(57)【要約】本発明は、炭素鎖長２０〜２２の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体又はその医薬的に許容できる塩を含むＰＰＡＲγ作動性医薬組成物、好ましくはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の水酸化誘導体又はその医薬的に許容できる塩を含むＰＰＡＲγ作動性医薬組成物に関し、さらに前記ＰＰＡＲγ作動性医薬組成物を循環器系疾患、動脈硬化症、脂質代謝病、糖尿病及び炎症性疾患の治療に使用することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素鎖長２０〜２２の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体又はその医薬的に許容できる塩を含むＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項２】
高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の水酸化誘導体である請求項１記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項３】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体が４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１０（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１１（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、８（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、および１７（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡから選択される１種以上である請求項２記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項４】
循環器系疾患を治療する為の請求項１〜３のいずれかに記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項５】
動脈硬化症を治療する為の請求項１〜３のいずれかに記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項６】
脂質代謝病を治療する為の請求項１〜３のいずれかに記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項７】
糖尿病を治療する為の請求項１〜３のいずれかに記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項８】
炎症性疾患を治療する為の請求項１〜３のいずれかに記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、高度不飽和脂肪酸の誘導体を含む医薬組成物に関する。さらに詳しくは、本発明はＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ：ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体γ）に作動する前記医薬組成物を提供する。
背景技術
ペルオキシソーム増殖因子応答性受容体（ＰＰＡＲ）は、最初核内オーファン受容体として発見され、その後α、σ（あるいはβ）、γの３種類の遺伝子が同定されている。α、σ、γはそれぞれ特異的な組織分布をしており、核ホルモン受容体遺伝子群の中の一群を構成している。ＰＰＡＲγは脂肪組織において高度に発現し、脂肪細胞分化及び脂肪産生において重要な役割を担っていると考えられている。
血糖低下薬を探索する中で、インスリン抵抗性改善薬として開発されたチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）誘導体がＰＰＡＲγのリガンドである可能性が報告された（’９５  Ｃｅｌｌ．８３  ｐ．８０３−８１２）。その後６年近く経って、今なお、ＴＺＤによる血糖低下のメカニズムは混沌としているものの、現時点では、２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に於いて、インスリンシグナル破錠によって引き起こされるインスリン抵抗性を、ＴＺＤがＰＰＡＲγを活性化する事によって改善し、ＴＺＤが血糖を低下させるという考え方が提案されている（’９９  Ｃｅｌｌ．１００  ｐ．１８６３）。つまり、健常者では、膵β細胞より分泌されるインスリンが、肝臓や末梢骨格筋に於てインスリン受容体（ＩＲ）と結合し、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）経由で、糖取り込み、糖利用が亢進するが、一方、ＮＩＤＤＭ患者では、ＩＲＳ以降の伝達が弱まり、高血糖を示す（’００  Ｓｅｉｅｎｃｅ  ２８９  ｐ．３７，’００  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．１０５，１０  ｐ．１４３７）。
門脇らの研究グループは、ＩＲＳサブタイプのひとつＩＲＳ−１遺伝子ＫＯマウスを作ったところ、糖尿病には至らないもののインスリン抵抗性を示した（’００  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．１０５，１０  ｐ．１４３７）。一方、ＮＩＤＤＭ患者では、脂肪細胞、炎症性細胞より分泌される炎症性サイトカインＴＮＦαがＩＲＳ−１のシグナル伝達を弱める（ＩＲＳのリン酸化を抑制する）が、ＴＺＤは、ＴＮＦαによって弱められたＩＲＳ−１のリン酸化を回復した（’９７  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．１００  ｐ．１８６３）。つまり、ＴＺＤがＩＲＳ−１の働きを良くする事によってインスリンシグナルを回復し、インスリン抵抗性を改善している事が示された。
門脇らの研究グループはＰＰＡＲγの直接的な作用を検討する為、ＰＰＡＲγＫＯマウス作製を試みた。両遺伝子のホモＫＯマウス（ｎｕｌｌ）は肺不全の胎生致死を示したので、便宜的に、ヘテロＫＯマウスを用いて解析したところ、ヘテロＫＯマウスはＰＰＡＲγ遺伝子を多く持った野性型と比較して、体重減少、脂肪細胞分化抑制を示し、ＰＰＡＲγが飢餓に備えたエネルギー蓄積遺伝子として働いている可能性を示唆した（’９９  Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌ  ４  ｐ．５９７）。即ち、ＰＰＡＲγが脂肪細胞数を増加する事によってエネルギーを蓄積し、糖質や脂質の恒常性を維持していると述べている。
ＰＰＡＲγによるインスリンシグナル正常化と脂肪細胞分化の両作用を機作として、ＴＺＤが血糖を低下すると考えられるが、ＴＺＤは強い副作用を引き起こす問題点がある。インスリン抵抗性改善薬として市販されたＴＺＤは深刻な肝障害を示して発売中止となったり、肝障害による死亡例が報告されているものがある。従って、ＴＺＤのような副作用を示すことのない、ＰＰＡＲγを経由する糖尿病治療薬が求められている。
さらに、ＰＰＡＲγ作動物質はＮＩＤＤＭ改善のみならず、高ＴＧ（トリアシルグリセロール）血症改善、降コレステロールなどの作用を示し、脂質レベルを改善することから、抗動脈硬化性、脂質代謝改善を示す可能性が指摘されている（’９８  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４１，ｐ．２５７）。
一方、ロイコトリエンやプロスタグランジンなどアラキドン酸の水酸化代謝物が好中球活性化、血小板凝集、血管収縮などを経由して疼痛、組織障害や発熱を引き起こす事が知られている。また、魚油に豊富に含まれる高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）（炭素数２２，ｎ−３系列で不飽和数６の直鎖不飽和脂肪酸）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）（炭素数２０，ｎ−３系列で不飽和数５の直鎖不飽和脂肪酸）の水酸化がマダイやニジマスの表皮や鰓に存在する酵素、リポキシゲナーゼによって代謝されている事が報告されていた。しかし、リポキシゲナーゼ活性を持った細胞種の同定は行われていなかった。昨年、英国のＡｎｄｅｒｅｗ  Ｆ．Ｒｏｗｌｅｙらの研究グループは、ニジマス鰓細胞をパーコルを用いた密度勾配によって分画し、得られた細胞集団の脂質水酸化活性を検討したところ、鰓の上皮細胞がリポキシゲナーゼ活性を示す事をつきとめた（’９９  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２２，ｐ．２９７）。
Ｒｏｗｌｅｙらは、体重１２０−５００ｇのニジマスの鰓をハンクス緩衝液中でミンスし、コラゲナーゼ消化で得られた細胞懸濁液をパーコルに重層、２０，０００×ｇにて１５分間遠心分離して３層の細胞集団に分画した。Ｈ＆Ｅ染色とＰＡＳ染色によって、３つの細胞集団が多形上皮細胞、ゴブレ上皮細胞と、それ以外の細胞である事を確認し、それぞれの細胞集団（１×１０７個）をＣａ２＋イオノフォアーで刺激した後、Ｃ１８ＯＤＳカラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって脂肪酸を分析した結果、上皮細胞集団がＯＨ−ＤＨＡやＯＨ−ＥＰＡを産生していた。つまり、以前より報告されていた魚鰓のリポキシゲナーゼ活性が上皮細胞に局在している可能性が示唆された事になる。
魚上皮細胞より見い出された水酸化ＰＵＦＡの生理作用に関し、血管平滑筋収縮に及ぼす作用を、Ｎｏｒｍａｎ  Ｓａｌｅｍ  Ｊｒらが検討している［Ｊ．Ｗ．Ｋａｒａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９９４）２７０，１１０５−１１０９．］。Ｎ．Ｓａｌｅｍ  Ｊｒらは、Ｃ−１１、Ｃ−１４、Ｃ−１７のモノＯＨ−ＤＨＡ、Ｃ−１２のＯＨ−ＥＰＡの４物質が、トロンボキサンＡ２（ＴＸ  Ａ２）類縁体Ｕ  ４６６１９（２．５ｍｉｃｒｏ  Ｍ）によるラット大動脈平滑筋収縮を抑制し、その作用強度は１４ＯＨ−ＤＨＡ＞１７ＯＨ−ＤＨＡ＞１１ＯＨ−ＤＨＡ＞１２ＯＨ−ＥＰＡの順に強く、最も強い１４ＯＨ−ＤＨＡによる２５％阻止点ＩＣ２５値は１．０７±０．３４ｍｉｃｒｏ  Ｍだった。つまり、魚鰓より見い出された水酸化ＰＵＦＡが、ＴＸ  Ａ２による血小板凝集や血管収縮を抑制し、抗炎症的に作用している可能性を示した事になる。
哺乳動物でも、リポキシゲナーゼ活性が血小板や腸上皮細胞に報告されており、例えば、ヒト血小板中で、１１ＯＨ−ＤＨＡ、１４ＯＨ−ＤＨＡが外因性ＤＨＡから代謝される事が示されている。また、魚油を摂食させたラット血小板をＣａ２＋イオノフォアーで刺激すると１．４ｍｉｃｒｏ  Ｍの１４ＯＨ−ＤＨＡが放出される事が確認されているが、先述の１４ＯＨ−ＤＨＡによる血管平滑筋収縮の２５％抑制点であるＩＣ２５値と比較すると、両者はほぼ同等である事が解る。つまり、哺乳動物体内に於ける１４ＯＨ−ＤＨＡ濃度は、抗炎症作用を発揮できる濃度域と一致する事になり、１４ＯＨ−ＤＨＡが動物体内に於ける恒常性維持に積極的に関与している可能性が示唆されている。
しかし、現在までのところ、このような高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体がＰＰＡＲγに作用するとの報告は出されていない。
発明の開示
本発明の目的は、新規なＰＰＡＲγ作動性医薬組成物を開発し、これをＰＰＡＲγが関与する各種疾患の治療薬として提供することにある。
本発明者らは、上記の点に鑑み、鋭意研究を行った結果、炭素鎖長２０〜２２の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体が、ＰＰＡＲγ作動性を示す事を見い出して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、炭素鎖長２０〜２２の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体又はその医薬的に許容できる塩を含むＰＰＡＲγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明において、ＰＰＡＲγ作動性医薬組成物とは、脂肪細胞などの細胞の核内受容体であるＰＰＡＲγに作用してこれを活性化することにより、ＰＰＡＲγが関与する種々の疾患を予防、治療する医薬品をいう。
本発明はさらに、循環器系疾患を治療する為の前記ＰＰＡＲγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、動脈硬化症を治療する為の前記ＰＰＡＲγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、脂質代謝病を治療する為の前記ＰＰＡＲγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、糖尿病を治療する為のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、炎症性疾患を治療する為のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物には、有効成分として炭素鎖長２０〜２２の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体を含む。
本発明において、炭素鎖長２０〜２２の高度不飽和脂肪酸とは、炭素鎖長が２０〜２２であって、二重結合を３個以上含む不飽和脂肪酸をいう。二重結合は好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個又は６個である。好ましい高度不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）（炭素鎖長２２，ｎ−３系列で不飽和数６の直鎖不飽和脂肪酸）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）（炭素鎖長２０，ｎ−３系列で不飽和数５の直鎖不飽和脂肪酸）であるが、これに限定されない。
高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体は、高度不飽和脂肪酸のいずれかの二重結合が水酸化された誘導体をいい、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の水酸化誘導体が好ましく、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体がより好ましい。水酸化誘導体の立体配置は（Ｒ）配置でも（Ｓ）配置でも構わないが、（Ｓ）配置であることが好ましい。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体として最も好ましいのは４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１０（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１１（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、８（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、および１７（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡであるが、これに限定されない。本発明のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物には、これらから選択される高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体を１種以上含むことができる。
高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体はいかなる方法で製造したものでもよく、例えば、魚類の鰓、上皮細胞などから、あるいはヒト、ラットなどの哺乳動物血小板などから分離、精製したものであってよい。また、天然由来のＤＨＡを水酸化し、これをＨＰＬＣなどによって分画することにより合成してもよく、特に制限はない。例えば、ニジマス鰓細胞や上皮細胞、哺乳動物血小板、あるいはＲＢＬ−１などのヒト白血球由来株化細胞懸濁液に１０〜２００ｍＭのＤＨＡを基質として加え、１０〜３７℃にて１〜５０分間反応させて得ることもできる。反応液を酸性（ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸などにより）にすることによって反応を停止し、各ＯＨ誘導体を有機溶媒（クロロホルム、メタノール、酢酸エチル、アセトニトリルなど）を用いて抽出した後、展開溶媒（クロロホルム、メタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸など）によってＨＰＬＣ、あるいは薄層クロマトグラフィーなどの方法によって分画することができるが、これらの方法に限定されるものではない。また、各ＯＨ誘導体は部位特異的な酵素を用いた選択的な合成法によって調製することもできる。なお、４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１０（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１１（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、８（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、および１７（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡについては、和光純薬工業より市販されており、入手することが可能である。
本発明のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物は、脂肪細胞などの細胞の核内受容体であるＰＰＡＲγに作用してこれを活性化することにより、ＰＰＡＲγが関与する種々の疾患の予防、治療に有効である。ＰＰＡＲγが関与する疾患としては、循環器系疾患（例えば、血栓症、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞など）、動脈硬化症、脂質代謝病（例えば、高脂血症、高コレステロール症、高ＴＧ症、高ＬＤＬ症など）、糖尿病（特に、ＮＩＤＤＭ）、炎症性疾患（例えば、血管透過性亢進を原因とする種々の炎症反応）を含むが、これに限定されない。
本発明のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物は、通常、全身的または局所的に、経口的または非経口的に投与される。投与量は、疾患の種類、症状の程度、投与対象の年齢や体重などの諸条件をもとに総合的に判断し、最適な量を適宜決定するべきであり、特に限定されない。しかし、通常、成人では１日当たり経口投与の場合０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、非経口投与の場合０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与は必要に応じて１日１回ないし複数回に分けて行われる。
本発明の有効成分である高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体はその医薬的に許容できる塩であってもよい。医薬的に許容できる塩としては、酸付加塩類、たとえばメタンスルホン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸および臭化水素酸塩が含まれる。
本発明の医薬組成物の投与は、固体組成物、液体組成物およびその他の組成物の経口投与、注射剤、外用剤、坐剤などの非経口投与のいずれの形態であってもよく、必要に応じて最適な方法が選択される。医薬組成物は、通常の製剤化に用いられる担体、賦形剤、その他の添加剤を用いて調製することができる。製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの活性物質（有効成分）が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤または丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性または腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水および注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。また、無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためのその他の医薬組成物としては本発明の化合物の少なくともひとつを有効成分として含み、常法によって処方される外用液剤、軟膏剤、塗布剤、坐剤、経皮剤、点眼剤などが含まれる。
更に、前記有効成分を、乳化剤として、リン脂質あるいは非イオン界面活性剤を用いて、Ｏ／Ｗ型エマルジョン製剤（乳剤）として、特開平６−２９８６４２に記載のように調製することができる。乳化剤は、単独あるいは２種以上組み合わせて使用でき、添加量は、適宜でよいが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）である。
リン脂質としては、大豆由来リン脂質、卵黄由来リン脂質、リゾレシチン、フォスファチジルコリン（レシチン）、フォスファチジルセリンなどの単独あるいは組み合わせが使用可能である。非界面活性剤としては、分子量５００〜１５０００のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体（例えば、プルロニックＦ−６８）、分子量１０００〜１００００のポリアルキレングリコール、分予量１０００〜２００００のポリオキシアルキレン共重合体、硬化ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体、ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ショ糖脂肪酸エステルなどの単独あるいは組み合わせが好適に用いられるがこれに限定されない。
以下の実施例に示すように、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体を用いてＰＰＡＲγ作動性を試験したところ、顕著なＰＰＡＲγ作動性活性を示した。すなわち、８（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１０（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１１（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、及び１７（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡはいずれも、陽性対照として用いた１５ｄｅｏｘｙ−ＰＧ  Ｊ２と同等、あるいはそれよりも強くＰＰＡＲγを作動した。
さらに、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体を遺伝的糖尿病マウスｄｂ／ｄｂに経口投与した結果、有意な血糖値低下作用を示した。
また、ｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝集試験では、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体は用量依存的に血小板凝集を抑制した。
疑似血管ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症モデルを用いた試験では、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体は好中球の粘着、透過のいずれをも抑制することが観察された。このことから、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体は好中球と血管内皮細胞の相互作用に対して抑制的に働き、抗炎症の方向に作用している可能性が示唆され、抗炎症的に作用することにより、循環器の恒常性を維持し、病態を改善する方向に作用することが期待できる。
本発明のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物の有効成分である高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体は天然物由来物質であり、毒性などの副作用が少ないことが期待できる。従って、本発明のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物は、ＴＺＤのような副作用を示さない糖尿病治療薬、特に２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の予防薬及び／又は治療薬として特に利用価値が大きい。また、本発明のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物は、炎症性疾患の治療薬としても効果が期待できる。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例
実施例１：ＤＨＡの水酸化誘導体の調製
ニジマス（体重３ｇ）の鰓を０．０５Ｍ  ＰＢＳ中でミンスし、３０秒間ポリトロンホモジナイザーを用いて懸濁した。１５０，０００×ｇにて１５分間超遠心分離して酵素液を得た。この酵素液１０ｍｉｃｒｏｌを０．９ｍｌの０．０５Ｍ  ＰＢＳ（１ｍＭ還元グルタチオン、２５℃、ｐＨ７．８）中にて反応させた。反応液中に７０ｍＭ  ＤＨＡを加え、１０分間酸化反応に処した後、３％ギ酸を用いてｐＨを４に調整して反応を停止した。反応液を酢酸エチルで抽出し、クロロフォルム：メタノール：酢酸：水（９０：８：１：０．８）を展開溶媒としてＨＰＬＣを用いて脂質を分画した。生成物をＧＣ−ＭＳで分析し、４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１０（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１１（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ（ｍ／ｚ４３０［Ｍ］，３７３［Ｍ−ＣＨ３］＋，３４０［Ｍ−ＨＯＳｉ（ＣＨ３）３］＋）、８（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、および１７（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡを得た。また、これらの化合物は和光純薬から購入することもできる。
実施例２：ＰＰＡＲγ作動性試験
ＣＯＳ−１細胞にＧＡＬ４（酵母転写アクチベーター）−ＰＰＡＲγ融合タンパク質発現プラスミド（エフェクタープラスミド）、と併せてレポータープラスミド１７Ｍ２ＣＡＴ（ＧＡＬ４応答配列＋ＴＫプロモーター＋クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ）を導入した後、培養培地に被検物質を添加し２４時間後のＣＡＴ活性を測定し、陰性対照（無添加）と比較した相対的ＣＡＴ活性を算出する事でＰＰＡＲγ作動性を評価した（’９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，ｐ．９９９５；’９４  Ｊ．Ｂ．Ｃ．２６９，ｐ．３２７００；’９５  ｉｂｉｄ．ｐ．５８５８；’００  Ｊ．Ｂ．Ｃ．２７５，ｐ．３３２０１）。
ＤＨＡ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）及びＥＰＡ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）各３ｍｉｃｒｏ  Ｍを被検物質として実験した結果、ＤＨＡは３ｍｉｃｒｏ  Ｍにて陰性対照比２０５±７９％と有意にＰＰＡＲγ転写活性を上昇させたが、一方、ＥＰＡは３ｍｉｃｒｏ  Ｍ濃度で作用を観察できなかった。
次に、実施例１で調製した４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、８（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１０（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１１（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ及び１７（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡを被検物質とし、ＰＰＡＲγのリガンドであることが知られている１５ｄｅｏｘｙ−ＰＧ  Ｊ２（Ｂｉｏ  Ｍｏｌ製）を陽性対称としてＰＰＡＲγ作動性を試験した。
得られた結果を図１に示す。８（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡはそれぞれ１ｍｉｃｒｏ  Ｍ濃度にて薬剤無添加の陰性対照群と比較して７培程度の活性を示し、４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１０（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１１（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、及び１７（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡは同濃度で陰性対照比３倍前後の活性を示し、いずれも陽性対照として用いた１５ｄｅｏｘｙ−ＰＧ  Ｊ２と同等、あるいはそれよりも強く作動した。
実施例３：遺伝的糖尿病マウスを用いた検討
遺伝的糖尿病マウスｄｂ／ｄｂ（平均体重４２ｇ、１群６匹、入手先：三協）を用い、８（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ  １００ｍｇ／ｋｇを１週間経口投与した結果、陰性対照群（溶媒として５％アラビアゴムを投与した）と比較して有意な血糖値低下を観察できた（表１）。
2002102364.tif 000002
実施例４：ｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝集試験
コラーゲンにより惹起される血小板凝集を４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡが阻止するかどうかを検討した。
（１）血小板の調製
ＳＤ系雄ラット（ＳＰＦ、９週齢）を麻酔した後、腹大動脈から採血し、３．８％クエン酸ナトリウム（山之内製薬、チトラール）を入れたチューブに血液を採取した。これを室温にて９００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することで上澄（ＰＲＰ、多血小板画分）を分取し、残渣をさらに２５００ｒｐｍにて１５分間遠心分離することで上澄（ＰＰＰ、貧血小板画分）を得た。
（２）透過度の測定
アグリゴメーター（ヘマトレーサー２４０  １２ｃｈ、ＭＣＭ社製）のＰＰＰ（貧血小板画分）用３７℃保温槽にＰＰＰをキュベットに入れて装着した。次にＰＲＰ（多血小板画分）２００μｌをキュベット内に添加しＰＲＰ用反応槽に装着した。マグネチックスターラーで撹拌しながら３０秒間、自動調整によってＰＰＰの透過度Ｔ６５０ｎｍ＝１００％、ＰＲＰの透過度Ｔ６５０ｎｍ＝０％に補正した。
１分後にコラーゲン（ＭＣＭ社製）２０μｌを加え、その後の透過度の変化を５分間記録した。血小板が凝集すると透過度が上昇する。凝集がピークに達した最大凝集時の透過度Ｔを陰性対照の透過度Ｔ０と比較し、以下の式を用いて凝集阻止率を百分率表示した。
凝集阻止率＝（１−Ｔ／Ｔ０）×１００
（３）薬効の発現時間の検討
ＳＤ系雄ラット（ＳＰＦ、９週齢）尾静脈に１０ｍｇ／ｋｇの４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡを投与して、投与後１０分、６０分後の２時点にて採血し、調製した血小板を用いて、３〜６μｇ／ｍｌのコラーゲンで惹起した際の凝集率を検討した。対照群として、溶媒（生理食塩水）を投与したものの凝集率を測定した。
その結果を図２に示す。
４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡの投与１０分、６０分後のいずれの時点でも、溶媒投与群と比較して、血小板凝集は抑制されたが、その作用はほぼ同等であった。
（４）用量依存性の検討
４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡが、ｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝集を用量依存的に抑制するかどうかを検討した。対照として、溶媒（生理食塩水）を用いた。ラット尾静脈に１０、１、０．１ｍｇ／ｋｇの被験物質を投与し、１０分後に採血、調製した血小板を用いて、３〜６μｇ／ｍｌのコラーゲンで凝集惹起した。その結果、１０、１ｍｇ／ｋｇ投与群に於て溶媒投与群と比較して血小板凝集が抑制された（図３）。
実施例５：疑似血管ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症モデルによる試験
炎症性サイトカインＴＮＦαが血管内皮細胞の接着分子を誘導し炎症を惹起すると炎症部位に好中球が移動し、さらに炎症を悪化させるという報告がある。重度の炎症は循環器の恒常性を破錠させ、動脈硬化を進行させると考えられている。
ＰＰＡＲγ作動性物質は血管内皮細胞において、ＴＮＦαが誘導する接着分子であるＩＣＡＭ−１の発現を抑制することで、炎症細胞の血管内皮細胞への接着を減弱させ、炎症を抑制する方向に働くことが報告されている（’００  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０１，ｐ．２３５）。
そこで、ＴＮＦαを惹起剤として用いた疑似血管ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症モデルにおいて、ＰＰＡＲγ作動性を有する４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡが抗炎症作用を有するかどうか検討した。
（１）疑似血管ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症モデルの確立
疑似血管ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症モデルは、生物薬科学実験講座、１２炎症とアレルギーＩＩ、ｐ．３２７−３４１（大内和雄編集、広川書店、平成５年５月１５日発行）に記載の方法に従って作成した。
３μｍ孔の多孔性ポリカーボネート膜により上室と下室とに区切られたトランスウェル（クラボー社製）を用い、上記膜の底面に一層のウシ内皮細胞を付着させ、３７℃、５％ＣＯ２条件下、８０分間培養した。次に、トランスウェル上室に蛍光標識した好中球浮遊液を加え、同時に、ＴＮＦαを終濃度５０、２５若しくは１７ｎｇ／ｍｌとなるように上室の細胞浮遊液に懸濁した。
つまり、上記モデルでは、好中球が、上室から血管内皮細胞層を潜り抜けて下室へ透過すること、及び、内皮細胞層に粘着することは、血管内部のＴＮＦαに応答して好中球が血管内より炎症部位に移動してゆくことを疑似している。
（２）好中球と血管内皮細胞との相互作用に対する４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡの影響
次に、上記疑似血管ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症モデルを用いて、好中球と血管内皮細胞との相互作用に、４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡがどのように影響するかを検討した。
トランスウェル上室に、４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡを、３０、３、０．３μＭの終濃度で、好中球浮遊液をＴＮＦαとともに上室に入れ、上記と同様、上室から血管内皮細胞層を潜り抜けて下室へ透過した好中球数、及び、内皮細胞層に粘着した好中球数を測定し、それから好中球移動率、粘着率（％）を算出した。
好中球移動率、粘着率は陰性対照群での好中球に対する薬物投与群での好中球移動数、粘着数を相対値として表示した。
その結果を図４及び図５に示す。４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡは好中球の粘着、透過どちらも抑制した。つまり、４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡは好中球と血管内皮細胞の相互作用に対して抑制的に働き、抗炎症の方向に作用している可能性が示唆された。
４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡは抗炎症的に作用することにより、循環器の恒常性を維持し、病態を改善する方向に作用する可能性が考えられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、種々のＯＨ−ＤＨＡ化合物のＰＰＡＲγ作動性試験の結果を示すグラフである。
図２は、コラーゲンにより惹起されるｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝集を４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡが阻止するかどうかを検討した結果を示すグラフである。
図３は、４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡが、ｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝集を用量依存的に抑制するかどうかを検討した結果を示すグラフである。
図４は、好中球と血管内皮細胞との相互作用に対する４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡの影響（好中球移動率（％））を示すグラフである。
図５は、好中球と血管内皮細胞との相互作用に対する４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡの影響（好中球粘着率（％））を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
2002102364.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月24日(2002.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
削除
【請求項２】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体又は又はその医薬的に許容できる塩を含むＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項３】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の水酸化誘導体が４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１０（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１１（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、１４（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、８（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡ、および１７（Ｓ）−ＯＨ−ＤＨＡから選択される１種以上である請求項２記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項４】
循環器系疾患を治療する為の請求項２または３に記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項５】
動脈硬化症を治療する為の請求項２または３に記載の巧ＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項６】
脂質代謝病を治療する為の請求項２または３に記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項７】
糖尿病を治療する為の請求項２または３に記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【請求項８】
炎症性疾患を治療する為の請求項２または３に記載のＰＰＡＲγ作動性医薬組成物。
【国際調査報告】
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