(57)【要約】ＩｇＥが関与するアレルギー疾患の治療に有効な抗体または抗体フラグメントを提供する。ファージ抗体法を用いて、ＩｇＥのＦｃ部に対して高い親和性を有する受容体（ＦｃεＲＩ）に対するヒト抗体及び抗体フラグメントを得た。当該ヒト抗ＩｇＥ受容体及びその抗体フラグメントは、ＩｇＥとＩｇＥ受容体の結合活性を阻害する活性を有しており、ＩｇＥ及びＩｇＥ受容体の結合により惹起されるアレルギー疾患の治療薬として期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＥ受容体に結合し、ＩｇＥ受容体とＩｇＥの結合活性を阻害する活性を有するヒト抗ＩｇＥ受容体抗体のＶＨ鎖をコードする遺伝子断片。
【請求項２】
当該ヒトＩｇＥ受容体が、ＩｇＥのＦｃ部に対する受容体（以下、ＦｃεＲ）、好ましくはＦｃεＲＩである請求項１に記載の遺伝子断片。
【請求項３】
当該ＶＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）が下記のアミノ酸配列である請求項１または２に記載の遺伝子断片：
2003008584.tif 000014
【請求項４】
当該ＶＨ鎖が配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる請求項１から３に記載の遺伝子断片。
【請求項５】
ヒトＩｇＥ受容体に結合し、ＩｇＥ受容体とＩｇＥの結合活性を阻害する活性を有するヒト抗ＩｇＥ受容体抗体のＶＬ鎖をコードする遺伝子断片。
【請求項６】
当該ヒトＩｇＥ受容体が、ＩｇＥのＦｃ部に対する受容体（以下、ＦｃεＲ）、好ましくはＦｃεＲＩである請求項５に記載の遺伝子断片。
【請求項７】
当該ＶＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）が下記のアミノ酸配列である請求項５または６に記載の遺伝子断片：
2003008584.tif 000015
【請求項８】
当該ＶＬ鎖が配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる請求項５から７に記載の遺伝子断片。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載のＶＨ鎖遺伝子及び請求項５から８のいずれかに記載のＶＬ鎖遺伝子を結合してなる一本鎖Ｆｖ遺伝子。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載のＶＨ鎖遺伝子及び請求項５から８のいずれかに記載のＶＬ鎖遺伝子を、それぞれヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子と結合してなるヒト抗ＩｇＥ受容体抗体をコードする遺伝子断片。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のＶＨ鎖遺伝子及び／または請求項５から８のいずれかに記載のＶＬ鎖遺伝子を、それぞれヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子またはその一部及びヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子またはその一部と結合してなるヒト型抗ＩｇＥ受容体抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項１２】
当該抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２から選ばれる請求項１１に記載の遺伝子断片。
【請求項１３】
請求項９に記載の一本鎖Ｆｖ遺伝子を、ヒト抗体ＣＨ鎖遺伝子またはその一部、またはヒト抗体ＣＬ鎖遺伝子またはその一部と結合してなるヒト型抗ＩｇＥ受容体抗体フラグメントをコードする遺伝子断片。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の遺伝子断片を発現ベクターに組込み、遺伝子組換え法により発現されるヒト抗ＩｇＥ受容体抗体またはヒト型抗ＩｇＥ受容体抗体フラグメント。
【請求項１５】
請求項１４に記載のヒト抗ＩｇＥ受容体抗体またはヒト型ＩｇＥ受容体抗体フラグメントを含有するＩｇＥ−ＩｇＥ受容体の結合活性阻害剤。
【請求項１６】
請求項１４に記載のヒト抗ＩｇＥ受容体抗体またはヒト型ＩｇＥ受容体抗体フラグメントを含有するアレルギー疾患治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
ＩｇＥとＩｇＥ受容体の結合活性を阻害するヒト抗ＩｇＥ受容体抗体及びその抗体フラグメントに関する。当該抗体及び抗体フラグメントは、ＩｇＥ及びＩｇＥ受容体の結合により惹起されるアレルギー疾患の治療薬として期待される。
背景技術
イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）のＦｃ部（Ｆｃε）に対する受容体（ＦｃεＲ）の一つであるＦｃεレセプターＩ（以下、ＦｃεＲＩと称することもある）は、ＩｇＥに対して高い親和性を有するレセプターである。ＦｃεＲＩは、主に肥満細胞、好塩基球の細胞膜上に発現する糖蛋白分子で、Ｉ型アレルギー反応においてこれらの細胞の活性化に重要な役割を果たす。抗原特異的ＩｇＥが、対応する多価抗原、すなわちアレルゲンによって架橋されると、ＦｃεＲＩは凝集し、シグナル伝達機構が作動し、肥満細胞が活性化される。その結果、細胞性脱顆粒が起こり、ヒスタミンやセロトニンなどの化学伝達物質が放出される。それにより、ロイコトリエン、プロスタグランジンなどの新たな合成、放出も誘導され、Ｉ型アレルギー反応が惹起される。
ヒトのＦｃεＲＩは、３つの異なるサブユニット（ＩｇＥ結合因子α鎖、シグナル増幅因子β鎖、シグナル伝達因子γ鎖）からなり、各一本ずつのα・β鎖、二本のγ鎖の四量体か、または一本のα鎖、二本のγ鎖の三量体を形成している。
肥満細胞、好塩基球の細胞膜上では、主に四量体ＦｃεＲＩが発現しており、上述の通りＩ型アレルギー反応においてこれらの細胞の活性化に重要な役割を果たす。
また、皮膚ランゲルハンス細胞や単球、好酸球、樹状細胞、及び血小板の細胞膜上では、主に三量体ＦｃεＲＩの発現が、前述の二細胞での四量体ＦｃεＲＩに比べ発現量は低いものの認められており、抗原提示や化学伝達物質の産生に寄与していることが示唆されている。
ＦｃεＲＩにおいて、ＩｇＥとの直接的な相互作用を行うのは、α鎖のみであると考えられており、α鎖のＩｇＥとの結合部位は、α鎖の細胞外領域全体にわたっている（Ｎａｔｕｒｅ，４０６巻（２０００年），２５９頁）。
ＦｃεＲＩの生体内での主な機能としては、α鎖のノックアウトマウスを用いた解析により、ある種の寄生虫に対する感染防御機構に寄与していることが示唆されている。しかし、そのノックアウトマウスにおいても、平常時における表現型は特に見出されないことから、マウスにおいては生存に必須な遺伝子ではないことが明らかにされている。
アレルギー疾患において、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの相互作用が病態形成において重要であることは前述の通りであるが、患者の血中には、ＦｃεＲＩ発現細胞が増加することも知られている。アトピー性喘息、アレルギー性鼻炎、及びアトピー性皮膚炎患者においては、末梢血中の好塩基球、単球、及び好酸球におけるＦｃεＲＩの発現が亢進していることが知られており、病態形成への関与が示唆されている。
また、慢性蕁麻疹の患者の一部には、ＦｃＥＲＩα鎖に対する自己抗体が血清中に存在することが報告されており、抗ＦｃεＲＩ自己抗体がＦｃεＲＩを架橋し、ＦｃεＲＩ発現細胞を活性化することが病態形成メカニズムの一つとして考えられている。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
Ｉ型アレルギーの治療には現在、抗ヒスタミン剤や、ステロイドなどの抗炎症剤が広く用いられているが、その治療効果あるいは副作用の点で問題も多い。そのため、Ｉ型アレルギーにおいて最も重要な反応であるＩｇＥとＦｃεＲＩとの結合を特異的に阻害する薬剤は、特異的かつ根本的な治療効果が期待でき、また副作用の低減も期待できる。
ＩｇＥとＦｃεＲＩとの結合阻害剤の候補としては、抗ヒトＦｃεＲＩ抗体（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１２９巻（２００１年），５頁）、可溶化ヒトＦｃεＲＩα鎖（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５巻（１９９３年），４７頁）、ヒトＩｇＥ定常領域（Ｆｃε）（Ｎａｔｕｒｅ，３３１巻（１９８８年），１８０頁）、抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１巻（１９９３年），２６２３頁）などが考えられ、実際に開発が進められているものもある。
上記ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ結合阻害剤候補の中でも、抗ヒトＦｃεＲＩ抗体は、ＦｃεＲＩに特異的に結合し、他のＩｇＥ結合分子には結合しないため、ＩｇＥ結合によるＦｃεＲＩ発現細胞の活性化を特異的に阻害することができる。また、抗ＦｃεＲＩ自己抗体によるＦｃεＲＩ発現細胞の活性化も阻害することが期待できる。さらに、ＦｃεＲＩ発現細胞に特異的に薬剤をデリバリーすることができる。以上のような点で、抗ヒトＦｃεＲＩ抗体は、他のＩｇＥ−ＦｃεＲＩ結合阻害剤の候補と比較して優れている。
ヒトＦｃεＲＩに対する抗体としては、マウスモノクローナル抗体（特開平５−２５２９８８）、ヒト型化抗体、半キメラ抗体及びキメラ抗体（特開平９−１９１８８６）が既に知られている。
しかし、抗体による治療を行う場合、マウス由来の配列を含む抗体分子では、その免疫原性により、ヒトの生体内においてヒト抗マウス抗体の産生を惹起させ、予定された効果を打ち消すばかりでなく、その頻回投与はアナフィラキシーショック等の副作用を患者にもたらす危険性が危惧される。
上記ヒト型化抗体もマウスモノクローナル抗体をヒト型化した分子であり、免疫原性が低減されているものの、ＣＤＲ領域はマウス由来の配列であるため、免疫原性及び副作用の危険性を否定できない。
それ故、上記のような危険性を回避でき、特異的な治療効果のみを生み出すことが期待できる完全ヒト型の抗体または抗体断片の取得及び開発が望まれるが、これまでにそのような報告はなされていない。
（その解決方法）
そこで、本発明では、ファージ抗体法を用いて、完全ヒト型抗ヒトＦｃεＲＩ一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子を取得し、その抗体ＶＨ鎖、ＶＬ鎖を明らかにした。さらに、その性状を解析し、当該ｓｃＦｖがＦｃεＲＩα鎖と特異的に結合すること、またＩｇＥ−ＦｃεＲＩ結合活性に阻害作用を示すこと、さらに、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの相互作用により起こる白血球からのヒスタミンの遊離を抑制することを明らかにした。
発明を実施するための最良の形態
健常者２０名分の末梢血Ｂリンパ球より、ＲＴ−ＰＣＲ法にて、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖、軽（Ｌ）鎖ｃＤＮＡを増幅、更に両者をｌｉｎｋｅｒ  ＤＮＡで結合し、健常者リンパ球由来のＶＨ鎖とＶＬ鎖のランダムな組み合わせによる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ＤＮＡを作製した。
このｓｃＦｖ  ＤＮＡをｐｈａｇｅｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組込み、１０９ｃｌｏｎｅからなる健常者由来ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーを作製した。このライブラリーを、固相に固定化されたヒトＦｃεＲＩα鎖の可溶性断片と結合させて回収、濃縮し、抗ヒトＦｃεＲＩα鎖ｓｃＦｖディスプレイファージクローンをスクリーニングした。その結果、スクリーニングされたｓｃＦｖクローンは、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ結合活性を阻害した。
上記阻害活性を有するｓｃＦｖクローンのＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、下記の通りである。
2003008584.tif 000002
2003008584.tif 000003
2003008584.tif 000004
2003008584.tif 000005
さらに、上記配列中、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を下記に示す。
2003008584.tif 000006
上記ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のいずれかまたは両方の可変領域を有する抗体フラグメントは、ヒト由来抗ヒトＦｃεＲＩ抗体の可変領域を有し、ヒトＦｃεＲＩのα鎖と強く反応して、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ結合活性に阻害作用を示す。
本発明で開示されるＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖は、ファージ抗体法を用いてｓｃＦｖの形で得られた物であるが、原則としてその適用はｓｃＦｖに限定されることはなく、開示したＶＨ鎖及び／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常部と連結した完全分子型、またヒト免疫グロブリンの定常部の一部と組み合わせたＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、さらにｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンの定常部と結合させた一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）などの他の抗体フラグメントもその適用範囲に含まれる。また、これらの抗体及び抗体フラグメント蛋白分子に高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子も同様である。
以上より、本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子は、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの結合によって引き起こされる種々のアレルギー反応を阻害することができ、アレルギー疾患の治療、及び予防のための薬剤として使用することができる。このことは、血中半減期が非常に長く、副作用を起こしにくいという、他の抗アレルギー剤にない優れた新規抗アレルギー剤となる可能性を示唆する。
また、他の抗体或いは薬剤と結合させて用いることにより、ＦｃεＲ発現細胞を標的としたミサイル療法へ応用することも期待できる。
さらに、本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子はその特性から、ヒト末梢血中または組織中のＦｃεＲＩ発現細胞を検出或いは測定する免疫学的測定法を提供することが可能である。
また、本発明のヒト型モノクローナル抗体及び抗体フラグメント分子を免疫学的に不活性な吸着物質からなる免疫吸着物質と吸着させた複合体は多くの応用が可能になる。
まず第一には、ヒト末梢血中または組織中のＦｃεＲＩ発現細胞上のＦｃεＲＩα鎖をイムノアフィニティクロマトグラフィにより精製することができる。
さらに、遺伝子組換え法により形質転換された培養細胞から産生される培養上清中のＦｃεＲＩα鎖の精製に用いることが可能である。
また、本発明のヒト型モノクローナル抗体の可変部位のペプチドまたはその誘導体は、それを認識するペプチドまたは抗イディオタイプ抗体を、ライブラリーより単離する新たな手段を提供する。得られるペプチドと抗イデオタイプ抗体、及びその誘導体は、ＩｇＥの中和によるアレルギー症状の治療、または抗ヒト高親和性ＩｇＥ受容体自己抗体を有する患者の治療に有効であることが期待できる。
さらに、本発明のヒト型モノクローナル抗体の可変部位のペプチドまたはその誘導体を患者に免疫して、抗イディオタイプ抗体産生を誘導できれば、血中のＩｇＥ抗体の働きを中和することが期待される。その場合には、新たな免疫療法薬すなわちワクチンとしての使用が可能と考えられる。
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
《実施例１：健常者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１）により報告されている方法を参考に調製した。
健常者２０名由来末梢血よりＦｉｃｏｌｌにてリンパ球を分離し、ＰＢＳで充分に洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）で処理して、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを４つに分割し、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、κ鎖、λ鎖の定常領域に特異的なプライマーを使用し、ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏ  ｔｅｃ）にて、それぞれのｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡをテンプレートにして、Ｍａｒｋｓらが報告したのと同様にＶＨ（γまたはμ）とＪＨ及びＶκとＪκ、ＶλとＪλの組合せで各ジーンファミリーに特異的なプライマーを用いて、それぞれの抗体Ｖ領域遺伝子をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法にて増幅した。
更に、ＶＨ（γまたはμ）とＶκ、及びＶＨ（γまたはμ）とＶλをｌｉｎｋｅｒ  ＤＮＡを用いて、アッセンブリーＰＣＲ法により結合させ、一本鎖ｓｃＦｖ  ＤＮＡを作製した。ｓｃＦｖ  ＤＮＡは更にＰＣＲを用いて、ＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ制限酵素部位を付加し、アガロースゲルで電気泳動後、精製した。精製したｓｃＦｖ  ＤＮＡは制限酵素ＳｆｉＩ（Ｔａｋａｒａ）とＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ）で消化後、ｐｈａｇｅｍｉｄ  ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。ｓｃＦｖ  ＤＮＡを結合させたｐＣＡＮＴＡＢ５ＥはＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ毎にエレクトロポレイションにより大腸菌ＴＧ１に導入した。形質転換したＴＧ１の数から、ＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλはそれぞれ１．１×１０８、２．１×１０８、８．４×１０７、５．３×１０７クローンの多様性を有すると評価された。この形質転換したＴＧ１から、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いてファージ抗体を発現し、健常者由来ｓｃＦｖ呈示ファージライブラリーを調製した。
《実施例２：スクリーニング》
ヒトＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖可溶性断片（４μｇ／ｍＬ）は０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３１ｍＬに溶解し、３５ｍｍのディッシュ（岩城）に４℃で一晩反応させて固定化した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて２０℃で２時間ブロッキングした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄した。これに健常者由来の抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液）を０．９ｍＬ（１×１０１２ｔｕ／ｍＬ）加え、反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１０回洗浄した後、０．４ｍＬのグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を加え、ＦｃεＲＩα鎖と結合する一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。溶出したファージは１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１を加えてｐＨを調製した後、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染させた。感染後のＴＧ１は３０００×ｇ、５分で遠心して、上清を除き、２００μＬの２×ＹＴ培地で懸濁し、ＳＯＢＡＧプレートに播き、３０℃のふ卵器中で一晩培養した。生じたコロニーは適量の２×ＹＴ培地を加えスクレイパー（Ｃｏａｓｔｏｒ）を使って懸濁、回収した。このＴＧ１  ５００μＬを、５０ｍＬの２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。健常者由来ファージライブラリーＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ、それぞれに対してスクリーニングを計４回行った。４回目のスクリーニング後に、ＳＯＢＡＧプレートから任意にクローンを抽出し、ｓｃＦｖの発現の確認及びＦｃεＲＩα鎖ＥＬＩＳＡによる特異性の確認と塩基配列の解析を行った。
《実施例３：スクリーニングＦｃεＲＩα鎖ＥＬＩＳＡ》
分離したクローンのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。ＦｃεＲＩα鎖及びコントロール蛋白をＥＬＩＳＡプレートに固定化してスクリーニングに用いた。２．５μｇ／ｍＬのＦｃεＲＩα鎖、２．５μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン、２．５μｇ／ｍＬのヒトＴＮＦＲＩまたはヒト血清を４０μＬ／ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に入れ、４℃で１６時間静置し、固定化した。固定化プレートは、０．５％ＢＳＡ、０．５％ゼラチン及び５％スキムミルクを含むＴＢＳ溶液４００μＬ／ｗｅｌｌをＥＬＩＳＡプレートに入れ、４℃で２時間静置し、ブロッキングを行った。
ｓｃＦｖ呈示ファージを含む試料液を１００μＬ／ｗｅｌｌを入れ、反応させた後試料液を捨て、洗浄液で５回洗った。ビオチン標識した抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。洗浄液で５回洗った後、発色基質液（１ｇ／ｍＬ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ）、１０％ジエタノールアミン（Ｗａｋｏ）を含むＰＢＳ溶液）を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れ、遮光し、室温〜３７℃で、５〜１０分発色させた。１規定硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌ入れ発色させ、マルチプレートオートリーダーＮＪ−２００１（Ｉｎｔｅｒ  Ｍｅｄ）で４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、評価したクローン全てで、ＦｃεＲＩに特異的であることが確認できた（図１）。
《実施例４：クローンの配列分析》
単離したクローンのｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ塩基配列をＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。ＥＬＩＳＡ及び配列分析の結果、単離したクローンは４種に分類された。
《実施例５：ｓｃＦｖの発現と回収》
可溶性ｓｃＦｖを大腸菌ＨＢ２１５１を用いて発現させ、大腸菌ペリプラズム画分より回収、粗精製した。更に精製が必要な場合はＲＰＡＳ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、アフィニティ精製を行った。精製したｓｃＦｖ蛋白の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、ｓｃＦｖ蛋白のＣ末端のＥｔａｇエピトープを標的にしたウェスタンブロッティングにより確認した。ｓｃＦｖ蛋白精製品の蛋白濃度の決定には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。
《実施例６：ＳＰＲ法による精製ｓｃＦｖの親和性測定》
ＢＩＡｃｏｒｅ（ＢＩＡｃｏｒｅ社）を用いて、ＳＰＲ法により精製ｓｃＦｖの親和性を測定した結果、最も高い親和性を示したクローンαＦｃＲ５１は、ヒトＦｃεＲＩα鎖に対して０．５８×１０−８Ｍの解離定数を有すると評価された。
《実施例７：ＩｇＥのＦｃεＲＩα鎖への結合阻害実験》
精製ｓｃＦｖを用いて、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ結合に対する阻害実験を行った結果、ＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合を阻害することが確認できたクローンαＦｃＲ５１について、詳細な検討を行った。
ヒトＩｇＥをＥＬＩＳＡプレートに固定化して結合阻害実験に用いた。２．５μｇ／ｍＬのヒトＩｇＥを４０μＬ／ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に入れ、４℃で１６時間静置し、固定化した。ビオチン標識したＦｃεＲＩα鎖（５５ｎｇ／ｍＬ）を、各濃度のαＦｃＲ５１  ｓｃＦｖ、及びコントロールとして特異性の異なるｓｃＦｖクローン（ａｐ６４）と反応させた後、４０μＬ／ｗｅｌｌずつＩｇＥ固定化プレートに加え、反応させた。ＦｃεＲＩα鎖とＩｇＥとの結合は、ＡＰ標識したストレプトアビジン及び基質を用いて測定した。その結果、図２に示すように、０．１μｇ／ｍｌ以上のｓｃＦｖでＩｇＥのＦｃεＲＩα鎖への結合を阻害し、１００μｇ／ｍｌ以上では９０％以上の阻害率を示した。
《実施例８：ヒスタミン遊離抑制実験》
末梢血より調製した白血球（１０６細胞）を乳酸バッファーで細胞表面のＩｇＥをはずした後、αＦｃＲ５１  ｓｃＦｖ（コントロールは特異性の異なるｓｃＦｖクローン：ＭＲＨ２）と氷上１５分間反応させ、ＩｇＥ（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を加えて、更に氷上１５分間反応させた。細胞を洗浄後、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＥ  ａｓｃｉｔｅｓ（Ｓｉｇｍａ）をコートしたプレートに細胞（２×１０５）を加え、３７℃で３０分間反応させ、上清を回収し、ヒスタミンキット（栄研）でヒスタミンの遊離を測定した。その結果、図３に示すように、αＦｃＲ５１は、濃度依存にヒスタミンの遊離を抑制することが確認された。
（従来技術より有効な効果）
本発明のヒト型抗ヒトＩｇＥ受容体抗体及び抗体フラグメントは、ヒトＩｇＥ受容体のＩｇＥ結合活性を中和することから、ＩｇＥとＩｇＥ受容体との結合により惹起されるアレルギー症状を治療するための薬剤として使用することができる。また、ＩｇＥ受容体発現細胞を標的としたミサイル療法への応用も期待される。さらに、細胞上に発現されたＩｇＥ受容体の検出や測定、ＩｇＥ受容体または発現細胞の分離・精製に使用でき、研究用試薬、患者のモニタリング用薬剤として使用することができる。
また、本発明のヒト型抗体及び抗体フラグメントまたはその誘導体を用いることにより、抗原エピトープとなるペプチドの単離と抗イデオタイプ抗体の単離または誘導が可能となる。得られるペプチドと抗イデオタイプ抗体、及びその誘導体は、ＩｇＥの中和によるアレルギー症状の治療、または抗ヒトＩｇＥ受容体自己抗体を有する患者の治療に有効であることが期待される。
【配列表】
2003008584.tif 000007
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【図面の簡単な説明】
図１は、種々の抗原（ヒトＦｃεＲＩα鎖、ヒト血清アルブミン、ヒトＴＮＦＲＩまたはヒト血清）に対する、得られたｓｃＦｖクローン（αＦｃＲ５１）の反応性をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
図２は、ｓｃＦｖクローン（αＦｃＲ５１）のＩｇＥ−ＦｃεＲＩ結合に対する阻害活性を、ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
図３は、ｓｃＦｖクローン（αＦｃＲ５１）のＩｇＥ−ＦｃεＲＩ結合阻害によるヒスタミン遊離抑制効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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