(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料観察用の第１光ビームと、
前記試料の部分領域に所定の反応を促す第２光ビームと、
前記両光ビームの各々を異なる光路に配置する光照射系と、
前記第１光ビームと前記第２光ビームとを同一光路に配置して前記試料上を２次元的に走査する走査手段と、
前記第１光ビームの照射によって前記試料から発する光を検出する検出手段と、
前記検出手段の出力と前記走査手段から得られる走査位置情報に基づいて前記試料の画像を得る画像取得手段とを備えた光走査型顕微鏡において、
前記光照射系と前記走査手段との間の前記第２光ビームの光路中に配置され、前記第２光ビームが前記試料へ向かうのを阻止する第１の状態と、前記第２光ビームが前記試料へ向かうのを許す第２の状態とを切換える音響光学変調器、電気光学変調器又は磁気光学変調器と、
前記画像取得手段で得られた画像を表示するモニタに表示された画像の少なくとも一部の領域をトレースし、その軌跡で囲まれた領域を前記一部の領域として指定する領域指定手段と、
前記モニタに表示された画像を構成する画素単位で定義されたアドレスに、前記音響光学変調器、電気光学変調器又は磁気光学変調器のいずれかを駆動するコントロールデータが書き込まれているメモリ部と、
前記領域指定手段で指定された領域に対応する前記アドレスに基いて前記音響光学変調器、電気光学変調器又は磁気光学変調器のいずれかを前記第２光ビームが前記試料へ向かうのを阻止する第１の状態又は前記第２光ビームが前記試料へ向かうのを許す第２の状態へ駆動するように制御する制御回路と
を備えることを特徴とする光走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記第２光ビームは、前記第１光ビームとは異なる波長であることを特徴とする請求項１記載の光走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記第２光ビームは、前記試料の部分領域に注入された試薬を開裂させる紫外線領域の光ビームであることを特徴とする請求項１又は２記載の光走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記モニタに表示される画像は蛍光画像であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の光走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は光走査型顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光走査型顕微鏡は、試料観察用の第１光ビームと、試料の部分領域に所定の反応を促す第２光ビームとを発し、各々を異なる光路に配置する光照射系と、第１光ビームと第２光ビームとを同一光路に配置して試料上を２次元的に走査する走査手段と、第１光ビームの照射によって試料から発する光を検出する検出手段と、この検出手段の出力と走査手段から得られる走査位置情報とに基づいて前記試料の画像を得る画像取得手段とを備えている。
【０００３】
この光走査型顕微鏡は生体細胞に光を照射し、そのときに生体細胞に起きる現象を観察する顕微鏡として使用される。
【０００４】
この光走査型顕微鏡、例えばレーザ走査型顕微鏡を使用して、ケイジドコンパウンド試薬を組み合わせた生体細胞の蛍光観察を行うとき、レーザの波長によって照射範囲を変える。
【０００５】
すなわち、生体細胞内の特定部位に特定量だけ入れたケイジドコンパウンド試薬を開裂させるため、生体細胞内の特定部位にＵＶ波長のレーザ光を照射し、細胞内に予め注入されている蛍光試薬とＵＶ波長のレーザ光の照射によって開裂したケイジドコンパウンド試薬とが選択的に結合して発した蛍光を観察するため、可視波長のレーザ光を観察対象の生体細胞全体に照射する。
【０００６】
波長により照射範囲を変える方法としては、従来次の方法が行われている。
▲１▼照射する波長毎に波長に応じた光路をそれぞれ設定し、スキャナを介さずに任意の範囲を照射する。
▲２▼光路毎にスキャナを用意し、各光路を通ったレーザ光の照射範囲を独立に照射する。
▲３▼照射する波長毎に順番に走査を行って照射範囲を変える。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、▲１▼の方法では、試料の厚さが非常に薄いため、開裂光と観察光とを同一焦点にする操作（ピント合わせ）が非常に難しい、▲２▼の方法では、複数のスキャナ等を必要とするシステム構成が複雑なものとなって、コストがかかり、システム自体が大きい、光学アライメントをし難くくなってしまい、▲３▼の方法では、ＵＶ光と可視光とを生体細胞の異なる範囲に同時に照射することができないため、蛍光試薬と開裂したケイジドコンパウンド試薬とが結合した時の現象をリアルタイムに観察できないという問題があった。
【０００８】
この発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、その課題は煩雑な操作を必要とせず、簡単な構成で複数の波長の光ビームを所定の範囲に同時に照射させることができる光走査型顕微鏡を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため請求項１に記載の発明の光走査型顕微鏡は、試料観察用の第１光ビームと、前記試料の部分領域に所定の反応を促す第２光ビームと、前記両光ビームの各々を異なる光路に配置する光照射系と、前記第１光ビームと前記第２光ビームとを同一光路に配置して前記試料上を２次元的に走査する走査手段と、前記第１光ビームの照射によって前記試料から発する光を検出する検出手段と、前記検出手段の出力と前記走査手段から得られる走査位置情報に基づいて前記試料の画像を得る画像取得手段とを備えた光走査型顕微鏡において、前記光照射系と前記走査手段との間の前記第２光ビームの光路中に配置され、前記第２光ビームが前記試料へ向かうのを阻止する第１の状態と、前記第２光ビームが前記試料へ向かうのを許す第２の状態とを切換える音響光学変調器、電気光学変調器又は磁気光学変調器と、前記画像取得手段で得られた画像を表示するモニタに表示された画像の少なくとも一部の領域をトレースし、その軌跡で囲まれた領域を前記一部の領域として指定する領域指定手段と、前記モニタに表示された画像を構成する画素単位で定義されたアドレスに、前記音響光学変調器、電気光学変調器又は磁気光学変調器のいずれかを駆動するコントロールデータが書き込まれているメモリ部と、前記領域指定手段で指定された領域に対応する前記アドレスに基いて前記音響光学変調器、電気光学変調器又は磁気光学変調器のいずれかを前記第２光ビームが前記試料へ向かうのを阻止する第１の状態又は前記第２光ビームが前記試料へ向かうのを許す第２の状態へ駆動するように制御する制御回路とを備えることを特徴とする。
【００１０】
制御回路が走査位置情報に基づき、走査手段による走査範囲内の所定の部分領域で光ビーム切換手段を第２の状態にするので、第１光ビームと第２光ビームとを１組の走査手段で走査しながら、第１光ビームを走査領域の全範囲に照射し、第2光ビームを走査領域の一部分である反応させたい範囲内にだけ照射することができる。また、制御回路が走査位置情報に基づき走査範囲の少なくとも一部の領域を第２光ビームを照射する領域とするので、走査範囲の一部の領域以外の試料への余計な光の照射が遮断される。更に、制御回路が走査位置情報に対応するメモリ部のデータに基づいて光ビーム切換手段を第２の状態にするので、領域指定手段で指定された領域以外の試料への余計な第２光ビームの照射が遮断される。
【００１１】
請求項３に記載の発明の光走査型顕微鏡は、請求項１又は２記載の光走査型顕微鏡において、前記第２光ビームは、前記試料の部分領域に注入された試薬を開裂させる紫外線領域の光ビームであることを特徴とする。
請求項４に記載の発明の光走査型顕微鏡は、請求項１〜３のいずれか１項記載の光走査型顕微鏡において、前記モニタに表示される画像は蛍光画像であることを特徴とする。
【００１２】
第１光ビームを照射した状態において、試薬に第２光ビームが照射されると試薬は開裂されるので、第２光ビームの照射に応じた観察を行うことができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００１８】
図１はこの発明の第１実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡のブロック構成図である。
【００１９】
レーザ走査型顕微鏡１は、光照射系１０と、走査装置（走査手段）２０と、スキャナ制御回路３０と、切換制御回路４０と、蛍光検出器（検出手段）５０と、画像処理回路（画像取得手段）６０と、高速シャッタ７０と、全反射ミラー２と、ダイクロイックミラー３，４と、バリアフィルタ５とを備える。
【００２０】
光照射系１０は、試料観察用の励起光（第１光ビーム）Ｌ１を発する励起用可視レーザ光源１１、開裂光（第２光ビーム）Ｌ２を発するＵＶレーザ光源１２とからなる。なお、光照射系１０は、マルチラインのレーザ光源を用い、ダイクロイックミラーを用いて光路を分離するようにしてもよい。
【００２１】
走査装置２０はステージ８０に載置された試料８１上で混合レーザ光Ｌ１２を２次元的に走査させる水平スキャナ２１と垂直スキャナ２２とからなる。
【００２２】
スキャナ制御回路３０は、ＣＰＵ９０の画像取得開始指令９０ａに基づいて水平スキャナ２１及び垂直スキャナ２２の駆動を制御する。
【００２３】
蛍光検出器５０は、試料８１の蛍光を検出し、入力した蛍光を光強度を表す信号５０ａに変換する。
【００２４】
画像処理回路６０は蛍光検出器５０の信号５０ａとスキャナ制御回路３０から出力される走査位置情報３０ａ（水平同期信号ＨＤ、垂直同期信号ＶＤ、ピクセルクロックＰＣ）とに基づいて試料８１の画像化を図る。この画像処理回路６０は、Ａ／Ｄ変換素子、フレームメモリ、Ｄ／Ａ変換素子等の画像化するための回路及びＣＰＵからの操作で画像にラインを重ね書きするためのオーバーレイメモリ回路からなる。
【００２５】
高速シャッタ７０は、光照射系１０と走査装置２０との間の開裂光Ｌ２の光路中（ここではＵＶレーザ光源１２と全反射ミラー２との間）に配置され、開裂光Ｌ２が試料８１へ向かうのを阻止する第１の状態と開裂光Ｌ２が試料８１へ向かうのを許す第２の状態とに切り換わる。高速シャッタ７０としては、例えばＡＯＤ（音響光学変調器）、ＥＯＤ（電気光学変調器）ＭＯＤ（磁気光学変調器）がある。
【００２６】
切換制御回路４０は、スキャナ制御回路３０から得られる走査位置情報３０ａに基づいて高速シャッタ７０の第１の状態と第２の状態とを切り換える。
【００２７】
ダイクロイックミラー３は、ＵＶレーザ光源１２から射出された開裂光Ｌ２を反射し、励起用可視レーザ光源１１から射出された励起光Ｌ１を透過する。
【００２８】
バリアフィルタ５は、ダイクロイックミラー４で反射されずにダイクロイックミラー４を透過した励起光Ｌ１及びＬ２をカットする。
【００２９】
上記構成におけるレーザ光の光路を説明する。なお、試料８１としては生体細胞が用いられ、細胞内には予め蛍光試薬が注入されている。また、この細胞内の特定部位にはケージドコンパウンド試薬が特定量だけ注入されている。
【００３０】
励起用可視レーザ光源１１から射出され、ダイクロイックミラー３を透過した励起光Ｌ１と、ＵＶレーザ光源１２から射出され、高速シャッタ７０を通過した後、全反射ミラー２及びダイクロイックミラー３で反射された開裂光Ｌ２とは、同一光路に導かれ混合光Ｌ１２となる。
【００３１】
混合光Ｌ１２は、ダイクロイックミラー４で反射され、水平スキャナ２１及び垂直スキャナ２２へ導かれ、スキャナ制御回路３０によって試料８１上で２次元走査される。この混合光Ｌ１２のうち、開裂光Ｌ１は試料８１内のケージドコンパウンド試薬を開裂させ、励起光Ｌ２は試料８１中の蛍光試薬を励起して蛍光Ｌ３を発生させる。
【００３２】
この蛍光Ｌ３は励起光Ｌ２と共に同じ光路を逆行し、垂直スキャナ２２及び水平スキャナ２１でデスキャニングされ、ダイクロイックミラー４を透過し、励起光Ｌ２と分離される。ダイクロイックミラー４を透過した蛍光Ｌ３はバリアフィルタ５で完全に蛍光Ｌ３のみとされ、蛍光検出器５０に入射する。
【００３３】
図２はスキャナ制御回路の詳細ブロック図であり、この図を参照してスキャナ制御回路の動作を説明する。
【００３４】
スキャナ制御回路３０は垂直同期信号発生回路３１と、垂直スキャナ駆動回路３２と、水平同期信号発生回路３３と、水平スキャナ駆動回路３４と、ピクセルクロック発生回路３５と、１水平ラインカウント回路３６と、１フレームカウント回路３７とからなる。
【００３５】
垂直同期信号発生回路３１は、システムをコントロールしているＣＰＵ９０から画像取得開始指令９０ａを受けて垂直走査を開始させる垂直同期信号ＶＤを出力する。
【００３６】
垂直スキャナ駆動回路３２は、垂直同期信号ＶＤを入力すると、垂直スキャナ２２の駆動信号（ノコギリ波）ＶＤＤを出力し、垂直スキャナ２２を駆動する。
【００３７】
垂直同期信号ＶＤは同時に水平同期信号発生回路３３に入力され、水平同期信号発生回路３３は水平走査を開始させる水平同期信号ＨＤを出力する。
【００３８】
水平スキャナ駆動回路３４は、水平同期信号ＨＤを入力し、水平スキャナ２１の駆動信号（ノコギリ波）ＨＤＤを出力し、水平スキャナ２１を駆動する。
【００３９】
水平同期信号ＨＤは同時にピクセルクロック発生回路３５に入力され、ピクセルクロック発生回路３５は蛍光データをサンプリングするピクセルクロックＰＣを画像処理回路６０へ出力する。
【００４０】
１水平ラインカウント回路３６は、水平同期信号ＨＤとピクセルクロックＰＣとを入力し、水平同期信号ＨＤの入力に同期してピクセルクロックＰＣのカウントを開始し、予め設定されたクロック数（１水平ラインの１周期に当たるピクセルクロックの数、例えば５１２）をカウントし終えると、トリガ信号ＴＲ１を出力する。
【００４１】
水平同期信号発生回路３３は、トリガ信号ＴＲ１を入力すると、次のラインを走査するための水平同期信号ＨＤを出力する。
【００４２】
１フレームカウント回路３７は、垂直同期信号ＶＤと水平同期信号ＨＤとを入力し、垂直同期信号ＶＤの入力に同期して水平同期信号ＨＤのカウントを開始し、予め設定された数（１フレームの１周期に当たる水平同期信号の数、例えば、５１２）をカウントし終えると、トリガ信号ＴＲ２を出力する。
【００４３】
垂直同期信号発生回路３１はトリガ信号ＴＲ２を入力すると、次のフレームの走査を開始し、垂直同期信号ＶＤを出力する。
【００４４】
スキャナ制御回路３０は、上記のようにして、水平スキャナ２１と垂直スキャナ２２とを、例えば同期信号発生器を用いて同期をとって駆動することで混合光Ｌ１２を２次元的に走査する。
【００４５】
図３は切換制御回路の詳細ブロック図であり、この図を参照して切換制御回路の動作を説明する。
【００４６】
切換制御回路４０は有効水平同期信号カウント回路（有効ＨＤカウント回路と称する）４１と、有効ピクセルクロックカウント回路（有効ＰＣカウント回路と称する）４２と、高速シャッタ駆動回路４３とからなる。
【００４７】
有効ＨＤカウント回路４１は、垂直同期信号ＶＤと水平同期信号ＨＤとを入力し、垂直同期信号ＶＤの入力に同期して水平同期信号ＨＤのカウントを開始し、ＣＰＵ９０で予め設定されたカウント値までの間は、例えばＨレベルのＨＤイネーブル信号ＨＤＥを出力する。
【００４８】
一方、有効ＰＣカウント回路４２は、水平同期信号ＨＤとピクセルクロックＰＣを入力し、水平同期信号ＨＤに同期してピクセルクロックをカウントし、ＣＰＵ９０で予め設定されたカウント値までの間は、例えばＨレベルのピクセルクロックイネーブル信号ＰＣＥを出力する。
【００４９】
高速シャッタ駆動回路４３は、有効ＨＤカウント回路４１及び有効ＰＣカウント回路４２の出力が共にＨレベルのとき、高速シャッタ駆動回路４３を開裂光の通過を許す状態（第２の状態）に駆動する信号４３ａを出力する。
【００５０】
上記第１実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、励起光Ｌ１は水平スキャナ２１及び垂直スキャナ２２による走査によって細胞全体に照射されるが、開裂光Ｌ２は予め設定された矩形の領域だけに照射させることができる。そして、励起光Ｌ１と開裂光Ｌ２とは同時に照射されるため、試料８１に生じた反応をリアルタイムで観察することができる。
【００５１】
図４はこの発明の第２実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡のブロック構成図であり、第１の実施形態と同一部分については同一符号を付し、その説明を省略する。
【００５２】
この実施形態には、画像処理回路６０で得られる画像信号６０ａを再生するモニタ１００と、このモニタ１００に表示された画像の少なくとも一部の領域を指定するポインティングデバイス（領域指定手段）９１とが付加されている。
【００５３】
モニタ１００にはＣＲＴが用いられ、モニタ１００は例えば画面を構成する画素に対応したバッファメモリを持ち、その内容を繰り返し表示する。なお、バッファメモリの内容は動的に変更可能となっている。
【００５４】
ポインティングデバイス９１は、例えばタブレット（デジタイザ）、ライトペン、マウス等であり、ＣＰＵ９０に接続されており、画像処理回路６０を介してモニタ１００の画面上の任意の１点を指示することができる。
【００５５】
図５は切換制御回路の詳細ブロック図である。
【００５６】
切換制御回路４０はピクセルクロックカウンタ４５、メモリ４６、高速シャッタ駆動回路４７からなる。
【００５７】
ピクセルクロックカウンタ４５は、垂直同期信号ＶＤとピクセルクロックＰＣとを入力し、垂直同期信号ＶＤの入力に同期してピクセルクロックＰＣのカウント値をリセットし、ピクセルクロックＰＣのカウントを開始し、そのカウント値４５ａを出力する。
【００５８】
メモリ４６は例えばＲＡＭで構成され、画像の画素サイズと同じかそれ以上で１ビットデータが記憶できる容量を有し、画素単位でアドレスが定義されている。ＣＰＵ９０によって画素と対応したアドレスにシャッタコントロールデータ４６ａが後述する方法で予め書込まれている。
【００５９】
このメモリ４６は、ピクセルクロックＰＣのカウント値４５ａをメモリ４６のアドレスとして入力し、インクリメントされたカウント値が入力する度に、カウント値に対応するアドレスに書込まれている１ビットのシャッタコントロールデータ４６ａを出力する。
【００６０】
高速シャッタ駆動回路４７は、シャッタコントロールデータ４６ａを入力し、このシャッタコントロールデータ４６ａに基づいて高速シャッタ７０を開裂光の通過を許す状態（第２の状態）に駆動する信号４７ａを出力する。
【００６１】
次に、予め行われる上記メモリ３６へのシャッタコントロールデータの書き込みについて説明する。
【００６２】
図６はモニタ画面上に表示されたラスタスキャンして取得された１フレームの蛍光画面を示す図、図７はシャッタコントロールデータを記憶してあるメモリのマッピングデータを示す図である。なお、図７において、説明を簡略化するため、画素サイズを２５×２５としている。
【００６３】
先ず、１フレーム（１画像）だけラスタスキャンして得た蛍光画面１０１の全体を図６に示すようにモニタ１００上に表示させる。
【００６４】
次に、このモニタ１００で試料８１の全体画像を見ながら、実際に開裂光Ｌ２で開裂したいケージドコンパウンド試薬の注入されている領域をポインティングデバイス９１を用いてトレースし、図６に示すような軌跡１０２で囲まれた領域１０３を表示させる。
【００６５】
なお、表示させる領域１０３は１つに限るものではなく、任意の数の領域を指定してもよい。
【００６６】
上記領域１０３を決定後、ＣＰＵ９０は図７に示すように画素と対応したアドレスをたよりにメモリ４６にアクセスし、高速シャッタ７０の第２の状態又は第１の状態を示すシャッタコントロールデータ４６ａをメモリ３６に直接書込む。
【００６７】
図において、「１」は第２の状態にすること、「０」は第１の状態にすることをそれぞれ表している。
【００６８】
上記第２実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡によれば、励起光Ｌ１は水平スキャナ２１及び垂直スキャナ２２による走査によって細胞全体に照射されるが、開裂光Ｌ２は、予め行われた走査に基づいてメモリ４６に記憶された領域１０３だけに１画素もずれずに照射される。そして、励起光Ｌ１と開裂光Ｌ２とは同時に照射されるため、試料８１に生じた反応をモニタ１００によってリアルタイムで観察することができる。
【００６９】
なお、上記実施形態においては、第２光ビームはケイジドコンパウンド試薬開裂用レーザ光として説明したが、細胞を殺すためのレーザ（レーザメス）として用いることもできる。
【００７０】
【発明の効果】
以上に説明したようにこの発明の光走査型顕微鏡によれば、制御回路が走査位置情報に基づき、走査手段による走査範囲内の所定の部分領域で光ビーム切換手段を前記第２の状態にするので、第１光ビームと第２光ビームとを１組の走査手段で走査しながら、第１光ビームで走査領域の全範囲に照射し、第２光ビームで走査領域の一部分である反応させたい範囲内だけ照射することができる。したがって、ピント合わせのような煩雑な操作を必要とせず、１組の走査手段だけの簡単な構成で複数の波長の光ビームを所定の範囲に同時に照射させることができる。例えば、ケイジドコンパウンド試薬を組合わせた蛍光観察では、蛍光試薬と開裂したケイジドコンパウンド試薬とが結合した時の現象をリアルタイムに反応を観察することができる。
【００７１】
請求項２記載の発明の光走査型顕微鏡によれば、第１光ビームを照射した状態において、試薬に第２光ビームが照射されると試薬は開裂されるので、第２光ビームの照射に応じた観察を行うことができる。
【００７２】
請求項３記載の発明の光走査型顕微鏡によれば、走査範囲内の一部の領域以外の試料への余計な光の照射が遮断され、第２光ビームは走査領域の一部分である反応させたい範囲内だけ照射することができる。
【００７３】
請求項４に記載の発明の光走査型顕微鏡によれば、領域指定手段で指定された領域以外の試料への余計な第２光ビームの照射が遮断され、第２光ビームは予め行われた走査に基づいてメモリに記憶された領域に対応する範囲内だけ照射することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はこの発明の第１実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡のブロック構成図である。
【図２】図２はスキャナ制御回路の詳細ブロック図である。
【図３】図３は切換制御回路の詳細ブロック図である。
【図４】図４はこの発明の第２実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡のブロック構成図である。
【図５】図５は切換制御回路の詳細ブロック図である。
【図６】図６はモニタ画面上に表示されたラスタスキャンして取得された１フレームの蛍光画面を示す図である。
【図７】図７はシャッタコントロールデータを記憶してあるメモリのマッピングデータを示す図である。
【符号の説明】
１  レーザ走査型顕微鏡
１０  光照射系
２０  走査装置（走査手段）
３０  スキャナ制御回路
４０  切換制御回路
４６  メモリ
５０  蛍光検出器（検出手段）
６０  画像処理回路（画像取得手段）
７０  高速シャッタ
８１  試料
９１  ポインティングデバイス（領域指定手段）
１００  モニタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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