(57)【要約】本発明の課題は、簡便且つ迅速に特定の核酸配列を均一系にて検出する方法を提供することである。課題解決手段として、シグナル発生標識物質および当該シグナルの発生を有効に減弱させるように配置した一対の標識物質を、プローブＤＮＡの５’末端部および鎖内部、３’末端部および鎖内部、または両方を鎖内部に各々結合させたものを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、エキソヌクレアーゼを作用させることによってプローブＤＮＡを５’または３’末端より分解させ、鎖内部のレポーター基またはクエンチャー基が標識されたヌクレオチドおよび／またはシグナル発生物質のシグナルを有効に減弱させる機能を有する物質を標識したヌクレオチドをプローブＤＮＡから遊離させる。これにより、クエンチャー基によるレポーター基からのシグナルの減弱効果がなくなるか、または低減し、検出可能なシグナルが発生し、特定配列を有する核酸の検出及び定量がなされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル発生標識物質および当該シグナルの発生を有効に減弱させるように配置した一対の標識物質を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用して核酸配列を検出するための均一測定系であって、標的核酸とプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの後、５’→３’エキソヌクレアーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼの作用によりプローブＤＮＡを５’または３’末端より消化せしめ、プローブＤＮＡ内に挿入したシグナル発生物質標識ヌクレオチドおよび／またはシグナル発生物質のシグナルを有効に減弱させる機能を有する物質を標識したヌクレオチドを遊離することによってシグナルを得ることを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項２】
５’→３’エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼであることを特徴とする請求の範囲１に記載の核酸配列検出方法。
【請求項３】
３’→５’エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩＩＩであることを特徴とする請求の範囲１に記載の核酸配列検出方法。
【請求項４】
請求の範囲１〜３のいずれか１に記載の核酸配列検出方法に使用する測定試薬またはキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は臨床化学、薬物化学、生化学、食品化学の分野における、主として遺伝子解析方法に関するものであり、ゲノム遺伝子、ウイルス又は細菌等の遺伝子の検出、定量、並びに遺伝子変異の検出に用いられる。
背景技術
標的核酸に対して相補的な配列を含むプローブ核酸を用いた分析方法として、古くからサザンブロットハイブリダイゼーション法やノーザンブロットハイブリダイゼーション法が広く、一般的に用いられてきたが、操作が煩雑であり、長時間を要し、放射性物質を取り扱わねばならなかった。
その後、サザンブロットハイブリダイゼーション法やノーザンブロットハイブリダイゼーション法に代わる種々の分析法が開発されている。Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０，２４０−２４８，１９９６）では、反応温度は一定であり、一方が他方の蛍光を効果的に消光するように２種の蛍光性物質で適切に標識されたプローブを切断したときに発する蛍光を検出することで、核酸配列の検出を簡便且つ迅速に均一系にて行うことが可能である。しかし、この方法では、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡのキメラプローブを用いるため、プローブの製造費は高価となる。
また、均一系の解析法としてＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１５８８−１５９４，１９８４）が報告されている。この方法は、アクリジニウムエステルを標識したＤＮＡプローブを標的核酸にハイブリダイズさせた後、加水分解処理を行うと、ハイブリダイズしたアクリジニウムエステルは二本鎖の核酸に挿入されるため加水分解を受けず、ハイブリダイズしていないプローブのアクリジニウムエステルのみが加水分解されて、化学発光性が失われることを利用している。しかし、加水分解の操作は煩雑であり、時間も要する。
その他には、二本鎖ＤＮＡを特異的に消化するλエキソヌクレアーゼ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３，８８８−８９２，１９９２）やエキソヌクレアーゼＩＩＩ（特開平６−３２７４９９）を用いたサイクリングアッセイ法が開発されている。この方法は、オリゴヌクレオチドプローブが相補的な配列とハイブリダイズして形成された二本鎖ＤＮＡにエキソヌクレアーゼを作用させ、消化に伴って短くなったプローブが標的核酸から解離すると、新たなプローブがハイブリダイズし、この行程が繰り返されることによってサイクリング反応が成立する。このプローブの分解産物を検出することにより、標的核酸の有無を判定することができる。この方法は、操作法が簡便であり、反応温度が一定であるため、特別の温度制御装置を要しないなどの点で有用性がある。しかし、この分解産物の検出方法としては、放射性物質を利用した煩雑な方法が示されているだけであり、実用性の面で問題点が残されている。
発明の開示
本発明は、エキソヌクレアーゼを用いた核酸検出法に関して、実用的で簡便な均一測定法を提供することを目的としている。
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、シグナル発生標識物質および当該シグナルの発生を有効に減弱させるように配置した一対の標識物質を、捕捉プローブに各結合させたものを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ある種のエキソヌクレアーゼの作用で該シグナル発生標識物質を結合したヌクレオチドおよび／またはシグナル発生物質のシグナルを有効に減弱させる機能を有する物質を標識したヌクレオチドが該プローブから遊離することによりシグナルが得られうることを見出し、この機構を用いて、均一系による核酸配列の有無の判定並びに定量が可能な測定技術を完成させるに至った。
すなわち本発明は、
１．シグナル発生標識物質および当該シグナルの発生を有効に減弱させるように配置した一対の標識物質を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用して核酸配列を検出するための均一測定系であって、標的核酸とプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの後、５’→３’エキソヌクレアーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼの作用によりプローブＤＮＡを５’または３’末端より消化せしめ、プローブＤＮＡ内に挿入したシグナル発生物質標識ヌクレオチドおよび／またはシグナル発生物質のシグナルを有効に減弱させる機能を有する物質を標識したヌクレオチドを遊離することによってシグナルを得ることを特徴とする核酸配列の検出方法、
２．５’→３’エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼであることを特徴とする前項１に記載の核酸配列検出方法、
３．３’→５’エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩＩＩであることを特徴とする前項１に記載の核酸配列検出方法、
４．前項１〜３のいずれか１に記載の核酸配列検出方法に使用する測定試薬またはキット、からなる。
発明を実施するための最良の形態
本発明は標的核酸（以下「ターゲットＤＮＡ」という。）を検出するための方法及び遺伝子変異検出方法であって、シグナル発生標識物質および当該シグナルの発生を有効に減弱させるように配置した一対の標識物質を、捕捉プローブ（以下「プローブＤＮＡ」という。）に各結合させたものをターゲットＤＮＡにハイブリダイゼーションさせ、エキソヌクレアーゼの作用によって、該シグナル発生標識物質を結合したヌクレオチドが該プローブＤＮＡから遊離することによりシグナルが得られる機構を用いて簡便に標的遺伝子の有無の判定、定量、及び遺伝子変異を検出する方法を見出したものである。
本発明におけるシグナル発生標識物質および該シグナルの発生を有効に減弱させるように配置した一対の標識物質の組合せは、このような機能を有する組合せであれば良く、さらにプローブＤＮＡと標的核酸とのハイブリダイゼーションを実質的に妨害しないものであれば特に限定されないが、好ましくは光学的に検出されるシグナルに対応するものが取り扱いやすく好適である。さらに、光学的に検出されるシグナルとは蛍光性であっても良いし、蛍光性でなくても良く、特に限定されない。具体的には、例えばプローブＤＮＡの標識物質はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎとＴｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＦＡＭとＴＡＭＲＡ、ＥＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬ、ＦＩＴＣとＤＡＢＣＹＬ、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎとＤＡＢＣＹＬ、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎとＣｙ３、ＦＩＴＣとＣｙ３、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎとＱＳＹ  ７ｄｙｅが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本シグナル発生標識物質（以下これを「レポーター基」ともいう。）は、当該シグナルの発生を有効に減弱させる機能を有する標識物質（以下これを「クエンチング基」ともいう。）と一対にして使用されるものである。すなわち、レポーター基は、クエンチング基との距離が十分短いとき、レポーター基が発生するシグナルを有効に減弱させる機能を有する。そのような機能を有する標識物質の組合せであれば特に限定されないが、例えば蛍光性物質の場合、レポーター基の蛍光波長とクエンチング基の吸収波長が共通のスペクトラムを有する場合にこのような一対の標識物質としての機能を有するといえる。
このような一対の標識物質を用いる手法は、一般的に蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）として公知である（特許公表２０００−５０９２７８）。
本発明は一対のクエンチング基とレポーター基を有するプローブＤＮＡが使用されるが、該標識プローブＤＮＡは、エキソヌクレアーゼの消化を受けていない場合にはシグナルが検出されないか、またはエキソヌクレアーゼの作用によってレポーター基またはクエンチング基が遊離した場合に比べて有意に低いシグナルしか発生しないように一対の標識物質が配置されていることを要する。そのような例として、プローブＤＮＡの５’末端または３’末端にクエンチング基および鎖内にレポーター基、５’末端または３’末端にレポーター基および鎖内にクエンチング基、鎖内にレポーター基及びクエンチング基、プローブＤＮＡのそれぞれの末端にレポーター基及びクエンチング基を有するものが例示される。クエンチング基とレポーター基の距離は、レポーター基のシグナル発生を有効に減弱させることができればよいが、好ましくは２０塩基以内、より好ましくは１０塩基以内が望ましい。
本発明は、プローブＤＮＡがエキソヌクレアーゼの作用によって消化され、且つレポーター基またはクエンチング基のいずれかが標識されたヌクレオチドが遊離した場合にレポーター基からシグナルが得られる機構を用いて核酸配列の検出または遺伝子変異の検出をすることも特徴とする。このシグナルが得られる機構とは、次のとおりである。すなわち、核酸配列の検出法においては、プローブＤＮＡをターゲットＤＮＡと相補的にハイブリダイゼーションさせた後、エキソヌクレアーゼの作用によって５’または３’末端から該プローブを消化することよってクエンチング基および／またはレポーター基が標識されたヌクレオチドが遊離し、その結果、レポーター基とクエンチング基の距離が離れ、クエンチング基による減弱が弱くなることによりシグナルを発生させる機構をいう。ターゲットＤＮＡが存在しない場合には、プローブＤＮＡは一本鎖として存在するため、二本鎖特異的なエキソヌクレアーゼによる消化を受けないか、または、消化を受けても最小限であり、その結果、シグナルの発生が起こらないか、ターゲットＤＮＡが存在するときと比べてシグナルの発生は有意に低くなる。
また、遺伝子変異の検出法においては、プローブＤＮＡをターゲットＤＮＡとハイブリダイズさせてヘテロデュプレックスを形成させ、ターゲットＤＮＡ内に塩基の変異、挿入または欠失が存在するために該ヘテロデュプレックスに生じたミスマッチ、バブルまたはループ構造をエキソヌクレアーゼ活性を有する蛋白が認識し、ミスマッチ、バブルまたはループ構造が存在する場合にのみプローブＤＮＡを末端から消化することによってクエンチング基またはレポーター基が標識されたヌクレオチドが遊離され、その結果、レポーター基とクエンチング基の距離が離れ、クエンチング基による減弱が弱くなることによりシグナルを発生させる。ミスマッチ、バブルまたはループ構造が存在しない場合には、エキソヌクレアーゼによる消化を受けないか、または、消化を受けても最小限であり、その結果、シグナルの発生が起こらないか、ミスマッチ、バブルまたはループ構造が存在するときと比べてシグナルの発生は有意に低くなる。
核酸配列の検出法において使用されるエキソヌクレアーゼとしては、プローブＤＮＡ中のクエンチング基またはレポーター基が標識されたヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖から遊離することのできるものであれば良く、特に限定されないが、５’エキソヌクレアーゼとしてλエキソヌクレアーゼ、３’エキソヌクレアーゼとして大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩを例示することができる。また、遺伝子変異の検出法において使用されるエキソヌクレアーゼ活性を有する蛋白としては、ヘテロデュプレックス中のミスマッチ、バブルまたはループ構造を認識し、ミスマッチ、バブルまたはループ構造が存在する場合にのみプローブＤＮＡを末端から消化し、プローブＤＮＡ中のクエンチング基またはレポーター基が標識されたヌクレオチドを遊離することのできるものであれば良く、特に限定されないが、ヒトのＷＲＮ遺伝子にコードされる蛋白（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８，３２６０−３２６８，２０００）を例示することができる。
さらに、本発明の実施条件について詳細に説明するが、これらは例示的にしめすものであり、限定されるものではない。
本発明におけるターゲットＤＮＡと該標識結合プローブＤＮＡのハイブリダイゼーションは、該ターゲットＤＮＡを変性により一本鎖としたのち行われる。該ターゲットＤＮＡが一本鎖であれば変性の必要はなくそのままプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションさせることも可能であるが、該一本鎖ターゲットＤＮＡの高次構造によるハイブリダイゼーションの阻害の可能性を排除するためには変性操作を行うのが好ましい。
本発明における変性の方法は通常行われる方法に従えば良いが、例えば熱変性によるものと化学的変性によるものが例示される。具体的な方法として、熱変性による方法は、通常９０℃以上に加熱することにより行われる。好ましくは、９４℃〜９７℃で約５分間加熱することにより変性が行われる。化学的変性による方法は尿素、ホルムアルデヒド等の変性剤の作用により、またはｐＨを上昇させることにより行われる。ｐＨは０．４〜１．０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨを用いることにより上昇させることができる。操作性などの点からから熱変性による方法が好適に用いられる。
また、ハイブリダイゼーションの方法は通常行われる方法に従えば良いが、その条件はプローブ又は変性二本鎖ターゲットＤＮＡの鎖長、塩基配列、Ｔｍ（融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）により異なる。一般的にはｐＨ６．４〜９．０で、１０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムイオン存在下にて室温〜７０℃の温度下でハイブリダイゼーションが行われる。
ＦＲＥＴの場合の蛍光の検出条件として、例えばプローブＤＮＡの５’末端にＤａｂｃｙｌ修飾、鎖内にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ修飾の場合、３’→５’エキソヌクレアーゼの作用により、３’末端より分解されるに伴って発せられる蛍光は最大励起波長４９４ｎｍ、最大蛍光波長５１８ｎｍの条件でフルオロメーターを用いて検出される。
エキソヌクレアーゼによるプローブＤＮＡの分解によって生じるシグナル、例えば、ＦＲＥＴの場合の蛍光シグナルは、プローブＤＮＡの分解反応に応じて増加し、反応の進行中にシグナルをモニターすることが可能であり、適切な反応時間を選択することにより、再現性並びに定量性の向上及び測定時間の短縮が図れる。
検体としては、生物試料から抽出されたＤＮＡを用いることができるが、解析に用いるには量が不充分なことが多い。そのような場合には、生物試料から抽出された核酸をＰＣＲ法などによって増幅することができ、増幅されたＤＮＡ産物を本発明による遺伝子変異解析に用いることができる。
プローブＤＮＡの作製は、例えば一般のＤＮＡ合成装置を用いて化学的な方法を用いて合成可能である。
（実施例）
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（１）ターゲットＤＮＡの調製
ターゲットＤＮＡにはヒトＫ−ｒａｓ領域をＰＣＲにて増幅した二本鎖ＤＮＡを用いた。ＰＣＲプライマーの配列は以下の通りである。
2002077282.tif 000002
各プライマー１０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰ  ２００μｍｏｌ／Ｌ、１．２５ＵのＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）、１×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）、約１００ｎｇのヒトゲノミックＤＮＡを含む反応液５０μＬを調製し、９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／２０秒の反応を３５サイクル行い、ＰＣＲによる遺伝子増幅を実施した。ＰＣＲ反応液の一部を２％アガロースゲルにて電気泳動したところ、単一のバンドが確認され、予想される増幅産物のサイズである１２８ｂｐと一致する移動度を示した。ＰＣＲ産物は精製を行うことなく、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で定量した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎはｄｓＤＮＡを特異的に染色する蛍光性色素であり、プライマーＤＮＡの存在下でＰＣＲ産物の定量が可能である。
（実施例２）
（１）プローブＤＮＡ
３’エキソヌクレアーゼであるエキソヌクレアーゼＩＩＩ及び５’末端にＤａｂｃｙｌ、鎖内にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを標識したプローブを用いた核酸配列検出のモデル系を構築した。ターゲットＤＮＡとしてヒト  Ｋ−ｒａｓ遺伝子の一部の配列を増幅したＰＣＲ産物を使用した。プローブＤＮＡとして、以下に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成して用いた。このプローブＤＮＡの５’末端にはＤａｂｃｙｌが、鎖内にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎが標識されている。配列中の″Ｚ″はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＴを表す。
2002077282.tif 000003
（２）反応条件
本発明による核酸配列検出法において、最適な酵素量、プローブＤＮＡ量、ＮａＣｌ濃度、反応温度、ハイブリダイゼーション条件を検討し、その結果より、本法の操作法を以下のように定めた。
すなわち、
１０μＭ  ｐｒｏｂｅ  ＤＮＡ                                ０．５μＬ
１０×  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）  ２μＬ
１Ｍ  ＮａＣｌ                                            ０．７５μＬ
ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ                                            １μＬ
ｄＷ                                                      ５．７５μＬ
をＬｏｗ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ９６（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）のウエル内に調製し、サーマルサイクラーを用いて９５℃にて５分加温することによって二本鎖ターゲットＤＮＡを変成させ、次いで３７℃まで冷却し、３７℃で１分間保温することによってプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせ、１．３５Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝酒造）１０μＬを添加し、３７℃にて３０分インキュベートした。その後、７０℃にて  １５分加温することによってエキソヌクレアーゼＩＩＩを失活させ、蛍光プレートリーダーＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４０００（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで蛍光を測定した。最終的な反応液の組成は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  メルカプトエタノール、３７５ｎＭ  プローブＤＮＡ、０．６７５Ｕ／μＬ  エキソヌクレアーゼＩＩＩとなる。
（実施例３）
（１）定量範囲
本発明の方法により定量可能なＤＮＡ量の範囲について検証した。図１に示した通り、ＰＣＲ産物量が３００ｆｍｏｌのときまで良好な検量線が描かれ、本法の定量範囲の広いことが示された。
（２）最低検出感度
０、０．７３、１．４５、２．９、５．８ｆｍｏｌのＰＣＲ産物をターゲットＤＮＡとして、各々４回同時測定したときの相対蛍光強度（ＲＦＵ）の平均値と標準偏差の２倍の値（２ＳＤ）を求め、ＲＦＵの平均値から２ＳＤを減じた値が、ターゲットＤＮＡが０ｆｍｏｌのときのＲＦＵの平均値に２ＳＤを加えた値を下回らない最少のターゲットＤＮＡ量を最低検出感度と定義した。この定義によると、本法の最低検出感度は１．４５ｆｍｏｌであり、非常に高感度であることが示された（図２）。
産業上の利用可能性
本発明によれば、簡便な操作にて核酸配列の特異的な検出及び定量が可能であるので、自動化も容易である。また、シグナルの測定は、反応の進行中に行うことも可能であり、迅速に解析結果が得られる。本発明で使用されるエキソヌクレアーゼは、レポーター基またはシグナル基が修飾されたヌクレオチドを遊離させることが可能であれば、いかなるものも利用可能である。
【配列表】
2002077282.tif 000004
2002077282.tif 000005
【図面の簡単な説明】
第１図は、定量可能なＤＮＡ量の範囲を示した説明図である（実施例３）。
第２図は、最低検出感度を示した説明図である（実施例３）。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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