(57)【要約】本発明は、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定化に関与する領域を同定することを目的とし、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
2002099104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
【請求項２】
低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質は有酸素条件下に比べて安定化される請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する請求の範囲第１項又は第２項に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
核局在化シグナルをコードするＤＮＡと、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、核局在化シグナル、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
【請求項５】
前記他のタンパク質をコードするＤＮＡを含む請求の範囲第４項に記載のベクター。
【請求項６】
細胞内が有酸素条件下であるときに、ベクター含有細胞において前記融合タンパク質を不安定にさせ得る請求の範囲第５項に記載のベクター。
【請求項７】
前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である請求の範囲第６項に記載のベクター。
【請求項８】
請求の範囲第４項〜第７項のいずれかに記載のベクターが導入された細胞。
【請求項９】
前記細胞が微生物細胞である請求の範囲第８項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記微生物がエシェリヒア・コリである請求の範囲第９項に記載の微生物。
【請求項１１】
請求の範囲第７項に記載のベクターを保持する細胞であって、前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質である細胞において、同タンパク質の存在状態をモニターすることを特徴とする、低酸素条件下の細胞を検出する方法。
【請求項１２】
請求の範囲第６項に記載のベクターを細胞に導入し、同ベクターがコードする融合タンパク質を発現させることを特徴とする、細胞内のタンパク質存在の調節方法。
【請求項１３】
タンパク質をコードするＤＮＡを保持する細胞における同タンパク質の存在を調節する方法であって、前記ＤＮＡに核局在化シグナル及び請求の範囲第１項に記載のＤＮＡを連結し、核局在化シグナル、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡがコードするポリペプチド及び前記タンパク質が融合した融合タンパク質として発現させることを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記融合タンパク質を、低酸素条件下では細胞中に存在させ、有酸素条件下では存在させないように調節することを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
前記他のタンパク質が、細胞毒性を有するタンパク質である請求の範囲第７項に記載のベクターを細胞に保持させ、低酸素条件下で同ベクターがコードする融合タンパク質を細胞中に存在させることを特徴とする、低酸素条件下の細胞の生育を阻害する方法。
【請求項１６】
核局在化シグナルと、膜透過性活性を有するタンパク質と、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドと、他のタンパク質からなる融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
【請求項１７】
前記膜透過性活性を有するタンパク質が、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質である請求の範囲第１６項に記載の融合タンパク質。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
【請求項１８】
以下の（Ａ）又は（Ｂ１）に示すポリペプチドと、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質と、他のタンパク質からなる融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質。
（Ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、ＴＡＴからなるタンパク質、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
【請求項１９】
低酸素条件下の細胞内では有酸素条件下に比べて安定に存在する請求の範囲第１６項〜第１８項の何れかに記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である請求の範囲第１６項〜第１９項の何れかに記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
請求の範囲第１６項又は第１８項に記載の融合タンパク質を細胞外から細胞内に透過させ、該透過した細胞中における酸素状態に応じて、該融合タンパク質の安定性を調節することを特徴とする、融合タンパク質存在の調節方法。
【請求項２２】
低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質を有酸素条件下に比べて安定に存在させる請求の範囲第２１項に記載の融合タンパク質存在の調節方法。
【請求項２３】
核局在化シグナルをコードするＤＮＡと、膜透過性活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したときに、核局在化シグナル、膜透過性活性を有するタンパク質、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
【請求項２４】
前記膜透過性活性を有するタンパク質が、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質である請求の範囲第２３項に記載のベクター。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
【請求項２５】
以下の（Ａ）又は（Ｂ１）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡと、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したときに、ＴＡＴからなるタンパク質、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
（Ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、ＴＡＴからなるタンパク質、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
【請求項２６】
低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質は有酸素条件下に比べて安定に存在する請求の範囲第２３項〜第２５項の何れかに記載のベクター。
【請求項２７】
ポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号２の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する請求の範囲第２３項〜第２５項の何れかに記載のベクター。
【請求項２８】
ＴＡＴからなるタンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号５の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する請求の範囲第２３項〜第２５項の何れかに記載のベクター。
【請求項２９】
前記他のタンパク質をコードするＤＮＡを含む請求の範囲第２３項〜第２８項の何れかに記載のベクター。
【請求項３０】
前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である請求の範囲第２９項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、有酸素条件下におかれた細胞内でタンパク質を不安定化させるポリペプチドと、同ポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び同ＤＮＡを利用する方法に関する。また、該ＤＮＡを含み、細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質を発現し得るベクターに関する。
さらに本発明は、上記ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質、及び、該融合タンパク質を用いる方法に関する。また、該融合タンパク質を発現し得るベクターに関する。
本発明は、微生物工業、医薬、医療等の分野で有用である。
背景技術
固形腫瘍内の酸素分圧は均一ではなく、腫瘍細胞はさまざまな酸素環境にさらされている。これは、血管から腫瘍組織へ酸素分子が拡散する距離が限られていることに起因する。放射線生物学の分野では、各腫瘍細胞に供給される酸素量に応じて固形腫瘍の内部を１）有酸素領域、２）懐死領域、３）低酸素領域という３つの領域に分類している。
１）毛細血管からの距離がおよそ７０μｍまでの腫瘍細胞には酸素分子が非常に多く供給されることから、この領域は有酸素領域と呼ばれている。固形腫瘍に対する放射線治療の効果を得るためには酸素分子が必須である。したがって文字どおり酸素分子に富む有酸素領域は、放射線感受性が非常に高い領域である事が知られている。化学療法を実施する際にも、血管系から有酸素領域へ抗癌剤が容易に拡散する事から、有酸素領域に対する化学療法の治療効果は高いと考えられている。
２）血管から放出された酸素分子は拡散途中に有酸素領域の腫瘍細胞に消費される。したがって、毛細血管から遠い領域に存在する腫瘍細胞には生存に十分な酸素分子が供給されない。その結果、血管系からの距離がおよそ７０μｍ以上離れている腫瘍細胞は懐死に陥り、懐死領域を形成している。
３）これら有酸素領域と懐死領域の間の領域に低酸素性細胞からなる低酸素領域が存在する。低酸素領域には腫瘍細胞の生存に必要最低限の酸素分子は供給されている。しかし、放射線治療の効果を得るために十分な量の酸素分子は供給されていない状態になっている。したがって、腫瘍内低酸素領域は放射線感受性が非常に低く、放射線治療後の腫瘍再増殖の一因であるとされている。化学療法を行う際においても、血管系から低酸素領域へ拡散する抗癌剤の量が限られている事から、十分な治療効果を期待できないのが現実である。
また、この様な低酸素性細胞の存在の確認は困難であった。それは、細胞に於ける酸素の存在状態をモニターする手段が実質的に存在しなかったためである。この様な低酸素性細胞のモニター方法としては、微小電極を用いて細胞の酸素電圧を測定する方法や、低酸素性細胞指示薬として知られるピモニダゾール（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１）を用いた免疫組織染色、さらに低酸素条件下におかれた細胞内で発現が誘導される遺伝子産物を標識とする免疫組織染色等が知られている。ところが、これらは技術的にも難しいばかりか、装置も複雑で汎用されていないのが現状であった。即ち、汎用的な低酸素細胞の検知手段の開発が望まれていた。
また、上述のとおり、癌療法に於いては、低酸素性癌細胞の存在は、放射線治療や化学療法剤による治療の妨げになるものであり、これらを効果的に取り除く手段が望まれていた。この様な低酸素性細胞に対する処置としては、低酸素性細胞放射線増感剤と放射線治療の併用が知られているのみであったが、目下１品が臨床試験にあるのみで、現在実用に供されている低酸素性細胞放射線増感剤はまだ存在していない。これは、低酸素性細胞放射線増感剤の母核である２−ニトロイミダゾールに神経毒性があり、この毒性と薬効とのコントロールが難しかったことに起因する。即ち、効果的に低酸素性の癌細胞を駆逐する手段の開発が望まれていた。
ところで、低酸素環境にある細胞内では血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）や赤血球系前駆細胞増殖因子（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＥＰＯ）をはじめとする生理的に重要な遺伝子の発現が誘導される。これらの遺伝子の発現は低酸素誘導因子−１（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｃｏｍｐｌｅｘ，以下ＨＩＦ−１）によって転写レベルで誘導される。
ＨＩＦ−１はＨＩＦ−１αタンパク質とＨＩＦ−１βタンパク質からなるヘテロダイマーである。両サブユニットともそのＮ末端にベーシック−ヘリックス−ループ−ヘリックス・ドメイン（ｂａｓｉｃ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ  ｄｏｍａｉｎ；ｂＨＬＨ  ｄｏｍａｉｎ）と呼ばれるＤＮＡへの結合を担う領域と、パス・ドメイン（ＰＥＲ−ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ（ＡＲＮＴ）−ＳＩＭ（ＰＡＳ）ｄｏｍａｉｎ）と呼ばれるヘテロダイマーの形成を担う領域を有する。また、ＨＩＦ−１αタンパク質は２つのトランスアクティベーションドメイン（Ｎ−／Ｃ−ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ；Ｎ−ＴＡＤ，Ｃ−ＴＡＤ）を有することも明らかになっている。
近年、ＨＩＦ−１の酸素濃度に依存した活性化機構が明らかになった。ＨＩＦ−１β  ｍＲＮＡの転写、および翻訳は常に活性化されており、その遺伝子産物（タンパク質）は外界の酸素分圧に非依存的に常に発現している。同様にＨＩＦ−１α  ｍＲＮＡの転写、および翻訳も常に活性化されているが、生合成されたＨＩＦ−１αタンパク質は有酸素条件下で積極的に分解され、低酸素条件下でのみ安定に存在する。
このように、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定性は外界の酸素濃度に依存して制御されており、主にそのタンパク質量に依存してＨＩＦ−１の転写活性も制御されていることが明らかになっている。
また、現在までにＨＩＦ−１αの部分欠失変異体を用いた実験で、ＨＩＦ−１αの低酸素条件下での安定化には４０１ａ．ａ．−６０３ａ．ａ．の領域が重要である事が報告されている（Ｈｕａｎｇ  ＬＥ，Ｇｕ  Ｊ，Ｓｃｈａｕ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂｕｎｎ  ＨＦ．１９９８．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  Ｏ２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：７９８７−７９９２．：文献１）。この領域はＯＤＤドメイン（Ｏｘｙｇｅｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）と呼ばれている。
ＨＩＦ−αの酸素依存的安定性は、この領域にあるアミノ酸残基が、有酸素状態で酸素依存的になんらかの修飾を受けることが示唆されており、最終的にユビキチン化され、プロテアゾームで分解されることが判っていた（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｅ．，Ｇｕ，Ｊ．Ｓｃｈａｕ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｕｎｎ，Ｈ．Ｆ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １α  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  Ｏ２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：７９８７−７９９２，１９９８．）。
従って、ＨＩＦ−αの安定性は、プロテアゾーム阻害剤、例えばＮ−カルボベンゾキシル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルバリナル（Ｎ−ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｎｏｒｖａｌｉｎａｌ）（以下、「Ｃｂｚ−ＬＬＬ」ともいう）（Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｇｒａｍｍ，Ｃ．，Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｌ．，Ｃｌａｒｋ，Ｋ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．，Ｄｉｃｋ，Ｌ．，Ｈｗａｎｇ，Ｄ．ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｂｌｏｃｋ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｏｎ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｅｌｌ  ７８：７６１−７７１，１９９４．：文献３）を加えた培地で培養することにより、低酸素状態と同様の安定性を得ることができることも判っていた（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｃ．Ｈ．，Ｌａｕｇｈｎｅｒ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １α  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｂｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：４７４８−４７５３，２０００．：文献４）。このことから、該ポリペプチドを含む融合蛋白の分解も、ＨＩＦ−１α同様にユビキチン−プロテアゾームによる分解機構を介しておこなわれることが想定され、低酸素状態およびＣｂｚ−ＬＬＬを含む培地で安定化することが想定された。
また、ＨＩＦ−１αタンパク質の５３０ａ．ａ．−６５２ａ．ａ．を融合させたＧａｌ−４タンパク質は、酸素濃度が高い場合にのみ培養細胞内で積極的に分解されるといった制御を受ける事が報告されている（Ｖｉｃｋｒａｍ  Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｌｉ−Ｐｉｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｘｉａｏ−Ｈｏｎｇ  Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｊａｉｍｅ  Ｃａｒｏ．１９９９．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｘｙｇｅｎ／Ｒｅｄｏｘ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｆａｃｔｏｒ  α（ＨＩＦ  α）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２６０：５５７−５６１：文献５）。また、Ｇａｌ−４とＨＩＦ−１αの５２９ａ．ａ．−８２６ａ．ａ．を融合させた遺伝子の中のＨＩＦ−１α５６１ａ．ａ．−５６８ａ．ａ．をアラニン残基に置換すると、上記の制御が消失する事も報告されている。この事から、マウスのＨＩＦ−１αからヒトのＨＩＦ−１αまで良く保存されているＨＩＦ−１αの５６１ａ．ａ．−５６８ａ．ａ．を中心とする領域が酸素濃度に依存したタンパク質の安定化に関わっているのではないかと推測されている。尚、ＨＩＦ−１αの５５７ａ．ａ．−５７１ａ．ａ．の領域が、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定性の制御に重要な役割を果たしているのではないかとも論じられている（上記文献５）。
しかしながら、本発明者らは、前記５５７ａ．ａ−５７１ａ．ａ．の領域のみでは、融合タンパク質の安定化を酸素濃度に依存させることができないことを見い出した。また、ＨＩＦ−１αタンパク質のうち、融合タンパク質の安定化に関与する領域は同定されているとはいえなかった。
一方、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）由来のＴＡＴと呼ばれるタンパク質が細胞膜を通過する活性を持つ事が１９８８年に報告されている（Ｃｅｌｌ；５５，１１７９（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ；９１，６６４（１９９４））。その後、ＴＡＴタンパク質のわずか１１アミノ酸からなる領域（ＴＡＴ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）が上記の活性を担っている事が明らかにされた。同時にこのＴＡＴ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎが融合されたβ−ガラクトシダーゼのタンパク質が細胞内に取り込まれる事も報告されている。
しかし、上記ＨＩＦ−１αとＴＡＴの関係、ひいてはＨＩＦ−１αと膜透過性活性を有するタンパク質の関係については従来知られておらず、よって、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定化を制御する特定領域を利用して、該特定領域を有するＨＩＦ−１αタンパク質、膜透過性活性を有するタンパク質及び他のタンパク質を融合したときに、該融合タンパク質を細胞内に取り込ませることができること、並びに融合タンパク質を保持する細胞内において、融合タンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与することができることについては知られていない。
発明の開示
本発明は、上記の様な状況下なされたものであり、融合させることによって任意のタンパク質の安定性を酸素濃度依存的に制御し得るＨＩＦ−１αタンパク質の領域を同定すること、及び、同領域を利用して酸素の多少に応じ、特定遺伝子の発現、及びそれに対応する融合タンパク質の発現を制御することを課題とする。
また、特定されたＨＩＦ−１αタンパク質の安定化に関与する領域を有するタンパク質を含む融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質、及び、該融合タンパク質を好適に細胞に取り込ませ、かつ取り込ませた細胞において、酸素の多少に応じ融合タンパク質の安定性を調節することができる、融合タンパク質の調節方法を提供することを課題とする。
また、これら融合タンパク質を発現し得るベクターを提供することを課題とする。
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＨＩＦ−１αタンパク質のアミノ酸配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列を有する領域が、同領域を融合させたタンパク質が有酸素下で分解を受ける場合のシグナルとなる部分の要部となっていることを見出した。
また、上記特定領域を有するＨＩＦ−１αタンパク質と膜透過性活性を有するタンパク質とを含む融合タンパク質は好適に細胞に取り込まれることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（２）低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質は有酸素条件下に比べて安定化される（１）に記載のＤＮＡ。
（３）配列番号２の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する（１）又は（２）に記載のＤＮＡ。
（４）核局在化シグナルをコードするＤＮＡと、（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、核局在化シグナル、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
（５）前記他のタンパク質をコードするＤＮＡを含む（４）に記載のベクター。
（６）細胞内が有酸素条件下であるときに、ベクター含有細胞において前記融合タンパク質を不安定にさせ得る（５）に記載のベクター。
（７）前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である（６）に記載のベクター。
（８）（４）〜（７）のいずれかに記載のベクターが導入された細胞。
（９）前記細胞が微生物細胞である（８）に記載の細胞。
（１０）前記微生物がエシェリヒア・コリである（９）に記載の微生物。
（１１）（７）に記載のベクターを保持する細胞であって、前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質である細胞において、同タンパク質の存在状態をモニターすることを特徴とする、低酸素条件下の細胞を検出する方法。
（１２）（６）に記載のベクターを細胞に導入し、同ベクターがコードする融合タンパク質を発現させることを特徴とする、細胞内のタンパク質存在の調節方法。
（１３）タンパク質をコードするＤＮＡを保持する細胞における同タンパク質の存在を調節する方法であって、前記ＤＮＡに核局在化シグナル及び（１）に記載のＤＮＡを連結し、核局在化シグナル、（１）に記載のＤＮＡがコードするポリペプチド及び前記タンパク質が融合した融合タンパク質として発現させることを特徴とする方法。
（１４）前記融合タンパク質を、低酸素条件下では細胞中に存在させ、有酸素条件下では存在させないように調節することを特徴とする（１３）に記載の方法。
（１５）前記他のタンパク質が、細胞毒性を有するタンパク質である（７）に記載のベクターを細胞に保持させ、低酸素条件下で同ベクターがコードする融合タンパク質を細胞中に存在させることを特徴とする、低酸素条件下の細胞の生育を阻害する方法。
（１６）核局在化シグナルと、膜透過性活性を有するタンパク質と、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドと、他のタンパク質からなる融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（１７）前記膜透過性活性を有するタンパク質が、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質である（１６）に記載の融合タンパク質。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
（１８）以下の（Ａ）又は（Ｂ１）に示すポリペプチドと、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質と、他のタンパク質からなる融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質。
（Ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、ＴＡＴからなるタンパク質、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
（１９）低酸素条件下の細胞内では有酸素条件下に比べて安定に存在する（１６）〜（１８）の何れかに記載の融合タンパク質。
（２０）前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である（１６）〜（１９）の何れかに記載の融合タンパク質。
（２１）（１６）又は（１８）に記載の融合タンパク質を細胞外から細胞内に透過させ、該透過した細胞中における酸素状態に応じて、該融合タンパク質の安定性を調節することを特徴とする、融合タンパク質存在の調節方法。
（２２）低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質を有酸素条件下に比べて安定に存在させる（２１）に記載の融合タンパク質存在の調節方法。
（２３）核局在化シグナルをコードするＤＮＡと、膜透過性活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したときに、核局在化シグナル、膜透過性活性を有するタンパク質、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、核局在化シグナル、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（２４）前記膜透過性活性を有するタンパク質が、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質である（２３）に記載のベクター。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
（２５）以下の（Ａ）又は（Ｂ１）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡと、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（ＴＡＴ）からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したときに、ＴＡＴからなるタンパク質、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクター。
（Ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、ＴＡＴからなるタンパク質、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列のうち、少なくとも９個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有し、かつ、融合タンパク質に膜透過性を付与するタンパク質。
（２６）低酸素条件下の細胞内では前記融合タンパク質は有酸素条件下に比べて安定に存在する（２３）〜（２５）の何れかに記載のベクター。
（２７）ポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号２の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する（２３）〜（２５）の何れかに記載のベクター。
（２８）ＴＡＴからなるタンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号５の塩基配列又はその一部の塩基配列を有する（２３）〜（２５）の何れかに記載のベクター。
（２９）前記他のタンパク質をコードするＤＮＡを含む（２３）〜（２８）の何れかに記載のベクター。
（３０）前記他のタンパク質が、標識のためのタンパク質及び／又は細胞毒性を有するタンパク質である（２９）に記載のベクター。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第１の発明であるＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。該ポリペプチドは核局在化シグナル（以下、「ＮＬＳ」ともいう）、及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与する。
そして、上記融合タンパク質は、該融合タンパク質を保持する細胞が、低酸素条件下にあるときは、有酸素条件下に比べて、安定的に保持される。また、有酸素条件下の細胞内においては、低酸素条件下に比べて速やかに分解される。
本発明においては、低酸素条件とは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）では約２０ｍｍＨｇ以下の酸素分圧にある状態をいう。例えば、インキュベータの中の酸素濃度を１％以下にした細胞培養は低酸素条件である。また、有酸素条件とは生体内で約２０ｍｍＨｇを越える酸素分圧にある状態をいう。
第１の発明のＤＮＡは、コードされるポリペプチドが、同ポリペプチドを含む融合タンパク質に、前記のような細胞内の酸素濃度に依存した安定性を付与することができる限り、その一部であってもよい。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する１６個以上、好ましくは１７個以上、より好ましくは１８個以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有しているポリペプチドが挙げられる。より具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、連続する１６個以上、１２０個以下、好ましくは１７個以上、５０個以下、より好ましくは１８個以上、３０個以下、特に好ましくは１８個以上、２０個以下のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。さらに具体的には、配列番号１のアミノ酸番号１〜１６からなるアミノ酸配列、又は、アミノ酸番号３〜１８からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
また、第１の発明のＤＮＡがコードするポリペプチドは、同ポリペプチドを含む融合タンパク質に、前記のような細胞内の酸素濃度に依存した安定性を付与することができる限り、前記配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する１５個以上、かつ２０個以下のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチドと８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。但し、配列番号１のアミノ酸番号９のチロシン残基に相当するチロシン残基は、保存されていることが必要である。
ＮＬＳとは、細胞内に核膜構造を持つ真核細胞でタンパク質が核に局在するために必要なアミノ酸配列をいう。つまり、同配列を有するタンパク質は核膜を通って核に輸送される。ＮＬＳはＤＮＡ結合タンパク質など核内での活性を有するタンパク質に見られる配列である。
第１の発明においては、ＮＬＳは、第１の発明のＤＮＡがコードするポリペプチド及び他のタンパク質と融合したときに、融合タンパク質を保持する細胞内において同融合タンパク質が核へ移行する活性を有していれば特に制限されないが、例えばＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）ｌａｒｇｅ−Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎに由来するＮＬＳ（ｌａｒｇｅ−Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎの１２６ａ．ａ．〜１３２ａ．ａ．の領域）が挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）８６：９３２７−９３３１：文献７）。また、ＨＩＦ−１αも固有のＮＬＳを含んでおり、同ＮＬＳを用いることもできる。
他のタンパク質としては、細胞内において酸素濃度に依存して安定化を制御することを目的とするものであれば特に制限されないが、例えば、標識のためのタンパク質、細胞毒性を有するタンパク質等が挙げられる。
標識のためのタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等、発色反応を触媒する酵素が挙げられる。これらの発色反応は、酵素免疫測定法や、細胞内のタンパク質の存在状態を調べる手法として、抗体分野及び微生物分野等でよく知られている。また、前記タンパク質として、ＧＦＰ（グリーンフローエッセンス、プロテイン）の蛍光性を有するタンパク質も使用できる。
細胞毒性を有するタンパク質としては、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼの毒素タンパク質、その他アポトーシス誘導因子等が挙げられる。
第１の発明のＤＮＡは、コードするアミノ酸配列が、上記条件をみたすものであれば特に制限されないが、具体的には例えば配列番号２に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
第１の発明のＤＮＡは、コードするアミノ酸配列に基づいて、通常の化学合成法にしたがって化学合成することができる。また、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列又はそれをコードしたｃＤＮＡの塩基配列は既に知られており（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２２４３１）、それらの配列及び配列番号２に示す塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）により、ヒト又はマウス等の動物の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから増幅することによっても、取得することができる。そのようなプライマーとしては、実施例に示す各種プライマーが挙げられる。プライマーの配列に、ＮＬＳをコードする配列や遺伝子の発現に必要な配列（例えばＫｏｚａｋ配列）、また制限酵素の認識配列を含ませておくと、融合タンパク質をコードするＤＮＡの作製が容易になる。
ＰＣＲにより得られた増幅産物は、エシェリヒア・コリ等の遺伝子組換えに適した宿主用のベクターに組み込んでおくと、以降の操作が容易になる。そのようなベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）が挙げられる。
次に、本発明の第１の発明であるベクターは、ＮＬＳをコードするＤＮＡと、第１の発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、核局在化シグナル、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクターである。
上記ベクターにおいて、ポリペプチドをコードするＤＮＡとは、具体的には、上述の配列番号２に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
また、ＮＬＳをコードするＤＮＡは、例えば配列番号６に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
また、本発明の第１の発明であるベクターの他の態様は、上記のような他のタンパク質をコードするＤＮＡを、ＮＬＳ及び第１の発明に係わるポリペプチドをコードするＤＮＡとともに、融合タンパク質を発現するように含むベクターである。融合タンパク質は、例えば、Ｎ末端から、ＮＬＳ、第１の発明に係るポリペプチド、他のタンパク質の順に含む。すなわち、第１の発明のベクターにおいて、これらのポリペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡは、フレームが一致するように連結され、さらに遺伝子発現に必要なプロモーター等の発現制御配列を含む。
前記プロモーターとしては、ＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｌａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等が挙げられる。
本発明の第１の発明である細胞は、前記第１の発明であるベクターが導入された細胞である。細胞としては、微生物細胞が挙げられる。微生物としては、エシェリヒア・コリ等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニジュランス等の糸状菌、及び、動物又は植物の培養細胞が挙げられる。これらの細胞に第１の発明のベクターを導入するには、通常の形質転換法を用いればよい。
第１の発明のＤＮＡを含むベクターの一例として後記実施例に示すプラスミドｐＣＨ／５５７−５７４を保持するエシェリヒア・コリＤＨ５αＩＱ／ＰＣＨ５５７−５７４は、平成１３年２月１日に独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番地中央第６）（旧：産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号））に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１９３として寄託されている。
また、上記プラスミドｐＣＨ／５５７−５７４を保持するエシェリヒア・コリＤＨ５αＩＱ／ＰＣＨ５５７−５７４は、平成１３年１２月１７日に、上記独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番地  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２８として国際寄託に移管されている。
次に、第１の発明のＤＮＡでコードされたポリペプチドを含む融合タンパク質を利用する方法について説明する。
核局在化シグナル、第１の発明のＤＮＡがコードするポリペプチド、及び他のタンパク質とが融合した、第１の発明である融合タンパク質は、細胞中における酸素状態に応じて、存在状態が異なる。
具体的には、細胞内が低酸素条件下にあるときは、融合タンパク質は安定に存在し、有酸素条件下にあるときは、融合タンパク質は積極的に分解される。
よって、上述した第１の発明のベクターを細胞に導入し、同ベクターがコードする融合タンパク質を発現させる場合、細胞内の酸素状態に応じて、第１の発明の融合タンパク質を構成するタンパク質の存在を調節することができる。
具体的には、細胞内を低酸素条件にすればタンパク質を安定に保持させることができ、有酸素条件にすればタンパク質量を減少させることができる。
他のタンパク質として標識のためのタンパク質を使用した第１の発明のベクターを細胞に保持させ、標識のためのタンパク質を含む第１の発明の融合タンパク質を発現させ、該標識を指標として、該標識のためのタンパク質をモニターすると、言い換えると該第１の発明の融合タンパク質の存在状態をモニターすると、低酸素条件下の細胞を検出することができる。特に、標識として可視化可能なものを用いると、低酸素細胞を可視化することができる。
また、他のタンパク質として細胞毒性を有するタンパク質を使用した第１の発明のベクターを細胞に保持させ、細胞毒性を有するタンパク質を含む第１の発明の融合タンパク質を該細胞中に発現させると、低酸素条件下の細胞の生育を阻害することができる。具体的には、レトロウィルスやアデノウィルスに第１の発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、これを体内に投与することで癌治療の現場で問題となっている腫瘍内低酸素領域でのみ毒性タンパク質を発現させることができる。したがって、低酸素条件にある細胞を選択的に除去することができるため、癌治療での新しい治療法の開発へと結びつく可能性がある。
次に、上述した第１の発明に係わるポリペプチドを含む融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する第２の発明の融合タンパク質について説明する。
第２の発明の融合タンパク質は、ＮＬＳと、膜透過性活性を有するタンパク質と、他のタンパク質と、ＮＬＳ及び他のタンパク質と融合したときに同融合タンパク質を保持する細胞内において他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチドとを含む融合タンパク質であり、細胞外から細胞内に透過することができ、細胞内の酸素状態に依存して安定性が異なる融合タンパク質である。
上記第２の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドは、上述した第１の発明のＤＮＡでコードされるポリペプチド、つまり第１の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドと同様のポリペプチドが使用できる。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、細胞内の酸素濃度に依存した安定性を付与することができる限り、配列番号１のアミノ酸配列の一部であってもよい。その一部の目安については、上述した第１の発明のＤＮＡでコードされるポリペプチドの記載箇所で説明している通りである。
また、上記第２の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドは、第１の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチド、つまり配列番号１のＨＩＦ−１α５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ．の特定領域に対応するポリペプチドを用いることが特に好ましい。但し、第２の発明の融合タンパク質に含まれるポリペプチドは、該特定領域を有するものであればよく、例えば、ＨＩＦ−１αの４０１ａ．ａ．−６０３ａ．ａ．の領域に対応するポリペプチドを用いることもできるし、好ましくは、例えばＨＩＦ−１αの５４８ａ．ａ．−６０３ａ．ａ．の領域に対応するポリペプチドを用いることもできる。
また、上記第２の発明の融合タンパク質に使用されるＮＬＳは、上述した第１の発明の融合タンパク質におけるＮＬＳと同様のものが使用できる。
また、上記第２の発明の融合タンパク質に使用される膜透過性活性を有するタンパク質とは、上記ポリペプチド及び他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質に細胞膜を透過する活性を付与するタンパク質であれば特に制限されないが、好ましくはＴＡＴ、ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ、ＶＰ２２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ等が挙げられる。
ＴＡＴとは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）由来の細胞膜を通過する活性を持つタンパク質である。具体的には、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
また、本発明でいうＴＡＴは、細胞膜を透過する活性を有する限り、配列番号４に記載されるアミノ酸配列のうち一部であってもよい。具体的には、配列番号４に示すアミノ酸配列のうち、９以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。さらに具体的には、配列番号４のアミノ酸番号３〜１１からなるアミノ酸配列を有するたんぱく質が挙げられる。
また、上記第２の発明の融合タンパク質に使用される他のタンパク質は、上述した第１の発明の融合タンパク質における他のタンパク質と同様のものが使用できる。例えば、標識のためのタンパク質、細胞毒性を有するタンパク質等同様の例が挙げられる。
また、本発明の第２の発明である融合タンパク質の他の態様は、上記ＴＡＴと、他のタンパク質と、ＴＡＴと他のタンパク質と融合したときに同融合タンパク質を保持する細胞内において他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチドとを含む融合タンパク質であり、細胞外から細胞内に透過することができ、細胞内の酸素状態に依存して安定性が異なる融合タンパク質である。
膜透過性活性を有するタンパク質として、上記ＴＡＴを用いた場合、ＮＬＳを有さない態様においても、細胞膜透過性及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質が得られる。つまり膜透過性活性を有するタンパク質にＴＡＴを用いる場合、ＮＬＳの有無に係わらず、本発明の第２の発明である融合タンパク質となる。
尚、本発明の第２の発明である融合タンパク質の他の態様におけるポリペプチド、他のタンパク質については、本発明の第２の発明である融合タンパク質に関する説明箇所で述べたとおりである。
本発明の第２の発明であるベクターは、上述の第２の発明の融合タンパク質を発現し得るベクターである。具体的には、ＮＬＳをコードするＤＮＡと、膜透過性活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、ＮＬＳと他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、核局在化シグナル、膜透過性活性を有するタンパク質、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクターである。
また、本発明の第２の発明であるベクターの他の態様は、ＴＡＴをコードするＤＮＡと、ＴＡＴと他のタンパク質と融合したときに、同融合タンパク質を保持する細胞内において、他のタンパク質に酸素濃度に依存した安定性を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、これらのＤＮＡに他のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、ＴＡＴ、前記ポリペプチド及び他のタンパク質との融合タンパク質を発現し得るベクターである。
第２の発明のベクターにおいて、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡとは、ポリペプチドのアミノ酸配列が、上記第２の発明の融合タンパク質の説明箇所で述べた条件をみたすものであれば特に制限されない。具体的にはＨＩＦ−１α５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ．のポリペプチドをコードするＤＮＡとして例えば配列番号２に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、ＨＩＦ−１αの５４８ａ．ａ．−６０３ａ．ａ．のポリペプチドをコードするＤＮＡとして例えば配列番号３に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
また、第２の発明のベクターにおいて、ＮＬＳをコードするＤＮＡは、例えば上述の第１の発明のベクターの記載箇所で説明しているとおり、配列番号６に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
また、第２の発明のベクターにおいて、膜透過性活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして、具体的には例えばＴＡＴをコードするＤＮＡが挙げられる。
そして、ＴＡＴをコードするＤＮＡは、細胞膜を通過する活性を有する限り特に制限されないが、具体的には配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡや配列番号４のアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３〜１１からなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる、より具体的には、例えば配列番号５に示す塩基配列又はその一部の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
本発明の第２の発明のベクターにおけるさらなる態様は、上記のような他のタンパク質をコードするＤＮＡを、ＮＬＳ、膜透過性活性を有するタンパク質及びポリペプチドをコードするＤＮＡとともに、又は、上記のような他のタンパク質をコードするＤＮＡを、ＴＡＴ及びポリペプチドをコードするＤＮＡとともに、第２の発明の融合タンパク質を発現するように含むベクターである。第２の発明の融合タンパク質は、例えば、Ｎ末端から、ＮＬＳ、膜透過性活性を有するタンパク質、ポリペプチド、他のタンパク質の順に含む。すなわち、第２の発明のベクターにおいて、これらのポリペプチド及び各種タンパク質をコードするＤＮＡは、フレームが一致するように連結され、さらに遺伝子発現に必要なプロモーター等の発現制御配列を含む。
前記プロモーターとしては、ＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｌａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等が挙げられる。
本発明の第２の発明であるベクターを導入する細胞としては、微生物細胞が挙げられる。微生物としては、エシェリヒア・コリ等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニジュランス等の糸状菌、及び、動物又は植物の培養細胞が挙げられる。
第２の発明のベクターの一例として、後記実施例に示すプラスミドｐＢＡＤ／３−０とｐＢＡＤ／５５７−５７４をそれぞれ保持するエシェリヒア・コリＬＭＰＧ１９４／ｐＢＡＤ３−０とＬＭＰＧ１９４／ｐＢＡＤ５５７−５７４は、平成１３年３月１６日に、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番地  中央第６）（旧：産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号））に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２５８とＦＥＲＭ  Ｐ−１８２５９としてそれぞれ寄託されている。
また、上記プラスミドｐＢＡＤ／３−０とｐＢＡＤ／５５７−５７４をそれぞれ保持するエシェリヒア・コリＬＭＰＧ１９４／ｐＢＡＤ３−０とＬＭＰＧ１９４／ｐＢＡＤ５５７−５７４は、平成１３年１１月２６日に、上記独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東一丁目１番地  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８０９とＦＥＲＭ  ＢＰ−７８１０としてそれぞれ国際寄託に移管されている。
次に、第２の発明の融合タンパク質を用いた、融合タンパク質存在の調節方法について説明する。
該調節方法は、上記第２の発明の融合タンパク質を細胞外から細胞内に透過させ、該透過した細胞中における酸素状態に応じて、第２の発明の融合タンパク質の存在状態を調節することを特徴とする。第２の発明の融合タンパク質を用いると、好適に細胞に取り込ませることができる。ここで、取り込ませるとは、細胞外から細胞内に透過させる場合をいうが、ある細胞の細胞内から細胞外へ融合タンパク質を排出させ、それを他の細胞の細胞内へ取り込ませる場合も含めることができる。
酸素状態に応じて、融合タンパク質の存在状態が調節されるとは、具体的には上記第１の発明の融合タンパク質の箇所でも説明しているように、低酸素条件下の細胞内では第２の発明の融合タンパク質が有酸素条件下に比べて安定に存在するように調節されることをいう。
尚、第２の発明の融合タンパク質の存在状態の調節方法を用いて、他のタンパク質として標識のためのタンパク質を使用し、該標識を指標として該融合タンパク質の存在状態をモニターすると、低酸素条件下の細胞を検出することができる点は、第１の発明の融合タンパク質の存在状態を調節する方法の箇所で説明しているとおりである。
また、第２の発明の融合タンパク質の存在状態の調節方法を用いて、他のタンパク質として細胞毒性を有するタンパク質を使用し、低酸素条件下で同融合タンパク質を細胞中に存在させれば、低酸素条件下の細胞の生育を阻害することができる点は、第１の発明の融合タンパク質の存在状態を調節する方法の箇所で説明しているとおりである。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
〔Ａ：材料と方法〕
＜１＞ＮＬＳ／ＨＩＦ１−αＯＤＤドメイン／ｌａｃＺ融合遺伝子発現プラスミドの構築
全ての表記したベクターは、プラスミドｐＣＨ１１０  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をもとに構築した。同プラスミドは、Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０  ｅａｒｌｙプロモーターを有している。
（１）プラスミド：ｐＣＨ／０−０、０−１、０−２、０−３、１−２、１−３、１−０、２−０、３−０、３−４、４−０の構築（図１及び２）
まず、Ｋｏｚａｋ配列（配列番号７の塩基番号８〜１４）（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１９８７）ｖｏｌ．１５，２０，８１２５〜８１３１：文献８）とＮＬＳ（核局在シグナル）（文献７）を含むＤＮＡ（配列番号７の塩基番号１７〜３７）を合成し、それぞれをアニーリングさせ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ処理した。次にヒトＨＩＦ１−αのＯＤＤドメイン（Ｏｘｇｅｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）をＰＣＲによりヒトｃＤＮＡから増幅し、制限酵素ＢｇｌＩＩとＫｐｎＩで処理した。上記ＤＮＡ断片をｐＣＨ１１０／ＮＬＳのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＫｐｎＩ部位の間に翻訳フレームが合うように３分子ライゲーションにより挿入した。ＰＣＲに使用した合成ＤＮＡは以下の通りである。
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各プラスミドに挿入したＯＤＤドメインをＰＣＲにて増幅した際に用いたプライマーの組み合わせは以下の通りである。
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それぞれのプラスミドは、表２に示すＯＤＤドメインと、ＮＬＳ及びｌａｃＺ遺伝子をタンパク質レベルで融合させる様に遺伝子組み換えを行った。「ａ．ａ．」は、ＯＤＤドメインのアミノ酸残基の位置を示す。表２中、例えばｐＣＨ／０−０は、ＯＤＤドメインの４０１位から６０３位をコードするＤＮＡ鎖と、ＮＬＳ及びｌａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖を融合させたことを示している。
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図１中、ＦＯ、ＲＯはＰＣＲに用いたプライマーの位置を表している。また、図中の太線は、各プラスミド中でｌａｃＺ遺伝子と融合させたＯＤＤドメイン、及びその長さを表している。ｐＣＨ／０−０は、ＯＤＤドメインの４０１位から６０３位をコードするＤＮＡ鎖と、ＮＬＳ及びｌａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖が融合している。図２中、Ｆ０、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、ＲＯ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、ＰＣＲに用いたプライマーの位置を表している。
（２）プラスミドｐＣＨ／５５７−５７４、５６２−５６９、５５７−５７１、５６０−５７４、５５７−５７４（Ｙ５６５Ａ）５５７−５７４（ΔＮＬＳ）の構築（図３）
ヒトＨＩＦ１−αのＯＤＤドメイン（Ｏｘｇｅｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）の一部をコードするＤＮＡ（配列番号１９〜２８）を合成し、それぞれの組み合わせでアニーリングさせ、ｐＣＨ１１０／３−０のＢｇｌＩＩ部位とＫｐｎＩ部位の間に翻訳フレームが合うように挿入した。使用した合成ＤＮＡは以下の通りである。
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それぞれのプラスミドは、表３に示すＯＤＤドメインと、ＮＬＳ及びｌａｃＺ遺伝子をタンパク質レベルで融合させる様に遺伝子組み換えを行った。
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図３中、「Ｌ」や「Ｄ」等は、各プラスミド中でｌａｃＺ遺伝子と融合させたＯＤＤドメインのアミノ酸配列を表している。例えば、ｐＣＨ／５６２−５６９は「ＬＡＰＹＩＰＭＤ（配列番号２９）」をコードするＤＮＡ鎖と、ＮＬＳ及びｌａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖が融合している。
（３）＜１−３＞プラスミドｐＣＨ／５５７−５７４（ΔＮＬＳ）、３−０（ΔＮＬＳ）の構築（図４）
ｐＣＨ／５５７−５７４（ΔＮＬＳ）、及びｐＣＨ／３−０（ΔＮＬＳ）の構築は、それぞれｐＣＨ／５５７−５７４、ｐＣＨ／３−０を基に行った。Ｋｏｚａｋ配列とＮＬＳ（核局在化シグナル）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ領域を、ｐＣＨ／５５７−５７４とｐＣＨ／３−０から切り出し、代わりにＫｏｚａｋ  ＡＴＧ配列のみをコードする下記のＤＮＡを合成し、それぞれをアニーリングさせたＤＮＡ断片を挿入した。
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それぞれのプラスミドは、表４に示すＯＤＤドメインとｌａｃＺ遺伝子をタンパク質レベルで融合させる様に遺伝子組み換えを行った。
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図４中、太線は各プラスミド中でｌａｃＺ遺伝子と融合させたＯＤＤドメインの長さを表している。例えば、ｐＣＨ／３−０（ΔＮＬＳ）は、５４８ａ．ａ．−６０３ａ．ａのＯＤＤドメインをコードするＤＮＡ鎖とｌａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖が融合している。
＜２＞細胞培養
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓由来）細胞は、通常培地として、５％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（明治製薬）を含むダルベッコＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。
＜３＞ＤＮＡトランスフェクション及びＸ−ｇａｌ染色
１×１０５ＨＥＫ２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ＦＬ，Ｓｍｉｌｅｙ  Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌ  ＷＣ，ａｎｄ  Ｎａｉｒｎ  Ｒ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６（１）：５９−７４，１９７７：文献１０）を６穴マルチウエルデッシュにまき、翌日５マイクログラムのプラスミドをリン酸カルシウム変法（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｈ．Ｏｋａｙａｍａ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２，１９８７：文献１１）により細胞に導入した。２４時間、３７℃，３％ＣＯ２インキュベーターで培養した後、トリプシン処理により細胞をデッシュから剥がし、６穴マルチウエルデッシュ２穴にまき直した。その際、低酸素状態におかれた細胞内と同様にユビキチン−プロテアゾーム系を阻害する目的で、一方の細胞をＣｂｚ−ＬＬＬ（文献３）を５０μＭ含む通常培地で２４時間培養した。その後、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）染色（Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｌ．Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｎｉｃｏｌａｓ．１９８６．Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｐｏｓｔ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｏｙｏｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３１３３−３１４２．：文献１２）を行った。
（実施例１）
＜１＞ＯＤＤドメインのＣｂｚ−ＬＬＬ依存的融合タンパク質安定性制御の確認
ＨＩＦ−１αタンパク質のＯＤＤドメイン（４０１ａ．ａ．−６０３ａ．ａの領域）を融合させたタンパク質の安定性を酸素濃度に依存して制御できるか検討するために、まずＯＤＤドメイン（４０１ａ．ａ．−６０３ａ．ａ）とＮＬＳ及びｌａｃＺ遺伝子を融合させたプラスミド：ｐＣＨ／０−０（ＮＬＳ／ＨＩＦ−１α  ４０１ａ．ａ．−６０３ａ．ａ．／ｌａｃＺ）を構築した（［Ａ：材料と方法］＜１＞（１））。尚、野生型のＨＩＦ−１αにはＮＬＳ配列がコードされているため、ｐＣＨ／０−０は、ＯＤＤドメインとともにＮＬＳを融合させる様に構築した。
１×１０５ＨＥＫ２９３細胞を６穴マルチウエルデッシュにまき、翌日５μｇのプラスミドｐＣＨ／０−０をリン酸カルシウム変法により細胞に導入した。２４時間、３７℃，３％ＣＯ２インキュベーターで培養した後、ＥＤＴＡ処理により細胞を２群に分け、一方は通常培地で、他方はＣｂｚ−ＬＬＬを５０μＭ含む培地で２４時間培養した。そして最後に融合タンパク質の発現を確認するためにＸ−ｇａｌ染色を行った。結果を表５に示す。
Ｘ−ｇａｌ染色の結果、Ｃｂｚ−ＬＬＬ非存在下で培養した場合に、Ｃｂｚ−ＬＬＬ存在下で培養した場合と比較して、青く染色された細胞の数とその染色の濃さは有意に減少した。尚、表５中（以下の表も同様とする）、このようにＣｂｚ−ＬＬＬの有無により融合タンパク質の安定性に違いが生じた場合、つまり、Ｃｂｚ−ＬＬＬに依存して融合タンパク質の安定性が制御できることが観察できた場合を、＋（プラス）と表示する。
一方、ＯＤＤドメインを含まないプラスミドｐＣＨ１１０を導入した場合、Ｃｂｚ−ＬＬＬの有無に関わらず青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。尚、表５中（以下の表も同様とする）、このようにＣｂｚ−ＬＬＬの有無に関わらず融合タンパク質の安定性に違いが生じない結果が観察された場合を、−（マイナス）と表示する。
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Ｃｂｚ−ＬＬＬは、転写活性にもｍＲＮＡの安定性にも影響をおよぼさないことが報告されているので、これらの結果はＨＩＦ−１αの４０１ａ．ａ．−６０３ａ．ａの領域を融合させることによって、β−ガラクトシターゼ（β−ｇａｌ）タンパク質の安定性をＣｂｚ−ＬＬＬに依存して制御できたことを示している。
＜２＞ＯＤＤドメインのＣｂｚ−ＬＬＬ依存的融合タンパク質安定性制御に必要な領域の同定
（１）次に、融合タンパク質のＣｂｚ−ＬＬＬに依存的な安定性制御に必須なＯＤＤドメイン中の領域を同定するために、ＯＤＤドメインのＮ末端側及び／又はＣ末端側を系統的に欠失させ、ＮＬＳおよびｌａｃＺ遺伝子と融合させたプラスミドを構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（１）参照）、上記＜１＞と同様にしてＨＥＫ２９３細胞にプラスミドを導入し、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。結果を表６に示す。
その結果、ｐＣＨ／０−１、０−２、０−３、１−２、１−３、４−０を導入した場合、Ｃｂｚ−ＬＬＬの有無に関わらず、青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。一方、ｐＣＨ／１−０、２−０、３−０、３−４を導入し、Ｃｂｚ−ＬＬＬ非存在下で培養した場合、Ｃｂｚ−ＬＬＬ存在下で培養した場合と比較して、青く染色された細胞の数とその染色の濃さは有意に減少した。
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これらの結果から、ＨＩＦ−１αの５４８ａ．ａ．−５８３ａ．ａ．の領域が、融合タンパク質のＣｂｚ−ＬＬＬに依存した安定性制御に重要であることが明らかになった。尚、ｐＣＨ／３−０のＸ−ｇａｌ染色の結果をｐＣＨ１１０と比較して、図５に示した。図中、Ａ，ＢはＨＥＫ２９３細胞にプラスミドｐＣＨ１１０を導入したものである。一方、Ｃ、ＤはｐＣＨ／３−０を導入したものである。また、Ｃｂｚ−ＬＬＬを含む培地で培養した場合がＢ、Ｄであり、Ｃｂｚ−ＬＬＬを含まない培地で培養した結果がＡ，Ｃである。
（２）ヒトＨＩＦ−１αのＯＤＤドメイン５４８ａ．ａ．−５８３ａ．ａ．の領域について、既知データベースに対して相同性検索を行った結果、この領域は、ヒトＨＩＦ−１αだけでなくマウスのＨＩＦ−１αにも保存されている１８残基のアミノ酸からなる配列（５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ．）を含むことが明かとなった。そこで、ＨＩＦ−１αの５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ．領域をｌａｃＺ遺伝子と融合させたプラスミドｐＣＨ／５５７−５７４を構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（２）、図３参照）、上記＜２＞と同様にしてＨＥＫ２９３細胞にプラスミドを導入し、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。
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その結果、ｐＣＨ／５５７−５７４を導入しＣｂｚ−ＬＬＬ非存在下で培養した場合に、Ｃｂｚ−ＬＬＬ存在下で培養した場合と比較して、青く染色された細胞の数とその染色の濃さは有意に減少した。これは、５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ．の領域のみを融合させただけで、β−ｇａｌタンパク質の安定性がＣｂｚ−ＬＬＬに依存することを示している。
（３）続いて、β−ｇａｌタンパク質と融合させるＨＩＦ−１αの領域をさらに短くしたプラスミドｐＣＨ／５６２−５６９、５５７−５７１、５６０−５７４（それぞれＨＩＦ−１αの５６２ａ．ａ．−５６９ａ．ａ．、５５７ａ．ａ．−５７０ａ．ａ．、５６０ａ．ａ，−５７４ａ．ａ．をＮＬＳ及びＬａｃＺと融合させた）を構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（２）、図３参照）、上記＜２＞と同様にしてＨＥＫ２９３細胞にプラスミドを導入し、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。結果を表８に示す。
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その結果、これらのプラスミドを導入した場合、Ｃｂｚ−ＬＬＬの有無に関わらず、青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。
上記の結果から、β−ｇａｌタンパク質の安定性を有意にＣｂｚ−ＬＬＬに依存させるためには、ＨＩＦ−１αの５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ．の領域を融合させればよいことが明らかになった。
＜３＞ＯＤＤドメイン５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ領域のチロシン残基のＣｂｚ−ＬＬＬ依存的安定性制御にに対する重要性
タンパク質のユビキチン／プロテアソーム系による分解は、標的タンパク質のリン酸化状態の変化によって制御されることが知られている。そこで、構築した融合タンパク質のユビキチン系による分解も、リン酸化状態の変化によって制御されている可能性が考えられる。そこで、プラスミドｐＣＨ／５５７−５７４のＨＩＦ−１α５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ．内で唯一リン酸化されうるアミノ酸である５６５位のチロシン残基をアラニン残基に置換したプラスミドｐＣＨ／５５７−５７４（Ｙ５６５Ａ）を構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（２）、図３参照）、上記と同様にしてＨＥＫ２９３細胞にプラスミドを導入し、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。結果を表９に示す。
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その結果、ｐＣＨ／５５７−５７４（Ｙ５６５Ａ）を導入した場合、Ｃｂｚ−ＬＬＬの有無に関わらず青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。これにより、ＨＩＦ−１αの５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ．を融合させたタンパク質の安定性に、５６５位のチロシン残基が特に重要なアミノ酸であることが明らかになった。
（実施例２）
一連の融合タンパク質のＣｂｚ−ＬＬＬに依存した安定性の制御に、ＮＬＳ（核局在化シグナル）が必要なのかを確認するために、ｐＣＨ／５５７−５７４及びｐＣＨ／３−０からＮＬＳを欠失させたプラスミド：ｐＣＨ／５５７−５７４（ΔＮＬＳ）及びｐＣＨ／３−０（ΔＮＬＳ）を構築し（［Ａ：材料と方法］＜１＞（３）、図４参照）、実施例１と同様にしてＨＥＫ２９３細胞にプラスミドを導入し、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。結果を表１０に示す。
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その結果、これらのプラスミドを導入した場合、Ｃｂｚ−ＬＬＬの有無に関わらず青く染色された細胞の数とその染色の濃さに違いはみられなかった。これにより、融合タンパク質のＣｂｚ−ＬＬＬに依存した安定性の制御に、ＮＬＳが関与することが確認された。
〔Ｂ：材料と方法〕
以下に記載の実施例３以降において用いた一般的な操作について説明する。
合成オリゴヌクレオチドのアニーリングは、次のようにして行う。互いに相補的な合成一本鎖オリゴヌクレオチド（濃度１００μＭ）を１０μｌずつ混ぜ、２０μｌのＮａＣｌ溶液（１Ｍ）、及び１６０μｌの精製水を加えて、計２００μｌの反応液を調整する。これを９５℃で１分間熱した後、７５℃で１分間保温し、さらに１℃あたり２分をかけて３７℃まで徐々に冷却する。次に１００μｌのＤＮＡ溶液に１０μｌの酢酸ナトリウム溶液（３Ｍ）と、２５０μｌのエタノールを加え、１２ｋｒｐｍで１０分間（４℃）遠心分離する。その後、上清を捨て７０％エタノールで沈殿物を洗い、最後に７０％エタノールを除去する事で精製したＤＮＡを得る。
制限酵素処理は、エタノール沈澱によって精製したプラスミドＤＮＡ１μｇを１０μｌのユニバーサルバッファ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）と９０μｌの精製水で溶解し、これに、目的の制限酵素を添加し、ピペッティング後３７℃で３０分間保温することにより行う。
ＤＮＡ断片の分離（切り出し）は、次のようにして行う。制限酵素処理した目的のＤＮＡ断片を他のＤＮＡ断片から単離するために、まず、アガロースゲル（含ＥｔＢｒ）電気泳動を行う。このアガロースゲルに３６５ｎｍのＵＶランプをあてる事によりＤＮＡ断片を可視化し、目的のＤＮＡ断片を含むアガロースゲルをカミソリで切り出す。最後にＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、このアガロースゲルから目的のＤＮＡ断片を抽出し精製する。
ライゲーションは、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で複数のＤＮＡ断片をホスホジエステル結合させるために、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を用い、キットの手順に従って行う。ライゲーションに用いたベクターＤＮＡ断片及びインサートＤＮＡ断片の量はどちらも１０ｎｇとする。
（実施例３）ＯＤＤドメイン、Ｈｉｓ残基×６、ＮＬＳ、ＴＡＴ及びｌａｃＺ融合遺伝子を発現するプラスミドの構築
＜１＞ＮＬＳ／ＨＩＦ１−αＯＤＤドメイン／ｌａｃＺ融合遺伝子含有プラスミドの構築
プラスミド：ｐＣＨ／３−０、及びプラスミドｐＣＨ／５５７−５７４の構築は、上記［Ａ：材料と方法］＜１＞（１）及び（２）に記載の方法（表２、表３、図１、図２、及び図３も参照）に従って行った。
＜２＞Ｈｉｓ／ＮＬＳ／ＴＡＴ／ＨＩＦ１−αＯＤＤドメイン／ｌａｃＺ融合遺伝子発現プラスミドの構築
全ての表記したベクターは、プラスミドｐＢＡＤ／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をもとに構築した。
（１）プラスミド：ｐＣＨ／ＴＡＴ／３−０、ｐＣＨ／ＴＡＴ／５５７−５７４の構築
ＴＡＴ配列をコードする下記の合成オリゴＤＮＡ（配列番号３２、３３）をアニーリングさせたＤＮＡ断片を、ｐＣＨ／３−０又はｐＣＨ／５５７−５７４を制限酵素ＢｇｌＩＩで処理したベクターに組み込み、ｐＣＨ／ＴＡＴ／３−０、ｐＣＨ／ＴＡＴ／５５７−５７４を得た。
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（２）プラスミド：ｐＢＡＤ／３−０、ｐＢＡＤ／５５７−５７４の構築
プラスミドｐＢＡＤ／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ  ＶｅｃｔｏｒにはＢａｍＨＩ部位が２ケ所存在する。このうち４１３塩基目の消化部位のみを切断した後、ＤＮＡ末端を平滑化した。引き続き制限酵素ＳａｃＩで消化して生じた約５１７０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により切り出し、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ  ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩベクターとした。一方、ｐＣＨ／ＴＡＴ／３−０、ｐＣＨ／ＴＡＴ／５５７−５７４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ末端を平滑化し、さらに制限酵素ＳａｃＩで処理して生じた約２２５０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により切り出した。これらをｐＢＡＤ／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ  ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩベクターにライゲーションし、ｐＢＡＤ／３−０、ｐＢＡＤ／５５７−５７４を得た。
（３）プラスミド：ｐＢＡＤ／Ｐ．Ｃ．の構築
まず、ｐＣＨ／３−０を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＫｐｎ  Ｉで処理して生じた約６９００ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で切り出した。これにＫｏｚａｋ  ＡＴＧおよびＮＬＳをコードする下記の合成ＤＮＡ（配列番号３４、３５）断片をアニーリングさせたものを挿入し、ｐＣＨ／Ｐ．Ｃ．とした。
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次に、ＴＡＴ配列をコードする下記の合成オリゴＤＮＡ（配列番号３６、３７）をアニーリングさせたＤＮＡ断片を、ｐＣＨ／Ｐ．Ｃ．を制限酵素Ｋｐｎ  Ｉで処理したベクターに組み込みｐＣＨ／ＴＡＴ／Ｐ．Ｃ．を構築した。
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引き続き、ｐＣＨ／ＴＡＴ／Ｐ．Ｃ．を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ末端を平滑化し、さらに制限酵素ＳａｃＩで処理して生じた約２０００ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により切り出した。これらをｐＢＡＤ／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ  ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩベクターにライゲーションし、ｐＢＡＤ／Ｐ．Ｃ．を得た。
（４）各プラスミドの説明
ｐＢＡＤ／Ｐ．Ｃ．、ｐＢＡＤ／３−０、ｐＢＡＤ／５５７−５７４においては、下記の表１１に示すＯＤＤドメインと、Ｈｉｓ残基×６、ＴＡＴ、ＮＬＳ及びｌａｃＺ遺伝子がタンパク質レベルで融合されている（図６参照）。
尚、表１１中、「ａ．ａ．」は、ＯＤＤドメインのアミノ酸残基の位置を示す。表１１中、例えばｐＡＤ／３−０は、ＯＤＤドメインの５４８位から６０３位をコードするＤＮＡ鎖と、Ｈｉｓ、ＮＬＳ、ＴＡＴ及びｌａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡ鎖を融合させたことを示している。
また、図６は、各融合タンパク質の構造を表す概略図である。本発明は、図６に示すような活性領域を持つように、各融合タンパク質を発現するプラスミドを構築した。
図６中、「６×Ｈｉｓ」はヒスチジン残基を６つ連続させた領域を、「ＮＬＳ」はＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ由来の核移行シグナルを、「ＴＡＴ」はＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列（Ｃｅｌｌ；５５，１１７９（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ；９１，６６４（１９９４））を、「ＯＤＤ」はヒトＨＩＦ−１α遺伝子由来の酸素誘導分解ドメイン（Ｏｘｇｅｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）を、「β−ｇａｌ」はＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子産物を表している。Ｎ．Ｃ．β−ｇａｌは野生型β−ｇａｌタンパク質を用いた。また、３−０β−ｇａｌ及び５５７−５７４β−ｇａｌに融合されたヒトＨＩＦ−１α遺伝子由来の酸素誘導分解ドメインは、それぞれＨＩＦ−１α５４８ａ．ａ．−６０３ａ．ａ．、ＨＩＦ−１α５５７ａ．ａ．−５７４ａ．ａ．である。
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また、各プラスミドの全塩基配列は表１２のように対応している。
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また、各プラスミド中の遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は表１３のように対応している。
2002099104.tif 000026
（実施例４）融合タンパク質のＣｂｚ−ＬＬＬ依存的安定性の確認
＜１＞融合タンパク質の精製
３種の発現ベクターａ）ｐＢＡＤ／Ｐ．Ｃ．、ｂ）ｐＢＡＤ／３−０、ｃ）ｐＢＡＤ／５５７−５７４を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＭＧ１９４株を形質転換した。翌日、それぞれの培養プレートからシングルコロニーをつつき取り、１０ｍｌのＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に植菌して、３７℃で振とう培養した。さらに翌日、それぞれ１ｍｌのオーバーナイトカルチャーを２００ｍｌのＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に加え、３７℃で振とう培養した。培養液の吸光度ＯＤ６００が０．５に達したところで、それぞれの培養液に０．４ｇのＬ−（＋）−アラビノースを添加して融合タンパク質の発現を誘導し、翌日まで培養を続けた。
次に、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、付属のプロトコールに従って融合タンパク質の粗精製を行った。粗精製を終えた融合タンパク質の精製度をさらに高めるため、また、融合タンパク質の濃度を高めるため、さらに緩衝液をＰＢＳに置換する目的で、ＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ−１００（ＡＭＩＣＯＮ）を付属のプロトコール通りに使用した。
＜２＞
以下の操作において、Ａ５４９（ヒト肺癌由来）細胞は、通常培地として５％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（明治製薬）を含むダルベッコＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。
１×１０４個のＡ５４９細胞を２４穴マルチウェルデッシュにまき、翌日、無血清Ｄ−ＭＥＭで各ウェルを２回洗浄した。これに下記表１４の様に融合タンパク質を添加し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで３０分培養した。
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尚、表１４中、※１として、Ｎ．Ｃ．タンパク質には野生型β−ｇａｌタンパク質を用いたことを特記する。また、「Ｕ」は３７℃、ｐＨ＝７．５の条件下で１分間に１μＭのＯＮＰＧ（ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ｂ−Ｄ−ｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）をｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌとｇａｌａｃｔｏｓｅに分解するために必要なタンパク量を示す。
そして、再度無血清Ｄ−ＭＥＭで各ウェルを２回洗浄した後、ウェルＮｏ．１、３、５、７には通常培地で、ウェルＮｏ．２、４、６、８には低酸素状態におかれた細胞内と同様にユビキチン−プロテアゾーム系を阻害する目的で、Ｃｂｚ−ＬＬＬ（文献３）を５０μＭ含む培地で２０時間培養した。その後、Ｘ−ｇａｌ染色（文献１２）を行った。
その結果、Ｎ．Ｃ．タンパク質を添加したＡ５４９細胞は、Ｃｂｚ−ＬＬＬの有無に関わらず青く染色された細胞は見られなかった。一方、Ｐ．Ｃ．タンパク質を添加したＡ５４９細胞は、Ｃｂｚ−ＬＬＬの有無に関わらず全ての細胞が青く染色された（図７Ａ、Ｂ参照）。これは、添加したタンパク質に融合させたＨＩＶ由来のＴＡＴ領域の活性によって融合タンパク質が細胞内に取り込まれた事を表わしている。
３−０タンパク質を添加したＡ５４９細胞はＣｂｚ−ＬＬＬを添加した場合に、有意に濃く染色された細胞が見られた（図７Ｃ、Ｄ参照）。これは、３−０タンパク質に融合させたＯＤＤ領域（ＨＩＦ−１αの５４８ａ．ａ．−６０３ａ．ａ）の活性によって、Ｃｂｚ−ＬＬＬ存在下で融合タンパク質の安定性が増した事を表わしている。５５７−５７４タンパク質を添加し同様の実験を行った場合にも、３−０タンパク質で得られた結果と同じ傾向の結果を得る事ができた。
尚、図７中、Ａ、Ｂは、Ｐ．Ｃ．β−ｇａｌを導入したものであり、Ｃ、Ｄは３−０β−ｇａｌを添加したものである。また、Ａ、ＣはＣｂｚ−ＬＬＬを含まない培地で培養した場合であり、Ｂ、ＤはＣｂｚ−ＬＬＬを含む培地で培養した場合である。
（実施例５）融合タンパク質の酸素濃度依存的安定性の確認
上記、実施例４において、低酸素状態を形成する形成方法を、以下で示すように変えた他は、実施例４と同様な方法を用いてＸ−ｇａｌ染色を行った。
融合タンパク質を添加し、その３０分後融合タンパク質を除去する。次に、有酸素条件とする場合には２０％Ｏ２ガスを、一方低酸素条件とする場合には１％Ｏ２ガスをそれぞれ培地に通気し、約２４時間培養する。そして、最後にＸ−ｇａｌ染色を行う。
その結果、Ｐ．Ｃ．タンパク質を添加したＡ５４９細胞は、酸素濃度に係わらず、全ての細胞が青く染色された（図８Ａ、Ｂ参照）。
一方、３−０タンパク質を添加したＡ５４９細胞は１％Ｏ２ガスを通気した低酸素状態とした場合に、有意に濃く染色された細胞が見られた（図８Ｃ、Ｄ参照）。
尚、図８中、Ａ、Ｂは、Ｐ．Ｃ．β−ｇａｌを導入したものであり、Ｃ、Ｄは３−０β−ｇａｌを添加したものである。また、Ａ、Ｃは２０％Ｏ２ガスを通気した培地（有酸素条件）であり、Ｂ、Ｄは１％Ｏ２ガスを通気した培地（低酸素条件）である。
（実施例６）融合タンパク質の酸素濃度依存的安定性の確認
＜１＞ＴＡＴ−ＯＤＤ−Ｃａｓｐａｓｅ３融合タンパク質発現ベクター（ｐＧＥＸ／ＴＡＴ−ＯＤＤ３−０−Ｃａｓｐ３）の構築
まず、ｐＢＡＤ／３−０を鋳型とし、下記の２種類の合成オリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ＨＩＶ由来のＴＡＴシグナル配列とＨＩＦ−１α遺伝子由来の酸素誘導分解ドメイン（ＯＤＤ）がコードされているＤＮＡを増幅した。これを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで処理した後、ｐＧＥＸ−６Ｐ−３プラスミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの間に組み込み、ｐＧＥＸ／ＴＡＴ−ＯＤＤを構築した。
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一方、ヒト肺癌由来細胞株Ａ５４９のｃＤＮＡを鋳型とし、下記２種類の合成オリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ヒト由来Ｃａｓｐａｓｅ−３遺伝子を増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで処理した後、ｐＧＥＸ／ＴＡＴ−ＯＤＤのＥｃｏＲＩとＳａｌＩの間に組み込み、ＧＳＴタグをＮ末端に融合させたタンパク質ＧＳＴ−ＴＡＴ−ＯＤＤ−ｗｔ．Ｃａｓｐａｓｅ３を発現するプラスミドｐＧＥＸ／ＴＡＴ−ＯＤＤ３−０−ｗｔ．Ｃａｓｐ３を構築した。
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また、アポトーシス誘導活性を持たない変異Ｃａｓｐａｓｅ３（以下ｍｕｔ．Ｃａｓｐａｓｅ３）をＶｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ，Ａ．Ｍ．，Ｈｅｙｄｅｎ，Ｎ．Ｖ．，Ｌｉｓｓｙ，Ｎ．Ａ．，Ｒａｔｎｅｒ，Ｌ．ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．Ｋｉｌｌｉｎｇ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：２９−３３，１９９９．の文献に従って構築し、この構造遺伝子をＣａｓｐ−ｓｅｎｓｅ−ＥｃｏＲＩプライマーとＣａｓｐ−ａｎｔｉ−ＳａｌＩプライマーを用いたＰＣＲで増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで処理し、ｐＧＥＸ／ＴＡＴ−ＯＤＤのＥｃｏＲＩとＳａｌＩの間に組み込み、ｐＧＥＸ／ＴＡＴ−ＯＤＤ３−０−ｍｕｔ．Ｃａｓｐ３を構築した。
＜２＞ＴＡＴ−ＯＤＤ−ｗｔ．／ｍｕｔ．Ｃａｓｐａｓｅ３融合タンパク質の精製
ｐＧＥＸ／ＴＡＴ−ＯＤＤ３−０−ｗｔ．Ｃａｓｐ３およびｐＧＥＸ／ＴＡＴ−ＯＤＤ３−０−ｍｕｔ．Ｃａｓｐ３を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。翌日、それぞれの培養プレートからシングルコロニーをつつき、１０ｍｌのＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）食菌して３７℃で浸透培養した。
さらに翌日、１ｍｌのオーバーナイトカルチャーを２００ｍｌのＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に加え、３７℃でさらに浸透培養した。培養液の吸光度ＯＤ６００が０．５に達したところで、最終濃度が０．５ＭになるようにＩＰＴＧを添加し融合タンパク質の発現を誘導し、さらに翌日まで培養を続けた。
大量発現させたそれぞれの融合タンパク質の精製はＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及びＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、付属のプロトコールに従って行った。
＜３＞酸素濃度依存的なアポトーシス誘導活性の検討
以下の操作において、マウス胎児由来細胞株ＮＩＨ３Ｔ３は、通常培地として１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（明治製薬）を含むダルベッコＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。
１×１０５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を６穴マルチウェルディッシュにまき、ウェルＮｏ．４、５、６はＣｂｚ−ＬＬＬを最終濃度５０μＭになるように添加し、ウェルＮｏ．１、２、３には、Ｎｏ．４、５、６のウェルに入れたＣｂｚ−ＬＬＬと同量のｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を加えた。翌日、無血清Ｄ−ＭＥＭで各ウェルを２回洗浄した。これに下記表１５の様に融合タンパク質等を添加した。さらに２４時間ウェルＮｏ．１、２、３は２０％Ｏ２、ウェルＮｏ．４、５、６は１％Ｏ２の条件で培養し、最後に各融合タンパク質による酸素濃度に依存したアポトーシス誘導活性を観察した。
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その結果、下表１６の様にＴＡＴ−ＯＤＤ−ｗｔ．Ｃａｓｐａｓｅ３融合タンパク質を添加し、かつ低酸素培養した場合に、特に強いアポトーシスを観察する事ができた（ウェル番号６）（表１６において＋＋＋で示す）。ウェルＮｏ．４および５で観察されたわずかなアポトーシスは、ゲノム由来のＣａｓｐａｓｅ３の活性がＣｂｚ−ＬＬＬによってわずかに誘導された結果であると考えられる。
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また、この各ウェル毎のアポトーシスの観察結果を図９に示す。
これらの結果は、ＴＡＴ−ＯＤＤ−Ｃａｓｐａｓｅ３融合タンパク質が有酸素条件下に置かれた細胞内では分解され、一方、低酸素条件下に置かれた細胞内では安定化し、かつ活性化する事によってアポトーシスを誘導した事を示している。
産業上の利用の可能性
本発明により、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定化に関与する領域を同定することができた。
また、特定されたＨＩＦ−１αタンパク質の安定化に関与する領域を有するタンパク質を含む融合タンパク質であって、細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質を提供することができた。
また、特定されたＨＩＦ−１αタンパク質の安定化に関与する領域を有するタンパク質を含む融合タンパク質であって、細胞膜透過性、及び細胞内の酸素状態に依存した安定性を有する融合タンパク質を提供することができた。
本発明により、融合タンパク質を保持する細胞内において、酸素の多少に応じ所望のタンパク質の存在を調節することができるため、低酸素条件下の細胞を検出すること、及び低酸素条件下の細胞の生育を阻害すること等に利用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＣＨ／０−０の概略図を示す。
図２は、プラスミドｐＣＨ／０−０〜ｐＣＨ／４−０の概略図を示す。
図３は、プラスミドｐＣＨシリーズの概略図を示す。
図４は、プラスミドｐＣＨ／３−０（ΔＮＬＳ）、ｐＣＨ／５５７−５７４（ΔＮＬＳ）の概略図を示す。
図５は、Ｘ−ｇａｌ染色の結果を示す図（写真）である。
図６は、各融合タンパク質の構造を表す概略図を示す。
図７は、Ｘ−ｇａｌ染色の結果を示す図（写真）である。
図８は、Ｘ−ｇａｌ染色の結果を示す図（写真）である。
図９は、実施例６の酸素濃度に依存したアポトーシスの観察結果を示す図（写真）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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