(57)【要約】イネの矮小型変異体ｄ６１を取得し、ｄ６１遺伝子座に対応する遺伝子（ＯｓＢＲＩ１）を単離した。ＯｓＢＲＩ１は、植物のブラシノステロイド感受性を高め、節間細胞の伸長の誘導による節間伸長や葉身結合部の屈曲などのイネの成長および発生過程で機能していた。ＯｓＢＲＩ１のアンチセンス鎖やドミナントネガティブを導入し、表現型が改変された形質転換イネ植物体を作出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号：２に記載のタンパク質とアミノ酸配列において５５％以上の相同性を有し、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
植物のブラシノステロイド感受性を向上させる機能、植物の稈の節間細胞の伸長を誘導する機能、植物の稈の節間においてその伸長方向に垂直に微小管を配置させる機能、植物の穂首の節間の伸長を抑制する機能、および植物の葉身の傾きを増加させる機能からなる群より選択される機能を有するタンパク質をコードする、請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
単子葉植物由来である、請求項４または５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
イネ科植物由来である、請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項１から７のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制させるＲＮＡをコードし、請求項１から７のいずれかに記載のＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項１１】
植物細胞における内在性の請求項１から７のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１から７のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項１２に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項１４】
請求項１から７のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項１４に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
請求項８から１１のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１７】
請求項１から１１のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項１２若しくは１６に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項２１】
請求項１４に記載のタンパク質に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物のブラシノステロイド感受性に関与する新規な遺伝子およびタンパク質、並びにそれらの製造および用途に関する。
従来の技術
植物の分子生物学的研究は、近年飛躍的に進歩してきており、様々な生理現象の解析において欠くべからざる存在となっている。草型の人為的改変、特に伸長生長の制御によって引き起こされる矮性は、「緑の革命」におけるメキシココムギや国際イネ研究所が開発したミラクルライス（ＩＲ−８）などで実証されたように、多肥料によって生育を促しても背丈がのびすぎて倒伏することもなくなる。また、イネのような密植性栽培の場合、立植葉形成により葉の受光量の効率が向上するため、収量の大幅な増加が期待できる。さらに、収量や生育管理の作業の効率化もはかれることから、これらの形質はきわめて重要な育種目標である。しかしながら、これらの形質を意図して人為的に改変する技術は存在しないのが現状である。
矮性は、正常な伸長生長の調節に関わる遺伝子に突然変異が生じた結果もたらされる生長異常である。植物の伸長生長は細胞分裂と細胞伸長の積み重ねによってもたらされるが、それらは温度や光などの外的環境要因や植物ホルモンなどの内的環境要因といった様々な因子による複合的な影響によって調節されている。従って、矮性に関わる遺伝子には、植物ホルモンの合成やその受容に直接関わるものや、それらの発現調節に関わるものなど、様々な種類があることが予測される（坂本ら（２０００）化学と生物、３８：１３１−１３９）。
Ｊａｐｏｎｉｃａイネの現代の栽培品種のほとんどは、栄養成長期に葉、腋芽、および短いまたは伸長した節間からなる１５〜１６のフィトマー（ｐｈｙｔｏｍｅｒ）を発生する。シュートの分裂組織が栄養成長期から生殖期へと移行した後、生殖分裂組織は、初期葉軸分枝を発生する腋芽および未発生の葉ならびに伸長した節間からなる約１０のフィトマーを発生する。栄養成長期に発生するフィトマーは、節間の形態によって３種類に分類される（Ｓｕｅｔｓｕｇｕ，ｉｓａｏ．（１９６８）Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．３７，４８９−４９８）。第１のタイプは幼若期に発生し、未分化な節および節間を形成する。第２のタイプはシュート頂端分裂組織（ＳＡＭ）が幼若期から成体期へ移行する時に、節板が分化し、節間中央部が抜け落ちて空隙を形成する。第３のタイプは節間分裂組織によって形成される長く伸長した節間を含む。
これら３種類のフィトマーは、栄養成長の進行に伴い第１タイプから第３タイプへと並べられる。正常な生育条件下では、多くのＪａｐｏｎｉｃａ品種における各々のタイプのフィトマー数は、４〜５、６〜７、４〜５である。タイプ１からタイプ２への移行は、厳密に調整されている。品種によるが、タイプ１のフィトマーが４〜５連続して発生した後、ＳＡＭはタイプ２のフィトマーを発生する。しかし、タイプ２からタイプ３への移行は、タイプ２のフィトマーの連続発生数に依存しない。タイプ３フィトマーは、ＳＡＭが１５〜１６フィトマーを発生し栄養成長期から生殖期に移行すると発生し始め、上端の４〜５の節間は伸長を開始する。異常な生育条件により移行時期にずれが生じると、タイプ２フィトマーの数は必ず変化するが、伸長した節間をもつタイプ３フィトマーの数に変化は生じない（Ｓｕｅｔｓｕｇｕ，ｉｓａｏ．（１９６８）Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．３７，４８９−４９８）。このことは、シロイヌナズナと同様に、イネのＳＡＭの栄養成長期から生殖期への移行により、節間の伸長が誘導されることを示している。
しかし、イネとシロイヌナズナでは、ＳＡＭの期の移行に誘導される節間の伸長に明らかな相違がある。イネは、伸長した節間は栄養成長性ＳＡＭに由来し、シロイヌナズナは生殖性に由来している。実際、イネでは、栄養成長性ＳＡＭから上端の４または５の節間が発生し、下方に位置するタイプ２フィトマーとに差異は見られない。そして、ＳＡＭの期の移行が起きると、節間分裂組織が発達する。直接の証拠はないが、ＳＡＭの期の移行と節間分裂組織発達の同期性を考えると、ＳＡＭが期を移行する時に、上端の４または５のフィトマーにシグナルを送っている可能性が考えられる。
作物学的に重要なため、イネでは多くの矮小型変異が蓄積され、解析されてきた。このような矮小型変異は、上端の４〜５の節間の伸長パターンによって、６つのグループに分類される（図１；Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．（１９７４）Ｂｕｌｌ．Ｆａｃ．Ａｇｒ．Ｈｉｒｏｓａｋｉ  Ｕｎｉｖ．２２，１９−３０から転載。なお、イネでは、各節間は、上から順に番号付けられ、円錐花序のすぐ下の節間が１番目となる）。このうちｄｎタイプの変異体の各節間の長さは、ほぼ均一に低下しており、野生型の植物と類似した伸長パターンになっている。反対に、ｄｍ型の変異体では、第２節間が特異的に減少している。特定の節間の短縮は、ｓｈまたはｄ６タイプの変異体にも観察され、これらはそれぞれ、上端の第１節間または上端の節間よりも下の節間が短縮している。ｄｍ、ｄ６、およびｓｈタイプのように各節間が特異的に短縮している変異体は、ＳＡＭから発せられるシグナルの認識機構に欠陥がある可能性があるため、節間の伸長の機構、特にＳＡＭ条件と節間伸長の間の関係について、研究するために良い植物材料となる。
ブラシノステロイド（ＢＲ）は植物の成長および発達に必要な天然の植物成長物質である。イネおよび他のイネ科植物の成長と発生に対するブラシノステロイドの生理学的な機能を扱った報告がいくつかある。外因性のブラシノステロイドは、単独で、又はオーキシンとの組み合わせにより、イネの葉身結合部の屈曲を増大させることが生理学的研究で示されている。この葉身結合部はブラシノステロイドに対して非常に感受性が強いため、ブラシノステロイドの感度の高いバイオアッセイとして使用されてきた（Ｍａｅｄａ，Ｅ．（１９６５）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１８，８１３−８２７；Ｗａｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２，３２３−３２５；Ｔａｋｅｎｏ，Ｋ．ａｎｄ  Ｐｈａｒｉｓ，Ｒ．Ｐ．（１９８２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３，１２７５−１２８１）。ブラシノライド及びその誘導体であるカスタステロン（ｃａｓｔａｓｔｅｒｏｎｅ）で処理すると、コムギの実生の黄化し巻いた葉身の展開を刺激する（Ｗａｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４９，２２４９−２２５１）。ブラシノステロイドによる処理は、イネの根の成長に影響し、低濃度または高濃度で、それぞれ促進または阻害する（Ｒａｄｉ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｅｄａ，Ｅ．（１９８８）Ｊ．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．５７，１９１−１９８）。ブラシノステロイドはイネの種子の発芽も促進する（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｇｅｄ  ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄｓ  ｂｙ  ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ．ｌｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ  ａｎｎｕａｌ  ｐｌａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｈｏｎｏｌｕｌｕ．（Ｃｏｏｋｅ  ＡＲ），ｐｐ．２６−２７）。
これらの結果は、内在性ブラシノステロイドがイネ科植物の種々の成長および発生過程で、重要な役割をもつことを示唆する。しかし、これらの結果は、内在性ブラシノステロイドではなく外因性ブラシノステロイドの影響に限定されている。
その一方、イネ科植物においてブラシノステロイドが細胞の伸長を誘導するかどうかについての議論のあることが報告されている。これは、ブラシノライド処理はイネの葉鞘の伸長を誘導しないが（Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．（１９８６）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄｓｔｅｒｏｉｄｓ．Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  １９８５．（Ｂｏｐｐ  Ｍ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ／Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１２９−１３８）、トウモロコシの子葉鞘および中胚軸の伸長は誘導するというものである（Ｈｅ，Ｒ．−Ｙ．ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｃｈｉｌｌｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．Ｉｎ：Ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｓ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＡＣＳ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｓｅｒｉｅｓ  ４７４．（Ｃｕｔｌｅｒ  ＨＧＣ，Ｙｏｋｏｔａ  Ｔ，Ａｄａｍ  Ｇ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ），ｐｐ．２２０−２３０）。
双子葉植物におけるブラシノステロイドの機能については確立されており、ブラシノステロイド合成変異体またはブラシノステロイド不感性変異体は、器官の発達異常をもつ重度の矮小性を示すことが知られている。
しかしながら、イネまたは他のイネ科植物など単子葉植物における内在性ブラシノステロイドの機能については、殆ど知られていない。
発明の開示
本発明は、植物、好ましくは単子葉植物のブラシノステロイド感受性に関与する新規な遺伝子を提供することを課題とする。さらに、本発明は、該遺伝子の発現制御を通じて、植物のブラシノステロイド感受性を改変することを課題とする。植物のブラシノステロイド感受性の改変は、植物の形態変化をもたらす。本発明の好ましい態様において、ブラシノステロイド感受性の低下により節間の伸長が抑制され矮小化し、立直葉を有する植物体を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、変異剤処理により、野生型よりもブラシノステロイド感受性が低く、節間が短縮されている新規なイネの矮小型変異体ｄ６１（ｄ６１−１およびｄ６１−２）を取得した。
連鎖分析により、ｄ６１遺伝子座が、シロイヌナズナＢＲＩ１に相同な遺伝子の位置と強く連鎖していることが示された。そこで、イネゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、シロイヌナズナＢＲＩ１に相同な遺伝子（ＯｓＢＲＩ１）を単離した。ｄ６１−１およびｄ６１−２変異体のＯｓＢＲＩ１遺伝子の塩基配列を解析したところ、アミノ酸の変換を誘導する単一ヌクレオチドの変換が、各々のｄ６１対立遺伝子の異なる部位に観察された。
さらに、ＯｓＢＲＩ１がｄ６１遺伝子座に対応することを確認するため、ｄ６１変異体にＯｓＢＲＩ１遺伝子を導入した。その結果、ｄ６１の表現型が相補され、野生型の表現型が得られたことから、ｄ６１変異がＯｓＢＲＩ１遺伝子の機能損失変異によって生じることが示された。表現型の分析により、ＯｓＢＲＩ１は、節間分裂組織の形成および節間細胞の縦の伸長の誘導による節間伸長、葉身結合部の屈曲、ならびに暗条件での暗黒形態形成などの、イネの種々の成長および発生過程で機能していることが示された。
さらに、ＯｓＢＲＩ１のアンチセンス鎖を導入した形質転換イネ植物体を作成したところ、殆どの形質転換体が実生段階で直立した葉を形成し、程度は異なるが全ての形質転換体において矮小性の表現型を得ることができた。ＯｓＢＲＩ１のドミナントネガティブを導入した植物体でも同様の効果が得られた。
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、植物のブラシノステロイド感受性に関与する新規な遺伝子およびタンパク質並びにそれらの製造および用途、特に該遺伝子の発現制御による改変された植物体の作出に関するものである。
より詳しくは、本発明は、
（１）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（２）  ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである、（１）に記載のＤＮＡ、
（３）  配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含む、（１）に記載のＤＮＡ、
（４）  配列番号：２に記載のタンパク質とアミノ酸配列において５５％以上の相同性を有し、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（５）  植物のブラシノステロイド感受性を向上させる機能、植物の稈の節間細胞の伸長を誘導する機能、植物の稈の節間においてその伸長方向に垂直に微小管を配置させる機能、植物の穂首の節間の伸長を抑制する機能、および植物の葉身の傾きを増加させる機能からなる群より選択される機能を有するタンパク質をコードする、（４）に記載のＤＮＡ、
（６）  単子葉植物由来である、（４）または（５）に記載のＤＮＡ、
（７）  イネ科植物由来である、（６）に記載のＤＮＡ、
（８）  （１）から（７）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（９）  （１）から（７）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、
（１０）  植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１）から（７）のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制させるＲＮＡをコードし、（１）から（７）のいずれかに記載のＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、
（１１）  （１）から（７）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（１２）  （１）から（７）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター、
（１３）  （１）から（７）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（１２）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
（１４）  （１）から（７）のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質、
（１５）  （１３）に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（１４）に記載のタンパク質の製造方法、
（１６）  （８）から（１１）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター、
（１７）  （１）から（１１）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（１２）若しくは（１６）に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、
（１８）  （１７）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
（１９）  （１８）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
（２０）  （１８）または（１９）に記載の形質転換植物体の繁殖材料、および
（２１）  （１４）に記載のタンパク質に結合する抗体、を提供するものである。
本発明は、イネ由来のＯｓＢＲＩ１タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。ＯｓＢＲＩ１のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に、ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に示す（配列番号：３に記載のゲノムＤＮＡは、イントロンは存在せず、１つのエクソンからなる）。
本発明のＤＮＡは、野生型よりもブラシノステロイド感受性が低く、節間が短縮されているイネの矮小型変異体（ｄ６１）の原因となる遺伝子であり、その発現制御により、植物の形態を改変することができる。
本発明における好ましい植物の形態の改変としては、本発明のＤＮＡの発現抑制による、植物体の矮小化が含まれる。植物体を矮小化することは、農業や園芸において様々な意義を有する。例えば、草丈を減少させることにより、植物を倒れにくくすることができ、その結果、子実重量を増加させることが可能となる。また、草丈を減少させ、１株あたりの植物体の形をよりコンパクトにすることにより、単位面積あたりに作付できる植物体の個体数を増加させることができる。このことは、特に、イネをはじめ、ムギ、トウモロコシなどの農作物の生産において大きな意義を有する。また、例えば、草丈またはかん長を矮小化することで、新たな美的価値を有する観賞用植物を作出することも可能であり、また、野菜や果実を矮小化することで一口サイズなどの新たな商品価値を有する作物を作ることもできる。また、このような産業上の利用以外でも、例えば、実験用植物の矮小化は、その取り扱いやすさのみならず、植物の栽培空間の減少による実験空間の有効利用の観点から重要である。
一方、本発明のＤＮＡをブラシノステロイド低感受性植物内で発現させることにより、該植物体のブラシノステロイド感受性を高めることも可能であると考えられる。これにより植物体の草丈を増加させ、植物体全体の収量を増加させることも考えられる。このことは、特に、飼料用作物全体の収穫量を向上させる上で有意義である。
本発明のＯｓＢＲＩ１タンパク質をコードするＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、植物細胞または組織からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１、３）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１、３）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲをおこなうことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、植物細胞または組織から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
本発明は、配列番号：２に記載のＯｓＢＲＩ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。ここで「ＯｓＢＲＩ１タンパク質と機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が配列番号：２に記載のＯｓＢＲＩ１タンパク質と同等の生物学的機能、例えば、植物のブラシノステロイド感受性を向上させる機能、植物の稈の節間の伸長を誘導する機能、植物の稈の節間細胞においてその伸長方向に垂直に微小管を配置させる機能、植物の穂首の節間の伸長を抑制する機能、および／または植物の葉身の傾きを増加させる機能を有することを指す。このようなＤＮＡは、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科植物由来であり、最も好ましくはイネ由来である。
このようなＤＮＡには、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．−Ｊ．（１９８７）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４：３５０−３６７）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のＯｓＢＲＩ１タンパク質（配列番号：２）をコードするアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても、天然型のＯｓＢＲＩ１タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のＤＮＡに含まれる。対象となるＤＮＡの塩基の変異数は、アミノ酸レベルにおいて、典型的には、１００アミノ酸以内、好ましくは５０アミノ酸以内、さらに好ましくは２０アミノ酸以内、さらに好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内）である。
あるＤＮＡが植物の葉身の傾きを増加させる機能を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、該ＤＮＡの発現を抑制させた植物体について葉身結合部試験を行ない、野生型と比較することにより評価することができる（実施例４参照）。該試験は、植物のブラシノステロイド感受性を評価する基準ともなる。また、植物の稈の節間の伸長を誘導する機能、植物の稈の節間細胞においてその伸長方向に垂直に微小管を配置させる機能、あるいは植物の穂首の節間の伸長を抑制する機能を有するタンパク質をコードするか否かは、該ＤＮＡの発現を抑制させた植物体の節間細胞の形態を観察し、野生型のそれと比較することにより評価することができる（実施例２、３参照）。
配列番号：２に記載のＯｓＢＲＩ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．（１９７５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９８，５０３）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、ＯｓＢＲＩ１遺伝子（配列番号：１または３）もしくはその一部をプローブとして、また該遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からＯｓＢＲＩ１遺伝子と高い相同性を有するＤＮＡを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうるＯｓＢＲＩ１タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用れば、より相同性の高いＤＮＡの効率的な単離を期待することができる。これにより単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、ＯｓＢＲＩ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも５５％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
本発明のＤＮＡは、例えば、組み換えタンパク質の調製や上述したように、その発現制御により表現型が改変された形質転換植物体の作出などに利用することが可能である。
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社発売のベクターｐＭＡＬシリーズ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として調製する方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社発売のベクターｐＧＥＸシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．＆  Ｈｉｇａ，Ａ．（１９７０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５８−１６２、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９８３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，５５７−５８０）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間のにちに血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
本発明のＤＮＡを発現する形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。
一方、本発明のＤＮＡの発現が抑制された形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現を抑制するためのＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した（Ｊ．Ｒ．ＥｃｋｅｒおよびＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ．８３：５３７２）。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスＲＮＡの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており（Ａ．Ｒ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：８６６）、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座２  核酸  ＩＶ遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人，ｐｐ．３１９−３４７，１９９３）。
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。配列の相補性は、上記した検索により決定することができる。
アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，（１９９０）蛋白質核酸酵素，３５：２１９１）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡまたはＵでも切断されることが示されている（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら，（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２８：２２５）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら，（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：２８５、小泉誠および大塚栄子，（１９９０）蛋白質核酸酵素，３５：２１９１、Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７０５９）。例えば、ＯｓＢＲＩ１遺伝子（配列番号：１、３）のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｊ．Ｍ．Ｂｕｚａｙａｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：３４９，１９８６）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｙ．ＫｉｋｕｃｈｉおよびＮ．Ｓａｓａｋｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６７５１、菊池洋，（１９９２）化学と生物３０：１１２）。
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたＲＮＡの５’末端や３’末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｋ．Ｔａｉｒａら，（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．３：７３３、Ａ．Ｍ．ＤｚｉａｎｏｔｔおよびＪ．Ｊ．Ｂｕｊａｒｓｋｉ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：４８２３、Ｃ．Ａ．ＧｒｏｓｓｈａｎｓおよびＲ．Ｔ．Ｃｅｃｈ（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３８７５、Ｋ．Ｔａｉｒａら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１２５）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる（Ｎ．ＹｕｙａｍａらＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６：１２７１，１９９２）。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：Ｒ７９３，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：８１０，１９９６）。例えば、ＯｓＢＲＩ１遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、ＯｓＢＲＩ１遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からＯｓＢＲＩ１変異体の形質を有する植物、例えば、節間の伸長が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記した検索を利用して決定することができる。
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。本発明において「ドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」とは、該ＤＮＡを発現させることによって、植物体が本来持つ本発明の内在性遺伝子がコードするタンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡのことを指す。好ましくは、本発明の蛋白質のキナーゼ領域を含み、Ｎ末端側領域が欠失したペプチド（例えば、配列番号：２のアミノ酸配列の７３９位から１０３５位を含むペプチドまたはこれに対応する他の蛋白質のペプチド）をコードするＤＮＡである。対照となるＤＮＡが本発明の内在性遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有するか否かは、上述したように、対象となるＤＮＡが、植物のブラシノステロイド感受性を向上させる機能、植物の稈の節間の伸長を誘導する機能、植物の稈の節間細胞においてその伸長方向に垂直に微小管を配置させる機能、植物の穂首の節間の伸長を抑制する機能、および／または植物の葉身の傾きを増加させる機能を消失または低下させるか否かにより判定することができる。
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１５０３−１５０７参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．（１９９５）Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．）ｐｐ６６−７４）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１５０３−１５０７）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１−２８２．）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
本発明の植物体は、好ましくは単子葉植物であり、さらに好ましくはイネ科植物であり、最も好ましくはイネである。本発明の植物体は、野生型植物体と比較して、その表現型が変化している。表現型の変化には、植物のブラシノステロイド感受性の変化、植物の草丈の変化（例えば、植物の稈の節間細胞の伸長の変化、植物の穂首の節間の伸長の変化）、植物の葉身の傾きの変化、および植物の稈の節間細胞における微小管の配置の変化などが含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
なお、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の種子は蒸留水に浸し、３０℃で４８時間吸水させ、蒸留水で数回洗浄後、３０℃の暗いチャンバーで８日間発芽させた。イネの植物体は、圃場または３０℃（昼）および２４℃（夜）の温室で栽培した。
［実施例１］  イネ矮小型変異体ｄ６１の解析
イネの矮小型変異体ｄ６１−１およびｄ６１−２を、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＮＭＵ）処理によって、それぞれ取得した（図２Ａ）。
ｄ６１変異体の弱い対立遺伝子は、第２節間の伸長を特異的に行わず（ｄｍタイプ）、強い対立遺伝子は、上端の節間以外の節間をすべて伸長しない（ｄ６タイプ）（Ｗｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．４９，１４７−１５３）（図１）。
ｄ６１−２の稈の長さはｄ６１−１よりもはるかに短く、ｄ６１−１は典型的なｄｍタイプの節間伸長パターンを示したのに対しｄ６１−２はｄ６タイプを示した（図２Ｂ）。最初、これら変異体は独立した変異体と解析されたが、交配試験により、単一の遺伝子座にある対立遺伝子であることが示された。イネの単一の遺伝子座の変異体が異なるパターンで特定の節間伸長の阻害を示した、最初の事例である。
これらの変異体は、特定の節間伸長の阻害を示したのみならず、多形質発現効果として他の異常な表現型も示した。変異体の穂首節間は、野生型よりも長くなっている（図２Ｃ）。穂首節間の長さは、これらの植物では稈の長さと逆平行の関係にあり、すなわち、野生型は最長の稈と最短の穂首節間を持ち、ｄ６１−１変異体は中間の稈と中間の穂首節間を持ち、ｄ６１−２は最短の稈と最長の穂首節間を持つ。
他の異常な表現型は、直立した葉である（図２Ｄ）。野生型植物では、葉身は垂直方向の葉鞘から背軸側へと分かれる。この葉鞘に対する葉身の分岐は、図２Ｄで矢印で示した葉身結合部とよばれる特定の組織によって起こる。葉身と葉鞘の伸長が完了すると、葉身結合部の向軸側の細胞が伸長を開始し、葉鞘の分岐が起きる。しかし、変異体では、そのような葉鞘に対する葉身の屈曲は明らかではない。ｄ６１−１の葉の中には、ある程度の屈曲を示したものもあったが（図２Ｄ、中央）。Ｄ６１−２のすべての葉は完全に直立していた（図２Ｄ、右）。
つまり、葉身の傾きの程度は、矮小性の強さと相関している。葉身の傾きの程度が継続することは、葉身の傾きを引き起こす葉身の向軸側にある表面細胞の縦方向への伸長が、ブラシノステロイドシグナルに継続的に応答することを示唆している。
変異体の葉が屈曲しないのは、葉身結合部の発達がなかったり、少なかったりするためではない。実際には、葉身結合部は強い表現型を持つｄ６１−２でも、正常に発達する。また、葉鞘の長さは、野生型植物よりも短くなった（図２Ｅ）。
［実施例２］  節間の細胞形態の観察
節間の伸長は、節間分裂組織の細胞の分裂、および伸長帯の細胞の伸長によって起こる（Ｈｏｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．（１９８９）Ｓｔｅｍ．Ｉｎ  Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔ．（Ｎｏｂｕｎｋｙｏ），ｐｐ１２３−１４８）。そのため、稈の発達抑制は、細胞伸長の異常もしくは細胞分裂の異常またはその両方に起因する可能性がある。このような可能性を区別するために、成体植物の各節間の切片を顕微鏡で分析した。
種々の段階にある発生中または発生した稈はＦＡＡ（ホルマリン：氷酢酸：７０％エタノール、１：１：１８）中で固定し、一連の段階的なエタノール中で脱水した。４５℃で重合後、樹脂Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ７１００（Ｋｕｒｚｅｒ、ドイツ）に包埋し、３〜５μｍの厚さの切片にした。切片はトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察した。
図３は、野生型および変異体ｄ６１−２の上部４つの節間の組胞形態である。野生型では、すべての節間の細胞は、縦方向に伸長し、縦方向の列に組織化されている（図３Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）。そのような縦方向の細胞列は、変異体植物の第１節間にも見られるが、細胞の長さは野生型よりもわずかに短い（図３Ｅ）。変異体の第２および第３節間のような伸長していない節間では、組織化された細胞列は観察されず、細胞の構成は混乱している（図３ＦおよびＧ）。節間細胞の混乱は、伸長した細胞の縦方向の細胞列を誘導する変異体の節間分裂組織が、非伸長節間では発達していないことを示す。第４節間では、組織化された細胞列が観察されるが、細胞の長さは野生型植物と比較して著しく短くなっている（図３ＤとＨを比較）。これは、非伸長節間では必ずしも節間分裂組織が発達しないわけではなく、節間の細胞の伸長のみが行われないことを示唆する。
［実施例３］  微小管の配列の観察
細胞の伸長が微小管（ミクロフィブリル）の方向に依存することは詳しく記述されている（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄ  Ｐｏｒｔｅｒ，Ｋ．Ｒ．（１９６３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９，２３９−２５０；Ｇｒｅｅｎ，Ｐ．Ｂ．（１９６２）Ｓｃｉｅｎｃｅ．１３８，１４０４）。よって、野生型およびＤ６１−２の節間細胞の微小管の配列を、免疫蛍光顕微鏡で観察した。
節間柔組織の微小管は、免疫蛍光によって染色した。室温で、微小管安定化緩衝液（０．１Ｍピペラジンジエタノールスルホン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭエチレングリコール−ビス−（３−アミノメチル−エーテル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、０．２％  ｖ／ｖトリトンＸ１００、１％  ｗ／ｖグリセロール、ｐＨ６．９）中の３．７％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドにより４５分間前固定した後、新しいかみそりの刃で縦方向の切片を作製し、固定溶液中に採集した。後固定として、切片を同じ溶液中で４０分間処理し、パラホルムアルデヒドを含まない固定溶液で洗った。その後、０．１％  ｖ／ｖトリトンＸ１００を含むリン酸緩衝生理食塩水で１：５００に希釈した、ウサギ抗αチューブリンモノクローナル抗体により、３７℃で１時間処理した。抗血清を含まないこの緩衝液で３回洗った後、フルオレセイン−イソチオシアネートで標識し、０．１％  ｖ／ｖトリトンＸ１００を添加したリン酸緩衝生理食塩水で１：５０に希釈したマウス抗ウサギＩｇＧ２次抗体と切片を、４℃で一晩インキュベートした。同じ緩衝液で３回洗浄後、退色防止溶液（Ｆｌｕｏｒｏ  Ｇｕａｒｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬、ＢＩＯ−ＲＡＤ）中でマウントして蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、伸長した節間では、野生型植物の細胞中の微小管は、伸長方向に対して垂直に配列されており（図４Ａ）、野生型植物では、うまく配列された微小管が、節間の迅速な伸長を支持することを示す。しかし、ｄ６１−２では、伸長する第１節間の細胞でも、垂直に配列した微小管は観察されず、各細胞中で不定の方向に向いた斜めに配列された微小管が見られた（図４Ｂ）。さらに、変異体の微小管は、野生型の垂直に配列された微小管よりも細くて弱く見えた。
さらに、変異体植物の非伸長節間の細胞の微小管の配列の観察も試みたが、観察できなかった。
実施例２の結果と合わせて考えると、変異体における非伸長節間は、節間分裂組織を発達させたり、微小管を配列させることができないのに対し、変異体の伸長した節間は、節間分裂組織を発達させることはできるが、垂直方向に配列した組織化した微小管は持たないため、野生型植物よりも節間の伸長が短いといえる。
［実施例４］  ブラシノライドに対する感受性試験
ｄ６１変異体が矮小型表現型および直立した葉を持つことを考慮すると、Ｄ６１遺伝子産物はブラシノステロイドの生合成またはシグナル伝達に関連している可能性が推測されるため、以下の実験を行った。
まず、ｄ６１の矮小性をブラシノライドを用いて回復することを試みたが、回復できなかった。
次に、野生型および変異型植物の種子を、１μＭのブラシノライドを含む寒天プレートおよび含まない寒天プレート上で発芽させた。発芽後１日目に実生全体の特徴を観察した。
その結果、野生型植物がブラシノライドを含むプレート上で発芽すると、子葉鞘はよじれて異常に伸長しており、普通葉はうまく成長せず、そのため普通葉は子葉鞘を突き破らなかった（図５）。さらに、根の伸長は阻害され、まっすぐに伸びずに波状の形態を示した。ブラシノライドを含まない寒天上の野生型植物は正常に成長し、子葉鞘の伸長は発芽の初期段階で停止し、普通葉の伸長は子葉鞘の伸長の停止後も継続したため、普通葉は子葉鞘を突き破った。根は正常に発生し、波状の形態を示さなかった（図５）。野生型に対して、変異体はブラシノライド寒天プレート上でも異常な成長を示さず、ブラシノライドを含まないプレート上の野生型植物と類似した正常な成長を示した。これらの結果は、野生型植物と比較して、変異体植物のブラシノライドに対する感受性が低下していることを示唆する。
さらにより定量的な方法でも、ブラシノライドに対する変異体の感受性を試験した。
イネの葉身と葉鞘の間の屈曲角度はブラシノライドやその類縁体の濃度により高感度で影響を受けることは良く知られている。イネを含む単子葉植物における内在性ブラシノステロイドの生体機能はまだ解明されていないが、イネの葉のこの特性は葉身結合部試験（Ｗａｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２，３２３−３２５）と呼ばれ、ブラシノステロイドの定量的バイオアッセイとして使用されている。変異体のブラシノステロイドに対する感受性が低下しているならば、変異体の葉身と葉鞘の間の角度は、野生型よりも小さくなっていると考えられる。
試験には、野生型（Ｔ６５、変異体のバックグラウンド株）、ｄ６１−１、ｄ６１−２の第２葉の葉身結合部を使用し、ブラシノライドはそれぞれ、１０−３、１０−２μｇ／ｍｌの濃度を使用した。
その結果、野生型は、ブラシノライド処理なしでは屈曲角度はほぼ直角で、ブラシノライドの濃度を上昇させるに連れて、角度は鋭角になった（図６Ａ）。試験に変異体を使うと、屈曲角度はやはりブラシノライドに影響され、野生型同様にブラシノライドの濃度を上昇させると角度は鋭角になったが、これらの変異体の葉の角度は、同じ条件下の野生型よりもはるかに小さかった（図６ＢおよびＣ）。特にｄ６１−２では、無処理の葉はほぼまっすぐで、１０−２μｇ／ｍＬのブラシノライド処理の葉の角度は、直角には到らなかった。葉身結合部試験の結果は、ブラシノステロイドに対する変異体の感受性は野生型よりも低いという上述の推測を確認するものである。
［実施例５］  ｄ６１−２におけるブラシノステロイド定量分析
実施例４より、変異体のブラシノステロイドに対する感受性が低下していることが示された。つまり、変異体はブラシノステロイドへの感受性の低下を補うために、ブラシノステロイドをより高濃度で合成している可能性がある。したがって、内部標準を用いたＧＣ−ＳＩＭを用いて、変異体ｄ６１−２および野生型のブラシノステロイド濃度を直接に測定した。
野生型およびｄ６１−２は、温室で１６時間明期、８時間暗期という条件で栽培した。２箇月齢のシュートを回収し、直ちに凍結乾燥した。凍結乾燥したシュート（新鮮重量５０ｇ相当）を２５０ｍＬのＭｅＯＨ−ＣＨＣＬ３（４：１［ｖ／ｖ］）で２度抽出し、重水素標識した内部標準（１ｎｇ／ｇ新鮮重量）を添加した。真空で溶媒を蒸発させた後、抽出物をＣＨＣＬ３とＨ２Ｏとに分割した。ＣＨＣＬ３可溶性の画分は、シリカゲルクロマトグラフィー（Ｗａｋｏ−ｇｅｌ　Ｃ−３００；Ｗａｋｏ；１５ｇ）にかけた。その後、カラムを２％および７％ＭｅＯＨを含むＣＨＣＬ３  １５０ｍＬで溶出し、それぞれの画分をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（カラム容量２００ｍＬ；カラムはＭｅＯＨ−ＣＨＣＬ３（４：１［ｖ／ｖ］）で溶出）で精製した。溶出体積０．６〜０．８（Ｖｅ／Ｖｔ）の溶出物をブラシノステロイド画分として採集した。ＭｅＯＨを用いてＯＤＳカートリッジカラム（１０ｘ５０ｍｍ［内径ｘカラム長］）で精製した後、７％ＭｅＯＨ画分由来の溶出物については、６５％アセトニトリルの溶媒を用いた８ｍＬ／分の流速のＤＯＳ−ＨＰＬＣにかけた。７％ＭｅＯＨ画分のＨＰＬＣ精製では、カスタステロン画分（保持時間１０〜１５分）、チファステロール（ｔｙｐｈａｓｔｅｒｏｌ）画分（保持時間２５〜３０分）、および６−デオキソカスタステロン（ｄｅｏｘｏｃａｓｔａｓｔｅｒｏｎｅ）画分（保持時間４０〜４５分）が得られ、２％ＭｅＯＨ画分のＨＰＬＣ精製では、６−ｄｅｏｘｏｔｙｐｈａｓｔｅｒｏｌ画分（保持時間５５〜６０分）が得られた。各画分は誘導体化してＧＣ−ＳＩＭにより分析した。内在性ブラシノステロイドのレベルは、内因性ブラシノステロイドと内部標準の顕著なイオンのピーク面積の比率で決定した。
その結果、変異体と野生型のいずれでも、シュートにはブラシノステロイドは検出されず、ブラシノライドがブラシノステロイドの重要でない成分であることが示唆された。しかし、野生型植物でテアステロンがなかった以外は、両方の植物で他のブラシノステロイド化合物はすべて検出され、これらすべてのブラシノステロイドの含有量は、野生型よりも変異体の方が高かった（図７）。特に、カスタステロンは、変異体では野生型の４倍見られた。この結果は、変異体がブラシノステロイドに不感性の植物であることを支持するものである。
［実施例６］  ｄ６１変異体の脱黄化表現型
ブラシノステロイドの生合成またはブラシノステロイドのシグナル伝達の欠如したシロイヌナズナの変異体は、暗条件で、胚軸の伸長の低下、子葉の開放、および完全な暗所での第一葉の出現を示すことが証明されている（Ｋａｕｓｃｈｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．９，７０１−７０３；Ｓｚｅｋｅｒｅｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ．８５，１７１−１８２）。
暗所におけるこの脱黄化（ＤＥＴ）または構成的光形態形成（ＣＯＰ）の表現型は、シロイヌナズナのブラシノステロイド関連変異体に一般的に見られる特徴である。短い胚軸、鉤型頂芽の欠如、及び子葉の拡張を示すトマトの矮小型（ｄ）変異体でも、同様のＤＥＴまたはＣＯＰ表現型が観察されている（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．８，９５９−９６９）。対照的に、エンドウのブラシノステロイド欠如変異体１ｋｂは、そのようなＤＥＴ表現型を示さない（Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌｎａｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９３，５７２−５７７）。ＤＥＴまたはＣＯＰ表現型が単子葉植物にも適用できるか、ｄ６１変異体がそのような暗黒形態形成の特徴を示すかどうかを確認するため、暗所にて変異体を栽培した。
その結果、野生型植物が暗所で発芽すると、明所で栽培した苗と比較して、中胚軸および節間の異常な伸長が起きた（図８Ａ）。変異体を暗所で栽培しても、そのような中胚軸および節間の伸長は起こらなかった（図８ＢおよびＣ）。中胚軸と節間の伸長の停止は、イネの矮小型変異体では珍しい。例えば、ジベレリンの生合成欠損の別の矮小型変異体ｄ３５およびｄ１８では、暗条件では中胚軸および節間の伸長が見られる（それぞれ図８ＤおよびＥ）。
従って、中胚軸と節間の伸長の低下は、ｄ６１変異体に特異的な特性であり、ｄ６１は脱黄化表現型を持つと考えられる。また、ブラシノステロイドシグナルの欠如に起因する脱黄化は、双子葉植物と単子葉植物に共通の特徴であることを示す。すなわち、ブラシノステロイドシグナルは双子葉植物と単子葉植物両方で、暗黒形態形成に重要であると考えられる。
［実施例７］  Ｄ６１遺伝子座のマッピングおよび連鎖分析
Ｄ６１遺伝子座のマッピングのために、変異体ｄ６１−２をＩｎｄｉｃａイネのＫａｓａｒａｔｈ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｃｖ．Ｋａｓａｒａｔｈ）と交配した。変異体の表現型と、イネゲノム解析プロジェクト（筑波）で発表された制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーとの間の連鎖分析によって、Ｄ６１遺伝子座は１番染色体の長腕上にマッピングされ、ＲＦＬＰマーカーＣ１３７０と強く連鎖することが分かった（図９Ａ）。
また、ｄ６１はブラシノステロイド不感性または感受性低下変異体と特徴づけられるので、変異体表現型と、シロイヌナズナＢＲＩ１遺伝子と相同なイネの遺伝子の連鎖も調べた。
シロイヌナズナのＢＲＩ１遺伝子は、ブラシノステロイドシグナル伝達に関連する唯一の遺伝子として単離された（Ｌｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．９０，９２９−９３８）。またブラストサーチによりシロイヌナズナＢＲＩ１と高い相同性を持つイネＥＳＴクローンＳ１６７６を同定した（Ｌｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．９０，９２９−９３８）。
イネのゲノムＤＮＡは、葉の組織からＩＳＯＰＬＡＮＴ  ＤＮＡ単離キット（Ｎｉｐｐｏｎ  ＧＥＮＥ  Ｃｏ．）を用いて単離し、１μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、アルカリ性条件でＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレン（アマシャム）に転写し、ＯｓＢＲＩ１をコードするゲノムＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズする部分的ｃＤＮＡ断片（キナーゼドメインの対応するＳｅｒ７４０〜Ａｓｐ１１１６）をプローブとして使用して、ＤＮＡゲルブロット分析により分析した。ハイブリダイゼーションは、厳密度の高い条件で行い（６８℃）、その他はＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）ＰＮＡＳ．８１，１９９１−１９９５の方法に従った。
ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した場合に、このｃＤＮＡクローンでプローブするとＪａｐｏｎｉｃａ（１２．５ｋｂ）とＩｎｄｉｃａ（１７．５ｋｂ）の間にＲＦＬＰが観察された。変異型表現型を持つすべてのＦ２植物は、Ｊａｐｏｎｉｃａ対立遺伝子（１２．５ｋｂ）のホモ接合体だったが、野生型の表現型を持つＦ２植物は、Ｉｎｄｉｃａ対立遺伝子（１７．５ｋｂ）のホモ接合体またはＪａｐｏｎｉｃａおよびＩｎｄｉｃａのヘテロ接合（１２．５＋１７．５ｋｂ、図９Ｂ）だった。この結果は、Ｄ６１遺伝子座がシロイヌナズナのＢＲＩ１に相同な遺伝子の位置に強く連鎖していることを示す。
［実施例８］  ｄ６１遺伝子の同定
上記連鎖分析で、ｄ６１変異体がシロイヌナズナＢＲＩ１に相同な遺伝子の機能損失変異に起因することが強く示唆された。この可能性を確認するために、プローブを用いてイネのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、イネＢＲＩ１相同遺伝子（ＯｓＢＲＩ１、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＢＲＩ１）全体を単離した。このスクリーニングのハイブリダイゼーションは、メンブレンに厳密度の高い条件（６８℃）でハイブリダイズさせた以外は、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）ＰＮＡＳ．８１，１９９１−１９９５によって記述されたようにして行った。塩基配列の決定は、上記のＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法により行なった。
ＯｓＢＲＩ１の構造は、全長に渡り、シロイヌナズナＢＲＩ１と類似していた（図１０および図１１）。予測されるＯｓＢＲＩ１ポリペプチドは、ＢＲＩ１でその機能が考察されている（Ｌｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．９０，９２９−９３８）いくつかのドメインを保持している。すなわち、シグナルペプチドと推測されるもの、間隔が保存された２つのシステインペア、ロイシンに富む繰り返しドメイン、膜貫通ドメイン、およびキナーゼドメインである。予測されるＯｓＢＲＩ１ポリペプチドのＮ末端には、この蛋白質を原形質へ輸送するためのシグナルペプチドと予測される疎水性の部分がある。ＢＲＩ１蛋白質では、ＬｉおよびＣｈｏｒｙ（Ｌｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．９０，９２９−９３８）は、シグナルペプチドに続く４つの７残基からなる両親媒性ロイシンジッパーモチーフの可能性を予測したが、ＯｓＢＲＩ１では、それに対応する領域にそのような典型的なロイシンジッパーモチーフは見られなかった。
シロイヌナズナのＢＲＩについては、１２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含む約２４アミノ酸のロイシンに富む繰返し配列（ＬＲＲ）の２２の縦列コピーからなる細胞外ドメインと推定されるもの（Ｍｅｔ１からＬｅｕ６７０）に、間隔の保存されたシステインのペアが隣接している。ＬＲＲは、蛋白質間相互作用に働くと示唆されている（Ｋｏｂｅ，Ｂ．ａｎｄ  Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９，４１５−４２１）。
ＢＲＩ１配列と比較して、ＯｓＢＲＩ１ではシロイヌナズナＢＲＩ１の３番目から５番目までの繰り返しに対応する３つのＬＲＲドメインが欠失している。欠失前には、他のＬＲＲ蛋白質の間のコンセンサス残基を除いては、２つの蛋白質のＬＲＲはあまり保存されていない。しかし、欠失後は、２つの蛋白質のＬＲＲは、コンセンサス残基のみならず、非保存アミノ酸でもよく保存されている。ＢＲＩ１のＬＲＲ領域の珍しい特徴は、２１番目と２２番目のＬＲＲの間に７０アミノ酸のアイランドが存在することである（Ｌｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．９０，９２９−９３８）。このような珍しい特徴は、ＯｓＢＲＩ１でも保持されており、ＢＲＩ１のアイランドの位置に対応する１８番目と１９番目のＬＲＲの間に同数のアミノ酸があり、高度に類似している。ＬＲＲ領域におけるこの珍しいアミノ酸アイランドは、その機能に重要なはずである。というのも、このアイランド中のアミノ酸残基を変換すると、ＢＲＩ１の機能が喪失したからである（Ｌｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．９０，９２９−９３８）。このモチーフはブラシノステロイドとの直接の相互作用、またはブラシノステロイド結合ドメインの構造の維持に重要であると考察している（Ｌｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．９０，９２９−９３８）。
ＯｓＢＲＩ１のプロテインキナーゼドメインには、真核生物のプロテインキナーゼに保存されている１１のサブドメインのすべてが含まれており、不変のアミノ酸残基も正しい位置に保存されている（Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，Ａ．Ｍ．（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００，３８−６２）。ＯｓＢＲＩ１のドメインは、領域全体に渡ってＢＲＩ１と高い関連があり（４６％）、シロイヌナズナＥＲＥＣＴＡ（Ｔｏｒｉｉ，Ｋ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．８，７３５−７４６）、ＣＬＶ１（Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．３，５７５−５８５）、およびＲＬＫ５（Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３，４５１−４５６）およびイネＸａ２１（Ｓｏｎｇら、１９９５）のような他の高等植物の受容体様プロテインキナーゼのキナーゼドメインにも関連があった。これらの受容体様キナーゼ、特にそのサブドメインＶＩｂおよびＶＩＩＩに対してＯｓＢＲＩ１が高度に保存された構造を持つということは、ＯｓＢＲＩ１がチロシンキナーゼではなくセリン／スレオニンキナーゼに分類されることを示唆する（Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｑｕｉｎｎ，Ａ．Ｍ．（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００，３８−６２）。
［実施例９］  ｄ６１−１およびｄ６１−２のＯｓＢＲＩ１の配列決定
ｄ６１−１およびｄ６１−２のＯｓＢＲＩ１の全体の配列も決定し、野生型と比較した。
いずれの場合も、アミノ酸の変換を誘導する単一ヌクレオチドの変換が、異なる部位に同定された（表１）。ｄ６１−１のゲノムでは、単一のヌクレオチドの変換（ＣからＴ）のために、ＯｓＢＲＩ１とＢＲＩ１で保存されているキナーゼドメインのサブドメインＩＸ中の９８９の位置が、スレオニンからイソロイシンに変換された。ｄ６１−２のゲノムでは、ヌクレオチドの変換（ＧからＡ）のために、珍しい７０アミノ酸の割り込み領域のすぐ前の１７番目のＬＲＲ中の４９１の位置のバリンがメチオニンに変わった。ｄ６１変異体におけるこれらのＯｓＢＲＩ１の変異は、ＯｓＢＲＩ１がＤ６１遺伝子座をコードすることを強く支持している。
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［実施例１０］  遺伝子ＯｓＢＲＩ１の導入による、ｄ６１の分子相補性
ＯｓＢＲＩ１がｄ６１遺伝子座に対応することを確認するため、野生型ＯｓＢＲＩ１遺伝子を導入し、ｄ６１−１の相補性分析を行った。
つまり、５’および３’隣接領域を持つＯｓＢＲＩ１ゲノムの導入によるｄ６１表現型の相補性の確認のため、ＯｓＢＲＩ１の全コード領域を含む制限断片１０．５ｋｂをハイグロマイシン抵抗性バイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ３のＸｂａＩ−ＳｍａＩ部位にクローニングした（Ｓａｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８，９９２−１００２）。ｐＢＩ−ｃｏｎｔを対照ベクターとして用いた。イネの組織培養及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる形質転換の手順は、Ｈｉｅｉら（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６，２７１−２８２）の方法に従った。イネのゲノムＤＮＡを含まない対照ベクターをｄ６１に導入した場合には、稈の長さや葉の構造に変化は観察されなかった。しかし、野生型ＯｓＢＲＩ１遺伝子全体を含む１０．５ｋｂのＤＮＡ断片を導入すると、ハイグロマイシン抵抗性のほとんどの植物で、正常な表現型が回復し、ｄ６１変異はＯｓＢＲＩ１の機能損失変異によって生じることが確認された。
［実施例１１］  ＯｓＢＲＩ１のＲＮＡゲルブロット分析
単子葉植物における内在性ブラシノステロイドの機能は全く解明されていない。従ってＲＮＡゲルブロット分析を行い、イネの様々な器官におけるＯｓＢＲＩ１の発現パターンを試験した。
ＲＮＡは種々のイネ組織から、文献（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ  ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２：１５６）記載の方法により、単離した。１０μｇの総ＲＮＡを１％アガロースゲルで電気泳動後、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレン（アマシャム）に転写し、ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションで分析した。プローブとして、ＯｓＢＲＩ１をコードするゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする部分的ｃＤＮＡ断片（キナーゼドメインに対応するＳｅｒ７４０からＡｓｐ１１１６）を用いた。プローブおよびハイブリダイゼーションの条件は、実施例７と同様にして行った。
その結果、栄養成長期の茎頂のＲＮＡ中に単一の強いバンドが検出された（図１２Ａ）。このバンドのサイズは約３．５ｋｂで、最長のｃＤＮＡクローンとほぼ同じサイズだった。花、花軸、および根、伸長した葉鞘由来のＲＮＡにも同一のサイズの弱いバンドが観察されたが、伸長した葉身のＲＮＡには、バンドは観察されないか、非常に弱かった。したがって、ＯｓＢＲＩ１の発現は器官ごとに異なっており、これはブラシノステロイドに対する感受性が器官ごとに異なることを示唆している。
さらに伸長中の稈のＯｓＢＲＩ１の発現を試験した（図１２Ｂ）。該稈を、節、節間の分裂帯、伸長帯、および伸長済の４つの領域に分割した。その結果、最も強いバンドは、分裂帯のＲＮＡに見られ、伸長帯でも強いバンドが見られた。節にも弱いバンドが見られたが、伸長済の節間部分にはバンドは見られなかった。この結果は、伸長中の稈は部分的にブラシノステロイドに対する感受性が大きく異なり、最も感受性の高い部分は、細胞が活発に分裂および伸長している分裂帯および伸長帯であることを示すものである。
さらに、各節間が活発に伸長している段階で、上部の４つの節間の伸長帯におけるＯｓＢＲＩ１の発現を試験した。その結果、上端の節間である第１節間、および下端の節間である第４節間の伸長帯で、強いバンドが見られたが、第２および第３の節間では、比較的弱いバンドしか見られなかった（図１２Ｃ）。この結果は、各節間の感受性は互いに異なり、最も感受性の低い節間は第２および第３であることを示す。
ブラシノステロイドに対する感受性は節間により差があることが観察された。ＯｓＢＲＩ１の量がブラシノステロイドシグナル伝達の制限因子であるならば、第１および第４節間は、第２および第３節間よりもブラシノステロイドに対して高い感受性を持つことを示唆している。この予測は、ｄｍ−ｄ６タイプをもつ変異対立遺伝子が中間的な表現型を持つということで支持される。このタイプの植物では、第２および第３節間が特異的に短縮するが、第１および第４節間は伸長する。ＯｓＢＲＩ１の発現量が低く感受性が低い第２および第３節間はブラシノステロイドシグナルに応答できず、節間の伸長が起きないが、ＯｓＢＲＩ１の発現量が高い第１および第４節間はブラシノステロイドに応答できるため伸長することができる。第１および第４節間におけるＯｓＢＲＩ１の高レベルの発現は、ｄｍ−ｄ６タイプの珍しい節間伸長パターンを説明できるが、ｄ６またはｄｍタイプの出現を説明できない。第１節間以外の全ての節間が短縮しているｄ６タイプは、第１節間は第４節間よりも高レベルのブラシノステロイドに露出しているためと解釈できるかもしれない。第１節間の伸長の時期は、多くの植物で高レベルのブラシノステロイドが観察される花の葯の発達に対応している（Ｇｒｏｖｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ，２８１，２１６−２１７；Ｐｌａｔｔｎｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．４９，５４０−５４５；Ｉｋｅｋａｗａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３６，４０５−４０７；Ｔａｋａｔｓｕｔｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９ｂ）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３，２１７７−２１８０；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５０，３１３３−３１３８；Ｇａｍｏｈ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．２２８，１０１−１０５）。葯における高レベルのブラシノステロイドが、第１節間のような下にある器官に移動して、節間の伸長を誘導するが、第４節間の伸長は花の発達前に完了しており、第４節間は活性をもつ伸長時期に花から高レベルのブラシノステロイドを受け取ることができないという可能性が高い。ｄｍ−ｄ６およびｄ６タイプとは反対に、ｄｍタイプで観察される第２節間の特異的な短縮は、ブラシノステロイドレベルや、ＯｓＢＲＩ１によるブラシノステロイドに対する感受性では解釈できず、別の道の要素で解釈する必要がある。ｄｍ表現型をもつ独立した矮小型変異体が数種類あるため（ｄ１，ｄ２，ｄ１１，およびｄ６１）、第２節間の伸長は、種々の要素によって調節されている可能性があると考えられている。
ごく最近、Ｄ１遺伝子が単離され、Ｇプロテインのαサブユニット（Ｇ−α）と類似した構造を持つ蛋白質をコードしていると解析された（Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６，７５７５−７５８０；Ａｓｈｉｋａｒｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６，１０２８４−１０２８９）。ｄ１変異対立遺伝子は、活性ＧＡに対して感受性がないか非常に低いので、現在、Ｄ１  Ｇα様蛋白質は、ジベレリン（ＧＡ）シグナル伝達経路に関連していると考えられている。ブラシノステロイドシグナル関連蛋白質ＯｓＢＲＩ１の機能損失変異と、ＧＡシグナル関連蛋白質Ｇα蛋白質の機能損失変異が、第２節間の特異的な短縮という同一の表現型を持つのは興味深い。したがって、第２節間の伸長の誘導には、第２節間におけるブラシノステロイドとＧＡのシグナル伝達の間に共通の特異的な機構があることが考えられる。
興味深いことに、節間伸長の起こらない栄養成長期の茎でも高レベルのＯｓＢＲＩ１発現が見られた。したがって、稈におけるＯｓＢＲＩ１の高レベルの発現は、節間伸長が起きることを直接に意味するわけではない。
［実施例１２］  外因性ブラシノライドおよび光がＯｓＢＲＩ１のｍＲＮＡレベルに与える影響
ＯｓＢＲＩ１のｍＲＮＡレベルに対する外因性ブラシノライドおよび光の影響も試験した。発芽した種子を１μＭブラシノライドを含む０．９％寒天プレートと含まないものに播種し、明所または暗所で６日間栽培した。
その結果、ブラシノライドを含まないプレートの場合、暗所で栽培した実生におけるＯｓＢＲＩ１の発現は、明所で培養した実生よりも高レベルだった（図１２Ｄ）。
このことは、暗所で栽培したイネの実生が明所で栽培した植物よりもブラシノステロイドに対して高い感受性を持つことを示唆する（Ｗｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｗ．（１９７１）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．９６，２７０−２７３）。暗所で栽培した植物がブラシノステロイドに対して高い感受性を持てば、明所で栽培した植物の細胞がブラシノステロイドに応答しない条件でも、節間細胞の伸長が誘導されると考えられる。
また、ブラシノライドを含むプレートの場合、明所および暗所栽培の実生両方でＯｓＢＲＩ１発現が低下した。
イネとは対照的に、シロイヌナズナのＢＲＩ１発現レベルには、暗所で栽培された実生と明所のものとの間で、余り違いはない（Ｌｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｏｒｙ，Ｊ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．９０，９２９−９３８）。イネのＯｓＢＲＩ１とシロイヌナズナＢＲＩ１の間の発現パターンに違いがある理由はまだ明らかではないが、発現パターンの差が、イネは短日植物であり、シロイヌナズナは長日植物であるという、光に応答する機構の違いに関連している可能性はある。
［実施例１３］  ＯｓＢＲＩ１のアンチセンス鎖を発現するトランスジェニック植物の表現型分析
上記ｄ６１変異体の表現型分析、および各変異体のＯｓＢＲＩ１遺伝子に１塩基の置換があることから、これらの対立遺伝子はヌルではなく、部分的に機能を保持している可能性がある。イネにおけるブラシノステロイドの機能をさらに解明するために、イネのアクチン１遺伝子のプロモーター（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．３，１１５５−１１６５）の制御下にあるＯｓＢＲＩ１転写産物のアンチセンス鎖を過剰発現させ、さらに強い表現型を持つ他の変異体の単離を試みた。
アクチン１プロモーター：：アンチセンスＯｓＢＲＩ１の作製のために、まず、ハイグロマイシン抵抗性バイナリーベクターｐＢＩ３５Ｓｎｏｓ（Ｓａｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８，９９２−１００２）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位にある３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターからなるプロモーター／ターミネーターカセットの３５Ｓプロモーターを、ＡｃｔＩプロモーターで置換し、Ａｃｔ１（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．３，１１５５−１１６５）プロモーターおよびＮＯＳターミネーターからなるプロモーター／ターミネーターカセットを調製した（ｐＢＩＡｃｔ１ｎｏｓ）。ｐＢＩＡｃｔ１ｎｏｓのＸｂａＩとＳｍａＩ部位の間に全ＯｓＢＲＩ１をコードするｃＤＮＡクローンを導入した。インサートを含まないｐＢＩ−ｃｏｎｔを対照ベクターとして使用した。
ＯｓＢＲＩ１の発現を低下させるためのアンチセンスｃＤＮＡを発現するトランスジェニック植物の生産には、イネの栽培品種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅを使用した。イネの組織培養およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる形質転換は、Ｈｉｅｉらの方法に従った（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６，２７１−２８２）。
その結果、ほとんどのトランスジェニック植物（９０％以上、２０のうちの１８）は実生の初期段階で直立した葉を形成した（図１３Ｄ）。矮小性の表現型は、程度は異なるがすべての形質転換体（２０のうち２０）で見られた（図１３Ａ）。最も弱い表現型の植物では、各節間の長さは部分的におよび均一に短縮されており、野生型の伸長パターンと類似したもの（ｄｎタイプ）が得られた（図１３Ｃ）。中間の表現型の植物は、典型的なｄｍ（第２節間が特異的に短縮、図１３Ｃ）の節間伸長パターン、またはｄ６（第２から第４節間の特異的な短縮、図１３Ｃ）、またはｄｍおよびｄ６の混合表現型（第２および第３節間の特異的な短縮、図１３Ｃ）を示した。強い表現型の植物は、発達した鞘器官なしに異常な葉のみを形成し、節間の伸長は全く起こらなかった（図１３Ｅ）。このタイプの植物の高さは、１年以上栽培したものでも１５ｃｍ未満だった（図１３Ｂ）。強い表現型の植物の種子は得られなかったため、強い表現型を除いて、ハイグロマイシン抵抗性との共分離でこれらの表現型は次世代にも遺伝した。異常な表現型とハイグロマイシン抵抗性の間の共分離およびアンチセンス植物とｄ６１変異体の中間表現型の間の類似性は、アンチセンス鎖がトランスジェニック植物中で活性を持ち、ＯｓＢＲＩ１の機能を抑制することを示す。
［実施例１４］  ＯｓＢＲＩ１のドミナントネガティブを発現するトランスジェニック植物の発現型
イネにおけるブラシノステロイド受容体の機能をさらに解明するために、イネのアクチン１遺伝子のプロモーター（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，３：１１５５−１１６５）の制御下に、ＯｓＢＲＩ１のキナーゼ部分のみを連結し、イネに形質転換を行った。すなわち、ブラシノステロイド受容体のアミノ末端側の最初のメチオニンから７３８番目のグリシンまでを削除し、カルボキシル側のキナーゼ部分のみが発現するように以下のようにプラスミドを構築した。まず、５’−ＧＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧ−３’／配列番号：４（５’側プライマー：ＴＣＴＡＧＡはＸｈｏＩサイト、ＣＡＧＣＣは翻訳効率を高めるために付加、ＡＴＧは開始コドン、ＧＣＧは新たに加えたアラニン、ＡＧＣは７３９番目のセリン、７４０番目以下のリジン、アルギニン、アルギニン、アルギニン、ロイシンと続く）と５’−ＡＧＡＴＣＴＡＣＴＣＣＴＡＴＡＧＧＴＡ−３’／配列番号：５（３’側プライマー：ＡＧＡＴＣＴはＸｂａ１サイト、以下３’非翻訳領域）の１対のプライマーを用いてブラシノステロイド受容体のキナーゼ部分を増幅し、Ｘｂａ１処理後、ｐＢＩベクターのＸｂａＩ−ＳｍａＩ部位の間に挿入した。インサートを含まないｐＢＩ−ｃｏｎｔを対照ベクターとして使用した。
ＯｓＢＲＩ１の発現を制御するためにキナーゼ部分を発現するトランスジェニック植物の生産にはイネの栽培品種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅを使用した。イネの組織培養およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる形質転換はＨｉｅｉらの方法に従った（Ｈｉｅｉら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：７１−２８２）。
その結果、ほとんどのトランスジェニック植物（９０％以上、２７のうちの２５）は実生の初期段階で直立した葉を形成した（図１４）。各節間の長さは部分的に及び均一に短縮されていた。これらの表現型はハイグロマイシン抵抗性との共分離で次世代にも遺伝した。異常な表現型とハイグロマイシン抵抗性の間の共分離およびドミナントネガティブ植物とｄ６１変異体の中間型の間の類似性は、キナーゼ部分の部分ｃＤＮＡがトランスジェニック植物中で活性をもち、ＯｓＢＲＩ１の機能を抑制することを示す。
産業上の利用の可能性
本発明により、イネのブラシノステロイド感受性を向上させる機能を有するタンパク質および遺伝子が提供された。該遺伝子は、植物の節間細胞の伸長や葉身の傾きなどに関与しており、その発現調節により形態が改変された植物体の作出が可能である。例えば、本発明の遺伝子の発現抑制により、植物を矮性化させ、植物を倒れにくくしたり、単位面積あたりに作付できる植物体の個体数を増加させることができ、農作物の生産において有意義である。また、例えば、本発明のＤＮＡの発現抑制により、草丈またはかん長を矮小化することで、新たな美的価値を有する観賞用植物を作出することも可能である。一方、本発明のＤＮＡを導入して発現させることにより、植物のブラシノステロイド感受性を高め、植物体の草丈を増加させ、植物体全体の収量を増加させることも考えられる。このことは、特に、飼料用作物全体の収穫量を向上させる上で有意義である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、野生型イネおよび種々の矮小性変異体の節間伸長パターンの模式図である。稈全体に対する各節間の相対的な長さが模式的に示されている。野生型はＮで示した。
図２は、ｄ６１変異体の表現型を示す写真である。
（Ａ）イネ科の形態学。左から、野生型、ｄ６１−１（弱い対立遺伝子）、ｄ６１−２（強い対立遺伝子）。
（Ｂ）節間の伸長パターン。野生型はＮタイプの伸長パターンを示し、ｄ６１−１（中央）およびｄ６１−２（右）はそれぞれ典型的なｄｎ−およびｄ６−タイプを示す。
（Ｃ）円錐花序の構造。野生型植物は短い円錐花序（左）を持ち、ｄ６１−１（中央）およびｄ６１−２（右）は長い円錐花序を持つ。
（Ｄ）ｄ６１の直立した葉。野生型植物の葉は、葉身結合部（左、白い矢印）で屈曲しているが、ｄ６１−１（中央）およびｄ６１−２（右）の葉は野生型に比べて直立している。
（Ｅ）ｄ６１の短い葉鞘。ｄ６１（ｄ６１−１、中央、およびｄ６１−２、右）の葉鞘の長さは、野生型（左）よりも短くなる。
図３は、野生型およびｄ６１−２植物の十分に発達した節間の細胞を顕微鏡により観察した写真である。
（Ａ）野生型植物の第１節間の縦方向の切片
（Ｂ）野生型植物の第２節間の縦方向の切片
（Ｃ）野生型植物の第３節間の縦方向の切片
（Ｄ）野生型植物の第４節間の縦方向の切片
（Ｅ）ｄ６１−２の第１節間の縦方向の切片
（Ｆ）ｄ６１−２の第２節間の縦方向の切片
（Ｇ）ｄ６１−２の第３節間の縦方向の切片
（Ｈ）ｄ６１−２の第４節間の縦方向の切片
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）および（Ｈ）のバーは１００μｍを示す。
図４は、野生型植物およびｄ６１−２の伸長する第１節間の微小管の方向を示す写真および図である。野生型植物（ＡおよびＣ）およびｄ６１−２（ＢおよびＤ）の第１節間の節間柔組織の微小管の配列の免疫蛍光画像（ＡおよびＢ）または模式図（ＣおよびＤ）を示したものである。バーは５０μｍを示す。
図５は、ブラシノライドに対する野生型（ｗｉｌｄ  ｐｌａｎｔ）およびｄ６１−１、ｄ６１−２実生の応答を示す写真である。
種子は、１μＭのブラシノライド（ＢＬ）を含む寒天プレートおよび含まない寒天プレート上で発芽させた。発芽後１日目に、実生の全体の特徴を観察した。ＢＬ処理は、野生型植物に異常な成長を誘導したが、変異体の実生には影響を与えなかった。
図６は、野生型、ｄ６１−１およびｄ６１−２植物における、黄化した葉身結合部の傾きに対する種々のレベルのブラシノライドの効果を示す写真である。
野生型の葉はブラシノライドに対して最も感受性が高く（パネルＡ）、変異体植物ｄ６１−１（パネルＢ）およびｄ６１−２（パネルＣ）はブラシノライドに対する感受性が低下していた。
図７は、野生型およびｄ６１−２植物におけるブラシノライドの量および生合成の前駆体を示す図である。
上段および下段の値は、それぞれ変異体および野生型植物における各化合物の量（ｎｇ／ｇ新鮮重量）を示す。ＮＤは検出されなかったことを示す。
図８は、暗所におけるｄ６１の脱黄化の表現型を示す写真である。
（Ａ）野生型植物。
左：暗所で栽培した２週齢の実生。
右：明所で栽培した２週齢の実生。
野生型（Ａ）ならびにジベレリン欠損変異体ｄ１８（Ｄ）およびｄ３５（Ｅ）は、暗所で伸長した節間を示した。
（Ｂ）ｄ６１−１。
左：暗所で栽培した２週齢の実生。
右：明所で栽培した２週齢の実生。
暗条件は各パネルの右側のもので白い矢印で示してあるが、そのような節間の伸長は明所では起こらなかった（各パネル左）。
（Ｃ）ｄ６１−２。
左：暗所で栽培した２週齢の実生。
右：明所で栽培した２週齢の実生。
ｄ６１変異体、ｄ６１−１（Ｂ）およびｄ６１−２（Ｃ）は、暗所でも伸長した節間を示さなかった。暗所で栽培した植物の葉鞘をはがした。
（Ｄ）ｄ１８。
左：暗所で栽培した２週齢の実生。
右：明所で栽培した２週齢の実生。
（Ｅ）ｄ３５。
左：暗所で栽培した２週齢の実生。
右：明所で栽培した２週齢の実生。
図９は、ｄ６１遺伝子座とＯｓＢＲＩ１の強い連鎖を示す図および写真である。
（Ａ）１番染色体の長腕上のｄ６１遺伝子座のマップ位置を示す図である。。（Ｂ）ｄ６１遺伝子座とＯｓＢＲＩ１の連鎖を試験するためのＤＮＡゲルブロット分析の結果を示す図である。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲ１で消化したとき、Ｔ６５、Ｊａｐｏｎｉｃａ（レーンＴ、１２．５ｋｂ）、およびＫａｓａｒａｔｈ、Ｉｎｄｉｃａ（レーンＫ、１７．５ｋｂ）の間でＯｓＢＲＩ１のＲＦＬＰが観察された。正常な表現型（ＷＴ）を持つ植物は、ヘテロ接合（１２．５＋１７．５ｋｂ）またはＩｎｄｉｃａホモ接合（１７．５ｋｂ）の対立遺伝子を持つが、変異体の表現型（ｍｕｔａｎｔ）は、常にＪａｐｏｎｉｃａホモ接合（１２．５ｋｂ）の対立遺伝子を持っていた。
図１０は、ＯｓＢＲＩ１およびシロイヌナズナＢＲＩ１の間の推定されるアミノ酸配列の比較図である。同一の残基には影を付けた。下線部で示す＊１、＊２、＊３および＊４の領域は、それぞれ、推定されるシグナルペプチド、ロイシンジッパーモチーフ、およびシステインペアのＮおよびＣ側を示す。
図１１は、図１０の続きの図である。
図１２は、種々の器官におけるＯｓＢＲＩ１の発現パターンを示す写真である。
各レーンには、野生型の種々の器官から単離した総ＲＮＡ、および１０μｇＲＮＡを使用した。ＯｓＢＲＩ１の器官特異的発現。
（Ａ）葉身（レーン１）、葉鞘（レーン２）、発達した花（レーン３）、花軸（レーン４）、茎頂（レーン５）、根（レーン６）および種子（レーン７）。発達する第１節間におけるＯｓＢＲＩ１の領域特異的発現。
（Ｂ）発達する節間の節（レーン１）、分裂帯（レーン２）、伸長帯（レーン３）および伸長した領域（レーン４）。各伸長する節間におけるＯｓＢＲＩ１の選択的発現。
（Ｃ）各節間（それぞれレーン１〜４）の、活発に伸長する段階における第１から第４節間の分裂帯と伸長帯。栄養成長期の伸長していない茎でもＯｓＢＲＩ１は高レベルで発現されていた（レーン５）。ＯｓＢＲＩ１の光依存性およびブラシノライド依存性発現。
（Ｄ）イネの実生は、１μＭのブラシノライドを含む（レーン２および４）または含まない（レーン１および３）寒天プレート上で、明所（レーン１および２）または暗所（レーン３および４）で１０日間栽培した。
図１３は、ＯｓＢＲＩ１アンチセンス鎖を発現するトランスジェニックイネの表現型を示す写真である。
（Ａ）トランスジェニック植物の矮小型表現型。左から、非トランスジェニック植物ならびに中間および強い表現型のトランスジェニック植物を示す。
（Ｂ）強い表現型を持つトランスジェニック植物の接写。バーは５ｃｍ。
（Ｃ）トランスジェニック植物の裸の稈の節間。左から、正常な節間伸長パターンを持つ非トランスジェニック植物、およびｄｍ、ｄｍ−ｄ６およびｄ６のトランスジェニック植物を示す。バーは２ｃｍ。
（Ｄ）トランスジェニック植物の直立した葉。非トランスジェニック植物（左）および弱い表現型を持つトランスジェニック植物（右）。
（Ｅ）強い表現型を持つトランスジェニック植物における発達した鞘器官のない異常な葉。バーは１０ｃｍ。
（Ｆ）トランスジェニック植物の円錐花序の長さ。左から、非トランスジェニック植物、および弱いおよび中程度の表現型を持つトランスジェニック植物を示す。
図１４は、ＯｓＢＲＩ１のドミナントネガティブを発現するトランスジェニック植物の発現型を示す写真である。写真左がトランスジェニック植物体、写真右がインサートを含まないベクターを導入した対照の植物体を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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