｂｃｌ９遺伝子についてはヒト染色体１ｑ２１に位置することが既に報告されている。
このようにして得られたβ−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子の染色体上の位置の情報は、疾患とβ−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子の関連を研究するのに役立つ。例えば、癌では癌抑制遺伝子の存在する可能性の高い染色体上の領域として、多くの癌について高頻度にＬＯＨ（ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ：２対の内の一方の遺伝子に見られる染色体欠失）が検出される領域の特定が進んでいるが（ＬＯＨのおきている領域にある癌抑制遺伝子のもう一方で変異が起こることにより癌抑制遺伝子の不活化がおこり、癌が発症すると考えられているため）、このような領域とβ−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子が存在する染色体の位置が一致すれば、β−カテニン核局在化蛋白質がこの領域にＬＯＨを持つ癌の発症に関与する可能性があることになる。この場合、このような癌におけるβ−カテニン核局在化蛋白質の遺伝子の変異やβ−カテニン核局在化蛋白質の発現量を解析することにより、β−カテニン核局在化蛋白質の関連が明らかになれば、このような癌の診断や治療にβ−カテニン核局在化蛋白質のＤＮＡやβ−カテニン核局在化蛋白質あるいはβ−カテニン核局在化蛋白質を認識する抗体を用いることができる。
７．β−カテニン核局在化蛋白質の活性を阻害することによる癌の治療
ＡＰＣ遺伝子やβ−カテニン遺伝子に変異を持つような大腸癌等の癌細胞では、β−カテニンの分解制御ができなくなりβ−カテニンが蓄積することによりβ−カテニン／ＴＣＦによる転写の活性化の抑制ができなくなっていることが、癌としての発症に関与していると考えられる。β−カテニン核局在化蛋白質のβ−カテニンを核内に局在させるという作用を阻害したり、β−カテニン核局在化蛋白質の発現を抑制することにより、蓄積したβ−カテニンの核内への移行が妨げられ、β−カテニン／ＴＣＦによる転写の活性化を抑制することができると考えられる。このような作用を持つ物質は癌の治療薬として使用することができる。
（１）β−カテニン核局在化蛋白質の阻害剤およびそのスクリーニング方法
β−カテニン核局在化蛋白質の阻害剤とは、β−カテニン核局在化蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害することにより、β−カテニンの核への移行を阻害する物質である。
β−カテニンとβ−カテニン核局在化蛋白質を接触させ、試験化合物を添加した場合としない場合でのβ−カテニンとβ−カテニン核局在化蛋白質の結合量を比較することによりβ−カテニン核局在化蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
例えばβ−カテニン核局在化蛋白質を３５Ｓ等で標識したβ−カテニンを試験化合物の存在下／非存在下で混合して結合させた後、抗体等によりβ−カテニン核局在化蛋白質を単離して、標識物質の量を測定することにより、β−カテニン核局在化蛋白質と結合したβ−カテニンの量を評価することができる。試験化合物が存在しない場合と比べて存在した場合に、結合したβ−カテニンの量が減少している場合、β−カテニン核局在化蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害する物質と考えられる。
このようにして得られたβ−カテニン核局在化蛋白質とβ−カテニンの結合を阻害する物質が、β−カテニンの核への移行を阻害するかどうかは、β−カテニンおよびβ−カテニン核局在化蛋白質の両者を強制発現させた細胞に試験化合物を添加／非添加の場合の細胞をそれぞれ固定化し、それぞれ抗β−カテニン抗体を用いた免疫染色によってβ−カテニンを検出することにより調べることができる。この場合、通常のβ−カテニンでは細胞内でＧＳＫ−３βによる分解制御を受けるので、分解を受けずに蓄積するリン酸化部位の変異体例えば、３３位セリンをチロシンに置換したβ−カテニン変異体を用いることにより、細胞内に存在するβ−カテニンの量が多くなり、細胞内でのβ−カテニンの検出が容易になる。β−カテニンには細胞内局在性はなく、β−カテニンのみを強制発現させた細胞では細胞全体に一様に分布するが、Ｂ９Ｌ／ｂｃｌ９類似体にβ−カテニンを核へ局在させる作用がある場合は、細胞質に比較して核により多くのβ−カテニンが検出される。
上記スクリーニング法に用いるβ−カテニンおよびβ−カテニン核局在化蛋白質は、該蛋白質を発現している組織、細胞などから精製した蛋白質を用いてもよいが、該蛋白質をコードするＤＮＡを用いて形質転換された形質転換体を培養し、常法に従って精製することにより、大量の該蛋白質を得ることができる。また該蛋白質を生産する培養細胞や培養細胞処理物を用いても、本スクリーニングを行うことは可能であるが、細胞をそのまま用いる場合は、該蛋白質を分泌生産する細胞を用いるのが好ましい。ここでいう培養細胞処理物とは、濃縮物、培養細胞の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる細胞、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白質分画物、該細胞の固定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素標品等があげられる。
（２）β−カテニン核局在化蛋白質の発現を抑制する方法
β−カテニン核局在化蛋白質の発現を抑制する方法としては、β−カテニン核局在化蛋白質遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡやアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与あるいはアンチセンスＲＮＡ発現ベクターの投与による、ｍＲＮＡからβ−カテニン核局在化蛋白質蛋白質への翻訳の抑制、β−カテニン核局在化蛋白質遺伝子プロモーターと結合するトリプルヘリックス形成オリゴヌクレオチド投与による転写の阻害、リボザイムの投与によるβ−カテニン核局在化蛋白質ｍＲＮＡの分解、β−カテニン核局在化蛋白質遺伝子の転写を特異的に阻害する化合物の投与による転写の阻害をあげることができる。
８．遺伝子治療用ベクター
β−カテニン核局在化蛋白質の発現量が少ないことが原因の疾患に対しては、β−カテニン核局在化蛋白質あるいはβ−カテニン核局在化蛋白質をヒト生体内で産生する遺伝子治療用ベクターを投与することにより治療を行うことができる。
β−カテニン核局在化蛋白質をヒト生体内で産生する遺伝子治療用ベクターとしてβ−カテニン核局在化蛋白質を産生する組み換えウイルスベクターをあげることができる。該組み換えウイルスベクターは、１．に記載の方法で取得したヒトβ−カテニン核局在化蛋白質完全長ｃＤＮＡ、あるいは必要に応じてβ−カテニン核局在化蛋白質をコードする領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、ウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、造成することができる。該組換えウイルスベクターは、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質例えばマウスモロニー白血病ウイルス等のレトロウイルスの場合はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等、ＨＩＶ等のレンチウイルスの場合はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ等、アデノウイルスの場合はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ等、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）等の遺伝子が欠損している。
該組換えウイルスベクターを、該組換えウイルスベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞としては、該組換えウイルスベクターで欠損しているウイルスのパッケジーングに必要な蛋白質を補給できる細胞は全て用いることができ、例えばヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３等を用いることができる。
ウイルスベクターとしては上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞でＢ９Ｌ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ［Ｒｉｖｉｅｒｅ　Ｉ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３（１９９５）］、ｐＢａｂｅｐｕｒｏ［Ｍｏｒｇｒｎｓｔｅｒｎ　Ｊ．Ｐ．＆　Ｌａｎｄ　Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，３５８７（１９９０）］、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ［Ｍｉｙｏｓｈｉ　Ｈ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，８１５０（１９９８）］、ｐＡｄｅｘ１［Ｋａｎｅｇａｅ　Ｙ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２３，３８１６（１９９５）］、プロモーターとしては、ヒト組織中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えばサイトメガロウイルスのＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター等をあげることができる。また、サイトメガロウイルスのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
上記パッケージング細胞への上記組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法［Ｆｅｌｇｎｅｒ　Ｐ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
また、ウィルスベクターを用いない遺伝子治療方法としては、所望の組織にＤＮＡを直接輸送する手段として、裸のプラスミドＤＮＡの形態で直接注入される治療用遺伝子トランスフェクション法がある［ＵＳ　５５８９４６６］。すなわち、β−カテニン核局在蛋白質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを、治療が必要な組織、例えば大腸癌組織に注射器等を用いて注入することにより、該蛋白質を該癌組織内で発現させることができる。
９．抗体を用いたβ−カテニン核局在化蛋白質の検出および定量方法
β−カテニン核局在化蛋白質を認識する抗体を用いてβ−カテニン核局在化蛋白質を免疫学的に検出する方法としては、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング法、サンドイッチＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＥＩＡ）や放射性免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）などがあり、文献［富山朔二・安東民衛編　単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック　１９８７年）、続生化学実験講座５　免疫生化学研究法（東京化学同人　１９８６年）、Ｇｏｄｉｎｇ　Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９９６）、Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．＆　Ｌａｎｅ　Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８８）］に基いて行うことができる。
免疫組織化学染色法は、生体組織や細胞を固定化し、β−カテニン核局在化蛋白質を認識する抗体を反応させ、さらに蛍光物質、酵素、ビオチン、金コロイド、放射性物質等で標識した抗イムノグロブリン抗体あるいは抗体断片を反応させた後、必要ならば標識抗体の可視化処理を行い、顕微鏡を用いて観察することにより組織や細胞中のβ−カテニン核局在化蛋白質を検出する方法である。蛍光物質標識には、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン・イソチオシアネート等が用いられ、蛍光顕微鏡によって観察することにより検出する。酵素標識の場合はペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等が用いられ、酵素により発色する基質を添加して発色反応させた後、光学顕微鏡で観察することにより検出できる。ビオチン標識の場合は、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識したアビジンを反応させた後、酵素標識抗体と同様の操作を行う。金コロイド標識の場合は、電子顕微鏡で観察することにより検出する。放射性物質標識には１２５Ｉ等が用いられ、感光乳剤をコートして放射線により析出した銀粒子を光学顕微鏡で観察することにより検出できる。
フローサイトメトリーは、被験者から採取した細胞に、β−カテニン核局在化蛋白質を認識する抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネートあるいはフィコエリスリンなどの蛍光物質でラベルした抗イムノグロブリン抗体あるいは抗体断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定することにより、細胞でのβ−カテニン核局在化蛋白質の発現を検出する方法である。
ウェスタンブロッティング法は、被験者から採取した生体組織または細胞あるいはそれらの破砕液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜にβ−カテニン核局在化蛋白質を認識する抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素や１２５Ｉ等の放射性物質で標識した抗イムノグロブリン抗体あるいは抗体断片を反応させた後、β−カテニン核局在化蛋白質のバンドを検出する方法である。検出は、酵素標識の場合は、酵素により発色する基質を添加して反応させβ−カテニン核局在化蛋白質のバンドを可視化したり、酵素により発光する基質を添加してＸ線フィルムのオートラジオグラフィーにより検出し、放射性物質の場合はＸ線フィルムのオートラジオグラフィーにより検出する。
酵素免疫測定法の一種であるサンドイッチＥＬＩＳＡでは、抗原認識部位の異なる２種類のβ−カテニン核局在化蛋白質を認識するモノクローナル抗体を用意し、あらかじめ一方のモノクローナル抗体または抗体断片はプレートに吸着させ、もう一方のモノクローナル抗体または抗体断片はペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素で標識しておく。被検者から採取した生体組織あるいは細胞から細胞破砕液を調製し、試験サンプルとする。抗体吸着プレートに試験サンプルを反応させ、さらに酵素標識したβ−カテニン核局在化蛋白質モノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、酵素により発色する基質を添加して発色反応させた後、分光光度計により発色強度を測定することにより、サンプル中のβ−カテニン核局在化蛋白質の検出または定量を行う。
放射性免疫測定法は、酵素でなく１２５Ｉ等の放射性物質で標識した抗体を用いて、酵素免疫測定法と同様の操作を行い、シンチレーションカウンターで放射線を測定することによりサンプル中のβ−カテニン核局在化蛋白質の検出または定量を行う方法である。
また酵素免疫測定法や放射性免疫測定法には、上記のようなサンドイッチ法の他に、抗体でなくβ−カテニン核局在化蛋白質標品を標識し、一定量の標識β−カテニン核局在化蛋白質標品と試験サンプルとをプレートに固相化したβ−カテニン核局在化蛋白質を認識する抗体と反応させ、プレート上の酵素活性や放射線を測定することにより、サンプル中のβ−カテニン核局在化蛋白質の検出または定量を行う競合法もある。
１０．医薬組成物
上記β−カテニン核局在化蛋白質を含有する治療薬は、薬剤として該物質または該中和抗体単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与または、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該蛋白質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該蛋白質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該蛋白質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例を用いて詳細に説明する。
実施例１　Ｂ９Ｌ　ｃＤＮＡのクローン化
酵母ツーハイブリッドシステムを利用して、マウスｍβ−カテニンａｒｍと結合する蛋白質をコードする遺伝子をクローン化した。
（１）ｍβ−カテニンａｒｍのベイトプラスミドの作製
マウスβ−カテニンのｃＤＮＡの塩基配列およびそのｃＤＮＡがコードするマウスβ−カテニンのアミノ酸配列は公知である［ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｍ９０３６４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，１１４２（１９９２）］。マウスβ−カテニンはそのアミノ酸配列の１２８〜６８３番目にアルマジロドメイン（ｍβ−カテニンａｒｍ）と呼ばれる繰り返し配列を有する。このｍβ−カテニンａｒｍ部分をコードするマウスβ−カテニンのＤＮＡ断片を、マウス細胞ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行なうことにより増幅し単離した。ＰＣＲプライマーは上記のｍβ−カテニンａｒｍをコードするｃＤＮＡの部分の塩基配列をもとにデザインした。増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ｍβ−カテニンａｒｍをコードしているものであることを確認後、ベクターｐＧＢＴ９（クローンテック社製）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩサイト間に挿入することによりＧＡＬ４　ＢＤと融合させた蛋白質を発現させるプラスミドＧＡＬ４−β−ｃａｔｅｎｉｎを作製した。
（２）ツーハイブリッド法によるスクリーニング
クローンテック社製のツーハイブリッド法に用いるライブラリーであるマッチメーカー・マウス胎児（Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ／ＮＩＨマウスの１７日胚）ｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行った。このｃＤＮＡライブラリーはベクターｐＧＡＤ１０（クローンテック社製）にｃＤＮＡが挿入されているものであり、選択マーカーとして酵母ロイシン合成系遺伝子ＬＥＵ２をもち、ＡＤＨ１プロモーターを使用して、ＧＡＬ４　ＡＤとｃＤＮＡのコードする蛋白とが融合蛋白の形で発現する。スクリーニングの具体的方法はライブラリーに添付されたクローンテック社のマニュアルに従って、以下のようにして行った。
すなわち、ツーハイブリッド法用のマウス胎児ｃＤＮＡライブラリーと上記（１）で作製したプラスミドＧＡＬ４−β−ｃａｔｅｎｉｎを酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＨＦ７Ｃ株（クローンテック社製）に導入した。ＨＦ７Ｃ株は、トリプトファン、ロイシン、ヒスチジン要求性であり、その染色体中には、レポーター遺伝子としてＧＡＬ４　ＢＤが結合するプロモーターであるＧＡＬ１プロモーターの下流につなげたヒスチジン合成系遺伝子ＨＩＳ３および、ＧＡＬ４　ＢＤが結合するような塩基配列の下流につなげた大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子ｌａｚＺを持っている菌株である［Ｇｅｎｅ，２１２，１９７（１９９８）］。プラスミドＧＡＬ４−β−ｃａｔｅｎｉｎおよびｍβ−カテニンａｒｍと結合する蛋白質のｃＤＮＡクローンの両者を保持しそれぞれの融合蛋白質を発現する形質転換体は、ｍβ−カテニンａｒｍと該結合蛋白質の結合によりＧＡＬ４　ＢＤとＧＡＬ４　ＡＤが近接し、ＧＡＬ４　ＢＤが結合する塩基配列の下流のＨＩＳ３遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子の転写が活性化されるため、ヒスチジン非要求性、β−ガラクトシダーゼ活性陽性となる。１．２×１０６個の形質転換体から、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファンを含まない培地上で増殖し、β−ガラクトシダーゼ活性陽性のコロニーを選択した。
このクローンからプラスミドＤＮＡを回収し、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、配列番号３に示した。この塩基配列を塩基配列データベースに対して相同性検索したところ、いくつかのマウスのＥＳＴに塩基配列が一致するものがあったが、既存の遺伝子の塩基配列で一致するものは見出されなかった。したがってツーハイブリッド法で単離された上記ｃＤＮＡ断片は、マウスβ−カテニンと結合する蛋白質をコードする、新規な塩基配列を有するｃＤＮＡ断片であることが明らかとなった。このｃＤＮＡ断片がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号４に示した。配列番号３で表される塩基配列を有するｃＤＮＡ断片は、終止コドンがみられずに全体が蛋白質をコードしていることから、全長ｃＤＮＡの部分断片であると考えられた。全長ｃＤＮＡは配列番号３で表される塩基配列の５’および３’側にさらに塩基配列が延長すると考えられた。そこで、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法により、得られたｃＤＮＡ断片よりもさらに５’側の塩基配列を含むｃＤＮＡ断片および３’側の塩基配列を含むｃＤＮＡ断片を増幅し、その塩基配列を決定した。ツーハイブリッド法によって得られたクローンのｃＤＮＡの塩基配列と５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法により得られたｃＤＮＡの塩基配列をつなぎ合わせることにより配列番号１で表される塩基配列を得た。この塩基配列は配列番号２で表される１４９４アミノ酸よりなる蛋白質をコードしていた。なおツーハイブリッド法で得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号１で表される塩基配列の塩基番号７３３〜１６９２番目に相当し、このｃＤＮＡ断片がコードしていたアミノ酸配列は配列番号２で表されるアミノ酸配列の２４５〜５６４番目に相当していた。このアミノ酸配列についてＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のアミノ酸配列データベースと相同性解析プログラムＢＬＡＳＴ２を用いて相同性を調べたところ、第１図に示すようにｂｃｌ９蛋白質［アクセス番号ＣＡＡ７３９４２；Ｗｉｌｌｉｓ　Ｔ．Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９１，１８７１（１９９８）］と全体に渡って３７％の相同性がみられたため、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるβ−カテニン結合蛋白質をＢ９Ｌ蛋白質（ｂｃｌ９　ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）と名づけた。なお、上記のｂｃｌ９蛋白質はヒトのものであり、マウスｂｃｌ９蛋白質のアミノ酸配列は明らかになっていないが、マウスｂｃｌ９蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列と考えられるＥＳＴが塩基配列データベースＧｅｎＢａｎｋに存在し（アクセス番号ＡＩ５５０００７、ＡＩ４２６８５８）、それらの塩基配列はヒトｂｃｌ９蛋白質に対して９０％以上と非常に高い相同性を有しているので（Ｂ９Ｌ蛋白質の塩基配列の相当部分の塩基配列の相同性は４０％以下）、得られたＢ９Ｌ蛋白質（マウス）はマウスのｂｃｌ９蛋白質にあたるものではないと考えられる。Ｂ９Ｌ蛋白質はｂｃｌ９蛋白質と同様にプロリンを非常に高い割合で含む蛋白質であり、核内移行シグナルと類似の配列を有する。
なお、このｃＤＮＡをプローブとしてマウス胎児（１３．５日胚）ｍＲＮＡに対してノーザンブロットハイブリダイゼーションを行ったところ、長さ７．５ｋｂのｍＲＮＡのバンドが検出された。
（３）ヒトＢ９Ｌ遺伝子および染色体上の位置
（２）で得られたマウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの塩基配列と相同性をもつヒトＤＮＡの塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースからＢＬＡＳＴ等の相同性プログラムを用いて検索した。その結果、ヒトＢ９Ｌ　ｃＤＮＡ由来と推定されるＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ４６３６５やＲ２４７６２のヒトＥＳＴおよび、ヒトＢ９Ｌゲノム遺伝子のエキソン部分を含むＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＰ０００８７７、ＡＰ００２３５７、ＡＰ０００９０９のヒトゲノムＤＮＡのワーキング・ドラフト・シークエンスを見出した。これらのワーキング・ドラフト・シークエンスと、マウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡおよびヒトＥＳＴの塩基配列を比較することにより、ヒトＢ９Ｌをコードするエキソン部分の配列として配列番号５〜８の塩基配列が得られた。配列番号５はマウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）の２７〜４１２番目に、配列番号６は４１３〜５３２番目に、配列番号７は１１８３〜３１１５番目に、配列番号８は３１１６〜３３９７番目にそれぞれ対応するエキソンである。配列番号９に配列番号５および６から導かれるヒトＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの部分塩基配列（配列番号１のマウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの塩基配列の２７〜５３２番目に対応する）、配列番号１０に配列番号９の塩基配列がコードするヒトＢ９Ｌ蛋白質の部分アミノ酸配列（配列番号２のマウスＢ９Ｌ蛋白質のアミノ酸配列の１０〜１７７番目に対応する）、配列番号１１に配列番号７および８から導かれるヒトＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの部分塩基配列（配列番号１のマウスＢ９Ｌ　ｃＤＮＡの塩基配列の１１８３〜３３９７番目に対応する）、配列番号１２に配列番号１１の塩基配列がコードするヒトＢ９Ｌ蛋白質の部分アミノ酸配列（配列番号２のマウスＢ９Ｌ蛋白質のアミノ酸配列の３９５〜１１３２番目に対応する）を示した。
また、ＡＰ０００８７７、ＡＰ０００９０９についてはヒト染色体１１ｑ２３に位置することがデータベース上に記載されており、ヒトＢ９Ｌ遺伝子はヒト染色体１１ｑ２３に位置すると考えられた。
実施例２　Ｂ９Ｌ蛋白質とβ−カテニンのインビトロでの結合
Ｂ９Ｌ蛋白質がβ−カテニンと直接結合することを、以下のようにして確認した。なお、実施例２〜５でＢ９Ｌ蛋白質として用いているのは、実施例１に記載のツーハイブリッド法により得られたＢ９Ｌ　ｃＤＮＡ断片がコードする配列番号４のアミノ酸配列からなる蛋白質である。
実施例１でツーハイブリッド法により得られたＢ９Ｌ　ｃＤＮＡ断片から、３５Ｓ標識メチオニンとＴＮＴ−網状赤血球溶解液システム（プロメガ社製）を用いたインビトロ転写・翻訳により３５Ｓ標識Ｂ９Ｌ蛋白質を合成した。マウスβ−カテニンＤＮＡを大腸菌用グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）発現プラスミドベクターｐＧＥＸ５Ｘ−１（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）のクローニングサイトに挿入したＧＳＴ−β−カテニン融合蛋白質（以下、ＧＳＴ−β−カテニンと略す）発現プラスミド［Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　ｔｏ　Ｃｅｌｌｓ，３，３９５（１９９８）］および対照用としてｐＧＥＸ５Ｘ−１でそれぞれ形質転換した大腸菌を培養し、それぞれの菌体破砕液を調製した。これらの菌体破砕液にグルタチオン−セファロース４Ｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を添加して、ＧＳＴ−β−カテニンまたはＧＳＴを吸着させて単離した。ＧＳＴ−β−カテニンまたはＧＳＴをそれぞれ吸着させたグルタチオン−セファロース４Ｂと上記の３５Ｓ標識Ｂ９Ｌ蛋白質とを０．１％トリトンＸ−１００を含む緩衝液Ａ［１０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１４０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＧＴＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン］中で４℃で２時間反応させた。グルタチオン−セファロース４Ｂを緩衝液Ａでよく洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加することにより、結合していた蛋白質をサンプルバッファー中に溶出させた。この溶出液および３５Ｓ標識Ｂ９Ｌ蛋白質をサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、ゲルのオートラジオグラフィーを行なった。その結果、ＧＳＴ−β−カテニン発現大腸菌では３５Ｓ標識Ｂ９Ｌ蛋白質のバンドが検出されたのに対して、ＧＳＴ発現大腸菌ではバンドは検出されなかった。したがって、ＧＳＴ−β−カテニンにＢ９Ｌ蛋白質がインビトロで直接結合すること、およびＢ９Ｌ蛋白質が結合する部分は、ＧＳＴ−β−カテニン中のβ−カテニン部分であることが確認された。
実施例３　Ｂ９Ｌ蛋白質とβ−カテニンの動物細胞内での結合
実施例１で得られたＢ９Ｌ　ｃＤＮＡ断片をグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クローンテック社製）に挿入し、ＧＦＰ−Ｂ９Ｌ融合蛋白質（以下ＧＦＰ−Ｂ９Ｌと略す。）発現用プラスミドを作製した。また、動物細胞発現用プラスミドベクターｐＭＫＩＴｎｅｏ［Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　ｔｏ　Ｃｅｌｌｓ，３，３９５（１９９８）］に、ＧＳＫ−３βによりリン酸化を受ける３３位のセリン残基をチロシンに置換した変異型マウスβ−カテニンＳ３３Ｙ　ｃＤＮＡをサブクローニングし、Ｓ３３Ｙβ−カテニン発現用プラスミドを作製した。これらのプラスミドＤＮＡをリポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ；ライフ・テクノロジーズ社製）を用いてサル腎臓細胞株ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）に導入し、強制発現させた。２４時間後に細胞を回収して、１％トリトンＸ−１００を含む緩衝液Ａを添加して細胞溶解液を調製し、この細胞溶解液と抗ＧＦＰ抗体あるいは抗β−カテニン抗体と４℃で１時間反応させて、ＧＦＰ−Ｂ９ＬあるいはＳ３３Ｙβ−カテニンと抗体の免疫複合体を形成させた後、反応液にＩｇＧと結合する性質をもつプロテインＧ−セファロース４Ｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を添加し、免疫複合体を吸着させた。プロテインＧ−セファロース４Ｂを溶解用緩衝液Ａでよく洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加して免疫複合体を溶出させた。この溶出液をサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜イモビロンＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ；ミリポア社製）に転写し、一次抗体として抗β−カテニン抗体［トランスダクション・ラボラトリー（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社製；免疫動物はマウス］、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングによりＳ３３Ｙβ−カテニンの検出を行なった。その結果を第２図に示したが、ＧＦＰ−Ｂ９Ｌを沈降させるための抗ＧＦＰ抗体による免疫沈降物中に、抗β−カテニン抗体によりバンドが検出されたことから、細胞内においてもＧＦＰ−Ｂ９Ｌはβ−カテニンと結合していることが確認された。
実施例４　Ｂ９Ｌ蛋白質のβ−カテニンの細胞内局在に対する作用
実施例３で作製したＧＦＰ−Ｂ９Ｌ発現用プラスミドおよびＳ３３Ｙβ−カテニン発現用プラスミドについて、それぞれ単独あるいは両者をマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞にエフェクチン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ：キアゲン社製）を用いて導入し、強制発現させた。またコントロールとしてＧＦＰ発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ２も同様にしてマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に強制発現させた。２４時間後の細胞をホルムアルデヒドで固定化後、抗β−カテニン抗体で細胞を染色後、ＲＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させ、蛍光顕微鏡で観察することにより、細胞内のＳ３３Ｙβ−カテニンを検出した。また、ＧＦＰ−Ｂ９Ｌは、ＧＦＰの直接蛍光顕微鏡（ＦＩＴＣ用フィルター使用）観察によって検出した。
その結果、Ｓ３３Ｙβ−カテニンのみを発現させた細胞では、Ｓ３３Ｙβ−カテニンが細胞質および核内に一様に分布しているのに対し、Ｓ３３Ｙβ−カテニンとＧＦＰ−Ｂ９Ｌの両者を発現させた細胞では、Ｓ３３Ｙβ−カテニン、ＧＦＰ−Ｂ９Ｌともに核内に局在していた。したがって、Ｂ９Ｌ蛋白質はβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内に局在させる性質をもつことがわかった。なお、ＧＦＰ−Ｂ９Ｌのみを発現させた場合も、ＧＦＰ−Ｂ９Ｌは核内に局在したが、ＧＦＰだけを発現させた場合は細胞質および核内に一様に分布していることから、核内への局在は付加したＧＦＰとは無関係でＢ９Ｌ蛋白質によることが確認された。
また、実施例１で得られたＢ９Ｌ全長ｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｃ２のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩサイト間に挿入した動物細胞発現用プラスミドｐＥＧＦ−Ｃ２Ｂ９Ｌを作製し、上記と同様にマウス３Ｔ３細胞にＳ３３Ｙβ−カテニン発現用プラスミドとともに強制発現させ、細胞内のＳ３３Ｙβ−カテニンを検出したところ、ツーハイブリッド法で得られたＢ９Ｌ蛋白質断片と同様に、Ｓ３３Ｙβ−カテニン、ＧＦＰ−Ｂ９Ｌ（全長）ともに核内に局在していた。したがって、Ｂ９Ｌ全長もβ−カテニンと結合し、β−カテニンを核内に局在させる性質をもつことが確認された。
実施例５　Ｂ９Ｌ蛋白質とβ−カテニンの結合様式
（１）β−カテニン中の結合領域
実施例１に記載のようにＢ９Ｌ蛋白質はβ−カテニンのアルマジロ・ドメイン部分（β−カテニンａｒｍ）に結合する蛋白質として得られたものだが、β−カテニンａｒｍのどの部分がＢ９Ｌ蛋白質と結合するかを、以下のようにしてβ−カテニンａｒｍの部分断片を発現させ、Ｂ９Ｌ蛋白質とそれぞれのβ−カテニン部分断片の結合を調べた。β−カテニンａｒｍほぼ全体（マウスβ−カテニンのアミノ酸配列の１４１〜６６４番目に相当）、β−カテニンａｒｍ前半（マウスβ−カテニンのアミノ酸配列の１４１〜３９０番目、アルマジロ・リピート１〜６に相当）、β−カテニンａｒｍ後半（マウスβ−カテニンのアミノ酸配列の３９１〜６６４番目、アルマジロ・リピート７〜１２に相当）をコードするＤＮＡを、実施例１で作製したβ−カテニンａｒｍのベイト・プラスミドを鋳型にして、それぞれ配列番号１３で表される塩基配列を有するセンスプライマーおよび配列番号１６で表される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列番号１３で表される塩基配列を有するセンスプライマーおよび配列番号１４で表される塩基配列を有するアンチセンスプライマー、配列番号１５で表される塩基配列を有するセンスプライマーおよび配列番号１６で表される塩基配列を有するアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、ベクターｐＧＢＴ９に挿入してそれぞれのベイト・プラスミドを作製した。
それぞれのベイト・プラスミドと実施例１でツーハイブリッド法により得られたＢ９Ｌ　ｃＤＮＡ断片発現クローンと酵母ＨＦ７Ｃ株に導入し、形質転換体のβ−ガラクトシダーゼ活性の有無により、Ｂ９Ｌ蛋白質とそれぞれのβ−カテニン部分断片の結合を調べた。その結果、β−カテニンａｒｍほぼ全体およびβ−カテニンａｒｍ前半（アルマジロ・リピート１〜６）とＢ９Ｌ蛋白質は結合がみられたが、β−カテニンａｒｍ後半（アルマジロ・リピート７〜１２）とは結合がみられなかった。したがって、Ｂ９Ｌ蛋白質はβ−カテニンａｒｍ前半（アルマジロ・リピート１〜６）の領域と結合すると考えられた。
（２）Ｂ９Ｌ蛋白質中の結合領域
実施例１に記載のように、Ｂ９Ｌ蛋白質のアミノ酸配列を表す配列番号２のアミノ酸番号２４５〜５６４番目のアミノ酸配列をもつ蛋白質がβ−カテニンａｒｍに結合する蛋白質として得られたことから、Ｂ９Ｌ蛋白質は、β−カテニンａｒｍとアミノ酸配列の２４５〜５６４番目の領域で結合すると推定される。そこで、さらにこの中のどの領域がβ−カテニンａｒｍと結合するかを、以下のようにしてツーハイブリッド法により調べた。Ｂ９Ｌ蛋白質のアミノ酸配列を表す配列番号２のアミノ酸番号２４５〜２９１番目、２９２〜４３９番目、４４０〜５６４番目、２４５〜４３９番目、２９２〜５６４番目をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅しベクターｐＧＡＤ４２４（クローンテック社製）に挿入することにより各Ｂ９Ｌ蛋白質部分断片をＧＡＬ４　ＡＤとの融合タンパク質として発現するツーハイブリッド法用の発現プラスミドを作製した。それぞれのプラスミドを実施例１で作製したβ−カテニンａｒｍベイト・プラスミドと酵母ＨＦ７Ｃ株に導入し、形質転換体のβ−ガラクトシダーゼ活性の有無により、それぞれのＢ９Ｌ蛋白質部分断片とβ−カテニンａｒｍの結合を調べた。その結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２９２〜４３９番目、２４５〜４３９番目および２９２〜５６４番目のＢ９Ｌ蛋白質部分断片はβ−カテニンａｒｍと結合がみられたが、２９２〜４３９番目の配列を含まない、アミノ酸配列の２４５〜２９１番目および４４０〜５６４番目のＢ９Ｌ蛋白質部分断片はβ−カテニンａｒｍとの結合がみられなかった。したがって、Ｂ９Ｌ蛋白質は配列番号２で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号２９２〜４３９番目の領域でβ−カテニンａｒｍと結合すると考えられた。
実施例６　ｂｃｌ９蛋白質とβ−カテニンの結合性
実施例５でβ−カテニンとの結合領域であると特定されたＢ９Ｌ蛋白質のアミノ酸配列を表す配列番号２のアミノ酸番号２９２〜４３９番目の領域は、相同性をもつ蛋白質であるｂｃｌ９蛋白質のアミノ酸配列の２４４〜４１０番目のアミノ酸に相当する。そこで、ｂｃｌ９蛋白質のこの領域がβ−カテニン結合能をもつかどうかを実施例５と同様にして調べた。
すなわち、ヒトｂｃｌ９蛋白質のアミノ酸配列の２４４〜４１０番目をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅しベクターｐＧＡＤ４２４（クローンテック社製）に挿入しｂｃｌ９蛋白質（２４４−４１０）部分断片をＧＡＬ４　ＡＤとの融合タンパク質として発現するツーハイブリッド法用の発現プラスミドを作製し、このプラスミドを実施例１で作製したβ−カテニンａｒｍベイト・プラスミドと酵母ＨＦ７Ｃ株に導入した。その結果、形質転換体でβ−ガラクトシダーゼ活性が確認されたことから、ｂｃｌ９蛋白質はβ−カテニンとアミノ酸配列の２４４〜４１０番目の領域で結合することがわかった。ｂｃｌ９蛋白質には、核移行シグナル類似の配列があることから、ｂｃｌ９蛋白質も、β−カテニンと結合し核に局在させる作用を有する蛋白質である推定された。したがってｂｃｌ９蛋白質、ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡ、ｂｃｌ９蛋白質を認識する抗体、ｂｃｌ９蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドもＢ９Ｌ蛋白質、Ｂ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡ、Ｂ９Ｌ蛋白質を認識する抗体、Ｂ９Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様の目的に用いることができると考えられる。ｂｃｌ９蛋白質は、Ｂ細胞前駆体の急性リンパ芽球性白血病患者から樹立された細胞株ＣＥＭＯ−１における異常に高い発現が報告されており［Ｗｉｌｌｉｓ　Ｔ．Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９１，１８７１（１９９８）］、ｂｃｌ９蛋白質がＢ９Ｌ蛋白質と同様にβ−カテニンの核への局在を起こし、β−カテニン／ＴＣＦによる転写活性化を亢進することにより、癌の発症に関与しているという仮説を裏付けるものである。
産業上の利用可能性
本発明により、新規なβ−カテニン核局在化蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡが提供され、β−カテニン核局在化蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡを利用して、癌などのβ−カテニン核局在化に関連する疾患の診断薬および治療薬を開発することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１３−人工配列の説明：５’末端にＭｕｎＩ認識配列を有するマウスβ−カテニンのアルマジロリピート１（１４１番目のＡｓｎ残基の下流）に対するセンスプライマー
配列番号１４−人工配列の説明：５’末端にＳａｌＩ認識配列を有するマウスβ−カテニンのアルマジロリピート６（３９０番目のＡｓｐ残基の上流）に対するアンチセンスプライマー
配列番号１５−人工配列の説明：５’末端にＭｕｎＩ認識配列を有するマウスβ−カテニンのアルマジロリピート７（３９１番目のＡｌａ残基の下流）に対するセンスプライマー
配列番号１６−人工配列の説明：５’末端にＳａｌＩ認識配列を有するマウスβ−カテニンのアルマジロリピート１２（６６４番目のＧｌｕ残基の上流）に対するアンチセンスプライマー
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図はマウスＢ９Ｌとヒトｂｃｌ９のアミノ酸配列を比較した図ある。
上段がマウスＢ９Ｌ、下段がヒトｂｃｌ９のアミノ酸配列を１文字表記で表したものである。ただし、＊はヒトｂｃｌ９で上段のマウスＢ９Ｌと同じアミノ酸を示し、−は対応するアミノ酸がないことを示す。下線はβ−カテニンとの結合部位を表し、二重下線は核移行シグナルと類似の配列を示す。
第２図は細胞内でのβ−カテニンとＢ９Ｌの結合を示す図である。
レーンの下の＋は発現させる遺伝子を示したもので、中央と右は、Ｓ３３Ｙβ−カテニンとＧＦＰ−Ｂ９Ｌを発現させたＣＯＳ−７、左は対照用のＳ３３Ｙβ−カテニンとＧＦＰを発現させたＣＯＳ−７の細胞溶解液の免疫沈降物を抗β−カテニン抗体を１次抗体として用いたウェスタンブロッティングの結果である。レーンの上は免疫沈降を行った抗体を示したもので、左と中央は抗ＧＦＰ抗体で、右は抗β−カテニン抗体でそれぞれ免疫沈降を行ったものである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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