(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原と（２）アビジンの少なくともサブユニット間が架橋され、且つ標識物質が結合している標識化架橋アビジンとの複合体を含むことを特徴とする、免疫学的分析用試薬。
【請求項２】
前記標識物質が、蛍光物質若しくは蛍光物質結合タンパク質、発光物質若しくは発光物質結合タンパク質、又は酵素である、請求項１に記載の免疫学的分析用試薬。
【請求項３】
前記アビジンが、卵白アビジン、ストレプトアビジン、又はリコンビナントアビジンである、請求項１又は２に記載の免疫学的分析用試薬。
【請求項４】
アビジンの少なくともサブユニット間の架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させたアビジンを含むことを特徴とする、免疫学的分析用試薬。
【請求項５】
（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原、及び（２）アビジンの少なくともサブユニット間の架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させたアビジンを使用することを特徴とする、免疫学的分析方法。
【請求項６】
前記標識物質が、蛍光物質若しくは蛍光物質結合タンパク質、発光物質若しくは発光物質結合タンパク質、又は酵素である、請求項５に記載の免疫学的分析方法。
【請求項７】
前記アビジンが、卵白アビジン、ストレプトアビジン、又はリコンビナントアビジンである、請求項５又は６に記載の免疫学的分析方法。
【請求項８】
アビジンの少なくともサブユニット間の架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させたアビジン、及びビオチン化剤を含むことを特徴とする、免疫学的分析用キット。
【請求項９】
（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原、及び（２）アビジンの少なくともサブユニット間の架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させたアビジンを含むことを特徴とする、免疫学的分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的分析用試薬、免疫学的分析方法、及び免疫学的分析用キットに関する。なお、本明細書における「分析」には、分析対象化合物の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象化合物の存在量を決定する「定量」との両方が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
バーソン及びヤーロウが放射性同位元素を抗原や抗体に標識して、ラジオイムノアッセイを完成させてから約４０年の月日が流れたが、その感度の良さ及び特異性の高さから現在でも有用な方法として用いられている。ラジオイムノアッセイ自体の測定方法は開発当初からほとんど変化していないが、そこから派生した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、又は発光免疫測定法等の開発改良の数はおびただしい物がある。
【０００３】
酵素免疫測定法は、放射性同位元素の代わりに、酵素を抗原や抗体に標識した方法で、酵素が持つ基質に対する触媒活性の高さから高感度な測定が可能となっている。
また、蛍光免疫測定法は、蛍光物質自体の感度は劣るが、最近、ユーロピウムキレート又はサマリウムキレートの蛍光消光時間が長いことを利用し、励起光をパルスで当て、他の物質の蛍光が消光する時間が経過してから、この物質の蛍光を測定する時間分解蛍光測定法が開発され、優れた方法となってきた。
更に、発光免疫測定法としては、イソルミノール又はアクリジニウムエステルを標識してその物質の発光量を測定する方法や、あるいは、標識物質は酵素であるが、基質に発光反応を起こすものを用いるペルオキシダーゼとルミノールとの組み合わせ、リン酸基が外れると発光する基質（例えば、ＡＭＰＰＤ）とアルカリフォスファターゼとの組み合わせ、又は標識酵素としてルシフェラーゼを用い、基質にルシフェリンを使用する組み合わせにより高感度な測定系が構築されている。
【０００４】
このような酵素、蛍光物質、又は発光物質といった標識物質の抗原又は抗体に対する標識方法は、種々考案されてきたが、その一つにアビジン−ビオチン反応を利用したものがある。この方法は、二試薬、すなわち、ビオチン化抗体又はビオチン化抗原と標識化アビジンとを別々に用いる方法であり、まず、分析対象化合物（抗原）を含む被検試料と、固相化抗体とを反応させ、洗浄操作を行ってから、ビオチン化抗体を反応させ、更に洗浄操作を行った後に、標識化アビジンを反応させ、ビオチン化抗体を介して固相化抗体−抗原複合体に結合した標識化アビジンに由来する標識物質量を測定して抗原量を知る方法である。
【０００５】
前記の標識化アビジンは、主に抗原又は抗体に酵素を標識するために開発された種々の化学的修飾法を用いて、標識タンパク質（例えば、標識酵素、蛍光物質結合タンパク質、又は発光物質結合タンパク質）とアビジンとを結合することにより調製することができる。このような化学的修飾法としては、例えば、標識タンパク質とアビジンとの混合液にグルタルアルデヒドを加え、アミノ基同士を架橋してランダムに標識タンパク質とアビジンとの凝集体を調製する方法、標識タンパク質の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化してアルデヒド基を生じさせ、アビジンのアミノ基と結合する方法、又はアミノ基同士、アミノ基とカルボキシ基、若しくはアミノ基とチオール基とを架橋することができる種々の架橋剤を用いて選択的にアビジンと標識タンパク質とを結合する方法などを挙げることができる。
このように調製した標識化アビジンを、種々の抗原又は抗体にビオチンを導入した試薬と組み合わせることにより、容易に高感度測定系を構築することが可能であり、種々の研究用試薬に用いられるようになってきた。
【０００６】
このような標識化アビジンとビオチン化抗原又は抗体との組み合わせにおいては、ビオチン化の操作が割合に容易であることから、市販の標識化アビジンと組み合わせることで簡便に測定系を構築することができるメリットがある。しかし、アビジン−ビオチン反応を利用する測定系では、これまで、抗体固相化担体と抗原との反応、ビオチン化抗体との反応、そして、標識化アビジンとの反応というように、反応ステップを多段階で実施することが当業者の常識となっていた。市販の測定試薬やキットにおいても、標識化アビジンとビオチン化抗原又は抗体とを分けた形で保存・流通されており、本発明者が知る限り、標識化アビジンとビオチン化抗原又は抗体とを混合して保存する報告は一切ない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、アビジン−ビオチン反応の長所を有しながら、操作ステップが少なく、迅速且つ簡易であって、しかも、正確な免疫学的分析方法を鋭意探求したところ、標識化アビジンを構成するアビジンのサブユニットを分子内架橋しておくと、得られた標識化架橋アビジンとビオチン化抗体とを混合しても、その反応性を安定に維持することができることを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原と（２）アビジンの少なくともサブユニット間が架橋され、且つ標識物質が結合している標識化架橋アビジンとの複合体を含むことを特徴とする、免疫学的分析用試薬に関する。
また、本発明は、アビジンの少なくともサブユニット間の架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させたアビジンを含むことを特徴とする、免疫学的分析用試薬にも関する。
また、本発明は、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原、及び（２）アビジンの少なくともサブユニット間の架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させたアビジンを使用することを特徴とする、免疫学的分析方法にも関する。
更に、本発明は、アビジンの少なくともサブユニット間の架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させたアビジン、及びビオチン化剤を含むことを特徴とする、免疫学的分析用キットにも関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本明細書において「アビジン」とは、ビオチンに特異的に強く結合することのできるタンパク質の総称であって、例えば、卵白アビジン、ストレプトアビジン、又は遺伝子操作で得られたアビジン（すなわち、リコンビナントアビジン）等を挙げることができる。
アビジンは、同一のサブユニット４個からなるタンパク質である。各サブユニットにはビオチン結合部位が１箇所ずつ存在するため、１分子のアビジンには４分子のビオチンが結合することができる。各サブユニットは共有結合で結合していないため、アビジンに高い熱が加わると、各サブユニットに開裂してしまうことが知られている。
【００１０】
本発明において使用する「標識化架橋アビジン」とは、アビジンの少なくともサブユニット間が架橋（すなわち、分子内架橋）され、しかも、標識物質が結合しているものを意味する。前記標識化架橋アビジンには、アビジン１分子のみからなる標識化架橋アビジンモノマー、及び複数のアビジン分子が、更に分子間架橋により共有結合で結合されている標識化架橋アビジンポリマーの両方が含まれる。
【００１１】
本発明において標識化架橋アビジンを調製する際に使用することのできる標識物質は、通常の免疫学的分析方法において、抗体又は抗原を標識するために使用される物質である限り、特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質若しくは蛍光物質結合タンパク質、発光物質若しくは発光物質結合タンパク質、又は酵素を挙げることができる。
前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、又はアルカリフォスファターゼを挙げることができる。
前記蛍光物質としては、例えば、フルオレッセイン、ローダミン、ユーロピウムキレート、又はサマリウムキレートを挙げることができ、前記蛍光物質結合タンパク質としては、前記蛍光物質をタンパク質に結合し、蛍光物質を集積したものを挙げることができる。
前記発光物質としては、例えば、アクリジウムエステル又はイソルミノールを挙げることができ、前記発光物質結合タンパク質としては、前記発光物質をタンパク質に結合し、発光物質を集積したものを挙げることができる。
【００１２】
前記の標識化架橋アビジンには、（１）アビジンの分子内及び分子間架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させた「ポスト標識化−架橋アビジン」と、（２）アビジンの分子内及び分子間架橋処理と標識物質の結合処理とを同時に行なって得られる「同時標識化−架橋アビジン」とが含まれる。
【００１３】
前記のポスト標識化−架橋アビジンは、標識物質の不在下で、アビジンを適当な架橋剤で処理することにより、分子内及び分子間が架橋された架橋アビジンを得た後に、得られた架橋アビジンと所望の標識物質とを公知手段により結合させることにより、調製することができる。
アビジンの架橋処理に使用する前記架橋剤としては、例えば、アミノ基同士を結合する架橋剤としてのグルタルアルデヒド、ジスクシンイミド、ジメチルピメルイミデート、若しくはジメチルスベルイミデート、又はアミノ基とカルボキシ基とを縮合反応させる架橋剤としての種々のカルボジイミド［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等］を使用することができる。
【００１４】
ポスト標識化−架橋アビジンの調製において、標識物質として酵素を使用する場合には、酵素と予め調製した架橋アビジンとを、公知の種々の架橋剤を用いて、結合させることができる。このような架橋剤としては、ポスト標識化−架橋アビジンの調製におけるアビジンの架橋処理に使用することのできる前記架橋剤（例えば、アミノ基同士を結合する架橋剤、又はアミノ基とカルボキシ基とを縮合反応させる架橋剤）、あるいは、アミノ基とチオール基とを架橋することができる架橋剤［例えば、スクシンイミドとマレイミドとを両端にもつヘテロバイファンクショナルな架橋剤である４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミドエステル（ＣＨＭ）］等を使用することができる。
【００１５】
ポスト標識化−架橋アビジンの調製において、標識物質として酵素を使用する場合には、標識物質の不在下におけるアビジンの架橋処理の際に、アビジンの架橋処理用の前記架橋剤と、標識物質の結合用の前記架橋剤とを同時に反応させることもできる。例えば、前者の架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用し、後者の架橋剤としてＣＨＭを使用し、両方の架橋剤を同時にアビジンに反応させると、一部のアミノ基にマレイミドが導入され、残りのアミノ基同士でサブユニット同士が架橋される。この処理を行った架橋アビジンと、チオール基を有する標識物質（酵素）とを混合すると、アビジン上のマレイミド基と標識物質のチオール基とが結合し、ポスト標識化−架橋アビジンが合成される。ＣＨＭとグルタルアルデヒドとの混合比率、標識物質のチオール基の数などにより、目的にあったポスト標識化−架橋アビジンを調製することができる。
【００１６】
ポスト標識化−架橋アビジンの調製において、標識物質として蛍光物質又は発光物質を使用する場合には、標識物質の不在下におけるアビジンの架橋処理の際に、アビジン以外の異種タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を共存させて架橋処理を実施することができる。得られる架橋アビジン−異種タンパク質ポリマーに含まれる異種タンパク質部分は、蛍光物質又は発光物質が大量に結合することのできる土台として機能するので、高感度の測定法を構築するための手段として有効である。
【００１７】
標識物質が酵素の場合には、特定の架橋剤を使用して、アビジンの分子内及び分子間架橋処理と、標識物質の結合処理とを同時に行なうことにより、同時標識化−架橋アビジンを調製することができる。
同時標識化−架橋アビジンの調製において使用することのできる架橋剤としては、アビジンの分子内及び分子間架橋処理と、標識物質の結合処理とを同時に行なうことのできる架橋剤を挙げることができ、このような架橋剤としては、例えば、アミノ基同士を結合する架橋剤としてのグルタルアルデヒド、ジスクシンイミド、ジメチルピメルイミデート、若しくはジメチルスベルイミデート、又はアミノ基とカルボキシ基とを縮合反応させる架橋剤としての種々のカルボジイミド［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等］を挙げることができる。
【００１８】
本発明において使用することのできるビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'は、分析対象化合物に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む）から得られる抗体フラグメントＦａｂ'に、ビオチン１分子を共有結合により導入したものである。
前記抗体フラグメントＦａｂ'は、抗体をペプシンで消化することにより得られる抗体フラグメントＦ（ａｂ'）2を、更に還元剤（例えば、β−メルカプトエタノール又はメルカプトエチルアミン）で還元することにより調製することができる。すなわち、抗体分子のヒンジ領域には、２本のＨ鎖を連結するＳ−Ｓ結合１個が存在しており、このＳ−Ｓ結合のＣ末端側下流で、ペプシンによる分解を受けるので、抗体フラグメントＦ（ａｂ'）2のＣ末端側領域には、前記Ｓ−Ｓ結合が残っている。続いて、還元剤により前記Ｓ−Ｓ結合を還元すると、抗体フラグメントＦ（ａｂ'）2１分子から、Ｃ末端側領域にＳＨ基１つを有する抗体フラグメントＦａｂ'２分子が生じる。
このようにして得られたＳＨ基１つを有する抗体フラグメントＦａｂ'と、マレイミド基を有するビオチン誘導体とを反応させると、抗体フラグメントＦａｂ'１分子当たり、ビオチン１分子が導入されたビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'を得ることができる。
【００１９】
本発明において使用することのできるビオチン導入抗原は、抗原に、ビオチン１分子を共有結合により導入したものである。このようなビオチン導入抗原は、例えば、化学的修飾法又は遺伝子操作法を用いることにより調製することができる。
前記化学的修飾法は、それぞれの抗原に固有の性質を利用する方法であって、特異性のあるアミノ酸残基１個のみを有する抗原について適用することができ、前記アミノ酸残基に対して化学的にビオチンを結合させる。
【００２０】
一方、前記遺伝子操作法は、抗原とビオチンアクセプターとの融合タンパク質を宿主細胞中で発現させることにより、ビオチン導入抗原を得るものである。化学的修飾に対して非常に不安定である抗原の場合には、遺伝子操作法を用いることが好ましい。前記ビオチンアクセプターとは、宿主細胞中でビオチンを付加される一定のアミノ酸配列を含むタンパク質の総称であり、目的に応じてアクセプタータンパク質に翻訳される配列を含む遺伝子を用いることができる。
例えば、抗原の遺伝子とビオチンアクセプターの遺伝子とを連結させた遺伝子を宿主細胞内で発現させると、抗原−ビオチンアクセプター融合タンパク質が宿主細胞内で合成され、続いて、この融合タンパク質に、宿主細胞の働きによりビオチンが結合され、ビオチン導入抗原（ビオチンが導入された抗原−ビオチンアクセプター融合タンパク質）を得ることができる。
【００２１】
このようにして得られた（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'と、（２）標識化架橋アビジン（ポスト標識化−架橋アビジンと同時標識化−架橋アビジンとを含む）とを、適当な比率で混合することにより、反応性及び再現性に優れた標識化抗体（複合体）を得ることができ、あるいは、（１）ビオチン導入抗原と、（２）標識化架橋アビジンとを、適当な比率で混合することにより、反応性及び再現性に優れた標識化抗原（複合体）を得ることができる。
本発明の免疫学的分析用試薬は、（Ａ）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'と標識化架橋アビジンとの複合体を含むか、あるいは、（Ｂ）ビオチン導入抗原と標識化架橋アビジンとの複合体を含む。本発明の免疫学的分析用試薬は、従来公知の免疫学的分析方法、例えば、サンドイッチ法又は競合法に、標識化抗体又は標識化抗原として、そのまま適用することができる。
【００２２】
本発明の別の免疫学的分析用試薬は、架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させたポスト標識化−架橋アビジンを含む。本発明の免疫学的分析用試薬は、他の試薬、例えば、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原と組み合わせて、本発明の免疫学的分析方法に用いることができる。
【００２３】
本発明の分析方法では、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原、及び（２）ポスト標識化−架橋アビジンを使用すること以外は、従来公知の免疫学的分析方法、例えば、サンドイッチ法又は競合法にそのまま適用することができる。
（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原と（２）ポスト標識化−架橋アビジンとは、複合体（すなわち、標識化抗体又は標識化抗原）として使用することもできるし、あるいは、それぞれ別々に使用することもできる。例えば、抗体固定化担体と分析対象化合物（抗原）とを反応させた後に、前記の２種類の試薬をこの順に添加し、二段階で反応させることもできる。
【００２４】
例えば、サンドイッチ法を利用し、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'と、（２）ポスト標識化−架橋アビジンとを、適当な比率で混合して得られた標識化抗体を用いる本発明の免疫学的分析方法では、具体的には、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'とは異なるエピトープで分析対象化合物と反応する抗体又は抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、被検試料を加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（１次反応）。続いて、２種類の試薬の混合物である前記標識化抗体を加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識化抗体の量を定量する。その値から、被検試料中の分析対象化合物の量を算出することができる。
本発明の分析方法においては、２種類の試薬の混合物である標識化抗体を添加して一段階で反応させる代わりに、先に説明したように、２種類の試薬を別々に加えて二段階で反応させることもできる。
【００２５】
次に、競合法を利用し、（１）ビオチン導入抗原と、（２）ポスト標識化−架橋アビジンとを、適当な比率で混合して得られた標識化抗原を用いる本発明の免疫学的分析方法では、具体的には、分析対象化合物と反応する抗体又は抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、２種類の試薬の混合物である前記標識化抗原と、被検試料とを加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識化抗原の量を定量する。その値から、被検試料中の分析対象化合物の量を算出することができる。
本発明の分析方法においては、２種類の試薬の混合物である標識化抗原を添加して一段階で反応させる代わりに、先に説明したように、２種類の試薬を別々に加えて二段階で反応させることもできる。
【００２６】
本発明の分析方法に使用するポスト標識化−架橋アビジン、又は本発明の免疫学的分析用試薬に含まれる標識化架橋アビジンは、分子内架橋により各サブユニット間が共有結合により連結されているので、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原と（２）標識化架橋アビジンとを適当な比率で混合し、標識化抗体又は標識化抗原を調製しても、その反応性を安定に維持することができる。
【００２７】
それに対して、アビジンのサブユニットが架橋されていない従来公知の標識化アビジンでは、非共有結合的に集まって一分子のアビジンを形成している４個のサブユニットが、架橋剤による化学処理等によって、高い熱を加えた場合と同様に、サブユニットへと開裂してしまうために、標識化アビジンとしての反応性が著しく低下しているのではないかと考えられる。
本発明者は、アビジンのアミノ基に分子内架橋を起こさない架橋剤である４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミドエステルを反応させ、抗体のＦａｂ'分画のＳＨ基との結合反応を試み、反応物をゲル濾過カラムで分子量的に分画したところ、標準物質の溶出位置から計算して、４個のサブユニットとからなる分子に変わって、２個のサブユニットからなる分子のピークが主に検出されることを確認している。
【００２８】
一方、アビジンに分子内架橋を形成する架橋剤であるグルタルアルデヒドを用いると、反応後の架橋アビジンをゲル濾過カラムで分子量的に分画しても、アビジンの２個のサブユニットからなる分子のピークは検出されず、アビジンの４量体構造の安定化がなされていることが確認された。
【００２９】
更に、本発明では、１分子中に含まれるビオチン数が１であるビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原を使用するので、標識化抗体又は標識化抗原の反応性を安定に維持することができる。もしも、抗体フラグメントＦａｂ'又は抗原中に複数のビオチン分子が存在すると仮定すると、アビジンを介して連鎖的に結合反応が進行し、標識化抗体又は標識化抗原が巨大分子化し、沈殿形成など好ましくない反応を起こすことが予想されるからである。
【００３０】
本発明の免疫学的分析用キットは、架橋処理を行なった後に、標識物質を結合させたポスト標識化−架橋アビジン、及びビオチン化剤を含む。前記ビオチン化剤としては、従来公知のビオチン化剤を使用することができ、例えば、Ｎ−ビオチノイル−Ｎ'−（６−マレイミドヘキサノイル）−ヒドラジド、又はビオチニル−ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等を挙げることができる。前記免疫学的分析用キットとは別に用意した抗体フラグメントＦａｂ'又は抗原を、前記ビオチン化剤によりビオチン化して得られるビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原と、前記免疫学的分析用キットに含まれるポスト標識化−架橋アビジンとを組み合わせて、本発明の免疫学的分析方法に用いることができる。
【００３１】
また、本発明の免疫学的分析用キットは、前記ビオチン化剤に代えて、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原を含む構成とすることもできる。すなわち、本発明の別の免疫学的分析用キットは、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原、及び（２）ポスト標識化−架橋アビジンを含む。本発明の免疫学的分析用キットは、（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原、及び（２）ポスト標識化−架橋アビジンをそれぞれ別々の試薬として含むこともできるし、あるいは、ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'又はビオチン導入抗原と、ポスト標識化−架橋アビジンとを予め混合した混合物として含むこともできる。
本発明の免疫学的分析用キットは、それ単独で、あるいは、所望により他の試薬と組み合わせて、本発明の免疫学的分析方法に使用することができる。
【００３２】
ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'に代えて、ビオチン導入抗体を使用することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
（１）ビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'の調製
ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）をウサギに対し免疫して得られた抗血清から、ＡＦＰ固定化セファロース４Ｂを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーで特異抗体ＩｇＧ分画を得た。
この特異抗体ＩｇＧ分画［０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）］に２％重量のペプシンを加え、３７℃の孵卵器で一夜消化を行い、ゲルクロマトグラフィーで分子量１０万の抗体フラグメントＦ（ａｂ'）2分画を得た。
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析したＦ（ａｂ'）2分画５ｍｇ（１ｍｌ）に、０．２５Ｍ−２−メルカプトエチルアミン［５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）］５０μｌを加え、３７℃で９０分間還元した。得られた反応液を、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５×１３ｃｍ）に通し、ボイドボリュームに溶出される抗体フラグメントＦａｂ'分画をプールした。
この抗体フラグメントＦａｂ'分画に、ジメチルホルムアミド０．１ｍｌに溶解したＮ−ビオチノイル−Ｎ'−（６−マレイミドヘキサノイル）−ヒドラジド０．４ｍｇを加え、室温で一夜静置反応させた後、生理食塩水で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５×１３ｃｍ）に通し、ボイドボリュームに溶出されるビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'をプールした。
【００３４】
（２）ＢＨＨＣＴ標識化架橋ストレプトアビジン−ＢＳＡポリマーの調整
ストレプトアビジン２ｍｇとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２ｍｇとを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍｌに溶解した。この混合液に、１％グルタルアルデヒド水溶液４０μｌを加え、４℃で一夜静置反応した。この反応液に２０ｍｇ／ｍｌ水素化ホウ素ナトリウム水溶液２０μｌを加え、室温で４時間静置して反応を止めた。反応液を０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）に対して透析して低分子を除き、架橋化アビジン−ＢＳＡポリマーとした。
得られた架橋化アビジン−ＢＳＡポリマー［０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）］に、ユーロピウムをキレートして蛍光を生じさせるビス−ヘプタフルオロ−ヘキサンジオン−クロロスルフォ−ｏ−テルフェニル（ＢＨＨＣＴ）２ｍｇのエタノール溶液６０μｌを徐々に滴下し、その後、室温で１時間攪拌した。反応液を、０．１Ｍ塩化ナトリウム及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（１．５×５０ｃｍ）で分画し、ボイドボリュームに溶出されるＢＨＨＣＴ標識化架橋ストレプトアビジン−ＢＳＡポリマーをプールした。
【００３５】
（３）抗ＡＦＰモノクローナル抗体のコーティング
５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で５μｇ／ｍｌに調整した抗ＡＦＰモノクローナル抗体（オリエンタル酵母社）１００μｌを、デルフィア用９６穴プレートのウェルに分注し、３７℃で２時間振盪コーティングを行った後、洗浄液［０．１％トウィーン２０を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］で洗浄し、以下の工程に用いた。
【００３６】
（４）標識化抗体の調整
前記実施例１（１）で得られたビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'（最終濃度＝１．２μｇ／ｍｌ）と、前記実施例１（２）で得られたＢＨＨＣＴ標識化架橋ストレプトアビジン−ＢＳＡポリマー（最終濃度＝１．５μｇ／ｍｌ）に塩化ユーロピウム（ナカライテスク社；最終濃度＝１５μｇ／ｍｌ）を加えたものとを等量混合し、希釈液［０．２％ＢＳＡ、０．１％トウィーン２０、及び０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］で５倍に希釈して、以下の工程に用いた。
【００３７】
（５）ＥＬＩＳＡ法によるＡＦＰの測定
前記希釈液で所定濃度（１０ｐｇ／ｍｌ，１００ｐｇ／ｍｌ，１０００ｐｇ／ｍｌ，及び１００００ｐｇ／ｍｌ）に希釈した標準ＡＦＰ溶液１００μｌを抗ＡＦＰモノクローナル抗体コートウェルに分注し、３７℃で１時間振盪反応を行った。洗浄液で４回洗浄した後、前記実施例１（４）で調製した標識化抗体１００μｌを分注し、３７℃で１時間振盪反応を行った。洗浄液で４回洗浄した後、１０μＭトリオクチルホスフィンオキサイドと０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムとを含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液２００μｌを蛍光増強剤として加え、時間分解蛍光測定装置（デルフィア；ワラック社）にセットして１秒間の積算蛍光量を測定した。
結果を図１に示す。ユーロピウムキレート標識化架橋ストレプトアビジンとビオチン導入抗体フラグメントＦａｂ'との混合試薬は、性能の良い標識化抗体として使用可能であることが示された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、アビジン−ビオチン反応の長所を生かしながら、迅速且つ簡易に、しかも、正確に分析対象化合物の分析を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ユーロピウムキレート標識化架橋ストレプトアビジンを用いるＥＬＩＳＡ法により、ＡＦＰを測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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