(57)【要約】正常型プリオンと異常型プリオンとを識別することを可能とするモノクローナル抗体及びその製造方法が開示されている。本発明の抗異常型プリオンモノクローナル抗体は、異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない。本発明の抗異常型プリオンモノクローナル抗体は、異常型プリオンの一次アミノ酸配列のうち不連続な複数の領域同士を連結して成る領域を含むペプチドを有する免疫原を用いることにより得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオンモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２】
免疫組織染色において異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは反応しない請求項１記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項３】
前処理していない異常型プリオンと反応する請求項１又は２記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項４】
担体に配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを結合したものを免疫原として免疫した動物に由来する請求項１ないし３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項５】
ハイブリドーマＥＢＥＢ４Ｃ３Ｅｂｂ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０８）により産生されるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項６】
モノクローナル抗体である請求項１ないし５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項７】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と異常型プリオンとの抗原抗体反応を利用した免疫測定により異常型プリオンを測定する方法。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、請求項８記載の方法を行うための免疫測定用キット。
【請求項１０】
異常型プリオンの一次アミノ酸配列のうち不連続な複数の領域同士を連結して成る領域から本質的に成るペプチドを有する免疫原を動物に免疫し、免疫した動物の抗体産生細胞由来のハイブリドーマを作製し、異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、スクリーニングにより選択されたハイブリドーマから前記抗異常型プリオンモノクローナル抗体を回収することを含む請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗異常型プリオンモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１１】
前記免疫原は、前記ペプチドを担体に結合したものである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫原は、複数種類の前記ペプチドを担体に結合したものである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドは、Ｅ１領域、Ｅ２領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域及びＢ３領域から成る群より選ばれる２以上の領域を連結して成る領域を含む請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドは、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫原は、担体に、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチドとを結合したものである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１０ないし１５のいずれかの方法により製造された抗異常型プリオンモノクローナル抗体。
【請求項１７】
請求項１０ないし１５のいずれかの方法に用いられる免疫原。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗異常型プリオンモノクローナル抗体及びその製造方法並びにそれを用いた異常型プリオンの免疫測定方法に関する。
背景技術
クロイツフェルト・ヤコブ病（以下、ＣＪＤと略）、ヒツジにおけるスクレーピー病、伝染性ミンク脳症をはじめとする脳神経系疾患は、長期間の潜伏期間を経た後に発症し、ほぼ神経系に限局した脳組織の海綿状変性およびアミロイド斑（クールー斑）を主徴とする疾患であり、進行性に増悪して死に至る。発症原因は未だ不明な点も多いものの、ウイルスなどの感染性病原体の関与ではなく、異常型プリオン蛋白質の沈着に起因するとの考え、いわゆる「プリオン仮説」が主流である。この疾患は脳薄切標本の病理学的手法により診断されている。
この疾患の起因源は感染性を有するとされ、脳神経組織の摂食（クールー病など）、電極あるいは脳硬膜移植などの医療行為による感染も報告されている。最近では、ウシ海綿状脳症ならびに新型ＣＪＤが経口感染により伝播すると考えられている。
正常型プリオン蛋白質は細胞膜に存在する糖蛋白質であり、真核細胞である酵母をはじめとして広く存在している。また、正常型プリオン蛋白質をコードする遺伝子は単一遺伝子であり、コードされるアミノ酸配列は哺乳類の間では非常によく保存されており、特にヒト、ヒツジ、ウシの間の相同性は約９０％以上と報告されている。
正常型プリオン蛋白質の機能については未だ不明といわざるを得ないが、アミノ酸配列が保存されていることから神経組織の発生分化および機能に重要な役割を担っているであろうと推測される。また、最近のプリオン蛋白質遺伝子ノックアウトマウスでの検討からは、加齢に伴う下半身の振戦などの歩行異常、病理学的には小脳の萎縮、特に小脳プルキンエ細胞の脱落などが観察されている。
ヒトにおいてはプリオン蛋白質のアミノ酸配列（一次構造）の一部で個人ごとの違いはあると報告されているものの、ＣＪＤを発症する患者と健常者の間ではプリオン蛋白質のアミノ酸配列に差異は認められない。このため、異常型プリオン蛋白質の沈着は、アミノ酸配列ではなく立体構造の異なることに起因すると考えられている。このため、従来の手技により作製された抗体のうち、アミノ酸の一次配列を認識する抗体では両者を区別することはできない。また、アミノ酸配列が動物間で非常によく保存されているために抗原性の弱いことも推測される。このため、立体構造を維持したままの免疫原であるとともに、抗原性を高めた抗原の作製が望まれる。
発明の開示
本発明の目的は、正常型プリオンと異常型プリオンとを識別することを可能とするモノクローナル抗体及びその製造方法を提供することである。また、本発明の目的は、該モノクローナル抗体を用いて異常型プリオンを免疫測定する方法を提供することである。
正常型プリオンと異常型プリオンとを識別することを可能とするモノクローナル抗体を作製しようとするのであれば、異常型プリオンを免疫原として用いて動物を免疫し、常法によりモノクローナル抗体を得、異常型プリオンと反応するが正常型プリオンとは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることが考えられる。しかしながら、プリオンタンパクは異常型と正常型でアミノ酸配列に差がないばかりではなく、種特異性も少ないので一般的に抗体ができづらいタンパク質であり、その上異常型と正常型の差を認識するような抗体は更にできづらい。また、異常型プリオンを免疫原として用いるのに十分な量を確保することが困難なタンパク質である。異常型プリオンを有する疾患の頻度が低い上に、病原体として強力なので取り扱いにも細心の注意が必要であり、取り扱える施設にも限りがある。そのようなものを大量に確保することはかなり困難である。更に、免疫原とするためにはある程度精製する必要があるが、精製する段階でこのタンパク質は不溶化してしまい免疫原には適さなくなる。免疫原として用いるためには変性剤等を用いて可溶化するが、このときに異常型に固有な立体構造が保持されているか問題になる。これらの理由により、異常型プリオンを免疫原として用いることにより、正常型プリオンと異常型プリオンとを識別することを可能とするモノクローナル抗体を作製することは困難である。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、異常型プリオンの立体構造において、外部に露出していると考えられる領域を推定し、これらの領域のうちの複数のものを連結したペプチドを含む免疫原を用いることにより、正常型プリオンと異常型プリオンとを識別することを可能とするモノクローナル抗体を作製することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオンモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。また、本発明は、上記本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と異常型プリオンとの抗原抗体反応を利用した免疫測定により異常型プリオンを測定する方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、上記本発明の免疫測定方法を行うための免疫測定用キットを提供する。さらに、本発明は、異常型プリオンの一次アミノ酸配列のうち不連続な複数の領域同士を連結して成る領域を含むペプチドを有する免疫原を動物に免疫し、免疫した動物の抗体産生細胞由来のハイブリドーマを作製し、異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、スクリーニングにより選択されたハイブリドーマから前記抗異常型プリオンモノクローナル抗体を回収することを含む、上記本発明の抗異常型プリオンモノクローナル抗体の製造方法を提供する。さらに、本発明は、該製造方法に用いられる免疫原を提供する。
本発明により、異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオンモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が初めて提供され、本発明により、異常型プリオンの免疫測定が初めて可能になった。従って、本発明は、ウシ海綿状脳症に感染しているウシや他の動物の診断及びＣＪＤの診断に大いに貢献するものと考えられる。
発明を実施するための最良の形態
本発明のモノクローナル抗体は、異常型プリオンと抗原抗体反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオンモノクローナル抗体である。ここで、「実質的に反応しない」とは、正常型プリオンに対する反応性が、異常型プリオンに対する反応性よりも識別可能な程度に低いことを意味する。従って、正常型プリオンに対して交差反応性を有する場合であっても、その免疫学的反応性が、異常型プリオンに対する免疫学的反応性よりも識別可能な程度に低い場合には、本明細書で言う「正常型プリオンとは実質的に反応しない」場合に含まれ、本発明の範囲に含まれる。言うまでもなく、正常型プリオンと交差反応性を有さないモノクローナル抗体、すなわち、異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは反応しないモノクローナル抗体が好ましい。
本発明のモノクローナル抗体は、免疫組織染色において異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは反応しないものが好ましい。また、プリオンの免疫組織染色は、従来、いわゆる「酸オートクレーブ処理」（１．０〜１００ｍＭ  ＨＣｌ溶液に浸漬した組織を１２１℃、２０分間でオートクレーブ処理する）を行った後に行っていたが、本発明のモノクローナル抗体は、この酸オートクレーブ処理のような前処理を行わない組織に存在する異常型プリオンと反応するものであることが好ましい。このような抗異常型プリオンモノクローナル抗体の具体例として、下記実施例において作製した、ハイブリドーマＥＢＥＢ４Ｃ３Ｅｂｂにより産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。なお、ハイブリドーマＥＢＥＢ４Ｃ３Ｅｂｂは、２０００年９月１日に、〒３０５−８５９６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧工業技術院生命工学工業技術研究所）にＦＥＲＭ  Ｐ−１８０１３の受託番号で寄託され（原寄託）、２００１年１１月２１日に原寄託よりブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、該国際寄託の受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０８である。
本発明は、また、上記本発明のモノクローナル抗体の抗原結合性断片をも提供する。ここで、「抗原結合性断片」とは、抗体のＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、当該抗体の抗原結合性を発揮する断片を意味する。これらの断片は、常法に基づき、本発明のモノクローナル抗体をパパインやペプシン等のタンパク質分解酵素で分解することにより容易に得ることができる。このような抗原結合性断片も、後述する免疫測定に本発明のモノクローナル抗体と同様に用いることができる。
上記の通り、異常型プリオンを免疫原として用いて、異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオンモノクローナル抗体を作製することは困難である。この問題を解決するために、本願発明者らは、先ず、異常型プリオンの立体構造を独自に推測した。図１に、正常型プリオンの立体構造（ＰｒＰＣモデル）、Ｋｏｒｔｈらにより推測された異常型プリオンの立体構造（（ＰｒＰＳＣモデル１）Ｃ．Ｋｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：７４−７７，１９９７）、及び本願発明者らが推測した異常型プリオンの立体構造（（ＰｒＰＳＣモデル２）を図１に示す。本願発明者らが推測した異常型プリオンの立体構造は、これまでにＫｏｒｔｈらによって推測されていた立体構造よりもβシート構造が多くなっている。この推測の根拠は、ＣＤスペクトルとＦＴ−ＩＲの結果から、ＰｒＰＣ−＞ＰｒＰＳｃの過程でαヘリックスは４０％から３０％へ減少し、β構造はごくわずかから４５％まで増大するといわれている。ＮＭＲによる立体構造（１２３−２３１）から計算すると、非常にフレキシブルで構造を決定できないＮ−末端の繰り返し配列部分をのぞいて、ＰｒＰＣの二次構造はαヘリックス２５％、β構造３．４％になる（全長２３１残基として）。計算できないＮ−末端部分のαヘリックス含量に対する寄与が１５％程度あるとして、ＫｏｒｔｈらのモデルでＰｒＰＳｃの計算をすると、αヘリックス３６％、β構造７％になる。したがって、Ｋｏｒｔｈらのモデルでは、ＣＤスペクトルとＦＴ−ＩＲの結果を一部しか説明できない。そこで、さらにαヘリックスが減少しβ構造が増加するような構造変化について考えてみた。ＳＳＴによる二次構造予測で二次構造の含量を計算すると、αヘリックス５．６％、β構造１８％となった。二次構造予測の精度は別として、Ｐｒｉｏｎタンパクはもともとαヘリックスよりもβ構造をとりやすいタンパクであるといえる。さらに詳しく見て行くと、ＰｒＰＣのαヘリックス２に当たる部分はほぼ半分がβ構造の判定で、その他はＣ（ｒａｎｄｏｍ  ｃｏｉｌ）構造であり、αヘリックス３でも後半にαヘリックス判定の残基があるほかはβ構造またはＣ構造である。そこで、αヘリックス２の前半とαヘリックス３の後半がβ構造に変化したモデルを作ってみた（モデル２）。
このモデルではＫｏｒｔｈらのモデルと違い、１５Ｂ３のｅｐｉｔｏｐｅを形成するＥ１、Ｅ２、Ｅ３の部分すべてが構造変化を起こしていることになるが、分子模型では３つの部分がすべてβヘアピン構造となって集まるようにすることができるので矛盾は起こらない。またこのモデルの二次構造含量は、αヘリックス２７％、β構造１７％になり、ＣＤスペクトルとＦＴ−ＩＲの結果と完全に一致するものではないがＫｏｒｔｈらのモデルよりも近い値を示した。
本願発明者らは、この独自に推測した異常型プリオンの立体構造において、外部に向かって露出している領域、すなわち、Ｂ１領域（プリオンの一次アミノ酸配列の第１２８番目のアミノ酸から第１３１番目のアミノ酸、以下「１２８−１３１ａ．ａ．」のように記載）、Ｂ２領域（１３８−１４１ａ．ａ．）及びＢ３領域（１４９−１５２ａ．ａ．）並びにＥ１領域（１４１−１４９ａ．ａ．）及びＥ２領域（１６４−１７０ａ．ａ．）及びＥ３領域のうちの２以上の領域を連結したペプチドを免疫原として用いることにより異常型プリオンに特異的に反応するモノクローナル抗体が得られるのではないかと考え、実験の結果、下記実施例に具体的に記載するように、Ｅ１領域とＢ２、Ｂ３領域の連結ペプチド（配列番号１）と、Ｅ２領域を含むペプチド（配列番号２）とをそれぞれ同一のＫＬＨに結合したものを免疫原として用いて、上記ハイブリドーマＥＢＥＢ４Ｃ３Ｅｂｂにより産生されるモノクローナル抗体を得た。なお、上記各領域は、直接連結してもよいし、１個ないし数個の他のアミノ酸を介在させて間接的に連結してもよい。従って、「連結されている」という語は、上記領域が直接連結されている場合及び１個ないし数個のアミノ酸残基を介して間接的に連結されている場合の両者を包含する。また、上記各領域は、１個ないし数個のアミノ酸が欠失又は付加されていてもよい。これらの領域から本質的に成るペプチドは、市販の自動ペプチド合成機を用いて容易に調製することができる。このように、タンパク質の一次アミノ酸配列における不連続な領域を連結したものを免疫原として用いるという思想は、本願発明者らの独創によるものである。なお、上記各領域のアミノ酸配列は次の通りである。
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上記ペプチドは、そのまま免疫原として用いることも可能ではあるが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）や、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような担体分子に上記ペプチドを結合したものを免疫原として用いると抗原性が高まるので好ましい。また、１つの担体分子に複数種類の上記ペプチドを結合したものを免疫原として用いることも好ましい。
上記した免疫原を用いること以外は、常法により本発明のモノクローナル抗体を作製することができる。すなわち、上記免疫原を動物に免疫し、免疫した動物の抗体産生細胞由来のハイブリドーマを作製し、異常型プリオンと反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、スクリーニングにより選択されたハイブリドーマから前記抗異常型プリオンモノクローナル抗体を回収することにより行うことができる。脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞と、ミエローマ細胞のような不死化細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法はこの分野において周知である。
本発明のモノクローナル抗体と異常型プリオンとの抗原抗体反応を利用した免疫測定により異常型プリオンを測定することができる。なお、ここで、「測定」には検出及び定量測定の両者が包含される。免疫測定方法自体はこの分野において周知であり、周知のいずれの方法も本発明の範囲に含まれる。すなわち、反応形式に基づき分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法等があり、標識に基づき分類すると、酵素免疫分析、放射免疫分析、蛍光免疫分析等があるがこれらのいずれもが本発明で言う「免疫測定」に包含される。さらに、免疫組織染色や、ウェスタンブロット等も本発明で言う「免疫測定」に包含される。
なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を第１抗体として固相に不動化し、検体と反応させ、洗浄後、異常型プリオンと抗原抗体反応する第２抗体（正常型プリオンとも抗原抗体反応する抗体でもよいし、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい）を反応させ、洗浄後、固相に結合した第２抗体を測定する。第２抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ビオチン等で標識しておくことにより固相に結合した第２抗体を測定することができる。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の異常型プリオン量の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の異常型プリオンを定量することができる。なお、第１抗体と第２抗体を上記の説明と入れ替えてもよい。また、凝集法では、ラテックス等の粒子に本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を不動化し、検体と反応させて吸光度を測定する。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の異常型プリオン量の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の異常型プリオンを定量することができる。
また、各免疫測定に必要な試薬類も周知であり、モノクローナル抗体に特徴があること以外は、通常の免疫測定キットを用いて免疫測定を行うことができる。例えば、通常、緩衝液、固相、標識第２抗体等が含まれる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（１）免疫原の作製
Ｋｏｒｔｈらは、ウシプリオン蛋白質を遺伝子組換え手法で発現させたリコンビナント抗原を免疫原として抗体認識部位（エピトープ）を解析し、プリオン蛋白質の主要抗原部位は上記Ｅ１領域、Ｅ２領域及びＥ３領域の３ヶ所と報告している（Ｋｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）。この結果を基に、正常型プリオン蛋白質の立体構造を推測すると、Ｅ２とＥ３は近接するもののＥ１とは距離があると考えられる。これに対し、上記のようにβシート構造を取った場合を推測すると、Ｅ１がループ構造をとることにより新たに出現する二本のβ鎖（Ｂ２，Ｂ３）を形成するとともに、新たなエピトープを形成すると思われる。このため、Ｅ１領域とＢ２、Ｂ３領域を連結したＥ１Ｂ１ペプチド（配列番号１）と、Ｅ２領域を含むＥ２−１ペプチド（配列番号２）とを常法により化学合成し、これらを常法によりＫＬＨに結合した結合体（上記ペプチドの両方が単一のＫＬＨ分子に結合されている）を免疫原として用いた。
（２）免疫および細胞融合
濃度０．５−１．０ｍｇ／ｍＬの免疫原を等量のフロイント完全アジュバントに懸濁し、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに０．２−０．３ｍＬ／ｍｏｕｓｅずつ、２ないし３回免疫した。最終免疫後３ないし４日後に脾臓を摘出し、細胞を分散させた後に、ポリエチレングリコール法によりＰ３Ｕ１ミエローマ細胞との細胞融合を行った。
ＨＡＴ培地中での培養によりハイブリドーマを選択した後、抗体産生細胞のスクリーニングは、上記各合成ペプタイドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）に結合させた抗原を使用してＥＬＩＳＡ法で行った。すなわち、細胞培養上清を採取し、ＢＳＡ結合体を固定したＥＬＩＳＡプレート（９６ｗｅｌｌ−ｔｙｐｅ）に分注して反応させた後に洗浄、さらに西洋わさびペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇ（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）を反応させ、発色反応で抗体産生細胞の有無を確認した。表１にＥＬＩＳＡによる陽性数を示す。
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（３）異常型プリオン特異反応性モノクローナル抗体のスクリーニング
抗体の特異性を確認する目的で、ＧＳＳ（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ  Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ症候群）患者脳より脳薄切切片を作製し、免疫組織学的検索で反応性を検討した。標本は前処理として酸オートクレーブ処理を行ったものと行わなかったものを用い、異常型プリオン蛋白質に特異的に反応する抗体クローンを選別した。また、対照としては、正常ヒト脳薄切切片を酸オートクレーブ処理したものおよびしなかったものを用い、反応の認められないことを確認した。この免疫組織染色の操作を具体的かつ詳細に述べると次の通りである。
１．  組織片をキシレンにて脱パラフィン化した後、アルコール濃度を段階的に下げ水和した。
２．  蒸留水にて５分間洗浄した。
３．  ０．３％過酸化水素・メタノール溶液に浸し３０分間反応させ、内因性ペルオキシダーゼの除去を行った。
４．  生理的燐酸緩衝液で５分間洗浄した。
５．  酸オートクレーブ処理するものは１０〜１０００ｍＭ塩酸液に浸漬し、１２１℃，２０分間オートクレーブ処理を行った。
６．  生理的燐酸緩衝液にて５％に希釈した家兎血清を室温で３０分間反応させた。
７．  余分な血清を取り除きハイブリドーマ培養液を室温で１時間反応させた。
８．  生理的燐酸緩衝液で５分間洗浄した。
９．  希釈したビオチン化抗マウスイムノグロブリン家兎抗体を室温で１時間反応させた。
１０．  生理的燐酸緩衝液で５分間洗浄した。
１１．  希釈したＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を室温で３０分間反応させた。
１２．  生理的燐酸緩衝液で５分間洗浄した。
１３．  ペルオキシダーゼ基質溶液を室温で５〜３０分反応させた。
１４．  蒸留水で洗浄した。
１５．  リリーマイヤー・ヘマトキシリンにて対比染色を行った後、洗浄・封入を行った。
上記操作にて選択された細胞株を表２に示した。
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（４）結果
以上の結果、異常型プリオンとは反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応せず、これらの識別を可能とするモノクローナル抗体が得られた。このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＥＢＥＢ４Ｃ３Ｅｂｂは、上記の通り独立行政法人産業技術総合研究所に寄託し、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０８である。
産業上の利用可能性
本発明のモノクローナル抗体は、異常型プリオンと抗原抗体反応するが、正常型プリオンとは実質的に反応しない抗異常型プリオンとは抗原抗体反応しないので、本発明により、異常型プリオンの免疫測定が初めて可能になった。従って、本発明は、ウシ海綿状脳症に感染しているウシや他の動物の診断及びＣＪＤの診断に大いに貢献するものと考えられる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、正常型プリオンの立体構造、Ｋｏｒｔｈらの報告に記載された異常型プリオンの立体構造及び本願発明者らが推測した異常型プリオンの立体構造を模式的に示す図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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