(57)【要約】血液腫瘍患者の病態を把握し、かつ抗癌剤の有効性等を適切に経過観察することのできる血液腫瘍の診断方法及びそれに用いる診断薬である。血液腫瘍の診断方法は、患者から採取した血液標本、細胞標本又は組織標本と抗Ｈ抗体とをインビトロで抗原抗体反応させたのち、抗原抗体反応の結果を定性的又は定量的に分析することによって、血液腫瘍患者の病態を診断する。抗原抗体反応の結果は、免疫組織染色法よって定性的に分析してもよく、フローサイトメトリー法よって定量的に分析してもよい。また、血液腫瘍の診断薬は、上記診断方法に使用され、抗Ｈ抗体を主成分として含有するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取した血液標本、細胞標本又は組織標本と抗Ｈ抗体とをインビトロで抗原抗体反応させたのち、抗原抗体反応の結果を定性的又は定量的に分析することによって、血液腫瘍患者の病態を診断することを特徴とする血液腫瘍の診断方法。
【請求項２】
抗原抗体反応の結果を、免疫組織染色法よって定性的に分析することを特徴とする請求の範囲第１項記載の血液腫瘍の診断方法。
【請求項３】
抗原抗体反応した抗Ｈ抗体量を、フローサイトメトリー法よって定量的に分析することを特徴とする請求の範囲第１項記載の血液腫瘍の診断方法。
【請求項４】
抗Ｈ抗体を主成分とすることを特徴とする血液腫瘍の診断薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキン病（ＨＤ）や非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などの悪性リンパ腫、リンパ性白血病等の血液腫瘍患者の病態を、容易に把握することができる診断薬及び診断方法に関する。
背景技術
悪性リンパ腫や白血病等の血液腫瘍は、リンパ球や白血球などの血球細胞やリンパ節が腫瘍化しているため、他の臓器の腫瘍で一般的に行われる外科的手術をでは治療できず、もっぱら抗癌剤を利用した化学療法、Ｘ線や他の高エネルギーの放射線を使用する放射線療法、他人の骨髄を移植する骨髄移植療法などによる治療が行われている。なかでも、骨髄提供者（ドナー）や特別な放射線施設を必要としない、化学療法による治療が最もよく行われている。
しかし、上記のような化学療法においては、抗癌剤が、ガン細胞のみならず、正常な血液細胞をも傷つけてしまうため、吐き気、嘔吐、口内炎、脱毛、高熱、下痢、感染症、貧血、呼吸困難、出血、薬物アレルギー等の副作用が生じたり、また、骨髄抑制による感染症、出血が生じることもある。
このような副作用を最小限にとどめながら、患者の病態を把握し有効な治療を行うには、治療の進み具合に応じて、抗癌剤の種類、投与量、投与時期等を抗癌剤の有効性を確認しながらコントロールする必要があり、治療の進み具合、すなわち、病気の治り具合を定期的に経過観察することが求められている。
そして、このような経過観察の方法としては、血液中の可溶性インターロイキン２受容体の量に基づく方法や、血中のリンパ球数や白血球数に基づく方法等が行われている。
しかし、可溶性インターロイキン２受容体の量に基づく方法は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、成人細胞白血病（ＡＴＬ）などにしか適用できず、適用範囲が狭いとの問題点があった。
また、血中のリンパ球数や白血球数に基づく方法は、必ずしも病態を把握するとは言えないとの問題点があった。
そこで、この発明は上記のような問題点を解決し、血液腫瘍患者の病態を把握し、かつ抗癌剤の有効性等を適切に経過観察することのできる血液腫瘍の診断方法及びそれに用いる診断薬を提供することを目的とする。
発明の開示
すなわち、この発明にかかる血液腫瘍の診断方法は、患者から採取した血液標本、細胞標本又は組織標本と抗Ｈ抗体とをインビトロで抗原抗体反応させたのち、抗原抗体反応の結果を定性的又は定量的に分析することによって、血液腫瘍患者の病態を診断することを特徴とする。また、抗原抗体反応の結果は、免疫組織染色法よって定性的に分析してもよく、フローサイトメトリー法よって定量的に分析してもよい。
このように、患者から採取した血液標本等と抗Ｈ抗体とを抗原抗体反応させ、反応の結果を定性的又は定量的に分析することによって、病態の把握及び抗癌剤による治療の進み具合を容易に経過観察することができ、患者に投与する抗癌剤の種類、投与量、投与時期、有効性等の判断に役立てることができる。
発明を実施するための最良の形態
この発明の血液腫瘍の診断方法は、患者から採取した血液標本又は組織標本と抗Ｈ抗体とをインビトロで抗原抗体反応させたのち、抗原抗体反応の結果を定性的又は定量的に分析することによって、血液腫瘍患者の病態を診断する。
ここで、抗Ｈ抗体とは、赤血球表面及びその他の組織に存在し、ＡＢＯ式の血液型を決定するＨ抗原（Ｏ型抗原）に対するヒト以外の動物由来の抗体であり、ポリクローナル抗体でもかまわないが、検出感度の点から、ハイブリドーマ法によって作られたモノクローナル抗体が好ましい。
抗原抗体反応の結果に基づいて、定性的に判断する方法としては、免疫組織染色法などの通常用いられる方法が、定量的に測定する方法としてはフローサイトメトリー法などの通常用いられる方法が挙げられる。
なお、免疫組織染色法とは、パラフィン固定された組織切片をスライドガラスに固定して、脱パラフィン化したのち、抗Ｈ抗体（１次抗体）を主要成分とする診断薬を降りかけて抗原抗体反応を行い、当該抗Ｈ抗体と特異的に抗原抗体反応する二次抗体を降りかけて抗原抗体反応させ、当該２次抗体につけられた蛍光色素による呈色やペルオキシダーゼなどの酵素による呈色反応によって、抗原抗体反応の結果を定性的に判断する方法である。また、フローサイトメトリー法とは、溶液中で血球細胞と蛍光色素によって標識された抗Ｈ抗体等とを抗原抗体反応させ、蛍光色素によって染色された細胞の数をフローサイトメーターによって測定する方法である。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例
組織標本として、成人の重篤な病態の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、Ｔ細胞又はＢ細胞由来の非ホジキンリンパ腫（Ｔ−ＮＨＬ、Ｂ−ＮＨＬ）患者から採取したリンパ節のパラフィン切片と、ＫＭ１３２（抗Ｈ抗体）、ＫＭ３２（抗Ａ抗体）、ＫＭ１２６（抗Ｂ抗体）、ＫＭ９３（抗シアル酸含有糖鎖抗体）、ＫＭ１７４（抗Ｆｏｒｓｓｍａｎ及び抗Ａ抗体）、ＫＭ３８０（抗Ｓｔａｇｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ−１抗体）の６種類の抗体を用いて、以下に示す手順によって免疫組織染色した。なお、各疾病ごとの標本数は、ＡＭＬは９例、ＨＤは２例、Ｔ−ＮＨＬは７例、Ｂ−ＮＨＬは２３例であり、抗原抗体反応の結果は、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ　ＡＢＣキット（フナコシ株式会社）に添付された説明書にしたがって呈色反応を行い、当該呈色反応の結果に基づいて判断した。
（１）脱パラフィン化
組織標本のパラフィン切片が接着されたスライドガラスを、室温で、キシレンに１０分間づつ３回、エタノールに２分間づつ３回通したのち、水道水で５分間洗浄した。なお、エタノールの濃度は一回ごとに段階的に下げた。
（２）内因性ペルオキシダーゼ及び非特異的反応のブロッキング
脱パラフィン化された組織標本を、０．３％過酸化水素加メタノール溶液（１００ｍｌのメタノール液に対して３０％の過酸化水素原液を１ｍｌの割合で加える）に室温で３０分間浸して、内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした。
つぎに、組織標本を流水で１０分間水洗し、蒸留水に浸した後、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５），０．９％ＮａＣｌ緩衝液）に５分間浸した。
さらに、ＰＢＳに浸した組織標本を、２次抗体を作製した動物と同じ動物種由来の希釈正常血清（ＰＢＳに２％の濃度となるようにブロッキング用血清を溶かしたもの）に室温で２０分浸し、２次抗体が非特異的に組織標本と反応するのを防いだ。
（３）１次抗体との反応
ＰＢＳで希釈した１次抗体（６種）を滴下し、室温で３０分間抗原抗体反応させ、ＰＢＳで５分間洗浄した。
（４）２次抗体との反応
希釈ビオチン化２次抗体溶液（ＰＢＳ１０ｍｌ、正常血清１５０μｌ、ビオチン化２次抗体５０μｌの割合で混合したもの）を滴下し、室温で３０分反応させ、ＰＢＳで５分間洗浄した。
（５）呈色反応
ＡＢＣ試薬（ＰＢＳ５ｍｌに試薬Ａ（アビジンＤＨ溶液）１００μｌを加えたのち、試薬Ｂ（ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼアビジンＨ溶液）１００μｌを加えたもの）を滴下し、室温で３０分反応させ、ＰＢＳで５分間洗浄した。
つぎに、０．０２％過酸化水素溶液と０．１％３，３’−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）溶液（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２で調整）とを等量混合してペルオキシダーゼ基質溶液を調製し、組織標本に滴下して室温で１０分間呈色反応させ、流水（水道水）で水洗して呈色反応を停止させた。
呈色反応終了後、組織標本をヘマトキシリンで核染色し、情報にしたがって脱水、透徹、封入した。
このようにして、免疫組織染色した結果を疾患別に、以下の表１から表４に示す。なお、表中の「＋」は陽性をであったことを示し、「−」は陰性であったことを示しており、「＋＋」及び「＋＋＋」は、それぞれ、強い陽性、かなり強い陽性をそれぞれ示している。
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以上の結果からも明らかなように、ＡＭＬ患者からの組織標本１例を除き、すべての血液腫瘍患者の病理組織において、ＫＭ１３２（抗Ｈ抗体）との反応が陰性であり、これらの組織においては、Ｈ抗原が消費されていることがわかった。
すなわち、Ｈ抗原が潤沢であることは、患者の病態が寛解・治癒に向かっていることを示し、Ｈ抗原が消費されていることは、患者の病態が再発・重篤に向かっていることを示していることがわかった。
なお、この発明は上記実施例に限定されるものではなく、請求の範囲に記載された技術的範囲内において様々な変形を加えることができる。
例えば、上記実施例においては、２次抗体につけられたペルオキシダーゼによる呈色反応に基づいて患者の病態を判断したが、このほかにも２次抗体又は１次抗体に蛍光色素や放射性元素マーカをつけ、当該２次抗体又は１次抗体と組織標本との抗原抗体反応の結果に基づいて患者の病態を定性的に判断してもよい。
また、溶液中の血球細胞と蛍光色素によって標識された抗Ｈ抗体等とを抗原抗体反応させ、蛍光色素によって染色された細胞の数をフローサイトメーターで測定するフローサイトメトリー法によって、患者の病態を定量的に経過観察することもできる。
さらに、上記実施例で実験した症例以外にも、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、形質細胞種などの血液腫瘍患者の経過観察にも適用することができる。なお、血液腫瘍患者であっても、生れつきＨ抗原を持たないボンベイ・パラボンベイ型の患者には適応することができない。
加えて、上記実施例の結果から、Ｈ抗原の消費を抑制するよって、血液腫瘍を寛解・治癒できる可能性があり、例えば、抗Ｈ抗体によってＨ抗原をカバーすることにより、血液腫瘍の治療に役立つ可能性がある。
産業上の利用可能性
この発明は、血球細胞等と抗Ｈ抗体とを抗原抗体反応させ、反応結果を分析することによって、簡便・容易に血液腫瘍患者を経過観察し、フォローアップすることができ、また、抗癌剤治療においては、抗癌剤の種類、投与量、投与時期や有効性の判断に役立てることができる。
【国際調査報告】
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