(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の体液を可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質の存在についてインビトロにおいて試験する方法であって、可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体を含む組成物を哺乳動物の体液サンプルに接触させ、該サンプル中のタンパク質への該抗体の結合を測定することを含む方法。
【請求項２】
ヒトの体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質を検定するテストキットであって、以下の(a)および(b)を含むキット：
(a)可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体、および
(b)前記抗体の前記可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質への結合を検出する検出手段。
【請求項３】
患者体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質を検出及び定量することにより患者におけるC-erbB-2タンパク質を過剰発現するヒト腫瘍細胞の存在をインビトロにおいて検出する方法であって、以下の(a)および(b)を含む方法：
(a)体液試料を可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体と接触させること、および
(b)該抗体に結合した可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質の量を検出すること、ここで、正常体液中の結合レベルを超えた結合レベルの増加はC-erbB-2を過剰発現する腫瘍細胞の存在を示すものである。
【請求項４】
ヒトの体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質を検定するテストキットであって、以下の(a)および(b)を含むキット：
(a)ラベル化した可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質、および
(b)(i)前記ラベル化した可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質と、
(ii)ヒトの体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質の
制限量のC-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体への競合的結合を検出する検出手段。
【請求項５】
可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質を用いた、ヒトの体液中の可溶性C-erbB-2細胞外ドメインタンパク質に特異性を有する抗体を検出及び定量するインビトロ検定方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、生化学工学及び免疫化学の分野におけるものである。特に、本発明は適当な宿主生物に発現された組換えＤＮＡ分子ならびにそのＤＮＡ分子から得られた新規な蛋白質及びポリペプチドに関するものであって、かかる蛋白質及びポリペプチドは組換え的に、合成的に又は、生物学的に生産された蛋白質及びポリペプチドをフラグメント化して生産することができるものである。本発明の組換えＤＮＡ分子は、ここで指定した糖蛋白質７５（gp７５）であるＣ−erbＢ−２オンコジーンの外部ドメインから得られる蛋白質及びポリペプチドをコード化するＤＮＡによって特徴付けられる。これら血清学的に活性で、免疫原性及び／又は抗原性を有する蛋白質及びポリペプチドは、癌患者の体液中にあるgp７５を免疫学的に検出するための試薬として有用であり、これらは診断医が患者の状態及び予後に関して重要な判断をすることを可能にするものであり、さらにこれらの蛋白質及びポリペプチドは、抗体の産生及び親和力による精製に用いる試薬として有用である。本発明の中心的な意義は、哺乳動物の体液中のgp７５を検出するよう設定した診断アッセイにある。発現され、または合成的に若しくは生物学的に生産された本発明の蛋白質及びポリペプチドは、腫瘍形成活性に対する癌患者及び二次的な腫瘍形成攻撃に対する回復癌患者の免疫学的応答の増強を図るためのワクチンとして、さらに有用である。さらに、前記gp７５蛋白質及びポリペプチドは、Ｃ−erbＢ−２発現細胞の腫瘍形成活性を抑制する治療において有用である。
哺乳動物細胞の悪性腫瘍に関する機序は、これまでも、また現在も熾烈な研究主題である。最も有望な領域の一つは、オンコジーンがいかにして発現し、また発現を停止するかということを解明することである。オンコジーンの多数が、癌の発生において重要な役割を演じていることが明らかにされている。オンコジーンによってコード化されている蛋白質が異常に作用し、正常細胞の癌細胞への転換において何らかの役割を演じているようである。まず最初に、オンコジーンがレトロウイルス中に検出され、続いてそのウイルスのオンコジーン細胞同等物が見出された。まず、急速なガン発生に応答し易いレトロウイルス遺伝子が１９７０年代始めにロウス（Rous）肉腫ウイルス（ＲＳＶ）に同定された。このウイルスは、ニワトリに癌を発生させるものであって、その遺伝子はsarcoma（肉腫）にちなんでsrcと命名された。１９７５年には、ウイルスのsrc遺伝子（ｖ−src）が、すべてのニワトリ細胞中にほぼ正確なコピーを有することが見出された。ｖ−srcの該細胞同等物は、ｃ−srcである。
オンコジーンのスコア（score）は、以前よりレトロウイルスから分離されており、この分離の対象となったウイルスは、ニワトリ、他の鳥類、ラット、マウス、猫又は猿に、癌、肉腫、白血病又はリンパ種を起こさせるものである。それぞれの場合において、オンコジーンは宿主動物の正常遺伝子と密接に関係しており、かつ正常蛋白質に類似のオンコジーン蛋白質をコードすることが見出された。
また、オンコジーンは、人組織及び動物組織にも発見された。多種の腫瘍細胞のＤＮＡ中の遺伝子は、正常な培養細胞中にトランスフェクションにより導入された場合、それらを癌細胞に転換する。このようなオンコジーンは、プロト−オンコジーンの事実上のコピーでもある。プロト−オンコジーンをオンコジーンに転換する具体的な機序がいかなるものであろうとも、オンコジーンは、そのオンコジーンがコード化する蛋白質によって効果を発揮する。オンコジーンを誘導するプロト−オンコジーンの生成物は、細胞の成長及び分化の調節及び初期発生において重大な役割を有するように思われる。形質転換蛋白質は、細胞に関し根本的な効果を有する。というのは、それらは、基本的細胞プロセスを妨害するからである。
アミノ酸へのリン酸分子の付加反応（リン酸化）を触媒する場合の酵素活性は、蛋白質機能の制御に重要であることが知られている。蛋白質をリン酸化する酵素は、蛋白質キナーゼ（ギリシア語Kinein“転位すること”に由来する。）と呼ばれている。公知の全オンコジーンのほぼ１／３は、チロシン残基に特異的な蛋白質キナーゼをコード化している。
表皮成長因子（ＥＧＦ）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を、分裂していない細胞の培養に加えた場合、細胞が分裂するよう刺激する。ＢＧＦ及びＰＤＧＦは、細胞の原形質膜に埋め込まれている特異的な蛋白質レセプターに結合することによって、そのシグナルを伝達する。ＥＧＦに対するレセプター蛋白質を分離した際に、ＥＧＦ分子がそのレセプターと結合した時に刺激されるチロシンキナーゼ活性に関連していることが見出された。次いで、ＰＤＧＦレセプターも同じ酵素機能があることが示された。
チロシンキナーゼ活性を有するヒトプロト−オンコジーンは、３つの研究グループによって確認された：センバ（Semba）らのグループ、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）, ８２：６４９７（１９８４）（遺伝子Ｃ−erbＢ−２を示している）、Coussensらのグループ、Science,２３０：１１３２（１９８５）（遺伝子ＨＥＲ２を示している）、Kingらのグループ，Science,２２９：９７４（1985）（遺伝子ＭＡＣ１１７を示している）である。関連するラットの遺伝子（neuで示される）について、シェクター（Schecter）らにより報告されている（Science, ２２９：９７６（１９８５）。遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現の増幅した翻訳が、腫瘍細胞及びセルラインにおいて観察されている。〔例えば、フクシゲ（Fukushige）ら，Mol. Cell. Biol., ６：９５５（１９８６）（遺伝子の増幅及び発現（elevated expression）（ｍＲＮＡ）がＭＫＮ−７胃セルラインで観察されたことを記載）、コーセンス（Coussens）らの前記論文（遺伝子の転写（elevated transcription）が、肝芽細胞腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、２種の神経芽細胞腫及びウィルムス（Wilms）癌から得られたセルラインで観察されたことを記載）、センバ（Semba）らの前記論文（遺伝子が人唾液腺癌で増幅されたことを記載）、キング（King）らの論文（増幅が乳ガンセルラインで観察されたことを記載）、ヨコタ（Yokota）ら、Lancet, Ｉ：７５６（１９８６）（遺伝子の増幅が胸部、腎臓及び胃の腺癌において観察されたことを記載）及びタル（Tal）ら、Cancer Res., ４８：１５１７（１９８８）（遺伝子の散発性の増幅が各種組織の腺癌において見出されたことを記載）を参照のこと。〕
Ｃ−erbＢ−２レセプターは、ＥＧＦレセプターと密接に関連しているとはいえ、相違もしている。ＥＧＦレセプターのように、Ｃ−erbＢ−２蛋白質は、細胞外ドメイン、２つの富システイン反復クラスター（cysteine-rich repeat clusters）を含む膜内外ドメイン及び細胞内キナーゼドメインを有するが、Ｃ−erbＢ−２タンパクは１８５，０００ダルトン（１８５ｋｄ）の分子量を有するのに対して、ＥＧＦレセプターは約１７０ｋの分子量を有する〔シェクター（Schechter）ら、Nature, ３１２：５１３(1984)〕。フンター（Hunter）は、Sci. Am., ２５１：７０〜７７（1984）で、Ｃ−erbＢ−２蛋白質（gp１８５）はＥＧＦレセプターのチロシンキナーゼ作用をまねるが、統制されていない方法においてであると仮定している。
チロシンキナーゼは、そのｃ−src遺伝子の産生物がプロトタイプである機能グループと、細胞表面レセプターとして機能する機能グループの２つの機能グループに分けることができる。細胞成長因子またはそれらのレセプターと関連したものとして、少なくとも１２の哺乳動物のチロシンキナーゼが同定されている。これらオンコジーンのうち３つは、成長因子〔血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を伴うｃ−sis、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を伴うhst及びint２〕と強い相同性を共有している。その他のものは、配位子が同定されている成長因子レセプター〔表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターを伴うＣ−erbＢ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ−１）レセプターを伴うfms〕と強い相同性を共有している。残りの７つ、即ち、eph, Ｃ−erbＢ−２, c-kit, met, ret, c-ros及びtrkは、配位子を伴うレセプターであるかも知れないが、現時点ではその配位子は同定されていない。
今日、細胞のあるものは、それら細胞表面レセプターにおける変化によって腫瘍を形成するようになるという証拠が明らかにされてきている。これらの変化は、遺伝子の再配列、点突然変異またはＤＮＡ，ＲＮＡまたはタンパクレベルでの遺伝子増幅からなるということがいえる〔ドレビン(Drebin)ら、oncogene, 2:387（１９８８）；バーグマン（Bargmann）ら、Cell, ４５：６４９（１９８６）；デル（Der）, Clin. Chem.,３３：６４１(1987)〕。上記で引用したレセプターは、正常細胞の表面に存在し、一定のオンコジーンの過剰発現（overexpression）が、腫瘍形成活性と関連することが示されてきたとはいえ、そのようなことは、Ｃ−erbＢ−２の場合においてである。
今日、細胞を悪性化する能力を有するＣ−erbＢ−２オンコジーンが、非常に高いレベルである腫瘍中に存在しているということが認められている〔ザウ（Zhou）ら、Cancer Research, ４７:６１２３（１９８７）；バーガー（Berger）ら、Cancer Research, ４８：１２３８（１９８８）；クラウス（Kraus）ら，The EMBO Journal, ６（３）：６０５（１９８７）；及びスラモン(Slamon)ら、Science, ２３５：１７７（１９８７）〕。Ｃ−erbＢ−２オンコジーンの発現及び細胞の外膜におけるその所在は、ガンと密接に関連していると思われ〔クラウス（Kraus）らの上記文献、スラモン(Slamon)らの上記文献、ドレビン(Drebin）ら、Cell, ４１：６９５（１９８５）；及びジ・フィオレ（Di Fiore）ら、Science, ２３７：１７８（１９８７）〕、事実、それは、少なくともある場合においては、ガン発育の主要な事象であるかも知れない〔ミュラー（Mullar）ら、Cell, ５４：１０５（１９８８）〕。正常細胞表面上のＣ−erbＢ−２蛋白質の過剰発現は、それら正常細胞を変化させるかまたはそうでなければ腫瘍細胞として振舞うように思われる〔ドレビン(Drebin)らの上記文献、ジ・フィオレ(Di Fiore)らの上記文献、及びフジャック（Hudzaik）ら、PNAS(USA),８４；７１５９（１９８７）〕。
更に、Ｃ−erbＢ−２オンコジーンが高いレベルで発現する患者は、非常に乏しい臨床的予後しか有しないということが示されている〔スラモン(Slamon)ら、Science, ２３５：177(1987)〕。Ｃ−erbＢ−２の過剰発現と乏しい予後のこの関係は診断評価及び予後評価の両方の情報を提供することができる〔クラウス(Kraus)ら，The EMBO Journal, ６：６０５（１９８７）；及びスラモン(Slamon)らの上記文献〕。患者に要求される臨床治療の範囲の決定は、Ｃ−erbＢ−２オンコジーンまたは蛋白質の過剰発現を測定できる能力に基づいて行なうことができる。
組織の薄片の評価または組織病理学によって腫瘍組織中に発現されたＣ−erbＢ−２を検出するのに、抗体が使用され得る。有用な予後の指標が得られうるということが、方法論によって実証された〔ビヨバー（Vijver）ら、Mol. and Cell. Biol.７：2019（１９８７）；ドウ（Zhou）ら、Cancer Res.,４７：６１２３（１９８７）；バーガー（Berger）ら、Cancer Res.,４８:１２３８（１９８８）；クラウス（Kraus）ら、上記文献（１９８７）；及びスラモン(Slamon)ら、上記文献〕。しかしながら、組織がすぐに手に入らないか、またはそれが望ましいものでないか、または、腫瘍から組織を取り出すことができない場合が多い。従って、便利でかつ患者に傷を与えない迅速で正確な診断上の検査方法が、医療技術において必要とされている。本出願で特許請求されている発明は、哺乳動物におけるＣ−erbＢ−２の過剰発現を検出する、組織を傷つけることのない診断測定方法を提供することによって、前記要求に応えるものである。
スミス（Smith）らは、Science, ２３８：１７０４（１９８７）で、過剰の可溶性膜レセプター（ＣＤ４抗原）がＨＩＶ−１の感染力を遮断することを報告している。
可溶性のＣＤ４の分泌型は、その膜内外ドメイン及び細胞質ドメインを欠いている多種のＣＤ４をコードするベクターとの哺乳動物細胞の形質移入（トランスフェクション）によって産生される。この産生した可溶性ＣＤ４は、ＨＩＶ−１の膜糖タンパク（gp１２０）を完全なＣＤ４に匹敵する親和力と特異性で結びつけていると報告されている。
ウェバーとギル（Weber and Gill）は、Science, ２２４：２９４（１９８４）で、培養したヒト表皮腫Ａ４３１細胞が、彼らがＥＧＦレセプターの細胞表面ドメインと関連していると決定した可溶性１０５ｋｄ蛋白質を生産することを報告した。彼らはさらに、可溶性１０５ｋｄ蛋白質は膜結合完全レセプターからは得られないが、単独でその細胞によって生産されることを決定した。
ヒアリング等（Hearing et al.）は、J. Immunol., １３７(1):３７９（１９８６）で、精製されたマウス黒色腫−特異性抗原によるマウスの免疫化は、同系の宿主に、マウス黒色腫の二次的な接種に対する耐性を与えることを証明した。
ベルナルド等（Bernards et al.）は、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８４:６８５４（１９８７）で、外部ドメイン、膜内外アンカードメイン及び“neu”オンコ遺伝子といわれるヒトＣ−erbＢ−２ガン遺伝子と同等の約５０のアミノ酸のラット細胞内ドメインを発現する遺伝子組換えワクシニアウイルスは、マウスを免疫するために使用した時に、neu発現腫瘍細胞の二次的な接種に対して防御をもたらすことを証明している。ラットのneu蛋白質の外側のドメイン（外部ドメイン）が、担ガンマウス（ＮＦＳ株）における高度に免疫原性な決定因子であることが、そこでは注目される。
アロンソン等（Aronson et al.）の“A Human Gene Related to but Distinct from EGF Receptor Gene”（米国特許出願第６−８３６，４１４号；１９８６年３月５日出願）と題されたNTIS（National Technical Information Service）出願では、遺伝子の族をコード化するチロシンキナーゼの１種であり、ヒト乳ガンにおいて増幅される、ｖ−erbＢ関連ヒト遺伝子のクローニング、単離および部分的特性表示を記載している。前記の遺伝子はＣ−erbＢ−２であると決定された。この出願はその目的として、前記の遺伝子によってコードされた蛋白質生産物に向けられる抗体と、腫瘍の検出のための前記の抗体を含む診断用キット；その遺伝子によってコードされた生産物；異種ベクターシステムにおいてその蛋白質を発現することが可能なｃＤＮＡクローン；その遺伝子を発現することのできる形質転換細胞または微生物；および前記の遺伝子または蛋白質を検出することのできる核酸プローブおよび／または抗体試薬キットを提供することを記載している。前記の出願はさらに、毒物と接合した遺伝子生産物に特異的な抗体の治療的用途を示唆し、もし配位子がｖ−erbＢ関連遺伝子に存在するならば、それをターゲット物質として使うことができることを示唆している。
クライン等（Cline et al.）は、米国特許第4,699,877号（１９８４年１１月２０日出願）で、オンコジーンの発現生産物を目的として、生理的試料が分析されることを特徴とする、腫瘍の存在を検出するための方法と組成物を記載している。
ジ・フィオレ（Di Fiore et al.）はScience, ２３７：１７８(1987)で広範囲にわたる多様なヒト腫瘍が、増幅されたあるいは過剰発現された（overexpressed）erbＢ−２遺伝子を含むことを指摘している。erbＢ−２蛋白質による形質転換に配位子−レセプターの相互作用は必要ないことを確立するためにジ・フィオレ等は、ＮＨ2−末端の６２１個のアミノ酸（外部ドメインから）をコードする配列を除いた構造物を作った。彼らの発見は、ＮＨ2−末端の切断が“何であっても、erbＢ−２蛋白質の形質転換活性を増加することを示唆した（１８０頁に記載がある）。
アバウト−ピラック等（About-Pirak et al.）は、J. Natl. Cancer Inst.,８０（２０）：１６０５（１９８８）でＥＧＦレセプターの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体が試験管内でヒトの口の類表皮腫細胞のクローン形成を減少させることを報告している。抗−ＥＧＦレセプター抗体をシスプラチンと共に添加した時、これらの物質の抗腫瘍効果は生体内で相乗性を示した。
ベルガー等（Berger et al.）は、Cancer Res.,４８：１２３８（１９８８）で、原発性ヒト乳ガンからの５１個のＤＮＡ試料のうち１３個（２６％）がＣ−erbＢ−２遺伝子の多コピーを含むことを報告し、Ｃ−erbＢ−２蛋白質の発現と乳ガンの予後に使われるパラメーター（結節の状態と核のグレード）の間に統計的に顕著な相関関係があることを観察した。ベルガー等は、最近の研究が、検査された原発性乳ガンの３３％までに、Ｃ−erbＢ−２が増幅されており〔King等、上記文献；Slamon等、上記文献；van de Vijver等、supra；そしてVenter等、Lancet ２：６９（１９８７）〕そして、ヒト乳ガンセルラインの２５％までに、Ｃ−erbＢ−２が増幅されていることを〔Kraus等，上記文献〕示していることを指摘した。
スラモン等（Slamon et al.）は上記文献（１９８７）で、Ｃ−erbＢ−２遺伝子の増幅が、腋窩リンパ節のガンの存在と、乳ガン患者のエストロジェンレセプターの状態と乳ガン患者中の原発性腫瘍の大きさとに相関関係を持つことを示した。その研究で、調査された１８９の原発性ヒト乳ガンうち３０％に、Ｃ−erbＢ−２が２倍から２０倍以上、増幅されていることが見出された。スラモン等は、Ｃ−erbＢ−２遺伝子の増幅は、乳ガン患者において、生存期間と再発までの時間の両方にとって顕著な予測指標となることを結論づけた。患者の腫瘍からのＤＮＡ中に該遺伝子の多数のコピーを有する患者は、生存期間が短いだけではなく、再発までの時間が短いため、より不幸な結末となった。
スラモンら（Slamon,et al., Cancer Cells 7/Molecular Diaogostics of Human Cancer, p. ３７１）（コールドスプリングハーバーラボ．１９８９）は、ヒト乳癌腫瘍から産生される数種のｃＤＮＡクローンの配列決定により、ラットneu遺伝子と異なり，膜内外ドメインにおける変異は遺伝子産物の変化に不可欠なものではないことが示されたと報告した。その代わり、上記のデータは正常産物の過剰発現（overexpression）を含む変化と一致している。
ドレビンら（Drebin et al., Cell, ４１：６９５（１９８５））は、neu gp１８５に対するモノクローン抗体はneu−形質転換ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を非形質転換表現型に復帰させることが、足場非依存性増殖により明らかになったことを報告した。ドレビンら（Drebin et al, Oncogene, ２：３８７（１９８８））は、gp１８５の細胞表面外部ドメインと反応するモノクローン抗体は試験管内及び生体内で直接に腫瘍増殖を禁止すると述べている。
マスコら（Masuko et al., Japn. J. Cancer Res.,８０：１０（１９８９））は、ヒトＣ−erbＢ−２遺伝子−形質移入NIH 3T3細胞に対してモノクローン産生したネズミ１gMについて、胃癌、結腸癌及び肝臓癌細胞セルラインを含む上皮腫瘍セルラインの一部と反応するが、いかなる非上皮セルラインとも反応しないと記載している。
ヤーデンとワインベルクは（Yarden and Weinberg, PNAS(USA), ８６：３１７９（１９８９））は、モデル系としてneuオンコジーンを用いて、成長因子レセプターを想起させる構造を有するオンコジーンコード膜内外チロシンキナーゼに対する仮想的配位子の検出へのいくつかの実験的アプローチを開発した。そこには、resオンコ遺伝子による形質転換された線維芽細胞が分泌したneu−コードオンコ蛋白質の配位子の候補が示唆されている。
以下の論文は、オンコジーンの一般的記載、治療薬としてのモノクローン抗体の使用、及びＣ−erbＢ−２オンコジーンについての情報を提供する。デール（Der, Clin. Chem. ３３(5):64１（１９８７））；ビショップ（Bishop, Science, ２３５：３05（１９８７））；ヘンリック及びウェスターマーク（Henrik and Westermark, Cell. ３７：９（１９８４））；デュースベルク（Duesberg,  Science,２２８：６６９（１９８５））；シベリー(Shively, J. Clin. Immunoassay, ７(1):１１２（１９８４）);ファンデビジャー（van de Vijver, Oncogenes２：１７５(1988)）;及びハンター（Hunter, Sci. Am.２５１：７０（１９８４））。
発明の要旨
方法及び組成物はＣ−erbＢ−２を過剰発現する悪性腫瘍を同定するために提供される。本出願により特許請求されている発明は、出願荷（tumor burden）を運搬する哺乳類の生物的流体(biological fluid)中におけるＣ−erbＢ−２遺伝子によりコードされた外部ドメイン糖タンパク質（gp７５）又はその部分の検出に基づく。該発明は、哺乳類の生物的流体中のgp７５を検出及び定量し、それにより腫瘍を検出しその増殖を定量する特殊な治療検出法を提供し、また腫瘍性疾患の治療及び予後に価値のある情報を提供する。宿主の体液中のgp７５の上昇した値、即ち、正常バックグラウンドバインデング値以上の値は、Ｃ−erbＢ−２の過剰発現を示す。（典型的なバックグラウンドバインデング値は、一連の正常ヒト血清に対して１．６８％と図１０には示されている。）
Ｃ−erbＢ−２増殖と関係する他の癌の中で乳癌又は卵巣腺癌のような腫瘍性疾患の患者の生存は、患者の生物的流体をgp７５又はその部分の存在について検査することにより決定できる。
さらに、本発明は患者の体液中のgp７５タンパク／ポリペプチドに対する抗体を検出及び定量する検査法を提供する。患者の体液中のgp７５タンパク／ポリペプチドの値を測定する本発明の検査法の結果と特に相関する上記検査法の結果は、診断し、患者の状態をモニターして治療方針を決定し、そして予後を作成する際に重要な情報を提供する。
さらにまた、本発明は、患者の体液中のgp７５に対する仮想の配位子の値を検出及び定量する検査法を提供する。同様に、本明細書で提供されるような、患者の体液中のgp７５タンパク／ポリペプチド及びその抗体の値を検出及び定量する方法の結果と特に相関する上記の情報は、治療及び予後に重要であり、患者の状態をモニターする際及び治療方針を決定する際に有用である。
上記の背景技術において示したように、Ｃ−erbＢ−２の増幅は、長期間の生存の可能性の減少及び疾患の再発時期の早期化と相関していることがわかっている。本発明の検査法は手術の前後において有用である。上記のＣ−erbＢ−２の増幅を示す患者は、疾患のかなりの初期の段階であっても、生存の可能性を増加させるためにより厳密に治療する方がよいであろう。さらに、腫瘍を取り除く手術後における患者の生物的流体中にgp７５が存在することは、例えば、系統的な化学療法又は放射線療法の介入をすぐに必要とする転移を示すものである。
本発明は、Ｃ−erbＢ−２過剰発現（overexpress）腫瘍の検出についての非侵入性診断検定及び予診検定に関する上記の要求を満たすものである。
さらに、本発明はＣ−erbＢ−２オンコジーン（以後、gp７５遺伝子という）の外部ドメインＤＮＡ配列又はそのフラグメントによりコードされる新規な蛋白質及びポリペプチドに関するものであり、かつgp７５遺伝子又はそのフラグメントを好適な発現ベクターに遺伝子組換えすること、このような発現ベクターで宿主を形質転換すること、及び組換え、合成又は他の生物学的手段によりgp７５蛋白質及びポリペプチドを生産することに関する。このような組換gp７５蛋白質及びポリペプチドはグリコシル化又は非グリコシル化のいずれをも行うことができるが、グリコシル化するのが好ましい。又、ここに記載の方法により実質的に純品となるまで精製することができる。本発明は、さらに合成又は生物学的に製造したgp７５蛋白質及びポリペプチドに関する。
上記gp７５蛋白質及びポリペプチドの用途の１つはワクチンである。さらに、gp７５エピトープを免疫系に効率的に与えるワクチンは、gp７５又はgp１８５を過剰発現する強化細胞膜を含むことができる。このような細胞膜は、Ｃ−erbＢ−２を過剰発現させるために形質転換した組換宿主、好ましくはトランケート内部ドメインを有する形にＣ−erbＢ−２を過剰発現するものから誘導、又は人癌細胞系から誘導することができる。さらに、本発明により提供される抗イディオタイプ抗体は、ワクチンとして有効である。
gp７５蛋白質及びポリペプチドの別の用途は、腫瘍活性を弱める治療剤であり、このものを単独で又は化学療法剤と組合せて使用することができる。
gp７５蛋白質及びポリペプチドのさらに別の用途は、親和性結合研究においてＣ−erbＢ−２に対する推定上のリガンド（配位子）を検出することである。仮に哺乳動物の生物学的流体中に該リガンドが検出されると、次にこれを本発明のgp７５蛋白質及びポリペプチドを用いて精製できるかも知れない。例えば、gp７５蛋白質及びポリペプチドは、遺伝子工学によって生産されたリガンドを精製する方法において使用できるかも知れない。
さらに、本発明は、gp７５蛋白質又はポリペプチドをコードするだけでなく、人に対して免疫原性を有さずかつ人の体液中の抗体に典型的には反応しない蛋白質／ポリペプチドのアミノ酸配列をもコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。このようなＤＮＡ配列の例は、ベータガラクトシダーゼのアルファペプチドコード領域である。さらに、本出願では、実質的に純粋で、かつ天然生成物を含まない組換え融合蛋白質／ポリペプチドをクレームする。
さらに、本発明は、gp７５遺伝子又はそのフラグメントを含む精製、単離ＤＮＡ分子に関する。
さらに本発明は、gp７５蛋白質及びポリペプチドに対する抗体の診断及び治療上の使用に関する。さらに本発明は、gp７５蛋白質及びポリペプチドに対するような抗体に対する非イディオタイプ抗体に関する。
さらに本発明は、組換により、合成により又は他の生物学的方法により製造した本発明のgp７５蛋白質及びポリペプチド及び／又はこれに対する抗体を用いたgp７５用診断検定に関する。
本発明は、また、本発明の検定を具体化したテストキットを提供するものであり、該テストキットは、抗体gp７５蛋白質／ポリペプチド及び／又はＣ−erbＢ−２の無傷（intact）外部ドメインに対する抗体を含む（ここで無傷とは、gp７５が細胞表面で発現することを意味する。）。これらの検定は固相検定とすることができるが、これに限定されるものではなく、液相形態でも行うことができ、エリサ法に基づく粒状検定や、例えばアビジン／ビオチン法を用いた増幅した又は非増幅の放射又は螢光検定とすることもできる。
本発明はさらに、本発明の診断検定におけるgp７５蛋白質／ポリペプチドを置換することができるgp７５蛋白質／ポリペプチド認識モノクローナル抗体に対する抗イディオタイプを提供する。
図１は、ＣＨＯ細胞から発現した組換Ｃ−erbＢ−２細胞外ドメイン蛋白質（gp７５）のイムノアフィニティークロマトグラムを示す。濃縮ＣＨＯ上清を０．５×５．０cmのイムノアフィニティーカラムに流速０．２μｌ／分で流した。次に、カラム溶離液の280ｎｍ（Ａ２８０ｎｍ）における吸収がベースラインに到達するまでカラムにＰＢＳを０．５μｌ／分の速度で流してカラムを洗浄した。特異結合物質が図中の矢印で示した、流速０．２μｌ／分、pH２．５の１００ｍＭグリシン−ＨＣｌの段階的グラジエントで溶離した。
図２Ａは、図１に示した組換的に生産したＣ−erbＢ−２ gp７５のイムノアフィニティーカラムフラクションのSDS−PAGEを示す。各フラクションのサンプルをラムリ（Laemmli）サンプルバッファー中で調製し、１０％ポリアクリルアミドゲル上で行った。ゲルをコーマシー（Coomassie）ブルーＲ−２５０で染色した。
第２Ｂ図は、ウェスタンブロットである。第２Ａ図で使用したゲルと同じゲルを使用し、分離したタンパク質は電気泳動により０．２２μｍのニトロセルロース膜に移した。Ｅ．coliで発現した組換フラグメントgp１８５に対して生起させたウサギポリクローナル抗体（抗体９２Ａ）を使用して膜をプローブ分析した。ヤギ抗ウサギ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合体及びインドファン基質（Vio-medics, Worcester, MA）を使用して特異的に結合した抗体を可視化した。各レーンには以下のように負荷した。レーン１：濃縮ＣＨＯ上清；レーン２：予備染色分子量標準（Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD）；及びレーン３から７：免疫アフィニティカラムフラクション１から５（第２Ａ図に示したのと同様）。
第３図は、クローニングベクターpＦＲＳＶの部分制限地図である。このベクターは、ＳＶ４０初期領域プロモーターによって駆動される転写ユニット及び複製開始点（origin）、並びにＳＶ４０大Ｔ抗原挟持配列（５′ｍＲＮＡスプライシング）及び初期領域ポリアデニル化部位を有している。第２の転写カセットは、突然変移体ＤＨＦＲ遺伝子、即ちメトレキセート（ＭＴＸ）耐性をコードする優勢選択マーカーを含んでいる。最初のＳＶ40 ori／プロモーターから下流に位置する唯一のＥcoＲＩ部位に、前記２．２kb ｃ−erbＢ−２secフラグメントをサブクローン化してpＦＲＳＶ−ｃ−erbＢ−２secを生成した。
第４図は、以下のように各レーンに負荷したＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１及び９：Ｓtd；レーン２から６：抗−ｃ−erbＢ−２  ＴＡb ２５２に結合するために、ＮＩＨ３Ｔ３  ｃ−erbＢ−２形質移入体により発現されたｃ−erbＢ−２の可溶フラグメントをgp７５と競合させる；レーン２から６：ＮＩＨ３Ｔ３−ｃ−erbＢ−２からの細胞溶解物を増加量で１０μｇの抗−ｃ−erbＢ−２  ＴＡb ２５２と共に７時間インキュベートし、その後gp７５発現ＣＨＯ細胞から回収したin vitroラベル化上清の４００μｌのインキュベートを１０時間行った；レーン７：アイソトープ適合非特異的コントロールのマウスミエローマｍＡb、（ＩｇＧ１）により免疫沈降させたin vitroラベル化gp７５ CHOクローンからの溶解物；レーン８：ＴＡb ２５２により免疫沈降させたＣＨＯ−gp７５からの溶解物。
第５図は、組織培養上清からのgp７５の放射活性免疫沈降を示す。レーン１及び１２：分子量マーカー；レーン３から６：１２倍に濃縮され９．２ウサギポリクローナルにより沈降されたSKBR３細胞からの上清−レーン３；レーン４：Ａ−２９ネズミ抗−ｃ−erbＢ−２ハイブリドーマペアレント；レーン５：ＴＡb 252ネズミ抗−ｃ−erbＢ−２モノクローナル；レーン６：Amershamネズミ抗−ＥＧＦレセプターモノクローナル；レーン７から１０：６倍に濃縮されたｃ−erbＢ−２腫瘍遺伝子により形質転換された３Ｔ３細胞からの上清；培地は沈降可能シグナルを可視化するのに充分なまでには濃縮しなかった。
第６図は、ｃ−erbＢ−２陽性及び陰性細胞系からの上清の放射活性免疫沈降を示す。レーン１及び１２：分子量マーカー；レーン２及び４：１２倍に濃縮されＴＡb ２５２により沈降されたＭＤＡ４３５からの上清；レーン３及び５：Amersham抗−EGFレセプター抗体で沈降された同じ上清；レーン６及び７；ＴＡb ２５２及び抗−ＥＧＦレセプター抗体でそれぞれ沈降されたMDA ４６８培養からの１２倍に濃縮された上清；レーン８及び９：無関係；レーン１０及び１１：１２倍に濃縮されＴＡb ２５２及び抗−ＥＧＦレセプタ−抗体で沈降された形質移入３Ｔ３細胞からのコントロール上清。
第７図は、ＴＡb ２５９を捕獲抗体として、ＴＡb ２５６を放射活性標識第２抗体として使用したサンドウイッチＩＲＭＡアッセイにおける、部分的に精製したgp１８５及びgp７５タンパク質の標準曲線を示す。このアッセイにより、形質移入したＮＩＨ３Ｔ３細胞から部分的に精製した全ｃ−erbＢ−２タンパク質並びに形質移入ＣＨＯ細胞の上清から精製された外部ドメインタンパク質の両方を検出することができる。このアッセイは、部分精製gp７５を標準として使用した場合、約１００倍感度が同上する。
第８図は、ＴＡb ２５９／２５６サンドウィッチＩＲＭＡアッセイで試験した場合における、ｃ−erbＢ−２形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞により生起された腫瘍を有するヌードマウス血清中に出現した抗原の検出を示す。血清はすべて１：５（容量／容量）の希釈で試験し、このアッセイにおける血清の前（プレ）腫瘍プールのバックグラウンド結合は１．７％である。このアッセイにおいてgp７５蛋白質を使用した標準曲線は、第７図のものと同等のものである。マウス中、シグナルは５００から１０００mm3の範囲の腫瘍サイズで検出することができ、腫瘍が３０００から10,000mm3に達するまで増加し続ける。
第９図は、ｃ−erbＢ−２遺伝子により形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞により生起された腫瘍を有するマウスから得られＴＡb ２５２又はＰＢＳ又はＩｇＧ１により処理されＴＡb ２59／２５６サンドウイッチＩＲＭＡで試験されたヌードマウス血清の分析を示す。血清は、１月の実験期間の間を通じて種々の採血日から得、１：５の希釈において試験した。マウスは、その血清を試験した時点において、ＴＡb ２５２、ｃ−erbＢ−２の外部ドメインと反応性を有するＭＡb、ＩｇＧ１又はＰＢＳによる２から８回の処理（１００−５００μｇ／処理）を受けていた。アッセイにおいて６種の前腫瘍血清を試験し、平均結合を調べた。アッセイにおけるバックグラウンドカットオフ（background cut-off）は、前腫瘍血清の平均＋２標準偏差分この平均より上、即ち２．２％と決定した。ＰＢＳ処理マウスは、１００１から３000mm3の腫瘍容量において有意にバックグラウンドを上回る抗原を発生し（ｎ＝７）、一方、ＴＡb ２５２処理マウスは同じ腫瘍容量において極くわずかの検出可能抗原しか発生しなかった（ｎ＝５）。より大きな腫瘍容量においても、ＴＡb処理マウスからの血清における発生抗原の検出可能性は（ｎ＝９）、ＰＢＳ処理マウスからの血清と比較して（ｎ＝８）、やはり抑制されている。
図１０は１：５の希釈度（容量／容量）において、ＴＡb 259／２５６サンドウイッチＩＲＭＡにおける、正常な志願者からの１２人の血清に対する試験結果を示す。これらの血清を使用し、１．６８％のバックグラウンドバインディングレベル（background binding level）が決定される（平均＋２の標準偏差）。
図１１は１：５の希釈度において、ＴＡＢ２５９／２５６IRMA検定における、２０人の乳癌患者からの連続的な出血に対する試験結果を示す。一連の試料が疾患および治療の経過を通じて採取された。１−４の患者に対しては、腫瘍の外科手術による切除の１日前の、最初の診断時に試料〔ａ〕が採取された。５−１０の患者の試料〔ａ〕は腫瘍の外科手術による切除の数日後に採取され、１１−２０の患者の試料〔ａ〕は最初の、またはつぎの再発時に採取された。残余の試料〔ｂ−ｆ〕（各患者に対し４または５）は治療期間中いろいろな間隔で採取され、疾患または治療に対する応答の特別な状態には相応しない。この検定に対するバックグラウンドカットオフ（background cut-off）は１．６８％であった。
〔図１２〕はＴＡb ２５９／２５６ＩＲＭＡ検定における、乳癌患者からの３人の血清をgp７５標準および正常な人の血清と比較した滴定曲線を示す。血清はすべて１：５の希釈度において試験され、検定中のバックグラウンドカットオフは１．６％である。患者１９ａに対しては、初期の腫瘍が切除されて約１−1/2年後に患者１９に転移があらわれた時に血清の試料がとり出された。患者１９はこの試料が採取されて１−1/2年後に死亡した。初期の腫瘍が診断された７ヶ月後に肝臓および骨髄への転移についての最初の減退があった時に患者７から７ｅの血清試料がとり出された。患者７は、この最後の試料がとり出された６日後に死亡した。患者４ｆの試料は、初期の腫瘍が診断された２年後に肝臓および結節への転移についての最初の減退があった時にとり出された。患者４はこの〔ｆ〕試料がとり出された６ヶ月後に死亡した。
図１３はＣ−erbＢ−２遺伝子で形質移入（トランスフェクション）されるＮＩＨ３Ｔ３細胞から溶解物へのＴＡb ２５１の結合に拮抗するいろいろな細胞溶解液の能力が試験された拮抗検定結果を示す。ＳＫＯＶ３、ＢＴ４７４およびＮＩＨ３Ｔ３tラインはすべてgp１８５蛋白質を過剰に表現し、これらのラインからの溶解物は増加する蛋白質濃度と拮抗する。対照のＮＩＨ３Ｔ３溶解物は拮抗することがない。
図１４はＣ−erbＢ−２遺伝子のgp７５部分でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞系からの上澄液がＮＩＨ３Ｔ３t細胞から溶解物へのＴＡb ２５１の結合と拮抗する拮抗検定に対する結果を示す。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞からの上澄液は拮抗することがない。
図１５はＣ−erbＢ−２でトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞によって誘導された動物が持つ腫瘍からのヌードマウスの血清はＮＩＨ３Ｔ３t細胞から溶解物へのＴＡb ２５１の結合と拮抗し得ることを表わす試験結果を示す。１１００mm3よりも大きなサイズの腫瘍を持ったマウス２−４は拮抗することができるが、マウス１の血清および血清のプレ腫瘍プールはこの検定において拮抗しない。
図１６はＣ−erbＢ−２遺伝子の完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。〔カウスセンス等、上記（Coussens et al. supra）〕。gp７５外部ドメインは約アミノ酸ナンバー２２（セリン；ser−２２）から約アミノ酸ナンバー６５３（セリン；ser−６５３）までを含む（このアミノ酸はそれらの上に黒わくで印がつけられている）。
本発明の多くの面を強調する概念は、Ｃ−erbＢ−２で過剰発現された細胞がＣ−erbＢ−２外部ドメイン（gp７５）を宿主の哺乳動物の体液中に放つということの発見である。実施例１、４、５および６はこの発見に導く証拠を略述する。可溶性のＣ−erbＢ−２誘導体（gp７５）は安定して変形されgp７５で表現された細胞の上澄液中に見出された。この蛋白質は約７５Ｋの分子量を有することおよびＮＩＨ３Ｔ３t（Ｃ−erbＢ−２で表現された細胞）中に存在する蛋白質と拮抗することがわかった。（実施例1.）実施例４、５および７はＣ−erbＢ−２外部ドメインに特有な親和性結合を有する発生した抗原の検出を、それぞれＣ−erbＢ−２トランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３t）によって誘導されたヌードマイスの持つ腫瘍の血清において、および人の腫瘍培養上澄液において、および乳癌患者からの人の血清において、詳しく述べている。この発見は人および他の哺乳動物における腫瘍疾患の診断および治療のための新規な方法および組成物の開発への道を開いた。
アッセイ
哺乳類、好ましくはヒトの体液中の三つの異なる実体を検出し、定量するためのアッセイが、ここに提供される。この場合、これらの実体は、以下のとおりである。gp７５タンパク質／ポリペプチド；gp７５タンパク質／ポリペプチドの抗体；及びＣ−erbＢ−２に対する推定配粒子（リガンド）。夫々のアッセイは患者の症状に関する重要に情報を与え、且つ新生物性疾患に関して哺乳類をスクリーニングし、新生物性疾患を診断し、その疾患の進行を監視するのに個別に有益であり、且つその疾患の進行を予測し、そして適切な治療プロトコルを決定することに有益である。しかしながら、これらのアッセイの一つ以上からの結果、好ましくは三つの全てに関する試験結果の相関関係は、患者の症状に関する最良のプロフィールを与える。
例えば、患者は大きな腫瘍を示すことがあるが、患者のgp７５の量は比較的少ないことがある。読み取りの低さはgp７５タンパク質／ポリペプチドの抗体の患者による発生のためによるものであり得るが、腫瘍の小さいことのためではない。
データを相関させる方法の別の例は、gp７５に対する推定リガンドの関係に関して患者の状態の広範な所見を与える。患者は多量の循環gp７５タンパク質／ポリペプチドを示すことがあるが、患者が推定リガンドを生産していない場合には、新生物性疾患を有していない。リガンドがない場合、Ｃ−erbＢ−２細胞表面レセプターはそれにより非制御増殖を開始するように刺激され得ない。こうして、リガンド対gp７５の比は、プロトオンコジーンがオンコジーンに活性化される機構であるリガンド／レセプター複合体のモデルのもとに有意である。
哺乳類体液中のgp７５タンパク質／ポリペプチドに関するアッセイ
哺乳類、好ましくはヒトの体液中のgp７５タンパク質／ポリペプチドを検出し、その中のこのようなgp７５タンパク質／ポリペプチドの量を定量するための非観血的診断アッセイが提供される。gp７５タンパク質／ポリペプチドという用語は、この状況下で体液中の標的抗原として使用される。何となれば、放出された（shed）gp７５タンパク質は患者の体液中で種々のフラグメントに分解されることがあり、これらのフラグメントがタンパク質（５０個より多いアミノ酸を有する）及びポリペプチド（５０個より少ないアミノ酸）を構成するからである。
このようなアッセイは、新生物性疾患の状態を監視する貴重な手段を与える。予測を改良することに加えて、症状の知識は、担当医師が個々の患者に最適の治療を選ぶことを可能にする。例えば、再発の高い可能性がある患者は、全身の化学療法及び／または放射線療法を通常伴なって激しく治療し得る。再発の可能性が少ない場合には、それ程積極的ではない治療が選択し得る。更に積極的な治療養生によりひき起こされる重度の患者の窮迫のために、このような積極的な治療を要するこれらの患者を高い確度でもって見分けることが望ましい。
本発明は、充実性腫瘍及び造血性癌の両方を含む多種の新生物性疾患をスクリーニングするのに有益である。新生物性疾患の例は、腺癌及びメラノーマの如き癌；神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫の如き中胚葉腫瘍；アソステオサルコーマ（asosteosarcomas）、ユーイングサルコーマ、及び種々の白血病の如きサルコーマ；及びリンパ腫を含む。胸、卵巣、特に結腸及び胃を含む胃腸管、肝臓、甲状腺、前立腺、脳、膵臓、尿管（膀胱を含む）、及び唾液腺の腫瘍が、特に関係がある。前立腺、卵巣及び胸の腫瘍が、更に特別な関係がある。更に詳しくは、胸及び卵巣の腺癌が広く研究され、Ｃ−erbＢ−２を過剰発現することを確かめられた。
本発明の方法によりgp７５を分析するのに特に関係がある体液は、血清、精液、胸部浸出液、唾液、尿、シトゾル、血漿及び髄液を含む。血清が本発明の方法によりスクリーニングするのに好ましい体液である。
Ｃ−erbＢ−２オンコジーン（gp７５）の外部領域（外部ドメイン）の構造を知るため、このタンパク質を特異的に認識する幾つかのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が生成し得る。gp７５はＣ−erbＢ−２増幅に関連する腫瘍の表面から特異的且つ特別に放出され、しかも哺乳類の生体液中に自由に存在するので、そのタンパク質の量を検出し定量することが可能である。Ｃ−erbＢ−２オンコジーンの外部領域への特別につくられたモノクローナル抗体の結合を定量化し得る現行の抗体検出技術を利用して、癌患者の体液中の外部領域の量を測定することができる。このようなアッセイは腫瘍を検出し、それらの増殖を定量化し、ヒトの疾患の診断及び予後を助けるのに使用し得る。そのアッセイは、哺乳類の体液中のgp７５を検出し定量化するために適当にラベルし得るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を伴なう。
本発明の主題は、宿主中の正常な細胞または宿主から新たに取り出された細胞の群中の悪性細胞の存在の可能性を評価するための方法及び組成物を提供する。好ましい方法は、第一段階として、精製量のＣ−erbＢ−２オンコジーンの外部領域を得、それを免疫原として使用してマウスまたはその他の適当な宿主中でモノクローナル抗体を生成することを伴なう。モノクローナル抗体はgp７５のエピトープと特異的に反応すべきである。また、膜表面でＣ−erbＢ−２を発現する全無傷細胞が抗原源として使用し得る。外部領域の異なるエピトープを認識するために多数のモノクローナル抗体を生成することが可能であり、これらのモノクローナル抗体は単独で使用でき、またはカクテルとして組合せて使用してアッセイの特異性及び感度を増大することができる。免疫原として全外部領域を使用することの他に、このタンパク質のフラグメント、または組換えＤＮＡ手段により生成されたタンパク質が、また、特異的なモノクローナル抗体を生成するのに使用し得る。また、外部領域配列内の種々の配列に相当するポリペプチドが免疫原の源として使用し得る。全ての場合、生成された抗体は、それらが腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の両方の表面に存在する他のタンパク質との極めて制限された交差反応性を有するような特異性を有する。それらは、例えば、多くの正常細胞の表面に存在するＥＧＦレセプターと反応しない。診断アッセイそのものは、典型的には、ヒト宿主からの少量の体液、好ましくは血清を得ることを伴なう。次いで、血清中のＣ−erbＢ−２外部領域の存在が、幾つかの良く特定された抗体診断アッセイを用いて定量化し得る。これらはウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＲＩＡアッセイ（放射性免疫測定法）、または二重抗体サンドイッチアッセイであってもよく、これらは全て診断業界で普通に使用される。全ての場合、結果の解釈は、抗体または抗体の組合せがＣ−erbＢ−２に無関係である血清中に存在するその他のタンパク質及びタンパク質フラグメントと交差反応しないという仮定に基く。これらの方法は、Ｃ−erbＢ−２外部領域の存在が背景に上記されたように腫瘍の存在と強い相関関係を有するという事実に基く。これらのアッセイは腫瘍の存在を検出し、腫瘍の持続される増殖を検出し、癌転移の存在を検出し、また外科手術、癌の化学療法また放射線療法後の全腫瘍組織の不在または除去を確かめるのに使用し得る。更に、それは癌化学療法及び腫瘍再発を監視するのに使用し得る。
実施例３は、本発明の好ましい診断方法−二重サンドイッチ免疫ラジオメトリック測定法（ＩＲＭＡ）のフォーマットを説明する。体液中のgp７５の検出のための多くのその他のフォーマットが勿論利用でき、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。ＥＬＩＳＡ試験の一つの型の代表は、マイクロタイタプレートがgpタンパク質／ポリペプチドの抗体またはＣ−erbＢ−２を発現、好ましくは過剰発現する全細胞（即ち、無傷gp７５）の抗体で塗布され、これに患者の血清の試料が添加されるフォーマットである。抗原を抗体に結合させるインキュベーションの期間の後に、プレートが洗浄され、酵素に結合される別の組の抗gp７５抗体が添加され、インキュベートされて反応を行ない、次いでプレートが再度洗浄される。その後、酵素基質がマイクロタイタプレートに添加され、酵素が基質上で作用するのに充分な期間にわたってインキュベートされ、最終調製物の吸光度が測定される。吸光度の大きな変化は陽性結果を示す。
また、gp７５タンパク質及び／またはポリペプチドの抗体が患者の体液中のgp７５の存在を検出し定量化するのに使用し得ることが、診断アッセイの当業者に明らかである。一つのこのような実施態様に於いて、競合イムノアッセイが使用され、その場合、gp７５タンパク質／ポリペプチドがラベルされ、体液が添加され、gp７５タンパク質／ポリペプチドに特異的な抗体へのラベルしたgp７５の結合を競合する。このようなアッセイはgp７５タンパク質／ポリペプチドを検出するのに使用し得る。
別の実施態様に於いて、イムノメトリックアッセイが使用でき、この場合、gp７５タンパク質またはポリペプチドのラベルした抗体が使用される。このようなアッセイに於いて、抗原結合された抗体と複合体形成するラベルした抗体の量は体液中のgp７５の量に直接比例する。本発明のアッセイに使用するためのモノクローナル抗体は、当業界で公知の方法、特に Nature 、２５６巻、４９５〜４９７頁（１９７５年）に記載されているコーラー（Kohler）及びミルスタイン（Milstein）の方法により得ることができる。
このような診断方法は、哺乳類、好ましくはヒトの体液中のgp７５に関して測定するための試験キットで具体化でき、その場合、このような試験キットはgp７５タンパク質及び／またはポリペプチドのポリクローナル抗体及び／またはモノクローナル抗体、及び／またはＣ−erbＢ−２を発現する全細胞（即ち、無傷gp７５）の抗体を含むことができる。更に、このような診断試験キットは、サンドイッチフォーマットに関して別の組のポリクローナル抗体及び／またはモノクローナル抗体を含むことができ、その場合、前記の第二組の抗体が適当にラベルされる。
好適な特異性を有する抗体が一旦調製された時、多種の免疫測定法が特定の抗体−抗原複合体の形成を測定するのに利用できる。多数の競合タンパク質結合アッセイ及び非競合タンパク質結合アッセイが科学文献及び特許文献に記載されており、多数のこのようなアッセイが商業的に利用できる。血清抗原を検出するのに適したイムノアッセイの例は、米国特許第3,791,932号；同第3,817,837号；同第3,839,153号；第3,850,752号；同第3,850,578号；同第3,853,987号；同第3,867,517号；同第3,879,262号；第3,901,654号；同第3,935,074号；同第3,984,533号；同第3,996,345号；同第4,034,074号；及び同第4,098,876号明細書に記載されたアッセイを含む。
アッセイに使用される抗体は、ラベルされてもよく、またラベルされなくてもよい。ラベルされていない抗体は凝集に使用でき、種々のラベルを用いてラベルされた抗体は多種のアッセイに使用し得る。
或種の技術では、抗体ではなく抗原またはそのフラグメントをラベルし、抗体に関してラベルした抗原と試料中の抗原との間の競合を有することが有益である。この状況下で、ラベルした抗原またはラベルしたフラグメントと最高の感度及び精度を与える量の抗体との組合せを有するキットを提供することが普通である。
その他の状況下で、固体担体を有することが望ましく、この場合、抗原または抗体が結合される。ポリエピトープ抗原が、担体に結合された抗体とアッセイ媒体中のラベルした抗体との間のブリッジとして利用できる。また、制限量の抗体に関して、ラベルした抗原と試料中の抗原との間の競合を有することができる。
好適な検出手段は、放射性核種、酵素、螢光物質、化学発光物質、酵素基質またはコファクター、酵素インヒビター、粒子、色素等の使用を含む。このようなラベルした試薬は、放射性免疫測定法、酵素イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、螢光イムノアッセイ、等の如き種々の公知のアッセイに使用し得る。例えば、米国特許第3,766,162号；同第3,791,932号；第3,817,837号；及び同第4,233,402号明細書を参照のこと。
gp７５タンパク質／ポリペプチドの抗体に関する分析
上記の如く、患者の体液中のgp７５タンパク質／ポリペプチドの抗体の量は、新生物性疾患についてスクリーニングし、その疾患の進行を監視し、予測すること及び治療のコースを決めることに重要なパラメータである。このような抗体を検出するのに代表的なアッセイは競合アッセイであり、その場合、ラベルしたgp７５タンパク質／ポリペプチドがgp７５タンパク質／ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体と組合せて患者血清中の抗体により沈殿される。当業者は、上記のフォーマットのいずれかを適用してgp７５の抗体の定量化のために抗gp７５抗体を検出し得る。
Ｃ−erbＢ−２の推定リガンドに関するアッセイ
Ｃ−erbＢ−２レセプターの推定リガンドの量を検出し定量化するためのアッセイが、新生物性疾患を診断しスクリーニングし、その疾患及び治療スケジュールの進行を監視し予測するのに同様に有益である。このようなアッセイは、gp７５タンパク質／ポリペプチド及びその抗体に関する上記のアッセイの一つと関連して、更に好ましくはこのようなアッセイの両方に関連して特に有益である。
gp７５タンパク質／ポリペプチドを利用するＣ−erbＢ−２リガンドに関するこのようなアッセイの代表的なフォーマットは、精製され、好ましくは実質的に純粋なgp７５タンパク質／ポリペプチドをプラスチック表面またはその他の固体担体にこのような表面へのそれ自体の結合により、または補足抗gp７５抗体により付着することを伴なう。未知の量のラベルされていないリガンドとのラベルしたリガンドの競合アッセイを利用して、gp７５タンパク質／ポリペプチドへの結合に関するラベルされていないリガンドの濃度が通常の診断器具使用を利用して定量化し得る。
別のフォーマット、ラベリング、及び一般にその他の改良（これらはgp７５タンパク質／ポリペプチドに関するアッセイについて上記されたように当業者の知識の範囲内にある）がＣ−erbＢ−２の推定リガンドを検出し定量化するためのアッセイに同様に適用する。
gp７５タンパク質／ポリペプチドの抗体の抗イディオタイプ抗体
gp７５タンパク質／ポリペプチドの抗体の抗イディオタイプ抗体が更に本発明の範囲内にある。上記のアッセイの夫々の場合に、このような抗イディオタイプ抗体がgp７５タンパク質／ポリペプチドに代えて使用し得る。ワクチンの項目に更に記載されるように、このような抗イディオタイプ抗体は免疫原性薬剤として使用し得る。
抗gp７５抗体の抗イディオタイプ抗体は、方法の部、モノクローナルＣ−erbＢ−２抗体の調製に実質的に上記されたように調製され、その場合、初期免疫化はＮＩＨ３Ｔ３t細胞ではなく適当な抗gp７５抗体による。融合プロトコルは同様にしてそれに従って行なわれる。スクリーニング方法は、免疫化に使用されるもとの抗gp７５モノクローナルへの結合に関する一次スクリーン、及び競合アッセイ、例えば、ラジオメトリックアッセイを含む二次スクリーニングであり、その場合、適当なgp７５タンパク質／ポリペプチドは放射能ラベルしたもとの抗gp７５モノクローナルによる結合に関して融合中に生産された抗イディオタイプ抗体と競合する。
試験キット
上記のアッセイは試験キットの形態で具体化し得る。前記の試験キットはgpタンパク質／ポリペプチドの抗体及び無傷のgp７５（即ち、Ｃ−erbＢ−２を発現する細胞の表面上にある）の抗体を含み得る。前記の抗体はポリクローナル及び／またはモノクローナルであり得る。更に、前記の試験キットはgp７５タンパク質／ポリペプチドを単独で、または上記の抗体と組合せて含み得る。上記のように、抗gp７５抗体の抗イディオタイプ抗体がこのような試験キット中で適当なgp７５タンパク質／ポリペプチドに代えて使用し得る。
例は推定リガンドに関して分析するためのキットであり、その場合、gp７５タンパク質／ポリペプチドが表面に塗布され、またはその上に捕捉されるか、あるいは抗gp７５抗体の抗イディオタイプ抗体が表面上にそうして塗布される。また、このようなアッセイは上記のように競合アッセイとして処方し得る。勿論、このようなアッセイは固相アッセイに限定されないが、液相フォーマットであってもよく、また酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、粒子アッセイ、例えばアビジン／ビオチン技術を用いて増幅され、または増幅されないラジオメトリックアッセイまたはフルオルメトリックアッセイに基いてもよい。
gp７５タンパク質及びポリペプチドの調製
本発明のgp７５タンパク質及びポリペプチドは種々の方法で調製し得る。gp７５タンパク質を調製するのに好ましい方法は組換え手段による。本発明の代表的な組換え法は実施例１に後記される。
本発明のgp７５タンパク質及びポリペプチドは、更に合成法または生物学的法により、即ち長いタンパク質及びポリペプチドを酵素及び／または化学的に切断することにより調製し得る。前記の合成法及び生物学的法は、項目、gp７５タンパク質及びそのポリペプチド部分の合成的及び生物学的生産（Synthetic and Biologic Production of gp 75 Protein and Polypeptide Proteins Thereof）のもとに詳細に後記される。このような方法はgp７５ポリペプチドを調製するのに好ましい。
gp７５配列またはそのフラグメントのクローニング
実施例１に従ってつくられたプラスミドpＦＲＳＶ−ｃ−erbＢ−２secは、本発明に従って調製し得る多くの可能なＤＮＡ組換え分子の代表にすぎない。使用される制限エンドヌクレアーゼに応じて、ｃ−erbＢ−２外部領域配列の全部または一部が本発明に従ってクローン化され、発現され、使用し得る。
本発明に有益な制限酵素は、生成されるＤＮＡフラグメントがgp７５配列の部分を含むような方法でＤＮＡを切断する酵素を含んでもよい。好適な制限エンドヌクレアーゼは、本発明の範囲から逸脱しないで本明細書に記載された因子を考慮して当業者により選択し得る。
実施例１に使用された代表的なクローニングビヒクルはpＳＶ７１８６である。しかしながら、多種の宿主−クローニングビヒクルの組合せがgp７５ＤＮＡをクローン化するのに有効に使用し得る。例えば、有益なクローニングビヒクルは、pＢＲ３２２、その他のＥ．coliプラスミド及びそれらの誘導体の如き種々の既知の細菌プラスミド及びＲＰ４の如き広範な宿主域プラスミド、ファージラムダの多数の誘導体、例えばＮＢ９８９の如きファージＤＮＡ及びファージＤＮＡ発現調節配列を使用するように修飾されたプラスミドのようにプラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクターの如き、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。
有益な宿主は、真核生物または原核生物、好ましくは真核生物であってもよく、Ｅ．coli株ＣＡＧ４５６、ＪＭ１０３、Ｎ４８３０、Ｘ１７７６、Ｘ２２８２、ＨＢ１０１及びＭＲＣ１及びシュードモナス株、枯草菌及びその他のかん菌の株、酵母及びその他の真菌類の如き細菌宿主、並びに培養中の動物細胞または植物細胞、昆虫細胞の如き動物宿主または植物宿主及びその他の宿主を含む。本発明の好ましい宿主は酵母細胞、培養中の哺乳類細胞、好ましくはサル細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。好ましいサル細胞は細胞系ＣＯＳ７からの細胞であり、好ましいＣＨＯ細胞は細胞系CHO−（dｘbll）からの細胞である。勿論、宿主の全てが等しく有効であるとは限らない。宿主−クローニングビヒクルの組合せの特別な選択は、本発明の範囲から逸脱しないで本明細書に記載された原理を考慮した後に当業者によりなし得る。
更に、夫々の特異的なベクター内で、種々の部位が単離された二本鎖ＤＮＡの挿入のために選択し得る。これらの部位は、通常、それらを切断する制限酵素またはエンドヌクレアーゼにより指示される。例えば、pＢＲ３２２では、ＰstＩ部位はペニシリナーゼタンパク質のアミノ酸１８１及び１８２をコードするヌクレオチドトリプレット間のペリシリナーゼの遺伝子中に配置される。
選択されたＤＮＡフラグメントをクローニングビヒクルに挿入して組換えＤＮＡ分子を生成するのに選ばれる特別な部位は、種々の因子により決定される。これらは、発現されるタンパク質またはポリペプチドのサイズ及び構造、宿主細胞成分による細胞内酵素分解に対する所望のタンパク質またはポリペプチドの感受性及びそのタンパク質による汚染、開始コドン及び停止コドンの位置の如き発現特性、及び当業者により認識されるその他の因子を含む。これらの因子のいずれもが単独では特別なタンパク質またはポリペプチドに関する挿入部位の選択を絶対に制御しないが、むしろ選択部位はこれらの因子のバランスに影響し、全ての部位が所定のタンパク質に等しく有効であるとは限らない。
勿論、クローニングビヒクルの選択された制限部位で挿入されるヌクレオチド配列または遺伝子フラグメントは、所望のタンパク質の実際の構造遺伝子の部分ではないヌクレオチドを含んでもよく、あるいはその構造遺伝子のフラグメントのみを含んでもよいことが理解されるべきである。どのようなＤＮＡ配列が挿入されようとも、形質転換宿主はgp７５のエピトープを示すタンパク質またはポリペプチドを生産することのみが必要とされる。
ハイブリッド遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子は、宿主（形質転換体）が構造遺伝子またはそのフラグメントを発現しハイブリッドＤＮＡがコードするタンパク質またはポリペプチドを生産することを可能にするように、宿主を形質転換するのに使用し得る。また、組換えＤＮＡ分子は、複製後の宿主がgp７５ＤＮＡ及びそのフラグメントの源として別の組換えＤＮＡ分子を生産することを可能にするように、宿主を形質転換するのに使用し得る。これらの使用のいずれかに適した宿主の選択は、当業界により認識される幾つかの因子により制御される。これらは、例えば、選択されたベクターとの適合性、同時生産物（co-product）の毒性、所望のタンパク質またはポリペプチドの回収の容易なこと、発現特性、生物学的安全性及びコストを含む。宿主の絶対的な選択は、これらの因子のいずれか単独から特別な組換えＤＮＡ分子またはタンパク質もしくはポリペプチドに関して、なし得ない。その代わり、これらの因子のバランスは、全ての宿主が特別な組換えＤＮＡ分子の発現に等しく有効であるとは限らないという認識により見つけることができる。
gpタンパク質／ポリペプチドの発現
宿主細胞がE. coliの如き原核生物である場合、ＤＮＡ取込みの可能なコンピテント細胞は指数増殖後に回収され、続いて公知の操作により塩化カルシウム（CaCl2）法により処理された細胞から調製される。また、形質転換は、宿主細胞のプロトプラストを形成した後に行ない得る。
使用される宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム沈殿としてのＤＮＡの形質移入法、マイクロインジェクションの如き通常の機械的操作、赤血球宿主またはリポソーム中に被包されたプラスミドの挿入、リゾホスファチジルコリンの如き薬剤による細胞の処理またはウイルスベクターの使用等が使用し得る。
タンパク質またはポリペプチドの生産量は、二つの主要因子：その遺伝子または細胞内でそれを暗号化コード化するＤＮＡ配列のコピー数及びこれらの遺伝子及び配列のコピーが転写され翻訳される効率により支配される。転写及び翻訳（これらは一緒に発現を含む）の効率は、順に、通常所望の暗号配列の前方に配置されるヌクレオチド配列に依存する。
これらのヌクレオチド配列または発現調節配列は、特に、RNA（ポリメラーゼが相互作用して転写を開始する位置（プロモーター配列）及びリボソームがｍＲＮＡ（転写の生産物）を結合し、それと相互作用して翻訳を開始する位置を規定する。このような発現調節配列の全てが等しい効率で作用するとは限らない。こうして、所望のタンパク質に特別な暗号配列をそれらの隣接ヌクレオチド配列から分離し、高レベルの発現を有利にするように既知の発現調節配列に代えてそれらを融合することが有利である。これが達成された場合、細胞内の遺伝子または配列のコピー数を増加し、それにより発現タンバク質の収率を更に改良するために、新たに処理されたＤＮＡフラグメントがマルチコピープラスミドまたはバクテリオファージ誘導体中に挿入し得る。
幾つかの発現調節配列が使用し得る。これらは、Ｅ．coliのラクトースオペロンのオペレータ、プロモーター及びリボソーム結合配列及び相互作用配列（シャイン−ダルガルノ（Sine−Dalgarno）配列の如き配列を含む）（“lac系”）、Ｅ．coliのトリプトファンシンセターゼ系の相当する配列（“trp系”）、trp及びlacプロモーターの融合（“tac系”）、ファージ１の主要なオペレーター及びプロモーター領域（ＯLＰL及びＯRＰR）、及びファージλコートタンパクの調節領域を含む。これらの配列を含むＤＮＡフラグメントは、lacオペロンまたはtrpオペロンを有する形質導入ファージから分離されたＤＮＡまたはファージλもしくはfdのＤＮＡから制限酵素による切断により切除される。次いで、これらのフラグメントは、必須の調節配列が暗号配動の開始コドンの極めて近くに、またはそのコドンと近位で接合し得るような分子の制限された集団を得るために、操作される。
次いで、融合生産物が適当な宿主の形質転換のためのクローニングビヒクル中に挿入され、抗原生産量が測定される。こうして、最も有効な発現を示す細胞が選択される。また、開始コドンに結合されるlac、trpまたはλＰL調節系を有するクローニングビヒクルが使用されて、gp７５タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むフラグメントに融合されてもよく、その結果、その遺伝子または配列がクローニングビヒクルの開始コドンから正確に翻訳される。
gp７５タンパク質及びそのポリペプチドフラグメントの合成的及び生物学的生産
本発明のgp７５タンパク質及びポリペプチドは、組換え手段によるだけでなく、合成手段及びその他の生物学的手段によっても生成し得る。所望のポリペプチドまたはタンパク質を調製するためのその他の生物学的手段は、所望のアミノ酸配列を含む長いgp７５ポリペプチドまたはタンパク質を選択的タンパク質加水分解にかけることである。例えば、長いポリペプチドまたはタンパク質は化学試薬または酵素により切断し得る。ポリペプチドまたはタンパク質の合成による生成は、当業界で公知の方法によりアミノ酸の所望の鎖を化学的に合成することを必要とする。
所望のアミノ酸配列を含む長いポリペプチドまたはタンパク質の部分は、下記の操作のいずれかにより切除し得る。
(a)タンパク質加水分解酵素、特にその基質がアミノ酸の所望の配列の直ぐ隣りの部位でタンパク質またはポリペプチドの切断を特異的に生じるこれらの酵素によるタンパク質または長いポリペプチドの消化。
(b)化学的手段によるタンパク質またはポリペプチドの切断。アミノ酸間の特別な結合は、特定の試薬との反応により切断し得る。その例は、下記のものを含む。メチオニンを伴なう結合は臭化シアンにより切断され；アスパラギニルグリシン結合はヒドロキシルアミンにより切断され；二つのシステイン残基間のジスルフィド結合は、例えばジチオスレイトールによる還元により切断される。
(c)タンパク質加水分解変化と化学変化の組合せ。勿論、上記のように、合成ポリペプチドをコードするＤＮＡの小部分をクローン化して単細胞宿主によるペプチドの生産をもたらすことがまた可能であるべきである。
生物学的に、または合成的に生産されたタンパク質及び一旦生産されたポリペプチドは、ゲル濾過、イオン交換または高速液体クロマトグラフィー、またはその他の好適な手段により精製し得る。
ポリペプチドの化学合成は、下記の刊行物に記載されている。メリフィールド（Merrifield）ら，J. Am. Chem. Soc. ８５巻、２１４９〜２１５６頁（１９６３）；ケント（Kent）ら，“Synthetic Peptides in Biology and Medicine”, ２９ff.,アリタロ（Alitalo）ら編集、（Elsevier Science Publishers １９８５年）；ハウグ（Haug）, ＡＢＬ，４０〜４７頁（１９８７年、１月／２月）；アンドリューズ（Andrews）, Nature ３１９巻、４２９〜４３０頁（１月３０日、１９８６年）；ケント，“Biomedical Polymers”, ２１３〜２４２頁、ゴールドバーグ(Goldberg)ら編集、（Academic Press １９８０年）；ミッチル（Mitchell)ら，J. Org. Chem.４３巻、２８４５〜２８５２頁（１９７８年）；タム（Tam）ら，Tet. Letters.,４０３３〜４０３６頁（１９７９年）；モジュゾフ（Mojsov）ら，J. Org. Chem. ４５巻、５５５〜５６０頁（１９８０年）；タムら、Tet Letters, ２８５１〜２８５４頁（１９８１年）；及びケントら、“Proceeding of the IV International Symposium on Methods of Protein Sequence Analysis（タンパク質配列分析の方法に関する第４回国際シンポジウムの会報）”（Brookhavn Press １９８１年）。
上記の刊行物に記載された“メリフィールド固相操作”は、カルボキシル末端アミノ酸からアミノ末端アミノ酸までのＬ−アミノ酸の適当な配列をつくるのに使用し得る。樹脂のクロロメチル基、ベンズヒドリルアミン基、またはその他の反応基への化学結合により適当な樹脂に付着された適当なカルボキシル末端アミノ酸から出発して、アミノ酸が夫々に関して下記の操作を用いて一つずつ付加される。
(a)ペプチジル樹脂が塩化メチレンで洗浄される；
(b)その樹脂が塩化メチレン中の５％（ｖ／ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（またはその他のヒンダード塩基）と室温で１０分間混合することにより中和される；
(c)その樹脂が塩化メチレンで洗浄される；
(d)生長するペプチド鎖のモル量の６倍に等しい量のアミノ酸が、それを半分のモル数のカルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドと０℃で１０分間合わせることにより活性化されてアミノ酸の対称酸無水物を生成する。使用されるアミノ酸は、ベンジルエステル（アスパラギン酸及びグルタル酸）、ベンジルエーテル（セリン、スレオニン、システイン、チロシン）、ベンジルオキシカルボニル基（リシン）またはペプチド合成に普通使用されるその他の保護基で保護された側鎖を有するＮ−α−ブチルオキシカルボニル誘導体として最初に与えられるべきである；
(e)活性化されたアミノ酸が室温で２時間にわたってペプチジル樹脂と反応させられて、成長するペプチド鎖の末端への新しいアミノ酸の付加を生じる；
(f)その樹脂が塩化メチレンで洗浄される；
(g)Ｎ−α−（ブチルオキシカルボニル）基が塩化メチレン中の３０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸と室温で３０分間反応させることにより直前に付加されたアミノ酸から除去される；
(h)その樹脂が塩化メチレンで洗浄される；
(i)必要とされるペプチド配列がつくられるまで工程ａ〜ｈが繰返される。次いで、１０％（ｖ／ｖ）のアニソールを含む無水のフッ化水素酸と反応させることにより、ペプチドが樹脂から除去され、同時に側鎖保護基が除去される。続いて、ペプチドはゲル濾過、イオン交換、または高速液体クロマトグラフィー、またはその他の適当な手段により精製し得る。
化学合成は固相樹脂を使用しないで行なうことができ、その場合、合成反応は完全に溶液中で行なわれる。反応、及び最終生成物は、特別なことがない限り実質的に同じである。
化学的ペプチド合成の技術は、自動ペプチド合成装置を使用すること、市販の保護されたアミノ酸を使用することを含む。このような合成装置は、例えば、バイオサーチ（Biosearch）（San Rafael, CA）型式９５００及び９６００、アプライド・バイオシステム・インコーポレーション(Applied Biosystems Inc.)（Foster City, CA）型式４３０、及びミリゲン(MilliGen)(ミリポア社の一部門）型式９０５０を含む。更に、デュポンズ・ランプ（Dupont's Ramp）（高速自動化多重ペプチド合成）を使用して約２５までのポリペプチドを一度に手動で合成し得る。
本発明の合成ポリペプチドは、gp７５の一つ以上のエピトープを含むことが好ましい。エピトープ（これは約３〜約１１個のアミノ酸、更に通常約５〜約１１個のアミノ酸であり得る）を形成するアミノ酸配列をその両側面にある少なくとも三つのアミノ酸に結合することによりこのようなポリペプチドを合成することが可能である。両側面の三つのアミノ酸は天然のgp７５配列中のものと同じアミノ酸であってもよく、またその他のアミノ酸であってもよい。
gp７５の抗体
本発明の組換体、合成もしくは天然のgp７５タンパク質及びポリペプチドは、診断アッセイだけでなく、gp７５タンパク質／ポリペプチドのアフィニティ精製及び治療上の使用に関して用途を有する。背景に上記されたように、Ｃ−erbＢ−２の抗体は、試験管内及び生体内で腫瘍増殖を抑制することが示された〔ドレビンらの上記の文献（１９８５年）を参照のこと〕。
ワクチン
本発明のgp７５タンパクおよびポリペプチドが腫瘍性疾患に対して防御免疫を誘発でき、かつ腫瘍形成活性に対する抑制効果をもつワクチンに配合し得ることは容易に理解されよう。ポリペプチドは単量体または多量体形状で、gp７５の１種以上のエピトープに対応する１種以上のアミノ酸を含むように、組換え手法であるいは生物学的に合成または調製することができる。次いで、これらのポリペプチドを、gp７５に対する防御免疫性を誘起することのできるワクチンに配合できる。かかるポリペプチドの抗原性を高める方法は多量体構造への組込み、免疫原性の高いタンパクキャリヤ、例えばキーホールリンプレットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはジフテリフ毒素などへの結合、およびアジュバントまたは任意の他の免疫応答のエンハンサとの組合せでの投与などを包含する。
更に、gp７５タンパク／ポリペプチドに対する抗体の抗イデオタイプ抗体もワクチンとして有用であり同様に処方し得ることも理解されよう。
単量体または多量体形状のいずれかのgp７５のエピトープに対応するアミノ酸配列を、化学的合成手段により、あるいは遺伝的に修飾された微生物またはその培養物を包含する生物起源から精製することにより得ることができる。〔ラーナー(Lerner), “シンセティックバクシンズ(Synthetic Vaccines)”,Sci. Am.,1983,２４８（２）, pp. ６６−７４参照〕。このポリペプチドは、例えば融合タンパクとして合成される場合における如く、アミノ酸配列中で他のタンパクのフラグメントを含む他のポリペプチドと結合するか、あるいは合成または天然起源の他の抗原性または非−抗原性のポリペプチドに結合することができる。
“gp７５のエピトープに対応する”なる用語は以下のような実際上の可能性を含むものと理解される。即ち、いくつかの例においては、天然にみられるタンパクおよびポリペプチドのアミノ酸配列の変動は抗原性であり得、かつ腫瘍性疾患に対する防御免疫および／または抗−腫瘍形成効果を与え得るという可能性を包含する。起こり得る配列変動はアミノ酸の置換、伸長、欠落、端部切除(truncations),挿入(interpolation)およびこれらの組合せを含むが、これに制限されない。このような変更は、これらの変更を含むタンパクまたはポリペプチドが免疫原性であり、しかもこのようなポリペプチドまたはタンパクが誘発する抗体が十分に天然に産するgp７５タンパクおよびポリペプチドと交叉反応して、ワクチンとして投与された場合に防御免疫性および／または抗−腫瘍形成活性を与えるとすれば、本発明の意図する範囲内に含まれる。
このようなワクチン組成物は生理的に許容される媒体と組合せられ、該媒体としては免疫学的に許容される希釈剤および担体並びに一般的に使用されているアジュバント、例えばフロインド完全アジュバント、サポニン、ミョーバンなどが挙げられる。投与はgp７５タンパクまたはポリペプチドの免疫学的に有効量、好ましくはレシピエントの体重１kg当たり免疫学的に活性なgp７５タンパクおよび／またはポリペプチド０．０ｌ〜１０．０μｇなる単位投薬量を与えるような量で行われる。全予防投薬量は抗原０．１〜約１００μｇの範囲内であり得る。
投与経路、抗原投与量、注入の回数および頻度は、当業者が最適化し得る範囲内の事項である。
gp７５タンパクおよびポリペプチドの治療での使用
本発明のgp７５タンパクおよびポリペプチドは、更に単独でもしくは化学療法薬と組合せて腫瘍性疾患の治療において使用できる。Ｃ−erbＢ−２の外部ドメインが、完全な(intact)分子として、体液中に注入されたという事実はそれ自体治療上の役に立つ。細胞に付着しない過剰のgp７５は、背景の項で既に述べたように〔スミス（Smith）等、上記文献（１９８７）〕、ＣＤ４レセプタおよびＨＩＶ−１のgp１２０エンベロープタンパクに類似する様式で、Ｃ−erbＢ−２に対する推定リガンドのオンコジーンの細胞表面レセプタへの結合と競合し、かつこれを妨害する可能性がある。gp７５タンパクおよびポリペプチドの治療上の効果を説明するためのもう一つの機序は、腫瘍形成を容易にするＣ−erbＢ−２表現細胞間のレセプタ／レセプタ相互作用を阻害もしくは破壊することであり得る。
このような治療法は、患者にＣ−erbＢ−２外部ドメイン物質、そのフラグメントあるいはその配列の一部に由来するペプチドを投与することを含む。gp７５タンパク／ポリペプチドの高い循環濃度は、上述の如く、腫瘍の成長を減衰もしくは排除することを期待できた。このgp７５タンパク／ポリペプチドは生理的に許容される、非毒性の液状ビヒクルに分散させ、治療上有効な量で投与できる。投与経路および投与量は上記のワクチンの項で述べたのと同様である。
定  義
用語“gp７５”とは、ここでは分子量約１８５キロダルトン（kd）の糖タンパク（gp１８５）即ちＣ−erbＢ−２の外部ドメインを構成する、分子量約７５kdの糖タンパクを意味するものとする。用語“gp７５”は正確には第１６図に示されたそのヌクレオチドおよびアミノ酸配列により定義され、gp７５外部ドメインは大体アミノ酸番号２２（セリン；Ｓer−２２）からほぼアミノ酸番号６５３（セリン；Ｓer−６５３）までの領域く第１６図においてこれらアミノ酸はその上部の黒丸でマークされている）を含み、これに対応するヌクレオチド配列をもつ。このアミノ酸配列はgp７５のグリコシル化されていないバージョン（version）を表し、およその分子量６９kdを有するものと思われる〔クッセンズ(Coussens)等の上記文献〕。用語“gp７５”に含まれるものとしては、タンパク生成物の分子量に影響する種々の度合のグリコシル化をもつ酵母および高等真核生物による組換え技術により生成される糖タンパクであり、例えば少量のgp９０は、以下の実施例１で示されるように、安定に形質転換されたgp７５−表現CHO細胞中で生成された。
“完全gp７５（intact gp７５）なる表現は細胞表面に発現されたgp７５外部ドメインを意味するものとしてここでは定義する。従って、この完全gp７５は依然として膜内外領域を介して該細胞に付着している。
“ポリペプチド”とはペプチド結合によって共有結合的に結合したアミノ酸の鎖であり、かつここでは５０以下のアミノ酸を含むものと考える。“タンパク”とは、ここでは５０以上のアミノ酸を含むポリペプチドであると定義する。
“gp７５タンパクおよびポリペプチド”なる表現は、ここでは、第１６図に示したようなgp７５外部ドメインＤＮＡ配列（ほぼ−Ｓer−２２乃至ほぼＳer−６５３をコードするヌクレオチド）により、あるいは該gp７５ＤＮＡ配列のフラグメントによってコードされるタンパクおよびポリペプチドを意味するものと定義する。“gp７５タンパクおよびポリペプチド”なる表現は、該“gp７５タンパクおよびポリペプチド”と実質的に同一のアミノ酸配列および実質的に同一の生物学的活性を有するタンパクおよびポリペプチドを包含するものと解釈すべきである。
遺伝子コードの縮重のために、即ち１種以上のコドンが１種のアミノ酸をコードする〔例えば、コドンＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧは夫々アミノ酸のロイシン（Ｌ）をコードする〕ことから、一つのコドンが他のコドンで置換されている第１６図のヌクレオチド配列の変更は、本発明によれば実質的に等価なタンパクまたはポリペプチドを生成するものと理解される。gp７５に対するヌクレオチド配列のこのようなすべての変更は、本発明の範囲内にはいる。
更に、第１６図のgp７５ＤＮＡ配列は天然に生ずるヌクレオチド配列の正確な構造のみを示していることを理解すべきである。僅かに修飾されたヌクレオチド配列が血清学的に類似の活性をもつ、免疫原性のおよび／または抗原性のタンパクおよびポリペプチドをコードすることが見出され、もしくはこれらをコードすべく当分野で公知の技術によって修飾し得ることが予想され、このようなヌクレオチド配列並びにタンパク／ポリペプチドは本発明の目的にとって等価であると考えられる。同等のコドンをもつＤＮＡは本発明の範囲内にあり、例えば該gp７５ＤＮＡ配列に相同もしくは実質的に相同なタンパク／ポリペプチドをコードする合成ＤＮＡ配列およびgp７５タンパク／ポリペプチドをコードする配列とハイブリッド化されたＤＮＡ配列並びに遺伝子コードの縮重がなければ該gp７５配列にハイブリッド化されるであろうこれらの配列が含まれる。更に、ここでいうgp７５配列に相補的なＤＮＡ配列も本発明の範囲内にある。ここで示したようなＤＮＡ配列の上記の如き修飾並びに変更は、gp７５配列またはそのタンパクと実質上同一である配列を与えるものと考えられる。
典型的には、このような関連ヌクレオチド配列は、実質的に相同の定義にはいるものと実質的に同一である。
更に、gp７５のアミノ酸配列は遺伝子技術により修飾し得ることを理解するであろう。１種以上のアミノ酸を削除もしくは置換することができる。このようなアミノ酸の変更は、特にこの変更がポリペプチドのエピトープ外の領域におけるものである場合には、タンパクまたはポリペプチドの血清学的、抗原性および／または免疫原性活性に何等検知し得る変化を生じ得ない。生成するタンパクまたはポリペプチドは実質的に同一のアミノ酸配列および実質的に同一の生物学的活性を有し、かつ本発明の範囲内にある。
好ましくは、該gp７５タンパク／ポリペプチドが化学療法薬と共に投与された場合には、該薬品はアルキル化剤である。この方法にとって好ましい化学療法薬はシスプラチン、カルボプラチンおよびメファラン(mephalan)である。
略  語
本明細書では以下のような略語を使用する。
0003859695.tif 000002
0003859695.tif 000003
セルライン
以下のセルラインを、以下に記載する実験で使用した。
0003859695.tif 000004
増殖培地
ここに記載する実験における、指定したセルラインの増殖のために以下の増殖培地を使用した。
0003859695.tif 000005
文  献
以下の文献は本明細書中で、著名または編者および年号で言及した参照文献である。
アウステル（Ausutel）等（編）、カレントプロトコールズ(Current Protocols), in Mol. Biol., vol. 2, （ウィリーインタサイエンス(Willey Interscience),１９８８）。
・  クッセンズ(Coussens)等, Science,１９８５, 230, p.1138
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・  ゾラー＆スミス(Zoller and Smith), Methods Enzymol.,１９８７, １５４,p.３２９
方  法
以下の方法を下記実施例において使用した。
タンパク分析
４％アクリルアミド濃縮用ゲルと、１０％解像ゲル(resolvinggel)（両者共に０．２％ＳＤＳを含む）を使用して、ラエムリ（Laemmli）〔Nature, １９７０, ２２７, pp. ６８０−６８５；この論文を本発明の参考文献とする〕により記載されたように、SDS−ＰＡＧＥによりタンパクを分析した。サンプルを５０μｌのサンプルバッファー〔６３mＭのトリス（ＴＲＩＳ）, pH６．８、１０％のグリセロール、５％の２−メルカプトエタノール、および２．３％のＳＤＳ〕中に適用し、２０mＡなる定電流条件で４時間電気泳動させた。タンパクの分子量は既知の分子量をもつ標準タンパクに対する各タンパクの易動度から評価した。タンパクの濃度はクーマシー青色色素−結合アッセイ（バイオラドラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories), リッチモンドＣＡ）を利用して測定した。
ウェスタンブロット
適当な抗体によって同定される抗原を特徴付けするために、トービン(Towbin)等（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, １９７９, ７６, pp. ４３５０−４３５４；この論文を本発明の参考文献とする）により記載されたようなウェスタンブロット法の改良法を利用したが、ここではタンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースフィルタに移され、かつ適当なモノクローナル抗体で同定された。ニトロセルロースフィルタに移した後、過剰なタンパク結合サイトを、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に該フィルタを浸漬することにより遮断した。１％のＢＳＡおよび１〜２×１０7カウント／分（cpm）のヨウ素化抗体を含む３０μｌのＰＢＳ中で該シートを１時間インキュベートすることによりこの抗原を配置させた。次いで、このフィルタを洗浄し、乾燥し、かつオートラジオグラフィーに付した。（この手順により１００ピコグラム（pg）程度までのタンパクを検出することができる）。
抗体の調製
ポリクローナル抗体：９２の調製
ニュージランド白兎を、Ｃ−erbＢ−２タンパクの８１％のＮ−末端に該当するＥ. コリ組換え抗原５０〜２００μｇで免疫した。初期免疫はフロインド完全抗原に１：１（ｖ／ｖ）の割合で乳化した該抗原からなっており、これは２箇所の皮下部分に注射された。後の追加免疫は不完全アジュバントに乳化した該抗原で２度に渡り２週間隔で行った。これら動物の耳静脈から２週毎に採血し、gp１８５表現細胞溶解物に対しウェスタンブロット法で、（以下に述べる）ＥＬＩＳＡを基に細胞に対する反応性により、放射性標識した細胞溶解物からのgp１８５タンパクの免疫沈降により、および放射性標識したＡ４３１細胞溶解物からのgp１７０タンパクの免疫沈降により該血清をアッセイした。これらの血清は２度の追加免疫後のウェスタンブロット法によりgp１８５との強い反応性をもつことが明らかとなりおよびＥＧＦレセプタタンパクとの交叉反応性を示すことが立証された。
ポリクローナル抗体：９．２の調製
Ｃ−erbＢ−２タンパクのＣ−末端における１４アミノ酸からなるペプチドに対する兎ポリクローナル抗血清を作成した。上述と同様の免疫化を利用した。この抗血清はＣ−erbＢ−２タンパクを発現する細胞の膜処方物から約１８５kdのタンパクを特異的に沈殿させる。これは該ＥＧＦレセプタと交叉反応しない。
モノクローナルＣ−erbＢ−２抗体の調製
Ｃ−erbＢ−２オンコジーン、ＮＩＨ３Ｔ３t（親切にもDr.S.アーロンソン（ＮＩＨ）により提供された）を移入した２×１０6〜１×１０7ＮＩＨ３Ｔ３細胞〔ディフィオレ(Di Fiore)等, Sciene, １９８７, ２３７, pp. １７８−１８２〕または完全フロインドアジュバント中に１：１（ｖ／ｖ）の割合で乳化した同数のＳＫＢＲ３細胞のいずれかで、腹腔内および皮下経路でBalb／ｃマウスを免疫した。これらの動物を、不完全アジュバントに乳化した細胞で２〜４週毎に追加免疫した。２週毎に血清を集め、（以下に述べる）ＥＬＩＳＡアッセイで、ホルマリンで固定したＮＩＨ３Ｔ３またはＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞に対する反応性につきテストした。正の力価を示す動物を細胞のＰＢＳ溶液で腹腔内または静脈内経路で追加免疫し、細胞融合のために４日後に動物を殺した。脾細胞を、ケーラー＆ミルシュタイン
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(Nature,１９７５, ２５６, pp. ４９５−４９７）の手順に記載されたようにＰＥＧ４０００を用いて、１：１〜７．５：１の比率でＰ３−Ｘ６３Ａg ８．６５３ミエローマ細胞と融合させた。融合細胞を緩かに洗浄し、ＲＰＭＩ中で１〜４×１０6細胞／μｌの密度で９６−ウェルをもつプレートに塗布した。融合の２４時間後にウェルをＨＡＴ培地で満たし、次いで３日毎に２〜３週間に亘りこの操作を続けた。形成コロニーが肉眼でみえるようになる１０〜１４日後に、培養上澄をＥＬＩＳＡアッセイにおける反応性についてテストした。良好な成長を示したクローンを２４ウェルを備えたプレートに展開し、７〜１０日後に再度スクリーニングした。次いで正のウェルを、流動選別解析（flow sorting analysis）により生きたＮＩＨ３Ｔ３およびＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞に対する外部ドメイン反応性につきアッセイした。ＥＬＩＳＡアッセイおよび流動選別解析両方に対して正であるハイブリドーマ（親ハイブリドーマという）を、限界希釈クローニングまたは表面免疫グロブリン表現の流動選別解析に基いた脾臓支持細胞を含む９６−ウェルを備えたプレートへの単一細胞付着によりクローニングした。成長がみられたウェルをＥＬＩＳＡで再度テストし、更に１〜３回再クローニング処理した。
ハイブリドーマクローンからの上澄を、イソタイプおよびサブイソタイプ、流動選別解析によるＮＩＨ３Ｔ３ｔ上での表面発現gp１８５に対する反応性、および移入細胞からの標識gp１８５プロテインの免疫沈降につきテストした。正のハイブリドーマを育生し、プリスタンで感作したＢalb／ｃマウス、Balb／ｃヌードマウスまたはＩＲＣＦ１マウス中に腹水生産のために注入した。腹水をベーカーボンド（Bakerbond）ＡＢｘカラム上でのＨＰＬＣで精製し、精製されたモノクローナル抗体（ＴＡｂ＃という）をＰＢＳに対して透析し、−２０℃にて保存した。全精製抗体を放射状免疫拡散法によるイソタイプおよびサブイソタイプにつき（１５％未満の汚染イソタイプ）、流動選別解析による、gp185表現セルラインの細胞表面染色性につき、移入または非移入NIH3T3細胞に対するＥＬＩＳＡアッセイ、標識Ｃ−erbＢ−２発現セルラインからのgp１８５の放射性免疫沈降、放射性標識されたＡ−４３１細胞から放射性標識された１７０ＫＤタンパクが沈殿しなかったことによる密接に関連したＥＧＦレセプタタンパクとの交叉反応性の欠如につきテストし、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルデンシトメトリーによる解析を行った（全精製タンパクは９０％以上免疫グロブリンである）。すべてのモノクローナル抗体は、ウエスタンブロット法によるgp１８５タンパクの認識を示さなかった。今日までに発展したＭＡｂｓおよびその反応性の概要を第１表に総める。Ａ２９はモノクローナル抗体、ＴＡＢ250−２５４に対する親ハイブリドーマである。初期のいくつかの実験においては、表に示したように、Ａ２９ハイブリドーマからの上澄を使用した。
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流動選別解析
ＮＩＨ３Ｔ３およびＮＩＨ３Ｔ３t（あるいは他のＣ−erbＢ−２表現セルライン）細胞を、ＤＭＥＭ＋４％ＦＢＳ中で８０％の集密度で育生した。細胞をパックスベルセン（Puck's Versene）で収穫し、２度冷ＦＡＣＳバッファー（ＨＢＳＳ（フェノールレッドを含まない）、２％ＦＢＳ、０．２％ナトリウムアジド、１０mＭ  ＨＥＰＥＳ）で洗浄した。細胞を１２×７５mmのガラス試験管当たり０．５〜１．０×１０6細胞なる密度で分配し（細胞は90％以上生存性でなければならない）、ペレット化し、上澄を除去した。これらの試験管を氷上に置き、試験管１本当たり１００μｌの上澄または精製抗体を加えた。各抗体または上澄をＮＩＨ３Ｔ３細胞並びにＮＩＨ３Ｔ３t細胞両方に対してテストした。この抗体を氷上で１時間該細胞と共にインキュベートした。細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２度洗浄し、１００μｌのＦＩＴＣ−複合山羊抗−マウス二次抗体を添加した。氷上に１時間放置した後、該細胞を２度ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリンで再懸濁して、５００μｌとした。この再懸濁した細胞はホイルで包んで４℃にて３日まで保存できる。この標識細胞をクールタ（Coulter）ＥＰＩＣＳ５４１流動選別機で分析し、平均ピークチャンネル蛍光を５０００細胞につき測定した。ＮＩＨ３Ｔ３t細胞に対する反応性の平均ピークを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する反応性の平均ピークと比較した。gp１８５の外部ドメインタンパクと反応する抗体について、該ピークは非重複性であった。
抗体アッセイ
ポリスチレンプレート（９６−ウェル）を、ＰＢＳで希釈したＣ−erbＢ−２表現細胞からの溶解物１００ngを被覆した。この溶解物は、２〜３μｌの冷溶解バッファ（０．１５Ｍ NaCｌ、０．１％トライトン（Triton）Ｘ−１００、０．１％デオキシコレート、０．１％ＳＤＳ、１０mＭトリス（Tris）、pＨ７．４、１mＭPMSF）を２×１０6〜１×１０7細胞に加え、氷上で１５分間インキュベートすることにより調製した。溶解物を１０，０００ｇにて２０〜３０分間遠心処理し、上澄をタンパクについてアッセイし、分割し、−２０℃で保存した。溶解物を加えたプレート（競合プレートという）を、室温にて一夜インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。もう一つの９６−ウェルプレート（インキュベーションプレート）を１％ＢＳＡ（ＰＢＳ溶液）で室温にて１時間遮断した（１００μｌ／ウェル）。これらのプレートを洗浄し、抗原（gp７５表現ＣＨＯ細胞からの上澄、即ちマウス血清または細胞溶解処方物）を該ウェル中にて５ng／μｌとなるようにＴＡｂ２５１と混合し、該プレートを室温にて２〜４時間インキュベートした。該競合プレートを同様に１％ＢＳＡ／ＰＢＳで遮断し、洗浄し、１００μｌの該インキュベーション混合物を、該インキュベーションプレートから該競合プレートに移し、室温にて１時間インキュベートした。次いで、これらのプレートをＰＢＳ／０．０５％ツイーン（Tween）２０で洗浄し、ビオチン処理した（biotinylated）山羊抗−マウスＩgＧ抗体を１：４００なる希釈率（v／ｖ）でウェル当たり１００μｌ添加した。これらのプレートを室温にて３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μｌのストレパビジン（Strepavidin）−ＨＲＰコンジュゲートを１：８０００なる希釈率（v／ｖ）で加えた。更に室温にて３０分間インキュベートした後、上記の如くアッシュ工程（ash step）を行い、ＴＭＢ基質を１００μｌ／ウェルで加えた。この基質は、５μｌのＴＭＢ母液（１μｇ／μｌの３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンのメタノール溶液）と５μｌのシトレートバッファー、pＨ４．５および４μｌの３０％過酸化水素と混合することにより、使用の直前に調製した。室温にて暗所で１５分間インキュベートした後、吸光度を４５０nmにて測定した。ＰＢＳと共に予めインキュベートしたＴＡb ２５１を不競合コントロールとして使用して、溶解物で被覆した競合プレートに対する最大結合量を求めた。
ＥＬＩＳＡアッセイ
ポリスチレンの９６−ウェルプレートを、１００μｌ／ウェルの牛コラーゲン（１μｇ／μｌ滅菌ＰＢＳ溶液）と共に３７℃にて２時間前処理した。ＮＩＨ３Ｔ３またはＮＩＨ３Ｔ３t細胞をＤＭＥＭ＋４％ＦＢＳ中で８０％集密度で育生し、温パックスベルセンで収穫し、洗浄し、予備処理した、かつ洗浄したコラーゲンプレート内で３７℃にて一夜１×１０6細胞／μｌ、１００μｌ／ウェルにて塗布した。プレートを穏やかに洗浄し、１００μｌの１０％中性緩衝ホルマリンで１時間処理した。プレートを再度ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃にて１時間遮断した。次いで、サンプルの上澄または抗体希釈物を、１００μｌ／ウェルで、該被覆し、遮断し、かつ洗浄したプレートに加え、該プレートを３７℃にて２時間インキュベートした。更にＰＢＳ洗浄工程を経た後、１：５００なる希釈率のアルカリンホスファターゼ−複合山羊抗−マウスＩgＧ Ｆc−特異的二次抗体を加え、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。最後のＰＢＳ洗浄後、バイオラド（BioRad）基質（ＰＮＰＰ＋ジエタノールアミン）を加え、室温にて１０〜１５分間インキュベートした後、吸光度を４０５nmで測定した。
イムノペルオキシダーゼ染色
使用したイムノペルオキシダーゼ染色法は、ヒュー（Heu）等のアビジン−ビオチンイムノペルオキシダーゼ法（J. Histochem. Cytochem. , １９８１, ２９, pp. ５７７−５８０）およびホラン−八ンド(Horan-Hand)等（Cancer Res.,１９８３, ４３, pp. ７２８−７３５）に記載の方法の改良法であった。これら文献を本発明の参考文献とする。
以下の実施例は本発明の十分な理解を助け、かつ例示のみの目的で与えられる。これらはいかなる意味においても本発明を何等限定するものではない。
実施例１
（ＣＨＯ細胞におけるＣ−erbＢ−２の発現）
（Ｃ−erbＢ−２ベクターの構築）
推定上のＣ−erbＢ−２たんぱく質の細胞外ドメインをコードするＣ−erbＢ−２ cＤＮＡの２．０ｋbフラグメントをＮcoＩおよびＡatIIを用いオカヤマ・バーグクローニングベクターｐＳＶ７１８６（ファルマシア社から市販、cat＃２７−４９４８−０１）から切り出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後ＥcoＲＩリンカー（ＮＥバイオラブス、cat＃１０７８）とライゲーションした。このＣ−erbＢ−２ cＤＮＡはＤ．スラモン(Slamon)（ＵＣＬＡ）によって、胸にアデノカルシノーマを持つ女性の患者から始めて単離された（Ｃ−erbＢ−２の完全なヌクレオチド配列は第１６図参照）。ＥcoＲＩリンカー結合の部分Ｃ−erbＢ−２ cＤＮＡをＥcoＲＩ消化したｐＦＲ４００のＳＶ４０に基づく誘導体であるｐＦＲＳＶ（ホーウィック(Horwich)等、１９８５）にサブクローン化した。ｐＦＲＳＶを構築するためにｐＫＳＶ１０（ファルマシア社から市販、cat＃２７−4926−０１）から２．６ｋbのＰvuII／ＨpaＩフラグメントを単離し、平滑末端化後ＰvuII消化したｐＦＲ４００にクローン化した。
ｐＫＳＶ−１０のヌクレオチド５１０７番に位置するＢglII部位を予め部位特異的突然変異誘発（ゾラー（Zoller）およびスミス(Smith),１９８７）でＥcoＲＩ部位とし、最終構築物ｐＦＲＳＶ中のユニークなＲＩクローニング部位とする。またこのベクターは優性な選択可能マーカーＤＨＦＲを含んでおり、それをgp７５Ｃ−erbＢ−２誘導体の増巾に使用した。ｐＦＲＳＶ−Ｃ−erbＢ−２secと命名した最終構築物（第３図）を大腸菌ＭＣ１０61株にトランスホームし、そのプラスミドＤＮＡをマニアチス(Maniatis)等（１９８２）の方法で単離した。
（ｐＦＲＳＶ−Ｃ−erbＢ−２secのトランスフェクション）
このプラスミドの発現をＣＯＳ７細胞およびリン酸カルシウム（CaPO4）トランスフェクション法（グラハム(Graham)およびヴァンデルエブ（van der Eb）１９７３）を用いてモニターした。トランスフェクションの２４時間前細胞を１００mm組織培養皿上１：１０に分けた（約３０〜５０％集密度）０．４９μｌ２×HeBS中の２０μｇ（１０μｌ）のプラスミド構築物に０．５μｌの０．２５Ｍ CaCl2をゆっくり加え（オースベル（Ausubel）等編、１９88参照）１０秒間ボルテックスした後２０〜３０分間室温に放置し、ＤＮＡを沈殿化させた。それからこの沈殿をＣＯＳ７細胞の皿に加え、その細胞／沈殿混合物を３７℃、５％ CO2条件下１５時間インキュベーションした。リン酸緩衝液（ギブコ）で細胞から沈殿を洗い落とし、完全生育培地（ＤＭＥＭ）中でインキュベーションしてからＤＮＡの導入後４８時間までＣ−erbＢ−２の発現を検定した。
CaPO4トランスフェクション法を用いることによりCHO細胞で安定したｐＦＲＳＶ−Ｃ−erbＢ−２secの発現が得られた（上述）。ＤＮＡ沈殿は２０μｇのプラスミドＤＮＡおよび４枚のCHO細胞の１００mmディッシュを用い上述の方法で調製した。プラスミドの導入後７２時間、各トランスフェクト化１００mmディッシュを１：２０に分け、１０％の透析化ウシ胎児血清および２０nＭ  ＭＴＸを含むａ−ＭＥＭ（ヌクレオシドおよびヌクレオチドなし）中１８日間培養した。段階的増巾を開始し、細胞を６日毎に濃度を増やしたＭＴＸ（１００nＭ、２．５mＭ、１２．５mＭおよび５０mＭ）に曝した。ＭＴＸ中２１日間の増殖後限界希釈によりＭＴＸ耐性集団をクローン化した。これらの集団の１つに由来する１０6個の細胞を以下のように増殖培地（上述）で希釈した：２×１：１００、ついで２×１：１０で希釈し９６穴マイクロプレート（コスター製）のウェル当りおよそ１細胞とする。この細胞を５０mＭ ＭＴＸ中に維持しながら３週間に渡り、２４穴および６穴マイクロプレートついで６０mmディッシュへと連続的に拡げていった。それから放射能免疫沈殿法、免疫蛍光法、およびウエスタンブロット法を用いＭＴＸ耐性クローンのgp７５発現を検定した。
（免疫蛍光法）
抗ーＣ−erbＢ−２ＴＡｂ２５２またはその親ハイブリドーマＡ２９の上清を用い、gp７５の細胞内存在部分を検出した（上述の該ＭＡｂの調製法参照）。ＰＢＳ／５mＭ  ＥＤＴＡを用いて細胞を分散させ、ＰＢＳで２回洗った後２μｌの４％ｐ−ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中３７℃、１０分間処理して固定した。この細胞をＰＢＳで洗浄後０．６％ｎ−オクチル−グルコシド／ＰＢＳ中室温で５分間インキュベーションし、膜透過性としてから１０μｇ／μｌのいずれかの抗−Ｃ−erbＢ−２ＭＡｂを含む２％ ＦＢＳおよび１０mＭ ＨＥＰＥＳ（pＨ７．０）からなる１×HBSSに懸濁した。この一次抗体とのインキュベーションは氷中６０分間行ない、ついでＰＢＳで２回洗浄した。それから細胞をFITC−Ｆ（ab′）2抗マウスＩgＧ（タゴ製、カタログ＃４９５０）を含む１００μｌのＨＢＳＳに懸濁した。またトランスフェクトした細胞を非特異的マウスミエローマＩgＧ１（リトンバイオネティクス製）で染色した。
（放射能免疫沈殿法）
一時的トランスフェクション化または安定発現Ｃ−erbＢ−２sec細胞を６０mmディッシュで８０％集密度となるよう生育させてから、２μｌ無システイン培地中１時間かけて飢餓化した。ついで細胞を３７℃、５％ CO2条件下２００mＣiの３５Ｓ−システイン（比活性＝６００Ｃｉ／mmol；アマーシャム社）で１５時間かけてラベル化した。その上清を回収し１mＭ ＰＭＳＦ中−20℃で保存した。冷リン酸緩衝液で細胞を２回洗浄してからディッシュ当り０．４μｌの１×ＲＩＰＡバッファ〔０．１５Ｍ  NaCｌ、１％トリトンＸ−１００（１０μｌ／Ｌ）、１％デオキシコール酸ナトリウム（１０ｇ／Ｌ）、０．１％ＳＤＳ（１ｇ／Ｌ）、１０mＭトリスpＨ７．４、１mＭ ＰＭＳＦ〕に溶かした。その溶解物をプロテインＡ−セファロースを用いて清澄化した後（溶解物４００μｌ当６０μｌ）、１０μｌの溶解物をＴＣＡ沈殿して取込みをチェックした。この溶解物をサンプル当り４×１０6カウントで標準化し、振とう器を用い４℃で１晩抗体とインキュベートした。この上清を濃縮し、その等価量を一晩抗体とインキュベートした（振とう器を用い、４℃で）。一晩のインキュベーション後このサンプルを６０μｌのプロテインＡ−セファロースを用い４℃、３０分間で沈殿化し、遠心で落とした後４回１×RIPAでで洗浄した。最後の洗浄後吸着した免疫複合体を３５μｌの２×レムリバッファに懸濁し、５分間煮沸してから７％アクリルアミドゲルで電気泳動した。このゲルを固定化し、乾燥後一晩のフィルム露光に使用した。
ウエスタンブロットには７％ＳＤＳアクリルアミドゲルで電気泳動し、トリス−グリシン−メタノールバッファを用いてニトロセルロースにブロッティングした。ブロッキングおよびインキュベーションは１０％ミルクおよび２％ＢＳＡ中で行った。検出には基質としてＤＡＢを用いたビオチン−アビジン法を使用した（０．１Ｍトリス、０．０２％過酸化水素溶液中ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド）。このブロットは０．０５Ｍトリス、０．２５Ｍ塩化ナトリウム（NaCｌ）３mＭ ＥＤＴＡ、０．０５％トウィーン２０溶液で洗浄した。
（CHO細胞における可溶性Ｃ−erbＢ−２誘導体（gp７５）の検出）
先に述べたようにｐＦＲＳＶ−Ｃ−erbＢ−２sec構築物を安定にＣＨＯｄ×１１株に導入し、ＭＴＸ濃度を段階的に増加して予期されるgp７５の増巾の後に細胞溶解物および上清における抗−Ｃ−erbＢ−２ＴＡｂ２５２との反応性を検定した。先に示されたＲＩＰ分析を用い、細胞溶解物中にgp７５の主要部分が検出された。gp７５安定発現ＣＨＯ集団の上清には実質的により少ない量が検出された。免疫蛍光法を行なうことによりこの構築物が疎水性の膜透過ドメインを含まないことからgp７５が生成し、かつgp７５安定トランスフェクト化ＣＨＯの上清に分泌される理由を決定した。免疫蛍光分析によって１つのトランスフェクト化ＣＨＯ集団のおよそ３０％および第２の集団の１０％が抗−Ｃ−erbＢ−２ＴＡb ２５２と反応性を有し、またそのたんぱく質が特定のオルガネラ；たとえばリソソームや核に局在化していないことが示された。我々は各々のgp７５発現ＣＨＯ集団の限界希釈クローニングによるgp７５の分泌画分を増加し得たと考えている。各MTX耐性（５０mＭ）クローンを単離し、増巾後抗−Ｃ−erbＢ−２ＴＡb ２５２を用いてgp７５発現を検定した。免疫蛍光法、ＲＩＰ分析およびウエスタン分析でgp７５のクローニングおよび発現の成功が確認された。ＣＨＯクローンからの分泌gp７５の発現レベルは非クローン化集団と比較して約１０〜２０倍大きかった。
Ｃ−erbＢ−２の“可溶性”誘導体がインビトロで生成する可能性を試すため細胞外エピトープを認識する抗−Ｃ−erbＢ−２ＴＡｂ２５２に対する結合の競争を行った。この実験に用いた２種の細胞は全長Ｃ−erbＢ−２ cＤＮＡで安定にトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３（キング（King）等、１９８５）および先に述べたgp７５発現ＣＨＯの１つである。予め３５Ｓ−システインを用いてラベル化したクローンから上清を回収した。競争は一定量の抗−Ｃ−erbＢ−２抗体ＴＡｂ２５２、一定量のラベル化gp７５−ＣＨＯ上清および種々の量の３Ｔ３−Ｃ−erbＢ−２非ラベル化細胞溶解物を用いて行った。ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより非ラベル化３Ｔ３−Ｃ−erbＢ−２（gp１８５）濃度が増加するにつれて約７５ｋdのＲＩＰバンドの強度は逆比例して減少することが示された（第４図）。このことは“可溶型”がこのたんぱく質の膜結合型を発現する細胞型から“放出”され、かつ種々の細胞型でグリコシル化に明確な不均一性が存在することを示している。gp７５発現ＣＨＯ細胞の上清はその結合についてNIH3T3t溶解物と競合した（第４図）。
（実施例２）
（組換えＣ−erbＢ−２たんぱく質の精製）
（プラスミドの精製）
バクテリアの１リットル培養においてＯＤ６００＝０．８のとき細胞に２００μｇ／μｌのクロラムフェニコールを加えることによりプラスミドＤＮＡを増巾した。３７℃、１晩のインキュベーション後バクテリアをペレット化し、１０μｌの５０mＭスクロース、２５mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ８．０）、１０mＭ  ＥＤＴＡ溶液に懸濁した。この溶液１０μｌの１０μｇ／mｌリゾチーム溶液を加え、室温で１０分間インキュベーションした。この混合物に４０mｌの０．２Ｍ NaOH、１％ＳＤＳ溶液をゆっくり添加し、氷中で１０分間インキュベーションした。それから３０mｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（pＨ５．０）を加え、この混合物を氷中でもう１０分間インキュベーションしてからベックマンＳＷ２７または同等物を用い２０，０００rpm、４℃で２０分間遠心した。等容量のイソプロパノールを上清に加え、室温で２０分間放置して沈殿化し、その沈殿をソーバール（Sor vall）を用い室温、１２，０００ｇで３０分間遠心して沈降させた。このペレットを２．４mｌのTEバッファ（１０mＭトリスＨＣｌ、pＨ７．４、１mＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、ついで４．２ｇ塩化セシウム（CsCｌ）および０．４mｌエチジウムブロミド（EtBr）（１０μｇ／mｌ）と混合した。このサンプルをベックマンクィック−シールポリアロマーチューブ中CsCｌ溶液層約８mｌ（密度＝１，４７０ｇ／mｌ，ｎ＝１．３７８０）の下５／８×３のところにロードし、ソーバールＴ１２７中２０℃、５０，０００rpmで１８時間遠心した。
（イムノアフィニティーゲルの調製）
モノクローナル抗体ＴＡｂ２５４（該ＭＡｂの調製法については上記方法のセクション参照）を業者の指示に従がいＮＨＳ活性化アフィニティーゲル（アフィ・プレップ１０；バイオラッドラブス社、リッチモンド、ＣＡ）にカップリングした。簡単に云うと精製抗体４．５μｇをカップリングバッファ（２０mＭ HEPES, pＨ＝７．５、１５０mＭ NaCｌ）に交換し限外濾過で最終容積１．０mｌに濃縮した。この溶液を氷冷カップリングバッファで平衡化した２．０mｌのゲルに加え、このスラリーを４℃で一晩混合した。カップリング後、このゲルを焼結ガラスフィルターで回収し、カップリングバッファで洗浄した。濾液サンプル中のたんぱく質をＢＣＡたんぱく質検定法で検定した（ピアス社、ロックフォード、ＩＬ）。濾液全てから回収された総たんぱく質は１．２μｇであった。それゆえＩgＧ３．３μｇがゲルにカップリングしたと考えられる。
残存する反応部位を２−アミノエタノールでブロックした。カップリングバッファ中１００mＭの２−アミノエタノール５．０mｌ（pＨ８．５）をゲルに加え、そのスラリーを室温で２時間混合した。それからこのゲルをＰＢＳで十分に洗浄し、４℃で保存した。アジ化ナトリウムを加え（最終濃度０．０２％w／v）、バクテリアの繁殖を防いだ。
（Ｃ−erbＢ−２細胞外ドメインの単離および精製）
可溶性Ｃ−erbＢ−２細胞外ドメインたんぱく質を精製するための出発物質としてトランスフェクト化ＣＨＯ上清の１０倍濃縮物を用いた。濃縮上清を融解し、以下に示す最終濃度となるようにプロテアーゼインヒビターを加えた。０．２mＭ ＰＭＳＦ，２．１μｇ／mｌアプロチニン、２．５μｇ／mｌペプスタチンＡ、１．０μｇ／mｌロイペプチン、２mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ ＥＧＴＡ。上清のpＨは１．０Ｎ水酸化ナトリウム（NaOH）で７．０に調整した。いくつかの実験では限外濾過を用い上清をさらに４倍濃縮した。さらに上清を濃縮すると濁りを生じ、この濁りはクロマトグラフィー前遠心で除去した（１０，０００×ｇ、２０分間）。
この上清を０．４５mmメンブレンで濾過した後２５４イムノアフィニティーゲル（１．０mｌベッド容積）を充填した０．５×５cmカラムにロードした。このカラムは毎分０．２mｌの流速で運転した。１０mＭリン酸ナトリウム、pＨ７．０、５００mＭ塩化ナトリウム（NaCｌ）で非特異的結合物質を洗い流した。洗浄は２８０nmの吸収ベースラインが安定するまで行った。特異的結合物質は流速０．２mｌ／minの１００mＭグリシン−ＨＣｌ（pＨ２．５）のステップグラジェントで溶出した。各１．０mｌのフラクションを採取した。その後カラムはＰＢＳで十分に洗浄した。サンプルロード、洗浄および溶出は４℃で行った（第１図）。
カラムフラクション中のＣ−erbＢ−２たんぱく質の存在はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析で測定した（第２Ａ図および第２Ｂ図参照）。ウエスタンブロット分析の場合抗原はポリクローナル抗体９２Ａの１／２０００希釈物（この調製法は上述の方法のセクション参照）で検出した。ピーク反応性を含むフラクションを回収し、上述のプロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳに対して透析した。この透析物を限外濾過で濃縮した。最終的たんぱく質収量は標準物質としてウシガンマグロブリン（バイオラドラブス社、リッチモンド、ＣＡ）を用いたＢＣＡたんぱく質検定法で測定した。
１回のクロマトグラフィーサイクルからの総たんぱく質収量は約９０μｇであった。このことはＩＲＭＡで測定された１０倍濃縮上清５００mｌ中の抗原活性の約９０％に相当する。同じカラムで５回のサンプルロードおよび溶出サイクルを行ったが抗原結合容量のロスはなかった。溶出物プールのＳＤＳ−ＰＡＧＥは約７５kＤの非常に接近した２つのバンドおよび９０kＤの１つのマイナーバンドを示した。これらのサイズの差はたんぱく質のグリコシル化の差またはたんぱく質分解の差によるものであろう。
（実施例３）
（イムノラジオメトリックサンドイッチアッセイ（ＩＲＭＡ））
ヨードゲン法を用いＴＡb ２５１および２５５−２６５を１０−２０mＣｉ／μｇの比活性となるよう放射能ラベルした。イムロンエリムーバル９６穴プレートをＰＢＳ（pＨ７．２）中１０μｇ／mｌの以下のＴＡｂ：２５１、２５５−２６５の１つを用い、４℃１晩でコーティングした。それからこのプレートをＰＢＳで洗浄し、ついでＰＢＳ中１％ＢＳＡを用い、３７℃１時間でこれをブロックした。さらに洗浄した後、ＰＢＳで希釈した１００mｌのサンプル（細胞溶解物または上清、部分精製gp１８５またはgp７５たんぱく質または血清サンプル）をＴＡｂコーティングウェルに加え、このプレートを３７℃で２〜５時間インキュベートした。プレート洗浄後ウェルに放射能ラベルしたトレーサー抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２００，０００cpm／１００mｌに調整したもの）を添加した。室温での２〜２４時間のインキュベーション後、このプレートを洗浄し、各ウェルをガンマカウンターで計数した。結合率（１％Ｂ）は以下の式で計算した。
％Ｂ＝（サンプルcpm／全cpm）×１００
アフィニティー精製したgp７５たんぱく質（トランスフェクトＣＨＯ細胞系列由来）が使用可能な検定ではシグモイド曲線関数を用いて標準曲線を作製し、そこからng／mｌで表わされるgp７５等価物として未知濃度を測定した。
第２表はモノクローナル抗体を組合せるとサンドイッチ・IRMA様式でgp７５たんぱく質を検出し得ることを示している。準精製gp１８５もgp７５標準物質と同様にＩＲＭＡ様式のテストを行った。興味深いことに、捕獲抗体としてＴＡb ２５１およびラベル化抗体としてＴＡb ２５５を用いたこの様式のテストでＣ−erbＢ−２発現細胞系列溶解物およびＣ−erbＢ−２オンコジーンでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から部分精製したgp185たんぱく質からのシグナルは検出できたがＣ−erbＢ−２誘導腫瘍を有するヌードマウス血清からのシグナルまたはgp７５たんぱく質は検出できなかった。第３表にまとめた競争検定法に基づくこれらのデータは最終的検定様式がヌドマウス血清中のシグナルも検出するgp７５たんぱく質検出に必要であることを示している。gp７５同様gp１８５に対しても適正な感度および特異性を示すこの最終的検定様式は捕獲抗体としてＴＡｂ２５９およびトレーサー抗体としてＴＡｂ２５６を用いる。この検定では０．５〜１ng／mｌの感度で部分精製したgp７５たんぱく質が検出され、部分精製したgp１８５、gp１８５を過剰発現する細胞溶解物中およびヌードマウス血清中のシグナルが検出された（第３表にまとめた）。gp７５に対する感度を示す本検定の標準曲線を第７図に示す。
ＴＡb ２５６／２５９ＩＲＭＡ検定を用いて細胞培養上清のシグナルを定量した。Ｃ−erbＢ−２たんぱく質ポジティブの細胞系列はこのＩＲＭＡ検定で検出および定量される抗原を放出している。第４表は、コントロールＮＩＨ３Ｔ３細胞系列の放出抗原レベルがバックグランドレベルであり、一方gp１８５を過剰発現し、放射能免疫沈殿法で検出されるgp７５を上清中に放出する細胞系列もサンドイッチＩＲＭＡで検出可能で２２〜７０ng／mｌのgp７５等価物として定量される抗原を放出することを示している。放出される抗原のレベルは培養物の集密度およびＣ−erbＢ−２過剰発現のレベルに依存する。
この様式の方法を用いて全てのマウスおよびヒト血清サンプル、および細胞上清および細胞溶解物を分析、定量した。競争およびサンドイッチ検定の結果を第３表にまとめた。この結果は部分精製したgp７５外部ドメインたんぱく質の検出能とＣ−erbＢ−２誘導腫瘍を有するヌードマウス由来の血清サンプルまたはヒト胸部がん患者由来の血清サンプル中の放出抗原検出能の相関関係を示している。
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（実施例４）
（ヌードマウス腫瘍増殖および治療）
実験を開始する前にBalb/cヌードマウスを尾の静脈から放血させた。それからこの動物に２００mｌのＰＢＳ中５×１０6〜１×１０7個のＮＩＨ３Ｔ３ｔ細胞を背中中央に沿って皮下注射した（０日目）。これらの細胞のは９０％以上が注射後も生存していた。細胞注射から２〜３日後（腫瘍容積が１００mm3に達する前）この処理動物に２〜３日毎にＰＢＳ、１００〜５００μｇ／３００mｌのＩｇＧコントロール抗体またはＴＡb抗体を腹腔注射した。バーニアキャリパーを用いて腫瘍の長さ、巾および高さを測定し、容積を計算することにより増殖を測定した。腫瘍は３−４日毎に測定した。１〜２週間毎に尾の静脈から放血させた。この実験は２８〜３１日間続けた。実験の終りに最後の放血を行ない、腫瘍を測定し、次の免疫組織学的実験に用いるためこれを切り取った。
（ヌードマウス血清中の放出抗原の検出）
第８図では、１：５血清希釈物（v／v)のＩＲＭＡ検定における結合シグナルの割合を血清採取時における腫瘍の大きさに関してグラフ化した。これらの血清はｃ−erbＢ−２トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞によって誘導される腫瘍を有する動物に由来する。この検定法は腫瘍サイズが約３０００mm3になるまでシグナルが増加しつづけ、その後一定になることを検出できた。非常に強いシグナルと血清量に限りがあることから血清を１／５〜１／６２５（v／v）に希釈して分析した。一番高い希釈率のときでもしばしば強いシグナルが検出できた。腫瘍含有マウスをＰＢＳまたはＩｇＧ１コントロール抗体で処理した場合ＩＲＭＡ検定法で検出されたシグナルは未処理のマウスと同じであった（第９図）。しかし、この動物はｃ−erbＢ−２外部ドメインを認識するＴＡbで処理したとき、この検定法で検出可能な放出抗原量は腫瘍サイズが３０００mm3となるまで厳しく抑制された。腫瘍サイズが＞３０００mm3のときでさえ、シグナルはテストした血清の約半分に抑制された。これらのデータはｃ−erbＢ−２の外部ドメインまたはその一部分を認識する抗体はサンドイッチＩＲＭＡ検定における検定可能シグナルのレベルを抑制することを示している。
またヌードマウス中で生育させたgp１８５たんぱく質を過剰発現するヒトの乳腺または卵巣細胞系列も第５表に示したとおりｃ−erbＢ−２ＩＲＭＡ検定で検出可能な抗原を放出した。このシグナルは腫瘍のサイズと相関関係を示した。ＭＣＦ７誘導腫瘍は小さいままであり、ｃ−erbＢ−２関連抗原を放出しなかった。ＭＤＡ４６８細胞系列は実質的な腫瘍増殖（＞２０００mm3）を誘導し、実質的量のＥＧＦvを有していたがサンドイッチIRMA検定で検出可能な抗原を放出しなかった（第５表）。
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この競争実験を使用しエクトドメイン反応性ＭＡbであるTAb２５１の結合についてトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の溶解物と競合するgp７５抗原を検出した。第１３図はヒトの乳腺細胞系列ＢＴ−４７４およびヒト卵巣細胞系列ＳＫＯＶ３などｃ−erbＢ−２gp１８５を発現する細胞系列由来の溶解物がＮＩＨ３Ｔ３t溶解物と同レベルにＮＩＨ３Ｔ３t溶解物への結合を競争し得ることを示している。トランスフェクトされていないコントロール３Ｔ３細胞は競争できなかった。同様にgp７５外部たんぱく質でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清はＮＩＨ３Ｔ３t溶解物への結合を争うことが示され（第１４図）、このことはＴＡb ２５１がエクトドメインを認識し、かつこの結合だけでＭＡbのgp１８５に対する結合と競争するのに十分であることを確証している。
ＮＩＨ３Ｔ３tトランスフェクトした細胞によって誘導される大きな腫瘍を有するマウス由来のヌードマウス血清は第１５図に示されているようにＮＩＨ３Ｔ３（ｃ−erbＢ−２発現細胞）溶解物への結合を競争し得る。競争能は腫瘍の大きさに相関しているが、この検定法では１／１６０（v／v）以下の血清希釈物について非特異的妨害から区別できるシグナルを検出するのに十分な感度は得られていない。
（実施例５）
（ヒト腫瘍細胞培養上清における放出されたＣ−erbＢ−２の検出）
ヒト胸部腫瘍細胞系列をＴ１５０フラスコ中で培養し、15μｌの無システインおよび無メチオニン培地中４００mＣiの３５Ｓ−システインを用いてラベルした（ダルベッコ修正イーグル培地、ＤＭＥ  Ｈ２１  ４．５ｇ／ｌグルコース含有）。細胞は３７℃で一晩かけてラベルした。２４時間後、培地を回収し、プロテアーゼインヒビター（ロイペプチン１μｇ／μｌ、べーリンガーマンハイム社、アプロチニン２．１μｇ／μｌ、シグマ社；ペプスタチンＡ２．５μｇ／μｌ、べーリンガーマンハイム社；およびPMSF０．１mＭ、シグマ社）を加えてからアミコンセントリプレップ３０を用い４００μｌになるまで濃縮した。
免疫沈殿前、プロテインＡ−セファロースビーズの５０％スラリー１００μｌと４℃で４時間インキュベーションすることにより非特異的プロテインＡ結合を取り除いた。このビーズおよび非特異的結合物をマイクロフュージによる３０秒遠心で除去し、その上清を新しいチューブに移した。それから抗体（約１０μｌを含む２０μｌ）を加え、この混合物を振とう器中４℃で２４時間インキュベーションした。次の日、５０μｌのプロテインＡスラリーをこのサンプルに加え振とう器中４℃で４時間インキュベーションした。次にビーズをマイクロフュージの３０秒遠心でペレット化し、氷冷ＲＩＰＡバッファ（１００mＭトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１００mＭ NaCｌ、０．５％トリトンＸ−１００、０．５％デオキシコール酸塩、１０μｇ／μｌウシ血清アルブミン、０．２mＭ  ＰＭＳＦ）で５回洗浄した。３回目と４回目の洗浄の間にチューブを交換した。最後にペレットを１％ベーターメルカプトエタノールを含むレムリサンプルバッファ５０μｌに懸濁した。このサンプルを７５℃で５分間加熱し、マイクロフュージの３０秒間遠心した後７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードした。
泳動は約１２０mＡ−時間で停止し、蒸留水中１０％酢酸、３０％メタノール溶液で４５分〜１時間かけてゲルの固定を行った。蒸留水で素早く洗浄した後、そのゲルを新鮮な蒸留水２５０μｌ中に１時間浸した。このゲルに９０分間かけて２５０μｌのエンハンス（デェポン社）を浸透させ、２％グリセリン溶液で平衡化してから濾紙上で乾燥させた。この乾燥したゲルで−８０℃で３日間かけてコダックＸ−ＯＭＡＴ  ＡＲ−５Ｘ線フィルムを感光させた。
（ヒト腫瘍細胞の培地上清中の可溶性Ｃ−erbＢ−２誘導体（gp７５）の検出）
第５図は種々の抗体で濃縮沈殿化したＳＫＢＲ３細胞の組織培養上清のオートラジオグラムを示している。細胞外ドメインと反応するＣ−erbＢ−２抗体（Ａ２９およびＴＡｂ２５２）で処理したこれらのサンプル中には明確な約７５kdの単一バンドが存在した。一方、Ｃ−erbＢ−２Ｃ−末端ペプチドに対して作製したウサギポリクローナル抗血清またはＢＧＦレセプターに対して特異的なモノクローナル抗体（アマーシャム社）のいずれかで処理した上清にはバンドは出現しなかった。さらにＳＫＢＲ３細胞由来の７５kdのバンドの特異性はＣ−erbＢ−２オンコジーンでトランスフェクトした３Ｔ３細胞由来の同一分子量の分子種を沈殿化する同モノクローナル抗体、ＴＡｂ２５２の能力で示された（第６図）。また、ＭＤＡ４６８の上清由来の７５kdバンドをＴＡｂ２５２が沈殿させないことも第６図に示されている。その細胞系列は大量のＥＧＦレセプターを発現するが検出可能なレベルのＣ−erbＢ−２は発現しない。約１０５kdのより大きな分子がこれらの細胞から抗ＥＧＦレセプターモノクローナル抗体によって沈殿した。
沈殿化はＣ−erbＢ−２および検出可能なＥＧＦレセプターを発現しない上清でも行ったが（第６図）、７５kdおよび１１０kdのいずれにもバンドは検出されなかった。
（実施例６）
（ヒト血清中に放出された抗原の検出）
連続的採血が可能な胸部がん患者の２０人のヒト血清をこの検定法で試験した。この検定で健康人の血清は１．６８％のバックグランドレベルを示したが（第１０図）、３人の患者由来の血清（患者４、７および１９）は有意にバックグランドレベル以上の放出抗原レベルを示した（第１１図）。これらの血清のシグナルはgp７５標準物質と平行して希釈率をあげるに従がい減少した（第１２図）。別に８８種の胸部がん血清もこの検定法でテストし、そのうちの１３個の血清がバックグランドより有意に高い９．９〜１５１１ng／μｌgp７５等価物のレベルでポジティブであることが示された。サンドイッチgp７５ＩＲＭＡで測定した放出抗原量とセントコア社から市販されている診断検定法による値には相関関係はみられなかった（第６表）。也ントコア検定法は数年間市販されてきているヒト胸部がん診断用のＦＤＡ認可の検定法である。このセントコア検定法はムチンを測定するものでIRMAgp７５検定でポジティブと判定された１３名の胸部がん血清の各々はこの方法でもポジティブであった。しかしＩＲＭＡgp７５検定は各患者でわずかに異なるgp７５プロフィールを示すがムチンレベルのセントコア検定では各患者について差はでてこない。gp７５レベルの差は患者ごとの病状の差を示している。
（結論）
ハイブリッド微生物、組換えＤＮＡ分子およびたんぱく質／ポリペプチドおよび本発明のこれらのものに適用し得る方法などは先に示した好ましい態様物で述べたものに限定されないことを理解すべきである。ハイブリッド生物、組換えＤＮＡ分子およびたんぱく質／ポリペプチドは生産の過程、またはその後に従来法によってより利点の多いものに修正し得る。たとえばＣ−erbＢ−２配列の転写により有効なコントロール配列を使用する、望ましくない産物の合成を減少させる変異も導入する、宿主内のプロテアーゼレベルを減少させる、Ｃ−erbＢ−２配列を含む熱誘導可能なライソジェンを宿主染色体に組込む、あるいは細胞中の配列コピー数を増加させるか、または目的とするたんぱく質／ポリペプチドを生産する上で細胞の生産性を増加するその他の修正および操作を行ない得る。
これまで述べてきた事項に加えて本発明に種々の修正が可能なことはこれまでの説明から当業者にとって明白であろう。このような修正は特許請求の範囲内にあると考える。
第６表、セントコア検定法と比較したＴＡｂ２５９／２５６サンドイッチＩＲＭＡによるヒト胸部がん血清における放出抗原の定量
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概要
Ｃ−erbＢ−２オンコジーンを過剰発現する悪性腫瘍を同定するための方法および組成物が提供される。悪性腫瘍の診断および予防に有用な方法で腫瘍を有する哺乳動物の生物学的液体中のＣ−erbＢ−２の外部ドメイン、糖たんぱく質gp７５の検出およびgp７５レベルの定量を行う方法が提供される。
さらにＣ−erbＢ−２オンコジーン（gp７５遺伝子）の外部ドメインＤＮＡ配列またはそのフラグメントによってコードされ、組換え的、合成的および他の生物学的に生産される新しいたんぱく質およびポリペプチドが公開される。このようなgp７５たんぱく質は単独で、または化学療法試薬と組合せてがん治療に用いられるワクチンとして有用である。また診断や治療に有用なgp７５たんぱく質に対する抗体も公開される。さらに本発明の検定法を行うテストキットも公開される。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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