(57)【要約】含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）、血清タンパク質濃度（ｘ）及び代謝酵素濃度（ｙ）が既知である少なくとも３種類の試料を調製し代謝反応を進行せしめる第１の工程と、前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する第２の工程と、総薬物濃度（Ｃｔ）と、血清タンパク質濃度（ｘ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、代謝速度（ｖ）と、非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）と、血清タンパク質結合率（Ｄ）血清中非結合型分率（ｆｐ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）との間の所定の関係に基づいて前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記血清タンパク質濃度（ｘ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）及び前記代謝速度（ｖ）から前記薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率を求める第３の工程と、を含むことを特徴とする薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法により、マトリックスへの薬物の吸着量を測定することなく、迅速に薬物の固有クリアランス、血清タンパク質結合率及び臓器クリアランスを測定することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物の固有クリアランス及び結成タンパク質結合率の測定方法であって、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）、血清タンパク質濃度（ｘ）及び代謝酵素濃度（ｙ）が既知である少なくとも３種類の試料を調製し代謝反応を進行せしめる第１の工程と、
前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する第２の工程と、
総薬物濃度（Ｃｔ）と、血清タンパク質濃度（ｘ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、代謝速度（ｖ）と、非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）と、血清タンパク質結合率（Ｄ）血清中非結合型分率（ｆｐ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）との間の所定の関係に基づいて前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記血清タンパク質濃度（ｘ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）及び前記代謝速度（ｖ）から前記薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率を求める第３の工程と、
を含むことを特徴とする、薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法。
【請求項２】
前記所定の関係が下記数式（１）〜（３）
ｖ＝（Ａ・ｙ・Ｃｔ）／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（１）
ｆｐ＝１／（ａ＋１）　　…（２）
Ｄ＝１−ｆｐ　…（３）
（式中、Ａは非結合型薬物の固有クリアランスを表し、Ｄは血清タンパク質結合率を表し、ｆｐは血清中非結合型分率を表し、ａはａ＝（１−ｆｐ）／ｆｐなる関係を満たす未知数を表し、ｂはｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは血清非添加時の反応液中の非結合型分率を表す）なる関係を満たす未知数を表す。）
で表される関係であることを特徴とする、請求項１に記載の薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法。
【請求項３】
薬物の固有クリアランスの測定方法であって、
含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）及び代謝酵素濃度（ｙ）が既知である少なくとも２種類の試料を調製し、代謝反応を進行せしめる第１の工程と、
前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し、前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する第２の工程と、
総薬物濃度（Ｃｔ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、代謝速度（ｖ）と、非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）と、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）との間の所定の関係に基づいて前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）及び代謝速度（ｖ）から非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）及び代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）を算出する第３の工程と、
を含むことを特徴とする、薬物の固有クリアランスの測定方法。
【請求項４】
前記所定の関係が下記数式（４）
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２）・Ｃｔ／（ｂ・ｙ＋１）　…（４）
（式中、Ａは非結合型薬物の固有クリアランスを表し、Ｂは代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランスを表し、ｂはｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは反応液中非結合型分率を表す）なる関係を満たす未知数を表す。）
で表される関係であることを特徴とする、請求項３に記載の薬物の固有クリアランスの測定方法。
【請求項５】
薬物の固有クリアランスの測定方法であって、
含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）、代謝酵素濃度（ｙ）及び添加タンパク質濃度（ｘ）が既知である少なくとも５種類の試料を調製し、代謝反応を進行せしめる第１の工程と、
前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し、前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する第２の工程と、
総薬物濃度（Ｃｔ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、添加タンパク質濃度（ｘ）と、代謝速度（ｖ）と、非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）と、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）と、タンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）と、酵素非存在下における反応液中非結合型分率（ｆａ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）との間の所定の関係に基づいて前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）、前記添加タンパク質濃度（ｘ）及び前記代謝速度（ｖ）から非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びタンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）を算出する第３の工程と、
を含むことを特徴とする、薬物の固有クリアランスの測定方法。
【請求項６】
前記所定の関係が下記数式（５）
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２＋Ｃ・ａ・ｘ・ｙ）・Ｃｔ／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（５）
（式中、Ａは非結合型薬物の固有クリアランスを表し、Ｂは代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランスを表し、Ｃはタンパク質に結合した薬物の固有クリアランスを表し、ａはａ＝（１−ｆａ）／ｆａ（ここでｆａは酵素非存在下における反応液中非結合型分率を表す）なる関係を満たす未知数を表し、ｂはｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは反応液中非結合型分率を表す）なる関係を満たす未知数を表す。）
で表される関係であることを特徴とする、請求項５に記載の固有クリアランスの測定方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の測定方法で得られた非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）及び血清タンパク質結合率（Ｄ）を用いて該薬物の臓器クリアランスを算出する工程を含むことを特徴とする、薬物の臓器クリアランスの測定方法。
【請求項８】
請求項３又は４に記載の測定方法で得られた非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）及び代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）を用いて該薬物の臓器クリアランスを算出する工程とを含むことを特徴とする、薬物の臓器クリアランスの測定方法。
【請求項９】
請求項５又は６に記載の測定方法で得られた非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びタンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）を用いて該薬物の臓器クリアランスを算出する工程とを含むことを特徴とする、薬物の臓器クリアランスの測定方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の臓器クリアランスの測定補法を用いて薬物の臓器クリアランスを測定し、所定の臓器クリアランスを有する薬物を選択する工程を含むことを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、薬物の固有クリアランス、血清タンパク質結合率及び臓器クリアランスの測定方法に関する。
背景技術
薬物の臓器クリアランスは、例えば、薬物の有効性や毒性の発現等と密接な関係があり、医薬品の開発において慎重に検討すべき重要な性質である。
生体における薬物の臓器クリアランスをｉｎ　ｖｉｔｒｏでの測定値から予測する際には、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの固有クリアランス（ＣＬｉｎｔｈ）と血清タンパク質結合率とを測定する必要がある。また、固有クリアランスを測定する際には薬物の反応系中のマトリックス（例えばミクロゾーム）に対する結合率も考慮する必要がある。
従来、固有クリアランスの測定法としては、臓器由来の酵素源に基質となる薬物を添加して消失速度の測定をする方法等が知られていた。しかしながら、この測定方法ではマトリックスへの薬物の吸着を補正する必要があり、別途マトリックスへの薬物の吸着率を測定する必要があるという問題があった。例えば、血清タンパク質結合率の測定方法としては、平衡透析法及び限外ろ過法等が知られていたが、これらの測定法では測定に時間がかかるうえ、薬物が透析膜や限外ろ過膜等に結合しやすく、正確な測定が困難であった。さらに、血清によって薬物が代謝される場合は今までの方法では測定ができなかった。一方、活性炭が有する薬物の吸着能を利用して血清タンパク質結合率を測定する方法が知られている（Ｊｉｎｈｕａ　Ｙｕａｎ，Ｄａｉ　Ｃｈａｎｇ　Ｙａｎｇ，Ｊｉｌｌ　Ｂｉｒｋｍｅｉｅｒ，Ｊａｍｅｓ　Ｓｔｏｌｚｅｎｂａｃｈ；Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１９９５，２３，４１−５５）。この方法によれば、透析膜や限外ろ過膜等に結合しやすい薬物の血清タンパク質結合率を測定することができるものの、測定に時間がかかる、血清で代謝される薬物には適用できないという欠点は克服されていなかった。
一方、前記固有クリアランスは非結合型薬物のみが代謝酵素によって代謝されると仮定して評価されていた。しかし、最近になって、結合型薬物も代謝酵素により代謝されていることを示す報告がなされている（Ｌｉｎｄａ　Ｋ．Ｌｕｄｄｅｎ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｍ．Ｌｕｄｄｅｎ，Ｊｅｒｒｙ　Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｈｅｌｅｎ　Ｓ．Ｐｅｎｔｉｋｉｓ　Ｊｏｈｎ　Ｍ．Ｓｔｒｏｎｇ；Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９９７，２８２，３９１−３９６、戸内明、山口義隆、馬場隆彦、伊藤清美、山添康、杉山雄一、大野泰雄；第１５回日本薬物動態学会年会、１２Ｃ１０−２）。しかしながら、代謝酵素に代謝される結合型薬物の代謝速度を評価する方法は未だ開発されておらず、その結果、このような結合型薬物の代謝速度までをも考慮した固有クリアランス及び臓器クリアランスの測定方法は知られていなかった。従って、薬物の正確な固有クリアランス値及び臓器クリアランス値の算出が不可能であるという問題があった。
また、薬物の臓器クリアランスは、上述のような方法を用いて求められた固有クリアランス及び血清タンパク質結合率を生理学的モデル（Ｗｅｌｌ−ｓｔｉｒｒｅｄ　ｍｏｄｅｌ，Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ，Ｐａｒａｌｌｅｌ−Ｔｕｂｅ　ｍｏｄｅｌ）に適用することにより求めることができるが、従来は固有クリアランスと血清タンパク質結合率とをそれぞれ異なる測定法によって求める必要があり、作業量が多く、処理に時間がかかる等の欠点があった。
さらに、医薬品の開発（特に創薬段階の初期スクリーニング）において、薬物の臓器クリアランスの評価を行う場合には、取り扱う化合物が非常に多いため、従来の測定方法では作業量、処理速度及びコストの面で十分な方法とは言えず、作業量の低減、処理速度の高速化及びコストの低減等が要求されていた。
発明の開示
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、非結合型薬物及び結合型薬物の固有クリアランスを測定することが可能な測定方法を提供すると共に、マトリックスへの薬物の吸着量を測定することなく、少ない作業量で迅速に薬物の固有クリアランス、血清タンパク質結合率及び臓器クリアランスを測定することが可能な測定方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、対象となる薬物の濃度、血清タンパク質濃度及び代謝酵素濃度を特定の数式に代入し計算することにより前記薬物の固有クリアランス、血清タンパク質結合率及び臓器クリアランスを算出可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の薬物の固有クリアランス、血清タンパク質及び臓器クリアランスの測定方法は、薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法であって、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）、血清タンパク質濃度（ｘ）及び代謝酵素濃度（ｙ）が既知である少なくとも３種類の試料を調製し代謝反応を進行せしめる第１の工程と、
前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する第２の工程と、
総薬物濃度（Ｃｔ）と、血清タンパク質濃度（ｘ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、代謝速度（ｖ）と、固有クリアランス（Ａ）と、血清タンパク質結合率（Ｄ）血清中非結合型分率（ｆｐ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）との間の所定の関係に基づいて前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記血清タンパク質濃度（ｘ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）及び前記代謝速度（ｖ）から前記薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率を求める第３の工程と、
を含むことを特徴とする、薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法であり、中でも、前記所定の関係が下記数式（１）〜（３）
ｖ＝（Ａ・ｙ・Ｃｔ）／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（１）
ｆｐ＝１／（ａ＋１）　…（２）
Ｄ＝１−ｆｐ　…（３）
（式中、Ａは固有クリアランスを表し、Ｄは血清タンパク質結合率を表し、ｆｐは血清中非結合型分率を表し、ａはａ＝（１−ｆｐ）／ｆｐなる関係を満たす未知数を表し、ｂはｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは血清非添加時の反応液中の非結合型分率を表す）なる関係を満たす未知数を表す。）
で表される関係であることが好ましい。
また、本発明の薬物の臓器クリアランスの測定方法は、前記固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法で得られた値を用いて前記臓器クリアランスを算出することを特徴とするものである。従って、前記の臓器クリアランスの測定方法で得られた値を用いて所定の臓器クリアランスを有する物質を選択することにより、少ない作業量で迅速に薬物をスクリーニングすることができるスクリーニング方法が提供される。
一方、本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、代謝酵素濃度及び添加タンパク質濃度を変化させた試料を用いて対象となる薬物の濃度、代謝酵素濃度及び添加タンパク質濃度を特定の数式に代入して計算することにより、前記結合型及び非結合型薬物の固有クリアランスを算出可能であることをも見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法は、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）及び代謝酵素濃度（ｙ）が既知である少なくとも２種類の試料を調製し、代謝反応を進行せしめる第１の工程と、前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し、前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する第２の工程と、総薬物濃度（Ｃｔ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、代謝速度（ｖ）と、非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）と、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）との間の所定の関係に基づいて前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）及び代謝速度（ｖ）から非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）及び代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）を算出する第３の工程と、を含むことを特徴とする、薬物の固有クリアランスの測定方法であり、中でも、前記所定の関係は下記数式（４）
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２）・Ｃｔ／（ｂ・ｙ＋１）　…（４）
であることが好ましい。
また、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法は、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）、代謝酵素濃度（ｙ）及び添加タンパク質濃度（ｘ）が既知である少なくとも５種類の試料を調製し、代謝反応を進行せしめる第１の工程と、前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し、前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する第２の工程と、総薬物濃度（Ｃｔ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、添加タンパク質濃度（ｘ）と、代謝速度（ｖ）と、非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）と、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）と、タンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）と、酵素非存在下における反応液中非結合型分率（ｆａ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）との間の所定の関係に基づいて前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）、前記添加タンパク質濃度（ｘ）及び前記代謝速度（ｖ）から非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びタンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）を算出する第３の工程と、を含むことを特徴とする、薬物の固有クリアランスの測定方法であり、中でも、前記所定の関係が下記数式（５）
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２＋Ｃ・ａ・ｘ・ｙ）・Ｃｔ／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（５）
であることが好ましい。
また、上記の測定方法で算出された固有クリアランスの値を用いて該薬物の臓器クリアランス（肝代謝クリアランス）を算出することにより、薬物の臓器クリアランスを算出することが可能となる。
さらに、本発明の薬物の臓器クリアランスの測定方法は、前記固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法で得られた値を用いて前記臓器クリアランスを算出することを特徴とするものである。従って、前記の臓器クリアランスの測定方法で得られた値を用いて所定の臓器クリアランスを有する物質を選択することにより、少ない作業量で迅速に薬物をスクリーニングすることができるスクリーニング方法が提供される
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先ず、本発明にかかる臓器クリアランス、固有クリアランス及び血清タンパク質結合率について説明する。
本発明にかかる「臓器クリアランス」とは、単位時間当たりに特定の臓器から消失した薬物量を流入血液の体積に換算した数値であり、非結合型薬物濃度に対する生体側の処理能力を示すものである。従って、臓器クリアランスは薬物を含む血液が、その血液に含まれる代謝酵素によって１分間に何ｍｌの血液が完全に浄化されたかを示す単位（ｍｌ／ｍｉｎ．）で表される。ここで、前記臓器にはいわゆる臓器だけでなく血清も含まれる。すなわち、前記臓器クリアランスとは、単位時間当たりに特定の臓器又は血清中から消失した薬物量を流入血液の体積に換算した数値である。
また、本発明にかかる「固有クリアランス」とは、単位時間当たりに臓器の細胞内液で消失した薬物量を、非結合型薬物が分布した細胞内液の体積に換算した数値である。
従って、薬物の消失機構を細胞内の反応として解析したものが固有クリアランスに対応し、これを前記細胞が構成する臓器又は血清中での反応として解析したものが臓器クリアランスに対応する。
また、本発明にかかる「血清タンパク質結合率」とは、血清中総薬物濃度に対して血清中に含まれるタンパク質に結合した薬物の濃度の比率をいう。
次に、本発明の薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法にかかる第１の実施形態について詳細に説明する。
本発明の薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法にかかる第１の実施形態は、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）、血清タンパク質濃度（ｘ）及び代謝酵素濃度（ｙ）が既知である少なくとも３種類の試料を調製し代謝反応を進行せしめる第１の工程と、
前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する第２の工程と、
総薬物濃度（Ｃｔ）と、血清タンパク質濃度（ｘ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、代謝速度（ｖ）と、非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）と、血清タンパク質結合率（Ｄ）血清中非結合型分率（ｆｐ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）との間の所定の関係に基づいて前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記血清タンパク質濃度（ｘ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）及び前記代謝速度（ｖ）から前記薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率を求める第３の工程と、
を含むことを特徴とする、薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法である。
ここで、本発明の第１の実施形態は、前記所定の関係が下記数式（１）〜（３）
ｖ＝（Ａ・ｙ・Ｃｔ）／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（１）
ｆｐ＝１／（ａ＋１）　…（２）
Ｄ＝１−ｆｐ　…（３）
（式中、Ａは固有クリアランスを表し、Ｄは血清タンパク質結合率を表し、ｆｐは血清中非結合型分率を表し、ａはａ＝（１−ｆｐ）／ｆｐなる関係を満たす未知数を表し、ｂはｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは血清非添加時の反応液中の非結合型分率を表す）なる関係を満たす未知数を表す。）
であることが好ましい。
また、本発明の薬物の臓器クリアランスの測定方法は、前記の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定方法で得られた非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）及び血清タンパク質結合率（Ｂ）を用いて前記薬物の臓器クリアランスを算出する工程を含むことを特徴とするものである。
先ず、本発明の第１の実施形態にかかる測定方法にかかる第１の工程について説明する。
本発明の第１の実施形態にかかる第１の工程は、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）、血清タンパク質濃度（ｘ）及び代謝酵素濃度（ｙ）が既知である少なくとも３種類の試料を調製し代謝反応を進行せしめる工程である。
本発明にかかる薬物は、その固有クリアランスまたは血清タンパク質結合率を測定する必要のある薬物であればその対象となる疾患、症状等は特に制限されない。また、前記薬物の剤形についても特に制限されず、液状、粒状、錠剤等のいずれであってもよく、液状であればそのままで、また、粒状または錠剤等の固形状であれば水等の代謝反応を阻害しない適当な溶媒に溶解して測定に用いればよい。また、前記薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）は非結合薬物濃度として、そのＫｍ及びＫｄより小さくなければならない。
また、本発明にかかる血清タンパク質は、動物から採取された血清をそのまま用いてもよく、この場合の動物種は特に制限されない。また、前記血清を用いる以外にも市販の血清タンパク質または血清タンパク質の近似タンパク質としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いることができる。また、前記血清蛋白質の濃度（ｘ）は特に制限されないが、最終濃度で１〜３０％であることが好ましい。前記最終濃度が１％より低い場合には薬物が結合する血清成分が少なく正確な血清タンパク質結合率の測定が困難になる傾向にあり、３０％より高い場合には代謝反応終了後の溶液からの薬物の回収率が変化し、正確な薬物の残存量の測定が困難になる傾向にある。
さらに、本発明にかかる代謝酵素は、代謝酵素を含む酵素源としては特に制限はなく、例えば、肝臓または腎臓等のＳ−９懸濁液またはミクロゾーム懸濁液をそのまま用いればよい。ここで、Ｓ−９懸濁液とは、例えば、ラット等の肝臓をホムジェナイズ液中でホモジェナイズし、得られたホモジェネートを９０００×ｇで２０分間遠心分離して得られた上清をいう。また、ミクロゾーム懸濁液とは、Ｓ−９懸濁液を１０５０００×ｇで６０分間遠心して得られた沈殿を懸濁溶液に懸濁したものをいう。また、前記Ｓ−９懸濁液及びミクロゾーム懸濁液の濃度は特に制限されず、各薬物の代謝速度を測定するのに適切な濃度を適宜選択すればよいが、通常、最終濃度で０．００１〜２０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。前記最終濃度が０．００１ｍｇ／ｍｌより低い場合には代謝反応が十分に進行しない傾向にあり、２０ｍｇ／ｍｌより高い場合には代謝反応が急速に進行し反応速度の測定が困難になる傾向にある。
本発明の第１の実施形態にかかる第１の工程では、前記の血清タンパク質濃度及び代謝酵素濃度が既知であり且つそれらの濃度が以下に示すように異なっている少なくとも３種類の試料を調製し、混合すればよい。
すなわち、３種類の試料をそれぞれＡ、Ｂ、Ｃとした場合に、（１）Ａ〜Ｃのいずれの試料も代謝酵素を含み、且つ、少なくとも１種類の試料は他のいずれかの試料と代謝酵素濃度が異なり、（２）少なくとも１種類の試料は血清タンパク質を含み、且つ、少なくとも１種類の試料は他のいずれかの試料と血清タンパク質濃度が異なり、（３）Ａ〜Ｃの試料から選ばれた２種類の試料のうち、いずれの組合わせにおいても試料に含まれる代謝酵素濃度または血清タンパク質濃度のいずれかが異なっている、ことが好ましく、少なくとも代謝酵素濃度または血清タンパク質濃度のいずれか一方が互いに異なることがより好ましい。具体的には、前記３種類の試料それぞれに含まれる代謝酵素濃度を順にＡｅ、Ｂｅ、Ｃｅとし、それぞれに含まれる血清タンパク質濃度を順にＡｂ、Ｂｂ、Ｃｂとすると、サンプルＡとＢを比較したときにはＡｅとＢｅまたはＡｂとＢｂの少なくともいずれかが異なっており、且つサンプルＢとＣを比較したときにはＢｅとＣｅまたはＢｂとＣｂの少なくともいずれかが異なっており、且つサンプルＡとＣを比較したときにはＡ≠Ｃであることが好ましい。また、この場合、Ａｅ≠Ｂｅ≠Ｃｅ及び／またはＡｂ≠Ｂｂ≠Ｃｂであることがより好ましい。
さらに、前記試料が４種類以上ある場合には、その中の３種類の試料が前記の条件を満たせば残りの試料に含まれる代謝酵素濃度及び血清タンパク質濃度は特に制限されない。しかしながら、前記試料の種類が多くなるほど得られる測定値の精度が高くなる傾向にあるため、必要とする測定値の精度に応じて所望の数の試料を用いて測定を行えばよい。
前述したような試料を準備し、一定の条件下（例えば３７℃で３０分間）で混合することにより代謝反応を進行させればよい。なお、代謝反応時の溶媒は前記Ｓ−９懸濁液またはミクロゾーム懸濁液に含まれる代謝酵素が失活しないような条件であれば特に制限されないが、例えば、ｐｏｔａｓｓｉｕｍｕ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液が挙げられる。
次に、本発明の第１の実施形態にかかる第２の工程について説明する。
本発明の第１の実施形態にかかる第２の工程は、前記第１の工程で得られた反応終了液に残存した前記薬物の濃度を測定し前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する工程である。
本発明の測定方法においては、第２の工程で前記薬物の代謝速度を算出する必要があるため、第１の工程の代謝反応の前後で反応液中に含まれる薬物の濃度を知る必要がある。ここで用いられる代謝反応終了後の薬物の残存量を測定する方法は特に制限されないが、例えば、代謝反応終了後の溶液をＨＰＬＣ等を用いて分析し残存量を算出する方法が挙げられる。また、薬物を放射性同位体（例えば３Ｈ）で標識したものを用い、代謝反応終了後の溶液をＨＰＬＣ等に供し分析し残存量を算出する方法が挙げられるが、こうすることにより、より正確な薬物の残存量の測定が可能となる。
次に、前記のようにして測定された薬物の残存量から代謝速度の算出を行う。この代謝速度の算出の方法は特に制限されないが、例えば、薬物代謝反応を行い反応後の薬物量を求め、反応前の薬物量とともに片対数プロットして、この傾きから代謝速度（ｖ）を算出すればよい。
次に、本発明の第１の実施形態にかかる第３の工程について説明する。
本発明の第１の実施形態にかかる第３の工程は、総薬物濃度（Ｃｔ）と、血清タンパク質濃度（ｘ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、代謝速度（ｖ）と、非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）と、血清タンパク質結合率（Ｄ）血清中非結合型分率（ｆｐ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）との間の所定の関係に基づいて前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記血清タンパク質濃度（ｘ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）及び前記代謝速度（ｖ）から前記薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率を求める工程である。ここで、前記所定の関係は、総薬物濃度（Ｃｔ）と、血清タンパク質濃度（ｘ）と、代謝酵素濃度（ｙ）と、代謝速度（ｖ）と、固有クリアランス（Ａ）と、血清タンパク質結合率（Ｄ）血清中非結合型分率（ｆｐ）と、反応液中非結合型分率（ｆｔ）とを用いて算出可能な方法であれば、その算出方法は特に制限されないが、前記所定の関係が下記数式（１）〜（３）ｖ＝（Ａ・ｙ・Ｃｔ）／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（１）
ｆｐ＝１／（ａ＋１）　…（２）
Ｄ＝１−ｆｐ　…（３）
（式中、Ａは固有クリアランスを表し、Ｄは血清タンパク質結合率を表し、ｆｐは血清中非結合型分率を表し、ａはａ＝（１−ｆｐ）／ｆｐなる関係を満たす未知数を表し、ｂはｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは血清非添加時の反応液中の非結合型分率を表す）なる関係を満たす未知数を表す。）
で表される関係であることが好ましい。
ここで、本発明にかかる前記数式（１）は以下のようにして求められる。
すなわち、血清中の薬物の結合型、非結合型の薬物濃度は以下の関係式（Ｌａｎｇｕｍｕｉｒの等温吸着式（８））で表される。
Ｃｔ＝Ｃｂ１＋Ｃｆ　…（６）
ｆｐ＝Ｃｆ／Ｃｔ　…（７）
Ｃｂ１＝Ｂｍａｘ１・Ｃｆ／（Ｋｄ１＋Ｃｆ）　…（８）
ここで、Ｋｄ１＞＞Ｃｆのとき、前記数式（８）は
Ｃｂ１＝Ｂｍａｘ１・Ｃｆ／Ｋｄ１　…（９）
と表すことができる。また、
ａ＝Ｂｍａｘ１／Ｋｄ１　…（１０）
とすると、
Ｃｂ１＝ａＣｆ　…（１１）
と表すことができる。ここで、Ｃｔは総薬物濃度、Ｃｆは非結合型薬物濃度、Ｃｂ１は血清中結合型薬物濃度、Ｂｍａｘ１は血清中タンパク質最大結合濃度、Ｋｄ１は血清中タンパク質への解離定数、ｆｐは血清中非結合型分率である。
また、反応液中の薬物の結合型、非結合型の薬物濃度は以下の関係式で表される。
Ｃｔ＝Ｃｂ２＋Ｃｆ　…（１２）
Ｃｂ２＝Ｂｍａｘ２・Ｃｆ／（Ｋｄ２＋Ｃｆ）　…（１３）
ここで、Ｋｄ２＞＞Ｃｆのとき、前記数式（１３）は
Ｃｂ２＝Ｂｍａｘ２・Ｃｆ／Ｋｄ２　…（１４）
と表すことができる。また、
ｂ＝Ｂｍａｘ２／Ｋｄ２　…（１５）
とすると、
Ｃｂ２＝ｂＣｆ　…（１６）
と表すことができる。ここで、Ｃｂ２は反応液中結合型薬物濃度、Ｂｍａｘ２は反応液中タンパク質最大結合濃度、Ｋｄ２は反応液中タンパク質への解離定数である。
ここで、反応液中に血清を添加した場合、添加した血清濃度をｘ、代謝酵素濃度をｙとすると、反応液中非結合型分率ｆは次式で表せる。
ｆ＝Ｃｆ／（Ｃｂ１＋Ｃｂ２＋Ｃｆ）　…（１７）
＝Ｃｆ／（ａ・ｘ・Ｃｆ＋ｂ・ｙ・Ｃｆ＋Ｃｆ）　…（１８）
＝１／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（１９）
また、代謝速度ｖは、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式
ｖ＝Ｖｍａｘ・Ｃｆ／（Ｋｍ＋Ｃｆ）　…（２０）
で表される。ここで、Ｖｍａｘは最大代謝速度、ＫｍはＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数である。数式（２０）において、Ｋｍ＞＞Ｃｆのとき、
ｖ＝Ｖｍａｘ・Ｃｆ／Ｋｍ　…（２１）
と表され、さらに、
Ａ＝Ｖｍａｘ／Ｋｍ　…（２２）
とすると、
ｖ＝Ａｙ・Ｃｆ　…（２３）
となる。ここで、Ａは単位濃度時の固有クリアランス（Ｃｌｉｎｔ）である。従って、代謝速度ｖは
ｖ＝Ａ・ｙ・Ｃｆ＝Ａ・ｙ・ｆ・Ｃｔ　…（２４）
と表され、さらに、
ｖ＝（Ａ・ｙ・Ｃｔ）／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（１）
と表される。
従って、数式（１）から、ｘ及び／またはｙを変化させた少なくとも３種類の試料を用いて代謝反応を行いｖを求めることにより未知数ａ、ｂ、Ａを求めることが可能となる。
また、
ｆｐ＝１／（ａ＋１）　…（２）
ｆｔ＝１／（ｂ＋１）　…（２５）
である。ここで、ｆｐは前述にように血清中非結合型分率を表し、ｆｔは血清非添加時反応液中非結合型分率を表す。
さらに、血清タンパク質結合率（Ｄ）は
Ｄ＝１−ｆｐ　…（３）
で表され、血清非添加時反応液中タンパク質結合率は１−ｆｔと表される。
以上より、数式（１）〜（３）に基づいて、薬物の固有クリアランス及び血清タンパク質結合率を求めることが可能となる。
ここで、上記の計算の具体的な計算手法は特に制限されないが、例えば、表計算ソフトＭｉｃｒｏｓｏｆｔ　ＥＸＣＥＬ　ｖｅｒ．７．０（（株）マイクロソフト社製）で作成されたマクロ「ＭＵＬＴＩ」（Ｋｉｙｏｓｈｉ　Ｙａｍａｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ａ　ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｇｒａｍ（ＭＵＬＴＩ）　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｙｎ．，４，８７９−８８５）を用いて、非線型最小二乗法により行い、固有クリアランス、血清タンパク質結合率を求めることができる。
次に、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の好適な第２の実施形態について説明する。
本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第２の実施形態は、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）及び代謝酵素濃度（ｙ）が既知である少なくとも２種類の試料を調製し、代謝反応を進行せしめる第１の工程と、前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し、前記薬物濃度（ｖ）を算出する第２の工程と、前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）、前記薬物濃度（ｖ）、非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びｂ（ｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは反応液中非結合型分率を表す））から、所定の関係に基づいて非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）及び代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）を算出する第３の工程と、を含むことを特徴とする、固有クリアランスの測定方法である。
ここで、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第２の実施形態は、前記所定の関係が下記数式（４）
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２）・Ｃｔ／（ｂ・ｙ＋１）　…（４）
であることが好ましい。
また、本発明の薬物の臓器クリアランスの測定方法は、前述の測定方法で得られた非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）及び代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）を用いて該薬物の臓器クリアランスを算出する工程とを含むことを特徴とする、薬物の臓器クリアランスの測定方法である。
次に、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第２の実施形態にかかる第１の工程について説明する。
本発明にかかる第１の工程は、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）及び代謝酵素濃度（ｙ）が既知である少なくとも２種類の試料を調製し、代謝反応を進行せしめる工程である。
本発明にかかる薬物は、その結合型及び非結合型の固有クリアランスを測定する必要のある薬物であればその対象となる疾患、症状等は特に限定されない。また、前記薬物の剤形についても特に制限されず、液状、粒状、錠剤等のいずれであってもよく、液状であればそのままで、また、粒状または錠剤等の固形状であれば水等の代謝反応を阻害しない適当な溶媒に溶解して測定に用いればよい。また、前記薬物の非結合型及び結合型薬物濃度はその薬物のミカエリス定数（Ｋｍ）よりも小さくなければならない。
さらに、発明にかかる代謝酵素は、代謝酵素を含む酵素源としては特に制限はなく、例えば、肝臓または腎臓等のＳ−９懸濁液またはミクロゾーム懸濁液をそのまま用いればよい。ここで、Ｓ−９懸濁液とは、例えば、ラット等の肝臓をホモジナイズし、得られたホモジネートを９０００×ｇで２０分間遠心分離し、得られた上清をいう。また、ミクロゾーム懸濁液とは、Ｓ−９懸濁液を１０５０００×ｇで６０分間遠心して得られた沈殿を懸濁溶液に懸濁したものをいう。また、前記Ｓ−９懸濁液及びミクロゾーム懸濁液の濃度は特に制限されず、各薬物の代謝速度を測定するのに適切な濃度を適宜選択すればよいが、通常、最終濃度で０．００１〜２０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。前記最終濃度が０．００１ｍｇ／ｍｌより低い場合には代謝反応が十分に進行しない傾向にあり、２０ｍｇ／ｍｌより高い場合には代謝反応が急速に進行し反応速度の測定が困難になる傾向にある。
本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第２の実施形態にかかる第１の工程では、前記の代謝酵素濃度が既知であり且つそれらの濃度が異なっている少なくとも２種類の試料を調製し、代謝反応に用いればよい。この場合、前記代謝酵素反応において反応液中の非結合型薬物濃度が既知である必要があるが、これは公知の測定方法（例えば平衡透析法）によって測定した数値を用いればよい。また、前記代謝酵素反応において、反応液中の非結合型薬物濃度が不明である場合には代謝酵素濃度が既知であり且つそれらの濃度が異なっている少なくとも３種類の試料を調製し、混合すればよい。このようにして混合した試料は、一定の条件下（例えば３７℃で３０分間）でインキュベートすることにより代謝反応を進行させればよい。なお、代謝反応時の溶媒は前記Ｓ−９懸濁液またはミクロゾーム懸濁液に含まれる代謝酵素が失活しないような条件であれば特に制限されないが、例えば、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液が挙げられる。　次に、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第２の実施形態にかかる第２の工程について説明する。
本発明にかかる第２の工程は、前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し、前記薬物濃度（ｖ）を算出する工程である。
本発明の測定方法においては、第２の工程で前記薬物の代謝速度を算出する必要があるため、第１の工程の代謝反応の前後で反応液中に含まれる薬物の濃度を知る必要がある。ここで用いられる代謝反応終了後の薬物の残存量を測定する方法は特に制限されないが、例えば、代謝反応終了後の溶液をＨＰＬＣ等を用いて分析し残存量を算出する方法が挙げられる。また、薬物を放射性同位体（例えば３Ｈ）で標識したものを代謝反応に用い、代謝反応終了後の溶液をＨＰＬＣ等に供して分析し残存量を算出する方法が挙げられるが、こうすることにより、より正確な薬物の残存量の測定が可能となる。
次に、前記のようにして測定された薬物の残存量から代謝速度の算出を行う。この代謝速度の算出の方法は特に制限されないが、例えば、薬物の初期量と残存量を時間に対して片対数プロットし、その傾きから代謝速度（ｖ）を算出すればよい。
次に、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第２の実施形態にかかる第３の工程について説明する。
本発明にかかる第３の工程は、前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）、前記代謝速度（ｖ）、非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びｂ（ｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは反応液中非結合型分率を表す））から、所定の関係に基づいて非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）及び代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）を算出する工程である。ここで、前記所定の関係は、総薬物濃度（Ｃｔ）、代謝酵素濃度（ｙ）、薬物濃度（ｖ）、非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びｂ（ｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは反応液中非結合型分率を表す））を用いて算出可能な方法であれば、その算出方法は特に制限されないが、前記所定の関係が下記数式（４）
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２）・Ｃｔ／（ｂ・ｙ＋１）　…（４）
であることが好ましい。
ここで、前記数式（４）は以下のようにして求められる。
すなわち、反応液中の薬物の結合型、非結合型の薬物濃度は以下の関係式で表すことができる。
Ｃｔ＝Ｃｂ１＋Ｃｆ　…（２６）
ｆｔ＝Ｃｆ／Ｃｔ　…（２７）
Ｃｂ１＝Ｂｍａｘ１・Ｃｆ／（Ｋｄ１＋Ｃｆ）　…（２８）
ここで、Ｋｄ１＞＞Ｃｆのとき、前記数式（２８）は
Ｃｂ１＝Ｂｍａｘ１・Ｃｆ／Ｋｄ１　…（２９）
と表すことができる。また、
ｂ＝Ｂｍａｘ１／Ｋｄ１　…（３０）
とすると、
Ｃｂ１＝ｂ・Ｃｆ　…（３１）
と表すことができる。ここで、Ｃｔは総薬物濃度、Ｃｆは非結合型薬物濃度、Ｃｂ１は代謝酵素へ結合した薬物濃度、Ｂｍａｘ１は代謝酵素への最大結合濃度、Ｋｄ１は代謝酵素への結合解離定数、ｆｔは反応液中非結合型分率である。
ここで、反応液中の代謝酵素濃度をｙとすると、反応液中非結合型分率ｆは次式で表せる。
ｆ＝Ｃｆ／（Ｃｂ１＋Ｃｆ）　…（３２）
＝Ｃｆ／（ｂ・ｙ・Ｃｆ＋Ｃｆ）　…（３３）
＝１／（ｂ・ｙ＋１）　…（３４）
また、代謝速度ｖはＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式
ｖ＝Ｖｍａｘ１・Ｃｆ／（Ｋｍ１＋Ｃｆ）＋Ｖｍａｘ２・Ｃｂ１／（Ｋｍ２＋Ｃｂ１）　…（３５）
で表される。ここでＶｍａｘ１は非結合型薬物の最大代謝速度、Ｋｍ１は非結合型薬物のミカエリス定数、Ｖｍａｘ２は結合型薬物の最大代謝速度、Ｋｍ２は結合薬物のミカエリス定数である。
数式（３５）においてＫｍ１＞＞Ｃｆ、Ｋｍ２＞＞Ｃｂ１のとき、
ｖ＝Ｖｍａｘ１・Ｃｆ／Ｋｍ１＋Ｖｍａｘ２・Ｃｂ１／Ｋｍ２　…（３６）
と表され、さらに、
Ａ＝Ｖｍａｘ１／Ｋｍ１　…（３７）
Ｂ＝Ｖｍａｘ２／Ｋｍ２　…（３８）
とすると、
ｖ＝Ａ・ｙ・Ｃｆ＋Ｂ・ｙ・Ｃｂ１　…（３９）
となる。Ａは単位濃度時の非結合型薬物に対する固有クリアランス、Ｂは単位濃度時の代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランスである。
従って代謝速度は
ｖ＝Ａ・ｙ・ｆ・Ｃｔ＋Ｂ・ｙ・ｂ・ｙ・ｆ・Ｃｔ　…（４０）
と表され、さらに
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２）・Ｃｔ／（ｂ・ｙ＋１）　…（４）
と表すことができる。
従って、数式（４）から、ｙを変化させた少なくとも３種類（反応液中非結合型薬物濃度が既知の場合２種類）の試料を用いて代謝反応を行いｖを求めることより、未知定数Ａ、Ｂを求めることが可能となる。
以上より、数式（４）に基づいて、非結合型薬物に対する固有クリアランス、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランスを求めることが可能となる。
ここで、上記の計算の具体的な計算方法は特に制限されないが、例えば、薬物動態解析プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎｅ　Ｖｅｒ．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）を用いて、非線形最少二乗法により、非結合型薬物に対する固有クリアランス及び代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランスを求めることができる。
以上説明した固有クリアランスの測定方法により、非結合型薬物に対する固有クリアランス及び代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランスが算出可能であるため、「肝固有クリアランス＝非結合型薬物の固有クリアランス＋代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス」という関係より、正確な肝固有クリアランスを算出することが可能となる。
次に、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第３の実施形態について説明する。
本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第３の実施形態は、薬物の固有クリアランスの測定方法であって、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）、代謝酵素濃度（ｙ）及び添加タンパク質濃度（ｘ）が既知である少なくとも５種類の試料を調製し、代謝反応を進行せしめる第１の工程と、前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し、前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する第２の工程と、前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）、前記添加タンパク質濃度（ｘ）、前記代謝速度（ｖ）、非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）、タンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）、ａ（ａ＝（１−ｆａ）／ｆａ（ここでｆａは酵素非存在下における反応液中非結合型分率を表す））及びｂ（ｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは反応液中非結合型分率を表す））から、所定の関係に基づいて非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びタンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）を算出する第３の工程と、を含むことを特徴とする、固有クリアランスの測定方法である。
ここで、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第３の実施形態は、前記所定の関係が下記数式（５）
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２＋Ｃ・ａ・ｘ・ｙ）・Ｃｔ／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（５）
であることが好ましい。
また、本発明の臓器クリアランスの測定方法は、前記固有クリアランスの測定方法で得られた非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びタンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）を用いて該薬物の臓器クリアランスを算出する工程とを含むことを特徴とする、薬物の臓器クリアランスの測定方法である。
先ず、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第３の実施形態にかかる第１の工程について説明する。
本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第３の実施形態にかかる第１の工程は、薬物の固有クリアランスの測定方法であって、含有される該薬物の総薬物濃度（Ｃｔ）、代謝酵素濃度（ｙ）及び添加タンパク質濃度（ｘ）が既知である少なくとも５種類の試料を調製し、代謝反応を進行せしめる工程である。
ここで用いられる薬物及び代謝酵素は、上記第１の測定方法で用いられた薬物と同様の条件の薬物であればよい。また、ここで用いられる添加タンパク質は、その濃度が既知であればその種類は特に制限されないが、具体的には、例えば、動物から採取された血清、サイトゾルまたはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）が挙げられる。前記血清またはサイトゾルを用いる場合は採取する動物種は特に制限されない。また、前記添加タンパク質の濃度は特に制限されないが、最終濃度で反応液の１〜３０％であることが好ましい。前記最終濃度が１％より低い場合には薬物が結合するタンパク質成分が少なく正確なタンパク質結合率の測定が困難になる傾向にあり、３０％より高い場合には代謝反応終了後の溶液からの薬物の回収率が変化し、正確な薬物の残存量の測定が困難になる傾向にある。
本発明の第１の工程では、前記の添加タンパク質濃度及び酵素濃度が既知であり且つそれらの濃度が以下に示すように異なっている少なくとも５種類の試料を調製し、混合すればよい。ここで、代謝反応液中の非結合型薬物濃度が既知の場合は前記試料は３種類でよい。
すなわち、５種類の試料をそれぞれＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅとした場合に、（１）Ａ〜Ｅのいずれの試料も代謝酵素を含み、且つ、少なくとも３種類の試料は他のいずれかの試料と代謝酵素濃度が異なり、（２）少なくとも３種類の試料は他のいずれかの試料と添加タンパク質濃度が異なり、（３）Ａ〜Ｅの試料のうち少なくとも３種類において試料中に含まれる代謝酵素濃度または添加タンパク質濃度のいずれかが異なっていることが好ましく、少なくとも代謝酵素または添加タンパク質濃度のいずれか一方が互いに異なることがより好ましい。具体的には前記試料に含まれる酵素濃度を順にＡｅ、Ｂｅ、Ｃｅ、Ｄｅ、Ｅｅとし、それぞれに含まれる添加タンパク質濃度をＡｂ、Ｂｂ、Ｃｂ、Ｄｂ、ＥｂとするとＡｅ≠Ｂｅ≠Ｃｅ及びＡｂ≠Ｄｂ≠Ｅｂであることが好ましい。
さらに、前記試料が５種類以上ある場合には、その中の５種類が前記の条件を満たせば残りの試料に含まれる代謝酵素濃度及び添加タンパク質濃度は特に制限されない。
また、反応液中の非結合型薬物濃度が既知の場合、前記の添加タンパク質濃度及び酵素濃度が既知であり且つそれらの濃度が以下に示すように異なっている少なくとも３種類の試料を調製し、混合すればよい。
すなわち、３種類の試料をそれぞれＡ、Ｂ、Ｃとした場合に、（１）Ａ〜Ｃのいずれの試料も代謝酵素を含み、且つ、少なくとも１種類の試料は他のいずれかの試料と代謝酵素濃度が異なり、（２）少なくとも１種類の試料は他のいずれかの試料と添加タンパク質濃度が異なり、（３）Ａ〜Ｃの試料の試料のうち少なくとも２種類の試料において試料中に含まれる代謝酵素濃度または添加タンパク質濃度のいずれかが異なっている、ことが好ましく、少なくとも代謝酵素または添加タンパク質濃度のいずれか一方が互いに異なることがより好ましい。具体的には前記試料に含まれる酵素濃度を順にＡｅ、Ｂｅ、Ｃｅとし、それぞれに含まれる添加タンパク質濃度をＡｂ、Ｂｂ、ＣｂとするとＡｅ≠Ｂｅ≠Ｃｅ及びＡｂ≠Ｂｂ≠Ｃｂであることが好ましい。
さらに、前記試料が３種類以上ある場合には、その中の３種類が前記の条件を満たせば残りの試料に含まれる代謝酵素濃度及び添加タンパク質濃度は特に制限されない。
本発明にかかる代謝反応は、前述したような試料を準備して一定の条件下（例えば３７℃で３０分間）でインキュベートすることにより反応を進行させればよい。なお、代謝反応時の溶媒は前記Ｓ−９懸濁液またはミクロゾーム懸濁液に含まれる代謝酵素が失活しないような条件であれば特に制限されないが、例えば、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液が挙げられる。
次に、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第３の実施形態にかかる第２の工程について説明する。
本発明にかかる第２の工程は、前記第１の工程で得られた反応液中に残存した前記薬物の濃度を測定し、前記薬物の代謝速度（ｖ）を算出する工程である。
前記第２の工程は、本発明の第１の測定方法にかかる第２の工程と同じ作業工程であり、残存薬物の濃度の測定方法及び代謝速度の算出方法は前記第１の測定方法にかかる第２の工程と同様の方法を用いればよい。
次に、本発明の薬物の固有クリアランスの測定方法の第３の実施形態にかかる第３の工程について説明する。
本発明にかかる第３の工程は、前記総薬物濃度（Ｃｔ）、前記代謝酵素濃度（ｙ）、前記添加タンパク質濃度（ｘ）、前記代謝速度（ｖ）、非結合型薬物の固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）、タンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）、ａ（ａ＝（１−ｆａ）／ｆａ（ここでｆａは酵素非存在下における反応液中非結合型分率を表す））及びｂ（ｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは反応液中非結合型分率を表す））から、所定の関係に基づいて非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びタンパク質に結合した薬物の固有クリアランス（Ｃ）を算出する工程である。ここで、前記所定の関係は、総薬物濃度（Ｃｔ）、代謝酵素濃度（ｙ）、添加タンパク質濃度（ｘ）、代謝速度（ｖ）、非結合型薬物に対する固有クリアランス（Ａ）、結合型薬物に対する薬物の固有クリアランス（Ｂ）及びａ（ａ＝（１−ｆａ）／ｆａ（ここでｆａは酵素非存在下における反応液中非結合型分率を表す））及びｂ（ｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは反応液中非結合型分率を表す））を用いて算出可能な方法であれば、その算出方法は特に制限されないが、前記所定の関係が下記数式（５）
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２＋Ｃ・ａ・ｘ・ｙ）・Ｃｔ／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（５）
であることが好ましい。
ここで、前記数式（５）は以下のようにして求められる。
すなわち、反応液中の薬物の結合型、非結合型の薬物濃度は以下の関係式で表すことができる。
Ｃｔ＝Ｃｂ１＋ｃｆ　…（４１）
ｆｔ＝Ｃｆ／Ｃｔ　…（４２）
Ｃｂ１＝Ｂｍａｘ１・Ｃｆ／（Ｋｄ１＋Ｃｆ）　…（４３）
ここで、Ｋｄ１＞＞Ｃｆのとき、前記数式（４３）は
Ｃｂ１＝Ｂｍａｘ１・Ｃｆ／Ｋｄ１　…（４４）
と表すことができる。また、
ｂ＝Ｂｍａｘ１／Ｋｄ１　…（４５）
とすると、
Ｃｂ１＝ｂ・Ｃｆ　…（４６）
と表すことができる。ここで、Ｃｔは総薬物濃度、Ｃｆは非結合型薬物濃度、Ｃｂ１は酵素へ結合した薬物濃度、Ｂｍａｘ１は酵素への最大結合濃度、Ｋｄ１は酵素への結合解離定数、ｆｔは反応液中非結合型分率である。
また、添加タンパク質の反応液中で、添加タンパク質への結合型の薬物濃度は以下の関係式で表せる。
Ｃｂ２＝Ｂｍａｘ２・Ｃｆ／（Ｋｄ２＋Ｃｆ）　…（４７）
ここでＫｄ２＞＞Ｃｆのとき、
Ｃｂ２＝Ｂｍａｘ２・Ｃｆ／Ｋｄ２　…（４８）
と表すことができる。また、
ａ＝Ｂｍａｘ２／Ｋｄ２　…（４９）
とすると、
Ｃｂ２＝ａ・Ｃｆ　…（５０）
と表すことができる。ここで、Ｃｔは総薬物濃度、Ｃｆは非結合型薬物濃度、Ｃｂ２は添加タンパク質へ結合した薬物濃度、Ｂｍａｘ２は添加タンパク質への最大結合濃度、Ｋｄ２は添加タンパク質への結合解離定数である。
ここで、反応液中の酵素濃度をｙ、添加タンパク質濃度をｘとすると、反応液中非結合型分率ｆは次式で表せる。
ｆ＝Ｃｆ／（Ｃｂ１＋Ｃｂ２＋Ｃｆ）　…（５１）
＝Ｃｆ／（ｂ・ｙ・Ｃｆ＋ａ・ｘ・Ｃｆ＋Ｃｆ）　…（５２）
＝１／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）　…（５３）
また、代謝速度ｖはＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式
ｖ＝Ｖｍａｘ１・Ｃｆ／（Ｋｍ１＋Ｃｆ）＋Ｖｍａｘ２・Ｃｂ１／（Ｋｍ２＋Ｃｂ１）＋Ｖｍａｘ３・Ｃｂ２／（Ｋｍ３＋Ｃｂ３）　…（５４）
で表される。ここでＶｍａｘ１は非結合型薬物の最大代謝速度、Ｋｍ１は非結合型薬物のミカエリス定数、Ｖｍａｘ２は代謝酵素結合型薬物の最大代謝速度、Ｋｍ２は代謝酵素結合型薬物のミカエリス定数、Ｖｍａｘ３は添加タンパク質結合型薬物の最大代謝速度、Ｋｍ３は添加タンパク質結合型薬物のミカエリス定数である。
数式（５４）においてＫｍ１＞＞Ｃｆ、Ｋｍ２＞＞Ｃｂ１、Ｋｍ３＞＞Ｃｂ２のとき、
ｖ＝Ｖｍａｘ１・Ｃｆ／Ｋｍ１＋Ｖｍａｘ２・Ｃｂ１／Ｋｍ２＋Ｖｍａｘ３・Ｃｂ２／Ｋｍ３　…（５５）
と表され、さらに、
Ａ＝Ｖｍａｘ１／Ｋｍ１　…（５６）
Ｂ＝Ｖｍａｘ２／Ｋｍ２　…（５７）
Ｃ＝Ｖｍａｘ３／Ｋｍ３　…（５８）
とすると、
ｖ＝Ａ・ｙ・Ｃｆ＋Ｂ・ｙ・Ｃｂ　…（５９）
となる。Ａは単位濃度時の非結合型薬物に対する固有クリアランス、Ｂは単位濃度時の代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス、Ｃは単位濃度時の添加タンパク質結合型薬物に対する固有クリアランスである。
従って代謝速度は
ｖ＝Ａ・ｙ・ｆ・Ｃｔ＋Ｂ・ｙ・ｂ・ｙ・ｆ・Ｃｔ＋Ｃ・ｙ・ａ・ｘ・ｆ・Ｃｔ　…（６０）
と表され、さらに
ｖ＝（Ａ・ｙ＋Ｂ・ｂ・ｙ２＋Ｃ・ａ・ｘ・ｙ）・Ｃｔ／（ａ・ｘ＋ｂ・ｙ＋１）…（５）
と表すことができる。
従って、数式（５）から、ｘとｙを変化させた少なくとも５種類（反応液中非結合型薬物濃度が既知の場合は少なくとも３種類）の試料を用いて代謝反応を行いｖを求めることより、未知定数Ａ、Ｂ及びＣを求めることが可能となる。
以上より、数式（５）に基づいて、非結合型薬物に対する固有クリアランス、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス、添加タンパク質結合型薬物に対する固有クリアランスを求めることが可能となる。
ここで、上記の計算の具体的な計算方法は特に制限されないが、例えば、薬物動態解析プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎｅ　Ｖｅｒ．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）を用いて、非線形最少二乗法により、非結合型薬物に対する固有クリアランス、代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス、添加タンパク質結合型薬物に対する固有クリアランスを求めることができる。
以上説明した固有クリアランスの測定方法により、非結合型薬物に対する固有クリアランス及び代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランスが算出可能であるため、「肝固有クリアランス＝非結合型薬物の固有クリアランス＋代謝酵素に結合した薬物の固有クリアランス」という関係より、正確な肝固有クリアランスを算出することが可能となる。
また、本発明にかかる臓器クリアランスは上記測定法によって求められた非結合型及び結合型薬物の固有クリアランスを用いて求められる。
すなわち、臓器クリアランスを算出するためのモデルであれば特に制限されないが、例えば、Ｗｅｌｌ−ｓｔｉｒｒｅｄモデル、Ｐａｒａｌｌｅｌ−ｔｕｂｅモデル、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎモデルのいずれかに、前記の固有クリアランス値及び反応液中非結合型分率から求められた血液中非結合型分率（ｆｂ）を代入して求められる。ここで、ｆｂは次式、
ｆｂ＝ｆｐ／ＲＢ　…（６１）
で求められる。なお、ＲＢは血球分配値であり、血液中薬物濃度（ＣＢ）及び血清中薬物濃度（ＣＰ）より、
ＲＢ＝ＣＢ／ＣＰ　…（６２）
で求められる。従って、血液中薬物濃度と血清中薬物濃度が近似値である場合には血球分配率は１として計算すればよく、血液中薬物濃度及び血清中薬物濃度のそれぞれが測定可能である場合には、測定に用いられる薬物に固有の血球分配率の値を用いればよい。
以下に、上記の３種類のモデルそれぞれについて臓器クリアランスの算出方法を説明する。なお、３種類のモデルに共通に用いられる数値は、血流量（ＱＨ）、固有クリアランス（ＣＬｉｎｔ）、臓器クリアランス（ＣＬ）であり、ＱＨは臓器クリアランスの測定に用いられる動物によって適宜測定した数値を用いればよく、例えば、体重が２５０ｇのラットでは肝血流量は１４．７（ｍＬ／ｍｉｎ．）である。
先ず、Ｗｅｌｌ−ｓｔｉｒｒｅｄモデルについて説明する。
Ｗｅｌｌ−ｓｔｉｒｒｅｄモデルとは、「臓器又は血清中に分布した薬物は完全に攪拌されていて、臓器又は血清中の薬物濃度は均一で、臓器毛細血管中薬物濃度と流出血液中薬物濃度とは等しい」というＷｅｌｌ−ｓｔｉｒｒｅｄ（完全攪拌状態）の仮定の下で数学的近似を行ってできるたけ単純化した条件で臓器クリアランスの測定を行うモデルである。Ｗｅｌｌ−ｓｔｉｒｒｅｄモデルにおいて用いられる数式は、
ＣＬ＝ＱＨ・ｆｂ・ＣＬｉｎｔ／（ＱＨ＋ｆｂ・ＣＬｉｎｔ）　…（６３）
で表される。
次に、Ｐａｒａｌｌｅｌ−ｔｕｂｅモデルについて説明する。
Ｐａｒａｌｌｅｌ−ｔｕｂｅモデルとは、組織中薬物濃度は組織の入口で高く、それが薬物の消失により次第に低下していくと仮定したモデルである。
Ｐａｒａｌｌｅｌ−ｔｕｂｅモデルにおいて用いられる数式は、
ＣＬ＝ＱＨ・（１−ＥＸＰ（−ｆｂ・ＣＬｉｎｔ／ＱＨ））　　…（６４）
で表される。
最後に、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎモデルについて説明する。
Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎモデルとは、Ｐａｒａｌｌｅｌ−ｔｕｂｅモデルに流れの方向の混合拡散を付加したモデルである。
Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎモデルにおいて用いられる数式は、
ＣＬ＝ＱＨ・（１−４・ｄ／（（１＋ｄ）２・ＥＸＰ（ｄ−１／（２／ＤＮ））−（１−ｄ）２・ＥＸＰ（−（ｄ−１）／（２・ＤＮ）））　…（６５）
ｄ＝（１＋４・ＤＮ・ｆｂ・ＣＬｉｎｔ／ＱＨ）１／２　…（６６）
ＤＮ＝０．１７　…（６７）
で表される。
上記の３種類の数式を用いることにより、薬物の臓器クリアランスを求めることが可能となる。
次に、本発明の薬物のスクリーニング方法について説明する。
本発明の薬物のスクリーニング方法は、上記の臓器クリアランスの測定方法を用いて薬物の臓器クリアランスを測定し、所定の臓器クリアランスを有する薬物を選択する工程を含むことを特徴とするものである。
すなわち、上記の臓器クリアランスの測定方法によって求められた臓器クリアランス値をもとに、所望の臓器クリアランス値を有する物質を選択することにより、所望の薬効を有する薬物のスクリーニングが可能となる。また、上述したように、代謝酵素濃度及びその時の薬物の代謝速度が既知であれば非常に簡便且つ正確に薬物の臓器クリアランスを求めることができるため、透析膜やろ過膜に対する吸着力が強くて従来の平衡透析法や限外ろ過法等の血清タンパク質結合率測定法が適用できない薬物に対しても正確な臓器クリアランスの測定が可能となる。
また、本発明の第３の実施形態によれば、固有クリアランスと血清タンパク質結合率とをそれぞれ異なる測定法によって求める必要がなく、より迅速な臓器クリアランスの測定が可能となるため、薬物のスクリーニングの速度が向上するのみならず、ハイスループットスクリーニンダ（ＨＴＳ）に適用することも可能となる。
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（肝Ｓ−９懸濁液及びミクロゾーム懸濁液の調製）
肝Ｓ−９懸濁液及びミクロゾーム懸濁液の調製のため、ラットから肝臓を採取した。入荷後１週間以上訓化したラット（Ｓｌｃ：ＳＤ、雄、７週齢、日本エスエルシー株式会社から購入）を断頭瀉血し、肝臓を摘出した後、その重量を測定し、１．１５％ＫＣｌで灌流した。
灌流したラット肝臓をはさみで細切し、肝湿重量の約３倍の氷冷したホモジェナイズ液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ−１．５％ＫＣｌ（ｐＨ７．４））を加え、テフロンホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。得られたホモジェネートを９０００×ｇで２０分間遠心分離し上清を得た（Ｓ−９）。得られた上清の一部をさらに１０５０００×ｇで６０分間遠心分離した後、上清を別の容器に移し、沈殿（ミクロゾーム）をホモジェナイズ溶液で洗浄した後、１０５０００×ｇで４０分間遠心分離した。得られたペレットを氷冷した懸濁溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，３０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ｐＨ７．４））に懸濁した。
上述のように調製したＳ−９懸濁液及びミクロゾーム懸濁液は使用時まで−８０℃にて冷凍保存した。また、タンパク質の定量はＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて行った。
実施例１
（ＯＣＴ（マキサカルシトール）を用いた固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定）
０．１ｍｏｌ／Ｌ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　５０μｌ、２０Ｕ／ｍｌ　Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　５０μｌ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２　５０μｌ及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰＨ　５０μｌを加え、さらに最終濃度が０、１、３、５、１０％になるようにラット血清を加え、それぞれについて０．５ｍｇ／ｍｌまたは０．２５ｍｇ／ｍｌのミクロゾームを加え、合計９５０μｌの溶液を調製した。これらを３７℃で５分間プレインキュベーションし、［２β−３Ｈ］ＯＣＴ（中外製薬（株）社製）を５０μｌ加えることにより反応を開始した。これを３７℃で３０分間反応後、冷アセトニトリル２ｍｌを添加して反応を停止した。
上記で得られた試料を４℃、３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清４００μｌをＨＰＬＣ分析に供した。また、３Ｈ活性を測定することにより未変化体を検出し、残存率を計算した後、これに基づいて代謝速度を算出した。なお、ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ　Ａ−３１２（６×１５０ｍｍ）（（株）ワイエムシイ社製）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
シンチレーター流速：３ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：室温
溶離液：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ＝３０／７０
検出：３Ｈ
分析時間：１０分。
前記で得られたデータは以下のようにして解析した。すなわち、それぞれの酵素濃度、血清添加量での試料の反応速度を表計算ソフトＭｉｃｒｏｓｏｆｔ　ＥＸＣＥＬ　ｖｅｒ．７．０（（株）マイクロソフト社製）で作成されたマクロ「ＭＵＬＴＩ」（Ｋｉｙｏｓｈｉ　Ｙａｍａｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ａ　ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｇｒａｍ（ＭＵＬＴＩ）　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｙｎ．，４，８７９−８８５）に入力し、非線型最小二乗法により固有クリアランス、血清タンパク質結合率、ミクロゾームタンパク質結合率を算出した。ここで算出した値を用いてｉｎ　ｖｉｖｏのデータへのスケーリングを行った。肝代謝クリアランスの算出はＷｅｌｌ−ｓｔｉｒｒｅｄ　ｍｏｄｅｌ、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ、Ｐａｒａｌｌｅｌ−ｔｕｂｅ　ｍｏｄｅｌを用いて行った。肝血流量は１４．７ｍｌ／ｍｉｎ．、肝重量は１１ｇ、ミクロゾーム含量は４４．８ｍｇ／ｍｌとし、血球分配率は１として算出した。得られた結果を表１及び表２に示す。
2002021124.tif 000002
2002021124.tif 000003
比較例１
一方、従来の血清タンパク質結合率の測定方法である平衡透析法を用いてＯＣＴの血清タンパク質結合率の測定を行った。すなわち、ラットの血清９９０〜９５０μｌにＯＣＴ溶液１０〜５０μｌを加えて総量を１０００μｌとし、ＰＢＳ１０００μｌに対して透析し、残存する血清タンパク質濃度を測定した。ここで得られた結果及び薬物の代謝速度から臓器クリアランスの算出を行った結果、実施例１で求められた値に極めて近い値を得ることができた。
従って、本発明の臓器クリアランスの測定方法によって公知の測定方法と同様に信頼し得る値を算出可能であることが確認された。
実施例２
（ワルファリンを用いた固有クリアランス及び血清タンパク質結合率の測定）
０．１ｍｏｌ／Ｌ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に最終濃度が１０μｌになるようにワルファリン（Ｗａｒｆａｒｉｎ）を加えたものに最終濃度が０、５、１０％となるようにラット血清を加えたものをそれぞれ準備し、さらに、それぞれに最終濃度が１、５、１０ｍｇ／ｍｌのラット肝ミクロソームを加え、全量が４９５μｌになるように溶液を調製した。次に、これらに１００ｍＭ　ＮＡＤＰＨ溶液を５μｌ加えることで反応を開始した。反応開始直後及び３７℃で２０分間反応後にそれぞれの溶液から１００μｌをサンプリングし、冷アセトニトリル１５０μｌを添加して反応を停止した。反応終了液を室温、１０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、得られた上清を乾固したものを５０％ＣＨ３ＣＮ　１００μｌで再溶解し、そのうち７５μｌをＨＰＬＣ分析に供した。なお、ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＳＹＭＭＥＴＲＹ　Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ）（日本ウオーターズ（株））
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：４５℃
溶離液Ａ：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ＝８０／２０／０．１
溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ＝４０／６０／０．１
溶離液Ｂ濃度５０％でアイソクラティック分析
検出：ＵＶ　３１０ｎｍ
得られた結果を表１及び表２に示す。
比較例２
一方、従来の血清タンパク質結合率の測定方法である平衡透析法を用いてワルファリンの血清タンパク質結合率の測定を行った。すなわち、ラットの血清９９０〜９５０μｌにワルファリン溶液１０〜５０μｌを加えて総量を１０００μｌとし、ＰＢＳ１０００μｌに対して透析し、残存する血清タンパク質濃度を測定した。ここで得られた結果及び薬物の代謝速度から臓器クリアランスの算出を行った結果、実施例２で求められた値に極めて近い値を得ることができた。
従って、本発明の臓器クリアランスの測定方法によって公知の測定方法と同様に信頼し得る値を算出可能であることが確認された。
実施例３
（ＯＣＴ（マキサカルシトール）を用いた固有クリアランス及び臓器クリアランスの測定）
０．１ｍｏｌ／Ｌ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　５０μｌ、２０Ｕ／ｍｌ　Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　５０μｌ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２５０μｌ及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰＨ　５０μｌを加え、さらに、０．５ｍｇ／ｍｌまたは０．２５ｍｇ／ｍｌのミクロゾームを加え、合計９５０μｌの溶液を調製した。これらを３７℃で５分間プレインキュベーションし、［２β−３Ｈ］ＯＣＴ（中外製薬（株）社製）を５０μｌ加えることにより反応を開始した。これを３７℃で３０分間反応後、冷アセトニトリル２ｍｌを添加して反応を停止した。
上記で得られた試料を４℃、３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清４００μｌをＨＰＬＣ分析に供した。また、３Ｈ活性を測定することにより未変化体を検出し、残存率を計算した後、これに基づいて代謝速度を算出した。なお、ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ　Ａ−３１２（６×１５０ｍｍ）（（株）ワイエムシイ社製）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
シンチレーター流速：３ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：室温
溶離液：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ＝３０／７０
検出：３Ｈ
分析時間：１０分。
前記で得られたデータは以下のようにして解析した。すなわち、それぞれの酵素濃度、試料の反応速度等を薬物動態解析プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎｅ　Ｖｅｒ．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）に入力し、非線型最小二乗法により非結合型薬物に対する固有クリアランス、代謝酵素に結合する薬物の固有クリアランス、添加タンパク質結合型薬物に対する固有クリアランスを算出した。
ここで算出した値を用いてｉｎ　ｖｉｖｏのデータへのスケーリングを行った。肝代謝クリアランスの算出はＷｅｌｌ−ｓｔｉｒｒｅｄ　ｍｏｄｅｌ、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ、Ｐａｒａｌｌｅｌ−ｔｕｂｅ　ｍｏｄｅｌを用いて行った。肝血流量は１４．７ｍｌ／ｍｉｎ．、肝重量は１１ｇ、ミクロゾーム含量は４４．８ｍｇ／ｍｌとし、血球分配率は１として算出した。また、数式（１）中のｂ（ｂ＝（１−ｆｔ）／ｆｔ（ここでｆｔは反応液中非結合型分率を表す））は平衡透析法により求められたｂ＝３．４６を用いた。得られた結果を表３に示す。
2002021124.tif 000004
従って、肝固有クリアランスは、「肝固有クリアランス＝非結合型薬物の固有クリアランス＋酵素に結合した薬物の固有クリアランス」という関係式より、
肝固有クリアランス＝１３６＋０．７６４＝１３６．７６４
と求められた。
また、前記肝固有クリアランス値を用いて臓器クリアランス（肝代謝クリアランス）を算出した結果を表４に示す。
2002021124.tif 000005
実施例４
（イミプラミン（Ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅ）を用いた固有クリアランスの測定）
０．１ｍｏｌ／Ｌ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　５０μｌ、２０Ｕ／ｍＬ　Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　５０μｌ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２　５０μｌ及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰＨ　５０μｌを加え、さらに最終濃度が０、１０、２０、３０％になるようにラット血清を加え、それぞれについて最終濃度が０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬになるようにミクロゾームを加え、合計９９０μｌの溶液を調製した。これに［３Ｈ］ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅを非標識ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅで希釈した０．７４Ｍｂｑ／ｍＬ（３６．１μｍｏｌ／Ｌ）ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅ溶液１０μｌを加えて反応を開始させた。前記溶液を３７℃で５分間反応させた後、冷アセトニトリル１ｍＬを添加して反応を停止した。
前記で得られた試料を４℃、３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清２００μｌをＨＰＬＣ分析に供した。また、３Ｈ活性を測定することにより未変化体を検出し、残存率を計算した後、これに基づいて代謝速度を算出した。なお、ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＵＧ−８０（４．６×１５０ｍｍ）（（株）資生堂社製）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ．
シンチレーター流速：３ｍＬ／ｍｉｎ．
カラム温度：室温
溶離液Ａ：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ＝８０／２０／０．１
溶離液Ｂ：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ＝４０／６０／０．１
溶離液Ｂ濃度５０％でアイソクラティック分析
検出：ＵＶ３１０ｎｍ
検出：３Ｈ
分析時間：１０分
前記で得られたデータは以下のようにして解析した。すなわち、それぞれの酵素濃度、試料の反応速度等を薬物動態解析プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎｅ　Ｖｅｒ．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）に入力し、非線型最小二乗法により非結合型薬物に対する固有クリアランス、代謝酵素に結合する薬物の固有クリアランス、添加タンパク質結合型薬物に対する固有クリアランスを算出した。得られた結果を表５に示す。
2002021124.tif 000006
産業上の利用の可能性
以上説明したように、本発明の固有クリアランス及び臓器クリアランスの測定方法によれば、マトリックスへの薬物の吸着量を測定することなく、少ない作業量で迅速に薬物の固有クリアランス、血清タンパク質結合率及び臓器クリアランスを測定することが可能となり、さらに、非結合型薬物及び結合型薬物の固有クリアランス及び臓器クリアランスを測定することが可能となり、薬物の正確な固有クリアランス及び臓器クリアランスを測定することが可能となる。
【国際調査報告】
2002021124.tif 000007
2002021124.tif 000008