(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的活性を有する化合物を同定するための自動化された方法であって：
（ａ）試験混合物を形成するためにミキシングチャンバー内で生きた細胞の均質懸濁液と未知の細胞作用を有する試験化合物とを混合するステップ；
（ｂ）試験混合物をミキシングチャンバーから検出ゾーンへ導路に沿って流すステップ；
（ｃ）試験混合物を連続的に流路に沿って検出ゾーンを通過させるステップ；及び
（ｄ）前記試験混合物が前記検出ゾーンを連続的に通過するときに前記試験化合物に対する前記生きた細胞の細胞応答を測定するステップ、を含む方法。
【請求項２】
（ｅ）標準混合物を形成するために前記細胞の均質懸濁液と前記細胞の前記細胞応答に既知の作用を有している標準化合物とを混合するステップ；
（ｆ）標準混合物をミキシングチャンバーから導路を通して検出ゾーンへ導くステップ；
（ｇ）標準混合物を検出ゾーンを通過するように導くステップ；及び
（ｈ）前記標準化合物に対する前記細胞の細胞応答を測定するステップ、をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標準化合物と前記試験化合物とが前記混合ステップにおいて前記細胞と同時に混合され、前記測定ステップが前記既知の作用又は前記既知の作用における変化を測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標準化合物が前記細胞応答のアンタゴニストである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標準化合物が前記細胞応答のアゴニストである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞の単一懸濁液を使用してステップ（ａ）及び（ｅ）が同時に実行され、ステップ（ｃ）及び（ｇ）が同時に実行され、さらにステップ（ｄ）及び（ｈ）が同時に実行される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が最初に実行され、次にステップ（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）が実行されるが、このとき試験化合物がステップ（ｅ）において標準化合物と一緒に添加される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｄ）において前記試験化合物が前記応答を生じる活性があることを示す前記細胞応答が検出され、前記標準化合物がアンタゴニストであり、それによってステップ（ｄ）からステップ（ｈ）における前記細胞応答における減少が、前記試験化合物が前記既知の作用のアゴニストであることの指標となる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）において前記細胞応答が検出されず、それが前記試験化合物が前記応答を生じる活性がないことを示しており、前記標準化合物がアゴニストであり、それによってステップ（ｈ）において検出された前記既知作用の変化が、前記試験化合物が前記既知作用のアンタゴニストであることの指標となる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
複数の試験化合物及び複数の標準化合物についてプログラム可能なコンピューターの指示下で自動的に実施される方法であり、
ステップ（ｄ）において前記試験化合物が前記細胞応答を生じる活性があることを示す前記細胞応答が検出された場合に、ステップ（ｅ）において連続する一連のアンタゴニストが自動的に前記標準化合物として添加され、それによってステップ（ｈ）において検出された前記細胞応答における減少が、前記試験化合物が前記既知作用のアゴニストであることの指標となり；及び
ステップ（ｄ）において前記細胞応答が検出されないときにステップ（ｅ）において一連のアゴニストが前記標準化合物として自動的に添加され、それによってステップ（ｈ）において検出された前記既知作用の変化が、前記試験化合物が前記既知作用のアンタゴニストであることの指標となる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｈ）で、前記化合物が前記既知作用のアゴニストであることを示した場合は、その後前記試験化合物及び前記標準化合物の濃度を変化させながら（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）のステップを繰り返すことによって前記試験化合物のアゴニスト活性の濃度依存性を自動的に測定し、結果として生じた前記細胞応答における変化を記録するステップ；及び
ステップ（ｈ）で、前記化合物がアンタゴニストであることを示した場合は、その後前記試験化合物及び前記標準化合物の濃度を変化させながら（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）のステップを繰り返すことによって前記アゴニスト標準化合物の存在下で前記細胞応答の阻害の濃度依存性を自動的に測定し、結果として生じた前記細胞応答における変化を記録するステップ、をさらに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｈ）で、前記化合物がアンタゴニストであることを示した場合の方法であって：
（ｉ）前記標準化合物の濃度を変化させながら前記試験化合物のゼロ濃度に対して（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）のステップを繰り返すことによって細胞応答活性化の濃度依存性を自動的に測定し、結果として生じた細胞応答における変化を記録し、その後種々の濃度の前記試験化合物に対してこのステップ（ｉ）
を繰り返すステップ、をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｈ）で、前記化合物がアゴニストであることを示した場合の方法であり：
（ｊ）前記試験化合物の濃度を変化させながら前記標準化合物のゼロ濃度に対して（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）のステップを繰り返すことによって細胞応答活性化の濃度依存性を自動的に測定し、結果として生じた細胞応答における変化を記録し、その後種々の濃度の前記標準化合物に対してこのステップ（ｊ）
を繰り返すステップ、をさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
試験化合物の濃度の変化が連続的に実行される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
試験化合物の濃度の変化が段階的に実行される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
標準化合物の濃度の変化が連続的に実行される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
標準化合物の濃度の変化が段階的に実行される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
さらに前記細胞応答において記録された変化をグラフによって表示するステップを含む、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞応答が細胞内イオン濃度における変化である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記イオンがカルシウム、マグネシウム、プロトン、ナトリウム又はカリウムである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記イオンが細胞内染料を用いて検出される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記染料が蛍光性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試験化合物の作用が前記一連の細胞タイプの各細胞タイプにおいて測定されるまで、一連の細胞タイプに含まれる各細胞タイプ上でステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すステップをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
一連の標準混合物を形成するために前記一連の細胞タイプに含まれる前記細胞タイプの各々の均質懸濁液を前記細胞の前記細胞応答に既知の作用を有している標準化合物と混合するステップ；
前記一連の標準混合物をミキシングチャンバーから導路を通して検出ゾーンへ導くステップ；
前記一連の標準混合物を検出ゾーンを通過するように導くステップ；及び
前記標準化合物に対する前記細胞タイプの各々の細胞応答を測定するステップ、をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記混合ステップにおいて、標準化合物及び試験化合物が前記細胞と同時に混合され、前記測定ステップが前記既知作用又は前記既知作用の変化を検出する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標準化合物が前記細胞応答のアンタゴニストである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記標準化合物が前記細胞応答のアゴニストである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
生きた細胞に対する複数の試験化合物の作用を自動的に測定するための装置であって、多数の試験化合物のサンプルを順次に供給するための試験化合物サンプラー；
生きた細胞の懸濁液を供給するための細胞懸濁液流入口；
試験化合物サンプラーから試験化合物のサンプルを受け入れ、細胞懸濁液流入口から生きた細胞の懸濁液を受け入れ、各試験化合物に対して各試験液を供給できるように各試験化合物を生きた細胞の懸濁液と混合するために試験化合物サンプラーに接続されている混合ゾーン；
各試験溶液を受け入れ、各前記試験用液について懸濁細胞の細胞応答を測定するために混合ゾーンへ接続されている検出器；及び
各前記試験溶液がミキシングチャンバーから検出器まで連続的に流れるように、ミキシングチャンバーと検出器との間の流路を確立する導路、を含む装置。
【請求項２９】
さらに前記懸濁細胞の前記細胞応答に対する既知の作用を有する標準化合物のサンプルを供給するために前記混合ゾーンへ接続された標準化合物サンプラーを含有しており、このとき前記混合ゾーンが標準化合物サンプラーから標準化合物のサンプルを受け入れ、標準化合物と懸濁細胞とを混合し、前記検出器が標準化合物に対する懸濁細胞の細胞応答を測定する、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記混合ゾーンが前記試験化合物及び前記標準化合物を前記懸濁細胞と同時に混合し、前記検出器が前記既知の作用又は前記既知の作用における変化を検出する、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
前記試験化合物サンプラーから前記混合ゾーンへ移される前記試験化合物の濃度レベルを自動的に調整するために前記試験化合物サンプラーに接続された第１濃度勾配装置；及び
前記標準化合物サンプラーから前記混合ゾーンへ移された前記標準化合物の濃度レベルを自動的に調整するために前記標準化合物サンプラーに接続された第２濃度勾配装置、をさらに含む請求項２９または３０に記載の装置。
【請求項３２】
ある濃度の前記試験化合物若しくはある濃度の前記標準化合物又はその両方の流れを試験化合物及び／又は標準化合物がその後、前記細胞懸濁液と混合される混合ゾーンへ選択的に切り換えるために、スイッチングバルブの流入口で第１及び第２濃度勾配装置へ接続され、そしてスイッチングバルブの流出口で前記混合ゾーンへ接続されているスイッチングバルブを含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
さらに前記スイッチングバルブに接続されたキャリブレーションユニットを含んでおり、ここでスイッチングバルブが、キャリブレーション液が前記細胞懸濁液と混合される前記混合ゾーン内へキャリブレーションユニツトによって供給されるキャリブレーション液の流れを選択的に切り換える、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記試験化合物、前記標準化合物又は前記キャリブレーション液のいずれかと混合された前記細胞懸濁液の混合物を受け入れ、さらに懸濁細胞が試験化合物、標準化合物又はキャリブレーション液と反応する適正な時間となるように混合物に流路を提供するための前記混合ゾーンの流出口に接続された反応展開ラインを前記導路が含んでおり、反応展開ラインがさらに反応展開ラインからの混合物を受け取る前記検出器の流入口に接続されている、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記検出器が細胞内イオン濃度における変化を検出する請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
前記イオンがカルシウム、マグネシウム、プロトン、ナトリウム又はカリウムである、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記検出器が細胞内染料を用いて細胞内イオン濃度における変化を検出する、請求項３５または３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記染料が蛍光性である、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記第１及び第２濃度勾配装置、前記試験化合物サンプラー、前記標準化合物サンプラー及び前記スイッチングバルブの作動を制御するために、それらに接続されている制御装置；及び
コンピューターによって実行されるソフトウエアプログラムに従って制御装置に指令シグナルを送信するために制御装置に接続されており、さらに細胞応答測定シグナルを検出器に送信したり、検出器から受信するために前記検出器にも接続されているコンピューター、をさらに含む請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４０】
前記試験化合物サンプラーが試験化合物ライブラリーから特定試験化合物を選択することのできる自動ロボットサンプラーである、請求項２８〜３９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４１】
試験化合物サンプラーの作動を制御するために前記試験化合物サンプラーに接続されている制御装置；及び
コンピューターによって実行されるソフトウエアプログラムに従って制御装置に指令シグナルを送信し、それによって前記試験化合物ライブラリーからの試験化合物サンプラーによる試験化合物の選択及び回収を制御するために制御装置に接続されているコンピューター、をさらに含む請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
さらに前記試験化合物サンプラーから前記混合ゾーンへ移される前記試験化合物の濃度レベルを調整するために前記試験化合物サンプラーに接続された流入口と流出口を有している濃度勾配ポンプを含んでおり、このとき
前記試験化合物サンプラーが
前記特定試験化合物を受け取るための第１吸込ノズルと緩衝液を受け取るための第２吸込ノズルとを含有しており、
さらにこのとき前記濃度勾配ポンプが第１及び第２吸込ノズルに接続されていて各々第１及び第２吸込ノズルによって受け取った試験化合物及び緩衝液の量を調整することによって特定濃度の試験化合物を受け入れ、このとき緩衝液が試験化合物の希釈剤である請求項４１に記載の装置。
【請求項４３】
さらに前記混合ゾーンへ標準化合物のサンプルを供給するために標準化合物サンプラーを含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
前記標準化合物サンプラーが標準化合物のライブラリーから特定標準化合物を選択することのできる自動ロボットサンプラーである、請求項４３に記載の装置。
【請求項４５】
さらに前記標準化合物サンプラーから前記混合ゾーンへ供給される前記標準化合物の濃度レベルを調整するために前記標準化合物サンプラーに接続された流入口と流出口を有している第２濃度勾配ポンプを含んでおり、このとき
前記標準化合物サンプラーが
前記特定標準化合物を受け取るための第３吸込ノズルと
緩衝液を受け取るための第４吸込ノズルとを含有しており、
さらにこのとき前記第２濃度勾配ポンプが、第３及び第４吸込ノズルに接続されていて各々第３及び第４吸込ノズルによって受け取る標準化合物及び緩衝液の量を調整することによって特定濃度の標準化合物を受け入れ、このとき緩衝液が標準化合物の希釈剤である、請求項４４に記載の装置。
【請求項４６】
さらに、第２混合ゾーンの流出口が前記第１混合ゾーンに提供されるように、前記特定濃度の前記特定試験化合物及び前記特定標準化合物を受け入れて混合するために、第１及び第２濃度勾配ポンプの流出口に接続された第２混合ゾーンを含む請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
キャリブレーション液を供給するためのキャリブレーションユニット；及び
第２混合ゾーンからの化合物混合物又はキャリブレーションユニットからのキャリブレーション液のどちらかの流れに切り換え、その後その流れを前記細胞懸濁液と混合される第１混合ゾーンへ供給するための、前記第２混合ゾーンへ接続された第１流入口、キャリブレーションユニットへ接続された第２流入口、及び前記第１混合ゾーンへ接続された流出口を有しているスイッチングバルブ：をさらに含む請求項４６に記載の装置。
【請求項４８】
前記キャリブレーションユニットが：
前記細胞懸濁液と混合されたときに最高細胞応答を供給する最高キャリブレーション液；
前記細胞懸濁液と混合されたときに最小細胞応答を供給する最小キャリブレーション液；
最高キャリブレーション液又は最小キャリブレーション液のどちらかの流れに切り換えるために、最高キャリブレーション液に接続された第１流入口及び最小キャリブレーション液に接続された第２流入口を有している切換バルブ；及び
切換バルブからスイッチングバルブ内へ最高キャリブレーション液又は最小キャリブレーション液のどちらかをポンプで送り出すために切換バルブの流出口及びスイッチングバルブの流入口へ接続されているポンプ、を含む請求項４７に記載の装置。
【請求項４９】
さらに、前記細胞懸濁液流入口から第１混合ゾーン内へ前記細胞懸濁液をポンプで送り出すために前記第１混合ゾーンの流入口に接続されている第２ポンプを含む、請求項４８に記載の装置。
【請求項５０】
前記導路が、第１混合ゾーンから受け入れた混合物のための流路及び反応時間遅延を提供し、さらに混合物を検出器に供給するために前記第１混合ゾーンの流出口に接続された流入口と前記検出器の流入口に接続された流出口とを有している反応展開ラインを含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５１】
前記第１及び第２濃度勾配ポンプ、前記試験化合物サンプラー、前記標準化合物サンプラー及び前記スイッチングバルブ、前記第１及び第２混合ゾーン、前記第１及び第２ポンプ及び前記切換バルブに接続されていてそれらの作動を制御するための制御装置；及び
コンピューターによって実行されるソフトウエアプログラムに従って制御装置に指令シグナルを送信するために制御装置に接続されているコンピューターであって、このときコンピューターが細胞応答測定シグナルを検出器に送信したり検出器から受信するために前記検出器にも接続されているコンピューター：をさらに含む請求項５０に記載の装置。
【請求項５２】
前記検出器が細胞内イオン濃度における変化を検出する請求項５１に記載の装置。
【請求項５３】
前記イオンがカルシウム、マグネシウム、プロトン、ナトリウム又はカリウムである、請求項５２に記載の装置。
【請求項５４】
前記検出器が細胞内染料を用いて細胞内イオン濃度における変化を検出する、請求項５２または５３に記載の装置。
【請求項５５】
前記染料が蛍光性である、請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
さらに、装置に陰圧を提供するために前記検出器の流出口に接続されているポンプ、及び前記試験化合物サンプラーから前記混合ゾーンへ移される前記試験化合物の濃度レベルを調整するために前記試験化合物サンプラーに接続されているプロポーショニングバルブを含んでおり、このとき前記試験化合物サンプラーがさらに
前記特定試験化合物を受け取るための第１吸込ノズルと
緩衝液を受け取るための第２吸込ノズルを含んでおり、
プロポーショニングバルブが第１及び第２吸込ノズル各々によって受け取る試験化合物及び緩衝液の量を調整することによって特定濃度の試験化合物を受け入れ、このとき緩衝液は試験化合物の希釈剤である、請求項４０〜５５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５７】
さらに、標準化合物ライブラリーから特定標準化合物を選択できる、自動標準化合物サンプラーであり、前記標準化合物サンプラーが前記特定標準化合物を受け取るための第３吸込ノズルと緩衝液を受け取るための第４吸込ノズルとを含んでおり、
第３及び第４吸込ノズルによって各々受け取られる標準化合物及び緩衝液の量を調整することによって特定濃度の標準化合物を受け取るために第３及び第４吸込ノズルに接続されている第２プロポーショニングバルブとを含んでおり、このとき緩衝液が標準化合物の希釈剤である、請求項５６に記載の装置。
【請求項５８】
前記特定濃度の前記試験化合物を受け入れ、試験化合物を前記混合ゾーンへ供給するために前記第１プロポーショニングバルブの流出口に接続された第１プライミングバルブ；及び
前記特定濃度の前記標準化合物を受け入れ、標準化合物を混合ゾーンへ供給するために前記第２プロポーショニングバルブの流出口に接続された第２プライミングバルブ、をさらに含む請求項５７に記載の装置。
【請求項５９】
細胞懸濁液と混合したときに最高細胞応答を生じさせる最高キャリブレーション液と細胞懸濁液と混合したときに最小細胞応答を生じさせる最小キャリブレーション液とを含むキャリブレーションユニット；
最高キャリブレーション液又は最小キャリブレーション液のどちらかの流れに切り換えるために、最高キャリブレーション液に接続した第１流入口と最小キャリブレーション液に接続した第２流入口とを有する第１切換バルブ；
第１切換バルブからのキャリブレーション液又は混合ゾーンからの混合物のどちらかの流れに切り換えるために、前記混合ゾーンの流出口に接続した第１流入口と、前記第１切換バルブの流出口に接続した第２流入口とを有する第２切換バルブ；
第２切換バルブからの混合物を受け取るために第２切換バルブの流出口に接続された第３プライミングバルブ；及び
第３プライミングバルブによって供給される混合物を前記細胞懸濁液と混合させるために、第３プライミングバルブの流出口に接続されている第２混合ゾーンであって、ここでは前記細胞懸濁液流入口及び前記検出器が第１混合ゾーンの代わりに第２混合ゾーンへ接続されている第２混合ゾーン、をさらに含む請求項５８に記載の装置。
【請求項６０】
前記導路が、混合物が前記検出器に到達する前に第２混合ゾーンから受け入れた混合物の流路及び反応遅延時間を提供するために、前記第２混合ゾーンの流出口に接続された流入口及び前記検出器の流入口に接続された流出口を有する反応展開ラインを含む、請求項５９に記載の装置。
【請求項６１】
前記細胞懸濁液流入口が
細胞懸濁液リザーバーと、
緩衝液リザーバーと、
細胞懸濁液の濃度を調製するために細胞懸濁液リザーバーに接続された第１流入口及び緩衝液リザーバーに接続された第２流入口を有する第３切換バルブであり、ここで緩衝液が細胞懸濁液の希釈剤であり、及び、
さらに第３切換バルブからの細胞懸濁液混合物を受け入れこの混合物を前記第２混合ゾーンへ提供するために第３切換バルブの流出口へ接続された第４プライミングバルブとを含む、請求項６０に記載の装置。
【請求項６２】
前記検出器が細胞内イオン濃度における変化を検出する、請求項６１に記載の装置。
【請求項６３】
前記イオンがカルシウム、マグネシウム、プロトン、ナトリウム、又はカリウムである、請求項６２に記載の装置。
【請求項６４】
前記検出器が細胞内染料を使用して細胞内イオン濃度における変化を検出する、請求項６２または６３に記載の装置。
【請求項６５】
前記染料が蛍光性である、請求項６４に記載の装置。
【請求項６６】
さらに複数の細胞懸濁液リザーバーを含む、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６７】
細胞中に存在する受容体を特性付けるための自動化された方法であって：
（ａ）試験混合物を形成するためにミキシングチャンバー内で細胞の懸濁液と特定受容体の活性に影響を及ぼすことが既知である試験物質とを混合するステップ；
（ｂ）前記試験混合物をミキシングチャンバーから検出ゾーンへ導路に沿って流すステップ；
（ｃ）前記試験混合物を連続的に流路に沿って検出ゾーンを通過させるステップ；
（ｄ）前記試験混合物が前記検出ゾーンを連続的に通過するときに前記試験物質に対する前記細胞の細胞応答を測定すること、このとき前記試験物質に対する応答が、前記細胞が前記試験物質に対して反応することが既知である受容体を発現することを示すステップ；及び
（ｅ）各試験物質の作用が測定されるまで、一連の試験物質を用いて（ａ）〜（ｄ）のステップを繰り返すステップ、を含む方法。
【請求項６８】
試験物質がアゴニストを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
試験物質がアンタゴニストを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
試験物質がアンタゴニスト及びアゴニストの混合物を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
さらに、各細胞タイプによって発現した受容体を測定するために一連の種々の細胞タイプについて（ａ）〜（ｅ）のステップを繰り返すことを含む、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
試験化合物が受容体の活性に対して作用を有していることを確認するための自動化された方法であって：
陰性対照混合物を形成するためにミキシングチャンバー内で前記受容体を含んでいない陰性対照細胞タイプを前記試験化合物と混合するステップ；
前記陰性対照混合物を前記ミキシングチャンバーから検出ゾーンへ導路に沿って流すステップ；
前記陰性対照混合物を前記検出ゾーンを通過させるステップ；
前記陰性対照混合物が前記検出ゾーンを通過するときに前記試験化合物に対する前記陰性対照混合物の細胞応答を測定するステップ；
試験混合物を形成するために前記ミキシングチャンバー内で、前記受容体を発現するように工学的に作製された、又は誘導された陰性対照細胞と同一細胞タイプの細胞を前記試験化合物と混合するステップ；
前記試験混合物を前記ミキシングチャンバーから検出ゾーンへ導路に沿って流すステップ；
前記試験混合物を連続的に流路に沿って前記検出ゾーンを通過させるステップ；
前記試験混合物が前記検出ゾーンを連続的に通過するときに前記試験化合物に対する試験混合物中の細胞の細胞応答を測定するステップ；および
前記陰性対照細胞の測定された応答に対して、前記試験化合物中の前記細胞の測定された応答を比較するステップであり、それによって相違が、前記試験化合物が前記受容体の活性に及ぼす作用を有していることを示すステップ、を含む方法。
【請求項７３】
前記試験物質がアゴニストを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記試験物質がアンタゴニストを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記試験物質がアンタゴニスト及びアゴニストの混合物を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
一連の細胞タイプにおける１種又はそれ以上の受容体の活性を測定するための自動化された方法であって：
（ａ）試験混合物を形成するためにミキシングチャンバー内で前記一連の細胞タイプの一部を含む生きた細胞の懸濁液と特定受容体の活性に影響を及ぼすことが既知である試験物質とを混合するステップ：
（ｂ）前記試験混合物をミキシングチャンバーから検出ゾーンへ導路に沿って流すステップ；
（ｃ）試験混合物を連続的に流路に沿って検出ゾーンを通過させるステップ；
（ｄ）前記試験混合物が前記検出ゾーンを連続的に通過するときに前記試験物質に対する生きた細胞の前記懸濁液の細胞応答を測定するステップ；及び
（ｅ）前記一連の各細胞タイプにおいて前記試験物質の作用が測定されるまで、一連の細胞タイプの各部分について（ａ）〜（ｄ）のステップを繰り返すステップ、を含む方法。
【請求項７７】
前記試験物質が既知の受容体アゴニストを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
試験物質が既知の受容体アンタゴニストを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
試験物質が既知のアンタゴニストと既知のアンタゴニストの混合物を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
試験物質に活性が未知である化合物が含まれている、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
試験物質に活性が未知である化合物と既知のアゴニスト又は既知のアンタゴニストである化合物との混合物が含まれている、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
生きた細胞に試験化合物が及ぼす作用を測定するための装置であり：
試験化合物リザーバー；
生きた細胞の懸濁液を供給する細胞懸濁液リザーバー；
試験化合物リザーバーに接続された第１チャンネルであり、それを通って試験化合物が流れることのできるチャンネル；
細胞懸濁液リザーバーに接続された第２チャンネルであり、それを通って生きた細胞の懸濁液が流れることのできるチャンネル；
第１及び第２チャンネルに接続された混合ゾーンであって、前記混合ゾーンにおいて試験化合物と細胞懸濁液の望ましい混合物を提供するために試験化合物及び細胞懸濁液が混合ゾーン内に流入できるような混合ゾーン；
液体流路を通って前記混合物が混合ゾーンから連続的に流れることのできる液体流路；及び、
試験化合物に対する懸濁細胞の細胞応答を測定する、液体流路に接続されている検出器であって、このとき試験化合物と細胞懸濁液の望ましい混合物がミキシングチャンバーから検出器に向かって液体流路に沿って連続的に流れる検出器を含む装置。
【請求項８３】
さらに、試験化合物の希釈剤を供給するための希釈剤リザーバーと、
希釈剤リザーバーに接続されている第３チャンネルを含み、それを通って希釈剤が流れることのできるチャンネルとを含んでおり、このとき望ましい濃度の前記試験化合物を供給できるように前記混合ゾーンが第３チャンネルに接続されており希釈剤を受け取る、請求項８２に記載の装置。
【請求項８４】
さらに、前記細胞懸濁液に対して既知の作用を有する標準化合物を供給する標準化合物リザーバーと、
標準化合物リザーバーに接続されている第４チャンネルを含み、それを通って標準化合物が流れることのできるチャンネルとを含んでおり、このとき前記ミキシングチャンバーが第４チャンネルに接続されており、第４チャンネルから標準化合物を受け入れ、標準化合物を細胞懸濁液と混合し、
さらに前記検出器が標準化合物に対する懸濁細胞の細胞応答を測定する、請求項８３に記載の装置。
【請求項８５】
前記ミキシングチャンバーが前記試験化合物及び前記標準化合物を前記懸濁細胞と同時に混合し、前記検出器が前記既知の作用又は前記既知の作用における変化を検出する、請求項８４に記載の装置。
【請求項８６】
さらに、第１、第２、第３及び第４チャンネルを通過する試験化合物、緩衝液、細胞懸濁液及び標準化合物の流れを各々自動的に制御する、第１、第２、第３及び第４チャンネルに接続されている制御装置を含む、請求項８５に記載の装置。
【請求項８７】
さらに、第１チャンネルを通過する試験化合物の流れを自動的に制御する、第１チャンネルに接続されている制御装置を含む、請求項８２〜８６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８８】
生きた細胞に対する試験化合物の作用を測定するための装置であり：
試験化合物リザーバー；
前記試験化合物リザーバーから前記ミキシングチャンバーへ移される試験化合物の濃度レベルを自動的に調製するために試験化合物リザーバーに接続されている第１濃度勾配装置；
細胞懸濁液リザーバー；
試験化合物と細胞懸濁液リザーバーからの生きた細胞の懸濁液を受け入れ、試験化合物を生きた細胞の懸濁液と混合する、第１濃度勾配装置及び細胞懸濁液リザーバーとに接続されているミキシングチャンバー；及び
試験化合物に対する懸濁細胞の細胞応答を連続的に測定するためにミキシングチャンバーに接続されている検出器、を含む装置。
【請求項８９】
さらに、前記細胞懸濁液に既知の作用を有している標準化合物を供給する標準化合物リザーバーを含んでおり、このとき前記ミキシングチャンバーが標準化合物リザーバーに接続されていて、標準化合物を受け入れ、標準化合物を細胞懸濁液と混合し、さらにこのとき前記検出器が標準化合物に対する懸濁細胞の細胞応答を測定する、請求項８８に記載の装置。
【請求項９０】
前記ミキシングチャンバーが前記試験化合物及び前記標準化合物を前記懸濁細胞と同時に混合し、前記検出器が前記既知の作用又は前記既知の作用における変化を検出する、請求項８９に記載の装置。
【請求項９１】
さらに前記細胞懸濁液から前記ミキシングチャンバーに移される前記標準化合物の濃度レベルを自動的に調整するために前記標準化合物リザーバーに接続されている第２濃度勾配装置を含む、請求項８９または９０に記載の装置。
【請求項９２】
さらに、前記ミキシングチャンバー内への試験化合物の流れを自動的に制御し、標準化合物の流れを自動的に制御するために、第１及び第２濃度勾配装置に接続されている制御装置を含む、請求項９１に記載の装置。
【請求項９３】
さらに前記ミキシングチャンバー内への試験化合物の流れを自動的に制御するために第１濃度勾配装置に接続されている制御装置を含む、請求項８８〜９２のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般に、細胞の生理的応答を調節する化合物をスクリーニング及び薬理学的プロファイリングするための装置に関する。本発明はさらに、細胞表面受容体及びイオンチャンネルの活性を調節する化合物の特性を迅速に評価するための装置に関する。より詳細には、本発明は、細胞表面膜上に存在する受容体及びイオンチャンネルに対してアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する物質の能力及び効力を検出し、評価し、さらに特性付けるための方法及び装置に関する。
背景情報
生物学的細胞はそれらの外膜上に存在する受容体分子を含有している。これらの受容体の機能は、細胞環境を“感知”し、環境における何らかの変化に関する入力シグナルを細胞に提供することである。真核生物の生体においては、そうした細胞環境は隣接細胞を含んでおり、受容体の機能は細胞が相互に直接的（パラクリン調節系）又は間接的（エンドクリン調節系）に連絡し合い、それによって組織、器官又は生体全体の調和の取れた応答達成を可能にすることである。原核細胞においては、表面に存在する受容体が細胞外環境を検出するための手段を提供する。
例えば神経伝達物質、ホルモン、化学誘因性若しくは化学忌避性物質であるそうしたシグナルを受け取ると、細胞がこれらの変化に順応するために特異的方法で応答するように、表面に存在する受容体は細胞外環境に関するこの情報を特異的細胞内経路を通して細胞に伝達する。外部シグナル分子の供給が変化したり、又は細胞表面分子の活性が変化した場合は、細胞応答が異常になって組織又は器官の機能不全が惹起されるであろう。
真核細胞では、受容体分子が細胞の選択的応答を決定する。各タイプの受容体は特異的セットのリガンド分子とのみ相互作用できる。例えば、アドレナリン受容体はアドレナリン及びノルアドレナリンと、コリン受容体はアセチルコリンと、セロトニン受容体は５−ヒドロキシトリプタミンと、ドーパミン受容体はＤＯＰＡと相互作用する、等である。種々の組織に由来する細胞は変わることなく特異的セットの組織受容体を発現する。相違するタイプの受容体は相違するシグナル形質導入経路に接続されている。例えば、ニコチン性コリン受容体は、アセチルコリン分子と結合するとナトリウムチャンネルを直接的に活性化する（Ｃｌａｕｄｉｏら，１９８７，が参照によりここに具体化される）。Ｇ−プロテイン結合受容体はセカンドメッセンジャー経路の酵素、例えばアデニル酸シクラーゼ又はホスホリパーゼＣを活性化させ、引き続いてｃＡＭＰ又はホスホイノシチド・カスケードを活性化させる（Ｄｉｖｅｃｈａ  ａｎｄ  Ｉｔｖｉｎｅ，１９９５，が参照によりここに具体化される）。受容体チロシンキナーゼは、細胞分化及び増殖をもたらすＭＥＫ／ＭＡＰＫキナーゼのカスケードを活性化する（Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９５及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９９５，が参照によりここに具体化される）。サイトカイン受容体は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴカスケードを活性化し、順にその他の経路を調節し、並びに遺伝子転写を活性化することができる（Ｈｉｌｌ  ＆  Ｔｒｅｉｓｍａｎ，１９９５，が参照によりここに具体化される）。
細胞表面膜は、受容体他にイオンポンプ、イオン輸送体及びイオンチャンネルを有する。これらの分子集合は、細胞内イオンのホメオスタシス（恒常性）を維持するために協同して働く。これらのシステムの活性における何らかの変化は、イオンの細胞内濃度の変化を惹起し、その結果として細胞の代謝性応答を引き起こすであろう。
イオンポンプは、エネルギー源としてＡＴＰを利用して膜内外イオン勾配を維持するために作用する。イオンポンプの例は次の通りである：ナトリウム及びカリウムイオンの膜内外勾配を維持するＮａ+／Ｋ+-ＡＴＰアーゼ、カルシウムイオンの膜内外勾配を維持するＣａ2+-ＡＴＰアーゼ、及びプロトンの膜内外勾配を維持するＨ+-ＡＴＰアーゼである。
イオン輸送体は、一つのイオン種の膜内外勾配の電気化学的エネルギーを使用して別のイオン対応物の勾配を維持する。例えば、Ｎａ+］／Ｃａ2+交換体は、内側へ向かうナトリウム勾配の化学ポテンシャルを使用して、それらの化学ポテンシャルに対するカルシウムイオンを流出させる。
イオンチャンネルは、活性化するとイオンをそれらの電気化学ポテンシャルに従って細胞膜を越えて移動させることができる。イオンチャンネルには主として、電位作動性及びリガンドゲーテッドという２つのタイプがある。電位作動性チャンネルは、膜内外電気ポテンシャル変化で開口状態へ活性化される。神経細胞軸索におけるナトリウムチャンネル又は神経筋接合部におけるＬ型カルシウムチャンネルはこの種のチャンネルの例である。リガンドゲーテッドチャンネルは、あるリガンドがそれらの分子の化学受容体部と結合することで開口状態へ活性化される。リガンドゲーテッドチャンネルの従来例は、同時にナトリウムチャンネルでもあるニコチン性コリン受容体である。
リガンド／受容体相互作用を検出するためには極めて多数の方法がある。最も一般的な方法は、放射性リガンド結合アッセイにおいて当該物質に対する受容体の親和性を測定する方法である。これらのアッセイで、種々の濃度で調製した当該化合物の存在下及び非存在下で標準放射標識リガンド分子の特異的結合を測定する。当該化合物との標準放射標識リガンドの特異的結合に関する特徴的な阻害パラメーターＩＣ50は、この化合物に対する受容体の親和性の尺度と見なされている（Ｗｅｉｌａｎｄ ＆ Ｍｏｌｉｎｏｆｆ，１９８１及びＳｗｉｌｌｅｎｓら，１９９５，が参照によりここに具体化される）。近年のマイクロチップセンサー技術における進歩は、受容体分子と当該化合物の相互作用をリアルタイムで直接に測定することを可能にした。この方法によって、引き続いての親和性パラメーターの計算で会合及び解離両方の速度定数の測定が可能になる（Ｆ＿ｇｅｒｓｔａｍら，１９９２，が参照によりここに具体化される）。だがこれらの方法は極めて正確及び便利ではあるが、化合物のアゴニスト活性及びアンタゴニスト活性を区別することはできない。
アゴニスト又はアンタゴニストである化合物の生物学的活性のタイプは、細胞をベースとするアッセイにおいて測定され得る。参照してここに組み込まれるＨａｒｐｏｌｄ ＆ Ｂｒｕｓｔ，１９９５，に記載された方法では、アゴニスト及びアンタゴニストの可能性がある製薬学的化合物を同定するための手段を提供するために、受容体遺伝子及びリポーター遺伝子構成物を用いて同時トランスフェクトされた細胞が使用される。だがこれらの方法は、遺伝子トランスフェクション方法を含む極めて手間のかかる操作を必要とし、膨大な時間がかかり、さらに人工的に修飾された細胞を使用するために不便である。その上、特定化合物のアゴニスト作用がトランスフェクトされた受容体の刺激と関与していることを証明するためには、陽性及び陰性対照細胞系を用いた幾つかの対照実験も同様に実施しなければならない。
本発明の方法に最も密接に関連しているのは、参照によりここに具体化されるＰａｒｃｅら，１９９４，に記載の方法である。これらの先行技術の方法は天然細胞を使用し、代謝性酸化速度のような生物学的に活性な化合物に対する天然細胞応答を記録することを基礎としている。だが先行技術の短所は、各測定点で約３分間を必要とする低い処理量速度である。先行技術のもう１つの短所は、測定用マイクロフローチャンバーの内面上に固定化された細胞を使用することである。これはアゴニスト分子へ結合すると脱感作を受ける受容体に対しては、アゴニスト若しくはアンタゴニストの各濃度点についてそれらに付着した細胞とともに個別のシリコーンセンサー、若しくはカバースリップを使用する必要性をもたらす。これは実験結果の高い変動性を生じさせる。
他の細胞内イオン事象とは相違して、イオン化カルシウムは例えばプロトン、ナトリウム、マグネシウム又はカリウムの細胞内濃度を変化させ、バクテリアから特殊ニューロンに及ぶ範囲の細胞の様々なシグナル形質導入経路における最も一般的な要素として役立つ（Ｃｌａｐｈａｍ，１９９５，が参照によりここに具体化される）。細胞内のシグナル形質導入経路にカルシウムイオンを供給するプールには細胞外腔と小胞体という２つの主要プールが存在する。又、シグナル形質導入のためにカルシウムの小バーストを細胞質ゾル内へ導入する幾つかのメカニズムが存在する。
興奮性及び非興奮性両方の細胞は主として形質膜上に、Ｇ−プロテイン結合セルペンチン受容体（ＧＰＣＳＲ）及び細胞の細胞質内へのカルシウム流入を制御する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）という２種の受容体クラスを有している。ＧＰＣＳＲ及びＲＴＫ受容体はどちらもホスホリパーゼＣを活性化してホスファチジルイノシトールをイノシトール（１，４，５）−トリリン酸（ＩｎｓＰ3）とジアシルグリセロールとに変換させる。ＩｎｓＰ3は、細胞内セカンドメッセンジャーとして機能し、小胞体膜に及ぶ特殊受容体を活性化する。この受容体の活性化は小胞体からのカルシウムイオンの遊離を誘発する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，１９９３，が参照によりここに具体化される）。カルシウムイオンはさらに、特異的リガンドによって誘発された特殊な電位非依存性Ｃａ2+選択性チャンネルを通って細胞外環境から興奮性及び非興奮性細胞の細胞質に流入することもできる。非興奮性細胞においては、形質細胞膜の過分極がさらに電気ポテンシャルに沿った受動的膜内外拡散を通してのカルシウムイオンの流入を増強する。例えば、カリウムチャンネルが開口すると膜ポテンシャルが細胞の内側でよりマイナスの数値となるので、従って形質膜を越えるＣａ2+の流入が容易になる。興奮性細胞は形質膜上に電位依存性Ｃａ2+チャンネルを含有しており、それらは膜が脱分極するとほんの短時間開口し、外膜から細胞質内へのＣａ2+の流入を可能にする。興奮性細胞の小胞体膜並びに形質膜は、ＩｎｓＰ3受容体と、各々膜受容体誘発性ホスホリパーゼＣ活性化に基づいて細胞内蓄積から、又は細胞外媒質から細胞質内へのＣａ2+流入の脱分極誘発性短時間バーストからそれぞれＣａ2+を遊離するＣａ2+感受性リアノジン受容体（ＲｙＲ）とを含有している。
Ｇ−プロテイン結合セルペンチン受容体がホスホリパーゼＣβの活性化を通してＣａ2+移動を開始し（Ｓｔｅｒｎｗｅｉｓ ａｎｄ Ｓｍｒｃｋ，１９９２，が参照によりここに具体化される）、他方チロシンキナーゼ受容体がホスホリパーゼＣγを活性化し、引き続いて細胞内Ｃａ2+移動を誘発する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ  ＆  Ｉｒｖｉｎｅ，１９８９，が参照によりここに具体化される）ことは明確に確証されている。
細胞内Ｃａ2+移動を開始することが知られている数多くの形質膜Ｇ−プロテイン結合セルペンチン受容体、チロシンキナーゼ成長因子受容体、および電位調節性及びリガンド調節性チャンネルがある。
Ｃａ2+は細胞の数多くの機能的プロセスにおいて極めて重要な役割を果たす。例えば、Ｃａ2+は細胞周期に影響を与え（Ｍｅａｎｓ，１９９４，が参照によりここに具体化される）、特異的転写因子を活性化する（Ｓｈｅｎｇら，１９９１，が参照によりここに具体化される）。多数の受容体及びイオンチャンネルは、Ｃａ2+シグナルを使用して細胞の移動性、収縮、分泌、分割等のような基本的事象を開始する。
細胞質ゾルにおける、そしてその結果としてＣａ2+の核濃度における上昇は又細胞死促進シグナルでもある。例えば遊離Ｃａ2+の長期増加はプログラムされた細胞死であるアポトーシスにおける分解プロセスを活性化し、ＤＮＡを切断して細胞染色質を分解するヌクレアーゼを活性化し、エンドヌクレアーゼの直接的刺激又はＣａ2+依存性プロテアーゼ、ホスファターゼ、及びホスホリパーゼの活性化によって間接的にＤＮＡ消化を促進し、その結果として染色質の構造的完全性の消失を生じさせる（Ｎｉｃｏｔｅｒａら，１９９４，が参照によりここに具体化される）。
細胞内蛍光カルシウム指示薬の開発（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，１９８５，が参照によりここに具体化される）は生きた細胞内で遊離カルシウムの細胞内濃度を直接的に測定することを可能にした。そこで細胞内カルシウム濃度における変化を記録する能力は、その作用が膜受容体とイオンチャンネルとの相互作用の結果であると考えられている様々な疾患を治療するときに有用な、様々な化合物の作用をモニターするための手段を提供する。
薬理学的に有用な化合物を同定するための組合せ化学アプローチの出現に伴って、合成組合せライブラリーにおける化合物の薬理学的プロフィール及び対応する効力の自動特性付けを実施することのできる方法及び装置が必要であることはますます明白である。これはおそらく、組合せライブラリーに含まれる極めて多数の化合物の迅速なスクリーニング、生物学的活性を有するそれらの化合物の同定、及び効力、親和性及び選択性に関するそれらの化合物の特性付けを可能にするであろう。
そこで本発明の目的は、細胞膜受容体、イオンポンプ及びイオンチャンネルと特異的に相互作用してそれらの活性を調節する薬理学的に有効である可能性のある化合物を生きた細胞を用いてスクリーニング及び定量特性付けを行うための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、細胞の結合部位に対する活性化合物の親和性を特性付けできる方法を提供することである。
本発明のさらにもう１つの目的は、化合物のアゴニスト活性とアンタゴニスト活性とを区別するための方法を提供することである。
さらに本発明の別の目的は、スクリーニングプロセス中に発見された活性化合物に感受性である受容体、イオンチャンネル又はイオンポンプ実体の性質を測定するための方法を提供することである。
さらになお本発明のもう１つの目的は、特定細胞由来組織に対する細胞受容体パターンを特性付けるための方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、一連の細胞タイプの各部分上で上記方法の各々を実施することである。
本発明のさらにもう１つの目的は、１種又はそれ以上の細胞タイプにおいて発現した細胞表面受容体のパターンを測定することである。
本発明のもう１っの目的は、試験化合物が特定受容体の活性に影響を及ぼすことを確証することである。
本発明のなおもう１つの目的は、それが発現している様々な細胞タイプにおける所定の受容体の活性を測定することである。
本発明の特別の目的は、上記の目的を実現するための装置を提供することである。
本発明のさらにもう１つの目的は、一連の細胞タイプの各部分について上記の目的の各々を実現するためめ装置を提供することである。
これら及びその他の目的の少なくとも一部は下記に開示する本発明の様々な態様によって取り扱われる。
発明の概要
本発明は、合成組合せライブラリーにおいて化合物の薬理学的プロフィール及び対応する効力の自動特性付けを可能にする方法及び対応する装置を提供することによって上記及びその他の必要を満たす。これは、組合せライブラリーの極めて多数の化合物の迅速なスクリーニング、生物学的活性を有するそれらの化合物の同定、及び効力、親和性と選択性に関するそれらの化合物の特性付けを可能にする。
本発明に従って、スクリーニングされる化合物によって惹起される様々な作用を検出して定量的に特性付けられる。好ましくは、これらの作用には例えば特異的な蛍光性、発光性又は発色性染料を使用する様々な従来の手段によって測定できる生きた細胞のイオン化カルシウムの細胞内濃度、ｃＡＭＰ若しくはｐＨ、膜内外ポテンシャル及びその他の生理学的及び生化学的特徴における変化が含まれるが、これらに限定されない。
本発明はさらに、薬物のアゴニスト又はアンタゴニスト活性に関してスクリーニングする方法、それらの効力プロフィールを特性付ける方法、細胞膜の受容体発現パターンを同定する（”受容体のフィンガープリンティング”）方法及び化合物に対する毒性プロフィールを測定する方法を含んでいる。これらの方法においては、細胞の定常流れが化合物及び標準物質の流れと混合される。化合物単独及び標準物質と混合した場合の作用が測定され、これが化合物の薬理学的プロファイリング、薬物スクリーニング及び細胞受容体パターン特性付けのための手段を提供する。
本発明の好ましい実施態様では、スクリーニングされる化合物と標準アゴニスト及びアンタゴニスト物質とが９６ウェル・プレートフォーマット、又は４８ウェルと２４ウェル・プレートフォーマット試験管配列のような他の通例の二次元配列内で組織化される。本発明の別の好ましい実施態様では、非付着細胞が適切な細胞培養系において増殖させることによって自由に流動している細胞の懸濁液中で増殖させられる。
本発明の別の好ましい実施態様では、増殖するためには表面への付着を必要とする天然付着細胞が、増殖中に細胞が付着する市販で入手可能な微小球状ビーズを含有している適切な細胞培養系内で増殖させられる。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、増殖するためには表面への付着を必要とする天然付着細胞が、細胞培養フラスコ内で増殖させられ、引き続いて適切な剥離試薬を用いてフラスコ底部から細胞が剥離させられる。
本発明に従うと、真核細胞又は原核細胞のどちらでも使用できる。細胞は、例えばオーファン受容体である当該受容体を発現するために遺伝子をコードしてトランスフェクトされることができる。さらに、生物学的に適切な活性を有する様々な化合物を使用することができ、神経伝達物質、ホルモン、毒素、受容体活性化物質及び阻害物質、イオンチャンネル及びイオンポンプモジュレーター、刺激物質及び／又は薬物を含むがこれらに限定されない。
上記の好ましい実施態様に従って増殖させた細胞は、例えば細胞内カルシウム濃度を測定するためにはＦＵＲＡ-２ＡＭ、又は細胞内ｐＨを測定するためにはＢＣＥＣＦ-ＡＭのような適切な蛍光染料と混合され、染料が細胞内に浸透できるような適切な条件でインキュベートされる。染料が負荷された細胞は装置に供給される。装置では、これらの細胞は引き続いて試験される化合物の溶液と混合される。
本発明の１つの態様は、生物学的活性を有する化合物を同定するための、下記のステップを含む方法である：（ａ）試験混合物を形成するために生きた細胞の均質懸濁液と未知の細胞作用を有する試験化合物とを混合するステップ、（ｂ）試験混合物を検出ゾーンへ導くステップ；及び（ｃ）試験混合物が検出ゾーンを通過して流れるときに試験化合物に対する懸濁した細胞の細胞応答を測定するステップ。本方法はしばしば追加して下記のステップを含んでいる：（ｄ）標準混合物を形成するために細胞の均質懸濁液と細胞の細胞応答へ既知の作用を有する標準化合物とを混合するステップ、（ｅ）標準混合物を検出ゾーンを通過させるステップ、及び（ｆ）標準化合物に対する細胞の細胞応答を測定するステップ。ある実施態様では、標準化合物と試験化合物は混合ステップにおいて細胞と同時に混合され、測定ステップが既知の作用又は既知の作用における変化を検出する。標準化合物は細胞応答のアゴニスト又はアンタゴニストであってよい。ある態様では、単一の細胞懸濁液を使用してステップ（ａ）及び（ｄ）が同時に実行され；ステップ（ｂ）及び（ｅ）が同時に実行され；さらにステップ（ｃ）及び（ｆ）が同時に実行される。別の態様では、最初にステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が実行され、その後ステップ（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）が実行されるが、このとき試験化合物はステップ（ｄ）において標準化合物と一緒に添加される。ステップ（ｃ）において試験化合物が応答を発生するほど活性であることを示す細胞応答が検出された場合は、標準化合物はアンタゴニストであるので、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）の細胞応答における低下は、試験化合物が既知の作用のアゴニストであることの指標である。ステップ（ｃ）において試験化合物が応答を発生するほど活性ではないことを示して細胞応答が検出されない場合は、標準化合物はアゴニストであるので、ステップ（ｆ）において検出された既知の作用の変化は、試験化合物が既知の作用のアンタゴニストである指標である。好ましくは、本方法は複数の試験化合物及び複数の標準化合物についてプログラム可能なコンピューターの指令下で自動的に実施され、ステップ（ｃ）において試験化合物が細胞応答を発生するほど活性であることを示して細胞応答が検出された場合は連続する一連のアンタゴニストがステップ（ｄ）における標準化合物として自動的に添加される；それによってステップ（ｆ）において検出された細胞応答における低下は試験化合物が既知の作用のアゴニストであると指示する。及びステップ（ｃ）において細胞応答が検出されない場合には、ステップ（ｄ）における標準化合物として一連のアゴニストが自動的に添加される。それによってステップ（ｆ）において検出された既知の作用の変化は試験化合物が既知の作用のアンタゴニストであると指示する。
本方法のある実施態様では、ステップ（ｆ）が試験化合物は既知の作用のアゴニストであることを示している場合は、本方法は試験化合物及び標準化合物の濃度を変化させながらステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）、さらに（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を繰り返し、結果として生じた細胞応答における変化を記録することによって試験化合物のアゴニスト活性の濃度依存性を自動的に測定することを含んでいる；及びステップ（ｆ）が試験化合物はアンタゴニストであることを示している場合は、本方法は試験化合物及び標準化合物の濃度を変化させながらステップ（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を繰り返し、結果として生じた細胞応答における変化を記録することによってアゴニストである標準化合物の存在下で細胞応答の阻害の濃度依存性を自動的に測定することを含んでいる。任意では、本方法はさらに又、ステップ（ｆ）が化合物はアンタゴニストであることを示している揚合は、次のステップを含んでいる：（ｇ）標準化合物の濃度を変化させながらゼロ濃度の試験化合物に対してステップ（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を繰り返し、結果として生じた細胞応答における変化を記録することによって細胞応答活性化の濃度依存性を自動的に測定し、その後さらに試験化合物の様々な濃度についてこのステップ（ｇ）を繰り返すこと。本方法はさらに又、ステップ（ｆ）が試験化合物はアゴニストであることを示している場合は、次のステップを含んでいることがある：（ｈ）試験化合物の濃度を変化させながらゼロ濃度の標準化合物に対してステップ（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を繰り返し、結果として生じた細胞応答における変化を記録することによって細胞応答活性化の濃度依存性を自動的に測定し、その後さらに標準化合物の様々な濃度についてこのステップ（ｈ）を繰り返すこと。試験化合物及び／又は標準化合物の濃度を変化させるのは、連続的又は段階的方法で実施できる。ある好ましいステップは、細胞応答において記録された変化をグラフ表示することを含んでいる。
細胞応答は、細胞流液が懸濁液で検出器を通過するときに測定又は検出されやすいあらゆる望ましい細胞応答であってよい。これは細胞自体又は細胞が懸濁している媒質を分析することによって明示されることができる。細胞応答は、例えばカルシウム、マグネシウム、プロトン、ナトリウム又はカリウムのような細胞内イオン濃度における変化から測定できる。ある実施態様では、イオンは可視及び／又は蛍光染料のような細胞内染料を使用して検出される。
別の実施態様では、本方法は次のステップを含んでいる：（ａ）試験混合物を形成するために生きた細胞の均質懸濁液と未知の細胞作用を有する試験化合物とを混合するステップ、（ｂ）試験混合物を検出ゾーンへ導くステップ；（ｃ）試験混合物が検出ゾーンを通って流れるときに細胞の試験化合物に対する懸濁した細胞応答を測定するステップ；及び試験される一連の細胞タイプの各細胞タイプについて、前記一連の細胞タイプの各細胞タイプに対する前記試験化合物の作用を測定できるようにステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すこと。この実施態様では、本方法はさらに次のステップを含んでいることがある：一連の標準混合物を形成するために前記一連の細胞タイプの中の前記細胞タイプ各々の均質懸濁液と前記細胞の前記細胞応答に既知の作用を有している標準化合物とを混合すること；前記一連の標準混合液に検出ゾーンを通過させること；及び前記標準化合物に対する前記細胞タイプ各々の細胞応答を測定すること。標準化合物は前記細胞応答のアゴニスト又はアンタゴニストのどちらでであってもよい。
本発明はさらに、生きた細胞に対して複数の試験化合物が及ぼす作用を自動的に測定するために、下記を含有する装置を含んでいる：多数の試験化合物のサンプルを連続的に供給するための試験化合物サンプラー、生きた細胞の均質懸濁液を供給するための細胞懸濁液インプット、試験化合物サンプラーから試験化合物のサンプルを受け入れ、細胞懸濁液インプットから生きた細胞の懸濁液を受け入れ、各試験化合物と生きた細胞の懸濁液とを混合するために試験化合物サンプラーに接続されている混合ゾーン、及び各試験化合物に対する懸濁した細胞の細胞応答を測定するために混合ゾーンへ接続されている検出器。本装置は追加して、懸濁した細胞の細胞応答に対して既知の作用を有する標準化合物のサンプルを供給するために混合ゾーンへ接続されている標準化合物サンプラーを含んでいる場合があるが、このとき混合ゾーンは標準化合物サンプラーから標準化合物のサンプルを受け入れ、標準化合物と懸濁した細胞とを混合し、検出器が標準化合物に対する懸濁した細胞の細胞応答を測定する。ある態様では、混合ゾーンは同時に試験化合物及び標準化合物と懸濁した細胞とを混合し、検出器は既知の作用又は既知の作用における変化を検出する。本装置はさらに、試験化合物サンプラーから混合ゾーンへ移された試験化合物の濃度レベルを自動的に調整するために試験化合物サンプラーに接続されている第１濃度勾配装置と、標準化合物サンプラーから混合ゾーンへ移された標準化合物の濃度レベルを自動的に調整するために標準化合物サンプラーへ接続されている第２濃度勾配装置とを含んでいることがある。本装置はさらに又、ある濃度の試験化合物若しくはある濃度の標準化合物又はその両方の流れを試験化合物及び／又は標準化合物がその後細胞懸濁液と混合される混合ゾーンへ選択的に切り換えるためにスイッチングバルブの流入口で第１及び第２濃度勾配装置へ接続され、スイッチングバルブの流出口で混合ゾーンへ接続されているスイッチングバルブを含んでいることがある。さらに、本装置は又、スイッチングバルブに接続されているキャリブレーションユニットを含んでいることがあり、このときスイッチングバルブは又、キャリブレーション液と細胞懸濁液とが混合される混合ゾーン内にキャリブレーションユニットによって供給されるキャリブレーション液の流れを選択的に切り換える。
細胞と様々な試験化合物及び標準化合物との反応時間は、細胞懸濁液が試験化合物、標準化合物又はキャリブレーション液と反応するために適正な時間であるように、試験化合物、標準化合物若しくはキャリブレーション液のいずれかと混合された細胞懸濁液の混合物を受け入れるため、及び混合のための流路を提供するために混合ゾーンの流出口へ接続されている様々な長さの反応展開ラインを使用することを通して制御することができるが、このとき反応展開ラインはさらに反応展開ラインから混合物を受け入れる検出器の流入口に接続されている。ある好ましい実施態様では、検出器が細胞内イオン濃度における変化を検出する。好ましいイオンは上記に記載されている。
本装置はさらに、第１及び第２濃度勾配装置、試験化合物サンプラー、標準化合物サンプラー及びスイッチングバルブの操作を制御するためにそれらに接続されている制御装置と、コンピューターによって実行されるソフトウエアのプログラムに従って制御装置へ指令シグナルを送信するために制御装置に接続されているコンピューターとを含んでいることがあり、このときコンピューターは又、細胞応答測定シグナルを検出器へ送信したり検出器から受信するために検出器に接続されている。さらに本装置を自動化するために、試験化合物サンプラーは試験化合物ライブラリーから特定試験化合物を選択できる自動ロボットサンプラーであってよい。制御装置は、コンピューターによって実行されるソフトウエアプログラムに従って制御装置へ指令シグナルを送信し、それによって試験化合物ライブラリーから試験化合物サンプラーによる試験化合物の選択及び回収を制御するために、制御装置へ接続されているコンピューターを使用して試験化合物サンプラーの操作を制御するために、試験化合物サンプラーへ接続することができる。
本装置は、陽圧下又は陰圧下のどちらかで流れを様々なコンポーネントに導くことができる。そこである態様は、試験化合物サンプラーから混合ゾーンへ移される試験化合物の濃度レベルを調整するために試験化合物サンプラーへ接続されている、流入口及び流出口を持つ濃度勾配ポンプを含んでおり、このとき試験化合物サンプラーは特定試験化合物を受け入れるための第１吸込ノズルと緩衝液を受け入れるための第２吸込ノズルとを含有しており、さらにこのとき濃度勾配ポンプは第１及び第２吸込ノズルに接続されていて、第１及び第２吸込ノズルによって各々受け入れる試験化合物及び緩衝液の量を調整することによって特定濃度の試験化合物を受け入れるが、このとき緩衝液は試験化合物の希釈剤である。この態様はさらに、混合ゾーンへ標準化合物のサンプルを供給するために標準化合物サンプラーを含んでいることがある。標準化合物サンプラーは、好ましくは標準化合物ライブラリーから特定標準化合物を選択できる自動ロボットサンプラーである。本装置はさらに、標準化合物サンプラーから混合ゾーンへ供給される標準化合物の濃度レベルを調整するために標準化合物サンプラーに接続されている、流入口及び流出口を有する第２濃度勾配ポンプを含んでいることがあり、このとき標準化合物サンプラーは特定標準化合物を受け入れるための第３吸込ノズルと緩衝液を受け入れるための第４吸込ノズルとを含んでおり、さらにこのとき第２濃度勾配ポンプは第３及び第４吸込ノズルと接続されていて、第３及び第４吸込ノズルから各々受け入れる標準化合物及び緩衝液の量を調整することによって特定濃度の標準化合物を受け入れるが、このとき緩衝液は標準化合物の希釈剤である。本装置はさらに、第２混合ゾーンの流出口が第１混合ゾーンに供給されるように、特定濃度の特定試験化合物及び特定標準化合物を受け入れて混合するための、第１及び第２濃度勾配ポンプの流出口へ接続されている第２混合ゾーンを含んでいることがある。さらに含めることのできる別の要素は、キャリブレーション液を供給するためのキャリブレーションユニット、及び第２混合ゾーンからの試験化合物混合物又はキャリブレーションユニットからのキャリブレーション液のどちらかの流れの間で切り換え、その後その流れを細胞懸濁液と混合される第１混合ゾーンへ供給するために、第２混合ゾーンへ接続されている第１流入口と、キャリブレーションユニットへ接続されている第２流入口と、及び第１混合ゾーンへ接続されている流出口とを有しているスイッチングバルブである。好ましくは、キャリブレーションユニットは、細胞懸濁液と混合したときに最高細胞応答を生じさせる最高キャリブレーション液、細胞懸濁液と混合したときに最小細胞応答を生じさせる最小最小キャリブレーション液、最高キャリブレーション液若しくは最小キャリブレーション液のどちらかの流れの間で切り換えるために最高キャリブレーション液に接続されている第１流入口と最小キャリブレーション液に接続されている第２流入口とを有する切換バルブ、及び切換バルブからスイッチングバルブへ最高キャリブレーション液又は最小キャリブレーション液のどちらかをポンプで流入させるために切換バルブの流出口及びスイッチングバルブの流入口へ接続されているポンプを含有している。本装置の陽圧バージョンは、さらに細胞懸濁液流入口から第１混合ゾーン内へ細胞懸濁液をポンプで流入させるために、第１混合ゾーンの流入口へ接続されている第２ポンプを含むことができる。第１混合ゾーンから受け入れる混合物のための流路及び反応遅延時間を提供するため、そして検出器に混合物を供給するために、第１混合ゾーンの流出口に接続されている流入口及び検出器の流入口に接続されている流出口を有している反応展開ラインも又含めることができる。
上記のような好ましい実施態様では、本装置は第１及び第２濃度勾配ポンプ、試験化合物サンプラー、標準化合物サンプラー及びスイッチングバルブ、第１及び第２混合ゾーン、第１及び第２ポンプ及び切換バルブの操作を制御するためにそれらに接続されている制御装置と、コンピューターによって実行されるソフトウエアプログラムに従って制御装置へ指令シグナルを送るために制御装置へ接続されているコンピューターとを含むことができるが、このときコンピューターはさらに細胞応答測定シグナルを検出器へ送信したり検出器から受信したりするために検出器にも接続されている。
本発明の装置はさらに又、装置へ陰圧を提供するために検出器の流出口へ接続されているポンプと、試験化合物サンプラーから混合ゾーンへ移される試験化合物の濃度レベルを調整するために試験化合物サンプラーへ接続されているプロポーショニングバルブとを利用することによって陰圧下でも実行できるが、このとき試験化合物サンプラーはさらに特定試験化合物を受け入れるための第１吸込ノズル、緩衝液を受け入れるための第２吸込ノズルを含んでおり、さらにプロポーショニングバルブは第１及び第２吸込ノズル各々によって受け入れる試験化合物及び緩衝液の量を調整することによって特定濃度の試験化合物を受け入れるが、このとき緩衝液は試験化合物の希釈剤である。陰圧装置はさらに、標準化合物サンプラーが特定標準化合物を受け入れるための第３吸込ノズル及び緩衝液を受け入れるための第４吸込ノズルを含んでいる、標準化合物のライブラリーから特定標準化合物を選択することのできる自動標準化合物サンプラーと、第３及び第４吸込ノズルから各々受け入れる標準化合物及び緩衝液の量を調整することによって特定濃度の標準化合物を受け入れるために第３及び第４吸込ノズルに接続されている第２プロポーショニングバルブとを含むことができるが、このとき緩衝液は標準化合物の希釈剤である。あるバージョンでは、本装置は特定濃度の試験化合物を受け入れて試験化合物を混合ゾーンへ供給するために第１プロポーショニングバルブの流出口へ接続されている第１プライミングバルブと、特定濃度の標準化合物を受け入れて標準化合物を混合ゾーンへ供給するために第２プロポーショニングバルブの流出口へ接続されている第２プライミングバルブとを含んでいる。上記で記載したように本装置にはキャリブレーションユニットを含めることができるが、同様に反応展開ライン、ロボット流入口及びコンピュータ制御装置も含めることができる。細胞懸濁液流入口は、細胞懸濁液リザーバー、緩衝液リザーバー、緩衝液が細胞懸濁液の希釈剤であるときに細胞懸濁液の濃度を調整するために細胞懸濁液リザーバーに接続されている第１流入口と緩衝液リザーバーに接続されている第２流入口とを有している第３切換バルブ、さらに第３切換バルブから細胞懸濁混合物を受け入れてこの混合物を第２混合ゾーンへ供給するために第３切換バルブの流出口へ接続されている第４プライミングバルブとを含んでいることがある。ある実施態様では、本装置はさらに複数の細胞懸濁液リザーバーを含んでいる。
本発明のもう１つの態様は、（ａ）試験混合物を形成するために細胞懸濁液と特定受容体の活性に影響を及ぼすことが既知である試験物質とを混合するステップ；（ｂ）前記試験混合物を検出ゾーンへ導くステップ；（ｃ）試験物質に対する応答が前記細胞が前記試験物質に対して応答することが既知である受容体を発現することを示すときに、前記試験混合物が前記検出ゾーンを通って流れるときに前記試験物質に対する前記生きた細胞の懸濁液の細胞応答を測定するステップを含んでおり；さらに（ｄ）各試験物質の作用が測定されるまで一連の試験物質を用いてステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップ、を含んでいる、細胞内に存在する受容体を特性付ける方法である。試験物質は、アゴニスト、アンタゴニスト、又はアンタゴニストとアゴニストとの混合物を含んでいてよい。ある実施態様では、本方法はさらに各細胞タイプによって発現した受容体を測定するために一連の様々な細胞タイプについてステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことを含んでいる。
本発明のもう１つの態様は、陰性対照混合物を形成するために前記受容体を含んでいない陰性対照細胞タイプを前記試験物質に接触させるステップと、前記陰性対照混合物に検出ゾーンへ導くステップと、前記陰性対照混合物が前記検出ゾーンを通って流れるときに前記試験化合物に対する前記生きた細胞の懸濁液の細胞応答を測定するステップと、試験混合物を形成するために前記受容体を発現させるために工学的に作製された、又は誘発された陰性対照と同一細胞タイプの細胞を前記試験物質と接触させるステップと、前記試験混合物を検出ゾーンへ導くステップと、試験混合物中の細胞の前記試験物質に対する細胞応答を測定するステップとを含んでおり、それにより前記陰性対照細胞の測定された応答に比較したときの前記試験混合物中に含まれる前記細胞の測定された応答における相違が前記試験物質が前記受容体の活性に作用を有していることを示すことによって、前記試験物質が受容体の活性に影響を及ぼすことを確認する方法である。試験物質は、アゴニスト、アンタゴニスト、又はアゴニストとアンタゴニストとの混合物を含有していてよい。
本発明のさらにもう１つの態様は、（ａ）試験混合物を形成するために一連の細胞タイプの一部を含んでいる生きた細胞の懸濁液と特定受容体の活性に影響を及ぼすことが既知である物質とを混合するステップ、（ｂ）試験混合物を検出ゾーンに導くステップ、（ｃ）前記試験物質に対する前記生きた細胞の懸濁液の細胞応答を測定するステップ、（ｄ）前記一連の各細胞タイプにおいて前記試験物質の作用が測定されるまで一連の細胞タイプの各部分についてステップ（ａ）〜（ｃ）のステップを繰り返すステップを含んでいる、一連の細胞タイプにおいて１種又はそれ以上の受容体の活性を測定する方法である。試験物質は、既知の受容体アゴニスト、既知の受容体アンタゴニスト、既知の受容体アゴニストと既知の受容体アンタゴニストの混合、その活性が未知である化合物又は、その活性が未知である化合物と既知の受容体アゴニスト又は既知の受容体アンタゴニストである混合物、を含んでよい。
下記では、本発明のある好ましい実施態様を図面及び好ましい実施態様の詳細な説明に関してより詳細に考察する。これらの好ましい実施態様は本発明の範囲又は特徴を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置の一実施態様のブロック図である。
図２は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置に使用されうる陽圧流体システムのブロック図である。
図３は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置に使用されうる好ましいシステムの一実施態様のブロック図である。
図４は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置に利用されうるスクリーニング様式の簡易アルゴリズムを表している。
図５は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置に利用されうる効力様式の簡易アルゴリズムを表している。
図６は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置によって実現されうる好ましい一次操作様式のフロー図である。図６は図６ａ〜６ｄの組合せを含んでいる。
図７は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置によって実現されうる好ましいスクリーニング操作様式のフロー図である。図７は図７ａ〜７ｇの組合せを含んでいる。
図８は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置によって実現されうる好ましい効力操作様式のフロー図である。図８は図８ａ〜８ｅの組合せを含んでいる。
図９は、ＢＱ-１２３の存在下でのＥＴ-１用量依存性Ｃａ2+移動の実験結果を示している。
図１０は、図９のデータの半対数変換を示している。
図１１は、ＢＱ-１２３を用いた場合の、ＴＥ-６７１細胞中におけるＥＴ-１誘発性Ｃａ2+移動の用量依存性阻害の実験結果を示している。
図１２は、ＢＱ-１２３を用いた場合の引き続いての阻害による、ＴＥ-６７１細胞中におけるＥＴ-１用量依存性Ｃａ2+移動の実験結果を示している。
図１３は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置において利用されうる細胞マッピングモードのための簡易アルゴリズムを示している。
図１４は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置において利用されうるオーファン受容体モードについての機能的特性付けのための簡易アルゴリズムを示している。
図１５は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置によって実現されうる好ましい細胞マッピング操作様式のフロー図を示している。図１５は図１５ａ〜１５ｆの組合せを含んでいる。
図１６は、本発明に記載の組合せスクリーニング装置によって実現されうる好ましいオーファン受容体測定様式のフロー図を示している。図１６は図１６ａ〜１６ｇの組合せを含んでいる。
好ましい実施態様の説明
本発明は、一連の細胞タイプ又は単一細胞タイプに対しての試験化合物の生理学的又は薬理学的作用をリアルタイムで連続的にモニター及び検出することを提供する。最も簡単な実施態様では、本発明は、単一細胞懸濁液、又は一連の細胞懸濁液で試験される一連の細胞タイプに含まれている単一細胞タイプを含有しており、これを一連の細胞懸濁液を所定の濃度の少なくとも１種の可能性ある活性化合物と、好ましくは所定の濃度の少なくとも２種の活性化合物と連続的に接触させるための方法及び装置を含んでいる。その後、試験される細胞タイプ又は試験される一連の細胞タイプの一部を含有する懸濁液及び試験化合物が検出器を通過するときに細胞と活性化合物との接触に反応して発生する細胞内変化が連続的に測定される。
本発明は、高処理量のスクリーニングにおいて、例えば１種又はそれ以上の細胞タイプに対する活性について非常に多数の候補化合物をスクリーニングするときに極めて高価値であると予想される。本方法は、例えば活性化合物に対する合成又は天然物ライブラリーをスクリーニングするときに特別な価値を有している。
ある好ましい実施態様では、試験化合物、標準化合物、及び試験される細胞タイプ又は試験される一連の細胞タイプの一部を含有している細胞懸濁液が一緒に連続的に混合され、培養時間の後に、細胞内又は少なくとも１種の分析物の細胞内媒質中の濃度を測定する検出器を通過させられる。ある実施態様では、試験化合物及び／又は標準化合物の濃度は検出器からの出力として用量／反応曲線を作成するために経時的に変化させられる。
本発明の装置はコンピューター又はその他のプログラム可能な制御装置の制御下にあることが好ましい。制御装置は工程の各ステップの結果を連続的にモニターすることができ、それらの結果に反応して試験パラダイムを自動的に変化させることができる。
化合物又は数種の化合物と細胞を混合後の培養時間は、その混合物を混合ゾーンと検出器とを接続しているある長さのチューブを通過させることによって有益に制御することができる。従って培養時間は流量及びチューブの長さによって決定される。培養時間は、特定分析物及び結果として生じる反応時間に依存して、数桁変動することがある。例えば、培養時間は迅速又は一時的な生理学的反応については１秒又は１秒の何分の１と短い場合もあれば、数分間若しくは数時間と長い場合もある。
分析物は検出器及び／又は検出器／化学装置の組合せによって容易に検出できるいかなる分析物であってよい。従って、様々なイオン又は電解質濃度、熱量計変化、光学密度変化、蛍光、発光、ｐＨ、ガス産生及びその他はどれも本発明の方法及び装置に使用するために容易に採用できる。
イオン又は電解質変化を検出するときには、熱量又は蛍光染料が特に好ましい実施態様である。例えば、カルシウムイオンはＦｕｒａ-２、Ｉｎｄｏ-１、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ又はＱｕｉｎ-２のようなプローグにより検出され、ナトリウムイオンはＳＢＦＬによって、プロトンイオンはＢＣＥＣＦ、ＳＮＡＦＬ、ＤＭ-ＮＥＲＦによって、マグネシウムイオンはＭａｇ-Ｆｕｒａ-２又はＭａｇ-Ｆｕｒａ-５によって、塩化物イオンはＳＰＯ、ＳＰＡ又はＭＯＡＥによって検出できる。これら全ての染料は、例えばモルキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｏｒｅｇｏｎ）から市販で入手できる。
図１は、本発明の装置の好ましい実施態様の概略構成図を示している。好ましい実施態様は、試験される化合物のサンプルを受け入れて保持するための試験化合物サンプラー１０１；試験される化合物と混合される標準液（例えば、緩衝液及び／又は既知のアゴニスト若しくはアンタゴニスト）のサンプルを受け入れて保持するための標準化合物サンプラー１０３；試験される化合物の流量を制御するために試験化合物サンプラー１０１に接続されている濃度勾配装置１０５；標準化合物液の流量を制御するために標準化合物サンプラー１０３に接続されている濃度勾配装置１０７；試験化合物／標準化合物混合物又はキャリブレーション液を受け入れ、これらの液の一つを試験される細胞タイプ又は試験される一連の細胞タイプの一部を含有している細胞懸濁液と混合するためにそれらを混合ゾーン１１２へ導くためのスイッチングバルブ１１１；少なくとも１つの細胞懸濁液リザーバー１１３（及び、ここで一連の細胞タイプが試験されることになっており、試験される一連の細胞タイプの１つの細胞懸濁液を各々が含有している複数の細胞懸濁液リザーバー）；所定の比率でキャリブレーション液が細胞懸濁液と混合されるようにキャリブレーション液をスイッチングバルブ１１１へ供給するためのキャリブレーションユニット１１７；試験化合物／標準化合物混合物又はキャリブレーション液のどちらかと混合されている細胞懸濁液を受け入れ、この混合物を検出器１１９へ移動させるための反応展開ライン装置１１５；及び細胞応答が検出器１１９によって検出及び測定された後に検出器から混合物を受け入れて排液するためのドレーン１２１から構成されている。制御装置１０９は、試験化合物サンプラー１０１、標準化合物サンプラー１０３、濃度勾配装置１０５及び１０７、及びスイッチングバルブ１１１に接続されている。制御装置は、コンピューター１２３からの指令シグナルを受信することによって上記装置を制御し、コンピューター１２３は順にソフトウエアプログラム１２５に従ってシグナルを発生し、送信し、受信する。混合ゾーン１１２は、チャンバー、チューブ、一連のバッフル、又はその中で混合が起こり得る何らかの他の構造を含むことができる。
試験化合物及び／又は標準化合物が、容易に市販で入手でき、好ましい実施態様では静的ミキサー１２５-１３４５（Ｂｉｏ Ｒａｄ）である混合ゾーン１１２内で細胞と混合された後は、その試薬がもう一方とより完全に混合され、完全に反応するための十分な時間が与えられるように、この混合物は反応展開ライン１１５を通って送られる。検出器１１９は反応展開ライン装置１１５に接続されており、反応展開ライン１１５から細胞／試験化合物／標準化合物混合物を受け入れる。
ある好ましい実施態様では、サンプラー１０１及び１０３の各々は各化合物又は標準液を含有しているバイアル内に配置できるシッパーノズルを含んでいる。これらサンプラーはこの技術においてよく知られており、容易に入手できる市販製品である（例えば、Ａ／Ｓ ３００オートサンプラー、製品番号１５００６３３０（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）。多数のサンプルを取り扱うためには、装置にサンプルを供給するために従来の自動又はロボット装置（図示されていない）を使用することができる。例えば４８ウェル又は９６ウェル・プレートフォーマットに調製された様々なサンプル列をそうした自動サンプリング装置によって容易に適応させることができる。
濃度勾配装置１０５及び１０７も又容易に入手できる市販装置である（例えば、ＧＰ４０Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｐｕｍｐ（Ｄｉｏｎｅｘ））。操作モードに依存して、対応する濃度勾配装置１０５及び１０７は緩衝剤で希釈することによって不連続濃度又は連続的勾配濃度の試験される化合物又は標準物質（アゴニスト又はアンタゴニスト）を調製できる。例えば、標準物質の存在下における化合物濃度に対する細胞応答の連続曲線が望ましい場合は、コンピューター１２３は連続勾配の各化合物及び所定の一定濃度の標準液がスイッチングバルブ１１１に供給されるような方法で濃度勾配装置１０５及び１０７を制御するように制御装置１０９に指示する。或いは又、ある化合物の存在下で標準液濃度に対する細胞応答の連続曲線が望ましい場合は、コンピューター１２３は連続勾配の各標準液及び所定の一定濃度の各化合物がスイッチングバルブ１１１へ提供されるような方法で濃度勾配装置１０５及び１０７を制御するように制御装置１０９に指示する。
スイッチングバルブ１１１へ接続されているキャリブレーションユニット１１７は、装置の出力シグナル、ＭＡＸ及びＭＩＮをキャリブレートするために必要なキャリブレーション液を供給する。好ましい実施態様では、こキャリブレーションユニットは容易に入手できる市販装置（例えば、ＳＶ３-２  Ｄｉｖｅｒｔｅｒ  Ｖａｌｖｅ（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）である切換バルブから構成されている。切換バルブはスイッチングバルブ１１１への２種のキャリブレーション液の供給を切り換える。スイッチングバルブ１１１は濃度勾配装置１０５及び１０７から、又はキャリブレーションユニット１１７からの液流に細胞懸濁液リザーバー１１３から（又は試験される一連の細胞タイプにおける１種の細胞タイプを各々が含有している複数の細胞懸濁液リザーバー１１３の１つから）の細胞液流を混合し、混合物流を反応展開ライン１１５の１つに導く。スイッチングバルブ１１１は工業において周知のタイプのものであり、好ましい実施態様ではゼネラルバルブ社（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖａｌｖｅ  Ｃｏｒｐ．）によって製造される三方マイクロバルブ４-８-９００である。細胞懸濁液リザーバー１１３も又その技術において周知のタイプのものであり、好ましい実施態様ではレギュラータイプのガラス製ビーカーである。細胞は、装置内へ導入されるまでは単純な低せん断攪拌によって懸濁液中に維持されている。
反応展開ライン１１５は、典型的にはそれを通って細胞懸濁液、試験化合物及び標準液の上記の混合物が流れることのできる特定径を有する非腐食性材料から作られたチューブである。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、又はポリテトラフルオロエチレン製のチューブを使用できる。細胞及びその他の試薬がそれらに粘着しないであろうチューブが特に好ましい。チューブの直径は重要な問題である。極めて小さなサンプルサイズの使用を可能にする、約０．２ｍｍ〜２ｍｍの内径を有するキャピラリーチューブが特に有益である。
このチューブは典型的には、混合物がその中を通って流れるときに混合物が完全に攪拌及び混合されるようにラセン形状でセットされる。チューブ内へ導入する前に混合物がしっかりと混合されている場合でさえ、スパイラル若しくはラセン形状はコンパクトな領域内での長いチューブ長さを可能にする。これらの反応展開ライン１１５は市販で入手でき、ある実施態様ではテフロン製チューブから成形できる。
試験される細胞タイプ又は試験される一連の細胞タイプに含まれる１種の細胞タイプ、及び“反応懸濁液”とも呼ばれる試験化合液／標準化合液を含む細胞懸濁液は、反応展開ライン１１５の長さによって決定された遅延時間又は培養時間で検出器の流通型光学セル又はその他の検出ゾーンに流入する。反応懸濁液が検出器１１９に達すると、検出器１１９は特定濃度の試験化合物に対する細胞懸濁液反応を測定することができる。好ましい実施態様では、検出器１１９は、細胞活性のレベルを測定するために、細胞内イオン化カルシウムの濃度に依存する分光特性であるカルシウム感受性染料ＦＵＲＡ２からの蛍光シグナルを測定する。この測定を行うために、検出器１１９は３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの波長の光線を用いて流通型光学キュベットを通過する反応懸濁液を交互に照射し、５４０ｎｍでの蛍光強度を測定する。３４０ｎｍ及び３８０ｎｍ各々での励起に基づき５４０ｎｍで記録された蛍光強度の比率（Ｒ）はコンピューター１２３へ伝送される。コンピューター１２３はこの技術において周知である下記の方程式に従って細胞内イオン化カルシウムの濃度を計算する：
［Ｃａ2+］＝Ｋd（Ｒ−Ｒmin）／（ＲMAX−Ｒ）（Ｉf／Ｉb）
式中、Ｋｄはカルシウム／ＦＵＲＡ２複合体の解離定数であり、Ｒmin及びＲMAXはＭＩＮ及びＭＡＸキャリブレーション液の存在下で得られた比率であり、Ｉf及びＩbはＭＩＮ及びＭＡＸキャリブレーション液の存在下で３８０ｎｍでの励起に基づき５４０ｎｍで測定された蛍光強度である。検出器１１９に接続されているコンピューター１２３がその作動を指令する。コンピューター１２３は又、第１及び第２濃度勾配装置１０５及び１０７、スイッチングバルブ１１１並びに試験化合物サンプラー１０１及び標準化合物サンプラー１０３をコンピューター１２３内で実現されるソフトウエア１２５に従って制御する制御装置１０９に接続されている、又はその一部である。検出器１１９はその由来が何であろうと、特定の必要なシグナルを測定することができる。光学検出器１１９は、各々が流通型光学セルを有している、分光光度計、蛍光計、又は発光計であってよい。これらの装置はこの技術においてよく知られており、市販で入手できる。例えば、本発明の装置のある実施態様はＡＭＩＮＣＯ-Ｂｏｗｍａｎ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆａ-２５６、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）を使用することがある。検出器が直接イオン測定装置の場合は、これは例えばｐＨセンサー又はイオン選択性電極を含むことができる。ナトリウム、カルシウム及びカリウム検出器はそうした装置の例である。このタイプの検出器は市販で入手できる。これらの装置はすべてデータ獲得プロセス中にコンピューター１２３によって制御されうる。
本発明の装置は２種の相違する特異的実施態様で計画される。陽圧システムは陽圧下で試薬を供給するピストン型ポンプ又は他の適切なポンプを備えて作製されうる。或いは又、陰圧システムはシステムを通して試薬を引き出す蠕動型ポンプ又は他の適切なポンプを備えて作製されうる。陰圧システムは、極めて多数のインプット源を単一のダウンストリーム・ポンプによって駆動させることができるので、最も単純な実施態様である。
図２は、陽圧流体システムのある実施態様の概略構成図である。好ましい実施態様では、このシステムは下記でより詳細に説明するように、プログラム可能な制御装置の制御下で自動的に作動する。この実施態様は、種々の濃度の化合物２０３を生じさせるために試験される１種又はそれ以上の化合物２０３と化合物２０３と一緒に混合できる緩衝液２０５とを保持するオートサンプラー２０１、各々化合物及び緩衝液を受け入れて、試験化合物２０３の濃度レベル及び混合ゾーン２２７内への流量を制御する濃度勾配ポンプ２１１へそれらを送達するための吸込ノズル、若しくはポート２０７及び２０９、様々な濃度の標準化合物を生じさせるために１種又はそれ以上の標準化合物（つまり、アンタゴニスト２１５及び／又はアゴニスト２１７）及び標準化合物２１５若しくは２１７と混合できる緩衝液２１９とを保持するオートサンプラー２１３、標準化合物及び緩衝液を受け入れ、標準液（アゴニスト又はアンタゴニスト）の濃度レベル及び混合ゾーン２２７内への流量を制御する濃度勾配ポンプ２２５へそれらを供給するための吸込ノズル、若しくはポート２２１及び２２３を含んでいる。濃度勾配ポンプ２１１及び２２５は各々、有益には２本の流入チューブライン及び１本の流出チューブラインを備えていてよく、流出チューブは混合ゾーン２２７を通して相互に接続されている。図２には示されていない制御装置（図１の１０９）が、ポンピングをスタート／ストップさせる遠隔シグナルを供給することによってオートサンプラー２０１及び２１３と濃度勾配ポンプ２１１及び２２５の作動を制御する。好ましい実施態様では、濃度勾配ポンプ２１１及び２２５はＤｉｏｎｅｘによって製造されたＧＰ ４０Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｐｕｍｐであってよい。
混合ゾーン２２７は、濃度勾配ポンプ２１１を通って流れる試験化合物液及び、任意で濃度勾配ポンプ２２５を通って流れる標準化合物液を受け入れ、試験化合物及び標準物質を一緒に混合する。切換バルブ２３５は、最高応答キャリブレーション液２３３又は最小応答キャリブレーション液２３７のどちらかの供給を切り換える。切換バルブ２３５は、好ましくは２本の流入チューブ、１本は２種のキャリブレーション液２３３、２３７各々のためチューブ、及び１本はポンプ２３１に接続されている、２本の流出チューブを含有している。切換バルブ２３５はこの技術においてよく知られており、ＳＶ-３ Ｄｉｖｅｒｔｅｒ Ｖａｌｖｅ（ＢｉｏＲａｄ）によって実現することができる。図２には示されていない制御装置（図１の１０９）が切換バルブ２３５にシグナルを送信し、切換バルブが一方のキャリブレーション液２３３若しくは他方の２３７をポンプ２３１の取入口へ接続するための取入口を切り換える流体システムへキャリブレーション液を供給するためのポンプ２３１も又図２に示されている。ポンプ２３１は最高キャリブレーション液２３３若しくは最小キャリブレーション液２３７のどちらかを切換バルブ２３５から受け入れ、その後受け入れたキャリブレーション液をスイッチングバルブ２２９ヘポンプで送り出す。ポンプ２３１の流出チューブはスイッチングバルブ２２９の流入口に接続されている。ポンプ２３１は有益にはこの技術において周知の標準ピストン型ポンプである。好ましい実施態様では、ポンプ２３１は１３５０シリーズのＳｏｆｔ-Ｓｔａｒｔ Ｐｕｍｐ（ＢｉｏＲａｄ）である。スイッチングバルブ２２９は混合ゾーン２３９への試験化合物／標準化合物混合物又はキャリブレーション液の一つのどちらかの供給を切り換える。ポンプ２４１は試験される１種の細胞タイプを含有する細胞懸濁液リザーバー２４３から（又は試験される一連の細胞タイプに含まれている１種の細胞タイプを各々が含有している複数の細胞懸濁液リザーバー２４３の１つから）の細胞を混合ゾーン２３９へ供給する。ポンプ２４１は、流入チューブを通して細胞懸濁液リザーバー２４３からの細胞を受け入れ、流出チューブを通して混合ゾーン２３９の１つの流入口へ受け入れた細胞をポンプで送り出す。試験化合物／標準化合物混合物又はキャリブレーション液は混合ゾーン２３９のもう１つの取入口を通って流入する。両方の混合ゾーン２２７及び２３９はこの技術においてよく知られており、好ましい実施態様ではＳｔａｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ、１２５-１３４５（ＢｉｏＲａｄ）によって実現されてよい。ポンプ２４１はこの技術において周知の標準ピストン形ポンプでよい。好ましい実施態様では、ポンプ２４１は１３５０シリーズのＳｏｆｔ-Ｓｔａｒｔ Ｐｕｍｐ（ＢｉｏＲａｄ）である。細胞と試験化合物／標準化合物の溶液及び細胞とキャリブレーション液の混合物はその後混合ゾーン２３９から反応展開ライン２４５へ送り出される。流量と組み合わされたこれらのラインの長さが培養時間を決定する；即ち、細胞が試験化合物／標準化合物混合物又はキャリブレーション混合物と混合させられる時点から検出器２４７への到達時点まで経過する時間である。検出器２４７はその後試験化合物／標準化合物混合物又はキャリブレーション混合物に起因する細胞応答の量を測定する。検出器２４７によって細胞応答が測定された後、混合物はその後ドレーン２４９を通って検出器から排液される。
図３は、陰圧流体システムの好ましい実施態様の概略構成図を示している。図３に示されているように、ある好ましい実施態様は１種又はそれ以上の化合物（Ｎi）３０３及び緩衝液３０５を保持しているオートサンプラー３０１であり、さらに前記オートサンプラー３０１は各々化合物（Ｎi）３０３及び緩衝液３０５を受け入れるための吸込ノズル、又はポート３０７及び３０９を含有している；所定の、若しくは特定の比率で緩衝液３０５を用いて試験化合物３０３の希釈液を調製し、この混合物をプライミングバルブ３１３へ送達するためのプロポーショニングバルブ３１１；標準アンタゴニスト（Ｍj）３１７、アゴニスト（Ｌk）３１９及び緩衝液３０５を保持しているオートサンプラー３１５で、前記オートサンプラー３１５はさらに各々標準化合物及び緩衝液を各々受け入れるための２本の吸込ノズル３２３及び３２５を含有している；所定の、若しくは特定の比率で緩衝液３０５を用いて標準物質３１７若しくは３１９の希釈液を調製し、この混合物をプライミングバルブ３２９へ送達するためのプロポーショニングバルブ３２７。プロポーショニングバルブ３１１及び３２７はこの技術において周知のどのタイプのものであってのよい。好ましいある実施態様では、これらのバルブ３１１及び３２７は、プロポーショニング周波数モードで作動する４シリーズ超小型ソレノイド型バルブ（４-８-９００  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖａｌｖｅ  Ｃｏｒｐ．）である。同様に、プライミングバルブ３１３及び３２９もこの技術において周知のどの“常時開”型バルブであってよく、好ましいある実施態様ではＧｅｎｅｒａｌ  Ｖａｌｖｅ  Ｃｏｒｐ．によって製造された４シリーズ超小型ソレノイド型バルブ（４-３９-９００）である。
混合ゾーン３３１は、プライミングバルブ３１３から受け入れた試験化合物液とプライミングバルブ３２９から受け入れた標準化合物液とを混合する。本明細書で論ずる他の混合ゾーンと同様に、第１混合ゾーン３３１は、単純な”Ｙ”型コネクター、チューブの数倍の直径を有するチャンバー、ある長さのチューブ；セルペンチン仕切り付きチャンバー、機械式回転ミキサーを含有しているチャンバー、又は他の適切な構造から構成されている。典型的には、本方法は極めて少量の液体を含有する（例えば、０．３ｍＬという非常に少量のサンプルを用いて完全濃度勾配ランを遂行できる）。従って混合される量は少量で、混合ゾーンは小さな内容積及び高度の混合効率を備えていなければならない。これらのタイプのミキサーはこの技術においてよく知られており、ある好ましい実施態様ではリー社（Ｌｅｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）によって製造されるＶｉｓｃｏ Ｊｅｔ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ-Ｍｉｘｅｒ（＃ＴＣＭＡ０１２０１１３Ｔ）によって実現することができる。
切換バルブ３３５は、最高応答キャリブレーション液３３７又は最小応答キャリブレーション液３３９のどちらかの供給を切り換える。切換バルブ３３５は、２種のキャリブレーション液を受け入れるための２本の流入チューブともう１つの切換バルブ３３３に接続されている流出チューブとを含んでいる。切換バルブ３３３は２つの流入チューブを有し、１つは試験化合物／標準化合物の混合液を受け入れるためであり、もう一方はキャリブレーション液３３７と３３９の一つを受け入れるためである。切換バルブ３３３はその後、受け入れた液を混合ゾーン３４３へ送達するプライミングバルブ３４１へ流出チューブを通して試験化合物／標準化合物混合物又は一方のキャリブレーション液のどちらかの供給を切り換える。第３切換バルブ３４７は、流出チューブ３４６を通しての試験される細胞タイプを含有する細胞懸濁液リザーバー３４９（又は各々が試験される一連の細胞タイプに含まれている１種の細胞タイプを含有している複数の細胞懸濁液リザーバーの１つ）からの細胞又は緩衝液３０５のどちらかをプライミングバルブ３４５への供給を切り換え、プライミングバルブはその後細胞又は緩衝液のどちらかを混合ゾーン３４３へ送達し、そこでそれはプライミングバルブ３４１から受け入れた試験化合物／標準化合物混合物又は一方のキャリブレーション液のどちらかと一緒に混合される。切換バルブ３３３、３３５及び３４７は、例えばＳＶ-３ Ｄｉｖｅｒｔｅｒ Ｖａｌｖｅ（ＢｉｏＲａｄ）のようなこの技術において周知のタイプのいかなるものであってよい。この混合物はその後細胞が試験化合物／標準化合物混合物又は一方のキャリブレーション液と一緒に混合される時点から混合物が検出器の光学セル３５５に到達する時点まで経過する時間を決定する反応展開ライン３５３へ送られる。上記で説明したように、反応展開ライン３５３及び検出器３５５はこの技術において周知のどのタイプのものであってもよい。
陰圧ポンプとして使用される蠕動型ポンプ３５７は、有益にも上記の様々な溶液及び混合物を様々なバルブ（３１１、３１３、３２７、３２９、３３３、３３５、３４１、３４５及び３４７）、混合ゾーン（３３１及び３４３）、反応展開ライン３５３、検出器３５５を通過させて最終的にドレーン３５９へ流動させるために必要な圧力を供給できる。適切な蠕動型ポンプ３５７は業界においてよく知られており、ある好ましい実施態様ではＥＰ-１ Ｅｃｏｎｏ Ｐｕｍｐ（ＢｉｏＲａｄ）によって実現できる。ポンプ、バルブ、検出器及びその他の本システムの役立つコンポネントは、好ましくは下記でより詳細に説明するように、プログラム可能な制御装置の自動制御下にある。
本発明における装置は、好ましくはスクリーニングモードと効力モードの２つの主要モードを有している。
図４は、本発明においスクリーニングモード中に細胞応答を検出するために使用できるアルゴリズムを示している。第１に、細胞／試験化合物混合物が検出器に供給される（ステップ４０１）。次に、試験化合物が細胞と接触したときに何らかの細胞応答を誘発するかどうかを装置が測定する（ステップ４０３）。このとき２つの可能性がある：試験化合物が何の応答も生じない（ＮＯ）、又は試験化合物が細胞応答を引き起こす（ＹＥＳ）。細胞応答は、検出される特定分析物についての検出器からのシグナルをモニターすることによって測定される。制御システムはまず最初にベースライン及び最高応答を確定するためにキャリブレートし、それらの数値の間に含まれる検出器からのシグナルは陽性応答と見なされる。
装置のモニター部によって測定されたときに試験化合物が細胞応答を惹起しない場合（ＮＯ）、細胞は引き続き及び自動的に試験化合物と所定のアゴニスト液セットからの標準物質との混合物と接触させられる（ステップ４０７）。セット内の各溶液は、例えば既知の細胞受容体、イオンポンプ又はイオンチャンネル分子の刺激を通して、試験化合物の非存在下で細胞応答を開始する１種又はそれ以上の成分を含有している。次に、特定アゴニストを用いて正常に誘発された細胞応答が特定化合物によって抑制されるかどうかについての測定が行われる（ステップ４１１）。本装置は特定標準アゴニストを用いて誘発された細胞応答が試験化合物の存在下で抑制されることを検出するまで、又は機械で利用できる全アゴニストについて試験されるまで、種々の標準アゴニスト物質と試験化合物との混合を繰り返す。ステップ４１１において、特定アゴニストを用いて正常に誘発された細胞応答が特定試験化合物によって抑制されることが測定されると（ＹＥＳ）、その試験化合物は受容体Ｒiにとってのアンタゴニストであると分類される（ステップ４１５）。これが起こると、装置の遂行を管理するソフトウエアによって指示されれば、機械は効力モードに切り換えられる（ステップ４１７）。
装置のモニター部によって測定されたときに細胞と試験化合物の接触が細胞応答を開始すると（ＹＥＳ）、細胞は自動的に試験化合物と所定のアンタゴニスト液セットからの標準物質と引き続き混合物と接触させられる（ステップ４０５）。アンタゴニストセット内の各溶液は既知の細胞受容体、イオンポンプ又はイオンチャンネル分子の刺激を通して少なくとも１種の既知のアゴニストによって開始される細胞応答を遮断する１種又はそれ以上の成分を含有している。次に、試験化合物を用いて誘発された細胞応答が特定標準アンタゴニストの存在下で抑制されるかどうかについての測定が行われる（ステップ４０９）。本装置は、試験化合物を用いて誘発された細胞応答が特定標準アンタゴニストの存在下で抑制されることを検出するまで、又は全アンタゴニストが試験されるまで種々の標準アンタゴニスト物質と試験化合物との混合を繰り返す。ステップ４０９において、試験化合物を用いて誘発された細胞応答が特定アンタゴニストによって抑制されることが測定された場合は（ＹＥＳ）、試験化合物は受容体Ｒiにとってのアゴニストであると分類される（ステップ４１３）。これが起こると、装置の遂行を管理するソフトウエアによって指示されれば、機械は効力モードに切り換えられる（ステップ４１７）。
種々の受容体に対する標準アゴニスト及びアンタゴニスト物質の既知のセットを使用することによって、数種の受容体のタイプ及びサブタイプに対する特異性及び選択性に関して試験化合物をスクリーニングすることが可能である。一連の細胞タイプを試験しなければならない場合は、数多くの細胞タイプにおける試験化合物の活性を評価するために試験される一連の細胞タイプに含まれる細胞タイプの各々についてプロセスを繰り返すことができる。
例えば、エンドセリン受容体については、その刺激はイオン化カルシウムの細胞内濃度の上昇によって指示され、下記の受容体サブタイプ特異的アンタゴニストを使用することができ：ＢＱ−１２３、ＢＱ−７８８、ＢＱ−１５３、ＢＱ−４８５、ＢＭＳ−１８２８７４  ＰＤ  １５１、２４２、さらに下記の受容体サブタイプ特異的アゴニストを使用することができる：エンドセリン−１、エンドセリン−２、及びエンドセリン−３。サラフォトキシン  Ｓ６ｃ、ＩＲＬ １６２０、ＢＱ−３０２０。
カルシウムチャンネルについては、好ましい実施態様で使用できるチャンネルタイプ特異的アゴニスト及びアンタゴニストのセットがある。例えば、細胞内カルシウムチャンネルのアゴニストはＩｎｓ（１，４，５）Ｐ3、リアノジン、カフェイン、ヘパリン、過塩素酸塩であり、それらのアンタゴニストはＤｅｃａｖａｎａｄｔｅ、ルテニウムレッド及び高濃度のリアノジンである。
別の好ましい実施態様では、スクリーニングモードは一般に”受容体フィンガープリンティング”として知られる細胞受容体パターンの特性付けのために使用される。この実施態様に従うと、試験される細胞タイプ又は一連の細胞タイプが所定のアゴニスト液セットからの標準物質に対してスクリーニングされる。セット中の各溶液は既知の細胞受容体の刺激を通して細胞応答を開始する１種又はそれ以上の成分を含有している。この方法では、２種又はそれ以上の細胞タイプにおける受容体発現のパターンを評価できる。１種又はそれ以上の細胞タイプが特定アゴニスト物質に応答するときは、装置の遂行を管理するソフトウエアによって指示されれば、機械は効力モードに切り換えられる。
図５は、本発明において好ましい効力モードで使用できる１つのアルゴリズムを示している。効力モードにおける第１ステップは特定試験化合物がアゴニスト又はアンタゴニストのどちらに分類されたのかを測定する（ステップ５０１）。本装置はその後、引き続き濃度勾配の標準物質又は試験されている試験化合物のどちらかを調製する。
試験化合物がスクリーニングモード中に試験される１種又はそれ以上の細胞タイプに対するアゴニストであると分類された場合は、装置は応答している細胞における細胞応答の濃度依存性を測定して記録する（ステップ５０３）。ステップ５０３中に、本装置は活性体化合物に対する連続実験活性化曲線を作成する。これらの曲線から、例えばＥＣ50（細胞の最高刺激応答の５０％を惹起する活性化因子の有効濃度）に関する化合物の効力を計算することができる（ステップ５０５）。この計算はこの技術において周知の曲線の当てはめソフトウエアを用いて実施できる。好ましい実施態様では、このソフトウエアはグラフパッド社（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｉｎｃ。）によって製造されたグラフ作成ソフトウエアＰＲＩＳＭによって実現できる。
試験化合物がスクリーニングモード中に試験される１種又はそれ以上の細胞タイプに対するアンタゴニストであると分類された場合は、装置は標準アゴニストの存在下でこれらの細胞タイプにおける細胞応答阻害の濃度依存性を測定して記録する（ステップ５０７）。ステップ５０７中に、本装置は一定濃度の標準アゴニスト物質で、アンタゴニスト化合物について連続実験阻害曲線を作成する。これらの曲線から、例えばＩＣ50（細胞の最高阻害応答の５０％を惹起する遮断薬の有効濃度）に関する化合物の効力を計算することができる（ステップ５０９）。ＩＣ50値の計算も又、ＰＲＩＳＭソフトウエアパッケージを用いて好ましい実施態様において実現できる。
試験化合物が試験される１種又はそれ以上の細胞タイプに対するアンタゴニストであると分類された場合は、装置は又数種の濃度のアンタゴニスト化合物の存在下で標準アゴニスト物質に対するこれらの細胞タイプにおける細胞応答の濃度依存性を測定して記録する（ステップ５１１）。ステップ５１１中に、本装置は相違する様々な濃度のアンタゴニスト化合物で、標準アゴニスト物質について連続実験活性化曲線を作成する。本装置はその後、例えばｐＡ2値に関して化合物の親和性及び効力を計算し、アンタゴニストが競合的であるか、又は非競合的であるかを測定する（ステップ５１３）。ｐＡ2値はリガンド／受容体複合体の結合定数の負の対数に比例しており、受容体に対するリガンドの親和性の尺度である：ｐＡ2値が大きければ大きいほど、受容体に対する試験化合物の親和性が高い。実際に、ｐＡ2値は種々の濃度のアンタゴニスト化合物の存在下での活性化曲線の変化から計算することができ、下記の式によって実現できる：
ｐＡ2・Ｌｏｇ（Ｒ−１）−ＬｏｇＢ
式中、Ｒは相違する濃度（Ｂ）のアンタゴニスト化合物の存在下及び非存在下の両方で測定された標準アゴニスト物質の等電位濃度の比率である。好ましい実施態様では、標準アゴニスト物質の等電位濃度はＰＲＩＳＭソフトウエア活性化曲線から見付けることができる。上記の実験曲線セットを用いると、Ｃｈｅｎｇ-Ｐｒｕｓｏｆｆ（参照によりここに具体化されるＣｈｅｎｇ ＆ Ｐｒｕｓｏｆｆ，１９７３）、Ｇａｄｄｕｍ（参照によりここに具体化されるＧａｄｄｕｍ，１９５７）又はＳｃｈｉｌｄ（参照によりここに具体化されるＡｒｕｎｌａｋｓｈａｎａ ＆ Ｓｃｈｉｌｄ，１９５９）分析法に従って試験下の化合物に対する効力及び薬理学的プロフィールを評価することができる。
図３に示された陰圧流体システムの作動に関する詳細な説明を下記に記載する。
プロセスは、コンピューターがオペレーターに３種のモード：システムプライミングモード、スクリーニングモード及び効力プロファイリングモードの中から１種類の操作モードを選択するように促したときから始まる。現在の好ましいトップレベルのプロセスでは、第１選択はシステムプライミングを実行することである。図３を参照すると、プライミングプロセスが開始する前に、オペレーターは流入口３０９、３２５及び３５１のノズルを緩衝液で充填されているリザーバー３０５の中へ、流入口３３６及び３３８のノズルを各々対応するキャリブレーション液で充填されているリザーバー３３７及び３３９の中へ、そして流入口３４８のノズルを試験される細胞タイプで充填されている細胞懸濁液リザーバー３４９の中へ挿入するように促される。
図３に示されている好ましい陰圧流体システムについての好ましいシステムプライミングプロセスの連続フロー図が図６ａ〜６ｄに示されている。図６ａを参照すると、システムプライミングプログラムはスタート状態６００から始まり、全パラメーターを初期値に設定する状態６０２に進む。これらの初期パラメーターはソフトウエア変数及びサブルーチンの内部初期化を含むが、これらに限定されない。
初期パラメーターが決定されると、オートサンプラー３０１及び３０２（図３）はそれらの対応する吸込ノズル３０７及び３２３を“ゼロ■位置に配置する（ステップ６０４）。“ゼロ”位置にある各オートサンプラーは洗浄用緩衝液で充填されているリザーバー３０５を含有している。ステップ６０４の間、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７（図３）、切換バルブ３３３、３３５及び３４７（図３）、そしてプライミングバルブ３１３、３２９、３４１及び３４５（図３）へ電力を供給する電源はスイッチが切られている。好ましい実施態様では、プライミングバルブ３１３、３２９、３４１及び３４５は、無電動状態（ｏｆｆ）では常態では開放している；無電動状態（ｏｆｆ）にあるプロポーショニングバルブ３１１及び３２７はそれらの流出口３１２及び３２８を各々“常態では開放している”流入口３０９及び３２５と連絡させている；さらに無電動状態（ｏｆｆ）では切換バルブ３３５は共通流出口３３４を“常態では開放している”流入口３３６と連絡させ、切換バルブ３３３は共通流出口３４２を“常態では開放している”流入口３３２と、及び切換バルブ３４７はその共通流出口３４６を“常態では開放している”流入口３４８と連絡させている。
システムが初期化された後、蠕動型ポンプ３５７がスタートし（ステップ６０６）、プライミングバルブ３１３及び３４５のスイッチが入れられる（ステップ６０８）。電動状態では、プライミングバルブ３１３及び３４５は閉鎖される。これは緩衝液をチューブ３２５、プロポーショニングバルブ３２７の流出チューブ３２８、プライミングバルブ３２９、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３の流入チューブと３３２流出チューブ３４２、プライミングバルブ３４１、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３、検出器３５５、ポンプ３５７を通過させ、その後ドレーン容器３５９内へ流動させる。
再び図１を参照すると、コンピューター１２３は本システムの様々なバルブ、チャンバー等を制御する制御装置１０９へ制御シグナルを供給するためにソフトウエアコード１２５を実行する。この制御シグナルは、流体ラインを液体が満たすための適正な時間を提供するために遅延させられる（ステップ６１０）。次に、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられる（ステップ６１２）。プロポーショニングバルブ３２７が電動状態にある間は、オートサンプラー３１５の“ゼロ”位置に位置する緩衝液がチューブ３２３、プロポーショニングバルブ３２７の流出チューブ３２８、プライミングバルブ３２９、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３の流入チューブ３３２と流出チューブ３４２、プライミングバルブ３４１、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３、検出器３５５、ポンプ３５７を通過してその後ドレーン容器３５９内へ流動する。
プロポーショニングバルブ３２７へエネルギーを供給した後、制御シグナルは流体システムに緩衝液を完全に充填するために必要な時間を提供するために再び遅延させられる（ステップ６１３）。ステップ６１３における遅延の後、制御シグナルはプロポーショニングバルブ３２７のスイッチを切り（ステップ６１４）、プライミングバルブ３１３のスイッチを切り（開放）（ステップ６１６）、プライミングバルブ３２９のスイッチを入れる（閉鎖）（ステップ６１８）。これはラインに緩衝液３０５を充填させるために必要とされる遅延（ステップ６１９）中に流体ライン３０９、３１２、３３２、３４２、プライミングバルブ３４１、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３、検出器３５５及びポンプ３５７を液体で満たすであろう。
次に、プロポーショニングバルブ３１１がステップ６２１によって制御される時間中、スイッチが入れられる（ステップ６２０）。この遅延時間中、同一流体ラインにはノズル３０７を通って流入するオートサンプラー３０１の“ゼロ”位置に配置される緩衝液が満たされる。
遅延時間（ステップ６２１）後、制御シグナルは同時にプロポーショニングバルブ３１１（ステップ６２２）及びプライミングバルブ３２９（ステップ６２４）の両方のスイッチを切り、切換バルブ３３５及び切換バルブ３３３（ステップ６２６）の両方のスイッチを入れる。ステップ６２７によって決定された遅延時間中、液流はプライミングバルブ３４１を通って、切換バルブ３３５の流入チューブ３３８及び流出チューブ３３４から切換バルブ３３３の流入チューブ３４０及び流出チューブ３４２を通過し、混合ゾーン３４３及びさらに反応展開ライン３５３、検出器３５５、ポンプ３５７を通過してその後ドレーン容器３５９へ向かわせられるであろう。その後、制御シグナルは切換バルブ３３５のスイッチを切り（ステップ６２８）、それによって流入チューブ３３６から同一流体ラインへの充填が可能になる。必要な時間の長さは、含まれている種々のラインの長さ及びシステムを通過する液体流量の速度の関数であり、これはどの特定システムについても容易に決定できる。
ステップ６２９によって遅延が与えられた後、制御シグナルは切換バルブ３３３のスイッチを切り（ステップ６３０）、プライミングバルブ３４５のスイッチを切り（開放する）（ステップ６３２）、プライミングバルブ３４１のスイッチを入れる（閉鎖する）（ステップ６３４）。これらの条件下では、液流は流入チューブ３４８から切換バルブ３４７の流出チューブ３４６を通過し、プライミングバルブ３４５、混合ゾーン３４３及びさらに反応展開ライン３５３、検出器３５５、ポンプ３５７を通過し、その後ドレーン容器３５９へ向かわせられるであろう。上記の液流を発生させるために必要な時間はステップ６３５における遅延時間によって与えられる。この遅延後、制御シグナルは切換バルブ３４７のスイッチを切り（ステップ６３６）、それによってステップ６３７中に与えられた遅延時間中に同一流体ラインへのチューブ３５１からの緩衝液３０５の充填が可能になる。
ステップ６３７によって与えられた遅延時間後、制御シグナルはプライミングバルブ３４１のスイッチを切り（開放する）（ステップ６３８）、さらに切換バルブ３４７のスイッチを切る（ステップ６４０）。その後制御シグナルはポンプ３５７のスイッチを切る（ステップ６４２）。最後に、プライミングプログラムはシステムプライミングモードを終了し、流体システムの全コンポーネントに液体が充填される（ステップ６４３）。
プログラムの各ステップでのバルブの状態は図６ｄに示されている。プライミングバルブ３４５、３４１、３１３及び３２９は、常態では開放している二方タイプのバルブである。切換バルブ３３５、３３３及び３４７は１つの共通流出口と各１つの常態では開放している流入口と常態では閉鎖している流入口を備えた三方タイプのバルブである。プロポーショニングバルブ３１１及び３２７も又切換バルブ３３５、３３３及び３４７に類似する三方タイプのバルブである。記号”−”及び”＋”はバルブのスイッチが切られている状態と入れられている状態を示している。プライミングモード後の全バルブの状態は初期状態と同一で終了する。
システムのプライミングが行われた後、オペレーターはスクリーニングモード又は効力プロファイリングモードのどちらかをスタートするように促される。スクリーニングモードを選択すると、オペレーターは試験される化合物セットの中に何種類の化合物（ＮMAX）を配置するのか、そして各セットの標準化合物中に何種類のアンタゴニスト（ＭMAX）及び何種類のアゴニスト（ＬMAX）液を配置するのかを特定するように促される。効力プロファイリングモードを選択すると、オペレーターはセット中のどの化合物を測定すべきなのかを特定するように促される。
図３の陰圧流体システムを用いた現在好ましいスクリーニングモードの連続フロー図は図７ａ〜７ｇに示されている。
スクリーニングプログラムはスタート状態７００から始まり、全パラメーターを初期値に設定する状態７０２に進む。これらの初期パラメーターはソフトウエア変数及びサブルーチンの内部初期化を含むが、これらに限定されない。
初期パラメーターが決定されると、オートサンプラー３０１及び３１５（図３）は吸込ノズル３０７及び３２３を洗浄用緩衝液リザーバー３０５によって占められた対応する“ゼロ”位置に配置し（ステップ７０４）、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７、切換バルブ３３３、３３５及び３４７、及びプライミングバルブ３１３、３２９、３４１及び３４５のスイッチを切る（ステップ７０６）。スイッチの切られた状態では、プライミングバルブ３１３、３２９、３４１及び３４５は常態では開放しており、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７は各々、それらの流出口３１２及び３２８を対応する“常態では開放している”流入口３０９及び３２５と連絡させ、切換バルブ３３５は共通流出口３３４を“常態では開放している”流入口３３６と、切換バルブ３３３は共通流出口３４２を“常態では開放している”流入口３３２と、及び切換バルブ３４７はその共通流出口３４６を“常態では開放している”流入口３４８と連絡させている。
システムが初期化された後、ポンプ３５７がスタートさせられる（ステップ７０８）。これは洗浄用緩衝液を両方のオートサンプラー３０１及び３１５の”ゼロ”位置のリザーバーからノズル３０９及び３２５を通過させ、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７の流出口各々３１２及び３２８、プライミングバルブ３１８及び３２９、混合ゾーン３３１、流入口３３２及び切換バルブ３３３の流出口３４２、プライミングバルブ３４１、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３、検出器３５５、ポンプ３５７を通過させてその後ドレーン容器３５９内へ流動させる。混合ゾーン３４３では、この液流は試験される細胞タイプを含有しており、切換バルブ３４７の流入チューブ３４８及び流出口３４６から流入しプライミングバルブ３４５を通る細胞懸濁液リザーバ３４９からの細胞懸濁液と混合させられる。従って混合ゾーン３４３を通過する全液流は、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７の各々からと切換バルブ３４７から流入する３つの液流の合計である。このステップ中、両方のプロポーショニングバルブは、最終混合物が細胞懸濁液：洗浄用緩衝液３０５が１：２で構成されるような方法で各オートサンプラーの“ゼロ”位置に配置されているリザーバーから洗浄用緩衝液３０５を供給する。
試験される細胞タイプ（又は試験される一連の細胞タイプの一部）を含有する細胞懸濁液の混合物を流動させ、さらに洗浄用緩衝液３０５を安定化させるために必要とされる、ステップ７０９において決定された遅延時間後、検出器３５５は細胞単独によって産生した基礎シグナル（ＢＳ）を記録する（ステップ７１０）。ＢＳシグナルが記録された後、それは標準値として保存され（ステップ７１２）、コンピューター１２３（図１）は増分計数器Ｎをトリガする（ステップ７１４）。
増分計数器Ｎの数値はトリガされる毎に単位ずつ増加するので、試験される試験化合物セット３０３からサンプル採取するオートサンプラー３０１の流入口３０７のノズルの位置を決定する。次に、増分計数器の数値Ｎiは試験される化合物の入力された最高数ＮMAXに対してチェックされる（ステップ７１６）。ＮiがＮMAXを越えなければ、オートサンプラー３０１は、試験化合物ラック３０３のＮiの位置に配置されている試験化合物リザーバー内にノズル３０７を配置する。次に、プロポーショニングバルブ３１１が、共通流出口３１２への“常態では閉鎖している”流入口３０７を開放するようにスイッチが入れられる（ステップ７２０）。ステップ７２０の間は、混合ゾーン３４３内及びその後は検出器３５５内への混合流は、一部はプロポーショニングバルブ３２７のノズル３２５を通って流入する緩衝液３０５、一部はプロポーショニングバルブ３１１のノズル３０７を通って流入する試験される化合物３０３、及び“常態では開放している”流入チューブ３４８から切換バルブ３４７の流出口３４６へ流入する試験される細胞タイプを含有している細胞懸濁液から構成されている。混合プロセスを安定化させるために必要とされる、ステップ７２１によって与えられる遅延時間後、検出器３５５は一定の化合物Ｎiの存在下で細胞によって産生するシグナルＳＮiを記録する（ステップ７２２）。ＳＮiシグナルが記録されると、その数値は標準値として保存される（ステップ７２３）。ＳＮiシグナルの数値はその後標準基本シグナル（ＢＳ）の数値と比較される（ステップ７２４）。ＳＮiシグナルがＢＳシグナルより大きい場合は、コンピューター１２３（図１）は対応する化合物を“陽性”と“フラッグ”するが（ステップ７２５）、これは試験化合物が細胞シグナルを刺激することを意味する。ＳＮiシグナルがＢＳシグナルより大きい場合は、コンピューター１２３は１セットのアンタゴニストを制御し、ラック３１７に配置されているアンタゴニストを含有するリザーバー上にオートサンプラー３１５のノズル３２３を配置するために対応する座標を計算する。ＳＮiシグナルがＢＳシグナルより小さい場合は、コンピューター１２３は“陰性”として、対応する化合物を“フラッグ”する。この場合は、コンピューター１２３は１セットのアゴニストを制御し、ラック３１９に配置されているアゴニストを含有するリザーバー上にオートサンプラー３１５のノズル３２３を配置するために対応する座標を計算する。
“ＳＮi＞ＢＳ”の状態が満たされる毎に、プログラムの流れは増分計数器ＭのループＫ−Ｏを通って流れる（ステップ７３０）。増分計数器Ｍは、トリガされる毎に計数値を増加させるので、従ってラック３１７上に配置されている標準アンタゴニストセットを供給するオートサンプラー３１５のノズル３２３の連続位置を決定する。次に、コンピューター１２３は増分計数器（Ｍj）の数値がオペレーターによって入力された試験される標準化合物の最高数（ＭMAX）を越えるかどうかをチェックする（ステップ７３２）。
ＭjがＭMAX以下か同じ場合は、オートサンプラーは増分計数器Ｍjの数値に対応するラック３１７に配置されている標準アンタゴニストリザーバー内にノズル３２３を配置する（ステップ７３４）。次に、プロポーショニングバルブ３２７の“常態では閉鎖している”流入口３２３と流出口３２８とを連絡するようにスイッチが切り換えられる（ステップ７３６）。ステップ７３６の間、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３及び検出器３５５を通過する混合流は、一部はプロポーショニングバルブ３２７から流入する標準アンタゴニスト、一部はプロポーショニングバルブ３１１から流入する試験される化合物、及び一部は切換バルブ３４７から流入する試験される細胞タイプを含有している細胞懸濁液から構成されている。
次に、検出器３５５は所定の標準アンタゴニストＭjの存在下で所定の試験化合物Ｎiによって産生したシグナルＳＮiＭjを記録し、その後の比較のために保存する（ステップ７３８）。その後、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７はどちらもスイッチが切られる（ステップ７４０）。これは流入口３０７及び３２３を閉鎖し、流入口３０９及び３２５を対応する流出口３１２及び３２８へ開放する。その後オートサンプラー３１５は洗浄用緩衝液リザーバー３０５によって占められた“ゼロ”位置内にノズル３２３を配置する。その後プロポーショニングバルブ３２７は再びその“常態では閉鎖している”流入口３２３を流出口３２８内へ開放するようにスイッチが入れられ（ステップ７４４）、ノズル３２３の中身が洗浄される（ステップ７４６）。次に、プロポーショニングバルブ３２７は、流入口３２３を閉鎖し、“常態では開放している”流入口３２５を開放するようにスイッチが切られる。このプロセス中、流体ラインはオートサンプラー３１５のノズル３２５から流入する緩衝液で洗浄される。
次に、コンピューター１２３（図１）は、試験化合物Ｎi単独の存在下で測定されたシグナルＳＮiを試験化合物Ｎi及び標準アンタゴニストＭjの両方の存在下で測定されたシグナルＳＮiＭjと比較する（ステップ７５０）。標準アンタゴニストＭjの存在下でのシグナルが試験化合物Ｎi単独の存在下で測定されたシグナルより小さい場合は（ＳＮiＭj＜ＳＮi）、試験化合物Ｎi及び標準アンタゴニストＭjの両方が“陽性”とフラッグされる（ステップ７５１）。両方のシグナルが相互に等しい場合は、試験化合物Ｎiが“陽性”、標準アンタゴニストＭjが“陰性”とフラッグされる（ステップ７５２）。データがフラッグされた後、試験化合物Ｎiのフラッグ値を添えたＩＤ番号及び標準アンタゴニストＭjのフラッグ値を添えたＩＤ番号を含有するデータがデータベース内に伝送される（ステップ７５３）。データが保存された後、プログラムはその計数を１つずつ増加させるために増分計数器Ｍをトリガするようにループバックし（ステップ７３０）、状態７３２が達成されるまでステップ７５４が繰り返される。
決定ステップ７３２において決定された状態が合致すると、つまり試験化合物が所定のセットにおける全標準アンタゴニストに対して試験されたときは、プログラムは増分計数器Ｍの内容をゼロへリセットし（ステップ７５５）、オートサンプラー３０１及びオートサンプラー３１５はどちらも各々のノズル３０７及び３２３を、洗浄用緩衝液３０５を含むリザーバーが配置されている“ゼロ”位置に配置する（ステップ７５６）。次にプロポーショニングバルブ３１１及び３２７両方のスイッチが入れられる（ステップ７５８）。これは“常態では閉鎖している”流入口３０７及び３２３を対応する流出口３１２及び３２８へ開放する。ステップ７６０によって決定されたこの洗浄遅延時間中、両方のノズル３１２及び３２８の中身は緩衝液３０５を用いて洗浄される。ステップ７６０が終了した後、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７両方のスイッチが切られる（ステップ７６２）。洗浄遅延時間（ステップ７６０）後、プログラムはコンピューター１２３（図１）からのシグナルＳtrをトリガすることによって１つずつ増分する増分計数器Ｎの内容へループバックする。その後、計数器Ｎの数値Ｎiは試験される化合物の最高数ＮMAXと比較される。ＮiがＮMAXを越える場合は、増分計数器Ｎの値はゼロ化され（ステップ７１７）、スクリーニングモードがストップされる（ステップ７１９）。さもなければステップ７１５が次の試験化合物を用いて繰り返される。
決定プロセス７２４の状態“ＳＮi＞ＢＳ”が満たされない場合は、試験化合物Ｎiは“陰性”とフラッグされ（ステップ７２６）、増分計数器Ｌがトリガされる（ステップ７６４）。増分計数器Ｌは、トリガされる毎に１ずつ増加するので（ステップ７６４）、ラック３１９上に配置された標準アゴニストセットに比較したオートサンプラー３１５のノズル３２３の連続位置を測定する。次に、増分計数器Ｌの数値Ｌkが使用される標準アゴニストの最高数ＬMAXと比較される（ステップ７６６）。
ＬkがＬMAX以下か同じ場合は、オートサンプラー３１５は、増分計数器Ｌの数値Ｌkに相当する、ラック３１９内の標準アゴニストリザーバー内にノズル３２３を配置する。次に、プロポーショニングバルブ３２７は“常態では閉鎖している”流入口３２３を流出口３２８へ開放するようにスイッチが入れられ、プロポーショニングバルブ３１１は流入口３０７を閉鎖して流入口３０９を流出口３１２へ開放するようにスイッチが切られる（ステップ７７０）。ステップ７７０の間、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３及び検出器３５５を通って流入する混合流は、一部はプロポーショニングバルブ３２７の流入口３２３から流入する標準アゴニスト３１９、一部はプロポーショニングバルブ３１１の流入口３０９から流入する緩衝液３０５、及び一部は切換バルブ３４７から流入する試験される細胞タイプを含有する細胞懸濁液から構成される。
混合プロセスを安定化させるために必要とされるステップ７７２によって与えられた遅延時間の後、所定標準アゴニストＬkによって産生したシグナルＳＬkが記録され、保存される（ステップ７７４）。次に、プロポーショニングバルブ３１１が“常態では閉鎖している”流入口３０７を流出口３１２へ開放するようにスイッチが入れられる（ステップ７７６）。混合プロセスを安定化させるために必要とされる遅延時間がステップ７７８によって与えられ、その後シグナルＳＬkＮiが、所定の試験化合物Ｎiの存在下で所定標準アゴニストＬkによって刺激され、記録され、そして保存される（ステップ７８０）。
シグナルＳＬkＮiが記録された（ステップ７８０）後、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７の両方が各々の“常態では閉鎖している”流入口３０７及び３２３を閉鎖して、流入口３０９及び３２５を対応する流出口３１２及び３２８へ開放するようにスイッチが切られる（ステップ７８２）。次に、オートサンプラー３１５が洗浄用緩衝液リザーバー３０５に相当する“ゼロ”位置へ流入口３２３のノズルを配置する（ステップ７８４）。その後、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられる（ステップ７８５）。これは“常態では閉鎖している”流入口３２３を流出口３２８へ開放し、ノズル３２３の中身を洗浄するために必要とされるステップ７８６によって与えられる幾らかの遅延時間の後に、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが切られ（ステップ７８７）、２つのシグナルＳＬkＮi及びＳＬkが比較される（ステップ７８８）。
ＳＬkＮiがＳＬkより小さい場合は、対応する標準アゴニストＬkが“陽性”であるとフラッグされる（ステップ７９０）。両方のシグナルが互いに等しい場合は、標準アゴニストＬkは“陰性”としてフラッグされる。データがフラッグされた後、試験化合物Ｎiのフラッグ値を添えたＩＤ番号と標準アゴニストＬkのフラッグ値を添えたＩＤ番号とを含有するデータがデータベース内に伝送される（ステップ７９４）。データが保存された後、プログラムはその計数を１つずつ増加するように増分計数器Ｌをトリガし（ステップ７６４）、状態７６６が達成されるまでステップ７９６が繰り返される。
ステップ７６６において決定された状態が合致すると、つまり試験化合物が所定のセットにおける全標準アゴニストに対して試験されたときは、増分計数器Ｌの数値はゼロへリセットされ（ステップ７５５）、オートサンプラー３０１及びオートサンプラー３１５はどちらも各々のノズル３０７及び３２３を、洗浄用緩衝液３０５を含むリザーバーが配置されている“ゼロ”位置に配置する（ステップ７５６）。その後システムは、“常態では閉鎖している”流入口３０７及び３２３を各々対応する流出口３１２及び３２８へ開放するようにプロポーショニングバルブ３１１及び３２７両方のスイッチを入れる（ステップ７５８）。ステップ７６０によって与えられる洗浄時間中、両方のノズル３０７及び３２３の中身は緩衝液３０５を用いて洗浄される。次に、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７両方のスイッチが切られ（ステップ７６２）、増分計数器Ｎが１ずつ増加される（ステップ７１４）。次にトリガされた計数器Ｎの数値Ｎiが試験される化合物の最高数ＮMAXと比較される（ステップ７１６）。ＮiがＮMAXを越える場合は、増分計数器Ｎがステップ７１７でゼロに設定され、スクリーニングモードがストップされる（ステップ７１９）。さもなければ全サイクルが次の試験化合物を用いて繰り返される。
スクリーニングモードがストップされると（ステップ７１９）、オペレーターはコンピューターから効力プロファイリングモードを行うか、又は新しい化合物セットを用いてスクリーニングモードを繰り返すかを選択するように促される。
図３の陰圧流体システムを用いる現在好ましい効力プロファイリングモードの連続フロー図は図８ａ〜８ｅに示されている。
効力プロファイリングプログラムはスタート状態８００から始まり、全ての増分計数器Ｌ、Ｍ及びＮをゼロに設定し、全パラメーターを初期値に設定する状態８０２へ進む。この初期パラメーターにはハードウエア及びソフトウエアの変数及びサブルーチンの内部初期化が含まれるが、これらに限定されない。次に、増分計数器Ｎがスタートされ（ステップ８０４）、その数値Ｎiがプログラムをスタートする前にオペレーターによって入力された標準化合物の最高数（ＮMAX）と比較される（ステップ８０６）。ＮiがＮMAXを越えれば、増分計数器Ｎはゼロ化され（ステップ８０８）、プログラムがストップする（ステップ８１０）。さもなければプログラムはポンプ３５７のスイッチを入れることによって進行する（ステップ８１６）。この時点で、ステップ８０２における初期パラメーターのセットアップに従って、オートサンプラー３０１及び３１５のノズル３０７及び３２３はゼロの位置にあり、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７、プライミングバルブ３１３、３２９、３４１及び３４５、及び切換バルブ３３５、３３３及び３４７はスイッチが切られている。ステップ８１６の間、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３及び検出器３５５を通って流入する混合流は、一部はプロポーショニングバルブ３１１のノズル３０９を通って流入する緩衝液３０５、一部はプロポーショニングバルブ３２７のノズル３２５を通って流入する緩衝液３０５及び一部は切換バルブ３４７から流入する細胞懸濁液から構成されている。次に、切換バルブ３３３のスイッチが入れられ（ステップ８２０）、“常態では閉鎖している”流入口３４０を流出口３４２に開放する。このプロセス中、最高応答を決定する最高キャリブレーション液３３７は、切換バルブ３３５の流出チューブ３３４に連絡しているチューブ３３６、切換バルブ３３３の流入口３４０、プライミングバルブ３４１を通過して混合ゾーン３４３内へ流れ込み、そこで切換バルブ３４７の流入チューブ３４８及び流出チューブ３４６、さらにその後はプライミングバルブ３４５を通って混合ゾーン３４３へ流入する細胞懸濁液から流入する細胞と混合させられる。細胞最高キャリブレーション混合物はその後展開ライン３５３さらに検出器３５５へ流動する。次に最高シグナルが測定されて記録される（ステップ８２４）。その後切換バルブ３３５は“常態では閉鎖している”流入口３３８を流出口３３４へ開放するようにスイッチが入れられ（ステップ８３２）、最小キャリブレーション液３３９が切換バルブ３３３、プライミングバルブ３４１を通過して、そこで切換バルブ３４７の流入チューブ３４８及び流出チューブ３４６、さらにその後はプライミングバルブ３４５を通って混合ゾーン３４３へ流入する細胞懸濁液から流入する細胞と混合させられる混合ゾーン３４３内へ流入するのを可能にする。細胞／最小キャリブレーション混合物はその後、展開ライン３５３さらに検出器３５５へ流動する。その後、最小応答シグナルが測定されて記録される（ステップ８３６）。次に切換バルブ３３５及び３３３の両方のスイッチが切られる（ステップ８４４）。ステップ８４４の間、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３及び検出器３５５を通って流���する混合流は、一部はプロポーショニングバルブ３１１のノズル３０９を通って流入する緩衝液３０５、一部はプロポーショニングバルブ３２７のノズル３２５を通って流入する緩衝液３０５及び一部は切換バルブ３４７から流入する細胞懸濁液から構成されている。これは流体ラインからキャリブレーション液の残りを洗い流すために必要とされる。次に、試験化合物Ｎiの“フラッグ”値がチェックされる（ステップ８１２）。
試験化合物Ｎiの“フラッグ”値が“陽性”の場合は、システムはステップ８５０に進むか、さもなければステップ８７６へ進む。試験化合物Ｎiの“フラッグ”値が“陽性”の場合は、オートサンプラー３０１はノズル３０７をラック３０３上に配置されている試験化合物Ｎiに対応するリザーバー内へ配置する（ステップ８５０）。次に、プロポーショニングバルブ３１１が濃度勾配モードで操作される（ステップ８５２）。濃度勾配モードでは、プロポーショニングバルブ３１１は、流出口３１２における試験化合物Ｎi流及び緩衝液流の比率が経時的に変化して試験化合物濃度の不連続変化を作り出すような方法で２つの流入口３０７及び３０９からの流れを混合する。濃度が経時的に変化している間、いかなる所定時間にも細胞懸濁液から混合ゾーン３１３へ流入する細胞の新しい部分は様々な濃度のＮi試験化合物と反応する。結果として生じたシグナルの用量反応依存性はステップ８５４において記録され、ステップ８５６ではＮi試験化合物についての活性化パラメーターが引き続き計算され、その後データがデータベース内に保存される（ステップ８５８）。
次に、標準アンタゴニストの増分計数器Ｍがスタートされ（ステップ８６０）、計数器Ｍの数値Ｍjがオペレーターによって入力された最高値ＭMAXと比較される（ステップ８６１）。数値ＭjがＭMAXを超えない場合は、標準化合物Ｍjの“フラッグ”値がチェックされる（ステップ８６２）。標準化合物Ｍjの“フラッグ”値が“陽性”ではない場合は、増分計数器Ｍは１ずつ増加させられ（ステップ８６０）、ステップ８６０に続くステップが上記の通りに繰り返される。標準化合物Ｍjの“フラッグ”値が“陽性”である場合は、オートサンプラー３１５はラック３１７上に配置されている標準アンタゴニストＭjに対応するリザーバー内にノズル３２３を配置する（ステップ８６４）。ノズル３２３が標準化合物液内に浸漬された後、プロポーショニングバルブ３１１のスイッチが入れられる（ステップ８６６）。プロポーショニングバルブ３１１のスイッチが入れられると、“常態では閉鎖している”、浸漬している流入口３０７をステップ８５０において試験化合物Ｎiに対応するリザーバー内へ開放するので、その結果試験化合物Ｎiは流体システムを通って流れ、切換バルブ３４７の流入チューブ３４８及び流出チューブ、プライミングバルブ３４５を通過して混合ゾーン３４３へ流入し、その後展開ライン３５３及び検出器３５５へ流れる細胞と混合されるとシグナルを発生する。次に、プロポーショニングバルブ３２７は濃度勾配モードで作動させられる（ステップ８６８）。濃度勾配モードでは、プロポーショニングバルブ３２７は、標準アンタゴニストＭj流と緩衝液流の比率が経時的に変化して標準アンタゴニスト濃度の不連続変化を作り出すような方法で２つの流入口３２３及び３２５から流出口３２８内へ流動する。濃度が経時的に変化している間、細胞の新しい部分が細胞懸濁液から混合ゾーン３４３内へ流入し、いかなる所定時間にも一定濃度の試験化合物Ｎi及び様々な濃度の標準アンタゴニストＭjから構成される混合物と反応する。結果として生じる試験化合物Ｎi刺激シグナルの標準アンタゴニストＭjによる用量反応阻害がステップ８７０において記録され、ステップ８７２では標準アンタゴニストＭjについての阻害パラメーターが引き続き計算され、データがデータベース内に保存される（ステップ８７４）。
ステップ８７０で曲線が記録された後、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７はどちらも閉鎖され（ステップ８７１）、プログラムの流れは増分計数器Ｍが１ずつ増分させられるステップ８６０へ戻り、プログラムはＭjがＭMAXと比較されるステップ８６１へ戻る。
標準アンタゴニストＭj全部が計数され、“陽性フラッグ”を持つものが測定されると、数値ＭjはＭMAXより大きくなり、ステップ８６１における決定プロセスは増分計数器Ｎが数値を１ずつ増加させるステップ８０４へ戻る。その後、Ｎiの数値が試験される化合物の最高数であるＮMAXと比較される（ステップ８０６）。ＮiがＮMAXを越えると、増分計数器Ｎはゼロにリセットされ（ステップ８０８）、プログラムがストップする（ステップ８１０）。多数の細胞タイプを評価しなければならないときは、このプロセスは試験される一連の細胞タイプに含まれる各細胞タイプについて繰り返すことができる。
ステップ８１２において試験化合物Ｎiのフラッグ値が“陰性”と決定された場合は、ラック３１９に配置されている１セットのアゴニスト中の標準化合物Ｌkを計数する増分計数器Ｌが更新される（ステップ８７６）。次に数値Ｌkがオペレーターによって入力された標準アゴニストの最高値ＬMAXと比較される（ステップ８７７）。
計数器Ｌの数値ＬkがＬMAX値より大きくなるまでは、プログラムはステップ８７８まで進み、そこで標準化合物Ｌkの“フラッグ”値がチェックされる。フラッグ値が陽性ではない場合、プログラムはステップ８７６へ戻る。標準化合物Ｌkのフラッグ値が陽性の場合は、オートサンプラー３１１はノズル３０７をラック３０３に配置されている試験化合物Ｎiを含有する対応するリザーバー内へ配置し（ステップ８８０）、オートサンプラー３１５はノズル３２３をラック３１９に配置されている標準アゴニストＬkを含有する対応するリザーバー内へ配置する（ステップ８８１）。
次に、プロポーショニングバルブ３２７の濃度勾配モードが活性化され（ステップ８８２）、標準アゴニストＬkによるシグナルの用量反応刺激が記録される（ステップ８８４）。濃度勾配モードでは、プロポーショニングバルブ３２７は、標準アゴニストＬk流と緩衝液流の比率が経時的に変化して標準アゴニストの濃度勾配を作り出すような方法で２つの流入口３２３及び３２５から流出口３２８内へ流入する流れを結合する。経時的に勾配が作り出されている間、新しい細胞が、細胞懸濁液から切換バルブ３４７の“常態では開放している”流入チューブ３４８及び流出口３４６、“常態では開放している”プライミングバルブ３４５を通過して混合ゾーン３４３内へ流入し、標準化合物の不連続に変化する濃度で標準アゴニストＬkと不連続に反応する。標準アゴニストＬkによるシグナル刺激の用量依存性が記録されると（ステップ８８４）、活性化パラメーターが計算され（ステップ８９２）、その後データベースに保存される（ステップ８９４）。
プロポーショニングバルブ３２７の勾配モードが終了した後、バルブは勾配モードの終了時までに到達した比例率か、又はその後のステップで使用される標準アゴニストＬkの一定濃度を確定する所定の比例率にとどまる。次に、プロポーショニングバルブ３１１の濃度勾配モードが作動させられる（ステップ８８６）。その後、標準アゴニストＬk刺激シグナルの試験化合物Ｎiによる用量反応阻害が記録され（ステップ８８８）、引き続いてステップ８９６において阻害パラメーターが計算され、このデータはその後データベースに保存される（ステップ８９４）。濃度依存性の記録が終了すると、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７の両方のスイッチが切られ（ステップ８９０）、それらの流入口３０７及び３２３は閉鎖され、“常態では開放している”流入口３０９及び３２５が開放される。このプロセス中、流体ラインはオートサンプラー３０１及び３１５のノズル３０９及び３２５からプロポーショニングバルブ３１１及び３２７の流出口３１２及び３２８、プライミングバルブ３１３及び３２９、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３の“常態では開放している”流入口３３２及び流出口３４２、“常態では開放している”プライミングバルブ３４１、混合ゾーン３４３、展開ライン３５３及び検出器３５５を通過する緩衝液３０５を用いて洗浄される。次に、プログラムはステップ８７６に戻り、その時点で全標準アゴニストがカウントされるまで上記のサイクルが繰り返され、陽性フラッグを持つものが測定され、増分計数器の数値ＬkがＬMAX値より大きくなった時点で、プログラムはステップ８０４へ戻る。
試験化合物Ｎi全部がカウントされ（ステップ８０４）試験されると、Ｎi値がＮMAX値より大きくなり、増分計数器Ｎはゼロにリセットされ（ステップ８０８）、プログラムがストップする（ステップ８１０）。
本装置で使用するための細胞は、特定の既知の受容体が存在すること、又は特定刺激に対して所定の細胞応答を生じさせる能力があることに基づいて選択できる。多数のそうした細胞は既知である。例えば、様々なタイプの受容体によって誘発されるカルシウム移動に対する試験化合物の作用を測定するためには、トロンビン受容体についてはジャーカットＴ細胞、血小板、臍帯静脈、内皮細胞、若しくはチャイニーズハムスター肺繊維芽細胞；ＡＭＰＡ受容体については脳プルキンエ細胞、皮質星状膠細胞及び皮質神経膠細胞；ＮＭＤＡ受容体については海馬ニューロン；プリン受容体についてはＰ-１２細胞；血小板由来成長因子受容体については乏突起神経膠細胞；ニューロペプチドＹ受容体及びプロテインチロシンキナーゼ及びプロテインチロシンホスファターゼ受容体についてはヒト神経芽細胞腫細胞及び下垂体細胞；エンドセリン受容体についてはヒト神経髄芽細胞腫細胞；ＴＮＦａ受容体については好中球；オピオイド、ブラジキニン及びＡＴＰについてはＮＧ１０８-１５細胞；プラスミノーゲン受容体については滑膜繊維芽細胞等を使用することを考慮することができる。例えば細胞内イオン濃度を測定することを望む場合は、細胞を染料又はその特定イオンの濃度に感受性を有する他の検出可能な物質と一緒にプレインキュベートすることができる。（カルシウムイオンを検出するための細胞調製を例示した実際の作業例は実施例１に記載されている）
或いは又、Ｃａ2+シグナル経路について信頼できる受容体の天然発現パターンを測定することを望む場合は、特別に関与する細胞を使用し、さらにＣａ2+移動を通してそれらの活性を発揮することが既知であるアゴニストセットを使用して、これらの特定細胞においてどのタイプの受容体が発現するかについて細胞を特性付けることができる。このアゴニストセットは、アセチルコリン、アドレナリン、ノルアドレナリン、５-ヒドロキシトリプタミン、ＤＯＰＡ、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ、アンギオテンシンＩＩ、ブラジキニン、ボンベシン、オピオイド、エンドセリン−１  ニューロペプチドＹ、ＴＮＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ等から構成することができる。
下記の実施例は本発明に従った特異的な、非限定的実験又は試験化合物プロファイリング作業を例示している。
実施例１
ヒト髄芽細胞腫（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８８０５）ＴＥ-６７１細胞は、自然にエンドセリンサブタイプＡ受容体ＥＴAＲを発現する。この受容体は７種の膜内外伸長性Ｇ−プロテイン結合受容体からなるファミリーに属しており、２１残基アミノ酸のペプチドである特異的アゴニストエンドセリン−１への結合に基づいて細胞質中でカルシウム移動を活性化することが知られている。受容体に対するアゴニストの親和性を特性付けるために従来の方法は、数種の濃度のアゴニスト又はアンタゴニストの存在下で細胞の生理的応答を測定する（Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ａ．ら，１９９４，が参照によりここに具体化される）。
図９は、本発明の装置及び方法を使用して、エンドセリン−１の濃度（ピコモル濃度で測定されたＥＴ-１）の関数としての細胞内カルシウム移動の活性化（ナノモル濃度で測定されたＣａ2+）の測定値を示している。本装置は上記のような陰圧コンピューター制御装置であった。このランは数種の濃度のＥＴAＲ特異的競合的アンタゴニストＢＱ-１２３（ナノモル濃度で示されている）の存在下で実行された。
ＴＥ-６７１細胞は、本発明の細胞生理機能測定計で使用するために、融合するまでＴ７５フラスコ内で増殖させることによって調製された。増殖培地がデカンテーションされ、細胞がダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を用いて２回洗浄され、これに容易に細胞質内に浸透し、そこで非特異的エステラーゼで加水分解するとカルシウムのイオン化形成に感受性のある染料であるＦＵＲＡ２を形成する２μＭ ＦＵＲＡ-２ＡＭを含有する新しいＤＰＢＳが補給された。３０分間のインキュベーショーン後、細胞に等量の新しいＤＰＢＳが補給され、さらに３０分間インキュベートされた。現在は染料が負荷されている細胞が０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡフラスコで、底部から剥離させられた。細胞はその後０．１％大豆トリプシン阻害剤を含有するＤＰＢＳで２回洗浄され、カルシウム、マグネシウム及びフェノールレッドを含有しないダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に再懸濁させられた。
図３を参照して手短に述べると、最小及び最高スタンダード（３３９、３３７）を用いてのキャリブレーション後、アゴニスト試験化合物ＥＴ-１液がプロポーショニングバルブ３１１によって連続的に比率を変化させながらＤＰＢＳ緩衝液と混合され、プロポーショニングバルブ３１１、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３、及びプライミングバルブ３４１を通過して混合ゾーン３４３へ向かわせられ、そこでＴＥ-６７１細胞の懸濁液と混合されて最終細胞濃度４×１０5細胞／ｍＬを提供した。同時に、標準アンタゴニスト溶液としてのＢＱ-１２３も又、プロポーショニングバルブ３２７においてＥＴ-１溶液と１：１の比でＢＱ-１２３をＤＰＢＳと混合することによって調製した所定の濃度で混合ゾーン３３１へ向かわせられた。混合ゾーン３４３では、一定濃度のＢＱ-１２３と経時的に連続的に変化する濃度のＥＴ−１との混合物流が２：１の比率で細胞と混合される。これは混合ゾーン３４３及び最終的には検出器３５５を通過する液流の各コンポーネントに対して３倍の最終希釈率を生じさせる。プロポーショニングバルブ３２７は、第１、第２及び第３回のランに対してＢＱ-１２３が各々０、１０ｎＭ及び４０ｎＭの最終濃度を生じさせるようにプログラミングされた。プロポーショニングバルブ３１１は各ランにおいてＥＴ−１の０〜１００ｐＭの最終濃度を生じさせるようにプレプログラミングされた。検出器３１５を通過するＴＥ-６７１細胞中の細胞内カルシウムイオン濃度における変化が上記のように蛍光染料ＦＵＲＡ-２を使用してＥＴ-１濃度の関数としてリアルタイムで測定された。
流量及び反応展開ラインの長さは、細胞を試験化合物と混合する時点から通過型光学セルにおいてシグナル検出を行う時点までの時間間隔が４０秒間であるように選択された。図９に示した曲線を作成するための完全な濃度勾配ランを行うために必要な時間は、本発明を使用すると５分間であった。これとは対照的に、ＥＴAＲ刺激の指標としてホスファチジルイノシトール代謝回転速度を使用する従来のアッセイでは、通常では反応曲線上でほんの少数の濃度点を得るだけでも数時間を用し、図９に示したような完全な曲線を作成するためには法外な時間を要する。
図１０は、アンタゴニストの存在下での最高細胞応答並びにアゴニストに対するＥＣ50値及びアンタゴニストに対するｐＡ2値を計算するための技術において使用される、図９におけるデータの対数変換である。ＢＱ-１２３を使用せずに活性化曲線から計算されたＥＣ50値は１０ｐＭに等しく、図１０における活性化曲線がこの技術において競合的タイプの阻害についての特徴であることが既知であるＢＱ-１２３の存在下では右方平行移動することを見て取ることができる。２種の濃度のＢＱ-１２３から計算された平均ｐＡ2値は７．９６に等しい。これは１１ｎＭのＢＱ-１２３についての阻害定数Ｋ1に相当する。ＥＣ50値及びｐＡ2値は文献データと密接に一致している（Ｍａｓａｋｉ  Ｉｈａｒａ等，１９９２，が参照によりここに具体化される）。
実施例２
図１１は、ＴＥ-６７１細胞におけるＢＱ-１２３を用いてのＥＴ-１誘発性細胞内カルシウム移動の阻害を示している。ここでは実施例１に記載と同一の細胞生理機能測定装置及び細胞調製方法が使用された。
本実験では、ＥＴ−１は本発明の装置の“標準化合物用”シッパーノズルから一定濃度で導入され、ＢＱ-１２３は本装置の“試験化合物用”ノズルを通して導入された。本実施例では、実施例１と同様に、濃度ランは５分間、反応時間（混合から検出まで）は４０秒間であった。
図３を参照して手短に述べると、最小及び最高スタンダード（３３９、３３７）を用いてのキャリブレーション後、アゴニスト標準化合物液であるＥＴ-１液が、ＤＰＢＳ緩衝液と混合することによってプロポーショニングバルブ３２７により調製された所定の濃度でプライミングバルブ３２９、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３及びプライミングバルブ３４１を通過してその後混合ゾーン３４３へ向かわせられ、そこでＴＥ-６７１細胞の懸濁液と混合されて、最終細胞濃度４×１０5細胞／ｍＬを提供した。同時に、ＥＴ-１液に対して容積比が１：１のＤＰＢが、プロポーショニングバルブ３１１の流入口３０９及び流出口３１２、プライミングバルブ３１３を通過して混合ゾーン３３１、さらには流体システムを通って検出器３５５へ向かわせられた。標準アゴニストの存在下で細胞内カルシウム濃度を安定化させた後に、ＤＰＢＳの代わりにアンタゴニスト試験化合物としてのＢＱ-１２３が、プロポーショニングバルブ３１１においてシステムを通してＥＴ-１溶液との１：１の容積比で、ＢＱ-１２３をＤＰＢＳと混合することによって調製された連続的に変化する濃度で、プロポーショニングバルブ３１１の流入口３０７から混合ゾーン３３１へ向かわせられた。混合ゾーン３４３では、一定濃度のＥＴ−１の混合物流、及び経時的連続的に変化する濃度のＢＱ-１２３とが２：１の比率で細胞と混合させられた。これは混合ゾーン３４３及び最終的には検出器３５５を通過する液流の各コンポーネントに対して３倍の最終希釈率を生じさせる。プロポーショニングバルブ３２７は、検出器でＥＴ−１の４０ｐＭの最終濃度を生じさせるようにプレプログラミングされた。プロポーショニングバルブ３１１は、ＢＱ-１２３の０〜３００ｎＭの最終濃度を生じさせるようにプレプログラミングされた。検出器３５５を通過するＴＥ-６７１２細胞中の細胞内カルシウムイオン濃度が、上記のように蛍光染料ＦＵＲＡ-２を使用してＢＱ-１２３濃度の関数としてリアルタイムで測定された。
実施例３
図１２は、“ゼロ法”実験デザインを示している（Ｌａｚａｒｅｎｏ ＆ Ｂｉｒｄｓａｌｌ，１９９３が参照によりここに具体化される）。本実施例では実施例１及び２と同一の装置及び同一の試薬を使用する。
本実施例では、本発明の装置の“標準化合物用”ノズル３２３から流入するＥＴ-１の第１濃度勾配が“試験化合物用”ノズルから流入する緩衝液を用いて調製される。最終ＥＴ-１濃度が４０ｐＭの値に到達したら、濃度勾配装置１はＥＴ-１濃度を一定に保持し、濃度勾配装置２が“試験化合物用”ノズルから流入するＢＱ-１２３の濃度を上昇させ始める。アゴニストのあらゆる所定の濃度でアゴニスト濃度勾配をアンタゴニストへ切り換えることができる。
実施例４
本発明の装置は、次のように１種又はそれ以上の細胞タイプに発現した細胞表面受容体のパターンを測定するために使用できる。試験される様々な細胞タイプの各々を複数の細胞懸濁液リザーバーの１つに挿入する、又は単一細胞タイプが試験される場合は、細胞を保持するために単一細胞懸濁液リザーバーを備えた装置が使用されてもよい。特定受容体の活性に影響を及ぼすことが既知である１種又はそれ以上の試験物質の作用は、細胞懸濁液を試験物質と混合して試験物質混合物を形成させ、試験物質混合物を検出ゾーンへ向かわせ、上記の方法を使用して細胞応答を測定することによって測定される。好ましくは、試験物質は１種又はそれ以上の受容体アゴニストを含有する。しかし、一部の実施態様では、試験物質はアンタゴニスト又はアゴニストとアンタゴニストとの混合物であってよい。
試験物質が受容体アゴニストである場合は、細胞応答は細胞活性の活性化でる可能性がある。或いは又、試験物質がアンタゴニストの場合は、細胞応答は細胞活性の阻害である可能性がある。同様に、試験物質がアゴニストとアンタゴニストの組合せの場合は、細胞応答はアンタゴニストの存在を原因として通常アゴニストに反応して得られる活性の低下又は活性がない可能性がある。試験物質が試験化合物の場合は、細胞応答はその物質を用いて観察されると予想される応答であろう。
細胞応答がアゴニスト、アンタゴニスト、アゴニスト／アンタゴニスト混合物又は特定受容体と相互作用することが既知である試験物質を用いて観察された場合は、評価される細胞タイプはその受容体を有している。細胞生理学に対する数種のアゴニスト、アンタゴニスト、アゴニスト／アンタゴニスト混合物又は試験化合物の作用を試験することによって、評価中の細胞タイプの受容体の範囲を測定できる。多数の細胞タイプを試験しなければならない場合は、各細胞タイプ中に存在する受容体の範囲を測定するために一連の細胞タイプの各々についてこのプロセスを繰り返す。多数の細胞タイプの分析を容易にするためには、細胞タイプの各々を上記の装置に含まれる複数の細胞懸濁液リザーバーの１つに配置することができる。
実施例５
本発明の装置は、次のように特定受容体の活性に試験物質が影響を及ぼすことを確認するために使用できる。試験物質はアゴニスト、アンタゴニスト、又はアゴニスト及びアンタゴニストの混合物であってよい。試験物質は、受容体の活性に影響を及ぼすことが既知である物質又は受容体に対する作用が未知である物質であってよい。受容体を含んでいない細胞タイプは陰性対照として使用でき、細胞懸濁液リザーバーの１つに配置される。受容体を発現するように工学的に作製された、又は誘導された陰性対照と同一の細胞タイプの細胞は、もう１つの細胞懸濁液リザーバーに配置される。１種又はそれ以上の試験物質の作用は、陰性対照混合物及び試験混合物を形成させるために細胞を試験物質と接触させ、陰性対照混合物及び試験物質混合物を検出ゾーンへ向かわせ、さらに陰性対照細胞と工学的に作製された又は誘導された細胞の細胞応答を測定することによってこれらの細胞タイプの各々において評価される。陰性対照細胞の応答と比較した際の工学的に作製された又は誘発された細胞の応答における相違は、試験物質が受容体の活性に対する作用を有していることを示している。
陰性対照細胞は一般的には“宿主細胞”と呼ばれており、工学的に作製された細胞は当業者には一般には“トランスフェクト細胞”と呼ばれている。工学的に作製された細胞を得るためには、形質転換、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、転位のような技術、又は当業者が習熟しているその他の技術を使用して、受容体をコードする遺伝子を陰性対照細胞と同一タイプの細胞内に導入することができる。受容体遺伝子の発現は当業者が習熟している様々なベクターによって行うことができる。或いは又、成長因子、サイトカイン、細胞分化因子のような化学的物質若しくは生物活性物質、又は当業者に既知のその他の物質を用いての処理を通して受容体を発現するように誘導することができる。
実施例６
特定受容体の活性は、それが発現している特定細胞タイプの特徴によっても影響されうる。従って同一受容体が種々の細胞タイプ間で活性における変動を示すことがある。本発明は又、受容体活性におけるそうした細胞タイプ依存性の相違を評価するためにも使用できる。評価される細胞タイプの各々を細胞懸濁液リザーバー内に配置し、試験混合物を形成するために細胞を１種又はそれ以上の試験物質と接触させ、試験混合物を検出ゾーンに向かわせ、試験混合物が検出ゾーンを通過するときに細胞の細胞応答を測定することによって１種又はそれ以上の試験物質の細胞上の１種又はそれ以上の受容体活性に対する作用を測定する。試験物質は既知の受容体アゴニスト、既知のアンタゴニスト、既知のアゴニストと既知のアンタゴニストとの混合物、又は上記のようにその活性が未知である化合物であってよい。このプロセスは各細胞タイプにおける細胞応答の性質及び大きさを測定するために試験される細胞タイプの各々について実行される。多数の細胞タイプの分析を容易にするためには、細胞タイプの各々が上記の装置内の複数の細胞懸濁液リザーバーの１つに配置されうる。
図１３は、細胞マッピング及び細胞受容体“フィンガープリンティング”を実行するために本発明において使用されうるアルゴリズムを示している。第１に、細胞は標準アゴニストと混合され（ステップ１３０１）、混合物は検出器に供給される（ステップ１３０２）。次に、装置は細胞との接触に基づいてこの標準アゴニストが何らかの細胞応答をトリガするかどうかを測定する（ステップ１３０３）。２つの可能性がある：標準アゴニストが何の応答も生じない（ＮＯ）か、又は細胞応答を誘発する（ＹＥＳ）か。細胞応答は、評価される特定標準アゴニストに対する検出器からのシグナルをモニターすることによって測定される。制御システムは、まず最初にベースライン及び最高応答を確定するためにキャリブレーションを行い、検出器からのそれらの数値の間のいかなるシグナルも陽性応答であると見なされる。
装置のモニター部によって測定したときに標準アゴニストが細胞応答を誘発しない場合は（ＮＯ）、システムはアゴニスト計数器を増加させ（ステップ１３０９）、計数器はアゴニストの特定セットに含まれる次の標準アゴニストが特定細胞系を用いて試験されるよう指示する。本システムはその後、利用可能な全てのアゴニストが試験されたかどうかを判定する（ステップ１３０５）。全標準アゴニストが特定細胞系を用いて試験されていない場合は、オリジナル細胞系からの新しい細胞がシステムに供給される（ステップ１３０６）。その後これらの新しい細胞が、所定のアゴニスト液のセットからの次の標準アゴニストと自動的に接触させられる（ステップ１３０１）。セット内の各アゴニスト溶液は既知の細胞受容体、イオンポンプ又はイオンチャンネル分子の刺激を通して細胞応答を開始することが既知である１種又はそれ以上の成分を含有している。本装置は、細胞応答が特定標準アゴニストを用いてトリガされることを検出するまで、又はその機械で利用できる全アゴニストが試験されるまで、種々の標準アゴニスト物質と細胞との混合を繰り返し続ける。
ステップ１３０３において特定アゴニストが細胞応答をトリガすることが測定された場合は、プロセスは種々の濃度レベルの標準アゴニストでの細胞応答が記録される効力作用のモードへ切り替えられる（ステップ１３０６）。ステップ１３０６が完了した後は、プロセスはその後、種々の濃度レベルの標準アゴニストで所定細胞系において生じた細胞応答のレベルを表す効力パラメーター又はプロフィールを記録する（ステップ１３０７）。プロセスはその後再び、利用可能な全ての標準アゴニストが試験されたかどうかを測定する（ステップ１３０４）。利用可能なアゴニスト全部が試験された場合は（ＹＥＳ）、システムは、今度は利用可能な全ての細胞系が試験されたかどうかを判定する（ステップ１３０８）。この質問の答えがＹＥＳの場合は、プロセスは完了する（ステップ１３１２）。
ステップ１３０８が利用可能な全ての細胞系が試験されていないと測定した場合は、細胞計数器が増加させられ（ステップ１３１０）、計数器は細胞系の特定セットに含まれる新しい細胞系を試験するように指示する。次に、標準アゴニスト計数器がリセットされ（ステップ１３１０）、計数器は標準アゴニストの特定セットに含まれる最初に指定されたアゴニストから開始して、利用可能な全ての標準アゴニストを用いて新しい細胞系が試験されるように指示する。新しい細胞系からの細胞がシステムに供給され（ステップ１３１１）、引き続いて特定アゴニストと混合される（ステップ１３０１）。その後上記のプロセスのステップ１３０１〜１３１１が繰り返される。ある実施態様では本装置は、本装置で利用可能な全てのアゴニストが本装置で利用可能な全ての細胞系を用いて試験されたことを検出するまで、様々な標準アゴニスト物質と細胞との混合を繰り返し続ける。
図１４は、トランスフェクト受容体、特にオーファン受容体の特性付けを実行するために本発明において使用されうるアルゴリズムを示している。第１にステップ１４０１では、装置は既知のオーファン受容体を産生する遺伝子でトランスフェクト細胞を供給し、それらを標準アゴニストと混合する（ステップ１４０２）。この混合物は検出器に供給される（ステップ１４０３）。次に、本装置はこの標準アゴニストが細胞との接触に基づいて何らかの細胞応答をトリガするかどうかを測定する（ステップ１４０４）。２つの可能性がある：標準アゴニストが何の応答も生じない（ＮＯ）か、又は細胞応答を誘発する（ＹＥＳ）か。細胞応答が評価されている特定標準アゴニストについて検出器からのシグナルをモニターすることによって判定する。制御システムはまず最初にベースライン及び最高応答を確定するためにキャリブレーションし、それらの値の間になる検出器からのあらゆるシグナルは陽性応答であると見なされる。
装置のモニター部によって測定したときに標準アゴニストが細胞応答を誘発しない場合は（ＮＯ）、システムはアゴニスト計数器を増加させ（ステップ１４０５）、計数器は標準アゴニストの特定セットに含まれる次の標準アゴニストがトランスフェクト細胞で試験されるように指示する。本システムはその後、利用可能な全ての標準アゴニストがトランスフェクト細胞を用いて試験されたかどうかを測定する（ステップ１４０６）。試験されていない場合は、プロセスはステップ１４０１へ戻り、そこで同一のトランスフェクト細胞系からの新しい細胞が自動的に所定のアゴニスト溶液セットからの次の標準アゴニストと接触させられる（ステップ１４０２）。セット内の各標準アゴニスト溶液は既知の細胞受容体、イオンポンプ又はイオンチャンネル分子の刺激を通して細胞応答を開始することが既知である１種又はそれ以上の成分を含有している。本装置は、細胞応答が特定標準アゴニストでトリガされることを検出するまで、又はその機械で利用できる全アゴニストが試験されるまで、種々の標準アゴニスト物質とトランスフェクト細胞との混合を繰り返し続ける。
装置のモニター部によって測定したときにステップ１４０４においてトランスフェクト細胞と標準アゴニストとの接触が細胞応答を開始すると測定された場合は（ＹＥＳ）、プロセスはその後同一標準アゴニストと混合される（ステップ１４０８）宿主細胞を供給する（ステップ１４０７）。この混合物はその後、宿主細胞上で標準アゴニストによって生じた細胞応答を測定するために検出器へ供給される（ステップ１４０９）。次に、システムは標準アゴニストが宿主細胞中で細胞応答を生じるかどうかを測定する（ステップ１４１０）。細胞応答が検出された場合は（ＹＥＳ）、システムはその後標準アゴニスト計数器を増加させ（ステップ１４０５）、その後システムは利用可能なアゴニスト全てが試験されたかどうかを測定する（１４１０）。利用可能な全てのアゴニストが試験されている場合は、プロセスは完了する（ステップ１４１２）。利用可能な全ての標準アゴニストが試験されていない場合は、プロセスはステップ１４０１へ戻り、そこで新しいなトランスフェクト細胞が供給されて標準アゴニストセットに含まれる次の標準アゴニストと混合され（ステップ１４０２）、上記のプロセスのステップが繰り返される。
ステップ１４１０において宿主細胞中で標準アゴニストによって細胞応答が生じない場合は、プロセスは宿主細胞とトランスフェクト細胞との相違を検出した。この時点で、プロセスは完了する（ステップ１４１２）。ある実施態様では、装置は特定アゴニストがオーファン受容体でトランスフェクトされた細胞中における応答を刺激し、宿主細胞上の応答を刺激しないことを検出するまで、又は機械で利用できる全ての標準溶液が試験されるまで種々の標準アゴニスト物質と細胞との混合を繰り返し続ける。
図３の陰圧流体システムを用いての現在好ましい細胞マッピング及び細胞受容体“フィンガープリンティング”モードの連続フロー図は図１５ａ〜１５ｆに示されている。このモードを実践するためには、切換バルブ３４７を、特定細胞系を用いての１つの実験が完了すると、バルブ３４７を次の細胞リザーバーへ切り換えることができるように、各々に相違する細胞懸濁液を有する多数のリザーバーが個別に共通流出口３４６へ接続されることを可能にするマルチチャンネル切換バルブ３４７に取り換える。
スクリーニングプログラムは状態１５００からスタートし、全パラメーターを初期値に設定する状態１５０２へ進む。これらの初期パラメーターには、ゼロ化した計数器、ソフトウエア変数及びサブルーチンの内部初期化が含まれるが、これらに限定されない。
初期パラメーターが設定されると、ソフトウエアはオペレーターに実験で使用する標準アゴニストの最高数ＬMAX及び細胞系の最高数ＣMAXを入力するように促す（ステップ１５０３）。オートサンプラー３０１および３１５（図３）は吸込ノズル３０７及び３２３を洗浄用緩衝液リザーバー３０５によって占められている対応する“ゼロ”位置に配置し（ステップ１５０４）、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７、切換バルブ３３３、３３５及び３４７、並びにプライミングバルブ３１３、３２９、３４１及び３４５のスイッチを切る（ステップ１５０６）。スイッチを切った状態では、プライミングバルブ３１３、３２９、３４１及び３４５は常態では開放しており、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７は各々それらの流出口３１２及び３２８を対応する“常態では開放している”流入口３０９及び３２５と連絡させており、切換バルブ３３５はその共通流出口３３４を“常態では開放している”流入口３３６と連絡させており、切換バルブ３３３はその共通流出口３４２を“常態では開放している”流入口３３２と連絡させており、さらにマルチチャンネル切換バルブ３４７はその共通流出口３４６を試験下の第１細胞懸濁液を含有しているリザーバーに接続された第１流入口３４８と連絡させている。
システムが初期化されると、ポンプ３５７がスタートさせられる（ステップ１５０８）。これは、洗浄用緩衝液をオートサンプラー３０１及び３１５両方の“ゼロ”に配置されたリザーバーからプロポーショニングバルブ３１１及び３２７各々のノズル３０９と３２５及び流出口３１２及び３２８、プライミングバルブ３１３及び３２９、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３の流入口３３２及び流出口３４２、プライミングバルブ３４１、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３、検出器３５５、ポンプ３５７を通過してその後ドレーン容器３５９内へ流れさせる。混合ゾーン３４３では、この流れは第１細胞系と接続された流入チューブ３４８と、さらにマルチチャンネル切換バルブ３４７の流出口３４６及びプライミングバルブ３４５を通過して流入する細胞懸濁液３４９と混合される。従って混合ゾーン３４３を通過する全液流は、プロポーショニングバルブ３１１から流入する第１の液流、バルブ３２７から流入する第２の液流およびマルチチャンネル切換バルブ３４７から流入する第３の液流の３つの液流の合計である。このステップ中、プロポーショニングバルブはどちらも、最終混合物流が１：２の割合で細胞懸濁液３４９と洗浄緩衝液３０５とから構成されるような方法で、各オートサンプラーの“ゼロ”位置に配置されたリザーバーから洗浄用緩衝液３０５を供給する。
細胞懸濁液３４９と洗浄用緩衝液３０５の混合物流を安定化させるために必要なステップ１５０９において決定された遅延時間後、検出器３５５は細胞単独によって生じる基本シグナルを記録する（ステップ１５１０）。基本シグナルが記録された後、これは標準シグナルＢＳiとして保存され（ステップ１５１２）、コンピューター１２３（図１）は計数器Ｌを増加させる（ステップ１５１４）。
増分計数器Ｌの数値はトリガされる毎に１ずつ増加させられる。計数器の数値は試験される標準アゴニスト３１９のセットをサンプリングするオートサンプラー３１５の流入口３２３のノズルの位置を決定する。次にステップ１５１６では、増分計数器Ｌの数値Ｌkが事前に入力された（ステップ１５０３）試験される標準アゴニストの最高の数値ＬMAXと比較される。
ＬkがＬMAXを越えなければ、オートサンプラー３１５は標準アゴニスト３１９のラックのＬk位置に配置された標準アゴニストリザーバー内にノズル３２３を配置する（ステップ１５１８）。次に、“常態では閉鎖している”流入口３２３を共通流出口３２８へ開放するためにプロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられる（ステップ１５２０）。ステップ１５２０の間、混合ゾーン３４３内及びその後は検出器３５５内の混合物流は、一部はプロポーショニングバルブ３１１のノズル３０９を通って流入する緩衝液３０５、一部はプロポーショニングバルブ３２７のノズル３２３から流入する試験される標準アゴニスト液３１９、及び一部は複数の細胞リザーバーの１つから流入チューブ３４８を通りマルチチャンネル切換バルブ３４７の流出口３４６を通過して流入する特定細胞懸濁液３４９から構成されている。混合プロセスを安定化させるために必要とされる、ステップ１５２１によって与えられる遅延時間後、検出器３５５は所定の標準アゴニストＬkの存在下で所定の細胞によって生じた標準アゴニスト誘発性シグナルＳＬkを記録する（ステップ１５２２）。ＳＬkシグナルが記録された後、その数値は数値ＳＬkとして保存され（ステップ１５２３）、装置はステップ１５３０に進行して、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが切られ、従って常態では開放している流入口３２５が緩衝液と連絡させられる。ステップ１５３２では、オートサンプラー３１５が洗浄用緩衝液の充填されたリザーバーによって占められているゼロ位置へノズル３２３を動かす。プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられ（ステップ１５３４）、常態では閉鎖している流入口３２３が流出口３２８と連絡させられる。ステップ１５３６において決定された遅延時間によって、プロポーショニングバルブ３２７の流入口３２３及び流出口３２８、プライミングバルブ３２９、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３の流入口３３２及び流出口３４２、プライミングバルブ３４１、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３及び検出器３５５から構成される流路が事前の化合物の残留物をきれいに洗い流されることを可能にする。遅延時間後、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチがステップ１５３８で切られ、これでシステムは始めの状態になる。
次に、標準アゴニスト誘発性シグナルＳＬkの値が標準基本シグナルＢＳiの値と比較される（ステップ１５４４）。ＳＬkシグナルがＢＳiシグナルより大きい場合は、コンピューター１２３（図１）は対応する標準アゴニストを“陽性”であると“フラッグ”するが（ステップ１５４０）、これは特定細胞が特定アゴニストによって刺激される受容体を発現することを意味している。ＳＬkシグナルがＢＳiシグナルより大きくない場合は、コンピューター１２３（図１）は対応する標準アゴニストを“陰性”であると“フラッグ”するが（ステップ１５４２）、これは特定細胞が特定アゴニストによって刺激されうる受容体を含有していないことを意味している。
“ＳＬk＞ＢＳi”の条件が満たされる毎に、プログラムの流れは作用の勾配モードを開始するループＫ−Ｏへ進む。勾配モードでは、ステップ１５５０がオートサンプラー３１５をステップ１５１４で測定されたＬk値に対応する位置に動かす。その後、勾配モードで作動するようにプロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられる（ステップ１５５２）。ステップ１５５４では、標準アゴニスト刺激シグナルに対する用量反応曲線が記録される。ステップ１５５６は、特定レベルのシグナルを惹起するアゴニストの特定濃度として測定できる効力パラメーターを計算する。データはステップ１５５８において保存される。
データが保存された後、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが切られ（ステップ１５６０）、オートサンプラー３１５はゼロ位置へ動かされ（ステップ１５６２）、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられ（ステップ１５６４）、ステップ１５６６で決定された洗浄遅延時間後に、バルブ３２７のスイッチが再び切られる（ステップ１５６８）。ステップ１５６８が実行された後、プロセスはラインＯを通って増分計数器Ｌへ戻る（ステップ１５１４）。
ステップ１５４４において、ＳＬkシグナルがＢＳiシグナルより大きくない場合は、ステップ１５４２は標準アゴニストが“陰性”とフラッグするが、これは特定細胞が発現した特定受容体を含有していないことを意味しており、プログラムの流れはラインＭを通ってステップ１５１４へ戻る。
ステップ１５１６（図１５ｂ）においてＬkがＬMAXを越える場合は、これは全アゴニストを試験したことを意味しており、プロセスはラインＮを通ってステップ１５７０へ進み、そこでコンピューター１２３は細胞計数器Ｃを増加させる。計数器の数値はステップ１５０３において入力された細胞の最高数と比較される（ステップ１５７２）。計数器の数値ＣiがＣMAXを越えない場合は、制御装置Ｌはステップ１５７４においてゼロに設定され、マルチチャンネル切換バルブ３４７は次の位置に切り換えられ、新しい細胞リザーバーが流出口３４６と連絡させられ、プロセスはラインPを通ってステップ１５０９へ戻る（図１５Ａ）。ステップ１５７２においてＣi値がＣMAXより大きい場合は、プロセスはステップ１５７８へ進み、そこでオートサンプラー３１５がゼロ位置に動かされ、さらにプロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられる（ステップ１５８０）。ステップ１５８２において決定された洗浄遅延時間後、バルブ３２７のスイッチが切られ（ステップ１５８４）、ポンプ３５７のスイッチが切られ（ステップ１５８６）、全プログラムがステップ１５８８でストップする。
図３の陰圧流体システムを用いての現在好ましいオーファン受容体検出モードの連続フロー図は図１６ａ〜１６ｇに示されている。このモードを実行するためには、切換バルブ３４７が、天然又はエンプティベクターでトランスフェクトされた宿主細胞及び関与するオーファン受容体を用いてトランスフェクトされた細胞を含有する少なくとも２つのリザーバー３４９を個別に共通流出口３４６へ連絡することのできるマルチチャンネル切換バルブ３４７に取り換えられる。
プログラムはスタート状態１６００から始まり、全パラメーターを初期値に設定する状態１６０２へ進行する。これらの初期パラメーターには、ソフトウエア変数及びサブルーチンの内部初期化が含まれるが、これらに限定されない。その後プログラムはオペレーターに試験されるアゴニストの最高数を入力するように促す（ステップ１６０３）。
初期パラメーターがセットアップされると、オートサンプラー３０１および３１５（図３）はそれらの吸込ノズル３０７及び３２３を洗浄用緩衝液リザーバー３０５によって占められている対応する“ゼロ”位置に配置する（ステップ１６０４）。プロポーショニングバルブ３１１及び３２７、切換バルブ３３３、３３５及び３４７、並びにプライミングバルブ３１３、３２９、３４１及び３４５のスイッチが切られる（ステップ１６０６）。スイッチを切った状態では、プライミングバルブ３１３、３２９、３４１及び３４５は常態では開放しており、プロポーショニングバルブ３１１及び３２７の流出口３１２及び３２８は各々対応する“常態では開放している”流入口３０９及び３２５と連絡させており、切換バルブ３３５の流出口３３４は“常態では開放している”流入口３３６と連絡しており、切換バルブ３３３の共通流出口３４２は“常態では開放している”流入口３３２と連絡している。
システムが初期化された後、切換バルブ３４７はその共通流出口３４６を宿主細胞が含有されているリザーバー、位置１と連絡するように設定されている（ステップ１６０８）。ポンプ３５７は液体をポンプで送り出すようにスタートさせられる（ステップ１６１０）。これは洗浄用緩衝液をオートサンプラー３０１及び３１５両方の“ゼロ”に配置されたリザーバーからプロポーショニングバルブ３１１及び３２７各々のノズル３０９と３２５及び流出口３１２と３２８、プライミングバルブ３１３及び３２９、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３の流入口３３２及び流出口３４２、プライミングバルブ３４１、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３、検出器３５５、ポンプ３５７を通過してその後ドレーン容器３５９内へ流れさせる。混合ゾーン３４３では、この流れはマルチチャンネル切換バルブ３４７の流入チューブ３４７及び流出口３４６からプライミングバルブ３４５を通過して流入する宿主細胞懸濁液と混合される。従って混合ゾーン３４３を通過する全液流は、プロポーショニングバルブ３１１から流入する第１の液流、プロポーショニングバルブ３２７から流入する第２の液流およびマルチチャンネル切換バルブ３４７から流入する第３の液流の３つの液流の合計である。このステップ中、プロポーショニングバルブはどちらも、最終混合物流が１：２で細胞懸濁液と洗浄緩衝液から構成されるような方法で各オートサンプラーの“ゼロ”位置に配置されたリザーバーから洗浄用緩衝液３０５を供給する。
細胞懸濁液と洗浄用緩衝液の混合物流を安定化させるために必要な、ステップ１６１２において決定された遅延時間後、検出器３５５は宿主細胞によって生じた基本シグナルを記録する（ステップ１６１４）。基本シグナルが記録された後、これは標準シグナル（ＢＳ）HCとして保存される（ステップ１６１６）。ステップ１６２０では、流出口３４６にトランスフェクト細胞の懸濁液を供給するために、マルチチャンネル切換バルブ３４７が位置２へ切り換えられる。新しい細胞懸濁液と洗浄用緩衝液の混合物流を安定化させるために必要な、ステップ１６２２において決定された遅延時間後、検出器３５５はトランスフェクト細胞によって生じた第２基本シグナルを記録する（ステップ１６２４）。基本シグナルが記録された後、これは標準シグナル（ＢＳ）TCとして保存され（ステップ１６２６）、ポンプのスイッチが切られる（ステップ１６２８）。コンピューター１２３（図１）は増分計数器Ｌをトリガする（ステップ１６３０）。
増分計数器Ｌの数値はトリガされる毎に１ずつ増加させられるので、試験されるアゴニスト３１９のセットをサンプリングするオートサンプラー３１５の流入口３２３のノズル位置を決定する。次に増分計数器Ｌの数値Ｌkが試験される標準アゴニストの最高数値ＬMAXと比較される（ステップ１６３２）。
ＬkがＬMAXを越えなければ、オートサンプラー３１５は数値ＬKによって決定された位置で、ラック３１９に位置するアゴニストリザーバ内にノズル３２３を配置する（ステップ１６３４）。ポンプ３５７のスイッチがステップ１６３６で入れられ、“常態では閉鎖している”流入口３２３を共通流出口３２８へ開放する（ステップ１６３８）ためにプロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられ、従って特定アゴニスト液流が、プライミングバルブ３２９、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３の流入口３３２及び流出口３４２、プライミングバルブ３４１、マルチチャンネル切換バルブ３４７の流出口３４６及びプライミングバルブ３４５から流入するトランスフェクト細胞の懸濁液と混合される混合ゾーン３４３へ流れることを可能にする。混合ゾーン３４３でトランスフェクト細胞と混合された後、流体は、反応展開ライン３５３を通り、検出器３５５へ、そしてさらに廃液リザーバ３５９へと流入する。混合プロセスを安定化させるために必要とされる、ステップ１６４０によって与えられた遅延時間後、検出器３５５は所定のアゴニストＬkの存在下で特定オーファン受容体トランスフェクト細胞によって生じたアゴニスト誘発性シグナル（ＳＬk）TCを記録する（ステップ１６４２）。シグナルが記録された後、その数値（ＳＬk）TCはステップ１６４３で保存され、装置はステップ１６４４に進行して、そこでプロポーショニングバルブ３２７のスイッチが切られ、従って常態では開放している流入口３２５が緩衝液３０５で流出口３２８と連絡させられる。ステップ１６４６では、オートサンプラー３１５が洗浄用緩衝液の充填されたリザーバーによって占められているゼロ位置へノズル３２３を動かす。プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが再び入れられ（ステップ１６４８）、流入口３２３と流出口３２８が連絡する。ステップ１６５０において決定された遅延時間によって、プロポーショニングバルブ３２７の流入口３２３及び流出口３２８、プライミングバルブ３２９、混合ゾーン３３１、切換バルブ３３３の流入口３３２及び流出口３４２、プライミングバルブ３４１、混合ゾーン３４３、反応展開ライン３５３及び検出器３５５から構成される流路がアゴニストの残留物をきれいに洗い流されることを可能にする。遅延時間（ステップ１６５０）後、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチがステップ１６５２で切られ、ポンプ３５７のスイッチが１６５４で切られ、これでシステムは始めの状態になる。
次に、トランスフェクト細胞について記録されたシグナル（ＳＬk）TCの数値が対応する標準基本シグナル（ＢＳ）TCの数値と比較される（ステップ１６５８）。アゴニスト誘発性シグナル（ＳＬk）TCが基本値（ＢＳ）TCより大きくない場合は、コンピューター１２３（図１）は対応するアゴニストＬkを“陰性”であると“フラッグ”するが（ステップ１６６０）、これは細胞が特定アゴニストによって刺激される受容体を含有していないことを意味しており、プログラムの流れはラインＭを通って増分計数器Ｌへ戻る（ステップ１６３０）。（ＳＬk）TCシグナルが（ＢＳ）TCシグナルより大きい場合は、コンピューター１２３は対応するアゴニストを“陽性TC”と“フラッグ”するが（ステップ１６５６）、これはトランスフェクト細胞が特定アゴニストによって刺激される受容体を発現することを意味している。
次の作業は、トランスフェクト細胞においてのみ発現されるはずのオーファン受容体と区別するために、宿主細胞も又この受容体を発現するかどうかを判定することである。これを行うためには、ステップ１６５６において標準アゴニストＬkが陽性であるとフラッグされた後に、プログラムの流れはループＫ−Ｏへ入り、ここでステップ１６６２においてオートサンプラー３１５がそのノズル３２３を計数器Ｌで得られた数値Ｌkに対応する位置へ動かす。ステップ１６６４は切換バルブ３４７を位置１へ切り換え、これは宿主細胞懸濁液リザーバー３４９を共通流出口３４６、マルチチャンネル切換バルブ３４７の流入口３４８、及びプライミングバルブ３４５を通して混合ゾーン３４３と連絡する。ステップ１６６６及び１６６８はバルブ３２７及びポンプ３５７各々のスイッチを入れ、オートサンプラー３０１の流入口３０９から流入する緩衝液３０５、プロポーショニングバルブ３２７の流入口３２３及び流出口３２９から流入する標準アゴニストとが一緒に混合ゾーン３３１へ運ばれ、この混合物が引き続いて混合ゾーン３４３において宿主細胞と一緒に混合されることを可能にする。細胞及びアゴニストの混合物の流れを安定化させるために必要とされる、ステップ１６７０によって決定された遅延時間後、検出器３５５は宿主細胞におけるアゴニスト誘発性シグナル（ＳＬk）HCを記録する（ステップ１６７２）。
シグナルが記録された後、これはステップ１６１４で測定された対応する基本シグナル（ＢＳ）HCと比較される（ステップ１６７４）。比較の結果に依存して、アゴニストＬkは“陽性TC／陽性HC”（ステップ１６７６）又は“陽性TC／陰性HC”（ステップ１６７８）とマークされる。どちらの場合も、データは研究者によってさらに評価されるためにステップ１６８０において保存される。
データが保存された後、ステップ１６８２においてマルチチャンネル切換バルブ３４７が位置２へ切り換えられ、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが切られ（ステップ１６８４）、オートサンプラー３１５はゼロ位置へ動かされ（ステップ１６８６）、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられ（ステップ１６８８）、ステップ１６９０で決定された洗浄遅延時間後に、プロポーショニングバルブ３２７のスイッチが再び切られ（ステップ１６９２）、ポンプ３５７のスイッチが切られる（ステップ１６９４）。ステップ１６９４が実行された後、プログラムの流れはラインＯを通って増分計数器Ｌへ戻る（ステップ１６３０）。
ステップ１６３２（図１６ｃ）において、ＬkがＬMAXを越える場合は、プロセスはステップ１７００（図１６ｇ）へ進み、計数器Ｌがゼロに設定される。次に、ステップ１７０２でオートサンプラー３１５がゼロ位置に動かされ、ステップ１７０４でプロポーショニングバルブ３２７のスイッチが入れられ、ステップ１７０６において決定された洗浄遅延時間後、各々ステップ１７０８及び１７１０においてプロポーショニングバルブ３２７及びポンプ３５７の両方のスイッチが切られ、その後プログラムがステップ１７１２でストップする。
本発明は特定の実施態様を参照しながら詳細に説明されたが、当業者には明白な何らかの変更及び修飾が本発明の気質及び範囲内に含まれることは理解されるであろう。本書に詳細には記載していない他の実施態様も又下記のクレームによって提供されているように、本発明の気質及び範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図７ｇ】
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【図８】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１６】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１６ｅ】
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【図１６ｆ】
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【図１６ｇ】
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