(57)【要約】本発明は、ＥＴＳ転写因子、より詳細にはＥＴＳ転写因子ＭＥＦが強い抗細胞増殖作用、及びＭＭＰ産生抑制作用を有することを見出し、ＥＴＳ転写因子ＭＥＦ又はそれをコードする遺伝子を用いた新規な細胞増殖抑制剤、より詳細には新規抗腫瘍治療薬ならびに新規抗リュウマチ治療薬を提供する。本発明は、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなる細胞増殖抑制剤に関する。また、本発明は、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ、ＭＭＰ）、より詳細にはＭＭＰ−９産生抑制剤、又はＩＬ−８産生抑制剤に関する。
2002064165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなる細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
ＥＴＳ転写因子又はそれをコードする遺伝子が、ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子である請求の範囲第１項に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
ＥＴＳ転写因子又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である請求の範囲第１項又は第２項に記載の発現調節剤。
【請求項４】
ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質が、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列、又はその１個若しくは２個以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求の範囲第２項又は第３項に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子が、配列表の配列番号２に記載のヌクレオチド配列、若しくはその１又は２以上のヌクレオチドが置換、欠失、または付加されたヌクレオチド配列、又はこれらのヌクレオチド配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有する遺伝子である請求の範囲第２項又は第３項に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
細胞が、上皮細胞である請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
細胞が、ガン細胞である請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
細胞が、滑膜細胞である請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
細胞増殖抑制剤が、抗腫瘍剤である請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１０】
細胞増殖抑制剤が、抗リウマチ剤である請求の範囲第１項〜第６項又は請求の範囲第８項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１１】
ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又はＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるＭＭＰ産生抑制剤、又はＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項１２】
ＭＭＰが、ＭＭＰ−９である請求の範囲第１１項に記載のＭＭＰ産生抑制剤。
【請求項１３】
ＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞のＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
ＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子が、ＭＥＦタンパク質をコードする遺伝子である請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤の有効成分となり得る物質をスクリーニングするための方法である請求の範囲第１３項又は第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗腫瘍剤。
【請求項１７】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である請求の範囲第１６項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１８】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、請求の範囲第１３項〜第１５項のいずれかに記載の方法により得られた物質である請求の範囲第１６項又は第１７項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１９】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗リウマチ剤。
【請求項２０】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である請求の範囲第１９項に記載の抗リウマチ剤。
【請求項２１】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、請求の範囲第１３項〜第１５項のいずれかに記載の方法により得られた物質である請求の範囲第１９項又は第２０項に記載の抗リウマチ剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明者らは、遺伝子転写調節活性を有するＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質、より詳細には、転写調節タンパク質Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｅｌｆ−１  ｌｉｋｅ  Ｆａｃｔｏｒ（以下、ＭＥＦまたはＭＥＦタンパク質という）、およびそれをコードする遺伝子、又はＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質がガン細胞増殖抑制作用、滑膜線維芽細胞増殖抑制作用などの細胞増殖抑制作用を有することを見出した。したがって、本発明は、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質、より詳細にはＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子、からなる細胞増殖抑制剤に関する。また、本発明は、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はそれらの作用を調節する物質、より詳細にはＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子又はそれらの作用を調節する物質、からなるマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ、ＭＭＰ）、より詳細にはＭＭＰ−９産生抑制剤、及びＩＬ−８産生抑制剤に関する。また本発明は、これらの作用に基づく細胞増殖抑制剤、抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤、及び、これらの有効成分となり得る物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
細胞は秩序ある増殖の後、その増殖は停止する機構を持っている。しかし、ガン細胞は秩序を逸脱し、無限増殖を遂げ、正常組織にまで浸潤し、正常組織の機能を破壊する。従ってこれら逸脱した無限増殖に秩序を提供する、もしくは正常組織への浸潤を抑制することによってその増殖を停止させる−すなわち死滅させることがガンの治療には必要である。
今日までに、シスプラチン、５−フルオロウラシルに代表される抗腫瘍治療薬および放射線療法や外科的切除による抗腫瘍治療法が開発されてきたが、その効果および副作用の面における問題が指摘されている。前者は腫瘍細胞と正常細胞に及ぼす質的な差異が少ないことから、抗腫瘍効果の高いものほど副作用が重篤である。さらに、癌の種類によっては薬剤に対して感受性が異なることから、抗腫瘍治療薬の使用には十分な注意が必要である。また後者は、一時的に腫瘍細胞を選択的に切除または死滅させるため非常に効果が高い治療法である一方、目に見えない腫瘍細胞を標的とする治療が不可能であるため、常に再発の危険性を秘めている。そこで、上記治療法および治療薬に代わり、サイトカイン、細胞周期調節因子、転写因子等をコードする遺伝子を用いた抗腫瘍治療の試みが行われている。
ところで、転写因子は細胞における遺伝子発現を調節するのみならず、分化・増殖を含めた細胞の機能をも調節する。従って、細胞の機能−すなわち無限増殖、正常細胞への浸潤および正常組織の破壊などガン細胞の機能を調節する転写因子を用い遺伝子治療に用いることが可能である。ＥＴＳ（Ｅ２６  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）転写因子群は、ショウジョウバエからヒトまで約５０種が報告され、相同性が高い８５アミノ酸からなるＤＮＡ結合領域を持ち、ＥＴＳ転写因子群が結合する塩基配列（以下、ＥＴＳ結合部位という）を共通して認識し、血球系細胞に特異的に発現する遺伝子の発現調節を行うことが知られている。また、ＥＴＳ転写因子群は遺伝子の発現調節活性を持つのみならず、血球系細胞をはじめ多くの細胞の分化・増殖・機能発現に対する関与が報告されている。癌細胞においても癌細胞の増殖や抑制にＥＴＳ転写因子が関与しているかもしれない。
単球・マクロファージやリンパ球にのみ発現するＥＴＳ転写因子ＰＵ．１は、ＤＭＳＯ刺激における分化において、白血病細胞に高発現させることによってアポトーシスによる細胞死を誘導することが報告された（Ｋｉｈａｒａ−Ｎｅｇｉｓｈｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７６（４），５２３−５３０，１９９８）。さらに、ガン細胞の無限増殖の阻害は、ガン細胞の浸潤転移および血管新生への関与が報告されているマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ、以下ＭＭＰという）類の産生分泌、またはその活性を抑制することにより可能である。そして、上記ＥＴＳ転写因子ＰＵ．１が、ＭＭＰ−１のプロモーター活性を他の転写因子に比べ劇的に抑制することが報告された（Ｋａｈａｒｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４（２２），２６５１−２６６０，１９９７）。
発明の開示
本発明は、ＥＴＳ転写因子、より詳細にはＥＴＳ転写因子ＭＥＦが強い抗細胞増殖作用、ＭＭＰ産生抑制作用、及びＩＬ−８産生抑制作用を有することを見出し、ＥＴＳ転写因子ＭＥＦ又はそれをコードする遺伝子を用いた新規な細胞増殖抑制剤、より詳細には新規抗腫瘍治療薬ならびに新規抗リウマチ治療薬を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、上記ＥＴＳ転写因子に関して鋭意検討した結果、ＥＴＳ転写因子ＭＥＦを安定高発現させたガン細胞は親細胞に対し著明にＭＭＰ−９活性が低く、ヌードマウスに移植した際、顕著に腫瘍の増殖を抑制することを見いだした。更に滑膜線維芽細胞の増殖に対して顕著な抑制作用を示した。
すなわち、本発明は以下１〜２１に記載の事項を提供する。
１．ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなる細胞増殖抑制剤。
２．ＥＴＳ転写因子又はそれをコードする遺伝子が、ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子である前記１に記載の細胞増殖抑制剤。
３．ＥＴＳ転写因子又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である前記１又は２に記載の発現調節剤。
４．ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質が、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列、又はその１個若しくは２個以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である前記２又は３に記載の細胞増殖抑制剤。
５．ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子が、配列表の配列番号２に記載のヌクレオチド配列、若しくはその１又は２以上のヌクレオチドが置換、欠失、または付加されたヌクレオチド配列、又はこれらのヌクレオチド配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有する遺伝子である前記２又は３に記載の細胞増殖抑制剤。
６．細胞が、上皮細胞である前記１〜５のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
７．細胞が、ガン細胞である前記１〜６のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
８．細胞が、滑膜細胞である前記１〜６のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
９．細胞増殖抑制剤が、抗腫瘍剤である前記１〜７のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
１０．細胞増殖抑制剤が、抗リウマチ剤である前記１〜６又は前記８のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
１１．ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又はＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるＭＭＰ産生抑制剤、又はＩＬ−８産生抑制剤。
１２．ＭＭＰが、ＭＭＰ−９である前記１１に記載のＭＭＰ産生抑制剤。
１３．ＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞のＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法。
１４．ＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子が、ＭＥＦタンパク質をコードする遺伝子である前記１３に記載の方法。
１５．抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤の有効成分となり得る物質をスクリーニングするための方法である前記１３又は１４に記載の方法。
１６．ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗腫瘍剤。
１７．ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である前記１６に記載の抗腫瘍剤。
１８．ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、前記１３〜１５のいずれかに記載の方法により得られた物質である前記１６又は１７に記載の抗腫瘍剤。
１９．ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗リウマチ剤。
２０．ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である前記１９に記載の抗リウマチ剤。
２１．ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、前記１３〜１５のいずれかに記載の方法により得られた物質である前記１９又は２０に記載の抗リウマチ剤。
即ち、本発明は、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質、及び製薬上許容される担体からなる医薬組成物、より詳細には上皮細胞における細胞増殖抑制剤として有用な医薬組成物、当該医薬組成物の有効量を良性又は悪性の腫瘍やリウマチなどの細胞の増殖を抑制しなければならない疾患を有する患者に投与することからなる細胞の増殖を抑制しなければならない疾患を治療、予防又は処置する方法、及び、当該医薬組成物を製造するためのＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質の使用に関する。
また、本発明は、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤、より詳細には上皮細胞における抗腫瘍剤、又は抗リウマチ剤に関する。
また、本発明は、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子、又はＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるＭＭＰ産生抑制剤、より詳細にはＭＭＰ−９産生抑制剤、及びＩＬ−８産生抑制剤に関する。
さらに本発明は、ＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞のＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法、及び当該方法によりスクリーニングされた細胞増殖を抑制、好ましくは上皮細胞における細胞増殖を抑制することができる物質に関する。
本発明の好ましいＥＴＳ転写因子又はそれをコードする遺伝子としては、ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子が挙げられる。
以下に、本発明について詳細に説明する。
（ＭＥＦタンパク質およびＭＥＦ遺伝子）
ＭＥＦは１９９６年、Ｍｉｙａｚａｋｉらによってヒト巨核球細胞株であるＣＭＫのｍＲＮＡから単離されたＥＴＳ転写因子群に属する６６３アミノ酸、分子量約１００ｋＤａの転写因子である。（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，１７２１−１７２９，１９９６）。本発明者らはすでに、血球系細胞におけるＥＴＳ転写因子ＰＵ．１の機能、すなわち該細胞におけるリゾチームの発現調節を行うごとく、ＭＥＦが上皮細胞におけるリゾチームの発現調節を行うことを明らかにした（Ｋａｉ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（２９），２００９８−２０１０２，１９９９）。すなわち、血球系細胞においてＰＵ．１により調節される機能は、上皮細胞においてはＥＴＳ転写因子ＭＥＦにより調節される可能性が示唆される。そこで、上皮細胞系ガン細胞にＭＥＦを安定高発現させ、ヌードマウスに移植した該細胞株におけるアポトーシスの有無、ＭＭＰ活性、血管新生ならびに腫瘍増殖性について検討した。
まず、細胞増殖抑制活性について検討した。
肺上皮ガン由来細胞株Ａ５４９、およびＭＥＦ高発現細胞株について血清存在下、及び非存在下での細胞増殖活性を試験した結果を第１図に示す。第１図の左側は１０％血清（仔ウシ血清）を含有した条件のものを示し、第１図の右側は血清非存在下のものを示す。第１図の白四角印（□）は親細胞のＡ５４９株の場合を示し、白菱形印（◇）はＭＥＦ高発現細胞株を示す。グラフの縦軸はＡＢＳを示し、横軸は培養日数（日）を示す。
その結果、血清存在下では顕著な増殖活性の差は見られなかったが、血清非存在下ではＭＥＦ高発現細胞株において顕著な細胞増殖の抑制が観察された。
さらに、正常細胞と癌細胞系におけるＭＥＦ発現の制御について検討した。ＲＴ−ＰＣＲ法によりヒト癌細胞と正常細胞のＭＥＦの発現を分析した。結果を第２図に図面に代わる写真で示す。第２図のＧＡＰＤＨはコントロールとして示したものである。第２図の左側から、ヒト正常腎臓細胞から得られるＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＮＣＩＨ２９２細胞、およびＨｅｌａ細胞を示す。
この結果、ヒト正常腎臓細胞から得られるＨＥＫ２９３細胞において、ＭＥＦは非常に多く発現されていた。しかしながら、他の癌細胞においては、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量により標準化されたデータに基づけば、ＭＥＦの発現量は正常細胞のＨＥＫ２９３細胞と比べて非常に低いか又はほとんど検出できない量であった。
また、エキソン１とプロモータ領域の周辺でＣｐＧリッチ領域が見出されたことから、本発明者らは癌細胞における低い発現量がＭＥＦ遺伝子のメチル化によるものであるかどうかを検討した。この領域のメチル化されたＣｐＧを調べるために、Ａ５４９、Ｃａｃｏ−２、ＮＣＩＨ２９２、およびＨｅｌａ細胞からのゲノムＤＮＡをメチルシトシンに感受性があり、かつそのアイソシゾマー酵素（イソ制限酵素）に抵抗力があるＨｐａＩＩおよびＭｓｐ  Ｉによって消化した。そして、ＣｐＧ領域（アイランド）を含有するエキソン１を増幅することができるプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。＋５００から＋１５００までの領域でメチル化されていたのは、ＭＥＦの発現量が少ないＡ５４９細胞でのみであり、他の細胞では無かった。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ−１）がＡ５４９細胞で高発現し、ＤＮＭＴ−１のｍＲＮＡのアンチセンスがＡ５４９細胞の中でのｐ２１の転写活性および細胞の成長を抑制することは既に報告されている［Ｋｎｏｘら，２０００年；Ｍｉｌｕｔｉｎｏｖｉｃら，２０００年］。
次に、メチルシトシンがＨＤＡＣと相互作用しているタンパク質ＭｅＣＰ２に結合しているメチル化ＤＮＡによって認識されるので［Ｎｇら，１９９９年］、本発明者らは、Ａ５４９細胞のＭＥＦの発現における、脱メチル化剤５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ａｚａ−２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）（５−アザシチジン）及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ｔｒｉｃｏｓｔａｔｉｎ  Ａ）の併用効果を検討した。結果を第３図の図面に代わる写真で示す。第３図は第２図と同様に各条件におけるＭＥＦの発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により検定した結果を示している。ＧＡＰＤＨはコントロールとして示したものであり、第３図の上段の左側から、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、下段の左側からＡ５４９細胞、Ｃａｃｏ−２細胞を示す。第３図のＤＭＳＯはジメチルスルホキサイドを示し、５−ＡＣは５−アザシチジンを示し、ＴＳＡはトリコスタチンＡをそれぞれ示す。第３図に示されるように、５−アザシチジン（１μＭ）およびトリコスタチンＡ（３００ｎＭ）の併用（第３図の下段の各細胞の右端）は、Ａ５４９細胞の中でＭＥＦの発現を明らかに増加させた。しかし、これらの試薬の単独での使用はＭＥＦの発現を僅かに増加させただけである。これらの結果は、メチル化のパターンは、メチル化と脱メチル化の力学的なバランス及びヒストンアセチル化の局在化状態によって維持されるという最近の発見によっても支持されるものである［Ｃｅｒｖｏｎｉら，２００１年］。同様の効果は、Ｃａｃｏ−２で観測されるが、ＨＥＫ２９３とＨｅｌａ細胞では観測されなかった。ＨｅＬａ細胞でのＭＥＦの低い発現は、他の未知のメカニズムによるものと考えられる。これは、公知のメチル化依存性の抑制剤ＭｅＣＰ２を欠くＨｅＬａ細胞は、ＭＢＤ２を含む別の経路を使用してサイレンスメチル化遺伝子になると報告されている［Ｎｇら，１９９９年］ことからも支持される。したがって、これらの知見から、ＭＥＦ遺伝子のメチル化が少なくともＡ５４９細胞とＣａｃｏ−２細胞におけるＭＥＦの低い発現に関係していることが示されたことになる。
また、ＭＥＦが癌抑制遺伝子であるならば、ＭＥＦ遺伝子高発現はＭＥＦが少ししか発現していないＡ５４９細胞の腫瘍形成を抑制することができる。そこで、Ａ５４９細胞とＭＥＦ遺伝子高発現細胞の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における特性を検討するためにＡ５４９細胞の安定なトランスフェクタント（これをクローン７１と呼ぶ。）を調製した。このＡ５４９細胞の安定なトランスフェクタントはＭＥＦを発現する。
第４図はＭＥＦ遺伝子高発現セルラインの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における特性を示すもので、第４図の上段は形態学的な状況を図面に代わる写真示したものである。第４図の下段はＦ−アクチン（Ｆ−ａｃｔｉｎ）染色を示す。第４図の左側からＡ５４９細胞、ＭＥＦ遺伝子高発現Ａ５４９細胞、ＢＢ９４（１０μＭ）で処理したＡ５４９細胞をそれぞれ示す。
この結果、細胞の外観を観察すると、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞は強い細胞−細胞接触を失って形態的変化を誘導した。また、第４図に示されるように、Ｆ−アクチンがＭＥＦ遺伝子高発現細胞の細胞間の境界に局在化しているのが観察され、これはＭＥＦ遺伝子高発現によって機能的な接触点の形成が促進され、細胞の運動性が抑制されたことを示している。また、Ａ５４９細胞を５−アザシチジン（１０μＭ）を含有する培地で培養したところ、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞と同様の形態学的変化が引き起こされた。さらに、上皮から間葉への転移がＥ−カドヘリンの欠乏あるいはＭＭＰ類の活性化によって引き起こされるとの報告があることから［Ｌｌｏｒｅｎｓら，１９９８年］、次にＭＭＰ類とＥ−カドヘリンの発現を検討した。第５図の右側はＡ５４９細胞及びＭＥＦ遺伝子高発現細胞の無血清培養上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）におけるＭＭＰ−９蛋白質の含有量を抗ＭＭＰ−９抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した結果を示し、第５図の左側はＭＭＰ−９のゼラチン−チモグラフィー（Ｇｅｌａｔｉｎ−ｚｙｍｏｇｒｐｈｙ）をそれぞれ示す図面に代わる写真である。第５図のウエスタンブロット分析とゼラチンザイモグラフィーに示されるように、ＭＭＰ−９の発現はＭＥＦ遺伝子高発現細胞で減少したが、Ｅ−カドヘリンのｍＲＮＡレベルは変化しなかった。ＭＥＦ遺伝子高発現細胞におけるＭＭＰ−９の活性の低下を検討するために、Ａ５４９細胞をＭＭＰ阻害剤であるＢＢ９４で処理した。第４図に示されるように、ＢＢ９４（１０μＭ）は典型的な形態学的変化を誘発し、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞のようにな細胞と細胞の境界にＦ−アクチンの局在を引き起こした。一般に、これらの形態学的変化は浸潤活性の軽減を示している。したがって、Ａ５４９細胞とＭＥＦ遺伝子高発現細胞の浸潤作用を検討するためにマトリゲル浸潤アッセイを行った。実験の概要を第６図に示す。第６図の上の房（ｃｈａｍｂｅｒ）に２．５Ｘ１０５個のＡ５４９細胞（左側）、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞（中央）、およびＢＢ９４によって処理されたＡ５４９細胞（右側）をそれぞれ播種し、２４時間後に、８μｍのフィルターを通過した下側の細胞数をカウントした。細胞の数をコントロール（Ａ５４９細胞）に対する百分率（％）として第７図に示した。また、各細胞の状況を第８図に図面に代わる写真で示す。第８図の左側からＡ５４９細胞（左側）、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞（中央）、及びＢＢ９４によって処理されたＡ５４９細胞（右側）をそれぞれ示す。第７図及び第８図に示されるように、Ａ５４９細胞は強力な浸潤作用を示したが、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞はＢＢ９４の抑制効果と同程度に低い浸潤作用を示した。
さらに、ＢＢ９４がＭＭＰ類によって誘導される様々な成長因子のプロセッシングの阻止及び／又は抑制による、癌細胞の細胞成長を抑制することが報告されていることから［Ｂｅｒｇｅｒｓら，２０００年；Ｍｉｒａら，１９９９年］、ＢＢ９４（１０μＭ）によるＡ５４９細胞の生体外の細胞成長への影響を検討した。無血清条件におけるＭＥＦ遺伝子高発現細胞の細胞成長速度はＡ５４９細胞に比べて遅かった。これは、おそらくＭＭＰの阻害による影響である。
以上のことから、ＭＭＰ−９あるいは他のＭＭＰ類の発現の抑制により、ＭＥＦが形態学的変化、浸潤作用、および細胞の成長に影響することが示された。
次に、ＭＥＦが生体外又は生体内でＡ５４９細胞の細胞形質転換と腫瘍発生の活性を抑制するかどうかを検討した。寒天培地におけるコロニーの形成評価により、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞はコロニーを形成しなかったが、Ａ５４９細胞を形成した。このことは、ＭＥＦが悪性腫瘍のマーカーとして知られている足場非依存性増殖を抑制することを示している。
次に、腫瘍形成に対する生体内での影響を検討した。前記のＡ５４９株、およびＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を、ヌードマウス背部皮下に接種し、無菌的環境下にて飼育した。２ヶ月後、腫瘍の大きさを比較した結果を第９図に図面に代わる写真で示す。第９図の左側のマウスはＡ５４９株を接種したものであり、右側はＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したものである。第９図の矢印部分が腫瘍を示している。投与から２カ月経過して、Ａ５４９細胞の腫瘍は直径約２ｃｍまで成長したが、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞の腫瘍は０．４ｃｍ以上成長しなかった。各腫瘍の大きさをグラフにして第１０図に示す。第１０図の縦軸は腫瘍の体積（ｍｍ３）を示し、左側はＡ５４９細胞を示し、右側はＭＥＦ遺伝子高発現細胞を示す。この結果、Ａ５４９を接種したヌードマウスに比べ、ＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍の形成は劇的に抑制されることがわかった。
さらにこれらの株についてＭＭＰ産生および活性に対する影響を調べた。Ａ５４９、およびＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種し、２ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収した。これらの組織におけるＭＭＰの産生をゼラチンザイモグラフィーとウェスタンブロッティング法により検討した。結果を第１１図に図面に代わる写真で示す。第１１図の上段はゼラチンザイモグラフィーの結果を示し、下段はＭＭＰ−９に対する抗体を用いて常法に従いウェスタンブロッティングを行った結果を示す。第１１図の左側はＡ５４９株のものであり、右側はＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株のものであり、各３例ずつ示す。
その結果、ＭＭＰ−９の活性がＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制されていることがわかった。また、ＭＭＰ−９の発現がＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制されていることがわかった。
さらに、これらの細胞に対してヘマトキシリン−エオシン（Ｈａｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ（ＨＥ））染色を行った。結果を第１２図に図面に代わる写真で示す。第１２図の上段はＨＥ染色の結果を示し、下段はリゾチームによるものを示す。この結果、Ａ５４９細胞の腫瘍は不完全に分化していたが、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞の腫瘍は多数の中央内腔を有する腺に十分に分化していた（第１２図）。以前に、本発明者らは腺漿液細胞分化のマーカーとしてＡ５４９細胞のリゾチームの発現によりＭＥＦがアップレギュレーションされることを示してきた［Ｋａｉ，１９９９年］。これによれば、リゾチームの高発現はＭＥＦ遺伝子高発現腫瘍の中央内腔のみに見られた（第１２図下段）。してみれば、ＭＥＦによる上皮細胞の分化の誘導は生体内におけるＡ５４９細胞の腫瘍の発生の抑制と関係している。
次に、Ａ５４９株、およびＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を移植された腫瘍組織における血管新生に対する影響を検討した。
即ち、Ａ５４９株、およびＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種し、２ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収し、これを凍結保存し、保存した組織を１０μｍの薄さの切片を作り、組織標本を作製した。これをＨＥ染色法を用いて染色した結果を、第１３図に図面に代わる写真で示す。第１３図の左側はＡ５４９株のものであり、右側はＭＥＦ遺伝子の安定高発現細胞株（Ｎｏ．７１）のものである。
この結果、ＭＥＦ遺伝子の安定高発現細胞株（Ｎｏ．７１）を接種したヌードマウスでは血管新生が顕著に抑制されていることがわかった。
次に、アポトーシスの誘導について検討した。
アポトーシス検出キットを用いて前述した組織標本におけるアポトーシスの検出を行った。結果を第１４図に図面に代わる写真で示す。第１４図の左側はＡ５４９株のものであり、右側はＭＥＦ遺伝子の安定高発現細胞株（Ｎｏ．７１）のものである。
その結果、ＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍においてアポトーシスの誘導が顕著に観察された。
さらに、ウサギを用いて膝滑膜線維芽細胞増殖作用に対する影響を調べた。
日本白色種ウサギ（体重約３ｋｇ）から摘出した膝関節滑膜組織よりＷｅｒｂ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｅｉｇｈ（１９７４）の方法に準じてアウトグロース（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）法により調製した滑膜線維芽細胞を使用して、滑膜細胞増殖に対する抑制作用についてＭＴＴ法により検討した。結果を次の表１に示す。
2002064165.tif 000003
その結果ＭＥＦを遺伝子導入した細胞は顕著な滑膜細胞増殖抑制作用があることがわかった。
これらの結果から、ＭＥＦを遺伝子導入した細胞株はアポトーシスの誘導が観察され、親細胞株と比較し、顕著なＭＭＰ産生並びに活性の低下、血管新生の抑制、腫瘍増殖性の抑制が観察された。従って、本発明により、ＥＴＳ転写因子ＭＥＦを疾患に起因する細胞に導入、発現させることにより、優れた細胞増殖抑制効果を発揮することがわかった。
さらに、ＭＥＦが腫瘍の脈管形成に影響しているかどうかを検討するために、脈管上皮細胞のマーカーであるＣＤ３１の免疫染色法によりヌードマウスの血管新生を分析した。ＭＥＦ遺伝子高発現腫瘍における中程度及び大きな脈管の数はコントロールに対してそれぞれ７５％及び３１％も明らかに減少していた。結果を第１５図に示す。第１５図の縦軸はＡ５４９細胞の脈管数に対する相対的な（％）値を示し、横軸は脈管サイズが５０ｍｍ以上のものと５０ｍｍ以下のものを示す。各々のサイズにおける左側はＡ５４９細胞のものを示し、右側はＭＥＦ遺伝子高発現細胞（クローン７１）のものを示す。
続いて、Ａ５４９細胞のＭＥＦ遺伝子高発現が脈管内皮細胞の転移へ影響するかどうかをさらに調べた。実験の概要を第１６図に示す。第１６図の小さな黒丸印は脈管形成因子を示し、楕円形の黒丸印はヒトさい帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を示す。上の房にヒトさい帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を播種し、８μｍのフィルターで下の房の培地に移行する細胞を観察した。
結果を第１７図に図面に代わる写真で示す。第１７図の左上は無処理の場合を示し、右上はｂＦＧＦを添加した場合を示し、左下はＡ５４９細胞の培地（ｍｅｄｉａ）の場合を示し、右下はＭＥＦ遺伝子高発現細胞（クローン７１）を示す。この結果をグラフ化したものを第１８図に示す。第１８図の縦軸は無処理の場合に対する相対的な（％）移行活性を示し、横軸は左から無処理の場合、ｂＦＧＦの場合、Ａ５４９細胞の場合、及びＭＥＦ遺伝子高発現細胞（クローン７１）の場合をそれぞれ示す。Ａ５４９細胞の無血清培養上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）ではヒトさい帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）の移行が促進され、これに対してＭＥＦ遺伝子高発現細胞の無血清培養上清では同じ効果はなかった。陽性のコントロールにおいて、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）はＨＵＶＥＣｓの移行を増加させた（第１７図、第１８図）。
ＩＧＦ−１のシグナル系の封鎖によりＡ５４９腫瘍における腺分化が誘導されることが報告されている［Ｊｉａｎｇ，１９９９年］。様々な成長因子が基質のマトリックス中に見出されており、様々な結合性蛋白質及び細胞外マトリックスに結合している［Ｂｅｒｇｅｒｓ，２０００年］。ＭＭＰ類が腫瘍の浸潤だけではなく、ＶＥＧＦやＩＧＦ−１などの様々な成長因子の処理と放出にかかわると報告されている［Ｂｅｒｇｅｒｓ，２０００年；Ｍｉｒａ，１９９９年］。したがって、ＭＭＰ類はこれらの成長因子を統合するのに必要であって、そして間接的に腫瘍の成長と脈管形成に関係している。これらの因子がＭＥＦの腫瘍抑制作用に関係していることを確認するために、本発明者らは最初にＭＭＰ類の発現と活性に着目した。その理由は、特にＡ５４９細胞におけるＶＥＧＦとＩＧＦ−１の発現がＭＥＦ遺伝子高発現によるものでないからである。ゼラチンザイモグラフィーによれば、ＭＥＦ遺伝子高発現腫瘍ではＭＭＰ−９とＭＭＰ−２の発現はかなり減少していた。ＭＭＰ−９のこの結果はウエスタンブロッティング分析と免疫組織化学によっても確認された。ＭＥＦはＭＭＰ−２の発現を阻害した。ｅｔｓコンセンサスモチーフを含んでいないと推定されるＭＭＰ−２のプロモーターがＥＴＳ転写因子によって直接制御されていないにもかかわらず、ＭＭＰ−２の阻害が悪性腫瘍の抑制に大きな寄与をしている。この理由のひとつはＭＭＰ−２単独の抑制が腫瘍発生における脈管前の状態（ｐｒｅｖａｓｃｕｌａｒ）から脈管への転移を阻害し、次いで腫瘍の成長を阻害するという知見に基づくものである。
脈管形成は血管内皮細胞の増殖と移動で引き起こされ、そしてＡ５４９細胞の場合には脈管形成因子により促進される。ＩＬ−８は強力な脈管形成因子である［Ａｒｅｎｂｅｒｇ，１９９６年］。最近、ＰＥＡ３がＩＬ−８の誘発により腫瘍の脈管形成に関係していることが報告された［Ａｒｅｎｂｅｒｇ，１９９６年］。そこで、ＭＥＦがＩＬ−８の発現を阻害することにより腫瘍の脈管形成を抑制するのかもしれないと考察した。ヌードマウスの腫瘍における免疫組織化学的分析は、ＩＬ−８の発現がＭＥＦ遺伝子高発現腫瘍の中で減少していることが示された（第１９図）。生体外の培養において、ＩＬ−８のｍＲＮＡの発現はＡ５４９細胞との比較においてＭＥＦ遺伝子高発現細胞ではかなり減少した（第１９図）。第１９図はＩＬ−８のｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲによる結果を示す図面に代わる写真である。第１９図のＧＡＰＤＨは確認のためのコントロールである。
これらの結果は、ＭＥＦがＩＬ−８の転写を抑制することにより、少なくとも一部分において、腫瘍の脈管形成を阻害することを示唆した。
そこで、本発明者らは、ＭＭＰ−９およびＩＬ−８の転写へのＭＥＦの作用をさらに調べた。ＭＥＦがＭＭＰ−９とＩＬ−８の転写を直接抑制するかどうか調べるために、本発明者らはＭＭＰ−９とＩＬ−８のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った。結果を第２０図に示す。第２０図の左側はＭＭＰ−９プロモーターを用いた場合を示し、第２０図の右側はＩＬ−８プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底（Ｂａｓａｌ）、Ａ５４９細胞、ＭＥＦを１．０μＭ添加した場合、ＭＥＦを３．０μＭ添加した場合、ＭＥＦを５．０μＭ添加した場合、及びＭＥＦ遺伝子高発現細胞（クローン７１）の場合をそれぞれ示す。Ａ５４９細胞中では、ＭＭＰ−９とＩＬ−８のプロモーターの高いルシフェラーゼ活性が観察された（第２０図）。ＭＥＦはこれらのプロモーターのルシフェラーゼ活性を濃度依存的に減少させた。これに対して、ＥＴＳ転写因子（ＥＬＦ−１、ＥＴＳ−１、ＰＥＡ３、ＥＳＥ−１）中のＥＴＳ−２のみがＭＭＰ−９及びＩＬ−８プロモーターのルシフェラーゼ活性を増加させ、そいてＥＴＳ−２のｍＲＮＡのアンチセンスはこれらのプロモーターのルシフェラーゼ活性を減少させた（第２１図）。第２１図はＭＭＰ−９とＩＬ−８のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った結果を示す。第２１図の左側はＭＭＰ−９プロモーターを用いた場合を示し、第２０図の右側はＩＬ−８プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底（Ｂａｓａｌ）、Ａ５４９細胞、Ｅｓｔ−２を添加した場合、及びアンチＥｓｔ−２を添加した場合をそれぞれ示す。
ＥＴＳ−２によるＭＭＰ−９の活性化の発見は、マウスを用いたＥｔｓ−２のターゲットされた欠失に関する研究によっても支持される［Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９８年］。ＭＥＦはＰＵ−１と異なって［Ｋｉｈａｒａ−Ｎｅｇｉｓｈｉ，２００１年］リプレッサー領域を持たないで、かつデアセチラーゼ活性を有するＨＤＡＣやＳｉｎ３Ａと相互作用をすることから、本発明者らは次にＭＥＦがこれらのプロモーターのｅｔｓ結合部位におけるＥＴＳ−２とのコンペティターであると仮定した。第２２図はＥｓｔ−２とＭＥＦを共導入した場合のルシフェラーゼアッセイを行った結果を示す。第２２図の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底（Ｂａｓａｌ）、Ａ５４９細胞、Ｅｓｔ−２を１．０μＭ添加した場合、ＭＥＦ及びＥｓｔ−２を０．５μＭ添加した場合、ＭＥＦ及びＥｓｔ−２を１．０μＭ添加した場合、並びにＭＥＦ及びＥｓｔ−２を２．０μＭ添加した場合をそれぞれ示す。また、これらの各々の場合におけるＥｓｔ−２の発現のウエスタンブロットの結果を第２３図に図面に代わる写真で示す。
第２２図に示したように、ＥＴＳ２はＭＥＦの共導入でこれらのプロモーターを活性化しかった。ＭＥＦのＥＴＳドメインのみが発現する発現ベクターの共導入によってさえもＥＴＳ２誘発活性は抑制された。プロモーターのｅｔｓ結合部位に結合するＥＴＳ−２をブロックすることによりプロモータの活性が抑制されるかどうかをさらに検討するために、ＭＭＰ−９及びＩＬ−２のプロモーターの３つのｅｔｓ結合モチーフ並びに腫瘍発生に重要なサイトカインであるマクロファージコロニー誘起因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる二本鎖の合成オリゴヌクレオチドによる「おとり型核酸」を作成した。ｅｔｓ結合モチーフを有するこの「おとり型核酸」は、ＥＴＳ２過発現によって誘発されるプロモータ活性を抑制したが、５’−ＧＧＡＡ−３’が５’−ＴＣＡＡ−３’に変異したｅｔｓ結合モチーフの変異体の「おとり型核酸」は抑制しなかった。前述した知見に基づき、ＭＥＦ遺伝子の脱メチル化がＭＭＰ−９及びＩＬ−８のプロモータ活性を制御するかどうかを確認するために、これらのプロモータ活性における５−アザシチジン（１μＭ）とトリコサミンＡ（１μＭ）の効果を検討した。ＭＭＰ−９およびＩＬ−８のプロモータ活性は、Ａ５４９細胞の中で５−アザシチジンとトリコサミン  Ａによって抑制された。
以上のことから、ＭＥＦが癌抑制遺伝子であり、また、これは癌細胞中のメチル化によって下流側で制御されているものであることが示された。
そして、以上のことから、ＭＥＦが生体外及び生体内でヒト非小細胞肺のカルシノーマＡ５４９細胞の腫瘍形成を抑制することが明らかとなり、これはＭＭＰ類とＩＬ−８の双方を抑制することに起因している。その抑制のメカニズムは、ＭＭＰ類とＩＬ−８のプロモーターの上のｅｔｓ結合部位へのＥＴＳ−２の結合に競合することである。さらに、いくつかの癌細胞におけるＭＥＦの発現は、ＭＥＦ遺伝子のエキソン１領域の周囲のＣｐＧアイランドのメチル化によりダウンレギュレーションされている。したがって、ＭＥＦがＸ染色体に局在している新規の癌抑制遺伝子であると考察した。このことは、ＬＯＨが卵巣癌と乳癌においてＸｑ２５−２６．１で見出されるという臨床の場においてよく見られる［Ｃｈｏｉ，１９９７年；Ｃｈｏｉ，１９９８年］ことによっても強く支持される。ＭＥＦによる転写制御が細胞周期のＧ１ファージを制限する［Ｍｉｙａｚａｋｉ，２００１年］という最近の研究によってもさらに支持される。癌抑制遺伝子としてのＭＥＦが腫瘍の成長を抑制するので、ＭＥＦが細胞周期のＳ期の間不活性にされるのは、理にかなっている。その上、腺分化による癌形成遺伝子であるＥＳＥ−３［Ｔｕｇｏｒｅｓ，２００１年］の発現は、ＭＥＦ遺伝子高発現の腫瘍におけるアップレギュレーションをかなり示した。したがって、ＭＥＦには、悪性腫瘍の抑制作用についてＥＳＥ−３と相乗的な作用があるかもしれない。本発明者らは、最近、ＧＭ−ＣＳＦが、蛋白質キナーゼＣのターゲットであるＥＴＳ−２によりアップレギュレーションされていることを見出した。そして、このアップレギュレーションはＭＥＦによっても阻害される。この知見もまた、ＧＭ−ＣＳＦの生産が生体外の侵入性と肺のへん平細胞癌の進行の両方にかかわると報告もあることから［Ｔｓｕｒｕｔａ，１９９８年］、本発明の癌抑制遺伝子としてＭＥＦが作用することが支持される。また、ＧＭ−ＣＳＦはヒト非肺小細胞癌に誘起効果を持つことができ、さらに、ＧＭ−ＣＳＦが腫瘍脈管形成のための内皮前駆細胞の移行を活性化するとも報告された［Ｔａｋａｈａｓｈｉ，１９９９年］。
腫瘍の進行には増殖、脈管形成、および転移といった段階があり、各段階は正又は負の調節のバランスによって制御されている。例えば、脈管形成は脈管形成のスイッチによって制御されている。脈管形成のスイッチは、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ類、ＩＬ−８、およびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）などの正の調節のレベルが、トロンボスポンジン−１と、２とエンドスタチンなどの負の調節のレベルよりも高くなることによりスイッチが入れられる［Ｈａｎａｈａｎ，１９９６年；Ｂｅｒｇｅｒｓ，２０００年］。腫瘍細胞においては、いくつかのＥＴＳ転写因子がＭＭＰ類やＩＬ−８などの正の調節の転写をアップレギュレートすることが示されている［Ｉｇｕｃｈｉ，２０００年；Ｓｅｍｅｎｔｃｈｅｎｋｏ，２０００年］。さらに、オンコジーン因子群によって活性化されたＥＴＳ因子群が腫瘍の進行を制御している。
多くの研究者が細胞外性要因が細胞の形質転換にどのように作用するかということに着目してきたが、転写因子などの細胞内因子のバランスが細胞の形質転換をどのように制御しているのかということは明らかにされていない。同じファミリーにおける転写因子のバランスが細胞の形質転換をどのように制御しているのかということを見出すために、本発明者らはＥＴＳ転写因子に着目した。転写因子のＥＴＳファミリーは細胞の成長、死滅、および分化における重要な役割を担っている。多くの形質転換関連遺伝子類はＥＴＳとＡＰ−１ファミリーの転写因子の双方に対する隣接する結合部位を含んでおり、そのようなエレメントは活性化された個体発生の広い範囲において転写の活性化を調整している［Ｓｈａｒｒｏｃｋｓ，１９９７年］。いくつかのＥＴＳ転写因子がＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫシグナリング経路の下流側のターゲットであることが知られている［Ｗａｓｙｌｙｋ，１９９８年］。この系路の発癌性の促進は転写活性を活性化し、そして主要な領域におけるトレオニン残基のリン酸化によるＥＴＳ−１及びＥＴＳ−２の局所化を変化させる［Ｙａｎｇ，１９９６年；Ｗａｓｙｌｙｋ，１９９７年］。ＥＴＳ−２は細胞の形質転換の重要なメディエーターとして知られている。なぜならば、ＥＴＳ−２の優位なネガティブな構造はＲａｓ又はＨＥＲ２による形質転換をブロックすることができるからである［Ｆｏｏｓ，１９９８年］。そして、乳癌細胞は、ＥＴＳ−２のターゲット変異を起こした異形接合マウスとの交尾によって抑制される［Ｎｅｚｎａｎｏｖ，１９９９年］。本発明によって支持されるように、ＥＴＳ−２はＡ５４９細胞におけるＭＭＰ−９、およびＩＬ−８のような腫瘍の悪性の因子群を活性化させる。ＥＴＳ−２によるＭＭＰ−９の活性化を見出したことは、マウスのＥｔｓ−２の標的化欠失に関する研究によっても支持される［Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９８年］。したがって、ＥＴＳ−２の抑制が分子癌腫療法には良い標的であるかもしれない。
最近、いくつかのＥＴＳ転写因子がＭＭＰｓとＨＥＲ２の転写を抑圧すると報告された［Ｍａｖｒｏｔｈａｌａｓｓｉｔｉｓ，２０００年］。したがって、腫瘍の進行が正又は負のＥＴＳ因子群のバランスによって制御することが可能である。本発明において、癌細胞の中のＭＥＦとＥＴＳ−２のバランスが悪性腫瘍を決定する重要な役割を示すことが明らかとなった。いくつかのＥＴＳ転写因子がＲａｓシグナル伝達によってリン酸化され、核に入り、その結果発癌遺伝子の転写を制御すると示した。しかしながら、ＥＳＥ−３（ＥＴＳ転写因子の１種）は、核のタンパク質であり、Ｒａｓシグナル伝達による転写を抑制するとの最近の報告もある［Ｔｕｇｏｒｅｓ，２００１年］。したがって、ＥＳＥ−３などの核ＥＴＳ因子群が細胞質のＥＴＳ因子群に対して負の調節をし、細胞の恒常性を安定化している。血清又は非血清状態で、かつ優位な負のＲａｓ及びＭＥＫの存在下において緑色蛍光蛋白質−ＭＥＦ融合蛋白質を使用することによりＭＥＦの細胞内の局在を決定した。Ａ５４９細胞には、Ｋ−Ｒａｓの変異を持っており［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，１９９５年］、その結果Ｒａｓ−ＭＥＫ−ＭＡＰＫ経路の活性化が生じている。ＭＥＦは核で局所化されるのがわかった。ＥＴＳ−２は非刺激の状態では細胞質と核に局所していた。ＥＴＳ因子群は細胞の形質転換を制御している。即ち、ＭＥＦとＥＳＥ−３はＥＴＳ−２のような発癌性ＥＴＳ転写因子に対する癌抑制物質として作用する。
本発明者らは、以前にＭＥＦはＡ５４９細胞においてリゾチームのプロモーターを活性化することを報告した［Ｋａｉ，１９９９年］。しかしながら、本発明ではＭＥＦはＭＭＰ−９及びＩＬ−８のプロモーターを抑制することが示された。すなわち、ＭＥＦによる転写の調節はプロモーターと細胞の状況に依存している。同様に、Ｆｌｉ−１はテナスシン−Ｃのプロモーターのためのアクチベータとして機能することができ［Ｓｈｉｒａｓａｋｉ，１９９９年］、一方、コラーゲンのプロモーターの状況によってはリプレッサーとして機能している［Ｃｚｕｗａｒａ−Ｌａｄｙｋｏｗｓｋａ，２００１年］。ＭＥＦによるリゾチームのアップレギュレーションに関して、本発明者らは以前に、ウシのリゾチーム遺伝子５Ａの近位のプロモーターのｅｔｓ結合部位（−４６／−４０）に加えて、第二のエレメント（−１００／−５１）サイトが存在していることを報告してきた［Ｋａｉ，１９９６年；Ｋａｉ，１９９９年］。このエンハンサーは未だ確認されていないが、ＭＥＦはリゾチームの発現を活性化するためにエンハンサー−結合蛋白質との特異的な相互作用を必要としている。いずれにしても、標的プロモーターの状況に依存しているＥＴＳ因子群の間の相互作用は、遺伝子の抑制と活性化の分子スイッチとして作用しており、逆もまた同様である。
本発明における「おとり型」ＤＮＡを使用する癌療法だけではなく、診療所での癌におけるＬＯＨ、ＳＮＰｓ、およびＭＥＦ遺伝子の後成の（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）修飾の発見に基づく癌診断に貢献する。
従って本発明は、メラノーマ、扁平上皮癌、乳癌、直腸癌、消化器癌、肺癌、大腸癌、子宮癌、腎細胞癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫神経芽細胞種および脳腫瘍、およびこれらが転移したことによる腫瘍に対する抗腫瘍治療薬、並びに抗リウマチ治療薬として有用である。
本発明のＥＴＳ転写因子としては、ＥＴＳ結合部位を認識し得る各種の転写因子を挙げられるが、この中でもＭＥＦが好ましい。ＭＥＦは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものであるが、本発明において使用できるＭＥＦはこのアミノ酸配列を有するものに限定されるものではなく、ＧＭ−ＣＳＦ、β−ディフェンシン−１、−２の少なくとも１種の発現を調整し得る活性を有するものであれば良く、好ましくはＥＴＳ結合部位を認識し得るアミノ酸配列を有するものであればよい。したがって、本発明のＭＥＦとしては配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸が置換、又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、或いは１個又は２個以上のアミノ酸が配列番号１に記載のアミノ酸配列に付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、ＭＥＦの変異タンパクであり前記活性を有する限り本発明に含まれる。
同様に、本発明のＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子としては、前記した本発明のＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子が挙げられる。本発明の好ましいＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子としては、前記したＭＥＦをコードする遺伝子が挙げられる。ＭＥＦをコードする遺伝子の例を配列表の配列番号２に記載するが、本発明の遺伝子はこの塩基配列を有するものに限定されるものではない。例えば。配列番号２に記載のヌクレオチド配列において、１又は２以上のヌクレオチドが置換、または欠失されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、或いは１又は２以上のヌクレオチドが配列番号２に記載のヌクレオチド配列に付加されたポリヌクレオチドも本発明の遺伝子に包含される。
また、本発明の遺伝子としては前記した塩基配列を有する遺伝子にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものも包含される。
通常のタンパク質の多くには糖鎖が付加され、アミノ酸を１個若しくは複数個変換することにより糖鎖付加を調節することが出来る。配列番号１に記載のアミノ酸配列において、その糖鎖付加を調節されたポリペプチドも上記活性を有する限り、本発明に包含される。また、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも同様に本発明に包含される。
さらに本発明は、上皮細胞内のＥＴＳ転写因子、好ましくはＭＥＦタンパク質あるいはＭＥＦ遺伝子の発現を増強するタンパク質、ペプチド、有機化合物、ステロイドなどの物質等を用いた疾患治療法もしくは治療薬を包含する。
（遺伝子治療）
本発明は、ＭＥＦを治療用ベクターに組み込みこむことにより、先に列挙した様々な疾患に対する遺伝子治療に用いることが可能である。
本発明において、遺伝子治療に用いるためのベクターとしては、特に限定されていないが、例えば、組換えワクチンウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、センダイウイルス等から誘導されるベクターを用いることが出来る。さらに、上記ベクターに適当なプロモーターや複製起源、選択マーカー、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の形質発現に関わる配列を導入する。
本発明は、上記ベクターに組み込み、通常の方法により遺伝子治療薬として使用する。すなわち、遺伝子治療を行う場合には、該組み換えウイルスベクターを治療の標的となる細胞に接触させるか、或いはプラスミドベクター等の発現ベクターに挿入し、標的細胞を導入すればよい。このとき遺伝子導入は、リン酸カルシウム法、リポソーム法、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等、公知の方法により行うことが出来る。
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる用語は、天然に存在する塩基および本来のホスホジエステル結合によって結合した糖部分から生成されたオリゴヌクレオチドおよびその類似体を意味する。従って、この用語が含む第１群は、天然に存在する種、または天然に存在するサブユニットまたはそれらの同族体から生成された合成種である。ここで、サブユニットに対してホスホジエステル結合または他の結合によって結合した塩基−糖の組み合わせをいう。またオリゴヌクレオチドの第２の群はその類似体であり、これらは前記オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在していない部分を有する残基を持つ。これらには、安定性を増加するためのリン酸基、糖部分、３’，５’末端に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドを含む。例えば、ヌクレオチド間のホスホジエステル基の酸素原子の１つを硫黄に置換したオリゴホスホロチオエート、−ＣＨ３に置換したオリゴメチルホスホネート等があげられる。またホスホジエステル結合は、非イオン性かつ非キラル性である他の構造で置換されていてもよい。さらに、オリゴヌクレオチド類似体としては、修飾された塩基形態、すなわち天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよびピリミジンを含む種を用いてもよい。以上のようなオリゴヌクレオチド類も本発明のアンチセンスＤＮＡと同様な機能を果たす限り、該ＤＮＡの誘導体として本発明に包含される。
本発明において、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするｍＲＮＡの標的部分は転写開始部位、翻訳開始部位、イントロン・エキソン結合部位または５’キャップ部位であることが好ましいが、ｍＲＮＡの２次構造を考慮して立体傷害のない部位が選択されるべきである。
（ＭＥＦの製造および用途）
本発明のＭＥＦは、配列番号２に記載のＤＮＡ、およびベクターに適当なプロモーターや複製起源、選択マーカー、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の形質発現に関わる配列を導入した発現ベクターにより、原核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換し、各宿主細胞においてＭＥＦ遺伝子を発現させ、製造することが可能である。また、本発明に関するＤＮＡに他のタンパク質をコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質として発現させ、ＭＥＦの精製を容易にしたり、発現量を上げたり、また精製工程において適当な処理を施すことにより、産生するＭＥＦを切り出し、製造することも可能である。
また、配列番号２に記載のＤＮＡの１または２以上のヌクレオチドを変異させたり、これに他のヌクレオチドを付加させたり、３’又は５’側の一部を切断したり、途中の１または２以上のヌクレオチドを除去させたりすることにより、変異したＭＥＦを製造することもできる。
上記目的のために、発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌が挙げられる。また、真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えばイースト、粘菌が挙げられる。代わりに、Ｓｆ９等の昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよい。さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞が挙げられる。
上記手法により製造された本発明はＭＥＦを宿主細胞内または細胞外から分離、精製し、使用することが出来る。ＭＥＦの分離、精製には、通常のタンパク質に用いられる分離、精製法を使用することが出来る。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせて使用することが出来る。
本発明は、ＭＥＦを静脈内投与、患部への局所投与、経口投与等により投与可能である。投与の際、ＭＥＦに必要ならば、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、溶解補助剤等の添加物を加えて前記投与に適した製剤とする。
また、本発明は、ＭＥＦのアミノ酸配列（配列番号１）のうち、少なくとも５個の連続するアミノ酸を有するオリゴペプチドを認識する抗体を作製することも可能である。具体的には、前記オリゴペプチドを抗原として動物に免役し、生体内にて産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗体には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体があり、それぞれの精製方法について当業者に公知である。このようにして得られるいずれの抗ＭＥＦ抗体もＥＬＩＳＡ等のエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫法等、各種免疫学的測定法を用いるＭＥＦの検出および定量、或いは上述のＭＥＦのカラムによる精製に用いることが出来る。
さらに本発明の有効成分としては、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子のみならず、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質であって生体内又はインヴィトロにおいて結果として前記したと同じ結果をえることができるので、ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を用いることもできる。
本発明のＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質としては、生体内又はインヴィトロにおいてＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の発現を調節することができるものであればよく、例えば、これらの発現を調節することができるタンパク質、ペプチド、有機化合物、ステロイドなどの物質であってもよい。また、本発明の方法における「作用を調節する」ということは、作用を抑制したり、又は作用を増強するものであり、条件によって両方の作用を有するものであってもよいが、好ましくは抑制するか又は増強するかのどちらか一方の作用を有する物質である。
また、本発明は、これらの物質をスクリーニングする方法を提供する。即ち、本発明は、ＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞ののＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法、及び当該方法によりスクリーニングされた細胞増殖を制剤することがでる物質を提供する。
本発明のＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞としては、天然のＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子を有する細胞をそのまま使用してもよいが、好ましくはＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに導入し、これを上皮細胞や各種の微生物細胞に導入した形質転換体を用いることができる。この方法に使用される微生物細胞としては、前記した原核生物の宿主細胞や真核微生物の宿主細胞を用いることができる。
本発明のこの方法は、ＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子が導入された細胞、又はその周辺に種々の濃度の被検物質を添加して、当該細胞におけるＥＴＳ転写因子の発現量を測定したり、または細胞増殖の抑制を測定することにより、目的の合致する物質であるか否かを知ることができる。
本発明のこの方法により得られる物質は、細胞、好ましくは上皮細胞における細胞増殖を抑制することができる物質であり、細胞増殖を抑制することができ、より具体的には前記した各種の良性又は悪性の腫瘍やリウマチなどの疾患の治療剤、予防剤、又は処置剤と有用な物質である。したがって、本発明はこの方法によって得られる細胞増殖を抑制することができる物質を包含している。
さらに本発明は、この方法よってスクリーニングされた物質を有効成分として含有する治療剤、予防剤、又は処置剤などの医薬組成物、それを用いた良性又は悪性の腫瘍やリウマチなどの細胞増殖を抑制することが必要とされている疾患の治療方法、及び医薬組成物の製造のための使用を包含している。
さらに、本発明は、ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又はＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質からなるＭＭＰ産生抑制剤又はＩＬ−８産生抑制剤を提供する。ＭＭＰとしては、ＭＭＰ−９が好ましいい。また、ＩＬ−８は強力な脈管形成因子である［Ａｒｅｎｂｅｒｇ，１９９６年］ことが知られており、ＩＬ−８の産生を抑制することにより脈管形成が抑制されるが、本発明のＩＬ−８産生抑制作用によりＩＬ−８の脈管形成作用のみならずＩＬ−８に起因する各種の作用を抑制できるものと考えられる。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。試薬の出所は便宜上のものであり、本発明を限定することを意味しない。
ヒト非小細胞肺癌細胞由来Ａ５４９、ヒト胎児肝臓由来細胞由来ＨＥＫ２９３、ヒト大腸癌由来Ｃａｃｏ−２は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手した。細胞は、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｇ／ｌストレプトマイシンを含む）に懸濁し培養フラスコに播種後、５％ＣＯ２、３７℃下で経代培養を行った。
実施例１  （ＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株の作製）
１．ヒト肺上皮由来Ａ５４９細胞株の培養
ヒト肺上皮由来細胞株Ａ５４９を、基礎培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ｐＨ＝７．４）に１０％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｔ．Ｎｏ．ＡＧＢ  ６２３５）、抗生物質（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ））を添加した細胞増殖用培養液で、５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で静置培養した。
２．遺伝子の調製
ＭＥＦ  ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクター（ｐＣＢ６）１００μｇを制限酵素ＡｐａＬＩにて制限酵素消化し、直鎖状ＤＮＡを調製した。
３．ＭＥＦ遺伝子の細胞への導入
サブコンフルエント状態（５０〜６０％）にある細胞をトリプシン消化により回収し、前項記述のＤＮＡ（１００μｇ）を含むサイトミックス溶液（１２０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．６，２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．６，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，ｐＨ７．６，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  ＡＴＰ，ｐＨ７．６；５ｍＭ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ；ｐＨ  ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＫＯＨ）で懸濁後、それをキュベット（ＥＬＥＣＴＲＯＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＣＵＶＥＴＴＥＳ  ＰＬＵＳＴＭ，２ｍｍ  ｇａｐ，ＢＴＸ）に注入して、氷上に１０分間静置した。その後、パルス発生装置（ＥＬＥＣＴＲＯ  ＣＥＬＬ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＯＲ  ＥＣＭ６００，ＢＴＸ）で電気ショック（５００Ｖ，１３５０ｍＦ）を与え、再び氷上に１０分間静置し、５％  ＣＯ２、３７℃条件下で培養した。なお、用いたＤＮＡの量はＵＶ（２６０ｎｍ）の吸光度より求め、純度８５％以上のものを用いた。
４．ＭＥＦ遺伝子安定高発現株の判定
該細胞が約５０％集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になった時点でＧ４１８（ナカライテスク）を最終濃度１．０ｍｇ／ｍｌとなるよう添加し、さらに１週間培養した。なお、Ｇ４１８は遺伝子導入が行われていない細胞が１週間で死滅する濃度を用いた。１週間後、生存している細胞のコロニーを回収し、各々別の６０ｍｍの培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ）にて培養し、Ｇ４１８を用いた選択を再度行った。最後に各々の細胞におけるＭＥＦ遺伝子の発現をノーザンブロッティング分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）およびＲＴ−ＰＣＲによって確認し、ＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株（Ｎｏ．７１株）を得た。
実施例２  （細胞増殖抑制活性）
肺上皮ガン由来細胞株Ａ５４９および実施例１で作製したＭＥＦ高発現細胞株を１０％血清（仔ウシ血清）を含有、または含有しない培地（ダルベッコ改変イーグル培地）に１ｘ１０４個／ｍｌとなるように播種し、２４時間、３７℃、５％  ＣＯ２下にて培養し、播種後経日的な細胞数をＭＭＴ法により測定した。
ＭＭＴ法は下記のように行った。まず、測定の４時間前の細胞にＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭素）のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ（−）溶液）に加えて更に９６穴マイクロプレート１ウェルあたり塩酸酸性（０．０４Ｎ）イソプロパノール１００ｍｌおよび３％ＳＤＳ水溶液２０ｍｌを加えて生細胞のミトコンドリアの作用により生成したホルマザンを溶解した後、溶液の５９５ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定した。結果を第１図に示す。
その結果、血清存在下では顕著な増殖活性の差は見られなかったが、血清非存在下ではＭＥＦ高発現細胞株において顕著な細胞増殖の抑制が観察された。
実施例３  （腫瘍形成に対する影響）
Ａ５４９、およびＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株１×１０６個／１００μｌをＰＢＳ（−）溶液中に懸濁後、ヌードマウス背部皮下に接種し、無菌的環境下にて飼育した。２ヶ月後、腫瘍の大きさを比較した。結果を示す写真を第２図に示す。
この結果、Ａ５４９を接種したヌードマウスに比べ、ＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍の形成は劇的に抑制された。
実施例４  （ＭＭＰ産生および活性に対する影響）
Ａ５４９、およびＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種し、２ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収した。これに等量の溶菌緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ＭＮａＣｌ，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，ｐＨ７．４）に浸し、４℃にて一夜静置後、上清を回収した。調製した上清をＳＤＳサンプルバッファー（ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（０．１８５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，３０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，６％ＳＤＳ，ｐＨ６．８）と２：１の割合で懸濁し、２０ｍｇ相当のタンパク質溶液を０．５ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含む１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。泳動後、ゲル中に含有のＳＤＳを除去するために洗浄溶緩衝液（ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）にて２０分間洗浄し、これを３回繰り返した。更にゲル洗浄緩衝液（ｇｅｌ  ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にて２０分間洗浄した。その後、ゲルインキュベーション緩衝液（ｇｅｌ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．０２％  ＮａＮ３）を用い３７℃下、２０時間酵素反応を行った。反応後、染色溶液（０．５％  ＣＢＢ−Ｇ２５０，４５％  ｍｅｔｈａｎｏｌ，１０％  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）にてゲルを染色、更に脱色液（５％  ｍｅｔｈａｎｏｌ，７．５％  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）にてゲルを脱色し、染色像をＬａｓ−１００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて解析した。結果を第３図の上段に示す。
その結果、ＭＭＰ−９の活性がＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制された。
更に、上述の上清２０ｍｇ相当を１０％アクリルアミドゲルにて電気泳動を行った後、ＭＭＰ−９に対する抗体を用いて常法に従いウエスタンブロッティング分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。結果を第３図の下段に示す。
この結果、ＭＭＰ−９の発現がＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において顕著に抑制された。
実施例５  （移植された腫瘍組織における血管新生に対する影響）
１．腫瘍切片の作製
Ａ５４９、およびＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種し、２ヶ月経過したヌードマウスより皮下に形成した腫瘍結節を回収し、ＯＣＴ化合物（ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を用いて、凍結保存した。保存した組織をクリオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔ）（ＬＥＩＣＡ  ＣＭ  １１００）を用いて、組織を１０μｍの薄さの切片を作り、ポリＬ−リジンコートしたスライドグラスに貼付した。これを４％パラホルムアルデヒド水溶液に浸し、１５分間反応させ組織を固定後、洗浄するためＰＢＳ（−）に５分間浸し、これを３回繰り返し、組織標本を作製した。
２．ヘマトキシリン−エオシン染色
組織標本をマイヤーヘマトキシリン溶液に３分間浸した後、蒸留水で色出しを行った。更に、０．５％エオシン溶液に１分間浸した後、蒸留水にて洗浄した。その後、脱水・脱アルコール・封入を行い検鏡した。結果を示す写真を第４図に示す。その結果、ＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍において血管新生が顕著に抑制された。
実施例６  （アポトーシスの誘導）
アポトーシス検出キット（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｗａｋｏ（ｗａｋｏ））を用い、前述した組織標本におけるアポトーシスの検出を行った。まず、１００倍希釈したＴｄＴ反応液１００μｌを組織標本に添加し、湿潤箱のなかで１５分間、３７℃にて反応させた。その後、標本を洗浄するためＰＢＳ（−）に５分間浸し、これを３回繰り返した。更に、標本の内因性のペルオキシダーゼを不活性化するために３％Ｈ２Ｏ２水溶液に５分間作用させた。その後、標本を洗浄するためＰＢＳ（−）に５分間浸し、これを３回繰り返した。更に、ＰＯＤ接合抗体（ＰＯＤ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）をＰＢＳ（−）にて１００倍希釈し、１００μｌを標本に滴下し、湿潤箱のなかで１５分間３７℃にて反応させた。この後、標本を洗浄するためＰＢＳ（−）に５分間浸し、これを３回繰り返した。次に、ＤＡＢ溶液１００μｌをスライドに添加し、室温で５分間反応させた後、メチルグリーン酢酸溶液を用いて標本を対比染色した。その後、標本を後脱水・脱アルコール・封入を行い検鏡した。結果を示す写真を第５図に示す。
その結果、ＭＥＦ遺伝子安定高発現細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍においてアポトーシスの誘導が顕著に観察された。
実施例７  （ウサギ膝滑膜線維芽細胞増殖作用に対する影響）
日本白色種ウサギ（体重約３ｋｇ）から摘出した膝関節滑膜組織よりＷｅｒｂ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｅｉｇｈ（１９７４）の方法に準じてｏｕｔｇｒｏｗｔｈ法により調製した滑膜線維芽細胞を使用した。培養液として１０％非働化ウシ胎児血清を添加した２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩含有ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）（以下、１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ）を用い、５％  ＣＯ２，９５％空気の加湿条件下で３７℃に調整されたＣＯ２のインキュベーター中で細胞を増殖させた。継代培養は０．２５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）／０．０２％ＥＤＴＡ液を用いて常法に従い行った。第３〜７代の滑膜線維芽細胞を用い、２０００ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに継代し、１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ中で、５％  ＣＯ２、９５％空気の加湿条件下で３７℃に調整されたＣＯ２のインキュベーター中で培養した。２４時間培養後、ＭＥＦ遺伝子をトランスファクタム（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）を用いて遺伝し導入した。導入２４時間後、ヒトリコンビナントインターロイキン−１（５ｎｇ／ｍｌ）を添加した。その後２４〜７２時間経過後の滑膜細胞増殖に対する抑制作用についてＭＴＴ法により検討した。結果を前記「表１」に示した。
その結果ＭＥＦを遺伝子導入した細胞は顕著な滑膜細胞増殖抑制作用が観察された。
実施例８  （ＲＴ−ＰＣＲ法）
培養細胞からの全ＲＮＡの抽出にはイソゲン（ｌｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン））を用いて行った。培養細胞の各種遺伝子発現を比較するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲには、ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＡＭＶ）ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ）を用いた。本発明において発現を確認した遺伝子について、以下にその方法の概要を示す。
１．ＭＥＦ
Ａ５４９およびその他の細胞から抽出した全ＲＮＡ  １μｇを鋳型とし、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応（４２℃で６０分、９９℃で５分、５℃で５分）を行った。その後、上流側のプライマー（５’−ＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧ−３，）および下流側のプライマー（５，−ＣＡＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲ（９４℃で２分を１サイクル、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒を４０サイクル）を行った。
２．ＩＬ−８
Ａ５４９およびＭＥＦ遺伝子高発現細胞株より全ＲＮＡ  １μｇを鋳型とし、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応（４２℃で６０分、９９℃で５分、５℃で５分）を行った。その後、上流側プライマー（５’−ＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴ−３’）および下流側プライマー（５’−ＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＴＣ−３’）を用いて、ＰＣＲ（９４℃で２分を１サイクル、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒を４０サイクル）を行った。
３．ＳＥ−３
Ａ５４９およびＭＥＦ遺伝子高発現細胞株より全ＲＮＡ  １μｇを鋳型とし、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応（４２℃で６０分、９９℃で５分、５℃で５分）を行った。その後、上流側プライマー（５’−ＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＣＣＡＣＧＴＧＣＡＡＴＧ−３’）および下流側プライマー（５’−ＣＴＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲ（９４℃で２分を１サイクル、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル）を行った。
実施例９  （Ｆ−アクチン（Ｆ−ａｃｔｉｎ）染色）
ガラスボトムディッシュ（Ｇｌａｓｓ−ｂｏｔｔｏｍ  ｄｉｓｈ）上で培養した細胞に４％パラホルムアルデヒドを加え、室温で１０分間静置し、細胞を固定した。その後、０．５％トリトンＸ−ＰＢＳで細胞を浸透（ｐｅｒｍｅａｌｉｚｅ）し、ＰＢＳで５０倍に希釈したローダミンファロイディン（ｒｈａｏｄａｍｉｎｅ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））を加え、室温で３０分間反応させた。
実施例１０  （ゼラチン−チモグラフィー（Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ））
１．無血清培養上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）の調製
細胞培養の前記した方法に従い、サブコンフルエントまで培養した細胞の培養液を、無血清培養に置換し、４８時間培養後培養液を回収し、濃縮した。
２．腫瘍溶解産物（ｔｕｍｏｒ  ｌｙｓａｔｅ）の調製
単離した腫瘍片を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、ハサミで細片化した。これに溶解緩衝液（２０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００、ｐＨ７．４）に懸濁し、氷中で１時間静置した。その後、２０００×ｇの遠心操作により上静を回収して腫瘍溶解産物とした。
３．ゼラチン−チモグラフィー（Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）
前記１．及び２．により調製したサンプルとＳＤＳサンプルバッファー（０．１８５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３０％グリセリン、６％ＳＤＳ、ｐＨ６．８）を２：１の割合で混合し、チモグラフィー用試料とした。この試料を、０．５ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含む１２．５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。泳動後のゲルをゲル洗浄液（２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で２０分間室温で振盪させＳＤＳを除去した。この操作を３回行った後、ゲルリンス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で室温で５分間、３回振盪し、トリトンＸ−１００を除去した。その後、ゲルをゲルインキュベーション緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２又は１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＮａＮ３、ｐＨ７．４）中で２０時間、３７℃で振盪しながら、酵素反応を行った。反応後、ゲル染色溶液（０．２５％ｗ／ｖ  ＣＢＢ−Ｇ２５０、４５％メタノール、１０％酢酸）で染色後、ゲル脱色溶液（５％メタノール、７．５％酢酸）で脱色した。
実施例１１  （ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ））
前記したゼラチン−チモグラフィー（Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）で用いた試料を試料とした。試料を１２．５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った後、ＰＶＤＦ膜に転写（２５０ｍＡ、１．５時間）した。転写したＰＶＤＦ膜は５％スキムミルクを含む０．０５％ツウィーン２０−ＰＧＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中で室温で１時間振盪しマスキングした。その後、ＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈したヒツジ抗ＭＭＰ−９１ｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて室温で１時間振盪し、１次抗体反応を行った。１次抗体反応後、１０，０００倍希釈したマウスＨＲＰ標識抗ヒツジ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて室温で１時間振盪し、２次抗体反応を行った。２次抗体反応後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により抗体反応を検出した。
実施例１２  （マトリゲルへの細胞浸潤能の測定）
１．０×１０６／ｍｌとなるように調製したそれぞれの細胞懸濁液を８μｍ孔（ｐｏｒｅ）のマトリゲル浸潤チェンバー（ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ））の上層に２００μｌ添加し、無血清の培養液を７００μｌ添加する。２４時間後、メンブレンフィルターの下層に浸潤してきた細胞をヘマトキシリンで染色した後、顕微鏡下で細胞数をカウントした。
実施例１３  （細胞増殖率の測定）
細胞増殖率はＷＳＴキット（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いそのプロトコールに従った。概要を以下に示す。１．０×１０４個の細胞を２４−ウエルのプレートに播き、４日間培養した。０日目と４日目の細胞に、培養液で２０倍希釈したＷＳＴ試薬を加え、２時間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度をそれぞれ測定し、４日目の吸光度を０日目の吸光度で割り、細胞増殖率とした。
実施例１４  （軟寒天内コロニー形成法）
６−ウエルのプレートに０．５％寒天−ＤＭＥＭ溶液を２ｍｌ添加し、室温で固化するまで放置し下層を形成させた。次に、０．３３％寒天−ＤＭＥＭ溶液に２．５×１０４／ｍｌとなるように、それぞれの細胞を混合した混合液２ｍｌを下層の上に添加し、室温で固化させ上層を作製した。さらに、作製した上層の上に培養液を１ｍｌ添加し、２週間５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した後、形成したコロニーを顕微鏡下で観察した。
実施例１５  （免疫組織染色）
１．ＰＥＣＡＭ−１
作製した組織標本に４％パラホルムアルデヒドを添加し、室温で１０分間放置し固定した。次に常法に従いＰＢＳ−Ｔで１００倍希釈したラット抗ＰＥＣＡＭ−１ｌｇＧ（Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加し、４℃で１６時間１次抗体反応を行った。１次抗体反応後、ＰＢＳ−Ｔで１００倍希釈したウサギビオチン標識抗ラットｌｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、室温で１時間２次抗体反応を行った。対比染色は３％メチルグリーン酢酸溶液で行った。なお血管新生の定量は、倍率２００倍の視野をランダムに４視野選択し、５０μｍ以上又は５０μｍ以下の血管数を測定し、平均を求めた。
２．ＭＭＰ−９
作製した組織標本に４％パラホルムアルデヒドを添加し、室温で１０分間放置し固定した。次に常法に従いＰＢＳ−Ｔで１５０倍希釈したヒツジ抗ＭＭＰ−９ｌｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を添加し、４℃で１６時間１次抗体反応を行った。１次抗体反応後、ＰＢＳ−Ｔで１００倍希釈したウサギビオチン標識抗ラットｌｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、室温で１時間２次抗体反応を行った。対比染色は３％メチルグリーン酢酸溶液で行った。
実施例１６  （ＨＵＶＥＣ  の遊走能の測定）
ＨＵＶＥＣｓが２．５×１０５個／ｍｌとなるような細胞懸濁液を、８μｍの孔を有するマトリゲル浸潤房（ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ））の上層に２００μｌ添加した。次に、実施例１０の１．に従い調製した無血清培養上清７００μｌを下層に添加した。２４時間後、メンブレンフィルターの下層に浸潤してきたＨＵＶＥＣｓをヘマトキシリンで染色した後、顕微鏡下で細胞数をカウントした。
実施例１７  （レポーター遺伝子の調製）
１．ＭＭＰ−９レポーター遺伝子の調製
細胞におけるＭＭＰ−９の転写活性を測定するためのレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子を用いた。ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、５’−ＭＭＰ−９ｐｒｏ（プライマー）、及び３’−ＭＭＰ−９ｐｒｏ（プライマー）を用い第１回目のＰＣＲ（９４℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ，５８℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ，７２℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ，３０ｃｙｃｌｅ）を行った。さらに得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、５’−ＭＭＰ−９ｐｒｏ２（プライマー２）、及び３’−ＭＭＰ−９ｐｒｏ２（プライマー２）を用い第２回目のＰＣＲ（９４℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ，５８℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ，７２℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ，３０ｃｙｃｌｅ）を行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した後、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理し、ｐＧＬ２ベーシックベクター（ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ）のＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入した。
２．ＩＬ−８レポーター遺伝子の調製
細胞におけるＩＬ−８の転写活性を測定するためのレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子を用いた。ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、５’ＩＬ−８ｐｒｏ（プライマー）、および３’−ＩＬ−８ｐｒｏ（プライマー）を用い第１回目のＰＣＲ（９４℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ，５４℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ，７２℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ，３０ｃｙｃｌｅ）を行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した後、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理し、ｐＧＬ２ベーシックベクター（ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ）のＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入した。
実施例１８  （Ｅｔｓ転写因子たんぱく発現遺伝子の構築）
ヒトＭＭＰ−９およびＩＬ−８の転写活性に対する影響を検討するため蛋白発現ベクターとしてｐＣＢ６を用いた。Ｅｔｓ転写因子のｐＣＢ６へのサブクローニングは以下の様に行い、ＤＮＡの塩基配列はサイクルシークエンス（ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）法を用いて確認した。
１．ｐＣＢ６／ＭＥＦ
気道上皮細胞由来の癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２のｍＲＮＡよりｃＤＮＡを作製し、これを鋳型に５’−ＭＥＦ（ＢａｍＨ  Ｉ）、及び３’−ＭＥＦ（ＥｃｏＲＩ）を用いＰＣＲ（９４℃  ｆｏｒ  １ｍｉｎ，６４℃  ｆｏｒ  １ｍｉｎ，６５℃  ｆｏｒ  １．５ｍｉｎ，４０ｃｙｃｌｅｓ，７２℃  ｆｏｒ  ２０ｍｉｎ，１ｃｙｃｌｅ）を行った。得られたＰＣＲ産物をオリジナルＴＡクローニングキット（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）によりｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした（ｐＣＲ２．１／ＭＥＦ）。このクローンをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａＩにより制限酵素処理し、ｐＣＢ６ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＣＢ６／ＭＥＦベクターを得た。
２．ｐＣＢ６／ＥＳＥ−１
ｐＣｌ／ＥＳＥ−１（Ｄｒ．Ｔ．Ａ．Ｌｉｂｅｒｍａｎｎより供与）をＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａ  Ｉにより制限酵素処理し、ｐＣＢ６のＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＣＢ６／ＥＳＥ−１ベクターを得た。
３．ｐＣＢ６／ＥＩｆ−１
ヒト心臓由来ｃＤＮＡライブラリーよりクローニングしたｐＵＣ１１８／Ｅｌｆ−１を鋳型に、５’−ＥＩｆ−１（ＫｐｎＩ）、及び３’−ＥＩｆ−１（ＸｂａＩ）を用いＰＣＲ（９４℃  ｆｏｒ  １ｍｉｎ，６０℃  ｆｏｒ  １ｍｉｎ，７２℃  ｆｏｒ  １．５ｍｉｎ，４０ｃｙｃｌｅｓ，７２℃  ｆｏｒ  ２０ｍｉｎ，１ｃｙｃｌｅ）を行った。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＸｂａＩにより制限処理し、ｐＣＢ６ベクターのＫｐｎＩおよびＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＣＢ６／ＥＩｆ−１ベクターを得た。
４．ｐＣＢ６／Ｅｔｓ−１
ｐＢｌｕｅｓｃｒＩｐｔ／Ｅｔｓ−１（Ｄｒ．Ｄ．Ｋ．Ｗａｔｓｏｎより供与）を鋳型にし、５’−ｅｔｓ１（Ｂｇｌ  ＩＩ）、及び３’−ｅｔｓ１（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）を用いＰＣＲ（９４℃  ｆｏｒ  １ｍｉｎ，６０℃  ｆｏｒ  １ｍｉｎ，７２℃  ｆｏｒ  １．５ｍｉｎ，４０ｃｙｃｌｅｓ，７２℃  ｆｏｒ  ２０ｍｉｎ，１ｃｙｃｌｅ）を行った。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌ  ＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩにより制限処理し、ｐＣＢ６ベクターのＢｇｌ  ＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入して、ｐＣＢ６／Ｅｔｓ−１ベクターを得た。
５．ｐＣＢ６／Ｅｔｓ−２
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／Ｅｔｓ−２（Ｄｒ．Ｄ．Ｋ．Ｗａｔｓｏｎより供与）５’−ｅｔｓ２（Ｂｇｌ  ＩＩ）、及び３’−ｅｔｓ２（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）を用いＰＣＲ（９４℃  ｆｏｒ  １ｍｉｎ，６０℃  ｆｏｒ  １ｍｉｎ，７２℃  ｆｏｒ  １．５ｍｉｎ，４０ｃｙｃｌｅｓ，７２℃  ｆｏｒ  ２０ｍｉｎ，１ｃｙｃｌｅ）を行った。得られたＰＣＲ産物をＢｇＩ  ＩＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩにより制限処理し、ｐＣＢ６ベクターのＢｇｌ  ＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入して、ｐＣＢ６／Ｅｔｓ−２ベクターを得た。
６．ｐＣＢ６／ＰＥＡ３
ｐＧＥＭ／ＰＥＡ３（Ｄｒ．Ｊ．Ａ．Ｈａｓｓｅｌより供与）をＸｂａＩにより制限酵素処理し、ｐＣＢベクターのＸｂａＩ部位に挿入して、ｐＣＢ６／ＰＥＡ３ベクターを得た。
７．ｐＣＢ６／アンチセンスＭＥＦ
ｐＣＢ６／ＭＥＦプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ  Ｉで制限酵素処理し、て得られた約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製後、再び連結反応を行った。得られたプラスミドを制限酵素処理することにより、インサートの方向を確認し、ＭＥＦ  ｃＤＮＡがアンチ−センス方向に導入された目的のプラスミドＤＮＡを得た。
８．ｐＣＢ６／アンチセンスＥＳＥ−１
ｐＣｌ／ＥＳＥ−１（Ｄｒ．Ｔ．Ａ．Ｌｉｂｅｒｍａｎｎより供与）をＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＫｐｎＩにより制限酵素処理し、ｐＣＢ６ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＫｐｎＩ部位に挿入して、ｐＣＢ６／アンチセンスＥＳＥ−１ベクターを得た。
実施例１９  （レポーター道伝子の細胞内へ導入およびプロモーター活性の測定）
（１）レポーター遺伝子および蛋白発現遺伝子の細胞内への導入
細胞へのＤＮＡの導入は、トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）ならびにＬＴ１を用い、そのプロトコールに従った。以下にその方法の概要を示す。
１．トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）
レポーターブラスミドＤＮＡ５００ｎｇ、蛋白発現用ブラスミドＤＮＡ０．５μｇ−５．０μｇと、トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）溶液２μｌ−１０μｌを混合し、全量をＤＭＥＭにて１５０μｌとした。この混合液を室温にて１０分間反応後、２４ウエルのプレート上のサブコンフルエント状態にある細胞に添加した。なお細胞間の導入効率の補正を目的に、ｐＲＬ−ＣＭＶベクター（１０ｎｇ／ｗｅｌｌ）を共導入（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。２時間、３７℃にて培養後、１０％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭを新たに０．５ｍｌ加えて、導入した。
２．ＬＴ１
オプティ−メン（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）５０μｌとＬＴ１の１−６μｌを混合し、室温で１０分間静置した。この混合液をレポーターブラスミドＤＮＡ５００ｎｇ、蛋白発現用ブラスミドＤＮＡ０．５μｇ−５．０μｇを含むＤＮＡ溶液に添加して、１０分間反応させた。その後、２４ウエルのプレート上のサブコンフルエント状態にある細胞に添加した。なお細胞間の導入効率の補正を目的に、ｐＲＬ−ＣＭＶベクター（１０ｎｇ／ｗｅｌｌ）を共導入（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。なお、プラスミドＤＮＡのサンプルの量はＵＶ（２６０ｎＭ）の吸光度より求め、純度８５％以上のものを用いた。
（２）プロモーター活性の測定
レポーター遺伝子を導入した細胞におけるプロモーター活性は、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて測定した。４８時間培養した細胞から、培地を除き、冷ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、１００μｌの細胞溶解液を加え、室温にて１５分間穏やかに振盪させた。その後、細胞溶解液を回収し、この溶液２０μｌと発光基質液１００μｌを室温で混和し、ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７，ｅｇ  ＆  ｇ  ｂｅｒｔｈｔｏｌｄ）にて測定した。
産業上の利用可能性
本発明は、ＥＴＳ転写因子又はそれをコードする遺伝子、好ましくはＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子が、細胞増殖抑制剤、又はＭＭＰ産生抑制剤、より詳細にはＭＭＰ−９産生抑制剤として有効であることを開示するものである。本発明の細胞増殖抑制剤、又はＭＭＰ産生抑制剤、より詳細にはＭＭＰ−９産生抑制剤若しくはＩＬ−８産生抑制剤は、悪性腫瘍、すなわち小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、乳癌、直腸癌、消化器癌、大腸癌、子宮頸癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫に対する抗腫瘍治療法および抗腫瘍治療薬、さらに抗リウマチ治療薬として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図はＭＴＴ法を用いて血清存在下、非存在下におけるヒト肺上皮由来細胞株Ａ５４９、およびＭＥＦ遺伝子の安定高発現細胞株（Ｎｏ．７１）における細胞増殖活性を示す図である。
第２図は、ＲＴ−ＰＣＲ法によりヒト癌細胞と正常細胞のＭＥＦの発現を分析した結果を示す図面に代わる写真である。第２図のＧＡＰＤＨはコントロールとして示したものである。第２図の左側から、ヒト正常腎臓細胞から得られるＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＮＣＩＨ２９２細胞、およびＨｅｌａ細胞を示す。
第３図は、ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒト癌細胞と正常細胞におけるＭＥＦの発現の脱メチル化剤５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ＡＣ）及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の併用効果を検討した結果を示す図面に代わる写真である。ＧＡＰＤＨはコントロールとして示したものであり、第３図の上段の左側から、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、下段の左側からＡ５４９細胞、Ｃａｃｏ−２細胞を示す。第３図のＤＭＳＯはジメチルスルホキサイドを示す。
第４図は、ＭＥＦ遺伝子高発現セルライン（クローン７１）の生体外における特性を示す図面に代わる写真である。第４図の上段は形態学的な状況を示し、第４図の下段はＦ−アクチン（Ｆ−ａｃｔｉｎ）染色を示す。第４図の左側からＡ５４９細胞、ＭＥＦ遺伝子高発現Ａ５４９細胞、ＢＢ９４（１０μＭ）で処理したＡ５４９細胞をそれぞれ示す。
第５図は、Ａ５４９細胞及びＭＥＦ遺伝子高発現細胞の無血清培養上清におけるＭＭＰ−９蛋白質の含有量を抗ＭＭＰ−９抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した結果（第５図右側）、及びＭＭＰ−９のゼラチン−チモグラフィー（Ｇｅｌａｔｉｎ−ｚｙｍｏｇｒｐｈｙ）の結果（第５図左側）をそれぞれ示す図面に代わる写真である。
第６図は、Ａ５４９細胞とＭＥＦ遺伝子高発現細胞の浸潤作用を検討するためのマトリゲル浸潤アッセイの実験の概要を図示したものである。第６図の上の房（ｃｈａｍｂｅｒ）にＡ５４９細胞（第６図左側）、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞（第６図中央）、およびＢＢ９４によって処理されたＡ５４９細胞（第６図右側）をそれぞれ播種し、２４時間後に８μｍのフィルターを通過した下側の細胞数をカウントした。
第７図は、第６図に示すマトリゲル浸潤アッセイの結果の細胞の数をコントロール（Ａ５４９細胞）に対する百分率（％）として示した図である。
第８図は、第６図に示すマトリゲル浸潤アッセイの結果の各細胞の状況を示す図面に代わる写真である。第８図の左側からＡ５４９細胞（左側）、ＭＥＦ遺伝子高発現細胞（中央）、及びＢＢ９４によって処理されたＡ５４９細胞（右側）をそれぞれ示す。
第９図はヌードマウスの背部皮下にヒト肺上皮由来細胞株Ａ５４９、およびＭＥＦ遺伝子の安定高発現細胞株（Ｎｏ．７１）を接種後２ヶ月後の腫瘍の形成を示す、図面に代わる写真である。
第１０図は、第９図のヌードマウスにおける各腫瘍の大きさをグラフにして示したものである。第１０図の縦軸は腫瘍の体積（ｍｍ３）を示し、左側はＡ５４９細胞を示し、右側はＭＥＦ遺伝子高発現細胞を示す。
第１１図は、ゼラチンザイモグラフィーとウェスタンブロッティング法を用いて、ＭＥＦ遺伝子の安定高発現細胞株（Ｎｏ．７１）を接種したヌードマウスで形成された腫瘍組織におけるＭＭＰ−９の産生、活性が抑制されていることを示す、図面に代わる写真である。
第１２図は、第９図のヌードマウスにおける各腫瘍細胞のＨＥ染色（第１２図上段）の結果、及びリゾチームによるもの（第１２図下段）を示す図面に代わる写真である。
第１３図は、ＨＥ染色法を用いてＡ５４９、およびＭＥＦ遺伝子の安定高発現細胞株（Ｎｏ．７１）を接種したヌードマウスで形成された腫瘍組織の形態学的変化について示す、図面に代わる写真である。
第１４図は、ＴＵＮＥＬ法を用いてＭＥＦ遺伝子の安定高発現細胞株（Ｎｏ．７１）を接種したヌードマウスで形成された腫瘍組織において、アポトーシスが誘導されたことを示す、図面に代わる写真である。
第１５図は、ＣＤ３１の免疫染色法によりヌードマウスの血管新生を分析した結果を示す図である。第１５図の縦軸はＡ５４９細胞の脈管数に対する相対的な（％）値を示し、横軸は脈管サイズが５０ｍｍ以上のものと５０ｍｍ以下のものを示す。各々のサイズにおける左側はＡ５４９細胞のものを示し、右側はＭＥＦ遺伝子高発現細胞（クローン７１）のものを示す。
第１６図は、Ａ５４９細胞のＭＥＦ遺伝子高発現が脈管内皮細胞の転移へ影響についての実験の概要を示すものである。第１６図の小さな黒丸印は脈管形成因子を示し、楕円形の黒丸印はヒトさい帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を示す。上の房にヒトさい帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を播種し、８μｍのフィルターで下の房の培地に移行する細胞を観察した。
第１７図は、第１６図に示した実験の結果を示す図面に代わる写真である。第１７図の左上は無処理の場合を示し、右上はｂＦＧＦを添加した場合を示し、左下はＡ５４９細胞の培地（ｍｅｄｉａ）の場合を示し、右下はＭＥＦ遺伝子高発現細胞（クローン７１）を示す。
第１８図は、第１６図に示した実験の結果をグラフ化したものである。第１８図の縦軸は無処理の場合に対する相対的な（％）移行活性を示し、横軸は左から無処理の場合、ｂＦＧＦの場合、Ａ５４９細胞の場合、及びＭＥＦ遺伝子高発現細胞（クローン７１）の場合をそれぞれ示す。
第１９図は、ヌードマウスの腫瘍におけるＩＬ−８のｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲによる結果を示す図面に代わる写真である。第１９図のＧＡＰＤＨは確認のためのコントロールである。
第２０図は、ＭＭＰ−９とＩＬ−８のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った結果を示すものである。第２０図の左側はＭＭＰ−９プロモーターを用いた場合を示し、第２０図の右側はＩＬ−８プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底（Ｂａｓａｌ）、Ａ５４９細胞、ＭＥＦを１．０μＭ添加した場合、ＭＥＦを３．０μＭ添加した場合、ＭＥＦを５．０μＭ添加した場合、及びＭＥＦ遺伝子高発現細胞（クローン７１）の場合をそれぞれ示す。
第２１図は、ＭＭＰ−９とＩＬ−８のプロモーターを使用してルシフェラーゼアッセイを行った結果を示すものである。第２１図の左側はＭＭＰ−９プロモーターを用いた場合を示し、第２０図の右側はＩＬ−８プロモーターを用いた場合を示す。各々の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底（Ｂａｓａｌ）、Ａ５４９細胞、Ｅｓｔ−２を添加した場合、及びアンチＥｓｔ−２を添加した場合をそれぞれ示す。
第２２図は、Ｅｓｔ−２とＭＥＦを共導入した場合のルシフェラーゼアッセイを行った結果を示すものである。第２２図の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を示し、横軸は左から基底（Ｂａｓａｌ）、Ａ５４９細胞、Ｅｓｔ−２を１．０μＭ添加した場合、ＭＥＦ及びＥｓｔ−２を０．５μＭ添加した場合、ＭＥＦ及びＥｓｔ−２を１．０μＭ添加した場合、並びにＭＥＦ及びＥｓｔ−２を２．０μＭ添加した場合をそれぞれ示す。
第２３図は、Ｅｓｔ−２とＭＥＦを共導入した場合のルシフェラーゼアッセイにおけるＥｓｔ−２の発現のウエスタンブロットの結果を示す図面に代わる写真である。台２３図の左からＡ５４９細胞、Ｅｓｔ−２を１．０μＭ添加した場合、ＭＥＦ及びＥｓｔ−２を０．５μＭ添加した場合、ＭＥＦ及びＥｓｔ−２を１．０μＭ添加した場合、並びにＭＥＦ及びＥｓｔ−２を２．０μＭ添加した場合をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年10月25日(2002.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
削除
【請求項２】
ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子又は当該遺伝子の作用を調節する物質からなる上皮細胞、ガン細胞又は滑膜細胞の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質をコードする遺伝子の作用を調節する物質が、当該遺伝子の発現調節剤である請求の範囲第２項に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質が、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列、又はその１個若しくは２個以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求の範囲第２項に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子が、配列表の配列番号２に記載のヌクレオチド配列、若しくはその１又は２以上のヌクレオチドが置換、欠失、または付加されたヌクレオチド配列、又はこれらのヌクレオチド配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有する遺伝子である請求の範囲第２項に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
細胞が、上皮細胞である請求の範囲第２項〜第５項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
細胞が、ガン細胞である請求の範囲第２項〜第６項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
細胞が、滑膜細胞である請求の範囲第２項〜第６項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
細胞増殖抑制剤が、抗腫瘍剤である請求の範囲第２項〜第７項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１０】
細胞増殖抑制剤が、抗リウマチ剤である請求の範囲第２項〜第６項又は請求の範囲第８項のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１１】
ＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又は当該遺伝子の作用を調節する物質からなるＭＭＰ産生抑制剤、又はＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項１２】
ＭＭＰが、ＭＭＰ−９である請求の範囲第１１項に記載のＭＭＰ産生抑制剤。
【請求項１３】
削除
【請求項１４】
ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞を用いて、当該細胞又はその細胞周辺に被検物質を添加して、当該細胞のＥＴＳ転写因子をコードする遺伝子の発現量を測定することからなる、細胞の増殖抑制剤となり得る物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
抗腫瘍剤又は抗リウマチ剤の有効成分となり得る物質をスクリーニングするための方法である請求の範囲第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
削除
【請求項１７】
ＥＴＳ転写因子ＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又は当該遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗腫瘍剤。
【請求項１８】
ＭＥＦタンパク質若しくはそれをコードする遺伝子、又は当該遺伝子の作用を調節する物質が、請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の方法により得られた物質である請求の範囲第１７項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１９】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質を含有してなる抗リウマチ剤。
【請求項２０】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、ＭＥＦタンパク質又はそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質である請求の範囲第１９項に記載の抗リウマチ剤。
【請求項２１】
ＥＴＳ転写因子若しくはそれをコードする遺伝子の作用を調節する物質が、請求の範囲第１３項〜第１５項のいずれかに記載の方法により得られた物質である請求の範囲第１９項又は第２０項に記載の抗リウマチ剤。
【国際調査報告】
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