(57)【要約】本発明の目的は、特定のアミノ酸配列を有する免疫増強活性にすぐれたペプチド、およびそのようなペプチドを含んでなる免疫増強剤を提供することである。本発明は、下記のアミノ酸配列（１）からなるペプチドを含んでなる免疫増強剤に関するものである。Ｑ１−ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ−Ｑ２                （Ｉ）［式中、ＳｅｒＰはホスホセリン残基を表し、Ｘは１〜３個の任意のアミノ酸残基を表し、かつＱ１およびＱ２は、いずれか一方もしくは両方が存在しないか、または、それぞれ独立して１個以上の任意のアミノ酸残基を表す］。
2002072629.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列（Ｉ）からなるペプチドを含んでなる、免疫増強剤：
Ｑ１−ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ−Ｑ２                  （Ｉ）
［式中、
ＳｅｒＰはホスホセリン残基を表し、
Ｘは１〜３個の任意のアミノ酸残基を表し、かつ
Ｑ１およびＱ２は、いずれか一方もしくは両方が存在しないか、または、それぞれ独立して１個以上の任意のアミノ酸残基を表す］。
【請求項２】
Ｘが１個の任意のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の免疫増強剤。
【請求項３】
ＸがＳｅｒＰまたはＬｅｕである、請求項２に記載の免疫増強剤。
【請求項４】
Ｑ１で表されるアミノ酸残基の数が０〜１２８個であり、かつ、Ｑ２で表されるアミノ酸残基の数が０〜１９２個である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫増強剤。
【請求項５】
Ｑ１で表されるアミノ酸残基の数が０〜１４個であり、かつ、Ｑ２で表されるアミノ酸残基の数が０〜８個である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫増強剤。
【請求項６】
Ｑ１およびＱ２で表されるアミノ酸残基がともに存在しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫増強剤。
【請求項７】
前記アミノ酸配列（Ｉ）が、
2002072629.tif 000021
2002072629.tif 000022
からなる群より選択される、請求項５に記載の免疫増強剤。
【請求項８】
前記アミノ酸配列（Ｉ）が、
2002072629.tif 000023
からなる群より選択される、請求項７に記載の免疫増強剤。
【請求項９】
前記アミノ酸配列（Ｉ）が、
2002072629.tif 000024
である、請求項５に記載の免疫増強剤。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列（Ｉ）が、
2002072629.tif 000025
（式中、Ｙは１個の任意のアミノ酸残基である）
である、請求項１に記載の免疫増強剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列（Ｉ）を、少なくとも２回反復した反復配列として含んでなるペプチドを含んでなる、免疫増強剤。
【請求項１２】
医薬として用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫増強剤。
【請求項１３】
薬学上許容可能な製剤用添加剤をさらに含んでなる、請求項１２に記載の免疫増強剤。
【請求項１４】
食品として用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫増強剤。
【請求項１５】
飼料として用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫増強剤。
【請求項１６】
下記のアミノ酸配列（Ｉａ）からなる、ペプチド：
Ｑ１−ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ−Ｑ２                  （Ｉａ）
［式中、
ＳｅｒＰはホスホセリン残基を表し、
Ｘは１〜３個の任意のアミノ酸残基を表し、
Ｑ１は０〜１４個の任意のアミノ酸残基を表し、
Ｑ２は０〜８個の任意のアミノ酸残基を表し、
（ただし、Ｑ１のアミノ酸残基の数が１４であって、かつＱ２のアミノ酸残基の数が８である場合を除く）］。
【請求項１７】
Ｘが１個の任意のアミノ酸残基からなる、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
ＸがＳｅｒＰまたはＬｅｕである、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
Ｑ１およびＱ２で表されるアミノ酸残基がともに存在しない、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記アミノ酸配列（Ｉａ）が、
2002072629.tif 000026
からなる群より選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記アミノ酸配列（Ｉａ）が、
2002072629.tif 000027
からなる群より選択される、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２２】
請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列（Ｉａ）を、少なくとも２回反復した反復配列として含んでなる、ペプチド。
【請求項２３】
免疫増強活性を有するものである、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２４】
請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法であって、
カゼインを用意し、
該カゼインをトリプシン処理した後、カルシウム塩とエタノールによる沈殿処理によって、ホスホペプチドを得、次いで
得られたホスホペプチドに、アミノペプチターゼ、カルボキシペプチターゼ、およびそれらの組合せからなる群より選択された酵素を作用させて、前記ペプチドを得る
ことを含んでなる、方法。
【請求項２５】
免疫力の低下したまたは免疫力の弱い患者に、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のペプチドを投与することを含んでなる、前記患者の免疫力を増強させる方法。
【請求項２６】
免疫増強剤を製造するための、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、特定のペプチドを含んでなる免疫増強剤に関するものである。
背景技術
牛乳はそれ自身栄養源であり、広く飲用されている。また、牛乳中に存在するタンパク質カゼインも、その消化性とそれより摂取される必須アミノ酸バランスが良好なことから、育児用調製乳や特殊調製乳のタンパク質源として古く利用されている。
カゼインは、一般的に、通常のタンパク質にはあまり存在しないリン酸基を有するホスホセリンというアミノ酸残基を含んでいる。カゼインを酵素で消化したものから、このホスホセリン残基を多く含む画分を分離・精製したものが、カゼインホスホペプチド（以下、「ＣＰＰ」と略すことがある）である。
ＣＰＰには、小腸で不溶化するカルシウムの可溶化状態を保ち、カルシウムの吸収を促進する作用があることが知られており、既に数々の食品または飼料原料として実用化されている。またＣＰＰには、培養細胞系または動物の消化管中で免疫グロブリンＡの産生を増強する作用があることも知られている（例えば、Ｍｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．４９（２０００），ｐｐ７３−７９、およびＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２（２０００），ｐｐ１６５−１７３）。
ＣＰＰは、カゼインを酵素で分解したものであるため、その抗原性はカゼインに比較すると低いものの、完全に消失はしてはいない。このため、牛乳カゼインに対してアレルギーのある者が、免疫増強を期待してＣＰＰを摂取すると、アレルギー反応を引き起こしてしまうことが懸念される。
またＣＰＰは、例えばＷＯ９６／２９３４０号公報に記載されている。ここでは、ＣＰＰは小腸におけるミネラル吸収を促進することが開示されているが、免疫増強活性に関しては何ら示唆されていない。
［発明の概要］
本発明者らは、今般、カゼイン由来のペプチドのうち、ホスホセリンを複数有する特定のアミノ酸配列を有するものが、優れた免疫増強作用を示すことを見出した。このようなペプチドは比較的小分子量のものであっても優れた免疫増強作用を示すものであった。本発明は、かかる知見に基づくものである。
したがって、本発明は、特定のアミノ酸配列を有し、かつ免疫増強活性にすぐれたペプチド、およびそのようなペプチドを含んでなる免疫増強剤を提供することをその目的とする。
そして、本発明による免疫増強剤は、下記のアミノ酸配列（Ｉ）からなるペプチドを含んでなる。
Ｑ１−ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ−Ｑ２          （Ｉ）
［式中、
ＳｅｒＰはホスホセリン残基を表し、
Ｘは１〜３個の任意のアミノ酸残基を表し、かつ
Ｑ１およびＱ２は、いずれか一方もしくは両方が存在しないか、または、それぞれ独立して１個以上の任意のアミノ酸残基を表す］。
また、本発明によるペプチドは、下記のアミノ酸配列（Ｉａ）からなる。
Ｑ１−ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ−Ｑ２          （Ｉａ）
［式中、
ＳｅｒＰはホスホセリン残基を表し、
Ｘは１〜３個の任意のアミノ酸残基を表し、
Ｑ１は０〜１４個の任意のアミノ酸残基を表し、
Ｑ２は０〜８個の任意のアミノ酸残基を表し、
（ただし、Ｑ１のアミノ酸残基の数が１４であって、かつＱ２のアミノ酸残基の数が８である場合を除く）］。
本発明によるアミノ酸配列（Ｉ）からなる前記ペプチドは、好ましくは免疫増強活性を有するものである。
本発明による免疫増強剤は、脾臓細胞のマイトジェン活性および免疫グロブリンの産生増強活性のような免疫賦活作用に優れたものである。また、本発明の免疫増強剤に含まれるアミノ酸配列（Ｉ）からなるペプチドは、ホスホセリンを複数含有する小分子量の免疫増強作用を有するペプチドである。これは、従来から免疫増強活性の認められていた分子量３０００〜５０００程度とされるＣＰＰとは、明らかに異なる物質である。このため、本発明のアミノ酸配列（Ｉ）からなるペプチドは、優れた免疫増強作用を有すると同時に、カゼインやＣＰＰを使用した場合に比べて引き起こされるミルクアレルギー反応が大幅に低減されるが、またはアレルギー反応を引き起こすことのないものである。すなわち、本発明による免疫増強剤は、安全性に優れたものである。
本発明による免疫増強剤は、免疫機能が弱い者に対して、免疫増強作用を賦与する食品素材または医薬品素材として有用である。例えば、本発明による免疫増強剤を乳児に与えることにより、免疫増強が期待できる。生後まもない乳児においては、母乳からの移行抗体により感染から守られている。母乳中の移行抗体は免疫グロブリンＡが主体である。このため、母乳を与えることができない母親が、乳児に本発明の免疫増強剤を与えれば、母乳を与えるのと同等の効果が期待できる。また、本発明による免疫増強剤は、抗原性のない小分子量のペプチドからなることができるので、ミルクアレルギーの幼児にも安心して与えることができる。さらに、加齢、疾病および疲労等に伴って免疫力が低下した成人においても、本発明の免疫増強剤を使用することにより、日常の健康増進を安全に図ることができる。
［発明の具体的説明］
ペプチド
本発明による免疫増強剤は、「ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ」の配列を少なくとも基本骨格として含むアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなる。したがって、本発明による免疫増強剤は、下記のアミノ酸配列（Ｉ）からなるペプチドを含んでなる。
Ｑ１−ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ−Ｑ２            （Ｉ）
［式中、
ＳｅｒＰはホスホセリン残基を表し、
Ｘは１〜３個の任意のアミノ酸残基を表し、かつ
Ｑ１およびＱ２は、いずれか一方もしくは両方が存在しないか、または、それぞれ独立して１個以上の任意のアミノ酸残基を表す］。
本発明において「免疫増強剤」とは、免疫増強活性を有する剤のことをいい、その用途が医薬に限られず、食品用、飼料用等であってもよい。
本発明において、「免疫増強活性を有する」とは、哺乳動物、特にヒトにおいて、脾臓細胞のマイトジェン活性および免疫グロブリンの産生増強活性のような免疫増強作用を増加させることができることをいい、例えば、本明細書の実施例の例１に記載の測定法と同様の条件において測定した場合に、脾臓細増殖および免疫グロブリン量増加のような指標によって免疫増強活性が有意に認められたと評価されることを意味する。
本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すなわちＤ体およびＬ体のいずれをも包含する。また、ここでいうアミノ酸には、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸のみならず、それら以外のα−アミノ酸、ならびにβ−、γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等も包含されてもよい。
本発明の好ましい態様によれば、前記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｘは１個の任意のアミノ酸残基からなる。
前記アミノ酸配列（Ｉ）におけるＸが１個の任意のアミノ酸残基からなる場合には、Ｘは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、およびＳｅｒＰからなる群から選択されるものであることが好ましく、より好ましくは、ＸはＳｅｒＰまたはＬｅｕであり、さらに好ましくは、ＸはＳｅｒＰである。
前記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｑ１が存在する場合には、Ｑ１は１個以上の任意のアミノ酸残基を表す。好ましくはＱ１におけるアミノ酸残基の数は１〜２０１個であり、より好ましくは１〜１２８個、さらに好ましくは１〜４５個、さらにより好ましくは１〜２３個、特に好ましくは１〜１４個である。
また、Ｑ２が存在する場合には、Ｑ２は１個以上の任意のアミノ酸残基を表す。好ましくは、Ｑ２におけるアミノ酸残基の数は１〜２０３個であり、より好ましくは１〜１９２個、さらに好ましくは１〜１５１個、さらにより好ましくは１〜７６個、特に好ましくは１〜３１個、最も好ましくは１〜１１個である。
本発明の一つの好ましい態様によれば、前記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｑ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１４個であって、かつＱ２で表されるアミノ酸残基の数は０〜８個である。より好ましくは、Ｑ１のアミノ酸残基数は０〜８個であって、かつＱ２のアミノ酸残基数は０〜５個である。さらに好ましくは、Ｑ１のアミノ酸残基数は０〜１個であって、かつＱ２のアミノ酸残基数は０〜２個である。
なお、本発明による免疫増強剤に用いられるペプチドにおいては、好ましくは、Ｑ１のアミノ酸残基の数が１４であって、かつＱ２のアミノ酸残基の数が８である場合は除かれる。
本発明の別の態様によれば、新規なペプチドが提供され、そのペプチドは下記の式（Ｉａ）で表されるものである。
Ｑ１−ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ−Ｑ２            （Ｉａ）
［式中、
ＳｅｒＰはホスホセリン残基を表し、
Ｘは１〜３個の任意のアミノ酸残基を表し、
Ｑ１は０〜１４個の任意のアミノ酸残基を表し、
Ｑ２は０〜８個の任意のアミノ酸残基を表し、
（ただし、Ｑ１のアミノ酸残基の数が１４であって、かつＱ２のアミノ酸残基の数が８である場合を除く）］。
この新規なペプチドは、前記した式（Ｉａ）で表されるものに包含される限りにおいて、前記したアミノ酸配列（Ｉ）からなるペプチドと同一であることができる。
本発明の別の好ましい態様によれば、前記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｑ１およびＱ２で表されるアミノ酸残基はともに存在しない。すなわち、前記アミノ酸配列（Ｉ）は「ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ」からなるオリゴペプチドであることが好ましい。このようにアミノ酸配列（Ｉ）のアミノ酸残基数が少ないものであると、抗原性が示されないので、免疫増強剤を使用した場合にアレルギー反応を引き起こさない。このため、安全性の高い免疫増強剤を得ることができる。
本発明のより好ましい態様によれば、前記アミノ酸配列（Ｉ）は、
2002072629.tif 000003
からなる群より選択され、より好ましくは、
2002072629.tif 000004
である。
本発明のさらに好ましい態様によれば、前記アミノ酸配列（Ｉ）は、
2002072629.tif 000005
からなる群より選択され、より好ましくは、
2002072629.tif 000006
である。
本発明の別の好ましい態様によれば、前記アミノ酸配列（Ｉ）は、
2002072629.tif 000007
であり、さらに好ましくは、
2002072629.tif 000008
である。
本発明のさらに別の好ましい態様によれば、前記アミノ酸配列（Ｉ）は、
2002072629.tif 000009
（式中、Ｙは１個の任意のアミノ酸残基であり、好ましくはＡｒｇまたはＣｙｓである）
であり、さらに好ましくは、
2002072629.tif 000010
である。
本発明において、ペプチドというときには、該ペプチドの誘導体も包含される。ここでペプチドの誘導体とは、前記した免疫増強活性を有するものであって、かつ、ペプチドにおける前記した基本骨格配列「ＳｅｒＰ−Ｘ−ＳｅｒＰ」以外の部分について、アミノ酸末端（Ｎ末端）のアミノ酸または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部、および／またはカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基または各種アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部、および／または、ペプチドの各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による修飾は、例えば、ペプチド中に存在する官能基の保護、安全性および組織移行性の向上、または活性の増強等を目的として行われることがある。したがって、上記した配列番号１〜１２のペプチドの誘導体も本発明に包含される。
本発明の好ましい態様によれば、本発明によるペプチドは、前記アミノ酸配列（Ｉ）を少なくとも２回反復した反復配列として含んでなる。
本発明によるペプチドにおけるアミノ酸配列（Ｉ）の反復回数は、少なくとも２回であり、好ましくは２〜７０回、より好ましくは２〜３０回、さらに好ましくは２〜１０回、さらにより好ましくは２〜４回である。前記効果をより顕著に発揮させる観点からは、その反復回数は多いほど好ましい。ただし、反復処理の煩雑によるコストの上昇、および免疫増強剤として使用する際の安全性もしくは利便性等の観点からは、前記反復回数は、好ましくは２〜１０回であり、より好ましくは２〜４回である。
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明によるペプチドが前記アミノ酸配列（Ｉ）を少なくとも２回反復した反復配列として含んでなる場合には、該ペプチドを構成するアミノ酸の数は、２２４個以下であることが好ましく、より好ましくは１００個以下、さらに好ましくは３０個以下である。
ペプチドの製造法
本発明によるペプチドは、慣用の各種合成法を利用することによって製造したものであっても、天然起源のものであってもよい。本発明によるペプチドは、そのアミノ酸配列が決定されていることから、その配列全てを合成することによって得てもよく、また、天然起源のものを一部利用してそれを基にさらに合成を行って得たものであってもよい。
本発明によるペプチドを、天然起源のものとして得る場合には、例えば下記のような手順により得ることができる。
まず、カゼインとして例えば、αＳ１−カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−カゼイン、フォスビチンのようなホスホセリンを複数含有するタンパク質を含む牛乳カゼイン、または、卵黄タンパク質を用意する。
次いで、これを慣用の条件下に所謂トリプシン処理に付して加水分解させた後、得られた上清を分離回収し、これよりカゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）を得る。このようなＣＰＰ調製法の具体例としては、下記（１）〜（３）のような方法が挙げられる：
（１）  結晶トリプシンでβ−カゼインを加水分解して、ＣＰＰを生成させ、次いでｐＨ４．７で未反応カゼインと一部の不純物を沈殿除去した後、上清部に塩化バリウムとエタノール（終濃度５０％（ｖ／ｖ））を加えてＣＰＰを沈殿として回収する方法（例えば、Ｒ．Ｆ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｗ．Ｎｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｔ．Ｌ．ＭｃＭｅｅｋｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，８０，ｐｐ９５−９９（１９５８））、
（２）  結晶トリプシンでβ−カゼインを加水分解して、ＣＰＰを生成させ、ついでトリクロロ酢酸で処理して不溶物を除去後、水酸化ナトリウムにより中和（ｐＨ５．０）し、その後、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｒ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により粗分画し、さらにイオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０ｘ２Ｒ，Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）にいったん吸着させた後、ピリジン−酢酸緩衝液（０．２規定ｐＨ２．５）で溶出させてＣＰＰを精製して得る方法（Ｈ．Ｎａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，ｐｐ１５４３−１５４５（１９７４））、および
（３）  カゼインをトリプシンにより所定の温度およびｐＨ等の条件（例えばｐＨ７．０−８．５、５０℃）下に加水分解し、ＣＰＰを生成させ、次いでｐＨ５前後で未反応カゼインと一部の不純物を沈殿除去した後、上清部にカルシウム塩もしくは酢酸カルシウムとエタノールなどの有機溶媒とを加えて、ＣＰＰを沈殿させて回収する方法（特公平２−７６１６号公報）。
次いで、上記のようにして得られたＣＰＰを、トリプシン、キモトリプシン等のエンドプロテアーゼと、アミノペプチターゼ、カルボキシペプチターゼのような種々のペプチターゼとを必要により組み合わせたものを用いて処理する。これによって、用途に応じた所望する長さを有する本発明によるペプチドを得ることができる。
したがって、本発明の別の態様によれば、前記したペプチドの製造方法であって、
カゼインを用意し、
該カゼインをトリプシン処理した後、カルシウム塩とエタノールによる沈殿処理によって、ホスホペプチドを得、次いで
得られたホスホペプチドに、アミノペプチターゼ、カルボキシペプチターゼ、およびそれらの組合せからなる群より選択された酵素を作用させて、前記ペプチドを得る
ことを含んでなる方法が提供される。
また本発明によるペプチドを、慣用の各種合成法を利用することによって得る場合は、例えば下記のような手順により得ることができる。
すなわち、本発明によるペプチドは、慣用の方法、例えばＰａｑｕｅｔ等による方法（Ａ．Ｐａｑｕｅｔ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊｏｈｎｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ，３６（２），ｐｐ９７−１０３，（１９９０））に従い、通常のペプチド合成法を応用することにより調製することができる。具体例を挙げて示すと、まずアミノ酸をｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）などで保護したホスホセリンと各種アミノ酸とをペプチド合成の常法である活性化エステル法や縮合法を用いて、段階的に鎖長を延ばすことにより、任意の位置にホスホセリン基を含有するホスホペプチドを調製することができる。この方法は液相法でも固相法であっても実施可能である。
免疫増強剤
本発明による免疫増強剤は、医薬、食品または飼料としての用途に用いることができる。
したがって、本発明の一つの好ましい態様によれば、医薬として用いられる免疫増強剤が提供される。より好ましくは、該免疫増強剤は、免疫グロブリン産生を増強するための医薬として用いられる。
本発明による免疫増強剤が医薬として用いられる場合には、免疫増強剤は、投与経路に応じて適当な剤形に調製することができる。具体的には、主として静注、筋注等の注射剤、カプセル剤、包み剤、ドロップ剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、糖衣錠、トローチ錠等の経口剤、直腸投与剤、油脂性座剤等のいずれかの製剤形態に調製することができる。また、該免疫増強剤は必要に応じて、液剤や液剤封入カプセル剤等の形であってもよい。
これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等の薬学上許容可能な製剤用添加剤をさらに用いて常法により製造することができる。すなわち、本発明による免疫増強剤は、薬学上許容可能な製剤用添加剤をさらに含んでなることができる。
使用可能な製剤用添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム等が挙げられる。
本発明による免疫増強剤が医薬として用いられる場合には、免疫増強剤の投与形態は、経口投与、非経口投与、吸入、経直腸投与、局所投与などの各種形態を採用することができる。このうち、非経口投与には、皮下注射、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与または注入などが含まれる。従って、例えば鼻、口腔、舌下、直腸等の粘膜投与あるいは経皮投与、埋め込み剤による投与であってもよい。したがって、このようないずれかの投与経路により、本発明による免疫増強剤を、ヒトおよびヒト以外の動物からなる群より選択される患者に投与することができる。
投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度等を考慮して適宜決定されるが、免疫増強剤における前記ペプチド量換算で、通常成人１日１人当たり約１０〜１０００ｍｇ、好ましくは５０〜５００ｍｇの投与量であり、これを１日１回または数回にわけて投与することができる。
このように医薬の形態で提供される本発明による免疫増強剤は、種々の感染症の治療または予防や、アレルギー性の疾患や自己免疫疾患のような疾患の治療等において有利に使用することができる。
すなわち、乳汁中に分泌される免疫グロブリンである分泌型ＩｇＡは、強力な病原性をもつ微生物の腸管粘膜への結合阻害および細菌毒素と特異的に結合してその作用を不活化すること、および、アレルゲンとして作用する食餌性の抗原と結合し消化管壁を通過することを防止してアレルギー反応を抑制すること等が知られている。一方で、分泌型ＩｇＡのない育児粉乳で育てられた人工栄養児およびＩｇＡ欠損症の患者では、食餌性抗原に対するＩｇＧ抗体が高頻度に出現し、アレルギー性の疾患や自己免疫疾患の発現頻度が高いことが知られている。本発明の免疫増強剤によれば、感染防御やアレルギー反応の抑制効果を有するＩｇＡの体内での誘導を促進することができるので、生体の免疫能を増強させることができる。
本発明による免疫増強剤が食品として用いられる場合には、免疫増強剤は、ガム、ビスケット、チョコレート、キャンディ、ゼリー、錠菓、粉乳、および飲料などの形で提供されてもよい。
このように本発明による免疫増強剤が食品形態で提供されることは、体力的に劣る幼年者や老年者、病後の患者等の栄養補給や健康増進、さらには、アレルギー性疾患のような疾患を有する患者の健康増進等を図る上で有効である。
本発明による免疫増強剤が飼料として用いられる場合には、免疫増強剤は、乳牛用飼料、養豚用飼料、養鶏用飼料等の家畜用飼料、ペットフード、各種配合飼料などの形で提供されてもよい。
このとき給与量は、家畜動物の種類、年齢、体重、性別、給餌する環境等を考慮して適宜決定されるが、飼料としての免疫増強剤成分が、給与する飼料全量に対して０．０１〜１重量％含まれることが好ましく、より好ましくは０．０５〜０．５重量％含まれる。これを一定期間、好ましくは３週間以上、より好ましくは５週間程度継続して子ブタのような家畜動物に給与することが好ましい。
飼料形態で提供される本発明による免疫増強剤は、家畜動物の免疫能を簡便に増強することができるものであり、したがって、例えば、牧場等における牛のような家畜動物の感染症やアレルギー性疾患等の治療および予防を図ることができる。
また本発明による免疫増強剤を飼料として利用することにより、ＣＰＰを用いる飼料に比べて、その使用量を少なくし、他の飼料成分の比率を高めることができる。
本発明の別の態様によれば、免疫力の低下したまたは免疫力の弱い患者に、本発明によるペプチドを投与することを含んでなる、前記患者の免疫力を増強させる方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、免疫増強剤を製造するための本発明によるペプチドの使用が提供される。
［実    施    例］
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
例１
ペプチドの調製：
β−カゼイン１−２８域の活性中心の同定を検討するため、以下の実験を行なった。
β−カゼイン（純度９０％以上）（シグマ社より入手可能）を、濃度１５％（ｗ／ｗ）とし、これにトリプシン（Ｎｏｖｏ社製）を加えて、ｐＨ７．０、６０℃の条件下において、２時間反応させた。その後、ｐＨ４．５に調整して不純物を沈殿として除去した。得られた上清に、カルシウムを対液１．１％、およびエタノールを終濃度５０％（ｖ／ｖ）添加し、沈殿としてカゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）を得た。これは、下記に示したペプチド（８）のような１−２８域からなるホスホペプチドであった。
得られた前記ホスホペプチドのアミノ酸配列に基づいて、その部分構造に相当する下記ペプチド（３）〜（７）のような５種類の合成ホスホペプチドを合成した。これらのホスホペプチドは、Ｆｍｏｃアミノ酸を用いた固相合成法により行った。具体的には、これらの合成は、樹脂に側鎖を保護したα−アミノ酸を順次結合させることにより合成した。このときαアミノ酸保護基には、強塩基で除去できるＦｍｏｃ基（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を用い、この保護基を取り除いた後、結合剤を用いて次のアミノ酸を結合させた。このようにして得られたペプチドを、強酸によって樹脂から切断し、同時に側鎖の保護基を除去し、その後、得られた粗ペプチドをＨＰＬＣにより精製して目的の合成ペプチドを得た。
なお、ペプチド（７）は株式会社バイオロジカ社製に、またペプチド（３）〜（６）は株式会社ベックス社製に、それぞれ合成を委託して入手した。これらは、それぞれ純度８０％であり、ペプチド量は１０ｍｇであった。
前記した合成ペプチド（３）〜（７）の他に、さらに、ホスホセリンのみからなるもの（ペプチド（２））と、アミノ酸またはペブチドを無添加とするコントロール（ペプチド（１））と、１〜２８域からなるカゼインホスホペプチド（ペプチド（８））とを用意した。
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評価試験１：
以上で得られたペプチド（１）〜（８）を、下記のような評価試験に付して、各ペプチドの免疫増強能を評価した。
試験で使用したマウス脾臓細胞は、６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ系雄マウスから無菌的に採取した。これを、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとを含むＣｅｌｇｒｏｓｓｅｒ−Ｐ培地において培養した。
マイクロプレート中で５×１０６個の脾臓細胞に対して、前記したサンプルである各ペプチドをそれぞれ２ｎＭの濃度になるように添加し、さらに、０．５μｇのコンカナバリン（ＣｏｎＡ）、５μｇのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、または５０μｇのリポ多糖（ＬＰＳ）のいずれかを、それぞれに加えて、それらを、３７℃、５％の炭酸ガス下において培養した。
試験１Ａ：  細胞の増殖活性
細胞の増殖活性は、４８時間後の細胞数で評価した。
培養終了後、免疫細胞の増殖は、色素ＭＴＴ法（Ｍｏｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，６５（１９８３），ｐｐ５５−６３）により測定し、フォルマゾンの生成は、５７０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｏｄｅｌ  ４５０）で測定することにより求めた。
なお、効果の有意差の判定は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた。
結果は、図１に示されるとおりであった。
試験１Ｂ：  免疫グロブリン産生
免疫グロブリンの産生は、７２〜１２０時間の培養で測定した。
免疫グロブリンＡの量は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．，２４（１９９０），ｐｐ２６７−２８３）により測定した。すなわち、ブタの抗マウス免疫グロブリンＡをコートしたプレートに細胞培養液を添加し、洗浄後、西洋ワサビパーオキシダーゼを標識した羊の抗マウス免疫グロブリンＡ抗体を反応させることにより求めた。
結果は、図２に示されるとおりであった。
例２
ペプチドの調製：
例１と同様にして下記のような合成ペプチドを得た。ここでペプチド（１１）が本発明に関するものである。
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なお、ペプチド（９）〜（１１）は株式会社ベックス社製にそれぞれ合成を委託して入手した。これらは、それぞれ純度８０％で、ペプチド量は１０ｍｇであった。
また、これら合成ペプチド（９）〜（１１）の他に、アミノ酸またはペプチドを無添加とするコントロール（ペプチド（１））と、１〜２８域からなるカゼインホスホペプチド（ペプチド（８））とを用意した。
評価試験２：
以上で得られたペプチド（９）〜（１１）、およびペプチド（１）および（８）を、下記のような評価試験に付して、各ペプチドの免疫増強能を評価した。
試験で使用したマウス脾臓細胞は、上記例１と同様にして、用意し培養を行った。
試験２Ａ：  細胞の増殖活性
マウスにおける脾臓細胞の増殖促進活性について、上記例１と同様にして評価した。
細胞の増殖数は、上記例１と同様に、５７０ｎｍの吸光度によるＭＴＴ値により求めた。
結果は、図３に示されるとおりであった。
試験２Ｂ：  免疫グロブリン産生
免疫グロブリンの産生は７２〜１２０時間の培養で測定した。
免疫グロブリンの量は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７４（１９９０）．ｐｐ３２３−３２９）により測定した。すなわち、ヤギの抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡまたはＩｇＡ）をコートしたプレートに細胞培養液を添加し、洗浄後、西洋ワサビパーオキシダーゼを標識したヤギの抗マウス免疫グロブリン抗体（ＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ）または同様の羊の抗マウス免疫グロブリン抗体Ａを反応させることにより求めた。
結果は、図４および図５に示されるとおりであった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例の例１において、（１）〜（８）のペプチドおよびコントロールについて、マウスの脾臓細胞の増殖活性へ及ぼす影響を調べた結果を示す。この図において、（１）〜（８）は例１におけるペプチド（１）〜（８）をそれぞれ表す。また図中、上付きの＊印はコントロールに対する統計学的有意差を表し、それぞれ、上付きの＊＊はＰ＜０．０１、上付きの＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
図２は、実施例の例１において、（１）〜（８）のペプチドおよびコントロールが、マウス脾臓細胞培養系での免疫グロブリＡン産生に及ぼす影響を調べた結果を示す。この図において、（１）〜（８）は例１におけるペプチド（１）〜（８）をそれぞれ表す。また図中、上付きの＊印はコントロールに対する統計学的有意差を表し、それぞれ、上付きの＊はＰ＜０．０５、上付きの＊＊はＰ＜０．０１、および上付きの＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
図３は、実施例の例１において、（８）〜（１１）のペプチドおよび（１）のコントロールについて、マウスの脾臓細胞の増殖活性へ及ぼす影響を調べた結果を示す。この図において、（１）と（８）は例１におけるペプチド（１）および（８）をそれぞれ表し、（９）〜（１１）は例２におけるペプチド（９）〜（１１）をそれぞれ表す。また図中、上付きの＊印はコントロールに対する統計学的有意差を表し、上付きの＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
図４は、実施例の例２において、（８）〜（１１）のペプチドおよび（１）のコントロールが、マウス脾臓細胞培養系での免疫グロブリン（ＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ）産生に及ぼす影響を調べた結果を示す。この図において、（１）と（８）は例１におけるペプチド（１）および（８）をそれぞれ表し、（９）〜（１１）は例２におけるペプチド（９）〜（１１）をそれぞれ表す。また図中、上付きの＊印はコントロールに対する統計学的有意差を表し、それぞれ、上付きの＊はＰ＜０．０５、上付きの＊＊はＰ＜０．０１、および上付きの＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
図５は、実施例の例２において、（８）〜（１１）のペプチドおよび（１）のコントロールが、マウス脾臓細胞培養系での免疫グロブリンＡ産生に及ぼす影響を調べた結果を示す。この図において、（１）と（８）は例１におけるペプチド（１）と（８）をそれぞれ表し、（９）〜（１１）は例２におけるペプチド（９）〜（１１）をそれぞれ表す。また図中、上付きの＊印はコントロールに対する統計学的有意差を表し、それぞれ、上付きの＊はＰ＜０．０５、上付きの＊＊はＰ＜０．０１、および上付きの＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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