(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図７〜９、図１０〜１２、または図１３〜１５に示されたアミノ酸配列を有する、タンパク質。
【請求項２】
図７〜９、図１０〜１２、または図１３〜１５に示されたアミノ酸配列からなる、タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１または２に記載のタンパク質を常に発現する上皮細胞系を調製するための、請求項３に記載のＤＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
哺乳動物、特にヒトにおいて、様々な分子構造のカチオン系薬物および生体異物、更にカテコールアミンや他の内因性カチオンは、管腔および基底外側原形質膜に存在する多特異性輸送タンパク質により、腎臓および肝臓によって排出される。これらの輸送タンパク質は、神経原形質膜およびシナプス小胞中の既知モノアミン輸送タンパク質と、疎水性薬物を輸出するＡＴＰ依存性タンパク質（多剤輸送タンパク質）とは、それらの機能の点で異なる。
【０００２】
本発明の範囲内において、相補的ＤＮＡ配列がラット腎臓から最初に単離されたが、その配列は長さが５５６アミノ酸の膜タンパク質をコードしており、以下でＯＣＴ１と呼ぶこととする。この輸送タンパク質は近位尿細管の基底外側膜および肝細胞で様々な標的分子のカチオン輸送体として作用する。
【０００３】
ＯＣＴ１と命名された輸送タンパク質はいかなる他の既知タンパク質とも相同的ではなく、疎水性および負荷電アミノ酸のこれまでにない独特な分布を示し、もっぱら腎臓、肝臓および腸でみられる。ＯＣＴ１輸送タンパク質は様々な構造のカチオンを輸送し、異なる疎水性の多数のカチオン系物質により阻害され、非常に疎水性の物質だけを輸送できる既知多特異性輸送タンパク質（多剤輸送体）の場合とは異なる機能的性質を有する。輸送タンパク質ＯＣＴ１は哺乳動物で多特異性輸送タンパク質の新規原型として考えられる。
【０００４】
抗ヒスタミン剤、抗不整脈剤、鎮静剤、オピエート、利尿剤、静細胞剤および抗生物質のような汎用薬物を含めた多数の有機カチオンは、腎臓上皮細胞および肝細胞から能動輸送されることで尿および胆汁中に排出される。腎臓で能動的に分泌されたとき、カチオンは近位尿細管の基底外側および管腔原形質膜で多特異性輸送系により輸送される。２つの系はそれらの機能的に異なる。基底外側膜の輸送タンパク質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、Ｎ１‐メチルニコチンアミド（ＮＭＮ）およびＮ‐メチル‐４‐フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）のような構造的に異なるカチオンを輸送することができるが、異なる構造の多数の細胞外カチオンにより阻害される。これらの輸送タンパク質は内部が負の膜電位と細胞内基質の反対方向輸送により駆動させることができる。外部方向プロトン勾配により駆動されるが、膜電位により影響されない、２つの輸送系が管腔膜において報告されている。これら輸送系のうち１つは近位尿細管の基底外側膜におけるカチオン輸送系の場合に匹敵する広い基質特異性を有している。機能的類似性のために、管腔膜のこの多特異性輸送系は心臓におけるノルアドレナリンの神経外輸送系と同一であると思われる。
【０００５】
【発明の具体的説明】
したがって、本発明は、血液から肝臓または腎臓の上皮細胞中にカチオン系生体異物および／または薬物を輸送するか、あるいは腸から血液循環中にカチオン系生体異物または薬物を輸送することに関与する輸送タンパク質に関する。
【０００６】
新規輸送タンパク質は、図７〜９、図１０〜１２、および図１３〜１５に示されたアミノ酸配列から選択される、少くとも７つのアミノ酸の構成配列を示す。好ましい態様において、図７〜９、図１０〜１２、および図１３〜１５からの構成配列は、少くとも１０のアミノ酸の長さ、特に好ましい態様において少くとも１４のアミノ酸の長さを有する。
【０００７】
本発明は、新規輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列にも関する。新規ＤＮＡ配列は図７〜９、図１０〜１２、および図１３〜１５に示された配列から選択される、少くとも２１の塩基の構成配列を示す。特に好ましい態様において、構成配列は少くとも３０の塩基の長さ、非常に特に好ましい態様において少くとも４２の塩基の長さを有する。
【０００８】
新規輸送タンパク質およびＤＮＡ配列は、医学的および薬理学的研究で特に重要である。新規ＤＮＡ配列は、例えば新規輸送タンパク質を永続的に発現する上皮細胞系を作るために使用できる。この目的のため、輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列はそれ自体公知の遺伝子操作方法を用いて適切なベクター中に組み込まれ、これが輸送タンパク質を以前発現しなかった適切な上皮細胞系を形質転換するために用いられる。こうして、新規輸送タンパク質を常に発現する細胞系が得られる。
【０００９】
輸送タンパク質を発現するこのような性質の上皮細胞系は、予想されるカチオン系薬物および／または生体異物の腎臓および胆汁排出と更に腸吸収を試験するためにインビトロで用いることができる。このため、このような細胞系は、薬物と更に他の生物活性化合物が腸から血液循環中に排出または吸収されるかどうか、そうであるとすればその程度について、入念な動物実験なしに、インビトロ段階で調べるために使用できる。
【００１０】
新規ＤＮＡ配列は、新規輸送タンパク質と相同的な輸送タンパク質を単離するために用いることができる。したがって、本発明による輸送タンパク質と相同的な対応輸送タンパク質は、すべての哺乳動物種およびヒトから単離できる。２つの対応ヒト配列が既に決定されている。このような単離を行う１つの可能な手段は、現在周知のポリメラーゼ連鎖反応法を用いることである。これをするためには、ポリメラーゼ連鎖反応法用のプライマーとしての図７〜９、図１０〜１２、および図１３〜１５に示された配列から適切なＤＮＡ配列を選択することが必要となる。これらのプライマーは相同的輸送タンパク質を単離する上で特に困難性なく使用できる。
【００１１】
新規輸送タンパク質および／または新規上皮細胞系の更に可能な使用法は、腎臓および胆汁排出または腸吸収を変えるために、薬物のような生物活性化合物に結合できるカチオン系シグナル分子の開発を行うために用いることである。こうして、異なる化学構造について試験を行い、それらが結合する分子の腎臓または肝臓からの排出を有利にして、しかも腸から血液循環中への吸収を促進するかどうか、あるいはそれらが各場合に反対の作用を生じるかどうかについてみることができる。
【００１２】
新規輸送タンパク質は、カチオン系薬物の腎毒性を減少させるために、尿細管細胞中への薬物の取込みを阻止する上で使用できる抗体、特にモノクローナル抗体を作る上でも特に使用できる。
【００１３】
更に、本発明の開示は、ある他のカチオン系薬物および／または生体異物の排出に影響を与える特異的薬物を開発する上で基礎として使用できる。こうして、他の活性化合物の取込みに影響を与えうる薬理活性物質を開発することができる。この性質の影響は、腸からの活性化合物の取込みを促進または防止するか、あるいは腎臓および肝臓で活性化合物の排出を促進または防止することからなる。
【００１４】
新規ＤＮＡ配列の更なる好ましい使用法は、アンチセンスヌクレオチド配列を開発する場合である。この関係において、対応する天然相補的ヌクレオチド配列と結合することで対応遺伝子の転写および／または翻訳を防止するヌクレオチド配列が開発できる。
【００１５】
新規ＤＮＡ配列の更なる好ましい使用法は、腎臓および／または胆汁カチオン排出メカニズムにおいてゲノムレベルで分子欠陥を診断するための分子試験キットにおけるそれらの使用である。この性質の分子試験キットにおいて、ＤＮＡ配列は特に好ましい態様でポリメラーゼ連鎖反応法を行うために使用できる。この場合に、公知のＤＮＡ配列は、カチオン輸送体をコードする各患者からの遺伝子を増幅させて、この遺伝子を遺伝子変異について調べるために、ポリメラーゼ連鎖反応法において使用できるプライマー配列を選択および合成する上で基礎として用いられる。
【００１６】
【実施例】
本発明は下記例を参照して更に詳細に説明されるが、しかしながらそれは発明を制限するためではない。
【００１７】
例１
輸送タンパク質をコードする遺伝子をクローニングするために、平滑末端化二本鎖ｃＤＮＡを、第一鎖を合成するためのＮｏｔＩオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてラット腎臓ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから最初に調製した。ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＥｃｏＲＩアダプターがｃＤＮＡに結合された後、後者をＮｏｔＩで切断し、得られた断片を大きさで分別し（１．５〜２．３kb）、ベクターｐBluescript(stratagene)のＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。次いで組換えベクターを大腸菌株ＤＨ１０Ｂ中にエレクトロポレーションした。プラスミドＤＮＡを形質転換株のプールから単離し、ＮｏｔＩで直鎖化し、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。
【００１８】
ｃＲＮＡをポリ（Ａ）＋選択により精製し、卵母細胞当たり２０〜４０ngの濃度で注入した。卵母細胞をインキュベートし、ＮＭＮ阻害性14Ｃ‐ＴＥＡ取込みを測定した。標的化スクリーニング法を用いて、腎臓カチオン輸送体をコードする遺伝子を含んだ単一クローンを遺伝子ライブラリーから単離した。用いた方法を最適化および部分的に修正した後にのみ、このクローンを単離することができた。同定されたＤＮＡを配列決定するために、ＯＣＴ１の重複制限断片をサブクローニングし、双方の鎖で完全に配列決定した。
【００１９】
ラット腎臓遺伝子バンクから単離された、鎖長１８８２塩基対のｃＤＮＡ断片からなるＯＣＴ１遺伝子を、Xenopus laevis卵母細胞で発現させた。この目的のため、卵母細胞を５mM Hepes-Tris 緩衝液、ｐＨ７．５、１１０mMＮａＣｌ、３mMＫＣｌ、２mMＣａＣｌ２、１mMＭｇＣｌ２（以下でＯＲｉと称される）中で３日間、ＲＮＡ注入後にインキュベートした。輸送はＯＲｉ（２２℃）に溶解された14Ｃ‐ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）と共に卵母細胞をインキュベートすることにより測定した。更に、実験は異なる濃度のＮａ＋およびＫ＋を用いて、実験中Ｂａ++の存在はそのままで、異なるｐＨ値および異なる阻害剤の存在下で行った。用いられた14Ｃ‐ＴＥＡ濃度において、発現されたＯＣＴ１タンパク質により生じる取込みは９０分間以上にわたりＯＲｉ緩衝液で直線的であったため、取込み率は９０分間のインキュベート後に決定した。測定を異なる濃度のＮａ＋、Ｋ＋およびＨ＋で阻害剤の存在下において行ったとき、卵母細胞は最初に適切な緩衝液条件下で３０分間インキュベートし、取込み率を14Ｃ‐ＴＥＡと３０分間のインキュベート中に決定した。14Ｃ‐ＴＥＡとインキュベート後、取込みを止め、卵母細胞を洗浄し、それらが取り込んだ放射能の量について調べた。
【００２０】
こうして、１８８２塩基対ｃＤＮＡ断片を（前記のように）Xenopus laevis卵母細胞を用いて発現させた。こうして発現されたＯＣＴ１タンパク質は、ＮＭＮ（Ｎ１‐メチルニコチンアミド）が阻害できる14Ｃ‐テトラエチルアンモニウム（14Ｃ‐ＴＥＡ）の取込みを誘導し、その取込みは卵母細胞に水を注入したコントロールで得られる値の２５０倍以上であった。結果は図１にグラフ化されている。
【００２１】
クローン化ＯＣＴ１  ｃＤＮＡは、５５６アミノ酸を有する膜タンパク質をコードするオープン読取枠を含んでいる。アミノ酸配列は図７〜９に示されている。それはデータバンクのタンパク質と類似性を示さない。
【００２２】
14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの発現は、注入されたＯＣＴ１  ｃＲＮＡの量に依存していた。これらの結果は図２に示されている。発現された取込みのｃＲＮＡ依存性はｎ＝約２であるHill式により記載することができる。
【００２３】
ＯＣＴ１輸送タンパク質により示される14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの基質依存性は、Michaelis Menten式に従った。これらの結果は図３に示されている。９５±μＭの評価Ｋｍ値は、初期実験で決定されたラット近位尿細管の基底外側膜からのカチオン輸送に関するＫｍ値（１６０μＭ）と似ていた。それはラット近位尿細管の刷子縁膜における多特異性Ｈ＋カチオン対向輸送体に関する大体のＫｍ値の１／１４であった。
【００２４】
例２
加えて、ＯＣＴ１輸送タンパク質が基底外側膜の電位依存性多特異性カチオン輸送系または刷子縁膜の電位依存性多特異性Ｈ＋カチオン対向輸送系を表すかどうかについて確定するために、ＯＣＴ１輸送タンパク質による取込みが膜電位または膜全体のタンパク質勾配に依存しているかどうかを調べる試験を行った。発現される14Ｃ‐ＴＥＡ取込みを阻害する異なる阻害剤の能力も研究した。
【００２５】
図４および５は、ＯＣＴ１輸送タンパク質により媒介される14Ｃ‐ＴＥＡの取込みが膜電位に依存しているが、ｐＨ単位で１の内部方向または外部方向タンパク質勾配が適用されたときにさほど変わらないことを明らかにしている。したがって、ＯＣＴ１輸送タンパク質は近位尿細管の基底外側膜全体で測定されたカチオン輸送と同様の基本的特徴を有している。
【００２６】
図６および表１は、ＯＣＴ１による14Ｃ‐ＴＥＡの取込みが異なる分子構造の有機カチオンにより阻害されることを明らかにしている。これらの構造には、キニン、デシプラミン、プロカインアミドおよびＯ‐メチルイソプレナリンのようないくつかの汎用薬物がある。評価Ｋｉ値は１‐エチル‐２‐〔（１，４‐ジメチル‐２‐フェニル‐６‐ピリミジニリデン）メチル〕キノリニウムクロリド（シアニン８６３）の０．１３μＭとテトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）の１mMとの間である。
【００２７】
【表１】
0003798447.tif 000002
【００２８】
表１は、ＯＣＴ１腎臓輸送タンパク質のｃＲＮＡを注入したXenopus laevis卵母細胞における14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの感受性を示している。
【００２９】
阻害実験を行うとき、Xenopus laevis卵母細胞にＯＣＴ１  ｃＲＮＡ５ngを注入し、表１で示された阻害剤の５〜８つの異なる濃度の効果を卵母細胞中９５μＭ取込みで測定した。その値も図６に示されている。阻害曲線を非直線回帰分析により適合させ、Ｋｉ値（±ＳＤ）を決定した。
【００３０】
既知多特異性輸送タンパク質とは対照的に、疎水性物質のみにより阻害されるいわゆる多剤輸送体、新規ＯＣＴ１輸送タンパク質はＴＭＡおよびＮＭＮのような親水性化合物によっても阻害された。デシプラミンは、神経細胞の原形質膜で神経ノルアドレナリン輸送を阻害する場合よりも７００倍大きなＫｉ値で、ＯＣＴ１による輸送を阻害した。５μＭレセルピンはＯＣＴ１誘導輸送に効果を有しないが、シナプス小胞の神経モノアミン輸送タンパク質はナノモル濃度以下のレセルピンで阻害される。
【００３１】
例３
ＯＣＴ１輸送タンパク質は、膜小胞および培養腎臓上皮細胞を用いた測定から既に得られた機能データとＯＣＴ１  Ｋｉ値を比較することにより、基底外側カチオン系輸送タンパク質と同一であることを確認することができた。このような比較をする上では、カチオン輸送における種依存性差異と、カチオン輸送の阻害を測定するための異なる方法の方法論的制限に関する考慮が払われねばならない。以前の研究において、ラット腎臓におけるカチオン輸送は短いインキュベート時間（４秒間）を用いて行われねばならないミクロ灌流実験により調べた。高親和性阻害剤に関する拡散非依存性Ｋｉ値を調べるためにこの方法を用いることはできないため、我々は低親和性阻害剤を比較することに制限した。低親和性阻害剤ＴＭＡおよびＮＭＮの比較において、我々はＯＣＴ１発現輸送タンパク質のＫｉ値（約１mM）がラット近位尿細管中へのＴＥＡの基底外側取込みに関して測定されたＫｉ値（ＴＭＡ１．４mMおよびＮＭＮ０．５４mM）に相当することを発見した。それらはＴＥＡの管腔取込みに関して測定されたＫｉ値（ＴＭＡ７０mMおよびＮＭＮ８．３mM）と明らかに異なる。
【００３２】
例４
ＯＣＴ１の基底外側存在に関する追加的支持は、１，１′‐ジエチル‐２，２′‐シアニンヨージド（デシニウム２２）によるＯＣＴ１誘導性取込みの阻害に関して得られたＫｉ値（０．４μＭ）により与えられた。ＬＬＣ‐ＰＫ１細胞において、５．６nMのＫｉ値が管腔膜を通るＴＥＡの輸送に関して測定され、一方基底外側膜を通るＴＥＡの輸送に関するＫｉ値は＞０．１μＭであると評価された。ＯＣＴ１輸送タンパク質を更に特徴付けるために、ＴＥＡよりも約１０倍多い親和性を有するＭＰＰも同様にＯＣＴ１により輸送されるかどうかについて調べる試験を行った。卵母細胞中へのＯＣＴ１  ｃＲＮＡ８ngの注入後、３Ｈ‐ＭＰＰの特異的取込みが発現されたが、これはキニンで阻害された。14Ｃ‐ＴＥＡ（１４８±４pmol×卵母細胞-1×ｈ-1）および３Ｈ‐ＭＰＰ（９７±５pmol×卵母細胞-1×ｈ-1）の発現取込みに関する同様のＶmax 値も卵母細胞のサンプルで調べた。肝臓細胞中における多特異性カチオン輸送体の存在が報告されている。培養肝細胞中へのＭＰＰの取込みが最近測定された。この関係において、ＯＣＴ１により発現されるカチオン輸送を阻害する同様の阻害剤を用いてＭＰＰ取込みの約９０％を阻害できることがわかった。肝細胞でＭＰＰ取込みについて調べられたＫｉ値（Ｏ‐メチルイソプレナリン７８μＭ、ＭＰＰ１３μＭ、キニン０．８μＭ、デシニウム２３  ０．２３μＭおよびシアニン８６３  ０．１０μＭ）は、Xenopus 卵母細胞により発現されたＯＣＴ１タンパク質によるＴＥＡの取込みについて得られた値と事実上同一であった。これらのデータは、ＯＣＴ１輸送タンパク質または高度に相同的な輸送タンパク質が肝細胞の原形質膜に存在することを示唆している。
【００３３】
例５
ＯＣＴ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は図７〜９に示されている。Kozak タイプ（ＡＣＧＣＣＡＴＧ）の停止コドンおよび翻訳開始部位はオープン読取枠の上流にみられる。
【００３４】
ＯＣＴ１の親水性／疎水性の分析から、膜をおそらく横断している１１の疎水性α‐ヘリックス領域を確認した。疎水性／親水性インデックスは図１６に示されている。推定膜貫通領域は長さ１７〜２７アミノ酸である。それらは１つの長い、２つの中間長さおよび７つの短い親水性領域で互いに結合されている。３つの潜在的Ｎ‐グリコシル化部位が最初の２つの膜横断タンパク質領域間にある親水性領域で予想されたため、図１７に示されたＯＣＴ１の向きが提案された。第一の親水性領域は１４の負荷電アミノ酸を含んでおり、ＯＣＴ１のカチオンの結合にとり重要である。
【００３５】
例６
様々なラット組織および一部の細胞系を、いわゆるノーザンブロットを用いて、ＯＣＴ１輸送タンパク質特異性ｍＲＮＡの局在性について分析した。この目的のため、全ＲＮＡをグアニジニウム／フェノール／クロロホルム法により単離し、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）‐セルロースクロマトグラフィーにより精製した。ｍＲＮＡをホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動により分別し、Hybond‐Ｎ膜(Amersham)に移し、その後ハイブリッド形成させた。このために、ラット細胞および細胞系２９３からのｍＲＮＡ５μｇと細胞系Ｃａｋｉ‐１およびＬＬＣ‐ＰＫＩ１からのｍＲＮＡ１．５μｇをホルムアルデヒドアガロースゲル上にのせた。ハイブリッド形成はプラスミドｐＯＣＴ１からの新たなＤＮＡ配列の32Ｐ‐標識ｃＤＮＡ断片を用いて行った（ヌクレオチド２８５〜１１９６を用いた）。ハイブリッド形成はハイブリッド用溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Denhardt´s溶液、０．５％ＳＤＳおよびサケ精子ＤＮＡ２０μｇ）中４２℃で１８時間行った。膜を６０℃で０．２５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳの最終厳密さまで数工程で洗浄した。細胞系ＬＬＣ‐ＰＫ１に関する結果を示すために、フィルムを２４時間暴露し、フィルムを他のトラックについて６時間暴露した。ＲＮＡ標準（GIBCO/BRL から０．１４〜９．５キロ塩基範囲）を用いて、ＲＮＡ断片のサイズを調べた。そのサイズは図１８に示されている。
【００３６】
ノーザンブロット分析から得られたオートラジオグラフは図１８に示されている。１．９キロ塩基の明確なバントと３．４および４．８キロ塩基の追加バントが腎皮質、腎髄質、肝臓および腸の場合で観察された。細胞系ＬＬＣ‐ＰＫ１において、ハイブリッド形成は３．４キロ塩基領域のみで観察された。逆に、ＯＣＴ１シグナルは腎乳頭、骨格筋、心筋、脳またはヒト胚芽腎細胞系２９３とＣａｋｉ‐１細胞で観察された。心臓およびＣａｋｉ‐１細胞は管腔腎臓膜のＨ＋カチオン対向輸送タンパク質とおそらく同一である神経外ノルアドレナリン輸送タンパク質を含んでいるため、近位尿細管の基底外側および管腔膜にあるカチオン輸送タンパク質は異なる遺伝子ファミリーに属するらしい。その場のハイブリッド形成では、ＯＣＴ１輸送タンパク質が近位尿細管、肝臓の上皮細胞および小腸の腸細胞で発現されることを示した。
【００３７】
上記例は、腎臓および肝臓からカチオン系薬物を除去する上で重要な役割を果たす新規で独特なタンパク質がクローニングされたことを証明している。このタンパク質はおそらく腸からのカチオン系化合物の吸収にも関与している。カチオン輸送および薬物の排出は３０年以上も研究されてきたが、過去の進歩はわずかであった。これに関する理由は、肝臓および腎臓からの薬物の排出が上皮細胞の基底外側および管腔原形質膜を通る輸送を含み、これらの輸送プロセスが機能的に異なるカチオン輸送タンパク質により起こるためである。これに加えて、同様の基質特異性を有する異なるカチオン輸送タンパク質が管腔および基底外側腎臓膜双方に存在する可能性が排除しえないからである。カチオン輸送タンパク質の１つのタイプが新規ＯＣＴ１輸送タンパク質をクローニングした結果として確認された。これはカチオン系薬物の排出に関する以後の研究のために多くの選択肢を与えるものである。
【００３８】
例７
本出願に記載された技術を用いて、ＯＣＴ１と相同的な２つのヒト遺伝子をクローニングして、それらを完全にまたは部分的に配列決定できることが各々わかった。完全に配列決定された遺伝子（ＨＯＣＴ１）は１８８５塩基からなり、５５３アミノ酸のタンパク質をコードしている。それは図１０〜１２に示されている。ＣＴ１およびＨＯＣＴ１のアミノ酸間には７８％の同一率がある。第二のヒト遺伝子（ＨＯＣＴ２）は１８９６塩基からなり、５５５アミノ酸のタンパク質をコードしている。ＯＣＴ２のヌクレオチド配列および演繹されたアミノ酸配列は図１３〜１５に示されている。ＯＣＴ１およびＨＯＣＴ２のアミノ酸間には６８％の同一率がある。
【００３９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH
<120>  Transport protein which effects the transport of cationic
xenobiotics and/or pharmaceuticals, DNA sequences encoding it
and their use
<130>  100351
<140>  JP 7-177671
<141>  1995-07-13
<150>  DE P 44 24 577.7
<151>  1994-07-13
<160>  6
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  556
<212>  PRT
<213>  Rattus sp.
<400>  1
Met Pro Thr Val Asp Asp Val Leu Glu Gln Val Gly Glu Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Phe Gln Lys Gln Ala Phe Leu Leu Leu Cys Leu Ile Ser Ala Ser Leu
20                  25                  30
Ala Pro Ile Tyr Val Gly Ile Val Phe Leu Gly Phe Thr Pro Gly His
35                  40                  45
Tyr Cys Gln Asn Pro Gly Val Ala Glu Leu Ser Gln Arg Cys Gly Trp
50                  55                  60
Ser Gln Ala Glu Glu Leu Asn Tyr Thr Val Pro Gly Leu Gly Pro Ser
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Ser Phe Leu Ser Gln Cys Met Arg Tyr Glu Val Asp Trp
85                  90                  95
Asn Gln Ser Thr Leu Asp Cys Val Asp Pro Leu Ser Ser Leu Val Ala
100                 105                 110
Asn Arg Ser Gln Leu Pro Leu Gly Pro Cys Glu His Gly Trp Val Tyr
115                 120                 125
Asp Thr Pro Gly Ser Ser Ile Val Thr Glu Phe Asn Leu Val Cys Gly
130                 135                 140
Asp Ala Trp Lys Val Asp Leu Phe Gln Ser Cys Val Asn Leu Gly Phe
145                 150                 155                 160
Phe Leu Gly Ser Leu Val Val Gly Tyr Ile Ala Asp Arg Phe Gly Arg
165                 170                 175
Lys Leu Cys Leu Leu Val Thr Thr Leu Val Thr Ser Val Ser Gly Val
180                 185                 190
Leu Thr Ala Val Ala Pro Asp Tyr Thr Ser Met Leu Leu Phe Arg Leu
195                 200                 205
Leu Gln Gly Met Val Ser Lys Gly Ser Trp Val Ser Gly Tyr Thr Leu
210                 215                 220
Ile Thr Glu Phe Val Gly Ser Gly Tyr Arg Arg Thr Thr Ala Ile Leu
225                 230                 235                 240
Tyr Gln Met Ala Phe Thr Val Gly Leu Val Gly Leu Ala Gly Val Ala
245                 250                 255
Tyr Ala Ile Pro Asp Trp Arg Trp Leu Gln Leu Ala Val Ser Leu Pro
260                 265                 270
Thr Phe Leu Phe Leu Leu Tyr Tyr Trp Phe Val Pro Glu Ser Pro Arg
275                 280                 285
Trp Leu Leu Ser Gln Lys Arg Thr Thr Arg Ala Val Arg Ile Met Glu
290                 295                 300
Gln Ile Ala Gln Lys Asn Gly Lys Val Pro Pro Ala Asp Leu Lys Met
305                 310                 315                 320
Leu Cys Leu Glu Glu Asp Ala Ser Glu Lys Arg Ser Pro Ser Phe Ala
325                 330                 335
Asp Leu Phe Arg Thr Pro Asn Leu Arg Lys His Thr Val Ile Leu Met
340                 345                 350
Tyr Leu Trp Phe Ser Cys Ala Val Leu Tyr Gln Gly Leu Ile Met His
355                 360                 365
Val Gly Ala Thr Gly Ala Asn Leu Tyr Leu Asp Phe Phe Tyr Ser Ser
370                 375                 380
Leu Val Glu Phe Pro Ala Ala Phe Ile Ile Leu Val Thr Ile Asp Arg
385                 390                 395                 400
Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Ile Ala Ala Ser Asn Leu Val Thr Gly Ala
405                 410                 415
Ala Cys Leu Leu Met Ile Phe Ile Pro His Glu Leu His Trp Leu Asn
420                 425                 430
Val Thr Leu Ala Cys Leu Gly Arg Met Gly Ala Thr Ile Val Leu Glu
435                 440                 445
Met Val Cys Leu Val Asn Ala Glu Leu Tyr Pro Thr Phe Ile Arg Asn
450                 455                 460
Leu Gly Met Met Val Cys Ser Ala Leu Cys Asp Leu Gly Gly Ile Phe
465                 470                 475                 480
Thr Pro Phe Met Val Phe Arg Leu Met Glu Val Trp Gln Ala Leu Pro
485                 490                 495
Leu Ile Leu Phe Gly Val Leu Gly Leu Thr Ala Gly Ala Met Thr Leu
500                 505                 510
Leu Leu Pro Glu Thr Lys Gly Val Ala Leu Pro Glu Thr Ile Glu Glu
515                 520                 525
Ala Glu Asn Leu Gly Arg Arg Lys Ser Lys Ala Lys Glu Asn Thr Ile
530                 535                 540
Tyr Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Ser Ser Ser Thr
545                 550                 555
<210>  2
<211>  553
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Pro Thr Val Asp Asp Ile Leu Glu Gln Val Gly Glu Ser Gly Trp
1               5                   10                  15
Phe Gln Lys Gln Ala Phe Leu Ile Leu Cys Leu Leu Ser Ala Ala Phe
20                  25                  30
Ala Pro Ile Cys Val Gly Ile Val Phe Leu Gly Phe Thr Pro Asp His
35                  40                  45
His Cys Gln Ser Pro Gly Val Ala Glu Leu Ser Gln Arg Cys Gly Trp
50                  55                  60
Ser Pro Ala Glu Glu Leu Asn Tyr Thr Val Pro Gly Leu Gly Pro Ala
65                  70                  75                  80
Gly Glu Ala Phe Leu Gly Gln Cys Arg Arg Tyr Glu Val Asp Trp Asn
85                  90                  95
Gln Ser Ala Leu Ser Cys Val Asp Pro Leu Ala Ser Leu Ala Thr Asn
100                 105                 110
Arg Ser His Leu Pro Leu Gly Pro Cys Gln Asp Gly Trp Val Tyr Asp
115                 120                 125
Thr Pro Gly Ser Ser Ile Val Thr Glu Phe Asn Leu Val Cys Ala Asp
130                 135                 140
Ser Trp Lys Leu Asp Leu Phe Gln Ser Cys Leu Asn Ala Gly Phe Phe
145                 150                 155                 160
Phe Gly Ser Leu Gly Val Gly Tyr Phe Ala Asp Arg Phe Gly Arg Lys
165                 170                 175
Leu Cys Leu Leu Gly Thr Val Leu Val Asn Ala Val Ser Gly Val Leu
180                 185                 190
Met Ala Phe Ser Pro Asn Tyr Met Ser Met Leu Leu Phe Arg Leu Leu
195                 200                 205
Gln Gly Leu Val Ser Lys Gly Asn Trp Met Ala Gly Tyr Thr Leu Ile
210                 215                 220
Thr Glu Phe Val Gly Ser Gly Ser Arg Arg Thr Val Ala Ile Met Tyr
225                 230                 235                 240
Gln Met Ala Phe Thr Val Gly Leu Val Ala Leu Thr Gly Leu Ala Tyr
245                 250                 255
Ala Leu Pro His Trp Arg Trp Leu Gln Leu Ala Val Ser Leu Pro Thr
260                 265                 270
Phe Leu Phe Leu Leu Tyr Tyr Trp Cys Val Pro Glu Ser Pro Arg Trp
275                 280                 285
Leu Leu Ser Gln Lys Arg Asn Thr Glu Ala Ile Lys Ile Met Asp His
290                 295                 300
Ile Ala Gln Lys Asn Gly Lys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Lys Met Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Glu Glu Asp Val Thr Glu Lys Leu Ser Pro Ser Phe Ala Asp
325                 330                 335
Leu Phe Arg Thr Pro Arg Leu Arg Lys Arg Thr Phe Ile Leu Met Tyr
340                 345                 350
Leu Trp Phe Thr Asp Ser Val Leu Tyr Gln Gly Leu Ile Leu His Met
355                 360                 365
Gly Ala Thr Ser Gly Asn Leu Tyr Leu Asp Phe Leu Tyr Ser Ala Leu
370                 375                 380
Val Glu Ile Pro Gly Ala Phe Ile Ala Leu Ile Thr Ile Asp Arg Val
385                 390                 395                 400
Gly Arg Ile Tyr Pro Met Ala Val Ser Asn Leu Leu Ala Gly Ala Ala
405                 410                 415
Cys Leu Val Ile Phe Ile Ser Pro Asp Leu His Trp Leu Asn Ile Ile
420                 425                 430
Ile Met Cys Val Gly Arg Met Gly Ile Thr Ile Ala Ile Gln Met Ile
435                 440                 445
Cys Leu Val Asn Ala Glu Leu Tyr Pro Thr Phe Val Arg Asn Leu Arg
450                 455                 460
Val Met Val Cys Ser Ser Leu Cys Asp Ile Gly Gly Ile Ile Thr Pro
465                 470                 475                 480
Phe Ile Val Phe Arg Leu Arg Glu Val Trp Gln Ala Leu Pro Leu Ile
485                 490                 495
Leu Phe Ala Val Leu Gly Leu Leu Ala Ala Gly Val Thr Leu Leu Leu
500                 505                 510
Pro Glu Thr Lys Gly Asp Ala Leu Pro Glu Thr Met Lys Asp Ala Glu
515                 520                 525
Asn Leu Gly Arg Lys Ala Lys Pro Lys Glu Asn Thr Ile Tyr Leu Lys
530                 535                 540
Val Gln Thr Ser Glu Pro Ser Gly Thr
545                 550
<210>  3
<211>  555
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Met Pro Thr Thr Val Asp Asp Val Leu Glu His Gly Gly Glu Phe His
1               5                   10                  15
Phe Phe Gln Lys Gln Met Phe Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ala Thr
20                  25                  30
Phe Ala Pro Ile Tyr Val Gly Ile Val Phe Leu Gly Phe Thr Pro Asp
35                  40                  45
His Arg Cys Arg Ser Pro Gly Val Ala Glu Leu Ser Leu Arg Cys Gly
50                  55                  60
Trp Ser Pro Ala Glu Glu Leu Asn Tyr Thr Val Pro Gly Pro Gly Pro
65                  70                  75                  80
Ala Gly Glu Ala Ser Pro Arg Gln Cys Arg Arg Tyr Glu Val Asp Trp
85                  90                  95
Asn Gln Ser Thr Phe Asp Cys Val Asp Pro Leu Ala Ser Leu Asp Thr
100                 105                 110
Asn Arg Ser Arg Leu Pro Leu Gly Pro Cys Arg Asp Gly Trp Val Tyr
115                 120                 125
Glu Thr Pro Gly Ser Ser Ile Val Thr Glu Phe Asn Leu Val Cys Ala
130                 135                 140
Asn Ser Trp Met Leu Asp Leu Phe Gln Ser Ser Val Asn Val Gly Phe
145                 150                 155                 160
Phe Ile Gly Ser Met Ser Ile Gly Tyr Ile Ala Asp Arg Phe Gly Arg
165                 170                 175
Lys Leu Cys Leu Leu Thr Thr Val Leu Ile Asn Ala Ala Ala Gly Val
180                 185                 190
Leu Met Ala Ile Ser Pro Thr Tyr Thr Trp Met Leu Ile Phe Arg Leu
195                 200                 205
Ile Gln Gly Leu Val Ser Lys Ala Gly Trp Leu Ile Gly Tyr Ile Leu
210                 215                 220
Ile Thr Glu Phe Val Gly Gly Arg Tyr Arg Arg Thr Val Gly Ile Phe
225                 230                 235                 240
Tyr Gln Val Ala Tyr Thr Val Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Val Ala
245                 250                 255
Tyr Ala Leu Pro His Trp Arg Trp Leu Gln Phe Thr Val Ala Leu Pro
260                 265                 270
Asn Phe Phe Phe Leu Leu Tyr Tyr Trp Cys Ile Pro Glu Ser Pro Arg
275                 280                 285
Trp Leu Ile Ser Gln Asn Lys Asn Ala Glu Ala Met Arg Ile Ile Lys
290                 295                 300
His Ile Ala Lys Lys Asn Gly Lys Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gln Arg
305                 310                 315                 320
Leu Arg Leu Glu Glu Glu Thr Gly Lys Lys Leu Asn Pro Ser Phe Leu
325                 330                 335
Asp Leu Val Arg Thr Pro Gln Ile Arg Lys His Thr Met Ile Leu Met
340                 345                 350
Tyr Asn Trp Phe Thr Ser Ser Val Leu Tyr Gln Gly Leu Ile Met His
355                 360                 365
Met Gly Leu Ala Gly Asp Asn Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Tyr Ser Ala
370                 375                 380
Leu Val Glu Phe Pro Ala Ala Phe Met Ile Ile Leu Ile Ile Asp Arg
385                 390                 395                 400
Ile Gly Arg Arg Tyr Pro Trp Ala Ala Ser Asn Met Val Ala Gly Ala
405                 410                 415
Ala Cys Leu Ala Ser Val Phe Ile Pro Gly Asp Leu Gln Trp Leu Lys
420                 425                 430
Ile Ile Ile Ser Cys Leu Gly Arg Met Gly Ile Thr Met Ala Tyr Glu
435                 440                 445
Ile Val Cys Leu Val Asn Ala Glu Leu Tyr Pro Thr Phe Ile Arg Asn
450                 455                 460
Leu Gly Val His Ile Cys Ser Ser Met Cys Asp Ile Gly Gly Ile Ile
465                 470                 475                 480
Thr Pro Phe Leu Val Tyr Arg Leu Thr Asn Ile Trp Leu Glu Leu Pro
485                 490                 495
Leu Met Val Phe Gly Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Gly Leu Ala Leu
500                 505                 510
Leu Leu Pro Glu Thr Lys Gly Lys Ala Leu Pro Glu Thr Ile Glu Glu
515                 520                 525
Ala Glu Asn Met Gln Arg Pro Arg Lys Asn Lys Glu Lys Met Ile Tyr
530                 535                 540
Leu Gln Val Gln Lys Leu Asp Ile Pro Leu Asn
545                 550                 555
<210>  4
<211>  1882
<212>  DNA
<213>  Rattus sp.
<400>  4
gcaggcctgg ctaaactggt gagggcccta cccagccatg cccaccgtgg atgatgtcct     60
ggagcaagtt ggagagtttg gctggttcca gaaacaagcc ttcctgttgc tatgcctgat    120
ctcagcttct ttagctccca tctatgtggg catcgtcttc ctgggcttca cccctggaca    180
ttattgccag aatcctgggg tggctgagct gagccagcgg tgtggctgga gccaggcaga    240
ggagctgaac tacactgtgc cgggcctggg accttcggac gaggcctcct tcctcagcca    300
gtgcatgagg tatgaggtgg actggaacca gagcaccctt gactgtgtgg acccactgtc    360
cagcctggtt gccaacagga gtcagttgcc attgggcccc tgcgagcatg gctgggtata    420
cgacactccc ggctcctcca tcgtcactga gtttaacctg gtgtgtggag acgcctggaa    480
agtggacctt tttcagtcct gtgtgaactt gggcttcttc ctgggctccc tggttgtggg    540
ttacattgca gacaggtttg gccgtaagct ctgtctcttg gtgaccacgc tggtcacatc    600
tgtgtccggt gtgctaacag cggtggcccc agactataca tccatgttgc tctttcgcct    660
gctgcagggc atggtcagca agggcagctg ggtgtccggc tataccttga tcacagagtt    720
tgtcggctct ggctacagga gaacgacggc cattttgtac cagatggcct tcacagtggg    780
gctagtgggg cttgccgggg tggcctatgc cattccagac tggcgctggc tccagctagc    840
tgtgtccctg cctaccttcc tcttcctgct gtattactgg tttgtcccag aatccccccg    900
gtggctgttg tcccagaaga gaaccacgcg agctgtcagg ataatggagc aaattgcaca    960
gaagaacggg aaggtgcctc ctgctgacct gaagatgctc tgccttgagg aggatgcctc   1020
agaaaagcga agtccttcgt ttgccgacct gttccgcact cccaacctga ggaagcacac   1080
cgtcatcctg atgtatctat ggttctcttg tgctgtgctg taccagggtc tcatcatgca   1140
cgtgggagcc acaggggcca acctctacct ggacttcttt tattcttctc tggtggaatt   1200
ccccgcggcc ttcatcatcc tggtcaccat tgaccgcatt ggccgcatct acccaatagc   1260
ggcctcgaat ctggtgacgg gggcagcctg cctcctcatg atctttatcc cgcatgagct   1320
gcactggttg aacgttaccc tcgcctgtct tggccgtatg ggggccacca ttgtgctgca   1380
gatggtctgc ctggtgaacg ctgagctgta ccctacattc atcaggaatc ttgggatgat   1440
ggattgctct gccctgtgtg acctgggtgg gatcttcacc cccttcatgg tgttcaggct   1500
gatggaagtt tggcaagccc tgcccctcat tttgtttggg gttttgggcc tgactgctgg   1560
ggccatgact cttcttctcc cagagaccaa gggtgtggct ttgcctgaga ctattgaaga   1620
agcagagaac ctggggagga ggaaatcaaa ggccaaagaa aacacgattt accttcaggt   1680
ccaaacaggc aagtcctcaa gtacctgaca gggatgctgt gccaggagct gagtggcaga   1740
gagaaaggag gacttgccac ttggaggatt cccagaagcc tttgcctttc cagactcttg   1800
tatatatgca ccaggttcca aatgaactac caaccttaaa gacttttctg aaagcccaaa   1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa                                            1882
<210>  5
<211>  1885
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  5
gagggagaca ttgcacctgg ccactgcagc ccagagcagg tctggccacg gccatgagca     60
tgctgagcca tcatgcccac cgtggatgac attctggagc aggttgggga gtctggctgg    120
ttccagaagc aagccttcct catcttatgc ctgctgtcgg ctgcctttgc gcccatctgt    180
gtgggcatcg tcttcctggg tttcacacct gaccaccact gccagagccc tggggtggct    240
gagctgagcc agcgctgtgg ctggagccct gcggaggagc tgaactatac agtgccaggc    300
ctggggcccg cgggcgaggc cttccttggc cagtgcaggc gctatgaagt ggactggaac    360
cagagcgccc tcagctgtgt agaccccctg gctagcctgg ccaccaacag gagccacctg    420
ccgctgggtc cctgccagga tggctgggtg tatgacacgc ccggctcttc catcgtcact    480
gagttcaacc tggtgtgtgc tgactcctgg aagctggacc tctttcagtc ctgtttgaat    540
gcgggcttct tctttggctc tctcggtgtt ggctactttg cagacaggtt tggccgtaag    600
ctgtgtctcc tgggaactgt gctggtcaac gcggtgtcgg gcgtgctcat ggccttctcg    660
cccaactaca tgtccatgct gctcttccgc ctgctgcagg gcctggtcag caagggcaac    720
tggatggctg gctacaccct aatcacagaa tttgttggct cgggctccag aagaacggtg    780
gcgatcatgt accagatggc cttcacggtg gggctggtgg cgcttaccgg gctggcctac    840
gccctgcctc actggcgctg gctgcagctg gcagtctccc tgcccacctt cctcttcctg    900
ctctactact ggtgtgtgcc ggagtcccct cggtggctgt tatcacaaaa aagaaacact    960
gaagcaataa agataatgga ccacatcgct caaaagaatg ggaagttgcc tcctgctgat   1020
ttaaagatgc tttccctcga agaggatgtc accgaaaagc tgagcccttc atttgcagac   1080
ctgttccgca cgccgcgcct gaggaagcgc accttcatcc tgatgtacct gtggttcacg   1140
gactctgtgc tctatcaggg gctcatcctg cacatgggcg ccaccagcgg gaacctctac   1200
ctggatttcc tttactccgc tctggtcgaa atcccggggg ccttcatagc cctcatcacc   1260
attgaccgcg tgggccgcat ctaccccatg gccgtgtcaa atttgttggc gggggcagcc   1320
tgcctcgtca tttttatctc acctgacctg cactggttaa acatcataat catgtgtgtt   1380
ggccgaatgg gaatcaccat tgcaatacaa atgatctgcc tggtgaatgc tgagctgtac   1440
cccacattcg tcaggaacct cagagtgatg gtgtgttcct ccctgtgtga cataggtggg   1500
ataatcaccc ccttcatagt cttcaggctg agggaggtct ggcaagcctt gcccctcatt   1560
ttgtttgcgg tgttgggcct gcttgccgcg ggagtgacgc tacttcttcc agagaccaag   1620
ggggacgctt tgccagagac catgaaggac gccgagaacc ttgggagaaa agcaaagccc   1680
aaagaaaaca cgatttacct taaggtccaa acctcagaac cctcgggcac ctgagagaga   1740
tgttttgcgg cgatgtcgtg ttggagggat gaagatggag ttatcctctg cagaaattcc   1800
tagacgcctt cacttctctg tattcttcct catacttgcc tacccccaaa ttaatatcag   1860
tcctaaagaa aaaaaaaaaa aaaaa                                         1885
<210>  6
<211>  1896
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  6
ggccctgccc tgaaggctgg tcacttgcag aggtaaactc ccctctttga cttctggcca     60
gggtttgtgc tgagctggct gcagccgctc tcagcctcgc tccgggcacg tcgggcagcc    120
tcgggccctc ctgcctgcag gatcatgccc accaccgtgg acgatgtcct ggagcatgga    180
ggggagtttc actttttcca gaagcaaatg tttttcctct tggctctgct ctcggctacc    240
ttcgcgccca tctacgtggg catcgtcttc ctgggcttca cccctgacca ccgctgccgg    300
agccccggag tggccgagct gagtctgcgc tgcggctgga gtcctgcaga ggaactgaac    360
tacacggtgc cgggcccagg acctgcgggc gaagcctccc caagacagtg taggcgctac    420
gaggtggact ggaaccagag cacctttgac tgcgtggacc ccctggccag cctggacacc    480
aacaggagcc gcctgccact gggcccctgc cgggacggct gggtgtacga gacgcctggc    540
tcgtccatcg tcaccgagtt taacctggta tgtgccaact cctggatgtt ggacctattc    600
cagtcatcag tgaatgtagg attctttatt ggctctatga gtatcggcta catagcagac    660
aggtttggcc gtaagctctg cctcctaact acagtcctca taaatgctgc agctggagtt    720
ctcatggcca tttccccaac ctatacgtgg atgttaattt ttcgcttaat ccaaggactg    780
gtcagcaaag caggctggtt aataggctac atcctgatta cagaatttgt tggggggaga    840
tatcggagaa cagtggggat tttttaccaa gttgcctata cagttgggct cctggtgcta    900
gctggggtgg cttacgcact tcctcactgg aggtggttgc agttcacagt tgctctgccc    960
aacttcttct tcttgctcta ttactggtgc atacctgagt ctcccaggtg gctgatctcc   1020
cagaataaga atgctgaagc catgagaatc attaagcaca tcgcaaagaa aaatggaaaa   1080
tctctacccg cctcccttca gcgcctgaga cttgaagagg aaactggcaa gaaattgaac   1140
ccttcatttc ttgacttggt cagaactcct cagataagga aacatactat gatattgatg   1200
tacaactggt tcacgagctc tgtgctctac cagggcctca tcatgcacat gggccttgca   1260
ggtgacaata tctacctgga tttcttctac tctgccctgg ttgaattccc agctgccttc   1320
atgatcatcc tcattatcga ccgcatcgga cgccgttacc cttgggctgc atcaaatatg   1380
gttgcagggg cagcctgtct ggcctcagtt tttatacctg gtgatctaca atggctaaaa   1440
attattatct catgcttggg aagaatgggg atcacaatgg cctatgagat agtctgcctg   1500
gtcaatgctg agctgtaccc cacattcatt aggaatcttg gcgtccacat ctgttcctca   1560
atgtgtgaca ttggtggcat catcacgcca ttcctggtct accggctcac taacatctgg   1620
cttgagctcc cgctgatggt tttcggcgta cttggcttgg ttgctggagg tctggtgctg   1680
ttgcttccag aaactaaagg gaaagctttg cctgagacca tcgaggaagc cgaaaatatg   1740
caaagaccaa gaaaaaataa agaaaagatg atttacctcc aagttcagaa actagacatt   1800
ccattgaact aagaagagag accgttgctg ctgtcatgac ctagctttat ggcagcaaga   1860
ccaaaagtag aaatccctgc actcatcaca aagccc                             1896
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１〜６はXenopus laevis卵母細胞におけるＯＣＴ１の発現について示している。示された14Ｃ‐ＴＥＡ取込み率は１０〜２０回測定の平均値±標準偏差を表す。
図１は水、ラット腎臓ｍＲＮＡ２０ngまたはＯＣＴ１  ｃＲＮＡ１０ng注入後に観察された14Ｃ‐ＴＥＡのＮＭＮ阻害取込みの比較について示している。インキュベート培地中14Ｃ‐ＴＥＡおよびＮＭＮの濃度は、各々２００μＭおよび１０mMであった。
【図２】  異なる量のＯＣＴ１  ｃＲＮＡ注入後２００μＭ14Ｃ‐ＴＥＡの取込み率について示している。曲線は得られたデータにHill式を適合させた後コンピューター計算した（ｎ＝１．９±０．２）。
【図３】  卵母細胞当たりＯＣＴ１  ｃＲＮＡ３ngの注入後に発現された14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの基質依存性について示している。連続線は水を注入したコントロール卵母細胞で測定された飽和性成分および直線的成分を含む全取込みについて示している。直線的成分は直線的回帰により適合させた（点線、３０fmol×ｈ-1×卵母細胞-1×μＭ-1）。飽和性成分はMichaelis Menten式を用いて適合させた（Ｋｍ９５±１０μＭ、Ｖmax ８１±５pmol×ｈ-1×卵母細胞-1）。実線は双方の成分を含んだ式に合わせることでコンピューター計算した。
【図４】  ＯＣＴ１  ｃＲＮＡ３ngを注入した卵母細胞における14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの電位依存性について示している。９５μＭ14Ｃ‐ＴＥＡの取込みを所定濃度のＮａ＋、Ｋ＋およびＢａ++の存在下で測定した。これらの条件下において、膜電位は−４０〜−６０mV（１００mMＮａ＋および３mMＫ＋）、０〜−１０mV（１mMＮａ＋および１０２mMＫ＋）および−１８〜−２２mV（１００mMＮａ＋、３mMＫ＋および１０mMＢａ++）であった。
【図５】  ＯＣＴ１  ｃＲＮＡ３ngを注入した卵母細胞中プロトン勾配の存在および不在下における９５μＭ14Ｃ‐ＴＥＡの取込みについて示している。14Ｃ‐ＴＥＡの取込みを変える膜電位のプロトン勾配誘導性変化を妨げるために、測定をインキュベート培地中１０２mMＫ＋および１mMＮａ＋の存在下で行った。これにより、膜電位は約０mVになった。微小電極を用いたｐＨ測定では、ｐＨが３０分の取込み時間中０．１単位以下で変化することを示した。
【図６】  デシニウム２２（ｏ）、キニン（△）、デシプラミン（□）、プロカインアミド（黒丸）、Ｏ‐メチルイソプレナリン（◇）およびテトラメチルアンモニウム（黒ひし形）によるＯＣＴ１誘導性14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの阻害について示している。卵母細胞にＯＣＴ１  ｃＲＮＡ５ngを注入し、９５μＭ14Ｃ‐ＴＥＡを用いて測定を行った。
【図７】  ＯＣＴ１のヌクレオチド配列とそれから演繹されたアミノ酸配列について示している。推定貫膜領域には下線がひかれ、ＮＸＴ／Ｓタイプの潜在的Ｎ‐グリコシル化部位は星印で示されている。
【図８】  図７の配列の続きである。
【図９】  図８の配列の続きである。
【図１０】  相同的ヒト腎臓遺伝子（ＨＯＣＴ１）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列について示している。示された遺伝子断片は１８８５塩基を含み、５５３アミノ酸をコードする。
【図１１】  図１０の配列の続きである。
【図１２】  図１１の配列の続きである。
【図１３】  第二の相同的ヒト腎臓遺伝子（ＨＯＣＴ２）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列について示している。示された遺伝子断片は１８５６塩基を含み、５５５アミノ酸をコードする。
【図１４】  図１３の配列の続きである。
【図１５】  図１４の配列の続きである。
【図１６】  ９アミノ酸の窓を用いたＯＣＴ１のKyte/Doolittle疎水性／親水性分析について示している。推定貫膜領域は番号１〜１１である。
【図１７】  ＯＣＴ１の概略を示している。アミノ酸残基Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓはプラス記号で示し、アミノ酸残基ＧｌｕおよびＡｓｐはマイナス記号で示している。第一親水性ループにおける潜在的グリコシル化部位が確認された。
【図１８】  様々なラット組織および一部の細胞系におけるＯＣＴ１特異性ｍＲＮＡの位置を示している。
【図１】
0003798447.tif 000003
【図２】
0003798447.tif 000004
【図３】
0003798447.tif 000005
【図４】
0003798447.tif 000006
【図５】
0003798447.tif 000007
【図６】
0003798447.tif 000008
【図７】
0003798447.tif 000009
【図８】
0003798447.tif 000010
【図９】
0003798447.tif 000011
【図１０】
0003798447.tif 000012
【図１１】
0003798447.tif 000013
【図１２】
0003798447.tif 000014
【図１３】
0003798447.tif 000015
【図１４】
0003798447.tif 000016
【図１５】
0003798447.tif 000017
【図１６】
0003798447.tif 000018
【図１７】
0003798447.tif 000019
【図１８】
0003798447.tif 000020