(57)【要約】一般式：2002000621.tif 000061（式中、Ｒ２０は−ＯＣＨ２ＣＯＯＨ等、Ｒ２１は−ＣＯＣＯＮＨ２等、Ｒ２２はＣ４−Ｃ６アルキル、Ｒ２３は−ＣＨ２−Ｒ１８（Ｒ１８はアリール等）、Ｒ２４は、水素原子またはＣ１−Ｃ６アルキル）等で示される化合物、その光学活性体、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物がＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有することを見出した。
2002000621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
2002000621.tif 000049
（式中、Ａ環は以下の（ａ）〜（ｃ）で表わされる環：
2002000621.tif 000050
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素原子、非妨害性置換基、または−（Ｌ１）−（酸性基）（式中、Ｌ１は酸性基との連結基を示し、酸性基との連結基の長さは１〜５である）。ただし、Ｒ１またはＲ２のどちらか一方は−（Ｌ１）−（酸性基）である。；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、非妨害性置換基、炭素環基、非妨害性置換基で置換された炭素環基、複素環基、または非妨害性置換基で置換された複素環基）；
−Ｂ−は以下の（ｄ）または（ｅ）で表わされる基：
2002000621.tif 000051
（式中、Ｒ５は（ｆ）Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、炭素環基、または複素環基、（ｇ）１またはそれ以上、それぞれ独立して、非妨害性置換基から選択される基によって置換された（ｆ）で示した基、または−（Ｌ２）−Ｒ８（式中、Ｌ２は水素原子、窒素原子、炭素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択される１〜１８原子の２価の連結基；Ｒ８は（ｆ）または（ｇ）から選択される基）から選択される基；
Ｒ６は、置換基を有していてもよいＣ４−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルＣ１−Ｃ４アルキル、またはアリールＣ１−Ｃ４アルキル；
ＲＡは、式：
2002000621.tif 000052
（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；
ＸおよびＹはそれぞれ独立して酸素原子または硫黄原子；
Ｚは−ＮＨ２または−ＮＨＮＨ２）で表わされる基；
ただし、Ａ環が（ａ）である場合は、−Ｂ−は（ｅ）である）
で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子または−（Ｌ３）−Ｒ１１（式中、Ｌ３は−ＯＣＨ２−、−ＳＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、または−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）−、Ｒ１１は式：
2002000621.tif 000053
（式中、Ｒ３８はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、またはＣ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン、置換されてもよいアミノ若しくはニトロで置換されてもよいアリール、））；
Ｒ２が水素原子または−（Ｌ４）−Ｒ１２（式中、Ｌ４は式：
2002000621.tif 000054
（式中、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリールＣ１−Ｃ１０アルキル、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、またはハロゲン）、Ｒ１２は−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）；ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではない）である請求の範囲第１項記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項３】
Ｒ３が水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、アリール、または複素環基であり、Ｒ４が水素原子またはハロゲンである請求の範囲第１項記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項４】
Ｒ５が−（ＣＨ２）１−６−Ｒ１５（Ｒ１５は式：
2002000621.tif 000055
（式中、ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｍ、およびｏはそれぞれ独立して０〜２の整数、Ｒ１６およびＲ１７はそれぞれ独立してハロゲン、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、アリールオキシ、およびＣ１−Ｃ１０ハロアルキルから選択される基、αは酸素原子または硫黄原子、βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−、γは酸素原子または硫黄原子、ｃ、ｉ、およびｐは０〜５の整数、ｅは０〜７の整数、ｇは０〜４の整数、ｋおよびｎはそれぞれ独立して０〜３の整数）で表わされる基である請求の範囲第１項記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項５】
Ｒ５が−ＣＨ２−Ｒ１８（Ｒ１８は式：
2002000621.tif 000056
（式中、βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−；Ｒ１９は水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；Ｅは単結合、−ＣＨ２−、または−Ｏ−）で表わされる基である）で示される請求の範囲第４項記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項６】
Ｒ１が−ＯＣＨ２ＣＯＯＨまたは−ＯＣＨ２ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ３８（式中、Ｒ３８はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１ハロアルキルまたはアリール）である請求の範囲第１項記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項７】
Ｒ２が水素原子である請求の範囲第１項記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項８】
Ｒ６がＣ４−Ｃ６アルキルである請求の範囲第１項記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項９】
ＲＡが−ＣＨ２ＣＯＮＨ２または−ＣＯＣＯＮＨ２である請求の範囲第１項記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項１０】
一般式（ＩＩ）：
2002000621.tif 000057
（式中、Ｒ２０は、−ＯＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＯＮＨＳＯ２ＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＯＮＨＳＯ２Ｃ６Ｈ５；
Ｒ２１は、−ＣＯＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、または−ＣＨ２ＣＯＮＨＮＨ２；
Ｒ２２は、Ｃ４−Ｃ６アルキル；
Ｒ２３は、−ＣＨ２−Ｒ１８（Ｒ１８は式：
2002000621.tif 000058
（式中、βは−（ＣＨ２）１−６−；Ｒ１９は水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；Ｅは単結合、−ＣＨ２−または−Ｏ−）
Ｒ２４は、水素原子またはＣ１−Ｃ６アルキルで表わせられる基）で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項１１】
一般式（ＩＩＩ）：
2002000621.tif 000059
（式中、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、およびＲ２４は請求の範囲第１０項と同意義）で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項１２】
一般式（ＩＶ）：
2002000621.tif 000060
（式中、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、およびＲ２４は請求の範囲第１０項と同意義）で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項１３】
請求の範囲第１項〜第１２項のいずれかに記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１４】
請求の範囲第１項〜第１２項のいずれかに記載の化合物を有効成分として含有するＸ型ｓＰＬＡ２阻害剤。
【請求項１５】
請求の範囲第１項〜第１２項のいずれかに記載の化合物を有効成分として含有する癌、肝硬変、アルツハイマー病および／または動脈硬化の予防または治療剤。
【請求項１６】
癌、肝硬変、アルツハイマー病および／または動脈硬化を治療するための医薬を製造するための請求の範囲第１項〜第１２項のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１７】
請求の範囲第１項〜第１２項のいずれかに記載の化合物の治療上効果を示す量を人を含む哺乳動物に投与することからなる、癌、肝硬変、アルツハイマー病および／または動脈硬化による影響を緩和するための哺乳動物を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｘ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物に関する。
背景技術
ｓＰＬＡ２阻害剤に関しては、ＥＰ−６２０２１４（特開平７−０１０８３８、ＵＳ−５５７８６３４）、ＥＰ−６２０２１５（特開平７−０２５８５０、ＵＳ−５６８４０３４）、ＥＰ−６７５１１０（特開平７−２８５９３３、ＵＳ−５６５４３２６）、ＷＯ９６／０３１２０（特開平１０−５０５３３６）、ＷＯ９６／０３３７６（特開平１０−５０３２０８、ＵＳ−５６４１８００）、ＷＯ９６／０３３８３（特開平１０−５０５５８４）、ＷＯ９７／２１６６４（ＥＰ−７７９２７１）、ＷＯ９７／２１７１６（ＥＰ−７７９２７３）、ＷＯ９８／１８４６４（ＥＰ８３９８０６）、ＷＯ９８／２４４３７（ＥＰ８４６６８７）、ＷＯ９８／２４７５６、ＷＯ９８／２４７９４、ＷＯ９８／２５６０９、ＷＯ９９／５１６０５、ＷＯ９９／５９９９９等に記載の化合物、パラブロモフェナシルブロマイド、メパクリン、マノアライド、チエロシンＡ１等が知られているが、これらのｓＰＬＡ２阻害剤がＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有するとの報告はない。
発明の開示
本発明は、Ｘ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物を提供する。
また、本発明者らは、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用い、各病理組織におけるＸ型ｓＰＬＡ２の発現を調べ、癌組織、肝硬変患者由来の肝臓組織中の偽小葉、およびアルツハイマー患者由来の大脳組織中の神経細胞群の一部（老人班や神経原繊維変化部位）においてＸ型ｓＰＬＡ２が高発現していることを確認した。
各組織の免疫組織化学的解析は以下に示す手順で行なった。まず、健常成人組織ならびに癌患者由来の癌組識から作成したスライドに、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を加え、数時間反応させた。次に、標識等の手段により、Ｘ型ｓＰＬＡ２の発現を可視化し、Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルを検出し、組織中のＸ型ｓＰＬＡ２の発現を調べた。その結果、癌組織から作成したスライドに、Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルが検出され、癌組織において、Ｘ型ｓＰＬＡ２が高発現していることが示唆された。
さらに、本発明者らはＸ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験を行った。すなわち、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質を数時間反応させ、その後上記と同様の操作を行い、Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルを調べた。その結果、癌組織から作成したスライドにおいて、Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルは消失した。
以上より、ヒト癌組織において、Ｘ型ｓＰＬＡ２が高発現していることを確認した。同様にして、肝硬変患者由来の肝臓組織中の偽小葉、およびアルツハイマー患者由来の大脳組織中の神経細胞群の一部（老人班や神経原繊維変化部位）Ｘ型ｓＰＬＡ２が高発現していることを確認した。
さらに、本発明者らは、癌細胞におけるＸ型ｓＰＬＡ２によるオレイン酸遊離に対するｓＰＬＡ２阻害剤による阻害効果を調べた。その結果、ｓＰＬＡ２阻害剤が、癌細胞におけるＸ型ｓＰＬＡ２によるオレイン酸遊離を有意に抑制することを確認した。
一方、ＰＧＥ２が癌の発生と綿密な関係を有することは　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５９，５０９３−５０９６，１９９９に記載されている。そこで本発明者らは、癌細胞におけるＸ型ｓＰＬＡ２によるＰＧＥ２産生作用に対するｓＰＬＡ２阻害剤による阻害効果を調べた。その結果、ｓＰＬＡ２阻害剤が、癌細胞におけるヒトＸ型ｓＰＬＡ２によるＰＧＥ２産生作用を有意に抑制することを確認した。
さらに、本発明者らは、単離ヒトリポタンパク質からＸ型ｓＰＬＡ２による脂肪酸遊離に対するｓＰＬＡ２阻害剤による阻害効果を調べた。その結果、ｓＰＬＡ２阻害剤が、単離ヒトリポタンパク質におけるＸ型ｓＰＬＡ２による脂肪酸遊離を有意に抑制することを確認した。
本発明者らは、以下の本発明を完成した。
本発明は、Ｉ）一般式（Ｉ）：
2002000621.tif 000003
（式中、Ａ環は以下の（ａ）〜（ｃ）で表わされる環：
2002000621.tif 000004
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素原子、非妨害性置換基、または−（Ｌ１）−（酸性基）（式中、Ｌ１は酸性基との連結基を示し、酸性基との連結基の長さは１〜５である）。ただし、Ｒ１またはＲ２のどちらか一方は−（Ｌ１）−（酸性基）である。；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、非妨害性置換基、炭素環基、非妨害性置換基で置換された炭素環基、複素環基、または非妨害性置換基で置換された複素環基）；
−Ｂ−は以下の（ｄ）または（ｅ）で表わされる基：
2002000621.tif 000005
（式中、Ｒ５は（ｆ）Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、炭素環基、または複素環基、（ｇ）１またはそれ以上、それぞれ独立して、非妨害性置換基から選択される基によって置換された（ｆ）で示した基、または−（Ｌ２）−Ｒ８（式中、Ｌ２は水素原子、窒素原子、炭素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択される１〜１８原子の２価の連結基；Ｒ８は（ｆ）または（ｇ）から選択される基）から選択される基；
Ｒ６は、置換基を有していてもよいＣ４−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルＣ１−Ｃ４アルキル、またはアリールＣ１−Ｃ４アルキル；
ＲＡは、式：
2002000621.tif 000006
（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；
ＸおよびＹはそれぞれ独立して酸素原子または硫黄原子；
Ｚは−ＮＨ２または−ＮＨＮＨ２）で表わされる基；
ただし、Ａ環が（ａ）である場合は、−Ｂ−は（ｅ）である）
で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物、に関する。
さらに詳しくは、以下のＩＩ）〜ＸＶＩＩ）に関する。
ＩＩ）Ｒ１が水素原子または−（Ｌ３）−Ｒ１１（式中、Ｌ３は−ＯＣＨ２−、−ＳＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、または−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）−、Ｒ１１は式：
2002000621.tif 000007
（式中、Ｒ３８はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、またはＣ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン、置換されてもよいアミノ若しくはニトロで置換されてもよいアリール、））；Ｒ２が水素原子または−（Ｌ４）−Ｒ１２（式中、Ｌ４は式：
2002000621.tif 000008
（式中、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アラルキル、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、またはハロゲン）、Ｒ１２は−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）；ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではない）であるＩ）記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
ＩＩＩ）Ｒ３が水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、アリール、または複素環基であり、Ｒ４が水素原子またはハロゲンであるＩ）またはＩＩ）に記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
ＩＶ）Ｒ５が−（ＣＨ２）１−６−Ｒ１５（Ｒ１５は式：
2002000621.tif 000009
（式中、ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｍ、およびｏはそれぞれ独立して０〜２の整数、Ｒ１６およびＲ１７はそれぞれ独立してハロゲン、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、アリールオキシ、およびＣ１−Ｃ１０ハロアルキルから独立に選択される基、αは酸素原子または硫黄原子、βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−、γは酸素原子または硫黄原子、ｃ、ｉ、およびｐは０〜５の整数、ｅは０〜７の整数、ｇは０〜４の整数、ｋおよびｎはそれぞれ独立して０〜３の整数）で表わされる基であるＩ）〜ＩＩＩ）のいずれかに記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
Ｖ）Ｒ５が−ＣＨ２−Ｒ１８（Ｒ１８は式：
2002000621.tif 000010
（式中、βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−；Ｒ１９は水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；Ｅは単結合、−ＣＨ２−または−Ｏ−）で表わされる基である）で示されるＩＶ）記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
ＶＩ）Ｒ１が−ＯＣＨ２ＣＯＯＨまたは−ＯＣＨ２ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ３８（式中、Ｒ３８はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１ハロアルキルまたはアリール）であるＩ）〜Ｖ）のいずれかに記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
ＶＩＩ）Ｒ２が水素原子であるＩ）〜ＶＩ）のいずれかに記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
ＶＩＩＩ）Ｒ６がＣ４−Ｃ６アルキルであるＩ）〜ＶＩＩ）のいずれかに記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
ＩＸ）ＲＡが−ＣＨ２ＣＯＮＨ２または−ＣＯＣＯＮＨ２であるＩ）〜ＶＩＩＩ）のいずれかに記載の化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
Ｘ）一般式（ＩＩ）：
2002000621.tif 000011
（式中、Ｒ２０は、−ＯＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＯＮＨＳＯ２ＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＯＮＨＳＯ２Ｃ６Ｈ５；
Ｒ２１は、−ＣＯＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、または−ＣＨ２ＣＯＮＨＮＨ２；
Ｒ２２は、Ｃ４−Ｃ６アルキル；
Ｒ２３は、−ＣＨ２−Ｒ１８（Ｒ１８は式：
2002000621.tif 000012
（式中、βは−（ＣＨ２）１−６−；Ｒ１９は水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；Ｅは単結合、−ＣＨ２−、または−Ｏ−）
Ｒ２４は、水素原子またはＣ１−Ｃ６アルキルで表わされる基である）で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
ＸＩ）一般式（ＩＩＩ）：
2002000621.tif 000013
（式中、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４はＸ）と同意義）で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
ＸＩＩ）一般式（ＩＶ）：
2002000621.tif 000014
（式中、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４はＸ）と同意義）で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
ＸＩＩＩ）Ｉ）〜ＸＩＩ）のいずれかに記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
ＸＩＶ）Ｉ）〜ＸＩＩ）のいずれかに記載の化合物を有効成分として含有するＸ型ｓＰＬＡ２阻害剤。
ＸＶ）Ｉ）〜ＸＩＩ）のいずれかに記載の化合物を有効成分として含有する癌、肝硬変、アルツハイマー病および／または動脈硬化の予防または治療剤。
ＸＶＩ）癌、肝硬変、アルツハイマー病および／または動脈硬化を治療するための医薬を製造するためのＩ）〜ＸＩＩ）のいずれかに記載の化合物の使用。
ＸＶＩＩ）Ｉ）〜ＸＩＩ）のいずれかに記載の化合物の治療上効果を示す量を人を含む哺乳動物に投与することからなる、癌、肝硬変、アルツハイマー病および／または動脈硬化による影響を緩和するための哺乳動物を治療する方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で示される化合物が１またはそれ以上のキラル中心を有する場合は、光学活性体として存在し得る。同様に、該化合物がアルケニルまたはアルケニレンを含む場合は、シスおよびトランス異性体の可能性が存在する。Ｒ−およびＳ−異性体、シスおよびトランス異性体の混合物やラセミ混合物を含むＲ−およびＳ−異性体の混合物は、本発明の範囲に包含される。不斉炭素原子はアルキル基のような、置換基にも存在し得る。このような異性体はすべて、それらの混合物と同様に本発明に包含される。特定の立体異性体が所望である場合は、あらかじめ分割した不斉中心を有する出発物質を、立体特異的反応に付する当業者には公知の方法により製造するか、または立体異性体の混合物を製造してから公知の方法により分割する方法により製造する。
プロドラッグは、化学的または代謝的に分解できる基を有する一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で示される化合物の誘導体であり、加溶媒分解によりまたは生理学的条件下でインビボにおいて薬学的に活性な化合物となる化合物である。該化合物の誘導体は、酸誘導体または塩基誘導体の両者において活性を有するが、酸誘導体が哺乳類生物における溶解性、組織結合性、放出制御において有利である（Ｂｕｎｇａｒｄ，Ｈ．，Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｐｐ．７−９，２１−２４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　１９８５）。例えばもとになる酸性化合物と適当なアルコールを反応させることによって製造されるエステル、またはもとになる酸性化合物と適当なアミンを反応させることによって製造されるアミドのような酸性誘導体を含むプロドラッグは当業者にはよく知られている。該化合物が有している酸性基から誘導される単純な脂肪族のまたは芳香族のエステルは好ましいプロドラッグである。さらに好ましくは、酸性基のＣ１−Ｃ６アルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル）である。場合によっては、（アシルオキシ）アルキルエステルまたは（（アルコキシカルボニル）オキシ）アルキルエステルのような二重エステル型プロドラッグを製造することもできる。
一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で示される化合物が、酸性または塩基性の官能基を有する化合物である場合は、そのもとの化合物よりも水溶性が高く、かつ生理的に適切な様々な塩を形成することができる。代表的な製薬上許容される塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等のアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩が含まれるがそれらに限定されない。塩は溶液中の酸を塩基で処理するか、または酸をイオン交換樹脂に接触させることによって遊離の酸から簡便に製造される。一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で示される化合物の比較的無毒の無機塩基及び有機塩基の付加塩、例えば、該化合物と塩を形成するに十分な塩基性を有する窒素塩基から誘導されるアミンカチオン、アンモニウム、第四級アンモニウムは製薬上許容される塩の定義に包含される（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒ．Ｓｃｉ．，６６，１−１９（１９７７））。さらに一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で示される阻害作用を有する化合物の塩基性基は適当な有機または無機の酸と反応させてアセテート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、ビカルボネート、ビスルフェート、ビタータレート、ポレート、ブロミド、カムシレート、カーボネート、クロライド、クラブラネート、シトレート、エデテート、エジシレート、エストレート、エシレート、フルオライド、フマレート、グルセプテート、グルコネート、グルタメート、グリコリアルサニレート、ヘキシルレゾルシネート、ヒドロキシナフトエート、イオダイド、イソチオネート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、マレート、マルセエート、マンデレート、メシレート、メチルブロミド、メチルニトレート、メチルスルフェート、ムケート、ナプシレート、ニトレート、オレエート、オキサレート、パルミテート、パントセネート、ホスフェート、ポリガラクトウロネート、サリシレート、ステアレート、スバセテート、スシネート、タネート、タルトレート、トシレート、トチフルオロアセテート、トリフルオロメタンスルホネート、バレレート等の塩を形成する。
溶媒和物としては、有機溶媒および／または水との溶媒和物を包含する。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位していてもよい。
「製薬上許容される」なる用語は、受容者にとって有害ではないことを意味する。
「癌」とは、様々な部位の上皮組織から発生する種々の悪性腫瘍を意味し、例えば、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、食道癌、喉頭癌、乳癌または子宮癌が挙げられる。本発明者は、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、精巣癌、卵巣癌、または皮膚癌の癌組織においてＸ型ｓＰＬＡ２が高発現されていることを実験で確認しており、特に、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、精巣癌、卵巣癌、または皮膚癌の予防または治療において、本発明は有用である。
「肝硬変」とは、肝小葉構造の改築などをともなった肝実質細胞の広範な損傷を特徴とする進行性の肝疾患であり、しばしば、黄疸、門脈圧亢進、腹水を生じ、最後には肝不全を起こす。本発明者は、肝硬変患者由来肝臓組織では　偽小葉において、Ｘ型ｓＰＬＡ２が高発現されていることを実験で確認しており、特に、肝硬変の予防または治療において、本発明は有用である。
「アルツハイマー病」とは、記憶障害、見当識障害を呈する進行性精神障害であり、病理学的には大脳、特に側頭葉の萎縮が、組織学的には神経原繊維変化と老人斑が特徴である。本発明者は、アルツハイマー患者由来大脳組織中の神経細胞群の一部、特に老人班や神経原繊維変化部位において、Ｘ型ｓＰＬＡ２が高発現されていることを実験で確認しており、特に、アルツハイマー病の予防または治療において、本発明化合物は有用である。
「動脈硬化」とは、動脈壁の肥厚、改築、弾性の低下および機能低下を示す限局性の動脈病変の総称である。病理学的には３型に分類されるが、その中でも虚血性心疾患、脳梗塞、大動脈瘤などの重篤な疾患の基盤となる粥状硬化（アテローム性動脈硬化）が最も重要である。本発明者は、本発明化合物がＸ型ｓＰＬＡ２によるヒトリポタンパク質からの脂肪酸の遊離を有意に抑制することを実験で確認しており、特に、動脈硬化の予防または治療において、本発明化合物は有用である。
本明細書中、単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アルキル」なる用語は、指定した数の範囲の炭素原子数を有する、直鎖または分枝鎖の１価の炭化水素基を意味する。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノナニル、ｎ−デカニル、ｎ−ウンデカニル、ｎ−ドデカニル、ｎ−トリデカニル、ｎ−テトラデカニル、ｎ−ペンタデカニル、ｎ−ヘキサデカニル、ｎ−ヘプタデカニル、ｎ−オクタデカニル、ｎ−ノナデカニル、ｎ−イコサニル等が挙げられる。
本明細書中、単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アルケニル」なる用語は、指定した数の範囲の炭素原子数および１個もしくは２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝鎖の１価の炭化水素基を意味する。例えば、ビニル、アリル、プロペニル、クロトニル、イソペンテニル、種々のブテニル異性体等が挙げられる。
本明細書中、「アルキニル」とは、指定した数の範囲の炭素原子数および１個もしくは２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝鎖の１価の炭化水素基を意味する。二重結合を有していてもよい。例えば、エチニル、プロピニル、６−ヘプチニル、７−オクチニル、８−ノニル等が挙げられる。
本明細書中、「炭素環基」とは、飽和または不飽和であって、置換されたまたは置換されていない、環を形成している原子が水素原子以外は炭素原子のみである５〜１４員環、好ましくは、５〜１０員環、さらに好ましくは５〜７員環の有機骨格から誘導される基を意味する。上記の炭素環が２〜３個連続しているものも包含する。代表的な炭素環基としては、シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル）、シクロアルケニル（シクロブチレニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、およびシクロオクテニル）、フェニル、ナフチル、ノルボルニル、ビシクロヘプタジエニル、インデニル、スチルベニル、テルフェニリル、フェニルシクロヘキセニル、アセナフチル、アントリル、ビフェニリル、ビベンジリル、および式（Ｖ）：
2002000621.tif 000015
で表わされるフェニルアルキルフェニル誘導体が挙げられる。
Ｒ３およびＲ４における炭素環基としては、フェニル、シクロヘキシル等が好ましい。
本明細書中、「複素環基」とは、単環式または多環式であって、飽和または不飽和であり、窒素原子、酸素原子、硫黄原子からなる群から選択される１〜３のヘテロ原子を含む５〜１４の環原子を有する、置換されたまたは置換されていない複素環骨格から誘導される基を意味する。例えば、ピリジル、ピロリル、フラニル、ベンゾフラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、フェニルイミダゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、インドリル、カルバゾリル、ノルハルマニル、アザインドリル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、インダゾリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、ベンゾトリアゾリル、アントラニリル、１，２−ベンズイソオキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、プリニル、プリジニル、ジピリジニル、フェニルピリジニル、ベンジルピリジニル、ピリミジニル、フェニルピリミジニル、ピラジニル、１，３，５−トリアジニル、キノリル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル等が挙げられる。
Ｒ３およびＲ４における複素環基としては、フリル、チエニル等が好ましい。
Ｒ５における炭素環基および複素環としては、式：
2002000621.tif 000016
（式中、ｈは０〜２の整数、Ｒ１６およびＲ１７はそれぞれ独立してハロゲン、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、アリールオキシ、およびＣ１−Ｃ１０ハロアルキルから独立に選択される基、αは酸素原子または硫黄原子、βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−、γは酸素原子または硫黄原子、ｃ、ｉ、およびｐは０〜５の整数、ｅは０〜７の整数、ｇは０〜４の整数、ｋおよびｎはそれぞれ独立して０〜３の整数）で表わされる基が好ましい。ｃ、ｅ、ｇ、ｉ、ｋ、ｎ、および／またはｐが２以上の場合、複数個のＲ１６および複数個のＲ１７はそれぞれ異なっていてもよい。Ｒ１６がナフチル基の置換基である場合は、当該ナフチル基上の任意の位置で置換し得る。
さらに好ましくは、式：
2002000621.tif 000017
（式中、βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−；Ｒ１９は水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；Ｅは単結合、−ＣＨ２−または−Ｏ−）で表わされる基が挙げられる。
Ｒ５としては、上記の「炭素環」Ｃ１−Ｃ３アルキルおよび上記の「複素環」Ｃ１−Ｃ３アルキルが好ましい。
本明細書中、「非妨害性置換基」とは、上記の「炭素環基」、「複素環基」、および基本骨格の置換基として適当な基を意味する。例えば、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ７−Ｃ１２アラルキル（例えば、ベンジルおよびフェネチル）、Ｃ７−Ｃ１２アルカリル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルケニル、フェニル、トリル、キシリル、ビフェニリル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシＣ１−Ｃ６アルキル（例えば、メチルオキシメチル、エチルオキシメチル、メチルオキシエチル、およびエチルオキシエチル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシＣ１−Ｃ６アルキルオキシ（例えば、メチルオキシメチルオキシ、およびメチルオキシエチルオキシ）、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル（例えば、メチルカルボニルおよびエチルカルボニル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルアミノ（例えば、メチルカルボニルアミノおよびエチルカルボニルアミノ）、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシアミノ（例えば、メチルオキシアミノおよびエチルオキシアミノ）、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシアミノカルボニル（例えば、メチルオキシアミノカルボニルおよびエチルオキシアミノカルボニル）、モノまたはジＣ１−Ｃ６アルキルアミノ（例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、およびエチルメチルアミノ）、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオカルボニル（例えば、メチルチオカルボニルおよびエチルチオカルボニル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル（例えば、メチルスルフィニルおよびエチルスルフィニル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル（例えば、メチルスルホニルおよびエチルスルホニル）、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキルオキシ（例えば、２−クロロエチルオキシおよび２−ブロモエチルオキシ）、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニル（例えば、クロロメチルスルホニルおよびブロモメチルスルホニル）、Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル（例えば、ヒドロキシメチルおよびヒドロキシエチル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシカルボニル（例えば、メチルオキシカルボニルおよびエチルオキシカルボニル）、−（ＣＨ２）１−８−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ベンジルオキシ、アリールオキシ（例えば、フェニルオキシ）、アリールチオ（例えば、フェニルチオ）、−（ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ２５）（Ｒ２５はＣ１−Ｃ６アルキルまたはアリール）、−ＣＨＯ、アミノ、アミジノ、ハロゲン、カルバミル、カルボキシル、カルブアルキルオキシ、−（ＣＨ２）１−８−ＣＯＯＨ（例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル、およびカルボキシプロピル）、シアノ、シアノグアニジノ、グアニジノ、ヒドラジド、ヒドラジノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、ニトロ、ホスフォノ、−ＳＯ３Ｈ、チオアセタール、チオカルボニル、炭素環基、複素環基等が挙げられる。これらは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびハロゲンからなる群から選択される１もしくは２以上の置換基で置換されていてもよい。
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の「非妨害性置換基で置換された」の「非妨害性置換基」としては、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルが好ましい。さらに好ましくは、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ３アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ３ハロアルキルが挙げられる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４における「非妨害性置換基」としては、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アラルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキルオキシ、ハロゲン、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールチオ、炭素環基、または複素環基が好ましい。さらに好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アラルキル、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、フェニル、またはＣ１−Ｃ６アルキルオキシカルボニルが挙げられる。
本明細書中、「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を意味する。
本明細書中、「シクロアルキル」とは、指定した数の範囲の炭素原子数を有する、環状の１価の炭化水素基を意味する。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。
本明細書中、「シクロアルケニル」とは、指定した数の範囲の炭素原子数および１個もしくは２個以上の二重結合を有する、環状の１価の炭化水素基を意味する。例えば、１−シクロプロペニル、２−シクロプロペニル、１−シクロブテニル、２−シクロブテニル等が挙げられる。
本明細書中、「アルキルオキシ」としては、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ等が挙げられる。
本明細書中、「アルキルチオ」としては、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ等が挙げられる。
本明細書中、「酸性基」とは、適当な連結原子（後に「酸性基との連結基」として定義する）を介して基本骨格に結合している時、水素結合を可能にするプロトン供与体として働く有機基を意味する。例えば、式：
2002000621.tif 000018
（式中、Ｒ２６は水素原子、金属、またはＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｒ２７はそれぞれ独立して水素原子またはＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｒ３８はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３ハロアルキルまたはＣ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン、置換されてもよいアミノ若しくはニトロで置換されてもよいアリール、ただしＲ２６およびＲ２７を共に有する酸性基の場合は、Ｒ２６およびＲ２７の少なくとも１つは水素原子）で表わされる基が挙げられる。好ましくは、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、または−ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ３８（式中、Ｒ３８はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、またはＣ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン、置換されてもよいアミノ若しくはニトロで置換されてもよいアリール、）が挙げられる。さらに好ましくは、−ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ３８（式中、Ｒ３８はＣ１−Ｃ６アルキル、またはアリール、）が挙げられる。
本明細書中、「酸性基との連結基」とは、−（Ｌ１）−なる記号で表わされる２価連結基を意味し、通常の関係では基本骨格のと「酸性基」を連結する役目をする。例えば、式：
2002000621.tif 000019
（式中、Ｍは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ３０）−、または−Ｓ−、Ｒ２８およびＲ２９はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキル、カルボキシ、またはハロゲン）で表わされる基、および式：
2002000621.tif 000020
（式中、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アラルキル、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、またはハロゲン）で表わされる基が挙げられる。好ましくは、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｎ（Ｒ３０）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、または−Ｏ−ＣＨ（（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ５）−（式中、Ｒ３０はＣ１−Ｃ６アルキル）が挙げられる。さらに好ましくは、−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｓ−ＣＨ２−が挙げられる。
本明細書中、「酸性基との連結基の長さ」なる用語は、基本骨格と「酸性基」をつなぐ連結基−（Ｌ１）−の最短の鎖の原子の数（水素原子を除く）を意味する。−（Ｌ１）−に炭素環がある場合、算出した炭素環の直径とほぼ等しい数の原子として計数する。従って、酸性基との連結基におけるベンゼン環およびシクロヘキサン環は、−（Ｌ１）−の長さを２原子として計数する。好ましい長さは、２〜３である。
本明細書中、「ハロアルキル」とは、任意の位置で前記「ハロゲン」により置換された前記「アルキル」を意味する。例えば、クロロメチル、トリフルオロメチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル等が挙げられる。
本明細書中、「ヒドロキシアルキル」とは、任意の位置でヒドロキシにより置換された前記「アルキル」を意味する。例えば、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル等が挙げられる。ヒドロキシメチルが好ましい。
本明細書中、「ハロアルキルオキシ」の「ハロアルキル」は前記と同義である。例えば、２−クロロエチルオキシ、２−トリフルオロエチルオキシ、２−クロロエチルオキシ等が挙げられる。
本明細書中、「アリール」とは、単環状もしくは縮合環状芳香族炭化水素を意味する。例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、アントリル等が挙げられる。特に、フェニル、１−ナフチルが好ましい。
本明細書中、「アラルキル」とは、前記「アルキル」に前記「アリール」が置換したもので、これらは置換可能な全ての位置で結合しうる。例えば、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル（例えば、３−フェニルプロピル）、ナフチルメチル（例えば、１−ナフチルメチル）等が挙げられる。
本明細書中、「アルキルオキシカルボニル」としては、例えば、メチルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニル、ｎ−プロプルオキシカルボニル等が挙げられる。
本明細書中、「アリールオキシ」としては、フェニルオキシ等が挙げられる。
本明細書中、「アリールチオ」としては、フェニルチオ等が挙げられる。
本明細書中、「ハロフェニル」とは前記「ハロゲン」で１または２個所以上置換されたフェニルを包含する。例えば、フルオロフェニル、クロロフェニル、ブロモフェニル、ヨードフェニル、ジフルオロフェニル、ジクロロフェニル、ジブロモフェニル、トリフルオロフェニル、トリクロロフェニル、トリブロモフェニル、クロロフルオロフェニル、ブロモクロロフェニル等が挙げられる。
Ａ環および−Ｂ−の好ましい組み合わせとしては、以下に示す（ｈ）〜（ｊ）で表わされる組み合わせが好ましい。
2002000621.tif 000021
（ｈ）〜（ｊ）において、Ｒ１が−ＯＣＨ２ＣＯＯＨまたは−ＯＣＨ２ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ３８（式中、Ｒ３８はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１ハロアルキルまたはアリール、）、Ｒ２が水素原子、Ｒ３が水素原子またはＣ１−Ｃ６アルキル、Ｒ４が水素原子、Ｒ５が−（ＣＨ２）１−２−Ｒ１８（Ｒ１８は式：
2002000621.tif 000022
（式中、βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−；Ｒ１９は水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；Ｅは単結合、−ＣＨ２−または−Ｏ−）、Ｒ６がＣ４−Ｃ６アルキル、ＲＡが−ＣＯＣＯＮＨ２である化合物が好ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）は、ＥＰ０６７５１１０Ａ１、ＷＯ９９／５１６０５、ＷＯ９９／５９９９９等に記載されている方法に従って合成することができる。以下にインドール誘導体、ピロロ［１，２−ａ］ピラジン誘導体、およびピロロ［１，２−ｂ］ピリダジン誘導体の合成法について代表的なスキームを示す。
（Ａ法）　インドール誘導体の製造方法（１）
2002000621.tif 000023
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は前記と同意義、Ｒ３１およびＲ３２はＣ１−Ｃ５アルキル）
（Ｂ法）　インドール誘導体の製造方法（２）
2002000621.tif 000024
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は前記と同意義、Ｈａｌはハロゲン）
（Ｃ法）　ピロロ［１，２−ａ］ピラジン誘導体の製造方法
2002000621.tif 000025
（式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ３１、Ｒ３２、およびＨａｌは前記と同意義、Ｒ３３はＲ５の前駆体、Ｒ３４はＣ１−Ｃ３アルキルまたはＣ１−Ｃ３アルキルで置換されていてもよいフェニル。）
（Ｄ法）　ピロロ［１，２−ｂ］ピリダジン誘導体の製造方法
2002000621.tif 000026
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ３２は前記と同意義、Ｒ３５はＣ１−Ｃ３アルキル、Ｒ３６およびＲ３７は同一または異なってＣ１−Ｃ３アルキルまたはＲ３６およびＲ３７は一緒になって隣接する酸素原子を含む１，３−ジオキソラン環を形成する。）
本発明予防または治療剤は経口、エアロゾル、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内を含む様々な経路によって投与できる。本発明の製剤は、治療有効量の化合物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに組み合わせる（例えば混合する）ことによって製造される。本発明の製剤は、周知の、容易に入手できる成分を用いて既知の方法により製造される。
本発明の組成物を製造する際、活性成分は担体と混合されるかまたは担体で希釈されるか、カプセル、サッシェー、紙、あるいは他の容器の形態をしている担体中に入れられる。担体が希釈剤として働く時、担体は媒体として働く固体、半固体、または液体の材料であり、それは錠剤、丸剤、粉末剤、口中剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（液体媒質中の固体）、軟膏の型にすることができ、例えば、１０％までの活性化合物を含む。本発明Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物は、投与に先立ち製剤化するのが好ましい。
当業者には公知の適当な担体はいずれもこの製剤のために使用できる。このような製剤では担体は、固体、液体、または固体と液体の混合物である。例えば、静脈注射のためにＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物化合物を２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、４％デキストロース／０．５％クエン酸ナトリウム水溶液中に溶解する。固形の製剤は粉末、錠剤およびカプセルを包含する。固形担体は、香料、滑沢剤、溶解剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤、カプセル剤にする材料としても役立つ１またはそれ以上の物質である。経口投与のための錠剤は、トウモロコシデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、および／またはゼラチン、アカシアなどの結合剤、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、滑石などの滑沢剤とともに炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムなどの適当な賦形剤を含む。
粉末剤では担体は細かく粉砕された活性成分と混合された、細かく粉砕された固体である。錠剤では活性成分は、適当な比率で、必要な結合性を持った担体と混合されており、所望の形と大きさに固められている。粉末剤および錠剤は約１〜約９９重量％の本発明の新規化合物である活性成分を含んでいる。適当な固形担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、ココアバターである。
無菌液体製剤は懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む。活性成分は、滅菌水、滅菌有機溶媒、または両者の混合物などの製薬上許容し得る担体中に溶解または懸濁することができる。活性成分はしばしば適切な有機溶媒、例えばプロピレングリコール水溶液中に溶解することができる。水性デンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液、または適切な油中に細かく砕いた活性成分を散布することによってその他の組成物を製造することもできる。
投与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なるが、成人に静注で投与する場合、通常０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時である。好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／時である。
本発明化合物は選択的にＸ型ｓＰＬＡ２を阻害する。Ｘ型ｓＰＬＡ２阻害剤は炎症性疾患、癌（特に大腸癌、肺癌、気管支癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、精巣癌、卵巣癌、または皮膚癌等）、肝硬変、アルツハイマー病、動脈硬化症等の治療または予防に有用である。炎症性疾患とは炎症性腸疾患、敗血症、敗血症ショック、成人呼吸窮迫症候群、膵臓炎、トラウマにより引き起こされるショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、慢性関節リウマチ、脳内出血、脳梗塞、心不全（ｃａｒｄｉａｃ　ｆａｉｌｕｒｅ）、心筋梗塞症、乾癬、嚢胞性繊維症、脳卒中、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、変形性関節症、痛風、脊髄炎（ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｏｐａｔｈｒｉｓ）、強直性脊椎炎、ロイター症候群（Ｒｅｉｔｅｒ’ｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、乾癬関節症、脊椎炎（ｅｎｔｅｒａｐａｔｈｒｉｃ　ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、年少者関節症（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ　ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）または年少者強直性脊椎炎（ｊｕｖｅｎｉｌｅ　ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ　ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、反応性関節症（Ｒｅａｃｔｉｖｃ　ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、感染性関節炎または感染後の関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節症、ウイルス性関節炎、菌による関節炎（ｆｕｎｇａｌ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、梅毒性関節炎、ライム病、「脈管炎症候群」により引き起こされる関節炎、結節性多発動脈炎、過敏症脈管炎（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、Ｌｕｅｇｅｎｅｃ肉芽腫症（Ｌｕｅｇｅｎｅｃ’ｓ　ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）、多発性筋痛リウマチ（ｐｏｌｙｍｙａｌｇｉｎ　ｒｈｅｕｍａｔｉｃａ）、関節細胞リウマチ（ｊｏｉｎｔ　ｃｅｌｌ　ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、カルシウム結晶沈殿関節症（ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｒｉｓ）、偽通風、非関節性リウマチ（ｎｏｎ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）、滑液嚢炎、腱滑膜炎（ｔｅｎｏｓｙｎｏｍｉｔｉｓ）、上顆炎（テニス肘）、手根管症候群、繰り返し使用による障害（タイピング）（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｕｓｅ　ｉｎｊｕｒｙ（ｔｙｐｉｎｇ））、関節炎の混合形態（ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ　ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、神経障害性関節症疾患（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ　ｊｏｉｎｔ　ｄｉｓｅａｓｅ（ｃｈａｒｃｏ　ａｎｄ　ｊｏｉｎｔ））、出血性関節症、血管性紫斑病、肥厚性骨関節症、多中心性網組織球症、特定の疾患により引き起こされる関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）、ｓｕｒｃｏｉｌｏｓｉｓ、血色素沈着症、鎌状赤血球病および他のヘモグロビン異常症、高リポ蛋白血症、低γ−グロブリン血症、上皮小体機能亢進症、末端肥大症、家族性地中海熱、Ｂｅｈａｔ病（Ｂｅｈａｔ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ）、全身性自己免疫疾患紅はん性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｌｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｅｍａｔｏｓｉｓ）、もしくは再発性多発性軟骨炎のような疾患または脂肪酸の遊離を仲介するｓＰＬＡ２を阻害するのに、またはそれによってアラキドン酸カスケードおよびその���害な生成物を阻害もしくは予防するのに十分な量の一般式（Ｉ）で表わされる化合物の治療上有効な量を哺乳動物に投与することが必要とされる関連疾患をいう。
実施例
以下に実施例および試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例中、以下の略号を使用する。
Ｍｅ：メチル
Ｅｔ：エチル
ｎ−Ｐｒ：ｎ−プロピル
ｉ−Ｐｒ：イソプロピル
ｎ−Ｂｕ：ｎ−ブチル
ｉ−Ｂｕ：イソブチル
ｔ−Ｂｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
ｎ−Ｐｅｎ：ｎ−ペンチル
ｃ−Ｐｅｎ：シクロペンチル
ｃ−Ｈｅｘ：シクロヘキシル
Ｐｈ：フェニル
Ｂｎ：ベンジル
４−Ｆ−Ｂｎ：４−フルオロベンジル
Ｔｏｌ：トリル
Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
実施例１　化合物（Ｉ−１）の調製
2002000621.tif 000027
（第１工程）
３−メトキシ−２，５−ジメチルピラジン（１）（３．２４ｇ，２３．４ｍｍｏｌ）と１−ブロモ−４−メチル−２−ペンタノン（４．２ｇ，２３．５ｍｍｏｌ）の混合物を６０℃で１２時間攪拌した。生じた４級塩をろ取し、エーテルで洗浄し、乾燥した。得られた４級塩をアセトニトリル（２５ｍｌ）に溶解し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（５．２６ｍｌ，３５．２ｍｍｏｌ）を加え１時間加熱還流を行った。反応終了後、氷水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１０：９０）で精製し、目的物（２）（３．６３ｇ，７１％）を黄色の油状物質として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９２（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８５（１Ｈ，ｍ），２．２６（３Ｈ，ｓ），２．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．０３（３Ｈ，ｓ），６．５０（１Ｈ，ｓ），７．０２（１Ｈ，ｓ），７．２３（１Ｈ，ｓ）．
（第２工程）
ベンゾイルクロリド（３．２ｍｌ，２７．６ｍｍｏｌ）のニトロメタン溶液（２０ｍｌ）に氷冷下、塩化アルミニウム（３．６８ｇ，２７．６ｍｍｏｌ）を加え、１０分間攪拌した。この溶液に同条件下、化合物（２）（２．０１ｇ，９．２ｍｍｏｌ）のニトロメタン溶液（１０ｍｌ）を加え、４０分間攪拌した。反応終了後、氷水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層をアンモニア水溶液、飽和食塩水の順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝５：９５）で精製し、目的物（３）（８８６ｍｇ，３０％）を黄色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．６３（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．５７（１Ｈ，ｍ），２．１９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．３５（３Ｈ，ｓ），４．０９（３Ｈ，ｓ），６．５７（１Ｈ，ｓ），７．４６（２Ｈ，ｍ），７．５６（１Ｈ，ｍ），７．６５（２Ｈ，ｍ），８．５２（１Ｈ，ｓ）．
（第３工程）
化合物（３）（８５３ｍｇ，２．６５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍｌ）に氷冷下、水素化ほう素ナトリウム（０．５ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）、塩化アルミニウム（１．０６ｇ，７．９５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応終了後、氷水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。精製することなく次の反応に用いた。
（第４工程）
先に得られた残さに濃塩酸（１０ｍｌ）を加え、３０分間加熱還流した。反応終了後、氷水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをエーテルとヘキサンの混合液で洗浄し、目的物（５）（５８６ｍｇ，９０％）を灰色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８４（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．７５（１Ｈ，ｍ），１．９６（３Ｈ，ｓ），２．３８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．１４（２Ｈ，ｓ），６．６９（１Ｈ，ｓ），６．８５（１Ｈ，ｓ），７．０５（２Ｈ，ｍ），７．１７（１Ｈ，ｍ），７．２７（２Ｈ，ｍ），１０．３７（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
（第５工程）
化合物（５）（５７９ｍｇ，２．３４ｍｍｏｌ）にオキシ塩化リン（３ｍｌ）を加え、３０分間加熱還流を行った。反応終了後、氷水に注ぎ、炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し茶色の油状物質を得た。精製することなく次の反応に用いた。
（第６工程）
先に得られた油状物質をエタノール（２０ｍｌ）に溶解し、ｐ−トルエンスルフィン酸ナトリウム（８３４ｍｇ，４．６８ｍｍｏｌ）を加え、１８時間加熱還流した。反応終了後、溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝４０：６０）で精製し、目的物（７）（６８６ｍｇ，６８％）を黄色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９４（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．９５（１Ｈ，ｍ），２．３０（３Ｈ，ｓ），２．４１（３Ｈ，ｓ），２．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．２３（２Ｈ，ｓ），６．９５（２Ｈ，ｍ），７．２０−７．３２（６Ｈ，ｍ），７．４１（１Ｈ，ｓ），８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）．
（第７工程）
メチルグリコレート（７００ｍｇ，７．７７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍｌ）に、氷冷下、ｔ−ブトキシカリウム（５２３ｍｇ，４．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。この溶液中に化合物（７）（６７２ｍｇ，１．５５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５ｍｌ）を加え、さらに４５分間攪拌した。反応終了後、氷水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１０：９０）で精製し、目的物（８）（５４５ｍｇ，９６％）を淡黄色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９１（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８７（１Ｈ，ｍ），２．１２（３Ｈ，ｓ），２．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．７８（３Ｈ，ｓ），４．１８（２Ｈ，ｓ），５．００（２Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｓ），６．９５（１Ｈ，ｓ），７．００（２Ｈ，ｍ），７．２３（３Ｈ，ｍ）．
（第８工程）
化合物（８）（５０３ｍｇ，１．３７ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１０ｍｌ）にＮ−メチルモルホリン（７５５μｌ，６．８６ｍｍｏｌ）、オキサリルクロリド（５９９μｌ，６．８６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応液をアンモニア水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を１Ｎ塩酸、飽和食塩水の順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９９：１）で精製し、目的物（９）（４１４ｍｇ，６９％）を黄色の結晶として得た。
融点：１６３−１６４℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８１（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．７２（１Ｈ，ｍ），２．１５（３Ｈ，ｓ），２．６７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．６６（３Ｈ，ｓ），４．３２（２Ｈ，ｓ），４．８８（２Ｈ，ｓ），７．０７（２Ｈ，ｍ），７．２０（１Ｈ，ｍ），７．２９（２Ｈ，ｍ），７．４９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．６５（１Ｈ，ｓ），７．８７（１ｈ，ｂｒ．ｓ）．
（第９工程）
化合物（９）（４１４ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）をメタノール（４ｍｌ）とテトラヒドロフラン（４ｍｌ）の混合液に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム（１．９ｍｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応終了後、氷水を加え、１Ｎ塩酸（４ｍｌ）で酸性とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。酢酸エチル−ヘキサンより再結晶を行い、目的物（Ｉ−１）（３６６ｍｇ，９１％）を黄色の結晶として得た。
融点：２０６−２０８℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８１（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．７３（１Ｈ，ｍ），２．１６（３Ｈ，ｓ），２．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．３２（２Ｈ，ｓ），４．８０（２Ｈ，ｓ），７．０６−７．３１（５Ｈ，ｍ），７．４９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．６３（１Ｈ，ｓ），７．８７（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
実施例１に従い、表１に示した化合物（Ｉ−２）から（Ｉ−８）を合成した。物理恒数を以下に示す。
2002000621.tif 000028
実施例９　化合物（Ｉ−９）の調製
2002000621.tif 000029
（第１工程）
化合物（１０）（２６．９ｇ，１５９ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（１００ｍｌ）にブロモアセトアルデヒドジメチルアセタール（２８．７ｍｌ，１９１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２６．４ｇ，１９１ｍｍｏｌ）、よう化カリウム（２．６４ｇ，１５．９ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１５時間攪拌した。反応終了後、氷水を加え、トルエンで抽出した。有機層を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。減圧蒸留を行い、沸点１００〜１０３℃（１ｍｍＨｇ）の化合物（１１）（３５．４ｇ，７８％）を黄色の油状物質として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．０６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．１７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．２１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．６５−１．９１（３Ｈ，ｍ），１．９７（１Ｈ，ｄ．ｄ，Ｊ＝１４．１，３．９Ｈｚ），２．３８（１Ｈ，ｄ．ｄ，Ｊ＝１４．１，８．４Ｈｚ），３．５５（２Ｈ，ｍ），３．６６（２Ｈ，ｍ），４．２３（２Ｈ，ｍ），４．７８（１Ｈ，ｄ．ｄ，Ｊ＝８．４，３．６Ｈｚ）．
（第２工程）
化合物（１１）（３５．３ｇ，１２４ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（７０ｍｌ）に酢酸カリウム（１３．４ｇ，１３７ｍｍｏｌ）を加え、１６０℃にて７時間攪拌した。反応終了後、氷水を加え、エーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水の順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、減圧蒸留を行い、沸点６７〜７１℃（１ｍｍＨｇ）の化合物（１２）（２２．１ｇ，８４％）を無色の油状物質として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．２２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．２３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３３（１Ｈ，ｍ），１．６１（１Ｈ，ｍ），１．８５（３Ｈ，ｍ），２．７４（１Ｈ，ｍ），３．５６（２Ｈ，ｍ），３．７０（２Ｈ，ｍ），４．６９（１Ｈ，ｄ．ｄ，Ｊ＝７．２，３．２Ｈｚ）．
（第３工程）
化合物（１２）（３ｇ，１４．１ｍｍｏｌ）のエーテル溶液（１０ｍｌ）をマグネシウム（４２７ｍｇ，１７．６ｍｍｏｌ）、エーテル（１０ｍｌ）、１，２−ジブロモエタン（７３μｌ，０．８５ｍｍｏｌ）、ベンジルブロミド（２ｍｌ，１６．８ｍｍｏｌ）より調整したグリニャール試薬に加え、室温にて２．５時間攪拌した後、１８時間加熱還流を行った。０℃に冷却し、塩化アンモニウム（１．５ｇ，２８ｍｍｏｌ）の水溶液（１５ｍｌ）を加え、更に２Ｎ硫酸３５ｍｌを加え、３０分間攪拌した。エーテルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝５：９５）で精製し、目的物（１３）（２．２ｇ，５１％）を黄色の油状物質として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８１（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．１５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．１８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．４５（２Ｈ，ｍ）１．６４（１Ｈ，ｍ），２．００（２Ｈ，ｍ），２．８５（１Ｈ，ｍ），３．２７−３．６２（４Ｈ，ｍ），３．７７（２Ｈ，ｓ），４．３５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．１９−７．３４（５Ｈ，ｍ）．
（第４工程）
化合物（１３）（２．２ｇ，７．２ｍｍｏｌ）の９５％エタノール溶液（５０ｍｌ）にＮ−アミノフタルイミド（２．２８ｇ，１４．１ｍｍｏｌ）、１Ｎ−塩酸（１．４ｍｌ）を加え、３０分間加熱還流を行った。冷却後、析出した結晶をろ取し、エタノールで洗浄した。目的物（１４）（１．９６ｇ，７６％）を淡黄色の結晶として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９６（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．８５（１Ｈ，ｍ），２．３７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．８１（２Ｈ，ｓ），６．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），６．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），６．９７（５Ｈ，ｍ），７．７７（４Ｈ，ｍ）．
（第５工程）
化合物（１４）（１ｇ，２．７９ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１０ｍｌ）にヒドラジン一水和物（３５０ｍｇ，６．９９ｍｍｏｌ）を加え、１時間加熱還流を行った。不溶物をろ過して除き、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１０：９０）で精製し、目的物（１５）（５７８ｍｇ，９１％）を無色油状物質として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．７５（１Ｈ，ｍ），２．２９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．９８（２Ｈ，ｓ），４．３２（２Ｈ，ｓ），５．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），６．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），７．０７−７．２９（５Ｈ，ｍ）．
（第６工程）
化合物（１５）（５６８ｍｇ，２．４９ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（１５ｍｌ）にアセト酢酸メチル（２８９ｍｇ，２．４９ｍｍｏｌ）、パラトルエンスルホン酸一水和物（２４ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を加え、４時間加熱還流を行った。生成する水はモレキュラーシーブ４Ａを充填したＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋで脱水した。反応終了後、クロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１５：８５）で精製し、目的物（１６）（６９２ｍｇ，９４％）を茶色の油状物質として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８４（１Ｈ，ｍ），２．３５（３Ｈ，ｓ），２．４９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．３６（２Ｈ，ｓ），５．８０（１Ｈ，ｓ），６．３８（１Ｈ，ｓ），７．１３−７．２４（５Ｈ，ｍ）．
（第７工程）
化合物（１６）（６８５ｍｇ，２．３３ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（１０ｍｌ）にブロモ酢酸メチル（４６３ｍｇ，３．０２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４１８ｍｇ，３．０２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１．５時間攪拌した。反応終了後、氷水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１０：９０）で精製し、目的物（１７）（７１８ｍｇ，８４％）を黄色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．８５（１Ｈ，ｍ），２．３７（３Ｈ，ｓ），２．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．８３（３Ｈ，ｓ），４．３４（２Ｈ，ｓ），４．７６（２Ｈ，ｓ），５．６０（１Ｈ，ｓ），６．４９（１Ｈ，ｓ），７．１３−７．２４（５Ｈ，ｍ）．
（第８工程）
化合物（１７）（６３６ｍｇ，１．７４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１０ｍｌ）にＮ−メチルモルホリン（９５４μｌ，８．６８ｍｍｏｌ）、オキサリルクロリド（７５７μｌ，８．６８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応液をアンモニア水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を１Ｎ塩酸、飽和食塩水の順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９８：２）で精製し、目的物（１８）（６０４ｍｇ，８０％）を淡黄色の結晶として得た。融点：２０５．５−２０７．５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．７４（１Ｈ，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．７２（３Ｈ，ｓ），４．３１（２Ｈ，ｓ），４．９４（２Ｈ，ｓ），６．４８（１Ｈ，ｓ），７．１４−７．２７（５Ｈ，ｍ），７．３５（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．７３（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
（第９工程）
化合物（１８）（３００ｍｇ，０．６９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８ｍｌ）とメタノール（８ｍｌ）の混合液に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム（１．３７ｍｌ）を加え室温にて１時間攪拌した。反応終了後、１Ｎ塩酸で酸性とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。メタノールから再結晶を行い、目的物（Ｉ−９）（１６８ｍｇ，５８％）を黄色の結晶として得た。
融点：２４５−２４７℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．７５（１Ｈ，ｍ），２．３８（３Ｈ，ｓ），２．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．３１（２Ｈ，ｓ），４．８２（２Ｈ，ｓ），６．４２（１Ｈ，ｓ），７．１４−７．２７（５Ｈ，ｍ），７．３７（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．７４（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
実施例１０　化合物（Ｉ−１０）の調製
2002000621.tif 000030
（第１工程）
化合物（１９）（４ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（７０ｍｌ）を−４０℃に冷却し、１Ｍ　ｓｅｃ−ブチルリチウム−シクロヘキサン・ヘキサン溶液（３３．８ｍｌ）をゆっくりと滴下した。１５分間攪拌した後、この反応溶液中にＮ−メトキシ−３，Ｎ−ジメチル−ブチルアミド（２．４５ｇ，１６．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２５ｍｌ）を−４０℃にて滴下した。同条件にて１時間、更に室温にて１時間攪拌した。反応終了後、１Ｎ塩酸とエーテルの混合液に注ぎ、エーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、粗製の（２０）を得た。精製することなく次の反応に用いた。
（第２工程）
粗製の（２０）を塩化メチレン（４０ｍｌ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（１６ｍｌ）を加え、室温にて１．５時間攪拌した。溶媒を留去し、クロロホルムで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１０：９０）で精製し、目的物（２１）（１．０６ｇ，３１％）を茶色の油状物質として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．９７（１Ｈ，ｍ），２．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．９５（３Ｈ，ｓ），６．３３（１Ｈ，ｓ），６．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．０４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．８５（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
（第３工程）
化合物（２１）（５７２ｍｇ，２．８１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（６ｍｌ）に６０％水素化ナトリウム（１２４ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。この反応液中にベンジルクロリド（３８９μｌ，３．３８ｍｍｏｌ）を加え、更に１時間攪拌した。反応終了後、氷水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１０：９０）で精製し、目的物（２２）（８０３ｍｇ，９７％）を黄色の油状物質として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９５（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．９２（１Ｈ，ｍ），２．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．９７（３Ｈ，ｓ），５．３０（２Ｈ，ｓ），６．４４（１Ｈ，ｓ），６．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．９４（２Ｈ，ｍ），７．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．２２（３Ｈ，ｍ）．
（第４工程）
化合物（２２）（８０３ｍｇ，２．７４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１０ｍｌ）に１Ｍ三臭化ほう素−塩化メチレン溶液（５．４７ｍｌ）を滴下し、室温にて１時間攪拌した。反応液を氷水に注ぎ、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝２０：８０）で精製し、目的物（２３）（６３８ｍｇ，８３％）を茶色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９６（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．９２（１Ｈ，ｍ），２．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．９６（１Ｈ，ｓ），５．２９（２Ｈ，ｓ），６．３７（１Ｈ，ｓ），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．９４（３Ｈ，ｍ），７．２３（３Ｈ，ｍ）．
（第５工程）
化合物（２３）（６３８ｍｇ，２．２８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（６ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（５６８ｍｇ，４．１１ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。この反応溶液にブロモ酢酸メチル（２５９μｌ，２．７４ｍｍｏｌ）、よう化カリウム（３８ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１．５時間攪拌した。反応終了後、氷水を注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１０：９０）で精製し、目的物（２４）（５９６ｍｇ，７４％）を白色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９５（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．９３（１Ｈ，ｍ），２．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．８２（３Ｈ，ｓ），４．８０（２Ｈ，ｓ），５．３０（２Ｈ，ｓ），６．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．５１（１Ｈ，ｓ），６．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９３（２Ｈ，ｍ），６．９７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２３（３Ｈ，ｍ）．
（第６工程）
化合物（２４）（５９６ｍｇ，１．７０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解し、オキサリルクロリド（１６３μｌ，１．８７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間２０分間攪拌した。反応液にアンモニア水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。酢酸エチル−ヘキサンから再結晶を行い、目的物（２５）（６４４ｍｇ，９０％）を無色の結晶として得た。
融点：１６７−１６８．５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．８５（１Ｈ，ｍ），２．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．７１（３Ｈ，ｓ），４．７６（２Ｈ，ｓ），５．５１（２Ｈ，ｓ），６．５６（１Ｈ，ｄ．ｄ，Ｊ＝１．８，６．３Ｈｚ），７．０２（４Ｈ，ｍ），７．２９（３Ｈ，ｍ），７．３５（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．７０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
（第７工程）
化合物（２５）（６３９ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）とメタノール（１０ｍｌ）の混合液に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム（３．０ｍｌ）を加え室温にて１．５時間攪拌した。反応終了後、１Ｎ塩酸で酸性とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。酢酸エチル−ヘキサンから再結晶を行い、目的物（Ｉ−１０）（５６１ｍｇ，９１％）を淡黄色の結晶として得た。
融点：２０８．５−２１０℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８５（１Ｈ，ｍ），２．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．６５（２Ｈ，ｓ），５．５１（２Ｈ，ｓ），５．５２（１Ｈ，ｄ．ｄ，Ｊ＝１．２，７．２Ｈｚ），７．００（４Ｈ，ｍ），７．２９（３Ｈ，ｍ），７．４０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．７４（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
実施例１０に従い、表２に示した化合物（Ｉ−１１）、（Ｉ−１２）を合成した。物理恒数を以下に示す。
2002000621.tif 000031
実施例１３　化合物（Ｉ−１３）の調製
2002000621.tif 000032
（第１工程）
５−メチル−１，３−シクロヘキサンジオン（２６）（６．１６ｇ，４８．８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍｌ）に溶解し、１−ブロモ−４−メチル−２−ペンタノン（８．７５ｇ，４８．９ｍｍｏｌ）、１Ｎ水酸化ナトリウム（６３．５ｍｌ）を加え、室温にて７２時間攪拌した。反応液を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝５０：５０）で精製し、目的物（２７）（１．３２ｇ，１２％）を白色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．８９（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．９９−２．２８（４Ｈ，ｍ），２．４６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．４９（２Ｈ，ｍ），３．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），３．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），９．９３（１Ｈ，ｓ）．
（第２工程）
化合物（２７）（１．２８ｇ，５．７１ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（３０ｍｌ）にベンジルアミン（６１２ｍｇ，５．７１ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流を行った。生成する水はモレキュラーシーブ４Ａを充填したＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋで脱水した。反応終了後、酢酸エチルで希釈し、１Ｎ塩酸で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝２５：７５）で精製し、目的物（２８）（１．４３ｇ，８５％）を淡黄色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．７８（１Ｈ，ｍ），２．１７−２．４３（５Ｈ，ｍ），２．５０（１Ｈ，ｍ），２．６９（１Ｈ，ｍ），５．０３（２Ｈ，ｓ），６．３６（１Ｈ，ｓ），６．８９（２Ｈ，ｍ），７．３２（３Ｈ，ｍ）．
（第３工程）
化合物（２８）（０．９５ｇ，３．２２ｍｍｏｌ）を２−（２−エトキシエトキシ）エタノール（１２ｍｌ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（１９０ｍｇ）を加え、２００℃で９時間加熱した。反応終了後、酢酸エチルで希釈し、水、飽和食塩水の順に洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１０：９０）で精製し、目的物（２９）（６３４ｍｇ，６７％）を淡黄色の粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９４（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８９（１Ｈ，ｍ），２．３４（３Ｈ，ｓ），２．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．８４（１Ｈ，ｓ），５．２５（２Ｈ，ｓ），６．３０（１Ｈ，ｓ），６．３５（１Ｈ，ｓ），６．５９（１Ｈ，ｓ），６．９４（２Ｈ，ｍ），７．２４（３Ｈ，ｍ）．
（第４工程）
化合物（２９）を出発原料として、実施例１０−第５工程〜第７工程と同様の方法を用いて化合物（Ｉ−１３）を合成した。
融点：２２０−２２１．５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８６（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８３（１Ｈ，ｍ），２．２９（３Ｈ，ｓ），２．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．６４（２Ｈ，ｓ），５．４７（２Ｈ，ｓ），６．３６（１Ｈ，ｓ），６．８３（１Ｈ，ｓ），６．９８−７．３４（５Ｈ，ｍ），７．４０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．７４（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），１２．９２（１Ｈ，ｂｒ）．
実施例１４　化合物（Ｉ−１４）の調製
実施例１３に従い化合物化合物（Ｉ−１４）の合成を行った。
2002000621.tif 000033
融点：２００．５−２０２℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．６７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．５６（１Ｈ，ｍ），２．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．６９（２Ｈ，ｓ），６．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．０５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．４７−７．６９（６Ｈ，ｍ），７．８２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
実施例１５　化合物（Ｉ−１５）の調製
2002000621.tif 000034
（第１工程）
化合物（Ｉ−１）（１５０ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解し、ベンゼンスルホンアミド（６１ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩（７５ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（４８ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応終了後、１Ｎ塩酸を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５）で精製し、目的物（Ｉ−１５）（１１４ｍｇ，５７％）を淡黄色の結晶として得た。
融点：１９３−１９５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８１（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．７３（１Ｈ，ｍ），１．９０（３Ｈ，ｓ），２．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．３１（２Ｈ，ｓ），４．７６（２Ｈ，ｓ），７．０４−７．３１（５Ｈ，ｍ），７．５４−７．７１（５Ｈ，ｍ），７．８５（２Ｈ，ｍ），７．９６（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），１２．２０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
実施例１５に従い、表３、４、５に示した化合物（Ｉ−１６）から（Ｉ−３２）を合成した。物理恒数を以下に示す。
2002000621.tif 000035
2002000621.tif 000036
2002000621.tif 000037
実施例３３　化合物（Ｉ−３３）の調製
2002000621.tif 000038
（第１工程）
化合物（Ｉ−２３）（４０３ｍｇ，０．８３ｍｍｏｌ）のエタノール懸濁液（１０ｍｌ）に水素化ほう素ナトリウム（４１ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）を加え、５０℃にて１５分間攪拌した。反応終了後、２Ｎ塩酸に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。目的物（３０）（３９８ｍｇ，９８％）を白色の粉末として得た。このまま次の反応に用いた。
（第２工程）
化合物（３０）（３５０ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）、トリエチルシラン（１４９μｌ，０．９３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１５分間攪拌した。酢酸エチルで希釈し、これを水、飽和食塩水の順に洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９７：３）で精製し、目的物（Ｉ−３３）（１１１ｍｇ，３３％）を無色の結晶として得た。
融点：１８９−１９０℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．７４（１Ｈ，ｍ），２．６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．２８（３Ｈ，ｓ），３．６９（２Ｈ，ｓ），４．７９（２Ｈ，ｓ），５．３８（２Ｈ，ｓ），６．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），６．９１（５Ｈ，ｍ），７．０６（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．２４（３Ｈ，ｍ），１２．１１（１Ｈ，ｂｒ）．
実施例１５に従い、化合物（Ｉ−３４）および表６に示した化合物（Ｉ−３５）、（Ｉ−３６）を合成した。
2002000621.tif 000039
融点：１８９−１９０℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８６（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．２５（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．７４（１Ｈ，ｍ），２．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．６０（１Ｈ，ｍ），３．６８（２Ｈ，ｓ），４．８３（２Ｈ，ｓ），５．３７（２Ｈ，ｓ），６．３５（１Ｈ，ｄ．ｄ，Ｊ＝１．８，６．６Ｈｚ），６．８８（５Ｈ，ｍ），７．０８（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．２３（３Ｈ，ｍ），１１．９２（ｂｒ）
2002000621.tif 000040
実施例３７　化合物（Ｉ−３７）の調製
2002000621.tif 000041
（第１工程）
化合物（Ｉ−１０）（１００ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（４ｍｌ）に１，１’−カルボニルジイミダゾール（４８ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。ここに、シアナミド（３１ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（２ｍｌ）に６０％水素化ナトリウム（２９ｍｇ，０．７３ｍｍｏｌ）を加え室温にて１時間攪拌したものを滴下し、さらに室温にて２時間攪拌した。反応液を２Ｎ塩酸に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水の順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残さをＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製（クロロホルム溶出）し、目的物（Ｉ−３７）（９４ｍｇ，８９％）を黄色粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８７（１Ｈ，ｍ），２．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．８４（２Ｈ，ｓ），５．５４（２Ｈ，ｓ），６．６３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），７．０２（２Ｈ，ｍ），７．０９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），７．３０（３Ｈ，ｍ），７．８２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），８．１６（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
実施例３７に従い、表７に示した化合物（Ｉ−３８）、（Ｉ−３９）を合成した。
2002000621.tif 000042
実施例４０　化合物（Ｉ−４０）の調製
2002000621.tif 000043
（第１工程）
化合物（２３）（５００ｍｇ，１．７９ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（４４５ｍｇ，３．２２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。この溶液に、ブロモアセトニトリル（１５０μｌ，２．１５ｍｍｏｌ）、よう化カリウム（３０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を加え、さらに３．５時間攪拌した。反応終了後、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝８５：１５）で精製し、目的物（３１）（５５０ｍｇ，９７％）を無色油状物質として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．９６（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．９３（１Ｈ，ｍ），２．５５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．９１（２Ｈ，ｓ），５．３１（２Ｈ，ｓ），６．４３（１Ｈ，ｓ），６．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．９４（３Ｈ，ｍ），７．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．２４（３Ｈ，ｍ）．
（第２工程）
化合物（３１）（２９１ｍｇ，０．９１ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液にオキサリルクロリド（８８μｌ，１．０１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応液をアンモニア水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。酢酸エチル−ヘキサンより再結晶を行い、目的物（３２）（２７９ｍｇ，７８％）を淡黄色結晶として得た。
融点：１５５−１５６．５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８４（１Ｈ，ｍ），２．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），５．１２（２Ｈ，ｓ），５．５４（２Ｈ，ｓ），６．８４（１Ｈ，ｄ．ｄ，Ｊ＝２．１，６．６Ｈｚ），７．０１（２Ｈ，ｍ），７．１３（２Ｈ，ｍ），７．２９（３Ｈ，ｍ），７．４２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．８５（１Ｈ，ｂｒ，ｓ）．
（第３工程）
化合物（３２）（１５０ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（３ｍｌ）にアジ化ナトリウム（３８ｍｇ，０．５８ｍｍｏｌ）、塩化アンモニウム（１１ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を加え、１４０℃にて４時間攪拌した。反応液を冷却し、２Ｎ塩酸を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製（クロロホルム溶出）し、目的物（Ｉ−４０）（１３８ｍｇ，８３％）を黄緑色粉末として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：０．８７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８５（１Ｈ，ｍ），２．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．５２（２Ｈ，ｓ），５．５５（２Ｈ，ｓ），６．７７（１Ｈ，ｄ．ｄ，Ｊ＝３．０，５．１Ｈｚ），７．０５（４Ｈ，ｍ），７．２９（３Ｈ，ｍ），７．４８（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．８９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）．
試験例１　ヒト分泌ホスホリパーゼＡ２阻害試験
分析実験
組み換えヒト分泌ホスホリパーセＡ２のインヒビターを同定及び評価するために、以下のクロモジェニックアッセイを用いる。ここに配慮したアッセイは９６ウェルマイクロタイタープレートを用いる高容量スクリーニングに適用されている。このアッセイの一般的な説明は、Ｌａｕｒｅ　Ｊ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｌｏｒｉ　Ｌ．Ｈｕｇｈｅｓ及びＥｄｗａｒｄ　Ａ．Ｄｅｎｎｉｓによる記事「Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｙｎｏｖｉａｌ　Ｆｌｕｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ａ２　ｏｎ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃｈａｉｎ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−Ｍｉｘｅｄ　Ｍｉｃｅｌｌｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｓｓａｙ　Ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ａ　Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０４，ｐｐ　１９０−１９７，１９９２）に記載されている。
試薬
（反応バッファー）
ＣａＣｌ２．６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　（２．１９ｇ／Ｌ）
ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　（７．４５５ｇ／Ｌ）
ウシ血清アルブミン（脂肪酸不含）　　　（１ｇ／Ｌ）
（Ｓｉｇｍａ　Ａ−７０３０）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　　　　　　　　　　（３．９４ｇ／Ｌ）
ｐＨ７．５（ＮａＯＨで調整）
（酵素バッファー）
０．０５Ｍ−ＡｃＯＮａ
０．２Ｍ−ＮａＣｌ
ｐＨ４．５（酢酸で調整）
（ＤＴＮＢ）
５，５’−ジチオビス−２−安息香酸（和光純薬製）１９８ｍｇをＨ２Ｏ　１００ｍｌに溶解ｐＨ７．５（ＮａＯＨで調整）
（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（基質）溶液）
ラセミ１，２−ビス（ヘプタノイルチオ）−１，２−ジデオキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン１００ｍｇを１ｍｌのクロロホルムに溶解する。
（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００　６２４．９ｍｇを１００ｍｌの反応バッファーで溶解する。
（酵素溶液）
Ｉ型酵素：ｓＰＬＡ２溶液（３３０ｎｇ／μｌ）（Ａ．Ｋａｎｄａ等，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，１１７１（１９９２）１−１０に記載）をアッセイの際には希釈して（酵素溶液２７μｌに反応バッファー１９７３μｌを加えて希釈）用いる。
ＩＩ型酵素：酵素１ｍｇを酵素バッファー１ｍｌに溶解する。以後４℃にて保存する。アッセイの際には、この溶液６μｌに反応バッファーを１９９４μｌ加えて希釈し用いる。
Ｖ型およびＸ型酵素：ヒトＶ型、Ｘ型ｓＰＬＡ２をコードするｃＤＮＡ配列（Ｃｈｅｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９４，２６９，２３６５−２３６８ならびにＣｕｐｉｌｌａｒｄ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９７，２７２，１５７４５−１５７５２）を動物細胞用発現ベクターであるｐＳＶＬ　ＳＶ４０　Ｌａｔｅ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）のプロモーター下流域に順方向に挿入した。得られた発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社）を用いて宿主細胞ＣＨＯに使用説明書にしたがってトランスフェクションし、ヒトＶ型、Ｘ型ｓＰＬＡ２をそれぞれ安定に発現するＣＨＯ細胞を得た。各発現細胞を、１０％ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ倍地にて３日間培養し、その培養上清を各酵素活性の測定に使用した。
酵素反応：マイクロタイタープレート１枚分
１）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（基質）溶液０．１０６ｍｌを遠心管に取り、窒素ガスを吹き付け溶媒を留去する。これに、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ　１００　０．５４ｍｌを加え攪拌後、Ｂａｔｈ　ｔｙｐｅ　ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ中で、ｓｏｎｉｆｙし溶解する。これに、反応バッファー１７．８ｍｌ及びＤＴＮＢ０．４６ｍｌを加えて、９６ウェルマイクロタイタープレートに、０．１８ｍｌずつ分注する。
２）被検化合物（又は溶媒ブランク）１０μｌを、あらかじめ設定したプレートの配列に従って加える。
３）４０℃で、１５分間インキュベートする。
４）ヒトＩ型酵素の場合は９０ｎｇ／ウェル、ヒトＩＩ型酵素の場合は６０ｎｇ／ウェル、ヒトＶ型酵素の場合は４０μｌ／ウェル、ヒトＸ型酵素の場合は１５μｌ／ウェルを反応させた。
５）ヒトＩ型、ＩＩ型、Ｘ型酵素は３０分間、ヒトＶ型酵素は４５分間の吸光度変化をプレートリーダーで測定し、阻害活性を算出した（ＯＤ：４０５ｎｍ）。
６）ＩＣ５０は、ｌｏｇ濃度を１０％〜９０％阻害の範囲の阻害値に対して、プロットすることにより求めた。
ｓＰＬＡ２阻害試験の結果を以下の表８に示した。
2002000621.tif 000044
試験例２　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト大腸癌組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人大腸組織ならびに大腸癌患者由来大腸癌組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し、組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常大腸組織にはほとんど検出されず、大腸腺癌組織中の癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、大腸癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例３　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト肺癌組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人肺組織ならびに肺癌患者由来肺組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常肺組織ではＩＩ型肺胞上皮細胞において低レベルながら検出されたが、肺癌患者由来肺組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、肺癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例４　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト肝臓組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人肝臓組織ならびに肝臓癌患者由来肝臓組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常肝臓組織では肝小葉およびＫｕｐｆｆｅｒ細胞において低レベルながら検出されたが、肝臓癌患者由来肝臓組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、肝臓癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例５　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト胃組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人胃組織ならびに胃癌患者由来胃組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常胃組織ではほとんど検出されず、胃癌患者由来胃組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、胃癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例６　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト腎臓組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人腎臓組織ならびに腎臓癌患者由来腎臓組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常腎臓組織では糸球体メサンギウム細胞において低レベルながら検出されたが、腎臓癌患者由来腎臓組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、腎臓癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例７　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト胆嚢癌組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人胆嚢組織ならびに胆嚢癌患者由来胆嚢組識の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常胆嚢組織ではほとんど検出されず、胆嚢癌患者由来胆嚢組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、胆嚢癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例８　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト前立腺組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人前立腺組織ならびに前立腺癌患者由来前立腺組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常前立腺組織ではほとんど検出されず、前立腺癌患者由来前立腺組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、前立腺癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例９　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト膵臓組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人膵臓組織ならびに膵臓癌患者由来膵臓組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常膵臓組織ではほとんど検出されず、膵臓癌患者由来膵臓組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、膵臓癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例１０　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト精巣組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人精巣組織ならびに精巣癌患者由来精巣組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼ活性を除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、１％メチルグリーン含有０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常精巣組織では精細管の一部にごくわずかながら検出されたが、精巣癌患者由来精巣組織においては、精細管および精嚢上皮に生じた癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、精巣癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例１１　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト卵巣組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人卵巣組織ならびに卵巣癌患者由来卵巣組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼ活性を除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、１％メチルグリーン含有０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常卵巣組織ではほとんど検出されなかったが、卵巣癌患者由来卵巣組織においては、卵胞上皮から卵管付近に生じた癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、卵巣癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例１２　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト皮膚組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人皮膚組織ならびに皮膚癌（悪性黒色腫）患者由来皮膚組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼ活性を除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、１％メチルグリーン含有０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常皮膚組織では表皮の有棘細胞層から基底細胞層のメラノサイトにおいて低レベルながら検出されたが、皮膚癌（悪性黒色腫）患者由来皮膚組織においては、異型メラノサイトに強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、皮膚癌（悪性黒色腫）ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例１３　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト大脳組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人大脳組織ならびにアルツハイマー患者由来大脳組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍｌのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常大脳組織にはほとんど検出されず、アルツハイマー患者由来大脳組織中の神経細胞群の一部、特に老人班（ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅ）や神経原繊維変化部位（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ｔａｎｇｌｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ）に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、アルツハイマー患者大脳ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例１４　抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト肝硬変組織の免疫組織化学的解析
本試験には、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１　１９９９記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いた。健常成人肝臓組織ならびに肝硬変患者由来肝臓組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％　Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍｌのジアミノベンジジンと０．００６％　Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常肝臓組織では肝小葉およびＫｕｐｆｆｅｒ星細胞において低レベルながら検出されたが、肝硬変患者由来肝臓組織では、偽小葉において顕著な発現増強が認められた。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、肝硬変組織ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質が顕著に高発現していることが示唆された。
試験例１５　ヒト大腸ガン細胞株ＨＴ−２９細胞におけるヒトＸ型ｓＰＬＡ２によるオレイン酸遊離に対するｓＰＬＡ２阻害剤の阻害効果
１０％ウシ胎児血清入りＤＭＥＭ培地にて培養したヒト大腸ガン細胞株ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣより購入）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄後、トリプシン・ＥＤＴＡ溶液によりプレートから剥離し、さらにＰＢＳで洗浄後、１２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度になるように０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＨａｎｋｓ緩衝生理食塩水に懸濁した。そのうち０．４ｍｌをポリプロピレンチューブにとり、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した被験化合物（最終濃度１０μＭ；ＤＭＳＯに溶解）を添加し、３７℃で１０分間保温した。その後、１００ｎＭ精製ヒトＸ型ｓＰＬＡ２酵素（Ｈａｎａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４，３４２０３−３４２１１）を添加し（最終反応容積０．５ｍｌ）、さらに３７℃で３０分間保温後、２ｍｌのドールズ試薬（ヘプタン：２−プロパノール：１Ｍ硫酸＝１０：４０：１，ｖ／ｖ／ｖ）を添加することにより反応を停止した。その後、Ｔｏｊｏらの方法（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９３）３４，８３７−８４４）に準じて、脂肪酸を抽出し、９−ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ（フナコシ）で脂肪酸を標識後、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ　１２５−４　Ｓｕｐｅｒｓｐｈｅｒ　１００　ＲＰ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ））にて、オレイン酸の定量を行った。データーは、Ｘ型ｓＰＬＡ２を添加していない時の値を差し引いた後、Ｘ型酵素添加により増加したオレイン酸量を１００％とし、これに対する各被験化合物存在下での遊離量を％で示した。表９に示すように、各被験化合物はＸ型ｓＰＬＡ２によるオレイン酸遊離反応を有意に抑制した。
試験例１６　ヒト大腸ガン細胞株ＨＴ−２９細胞におけるヒトＸ型ｓＰＬＡ２によるＰＧＥ２産生作用に対するｓＰＬＡ２阻害剤の阻害効果
ＨＴ−２９細胞を２．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で２４穴プレートに播種し、２４時間後に細胞をＰＢＳにて洗浄後、３０ｎｇ／ｍｌのＴｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ−α（Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を含む１０％ウシ胎児血清入りＤＭＥＭ培地にてさらに１８時間培養した。ＰＢＳにて洗浄後、ＤＭＳＯに溶解した被験化合物（最終濃度１０μＭ；ＤＭＳＯに溶解）を含む０．１％ＢＳＡ含有Ｈａｎｋｓ緩衝生理食塩水を添加し、３７℃で１０分間保温後、１００ｎＭ精製ヒトＸ型ｓＰＬＡ２酵素を添加し（最終反応容積０．５ｍｌ）、さらに３７℃で３時間保温した。その後、培養上清を回収し、遠心分離にて浮遊細胞を除いた後、上清中のＰＧＥ２量を市販の酵素免疫測定キット（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ．）にて定量した。データーは、Ｘ型ｓＰＬＡ２を添加していない時の値を差し引いた後、Ｘ型酵素添加により産生されたＰＧＥ２量を１００％とし、これに対する各被験化合物存在下での産生量を％で示した。表９に示すように、各被験化合物はＸ型ｓＰＬＡ２によるＰＧＥ２産生反応を有意に抑制した。
ＰＧＥ２が癌の発生と綿密な関係を有することがＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５９，５０９３−５０９６，１９９９に記載されている。本発明化合物は、Ｘ型ｓＰＬＡ２によるＰＧＥ２産生反応を有意に抑制することから、抗癌剤として使用し得る。
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試験例１７　Ｘ型ＰＬＡ２による単離ヒトリポタンパク質からの脂肪酸遊離作用と薬物の作用
ＬＤＬは、ヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３（１９５５））により単離した。１０ｎｍｏｌ／ＬのヒトＸ型ｓＰＬＡ２を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中で、ＬＤＬ（０．５ｍｇ／ｍｌ）と３７度で４時間反応させた。リポタンパク質から遊離された脂肪酸をＤｏｌｅらの方法（Ｄｏｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５，２５９５−２５９９（１９６０））により抽出し、既知の方法（Ｈａｎａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３４２０３−３４２１１（１９９９））に従って９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅにより標識した後、逆相カラム（ＬｉｃｈｒｏＣＡＲＴ　１２５−４　Ｓｕｐｅｒｓｐｈｅｒ　１００　ＲＰ−１８　ｃｏｌｕｍｎ，Ｍｅｒｃｋ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって溶出される標識物（脂肪酸）の蛍光を検出することにより定量を行った。薬物の阻害作用を調べる実験では、反応液中にｓＰＬＡ２を添加するのとほぼ同時に、ｓＰＬＡ２阻害剤を、終濃度が１０μＭになるように添加した。その結果は表１０に示すとおりである。
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本発明化合物は、Ｘ型ｓＰＬＡ２によるヒトリポタンパク質からの脂肪酸の遊離を有意に抑制することから、動脈硬化治療剤として使用し得る。
製剤例
以下に示す製剤例１〜８は例示にすぎないものであり、発明の範囲を何ら限定することを意図するものではない。「活性成分」なる用語は、Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの水和物を意味する。
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成分を混合し、圧縮して各重量６６５ｍｇの錠剤にする。
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活性成分とエタノールを混合し、この混合物をプロペラント２２の一部に加え、−３０℃に冷却し、充填装置に移す。ついで必要量をステンレススチール容器へ供給し、残りのプロペラントで希釈する。バブルユニットを容器に取り付ける。
製剤例４
活性成分６０ｍｇを含む錠剤は次のように製造する：
活性成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０ｍｇ
デンプン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５ｍｇ
微結晶性セルロース　　　　　　　　　　　　　　　　３５ｍｇ
ポリビニルピロリドン（水中１０％溶液）　　　　　　　４ｍｇ
ナトリウムカルボキシメチルデンプン　　　　　　　　　４．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　０．５ｍｇ
滑石　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｇ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０ｍｇ
活性成分、デンプン、およびセルロースはＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．のふるいにかけて、十分に混合する。ポリビニルピロリドンを含む水溶液を得られた粉末と混合し、ついで混合物をＮｏ．１４メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。このようにして得た顆粒を５０℃で乾燥してＮｏ．１８メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。あらかじめＮｏ．６０メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通したナトリウムカルボキシメチルデンプン、ステアリン酸マグネシウム、および滑石をこの顆粒に加え、混合した後、打錠機で圧縮して各重量１５０ｍｇの錠剤を得る。
製剤例５
活性成分８０ｍｇを含むカプセル剤は次のように製造する：
活性成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０ｍｇ
デンプン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５９ｍｇ
微結晶性セルロース　　　　　　　　　　　　　　　　５９ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２００ｍｇ
活性成分、デンプン、セルロース、およびステアリン酸マグネシウムを混合し、Ｎｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．のふるいに通して硬質ゼラチンカプセルに２００ｍｇずつ充填する。
製剤例６
活性成分２２５ｍｇを含む坐剤は次のように製造する：
活性成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２５ｍｇ
飽和脂肪酸グリセリド　　　　　　　　　　　　　２０００ｍｇ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２２５ｍｇ
活性成分をＮｏ．６０メッシュＵ．Ｓ．のふるいに通し、あらかじめ必要最小限に加熱して融解させた飽和脂肪酸グリセリドに懸濁する。ついでこの混合物を、みかけ２ｇの型に入れて冷却する。
製剤例７
活性成分５０ｍｇを含む懸濁剤は次のように製造する：
活性成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
ナトリウムカルボキシメチルセルロース　　　　　　　５０ｍｇ
シロップ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２５ｍｌ
安息香酸溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１０ｍｌ
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｑ．ｖ．
色素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｑ．ｖ．
精製水を加え合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｍｌ
活性成分をＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．のふるいにかけ、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびシロップと混合して滑らかなペーストにする。安息香酸溶液および香料を水の一部で希釈して加え、攪拌する。ついで水を十分量加えて必要な体積にする。
製剤例８
静脈用製剤は次のように製造する：
活性成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
飽和脂肪酸グリセリド　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ
上記成分の溶液は通常、１分間に１ｍｌの速度で患者に静脈内投与される。
産業上の利用可能性
本発明に係る一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、Ｘ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有し、癌、肝硬変、アルツハイマー病、および／または動脈硬化等の予防または治療剤として有効であることを見出した。
【国際調査報告】
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