(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１以上の変異を有する塩基配列を含み、5'末端がリン酸化された１又は２以上のプライマーを環状鋳型ＤＮＡにアニーリングさせ、その後、耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行い、反応後、耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いてリン酸化された5'末端と伸長末端とを連結することにより、上記プライマーを含む環状ＤＮＡを合成するＤＮＡ合成工程と、
上記ＤＮＡ合成工程を複数回繰り返して上記プライマーを含むＤＮＡを増幅した後、メチル化及びヘミメチル化された塩基配列を選択的に切断する制限酵素を用いて少なくとも増幅された環状ＤＮＡを除くＤＮＡを複数の断片に消化する消化工程と、
上記消化工程で得られた複数の断片をメガプライマーとして、該メガプライマーを上記ＤＮＡ合成工程で合成された上記環状ＤＮＡにアニーリングさせ、その後、上記耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う２本鎖ＤＮＡ合成工程とを備える突然変異導入方法。
【請求項２】
上記ＤＮＡ合成工程では、上記プライマーを複数用いることによって、複数の部位に同時に突然変異を導入する請求項１記載の突然変異導入方法。
【請求項３】
上記ＤＮＡ合成工程では、上記プライマーを縮重プライマーとすることによって、塩基配列の所定の部位にランダムな突然変異を導入する請求項１又は２記載の突然変異導入方法。
【請求項４】
上記２本鎖ＤＮＡ合成工程の際に、変異を導入した塩基配列に近接した領域に相補的な塩基配列を有する補助的プライマーを加えることを特徴とする請求項１乃至３いずれか１項に記載の突然変異導入方法。
【請求項５】
上記補助的プライマーがT7プライマーであることを特徴とする請求項４記載の突然変異導入方法。
【請求項６】
上記消化工程では、DpnIを用いることを特徴とする請求項１記載の突然変異導入方法。
【請求項７】
上記ＤＮＡ合成工程で使用した耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は耐熱性ＤＮＡリガーゼを、上記２本鎖ＤＮＡ合成工程で使用することを特徴とする請求項１記載の突然変異導入方法。
【請求項８】
上記ＤＮＡ合成工程では、少なくとも、上記プライマー、上記環状鋳型ＤＮＡ、上記耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ及び耐熱性ＤＮＡリガーゼを含む反応溶液中で全工程を完了することを特徴とする請求項１記載の突然変異導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、塩基配列の所定の部位に所定の変異を導入する際、或いは、塩基配列の所定の部位にランダムな変異を導入する際に適用される、全く新規な突然変異導入方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
部位特異的突然変異導入方法は、例えば、タンパク質の構造と機能における特定のアミノ酸残基の重要性を評価するための突然変異体を作製する上で、強力なツールとして使用されている。この部位特異的突然変異導入方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)を用いた様々なプロトコールが確立されている。
【０００３】
PCR法に基づくプロトコールのうち、Quik ChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA, USA)（以下、Quik Change法と呼ぶ。）は広く用いられている。Quik Change法のプロトコールによれば、以下の３工程を経ることによって突然変異を有するＤＮＡを得ることができる。
１）．所望の部位に突然変異を有するように設計された相補的な一対のプライマーを用いてPCR法を行う工程。
２）．反応液中の鋳型ＤＮＡ（変異を有さない）のみを消化する工程。
３）．上記工程で消化されなかったＤＮＡ断片を用いて形質転換する工程。
【０００４】
特に、Quik Change法では、PCR法を行う工程において、鋳型ＤＮＡとしてスーパーコイルの二本鎖(ds)DNAプラスミドを用い、また、酵素として高忠実性(high-fidelity)のPfu TurboTM DNAポリメラーゼを用いる。PCR法を行う工程では、相補的な一対のプライマーをdsＤＮＡにアニーリングさせた後に伸長反応を行い、変異を有するとともに伸長末端とプライマーの５'末端との間にニック（切れ目）が入ったＤＮＡ断片を増幅する。
【０００５】
次いで、Quik Change法では、反応溶液にDpnIエンドヌクレアーゼを作用させることによって、完全メチル化またはヘミメチル化された5'-GATC-3'配列を特異的に切断する。次に、所望の突然変異を含むin vitroで合成されニックを有するプラスミドDNAは、大腸菌(E.coli)中へ形質転換される。これにより、ニックを有するプラスミドＤＮＡは、大腸菌内で修復されて環状となる。
【０００６】
このように、Quik Change法によれば、所望の部位に突然変異を有するＤＮＡを合成することができる。しかしながら、Quik Change法は、以下の問題を有している。
１）．塩基配列における比較的離れた位置に、複数の変異を同時に導入することができない。すなわち、この方法では、相補的な一対のプライマー内においてのみ複数の変異を導入することができるが、離れた位置に複数の変異を導入することは不可能である
２）．突然変異を導入する際に、相補的な一対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。すなわち、この方法では、１カ所の変異を導入するために２本のプライマーを要する。
３）．相補的な一対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを必要とするため、縮重プライマーを用いて所望の部位にランダムに突然変異を導入することができない。
【０００７】
Quik Change法では、上記１）の問題があるため、複数の部位に突然変異を導入する際に上述した３工程を変異導入する数に相当する回数繰り返す必要がある。このため、Quik Change法によれば、複数の部位に突然変異を導入する場合に長時間を要し、効率が悪いといった不都合がある。また、Quik Change法では、上記２）の問題があるため、一対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成或いは購入するためのコストがかかり、コスト高となってしまう。さらに、Quik Change法では、上記３）の問題があるため、例えば、解析対象のタンパク質における所定のアミノ酸残基を様々な他のアミノ酸に変異させるような実験系にには使用することができず、適用可能な実験系が限られてしまう。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上述したような従来の問題に鑑み、簡易に、迅速に、低コストに且つ広範囲に亘って応用可能な、全く新規な突然変異導入方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成した本発明に係る突然変異導入方法は、少なくとも１以上の変異を有する塩基配列を含み、5'末端がリン酸化された１又は２以上のプライマーを鋳型ＤＮＡにアニーリングさせ、その後、耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行い、反応後、耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いてリン酸化された5'末端と伸長末端とを連結することにより、上記プライマーを含む環状ＤＮＡを合成するＤＮＡ合成工程と、上記ＤＮＡ合成工程を複数回繰り返して上記プライマーを含むＤＮＡを増幅した後、少なくとも増幅された環状ＤＮＡを除くＤＮＡを複数の断片に消化する消化工程と、上記消化工程で得られた複数の断片をメガプライマーとして、該メガプライマーを上記ＤＮＡ合成工程で合成された上記環状ＤＮＡにアニーリングさせ、その後、上記耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う２本鎖ＤＮＡ合成工程とを備える。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る突然変異導入方法について、図面を参照して詳細に説明する。以下の例では、エクオレア(Aequorea)属が産生する緑色蛍光タンパク質（GFP）を改変した増強緑色蛍光タンパク質(以下、EGFPと呼ぶ。)をコードする遺伝子に対して、所定の部位に突然変異を導入する方法について説明する。なお、本発明に係る突然変異導入方法は、当該遺伝子に対して突然変異を導入する際に限定されず、いかなる遺伝子に対しても適用される方法である。
【００１１】
ここで、このEGFPをコードする遺伝子（配列番号１）は、GFPをコードする遺伝子（配列番号３）と比較してコドン使用頻度を変更し、また、GFPにおける１番目のメチオニンと２番目のセリンとの間にバリンをコードするコドンを付加することによって宿主内での発現が増強されたものである。また、EGFP（配列番号２にアミノ酸配列を示す。）は、GFP（配列番号４にアミノ酸配列を示す。）の６４番目のフェニルアラニンがロイシン（EGFPにおける６５番目）に、６５番目のセリンがトレオニン（EGFPにおける６６番目）に置換されたものである。本明細書において、アミノ酸の位置を表記する場合は、全てGFPのアミノ酸配列に基づいて数えられた数値とする。したがって、例えば「EGFPの６６番目のチロシン」と記載する場合には、配列番号２における６７番目のアミノ酸を意味する。
本方法では、図１に示すように、「突然変異鎖の合成」を行う第１の工程と、「DpnIによる消化」を行う第２の工程と、「メガプライマーを用いた相補鎖の合成」を行う第３の工程とを経てEGFPをコードする遺伝子に突然変異を導入する。
【００１２】
（１）「突然変異鎖の合成」
先ず、既知のEGFPをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）における所定の部位に変異を導入するための突然変異導入用プライマーを準備する。本方法では、同時に複数の突然変異を導入することができるため、突然変異を導入する部位の数に相当する数の突然変異導入用プライマーを準備する。
【００１３】
これら突然変異導入用プライマーは、配列番号１に基づいて設計されるとともに配列番号１における所定の塩基を置換したものとして設計される。なお、突然変異導入用プライマーにおいては、単一の塩基を置換したものに限定されず、複数の塩基を置換したものであってもよい。この場合、突然変異導入用プライマーは、EGFPをコードする遺伝子を有するプラスミドに対してアニーリングすることができるように設計される。
これら突然変異導入用プライマーの５'末端は、例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化しておく。なお、Pri-1及びPri-2の５'末端をリン酸化する酵素としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼに限定されず、プライマーの５'末端をリン酸化できる酵素をいずれも使用することができる。
【００１４】
具体的に、突然変異導入用プライマーとしては、例えばEGFPアミノ酸配列における６６番目のチロシン（Y）をトリプトファン（W）に突然変異させるためのPri-1（5'-GCACTGCACGCCCCAGGTCAGGGTGGT-3'：配列番号５）及びEGFPアミノ酸配列における２０３番目のトレオニン（T）をチロシン（Y）に突然変異させるためのPri-2（5'-GGGCGGACTGGTAGCTCAGGTAGTGG-3'：配列番号６）を例示できる。
【００１５】
また、EGFPをコードする遺伝子を有するプラスミドを準備する。このプラスミドとしては、例えば、T7発現系を有するpRSETB（インビトロジェン(Invitrogen)社製）を使用することができる。このとき、従来公知の手法を用いることによって、EGFPをコードする遺伝子を有するpRSETB（pRSETB/EGFP）を構築することができる。なお、通常、プラスミドはメチル化されており、ここで使用されるpRSETB/EGFPもメチル化されている。
【００１６】
突然変異鎖を合成する際には、これら突然変異導入用プライマー（Pri-1及びPri-2）及び当該プラスミド（pRSETB/EGFP）を用いたPCR法を行う。このPCR法において、プラスミドを鋳型とした突然変異導入用プライマーからの伸長反応は、耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いる。この耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼは、TaqＤＮＡポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと比較して約１０倍の忠実性を有するものであり、伸長鎖の３'末端に１塩基程度を余分に付加する活性がほとんどないため、鋳型ＤＮＡに対する相補鎖をほぼ間違えることなく合成することができる。耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼとしては、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ(ストラタジーン社製, La Jolla, CA)を使用することができる。なお、耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼとしては、Pfu ＤＮＡポリメラーゼに限定されず、高忠実度を有し、且つ伸長鎖の３'末端に１塩基程度を余分に付加する活性がほとんどないものであればいかなるものを使用しても良い。
【００１７】
このPCR法においては、耐熱性高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長反応の後、突然変異導入用プライマーの５'末端と伸長したＤＮＡ鎖の３'末端とを、耐熱性ＤＮＡリガーゼにより連結する。耐熱性ＤＮＡリガーゼとしては、特に限定されないが、例えば、Taq DNAリガーゼ(New England BioLabs)を使用することができる。本方法においては、突然変異導入用プライマーの５'末端をリン酸化しているため、上述したような連結反応を行うことができる。
【００１８】
PCR法におけるサーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。すなわち、先ず、65℃、５分のプレインキュベーションを行ってTaq DNAリガーゼによる鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後、95℃、２分の最初の変性を行う。続いて、95℃、30秒のＤＮＡ変性、55℃、30秒のアニーリング反応、及び65℃、７分の伸長・連結反応を１サイクルとして18サイクル行う。最後に、75℃、７分のポストインキュベーションを行う。このプログラムにおいて、６５℃の伸長・連結反応を長く設定することによって、特に、Taq DNAリガーゼによる連結反応を完全に行うことができる。
【００１９】
このようなプログラムによって、EGFPをコードする遺伝子に、突然変異導入プライマーが有する突然変異を導入してなる変異EGFP遺伝子を有する単鎖プラスミドＤＮＡのみを増幅することができる。具体的に、突然変異導入用プライマーとしてPri-1及びPri-2を用いて合成された変異EGFP遺伝子の塩基配列を配列番号８に示す。
【００２０】
なお、このPCR法の最終反応液中には、変異EGFP遺伝子を有する１本鎖プラスミドＤＮＡと、鋳型となったプラスミドに由来する一本鎖ＤＮＡと、鋳型となった２本鎖プラスミドと、変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドＤＮＡ及び鋳型となったプラスミドに由来する一本鎖ＤＮＡがアニールしてなる２本鎖ＤＮＡとを含んでいる。
【００２１】
（２）「DpnIによる消化」
ここでは、上述したように得られた反応液中に、少なくとも、変異EGFP遺伝子を有する１本鎖ＤＮＡ以外のＤＮＡを消化する酵素を添加し、所定のＤＮＡのみを消化して除去する。例えば、使用可能な酵素としては、所定の塩基配列（5'-Gm6ATC-3'）を認識して切断するDpnIを挙げることができる。
反応溶液中にDpnIを添加した場合、反応溶液中に残存するメチル化したプラスミド（pRSETB/EGFP）と、反応溶液中に残存する変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドＤＮＡ及び鋳型となったプラスミドに由来する一本鎖ＤＮＡがアニールしてなるヘミメチル化した２本鎖ＤＮＡとが選択的に切断されることとなる。これにより、反応溶液中には、変異EGFP遺伝子を有する１本鎖ＤＮＡと、微量ながらも存在する鋳型となったプラスミドに由来する一本鎖ＤＮＡのみが環状のＤＮＡとして存在する。
【００２２】
（３）「メガプライマーを用いた相補鎖の合成」
ここでは、上記（２）で切断されたＤＮＡ断片をメガプライマーとし、変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として、２本鎖ＤＮＡを合成する。すなわち、この反応においては、DpnIにより切断されたＤＮＡ断片を変性して１本鎖ＤＮＡ断片とし、変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドＤＮＡに該１本鎖ＤＮＡ断片をアニーリングさせ、該１本鎖ＤＮＡ断片をメガプライマーとして伸長反応を行う。これにより、変異EGFP遺伝子を有する一本鎖プラスミドＤＮＡに相補的な塩基配列が合成され、所定の位置に突然変異が導入されたEGFP遺伝子を有する２本鎖プラスミドＤＮＡを構築することができる。
具体的に、95℃、30秒の熱変性によりメガプライマーを１本鎖とし、次いで、95℃、30秒の熱変性、55℃、1分のアニーリング及び70℃、７分の伸長反応を１サイクルとして２サイクル行うことによって、２本鎖ＤＮＡを合成することができる。
【００２３】
ここで、鋳型ＤＮＡをDpnI処理して得られるＤＮＡ断片のなかには、変異を導入する前の野生型の塩基を有するものが含まれる。変異を導入する箇所が野生型の塩基配列であるＤＮＡ断片をメガプライマーとして使用すると、合成した相補鎖に変異が導入されていないこととなってしまう。したがって、この工程では、補助的プライマーを大量に加え、当該ＤＮＡ断片のアニーリングを防止した状態で２本鎖ＤＮＡを合成することが好ましい。
【００２４】
補助的プライマーとしては、EGFP遺伝子のクローニング部位近傍に存在する配列と相補的なT7プライマーを使用することができる。T7プライマーを反応溶液中に添加することによって、T7プライマーが優先的にアニールすることとなり、変異を導入する箇所が野生型の塩基配列であるＤＮＡ断片のアニールを防止することができる。
【００２５】
また、この反応では、上記（１）におけるPCRから引き継がれたPfuＤＮＡポリメラーゼ、Taq DNAリガーゼ、dNTPs及びNADも利用することができる。すなわち、本方法では、上記（１）及び（２）の各反応に引き続いて同一の反応溶液中で反応を行うことができるため、ＤＮＡ断片の精製等の煩雑な工程を経ることなく、所望の２本鎖プラスミドＤＮＡを合成することができる。
【００２６】
以上のように、上述した（１）、（２）及び（３）の工程を経ることによって、EGFP遺伝子の所定の部位に突然変異を導入してなる変異EGFP遺伝子を有する２本鎖プラスミドを構築することができる。そして、当該２本鎖プラスミドを有する反応液を用いて所定の細胞を形質転換することによって、変異EGFP遺伝子を有するプラスミドを備える形質転換細胞を得ることができる。
【００２７】
ここで使用可能な細胞としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞等、いずれを使用しても良く、変異を導入する遺伝子の由来や使用するプラスミド等に応じて適宜選択される。また、形質転換には、一般的に行われている手法、例えば、コンピテントセル使用する方法、電気的パルスを引加する手法等を適用することができる。
【００２８】
突然変異を導入した遺伝子は、得られた形質転換細胞を培養することにより発現することができる。例えば、pRSETB/EGFPを鋳型ＤＮＡとして用いた場合には、大腸菌JM109(DE3)を形質転換し、イソプロピルβ-D-チオガラクシド（IPTG）を培地中に添加することによって、突然変異を導入したEGFPの発現を誘導することができる。
形質転換細胞中に発現した変異タンパク質は、一般的に行われているタンパク質精製工程を経ることによって精製することができる。変異タンパク質の精製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィやゲル濾過等の手法を使用することができる。
【００２９】
ところで、本発明に係る突然変異導入方法は、上記（１）「突然変異鎖の合成」において、複数の突然変異導入用プライマーを用いるものに限定されず、縮重プライマーを用いて、所定の塩基配列にランダムな突然変異を導入するようなものであってもよい。以下の例では、縮重プライマーを用いてECFP（エクオレア(Aequorea)属が産生するシアン蛍光タンパク質を改変した増強シアン蛍光タンパク質）における所定の部位のアミノ酸をランダムに変異させる方法を説明する。
【００３０】
この場合、例えば、縮重プライマーとしては、ECFPアミノ酸配列における２０３番目のトレオニン（T）をランダムに突然変異させるための縮重プライマーPri-3（5'-GCGGACTGNNNGCTCAGGTAG-3'：配列番号７）を合成する。なお、Pri-3の塩基配列（配列番号７）における「N」は、A、G、C又はTを意味し、例えば、等モル濃度のA、G、C及びTを有するヌクレオシドホスホロアミダイドを用いることによって合成することができる。
上記（１）「突然変異鎖の合成」においてPri-3を用いることによって、ECFPにおける２０３番目のトレオニンをランダムに変異させた様々な変異ECFP遺伝子を構築することができる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
１）突然変異導入用プライマー及び鋳型プラスミドＤＮＡの準備
本実施例では、GFPアミノ酸配列における６６番目のチロシン（Y）をトリプトファン（W）に、２０３番目のトレオニン（T）をチロシン（Y）に突然変異させる。突然変異導入用プライマーとして、６６番目のチロシン（Y）をトリプトファン（W）に突然変異させるためのPri-1（5'-GCACTGCACGCCCCAGGTCAGGGTGGT-3'：配列番号５）及び２０３番目のトレオニン（T）をチロシン（Y）に突然変異させるためのPri-2（5'-GGGCGGACTGGTAGCTCAGGTAGTGG-3'：配列番号６）を設計して合成した。これらPri-1及びPri-2の５'末端を、それぞれT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。
鋳型プラスミドＤＮＡとして、EGFP遺伝子をプラスミドベクターpRSETB（インビトロジェン社製(Invitrogen)にクローニングした。以下、鋳型プラスミドＤＮＡを「pRSETB/EGFP」とする。
【００３２】
２）突然変異鎖の合成
以下の組成の反応溶液50μlを準備しPCRを行った。
pRSETB/EGFP               50ng
Pri-1                    14pmol
Pri-2                    14pmol
dNTPs                    10nmol
Pfu DNAポリメラーゼ      2.5U
Taq DNAリガーゼ          20U
なお、Pfu DNAポリメラーゼは、ストラタジーン社製であり、0.5×Pfuポリメラーゼ反応バッファー中に溶解したものである。また、Taq DNAリガーゼは、New England BioLabs社製であり、50nmolのNADを含む0.5×Taq DNAリガーゼバッファー中に溶解したものである。
【００３３】
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。すなわち、先ず、65℃、５分のプレインキュベーションを行ってTaq DNAリガーゼによる鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後、95℃、２分の最初の変性を行った。続いて、95℃、30秒のＤＮＡ変性、55℃、30秒のアニーリング反応及び65℃、７分の伸長・連結反応を１サイクルとして18サイクル行った。最後に、75℃、７分のポストインキュベーションを行った。
【００３４】
３）DpnIによる消化
以下の条件に従ってDpnIを用いて、メチル化又はヘミメチル化したプラスミドＤＮＡを選択的に消化した。すなわち、上記PCR後の反応溶液50μlに、1μl(20U)のDpnI(New England BioLabs社製)を加え、37℃で１時間インキュベートした。  DpnIは、(5'-Gm6ATC-3')を認識して２本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。DpnIによれば、3672bpのプラスミドpRSETB/EGFPを完全切断すると、6、8、11、12、17、18、24、31、36、38、46、47、75、78、105、133、148、160、258、341、506、740、789塩基対の23のＤＮＡ断片を生じる。
【００３５】
４）メガプライマーを用いた相補鎖の合成
DpnIによる消化後の反応溶液51μlを用い、２）で合成した突然変異鎖の相補鎖を以下の条件により合成した。すなわち、該反応溶液51μlについて、95℃、30秒の変性、次いで95℃で30秒、55℃で1分、70℃で７分を２サイクル行った。このとき、３）で得られたＤＮＡ断片２３のうちいくつかがメガプライマーとして作用する。
【００３６】
５）形質転換及び変異EGFPの発現
４）の反応後のサンプルの２μlを用いて、Ca2+共沈法により大腸菌(E.coli)コンピテントセル(JM109(DE3))を形質転換した。そして、形質転換した大腸菌細胞を、100μg/mlのアンピシリンを含むLB固体培地で37℃にて培養し、生育した単一コロニーをピックアップして100μg/mlのアンピシリンを含むLB培養液２ml中へ移し、37℃で一晩培養して増殖させた。
【００３７】
変異を導入したEGFPは、T7発現系(pRSETB/JM109(DE3))を用いて発現させた。すなわち、培養液の100倍希釈物を作製し、該培養物を濃度がおよそOD600=0.5に達するまで室温で増殖させ、次いで最終濃度0.2mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)によって変異EGFPの発現を誘導し、その後、更に18時間培養した。得られた細胞をフレンチプレスにより破砕し、得られた上清液から、ニッケルキレートカラム(Qiagen社製)を用いてポリヒスチジン標識化タンパク質を精製した。さらに、この溶出液(100mMイミダゾール、50mM Tris/Cl pH7.5、300mM NaCl)中のタンパク質サンプルをCentricon 10(Amicon)によって濃縮し、ゲル濾過によりさらに精製した。
【００３８】
６）結果
１．得られたタンパク質が所望の突然変異を２カ所同時に導入したものであることを、該タンパク質の励起波長及び発光波長を測定するとともに既存のタンパク質（野生型EGFP等）の励起波長及び発光波長と比較することにより確認した。得られたタンパク質の励起波長を測定し、規格化したものを図２（Ａ）中曲線Ａで示す。また、得られたタンパク質の発光波長を測定し、規格化したものを図２（Ｂ）中曲線Ａで示す。なお、図２（Ａ）及び（Ｂ）には、比較のために、野生型EGFP、野生型EGFPの６６番目のチロシンをトリプトファンに変異させてなるEGFP-Y66W及び野生型EGFPの２０３番目のトレオニンをチロシンに変異させてなるEGFP-T203Yについて励起波長及び発光波長を併せて示す。図２（Ａ）及び（Ｂ）において、野生型EGFPは曲線Ｂで示し、EGFP-Y66Wは曲線Ｃで示し、EGFP-T203Yは曲線Ｄで示す。
【００３９】
図２（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、上述した方法で変異を導入したタンパク質は、励起波長のピークが458nmであり、発光波長のピークが504nmであることがわかる。これに対して、野生型EGFPは、励起波長のピークが488nmであり、発光波長のピークが509nmである。EGFP-Y66Wは、６６番目のチロシンをトリプトファンに置換することによってインドールを有する新たな発色団を生じるため、励起波長のピークが450nmであり、発光波長のピークが494nmである。EGFP-T203Yは、２０３番目のトレオニンをチロシンに置換することによって６６番目のチロシンとの間でπ−π相互作用を生じるため、励起波長のピークが514nmであり、発光波長のピークが524nmである。
得られたタンパク質は、６６番目のチロシンをトリプトファンに変異させるとともに２０３番目のトレオニンをチロシンに変異させてなる（EGFP-Y66W/T203Y）ため、上述したインドールを有する発色団とπ−π相互作用とを生じるため、シアン色−緑色蛍光を示している。
【００４０】
２．一方、アンピシリン添加LB固体培地上に生育したコロニーの蛍光を測定することによって、突然変異導入率を算出した。当該コロニーのスペクトル特性を、Bairdらの報告（Baird,G.S., Zacharias,D.A. and Tsien,R.Y. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11241-11246）に基づいて改変した蛍光イメージ解析システムを用いて測定した。蛍光イメージ解析システムでは、LBプレート（直径9cm）上に生育したコロニーを、150Wのキセノンランプ光によって励起する。励起波長は回折格子モノクロメーター(CT-10, JASCO社製)によって選択することができる。具体的には、回折格子モノクロメーターによる励起波長を４５０ｎｍ及び４９０ｎｍとする（図２（Ａ）中、直線ａ及びｂで示す。）。
【００４１】
また、このシステムでは、LBプレート全体を均一に照らすために、一対の光ファイバー（１m）を用いた。コロニーからの蛍光イメージは、干渉バンド透過フィルター（Omega社製, 535DF25  直径１インチ）を介して、レンズ(Nikon社製, AF NIKKOR)で集光した。そのイメージはSenSys冷却CCDカメラ(Photometrics社製)によって取り込まれ、MetaMorph 3.0ソフトウェア(Universal Imaging社製, West Chester, PA)を用いて解析した。具体的に、比率イメージとしては、490nmイメージを450nmイメージで除することによって得られた。図２（Ａ）に示した励起スペクトルから予測されるように、該比率値は、EGFP-T203Y > 野生型EGFP > EGFP-Y66W/T203Y > EGFP-Y66Wであった。
【００４２】
このとき、干渉バンド透過フィルターを用いて比較する場合、回折格子モノクロメーターを使用すると、励起波長を非常に狭い幅で変化させ、選択することができた。したがって、このシステムでは当該モノクロメーターを使用した励起によって、近接した励起スペクトルを示す野生型EGFP、EGFP-T203Y、EGFP-Y66W及びEGFP-Y66W/T203Yをそれぞれ確実に区別することができた。
【００４３】
その結果、アンピシリン添加LBプレート上に生育した42個のコロニーのうち、32個はシアン-グリーン蛍光を示し(EGFP-Y66W/T203Y)、２部位同時の突然変異誘発率は76％と算出された。残りのコロニーのうち、４個がイエロー蛍光を示し（EGFP-T203Y）、４個がシアン蛍光を示し（EGFP-Y66W）２個がグリーン蛍光を示した（野生型EGFP）。なお、非蛍光のコロニーは存在しなかった。
【００４４】
さらに、上述した実験を４回繰り返し、シアン-グリーン蛍光を示すコロニーの割合、すなわち、２部位同時の突然変異誘発率を算出した。その結果、（シアン-グリーン蛍光を示すコロニー数）／（全コロニー数）がそれぞれ、21/30、42/50、50/72及び32/40であり、２部位同時の突然変異誘発効率が75.8％±4.2％(n=5)であった。
さらにまた、シアン-グリーン蛍光を示すコロニーから精製したプラスミドのDNA配列決定により、Pri-1及びPri-2以外の部位で突然変異は導入されていないことが明らかになった。
【００４５】
さらにまた、４）でメガプライマーとして作用する２３個のＤＮＡ断片のうち506塩基対及び148塩基対のセンス鎖には、それぞれ６６番目のアミノ酸残基及び２０３番目のアミノ酸残基をコードする領域を含んでいる。このため、これら506塩基対及び148塩基対のＤＮＡ断片は、メガプライマーとしてはたらかないようにすることが好ましい。本例において、クローニング部位の外側にアニールするコモンセンスプライマー(T7プライマー14pmol)をDpnI消化後に加えると、これら506塩基対及び148塩基対のＤＮＡ断片のアニーリングを防止することができるため、突然変異誘発効率を90％を超えるまでに増大させることができる。具体的には、200個のコロニーのうち、196個がシアン-グリーン蛍光を示した。
【００４６】
［実施例２］
本実施例では、縮重プライマーを用いてECFPアミノ酸配列における２０３番目のトレオニン（T）をランダムに突然変異させる。突然変異導入用プライマーとして、２０３番目のトレオニン（T）をランダムに突然変異させるための縮重プライマーPri-3（5'-GCGGACTGNNNGCTCAGGTAG-3'：配列番号７）を合成する。なお、Pri-3の塩基配列（配列番号７）における「N」は、A、G、C又はTを意味する。そして、これらPri-3の５'末端を、それぞれT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。
【００４７】
鋳型プラスミドＤＮＡとして、ECFP遺伝子をプラスミドベクターpRSETB（インビトロジェン社製(Invitrogen)にクローニングした。以下、鋳型プラスミドＤＮＡを「pRSETB/ECFP」とする。なお、このECFP遺伝子は、実施例１で使用したEGFP遺伝子と比較して、タンパク質の折り畳みおよび成熟を助けるための更なる置換（N146I、M153T、V163A及びN164H）を有し、且つ、６６番目のチロシンがトリプトファンに置換（Y66W）されている。
実施例２では、縮重プライマーとしてPri-3及び鋳型ＤＮＡとしてpRSETB/ECFPを使用した以外は実施例１と同様に実験を行った。
【００４８】
１）結果
本例では、実施例１と同様に形質転換を行って形質転換大腸菌細胞をアンピシリン添加LBプレート上に生育させた。該LBプレート上に生育した62個のクローンをランダムにピックアップし、配列決定した。その結果、28個のクローンは、Thr203をK、N、H、R、Lで置換した突然変異が導入されており、非蛍光タンパク質を産生した。一方、34個のクローンは、蛍光タンパク質を産生し、そのうち23個のクローンは、２０３番目のトレオニンをP、V、I、W、F、S、C、Yで置換した突然変異体を含んでいた。特に、２０３番目のトレオニンをチロシンに変異させたクローンでは、顕著なスペクトル変化を観察することができた。この突然変異は、その励起および発光のスペクトル全体がECFPとEGFPのものの中間であるため、ECGFP（強化シアングリーン蛍光タンパク質）と称する。ECGFPのアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【００４９】
ECGFPの蛍光励起スペクトル及び発光スペクトルを、ECFP及びEGFPの蛍光励起スペクトル及び発光スペクトルを併せて図３に示す。図３において、ECGFPの蛍光励起スペクトルを曲線Ａ（波線）で示し、ECGFPの発光スペクトルを曲線Ｂ（実線）で示す。また、図３において、EGFPの蛍光励起スペクトルを曲線Ｃ（波線）で示し、EGFPの発光スペクトルを曲線Ｄ（実線）で示し、ECFPの蛍光励起スペクトルを曲線Ｅ（波線）で示し、ECFPの発光スペクトルを曲線Ｆ（実線）で示す。
【００５０】
この図３から判るように、ECGFPの励起ピーク（455nm）及び発光ピーク（506nm）はECFPにおける長波長成分の励起ピーク（452nm）及び発光ピーク（505nm）とかなり近接していた。変異によって、π-π相互作用はより長波長が優位を占める量子状態を促進することが示唆される。また、図３に示すように、ECGFP及びEGFPは同程度の発光ピークを有する（ECGFPは506nm、EGFPは511nm）が、ECGFPではより大きなストークスシフト（励起ピーク及び発光ピークの間隔）を示している。ECGFPにおいては、ECFP及びEGFPと比較してストークスシフトが大きいため、落射蛍光観察において、蛍光シグナルと励起光とを容易に分離することができる。
【００５１】
一方、ECGFP、EGFP及びECFPについて、ｐＨ抵抗性を検討した。
ここでは、先ず、50mM酢酸塩(pH3.8〜5.6)、Na2HPO4-Na2H2PO4(pH5.5〜7.0)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホネート(pH5.5〜6.0)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホネート(pH6.5〜7.0)、ヘペス(pH7.0〜7.9)、グリシン(pH9.0〜10.0)及びリン酸塩(pH11)のいずれかを用いて、pH値3.8〜11の範囲となるような一連のpHバッファーを調製した。ｐＨ抵抗性を検討する溶液は、先ず、タンパク質を弱緩衝溶液中に濃縮し、当該弱緩衝溶液を、所定のｐＨバッファー溶液と等量混合して調製した。
【００５２】
得られた溶液を用いて吸収波長スペクトル及び発光波長スペクトルを測定した結果を図４及び図５に示す。なお、図４において、（Ａ）はEGFPの吸収スペクトルを示し、（Ｂ）はEGFPの発光スペクトルを示し、（Ｃ）はECFPの吸収スペクトルを示し、（Ｄ）はECFPの発光スペクトルを示し、（Ｅ）はECGFPの吸収スペクトルを示し、（Ｆ）はECGFPの発光スペクトルを示す。また、図５において、（Ａ）は図４（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）のスペクトルをプロットし直したものであり、（Ｂ）は図４（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）のスペクトルをプロットし直したものである。
【００５３】
また、EGFP、ECFP及びECGFPに関して、量子収率(Φ)及びモル吸光係数(ε)を測定した。量子収率(Φ)及びモル吸光係数(ε)の値は、50mMのヘペス(pH7.5)中で測定した。ECGFPの量子収率(Φ)は、標準（フルオレセイン(Φ=0.91)およびECFP(Φ=0.40)）との比較により決定した。モル吸光係数を算出するためのタンパク質濃度の測定には、標準物質としてBSA(ウシ血清アルブミン)を用いたBradfordアッセイキット(Bio Rad)を使用した。結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
0003859947.tif 000002
【００５５】
なお、この表１において、λabsはナノメーター単位での吸光度スペクトルのピークを表している。（ε）は103M-1cm-1単位でのモル吸光係数である。λemはナノメーター単位での発光スペクトルのピークを表している。（Φ）は量子収率である。また、Kaは酸解離定数であり、pKa=-log10Kaで求められる。pKaは図５（Ｂ）から算出した。
絶対輝度はε及びΦの積で算出され、ECGFPは中性pH付近で、EGFP及びECFPよりも光が弱いことが表１より判る。なお、GFP突然変異体のほとんどすべては酸性pHによりいくらか光が弱まることが知られている。
【００５６】
一方、図４（Ａ）及び（Ｂ）から判るように、EGFPは、488nmにおける吸光度ピークが酸性化に依存した低下を示すとともに398nmにおける吸光度ピークは増大した。EGFPにおいては、発光（511nmピーク）および励起（488nmピーク）スペクトルはpHが低下するにつれて低下したが、蛍光励起スペクトルは398nmでの補償的増加を示さなかった。このことから、398nmでの吸光種は非蛍光性であることがわかる。また、EGFPは、図４（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、その吸光スペクトル及び発光スペクトルの両方についてpKa6.0を示し、図５（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、その吸光度はpH感受性であるが量子収率はpH感受性でない。
【００５７】
また、ECFPは、図４（Ｃ）及び（Ｄ）に示すように、EGFPと比較してｐＨの影響が小である。pHの低下した条件下においても、その吸光度スペクトル(図４Ｃ）にほとんど影響を与えず、発光スペクトルのみが弱めたられた。このことは、ECFPにおいては、図５（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、量子収率が酸性により低下させられる。
【００５８】
一方、ECGFPに関しては、図４（Ｅ）及び（Ｆ）に示すように、広いpH範囲(pH4〜12)において安定であった。言い換えると、このECGFPは、図５（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、いかなるｐＨ条件下においても、変わらない蛍光特性を有していることが判った。
ECGFPの蛍光を使用することによって、例えば、分泌およびエンドサイトーシスオルガネラといった、酸性オルガネラの細胞内膜挙動の解析に際して、画像化した分子種を正確に報告することが可能となる。
【００５９】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明に係る突然変異導入方法では、複数の部位に同時に突然変異を導入することができる。このため、本発明の突然変異導入方法によれば、迅速に、簡易に且つ低コストで、所望の塩基配列を合成することができる。したがって、本発明によって、広範囲に亘って応用可能な遺伝子工学の新手法を提供することができる。
【配列表】
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【００６０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５〜配列番号７は、合成プライマーである。
配列番号７，第９塩基、第１０塩基及び第１１塩基のｎは、ａ、ｔ、ｃ又はｇである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る突然変異導入方法のプロトコールを説明するための概略図である。
【図２】  EGFP、ECFP、EYFP及びEGFP-Y66W/T203Yの蛍光励起スペクトル(A)及び発光(B)スペクトルを示す特性図である。
【図３】  ECFP、ECGFP、EGFPの励起スペクトル（波線）及び発光スペクトル（実線）を示す特性図である。
【図４】  EGFP、ECFP及びECGFPそれぞれの吸光スペクトル及び発光スペクトルのｐＨ依存性を示す特性図であり、（Ａ）がEGFPの吸光スペクトルであり、（Ｂ）がEGFPの発光スペクトルであり、（Ｃ）がECFPの吸光スペクトルであり、（Ｄ）がECFPの発光スペクトルであり、（Ｅ）がECGFPの吸光スペクトルであり、（Ｆ）がECGFPの発光スペクトルである。
【図５】  EGFP、ECFP及びECGFPそれぞれの吸光ピーク及び発光ピークのｐＨ依存性を示す特性図であり、（Ａ）が吸収ピークとｐＨとの関係を示し、（Ｂ）が蛍光ピークとｐＨとの関係を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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