(57)【要約】本発明は、免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む発現ベクターを有効成分とする炎症・腫瘍性疾患治療剤に関する。また、本発明は、免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む治療的有効量の発現ベクターを、炎症・腫瘍性疾患を患う患者に投与することを含む炎症・腫瘍性疾患の治療方法に関する。
2002066069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む発現ベクターを有効成分とする炎症・腫瘍性疾患治療剤。
【請求項２】
免疫抑制性サイトカイン及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子がＩＬ−１ｒａ、ｖＩＬ−１０及び可溶性ｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
炎症・腫瘍性疾患が心血管系疾患である請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
炎症・腫瘍性疾患が心筋炎である請求項３に記載の治療剤。
【請求項５】
免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む治療的有効量の発現ベクターを、炎症・腫瘍性疾患を患う患者に投与することを含む炎症・腫瘍性疾患の治療方法。
【請求項６】
治療的有効量の該発現ベクターの投与後に、該投与部位を挟むようにして電気パルスを与えることを特徴とする請求項５に記載の治療方法。
【請求項７】
免疫抑制性サイトカイン及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子がＩＬ−１ｒａ、ｖＩＬ−１０及び可溶性ｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項５に記載の治療方法。
【請求項８】
炎症・腫瘍性疾患が心血管系疾患である請求項５に記載の治療方法。
【請求項９】
炎症・腫瘍性疾患が心筋炎である請求項８に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、炎症・腫瘍性疾患治療剤に関する。
背景技術
心疾患は、先進諸国の中で主要な死因の１つとなっている。なかでも急性ウイルス性心筋炎は、心臓の多病巣性炎症により特徴付けられ、慢性相では、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、心室瘤、不整脈原性右心室形成異常症を導く。脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスは、マウスで心筋炎を誘発し、この実験モデルを用いた研究は心筋炎及びＤＣＭのメカニズムに重要な洞察を提供した（松森、１９９７）。このモデルにおいて、細胞性免疫が賦活化され、サイトカイン発現の亢進並びに心筋層中の細胞障害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化が認められる。従って、免疫系は治療的標的と考えられる。
直接的ウイルス性障害及び宿主の免疫応答は、ウイルス性心疾患の病因に重要な役割を果たす（Ｂｏｗｌｅｓら、１９９８）。免疫応答はウイルス感染と戦うのに重要な役割を果たすが、同時にそれは心筋細胞を不適切に攻撃することにより宿主に有害な効果を有し得る。このような保護効果と有害作用のバランスは、疾患の予後を最終的に決定し得る。さらに、心臓中の炎症性サイトカイン発現の亢進は、ウイルス性心筋炎に伴う心筋機能の低下に関与し得る（Ｓｈｉｏｉら，１９９６）。インターロイキン（ＩＬ）−１β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、及びインターフェロン（ＩＦＮ）−γを含むサイトカインｍＲＮＡは、ウイルス接種の３日後に誘導されるが、その時点では細胞浸潤はほとんど見られない（Ｓｈｉｏｉら，１９９６）。
ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、ＩＬ−１ファミリーのメンバーであり、ＩＬ−１受容体に結合するが、細胞内応答を誘発せず、重要な内在性の抗炎症蛋白質である（Ａｒｅｎｄら，１９９８；Ｂｒｅｓｎｉｈａｎら，１９９８）。ウイルス性ＩＬ−１０（ｖＩＬ−１０）は、ＥＢウイルスにより捕捉される細胞性サイトカインと考えられ、細胞性ＩＬ−１０の抗炎症特性の多くを共有するが、免疫刺激作用を欠如し、それゆえ優れた免疫抑制を提供し得る。これらは、ウイルス性心筋炎の治療剤の有望な候補である。
免疫抑制性サイトカインを利用した抗炎症剤としては、特開２０００−２３９１８２号に記載されているが、このように、サイトカインを蛋白質として投与することは非常にコストがかかる欠点がある。
また、特開２０００−４７１５号公報には、サイトカイン遺伝子を組み込んだプラスミドが記載されているが、該公報には、このようなプラスミドを用いて心筋炎等の炎症を治療する具体的な方法については記載されていない。
本発明は、免疫抑制性サイトカインを生体内で産生し得る炎症・腫瘍性疾患治療剤を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、以下の炎症・腫瘍性疾患治療剤を提供するものである。
（１）免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む発現ベクターを有効成分とする炎症・腫瘍性疾患治療剤。
（２）免疫抑制性サイトカイン及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子がＩＬ−１ｒａ、ｖＩＬ−１０及び可溶性ｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくとも１種である（１）に記載の治療剤。
（３）炎症・腫瘍性疾患が心血管系疾患である（１）に記載の治療剤。
（４）炎症・腫瘍性疾患が心筋炎である（３）に記載の治療剤。
（５）免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む治療的有効量の発現ベクターを、炎症・腫瘍性疾患を患う患者に投与することを含む炎症・腫瘍性疾患の治療方法。
（６）治療的有効量の該発現ベクターの投与後に、該投与部位を挟むようにして電気パルスを与えることを特徴とする（５）に記載の治療方法。
（７）免疫抑制性サイトカイン及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子がＩＬ−１ｒａ、ｖＩＬ−１０及び可溶性ｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくとも１種である（５）に記載の治療方法。
（８）  炎症・腫瘍性疾患が心血管系疾患である（５）に記載の治療方法。
（９）  炎症・腫瘍性疾患が心筋炎である（８）に記載の治療方法。
発明の詳細な説明
本発明において、免疫抑制性サイトカインとしては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ｖＩＬ−１０、ＩＬ−２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８などのインターロイキン類、インターフェロン（α、β、γ）、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ，Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３，γＩＰ−１０，ＭＩＰ−１α，ＭＩＰ−１β，ＭＩＰ−２，ＭＣＰ−１，２，３，Ｍ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＴＰＯ，ＳＣＦ，ＬＩＦ，ＰＤＧＦ，ＫＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＣＤＴＦ，ＯＳＭ，ＨＧＦなどが例示される。また、これらのサイトカインの可溶性受容体に対しては可溶性サイトカイン受容体も含まれる。例えばＳＣＦに対しては可溶性ｃ−ｋｉｔが例示され、他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−αに対しては可溶性ＴＮＦ−α受容体が例示される。これらの免疫抑制性サイトカインの遺伝子配列は、公知であり、特にヒトの免疫抑制性サイトカイン遺伝子を用いるのが好ましい。
発現ベクターとしては、例えばｐＣＡＧＧＳを使用することができ、プロモーター／エンハンサー配列、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を適宜に組み合わせて用いることができる。免疫抑制性サイトカイン遺伝子を発現可能な状態で含むサイトカイン発現ベクターの構築は、例えば本明細書の下記の記載及び特開２０００−４７１５号公報の記載を参照して当業者であれば、容易に行うことができる。
炎症・腫瘍性疾患としては、心筋炎、脳心筋炎、拡張性心筋症、心不全、冠動脈炎、移植心の早期冠動脈硬化、血管炎、大動脈炎などの心血管系の疾患、関節炎、腰痛、痛風、気管支喘息、びまん性肺疾患、アトピー、アレルギー、肝炎、肝硬変、腎炎、胃潰瘍、腸炎、脳脊髄炎、多発性硬化症、自己免疫病、癌、骨髄腫などが例示される。
本発明において、特定の免疫抑制性サイトカインと治療対象疾患との組み合わせとしては、インターフェロンα（慢性髄性白血病、多発性骨髄腫、腎癌、悪性黒皮腫、慢性Ｔ細胞白血病、肝炎）、インターフェロンβ（脳腫瘍、、肝炎）、インターフェロンγ（慢性肉芽腫症）、ＩＬ−２（原発性免疫不全症、悪性黒皮腫、腎癌、肝癌）、ＩＬ−６（血小板減少症）、ＩＬ−１１（血小板減少症）、Ｅｐｏ（血小板減少症）、ＭＣＳＦ（血小板減少症、急性白血病、好中球減少症）、ＧＣＳＦ（急性白血病、好中球減少症）、ＩＬ−３（好中球減少症）、ＧＭＣＳＦ（好中球減少症）、ＳＣＦ（好中球減少症）が例示される。
本発明の炎症・腫瘍性疾患治療剤は、好ましくは注射（筋肉内、皮下、皮内、臓器内など）等の非経口経路により、例えば生理食塩水等の任意の溶媒を用いて投与することができる。投与部位は、四肢の筋肉内などが好ましい。治療的有効量は、成人１日当たり０．００００１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ程度であり、１回又は数回に分けて投与され得る。
本発明の炎症・腫瘍性疾患治療剤は、投与後、好ましくは投与直後に、投与部位を挟むようにして電気パルスを与えるエレクトロポレーションを行うのが好ましい。電気パルスは、例えば、任意のパルス形状、パルス幅、パルス頻度、電圧等からなるＤＣパルスであり、これらのパルス変数およびパルス印加時間等は対象動物（好ましくはヒト）の種類、発現プラスミドＤＮＡの注入部位、注入量等に応じて適宜に設定することができる。エレクトロポレーションは、好ましくは投与部位の周囲に複数箇所電極を差し込み、５０〜１００Ｖ程度の電圧を印加し、波形は矩形波、パルス幅は約０．１〜約１００ｍ秒、パルス頻度は１〜１０パルス／秒、回数は１〜１０回である。
発明を実施するための最良の形態
以下、免疫抑制性サイトカインとしてｖＩＬ−１０、ＩＬ−１ｒａ及び可溶性ｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦ受容体）を用いて心筋炎を治療する例を示すが、他のサイトカインについても同様にして本発明の炎症・腫瘍性疾患治療剤を得ることができる。
方法及び結果
・心筋炎のマウスモデル
４週齢ｉｎｂｒｅｄオスＤＢＡ／２マウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＭ変異株を１０ｐｆｕ腹腔内接種した。
・プラスミドＤＮＡ
マウスＩＬ−１ｒａ  ｃＤＮＡをマウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ．１から抽出された全ＲＮＡからＰＣＲにより抽出した。プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａをＣＡＧプロモーター及びｐＣＡＧＧＳ発現ベクター上のウサギβ−グロブリン遺伝子の３’−フランキング配列の間のＸｈｏＩ部位にマウスＩＬ−１ｒａ  ｃＤＮＡを挿入することにより構築した（Ｎｉｗａら，１９９１）。同様に、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｖＩＬ−１０はマウスｖＩＬ−１０ｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ発現ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより構築された（Ｎｉｔｔａら，１９９８）。ｖＩＬ−１０はｐｃＤＳＲα−ＢＣＲＦに由来のものであった（Ｓｕｚｕｋｉら，１９９５）。同様に、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｃ−ｋｉｔはマウスｃ−ｋｉｔ  ｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ発現ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより同様に構築された。ｃ−ｋｉｔはｐＣＡＧｎ−ｃ−ｋｉｔ−ｈＦｃに由来のものであった（Ｋａｔａｏｋａ，Ｔａｋａｋｕｒａら，１９９７）。プラスミドは大腸菌株ＤＨ１０Ｂ細胞で増殖し、アルカリ性溶菌法（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）により抽出し、２サイクルのエチジウムブロミド−ＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心分離法により精製した。プラスミドをイソプロパノール沈殿、フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりさらに精製した。プラスミドＤＮＡは次いでＰＢＳに溶解した。
・Ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーション
マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔した。プラスミドＤＮＡ（７５μｇ、各々１．５μｇ／μｌ）を両側前脛骨筋に注入し、電気パルスを既述のように与えた（Ａｉｈａｒａら，１９９８）。簡単に述べると、１対の電極針を筋肉に深さ５ｍｍで挿入し、ＤＮＡ注入部位とした。６回のパルスを両側筋に電気パルス発生器（Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ  Ｔ８２０Ｍ；ＢＴＸ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により１パルス／秒の割合で、各パルスが５０ｍｓｅｃの持続時間で発した。
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング
ｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａおよびｐＣＡＧＧＳをＢＭＴ−１０細胞にリポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、培養上清を３分の１容量のＳＤＳサンプルバッファー（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，６％ＳＤＳ，１５％グリセロール，１５％ＭＥおよび０．０１５％ブロモフェノールブルー）と混合し、９８℃で５分間加熱し、１５％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。組換えマウスＩＬ−１ｒａは同時にゲルにロードされた。電気泳動後、サンプルをポリビニリデンジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に移した。膜は室温で３時間ヤギ抗ＩＬ−１ｒａポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とインキュベートし、洗浄した。次いで膜は室温で１時間ビオチン化抗ヤギＩｇＧ２ａとインキュベートし、洗浄し、製造業者の仕様書に従い、化学発光法（ＥＣＬキット；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いたオートラジオグラフィー処理した。
・ＥＬＩＳＡ
ＩＬ−１ｒａ  ＥＬＩＳＡのために、マウス尾静脈から得られた血清サンプルをＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用い、供給元の仕様書に従いアッセイした。組換えマウスＩＬ−１ｒａ（Ｒ＆Ｄシステム）の連続希釈物を標準品として使用した。ｖＩＬ−１０の血清濃度は、以下のようにしてアッセイした：９６−ウェルプレートを２μｇ／ｍｌのラット抗ＩＬ−１０ｍＡｂ，ＪＥＳ３−９Ｄ７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）とともに４℃で終夜コートし、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて室温で１時間洗浄した。０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、適切に希釈されたサンプルを該ウェルに加えた。プレートを４℃で終夜インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ビオチン化ラット抗ＩＬ−１０  ｍＡｂ（ＪＥＳ３−１２Ｇ８；２μｇ／ｍｌ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を該ウェルに加え、プレートを室温で３時間激しく振とうしながらインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄後、希釈されたストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼ複合体をウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。基質（ｏ−フェニレンジアミン）をウェルに加え、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。組換えｖＩＬ−１０（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を標準品として用い、このＥＬＩＳＡシステムの直線範囲は３０〜２０００ｐｇ／ｍｌであった。このＥＬＩＳＡシステムはマウスＩＬ−１０を検出しない。
・組織学的知見
心臓を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン上に包埋し、切片標本とし、マッソン三色染色により染色した。心臓切片標本をＣＣＤカメラで写真撮影し、全心臓切片標本の面積及び浸潤ゾーンの面積をブラインド様式（ｂｌｉｎｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）で、ＮＩＨイメージソフトウェアにより測定した。細胞浸潤の程度を浸潤ゾーンの面積を全心臓切片標本の面積で割ることにより計算した。
・リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡをグアニジンチオシアネート−セシウムクロライド遠心分離法によりマウスの心臓から抽出した。ＲＮＡをオリゴｄＴプライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて逆転写した。心臓中のサイトカインのｍＲＮＡのレベルを測定するために、リアルタイム定量ＰＣＲをＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）（Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈら，１９９９）を用いて行った。これらの分析のために使用したプライマー対及びプローブは、以下の通りである。
2002066069.tif 000003
2002066069.tif 000004
これらのプローブは、適切なＰＣＲ産物を汚染されたゲノムＤＮＡ由来の増幅産物と区別するために、イントロン配列を包含するように設計された。プローブの５’及び３’末端を６−カルボキシフルオレセイン及び６−カルボキシテトラメチルローダミンで各々標識した。
・統計的分析
生存をカプランメイヤー法（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）で分析した。統計的比較は、ｌｏｇ−ランクテスト及びＡＮＯＶＡにより行った。スチューデントのｔ検定を使用して組織学的知見、サイトカインの血清レベルおよび心臓のサイトカインの発現を比較した。
結果
・導入された遺伝子の発現
マウスＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０及びｃ−ｋｉｔがｐＣＡＧＧＳ発現ベクターに挿入されて、ｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａ及びｐＣＡＧＧＳ−ｖＩＬ−１０及びｐＣＡＧＧＳ−ｃ−ｋｉｔを得た。ｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａを用いてトランスフェクトされたＢＭＴ−１０由来の培養上清のイムノブロッティングは、正確なサイズのマウスＩＬ−１ｒａである、１７ｋＤａ蛋白質の成功した発現を示した（図１Ａ）。同様に、ｖＩＬ−１０発現は、ｐＣＡＧＧＳ−ｖＩＬ−１０のＢＭＴ−１０細胞への一時的トランスフェクションにより確認された。同様に、ｃ−ｋｉｔ発現は、ｐＣＡＧＧＳ−ｃ−ｋｉｔのＢＭＴ−１０細胞への一時的トランスフェクションにより確認された。各プラスミドのエレクトロポレーションが蛋白質の生理学的に有意なレベルを生じるかどうかを測定するために、ＥＭＣＶ接種されたＤＢＡ／２マウスの両側性前脛骨筋に７５μｇのプラスミドを注入し、導入された遺伝子の発現レベルがそのピークと予測されるときに、ＩＬ−１ｒａまたはｖＩＬ−１０の血清レベルをエレクトロポレーションの５日後ＥＬＩＳＡにより測定した（図１Ｂ；Ａｉｈａｒａら，１９９８）。ＩＬ−１ｒａの濃度は、未感染のコントロールマウスよりもＥＭＣＶ接種マウスが３．５倍高く（ｐ＜０．００５）、ＩＬ−１ｒａ遺伝子導入は、さらに血清ＩＬ−１ｒａレベルを１．９倍増大した（ｐ＜０．０１、ＥＭＣＶ感染マウスとの比較）。ＩＬ−１ｒａの血清濃度は、未感染マウスへのエレクトロポレーションの０，３，５，７及び１４日後調べられた。該時間経過は、ＩＬ−１ｒａの血清濃度は第５日（ｐ＜０．０１、第０日との比較）でピークとなり、その後徐々に減少し（図１Ｃ）、この結果は既報告と一致する（Ｗｅｌｌｓ，１９９３；Ｖｉｔａｄｅｌｌｏら、１９９４）。ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションの５日後のｖＩＬ−１０濃度は２２９４ｐｇ／ｍｌであった（図１Ｄ）。これらの結果は明らかにｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションがサイトカインを全身に送達するのに優れていることを示す。
・心筋炎に関するＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０及び可溶性ｃ−ｋｉｔの導入
ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーション法を適用し、本発明者は実験的心筋炎に対するサイトカイン遺伝子治療を試みた。４週齢のＤＢＡ／２雄マウスに１０ｐｆｕのＥＭＣＶを接種した。接種１４日後に生存するのはこれらマウスの２０％未満であった。ＩＬ−１ｒａ遺伝子導入の結果の統計的分析は、処理群が有意に高い生存を示すことを明らかにした（図２Ａ）。ｖＩＬ−１０遺伝子導入は、ＥＭＣＶ接種後の死亡率も減少し（図２Ｂ）、ＩＬ−１ｒａ導入よりもわずかに良好な生存率を生じた。これらのデータは、２つの抑制性サイトカインが有利な効果を有することを示唆した。プラスミド自身が効果を有する可能性を排除するために、空のｐＣＡＧＧＳプラスミドを同様に感染マウスに導入し、生存率をＰＢＳ注入マウスと比較した。図２Ｃに示すように、空のプラスミドの導入は、生存曲線を変化させなかった。
可溶性ｃ−ｋｉｔ遺伝子導入では、空のｐＣＡＧＧＳプラスミド群では１０匹中５匹が死亡したのに対し、可溶性ｃ−ｋｉｔ遺伝子導入群では１０匹中死亡はなく、ＥＭＣＶ接種後の死亡率を有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
・組織学的知見
ＩＬ−１ｒａ処理群及びｖＩＬ−１０処理群において、心臓切片標本を炎症は進行するがどのマウスも死んでいない時点である第５日に組織学的に評価した（図３Ａ）。心筋浸潤の定量的病理学的スコアは、ＩＬ−１ｒａ処理群及びｖＩＬ−１０処理群の両方で明らかな改善が見られ、このことは生存率の改善は心筋障害の緩和によるものであることを示唆した。可溶性ｃ−ｋｉｔ遺伝子導入でも心筋の細胞浸潤は減少した（図３Ｂ）
・心臓におけるサイトカイン発現
ＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０の有利な効果に横たわるメカニズムをさらに明らかにするために、心臓における炎症遺伝子の発現レベルをリアルタイム定量的ＰＣＲ法で測定した。ＩＬ−１ｒａ導入マウスにおいて、ＴＮＦ−α及びｉＮＯＳの発現は未処理マウスで見られるレベルの４７％及び８３％に抑制し（ＴＮＦ−α，ｐ＜０．００１；ｉＮＯＳ，ｐ＜０．０５；図４Ａ）、一方、ｖＩＬ−１０導入マウスにおいて、ＩＦＮ−γ及びｉＮＯＳは各々１４％及び１６％に抑制された（ＩＦＮ−γ，ｐ＜０．０１；ｉＮＯＳ，ｐ＜０．００５；図４Ｂ）。ＩＬ−１βはまたｖＩＬ−１０処理群で減少した。これらの炎症遺伝子の発現パターンの相違は、これら２つの免疫調節処理が異なるメカニズムでその治療的効果を引き出すことを示唆する。
現在、感染は多くの心臓疾患の病因に関与すると考えられている。ウイルス性心筋炎は、特に懸念され、各種の形態が見られる（Ｍａｔｓｕｍｏｒｉ，１９９７）。過去数年において、サイトカイン、特にＩＬ−１β及びＴＮＦ−αのような前炎症（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインは、心筋炎及び心筋症の病因に重要な因子としてますます認識されている。各種の形態のストレスに対応して、心臓はＩＬ−１β及びＴＮＦ−αのような前炎症サイトカイン、単球走化性蛋白質−１の様なケモカイン、誘導性一酸化窒素合成酵素の様な炎症性酵素、細胞内接着分子−１のような接着分子を含むサイトカインを分泌する。これらの生成物は、病因に関係なく心臓病患者の心臓、並びに実験的心臓機能不全を有する動物の心臓で増加する。これらの生成物は、炎症及び免疫応答を介在し、全てＮＦ−κＢにより調節される。興味深いことに、前炎症サイトカインであるＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの発現はＮＦ−κＢの活性化を必要とするだけでなく、逆にその活性化を引き起こす。このタイプのポジティブレギュレーションループは、局所炎症反応を増強し及び永続的にし得る。この観点から、ウイルス性心筋炎を治療するために抗サイトカイン又は免疫調節剤を利用する幾つかの治療法が報告された。しかしながら、薬物送達の伝統的な方法は、組換え蛋白質に適用されるとき多くの落とし穴：短持続性の効力、頻回投与の必要性、及び最も重要である蛋白質を送達することの不適切さ、を有する。例えば、ＩＬ−１βは実験的敗血症の間１５０−２００ｐｇ／ｍｌの最大濃度に達し、ＩＬ−１受容体を発現する細胞中のＩＬ−１応答の５０％を抑制するために１０〜１００倍過剰量のＩＬ−１ｒａが要求される（Ｂｒｅｓｎｉｈａｎら，１９９８；Ｇｒａｎｏｗｉｔｚら，１９９１）。この研究で、本発明者はｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションを用いた遺伝子導入を行うことによりこれらの落とし穴を克服した。この方法により高レベルのサイトカインが血清中で得ることができる。
ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＩＬ−１の多くの作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方でＩＬ−１受容体に競合することで抑制する。ＩＬ−１のアゴニスト効果は、部分的にはＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１受容体の相互作用により調節される。組換えＩＬ−１ｒａの投与は、マウスにおけるＴＮＦ投与による致死率を改善し、ＬＰＳの腹腔内投与は、正常マウスよりもＩＬ−１ｒａノックアウトマウスでより致死的である（Ａｒｅｎｄら，１９９８；Ｅｖｅｒａｅｒｄｔら，１９９４）。一方、内因性ＩＬ−１ｒａを欠損するマウスは正常マウスよりもＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの感染により感受性が低く、これはＩＬ−１は細胞内生物による感染に対する抵抗性に重要な役割を果たしているという考えを支持する。これらの研究は、内因性ＩＬ−１及びＩＬ−１ｒａの間のｉｎ  ｖｉｖｏバランスが感染に対する宿主応答の影響に重要であることを確立する。ウイルスベクターを用いたＩＬ−１ｒａ遺伝子導入は最近関節炎及び虚血性脳障害のような炎症性疾患の実験的動物モデルで調べられた（Ｈｕｎｇら，１９９４；Ｍａｋａｒｏｖら，１９９６；Ｏｔａｎｉら，１９９６；Ｙａｎｇら，１９９７；Ｙａｎｇら，１９９８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら，１９９９）；。これらの研究のデータは、ＩＬ−１ｒａの治療的非有用性及びｉｎ  ｖｉｖｏでの炎症細胞の活性化におけるＩＬ−１の重要な役割を示唆する。本発明の研究は、遺伝子導入によりＩＬ−１ｒａを用いた心筋炎治療のための新規な治療的アプローチを示唆し、そこでは、導入効率がエレクトロポレーションによって増大された。本発明者はさらにＩＬ−１ｒａが心筋損傷を軽減するメカニズムを分析した。ＩＬ−１経路は、心筋層のｉＮＯＳの調節に決定的な役割を果たす（Ｕｎｇｕｒｅａｎｕ−Ｌｏｎｇｒｏｉｓら、１９９５）。ＴＮＦ−αは培養心筋細胞に直接的細胞障害性効果及び負の変力作用を有し、さらに細胞障害性Ｔ細胞を活性化し、それは筋細胞障害を引き起こし得る（Ｐｉｎｓｋｙら，１９９５；Ｙｏｋｏｙａｍａら，１９９３；Ｗｏｏｄｌｅｙら，１９９１）。ＴＮＦ−αが免疫応答の非常に初期の段階で重要な役割を果たすこと、及び抗ＴＮＦ−α  ｍＡｂの投与は急性ウイルス性心筋炎の初期の経路を妨げ得ることが示唆された（Ｙａｍａｄａら，１９９４）。本研究では、ＩＬ−１ｒａでの処置がｉＮＯＳ及びＴＮＦ−α発現の抑制により心筋を保護し得る。
ＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０は両方とも本発明の心筋炎のマウスモデルに有効な処置であったが、ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションそのものによる処置はＥＭＣＶ接種されたマウスの生存率を変化させなかった。ＩＬ−１０はウイルス感染の初期の免疫応答の重要なレギュレータであると考えられる。ウイルス誘導された脳脊髄炎を有するＩＬ−１０ノックアウトマウスで致死率及び炎症は増大する（Ｌｉｎら，１９９８）。最近、本発明者は組換えＩＬ−１０を用いた処置が、致死率及び心筋炎のマウスモデルにおける心臓でのサイトカイン発現を減少することを示した（Ｎｉｓｈｉｏら，１９９９）。本発明では、ｖＩＬ−１０処置はこの実験的心筋炎の効果を強力に改善した。細胞性ＩＬ−１０及びｖＩＬ−１０は多くの免疫抑制特性を共有する：それらは、ともに活性化マウスＴｈ１クローン、ヒト末梢性単核細胞、ヒトナチュラルキラー細胞によるＩＮＦ−γ産生を抑制する（Ｈｓｕら，１９９０；Ｖｉｅｉｒａら，１９９１；ｄｅＷａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔら，１９９１）。以前の報告によると、ＩＦＮ−γの発現の減少は、ｖＩＬ−１０処理群でも観察された。ｖＩＬ−１０はＥＢウイルスにより捕捉された細胞性サイトカインであると考えられる。しかしながら、ＩＬ−１０及びｖＩＬ−１０の効果の間にいくつかの相違がある。ｖＩＬ−１０はＩＬ−１０に比してサイトカイン合成抑制因子としては活性が低いが、それは単球、リンパ球及び肥満細胞に対するＩＬ−１０の免疫刺激活性のいくつかを欠如する。それゆえ、ｖＩＬ−１０は優れた免疫抑制を提供し得る（Ｄｒａｚａｎら，１９９６；Ｄｅｂｒｕｙｎｅら，１９９８；Ｈｅｎｋｅら，２０００）。これらの相違は、ＩＬ−１０と比較して心筋炎の作用を減少する点に関するｖＩＬ−１０の優れた効果を説明し得る。最近、ＩＬ−１０及びｖＩＬ−１０の異なる活性の構造的基礎が解明された（Ｄｉｎｇら，２０００）。該結果は、単一アミノ酸がＩＬ−１０の免疫刺激活性に重要であることを示唆する。本発明者のモデルでは、心筋層におけるｉＮＯＳ発現はまたｖＩＬ−１０処理マウスで抑制され、単球／マクロファージの直接的脱活性化またはＩＦＮ−γの阻害を介した間接的脱活性化を示唆する。ＬＰＳ−刺激白血球では、ＩＬ−１０はｍＲＮＡ安定化によりＩＬ−１ｒａを誘導することが知られ、一方、それはＩＬ−１β、ＴＮＦ及びＩＬ−８の産生を抑制する（Ｃａｓｓａｔｅｌｌａら，１９９４；Ｃｈｏｍａｒａｔら，１９９５）。ｖＩＬ−１０がＩＬ−１ｒａを誘導するかどうかは不明であるが、ｖＩＬ−１０を導入されたマウスはＩＬ−１ｒａの上昇した血清濃度（８７４ｐｇ／ｍｌ）を示す。このｖＩＬ−１０の付加的な効果は、ＩＬ−１ｒａと比較して、そのより高い有効性を説明するかもしれない。
サイトカイン発現の１つの一般的な効果はｉＮＯＳの誘導である。一酸化窒素（ＮＯ）はＥＭＣＶにより誘導されるサイトカインに応答した亜急性期中に生成される。一酸化窒素は両刃の剣である（Ｂｅｃｋｍａｎら，１９９０；Ｂｅｃｋｍａｎ，１９９１）。一酸化窒素は免疫学的自己防御メカニズムのモジュレーターとして有用であり、同時に、それは病原菌を殺すのに重要な役割を果たす。逆に、ｉＮＯＳにより産生される過剰の一酸化窒素もウイルス性心筋炎及び自己免疫性心筋炎において心筋組織に有害な効果を与える。炎症性サイトカインの直接のネガティブ変力効果が一酸化窒素により介在されるかもしれない（Ｂａｌｌｉｇａｎｄら，１９９３；Ｕｎｇｕｒｅａｎｕ−Ｌｏｎｇｒｏｉｓら，１９９５）。この研究では、ｉＮＯＳ発現はＩＬ−１ｒａおよびｖＩＬ−１０投与の両方で抑制され、これは、一酸化窒素が心筋炎における心筋損傷のターミナルエフェクターであることを示唆する。結論として、本発明者は、（１）ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションがｉｎ  ｖｉｖｏでサイトカインサイトカイン遺伝子を導入する有効な方法であること、（２）抑制性サイトカインＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０の遺伝子導入が心筋炎のマウスモデルの死亡率を低下させること、（３）治療効果は心臓における免疫抑制性サイトカインの阻害にあることを実証した。これらの結果は、サイトカイン治療を開発する根拠を強力に支持し、ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションによるサイトカイン治療は心筋炎だけでなく、他の心血管系疾患に対する新規な治療的アプローチを切り開くものである。
本発明の治療剤によれば、免疫抑制性サイトカインを生体内で持続的に産生・放出することが可能となり、高価なサイトカイン蛋白質を頻回投与する必要がない。
また、疾患に関係する免疫抑制性サイトカインの種類を適切に選択し、あるいは組み合わせることにより、高レベルの免疫抑制性サイトカインを血液中で得ることができ、１以上の炎症・腫瘍性疾患を効率的に治療することができる。
本明細書に記載した文献を以下に列挙する。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜図１Ｄは、導入遺伝子の発現を示す。
図１Ａは、１７−ｋＤａ蛋白質の成功した発現及びマウスＩＬ−１ｒａの正確なサイズを示すｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａでトランスフェクトされたＢＭＴ−１０細胞由来の培養上清のイムノブロットである。各レーンは、ｐＣＡＧＧＳでトランスフェクトされた細胞及びｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａでトランスフェクトされた細胞、及び組換えマウスＩＬ−１ｒａを示す。
図１Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションの５日後のＩＬ−１ｒａの血清レベルである。ＩＬ−１ｒａ濃度は、ＥＭＣＶ−接種マウス（ｎ＝５）は未感染コントロールマウス（ｎ＝４）（ｐ＜０．００５）より３．５倍高く、ＩＬ−１ｒａ遺伝子導入（ＩＬ−１ｒａ−ＥＭＣＶ）（ｎ＝５）は、ＥＭＣＶ−接種マウス（ＰＢＳ−ＥＭＣＶ）よりもさらに１．９倍（ｐ＜０．０１）血清ＩＬ−１ｒａレベルを増加させる。
図１Ｃにおいて、タイムコースは、ＩＬ−１ｒａの血清濃度は（０日目と比較して、ｐ＜０．０１）第５日にピークとなり、その後徐々に減少する（それぞれｎ＝３）。
図１Ｄにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションの導入５日目の血中濃度はＩＬ−１ｒａ（１７３４ｐｇ／ｍｌ），ｖＩＬ−１０（２２９４ｐｇ／ｍｌ）（それぞれｎ＝５）であった。
図２Ａ〜図２Ｃは、ＥＭＣＶ接種後の生存曲線を示す。
図２Ａにおいて、生存曲線の分析は、ＩＬ−１ｒａ処理群（○；ｎ＝１７）がＰＢＳ−処理群（□；ｎ＝２９）よりも有意に高い生存率を示した（ｐ＜０．０５）。
図２Ｂにおいて、ｖＩＬ−１０遺伝子導入（□；ｎ＝１９）もＰＢＳ処理（○；ｎ＝２７）と比較してＥＭＣＶで接種されたマウスの死亡率を減少した（ｐ＜０．０１）。
図２Ｃにおいて、空のｐＣＡＧＧＳ導入（□；ｎ＝１０）はＰＢＳ処理（○；ｎ＝１０）と比較して生存曲線を変化しない。
図３Ａは、組織学的知見である。図３Ａにおいて、心筋浸潤の定量的病理学的スコアは、ＩＬ−１ｒａ処理群及びｖＩＬ−１０処理群（各々ｎ＝５）の両方における有意な改善を示す（ＩＬ−１ｒａ処理群ｖｓコントロール、ｐ＜０．０１；ｖＩＬ−１０処理群ｖｓコントロールｐ＜０．０１）。下のパネルは各群の代表的な組織学的結果を示す。
図３Ｂは、可溶性ｃ−ｋｉｔ遺伝子導入によるＥＭＣＶ接種後６日後の組織学的知見を示す。図３Ｂにおいて、細胞浸潤の定量的病理学的スコアは可溶性ｃ−ｋｉｔ処理群（ｎ＝７、１．４±０．７平均±標準偏差）で空プラスミド群（ｎ＝９、０．９±０．４）に対し有意な改善を示す（ｐ＜０．０５）。
図４は、心臓におけるサイトカイン発現を示す。図４ＡのＩＬ−１ｒａ導入マウスにおいて、心臓におけるＴＮＦ−α及びｉＮＯＳの発現レベルは有意に減少した（各々ｎ＝５）。図４ＢのｖＩＬ−１０導入マウスにおいて、心臓におけるＩＦＮ−γ及びｉＮＯＳの発現レベルは有意に減少した。ＩＬ−１βもｖＩＬ−１０処理群において減少した（各々ｎ＝５）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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