(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
副甲状腺ホルモン受容体遺伝子の第１イントロン部分を増幅して得られたDNA 断片を制限酵素 Van91 I で処理することにより、副甲状腺ホルモン受容体の遺伝子多型を判定することを特徴とする、副甲状腺ホルモンの反応性を予測するために副甲状腺ホルモン受容体の遺伝子多型を分析する方法。
【請求項２】
増幅を配列番号１に記載の塩基配列を有するプライマーおよび配列番号２に記載の塩基配列を有するプライマーを用いて行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
副甲状腺ホルモン受容体遺伝子の多型性測定に用いるための、配列番号１に記載の塩基配列を有するプライマーおよび配列番号２に記載の塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット。
【請求項４】
請求項３記載のプライマーセットおよび制限酵素 Van91 I を含む、副甲状腺ホルモンの反応性予測用キット。
【請求項５】
副甲状腺ホルモン受容体遺伝子の第１イントロン部分を増幅して得られたDNA 断片を制限酵素 Van91 I で処理することにより、副甲状腺ホルモン受容体の遺伝子多型を判定することを特徴とする、血液透析患者の二次性副甲状腺機能亢進症の重症化を予測するために副甲状腺ホルモン受容体の遺伝子多型を分析する方法。
【請求項６】
副甲状腺ホルモン受容体遺伝子の第１イントロン部分を増幅して得られたDNA 断片を制限酵素 Van91 I で処理することにより、副甲状腺ホルモン受容体の遺伝子多型を判定することを特徴とする、退行期骨粗鬆症の治療において投与する副甲状腺ホルモンの反応性を予測するために副甲状腺ホルモン受容体の遺伝子多型を分析する方法。
【請求項７】
増幅を配列番号１に記載の塩基配列を有するプライマーおよび配列番号２に記載の塩基配列を有するプライマーを用いて行う、請求項５記載の方法。
【請求項８】
増幅を配列番号１に記載の塩基配列を有するプライマーおよび配列番号２に記載の塩基配列を有するプライマーを用いて行う、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、副甲状腺ホルモンの反応性の予測方法に関し、この方法で得られた結果は、血液透析患者における二次性副甲状腺機能亢進症の重症度の予測や原発性副甲状腺機能亢進症の重症度の予測、さらに退行期骨粗鬆症の治療における副甲状腺ホルモン投与の効果の予測に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
副甲状腺ホルモン（以下、PTH と称することがある）は副甲状腺で産生・分泌されるポリペプチドホルモンであり、主要な作用は細胞外液のカルシウム濃度を一定に保つことである。PTH は骨吸収を促進し、腎のカルシウム再吸収を促進することなどにより血中カルシウム濃度を上昇させ、一方、尿中へのリン酸の排泄を促進して血中リン濃度を低下させる。血中カルシウム濃度の低下はPTH の分泌を促進し、逆にカルシウム上昇によりPTH の分泌は抑制される。
【０００３】
PTH の分泌が過剰となる副甲状腺機能亢進症には原発性と二次性（続発性）があり、原発性は副甲状腺の腫大等によりPTH が過剰に分泌されることによりカルシウムの代謝異常をきたし、高カルシウム血症、低リン酸血症、線維性骨炎、腎結石、高血圧などの症状を引き起こす。二次性は、腎機能低下や活性型ビタミンＤの欠乏、骨のPTH に対する反応低下などによる、血清カルシウム値が長期間低い病態で発症しPTH の分泌が増加する。このPTH の過剰分泌は血清カルシウム値が正常あるいは高くなっても持続して、副甲状腺機能亢進症が重症化する場合がある。例えば、慢性腎不全により血液透析を行っている患者においては、二次性副甲状腺機能亢進症が重症化しやすい傾向が認められるが、これを規定している重要な因子の一つがPTH に対する抵抗性の進展である。そして、この抵抗性はPTH に対する反応性と関連すると考えられる。二次性副甲状腺機能亢進症の治療は活性型ビタミンＤ3 の投与により行う。
【０００４】
血液透析患者における二次性副甲状腺機能亢進症の重症度は、患者間の固体差が大きいことから、遺伝的要因に関心が寄せられている。これまで、遺伝的要因に関する検討としては、Y. TsukamotoらがNature Med. vol.2, 1996, pp1162 において、日本人におけるビタミンＤ受容体 (VDR)遺伝子の制限酵素 BsmＩによる多型と、血液透析患者の血清PTH 濃度との関係を調べた報告がある。VDR 遺伝子多型は二次性副甲状腺機能亢進症の発症およびビタミンＤ治療による反応性と関連する。また、原発性副甲状腺機能亢進症における重症化においても、同様の遺伝的要因が関与すると考えられる場合がある。
【０００５】
これらの副甲状腺機能亢進症の発症機序については、PTH に対する反応性の遺伝的な差異がより強い決定因子であると考えられてきたが、これまでPTH の反応性を予測するための遺伝子多型を検討する方法論が得られなかった。
【０００６】
これまで、副甲状腺ホルモン受容体遺伝子の多型については、Frank G. Hustmyer らがHuman Mol. Genet. vol.2, pp1330 で BsmＩ多型について、E. Schipani らがHumnan Mol. Genet. vol.3, pp1210でexon M7 における多型を報告しているが、PTH 反応性との関連は全く報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、副甲状腺機能亢進症の重症化に関連すると考えられるPTH 反応性を遺伝子多型により予測する方法は見出されておらず、重症化の予測は困難であった。例えば、血液透析患者において認められる二次性副甲状腺機能亢進症の重症化の傾向を予測できれば、適切な治療方法を選択して重症化を予防することができ、また、原発性副甲状腺機能亢進症に伴う各症候、例えば高カルシウム血症、骨病変、尿路結石等の重症度を予測して、それにより、副甲状腺摘出術の適用の有無とその施行の緊急度を決定することができる。さらに、PTH 反応性の予測は、退行期骨粗鬆症の治療においてPTH 投与の効果を予測するのに有用である。
従って、本発明の目的は、PTH 反応性を遺伝子多型の測定により予測する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、副甲状腺ホルモン受容体遺伝子多型が副甲状腺機能亢進症の重症度に与える影響、およびこの遺伝子多型とPTH 反応性との良好な相関関係を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、副甲状腺ホルモン受容体の遺伝子多型を測定することにより副甲状腺ホルモンの反応性を予測する方法を提供する。
【０００９】
上記遺伝子多型の測定は制限酵素による切断の有無で行うことができる。好適態様としては、遺伝子多型の測定を、副甲状腺ホルモン受容体遺伝子の第１イントロン部分を増幅して得られたDNA 断片を、制限酵素 Van91Ｉで処理することにより行う方法が挙げられる。増幅は配列番号１に記載の塩基配列を有するプライマーおよび配列番号２に記載の塩基配列を有するプライマーを用いて行うのが好ましい。
【００１０】
また、本発明は、副甲状腺ホルモン受容体遺伝子の多型性測定のための、配列番号１に記載の塩基配列を有するプライマーおよび配列番号２に記載の塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット、さらにこのプライマーセットおよび制限酵素 Van91Ｉを含む、副甲状腺ホルモンの反応性予測用キットにも関する。
【００１１】
さらに本発明は、上記の副甲状腺ホルモン反応性予測方法により、血液透析患者の二次性副甲状腺機能亢進症の重症度を予測する方法、および原発性副甲状腺機能亢進症の病態の重症度を予測する方法にも関する。また、上記方法により、退行期骨粗鬆症の治療において投与する副甲状腺ホルモンの反応性を予測する方法にも関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
副甲状腺ホルモンは、骨や腎尿細管の細胞膜上のPTH 受容体（PTHR）に結合することによりそのホルモン作用を発揮させる。本発明者等は、PTH 反応性がPTHR遺伝子に規定されることを見出し、従って、PTH 反応性の違いは受容体の反応性の違いによるものと推測される。
【００１３】
PTH 反応性の測定はエルスワース・ハワード（Ellsworth-Howard) 試験により行うことができる。この試験の原理は、PTH が腎尿細管の細胞膜上のPTH 受容体に作用し、アデニル酸シクラーゼを活性化して細胞内cAMPを増加させ、PKA 経路を介してホルモン作用を発揮させることから、PTH 投与前後の尿中cAMP濃度の差がPTH 反応性の指標となる。すなわち、cAMPの差が大きいことがPTH 高反応性であることを意味する。
遺伝子型を決定するための生体試料としては特に限定されないが、採取の容易さから血球成分が好ましい。また、生体組織も使用できる。
【００１４】
副甲状腺ホルモン受容体の遺伝子多型の測定は、PTHR遺伝子の一定領域を増幅し、増幅DNA 断片を特定の制限酵素で処理し、切断のパターンにより遺伝子型を決定することにより行うことができる。PTHR遺伝子は第３染色体上にあり、その塩基配列は既知である。既知の塩基配列のデータから、増幅しようとする領域に合わせてプライマーを設計する。本発明においては、例えばPTHR遺伝子第１イントロン領域を増幅する。そのためのプライマー対は以下の実施例に示すプライマーＡおよびＢが好ましく、このプライマー対で約10kbの増幅DNA が得られる。遺伝子増幅にはポリメラーゼチェインリアクション法 (PCR 法) 等が利用でき、増幅の操作は常法によればよい。
【００１５】
増幅したDNA 断片において遺伝子多型をみるために使用する制限酵素としては、例えば Van91Ｉが例示できる。第１イントロン領域を増幅して得られたDNA 断片をこの制限酵素を用いて切断処理し、電気泳動等の適宜方法でDNA 断片を分離、検出する。例えば、アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドによる染色を行った後、UV照射によりあらわれるバンドから切断のパターンを観察する。
【００１６】
プライマーＡおよびＢを用いて増幅したDNA 断片を Van91Ｉで処理した場合、切断されない対立遺伝子をＶ、切断される対立遺伝子をｖとするとこれらの組み合わせで決定される遺伝子型はVV、Vvおよびvvとなる。ヒトにPTH を投与した場合のPTH 反応性の指標となるcAMPの濃度差から、これらの遺伝子型とPTH 反応性との関係を調べることができる。
【００１７】
また、血液透析患者において血清中のintact PTH値はVV型およびVv型がvv型に比べ有意に高いことを見出した。すなわち、VV型およびVv型である血液透析患者では二次性副甲状腺機能亢進症が重症化しやすい。
【００１８】
このようにPTHR遺伝子多型の測定により PTH反応性を予測することができ、また、血液透析患者における二次性副甲状腺機能亢進症の重症度を予測することができる。それにより、血液透析導入初期から適切な治療方法を選択することが可能となる。例えば、長期透析患者では保存期における活性型ビタミンD3剤の投与量が治療効果を規定するので、二次性副甲状腺機能亢進症の重症度を予測することは有利である。また、二次性のものだけでなく、原発性副甲状腺機能亢進症の重症度なども予測することができる。さらに、このPTH 反応性の予測は、退行期骨粗鬆症の治療においても投与するPTH の効果を予測でき、適切な治療方法を選択する上で有用である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例において用いる、遺伝子多型の測定のためのDNA 抽出操作、DNA 増幅操作、制限酵素切断処理、電気泳動操作および遺伝子型判定方法は以下の通りである。
【００２０】
(1) DNA 抽出操作
ゲノムDNA の抽出はDNA 抽出キットMag Extractor-Genome-(TOYOBO) を用いてその説明書に沿って以下のように行う。
【００２１】
1.全血 100μｌ(2Na-EDTA 抗凝固剤使用) を1.5 ml容のマイクロ遠心管に入れる。
2.溶解・吸着液を 750μｌ加えて、ミキサーで数回混合させる。
3.シリカコート磁性粒子を40μｌ加えて、ミキサーで10分間混合させる。
4.マグネットスタンドで粒子を分離させた後、上清を除く。
5.洗浄液を 900μｌ加えて、ミキサーで10秒間混合させる。
6.マグネットスタンドで粒子を分離させた後、上清を除く。
7.ステップ５〜７を１回繰り返す。
8.70％エタノールを 900μｌ加えて、ミキサーで10秒間混合させる。
9.マグネットスタンドで粒子を分離させた後、上清を除く。
10. ステップ８〜９を１回繰り返す。
11. 遠心 (5,000g、10秒、室温) した後、上清を取り除く。
12. 滅菌蒸留水を 100μｌ加えて、ミキサーで10分間混合させる。
13. マグネットスタンドで粒子を分離させた後、上清を新しい 1.5ml容マイクロ遠心管に入れる。
【００２２】
(2) DNA 増幅操作
Long PCR法
反応液組成：5 mM MgCl2、25mM TAPS (pH9.3, 25℃) 、50mM KCl、1 mM 2- メルカプトエタノール、0.35mM dNTPs、0.2 μM フォワードプライマー、0.2 μM リバースプライマー、0.2 μｇ/ml ゲノムDNA 、２ユニットLA TaqDNA ポリメラーゼ、全容量50μｌ
反応サイクル：98℃、20秒；70℃、12分を１サイクルとし、33サイクル実施
増幅用プライマーは下記の塩基配列を有する。
【００２３】
プライマーＡ (フォワードプライマー) ：
5'-GGAGTAGGTCTAAGGCACGCAGTC-3' (配列番号１）
プライマーＢ（リバースプライマー）：
5'-TCAGACCACAGGCAGGACTTTCCGG-3'  (配列番号２）
(3) 制限酵素切断処理
Van91Ｉ用反応液組成：20mM  トリス-HCl(pH8.5) 、10mM MgCl2、１mM DTT、100 mM KCl
Van91Ｉを４ユニット／20μｌ反応液の濃度で加え、37℃で３時間インキュベーションを行う。
【００２４】
(4) 電気泳動操作
電気泳動緩衝液：１×TAE (50 ×TAE は１リットル中、Trisベース 242ｇ、57.1ml氷酢酸、EDTA 50 mM含有、pH8.0)
上記緩衝液を用い、0.8 ％アガロースゲル (AGAROSE Type l、SIGMA)を使用して、電圧100Vで30分間泳動する。その後、5 μｇ/ml エチジウムブロマイド溶液で５分間染色を行い、染色後、蒸留水で５分間脱染色を行う。その後UVランプでDNA のバンドを観察する。
【００２５】
(5) 遺伝子型判定
プライマーＡおよびＢを用いて増幅処理し、得られたDNA 断片を Van91Ｉで処理した場合、電気泳動によりあらわれるバンドが、約3.5kb (3.4kbと3.5kb のバンドが重なって検出) と約2.5kb であれば遺伝子型VVと判定し、約3.4kb 、約3.3kb および約2.5kb であれば遺伝子型vv、約3.5kb (3.4kbと3.5kb のバンドが重なって検出) 、約3.3kb および約2.5kb であれば遺伝子型Vvと判定する（図１）。
【００２６】
【実施例１】
無作為に選んだ日本人の血液透析患者712 名と健常人106 名について、上記操作に従ってV-v 型による遺伝子型を判定した。各遺伝子型の出現頻度は表１に示す通りであり、VV型およびVv型の出現頻度は約25％である。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
上記で遺伝子型を判定した健常人の中から17名 (Vv型およびvv型) について、遺伝子型とPTH 反応性との関係を調べた。PTH 反応性は、Ellsworth-Howard試験により尿中のcAMP量変化を測定することにより判定する。
【００２９】
Ellsworth-Howard試験
試験開始時に、排尿、飲水200 mlを行う。その一時間後に飲水200 ml、さらに１時間後に飲水200 mlを行う。次いで採尿（量測定）、採血５mlを行い、PTH 100 単位静注 (ヒトPTH 注 (旭化成) 、酢酸テリパラチド100 単位) する。15分後に５ml採血し、さらに45分後に飲水200 ml、その１時間後に採尿 (量測定) を行う。PTH 注前後の尿と血清を用い、尿についてはcAMP、クレアチニン、カルシウム、無機リン、血清についてはカルシウムイオン、クレアチニン、カルシウム、無機リンの測定を行う。cAMP量の測定はラジオイムノアッセイ- デキストラン被覆チャコール法を用いて行う。ここで、ΔcAMPが大きいことはPTH 高反応性であること示す。
【００３０】
尿中のΔcAMPに関する測定結果を遺伝子型別に示す (図２）。
図２から明らかなように、Vv型がvv型に比べ有意にPTH 反応性が上昇している。また、上述したようにVV型およびVv型の出現頻度は約25％である。従って、PTHR遺伝子の多型性の分析によりPTH 反応性を予測することができる。
【００３１】
【実施例２】
血液透析患者661 例において、上記方法により制限酵素 Van91Ｉを用いてPTHR遺伝子多型を測定した。また、それぞれの患者において血清中のPTH 濃度を測定した。
【００３２】
結果は、血清中完全PTH 値は、vv型 (n ＝494)で129 ±162pg/ml、Vv型 (n ＝146)で167 ±200pg/ml、VV型 (n ＝21) で136 ±175pg/mlであった。Fisher分散分析によりvv型とVv型で有意な差を認め (p ＜0.05) 、また、vv型と(Vv ＋VV) 型でMann-Whitney検定をした結果も有意差をみた。従って、PTHR遺伝子多型が二次副甲状腺機能亢進症の重症度に強い影響を与えていることが明らかである。
以上の実施例１および２の結果より、PTHR遺伝子に遺伝子多型が存在し、この多型性がPTH 反応性および副甲状腺機能亢進症の重症度と関連することが分かる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明方法によれば、副甲状腺ホルモン受容体遺伝子多型を分析することにより、PTH 反応性を予測することができる。また、この多型性の分析により、二次性副甲状腺機能亢進症や原発性副甲状腺機能亢進症の重症化を予測し、適切な治療方法を選択して、その重症化を予防できる。またPTH 反応性の予測を、老人性骨粗鬆症の治療において投与するPTH の効果の予測に用いて、適切な治療方法を選択することが可能となる。
【００３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  PTHR遺伝子の制限酵素 Van91Ｉによる切断のパターンを示す図である。
【図２】遺伝子型別の、PTH 反応性の指標であるΔcAMP値を示す図である。
【図１】
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【図２】
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