(57)【要約】本発明は、椎間板ヘルニアの自然退縮の作用機序を分子レベルで解析することにより、椎間板ヘルニアの治療剤を提供する。血管形成を誘導する物質を投与して、ヘルニア組織に血管形成を誘導することによりヘルニアの自然退縮を促進させる。
2003000287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管形成を誘導する物質を有効成分として含有するヘルニア治療剤。
【請求項２】
血管形成を誘導する物質が、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βからなる群から選択される、請求項１に記載のヘルニア治療剤。
【請求項３】
血管形成を誘導する物質がＶＥＧＦである請求項２に記載のヘルニア治療剤。
【請求項４】
蛋白質分解酵素を併用する請求項１〜３のいずれか１項に記載のヘルニア治療剤。
【請求項５】
蛋白質分解酵素が、細胞外マトリクス分解酵素である請求項４に記載のヘルニア治療剤。
【請求項６】
有効成分としてＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群から選択される一の血管形成を誘導する物質並びにＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−１３からなる群から選択される一の蛋白質分解酵素を組み合わせてなる請求項５に記載のヘルニア治療剤。
【請求項７】
ヘルニア患部に直接投与する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘルニア治療剤。
【請求項８】
血管形成を誘導する物質と蛋白分解酵素を投与するヘルニアの治療方法。
【請求項９】
血管形成を誘導する物質と蛋白分解酵素を同時に投与する請求項８記載のヘルニアの治療方法。
【請求項１０】
血管形成を誘導する物質を患部に直接投与し、蛋白分解酵素を全身投与する請求項９記載のヘルニアの治療方法。
【請求項１１】
血管形成を誘導する物質と蛋白分解酵素を異なった時点で投与する請求項８記載のヘルニアの治療方法。
【請求項１２】
血管形成を誘導する物質を患部に直接投与し、蛋白分解酵素を全身投与する請求項１１記載のヘルニアの治療方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、血管形成を誘導する物質を有効成分として含有するヘルニア治療剤に関する。詳細には、椎間板ヘルニアの患部に投与して、脱出したヘルニアの自然退縮を促進することにより椎間板ヘルニアを治療する薬剤およびその薬剤を用いる椎間板ヘルニアの治療方法に関する。
従来の技術
脊椎体と脊椎体の間に存在する円盤状の軟骨体である椎間板は、内側の髄核とこれを取り囲む外側の線維輪から構成され、プロテオグリカン、アグリカン、ＩＩ型コラーゲンなどの軟骨成分からなる。椎間板は、主に加齢と共に生じる椎間板中の水の含量の減少により弾力性が失われ、線維輪、軟骨板の軟化、弱化が起きる（Ｌｉｐｓｏｎ  Ｓ．Ｊ．＆  Ｍｕｉｒ  Ｈ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２４（１９８１），ｐ．１２−２１）。このように椎間板変性は正常な加齢変化の一部分であり、７０歳までに８０％の椎間板が変性に陥ると報告されている（Ｐｏｗｅｌｌ  Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２（１９８６），ｐ．１３６６−１３６７）。
椎間板変性が原因と考えられている主要な骨格系の不具合は腰痛であり、非常に多くの人が腰痛を経験している。椎間板変性は、場合により椎間板が脊柱管に脱出し、椎間板ヘルニアを引き起こす。椎間板ヘルニア、特に腰椎椎間板ヘルニアは、腰痛症、坐骨神経痛の原因疾患としての頻度が高く、日本における最近の統計では腰椎椎間板ヘルニアが原因で入院治療を行っている割合は１０００人中７．４人と多く、また若年者から高齢者にまで広く発生する。しかしながら、椎間板ヘルニアのメカニズムについてはいまだ不明のことが多い。
一方、磁気共鳴画像法（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ：ＭＲＩ）は、椎間板ヘルニアを診断するために広く利用されている。特に、造影剤ガドリニウム−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）を用いることで椎間板ヘルニア組織の造影が増強され、より正確な診断が可能となっている（Ｋｏｍｏｒｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ．２３（１９９８），ｐ．６７−７３）。ＭＲＩによりヘルニア組織のより正確な造影が可能になったことで、椎間板ヘルニア部分、即ち脊柱管に脱出した椎間板の自然退縮がたびたび観察されるようになった（Ｋｏｍｏｒｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ．２１（１９９６），２２５−２２９）。ヘルニア塊は軟骨基質の中に新生血管の増生と多数のマクロファージを中心とした炎症性細胞の浸潤が認められることが報告されている（Ｈａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ  ２１（１９９６），６４７−６５２）。しかし、自然退縮のメカニズムは詳細には明らかにされていない。
発明が解決しようとする課題
本発明の課題は、椎間板ヘルニアの自然退縮の作用機序を分子レベルで解析し、これを促進する物質を明らかにすることで、椎間板ヘルニアの治療剤および治療方法を提供することである。
課題を解決するための手段
本発明者は、課題を解決するため鋭意研究した結果、成人の椎間板には血管が無いにもかかわらず、ヘルニア組織に血管が形成され、血管形成したヘルニア組織に多くのマクロファージが集まり、その後自然退縮が起こること、そして、血管形成を誘導する物質により椎間板組織に血管形成を生じさせうることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、椎間板組織およびマクロファージにおける、分子レベルにおける物質発現を詳細に調べた結果、血管形成を誘導する物質がヘルニアの自然退縮におけるキーとなる物質であることを見出した。
従って、本発明は血管形成を誘導する物質を有効成分として含有するヘルニア治療剤に関する。本発明において血管形成を誘導することが知られている薬剤はいかなるものでも本発明のヘルニア治療剤の有効成分として用いることができる。血管形成を誘導する物質としては、例えばＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，血管内皮細胞増殖因子）、ａＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，繊維芽細胞増殖因子）、ｂＦＢＦ、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，血小板由来増殖因子）、ＥＤＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，上皮増殖因子）、ＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，トランスフォーミング増殖因子）、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，腫瘍壊死因子）およびＩＬ−１β（インターロイキン）が挙げられる。血管形成を誘導する物質としては、好ましくはＶＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦ、より好ましくはＶＥＧＦである。
ヘルニアの自然退縮に関与すると考えられているＭＭＰ−３はストロメライシン−１（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１）とも呼ばれ、強力なプロテオグリカン分解酵素である。この蛋白分解酵素作用によって、軟骨性の細胞外基質が分解されヘルニアが退縮する。したがって、血管形成誘導物質によって血管形成を促進した後、蛋白分解酵素を投与することはより好ましいヘルニア治療となる。したがって、本発明の一態様は、血管形成を誘導する物質と蛋白分解酵素を併用する治療剤である。その蛋白分解酵素としては、医薬の分野で使用しうるあらゆる公知の蛋白質分解酵素を使用することができる。蛋白質分解酵素の例には、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７など）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）などのマトリクスメタロプロテゼアーゼ、パパイン、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、カルパイン等が挙げられる。好ましくは細胞外マトリクス分解酵素であるマトリクスメタロプロテゼアーゼであり、より好ましくはＭＭＰ−３またはＭＭＰ−７である。
好ましい態様において、本発明はＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群から選択される一の血管形成を誘導する物質並びにＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−１３からなる群から選択される一の蛋白質分解酵素を併用するヘルニア治療剤および治療方法に関する。
本発明のヘルニア治療剤は非経口的に投与される。例えば椎間板穿刺でレントゲン透視下に経皮的に穿刺針を進め、椎間板内に穿刺する。そこから、脱出椎間板ヘルニア方向に内筒を進めて脱出したヘルニアに選択的に穿刺して、本発明の薬剤を注入する。または硬膜外腔注射により投与することができる。本発明のヘルニア治療剤はこのように投与して、ヘルニア組織に血管形成を誘導することによりヘルニアの自然退縮を促進させることができる。
蛋白分解酵素は、血管形成誘導物質とともに投与すること、それよりも先に投与することも、後に投与することもできる。血管形成が誘導された時点で投与することは、治療法として優れている。蛋白分解酵素は、ヘルニア患部に直接投与するか、全身に投与することができる。全身投与の場合は、経口、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内投与など従来用いられるあらゆ方法を用いることができる。血管形成誘導物質と蛋白分解酵素を同時に投与する場合は、（ａ）血管形成誘導物質と蛋白分解酵素の両者をヘルニア患部に直接投与する方法、および（ｂ）血管形成誘導物質を患部に投与し、蛋白分解酵素を全身投与する方法がある。血管形成誘導物質と蛋白分解酵素を異なる時点で投与する場合も、（ａ）両者を直接投与する方法、および（ｂ）血管形成誘導物質を患部に投与し、蛋白分解酵素を全身投与する方法がある。
本発明のヘルニア治療剤の使用に際して、造影剤、好ましくは軟骨組織や液体の造影を増強させ得る造影剤（例えばＧｄ−ＤＴＰＡ等）を用いる磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により患者の神経圧迫の状態および部位並びに椎間板ヘルニアの程度を正確に診断することが好ましい。
従って、本発明の一態様は、
（ａ）椎間板ヘルニアの疑いがある患者に対してＭＲＩを実施し、
（ｂ）患者に椎間板ヘルニアが認められた場合には、その病態に応じて本発明の血管形成誘導物質をヘルニア患部に投与し、
（ｃ）必要に応じ蛋白分解酵素を投与して、ヘルニア組織の自然退縮を促進する椎間板ヘルニアの治療方法である。
本発明のヘルニア治療剤の投与量は、ヘルニアの程度、投与方法、患者の状態、血管形成誘導物質の種類等により異なる。血管形成誘導物質は患部に直接投与され、通常１回当たり約１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。投与回数は、１回から数回が望ましいが、血管形成の度合いを見てさらに多くすることができる。蛋白分解酵素を患部に直接投与する場合は、１回当たり約１μｇ〜１００ｍｇの範囲であるが、全身投与する場合は、約１〜３，０００ｍｇの範囲である。投与回数は、必要に応じて決めることができる。血管形成誘導物質を投与した後、蛋白分解酵素のみを数日から数ヶ月投与することもできる。その場合の１日当たりの投与量および投与回数は適宜決めることができる。
本発明を下記の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例
実施例１  椎間板ヘルニアの免疫組織学的観察
ヘルニア組織の検体としては、椎間板ヘルニアの患者（１０人；うち男性７人、女性３人；平均年齢３２．０歳［２１〜５１歳］）から外科手術治療の際に患者から摘出したものを用いた。摘出したヘルニア組織は、４％パラホルムアルデヒド中にて４℃で３時間固定し、パラフィンに包埋した。次いで検体のプレパレートを調製し、０．０３％サポニン含有リン酸緩衝液（Ｓ−ＰＢＳ）で洗浄し、メタノール中で０．６％過酸化水素で処理して内在性のペルオキシダーゼを失活させた。次に、抗第ＶＩＩＩ因子抗体、抗ＣＤ−１４抗体、抗ヒトＶＥＦＧ抗体、抗ヒトＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）抗体または抗ヒトＶＥＧＦ受容体−２（ＫＤＲ−ｆｌｋ−１）抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と共にインキュベートした。なお、各抗体はマウス抗体であり、ネガティブコントロールとしてはマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）を用いた。次に切片をＳ−ＰＢＳで洗浄し、ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｃｏ．）と共に１０分間インキュベートし、そしてペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを添加して５分間インキュベートして発色させた。
その結果、内皮細胞特異的マーカーである第ＶＩＩＩ因子陽性である血管内皮細胞がヘルニア組織中で多く観察され、ＣＤ−１４陽性細胞であるマクロファージが多数ヘルニア組織に浸潤していることが示された。内皮細胞特異的なマイトジェンであり、血管新生に重要な因子であるＶＥＧＦは全ての検体中で観察され、マクロファージと椎間板細胞の両方で発現していることが示された（図１ＡおよびＢ）。ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２は７つの検体において、血管内皮細胞でその発現が検出された（図１ＣおよびＤ）。なお、ネガティブコントロールのＩｇＧではいずれの検体でも発色が認められなかった（図１Ｅ）。また、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２について陽性の細胞は、脊柱管内の硬膜外腔中に脱出したヘルニア組織にて多く観察された。このことから、ＶＥＧＦなどの血管形成を誘導する物質がヘルニア組織中の血管形成に重要な役割を果たしていることが示される。
実施例２  椎間板ヘルニアモデル中における血管形成誘導因子の発現
実施例１から椎間板組織とマクロファージの間に相互作用があることが示されたため、両者を共培養した。その結果、本共培養系は、ヒト椎間板ヘルニアと同様な所見が観察され、急性期椎間板ヘルニアのインビトロモデルとして用いうることが示された。
１）マクロファージおよび椎間板組織
３％チオグリコール酸培地（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）を含有する２ｍｌのＰＢＳをマウスの腹腔内に注射した。４日後、腹膜洗浄により活性化したマクロファージを収集した。また、椎間板組織はマウスの尾骨から椎間板組織を採取した。
２）共培養
▲１▼直接培養系
採取した椎間板組織（５椎間板／３５ｍｍシャーレ）または腹膜のマクロファージ（１×１０６個／ｍｌ）を単独で、または共に、５０ｍｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を含有する５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中にて、５％  ＣＯ２、３７℃で２日間インキュベートした。
▲２▼トランスウェル培養系
細胞培養インサート［ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ］（８．０μｍ，Ｆａｌｃｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を６ウェルプレート（Ｃｏｒｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に置き、トランスウェルチャンバーを作成した。次いで、椎間板組織を細胞培養インサート中に移し、マクロファージはウェルの底に移した。ウェルに５０ｍｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅを含有する５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を添加し、椎間板組織とマクロファージを５％  ＣＯ２、３７℃で４日間共培養した。また、ＴＮＦ−αの効果を確かめるために、培地に抗ＴＮＦ−α中和抗体を添加して共培養実験を行った。
３）ウェスタンブロット法による分析
各培地を収集し、蛋白質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて総蛋白質量を定量した。また、培地試料（蛋白質量３２μｇ）を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミドゲル）に供し、蛋白質をニトロセルロース膜（Ｎｉｔｒｏ  ＭＥ，ＭＳＩ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）またはＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）にトランスファーした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％脱脂粉乳で膜をブロックし、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで、膜をビオチン化抗マウスＩｇＧと共に１時間インキュベートした後、洗浄し、そしてペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と１時間インキュベートした。ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて化学発光により免疫反応蛋白質を検出した。なお、ポジティブコントロールとして、組換え発現ＶＥＧＦを用いた。
４）ＲＴ−ＰＣＲによる分析
ＶＥＧＦの発現をＲＴ−ＰＣＲで検出した。また、コントロールとしてＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲを同時に行った。ＰＣＲには下記のプライマーを用いた：
［ＶＥＧＦ］
2003000287.tif 000003
［ＧＡＰＤＨ］
2003000287.tif 000004
ＶＥＧＦ、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡが存在すれば、それぞれ４９２ｂｐ、５６４ｂｐの断片が得られる。
▲２▼のトランスウェル培養系で単独培養または共培養した椎間板組織、マクロファージからそれぞれ修飾グアニジンイソチオシアネート法を用いて総ＲＮＡを抽出した。１μｇの総ＲＮＡをオリゴｄ（Ｔ）プライマー（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と６５℃で１０分間インキュベートし、次いで氷冷した。これにｃＤＮＡ合成反応緩衝液（最終濃度，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ）、ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ，Ｐｒｏｍｅｇａ）、リボヌクレアーゼインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｄＮＴＰｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＭＭＬＶ−逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡ合成反応を２分間煮沸して氷冷することにより停止させた。５μｌのｃＤＮＡをＰＣＲに供した。ｃＤＮＡ混合物に、１０ｐｍｏｌの５′、３′各プライマー、１０×緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，５０％  グリセロール，１．０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＭｇＣｌ２（１．５ｍＭ）、ｄＮＴＰ（０．２５ｍＭ）および１．５Ｕ  Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を添加した。ＰＣＲ反応は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、７２℃１分間を３０サイクル行った。ＰＣＲ後、１０μｌの反応液を２．０％アガロースゲル（１×ＴＢＥ）にて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で生成物を可視化した。
５）結果
▲１▼ウェスタンブロット分析
椎間板組織またはマクロファージを単独培養した場合には、産生されるＶＥＧＦレベルは非常に低いが、椎間板組織とマクロファージを共培養すると、直接共培養系、トランスウェル培養系のいずれにおいてもＶＥＧＦの産生が増大することが示された（図２）。また、培地中に抗ＴＮＦ−α中和抗体を添加すると、共培養の効果が強く阻害され、マクロファージと椎間板組織との相互作用にＴＮＦ−αが作用していることが示された（図２）。
▲２▼ＲＴ−ＰＣＲ分析
単独培養したマクロファージでもＶＥＧＦは発現しているが、椎間板組織と共培養することによりその発現が増加していることが示された（図３）。また、椎間板組織では単独培養で発現が認められるがマクロファージと共培養することにより、ＶＥＧＦの発現が顕著に増加していることが示される（図３）。この結果は、ウェスタンブロット法による分析の結果と一致するものである。
実施例３  インビトロ血管形成アッセイ
インビトロで血管新生を示す血管形成アッセイは、血管形成を刺激または阻害する物質をスクリーニングするために近年開発された（Ｂｉｓｈｏｐ  Ｅ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３（２０００），ｐ．３３５−３４４）。このアッセイ法を用いて、椎間板組織とマクロファージを培養した培地の血管形成活性を試験した。
内皮細胞と血管形成の極初期の皮膚繊維芽細胞を２４ウェルプレートに播種し、これに新しい培地と実施例２で得られた各培地との１：１混合物を添加して、１１日間インキュベートし、血管形成を観察した。なお、ポジティブコントロールとして組換えＶＥＧＦを、ネガティブコントロールとしてスラミン（ＴＣＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いた。インキュベート後、細胞を７０％エタノールで室温にて固定し、抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）抗体とＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いて形成された血管を染色した。
その結果、培地のみ、椎間板組織またはマクロファージを単独培養した培地においても血管形成は観察された（図４−Ａ，Ｂ，Ｃ）。しかし、これらと比較して椎間板組織とマクロファージを共培養した培地では、形成された血管ネットワークは著しく多かった（図４−Ｄ）。同様な結果がポジティブコントロールの組換えＶＥＧＦを添加したもので得られた（図４−Ｆ）が、ネガティブコントロールのスラミンでは血管形成がほとんど観察されなかった（図４−Ｅ）。また、共培養した培地を抗ＶＥＧＦ中和抗体で処理すると、その血管形成誘導作用が阻害されることが示された（図４−Ｇ）。さらにマクロファージとＣＤ−３１陽性細胞の数を計測したところ、共培養した培地では単独培養のものと比較してマクロファージの数は２．９倍、ＣＤ３１陽性細胞の数は２．３倍であった（図５）。これらの結果から、椎間板組織とマクロファージの共培養により、血管形成が顕著に促進されることが示された。
実施例４  椎間板ヘルニアモデル中における血管形成誘導因子の発現
実施例２と同様に椎間板組織とマクロファージを共培養し、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ，ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−３およびコントロールとしてのＧＡＰＤＨの発現を検出した。
ＰＣＲに用いたＶＥＧＦおよびＧＡＰＤＨのプライマーは、実施例２と同じである。ＴＮＦ−α、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−７のプライマーは以下のとおりである。
［ＴＮＦ−α］
2003000287.tif 000005
［ＭＭＰ−３］
2003000287.tif 000006
［ＭＭＰ−７］
2003000287.tif 000007
結果を図６に示した。共培養したマクロファージにおいてはＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、およびＭＭＰ−７の発現が３時間後確認され、ＭＭＰ−３の発現が１２時間後に確認された。共培養した椎間板組織では、ＶＥＧＦとＭＭＰ−３の発現が３時間後に確認され、ＴＮＦ−αおよびＭＭＰ−７の発現が６時間後に確認された。
実施例５  ＶＥＧＦによるＭＭＰ−３発現制御の確認
（１）目的
ヘルニア組織におけるＭＭＰ−３およびＭＭＰ−７の発現が、ＶＥＧＦによって制御されることを、ＶＥＧＦ中和抗体を用いて確認する。
（２）マウスマクロファージの採取
３％チオグリコレートを含有するＰＢＳの２ｍｌをマウスの腹腔内に注射し、４日後に腹腔液を採取し遠沈後活性型マクロファージを採取した。
（３）椎間板器官培養
マウス尾椎から軟部組織を取り除いた後に顕微鏡下で椎間板組織を採取した。細胞培養インサート［ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ］（８．０ｍｍ，ＦＡＬＣＯＮ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を６穴培養皿に置きインサート内に尾椎椎間板を、培養皿底面にマクロファージ（１Ｘ１０６／ｍｌ）を置いて共培養を行った。また、培養開始から６時間毎に抗−ＶＥＧＦ抗体（１ｎｇ／ｍＬ）を投与し、培養開始から３、６、１２、１８、２４時間毎に椎間板及びマクロファージそれぞれから総ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲ法を行ってＶＥＧＦ，ＭＭＰ−３，ＭＭＰ−７の発現を検討する。また、培養当初から抗ＶＥＧＦ抗体（１ｎｇ／ｍＬ）を投与して１２時間培養した後、組替ＶＥＧＦ（１ｎｇ／ｍＬ）を投与し、椎間板及びマクロファージにおけるＶＥＧＦ，ＭＭＰ−３，ＭＭＰ−７の発現を経時的に検討する。
（４）結果
ＶＥＧＦの中和抗体を投与すると、ＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルでの発現は認められるものの、培養開始から１２時間後には発現が増強してくるＭＭＰ−３の発現は抑制される。一方、ＶＥＧＦの中和抗体を投与したものに組替ＶＥＧＦを投与すると、ＭＭＰ−３の発現の抑制が解除される。このことにより、ＭＭＰ−３の発現はＶＥＧＦと重要な関連を持つことが証明される。
発明の効果
本発明によれば、ヘルニア組織における血管形成は椎間板ヘルニアの自然退縮において重要な役割を果たしており、さらに当該組織の血管形成は、血管形成誘導しうる物質、即ち血管形成刺激活性を有する物質により顕著に促進されることが示された。このような物質を有効成分として含有する本発明のヘルニア治療剤は、椎間板ヘルニアの自然退縮を促進することによりこれを治療しうるものであり、非常に有用である。
【配列表】
2003000287.tif 000008
2003000287.tif 000009
2003000287.tif 000010
2003000287.tif 000011
【図面の簡単な説明】
図１．  ヒト椎間板ヘルニア組織の組織免疫学的分析の結果を示す顕微鏡写真であり、ヘルニア組織が抗ヒトＶＥＧＦ抗体（Ａ，Ｂ）、抗ＶＥＧＦＲ−１抗体（Ｃ）、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体（Ｄ）で染色されるが、コントロールのＩｇＧでは染色されないことを示す。
図２．  椎間板組織とマクロファージの共培養によるＶＥＧＦ蛋白質の発現をウェスタンブロット法で分析した結果を示す図であり、共培養（Ｍ−Ｄ（１），Ｍ−Ｄ（２））ではＶＥＧＦの発現が増加するが、単独培養では増加が観察されず、抗ＴＮＦ−α抗体処理によりＶＥＧＦの発現が阻害されることを示す。
図３．  椎間板組織とマクロファージの共培養によるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示す図であり、マクロファージでは共培養により発現が増加し、椎間板組織では発現が誘導されることを示す。
図４．  インビトロ血管形成アッセイの結果を示す顕微鏡写真であり、共培養の培地（Ｄ）、同様に組換えＶＥＧＦ（Ｆ）により血管形成が強く刺激されるが、抗ＶＥＧＦ中和抗体によりその作用が阻害されることを示す。
図５．  インビトロ血管形成アッセイにおいて、コントロールの培地のみ（Ｍｅｄ）、またはマクロファージ（Ｍ）、椎間板組織（Ｄ）の単独培養の培地、もしくはこれらの共培養の培地（Ｍ−Ｄ）を用いたＣＤ３１陽性細胞数を示すグラフである。また、共培養の培地に抗ＶＥＧＦ抗体を添加したもの（αＶＥＧＦ）、ポジティブコントロール（Ｃ（Ｐ））として組換えＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびネガティブコントロール（Ｃ（Ｎ））としてスラミン（１００ｍＭ）を用いた。データはマンホイットニー検定を用いて分析し、平均ＳＤとして示した。共培養（Ｍ−Ｄ）の有意差：Ｐ＜０．０１
図６．  椎間板組織とマクロファージを共培養した場合の、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−３、およびコントロールとしてのＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を、培養開始からの時間で比較できるように並べて示す図である。図中＜Ｃｏ−ＭΦ＞は共培養したマクロファージを意味し、＜Ｃｏ−Ｄｉｓｃ＞は共培養した椎間板組織を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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