(57)【要約】本発明は、ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物を有効成分として用いるいることにより、心筋細胞のアポトーシスを抑制する薬剤、虚血再灌流障害を治療する薬剤、心筋梗塞を治療する薬剤、心筋症を治療する薬剤、および心筋炎を治療する薬剤を提供する。また本発明は、心筋細胞のアポトーシス抑制作用、虚血再灌流障害抑制作用、心筋梗塞抑制作用、心筋症抑制作用、および心筋炎抑制作用のうち少なくとも１つ以上の作用を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
2003018058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物を有効成分とする心筋細胞のアポトーシス抑制剤。
【請求項２】
心筋細胞のアポトーシスがカルシウム過負荷および／または酸化ストレスを惹起する疾患により誘導されるアポトーシスである請求項１に記載のアポトーシス抑制剤。
【請求項３】
カルシウム過負荷および／または酸化ストレスを惹起する疾患が虚血再灌流障害、心筋梗塞、心筋症または心筋炎である請求項２に記載のアポトーシス抑制剤。
【請求項４】
ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物がニコランジルである請求項１から３のいずれか一項に記載の心筋細胞のアポトーシス抑制剤。
【請求項５】
ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物を有効成分とする虚血再灌流障害治療剤および／または心筋梗塞治療剤および／または心筋症治療剤および／または心筋炎治療剤。
【請求項６】
ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物がニコランジルである請求項５に記載の虚血再灌流障害治療剤および／または心筋梗塞治療剤。
【請求項７】
ＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する薬剤と併用することを特徴とする、ＮＯ供与作用を有する化合物を有効性成分とする虚血再灌流障害治療剤および／または心筋梗塞治療剤および／または心筋症治療剤および／または心筋炎治療剤。
【請求項８】
ＮＯ供与作用を有する薬剤と併用することを特徴とする、ＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する化合物を有効成分とする虚血再灌流障害治療剤および／または心筋梗塞治療剤および／または心筋症治療剤および／または心筋炎治療剤。
【請求項９】
心筋細胞のアポトーシスを抑制する方法であって、心筋細胞内のリン酸化Ｂａｄ量を増加させるのに十分量のＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物を心筋細胞に接触させることを含む方法。
【請求項１０】
心筋細胞のアポトーシス抑制作用、虚血再灌流障害抑制作用、心筋梗塞抑制作用、心筋症抑制作用、心筋炎抑制作用のうち、少なくとも１つ以上の作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）細胞と被検化合物とを接触させる工程、
（２）前記細胞内に存在するリン酸化されたＢａｄタンパク質を定量する工程、
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法によって得られる化合物を有効成分とする、心筋細胞のアポトーシス抑制剤および／または虚血再灌流障害治療剤および／または心筋梗塞治療剤および／または心筋症治療剤および／または心筋炎治療剤。
【請求項１２】
心筋細胞のアポトーシス抑制のための有効量のＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物およびその使用説明書を含む心筋細胞のアポトーシス抑制用キット。
【請求項１３】
心筋細胞のアポトーシスがカルシウム過負荷および／または酸化ストレスを惹起する疾患により誘導されるアポトーシスである請求項１２に記載のアポトーシス抑制用キット。
【請求項１４】
カルシウム過負荷および／または酸化ストレスを惹起する疾患が虚血再灌流障害、心筋梗塞、心筋症または心筋炎である請求項１３に記載のアポトーシス抑制用キット。
【請求項１５】
ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物がニコランジルである請求項１２から１４のいずれか一項に記載の心筋細胞のアポトーシス抑制用キット。
【請求項１６】
虚血再灌流障害治療のためのおよび／または心筋梗塞治療のための有効量のＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物並びにその使用説明書を含む虚血再灌流障害治療用および／または心筋梗塞治療用および／または心筋症治療用および／または心筋炎治療用キット。
【請求項１７】
ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物がニコランジルである請求項１６に記載の虚血再灌流障害治療用および／または心筋梗塞治療用および／または心筋症治療用および／または心筋炎治療用キット。
【請求項１８】
ＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する薬剤と併用することを特徴とする、虚血再灌流障害治療のためのおよび／または心筋梗塞治療のためのおよび／または心筋症治療のためのおよび／または心筋炎治療のための有効量のＮＯ供与作用を有する化合物並びにその使用説明書を含む虚血再灌流障害治療用および／または心筋梗塞治療用および／または心筋症治療用および／または心筋炎治療用キット。
【請求項１９】
ＮＯ供与作用を有する薬剤と併用することを特徴とする、虚血再灌流障害治療のためのおよび／または心筋梗塞治療のためのおよび／または心筋症治療のためのおよび／または心筋炎治療のための有効量のＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する化合物並びにその使用説明書を含む虚血再灌流障害治療用および／または心筋梗塞治療用および／または心筋症治療用および／または心筋炎治療用キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物を有効成分とする心筋細胞のアポトーシス抑制剤、虚血再灌流障害治療剤、および心筋梗塞治療剤、当該化合物を用いた心筋細胞のアポトーシスを抑制する方法、心筋細胞のアポトーシス抑制作用、虚血再灌流障害抑制作用、および心筋梗塞抑制作用のうち少なくとも１つ以上の作用を有する化合物をスクリーニングする方法、並びに、心筋細胞のアポトーシス抑制、虚血再灌流障害治療、および心筋梗塞治療のための有効量のＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物およびその使用説明書を含むキット、に関する。
背景技術
心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患により引き起こされる冠血流量の低下、あるいは途絶による酸素供給量の低下は、心筋細胞のエネルギー産生を阻害し、心機能の低下、さらには心筋細胞の不可逆的な細胞傷害をもたらす。そのため、虚血性心疾患発症時には速やかな血行の回復が求められる。しかしながら、虚血後に冠動脈の血行の回復を求めて再灌流を行って酸素供給を再開させると、心筋壊死や気絶心筋（ｓｔｕｎｎｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）の様な心筋傷害がむしろ増悪されることがよく知られている。特に、再灌流後に生じる梗塞巣の増大は虚血再灌流傷害として呼ばれ、虚血再灌流傷害を抑制する方法あるいは薬剤が望まれている。
虚血再灌流傷害は種々の要因によって誘導されるが、心筋細胞の壊死に加え、心筋細胞のアポトーシスが誘導されることが原因のひとつと考えられている。これまでに、虚血再灌流傷害の抑制に働くことが知られている虚血耐性（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ：ＩＰ）は、好中球の蓄積を抑制し、ＢＡＸの発現を低下させることにより心筋細胞のアポトーシスを減少させることが示唆されている。
一方、ニコランジル（Ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ：ＮＣＲ）はＮｉｔｒａｔｅ（硝酸薬）様のＮＯ供与作用（ＮＯドナー作用）に加え、ＫＡＴＰチャンネル開口作用を併せ持つことが示されており、動物の虚血再灌流モデルにおいて梗塞巣の減少を示すことが確認されている（Ｓａｎａｄａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２８０（１），２５６−２６３（２００１）；Ｍｅｎａｓｃｈｅ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１１０（６），１６０６−１６１３（１９９５））。また、心筋細胞を用いた酸化ストレスによるアポトーシス誘導においては、ｐ５３の発現量が上昇するが、ＢａｘやＢｃｌ−２の発現量は変化しないが、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）刺激においては、Ｂａｄタンパク質量を増加させ、ＢａｘとＢａｄの細胞質からミトコンドリアへのトランスロケーションを誘導し、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃの放出、ＣＰＰ３２の活性化とｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ切断が起こることが知られているが、その他のアポトーシス誘導機序が存在することが示唆さている（Ｈａｒｓｄｏｒｆ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９９，２９３４−２９４１（１９９９））。
しかしながら、上述のように虚血再灌流傷害は種々の要因によって引き起こされるため、どのような作用機序によりニコランジルの梗塞巣の減少作用が誘導されているのか未だ不明である。また、ニコランジルが心筋細胞のアポトーシスを直接的に抑制するかどうかについても明らかになっていない。
虚血再灌流傷害は，心筋細胞が細胞膜障害を受けた状態で血流が再開するために情報伝達にかかわっているカルシウムの細胞内濃度が急増し，細胞に大きな負担をかけるために起こると考えられている。また、近年，再灌流時の活性酸素などのフリーラジカルの発生が再灌流障害を増幅していると考えられている。
発明の開示
本発明は、心筋細胞のアポトーシスを抑制する薬剤、虚血再灌流障害を治療する薬剤、心筋梗塞を治療する薬剤、心筋症を治療する薬剤、および心筋炎を治療する薬剤、並びに、心筋細胞のアポトーシス抑制作用、虚血再灌流障害抑制作用、心筋梗塞抑制作用、心筋症抑制作用、および心筋炎抑制作用のうち少なくとも１つ以上の作用を有する化合物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の虚血再灌流時の心筋細胞のアポトーシスに関与していると考えられる細胞内カルシウム過負荷や酸化ストレスに対するニコランジルの作用について鋭意研究した結果、カルシウムイオノファーによる細胞内Ｃａ過負荷や、過酸化水素による酸化ストレスによって誘導される心筋細胞のアポトーシスにおいて、ニコランジルが直接的に心筋細胞のアポトーシスを抑制することを見いだした。さらに、ニコランジルの心筋細胞のアポトーシス抑制作用は、ＫＡＴＰチャンネル開口作用とＮＯ供与作用の両方によってもたらされていること、ＰＫＣを活性化することでＢａｄのリン酸化を増大し、その結果、アポトーシスの誘導が抑制されていることを明らかにした。
すなわち、本発明は、ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物を有効成分とする心筋細胞のアポトーシス抑制剤を提供する。
また、本発明は、ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物を有効成分とする虚血再灌流障害治療剤および／または心筋梗塞治療剤および／または心筋症治療剤および／または心筋炎治療剤を提供する。
さらに、本発明は、ＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する薬剤と併用することを特徴とする、ＮＯ供与作用を有する化合物を有効性成分とする虚血再灌流障害治療剤および／または心筋梗塞治療剤および／または心筋症治療剤および／または心筋炎治療剤を提供する。
加えて、本発明は、ＮＯ供与作用を有する薬剤と併用することを特徴とする、ＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する化合物を有効成分とする虚血再灌流障害治療剤および／または心筋梗塞治療剤および／または心筋症治療剤および／または心筋炎治療剤を提供する。
加えて、本発明は、心筋細胞のアポトーシスを抑制する方法であって、心筋細胞内のリン酸化Ｂａｄ量を増加させるのに十分量のＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物を心筋細胞に接触させることを含む方法を提供する。
さらに、本発明は、心筋細胞のアポトーシス抑制作用、虚血再灌流障害抑制作用、心筋梗塞抑制作用、心筋症抑制作用、および心筋炎抑制作用のうち、少なくとも１つ以上の作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）細胞と被検化合物とを接触させる工程、
（２）前記細胞内に存在するリン酸化されたＢａｄタンパク質を定量する工程、
を含む方法を提供する。
さらに、本発明は、上記スクリーニング方法によって得られる化合物を有効成分とする、心筋細胞のアポトーシス抑制剤および／または虚血再灌流障害治療剤および／または心筋梗塞治療剤および／または心筋症治療剤および／または心筋炎治療剤を提供する。
さらに、本発明は、心筋細胞のアポトーシス抑制のための有効量のＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物およびその使用説明書を含む心筋細胞のアポトーシス抑制用キットを提供する。
さらに、本発明は、虚血再灌流障害治療のためのおよび／または心筋梗塞治療のためのおよび／または心筋症治療のためのおよび／または心筋炎治療のための有効量のＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物並びにその使用説明書を含む虚血再灌流障害治療用および／または心筋梗塞治療用および／または心筋症治療用および／または心筋炎治療用キットを提供する。
さらに、本発明は、ＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する薬剤と併用することを特徴とする、虚血再灌流障害治療のためのおよび／または心筋梗塞治療のためのおよび／または心筋症治療のためのおよび／または心筋炎治療のための有効量のＮＯ供与作用を有する化合物並びにその使用説明書を含む虚血再灌流障害治療用および／または心筋梗塞治療用および／または心筋症治療用および／または心筋炎治療用キットを提供する。
さらに、本発明は、ＮＯ供与作用を有する薬剤と併用することを特徴とする、虚血再灌流障害治療のためのおよび／または心筋梗塞治療のためのおよび／または心筋症治療のためのおよび／または心筋炎治療のための有効量のＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する化合物並びにその使用説明書を含む虚血再灌流障害治療用および／または心筋梗塞治療用および／または心筋症治療用および／または心筋炎治療用キットを提供する。
発明を実施するための最良の形態
心筋細胞とは、心臓を構成する細胞であり、特に、心臓壁を構成する細胞を指し、心室筋細胞と心房筋細胞を含む。心臓壁は、心内膜、心筋層、心外膜の３層からなるが、本発明の心筋細胞は心内膜、心筋層、心外膜のいずれを構成する細胞であってもよい。心筋梗塞巣は、発症の程度により一層に限局した梗塞巣から、多層にまたがる梗塞巣まで多岐にわたる。従って、本発明の薬物は、これらいずれかの心筋細胞のアポトーシス、いずれかの心筋細胞が含まれる虚血再灌流障害または心筋梗塞を抑制することができる。
アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）とは、１９７２年に英国のＨ．Ｋｅｒｒ氏とＡ．Ｈ．Ｗｙｌｌｅ氏が提唱した壊死とは異なる細胞死である。アポトーシスは形態学的には，核の凝縮、細胞縮小、空胞化・細胞表面の平滑化、細胞間間隙の拡大、周囲からの細胞の遊離、細胞の断片化（アポトーシス小体）、マクロファージなどによる貪食のプロセスを経て起こると考えられている。生化学的にはＤＮＡ分解酵素が活性化され，ヌクレオソームごとにＤＮＡが断片化（１８０塩基）されることを特徴とする。従って、被検細胞からＤＮＡを抽出し、電気泳動等の分析手段により断片化したＤＮＡが橋桁（ＤＮＡラダー）状に観察できれば細胞がアポトーシスを起こしていることを確認することができる。尚、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）は、細胞膜・ミトコンドリアの障害、細胞の膨潤、エネルギー生産障害、細胞内浸透圧制御不全、細胞融解のプロセスを経る。従って、壊死細胞ではＤＮＡラダーを明確に確認することができない。また、壊死では、壊死した細胞から放出された蛋白分解酵素などによって壊死細胞の周辺で炎症が引き起こされるが，アポトーシスではアポトーシス細胞周辺での炎症は引き起こされない。
ＫＡＴＰチャンネルは、ＡＴＰ感受性カリウムチャンネル（ＡＴＰ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｋ  ｃｈａｎｎｅｌ：ＫＡＴＰチャンネル）とも呼ばれ、カリウム輸送性イオンチャンネルの一種であり、細胞内ＡＴＰによって阻害される特徴を有する（Ｎｏｍａ  Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，１４７−１４８（１９８３））。ＫＡＴＰチャンネルは、神経細胞、膵臓のβ細胞、平滑筋細胞をはじめ、多くの細胞で発現していることが知られている。ＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する化合物は既に多数知られており、ニコランジル、クロマカリム（ｃｒｏｍａｋａｌｉｍ）、レマカリム（ｌｅｍａｋａｒｉｍ）、ピナシジル（ｐｉｎａｃｉｄｉｌ）、アプリカリム（ａｐｒｉｋａｌｉｍ）、ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、ジアゾキシド（ｄｉａｚｏｘｉｄｅ）等を例示することができる（Ｓａｔｏｈ  Ｙ．，Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊａｐｏｎ，１００，２１９−２２７（１９９２））。
本発明のＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する化合物は、少なくとも心筋細胞に発現するＫＡＴＰチャンネルを活性化する化合物であればよいが、好ましくは心筋細胞に発現するＫＡＴＰチャンネルを特異的に活性化する化合物である。尚、ＫＡＴＰチャンネル開口作用とＫＡＴＰチャンネル活性化作用は同義であり、いずれもＫＡＴＰチャンネルを介するカリウムイオン輸送を惹起する作用を指す。ＫＡＴＰチャンネル開口作用を測定するには、微小電極を用いたパッチクランプ法により細胞膜電位を測定すればよい。少なくともニコランジルと同等以上のＫＡＴＰチャンネル開口活性を有する化合物は本発明に使用することができる。
ＫＡＴＰチャンネルを阻害する化合物も既に多数知られており、グリベンクラミド（ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ）、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）、４−アミノピリジン（４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）等が例示される。これらの化合物を適宜組み合わせて使用すればＫＡＴＰチャンネル自体の同定や、ＫＡＴＰチャンネル開口作用を有する化合物の特異性を決定することができる。また、心筋細胞に発現するＫＡＴＰチャンネルを特異的に開口する化合物を選択するためには、心筋細胞とその他の細胞、例えば神経細胞や膵臓のβ細胞を用意し、これらの細胞に被検化合物を接触させ、各細胞の細胞膜電位を測定すればよい。
ＮＯ供与作用とは生体内においてＮＯ（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）を放出する作用であり、ＮＯドナー作用とも呼ばれる。従って、ＮＯ供与作用を有する化合物とは、生体内において、ＮＯの供給源として作用し、ＮＯを放出することができる化合物を指す。生体内は血中であってもよいし、細胞内であってもよく、細胞間隙、あるいは細胞外マトリックス中であってもよい。
ＮＯ供与作用を有する化合物は、生体内に本来存在する物質でもよいし、生体内には存在しない物質であってもよい。ＮＯ供与作用を有する化合物がＮＯを放出するメカニズムは幾つか知られているが、化学的な分解によりＮＯを放出する過程と酵素的にＮＯを放出する過程に分かれる。たとえば、ニトロプルシドナトリウム塩（ｓｏｄｉｕｍ  ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ）、ヒドロキシルアミン、酸性亜硝酸塩（ａｃｉｄｉｆｉｅｄ  ｎｉｔｒａｔｅ）、モルシドミン（ｍｏｌｓｉｄｏｍｉｎｅ）、シドノミニン（ｓｙｄｏｎｏｍｉｎｉｎｅ）、さらには、有機亜硝酸類（ｏｒｇａｎｉｃ  ｎｉｔｒｉｔｅ；Ｒ−ＯＮＯ）、ニトログリセリンやニコランジルに体表される有機硝酸類（ｏｒｇａｎｉｃ  ｎｉｔｒａｔｅ；Ｒ−ＯＮＯ２）、Ｓ−ニトロソチオール類（ｓ−ｎｉｔｒｏｓｏｔｈｉｏｌｓ；Ｒ−Ｓ−ＮＯ）等が例示される（Ｂａｕｅｒ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３４，３６１−３８１（１９９５））。生体内においてＮＯを放出する活性を有する限り本発明のＮＯ供与作用を有する化合物に含まれる。
ＮＯ供与作用を測定する方法は種々知られており、適宜選択して使用することができる。例えば、血管平滑筋の弛緩度により測定する方法、グリース試薬（Ｇｒｉｅｓｓ’  ｒｅａｇｅｎｔ）による発色法、ＤＡＮ試薬（２，３−ジアミノナフタレン）を用いる蛍光法、ルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）を用いる化学発光法、ＤＢＮＢＳ（２，５−ジブロモ−４−ニトロベンゼン）を用いる電子スピン共鳴法、メトログロブリンによる分光学的測定法、ポルフィリン重合体を用いる電気的測定法、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾニウム）を用いるＮＡＤＰＨディアフォレース染色法等、をあげることができる。本発明に使用できるＮＯドナー活性を有する薬物は、上記いずれかの測定方法において、少なくともニコランジル以上の活性を有すればよい。
本発明の化合物および被検化合物としては特に制限はなく、例えば、合成有機化合物、ペプチド、非ペプチド性化合物、天然化合物、細胞抽出物、細胞培養上清培養液、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製もしくは粗精製タンパク質が挙げられる。好ましくは、合成有機化合物であり、分子量２０００以下の合成低分子化合物、さらに好ましくは分子量１０００以下の合成低分子化合物である。
カルシウム過負荷とは、細胞内のカルシウム濃度が正常レベルよりも上昇する状態を指し、虚血再灌流障害、心筋梗塞、心筋症、心筋炎等の種々の疾患において誘導される。試験管内で細胞内カルシウム濃度を上昇させるには、Ａ２３１８７等のカルシウムイオノファーを使用すればよい。また、酸化ストレスとは、生体内に生じた活性酸素などのフリーラジカルによってタンパク質が酸化される、あるいは切断されることによって細胞に機能障害が生じること、あるいは細胞に機能障害を生じさせる過程を指す。試験管内で酸化ストレスを誘導するには、細胞の培養液中に過酸化水素水を添加すればよい。酸化ストレスを惹起する疾患には、虚血再灌流障害、心筋梗塞、心筋症、心筋炎等がある。従って、虚血再灌流傷害、心筋梗塞、心筋症、心筋炎では、カルシウム過負荷と酸化ストレスの両方が細胞に傷害を誘導する。
ニコランジルは、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ニコチンアミド硝酸エステルの一般名であり、狭心症治療剤として市販されている化合物である。本発明に使用する場合、市販のニコランジル錠剤または注射用製剤をそのまま用いてもよいが、例えば、特開昭５２−１２２３７３号公報等に記載された方法で製造したものを用いてもよい。
抑制剤、治療剤、薬剤は、いずれも医薬品として人体に投与可能な組成物であり、少なくともひとつ以上の有効成分を含有する医薬組成物を指す。医薬組成物は、通常、有効成分以外の薬理学的に許容できる担体もしくは媒体を含有し、公知の製剤学的方法により製剤化される。例えば、経口投与用製剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤が挙げられ、非経口投与用製剤としては注射剤をあげることができる。薬理学的に許容できる単体もしくは媒体としては、界面活性剤、安定化剤、乳化剤、植物油、賦形剤、防腐剤、結合剤、潤滑剤、膨化剤、等張剤、等を適宜組み合わせて使用することができる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントゴム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳酸またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状単体を含有することができる。
注射のための無菌組成物は、注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填されるか、シリンジに充填し、そのまま使用できるようにすることも可能である。
本発明におけるキットは、ＫＡＴＰチャンネル開口作用および／またはＮＯ供与作用を有する化合物を有効成分とし、薬理学的に許容できる担体もしくは媒体を含有し、公知の製剤学的方法により製剤化した抑制剤、治療剤、薬剤およびその使用説明書または指示書を含む。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、障害あるいは症状の程度、投与方法などにより変動するが、当業者であれば、適当な投与量を適宜選択することができる。例えば、経口的に投与される場合、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは５０ｍｇ〜３００ｍｇを一回に投与することができる。
Ｂａｄタンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーの一員であり、アポトーシス誘導性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）のメンバーのひとつと考えられている。一般に、Ｂｃｌ−２ファミリーはＢｃｌ−２  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＢＨ１−４）の全てあるいは一部を有し、アポトーシス抑制性（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）とアポトーシス誘導性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）のタンパク質が含まれている。アポトーシス抑制性タンパク質としては、Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−ＸＬ，Ｂｃｌ−Ｗ，ＭＣＬ−１等が含まれる。一方、アポトーシス誘導性タンパク質には、Ｂａｘ，Ｂａｋ，Ｂｏｋ／ＭＴＤ，Ｂｃｌ−Ｘｓが含まれる。
Ｂａｄタンパク質はＢｃｌ−２  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎｓのうちＢＨ３のみを有し、アポトーシス抑制性に作用するＢｃｌ−ＸＬ等に結合し、Ｂｃｌ−ＸＬのアポトーシス抑制作用を阻害することが示唆されている。また、Ｂａｄタンパク質の１１２位と１３６位のＳｅｒ残基がリン酸化を受け、当該リン酸化がＢａｄタンパク質の活性を調節していることが示されている（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ  Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６４，３４３−３５０（１９９９）；Ｈａｒｓｄｏｒｆ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９９，２９３４−２９４１（１９９９））。
Ｂａｄタンパク質のリン酸化を促進する化合物をスクリーニングするためには、細胞、好ましくは心筋細胞に被検化合物を接触させて、当該細胞中に存在するＢａｄタンパク質のリン酸化量を定量すればよい。細胞と被検化合物を接触させるには、細胞の培養液中に、被検化合物を溶解した溶液を添加すればよい。被検化合物を溶解する溶媒としては、被検化合物の特性により適宜選択することができる。例えば、水溶性の高い被検化合物であれば、生理食塩水や細胞培養液を用いることができる。水溶性が低い被検化合物の場合には、エタノール、ＤＭＳＯ，ＤＭＦ等の有機溶媒を用いることができる。有機溶媒の効果を差し引くために、対照として、被検化合物を含まない有機溶媒を対照として用いることが好ましい。
被検化合物と接触させた細胞内におけるリン酸化Ｂａｄタンパク質の量を定量するには、まず、細胞から細胞内タンパク質を抽出する。細胞内に存在するタンパク質を抽出する方法は当業者であれば適宜選択することができる。必要に応じて、対照として、被検化合物を接触させない細胞を用意し、被検化合物を接触させた場合のリン酸化Ｂａｄタンパク質の量と、被検化合物を接触させなかった場合のリン酸化Ｂａｄタンパク質の量とを比較してもよい。
Ｂａｄタンパク質を定性的、あるいは定量的に測定するには、市販の抗Ｂａｄタンパク質抗体を使用すればよい。また、リン酸化Ｂａｄタンパク質に対する特異抗体も市販の試薬として入手可能である。リン酸化されたＢａｄタンパク質とリン酸化されていないＢａｄタンパク質の両方を認識する抗体と、リン酸化Ｂａｄタンパク質を特異的に認識する抗体をもちいれば、リン酸化Ｂａｄタンパク質を定性的、あるいは定量的に測定することができる。例えば、抗Ｂａｄタンパク質抗体にアルカリフォスファターゼ等の酵素を直接結合し、種々の方法によりＢａｄタンパク質に結合した酵素量を測定すればよい。通常は、酵素の基質の変換量を比色法により測定することが好適に用いられる。測定方法としてはドットブロット法により検出してもよいし、ＥＬＩＳＡ法により検出してもよい。また、電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写して、膜上に存在する量を測定してもよい。さらに、一旦抗Ｂａｄタンパク質に対する抗体を反応させた後、当該抗Ｂａｄ抗体に対する酵素標識二次抗体を反応させてもよい。二次抗体に結合させる酵素としては、一次抗体の場合と同様にアルカリフォスファターゼ等を使用することができる。
実施例
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験材料と方法
（１）心筋細胞の調製
実験に用いる心筋細胞として、新生仔ラット培養心室筋細胞（ＮＲＶＭｓ）を使用した。すなわち、生後０−１日齢の新生仔ラット（Ｗｉｓｔｅｒ，中部資材より妊娠ラットを購入）から心臓を摘出し、心室部分からｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ２（ＩＩ型コラゲナーゼ）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社））とｐａｎｃｒｅａｔｉｎ（パンクレアチン）（Ｓｉｇｍａ社））を用いて酵素的に心筋細胞を単離し（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ０．５ｍｇ／ｍｌ，ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ  ０．６ｍｇ／ｍｌ，４回の処理）、初代培養を行った。酵素的に採取した細胞をプレートに播種し、３０分間静置した後、非接着性細胞を回収することで、線維芽細胞を除去した。得られた心筋細胞は１ｘ１０５細胞／ｃｍ２の密度で１％  ｇｅｌａｔｉｎ（ゼラチン）でプレコートした６−ウエルプレートまたは７５ｃｍ２フラスコ上に播種し、ＤＭＥＭ：Ｍｅｄｉｕｍ  １９９（培地１９９）＝４：１、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ウシ胎仔血清）（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ社）、０．１ｍＭ  ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ブロモデオキシウリジン）（ＢｒｄＵ；Ｒｏｃｈｅ社）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（ペニシリン）（５０ｕｎｉｔｓ（単位）／ｍｌ；ＧＩＢＣＯ社）、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ストレプトマイシン）（５０μｇ／ｍｌ；ＧＩＢＣＯ社）から成る培地（ｍｅｄｉｕｍ）中で３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間培養した。尚、培養はＣＯ２インキュベーターにより３７℃の条件で行った。その後、ｍｅｄｉｕｍは上記のｍｅｄｉｕｍからＦＢＳを除いたｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ（無血清培地）にｉｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｓｅｌｅｎｉｕｍ（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）（ＩＴＳ；ＧＩＢＣＯ社）を加えたものに交換した。これらの細胞はｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍに交換してから２４時間後に実験に使用した。心筋細胞特異的な抗体（α−ａｃｔｉｎｉｎ（α−アクチニン）抗体）による免疫細胞染色の後、顕微鏡観察により心筋細胞の割合を測定した結果、この時点で、細胞の９０％以上が心筋細胞であった。
（２）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（フローサイトメトリー）解析
Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ解析はＣｏｕｌｔｅｒ社製ＥＰＩＣＳＸＬと専用のソフトウエアを用いて行った。１Ｘ１０６細胞／ｗｅｌｌで培養した培養液中の浮遊心筋細胞を回収した後、トリプシン化により粘着心筋細胞を同一チューブに回収した。遠心後、ペレットをＰＢＳで洗浄した後、７０％  ＥｔＯＨを加え、室温で２０分以上放置し、細胞を固定した。固定後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、５０μＬのＲＮａｓｅ（ＲＮアーゼ）（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ社）を加え、３７℃で４０分間反応させた。その後、室温に適宜放置した後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、約２５０μＬのＰＢＳを加えて細胞懸濁液を調製した。２５０μＬのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ヨウ化プロピジウム）（２５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ社）を加えてよく懸濁し、室温で２０分以上放置した後、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ解析を行った。Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅによる核染色がＳｕｂ−Ｇ１ピークを示す細胞をアポトーシスが誘導された細胞としてカウントし、測定した全細胞数（１ｘ１０４細胞）に対するＳｕｂ−Ｇ１ピークを示した細胞の割合を算出し、アポトーシスが誘導された細胞の割合とした。
（３）Ｌａｄｄｅｒ  Ａｓｓａｙｓ（ラダーアッセイ）
上記と同様に浮遊心筋細胞と粘着心筋細胞を同一チューブに回収した後、３７０μＬのｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（溶解バッファー）（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ａｎｄ  ０．５％  ＳＤＳ）を加えて、ｔｏｔａｌ  ＤＮＡを回収した。すなわち、Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ（細胞溶解物）をエッペンドルフチューブに移した後、最終濃度１ｍｇ／ｍｌでｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（蛋白分解酵素Ｋ）（ＧＩＢＣＯ社）処理をした。Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを３７℃、一晩で分解した後、氷冷した。最終濃度１．３ＭのＮａＣｌを加え、沈殿物を遠心により除去した。上清をｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（フェノール−クロロホルム）抽出した後、ＥｔＯＨ沈殿することにより、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を分離した。ＤＮＡは７０％  ＥｔＯＨで洗浄後、ＴＥ（ｐＨ８．０）で再懸濁した後、ＲＮａｓｅ（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）で３７℃、３０−６０分間分解した。１０μｇのＤＮＡを各レーンに注入（ｌｏａｄ）し、２％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（アガロースゲル）上で電気泳動し、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅで染色した後、ＵＶ照射により可視化した。Ｌａｄｄｅｒ形成が観察された場合にフラグメンテーションが起こった細胞とした。
（４）Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（免疫細胞化学）
細胞を４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（パラホルムアルデヒド）で固定し、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（トリトンＸ−１００）と２％  ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ（正常ヤギ血清）を含むＰＢＳで３０分間処理した後、ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  α−ａｃｔｉｎｉｎ抗体（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）、ｎａｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ（天然チトクロームＣ）に対するマウスモノクローナル抗体（１：５００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）で室温で１時間ｉｎｃｕｂａｔｅ（インキュベート）した。二次抗体はＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ（ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ）（１：１００，ＭＢＬ社）を用いた。ＤＮＡ結合色素ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社）で核を染色した。
（５）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ウェスタンブロット分析）
浮遊心筋細胞と粘着心筋細胞を回収し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２ｍＭ  ＥＤＴＡ，３ｍＭ  ＥＧＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ，２５０ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ（ショ糖），１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（アプロチニン），１０μＭ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（ロイペプチン），０．１ｍＭ  ＰＭＳＦから成るｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで４℃で１時間溶解した。Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅのタンパク濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した後、２Ｘｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（２ｘサンプルバッファー）で可溶化した後９５℃で３分間煮沸した。５０μｇを各レーンに注入し、１２．５％  ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル）上で電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。Ｂｌｏｔ（ブロット）を３％  ＢＳＡ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＰＢＳで一晩、ｂｌｏｃｋｉｎｇ（ブロッキング）した後、次の一次抗体で検出した：ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ（ウサギポリクローナル）Ｂｃｌ−２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｂａｘ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（マウスポリクローナル）ｐ５３抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（マウスモノクローナルポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）（ＰＡＲＰ）抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ＣＰＰ３２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）。Ｂａｄはｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｂａｄ抗体で免疫沈降し、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（蛋白Ｇ−セファロース）で回収した。１５％  ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ上で電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｂａｄ（マウスモノクローナル抗リン酸化Ｂａｄ）（Ｓｅｒ−１３６）抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）でｐｒｏｂｅした。
（６）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（細胞分画）
心筋細胞を氷冷ＰＢＳで二度洗浄し、４℃で２００Ｘｇ、１０分間の遠心により回収した。ペレットを２００μＬのｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（抽出バッファー）（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），２２０ｍＭ  ｍａｎｎｉｔｏｌ（マンニトール），６８ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，１０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１０μＭ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で再懸濁した。細胞をダウンス型ホモジナイザー（Ｄｏｕｎｃｅ−ｔｙｐｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で２０ストローク処理し、均質化した。細胞ホモジネート（ｃｅｌｌ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）をエッペンドルフチューブに移し、４℃で１４０００ｘｇ、３０秒間遠心し、核を沈殿させた。上清を超遠心管に移し、４℃で２０００００ｘｇ、３０分間超遠心した。上清（可溶性タンパク）とｐｅｌｌｅｔ（ミトコンドリア、ミクロゾーム、不溶性タンパク）のタンパク濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。上清とペレットをＳＤＳで可溶化した後、２μｇを各レーンに注入し、１２．５％  ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ上で電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。Ｂｌｏｔを３％  ＢＳＡ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＰＢＳでｏｖｅｒｎｉｇｈｔ、ｂｌｏｃｋｉｎｇした後、ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ（変性チトクロームＣ）に対するｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体（１：５００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で室温で１時間ｉｎｃｕｂａｔｅした。二次抗体はＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（１：２０００，ＭＢＬ）を用い、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により検出した。
（７）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｂａｄ蛋白の検出）
７５ｃｍ２フラスコの浮遊心筋細胞と粘着心筋細胞を回収し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．２ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏ−ｖａｎａｄａｔｅ（オルトバナジン酸ナトリウム），０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．５％  ＮＰ−４０から成るｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．５ｍＬに溶解した。Ｂａｄタンパク質はｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｂａｄ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を５μｌ加えて４℃でｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｉｎｃｕｂａｔｅすることにより免疫沈降した。続いて、２５ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓのｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えて４℃で１時間ｉｎｃｕｂａｔｅすることにより回収した。２Ｘｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを２５ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ加えた後、９５℃で３分間ｂｏｉｌした。１５％  ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ上で１ｗｅｌｌに２０μｌ注入し、電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｂａｄ（Ｓｅｒ１３６）抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐｒｏｂｅした。ｔｏｔａｌ  Ｂａｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ（Ｂａｄ総含有量）はｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｂａｄ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐｒｏｂｅした。２次抗体はＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１：２０００，ＭＢＬ）を用い、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により検出した。
実施例１
上記方法にて調製した心筋細胞の培養液（最終濃度として１Ｘ１０６細胞／２  ｍｌ／ｗｅｌｌ）にＨ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度１Ｘ１０−４Ｍになるように添加し、ＣＯ２インキュベーターにより、１６時間培養した。細胞を回収し、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によりアポトーシスが誘導された細胞の割合を定量した。また、Ｈ２Ｏ２添加直前にニコランジルを最終濃度１Ｘ１０−４Ｍになるように添加した。結果を図１に示した。図１において、４Ｈ２Ｏ２は最終濃度１Ｘ１０−４ＭのＨ２Ｏ２添加を意味し、４ＮＣＲは最終濃度１Ｘ１０−４Ｍのニコランジル添加を意味し、４ＮＣＲ＋４Ｈ２Ｏ２は最終濃度１Ｘ１０−４ＭのＨ２Ｏ２および最終濃度１Ｘ１０−４Ｍのニコランジルの双方の添加を意味し、ｃｏｎｔｒｏｌは上記いずれの化合物も含まない対照を意味する。Ｈ２Ｏ２非添加においては、１０％以下のアポトーシス誘導率であったのに対し、Ｈ２Ｏ２添加では７０％以上の細胞においてアポトーシスが誘導された。また、１Ｘ１０−４Ｍのニコランジルの添加により、Ｈ２Ｏ２により誘導されるアポトーシスは、コントロールレベルまで有意に抑制された。
さらに、ミトコンドリアＫＡＴＰチャンネル阻害薬である５−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏａｔｅ（５−ヒドロキシデカノエート）を、最終濃度５Ｘ１０−４Ｍで添加したところ、ニコランジルによるアポトーシス抑制効果を部分的に阻害した（図２及び図３）。また、非選択性ＫＡＴＰチャンネル阻害薬であるｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ（グリベンクラミド）を最終濃度１ｘ１０−５Ｍで添加した場合には、ニコランジルによるアポトーシス抑制効果を完全に阻害した（図３）。なお、図２において、４Ｈ２Ｏ２および４ＮＣＲ＋４Ｈ２Ｏ２は図１と同じ意味を表し、５＊４５ＨＤ＋４ＮＣＲ＋４Ｈ２Ｏ２は最終濃度５Ｘ１０−４Ｍの５−ヒドロキシデカノアート、最終濃度１Ｘ１０−４Ｍのニコランジルおよび最終濃度１Ｘ１０−４ＭのＨ２Ｏ２の添加を意味し、ｃｏｎｔｒｏｌは上記いずれの化合物も含まない対照を意味する。また、図３において、５ＨＤ＋４ＮＣＲ＋４Ｈ２Ｏ２は最終濃度５Ｘ１０−４Ｍの５−ヒドロキシデカノアート、最終濃度１Ｘ１０−４Ｍのニコランジルおよび最終濃度１Ｘ１０−４ＭのＨ２Ｏ２の添加を意味し、３ＮＣＲは最終濃度１Ｘ１０−３Ｍのニコランジルの添加を意味し、３ＮＣＲ＋４Ｈ２Ｏ２は最終濃度１Ｘ１０−３Ｍのニコランジルおよび最終濃度１Ｘ１０−４ＭのＨ２Ｏ２の添加を意味し、５ＧＬＩＢ＋３ＮＣＲ＋４Ｈ２Ｏ２は最終濃度５Ｘ１０−４Ｍのグリベンクラミド、最終濃度１Ｘ１０−３Ｍのニコランジルおよび最終濃度１Ｘ１０−４ＭのＨ２Ｏ２の添加を意味し、４Ｈ２Ｏ２、４ＮＣＲ、４ＮＣＲ＋４Ｈ２Ｏ２および５＊４５ＨＤ＋４ＮＣＲ＋４Ｈ２Ｏ２は図１および図２と同じ意味を表し、ｃｏｎｔｒｏｌは上記いずれの化合物も含まない対照を意味する。
実施例２
実施例１と同様の方法により調製した心筋細胞培養液中に、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度５Ｘ１０−６Ｍ添加し、実施例１と同様に培養し、アポトーシスが誘導された心筋細胞の割合を測定した。その結果、Ａ２３１８７の添加により有意なアポトーシスが誘導され、このＡ２３１８７によるアポトーシス誘導作用は、１Ｘ１０−５ＭのＺＶＡＤ（ｐａｎ  ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（全てのカスパーゼに対する阻害剤））あるいは、１Ｘ１０−４Ｍのニコランジルの添加により、部分的（５０％程度）に阻害されることが確認された（図４）。さらに、ミトコンドリアＫＡＴＰチャンネル阻害薬である５−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏａｔｅを、最終濃度５Ｘ１０−４Ｍで添加したところ、ニコランジルによるアポトーシス抑制効果は完全に阻害された（図４）。図４において、５＊６Ａ２３は最終濃度５Ｘ１０−６ＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の添加を意味し、５ＺＶＡＤは最終濃度１Ｘ１０−５ＭのＺＶＡＤの添加を意味し、５ＺＶＡＤ＋５＊６Ａ２３は最終濃度１Ｘ１０−５ＭのＺＶＡＤおよび最終濃度５Ｘ１０−６ＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の添加を意味し、４ＮＣＲ＋５＊６Ａ２３は最終濃度１Ｘ１０−４Ｍのニコランジルおよび最終濃度５Ｘ１０−６ＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の添加を意味し、５＊４５ＨＤ＋４ＮＣＲ＋５＊６Ａ２３は最終濃度５Ｘ１０−４Ｍの５−ヒドロキシデカノアート、最終濃度１Ｘ１０−４Ｍのニコランジルおよび最終濃度５Ｘ１０−６ＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の添加を意味し、ｃｏｎｔｒｏｌは上記いずれの化合物も含まない対照を意味する。
実施例１との結果をあわせ、ニコランジルの前処置（１０−４Ｍ）はＨ２Ｏ２やカルシウムイオノフォアＡ２３１８７によって誘導されるＮＲＶＭｓのアポトーシスを各々６０％、５０％抑制することが示された。
実施例３
上記実施例において誘導されたアポトーシス細胞を、Ｌａｄｄｅｒ  ａｓｓａｙｓによりＤＮＡのｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（断片化）を測定したところ、ＤＮＡの断片化が誘導されていることが確認された。また、免疫細胞染色（ＤＡＰＩ）においても核のｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎが誘導されていることが確認された。これらの結果は、Ｈ２Ｏ２やＡ２３１８７により誘導された心筋細胞の細胞死がアポトーシスであることを示す。アポトーシス細胞における各種タンパク質の発現量の変化をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓにより測定した結果、Ｂｃｌ−２やＢａｘのタンパク発現量は不変であったが、ｐ５３のタンパク発現量は増加していることが確認された。また、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣのミトコンドリアから細胞質へのｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（トランスロケーション）、ＣＰＰ３２の活性化、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）の裂開が確認された。このことは、ミトコンドリア依存性のアポトーシス経路が活性化され、ＤＮＡの断片化が惹起されたことを示す。さらに、Ｂａｄのリン酸化レベルが減少していることが示された。一方、ニコランジルの前処理は、Ｂａｄのリン酸化レベルを増加させることが確認された。このことは、ニコランジルのアポトーシス抑制効果は、Ｂａｄのリン酸化を介して発現していることを示す。
実施例４
実施例１及び実施例２と同様の方法により心筋細胞のアポトーシスを測定した。その結果、選択的ＰＫＣ阻害薬ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ（チェレリスリン）（最終濃度１０−６Ｍ）の添加によりニコランジルの抗アポトーシス効果は完全に消失した。一方、ＮＯ  ｄｏｎｏｒであるｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ（最終濃度１０−４Ｍ）の添加によりニコランジルのアポトーシス抑制効果は増大し、ＮＯＳ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥ（ＮＧ−ｎｉｔｒｏ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）（最終濃度１０−６Ｍ）の添加ではニコランジルの抗アポトーシス効果を部分的に阻害した。これらの結果は、ニコランジルの心筋細胞アポトーシスの抑制効果が、ＫＡＴＰチャンネル開口作用とＮｉｔｒａｔｅ（硝酸薬）様作用の両方に依存していること、また、ニコランジルは細胞内シグナル伝達経路を介してＰＫＣを活性化し、Ｂａｄをリン酸化することでアポトーシス抑制作用を発現していることを示唆している。
実施例５
ニコランジルがＨ２Ｏ２刺激による心筋細胞のアポトーシスを抑制することを、ミトコンドリア膜電位検出試薬である蛍光プローブＪＣ−１を用いて確認した。多くの場合、細胞のアポトーシスではチトクロームＣがミトコンドリア膜から細胞質へ移行し、この際、ミトコンドリア膜電位が低下することが知られている。ＪＣ−１は陽イオン性の蛍光物質であり、容易に細胞内に入り、正常細胞のミトコンドリアの中でＪ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓと呼ばれる重合体を形成し、赤色蛍光（λｅｍ＝５９０ｎｍ）を発する。一方、アポトーシス細胞では、ミトコンドリア膜電位が崩れ、ＪＣ−１はミトコンドリアに蓄積されず、細胞質内でモノマーとして存在し、緑色蛍光（λｅｍ＝５２７）を発する。
そこで、新生仔ラットの心筋細胞をガラス底の３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ製）に１ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、ＪＣ−１（和光純薬）１０μｇ／ｍＬを含む無血清のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で３７℃にて１０分間培養した。ディッシュ上の細胞を共焦点レーザー顕微鏡を用いて、対物レンズ２０倍で観測した。蛍光は４８８ｎｍのアルゴンレーザー線と５４３ｎｍのヘリウム／ネオンレーザー線により誘起した。
結果を図５に示す。ニコランジルで前処理していない上段の細胞では、Ｈ２Ｏ２刺激前の細胞（上段左側）では大部分が斑状赤色に染まっており、ＪＣ−１がミトコンドリアに適切に取り込まれていることが確認された。一方、Ｈ２Ｏ２刺激（２００μｍｏｌ／Ｌ、２０分）の後の細胞（上段右側）では、細胞質がびまん性に緑色（実際には赤色と緑色が混合され黄色の観測される）に染まっており、ミトコンドリア膜電位の崩壊していること、すなわちアポトーシスが誘起されていることが確認された。一方、ニコランジルの前処理（１００μｍｏｌ／Ｌ）により、Ｈ２Ｏ２刺激により生じる心筋細胞の緑色蛍光が抑制されていることが確認された（下段右側）。この結果は、ニコランジルの前処理が、心筋細胞におけるＨ２Ｏ２刺激によるアポトーシスを抑制することを示す。
産業上の利用の可能性
本発明は、臨床上有効な心筋細胞のアポトーシス抑制剤、虚血再灌流障害治療剤、心筋梗塞治療剤、心筋症治療剤および心筋炎治療剤、並びに心筋細胞のアポトーシス抑制作用、虚血再灌流障害抑制作用、心筋梗塞抑制作用、心筋症抑制作用、心筋炎抑制作用のうち、少なくとも１つ以上の作用を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する点において有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例に記載した方法で調製した心筋細胞の培養液にＨ２Ｏ２、ニコランジル、並びにニコランジル＋Ｈ２Ｏ２をそれぞれ添加した場合について、フローサイトメトリーによりアポトーシスが誘導された細胞の割合を定量した結果を示すグラフである。
図２は、実施例に記載した方法で調製した心筋細胞の培養液にＨ２Ｏ２、ニコランジル＋Ｈ２Ｏ２、並びに５−ヒドロキシデカノアート＋ニコランジル＋Ｈ２Ｏ２をそれぞれ添加した場合について、フローサイトメトリーによりアポトーシスが誘導された細胞の割合を定量した結果を示すグラフである。
図３は、実施例に記載した方法で調製した心筋細胞の培養液にＨ２Ｏ２、ニコランジル２、５−ヒドロキシデカノアート並びにグリベンクラミドを種々の濃度で単独または組み合わせて添加した場合について、フローサイトメトリーによりアポトーシスが誘導された細胞の割合を定量した結果を示すグラフである。
図４は、実施例に記載した方法で調製した心筋細胞の培養液にカルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ＺＶＡＤ、ＺＶＡＤ＋カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ニコランジル＋カルシウムイオノフォアＡ２３１８７並びに５−ヒドロキシデカノアート＋ニコランジル＋カルシウムイオノフォアＡ２３１８７をそれぞれ添加した場合について、フローサイトメトリーによりアポトーシスが誘導された細胞の割合を定量した結果を示すグラフである。
図５は、ニコランジル処理していない細胞（上段）とニコランジル処理した細胞（下段）について、それぞれＨ２Ｏ２添加前（左側）とＨ２Ｏ２添加後（右側）における蛍光発色を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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