(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロデキストリンの1級水酸基をアミノ基で置換したアミノシクロデキストリン誘導体のアミノ基を、高マンノース型、複合型、混成型から選ばれるアスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖を有するNα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nβ-グリコシルアスパラギンでアシル化した構造であることを特徴とする天然糖鎖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体。
【請求項２】
アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖が、(NeuAc-Gal-GlcNAc)2-(Man)3-(GlcNAc)2-あるいは(Gal-GlcNAc)2-(Man)3-(GlcNAc)2-からなる複合型糖鎖、あるいは、(Man)6-(GlcNAc)2-からなる高マンノース型糖鎖であることを特徴とする請求項１記載の天然糖鎖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体。但し、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、ＧａｌはＤ−ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ＭａｎはＤ−マンノースを示す。
【請求項３】
シクロデキストリンとして6-モノアミノ-β-シクロデキストリンを用いることを特徴とする請求項１または２記載の天然糖鎖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体。
【請求項４】
単糖を有するカルボン酸とシクロデキストリンの１級水酸基をアミノ基で置換したアミノシクロデキストリン誘導体を縮合して得られる単糖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体を、エンドグリコシダーゼの存在下、糖鎖転移反応させることを特徴とする、請求項１から3のいずれか１項に記載の天然糖鎖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体の製造法。
【請求項５】
単糖としてN-アセチルグルコサミンを有することを特徴とする請求項４記載の製造法。
【請求項６】
カルボン酸とアミノシクロデキストリン誘導体との縮合にジメチルチオホスフィン酸混合酸無水物法を用いることを特徴とする請求項４または５記載の製造法。
【請求項７】
エンドグリコシダーゼとしてエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(EC3.2.1.96)を用いることを特徴とする請求項４から６のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は天然糖鎖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体に関する。シクロデキストリン類は包接化合物として周知の化合物である。芳香族系の化合物を包接できることから医薬や食品添加剤として広く利用されている。一方、糖鎖は細胞表層において細胞の認識や接着などの重要な働きを担っていることが明らかになってきている。更に、種々の細胞にはこれら糖鎖と特異的に結合できる受容体蛋白質やレクチンの存在も明らかにされてきている。そこで、もし、シクロデキストリンに天然糖鎖を結合させることが出来れば、医薬を包接させ、糖鎖の認識機構を利用し、いわゆるドラッグデリバリーシステム、とりわけ標的ドラッグデリバリーシステムのツールとなり、新しい医薬の輸送技術を提供できるものと考えられる。
【０００２】
【従来の技術】
しかしながら、糖鎖の化学合成が極めて困難な課題であると同時に、シクロデキストリンの側鎖に糖を導入させる技術さえも難しく、天然糖鎖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体は未だその例を見ていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、天然糖鎖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体と、その製造法を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、複合糖ペプチドの製造法を参考に鋭意検討し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、シクロデキストリンの１級水酸基をアミノ基で置換したアミノシクロデキストリン誘導体のアミノ基を、高マンノース型、複合型、混成型から選ばれるアスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖を有するアシル基でアシル化した構造であることを特徴とする天然糖鎖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体と、単糖を有するカルボン酸とシクロデキストリンの１級水酸基をアミノ基で置換したアミノシクロデキストリン誘導体を縮合して得られる単糖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体を、エンドグリコシダーゼの存在下、糖鎖転移反応させることを特徴とするその製造法及び中間体である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
まず、本発明方法の原料となるシクロデキストリンの１級水酸基をアミノ基で置換したアミノシクロデキストリン誘導体としては周知の誘導体を使用できる。シクロデキストリンとしてはグルコース単位が６個のαシクロデキストリン、７個のβシクロデキストリン、８個のγシクロデキストリンなどを挙げることが出来る。加えて、化学的、酵素的に合成した誘導体であっても何ら支障はない。例えば、グルコース単位が５個以下のものや、９個以上のものなど、あるいは、グルコース以外の単糖をその構成糖とする誘導体などを挙げることが出来る。こうした一連のシクロデキストリン類の１級水酸基をアミノ基に置換した誘導体が利用できる。
【０００７】
アミノ基へ置換する方法も周知の方法を利用できる。水酸基に適当な脱離基を導入し、これをアジド化し、次いで還元する方法が一般的である。アミノ基の導入数にも何ら制限はない。例えば、モノアミノ体、ジアミノ体、あるいはより高度に置換された誘導体を利用することもできる。
【０００８】
シクロデキストリン誘導体の水酸基は必ずしも保護する必要はない。アミノ基をアシル化する際に、アミノ基と水酸基との反応性に差のあるアシル化の方法を選択すれば、水酸基無保護のまま使用することが出来る。例えば、コハク酸イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステルなどの活性エステルやジメチルチオホスフィン酸混合酸無水物法などを挙げることが出来る。特に、反応性に違いのあるジメチルチオホスフィン酸混合酸無水物法が優れている。
【０００９】
単糖を有するカルボン酸も特に制限はない。ジカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸など少なくとも一つのカルボキシル基を有し、他の官能基を分子内に有するカルボン酸が適当である。より高度に置換されたトリカルボン酸などを使用できることは言うまでもない。
【００１０】
単糖としては、エンドグリコシダーゼの糖鎖転移反応の基質となりうる単糖であれば、周知の単糖を使用できる。例えば、グルコース、N-アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトース、アラビノース、フルクトース、リボースなどを挙げることが出来る。特に、エンド-N-アセチルグルコサミニダーゼを使用するにはN-アセチルグルコサミンが好ましい。
【００１１】
単糖とカルボン酸との結合様式も何ら制限はない。糖のどの水酸基と結合してもかまわないが、エンドグリコシダーゼによる糖鎖転移反応を用いることを考慮すると糖のアノメリック位の水酸基との結合が、反応性の面からも推奨される。その結合様式はカルボン酸が少なくとも１つ有するカルボキシル基以外の官能基の種類によって決定される。例えば、ジカルボン酸では、エステル結合で、ヒドロキシ酸では0-グリコシド結合で結合できる。又、アミノ酸の側鎖へ導入する場合にはN-グリコシド結合やO-グリコシド結合などを挙げることが出来る。具体的には、Fmoc-グリコシルアスパラギンやBoc-グリコシルセリンなどを挙げることが出来る。
【００１２】
エンドグリコシダーゼの存在下、糖鎖転移反応させる方法としては、周知の方法を使用できる。例えば、Ｋ．タケガワ（K. Takegawa）らによる［ジャーナルオブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２７０巻、第３０９４〜３０９９頁（１９９５）］がアルスロバクター  プロトホルミエ（Arthrobacter protophormiae）由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンド−Ａ）による糖質への糖鎖転移反応、Ｋ．ヤマモト（K. Yamamoto）らによる［バイオケミカル  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、第２０３巻、第２４４〜２５２頁（１９９４）］ムコール  ヒエマリス（Mucor hiemalis）由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンド−Ｍ）による糖質への糖鎖転移反応、あるいは、Ｋ．ハネダ（K. Haneda）らによる［カ−ボハイドレート  リサーチ（Carbohydr. Res.）、第２９２巻、第６１〜７０頁（１９９６）］合成基質への糖鎖転移反応などを挙げることが出来る。
【００１３】
糖鎖供与体としては複合型糖鎖、高マンノース型糖鎖あるいは混成型糖鎖を持つ糖質を用いることにより各々に対応する糖鎖を持った目的物質を得ることが出来る。転移付加される糖鎖としては、例えば（ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡｃ）−あるいは（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡｃ）−といった複合型糖鎖、あるいは（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）−といった高マンノース型糖鎖である。
【００１４】
酵素反応系で重要な点は、反応を酵素律速条件下で行うことおよび糖鎖供与体と受容体の仕込濃度を高めることで、与酵素量を制限しつつ両基質を高濃度に仕込むことにより糖鎖転移反応が促進され副反応が抑えられて反応収率が向上する。
【００１５】
本発明に用いる糖鎖供与体としては、酸性糖であるシアル酸を含有する複合型糖鎖は、例えばヒトトランスフェリンや牛フェツインあるいは卵黄等からプロナーゼ等のプロテアーゼ処理とセファデックスＧ−２５によるゲルろ過を繰り返して調製される。シアリダーゼ処理等によりシアル酸を外せばアシアロ複合型糖鎖が調製される。高マンノース型糖鎖は例えば卵白アルブミン等から同様に処理した後にＤｏｗｅｘ５０イオン交換樹脂により精製して調製される。酵素的あるいは化学的に修飾された糖鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用いることができる。
【００１６】
本発明の反応は、単糖を有するカルボン酸とシクロデキストリンの１級水酸基をアミノ基で置換したアミノシクロデキストリン誘導体を縮合して得られる単糖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体と、天然由来の糖鎖供与体および酵素のエンドグリコシダーゼを緩衝溶液中で混合することにより行われる。糖鎖供与体の濃度を１０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７５ｍＭ、糖鎖受容体の濃度を２．５ｍＭ以上、望ましくは７．５〜２０ｍＭになるように加える。酵素量は５００Ｕ／モル（供与体）以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／モル（供与体）程度に制限し、例えば、エンド−Ｍの場合、２〜１０ｍＵ／ｍｌ程度の量で用いる。緩衝液としては、ｐＨ５〜８程度、濃度５〜２００ｍＭ、望ましくは１０〜１００ｍＭの適当な緩衝液が用いられる。エンド−Ｍの場合、通常ｐＨ５．５〜６．５、濃度５〜５０ｍＭの酢酸あるいはリン酸緩衝液中で反応が行われる。
【００１７】
反応温度は通常、室温〜５０℃程度、好ましくは３０〜４０℃で行われ、反応時間は１〜２４時間である。例えば、エンド−Ｍ酵素の場合、通常、３７℃で３〜１８時間程度反応が行われる。
【００１８】
酵素反応液中の反応生成物の分析は通常、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行われる。例えば、Ｃ18の逆相系（ＯＤＳ）カラムを用い、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水−アセトニトリル系溶媒で展開し、２１４ｎｍの紫外末端吸収により検出される。
【００１９】
生成したシクロデキストリンの１級水酸基をアミノ基で置換したアミノシクロデキストリン誘導体のアミノ基を、高マンノース型、複合型、混成型から選ばれるアスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖を有するアシル基でアシル化した構造であることを特徴とする天然糖鎖を側鎖に有するシクロデキストリン誘導体は公知の手段に従って反応終了液から容易に分離精製することが出来る。例えば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により反応終了液から反応生成物を分離し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよい。
【００２０】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、以下の実施例により何ら制限を受けるものではない。
【００２１】
【実施例１】
（１）中間体の製造：Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nβ-(2-アセトアミド-2-デオキシ-D-グルコピラノシル)アスパラギン111.5mgをDMF５mlに溶解させ、N,N-ジイソプロピルエチルアミン35μlと塩化ジメチルホスフィノチオイル２６mgを加えた。30分後、更に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン35μlと6-モノアミノ-β-シクロデキストリン230mgを加え、一晩撹拌した。水とジクロルメタンを加え分液し、水相をジクロルメタンで洗浄した。水相にダイヤイオンHP-20樹脂を加え、静置した後、樹脂を濾取した。水で充分洗浄後、メタノールで溶出し、減圧留去したところ、白色結晶が241.1mg得られた。これを、HPLCにより分取精製を行ったところ、171.6mgのグルコサミンを側鎖に有するシクロデキストリン(Fmoc-Asn(GlcNAc)-NH-βCD)が得られた。HPLCの保持時間;27.9分(Mightysil RD-18 6x250 mm; 0.1%TFA/ 15-35%アセトニトリル/ 40 min; 1.2 ml/min), MALDI TOF-MS 1699 計算値 1696.
【００２２】
（２）糖鎖供与体の調製：ヒトトランスフェリン（生化学工業）をプロナーゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過を繰り返してＡｓｎ残基のみを有するシアロ糖ペプチド［ＴＦ−ＳＧＰ，（ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ  （分子量２３３８）］を調製した。ヒトトランスフェリン由来シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰ）をシアリダーゼ処理してシアル酸（ＮｅｕＡｃ）を除いてアシアロ糖ペプチド［ＴＦ−ＡＳＧＰ、（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ  （分子量１７５６）］を調製した。卵白アルブミンをプロナーゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過、更にＤｏｗｅｘ５０イオン交換クロマトにより分離精製して、マンノース６個からなる高マンノース型糖ペプチド［Ｍ6ＧＰ；（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ（分子量１５１１）］を調製した。
【００２３】
（３）糖鎖転移反応：シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）あるいは高マンノース型糖ペプチド（Ｍ6ＧＰ）１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＦｍｏｃ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＮＨ−βＣＤ  ４００ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解し、エンド−Ｍ  １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを加え、３７℃で６時間反応させた。反応停止後反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣ［Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８カラム（φ６ｘ２５０ｍｍ、関東化学）、０．１％ＴＦＡ／１５％〜２５％（３０分）アセトニトリル水溶液  １．２ｍｌ／分］で２５４ｎｍの紫外吸収により分析した。シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）あるいは高マンノース型糖ペプチド（Ｍ6ＧＰ）から糖鎖受容体であるＦｍｏｃ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＮＨ−βＣＤ誘導体への糖鎖転移反応生成物がＨＰＬＣ分析の保持時間、各１５．０分、１７．６分および１８．０分（糖鎖受容体Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＮＨ−βＣＤ  ２５．５分）のピークとして検出され、その収率（対糖鎖受容体、モル比）は各１２．４％、９．１％および６．３％であった。
【００２４】
（４）反応生成物の単離と同定：シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）あるいは高マンノース型糖ペプチド（Ｍ6ＧＰ）からの糖鎖転移反応生成物に相当するＨＰＬＣ分析の溶出区分を分取し凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にかけた。ｍ／ｚ  各３６９５、３１２１および２８７０に各々の［Ｍ＋Ｎａ］+に相当する主イオンピークが認められ、各々、シアロ複合型糖鎖の転移したＦｍｏｃ−Ａｓｎ［（ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡｃ）2］−ＮＨ−βＣＤ（分子量  ３６７６．４）、アシアロ複合型糖鎖の転移したＦｍｏｃ−Ａｓｎ［（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡｃ）2］−ＮＨ−βＣＤ（分子量３０９３．９）および高マンノース型糖鎖の転移したＦｍｏｃ−Ａｓｎ［（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2］−ＮＨ−βＣＤ（分子量  ２８４９．６）であることが確認された。
【００２５】
【発明の効果】
シクロデキストリン（ＣＤ）に糖タンパク質に見られるアスパラギン（Ｎ）結合型糖鎖を酵素的に転移付加して合成した糖鎖を有するシクロデキストリン誘導体は、糖部分の標的細胞あるいは臓器の認識能とシクロデキストリンの抱接能を合わせ持った医薬の新しいドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として利用される可能性が高い。この様に本発明は新たな医薬の開発や製造への貢献が著しく、その工業的価値は大である。