(57)【要約】ヒトゲノム上のＨＬＡクラスＩ抗原またはクラスＩＩ抗原に属する遺伝子群の配列を由来とし且つその配列中にアロ抗原としての遺伝子の多型性を含む１０〜２４塩基長のオリゴヌクレオチドを共有結合により固定化した基板を用い、被検体に由来する核酸配列とのハイブリダイゼーションによりその被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定する。
2001092572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトゲノム上のＨＬＡクラスＩ抗原またはクラスＩＩ抗原に属する遺伝子群の配列を由来とし且つその配列中にアロ抗原としての遺伝子の多型性を含む１０〜２４塩基長のオリゴヌクレオチドを共有結合により固定化した基板を含み、被検体に由来する核酸配列とのハイブリダイゼーションによりその被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定するためのタイピングキット。
【請求項２】
表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基がコートされ、このカルボジイミド基またはイソシアネート基と前記オリゴヌクレオチドの末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成された請求項１記載のタイピングキット。
【請求項３】
前記リンカーがアミノ基または末端に、アミノ基、またはチミジン残基のホモポリマーを有する化合物である請求項１記載のタイピングキット。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、前記基板の表面に径１０〜１，０００μｍのサイズで固定化された請求項１記載のタイピングキット。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡまたはペプチド核酸のいずれかの核酸である請求項１記載のタイピングキット。
【請求項６】
前記のクラスＩ抗原がＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｄ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦまたはＨＬＡ−Ｇをコードするいずれかの遺伝子座によって支配される抗原であり、クラスＩＩ抗原がＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＰをコードするいずれかの遺伝子座により支配される抗原である請求項１記載のタイピングキット。
【請求項７】
ＨＬＡ−ＤＱが、ＤＱＡ１、ＤＱＡ２、ＤＱＢ１、ＤＱＢ２のうちのいずれかの遺伝子座を由来とする抗原である請求項１又は６に記載のタイピングキット。
【請求項８】
ＨＬＡ−ＤＲが、ＤＲＡ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５のうちのいずれかの遺伝子座を由来とする抗原である請求項１又は６に記載のタイピングキット。
【請求項９】
ＨＬＡ−ＤＰが、ＤＰＡ１、ＤＰＡ２、ＤＰＢ１およびＤＰＢ２のうちのいずれかの遺伝子座を由来とする抗原である請求項１又は６に記載のタイピングキット。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１〜３９７、４５６〜５０３、５０７〜５８９、５９４〜８９８、９０８〜１０７２または１０８０〜１２９８に示す核酸配列のうちの少なくとも１つを含むことによりなる請求項１又は６に記載のタイピングキット。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１〜５４に示す核酸配列のうちの少なくとも１つを含むことによりなるＨＬＡ−ＤＱＡ１の遺伝子型を決定するための請求項１、６および７のいずれか一項に記載のタイピングキット。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号５５〜１４０または５０７〜５８９に示す核酸配列のうちの少なくとも１つを含むことによりなるＨＬＡ−ＤＱＢ１の遺伝子型を決定するための請求項１、６および７のいずれか一項に記載のタイピングキット。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１４１〜１４４に示す核酸配列のうちの少なくとも１つを含むことによりなるＨＬＡ−ＤＲＡの遺伝子型を決定するための請求項１、６および８のいずれか一項に記載のタイピングキット。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１４５〜３２３または５９４〜８５３に示す核酸配列のうちの少なくとも１つを含むことによりなるＨＬＡ−ＤＲＢ１、−ＤＲＢ３、−ＤＲＢ４、−ＤＲＢ５、−ＤＲＢ６または−ＤＲＢ７の遺伝子型を決定するための請求項１、６および８のいずれか一項に記載のタイピングキット。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号３２４〜３４８に示す核酸配列のうちの少なくとも１つを含むことによりなるＨＬＡ−ＤＰＡ１の遺伝子型を決定するための請求項１、６および９のいずれか一項に記載のタイピングキット。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号３４９〜３９７または４５６〜５０３に示す核酸配列のうちの少なくとも１つを含むことによりなるＨＬＡ−ＤＰＢ１の遺伝子型を決定するための請求項１、６および９のいずれか一項に記載のタイピングキット。
【請求項１７】
請求項１０記載のタイピングキットにおいて、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、遺伝子の多型性に関わる塩基を除去もしくは変更することなく配列番号１〜３９７、４５６〜５０３、５０７〜５８９、５９４〜８９８、９０８〜１０７２または１０８０〜１２９８のいずれかの核酸配列に対してゲノム上の遺伝子配列を５’側もしくは３’側またはその両方に伸長させるか短縮させることにより得られ、前記ハイブリダイゼーションにおける結合親和性が最適化された８〜２４塩基長の核酸配列であるオリゴヌクレオチドで代替されたタイピングキット。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドの少なくともいずれかが、遺伝子の多型性に関係しない任意の塩基をスペーサー化合物で置換することによりハイブリダイゼーションにおける結合親和性を緩和したオリゴヌクレオチドである請求項１〜２、４〜５および１０〜１７記載のいずれか一項に記載のタイピングキット。
【請求項１９】
前記スペーサー化合物が、いずれの種類の塩基との相補結合性を有しない核酸骨格である請求項１８記載のタイピングキット。
【請求項２０】
前記被検体のＨＬＡクラスＩ抗原またはクラスＩＩ抗原の遺伝子の多型性に関係する核酸配列を切り出して増幅するためのＰＣＲプライマー。
【請求項２１】
ＨＬＡ−ＤＱに対応する５’側プライマーと３’側プライマーの組み合わせが（配列番号３９８と４００）および（配列番号３９９と４００）のうち少なくとも１組からなり、ＨＬＡ−ＤＲに対応する５’側プライマーと３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４０１と４０３）および（配列番号４０２と４０３）のうち少なくとも１組からなる低精度遺伝子型判定のための請求項２０記載のＰＣＲプライマー。
【請求項２２】
ＨＬＡ−ＤＱＢ１に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４０４と４０６）、（配列番号４０５と４０６）、（配列番号４０７と４０９）、（配列番号４０８と４０９）、（配列番号４１０と４１２）および（配列番号４１１と４１２）のうち少なくとも１組からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４１３と４１７）、（配列番号４１４と４１７）、（配列番号４１５と４１７）および（配列番号４１６と４１７）のうち少なくとも１組からなる高精度遺伝子型判定のための請求項２０記載のＰＣＲプライマー。
【請求項２３】
ＨＬＡ−ＤＱＡ１に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４１８と４２０）および（配列番号４１９と４２０）のうち少なくとも１組からなり、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４２１と４２２）であり、ＨＬＡ−ＤＲＡに対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４２３と４２４）であり、ＨＬＡ−ＤＲＢ２に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４２５と４２８）、（配列番号４２６と４２８）および（配列番号４２７と４２８）のうち少なくとも１組からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ３に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４２９と４３１）および（配列番号４３０と４３１）のうち少なくとも１組らなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ４に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４３２と４３３）および（配列番号４３４と４３５）のうち少なくとも１組からなり、ＨＬＡ−ＤＲＢ５に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４３６と４３７）であり、ＨＬＡ−ＤＲＢ６に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４３８と４３９）および（配列番号４３９と４４０）のうち少なくとも１組からなり、
ＨＬＡ−ＤＲＢ７に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４４１と４４２）であり、ＨＬＡ−ＤＰＡ１に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４４３と４４４）であり、ＨＬＡ−ＤＰＢ１に対応する５’側プライマーおよび３’側プライマーの組み合わせが（配列番号４４５と４４６）および（配列番号４４５と４４７）のうち少なくとも１組からなる、高精度遺伝子型判定のための請求項２０記載のＰＣＲプライマー。
【請求項２４】
被検体に由来する核酸配列を、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタイピングキット上の各々のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、各々のオリゴヌクレオチドについて被検体に由来する核酸配列とのハイブリダイゼーションの有無を検出することによって、被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定する方法。
【請求項２５】
被検体に由来する核酸配列を鋳型として請求項２１記載の低精度遺伝子型判定のためのプライマーを用いて第一段階のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物を請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタイピングキット上の各々のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、各々のオリゴヌクレオチドについて被検体に由来する核酸配列とのハイブリダイゼーションの有無を検出することによって被検体ＨＬＡの遺伝子型の低精度判定を行うステップと、
前記判定結果に基づいて請求項２２記載の高精度遺伝子型判定のためのプライマーから適当なプライマーを選択して被検体に由来する核酸配列を鋳型とする第二段階のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物を請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタイピングキット上の各々のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、各々のオリゴヌクレオチドについて被検体に由来する核酸配列とのハイブリダイゼーションの有無を検出することによって被検体ＨＬＡの遺伝子型を高精度判定するステップを含む、請求項２４記載の被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定する方法。
【請求項２６】
被検体に由来する核酸配列を鋳型として請求項２４記載の高精度遺伝子型判定のためのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物を請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタイピングキット上の各々のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを特徴とする請求項２４記載の被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定する方法。
【請求項２７】
各ＨＬＡの遺伝子配列のアラインメントを取り、１〜１０個の塩基からなる塩基配列内に、ＨＬＡタイピングに関わる少なくとも２個以上の塩基多型または塩基配列多型が認められる塩基配列をパッチワーク領域と定め、及び／又は、少なくとも１個以上の塩基多型もしくは塩基配列多型が認められる塩基配列をサテライト領域と定め、
上記パッチワーク及び／又はサテライトを全てのＨＬＡ遺伝子配列内に見出し、パッチワークの組み合わせ及び／又はサテライトの組み合わせでタイピングを行い、被検体の各ＨＬＡ型がホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別するのと同時にＨＬＡのタイプを決定する請求項２４記載の被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定する方法。
【請求項２８】
判定されるＨＬＡ型の中にＤＲＢ１の偽遺伝子が含まれる請求項２７記載の被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定する方法。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号９０８〜１０７１に示す核酸配列のうちの少なくとも１つを含み、ＨＬＡ−Ａの遺伝子型を決定するためのものである請求項１又は６のいずれか一項に記載のタイピングキット。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１０８０〜１２９８に示す核酸配列のうちの少なくとも１つを含み、ＨＬＡ−ＤＲＡの遺伝子型を決定するためのものである請求項１又は６のいずれか一項に記載のタイピングキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＨＬＡの遺伝子型を判定するためのタイピングキット及び判定法に関する。ＨＬＡの判定は免疫遺伝学的に違いのある個体間の移植の可否を判定するためのもので、具体的には、骨髄、腎臓、肝臓、膵臓、膵ランゲルハンス島、角膜などの臓器や組織を移植する際の移植適合性を決定するための遺伝子情報の提供を目的とする。本発明のキットは、遺伝的要因である特定の疾患に対する感受性診断や個人識別にも応用することができる。
本発明は、さらに上記キット及び方法に用いられるＰＣＲプライマーおよびそれらの製造方法に関する。
背景技術
１．ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のタイプと組織適合性の重要性
組織や細胞を自分自身に移植する場合や、一卵性双生児のように免疫遺伝学的に相同な個体間の移植においては、移植片は拒絶反応を誘起することなく生着する。一方、家族や他人といった免疫遺伝学的に異なる個体間の移植（同種移植）や、ヒトと他の霊長類のような異なった種属間の移植（種間移植）では、移植免疫が成立し、移植片に対して拒絶反応が起こる。この反応における標的として主要組織適合抗原と称される特に強い移植免疫を惹起する抗原があり、これらはＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）と呼ばれる遺伝子群により支配されている。ＭＨＣはクラスＩ，ＩＩおよびＩＩＩに分かれており、クラスＩ遺伝子とクラスＩＩ遺伝子が移植抗原であるＨＬＡ（白血球型抗原）をコードしている。ＨＬＡ抗原は、免疫機構における自己・非自己の識別をつかさどる蛋白質であり、それらの遺伝子座には多数の対立遺伝子が存在して、これらをコードする遺伝子配列は多型性に富んでいることが知られている。
ＨＬＡの遺伝子型の判定（タイピング）は、免疫遺伝学的に違いのある個体間の移植の可否を決定するための情報を提供するもので、具体的には、骨髄、腎臓、肝臓、膵臓、膵ランゲルハンンス島、角膜などの臓器や組織の移植の際に用いられる。ＨＬＡの遺伝子型は特定の難治性疾患とも関係があるとされており、慢性関節リウマチ、ＩＤＤＭ、およびインスリン自己免疫症候群などの診断のための補助的手段としても使用できる。この他、ＨＬＡは遺伝学的多型性に富んでいることから親子鑑定や個人鑑定にも応用されている。
２．ＨＬＡタイピングに関わる遺伝子と多型性
ヒトＭＨＣは第６染色体上の短腕に位置するＨＬＡ遺伝子複合体であり、それらによってコードされるＨＬＡ抗原には、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ座により支配されるクラスＩ抗原と、ＨＬＡ−Ｄ領域（ＤＲ，ＤＱ，ＤＰ）により支配されるクラスＩＩ抗原がある。
クラスＩ抗原は、β２ミクログロブリンと呼ぶ１２ｋＤａのＬ鎖と分子量４５ｋＤａのＨ鎖よりなる２本鎖構造を有し、Ｔ細胞を介した細胞性免疫に関係して抗原特異性を決定するもので、移植免疫の標的抗原となる。クラスＩＩ抗原は、分子量３４ｋＤａと２９ｋＤａの２本鎖構造を有し、抗原認識を決定し、液性免疫における抗原提示に関係する。ＨＬＡ−Ｄ領域のＤＰ，ＤＱ，ＤＲの分類は、アミノ酸もしくは塩基配列に基づく多型性によりさらに詳細な分類がなされている。ＤＲはおよそ２０種類のサブタイプに、ＤＱはおよそ１０種類に、ＤＰは数種類に分類される。サブタイプの多さは、ＨＬＡ抗原が分子量の異なるα鎖とβ鎖から構成され、ＤＱ抗原を除いてアロ抗原決定基がβ鎖のみによっていることによる。さらに抗原決定基のアミノ酸配列もしくは対応する塩基配列に基づいて、サブタイプはさらに細分化される。
３．ＨＬＡタイピングの手段
抗血清反応を利用した血清学的検査とリンパ球の幼若化反応を利用した細胞学的手法は、一般的に利用されてきた方法であるが、検査に時間と労力を要し、操作が煩雑であるばかりでなく、得られる結果の精度も高くないため、これらの欠点を克服するためにＰＣＲを応用したＤＮＡタイピング手法が開発され、実用化されている。例としては、ＰＣＲ−ＳＳＰ（２）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（３）、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法（４）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（５）などがある。
ＰＣＲ−ＳＳＰは、目的とするＨＬＡ抗原の超可変領域を増幅することにより遺伝子配列の確認を行い、それによってＨＬＡ抗原タイプを決定する。この方法では高精度タイピングを可能にするために特異的プライマーを数多く用意しなければならず、また膨大な回数のＰＣＲを行う必要があり必ずしも実用的ではない。
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）法は、ＨＬＡ抗原のタイピングに関係する領域を含むように塩基配列をＰＣＲ増幅し、得られた増幅産物を制限酵素で切断する。ＨＬＡタイプによって切断部位が生じる制限酵素を用いて増幅産物である塩基配列を切断した後電気泳動で分離し、泳動パターンに基づいてタイプが決定される。この方法は、迅速に結果が得られることを特徴とするが、配列中に制限酵素切断部位が必ずしも存在するとは限らない。また、１つのタイピングに増幅産物を複数種の制限酵素で切断する必要があり、大量検体の処理については実用的とは言い難い。
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ（ＰＣＲ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ）法は、ＨＬＡ遺伝子特異的なプライマーで増幅したＤＮＡを固定化したナイロンメンブレンを作製し、各ＨＬＡタイプ特異的なオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせてタイピングするものである。また、ＰＣＲ−ＳＳＯＰの変法で、各ＨＬＡタイプ特異的なオリゴヌクレオチドを固定化したメンブレンを作製し、ＨＬＡ遺伝子特異的なプライマーを用いて増幅したＤＮＡをハイブリダイズさせるものもある。増幅ＤＮＡを固定化する方法では、各タイプのプローブごとにメンブレンを用意してハイブリダイゼーションを行わなければならず、多検体のタイピングには多大な労力を必要とする。増幅ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを固定化する基材がメンブレンであるため、１枚のメンブレンで高精度タイピングを実施するためには多大な面積のメンブレンを用意せねばならず、判定パターンが複雑になることが考えられる。
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ＰＣＲ−ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）法は、ＰＣＲで増幅させたＤＮＡを１本鎖に変性させ、塩基配列の違いによる高次構造の変化を電気泳動で検出するものである。この方法では、同一ゲル上にすべて既知タイプのＤＮＡを泳動する必要があり、実用的な多検体処理は不可能に近い。
４．高精度ＨＬＡタイピングの重要性
理想的な移植の実現には、ドナーおよびレシピエントのＨＬＡタイプが高精度で一致していることが重要である。従って高精度にタイピングされた組織または個人情報が事前に明らかになっている必要性が生じてくる。その点において、移植前に現在明らかになっている全タイプに照らし合わせて判定される必要がある。また完全に一致したＨＬＡタイプのドナーが見つけられなかった場合でも、高精度ＨＬＡタイプが判明していれば移植などを類似したタイプ同士で行うことによって高い成功率が期待できる。また、移植後に生じる拒絶反応などの免疫応答においてもレシピエントの負担を軽減できることが期待できる。
また、個人鑑定においては、高精度タイピングを実施して完全一致する個人は数万人から数十万人に一人であり、高い確度で鑑定を実施できる。さらに、ＨＬＡの各遺伝子座において高精度タイピングを実施すれば、さらに個人鑑定の確度を上昇させることができる。
発明の開示
ＨＬＡタイプ情報を必要とする医療現場、または個人鑑定が必要とされる状況において、信頼性の高いＨＬＡタイプ情報を迅速に提供することが求められている。そのためのＨＬＡタイピング手法は、数多い検体のタイピングを容易かつ簡便に実施できることが重要である。現在様々な手法が考案され改良に取り組まれているが、操作が煩雑であったり、多検体処理ができなかったりと多くの欠点を残している。
本発明は、このような問題を解決するために、多検体処理に適し、尚かつ、１つの検体に対して一度の試験で多くの高精度タイピングが実施可能なキットおよび方法を提供することを課題とする。
本発明は、ヒトゲノム上のＨＬＡクラスＩ抗原またはクラスＩＩ抗原に属する遺伝子群の配列を由来とし且つその配列中にアロ抗原としての遺伝子の多型性を含む１０〜２４塩基長のオリゴヌクレオチドを共有結合により固定化した基板を含み、被検体に由来する核酸配列とのハイブリダイゼーションによりその被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定するためのタイピングキットである。
また本発明は、前記タイピングキット上の各々のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、各々のオリゴヌクレオチドについて被検体に由来する核酸配列とのハイブリダイゼーションの有無を検出することによって、被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定する方法を提供する。
本発明はまた、前記タイピングキットにおいて、前記のクラスＩ抗原がＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｄ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦまたはＨＬＡ−Ｇをコードするいずれかの遺伝子座によって支配される抗原もしくはヌル遺伝子であり、クラスＩＩ抗原がＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＰをコードするいずれかの遺伝子座により支配される抗原もしくは偽遺伝子であるキット、
ＨＬＡ−ＤＱが、ＤＱＡ１、ＤＱＡ２、ＤＱＢ１、ＤＱＢ２のうちのいずれかの遺伝子座を由来とする抗原または偽遺伝子であるキット、
ＨＬＡ−ＤＲが、ＤＲＡ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５のうちのいずれかの遺伝子座を由来とする抗原または偽遺伝子であるタイピングキット、及び、
ＨＬＡ−ＤＰが、ＤＰＡ１、ＤＰＡ２、ＤＰＢ１およびＤＰＢ２のうちのいずれかの遺伝子座を由来とする抗原または偽遺伝子であるタイピングキットを提供する。
本発明はさらに、前記オリゴヌクレオチドが由来する遺伝子の塩基配列の５’側もしくは３’側またはその両方において、各々の塩基配列をベースとしてヒトゲノム上のＨＬＡ遺伝子配列の各タイプに関わる固有の塩基配列を含む塩基配列からなり、１０〜２４塩基の長さのオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドを伸長させるか、または短縮させることによって得られる塩基配列であり、各ＨＬＡタイプ固有の配列は置換されないことを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供する。
また本発明は、前記のいずれかのタイピングキットにおいて、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、遺伝子の多型性に関わる塩基を除去もしくは変更することなく配列番号１〜３９７、４５６〜５０３、５０７〜５８９、５９４〜８９８、９０８〜１０７２または１０８０〜１２９８のいずれかの核酸配列に対してゲノム上の遺伝子配列を５’側もしくは３’側またはその両方に伸長させるか短縮させることにより得られ、前記ハイブリダイゼーションにおける結合親和性が最適化された８〜２４塩基長の核酸配列であるオリゴヌクレオチドで代替されたタイピングキットを提供する
さらに、前記のいずれかのタイピングキットにおいて、オリゴヌクレオチドの少なくともいずれかが、遺伝子の多型性に関係しない任意の塩基をスペーサー化合物、例えばどの塩基とも水素結合を形成しない核酸骨格を有するスペーサー化合物で置換することによりハイブリダイゼーションにおける結合親和性を緩和したオリゴヌクレオチドであるタイピングキットを提供する。
さらにこれらオリゴヌクレオチドに代わってペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いることもできる。
さらに本発明は、被検体に由来する核酸配列を鋳型として低精度遺伝子型判定のためのプライマーを用いて第一段階のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物を前記タイピングキット上の各々のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、各々のオリゴヌクレオチドについて被検体に由来する核酸配列とのハイブリダイゼーションの有無を検出することによって被検体ＨＬＡの遺伝子型の低精度判定を行うステップと、
前記判定結果に基づいて高精度遺伝子型判定のためのプライマーから適当なプライマーを選択して被検体に由来する核酸配列を鋳型とする第二段階のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物を前記タイピングキット上の各々のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、各々のオリゴヌクレオチドについて被検体に由来する核酸配列とのハイブリダイゼーションの有無を検出することによって被検体ＨＬＡの遺伝子型を高精度判定するステップを含む、被検体ＨＬＡの遺伝子型を判定する方法を提供する。
本発明は、低精度タイプのタイピングに用いられるプローブの作製に用いられるＤＱＢ１を増幅するための配列番号３９８と配列番号４００に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＱＢ１を増幅するための配列番号３９９と配列番号４００に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ１を増幅するための配列番号４０１と配列番号４０３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ１を増幅するための配列番号４０２と配列番号４０３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
から選択されるいずれかまたは任意の組み合わせであることを特徴とする低精度タイピング用プライマーを提供する。
本発明はさらに、低精度タイピングの結果をもとに高精度タイピング用プローブの作製のために用いられる
ＤＱＢ１を増幅するための配列番号４０４と配列番号４０５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＱＢ１を増幅するための配列番号４０４と配列番号４０６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＱＢ１を増幅するための配列番号４０７と配列番号４０９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＱＢ１を増幅するための配列番号４０８と配列番号４０９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＱＢ１を増幅するための配列番号４１０と配列番号４１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＱＢ１を増幅するための配列番号４１１と配列番号４１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ１を増幅するための配列番号４１３と配列番号４１７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ１を増幅するための配列番号４１４と配列番号４１７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ１を増幅するための配列番号４１５と配列番号４１７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ１を増幅するための配列番号４１６と配列番号４１７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
から選択されるいずれかまたは任意の組み合わせであることを特徴とする高精度タイピング用プライマーを提供する。
本発明はさらに、高精度タイピング用プローブの作製のために用いられる
ＤＱＡ１を増幅するための配列番号４１８と配列番号４２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＱＡ１を増幅するための配列番号４１９と配列番号４２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＱＢ１を増幅するための配列番号４２１と配列番号４２２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＡ１を増幅するための配列番号４２３と配列番号４２４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ１を増幅するための配列番号４２５と配列番号４２８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ１を増幅するための配列番号４２６と配列番号４２８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ１を増幅するための配列番号４２７と配列番号４２８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ３を増幅するための配列番号４２９と配列番号４３１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ３を増幅するための配列番号４３０と配列番号４３１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ４を増幅するための配列番号４３２と配列番号４３３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ４を増幅するための配列番号４３４と配列番号４３５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ５を増幅するための配列番号４３６と配列番号４３７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ６を増幅するための配列番号４３８と配列番号４３９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ６を増幅するための配列番号４３８と配列番号４４０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＲＢ７を増幅するための配列番号４４１と配列番号４４２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＰＡ１を増幅するための配列番号４４３と配列番号４４４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対、
ＤＰＢ１を増幅するための配列番号４４５と配列番号４４６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対
ＤＰＢ１を増幅するための配列番号４４５と配列番号４４７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド対
から選択されるいずれかまたは任意の組み合わせであることを特徴とする高精度タイピング用プライマーを提供する。
本願におけるＨＬＡクラスＩおよびＩＩという場合のクラスとは、それぞれが生体内で行う役割に基づく分類を表している。従って本願においてもこの分類手法に従った。クラスＩ抗原とは各ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｄ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦおよびＨＬＡ−Ｇ抗原の総称であり、クラスＩＩ抗原とは各ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＰ抗原の総称である。アロ抗原とは、同一の動物種に属するが遺伝的に差異のある個体について、各々の個体を特徴付けている抗原のことであり、遺伝的差異とは塩基配列の差異であることを表している。さらに、遺伝的差異により分類されたアロ抗原のそれぞれをアロ抗原型として命名される。
本願における多型性とはたんぱく質あるいはそれをコードするＤＮＡにおいて同じ機能を有し、かつ一次構造が異なっている性質をあらわすものとする。
本願で言う遺伝子座とは多型性を有する各ＨＬＡ遺伝子が染色体に占める位置を表し、ＤＲ、ＤＱ、ＤＰ抗原の遺伝子座は、ＤＲにはＤＲＡ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４およびＤＲＢ５が、ＤＱにはＤＱＡ１、ＤＱＡ２、ＤＱＢ１およびＤＱＢ２がＤＰには、ＤＰＡ１、ＤＰＡ２、ＤＰＢ１およびＤＰＢ２がある。
本願における遺伝子座を由来とする抗原とは、各遺伝子座に存在する遺伝子から翻訳された抗原であることを意味する。
本願における遺伝子の多型性に関わる塩基とは、各アロ抗原をコードする遺伝子間において塩基の一次配列が異なっている塩基を指す。
本願における被検体とは、タイピングされる試料（サンプル）を意味し、本願では組織あるいは体細胞から抽出された染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらを鋳型として酵素によって生成される反応物を意味している。
本願で言うチミジン残基のホモポリマーとは、タイピングに関わる塩基配列部分の５’又は３’の末端にデオキシチミジンを連続して合成したものである。このオリゴヌクレオチドの合成は市販されているＤＮＡ合成機で合成することができる。
以下、本発明のキットの構成およびその製造方法、本発明のキットを用いたＨＬＡのタイピング法、これらのキットまたは方法に用いるオリゴヌクレオチド、本発明のキットを用いたＨＬＡのタイピングに使用する試料である被検ヒトゲノムに由来する核酸ターゲットおよびその製造方法、ならびに核酸ターゲットを作製するためのプライマーに分けて説明する。
＜１＞本発明に用いる合成オリゴヌクレオチド
本発明に用いる合成オリゴヌクレオチドは、ＨＬＡタイピングに関わるヒトゲノム上の遺伝子を由来として、これら遺伝子から得られる塩基配列をもとに合成されたオリゴヌクレオチドである。以下、これらのオリゴヌクレオチドをキャプチャーオリゴということがある。
キャプチャーオリゴの設計は、各タイプのＨＬＡ遺伝子に存在するタイプ固有の塩基配列領域を含むように行う。本発明は、被検ヒトゲノムがこれらの領域を有するか否かを同定し、ＨＬＡのタイピングを行うことを要旨とする。
ＨＬＡタイピングに関わる遺伝子中のタイプ特異的塩基配列の有無は、ヒト染色体ＤＮＡのＨＬＡタイピングに関わる遺伝子の塩基配列の一部を有する核酸断片ターゲット（「核酸ターゲット」ということがある）と各タイプ特異的なキャプチャーオリゴとをハイブリダイズさせ、いずれのキャプチャーオリゴにハイブリダイズするかによって、タイピングすることができる。
キャプチャーオリゴは、ＨＬＡタイピングに関わる遺伝子の塩基配列中の、各タイプ固有の塩基配列を含む１０から２４塩基からなる塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドとして作製することができる。キャプチャーオリゴの設計に際し、キャプチャーオリゴのタイプ固有の塩基配列の位置は、通常、キャプチャーオリゴの中央部に存在することが好ましい。キャプチャーオリゴが短すぎると、ハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長すぎるとタイプ固有の配列によるハイブリダイゼーションの阻害が起こらなくなるため、１０から２４塩基の範囲が好ましい。但し、このキャプチャーオリゴの長さの最適化は、主として配列の特性（特定の塩基の含有率、同一塩基のリピート）に依存するもので、結合性の良いものは短鎖でも良いことが本発明の実験で確認されている。またキャプチャーオリゴとターゲットとのハイブリッド形成過程において、ハイブリダイゼーションに負の影響を与える２次構造的障害がある場合は、オリゴヌクレオチド配列内にスペーサーまたはどの塩基とも水素結合を形成しない塩基を導入し、前記障害を回避することができる。さらに、キャプチャーオリゴの塩基配列を、各タイプ固有の配列部分を含むように、キャプチャーオリゴに対応するゲノム上の遺伝子配列を、キャプチャーオリゴの５’側または３’側またはその両方において伸長もしくは短縮させることによって、ターゲットおよびキャプチャーオリゴの２次構造的障害を回避することができる。
キャプチャーオリゴとしては、通常ＤＮＡが用いられるが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。ペプチド核酸が形成する被検ヒトゲノム由来の核酸とのハイブリッドはオリゴヌクレオチドを用いた場合に比べＴｍ（融解温度）が高く、安定したハイブリダイゼーションシグナルを得ることことが期待できる。ペプチド核酸の合成は、一般的なペプチド合成機を用いて容易に合成することができる。
キャプチャーオリゴの塩基配列の例を、配列番号１〜３９７、４５６〜５０３、５０７〜５８９、５９４〜８９８、９０８〜１０７８および１０８０〜１２９８に示す。これらのキャプチャーオリゴは、公表文献および日本組織適合性学会ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｓｑｕａｒｅ．ｕｍｉｎ．ａｃ．ｊｐ／ＪＳＨＩ／ｆｒａｍｅ．ｈｔｍｌ）から得られる塩基配列データに基づいて設計したものであり、それぞれのＨＬＡタイプを網羅している。
特定のＨＬＡタイプのタイピングは、この中からキャプチャーオリゴを適宜選択して試験に供することにより可能である。
キャプチャーオリゴ長は、おおむね１４から２２塩基の範囲とし、ハイブリダイゼーションの観点から１６から１７塩基を中心的なサイズとした。尚、配列番号１から３９７に示す塩基配列の他、各塩基配列の５’側もしくは３’側またはその両方において、各々のＨＬＡタイプ遺伝子配列を伸長させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをキャプチャーオリゴとして用いることもできる。
また、配列番号１から３９７、４５６〜５０３、５０７〜５８９、５９４〜８９８、９０８〜１０７８および１０８０〜１２９８のいずれかに示す塩基配列の５’側もしくは３’側の一方を伸長させ、他方を短縮させても良いが、いずれの場合もキャプチャーオリゴは１０〜２４塩基の範囲とする。
本発明において、設計されたキャプチャーオリゴは、出願時点までの研究・調査結果を良く反映したものであるが、新しいＨＬＡタイプの塩基配列に関してこの後追加的な情報が得られた場合には、本出願に記載の方法に基づいて新たなキャプチャーオリゴが設計されることになり、それらは本出願の請求範囲に包含されるものである。
オリゴヌクレオチドの合成および染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲの技法は、当業者に良く知られた通常の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）に従って行うことができる。また、オリゴヌクレオチドは、市販のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
＜２＞本発明に用いる基板の製造
オリゴヌクレオチドを固定化する基板の材質は、オリゴヌクレオチドを安定して固定化できるものであれば特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリカーボネイトやプラスティックなどの合成樹脂が挙げられる。基板の形態は特に制限されないが、板状またはフィルム状が挙げられる。基板の表面は均質で平坦なものが適している。
基板へのオリゴヌクレオチドの固定化は、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合など、通常のハイブリダイゼーション法に用いられる手法を用いることができるが、本発明実施例においては、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基をコートした基材（特開平０８−０２３９７５）を使用した。表面にカルボジイミドイミド基またはイソシアネート基をコートした基材の作製には、カルボジイミド基又はイソシアネート基を含有する高分子化合物を基材表面に塗布し、紫外線照射し共有結合によりオリゴヌクレオチドを固定化する方法を採用した。これは、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材に紫外線照射することで固定化効率を大幅に上げることに成功したためである。また、カルボジイミド基またはイソシアネート基とオリゴヌクレオチドとを結合させるためのリンカーは、カルボジイミド基またはイソシアネート基と高い反応性を有するアミノ基またはイミノ基を有する化合物を用いる。イミノ基の場合は、キャプチャーオリゴのどちらか一方の末端にチミンを重合させることで、カルボジイミド基またはイソシアネート基とを結合させることが可能である。
オリゴヌクレオチドをスポットする際に、オリゴヌクレオチドのスポット量が少なすぎると、オリゴヌクレオチドと核酸ターゲットとの間の充分な反応性を確保することができず、判定が困難になることがある。また、高集積度のスポッティングは、技術的な問題と同時にコストがかかり、かつ核酸ターゲットの蛍光標識や、化学発色などを用いたハイブリダイゼーションの有無の判定にも、より精密で高額な検出装置（代表的にはスキャナー）を必要とすることになる。従って、オリゴヌクレオチドは、基板の表面に径１０〜１，０００μｍのサイズに固定することが好ましい。オリゴヌクレオチドの固定化は、例えばスポッティングマシーンを使用して基板上にオリゴヌクレオチド溶液をスポッティングすることにより行うことができる。オリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形にスポッティングされることが好ましい。
また、各々のオリゴヌクレオチドは、単一の基板に複数スポットされるが、それぞれのスポットは格子状に配置することが好ましい。スポット数は、スポットのサイズが径１０００μｍであればｃｍ２あたり総数で１６００以下、正方形状にスポットする場合は縦横４０×４０以下にスポットすることが好ましい。また、スポットのサイズが径１０μｍであればｃｍ２あたり総数で４００以下、正方形状にスポットする場合は縦横２０×２０以下にスポットすることが好ましい。また、縦横のサイズが異なる場合には、形状に応じて縦横の数を調整すればよい。
＜３＞オリゴヌクレオチドの基板上への配置
各オリゴヌクレオチドの基板上への配置は、各ＨＬＡタイプのタイピングを容易にするために、各々のＨＬＡタイプの判定に用いられるオリゴヌクレオチドを１区画にまとめる、もしくは一列に並べるなどして配置することが好ましい。オリゴヌクレオチドは、低精度遺伝子型判定と高精度遺伝子型判定とを同時に行うために、低精度遺伝子型判定に適したオリゴヌクレオチドと、高精度遺伝子型判定に適したオリゴヌクレオチドをともに同一の基板に固定しもよい。また、低精度遺伝子型判定と高精度遺伝子型判定と段階的に行うために、低精度遺伝子型判定に適したオリゴヌクレオチドを固定した基板と、高精度遺伝子型判定に適したオリゴヌクレオチドを固定した基板を作製してもよい。
または、各ＨＬＡ遺伝子の塩基配列のアラインメントを取り、１〜１０個の塩基からなる塩基配列内にＨＬＡタイピングに関わる少なくとも２個以上の塩基多型または塩基配列多型が認められる塩基配列を含む領域をパッチワークと定義し、これらパッチワークを全てのＨＬＡ遺伝子配列内に見出し、パッチワークの組み合わせでタイピングすることも可能である。さらに高度なタイピングを実施するために、各ＨＬＡ遺伝子の塩基配列のアラインメントに基づいて１〜１０個の塩基からなる塩基配列内に少なくとも１箇所以上の塩基多型または塩基配列多型が認められる塩基配列を含む領域をサテライトと定義し、これらパッチワークを全てのＨＬＡ遺伝子配列内に見出し、サテライトの組み合わせでタイピングすることができる。それによって、上記パッチワークで分別できないタイプを分別することもできる。パッチワーク及びサテライトを用いたタイピングにより、被検体の各ＨＬＡ型がホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別するのと同時にＨＬＡのタイプを決定することができる。被検体において上記パッチワークおよびサテライトを各々明らかにしていくことでＨＬＡタイプが決定できるようにオリゴヌクレオチドを配置して作製しても良い。
基板上のスポットの配置は通常１ｃｍ２以内とする。基板上に固定化されるオリゴヌクレオチドの好ましい配置の一例を図１〜７および図１１〜１７に示した。図中の四角は各オリゴヌクレオチドの点を表し、記載される数字はオリゴヌクレオチドの配列番号を表している。
＜４＞被検試料からの核酸の調製と核酸プローブの作製
被検試料からの核酸の調製は、通常の動物細胞からの核酸の調製法と同様にして行うことができる。例えば、ＤＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）で紹介されている方法に従い調製することができる。また、培養により得られた細胞からのＤＮＡの抽出も同様にして行える。この方法は、標準的な試験法であるが、多くの代替法があり、いずれを採用しても良い。
得られたＤＮＡをもとに、ＨＬＡタイピングに用いる核酸ダーゲットを作製する。核酸ターゲットは、キャプチャーオリゴの塩基配列に対応して設計されたプライマーを使用して核酸増幅することにより作製することができる。核酸ターゲットは、通常ＤＮＡが用いられるが、ＲＮＡであっても良い。核酸増幅の方法としては、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）によりＤＮＡとして増幅する方法、あるいはインビトロ・トランスクリプション（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）法によりＲＮＡとして増幅する方法が挙げられる。
ＰＣＲに用いるプライマーは、核酸ターゲットが、各ＨＬＡタイプ固有の配列領域を除いてキャプチャーオリゴと相補的な塩基配列を含む様に設計される。尚、ハイブリダイゼーションが可能である限りにおいて、核酸ターゲットはキャプチャーオリゴよりも長いが、短くても良い。尚、増幅反応の特異性を高めるために、目的とする核酸プローブよりも広い領域を増幅する予備的プライマーを用いて初回の増幅を行い、増幅されたＤＮＡを鋳型として目的の核酸プローブを得るためのプライマーを用いて核酸増幅を行ってもよい。
ＨＬＡのタイプによっては、タイピングに関わる固有の塩基配列領域が複数個所存在する場合は、各固有領域に応じた核酸ターゲットを作製することができる。
さらにＤＱＢおよびＤＲＢのタイピングは、低精度プライマーで増幅される核酸配列を用いて得られた結果より高精度プライマーを選択し、各高精度タイピングを実施するか、全てのＤＱＢおよびＤＲＢ用低精度プライマーを用いて増幅される核酸配列と全てのＤＱＢおよびＤＲＢ用高精度用プライマーを用いて増幅される核酸配列を別々のキャプチャーが固定化されたブロックにハイブリダイズして得られたそれぞれの結果から低精度および高精度タイプを決定する。ＤＱＡ、ＤＲＡ、ＤＰＡおよびＤＰＢのタイピングは各々の高精度プライマーを用いて増幅される核酸配列を用いて高精度タイピングを実施する。
最終的な核酸増幅に用いるプライマーをあらかじめ標識しておくと、標識化された核酸ターゲットを得ることができる。核酸増幅反応中、あるいは反応後に核酸ターゲットを標識しても良い。標識物質には、蛍光物質またはハプテンなど、通常のハイブリダイゼーションに用いるプローブと同様の標識物質を使用することができる。具体的には、例えば蛍光物質としてはフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン（Ｒｏｄａｍｉｎｅ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、シアニン系蛍光色素などが、ハプテンとしてはビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）などが挙げられる。
核酸ターゲットを作製するためのプライマーは、オリゴヌクレオチドを固定化した基板と共に、ＨＬＡタイピングキットに含めることができる。
＜５＞基板上のオリゴヌクレオチドと核酸ターゲットのハイブリダイゼーションハイブリダイゼーションは、通常の核酸のハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。以下に具体的な方法を例示する。
ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング溶液、および融合反応促進のための添加剤からなる融合液に、核酸ターゲットを加える。ターゲットが２本鎖の場合は熱などによる変性を行う。基板上に核酸ターゲット溶液を数μＬ添加した後、数時間加熱操作（通常３７℃〜７０℃）を行い、基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドと核酸ターゲット間でハイブリッドを形成させる。
基板上に５×ＳＳＣまたは３Ｍテトラメチルアンモニウムクロリドを加えて加熱し（通常３７℃〜５０℃）、非特異的なハイブリッドを形成していないものを基板から剥離させ、特異的なハイブリッドのみを選択的に基板上に残す。
ハイブリッドの検出には、核酸ターゲットに導入されている蛍光物質またはハプテンを使用する。ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼなどの結合体（酵素コンジュゲート）を含む溶液を基板上に加え、室温で数１０分間反応させる。なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を行う前に、オリゴヌクレオチドを固定した領域以外の基板の領域をカゼインなどのタンパクを用いて完全に被覆することによって、酵素コンジュゲートと基板の非特異的吸着反応を阻止することができる。この処置は、オリゴヌクレオチドを固定した後、基板上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数１０分間放置することによって行うことができる。酵素コンジュゲートと核酸ターゲットのハプテンとの結合反応終了後、ハプテンと結合しなかった酵素コンジュゲートを界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄し排除することによって、基板上には核酸ターゲット中のハプテンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることになる。
ハイブリッドを視覚化するには、ハプテンと酵素コンジュゲート結合体のみが存在する場合にのみ不溶化合物になるような化合物を添加し、その不溶性化合物生成が酵素反応によって増幅され可視化する。この時用いられる化合物としては、酵素コンジュゲート中の酵素がアルカリフォスファターゼの場合、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）とＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐトルイジントルイジン塩）が用いられる。酵素がホースラディッシュ・パーオキシダーゼの場合は、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン）などを用いることができる。
得られたハイブリダイゼーションの結果をもとにしたＨＬＡタイプのタイピングは、キャプチャーオリゴを固定化した位置における色素沈着または蛍光発色を見ることによって行う。すなわち色素沈着または蛍光発色のある位置が該当する遺伝子であり、各タイプに属するオリゴヌクレオチドの全てが発色しているときにそのタイプが決定される。例えば、実施例中の図８〜１０では、配列番号１４１から１４４までのオリゴヌクレオチドのうち配列番号１４１と１４３にのみハイブリシグナルが得られ、試験に供した検体はＤＲＡ＊０１０１とタイピングされる。さらに配列番号１から３９７のキャプチャーオリゴの位置に得られるハイブリダイゼーションシグナルとＨＬＡタイプの対応表を表１から表２０にまとめた。
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本発明のキットは、キャプチャーオリゴを固定化した基板を含む。また、本発明のキットは、核酸ターゲットを作製するためのプライマーまたは標識化核酸ターゲット、緩衝液、ハプテンを認識する酵素コンジュゲート等のハイブリダイゼーション用の試薬などを含めることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  オリゴヌクレオチドの合成
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、５’末端にアミノ基又は水酸基を有するオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液を用いて溶解し、１００ｐｍｏｌ／μＬのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。この合成法は、キャプチャーオリゴ又はプライマーとして使用するいずれのオリゴヌクレオチドに対しても同様である。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列表の配列番号１〜４４７に示す。これらのうち、配列番号１〜３９７がキャプチャーオリゴであり、配列番号３９８〜４４７がプライマーである。
実施例２  基板へのキャプチャーオリゴのスポッティング（５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合）
５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液１０μＬに対してマイクロスポッティング溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）を１０μＬ混合し、マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にシラン化スライドグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｉｎｄ．Ｌｔｄ．）を配置し、スポッティングマシーンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を３０ｍＪ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液でスライドグラスをすすいだ後、蒸留水で濯いだ。スライドグラスを３％  ＢＳＡ（仔牛血清アルブミン）を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に室温で３０分間浸し、ブロッキングした。その後室温で乾燥させたのち、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。スライドグラスを再度室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。
実施例３  基板へのキャプチャーオリゴのスポッティング（５’末端に水酸基を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合）
５’末端に水酸基を有するオリゴヌクレオチド溶液１０μＬに対してマイクロスポッティング溶液（２Ｍ  塩化ナトリウム水溶液）を１０μＬ混合し、マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にシラン化スライドグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｉｎｄ．Ｌｔｄ．）を配置し、スポッティングマシーンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスを３７℃の乾燥機に３０分間置いた。スライドグラスを３％  ＢＳＡ（仔牛血清アルブミン）を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に室温で３０分間浸し、ブロッキングした。その後室温で乾燥させたのち、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。スライドグラスを再度室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。
実施例４  核酸ターゲットの調製
末梢血または培養細胞などから有核細胞を採取し、マイクロチューブに入れ、生理食塩水で３回洗浄した。これに０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，０．２Ｍ  ＮａＣｌ，０．０４Ｍ  ＥＤＴＡ，２％  ＳＤＳを８００μｌ加え混和したのち、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを１２０μｇ加え、５０℃で一晩インキュベートした。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フェノールを８００μｌ加え、ローテーターで１時間以上回転させた後、フェノール抽出を３回行うことによりタンパク除去した。水層に２−プロパノール２ｍｌと５Ｍ  ＮａＣｌ  ６０μｌを加え軽く混和し、析出したＤＮＡをマイクロピペットですばやく吸い取り、７０％冷エタノールを加えて遠心洗浄を３回行った。減圧乾燥し、滅菌水７０μｌに溶かしたものをＰＣＲテンプレート溶液とした。
ＰＣＲ増幅の組成は、Ｔａｑポリメレースを２Ｕｎｉｔ、プライマーを各２５ｐｍｏｌ、反応用緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰを各１０ｎｍｏｌ、テンプレートＤＮＡ溶液を０．５μｌ、および滅菌水を加えて総量５０μｌとした。チューブに入れた溶液をサーマルサイクラーにセットして、▲１▼９５℃：３分間、▲２▼９５℃：３０秒間、▲３▼７１℃：３０秒間、▲４▼７２℃：３分間のサイクル中、▲２▼〜▲３▼を３０回繰り返すプログラムを作動させた。
本実施例では、確認試験として、次に記載のアガロースゲルを用いた電気泳動を行ったが、実際の臨床における鑑別の際には不要である。ＰＣＲ反応混合物を１μｌ取り、６×泳動色素（３０％グリセロール、０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノール）を１μｌ、蒸留水４μｌと混和した。２％アガロースゲル上で、１００Ｖ、９０分間の条件で泳動させたのち、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを含む蒸留水に３０分間浸し、紫外線照射下でゲルをＣＣＤカメラで撮影した。
実施例５  ハイブリダイゼーション
実施例４で作製した核酸ターゲット２μｌ取り、ＡｒｒａｙＩｔ  Ｕｎｉｈｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）８μｌを加えて混合し、１００℃で１０分間加熱処理を行った後、氷中に５分間浸した。この核酸ターゲット溶液を５μｌとり、実施例２または実施例３で作製したキャプチャーオリゴを固定化した基板にのせ、その上にカバーグラスをのせた。これを保湿箱にいれ、さらに４２℃に設定した恒温器に入れて６０分間静置した。基板を取り出し、すばやく４℃の５×ＳＳＣ（０．０８３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０８３Ｍクエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去した。基板を４℃の５×ＳＳＣに１０分間浸す操作を２回行い、室温の３Ｍテトラメチルアンモニウムクロリド水溶液で２回濯いだ。４５℃の３Ｍテトラメチルアンモニウムクロリド水溶液に２０分間浸す操作を２回行い、最後に２×ＳＳＣ（０．０３３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３３Ｍクエン酸ナトリウム）に浸した。
実施例６  化学発色検出
実施例５でハイブリダイゼーションを終えた基板を２×ＳＳＣから取り出し、ブロックエース（大日本製薬株式会社）原液（４％水溶液）を、基板の１平方センチメートル当り７０μｌとなる量を載せ、室温で２０分間静置したのち溶液を除去した。次に、５ｍｌのＴＢＳＴ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）にアビジンＤＨ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼＨ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を各２滴加えて混合した溶液を、基板の１平方センチメートル当り７０μｌとなる量を載せ、室温で３０分間静置したのち溶液を除去した。室温のＴＢＳＴに５分間浸す操作を２回行ったのち基板を取り出し、ペーパータオルで水分を十分に取り除いた。基板上に、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン）基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、基板の１平方センチメートル当り７０μｌとなる量を載せ、室温で１０分間静置したのち溶液を除去し、基板を脱イオン水に浸して酵素反応を停止した。
以上の結果を図８〜１０に示した。本発明の方法により、ＨＬＡタイピングが可能なことが明らかである。
実施例７  パッチワークを用いたタイピング
アレイ作製に用いるオリゴヌクレオチドは、実施例１に準じて作製した。アレイは実施例２または実施例３に準じて作製した。各タイプ判定用アレイ作製に用いたオリゴヌクレオチド配列と各ＨＬＡタイプの対応表は表２１〜３２にまとめた。ターゲット増幅には表３３に示したプライマーの組み合わせを用いた。
実施例４〜実施例６に準じてタイプ判定を行った。
以上の結果を図１８〜２４に示した。以上のことより、パッチワークとサテライトによって設計されたオリゴヌクレオチドを用いて作製されたアレイを用いた被検体のＨＬＡ型の判定が可能であることが示された。
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産業上の利用可能性
本発明により、多検体処理が可能であり、かつ、一度の試験で高精度なＨＬＡタイピングが可能なキットおよび方法、ならびにそれらに用いるオリゴヌクレオチド及びプライマーが提供される。
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【図面の簡単な説明】
図１は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＱＡ１用）の配置を示す図である。図中の数字は配列番号を表す（図２〜７も同様）。
図２は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＱＢ１用）の配置を示す図である。
図３は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＲＡ用）の配置を示す図である。
図４は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１用）の配置を示す図である。
図５は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＲＢ３，ＤＲＢ４，ＤＲＢ５，ＤＲＢ６用）の配置を示す図である。
図６は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＰＡ１用）の配置を示す図である。
図７は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＰＢ１用）の配置を示す図である。
図８は、本発明のキットの模式図及びそれを用いたＤＲＡタイピングの検出結果を示す写真（ＤＲＡ＊０１０１と判定された検出結果）である。
図中の数字は配列番号を表す。Ｂはオリゴヌクレオチドの５’末端にビオチンを導入したものが固定化されている。□はハイブリダイゼーションシグナルが得られていないことを、■はハイブリダイゼーションシグナルが得られていることを表す（以下の図においても同様）。
図９は、本発明のキットの模式図及びそれを用いたＤＲＢ低解像度タイピングの検出結果を示す写真（ＤＲ４と判定された検出結果）である。
図１０は、本発明のキットの模式図及びそれを用いたＤＲＢ１高解像度タイピングの検出結果を示す写真（ＤＲＢ１＊０４０１１と判定された検出結果）である。
図１１は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＰＢ１用）の配置を示す図である。
図１２は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＱＢ１用）の配置を示す図である。
図１３は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１用）の配置を示す図である。
図１４は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＲＢ偽遺伝子用）の配置を示す図である。
図１５は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−ＤＲＢ３、４、５用）の配置を示す図である。
図１６は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−Ａ用）の配置を示す図である。
図１７は、基板上に固定化されているキャプチャーオリゴ（ＨＬＡ−Ｂ用）の配置を示す図である。
図１８は、本発明のキットの模式図（Ａ）、及びそれを用いたＤＰＢ１タイピングの検出結果（ＤＰＢ１＊０１０１１と判定された検出結果）を示す写真（Ｂ）である。
図１９は、本発明のキットの模式図（Ａ）、及びそれを用いたＤＱＢ１タイピングの検出結果（ＤＱＢ１＊０５０３１と判定された検出結果）を示す写真（Ｂ）である。
図２０は、本発明のキットの模式図（Ａ）、及びそれを用いたＤＲＢ１タイピングの検出結果（ＤＲＢ１＊０１０１と判定された検出結果）を示す写真（Ｂ）である。
図２１は、本発明のキットの模式図（Ａ）、及びそれを用いたＤＲＢ９タイピングの検出結果（ＤＲＢ９  ０１０１と判定された検出結果）を示す写真（Ｂ）である。
図２２は、本発明のキットの模式図（Ａ）、及びそれを用いたＤＲＢ３タイピングの検出結果（ＤＲＢ３  ０３０１と判定された検出結果）を示す写真（Ｂ）である。
図２３は、本発明のキットの模式図（Ａ）、及びそれを用いたＡタイピングの検出結果（Ａ  ０１０１１と判定された検出結果）を示す写真（Ｂ）である。
図２４は、本発明のキットの模式図（Ａ）、及びそれを用いたＢタイピングの検出結果（Ｂ  ０７２４と判定された検出結果）を示す写真（Ｂ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８Ａ】
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【図１９Ａ】
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【図２０Ａ−１】
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【図２０Ａ−２】
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【図２１Ａ】
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【図２２Ａ】
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【図２３Ａ】
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【図２４Ａ】
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【国際調査報告】
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