(57)【要約】配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するホップファルネシルピロリン酸シンターゼのゲノミックＤＮＡ、配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するホップファルネシルピロリン酸シンターゼのｃＤＮＡ及び前記ゲノミックＤＮＡとｃＤＮＡの塩基配列情報を基に見出されたホップルプリン腺毛に特異的に発現するファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域により、ホップにおいて二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子及びホップのルプリン腺毛で組織特異的に機能するプロモーター遺伝子の塩基配列を明らかとなり、遺伝子工学的手法によるホップの形質転換や、ホップの二次代謝産物の試験管内での合成が可能となる。
2002031164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項４】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸。
【請求項５】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列の一部からなることを特徴とする核酸。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の核酸と、若しくは相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項７】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸。
【請求項８】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列の一部からなることを特徴とする核酸。
【請求項９】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、塩基番号１〜１８８６で表される塩基配列を有することを特徴とする核酸。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の核酸と、若しくは相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有することを特徴とする核酸。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ホップのファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼ遺伝子及び前記遺伝子のプロモーター領域に関する。
背景技術
植物は、その植物体内にテルペノイド、アルカロイド、フェノーリスク、サポニンなどの膨大な種類の低分子有機化合物を生産し蓄積している。当初、これらの化合物は、生物の生命維持に直接関与するものでなく、単に副次的な機能しかないと考えられていたことから二次代謝産物と呼ばれていた。
しかしながら、近年では、この二次代謝産物が細胞の分化または外的因子からの防御に関与する物質として機能することが明らかになりつつあるとともに、嗜好物、医薬品、染料等の広い分野で利用法が見出され、農学分野のみならず、幅広い分野でその有用性に注目が集まっている。
このような二次代謝産物は産業上利用価値が高いことから、植物細胞内での生成過程の解明が進められ、現在ではこれら物質が多数の酵素等が関与した複雑なカスケードを経て生合成されていることが示されてきた。しかしながら、このような物質を得るには植物から直接抽出する必要があり、このような場合に一度に単離できる量が非常に少なく、その結果コスト高になるため、遺伝子工学技術や培養細胞等を用いた試験管内での合成方法の開発が望まれていた。
植物における二次代謝産物の合成カスケードに関与する酵素としてファルネシルピロリン酸シンターゼが知られている。ファルネシルピロリン酸シンターゼは植物における色素、香り、植物ホルモン、ファイトアレキシン、害虫等に対する防御物質等の様々な物質の基幹となっているイソプレノイドの代謝に関与する酵素であり（Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｓ−Ｗａｌｔｅｒ　Ｈｅｌｄｔ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ３６０−３７６，１９９７）、イソペンテニルピロリン酸にジメチルアリルピロリン酸を付加してゲラニルピロリン酸へ変換する反応を触媒する他、前記ゲラニルピロリン酸にイソペンテニルピロリン酸を付加してファルネシルピロリン酸へ変換する反応を触媒することが明らかとなっている。
一方、ホップはビールの爽快な苦味と香りを与える主要な原料であるが、このホップにおいても球果に含まれるルプリン腺毛内で二次代謝産物が多く分泌され、この二次代謝産物がビールの苦味や香りに大きく寄与していることが明らかになってきた。さらに、近年では、このホップの二次代謝産物が薬理作用を有していることが示されている（例えば、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（１），１５８，１９９７）。こうした経緯から、ホップにおいても、苦味質、精油成分といったルプリン腺毛中に蓄積される二次代謝産物に主眼をおいた様々な品種改良が行われている。
しかしながら、ホップは雌雄異株の植物であり、特に雄株はビールの原料となる球果を付けず、商業上重要視されないことからあまり研究がなされておらず、醸造上有用な遺伝形質についてもほとんど明らかにされていない。そのため、従来の交配による育種法では、経験と勘に頼る部分が多く、特に醸造品質については実際に球果が着生するまで全く予想が付かないというのが現状である。従って、ホップにおいても上述のファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を単離し、遺伝子工学的手法を用いたアプローチでホップにおける二次代謝産物の制御や試験管内での合成法の確立が強く望まれている。
一方、今日では、形質転換技術や分子選抜技術といった遺伝子工学を用いた育種法が各種の植物において可能となりつつある。これらの方法の場合、経験と勘に頼る部分が多い伝統的な育種法に比べ、より客観的で効率的な育種が可能である。すなわち、形質転換技術は外来遺伝子を植物細胞内に導入、発現させて付与したい形質を直接導入させる技術であるが、外来遺伝子を発現させるには、遺伝子の発現を制御する植物細胞内で機能可能なプロモーターに目的とする構造遺伝子及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを連結し、これを植物細胞内に導入するといった方法が採られる。これまでに、実験レベルでよく使われるプロモーターとしては、比較的多くの植物で組織を問わずに導入遺伝子を発現させることのできるＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターやノパリン合成酵素遺伝子プロモーター（Ｓａｎｄｅｒｓ　Ｐ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ，１５（１９８７）１５４３−１５５８）等があった。しかしながら、前記のプロモーターを用いて全ての組織に導入遺伝子を発現させた場合に、導入遺伝子によっては植物の生育等に害を及ぼすこともあるため、目的の組織において外来遺伝子を発現させるような組織特異的プロモーター遺伝子の単離が強く望まれていた。
発明の開示
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ホップにおいて二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子及びホップのルプリン腺毛で組織特異的に機能するプロモーター遺伝子の塩基配列を明らかにし、遺伝子工学的手法によるホップの形質転換や、ホップの二次代謝産物の試験管内での合成を可能とすることを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ホップのルプリン腺毛に強く発現し、二次代謝産物の生合成に関与するファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子及びそのプロモーター遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明に従えば、以下１〜２に記載のタンパク質が提供される。
１．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
２．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
また、本発明に従えば、３〜１０に記載の核酸が提供される。
３．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
４．配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸。
５．配列表の配列番号３に記載の塩基配列の一部からなることを特徴とする核酸。
６．配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸と、若しくは相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
７．配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸。
８．配列表の配列番号２に記載の塩基配列の一部からなることを特徴とする核酸。
９．配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、塩基番号１〜１８８６で表される塩基配列を有することを特徴とする核酸。
１０．前記７〜８に記載の塩基配列を有する核酸、若しくは相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有することを特徴とする核酸。
そして、このようなタンパク質又は核酸を用いることにより、遺伝子工学的手法によるホップの形質転換や、ホップの二次代謝産物の試験管内での合成を可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明における「核酸」とは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または誘導化された活性なＤＮＡ若しくはＲＮＡでありうるポリヌクレオチドを指し、好ましくはＤＮＡ及び／またはＲＮＡをいう。この場合、前記核酸の形態としては、例えば、ゲノミックＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡが挙げられる。
また、本発明における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、２つの核酸断片が、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ）」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズすることをいう。
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０×ＳＳＣで洗浄することをいう。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．１×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温（約２２℃）から高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
また、本発明における「プロモーター」とは、ＤＮＡ上に存在する塩基配列であって、ＲＮＡ合成（転写）を開始させたり終了させたりする指令、またはその頻度を調節する指令を司る役割を果たすシグナル配列を指す。
また、本発明における「プロモーター活性」とは、前記プロモーターが前述のように転写の開始、終了及びその調節を行う働きをすることを指す。
先ず、本発明のホップファルネシルピロリン酸シンターゼについて説明する。
本発明のタンパク質は、配列表の配列番号１に記載の３４２アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有するホップファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質である。
また、本発明のタンパク質は、ファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有するタンパク質であれば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
さらに、多くのタンパク質には糖鎖が付加され、アミノ酸を１若しくは複数変換することにより糖鎖の付加を調節することができる。従って、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、前記糖鎖の付加を調節されたタンパク質も上述のファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有する限り本発明のタンパク質に包含される。
また、上記のファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸も本発明に含まれる。すなわち、一つのアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）は複数存在するため、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする核酸は多数存在する。従って、このような核酸も本発明の核酸に包含される。ここで、「タンパク質をコードする」とは、ＤＮＡが２本鎖である場合には、相補２本鎖のいずれか一方がタンパク質をコードする塩基配列を有するものを含むことを意味するため、本発明の核酸には配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を直接コードする塩基配列からなる核酸若しくはその相補的な塩基配列からなる核酸をも包含される。
次に、本発明にかかるファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子について説明する。
本発明の核酸は配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有し、ホップファルネシルピロリン酸シンターゼをコードする核酸（ｃＤＮＡ）である。
また、本発明の核酸は、前記配列番号３に記載の塩基配列の一部からなる核酸であってもよい。
さらに、本発明の核酸は、前記配列番号３に記載の１０２９塩基数の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよく、この条件を満たす限りにおいてはその塩基配列は特に制限されない。さらに、本発明の核酸には前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に相補的な塩基配列を有する核酸も包含され、具体的には、例えば、前記配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸の塩基のいくつかに欠失、置換、挿入、付加等があり、かつファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。ここで、欠失、置換、挿入、付加とは、１〜１０塩基の短い欠失、置換、挿入、付加のみならず、１０〜１００塩基の長い欠失、置換、挿入、付加も含む。また、ファルネシルピロリン酸シンターゼ活性とは、ファルネシルピロリン酸シンターゼの触媒作用によってファルネシルピロリン酸を合成する反応を進行させる活性をいう。この場合、ファルネシルピロリン酸シンターゼの基質となる物質は最終的にファルネシルピロリン酸が合成される物質であれば特に制限されないが、例えば、イソペンテニルピロリン酸やゲラニルピロリン酸が挙げられる。
ホップにおいては前記のゲラニルピロリン酸やファルネシルピロリン酸はミルセン、フムレン、カリオフィレン及びファルネッセン等の精油成分の前駆体と考えられることから、上記の配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する核酸をを検出することにより、ホップの精油成分の代謝系の制御や精油成分に関する形質の遺伝子マーカーとして利用することができる。前記の核酸の検出には配列表の配列番号３に記載の塩基配列の全ては必要でなく、例えば、その一部をＰＣＲ法により増幅し塩基配列の決定またはＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等のような遺伝子解析手段を用いて検出を行えばよい。従って、本発明の核酸には、配列表の配列番号３に記載の塩基配列の一部からなる核酸も包含される。
次に、本発明にかかるファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域について説明する。
本発明の核酸は配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸である。また、本発明の核酸は、前記配列番号２に記載の４６９９塩基数の塩基配列を有する核酸の一部であってもよく、塩基番号１〜１８８６で表される塩基配列であってもよい。
前記配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸は、ファルネシルピロリン酸シンターゼのゲノミックＤＮＡであり、ファルネシルピロリン酸シンターゼの開始メチオニンをコードする塩基配列はその中の塩基番号１８８７〜１８８９である。従って、前記配列番号２に記載の塩基配列中の塩基番号１〜１８８６は５’非翻訳領域であり、この領域にファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域が含まれる。前記塩基番号１〜１８８６のうちプロモーター領域の両末端の境界を厳密に特定することは困難であるが、プロモーター活性を有する限り前記塩基番号１〜１８８６中の一部からなる配列も本発明の核酸に包含される。
また、本発明の核酸は、前記配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸またはこの核酸のうち塩基番号１〜１８８６で表される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する核酸であってもよく、この条件を満足する限りにおいてはその塩基配列は特に制限されない。さらに、本発明の核酸には前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する核酸に相補的な塩基配列を有する核酸も包含され、具体的には、例えば、前記配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸において１または複数の欠失、置換、挿入、付加等があり、かつプロモーター活性を有する核酸が挙げられる。ここで、欠失、置換、挿入、付加とは、１〜１０塩基の短い欠失、置換、挿入、付加のみならず、１０〜１００塩基の長い欠失、置換、挿入、付加も含む。
次に、本発明の核酸を単離し、その遺伝子産物の機能を解析する好適な方法について説明する。
本発明の核酸は、以下の（１）〜（５）のステップを経て単離することができ、（６）〜（７）のステップにおいて、単離された遺伝子がファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を示すこと、またはプロモーター活性を有することを確認することが可能である。
１．ホップのファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子及びそのプロモーターの単離
（１）ホップゲノミックＤＮＡの調製
ホップゲノミックＤＮＡの調製は公知の方法で行うことができ、例えばＷａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．らの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４，２０９７−２１００（１９８７））で行うことができる。
（２）ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子及びそのプロモーターの単離
ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子の部分断片は、シロイヌナズナ、トウモロコシ等の既知となっている他の植物のファルネシルピロリン酸シンターゼの塩基配列に基づいてプライマーを設計し、逆ＰＣＲ法（Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ）やＣａｓｓｅｔｔ−ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＰＣＲといった公知の方法を用いて単離することができる。逆ＰＣＲ法は、図２の模式図に示したように、試料となるＤＮＡを制限酵素で消化し、増幅前に前記制限酵素消化産物を環状化した試料を鋳型とし、通常ＰＣＲ法に用いるプライマーとは反対の向きに合成したプライマーとを用いてＰＣＲ法を行う方法であり、特定の塩基配列に隣接する上流や下流領域を増幅させることが可能である。逆ＰＣＲ法の具体例としては、例えば、Ｌｉｕ，Ｙ．Ｇ．らの方法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２５，６７４−６８１（１９９５））が挙げられる。また、Ｃａｓｓｅｔｔ−ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＰＣＲとは、図３の模式図に示したように、既知の塩基配列に隣接した未知の塩基配列を知りたい場合に用いられる方法である（例えば、「ＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ」（宝酒造社製）に添付のプロトコールに記載の方法）。具体的には、先ず、このような核酸領域を含む核酸を制限酵素により消化し、前記制限酵素認識部位を有しかつプライマーを設定できうる既知の塩基配列を有するアダプター核酸を前記の核酸に連結することにより塩基配列が既知である領域に挟まれた未知の塩基配列の領域をＰＣＲ法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定すればよい。このような逆ＰＣＲ法及び／またはＣａｓｓｅｔｔ−ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＰＣＲを繰り返すことにより、ホップのファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子の全領域及びそのプロモーターを単離することができる。
（３）塩基配列の決定
単離された遺伝子の塩基配列は公知の方法で決定することができる。例えば、ＰＥバイオシステムズ社製の「ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｄｙｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」に添付のプロトコール等に従って行うことができる。また、前記の方法で決定された塩基配列をデータベース（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／等）を用いて相同性検索を行うことにより他の植物種から得られた既知遺伝子との相同性の有無やその程度を知ることが可能となり、得られた遺伝子が新規遺伝子であるか否かの判断を行うことが可能となる。
（４）各組織画分における全ＲＮＡの調製
全ＲＮＡの調製は任意の組織画分を調製した後、公知の方法で行うことができ、例えば、Ｃｈａｎｇ，Ｓ．らの方法（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔ　１１，１１３−１１６（１９９３））で行うことができる。
（５）ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子ｃＤＮＡの単離
ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のｃＤＮＡは公知の方法を用いて単離することができ、例えば、（２）で単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のゲノミックＤＮＡの塩基配列に基づいてプライマーを設定し、全ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法により単離すればよい。この場合の具体的な方法は、例えば、ロシュ・ダイアグノスティクス社製の「Ｔｉｔａｎ　Ｏｎｅ　Ｔｕｂｅ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ」に添付のプロトコール等に記載の方法を用いることができる。
（６）単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子にコードされたタンパク質の機能解析
（５）で単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子にコードされたタンパク質は、ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、このベクターを大腸菌に導入することにより大腸菌の菌体内で発現させることができる。前記のようなファルネシルピロリン酸シンターゼにコードされたタンパク質の発現及び前記タンパク質の精製は、例えば「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）に添付のプロトコールに記載の方法で精製することができる。また、この大腸菌で発現、精製したファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質の機能は公知の方法で確認することができ、例えば、Ｓｙｌｖｉｅ　Ａ．らの方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２１，４９３−５００，（１９９５））で確認することができる。
（７）ノーザンハイブリダイゼーション解析（以下、ノーザン解析という）
単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子がどの組織で発現しているか、または、単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のプロモーターがどの組織で機能しているかは、単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子をプローブとしてノーザン解析により解析することができ、例えば「Ｔｈｅ　ＤＩＧ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ　ｆｏｒ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」ベーリンガーマンハイム社、ｐ．５３−５５（１９９５）に記載された方法に基づいて行うことができる。
次に、本発明の核酸によって可能となる実施形態の一例について説明する。
（１）ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブとして使用することによって少なくともホップにおいて発現しているファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を検出することが可能である。また、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブとして使用してホップ組織における遺伝子発現を調べることで、遺伝子発現の分布を同定することも可能である。
本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション法自身については特に限定されないが、具体的には、例えば、ノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）、ＤＮＡチップ法、マイクロアレイ法、などが挙げられる。
本発明の塩基配列をハイブリダイゼーション用プローブとして使用する場合は、少なくとも２０個の塩基長が必要であり、本発明の遺伝子配列のうち、２０個以上の連続した塩基長がある遺伝子が好ましく用いられる。より好ましくは４０個以上、特に好ましくは、６０個以上の塩基長を有するものが用いられる。
当業者には、核酸プローブ技法は周知であり、個々の長さの本発明によるプローブと目的とするポリヌクレオチドとの適当なハイブリダイズ条件は容易に決定される。種々の長さを含むプローブに対し至適なハイブリダイズ条件を得るためのこのような操作は当業者では周知であり、例えばサンブルックら、「分子クローニング：実験手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）」が参照される。
ここで、前記プローブは、容易に検出されるように標識されているものが好ましい。検出可能な標識は、目視によって、または機器を用いるかのいずれかによって検出され得るいかなる種類、部分であってもよい。通常使用される検出可能な標識は、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ等の放射性標識である。ビオチン標識ヌクレオチドは、ニックトランスレーション、化学的及び酵素的手段等によって、核酸に組み込むことができる。ビオチン標識されたプローブは、アビジン／ストレプトアビジン、蛍光標識剤、酵素、金コロイド複合体等の標識手段を使用したハイブリダイゼーションの後検出される。核酸はタンパク質と結合させることによって標識されてもよい。また、放射性又は蛍光ヒストン一本鎖結合タンパク質に架橋された核酸を使用してもよい。
（２）ＰＣＲ法に用いるプライマー
ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子の検出は、開示された塩基配列の任意の配列をプライマーとし、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法を用いることによっても可能である。例えば、検定したいサンプルからＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。このような方法は当事者にとって周知の方法によって行われる。
本発明の核酸をＰＣＲ用プライマーとして使用する場合は、１０個から６０個の塩基の長さが必要であり、本発明の核酸のうち、１０個から６０個の連続した塩基を持つ核酸が好ましく用いられ、より好ましくは１５個から３０個の塩基をもつものが用いられる。また一般的には、前記プライマー配列中のＧＣ含量が４０％から６０％が好ましい。さらに、増幅に用いる２つのプライマー間のＴｍ値に差がないことが好ましい。またプライマーの３’末端でアニールせず、プライマー内で２次構造をとらないことが好ましい。
（３）核酸のスクリーニング
本発明において開示された塩基配列の一部、または全部を使用することによってホップで発現しているファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子の発現分布を検出することが可能である。例えば、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用することによって、遺伝子発現の分布を検出することが可能である。
またＤＮＡチップ、マイクロアレイ等を用いても当該遺伝子発現の分布を検出することが可能である。すなわち本発明により開示された塩基配列の一部、又は全部を直接チップ、アレイ上に張り付けことが出来る。そこに細胞から抽出したＲＮＡを蛍光物質などでラベルし、ハイブリダイズさせ、その遺伝子がどの様な細胞で高発現しているかを解析することが可能である。またチップ、アレイ上に張り付けるＤＮＡは本発明により開示された塩基配列の一部、又は全部を用いたＰＣＲの反応産物であっても良い。
（４）ＤＮＡのクローニング
本発明において開示された塩基配列の一部、又は全部を使用することによって少なくともホップにおいて発現している遺伝子をクローニングすることが可能である。例えば、本発明において開示された塩基配列の一部、又は全部をノザンハイブリダイゼーションのプローブ、コロニーハイブリダイゼーションのプローブ又はＰＣＲのプライマーとして使用し、本発明において開示された塩基配列の一部、又は全部を含む遺伝子をクローニングすることが可能である。
以上説明した実施形態以外にも、本発明のタンパク質又は核酸を用いてホップファルネシルピロリン酸シンターゼに関する情報を得たり、ホップの形質転換、二次代謝産物の生産等を行うことが可能となる。
すなわち、上述のファルネシルピロリン酸シンターゼは、植物における色素、香り、植物ホルモン、ファイトアレキシン、害虫等に対する防御物質等の様々な物質の基になっているイソプレノイドの代謝に関与する酵素である。従って、例えば上記のようにして単離されたファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を利用することにより、植物における色素、香り、植物ホルモン、ファイトアレキシン、害虫等に対する防御物質等の代謝系の制御やこれらの形質を司る遺伝子の検出が可能となる。
また、本発明で単離されたファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を用いて遺伝子工学的手法により製造されたファルネシルピロリン酸シンターゼを用いることにより、試験管内で植物の二次代謝産物の生産を行うことが可能となる。
さらに、ホップにおいてその樹脂成分及び抗癌作用を有するといわれるキサントフモール（Ｂｒａｕｗｅｌｔ，３６，１９９８）の代謝系においてもファルネシルピロリン酸シンターゼが関与している可能性も考えられるため、本発明の核酸を用いることにより、ホップの樹脂成分やキサントフモールの代謝系の制御が可能となるばかりか、前記樹脂成分及びキサントフモールに関する形質の遺伝子マーカーとして利用することが可能となる。
従って、従来では経験と勘に頼らざるを得なかったホップの育種方法を遺伝子工学的手法により行うことが可能となり、例えば、植物における形質転換技術を利用して本発明のファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子をホップに導入することにより、ルプリン腺毛における二次代謝産物の組成等を制御することが可能となる。従って、ホップを利用した食品（例えばビールや発泡酒）における品質の向上や維持、若しくは二次代謝産物を利用した医薬品の品質の向上や効率化が可能となる。
さらに、本発明にかかるファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域を含む核酸を利用することにより、前記プロモーターの下流に対象とするホップに導入したい遺伝子及びホップで機能するターミネーターを連結し、前記ホップに導入することにより、前記の遺伝子をルプリン腺毛で特異的に発現させることが可能となる。
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ホップゲノミックＤＮＡの調製）
ホップゲノミックＤＮＡの調製は以下のようにして行った。すなわち、ホップの葉を液体窒素中で凍結粉砕し、２％ＣＴＡＢ溶液（２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド、０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５）、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．４Ｍ　ＮａＣｌ、５％βメルカプトエタノール）に懸濁して６５℃で３０分間保温した。前記懸濁液をクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出後、３／４倍量のイソプロパノールを加えてＤＮＡ及びＲＮＡを析出させた。析出したＤＮＡ及びＲＮＡをＨｉｇｈ　Ｓａｌｔ　ＴＥ緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解し、ＲＮａｓｅを加えて６０℃で保温しＲＮＡのみを分解した。これに２倍量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを析出させ、析出したＤＮＡをさらに７０％エタノールで洗浄後、水に溶解し、ゲノミックＤＮＡサンプルとした。
実施例２
（ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子及びそのプロモーターの単離）
塩基配列が既知であるシロイヌナズナ、トウモロコシ、グアユールゴムノキ、パラゴムノキ、シロバナルピルス及びコショウのファルネシルピロリン酸シンターゼのアミノ酸配列のうち、各植物間で共通となっている配列に基づいてプライマー１（配列番号４）及びプライマー２（配列番号５）を合成した。これらのプライマーを用いてホップゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、図１の断片１を得た。
次に、得られた増幅断片の塩基配列を決定した。ここで得られた塩基配列から表１に示すプライマー３（配列番号６）、プライマー４（配列番号７）、プライマー５（配列番号８）及びプライマー６（配列番号９）を設計し、逆ＰＣＲ法を用いて図１の断片２及び断片３を得た。
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具体的には、ホップゲノミックＤＮＡを制限酵素ＢｇＩＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、「ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．１」（宝酒造社製）を用いて添付されたプロトコールに従い、分子内ライゲーション（Ｓｅｌｆ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行い、分子内ライゲーションが終了した反応液の一部を鋳型として、プライマー３及びプライマー５を用いてＰＣＲを行った。次に前記ＰＣＲが終了した反応液の一部を鋳型として、表１に示すプライマー４及びプライマー６を用いてＰＣＲをおこない、図１の断片２及び断片３を得た。
同様にして、図１の断片２の塩基配列からプライマー７（配列番号１０）、プライマー８（配列番号１１）、プライマー９（配列番号１２）を設計した。制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したホップゲノミックＤＮＡについて分子内ライゲーションを行い、これを鋳型として上記プライマー７及びプライマー９を用いて再度ＰＣＲを行い、図１の断片４を得、塩基配列を決定した。
また、図１の断片５は「ＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ」（宝酒造社製）によるＣａｓｅｔｔ−ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＰＣＲ法を用い、添付のプロトコールに従って単離した。すなわち、ホップゲノミックＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、これにキットに付属しているＥｃｏＲＩアダプターを結合した。次に、断片３の塩基配列を基に設計したプライマー１０（配列番号１３）と前記キットに付属のカセットプライマーＣ１を用いてＰＣＲを行った。更に、このＰＣＲ反応液を鋳型として、断片３の塩基配列を基に設計したプライマー１１（配列番号１４）とキットに付属のカセットプライマーＣ２を用いてＰＣＲを行い、断片５を得、その塩基配列を決定した。
最後にホップゲノミックＤＮＡを鋳型として、図１の断片４及び断片５の塩基配列を基に設計したプライマー１２（配列番号１５）及びプライマー１３（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、ホップファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子及びそのプロモーターを含む断片６を得た。上記のいずれのＰＣＲにも「Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ」（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて添付されたプロトコールに従って行った。
実施例３
（ホップファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子及びプロモーターの塩基配列の決定）
実施例２において得られたホップファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子及びそのプロモーターを含む断片６の両末端を「ＴａＫａＲａ　ＢＫＬ　Ｋｉｔ」（宝酒造社製）を用いて平滑化し、ｐＵＣベクターにサブクローニングした。断片６の両末端の平滑化とｐＵＣベクターへのサブクローニングは前記キットに添付のプロトコールに従って行った。
塩基配列の決定は「ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」（ＰＥバイオシステム社製、ＡＢＩ３７３Ｓ型）を用い、添付のプロトコールに従って行った。断片６の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
実施例４
（各組識画分及び全ＲＮＡの調製）
全ＲＮＡを抽出する組織として、ホップの葉、茎、ルプリン（−）画分及びルプリン（＋）画分を調製した。ここで、ルプリン（−）画分とはルプリン腺毛のほとんど存在しない球芽の外苞を主として回収した画分であり、ルプリン（＋）画分とは球芽からルプリン腺毛以外の組織を極力除いた主としてルプリン腺毛からなる画分である。これらの組織画分を液体窒素中で凍結粉砕し、２％ＣＴＡＢ溶液（２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド、０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５）、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．４Ｍ　ＮａＣｌ、５％βメルカプトエタノール）に懸濁して、６５℃で１０分間保温した。クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出後、１／３倍量の１０Ｍ塩化リチウムを加え、一晩放置し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、沈殿を水に溶解した。ここで、全ＲＮＡを実施例５において使用する場合には、前記の水に代えてＤＮａｓｅ反応バッファー（１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、５ｍＭ塩化マグネシウム）に溶解し、ＤＮａｓｅを加えて３７℃で保温してＤＮＡを分解した。前記溶液に更に１／３倍量の１０Ｍ塩化リチウムを加え、一晩放置し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿を７０％エタノールで洗浄後乾燥し、再度水に溶解して全ＲＮＡサンプルとした。
実施例５
（ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のｃＤＮＡの単離及びその塩基配列の決定）
ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のｃＤＮＡは、塩基配列が既知であるシロイヌナズナ等のファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子の情報から実施例３において決定された配列番号２に記載のホップファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のコーディング領域両末端を推定し、その配列にＢａｍＨＩ認識配列を付加した配列を有するプライマーを設計し、実施例４で得た全ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法により単離した。すなわち、プライマーはプライマー１４（配列番号１７）及びプライマー１５（配列番号１８）を用い、ＲＴ−ＰＣＲは「Ｔｉｔａｎ　Ｏｎｅ　Ｔｕｂｅ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ」（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った。こうして得られたファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のｃＤＮＡはｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターにサブクローニングし、ｐＦＰＰＳ１０１Ｒとした。前記サブクローニングされたファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子ｃＤＮＡは「ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」（ＰＥバイオシステム社製）及びＤＮＡシークエンサーＡＢＩ３７３Ｓ型（ＰＥバイオシステム社製）を用い、添付のプロトコールに従って塩基配列の決定を行った。得られたファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。また、このｃＤＮＡにコードされているタンパク質のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示す。
配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、６６０番目の塩基が対応するゲノミックＤＮＡの配列（配列番号２の３７３７番目の塩基）（塩基配列の確認は複数回行った）と異なるが、これはｃＤＮＡを単離する際に行ったＲＴ−ＰＣＲにおいて生じた塩基の取り込みエラーと考えられる。しかし、このエラーはアミノ酸レベルでは本来コードされるアミノ酸と同一となるため、実施例６で述べるタンパク質の機能解析には影響を及ぼさない。
実施例６
（単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子にコードされたタンパク質の機能解析）
単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子にコードされたタンパク質が、実際にファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有するか否かを確認する為、実施例５において単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のｃＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで処理したＤＮＡを「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）に付属の発現ベクターｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ部位に組み込んだ後、大腸菌に導入してファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を前記大腸菌内で発現させ、その発現産物を精製した。前記大腸菌内でのファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子の発現及び発現産物の精製は「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）に添付のプロトコールに従って行った。
次に、得られた発現産物がファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有するか否かをＳｙｌｖｉｅ　Ａ．らの方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２１，４９３−５００，（１９９５））に従って確認した。すなわち、酵素反応液１００μｌ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭジチオエリスリトール、１ｍＭ塩化マグネシウム、１００μＭジメチルアリルピロリン酸）に精製したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子の発現産物２μｌ（２８μｇ）と１４Ｃ−イソペンテニルピロリン酸２．５μｌ（０．０５μＣｉ）を加え、３０℃で３０分間反応させた。次に、アルカリフォスファターゼ（和光純薬社製）に付属の１０倍濃度反応緩衝液を３０μｌ加え、アルカリフォスファターゼ１μｌ（１０ｕｎｉｔｓ）を加えて３７℃で３時間反応後、さらに２５℃で一晩反応した。前記反応液にファルネソール１μｌ（４．５ｎｍｏｌ）をキャリアーとして加え、さらにヘキサン２００μｌを加えて混合し、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離してからヘキサン層を回収し、残った水層に再びヘキサン１００μｌを加えて混合、遠心分離し、ヘキサン層を回収して先に回収したヘキサン層と混合した。このヘキサン抽出液に窒素ガスを吹き付けて１μｌまで濃縮し、メタノール１０μｌを加えて混合した後、１μｌを薄層クロマトプレート（ＨＰＴＬＣ−ａｌｕｍｉｎｉｕｍ　ｓｈｅｅｔｓ　ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０　Ｆ２５４　ｐｒｅ−ｃｏａｔｅｄ，メルク社製）にスポットし、ベンゼン：酢酸エチル＝９：１の展開溶媒で展開した。なお、スタンダードとして、ファルネソールとゲラニオールを同時にスポットした。展開が終了した薄層クロマトプレートを乾燥後、よう素を噴霧してファルネソールとゲラニオールの位置を確認した後、Ｘ線フィルムにて−８０℃で７日間露出を行った。得られた結果を図４に示す。
図４に示した通り、反応産物によるシグナルがファルネソールとゲラニオールの位置に検出された。すなわち単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子にコードされるタンパク質がファルネシルピロリン酸シンターゼ活性を有することが確認された。
実施例７
（ノーザンハイブリダイゼーション解析）
単離したファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子がホップの中のどの組織でまたどの程度の量が発現しているかを確認する為、ノーザンハイブリダイゼーション解析を行った。
まず、実施例５において作製したプラスミドｐＦＰＰＳ１０１Ｒを制限酵素ＫｐｎＩで消化して直鎖状としたものを鋳型として「ＤＩＧ　ＲＮＡラベリングキット（ＳＰ６／Ｔ７）」（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いてファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のＲＮＡプローブを作製した。作製方法は前記キットに添付のプロトコールに従って行った。
次に、実施例４で調製した葉、茎、ルプリン（−）画分及びルプリン（＋）画分の全ＲＮＡについて各１５μｌずつを変性アガロースゲル（１．２％アガロース、６．７％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を用いて電気泳動を行った。電気泳動が終了したゲルを蒸留水中で４０分ずつ３回振盪して前記アガロースゲル中のホルムアルデヒドを抜いた後、２０×ＳＳＣ（０．３Ｍクエン酸ナトリウム、３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を緩衝液として前記アガロースゲル中のＲＮＡをナイロンメンブレンに転写した。ＲＮＡが転写されたナイロンメンブレン及び上記のプローブを用いて６８℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行った。なお、ハイブリダイゼーションに用いられたハイブリダイゼーションバッファーの組成は、５×ＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳ、０．１％Ｎ−らウロイルサルコシン、５０％ホルムアミド、２％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）である。ハイブリダイゼーション終了後、洗浄液（０．１％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ）を用いて６８℃で３０分間の洗浄処理を２回行い、さらに、洗浄液（０．１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ）を用いて６８℃で３０分間の洗浄処理を２回行った。洗浄後、プローブがハイブリダイズしたＲＮＡ断片の検出を行った。前記の検出は「ＤＩＧシステムを用いてハイブリダイゼーションを行うためのユーザーガイド」（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）に記載のプロトコールに従って行った。得られた結果を図５に示す。
図５の結果から、葉、茎、ルプリン（−）画分及びルプリン（＋）画分のいずれの組織画分においても、ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子をコードしている配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸のサイズに近い１．１ｋｂの位置にシグナルが見られることから、ホップのファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子はいずれの組織画分においても発現していることが確認された。しかしながら、シグナルの強度がルプリン（＋）画分＞ルプリン（−）画分＞茎＞葉の順であることから、ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子由来のｍＲＮＡが各組織において占める割合はルプリン腺毛で最も多く、次いで茎と外苞、最も占める割合が少ないのが葉であることが確認された。すなわち、ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子はルプリン腺毛において最も強く発現し、また、ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子のプロモーターはルプリン腺毛で最もプロモーター活性が高いことが確認された。
産業上の利用の可能性
以上説明したように、本発明に従えば、ファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質及び遺伝子を同定できるので、ホップにおいて二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子及びホップのルプリン腺毛で組織特異的に機能するプロモーター遺伝子の塩基配列が明らかとなり、遺伝子工学的手法によるホップの形質転換や、ホップの二次代謝産物を試験管内で合成することが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を単離する過程で得られた核酸断片を示す図である。
図２は、本発明において用いられた逆ＰＣＲ法の原理を示す模式図である。
図３は、本発明において用いられたＣａｓｅｔｔ−ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＰＣＲ法の原理を示す模式図である。
図４は、本発明のファルネシルピロリン酸シンターゼの活性を測定した薄層クロマトグラフィーの展開像を示す図である。
図５は、本発明のファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子の発現を確認したノーザン解析の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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