(57)【要約】試料中のＰＳ２Ｖを、固相に結合され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体と反応させ、ＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体と、以下の手法：（ａ）酵素標識され、かつＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体を反応させる、（ｂ）ビオチン化され、かつＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された酵素を反応させる、（ｃ）ビオチン化され、かつＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体を反応させた後、ビオチン化された酵素およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および（ｄ）ＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体と反応させた後、酵素標識され、かつ該２次抗体を認識する抗体を反応させる、のいずれかにより反応させ、次いで、前記酵素の基質を加え、酵素反応によって生成した生成物を検出することを特徴とするＰＳ２Ｖの検出方法により提供される。
2003008970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＰＳ２Ｖを、固相に結合された１次抗体と反応させ、さらに２次抗体と、以下の手法：
（ａ）標識された前記２次抗体を反応させる、
（ｂ）ビオチン化された前記２次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された標識を反応させる、
（ｃ）ビオチン化された前記２次抗体を反応させた後、ビオチン化された標識およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
（ｄ）該２次抗体と反応させた後、標識され、かつ前記２次抗体を認識する抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、固相に捕捉された標識量を測定することを特徴とするＰＳ２Ｖの検出方法。
【請求項２】
１次抗体と２次抗体が、（ａ）１次抗体がＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体であり、２次抗体がＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する抗体であるか、または（ｂ）１次抗体がＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する抗体であり、２次抗体がＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体である請求項１記載のＰＳ２Ｖの検出方法。
【請求項３】
固相に結合された一定量のＰＳ２Ｖと、試料由来のＰＳ２Ｖとの共存下で、ＰＳ２Ｖを特異的に認識する一定量の１次抗体と、以下の手法：
（ａ）標識され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体を反応させ、
（ｂ）ビオチン化され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された標識を反応させる、
（ｃ）ビオチン化され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体を反応させた後、ビオチン化された標識およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
（ｄ）ＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体を反応させた後、標識され、かつ該１次抗体を認識する２次抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、固相に捕捉された標識量を測定し、試料由来のＰＳ２Ｖを、１次抗体の一定量および該標識量から検出することを特徴とするＰＳ２Ｖの検出方法。
【請求項４】
固相に結合され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する一定量の抗体に、標識された一定量のＰＳ２Ｖと、試料由来のＰＳ２Ｖとを競合させて反応を行った後、固相に捕捉された標識量を測定し、試料由来のＰＳ２Ｖを、該抗体の一定量および該標識量から検出することを特徴とするＰＳ２Ｖの検出方法。
【請求項５】
標識が放射性同位体、酵素、蛍光分子、発光分子、発色分子あるいは電気化学活性をもつ分子である請求項１から４に記載の方法。
【請求項６】
試料中のＰＳ２Ｖを、固相に結合され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体と反応させ、
さらに、ＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体と、以下の手法：
（ａ）酵素標識され、かつＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体を反応させる、
（ｂ）ビオチン化され、かつＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された酵素を反応させる、
（ｃ）ビオチン化され、かつＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体を反応させた後、ビオチン化された酵素およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
（ｄ）ＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体と反応させた後、酵素標識され、かつ該２次抗体を認識する抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、前記酵素の基質を加え、酵素反応によって生成した生成物を検出することを特徴とするＰＳ２Ｖの検出方法。
【請求項７】
前記酵素が、ＨＲＰ、ＡＬＰ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素またはルシフェラーゼである請求項５または６に記載のＰＳ２Ｖの検出方法。
【請求項８】
前記酵素がＡＬＰであり、前記酵素の基質が電子供与性基をｏ位およびｐ位の少なくとも１つに有するフェノール誘導体のリン酸エステルである請求項５から７に記載のＰＳ２Ｖの検出方法。
【請求項９】
電子供与性基が低級アルコキシ基である請求項８記載のＰＳ２Ｖの検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、孤発性アルツハイマー病で認められるＰＳ２Ｖを抗原抗体反応により検出する方法に関する。
背景技術
高齢化社会を迎え、痴呆患者の急激な増加は大きな社会問題となっている。アルツハイマー病（ＡＤ）は、痴呆症の一部を構成し、老年期痴呆に占める割合は、日本で約３０％、欧米では過半数にも及ぶ。ＡＤは、神経変性疾患の一つで、病理学的特徴として、（１）Ａβを主要構成成分として蓄積した老人斑が神経細胞間隔に観察される、（２）神経細胞内に異常リン酸化タウが凝集し、繊維化する神経原繊維が見られる、（３）大脳の萎縮（大脳新皮質や海馬の神経細胞の脱落）が挙げられる。また、臨床的特徴として、進行性の痴呆であり、記憶障害を中心に認知機能全般の低下が起こる。
ＡＤの中には、少数例の常染色体優性遺伝を示す家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）と明らかに家族歴のない孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）に分類される。後者は実にＡＤ全体の９割を占める。ＦＡＤは、その原因遺伝子として、第２１染色体上にアミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）遺伝子、第１４染色体上にプレセニリン−１（ＰＳ１）遺伝子、第１染色体上にプレセニリン−２（ＰＳ２）遺伝子が同定され、その発症機構が徐々に明らかになってきている。一方、ＡＤの大部分を占めるＳＡＤについては、神経病理学的にはＦＡＤと同様な所見を示すが発症メカニズムについては、不明な点が多い。
ＡＤの一般的な臨床診断には、米国で提唱されているＳＭ−ＩＶ、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ等の認知機能検査が使用されている。しかし、初期のＡＤにおける極めて軽微な認知障害を、従来の認知機能検査を用いて痴呆症状であると診断を行うのは難しい。また、現在用いられているＡＤの確定診断は、死後の脳にアミロイド蛋白の沈着（老人斑）とタウ蛋白の蓄積（神経原繊維変化）を認めることである。よって、有効な生前早期診断法はいまだ確立されておらず、ＡＤの典型的症状（脱見識等の特有の痴呆症状）が現れたときには既に手遅れであるのが現状である。
現在、国際的には数種類の抗痴呆薬が流通しており、日本においても１９９９年よりドネペジルが臨床で用いられている。これらの薬剤は、早期の症例に対して有効な場合が多く、ＡＤを早期に発見できれば治療効果が期待できるため、ＡＤの早期治療を行う上で有効な診断マーカーの開発が切望されている。
これまでに、ＰＳ２遺伝子の５番目のエキソンを欠失したスプライシング変種（ＰＳ２Ｖ）のｍＲＮＡがＳＡＤ患者脳の約７０％と高頻度に発現していることが報告されている（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．６，１９９９，２４９８−２５０５）。このＰＳ２ＶのｍＲＮＡは、ＰＳ２のＮ末端のアミノ酸残基１１９残基（Ｍｅｔ１−Ｌｅｕ１１９）に５つのアミノ酸（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）が付加された１２４アミノ酸からなる蛋白質をコードする。
また、ＳＡＤ患者脳海馬ＣＡｌ領域の標本を用いて免疫組織学的にＰＳ２Ｖを検索した結果、１００％の発現が確認された（Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１  Ｊａｎ  １９；２７６（３）：２１０８−２１１４）。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析により▲１▼ＰＳ２Ｖを強制発現させたヒト神経細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞ではストレス応答蛋白質ＧＲＰ７８の発現が抑制されているために、小胞体（ＥＲ）ストレスに対し感受性が増していること、▲２▼ＧＲＰ７８の発現抑制はＰＳ２ＶがＩｒｅ１蛋白質（ＥＲストレスセンサー）のリン酸化を阻害し、ＥＲストレス応答を不活性化するためであると考えられたこと、▲３▼ＰＳ２Ｖ発現細胞ではＡβ１−４０、Ａβ１−４２共に産生が亢進していたことが認められている。この３点から、ＳＡＤにおいては、ＰＳ２Ｖの発現が引き金となり、神経細胞死やＡβの産生亢進を引き起こしている可能性がある。
したがって、ＰＳ２Ｖの発現がＡＤ発症に重要な役割を果たしていることから、ＰＳ２Ｖの高感度検出はＡＤの早期発見につながると考えられる。
ＰＳ２Ｖの検出方法としては、ＰＳ２ＶのｍＲＮＡを検出する方法とＰＳ２Ｖを検出する方法が挙げられる。早期診断に際しては、患者の脳切片を採取することは不可能である。従って、採取が比較的容易な患者の髄液、血液、血清あるいは尿等の体液を用いて検査を行うことが必要である。しかし、髄液や血清中のｍＲＮＡの保持時間は極めて短く、速やかに分解されてしまうので、ｍＲＮＡによる診断は困難である。一方、ＰＳ２ＶはｍＲＮＡと比べて髄液や血清中の保持時間は長く、診断方法に用いるのに適すると考えられる。ただし、髄液あるいは血清等中のＰＳ２Ｖの量は非常にわずかであるので、高感度にＰＳ２Ｖを検出する方法が必要である。
なお、神経細胞の培養系において、酸化ストレス負荷やβ−アミロイド刺激などにより、異常なＰＳ２遺伝子のスプライシング変種を発現誘導することによるＰＳ２Ｖの製造法は特開２０００−３７１９２号に既に開示されているが、ＰＳ２Ｖの高感度検出を行った方法はいまだ見出されていない。
また、従来より酵素免疫測定法や核酸検出法において、アルカリホスファターゼ（以下ＡＬＰ）が標識分子としてしばしば用いられる。このＡＬＰはリン酸エステル体である基質を加水分解するので、得られた生成物を定量することにより、ＡＬＰで標識された目的とする生体関連分子の定量を行うことができる。
ＡＬＰによる加水分解生成物の定量方法の相違により、加水分解生成物の検出方法は吸光検出、化学発光検出、蛍光検出および電気化学的検出の４種類に分類される。
ＡＬＰの基質として、ｐ−メトキシフェニルリン酸等を用いて、電気化学的に検出する方法が、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３９３（１９９９）９５−１０２等の文献に、既に報告されている。しかし、これらの基質を用いてＰＳ２Ｖの高感度検出を行った方法はいまだ見出されていない。
従って、早期診断に利用可能なＰＳ２Ｖの高感度検出法およびその方法に用いる標識酵素の基質を見出すことが所望されていた。
発明の開示
本発明によれば、試料中のＰＳ２Ｖを、固相に結合された１次抗体と反応させ、さらに２次抗体と、以下の手法：
（ａ）標識された前記２次抗体を反応させる、
（ｂ）ビオチン化された前記２次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された標識を反応させる、
（ｃ）ビオチン化された前記２次抗体を反応させた後、ビオチン化された標識およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
（ｄ）該２次抗体と反応させた後、標識され、かつ前記２次抗体を認識する抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、固相に捕捉された標識量を測定することを特徴とするＰＳ２Ｖの検出方法が提供される。
ここで、１次抗体と２次抗体は、（ａ）１次抗体がＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体であり、２次抗体がＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する抗体であるか、または（ｂ）１次抗体がＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する抗体であり、２次抗体がＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体であることができる。
とくに標識が酵素の場合、試料中のＰＳ２Ｖを、固相に結合され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体と反応させ、
ＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体と、以下の手法：
（ａ）酵素標識され、かつＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体を反応させる、
（ｂ）ビオチン化され、かつＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された酵素を反応させる、
（ｃ）ビオチン化され、かつＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体を反応させた後、ビオチン化された酵素およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
（ｄ）ＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体と反応させた後、酵素標識され、かつ該２次抗体を認識する抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、前記酵素の基質を加え、酵素反応によって生成した生成物を検出することを特徴とするＰＳ２Ｖの検出方法が好適に使用される。
または、固相に結合された一定量のＰＳ２Ｖと、試料由来のＰＳ２Ｖとの共存下で、ＰＳ２Ｖを特異的に認識する一定量の１次抗体と、以下の手法：
（ａ）標識され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体を反応させ、
（ｂ）ビオチン化され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体を反応させた後、アビジン化またはストレプトアビジン化された標識を反応させる、
（ｃ）ビオチン化され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体を反応させた後、ビオチン化された標識およびアビジンまたはストレプトアビジンを反応させる、および
（ｄ）ＰＳ２Ｖを特異的に認識する１次抗体を反応させた後、標識され、かつ該抗体を認識する２次抗体を反応させる、
のいずれかにより反応させ、
次いで、固相に捕捉された標識量を測定し、試料由来のＰＳ２Ｖを、１次抗体の一定量および該標識量から検出することを特徴とするＰＳ２Ｖの検出方法も提供される。
さらに、固相に結合され、かつＰＳ２Ｖを特異的に認識する一定量の抗体に、標識された一定量のＰＳ２Ｖと、試料由来のＰＳ２Ｖとを競合させて反応を行った後、固相に捕捉された標識量を測定し、試料由来のＰＳ２Ｖを、該抗体の一定量および該標識量から検出することを特徴とするＰＳ２Ｖの検出方法も提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明で検出の対象とするＰＳ２Ｖ（配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）は、プレセニリン−２のエキソン５を欠くスプライシング変種に由来するポリペプチドであって、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示した配列のアミノ酸配列を有するか又はこのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。アミノ酸の付加、欠失又は置換は、通常１〜約２０個、好ましくは１〜約１０個、より好ましくは１〜約５個である。このようなポリペプチドは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸配列と通常約８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のホモロジーを有する。
正常のＰＳ２遺伝子のｃＤＮＡの配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に示したもので、エキソン５を欠く（エキソン４とエキソン６の接合した）スプラインシング変種（ＰＳ２Ｖ）遺伝子のｃＤＮＡの配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４において示される。配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４の塩基配列において、エキソン４とエキソン６の接合部位は、７０５番目と７０６番目の塩基配列の間に存在する。配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の塩基配列は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４の塩基配列において、３５９番目から７２４番目の領域に相当する。なお、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜４までの配列は、特開２０００−３７１９２に開示されている。
本発明で使用する試料としては、髄液や血清等の体液試料を用いることが好ましい。
ＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体とは、ＰＳ２を認識しないがＰＳ２Ｖを認識する抗体であり、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸配列において、Ｃ末端側のＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙのアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体である。
ＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する抗体とは、ＰＳ２とＰＳ２Ｖとで共通するアミノ酸配列を認識する抗体であり、例えば、ＰＳ２のアミノ酸配列の４２〜５８残基目を認識する抗体が挙げられる。
これらの抗体は、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙを含むペプチドやＰＳ２のアミノ酸配列の４２〜５８残基目を含むペプチドを調製し、これらのペプチドを常法に従って、ウサギ等に一定期間免疫後得られる血清から入手することができる。
また、これらの抗体は、非特異反応抑制のために、Ｆ（ａｂ′）２またはＦａｂ′フラグメントとして使用することが好ましい。
なお、抗体への標識には、放射性同位体（１２５Ｉ）、酵素、蛍光及び発光分子（フルオロセインなどの色素、ＧＦＰなどの蛍光蛋白，希土類錯体、有機ＥＬ素子材料など）、発色分子（光活性黄色タンパク質：ＰＹＰなど）、電気化学活性をもつ分子（フェロセンなど）などが使用できる。
例えば、抗体を酵素標識するには、抗体に直接酵素で標識した酵素標識抗体を使用してもよい。または抗体をビオチン化し、ついでビオチン−アビジン（ストレプトアビジン）の特異結合を利用して、アビジン（あるいはストレプトアビジン）化された酵素を結合させてもよい。もしくはビオチン化した抗体にアビジン（あるいはストレプトアビジン）とビオチン化された酵素を作用させてもよい。または、未標識の抗体と反応させた後、この抗体を認識する酵素標識された抗体を使用してもよい。
なお、高感度にＰＳ２Ｖを検出する必要がある場合、標識反応時の影響による抗体活性の低下および酵素標識された抗体の非特異吸着が問題となることが多い。つまり抗体の抗原結合部位への修飾を抑制し、かつ、多量体化を防ぐことが重要である。この対策としてＦａｂ′のチオール基に酵素を導入する方法がある。具体的には抗体のアミノ基を無差別に修飾する試薬を避け、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエートのようなヘテロ２官能性架橋剤を用い、抗体のジスルフィドを還元して得たチオール基と酵素のアミノ基の間で複合体化する。具体的には、まず、疎水性が高いＦｃ部分を除去するためＩｇＧをペプシン消化してＦ（ａｂ′）２フラグメントを回収し、ヒンジ部のジスルフィド結合を２ｍｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエチルアミン（５ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡを含０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、３７℃、９０分）により温和な条件で還元し、チオール基とすることによりＦａｂ′を調製する。Ｆａｂ′を濃縮した後、マレイミド基を導入した酵素と反応させると酵素標識された抗体が得られる。
酵素としては、標識として使用される公知のものが使用でき、例えば、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）やＡＬＰ（アルカリホファターゼ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ等を使用することができる。基質は吸光基質や蛍光基質、そして発光基質等使用する酵素によって適宜選択される。例えば、ルミノール、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−ニトロフェニル−フォスフェート、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、グルコース−６−リン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニルプロピオン酸等が挙げられる。酵素がＡＬＰであるとき、その基質はｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、フェニルリン酸、アミノフェニルリン酸、ナフチルリン酸、４−メチルベリフェリルフォスフェートなどを使用することができる。
本発明の方法においては、酵素がＡＬＰであるとき、その基質として、電子供与性基をｏ位およびｐ位の少なくとも１つに有するフェノール誘導体のリン酸エステルを用いるのが好ましい。電子供与性基としては、アルキル、エーテル、シリル、アミノ基およびそれらの誘導体等が挙げられる。好ましくは、低級アルコキシ基が挙げられる。さらには、ｐ−メトキシフェニルリン酸を用いるのがより好ましい。
本発明のＰＳ２Ｖの検出法を、１次抗体としてＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体を、２次抗体としてＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する抗体を用い、標識として酵素を用いる場合を例に挙げて説明する。なお、１次抗体と２次抗体の組み合わせが逆の場合でも同様に測定を実施できる。
まず、ＰＳ２とは反応しないがＰＳ２Ｖとは反応する（ＰＳ２Ｖを特異的に認識する）１次抗体を固相に結合させる。固相としては、試験管、９６穴の反応プレート、ビーズ等が使用できる。また、固相への１次抗体の結合は従来公知の方法が実施でき、例えば物理吸着法や、グルタルアルデヒドやカルボジイミド等の架橋化剤を用いた化学結合法が挙げられる。
抗体を結合させた後、固相への非特異吸着を防ぐために、該固相にＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、カゼイン、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、スキムミルク、ケラチン、デキストラン、ゼラチン等適当なブロッキング剤を使用してブロッキング処理を施す。
次に、試料中のＰＳ２Ｖをこの１次抗体と反応させる。反応温度は、約４〜４０℃、好ましくは約４〜３０℃、反応時間は、約５分〜オーバーナイト、好ましくは約４０分〜６時間で行うことができる。本工程により、ＰＳ２Ｖのみが固相に捕捉される。
次にＢ／Ｆ分離を行った後、ＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する２次抗体と反応させる。反応条件は、１次抗体の反応条件と同様の条件で行うことができる。この２次抗体としては、前述のように抗体に直接酵素で標識した抗体を用いることができる。あるいはビオチン化した２次抗体を反応させた後、さらにアビジン（あるいはストレプトアビジン）化酵素を結合させて酵素標識することができる。もしくはビオチン化した２次抗体にアビジン（あるいはストレプトアビジン）とビオチン化酵素を作用させることもできる。あるいは未標識の２次抗体と反応させた後、この２次抗体を認識する酵素標識抗体を反応させて酵素標識を行うこともできる。
次いで、酵素の基質を加えて反応させ、酵素反応によって生成した生成物を検出する。好適な反応温度や反応時間等の反応条件は、使用する酵素や基質の組み合わせによって異なるが、例えば、酵素としてＨＲＰを用いる場合について説明する。（１）基質にＯＰＤを用いたとき、反応緩衝液に０．０１２〜０．０２％の過酸化水素を含むＯＰＤ濃度０．４ｍｇ／ｍｌの０．０５Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１分〜２時間、好ましくは１０分〜１時間、２０〜４５℃、好ましくは２４〜３７℃で反応を行い、基質液量の１／４量の３Ｎの塩酸もしくは３Ｍの硫酸で反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定する。（２）ＴＭＢを用いたとき、反応緩衝液に０．０１〜０．０２％の過酸化水素を含むＴＭＢ濃度０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの１％ＤＭＦ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０入り０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で１分〜２時間、好ましくは５〜３０分、２０〜４５℃、好ましくは２４〜３７℃で反応を行い、基質液量と等量の１Ｍのリン酸、塩酸もしくは硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定する。（３）ルミノール基質の場合、１〜３０分、好ましくは１〜７分、２０〜３７℃、好ましくは２４〜３７℃で反応を行う。酵素反応によって生成した反応物は、吸光度で検出可能なものであれば分光光度計で、蛍光検出可能なものは、蛍光分光光度計で、発光物質の場合は発光光度計で、反応物が電極上で酸化されるときに生じる電流を検出する場合は電気化学検出器で検出することができる。ＰＳ２Ｖは酵素反応により生成した生成物の存在により検出される。より詳細には、ＰＳ２Ｖの量は、濃度既知のＰＳ２Ｖを添加した際に得られる酵素反応生成物から作成した検量線より算出できる。
また、別の実施形態として、あらかじめ試料と２次抗体を混合し１時間程度反応させた後、この反応混合物を含む液を１次抗体を固定した反応プレートのウェルに添加して１次抗体と反応させ、Ｂ／Ｆ分離を行った後、上記と同様に操作を行って測定を実施することができる。
なお、ＰＳ２Ｖの検出は、競合法を用いて行うこともできる。まず、抗原を固相に結合させる形態では、一定量のＰＳ２Ｖを公知の手段によって固相に固定化する。このとき使用するＰＳ２Ｖは、前述の変異ポリペプチドを含むものであれば特に制限されず、精製したＰＳ２Ｖ、合成ペプチド、あるいは融合蛋白が使用できる。
次に、ＰＳ２Ｖを固定化した反応容器内に試料を添加し、続いてＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体を一定量添加して固相上のＰＳ２Ｖと試料由来のＰＳ２Ｖとを競合させて反応を行う。このとき固相上のＰＳ２Ｖと試料由来のＰＳ２Ｖとの間で抗体を奪い合う。固相上のＰＳ２Ｖと抗体の量は一定であるため、試料由来のＰＳ２Ｖの量が多くなるほど抗体の固相上のＰＳ２Ｖへの結合量は減少する。あらかじめブランク試料としてＰＳ２Ｖを含まない試料を測定して固相への抗体の結合量を求めておけば、減少した結合量から試料中のＰＳ２Ｖ量を求めることができる。反応温度、反応時間などの反応条件はサンドイッチ法と同様である。反応後、Ｂ／Ｆ分離を行って、固相に結合していないＰＳ２Ｖや抗体を除去する。続いて、抗体としてあらかじめ標識した標識抗体を使用する場合は標識量を測定し、ビオチン化された抗体を使用する場合は、さらにアビジン（またはストレプトアビジン）化された標識を用いて標識を行い、あるいは、ＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体と反応させた後、これを認識する標識抗体を用いることによって標識し、標識された量を測定することによってＰＳ２Ｖを検出できる。なお、標識には上記と同様のものが使用できる。
また、抗体を固相に結合させる形態では、ＰＳ２Ｖを特異的に認識する一定量の抗体を公知の手段によって固相に固定化する。また、標識したＰＳ２Ｖを用意する。このとき使用するＰＳ２Ｖは、前述の変異ポリペプチドを含むものであれば特に制限されず、精製したＰＳ２Ｖ、合成ペプチド、あるいは融合蛋白が使用できる。ＰＳ２Ｖを標識するには、公知の蛋白の標識手段で実施できる。標識としては、上記と同様のものを使用することができる。
さらに、ＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体を一定量固定化した反応容器内に、標識されたＰＳ２Ｖ一定量と、未知量のＰＳ２Ｖを含む試料を添加し、標識ＰＳ２Ｖと試料由来のＰＳ２Ｖとを競合させて、抗体を奪い合う。固相上の抗体と標識されたＰＳ２Ｖの量は一定であるため、試料由来のＰＳ２Ｖが多くなるほど標識ＰＳ２Ｖの固相上の抗体への結合量は減少する。あらかじめブランク試料としてＰＳ２Ｖを含まない試料を測定して固相への標識ＰＳ２Ｖの結合量を求めておけば、減少した結合量から試料中のＰＳ２Ｖ量を求めることができる。反応温度、反応時間などの反応条件はサンドイッチ法と同様である。反応後、Ｂ／Ｆ分離を行って、固相に結合していない標識ＰＳ２Ｖを除去する。続いて、固相に捕捉された標識ＰＳ２Ｖの量を測定することによってＰＳ２Ｖを検出できる。
以下に、１次抗体としてＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体を、２次抗体としてＰＳ２またはＰＳ２Ｖを認識する抗体を用いた実施例を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
１次抗体（ウサギ抗ＳＳＭＡＧ抗体）の調製
合成ペプチドＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−ＧｌｙのＮ末端側にシステイン残基を加え、このＳＨ基とヘモシアニン（ＫＬＨ）のアミノ基をｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを用いて常法に従い、複合体化した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，６９０−６９７（１９７９））。この複合体をウサギの背中皮内に免疫し抗血清を調製し、同ペプチドを架橋したアフィニティカラムにて精製した。なお、抗体はサワディテクノロジー株式会社に依頼して調製した。
２次抗体（ウサギ抗ＰＳ２Ｎ抗体：Ａｎｔｉ  ＰＳ２Ｎ  Ａｂ）の調製
合成ペプチドＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＰＳ２のアミノ酸配列の４２〜５８番目）のＮ末端側にシステイン残基を加え、このＳＨ基とヘモシアニン（ＫＬＨ）のアミノ基をｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを用いて常法に従い、複合体化した。この複合体をウサギの背中皮内に免疫し抗血清を調製し、同ペプチドを架橋したアフィニティカラムにて精製した。なお、抗体はサワディテクノロジー株式会社に依頼して調製した。
２次抗体のビオチン化
Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ３０（Ｃｕｔ−ｏｆｆ＝３００００Ｄａ、Ａｍｉｃｏｎ社製）へ上記で調製したＡｎｔｉ  ＰＳ２Ｎ  Ａｂ  ３７２．１μｇ／ｍｌを１ｍｌ加え、４℃、４５００ｒｐｍ、３０分間処理し、１００μｌへ濃縮した。ＰＢＳ（−）１．５ｍｌを添加し、同じ条件で遠心操作を行い、濃縮し、５００μｌになるようにＰＢＳ（−）でメスアップした。
１０ｍｌのＰＢＳ（−）で平衡化を行ったＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に上記で処理したＡｎｔｉ  ＰＳ２Ｎ  Ａｂ溶液５００μｌを通し、５００μｌの溶出液を廃棄した後１ｍｌの溶出液（抗体を含むフラクション）を回収した。吸光度Ａ２８０を測定し（吸光係数ε＝１．４ｍｌ／ｍｇ・ｃｍ）、抗体濃度を算出した。（抗体濃度＝２８２．４μｇ／ｍｌ）
次に、ビオチン化試薬ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（スルフォスクシニミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート，Ｐｉｅｒｃｅ社製）を、ビオチン化試薬：ＩｇＧ＝５４ｍｏｌ：１．３ｍｏｌ＝４２：１となるように抗体液にビオチン化試薬を添加し、４℃、２時間反応させた。次いで、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ３０へ反応物を含む溶液を１ｍｌ加え、４℃、４５００ｒｐｍ、３０分間処理し、１００μｌへ濃縮した。ＴＢＳ１．５ｍｌを添加し、同じ条件で遠心操作及び濃縮を２回実施し未反応のビオチン化試薬の除去と濃縮を行った。吸光度Ａ２８０を測定し（吸光係数ε＝１．４ｍｌ／ｍｇ・ｃｍ）、抗体濃度を算出した。（抗体濃度＝３７８．８３μｇ／ｍｌ）
遺伝子組換えＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ（ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ）の調製
（１）ヒト神経細胞の培養とＲＮＡ調製
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１）を、１０ｃｍ径の培養皿で、１０％ｖ／ｖウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ培地（α−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＧＩＢＣＯ社製）中、コンフルエントな状態まで、３７℃で約４８時間ＣＯ２培養器で培養後、ウシ胎児血清不含の同培地に培地交換し、約２時間培養した。
前記培養細胞についてさらに、培養皿を低酸素培養器（酸素濃度１％以下、９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）に移し１６時間培養した。
前記のように培養した細胞を回収し、生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。これを、細胞溶解用緩衝液（ＲＬＴ溶液、ＱＩＡＧＥＮ社製）７００μｌに懸濁した後、細胞を破砕し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液から、トータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡの調製は、ＲＮＡ調製用キット（商品名：ＲＮｅａｓｙ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。
（２）ＰＳ２ＶのｃＤＮＡの調製
前記で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ、１μｇ）を鋳型とし、オリゴｄＴプライマー（５０ｐｍｏｌｅ）、ランダムオリゴヌクレオチド（５ｐｍｏｌｅ）及びリバーストランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（２００単位）を含む緩衝液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，０．０７５Ｍ  ＫＣｌ，０．００３Ｍ  ＭｇＣｌ２，ＤＴＴ，０．０００２Ｍ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）０．０５ｍｌ中、４２℃で１時間反応させて、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（３）ベクターの調製
ＰＳ２Ｖ遺伝子の５′と３′末端に、ベクターｐ  ＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のマルチクローニングサイトに組み込め、インフレームとなるようにプライマー（配列は以下の通り。センスプライマー：５′−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  Ｇ−３′（配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）およびアンチセンスプライマー：５′−ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  Ｃ−３′（配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６））を設計し、上記で得た一本鎖ＤＮＡを用いてＰＣＲ（変性反応９５℃、３０秒、伸長反応７２℃で１分、アニーリング５５℃で３０秒の条件（サイクル数；３０サイクル）で行った。）を行って遺伝子断片を調製、単離し、これを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切り出した。また、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１についても同様にＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位を切断した。
次に、単離したＰＳ２Ｖ遺伝子断片を精製し、上記で処理したｐ  ＧＥＸ−４Ｔ−１を混合し、ライゲーションを行って、ｐ  ＧＥＸ−４Ｔ−１のマルチクローニングサイトにＰＳ２Ｖ遺伝子を導入した。ＤＮＡシーケンサで正しい配列であることを確かめｐＧＥＸ−４Ｔ−１／ＰＳ２Ｖプラスミドとした。ライゲーションはライゲーションキット（商品名：ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２、ＴａＫａＲａ社製）を用いて行った。
（４）ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの発現
上記で調製したｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ発現ベクターをＪＭ１０９コンピテントセル（大腸菌）にトランスフォーメーションしてＬＢ培地プレートに添加し、培養した。出てきたコロニーに正しくベクターが導入されていることをＰＣＲで確認した。
次に、コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウム入りの液体のＬＢ培地に加え、オーバーナイトで培養した。
上記オーバーナイト培養液２ｍｌを２００ｍｌのＬＢ培地に加え、３７℃、２時間後に最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加えて融合蛋白の発現誘導を行った。
２時間後に菌体を回収した。５０ｍｌの培養液に対し、４℃、８０００ｒｐｍ、１０分間遠心後、沈渣を回収した。沈渣に最終濃度１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む３ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、懸濁液を氷冷し、ソニケータで菌体を破壊し、遠心後（４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分）、上清を回収した。
次いで、回収した上清をグルタチオンセファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）カラムに通した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、１０ｍＭ還元型グルタチオン溶液でｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを溶出させた。回収した各フラクションの吸光度を測定し、Ａ２８０の大きなフラクションの電気泳動を行い、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの存在を確認した。透析によりグルタチオンを除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて蛋白濃度を測定してｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの標品とした。
実施例１  サンドイッチ法によるｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの測定（ＨＲＰおよびルミノールを用いる方法）
（１）固相への１次抗体の固定
９６穴プレート（Ｃｌｉｎｉｐｌａｔｅ，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）に上記で調製した１次抗体を１ｐｍｏｌ／ウェル添加し、３７℃、１時間放置した。０．５％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（大日本製薬株式会社製）を含むＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ０．０５％ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ７．４））０．３２ｍｌ／ウェルで３回洗浄し、２５％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））溶液３００μｌ／ウェルを加え、３７℃で１時間放置してブロッキングを行った。
（２）ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの化学発光測定
上記で調製したプレートに、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを０〜３１ｐｍｏｌ含む正常血清溶液を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃、１時間反応させた。反応後、０．５％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ−Ｔ  ０．３２ｍｌ／ウェルで３回洗浄し、Ｂ／Ｆ分離を行った。
次に上記で調製したビオチン化２次抗体を０．３ｐｍｏｌ／ウェル添加し、３７℃、１時間反応させた。反応後、０．５％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ−Ｔ  ０．３２ｍｌ／ウェルで３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）の５０００倍希釈０．５％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ含有ＴＢＳ−Ｔ溶液を５０μｌ／ウェルを添加し、３７℃、１時間反応させた。反応後、０．５％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ−Ｔ  ０．３２ｍｌ／ウェルで３回洗浄した。
次に、発光基質であるルミノール（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ，Ｐｉｅｒｃｅ製）を８０μｌ／ウェル添加し、３０℃、５分反応させた。酵素反応開始より５分経過した時点で１０秒間の積算発光量を求めた。発光量の測定には、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（大日本製薬株式会社）を用いた。図１に示したようにａｍｏｌ（１０−１８ｍｏｌ）オーダーの検出感度が得られた。
ＳＡＤ患者脳脊髄液の測定
ＳＡＤ患者４例、くも膜下出血患者１例及び水頭症患者２例の脳脊髄液を試料とし、上記と同様にして、ＰＳ２Ｖの測定を行った。結果を図２に示す。他の症例に比較して高値を示し、ＳＡＤ診断の指標になり得ることが確認できた。
ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの吸光度測定
９６穴プレート（ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ，ＩＷＡＫＩ製）に上記で調製した１次抗体を３ｐｍｏｌ／ウェル添加した以外は上記と同様の操作を行って抗原抗体反応を行った。酵素反応は、基質としてＴＭＢ（ＫＰＬ製）を１００μｌ／ウェル添加し、３０℃、１５分間反応させた。酵素反応開始より１５分後１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４  １００μｌ／ウェル添加し、ＶＥＲＳＡｍａｘ  ｔｕｎｅａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製）を用いて４５０ｎｍと６５０ｎｍにおける吸光度の間でバックグラウンド補正を行い、４５０ｎｍで吸光度測定を行った。吸光度の平均値を図３に示す。化学発光法と同様にａｍｏｌオーダーの検出感度が得られた。
実施例２  サンドイッチ法によるｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの測定（ＡＬＰおよびｐＭＰＰ（ｐ−メトキシフェニルリン酸）を用いる方法）
（１）固相への１次抗体の固定
９６穴プレート（Ｃｌｉｎｉｐｌａｔｅ，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）に上記で調製したウサギＳＳＭＡＧ抗体（１次抗体）を６．２５×１０−１１ｍｏｌ／ウェル添加し、３７℃、１時間放置した。０．１％ｗ／ｖ  ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ製Ａ６００３）を含むＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ０．０５％ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４））３００μｌ／ウェルで３回洗浄し、３％ｗ／ｖ  ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ溶液３０５μｌ／ウェルを加え、３７℃で１時間放置してブロッキングを行った。
（２）ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの電気化学検出による測定
上記で調製したプレートに、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを１×１０−１７〜１×１０−１２ｍｏｌ含む正常血清溶液を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃、１時間反応させた。反応後、０．１％ｗ／ｖ  ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ  ３００μｌ／ウェルで３回洗浄し、Ｂ／Ｆ分離を行った。
次に上記で調製したビオチン化２次抗体（ウサギ抗ＰＳ２Ｎ抗体）を３．１２×１０−１３ｍｏｌ／ウェル添加し、３７℃、１時間反応させた。反応後、３％ｗ／ｖ  ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ製Ａ６００３）を含むＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））溶液３０５μｌ／ウェルを加え、３７℃で１時間放置してブロッキングを行い、０．１％ｗ／ｖ  ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ  ０．３２ｍｌ／ウェルで３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＡＬＰ（ＤＡＫＯ製）の５０００倍希釈０．５％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ含有ＴＢＳ−Ｔ溶液を５０μｌ／ウェルを添加し、３７℃、１時間反応させた。反応後、０．１％ｗ／ｖ  ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ  ３００μｌ／ウェルで３回洗浄した。
次に、基質である０．５Ｍ  ＣＢ−Ｂｕｆｆｅｒ中１０ｍＭのｐＭＰＰ（Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３９３（１９９９）９５−１０２に記載の方法に従い製造した、田辺Ｒ＆Ｄ製）を９０μｌ／ウェル添加し、さらに０．１Ｍ  Ｍｇ（ＣｌＯ４）２を２０μｌ、０．５Ｍ  ＣＢ−Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．５）１０μｌおよびＲＯ水を６０μｌ添加し、３７℃、３０分反応させた。その後、４５μｌの０．６Ｍ  ＥＤＴＡ−３Ｎａ溶液（ＮａＯＨにてｐＨ９．５に調製）を０℃で添加して酵素反応を停止させた。また酵素反応停止後、各ウェルの酵素反応停止液を別のプレート（ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ，ＩＷＡＫＩ製）に移し変えた。
次いで、ＡＬＰによるｐＭＰＰの加水分解された生成物、ｐ−メトキシフェノールを検出した。検出には、フロー式電気化学アンペロメトリック検出システム（Ｆｌｏｗ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ−Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：以下ＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴ）を用いた。そのＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴの構成図を図４に示す。
ＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴは、デガッサ（：Ｖａｃｕｕｍ  Ｄｅｇａｓｓｅｒ  ＬＣ−２７Ａ），ポンプ（：ＭＩＣＲＯ  ＬＣ  ＰＵＭＰ  ＬＣ−１００），インジェクトバルブ（Ｒｅｏｄｉｎｅ製  ７７２５１），ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−ＡＭ，ＡＭ３Ｃ７ＡＭ１２Ｓ０５−Ｌ５０２ＷＴ  Ｎｏ．０２０７０４５８（Ｗ）），ショートカラム（ＹＭＣセミミクロガードカートリッジカラム２×１０ＡＭ１２Ｓ０５−０１０２ＣＣ），電極検出部で構成される。
ＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴ流路内には、４５％ｖ／ｖまたは５０％ｖ／ｖメタノールを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液を溶出液として流す。デガッサ（：Ｖａｃｕｕｍ  Ｄｅｇａｓｓｅｒ  ＬＣ−２７Ａ）は、溶出液の気泡を除去し、ポンプ（：ＭＩＣＲＯ  ＬＣ  ＰＵＭＰ  ＬＣ−１００）は溶出液を２５０μｌ／ｍｉｎで電極検出部まで送液する。この送液状態で、インジェクトバルブ（Ｒｅｏｄｉｎｅ製  ７７２５１）からサンプルを注入する。本発明におけるＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴ流路への測定試料のサンプル量は２０μｌとなるように設定した。
インジェクトバルブと電極検出部の間には、測定試料に混入する蛋白成分が電極検出部に到達することで電極表面の汚れを防止するために、ショートカラムを配置した。またショートカラムにより、緩衝液由来のノイズ電流と検出成分の電流を検出器に到達する時間で分離する
電極検出器の構成を図５に示す。電気化学検出では一般に、検出対象物質の酸化還元電位を供給し、酸化還元反応に伴う酸化還元電流を取り込む作用電極、また作用電極（ＷＥ）の酸化還元電位を設定する時に基準となる参照電極、また酸化還元反応の時に余剰の酸化還元電流が参照電極（ＲＥ）に流れないようにするためのカウンター電極（ＣＥ）が必要である。良く用いられる電気化学検出系では各電極を１つずつ構成する３電極系、作用電極を２つ，他の電極を各１つずつもつ４電極系がある。本システムＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴの電極検出部には３電極系を使用しており、参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極（ＢＡＳ  ＲＥ−３Ｖ）、カウンター電極には流路一体型電極、作用電極にはグラッシーカーボン電極（ＢＡＳ  ００３４５６）を使用した。また電気化学測定器はＢＡＳ社のＡＬＳ８３２ａを使用した。
検出物質は、基質の加水分解反応生成物であるｐ−メトキシフェノールである。あらかじめｐ−メトキシフェノール（和光純薬工業株式会社０８４−０１２８２（特級品）をそのまま使用）を０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．９２）により１ｎＭ〜１μＭまで系列希釈液を作製し、各サンプルをＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴにインジェクトし、酸化電流値のピークを求めて電気化学検出し、検量線を作成した。検出条件は、作用電極電位（酸化電位）が０．５５Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ、インジェクトから電極検出部までの出現時間が９０秒である。
同検出条件下で、酵素反応を停止させた本実施例のサンプルをＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴにインジェクトし、酸化電流値のピークを求めた。その結果を図６および７に示す。
図６および７の結果から、１×１０−１７ｍｏｌ〜１×１０−１２ｍｏｌ（１０ａｍｏｌ〜１ｐｍｏｌ）の範囲内で３回測定の同時再現性（変動率）１０％以下のｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ量依存性が確認された。またｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ  ０ｍｏｌのシグナルレベルをバックグラウンド電流として、各ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ分子数における電流値からバックグラウンド電流を引いて（０補正）、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ依存性を確認すると１×１０−１７ｍｏｌ〜１×１０−１２ｍｏｌ（１０ａｍｏｌ〜１ｐｍｏｌ）の範囲でも直線性が良好であることが示された。これにより、基質ｐＭＰＰを用いたＡＬＰの電気化学検出をＳａｎｄｗｉｃｈ−ＥＬＩＳＡに適用した場合、例えばｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの蛋白でもａｍｏｌオーダーの検出能を有することができることが示された。
実施例３  競合法によるｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの測定
（１）固相へのｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの固定
９６穴プレート（Ｃｌｉｎｉｐｌａｔｅ，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）に上記で調製した
ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ  １．４５μｇ／ｍｌＴＢＳ溶液を５０μｌ／ウェル添加し、室温で２時間放置した。０．１％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ−Ｔ  ０．３２ｍｌ／ウェルで３回洗浄し、２５％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液３００μｌ／ウェルを加え、３７℃で１時間放置してブロッキングを行った。
（２）ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの測定
上記で調製したプレートに、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを０〜３１ｐｍｏｌ含む正常血清溶液を２５μｌ／ウェル添加し、続いて上記で調製したウサギ抗ＳＳＭＡＧ抗体（ＰＳ２Ｖを特異的に認識する抗体）０．０３μｇ／ｍｌを２５μｌ／ウェル添加し、３７℃で１時間反応させた。０．１％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ−Ｔ  ０．３２ｍｌ／ウェルで３回洗浄した後、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）１０００倍希釈ＴＢＳ−Ｔ溶液（０．１％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ含有）５０μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。
０．１％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ−Ｔ  ０．３２ｍｌ／ウェルで３回洗浄した後、発光基質であるルミノール（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ，Ｐｉｅｒｃｅ製）を８０μｌ／ウェル添加し、３０℃で５分反応させた。酵素反応開始より５分経過した時点で１０秒間の積算発光量を求めた。発光量の測定には、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎを用いた。結果を図８に示す。競合法でも測定できることが確認された。
実施例４  競合法によるｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの測定
（１）固相へのｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの固定
９６穴プレート（Ｃｌｉｎｉｐｌａｔｅ，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）に上記で調製したｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ  １．４５μｇ／ｍｌＴＢＳ溶液を５０μｌ／ウェル添加し、室温で１時間放置した。０．１％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ−Ｔ  ３００μｌ／ウェルで３回洗浄し、２５％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液３０５μｌ／ウェルを加え、３７℃で１時間放置してブロッキングを行った。
（２）ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの電気化学検出による測定
上記で調製したプレートに、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを０〜１ｍｏｌ含む正常血清溶液を２５μｌ／ウェル添加し、続いて上記で調製したウサギ抗ＳＳＭＡＧ抗体（１次抗体）０．１ｍｇ／ｍｌを２５μｌ／ウェル添加し、３７℃で１時間反応させた。０．１％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ−Ｔ  ３００μｌ／ウェルで３回洗浄した後、抗ウサギＩｇＧ−ＡＬＰ（２次抗体）（ＤＡＫＯ社製）４０００倍希釈ＴＢＳ−Ｔ溶液（０．１％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ含有）５０μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。
０．１％ｗ／ｖ  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＴＢＳ−Ｔ  ３００μｌ／ウェルで１回洗浄した後、基質であるｐＭＰＰ（田辺Ｒ＆Ｄ製）の１ｍｍｏｌ／ｌの溶液を１００μｌ／ウェル添加し、３７℃で３０分反応させた。その後、４５μｌの０．６Ｍ  ＥＤＴＡ−３Ｎａ溶液（ＮａＯＨにてｐＨ９．５に調製）を０℃で添加して酵素反応を停止させた。実施例２と同様にして、電気化学検出によりｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖの量を測定した。
図９に測定した結果を示す。試料中の抗原ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖ量が３０ｆｍｏｌより変化が認められ、３０ｆｍｏｌの検出感度の競合アッセイを組むことができると考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、体液試料を用いてＰＳ２Ｖを高感度に検出することができるので、孤発性アルツハイマー病の早期診断に有用な検査データを提供することができる。
【配列表】
2003008970.tif 000003
2003008970.tif 000004
2003008970.tif 000005
2003008970.tif 000006
【図面の簡単な説明】
図１は、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを試料としてサンドイッチ法による化学発光測定を行った本発明による実施例１の結果を示した図である。
図２は、くも膜下出血患者、水頭症患者及び孤発性アルツハイマー病患者の脳脊髄液中のＰＳ２Ｖを測定した本発明による結果を示した図である。
図３は、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを試料としてサンドイッチ法による吸光度測定を行った本発明による実施例１の結果を示した図である。
図４は、本発明による電気化学的検出において用いるＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴの構成を示した図である。
図５は、本発明によるＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴの検出器の構成を示す図である。
図６は、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを試料としてサンドイッチ法による電気化学検出を行った本発明による実施例２の結果を示した図である（抗原量依存性、３回平均値）。
図７は、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを試料としてサンドイッチ法による電気化学検出を行った本発明による実施例２の結果を示した図である（抗原０をバックグラウンドとして差し引いた値）。
図８は、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを試料として競合法による吸光度測定を行った本発明による実施例３の結果を示した図である。
図９は、ｒＧＳＴ−ＰＳ２Ｖを試料として競合法による電気化学検出を行った本発明による実施例４の結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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