(57)【要約】本発明は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物を、ＤＬ−セリンを含有する媒体中、ＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存するＤ−セリンを該媒体中から採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法および該製造法に係る微生物に関する。Ｄ−セリンはＤ−サイクロセリン等の有用医薬品の合成中間体として有用な化合物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物を、ＤＬ−セリンを含有する媒体中、ＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存するＤ−セリンを該媒体中から採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
【請求項２】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物を、ＤＬ−セリンを含有する培地に培養し、Ｌ−セリンを分解させ、該培養物より残存するＤ−セリンを採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
【請求項３】
改変された微生物が、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物を変異処理して得られる変異微生物である請求項１または２記載のＤ−セリンの製造法。
【請求項４】
改変された微生物が、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子を微生物に組み込んで得られる形質転換体である請求項１または２記載のＤ−セリンの製造法。
【請求項５】
改変された微生物のＬ−セリンデアミナーゼ活性が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性に比べて２倍以上である請求項１〜４いずれか１項に記載のＤ−セリンの製造法。
【請求項６】
改変された微生物のＬ−セリンデアミナーゼ活性が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性に比べて５倍以上である請求項１〜４いずれか１項に記載のＤ−セリンの製造法。
【請求項７】
Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来のｓｄａＡ遺伝子またはｓｄａＢ遺伝子である請求項４記載のＤ−セリンの製造法。
【請求項８】
改変された微生物が、エシェリヒア・コリに属する微生物である請求項１〜７いずれか１項に記載のＤ−セリンの製造法。
【請求項９】
改変された微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＨＩＢ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＨＩＡ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＢおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＥ５３８６／ｐＨＩＡ２からなる群から選ばれる微生物である請求項１〜８いずれか１項に記載のＤ−セリンの製造法。
【請求項１０】
改変された微生物が、Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い、もしくは活性を有しない微生物である請求項１〜９いずれか１項に記載のＤ−セリンの製造法。
【請求項１１】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に属し、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物。
【請求項１２】
微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＨＩＢ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＨＩＡ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ２、　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＭＭ２９４／ｐＨＩＢおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＥ５３８６／ｐＨＩＡ２からなる群から選ばれる微生物である請求項１１記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物を、ＤＬ−セリンを含有する媒体中、ＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存するＤ−セリンを該媒体中から採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法および該製造法に係る微生物に関する。Ｄ−セリンはＤ−サイクロセリン等の有用医薬品の合成中間体として有用な化合物である。
背景技術
Ｄ−セリンに関しては、以下の製造法が知られている。
（ｉ）ＤＬ−ヒドロキシメチルヒダントインを微生物によってＮ−カルバミル−Ｄ−セリンとした後、加水分解してＤ−セリンを得る方法（特開昭６１−１５２２９１）。
（ｉｉ）ＤＬ−セリンを含有する培地中でキャンディダ属、トルロプシス属、クリプトコッカス属、サッカロマイコプシス属、ハンゼヌラ属、エッシェリヒア属、クレブシェラ属、プロビデンシア属、ミクロバクテリウム属、またはセラチア属に属しＬ−セリンを資化しＤ−セリンを実質的に資化しない微生物を培養し、培養液中からＤ−セリンを単離する方法（特開昭６４−２５９４）。
（ｉｉｉ）チロシナーゼ活性を有する微生物をＤＬ−セリンとフェノールを含有する反応液に作用させ、Ｌ−セリンをＬ−チロシンに変換し、残存したＤ−セリンを採取する方法（特開平５−９１８９５）。
これらの製造法はいずれも工業的なＤ−セリンの製法として用いるには難点がある。即ち、（ｉ）の方法では、ＤＬ−ヒドロキシメチルヒダントインからのＮ−カルバミル−Ｄ−セリンの収率が４０％と低い上、触媒用に多量の菌体を必要とする点、（ｉｉ）の方法では、反応終了後もＬ−セリンが残存しており、結局ＤＬ−セリンの分割を要する点、（ｉｉｉ）の方法では、基質濃度が１％と低い上、有害なフェノールを反応に必要とする点、などがこれら製造法の工業的利用を難しくしている。
エシェリヒア・コリが、Ｌ−セリンをアンモニアとピルビン酸と水に分解するＬ−セリンデアミナーゼ活性を有していることは知られている〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，５０９５−５１０２（１９８９）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１２，７７７−７８４（１９９３）〕。しかし、エシェリヒア・コリより抽出された該酵素は反応時に鉄や還元剤の添加など複雑な条件を必要とすることが報告されており〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２，１２７０−１２７５（１９８５）〕、該精製酵素をＤ−セリン製造に用いることは実用的ではない。
またエシェリヒア・コリはＤ−セリンを分解するＤ−セリンデアミナーゼ活性も有していることが知られている〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２１，１０９２−１１０１（１９７５）〕。したがって、エシェリヒア・コリを用いて、Ｌ−セリンデアミナーゼにより、ＤＬ−セリンから生産されたＤ−セリンは、該Ｄ−セリンデアミナーゼにより分解されてしまい、生産効率が低下することがあった。
以上、従来公知の方法においては、ＤＬ−セリンからＤ−セリンを効率よく生産する方法は確立されていない。
発明の開示
本発明の目的は、工業的に有利なＤ−セリンの製造法を提供することにある。
本発明者は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に比べて高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変されたエシェリヒア・コリからＬ−セリンデアミナーゼの抽出または精製を行うことなく、該菌体または菌体処理物をＤＬ−セリンに接触させることによって、意外にもＤ−セリンをほとんど減じることなく迅速にＬ−セリンを検出限界以下にまで分解消去でき、Ｄ−セリンを工業的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下（１）〜（１２）に関する。
（１）　エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物を、ＤＬ−セリンを含有する媒体中、ＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存するＤ−セリンを該媒体中から採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
（２）　エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物を、ＤＬ−セリンを含有する培地に培養し、Ｌ−セリンを分解させ、該培養物より残存するＤ−セリンを採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
（３）　改変された微生物が、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物を変異処理して得られる変異微生物である上記（１）または（２）のＤ−セリンの製造法。
（４）　改変された微生物が、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子を微生物に組み込んで得られる形質転換体である上記（１）または（２）のＤ−セリンの製造法。
（５）　改変された微生物のＬ−セリンデアミナーゼ活性が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性に比べて２倍以上である上記（１）〜（４）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（６）　改変された微生物のＬ−セリンデアミナーゼ活性が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性に比べて５倍以上である上記（１）〜（４）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（７）　Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来のｓｄａＡ遺伝子またはｓｄａＢ遺伝子である上記（４）のＤ−セリンの製造法。
（８）　改変された微生物が、エシェリヒア・コリに属する微生物である上記（１）〜（７）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（９）　改変された微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＨＩＢ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＨＩＡ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＢおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＥ５３８６／ｐＨＩＡ２からなる群から選ばれる微生物である上記（１）〜（８）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（１０）　改変された微生物が、Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い、もしくは活性を有しない微生物である上記（１）〜（９）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（１１）　エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に属し、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物。
（１２）　微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＨＩＢ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＨＩＡ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＢおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＥ５３８６／ｐＨＩＡ２からなる群から選ばれる微生物である上記（１１）の微生物。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に比べて高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の取得
本発明で用いる、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株（東洋紡社製、以下すべておなじ）に比べて高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物（以下、改変された微生物と略す）は以下に述べる方法で取得することができる。
改変される微生物（以下、親株という）はＬ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物であっても、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有していない微生物であってもいずれでもよい。
親株が、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有している場合は、以下に述べる（１）または（２）記載の方法により、改変された微生物を得ることができる。
該親株がＬ−セリンデアミナーゼ活性を有していない場合には、以下に述べる（２）記載の方法により、改変された微生物を得ることができる。
なお、本発明の製造法では、高収率でＤ−セリンを製造することができるので、Ｄ−セリンデアミナーゼによるＤ−セリンの分解があったとしても、なお、高収率でＤ−セリンを製造することができる。
したがって、親株のＤ−セリンデアミナーゼ活性はあってもなくてもいずれでもよい。
（１）変異処理法による取得
改変された微生物は、親株に変異処理を行い、突然変異を生じさせることにより得られる微生物（以下、変異微生物と略す）より得ることができる。
変異処理法は、通常用いられる方法であればいずれの方法でもよい。例えば、変異処理剤を用いる方法、紫外線照射法などがあげられる。
変異処理剤を用いる方法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１３１頁、１９８６年、講談社サイエンティフィック社）が好ましく用いられる。
変異処理された微生物を下記に述べる方法で培養し、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株より向上した微生物を選択することにより、改変された微生物を得ることができる。
Ｌ−セリンデアミナーゼ活性は少なくともエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より向上していればよく、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上向上していることが望ましい。
Ｌ−セリンデアミナーゼ活性の測定は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７Ｂ，３４６（１９７１）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７Ｂ，３５１（１９７１）等に記載されている方法に準じて行うことができる。また、簡便法として、下記に述べる方法をあげることができる。
すなわち、改変された微生物をＤＬ−セリンと接触させた後に、反応液中に残存するＬ−セリンの量を測定し、単位時間あたりに減少したＬ−セリンの量を算出することで測定することができる。
例えば、反応開始から反応中のある時間までのＬ−セリンの減少量すなわち分解量を測定し、得られた分解量の値を反応時間で割ることにより、単位時間当たりのＬ−セリンの分解量を算定し、得られた値をＬ−セリンデアミナーゼ活性とすることができる。
具体的には、得られた変異微生物を３０℃で１日間培養して得られる培養液を遠心分離して菌体を取得する。培地は、該変異微生物を培養できる培地であればいずれの培地も用いることができる。該菌体を５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、遠心分離して得られる菌体（湿菌体重量約２ｇ）を反応に用いる。
ＤＬ−セリンを５０ｇ／Ｌ含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に得られた菌体を懸濁し、３７℃で１０時間〜２２時間反応を行う。反応終了後、Ｄ−セリンおよびＬ−セリンの濃度をＨＰＬＣにより定量し、バッファー中の含量を算定する。
（２）遺伝子組換えによる方法
以下に述べる方法で、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子を取得し、該遺伝子を宿主細胞に組み込むことにより、改変された微生物を得ることができる。
（ａ）　Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の取得
公知のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子配列〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，５０９５−５１０２（１９８９）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１２，７７７−７８４（１９９３）〕をもとに、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子をクローニングすることができる。以下に、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子ｓｄａＡ、ｓｄａＢの取得法を例に説明するが、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の取得源は、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物であればエシェリヒア・コリに限定されない。
例えば、以下の方法により取得することができる。
エシェリヒア・コリ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株をエシェリヒア・コリの培養に適した培地、例えばＬＢ培地〔バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇ、ＮａＣｌ　５ｇを水１リットルに含みｐＨ７．２に調整した培地〕を用い、常法に従って培養する。培養後、培養物より遠心分離により菌体を取得する。
取得した菌体より公知の方法〔例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２００１）、以下、モレキュラー・クローニング　第３版という〕に従い染色体ＤＮＡを単離する。
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，５０９５−５１０２（１９８９）またはＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１２，７７７−７８４（１９９３）に記載されたＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子の塩基配列情報を利用し、ｓｄａＡ遺伝子またはｓｄａＢ遺伝子に対応する塩基配列を含有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成する。
得られたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーおよび染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅する。該増幅ＤＮＡ断片をプラスミドに導入可能とするために、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５’末端には適切な制限酵素サイト、例えばＢａｍＨＩ等の制限酵素サイトを付加させることが好ましい。
該センスプライマーとアンチセンスプライマーの組み合わせとしては、例えば、配列番号１および２記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせと配列番号１および３記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせ（ｓｄａＡ用）、配列番号４および５記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせ（ｓｄａＢ用）等をあげることができる。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマー、ＴａＫａＲａ　ＬＡ−ＰＣＲ　ＴＭ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）またはＥｘｐａｎｄ　ＴＭ　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用い、ＤＮＡ　ＴＨｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｊａｐａｎ社製）でＰＣＲを行う。
ＰＣＲの条件として、上記プライマーが２ｋｂ以下のＤＮＡ断片の場合には９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒〜１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、２ｋｂを超えるＤＮＡ断片の場合には９８℃で２０秒間、６８℃で３分間からなる反応工程を１サイクルとして、いずれも３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件をあげることができる。
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片とエシェリヒア・コリで増幅可能なベクターとを、制限酵素を用い、上記プライマーで付与した制限酵素サイトと同じサイトで切断後、アガロースゲル電気泳動、シュークロース密度勾配超遠心分離等を行いＤＮＡ断片を回収する。
回収したＤＮＡ断片を用い、常法、例えば、モレキュラー・クローニング第２版、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１〜３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）：以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメントと略す、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法により、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｃｏｌｏｇｉｅｓ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製〕を用いクローニングベクターを作製し、作製したクローニングベクターを用い、エシェリヒア・コリ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換する。
エシェリヒア・コリを形質転換するためのクローニングベクターとしては、エシェリヒア・コリＫ１２株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。エシェリヒア・コリ用の発現ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、Ｌａｍｂｄａ　ＺＡＰ　ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＭＷ２１８（和光純薬工業社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＨＭＶ１５２０（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）等をあげることができる。
得られた形質転換株より、目的とする遺伝子を含有するプラスミドを常法、例えば、モレキュラー・クローニング　第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー　サプルメント、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法により取得することができる。
上記方法によりＬ−セリンデアミナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドを取得することができる。該プラスミドとして、例えば、実施例に示すｐＨＩＡ１、ｐＨＩＡ２、ｐＨＩＢをあげることができる。
同様な方法で、ゲノムのＤＮＡ塩基配列が公知な生物からＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を取得することができる。また、ゲノムのＤＮＡ塩基配列が知られていない生物であっても、適当なベクターを用いてエシェリヒア・コリを宿主として染色体ＤＮＡライブラリーを作成し、このライブラリーの各株についてＬ−セリンデアミナーゼ活性を調べることによって、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを取得することができる。
（ｂ）Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の発現方法
上記のようにして得られたＬ−セリンデアミナーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、目的とするＬ−セリンデアミナーゼをコードするＤＮＡを、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で切断して、コード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、該ＤＮＡ断片を発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いで該ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌、放線菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０８）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳＰ４６８６１９１、ＵＳＰ４９３９０９４、ＵＳＰ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＰＨＹ３００（宝酒社製），ｐＨＷ１５２０（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）等を例示することができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＨプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。さらにバチルス属細菌中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーターやコリネバクテリウム属細菌中で発現させるためのＰ５４−１プロモーターなども用いることができる。
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
転写・翻訳を効率的に行なうため、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する蛋白質のＮ末端またはその一部を欠失した蛋白質と発現ベクターのコードする蛋白質のＮ末端部分を融合させた蛋白質を発現させてもよい。
目的とする蛋白質の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エッシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アナバエナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾバクター（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルウイニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ホルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネココッカス（Ｓｙｎｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物をあげることができる。
例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ　ｓｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ等をあげることができる。
さらに具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１（モレキュラークローニング　第２版、ｐ５０５）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（東洋紡社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００［Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３８，１７９−２０７（１９８０）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５（ＡＴＣＣ１２４３５）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（東洋紡社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ１４９４８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３３７１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０３０、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４２９７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ１３８８０、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ１１３２５、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｕｒｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ１３３４４、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ　ＡＴＣＣ１５２３６、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ１９０９８、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ　ＡＴＣＣ７５６２、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　ＡＴＣＣ１５３９０、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ　ＡＴＣＣ２１４３４、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ　ＤＳＭ１３３７、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ　ＡＴＣＣ２１２８６、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕｍ　ＡＴＣＣ１１１７０、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ　ＡＴＣＣ１０７６２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ１０１３７、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ１０９８８等をあげることができる。
Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い微生物またはＤ−セリンデアミナーゼ活性の欠損した微生物としては、たとえばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＥ５３８６株（国立遺伝研から入手可能）があげられる。
組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、
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プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−０００２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメント、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ　２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング　第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
２．改変された微生物の培養
上記１で得られる本発明の改変された微生物を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。本発明の改変された微生物がエシェリヒア・コリ等の原核微生物、酵母菌等の真核微生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの改変された微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜５０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を、ｘｙｌＡプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する時にはキシロースを、それぞれ培地に添加してもよい。
本発明の改変された微生物が動物細胞である場合、該改変された動物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％　ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の改変された微生物が昆虫細胞である場合、該改変された昆虫細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製〕、Ｓｆ−９００　ＩＩＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
３．Ｄ−セリンの製造
ＤＬ−セリンを含有する媒体中、改変された微生物をＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存したＤ−セリンを該媒体中から採取することによりＤ−セリンを製造することができる。
形質転換体および変異微生物におけるＬ−セリンデアミナーゼ活性増強の程度は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に比較して増強されている必要があり、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より強ければよいが、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上であることが望ましい。
また、Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い、または該活性を有しない株を用いることにより、Ｄ−セリンの製造の効率を上げることができる。
Ｌ−セリンデアミナーゼ活性の測定は上記１．（１）で述べたとおりである。
これらの微生物を用いたＤ−セリンの製造は、以下の方法で行うことができる。
すなわち、上記方法で得られる改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物（以下、酵素源という）を、媒体中でＤＬ−セリンに接触させる。
細胞または該細胞の処理物としては、細胞の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波破砕物、機械的摩砕物、溶媒処理物などの細胞処理物、培養物の濃縮物、乾燥物などの培養処理物、細胞の蛋白質分画物、細胞および細胞処理物の固定化物、あるいは細胞より得られる精製酵素等があげられる。
改変された微生物とＤＬ−セリンとの接触は、該改変された微生物を培養する培地にあらかじめＤＬ−セリンを添加する方法を用いてもよいし、培養中にＤＬ−セリンを添加する方法を用いてもよい。また、該改変された微生物を培養して得られた酵素源を、ＤＬ−セリンを含有する媒体に添加してもよい。
改変された微生物を培養する培地中にＤＬ−セリンを添加する場合、ＤＬ−セリンは培地１ｍｌあたり１〜３００ｍｇ、好ましくは３０〜１００ｍｇを培養の開始時または途中に添加する。培養は上記（２）で述べた条件下で行うことができる。
改変された微生物より得られる酵素源とＤＬ−セリンを媒体中で接触させる場合は、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なる。例えば、酵素源として該改変された微生物の細胞を用いる場合は、ＤＬ−セリン１ｍｇあたり湿菌体として５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
接触反応は２０〜５０℃で行なうことが好ましく、特に２５℃〜３７℃で行なうことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常２〜１５０時間、好ましくは５〜６０時間である。
媒体としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒または水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。
ＤＬ−セリンを媒体中に添加する場合、ＤＬ−セリンを溶解することのできる水もしくは水性媒体、有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液にＤＬ−セリンを溶解し、媒体中に添加してもよいし、粉末または細粒状のまま添加してもよい。
反応媒体からのＤ−セリンの採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
本発明により得られるＤ−セリンの確認または定量方法は、Ｄ−セリンを確認または定量できる方法であればいずれの方法も用いることができるが、例えば、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の方法により行うことができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１
１）Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の取得
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ１４９４８）を１白金耳、１０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。培養後、得られた培養液より遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を取得した。該菌体より、常法（モレキュラー・クローニング　第２版に記載の方法）に従い染色体ＤＮＡを単離精製した。
Ｌ−セリンデアミナーゼをコードする遺伝子であるｓｄａＡ〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，５０９５−５１０２（１９８９）〕の有する塩基配列情報をもとにセンスプライマーとアンチセンスプライマーの組み合わせである配列番号１および２記載の塩基配列を有する２種類のプライマー、配列番号１および３記載の塩基配列を有する２種類のプライマー、およびｓｄａＡと同様にＬ−セリンデアミナーゼをコードする遺伝子であるｓｄａＢ〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１２，７７７−７８４（１９９３）〕の有する塩基配列情報をもとに配列番号４および５記載の塩基配列を有する２種類のプライマーをそれぞれＤＮＡ合成機を用いて合成した。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマー、ｐｆｕ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｌｏｎｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）およびｐｆｕ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１０　Ｘ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｂｕｆｆｅｒ）を用い、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｊａｐａｎ社製）でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒〜１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件で行った。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、いずれも制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＢａｍＨＩで処理した。処理後これらの制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にかけ、各制限酵素で処理されたＤＮＡ断片を取得した。
２）組換え体ＤＮＡの製造
アンピシリン耐性遺伝子とＴｒｐプロモータを有するベクタープラスミドｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０７より常法により抽出）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理ｐＴｒＳ３０断片を取得した。
上記で取得されたＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理ＤＮＡ断片とＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理ｐＴｒＳ３０断片を混合した後、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（東洋紡社製）を常法に従って形質転換後、該形質転換体を、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇ、ＮａＣｌ　５ｇを水１リットルに含み、ｐＨ７．２に調整され、寒天を１．５％になるように添加された培地］に塗布し、３０℃で１日間培養した。
該培地上で生育した形質転換体のコロニー数個ずつを、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地１０ｍＬで３０℃で１日間培養した。
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理ＤＮＡ断片（配列番号１および２記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせでＰＣＲ増幅して得られたＤＮＡ断片）とＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理ｐＴｒＳ３０断片とを連結して得られたプラスミドをｐＨＩＡ１、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理ＤＮＡ断片（配列番号１および３記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせでＰＣＲ増幅して得られたＤＮＡ断片）とＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理ｐＴｒＳ３０断片とを連結して得られたプラスミドをｐＨＩＡ２、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理ＤＮＡ断片（配列番号４および５記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせでＰＣＲ増幅して得られたＤＮＡ断片）とＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ処理ｐＴｒＳ３０断片とを連結して得られたプラスミドをｐＨＩＢ１とそれぞれ命名した。
３）形質転換体の製造
このようにして得られたプラスミドを常法に従ってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）およびＤ−セリンデアミナーゼ活性を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＥ５３８６株（国立遺伝研より入手）に導入した。
これらの菌株のうち、ｐＨＩＡ１を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ１、ｐＨＩＡ２を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＡ２、およびｐＨＩＢを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４／ｐＨＩＢは、ブタペスト条約に基づき、それぞれＦＥＲＭ　ＢＰ−７３０９、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３１０、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３１１として独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１２年９月２８日付けで寄託されている。
実施例２　Ｌ−セリンデアミナーゼの発現およびＤ−セリンの製造
上記のようにして得られた形質転換体およびＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を含まないプラスミドｐＴｒＳ３０を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＴｒＳ３０株を、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地１００ｍＬで３０℃、１日間培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を取得し、これを５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に再び懸濁し、遠心分離して得られる菌体（湿菌体重量約２ｇ）を反応に用いた。
ＤＬ−セリンを５０ｇ／Ｌ含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に上記の菌体を懸濁し、３７℃で１０時間〜２２時間反応を行った。
反応開始時、反応中および反応終了後に反応液中のＤ−セリンおよびＬ−セリンの濃度をＨＰＬＣにより定量した。
ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
カラム：ＣＲＡＷＮＰＡＫ　ＣＲ（＋）　（Ｄａｉｃｅｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）
移動層：過塩素酸水溶液（ｐＨ　１．０）
流速：０．２ｍＬ／分
カラム温度：２℃
検出はオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いたポストカラム誘導体化法〔Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３３，３５３−３５５（１９７３）〕を用いた。
第１表に結果を示した。
2002036803.tif 000003
反応開始後１０、１１または１２時間目の反応液中のＬ−セリン濃度を求め、反応開始時の反応液中のＬ−セリン濃度との差をＬ−セリンの総分解量として示した。
Ｌ−セリンの総分解量を反応開始からの時間（１０、１１または１２時間）で割った値をＬ−セリンデアミナーゼ活性として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＴｒＳ３０株のＬ−セリンデアミナーゼ活性を１．０とした場合の各菌株の活性を相対活性として示した。
第１表から明らかなように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＥ５３８６／ｐＨＩＡ２株について反応開始後１２時間目、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＨＩＢ株およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＨＩＡ１株について反応開始後２１時間目、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ２９４／ｐＨＩＡ２株について反応開始後２２時間目のＬ−セリン濃度およびＤ−セリン濃度を測定したところ、反応液中のＬ−セリン残量はゼロであり、Ｄ−セリンのみが残存していた。
産業上の利用可能性
本発明により、ＤＬ−セリンから、Ｄ−サイクロセリン等の有用医薬品の合成中間体等として有用なＤ−セリンを効率よく生産することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
【配列表】
2002036803.tif 000004
2002036803.tif 000005
【国際調査報告】
2002036803.tif 000006
2002036803.tif 000007