(57)【要約】被験者の口腔から採取した試料に、抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体を用いるイムノアッセイを行い、８−ヒドロキシデオキシグアノシンを定量する工程を含む歯周病の検査方法が提供される。これにより、歯周病の簡便な検査が可能になる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の口腔から採取した試料に、抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体を用いるイムノアッセイを行い、８−ヒドロキシデオキシグアノシンを定量する工程を含む歯周病の検査方法。
【請求項２】
前記試料が唾液である請求の範囲第１項記載の検査方法。
【請求項３】
前記試料が唾液であり、前記イムノアッセイを行う前に、該唾液に遠心分離処理を行う請求の範囲第１項記載の検査方法。
【請求項４】
前記イムノアッセイが、競合法により行われる請求の範囲第１項記載の検査方法。
【請求項５】
前記イムノアッセイが、競合法により行われる請求の範囲第２項記載の検査方法。
【請求項６】
前記イムノアッセイが、競合法により行われる請求の範囲第３項記載の検査方法。
【請求項７】
前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる請求の範囲第１項記載の検査方法。
【請求項８】
前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる請求の範囲第２項記載の検査方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる請求の範囲第３項記載の検査方法。
【請求項１０】
口腔から採取した試料中の８−ヒドロキシデオキシグアノシンの定量による歯周病の検査方法に使用される、標識抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体、非標識抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体、標識８−ヒドロキシデオキシグアノシン及び非標識８−ヒドロキシデオキシグアノシンからなる群より選択される固相に固定化されたまたは固定化されていない１または２以上の試薬を少なくとも含むキットまたは検査器具。
【請求項１１】
口腔から採取した試料中の８−ヒドロキシデオキシグアノシンを、抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体との免疫特異的反応を利用して標識剤と結合させる手段と、該標識剤の活性を測定するかまたは視覚化するための手段を含む、８−ヒドロキシデオキシグアノシンの定量による歯周病の検査のためのキットまたは検出器具。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は歯周病の検査方法に関する。
背景技術
高齢者の健康状態と口腔機能の維持との関係が近年注目されている。即ち、口腔機能の低下が種々の疾患の発症に関連することが報告されている。また、口腔機能の低下が老人性痴呆症にも関連することが報告されている。歯周病は歯牙喪失の主要な原因であるため、口腔機能を維持するには、歯周病の予防が重要である。そして、歯周病は長い年月をかけて進行していくため、集団検診等で歯周病を早期に発見し、治療していくことが望ましい。
現在、歯周病の診断は歯周プロービング法により行われている。これは、歯周ポケットにプローブと呼ばれる器具を挿入し、その深さを測ることにより、歯周組織の損傷の程度を評価する方法である。従って、その診断には高度な専門技術が必要であり、しかも時間がかかるため、集団検診等で行うのが困難である。また、プロービング法は、歯周病により蓄積した炎症の程度（歯周ポケットの深さ）を知るものであり、検査時点での病態、炎症の程度を知ることはできない。
歯周病の診断を炎症に伴い分泌される物質の測定により行うことも提案されている。例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと歯周病との関連が報告されている。しかしながら、この方法においては、口中の阻害物質の存在のため、正確な測定ができなかった。また、他の炎症に関連する物質についても、歯周病との関連が明確にされていない、また阻害物質の存在により正確な測定が困難である等の理由により、歯周病の診断に採用するには至らず、依然として歯周プロービング法による診断が行われていた。
本発明の発明者は、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（以下、場合により８−ＯＨｄＧと記す）が歯周病に関連し、イムノアッセイにより阻害物質等の問題なく測定が可能であり、しかも測定値が歯周病の疾病状態と有意に関連することを見出し、本発明を完成させた。
従って、本発明の目的は、歯周病の検査方法を提供することにある。
発明の開示
第１に、本発明は、下記の方法に関する。
（１）被験者の口腔から採取した試料に、抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体を用いるイムノアッセイを行い、８−ヒドロキシデオキシグアノシンを定量する工程を含む歯周病の検査方法。
（２）前記試料が唾液である（１）の検査方法。
（３）前記試料が唾液であり、前記イムノアッセイを行う前に、該唾液に遠心分離処理を行う（１）の検査方法。
（４）前記イムノアッセイが、競合法により行われる（１）の検査方法。
（５）前記イムノアッセイが、競合法により行われる（２）の検査方法。
（６）前記イムノアッセイが、競合法により行われる（３）の検査方法。
（７）前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる（１）の検査方法。
（８）前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる（２）の検査方法。
（９）前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる（３）の検査方法。
また、本発明は、口腔から採取した試料中の８−ヒドロキシデオキシグアノシンの定量による歯周病の検査方法に使用される、標識抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体、非標識抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体、標識８−ヒドロキシデオキシグアノシン及び非標識８−ヒドロキシデオキシグアノシンからなる群より選択される固相に固定化されたまたは固定化されていない１または２以上の試薬を少なくとも含むキットまたは検査器具に関する。
さらに、本発明は、口腔から採取した試料中の８−ヒドロキシデオキシグアノシンを、抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体との免疫特異的反応を利用して標識剤と結合させる手段と、該標識剤の活性を測定するかまたは視覚化するための手段を含む、８−ヒドロキシデオキシグアノシンの定量による歯周病の検査のためのキットまたは検出器具に関する。
本明細書において「定量」は、正確な量を測定する場合だけでなく、おおよその量を測定することも含む。
また、本発明の検査方法は、特にヒトを含む哺乳類の歯周病の検査に使用される。
発明を実施するための最良の形態
（８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体）
本発明で使用される抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体（以下、場合により抗８−ＯＨｄＧ抗体と記す）は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であるが、好ましくはモノクローナル抗体である。
ポリクローナル抗体は、例えば、８−ＯＨｄＧをタンパク質やポリペプチドと結合したものを免疫原として一定期間温血動物に投与した後、その腹水、血液等を採取したものから精製して製造したものである。
８−ＯＨｄＧ抗体の血清からの精製は、免疫グロブリンの分離精製法、例えば、塩折法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原抗体結合物あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法により行われる。より具体的には、リガンドとしてアルブミン結合領域を欠失した組換えＰｒｏｔｅｉｎＧを用いたクロマトグラフィで分離することができる。この場合、ベース担体は、好ましくは高度架橋球状のセファロースであり、精製時間は例えば５〜２０分間、最大流速は、例えば１〜１０ｍｌ／分である。
モノクローナル抗体は、市販品として入手可能である（日研フード株式会社、日本老化制御研究所、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体）。また、例えばケーラーとミルステインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），第２５６巻（１９７５）、第４９５頁〕と同様の方法により得られる。８−ＯＨｄＧで免疫された温血動物の脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
モノクローナル抗体は、ラット、マウスを用いて得るのが好ましい。例えばマウスを免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内に注入するのが好ましい。例えば２週間の免疫間隔で約２〜６回免役し、最終免疫後、約１〜５日、好ましくは約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法が一般的である。投与量はマウス当り例えば約０．１μｇ以上、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇである。また、脾臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認し、抗体価の上昇した個体の脾臓を摘出する。
融合操作は既知の方法、例えば上記ケーラーとミルスタインの方法またはこれに準じた方法により行うことができる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられる。抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は約１：１〜約２０：１である。
融合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。ＰＥＧの重合度は、通常、約１，０００〜６，０００であり、濃度は約１０％〜８０％で用いられる。融合時間は約０．５〜３０分、融合温度は例えば２０〜４０℃、好ましくは３０〜７０℃である。好ましい条件の一例として、ＰＥＧ６，０００を約３５〜５５％で約４〜１０分間処理することにより、効率よく融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地〔ＨＡＴ培地；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２５６，４９５（１９７５）〕等を用いて、選択的に増殖させることが出来る。
増殖した細胞の培養上清は、目的とする抗体産生があるか否かについてスクリーニングを行うことができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫原に対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法またはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法等の方法で調べることが出来るが、これらの方法についても種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例として、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。セルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリングさせておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一定時間、一定温度（約４〜４０℃）で反応させる。この後、反応物をよく洗った後、酵素で標識した免疫原を加え、一定時間、一定温度（約４〜４０℃）で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基質を加え、一定時間、一定温度（約４〜４０℃）で反応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。選択培地で増殖を示し、かつ免疫原に対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界希釈法等によりクローニングを行うことが望ましい。クローン化された細胞の上清について同様にスクリーニングを行い抗体価の高いウエルの細胞を増やすことにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。
このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地、例えばＲＰＭＩ−１６４０〔Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．）１９９，５４９（１９６７）〕に約０．１〜４０％の牛血清を加えた培地等で約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間培養することにより、培養液から該モノクローナル抗体を得ることができる。また哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を得ることができる。このためには、例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を前もって接種したＢＡＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０４〜１×１０７個、好ましくは約５×１０５〜２×１０６個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１４日後に腹水液を採取する。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離することが出来る。
（試料）
本発明において使用される被験者の口腔から採取した試料は、例えば、唾液、口中すすぎ液、歯肉溝滲出液等であるが、好ましくは唾液である。唾液は、食後口中を清浄にしてから、約１０分間以上経過後、好ましくは約３０分間以上経過後、より好ましくは約６０分以上、例えば約６０〜１８０分間経過後に採取するのが望ましい。
また、全体的な歯周病の症状を唾液を試料として測定した後、各歯毎の詳しい検査を歯肉溝滲出液を採取して行うことも可能である。
試料としての唾液は、好ましくは被験者にパラフィンガム等を約１０秒間〜約１０分間咀嚼させた後に唾液を容器に吐出させることにより採取される。
歯間溝滲出液の場合は、濾紙等の吸収性材料を歯周ポケットに挿入することにより行われる。
口腔すすぎ液の場合は、好ましくは被験者にパラフィンガム等を約１０秒間〜約１０分間咀嚼させ後に水で口腔内をすすいで、容器に吐出させることにより採取される。
試料採取直後にイムノアッセイを行ってもよいが、試料を採取し、数時間〜数日後にイムノアッセイを行ってもよい。即ち、集団検診等では、試料の採取までを行い、その後の分析は臨床検査センター等、別の場所で行うこともできる。数時間から数日後にイムノアッセイを行う場合、好ましくは−４０℃〜２０℃、さらに好ましくは−２０℃〜４℃の温度で、密閉容器内に保存する。
試料が唾液の場合、遠心分離、界面活性剤による処理等の前処理を行った後に分析するのが好ましい。
遠心分離は、１０００〜１２０００ｒｐｍ、好ましくは４５００〜１２０００ｒｐｍ、特に１００００〜１２０００ｒｐｍで１〜３０分間、好ましくは１０〜３０分間、特に２０〜３０分間行い、その上清液を試料として用いる。
界面活性剤は、好ましくは陽イオン活性剤、例えばＴｗｅｅｎ  ２０である。
（イムノアッセイ）
イムノアッセイは、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイである。イムノアッセイで用いる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が挙げられるが、酵素、または金コロイド、染料ゾル等のいわゆる直接標識を用いるのが好ましい。
エンザイムイムノアッセイは、サンドイッチ法、競合法等の任意の方法であり得る。ＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のものを用いることができるが、その例としてはたとえば西洋わさび、パイナップル、イチジク、甘諸、ソラマメ、トウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好ましい。
なお、本発明の検査方法は、さらに、定量値が一定値以上であれば、歯周病に罹患している可能性があり、一定値未満であれば、歯周病のおそれがないと判定する工程を含んでいてもよい。
（判定の数値範囲）
本発明の検査方法は、特に、集団検診等のような健康診断において、歯周病の可能性がある受診者を選択し、さらに歯科医による診断を受けさせるためのスクリーニング法として用いるのに有効である。この場合、８−ＯＨｄＧの濃度が、例えば３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは４ｎｇ／ｍｌ以上、特に５ｎｇ／ｍｌ以上の時に歯周病の可能性がある、即ち陽性と判断される。さらに、本発明の検査方法は、検査時点での病態を知ることができるため、歯科医師が歯周病治療の過程において、治療の効果を知るための検査方法として行うこともできる。
（キット，検出器具）
本発明は、抗８−ＯＨｄＧ抗体を利用する上記検査方法を実施するためのキットまたは検出器具にも関する。
例えば、本発明は、口腔から採取した試料中の８−ヒドロキシデオキシグアノシンの定量による歯周病の検査方法に使用される、標識もしくは非標識抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体、及び／または標識もしくは非標識８−ヒドロキシデオキシグアノシンを含むキットまたは検査器具に関する。
口腔から採取した試料中の８−ＯＨｄＧを、抗８−ＯＨｄＧ８抗体との免疫特異的反応を利用して標識剤と結合させる手段と、該標識剤の活性を測定するかまたは視覚化するための手段を含む、８−ＯＨｄＧの定量による歯周病の検査のためのキットまたは検出器具にも関する。このようなキットや検出器具は、健康診断、臨床検査、歯科医の診療等において使用することができるが、個人が歯周病の自己管理をするために使用することもできる。
結合させる手段は、標識されたまたは標識されていない抗８−ＯＨｄＧ抗体、標識されたまたは標識されていない８−ＯＨｄＧから、イムノアッセーの種類によって適宜選択される。上記抗８−ＯＨｄＧ抗体及び上記８−ＯＨｄＧは、イムノアッセーの種類によって固相に固定化されたものまたは固定化されていないものであり得る。
標識剤の活性を測定するかまたは視覚化するための手段は、例えば標識剤が酵素の場合はその基質及び反応停止剤等である。
固相は、例えば、ポリスチレン製のビーズ、プレート、管等のほか、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、または他の多孔性ポリマーでありうる。固相、例えば多孔性ポリマーは、ディップスティックの形態であってもよい。
キットの場合は、上記手段、例えば抗８−ＯＨｄＧ抗体、８−ＯＨｄＧ、基質等に加えて、溶媒、洗浄剤、標準物質等を含んでいても良い。
検査器具は、例えば、抗８−ＯＨｄＧ抗体が固定され、標識化抗８−ＯＨｄＧ抗体が湿潤時に移動可能な状態で担持された多孔性材料よりなる固相と、該固相を、該固相の一部を試料に接触させ得るように収納したケーシングからなる検査器具であり得る。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１
歯周病患者（軽度から重度まで）６４名と健常者１０名を被験者とした。被験者にパラフィンガムを５分間咀嚼させ、その唾液を採取した。唾液に１００００ｒｐｍで１０分間の遠心分離処理を行った後、その上清について、市販の８−ＯＨｄＧ用ＥＬＩＳＡキット（商品名：８−ＯＨｄＧ  Ｃｈｅｃｋ、日本油脂株式会社製）を用いて、８−ＯＨｄＧの濃度を測定した。結果を図１のグラフに示す。
グラフより、明らかなように、歯周病群の平均値は４．８２ｎｇ／ｍｌであり、病状により、５０ｎｇ／ｍｌまでばらつきがあるが、健常者群では平均値が２．３ｎｇ／ｍｌであり、最高でも９．９ｎｇ／ｍｌであった。また、歯周病群において、８−ＯＨｄＧの濃度は、歯周病の進行度にほぼ比例した。
実施例２：
歯周病の患者１４名について、実施例１と同様の方法により、初診時と初期治療を施した後の８−ＯＨｄＧ濃度を測定した。結果を図２のグラフに示す。図より、治療により、病状の改善と共に、８−ＯＨｄＧの濃度が低下したことが明らかである。
産業上の利用可能性
本発明の方法により、簡便な方法で歯周病の検査を行うことができる。これにより、集団検診等での歯周病の検査が可能になり、歯周病の予防及び早期治療が可能になり、ひいては高齢者の健康状態の向上を図ることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、健常者と歯周病患者の８−ＯＨｄＧ濃度を示すグラフである。
第２図は、歯周病患者の治療前後の８−ＯＨｄＧ濃度を示すグラフである。
【図１】
2002079780.tif 000003
【図２】
2002079780.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成15年1月24日(2003.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の口腔から採取した試料に、抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体を用いるイムノアッセイを行い、８−ヒドロキシデオキシグアノシンを定量する工程を含む歯周病の検査方法。
【請求項２】
前記試料が唾液、口中すすぎ液または歯溝浸出液である請求の範囲第１項記載の検査方法。
【請求項３】
前記試料が唾液である請求の範囲第１項記載の検査方法。
【請求項４】
前記試料が唾液であり、前記イムノアッセイを行う前に、該唾液に遠心分離処理を行う請求の範囲第１項記載の検査方法。
【請求項５】
前記イムノアッセイが、競合法により行われる請求の範囲第１項記載の検査方法。
【請求項６】
前記イムノアッセイが、競合法により行われる請求の範囲第２項記載の検査方法。
【請求項７】
前記イムノアッセイが、競合法により行われる請求の範囲第３項記載の検査方法。
【請求項８】
前記イムノアッセイが、競合法により行われる請求の範囲第４項記載の検査方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる請求の範囲第１項記載の検査方法。
【請求項１０】
前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる請求の範囲第２項記載の検査方法。
【請求項１１】
前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる請求の範囲第３項記載の検査方法。
【請求項１２】
前記イムノアッセイが、サンドイッチ法により行われる請求の範囲第４項記載の検査方法。
【請求項１３】
口腔から採取した試料中の８−ヒドロキシデオキシグアノシンの定量による歯周病の検査方法に使用される、標識抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体、非標識抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体、標識８−ヒドロキシデオキシグアノシン及び非標識８−ヒドロキシデオキシグアノシンからなる群より選択される固相に固定化されたまたは固定化されていない１または２以上の試薬を少なくとも含むキットまたは検査器具。
【請求項１４】
前記試料が唾液、口中すすぎ液または歯溝浸出液である請求の範囲第１３項記載のキットまたは検査器具。
【請求項１５】
前記試料が唾液である請求の範囲第１３項記載のキットまたは検査器具。
【請求項１６】
口腔から採取した試料中の８−ヒドロキシデオキシグアノシンを、抗８−ヒドロキシデオキシグアノシン抗体との免疫特異的反応を利用して標識剤と結合させる手段と、該標識剤の活性を測定するかまたは視覚化するための手段を含む、８−ヒドロキシデオキシグアノシンの定量による歯周病の検査のためのキットまたは検出器具。
【請求項１７】
前記試料が唾液、口中すすぎ液または歯溝浸出液である請求の範囲第１６項記載の検査方法。
【請求項１８】
前記試料が唾液である請求の範囲第１６項記載の検査方法。
【国際調査報告】
2002079780.tif 000005
2002079780.tif 000006
2002079780.tif 000007