(57)【要約】本発明は、ＯｓＳＵＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡ及びこれをプロモータに用いて所望の外来遺伝子を維管束またはその篩部で特異的に発現しうる形質転換植物等を提供する。本発明により、イネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）のゲノムライブラリーよりＯｓＳＵＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡには、配列表の配列番号１に記載の塩基配列中に篩部特異性及び生育時期特異性を発揮するプロモーター配列が存在した。該プロモーターＤＮＡの下流に所望の外来遺伝子を接続し、これをゲノムに組み込み、篩部特異的または維管束系組織特異的に外来遺伝子を発現する形質転換植物を作出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列中に存在するプロモータ配列を有するＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１における２８５番目のＴないし２９６番目のＧから１０８８番目のＧないし１４０３番目のＣまでの塩基配列、または、上記塩基配列における５′末端から９５３番目のＡまでの一部を欠失した塩基配列からなる、植物維管束組織の篩部で特異的にプロモーター活性を保持するＤＮＡ、または、該ＤＮＡに高いストリンジェント条件下でハイブリダイズし、植物維管束組織の篩部で特異的にプロモーター活性を保持するＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１における２８５番目のＴないし２９６番目のＧから１０８８番目のＧないし１４０３番目のＣまでの塩基配列において、１ないし数個の塩基が挿入、付加、削除または置換された塩基配列からなる、植物維管束組織の篩部で特異的にプロモーター活性を保持するＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１における２８５番目のＴないし２９６番目のＧから１０８８番目のＧないし１４０３番目のＣまでの塩基配列における５′末端から９５３番目のＡまでの一部を欠失した塩基配列において、１ないし数個の塩基が挿入、付加、削除または置換された塩基配列からなる、植物維管束組織の篩部で特異的にプロモーター活性を保持するＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１における９５３番目のＡから１４０３番目のＣまでの塩基配列からなる、植物維管束組織で特異的にプロモーター活性を有するＤＮＡ、または該ＤＮＡに高いストリンジェント条件下でハイブリダイズし、植物維管束組織で特異的にプロモーター活性を保持するＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１における９５３番目のＡから１４０３番目のＣまでの塩基配列において、１ないし数個の塩基が挿入、付加、削除または置換された塩基配列からなる、植物維管束組織で特異的にプロモーター活性を保持するＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載のＤＮＡと、該ＤＮＡの下流に接続された外来遺伝子を含む発現カセット。
【請求項８】
形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子をさらに含む、請求項７の発現カセット。
【請求項９】
請求項７または８の発現カセットを含む形質転換用ベクター。
【請求項１０】
請求項１ないし６のいずれかに記載のプロモーターＤＮＡ、および、該ＤＮＡの下流に接続された外来遺伝子をゲノムに組み込まれた、維管束組織の篩部特異的または維管束系組織特異的に外来遺伝子を発現する、形質転換植物細胞、該細胞由来のカルス、該カルス由来の形質転換植物体、またはそれらの子孫。
【請求項１１】
単子葉植物である、請求項１０の形質転換植物細胞、該細胞由来のカルス、該カルス由来の形質転換植物体、またはそれらの子孫。
【請求項１２】
以下の工程を含む、維管束組織の篩部特異的または維管束系組織特異的に外来遺伝子を発現する形質転換植物の製造方法：
（ａ）請求項１ないし６のいずれかに記載のプロモーターを用意する；
（ｂ）上記プロモーターの下流に所望の構造遺伝子を接続し、必要であれば、さらに該構造遺伝子に続いて選択マーカー遺伝子を接続して発現カセットを調製する；
（ｃ）アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、マイクロインジェクション法、またはパーティクルガン法により、上記発現カセットを植物のゲノムへ導入する；
（ｄ）形質転換された植物細胞を選択マーカーによりスクリーンニングし、カルス培養する；
（ｅ）生じたカルスを再生培地で完全な植物体になるまで培養する。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物、特に単子葉植物の維管束系組織、特に維管束篩部を標的とした遺伝子発現システムに関し、詳しくは、イネスクローストランスポーター遺伝子のプロモーター活性を有する塩基配列を含むＤＮＡ及び発現カセット並びにこれを用いて形質転換された形質転換植物等に関する。
従来の技術
一般に植物の維管束系は光合成同化産物や水の通道器官として周知であるが、単にそればかりではなく、最近は植物個体レベルでのシグナル伝達や形態形成等へ関与することが報告されている。維管束系組織に偏在するタンパク質としてスクローストランスポーター（以下、「ＳＵＴ」と称する）が知られている。このＳＵＴは高等植物においてショ糖（スクロース）輸送を担う膜蛋白質であり、膜に局在するＨ＋−ＡＴＰａｓｅと共役してプロトン（Ｈ＋）能動輸送を駆動力にスクロースの能動輸送を行うと考えられる。
そのＳＵＴ遺伝子は既に、双子葉植物を中心にして複数の植物種で単離されている。ＳＵＴを植物から単離した最初の報告例はホウレンソウである（Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒ　ＪＷ，Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　Ｌ，Ｆｒｏｍｍｅｒ　ＷＢ（１９９２）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｃＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｓｐｉｎａｃｈ　ｂｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ．ＥＭＢＯ　Ｊ　１１：４７０５−４７１３）。
双子葉植物において、バレイショより単離されたＳＵＴの維管束篩部特異的発現が確認されており（Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒ　ＪＷ，Ｈｉｒｎｅｒ　Ｂ，Ｆｒｏｍｍｅｒ　ＷＢ（１９９３）Ｐｏｔａｔｏ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ　ｍｉｎｏｒ　ｖｅｉｎｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｐｈｌｏｅｍ　ｌｏａｄｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　５：１５９１−１５９８）。次いで、オオバコ（Ｇａｈｒｔｚ　Ｍ，Ｓｔｏｌｚ　Ｊ，Ｓａｕｅｒ　Ｎ（１９９４）Ａ　ｐｈｌｏｅｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｕｃｒｏｓｅ−Ｈ＋　ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ　ｆｒｏｍ　Ｐｌａｎｔａｇｏ　ｍａｊｏｒ　Ｌ．ｓｕｐｐｏｒｔｓ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ａｐｏｐｌａｓｔｉｃ　ｐｈｌｏｅｍ　ｌｏａｄｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６：６９７−７０６）、シロイヌナズナ（Ｓａｕｅｒ　Ｎ，Ｓｔｏｌｚ　Ｊ（１９９４）ＳＵＣ１　ａｎｄ　ＳＵＣ２：ｔｗｏ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ　ｆｒｏｍ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂａｋｅｒ’ｓ　ｙｅａｓｔ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ　６：６７−７７）で報告され、さらにアラビドプシス、トマト、エンドウ等でも篩部特異的発現は確認されている。
上記双子葉植物アラビドプシスに関しては既に、プロモーターが単離されており、「プロモーター：ＧＵＳ」並びに「プロモーター：ＧＦＰ形質転換体」を用いた発現系の解析も行われている（Ｔｒｕｅｒｎｉｔ　Ｅ，Ｓａｕｅｒ　Ｎ（１９９５）Ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＳＵＣ２　ｓｕｃｒｏｓｅ−Ｈ＋　ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ｄｉｒｅｃｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｈｌｏｅｍ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｐｈｌｏｅｍ　ｌｏａｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｕｎｌｏａｄｉｎｇ　ｂｙ　ＳＵＣ２．Ｐｌａｎｔａ　１９６：５６４−５７０：Ｉｍａｌａｕ　Ａ．，Ｔｒｕｅｒｎｉｔ　Ｅ．，Ｓａｕｅｒ　Ｎ．（１９９９）Ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｌｏｎｇ−ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｈｌｏｅｍ　ａｎｄ　ｓｙｍｐｌａｓｔｉｃ　ｕｎｌｏａｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｏ　ｓｉｎｋ　ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１１：３０９−３２２）。
一方、単子葉植物のＳＵＴ遺伝子は、最初にイネから単離された（Ｈｉｒｏｓｅ　Ｔ，Ｉｍａｉｚｕｍｉ　Ｎ，Ｓｃｏｆｉｅｌｄ　ＧＮ，Ｆｕｒｂａｎｋ　ＲＴ，Ｏｈｓｕｇｉ　Ｒ（１９９７）ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｆｒｏｍ　ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　３８：１３８９−１３９６）。その後、トウモロコシ等からも単離されている（Ａｏｋｉ　Ｎ．，Ｈｉｒｏｓｅ　Ｔ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｓ．，Ｏｎｏ　Ｋ．，Ｉｓｈｉｍａｒｕ　Ｋ．，Ｏｈｓｕｇｉ　Ｒ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ａ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．４０：１０７２−１０７８）。
従来、単子葉植物でＳＵＴ遺伝子発現の篩部局在性が確認されているのはイネのみである（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ　Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４：８５−９４）。またＳＵＴに関する報告ではないが、ＲＰＰ１３−１遺伝子が既にそのプロモーターと共に篩部特異的発現を示す遺伝子として単離されている（Ｉｓｈｉｗａｔａｒｉ　Ｙ，Ｆｕｊｉｗａｒａ　Ｔ，ＭｃＦａｒｌａｎｄ　ＫＣ，Ｎｅｍｏｔｏ　Ｋ，Ｈａｙａｓｈｉ　Ｈ，Ｃｈｉｎｏ　Ｍ，Ｌｕｃａｓ　ＷＪ（１９９８）Ｒｉｃｅ　ｐｈｌｏｅｍ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｈ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｔｏ　ｍｅｄｉａｔｅ　ｉｔｓ　ｏｗｎ　ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｐｌａｓｍｏｄｅｓｍａｔａ．Ｐｌａｎｔａ　２０５：１２−２２）。
その他、何れもＳＵＴ遺伝子プロモーターに関するものではないが、篩部特異的発現を支配するプロモーターに関する報告は幾つかなされている（米国特許第５，４９５，００７号、ドイツ国特許第４，３０６，８３２号、国際公開公報ＷＯ９３／０４１７７、ＷＯ９２／２２５８２、ＷＯ９１／０９０５０、ＷＯ００／１１１９７）。
発明の概要
近年の植物形質転換技術においては、従来の全組織的または恒常的発現システムではなく、組織・器官・生育時期特異的なプロモーターを用いた遺伝子発現システムが求められている。特に病原菌・ウィルスの感染経路ともなっている維管束系組織を標的とした有用遺伝子の発現システムを確立することは、耐病性の付与、形質転換による維管束の輸送能力の改変、草型の改良等の有力な手法になりうると期待できる。
とりわけ重要作物であるイネにおいて、殺虫タンパク質、抗ウィルスタンパク質耐病性タンパク質等の目的遺伝子の維管束を標的とした特異的発現システムは極めて有用であり、またそれだけでなく、維管束を介した糖輸送環境の改善を目的として糖代謝（ショ糖合成酵素、ショ糖リン酸合成酵素等）・糖輸送（ＳＵＴ、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ等）系のタンパク質や、糖シグナル伝達因子をコードする遺伝子を維管束特異的に発現させたり、それ以外にも、篩管を通して物質を輸送させる目的で特定タンパク質を発現させることが望まれる。
このように、高等植物イネにおいて、そのプロモータ制御特性に着目して維管束系組織を標的とした所望の遺伝子を発現可能な遺伝子発現システムを構築することは産業上極めて重要である。
しかしながら、従来においては単子葉植物のＳＵＴ遺伝子プロモーターは単離されておらず、また、単子葉植物において維管束の篩部で特異的なプロモータの報告は極めて少ない。
本発明の目的は、主要単子葉作物、特にイネ植物から維管束組織特異的、特にその篩部で特異的に活性を有するプロモーターを単離することである。本発明のさらなる目的は、該ＳＵＴ遺伝子プロモーターの制御特性を応用して、上記種々の改良を施した形質転換植物を提供することである。本発明はさらに、上記形質転換植物の製造方法および該方法に使用する発現ベクター並びに発現カセットを提供する。
発明の詳細な説明
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、イネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．；品種葵の風）のゲノムライブラリーよりＯｓＳＵＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡを初めて同定し、その塩基配列を決定した。そして、このプロモーターがその下流に連結した構造遺伝子を、植物の維管束篩部あるいは開花期の維管束で特異的に発現しうることを見出し、このプロモーターの下流に外来の構造遺伝子を連結した発現カセット、それを含むベクター及びこれらを用いて形質転換された植物を実際に作出することに成功し、本発明を完成するに至った。
同時に本発明者らは、上記塩基配列の５′側を一部欠失させると篩部特異性を失って維管束系組織全体に発現すること、および発現の時期特異性にも変化が生じることを見出した。このことは、ＯｓＳＵＴ１遺伝子のプロモーターは５′側と３′側で異なる性質を有することを意味しており、これらの性質の相違を利用して、発現の部位および時期を制御しうる発現システムの構築が可能であることを示唆している。
プロモーター
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列中に存在するプロモーター配列を有するＤＮＡを提供する。本明細書で「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写開始点の上流に存在して該遺伝子の発現を司る塩基配列を一般的に意味し、例えばエンハンサー等の転写調整配列をも含むものである。
ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１
より詳しくは、配列番号１に記載の塩基配列中に存在する第一のプロモーターは、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１と命名され、配列番号１における「２８５番目のＴないし２９６番目のＧ」から「１０８８番目のＧないし１４０３番目のＣ」までの塩基配列、または上記塩基配列における５′末端から９４７番目のＧまでの一部を欠失した塩基配列からなる、植物の維管束篩部位を標的とした強力な部位特異プロモーター活性を有するＤＮＡである。このプロモーターは、また、緑葉や根以外にも、出穂・開花期の節や節間・花器官において維管束篩部特異的且つ時期特異的なプロモーター活性を有する。
本発明はさらに、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１に、高いストリンジェント条件下でハイブリダイズし、実質的に同一のプロモーター活性、特に維管束組織篩部での特異的なプロモーター活性を保持するＤＮＡを提供する。
本発明はさらに、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１の塩基配列において、１ないし数個の塩基が挿入、付加、削除または置換された塩基配列からなる、実質的に同一のプロモーター活性、特に維管束組織篩部での特異的なプロモーター活性を保持するＤＮＡを提供する。
本発明はさらに、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１と塩基配列の相同性が高く、且つＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１と実質的に同一のプロモーター活性、特に維管束組織篩部での特異的なプロモーター活性を保持するＤＮＡを提供する。そのようなＤＮＡの塩基配列の相同性は、少なくとも８０％、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上である。相同性の％は、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２（１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムは、インターネットで容易に入手可能である。
ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２
配列番号１に記載の塩基配列中に存在する第二のプロモーターは、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２と命名され、配列番号１における「９４８番目のＴから１４０３番目のＣ」までの塩基配列からなる、植物の維管束組織で特異的にプロモーター活性を有するＤＮＡである。このプロモーターは、篩部特異性は低いが、植物維管束組織での特異的なプロモーター活性を保持しており、例えば、緑葉、根における維管束篩部・木部・維管束柔細胞において特異的にプロモーター活性を有する。さらに、このプロモーターの維管束系組織での特異的な活性は、上記第一のプロモーターと比較して、成育時期および器官への依存性が低い傾向を有する。
本発明はさらに、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２に高いストリンジェント条件下でハイブリダイズし、実質的に同一のプロモーター活性、特に植物維管束組織での特異的なプロモーター活性を保持するＤＮＡを提供する。
本発明はさらに、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２の塩基配列において、１ないし数個の塩基が挿入、付加、削除または置換された塩基配列からなり、実質的に同一のプロモーター活性、特に植物維管束組織での特異的なプロモーター活性を保持するＤＮＡを提供する。
本発明はさらに、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２と塩基配列の相同性が高く、且つＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２と実質的に同一のプロモーター活性、特に植物維管束組織での特異的なプロモーター活性を保持するＤＮＡを提供する。そのようなＤＮＡの塩基配列の相同性は、少なくとも８０％、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上である。相同性の％は、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２（１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムは、インターネットで容易に入手可能である。
なお、配列番号１中の１１１９〜１１２５番目のＴＡＴＴＡＴＡは、推定ＴＡＴＡｂｏｘである。したがって、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１及びＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２が、配列番号１の１１２５番目のＡの前後まで含むことは、本発明の好ましい態様に含まれる。
プロモーターの調製
本発明に関わるＯｓＳＵＴ１プロモーターの単離、精製、クローニング、発現ベクターの構築、植物細胞の形質転換、及び再生等は、本明細書中に開示した実施例のほか、遺伝子工学における公知の技術を参酌することで当業者に実施可能である。その実験的手法の詳細については、本明細書に引用する文献等を参照することで当業者に容易に理解される。
一例として、本発明のＯｓＳＵＴ１プロモーター活性を有するＤＮＡは、次のようにして得られる。単子葉植物、好ましくはイネ科植物（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）のＤＮＡゲノムライブラリーから、配列番号１に示した塩基配列の適当な部分、そのプロモーター活性部分の全部もしくは一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション等の方法でスクリーニングすることが可能である。目的のＤＮＡは、プローブとハイブリダイズする例えば約１０００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を含むコロニー中から選択するとよい。
ハイブリダイズの条件は、「高いストリンジェント条件」すなわち、ハイブリダイゼーションバッファー（０．５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，７％ＳＤＳ，１％ポリビニルピロリドン）中で温度約６３℃以上、好ましくは約６５℃以上でのハイブリダイズ条件が好ましい。このようなハイブリダイズ条件下でスクリーニングを２回以上、好ましくは３回以上繰り返すことにより、上記ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１または２の塩基配列と同一のプロモーターまたはこれらのプロモーターと高い相同性、例えば約８５％以上、好ましくは約９５％以上の塩碁配列からなり、実質的に同一のプロモーター活性を有するＤＮＡを得ることが可能である。
また、上記ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１または２の塩基配列「１ないし数個の塩基が挿入、付加、削除または置換された塩基配列」を有するＤＮＡを得るには、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１もしくは２から、またはこれらと相同性のＤＮＡから、例えば、部位特異的変異形成法により容易に得ることができる。そのような変異体の誘導は部位特異的変異形成法以外にも当業者に周知の任意の方法で行うことができる。
得られたＤＮＡ断片は、周知のＰＣＲ法により増幅し、塩基配列を決定し、配列番号１の塩基配列と比較することにより、目的のプロモーターであることを確認することができる。
ＤＮＡ断片のプロモーター活性を直接確認するには、その３’−側下流にレポーター遺伝子を連結した発現ベクターを作成し植物細胞へ導入する。形質転換植物体でその発現が検出されるレポーター遺伝子としては、検定が簡単で定量可能なＧＵＳ、ＬａｃＺ、Ｃａｔ遺伝子、さらには組織特異性の検定が可能な前記ＧＵＳ及びＧＦＰ遺伝子等があり、それらに確立された公知の検定法を適用することができる。活性を調べた結果、そのＤＮＡ断片の有する発現特異性が明らかとなれば、その配列が、後に所望の発現特異性を選択するための「プロモーター活性を有する所定領域の塩基配列」の一つとして使用できる。
発現カセットおよびベクター
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡは、そのプロモーター活性により、維管束の篩部特異的、維管束特異的又は器官もくしは生育時期特異的に発現させるべき外来遺伝子と共に、発現カセットとして用いることができる。
「外来遺伝子」は、上記維管束、特に維管束篩部において本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡの制御下にあって発現しうるかぎり、ＯｓＳＵＴ１遺伝子以外のいかなる遺伝子であってもよく、典型的には、維管束での部位特異的発現によって有用な作用をもたらすタンパク質をコードするものが挙げられる。好ましい外来遺伝子は、維管束が感染経路となっていることに着目すれば、植物体に耐病性を付与するタンパク質、特に抗害虫タンパク質、抗細菌タンパク質、若しくは抗ウイルスタンパク質が有用である。維管束系の形成が個体レベルの形態形成に重要な役割を果たすことに注目すれば、維管束全体を標的として草丈・草型などを制御する遺伝子を発現させることも有用である。特に好ましい遺伝子の例として、ジベレリンのシグナル伝達に関わるＧＡＩ遺伝子などが挙げられる。
プロモーター領域の３′側に目的の外来遺伝子を連結して発現カセットを構築する方法は当業者に知られている。構築したカセットは、適当なベクター（例えばｐＢＳＩＩやこれと同種のもの）中で増幅する。増幅した発現カセットは、例えば組換え用の中間ベクターを介して植物細胞のゲノムへ相同的組換により組み込むために使用できる。これらの構築したカセットは、大腸菌などに導入し、増幅させることができる。さらにこれらのカセットをアグロバクテリウムと２種類の大腸菌（一方は、これらのカセットを保持する大腸菌）を用いた３系交雑法により、アグロバクテリウム内に導入することができる。
上記発現カセットは、エンハンサー配列、外来遺伝子の５′側及び３′側の非翻訳領域なども適宜含んでいてもよい。また、形質転換体を選抜するためにマーカー遺伝子を含んでいてもよい。マーカー遺伝子の例としては、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシン若しくはネオマイシン、ハイグロマイシン又はスペクチノマイシン等の坑生物質耐性遺伝子等の他、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等が挙げられる。
植物細胞への発現カセット導入
本発明は、上記発現ベクターで形質転換した植物のゲノムに上記発現カセットが組み込まれて、そのプロモーター活性により外来遺伝子を維管束組織、特にその篩部で特異的に発現しうる形質転換植物も提供する。
上記発現カセットを用いた外来遺伝子の植物細胞ゲノムへの導入方法は特に限定されず、例えばアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などが挙げられる。好ましい方法は、アグロバクテリウム法である。その具体的方法は、例えばＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１３９５７に記載されている。これは、後述の実施例でも示されるように、アグロバクテリウムによる自然形質転換を応用し、好ましくは発現カセットを含む中間ベクターから、接合操作等を利用してアグロバクテリウム内に移し、このアグロバクテリウムを植物に感染させるというものである。アグロバクテリウムを植物に感染させるための方法も当業者に周知であり、例えば、植物体の一部を傷つけ、そこに細菌を感染させる方法、植物体の胚組織（未熟胚を含む。）に細菌を感染させる方法、カルスに感染させる方法、プロトプラストと細菌を共培養する方法、又は葉組織の小片を細菌とともに培養する方法（リーフディスク法）がある。
得られた形質転換細胞は、適当なマーカーを指標とするか、又は所望の形質を発現しているか否かによって他の細胞から選択することができる。形質転換した植物細胞を、再生培地で完全な植物体になるまで培養する方法は、例えば、Ｙ．Ｈｉｅｉ　ａｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６．２７１−２８２：１９９４に記載されている。
得られた形質転換植物の解析は、当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができる。例えば、導入した遺伝子のＤＮＡ配列を基にオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これを用いたＰＣＲにより形質転換植物の染色体ＤＮＡを解析することができる。また、導入した遺伝子に対応するｍＲＮＡや、タンパク質の発現の有無により解析することができる。さらには、植物体の外観（例えば、局部壊死斑を生じうるタンパク質をコードする遺伝子を導入した場合は、局部壊死斑の有無、又は局部壊死斑の大きさ、数等）、病害抵抗性（例えは、病原菌と接触させた場合の抵抗性の有無、又その程度）等によっても解析することができる。
したがって、一例を示せば、次の工程により植物細胞のゲノムに本発明のプロモーターとともに外来遺伝子を導入することができる。
（ａ）本発明のプロモーターを用意する；
（ｂ）上記プロモーターの下流に所望の構造遺伝子を接続し、必要であれば、さらに該構造遺伝子に続いて選択マーカー遺伝子を接続して発現カセットを調製する；
（ｃ）アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、マイクロインジェクション法、またはパーティクルガン法により、上記発現カセットを植物のゲノムへ導入する；
（ｄ）形質転換された植物細胞を選択マーカーによりスクリーンニングし、カルス培養する；
（ｅ）生じたカルスを再生培地で完全な植物体になるまで培養する；
（ｄ）所望により、生じた植物を自家または他家受粉によって、交配育種することにより、ホモに形質転換された植物品種に固定する。
なお、本明細書で「形質転換体」というときは、本発明の方法により組換え植物細胞を得て、該植物細胞を植物体に再生させることにより得た形質転換体のみならず、その特定の発現特異性が維持されている限り該形質転換体より得られた後代の植物をも含む。また、本明細書で「植物」というときは、特に明記した場合を除き、植物体（個体）の他、種子（発芽種子、未熟種子を含む）、器官又はその部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。
発明の効果
本発明により、高等植物で極めて有用なプロモーター活性を有するＤＮＡやこれを有する発現カセットが提供され、従来の維管束発現系で成しえなかった新規な遺伝子発現システムが提供された。
特に、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１をプロモーターとして用いることにより、目的遺伝子をイネ維管束篩部に特異的に発現させることが可能となった。さらに、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１は生殖成長期（出穂・開花期の生殖器官及び節間・節）の維管束篩部伴細胞を標的とした遺伝子発現用プロモーターとしても有効である。
また、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２をプロモーターとして用いることにより、生育時期、器官に関わらず維管束系で特異的に発現させることが可能となった。この活性によれば、植物個体レベルでの維管束を標的とした発現、例えば維管束の輸送能力の改善や草型改変等を目的とした発現システムに有効である。
また、これらのプロモーターをセットで用いることにより、従来の維管束特異的プロモーターでは困難であった、維管束内の微細な組織特異性（例：篩部又は木部・維管束柔細胞）や発育時期特異性を選択して目的遺伝子を発現させることが可能である。
本発明にいう「維管束」とは、同化産物や水の通道器官として機能する篩部（篩部伴細胞や篩管液を含む）及び木部を含む維管束鞘（維管束柔細胞を含む）、また、イネの葉鞘や葉身等の緑葉を配走する縦走維管束及び横走維管束はもちろん、開花・登熟期の各器官、例えば頴花、雌蘂（柱頭）、花糸、鱗皮ないし子房壁（果皮）等に存在するいずれの維管束も含む（但し登熟初期、開花後３日前後においては子房壁組織全体で発現する）。また、「維管束特異的」とは、上記維管束鞘にほぼ特異的であることをいうが、好ましいプロモーターは維管束内の特に篩部組織に特異的である。また、「生育時期特異的」とは、節間伸長時の節や節間、出穂や開花・登熟期の特定期をいう。さらに、「生育時期特異的」というときにも、節や節間における篩部特異的あるいは出穂や開花期における器官特異的ということもあり、したがって、部位特異的と時期特異的とを兼ね備えた態様も、本明細書にいう「発現特異性」に含まれる。
以上の特徴を持つ本発明のプロモーターは、殺虫タンパク質、抗ウィルスタンパク質、耐病性タンパク質等を発現させることにより、植物に耐病虫害性を付与するときに有効である。また、維管束を介した糖輸送環境の改善を目的として、糖代謝（ショ糖合成酵素、ショ糖リン酸合成酵素等）・糖輸送（ＳＵＴ、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ等）系のタンパク質や、糖シグナル伝達因子をコードする遺伝子を維管束特異的に発現させる際にも有効である。これ以外にも、篩管を通して物質を輸送させる目的でタンパク質を発現させる際に特に有用である。
実施例
ＯｓＳＵＴ１　ゲノムクローンの単離
イネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）品種「葵の風」緑葉よりゲノムＤＮＡ抽出キット・ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いてゲノムＤＮＡを単離・精製した。ＤＮＡ１００μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（ファルマシア社製）によって部分分解した。これをイソプロパノール沈殿により濃縮後、２０〜５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌの連続密度勾配遠心を行い、少量ずつ分画した。アガロース電気泳動で各画分のサイズを確認し、２３〜１５ｋｂｐのＤＮＡをλＢｌｕｅＳＴＡＲベクター（商品名：ノバージェン社製）のＸｈｏＩ部位に接続し、ギガパックゴールド（商品名：ストラタジーン社製）パッケージミックスでゲノミックライブラリーを作製した。ＯｓＳＵＴ１ｃＤＮＡ配列の一部であるＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（８１４ｂｐ）をプローブとして用い、定法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮＹ）によってゲノミックライブラリーをスクリーニングし、３個のポジティブクローンを得た。これらのクローンを任意の５種類の制限酵素で各々消化し、ＯｓＳＵＴ１ｃＤＮＡ配列のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（８１４ｂｐ）をプローブとしてサザンハイブリダイゼーション解析を行った。その結果、最も強いシグナルを示したＥｃｏＲＩフラグメント（４ｋｂｐ）をＯｓＳＵＴ１構造領域を含む断片として単離した。これらの塩基配列をＡＢＩ　ＰｒｉｓｍＴＭＢｉｇｄｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ及び３７３Ａ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（共にＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；現ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）を用いて決定したところ、ＯｓＳＵＴ１の５′側構造領域及び翻訳開始点を起点としてその上流１４０３ｂｐを含んでいることが判明した（図９を参照）。
ＯｓＳＵＴ１プロモーター活性調査のためのベクター構築
両端に制限酵素配列を含むように設計した合成プライマーとＴａｋａｒａ　ＥＸ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名：宝酒造株式会社）を用いてＰＣＲ法によりＯｓＳＵＴ１のプロモーター領域を増幅した。用いた合成プライマーの配列は以下の通りである。
2002055689.tif 000002
翻訳開始点を起点・＋１とした場合、上記プライマー１及びプライマー３を用いて−１１１９〜＋１４ｂｐ（１１３３ｂｐ）、上記プライマー２及びプライマー３を用いて−３１５〜＋１４ｂｐ（３２９ｂｐ）の２本の増幅断片を得た。また、１１３３ｂｐの増幅断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、翻訳開始点を含む−４５５〜＋１４ｂｐ（４９６ｂｐ）の断片を得た。これら３つの断片を以下に示した各々のリンカーに対応する制限酵素で切断した。
ＤＮＡ断片１：１１３３ｂｐ断片　：　ＮｏｔＩ　及びＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片２：　４６９ｂｐ断片　：　ＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片３：　３２９ｂｐ断片　：　ＸｂａＩ　及びＢａｍＨＩ
図２に示すように、これら３つの増幅断片を各々ｐＢＳＩＩベクターの当該制限酵素部位へ挿入し、更にその下流へＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩで切断したＧＵＳ−ＮＯＳ遺伝子断片（ｐＢＩ１２１由来）を連結した。続いて、これら３種類のプロモーター配列の両端及びＧＵＳ構造領域との連結部分の塩基配列をＡＢＩ　ＰｒｉｓｍＴＭＢｉｇｄｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ及び３７３Ａ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（共にＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；現ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）を用いて決定した。その結果、両端の配列が上述のゲノム配列と一致したため、目的配列が増幅されたと判断した。また、ＧＵＳ構造領域との連結部分にもフレームシフト等の異常は見られなかった。
各ＤＮＡ断片及びＧＵＳ構造領域を組み込んで増幅されたベクターから、転写プロモータ制御領域として、上記ＤＮＡ断片１（１１３３ｂｐ）については翻訳開始点〜１１０８ｂｐの上流域をＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１（図９を参照）とし、上記ＤＮＡ断片２（４６９ｂｐ）については翻訳開始点〜４５６ｂｐの上流域をＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２（図１０を参照）とし、また、上記ＤＮＡ断片３（３２９ｂｐ）については翻訳開始点〜３０６ｂｐの上流域をＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−３（図１１を参照）とした。
各ＤＮＡ断片１ないし３を有するベクターから、プロモーター；ＧＵＳ−ＮＯＳ配列をカセットとしてＮｏｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、中間ベクターｐＳＢ１００の当該制限酵素部位へ挿入した。これらのベクターを大腸菌株ＬＥ３９２へ導入し、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ４と大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３との３系交雑によりアグロバクテリウムへの導入と相同組換え（Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．らＰｌａｎｔ　Ｊ．（１９９６）１０：１６５−１７４）を行った。
アグロバクテリウム法による形質転換イネの作出
日本稲「朝の光」を用い、既報（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６：２７１−２８２）に順じてアグロバクテリウム法によって行った。得られた形質転換個体は空調温室（１６時間日長、昼：２８℃、夜：２３℃）にて育成した。
ＧＵＳ染色
形質転換後、カルスをハイグロマイシン（５０ｇ／ｍｌ）を含むＮ６培地で４〜５週間培養・再分化し、選抜されたものを形質転換体としてＧＵＳ染色に用いた。再分化した幼植物体は５〜６葉齢期まで育成し、その緑葉及び根をＫｏｓｕｇｉ，Ｓ．ら（Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）７０：１３３−１４０）の方法に順じてＧＵＳ染色した。組織特異的発現を解析する為の切片作成は村上ら（植物細胞工学（１９９２）４：２８１−２８６）の方法に順じてマイクロスライサーＤＴＫ−１０００（堂阪イーエム社製）を用いて行った。
染色によるプロモーター発現解析（図２〜７参照）
ＯｓＳＵＴ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１〜３を導入した個体を各々３０体ずつ選抜し、ＧＵＳ染色で陽性を示した個体について詳細な組織特異性を観察した。イネの維管束系組織は、図２に示すように、葉身と葉鞘との間に小維管束に囲まれた大維管束が縦走し、これらの横方向で繋がるような横走維管束が配走する。なお、図中の各写真において、符号ＶＢは縦走維管束で、符号Ｌは縦走維管束中の大維管束（縦走）を示し、また、符号ＴＶ及び符号Ｔは横走維管束を示し、符号Ｍは縦走維管束中の小維管束を指す。
図３に示すように、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１を導入した個体では、緑葉の維管束篩部で強い発現が見られた。写真の中では縦走維管束Ｍや横走維管束Ｔのうち、その中心部を通る篩部が選択的に染色され、くっきりとした濃淡が現れている。このことは、ＯｓＳＵＴ１のｃＤＮＡをプローブに用いたｉｎ　ｓｉｔｕ解析（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ，Ｃ．らＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０００）１２４：８５−９４）の結果と合致しており、ＯｓＳＵＴ１本来の発現を反映していると考えられる。
一方、図４に示すように、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２を導入した個体では、各維管束の篩部とこれを囲む木部との濃淡は、上記ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１の場合のようにくっきりと現れず、大凡、維管束鞘全体に染まっている。つまり、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１よりも５′側を６５２ｂｐ欠失させたＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２を導入した個体においては、緑葉・根の維管束鞘内（篩部・木部・維管束柔細胞）への発現が見られたものの、篩部への特異性は失われる傾向にあることが判明した。
またＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１よりも５′側を８０２ｂｐ欠失させたＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−３を導入した個体については、全体的にＧＵＳ染色で陽性を示す個体自体が減少し、また、図５に示すように、陽性個体においても葉鞘の全体が染まる傾向にあり、維管束特異性は見られなかった。
さらに、発育時期特異性を明らかにするため、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１を導入した個体を引き続きポット栽培し、開花迄の発現をＧＵＳ染色で解析した。その結果、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１は節間伸長時の節及び節間の維管束篩部に（図６）、また、開花期の頴花、雌蕊（柱頭）、花糸、鱗皮の維管束（微細構造のため、本解析における篩部・木部の識別は不可能）において強い発現が観察された（図７、８）。更に、登熟期初期の子房壁全体（開花後３日目迄、特に上表皮及び下表皮）、果皮維管束篩部（開花後１０日前後）における発現も観察された（図８）。これらの部位及び時期特異的な発現を示す結果は、ノーザンブロット解析において得られている結果（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．ら（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：１３８９−１３９６）と一致した。
以上の結果から、次の見解に達した。
（１）ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１（−１１０８〜−１）は、維管束篩部を標的とした強力な部位特異的プロモーター活性を有する。また、緑葉以外にも、出穂〜開花〜登熟期の節や節間、花器官において維管束篩部特異的且つ時期特異的なプロモーター活性を有する。
（２）ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２（−４５６〜−１）は、緑葉、根における維管束鞘全体、つまり維管束篩部、木部及び維管束柔細胞で発現させる特異的なプロモーター活性を有する。維管束への特異性は維持するが−１１０８〜−４５７の欠失により篩部特異性が失われる。したがって、−１１０８〜−４５７の領域に篩部特異的発現を担うプロモータ配列があると予期される。また、篩部の特異性、時期特異性の認識が緩くなり維管束鞘内全体に発現する傾向を利用すれば、維管束柔細胞及び木部を標的とした遺伝子の過剰や抑制発現の制御に有効である。
（３）ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−３（−３０６〜−１）は、維管束特異的発現を示さなかったことから、ＯｓＳＵＴ１の発現特異性を司るプロモーター配列は−１１０８〜−３０７ｂｐの領域に存在すると考えられる。
上記プロモーターを用いた発現システムの構築
実際に有用タンパク質をコードする遺伝子を発現させるには、上記ＧＵＳ−ＮＯＳ配列の代わりに、所望のタンパク質をコードする構造遺伝子を組み込めばよい。この際にも、各ＤＮＡの増幅及びスクリーニング、発現カセットや発現ベクターの構築、形質転換、並びにその再生等は既述のように、当業者に公知な技術により実施可能である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＯｓＳＵＴ１プロモータを含むＧＵＳ発現ベクターの構築を説明する図である。
図２は、イネの葉身−葉鞘における維管束の走行状態を示す。図２ａにはイネの葉における維管束の配走を模式的に示し、図２ｂは図２ａの一部に相当する組織の拡大写真であり、そして図２ｃは葉の横断面から見た横走維管束を示す拡大写真である。
図３は、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１の活性をＧＵＳ染色法により示す写真である。図３ａは葉表面の拡大写真であり、図３ｂは根の拡大写真であり、図３ｃは葉の横断面の拡大写真であり、図３ｄは根の横断面の拡大写真である。図中のＬ、Ｍ、Ｔおよびｃｃは、それぞれ、大維管束（縦走）、小維管束（縦走）、横走維管束、および篩部伴細胞である。
図４は、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２の活性をＧＵＳ染色法により示す写真である。図４ａは葉表面の拡大写真であり、図４ｂは根の拡大写真であり、図４ｃは葉の横断面の拡大写真であり、図４ｄは根の横断面の拡大写真である。図中のＬ、ＭおよびＴは、それぞれ、大維管束（縦走）、小維管束（縦走）および横走維管束である。
図５はＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−３の活性をＧＵＳ染色法により示す写真である。図５ａは葉表面の拡大写真であり、上のパネルはＧＵＳが発現しているが維管束特異的発現ではない個体を示し、下のパネルはＧＵＳが発現していない個体を示す。図５ｂは図５ａの上のパネルに相当する葉の横断面の拡大写真であり、図５ｃは根の横断面の拡大写真である。図中のＬ、ＭおよびＴは、それぞれ、大維管束（縦走）、小維管束（縦走）および横走維管束である。
図６は、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１の出穂期における節・節間での活性をＧＵＳ染色法により示す。図６ａは出穂期における節の横断面の写真であり、図６ｂおよび図６ｃは各々図６ａの節の一部を拡大した写真である。図６ｄは出穂期の節間表面を拡大した写真であり、左のパネルが分化帯、中央のパネルが伸長帯、右のパネルが成熟帯を各々示す。図６ｅは、節間における分化帯、伸長帯、成熟帯の位置を模式的に示す。図中のＶＢは維管束であり、Ｐは篩部であり、Ｘは木部である。
図７は、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１の開花期における花器での活性をＧＵＳ染色法により示す。図７ａおよび図７ｂは開花前の頴花を含む花器領域を各々拡大した写真であり、図７ｃおよび図７ｄは開花直後の頴花を含む花器領域を各々拡大した写真である。図７ｅは花器の構造を模式的に示したものである。図中のＬは鱗皮であり、Ｐは雌蕊である。
図８は、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１の開花・登熟期の花器領域における活性を示す写真である。図８ａは開花前の柱頭であり、図８ｂは開花後３日目の子房であり、図８ｃは開花後１０日目の果皮維管束であり、図８ｄは開花前の柱頭の縦断切片であり、図８ｅは開花後３日目の子房壁の横断切片であり、そして図８ｆは開花後１０日目の果皮維管束篩部の横断切片である。
図９は、配列番号１に対応する塩基配列中の、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１の存在部位を下線で示す。
図１０は、配列番号１に対応する塩基配列中の、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２の存在部位を下線で示す。
図１１は、配列番号１に対応する塩基配列中の、ＯｓＳＵＴ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−３の存在部位を下線で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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