(57)【要約】ＰＣ系除草剤に対して極めて高度な抵抗性を示すＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を提供する。以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求の範囲１記載の遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼタンパク質。
【請求項３】
請求の範囲１記載の遺伝子を有する組換えベクター。
【請求項４】
請求の範囲３記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項５】
請求の範囲１記載の遺伝子を有し、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有する植物。
【請求項６】
請求の範囲５記載の植物を、ピリミジニルカルボキシ除草剤存在下で育成することを特徴とする植物育成方法。
【請求項７】
請求の範囲１記載の遺伝子を選択マーカーとして使用し、該遺伝子を有する形質転換細胞を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、分岐鎖アミノ酸生合成経路における律速酵素であるアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子に関する。
背景技術
アセト乳酸シンターゼ（以下、「ＡＬＳ」という。）は、ロイシン、バリン及びイソロイシン等の分岐鎖アミノ酸生合成経路における律速酵素であり、植物の成長にとって必須な酵素として知られている。ＡＬＳは、高等植物全体に渡って広く存在していることが知られており、種々の微生物、例えば酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等においても見い出されている。
大腸菌及びネズミチフス菌には、ＡＬＳのイソ酵素が３種存在していることが知られている。これら各々のイソ酵素は、酵素の触媒活性を司る分子量の大きい触媒サブユニットと分岐鎖アミノ酸が結合することによりフィードバック阻害剤として機能する分子量の小さい制御サブユニットとからなるヘテロオリゴマーである（Ｃｈｉｐｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３８５，４０１−４１９，１９９８）。触媒サブユニットは、それぞれＩｌｖ　ＩＨ、Ｉｌｖ　ＧＭ、Ｉｌｖ　ＢＮオペロンに位置している。一方、酵母菌の場合、ＡＬＳは、単一な酵素であるが、細菌と同様に触媒サブユニットと制御サブユニットとからなり（Ｐａｎｇｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，５２２２−５２３１，１９９９）、触媒蛋白質サブユニットはＩＬＶ２座位に位置している。
一方、植物におけるＡＬＳの場合も、上述した微生物と同じように触媒サブユニットと制御サブユニットとからなることが知られている（Ｈｅｒｓｈｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．４０，７９５−８０６，１９９９．）。例えば、双子葉植物のタバコの場合、ＡＬＳの触媒サブユニットは、ＳｕＲＡ及びＳｕＲＢの２つの遺伝子座位によってコードされ（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８）、トウモロコシの場合、ＡＬＳの触媒サブユニットは、ａｌｓ　１及びａｌｓ　２の２つの遺伝子座位にコードされている（Ｂｕｒｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７，５５−６１，１９９１；Ｌａｗｒｅｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８，１１８５−１１８７，１９９２）。触媒サブユニットをコードする遺伝子に関しては、双子葉植物の場合、タバコだけでなくアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ナタネ、ワタ、オナモミ（Ｘａｎｔｈｉｕｍ）、アマランサス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）及びホウキギ（Ｋｏｃｈｉａ）について完全に塩基配列が決定されている（Ｃｈｉｐｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３８５，４０１−４１９，１９９８及び再公表特許ＷＯ９７／０８３２７参照）。しかしながら、単子葉植物で塩基配列が完全に決定されているのはトウモロコシだけである。
一方、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤並びにピリミジニルカルボキシ系除草剤（以下、「ＰＣ系除草剤」という。）等の除草剤は、このＡＬＳを阻害することによって植物の成長を抑制することが知られている（Ｒａｙ，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５，８２７−８３１，１９８４；Ｓｈａｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６，５４５−５４６，１９８４；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．９６，３１０−３１３，１９９１；Ｓｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．１９，５９−６７，１９９４）。
これら除草剤に対して抵抗性を有する植物としては、ＡＬＳをコードする遺伝子において、種を越えて保存されている保存領域中の１個又は２個のアミノ酸置換を引き起こす１個又は２個の塩基置換を有しているものが知られている。例えば、スルホニルウレア系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（Ｋａｔｈｌｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８；Ｍｏｕｒａｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，１８８，４９１−４９７，１９９２；Ｇｕｔｔｉｅｒｉ　ｅｔａｌ．，Ｗｅｅｄ　Ｓｃｉ．４３，１７５−１７８，１９９５；Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７３８１−１７３８５，１９９５及び特開昭６３−７１１８４号公報参照）、イミダゾリノン系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（Ｍｏｕｒａｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ，１８８，４９１−４９７，１９９２；Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４５２，３４１−３４５，１９９９及び特開平５−２２７９６４号公報参照）、或いはスルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に対して抵抗性を有するＡＬＳをコードするもの（Ｋａｔｈｌｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．７，１２４１−１２４８，１９８８；Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７３８１−１７３８５，１９９５；Ｈａｔｔｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６，４１９−４２５，１９９５；Ａｌｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１，１３５３，１９９６；Ｒａｊａｓｅｋａｒａｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．１１９，１１５−１２４，１９９６、特開昭６３−７１１８４号公報、特開平４−３１１３９２号公報及びＢｅｒｎａｓｃｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　Ｐａｔｅｎｔ　５６３３４３７，１９９７参照）が挙げられる。スルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に対して抵抗性を示すＡＬＳは、ＰＣ除草剤やトリアゾロピリミジン系除草剤に対しても交差抵抗性を示すことがわかっている（Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ　ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７３８１−１７３８５，１９９５）。また、スルホニルウレア系除草剤に特異的に抵抗性を示すＡＬＳを有する個体とイミダゾリノン系除草剤に特異的に抵抗性を示すＡＬＳを有する個体とを掛け合わせて、両方に抵抗性を示す植物体を作る試みもなされている（Ｍｏｕｒａｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２４３，１７８−１８４，１９９４）。さらに、ＡＬＳをコードする遺伝子を人為的に除草剤抵抗性遺伝子へ変えることも行われており（Ｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３，３５９−３６８，１９９６、特開昭６３−７１１８４号公報、特開平５−２２７９６４号公報、特表平１１−５０４２１３号公報参照）、１個のアミノ酸の欠失がスルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に抵抗性を示すことが明かにされている（特開平５−２２７９６４号公報参照）。
上述のように除草剤に対する抵抗性を有するＡＬＳ及びＡＬＳをコードする遺伝子について精力的に研究されてきた経緯があるが、ＰＣ系除草剤抵抗性を指標とし、ＰＣ系除草剤に対して特異的な抵抗性を有する変異ＡＬＳ遺伝子については現在までに報告が無かった。
そこで、本発明は、ＰＣ系除草剤に対して極めて高度な抵抗性を示すＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされるＡＬＳタンパク質、該遺伝子を有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体、該遺伝子を有する植物、該植物の育成方法及び、該遺伝子を選択マーカとして使用する形質転換細胞を選択する方法を提供することを目的とする。
発明の開示
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、野生型ＡＬＳにおける所定のアミノ酸残基を、所定のアミノ酸で置換してなる変異ＡＬＳがＰＣ系除草剤に対して極めて高度な抵抗性を示すことを見出し本発明を完成するに至った。
（１）すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
（２）また、本発明は、（１）記載の遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼタンパク質である。
（３）さらに、本発明は、（１）記載の遺伝子を有する組換えベクターである。
（４）さらにまた、本発明は、（３）記載の組換えベクターを有する形質転換体である。
（５）さらにまた、本発明は、（１）記載の遺伝子を有し、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有する植物である。
（６）さらにまた、本発明は、（５）記載の植物を、ピリミジニルカルボキシ除草剤存在下で育成することを特徴とする植物育成方法である。
（７）さらにまた、本発明は、（１）記載の遺伝子を選択マーカーとして使用し、該遺伝子を有する形質転換細胞を選択する方法である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアセト乳酸シンターゼタンパク質（以下、「変異型ＡＬＳタンパク質」という。）は、イネで発現している野生型ＡＬＳタンパク質における所定の部位を変異させることによって得ることができる。本発明の変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、本発明のＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。
変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質における５４８番目のトリプトファンがロイシンに置換されるとともに、野生型ＡＬＳタンパク質における６２７番目のセリンがイソロイシンに置換されたものである。図１に、変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列と野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列とを比較した結果を示す。なお、図１において、一列目のアミノ酸配列は変異型ＡＬＳタンパク質を示し、二列目のアミノ酸配列は野生型ＡＬＳタンパク質を示している。
変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子（配列番号２）は、野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子と比較して、野生型ＡＬＳタンパク質における５４８番目のトリプトファンをコードするコドンがロイシンをコードするコドンに置換されるとともに、野生型ＡＬＳタンパク質における６２７番目のセリンをコードするコドンがイソロイシンをコードするコドンに置換されたものである。図２に、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と野生型ＡＬＳタンパク質をコードする塩基配列とを比較した結果を示す。なお、図２において、一列目の塩基配列は変異型ＡＬＳタンパク質を示し、二列目の塩基配列は野生型ＡＬＳタンパク質を示している。
この変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、日本型イネ品種である金南風のゲノムＤＮＡに存在する野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子に対して、上述したような変異を導入することによって得ることができる。変異を導入する手法としては、従来より公知の手法を使用することができ、例えば、部位特異的変異導入法を用いることができる。部位特異的変異導入法は、市販のキット、例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造株式会社製）、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ（プロメガ社製）、ＥｘＳｉｔｅ（ストラタジーン社製）等を使用して行うことができる。
また、変異ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、ＰＣ系除草剤感受性の野生株培養細胞をＰＣ系除草剤の存在下で培養し、その後、出現したＰＣ系除草剤に対する抵抗性を示す変異株培養細胞から得ることができる。具体的には、先ず、ＰＣ系除草剤抵抗性の変異型培養細胞からｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成後、λｇｔ１１ファージのｃＤＮＡライブラリーを作出する（抵抗性特徴に関してヘテロ接合性と考えられるライブラリー）。これを、野生型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子の一部を含んでいる核酸プローブ（例えば、日本型イネ品種である日本晴から得られたＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＤＤＢＪ及びＥＭＢＬアクセッション番号：Ｃ７２４１１））を用いてスクリーニングし、得られる陽性クローンのインサートＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋にサブクローニングし塩基配列を決定する。その結果、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするインサートＤＮＡを有するクローンを選択することによって、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる。なお、上述のようにして得られた変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋に組み込んだプラスミドは、Ｍｕｔａｎｔ　ＡＬＳ　ｃＤＮＡ　ｉｎ　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３４８）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成１２年１１月２日付けでブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質と比較して、ＰＣ系除草剤に対する優れた抵抗性を有するばかりでなく、スルホニルウレア系除草剤及びイミダゾリノン系除草剤に対しても抵抗性を有する。特に、変異型ＡＬＳタンパク質は、ＰＣ系除草剤に対する抵抗性が高度である。このことは、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌等の発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターで形質転換された大腸菌等の除草剤感受性を調べることにより判断することができる。
ここで、ＰＣ系除草剤としては、化１に示すように、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ，ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ，ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃを例示することができる。
【化１】
2002044385.tif 000002
スルホニルウレア系除草剤としては、化２に示すように、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ，ｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｍｅｔｈｙｌ，ｐｙｒａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｅｔｈｙｌ，ｉｍａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎを例示することができる。
【化２】
2002044385.tif 000003
イミダゾリノン系除草剤としては、化３に示すように、ｉｍａｚａｑｕｉｎ，ｉｍａｚａｐｙｒを例示することができる。
【化３】
2002044385.tif 000004
一方、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を、標的とする植物に形質転換することによって、当該植物に対してＰＣ除草剤抵抗性を与えることができる。植物に形質転換する手法としては、従来より公知の手法を使用することができる。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて外来遺伝子を標的植物細胞に導入する手法を例示することができる。
具体的には、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ配列を含んでいるバイナリーベクターに変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を挿入する。このＴｉプラスミドを大腸菌等に形質転換する。次に、大腸菌等で増殖させた変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を保持するバイナリーベクターを、ヘルパープラスミドを含んでいるアグロバクテリウム菌に形質転換する。そして、このアグロバクテリウム菌を、標的とする植物に感染させた後、形質転換植物を同定する。同定された形質転換植物が培養細胞の場合には、従来より公知の手法により、その植物細胞を完全な植物に再生させることができる。
また、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を標的とする植物に形質転換する場合、従来より公知の手法を用いて直接的に植物体に導入してもよい。さらに、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを形質転換する方法としては、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を使用することができる。
一方、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、単子葉植物及び双子葉植物等のいかなる種類の植物に形質転換してもよい。変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を形質転換する対象の作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、大豆、棉、アブラナ、サトウダイコン及びタバコ等を挙げることができる。さらに、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって、芝草や樹木等を形質転換してもよい。
いずれの場合であっても、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を植物に形質転換することによって、当該植物に対して、ＰＣ系除草剤、スルホニルウレア系除草剤及びイミダゾリノン系除草剤に対する抵抗性を付与することができる。
ところで、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、植物形質転換実験における選択性マーカーとしても使用することができる。例えば、目的遺伝子を用いて植物細胞を形質転換する場合、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子と目的遺伝子とを有するベクターを植物細胞内に導入した後、当該植物細胞をＰＣ系除草剤の存在下で培養する。その結果、ＰＣ系除草剤の存在下で生存する植物細胞には、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子と共に目的遺伝子が導入されたことが判る。また、目的遺伝子及び変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子が植物細胞の染色体に組み込まれたかどうかは、その植物の表現型を観察した後、ゲノムサザーンハイブリダイゼーション或いはＰＣＲによって、これらの遺伝子のゲノム上の存在を調べることで確認することができる。
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いて更に詳細に説明する。ただし、本発明の技術範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕　ＰＣ除草剤抵抗性のイネ（金南風）培養細胞の作出
イネの種子（品種；金南風、学名：Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｖａｒ．Ｋｉｎｍａｚｅ）の籾を除いた後、当該種子を７０％のエタノール中に５分間浸漬し、その後、約５％のアンチホルミン中に２０分間浸漬し、その後、滅菌蒸留水で数回洗浄した。次に、この種子を表１に示す組成の培地上で静置培養した。
【表１】
2002044385.tif 000005
なお、上記培地組成中、２，４−Ｄは合成オーキシンである。培地を作製する際には、先ず、上記培地組成を１リッターのビーカーに入れ、蒸留水で１０００ｍｌにする。次に、これをｐＨ５．７に調製し、３ｇのゲルライトを添加する。次に、電子レンジを用いて加熱してゲルライトを解かした状態とし、分注機を用いて３０ｍｌずつ培養フラスコに分注する。次に、培養フラスコに３重のアルミ箔をかぶせ、オートクレーブ装置内で１２１℃で１５〜２０分間加熱滅菌する。その後、室温にまで冷却することによって、上記種子を静置培養するための培地を作製した。
続いて、この培地上で誘導されたカルスから胚乳の部分を除き継代培養を行った。そして、得られたカルスの一部を、ＰＣ系除草剤の１つあるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを１μＭ添加した液体培地（表１の培地組成と同様であり、ゲルライトを添加しないもの）中でおよそ２週間に１回継代しながら培養を行った。その結果、２週間〜６週間程度で培養細胞が枯死し始め、約２ヵ月後でほとんどが枯死して茶色に変色している培養細胞集団の中に、変色が無く細胞分裂を行っていると考えられる細胞塊が複数個得られた。これら細胞塊を単離し、培養を行った結果、２μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ存在下でも増殖する複数の細胞株を得ることができた。
その後、得られた複数の細胞株をｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍの添加濃度を順次上げて培養した結果、１００μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ共存下でも増殖できる細胞株が得られた。このｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性培養細胞（以下、抵抗性変異株）を１００μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを添加したＭＳ−２，４−Ｄ固体培地で継代培養した。継代培養した抵抗性変異株の一部を採取し、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ無添加のＭＳ−２，４−Ｄ液体培地に添加して、８日〜１０日間のサイクルで懸濁培養した。
そして、この抵抗性変異株約１．５ｇ（湿重量）を、ＭＳ−２，４−Ｄ液体培地５０ｍｌと所定の濃度のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍとを入れておいた２００ｍｌの三角フラスコに移植し、約２７℃で所定期間培養した。経時的にカルスの湿重量を測定し、移植した抵抗性変異株の湿重量を基準にして相対的な増殖量を求めた。なお、試験は、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ濃度を変化させたものを３連で行ない、標準誤差（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｅｒｒｏｒ）を算出した。抵抗性変異株におけるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ濃度変化と８日目の相対重量との関係を図３に示す。また対照として、金南風の野生株を用いて同様な実験を行い、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ濃度と８日目の相対重量との関係を測定した結果を図４に示す。
図４から判るように、野生株では、１ｎＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ添加区で増殖阻害されなかったが、１０ｎＭ以上のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ添加区で増殖阻害されていることが判る。一方、図３から判るように、抵抗性変異株では、１０μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ添加区においてもほとんど増殖に影響を受けていないことが判る。
一方、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに代えてｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎを用いた以外は、上述したように野生株及び抵抗性変異株の増殖率を測定した。野生株におけるｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ濃度変化と９日目の相対重量との関係を図５に示す。また、抵抗性変異株におけるｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ濃度変化と９日目の相対重量との関係を図６に示す。
図５から判るように、野性株では、１ｎＭのｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ添加で増殖阻害を受けており、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍの場合よりも高い感受性を示した。一方、図６から判るように、抵抗性変異株では、１μＭのｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ添加により増殖が強く阻害されている。なお、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ及びｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性は、野性株及び抵抗性変異株において、培養時間が長くても共に大きく変化することはなかった。また、増殖速度は、抵抗性変異株及び野性株において、ともにほぼ同じであった。
これらの結果から、抵抗性変異株は、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対して特異的に抵抗性を有するものであることが明らかとなった。また、抵抗性変異株は、野生株と比較してｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する抵抗性が向上していることも明らかとなった。
〔実施例２〕抵抗性変異株から部分精製したＡＬＳ酵素の薬剤感受性
本例では、実施例１で得られた抵抗性変異株から変異型ＡＬＳタンパク質を部分精製し、得られた変異型ＡＬＳタンパク質における薬剤感受性を検討した。変異型ＡＬＳタンパク質は以下のようにして部分精製した。
先ず、表１のうちゲルライトを除いた組成で液体培養法（ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ無添加）により抵抗性変異株を２００ｇ以上調製した。次に、これらの約１５０ｇを組織重量の３倍量の緩衝液−１（２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５ｍＭのチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、１０μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、組織重量の１／１０量のポリビニルポリピロリドンを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５）でヒスコトロンを用いてホモジナイズした。ホモジネートをナイロンガーゼでろ過した後、１５０００×ｇで２０分間遠心した。遠心上澄に、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、氷中に約１時間放置した。これを再度、１５０００×ｇで２０分間遠心し、その沈澱画分を約３０ｍｌの緩衝液−２（２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５ｍＭのＴＰＰ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液緩衝液ｐＨ７．５）に溶解した。これを再度、１５０００×ｇで２０分間遠心し、その上澄画分をセファデックスＧ−２５（アマシャム　ファルマシア　バイオテック社製）にアプライして素通り画分を約４０ｍｌ採取した。そして、採取した液を「粗酵素液」とした。
次に、粗酵素液のタンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙのマニュアルに従ってＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。その後、粗酵素液をワットマンフィルター（ワットマン社製）でろ過し、タンパク質量として適正な量の粗酵素液（１０〜１５ｍｌ）をＦＰＬＣ装置（アマシャム　ファルマシア　バイオテック社製）を使用して、３本連結したＨｉＴｒａｐ　Ｑ（アマシャム　ファルマシア　バイオテック社製）にアプライした。ＨｉＴｒａｐ　Ｑを用いてタンパク質成分を吸着させた後、ベッドボリュームの３〜５倍量の緩衝液−２で非吸着画分を流し出した。その後、吸着したタンパク質成分を、ベッドボリュームの１０倍量（１５０ｍｌ）の溶出液を用いて溶出した。ここで、溶出液は、０〜０．４Ｍの直線濃度勾配で緩衝液−２にＫＣｌを溶解させたものである。タンパク質成分を溶出した溶出液は、複数の分取用試験管に５ｍｌずつ分取した。なお、溶出したタンパク質成分に含まれるＡＬＳ酵素を安定化するために、２０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む緩衝液−２（０．５ｍｌ）を事前に分取用試験管の中へ添加しておいた。
次に、複数の分取用試験管に分取された溶出画分に含まれる変異型ＡＬＳタンパク質に由来するＡＬＳ活性を、以下のように測定した。測定反応に使用する反応溶液は、２０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭのＴＰＰ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＦＡＤ及び２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）からなる溶液に、測定対象の溶出画分を混合したものである。この反応溶液を１ｍｌ使用した。測定反応は、測定対象の溶出画分を添加した後、３０℃で４０分〜６０分間行った。また、測定反応は、０．１ｍｌの６Ｎ硫酸（あるいは０．２５Ｎの水酸化ナトリウム）を添加することにより停止させた。
次に、反応が終了した反応溶液を６０℃で１０分間インキュベートした。これにより、反応溶液中に含まれるアセト乳酸をアセトインに変化させた。
次に、反応溶液中に含まれるアセトインを定量するため、０．５％（ｗ／ｖ）のクレアチン１ｍｌと２．５Ｎの水酸化ナトリウムに溶かした５％（ｗ／ｖ）のα−ナフトール１ｍｌとを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、反応溶液における吸光度５２５ｎｍを比色することでアセトインを定量し、ＡＬＳ活性を評価した。なお、反応溶液中には、少量のピルビン酸ナトリウムが含まれるため、反応０時間をコントロールとした。
その結果、ＯＤ５２５ｎｍにおける吸光度が反応溶液０．２ｍｌ当たりで約７という高い値となった。しかしながら、上述した測定反応を水酸化ナトリウムで停止させ、ＡＬＳ活性以外によるアセトイン生成活性を調べた結果、この見掛け上のＡＬＳ活性の８０％近くが変異型ＡＬＳタンパク質以外の直接的なアセトイン生成活性であることが判った。そこで、変異型ＡＬＳタンパク質と変異型ＡＬＳタンパク質以外のアセトイン生成活性を、陰イオン交換樹脂を使用したＦＰＬＣで分離した。その結果、図７に示すように、２つの活性ピークが検出された。
これら２つの活性ピークのうち、どちらに変異型ＡＬＳタンパク質が含まれているのを判定するために、両ピークのアセトイン生成活性を調べた。その結果、変異型ＡＬＳタンパク質は、先に溶出したピークで示される画分に含まれていることがわかった。
そして、変異型ＡＬＳタンパク質を含む酵素溶液を用いて、当該変異型ＡＬＳタンパク質のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ及びｉｍａｚａｑｕｉｎに対する感受性を調べた。各除草剤に対する感受性は、酵素溶液を添加する前に除草剤を所定の濃度となるように反応液中に添加した以外は、上述した測定反応と同様にしてＡＬＳ活性を測定することによって評価した。また、比較のために、野生型ＡＬＳタンパク質を同様にして分離精製し、実験に供した。なお、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍは水溶液とし、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ及びｉｍａｚａｑｕｉｎはアセトン溶液とした。アセトン溶液は最終濃度１％とした。
ＡＬＳ活性阻害率とｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ濃度との関係を図８に示す。ＡＬＳ活性阻害率とｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ濃度との関係を図９に示す。ＡＬＳ活性阻害率とｉｍａｚａｑｕｉｎ濃度との関係を図１０に示す。なお、これら図８〜図１０において、白抜きの四角を結んだグラフは野生型ＡＬＳタンパク質を示し、塗りつぶしの四角を結んだグラフは変異型ＡＬＳタンパク質を示している。
また、上述した実験から、ＡＬＳ活性を５０％阻害する除草剤濃度（Ｉ５０値）をプロビット法に準じて算出し、変異ＡＬＳタンパク質におけるＩ５０値と野生型ＡＬＳタンパク質におけるＩ５０値との比を算出した。結果を表２に示す。
【表２】
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これら図８〜図１０及び表２に示すように、変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質と比較して除草剤存在下でも比較的高いＡＬＳ活性を示した。特に、変異型ＡＬＳタンパク質と野生型ＡＬＳタンパク質とでは、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ除草剤に対する感受性が最も顕著な差が見られた。すなわち、変異型ＡＬＳタンパク質は、特にｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する抵抗性に優れたものであることが判った。
〔実施例３〕変異型ＡＬＳ遺伝子のクローニング
抵抗性変異株から変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子（変異型ＡＬＳ遺伝子）をクローニングする際に使用するプローブを以下のようにして調製した。本例においてプローブとしては、トウモロコシのＡＬＳ遺伝子と高い相同性を示したイネ（日本晴）由来部分ｃＤＮＡを使用した。
（１）トウモロコシのＡＬＳ遺伝子と高い相同性を示したイネ（日本晴）由来部分ｃＤＮＡの塩基配列の決定
（社）農林水産先端技術産業振興センター及び農林水産省農業生物資源研究所が行っているイネゲノムプロジェクトの一環でイネ（日本晴）のｃＤＮＡの部分塩基配列の決定が行われており、ｃＤＮＡの部分塩基配列データベースが構築されている。このデータベースに含まれる約３５０ｂｐの塩基配列として既に知られているｃＤＮＡクローン（アクセッション番号：Ｃ７２４１１）がトウモロコシにおけるＡＬＳ遺伝子と高い相同性を示した。なお、トウモロコシにおけるＡＬＳ遺伝子は完全に塩基配列が決定されている。
そして、このｃＤＮＡクローン（アクセッション番号：Ｃ７２４１１）を農業生物資源研究所から入手し、以下のように塩基配列を決定した。なお、このＣＤＮＡクローンは、ＡＬＳホモログ遺伝子がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋中に挿入されており、大腸菌内で自律複製を行うことができる形であった。
先ず、このＡＬＳホモログ保持プラスミドベクターを大腸菌（ＤＨ５α）へ形質転換した。プレートより得られた白色のコロニーを液体培養し、菌体より常法に従いプラスミドを抽出した。インサートＤＮＡはプラスミドベクター中のマルチクローニングサイトの制限酵素、Ｓａｌ　ＩとＮｏｔ　Ｉの間に挿入されていたのでこの２つの酵素でベクターを消化し、アガロース電気泳動でインサートの確認を行った。この後、得られたＡＬＳホモログ保持プラスミドベクターをＲＮａｓｅＡ、ＰＥＧ、ＬｉＣｌ等を使用する常法に従って精製し、プライマー及びＡＢＩ　ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔを用いシークエンス反応を行った。ＰＣＲ反応の条件はプロトコールに従った。またプライマーはＭ１３プライマー及び決定した塩基配列から設計した合成プライマーを用いた。得られたＰＣＲ産物をエタノール沈殿で精製し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３１０シークエンサーで塩基配列を決定した。
このＡＬＳホモログ保持プラスミドベクターには、１．６１ｋｂｐのインサートＤＮＡが入っているという情報であった。得られたＡＬＳホモログ保持プラスミドベクターをＳａｌＩとＮｏｔＩの制限酵素で消化し、電気泳動を行ったところ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋も相当する約３ｋｂｐのバンドとインサートＤＮＡ断片に相当する１．６ｋｂｐのバンドが検出された（図示せず）。インサートＤＮＡ部分についての全塩基配列を決定し、トウモロコシの塩基配列の相同性検索を行った結果、図１１に示すように、８４．７％の相同性を示した。したがって、このＡＬＳホモログは日本晴におけるＡＬＳ遺伝子の部分ｃＤＮＡであると判断されたので、Ｓａｌ　Ｉ及びＮｏｔ　Ｉで消化して切り出したインサートＤＮＡをプローブとした。なお、図１１において、一列目は日本晴におけるＡＬＳ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列であり、二列目はトウモロコシにおけるＡＬＳ遺伝子の塩基配列である。
（２）抵抗性変異株からのｍＲＮＡの調製
先ず、液体窒素で凍結した抵抗性変異株を、乳鉢と乳棒を用いて摩砕した後、ミキサーにより３０秒間細かく粉砕した。粉砕後の粉末を抽出緩衝液〔（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ９．０，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，１重量％ＳＤＳ，５ｍＭ　ＥＤＴＡ）：（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）：（Ｔｒｉｓ飽和フェノール）＝１５：３：２０〕中に懸濁し，その後よく撹拌した。この溶液を１２０００×ｇで１５分間遠心し上澄を回収し、２００ｍｌのＰＣＩ〔（Ｔｒｉｓ飽和フェノール）：（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）：（ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ）＝２５：２４：１〕を加え、４℃で１０分間振とうした後、１２０００×ｇで１５分間遠心し上澄を回収した。この操作を２回繰り返した。得られた上澄に１／２０量の５ＭのＮａＣｌ、２．２倍量のエタノールを加え、−８０℃で３０分間静置した後、１２０００×ｇで５分間遠心することで沈殿を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、乾燥させた後に１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール溶液に溶かし、この溶液を２７０００×ｇで１０分間遠心して不溶性画分を除いた後、１０ＭのＬｉＣｌを１／４量加えて氷上で１時間静置した。これをさらに２７０００×ｇで１０分間遠心して沈殿を回収し、４ｍｌのＨ２Ｏに溶かした後、２６０ｎｍの吸光度を測定してＲＮＡの濃度を求めた。これに１／２０量の５Ｍ　ＮａＣｌと２．２倍量のエタノールを加えて、−８０℃で３０分間静置した後、２７０００×ｇで１０分間遠心して沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄後乾燥させた。これを適量のＨ２Ｏに溶かしトータルＲＮＡ溶液とした。なお、遠心操作は４℃で行った。
このトータルＲＮＡから次の方法でｍＲＮＡの分離精製した。抽出したトータルＲＮＡ溶液の液量に対して等量の２×結合バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，１Ｍ　ＮａＣｌ）を加えた。０．１ｇのｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（アマシャム　ファルマシア　バイオテック社製）を詰めたカラムを１×結合バッファーで洗浄した後、このトータルＲＮＡ溶液をカラムにかけた。１×結合バッファーで洗浄した後、溶出バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ）をアプライし、溶出液を０．５ｍｌずつ回収した。なお、カラムを素通りした画分については、別のｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（アマシャム　ファルマシア　バイオテック社製）カラムにかけ、同様の操作を行った。各画分の吸光度から溶出されたｍＲＮＡの濃度を計算した後、１／１０量の１０Ｍ　ＬｉＣｌと２．５倍量のエタノールを加えて−８０℃で３０分間静置した。これを遠心して沈澱画分を乾燥した後１００μｌのＨ２Ｏに溶かした。こうして得られたｍＲＮＡをショ糖密度勾配遠心法によりサイズ分画した。
分離精製したｍＲＮＡを、２５％ショ糖溶液及び５％ショ糖溶液を用いて密度勾配をつけた遠心管にアプライし、スウィングローターを用いて４℃、２７０００ｒｐｍで１５時間超遠心を行った。遠心後、密度勾配の順に各０．５ｍｌずつ分画回収した。それぞれの画分の吸光度を測定し、回収されたｍＲＮＡの濃度を計算するとともにＥＣＬキット（ＥＣＬ　ｄｉｒｅｃｔ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃ社）によるハイブリダイゼーションによりＡＬＳ　ｍＲＮＡの存在を確認した。ハイブリダイゼーションは、上記（１）で調製したプローブを用いて４２℃で１６時間行った。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、キット添付の１次洗浄バッファーを用いて４２℃で５分間を２回、その後、２×ＳＳＣ溶液を用いて４２℃で５分間を１回行った。洗浄後の膜は、透明のプラスティックフィルムで包みキット付属の発光試薬に浸し多状態を維持し、その後、Ｘ線フィルムに感光させた。
これらの操作により、抵抗性変異株からは、約３５ｍｇのトータルＲＮＡを抽出するとともに、約４ｍｇのｍＲＮＡを抽出することができた。また、ショ糖密度勾配遠心法では、予想される画分にハイブリダイゼーション腸性のスポットが認められた。
一方、野生株を用いたところ、約９５ｍｇのトータルＲＮＡを抽出するとともに、約７ｍｇのｍＲＮＡを抽出することができた。野生株からｍＲＮＡを抽出する際には、抵抗性変異株に代えて野生株を使用した以外は、上述した方法を適用した。
（３）抵抗性変異株由来のｃＤＮＡライブラリの作製
上記（２）で精製したｍＲＮＡ２μｇ及びｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行い、抵抗性変異株由来のｃＤＮＡライブラリの作製した。
先ず、逆転写反応にはキット添付のＲＴａｓｅを使用し、その後の相補鎖伸長反応にはキットに添付のＴ４　ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。相補鎖伸長反応の際には、ｃＤＮＡ合成の収率を計算するために３２Ｐ−ｄＣＴＰを加えた。合成したｃＤＮＡは、アダプターを付加した後、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング方によりλファージへ組み込んだ。
ｃＤＮＡに付加するアダプターとしては、宝酒造株式会社製のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−Ｂａｍ　ＨＩアダプターを使用した。ｃＤＮＡを含む溶液にｃＤＮＡに対してモル濃度で５０倍のアダプターを加え、この混合溶液にＴ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を加えてライゲーション反応を４℃で一晩行った。この反応溶液をＡｓａｈｉＰａｋ　ＧＳ　７１０カラム（旭化成工業株式会社製）を用いてＨＰＣＬにアプライし、溶出液を波長２６０ｎｍの紫外線でモニターした。溶出液を０．５ｍｌ程度ずつ２５本に分画し、各フラクションをＣｅｒｅｎｋｏｖカウンターで測定し、カウントの高いフラクションを３〜４本回収した。このフラクションをＴ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ（宝酒造株式会社社製）を用いてアダプターの５’末端をリン酸化した後、λｇｔ　１１　Ｅｃｏ　ＲＩアームを加えてライゲーションした。ライゲーション反応は、溶液にＧｉｇａＰａｃｋ　Ｇｏｌｄ　ＩＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を加えて室温で２時間行った。反応終了後、２００μｌのＳＭバッファーと８μｌのクロロホルムを加えてファージ溶液とした。このファージ溶液を１０倍希釈し、これの１μｌを大腸菌（Ｙ−１０８８）に感染させた後、０．７％トップアガーを加え、ＬＢプレートに蒔き、４時間から８時間後にプレートに現れたプラークの数を数えることでタイターを測定した。
ＤＥ　８１ペーパーとＣｅｒｅｎｋｏｖカウンティングの結果から抵抗性変異株由来のｃＤＮＡが約７４ｎｇ合成されたことが判った。アダプターを付加したベクターのライゲーション後のＣｅｒｅｎｋｏｖカウンティングの結果から抵抗性変異株について約２２ｎｇのインサートが挿入されたλＤＮＡが得られた。このλＤＮＡをファージへパッケージングし、これを抵抗性変異株細胞由来のｃＤＮＡライブラリとした。このライブラリ溶液のタイターは、１６６００ｐｆｕ／μｌであった。
一方、野生株から抽出したｍＲＮＡを用いて、上述した方法に準じてｃＤＮＡライブラリを調製したところ、野生株由来のｃＤＮＡが約３８ｎｇ合成されたことが判った。また、野生株についてインサートが挿入されたλＤＮＡが約５ｎｇ得られた。さらに、野生株由来のｃＤＮＡライブラリ溶液のタイターは１８１６０ｐｆｕ／μｌであった。
（４）ＡＬＳ遺伝子を含むｃＤＮＡのスクリーニング
プレートに２００００個程度のプラークが出るように、上記（３）で調製したライブラリ溶液を希釈した後、野性株由来及び抵抗性変異株由来のファージをそれぞれ１０枚ずつ蒔いた。プラークをニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｎｅｌｌ社製，ＰＲＯＴＯＲＡＮ　ＢＡ８５，ポアサイズ０．４５μｍ）へ転写し、転写したニトロセルロースメンブレンを変性溶液（０．５Ｍ　ＮａＣｌ，１．５Ｍ　ＮａＣｌ）、続いて中和溶液（１．５ＭＮａＣｌ，０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に約２０秒浸した。濾紙を用いてニトロセルロースメンブレンから余分な水分を除去した後、ニトロセルロースメンブレンを８０℃で２時間ベーキングした。なお、ニトロセルロースメンブレンに代えてＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャム　ファルマシア　バイオテック社製）を用いた際には、ベーキング操作は省略し、０．４ＭＮａＯＨにて２０分間固定した。
上記（１）で調製したインサートＤＮＡを、ＲＩ及び非ＲＩの２種類の方法でラベル化しプローブＤＮＡとして使用した。ＲＩラベル化とハイブリダイゼーションは次の方法で行った。まず、約２００〜５００ｎｇのプローブＤＮＡを熱変性させた。ＢｃａＢＥＳＴ　ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いてラベルを行った。このラベル化反応に際して、キットに添付のバッファー、ランダムプライマー及び３２Ｐ−ｄＣＴＰを加えた。ＢｃａＢＥＳＴを加え、６５℃で３０分間インキュベートした。その後、ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。ニトロセルロースメンブレン８枚程度にプローブがおよそ１００ｎｇ程度含まれる容量を加え、４２℃、一晩、微振とうでハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液で３回洗浄し後、ＢＡＳ　２０００イメージングアナライザー（富士フィルム株式会社製）のイメージングプレートに約１時間露光させた。露光後イメージングアナライザーを用いて陽性クローンを検出した。
一方、非ＲＩラベル化は次の方法で行った。約２００〜５００ｎｇのプローブＤＮＡを熱変性させた後、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）添付のＤＮＡ標識試薬（ペルオキシダーゼ）及びグルタルアルデヒドを加えて３７℃でインキュベートした。この場合、ニトロセルロースメンブレン膜８枚程度におよそ１００ｎｇ程度のラベル化プローブＤＮＡが含まれるように添加した後、４２℃、一晩、微振とうでハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、ｐｒｉｍａｒｙ　ｗａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを室温、１０分間、３回、その後２×ＳＳＣで室温、１０分間、１回で膜の洗浄を行った。膜をＥＣＬキット添付の発光液に浸し、３０分から３時間でＸ線フィルムに露光した。
ハイブリダイゼーション（１次スクリーニング）の結果得られた陽性ファージを滅菌した爪楊枝でトップアガーごと掻き取り、２００μｌのＳＭバッファーに懸濁し、ファージ溶液を得た。このファージ溶液を各クローンごと適宜希釈を行い、大腸菌Ｙ−１０８８株に感染させ、ＬＢプレートに蒔いた。この新たに作製したプレートを用いて、同様にハイブリダイゼーション（２次スクリーニング）を行い、陽性ファージを２００μｌのＳＭバッファーに懸濁し、シングルファージとした。なお、２次スクリーニングでシングルファージとして単離できなかった場合、もう一度希釈してＬＢプレートに蒔き、ハイブリダイゼーション（３次スクリーニング）を行ってシングルファージにした。
このシングルファージから次の方法でλＤＮＡを調製した。竹串又は爪楊枝を使って陽性クローンのプラークから集めたλファージを、新鮮な宿主大腸菌（Ｙ１０８８）懸濁液を５μｌ含む２００μｌの２ｘＹＴ培地（１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と０．２％マルトースを含む）にイノキュレートした。静置状態４２℃で一晩インキュベートした後、再度宿主大腸菌（Ｙ１０８８）懸濁液を２５μｌ含む１ｍｌの２ｘＹＴ培地（１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と０．２％マルトースを含む）にイノキュレートし一晩振とう培養した（以上が前培養）。前培養した溶液（１０〜５０μｌ）を１０ｍＭのＭｇＣｌ２と０．５ｍｌの大腸菌Ｙ１０８８懸濁液とを含む１２ｍｌの２ｘＹＴ培地にイノキュレートし、比較的強く振とうしながら溶菌後濁度が増すまで４２℃で一晩インキュベートした。培養終了後、５０μｌのクロロホルムと１．２ｍｌの５Ｍ　ＮａＣｌを加え、振とうしながら４２℃で１０分間インキュベートした。これを２７０００×ｇで１０分間遠心した後、新たに遠心管に移した上澄に５ｍｌの５０％ＰＥＧを加え、氷上で１時間以上インキュベートした。これを２７０００×ｇで１０分間遠心し上澄を捨てた後、再度２７０００×ｇで遠心して液体部分を捨てた。沈澱画分を４μｇのＤＮａｓｅ　Ｉ、２０μｇのＲＮａｓｅ　Ａならびに１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む３０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５の３００μｌに懸濁させ、１．５ｍｌチューブへ移した。この懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした後、７．５μｌの２０％ＳＤＳ、３μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）、１２μｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡを加え、さらに５５℃で１５分間インキュベートした。これに１５０μｌのフェノールを加えて激しく撹拌した後、トミーマイクロ遠心機ＭＲ−１５０（トミー精工社製）を用いて１５０００ｒｐｍで３分間遠心し、水層を回収した。集めた水層に８００μｌのエチルエーテル（蒸留水を加えて過酸化物を除いておく）を加え激しく撹拌した後、１５０００ｒｐｍで１０秒間遠心しエーテル層を捨てた。このエーテル抽出操作を繰り返した後、水層に残存するエーテルを窒素ガスで除去した。水層に３０μｌの５Ｍ　ＮａＣｌ、８７５μｌのエタノールを加えることで沈澱してきたλＤＮＡを速やかに回収し、λＤＮＡを１ｍｌ程度の７０％エタノールでリンスした後、約１分間減圧下で乾燥させてエタノールを除いた。これを２０μｌ〜５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かしてλＤＮＡ溶液とした。
得られたλＤＮＡ中のインサートＤＮＡのサブクローニング及び塩基配列決定は次の方法で行った。得られたλＤＮＡ溶液（１μｌ）をＮｏｔ　Ｉで消化し、インサートＤＮＡを切り出した。切り出し反応の反応液組成は制限酵素添付の説明書に従い、３７℃で約２時間反応させた後、１％アガロースゲルを使用した電気泳動でインサートサイズの確認を行った。インサートＤＮＡを持つλＤＮＡ（１０μｌ〜２０μｌ）をＮｏｔ　Ｉで消化し、インサートＤＮＡを切り出した。これを分取用のアガロースゲルで分離した後、相当するバンドをゲルから切り出し、常法によりインサートＤＮＡを精製した。このインサートＤＮＡとＢＡＰ処理（エビのアルカリフォスファターゼを用いた脱リン酸化処理）したベクターとをモル比で１：１の割合で混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで１６℃、２時間以上ライゲーション反応を行った。なお、インサートＤＮＡはＮｏｔ　Ｉで切り出したものを材料としたので、ＢＡＰ処理についてもＮｏｔ　Ｉで切断したベクターについて行った。ライゲーション終了後、その溶液の一部をコンピテントセル（ＤＨ５α）と混合し、氷上に３０分間放置した。これを４２℃で３０秒間ヒートショックを行い、さらに氷上に２分間放置した。続いてＳＯＣを添加し３７℃で１時間インキュベートした後、２×ＹＴ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン入り）の１００μ及び３％Ｘ−Ｇａｌ３０μｌならびに１Ｍ　ＩＰＴＧ３μｌを混合したものを事前に均一になるようにまいておいたＬＢ培地上プレートにまき、３７℃で１０時間以上培養した。形質転換された白色コロニーをアンピシリン入りのＬＢ培地あるいは２×ＹＴ培地の２ｍｌに１つのコロニーを接種した後３７℃で一晩培養した。この培養液から常法によりプラスミドを調製しＨ２Ｏに溶かしＤＮＡ濃度を定量した後シークエンス用ＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲ反応及び塩基配列決定は上述した方法で行った。
以上の実験により、約２．２ｋｂの不完全長のＡＬＳ　ｃＤＮＡが得られた。このＤＮＡの５’側から約２５０ｂｐの位置にＳｍａ　Ｉサイトが存在したので。さらに次の方法で新たなプローブを作製した。約２．２ｋｂｐを保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋を宿主大腸菌のＪＭ１０９で増やした後、プラスミドを自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯ　ＰＩ−１００）で抽出した。このプラスミドを直接Ｓｍａ　Ｉで消化し、生成した約２５０ｂｐの断片を１％のアガロース電気泳動で分離精製し濃度を算出後プローブとした。このプローブを用いて上述のＲＩを使用した方法で再度ライブラリをスクリーニングした。その結果得られたシングファージからλＤＮＡを調製し、そのλＤＮＡ溶液（１μｌ）をＥｃｏ　ＲＩで消化し、電気泳動でサイズを確認した後、ニトロセルロースメンブランに固定した。電気泳動後のゲルを１．５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．５Ｍ　ＮａＯＨ溶液中に浸し１５分間程度軽く振とうした。この後ゲルを水洗し、３ＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５に浸し１５分程度振とうしながらゲルを中和した。ステンレスバットに２０×ＳＳＣを張り、その中に工業用の厚手のろ紙を５枚程度重ねた台座を置いた。その上に中和後のゲル、メンブラン（所定の大きさに切断したニトロセルロースメンブランを蒸留水になじませた後、２０×ＳＳＣでさらに１０分間なじませた）、２枚重ねのろ紙を順番に乗せた後、さらにその上に３ｃｍ〜４ｃｍ厚のペーパータオルを重ねた。この上にガラス板を乗せ、その上に軽い重しを乗せた後、約５分間ブロッティングを行った。この後、ゲルとメンブランの間に気泡が入っていないことを確かめた上で１０分間程度ブロッティングを行った。ブロッティング終了後、メンブランをトランスイルミネーターでＵＶ処理し、１５分から３０分程度８０℃でベーキングした。ベーキング終了後、３２Ｐでラベルした上述の２５０ｂｐプローブＤＮＡによるハイブリダイゼーション（ハイブリダイゼーション緩衝液組成：５×ＳＳＰＥ，０．５％ＳＤＳ，５×Ｄｅｎｈａｒｌｔｓ，ｓｏｌｕｍ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ，５０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を行い、結合したバンドの放射能をイメージングプレートへ写し取り、ＢＡＳ−２０００でその結果を解析した。このハイブリダイゼーションで陽性を示したインサートの中で比較的大きなサイズを示したものを大量に調製し、上述した方法でＥｃｏ　ＲＩ消化後ＢＡＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ＋にサブクローニングした（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３４８）。これを大腸菌（ＪＭ　１０５）に形質転換し、得られた形質転換体を液体培養後、常法によりプラスミドを調製し、上述の方法で塩基配列を決定した。
その結果、完全長の変異ＡＬＳ遺伝子を含むｃＤＮＡを取得することができた。このｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。また、野生株由来のｃＤＮＡライブラリからは、完全長ＡＬＳ遺伝子を含むｃＤＮＡを一種類を取得することができた。これら変異型ＡＬＳ遺伝子と野生型のＡＬＳ遺伝子との相同性を比較した結果を図１に示した。
〔実施例４〕変異型ＡＬＳタンパク質の発現
実施例３（４）で得られたプラスミドをＥｃｏ　ＲＩで消化して、野性型のＡＬＳ遺伝子を含むｃＤＮＡ及び変異型ＡＬＳ遺伝子を含むｃＤＮＡを切り出した後、ｐＧＥＸ発現ベクターにそれぞれ組み込んだ。野生型ＡＬＳ遺伝子を含むｃＤＮＡは、開始コドンよりも４７塩基長い５’非翻訳領域を有しており、ｐＧＥＸ−２ＴのＥｃｏ　ＲＩサイトに組み込んだ。また、変異型ＡＬＳ遺伝子を含むｃＤＮＡは、開始コドンよりも３１塩基長い５’非翻訳領域を有しており、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３のＥｃｏ　ＲＩサイトに組み込んだ。
これらを大腸菌（ＪＭ　１０５）にそれぞれ形質転換し、形質転換により得られたコロニーを液体培養してプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターン及びシークエンスによりインサートＤＮＡの挿入方向を確認した。インサートＤＮＡの方向が正しいクローンを１つずつ選び、これを２ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中２７℃で振とう培養した。この前培養液１ｍｌを用いて５０ｍｌあるいは２５０ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で本培養を行った。一晩培養後、１ｍＭ　ＩＰＴＧを加えて３時間〜４時間、ＧＳＴ融合タンパク質の発現誘導を行った。
ここで、ＩＰＴＧを添加してから３〜４時間培養した後のＡＬＳ活性を測定した結果を表３に示す。
【表３】
2002044385.tif 000007
この表３から判るように、プラスミドを有さない対照区と比較して、野生株ＡＬＳ遺伝子を有する大腸菌及び変異型ＡＬＳ遺伝子を有する大腸菌では、３倍〜４倍程度高い比活性を示した。したがって、ＩＰＴＧを添加してから３〜４時間培養した後、形質転換大腸菌を−８０℃に保存し、これを用いてＧＳＴ融合ＡＬＳタンパク質を精製した。
大腸菌からのＡＬＳの調製と精製は次の方法で行った。先ず、−８０℃に保存しておいた形質転換大腸菌のペレットをＡＬＳ抽出緩衝液（３０％グリセロールと０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含んだリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５）に懸濁した（培養液５０ｍｌから得られたペレットに対して２．５ｍｌの緩衝液を添加）。この懸濁液を超音波処理（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社製、Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ　Ｗ−２２５Ｒ、マイクロチップ、アウトプットコントロール８、約１秒インターバル、４０秒２回）した後、４℃、１５０００×ｇで２０分間遠心し、その上澄を粗酵素溶液とした。
粗酵素溶液からのＧＳＴ融合ＡＬＳタンパク質（以下ＧＳＴ−ＡＬＳ）の精製は次の方法で行った。培養液２５０ｍｌ分のペレットから調製した粗酵素溶液（１２．５ｍｌ）をグルタチオンセファロース４Ｂアフィニティーカラム（アマシャム　ファルマシア　バイオテック社製、ベッドボリュームは約１ｍｌで事前に１０ｍｌの１×ＰＢＳ（０．１４Ｍ　ＮａＣｌ，２．７ｍＭ　ＫＣｌ，１０．１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．３）で平衡化しておいた）にアプライした後、１０ｍｌの１×ＰＢＳで当該カラムを洗浄し、吸着したＧＳＴ−ＡＬＳを２ｍｌの１０ｍＭグルタチオン溶液で溶出（４回）した。各々の画分のＧＳＴ活性及びＡＬＳ活性を測定し、高活性画分を集めた。なお、ＡＬＳ抽出緩衝液を使った場合には、上記カラムへの吸着率が悪かったため、１×ＰＢＳで酵素を抽出した後に上記カラムに吸着させる実験も併せて行った。ＡＬＳ活性測定及びタンパク質定量は上述の方法に従い、ＧＳＴ活性測定は、１−ｃｈｌｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（別名２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎ（ＣＤＮＢ）と略記）を基質とする方法で行った。反応液量を３ｍｌ、反応液組成を１ｍＭ　ＣＤＮＢ、１ｍＭグルタチオン（還元型）、酵素溶液、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５とした。酵素溶液を添加後３０℃で３４０ｎｍの吸光度増加をレートアッセイした。なお、ＣＤＮＢは１００倍濃度のエタノール溶液を調製して反応液に添加した。
上記アフィニティーカラムに吸着しない活性（ＡＬＳ活性及びＧＳＴ活性）も多く検出されたが、アフィニティーカラムに吸着した分についてはその大部分の活性が初めと２回目のグルタチオン溶出画分に検出されたのでこれを合わせて精製ＧＳＴ−ＡＬＳとした。
このＧＳＴ−ＡＬＳをトロンビンプロテアーゼ（２５ｕｎｉｔ）で４℃、一晩消化したものをＧＳＴから遊離したＡＬＳとした。表４に、粗酵素溶液、上記アフィニティーカラムを用いたクロマトグラフィ後及びトロンビンプロテアーゼ処理後の、ＡＬＳ活性、タンパク質量及び比活性を示す。
【表４】
2002044385.tif 000008
また、調製したＡＬＳ酵素の中には、大腸菌由来のＡＬＳ活性が含まれる。しかしながら、表５に示すように、大腸菌由来のＡＬＳ活性は、ＡＬＳアイソザイムＩによるもので１ｍＭのバリン添加によりほぼ完全に阻害できる。
【表５】
2002044385.tif 000009
〔実施例５〕変異型ＡＬＳタンパク質の薬剤感受性
実施例４で得られた粗酵素溶液を用いて、変異型ＡＬＳタンパク質の薬剤感受性を調べた。薬剤感受性試験は、実施例２と同様な手順に従って行った。この薬剤感受性試験には、ＰＣ除草剤としてｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ，ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ，ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃの３薬剤、スルホニルウレア系除草剤としてｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ，ｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｍｅｔｈｙｌ，ｐｙｒａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｅｔｈｙｌ，ｉｍａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎの４薬剤、イミダゾリノン系除草剤としてｉｍａｚａｑｕｉｎ，ｉｍａｚａｐｙｒの２薬剤を使用した。
これら薬剤は、変異型ＡＬＳタンパク質を添加する前に、これらの薬剤の所定の濃度の溶液（ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍとｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍは水溶液、その他はアセトン溶液）を反応液中に添加した。アセトンの最終濃度は１％とした。なお、大腸菌内で発現するイネｃＤＮＡからのＡＬＳタンパク質はバリン非感受性である（Ｋｉｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１　２８７−２９５，１９９８）ので、大腸菌由来のＡＬＳ活性をバリンで阻害した条件下で薬剤感受性試験を行った。
ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを用いた場合の感受性を示す結果を図１２に示す。また、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎを用いた場合の感受性を示す結果を図１３に示す。図１２から判るように、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍにより野生型ＡＬＳの活性が阻害されたのに対して、変異型ＡＬＳの活性は完全に阻害されなかった。また、図１３から判るように、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎについては、変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質と比較して所定の濃度まで高い活性を維持したが、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍの場合と比較すると抵抗性は中程度であった。
また、薬剤としてｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを用いた場合の感受性を示す結果を図１４に示し、薬剤としてｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃを用いた場合の感受性を示す結果を図１５に示し、薬剤としてｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｍｅｔｈｙｌを用いた場合の感受性を示す結果を図１６に示し、薬剤としてｐｙｒａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｅｔｈｙｌを用いた場合の感受性を示す結果を図１７に示し、薬剤としてｉｍａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎを用いた場合の感受性を示す結果を図１８に示し、薬剤としてｉｍａｚａｑｕｉｎを用いた場合の感受性を示す結果を図１９に示し、薬剤としてｉｍａｚａｐｙｒを用いた場合の感受性を示す結果を図２０に示す。なお、図１２〜図２０において、塗りつぶしの三角を結んだグラフが野生型ＡＬＳタンパク質を含む粗酵素溶液を示し、塗りつぶしの四角を結んだグラフが変異型ＡＬＳタンパク質を含む粗酵素溶液を示ている。
これら図１４〜図２０に示すように、変異型ＡＬＳタンパク質は、野生型ＡＬＳタンパク質と比較して各薬剤に対して優れた抵抗性を有しており、特に、ＰＣ系除草剤に対して優れた抵抗性を有していることが判る。また、図１２、図１４及び図１５を比較すると、変異型ＡＬＳタンパク質は、ＰＣ系除草剤のうちでｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する抵抗性が最も優れていることが判る。
これらの結果は、実施例２の結果と相関すると判断できるため、実施例２においてＰＣ系除草剤に対する抵抗性を向上させた要因が変異型ＡＬＳ遺伝子であることを示している。
一方、実施例４で調製した精製ＧＳＴ−ＡＬＳ及び遊離ＡＬＳを用いて薬剤感受性試験を行った。野生型ＡＬＳタンパク質のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する抵抗性を示す結果を図２１に示し、変異型ＡＬＳタンパク質のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する抵抗性を示す結果を図２２に示す。また、変異型ＡＬＳタンパク質のｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する抵抗性を示す結果を図２３に示し、変異型ＡＬＳタンパク質のｉｍａｚａｑｕｉｎに対する抵抗性を示す結果を図２４に示す。なお、図２１〜図２４に結果を示す薬剤感受性試験においては、バリン非添加で行った。また、図２１において、塗りつぶしの三角を結んだグラフが野生型ＡＬＳタンパク質を含む粗酵素溶液を示し、塗りつぶしの四角を結んだグラフが野生型ＧＳＴ−ＡＬＳを示し、塗りつぶしの円を結んだグラフが遊離したＡＬＳタンパク質を示している。図２２〜図２４において、塗りつぶしの三角を結んだグラフが変異型ＡＬＳタンパク質を含む粗酵素溶液を示し、塗りつぶしの四角を結んだグラフが変異型ＧＳＴ−ＡＬＳを示している。
これら図２１〜図２４に示すように、精製ＧＳＴ−ＡＬＳにおいても、粗酵素溶液を用いた場合と同様な薬剤感受性を示した。
〔実施例６〕変異型ＡＬＳ遺伝子における変異箇所と薬剤感受性との関係
実施例３（４）で決定した変異型ＡＬＳ遺伝子における変異箇所は、図１に示したように、野生型における５４８番目のトリプトファン（Ｗ）がロイシン（Ｌ）に変異したＷ５４８Ｌ変異と、野生型における６２７番目のセリン（Ｓ）がイソロイシン（Ｉ）に変異したＳ６２７Ｉ変異とであった。そこで、これらの変異による薬剤感受性に対する影響を検討するため、これらＷ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異のいずれかの変異のみを有する変異型ＡＬＳ遺伝子を調製し、いずれか一方の変異のみを有するＡＬＳタンパク質の薬剤感受性を調べた。
（１）変異遺伝子の調製
具体的に、Ｗ５４８Ｌ変異のみを有する変異型ＡＬＳ遺伝子（以下、「Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳ遺伝子」と呼ぶ）は、図２５及び図２６に示すようにして調製した。まず、ＡＬＳ−Ｒｓｐ６と命名したセンスプライマー（５’−ＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＴＴ−３’：配列番号３）とＡＬＳ−ＲｓｐＦと命名したアンチセンスプライマー（５’−ＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡ−３’：配列番号４）とを用いて、２点変異型ＡＬＳ遺伝子を保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３４８）を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｗ５４８Ｌ変異を有し、Ｓ６２７Ｉ変異を有さないＤＮＡ断片を増幅させた（図２５）。一方、ＡＬＳ−ＲｓｐＥと命名したセンスプライマー（５’−ＴＴＡＣＡＡＧＧＣＧＡＡＴＡＧＧＧＣ−３’：配列番号５）とＭ１３Ｒのアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’：配列番号６）を用いて、野性型ＡＬＳ遺伝子を保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋を鋳型として、６２７番目のセリンをコードする領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた（図２５）。
次に、これらの２つのＤＮＡ断片を元にしてＳＰＲ法（１本鎖のＤＮＡ同士を配列が対応する末端部分で結合させ、互いを鋳型としてＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで複製させて２本鎖ＤＮＡとする遺伝子作製法：Ｓｅｌｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２つのＤＮＡ断片が連結したサイズの大きいＤＮＡ断片を得た（図２６）。得られたＤＮＡ断片をＡｃｃ　Ｉ及びＥｃｏ　ＲＩで消化しＡｃｃ　Ｉ−Ｅｃｏ　ＲＩ断片を得た。また、野性型のＡＬＳ遺伝子を組み込んだｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド（ｐＧＥＸ−２Ｔ−ｗＡＬＳ）をＡｃｃ　Ｉサイトで消化した後さらにＥｃｏ　ＲＩで３７℃１分の部分消化を行い、ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド部分断片を得た（図２６）。そして、Ａｃｃ　Ｉ−Ｅｃｏ　ＲＩ断片とｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド部分断片とをライゲーションすることによって、Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳ遺伝子を有するプラスミドを得た。
なお、Ｓ６２７Ｉ変異のみを有する変異型ＡＬＳ遺伝子（以下、「Ｓ６２７Ｉ変異型ＡＬＳ遺伝子」と呼ぶ）は、上述したＷ５４８Ｌ変異型ＡＬＳ遺伝子を調製した方法に準じて得ることができた。すなわち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３４８）を鋳型としたＰＣＲでＡＬＳ−ＲｓｐＥ及びＭ１３Ｒをプライマーとして用い、野性型ＡＬＳ遺伝子を保持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋を鋳型としたＰＣＲでＡＬＳ−Ｒｓｐ６及びＡＬＳ−ＲｓｐＦをプライマーとして用いた以外は同様に行った。
Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳ遺伝子を有するプラスミド及びＳ６２７Ｉ変異型ＡＬＳ遺伝子を有するプラスミドを用いて、それぞれ大腸菌（ＪＭ１０９株）に形質転換した。得られた大腸菌コロニーのＡＬＳ遺伝子の全シークエンスを行ったところ、Ｗ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異の１点変異を確認することができた
（２）各変異タンパク質の薬剤感受性
Ｗ５４８Ｌ変異型ＡＬＳ遺伝子を有するプラスミド又はＳ６２７Ｉ変異型ＡＬＳ遺伝子を有するプラスミドを大腸菌（ＪＭ　１０９）に形質転換し、形質転換により得られたコロニーを液体培養し、実施例４及び５と同様にして、ＧＳＴ誘導タンパク質の発現誘導を行い、粗酵素液を調製し、１ｍＭのバリン存在下でＡＬＳの薬剤感受性を調べた。
ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを用いた場合の結果を図２７に示す。またｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ及びｉｍａｚａｑｕｉｎを用いた場合の結果を図２８及び図２９に示す。ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍの図２７から判るように、Ｗ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異のそれぞれの１点変異はｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する抵抗性を与え、その度合いはＷ５４８Ｌ変異のみの１点変異の方がＳ６２７Ｌ変異のみの１点変異よりも高かった。
しかしながら、これら１点変異の抵抗性の度合いは、いずれも実施例５で示した２点変異の場合よりも数段低いことが判った。すなわち、Ｗ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｌ変異を併せ持つ場合には、Ｗ５４８Ｌ変異又はＳ６２７Ｌ変異いずれかを有する場合から予測できない程、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する抵抗性が著しく強くなった。
一方、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎの場合には（図２８）、Ｗ５４８Ｌ変異のみの場合は、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する抵抗性を与えたが、Ｓ６２７Ｉ変異のみの場合は明確な抵抗性を与えなかった。また、Ｗ５４８Ｌ変異のみの場合とＷ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異の場合とを比較すると、ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する抵抗性の度合いは同程度であった。さらに、ｉｍａｚａｑｕｉｎの場合には（図２９）、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍと同じような結果が得られたが、本例の濃度範囲では２点変異を併せ持つことによる相乗的な抵抗性の増大については確認できなかった。
以上の結果、今回新たに見つかったＳ６２７Ｉ変異は、Ｗ５４８Ｌ変異によるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性を飛躍的に高めることが判明した。従ってＷ５４８Ｌ変異及びＳ６２７Ｉ変異を有するＡＬＳ遺伝子は、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに特異的に高い抵抗性を与える遺伝子であると結論できた。
〔実施例７〕形質転換植物の作出
実施例３（４）で決定した変異型ＡＬＳ遺伝子を用いて、イネ（日本晴）を形質転換し、形質転換イネのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性を調べた。
（１）変異ＡＬＳ遺伝子を組み込んだバイナリーベクターの作製
イネの形質転換用に開発されたバイナリベクターであるｐＭＬＨ　７１３３（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７　４９−５９，１９９６）に以下の方法により、実施例３（４）で得られた変異型ＡＬＳ遺伝子を組み込んだ。
すなわち、図３０に示すように、先ず、変異型ＡＬＳ遺伝子を組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３４８）から変異ＡＬＳ遺伝子を、マルチクローニングサイトの制限酵素切断部位とアダプターの切断部位を利用して切り出した（Ｓａｃ　Ｉ消化及びＢａｍ　ＨＩによる部分消化）。また、ｐＭＬＨ　７１３３をＳａｃ　Ｉ及びＢａｍ　ＨＩを用いて消化し、ｐＭＬＨ　７１３３におけるＧＵＳ領域を切り出して直鎖状にした。変異型ＡＬＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片と直鎖状のｐＭＬＨ　７１３３とをライゲーションし、ｐＭＬＨ　７１３３−ＡＬＳを得た。
得られたｐＭＬＨ　７１３３−ＡＬＳを大腸菌（ＪＭ　１０５株）に形質転換し、得られたシングルコロニーを液体培養後プラスミドを調製した。調製したプラスミドをＳａｃ　ＩとＢａｍ　ＨＩとで消化してインサートの有無を確認（図３１）することで、変異ＡＬＳ遺伝子を保持しているクローンを選別した。インサートが確認できたプラスミドを鋳型として変異ＡＬＳ遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅させる２セットのプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマーセットは、ＡＬＳ−Ｒｓｐ１センスプライマー（５’−ＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡ−３’：配列番号７）と４−８３−３アンチセンスプライマー（５’−ＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＴＡＣＡＧ−３’：配列番号８）とのセット、３−１−４センスプライマー（５’−ＡＧＧＴＧＴＣＡＣＡＧＴＴＧＴＴＧ−３’：配列番号９）と３−１−１アンチセンスプライマー（５’−ＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＣＧ−３’：配列番号１０）とセットを用いた。その結果、特異的なフラグメントバンドが検出され（図３２）、実施例３（４）で得られた変異型ＡＬＳ遺伝子がｐＭＬＨ７１３３ベクターへ組み込まれたと判断することができた。
また、変異型ＡＬＳ遺伝子が正常に組み込まれたか否かは、ＰＣＲによるインサートの挿入方向の確認及びシークエンスの決定により確認した。ＰＣＲによるインサートの挿入方向確認は次の方法で行った。ｐＭＬＨ７１３３−ＡＬＳをＥｃｏ　ＲＩで完全消化することによりＴＮＯＳ部分を取り除くとともに直鎖状とし、これを鋳型として上記ＡＬＳ−Ｒｅｓ１及び４−８３−３のセットと３−１−４及び３−１−１のセットとを用いてＰＣＲを行った。その結果（図３３）、予想される位置にＰＣＲ産物のバンドが確認されたことから、変異型ＡＬＳ遺伝子が順方向で挿入されていると判断された。なお、変異型ＡＬＳ遺伝子が逆方向で挿入されている場合にはＥｃｏ　ＲＩ消化により当該変異型ＡＬＳ遺伝子部分がｐＭＬＨ７１３３−ＡＬＳから切り出されてしまうためＤＮＡ断片が増幅されず、ＰＣＲ産物が検出されない。
一方、シークエンスの決定は、ｐＭＬＨ７１３３−ＡＬＳを調製し、これを鋳型として変異ＡＬＳ遺伝子の５’側とｐＭＬＨ７１３３との接合領域について行った。なお、ｐＭＬＨ７１３３−ＡＬＳは、大腸菌内でのコピー数が少ないことから、従来の２０倍量の培養液（２ｍｌの培養液２０本分）からアルカリＳＤＳ法で調製した。その結果、変異ＡＬＳ遺伝子は順方向で挿入されていると判断された。
（２）アグロバクテリウム菌に対するバイナリーベクターの導入
上記（１）で得られたバイナリーベクター（ｐＭＬＨ　７１３３−ＡＬＳ）を、以下のようにアグロバクテリウム菌に導入した。アグロバクテリウム菌としては、−８０℃で保存しているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＥＨＡ　１０５のコンピテントセルを氷中で溶かして使用した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＥＨＡ　１０５のコンピテントセルを含む溶液に、ｐＭＬＨ　７１３３−ＡＬＳを加え、氷中で１５分放置した後、３７℃で５分間の熱ショックを加えた。その後、氷中に２分間放置し、続いて１ｍｌのＳＯＣ液体培地を加え、２８℃で２〜４時間ゆっくり振とうした。その後、遠心して上澄みの大部分を捨て、沈殿した菌体を、残った上澄みに懸濁させた。カナマイシンとハイグロマイシンとをそれぞれ５０ｐｐｍ含有するＬＢプレート培地に、懸濁液を塗り広げ、２８℃で２？３日インキュベートして、シングルコロニーを得た。
（３）ｐＭＬＨ　７１３３−ＡＬＳ導入アグロバクテリウム菌によるイネの形質転換
（２）で得られたアグロバクテリウム菌を、滅菌したミクロスパーテルで１／２さじ程度とり、表６に示したアセトシリンゴンを１０ｍｇ／ｌの濃度で加えた３０ｍｌのＡＡＭ培地（ファルコンチューブ）によく懸濁した。
【表６】
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このときアグロバクテリウム菌の塊が残らないようにパスツールピペットでよくピペッティングした。得られた懸濁液を９ｃｍシャーレに入れた。
一方、日本晴の種子から誘導し、表７に示したＮ６Ｄ培地で前培養したカルスをステンレスメッシュ（あるいは茶こし）に入れ、メッシュごと１．５から２分間アグロバクテリウムの懸濁液につけた（このときカルス全体が菌液に浸るようにし、薬さじで穏やかにかき混ぜた）。その後、ステンレスメッシュを、滅菌したろ紙の上に置き、余分な菌液を除去した。このように処理されたカルスを、表８に示した２Ｎ６ＡＳ固形培地（アセトシリンゴン１０ｍｇ／ｌ）に置床し（１シャーレに１６カルス）、サージカルテープでシールして２８℃、暗条件で２〜３日間培養した（菌体がカルスをうっすら覆うように増殖するまで培養した）。
【表７】
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【表８】
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３日間の共存培養でカルスにうっすら菌体がかぶるくらいになった時点で、次の方法でカルスを洗浄し、アグロバクテリウム菌を除去した。上述のように処理されたカルスをステンレスメッシュ（あるいは茶こし）に入れ、メッシュごとＮ６Ｄ液体培地（カルベニシリンを５００ｍｇ／ｌを含む）に浸し、当該培地が白濁しなくなるまでシャーレを交換した。この処理によって、カルスに付着したアグロバクテリウム菌を洗い流した。その後、メッシュを滅菌したろ紙の上に乗せて、余分な水分を除去した。このカルスをＮ６Ｄ固形培地（５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンと５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む）に置床して、２８℃、明所で２〜３週間培養した。なお、この操作の後、アグロバクテリウムが再び増殖する場合には、同様に再び洗浄して新しい培地に置床した。
２８℃、明所で２〜３週間の培養により選抜した後、カルスを再分化培地（２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンと５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む）に１シャーレにつき９カルスずつ移植し、２８℃、明条件で２〜３週間培養した。カルスから茎葉部と根部がそれぞれ１ｃｍ以上分化した時点で、ホルモンフリー培地（５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む）に１シャーレにつき２〜３カルスとなるように移植した。この後、得られた植物体がシャーレいっぱいに広がった時点で、培養土（ボンソル）に鉢上げし、訓化させた。なお、移植の時には、根に付着している培地は水中で完全に洗い落とした。以上の操作フローを図３４に示した。
一方、上述した鉢上げをする時点で、再分化していないカルスの一部（９株）（図３５）を、実施例１で使用したｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性カルス作出用の個体培地で継代培養した。なお、この個体培地には１０μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍを含有している。その結果、９株の内６つが正常に増殖した。そこで、正常に増殖したｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性を示すカルス６株の１つについて、液体培養を行い、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する薬剤感受性を詳しく調べた。その結果、図３６に示すように、２点変異型遺伝子の由来株であるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性のＳｒ系統株とほぼ同様に、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性を示した。なお、図３７に示すように、野生型イネ（日本晴）のカルスにおいては、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ感受性を示した。このことから、１０μＭのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ含有固体培地で生育した６株は総べて強いｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性を有すると判断された。
一方、これらのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性のカルスから、ＱＩＡＧＥＮ社のＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを調製して、これを鋳型として、２点変異部分を挟むセンスプライマー（３−１−４：配列番号９）とアンチセンスプライマー（４−８３−３：配列番号８）のセットでＰＣＲを行った。その結果、図３８に示すように、予想されるＤＮＡ断片が増幅した。増幅したＤＮＡ断片を精製後、塩基配列を調べた（センス鎖を読むのにはプライマー（３−１−４：配列番号９）、アンチセンス鎖を読むのにはプライマー（ＡＬＳ−Ｒｓｐ２：５’−ＡＧＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧ−３’：配列番号１１）を用いた。
ＡＬＳタンパク質における５４８番目のアミノ酸をコードする塩基配列周辺の解析結果を図３９Ａ及びＢに示す。また、ＡＬＳタンパク質における６２７番目のアミノ酸をコードする塩基配列周辺の解析結果を図３９Ｃ及びＤに示す。これら図３９Ａ〜Ｄに示すように、これらの株の２点変異部位には野性型と変異型のヘテロな配列が認められた。したがって、変異型ＡＬＳ遺伝子がゲノム中に組み込まれていることが確認された。なお、９株の内３つにおいては１０μＭｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ存在下で生育が悪かったが、これは導入された２点変異型ＡＬＳ遺伝子の発現量が低いためと考えられた。
他方、鉢上げしたハイグロマイシン抵抗性の形質転換イネ約８０株の中で５葉期の段階で正常に生育しているものは、変異型ＡＬＳ遺伝子を導入したもので２７個体、野性型ＡＬＳ遺伝子を導入したもので４６個体であった。野性型ＡＬＳ遺伝子を導入したものの方が変異型ＡＬＳ遺伝子を導入したものよりも健全に生育している傾向にあった。この時点で、変異型ＡＬＳ遺伝子導入の４株及び野性型ＡＬＳ遺伝子導入の５株を適当に選別して、１ｋｇ　ａ．ｉ．／ｈａのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ塩を、０．２％サーファクタントＫを添加して茎葉部に散布した。その後、約４０日後に生育調査を行った結果を図４０に示す。なお、図４０中、Ａの草丈は約９０ｃｍであった。
図４０より変異型ＡＬＳ遺伝子を導入した１個体がほぼ正常に生育（Ａ）し、この株がｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性であることが判明した。このｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ抵抗性の形質転換イネからゲノムＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ社のＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔにより調製し、２点変異部分を挟むセンスプライマー（３−１−４：配列番号９）とアンチセンスプライマー（４−８３−３：配列番号８）のセットでＰＣＲを行い得られたＤＮＡ断片の塩基配列を、上述したカルスの場合と同じ方法で調べた。その結果、この形質転換イネには２点変異が存在していることが確認された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用の可能性
以上、詳細に示したように、本発明よれば、あらゆる薬剤に対して優れた抵抗性を有するとともに、ＰＣ系除草剤に対して極めて高度な抵抗性を示すＡＬＳ酵素をコードするＡＬＳ遺伝子を提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、変異型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列及び野生型ＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。
図２は、変異型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列及び野生型ＡＬＳ遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図３は、抵抗性変異株のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図４は、野生株のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図５は、野性株のｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図６は、抵抗性変異株のｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図７は、野生株から抽出したＡＬＳタンパク質粗酵素の陰イオンクロマトグラムを示す特性図である。
図８は、野生型ＡＬＳタンパク質及び変異型タンパク質におけるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図９は、野生型ＡＬＳタンパク質及び変異型タンパク質におけるｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図１０は、野生型ＡＬＳタンパク質及び変異型タンパク質におけるｉｍａｚａｑｕｉｎに対する感受性を示す特性図である。
図１１は、日本晴ＥＳＴとトモロコシＡＬＳ遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図１２は、実施例４で得られた粗酵素溶液におけるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図１３は、実施例４で得られた粗酵素溶液におけるｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図１４は、実施例４で得られた粗酵素溶液におけるｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図１５は、実施例４で得られた粗酵素溶液におけるｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃに対する感受性を示す特性図である。
図１６は、実施例４で得られた粗酵素溶液におけるｂｅｎｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｍｅｔｈｙｌに対する感受性を示す特性図である。
図１７は、実施例４で得られた粗酵素溶液におけるｐｙｒａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎ−ｅｔｈｙｌに対する感受性を示す特性図である。
図１８は、実施例４で得られた粗酵素溶液におけるｉｍａｚｏｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図１９は、実施例４で得られた粗酵素溶液におけるＩｍａｚａｑｕｉｎに対する感受性を示す特性図である。
図２０は、実施例４で得られた粗酵素溶液におけるＩｍａｚａｐｙｒに対する感受性を示す特性図である。
図２１は、実施例４で得られた野生型の粗酵素溶液、ＧＳＴ−ＡＬＳ及びＡＬＳタンパク質のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図２２は、実施例４で得られた変異型の粗酵素溶液及びＧＳＴ−ＡＬＳのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図２３は、実施例４で得られた変異型の粗酵素溶液及びＧＳＴ−ＡＬＳのｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図２４は、実施例４で得られた変異型の粗酵素溶液及びＧＳＴ−ＡＬＳのＩｍａｚａｑｕｉｎに対する感受性を示す特性図である。
図２５は、Ｗ５４８Ｌ変異のみを有するＡＬＳ遺伝子の作製法を示す概念図である。
図２６は、図２５の続きであり、Ｗ５４８Ｌ変異のみを有するＡＬＳ遺伝子の作製法を示す概念図である。
図２７は、実施例６（２）で得られた粗酵素溶液におけるｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍに対する感受性を示す特性図である。
図２８は、実施例６（２）で得られた粗酵素溶液におけるｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎに対する感受性を示す特性図である。
図２９は、実施例６（２）で得られた粗酵素溶液におけるｉｍａｚａｑｕｉｎに対する感受性を示す特性図である。
図３０は、実施例７で作製したバイナリーベクターの作製法を示す概念図である。
図３１は、大腸菌（ＪＭ　１０９）のシングルコロニーから単離したプラスミド中のＡＬＳ遺伝子インサートの確認した電気泳動写真であり、レーン１はλＨｉｎｄ　ＩＩＩ／１００ｂｐ　ＤＮＡマーカー、レーン２は変異型ＡＬＳ遺伝子を保持するｐＭＬＨ　７１３３で形質転換した大腸菌由来プラスミド、レーン３は野性型ＡＬＳ遺伝子を保持するｐＭＬＨ　７１３３で形質転換した大腸菌由来プラスミド、レーン４はＧＵＳ遺伝子（対照区）を保持するｐＭＬＨ　７１３３であり、矢印はインサートＤＮＡを指し示している。
図３２は、プラスミドＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真であり、レーン１はλＨｉｎｄ　ＩＩＩ／１００ｂｐ　ＤＮＡマーカー、レーン２及び５は野性型ＡＬＳ遺伝子を保持するｐＢＩ　１２１プラスミド（対照区）、レーン３及び６は変異型ＡＬＳ遺伝子を保持すると考えられるｐＭＬＨ　７１３３、レーン４及び７は野性型ＡＬＳ遺伝子を保持すると考えられるｐＭＬＨ　７１３３であり、矢印はＰＣＲ産物を指し示している。
図３３は、ＡＬＳ遺伝子のインサート方向を確認した結果を示す電気泳動写真であり、レーン１はλＨｉｎｄ　ＩＩＩ／１００ｂｐ　ＤＮＡマーカー、レーン２は変異型ＡＬＳ遺伝子を保持するｐＭＬＨ　７１３３、レーン３は野性型ＡＬＳ遺伝子を保持するｐＭＬＨ　７１３３、レーン４はＧＵＳ遺伝子を保持するｐＭＬＨ　７１３３（対照区）であり、矢印はＰＣＲ産物を指し示している。
図３４は、アグロバクテリウム菌を用いたイネ（日本晴）の形質転換方法を示すフローチャートである。
図３５は、カルスから再分化中にあるイネ（日本晴）の写真である。
図３６は、変異型ＡＬＳ遺伝子で形質転換したイネ（日本晴）カルスのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ感受性を示す特性図である。
図３７は、野性型イネ（日本晴）カルスのｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ感受性を示す特性図である。
図３８は、形質転換カルスから調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして行ったＰＣＲの結果を示す電気泳動写真であり、レーン１はλＨｉｎｄ　ＩＩＩ／１００ｂｐ　ＤＮＡマーカー、レーン２〜７はそれぞれ異なるカルス由来のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のＰＣＲ結果であり、矢印はＰＣＲ産物を指し示している。
図３９は、形質転換カルスから調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして行ったＰＣＲの結果、得られたＰＣＲ産物のシークエンスを行った結果を示す特性図であり、Ａはセンスプライマー（３−１−４）による５４８番目周辺の解析結果、Ｂはアンチセンスプライマー（ＡＬＳ−Ｒｓｐ２）による５４８番目周辺の解析結果、Ｃはセンスプライマー（３−１−４）による６２７番目周辺の解析結果、Ｄはアンチセンスプライマー（ＡＬＳ−Ｒｓｐ２）による６２７番目周辺の解析結果を示している。
図４０は、変異型ＡＬＳ遺伝子で形質転換したイネ（日本晴）のｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ感受性を測定した結果を示す写真であり、Ａは変異型ＡＬＳ遺伝子で形質転換したイネ、Ｂは野性型ＡＬＳ遺伝子で形質転換したイネを示している。
【図１】
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【図２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１−１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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