(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体。
【化１】
0003798064.tif 000018
［式（Ｉ）中、Ｚは、下記一般式（Ｚ）で表されるジゴキシゲニン含有基を示す。Ｗは４級アンモニウム基を表す。Ｙ1及びＹ2は、各々直鎖結合、又は、主鎖の炭素数が１〜２０であり、場合により該主鎖中に−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を有していてもよい直鎖状又は分岐状のアルキレン基を表す。Ｂは水素原子又は式（Ｉ）中の−Ｗ−Ｚと同一もしくは異なる一価の有機基を表す。］
【化２】
0003798064.tif 000019
［式（Ｚ）中、Ｌは、主鎖中に−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を有していてもよい直鎖状又は分岐状のアルキレン基を表す。］
【請求項２】
一般式（Ｉ）中、Ｗが下記一般式（Ｗ）で表される４級アンモニウム基である、請求項１記載のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体。
【化３】
0003798064.tif 000020
［式（Ｗ）中、Ｒ1及びＲ2は、各々炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状の飽和もしくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基、又はＲ1とＲ2とが相互に結合して形成する含窒素複素環式基を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。］
【請求項３】
一般式（Ｉ）中、Ｂは３級アミノ基又は４級アンモニウム基である、請求項１記載のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体。
【請求項４】
一般式（Ｉ）中、Ｂは−Ｗ−Ｚで表される一価の有機基（Ｗ及びＺは各々式（Ｉ）中におけるのと同義である。）である、請求項１記載のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体。
【請求項５】
一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体が、下記式（ＩＩ）で表される化合物である、請求項１又は２記載のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体。
【化４】
0003798064.tif 000021
［式（ＩＩ）中、ｋ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは各々１〜１２の整数を表す。Ｌ1及びＬ2は各々−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を表す。Ｂは式（Ｉ）におけるのと同義である。Ｒ1及びＲ2は、各々炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状の飽和もしくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基、又はＲ1とＲ2とが相互に結合して形成する含窒素複素環式基を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。］
【請求項６】
一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体が、下記式（Ｖ）で表される化合物である、請求項１に記載のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体。
【化５】
0003798064.tif 000022
［式（Ｖ）中、Ｑ−はアニオン、Ｘはハロゲン原子を表す。］
【請求項７】
下記一般式（ＩＩＩ）で表されるカルボジイミド化合物と、下記一般式（ＩＶ）で表されるハロゲン化ジゴキシゲニン誘導体とを反応させる工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体の製造方法。
【化６】
0003798064.tif 000023
［式（ＩＩＩ）中、Ｂ、Ｙ1及びＹ2は各々前記一般式（Ｉ）におけるのと同義であり、Ｗ’は置換されていてもよいアミノ基を表す。］
【化７】
0003798064.tif 000024
［式（ＩＶ）中、Ｚは前記一般式（Ｉ）におけるのと同義であり、Ｘはハロゲン原子を表す。］
【請求項８】
標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法において、前記標識物質として、請求項１〜６のいずれかに記載のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を用いることを特徴とする方法。
【請求項９】
標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、前記標識物質として、請求項１〜６のいずれかに記載のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を用いることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なジゴキシゲニン誘導体に関する。詳しくは、本発明は、高感度で且つ核酸、蛋白質への標識が容易な新規なジゴキシゲニン誘導体及びその製造方法並びにそれを使用した検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、核酸の標識は放射性同位体（32Ｐ、14Ｃ、3Ｈなど）を標識化合物として用い、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法、テーリング法などの方法で核酸に取り込ませることにより行われてきた。このような放射性同位体で標識した核酸を用いた検出法は、一般に高感度で特異的であるという特徴を有しているが、安全性、経済性、安定性などの点では問題がある。すなわち、放射性同位体は半減期を考慮して保存、使用する必要があり、長期保存して繰り返し使用することができない。また、一般に人体に有害であり、取り扱いに専用の施設を必要とするなど厳密な注意をしなければならない。
【０００３】
このような理由により非放射性標識物質を用いた核酸、蛋白質の標識が盛んに利用されはじめている。このうち、アビジン又はストレプトアビジンと高い親和性を有するビオチンを用いた方法が多用されており、例えば酵素標識したアビジンを核酸に取り込ませたビオチンに結合させた後、結合した酵素の活性を測定する方法等がある。しかし、このようなビオチン標識法は、取り扱いが煩雑であり、特別な反応装置や条件が必要であったり、また、標識操作に時間がかかる等の問題がある。
【０００４】
一方、ジゴキシゲニンの基本骨格を有し、これに他の分子や担体等が結合したジゴキシゲニン誘導体は、検出試薬として多数の生物学的分析に使用されている。例えば、ジゴキシゲニン誘導体は、イムノアッセイ（免疫検定法）において、強心配糖体に対する抗体として、強心配糖体、特にジゴキシンの測定に用いられる。また、ハプテンを標識として結合させた相補的な塩基配列を有する核酸を用いた核酸検出法において、前記ハプテンとして用いられる。これらの分析方法は、ハプテン−抗ハプテン抗体−相互作用の原理に基づいて行われ、これには一般に、ジゴキシゲニンがステロイド骨格の３位を介して他の分子に結合しているジゴキシゲニン誘導体が使用されている。
【０００５】
しかしながら、従来使用されてきたジゴキシゲニン誘導体は、次のような欠点を有していた。すなわち、ジゴキシゲニンのステロイド骨格とエステル結合又はウレタン結合を介して他の分子が結合しているジゴキシゲニン誘導体は、前記エステル結合又はウレタン結合が塩基性条件下に極めて不安定であり、加水分解を起こしやすいため、使用中にジゴキシゲニン誘導体の分解が生じるという問題があった。
【０００６】
また、ジゴキシゲニン誘導体は、ステロイド骨格の３位の他に１２位に反応性の水酸基を有しており、合成時に３−及び１２−誘導体からなる混合物がしばしば生じる。このような混合物を精製することなく用いると、誤差が生じて分析精度が低下し、一方、これらを各々の位置異性体に分離しようとすると著しく経費がかかるという問題があった。更に、ジゴキシゲニン誘導体には、例えばステロイド骨格の３位の酸素原子がアミノ基の窒素原子に置換されたような変性体が存在する場合があり、このような変性体は、非変性ステロイド骨格に対する抗体によるハプテンの認識を損なう場合があった。
【０００７】
このような問題点を解決しうるものとして、ステロイド骨格と他の分子との間を３位のエーテル結合を介して結合させたジゴキシゲニン誘導体が提案されている（特公平６−３７５１３号公報参照）。しかしながら、このジゴキシゲニン誘導体は、ジゴキシゲニンから側鎖を伸ばしてアミノ基反応性基をもたせたものであり、アミノリンカー等で人工的に修飾された核酸と反応させて標識させる必要があるため、標識工程が煩雑であり、しかも天然由来のＤＮＡに対して標識できないという問題があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核酸検出法又はイムノアッセイ法における測定用標識として、標識方法が簡便であり、天然由来の核酸にも標識でき、且つ高感度な分析が可能な標識物質である新規ジゴキシゲニン誘導体を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
カルボジイミド化合物が核酸と反応することは知られている。例えば、カルボジイミド化合物は核酸中の水素結合を形成していないグアニン及びチミンと反応して付加体を形成することが報告されている［P. T. Gilham, J. Amer. Chem. Soc., 84, 688(1962)］。
【００１０】
本発明者らは、簡便で効率的な核酸及び蛋白質へのジゴキシゲニン導入法に関して鋭意研究を重ねた結果、カルボジイミド基の核酸、蛋白質等への高い反応性を利用して、カルボジイミド化合物にジゴキシゲニン基を導入することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を提供するものである。
【００１２】
【化７】
Ｂ−Ｙ2−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ1−Ｗ−Ｚ  ・・・（Ｉ）
【００１３】
［式（Ｉ）中、
Ｚは、下記一般式（Ｚ）で表されるジゴキシゲニン含有基を示す。
Ｗは４級アンモニウム基を表す。
Ｙ1及びＹ2は、各々直鎖結合、又は、主鎖の炭素数が１〜２０であり、場合により該主鎖中に−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を有していてもよい直鎖状又は分岐状のアルキレン基を表す。
Ｂは水素原子又は式（Ｉ）中の−Ｗ−Ｚと同一もしくは異なる一価の有機基を表す。］
【００１４】
【化８】
0003798064.tif 000002
【００１５】
［式（Ｚ）中、
Ａは−Ｏ−、−ＣＯＯ−、又は−ＮＨＣＯＯ−を表す。
Ｌは、主鎖中に−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を有していてもよい直鎖状又は分岐状のアルキレン基を表す。］
【００１６】
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）中、Ｗが下記一般式（Ｗ）で表される４級アンモニウム基であるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を提供する。
【００１７】
【化９】
0003798064.tif 000003
【００１８】
［式（Ｗ）中、
Ｒ1及びＲ2は、各々炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状の飽和もしくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基、又はＲ1とＲ2とが相互に結合して形成する含窒素複素環式基を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。］
【００１９】
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）中、Ｂが３級アミノ基又は４級アンモニウム基であるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を提供する。
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）中、Ｂが−Ｗ−Ｚで表される一価の有機基（Ｗ及びＺは各々式（Ｉ）中におけるのと同義である。）であるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を提供する。
【００２０】
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体が下記式（ＩＩ）で表される化合物であるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を提供する。
【００２１】
【化１０】
0003798064.tif 000004
【００２２】
［式（ＩＩ）中、ｋ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは各々１〜１２の整数を表す。
Ｌ1及びＬ2は各々−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を表す。
Ａ及びＢは、各々式（Ｉ）及び式（Ｚ）におけるのと同義である。
Ｒ1及びＲ2は、各々炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状の飽和もしくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基、又はＲ1とＲ2とが相互に結合して形成する含窒素複素環式基を表す。
Ｘはハロゲン原子を表す。］
【００２３】
また、本発明は、下記一般式（ＩＩＩ）で表されるカルボジイミド化合物と、下記一般式（ＩＶ）で表されるハロゲン化ジゴキシゲニン誘導体とを反応させる工程を含む前記カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体の製造方法を提供するものである。
【００２４】
【化１１】
Ｂ−Ｙ2−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ1−Ｗ’  ・・・（ＩＩＩ）
【００２５】
［式（ＩＩＩ）中、Ｂ、Ｙ1及びＹ2は各々前記一般式（Ｉ）におけるのと同義であり、Ｗ’は置換されていてもよいアミノ基を表す。］
【００２６】
【化１２】
Ｚ−Ｘ  ・・・（ＩＶ）
【００２７】
［式（ＩＶ）中、Ｚは前記一般式（Ｉ）におけるのと同義であり、Ｘはハロゲン原子を表す。］
【００２８】
また、本発明は、標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法において、該標識物質として、前記カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を用いることを特徴とする方法に関する。
【００２９】
更に、本発明は、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、該標識物質として、前記カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を用いることを特徴とする方法に関する。
【００３０】
一般式（Ｉ）で表される本発明のジゴキシゲニン誘導体は、核酸塩基に対して高い反応性を示すカルボジイミド基と、高感度な検出反応性を示すものとして知られるジゴキシゲニンとを同時に有する化合物であり、アミノリンカー等で人工的に修飾された核酸を用いる必要がなく天然由来のＤＮＡにも簡便な方法で標識可能である。また、光反応性標識化合物に比べ取り扱いが簡便である。よって、核酸や蛋白質にジゴキシゲニン基を導入するための標識試薬として有用である。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００３２】
（１）本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体
本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体は、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。ここで、式（Ｉ）中、Ｚは上記一般式（Ｚ）で表されるジゴキシゲニン含有基、Ｗは４級アンモニウム基を表す。Ｙ1及びＹ2は各々直接結合又は主鎖の炭素数が１〜２０であり、場合により主鎖中に−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を有していてもよい直鎖状又は分岐状のアルキレン基を表す。Ｂは水素原子又は式（Ｉ）中の−Ｗ−Ｚと同一もしくは異なる一価の有機基を表す。
【００３３】
一般式（Ｚ）中、Ａは−Ｏ−、−ＣＯＯ−、又は−ＮＨＣＯＯ−を表し、好ましくは−Ｏ−である。Ｌは、主鎖中に−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を有していてもよい直鎖状又は分岐状のアルキレン基を表す。Ｌの主鎖の炭素数は好ましくは１〜２０である。Ｌとしては具体的には下記一般式（Ｌ）で表されるアルキレン基が挙げられる。
【００３４】
【化１３】
−（ＣＨ2）q−Ｌ1−（ＣＨ2）r−Ｌ2−（ＣＨ2）s−  ・・・（Ｌ）
【００３５】
式（Ｌ）中、ｑ、ｒ及びｓは各々１〜１２の整数を表す。Ｌ1及びＬ2は各々−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を表す。特に、Ｌ1及びＬ2が各々−ＮＨＣＯ−であるものが好ましい。
【００３６】
一般式（Ｉ）中、Ｗは４級アンモニウム基を表し、好ましくは上記一般式（Ｗ）で表されるものである。ここで、式（Ｗ）中、Ｒ1及びＲ2は、各々炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状の飽和もしくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。Ｒ1とＲ2とは相互に同一であっても異なっていてもよい。脂肪族炭化水素基としてはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が包含され、アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、このうちメチル基が好ましい。アルケニル基としては、例えばビニル、アリル、クロチル、チグリル、プレニル等が挙げられ、特に炭素数２〜５のものが好ましい。アルキニル基としては、エチニル基、プロパルギル基等が挙げられ、特に炭素数２〜５のものが好ましい。シクロアルキル基としては、場合により環状にアルキル基等の置換基を有していてもよく、具体的にはシクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、４−メチルシクロヘキシル、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル、シクロオクチル等が挙げられる。特に炭素数６〜１０のものが好ましい。アリール基としては、単環式又は多環式のいずれのタイプのものであっても良く、例えば、フェニル、ナフチル等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル、フェネチル等が挙げられる。
【００３７】
また、Ｒ1とＲ2とが相互に結合して含窒素複素環式基を形成していてもよい。このような含窒素複素環式基としては、例えばピリジニウム基、ピロリジニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、モルホリノ基等が挙げられる。
【００３８】
式（Ｗ）中、Ｘはハロゲン原子であり、具体的にはＢｒ、Ｃｌ、Ｉが挙げられる。Ｙ1及びＹ2は、カルボジイミド基とＢ又は−Ｗ−Ｚとを結合するためのリンカー部分であり、各々直接結合、又は、主鎖の炭素数が１〜２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を表す。好ましくは、主鎖の炭素数が１〜４であり且つ場合により分岐鎖としてメチル基を有していてもよいアルキレン基、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、１−メチルトリメチレン、１−メチルテトラメチレン、２，２−ジメチルトリメチレン等が挙げられる。また、Ｙ1及びＹ2は、各々その主鎖中に−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を有していてもよく、例えばアルキレン基の任意の複数が−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基によって相互に結合したものであってもよい。
【００３９】
一般式（Ｉ）中、Ｂは、水素又は一価の有機基、好ましくは３級アミノ基又は４級アンモニウム基であり、好適な基としては以下に述べるものが挙げられる。
【００４０】
（ｉ）窒素原子が水素原子、飽和もしくは不飽和の炭化水素基、アリール基、アラルキル基、又は前記一般式（Ｚ）で表されるジゴキシゲニン含有基で４級化されていてもよい含窒素複素環式基、例えばピリジル基もしくはピリジニウム基、ピロリジル基もしくはピロリジニウム基、ピペリジリル基もしくはピペリジニウム基。特に、窒素原子がＣ1〜Ｃ10のアルキル基、例えばメチル基で４級化されていてもよい、２−、３−、もしくは４−ピリジル基又はピリジニウム基、２−もしくは３−ピロリジル基又はピロリジニウム基、２−、３−もしくは４−ピペリジリル基又はピペリジニウム基。
【００４１】
（ｉｉ）窒素原子が水素原子、飽和もしくは不飽和の炭化水素基、アリール基、アラルキル基、又は前記一般式（Ｚ）で表されるジゴキシゲニン含有基で４級化されていてもよいアミノ基。特に窒素原子がＣ1〜Ｃ10のアルキル基、例えばメチル基、又は前記一般式（Ｚ）で表されるジゴキシゲニン含有基で４級化されていてもよいアミノ基。具体的にはジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基。
【００４２】
（ｉｉｉ）下記式で表される複素環式３級アミノ基又は３級もしくは４級アンモニウム基。
【００４３】
【化１４】
0003798064.tif 000005
【００４４】
［式中、Ｒ3及びＲ4は各々水素原子、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1〜Ｃ10の脂肪族炭化水素基、又は置換基を有していてもよいアリール基もしくはアラルキル基、特にＣ1〜Ｃ10のアルキル基又はＣ1〜Ｃ10のアルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。Ｑはアニオン、例えばサルフェートイオン、アルキルサルフェートイオン、アリールサルフェートイオン、ハロサルフェートイオン、ハライドイオン等を表す。Ｒ5は酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表す。ｍは０又は１である。］
【００４５】
具体的には、下記式で示される基：
【００４６】
【化１５】
0003798064.tif 000006
【００４７】
［式中、Ｒ6及びＲ7は各々水素原子、Ｃ1〜Ｃ10のアルキル基又はＣ1〜Ｃ10のアルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。］
【００４８】
Ｂは、一般式（Ｉ）中の−Ｗ−Ｚで表される一価の有機基（Ｗ及びＺは各々式（Ｉ）中におけるのと同義である。）と同一であっても異なっていてもよく、同一の場合は、例えば、一般式（Ｉ）においてカルボジイミド基を中心として対象な形となる化合物などが挙げられる。
【００４９】
本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体のうち特に好ましいものは、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物である。
【００５０】
【化１６】
0003798064.tif 000007
【００５１】
［式（ＩＩ）中、ｋ及びｐは各々１〜１２の整数を表す。Ｌ1、Ｌ2、ｑ、ｒ及びｓは各々式（Ｌ）におけるのと同義である。Ａ及びＢは、各々式（Ｉ）及び式（Ｚ）におけるのと同義である。Ｒ1及びＲ2は、式（Ｗ）におけるのと同義である。］
【００５２】
具体的には、下記式で表される化合物が挙げられる。
【００５３】
【化１７】
0003798064.tif 000008
【００５４】
（２）本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体の製造方法
本発明の上記一般式（Ｉ）で表されるジゴキシゲニン誘導体の製造は、上記一般式（ＩＩＩ）で表されるカルボジイミド化合物と、上記一般式（ＩＶ）で表されるハロゲン含有ジゴキシゲニン誘導体とを反応させる工程を含む方法により行われる。すなわち、一般式（ＩＩＩ）で表されるカルボジイミド化合物は、末端に置換されていてもよいアミノ基（Ｗ’）を有するものであり、一般式（ＩＶ）で表されるジゴキシゲニン誘導体の末端ハロゲン原子（Ｘ）と反応して結合する。
【００５５】
一般式（ＩＩＩ）中のＢ、Ｙ1及びＹ2並びに一般式（ＩＶ）中のＺは、上記一般式（Ｉ）におけるのと同義であり、一般式（ＩＩＩ）で表されるカルボジイミド化合物及び一般式（ＩＶ）で表されるハロゲン含有ジゴキシゲニン誘導体は、各々所望するカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体の構造に応じて適宜選択することができる。
【００５６】
一般式（ＩＩＩ）で表されるカルボジイミド化合物の具体例としては、Ｎ−３，３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−３−（４−モルホリノ）プロピルカルボジイミド、１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、ビス−（３，３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等が挙げられる。これらのカルボジイミド化合物は、下記反応式で示すように、先ず、アミノ基含有イソチオシアネート化合物（反応式中、ａ）をアミン化合物（ｂ）と反応させてチオ尿素化合物（ｃ）を合成した後、得られたチオ尿素化合物について、酸化水銀、酸化鉛等を触媒として常法に従い脱硫反応を行うことにより得られる。
【００５７】
【化１８】
0003798064.tif 000009
【００５８】
ここで用いるアミノ基含有イソチオシアネート化合物及びアミン化合物は、所望するカルボジイミド化合物の構造に応じて適宜選択することができる。例えば、アミノ基含有イソチオシアネート化合物としては、３，３−ジメチルアミノプロピルイソチオシアネート、３−（４−モルホリノ）プロピルイソチオシアネート等が挙げられる。また、アミン化合物としては、４−（３−アミノプロピル）モルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミン等が挙げられる。
【００５９】
次に、一般式（ＩＶ）で表されるハロゲン含有ジゴキシゲニン誘導体としては、下記式（化２０）で表されるジゴキシゲニンの臭素体もしくは同ヨウ素体、塩化物等が挙げられる。
【００６０】
【化１９】
0003798064.tif 000010
【００６１】
これらのハロゲン含有ジゴキシゲニン誘導体は、下記式（化２１）で表されるジゴキシゲニンコハク酸イミドエステル誘導体、ｐ−ニトロフェノールエステル誘導体等のジゴキシゲニンのエステル誘導体を、常法に従い２−ブロモエチルアミン、２−イオドエチルアミン、２−クロロエチルアミン等のハロゲン化試薬と反応させることにより得ることができる。この場合、ジゴキシゲニンのエステル誘導体を予め、ほう酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液を含む混合溶媒に溶解させて反応に供するのが好ましい。
【００６２】
【化２０】
0003798064.tif 000011
【００６３】
これらの個々の反応工程は、例えば通常用いられるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、ベンゼン、エーテル、ジクロロメタン等の溶媒を用いて、公知の方法により行われる。
【００６４】
本発明においては、このようにして得られる前記一般式（ＩＩＩ）で表されるカルボジイミド化合物と前記一般式（ＩＶ）で表されるハロゲン含有ジゴキシゲニン誘導体とを、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の通常用いられる溶媒を用いて反応させることにより、例えば下記反応式で表されるような反応工程を経てカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体が得られる。
【００６５】
【化２１】
0003798064.tif 000012
【００６６】
更に、得られるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体の一般式（Ｉ）におけるＢ−部分が３級アミノ基の場合は、更にジメチルホルムアミド等の溶媒中でｐ−トルエンスルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル等と反応させて前記Ｂ−部分を４級アンモニウム化することにより、水溶性の向上したカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体が得られる。
【００６７】
このようにして得られる本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体は、核酸検出法やイムノアッセイにおいて標識物質として好適に使用することができる。その場合は、標識しようとするＤＮＡ等の核酸又は抗原もしくは抗体等のタンパク質とともに、本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を、溶媒中で混合させる等の方法で接触させることにより、前記核酸又はタンパク質に結合させることができる。すなわち、本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を、核酸塩基と高い反応性を示すカルボジイミド基において核酸又はタンパク質と結合させることにより、高感度な検出試薬であるジゴキシゲニンをこれらに付加し、標識とすることができるのである。よって、カルボジイミド基が反応しやすい条件下、例えばｐＨ７．５〜８．５程度のアルカリ性の条件下で接触させるのが好ましい。
【００６８】
（３）本発明の核酸検出法
本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体は、標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法において、標識物質として用いることができる。すなわち、カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体で標識された核酸は、ハイブリダイゼーション用のプローブとして用いることができる。測定対象である核酸にプローブをハイブリダイズさせて、核酸−核酸ハイブリッドを形成させ、系から遊離のプローブを除去した後にハイブリッドに含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の核酸を検出することができる。本発明においては、標識物質であるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体は、酵素を結合させた抗ジゴキシゲニン抗体を用いて検知することができる。測定対象である核酸は、通常、ナイロンメンブレン、ニトロセルロース等の膜に固定化されて用いられる。
【００６９】
本発明の核酸の検出法におけるハイブリダイゼーションは、核酸プローブの標識にカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を用いる以外は、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション等の、通常の核酸のハイブリダイゼーションと特に変わるところはない。測定対象である核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、プローブに用いる核酸もまたＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００７０】
プローブに用いる核酸の標識は、上記の方法によってポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを標識することによって行うことが好ましいが、標識されたヌクレオチドをポリメラーゼ反応によってポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに取り込ませることによって行うこともできる。
【００７１】
（４）本発明のイムノアッセイ
本発明の前記カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体は、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイにおいて、前記標識物質として用いることができる。
【００７２】
測定対象が抗原であるときは、その抗原に特異的に結合する抗体を標識し、抗原−抗体複合体を形成させ、系から遊離の抗体を除去した後に複合体に含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の抗原を検出することができる。本発明においては、標識物質であるカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体は、酵素を結合させた抗ジゴキシゲニン抗体を用いて検知することができる。また、抗原に特異的に結合する第１の抗体を固相化しておき、これに抗原を結合させ、抗原に特異的に結合する第２の抗体を標識したものを結合させてもよい。この場合、第１の抗体と第２の抗体は、同一のポリクローナル抗体を用いてもよく、異なるモノクローナル抗体を用いてもよい。さらに、一方をポリクローナル抗体とし、他方をモノクローナル抗体としてもよい。各々の方法において、標識した抗体の代わりに未標識の抗体を用い、これを抗原に結合させた後に、前記抗体に結合する二次抗体を標識したものをさらに結合させてもよい。二次抗体は、抗体の調製に用いた動物のイムノグロブリンで前記動物と異なる動物を免疫することによって得られる。
【００７３】
測定対象が抗体であるときは、その抗体に特異的に結合する抗原を標識し、抗原−抗体複合体を形成させ、系から遊離の抗原を除去した後に複合体に含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の抗体を検出することができる。また、測定対象である抗体に特異的に結合する抗体が得られる場合には、その抗体を標識したものを用い、抗体−抗体複合体を形成させてもよい。
【００７４】
本発明のイムノアッセイ法は、抗原又は抗体の標識にカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を用いる以外は、通常のイムノアッセイ法と特に変わるところはなく、抗原又は抗体の固相化、抗原抗体反応、洗浄操作等は、通常行われているのと同様にして行えばよい。また、イムノアッセイの態様も、直接法、間接法、競合法等、いずれの態様も適用され得る。
【００７５】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を説明する。
【００７６】
【製造例】
本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体の製造方法の一例を、反応式とともに以下に示す。
【００７７】
（１）チオ尿素化合物の合成（反応式（１））
３−ジメチルアミノプロピルイソチオシアネート１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、乾燥塩化メチレン１５ｍｌに溶解し、氷浴で冷却した。これに４−（３−アミノプロピル）モルホリン１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に水を加えた後、塩化メチレンで抽出し（５ｍｌ×３回）、無水炭酸カリウムで乾燥した後、濃縮してＮ−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−３−（４−モルホリノ）プロピルチオ尿素（下記反応式（１）中、化合物−１）２．７ｇを得た（収率９８％）。
【００７８】
【化２２】
0003798064.tif 000013
【００７９】
（２）カルボジイミド化合物の合成（反応式（２））
Ｎ−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−３−（４−モルホリノ）プロピルチオ尿素（化合物−１）２．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）をアセトン３５ｍｌに溶解し、酸化水銀４．２ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加えて、還流下、２時間撹拌した。放冷後、反応混合物をろ過し、溶媒を留去して粗生成物を得た。減圧蒸留により、Ｎ−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−３−（４−モルホリノ）プロピルカルボジイミド（化合物−２）１．５ｇを得た（収率６０％）。このものの沸点（ｂ．ｐ．）は１２５〜１２８℃／０．２ｍｍＨｇであった。
【００８０】
【化２３】
0003798064.tif 000014
【００８１】
（３）ジゴキシゲニンの臭素体の合成（反応式（３））
ジゴキシゲニンコハク酸イミドエステル誘導体２０ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．５ｍｌと１Ｎほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）０．５ｍｌの混合液に溶解した。この溶液に２−ブロモエチルアミン臭化水素塩６ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１８時間穏やかに室温で振盪しながら反応させた。反応液をクロロホルム（１ｍｌ）で３回抽出し、飽和食塩水で１回洗浄した後、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。その後、溶媒を留去して、固体の反応混合物２１ｍｇを得た。この反応混合物をシリカゲルカラム上で精製し、ジゴキシゲニンの臭素体（化合物−３）１０ｍｇを得た。
【００８２】
【化２４】
0003798064.tif 000015
【００８３】
（４）カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体の合成（反応式（４））
ジゴキシゲニンの臭素体（化合物−３）１０ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３ｍｌ中に溶解し、これにＮ−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−３−（４−モルホリノ）プロピルカルボジイミド（化合物−２）１０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド２ｍｌ溶液を加え、１８時間室温で撹拌した。反応溶媒を減圧留去し、残った反応混合物を少量のジメチルホルムアミドに溶解させ、これをジメチルエーテル中に滴下した。析出した白色結晶を濾別後、乾燥させ、カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体（化合物−４）１０ｍｇを得た。
【００８４】
【化２５】
0003798064.tif 000016
【００８５】
（５）カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体の４級アンモニウム化（反応式（５））
カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体（化合物−４）１０ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３ｍｌに溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）１０ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド２ｍｌ溶液を加え、１８時間室温で撹拌した。反応溶媒を減圧留去し、残った反応混合物を少量のジメチルホルムアミドに溶解させ、これをジメチルエーテル中に滴下した。析出した白色結晶を濾別後、乾燥させ、４級アンモニウム基を有するカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体（化合物−５）５ｍｇを得た。
【００８６】
【化２６】
0003798064.tif 000017
【００８７】
【実施例１】
（１）ＤＮＡのジゴキシゲニン標識
ＤＮＡをジゴキシゲニン標識するために、反応溶液［ファージＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８複製型：宝酒造株式会社）１μｇ；０．１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８，５）；０．２５％ＳＤＳ；０．１Ｍのカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体（化合物−５）］を８５℃で１分間インキュベートした。次に、未反応のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を除去するために、試料の１／９倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で４５分間静置した。遠心機（国産社製、Ｈ−１５００ＦＲ）により、４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心して上層を除去し、７０％エタノール５００μｌを加えて更に４℃、１２０００ｒｐｍで１分３０秒間遠心した。上層を除去した後、１００μｌの滅菌水に沈殿を溶解し、−２０℃で保存した。このようにして得られたジゴキシゲニン標識ＤＮＡを用いてドットブロット検出を以下に述べるようにして行った。
【００８８】
（２）ＤＮＡの固定化
ジゴキシゲニン標識ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ濃度をＵＶ測定器（UV-VISIBLE RECORDING SPECTROPHOTOMETER UV-2100）（島津製作所）によって調べた。次に、このジゴキシゲニン標識ＤＮＡの種々の濃度の希釈液（１０ｐｇ／μｌ、１ｐｇ／μｌ、１００ｆｇ／μｌ、１０ｆｇ／μｌ、１ｆｇ／μｌ）を作成し、ナイロンメンブレン（Hybond N+）（アマシャム社製）に各１μｌをドットブロットした。メンブレンを乾燥させた後、UV stratalinkerTM(STRATAGENE)でオートクロスリンク（ＤＮＡ固定用プログラム）を行い、ＤＮＡをメンブレン上に固定した。
【００８９】
（３）化学発色
メンブレンをバッファーＡ溶液［０．２Ｍ ＮａＣｌ；０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００］に１分間浸した。次に、プラスチック袋（商品名ハイブリバッグ：ＢＲＬ社（Bethesda Research Laboratories）製）に前記メンブレンを入れ、バッファーＢ溶液［３％ＢＳＡ＋バッファーＡ溶液］を、メンブレン１００ｃｍ2当たり５ｍｌの割合で添加し、室温で３０分間静置した。
【００９０】
次いで、前記メンブレンを新しいハイブリバッグに移し、バッファーＡ溶液１ｍｌに対して抗ジゴキシゲニン抗体−アルカリホスファターゼ複合体（Anti DIG alkaline phosphatase conjugate：Boehringer Mannheim Biochemica 社製）２．５μｌを加えた溶液を作成し、メンブレン１００ｃｍ2当たり１ｍｌの割合で添加し、室温で２５分間静置した。メンブレンをハイブリバックから取り出し、バッファーＡ溶液１００ｍｌを用いた１０分間のメンブレン洗浄操作を、３回繰り返した後、前記メンブレンをバッファーＣ溶液［０．１Ｍ ＮａＣｌ；０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）；５０ｍＭ ＭｇＣｌ2］５０ｍｌに５分間浸透し、再度ハイブリバッグに移した。
【００９１】
バッファーＣ溶液５ｍｌに対してＮＢＴ（Nitroblue tetrazolium chloride）３２μｌ、Ｘ−phosphate（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate）１６μｌを加えた溶液を作成し、メンブレン１００ｃｍ2当たり５ｍｌの割合で添加し、暗所で１時間発色させた。メンブレンを滅菌水で洗浄し、乾燥して保存した。
【００９２】
この結果、本発明のジゴキシゲニン誘導体を用いて標識したＤＮＡは１ｆｇまで検出することができることがわかった。一方、標識物質としてDIG DNA Labeling and Detection Kit （Boehringer Mannheim Biochemica 社製）を用いてランダムプライマー法で標識したＤＮＡを同様の操作で発色させたところ、１０ｆｇまでしか検出することができなかった。
【００９３】
【実施例２】
本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を標識物質として、以下に示す方法で、メンブレンを用いた抗原抗体反応を用いてタンパク質の検出を行った。
【００９４】
（１）タンパク質へのジゴキシゲニン標識
タンパク質をジゴキシゲニン標識するために、反応溶液［抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）（Anti-RABBIT-IgG(goat)、VECTER LABORATORIES社製）１００μｇ；０．１Ｍ ほう酸緩衝液（ｐＨ９．０）；０．１Ｍのカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体（化合物−５）］を氷上で１０分間静置した。全量の０．３％になるように１０％ＳＤＳを加え、マイクロ遠心チューブ（商品名ウルトラフリーＣ３ＬＧＣ；ミリポア(MILLIPORE)社製）を用いて、５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、未反応のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を取り除いた。さらに、フィルターカップに１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）及び５０ｍＭのＮａＣｌを各５０μｌ加え、５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。同様の操作を再度行い、残渣をエッペンドルフチューブに移し、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）と５０ｍＭのＮａＣｌで０．１Ｍの溶液に調整した後、４℃で保存した。
【００９５】
（２）ＩｇＧのメンブレン上への固定
ウサギＩｇＧ（RABBIT-IgG）をバッファーＡ溶液中で１００ｐｇ〜１ｆｇ／μｌの１０倍希釈系列を作成した。各濃度のＩｇＧ溶液をミリポア社製ＰＶＤＦ（Polyvinylidene fluoride）メンブレン上に各１μｌをドットブロットし、３７℃で１０分間乾燥してメンブレン上にＩｇＧを固定した。次に、ＩｇＧを固定したメンブレンをバッファーＢ溶液に浸漬し、３０分間静置してブロッキングを行った。
【００９６】
（３）抗原抗体反応
メンブレンをバッファーＢ溶液から取り出し、反応溶液に浸し室温で３０分間シェーカーでゆっくり振盪した。用いた反応溶液の組成は以下の通りであった。バッファーＢ溶液１０ｍｌ、４μｇ／μｌジゴキシゲニン標識抗ウサギＩｇＧ１０μｌ。但し、ジゴキシゲニン標識抗ウサギ抗体は、上記（１）項に示した方法で得られたものである。
【００９７】
（４）未反応ジゴキシゲニン標識抗ウサギ抗体の除去
固定した抗体と反応しなかったジゴキシゲニン標識抗ウサギ抗体を、次の方法で除去した。すなわち、反応させたメンブレンをバッファーＡ溶液に浸し５分間室温で振盪する洗浄操作を３回行った。
【００９８】
（５）化学発色
メンブレンをハイブリバッグ（ＢＲＬ社製）に入れ、バッファーＢ溶液をメンブレン１００ｃｍ2当たり５ｍｌの割合で添加し、室温で３０分間静置した。次に、メンブレンを新しいハイブリバッグに移し、バッファーＢ溶液１ｍｌII対してAnti DIG alkaline phosphatase conjugate（Boehringer Mannheim Biochemica 社製）２．５μｌを加えた溶液を作成し、メンブレン１００ｃｍ2当たり１ｍｌの割合で添加し、室温で２５分間静置した。メンブレンをハイブリバックから取り出し、バッファーＡ溶液１００ｍｌを用いた１０分間のメンブレン洗浄操作を３回繰り返した。メンブレンをバッファーＣ溶液５０ｍｌに５分間浸透し、再度ハイブリバッグに移した。バッファーＣ溶液５ｍｌに対してＮＢＴ３２μｌ、Ｘ−phosphate（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate）１６μｌを加えた溶液を作成し、メンブレン１００ｃｍ2当たり５ｍｌの割合で添加し、暗所で１時間発色させた。メンブレンを滅菌水で洗浄し、乾燥して保存した。
【００９９】
この結果、本発明のジゴキシゲニン誘導体を用いて標識したタンパク質は１ｐｇまで検出することができることがわかった。一方、標識物質としてジゴキシゲニン−３−ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（Boehringer Mannheim Biochemica 社製）を用いて標識したタンパク質を同様の操作で発色させたところ、１０ｐｇまでしか検出することができなかった。
【０１００】
【発明の効果】
本発明のカルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体を用いれば、簡便な標識操作で高感度な核酸検出及びイムノアッセイを行うことができる。