(57)【要約】迅速かつ効率良く試料中タンパク質（ペプチドを含む）を分解できるタンパク質分解物の製造方法を提供する。タンパク質を含む試料を、テトラゾリウム化合物の存在下においてプロテアーゼ処理することにより、タンパク質分解物を製造する。また、このタンパク質分解物の製造方法により得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとを反応させ、この酸化還元反応を測定することにより糖化タンパク質量を迅速に測定できる。前記テトラゾリウム化合物としては、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含む試料を、テトラゾリウム化合物の存在下においてプロテアーゼ処理するタンパク質分解物の製造方法。
【請求項２】
テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも一つの官能基を有する請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項３】
テトラゾリウム化合物が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項４】
テトラゾリウム化合物の添加量が、試料１μＬ当たり０．０２〜１０μｍｏｌの範囲である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項５】
プロテアーゼの添加量が、試料１μＬ当たり１０〜１０００，０００Ｕの範囲である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項６】
テトラゾリウム化合物の添加量が、プロテアーゼ１ＫＵ当たり、０．００１〜１００μｍｏｌの範囲である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項７】
テトラゾリウム化合物および界面活性剤の存在下においてプロテアーゼ処理する請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項８】
界面活性剤が、非イオン界面活性剤である請求の範囲７記載の製造方法。
【請求項９】
非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびソルビタン脂肪酸エステルからなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求の範囲８記載の製造方法。
【請求項１０】
界面活性剤の添加量が、テトラゾリウム化合物１ｍｍｏｌ当たり０．０１〜３００ｍｍｏｌの範囲である請求の範囲７記載の製造方法。
【請求項１１】
界面活性剤の添加量が、試料１μＬあたり０．０１〜５０μｍｏｌの範囲である請求の範囲７記載の製造方法。
【請求項１２】
プロテアーゼが、トリプシン、プロティナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラスターゼおよびアミノペプチダーゼからなる群から選択された少なくとも一つの請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１３】
プロテアーゼが、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであって、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１４】
分解するタンパク質が、糖化タンパク質である請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１５】
糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求の範囲１４記載の製造方法。
【請求項１６】
試料が、全血である請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１７】
試料が、赤血球を含む試料である請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１８】
請求の範囲１に記載のタンパク質分解物の製造方法により、試料中の糖化タンパク質を分解し、得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとを反応させ、この酸化還元反応を測定することにより糖化タンパク質の量を測定する糖化タンパク質の測定方法。
【請求項１９】
酸化還元反応の測定が、糖化タンパク質分解物とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとを反応させることにより発生した過酸化水素の量の測定である請求の範囲１８記載の測定方法。
【請求項２０】
過酸化水素の測定が、過酸化水素と酸化により発色する基質とを用いた測定である請求の範囲１９記載の測定方法。
【請求項２１】
過酸化水素の測定が、酸化酵素を用いて過酸化水素と基質とを反応させることにより発色した前記基質の吸光度の測定である請求の範囲２０記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、試料中のタンパク質をプロテアーゼ処理して、タンパク質分解物を製造する方法に関する。
背景技術
従来から、試料中の目的のタンパク質（ペプチドを含む）を検出したり、測定に影響を与えるタンパク質の機能を失活させるために、前記タンパク質をプロテアーゼで分解する方法が、各種測定方法等において適用されている。
例えば、糖尿病診断や治療等における重要な指標となる血球中の糖化タンパク質、特に生体血糖値の過去の履歴を反映している赤血球中の糖化ヘモグロビンを、酵素法により測定することが現在試みられており、その際にも糖化タンパク質をプロテアーゼ分解する方法が適用されている。前記酵素法では、溶血試料中の糖化タンパク質の糖化部分にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を作用させ、過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、このＦＡＯＤ処理後の前記試料に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。この時、前記還元剤として、酸化されることにより発色する発色性基質を用いれば、その発色の測定により前記過酸化水素量を測定でき、この結果、試料中の糖化タンパク質量を知ることができる。
しかし、前記糖化部分に作用させるＦＡＯＤは、糖化タンパク質や糖化ペプチドよりも、糖化アミノ酸や、より短いペプチド断片に作用し易い。そこで、予め、糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、ＦＡＯＤを糖化部分に作用し易くすることによって、測定精度の向上を図っている。
発明の開示
しかしながら、プロテアーゼは基質特異性を有し、処理する基質によって分解活性が異なるため、目的のタンパク質の種類によっては、分解に長時間を要し、測定を迅速に行うことができないという問題がある。さらに、前記糖化タンパク質のように、目的のタンパク質が糖化されている場合は、その立体障害等により分解し難い場合もある。このような理由から、例えば、前述のような糖化タンパク質の測定においても、予め行うプロテアーゼ処理のために、測定全体に時間がかかってしまう。このため、臨床検査等の分野における利用の点からも、前記糖化タンパク質の測定をより迅速に行える方法が求められている。
そこで、本発明の目的は、迅速かつ効率良く試料中のタンパク質を分解できるタンパク質分解物の製造方法の提供である。
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質分解物の製造方法は、タンパク質を含む試料を、テトラゾリウム化合物の存在下においてプロテアーゼ処理する方法である。なお、本発明において、前記タンパク質とはペプチドも含む。
このように、プロテアーゼ処理をテトラゾリウム化合物存在下で行えば、試料中のタンパク質の分解を迅速に行うことができる。
前記テトラゾリウム化合物とは、テトラゾール環構造を有する化合物である。本発明の製造方法において、前記テトラゾリウム化合物としては、後述するものが使用でき、好ましくはテトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有するものであり、特に好ましくは、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である。
本発明の製造方法において、前記テトラゾリウム化合物の添加量は、特に制限されないが、前記プロテアーゼの種類および添加量、前記試料の種類や含まれるタンパク質の量等により適宜決定できる。具体的には、試料１μＬ当たり、例えば、前記テトラゾリウム化合物を、０．０２〜１０μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５〜２μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．１〜２μｍｏｌの範囲である。
また、プロテアーゼとテトラゾリウム化合物との添加割合は、プロテアーゼ１ＫＵに対して、例えば、０．００１〜１００μｍｏｌの範囲であり、好ましくは０．０１〜２０μｍｏｌの範囲であり、より好ましくは０．０５〜５μｍｏｌの範囲である。
本発明の製造方法において、テトラゾリウム化合物および界面活性剤の存在下においてプロテアーゼ処理することが好ましい。このように、さらに界面活性剤が共存する条件下でプロテアーゼ処理を行えば、より一層プロテアーゼによる分解が促進され、迅速にタンパク質の分解を行うことができる。
前記界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、非イオン界面活性剤等が使用でき、具体的には、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル等があげられる。これらの中でも好ましくはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。その他に、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸等も使用できる。
具体的には、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルである市販のＴｒｉｔｏｎ系界面活性剤等、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである市販のＴｗｅｅｎ系界面活性剤等、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである市販のＢｒｉｊ系界面活性剤等が使用できる。この他に、例えば、ポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル、商品名Ｎｉｋｋｏｌ  ＢＬ−９ＥＸ（ポリオキシエチレンの重量平均重合度Ｎが９：和光純薬工業社製）等のようなポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル、商品名Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰＸ（ポリオキシエチレンの重量平均重合度Ｎが約１０．５：ナカライテスク社製）および商品名Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−４０（ポリオキシエチレンの重量平均重合度Ｎが２０：ナカライテスク社製）等のようなポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等も使用できる。
本発明の製造方法において、前記界面活性剤の添加量は、特に制限されないが、テトラゾリウム化合物１ｍｏｌ当たり、例えば、０．０１〜３００ｍｏｌの範囲であることが好ましく、より好ましくは、０．０５〜１５０ｍｏｌの範囲であり、特に好ましくは０．２〜１００ｍｏｌの範囲である。
また、試料１μＬに対する界面活性剤の添加量は、例えば、０．０１〜５０μｍｏｌの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．０５〜１０μｍｏｌの範囲である。
本発明の製造方法において、前記分解するタンパク質は、糖化タンパク質であることが好ましい。前記糖化タンパク質としては、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等があげられ、この中でも好ましくは糖化ヘモグロビンである。本発明の製造方法により糖化タンパク質の分解物を製造すれば、後述する糖化タンパク質（糖化ペプチドを含む）の測定方法において、迅速に前記糖化タンパク質を測定できる。
本発明の製造方法において、前記プロテアーゼは、特に制限されないが、例えば、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ等が使用でき、具体的には、トリプシン、プロティナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ等が好ましい。
また、前記分解するタンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、前記プロテアーゼは、前記糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであり、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼ等が好ましい。前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼとしては、商品名プロテアーゼＮ（例えば、フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタロプロテイナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）（例えば、東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロテイナーゼである。このように、選択的に分解するプロテアーゼを使用すれば、特定のタンパク質の分解物を選択的に調製できるからである。
本発明の製造方法において、プロテアーゼの添加量は、使用するプロテアーゼの種類、分解するタンパク質の種類や量等に応じて適宜決定できるが、例えば、試料１μＬに対して、１０〜１０００，０００Ｕの範囲であることが好ましく、より好ましくは１００〜５００，０００Ｕの範囲であり、特に好ましく５００〜２００，０００Ｕの範囲である。
本発明の製造方法において、前記試料は、特に制限されないが、全血、血漿、血清、血球等の血液試料の他に、例えば、尿、髄液、唾液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等もあげられる。この中でも好ましくは、全血等の血液試料や血球試料である。
つぎに、本発明の糖化タンパク質の測定方法は、前記本発明のタンパク質分解物の製造方法により、試料中の糖化タンパク質を分解し、得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分とＦＡＯＤとを反応させ、この酸化還元反応を測定することにより糖化タンパク質量を測定する方法である。なお、糖化タンパク質は、前述と同様に、糖化ペプチドを含む。
テトラゾリウム化合物非存在下で行う従来の方法においては、プロテアーゼにより糖化タンパク質を十分に分解し、ＦＡＯＤを糖化部分に作用し易くするためには、約６〜４０時間もプロテアーゼ処理する必要があった。このため、前記酵素法により糖化タンパク質を測定するには、長時間を要し、有用な方法とは言い難かった。しかし、本発明の測定方法によれば、短時間でタンパク質を分解できるため、迅速に糖化タンパク質の測定を行うことが可能である。本発明の測定方法によれば、例えば、テトラゾリウム化合物を添加する以外は従来法と同じ条件で測定した場合、テトラゾリウム化合物非存在下の場合に比べて、約２５〜１２００倍の範囲で測定時間を短縮できる。
本発明の製造方法において、前記テトラゾリウム化合物や前記プロテアーゼは、前述と同様のものが使用でき、その添加量も同様である。
本発明の測定方法において、前記糖化タンパク質は、前述と同様のものがあげられ、特に好ましくは糖化ヘモグロビンである。血液中のヘモグロビンは、その濃度が約６０〜２００ｇ／Ｌと高く、また、分解が困難であったため、プロテアーゼ処理に数時間〜数日かかっていたが、本発明の測定方法によれば、例えば、２０秒〜２時間での処理が可能になり、糖化ヘモグロビンの測定を迅速に行うことができる。
本発明の測定方法において、前記酸化還元反応の測定は、糖化タンパク質分解物の糖化部分とＦＡＯＤとを反応させることにより生成する過酸化水素量の測定であることが好ましい。
前記過酸化水素量の測定は、酸化酵素と酸化により発色する基質（発色性基質）とを用いた測定であることが好ましい。前記酸化酵素としては、特に制限されないが、ＰＯＤが好ましい。前記発色性基質としては、特に制限されないが、高感度に検出可能であることから、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（例えば、商品名ＤＡ−６４：和光純薬工業社製）が好ましい。
本発明の測定方法において、前記試料は、特に制限されず、前述と同様のものがあげられる。
本発明の測定方法において、前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
2002027012.tif 000002
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
2002027012.tif 000003
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
2002027012.tif 000004
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。
2002027012.tif 000005
前記式（４）において、Ｒ５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ５は
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−
である。
また、前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
2002027012.tif 000006
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
2002027012.tif 000007
発明を実施するための最良の形態
本発明の製造方法において使用するテトラゾリウム化合物は、例えば、テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有することが好ましく、より好ましくは、３箇所に環構造置換基を有する構造である。
前記テトラゾリウム化合物が、前述のように、前記テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位および３位に有することが好ましい。また、テトラゾリウム化合物が３箇所に環構造置換基を有する場合は、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位、３位および５位に有することが好ましい。
前記テトラゾリウム化合物の少なくとも２つの環構造置換基の環構造が、ベンゼン環であることが好ましい。また、ベンゼン環以外の環構造置換基としては、例えば、環骨格にＳまたはＯを含み、かつ共鳴構造である置換基があげられ、例えば、チエニル基、チアゾイル基等である。
前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の少なくとも３箇所に環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。
前記テトラゾリウム化合物の少なくとも１つの環構造置換基が官能基を有することが好ましく、前記官能基の数が多いことがより好ましい。
前記官能基としては、電子吸引性の官能基が好ましく、例えば、ハロゲン基、エーテル基、エステル基、カルボキシ基、アシル基、ニトロソ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基等があげられる。これら以外にも、例えば、ヒドロペルオキシ基、オキシ基、エポキシ基、エピジオキシ基、オキソ基等の酸素を含む特性基や、メルカプト基、アルキルチオ基、メチルチオメチル基、チオキソ基、スルフィノ基、ベンゼンスルホニル基、フェニルスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、ｐ−トリルスルホニル基、トシル基、スルファモイル基、イソチオシアネート基等の硫黄を含む特性基等があげられる。これらの電子吸引性官能基の中でも、好ましくは、ニトロ基、スルホ基、ハロゲン基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基である。また、前記電子吸引性の官能基の他に、例えば、フェニル基（Ｃ６Ｈ５−）、スチリル基（Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨ−）等の不飽和炭化水素基等もあげられる。なお、前記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。
前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を有することが好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇所（ｏｒｔｈｏ−、ｍｅｔａ−、ｐｒａ−）に前記官能基を有してもよい。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を有しても、異なる官能基を有してもよい。
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前記テトラゾール環の２位、３位および５位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジル）−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム塩および２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム塩等があげられる。
また、前記テトラゾリウム化合物は、前述のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム塩、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル  カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，２’−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ’−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩および３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等があげられる。
また、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリウム化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム塩等があげられる。
前述のテトラゾリウム化合物の中でも、前述のように、環構造置換基を３つ有する化合物が好ましく、より好ましくは、環構造がベンゼン環である置換基を３つ有し、かつ電子吸引性官能基を多く有するものであり、特に好ましくは、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である。このようなテトラゾリウム化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態等であってもよい。なお、テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
本発明のタンパク質分解物の製造方法について、血球中の糖化タンパク質を分解する例をあげて説明する。
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用でき、この中でも前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
溶血用の界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル  エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン  ソルビタン  アルキル  エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン  アルキル  エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血できる。
つぎに、前記溶血試料を、前記テトラゾリウム化合物存在下で前記プロテアーゼ処理する。これによって糖化タンパク質分解物が得られる。
前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われる。前記緩衝液の種類は、特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシンアミド緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液等が使用でき、そのｐＨは、ｐＨ５〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは６〜１０の範囲、特に好ましくは７〜９の範囲である。
前記プロテアーゼの添加割合は、例えば、前処理溶液中の血球濃度が、０．１〜１０体積％の場合、プロテアーゼを０．１〜１００ｇ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．３〜５０ｇ／リットルの範囲、特に好ましくは０．５〜２０ｇ／リットルの範囲である。
また、分解対象タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、プロテアーゼは、前述のように、例えば、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであり、前記プロテアーゼが、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼであることが好ましい。これらのプロテアーゼの添加割合は、例えば、前処理溶液中の血球濃度が、０．１〜１０体積％の場合、プロテアーゼを０．１〜５０ｇ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．３〜３０ｇ／リットルの範囲、特に好ましくは１〜２０ｇ／リットルの範囲である。具体的には、プロテアーゼがメタロプロテイナーゼの場合、血球濃度０．３〜５体積％の前処理溶液に、０．１〜３０ｇ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．３〜２０ｇ／リットルの範囲、特に好ましくは１〜１０ｇ／リットルの範囲である。
前記テトラゾリウム化合物の添加割合は、例えば、前処理溶液中の血球濃度が、０．１〜１０体積％の場合、濃度０．１〜５０ｍｍｏｌ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２〜２０ｍｍｏｌ／リットルの範囲、特に好ましくは０．３〜１０ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。具体的に、前記テトラゾリウム化合物が  ２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩であり、前処理溶液中の血球濃度が、０．１〜１０体積％の場合、濃度０．３〜１５ｍｍｏｌ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．５〜１５ｍｍｏｌ／リットルの範囲、特に好ましくは１〜１０ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。
前記テトラゾリウム化合物は、そのまま使用してもよいが、操作の簡便性や処理効率等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液として使用することが好ましい。前記溶液の濃度は、テトラゾリウム化合物の種類（例えば、分子量等）等により適宜決定でき、例えば、０．０１〜１２０ｍｍｏｌ／リットルの範囲であり、好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／リットルの範囲、より好ましくは０．２〜２０ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。前記溶媒としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が使用でき、前記緩衝液としては、例えば、前述の緩衝液等が使用できる。なお、前記テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記テトラゾリウム化合物存在下におけるプロテアーゼ処理の条件は、特に制限されないが、例えば、温度１０〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜６０分の範囲であり、好ましくは、温度２０〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜１０分の範囲であり、より好ましくは、温度２５〜３７℃の範囲、処理時間３０秒〜５分の範囲である。
このようにテトラゾリウム化合物存在下で試料のプロテアーゼ処理を行えば、試料中の糖化タンパク質の分解を促進できる。このため、短時間、かつ優れた分解効率で糖化タンパク質の分解物を得ることができる。
また、このプロテアーゼ処理は、前述のようなテトラゾリウム化合物だけでなく、テトラゾリウム化合物と界面活性剤との共存下で行うことにより、さらにプロテアーゼによる分解を促進できる。
界面活性剤の添加量は、特に制限されないが、例えば、前処理溶液中の血球濃度が、０．３〜５体積％の場合、濃度０．１〜５００ｍｍｏｌ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．５〜１５０ｍｍｏｌ／リットルの範囲、特に好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。具体的に、前記界面活性剤が商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の場合、濃度０．２〜４００ｍｍｏｌ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは１〜１５０ｍｍｏｌ／リットルの範囲、特に好ましくは２〜１００ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。また、商品名Ｂｒｉｊ３５の場合、濃度０．１〜２００ｍｍｏｌ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．５〜１０ｍｍｏｌ／リットルの範囲、特に好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。
また、前記界面活性剤は、前記テトラゾリウム化合物１ｍｍｏｌに対して、例えば、０．０１〜３００ｍｍｏｌの範囲になるように添加してもよく、好ましくは０．０５〜１５０ｍｍｏｌの範囲、より好ましくは０．２〜１００ｍｍｏｌの範囲である。
具体的に、前記界面活性剤が商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の場合、テトラゾリウム化合物１．５ｍｍｏｌに対して、０．２〜４００ｍｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは１〜１５０ｍｍｏｌの範囲、特に好ましくは２〜１００ｍｍｏｌの範囲である。また、また、商品名Ｂｒｉｊ３５の場合、テトラゾリウム化合物１．５ｍｍｏｌに対して、０．１〜２００ｍｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．５〜１５０ｍｍｏｌの範囲、特に好ましくは１〜５０ｍｍｏｌの範囲である。
なお、前述のように界面活性剤処理によって試料の溶血処理を行う場合は、予め、前処理において必要な濃度となるように、溶血工程において界面活性剤を添加しておいてもよい。
つぎに、本発明の糖化タンパク質の測定方法について、血球中の糖化タンパク質量を測定する例をあげて説明する。
まず、前述と同様にして、全血試料または血球試料から溶血試料を調製する。そして、前記溶血試料を、前述と同様にしてテトラゾリウム化合物存在下でプロテアーゼ処理し、糖化タンパク質の分解物を調製する。このように糖化タンパク質をプロテアーゼで処理するのは、前述のように後の処理に使用するＦＡＯＤが、糖化タンパク質よりも、糖化アミノ酸や、より短い糖化ペプチド断片に作用し易いため、分解して糖化部分に作用し易くするためである。前述のように、テトラゾリウム化合物存在下でプロテアーゼ処理すれば、短時間で、かつ高い分解効率で糖化タンパク質を分解できるため、プロテアーゼ処理時間が短くても、ＦＡＯＤは十分に糖化部分に作用できる。なお、より分解を促進できることから、テトラゾリウム化合物および界面活性剤の存在下で処理してもよい。
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／リットル、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよび前記発色性基質を用いて酸化還元反応により測定する。
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記４−アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、前述のように、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜２０，０００ＩＵ／リットル、発色性基質濃度０．００１〜１ｍｍｏｌ／ｌ、反応温度２０〜３７℃、反応時間１〜５分、ｐＨ６〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
このような本発明の測定方法によれば、前述のように迅速に測定を行うことができる。また、従来法では、プロテアーゼ処理を短時間にすると、測定精度が低下するおそれがあったが、本発明の測定方法によれば、短時間でも優れた精度で測定できる。
実施例
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
（実施例１、比較例１）
この実施例は、テトラゾリウム化合物存在下でヘモグロビン（Ｈｂ）をプロテアーゼ処理し、その分解物の糖化物量を測定することにより、Ｈｂの分解程度を調べた例である。使用した試料、試薬および方法を以下に示す。
（Ｈｂの調製）
採取した健常人の全血を０．９重量％ＮａＣｌ水溶液で３〜５回洗浄した。血球を蒸留水で５倍希釈（体積）することにより、溶血させ、遠心分離（７０００ｇ、３０分間）して上清（溶血試料）を回収した（約７５〜２００ｍＬ）。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５００ｍＬに、陽イオン交換ゲル（商品名ＰＯＲＯＳ  ＨＳ／５０：アプライドバイオシステムズ社製）約３０ｇを膨潤させ、これに、前記上清を加えて攪拌し、Ｈｂを吸着させた。約６０分間静置した後、直径９５ｍｍの桐山ロートでろ過し、回収したゲルを、ろ液が透明になるまで前記リン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。つぎに、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出を行い、溶出画分を回収し（約３００〜４００ｍｌ）、これを精製Ｈｂ試料とした。なお、前記試料のＨｂ濃度は、常法（例えば、ＳＬＳ法等）により測定し、保存温度は−８０℃とした。
（プロテアーゼ溶液）
商品名プロティナーゼＫ（和光純薬工業社製）、商品名トヨチーム（東洋紡社製）、商品名プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）、商品名パパイン（ロシュ社製）を、それぞれ精製水に溶解して、各プロテアーゼ溶液（２ｇ／Ｌ）を調製した。
（ＷＳＴ−３溶液  ：以下同じ）
濃度が５ｍＭになるように、テトラゾリウム化合物である下記式（７）に示す２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（商品名  ＷＳＴ−３、同仁化学研究所社製）を精製水に溶解して調製した。
2002027012.tif 000008
（緩衝液）
８０ｍＭグリシン−ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０、ｐＨ１１）
（プロテアーゼ反応液の組成）
2002027012.tif 000009
（試薬Ａ）
ＰＯＤ（東洋紡績社製、以下同じ）                ２０ＫＵ／Ｌ
商品名ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）        ４０μｍｏｌ／Ｌ
リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）ｐＨ７．０    ０．１ｍｏｌ／Ｌ
（試薬Ｂ）
ＦＡＯＤ（旭化成社製）        １４．６ＫＵ／Ｌ
ＫＰＢ                        ０．１ｍｏｌ／Ｌ
（方法）
前記各プロテアーゼを用いて、前記組成になるようにプロテアーゼ反応溶液を混合することにより、３７℃で反応を開始し、所定の時間（０分、１０分、３０分および６０分）反応させた後、反応溶液を氷冷して反応を停止させた。これらの反応溶液を限外ろ過膜（分画分子量１０，０００、７０００Ｇ、６０分間、４℃）に供し、ろ液を回収した。
そして、前記ろ液２５μｌに前記試薬Ａ  ４５μｌを添加し、その５分後に、さらに前記試薬Ｂ  ２０μｌを添加した。そして、前記試薬Ｂ添加時を０分として３分後の吸光度の増加を生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ  ＢＭ−８：日本電子社製）により測定した。測定波長は、主波長７５１ｎｍ、副波長８８４ｎｍとした。ＷＳＴ−３存在下における実施例１についての吸光度を下記表１に示す。反応開始０分の吸光度は０．０００とした。また、比較例１としては、前記反応液組成に示すようにＷＳＴ−３の代わりに精製水を添加した以外は、前記実施例１と同様に処理して吸光度を測定した。
2002027012.tif 000010
比較例１においては、プロテアーゼ処理を６０分間行っても吸光度の増加は確認できず（吸光度０．００）、３〜６時間プロテアーゼ処理することによってかろうじて吸光度の増加（０．０００〜０．００４）が見られるという結果であった。これに対し、ＷＳＴ−３存在下でプロテアーゼ処理した実施例１においては、Ｈｂが１０〜６０分間のプロテアーゼ処理によって分解されたため、前記表１に示すように経時的な吸光度の増加が確認できた。
（実施例２）
この実施例は、さらにＷＳＴ−３および界面活性剤存在下でヘモグロビンをプロテアーゼ処理し、その分解程度を調べた例である。以下に、使用した試料、試薬および方法を示す。特に示す以外は前記実施例１と同様にして行った。
（界面活性剤溶液）
商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬工業社製）および商品名Ｂｒｉｊ３５（シグマ社製）を精製水に０．３重量％となるように添加して調製した。
精製水２５０μｌを前記界面活性剤溶液２５０μｌに代えた以外は、前記実施例１と同様にしてプロテアーゼ反応を行い（界面活性剤の終濃度０．１５重量％）、同様にして吸光度測定を行った。ＷＳＴ−３およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下で処理した場合の結果を下記表２に、ＷＳＴ−３およびＢｒｉｊ３５存在下で処理した場合の結果を下記表３に示す。
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前記表２および表３に示すように、ＷＳＴ−３存在下でプロテアーゼ処理を行う際に、界面活性剤を併用することにより、前記表１に示す実施例１の吸光度よりさらに高い吸光度増加が見られた。なお、吸光度が０．０２０付近から増加が見られないのは、反応が終了したものと考えられる。
このように、タンパク質のプロテアーゼ処理をＷＳＴ−３の存在下で行えば、タンパク質の分解が促進されるため、短時間で、かつ高い分解効率でタンパク質を分解できることがわかる。また、さらに、界面活性剤を併用することによって、より一層プロテアーゼ処理を促進することができる。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明のタンパク質分解物の製造方法は、テトラゾリウム化合物存在下で、試料をプロテアーゼ処理することにより、迅速に試料中のタンパク質を分解できる。したがって、この製造方法を適用した本発明の糖化タンパク質の測定方法によれば、例えば、糖尿病診断において重要である赤血球中の糖化ヘモグロビン等の測定を迅速に行うことができる。
【国際調査報告】
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