(57)【要約】悪性腫瘍、特にメラノーマの治療において、高い治療効果を得るために副作用の低い治療法、または従来の薬剤の投与量でさらに高い治療効果が得られるような、新たな治療法の確立が求められている。本発明の目的は、ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体またはその抗体断片と、少なくとも１種類の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせることにより、ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体あるいはその抗体断片、または免疫担当細胞を活性化させる物質あるいは抗腫瘍活性を有する物質のいずれかの単独投与よりも高い治療効果をあたえる医薬を提供することにある。また、該医薬は、単独の投与では課題であった副作用を軽減することが期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体あるいは該抗体断片と、少なくとも１種類の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる医薬。
【請求項２】
ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体あるいは該抗体断片と、少なくとも１種類の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる抗腫瘍剤。
【請求項３】
腫瘍がメラノーマである請求項２記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体がガングリオシドＧＤ３に対するヒト化抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体である請求項４記載の薬剤。
【請求項６】
ヒト化抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５、軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体である、請求項５記載の薬剤。
【請求項７】
ヒト型キメラ抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号４９、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号５０で表されたアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体である、請求項５記載の薬剤。
【請求項８】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号９、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号１０で表されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体である、請求項５記載の薬剤。
【請求項９】
免疫担当細胞を活性化させる物質が、サイトカインである請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１０】
サイトカインが、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦから選ばれるサイトカインである請求項９記載の薬剤。
【請求項１１】
抗腫瘍活性を有する物質が、ホルモン療法剤または化学療法剤である請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１２】
ホルモン療法剤または化学療法剤が、ダカルバジン、シスプラチン、フォートムスチン、カルムスチン、ニムスチン、ロムスチン、セムスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンデシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カルボプラチン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェンから選ばれる薬剤である請求項１１記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体あるいは該抗体断片と、少なくとも１種類の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる医薬に関する。
背景技術
シアル酸を含有する糖脂質の一種であるガングリオシドは、動物の細胞膜を構成している。また、ガングリオシドは、親水性側鎖である糖鎖、疎水性側鎖であるスフィンゴシン及び脂肪酸から構成されている。ガングリオシドの種類と発現量は、細胞種、臓器種、動物種等によって異なることが知られている。更に細胞が癌化する過程においては、ガングリオシドの発現が量的及び質的に変化を起こすことも知られている［キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），４５，２４０５（１９８５）］。
特にＧＤ３は、正常細胞ではごく微量にしか存在しないが、癌、特にメラノーマで高発現し、またザルコーマ、グリオーマ、ニューロブラストーマ等の癌細胞でもガングリオシドＧＤ２と共に多量に存在することが知られている［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７７，６１１４（１９８０）；ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１５５，１１３３（１９８２）；キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．），４５，４４０１（１９８５）、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ），７０，６３３（１９９２）、アクタ・ニューロパソロジカ（Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ），８２，４５（１９９１）］。したがって、ＧＤ３に対する抗体（以下、抗ＧＤ３抗体と表記する）は、これらの癌の治療に有用であると考えられている［メラノーマ・リサーチ（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），７，Ｓ１５５（１９９７）］。
抗ＧＤ３マウスモノクローナル抗体であるＲ２４（以下、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４と表記する）ではメラノーマ患者に対する投与試験がすでに行われており、一部の患者で臨床効果は認められたものの、患者体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：以下、ＨＡＭＡと表記する）が誘導され、抗体の血中からの消失が極めて速く、期待された程の効果には至らなかった［メラノーマ・リサーチ（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），７，Ｓ１５５（１９９７）］。
マウス抗体をヒトに投与した際のＨＡＭＡの出現など、抗原性に由来する薬効の低下を防ぐために、ヒト以外の動物由来の可変領域とヒト由来の定常領域とを結合させたヒト型キメラ抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８１，６８５１（１９８４）］や、可変領域の中でもさらに、抗原との結合に直接関与する超可変領域以外のフレームワーク領域を全てヒト由来の配列に変えたヒト型ＣＤＲ移植抗体［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２１，５２２（１９８６）］等、ヒトに対する抗原性を減弱するためのヒト化抗体の製造方法がこれまでに知られている。メラノーマに対する抗体としては、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１（特開平５−３０４９８９）、抗ＧＤ２ヒト型キメラ抗体ｃｈ１４．１８［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）．，１４４，１３８２（１９９０）］が知られている。ｃｈ１４．１８は既に臨床試験で用いられており、良好な血中滞留性が観察されている［ヒューマン・アンティボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＆  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１９（１９９２）］。
また、ヒト化抗体の生体内投与により、定常領域を介した細胞障害活性の上昇が見られるので、癌に対する抗体等に関しては特に薬効面で有利であると考えられる。抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１は、ヒト末梢血単核球をエフェクターとして用いた抗体依存性細胞障害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＡＤＣＣ活性と表記する）や、ヒト血清を補体源とした補体依存性細胞障害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＣＤＣ活性と表記する）が、元のマウス由来の抗体と比較して上昇しており［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］、ＧＤ３陽性のメラノーマの治療に有用であると考えられる。
通常の化学療法では、薬剤耐性腫瘍細胞の出現などにより寛解を導入することが難しい場合にも、抗体との併用療法で優れた治療成績が得られる場合がある。乳癌に対する抗ＨＥＲ２／ｎｅｕヒト化抗体ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ／ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）はｔａｘａｎｅ系抗癌剤との併用で［クリニカル・セラピューティクス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ），２１，３０９（１９９９）］、Ｂ細胞リンパ腫に対する抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘａｎ、ロシュ社）は多剤療法との併用で［ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），１７，２６８（１９９９）］、それぞれ顕著な治療成績が得られている。
メラノーマ治療における、抗体と抗腫瘍活性を有する物質との併用に関しては、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とドキソルビシンとの併用により、補体非感受性のメラノーマ細胞株に対する抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４のＣＤＣ感受性が上昇することが知られている［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８３，９１４４（１９８６）］。しかしながら、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とダカルバジン、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とシスプラチンまたは抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とドキソルビシンとの併用投与の第一相臨床試験では、顕著な薬効は観察されなかった［Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．，７，Ｓｕｐｐｌ２，Ｓ１５５（１９９７）］。
抗体とサイトカインとの併用療法も新たな免疫療法として期待されている。サイトカインは免疫反応における細胞間相互作用を司る種々の液性因子の総称である。細胞障害活性の一つであるＡＤＣＣ活性は、単核球、マクロファージ、ＮＫ細胞など、Ｆｃ受容体を細胞表面に有するエフェクター細胞により引き起こされるが［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，１９９２（１９８７）］、種々のサイトカインはこれらのエフェクター細胞を活性化することから、抗体のＡＤＣＣ活性等を高める目的で、抗体と組み合わせて投与することが試みられている。
抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４に関しては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価でＩＬ−２との併用効果の可能性が示唆されている（米国特許第５１０４６５２号）。また、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とＩＬ−２、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とＩＦＮα、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とＭ−ＣＳＦ、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とＧＭ−ＣＳＦ等の併用投与の臨床試験が行われた［メディカル・オンコロジー（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ），１５，１９１（１９９８），クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），３，１７（１９９７），Ｃａｎｃｅｒ，７５，２２５１（１９９５），ジャーナル・オブ・イムノセラピー・ウィズ・エンファシズ・オン・テューモア・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｏｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），１６，１３２（１９９４）］。しかしながらこれらの併用療法は、マウス抗体の抗原性またはサイトカインの副作用などから、期待された程の効果は認められていない。前臨床段階において、ヒトメラノーマ治療への外挿性の高い腫瘍モデル動物を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ評価により、臨床で用いた場合の治療効果を予測することは重要である。しかしながら、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とサイトカインの動物腫瘍モデルへの併用投与における抗腫瘍効果の検討については、抗ＧＤ３マウス抗体Ｒ２４とＭ−ＣＳＦとの併用しか知られていない［Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｏｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９，３１７（１９９６）］。
メラノーマは色素細胞系の悪性腫瘍であり、転移を生じ易く、化学療法などにも抵抗性が高く、悪性度の高い腫瘍として知られている。これまでにＩＬ−２やインターフェロンによる免疫療法、ダカルバジンとシスプラチンを中心とした化学療法、またははこれらの併用療法等が行われてきた。
免疫療法の例としては、ＩＬ−２とＩＦＮαとの組み合わせ［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，７，１８６３（１９８９）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１１，１９６９（１９９３）、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），１３，１１７（１９９３）］が知られている。
化学療法の例としては、ダカルバジン・シスプラチン・カルムスチン・タモキシフェンの組み合わせや［キャンサー・トリートメント・リポート（Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．），６８，１４０３（１９８４）、Ｃａｎｃｅｒ，６３，１２９２（１９８９）］、ダカルバジン・シスプラチン・ビンブラスチンの組み合わせ［プロシーディングス・オブ・アメリカン・ソサエティー・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｐｒｏｃ．ＡＳＣＯ），１２，１３２８（１９９３）］、ダカルバジン・フォートムスチン・ビンデシンの組み合わせ［Ｐｒｏｃ．ＡＳＣＯ，３３，１３３６（１９９２）］等が知られている。
免疫療法と化学療法との併用療法の例としては、ダカルバジンとＩＬ−２［ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティチュート（Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．），８２，１３４５（１９９０）］、ダカルバジンとＩＦＮα［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．９，１４０３（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２，８０６（１９９４）］、シスプラチンとＩＬ−２［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．９，１８２１（１９９１）］、シスプラチンとＩＦＮα［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０，１５７４（１９９２）］、シスプラチンとダカルバジンとＩＬ−２とＩＦＮα［Ｐｒｏｃ．ＡＳＣＯ．１０，１０２９（１９９１）］等が知られている。
しかしながら、化学療法は、奏効率に若干の改善は認められるものの、依然として５年以上の生存率に大きな改善は認められていない［ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・キャンサー・ケモセラピー（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ），２７，Ｓ２３８（２０００）］。また、ＩＬ−２［イムノロジー・トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ），９，５８（１９９８）］や化学療法は副作用が強いために患者に高用量を投与することができない。
発明の開示
悪性腫瘍、特にメラノーマの治療において、高い治療効果を得るために副作用の低い治療法、または従来の薬剤の投与量でさらに高い治療効果が得られるような、新たな治療法の確立が求められている。本発明の目的は、ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体またはその抗体断片と、少なくとも１種類の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせることにより、ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体あるいはその抗体断片、または免疫担当細胞を活性化させる物質あるいは抗腫瘍活性を有する物質のいずれかの単独投与よりも高い治療効果をあたえる医薬を提供することにある。また、該医薬は、単独の投与では課題であった副作用を軽減することが期待される。
本発明は、以下の（１）〜（１２）に関する。
（１）  ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体あるいは該抗体断片と、少なくとも１種類の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる医薬。
（２）  ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体あるいは該抗体断片と、少なくとも１種類の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる抗腫瘍剤。
（３）  腫瘍がメラノーマである上記（２）記載の抗腫瘍剤。
（４）  ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体がガングリオシドＧＤ３に対するヒト化抗体である上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の薬剤。
（５）  ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体である上記（４）記載の薬剤。
（６）  ヒト化抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５、軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体である、上記（５）記載の薬剤。
（７）  ヒト型キメラ抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号４９、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号５０で表されたアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体である、上記（５）記載の薬剤。
（８）  ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖Ｖ領域が配列番号９、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号１０で表されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体である、上記（５）記載の薬剤。
（９）  免疫担当細胞を活性化させる物質が、サイトカインである上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤。
（１０）  サイトカインが、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦから選ばれるサイトカインである上記（９）記載の薬剤。
（１１）  抗腫瘍活性を有する物質が、ホルモン療法剤または化学療法剤である上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の薬剤。
（１２）  ホルモン療法剤または化学療法剤が、ダカルバジン、シスプラチン、フォートムスチン、カルムスチン、ニムスチン、ロムスチン、セムスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンデシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カルボプラチン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェンから選ばれる薬剤である上記（１１）記載の薬剤。
本発明はガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも１種類の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる医薬に関する。本発明の医薬としては、当該抗体と単独の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質との組み合わせ、当該抗体と複数の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質との組み合わせ、当該抗体と少なくとも１種類以上の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを含む医薬、当該抗体と少なくとも１種類以上の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを生体内に同時に、あるいは別々に投与する医薬のいずれでもよい。
遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体、ヒト抗体等があげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＧＤ３に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体としては、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されたアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、より具体的にはＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４９および配列番号５０で表されたアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体、さらに具体的には、ＶＨのアミノ酸配列が配列番号４９、Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体ＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号５０記載のアミノ酸配列、Ｌ鎖Ｃ領域がヒト抗体κクラスのアミノ酸配列からなるヒト型キメラ抗体があげられる。例えば特開平５−３０４９８９に開示された抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１があげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
本発明の抗ＣＤ３ＣＤＲ移植抗体は、ＧＤ３に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、該ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体としては、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、より具体的にはＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列が、配列番号９および配列番号１０で表されたアミノ酸配列であるヒト型ＣＤＲ移植抗体、さらに具体的には、ＶＨのアミノ酸配列が配列番号９、Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体ＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号１０記載のアミノ酸配列、Ｌ鎖Ｃ領域がヒト抗体κクラスのアミノ酸配列からなるヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられる。例えば、平成１１年７月２２日で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）（現：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９０として寄託されている形質転換細胞クローンＫＭ８８７１が生産する抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８８７１があげられる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体生産トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明に用いられるＦａｂは、ＧＤ３に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明に用いられるＦ（ａｂ’）２は、ＧＤ３に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明に用いられるＦａｂ’は、ＧＤ３に特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ断片をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入することによりＦａｂ’を発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
本発明に用いられるｓｃＦｖは、ＧＤ３に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりｓｃＦｖを発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明に用いられるｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬはハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
本発明に用いられるｄｓＦｖは、ＧＤ３に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明に用いられるＣＤＲを含むペプチドは、ＧＤ３に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、該ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明に用いられる免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質としては、サイトカイン、化学療法剤、ホルモン療法剤などがあげられる。
サイトカインとしては、免疫担当細胞であるＮＫ細胞、マクロファージ、単球、顆粒球など、抗体によるＡＤＣＣ活性を担うエフェクター細胞を活性化するサイトカインであればいかなるものでもよい。ＮＫ細胞を活性化するサイトカインとしてはＩＬ−２、ＩＦＮα、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８等があげられ、好ましくはＩＬ−２があげられる。マクロファージを活性化するサイトカインとしてはＭ−ＣＳＦがあげられる。単球、顆粒球を活性化するサイトカインとしてはＧＭ−ＣＳＦがあげられる。
抗腫瘍活性を有するサイトカインとしては、インターフェロン類、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β等があげられ、好ましくはＩＦＮαがあげられる。
本発明に用いられる化学療法剤およびホルモン療法剤としては、ダカルバジン、シスプラチン、フォートムスチン、カルムスチン、ニムスチン、ロムスチン、セムスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンデシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カルボプラチン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェンなどがあげられる。
本発明の医薬としては、具体的には抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１あるいは抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８７１と、ＩＬ−２、ＩＦＮα、ダカルバジンおよびシスプラチンから選ばれる少なくとも１種類以上の薬剤との組み合わせがあげられる。
上記免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質は、単独で高用量を生体内に投与した場合には副作用が懸念されるが、本発明の医薬は低用量で用いることができるので、副作用を軽減することができる。
本発明の医薬は、メラノーマ、ザルコーマ、グリオーマ、ニューロブラストーマなどの腫瘍に用いることができる。特に、ガングリオシドＧＤ３を高発現している腫瘍に対して用いることが好ましい。
抗腫瘍効果は、動物モデルを用いて調べることができる。
動物モデルとしては、異種移植モデル、同系移植モデルなどがあげられる。異種移植モデルは、ヌードマウス等の免疫不全マウスの皮下、皮内、腹腔内、静脈内等様々な部位にヒト癌組織由来の培養細胞株を移植することにより作製することができる。
同種移植モデルは、正常な免疫系を有する野生型マウスの皮下、皮内、腹腔内、静脈内等様々な部位に培養マウス癌細胞株をを移植することにより作製することができる。
Ｔ細胞活性化能を有するＩＬ−２等のサイトカインとの併用による抗腫瘍効果を調べるには、Ｔ細胞を欠損していない同系移植モデルを用いて評価することが好ましい。
ＧＤ３モノクローナル抗体評価用の同系移植モデルを作製するには、以下の方法に従う。
ＧＤ３の生合成前駆体であるＧＭ３を発現するマウス培養細胞株に、ＧＭ３特異的α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ（ＧＤ３合成酵素）遺伝子を導入することにより、ＧＤ３陽性の形質転換株を作製し［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９１，１０４５５（１９９４）］、該形質転換株を正常な免疫系を有する野生型マウスへ移植することにより、抗ＧＤ３モノクローナル抗体評価用の同系移植モデルを作製することができる。
ＧＤ３モノクローナル抗体評価用の異種移植モデルは、ＧＤ３陽性ヒト悪性骨髄腫細胞株であるＨ−１８７細胞あるいはＧ−３６１などの腫瘍塊より採取した腫瘍片をヌードマウスへ移植することにより作製することができる。
上記動物モデルを用いて抗体の単独投与、免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質の単独投与の効果と、本発明の医薬の効果とを比較することにより、本発明の医薬の抗腫瘍効果を評価することができる。
本発明の医薬は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、蛋白質製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該医薬そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該医薬を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該医薬および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１回当たり抗ＧＤ３抗体として０．１〜２０ｍｇ／ｋｇである。抗体と併用する薬剤は、単独で臨床に用いられる場合の投与量と同用量またはそれより少ない用量である。
以下にガングリオシドＧＤ３に対するヒト化抗体の製造法について説明する。
１．ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプ或いは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８［ハイブリドーマ（ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ），１７，５５９（１９９８）］等があげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用することができる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下の様にして取得することができる。
マウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。
組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９、以下、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアルと表記する］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４、以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと表記する］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法等があげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡクローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９，（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｃ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１、以下、シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレストと表記する］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することによって見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体ＶＨおよびＶＬの３末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下の様にして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項１の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与している。したがって、ヒト抗体のＦＲ移植によりそれらアミノ酸残基が、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化するため、抗原結合活性に影響を及ぼすと考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基などを同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体のアミノ酸残基に置換し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５，（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の置換は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項１の（５）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項１の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的のアミノ酸残基の置換が施されたことを確認する。
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項１の（５）および（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、本項１の（５）および（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項１の（４）および（７）に記載のヒト化抗体発現ベクター、或いはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる［メソッズ・イン・ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．），ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法［メソッズ・イン・ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．），ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３（１９８７）］等があげられる。
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９８８、以下、アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアルと表記する、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６、以下、モノクローナル・アンティボディズ（１９９６）と表記する］等により測定できる。
（９）ヒト化抗体の安定発現
本項１の（４）および（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１、サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６（１９８０）］、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）等があげられる。
高いＡＤＣＣ活性が付与された抗体を発現させる宿主細胞としては、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素蛋白質、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、好ましくはＹＢ２／０細胞などが用いられる。
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する：ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系等を利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル、モノクローナル・アンティボディズ（１９９６）］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル、モノクローナル・アンティボディズ（１９９６）］等で測定することができる。
（１０）ヒト化抗体の活性評価
精製したヒト化抗体の抗原との結合活性、培養癌細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養癌細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定し、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
発明を実施するための最良の形態
実施例１抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１とヒトＩＬ−２の併用投与による抗腫瘍効果の測定
（１）  マウス異種移植モデルを用いたＫＭ８７１とヒトＩＬ−２の併用投与による抗腫瘍効果の測定Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア、雄）の背部皮下にて継代したＧＤ３陽性ヒト悪性黒色腫細胞株Ｈ−１８７の腫瘍塊より作製した２〜３ｍｍ角の腫瘍片を、６週令の雄のヌードマウスの背部皮下に移植針を用いて移植した。移植後１０日目にノギスを用いて腫瘍径を測定し、次式より腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積＝短径×長径×高さ×０．５
腫瘍体積が１００ｍｍ３前後の個体を選抜し、平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後に下記のＡ〜Ｄの投与群を設定した。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＫＭ８７１単独群：移植後１４日目に１匹あたり８００μｇ／２００μＬを単回投与
Ｃ．ＩＬ−２（イムネース注３５、シオノギ製薬株式会社製）単独群：１匹あたり１×１０５ＪＲＵ／４００μＬ／日、１日１回、５日間連続投与（移植後１０〜１４日目）
Ｄ．ＫＭ８７１＋ＩＬ−２併用群：ＩＬ−２は、１匹あたり１×１０５ＪＲＵ／４００μＬ／日、１日１回、５日間連続投与（移植後１０〜１４日目）し、ＫＭ８７１は、移植後１４日目に１匹あたり８００μｇ／２００μＬを単回投与
実験は各群６匹で行った。薬剤は生理食塩水（大塚製薬製）で希釈調製し、尾静脈内より投与した。移植後１０日目より経日的に腫瘍体積の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、各群の比体積Ｖ／Ｖ０の平均値の比較で行った。Ｖ／Ｖ０の算出法を次式に示す。
Ｖ／Ｖ０＝（測定日の各個体の腫瘍体積）／（測定開始日の各個体の腫瘍体積）
各群のＶ／Ｖ０の平均値の経日的推移の結果を第１図に示す。第１図に示したように、ＫＭ８７１とＩＬ−２との併用投与はＩＬ−２単独、あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。さらにＫＭ８７１とＩＬ−２との併用が単独投与よりも有意な効果をもたらすことを示すために、併用投与群のＶ／Ｖ０の値とその他の各群のＶ／Ｖ０の値の間で有意差検定を行い、得られたｐ値の結果を第１表に示した。
2002078739.tif 000002
第１表に示したように、併用投与群は陰性対照群と比較して、移植後１７日目以降有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。また抗体単独投与に対し２１日目から２７日目までの間、ＩＬ−２単独投与に対しては２１日目以降で有意な増殖抑制効果が見られた。以上より、ＫＭ８７１とＩＬ−２の併用投与によりそれぞれの単独投与よりも有意に高い腫瘍の増殖抑制効果が得られることが明らかとなった。なお有意差の判定には両側ｔ検定を用い、有意差判定の基準はｐ＜０．０５とした。
（２）マウス同系移植モデルを用いたＫＭ８７１とヒトＩＬ−２の併用投与による抗腫瘍効果の測定
抗腫瘍免疫に関わる種々のエフェクター細胞のうち、ＩＬ−２によって活性化される主な細胞集団としてはＮＫ細胞及びＴ細胞が知られている。そこでＩＬ−２と抗体の併用投与による抗腫瘍効果を検討するために、Ｔ細胞を欠損しない正常マウスにマウス由来の腫瘍細胞を移植する同系移植モデルを構築した。ＧＤ３を発現するマウス由来腫瘍細胞株に既存のものがないため、まずＧＤ３の生合成前駆体であるＧＭ３にシアル酸を付加してＧＤ３を合成する反応を触媒するＧＤ３合成酵素の動物細胞安定発現ベクターを作製し、ＧＭ３を発現するマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞に導入することにより細胞を作製した。該細胞を用いて構築した同系移植モデルでＫＭ８７１とＩＬ−２の併用投与による抗腫瘍効果の測定を行った。以下に詳細を示す。
ａ．ＧＤ３合成酵素遺伝子の安定発現ベクターの構築
安定発現ベクターの構築方法に関する概略を第２図に示した。ＧＤ３合成酵素遺伝子の動物細胞発現用ベクターｐＡＭｏ−ＧＤ３（ＷＯ９４／２３０２０）の３μｇを１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ及び０．０１％トライトンＸ−１００から成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、制限酵素消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約２．１ｋｂの平滑末端ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ６４１（特開平５−３０４９８９）の３μｇを１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液とし、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、制限酵素消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液とし、更に１０単位の制限酵素ＮｒｕＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、及び１０ｍＭ塩化マグネシウムから成る緩衝液とし、更に１０単位の５’末端脱リン酸化酵素Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させて５’末端を脱リン酸化した。該反応液をフェノール処理後アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約９．４ｋｂの平滑末端・脱リン酸化ＥｃｏＲＩ−ＮｒｕＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ６４１由来のＥｃｏＲＩ−ＮｒｕＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＡＭｏ−ＧＤ３由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片０．１μｇを全量１０μｌの滅菌水に加え、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて使用説明書に従い、連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第２図に示したＧＤ３合成酵素の安定発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＧＤ３を得た。
ｂ．ＧＤ３合成酵素発現ベクターのＢ１６細胞への導入
上記実施例１の（２）項ａ．で得られたＧＤ３合成酵素遺伝子の安定発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＧＤ３の４μｇをＰＢＳ（ギブコＢＲＬ社製）で４×１０６個／２００μｌとなるように懸濁したＢ１６・Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）に加え、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド社製）を用いてエレクトロポレーション法による遺伝子の導入を行った。最終的にＧ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ）による選択を行い、形質転換細胞クローンＢ１６・８−３およびＢ１６・２９−１０を得た。細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養には１０％の非働化牛胎児血清（ギブコＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコＢＲＬ社製）を用いた。
ｃ．ＧＤ３発現株のＧＤ３発現量解析（蛍光抗体法）
上記実施例１の（２）項ｂ．で得られたＧＤ３合成酵素遺伝子トランスフェクタントＢ１６・８−３及びＢ１６・２９−１０、さらに親株のＢ１６・Ｆ１０細胞のそれぞれ１×１０６細胞をＰＢＳに懸濁させ、マイクロチューブ（Ｔｒｅｆｆ社製）に取り、遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分間）して細胞を洗浄後、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１を５０μｌ（１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５μｇ／ｍｌに調整した溶液、陰性対照は１％ＢＳＡ−ＰＢＳのみ）加えて撹拌し、４℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心分離して洗浄した後、ビオチン標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）溶液（ＶＥＣＴＯＲ社製、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで４００倍希釈して使用）を１００μｌ加えて撹拌後、４℃で１時間反応させた。ＰＢＳで３回遠心分離して洗浄した後、ストレプトアビジン標識したＣｙ５色素溶液（ギブコ社製Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＲＥＤ６７０、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１００倍希釈して使用）を１００μｌ加えて撹拌後、４℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心分離して洗浄した後、更にＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅ（ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて解析を行った。その結果を第３図に示した。第３図に示した様に、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１はＢ１６・８−３及びＢ１６・２９−１０のみに反応し、親株のＢ１６・Ｆ１０細胞には反応性を示さなかった。以上の結果は、Ｂ１６・８−３及びＢ１６・２９−１０の両トランスフェクタントは表面にＧＤ３を発現し、Ｂ１６細胞の由来であるＣ５７  ＢＬ／６マウスに移植することによりＫＭ８７１のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果測定のための動物モデルを作製した。
ｄ．同系腫瘍モデルを用いたＫＭ８７１とヒトＩＬ−２の併用投与による抗腫瘍効果の測定
上記実施例１の（２）項ｃ．で得られたＧＤ３発現Ｂ１６細胞Ｂ１６・２９−１０を１×１０８個／ｍｌでＰＢＳに懸濁し、Ｃ５７  ＢＬ／６マウス（雄、７週齢、日本チャールスリバー社製）の腹側部皮内に５０μｌ移植した。腫瘍移植後６日目にノギスによる腫瘍径の測定を行い、次式より腫瘍体積を計算し、１０〜８０ｍｍ３の範囲内の個体を選抜した。
腫瘍体積＝（短径）２×長径×０．５
平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後に下記のＡ〜Ｄの投与群を設定し、１日１回、８日間連続（移植後６日目〜１４日目）で下記の薬剤を尾静脈投与した。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＫＭ８７１単独群：５０μｇ／日
Ｃ．ＩＬ−２（Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩＬ−２、ペプロテック社製）単独群：１０μｇ／日
Ｄ．ＫＭ８７１＋ＩＬ−２併用群：５０μｇ／日＋１０μｇ／日
実験は各群５匹で行った。薬剤はクエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ６に調製）で希釈し、１匹あたり２００μｌとなるように調製した。移植後６日目より経日的に腫瘍体積の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、各群の比体積Ｖ／Ｖ０の平均値の比較で行った。各群のＶ／Ｖ０の平均値の経日的推移の結果を第４図に示す。第４図に示したように、ＩＬ−２単独、または抗体単独では抗腫瘍効果が見られなかったが、ＫＭ８７１とＩＬ−２との併用投与は増殖抑制効果を示した。
さらにＫＭ８７１とＩＬ−２との併用が単独投与よりも有意な効果をもたらすことを示すために、併用投与群のＶ／Ｖ０の値とその他の各群のＶ／Ｖ０の値の間で有意差検定を行い、得られたｐ値の結果を第２表に示した。
2002078739.tif 000003
第２表に示したように、併用投与群は陰性対照群と比較して、移植後８日目以降有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。また抗体単独投与に対し８、１０、１２、１３、１４、１７日目に、ＩＬ−２単独投与に対しては８日目以降で有意な増殖抑制効果が見られた。以上より、同系移植モデルにおいて、ＫＭ８７１とＩＬ−２の併用投与によりそれぞれの単独投与よりも有意に高い腫瘍の増殖抑制効果が得られることが明らかとなった。なお有意差の判定には両側ｔ検定を用い、有意差判定の基準はｐ＜０．０５とした。
実施例２  抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１とヒトＩＦＮαの併用投与による抗腫瘍効果の測定
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（日本クレア社製、雄）の背部皮下にて継代したＧＤ３陽性ヒト悪性黒色腫細胞株Ｈ−１８７の腫瘍塊より作製した２〜３ｍｍ角の腫瘍片を、６週令の雄のヌードマウスの背部皮下に移植針を用いて移植した。移植後１０日目にノギスを用いて腫瘍径を測定し、前述の式を用いて腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積が１００ｍｍ３前後の個体を選抜し、平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後に下記のＡ〜Ｄの投与群を設定した。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＫＭ８７１単独群：移植後１０日目に１匹あたり８００μｇ／２００μＬを単回投与
Ｃ．ＩＦＮα（イントロンＡ注、シェリング・プラウ社製）単独群：１匹あたり２×１０５ＩＵ／４００μＬ／日、１日１回、５日間連続投与（移植後１０〜１４日目）
Ｄ．ＫＭ８７１＋ＩＦＮα併用群：ＩＦＮ−αは、１匹あたり１２×１０５ＩＵ／４００μＬ／日、１日１回、５日間連続投与（移植後１０〜１４日目）し、ＫＭ８７１は、移植後１０日目に１匹あたり８００μｇ
実験は各群６匹で行った。薬剤は生理食塩水（大塚製薬製）で希釈調製し、尾静脈内より投与した。移植後１０日目より経日的に腫瘍体積の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、各群の比体積Ｖ／Ｖ０の平均値の比較で行った。
各群のＶ／Ｖ０の平均値の経日的推移の結果を第５図に示す。第５図に示したように、ＫＭ８７１とＩＦＮαの併用投与はＩＦＮα単独、あるいは抗体単独よりもさらに高い増殖抑制効果を示した。
さらにＫＭ８７１とＩＦＮ−αとの併用が単独投与よりも有意な効果をもたらすことを示すために、併用投与群のＶ／Ｖ０の値とその他の各群のＶ／Ｖ０の値の間で両側ｔ検定を行い、得られたｐ値の結果を第３表に示した。
2002078739.tif 000004
第３表に示したように、併用投与群は陰性対照群と比較して、移植後１４日目以降有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。またＩＦＮα単独投与に対しては２１、２４日目に有意差が見られた。
上記結果において併用投与群と抗体単独投与群の間には有意差が見られなかったため、さらに陰性対照群と抗体単独群、あるいは併用投与群の間で有意差検定を行い、得られたｐ値の結果を第４表に示した。
2002078739.tif 000005
第４表に示したとおり、併用投与群は１４日目以降全ての測定日において陰性対照に対して増殖抑制効果に有意差が得られたのに対し、抗体単独群は１４日目には有意差が得られなかった。以上より、ＫＭ８７１とＩＦＮαの併用投与によりそれぞれの単独投与よりも高い腫瘍増殖抑制効果が得られることが明らかとなった。なお有意差の判定には両側ｔ検定を用い、有意差判定の基準はｐ＜０．０５とした。
実施例３  抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体ＫＭ８７１とダカルバジンの併用投与による抗腫瘍効果
１０％の非働化牛胎児血清（ギブコＢＲＬ社製）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（ギブコＢＲＬ社製）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した、ＧＤ３陽性ヒト悪性黒色腫細胞株Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４２４）を１×１０８個／ｍｌでＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ギブコＢＲＬ社製）に懸濁し、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（雄、７週齢、日本クレア社製）の腹側部皮内に５０μｌ移植した。腫瘍移植後１３日目にノギスによる腫瘍径の測定を行い、前述の式より腫瘍体積を計算した。
腫瘍体積が５．０〜６０ｍｍ３の範囲内の個体を選抜し、平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後に下記のＡ〜Ｄの投与群を設定した。
Ａ．陰性対照群：非投与
Ｂ．ＫＭ８７１単独群：移植後１３日目に１匹あたり８００μｇ／２００μＬを単回投与
Ｃ．ダカルバジン（ダカルバジン注、協和発酵工業株式会社製）単独群：５０ｍｇ／ｋｇ／日、１日１回、５日間連続投与（移植後１３〜１７日目）
Ｄ．ＫＭ８７１＋ダカルバジン併用群：ダカルバジンは、１匹あたり５０ｍｇ／ｋｇ／日、１日１回、５日間連続投与（移植後１３〜１７日目）し、ＫＭ８７１は、移植後１３日目に１匹あたり８００μｇ
実験は各群５匹で行った。薬剤は生理食塩水（大塚製薬製）で希釈調製し、尾静脈内より投与した。移植後１３日目より経日的に腫瘍体積の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、各群の比体積Ｖ／Ｖ０の平均値の比較で行った。
各群のＶ／Ｖ０の平均値の経日的推移の結果を第６図に示す。第６図に示したように、ＫＭ８７１とダカルバジンの併用投与はダカルバジン単独、あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。
さらにＫＭ８７１とダカルバジンの併用効果を明らかにするために、併用投与群のＶ／Ｖ０の値とその他の各群のＶ／Ｖ０の値の間で有意差検定を行い、得られたｐ値の結果を第５表に示した。
2002078739.tif 000006
第５表に示したように、併用投与群は陰性対照群と比較して、移植後７日目以降有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。しかしながら、併用投与群と抗体単独投与群、あるいはダカルバジン単独投与群の間には有意差が見られなかったため、さらに陰性対照群に対するその他の各群の間で有意差検定を行い、得られたｐ値の結果を第６表に示した。
2002078739.tif 000007
第６表に示したとおり、併用投与群は７日目以降の全ての測定日において陰性対照に対して有意差が得られたのに対し、抗体単独群は７、１５日目に、ダカルバジン単独群は１５日目に有意差が得られたのみであった。以上より、ＫＭ８７１とダカルバジンの併用投与によりそれぞれの単独投与よりも高い腫瘍増殖抑制効果が得られることが明らかとなった。なお有意差の判定には両側ｔ検定を用い、有意差判定の基準はｐ＜０．０５とした。
参考例  抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の作製
１．抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶ領域のアミノ酸配列の解析
特開平５−３０４９８９に開示されているシグナル配列を含む抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＨの全アミノ酸配列を配列番号１に、ＶＬの全アミノ酸配列を配列番号２に示す。両配列と既知の抗体のアミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）および精製した抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列の解析結果との比較から、Ｈ鎖についてはアミノ酸配列の−１９から−１番目が、Ｌ鎖についてはアミノ酸配列の−２０から−１番目がであることが確認された。配列番号４９に分泌型ＶＨの全アミノ酸配列を、配列番号５０に分泌型ＶＬの全アミノ酸配列を示す。また、ＶＨのＣＤＲ１、２および３はそれぞれ配列番号３、４および５、ＶＬのＣＤＲ１、２および３はそれぞれ配列番号６、７および８に示すアミノ酸配列であることが明らかとなった。
２．抗体の各種ガングリオシドに対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗体の各種ガングリオシドに対する結合活性は以下の様にして測定した。
２ｎｍｏｌの各種ガングリオシドを１０μｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ社製）と５μｇのコレステロール（ＳＩＧＭＡ社製）とを含む２ｍｌのエタノール溶液に溶解した。該溶液の２０μｌ（２０ｐｍｏｌ／ウェルとなる）または該溶液をエタノールで希釈した溶液の２０μｌを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清或いは精製したヒト化抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）の０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液］を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
３．抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
（１）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
まず、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。参考例１項で同定した抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性から３種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計することとした。より活性の高い抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＨの３種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ６４１のＶＨのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択することとした。第７表には、相同性の検索結果を示した。第７表に示した様に、ＫＭ６４１のＶＨのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＩＩと最も高い相同性を有していた。
2002078739.tif 000008
以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０を設計した。
次に、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。参考例１項で同定した抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＶ）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）。そこでＨ鎖の場合と同様にして、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ６４１のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。第８表には、相同性の検索結果を示した。第８表に示した様に、ＫＭ６４１のＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。
2002078739.tif 000009
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０を設計した。
上記で設計した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。一般に、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、マウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは抗体の活性が低下してしまうことが多い。そこで、抗体の活性低下を回避するため、ヒト抗体とマウス抗体で異なるＦＲのアミノ酸残基のうち、抗体の活性に影響を与えると推定されるアミノ酸残基をＣＤＲのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本参考例においても、活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を同定することを検討した。
まず、上記で設計した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０よりなる抗体Ｖ領域（以下、ＨＶ０ＬＶ０と表記する）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標の作製にはソフトウェアＡｂＭ（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ社製）、三次元構造の表示にはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列において、抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１と異なっている複数のアミノ酸残基について順次、抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１に相当する位置のアミノ酸残基へ置換したアミノ酸配列から成るＨＶ０ＬＶ０改変体三次元構造モデルも構築した。抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１、ＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較した。その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で、抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を選択した。選択されたＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基をマウス抗体ＫＭ６４１に見られるアミノ酸残基へ置換した結果、配列番号９に示す抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ｈＫＭ６４１Ｈおよび配列番号１０に示す抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ｈＫＭ６４１Ｌを設計した。ｈＫＭ６４１Ｈにおいては、ＨＶ．０のＦＲのアミノ酸配列の中で、１０番目のＧｌｙ、１１番目のＬｅｕ、２０番目のＬｅｕ、２８番目のＴｈｒ、８４番目のＡｓｎ、９１番目のＴｈｒ、９５番目のＴｙｒ、９７番目のＡｌａ、１１５番目のＶａｌをそれぞれ、抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＨに相当する位置のアミノ酸残基であるＡｓｐ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕに置換した。ｈＫＭ６４１Ｌにおいては、ＬＶ．０のＦＲのアミノ酸配列の中で、４９番目のＴｙｒ、６５番目のＳｅｒ、７１番目のＰｈｅをそれぞれ、抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＬに相当する位置のアミノ酸残基であるＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅに置換した。
（２）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
参考例３項（１）で設計した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ｈＫＭ６４１ＨをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に配列番号１に記載の抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＨ鎖の分泌シグナル配列を繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。一つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、更に、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で自動ＤＮＡ合成機（３８０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて合成した。
実際には、配列番号１１から配列番号１６の６本の合成ＤＮＡを合成した。各ＤＮＡを最終濃度が０．１μＭとなる様に５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）および２単位のＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｃ（宝酒造社製）よりなる緩衝液に加え、５０μｌの鉱油で覆い、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＪ４８０、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）にセットし、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間、７２℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行った。該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の使用説明書に従い、精製後、３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液とし、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．０１％トライトンＸ−１００から成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約０．４４ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の３μｇを１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．０１％トライトンＸ−１００から成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約２．９５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られた抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＨのＰＣＲ産物のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換株の１０個のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＡｕｔｏＲｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に添付の説明書に従って反応後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、目的の塩基配列を有する第７図に示したプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｈを得た。
（３）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
参考例３項（１）で設計した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ｈＫＭ６４１ＬをコードするｃＤＮＡをＶＨと同様にＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。但し、分泌シグナル配列としては、配列番号２に記載の抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＬ鎖のアミノ酸配列を用いた。
まず、配列番号１７から配列番号２２の６本の合成ＤＮＡを自動ＤＮＡ合成機（３８０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて合成した。合成した各ＤＮＡを最終濃度が０．１μＭとなる様に５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）および２単位のＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）よりなる緩衝液に加え、５０μｌの鉱油で覆い、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＪ４８０、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）にセットし、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間、７２℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行った。該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の使用説明書に従い、精製後、３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡから成る緩衝液とし、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約０．３９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、特開平１０−２５７８９３に記載のプラスミドｐＢＳＬ３の３μｇを１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約２．９５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られた抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢＳＬ３のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換株の１０個のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、Ａｕｔｏ  Ｒｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に添付の説明書に従って反応後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、目的の塩基配列を有する第８図に示したプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌを得た。
４．抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた一過性発現による活性評価
抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の活性評価をより迅速に行なうために、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）を用いて抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現を以下の様にして行なった。
（１）抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１の一過性発現ベクターｐＴ６４１の構築  抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現による活性評価における陽性対照として用いるため、抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１の一過性発現ベクターｐＴ６４１を以下の様にして構築した。
一般に、動物細胞を用いた一過性発現の効率は導入された発現ベクターのコピー数に依存していることから、より小さい発現ベクターの方が発現効率が高いことが考えられた。そこで特開平１０−２５７８９３に記載の抗ガングリオシドＧＭ２キメラ抗体ＫＭ９６６の一過性発現ベクターｐＴ７９６と特開平５−３０４９８９に記載の抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＨを有するプラスミドｐＫＭ６４１ＨＦ１および抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＬを有するプラスミドｐＫＭ６４１ＬＡ２を用いて抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１の一過性発現ベクターｐＴ６４１を以下の様にして構築した。
まず、特開平５−３０４９８９に記載の抗ＧＤ３マウス抗体ＫＭ６４１のＶＬを有するプラスミドｐＫＭ６４１ＬＡ２の３μｇを１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約０．３５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、特開平１０−２５７８９３に記載の抗ガングリオシドＧＭ２キメラ抗体ＫＭ９６６の一過性発現ベクターｐＴ７９６の３μｇを１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約９．２０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、配列番号２３および配列番号２４に記載の塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを自動ＤＮＡ合成機（３８０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて合成した。得られた合成ＤＮＡの０．３μｇずつを１５μｌの滅菌水に加え、６５℃で５分間加熱した。該反応液を室温にて３０分間放置した後、２μｌの１０倍緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ  ＤＴＴ）と２μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰを加え、更に１０単位のＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３０分間反応させ、５’末端をリン酸化した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＭ６４１ＬＡ２由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＴ７９６由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇとリン酸化合成ＤＮＡ０．０５μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、第９図に示したプラスミドｐＴ７９６Ｈ６４１Ｌを得た。得られたプラスミドの１０μｇを用い、ＡｕｔｏＲｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に添付の説明書に従って反応後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、目的のＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の３μｇを１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、３０μｌの３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ酢酸亜鉛および５％グリセロールから成る緩衝液に加え、更に３０単位の修飾酵素Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｃ（宝酒造社製）を加えて２５℃で１５分間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約２．９５ｋｂのＢｌｕｎｔ  ｅｎｄ−ＡｐａＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、プラスミドｐＫＭ６４１ＨＦ１の３μｇを１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、制限酵素消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約０．４４ｋｂのＢｌｕｎｔ  ｅｎｄ−ＡｐａＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＢｌｕｎｔ  ｅｎｄ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＭ６４１ＨＦ１のＢｌｕｎｔ  ｅｎｄ−ＡｐａＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、第１０図に示したプラスミドｐＢＳ６４１Ｈを得た。
次に、上記で得られたプラスミドｐＴ７９６Ｈ６４１Ｌの３μｇを１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．０１％トライトンＸ−１００から成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約９．１６ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ６４１Ｈの３μｇを１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．０１％トライトンＸ−１００から成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約０．４４ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＴ７９６Ｈ６４１Ｌ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢＳ６４１Ｈ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、第１１図に示したプラスミドｐＴ６４１を得た。
（２）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現ベクターの構築
上記参考例４項（１）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体一過性発現ベクターｐＴ６４１と参考例３項（２）および（３）で得られたプラスミドｐｈＫＭ６４１ＨおよびｐｈＫＭ６４１Ｌを用いて抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現ベクターを以下の様にして構築した。
まず、参考例３項（２）で得られたプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｈの３μｇを１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．０１％トライトンＸ−１００から成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約０．４４ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、参考例４項（１）で得られたプラスミドｐＴ６４１の３μｇを１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．０１％トライトンＸ−１００から成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約９．１６ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｈ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＴ６４１由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、第１２図に示したプラスミドｐＴ６４１ＨＣＤＲを得た。
次に、参考例３項（３）で得られたプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌの３μｇを１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約０．３９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、参考例４項（１）で得られたプラスミドｐＴ６４１および上記で得られたプラスミドｐＴ６４１ＨＣＤＲの３μｇを１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、それぞれのプラスミド由来の約９．２０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片を約２μｇずつ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌ由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＴ６４１由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。また、上記で得られたプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌ由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＴ６４１ＨＣＤＲ由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られたそれぞれの組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、第１３図に示したプラスミドｐＴ６４１ＬＣＤＲおよびｐＴ６４１ＨＬＣＤＲを得た。
（３）抗ＧＤ３キメラ抗体および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた一過性発現による活性評価
上記参考例４項（１）および（２）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体の一過性発現ベクターｐＴ６４１、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲおよびマウス抗体とヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域を有する抗ＧＤ３ハイブリッド抗体の一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＣＤＲ、ｐＴ６４１ＬＣＤＲを用いて抗体の一過性発現を以下の様にして行った。
ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）を１×１０５細胞／ｍｌで６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に２ｍｌずつ分注し、３７℃で一晩培養した。１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）に各発現ベクターの２μｇを加え、更に１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に１０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を添加した溶液を加え、室温で４０分間反応させ、ＤＮＡ−リポソームの複合体を形成させた。一晩培養したＣＯＳ−７細胞を２ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）で２回洗浄後、複合体を含む溶液に０．８ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を添加した溶液を加え、３７℃で７時間培養後、溶液を除去し、２ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を添加し、３７℃で培養した。各発現ベクターの導入後、７２時間後に培養上清を回収し、必要に応じて濃縮操作を行ない、参考例２項に記載のＥＬＩＳＡ法により培養上清中の抗ＧＤ３ヒト化抗体のＧＤ３（ＤＩＡ−ＩＡＴＲＯＮ社製）に対する結合活性を、後述する本項（４）に示すＥＬＩＳＡ法により培養上清中の抗ＧＤ３ヒト化抗体の濃度を測定し、それらの値から活性を、陽性対照である抗ＧＤ３キメラ抗体の活性を１００とした時の相対活性値（％）として算出した。その結果を第１４図に示した。第１４図に示した様に、一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＣＤＲに由来する抗ＧＤ３ハイブリッド抗体（ＶＨがヒト型ＣＤＲ移植抗体由来で、ＶＬがキメラ抗体由来）は、一過性発現ベクターｐＴ６４１に由来する抗ＧＤ３キメラ抗体とほぼ同等の結合活性を示したが、一方、一過性発現ベクターｐＴ６４１ＬＣＤＲに由来する抗ＧＤ３ハイブリッド抗体（ＶＨがキメラ抗体由来で、ＶＬがヒト型ＣＤＲ移植抗体由来）は、抗ＧＤ３キメラ抗体に比べ約５０％の結合活性を示した。更に、一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲに由来する抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体では、抗ＧＤ３キメラ抗体に比べ約５％の結合活性しか示さず、活性の著しい低下が認められた。
以上の結果から、参考例３項（１）で設計したＶＨおよびＶＬを有する抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体では、その結合活性が著しく低下してしまうこと、また、その活性低下の主な原因はＶＬにあると考えられるが、抗ＧＤ３キメラ抗体のＶＨとの組合せで約５０％の活性が認められることから、特にＶＨとの相互作用部位に問題があることが示唆された。そこで、参考例３項（１）で設計したＶＬのアミノ酸残基の更なる改変による抗体の活性の上昇を検討した。
（４）ＥＬＩＳＡ法による一過性発現培養上清中のヒト化抗体の濃度の測定
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ−ｃｈａｉｎ）抗体（医学生物学研究所社製）をＰＢＳで４００倍希釈した溶液の５０μｌを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルに分注し、４℃で一晩反応させた。抗体溶液を除去後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、参考例４項（３）で得られた一過性発現培養上清或いは精製した抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１の各種希釈液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトκＬ鎖抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）をＰＢＳで５００倍希釈した溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）の０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液］を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。
５．抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸残基の改変による結合活性の上昇
参考例３項（１）で設計した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸残基の改変による結合活性の上昇を以下の様にして行った。
（１）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸残基の改変および改変したＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
まず、参考例３項（１）で構築した各種抗体のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルより、ＶＨとＶＬの相互作用部位に位置するアミノ酸残基およびＶＬの各ＣＤＲの立体構造に影響を与えると考えられるアミノ酸残基で、かつ、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＬにおいてマウス抗体のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を同定した。その結果、配列番号１０に示した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列であるｈＫＭ６４１Ｌの７番目のＳｅｒ、８番目のＰｒｏ、１２番目のＳｅｒ、４１番目のＧｌｙ、４４番目のＰｒｏ、７２番目のＴｈｒ、７７番目のＳｅｒ、８３番目のＰｈｅ、８７番目のＴｙｒを同定した。これらのアミノ酸残基について、マウス抗体に見られるアミノ酸残基へ置換することにより、以下の８種類の改変体抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬを設計した。即ち、ｈＫＭ６４１ＮＬにおいてはｈＫＭ６４１Ｌアミノ酸配列のうち、８番目のＰｒｏをＡｌａ、１２番目のＳｅｒをＰｒｏ、４４番目のＰｒｏをＶａｌ、８７番目のＴｙｒをＰｈｅに、ｈＫＭ６４１Ｌｍ−１においてはｈＫＭ６４１Ｌアミノ酸配列のうち、７番目のＳｅｒをＴｈｒ、８番目のＰｒｏをＡｌａ、１２番目のＳｅｒをＰｒｏに、ｈＫＭ６４１Ｌｍ−４においてはｈＫＭ６４１Ｌアミノ酸配列のうち、８７番目のＴｙｒをＰｈｅに、ｈＫＭ６４１Ｌｍ−６においてはｈＫＭ６４１Ｌアミノ酸配列のうち、４１番目のＧｌｙをＡｓｐ、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、ｈＫＭ６４１Ｌｍ−７においてはｈＫＭ６４１Ｌアミノ酸配列のうち、７２番目のＴｈｒをＳｅｒ、７７番目のＳｅｒをＡｓｎ、８３番目のＰｈｅをＩｌｅに、ｈＫＭ６４１Ｌｍ−８においてはｈＫＭ６４１Ｌアミノ酸配列のうち、７７番目のＳｅｒをＡｓｎに、ｈＫＭ６４１Ｌｍ−９においてはｈＫＭ６４１Ｌアミノ酸配列のうち、８３番目のＰｈｅをＩｌｅ、８７番目のＴｙｒをＰｈｅに、ｈＫＭ６４１Ｌｍ−６９においてはｈＫＭ６４１Ｌアミノ酸配列のうち、４１番目のＧｌｙをＡｓｐ、４４番目のＰｒｏをＶａｌ、８３番目のＰｈｅをＩｌｅ、８７番目のＴｙｒをＰｈｅにそれぞれ置換した。これら改変したＶＬのうち、ｈＫＭ６４１ＮＬとｈＫＭ６４１Ｌｍ−６９を除く６種類の改変したＶＬをコードするｃＤＮＡは、ＰＣＲ法を用いた変異導入法により以下の様にして構築した。即ち、変異を導入する為のアンチセンス鎖およびセンス鎖のＤＮＡプライマーを自動ＤＮＡ合成機（３８０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて合成し、プラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌの１ｎｇを鋳型として最終濃度０．５μＭのＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）とアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーおよびＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）とセンス鎖ＤＮＡプライマーを用いて第一ＰＣＲを参考例３項（２）に記載の方法に従って行った。該各反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、２０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）で溶出、精製した後、各溶出液の５μｌを用いて第二ＰＣＲを参考例３項（２）に記載の方法に従って行った。該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付��説明書に従い、精製後、３０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡから成る緩衝液とし、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約０．３９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、上記で得られた改変した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＶＬのＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇと参考例３項（３）で得られたプラスミドｐＢＳＬ３のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換株の１０個のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＡｕｔｏＲｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に添付の説明書に従って反応後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により電気泳動して塩基配列を決定し、目的の改変が施されたｃＤＮＡを有するプラスミドを得た。
具体的には、アンチセンス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号２５の合成ＤＮＡ、センス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号２６の合成ＤＮＡを用いて上記の一連の操作を行い、配列番号２７に示した塩基配列を有するプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−１を得た。また、配列番号２７には、該塩基配列がコードするアミノ酸配列であるｈＫＭ６４１Ｌｍ−１を併記した。
アンチセンス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号２８の合成ＤＮＡ、センス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号２９の合成ＤＮＡを用いて上記の一連の操作を行い、配列番号３０に示した塩基配列を有するプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−４を得た。また、配列番号３０には、該塩基配列がコードするアミノ酸配列であるｈＫＭ６４１Ｌｍ−４を併記した。
アンチセンス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号３１の合成ＤＮＡ、センス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号３２の合成ＤＮＡを用いて上記の一連の操作を行い、配列番号３３に示した塩基配列を有するプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−６を得た。また、配列番号３３には、該塩基配列がコードするアミノ酸配列であるｈＫＭ６４１Ｌｍ−６を併記した。
アンチセンス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号３４の合成ＤＮＡ、センス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号３５の合成ＤＮＡを用いて上記の一連の操作を行い、配列番号３６に示した塩基配列を有するプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−７を得た。また、配列番号３６には、該塩基配列がコードするアミノ酸配列であるｈＫＭ６４１Ｌｍ−７を併記した。
アンチセンス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号３７の合成ＤＮＡ、センス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号３８の合成ＤＮＡを用いて上記の一連の操作を行い、配列番号３９に示した塩基配列を有するプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−８を得た。また、配列番号３９には、該塩基配列がコードするアミノ酸配列であるｈＫＭ６４１Ｌｍ−８を併記した。
アンチセンス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号４０の合成ＤＮＡ、センス鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号４１の合成ＤＮＡを用いて上記の一連の操作を行い、配列番号４２に示した塩基配列を有するプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−９を得た。また、配列番号４２には、該塩基配列がコードするアミノ酸配列であるｈＫＭ６４１Ｌｍ−９を併記した。
改変したＶＬのうち、ｈＫＭ６４１ＮＬをコードするｃＤＮＡは、配列番号１７、２２、４３から４６の６本の合成ＤＮＡを自動ＤＮＡ合成機（３８０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて合成し、それらを用いて参考例３項（３）に記載の操作を行うことにより、構築した。その結果、目的の改変が施された配列番号４７に示した塩基配列を有するプラスミドｐｈＫＭ６４１ＮＬを得た。また、配列番号４７には、該塩基配列がコードするアミノ酸配列であるｈＫＭ６４１ＮＬを併記した。
改変したＶＬのうち、ｈＫＭ６４１Ｌｍ−６９をコードするｃＤＮＡは、上記で得られた改変したＶＬのｃＤＮＡを有するプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−６およびｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−９を用いて以下の様にして構築した。
まず、プラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−６の３μｇを１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＰｓｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約０．３０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、プラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−９の３μｇを１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＰｓｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約３．０５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−６由来のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片０．１μｇとプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−９由来のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、第１５図に示したプラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−６９を得た。得られたプラスミドの１０μｇを用い、ＡｕｔｏＲｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に添付の説明書に従って反応後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、目的の改変が施された配列番号４８に示した塩基配列を有することが確認された。また、配列番号４８には、該塩基配列がコードするアミノ酸配列であるｈＫＭ６４１Ｌｍ−６９を併記した。
（２）改変ＶＬを有する抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現ベクターの構築
上記参考例５項（１）で得られた各種改変ＶＬをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドと参考例４項（２）で得られた抗ＧＤ３ハイブリッド抗体の一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＣＤＲを用いて各種改変ＶＬを有する抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現ベクターを以下の様にして構築した。
まず、参考例５項（１）で得られた各プラスミドｐｈＫＭ６４１ＮＬ、ｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−１、ｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−４、ｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−６、ｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−７、ｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−８、ｐｈＫＭ６４ＩＬｍ−９、ｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−６９の各３μｇを１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該各反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、それぞれ約０．３９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、上記で得られた各種改変ＶＬのＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇと参考例４項（２）で得られた抗ＧＤ３ハイブリッド抗体の一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＣＤＲ由来のＥｃｏＲＩ−ＳｐｌＩ断片０．１μｇを全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られたそれぞれの組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、第１６図に示した各種改変ＶＬを有する抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＮＬ、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−１、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−４、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−７、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−８、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９を得た。
（３）改変ＶＬを有する抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた一過性発現による活性評価
上記参考例４項（２）で得られた抗ＧＤ３キメラ抗体の一過性発現ベクターｐＴ６４１、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲおよび上記参考例５項（２）で得られた改変ＶＬを有する抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＮＬ、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−１、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−４、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−７、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−８、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９を用いて各抗体の一過性発現および活性評価を参考例４項（３）に記載の方法に従い、行った。その結果を第１７図に示した。第１７図に示した様に、一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−７、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９に由来する改変抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体では、改変前の抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体に比べ結合活性の上昇が認められ、特に一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９に由来する改変抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体では、その結合活性は抗ＧＤ３キメラ抗体の約８０％を示した。一方、これら以外の一過性発現ベクターに由来する改変抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体では、改変前の抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体に比べ結合活性の上昇は認められなかった。以上の結果より、参考例５項（１）で同定したＶＬの改変アミノ酸残基のうち、４１番目、４４番目、８３番目および８７番目のアミノ酸残基が結合活性の上昇に大きく寄与することが判明した。また、４１番目と４４番目または８３番目と８７番目の２種類のアミノ酸残基を同時置換することは、活性上昇に相乗的に寄与し、更に４１番目、４４番目、８３番目および８７番目の４種類のアミノ酸残基の同時改変も活性上昇に相乗的に寄与することが判明した。参考例３項（１）で構築した各種抗体のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルより、４１番目と４４番目のアミノ酸残基はＶＨとの相互作用に、８３番目と８７番目のアミノ酸残基はＶＬのＣＤＲ３の立体構造にそれぞれ影響を与えることが示唆され、これらのアミノ酸残基をマウス抗体に見られるアミノ酸残基に改変することで、抗体全体の立体構造が適切に保たれ、その結果、結合活性が上昇することが考えられた。本知見は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においてはＶＨとＶＬの相互作用部位をも考慮する必要があることを示しており、それら相互作用部位の同定には抗体Ｖ領域の立体構造からの情報を基にした種々の検討が必要であることを示している。そして、それら相互作用部位に関しては、個々の抗体により異なることは容易に類推され、現段階では一般的な法則を見出すことは困難であり、目的とする個々の抗体に応じた試行錯誤が必要である。
６．抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現
上記参考例５項（３）に記載の結果から、一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９に由来する抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体は、抗ＧＤ３キメラ抗体に比べ、それぞれ約２０％、約８０％程度のＧＤ３に対する結合活性を有することが示唆された。そこで、それら抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の活性を更に詳細に評価するため、以下に示す方法に従い、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体を安定に発現する形質転換細胞株を得、形質転換細胞株の培養上清より抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の精製を行った。また、比較の為、一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲに由来する抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の安定発現、精製も同様にして行った。
（１）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の安定発現ベクターの構築
上記参考例５項（２）で構築した各種一過性発現ベクターに、以下の様な方法で薬剤Ｇ４１８に対する耐性遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子を導入し、安定発現ベクターを構築した。
まず、ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の３μｇを１０μｌの２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００ｍＭ塩化カリウムから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約８．６８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を約１μｇ回収した。
次に、上記参考例５項（２）で構築した一過性発現ベクターｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲの各３μｇを１０μｌの２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００ｍＭ塩化カリウムから成る緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）、制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｔｕＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、約４．９０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を約１μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片０．１μｇと各種一過性発現ベクター由来のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片０．１μｇをそれぞれ全量２０μｌの滅菌水に加え、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて連結した。この様にして得られた各組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、第１８図に示した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の安定発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＫＡＮＴＥＸ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９、ｐＫＡＮＴＥＸ６４１ＨＬＣＤＲを得た。
（２）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現
上記参考例６項（１）で得られた各種抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の安定発現ベクターを用いて抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現を以下の様にして行った。
各種抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの４μｇを４×１０６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］により導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ６４０−ＦＢＳ（１０）［牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地］に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになる様に添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の各種抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を参考例２項に示すＥＬＩＳＡ法［二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体を使用］により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと表記する）の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する：ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになる様に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の各種抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を参考例２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。安定発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＫＡＮＴＥＸ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９、ｐＫＡＮＴＥＸ６４１ＨＬＣＤＲを導入して得られたそれぞれの形質転換細胞クローンは、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１、ＫＭ８８６９と命名し、それぞれの形質転換細胞クローンの抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の発現量は約５μｇ／１０６細胞／２４ｈｒ、約１０μｇ／１０６細胞／２４ｈｒ、約３０μｇ／１０６細胞／２４ｈｒであった。
（３）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の培養上清からの精製
上記参考例６項（２）で得られた各種抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体を発現する形質転換細胞クローンＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１、ＫＭ８８６９をＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＧＩＴ培地（日本製薬社製）に１〜２×１０５細胞／ｍｌとなる様に懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２００ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で５〜７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、各抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体を精製した。ＫＭ８８７０の培養上清５００ｍｌからは抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８７０を約３ｍｇ、ＫＭ８８７１の培養上清１６００ｍｌからは抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８７１を約２５ｍｇ、ＫＭ８８６９の培養上清１０００ｍｌからは抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９を約６５ｍｇ取得した。得られた各抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の約４μｇを、公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果を第１９図に示した。第１９図に示した様に、精製した各抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）であり、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２４Ｋｄ、分子全体：約１４６Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告（アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス）と一致し、各抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。また、精製した各抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（４７０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果、それぞれのｃＤＮＡの塩基配列から推定されるＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列と一致することを確認した。
７．抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の活性評価
（１）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のＧＤ３に対する反応性（ＥＬＩＳＡ法）
精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のＧＤ３（ＤＩＡ−ＩＡＴＲＯＮ社製）に対する反応性を参考例２項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。第２０図は、ＥＬＩＳＡ用のプレートの各ウェルに吸着させるＧＤ３の量を２０ｐｍｏｌ／ウェルに固定し、添加する抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１の濃度を変化させて反応性を検討した結果である。第２０図に示した様に、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のうち、ＫＭ８８７１が最も高い結合活性を示し、それは抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１の約１／２であった。第２１図は、ＥＬＩＳＡ用のプレートの各ウェルに吸着させるＧＤ３の量を変化させ、一定濃度（１０μｇ／ｍｌ）の抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１の反応性を検討した結果である。第２１図に示した様に、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のうち、ＫＭ８８７１が最も高い結合活性を示し、それは抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１と同等であった。第２２図は、ＥＬＩＳＡ用のプレートの各ウェルに吸着させるガングリオシドの種類を変えて（吸着量：２０ｐｍｏｌ／ウェル）、一定濃度（１０μｇ／ｍｌ）の抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１の反応性を検討した結果である。使用したガングリオシドは、ＧＭ１、Ｎ−アセチルＧＭ２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ社製、以下、ＡｃＧＭ２と表記する）、Ｎ−グリコリルＧＭ２（以下、ＧｃＧＭ２と表記する）、Ｎ−アセチルＧＭ３（以下、ＡｃＧＭ３と表記する）、Ｎ−グリコリルＧＭ３（以下、ＧｃＧＭ３と表記する）、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ（ＤＩＡ−ＩＡＴＲＯＮ社製）、ＧＤ２、ＧＤ３（ＤＩＡ−ＩＡＴＲＯＮ社製）、ＧＱ１ｂ（ＤＩＡ−ＩＡＴＲＯＮ社製）、ＧＴ１ｂ（フナコシ社製）の１１種類である。なお、ＧＭ１とＧＤ１ａはウシ脳より、Ｎ−グリコリルＧＭ２とＮ−グリコリルＧＭ３はマウス肝臓より、Ｎ−アセチルＧＭ３はイヌ赤血球より、ＧＤ２はヒト神経芽細胞腫培養細胞株ＩＭＲ３２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１２７）より、それぞれ公知の方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６３，１０９１５（１９８８）］に準じて精製した。第２２図に示した様に、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１は、いずれも抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１と同様にＧＤ３に対して強く、ＧＱ１ｂに対して弱く結合し、その他のガングリオシドとは結合せず、キメラ抗体ＫＭ８７１の結合特異性を保持していることが示された。
（２）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のヒト癌細胞との反応性（蛍光抗体法）
精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のヒト癌細胞との反応性は、以下の様にして測定した。ヒトメラノーマ培養細胞株Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４２４）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ７２）のそれぞれ１×１０６細胞をＰＢＳに懸濁させ、マイクロチューブ（Ｔｒｅｆｆ社製）に取り、遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分間）して細胞を洗浄後、抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１または抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１を５０μｌ（１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５μｇ／ｍｌに調整した溶液）加えて撹拌し、４℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心分離して洗浄した後、フルオレッセインイソシアネート（以下、ＦＩＴＣと表記する）で蛍光標識したウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２溶液（和光純薬工業社製、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０倍希釈して使用）を２０μｌ加えて撹拌後、４℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心分離して洗浄した後、更にＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅ（ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて解析を行った。対照として抗体無添加で上記と同様の操作を行い解析した。その結果を第２３図に示した。第２３図に示した様に、抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１はいずれも両細胞株と反応性を示した。抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の中では、ＫＭ８８７１が最も強い反応性を示した。以上の結果は、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体がメラノーマを始めとするＧＤ３陽性ヒト腫瘍の診断、治療等に有用であることを示している。
（３）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＣＤＣ活性）
精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＣＤＣ活性を測定した。
ａ．標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で培養したヒトメラノーマ培養細胞株Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４２４）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ７２）のそれぞれ５×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、１×１０６細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
ｂ．補体溶液の調製
３人の健常人の血清を混合し、ヒト補体源とした。使用時には、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で１５％ｖｏｌ．／ｖｏｌ．に希釈して補体溶液として用いた。
ｃ．ＣＤＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルにａ．で調製した標的細胞溶液の５０μｌを加え（５×１０４細胞／ウェル）、次いで抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１或いは抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１を各最終濃度０．０５〜５０μｇ／ｍｌとなる様に加え、室温で３０分間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清を除去し、ｂ．で調整したヒト補体溶液を１５０μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。遠心分離後、上清へ遊離した５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液、補体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、補体溶液の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＣＤＣ活性は、下式により求めた。
2002078739.tif 000010
その結果を第２４図に示した。第２４図に示した様に、抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１は、いずれも両細胞株に対してＣＤＣ活性を示し、特にヒトメラノーマ培養細胞株Ｇ−３６１に対しては非常に強い細胞障害活性を示すことが明らかとなった。抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の中では、ＫＭ８８７１が最も強い細胞障害活性を示し、それは抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１の約１／３であった。
（４）抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
ａ．標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で培養したヒトメラノーマ培養細胞株Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４２４）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ７２）のそれぞれ１×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を１．８５ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
ｂ．エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品工業社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（１，５００〜１，８００×ｇ、３０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離（１，５００〜１，８００×ｇ、５分間）して洗浄後、培地を用いて５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
ｃ．ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルにａ．で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いでｂ．で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（５×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１となる）添加した。更に、抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１を各最終濃度０．０５〜５０μｇ／ｍｌとなる様に加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。
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その結果を第２５図に示した。第２５図に示した様に、抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１は、いずれも両細胞株に対して強いＡＤＣＣ活性を示すことが明らかとなった。抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１の間では、その細胞障害活性に差は認められなかった。
以上の結果は、抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１と同様に抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体がＧＤ３陽性ヒト腫瘍の診断、治療等に有用であることを示している。更に、抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体では、ヒトにおいてより免疫原性が低下し、その効果がより持続することが期待される。
抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体のうち、最も高活性を示したＫＭ８８７１を生産する形質転換細胞クローンＫＭ８８７１は平成１１年７月２２日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨域県つくば市東１丁目１番３号）（現：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９０として寄託されている。
産業上の利用可能性
本発明により、ガングリオシドＧＤ３に対する遺伝子組換え抗体あるいは該抗体断片と、少なくとも１種類の免疫担当細胞を活性化させる物質または抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる医薬が提供される。本発明の医薬は、抗体または免疫担当細胞を活性化させる物質あるいは抗腫瘍活性を有する物質をそれぞれ単独で投与した場合よりも低用量で高い治療効果を示した。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図  異種移植モデルを用いたＫＭ８７１とＩＬ−２併用による抗腫瘍効果を示すグラフである。横軸はＨ−１８７細胞移植後の日数、縦軸はＶ／Ｖ０を表す。点線は陰性対照群、□はＫＭ８７１投与群、△はＩＬ−２投与群、●はＫＭ８７１とＩＬ−２の併用投与群をそれぞれ表す。
第２図  ＧＤ３合成酵素発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＧＤ３の造成工程を示す。
第３図  蛍光抗体法によるＢ１６・２９−１０細胞、Ｂ１６・８−３細胞のＧＤ３合成酵素トランスフェクタントのＧＤ３発現量の解析結果を示す。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を表す。▲１▼はヒトＩｇＧによる染色ヒストグラム、▲２▼はＫＭ８７１による染色ヒストグラムをそれぞれ示す。
第４図  同系移植モデルを用いたＫＭ８７１とＩＬ−２併用による抗腫瘍効果を示すグラフである。横軸はＢ１６・２９−１０細胞移植後の日数、縦軸はＶ／Ｖ０を表す。点線は陰性対照群、□はＫＭ８７１投与群、△はＩＬ−２投与群、●はＫＭ８７１とＩＬ−２の併用投与群をそれぞれ表す。
第５図  異種移植モデルを用いたＫＭ８７１とＩＦＮα併用による抗腫瘍効果を示すグラフである。横軸はＨ−１８７細胞移植後の日数、縦軸はＶ／Ｖ０を表す。点線は陰性対照群、□はＫＭ８７１投与群、△はＩＦＮα投与群、●はＫＭ８７１とＩＦＮαの併用投与群をそれぞれ表す。
第６図  異種移植モデルを用いたＫＭ８７１とダカルバジン併用による抗腫瘍効果を示すグラフである。横軸はＧ−３６１細胞移植後の日数、縦軸はＶ／Ｖ０を表す。点線は陰性対照群、□はＫＭ８７１投与群、△はダカルバジン投与群、●はＫＭ８７１とダカルバジンの併用投与群をそれぞれ表す。
第７図  プラスミドｐｈＫＭ６４１Ｈの造成工程を示した図である。
第８図  プラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌの造成工程を示した図である。
第９図  プラスミドｐＴ７９６Ｈ６４１Ｌの造成工程を示した図である。
第１０図  プラスミドｐＢＳ６４１Ｈの造成工程を示した図である。
第１１図  プラスミドｐＴ６４１の造成工程を示した図である。
第１２図  プラスミドｐＴ６４１ＨＣＤＲの造成工程を示した図である。
第１３図  プラスミドｐＴ６４１ＬＣＤＲおよびｐＴ６４１ＨＬＣＤＲの造成工程を示した図である。
第１４図  プラスミドｐＴ６４１、ｐＴ６４１ＨＣＤＲ、ｐＴ６４１ＬＣＤＲ、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲを用いた抗ＧＤ３キメラ抗体および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現による活性評価を示した図である。縦軸に発現ベクター名、横軸に抗ＧＤ３キメラ抗体の活性を１００とした時の相対活性値（％）をそれぞれ示す。
第１５図  プラスミドｐｈＫＭ６４１Ｌｍ−６９の造成工程を示した図である。
第１６図  プラスミドｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＮＬ、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−１、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−４、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−７、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−８、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９の造成工程を示した図である。
第１７図  プラスミドｐＴ６４１、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲ、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＮＬ、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−１、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−４、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−７、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−８、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＴ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９を用いた抗ＧＤ３キメラ抗体および抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体の一過性発現による活性評価を示した図である。縦軸に発現ベクター名、横軸に抗ＧＤ３キメラ抗体の活性を１００とした時の相対活性値（％）をそれぞれ示す。
第１８図  プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ６４１ＨＬＣＤＲ、ｐＫＡＮＴＥＸ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−９、ｐＫＡＮＴＥＸ６４１ＨＬＣＤＲＬｍ−６９の造成工程を示した図である。
第１９図  精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーン１が高分子量マーカー、２がＫＭ８８６９、３がＫＭ８８７０、４がＫＭ８８７１、５が低分子量マーカー、６がＫＭ８８６９、７がＫＭ８８７０、８がＫＭ８８７１の泳動パターンをそれぞれ示す。
第２０図  精製した抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１と精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のＧＤ３との結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はＧＤ３との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がＫＭ８７１、●がＫＭ８８６９、□がＫＭ８８７０、■がＫＭ８８７１の活性をそれぞれ示す。
第２１図  精製した抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１と精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のＧＤ３との結合活性をプレートに吸着させるＧＤ３量を変化させて測定した図である。縦軸はＧＤ３との結合活性、横軸はプレートに吸着させたＧＤ３量をそれぞれ示す。○がＫＭ８７１、●がＫＭ８８６９、□がＫＭ８８７０、■がＫＭ８８７１の活性をそれぞれ示す。
第２２図  精製した抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１と精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１の各種ガングリオシドとの反応性を示した図である。縦軸にガングリオシドの種類、横軸に結合活性をそれぞれ示す。ＡｃＧＭ２はＮ−アセチルＧＭ２、ＧｃＧＭ２はＮ−グリコリルＧＭ２、ＡｃＧＭ３はＮ−アセチルＧＭ３、
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■がＫＭ８８７１の反応性をそれぞれ示す。
第２３図  精製した抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１と精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１およびＳＫ−ＭＥＬ−２８との反応性を示した図である。縦軸に細胞数、横軸に蛍光強度をそれぞれ示す。各図は下段より、コントロール、ＫＭ８７１、ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１の反応性をそれぞれ示す。
第２４図  精製した抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１と精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１およびＳＫ−ＭＥＬ−２８に対するＣＤＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸
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ＫＭ８８７１の活性をそれぞれ示す。
第２５図  精製した抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ８７１と精製した抗ＧＤ３ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８８６９、ＫＭ８８７０、ＫＭ８８７１のヒトメラノーマ細胞株Ｇ−３６１およびＳＫ−ＭＥＬ−２８に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸
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ＫＭ８８７１の活性をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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