(57)【要約】本発明は、多種多様な選定分子を多種多様な細胞に高効率に導入することができる方法および細胞を融合する方法を提供する。細胞および／またはポリヌクレオチド等の選定分子を低温ガスプラズマで処理することにより、細胞の近傍に存在する選定分子を細胞内に導入するまたは細胞を低温ガスプラズマで処理することにより、細胞を融合する。さらに本発明は、細胞に選定分子を導入するための低温ガスプラズマ発生装置をもつ選定分子導入または細胞融合のための装置を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に、選定分子を導入する方法であって、細胞および／または選定分子を低温ガスプラズマで処理することにより、細胞の近傍に存在する選定分子を細胞内に導入することからなる選定分子導入方法。
【請求項２】
細胞の近傍にあらかじめ選定分子を存在せしめた後、細胞を低温プラズマで処理することからなる請求項１の選定分子導入方法。
【請求項３】
選定分子がポリヌクレオチドである請求項１または２の選定分子導入方法。
【請求項４】
細胞をプラズマで処理することにより、細胞を融合する方法
【請求項５】
細胞および／または選定分子を標的に、低温ガスプラズマで処理することにより、細胞の近傍に存在する選定分子を細胞内に導入することを可能とする、または細胞をプラズマで処理することにより細胞を融合すを可能とするための装置。。
【請求項６】
請求項５において、開放形の放電による低温ガスプラズマ発生装置をもつ選定分子導入装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、遺伝子等のポリヌクレオチドや蛋白質、生理活性分子等の選定分子を細胞内に導入する方法および細胞の融合方法またはこれらのための装置に関する。
背景技術
近年、医学、薬学等の分野において、遺伝子工学や医薬品開発を行う際に、遺伝子等のポリヌクレオチドや蛋白質、生理活性分子、薬剤候補品等の選定分子を細胞内に導入し、細胞内での遺伝子の機能や生理活性分子の生理的な活性を試験する必要性が増している。現在、選定分子導入法としてエレクトロポレーション法、ジーンガン法、リポソーム法、細胞融合法、ウイルスベクター法などの方法が用いられているが、必ずしも十分に選定分子を細胞内に導入できるものではなかった。
エレクトロポレーション法やジーンガン法においては、多くの細胞に応用できるが、操作が煩雑であり、ＨＴＳ化することは難しく、また、リポソーム法は、応用できる細胞が限定されるといった問題点があった。更に、いずれの方法も高価であるため、仮にＨＴＳ化できたとしても、非常に高価なものとなる。また、多くの場合、導入効率においても満足できるものではなかった。
ヒトやマウスの遺伝子配列の解読がなされ、機能未知な遺伝子の機能解析が急務になっているなかで、ＨＴＳ化された遺伝子導入方法の開発が必要不可欠である。ＨＴＳ化においても、高効率であること、また様々な遺伝子の機能解析を可能にするには、特定の限られた細胞への遺伝子導入ではなく、様々な細胞への高効率な遺伝子導入法の開発が急務である。
本発明は、かかる従来の問題点を解決し、高効率に多種の細胞に選定分子を導入する方法および細胞の融合方法を提供することを目的とする。
発明の開示
本願発明者等は、細胞および／または選定分子を低温ガスプラズマで処理することにより、細胞の近傍に存在する選定分子を細胞内に導入することを見いだし本発明を完成した。さらに、細胞を低温ガスプラズマで処理することにより、細胞は融合を起こすことを見いだした。
すなわち、本発明は以下の示す通りである。
［１］細胞に、選定分子を導入する方法であって、細胞および／または選定分子を低温ガスプラズマで処理することにより、細胞の近傍に存在する選定分子を細胞内に導入することからなる選定分子導入方法。
［２］細胞の近傍にあらかじめ選定分子を存在せしめた後、細胞低温プラズマで処理することからなる［１］の選定分子導入方法。
［３］選定分子がポリヌクレオチドである［１］または［２］の選定分子導入方法。
［４］細胞をプラズマで処理することにより、細胞を融合する方法。
［５］細胞および／または選定分子を標的に、低温ガスプラズマで処理することにより、細胞の近傍に存在する選定分子を細胞内に導入することを可能とする、または細胞をプラズマで処理することにより細胞を融合すを可能とするための装置。
［６］［５］において、開放形の放電による低温ガスプラズマ発生装置をもつ装置。
本発明における選定分子とは、目的の細胞に導入するために選定した分子をいう。このような選定分子とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等のポリヌクレオチドまたはその誘導体、シグナル伝達蛋白質や転写調節因子等の蛋白質やその誘導体等の高分子化合物、低分子生理活性物質、薬剤候補品が含まれる。このような選定分子の中でも、ポリヌクレオチドおよびその誘導体が好ましい。
本発明における細胞とは、選定分子を導入する目的の細胞であり、特に限定されない。このような細胞の例としては、大腸菌、放線菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞等の真核細胞が挙げられる。また、赤血球ゴーストやリポソーム等の脂質二重膜構造をもつものも本発明で言う細胞に含まれる。
これらの細胞への選定分子の導入効率を上げるためには、遺伝子導入の際に一般的に用いられるコンピータント細胞の作成法に準じて作成した細胞を用いても良い。また、リポフェクタミン（ギブコＢＲＬ社製）等のカチオン性脂質やリポソームを用いたリポソーム法等の他の遺伝子導入法と組み合わせることにより、更に選定分子の細胞への導入効率を高めることができる。
本発明においては、使用される低温ガスプラズマ（低温非平衡プラズマ、低温弱電離プラズマ）は、例えばコロナ放電により発生させることができるが、発生装置のタイプや発生条件によりその性質を変えることができる。本発明を実施するために使用するプラズマは、用いる細胞や選定分子、操作を行う環境等によりそのガスの種類やプラズマ密度、電子温度、処理時間等は、適宜選択される。低温ガスプラズマに、使用するガスの種類としては、酸素、空気、二酸化炭素、窒素、アルゴンからなる群から選ばれた少なくとも１種であることが好ましい。
本発明において、使用される低温ガスプラズマの発生装置は、密閉型、開放型いずれの発生装置を用いても良いが、細胞の処理の容易性からは開放型の装置が望ましい。
本発明の装置の具体的な例としては、例えば図１で示されたタイプのものがある。本装置は、電気系統とガス系統から構成され、電気系統の信号発生器，リニアンプ，整合回路，昇圧トランスにより、電極間電圧、電極間距離、周波数，パルス周期，Ｄｕｔｙなどのパラメータを種々の条件に設定することができ、その条件下でヘッド部で放電させることにより種々のプラズマが発生する。一方ガス系統では、ガスボンベまたはエアーポンプより供給された単一または混合ガスが、ニードル弁で適当な流量に設定されてヘッド部に供給される。ヘッド部で生成したプラズマはガスによって吹き出され、その先に設置した試料に照射される。細胞、生物種、あるいは選定分子（遺伝子、低分子、蛋白などを含む）など、試料ごとにその試料に適した条件でプラズマを照射できるようにするため、これらの条件を変化させ、プラズマとその照射の条件の設定を変化させることができる。
本発明の具体的な態様としては、例えばプレート等の細胞培養容器上で培養した培養接着細胞もしくは遠心またはろ過等の操作で採取した細胞の培養液を除いた後、細胞表面に選定分子を含む溶液を少量加える。その後、プラズマ発生機による発生したプラズマを利用してプラズマ処理をおこなう。プラズマの処理時間は、その条件により異なるが、概ね数秒から数十秒である。プラズマ処理後、培地を加えて培養する。選定分子が遺伝子等を含むベクターである場合は、遺伝子組み換え実験に、選定分子が例えば、細胞内標的分子に対する薬剤候補物質である場合は、そのスクリーニングが有効に行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されるものではない。
実施例１
第１図に従い、本発明の装置を作成した。本装置は、プラズマ照射機の条件として、電極間電圧数ｋＶ〜十数ｋＶ、電極間距離１０〜１５ｍｍ、周波数２０〜４０ｋＨｚ、パルス周期３０〜９０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ  ２５〜１００％、ガスとしては空気，窒素，酸素，二酸化炭素，アルゴン，ヘリウム：空気＝１：１などの条件でそれぞれ約１〜５秒間照射した。電極から試料までの距離はおよそ１〜３ｃｍで適正な条件を選択した。
本装置により、例えば第３図から第５図に表示したような分光スペクトルを有するプラズマを発生させることができる。同プラズマ発生装置により遺伝子導入を実施した。
チャイニーズハムスター肺線維芽細胞ＣＨＬ細胞を直径６０ｍｍのｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅにまき、３７℃，二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。培養細胞数は１ｗｅｌｌあたり１ｘ１０６個で培養を開始した。細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に１１０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加え、本願の装置で様々な条件でプラズマ照射を行なった。プラズマ照射後直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ蛋白の発現を観察し、視野あたりの発現細胞数を定量化した。また、ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いてｗｅｌｌ内全細胞あたりのＧＦＰ蛋白発現細胞を定量化した。
その結果、いずれの条件においてもＧＦＰの発現が観察された。導入効率としては顕微鏡による目視で最大約６０％、ＦＡＣＳによる検討で約５〜２５％であった。
なお、同タイプの装置として、ＫＥＹＥＮＣＥ社よりプラズマ照射器ＳＴ−７０００が市販されており、同装置により、第５図に表示したような分光スペクトルを有するプラズマを発生させることができ、本発明の目的にも使用可能である。
実施例２．
２−１）接着性動物樹立細胞株への導入
動物樹立細胞を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまき、３７℃，二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。培養細胞数は１ｗｅｌｌあたり、チャイニーズハムスター肺線維芽細胞ＣＨＬ細胞の場合１ｘ１０６個、ヒト子宮癌由来Ｈｅｌａ細胞の場合２．５ｘ１０５個で培養を開始した。細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に５０μｌのＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１）液（１μｇ／μｌ）を加え、プラズマ発生装置によるプラズマ照射を行なった。プラズマ照射機の条件として、放電時電極間電圧１０〜１４ｋＶ、電極間距離１３ｍｍ、周波数２３．３ｋＨｚ、パルス周期６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ  ５０％、ガス  空気、ガス流量３８Ｌ／ｍｉｎの条件でそれぞれ約３秒間照射した。電極から試料までの距離は適正な条件を選択した。プラズマ照射後直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ蛋白の発現を観察し、視野あたりの発現細胞数を定量化した。また、ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いてｗｅｌｌ内全細胞あたりのＧＦＰ蛋白発現細胞を定量化した。
その結果、いずれの細胞においてもＧＦＰの発現が観察された。導入効率としては放電時電極間電圧１０〜１４ｋＶ、電極間距離１３ｍｍ、周波数２０ｋＨｚ、パルス周期６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ  ５０％、ガス  空気、ガス流量３８Ｌ／ｍｉｎの条件において、顕微鏡による目視で最大約７０％、ＦＡＣＳによる検討（シャーレ内全細胞数当たりの遺伝子導入効率）で約３０％であった。Ｈｅｌａ細胞は既存法では導入効率が低いとされているが、本発明の方法により領域によっては約７０％程度と高い導入効率を得ることが可能になった。
実施例３．浮遊性動物樹立細胞株への導入
ヒト急性リンパ芽球性白血病末梢血由来Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞を２．２５ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌリン酸バッファー懸濁液を調製し、その２５μｌに等量のＧＦＰ発現プラスミド溶液（２μｇ／μｌ）を混合後、その混合液を新しい６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり５０μｌ入れた。Ｗｅｌｌ底面に薄く広げたのちプラズマ発生装置によるプラズマ照射を行なった。本願の装置の条件は実施例１に準じて実施した。プラズマ照射後直ちに培地を加えて３７℃，二酸化炭素５％の条件下で一晩培養後、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ蛋白の発現を観察し、さらにＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いてｗｅｌｌ内全細胞あたりのＧＦＰ蛋白発現細胞を定量化した。
その結果、蛍光顕微鏡を用いた観察によりＧＦＰ蛋白の発現が観察された。ＦＡＣＳを用いて検討した導入効率としては約２５％であった。
実施例４．ラット大脳皮質細胞への導入
ラット大脳皮質は次のように調製した。すなわち、妊娠ラット（Ｗｉｓｔｅｒ，１７日目）を麻酔後開腹して胎仔を子宮ごとＬ−１５（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中に取り出し、胎仔全脳中より大脳皮質部位を切り分けた。大脳皮質部に０．２５％トリプシン溶液４０ｍｌと１％ＤＮＡｓｅ溶液８０μｌを加え、３７℃で２０分間インキュベート後、上清を捨ててＦＢＳ  １０ｍｌを加え、ピペッティングで細胞をほぐした。これをセルストレイナーに通し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を２０ｍｌ程度加えて遠心により細胞を集めた。５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培養開始用Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（２５μＭグルタミン酸、５００μＭグルタミン、３０ｎＭ  ＮａＳｅＯ３、ペニシリン・ストレプトマイシン含有）に懸濁し、３７℃，二酸化炭素５％条件下で６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを用いて培養を開始した。
細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に５０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加え、プラズマ発生装置によるプラズマ照射を行なった。プラズマ照射機の条件として、放電時電極間電圧１０〜１４ｋＶ、電極間距離１３ｍｍ、周波数２３．３ｋＨｚ、パルス周期６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ  ５０％、ガス  空気、ガス流量３８Ｌ／ｍｉｎの条件でそれぞれ約１秒間照射した。プラズマ照射後直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ蛋白の発現を観察した。
その結果、ＧＦＰ蛋白発現細胞が観察された。導入効率は一視野当たり、最大で約７０％であった。既存の遺伝子導入法ではほとんど遺伝子の導入が得られなかった動物初代培養細胞において、本発明の方法により安全、簡便かつ効率的な遺伝子導入が可能になった。
実施例５．ラット小脳顆粒細胞への導入
生後９日目のＷｉｓｔｅｒラットをエーテル麻酔し脳を摘出後、小脳を切り出し髄膜を除去した。小脳を細断後、パパイン溶液（ＤＬ−システイン（Ｓｉｇｍａ）２ｍｇ，アルブミン５０ｍｇを溶かしたリン酸緩衝液１０ｍｌに、パパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ−ｂｉｏｃｈｅｍ）９０単位を混ぜて３７℃で暫く放置して活性化後、ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＴａＫａＲａ）を５０μｌ加え、使用時にはフィルター濾過滅菌した）１０ｍｌを加え、３７℃で約３０分間浸透した。ウマ血清（ＨＳ）６ｍｌを添加し遠心して沈殿した組織に血清培地（５％ＰＦＣＳ，５％ＨＳ，含有ＤＭＥ／Ｆ１２（１／１）培地）に懸濁した。これを２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるようにポリエチレンイニンコートした６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまきつけ、３７℃，二酸化炭素５％条件下で一晩培養後、１μＭ  ＡｒａＣ（Ｓｉｇｍａ）含有血清入り高カリウム（２６ｍＭ）培地（５％ＨＳ，重炭酸カリウム／２．１ｇ，３０ｎＭ  Ｎａ２ＳｅＯ４  ｉｎ  ＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ））に培地交換し、３７℃，二酸化炭素５％条件下で５日間培養した。
細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に５０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加え、プラズマ発生装置によるプラズマ照射を行なった。プラズマ照射機の条件として、放電時電極間電圧１０〜１４ｋＶ、電極間距離１３ｍｍ、周波数２３．３ｋＨｚ、パルス周期６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ  ５０％、ガス  空気、ガス流量３８Ｌ／ｍｉｎの条件でそれぞれ約１秒間照射した。プラズマ照射後直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ蛋白の発現を観察した。
その結果、ＧＦＰ蛋白発現細胞が観察された。導入効率は一視野当たり、最大で約４０％であった。既存の遺伝子導入法ではほとんど遺伝子の導入が得られなかった動物初代培養細胞において、本発明の方法により安全、簡便かつ効率的な遺伝子導入が可能になった。
実施例６．ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への導入
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞Ｔｏｔａｌ  Ｋｉｔ（東洋紡）を用いて細胞を培養した。
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり２．５×１０５個まき、３７℃，二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。細胞がプレート上によくはりついていることを確認後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に５０μｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１μｇ／μｌ）を加え、プラズマ発生装置によるプラズマ照射を行なった。プラズマ照射機の条件として、放電時電極間電圧１０〜１４ｋＶ、電極間距離１３ｍｍ、周波数２３．３ｋＨｚ、パルス周期６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ  ５０％、ガス  空気、ガス流量３８Ｌ／ｍｉｎの条件でそれぞれ約１，３秒間照射した。プラズマ照射後直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ蛋白の発現を観察した。
その結果、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞においてもＧＦＰ遺伝子の導入が観察された。導入効率は一視野当たり、最大で約５０％であった。既存の遺伝子導入法ではほとんど遺伝子の導入が得られなかった動物初代培養細胞において、本発明の方法により安全、簡便かつ効率的な遺伝子導入が可能になった。
実施例７．ＰＣ１２細胞の交感神経系への分化誘導
本発明の方法により遺伝子を導入された細胞がその細胞としての機能を維持しているか否かを検討するために、ＰＣ１２細胞について交感神経系への分化能が維持されているか否かについて検討した。
実施例１．に準じて本発明の方法によるＧＦＰ遺伝子を導入したＰＣ１２細胞の培養液に、１００  ｎｇ／ｍｌになるようにＮＧＦを添加して６日間培養を行なった後、蛍光顕微鏡にてＧＦＰ蛋白の発現が確認されているＰＣ１２細胞の形態を観察して、交感神経様細胞への分化能を検討した。
その結果、本発明の方法によりＧＦＰ遺伝子の導入されたＰＣ１２細胞は、ＮＧＦ添加６日後においてもＧＦＰ蛋白を発現し、かつ細胞の形態観察から確かに神経突起の伸展が行われていることが認められた。このことにより、プラズマ照射による遺伝子導入法は、ＰＣ１２細胞が本来持っているＮＧＦに対する交感神経様細胞への分化能という性質を変えていないことが確認された。
実施例８．ＰＣ１２細胞への遺伝子導入によるＣＲＥＢの活性化（レポータージーンアッセイ）
本発明の方法により導入された遺伝子が細胞内でその機能を発揮できるか否かについて検討するために、ＰＣ１２細胞へ導入されたＣＲＥＢが同じく導入されたＰＫＡ遺伝子により活性化されるか否かをレポータージーンアッセイを用いて検討した。
ラットｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１７２１）をコラーゲンＩＶでコートした６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり１ｘ１０６個まき、３７℃，二酸化炭素５％条件下で一晩培養した。細胞がプレートによくはりついていることを確認した後、培養プレートから培地を除去して細胞表面に、ＰＫＡ遺伝子（ｐＦＣ−ＰＫＡ）（１μｇ／μｌ）と活性化ＣＲＥＢの応答配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結されているＣＲＥＢレポーター遺伝子（ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ）（１μｇ／μｌ）および内部標準としてウミシイタケのルシフェラーゼ遺伝子（ｐＲＬ−ＳＶ４０）をそれぞれ１７μｌずつ混合した混合液を用い、実施例２．に準じて本発明の方法によって共導入したＰＣ１２細胞の導入１日後におけるルシフェラーゼ活性を検討した。
その結果、コントロールベクターを導入した細胞に比較して、ＰＫＡを導入した細胞は、有意にルシフェラーゼ活性の上昇、すなわちＣＲＥＢの転写活性の上昇が認められた。このことによりプラズマ照射による遺伝子導入法において、樹立培養細胞であるＰＣ１２細胞において、導入された遺伝子がその機能を発現することが確認された。
実施例９．ラット小脳顆粒細胞への遺伝子導入によるＣＲＥＢの活性化（レポータージーンアッセイ）
従来法では遺伝子の導入が困難な動物初代培養細胞においても、同様のことが確認されるか否かを検討するために、ラット小脳顆粒細胞を用いて実施例８．と同様に検討した。
実施例５．に準じて樹立したラット小脳顆粒細胞に、ＰＫＡ遺伝子（ｐＦＣ−ＰＫＡ）（１μｇ／μｌ）と活性化ＣＲＥＢの応答配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結されているＣＲＥＢレポーター遺伝子（ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ）（１μｇ／μｌ）および内部標準としてウミシイタケのルシフェラーゼ遺伝子（ｐＲＬ−ＳＶ４０）を実施例２．に準じた方法にてプラズマ発生装置を用いて共導入して培養１日後、ルシフェラーゼ活性について検討した。
その結果、ラット初代神経細胞のルシフェラーゼ活性はコントロール遺伝子を導入した細胞と比較して有意に上昇していた。従って、ラット初代神経細胞（ラット小脳顆粒細胞）においても、プラズマ導入法はＰＫＡによるＣＲＥＢシグナル伝達経路に異常を与えていないことが確認された。
このようにプラズマ照射による遺伝子導入法は、従来法では遺伝子導入が困難であった初代神経細胞を用いても遺伝子が導入されてその機能が発現し、またこれを用いて簡単にレポータージーンアッセイを行なえることが明らかとなった。
実施例１０．ラット小脳顆粒細胞へのＢＡＤ遺伝子導入によるアポトーシスの誘導
ラット小脳顆粒細胞を実施例５．に準じて調製し、ＡｒａＣ添加後５日目の細胞について、培地を抜き取った後、１ｗｅｌｌ当たリアポトーシス誘導遺伝子であるＢＡＤ遺伝子（ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ−ＢＡＤ）溶液（１μｇ／５０μｌ）５０μｌを添加して実施例２．の条件下でプラズマ照射を行なった。その後直ちに培地を添加し、３７℃，二酸化炭素５％条件で一晩培養後、ＣａｓｐＡＳＥ  ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＣａｓｐａｓｅ活性を測定することによりアポトーシスが誘導されているか否かについて検討した。
その結果、ベクターのみを導入したＭＯＣＫ細胞に比べ、ＢＡＤ遺伝子導入細胞では有意にＣａｓｐａｓｅ活性を有する、つまり、アポトーシス誘導細胞が検出された。
また本発明の方法によりＢＡＤ遺伝子を導入された細胞が確かにアポトーシスを誘導されていることを確認するために、ＡＰＯ−ＤＩＲＥＣＴ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてＤＮＡ断片化も合わせて検討した。
その結果、ベクターのみを導入したＭＯＣＫ細胞に比べ、ＢＡＤ遺伝子導入細胞では有意にＤＮＡ断片化を起こしている細胞が検出された。
これらの結果、本発明の方法によって導入されたＢＡＤ遺伝子はラット小脳顆粒細胞に対し有意にアポトーシスを誘導し、その機能を発揮することが確認された。以上のことから本発明の方法により初代培養細胞に導入された遺伝子は細胞に対し確かにその機能を発揮することが確認された。
２）
実施例１１．チャイニーズハムスター肺由来ＣＨＬ細胞、ヒト子宮癌由来Ｈｅｌａ細胞、およびラットｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ＰＣ１２細胞を用いた細胞融合の検討
実施例２．に準じてＧＦＰ遺伝子を導入したＣＨＬ細胞、およびＨｅｌａ細胞について、蛍光顕微鏡を用いて融合細胞の検出を行なった。またディフ・クイック（国際試薬）を用いて核を染色し、融合細胞の様子を顕微鏡にて観察した。核の染色は次のように行なった。すなわち、プラズマ処理して培養１日後の細胞について、細胞培養液を吸い取りリン酸緩衝液でシャーレに接着している細胞を洗浄後、１ｗｅｌｌ当たりメタノール（和光）を約５ｍｌ加え、室温にて５分間固定した。その後染色液Ｉを１ｗｅｌｌ当たり約２ｍｌ添加後すぐ吸い取り続いて染色液ＩＩを約２ｍｌ添加後またすぐ吸い取った。イオン交換水で接着細胞を数回洗浄後顕微鏡にて細胞を観察した。
本発明の方法によりＧＦＰ遺伝子を導入されたＣＨＬ、およびＨｅｌａ細胞の中には、細胞が融合されて大きくなった細胞が観察された。またプラズマを照射されたそれぞれの細胞の核を染色したところ、細胞とともに核も融合しているもの、また細胞が融合して多核になっているものが観察された。
また、細胞数を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの１ｗｅｌｌに５ｘ１０６個とやや多めにまいた条件で、実施例１．に準じた方法でＧＦＰ遺伝子を導入したラットｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ＰＣ１２細胞について、実施例７．に準じた方法でＮＧＦを添加し分化能を検討した。
融合細胞についてもＮＧＦ添加６日後においてＧＦＰ蛋白を発現し、かつ確かに神経突起の伸展が行われていることが認められた。このことにより、プラズマ照射により形成された融合細胞もＰＣ１２細胞が本来持っているＮＧＦに対する交感神経様細胞への分化能という性質を変えていないことが示唆された。
実施例１２．リポソーム法との組み合わせ
本発明の方法を利用することによりリポソーム法では導入されにくい条件における、細胞への遺伝子導入を可能にするか否かについて検討した。
リポソーム法は、リポソーム試薬と導入プラスミドとの混合により適切なサイズの混合粒子を作製し、細胞に取り込ませる方法である。そのため、細胞に取り込まれる適正なサイズ、数量の粒子を作製する必要がある。適正化された条件より濃い濃度のプラスミド、およびリポソーム試薬の条件において細胞への遺伝子導入効率が改善されるか否かをＧＦＰ遺伝子を用いて次のように検討した。
すなわち、予めＧＦＰ発現用プラスミド１００μｇとＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）１００μｌを混合し、室温で１５分間静置してプラスミド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを作製した。前日から６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにて培養していたＣＨＬ細胞の培養上清を抜き取り、プラスミド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを２００μｌ添加した。プラズマ照射機にて周波数２３．３ｋＨｚ、パルス周期６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ  ５０％、ガス  空気、ガス流量３８Ｌ／ｍｉｎの条件でプラズマを照射後、直ちに培地を加えて３７℃，二酸化炭素５％条件下で培養した。１日培養後、蛍光顕微鏡、およびＦＡＣＳを用いてＧＦＰ蛋白発現細胞を検出した。
この条件下においてもリポソーム法単独でわずかにＧＦＰの導入された細胞が検出された。本発明の方法を組み合わせたものは、リポソーム法単独に比べ、プラズマ照射領域において遺伝子導入細胞が増加していた。またｗｅｌｌ中の総細胞数に対する遺伝子導入細胞の割合をＦＡＣＳを用いて検討したところ、本発明の方法を組み合わせたものはリポソーム法単独の約１．６倍の導入効率の増加が見られた。従って、本発明の方法は他の遺伝子導入法と組み合わせることにより、また、リポソーム、またはそれに変わるようなプラスミドに細胞への移動を促す担体などを結合させることにより、これまで導入効率の悪かった条件下、および細胞において導入効率の改善が見込まれることが期待される。
実施例１３．プラズマ照射器による培養細胞へのＧＦＰ発現プラスミドの導入を検討した。
方法：ラットｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１７２１）をコラーゲンＩＶでコートした６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ウェルあたり１ｘ１０６個まき、一夜培養を行った。細胞がプレート上によく張り付いていることを確認した後、培養プレートから培地を除去して、細胞表面に５０ｕｌのＧＦＰ発現プラスミド液（１ｕｇ／ｕｌ）を加え、プラズマ照射機ＳＴ−７０００（株式会社キーエンス社製）によるプラズマ照射を行った。プラズマ照射機ＳＴ−７０００の条件として、周波数はＨｉｇｈ、ＬｏｗまたはＭｅｔａｌの３条件において、それぞれ約５秒間照射した。プラズマ照射後、直ちに培地を加えて一晩培養し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ蛋白の発現を観察した。
結果：いずれの条件においても、ＧＦＰの発現が確認された。
導入効率としては周波数がＨｉｇｈの条件において最も高く、５０〜６０％であった
実施例１４
ヌードマウス（８週齢、メス、日本チャールスリバー）を麻酔下で腹部一面に薄くＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅ（１０ｍｇ／ｍｌ生理食塩水溶液）を塗り付けた。プラズマ照射装置を用いて、放電時電極間電圧１０〜１４ｋＶ、電極間距離１３ｍｍ、周波数２３．３ｋＨｚ、パルス周期６０Ｈｚ、Ｄｕｔｙ  ５０％、ガス  空気、ガス流量３８Ｌ／ｍｉｎの条件で２．５秒間照射した。電極から腹部までの距離は、遠い箇所で約２４ｍｍ、近い箇所で約１８ｍｍであった。そのまま３分程度放置後、Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅを塗り付けた場所を水を含んだ脱脂綿、続いて７０％エタノールを含んだ脱脂綿できれいに拭き取り、皮膚への色素の沈着を観察した。そして、プラズマのみを照射したもの、Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅを塗り付けてプラズマを照射しなかったものと、それぞれ比較した。
その結果、プラズマを照射しただけのマウス、Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅを塗り付けてプラズマを照射しなかったマウスはいずれも皮膚に色素の沈着は見られなかった。それに対し、Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅを塗り付けてプラズマを照射したものは、腹部のプラズマ照射領域に青色の斑点がいくつか観察された。また、約２４時間後においてもその斑点は観察された。従って、プラズマによりＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅなみの分子量の物質は動物個体に導入されたと考えられる。
これまで、非温熱超音波により動物個体に経皮的に色素が導入されることが発表されている（立花克郎；福岡大医／２００１年日本分子生物学会）が、プラズマ法でも同様に動物個体への物質の導入が可能であることが示唆される。
産業上の利用可能性
本発明により、多種多様な選定分子を多種多様な細胞に高効率に導入することができる。また細胞融合も行うことができる。さらに、エレクトロポレーションのように、１つ１つの試料に対し電極を用いて、電界をかける様な煩雑な操作の必要もなく、また遺伝子銃のような大がかりな装置も必要としない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、この発明にかかる遺伝子導入または細胞融合のための装置の模式図である。
第２図は、この発明にかかる遺伝子導入または細胞融合のための装置のプラズマ発生部（電極部）と試料の関係を表す模式図である。
第３図、第４図および第５図は、この発明の実施例で用いた遺伝子導入または細胞融合のための装置から、種々の条件で発生するプラズマを分光的に測定した結果を示した。測定は大塚電子製分光器ＭＣＰＤ−３０００を用いて、プローブをプラズマより約３ｃｍ離れた位置に設置して、プラズマの分光スペクトルを取得した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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