(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質類の測定に用いられ、かつ、イオン交換基としてリン酸基を有する粒子からなることを特徴とするカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
粒子が、リン酸基を有する単量体を重合してなることを特徴とする。請求項１記載のカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の充填剤を用いたことを特徴とするカチオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カチオン交換クロマトグラフィー用充填剤及びそれを用いた測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イオン交換クロマトグラフィーは、イオン性を有する物質の分離に汎用されている。そのうち、カチオン交換クロマトグラフィーは、一定条件下でアニオン性を有する官能基をもつ充填剤を用いて、主にカチオン性物質の分離を行う。上記官能基としては、カルボキシル基及びスルホン酸基が挙げられる。カルボキシル基を有する充填剤としては、例えば特公昭63-59463号公報や特公平8-7197号公報；スルホン酸基を有する充填剤としては、例えば特開平1-262468号公報などに記載されている。カチオン交換クロマトグラフィーによる測定対象となるカチオン性の物質としては、タンパク質や核酸などの生体試料；各種イオン類；各種薬物など多岐に渡っている。
【０００３】
このカチオン交換クロマトグラフィーにおいて、測定時間の短縮及び測定値の高い再現性を図るためには、高精度な分離能が必要とされる。この分離能は充填剤の素材と緩衝液の組み合わせによって決定される。しかしながらカルボキシル基とスルホン酸基では、酸としての強さが大きく異なるため、測定試料によっては、どちらの官能基を有する充填剤を用いた場合でも、測定時間又は測定精度において不十分である場合があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来のカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合の測定時間の延長、分離の不十分性という欠点をなくしたカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤及びそれを用いた測定方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
請求項１、２記載のカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基としてリン酸基を有する粒子からなることを特徴とする。
請求項３記載の測定方法は、請求項１、２記載の充填剤を用いたことを特徴とするカチオン交換クロマトグラフィーによる試料の測定方法である。
【０００６】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明のカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基としてリン酸基を有する粒子からなる。該リン酸基の量は特に制限されないが、好ましくは、充填剤の乾燥重量１ｇ当たり０．１μｅｑ〜１００ｍｅｑである。
【０００７】
本発明の充填剤は、イオン交換基として、少なくともリン酸基を有する必要があるが、リン酸基以外のイオン交換基を有していてもよい。上記リン酸基以外のイオン交換基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、３級アミノ基、４級アンモニウム基などが挙げられる。リン酸基以外の官能基の量は特に制限されず、リン酸基よりも多くても少なくてもかまわない。官能基の量は測定対象物質により適宜選択される。
【０００８】
本発明の充填剤の粒径は、特に制限されないが、好ましくは０．５〜２０μｍである。上記充填剤の粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均粒径×１００）として、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下である。
【０００９】
本発明の充填剤は、高分子粒子にリン酸基を導入することにより得られる。
【００１０】
本発明の充填剤粒子を構成する高分子粒子の素材としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
【００１１】
本発明の充填剤におけるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性に富む粒子とするため、架橋度の高い粒子とするのが好ましい。
【００１２】
高分子粒子がシリカ粒子の場合、該シリカ粒子は、例えばアルコキシラン誘導体をアルコール／水の混合溶媒に添加し、触媒存在下に重合を行うことにより得られる。さらに必要に応じて、官能基含有シランカップリング剤を反応させることにより、適当な官能基を導入することができる。
【００１３】
高分子粒子がセルロース粒子の場合、例えば、三酢酸セルロースを有機溶媒に溶解し、さらにゼラチン水溶液を添加して有機溶媒を除去後、アルカリ性下で加水分解するなどして得ることができる。
【００１４】
高分子粒子がポリアミノ酸粒子の場合、例えば、Ｎ−カルボン酸無水物を重合することにより得ることができる。
【００１５】
高分子粒子が合成高分子粒子の場合、例えば、スチレン、ジビルベンゼン、ジビニルトルエン；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレートなどの単量体を、重合開始剤存在下で重合することにより得ることができる。
【００１６】
高分子粒子へのリン酸基の導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、（ａ）高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でリン酸基を導入させる方法；（ｂ）リン酸基を有する化合物を素材として粒子を調製する方法などが挙げられる。
【００１７】
上記（ａ）の方法の具体例としては、例えば、水酸基含有単量体（２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレートなど）；アミノ基含有単量体（２−アミノエチル（メタ）アクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、アリルアミンなど）；カルボキシル基含有単量体（（メタ）アクリル酸、イタコン酸など）；又はエポキシ基含有単量体（グリシジル（メタ）アクリレートなど）を、架橋性単量体などと混合し、重合開始剤の存在下に重合することにより、各種の官能基を有する高分子粒子を調製する。その後、該官能基と反応性を有する官能基及びリン酸基の両者を有する物質を化学結合させることによりリン酸基を有する充填剤が調製される。
【００１８】
上記（ｂ）の方法の具体例としては、リン酸基を有する単量体として、例えば（（メタ）アクリロイルオキシメチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェートなどを用い、該単量体と架橋性単量体などとを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。或いは、重合性のリン酸エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、リン酸エステルをリン酸基に変換させてもよい。
【００１９】
本発明のリン酸基を有する充填剤は、カラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に利用される。上記カラムは公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されず、内径０．５〜１０ｍｍ、長さ５〜３００ｍｍのものが好ましい。カラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用可能であり、スラリー充填法が好ましい。具体的には、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させ、得られたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行うことができる。
【００２０】
本発明の測定方法は、上記の充填剤を用いるカチオン交換クロマトグラフィーによる試料の測定方法である。
【００２１】
本発明の測定方法の対象となる試料は、タンパク質が挙げられる。
【００２２】
上記測定に使用される液体クロマトグラフは、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００２３】
測定に用いられる溶離液は、イオン交換クロマトグラフィーに用いられる公知の溶離液の中から選択される。具体的には、リン酸、ホウ酸およびその塩を含む無機系緩衝液；各種アミノ酸類、クエン酸、コハク酸、フタル酸およびその塩などを含む有機酸系緩衝液；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸）などのＧｏｏｄの緩衝液類などが挙げられる。また、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどの各種塩類；塩酸、酢酸などの無機酸類；水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの塩基類；メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒類などを添加又は単独で使用してもよい。
【００２４】
溶離液の濃度は、他の測定条件により異なるが、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭである。また、上記の溶離液を複数混合して用いてもよい。また、溶離液を測定途中で切り替えたり、グラディエント溶出を行ってもよい。
【００２５】
（作用）
本発明の充填剤は、リン酸基を有するカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤である。該充填剤を用いることにより、従来の、カルボキシル基やスルホン酸基を有するカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤では、測定時間がかかりすぎたり、分離が不十分であった測定試料の分析時において、より短時間に、かつ高精度に分離が可能となる。特にヘモグロビン類などのタンパク質類の、短時間測定において有効である。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明の非限定的な実施例を挙げることにより、本発明を更に明らかにする。
（実施例１）
充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート（共栄社化学社製）１００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【００２７】
カラムの充填
得られた充填剤をカラムに以下のようにして充填した。粒子１．０ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（４．６φ×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００２８】
ヘモグロビン（Ｈｂ）類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。測定条件
0003834148.tif 000002
【００２９】
測定試料
健常人血をフッ化ナトリウム採血し、以下の試料を調製した。
試料ａ）糖負荷血：健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させたもの。
試料ｂ）カルバミル化ヘモグロビン（ＣＨｂ）含有試料：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で３時間反応させたもの。
試料ｃ）アセチル化ヘモグロビン（ＡＨｂ）含有試料：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、室温で３時間反応させたもの。
ｄ）上記試料ｂ）及び試料ｃ）の等量混合物
試料ａ）は、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
試料ｄ）は、溶血洗浄液Ｙ（溶血洗浄液Ｘにポリリン酸ナトリウム（太平化学社製）を０．０５重量％となるよう添加したもの）で１５０倍に溶血希釈し、３５℃で２．５分間加温したものを測定試料とした。
【００３０】
測定結果
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１に示す。図１（イ）図は試料ａ）を測定した結果、（ロ）図は試料ｄ）を測定した結果を示す。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＡＨｂ、ピーク７はＣＨｂを示す。
（イ）図では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、（ロ）図ではＡＨｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良好に分離されていることがわかる。
【００３１】
他のタンパク質混合物の測定
上記のカラムを用いて、以下の測定条件でタンパク質混合物の測定を行った。測定条件
0003834148.tif 000003
【００３２】
測定試料
以下のタンパク質標準品（いずれもＳｉｇｍａ社製）の混合物を、溶離液Ａに溶解した溶液を試料とした。
ミオグロビン（ウマ骨格由来）、α−キモトリプシノーゲン（ウシ膵臓由来）、リボヌクレアーゼＡ（ウシ膵臓由来）、リゾチーム（ニワトリ卵白由来）
【００３３】
測定結果
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図２に示す。図２においてピーク８はミオグロビン、ピーク９はα−キモトリプシノーゲン、ピーク１０はリボヌクレアーゼＡ、ピーク１１はリゾチームを示す。いづれのピークも短時間で良好に分離されている。
【００３４】
（実施例２）
テトラメチロールメタントリアクリレート（新中村化学社製）５０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）１００ｇ、（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート５０ｇ、メタクリル酸（和光純薬製）１００ｇ及び多孔質化剤としてイソアミルアルコール（和光純薬社製）１００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【００３５】
得られた粒子を用い、溶離液Ａとして２０ｍＭ Bis-Tris （和光純薬社製）を含む１１０ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ５．７）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、実施例１と同様にしてＨｂ類及びタンパク質混合物の測定を行った。得られたクロマトグラムは、図１及び２と同様であった。
【００３６】
（実施例３）
ジエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇに過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温した。８０℃で１時間重合後、（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート２００ｇを反応系に添加し、さらに８０℃で２時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【００３７】
得られた粒子を用い、実施例１と同様にしてＨｂ類及びタンパク質混合物の測定を行った。得られたクロマトグラムは、図１及び２と同様であった。
【００３８】
（比較例１）
特公昭６３−５９４６３号公報に記載の方法により、カルボキシル基を有する充填剤を以下のように調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート４００ｇ及びメタクリル酸１５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【００３９】
得られた粒子を用い、実施例１と同様にしてＨｂ類の測定を行ったところ、図３のクロマトグラムを得た。図３（イ）図は試料ａ）を測定した結果、（ロ）図は試料（ｄ）を測定した結果を示す。図１に比較して、（イ）図では、同程度の分離を得るためには長時間を要し、（ロ）図では、長時間を要しているにもかかわらず安定型ＨｂＡ１ｃ、ＡＨｂ及びＣＨｂの分離は不十分であった。
またタンパク質混合物の測定を行った結果を図４に示す。実施例１〜３と同程度の分離性能を得るためには、測定に長時間を要した。
【００４０】
（比較例２）
特開平１−２６２４６８号公報に記載の方法により、以下のようにしてスルホン酸基を有する充填剤を調製した。
トリエチレングリコールジメタクリレート５０ｇ及びグルシジルメタクリレート３５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、得られた粒子１００ｇにキシレン３００ｇを添加し、さらにポリビニルアルコール４０ｇ及び硫酸１５ｇを加えて８０℃で１時間反応させた。粒子を洗浄後、１００ｍｌのジメチルスルホキシド中に懸濁し、１，３−プロパンスルトン５ｇ及び水酸化ナトリウム１０ｇを添加し、３０℃で７時間反応させた。得られた粒子を洗浄し、乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【００４１】
得られた粒子を用い、実施例１と同様にしてＨｂ類及びタンパク質混合物の測定を行ったところ、得られたクロマトグラムは、図３及び図４と同様であった。
【００４２】
（比較例３）
特公平８−７１９７号公報に記載の方法により、以下のようにしてカルボキシル基を有する充填剤を調製した。
ジエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇに過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温した。８０℃で１時間重合後、メタクリル酸２００ｇを反応系に添加し、さらに８０℃で１時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【００４３】
得られた粒子を用い、実施例１と同様にしてＨｂ類の測定を行ったところ、図５のクロマトグラムを得た。図５（イ）図は試料ａ）を測定した結果、（ロ）図は試料ｄ）を測定した結果を示す。図３よりは分離性はよいが、図１に比較すると、（イ）図では、同程度の分離を得るために長時間を要し、また（ロ）図では、長時間を要しているにもかかわらず、ＡＨｂとＣＨｂの分離はできなかった。また、タンパク質混合物の測定を行い得られたクロマトグラムを図６に示す。この場合は、良好な分離能が得られたが、測定に多少時間を要している。
【００４４】
【発明の効果】
本発明に係るカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基としてリン酸基を有する粒子からなるので、従来のカルボキシル基やスルホン酸基を有するカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤に比べ、ヘモグロビン類などのタンパク質をはじめとする、従来から測定されていた試料について、より短時間に、より高精度に分離できる。
【００４５】
本発明に係る測定方法は、請求項１、２記載の充填剤を用いたことを特徴とするカチオン交換クロマトグラフィーによる試料の測定方法であるので、従来のカルボキシル基やスルホン酸基を有するカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤に比べ、ヘモグロビン類などのタンパク質をはじめとする、従来から測定されていた試料について、より短時間に、より高精度に分離できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１によって得られた充填剤を用いて、ヘモグロビン類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】実施例１によって得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】比較例１によって得られた充填剤を用いて、ヘモグロビン類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】比較例１によって得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】比較例３によって得られた充填剤を用いて、ヘモグロビン類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】比較例３によって得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図。
【図１】
0003834148.tif 000004
【図２】
0003834148.tif 000005
【図３】
0003834148.tif 000006
【図４】
0003834148.tif 000007
【図５】
0003834148.tif 000008
【図６】
0003834148.tif 000009