(57)【要約】ＨＣＶコア蛋白質が、酵母核内輸送受容体Ｐｓｅ１ｐによる核内輸送分子の輸送を阻害することが判明した。コア蛋白質はＰｓｅ１ｐと結合し、Ｐｓｅ１ｐと輸送分子との結合を阻害した。また、コア蛋白質は核内輸送受容体Ｋａｐ１２３ｐにより核へ輸送されることが判明した。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合、または核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合を指標とした化合物のアッセイ方法およびスクリーニング方法を提供する。本発明により、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝細胞障害および肝癌を抑制するための薬剤のアッセイおよびスクリーニングが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害に及ぼす化合物の作用を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現させる工程、および
（ｂ）核内輸送受容体の活性を検出する工程、を含む方法。
【請求項２】
核内輸送受容体の活性が、細胞質−核間輸送活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が酵母細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合に及ぼす化合物の作用を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体とを接触させる工程、および
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を検出する工程、を含む方法。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合の阻害に及ぼす化合物の作用を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料およびＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質の存在下で、核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質とを接触させる工程、および
（ｂ）核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合を検出する工程、を含む方法。
【請求項６】
核内輸送受容体結合蛋白質が核内輸送分子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核内輸送受容体がＫａｐ１２３ｐまたはＰｓｅ１ｐである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現させる工程、
（ｂ）核内輸送受容体の活性を検出する工程、および
（ｃ）該被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比較して、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による該活性の阻害を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項９】
核内輸送受容体の活性が、細胞質−核間輸送活性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が酵母細胞である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体とを接触させる工程、
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を検出する工程、および
（ｃ）該結合を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１２】
Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合の阻害を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料およびＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質の存在下で、核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合を検出する工程、および
（ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による該結合の阻害を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１３】
核内輸送受容体結合蛋白質が核内輸送分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核内輸送受容体がＫａｐ１２３ｐまたはＰｓｅ１ｐである、請求項８から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれかに記載の方法により単離し得る化合物。
【請求項１６】
Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する活性を有する化合物を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１７】
Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体と核内輸送分子との結合の阻害を抑制する活性を有する化合物を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１８】
Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を阻害する活性を有する化合物を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１９】
Ｃ型肝炎ウイルスによる肝細胞障害の予防または治療に用いられる、請求項１６から１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２０】
肝炎または肝癌の予防または治療に用いられる、請求項１６から１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝細胞障害および肝癌の予防または治療に有用な化合物をアッセイまたはスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、このスクリーニング方法によって得ることができる化合物を含む医薬組成物に関する。
背景技術
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は全長約９．５ｋｂの＋鎖のＲＮＡをゲノムとして持つウイルスである。感染細胞内では細胞質にてそのゲノムＲＮＡにコードされる一つの長いオープンリーディングフレームから約３０００アミノ酸からなるポリペプチドが合成されるが、宿主由来とウイルスＲＮＡにコードされているプロテアーゼによる切断を受け、コア蛋白質、エンベロープ蛋白質、その他非構造蛋白質などのウイルス蛋白質が作られる。ＨＣＶはその遺伝子の塩基配列の違いから１〜６までのクレードと呼ばれるサブタイプに分類されているが、遺伝子発現機構やウイルスの各蛋白質の機能は共通している。
ＨＣＶに感染した患者の病態は、慢性肝炎を経て、１０〜２０年かかって肝硬変・肝癌へと移行する。この長い年月をかけた肝障害と肝細胞癌化の過程は癌（原）遺伝子の活性化や、感染の初期では癌抑制遺伝子の不活化では説明しにくい。実際、ＨＣＶ感染患者において、癌抑制遺伝子であるｐ５３やＲｂ、ｐ１６遺伝子の変異の増加を見出すことはできていない。ＨＣＶ感染者はかなりの確率で肝癌に移行することから、肝癌への移行を予防することは大きな課題である。現在、ＨＣＶ感染者の治療にはＩＦＮ−αの大量投与が有効とされているが、この治療法はＨＣＶ全てのタイプに有効性を示すとは限らない上に副作用が伴う。したがって、ＨＣＶ感染患者の肝癌への移行を確実に予防することができる新たな薬剤の提供が望まれている。
ＨＣＶコア蛋白質は培養細胞のトランスフォーメーションおよびこのｃＤＮＡをもつトランスジェニックマウスの発癌に深く関わっていることが知られている。本発明者らはＨＣＶコア蛋白質が細胞質及び核内に局在化すること、ＨＣＶコア蛋白質には核内輸送シグナル様配列が複数存在することから、ＨＣＶコア蛋白質が細胞質−核間輸送のステップで細胞側の蛋白質の輸送に影響を与えていると考え、分子遺伝学的に扱いやすい真核細胞である出芽酵母細胞を用いて検証を試みた。そして酵母のＡＰ−１様転写因子（Ｙａｐ１ｐ）の細胞質から核への輸送がＨＣＶコア蛋白質により阻害されることを明らかにした。ところで細胞質−核間輸送に必要なシグナルやその受容体は真核生物の中で複数種存在しており多様性があるが、酵母細胞及びヒト細胞などの哺乳動物細胞との間でかなり類似性がある。一方出芽酵母細胞の全ゲノムはすでに公知であり、１４種の輸送受容体の存在が明らかになっている。したがって酵母細胞を用いることにより細胞質−核間輸送のメカニズムを明らかにすることはヒト細胞の本体を明らかにすることに直結している。
本発明者らはさらに、Ｙａｐ１ｐはＰｓｅ１ｐ核内輸送受容体により、Ｒａｎ　ＧＴＰ結合蛋白質の活性を要求しながら核内に輸送されることを示した。しかしながらＨＣＶコア蛋白質がＹａｐ１ｐの核内輸送を阻害するメカニズムに関しては全く明らかにされていなかった。
発明の開示
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害に及ぼす化合物の作用を検出する方法を提供することを課題とする。また本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。また、本発明は、この検出方法またはスクリーニング方法によって得ることができる化合物を含む医薬組成物を提供する課題とする。
本発明者らは、ＨＣＶコア蛋白質によるＡＰ−１様転写因子Ｙａｐ１ｐの核内輸送の阻害は、ＨＣＶコア蛋白質とＹａｐ１ｐが核内輸送受容体と競合するか、または類似の分子を利用しているために生じると洞察し、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを真核細胞のモデル系として用いてその検証を試みた。出芽酵母細胞内で発現させたＨＣＶコア蛋白質の細胞内局在性について免疫染色法を用いて調べたところ、ＨＣＶコア蛋白質は出芽酵母細胞内においても哺乳動物細胞内と同様の細胞内局在性を示し、出芽酵母を用いた実験系が哺乳動物細胞の良いモデル系となり得ることが確認された。Ｃ端側を欠失した核局在型ＨＣＶコア蛋白質の局在を観察することで、ＨＣＶコア蛋白質はＹａｐ１ｐと同様に、低分子ＧＴＰ結合蛋白質であるＲａｎ依存的に核内輸送されることが明らかとなった。また、出芽酵母のＡＰ−１様転写因子Ｙａｐ１ｐをＧＦＰ融合蛋白質として発現させ挙動を観察すると、ＨＣＶコア蛋白質の発現によりＹａｐ１ｐの核内輸送は阻害された。この阻害機構を検討するために輸送機構に着目し、細胞質−核間輸送に関わる分子についての変異株を用いてＹａｐ１ｐの核内輸送を観察した結果、Ｐｓｅ１ｐ核内輸送受容体がＹａｐ１ｐの核内輸送に関わる分子であることを見出すに至った。
大腸菌で発現、精製したリコンビナントＹａｐ１ｐ蛋白質を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏの蛋白質間相互作用について解析した。その結果、ＨＣＶコア蛋白質は、Ｙａｐ１ｐとＰｓｅ１ｐとの結合を阻害することが明らかになった。さらに、細胞質−核間輸送に関わる分子についての変異株を用いてＨＣＶコア蛋白質の局在を観察することで、ＨＣＶコア蛋白質は、Ｋａｐ１２３ｐ核内輸送受容体によって核内に輸送されていることが判明した。Ｋａｐ１２３ｐと、Ｙａｐ１ｐの核内輸送受容体であるＰｓｅ１ｐはもっとも相同性が高く、同類の輸送受容体と考えられる。実際リボゾーム蛋白質Ｌ２５は両者により核内に輸送されていることが知られている。
このような事実に基づいて、本発明者らは、ＨＣＶコア蛋白質はＰｓｅ１ｐ受容体およびＫａｐ１２３ｐ受容体に直接または間接的に相互作用する事により、これらの受容体により核内に輸送される細胞側の蛋白質の核内輸送を阻害することを明らかにするに至った。本発明者らが明らかにした機構によって、Ｃ型肝炎患者において長い年月を経て慢性肝炎から肝癌を発症する機構の少なくとも一部を説明することが可能である。すなわち、ＨＣＶコア蛋白質の作用によって遺伝子発現または細胞複製等を忠実に行うため必須な核蛋白質の一部が核内に正常に輸送されなくなり、これによる細胞機能の障害が長い年月をかけて癌を誘起させるものと考えられる。
以上のような知見に基づいて本発明者らは、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の機能阻害を抑制する化合物をスクリーニングすることにより、ＨＣＶによる細胞障害および肝癌の発症を防ぐ医薬を開発することができることを見出した。例えば、ＨＣＶコア蛋白質とＫａｐ１２３ｐやＰｓｅ１ｐなどの酵母核内輸送受容体または哺乳動物細胞のＲａｎＢＰ５を含むその核内輸送受容体ホモログとの結合、アダプター分子などを含む他の核内輸送受容体蛋白質とＨＣＶコア蛋白質との相互作用、あるいはＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体蛋白質と核内輸送分子との結合の阻害などのＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を低減する因子を細胞に与えれば、ＨＣＶ感染による肝細胞障害、および肝細胞癌の発症を防ぐことが可能である。
すなわち本発明は、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物のアッセイおよびスクリーニング方法、およびこのアッセイまたはスクリーニングによって得られる化合物を含む医薬組成物等に関し、より具体的には、
（１）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害に及ぼす化合物の作用を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現させる工程、および
（ｂ）核内輸送受容体の活性を検出する工程、を含む方法、
（２）核内輸送受容体の活性が、細胞質−核間輸送活性である、（１）に記載の方法、
（３）細胞が酵母細胞である、（１）または（２）に記載の方法、
（４）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合に及ぼす化合物の作用を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体とを接触させる工程、および
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を検出する工程、を含む方法、
（５）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合の阻害に及ぼす化合物の作用を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料およびＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質の存在下で、核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質とを接触させる工程、および
（ｂ）核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合を検出する工程、を含む方法、
（６）核内輸送受容体結合蛋白質が核内輸送分子である、（５）に記載の方法、
（７）核内輸送受容体がＫａｐ１２３ｐまたはＰｓｅ１ｐである、（１）から（６）のいずれかに記載の方法、
（８）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現させる工程、
（ｂ）核内輸送受容体の活性を検出する工程、および
（ｃ）該被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比較して、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による該活性の阻害を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、
（９）核内輸送受容体の活性が、細胞質−核間輸送活性である、（８）に記載の方法、
（１０）細胞が酵母細胞である、（８）または（９）に記載の方法、
（１１）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体とを接触させる工程、
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を検出する工程、および
（ｃ）該結合を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１２）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合の阻害を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料およびＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質の存在下で、核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質とを接触させる工程、および
（ｂ）核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合を検出する工程、および
（ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による該結合の阻害を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１３）核内輸送受容体結合蛋白質が核内輸送分子である、（１２）に記載の方法、
（１４）核内輸送受容体がＫａｐ１２３ｐまたはＰｓｅ１ｐである、（８）から（１３）のいずれかに記載の方法、
（１５）（８）から（１４）のいずれかに記載の方法により単離し得る化合物、
（１６）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する活性を有する化合物を有効成分とする医薬組成物、
（１７）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体と核内輸送分子との結合の阻害を抑制する活性を有する化合物を有効成分とする医薬組成物、
（１８）Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を阻害する活性を有する化合物を有効成分とする医薬組成物、
（１９）Ｃ型肝炎ウイルスによる肝細胞障害の予防または治療に用いられる、（１６）から（１８）のいずれかに記載の医薬組成物、
（２０）肝炎または肝癌の予防または治療に用いられる、（１６）から（１９）のいずれかに記載の医薬組成物、に関する。
なお、「核内輸送受容体」とは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を持つ蛋白質の認識または核内輸送に関与する蛋白質または蛋白質複合体を言う。また「核内輸送」には、輸送される蛋白質（例えば核内輸送分子）の細胞質での受容体による認識または結合、核内への移行、あるいは核内での受容体とＲａｎ−ＧＴＰとの結合による核内輸送分子の受容体からの解離までの過程などが含まれる。
核内輸送分子には、アダプター分子を必要とせず単独の受容体により輸送されるものも存在するが、核内輸送分子がアダプター分子と結合し、これが別の受容体蛋白質との複合体を形成して輸送されるものも存在する。本発明においては、このようなアダプター分子も核内輸送受容体に含まれる。
具体的には、本発明において「核内輸送受容体」には、ｉｍｐｏｒｔｉｎαまたはβファミリー、ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎαまたはβファミリー、ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎファミリーに属する蛋白質などが含まれる。
また、本発明において「核内輸送分子」とは、核内輸送受容体により輸送される細胞内分子（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を指す。
また、本発明において「Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白質」には、全長コア蛋白質およびその部分ペプチドが含まれる。また、他の蛋白質と融合されたコア蛋白質、アミノ酸に変異を有するコア蛋白質が含まれる。本明細書においてＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質は、「ＨＣＶコア蛋白質」または単に「コア蛋白質」とも称す。Ｃ型肝炎ウイルスは、いずれのサブタイプに属するものであってもよい。
１．核内輸送受容体の機能を指標とするアッセイおよびスクリーニング
本発明により、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白質により核内輸送受容体の活性が阻害されることが明らかとなった。具体的には核内輸送受容体の活性は、ＨＣＶコア蛋白質を核内輸送受容体に接触させることにより阻害することができる。また細胞においては、ＨＣＶコア蛋白質を細胞で発現させることにより核内輸送受容体の活性を阻害することができる。また、ＨＣＶコア蛋白質により核内輸送受容体を阻害する上記の方法を所望の条件下で実施して、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の阻害を検出することにより、様々な化合物や、温度、ｐＨ変化などの刺激や環境変化がＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の阻害に及ぼす影響を調べることができる。これにより、例えば以下に述べるアッセイ系やスクリーニング系を構築することができる。
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を指標として、該阻害に対する化合物の作用を検出する方法（化合物の作用を検出する方法を本発明において「アッセイ方法」と称す）、および該阻害を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、ＨＣＶコア蛋白質が核内輸送受容体の機能を阻害するという知見に基づいている。核内輸送受容体の阻害により、核内輸送分子の正常な輸送調節機能が障害を受ける。ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の機能阻害を低減させる化合物をスクリーニングすることにより、ＨＣＶによる細胞障害および肝癌を抑制する化合物を得ることができる。
ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害に対する化合物の作用を検出する方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させる工程、および
（ｂ）核内輸送受容体の活性を検出する工程、を含む方法である。
このアッセイにより、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害に及ぼす化合物の作用を知ることができる。また、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物のスクリーニング方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させる工程、
（ｂ）核内輸送受容体の活性を検出する工程、および
（ｃ）該被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比較して、ＨＣＶコア蛋白質による該活性の阻害を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法である。
１−１　核内輸送受容体
上記のアッセイやスクリーニングで用いられる核内輸送受容体は、ＨＣＶコア蛋白質により活性が阻害されるものが用いられる。核内輸送受容体の活性としては、例えば蛋白質や核酸などの細胞内分子を細胞質から核、または核から細胞質へ輸送する細胞質−核間の輸送機能が挙げられる。輸送される分子に特に制限はなく、核内輸送分子、ＨＣＶ蛋白質、または適当なＮＬＳ等を用いて人工的に合成された蛋白質などであり得る。また、核内輸送受容体自身の輸送であってもよい。また、ある種の核内輸送受容体は、分泌蛋白質の分泌促進やミトコンドリア蛋白質の移送調節などに関与することが示唆されており、核内輸送受容体の活性としてはこれらの活性を挙げることもできる。
また核内輸送受容体の活性としては、核内輸送分子との相互作用などが挙げられ、これらの活性の阻害の検出を通して、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を評価することができる。また、核内輸送受容体はＨＣＶコア蛋白質と相互作用することから、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害として、核内輸送受容体とＨＣＶコア蛋白質との相互作用を挙げることもできる。例えば、ＨＣＶコア蛋白質と相互作用する核内輸送受容体、または核内輸送分子との相互作用がＨＣＶコア蛋白質により阻害される核内輸送受容体などをアッセイやスクリーニングに用いることができる。ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との相互作用、または核内輸送受容体と核内輸送分子との相互作用のＨＣＶコア蛋白質による阻害は、例えばＴｗｏハイブリッド法、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、ＥＬＩＳＡ法、ＢＩＡＣＯＲＥなどの蛋白質間の結合を検出する方法により検出することができる。例えば、免疫沈降法においては、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体とをインキュベートし、一方の蛋白質に対する抗体で免疫沈降を行い、回収した試料を他方の蛋白質に対する抗体によるウェスタンブロットなどで解析することにより、両者の蛋白質の結合を検出することができる。また、核内輸送受容体と核内輸送分子との相互作用も、上記と同様の方法で検出することができる。すなわち、核内輸送受容体と核内輸送分子とをＨＣＶコア蛋白質の存在下でインキュベートするか、あるいは核内輸送受容体と核内輸送分子の複合体にＨＣＶコア蛋白質を添加し、核内輸送受容体と核内輸送分子の結合が解離するかを免疫沈降法などを利用して決定することができる。また、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を、細胞系を用いて検出することもできる。例えば、ＨＣＶコア蛋白質が核内輸送受容体の輸送機能を阻害するかを直接的に決定するには、細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させ、核内輸送受容体の輸送機能を観察する。例えば、タグなどで標識した核内輸送分子を細胞で発現させ、タグを指標に輸送を検出したり、または核内輸送分子の抗体で輸送を検出することができる。また、核内輸送受容体自身の輸送を検出してもよい。このような方法により、核内輸送受容体の活性がＨＣＶコア蛋白質により阻害されるかを確認することができる。
本発明において、酵母核内輸送受容体Ｐｓｅ１ｐ（Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｍ．ａｎｄ　Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：８５９０−８５９５，１９９７；Ｓｃｈｌｅｎｓｔｅｄｔ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：６２３７−６２４９，１９９７、「Ｋａｐ１２１ｐ」とも呼ばれる）の輸送機能がＨＣＶコア蛋白質により阻害されることが判明した。また、ＨＣＶコア蛋白質はＫａＰ１２３ｐ（Ｒｏｕｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　８９：７１５−７２５，１９９７；Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｍ．ａｎｄ　Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：８５９０−８５９５，１９９７；Ｓｃｈｌｅｎｓｔｅｄｔ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：６２３７−６２４９，１９９７、「Ｙｒｂ４ｐ」とも呼ばれる）により核に輸送されることが示された。またｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験においても、ＨＣＶコア蛋白質はＰｓｅ１ｐと結合し、Ｙａｐ１ｐとＰｓｅ１ｐとの結合を阻害することが判明した。これらの事実から、Ｐｓｅ１ｐ、Ｋａｐ１２３ｐ、またはこれらと相同な核内輸送受容体を標的にして本発明のアッセイまたはスクリーニングを行うことができる。Ｐｓｅ１ｐまたはＫａｐ１２３ｐと相同な哺乳動物細胞の核内輸送受容体としては、ＲａｎＢＰ５／Ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎβ３（Ｄｅａｎｅ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５０８７−５０９６，１９９７）などが挙げられる。
ＰＳＥ１遺伝子の塩基配列はアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ；Ａｃ．Ｎｏ．）Ｓ４５３５７、Ｐｓｅ１ｐのアミノ酸配列はＡｃ．Ｎｏ．Ｐ３２３３７に示されている。ＫＡＰ１２３遺伝子の塩基配列はＡｃ．Ｎｏ．Ｕ１８９１６、Ｋａｐ１２３ｐのアミノ酸配列はＡｃ．Ｎｏ．Ｐ４００６９に示されている。また、ヒトＲａｎＢＰ５／Ｋａｒｙｏｐｈｅｐｉｎβ３遺伝子の塩基配列はＡｃ．Ｎｏ．Ｙ０８８９０に、アミノ酸配列はＡｃ．Ｎｏ．ＣＡＡ７０１０３に示されている。
１−２　被検試料
被検化合物を含む試料としては特に制限はなく、例えば、天然または合成化合物、各種有機化合物、天然または合成された糖類、蛋白質、ペプチド、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、あるいは菌体成分などを挙げることができる。被検試料としてＤＮＡ発現ライブラリー等を用いる場合は、常法によりライブラリーを細胞に導入する。
本発明のアッセイまたはスクリーニング方法においては、核内輸送受容体蛋白質そのもの、その断片、それらをコードする核酸、あるいは核内輸送受容体遺伝子の転写を促進し得る化合物も望ましい被検化合物の一つである。また、ＨＣＶコア蛋白質の断片などであってもよい。核内輸送受容体やその遺伝子の転写を促進する化合物には、ＨＣＶコア蛋白質による抑制作用により低下した核内輸送受容体本来の機能を補う作用が期待できる。あるいは核内輸送受容体やコア蛋白質の断片は、ＨＣＶコア蛋白質による機能阻害に対して競合的に作用することによって、核内輸送受容体本来の機能の阻害を低減させる可能性を持つ。
１−３　細胞
本発明のアッセイまたはスクリーニングに用いられる細胞としては、核内輸送受容体に属する少なくとも１つの遺伝子を発現し、その輸送受容体またはその機能を検出可能な細胞であれば特に制限はない。具体的には、通常培養条件下で良く増殖し、取り扱いが容易であり、さらに一般に手に入り易い細胞が望ましい。このような細胞の１つとして酵母細胞が挙げられる。本発明者らは、出芽酵母において、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の機能の阻害を再現する系を確立することに成功した。酵母細胞は取り扱いが簡便であり、多数の被検試料を同時に処理する大規模なアッセイ系やスクリーニング系を構築することが容易である。従って、出芽酵母は本発明のアッセイまたはスクリーニングにおいて特に好適に用いられる。また、同様の系は分裂酵母または他の酵母類を用いて構築することも可能であると考えられる。特に、全ゲノム情報が明らかになりつつある分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅを用いた遺伝学的解析は有用である。さらに、酵母以外の真核細胞を用いることができる。このような細胞としては、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等が含まれる。例えばアフリカツメガエル卵母細胞などを用い、マイクロインジェクション法と組み合わせた生化学的・細胞生物学的な解析を行う系、さらにＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞を用い、マイクロインジェクション法やトランスフェクション法と組み合わせた系を用いたアッセイやスクリーニングが考えられる。例えば酵母細胞を用いたスクリーニングにより選択された化合物を、さらにアフリカツメガエル卵母細胞やヒト細胞などの高等動物細胞を用いて２次スクリーニングを行うことができる。
１−４　ＨＣＶコア蛋白質の発現
細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させるには、例えば実施例に記載のようにＨＣＶコア蛋白質をコードする発現ベクターを細胞に導入する。ＨＣＶコア蛋白質を発現させるためには、例えばＨＣＶのポリプロ蛋白質全体を発現させることができる。また、コア蛋白質全長を発現させることができる。あるいは、核内輸送受容体の機能を損うのに必須の領域を含むコア蛋白質の断片であることもできる。分子量が小さいコア蛋白質の断片を利用すれば、蛋白質の細胞内発現を高い水準に維持しやすいことから、候補化合物の効果をより明瞭に確認することができ得る。本発明者らの得た知見によれば、ＨＣＶのコア蛋白質ｐ２１（アミノ酸１−１９１）（配列番号：２）、ｐ１９（アミノ酸１−１７３）（配列番号：４）、ｐ１６（アミノ酸１−１５１）（配列番号：６）はいずれも核内輸送受容体による核内輸送分子の核輸送を阻害する。従って、これらのいずれかのＨＣＶコア蛋白質を細胞で発現させ、コア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を検出することを通して、化合物のアッセイやスクリーニングを行うことができる。核輸送の阻害効果はｐ２１及びｐ１９では強くｐ１６では比較的弱かった。従って、コア蛋白質ｐ２１及びｐ１９などのＣ末側を長く含むコア蛋白質を発現させることで核内輸送受容体の機能を強く阻害することが可能であり、ｐ１６等のＣ末側の欠失部分が多いコア蛋白質は核内輸送受容体の機能阻害が比較的弱いと考えられる。アッセイやスクリーニングにおいては、操作が容易でかつ被検試料の効果が最も判別しやすくなるよう、発現させるＨＣＶコア蛋白質の種類および／または発現量を適宜調節することができる。
ＨＣＶコア蛋白質などの外来蛋白質の発現は、公知の発現ベクターを用いて行うことができる。例えば、酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばＹｅｐ１３、Ｙｃｐ５０、ｐＲＳ４００シリーズ、ｐＲＳ３１０シリーズ等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばｇａｌ　１プロモーター、ｇａｌ　１０プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポーレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，ｐｐ１８２−１８７（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，ｐｐ１９２９−１９３３（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３）］等が挙げられる。
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が用いられ得る。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポーレーション法、リポフェクション法、あるいはリン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＭＢａｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＢａｃＰＡＫ８／９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＡｃＨＬＴ−Ｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、あるいはエレクトロポーレーション法等が挙げられる。
１−５　核内輸送受容体の活性の検出
上記のアッセイやスクリーニングでは、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害が被検化合物によってどのように影響されるかを指標とする。核内輸送受容体の活性としては、例えば細胞質−核間輸送機能が挙げられる。細胞質−核間輸送には、細胞質から核への輸送、および核から細胞質への輸送が含まれる。輸送される分子に制限はなく、核内輸送分子を含む細胞内蛋白質、ＨＣＶ蛋白質などを含む外来蛋白質、または核内輸送受容体自身などの輸送を検出することができる。スクリーニングにおいては、例えば被検化合物を含む試料の存在下および該被検化合物を含む試料の非存在下で検出を行い、被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比べ、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を有意に抑制する化合物を選択する。例えば被検化合物を担体と共に投与する場合には、「被検化合物を含む試料の非存在下」の条件として該被検化合物を含まない担体のみを投与してもよいし、何も投与しなくてもよい。また、該被検化合物以外の化合物を含む試料を投与してもよい。細胞質−核間輸送を指標とする被検化合物のアッセイまたはスクリーニングは、例えば以下のような評価を通じて実施することができる。
（１）核内輸送分子の細胞内局在の検出
核内輸送受容体により輸送される分子の細胞内局在の検出を通して、該受容体の輸送活性を検出することできる。この方法は、「核内輸送受容体の活性」として「核内輸送分子の細胞質−核間輸送」を検出する方法である。具体的には、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送分子の細胞質−核間輸送の阻害に及ぼす化合物の作用を検出するアッセイ方法であれば、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させる工程、および
（ｂ）核内輸送分子の細胞質−核間輸送を検出する工程、を含む方法である。
また、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送分子の細胞質−核間輸送の阻害を抑制する化合物のスクリーニング方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させる工程、
（ｂ）核内輸送分子の細胞質−核間輸送を検出する工程、および
（ｃ）該被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比較して、ＨＣＶコア蛋白質による該輸送の阻害を抑制する化合物を選択する工程、を含む。
例えば、核内輸送分子に対する抗体を用いて細胞を染色し、顕微鏡下で輸送分子の細胞内局在を検出する。核内輸送分子としては、該受容体により輸送される分子であれば制限はない。このような核内輸送分子としては、例えば核を構成する構造蛋白質、ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写因子、ＲＮＡプロセッシング因子、ｓｎＲＮＰ（ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。例えば、酵母核内輸送受容体Ｐｓｅ１ｐに対しては、核内輸送分子Ｙａｐ１ｐ、Ｐｈｏ４ｐ（Ｋａｆｆｍａｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１２：２６７３−２６８３，１９９８）、リボソーム蛋白質Ｌ２５（Ｓｃｈｌｅｎｓｔｅｄｔ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：６２３７−６２４９，１９９７）、またはそれらの断片などを使用することができる。ＹＡＰ１遺伝子の塩基配列はＡｃ．Ｎｏ．ｘ５８６９３に、Ｙａｐ１ｐのアミノ酸配列はＡｃ．Ｎｏ．Ｐ１９８８０に示されている。また、核内輸送受容体Ｋａｐ１２３ｐに対しては、Ｋａｐ１２３ｐにより核内輸送されることが知られているリボソーム蛋白質Ｌ２５（Ｓｃｈｌｅｎｓｔｅｄｔ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：６２３７−６２４９，１９９７）などを用いることができる。核内輸送分子は内因的に発現される分子であってもよいが、該核内輸送分子またはその部分ペプチドをコードする発現ベクターを細胞に導入した形質転換体を用いることができる。このとき、検出が容易となるようにタグ（例えばＦｌａｇまたはＨＡタグなど）を付加したり、ＧＦＰなど他の蛋白質との融合蛋白質としてもよい。使用される発現ベクターおよびベクターの導入方法は公知のものを利用することができる。
輸送は細胞質から核への輸送と、核から細胞質への輸送が含まれるが、本発明のアッセイまたはスクリーニングにおいてはそのどちらか、あるいは両方を検出することができる。輸送方向は、用いる輸送分子や細胞環境を適宜調節することにより制御することができる。例えば、酵母においては、細胞を酸化ストレス条件に置くことにより、Ｐｓｅ１ｐによる核内輸送分子Ｙａｐ１ｐの核局在を誘導することが、できる。また、Ｙａｐ１ｐのＣ末欠損部分ペプチドＹａｐ１ｐ（１−５７１）などは恒常的に核局在性を示す。このような分子を用いることも可能である。
標的とする核内輸送受容体または核内輸送分子が由来する生物は、アッセイやスクリーニングに用いる宿主細胞が由来する生物と一致していなくてもよい。すなわち、輸送機能が損なわれない限り、核内輸送受容体および／または核内輸送分子を異種細胞で発現させることも考えられる。
核内輸送分子の局在を直接検出する代わりに、核内輸送分子の輸送により生じる形質の変化などを利用して輸送活性を検出することも可能である。例えば、輸送分子が転写因子である場合、その蛋白質の転写活性化能を指標に検出することができる。Ｙａｐ１ｐは酵母のＡＰ−１様転写因子であり、標的遺伝子のプロモーター領域のＹａｐ１ｐ結合配列に結合して転写を活性化する。従って、Ｙａｐ１ｐによる標的遺伝子の発現を検出することによって核内輸送受容体によるＹａｐ１ｐの輸送機能を評価することが可能である。転写因子でなくとも、輸送分子の細胞内局在の変化によりある種の遺伝子の発現に変化が生じたり、細胞の生存や増殖、またはその他の表現型が影響を受ける場合には、それらの表現型を指標にして、同様のアッセイまたはスクリーニングを行うことができる。例えば、標的とする核内輸送受容体により輸送される分子により、それに応答性の遺伝子の発現が誘導される場合、これらの応答性遺伝子の発現を解析することによって、核内輸送受容体の輸送機能を検出することができる。
遺伝子の発現の検出は、転写レベル、翻訳レベルの検出の他、発現によって生じる生化学的・生物学的変化により検出することが可能である。例えば、転写産物の検出はノーザンブロット法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｉｎ“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ．２０１−２０６）、またはＲＴ−ＰＣＲ法（Ａ．Ｌ．Ｓｈａｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９０：２９２−２９６）などの方法により行うことができる。翻訳産物の検出は、抗体を用いたウェスタンブロット法、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ；Ｉ．Ｒｏｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｉｎ“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｔｈｅ　Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ　Ｃｏ．，ｐｐ２５．５−２５．６）、ＥＩＡ、ＲＩＡ、免疫組織化学的染色法などを用いて行うことができる。抗体は公知の方法に従って作製することが可能である。
また、例えば、実施例に記載したように、核内輸送分子により発現が調節される遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したベクターを細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を指標にすれば、より簡便に核内輸送分子の局在変化を検出することができる。レポーター遺伝子としては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、アミノ酸代謝酵素、細胞毒素などの遺伝子が挙げられる。また、輸送分子に他の機能蛋白質を付加した融合蛋白質を細胞で発現させ、付加した蛋白質の機能を指標に細胞内局在の変化を検出することも考えられる。
被検化合物を含む試料を用いてアッセイまたはスクリーニングを行い、スクリーニングにおいてはＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害が有意に低減される化合物を選択する。培養細胞を用いる場合、被検化合物を含む試料は例えば培地に添加される。発現ベクター等を被検試料として用いる場合は、ベクターを細胞に導入して発現させる。個体を用いたｉｎ　ｖｉｖｏ系でアッセイやスクリーニングを行う場合は、被検化合物を含む試料は所望のルートにより投与される。アッセイによる化合物の評価やスクリーニングを通して得ることができる、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物は、ＨＣＶによる肝細胞の障害および肝癌を抑制する化合物の候補となる。
（２）核内輸送受容体の細胞内局在の検出
また、本発明のアッセイやスクリーニングは、核内輸送受容体自身の細胞内局在の検出により行うことができる。核内輸送受容体は核内輸送分子と共に核に移行し、核内輸送分子を輸送した後、核から細胞質へ核外輸送されリサイクルされる。核内輸送受容体自身の輸送に対するＨＣＶコア蛋白質の影響を調べることにより、本発明のアッセイやスクリーニングを行うことができる。これらの方法は、「核内輸送受容体の活性」として「核内輸送受容体の細胞質−核間輸送」を検出する方法である。
具体的には、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の細胞質−核間輸送の阻害に及ぼす化合物の作用を検出するアッセイ方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させる工程、および
（ｂ）核内輸送受容体の細胞質−核間輸送を検出する工程、を含む。
また、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の細胞質−核間輸送の阻害を抑制する化合物スクリーニング方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させる工程、
（ｂ）核内輸送受容体の細胞質−核間輸送を検出する工程、および
（ｃ）該被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比較して、ＨＣＶコア蛋白質による該輸送の阻害を抑制する化合物を選択する工程、を含む。
核内輸送受容体の細胞質−核間輸送は、例えば核内輸送受容体の細胞内局在を検出することにより評価することができる。これらの方法により、核内輸送受容体の核内から細胞質への移行に対するＨＣＶコア蛋白質の阻害を抑制する化合物などをスクリーニングしたり評価したりすることができる。具体的には、例えばＰｓｅ１ｐ、Ｋａｐ１２３ｐ、またはこれらと相同な核内輸送受容体蛋白質等にペプチドタグを付加したり、ＧＦＰなどとの融合蛋白質とすることにより標識し、酵母などで発現させこの核内輸送受容体の細胞内局在を観察する。スクリーニングにおいては、核内輸送受容体の細胞内局在に対するＨＣＶコア蛋白質の影響を抑制する化合物を選択する。このアッセイやスクリーニングにより得られる化合物は、上記の核内輸送分子の細胞内局在の検出によるアッセイやスクリーニングと同様、ＨＣＶによる肝細胞の障害および肝癌を抑制する化合物の候補となる。
（３）ＨＣＶコア蛋白質の輸送の検出
ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の機能阻害は、ＨＣＶコア蛋白質が核内輸送受容体と相互作用することに起因している。ＨＣＶコア蛋白質の一部は核内輸送受容体と結合し核に移行する。従って、「核内輸送受容体の活性」として「ＨＣＶコア蛋白質の細胞質−核間輸送」を指標にすることもできる。この場合、「ＨＣＶコア蛋白質の細胞質−核間輸送」自体が、「ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害」に対応する。例えばＨＣＶコア蛋白質の細胞質から核への輸送を指標に化合物のアッセイを行ったり、該輸送を阻害する化合物を選択することによりＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、核内輸送受容体によるＨＣＶコア蛋白質の細胞質−核間輸送に化合物が及ぼす作用を検出するアッセイ方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させる工程、および
（ｂ）核内輸送受容体によるＨＣＶコア蛋白質の細胞質−核間輸送を検出する工程、を含む方法である。
また、核内輸送受容体によるＨＣＶコア蛋白質の細胞質−核間輸送を抑制する化合物のスクリーニング方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、細胞にＨＣＶコア蛋白質を発現させる工程、
（ｂ）核内輸送受容体によるＨＣＶコア蛋白質の細胞質−核間輸送を検出する工程、および
（ｃ）該被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比較して、該輸送を抑制する化合物を選択する工程、を含む。
ＨＣＶコア蛋白質は、核移行を検出し易いようにタグやＧＦＰなどによる標識を付加したり、他の機能蛋白質との融合蛋白質として発現させ、付加したペプチドや蛋白質を利用してＨＣＶコア蛋白質の核移行等を検出することもできる。例えば、スクリーニングにおいては被検化合物を含む試料の存在下でＨＣＶコア蛋白質の核移行を検出し、該核移行が有意に低減される化合物を選択する。このアッセイやスクリーニングにより得られる化合物は、上記と同様にＨＣＶによる肝細胞の障害および肝癌を抑制する化合物の候補となる。
（４）蛋白質間の相互作用の検出
本発明により、ＨＣＶコア蛋白質は核内輸送受容体と相互作用し、該受容体の機能を抑制することが示された。従って、本発明のアッセイやスクリーニングを、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との相互作用を指標に行うことも可能である。また、ＨＣＶコア蛋白質は核内輸送受容体と核内輸送分子との本来の相互作用を阻害することが判明した。従って、本発明のアッセイやスクリーニングを、核内輸送受容体と核内輸送分子との相互作用を指標に行うことも可能である。このように、核内輸送受容体の活性、およびＨＣＶコア蛋白質による該活性の阻害を検出するために、「核内輸送受容体とＨＣＶコア蛋白質との相互作用」、または「核内輸送受容体と核内輸送分子との相互作用」を指標とすることが可能である。スクリーニングにおいては、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との相互作用を阻害する化合物、あるいはＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と核内輸送分子との相互作用の阻害を抑制する化合物を選択する。細胞系を利用してこれらのアッセイやスクリーニングを行う方法としては、酵母細胞または哺乳動物細胞等を用いたｔｗｏハイブリッド系などが知られている。このような方法については、細胞系を使わない方法と共に以下に述べる。
２．蛋白質−蛋白質相互作用を指標とするアッセイおよびスクリーニング
本発明において、ＨＣＶコア蛋白質は核内輸送受容体と結合することが見出された。また、ＨＣＶコア蛋白質は、核内輸送受容体と核内輸送分子との結合を阻害することが判明した。例えばＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体とを接触させることにより、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体とを結合させることができる。また、核内輸送受容体および該受容体結合蛋白質を接触させる際にＣ型肝炎ウイルスコア蛋白質を存在させることにより、核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合を阻害することができる。このような、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体とを結合させる方法、または核内輸送受容体と核内輸送分子などの核内輸送受容体結合蛋白質との結合をＨＣＶコア蛋白質により阻害する方法を、様々な化合物や温度、ｐＨ変化などの刺激や環境変化を含む所望の条件下で実施して、それぞれＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合、または核内輸送受容体と核内輸送分子などの核内輸送受容体結合蛋白質との結合を検出することにより、これらの刺激や環境変化がこれらの結合に及ぼす影響を調べることができる。これにより、以下に述べるアッセイ系やスクリーニング系を構築することができる。ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を阻害する化合物、または核内輸送受容体と核内輸送分子などの核内輸送受容体結合蛋白質との結合におけるＨＣＶコア蛋白質の阻害を抑制する化合物により、ＨＣＶによる細胞障害および肝癌を抑制することが可能である。本発明は、核内輸送受容体と他の蛋白質との相互作用を指標として、化合物をアッセイまたはスクリーニングする方法を提供する。これらのアッセイやスクリーニングは無細胞系または細胞系で行うことができる。
２−１　ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合の検出
ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合に及ぼす化合物の作用を検出するアッセイ方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体とを接触させる工程、および
（ｂ）ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を検出する工程、を含む。
また、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を抑制する化合物のスクリーニング方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体とを接触させる工程、
（ｂ）ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を検出する工程、および
（ｅ）該結合を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法である。
これらのアッセイやスクリーニングにおいて用いられるＨＣＶコア蛋白質および核内輸送受容体は、両者が結合する活性を保持する限り特に制限はない。本発明において「結合」には、安定な結合、弱い結合、一時的な結合、および蛋白質間の様々な相互作用（例えば修飾、コンフォメーションまたは活性の変化の誘導など）等が含まれる。結合は直接的な結合でも間接的な結合でもよい。例えば、対象とする２つの蛋白質が、他の蛋白質を介して結合する場合なども含まれる。蛋白質の結合は、例えばＴｗｏハイブリッド法、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、ＥＬＩＳＡ法、ＢＩＡＣＯＲＥなどの公知の方法により検出することができる。
ＨＣＶコア蛋白質としては、ｐ２１（アミノ酸１−１９１）（配列番号：２）、ｐ１９（アミノ酸１−１７３）（配列番号：４）、ｐ１６（アミノ酸１−１５１）（配列番号：６）等が挙げられる。また、その他のコア蛋白質部分ペプチドであってもよい。核内輸送受容体としては、ＨＣＶコア蛋白質との結合活性を示すものが用いられる。上記の核内輸送受容体の活性を検出するアッセイまたはスクリーニングと同様、核内輸送受容体としては、例えばＰｓｅ１ｐ、Ｋａｐ１２３ｐ、またはこれらと相同な核内輸送受容体が好適に用いられる。また、それら以外にも、ＨＣＶコア蛋白質と結合する所望の核内輸送受容体を用いることができる。核内輸送受容体は、ＨＣＶコア蛋白質と結合する限り、これらの断片または他のペプチドとの融合蛋白質などであってもよい。ＨＣＶコア蛋白質および核内輸送受容体の様々な断片を利用して、両者の結合に本質的な領域を特定することは、当業者が通常行っている。
アッセイやスクリーニングに用いる蛋白質の形態に特に制限はなく、精製または粗精製蛋白質、可溶性蛋白質、担体と結合した蛋白質、膜に結合した蛋白質などであってよい。天然の蛋白質は、細胞抽出液から塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の蛋白質分離方法により調製することができる。組み換え蛋白質は、公知のベクター系を用いて大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等で目的の蛋白質を発現させ、調製することができる。発現ベクターとしては、大腸菌で発現させる場合は、例えばｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ社）やｐＢＴｒｐ２等のベクターが挙げられる。形質転換は、例えばＨａｎａｈａｎの方法［“Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ”Ｉｎ“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｖｏｌ．１，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），ｐｐ１０９−１３６，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９８５）］により行うことができる。また、酵母、動物細胞、または昆虫細胞などにおいても、例えば先に記載した発現ベクターを用いて発現させることができる。発現させる蛋白質にＨｉｓタグ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４：１２１−１５２（１９９０））やグルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等を付加して精製を容易にする方法は公知である。
被検試料としては特に制限はなく、上記したアッセイやスクリーニングと同様、例えば、天然または合成化合物、各種有機化合物、天然または合成された糖類、蛋白質、ペプチド、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、あるいは菌体成分などを挙げることができる。被検試料としてＤＮＡ発現ライブラリー等を用いて細胞系でアッセイやスクリーニングを行う場合は、常法によりライブラリーを細胞に導入する。被検試料としては核内輸送受容体蛋白質そのもの、その断片なども、望ましい試料の一つである。また、ＨＣＶコア蛋白質の断片などであってもよい。核内輸送受容体やＨＣＶコア蛋白質の断片は、ＨＣＶコア蛋白質または核内輸送受容体に対して競合的に作用することによって、両者の結合を低減させる可能性を持つ。
蛋白質間の結合は、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、Ｔｗｏハイブリッド法、ＢＩＡｃｏｒｅなどの公知の方法により検出することができる。
（１）免疫沈降法
例えば、核内輸送受容体を発現する培養細胞にＨＣＶコア蛋白質をコードする発現ベクターを導入し、この細胞から抽出液を調製する。ＨＣＶコア蛋白質または核内輸送受容体どちらかに対する抗体を固定したアガロースやセファロースのビーズ等でこの抽出液中に含まれる蛋白質複合体を回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。そして他方の蛋白質に対する抗体を用いたウエスタン・ブロットにより、免疫沈降で共沈した蛋白質を検出することができる。用いられる細胞に特に制限はない。例えば、酵母細胞、およびヒト細胞を含む動物細胞などが用いられ得る。核内輸送受容体は細胞が内因的に発現する蛋白質であってもよく、外来遺伝子の導入により発現させた蛋白質であってもよい。被検化合物を含む試料は、細胞培養時または細胞抽出物の調製後など、任意のタイミングで添加し得る。以下の各方法においても、被検化合物を含む試料を適用するタイミングに特に制限はない。
（２）プルダウンアッセイ
ＨＣＶコア蛋白質または核内輸送受容体のどちらか一方の蛋白質をＧＳＴと融合させた融合蛋白質として発現、精製し、グルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に固定する。ＧＳＴ融合蛋白質が固定されたグルタチオンセファロースを、精製した他方の蛋白質と混合し、洗浄によって未結合蛋白質を除去した後、過剰量のグルタチオンを含む緩衝液でＧＳＴ融合蛋白質を含む複合体をグルタチオンセファロースから遊離させＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。そしてＧＳＴと融合させなかった方の蛋白質に対する抗体を用いたウエスタン・ブロットにより、ＧＳＴ融合蛋白質と結合した蛋白質を検出することができる。
（３）Ｔｗｏハイブリッド法
ＨＣＶコア蛋白質または核内輸送受容体のどちらか一方の蛋白質を出芽酵母の転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合部位との融合蛋白質として発現するプラスミド及び、他方の蛋白質をＧａｌ４の転写活性化部位との融合蛋白質として発現するプラスミドを構築する。Ｇａｌ４の認識配列の下流にレポーター遺伝子をもつ酵母株に両プラスミドを導入する。レポーター遺伝子としては、例えばｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。二種類の融合蛋白質が発現し、酵母核内で核内輸送受容体とＨＣＶコア蛋白質が結合した場合、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合部位と転写活性化部位が物理的に近くなることにより、転写活性化が生じ、レポーター遺伝子の発現が誘導される。レポーター遺伝子の発現量を測定することにより、核内輸送受容体とＨＣＶコア蛋白質との結合を検出することができる。Ｔｗｏハイブリッド系によるアッセイまたはスクリーニングは、酵母細胞の他、哺乳動物細胞等で行うこともできる。
Ｇａｌ４以外にも、大腸菌蛋白質ＬｅｘＡを応用した方法が挙げられる。ＨＣＶコア蛋白質または核内輸送受容体を、大腸菌のＬｅｘＡ蛋白質のＤＮＡ結合部位との融合蛋白質として発現するプラスミドを構築する。また、他方の蛋白質を、酵母において転写活性能のある８８アミノ酸からなる大腸菌Ｂ４２ペプチドとの融合蛋白質として発現するプラスミドを構築する。ＬｅｘＡの認識配列の下流にレポーター遺伝子を持つ酵母株に両プラスミドを導入する。レポーター遺伝子としては、例えばｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。二種類の融合蛋白質が発現し、酵母核内で核内輸送受容体とＨＣＶコア蛋白質が結合した場合、ＬｅｘＡ蛋白質のＤＮＡ結合部位とＢ４２ペプチドの転写活性化部位が物理的に近くなることにより、転写活性化が生じ、レポーター遺伝子の発現が誘導される。レポーター遺伝子の発現量を測定することにより、核内輸送受容体とＨＣＶコア蛋白質の結合を検出することができる。
（４）ＢＩＡｃｏｒｅを用いた結合の検出
精製したＨＣＶコア蛋白質または核内輸送受容体をセンサーチップ（ＣＭ５）に固定化する。他方の蛋白質をＢＩＡｃｏｒｅに注入し結合曲線を評価することにより、センサーチップに固定された核内輸送受容体とＨＣＶコア蛋白質の結合を検出することができる。
上記のような方法などによって核内輸送受容体とＨＣＶコア蛋白質の結合を検出することができる。いずれの検出方法においても、被検化合物を含む試料は、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体とを接触させる前または後、あるいは同時に添加すればよい。Ｔｗｏハイブリッド法によるアッセイまたはスクリーニングにおいては、被検化合物を含む試料は細胞培地に添加されるが、または細胞に導入され得る。スクリーニングにおいては、被検化合物を含む試料の存在下および該被検化合物を含む試料の非存在下で同様の検出を行い、被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比べ、核内輸送受容体とＨＣＶコア蛋白質との結合を抑制する化合物を選択する。このアッセイやスクリーニングで選択される化合物は、Ｃ型肝炎ウイルスによる細胞の障害および肝癌を抑制する化合物の候補となる。
２−２　ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との結合の阻害の検出
ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との結合の阻害に及ぼす化合物の作用を検出することができる。このアッセイ方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料およびＨＣＶコア蛋白質の存在下で、核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質とを接触させる工程、および
（ｂ）核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合を検出する工程、を含む。
また、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との結合の阻害を抑制する化合物のスクリーニング方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料およびＨＣＶコア蛋白質の存在下で、核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合を検出する工程、および
（ｃ）ＨＣＶコア蛋白質による該結合の阻害を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法である。このアッセイ方法およびスクリーニング方法も、上記のＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を抑制する化合物のアッセイおよびスクリーニングと同様、細胞系または無細胞系で行うことができる。
上記のアッセイやスクリーニングにおいて使用される核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との組み合わせは、両者の結合がＨＣＶコア蛋白質により阻害される限り制限はない。上記の核内輸送受容体の活性を検出するアッセイ方法またはスクリーニング方法と同様、核内輸送受容体としては、例えばＰｓｅ１ｐ、Ｋａｐ１２３ｐ、またはこれらと相同な核内輸送受容体が好適に用いられる。核内輸送受容体結合蛋白質としては、核内輸送受容体により輸送される核内輸送分子が挙げられる。また、核内輸送受容体結合蛋白質としては、核内輸送分子と核内輸送受容体との相互作用に関与するＲａｎ　ＧＴＰ−ＧＤＰ交換活性促進因子（ＲａｎＧＥＦ）、ＮＰＣ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）及びＮＰＣを構成するＮｕｐ蛋白質、Ｒａｎ蛋白質（Ｒａｎ−ＧＴＰ）、ならびにＮＴＦ２（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｐａｎｓｐｏｒｔ　ｆａｃｔｏｒ　２）などであってもよい。Ｐｓｅ１ｐ、Ｋａｐ１２３ｐ、およびそれらの相同蛋白質に結合する核内輸送分子としては、例えばＹａｐ１ｐ、リボソーム蛋白質Ｌ２５、およびＰｈｏ４ｐなどが挙げられる。また、これらの蛋白質の断片または他のペプチドとの融合蛋白質などを用いることもできる。核内輸送受容体および核内輸送受容体結合蛋白質の様々な部分ペプチドを利用して、蛋白質間の結合に本質的な領域を特定することは、当業者が通常行っている。
このアッセイやスクリーニングにおいて用いられるＨＣＶコア蛋白質は、核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との結合を阻害する活性を有する限り制限はない。ＨＣＶコア蛋白質としては、ｐ２１（アミノ酸１−１９１）（配列番号：２）、ｐ１９（アミノ酸１−１７３）（配列番号：４）、ｐ１６（アミノ酸１−１５１）（配列番号：６）等が挙げられる。また、これらの断片であっても、核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との結合を阻害する活性を有する限り使用することができる。
用いられる蛋白質の形態および被検試料は、上記のＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を指標とするアッセイおよびスクリーニングと同様である。蛋白質間の結合は、上記と同様、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、Ｔｗｏハイブリッド法、ＢＩＡｃｏｒｅなどの公知の方法により検出することができる。ＨＣＶコア蛋白質の存在下での核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との接触の順序は特に制限されず、分離されている核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質とを、コア蛋白質の存在下で接触させてもよいし、あらかじめ接触（または結合）させた核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質とを、コア蛋白質に接触させてもよい。すなわち、核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との複合体にコア蛋白質を接触させるような場合であってもよい。
（１）免疫沈降法
核内輸送受容体およびその結合蛋白質を発現する培養細胞から抽出液を調製し、一方に対する抗体を固定したアガロースやセファロースのビーズで回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。そして他方の蛋白質に対する抗体を用いたウエスタン・ブロットにより、共沈してきた蛋白質を検出することができる。例えば、細胞にＨＣＶコア蛋白質をコードする発現ベクターを導入してＨＣＶコア蛋白質を発現させておく。あるいは、細胞抽出液を調製後にＨＣＶコア蛋白質を添加し、その後で免疫沈降を行ってもよい。
（２）プルダウンアッセイ
ＧＳＴと融合させた核内輸送受容体またはその結合蛋白質を発現、精製し、グルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に固定する。ＧＳＴと融合させた蛋白質が固定されたグルタチオンセファロースを、精製した他方の蛋白質と混合し、洗浄によって未結合蛋白質を除去した後、過剰量のグルタチオンを含む緩衝液でＧＳＴ融合蛋白質をグルタチオンセファロースから遊離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。そしてＧＳＴと融合させなかった方の蛋白質に対する抗体を用いたウエスタン・ブロットにより、結合した蛋白質を検出することができる。
ＨＣＶコア蛋白質による結合の阻害を起こすには、ＧＳＴ融合蛋白質（核内輸送受容体またはその結合蛋白質）が固定されたグルタチオンセファロースと他方の精製蛋白質とを混合する前または後、あるいは同時に、精製したＨＣＶコア蛋白質を混合する。その後、プルダウンアッセイを行う。
（３）Ｔｗｏハイブリッド法
核内輸送受容体またはその結合蛋白質のどちらか一方の蛋白質が出芽酵母の転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合部位と融合した蛋白質を発現するプラスミド及び、他方の蛋白質がＧａｌ４の転写活性化部位と融合した蛋白質を発現する発現プラスミドを構築する。Ｇａｌ４の認識配列の下流にレポーター遺伝子をもつ酵母株に両プラスミドを導入する。レポーター遺伝子としては、例えばｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。二種類の融合蛋白質が発現し、酵母核内で核内輸送受容体とその結合蛋白質が結合すると、転写活性化が生じ、レポーター遺伝子の発現が誘導される。したがってレポーター遺伝子の発現量を測定することにより、核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合を検出することができる。また、Ｇａｌ４以外にも、上記のように大腸菌蛋白質ＬｅｘＡおよびＢ４２ペプチド等を利用することもできる。ＨＣＶコア蛋白質により該結合を阻害するには、例えばＨＣＶコア蛋白質を発現する酵母株を用いてＴｗｏハイブリッド法を行う。
（４）ＢＩＡｃｏｒｅを用いた結合の検出
精製した核内輸送受容体または核内輸送受容体結合蛋白質をセンサーチップ（ＣＭ５）に固定化する。精製した他方の蛋白質をＢＩＡｃｏｒｅに注入し結合曲線を評価することにより、センサーチップに固定された核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質の結合を検出することができる。
ＨＣＶコア蛋白質により該結合を阻害するには、センサーチップに固定化された核内輸送受容体または核内輸送受容体結合蛋白質に、精製した他方の蛋白質をＢＩＡｃｏｐｅに注入するに前または後、あるいは同時に精製したＨＣＶコア蛋白質を注入する。
上記のような方法に基づいて、核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との結合を検出することにより、ＨＣＶコア蛋白質による該結合の阻害の程度を検出することできる。いずれの方法においても、被検化合物を含む試料は、核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質とを接触させる前または後、あるいは同時に添加すればよく、そのタイミングは制限されない。Ｔｗｏハイブリッド法によるアッセイまたはスクリーニングにおいては、被検化合物を含む試料は細胞培地に添加されるか、または細胞に導入され得る。スクリーニングにおいては、被検化合物を含む試料の存在下および該被検化合物を含む試料の非存在下で同様の検出を行い、被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比べ、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との結合の阻害を抑制する化合物を選択する。これらのアッセイやスクリーニングで選択される化合物は、Ｃ型肝炎ウイルスによる細胞の障害および肝癌を抑制する化合物の候補となる。
３．Ｃ型肝炎ウイルスによる細胞障害および肝癌を予防または治療するための医薬組成物
ＨＣＶコア蛋白質は核内輸送受容体と相互作用し、核内輸送受容体と核内輸送分子との結合を阻害して核内輸送受容体の輸送活性を阻害する。この事実は、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物や、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を抑制する化合物、およびＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合の阻害を抑制する化合物が、ＨＣＶによる核内輸送受容体の機能阻害を低減し、ＨＣＶによる細胞障害および癌化を抑制する作用を有する薬剤となることを示している。ＨＣＶに感染した肝細胞が高い確率で癌を発症する背景には、ＨＣＶ感染細胞における長期間をかけた染色体ＤＮＡの変異が関与していると考えられる。従ってＨＣＶ感染による発癌には、このような変異を誘発させるゲノムの不安定化も一因となっている可能性がある。本発明の薬剤によりＨＣＶによる核内輸送受容体の機能阻害を低減させれば、ＨＣＶ感染により引き起こされる宿主細胞のゲノム不安定化を防止することも可能になる。
本発明は、上記の化合物を有効成分として含む医薬組成物を提供する。本発明による医薬組成物は、ＨＣＶ感染による核内輸送受容体の活性阻害を抑制するために有用である。核内輸送受容体の活性としては、細胞質−核間輸送活性が挙げられる。また本発明による医薬組成物は、ＨＣＶ感染による肝細胞障害を予防または治療するために用いられ得る。ＨＣＶ感染による肝細胞障害には、ＨＣＶ感染による肝炎および肝硬変なども含まれる。また、本発明の医薬組成物は、ＨＣＶ感染に起因する肝発癌の予防にも用いられる。また、本発明の医薬組成物は肝癌発症後の治療に用いられ得る。ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を抑制する化合物、およびＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合の阻害を抑制する化合物は、上記の本発明のアッセイ方法により評価したり、本発明のスクリーニング方法により単離することができる。
また、このような化合物の例として、核内輸送受容体そのもの、核内輸送受容体の断片、あるいはＨＣＶコア蛋白質断片等を示すことができる。また、これらをコードする核酸であってもよい。核内輸送受容体には、ＨＣＶコア蛋白質によって抑制された本来の活性を補う作用が期待できる。あるいは核内輸送受容体またはＨＣＶコア蛋白質の断片は、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の機能抑制作用に対して競合的に作用することによって、核内輸送受容体の機能の抑制を低減させる可能性を持つ。これらの医薬組成物の投与によりＨＣＶ感染細胞の細胞障害および癌化を抑制することができる。
本発明の医薬組成物は、公知の製剤学的製造法により製剤化して投与することができる。また主成分である化合物自体を直接投与することもできる。本発明の医薬組成物は、主成分に応じて蛋白質製剤として、核酸製剤として、また低分子化合物製剤として製剤化され得る。製剤化する場合は、例えば、薬剤として一般的に用いられる媒体または担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することができる。投与形態や投与量は、例えば文献「Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７９，Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ」、「Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第６版」、「Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｄｏｓａｇｅ　ｆｏｒｍｓ　ａｎｄ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍｓ，第５版，Ｌｅａ　＆　Ｆｅｂｉｇｅｒ社，１９９０」、および「Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０」等により決定することもできる。また、該化合物がＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸によりコードされうるものであれば、該核酸を遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。生体内に導入することができるベクターとしては、レトロウイルスやアデノウイルスから誘導されたウイルスベクター、あるいはリポソーム等を用いた非ウイルスベクターが挙げられる。これら本発明による各種製剤は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、鼻腔内投与、気管支内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、患部への直接投与などの方法によって投与することができる。投与量は、患者の体重、年齢、健康度、あるいは投与方法などの諸要因に応じて変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。
すなわち、たとえばｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＨＣＶコア蛋白質発現細胞における核内輸送受容体の活性の阻害の抑制効果、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合の抑制効果、あるいはＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との結合阻害の抑制効果を、様々な化合物濃度間で比較することにより有効濃度が決定される。そして、上記のような各投与形態において、患部（肝臓）における投与化合物の濃度がその有効濃度に達するような投与量を経験的に決定する。一般的な投与形態においては、有効成分が全身に分布するものとして、体重１ｋｇ当たりの投与量を決定する。実験動物における薬物動態の解析結果に基づいて肝細胞における集積性が高いと考えられる化合物であれば、投与量をより低く設定することができる。化合物の投与量は、通常は１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲内であると考えられる。
本発明の医薬組成物は、決定された投与量と投与形態とを考慮して、媒体や担体と配合される。必要な投与量を達成することができるように有効成分を配合することは、当業者が通常行っている。本発明は、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を抑制する化合物、またはＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合の阻害を抑制する化合物を投与する工程を含む、ＨＣＶ感染による核内輸送受容体の活性阻害の予防および／または治療方法に関する。また本発明は、上記化合物を投与する工程を含む、ＨＣＶによる細胞の障害および肝癌の予防および／または治療方法に関する。また本発明は、本発明の医薬組成物の製造のための、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を抑制する化合物、およびＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と該受容体結合蛋白質との結合の阻害を抑制する化合物の使用に関する。
本発明の医薬組成物は、その容器、包装ケース、および／または説明書を含むことができる。本発明の医薬組成物としては、その容器、包装ケース、または添付される説明書に、ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する効力、ＨＣＶコア蛋白質と核内輸送受容体との結合を抑制する効力、および／またはＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体と核内輸送受容体結合蛋白質との結合阻害を抑制する効力を有することが記載されていることが好ましい。また説明書には、上記のような本発明の医薬組成物の投与方法を記載することができる。
本発明に基づいて、核内輸送受容体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸を本発明による医薬組成物を構成する有効成分として用いる場合、核内輸送受容体をコードするゲノムＤＮＡの全長若しくは一部、または核内輸送受容体ｃＤＮＡの全長若しくは一部の配列を含む核酸を、アデノウイルス、レトロウイルス、または無毒化した組換えＨＣＶ等の適当なベクターに組み込み、静脈内投与、患部への局所投与等の方法により患者に投与する。投与方法としては、インビボ法の他、エクスビボ法を用いることも可能である。
先に述べたような方法で予め決定された有効濃度が、患部（肝臓）において維持できるように導入遺伝子の発現量を設定する。このように設定された発現量を達成するために必要な核酸量またはベクターの力価を含むように、該遺伝子を発現する核酸またはそれを含むベクターを製剤化して用いることができる。導入する核酸としては、例えば核内輸送受容体をコードする核酸等が挙げられる。これにより患者体内における核内輸送受容体レベルを上昇させ、ＨＣＶ感染による肝細胞の障害および肝癌の予防や治療を行うことができる。
本発明による医薬組成物を構成する有効成分として核内輸送受容体を用いる場合、天然の蛋白質として、また遺伝子組み換え技術を利用した組換え蛋白質として調製することができる。天然の蛋白質は、当業者に周知の方法、例えば、核内輸送受容体に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、核内輸送受容体発現の高い組織や細胞から単離することが可能である。一方、組換え蛋白質は、例えば、核内輸送受容体をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。組換え蛋白質の生産に用いる細胞としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。用いられる発現ベクター、宿主細胞へのベクターの導入、および得られた形質転換体からの組換え蛋白質の精製は、公知の方法を用いて行うことができる。得られた核内輸送受容体を医薬組成物として用いる場合には、核内輸送受容体を直接投与することもできるが、公知の製剤学的製造法により製剤化して投与することもできる。
本発明による医薬組成物の有効成分としては、核内輸送受容体の活性を促進・上昇させる化合物を用いることもできる。このような化合物には、核内輸送受容体の発現を促進・上昇させる化合物が含まれる。発現を上昇させる化合物のスクリーニングは、例えば被検化合物を含む試料の存在下で細胞を培養し、核内輸送受容体またはそれをコードするｍＲＮＡをウェスタンブロットやノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ等により検出し、該受容体蛋白質またはｍＲＮＡレベルを上昇させる化合物を選択することにより行うことができる。または、核内輸送受容体をコードする遺伝子の転写制御領域の下流にレポーター遺伝子を連結し、被検化合物存在下で細胞を培養してレポーター活性を上昇させる化合物を選択することによりスクリーニングすることができる。核内輸送受容体遺伝子の発現を促進・上昇させる化合物を医薬として用いる場合には、上記核内輸送受容体を医薬として用いる場合等と同様に、公知の製剤学的製造法により製剤化して投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、全て本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］　ＨＣＶコア蛋白質の出芽酵母細胞内での発現と性状
ＨＣＶコア蛋白質を出芽酵母内で構成的に発現させた時のＨＣＶコア蛋白質のプロセッシングをウエスタンブロッティング法で下記のように観察した。ＨＣＶゲノムがコードする約３０００アミノ酸残基からなるポリプロテインの一部であるコア蛋白質を出芽酵母内で発現させるプラスミドを作製した。３種類の長さに対応する遺伝子部分、コア蛋白質ｐ２１（アミノ酸番号１−１９１）、ｐ１９（アミノ酸番号１−１７３）、ｐ１６（アミノ酸番号１−１５１）を酵母発現ベクターｐＫＴ１０−ＧＡＤ（Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．２：４９５−５０２，１９８８；Ｔａｎａｋａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４３０３−４３１３，１９９０）に挿入しｐＫＴ１０−ｐ２１，−ｐ１９，および−ｐ１６を作製した。ＨＣＶコア蛋白質ｐ２１，ｐ１９およびｐ１６をコードするＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列番号：１、配列番号：３、および配列番号：５に示し、それぞれのアミノ酸配列を配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：６に示す。ＨＣＶコア蛋白質ｐ２１，ｐ１９，ｐ１６の発現プラスミドを酵母細胞株Ｃ３（Ｋｕｇｅ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６，１７１０−１７２０，１９９７）に導入し、ＳＤ（−ＵＲＡ）（ウラシルドロップアウト）寒天培地で選択しコロニーを形成させた。
得られた酵母細胞をＳＤ（−ＵＲＡ）液体培地で対数増殖期まで培養し、集菌後細胞破砕溶液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ　ＰＭＳＦ，０．５ｍＭ　ＴＰＣＫ，２５μＭ　ＴＬＣＫ）に懸濁しグラスビーズを加えて激しく混ぜることにより破砕した。１２０００ｇで５分間遠心分離後、上清中の蛋白質（１０μｇ）をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法にて分離した。分離された蛋白質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，Ｇｉｂｃｏ）に２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％メタノール中でセミドライブロッター（日本エイドー）を用いてトランスファーした。５％スキムミルクを含むｗａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　リン酸緩衝液，ｐＨ７．５，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．０４％　Ｔｗｅｅｎ２０）中で、得られたＰＶＤＦ膜を４℃で一晩放置した。次にこのＰＶＤＦ膜をｗａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、０．５％スキムミルクを含むｗａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで２０００倍に希釈したモノクローナル抗ＨＣＶコア抗体（Ｋａｓｈｉｗａｋｕｍａ，Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９０，７９−８９，１９９６）で室温一時間の反応を行った。さらにこのＰＶＤＦ膜をｗａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、０．５％スキムミルクを含むｗａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで２０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウス抗体（Ｄａｋｏ）を二次抗体として室温一時間で反応させた。洗浄後ＥＣＬ（アマシャムファルマシア）を用いて発光反応を行い、Ｘ線フィルム（アマシャムファルマシア）を用いて検出した。
この結果、ｐ１６発現ベクターを持つ酵母株からは分子量約２万の蛋白質が、ｐ１９発現ベクターを持つ酵母株からは分子量約２万２千のコア蛋白質の発現が観察された。ｐ２１発現ベクターを持つ酵母株からは分子量約２万３千と２万２千の２本の蛋白質のバンドが確認された（図１Ａ）。これらの結果は、ＨＣＶコア蛋白質が哺乳動物細胞内で切断されるという公知の事実に良く合うものであり、コア蛋白質は酵母内でも哺乳動物細胞と同様の切断を受けると考えられた。
［実施例２］　ＨＣＶコア蛋白質の出芽酵母細胞内局在
ＨＣＶコア蛋白質の酵母細胞内の局在を蛍光抗体法で下記のように観察した。ＨＣＶコア蛋白質ｐ２１、ｐ１９、ｐ１６発現ベクターを持つ酵母細胞を対数増殖中期まで５ｍｌのＳＤ（−Ｕｒａ）培地中で培養し、１０分の１量の３７％ホルムアルデヒドを加え室温で１時間放置し固定した。固定された酵母細胞を集菌しＰＢＳ−及び、１Ｍソルビトールを含むＰＢＳで洗浄後、１Ｍソルビトール、２５ｍＭ　ＤＴＴを含むＰＢＳ中で室温で１０分間放置後、最終濃度３００μｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌｙａｓｅ　１００，０００Ｔ（生化学工業）で室温で３０分間処理することにより細胞壁を消化した。この細胞懸濁液３０μｌをスライドグラス上にスポットし室温１５分放置後、等量の１％ＮＰ−４０、１Ｍソルビトールを含むＰＢＳを加え室温で５分間放置した。この処理により酵母細胞をスライドグラス上に吸着させた。次にスライドグラスから溶液を除き−２０℃のメタノール溶液中で６分処理し、さらに−２０℃のアセトンで３０秒の処理を行った後に風乾させた。次にＡＢＢ溶液（０．０２％アジ化ナトリウム、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で１５分間処理した後、１００μｇ／ｍｌの抗ＨＣＶコア抗体５０μｌを加えて室温１時間反応させた。スライドグラスをＰＢＳで１０分間洗浄した。次にスライドグラスに１００倍希釈した２次抗体（ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇヤギ抗体ＩｇＧ）を加えたＡＢＢ溶液５０μｌをスポットして室温で４５分間反応させた。最終濃度で１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡで１０分間処理した後、最終濃度５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで室温１５分間染色した。ＰＢＳで洗浄後、最終濃度１ｍｇ／ｍｌのｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅを含む９０％グリセロール溶液を塗布してカバーグラスで封入した。
共焦点レーザー顕微鏡（バイオラッドＭＲＣ１０２４、Ｎｉｋｏｎ　Ｏｐｔｉｐｈｏｔｏ　２、対物レンズＰｌａｎＡｐｏ　６０倍）を用いてＨＣＶコア蛋白質において４８８ｎｍの波長で励起されるＦＩＴＣの蛍光を観察し、５６８ｎｍで励起されるヨウ化プロピジウムをＴ１／Ｔ２Ａフィルターユニットで検出した。
その結果、図１Ｂに示すようにＨＣＶコア蛋白質ｐ２１は細胞質及び核内に観察され、ｐ１９は細胞質にも存在するが主に核内に局在化されていた。またｐ１６は核内に局在化することが明らかになった。これらの結果は哺乳動物細胞で観察されている公知の結果と同様であり、酵母細胞はＨＣＶコア蛋白質の哺乳動物細胞における生物活性を観察するために有効な実験系であることが示された。
［実施例３］　ＨＣＶコア蛋白質による転写因子Ｙａｐ１ｐの核局在化阻害
ＨＣＶコア蛋白質が細胞質から核内に移行していることからＨＣＶコア蛋白質が細胞側の蛋白質の細胞質−核間輸送に影響を与えている可能性があると考えられた。転写因子Ｙａｐ１ｐ（Ａｃ．Ｎｏ．Ｐ１９８８０）は細胞質−核間をシャトルする転写因子である。Ｙａｐ１ｐの挙動を観察することにより細胞質から核への核内輸送及び、核から細胞質への核外輸送の両方への影響をモニターすることができる。また、Ｙａｐ１ｐ蛋白質は酸化ストレスに応答してその核外輸送のみが阻害され核に局在化する。この核局在化によりＹａｐ１ｐのレポーター遺伝子（Ｙａｐ１ｐ結合配列をプロモーターとしてβガラクトシダーゼ遺伝子をつなげた）（Ｋｕｇｅ，Ｓ．ａｎｄ　Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１４，６５５−６６４，１９９４）の転写活性を上昇させるため、酸化ストレスを与えた条件下でＹａｐ１ｐの転写活性化を観察することは、核内輸送への影響を観察する指標となる。ＨＣＶコア蛋白質によるＹａｐ１ｐの局在変化及び転写活性への影響を次のように観察した。
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）−Ｙａｐ１ｐ融合蛋白質の発現遺伝子を組み込んだ酵母細胞株Ｃ３（Ｋｕｇｅ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６，１７１０−１７２０，１９９７）にＨＣＶコア蛋白質発現プラスミドｐＫＴ１０ＧＡＤ−Ｐ２１，−ｐ１９，及び−ｐ１６を導入しＳＤ（−Ｕｒａ）寒天培地でコロニーを形成させた。得られた酵母細胞株をＳＤ（−Ｕｒａ）液体培地で対数増殖期まで培養し、転写活性能はβガラクトシダーゼ活性を検出することにより、ＧＦＰ−Ｙａｐ１ｐの細胞内局在は共焦点レーザー顕微鏡を用いてＧＦＰの蛍光を検出することにより観察した。酸化ストレスの条件は以前に記載の文献に従った（Ｋｕｇｅ，Ｓ．ａｎｄ　Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１４，６５５−６６４，１９９４；Ｋｕｇｅ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６，１７１０−１７２０，１９９７）。
その結果Ｙａｐ１ｐによるβガラクトシダーゼ遺伝子の転写活性化能（非誘導時および酸化ストレス時）はＨＣＶコア蛋白質の発現により阻害されたことから、Ｙａｐ１ｐの核内輸送がＨＣＶコア蛋白質により阻害されている可能性が示された。そこでＨＣＶコア蛋白質発現細胞を用いてＹａｐ１ｐの核局在化を観察した結果、図２に示すように酸化ストレスによるＹａｐ１ｐの核局在化はＨＣＶコア蛋白質ｐ２１，ｐ１９またはｐ１６の発現により阻害されることが明らかになった。阻害効果はｐ２１及びｐ１９では強くｐ１６では比較的弱かった。この阻害効果に関し、Ｙａｐ１ｐのＣ末端部分を欠失して酸化ストレスがなくても核に局在化するＹａｐ１ｐ（１−５７１）［Ｙａｐ１ｐ（Ａｃ．Ｎｏ．Ｐ１９８８０）のアミノ酸１〜５７１］を用いて速度論的な解析を行ったところ、同様の結果が得られた。しかしながら、ＨＣＶコア蛋白質は典型的な核内輸送シグナル（ＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　ＴのＮＬＳ）をもつ他の蛋白質の核内輸送は阻害しなかった。
［実施例４］　ＨＣＶコア蛋白質の核内輸送受容体の同定
本発明者らは、ＨＣＶコア蛋白質によりＹａｐ１ｐの核内輸送が特異的に阻害されるのは、その阻害が特異的核内輸送のステップで行われているためではないかと考えた。そこで次に、ＨＣＶコア蛋白質がどの核内輸送受容体によって運ばれているかを明らかにした。細胞質−核間輸送受容体のファミリー（Ｉｍｐｏｒｔｉｎβファミリー）の酵母変異株にＨＣＶコア蛋白質発現ベクターを導入して発現させた。その結果、図３に示すようにＫａｐ１２３を欠損させた変異株（ＰＳＹ９６７；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９４，８５９０−８５９５，１９９７）では発現させたＨＣＶコア蛋白質の核局在化は阻害された。したがって、ＨＣＶコア蛋白質はＫａｐ１２３ｐ核内輸送受容体により核内に輸送されることが明らかとなった。
さらにＲａｎ蛋白質依存的な核内輸送かどうかをｇｓｐ１−１温度感受性変異株（Ｗｏｎｇ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，３７５５−３７６７，１９９７）で検討した結果、３７℃の制限温度下ではＨＣＶコア蛋白質は核内に輸送されないことが明らかとなり、ＨＣＶコア蛋白質もＲａｎ　ＧＴＰ結合蛋白質依存的に核内輸送されることが明らかになった。
［実施例５］　Ｙａｐ１ｐ転写因子の核内輸送受容体の同定
ＨＣＶコア蛋白質により核内輸送が阻害されたＹａｐ１ｐ蛋白質の受容体を次に示すように同定した。
酸化ストレスを与えなくても定常的に核に局在化するＹａｐ１ｐ変異蛋白質（Ｙａｐ１ｐ（１−５７１））をＨＣＶコア蛋白質と共に核内輸送受容体の酵母変異株内で発現させた。その結果、ＰＳＥ１の温度感受性変異株（ｐｓｅ１−１，Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｍ．ａｎｄ　Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４，８５９０−８５９５，１９９７）を制限温度下で培養したときに、図４に示すようにＹａｐ１ｐ（１−５７１）蛋白質の核内輸送は著しく阻害された。この結果は、Ｙａｐ１ｐ蛋白質はＰｓｅ１ｐ核内輸送受容体によって核内に輸送されることを示している。またＹａｐ１ｐ蛋白質の核内輸送もまた、Ｒａｎ　ＧＴＰ結合蛋白質が関与して核内輸送されることが明らかとなった。
［実験例６］Ｐｓｅ１ｐ核内輸送受容体とＹａｐ１ｐとの結合およびＨＣＶコア蛋白質による結合阻害
ＨＣＶコア蛋白質によるＹａｐ１ｐの核内輸送阻害がＹａｐ１ｐの核内輸送受容体との結合阻害によるかを検討した。
ＰＳＥ１遺伝子（Ａｃ．Ｎｏ．Ｓ４５３５７）（Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｍ．ａｎｄ　Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：８５９０−８５９５，１９９７）をｐＧＥＸ６Ｐ−２（ファルマシアバイオテク）に組み込み、グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合Ｐｓｅ１ｐ蛋白質（ＧＳＴ−Ｐｓｅ１ｐ）発現プラスミドを構築した。Ｈｉｓタグ融合ＨＣＶコア蛋白質またはＨｉｓタグ融合Ｙａｐ１ｐ蛋白質の発現プラスミドは、コア遺伝子またはＹＡＰ１遺伝子（Ａｃ．Ｎｏ．ｘ５８６９３）をｐＥＴ−２８ｂ（ノバジェン社）に組み込むことにより作製した。各ベクターを大腸菌に導入し、発現誘導後に発現蛋白質を、ＧＳＴ−Ｐｓｅ１ｐはグルタチオンセファロース（アマシャムファルマシア）で、Ｈｉｓ−コア蛋白質またはＨｉｓ−Ｙａｐ１ｐはＮｉ−ＮＴＡレジン（ＱＩＡＧＥＮ）に結合させることにより精製した。
ＧＳＴ−Ｐｓｅ１ｐをグルタチオンセファロースに結合させた後、Ｈｉｓ−Ｙａｐ１ｐを加え、４℃で９０分反応させた。またこのときＨｉｓ−コア蛋白質を加えて阻害効果を解析した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で各蛋白質の量を観察した。添加したＧＳＴ−Ｐｓｅ１ｐはクマシブリリアントブルー染色で検出し、ＧＳＴ−Ｐｓｅ１ｐに結合したＹａｐ１ｐおよびコア蛋白質は抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタン法で検出した。
この結果、図５に示すように、Ｙａｐ１ｐは試験管内でＰｓｅ１ｐと直接結合することが確認され、さらにこの結合はＨＣＶコア蛋白質により阻害されることが明らかとなった。
以上の結果から、ＨＣＶコア蛋白質によるＹａｐ１ｐの核内輸送阻害は、ＨＣＶコア蛋白質がＹａｐ１ｐの輸送因子への結合を阻害するためであることが示唆された。哺乳動物細胞においてもＨＣＶコア蛋白質は類似の機能により核内輸送受容体の活性を阻害すると考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明により、Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質による核内輸送受容体の活性の阻害を抑制する化合物のアッセイ方法およびスクリーニング方法が提供された。これらの方法により得られる化合物は、ＨＣＶによる肝細胞の障害および癌化を予防または治療するための医薬となる。本発明の医薬により、ＨＣＶによる発癌を予防することが可能となる。ＨＣＶコア蛋白質による核内輸送受容体の阻害は、遺伝子発現や細胞複製に関与する核蛋白質の輸送を阻害し、遺伝子発現パターンや細胞複製サイクルに障害を与える可能性がある。これがゲノム複製や細胞周期に影響を与え、結果的に染色体の不安定性を招き長い年月かけて癌化を誘起し得る。本発明の医薬は、ＨＣＶによるこのようなゲノム不安定化を予防するためにも有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１Ａは出芽酵母細胞内で発現させたＨＣＶコア蛋白質ｐ２１、ｐ１９またはｐ１６のウェスタンブロッティング法による検出結果、Ｂは局在を観察した結果を示す写真である。ＢではＨＣＶコア蛋白質特異抗体による検出（図中の「コア蛋白質」）と、ＰＩによる核染色（図中の「核」）、及び両者を重ねた像を示す。また透過像も示す。ＨＣＶコア蛋白質ｐ２１は出芽酵母細胞内でプロセスされてｐ１９の分子量に近いものが検出された。またＨＣＶコア蛋白質ｐ２１、ｐ１９は核及び細胞質に検出され、ｐ１６は核内に検出された。
図２Ａはコントロール、ＢはＨＣＶコア蛋白質ｐ２１、Ｃはｐ１９、Ｄはｐ１６を発現させた出芽酵母細胞、Ｅはベクターのみを導入した出芽酵母細胞を示す写真である。それぞれの出芽酵母細胞にはＧＦＰ−Ｙａｐ１を発現させた。ＧＦＰの蛍光を観察することによりＨＣＶコア蛋白質発現によるＹａｐ１ｐの細胞内局在変化を観察した。Ｙａｐ１ｐは細胞質および核に局在するが酸化ストレスにより核に局在化する（図中のＯｘ．＋）。ＨＣＶコア蛋白質の発現により酸化ストレスによるＹａｐ１ｐの核局在化は阻害された。この阻害効果はｐ２１、ｐ１９によるものが顕著であった。
図３は、野生株（Ａ）または温度感受性ｋａｐ１２３変異株（Ｂ）におけるＨＣＶコア蛋白質の細胞内局在を示す写真である。ＨＣＶコア蛋白質の出芽酵母細胞内の核内輸送はＫａｐ１２３核内輸送受容体により行われることが明らかとなった。ｋａｐ１２３欠損変異株ではＨＣＶコア蛋白質は核内に輸送されないことが明らかになった。
図４は、野生株（図中ＰＳＥ１）または温度感受性ｐｓｅ１変異株（図中ｐｓｅ１ｔｓ）におけるＹａｐ１ｐの細胞内局在を示す写真である。Ｙａｐ１ｐ蛋白質の出芽酵母内の核内輸送はＰｓｅ１ｐ核内輸送受容体により行われることが明らかとなった。野生株（ＰＳＥ１）で核局在化するＹａｐ１ｐ（１−５７１）はｐｓｅ１温度感受性株（ｐｓｅ１ｔｓ）の非許容温度（３７℃）では細胞全体に広がり核内輸送が阻害された。
図５は、Ｐｓｅ１ｐ蛋白質とＹａｐ１ｐの相互作用のＨＣＶコア蛋白質による阻害を示す写真である。添加したＧＳＴ−Ｐｓｅ１ｐの量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果（クマシブリリアントブルー染色像）を示した（上段）。ＧＳＴ−Ｐｓｅ１ｐに結合したＹａｐ１ｐおよびコア蛋白質（図中ｃｏｒｅ）は、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタン法で検出した（下段）。パネル下に加えたコア蛋白質の量（Ｙａｐ１ｐ量に対する倍数）を示した。加えたコア蛋白質の量を増やすと、Ｐｓｅ１ｐに結合したＹａｐ１ｐの減少が観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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