(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステル系ポリウレタンエステラーゼの精製方法において、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＴＢ−３５株（ＦＥＲＭ  Ｐ-１５３８１）の培養液を遠心分離した上清に界面活性剤を加えて、菌体表面の成分を抽出する工程と、この抽出液に疎水クロマトグラフィー用担体を加えて、該担体に吸着した画分を疎水クロマトグラフィー用担体の吸着画分として集める工程と、該吸着画分に陰イオン交換体を加えて、該陰イオン交換体非吸着の画分を集めて精製ポリウレタンエステラーゼを得る工程とを含むポリウレタンエステラーゼの精製方法であって、前記ポリウレタンエステラーゼは、分子量約６２，０００の単量体であり、最適ｐＨは４〜８であって、エステル系ポリウレタンのエステル結合を切断し、アジピン酸とジエチレングリコールを産出することを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の精製方法において、上記陰イオン交換体非吸着の画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動して、約６２，０００の分子量のバンドを切り出すことをさらに含むポリウレタンエステラーゼの精製方法。
【請求項３】
請求項１に記載の精製方法において、上記陰イオン交換体非吸着の画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供し、約６２，０００の分子量のピークを集めることをさらに含むポリウレタンエステラーゼの精製方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一に記載の精製方法において、上記界面活性剤がデオキシＢＩＧＣＨＡＰ又はｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドであるポリウレタンエステラーゼの精製方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一に記載の精製方法によって得られたポリウレタンエステラーゼを用いて、ｐＨを６〜７. ５に保った溶液中でポリウレタンを分解するポリウレタンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物由来の酵素による、エステル系ポリウレタンの分解処理に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリウレタンは、四輪自動車や二輪自動車のシートクッション、衣類の繊維、靴のクッション、接着剤、及び塗料など様々な製品に用いられている。しかし、ポリウレタンは、熱硬化性樹脂であり、リサイクルが困難である。ポリウレタンの処分には、以下の方法が挙げられる。
【０００３】
最も一般的な処分方法として、使用済みのポリウレタンや製造工程で生じるポリウレタン片をそのまま埋め立てて処分する埋め立て処理が知られている。化学的分解処理は、熱分解により、ガス、石油に分解したり、グリコール分解により、原料のポリオールを再生する方法である。焼却処理は、ゴミとして炉で消却するものである。ポリウレタンを微生物によって分解して処理する方法は、基礎技術の段階であり、まだ実用化していない。
【０００４】
ポリウレタンに微生物分解法を用いる場合、エーテル系ポリオールを原料とするポリウレタンは、微生物に耐性があり、分解が困難である。これに対し、エステル系ポリオールを原料としたエステル系ポリウレタンは、微生物の産生する酵素により分解されることが報告されている。例えば、Ｔｏｋｉｗａ，Ｙ．ｅｔａｌ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，ｐ１９３７（１９８８）には、エステル系ポリウレタンがクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ及びＲ．ｄｅｌｅｍａｒ）のリパーゼによって加水分解されることが記載されている。
また、Ｔｏｓｈｉａｋｉ  Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｋａｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２９，３９−４２（１９９５）には、土壌から分離した細菌であるコマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＴＢ−３５）がエステル系ポリウレタンを分解し、アジピン酸とエチレングリコールを産することが記載されている。
【０００５】
コマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株によるエステル系ポリウレタンの分解方法は次のように行われる。
まず、ポリエチレングリコールアジペートと２，４−トリレンジイソシアネートから合成されたポリウレタンとともに、上記菌株を液体培地中で培養した。分解の代謝産物は、主に、ジエチレングリコールであった。
【０００６】
ポリウレタン分解酵素の精製については、カビ由来の酵素はいくつか報告があるが、細菌由来の酵素の完全精製の例はない。特願平８−９６７４号には、ＴＢ−３５株の菌体表面に付着しているエステラーゼがエステル系ポリウレタン分解活性を有すること、及びこのエステラーゼ粗酵素液の調整方法及び粗酵素液を用いたエステル系ポリウレタンの分解方法が開示されている。
【０００７】
このエステラーゼ粗酵素液の調整法は次に述べる通りである。まず、コマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株をエステル系ポリウレタンを炭素源とした培地で培養し、その培養液を遠心分離して、上清と菌体に分離する。分離した菌体をコール酸ナトリウム溶液、デオキシコール酸ナトリウム溶液、ドデシル硫酸ナトリウム溶液から選ばれる界面活性剤によって処理して、該菌体からエステラーゼを遊離させ、該エステラーゼを含有する溶液を限外濾過で濃縮すると共に界面活性剤を除去し、ポリウレタンエステラーゼの粗酵素液を得る。
【０００８】
上記の方法によって粗精製したエステラーゼをエステル系ポリウレタンに対して、１. ９〜１８８. ０ｍＵ添加してポリウレタンを分解する。
【０００９】
細菌の産生する一般的な酵素の精製方法を以下に述べる。
磨砕、自家分解、超音波処理、圧力の急激な変化、酵素による分解、自己消化などにより、緩衝液中で菌体を壊す。この際、細胞膜など緩衝液に不溶性の構造と結びついているものは、さらに種々の界面活性剤や希薄な酸、アルカリ、アルコール等で抽出する。得られた粗抽出液をカラムクロマトグラフィー（イオン交換、ゲル濾過、アフィニティー、疎水など）、透析、限外濾過、電気泳動、硫酸アンモニウムや硫酸マグネシウムなどによる分別塩析、アルコール、アセトンなどのよる分別沈殿の過程を経て濃縮精製する。酵素は、最終的に、分別塩析や分別沈殿法により結晶状態で得られるものが多い。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
ポリウレタンは、スポンジ、クッションなどに使用される、密度の低い樹脂である。ポリウレタンの処分に関していえば、埋め立てによるポリウレタンの処理では、地盤が固まらず、安定しない。また、重量の割にかさばるため、輸送効率が悪い。さらに、ポリウレタンは、微生物により分解されにくく、腐らないため、埋め立て処理場に占める割合が高く、処理場不足の原因となっている。
【００１１】
化学的分解処理は、グリコール分解によって、原料のポリオールを再生できるという利点があるが、処分するポリウレタンの品質にばらつきがあるため、分解産物の品質が安定しない。さらに、処理にかかる費用や手間が莫大であるため採算が合わないという欠点がある。
【００１２】
焼却処理は、旧来の炉では、ポリウレタンの焼却の際に発生する高温に耐えることができない。また、四輪自動車や二輪自動車のシートクッションに使用されるホットキュア製ポリウレタンには、２９％の塩素を含む縮合リン酸エステルが難燃剤として用いられているため、ポリウレタンを焼却する際に、塩素ガスが発生し、炉を腐食させる。さらに、焼却時に二酸化炭素や有毒ガスが発生し、大気環境を汚染する。
【００１３】
微生物を接種してポリウレタンを分解する方法では、保存菌株の変異や雑菌による汚染のため分解が困難となる。
また、特願平８−９６７４号の方法によって得られる粗精製エステラーゼは、不純物を多く含むため、比活性が小さく、反応効率が良くない。また、酵素作用の分子的機構及び反応機構を明らかにするためには、完全精製された酵素を要する。
【００１４】
細菌から一般的に酵素を精製する方法に関していえば、精製するためには、数回にわたってカラムクロマトグラフィーにかける必要があるので、高価なクロマト機器及びカラム、高価な薬品を必要とし、精製するまでに時間がかかる。また、エタノール、アセトン及びジメチルスルホキシドなどの有機溶剤を用いると、エステル系ポリウレタンエステラーゼは、失活してしまう。
特願平８−９６７４号の方法では、エステラーゼを粗精製するのに界面活性剤としてコール酸ナトリウムなどを用いたが、抽出に２％以上の高濃度を必要とし、その後の精製が困難であった。
【００１５】
したがって、将来的にコマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株から得られるポリウレタンエステラーゼを用いて、ポリウレタンの大量処理を行うためには、エステラーゼの精製方法を確立し、その精製エステラーゼによるエステル系ポリウレタンの分解方法を明らかにする必要がある。
【００１６】
したがって、本発明は、コマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株又は菌学的に同等なコマモナス・アシドボランスからポリウレタンエステラーゼを精製することを目的とする。さらに、得られたポリウレタンエステラーゼを用いて、効率よくポリウレタンを分解することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、エステル系ポリウレタンエステラーゼの精製方法において、コマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株又はＴＢ−３５株と同等の菌学的な性質を有するコマモナス・アシドボランスの培養液を遠心分離した上清に界面活性剤を加えて、菌体表面の成分を抽出する工程と、この抽出液に疎水クロマトグラフィー用担体を加えて、該担体に吸着した画分を疎水クロマトグラフィー用担体の吸着画分として集める工程と、該吸着画分に陰イオン交換体を加えて、該陰イオン交換体非吸着の画分を集めて精製ポリウレタンエステラーゼを得る工程とを含むポリウレタンエステラーゼの精製方法を提供する。
【００１８】
この精製方法では、さらに上記陰イオン交換体非吸着の画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動して、約６２，０００の分子量のバンドを切り出しても良い。
また、さらに上記陰イオン交換体非吸着の画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供し、約６２，０００の分子量のピークを集めても良い。
上記界面活性剤は、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ又はｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドが望ましい。
さらに本発明は、上記の方法によって得られたポリウレタンエステラーゼを用いて、ｐＨを６〜７. ５に保った溶液中でポリウレタンを分解するポリウレタンの分解方法を提供する。
【００１９】
本発明のエステラーゼの精製方法によれば、比活性の高いエステル系ポリウレタンエステラーゼを従来法に比べて簡便、迅速に、かつ安価に得ることができ、ポリウレタンエステラーゼを完全精製することができる。また、本発明の精製エステラーゼを用いたエステル系ポリウレタンの分解法によれば、酵素活性の高い状態を保ったまま、ポリウレタンの分解を進めることができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
（細菌の性質）
本発明におけるエステル系ポリウレタンとは、ポリオールとしてポリエステルを用いたポリウレタンをいう。
本発明で用いるコマモナス・アシドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｖｏｒａｎｓ）ＴＢ−３５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３８１）は、茨城県つくば市内の土壌から分離した細菌であり、ポリウレタンを分解することが知られている。本発明は、コマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株又はＴＢ−３５株と同等の菌学的な性質を有するコマモナス・アシドボランスを用いてエステル系ポリウレタンエステラーゼを精製することができる。
【００２１】
コマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株の菌学的性質としては、以下のことが知られている。すなわち、細胞形態は桿菌で、グラム陰性細菌である。嫌気性の呼吸を行い、運動性を持つ。オキシダーゼ、カタラーゼ、硝酸塩還元に関しては陽性。インドール形成、アルギニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼに関しては陰性。フルクトースＯ−Ｆからの酸は陽性。エスクリン及びゲラチンの加水分解は陰性。トゥイーン８０の加水分解は陽性。マンニトール利用性、グルコン酸塩利用性、アジピン酸塩利用性、リンゴ酸塩利用性、クエン酸塩利用性、及び酢酸塩利用性に関しては陽性。グルコース利用性、アラビノース利用性、マンノース利用性、マルトース利用性、カプリン酸塩利用性、フェニル酢酸塩利用性、Ｎ−アセチルグルコサミン利用性に関しては陰性。キノン型はユビキノン（Ｑ−８）であり、Ｇ＋Ｃのモル％は６８. ８％である。
【００２２】
（培養）
本発明のエステル系ポリウレタンエステラーゼの精製方法では、エステル結合を持たない物質を炭素源として用いて培養し、コマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株又はその同等菌を培養してエステラーゼを精製することができる。
炭素源としては、コマモナス・アシドボランスが利用できるものであればよく、例えば、マンニトール、グルコン酸塩、アジピン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ポリウレタンなどが挙げられ、特に、マンニトール、ポリウレタンが好ましい。炭素源は、培地に対して、約１％ｗ／ｗ添加すればよい。
【００２３】
マンニトールを炭素源として用いると、ポリウレタンを炭素源としたとき比べて、得られるエステラーゼが生育菌体量あたりのエステラーゼ活性として約１／２である。しかし、ポリウレタンを炭素源としたときと比べ、細菌の増殖が速いので大量の酵素を迅速に調製できる。なお、マンニトールは多くの植物、キノコ類、藻類などに存在する糖アルコールであり、入手が容易で安価である。したがって、酵素精製にかかる費用も安価になるので、本発明のエステラーゼの精製に特に適している。表１に例として、マンニトールを炭素源として用いた場合の培地を示す。
また、マンニトールの代わりに、一般的天然培地を用いてもエステラーゼが精製できる。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
上記に述べたような培地をオートクレーブなどで滅菌し、コマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株又はその同等菌を植菌し、約３０℃で振とう培養する。培養後５〜８日、好ましくは菌体の生育量が最も大きい６日後に培養を止めて酵素を精製する。
【００２６】
（酵素の精製）
本発明のエステル系ポリウレタンエステラーゼの精製方法は、室温で行うことが可能である。ポリウレタンエステラーゼは、菌体表面に付着しているため、精製に当たって、界面活性剤で抽出する。用いる界面活性剤としては、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドが好適である。
デオキシＢＩＧＣＨＡＰ及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドはそれぞれ、分子量８６２. ０７及び５１０. ６２の界面活性剤である。デオキシＢＩＧＣＨＡＰ及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの構造式をそれぞれ（１）、（２）に示す。
【００２７】
【化１】
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【００２８】
【化２】
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【００２９】
デオキシＢＩＧＨＣＨＡＰは、臨界ミセル濃度が約０. １２％と低く、溶液を２倍程度に希釈することによって、容易にミセルを破壊できる。また、電荷を持たないため、イオン交換クロマトグラフィーの操作に影響を及ぼさない。さらに、使用濃度では硫安分画時に沈殿しない。これらの理由から、特に、デオキシＢＩＧＣＨＡＰが好適である。デオキシＢＩＧＣＨＡＰの使用濃度は、０. ２〜０. ２５％ｗ／ｗが好ましい。０. ２％より低い濃度だと、抽出効果が悪く、０. ２５％より高い濃度だとその後の精製が困難である。
【００３０】
培養後の菌体を集菌後、上記の界面活性剤を含むリン酸バッファー、トリス・ＨＣｌバッファー（ｐＨ約７. ０）などの一般に用いられる緩衝液に懸濁し、攪拌して抽出する。その後、遠心して上清と菌体に分け、上清を粗抽出液とする。粗抽出液は、硫安等の塩析などによって濃縮後、疎水クロマトグラフィー用担体を添加する。担体吸着分を界面活性剤を含む緩衝液に溶出させ、その溶出液を塩析などによって濃縮する。濃縮した担体吸着液を界面活性剤を含む緩衝液に溶かして、陰イオン交換体を添加し、陰イオン交換体に吸着しない画分を、塩析などによって濃縮後、さらに緩衝液に溶かしたものを精製エステラーゼ標品とする。精製過程での担体の添加は、カラムクロマトグラフィーを行うことで代替することができる。
【００３１】
上記に述べた本発明の精製方法によって、粗抽出液から比活性約８倍以上、収率約２５％でポリウレタンエステラーゼを精製できる。本発明の精製方法は、すべてバッチ処理のみで精製を行うことができるので、高価なクロマト機器やカラム等を必要とせず、攪拌器のみで精製が行える。従って、スケールアップが極めて容易、安価に行える。
本発明の精製方法によって、電気泳動に供して、単一のバンドで確認される程度に高純度のポリウレタンエステラーゼが得られる。
【００３２】
（ポリウレタンエステラーゼの性質）
本発明で得られるポリウレタンエステラーゼは、分子量約６２，０００の単量体で、酵素が働くのに適切なｐＨは４〜８、特に好ましくはｐＨ６. ５である。従って、ｐＨ約６〜７. ５の緩衝液中でポリウレタン分解を行うのが望ましい。本発明のポリウレタンエステラーゼは、エステル系ポリウレタンのエステル結合を切断し、アジピン酸とジエチレングリコールを産出する。分解産物のアジピン酸の産生によって、反応溶液のｐＨの低下が起こりやすい。したがって、至適ｐＨから外れるのを防ぐために、例えば、１％のＣａＣＯ3 の添加などの処理をしてｐＨ管理をすることが望ましい。分解するポリウレタンの形状は特に限定しないが、フィルム状、球状など表面積の大きな形状にするのが望ましい。
【００３３】
本発明のポリウレタンエステラーゼの活性測定は、エステラーゼによりｐ−ニトロフェニルアセテートを基質として、生成するｐ−ニトロフェノールの量を４０５ｎｍの吸光度で測定することによって行う。本発明のポリウレタンエステラーゼの活性の単位として、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニットとする。
【００３４】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例により本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
実施例１（マンニトールを炭素源とした細菌の培養）
実験に用いたポリウレタンは、ポリエチレングリコールアジペート（ニッポラン２２００−Ａ、日本ポリウレタン工業社製）に、２，４−トリレンジイソシアネート（和光純薬工業社製）をＯＨ基：イソシアネート基が１：１になるように加えて合成したものである。
３０ｍｌの上記に述べた表１の組成の培地を３００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブをかけて滅菌処理を行った。滅菌処理後の培地にＴＢ−３５株を１白金耳植菌し、３０℃で回転振とう培養を行った。２日おきにサンプリングを行い、菌体生育量及びポリウレタン分解活性を測定した。菌体生育量は５８０ｎｍでの濁度によって測定した。
【００３５】
比較例１（ポリウレタンを炭素源とした細菌の培養）
表１の培地のうち、マンニトールの代わりにポリウレタンを１％ｗ／ｗ添加した培地で培養し、同様に培養し、菌体生育量及びポリウレタン分解活性を測定した。
実施例１及び比較例１の結果を図１及び図２に示す。
【００３６】
上記の結果から、菌体は培養６日目に最も大きい生育量を示すことがわかった。マンニトールを炭素源とした場合には、ポリウレタンを炭素源としたときと比べて、生育菌体当たりのポリウレタンエステラーゼ活性は約１／２と低い。しかし、菌体の生育は、マンニトールを炭素源としたときのほうがよい。また、マンニトールは安価で、かつ、入手しやすいため、大量の酵素を迅速に調製するためには、ポリウレタンよりもマンニトールを炭素源としたほうが良いとわかった。
【００３７】
実施例２（酵素の抽出）
ポリウレタンを炭素源として培養した菌体を集菌し、湿重量で約１０％になるように２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７. ０）を添加し、懸濁した。この懸濁液にデオキシＢＩＧＣＨＡＰ又はｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（共に同仁化学研究所社製）を界面活性剤として０. ２％ｗ／ｗ加え、ボルテックスミキサーによって室温で２時間攪拌して抽出した。その後、遠心して上清と菌体とにわけ、上清のポリウレタンエステラーゼの活性を測定した。
【００３８】
比較例２
界面活性剤として、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０、スクロースモノカプレート、スクロースモノラウレート、コール酸ナトリウム、又はジギトニン（すべて同仁化学研究所社製）を用いた以外は、実施例２と同様な方法でポリウレタンエステラーゼの活性を測定した。また、界面活性剤未添加の上清及び未処理の菌体についてもエステラーゼ活性の測定をした。
実施例２及び比較例２の結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
0003735925.tif 000005
【００４０】
上記の結果から、界面活性剤１５種中、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドに高い抽出能がみられた。特に、デオキシＢＩＧＣＨＡＰに高い抽出能がみられた。また、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒での抽出についても同様に調べたが、抽出効率が極めて悪いか、酵素の失活が起こった。
【００４１】
実施例３（酵素の完全精製）
ポリウレタンを炭素源として培養した菌体（湿重量５４. ８ｇ）を集菌し、湿重量で約１０％になるように、０. ２％ｗ／ｗのデオキシＢＩＧＣＨＡＰを含む５００ｍｌの２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７. ０）を加えた。室温にて、マグネチックスターラーで３０分間抽出を行い、その後、遠心して上清と菌体とに分け、上清を粗抽出液とした。
粗抽出液に細粉化した硫酸アンモニウムを４５％飽和になるように添加し、３０分間攪拌した。これを遠心分離して、上清を除き、沈殿に２０ｍＭリン酸バッファーを４００ｍｌを加え、再溶解し、これを硫酸沈殿画分とした。
硫酸沈殿画分にフェニル・トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）１００ｍｌを添加し、攪拌器にて４０分間５００ｒｐｍで穏やかに攪拌して、ポリウレタンエステラーゼを吸着させた。反応後、グラスフィルターで濾過して、非吸着成分を取り除き、２０ｍＭリン酸バッファーで数回洗浄した。担体をビーカーに戻し、０. ２５％のデオキシＢＩＧＣＨＡＰを含むリン酸バッファー３００ｍｌを加え、４０分間穏やかに攪拌してポリウレタンエステラーゼを溶出させた。これをフェニル・トヨパール溶出画分とした。
【００４２】
得られたフェニル・トヨパール溶出画分に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように加えて遠心し、沈殿を０. ２％のデオキシＢＩＧＣＨＡＰを含む２０ｍＭリン酸バッファー１０ｍｌに溶解した。溶け残りを遠心して除き、Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに供した。カラムは内径１６ｍｍ長さ１０ｃｍのものを用い、移動相には、０. ２％のデオキシＢＩＧＣＨＡＰを含むリン酸バッファーを用いた。カラムを素通りした画分を集め、これをＱ−セファロース素通り画分とした。Ｑ−セファロース素通り画分に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように加えて遠心し、２０ｍＭリン酸バッファーに再懸濁したものを精製酵素標品とした。
実施例３で得られた粗抽出液、硫安沈殿画分、フェニル・トヨパール溶出画分、及びＱ−セファロース素通り画分それぞれについての容量、全蛋白質量、全活性、比活性を表３に示す。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
上記の結果から、ＴＢ−３５株のポリウレタンエステラーゼは、比活性で８. ３倍、収率２５％で精製された。実施例３では、最終精製段階でＱ−セファロースＦＦのカラムクロマトグラフィーを用いたが、この精製過程においてもカラムを素通りした画分にポリウレタンエステラーゼが含まれていることから、すべての過程がバッチ処理で行えることがわかった。
【００４５】
実施例４（精製した酵素の分子量測定）
実施例３で得られた精製酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分子量を測定した。電気泳動は、通常行われているとおりの方法にて行った。
その結果、分子量約６２，０００の位置に単一のバンドが検出された。なお、０. ２％のデオキシＢＩＧＣＨＡＰ存在下でゲル濾過クロマトグラフィーに供したところ、分子量約６２，０００の位置にピークが認められた。
したがって、実施例３の精製方法によって、ポリウレタンエステラーゼは、完全に精製されたことを示し、このエステラーゼは、約６２，０００の分子量を持つ単量体であることがわかった。
【００４６】
実施例５（精製した酵素の諸性質）
１３μｇの実施例３で得られた精製酵素標品（０. ２ユニット）を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）とポリウレタン約１５ｍｇ（４×４×１ｍｍのフィルム状のもの）を入れ、３０℃で２４時間反応させた。反応終了後、ポリウレタンを取り出し、水洗して重量を測定した。その結果、４. ９ｍｇのポリウレタンの重量減少がみられ、精製された酵素が確かにポリウレタンを分解することがわかった。また、反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析したところ、アジピン酸とジエチレングリコールが検出され、その量は分解されたポリウレタン量から計算した理論値とほぼ一致した。このことから、精製された酵素によって、ポリウレタン中のエステル結合が切断され、分解産物として少なくともアジピン酸とジエチレングリコールが生成することがわかった。
【００４７】
実施例６（精製した酵素の至適ｐＨの測定）
ｐＨを種々に調製した緩衝剤を用いた以外は実施例５と同様な条件でポリウレタンを分解させた。用いた緩衝液は、ｐＨ４〜６は酢酸バッファー、ｐＨ６〜８はリン酸バッファー、ｐＨ８〜９はトリス・塩酸バッファーであり、すべて１００ｍＭの濃度であった。ｐＨ６. ５での酵素活性を１００％としたときのｐＨと酵素活性の関係を図３に示す。
図３から、至適ｐＨ６〜７. ５、特にｐＨ６. ５である。従って、ｐＨ約６〜７. ５の緩衝液中でポリウレタン分解を行うのが望ましいことがわかった。ポリウレタンエステラーゼは、至適ｐＨが比較的狭く、ポリウレタンの分解に用いるときには、分解産物のアジピン酸による反応液のｐＨの低下に注意を要すことがわかった。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、コマモナス・アシドボランス  ＴＢ−３５株は、エステル系ポリウレタン以外の炭素源を基質としても生育し、ポリウレタンエステラーゼを産生する。よって、一般的な培地を用いて、大量のポリウレタンエステラーゼを迅速、かつ安価に調製することができる。
また、本発明の精製方法によって、ポリウレタンエステラーゼの精製に、界面活性剤を用いたバッチ処理で精製ができる。そのため、高価な機械を使用することなく、容易、かつ安価にポリウレタンエステラーゼを得ることができる。本発明の精製方法によれば、ＴＢ−３５株のポリウレタンエステラーゼは粗抽出液と比べて、比活性で約８倍以上に精製できる。
なお、本発明によれば、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ又はｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドは、酵素を失活させることなく３０分間で抽出できる界面活性剤であることがわかった。特に、デオキシＢＩＧＣＨＡＰは、硫安沈殿の際も沈殿を生じることがなく、電荷を持たないのでイオン交換クロマトグラフィー操作に影響を及ぼすこともないので好適である。
【００４９】
本発明の精製方法で得られるポリウレタンエステラーゼは、エステル系ポリウレタンを分解し、アジピン酸、ジエチレングリコールを得ることが可能である。この分解反応は、常温の反応であり、高価な薬品を必要としない。したがって、分解が困難であったポリウレタンを容易、かつ安価に分解することができ、ゴミ処理などの環境問題解決の糸口となるうえに、資源の再利用をはかることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マンニトール又はポリウレタンを炭素源として用いたときの菌体生育量を示すグラフ。
【図２】マンニトール又はポリウレタンを炭素源として用いたときのポリウレタン分解活性を示すグラフ。
【図３】精製したポリウレタンエステラーゼの活性とｐＨとの関係を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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