(57)【要約】ラミニン５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体と生体試料とを接触させる工程、前記抗体の反応を測定する工程、及び、前記反応の測定結果に基づいてラミニン５抗原の量を決定する工程を含んでなる、生体試料中のラミニン５抗原を測定する方法、ならびに、この方法を利用したラミニン５を産生する癌細胞の検出法、急性呼吸窮迫症候群の検査法及び悪性腫瘍の悪性度の判定法。
2003016907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニン５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体と生体試料とを接触させる工程、前記抗体の反応を測定する工程、及び、前記反応の測定結果に基づいてラミニン５抗原の量を決定する工程を含んでなる、生体試料中のラミニン５抗原を測定する方法。
【請求項２】
抗体が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４の受託番号で寄託されている細胞により産生されるモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ラミニン５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体を含有してなる、生体試料中のラミニン５抗原の測定試薬。
【請求項４】
抗体が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４の受託番号で寄託されている細胞により産生されるモノクローナル抗体である、請求項３に記載のラミニン５抗原の測定試薬。
【請求項５】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４の受託番号で寄託されている細胞により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の方法により生体試料中のラミニン５抗原を測定する工程、及び、前記ラミニン抗原の測定結果に基づいてラミニン５を産生する癌細胞を検出する工程を含んでなる、ラミニン５を産生する癌細胞を検出する方法。
【請求項７】
請求項３又は４に記載の測定試薬を含んでなる、ラミニン５を産生する癌細胞の検出用の検査試薬。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の方法により生体試料中のラミニン５抗原を測定する工程、及び、前記ラミニン５抗原の測定結果に基づいて急性呼吸窮迫症候群を検査する工程を含んでなる、急性呼吸窮迫症候群を検査する方法。
【請求項９】
請求項３又は４に記載の測定試薬を含んでなる、急性呼吸窮迫症候群の検査用の検査試薬。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の方法により生体試料中のラミニン５抗原を測定する工程、及び、前記ラミニン５抗原の測定結果に基づいて悪性腫瘍の悪性度を判定する工程を含んでなる、悪性腫瘍の悪性度を判定する方法。
【請求項１１】
請求項３又は４に記載の測定試薬を含んでなる、悪性腫瘍の悪性度の判定用の検査試薬。
【請求項１２】
ラミニン５に反応性を有する抗体と、細胞の培養上清とを接触させる工程、前記抗体の反応を測定する工程、及び、前記反応の測定結果に基づいて前記細胞のβ４インテグリンの発現量を決定する工程を含んでなる、β４インテグリン発現を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体試料中のラミニン５抗原の測定方法及び測定試薬に関する。
背景技術
基底膜はコラーゲンを中心とする細胞外マトリックス成分により構成されており、生体内に普遍的に存在する。基底膜を構成する高分子タンパク質としてラミニン（以下、ＬＮと略記することがある）がある。ＬＮはその構造によって十数種に分類されており、それぞれ機能と局在組織が異なっており、例えばＬＮ１やＬＮ２の様に末尾に番号をつけて分類されている。いずれのＬＮも異なるアミノ酸配列を持つポリペプチド鎖３本が複合体を形成することにより成り立っており、電子顕微鏡下の観察では十字架様の分子形態を呈する。その３本のポリペプチド鎖はそれぞれα鎖、β鎖、γ鎖と呼ばれており、それぞれの鎖に数種の分子種（α１〜α５、β１〜β３、γ１及びγ２）が存在する。
上皮細胞と上皮細胞を裏打ちしている結合組織との間に存在する基底膜には、上皮細胞特有の細胞接着構造が存在しており、その中に主として存在する細胞外マトリックス構成タンパク質としてラミニン５（以下、ＬＮ５と略記することがある）が知られている。ＬＮ５の生理学的な特徴は、上記のＬＮ群の中で唯一上皮細胞のみから産生され、上皮細胞の基底膜への接着や運動機能を促進する活性を有することである。上皮細胞は自身の細胞膜上のインテグリンと呼ばれる特定のレセプターを介して、ＬＮ５およびＬＮ５を含む基底膜に強固に接着し、また激しく遊走する現象が知られている。
このＬＮ５はα３鎖、β３鎖、γ２鎖のそれぞれ１本ずつが複合体を形成したものである。特にγ２鎖はＬＮ５固有と考えられており、他のＬＮ分子種には含まれていない［Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８，２１３−２３４（２０００）］。また、ＬＮ５は上皮細胞から分泌される際に蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）により一部の領域で分解を受けることがわかっており、特にγ２鎖のＮ末端部が切断されることにより、Ｎ末端部が遊離した残りのＬＮ５分子本体はその細胞運動促進活性が増大することが示されている［Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４８，６１５−６２４（２０００）］。
すなわち、上皮細胞等から遊離するＬＮ５γ２鎖断片の量は、その細胞におけるＬＮ５産生量を反映しており、また、上皮組織でのＬＮ５による上皮細胞の運動促進活性を測定する指標となりうると考えられる。
最近、上皮細胞由来の悪性腫瘍組織でＬＮ５の発現が増大しているという研究結果が多数報告された。特に、ＬＮ５の発現度が悪性腫瘍の浸潤性と良く相関したという報告が多く、癌の体外診断を目的として病態マーカーとしての利用が可能ではないかと考えられている［Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９１，１８８２−１８８７（１９９９），およびＣａｎｃｅｒ，８５，２３１５−２３２１（１９９９）］。
しかし、これらの研究では、患者の体内から手術等により病理組織を摘出し切片としてから、目的のタンパク質の発現部位を抗体により免疫染色する方法が主に用いられており、実際に医療現場での体外診断に応用していく上では、定量性や汎用性に欠けているとともに、外科的手術や組織生検など患者への肉体的負担が問題となっている。このことから、比較的安全に採取できる血液などの生体試料中のＬＮ５抗原の量を測定する簡便で迅速な測定方法の確立が望まれている。
最近、ＬＮ５に対する２種のモノクローナル抗体（α３鎖に対するモノクローナル抗体ＢＭ１６５とβ３鎖に対するモノクローナル抗体６Ｆ１２）を用いた酵素免疫学的測定法（ＥＬＩＳＡ）が報告された［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２２４，１６１−１６９（１９９９）］。しかし、この報告では、ＥＬＩＳＡによって生体試料中のＬＮ５抗原を検出した例が示されていない。
発明の開示
本発明の課題は、ＬＮ５に対して特異的に結合する抗体を用いて、微量の生体試料中から、精度良く簡便にその中に含有されるＬＮ５抗原を定量する方法を提供することにある。
本発明者らは、生体試料中のＬＮ５抗原の定量方法に関して、様々な検討をする過程において、ＬＮ５γ２鎖の分解に着目した。そして、本発明者らはＬＮ５の各鎖を認識するモノクローナル抗体を作製し、上皮系癌細胞培養上清中のＬＮ５抗原を免疫学的に解析した。その結果、多くの上皮系癌細胞はその培養上清中にγ２鎖が切断されたＬＮ５を分泌することが判明した。また、作製したγ２鎖に対するモノクローナル抗体が、ＬＮ５のプロテアーゼ分解の結果遊離するγ２鎖断片に反応していることを確認した。
さらに解析を進めて、その遊離するγ２鎖断片に対して反応性を有するモノクローナル抗体を複数種類作製し、γ２鎖断片に対して反応性を有する２種の異なるモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ方式の免疫学的測定試薬を作製した。また、このＬＮ５γ２鎖断片に対して反応性を有する２種のモノクローナル抗体を用いた測定試薬により血清及び血漿中のＬＮ５抗原を効率よく測定することができることを見出した。
前述の様に、γ２鎖はＬＮ５固有の構成因子であり他のＬＮ分子種には含まれていない。すなわち、γ２鎖断片に対する抗体を用いる測定試薬は、生体試料中のγ２鎖断片、または非断片化γ２鎖、またはβ３鎖γ２鎖複合体、またはα３鎖β３鎖γ２鎖複合体のいずれの分子も測定することが可能となり、生体試料中のほとんどのＬＮ５抗原を測定し、上皮組織におけるＬＮ５の産生量を反映する病態把握上の有用な指標になると考えられる。
また、生体試料中のＬＮ５抗原の増加はどのような生体内現象を反映しているのかについても実験的検討を加えた。ヒト膵臓癌細胞株１１種について、１０％牛胎児血清存在下液体培地中で一定期間培養し、その培養上清中のＬＮ５抗原の濃度と発現している接着分子レセプターである各種インテグリンの発現量を比較した。ＬＮ５産生株６種では、ＬＮ５非産生株５種に比較して明らかにβ４インテグリンの発現量が高い傾向があった。すなわち、生体内におけるＬＮ５抗原の産生量は生体内上皮組織でのβ４インテグリン発現量の指標となりうることを実験的に示された。
さらに、ＬＮ５を産生するヒト腫瘍をヌードマウスに移植し、腫瘍の増殖と血清中のＬＮ５の濃度が相関することを見出し、血清中のＬＮ５を測定することにより、ＬＮ５を産生する腫瘍の増殖をモニター出来ることを明らかにした。
加えて、ＬＮ５が生体内臓器の中でも特に肺上皮組織に多く含まれていることから、肺の炎症性疾患において生体内のＬＮ５代謝が高まるのではないかという仮説を立てた。その仮説の元に、急性呼吸窮迫症候群（Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｔｒｅｓｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、以下ＡＲＤＳと称す）患者から採取した血漿検体と健常人から採取した血漿検体中のＬＮ５抗原濃度を上記方法にて測定した。健常人群に比較して、急性呼吸窮迫症候群患者群は明らかに高い血中濃度を示し、本疾患の臨床診断に極めて有用であることを見出した。
以上の知見に基づき本発明は完成された。すなわち本発明は、以下のものを提供する。
１．ラミニン５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体と生体試料とを接触させる工程、前記抗体の反応を測定する工程、及び、前記反応の測定結果に基づいてラミニン５抗原の量を決定する工程を含んでなる、生体試料中のラミニン５抗原を測定する方法。
２．抗体が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４の受託番号で寄託されている細胞により産生されるモノクローナル抗体である、１に記載の方法。
３．ラミニン５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体を含有してなる、生体試料中のラミニン５抗原の測定試薬。
４．抗体が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４の受託番号で寄託されている細胞により産生されるモノクローナル抗体である、３に記載のラミニン５抗原の測定試薬。
５．ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４の受託番号で寄託されている細胞により産生されるモノクローナル抗体。
６．１又は２に記載の方法により生体試料中のラミニン５抗原を測定する工程、及び、前記ラミニン抗原の測定結果に基づいてラミニン５を産生する癌細胞を検出する工程を含んでなる、ラミニン５を産生する癌細胞を検出する方法。
７．３又は４に記載の測定試薬を含んでなる、ラミニン５を産生する癌細胞の検出用の検査試薬。
８．１又は２に記載の方法により生体試料中のラミニン５抗原を測定する工程、及び、前記ラミニン５抗原の測定結果に基づいて急性呼吸窮迫症候群を検査する工程を含んでなる、急性呼吸窮迫症候群を検査する方法。
９．３又は４に記載の測定試薬を含んでなる、急性呼吸窮迫症候群の検査用の検査試薬。
１０．１又は２に記載の方法により生体試料中のラミニン５抗原を測定する工程、及び、前記ラミニン５抗原の測定結果に基づいて悪性腫瘍の悪性度を判定する工程を含んでなる、悪性腫瘍の悪性度を判定する方法。
１１．３又は４に記載の測定試薬を含んでなる、悪性腫瘍の悪性度の判定用の検査試薬。
１２．ラミニン５に反応性を有する抗体と、細胞の培養上清とを接触させる工程、前記抗体の反応を測定する工程、及び、前記反応の測定結果に基づいて前記細胞のβ４インテグリンの発現量を決定する工程を含んでなる、β４インテグリン発現を測定する方法。
発明を実施するための最良の形態
本明細書におけるＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片とは、γ２鎖が分解されて生じる断片のうちのＮ末端側の断片を意味する。Ｎ端断片は、通常には、生体試料中に遊離し得る断片、すなわち、液体試料である生体試料に、又は、生体試料から調製される液体画分に存在し得る断片である。このようなＮ端断片の例としては、γ２鎖のドメインＩＶ及びＶを含む、分子量約５万の断片が挙げられる。
本明細書におけるＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体とは、ＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片に対して免疫化学的に結合する抗体、すなわち、抗原抗体反応を示す抗体を意味する。
本明細書における生体試料とは、血清、血漿、髄液、腹水、尿、涙液、汗、唾液といった体液、排泄物や組織抽出物などであり、医療機関等において通常採取されるものであれば特に限定されるものではないが、被験者からの血清及び血漿などの血液検体が特に好適である。
本明細書におけるＬＮ５抗原とは、ＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体が免疫化学的に反応する抗原であり、ＬＮ５γ２鎖及びそのＮ端断片ならびにγ２鎖を含む複合体が包含される。
本発明の、生体試料中のＬＮ５抗原を測定する方法における、ＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体と生体試料とを接触させる工程、前記抗体の反応を測定する工程、及び、前記反応の測定結果に基づいてＬＮ５抗原の量を決定する工程は、抗体として、ＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体を用いる他は、通常の免疫化学的方法による抗原の測定方法と同様でよい。
本発明の測定方法においては、分解して体液中に分泌され、生体試料からも測定可能なＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片を、このＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、さらに好ましくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４の受託番号で寄託されている細胞により産生されるモノクローナル抗体を用いて免疫化学的方法により測定することが好ましい。
免疫化学的方法としては、ラテックス凝集法、競合法、サンドイッチ法等などがあるが特に限定されるものではない。競合法、サンドイッチ法では、それぞれＬＮ５抗原あるいは抗体を放射性標識、酵素標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識または蛍光標識等の標識物質により標識し、標識に適した方法により検出する。好ましくは酵素標識、電気化学発光標識した抗体を用いたサンドイッチ法、さらに好ましくは電気化学発光標識した抗体を用いたサンドイッチ法が適している。
本発明の測定試薬は、本発明の測定方法に用いる測定試薬であり、少なくともＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、さらに好ましくはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４の受託番号で寄託されている細胞により産生されるモノクローナル抗体を含み、場合によっては、ＬＮ５の標準抗原、標識の種類に応じた該標識の検出試薬、例えば酵素標識であれば酵素の基質を含んでいても良い。また、測定試薬中に適当なバッファーを含むことも許される。抗体に、測定試薬に用いるのに許容可能な担体や標識を結合させて、固定化抗体や標識抗体としてもよい。本発明の測定試薬は、抗体を含む試薬の製造に通常に用いられる技術を選択して用いることにより製造することができる。測定試薬が複数の構成成分からなる場合には、キットとされていてもよい。
ＬＮ５γ２Ｎ端断片に反応性を有する抗体は、精製ＬＮ５γ２鎖断片を実験動物に免疫感作して得られる抗血清由来のポリクローナル抗体などＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片に対して結合性を有するものであれば特に限定されるものではないが、反応特異性に優れており製造のコストも低いことからマウスモノクローナル抗体が最適である。
モノクローナル抗体の作製法を以下に述べる。ヒトＬＮ５は既に報告されている方法に従って精製することができる［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７６，６３−７２（１９９８）］。精製ＬＮ５または精製ＬＮ５γ２鎖断片を免疫用抗原として生理食塩水などに溶解し、適当なアジュバントとともに実験動物体内へ投与する。実験動物としては業者から入手されるものが挙げられ、特に限定されないが、特にＢａｌｂ／Ｃマウスがよく用いられる。その抗原の投与を数週間間隔で数回繰り返す。最後の投与が終了した３日後にその免疫動物から脾臓を摘出する。摘出した脾臓細胞を単細胞に分散させ、あらかじめ培養しておいたマウスミエローマ細胞とポリエチレングリコール試薬の存在下に細胞融合する。細胞融合した後に薬剤により選択培養を行い、ＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のみを選別する。その後、抗体産生細胞は数回のクローニング操作により完全なモノクローナル抗体産生細胞として樹立される。モノクローナル抗体の特異性は、例えば、免疫に使用した精製抗原を電気泳動により分離しウエスタンブロット解析等を行うことにより確認することができる［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）］。
またモノクローナル抗体としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４の受託番号で寄託されている細胞が産生する抗体を使用することができる。
以下にＥＣＬ法について説明する。生体試料中のＬＮ５抗原のＥＣＬ測定においては、その測定方式としても様々なものが知られているが、特に簡便で定量性が高いものとして第１抗体固相化磁気ビーズとルテニウム錯体によって標識した第２抗体を同時に用いたサンドイッチ方式が好ましい。この場合の第１抗体と第２抗体はＬＮ５γ２鎖断片に対して特異的に反応するものの、それぞれ異なる抗原決定基に結合することが望ましい。
標準抗原は、ヒト癌細胞株、例えばヒト癌細胞株の培養上清より精製して、吸光度分析等によりタンパク質濃度を決定し調製することができ、使用時に希釈液にて適度な濃度に希釈して使用することができる。
以下に測定手順の一例について説明するが、本発明はこの例に限定されるものではない。
ＬＮ５γ２鎖断片抗体（第１抗体）を市販磁気ビーズに固相化させる。固相化は共有結合により結合させても非共有結合により結合させても構わない。次に、他の分子の磁気ビーズへの非特異結合を低減するためにミルクカゼインなどのブロッキングタンパク質を吸着させる。
そこへあらかじめ濃度の明らかな標準ＬＮ５抗原溶液、または被験生体試料を加えて一定時間撹拌する。試料中のＬＮ５抗原を抗体結合粒子表面に吸着させた後に粒子を洗浄し、今度はルテニウム等の化学発光性錯体にて標識した別の抗ＬＮ５γ２鎖断片抗体（第２抗体）を適当な濃度で加える。一定時間まで撹拌して第１抗体とＬＮ５抗原と第２抗体の３者の複合体を磁気ビーズ上に形成させる。
その後にビーズを洗浄して、専用の装置中の電極間にて電流を通し標識物である錯体を発光させ、発光強度を計測する。この際にルテニウム標識物の量に対応して発光量が得られる。被験生体試料の発光量と標準品の発光量を検量線等を用いて比較することにより精度良く被験生体試料中のＬＮ５抗原の量を知ることができる。
本発明の、ＬＮ５を産生する癌細胞の検出方法、急性呼吸窮迫症候群の検査方法、及び、悪性腫瘍の悪性度の判定方法は、生体試料中のＬＮ５抗原を測定し、その測定結果に基づいて検出、検査及び判定を行うことを特徴とする。
生体試料中のＬＮ５抗原の測定は、本発明の測定方法により行われる。ＬＮ５抗原の測定結果を指標として用いることにより、ＬＮ５を産生する癌細胞が検出され、急性呼吸窮迫症候群が検査され、または、悪性腫瘍の悪性度が判定される。例えば、ＬＮ５抗原の定量値が、正常値よりも高い場合に、ＬＮ５を産生する癌細胞が検出されたとすること、急性呼吸窮迫症候群が検出されたとすること、または、悪性腫瘍の悪性度が高いと判定することができる。
本発明の測定試薬は、ＬＮ５を産生する癌細胞の検出、急性呼吸窮迫症候群の検査、及び、悪性腫瘍の悪性度の判定の用途に用いることができる。
本発明は、また、細胞のβ４インテグリン発現を測定する方法を提供する。この方法は、ＬＮ５に反応性を有する抗体と、細胞の培養上清とを接触させる工程、前記抗体の反応を測定する工程、及び、前記反応の測定結果に基づいて前記細胞のβ４インテグリンの発現量を決定する工程を含んでなる。
ＬＮ５に反応性を有する抗体と、細胞の培養上清とを接触させる工程、及び、前記抗体の反応を測定する工程は、ＬＮ５に反応性を有する抗体を用いる他は、通常の免疫化学的方法による抗原の測定方法と同様でよい。免疫化学的方法は、本発明の測定方法に関して上記に説明したのと同様でよい。
ＬＮ５に反応性を有する抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、このよようなモノクローナル抗体としては、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３７またはＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４０の受託番号で寄託されている細胞により産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
ＬＮ５に反応性を有する抗体の反応の測定結果は培養上清中へのＬＮ５産生量を反映しており、これを指標として用いることにより、β４インテグリンの発現量が決定される。
実施例
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
［実施例１］ＬＮ５に対するモノクローナル抗体の作製
ヒトＬＮ５の精製は既報［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７６，６３−７２（１９９８）］に従って実施した。すなわち、ヒト乳癌細胞ＭＫＮ４５（Ｊａｐａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋから入手）を、２．５％牛胎児血清および１００ｎｇ／ｍＬフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（和光純薬工業社製）を含有する液体培地中にて培養した。その後、培養上清を採取し遠心分離にて細胞成分を除去した後に、上清にプロテアーゼ阻害剤を添加した。この培養上清を、抗ＬＮ５γ２鎖ポリクローナル抗体を固定化したゲルを充填したカラムに流し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した。カラムに結合したＬＮ５は、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出した。カラムから溶出したＬＮ５を素早く中和し、透析チューブに入れてＰＢＳに対して十分に透析した。このように精製したＬＮ５標品をポリアクリルアミド電気泳動にて解析し、α３鎖とβ３鎖とγ２鎖の存在を確認した。
この精製ＬＮ５を、Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウス（６週齢）の腹腔内へ、一匹当たり０．０１５ｍｇの量でコンプリート・フロイント・アジュバント（シグマアルドリッチ社製）とともに投与した。３週間後に同量のＬＮ５をインコンプリート・フロイント・アジュバント（シグマアルドリッチ社製）とともに腹腔内へ投与した。さらに３週間後に同マウスへ精製ＬＮ５のみを一匹当たり０．０３ｍｇ投与した。
最終の免疫感作が終了した３日後にマウスから脾臓を摘出した。以降の作業は無菌クリーンベンチ内で実施した。摘出した脾臓をメッシュで分散させ、あらかじめ培養しておいたＳｐ２／０−Ａｇ１４マウスミエローマ細胞と混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社製）存在下で細胞融合した。融合したハイブリドーマ細胞は、９６ウエルマイクロカルチャープレート数枚に分散させ、１０％牛胎児血清とＨＡＴ試薬（ＩＣＮバイオメディカル社製）を含むＲＰＭＩ１６４０液体培地中で１〜２週間培養した。この間にモノクローナル抗体を安定的に産生するハイブリドーマ細胞のみが生存し、融合しなかったミエローマ細胞やマウス脾臓細胞は死滅した。
ＬＮ５に対するモノクローナル抗体を産生する細胞の選択は抗原固相プレートによるＥＬＩＳＡにより実施した。すなわち、ハイブリドーマ細胞のコロニーが十分に育った時点でその培養上清を採取し、免疫抗原を固相吸着した９６ウエルマイクロプレート（ナルジェ・ヌンク社製）へ添加して、その上清中のモノクローナル抗体を反応させた。その後に、マウスＩｇＧに反応する２次抗体のペルオキシダーゼ標識物（アメリカンコーレックス社製）を適当な濃度で添加した。一定時間後にプレートを洗浄し、オルソフェニレンジアミン酵素基質発色剤（和光純薬工業社製）と過酸化水素の溶液を加えた。その発色の有無により目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを４株選択した。選択された４株は、それぞれ数回のクローニングを施し、１９、５７、８Ｃ２、２Ｂ１０と命名した。それぞれのモノクローナル抗体の大量製造は、常法に従い、ハイブリドーマをマウスの腹腔内に接種し、そのマウスの腹水からプロテインＧ固定化セファロースゲル（ファルマシア社製）を用いたアフィニィティークロマトグラフィーにより精製することにより行った。
得られたモノクローナル抗体の特異性を、ヒト乳癌細胞ＭＫＮ４５細胞、ヒトグリア芽細胞種細胞株Ａ−１７２細胞、ヒト平滑筋肉腫細胞株ＨＴ−１０８０細胞、及びヒト類表皮癌細胞株Ａ−４３１細胞の産生するＬＮ５により検討した。Ａ−１７２細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、ＨＴ−１０８０細胞及びＡ−４３１細胞はＪａｐａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋからそれぞれ入手した。
それぞれの細胞を、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で組織培養フラスコ中にて培養し、培養上清を採取した。培養上清から上述の方法によりＬＮ５の精製を実施した。Ａ−１７２細胞はγ２鎖を単体で分泌することが知られており、精製されたＬＮ５はγ２鎖が主成分であった。それに対してＭＫＮ４５細胞培養上清由来のＬＮ５はα３鎖とβ３鎖とγ２鎖をほぼ同量含有していた。これら２種のＬＮ５に対する４種のモノクローナル抗体の反応性を上述の方法に準じてＥＬＩＳＡにて比較した。その結果、８Ｃ２のみが両者へ強く反応したことから、８Ｃ２モノクローナル抗体はＬＮ５γ２鎖を認識することが判明した（図１）。
また、ＨＴ−１０８０およびＡ−４３１の各細胞を培養する際に、エクスプレス３５Ｓプロテインラベリングミックス試薬（ＮＥＮライフサンエンス社製）にて分泌タンパク質のラベルを行った。その培養上清を用いて４種のモノクローナル抗体による抗原タンパク質の免疫沈降を実施した。すなわち、３５Ｓラベルした各細胞培養上清一定量に抗体を添加し、抗マウスＩｇＧ抗体を固定化したゲルをさらに添加した。しばらくの間ゆっくりと撹拌した後に、低速遠心分離にてゲルを分離し、そのままＳＤＳ含有サンプル液にて加熱し、ゲルに吸着した抗原タンパク質を電気泳動にて分離した。
ＨＴ−１０８０細胞は、α３鎖を発現しておらずβ３鎖とγ２鎖の複合体を分泌することが知られている。それに対してＡ−４３１細胞はすべての鎖を発現することが知られている。この免疫沈降物の電気泳動解析の結果、１９と５７はいずれも、ＨＴ−１０８０上清からの、分子量約１４５ｋＤａの位置に泳動される抗原（β３鎖）に強く反応した。また、８Ｃ２は、ＨＴ−１０８０上清中からの、分子量約１５５ｋＤａの位置に泳動される抗原（γ２鎖）に強く反応した（図２）。２Ｂ１０反応抗原はＨＴ−１０８０上清中に検出されなかった。４種のモノクローナル抗体はいずれも、Ａ−４３１細胞培養上清からはα３鎖、β３鎖およびγ２鎖の３本鎖複合体を沈降させた（図３）。
これらの実験結果より、１９と５７はβ３鎖に、２Ｂ１０はα３鎖に、８Ｃ２はγ２鎖にそれぞれ反応することが判明した。１９と５７はいずれもβ３鎖に同様に反応することから以降の検討においては５７のみを使用した。
［実施例２］モノクローナル抗体によるヒト癌細胞培養上清中ＬＮ５量の測定
ヒト膵臓癌細胞株１１種（ＫＰ−１、ＫＰ−２、ＫＰ−３、ＫＰ−４、ＡｓＰＣ−１、ＨＰＡＣ、ＳＵＩＴ−２、ＭＩＡｐａｃａ−ＩＩ、ＰＳＮ−１、ＢｘＰＣ−３、ＰＡＮＣ−１：ＭＩＡｐａｃａ−ＩＩ（ＣＲＬ−１４２０）、ＰＡＮＣ−１（ＣＲＬ−１４６９）、ＡｓＰＣ−１（ＣＲＬ−１６８２）及びＨＰＡＣ（ＣＲＬ−２１１９）はＡＴＣＣから入手した。ＫＰ−１〜ＫＰ−４、ＳＵＩＴ−２及びＢｘＰＣ−３は国立九州がんセンターの船越顕博先生より恵与された。ＰＳＮ−１は国立がんセンターの西尾和人先生より恵与された。）を培養フラスコ中にて１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にて培養し、十分に生育した段階でその培養上清を採取した。培養上清は無菌的に密封し使用時まで４℃にて保存した。
実施例１にて作製され特異性が確認されたモノクローナル抗体３種（５７、２Ｂ１０、８Ｃ２）のうち、５７および２Ｂ１０モノクローナル抗体を過ヨウ素酸法にて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）により標識した。標識した各モノクローナル抗体はＰＢＳに対して十分に透析し、メンブレンフィルター（日本ミリポア社製）にて濾過滅菌した後に４℃にて保存した。５７または８Ｃ２の精製モノクローナル抗体を０．０１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳにて希釈し、マキシソープ９６ウエルマイクロプレート（ナルジェ・ヌンク社製）の各ウエルに０．２ｍＬ添加し、各抗体を固相化した。これらのプレートを乾燥しないように密封し４℃下で１２時間以上静置した。その後、プレートの抗体溶液を廃棄して、１％スキミミルク含有ＰＢＳ溶液を各ウエルに０．２ｍＬ添加して１時間静置することによりプレートをブロッキングした。
ヒトＬＮ５標準品（ＭＫＮ４５細胞由来）を１％スキムミルク含有ＰＢＳ溶液にて希釈して１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５ｎｇ／ｍＬの濃度となる溶液を調製した。ブロッキングが終了した抗体固相化プレートからブロッキング液を廃棄し、各ヒトＬＮ５濃度標準品と既に採取した１１種のヒト膵臓癌細胞培養上清をウエルに０．１ｍＬずつ添加した。そのまま室温にて２時間静置し、液を廃棄してＰＢＳにて十分に洗浄した。上記の５７または２Ｂ１０モノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識物を１％スキムミルク含有ＰＢＳにて適度に希釈し、各ウエルに０．１ｍＬずつ添加した。そのまま室温にて２時間静置し、液を廃棄してＰＢＳにて十分に洗浄した。ＡＢＴＳ酵素基質溶液（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を各ウエルに０．１ｍＬずつ添加し、時々撹拌しながら室温にて１０分間静置した。反応を停止させるために２ｍＭアジ化ナトリウム水溶液をさらに０．１ｍＬずつ添加してよく混合した。各ウエルの４９２ｎｍにおける吸光度をＴ−ｍａｘマイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス社製）にて測定し、標準品の吸光度から検量線を作製し、各培養上清中のＬＮ５濃度を算定した。
測定の結果、一部のヒト膵臓癌細胞株でＬＮ５の産生が確認され、８Ｃ２モノクローナル抗体を固相化抗体として用いたＥＬＩＳＡによるＬＮ５測定値が８Ｃ２モノクローナル抗体を用いないＥＬＩＳＡによるＬＮ５測定値に比較して明らかに低くなった（図４）。しかし、ＭＫＮ４５細胞の培養上清ではそのような低値傾向は検出されなかった。ＭＫＮ４５由来ＬＮ５はγ２鎖が断片化しないことが知られており、８Ｃ２はγ２鎖の遊離断片部位に反応特異性を有すると考えられた。
また、培養上清採取と同時にトリプシン処理にて上記１１種のヒト膵臓癌培養細胞をフラスコから回収し、細胞数を計数した後にマイクロチューブに同じ細胞数となるように分注した。各チューブにヒトα１、α２、α３、α５、α６、β１、β３、β４インテグリンそれぞれに対するモノクローナル抗体（ケミコン社製）を添加し、３０分間氷冷しながら静置した後にＰＢＳにて細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識第２抗体を添加して３０分間再び氷冷しながら静置した。最後にＰＢＳ洗浄をしたのちに１％パラホルムアルデヒド固定液を添加し、細胞表面抗原を固定した。各固定細胞浮遊液をＦＡＣＳｃａｎセルアナライザー（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に通して細胞表面の蛍光強度平均値を測定し、細胞膜表面の各インテグリン発現量とした。蛍光強度平均値はバックグラウンド平均値に対する比（平均蛍光強度相対値：Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）として表示した。
ヒト膵臓癌細胞株１１種のうち、ＬＮ５産生株６種とＬＮ５非産生株５種での各種インテグリンの発現を比較した（図５）。ＬＮ５産生株ではＬＮ５非産生株に比較して、β１インテグリン等の発現はほぼ同等であるにも関わらず、明らかにβ４インテグリンの発現が増大しており、ＬＮ５の産生量がβ４インテグリン発現の指標となることが示された。
［実施例３］γ２鎖分解断片に対するモノクローナル抗体の作製
（１）γ２鎖分解断片の精製
精製８Ｃ２モノクローナル抗体をブロムシアン活性化セファロース（ファルマシア社製）に使用説明書に従って架橋させ、抗体固相化ゲルを作製した。ヒト膵臓癌細胞株ＫＰ−２、またはＢｘＰＣ−３を、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０液体培地にて組織培養フラスコ中にて大量に培養した。十分に培養した後に、その培養上清１Ｌを採取し遠心分離により細胞成分を除去した。その培養上清をＰＢＳにて希釈して、８Ｃ２モノクローナル抗体固定化ゲルを充填したカラムに流した。ＰＢＳにて十分にカラムを洗浄した後に、カラムに結合したＬＮ５抗原を８Ｍ尿素含有ＰＢＳによって溶出した。溶出した画分を透析チューブ内に入れてＰＢＳに対して透析し、尿素を除去した。十分に透析を行った後にセントリコン遠心濃縮器（アミコン社製）にて濃縮し、精製ヒトＬＮ５抗原とした。
この精製品を、４−２０％グラジェントＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（第一化学薬品社製）にて分離した。ゲルをクイックＣＢＢ染色液（和光純薬工業社製）にてタンパク質染色して、ＬＮ５抗原の分子量を解析した。また、同様に電気泳動したゲルからＬＮ５抗原をイモビロン−Ｐメンブレン（日本ミリポア社製）に電気的に転写し、８Ｃ２モノクローナル抗体にて免疫染色した（図６）。８Ｃ２モノクローナル抗体の反応する分解物は約５万と推定され、過去の論文報告［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，２２５−２２８（１９９７）］においてタンパク質分解酵素による分解が原因となって遊離することが示唆されているγ２鎖のＮ末端由来の断片（Ｎ端断片）であると考えられた。ここで得られた精製ヒトＬＮ５γ２鎖Ｎ端断片は防腐剤を添加せず分注して使用時まで冷凍保存した。
（２）γ２鎖分解断片に対するモノクローナル抗体の作製
冷凍保存していたＫＰ−２細胞由来の精製γ２鎖Ｎ端断片を免疫原として、新規なモノクローナル抗体の作製を実施した。モノクローナル抗体の作製は実施例１で述べた方法に準じて行った。新たに、２種のモノクローナル抗体ＫＰ２−ＬＮ５−８Ｃ２Ｅ  １２−１（以後１２−１と略記）とＫＰ２−ＬＮ５−８Ｃ２Ｅ  １８−４（以後１８−４と略記）が取得された。ウエスタンブロット解析により、このいずれのモノクローナル抗体も、８Ｃ２と同様に分子量約５万のγ２鎖断片に反応することを確認した（図６）。
それぞれのモノクローナル抗体は、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ無血清培地（ギブコ社製）によるハイブリドーマ細胞の培養上清から、プロテインＡ固定化ゲルを用いてアフィニィティー精製することにより大量製造した。得られたモノクローナル抗体はいずれもＩｇＧ１タイプであることをＭｏｕｓｅ−Ｔｙｐｅｒ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ試薬（日本バイオラッド社製）により確認した。
得られたモノクローナル抗体産生細胞（１２−１、１８−４、２Ｂ１０、８Ｃ２、１９および５７）は、それぞれ、２００１年８月１６日にＦＰＲＭ  Ｐ−１８４６５、ＦＰＲＭ  Ｐ−１８４６６、ＦＰＲＭ  Ｐ−１８４６７、ＦＰＲＭ  Ｐ−１８４６８、ＦＰＲＭ  Ｐ−１８４６９、ＦＰＲＭ  Ｐ−１８４７０の受託番号で独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（あて名：郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６）に寄託され、２００２年８月１日（５７については２００２年８月５日）に、ブタペスト条約に基く国際寄託に移管され、それぞれ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４０の受託番号が付与されている。
（３）生体試料中ＬＮ５分解物の測定
（２）で得られた抗ヒトＬＮ５γ２鎖モノクローナル抗体２種（１２−１および１８−４）を精製ＩｇＧとして用意した。
１８−４モノクローナル抗体精製品を最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとしてＰＢＳにて希釈した。抗体溶液１ｍＬに対して、ダイナビーズＭ−４５０エポキシル（ダイナル社製）浮遊液０．２５ｍＬを添加し、ポリプロピレン容器に密封して室温にて４時間静かに撹拌した。その後、４℃にて１２時間程度静置して結合を安定化させた。その後、ビーズ表面の余分な結合部位をブロッキングすることを目的として、抗体結合ビーズに対して、１％スキムミルク、０．１％アジ化ナトリウムおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ溶液（以降ＳＭ／ＰＢＳと略記する）を２ｍＬ添加した。そのまま１２時間程度静置してブロッキングを安定化させた。その後、ビーズをＰＢＳにて２回洗浄し、ＳＭ／ＰＢＳ溶液にて２０倍希釈して使用時まで４℃にて液状保存した。
１２−１抗体精製品の最終濃度６ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。その抗体溶液１ｍＬにルテニウム（アイジェン社製）約２ｍｇを添加し室温にて２時間静置した。その後０．２Ｍグリシン／ＰＢＳ（ｐＨ７．８）２ｍＬを添加して余分な反応部位をブロックした。このルテニウム標識抗体液をウルトロゲルＡｃＡ４４ゲルクロマトグラフィーにかけて、０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳにて溶出し、最も最初に溶出されてくる標識された抗体を分離した。この様に調製されたルテニウム標識１２−１モノクローナル抗体は使用時までそのまま４℃にて保存した。
ニワトリ血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）とＳＭ／ＰＢＳを等量混合して、ＬＮ５標準品希釈液および標識抗体希釈液として使用した（以降Ｄｉｌｕｅｎｔと略記する）。標準品としては、上記実施例１で得られたＭＫＮ４５細胞由来精製ＬＮ５を使用し、ＬＮ５濃度が１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５ｎｇ／ｍＬとなる様にＤｉｌｕｅｎｔにて希釈し標準品液を調製した。また、各ルテニウム標識抗体をＤｉｌｕｅｎｔにて１００倍希釈した。生体試料の測定は自動測定器（ピコルム８２２０：三光純薬社製）にて実施した。標準品ならびにヒト血清及び血漿検体をそれぞれ０．２ｍＬ採取し専用反応管に添加し、専用反応管ラックにセットした。調製した抗体結合ビーズと標識抗体もそれぞれ専用容器に入れて自動測定器にセットした。自動測定の工程は以下の通りであった。まず、反応管に０．０２５ｍＬの抗体結合ビーズを加え、約９分間間欠的に撹拌しながら第１抗体との反応を行う。反応管内の液を吸引除去後、洗浄液で２回洗浄する。洗浄後、０．２ｍＬのルテニウム標識抗体液を加え、約９分間間欠的に撹拌しながら第２抗体との反応を行う。反応管内の液を吸引除去後、洗浄液で２回洗浄する。洗浄後、０．３ｍＬの発行電解液を加え発光量を測定する。
同時測定した標準抗原より検量線を作製し、抗原濃度を算定した。Ｄｉｌｕｅｎｔのみの発光カウント数をブランク値とした。抗原濃度１０００〜１５．６２５ｎｇ／ｍＬの間で良好な測定を実施できた（図７）。
［実施例４］ヒト癌を移植したヌードマウス血清中のＬＮ５抗原
（１）ヌードマウスへのヒト膵臓癌細胞の同所移植
ヒト膵臓癌細胞株３種（ＨＰＡＣ、ＭＩＡｐａｃａ−ＩＩ、ＫＰ−１）をそれぞれ培養フラスコ中にて１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にて培養し、十分に生育した段階でトリプシン−ＥＤＴＡ液処理にて細胞のみを回収した。それぞれの細胞をよく洗浄して、麻酔下の８週齢ヌードマウス（日本チャールズリバー社製）の膵臓内へ同所移植した。各細胞を移植したマウスはクリーンルーム内にて飼育した。移植後２週間目、３週間目、４週間目、５週間目にそれぞれ３匹ずつを無作為に選出してエーテル麻酔下にて心臓より採血を実施した。採血した全血は４℃にて一晩清置した後に、遠心処理にて血清のみを分離した。分離した血清は測定まで冷凍保存した。また、採血後にマウスを解剖して原発膵臓腫瘍部を摘出し、重量を測定した。
（２）マウス血清中ＬＮ５分解物の測定
実施例３（３）に記載の測定方法により、前項にて採取したマウス血清中ＬＮ５抗原の測定を実施した。測定の結果、ＨＰＡＣ細胞を移植したヌードマウスの血中へは、明らかに移植細胞由来のＬＮ５抗原が遊離することが判明した。また、原発腫瘍巣の増大と相関してその血中濃度が上昇することも確認された（図８）。
また、ＬＮ５抗原の産生能のないＭＩＡｐａｃａ−ＩＩ細胞を移植したヌードマウスでは原発腫瘍巣の増大は確認されたが、ＬＮ５抗原の血中濃度上昇はまったく検出されなかった（図９）。
さらに、実施例２での実験結果からＫＰ−１細胞はα３鎖およびβ３鎖の分泌能がないことが確認されており、ＬＮ５抗原を産生しないと想定されていたが、今回の検討でＫＰ−１移植ヌードマウスの血中に原発腫瘍巣の増大と相関するＬＮ５抗原濃度の上昇を検出した（図１０）。これにより、ＫＰ−１細胞がＬＮ５のγ２鎖モノマーを産生する性質を有する細胞であることが示され、本測定法によるＬＮ５抗原測定がγ２鎖モノマー産生型の癌の検出にも有用であることが示された。
これらの結果により、本測定法によって、原発腫瘍巣での様々なタイプのＬＮ５抗原の産生をモニターすることが可能であることが示された。
［実施例５］ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）患者血中のＬＮ５抗原濃度
ＬＮ５が生体内臓器の中でも特に肺上皮組織に多く含まれていることから、肺の炎症性疾患において生体内のＬＮ５代謝が高まるのではないかと考え、健常人及びＡＲＤＳ患者から採取した血漿検体中のＬＮ５抗原濃度を、実施例３（３）に記載の測定方法にて測定した。
健常人１５例、ＡＲＤＳ患者生存例１９例、ＡＲＤＳ患者死亡例８例の血漿中ＬＮ５抗原濃度を図１１に示した。血漿中ＬＮ５抗原濃度は、それぞれ６０．８ｎｇ／ｍＬ、１５８ｎｇ／ｍＬ、２５０．９ｎｇ／ｍＬとなり、明らかにＡＲＤＳ患者群で血中濃度が上昇することが判明した。このことから、ＬＮ５抗原が新たなＡＲＤＳ診断及び重症度判定用の血中マーカーとなりうることが確認された。
［実施例６］  各種消化器系癌患者血中のＬＮ５抗原濃度
ＬＮ５は上皮系悪性腫瘍細胞からの産生が高いのではないかと考え、消化器系良性疾患患者３１例（糖尿病患者８例、慢性膵炎患者２５例）、粘液産生膵腫瘍患者９例、及び消化器系悪性腫瘍患者１５５例（膵臓癌患者３６例、膵臓癌（肝臓転移）患者１８例、胃癌患者１０例、胆嚢・胆管癌患者１６例、肝臓癌患者７５例）から採取した血清検体中のＬＮ５抗原濃度を、実施例３（３）に記載の測定方法にて測定した。
糖尿病患者８例、慢性膵炎患者２５例、粘液産生膵腫瘍患者９例、膵臓癌患者３６例、膵臓癌（肝臓転移）患者１８例、胃癌患者１０例、胆嚢・胆管癌患者１６例、肝臓癌患者７５例の血清中ＬＮ５抗原濃度を図１２に示した。血清中ＬＮ５抗原濃度はそれぞれ平均値として、５４．２ｎｇ／ｍＬ、５０．６ｎｇ／ｍＬ、３５．０ｎｇ／ｍＬ、６８．３ｎｇ／ｍＬ、１６５．９ｎｇ／ｍＬ、１１１．０ｎｇ／ｍＬ、１３６．０ｎｇ／ｍＬ、１２１．９ｎｇ／ｍＬとなり、明らかに各種消化器系癌患者群で血中濃度が上昇することが判明した。また、肝臓転移例においてその濃度が上昇する傾向を検出した。このことからＬＮ５抗原が新たな消化器系悪性腫瘍の悪性度判定用の血中マーカーとなりうることが確認された。
産業上の利用の可能性
本発明により生体試料中のＬＮ５抗原の測定試薬及び測定方法が提供される。これにより、ＬＮ５を産生する癌細胞の検出、急性呼吸窮迫症候群の検査及び悪性腫瘍の悪性度の判定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＭＫＮ４５細胞およびＡ−１７２細胞の培養液由来のＬＮ５に対する各モノクローナル抗体（１９、５７、２Ｂ１０、８Ｃ２）の反応性を示したグラフである。「抗血清」は抗ヒトＬＮ５マウスポリクローナル抗体の反応を示す。「ＰＢＳ」は抗体を添加しない時の反応を示す。グラフ横軸はＥＬＩＳＡでの吸光度値を示す。
図２は、ＨＴ−１０８０細胞培養液中のＬＮ５抗原の各抗体による免疫沈降実験の結果を示す。左の数値は分子量マーカーの泳動位置である（ｋＤａ）。「培養上清」は総タンパク質の泳動像である。「ｇｅｌのみ」は免疫沈降に使用したゲルからのタンパク質の泳動像である。「ｐＡｂ  ＬＮ−５」はヒトＬＮ５に対するポリクローナル抗体による免疫沈降タンパク質の泳動像である。「ｐＡｂγ２」はヒトＬＮ５γ２鎖に対するポリクローナル抗体による免疫沈降タンパク質の泳動像である。「ｍＡｂβ３」はヒトＬＮ５β３鎖に対するモノクローナル抗体による免疫沈降タンパク質の泳動像である。
図３は、Ａ−４３１細胞培養液中のＬＮ５抗原の各抗体による免疫沈降実験の結果を示す。左の数値は分子量マーカーの泳動位置である（ｋＤａ）。「培養上清」は総タンパク質の泳動像である。「ｇｅｌのみ」は免疫沈降に使用したゲルからのタンパク質の泳動像である。「ｐＡｂ  ＬＮ−５」はヒトＬＮ５に対するポリクローナル抗体による免疫沈降タンパク質の泳動像である。「ｐＡｂγ２」はヒトＬＮ５γ２鎖に対するポリクローナル抗体による免疫沈降タンパク質の泳動像である。「ｍＡｂβ３」はヒトＬＮ５β３鎖に対するモノクローナル抗体による免疫沈降タンパク質の泳動像である。
図４は、１１種のヒト膵臓癌細胞株およびＭＫＮ４５ヒト胃癌細胞株の培養上清中のＬＮ５濃度測定の結果を示す。「α３γ２」は、８Ｃ３（抗γ２モノクローナル抗体）固相化プレートと酵素標識２Ｂ１０（抗α３鎖モノクローナル抗体）との組み合わせによるＥＬＩＳＡでの測定値を示す。「β３γ２」は、８Ｃ３（抗γ２モノクローナル抗体）固相化プレートと酵素標識５７（抗β３鎖モノクローナル抗体）との組み合わせによるＥＬＩＳＡでの測定値を示す。「α３β３」は、５７（抗β３モノクローナル抗体）固相化プレートと酵素標識２Ｂ１０（抗α３鎖モノクローナル抗体）との組み合わせによるＥＬＩＳＡでの測定値を示す。
図５は、１１種のヒト膵臓癌細胞株の各インテグリン分子の発現量を比較した結果を示す。ＬＮ５産生株（ＫＰ−２、ＫＰ−３、ＡｓＰＣ−１、ＨＰＡＣ、ＳＵＩＴ−２、ＢｘＰＣ−３）での各インテグリン発現量の平均値と標準偏差、およびＬＮ５非産生株（ＫＰ−１、ＫＰ−４、ＭＩＡｐａｃａ−ＩＩ、ＰＳＮ−１、ＰＡＮＣ−１）での各インテグリン発現量の平均値と標準偏差を示す。
図６は、ＢｘＰＣ−３細胞培養液中のＬＮ５抗原の各モノクローナル抗体によるウエスタンプロット実験の結果を示す。右の数値は分子量マーカーの泳動位置である（ｋＤａ）。「５７」は５７モノクローナル抗体による反応抗原、「８Ｃ２」は８Ｃ２モノクローナル抗体による反応抗原、「２Ｂ１０」は２Ｂ１０モノクローナル抗体による反応抗原、「１８−４」はＫＰ２−ＬＮ５−８Ｃ２Ｅ  １８−４モノクローナル抗体による反応抗原、「１２−１」はＫＰ２−ＬＮ５−８Ｃ２Ｅ  １２−１モノクローナル抗体による反応抗原、「対照」はコントロール抗体による反応抗原を示す。８Ｃ２、ＫＰ２−ＬＮ５−８Ｃ２Ｅ  １２−１、ＫＰ２−ＬＮ５−８Ｃ２Ｅ  １８−４の３種は明らかに分子量約５万の断片に反応している。
図７は、ＫＰ２−ＬＮ５−８Ｃ２Ｅ  １８−４モノクローナル抗体固相化ビーズとルテニウム標識ＫＰ２−ＬＮ５−８Ｃ２Ｅ  １２−１モノクローナル抗体を用いた電気化学発光免疫測定での検量線を示す。
図８は、ＨＰＡＣ細胞を移植したヌードマウスの移植後２、３、４、および５週間目の原発腫瘍重量（●）と血清中ＬＮ５抗原濃度（○）の変化。
図９は、ＭＩＡｐａｃａ−ＩＩ細胞を移植したヌードマウスの移植後２、３、４、および５週間目の原発腫瘍重量（●）と血清中ＬＮ５抗原濃度（○）の変化。
図１０は、ＫＰ−１細胞を移植したヌードマウスの移植後２、３、４、および５週間目の原発腫瘍重量（●）と血清中ＬＮ５抗原濃度（○）の変化。
図１１は、２７例のＡＲＤＳ患者および１５例の健常人の血漿中ＬＮ５抗原濃度の分布、平均値、及び標準偏差を示す。ＡＲＤＳは、生存例１９例（軽症例）と死亡例８例（重症例）に分けた。
図１２は、消化器系良性疾患患者３１例、粘液産生膵腫瘍患者９例、および消化器系悪性腫瘍患者１５５例の血清中ＬＮ５抗原濃度の分布を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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