(57)【要約】動物へ免疫するＤＮＡとして、従来のＥＬＩ法において用いていたゲノムＤＮＡライブラリーに代えて、全長ｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、病原体に感染した動物の病態または生存に影響を与える遺伝子を効率的にスクリーニングすることが可能となった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体に感染した脊椎動物の病態または生存に影響を与える遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）脊椎動物に全長ｃＤＮＡを投与する工程、
（ｂ）該脊椎動物に対し、病原体を投与する工程、および
（ｃ）該脊椎動物の病原体投与後の病態または生存の変化を測定し、対照と比較して、該脊椎動物の病態または生存を悪化または改善させる全長ｃＤＮＡを選択する工程、を含む方法。
【請求項２】
全長ｃＤＮＡが病原体に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
病原体がマラリア原虫である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の方法により単離される、病原体に感染した脊椎動物の病態または生存に影響を与える遺伝子。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、病原体に感染した動物の病態または生存に影響を与える遺伝子のスクリーニング方法に関し、主として医薬品開発の分野に属する。
背景技術
これまで病原体に感染した動物の病態または生存に影響を与える遺伝子をスクリーニングするための方法として、ＥＬＩ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）法が報告されている（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ａ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３７７，６３２−６３５，１９９５）。この方法によれば、ゲノムライブラリーを発現ベクターに組み込み、マウスに免疫後、チャレンジ感染を行い、病態または生存への影響を観察することで、有効なクローンの同定が可能であるとされている。
しかしながら、この方法において、目的遺伝子のスクリーニングの対象として用いるゲノムＤＮＡライブラリーは、必ずしも遺伝子部分を正しいフレームで含むとは限らないため、生体内での発現効率が低く、このことがＥＬＩ法における目的遺伝子のスクリーニングの効率を低下させる大きな要因となっていた。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、病原体に感染した動物の病態または生存に影響を与える遺伝子を、従来のＥＬＩ法よりも効率的にスクリーニングするための新たな方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、動物へ免疫するＤＮＡとして、従来のＥＬＩ法において用いていたゲノムＤＮＡライブラリーに代えて、全長ｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、目的の遺伝子を効率的にスクリーニングしうると考えた。即ち、本発明者らは、ゲノムＤＮＡライブラリーが、必ずしも遺伝子部分を正しいフレームで含むとは限らないのに対し、全長ｃＤＮＡライブラリーは、発現遺伝子に対応するｍＲＮＡから作成され、タンパク質をコードする遺伝子の全長を含む点で、生体内における遺伝子発現において、優位性を有すると考えた。
そこで、本発明者らは、かかる着想に基づき、全長ｃＤＮＡライブラリーを利用して、病原性真核生物に感染した生物の病態および生存に影響を与える遺伝子のスクリーニングを試みた。具体的には、致死性のネズミマラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉＡＮＫＡ株から全長ｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからランダムに選択した２０００クローンをマウスに免疫した。次いで、該マウスに原虫を感染させ、その感染率および感染後のマウスの病態および生存期間を解析した。その結果、全長ｃＤＮＡライブラリー投与群と対照群では原虫感染率に有意差は見とめられなかったが、感染後のマウスの生存期間は、全長ｃＤＮＡライブラリー投与群で有意に短縮することを見出した。この事実は、全長ｃＤＮＡライブラリー投与群では、全身の立毛、ふるえ、けいれんが観察されたことと一致した。以上の結果は、マウスに投与した全長ｃＤＮＡライブラリー中に、病原体感染したマウスに対し、悪影響を与える遺伝子が含まれていることを示すものである。
即ち、本発明者らは、全長ｃＤＮＡライブラリーを免疫源としたＥＬＩ法を開発すると供に、該方法を利用して、病原体感染後の動物の病態または生存に影響を与える遺伝子のスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、より詳しくは、
（１）　病原体に感染した脊椎動物の病態または生存に影響を与える遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）脊椎動物に全長ｃＤＮＡを投与する工程、
（ｂ）該脊椎動物に対し、病原体を投与する工程、および
（ｃ）該脊椎動物の病原体投与後の病態または生存の変化を測定し、対照と比較して、該脊椎動物の病態または生存を悪化または改善させる全長ｃＤＮＡを選択する工程、を含む方法、
（２）　全長ｃＤＮＡが病原体に由来する、（１）に記載の方法、
（３）　病原体がマラリア原虫である、（１）または（２）に記載の方法、および
（４）　（１）から（３）のいずれかに記載の方法により単離される、病原体に感染した脊椎動物の病態または生存に影響を与える遺伝子、を提供するものである。
本発明は、病原体に感染した脊椎動物の病態または生存に影響を与える遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法においては、まず、脊椎動物に全長ｃＤＮＡを投与する（工程（ａ））。
本発明の方法において、脊椎動物に投与する全長ｃＤＮＡとしては特に制限はない。病原体に感染した脊椎動物の病態または生存に影響を与えることが期待される所望の全長ｃＤＮＡを用いることができる。病原体に対するＤＮＡワクチンをスクリーニングする目的の場合には、全長ｃＤＮＡとしては病原体由来のものを用いることが好ましい。脊椎動物には、複数種の全長ｃＤＮＡ（全長ｃＤＮＡライブラリー）を投与しても良く、また、一種の全長ｃＤＮＡを投与してもよい。
本工程において用いる全長ｃＤＮＡは、文献（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．Ｇｅｎｅ　１３８，１７１−１７４，１９９４．、Ｙｕｔａｋａ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　２００，１４９−１５６，１９９７．）に記載の方法を参考に各種生物から調製することができる。真核生物のメッセンジャーＲＮＡの５’端にはキャップ構造と呼ばれる特有の構造が存在するが、上記文献記載の方法は、このキャップ構造を特異的に認識するタバコ酸性ピロフォスファターゼを利用して、キャップ構造を合成オリゴＲＮＡに置換し、その後、適当なプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製するものである。具体的には、生物から抽出精製したメッセンジャーＲＮＡをバクテリア由来のアルカリフォスファターゼで前処理し、キャップ構造を有しない、メッセンジャーＲＮＡの５’端のリン酸を除去する。次いで、リン酸が除去されたＲＮＡ分子をタバコ酸性ピロフォスファターゼで処理し、キャップ構造中のリン酸結合を切断する。その結果、ＲＮＡ分子の５’端に一分子のリン酸が残る。このＲＮＡ分子の５’端に、合成オリゴＲＮＡ分子をＲＮＡリガーゼの作用で結合させる。これにより、キャップ構造を有する全長メッセンジャーＲＮＡの５’端に選択的に合成オリゴＲＮＡ分子が結合される。次ぎに、得られたＲＮＡ分子を鋳型とし、ポリＴプライマーとＲＮａｓｅ　Ｈ　ｆｒｅｅの逆転写酵素を利用してｃＤＮＡを合成し、これにより全長ｃＤＮＡを得ることができる。
本発明における全長ｃＤＮＡの投与の対象としては、哺乳類、鳥類を含む非ヒト脊椎動物を用いることができる。好ましくは哺乳類である。安価、かつ、多数の飼育が容易で、多数固体を用いた実験が行いやすいという観点からは、哺乳類の中でも、特に、マウスなどのげっ歯類が好適である。ヒトへの応用という観点からは、サルなどの霊長類が好適である。
全長ｃＤＮＡは、その発現を生体内で保証するベクターに組み込み、例えば、脾臓内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、胸腔内接種、脳内接種、電子銃による接種、経口接種、経鼻接種、経気道吸入などの手法で動物へ投与することができる。投与量は、十分な効果を上げうる量であって、かつ毒性および副作用を生じない量である。投与量は、当業者であれば、適宜選択することが可能である。一般的には、１回当り０．１μｇから１００μｇであり、必要に応じて複数回投与を行なう。
本発明の方法においては、次いで、全長ｃＤＮＡが投与された脊椎動物に対し、病原体を投与する（工程（ｂ））。
動物に投与する病原体としては、投与する動物に対して病原性を示すものであれば特に制限はない。このような病原体には、病原性原虫、病原性真菌、および病原性真核微生物が含まれる。病原体の動物への投与は、例えば、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、媒介昆虫による接種、経鼻投与、吸入感染などにより行なうことができる。病原体は、動物に対し病原性を示すのに必要な量の投与を行なう。このような投与量は当業者であれば適宜選択することができる。
本発明の方法においては、次いで、病原体投与後の脊椎動物の病態または生存の変化を測定し、対照と比較して、該脊椎動物の病態または生存を悪化または改善させる全長ｃＤＮＡを選択する（工程（ｃ））。
ここで「病態の変化」とは、病原の感染により動物に引き起こされる各種症状の変化を指す。病態は、動物に感染する病原により異なり得るが、例えば、体重減少、貧血、精神症状などが挙げられる。「生存の変化」とは、病原体を感染させた動物の生存期間または生存率の変化を指す。
本工程においては、全長ｃＤＮＡの病態または生存に与える影響を判定するために、対照として、全長ｃＤＮＡのインサートを含まない空のベクターなどを用いることができる。本工程における病態または生存の変化の測定の結果、対照群と比較して、全長ｃＤＮＡ投与群において、脊椎動物の病態または生存が悪化すれば、当該全長ｃＤＮＡは、病原体に感染した脊椎動物の病態または生存に悪影響を与えるポリペプチドをコードしていると判定され、一方、対照群と比較して、全長ｃＤＮＡ投与群において、脊椎動物の病態または生存が改善すれば、当該全長ｃＤＮＡは、病原体に感染した脊椎動物の病態または生存に好影響を与えるポリペプチドをコードしていると判定される。
本発明の方法により同定される宿主動物に悪影響を与える遺伝子は、疾病の病原性と密接に関連していると考えられる。このため、このような遺伝子は、病原体の宿主動物に対する病原性の解明の理解に重要であるだけでなく、病原性を軽減する目的の研究、例えば、同定した遺伝子やそれがコードするタンパク質を標的とした医薬品の開発においても重要である。一方、本発明の方法により同定される宿主動物に好影響を与える遺伝子は、病原体感染予防のためのＤＮＡワクチンとしての利用のほか、例えば、病原体感染時の遺伝子治療にも有用であると考えられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　全長ｃＤＮＡライブラリーの作成
ネズミマラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ　ＡＮＫＡ株を、Ｗｉｓｔａｒラットに接種、ラット体内で原虫を増殖させた。ラットを麻酔後、ＥＤＴＡ入りの注射筒に心臓採血で回収した。全血を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｐｕｒ　ｆｉｌｔｅｒを濾過し白血球を除去、遠心で回収した。感染赤血球に２０倍容積のＴｒｉｚｏｌ　ＬＳを加え、ピペッティングで原虫を破砕した。次いで、Ｔｒｉｚｏｌ　ＬＳのプロトコルに従って全ＲＮＡを回収し、さらに全ＲＮＡからｏｌｉｇｏ−ｔｅｘカラムを用いてｐｏｌｙ−Ａ　ＲＮＡを精製した。文献（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．Ｇｅｎｅ　１３８，１７１−１７４，１９９４．、Ｙｕｔａｋａ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　２００，１４９−１５６，１９９７．）に記載の方法により、ｐｏｌｙ−Ａ　ＲＮＡから全長ｃＤＮＡを調製した。これにより調製されたｃＤＮＡをｐＣＥ−ＦＬベクターに組み込んだ。なお、ｐＣＥ−ＦＬベクターは、ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）から、作成されたもので、ＥＦ３２１プロモーターとＣＭＶ−ＩＥエンハンサーをインサートの上流に有するものである。
［実施例２］　原虫感染させたマウスにおける全長ｃＤＮＡライブラリーの免疫の影響
このようにして作成されたライブラリーから２０００クローンをランダムに選び、これらを大腸菌内で増殖させ、キアゲンのＥｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｆｒｅｅ（ＱＩＡＧＥＮ　プラスミド精製キット）を用いて大腸菌からプラスミドＤＮＡを精製した。同様にして５群のサブライブラリーを調製した。対照としては、インサートを有さない空ベクターを同様に調製したものを免疫に用いた。これらのＤＮＡの５０μｇを、５０μｌの生理食塩水に溶解し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓内部に直接注射した。具体的には、麻酔下で側腹部に小切開を加え、脾臓を取り出し、目視下に注射し、脾臓を腹腔内に戻した後、縫合した。１週間後、筋肉内に同量のＤＮＡを注射し、その１週間後に同様に注射を繰り返した。３回目の免疫の後、１週間後に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ　ＡＮＫＡ株感染赤血球５万個を腹腔内に接種した。その後、毎日、感染マウスを観察し、体重を測定した。また、２日ごとに、すべてのマウスから尾採血し、血液とまつ標本を作製し、ギムザ染色し、原虫感染率を測定した。
その結果、ネズミマラリア原虫から作成した全長ｃＤＮＡライブラリーを投与した群では、対照に比較して生存期間が短縮していた（図１）。カプランマイヤー法を用い、全長ｃＤＮＡライブラリー投与群５群をまとめて、対照群と比較すると、Ｐ値は、０．０５３であった。両群の間で、体重の変化や、原虫感染率には、有為な差は認められなかった（図２）。
また、免疫に使用した発現ベクターライブラリーの一部をシークエンスしたところ、マラリア原虫の遺伝子、宿主であるラットの遺伝子、および、マラリア原虫とラットの遺伝子のキメラが含まれていた。これらのいずれか、あるいは、複数が競合して生存期間に影響を及ぼした可能性が示唆された。
産業上の利用の可能性
本発明により、病原体に感染した動物の病態または生存に影響を与える遺伝子を効率的にスクリーニングすることが可能となった。本発明の方法は、病原体の宿主動物に対する病原性の解明の他、病原体に対する治療薬や予防薬の開発において大きく貢献しうるものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、全長ｃＤＮＡライブラリーを投与したマウスにおける、原虫感染後の生存率を経時的に観察した結果を示す図である。
図２は、全長ｃＤＮＡライブラリーを投与したマウスにおける、原虫感染率を経時的に観察した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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