(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン−１５を有効成分として含有することを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、巨核球系細胞に作用し、その分化、成熟及び／又は増殖を促進し、血小板の生成を促進する活性を有するヒトインターロイキン−１５（以後「ｈＩＬ−１５」と記載することがある）を有効成分とする血小板減少治療用医薬組成物に関するものである。本発明のｈＩＬ−１５は、巨核球−血小板系に作用し、その分化、成熟及び／又は増殖を促進し、血小板の生成を促進する活性を有するので、化学療法や骨髄移植に伴う血小板減少症及び血小板減少性紫班病、血小板減少が原因と考えられる出血傾向を示す各種の疾患の治療薬、予防薬の有効成分等として、特に医療の分野において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体を構成する体細胞に不可欠な媒質である血液中には、有形成分としての、赤血球、白血球、リンパ球、血小板等の血液細胞が存在し、当該血液細胞は、それぞれ固有の機能を分担して、生体を恒常に保つ役割を担っている。ところで、当該血液細胞の生体内における分化、成熟、及び増殖等の実体を解明することは、血液学分野における長年の研究課題とされてきたが、近年になって、各種の血液細胞は、骨髄中の１種類の多機能性造血幹細胞より分化、成熟すること、及び、その分化、成熟の課程において各種の生体内液性因子が関与していること等の事実が明らかとなった。
【０００３】
これらの事実から、当該生体内液性因子は、血球系細胞の減少を伴う疾患の治療薬等の医薬品への応用が期待されており、これまでに、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターロイキン  （ＩＬ）等の各種の液性因子が見い出され、その一部は、赤血球系、白血球系、リンパ球系等の血液細胞に対する分化、成熟を促進する作用を有する医薬品として実際に応用されるに至っている。
【０００４】
ところで、血小板は、血液中に存在する直径２〜３μｍの無核の細胞であり、生体における止血や血栓の形成に重要な役割を有する血液中の有形成分の一種であるが、当該血小板は、骨髄中の多機能性造血幹細胞から巨核球系前駆細胞を経て巨核芽球となり、更に成熟した巨核球の細胞質が断片化して生成され、血液中に放出されることが明らかとなっている。
【０００５】
そして、最近になって、巨核球−血小板系についての研究成果も種々報告されており、例えば、ＩＬ−６が、血小板の前駆細胞である巨核球の成熟を促進する作用を有することが報告されている〔Ishibashi T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,86,5953-5957(1989)、Ishibashi T.et al.,Blood,74,1241-1244(1989)〕。
【０００６】
更に、これまでの研究によると、骨髄細胞から巨核球コロニーを形成させるには、２種類の異なった作用を有する因子があると考えられている〔Williams N.et al.,J.Cell Physiol.,110,101(1982)〕。すなわち、当該因子としては、単独で巨核球コロニーを形成する巨核球コロニー刺激因子Ｍｅｇ−ＣＳＦと、それだけでは巨核球コロニーを形成させる活性はないが、当該Ｍｅｇ−ＣＳＦの存在下に巨核球コロニー数を増加させたり、その成熟を促進する活性を有する巨核球増幅因子Ｍｅｇ−ＰＯＴの存在が報告されている。
【０００７】
そして、例えば、ヒトでＭｅｇ−ＣＳＦ活性を有するものとしては、ＩＬ−３〔Teramura M.et al.,Exp.Hematol.,16,843(1988)〕や、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子〔Teramura M.et al.,Exp.Hematol.,17,1011  (1989)〕等が報告されている。また、ヒトでＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有するものとしては、ＩＬ−６〔Teramura M.and Mizoguthi H.,Int.J.Cell Cloning,8,245(1990)〕、ＩＬ−１１〔Teramura M.et al.,Blood,79,327(1992)〕、及びエリスロポエチン〔Bruno E.et al.,Blood,73,671(1989)〕等が報告されている。
【０００８】
しかしながら、これらのものの多くは巨核球−血小板系に特異的に作用する因子ではなく、むしろ他の血球系や血球系以外の細胞に対しても作用してその活性を発現することが知られている。従って、仮に、これらのものを医薬品として巨核球−血小板系への作用を期待して投与した場合、当該活性とは別の活性をも発現してしまうことが危惧される。すなわち、例えば、前記ＩＬ−６は、前記作用以外にも多岐に亘る作用を有しており、その一例として、生体内での急性期反応蛋白質として、炎症の惹起に深く関与していること等が知られていることから示唆されるように、当該ＩＬ−６をそのまま医薬品として使用した場合には、強力な副作用を伴うことが危惧される。最近、ｃ−Ｍｐｌリガンドが、弱いＭｅｇ−ＣＳＦ活性と強力なＭｅｇ−ＰＯＴ活性とを併有することが報告されている〔dc Sauvage F.J.et al.,Nature,369,533(1994)、Kaushansky K.et al.,Nature,369,568(1994)〕。しかし、ｃ−Ｍｐｌリガンドの作用についての知見は乏しく、医薬品としての実用性は未知である。
【０００９】
このようなことから、巨核球−血小板系に作用する因子については、当該巨核球−血小板系に特に強く作用するものであって、かつ、その分化、成熟及び／又は増殖を促進する高い活性を有する生理活性物質を見い出すことが重要であり、当業界において、このような生理活性物質を開発することが強く要請されている状況にあった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況を踏まえて、本発明者等は、巨核球−血小板系に作用し、その分化、成熟及び／又は増殖を促進し、血小板の生成を促進する活性を有する新しい生理活性物質を見い出すことを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、ｈＩＬ−１５が当該活性を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
ＩＬ−１５は、グラブシュタイン（Grabstein）ら［Science, 264,965,(1994)］によってアフリカミドリザル腎由来上皮細胞株ＣＶ−１／ＥＢＮＡの培養上清よりマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖支持能を指標に精製された分子量１万４千程度の蛋白質である。遺伝子の単離により、１６２アミノ酸残基よりなる前駆体が切断されることによって、１１４アミノ酸残基の成熟蛋白が生成することが明らかになった。胎盤、末梢血単球核および骨格筋によく発現しており、心臓、肺、肝臓、腎臓などにも弱いながら発現が認められている。ＩＬ−１５生物活性については、これまで、Ｔ細胞およびＢ細胞の分化、増殖を支持し、ＮＫ細胞の活性化や、ＣＴＬ活性およびＬＡＫ活性の誘導などの作用が報告されており、主にリンパ球の増殖、分化、活性化などの免疫化にかかわるサイトカインであると考えられている。
【００１２】
本発明は、ｈＩＬ−１５を有効成分として含有することを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物を提供することを目的とするものである。
【００１３】
更に、本発明は、ｈＩＬ−１５を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物であって、血小板減少に伴う疾患や、血小板の機能異常を伴う疾患の治療あるいは予防等に有効な医薬組成物を提供することを目的とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
このような課題を達成する本発明は、ｈＩＬ−１５を有効成分として含有することを特徴とする血小板減少治療用医薬組成物である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の内容を詳細に説明する。
【００１６】
本発明において、ｈＩＬ−１５は、げっ歯類の巨核球−血小板系に作用し、アセチルコリンエステラーゼ（以後「ＡｃｈＥ」と記載することがある）の産生を促進する活性を有することが見いだされた。アセチルコリンエステラーゼは、げっ歯類の巨核球系細胞の分化及び／又は成熟に伴い産生される酵素であることから［Acta.Haematol.JPN.,49,1688-1695(1986)］、前記ＡｃｈＥ産生を促進する活性は、ｈＩＬ−１５が、巨核球−血小板系に対して作用することを示すものである。
【００１７】
即ち、本発明において、ｈＩＬ−１５は巨核球−血小板系に対する活性を有することが見いだされたが、ここで言う巨核球−血小板系に対する活性とは、巨核球もしくはその前駆細胞の分化、成熟を促進する、あるいは、巨核球から血小板が生成される課程における血小板の生成を促進する活性を有することを意味する。
【００１８】
本発明のｈＩＬ−１５の巨核球−血小板系に対する前記活性を測定するには、例えば、骨髄細胞や巨核球系細胞を使用し、被実験物質をこれらの細胞に作用させて、巨核球や血小板に特異的な蛋白質や酵素の出現を測定する方法が好適なものとして使用される。
【００１９】
げっ歯類の巨核球系細胞は、その分化、成熟に伴い、ＡＣｈＥを産生するので、例えば、細胞を染色してＡｃｈＥを産生する細胞数を測定するか、もしくは産生されるＡｃｈＥ活性を分光光度計で測定すること〔Toshiro Nagasawa等、日本血液学会雑誌、４９巻、１６８８−１６９５頁（１９８６年）〕等により、生理活性物質の巨核球−血小板系に対する前記活性を測定することができる。
【００２０】
尚、後述するように、本発明のｈＩＬ−１５は、当該測定方法によりその活性を測定した結果、巨核球系細胞に作用し、アセチルコリンエステラーゼ産生を促進する活性を有するものであり、その分化、成熟を促進し、血小板の生成を促進する活性を有するものであることが判明した。
【００２１】
また、本発明者らは、巨核球コロニーアッセイ（Metcalf D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,72,1744(1975)）によって、ｈＩＬ−１５が単独で巨核球コロニーを形成する活性（Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性）を有することを見いだした。
【００２２】
次に、本発明の血小板減少治療用医薬組成物について説明する。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、本発明のｈＩＬ−１５を有効成分として含有することを特徴とするものである。ｈＩＬ−１５としては、天然型のアミノ酸配列の全長または一部をその分子中の適当な部位に有するものを適宜使用することができる。本発明の医薬組成物は、ｈＩＬ−１５を、凍結乾燥、除菌瀘過等の製剤学的に必要な工程で処理しただけのものでも充分にその効果を奏することができるものであるが、ｈＩＬ−１５に、製剤学的に許容されうる補助成分を適宜添加し、常法により製剤化し得ることは言うまでもない。また、本発明に用いられるｈＩＬ−１５は、天然型のみならず、組換えｈＩＬ−１５も含む。組換えｈＩＬ−１５を産生する宿主としては、原核、真核を問わず様々なものが用いられるが、例えば大腸菌、哺乳動物細胞が好適に用いられる。
【００２４】
この補助成分としては、基剤、安定剤、防腐剤、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、溶解剤、溶解補助剤、滑沢剤、矯味剤、着色剤、芳香剤、無痛化剤、賦形剤、結合剤、粘稠剤、緩衝剤等があげられるが、具体的には、例えば、炭酸カルシウム、乳糖、庶糖、ソルビット、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、カカオ脂、注射用蒸留水、塩化ナトリウム水溶液、リンゲル液、グルコース溶液、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等があげられる。
【００２５】
これらの補助成分を利用して、本発明の医薬組成物を調製するに際しては、例えば、医薬品添加物一覧表（財団法人東京医薬品工業協会医事法規委員会及び大阪医薬品工業協会医事法規研究委員会発行）にある如く、当該補助成分を適宜選択し、使用すればよい。また、補助成分の使用量は、製剤学的に許容され得る範囲内において、医薬組成物の薬剤形態等に応じて適宜選択すればよい。
【００２６】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の状態、年齢、性別、体重等に応じて適宜決定される。また、その投与方法は、患者の状態に応じ、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、直腸投与等の種々の投与方法から適宜選択される。
【００２７】
当該医薬組成物は、化学療法や骨髄移植に伴う血小板減少症及び血小板減少性紫斑病、血小板減少が原因と考えられる出血傾向を示す各種の疾患や、巨核球及び／又は血小板の機能異常を伴う患者の治療薬や予防薬等として有用なものである。
【００２８】
【実施例】
以下に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。尚、以下の記載においては、一部、当該分野における慣用の略号を使用して記載した。
［実施例１］  アセチルコリンエステラーゼ活性の測定（ＩＬ−３非存在下）
「１％「Nutridoma・SR」（ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)社製）を添加した「RPMI 1640」（ギブコ(Gibco)社製）」（以後「培地Ａ」という）によって、１×１０6細胞／ｍｌに希釈したマウス（C57BL/6N系、１１〜１５週令）骨髄細胞１００μｌに、試料［ｈＩＬ−１５（Pepro Tech社製／カタログ番号200-15）を培地Ａに溶解し所定の濃度としたもの／ネガティブコントロールとしてヒトＩＬ−１１（Pepro Tech社製）を培地Ａに溶解し所定の濃度としたもの／ポジティブコントロールとしてマウスＩＬ−３（ベーリンガー・マンハイム社製）を培地Ａに溶解し所定の濃度としたもの］５０μｌを加えた。全量１５０μｌを、９６穴培養プレート（コーニング(Corning)社製）にて、３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気、湿度１００％の条件で培養を行った。
【００２９】
培養６日目に、「０．２６５ｍＭＤＴＮＢ（シグマ(sigma)社製）、１％トライトン(Triton)Ｘ−１００、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）」溶液５０μｌを加え、この溶液の４１５ｎｍの吸光度を測定した。（この吸光度を「吸光度Ａ」と称する。）更に、３ｍＭ アセチルチオコリンヨウ化物を５０μｌ加え、３０分室温に静置したのち、この溶液の４１５ｎｍの吸光度を測定した。（この吸光度を「吸光度Ｂ」と称する。）「吸光度Ｂ」−「吸光度Ａ」で求められた値をＡＣｈＥ活性とした。
【００３０】
結果を図１〜図４に示す。横軸は９６穴培養プレートで培養する際の各ＩＬの濃度を、縦軸は、前記ＡＣｈＥ活性（「吸光度Ｂ」−「吸光度Ａ」）を表す。図１においては黒丸はＩＬ−１５のデータを、黒三角はネガティブコントロールとしてのＩＬ−１１のデータを示す。図２は、図１の実験とはサンプルの濃度を変えたＩＬ−１５のデータを、図３は図１の実験とはサンプルの濃度を変えたネガティブコントロールとしてのＩＬ−１１のデータを、図４はポジティブコントロールとしてのＩＬ−３のみを加えたデータを示す。ＩＬ−３非存在下では、ＩＬ−１５は、ＩＬ−３と同等もしくはそれ以上の、マウス骨髄細胞にＡＣｈＥを誘導する活性を示した。即ち、ＩＬ−３非存在下では、ＩＬ−１５が、マウス骨髄細胞中の巨核球系細胞を、分化、成熟させることが判明した。
［実施例２］  アセチルコリンエステラーゼ活性の測定（ＩＬ−３存在下）
１％「Nutridoma・SR」を添加した「RPMI 1640」によって、１×１０6細胞／ｍｌに希釈したマウス骨髄細胞１００μｌに、組換えマウスＩＬ−３（ベーリンガー・マンハイム社製）を０．７５ｎｇ／ｍｌの濃度（培養時の濃度０．５ｎｇ／ｍｌ）になるように加えたことを除いては、実施例１と同じ実験を行った。なお、前述のように、ＩＬ−１１はＭｅｇ−ＣＳＦであるＩＬ−３存在下でＭｅｇ−Ｐｏｔ活性を示すことが知られているので、実施例１と異なり、ＩＬ−１１はポジティブコントロールとなる。
【００３１】
結果を図５に示す。横軸は９６穴培養プレートで培養する際の各ＩＬの濃度を、縦軸は、前記ＡＣｈＥ活性（「吸光度Ｂ」−「吸光度Ａ」）を表す。図５においては黒丸はＩＬ−１５のデータを、黒三角はポジティブコントロールとしてのＩＬ−１１のデータを示す。ＩＬ−３存在下でも、ＩＬ−１５は、マウス骨髄細胞にＡＣｈＥを誘導する活性を示した。即ち、ＩＬ−３非存在下でも、ＩＬ−１５は、マウス骨髄細胞中の巨核球系細胞を、分化、成熟させることが判明した。［実施例３］  巨核球コロニーアッセイ
マウス骨随細胞を用い、単層軟寒天培養法によって行った。即ち、ウマ血清（５６℃３０分処理したもの、バイオセル(Biocell)社製）０．２ｍｌ、マウス（C57BL/6N系雄性、６〜１２週令）大腿骨骨髄細胞０．１ｍｌ（２×１０6／有核細胞）、「Iscove's Modified Dulbecco's 培養液」（ＩＭＤＭ）０．２ｍｌ、寒天を０．７５％含む「改変McCoy's5A培養液」０．４ｍｌ、及びＩＬ−１５溶液（ＩＬ−１５（Pepro Tech社製／カタログ番号200-15）をＩＭＤＭに溶解し１００ｎｇ／ｍｌとしたもの）０．１ｍｌを混合して、直径３５ｍｍの組織培養プラスティックディッシュに入れて固まらせたのち、３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気、湿度１００％の条件で培養を行った。
【００３２】
培養６日目に寒天層ごとスライドガラス上に取り出し乾燥させ、フィルム状標本としたものを５％グルタルアルデヒドで固定し、Nakeffらの方法［Proc.Sco.Exp.Biol.Med.,151,587(1976)］により、ＡＣｈＥ染色および巨核球コロニー数の算定を行った。この際、ＡＣｈＥ染色陽性細胞を４個以上含む集塊を巨核球コロニーとした。検鏡の倍率は２００倍に設定した。その結果、培養液中最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−１５の添加により、３０個の巨核球コロニーが観察された。なお、ｈＩＬ−１５を添加しない以外は同じ実験を行った結果、２個の巨核球コロニーしか観察されなかった。このことから、ｈＩＬ−１５は、単独で巨核球系細胞を増殖させる活性を有することが判明した。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によって、ｈＩＬ−１５が巨核球−血小板系に作用し、その分化、成熟及び／又は増殖を促進し、血小板の生成を促進する活性を有することが明らかになり、血小板減少に伴う疾患や、血小板の機能異常を伴う疾患の治療あるいは予防等に有効な、ｈＩＬ−１５を有効成分として含有する医薬組成物が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｈＩＬ−１５のＡＣｈＥ誘導活性を示す図である。
【図２】ｈＩＬ−１５のＡＣｈＥ誘導活性を示す図である。
【図３】ＩＬ−３のＡＣｈＥ誘導活性を示す図である。
【図４】ＩＬ−１１のＡＣｈＥ誘導活性を示す図である。
【図５】ＩＬ−３存在下におけるｈＩＬ−１５のＡＣｈＥ誘導活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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