(57)【要約】本発明は、１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避、２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化、３）正確にアルブミンを測定、４）糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことに糖化アルブミンを測定することにより、糖化蛋白質を正確に測定するための組成物、測定方法を提供する。本発明により、より正確に糖化蛋白質及び糖化アルブミン割合を測定することが可能になった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する組成物において、プロテアーゼと
１）    デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、オクチルグルコシド、第四級アンモニウム塩、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ若しくはベタインのなかから選択される１種以上、
及び／または
２）    アスコルビン酸オキシダーゼ及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持たない緩衝剤、
を共存させることを特徴とする糖化蛋白質を測定するための組成物。
【請求項２】
デオキシコール酸アミドがビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミドであり、コール酸アミドが硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン、硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ハイドロキシ−１−プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミドである請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項３】
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持たない緩衝剤がトリスヒドロキシエチルアミノメタン若しくはピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）である請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項４】
糖化蛋白質が糖化アルブミンであり、別途アルブミンを測定する組成物を含み、アルブミンに対する糖化アルブミンの糖化割合を測定する組成物において、アルブミン測定用組成物が、蛋白質変性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物及びブロムクレゾールパープルを含有する請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化アルブミンを測定し、別途アルブミンを測定しアルブミンに対する糖化アルブミンの糖化割合を算出するための組成物において、アルブミン測定用組成物が、蛋白質変性剤及び／または、Ｓ−Ｓ結合を有する化合物びブロムクレゾールパープルを含有することを特徴とする組成物。
【請求項６】
蛋白質変性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物が、２，２’−ジチオサリチル酸（２，２’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、４，４’−ジチオジモルホリン（４，４’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、２，２’−ジヒドロキシ−６，６’−ジナフチルジスルフィド（２．２’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６，６’−ｄｉｎａｐｈｔｈｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ；ＤＤＤ）、２，２’−ジチオジピリジン（２，２’−ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；２−ＰＤＳ）、４，４’−ジチオジピリジン（４，４’−ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；４−ＰＤＳ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）；ＤＴＮＢ）若しくはラウリル硫酸ナトリウムである請求の範囲第４項または第５項に記載の組成物。
【請求項７】
プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加する請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する組成物であって、ジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を含有することを特徴とする糖化蛋白質を測定するための組成物。
【請求項９】
少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素に糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤を添加する請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する組成物であって、糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤を含有することを特徴とする糖化蛋白質を測定するための組成物。
【請求項１１】
プロテアーゼがバチルス属由来のプロテアーゼである請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素が配列表配列番号１のアミノ酸配列の３７２番目のリジンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼである請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
他のアミノ酸としてトリプトファン、メチオニン若しくはバリンに置換された変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いる請求の範囲第１２項に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物が液状品である請求の範囲第１〜１３項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
プロテアーゼ及び少なくともと糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する組成物であって、第１試薬に少なくともと糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬にプロテアーゼを含有することを特徴とする組成物。
【請求項１６】
組成物が液状品である請求の範囲第１５項に記載の組成物。
【請求項１７】
配列表配列番号１のアミノ酸配列の３７２番目のリジンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項１８】
他のアミノ酸がトリプトファン、メチオニン若しくはバリンである請求の範囲第１７項に記載の変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項１９】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する方法において、プロテアーゼ反応時に、
１）    デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ、オクチルグルコシド若しくはベタインから選択される１種以上を共存させることにより、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を低下し、
及び／若しくは
２）    アスコルビン酸オキシダーゼを４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持たない緩衝剤中で作用させ、アスコルビン酸の消去及び蛋白質の断片化を同時に行い、
糖化蛋白質を測定する方法。
【請求項２０】
デオキシコール酸アミドがビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミドであり、コール酸アミドが、硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン、硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ハイドロキシ−１−プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミドである請求の範囲第１９項に記載の方法。
【請求項２１】
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持たない緩衝剤がトリスヒドロキシエチルアミノメタン若しくはピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）である請求の範囲第１９項に記載の方法。
【請求項２２】
糖化蛋白質がアルブミンであり、別途アルブミンを測定し、アルブミンに対する糖化アルブミンの糖化割合を算出する糖化アルブミン測定方法において、アルブミン測定のさい、被検液を、蛋白質変性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物にて前処理を行い、同時若しくは続いてブロモクレゾールパープルを用いてアルブミンを測定する請求の範囲第１９〜２１項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
被検液に、プロテアーゼを作用させアルブミンの断片化を行い、次いで少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化アルブミンを測定し、この値を別途ブロモクレゾールパープルを用い測定したアルブミンで除しアルブミンに対する糖化アルブミン割合を算出する方法において、蛋白質変性剤又は／及びＳ−Ｓ結合を有する化合物にて前処理を行い、同時若しくは続いてアルブミンを測定することを特徴とする方法。
【請求項２４】
蛋白質変性剤又は／及びＳ−Ｓ結合を有する化合物が、２，２’−ジチオサリチル酸（２，２’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、４，４’−ジチオジモルホリン（４，４’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、２，２’−ジヒドロキシ−６，６’−ジナフチルジスルフィド（２．２’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６，６’−ｄｉｎａｐｈｔｈｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ；ＤＤＤ）、２，２’−ジチオジピリジン（２，２’−ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；２−ＰＤＳ）、４，４’−ジチオジピリジン（４，４’−ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；４−ＰＤＳ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）；ＤＴＮＢ）若しくはラウリル硫酸ナトリウムである請求の範囲第２２項または第２３項に記載の方法。
【請求項２５】
プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加する請求の範囲第１９〜２３項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する方法に於いて、プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加することを特徴とする、糖化蛋白質を測定する方法。
【請求項２７】
少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素に、糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる安定化剤を添加する請求の範囲第１９〜２６項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する方法に於いて、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素に糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤を添加することを特徴とする、糖化蛋白質を測定する方法。
【請求項２９】
プロテアーゼがバチルス属由来のプロテアーゼである請求の範囲第１９〜２８項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素が配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番目のリジンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼである請求の範囲第１９〜２９項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
他のアミノ酸としてトリプトファン、メチオニン若しくはバリンを用いて置換した変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いる請求の範囲第３０項に記載の方法。
【請求項３２】
組成物が液状品である請求の範囲第１９〜３１項のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
試料に、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、次いでプロテアーゼを作用させ、糖化蛋白質を測定する請求の範囲第３２項に記載の方法。
【請求項３４】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する方法において、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、次いでプロテアーゼを作用させることを特徴とする糖化蛋白質を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
本発明は、糖化蛋白質を測定するための組成物及び糖化蛋白質の測定方法に関する。本発明における糖化蛋白質の測定用組成物及び測定方法は臨床検査に用いられ、正確に糖化蛋白質を測定することができる。
［背景技術］
糖尿病の診断及び管理を行う上で糖化蛋白質の測定は非常に重要であり、過去約１〜２ヶ月の平均血糖値を反映する糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、過去約２週間の平均血糖値を反映する糖化アルブミン（ＧＡ）、及び血清中の還元能を示す糖化蛋白質の総称であるフルクトサミン（ＦＲＡ）等が日常的に測定されている。ＧＨｂはヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端バリンのαアミノ基が、ＧＡ、ＦＲＡはアルブミン、血清蛋白質のリジン残基のεアミノ基がそれぞれ糖化されている。
精度が高く、簡便かつ安価な糖化蛋白質の測定法としては酵素法があげられる。その例としては特開平６−４６８４６号公報、特開平５−１９２１９３号公報、特開平２−１９５９００号公報、特開平２−１９５８９９号公報、ＷＯ９８／４８０４３号公報、ＷＯ９７／１３８７２号公報等がある。
しかしながら、真に糖化蛋白質を正確に測定する組成物を提供するには、１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避、２）プロテアーゼ、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化が必須であり、さらに糖化蛋白質が糖化アルブミンである場合には、３）正確にアルブミンを測定する方法、４）糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことも重要である。
１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避に関する従来の技術
糖尿病患者ではグロブリン蛋白質量が変化しＦＲＡの値に影響を及ぼすことが知られている［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．３５：１３４−１３８（１９８９）］。そこで本発明者らはプロテアーゼ反応液にある種の金属イオンやプロテインＡ若しくはＧを添加することによりプロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法（特願平１１−２３１２５９）を開発してきた。この発明ではグロブリン成分の影響を受けることなく糖化蛋白質を測定することが出来るが、そこで用いられるグロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤としては、金属、プロテインＡ、Ｇが記載されている。しかし、ここで示されている特定の金属のうち、効果が強い金属は重金属であり、環境安全上の問題がないとは言えず、また効果の弱い金属は他の試薬成分（他の組成物）と組み合わせると試薬溶液に濁りが生じることがあった。またプロテインＡ、Ｇは非常に高価である。
さらに、血液中のグロブリンを選択的に吸着する方法としてステロイド骨格を持ったリガンドをビニル系の共重合体に導入しクロマトグラフィーの原理を用いて血液中の内毒素やグロブリンを吸着する血液処理剤（特開昭６１−９４６６３号公報）が知られている。しかし特開昭６１−９４６６３号公報の実施例表１の検討結果ではグロブリンのうち吸着が確認できているのはα１、α２グロブリンだけでありグロブリン成分の７０％以上を占めるγグロブリンには吸着能を示していない。またたとえγグロブリンに吸着能を示したとしてもプロテアーゼのγグロブリンへの作用をどの程度阻害できるかは予測不可能である。
アスコルビン酸は近年補助食品として大量に摂取されるケースが増えており、高濃度のアスコルビン酸を含有する臨床検体が増加している。アスコルビン酸は、その強力な還元力により臨床検査を行う上で様々な影響を引き起こす。
検体中のアスコルビン酸の影響を回避する方法としては化学的な方法やアスコルビン酸オキシダーゼを用いた酵素的な方法を用いて検体中のアスコルビン酸を消去する方法が知られている。プロテアーゼを用いて糖化蛋白質を断片化し、次いで少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて生じた糖化アミノ酸を測定する場合、プロテアーゼ反応と同時にアスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯｘ）を作用させ、前もってアスコルビン酸を消去する方法が発色系への影響が小さく好ましい。
プロテアーゼの存在下、被検液中のアスコルビン酸をＡＳＯｘを用いて消去した例としては、被検液に、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液ｐＨ８．０の条件で作用させた例（臨床化学  ２７：９９−１０６，１９９８）があり、冷蔵保存で２週間はアスコルビン酸の処理能に変化は無いと記述されている。
しかし、本発明者らの検討ではＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８．０、プロテアーゼ及びＡＳＯｘが共存した場合のアスコルビン酸処理能は３７℃−１日若しくは１０℃−２週間の保存でほとんど消失した。
２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化に関する従来の技術
糖化蛋白質の臨床的な測定には他の分野、例えば食品分野等では考えられない程高濃度のプロテアーゼが水溶液の状態で使用される。プロテアーゼは水溶液中では自己消化がおこることが知られており、この様な高濃度の水溶液中で安定に存在するとは考えにくい。よってこれまでの糖化蛋白測定用組成物に用いられるプロテアーゼは凍結乾燥品で供給されている。
糖化蛋白測定用組成物、測定方法に関し液状で長期に保存出来るレベルまでプロテアーゼの安定化を行った例はない。同様に糖化蛋白測定用組成物、測定方法に関し液状で長期に保存出来るレベルまで少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化を行った例はない。
３）正確にアルブミンを測定する方法に関する従来の技術
アルブミン測定法には抗アルブミン抗体を用いた免疫法、ブロモクレゾールグリーン（ＢＣＧ）、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）等を用いた色素法等がある。操作が簡便でかつコストが安いことから、日常検査では色素法が広く用いられているが、ＢＣＧ法はグロブリン成分に作用が確認されておりアルブミンに対する特異性が低いという欠点がある。
一方ＢＣＰ法はアルブミンに対する特異性は高いものの、共存物質の影響を受けやすく、またＳＨ化合物の影響を受けることからアルブミンの酸化還元状態により値が変化するという問題があった。この問題を解決する方法としては蛋白質変性剤及び／またはＳＨ試薬の存在下ＢＣＰの反応を行った例（特開平１０−２３２２３３号公報）が知られている。しかし、ＧＡと非糖化アルブミン（ＮＧＡ）に対するＢＣＰ反応性の検討を行った例はこれまでなかった。
４）糖化ヘモグロビンの影響回避に関する従来の技術
前述のようにＧＡはアルブミンのεアミノ基が糖化されており、一方ＧＨｂはヘモグロビン中のβ鎖Ｎ末端バリンのαアミノ基が糖化されている。よってＧＡを測定対象とする場合にはεアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを測定できれば好ましい。
これまでεアミノ基に高い特異性を示し、糖化バリンに作用しない酵素はいくつか知られているが（特開平１１−２４３９５０号公報）、実用化できるほど安いコストで供給されているものはない。このうち特にフザリウム・オキシスポルム由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＯＤ）は反応性が高く有用であり、発明者らは該ＦＯＤの遺伝子を分離し報告している（特開平１０−２０１４７３号公報）。ただし本遺伝子を用いた製造法は生産性が高く、低いコストでＦＯＤが生産できるもののαアミノ基が糖化されている糖化バリンへの反応性が確認されており、特異性の点で満足いくものではなかった。
［発明の開示］
本発明の目的は、糖化蛋白質を正確に測定するにあたり、１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避した、２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を安定化した組成物、安定化方法を提供することにあり、さらに糖化蛋白質が糖化アルブミンである場合には、３）正確にアルブミンを測定する、４）糖化ヘモグロビンの影響回避を行う組成物、影響回避方法を提供することにある。
糖化蛋白質を正確に測定するにあたり、１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避、２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化が正確な糖化蛋白質の測定には必須であり、さらに糖化蛋白質が糖化アルブミンである場合には、３）アルブミンの正確な測定、４）糖化ヘモグロビンの影響回避が必須である。
１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避
本発明者らは鋭意検討の結果、プロテアーゼ反応液にデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ、オクチルグルコシドまたはベタインから選択される１種以上を添加することによりプロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害できること、またこの反応液に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を直接作用させても酵素作用が阻害されることなく、再現性良く、精度良くかつ簡便に糖化蛋白質が測定できることを見出した。しかも、これらの化合物は、経済的に有利で、かつ従来の技術を用いたときに比べて環境安全上問題がなく、検体と混合された場合に濁りを生じることもないものである。
またアスコルビン酸の消去にはＡＳＯｘを用いると効率的であるがプロテアーゼが大量に存在する反応液中でＡＳＯｘが安定に存在するとは通常考えにくい。実際本発明者らの検討結果ではプロテアーゼの種類やプロテアーゼ阻害剤及びＡＳＯｘの種類等の検討ではプロテアーゼが大量に存在する反応液中でＡＳＯｘを安定に存在させる条件は見つからなかった。
ところが本発明者らは鋭意検討の結果、意外にも緩衝液の種類によってＡＳＯｘの安定性が飛躍的に向上することを見出した。
２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化
糖化蛋白質の臨床的な測定には前述のように高濃度のプロテアーゼが水溶液の状態で使用され、基本的にプロテアーゼ自体が不安定になる。ところが、本発明者らは鋭意検討の結果、ジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤を添加することにより、プロテアーゼの安定性が飛躍的に向上し、液状かつ高濃度の条件でも長期間保存が可能であることを見出した。
また少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素は液状での３７℃−４日保存で活性が約１割に低下する酵素であり、安定な酵素とは言い難かった。しかしながら本発明者らは鋭意検討の結果、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素に糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる安定化剤を添加することにより液状、３７℃−４日保存にて殆ど活性低下が見られない程の驚くべき安定化効果が得られることを見出した。
さらにプロテアーゼは至適ｐＨ付近では強い蛋白質分解活性を示すが、同時に自己消化反応も進行し特に液状での保存が困難になる。ところが本発明者らは鋭意検討の結果、第１試薬をプロテアーゼ作用に適した条件にし、第２試薬にプロテアーゼを液状でも安定な条件で処方することにより、測定時の条件には作用されずにプロテアーゼを安定に保存できること、また意外にも、前処理反応に使用する酵素を第２試薬に処方しても測定には影響を与えず正確な測定が可能であることを見出した。加えて第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を処方することにより、試料中に存在する糖化アミノ酸を予め消去し、選択的に糖化蛋白質を測定することが可能であった。
３）正確にアルブミンを測定する方法
本発明者らの検討により意外なことにＢＣＰの反応性がＧＡとＮＧＡで異なり、ＮＧＡが大量に混入すると値が負の影響を受けることが判明した。そこで本発明者らは鋭意検討の結果、アルブミン測定の前、若しくは同時に蛋白質変性剤及び／又はＳ−Ｓ結合を有する化合物にて試料を処理することにより良好にＮＧＡを大量に含むアルブミンを正確に測定できることを見出した。
４）糖化ヘモグロビンの影響回避
本発明者らは、上記問題点に関し鋭意研究の結果、フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２株由来ＦＯＤの遺伝子を改変して、変異ＦＯＤを作成し、その性状を測定することによってＮ末端より３７２番目のリジンを他のアミノ酸に置換することによって基質特異性が顕著に変化することを見出し、糖化バリンへの反応性が著しく低く、ほぼ糖化リジンに特異的に作用する改変ＦＯＤを複数作成した。
本変異ＦＯＤは、上記の知見に基づいてなされたもので、ＦＯＤについて配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番のリジンを別のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性が消失した変異型ＦＯＤである。配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番のリジンがトリプトファン、メチオニンまたはバリンに置換された請求項１記載の変異型ＦＯＤである。
最後に、本発明者らはこれらの発明を総合して正確に糖化蛋白質を測定する組成物、測定方法を完成するに至った。
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうるプロテアーゼは、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、かつ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸及び／若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いても良く、例えば動物、植物、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）、グリフォラ（Ｇｌｉｆｉｌａ）、酵母（Ｙｅａｓｔ）、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）等の微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
また測定対象である糖化蛋白質がＧＡある場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミン（Ａｌｂ）に対する作用が大きい為より好まし。また測定対象である糖化蛋白質がＧＨｂである場合にはバチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビン（Ｈｂ）に対する作用が大きい為により好ましい。
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法を下記に示す。
＜＜プロテアーゼの活性測定方法＞＞
下記の測定条件で３０℃、１分間に１μｇのチロシンに相当する呈色を示すプロテアーゼ活性度を１ＰＵ（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｕｎｉｔ）と表示する。
2002061119.tif 000002
＜操作＞
プロテアーゼ溶液を１０〜２０ＰＵ／ｍｌになるように酵素希釈溶液にて溶解し、この液１ｍｌを試験管に取り３０℃に加温する。あらかじめ３０℃に加温しておいた基質溶液５ｍｌを加え正確に１０分後反応停止液５ｍｌを添加し反応を停止する。そのまま３０℃、３０分加温を続け沈殿を凝集させ、東洋ろ紙ＮＯ．１３１（９ｃｍ）で濾過を行い、濾液を得る。ブランク測定はプロテアーゼ溶液１ｍｌを試験管に取り３０℃に加温し、まず反応停止液５ｍｌを添加し続いて基質溶液５ｍｌを添加後同様に凝集、濾過を行う。濾液２ｍｌを０．５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌ、３倍希釈フォリン試薬１ｍｌを加え３０℃、３０分反応後６６０ｎｍの吸光度を測定する。酵素作用を行った吸光度からブランク測定の吸光度を差し引いた吸光度変化を求め、別に作成した作用標準曲線より酵素活性を求める。
＜標準作用曲線作成法＞
約５０ＰＵ／ｍｌに調整した酵素溶液を希釈し２〜５０ＰＵ／ｍｌの一連の希釈倍率を持った酵素溶液を作成し上記操作を行い、得られた吸光度変化を縦軸に希釈倍数を横軸にプロットする。一方Ｌ−チロシンを０．２Ｎ塩酸に０．０１％の濃度に溶解しその１ｍｌに０．２Ｎ塩酸１０ｍｌ加えたものを標準チロシン溶液とする（チロシン濃度９．０９μｇ／ｍｌ）。標準チロシン溶液２ｍｌと０．２Ｎ塩酸２ｍｌについてそれぞれ上記測定操作を行い、得られた吸光度変化がチロシン１８．２μｇに相当する。この吸光度変化を前記グラフ上にとり、その点から横軸に垂線を下ろし横軸との交点が１０ＰＵ／ｍｌに相当する。
また、これらのプロテアーゼの使用濃度としては、目的とする蛋白質を一定の時間で効率よく切断できる濃度であれば良く、例えば通常１〜１０００００ＰＵ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００００ＰＵ／ｍｌの濃度で用いればよい。
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素としては、前記プロテアーゼの作用により、被検液に含まれる糖化蛋白質から生成される糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに有効に作用し、実質的に糖化蛋白質が測定できる酵素であれば如何なるものを用いても良いが、αアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、εアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素等が挙げられる。
εアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属又はデバリオマイゼス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来のＦＯＤ等が挙げられる。
αアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来の酵素が挙げられる。
さらに、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有し、かつ安価に製造可能な酵素の例としては、遺伝子組み替え型ケトアミンオキシダーゼ（Ｒ−ＦＯＤ；旭化成社製）および加えて糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型ＦＯＤ（Ｒ−ＦＯＤ−ＩＩ；旭化成社製）が挙げられる。
Ｒ−ＦＯＤ−ＩＩのもととなるフザリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２株由来のＦＯＤ蛋白質をコードするＤＮＡは、フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２株から常法により染色体ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法などで分離して得られる。
得られた該ＦＯＤ遺伝子への変異の導入は、ＤＮＡに直接変異を加えるならＰＣＲ法を応用してもよいし部位特異的変異法を使用してもよい。また偶発変異によるならば、ＤＮＡ修復能力の低下した大腸菌宿主を使用しても良いし、あるいはＤＮＡ変異源を添加した培地でＦＯＤ遺伝子を導入した宿主生物を培養することもできる。
かくして得られた変異ＦＯＤ遺伝子を適当な宿主−ベクター系を用いて宿主微生物に導入し、発現ベクターのマーカーと、ＦＯＤの活性発現若しくはＤＮＡプローブを指標としてスクリーニングを行い、ＦＯＤ遺伝子を含有する組換えＤＮＡプラスミドを保持する微生物を分離し、該遺伝子組換え微生物を培養し、該培養菌体から組換え蛋白を抽出精製することで変異ＦＯＤを得ることができる。
変異ＦＯＤを得るためには、具体的には以下のように行えばよいが、その操作法のうち常法とされるものは、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８２，１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
分離したＦＯＤ遺伝子に変異を導入するにはマンガンイオン添加条件下に於けるＴａｑポリメラーゼを始めとする３’→５’修復能欠損型ポリメラーゼを使用したＰＣＲ法や、ＤＮＡ修復能を欠損した大腸菌宿主にＦＯＤ遺伝子を導入しジアニシジンなどの変異源を添加した培地で培養することにより遺伝子変異を誘発し、作成した変異候補株群より目的の基質特異性を獲得した変異体を分離すればよい。
上述の方法によって導入されたＦＯＤの変異は、ジデオキシ法（Ｓａｎｇａｒ，Ｆ．（１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０）で変異を導入した遺伝子の塩基配列を確認することにより決定できる。
また一度変異が決定した後はゾラーらの方法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７）による部位特異変異法で特定の変異を導入することもできる。
変異ＦＯＤを構成するポリペプチドのアミノ酸配列の変異は、変異遺伝子の塩基配列より決定できる。以上の方法で得られた変異ＦＯＤは変異ＦＯＤ遺伝子を適当な宿主−ベクター系に組み込むことにより組換え体として生産できる。
変異ＦＯＤ遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合にはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ  Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を宿主とする場合にはＹｒｐ７、ｐＹＣ１、Ｙｅｐ１３などが使用できる。
このようなベクターに変異ＦＯＤ遺伝子を組み込むには、双方を同じ末端を生成する適当な制限酵素で切断し、変異ＦＯＤ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントとベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
変異ＦＯＤ遺伝子を結合したベクターを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がＥ．ｃｏｌｉに属する微生物の場合、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ６００などが利用できる。また、微生物宿主が枯草菌に属する微生物の場合、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＳＷ１２１４など、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエＩＮＶＳＣ１などが使用できる。
宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がＥ．ｃｏｌｉやサッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス・リビダンスに属する微生物の場合には、常法に従ってコンピテントセル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移入を行えばよく、菌株によっては電気穿孔法を使用してもよい。
変異ＦＯＤを生産するためには、変異ＦＯＤ遺伝子を導入した宿主を適切な培地で培養し、培養した菌体を集菌後、適当な緩衝液中にて超音波破砕やリゾチーム処理などにより菌体を破壊し、菌体抽出液を調製すればよい。また、シグナル配列を付加することによる分泌発現により、培養溶液中に変異ＦＯＤを蓄積させても良い。
かようにして生産された変異ＦＯＤは、通常の硫安沈殿、ゲル濾過、カラム精製などによって分離精製され、酵素標品として供給される。
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びベクターＤＮＡを０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０Ｕ、リガーゼ約３００Ｕ、その他の酵素約１〜１０Ｕ、程度が例示される。
変異ＦＯＤ遺伝子を含み、変異ＦＯＤを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示としては、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とし、その内部に変異ＦＯＤ遺伝子を含有するプラスミドｐｃｍＦＯＤ３を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃｍＦＯＤ３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４７）、およびｐｃｍＦＯＤ４を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃｍＦＯＤ４、およびｐｃｍＦＯＤ５を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃｍＦＯＤ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４８）が挙げられる。これらの構造を図７に示した。
なお、前記エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃｍＦＯＤ３及びエシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｃｍＦＯＤ５は、共に平成１３年１月１６日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４７及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４８を付与された。
形質転換微生物により該変異ＦＯＤを製造するに当っては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内又は培養液中に該変異ＦＯＤを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤などを添加して該変異ＦＯＤの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度のよい該変異ＦＯＤを得ることができる。
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用される。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
培養温度は微生物が発育し、変異ＦＯＤを生産する範囲で適宜変更し得るが、Ｅ．ｃｏｌｉの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、変異ＦＯＤが最高終了に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、Ｅ．ｃｏｌｉの場合、通常は１２〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、変異ＦＯＤを生産する範囲で適宜変更し得るが、Ｅ．ｃｏｌｉの場合、好ましくはｐＨ６〜８程度である。
培養物中の変異ＦＯＤは、菌体を含む培養液そのままを採取し、利用することもできるが、一般には常法に従って、変異ＦＯＤが培養液中に存在する場合には、濾過、遠心分離などにより変異ＦＯＤ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。変異ＦＯＤが菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を必要に応じて機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、またＥＤＴＡなどのキレート剤及び／又は界面活性剤を添加して変異ＦＯＤを可溶化し水溶液として分離採取する。
この様にして得られた変異ＦＯＤ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。
次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去することができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により精製し、これらの手段を用いて得られる変異ＦＯＤ含有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製された変異ＦＯＤが得られる。
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は下記の方法にて測定した。
＜＜糖化アミノ酸に作用する酵素の活性測定法＞＞
＜反応液の組成＞
５０ｍＭ        トリス緩衝液  ｐＨ７．５
０．０３％      ４アミノアンチピリン（４−ＡＡ）（和光純薬社製）
０．０２％      フェノール（和光純薬社製）
４．５Ｕ／ｍｌ    パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）（シグマ社製）
１．００ｍＭ      α−カルボベンズオキシ−ε−Ｄ−フルクトシル−Ｌ−リジン若しくはフルクトシルバリン（ハシバらの方法に基づき合成、精製した。Ｈａｓｈｉｂａ  Ｈ、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２４：７０、１９７６以下ＺＦＬ、ＦＶと略す。）
上記の反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３７℃−５分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液０．０２ｍｌを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に１０分間反応の後に０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を停止し、波長５００ｎｍの吸光度を測定する（Ａｓ）。またブランクとして酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この酵素作用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。別にあらかじめ過酸化水素の標準溶液を用いて吸光度と生成した過酸化水素との関係を調べ、３７℃−１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。計算式を下記に示す。
2002061119.tif 000003
2002061119.tif 000004
以上の方法によって得られる変異ＦＯＤのうち、配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番のリジンがトリプトファンに置換された変異ＦＯＤの酵素学的性質は以下のようである。
（１）基質特異性
ＺＦＬ                                １００％
ＦＶ                                      ０％
（２）酵素作用
下記に示すように、少なくともα−アミノ酸、ε−アミノ酸のアマドリ化合物を分解して、グルコソンと過酸化水素および対応するα−アミノ酸、ε−アミノ酸を生成する反応を触媒する。
2002061119.tif 000005
（３）分子量
本酵素の分子量はＳｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−１００を用いたカラムゲル濾過法で、０．２ＭのＮａＣｌ含有０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶出液として測定した結果、４８０００±２０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは４７０００±２０００であった。
（４）等電点
キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法によって４℃、７００Ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画し、各画分の酵素活性を測定した結果、ｐＨ４．３±０．２であった。
（５）Ｋｍ値
５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．０３％の４−ＡＡ
０．０２％のフェノール
４．５Ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ
を含む反応液中で合成基質ＺＦＬの濃度を変化させて、ＺＦＬに対するＫｍ値を測定した結果、３．４ｍＭの値を示した。
（６）至適ｐＨ
前記の酵素活性測定法に従い、反応液中の５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に代えて１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４−５．４）、リン酸緩衝液（ｐＨ５．６−７．９）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３−８．５）、およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０−１０．３）の各緩衝液を用いて測定した。この結果、ｐＨ７．５で最大の活性を示した。
（７）ｐＨ安定性
本酵素０．５Ｕを含有する０．５Ｍの至適ｐＨを測定するときに用いた各種緩衝液０．５ｍｌを４０℃、１０分間処理した後、その残存活性を後記の活性測定法に従って測定した。この結果、ｐＨ７．０−９．０の範囲で８０％以上の活性を保持していた。
（８）熱安定性
本酵素０．５Ｕを０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製し、１０分間加熱処理後、その残存活性を活性測定法に従って測定した。この結果、４０℃までは残存活性として９５％以上を保持した。
（９）至適温度
４０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、活性測定法に従い、各温度で１０分間反応後、０．５％のラウリル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略称する）溶液２ｍｌで反応を停止し、波長５００ｎｍで吸光度を測定した。この結果、５０℃で最大の活性を示した。
次に、ＦＯＤについて配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番のリジンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型ＦＯＤを用いて被検液中の糖化リジンを消去した後に、糖化バリンに反応性を有するＦＯＤを用いて被検液中の糖化バリンを測定する方法について述べる。
被検液中の糖化リジンを消去するＦＯＤは糖化バリンに作用しないＦＯＤであればなんら限定されるものではないが、例えばＦＯＤについて配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番のリジンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型ＦＯＤが用いられ、さらに好適には変異ＦＯＤのうち、配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番のリジンがトリプトファン、メチオニン、バリンのいずれかに置換された変異ＦＯＤを用いれば良い。このとき反応液に添加する酵素量は被検液中の糖化リジンを消去するのに十分な量であればよく、例えば、０．５〜２００Ｕ／ｍｌ、好適には１〜５０Ｕ／ｍｌである。
また、糖化バリンを測定するＦＯＤについては糖化バリンに反応性を持つＦＯＤであれば何ら限定されるものではなく、例えば、フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２株由来ＦＯＤを用いれば良い。このとき反応液に添加する酵素量は被検液中の糖化バリンを測定するのに十分な量であればよく、例えば、０．５〜２００Ｕ／ｍｌ、好適には１〜５０Ｕ／ｍｌである。
具体的な測定方法は、まず、第一反応にて、糖化リジンおよび糖化バリンを含有する被検液中の糖化リジンに変異型ＦＯＤを作用させ、このとき生成する過酸化水素はカタラーゼ等によって分解させ、第二反応にて、被検液中の糖化バリンにＦＯＤを作用させ生成する過酸化水素を４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）およびトリンダー試薬と反応させ、生成する色素を比色測定すればよい。また、第二反応液中にカタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウムを添加してもよい。
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうるグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤としては、被検液に、プロテアーゼをグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤存在下作用せしめ、主にグロブリン成分以外の蛋白質を断片化しうるグロブリン成分選択的な阻害剤であればいかなる阻害剤を用いても良い。その好ましい例としてはデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ、オクチルグルコシド若しくはベタインがあげられる。
デオキシコール酸アミドとしては、例えばビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミド（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｏ）等が好ましく、コール酸アミドとしては、例えば、硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）、硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ハイドロキシ−１−プロパン（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏ  ｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｏ）等が好ましい。
第四級アンモニウム塩としては、例えば塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベンジルトリ−ｎ−ブチルアンモニウム等が好ましく、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤としては、例えば塩化ラウリルトリメチルアンモニウム若しくはラウリルジメチルアミンオキサイド等が好ましい。
これらのグロブリン成分選択的な阻害剤は単独若しくは組み合わせて用いても良い。
また、これらのグロブリン成分選択的な阻害剤の使用濃度としては、プロテアーゼ作用中にグロブリン成分への作用を十分抑えられる量であれば良く、例えばデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、オクチルグルコシド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤を用いる場合には０．０１％〜２０％程度の濃度で使用することが好ましく、さらに好ましくは０．０５％〜１０％でありまたこれ以外の濃度を用いることもできる。
また同様に例えばコンカナバリンＡ、オクチルグルコシドもしくはベタインを用いる場合にはそれぞれ０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、０．００５〜５％の濃度で使用することが出来、またそれぞれ０．０２〜２ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜２％の濃度で使用することが好ましくこれ以外の濃度を用いることもできる。
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうるＡＳＯｘとしては、被検液に含まれるアスコルビン酸に有効に作用するものであればいかなるものを用いても良いが、例えば植物または微生物由来のＡＳＯｘ等が挙げられる。具体的な例を以下に示すがこれらは１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
植物由来のＡＳＯｘの例としては、キュウリ由来（アマノ社製、東洋紡社製）およびカボチャ由来（ロシュ社製、東洋紡社製）が挙げられる。
徹生物由来のＡＳＯｘの例としてはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来（旭化成社製）、微生物由来（アマノ社製）が挙げられる。
ＡＳＯｘの活性は下記の方法にて測定した。
＜＜ＡＳＯｘの活性測定法＞＞
＜保存基質溶液＞
Ｌアスコルビン酸（和光純薬社製）１７６ｍｇとＥＤＴＡ（第一化学薬品社製）３７ｍｇを１ｍＭ塩酸１００ｍｌで溶解する。
＜反応試薬混合液＞
上記の保存基質溶液を０．４５ｍＭのＥＤＴＡを含む９０ｍＭ  燐酸２カリ−５ｍＭ燐酸１ナト緩衝液で２０倍に希釈する。
＜操作＞
上記の反応試薬混合液１ｍｌを小試験管に入れ、３０℃−５分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液０．１０ｍｌを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に５分間反応の後に０．２Ｎ塩酸水溶液３．０ｍｌを添加して反応を停止し、波長２４５ｎｍの吸光度を測定する（Ａｓ）。またブランクとして上記の反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３０℃−５分間予備加温した後、０．２Ｎ塩酸水溶液３．０ｍｌを添加して反応を停止する。適当に希釈した酵素液０．１０ｍｌを添加して攪拌し、波長２４５ｎｍの吸光度を測定する（Ａｂ）。この酵素作用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｂ−Ａｓ）より酵素活性を求める。３０℃−１分間に１μｍｏｌのアスコルビン酸をデヒドロアスコルビン酸に酸化する酵素量を１Ｕと定義する。計算式を下記に示す。
2002061119.tif 000006
2002061119.tif 000007
また、これらのＡＳＯｘの使用濃度としては、プロテアーゼとＡＳＯｘを共存させ保存する場合に、試薬使用時でも十分なアスコルビン酸の消去が可能な量であれば良く、例えば通常０．１Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌの濃度で用いればよい。
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際にＡＳＯｘと組み合わせて使用しうる４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持たない緩衝剤としては、プロテアーゼとＡＳＯｘを共存させた状態で、ＡＳＯｘが安定である緩衝剤であればいかなるものを用いても良いが、例えば３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）等の４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持つ緩衝剤以外の緩衝剤であればいかなる緩衝剤を用いても良い。
さらに、好ましい緩衝剤の例としては、例えばＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、２−モルフィリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−モルフィリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルフィリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピベラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２−ハイドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノプロパンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）等があげられる。
最も好ましい緩衝剤の例としては例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）及びピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）が挙げられる。
これらのＡＳＯｘと共に使用する緩衝剤の使用濃度としては、プロテアーゼ共存下でもＡＳＯｘが安定である濃度であり、かつプロテアーゼ及びＡＳＯｘの反応に影響を及ぼさない濃度であればいかなる量用いても良く、例えば通常１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で用いればよい。
本発明を用いて糖化アルブミンを正確に測定する際に使用しうるアルブミンの蛋白質変性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物としてはＢＣＰのアルブミンに対する反応性がＧＡ及びＮＧＡで一致すればいかなるものを用いても良い。
好ましい蛋白質変性剤の例としては、例えば、尿素、グアニジン化合物、陰イオン界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩が挙げられ、これらは単独若しくは組み合わせて用いることが出来る。また、これらの蛋白質変性剤の使用濃度としては、ＢＣＰのアルブミンに対する反応性がＧＡ及びＮＧＡで一致する濃度であれば良く、例えば通常０．０１％〜１０％、好ましくは０．０５％〜５％の濃度で用いればよい。
好ましいＳ−Ｓ結合を有する化合物としては６，６’−ジチオジニコチン酸（６，６’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、３，３’−ジチオジプロピオン酸（３，３’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、２，２’−ジチオジサリチル酸（２，２’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、４，４’−ジチオジモルホリン（４，４’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、２，２’−ジヒドロキシ−６，６’−ジナフチルジスルフィド（２．２’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６，６’−ｄｉｎａｐｈｔｈｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ；ＤＤＤ）、２，２’−ジチオジピリジン（２，２’−ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；２−ＰＤＳ）、４，４’−ジチオジピリジン（４，４’−ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；４−ＰＤＳ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）；ＤＴＮＢ）、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（２，２’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−（５−ｎｉｔｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ））等があげられる。
また、これらのＳ−Ｓ結合を有する化合物の使用濃度としては、ＢＣＰのアルブミンに対する反応性がＧＡ及びＮＧＡで一致する濃度であれば良く、例えば通常１μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１０μＭ〜５ｍＭの濃度で用いればよく、これ以外の濃度で用いても良い。
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうるプロテアーゼの安定化剤としては、試薬保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であればいかなるものを用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であれば好ましい。
好ましい安定化剤の例としてはジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤があげられる。アルコールの例としては、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、グリセリン等が、第四級アンモニウム塩第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤の例としてはラウリル硫酸トリエタノールアミン、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等があげられる。
また、これらのプロテアーゼ安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、例えば通常０．０１％〜３０％、好ましくは０．１％〜２０％の濃度で用いればよく、これ以外の濃度で用いても良い。
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤としては、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であればいかなるものを用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であれば好ましい。
好ましい安定化剤の例としては糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンがあげられる。糖アルコールの例としては、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、グリセリン等が、アミノ酸としては全てのアミノ酸に強い安定化効果があるが中でもより好ましくは、プロリン、グルタミン酸、アラニン、バリン、グリシン、リジン等があげられる。
また、これらの少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、例えば糖アルコール、スクロース、アミノ酸、ザルコシンの場合、通常０．０１％〜３０％、好ましくは０．１％〜２０％の濃度で用いればよく、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安の場合、通常１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で用いればよく、これ以外の濃度で用いても良い。
本発明の糖化蛋白質測定用組成物に於ける液組成については、プロテアーゼを含む蛋白質分解試薬、生成した糖化アミノ酸若しくはペプチドの測定を行う糖化アミノ酸測定試薬を同一反応槽中で使用できるよう適宜組み合わせれば良い。またこれらの試薬は液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
本発明に使用しうる蛋白質分解試薬組成としては、蛋白質分解反応が効率よく進行するようにｐＨ、緩衝剤及びプロテアーゼ濃度を決定し、その後グロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤、ＡＳＯｘ、プロテアーゼ安定化剤を前述の有効な濃度になるよう適宜調製して添加すればよい。
例えばプロテアーゼタイプＸＸＩＶ（シグマ社製）を用いる場合にはｐＨが７〜１０付近で蛋白質分解活性が強く、反応のｐＨは７〜１０を選択できる。緩衝液としては４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持たない緩衝剤である例えばｐＨ７．２〜８．５に緩衝作用のあるＰＯＰＳＯ緩衝液を使用することが出来、ＰＯＰＳＯの濃度は１〜１００ｍＭの濃度、好ましくは１０〜５００ｍＭで使用すればよい。
またプロテアーゼ添加濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中の糖化蛋白質を十分に分解し得る濃度で有れば良く、１００〜５０万ＰＵ／ｍｌが好ましく、５００〜１０万ＰＵ／ｍｌがより好ましい。
グロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤、ＡＳＯｘ、プロテアーゼ安定化剤との組み合わせとしては、例えばグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤として硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン、０．０１％〜２０％、好ましくは０．０５％〜１０％、カボチャ由来アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製）、０．１Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌ、プロテアーゼ安定化剤としてジメチルスルホオキシド０．０１％〜３０％、好ましくは０．１％〜２０％等を用いることができる。
本発明に使用しうる糖化アミノ酸測定試薬組成については、使用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の至適ｐＨを考慮し反応が効率よく進行するようにｐＨを選択し、次に糖化アミノ酸に作用する酵素量を決定し、最後に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤を添加すればよい。
例えばＲ−ＦＯＤ若しくはＲ−ＦＯＤ−ＩＩ（旭化成社製）を使用する場合、最大活性の５０％以上の活性を示す領域がｐＨ６．５〜１０と広く、反応のｐＨは６．５〜１０を選択できる。また酵素添加濃度は、使用される反応液中で糖化アミノ酸を十分に検出し得る濃度で有れば良く、０．５〜２００Ｕ／ｍｌが好ましく、１〜５０Ｕ／ｍｌがより好ましい。
少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤としては、例えばグルタミン酸を用いることができ、０．０１％〜３０％、好ましくは０．１％〜２０％の濃度で用いればよい。
本発明に使用しうる第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬にプロテアーゼを含有する組成物としては、第１試薬をプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の作用可能な条件、例えばｐＨ、塩濃度、等を設定し、第２試薬にはプロテアーゼの保存に適した条件を設定すれば如何なる条件を用いても良い。
例えばＲ−ＦＯＤ、プロテアーゼタイプＸＸＩＶを使用する場合には、それぞれｐＨ６．５〜１０、７〜１０で酵素が良く作用することから第１試薬はｐＨ７〜１０を選択し比較的高濃度の例えば２０〜１０００ｍＭの緩衝剤濃度を選択すればよい。一方本プロテアーゼはｐＨ７以下で安定であることから、第２試薬のｐＨは７以下を選択し第１試薬よりも比較的低濃度の例えば１〜５０ｍＭ緩衝剤濃度を選択し、加えて例えばジメチルスルホオキシド１〜５０％程度のプロテアーゼ安定化剤を添加すると好ましい。この場合第１試薬と第２試薬の混合の割合を例えば４：１と第１試薬を多くすればさらに高濃度の安定化剤や第１試薬からかけ離れたｐＨ等が選択可能である。
さらに本発明に基づく糖化蛋白質を測定する酵素反応組成には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリビニルアルコール等の０．０１〜１０％、好適には０．０５〜５％、各種金属塩類、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウム等の１ｍＭ〜５Ｍ、好適には１０ｍＭ〜１Ｍ、各種緩衝液、例えばトリス−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、燐酸緩衝液、グッドの緩衝液等の１０ｍＭ〜２Ｍ、好適には２０ｍＭ〜１Ｍ、各種防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの０．０１〜１０％、好適には０．０５〜１％を適宜添加すれば良い。
本発明に使用しうる糖化蛋白質の測定方法としては、前記本発明の糖化蛋白質測定用組成物に被検液０．００１〜０．５ｍｌを加え、３７℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合には、反応開始後一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３分後と８分後の５分間における変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を直接または間接的に前記の方法で測定すれば良く、エンドポイントアッセイの場合には反応開始後一定時間後の変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を同様に測定すれば良い。この場合既知濃度の糖化蛋白質を用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖化蛋白質量を求めることができる。
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素作用の検出は、例えばデヒドロゲナーゼを用いた場合には補酵素の変化量を直接測定するか、若しくは生じた還元型補酵素を各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、ＷＳＴ−１、８（以上同人化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用い間接的に測定しても良く、またこれ以外の公知の方法により直接、間接的に測定しても良い。
また例えばオキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量または反応生成物の量を測定することが好ましい。反応生成物として、例えばＲ−ＦＯＤを用いた場合には反応により過酸化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソン共に公知の方法により直接、間接的に測定する事が出来る。
上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色、発光、蛍光等により測定しても良く、また電気化学的手法によって測定しても良く、カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドの量を測定しても良い。
過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼの存在下で４−ＡＡ若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬等を用いることが出来る。
トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例として、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ，Ｎビス（４−スルホプロピル）−３−メチルアニリン２ナトリウム（ＴＯＤＢ）（以上同人化学研究所社製）等が挙げられる。
またロイコ型試薬の具体例としては、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）（以上和光純薬社製）等が挙げられる。
蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸等を、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール等を用いることが出来る。
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられ、電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を測定しても良い。
糖化蛋白質が糖化アルブミンであり、糖化アルブミン割合を正確に測定する場合に、本発明において用いることができるアルブミン測定試薬としては、蛋白質変性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物及びブロモクレゾールパープルを含有する組成物として調製されているものであり、ＧＡとＮＧＡの間で測定に乖離を生じない組成であればいかなる組成を用いても良い。
例えば蛋白質変性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物としてラウリル硫酸ナトリウム及び５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を用いる場合には、ＢＣＰの発色に影響を与えないように低濃度の緩衝液例えば１〜２０ｍＭを用い、ラウリル硫酸ナトリウム０．０１％〜１０％、好ましくは０．０５％〜５％及び５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）１μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１０μＭ〜５ｍＭの濃度で用いれば良い。またＢＣＰは中性以上で激しく着色することからｐＨ４．５〜７．５で使用すると良い。
本発明に使用しうるアルブミンの測定方法としては、前記本発明のアルブミン測定用組成物に被検液０．００１〜０．５ｍｌを加え、３７℃の温度にて反応させ、１ポイントアッセイにて反応開始から一定時間後の色素の量を測定すれば良い。アルブミン−ＢＣＰの発色の検出は吸収極大が６００ｎｍ付近であるから、５５０ｎｍ〜６３０ｎｍ付近で検出を行うと良い。この場合既知濃度のアルブミンを用いて測定した場合の吸光度及び水のブランクと比較すれば被検液中のアルブミンの量を求めることができる。
本発明の測定対象となる被検液は、少なくとも糖化蛋白質を含有する被検液であれば如何なるものを用いても良いが、好ましい被検液としては血液成分、例えば血清、血漿、血球、全血等が挙げられる。また分離された赤血球も、分離の条件によってはグロブリン成分が混入し測定値に影響を与える可能性があることから好ましい被検液として用いることができる。
本発明の糖化蛋白質測定組成物及び測定方法に於ける測定対象である糖化蛋白質としては、例えばＧＡまたはＧＨｂが挙げられるが、測定対象となる糖化蛋白質は何らこれらに限定されるものではなく、何れの糖化蛋白質を測定しても良い。
［発明を実施する最良の形態］
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
実施例１
グロブリン成分に作用しないプロテアーゼをスクリーニングする目的で、プロテアーゼをアルブミン、グロブリン成分及びヘモグロビンに作用させ生じた糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドをＲ−ＦＯＤ（旭化成社製）にて測定した。
＜基質溶液＞
１；ＨＳＡ基質溶液；Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｈｕｍａｎ；Ｅｓｓｅｎｃｉａｌｌｙ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｒｅｅ；２５ｍｇ／ｍｌ、ＧＡ％＝３１．９％、フルクトサミン（ＦＲＡ）値＝２５６μｍｏｌ／Ｌ［シグマ社製；基質溶液中のアルブミン濃度はアルブミン測定キット（アルブミンＩＩ―ＨＡテストワコー；和光純薬社製）にて測定、ＧＡ％は糖化アルブミン測定計（ＧＡＡ−２０００；京都第一科学社製）にて測定した。
２；Ｇ−ＩＩ，ＩＩＩ基質溶液、ＦＲＡ値４８μｍｏｌ／Ｌ［Ｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｈｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＩ，ＩＩＩ；１６．９ｍｇ／ｍｌ（シグマ社製）］
３；Ｇ−ＩＶ基質溶液、ＦＲＡ値２６μｍｏｌ／Ｌ［Ｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｈｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＶ；６ｍｇ／ｍｌ（シグマ社製）］
４；Ｇ−Ｉ基質溶液、ＦＲＡ値７７μｍｏｌ／Ｌ［グロベニンＩ；ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉ；免疫グロブリン製剤（武田薬品社製）］
５；Ｈｂ基質溶液；Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｈｕｍａｎ；５５ｍｇ／ｍｌ、糖化ヘモグロビン率；ＨｂＡ１ｃ＝４．５％［シグマ社製；ＨｂＡ１ｃ値は糖化ヘモグロビン計（ハイオートエーワンシーＨＡ−８１５０；京都第一科学社製）にて測定した。］
なお基質溶液のフルクトサミン値はフルクトサミン測定キット（オートワコーフルクトサミン、和光純薬社製）にて測定した。
＜プロテアーゼ反応試料作成＞
Ｈｂ以外の基質溶液２００μｌ、プロテアーゼ溶液１００ｍｇ／ｍｌ（この濃度が作成できない場合は可能な限り濃い濃度、また溶液状のものはそのままの濃度）４０μｌ、及び１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）１０μｌを良く混合し３７℃−３０分反応させ、１万膜（ウルトラフリーＭＣ；ミリポア社製）で濾過し、濾液をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行い、ブランク試料とした。
一方Ｈｂ基質溶液の場合は基質溶液１５０μｌ、プロテアーゼ溶液２００ｍｇ／ｍｌ（この濃度が作成できない場合は可能な限り濃い濃度、また溶液状のものはそのままの濃度）を６０μｌ及び１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）５μｌを良く混合し３７℃−６０分反応させ、１万膜（ウルトラフリーＭＣ；ミリポア社製）で濾過し、濾液をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行い、ブランク試料とした。
＜プロテアーゼ反応試料中の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの測定＞
＜反応液組成＞
５０ｍＭ      トリス緩衝液  ｐＨ８．０
０．０２％    ４−ＡＡ（和光純薬社製）
０．０２％    Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）（同人化学研究所社製）
２Ｕ／ｍｌ    Ｒ−ＦＯＤ（旭化成社製）
５Ｕ／ｍｌ    ＰＯＤ（シグマ社製）
＜反応手順＞
上記糖化アミノ酸測定反応液３００μｌをセルに分注し３７℃−３分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ０）。続いてプロテアーゼ反応試料３０μｌを添加し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ１）。またプロテアーゼ反応試料の代わりにブランク試料を用い同様の操作を行いＡ０ブランク、Ａ１ブランクを測定する。プロテアーゼの糖化蛋白質への作用を吸光度変化で示すと下式となる。
ΔＡ＝（Ａ１−Ａ０）−（Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）
ｐＨ８．０における代表的なプロテアーゼのアルブミン、グロブリン、ヘモグロビンへの作用（ΔＡ）を表１に示す。
2002061119.tif 000008
Ｇ−ＩＶ基質溶液中の糖化蛋白質に対する作用はどのプロテアーゼも小さい若しくは０であったため、またＧ−ＩＩ、−ＩＩＩ基質溶液の測定値とＧ−Ｉ基質溶液の測定値がほぼ同じであったために表１にはグロブリン成分についてＧ−Ｉ基質溶液の結果のみを記載した。表１から分かるようにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のプロテアーゼ、及びプロテアーゼタイプＸＩＶはグロブリン成分中の糖化グロブリンにも良く作用している。
しかしながらアルブミン中のＧＡ及びヘモグロビン中のＧＨｂに作用するエンド型、エキソ型プロテアーゼは共にグロブリン成分中の糖化グロブリンに作用を示した。よって血清又は血漿中のＧＡ若しくは全血及び血球中のＧＨｂを測定する場合にプロテアーゼの選択のみではグロブリン成分の影響を回避できないと考えられた。
実施例２
＜グロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング＞
前記ＨＳＡ基質溶液に高い作用を示すプロテアーゼタイプＸＸＩＶ（シグマ社製）を用いて、ＨＳＡ基質溶液を基準に、前記各種グロブリン基質溶液へのプロテアーゼ作用を低下させる物質をスクリーニングした。
＜反応液組成＞
Ｒ−１蛋白質分解試薬
１５０ｍＭ        トリシン緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．５
２５００Ｕ／ｍｌ  プロテアーゼタイプＸＸＩＶ（シグマ社製）＋グロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤（デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤；１％、コンカナバリンＡ；０．２１ｍｇ／ｍｌ、ベタイン；０．１％、オクチルグルコシド；１％；同人化学研究所社製）
Ｒ−２糖化アミノ酸測定試薬
１５０ｍＭ      トリシン緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．５
０．１２％      ４−ＡＡ（和光純薬社製）
０．０８％      ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２４Ｕ／ｍｌ    Ｒ−ＦＯＤ（旭化成工業社製）
２０Ｕ／ｍｌ    ＰＯＤ（シグマ社製）
Ｒ−１蛋白質分解試薬中のデオキシコール酸アミドとしては、ビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミドを、コール酸アミドとしては硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン、硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ハイドロキシ−１−プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド、第四級アンモニウム塩としては塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベンジルトリ−ｎ−ブチルアンモニウム、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤としては、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム及びラウリルジメチルアミンオキサイドを使用した。
＜基質溶液＞
１；ＨＳＡ基質溶液；Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｈｕｍａｎ；４０ｍｇ／ｍｌ、ＧＡ％＝１０．５％［和光純薬社製；基質溶液中のアルブミン濃度はアルブミン測定キット（アルブミンＩＩ−ＨＡテストワコー；和光純薬社製）にて測定し、ＧＡ％は糖化アルブミン測定計（ＧＡＡ−２０００；京都第一科学社製）にて測定した。］
２；γグロブリン添加基質溶液；上記ＨＳＡ基質溶液にγグロブリン［γＧｌｏｂｕｌｉｎｓ  Ｈｕｍａｎ（シグマ社製）フルクトサミン値３４μＭ］１７．０ｍｇ／ｍｌを添加した。
＜反応手順＞
３７℃にインキュベートされたＲ−１；２４０μｌに基質溶液（ＨＳＡ基質溶液、Ｇ−Ｉ基質溶液）８μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、正確に５分後にＲ−２；８０μｌを添加した。Ｒ−２添加前後の５４６ｎｍの吸光度を測定し、その差を吸光度変化とした。また基質の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行い、ブランク試料とし、さらにグロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤を添加しない反応液をコントロールとした。
ＨＳＡ基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔＡ（ＨＳＡ）及びγグロブリン添加基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔＡ（＋γグロブリン）を算出し、
γグロブリン添加の影響
＝（ΔＡ（＋γグロブリン）−ΔＡ（ＨＳＡ））／ΔＡ（ＨＳＡ）×１００（％）
様々な候補物質の共存下及び非共存下（コントロール試料）にて比較した。その結果を表２に示す。
2002061119.tif 000009
表２から分かるようにデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ、オクチルグルコシド及びベタインにグロブリンへのプロテアーゼ作用を阻害する効果が確認され、これらグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤及びプロテアーゼを用いることにより主にグロブリン以外の蛋白質を断片化できることが明白となった。
さらにＨＳＡ基質溶液の代わりにＨｂ基質溶液を用い同様の測定を行った。但しＨｂ基質溶液を用いた場合にはＲ−１反応終了後、トリクロル酢酸にて除蛋白、中和後Ｒ−２を添加し評価を行った。Ｈｂ基質溶液を用いた場合にもデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ及びベタインにグロブリンへのプロテアーゼ作用を阻害する効果が確認された。
実施例３
＜硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンのグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害効果＞
様々なプロテアーゼを用い、硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンのグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害効果を確認した。
Ｒ−１蛋白質分解試薬
１５０ｍＭ        トリシン緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．５
２５００Ｕ／ｍｌ  プロテアーゼ＊
１％              硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン
＊  プロテアーゼはオリエンターゼ２２ＢＦ（阪急バイオインダストリー社製）、プロテアーゼタイプＶＩＩＩ、プロテアーゼタイプＸＩＶ、プロテアーゼタイプＸＸＶＩＩ（以上シグマ社製）を使用した。
Ｒ−２糖化アミノ酸測定試薬
実施例２に同じ
＜基質溶液＞
実施例２に同じ。
＜反応手順＞
実施例２に同じ手順でγグロブリン添加の影響を硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンの共存下及び非共存下（コントロール試料）にて比較した。その結果を表３に示す。なお、判定の欄について、γグロブリンの添加の影響が有意に低下した場合に○とした。
2002061119.tif 000010
2002061119.tif 000011
表３から分かるようにオリエンターゼ２２ＢＦ、プロテアーゼタイプＶＩＩＩ、プロテアーゼタイプＸＩＶ、プロテアーゼタイプＸＸＶＩＩはすべて硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン共存下にγグロブリン基質へのプロテアーゼ作用が低下し、一方ＨＳＡ基質に対する作用は保持されていた。このことから本発明におけるグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤はプロテアーゼの種類を問わず有効であることが明らかとなった。
さらに同様にＧＨｂを測定する場合にも本発明を用いることにより、グロブリン成分の影響を回避できた。
実施例４
＜糖化アルブミンの希釈直線性＞
Ｒ−１蛋白質分解試薬
１５０ｍＭ        トリシン緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ８．５
２５００Ｕ／ｍｌ  プロテアーゼタイプＸＸＶＩＩ（シグマ社製）
１％              硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ハイドロキシ−１−プロパン（シグマ社製）
Ｒ−２糖化アミノ酸測定試薬
実施例２に同じ
＜基質溶液＞
１：ＨＳＡ基質溶液；実施例１と同じ。但し濃度は４．０ｇ／ｄｌで用いた。
２：γグロブリン基質溶液；実施例２と同じ。
３；グロブリンＩＶ基質溶液；実施例１と同じ。
＜操作＞
ＨＳＡ基質溶液（４ｇ／ｄｌ）、γグロブリン（γＧ）及びグロブリンＩＶ（ＧＩＶ）基質溶液（１．７ｇ／ｄｌ）の０．０、０．５、１．０、１．５、２．０倍濃度の試料を調製し希釈直線性を確認した。操作は実施例３に同じ。但しＨＳＡ１．０倍濃度は１０回測定しＣＶ値を計算した。その結果を図１に示す。
図１から分かるようにγグロブリン及びグロブリンＩＶ基質溶液共に濃度を変化させても吸光度変化が得られなかった。一方ＨＳＡ基質溶液は濃度に応じて良好な直線性が得られ、グロブリン成分の影響を実質的に受けずに糖化アルブミンが測定されていることが明白である。またＨＳＡ１．０倍濃度ではＣＶ値＝０．９％と良好な再現性が確認されており、本発明の測定系を用いて１０分の反応時間で糖化アルブミンが選択的に、感度良く、また再現良く測定されていることが明らかとなった。
実施例５
＜糖化ヘモグロビンの希釈直線性＞
Ｒ−１蛋白質分解試薬
７７ｍＭ          トリス緩衝液  ｐＨ８．０
２５００Ｕ／ｍｌ  プロテアーゼタイプＸＩＶ（シグマ社製）
１％          硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ハイドロキシ−１−プロパン（シグマ社製）
Ｒ−２糖化アミノ酸測定試薬
実施例２に同じ。
＜基質溶液＞
実施例１と同一のＨｂ基質溶液及び実施例４と同じγグロブリン及びグロブリンＩＶ基質溶液を使用した。
＜操作＞
Ｈｂ基質溶液（４ｇ／ｄｌ）、γグロブリン及びグロブリンＩＶ基質溶液（１．７ｇ／ｄｌ）の０．０、０．５、１．０、１．５、２．０倍濃度の試料を調製し希釈直線性を確認した。操作は実施例１に同じ。但しＨｂ１．０倍濃度は１０回測定しＣＶ値を計算した。その結果を図２に示す。
図２から分かるようにγグロブリン及びグロブリンＩＶ基質溶液共に濃度を変化させても吸光度変化が得られなかった。一方Ｈｂ基質溶液は濃度に応じて良好な直線性が得られ、グロブリン成分の影響を実質的に受けずに糖化ヘモグロビンが測定されていることが明白である。またＨｂ１．０倍濃度ではＣＶ値＝２．０％と良好な再現性が確認されており、本発明の測定系を用いて１０分の反応時間で糖化ヘモグロビンが選択的に、感度良く、また再現良く測定されていることが明らかとなった。
実施例６
＜糖化アルブミンの直線性＞
Ｒ−１蛋白質分解試薬        実施例４に同じ。
Ｒ−２糖化アミノ酸測定試薬  実施例４に同じ。
＜基質溶液＞
血清Ａ）＊糖尿病患者血清  ＧＡ％＝３２．９％；アルブミン濃度  ４．３ｇ／ｄｌ
血清Ｂ）＊健常者血清      ＧＡ％＝１６．４％；アルブミン濃度  ４．１ｇ／ｄｌ
＊  上記血清Ａ）とＢ）とを１０：０、８：２、６：４、４：６、２：８、０：１０の割合で混合し試料とした。
＜操作＞  実施例３に同じ。
結果を図３に示す。
図３から分かるようにアルブミン濃度を一定にした異なる糖化アルブミン率の試料に於いても良好な直線性が得られた。従って本発明の糖化蛋白質の測定方法により、実際の血清、血漿中の糖化アルブミンを定量的に検出できる事が分かった。また血清の代わりに赤血球を溶血し作成したヘモグロビン基質溶液を用いても同様の直線性が確認された為、本発明の糖化蛋白質の測定方法により、糖化ヘモグロビンを定量的に検出できることも確認できた。
実施例７
＜糖化アルブミンＨＰＬＣ法と酵素法（本発明）の相関性＞
2002061119.tif 000012
糖尿病患者血清１４検体を用い本発明に基づく酵素法と、公知のＨＰＬＣ法の相関を確認した。尚ＨＰＬＣ法の測定は、糖化アルブミン計（ＧＡＡ−２０００；アークレイ社製）にて糖化アルブミン率を測定した。本発明に基づく測定方法から得られる吸光度変化は糖化アルブミン率と、相関係数ｒ＝０．９９１と非常によい相関を示し、本発明に基づく測定方法は糖化アルブミンを正確に測定していることが明らかとなった。
実施例８
＜アスコルビン酸オキシダーゼの安定化に及ぼす緩衝剤種類の効果＞
＜反応液組成＞
2002061119.tif 000013
Ｒ−１蛋白質分解試薬中の緩衝剤としては３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）（以上同人化学研究所社製）及び燐酸（和光純薬社製）を用いた。
＜操作手順＞
上記反応液を各種緩衝剤を用いて作成し、その一部をとり、試薬中のアスコルビン酸オキシダーゼ活性を測定しコントロールとした。活性測定方法は前述の＜＜アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯｘ）の活性測定法＞＞を用いた。残りの反応液は室温にて２日間保存後同様に活性を測定した。コントロールの活性に対する、室温−２日間保存後の活性の割合を計算しアスコルビン酸オキシダーゼの安定性を比較した。結果を表４に示す。
2002061119.tif 000014
表４からわかるように４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持つ３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）を緩衝剤に用いた場合よりも、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持たないトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）及び燐酸を緩衝剤に用いた場合、プロテアーゼの共存下に於いてアスコルビン酸オキシダーゼがより安定に存在していることが明白であった。
またアスコルビン酸オキシダーゼ、プロテアーゼの種類に係わらず同様の効果が確認されていることも明白である。
実施例９
＜糖化蛋白質測定用組成物中のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化に及ぼす緩衝剤種類の効果＞
＜反応液組成＞
Ｒ−１蛋白質分解試薬
１５０ｍＭ    各種緩衝液  ｐＨ８．０
２５００Ｕ／ｍｌ    プロテアーゼタイプＸＸＩＶ（シグマ社製）
２．０ｍＭ    ４−アミノアンチピリン（和光純薬社製）
１０Ｕ／ｍｌ    アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製）
Ｒ−２糖化アミノ酸測定試薬
１５０ｍＭ    ＨＥＰＥＳ緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
６．０ｍＭ    ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
２４Ｕ／ｍｌ    Ｒ−ＦＯＤ（旭化成社製）
２０Ｕ／ｍｌ    ＰＯＤ（シグマ社製）
Ｒ−１蛋白質分解試薬中の緩衝剤としてはＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｓ及びＰＯＰＳＯを用いた。
＜コントロール基質溶液、アスコルビン酸添加基質溶液＞
ヒトプール血清９容に１容のアスコルビン酸（国産化学社製）１ｇ／ｄｌを添加しアスコルビン酸添加基質溶液とした。アスコルビン酸の代わりに蒸留水を添加したものをコントロール基質溶液とした。
＜反応手順＞
３７℃にインキュベートされたＲ−１；２４０μｌにコントロール基質溶液若しくはアスコルビン酸添加基質溶液８μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、正確に５分後にＲ−２；８０μｌを添加した。Ｒ−２添加前及び添加５分後の５５５ｎｍの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、コントロール基質溶液、アスコルビン酸添加基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔＡ０を算出した。一方同じ反応液Ｒ−１を室温にて２４時間保存し同様の測定を行いΔＡ２４を算出した。コントロール基質溶液から得られた吸光度変化を１００としてアスコルビン酸添加基質溶液から得られたΔＡ０及びΔＡ２４の割合を計算した。結果を図４に示す。
アスコルビン酸は測定系に大きな負の影響を与え１００ｍｇ／ｄｌの濃度の場合消去反応を行わなければ糖化蛋白質のシグナルが観察できなくなる。図４からわかるようにアスコルビン酸処理能は糖化蛋白質を測定する系でも４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持たないＴｒｉｓ及びＰＯＰＳＯにおいて室温−２４時間保存後にも変化なく、一方ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＨＥＰＰＳＯを用いた４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持つ緩衝剤の系ではアスコルビン酸処理能が室温−２４時間保存後にはほとんど観察されなかった。以上の結果からプロテアーゼとアスコルビン酸オキシダーゼが共存する糖化蛋白質測定試薬に於いても４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持つ緩衝剤に用いた場合よりも、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル基を持たない緩衝剤に用いた場合アスコルビン酸オキシダーゼがより安定に存在していることが明白であった。
また本結果から糖化アルブミン、フルクトサミン及び糖化ヘモグロビンの測定に関し本発明が有用であることも明白である。
実施例１０
＜グリコアルブミン、ノングリコアルブミンに対するブロモクレゾールパープルの作用の違い、及び蛋白質変性剤及び／または、Ｓ−Ｓ結合を有する化合物の効果＞
＜反応液組成＞
Ｒ−１前処理試薬
１０ｍＭ      Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．０＋各濃度の蛋白質変性剤及び／または、Ｓ−Ｓ結合を有する化合物、対照としては蒸留水を添加した。
Ｒ−２アルブミン発色試薬
２００ｍＭ    コハク酸緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ５．５
０．１５ｍＭ  ブロモクレゾールパープル（和光純薬社製）
０．３％      Ｔｘ−１００（和光純薬社製）
Ｒ−１前処理試薬中の蛋白質変性剤及び／または、Ｓ−Ｓ結合を有する化合物として以下の１）〜９）を用いた。
１）  ６，６’−ジチオジニコチン酸（６，６’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ；１００ｍＭ）
２）  ３，３’−ジチオジプロピオン酸（３，３’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；１００ｍＭ）
３）  ２，２’−ジチオジサリチル酸（２，２’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ；１００ｍＭ）
４）  ４，４’−ジチオジモルホリン（４，４’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ；１００ｍＭ）
５）  ＤＴＮＢ（５０ｍＭ）
６）  ＤＤＤ（３３ｍＭ）
７）  ２−ＰＤＳ（２５ｍＭ）
８）  ４−ＰＤＳ（５０ｍＭ）
９）  ＳＤＳ（０．３％）
１）〜５）和光純薬社製、６）〜９）同人化学研究所社製
＜試料＞
グリコアルブミン、ノングリコアルブミン、健常者血清、患者血清を試料として、ブランクとしては蒸留水を用いた。グリコアルブミン、ノングリコアルブミンはヒト血清よりアルブミンを公知の方法で精製し、ホウ酸固定化樹脂を用いて精製した。
＜反応手順＞
３７℃にインキュベートされた前処理試薬；１６０μｌに試料２μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、正確に５分後にアルブミン発色試薬；１６０μｌを添加した。アルブミン発色試薬添加前及び添加５分後の６００ｎｍの吸光度を測定した。また試料の代わりに蒸留水及びアルブミン濃度が既知である試料から検量線を作成しアルブミン測定値を求めた。またラテックス試薬を用いた免疫法（ＬＸ試薬、栄研社製、Ａｌｂ−ＩＩ）を別途測定し、コントロールとした。結果を表５に示す。
2002061119.tif 000015
2002061119.tif 000016
表５からわかるように、前処理なしのＢＣＰ法では意外にもＮＧＡに於いて低値を示し、同様にＮＧＡの少ない患者では免疫法とＢＣＰ法との乖離は、ＮＧＡの多い健常者に比べて小さかった。また、蛋白質変性剤及び／または、Ｓ−Ｓ結合を持つ化合物にて前処理することにより免疫法との乖離は有意に小さくなった。なかでも２，２’−ジチオサリチル酸、４，４’−ジチオジモルホリン、ＤＤＤ、２−ＰＤＳ、４−ＰＤＳ、ＤＴＮＢ及びラウリル硫酸ナトリウムの効果が顕著であった。このことから、糖化アルブミン割合を測定する際に使用するアルブミン試薬として、蛋白質変性剤及び／または、Ｓ−Ｓ結合を持つ化合物にて前処理し、続いて若しくは同時にＢＣＰを作用させてアルブミンを測定する方法を用いることにより、ＮＧＡにより負の誤差を与える現象が回避され、正確に糖化アルブミン割合が測定できることが明白となった。
実施例１１
＜プロテアーゼの安定化＞
＜反応液組成＞
Ｒ−１蛋白質分解試薬
１５０ｍＭ          Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．５
５０００ＰＵ／ｍｌ  プロテアーゼタイプＸＸＩＶ（シグマ社製）
８ｍＭ              ４−アミノアンチピリン（同人化学研究所社製）
１５Ｕ／ｍｌ        パーオキシダーゼ
１．０％        硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ハイドロキシ−１−プロパン（シグマ社製）＋各濃度のプロテアーゼ安定化剤、対照としては蒸留水を添加した。
Ｒ−２糖化アミノ酸測定試薬
１５０ｍＭ          Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．５
２４Ｕ／ｍｌ        Ｒ−ＦＯＤ−ＩＩ（旭化成社製）
１２ｍＭ            ＴＯＯＳ（同人化学研究所社製）
前処理試薬中のプロテアーゼ安定化剤として以下の１）〜７）を用いた。
１）０．５ｍＭ    塩化マグネシウム
２）１０ｍＭ      塩化カルシウム
３）１００ｍＭ    塩化ナトリウム
４）０．１％      エチレングリコール（ＥｔＧｌｙ）
５）１０％        ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）
６）１％          エタノール（ＥｔＯＨ）
７）０．１％      ラウリル硫酸トリアタノールアミン（ＴＥＡＬＳ）
１）〜７）和光純薬社製
＜試料＞
５ｇ／ｄｌ  ＨＳＡ（シグマ社製；ＬＯＴ３８Ｈ７６０１）
＜反応手順＞
３７℃にインキュベートされた蛋白質分解試薬；２４０μｌに試料８μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、正確に５分後に糖化アミノ酸測定試薬；８０μｌを添加した。糖化アミノ酸測定試薬添加前及び添加５分後の５４６ｎｍの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔＡ０を算出した。一方同じ反応液蛋白質分解試薬を３７℃にて２４時間保存し同様の測定を行いΔＡ２４を算出した。安定化剤なしで、かつ保存なしの場合のΔＡ０を１００％として、安定化剤有り、無しの場合の相対感度を算出した。結果を図５に示す。
図５からわかるように、安定化剤がない場合、相対感度は６０％に低下し蛋白質分解試薬の安定化効果が観察された。一方安定化剤を添加した場合には安定化効果が塩化カルシウム、塩化ナトリウム、ＤＭＳＯ、ＥｔＯＨ、ＴＥＡＬＳに観察され、中でも塩化カルシウム、ＤＭＳＯに関してはほとんど性能低下は観察されなかった。さらにＤＭＳＯ及び塩化カルシウムは安定性試験を継続した結果、３７℃−４週間保存でも性能低下が観察されず、液状、冷蔵で１年以上の保存安定性を有することが明らかとなった。
実施例１２
＜少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化＞
＜反応液組成＞
Ｒ−１蛋白質分解試薬
１５０ｍＭ      Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．５
８ｍＭ          ４−アミノアンチピリン（同人化学研究所社製）
１５Ｕ／ｍｌ    パーオキシダーゼ
Ｒ−２糖化アミノ酸測定試薬
１５０ｍＭ      Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．５
２４Ｕ／ｍｌ    Ｒ−ＦＯＤ−ＩＩ（旭化成社製）
１２ｍＭ        ＴＯＤＢ（同人化学研究所社製）＋各濃度のプロテアーゼ安定化剤、対照としては蒸留水を添加した。
糖化アミノ酸測定試薬中の少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の定化剤として以下の１）〜１５）を用いた。
１）      ５％          マンニトール
２）      ５％          ソルビトール
３）      ５％          スクロース
４）      ５％          トレハロース
５）      ０．５ｍＭ    塩化カルシウム
６）      ０．５ｍＭ    塩化マグネシウム
７）      ３％          Ｌ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）
８）      ３％          Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）
９）      ３％          Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）
１０）    ３％          Ｌ−アラニン（Ａｌａ）
１１）    ３％          Ｌ−バリン（Ｖａｌ）
１２）    ３％          グリシン（Ｇｌｙ）
１３）    ３％          Ｌ−リジン（Ｌｙｓ）
１４）    ３％          ザルコシン
１５）    １００ｍＭ    硫安
１）〜１４）和光純薬社製
＜試料＞
０．５ｍＭ  ＦＺＬ
＜反応手順＞
３７℃にインキュベートされた蛋白質分解試薬；２４０μｌに試料８μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、正確に５分後に糖化アミノ酸測定試薬；８０μｌを添加した。糖化アミノ酸測定試薬添加前及び添加５分後の５４６ｎｍの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔＡ０を算出した。一方同じ反応液糖化アミノ酸測定試薬を３７℃にて２日間保存し同様の測定を行いΔＡ２４を算出した。安定化剤なしで、かつ保存なしの場合のΔＡ０を１００％として、安定化剤有り、無しの場合の相対感度を算出した。結果を図６に示す。
図６からわかるように、安定化剤がない場合、相対感度は３０％に低下し糖化アミノ酸測定試薬の安定化効果が観察された。一方安定化剤を添加した場合には安定化効果がマンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、グリシン、Ｌ−リジン、ザルコシン、硫安に観察され、中でも糖アルコール、アミノ酸、ザルコシンに関しては特に強い安定化効果が確認された。さらにＬ−アラニン、グリシン及びザルコシンは安定性試験を継続した結果、３７℃−４週間保存でも性能低下がほとんど観察されず、液状、冷蔵で１年以上の保存安定性を有することが明らかとなった。
実施例１３
＜変異ＦＯＤ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントライブラリーの作成＞
配列表配列番号５の塩基配列の１から３０の配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表配列番号６の塩基配列の１から３０の配列を有するオリゴヌクレオチドの合成を外部委託（ＢＥＸ社）し、さらにフザリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２株由来のＦＯＤ蛋白質をコードするＤＮＡを鋳型にして、Ｔａｑポリメラーゼキット（宝酒造社製）を用いて添付のマニュアルに従ってＰＣＲを実施し、ＦＯＤ構造遺伝子を増幅した。この際、反応液中に最終濃度０．５ｍＭ相当の２価マンガンイオンを添加し、塩基をｄＡＴＰ：０．５１ｍＭ、ｄＣＴＰ：０．２０ｍＭ、ｄＧＴＰ：１．１５ｍＭ、ｄＴＴＰ：３．７６ｍＭと濃度を偏在させて反応を実施し、変異導入効率を高めた。
実施例１４
＜変異ＦＯＤ組換え体ライブラリーの作成＞
実施例１３により増幅したＦＯＤ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化し、同じ制限酵素で処理したプラスミドｏＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）に組み込み、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株（東洋紡績社製）に導入し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天平板培地（ＤＩＦＣＯ社製）上、３７℃で一晩培養して形質転換体のコロニーを形成させた。
実施例１５
＜リジン特異的変異ＦＯＤのスクリーニング＞
実施例１４で用意したライブラリーのコロニーを２枚の１００μｇ／ｍｌアンピシリンと１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬社製）を含有するＬＢ寒天平板培地にレプリカし、それぞれの培地上に５Ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ（旭化成社製）、０．０２％のオルトジアニシジン（和光純薬社製）、２．０ｍＭの糖化バリンまたは糖化リジン（ハシバらの方法（Ｈａｓｈｉｂａ，Ｈ．（１９７６）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２４，７０）により調製）を含有するＬＢ寒天（０．３％）培地を重層し、３７℃で８時間培養して糖化アミノ酸のＦＯＤによる酸化で発生する酸素ラジカルとジアニシジンによるコロニーの発色を観察した。これにより糖化リジンで暗紫色に発色し、糖化バリンで発色しないコロニーをスクリーニングし、該当するコロニーを１６４株得た。
実施例１６
＜変異ＦＯＤ候補株の細胞抽出液の調製＞
実施例１５で得た変異体コロニー１６４株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１ｍＭのＩＰＴＧを含有する３．７％のＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社製）液体培地１．５ｍｌで３０℃、１６時間培養し、そのうち１ｍｌを遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２００μｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１４，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
実施例１７
＜変異ＦＯＤの基質特異性検定＞
実施例１６で調製した細胞抽出液について、含有するＦＯＤ変異組換え体の糖化アミノ酸基質特異性を、前述のＦＯＤ酵素活性測定法によって測定した。その結果、候補株の中に糖化バリンへの活性が糖化リジンの活性の１０００分の１未満となっている変異体を２つ確認し、目的の変異体とした。
実施例１８
＜組み換えプラスミドの抽出＞
実施例１７で選ばれた変異体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。このプラスミドをｐｃｍＦＯＤ１及びｐｃｍＦＯＤ２と命名した。
実施例１９
＜変異ＦＯＤ遺伝子塩基配列の決定＞
実施例１８で得られた変異ＦＯＤ遺伝子についてジデオキシ法により塩基配列を決定した。その結果、２つの変異体は同じ構造を有し、配列表配列番号１の塩基配列１１１５のＡがＧに変換され、コードされる組換え変異ＦＯＤのアミノ酸配列が配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番のリジンがアルギニンに変換されていることを確認した。
実施例２０
＜各種変異体の基質特異性確認＞
実施例１９で確認されたアミノ酸変異箇所について、他のアミノ酸への置換の効果を観察するためにＫｕｎｋｅｌらの部位特異的変異法を行った。配列表配列番号７記載の塩基配列の１から２７までの配列を有するオリゴヌクレオチドの合成を外部に委託（ＢＥＸ社）し、さらにＭｕｔａｎ−Ｋキット（宝酒造社製）を使用して、添付されたマニュアルに従って部位特異変異を行った。取得した変異遺伝子は再び発現プラスミドｐＴＶ１１９Ｎに組み込み、大腸菌宿主に導入して５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１ｍＭのＩＰＴＧを含有する３．７％のＢＨＩ液体培地で３０℃、１６時間培養し、変異ＦＯＤ蛋白を生産させた。以上のようにして得られた複数の変異体について実施例１６、１７と同様の方法で基質特異性を測定したところ、アルギニン以外にトリプトファン、メチオニン、スレオニン、バリン、アラニン、セリン、システイン、グリシンに変換した変異体がアルギニンに変換した変異体と同様の糖化リジン特異的な基質特異性を有していることを確認した。この結果を表６に示す。
2002061119.tif 000017
なお表中の限界以下は測定限界以下、Ｎ．Ｄ．は測定データなしを示す。これにより、配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番目のリジンを変換することによりＦＯＤの糖化リジン反応性を糖化バリン反応性に対して相対的に低下させることができることが確かめられ、特にトリプトファン、メチオニン、バリンへの変異体が高い糖化リジン特異性と良好な酵素性状を有していることが判明した。このトリプトファンへの変異体をＦＯＤ−Ｗ、ＦＯＤ−Ｗを生産する発現プラスミドをｐｃｍＦＯＤ３、メチオニンへの変異体をＦＯＤ−Ｍ、ＦＯＤ−Ｍを生産する発現プラスミドをｐｃｍＦＯＤ４、バリンへの変異体をＦＯＤ−Ｖ、ＦＯＤ−Ｖを生産する発現プラスミドをｐｃｍＦＯＤ５と命名した。図７に各プラスミドの共通構造を示す。
実施例２１
＜被検液中のε−フルクトシル−Ｌ−リジン（ＺＦＬ）を消去した後、フルクトシル−Ｌ−バリン（ＦＶ）の測定＞
反応液１
５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１０Ｕ／ｍｌのＦＯＤ−Ｖ
５Ｕ／ｍｌのカタラーゼ
反応液２
５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１０Ｕ／ｍｌのＦＯＤ
２０Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼ
０．０５％のアジ化ナトリウム
０．０４％の４−アミノアンチピリン
０．０４％のＴＯＯＳ
被検液：０．３ｍＭのＺＦＬ溶液に終濃度が０、０．１、０．２、０．３ｍＭとなるようにＦＶを添加したもの。
０．５ｍｌの反応液１を３７℃、５分間、予備加温した後、０．０５ｍｌの上記被検液を添加して、３７℃、５分間反応させ、０．５ｍｌの反応液２を添加し、５分後に５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。ブランクには被検液の変わりに蒸留水を使用する。また対照として、反応液１のＦＯＤ−Ｖを添加していない反応液を用いて同様に操作した。
図８の白丸はＦＯＤ−Ｖ無添加を、白四角はＦＯＤ−Ｖを添加した場合の測定値をそれぞれ示す。
ＦＯＤ−ＶおよびＦＯＤを用いることにより図８から明らかなように、ＦＯＤ−Ｖにより、被検液中のＺＦＬを消去した後に、ＦＶを定量的に測定することができた。
なお、配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番目のリジンをトリプトファン、メチオニン及びバリンに変換した配列をそれぞれ配列表配列番号２、３及び４に示す。
実施例２２
＜糖化アルブミン割合の測定＞
Ｒ−１蛋白質分解試薬
５０ｍＭ      ＰＯＰＳＯ酸緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
２５００Ｕ／ｍｌ    プロテアーゼタイプＸＸＩＶ（シグマ社製）
１％            硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ハイドロキシ−１−プロパン（シグマ社製）
５Ｕ／ｍｌ          アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製）
５％                ＤＭＳＯ
５ｍＭ              ４−アミノアンチピリン
Ｒ−２糖化アミノ酸測定試薬
１５０ｍＭ      ＨＥＰＥＳ酸緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ７．５
５ｍＭ      ＴＯＤＢ
１０Ｕ／ｍｌ    ＰＯＤ
２０Ｕ／ｍｌ    Ｒ−ＦＯＤ−ＩＩ
３％      グルタミン酸
Ｒ−３アルブミン前処理試薬
１０ｍＭ        Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．０
０．３％        ラウリル硫酸ナトリウム
Ｒ−４アルブミン発色試薬
２００ｍＭ      コハク酸緩衝液（和光純薬社製）ｐＨ５．５
０．１５ｍＭ    ブロモクレゾールパープル（和光純薬社製）
０．３％        Ｔｘ−１００（和光純薬社製）
＜試料＞
１：健常者及び糖尿病患者血清各３５検体
２：キャリブレーターは管理血清Ｈ（ビー・エム・エル社製）を用いた。
キャリブレーターのグリコアルブミン濃度は臨床検体のＨＰＬＣ法測定値と酵素法の測定値が一致するようにあらかじめ設定した。アルブミン値はＣＲＭ４７０の値を移した。
＜反応手順＞
３７℃にインキュベートされたＲ−１；２４０μｌに試料８μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、正確に５分後にＲ−２；８０μｌを添加した。Ｒ−２添加前及び添加５分後の５５５ｎｍの吸光度変化を測定した。別途管理血清Ｈ、蒸留水を測定し検量線を作成し、検体中の糖化アルブミン濃度を算出した。
一方３７℃にインキュベートされたＲ−３；アルブミン前処理試薬；１６０μｌに試料２μｌを添加し、３７℃で反応を開始し、正確に５分後にＲ−４；アルブミン発色試薬；１６０μｌを添加した。アルブミン発色試薬添加前及び添加５分後の６００ｎｍの吸光度を測定した。また試料の代わりに蒸留水及びアルブミン濃度が既知である試料から検量線を作成しアルブミン測定値を求めた。
酵素法によるＧＡ％はＧＡ％＝ＧＡ濃度／アルブミン濃度×１００より求めた。またＨＰＬＣ法測定値はハイオートジー・エイ・エイ２０００（アークレイ社製）を用いて測定した。結果を図９に示す。
図９から分かるように酵素法とＨＰＬＣ法はｒ＝０．９９８と非常に良い相関を示した。また本試薬全てを液状で３７℃−２週間保存しても性能に変化はなかった。この事から１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避、２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化、３）正確にアルブミンを測定、４）糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことにより正確に糖化アルブミンを測定していること及び糖化アルブミン割合を測定していることが明らかであった。
＜実施例２３＞
＜第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬にプロテアーゼを含有する組成物＞
Ｒ−１
２００ｍＭ      ＰＯＰＳＯ  緩衝液  ｐＨ７．５
５０ｍＭ      ４−アミノアンチピリン
１０Ｕ／ｍｌ    ＰＯＤ
２０Ｕ／ｍｌ    Ｒ−ＦＯＤ
５Ｕ／ｍｌ    アスコルビン酸オキシダーゼ
３％          グルタミン酸
Ｒ−２
２０ｍＭ      ピベラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）緩衝液  ｐＨ６．５
２０％        ＤＭＳＯ
８０００Ｕ／ｍｌ    プロテアーゼタイプＸＸＩＶ
４％          硫酸−３−［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２ハイドロキシ−１−プロパン
５ｍＭ        ＴＯＤＢ
Ｒ−３，４    実施例２２に同じ
＜試料＞実施例２２に同じ試料及び１０−２００μＭのＦＺＬ
＜反応手順＞実施例２２に同じ
結果を図２３に示す。
図２３から分かるように第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬にプロテアーゼを処方した場合にも反応時間１０分という短い時間で良好に糖化蛋白質が測定できており、また試料中に糖化アミノ酸が存在した場合にも、Ｒ−１に処方されている少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素により糖化アミノ酸が消去されてより正確に糖化蛋白質が測定できることが明白である。
また本試薬とＨＰＬＣ法との相関は、
酵素法ＧＡ％＝１．０３＊ＨＰＬＣ法ＧＡ％−０．３  Ｒ＝０．９９と良好な相関を示し、正確に糖化蛋白質が測定されていることも明らかであった。さらに本試薬は液状で３７℃−３週間若しくは冷蔵１５ケ月保存しても性能の低下はなかった。
［産業上の利用の可能性］
本発明により、より正確に被検体中の糖化蛋白質及び糖化アルブミン割合を測定することが可能になった。したがって、臨床検査薬として有用に利用することができる。
［寄託生物材料への言及］
（１）イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの機関に寄託について付した日付（原寄託日）
平成１３年１月１６日
ハ  イの機関に寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４７
（２）イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの機関に寄託について付した日付（原寄託日）
平成１３年１月１６日
ハ  イの機関に寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４８
【配列表】
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2002061119.tif 000019
2002061119.tif 000020
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2002061119.tif 000029
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2002061119.tif 000032
【図面の簡単な説明】
［図１］
本発明の実施例４に基づくＨＳＡ基質溶液（４ｇ／ｄｌ）、γグロブリン及びグロブリンＩＶ基質溶液の測定曲線及び再現性を示すグラフである。
［図２］
本発明の実施例５に基づくＨｂ基質溶液（４ｇ／ｄｌ）、γグロブリン及びグロブリンＩＶ基質溶液の測定曲線及び再現性を示すグラフである。
［図３］
本発明の実施例６に基づく糖化アルブミンの測定曲線を示すグラフである。
［図４］
本発明の実施例９に基づく糖化蛋白質測定用組成物中のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化に及ぼす緩衝剤種類の効果を示すグラフである。
［図５］
本発明の実施例１１に基づくプロテアーゼの安定化に及ぼす安定化剤種類の効果を示すグラフである。
［図６］
本発明の実施例１２に基づく少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化に及ぼす安定化剤種類の効果を示すグラフである。
［図７］
本発明の実施例２０のプラスミドｐｃｍＦＯＤ１からｐｃｍＦＯＤ５までの共通構造を示す。
［図８］
本発明の実施例２１の本変異フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより混入糖化リジンを消去した糖化バリン濃度測定反応液と非消去反応液における５５５ｎｍの吸光度の測定結果を示すグラフである。
［図９］
本発明の実施例２２に基づくグリコアルブミン割合測定結果の酵素法とＨＰＬＣ法の相関を示すグラフである。
［図１０］
本発明の実施例２３に基づく糖化蛋白質測定試薬の反応曲線である。
【図１】
2002061119.tif 000033
【図２】
2002061119.tif 000034
【図３】
2002061119.tif 000035
【図４】
2002061119.tif 000036
【図５】
2002061119.tif 000037
【図６】
2002061119.tif 000038
【図７】
2002061119.tif 000039
【図８】
2002061119.tif 000040
【図９】
2002061119.tif 000041
【図１０】
2002061119.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成14年6月21日(2002.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する組成物であって、ジメチルスルホオキシド、アルコール、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を含有することを特徴とする糖化蛋白質を測定するための組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２５】
プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、アルコール、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加する請求の範囲第１９〜２３項のいずれかに記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２６】
プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する方法に於いて、プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、アルコール、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加することを特徴とする、糖化蛋白質を測定する方法。
【国際調査報告】
2002061119.tif 000043
2002061119.tif 000044
2002061119.tif 000045
2002061119.tif 000046
2002061119.tif 000047
2002061119.tif 000048