(57)【要約】新規蛋白質及びそれをコードする遺伝子を提供する。腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有する、マウスあるいはヒト由来の新規な機械刺激応答チャネル蛋白質。該蛋白質をコードするＤＮＡ。該蛋白質を用いて陽イオンチャネル活性を亢進又は阻害する物質のスクリーニング方法。該蛋白質に対する抗体。高血圧症や糖尿病などの陽イオンチャネルの異常に基づく疾患の診断薬あるいは治療剤、又は該疾患に対する予防及び／又は治療剤探索のためのツールとして有用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有する蛋白質。
【請求項２】
マウス由来である、請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
配列表配列番号１記載のアミノ酸配列で示される、請求項２記載の蛋白質。
【請求項４】
請求項３記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列表配列番号２記載の塩基配列で示される、請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】
ヒト由来である、請求項１記載の蛋白質。
【請求項７】
配列表配列番号３記載のアミノ酸配列で示される、請求項６記載の蛋白質。
【請求項８】
請求項７記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
配列表配列番号４記載の塩基配列で示される、請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項３又は７記載の蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項１１】
請求項４、５、８、又は９記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１、２、３、６、又は７記載の蛋白質を用いて、陽イオンチャネルを亢進又は阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
請求項１、２、３、６、又は７記載の蛋白質に対する抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体である、請求項１３記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、腎臓に特異的に発現し、マウスあるいはヒト由来の新規な機械刺激応答チャネル蛋白質（ＳＡＣ１（マウス）及びｈＳＡＣ（ヒト））、それをコードするＤＮＡ、該蛋白質を用いて陽イオンチャネル活性を亢進又は阻害する物質のスクリーニング方法、及び該蛋白質に対する抗体に関する。
本発明の蛋白質、ＤＮＡ、及び蛋白質に対する抗体は、高血圧症や糖尿病などの陽イオンチャネルの異常に基づく疾患の診断薬あるいは治療剤、又は該疾患に対する予防及び／又は治療剤探索のためのツールとして利用することができる。なお、本発明においては、ＳＡＣ１及びｈＳＡＣなどの機械刺激応答チャネル蛋白質を、総称してＳＡＣと呼ぶことがある。
背景技術
イオンチャネルは、脂質二重層を基本構造とする生体膜を貫通して存在する膜内在性蛋白質であり、その内部にポア構造を有している。イオンチャネルは、その電気生理学的性質、すなわちゲーティング、コンダクタンス、イオン選択性などにより分類される。イオンチャネル分子は、複数のコンフォメーションをとり、ある状態（開状態）ではイオンの透過を許すが、別の状態（閉状態）ではそれを許さない。このようなコンフォメーション変化を「ゲートの開閉（ゲーティング；ｇａｔｉｎｇ）」と呼ぶ。このゲーティングを制御する因子としては、膜電位、低分子（リガンド）の結合、膜の伸張の３つが知られている。
電位依存性チャネルには、Ｎａ＋チャネル、Ｃａ２＋チャネル、Ｋ＋チャネルなど多くの例があるが、これらのチャネルの分子構造には、電荷の集合した領域、あるいは電位センサーがあり、これが膜の両側の電位差により力を受けて移動することによりコンフォメーション変化が起きるものと考えられる。リガンド感受性チャネルとは、細胞外から特異的なリガンド（ａｇｏｎｉｓｔ）が結合することにより活性化されるチャネルで、受容体内蔵チャネルと呼ばれる。これに対して、細胞内にあるセカンドメッセンジャーなどの低分子の結合により、開閉が制御されるチャネルがある。また、細胞内膜に存在するＩＰ３（イノシトール３リン酸）受容体（細胞質側からＩＰ３が結合すると開くＣａ２＋チャネル）もこの例である。機械刺激応答チャネルは、膜の伸張によりゲート開閉が制御されるイオンチャネルで、多くは伸張により開くので張力感受性チャネルと呼ばれる。このチャネルは、浸透圧調整や細胞の体積調節に関与していると考えられている。このイオンチャネルは筋紡錘のような伸展受容器に存在することは当然であるが、これまでに多種類の細胞で見出されている（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｃ．Ｅ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．，１１３，９３−１０７（１９９０）；Ｂｅａｒ，Ｃ．Ｅ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５８，Ｃ４２１−８（１９９０）；Ｃｅｍｅｒｉｋ，Ｄ．＆  Ｓａｃｋｉｎ，Ｈ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６４，Ｆ６９７−７１４（１９９３）；Ｌａｎｓｍａｎ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，８１１−３（１９８７）；Ｓａｃｋｉｎ，Ｈ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５３，Ｆ１２５３−６２（１９８７））。
また、４個の膜貫通部位をもつＴＷＩＫ１（ｔａｎｄｅｍ  ｏｆ  Ｐ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｗｅａｋ  ｉｎｗａｒｄ  ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ  Ｋ＋ｃｈａｎｎｅｌ）関連ＴＡＳＫ（ＴＷＩＫ−１  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｃｉｄ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ）をコードする哺乳動物のＫ＋チャネルが、機械刺激により開閉する性質を有することが示されている（Ｄｕｐｒａｔ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６，５４６４−７１，Ｐａｔｅｌ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，４２８３−９０）。
本発明者らは、物理的因子である熱に感受性であるバニロイド（Ｖａｎｉｌｌｏｉｄ）受容体が機械刺激応答チャネルであるという仮定に基づいて遺伝子クローニングを行い、バニロイドレセプター（Ｃａｔｅｒｉｎａ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８９，８１６−２４）に類似し、Ａｎｋｙｒｉｎ繰り返しと６個の膜貫通部位を有する張力により抑制される非選択的陽イオンチャネル（ＳＩＣ）をコードするｃＤＮＡを既に報告している（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，６３３０−５）。機械刺激応答チャネルは、機械的刺激をＣａ２＋流入に変換できるため、張力により活性化する（ｓｔｒｅｔｃｈ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ；ＳＡ）非選択的陽イオンチャネルは重要である。
発明の開示
本発明者らは、上述の状況に鑑み新規な機械応答チャネル蛋白質を鋭意探索した結果、腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有する蛋白質、すなわち、新規な機械刺激応答チャネル蛋白質を見出した。従って本発明は、腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有するマウスあるいはヒト由来の新規な機械刺激応答チャネル蛋白質（ＳＡＣ１（マウス）（Ｓｔｒｅｔｃｈ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）及びｈＳＡＣ（ヒト）（ｈｕｍａｎ  Ｓｔｒｅｃｈ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ））、それをコードするＤＮＡ、該蛋白質を用いて陽イオンチャネル活性を亢進又は阻害する物質のスクリーニング方法、及び該蛋白質に対する抗体を提供することを課題とする。
本発明は、腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有するマウスあるいはヒト由来の新規な機械刺激応答チャネル蛋白質（ＳＡＣ１（マウス）及びｈＳＡＣ（ヒト））に関する。又、該蛋白質をコードするＤＮＡに関する。又、該蛋白質を用いて陽イオンチャネル活性を亢進又は阻害する物質のスクリーニング方法に関する。又、該蛋白質に対する抗体に関する。該蛋白質、該ＤＮＡ、及び該蛋白質に対する抗体は、高血圧症や糖尿病などの陽イオンチャネルの異常に基づく疾患の診断薬あるいは治療剤、又は該疾患に対する予防及び／又は治療剤探索のためのツールとして利用することができる。
新規な膜チャネルの単離、同定および機能解析を行うためには、分子生物学的技術、細胞生物学的技術や電気生理学的技術などの高度な技術を必要とする。そこで、本発明者はこれらの技術を駆使して、マウス腎臓からＳＡ陽イオンチャネル（ＳＡＣ１）のｃＤＮＡを単離し、そのアミノ酸配列を決定した。これはＶａｎｉｌｌｏｉｄレセプターのスーパーファミリーに属し、腎臓の尿細管に局在していた。このＳＡＣ１を哺乳動物細胞系で発現させた。さらに、マウス由来のＳＡＣ１遺伝子を用いて、ヒトで相当するチャネル遺伝子を得た。
電気生理学的解析の結果、細胞内の遊離カルシウムはＳＡＣ１を発現する形質転換した細胞を機械的刺激することによって増加した。また、これは陰圧により活性化される単一のチャネルで、Ｇｄ３３＋によりブロックされ、陽イオンの通過に関しては非選択的であり、ＳＡＣ１でイオン透過性はＮａ＋＞Ｋ＋あった。細胞の逆転電位は細胞を膨らませることによってプラス側に偏位した。さらに、欠失変異体を発現させると、伸張に対してこのチャネルが不応答性となることから、ＳＡＣ１がＳＡチャネルとなりうることが示唆された。
上述のように本発明は、腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有するマウスあるいはヒト由来の新規な機械刺激応答チャネル蛋白質（ＳＡＣ１（マウス）及びｈＳＡＣ（ヒト））、及び該蛋白質をコードするＤＮＡに関する。本発明蛋白質は、以下のようにして得ることができる。即ち、マウス腎臓ｃＤＮＡライブラリーを用意し、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅することにより、ＳＡＣ１ｃＤＮＡを得ることができる。又、このＳＡＣ１ｃＤＮＡをプローブとしてヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをクローニングすることにより、ｈＳＡＣｃＤＮＡを得ることができる。マウス由来ＳＡＣ１は８７１アミノ酸残基からなる蛋白質で、ヒト由来ｈＳＡＣも８７１アミノ酸残基からなる蛋白質であった。これらはアミノ酸配列において９４．４％の同一性を示し、この顕著なホモロジーはＳＡＣ１が哺乳動物の細胞で構造的にも機能的にも共通した働きを行っていると考えられる。ｈＳＡＣをコードしているＤＮＡは、約１８Ｋｂの長さで、１４個のエクソンから構成され、染色体上の１２ｑ２４．１に存在する。
得られたマウスあるいはヒトのＳＡＣ遺伝子を適当なベクターに導入し、そのベクターを用いて宿主を形質転換することにより、マウスあるいはヒトのＳＡＣ蛋白質を得ることができる。宿主細胞としては、細菌、酵母、あるいは動物細胞等が挙げられる。特に動物細胞としては、ＨｅＬａ細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞、あるいはＣＯＳ−７細胞などを用いることが好ましい。又、細胞系の発現プラスミドの制御機能として、ウイルスのＰｏｌｙｏｍａ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０のプロモーターが用いられる。特に、動物細胞の発現系で利用性の高いプラスミドとして、ｐＣＭＶが好ましい（Ｔｈｏｍｓｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ，（１９８４）８１，６５９）。得られた蛋白質は、機械刺激に応答する膜結合蛋白質であり、高血圧あるいは糖尿病などの陽イオンチャネルの異常に基づく疾患の診断薬あるいは治療剤、又は該疾患に対する予防及び／又は治療剤探索のためのツールとして利用することができる。
又、本発明蛋白質あるいはそのフラグメントは、欠損ｈＳＡＣのＤＮＡハイブリダイゼーション診断に有用であり、ｈＳＡＣの変異体は高血圧症や糖尿病の研究に有用である。さらに、ＳＡＣのＤＮＡ及びその変異体の５’および３’末端部に他の蛋白質や合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を結合して融合蛋白質を作製することも、公知の技術で容易である。例えば、融合蛋白質が、前駆蛋白質として作製され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて機能したり、本来の機能に加えて標的組織等への指向性を持つようにすることもできる。
又、発現した蛋白質や変異体およびそれらのフラグメントを動物に免疫してポリクローナル抗体を得ることができる。また、免疫動物のリンパ球をミエローマ細胞と融合したハイブリドーマ細胞を用いてモノクローナル抗体を調製できる。
又、本発明蛋白質あるいはその変異体及び類縁体を用いて、チャネル蛋白質の関連する疾患の診断薬あるいは治療薬など、ＳＡＣにアゴニスト的およびアンタゴニスト的に作用する物質の探索に用いることができる。さらに、ＳＡＣのＤＮＡ配列情報が得られたことで、部分配列ＤＮＡやＲＮＡを調製することが容易になった。これらの部分ＤＮＡは、選択されるべき遺伝子にハイブリダイズする能力を持つことから、核酸のプローブとして利用される。種々の組織におけるｃＤＮＡ配列の検出に、これらのプローブが有効である。ＳＡＣを用いて作製したプローブで、種々の生物やそれらの組織からハイブリダイズする核酸を得ることができる。得られた核酸は、ＳＡＣと同じアイソタイプ、または新規性を示す蛋白質をコードする核酸も含む。又、作製されたプローブは、疾患の遺伝子診断に利用できる。プローブでハイブリダイズした患者のヌクレオチド配列を調べることで、疾患遺伝子の検出が可能である。さらに、本質的な治療法に用いる遺伝子治療薬の作製も含まれる。ＳＡＣや、その変異体、それらの誘導体のヌクレオチド配列をプラスミドや幹細胞に組み込み、投与することで、遺伝子治療剤として使用できる。
本発明蛋白質あるいはそれに対する抗体は、ヒト及び霊長動物に対して安全に投与されるものである。本発明蛋白質は、製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。医薬組成物の形態としては、注射用組成物、点滴用組成物、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。これらの製剤は、公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、安定剤、着色剤、界面活性剤、及び／又はその他の添加剤などを用いることにより、目的とする製剤とすることができる。注射用組成物の場合は、本発明蛋白質の薬理学的有効量、及び製剤学的に許容しうる賦形剤／賦活剤、例えばアミノ酸、糖類、セルロース誘導体、及びその他の有機／無機化合物などとの混合物としても良い。又、本発明抗体とこれらの賦形剤／賦活剤を用い注射剤を調製する場合は、必要に応じてｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加して常法によって各種注射剤とすることができる。
また、本発明のＤＮＡは、単独、リポソームに封入、あるいはレトロウィルスやアデノウィルス等の遺伝子治療用ベクターに組み込んで、遺伝子治療に用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
実施例
本発明を次の実施例によってより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１
ＳＡＣ１をコードするｃＤＮＡの単離
ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（ギブコ−ＢＲＬ社）を用いたグアニジンチオシアネート法により単離した。ｍＲＮＡはｐｏｌｙＡカラム（ファルマシア社）を用いて精製した。マウス腎臓のｃＤＮＡライブラリーは、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クローンテック社）を用いて調製した。ｃＤＮＡを、プライマーセット１（ＡＡ１３ｆ２（配列表配列番号５）及びｍＡ１３ｅｎｄ１（配列番号６）でＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社）を用いてＰＣＲ増幅した（９４℃３０秒、７０℃４分の１サイクルとして３０サイクル実施）。ネストプライマー（ＡＡ１３ｒ２（配列番号７））を合成し、５’ＲＡＣＥ法により５’末端を決定した。プライマーセット２（Ａ１３ｓｔ１（配列番号８）及びＡＡ１３ｒ１（配列番号９））でＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社）を用いて同条件でＰＣＲ増幅した。２種類のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅して得られたそれぞれのフラグメントを用いて、完全長を含有する領域をプライマーセット（Ａ１３ｓｔ１及びｍＡ１３ｅｎｄ１）を使ってＰＣＲ増幅した。ｃＤＮＡライブラリーから約３．２ＫｂのＳＡＣ１ｃＤＮＡを再クローニングした。クローニングしたｃＤＮＡをＴＡクローニングベクター（ＴＯＰＯ−ＸＬ；インビトロージェン社）にライゲートし、そのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを動物細胞発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ；ギブコ−ＢＲＬ社）にライゲートした。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉ  ｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｅｍｉｘを用いて、自動シークエンサー（モデル３７３−Ｓ；アプライドバイオインストゥルメンツ社）にてシークエンスした。ＳＡＣ１ｃＤＮＡは８７１アミノ酸をコードする２６１６ヌクレオチドであった。配列を配列表配列番号１（アミノ酸配列）及び配列番号２（塩基配列）で示す。ＳＡＣ１のｃＤＮＡを挿入したプラスミドをｐｍＳＡＣ１ＴＯＰＯと命名し、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（〒３０５−８５６６））に平成１１年（１９９９）１１月３０日に原寄託し、平成１２年（２０００）１１月１日に原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託へ移管請求をし、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４５として受領されている。
次に、３２Ｐ標識したＳＡＣ１ｃＤＮＡをプローブとしたノーザンハイブリダイゼーション（６５℃）により、ＳＡＣ１の各組織での発現を確認した。その結果、約３ＫｂのＳＡＣ１ｍＲＮＡは、腎臓にのみ発現していることが確認された（図１（ａ））。
又、ヒト由来ＳＡＣ（ｈＳＡＣ）をコードしているｃＤＮＡを単離するために、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーを３２Ｐ標識ＳＡＣ１ｃＤＮＡをプローブに用いて検索した。得られたクローンをベクターＭ１３ｍｐ１、Ｍ１３ｍｐ１９（宝酒造社）、及びｐＧＥＭ３Ｚ（プロメガ社）にそれぞれサブクローニングした後、上述と同様な方法で塩基配列を決定した。配列を配列表配列番号３（アミノ酸配列）及び配列番号４（塩基配列）に示す。
実施例２
抗体の調製と免疫染色
ポリエチレングリコールと結合した、ＳＡＣ１蛋白質のＣ末端部（８４４−８５３番目）の特異ペプチド（以下、Ｃ端ペプチドという）（配列表配列番号１０）に対する抗体を作製した。マウスＳＡＣ１蛋白質のＣ端ペプチドのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への結合は、Ｍａｅｄａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９８）２４８，４８５−４８９）に従って行った。即ち、ジクロロメタンに溶解した酸化ＰＥＧ（和光純薬社）に、１当量のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し０℃で攪拌した後、１０当量のエチレンジアミンを添加して一晩攪拌した。ろ液を溶媒留去して、得られた生成物を５０％酢酸に溶解した。これよりアミノ酸型ＰＥＧ（ａａＰＥＧ）をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムにて精製し、Ｎ末端アミノ基をＦｍｏｃ化してＦｍｏｃ−ａａＰＥＧを調製した。これをＲｉｎｋ樹脂（３００ｍｇ；渡辺化学社）に、ジイソプロピルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール法（Ｋｏｎｉｇ  ａｎｄ  Ｇｅｉｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．（１９７０）１０３，７８８−７９８，２０２４−２０３３）を用いて、Ｆｍｏｃ−ａａＰＥＧ、次いでＢｏｃ−ＰＬＤ（Ｐｍｃ）ＮＬＧＮＰＮＣ−ＯＨの順に導入した。脱Ｆｍｏｃ化後、樹脂をトリフルオロ酢酸／チオアニソール／アニソール／エタンジチオール（９４／２／２／２）で３時間処理することによって、Ｃ端ペプチド−ａａＰＥＧを切出した。ろ液にエーテルを添加して沈殿させた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣにて精製し、Ｃ端ペプチド−ａａ  ＰＥＧを４３ｍｇ得た。
フロイント完全アジュバントにてエマルジョンとした抗原（Ｃ端ペプチド−ａａＰＥＧ）１ｍｇを２羽のＮＺＷウサギの筋肉内に注射して免疫し、その後フロイント不完全アジュバントでエマルジョンとした同量の抗原を２週間毎に同様に免疫した。投与した４から８週間後の血清について、その抗体力価をＥＬＩＳＡにて測定した。コントロール血清よりも１００００倍高い力価を示した血清を分離した。これらから抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ファルマシア社）にて精製し、ＰｒｏｔＯｎキット（マルチプルペプチドシステム社）にてアフィニティー精製した。新鮮な腎臓スライスを５００倍希釈した抗体で染色した後、ＦＩＴＣラベルした抗ウサギＩｇＧ抗体（ダコ社）にて検出した。その結果、尿細管の基底膜が染色され、この部位にＳＡＣ１蛋白質が局在することが明らかになった（図１（ｂ）参照）。
実施例３
ｃＤＮＡ発現
緑色蛍光蛋白質を発現するプラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１；クローンテック社）をトランスフェクションのマーカーとして使用した。一過性発現のために、ＣＨＯ細胞を１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＨａｍＦ−１２培地（ギブコ−ＢＲＬ社）にて培養した。形質転換前日に、ＣＨＯ細胞１０５個をラット尾部コラーゲンでコートしたカバースリップを入れた３５ｍｍディッシュに添加した。翌日、室温で５分間インキュベートしたＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ社３μｌ）と無血清培地（９７μｌ）の混合液に、１回のトランスフェクション当たり、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ（ギブコ−ＢＲＬ社）に入れたＳＡＣ１プラスミド（１μｇ）とｐＥＧＦＰ−Ｎ１（１μｇ）を添加した。室温で１５分間インキュベートしたのちに、これを３ｍｌの血清添加培地を入れたディッシュに加えた。カバースリップ上で増殖させた細胞を、パッチクランプサンプルとして使用した。増殖とトランスフェクションには１０％ＦＣＳ含有培地を用いた。電気生理学的試験は２４時間目に開始し、蛍光測定は、トランスフェクション後４８時間に実施した。
実施例４
ＳＡＣ１発現細胞での蛍光測定
形質転換細胞は、実験開始前の２ないし３時間内に、無血清培地に溶解した１０μＭのｆｕｒａ−２ＡＭ（ドージン社）とインキュベートした。４８０ｎｍのＧＦＰ蛍光と３６０／３８０ｎｍのｆｕｒａ−２蛍光をダイクロイックオリンパスシステムミラー（メルリン社）をマニュアルで交換して視覚化した。４８０ｎｍの蛍光と３６０ｎｍおよび３８０ｎｍの蛍光のイメージを２秒毎に得た。解析のために目的のエリアの蛍光強度を算出した。細胞は１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）溶液中に３４℃で浸した。細胞に直接機械的ストレスを生じさせるために、丸い先端のガラスピペットを細胞に電気制御ミクロマニピュレーター（モデル５１７０；エッペンドルフ社）を用いて接触させた。明るい細胞（ＧＦＰ陽性）にガラスピペットを用いた機械刺激を与えた結果を、図２及び表１に示す。ｆｕｒａ−２蛍光比は、対照細胞と比べるとＳＡＣ１発現細胞で変化が認められたことから、本発明蛋白質は明らかな［Ｃａ２＋］ｉ（細胞内のカルシウムイオン濃度）の変動をもたらすチャネル蛋白質として機能していることが示された。
2001062915.tif 000002
実施例５
ＳＡＣ１発現細胞のシングルチャネル解析
パッチクランプの記録は、既報（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｓａｔｏ，Ｊ．，Ｋｕｔｓｕｗａｄａ，Ｋ．，Ｏｏｋｉ，Ｇ．ａｎｄ  Ｉｍａｉ，Ｍ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，６３３０−５）に従って行った。ＧＦＰ陽性細胞は、４９０ｎｍでの蛍光測定（ＣＡＭ２０００システム；ジャスコ社）にて検出した。１ｍｌ／ｍｌの溶液流速で還流されるマウントに細胞をセットした。マウントする前に、温度を制御するために溶液をＤＣ  ｓｕｐｐｌｙ（菊水電子工業社；モデルＬＰＤ）にて３４℃に加温した。浸漬溶液には、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，３ｍＭ  ＨＥＰＥＳを使用した。シングルチャネル解析において、電流はＥＰＣ−７パッチクランプ増幅器（リストエレクトロニック社）にて記録し、１０ＫＨｚでＤＡＴ記録計（ＤＡＴ−２００；ソニー社）にて保存した。解析には、５ＫＨｚのフィルターをかけた。開口確率を解析するために、記録をＦｅｔｃｈｅｘ（ソフトウェアーＡｘｏｎバージョン６．０）によりサンプリングした。データを１ｇｏｒ  ｖｅｒ  ２．０１とＰａｔｃｈ  Ａｎａｌｙｓｉｓｔ  ｖｅｒ  １．２１にて解析した。デジタルフィルターを２ＫＨｚで使用し、開口確率を電流分布解析で計算した。ＧｄＣｌ３添加時の開口確率を解析するために、シングルチャネル振幅を試薬非添加時にセットし、平均開口確率（Ｐｏ）を１０秒間の記録から決定した。ピペット圧はマノメーターで調節し、陰圧はマニュアルで変化させた。また、チャネル開口を調べるために、１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を用いたセルアタッチピペットを通して陰圧をかけた。その結果、発現細胞上の半数以上のパッチが陰圧にすることによってチャネル活性を示した。図３Ａのように、ＳＡＣ１チャネルは３０ｍｍＨｇ陰圧で急に開く。開口確率は突然に完全開口状態に達したが、この現象を確認するために徐々に吸引を行ったが（図３Ｂ）、開口に閾値が存在するかのようにチャネルが急に開いた。この閾値は一定で（３３±２．３ｍｍＨｇ）、再現的であった。電流−電圧を種々の溶液（塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウムまたは塩化カリウム）を用いてピペットで測定したが、大きな偏位は観察されなかった。シングルチャネルコンダクタンスをセルアタッチモードでコンダクタンス勾配で測定した。塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムまたは塩化カリウムに置換しても、これらのパラメーターに殆ど影響を与えなかったことから、このチャネルは陽イオンには非選択的であることが明らかとなった。圧力に対する異なる感受性を持つ個々のチャネルにおけるａｌｌ−ｏｒ−ｎｏｎｅ開口の蓄積は、伸張に伴うＳ字型の開口応答を示したが、圧力ＰｏはＢｏｌｚｍａｎｎ関数にフィットしなかった。ピペットに０．５μＭ  ＧｄＣｌ３を入れた時に応答は影響を受けなかったことから、機械刺激応答チャネル蛋白質としての機能を有することが示された（図３Ｃ）。
産業上の利用可能性
本発明により、腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有するマウスあるいはヒト由来の新規な機械刺激応答チャネル蛋白質（ＳＡＣ１（マウス）及びｈＳＡＣ（ヒト））、及びそれをコードするＤＮＡ、該蛋白質を用いた陽イオンチャネル活性を亢進又は阻害する物質のスクリーニング方法、及び該蛋白質に対する抗体が提供される。該蛋白質、該ＤＮＡ、及び該蛋白質に対する抗体は、高血圧症や糖尿病などの陽イオンチャネルの異常に基づく疾患の診断薬あるいは治療剤、又は該疾患に対する予防及び／又は治療剤探索のためのツールとして利用することができる。
寄託された生物材料への言及
イ．当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及びあて名
名  称：経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所
あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−３５６６）
ロ．イの機関に寄託した日付    平成１１年（１９９９）１１月３０日（原寄託日）
ハ．イの機関に寄託について付した受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４５
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１（ａ）は、ＳＡＣ１ｍＲＮＡ発現を全長ｃＤＮＡを用いて行ったノーザンブロット解析結果を示す。マウス組織から調製した全ＲＮＡ（２μｇ）を各レーンにアプライした。
図１（ｂ）は、腎臓組織を用いた免疫染色の結果を示す。染色された部分は白く表されている。
図２は、ＳＡＣ１発現細胞（ＧＦＰ陽性）のｔｏｕｃｈストレスに対する影響を調べた結果を示す。
図中、○は３８０ｎｍでの蛍光強度を、▲は、蛍光強度の比率（３６０ｎｍ／３８０ｎｍ）を、●は、３６０ｎｍでの蛍光強度をそれぞれ示す。
図３は、ＳＡＣシングルチャネルの伸張に対する応答結果を示す。
（Ａ）は、段階的な陰圧をかけたときのＳＡＣ１チャネルの代表的な結果を示す。
（Ｂ）は、徐々に陰圧をかけたときの結果を示す。
（Ｃ）は、ＧｄＣｌ３添加および非添加時にＳＡＣ１にかけた圧力とＰｏとの関係をそれぞれ示す。
図中、○は対照（ＧｄＣｌ３非添加時の圧力）を、△はＧｄＣｌ３  ０．５Ｍ添加時の圧力をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年4月4日(2002.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
マウス由来であり、腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有する蛋白質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
ヒト由来であり、腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有する蛋白質。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
図中、○は３８０ｎｍでの蛍光強度を、▲は、蛍光強度の比率（３６０ｎｍ／３８０ｎｍ）を、●は、３６０ｎｍでの蛍光強度をそれぞれ示す。
図３は、ＳＡＣシングルチャネルの伸張に対する応答結果を示す。
（Ａ）は、段階的な陰圧をかけたときのＳＡＣ１チャネルの代表的な結果を示す。
（Ｂ）は、徐々に陰圧をかけたときの結果を示す。
（Ｃ）は、ＧｄＣｌ３添加および非添加時にＳＡＣ１にかけた圧力とＰｏとの関係をそれぞれ示す。
図中、○は対照（ＧｄＣｌ３非添加時の圧力）を、△はＧｄＣｌ３  ０．５Ｍ添加時の圧力をそれぞれ示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例
本発明を次の実施例によってより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１
ＳＡＣ１をコードするｃＤＮＡの単離及びｈＳＡＣをコードするｃＤＮＡの単離
ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（ギブコ−ＢＲＬ社）を用いたグアニジンチオシアネート法により単離した。ｍＲＮＡはｐｏｌｙＡカラム（ファルマシア社）を用いて精製した。マウス腎臓のｃＤＮＡライブラリーは、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クローンテック社）を用いて調製した。ｃＤＮＡを、プライマーセット１（ＡＡ１３ｆ２（配列表配列番号５）及びｍＡ１３ｅｎｄ１（配列番号６）でＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社）を用いてＰＣＲ増幅した（９４℃３０秒、７０℃４分の１サイクルとして３０サイクル実施）。ネストプライマー（ＡＡ１３ｒ２（配列番号７））を合成し、５’ＲＡＣＥ法により５’末端を決定した。プライマーセット２（Ａ１３ｓｔ１（配列番号８）及びＡＡ１３ｒ１（配列番号９））でＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社）を用いて同条件でＰＣＲ増幅した。２種類のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅して得られたそれぞれのフラグメントを用いて、完全長を含有する領域をプライマーセット（Ａ１３ｓｔ１及びｍＡ１３ｅｎｄ１）を使ってＰＣＲ増幅した。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＨａｍＦ−１２培地（ギブコ−ＢＲＬ社）にて培養した。形質転換前日に、ＣＨＯ細胞１０５個をラット尾部コラーゲンでコートしたカバースリップを入れた３５ｍｍディッシュに添加した。翌日、室温で５分間インキュベートしたＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ社３μｌ）と無血清培地（９７μｌ）の混合液に、１回のトランスフェクション当たり、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ（ギブコ−ＢＲＬ社）に入れたＳＡＣ１プラスミド（１μｇ）とｐＥＧＦＰ−Ｎ１（１μｇ）を添加した。室温で１５分間インキュベートしたのちに、これを３ｍｌの血清添加培地を入れたディッシュに加えた。カバースリップ上で増殖させた細胞を、パッチクランプサンプルとして使用した。増殖とトランスフェクションには１０％ＦＣＳ含有培地を用いた。電気生理学的試験は２４時間目に開始し、蛍光測定は、トランスフェクション後４８時間に実施した。
実施例４
ＳＡＣ１発現細胞での蛍光測定
形質転換細胞は、実験開始前の２ないし３時間内に、無血清培地に溶解した１０μＭのｆｕｒａ−２ＡＭ（ドージン社）とインキュベートした。４８０ｎｍのＧＦＰ蛍光と３６０／３８０ｎｍのｆｕｒａ−２蛍光をダイクロイックオリンパスシステムミラー（メルリン社）をマニュアルで交換して視覚化した。４８０ｎｍの蛍光と３６０ｎｍおよび３８０ｎｍの蛍光のイメージを２秒毎に得た。解析のために目的のエリアの蛍光強度を算出した。細胞は３ｍＭヘペス緩衝液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中に３４℃で浸した。細胞に直接機械的ストレスを生じさせるために、丸い先端のガラスピペットを細胞に電気制御ミクロマニピュレーター（モデル５１７０；エッペンドルフ社）を用いて接触させた。明るい細胞（ＧＦＰ陽性）にガラスピペットを用いた機械刺激を与えた結果を、図２及び表１に示す。ｆｕｒａ−２蛍光比は、対照細胞と比べるとＳＡＣ１発現細胞で変化が認められたことから、本発明蛋白質は明らかな［Ｃａ２＋］ｉ（細胞内のカルシウムイオン濃度）の変動をもたらすチャネル蛋白質として機能していることが示された。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
2001062915.tif 000018
実施例５
ＳＡＣ１発現細胞のシングルチャネル解析
パッチクランプの記録は、既報（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｓａｔｏ，Ｊ．，Ｋｕｔｓｕｗａｄａ，Ｋ．，Ｏｏｋｉ，Ｇ．ａｎｄ  Ｉｍａｉ，Ｍ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，６３３０−５）に従って行った。ＧＦＰ陽性細胞は、４９０ｎｍでの蛍光測定（ＣＡＭ２０００システム；ジャスコ社）にて検出した。１ｍｌ／ｍｌの溶液流速で還流されるマウントに細胞をセットした。マウントする前に、温度を制御するために溶液をＤＣ  ｓｕｐｐｌｙ（菊水電子工業社；モデルＬＰＤ）にて３４℃に加温した。浸漬溶液には、３ｍＭヘペス緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を使用した。シングルチャネル解析において、電流はＥＰＣ−７パッチクランプ増幅器（リストエレクトロニック社）にて記録し、１０ＫＨｚでＤＡＴ記録計（ＤＡＴ−２００；ソニー社）にて保存した。解析には、５ＫＨｚのフィルターをかけた。開口確率を解析するために、記録をＦｅｔｃｈｅｘ（ソフトウェアーＡｘｏｎバージョン６．０）によりサンプリングした。データをＩｇｏｒ  ｖｅｒ  ２．０１とＰａｔｃｈ  Ａｎａｌｙｓｉｓｔ  ｖｅｒ１．２１にて解析した。デジタルフィルターを２ＫＨｚで使用し、開口確率を電流分布解析で計算した。ＧｄＣｌ３添加時の開口確率を解析するために、シングルチャネル振幅を試薬非添加時にセットし、平均開口確率（Ｐｏ）を１０秒間の記録から決定した。ピペット圧はマノメーターで調節し、陰圧はマニュアルで変化させた。また、チャネル開口を調べるために、１５０ｍＭＮａＣｌ溶液を用いたセルアタッチピペットを通して陰圧をかけた。その結果、発現細胞上の半数以上のパッチが陰圧にすることによってチャネル活性を示した。図３Ａのように、ＳＡＣ１チャネルは３０ｍｍＨｇ陰圧で急に開く。開口確率は突然に完全開口状態に達したが、この現象を確認するため


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
に徐々に吸引を行ったが（図３Ｂ）、開口に閾値が存在するかのようにチャネルが急に開いた。この閾値は一定で（３３±２．３ｍｍＨｇ）、再現的であった。電流−電圧を種々の溶液（塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウムまたは塩化カリウム）を用いてピペットで測定したが、大きな偏位は観察されなかった。シングルチャネルコンダクタンスをセルアタッチモードでコンダクタンス勾配で測定した。塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムまたは塩化カリウムに置換しても、これらのパラメーターに殆ど影響を与えなかったことから、このチャネルは陽イオンには非選択的であることが明らかとなった。圧力に対する異なる感受性を持つ個々のチャネルにおけるａｌｌ−ｏｒ−ｎｏｎｅ開口の蓄積は、伸張に伴うＳ字型の開口応答を示したが、圧力ＰｏはＢｏｌｚｍａｎｎ関数にフィットしなかった。ピペットに０．５μＭ  ＧｄＣｌ３を入れた時に応答は影響を受けなかったことから、機械刺激応答チャネル蛋白質としての機能を有することが示された（図３Ｃ）。
実施例６
イオンチャネル活性に影響を与える物質のスクリーニング
ＳＡＣ１発現細胞を用いて機械刺激による細胞内Ｃａ２＋濃度を指標としてチャネル活性に影響を与える物質のスクリーニングが可能である。実施例３に記載した同様な方法にて、１０５個のＣＨＯ細胞をｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ  １（１μｇ）で形質転換した。実施例４に記載した同様な方法にて蛍光測定を行う。すなわち、カバースリップ上で増殖させた形質転換細胞を試験開始２時間前に無血清培地に溶解した１０μＭのｆｕｒａ−２ＡＭと３７℃で１時間インキュベートする。細胞を測定緩衝液にて洗浄し、パーフュージョンチャンバーにセットする。測定緩衝液として、３ｍＭヘペス緩衝液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））を使用する。一定濃度の検体を添加した測定緩衝液に置換した後に、機械的ストレスを与えるために、ミクロマニピュレーターを用いてガラスピペットを細胞に接触させる。機械刺激を与えた際の３６０ｎｍと３８０ｎｍの蛍光を測定し、その比から細胞内Ｃａ２＋濃度変化を検出することによって、検体のイオンチャネル活性に与える効果を判定する。
産業上の利用可能性
本発明により、腎臓に特異的に発現し、機械刺激に応答して非選択的に陽イオンを細胞内に取り込む機能を有するマウスあるいはヒト由来の新規な機械刺激応答チャネル蛋白質（ＳＡＣ１（マウス）及びｈＳＡＣ（ヒト））、及びそれをコードするＤＮＡ、該蛋白質を用いた陽イオンチャネル活性を亢進又は阻害する物質のスクリーニング方法、及び該蛋白質に対する抗体が提供される。該蛋白質、該ＤＮＡ、及び該蛋白質に対する抗体は、高血圧症や糖尿病などの陽イオンチャネルの異常に基づく疾患の診断薬あるいは治療剤、又は該疾患に対する予防及び／又は治療剤探索のためのツールとして利用することができる。
寄託された生物材料への言及
イ．当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及びあて名
名  称：経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所
あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−３５６６）
ロ．イの機関に寄託した日付    平成１１年（１９９９）１１月３０日（原寄託日）




【国際調査報告】
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