(57)【要約】インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分とする小児慢性関節関連疾患、例えば小児慢性関節炎、スティル病等の治療剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分として含んで成る小児慢性関節炎関連疾患治療剤。
【請求項２】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分として含有する小児慢性関節炎治療剤。
【請求項３】
ＩＬ−６アンタゴニストがＩＬ−６受容体に対する抗体であることを特徴とする請求項２記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項４】
ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項５】
ＩＬ−６受容体に対する抗体がヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項６】
ＩＬ−６受容体に対する抗体がマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項７】
ＩＬ−６受容体に対する抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項８】
ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＰＭ−１抗体であることを特徴とする請求項５に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項９】
マウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＭＲ１６−１抗体であることを特徴とする請求項６に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項１０】
ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項１１】
ＩＬ−６受容体に対するヒト型化抗体がヒト型化ＰＭ−１抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項１２】
前記小児慢性関節炎が、ＡＲＡ分類では全身型、多関節型、少関節型、ＥＵＬＡＲ分類では全身型、多関節型、少関節型、ＩＬＡＲ分類では、全身型、多関節型（ＲＦ陽性型）、多関節型（ＲＦ陰性型）、少関節型、進展型少関節型、本発明者らの分類では、小児一次性慢性関節炎（ＳＰＲＡＳＨ症候群、小児特発性慢性関節炎（ａ．リウマトイド因子（ＲＦ）陽性型、ｂ．抗核抗体（ＡＮＡ）陽性型、ｃ．ＲＦ／ＡＮＡ陰性型））である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項１３】
前記小児慢性関節炎が、ＡＲＡ分類では全身型、多関節型、ＥＵＬＡＲ分類では全身型、多関節型、ＩＬＡＲ分類では、全身型、多関節型（ＲＦ陽性型）、多関節型（ＲＦ陰性型）、進展型少関節型、本発明者らの分類では、小児一次性慢性関節炎（ＳＰＲＡＳＨ症候群、小児特発性慢性関節炎（ａ．リウマトイド因子（ＲＦ）陽性型、ｂ．抗核抗体（ＡＮＡ）陽性型））である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項１４】
前記小児慢性関節炎が、ＡＲＡ分類では全身型、多関節型、ＥＵＬＡＲ分類では全身型、多関節型、ＩＬＡＲ分類では、全身型、多関節型（ＲＦ陽性型）、進展型少関節型、本発明者らの分類では、小児一次性慢性関節炎（ＳＰＲＡＳＨ症候群、小児特発性慢性関節炎（ａ．リウマトイド因子（ＲＦ）陽性型）である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の小児慢性関節炎治療剤。
【請求項１５】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分として含有するスティル病治療剤。
【請求項１６】
ＩＬ−６アンタゴニストがＩＬ−６受容体に対する抗体であることを特徴とする請求項１５記載のスティル病治療剤。
【請求項１７】
ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１６に記載のスティル病治療剤。
【請求項１８】
ＩＬ−６受容体に対する抗体がヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１７に記載のスティル病治療剤。
【請求項１９】
ＩＬ−６受容体に対する抗体がマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１７に記載のスティル病治療剤。
【請求項２０】
ＩＬ−６受容体に対する抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のスティル病治療剤。
【請求項２１】
ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＰＭ−１抗体であることを特徴とする請求項１８に記載のスティル病治療剤。
【請求項２２】
マウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体がＭＲ１６−１抗体であることを特徴とする請求項１９に記載のスティル病治療剤。
【請求項２３】
ＩＬ−６受容体に対する抗体がＩＬ−６受容体に対するキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のスティル病治療剤。
【請求項２４】
ＩＬ−６受容体に対するヒト型化抗体がヒト型化ＰＭ−１抗体であることを特徴とする請求項２３に記載のスティル病治療剤。
【請求項２５】
スティル病が成人スティル病であることを特徴とする請求項１５〜２４いずれかに記載のスティル病治療剤。
【請求項２６】
スティル病が小児のスティル病であることを特徴とする請求項１５〜２４いずれかに記載のスティル病治療剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はインターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分として含有する小児慢性関節炎関連疾患治療剤に関する。小児慢性関節炎関連疾患には、小児慢性関節炎及びスティル病等が含まれる。
背景技術
ＩＬ−６はＢ細胞刺激因子２（ＢＳＦ２）あるいはインターフェロンβ２とも呼称されたサイトカインである。ＩＬ−６は、Ｂリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４，７３−７６）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかになった（Ａｋｉｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５４，１−７８）。ＩＬ−６は、Ｔリンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている（Ｌｏｔｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６７，１２５３−１２５８）。
ＩＬ−６は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、ＩＬ−６が結合する分子量約８０ｋＤのリガンド結合性蛋白質のＩＬ−６受容体である（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，９６７−９８１，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２４１，８２５−８２８）。ＩＬ−６受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性ＩＬ−６受容体としても存在する。
もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０ｋＤの膜蛋白質ｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩＬ−６受容体はＩＬ−６／ＩＬ−６受容体複合体を形成し、次いでｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６の生物学的活性が細胞内に伝達される（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８９）５８，５７３−５８１）。
ＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６の生物学的活性の伝達を阻害する物質である。これまでに、ＩＬ−６に対する抗体（抗ＩＬ−６抗体）、ＩＬ−６受容体に対する抗体（抗ＩＬ−６受容体抗体）、ｇｐ１３０に対する抗体（抗ｇｐ１３０抗体）、ＩＬ−６改変体、ＩＬ−６又はＩＬ−６受容体部分ペプチド等が知られている。
抗ＩＬ−６受容体抗体に関しては、いくつかの報告がある（Ｎｏｖｉｃｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９１）１０，１３７−１４６、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９３）１２，６２１−６３０、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９５−０９８７３、フランス特許出願公開番号ＦＲ  ２６９４７６７、米国特許番号ＵＳ  ５２１６２８）。その一つであるマウス抗体ＰＭ−１（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３，２９００−２９０６）の相捕性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体へ移植することにより得られたヒト型化ＰＭ−１抗体が知られている（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９）。
小児慢性関節炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ）は、１６歳未満に発症する慢性関節炎を主体とする疾患であり、小児に起こる膠原病のうち最も多い疾患である。成人の慢性関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＲＡ））と異なりｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓな疾患とは言えずさまざまな病型を持つため、成人の慢性関節リウマチとは別の疾患として扱う傾向がある。
小児慢性関節炎の名称としては、日本においては米国の診断基準に従い「若年性関節リウマチ（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＪＲＡ））」が用いられてきたがヨーロッパにおいては主にＪｕｖｅｎｉｌｅ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＪＣＡ）が用いられていた。最近ではＩｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＩＣＡ）やＪｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＪＩＡ）などの名称もよく用いられている。
小児慢性関節炎の病型はさまざまな分類がなされており、アメリカリウマチ協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（ＡＣＲ））では１６歳未満の小児に発症する、６週間以上の持続する関節炎疾患として１）全身型（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｏｎｓｅｔ  ＪＲＡ）、２）多関節型（Ｐｏｌｙａｒｔｉｃｕｌａｒ）、３）少関節型（Ｐａｕｃｉａｒｔｉｃｕｌａｒ）との３病型に分類されている（ＡＲＡ分類）（ＪＲＡ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２０（Ｓｕｐｐｌ）１９５，１９７７）。また、ヨーロッパにおいてはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（ＥＵＬＡＲ）が、関節炎の持続期間が３ヶ月以上という点や、乾癬、強直性脊椎炎などを原因とする関節炎は除外する点などが上記ＡＲＡ分類とは異なるが、３病型は同様である分類を行っている（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ４，Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｂａｓｅｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｚｅｉｔｕｎｇ  ＡＧ，１９７７．）。
最近、この分類を見なおす動きがあり、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅａｇｕｅ  ｏｆ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（ＩＬＡＲ）は１９９５年にＩｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄの分類案を提案し（Ｆｉｎｋ  ＣＷ，Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｉａ  ｆｏｒ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，ｖｏｌ．２２，１５６６（１９９５））、さらに１９９７年にはその改定をＩＬＡＲ案として提案している（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ  ＴＲ，Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｖｏｌ．５６，７９（１９９７））。この分類では、１）全身型関節炎（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、２）多関節型（ＲＦ陽性型）（Ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＲＦ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、３）多関節型（ＲＦ陰性型）（Ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＲＦ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）、４）少関節型（Ｏｌｉｇｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、５）進展型少関節型（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、６）付着部炎関連関節炎（Ｅｎｔｈｅｓｉｔｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、７）乾癬関連関節炎（Ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、８）その他に分類されている。
さらに本発明者らは、小児慢性関節炎を、
１）小児一次性慢性関節炎（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ）
（１）ＳＰＲＡＳＨ症候群（ＳＰＲＡＳＨ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＳＰＲＡＳＨ：ｓｐｉｋｉｎｇ  ｆｅｖｅｒ，ｐｅｒｉｃａｒｄｉｔｉｓ，ｒａｓｈ，ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ，ｈｅｐａｔｏｍｅｇａｌｙ）
弛張熱と皮疹に始まり、漿膜炎、肝脾腫を見とめ、同時あるいは遅れて関節炎を併発するが関節炎を見とめない場合もある。
（２）小児特発性慢性関節炎（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ）
基礎疾患がなく、関節炎が病態の中心である。
ａ）リウマトイド因子（ＲＦ）陽性型
ｂ）抗核抗体（ＡＮＡ）陽性型
ｃ）ＲＦ／ＡＮＡ陰性型
２）小児二次性慢性関節炎（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ）
遺伝性、非遺伝性の原疾患に伴い関節炎が発現する。
と分類する方法を提案している（横田俊平、「小児慢性関節炎の最近の治療法の進歩」、リウマチ、３９巻、８６０、（１９９９））。
小児慢性関節炎には各種のサイトカインが関与していることが報告されている。特に炎症性のサイトカインであるＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αと抗炎症性サイトカインのＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ｓＴＮＦＲ（可溶性ＴＮＦレセプター）の不均衡が疾患と関連していると考えられている。
小児慢性関節炎の治療としては、非ステロイド系抗炎症剤、副腎皮質ステロイド薬、抗リウマチ剤（金剤など）、免疫抑制剤、メソトレキセート（ＭＴＸなど）が用いられてきた。しかし、患者によりその治療効果は一定していないため、さらに有効な治療法の開発が望まれている。
スティル病（Ｓｔｉｌｌ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、１８９７年英国の小児科医スティルにより報告された、成人の慢性関節リウマチと明らかに異なっている臨床像をもつ疾患として報告された小児から成人（成人では特に青年期）に発症する疾患であり、発熱、紅斑、関節炎、漿膜炎などを主症状とする。その中で成人発症例を成人スティル病（Ａｄｕｌｔ  ｏｎｓｅｔ  Ｓｔｉｌｌ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）と呼称している。スティル病ではリウマトイド因子は通常陰性である。
スティル病は小児においては、１６歳未満の小児に発生する慢性関節炎である若年性関節リウマチ（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＪＲＡ），ＪＣＡ（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ），Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＪＩＡ））のうちの全身発症型（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｔｙｐｅ）の別名である。スティル病の原因についてはウィルスなどの環境要因やＨＬＡなどの宿主要因および免疫異常などについての報告があるもののいまだ不明である。
成人スティル病と小児のスティル病は発症年齢以外に若干の臨床像の違いはあるもののほぼ同一疾患と考えられている。小児のスティル病は前述のように全身発症型のＪＲＡをさすものであるが、ＪＲＡと成人の関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，（ＲＡ））は臨床的にも異なる点が多いため別の疾患として扱われており、このことからも成人スティル病はリウマチ性の疾患の中で独立した疾患単位として扱われることが多い。
スティル病の診断基準としては、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．１９（３）：４２４−３０，１９９２）、Ｒｅｇｉｎａｔｏ（Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ．１７（１）３９−５７，１９８７）、Ｃｕｓｈ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｇｒａｎｄ  Ｒｏｕｎｄｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ；Ｊａｎ．３０，１９８４）、Ｇｏｌｄｍａｎ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７３：５５５−５６３，１９８０）らの基準が知られている。
スティル病とサイトカインの関係については、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０，ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γなどのサイトカインとの関係が報告されており、なかでもＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインとスティル病の病態には何らかの関連があると考えられている。
ＩＬ−６に関しては、ｄｅ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉらが小児スティル病において血清中ＩＬ−６の値が上昇しているという報告（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．Ｖｏｌ．３４，１１５８，１９９１）や、同じくｄｅ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉらにより、小児スティル病患者の血清中にはＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６レセプター（ｓＩＬ−６Ｒ）複合体が多く存在し、この複合体レベルとＣＲＰ値に相関関係が見られるという報告（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．９３，２１１４，１９９４）がなされている。また、Ｒｏｏｎｅｙらは小児スティル病患者では血漿中のＩＬ−６とＴＮＦ−αのレベルが上昇しているという報告（Ｂｒ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｖｏｌ．３４  ４５４，１９９５）をしている。
スティル病の治療法としては、非ステロイド系抗炎症剤、副腎皮質ステロイド薬、抗リウマチ剤（金剤など）、免疫抑制剤、γグロブリン製剤、メソトレキセート（ＭＴＸなど）が用いられてきた。しかし、患者によりその治療効果は一定していないため、さらに有効な治療法の開発が望まれている。
発明の開示
従って本発明は、従来の小児慢性関節炎関連疾患治療剤とは異るタイプの新規な小児慢性関節炎関連疾患治療剤を提供しようとするものである。本発明において、小児慢性関節炎関連疾患には、小児慢性関節炎及びスティル病が含まれる。
本発明者らは上記の課題を解決すべく、種々検討の結果、インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストが、小児慢性関節炎関連疾患治療効果を有することを見出し、本発明を完成した。
従って本発明は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分として含んで成る小児慢性関節炎関連疾患治療剤を提供する。
より具体的には、本発明は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分として含有する小児慢性関節炎治療剤を提供する。
本発明はさらに、インターロイキン−６（ＩＬ−６）アンタゴニストを有効成分として含有するスティル病治療剤を提供する。
発明の実施の形態
前記ＩＬ−６アンタゴニストは、好ましくはＩＬ−６受容体に対する抗体であり、好ましくはヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体又はマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体である。上記ヒトＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体としてはＰＭ−１抗体が例示され、またマウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体としてはＭＲ１６−１抗体が挙げられる。
前記の抗体は、好ましくは、キメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体であり、例えばヒト型化ＰＭ−１抗体である。
本発明の治療剤による治療の対象となる小児慢性関節炎としては、先のＡＲＡ、ＥＵＬＡＲ、ＩＬＡＲおよび発明者らの分類のすべての疾患が含まれる。血清学的診断法の進歩、治療法の進歩により、現在小児慢性関節炎の病型分類については世界的規模で見直しが進められており、いわば「病型分類の混乱期」にあるということができるが、本発明の治療剤の好ましい治療対象としては、ＡＲＡ分類では全身型、多関節型、少関節型、ＥＵＬＡＲ分類では全身型、多関節型、少関節型、ＩＬＡＲ分類では、全身型、多関節型（ＲＦ陽性型）、多関節型（ＲＦ陰性型）、少関節型、進展型少関節型、本発明者らの分類では、小児一次性慢性関節炎（ＳＰＲＡＳＨ症候群、小児特発性慢性関節炎（ａ．リウマトイド因子（ＲＦ）陽性型、ｂ．抗核抗体（ＡＮＡ）陽性型、ｃ．ＲＦ／ＡＮＡ陰性型））であり、特に好ましい治療対象としては、ＡＲＡ分類では全身型、多関節型、ＥＵＬＡＲ分類では全身型、多関節型、ＩＬＡＲ分類では全身型、多関節型（ＲＦ陽性型）、多関節型（ＲＦ陰性型）、進展型少関節型、本発明者らの分類では、小児一次性慢性関節炎（ＳＰＲＡＳＨ症候群、小児特発性慢性関節炎（ａ．リウマトイド因子（ＲＦ）陽性型、ｂ．抗核抗体（ＡＮＡ）陽性型））である。さらに最も好ましい治療対象としてはＡＲＡ分類では全身型、多関節型、ＥＵＬＡＲ分類では全身型、多関節型、ＩＬＡＲ分類では全身型、多関節型（ＲＦ陽性型）、進展型少関節型、本発明者らの分類では、小児一次性慢性関節炎（ＳＰＲＡＳＨ症候群、小児特発性慢性関節炎（ａ．リウマトイド因子（ＲＦ）陽性型）があげられる。
本発明で使用されるＩＬ−６アンタゴニストは、小児慢性関節炎関連疾患治療効果を示すものであれば、その由来、種類および形状を問わない。
ＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する物質である。ＩＬ−６アンタゴニストは、好ましくはＩＬ−６、ＩＬ−６受容体及びｇｐ１３０のいずれかの結合に対する阻害作用を有する物質である。ＩＬ−６アンタゴニストとしては、例えば抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ｇｐ１３０抗体、ＩＬ−６改変体、可溶性ＩＬ−６受容体改変体あるいはＩＬ−６又はＩＬ−６受容体の部分ペプチドおよび、これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられる。
本発明で使用される抗ＩＬ−６抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＩＬ−６抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＩＬ−６と結合することにより、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害してＩＬ−６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、ＭＨ１６６（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１８，９５１−９５６）やＳＫ２抗体（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，第２１回  日本免疫学会総会、学術記録（１９９１）２１，１６６）等が挙げられる。
抗ＩＬ−６抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＩＬ−６を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗ＩＬ−６抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＩＬ−６は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）１６８，５４３−５５０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４０，１５３４−１５４１、あるいはＡｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）５４，２６８５−２６８８に開示されたＩＬ−６遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
ＩＬ−６の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＩＬ−６蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ＩＬ−６蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、ＩＬ−６蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＩＬ−６受容体抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＩＬ−６受容体と結合することにより、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害してＩＬ−６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、ＭＲ１６−１抗体（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０，１１９２４−１１９２８）、ＰＭ−１抗体（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３，２９００−２９０６）、ＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体あるいはＡＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９）などが挙げられる。これらのうちで、特に好ましい抗体としてＰＭ−１抗体が挙げられる。
なお、ＰＭ−１抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、ＰＭ−１として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成２年７月１０日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９９８としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。また、ＭＲ１６−１抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、Ｒａｔ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＭＲ１６−１として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成９年３月１３日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８７５としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＩＬ−６受容体を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗ＩＬ−６受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＩＬ−６受容体は、欧州特許出願公開番号ＥＰ  ３２５４７４に、マウスＩＬ−６受容体は日本特許出願公開番号特開平３−１５５７９５に開示されたＩＬ−６受容体遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
ＩＬ−６受容体蛋白質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱しているもの（可溶性ＩＬ−６受容体）（Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１０８，６７３−６７６）との二種類がある。可溶性ＩＬ−６受容体抗体は細胞膜に結合しているＩＬ−６受容体の実質的に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６受容体と異なっている。ＩＬ−６受容体蛋白質は、本発明で用いられる抗ＩＬ−６受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、いずれのＩＬ−６受容体を使用してもよい。
ＩＬ−６受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＩＬ−６受容体蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ＩＬ−６受容体蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、ＩＬ−６受容体を発現している細胞やＩＬ−６受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
ヒトＩＬ−６受容体をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＩＢＩＢＳＦ２Ｒを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、平成元年（１９８９年）１月９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＨＢ１０１−ｐＩＢＩＢＳＦ２Ｒとして、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３２としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
本発明で使用される抗ｇｐ１３０抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ｇｐ１３０抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６／ＩＬ−６受容体複合体のｇｐ１３０への結合を阻害してＩＬ−６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、ＡＭ６４抗体（特開平３−２１９８９４）、４Ｂ１１抗体および２Ｈ４抗体（ＵＳ  ５５７１５１３）Ｂ−Ｓ１２抗体およびＢ−Ｐ８抗体（特開平８−２９１１９９）などが挙げられる。
抗ｇｐ１３０モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ｇｐ１３０を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるｇｐ１３０は、欧州特許出願公開番号ＥＰ  ４１１９４６に開示されたｇｐ１３０遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
ｇｐ１３０の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のｇｐ１３０蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ｇｐ１３０受容体蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、ｇｐ１３０を発現している細胞やｇｐ１３０蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７、ＷＯ  ９２／０３９１８、ＷＯ  ９４／０２６０２、ＷＯ  ９４／２５５８５、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
例えば、抗ＩＬ−６受容体抗体産生ハイブリドーマの作製は、特開平３−１３９２９３に開示された方法により行うことができる。工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成２年７月１０日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９９８としてブタペスト条約に基づき国際寄託されたＰＭ−１抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入して腹水を得、この腹水からＰＭ−１抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、１０％ウシ胎児血清、５％ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地、ハイブリドーマＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）、ＰＦＨＭ−ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）等で培養し、その培養上清からＰＭ−１抗体を精製する方法で行うことができる。
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト（ｈｕｍａｎ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
例えば、キメラＰＭ−１抗体のＬ鎖およびＨ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、各々ｐＰＭ−ｋ３およびｐＰＭ−ｈ１と命名され、このプラスミドを有する大腸菌は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄに、１９９１年２月１１日に、各々ＮＣＩＭＢ  ４０３６６及びＮＣＩＭＢ４０３６２としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体、ヒト型化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。ヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
本発明に使用されるヒト型化抗体の好ましい具体例としては、ヒト型化ＰＭ−１抗体が挙げられる（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングにによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列をを適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考にすることができる。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、ＳＶ  ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８−１１４）、また、ＨＥＦ１αロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９−４３８３）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
複製起源としては、ＳＶ  ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏなど、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにて抗体を産生してもよい。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｍａｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
上述のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４−１１５２３参照）。
本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖又は、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖又は、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、ｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ；ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用し得る。また、逆相ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ）を用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はＥＬＩＳＡ等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、ＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５  ＯＤとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＴＡＧ製）１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ製）１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
本発明で使用されるＩＬ−６改変体は、ＩＬ−６受容体との結合活性を有し、且つＩＬ−６の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＩＬ−６改変体はＩＬ−６受容体に対しＩＬ−６と競合的に結合するが、ＩＬ−６の生物学的活性を伝達しないため、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断する。
ＩＬ−６改変体は、ＩＬ−６のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入して作製される。ＩＬ−６改変体のもととなるＩＬ−６はその由来を問わないが、抗原性等を考慮すれば、好ましくはヒトＩＬ−６である。
具体的には、ＩＬ−６のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、ＷＨＡＴＩＦ（Ｖｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ（１９９０）８，５２−５６）を用いてその二次構造を予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒトＩＬ−６遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるＰＣＲ法によりアミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、ＩＬ−６改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じてＩＬ−６改変体を得ることができる。
ＩＬ−６改変体の具体例としては、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９，８６−９３、及びＳａｖｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９４）１３，１３５７−１３６７、ＷＯ  ９６−１８６４８、ＷＯ９６−１７８６９に開示されている。
本発明で使用されるＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドは、各々ＩＬ−６受容体あるいはＩＬ−６との結合活性を有し、且つＩＬ−６の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドはＩＬ−６受容体又はＩＬ−６に結合し、これらを捕捉することによりＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を特異的に阻害する。その結果、ＩＬ−６の生物学的活性を伝達しないため、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断する。
ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドは、ＩＬ−６又はＩＬ−６受容体のアミノ酸配列においてＩＬ−６とＩＬ−６受容体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常１０〜８０、好ましくは２０〜５０、より好ましくは２０〜４０個のアミノ酸残基からなる。
ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドは、ＩＬ−６又はＩＬ−６受容体のアミノ酸配列において、ＩＬ−６とＩＬ−６受容体との結合に係わる領域を特定し、その一部又は全部のアミノ酸配列を通常知られる方法、例えば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
ＩＬ−６部分ペプチド又はＩＬ−６受容体部分ペプチドをペプチド合成法により作製するには、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。
具体的には、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成  監修矢島治明廣川書店１９９１年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しようとするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を結合させ、α−アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸をＣ末端からＮ末端方向の順番に１アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はペプチドのα−アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種類によりＢｏｃ法とＦｍｏｃ法に大別される。
このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応をする。ペプチド鎖との切断反応には、Ｂｏｃ法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、又Ｆｍｏｃ法ではＴＦＡを通常用いることができる。Ｂｏｃ法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をアニソール存在下で処理する。次いで、保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチドを回収する。これを凍結乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、Ｆｍｏｃ法では、例えばＴＦＡ中で上記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行うことができる。
得られた粗ペプチドは、ＨＰＬＣに適用することにより分離、精製することができる。その溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水−アセトニトリル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分について、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解析等により同定する。
ＩＬ−６部分ペプチド及びＩＬ−６受容体部分ペプチドの具体例は、特開平２−１８８６００、特開平７−３２４０９７、特開平８−３１１０９８及び米国特許公報ＵＳ  ５２１００７５に開示されている。
本発明で使用されるＩＬ−６アンタゴニストのＩＬ−６シグナル伝達阻害活性は、通常用いられる方法により評価することができる。具体的には、ＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫株（Ｓ６Ｂ４５，ＫＰＭＭ２）、ヒトレンネルトＴリンパ腫細胞株ＫＴ３、あるいはＩＬ−６依存性細胞ＭＨ６０．ＢＳＦ２を培養し、これにＩＬ−６を添加し、同時にＩＬ−６アンタゴニストを共存させることによりＩＬ−６依存性細胞の３Ｈ−チミジン取込みを測定すればよい。また、ＩＬ−６受容体発現細胞であるＵ２６６を培養し、１２５Ｉ標識ＩＬ−６を添加し、同時にＩＬ−６アンタゴニストを加えることにより、ＩＬ−６受容体発現細胞に結合した１２５Ｉ標識ＩＬ−６を測定する。上記アッセイ系において、ＩＬ−６アンタゴニストを存在させる群に加えＩＬ−６アンタゴニストを含まない陰性コントロール群をおき、両者で得られた結果を比較すればＩＬ−６アンタゴニストのＩＬ−６阻害活性を評価することができる。
後述の実施例に示されるように、抗ＩＬ−６受容体抗体の投与により、小児慢性関節炎患者において、治療効果が認められたことから、抗ＩＬ−６受容体抗体等のＩＬ−６アンタゴニストは小児慢性関節炎関連疾患治療剤として有用であることが示唆された。
本発明における治療対象は哺乳動物である。治療対象の哺乳動物は、好ましくはヒトである。
本発明の小児慢性関節炎関連疾患治療剤は、経口的にまたは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗ＩＬ−６レセプター抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．５ｍｇから４０ｍｇ、好ましくは１ｍｇから２０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、病状の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
本発明の小児慢性関節炎関連疾患治療剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
実施例
以下、実施例および参考例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１．
以下の経過を有する全身型若年性関節リウマチ患者（５歳、男性）に対し、ＭＲＡ治療を行った。
治療前の経過
弛張熱（連日〜４０℃の一峰性発熱）、両膝関節痛、皮疹にて発症。白血球増多、抗核抗体陰性、リウマトイド因子陰性、赤沈値亢進、ＣＲＰ高値などから診断後、アスピリン投与が開始されたが弛張熱、関節炎の改善は認められず全身状態の悪化が進行した。そこで、大量ステロイド薬（プレドニゾロン３０ｍｇ／日）の経口投与に切り替え諸症状の改善を見た。しかしプレドニゾロン漸減に伴い１０ｍｇ／日量で再燃し、再入院し、メチルプレドニゾロン（ｍＰＳＬ）パルス療法および血漿交換療法、さらにシクロスポリンＡ（Ｃｓ  Ａ）の併用を行ったが改善を認めず、炎症症状が強く（白血球数２５４００／μＬ、ＣＲＰ  １１．２ｍｇ／ｄＬ）、血漿交換療法＋ｍＰＳＬパルス療法＋Ｃｓ  Ａにて見解に入った、後療法としてプレドニゾロン＋フロベンにて弛張熱のコントロールを行い、臨床的には解熱をみたが、血液炎症所見は高値を維持したままで経過し（ＣＲＰ＞５ｍｇ／ｄＬ）、退院以後、周期的に弛張熱をみたが外来中心の治療観察を行っていた。しかし、発熱時に増強する背部痛を訴えるようになり、ＭＢＩなどの精査の結果、第４〜５胸椎破壊傷が認められ、ステロイドによる圧迫骨折と考えられた。胸椎への免荷を必要とすることから、約１年間にわたりベット上安静状態が続き、下肢筋肉が著しく衰え歩行が全く不能の状態に至った。プレドニゾロン＋フロベン＋Ｃｓ  Ａの三者療法が継続されているが、ＣＲＰは５ｍｇ／ｄＬ以下に低下することなかった。
治療の結果
２ｍｇ／ｋｇから投与を開始したが特に副作用は見られなかったため、４ｍｇ／ｋｇに増量し、週１回の投与を行った。それまで認められた発熱はすみやかに消失し、ＣＲＰは約２週間後に陰性化した。全身倦怠感もとれ、患者に活気が見られるようになった。プレドニゾロンも徐々に減量が可能となり、１ｍｇ／日まで減量している。
以上の結果より、ＭＲＡはアスピリン、フロベンなどの非ステロイド性抗炎症薬、長期大量のステロイド薬（プレドニン、メドロールなど）、シクロスポリンＡ、メトトレキサートなどの免疫抑制薬でも病状を抑制できなかった小児慢性関節炎の治療に有用であることが明らかになった。したがって、ＩＬ−６アンタゴニスト、特に抗ＩＬ−６レセプター抗体は小児慢性関節炎、特にＡＲＡ分類の全身型、ＥＵＬＡＲ分類の全身型、ＩＬＡＲ分類の全身型、発明者らの分類のＳＰＲＡＳＨ症候群の小児慢性関節炎の治療剤として有用であるということができる。
実施例２．
２２歳女性。１９９８年４月、大腿・前胸部・手指に点状紅斑出現、５月には肩・肘・膝関節痛、３８℃台の発熱が出現した。非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）が開始されたが発熱は持続し、７月には白血球数１８１００／μｌ，ＣＲＰ  １８．３ｍｇ／ｄｌ，血清フェリチン４４０ｎｇ／ｍｌであり、成人スティル病と診断された。２０００年１月初めより３９℃台の発熱及び関節痛出現し、成人スティル病の再燃（ＣＲＰ１５．８ｍｇ／ｄｌ、フェリチン２０５．８ｎｇ／ｍｌ）と考えられた。
ステロイド減量困難なため、メソトレキセート（ＭＴＸ）およびシクロスポリン（ＣｓＡ）を併用したものの病勢は抑制できず。病勢の進行から呼吸状態が悪化し、人工呼吸管理となった。ステロイドパルス療法にて病勢は改善状態にあったが重症骨粗鬆症を合併していることもあり、ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体（ＭＲＡ）治療を開始した。ＭＲＡ  ２００ｍｇを２週間ごとに点滴にて静脈内注射した。炎症反応は投与６日後には陰性化し、副腎皮質ステロイド薬の減量も順調に進行し、重篤な副作用も認められなかった。
以上の結果より、ＭＲＡはＭＴＸとＣｓＡの併用でも病状を抑制できなかった成人スティル病の治療に有用であることが明らかになった。したがって、ＩＬ−６アンタゴニスト、特に抗ＩＬ−６レセプター抗体はスティル病特に成人スティル病の治療剤として有用であるということができる。
参考例１．ヒト可溶性ＩＬ−６受容体の調製
Ｙａｍａｓａｋｉらの方法（Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１，８２５−８２８）に従い得られたＩＬ−６受容体をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳＦ２Ｒ．２３６を用いて、ＰＣＲ法により可溶性ＩＬ−６受容体を作成した。プラスミドｐＢＳＦ２Ｒ．２３６を制限酵素Ｓｐｈ  Ｉで消化して、ＩＬ−６受容体ｃＤＮＡを得、これをｍｐ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に挿入した。ＩＬ−６受容体ｃＤＮＡにストップコドンを導入するようにデザインした合成オリゴプライマーを用いて、インビトロミュータジェネシスシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）により、ＰＣＲ法でＩＬ−６受容体ｃＤＮＡに変異を導入した。この操作によりストップコドンがアミノ酸３４５の位置に導入され、可溶性ＩＬ−６受容体をコードするｃＤＮＡが得られた。
可溶性ＩＬ−６受容体ｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で発現するために、プラスミドｐＳＶ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）と連結させ、プラスミドｐＳＶＬ３４４を得た。ｄｈｆｒのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒにＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓａｌ  Ｉで切断した可溶性ＩＬ−６受容体ｃＤＮＡを挿入し、ＣＨＯ細胞発現プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３４４を得た。
１０μｇのプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３４４をｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞株ＤＸＢ−１１（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）へカルシウムフォスフェイト沈降法（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）７，２７４５−２７５１）により、トランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を１ｍＭグルタミン、１０％透析ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むヌクレオシド不含αＭＥＭ選択培養液で３週間培養した。
選択されたＣＨＯ細胞を限界希釈法でスクリーニングし、単一のＣＨＯ細胞クローンを得た。このＣＨＯ細胞クローンを２０ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のメトトレキセートで増幅し、ヒト可溶性ＩＬ−６受容体産生ＣＨＯ細胞株５Ｅ２７を得た。ＣＨＯ細胞株５Ｅ２７を５％ＦＢＳを含むイスコーブ改変ダルベコ培養液（ＩＭＤＭ、Ｇｉｂｃｏ製）で培養した。培養上清を回収し、培養上清中の可溶性ＩＬ−６受容体の濃度をＥＬＩＳＡにて測定した。その結果、培養上清中には可溶性ＩＬ−６受容体が存在することが確認された。
参考例２．抗ヒトＩＬ−６抗体の調製
１０μｇの組換型ＩＬ−６（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９８８）１７，４１）をフロイント完全アジュバントとともにＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、血清中に抗ＩＬ−６抗体が検出できるまで一週間毎にこれを続けた。局部のリンパ節から免疫細胞を摘出し、ポリエチレングリコール１５００を用いてミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させた。ハイブリドーマをＨＡＴ培養液を用いるＯｉらの方法（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，３５１，１９８０）に従って選択し、抗ヒトＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
抗ヒトＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマは下記のようにしてＩＬ−６結合アッセイをおこなった。すなわち、柔軟なポリビニル製の９６穴マイクロプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製，Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，ＶＡ）を０．１Ｍのｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．６）中で１００μｌのヤギ抗マウスＩｇ（１０μｌ／ｍｌ，Ｃｏｏｐｅｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ製Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）により４℃で一晩コートした。次いで、プレートを１００μｌの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳにより室温で２時間処理した。
これをＰＢＳで洗浄した後、１００μｌのハイブリドーマ培養上清を各穴へ加え、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを洗浄して、２０００ｃｐｍ／０．５ｎｇ／ｗｅｌｌとなるように１２５Ｉ標識組換型ＩＬ−６を各穴へ添加し、洗浄した後各穴の放射活性をガンマカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇａｍｍａ  ９０００，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で測定した。２１６ハイブリドーマクローンのうち３２のハイブリドーマクローンがＩＬ−６結合アッセイにより陽性であった。これらのクローンのなかで最終的に安定なＭＨ１６６．ＢＳＦ２が得られた。該ハイブリドーマが産生する抗ＩＬ−６抗体ＭＨ１６６はＩｇＧ１κのサブタイプを有する。
ついで、ＩＬ−６依存性マウスハイブリドーマクローンＭＨ６０．ＢＳＦ２を用いてＭＨ１６６抗体によるハイブリドーマの増殖に関する中和活性を調べた。ＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を１×１０４／２００μｌ／穴となるように分注し、これにＭＨ１６６抗体を含むサンプルを加え、４８時間培養し、０．５μＣｉ／穴の３Ｈチミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を加えた後、更に６時間培養を続けた。細胞をグラスフィルターペーパー上におき、自動ハーベスター（Ｌａｂｏ  Ｍａｓｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で処理した。コントロールとしてウサギ抗ＩＬ−６抗体を用いた。
その結果、ＭＨ１６６抗体はＩＬ−６により誘導されるＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞の３Ｈチミジンの取込みを容量依存的に阻害した。このことより、ＭＨ１６６抗体はＩＬ−６の活性を中和することが明らかとなった。
参考例３．抗ヒトＩＬ−６受容体抗体の調製
Ｈｉｒａｔａらの方法（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３，２９００−２９０６）により作成した抗ＩＬ−６受容体抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させたセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と添付の処方にしたがって結合させ、ＩＬ−６受容体（Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１，８２５−８２８）を精製した。ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を１％ジギトニン（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製），１０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．８）および０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１ｍＭ  ｐ−パラアミノフェニルメタンスルフォニルフルオライドハイドロクロリド（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化し、セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合した。その後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回洗浄し、免疫するための部分精製ＩＬ−６受容体とした。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを３×１０９個のＵ２６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６受容体で１０日おきに４回免疫し、その後常法によりハイブリドーマを作成した。成長陽性穴からのハイブリドーマ培養上清を下記の方法にてＩＬ−６受容体への結合活性を調べた。５ラ１０７個のＵ２６６細胞を３５Ｓ−メチオニン（２．５ｍＣｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可溶化した。可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ｍｌ容量のセファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合し、その後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２５ｍｌのジギトニン緩衝液（ｐＨ３．４）により３５Ｓ−メチオニン標識ＩＬ−６受容体を流出させ、０．０２５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）で中和した。
０．０５ｍｌのハイブリドーマ培養上清を０．０１ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇセファロース（Ｐｈｒａｍａｃｉａ製）と混合した。洗浄した後、セファロースを上記で調製した０．００５ｍｌの３５Ｓ標識ＩＬ−６受容体溶液とともにインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＩＬ−６受容体と反応するハイブリドーマ培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリドーマクローンＰＭ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９９８）を樹立した。ハイブリドーマＰＭ−１から産生される抗体は、ＩｇＧ１κのサブタイプを有する。
ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体のヒトＩＬ−６受容体に対するＩＬ−６の結合阻害活性をヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組換型ＩＬ−６を大腸菌より調製し（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９８８）１７，４１−４５）、ボルトン−ハンター試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により１２５Ｉ標識した（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，９６７−９８１）。
４×１０５個のＵ２６６細胞を１時間、７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養上清および１４０００ｃｐｍの１２５Ｉ標識ＩＬ−６とともに培養した。７０μｌのサンプルを４００μｌのマイクロフュージポリエチレンチューブに３００μｌのＦＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定した。
その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体は、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体に対する結合を阻害することが明らかとなった。
参考例４．抗マウスＩＬ−６受容体抗体の調製
Ｓａｉｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７，１６８−１７３に記載の方法により、マウスＩＬ−６受容体に対するモノクローナル抗体を調製した。
マウス可溶性ＩＬ−６受容体を産生するＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液で培養し、その培養上清から抗マウスＩＬ−６受容体抗体ＲＳ１２（上記Ｓａｉｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ参照）をＡｆｆｉｇｅｌ  １０ゲル（Ｂｉｏｒａｄ製）に固定したアフィニティーカラムを用いてマウス可溶性ＩＬ−６受容体を精製した。
得られたマウス可溶性ＩＬ−６受容体５０μｇをフロイント完全アジュバンドと混合し、ウィスターラットの腹部に注射した。２週間後からはフロイント不完全アジュバンドで追加免疫した。４５日目にラット脾臓細胞を採取し、２×１０８個を１×１０７個のマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と５０％のＰＥＧ１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）をもちいて常法により細胞融合させた後、ＨＡＴ培地にてハイブリドーマをスクリーニングした。
ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ製）をコートしたプレートにハイブリドーマ培養上清を加えた後、マウス可溶性ＩＬ−６受容体を反応させた。次いで、ウサギ抗マウスＩＬ−６受容体抗体およびアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧによるＥＬＩＳＡ法によりマウス可溶性ＩＬ−６受容体に対する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。抗体の産生が確認されたハイブリドーマクローンは２回のサブスクリーニングを行い、単一のハイブリドーマクローンを得た。このクローンをＭＲ１６−１と名付けた。
このハイブリドーマが産生する抗体のマウスＩＬ−６の情報伝達における中和活性をＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１８，９５１−９５６）を用いた３Ｈチミジンの取込みで調べた。９６ウェルプレートにＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を１ラ１０４個／２００μｌ／ウェルとなるように調製した。このプレートに１０ｐｇ／ｍｌのマウスＩＬ−６とＭＲ１６−１抗体又はＲＳ１２抗体を１２．３〜１０００ｎｇ／ｍｌ加えて３７℃、５％ＣＯ２で４４時間培養した後、１μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジンを加えた。４時間後に３Ｈチミジンの取込みを測定した。その結果ＭＲ１６−１抗体はＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞の３Ｈチミジン取込みを抑制した。
したがって、ハイブリドーマＭＲ１６−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８７４）が産生する抗体は、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体に対する結合を阻害することが明らかとなった。
【国際調査報告】
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