(57)【要約】本発明により移植可能な肝組織を調製する方法、そのために適した細胞コロニーおよびその調製方法が提供される。本発明の小型肝細胞高含有細胞コロニーは、全細胞数の約７０％以上が小型肝細胞によって構成されている小型肝細胞高含有細胞コロニー、特に、約１０個〜約３０個の細胞からなり、小型肝細胞数が全細胞数の約７０％以上を占める細胞コロニーである。このような小型肝細胞高含有コロニーの調製方法も開示される。また、本発明の小型肝細胞高含有細胞コロニーの肝組織への成熟化を誘導する方法、成熟化を誘導された小型肝細胞高含有細胞コロニーを用いて薬物の作用、特に正常な肝機能と関連した作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定する方法も開示される。
2002088332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コロニーを構成する総細胞の７０％以上が小型肝細胞で占められている、小型肝細胞高含有コロニー。
【請求項２】
コロニーを構成する総細胞数が１０個〜３０個である、請求項１に記載の小型肝細胞高含有コロニー。
【請求項３】
（ｉ）肝臓より肝細胞を分離すること、
（ｉｉ）分離された前記肝細胞を、実質細胞をより多く含む重量画分と、非実質細胞をより多く含み実質細胞をより少なく含む軽量画分とに分画し、前記軽量画分を回収すること、
（ｉｉｉ）前記軽量画分中の細胞をニコチンアミドを添加した培養液を用いて培養し、小型肝細胞コロニーを形成させること、および、
（ｉｖ）総細胞数が１０個〜３０個である小型肝細胞コロニーを回収すること、を含む、小型肝細胞高含有コロニーの調製方法。
【請求項４】
（ｉ）コロニーを形成している小型肝細胞に酵素を作用させ、または、作用させずに培養皿から剥がし、回収すること、
（ｉｉ）回収された前記小型肝細胞をニコチンアミドを添加した培養液を用いて継代培養し、総細胞数が１０個〜３０個であるコロニーを形成させること、および、
（ｉｉｉ）前記総細胞数が１０個〜３０個であるコロニーを回収すること、
を含む、小型肝細胞高含有コロニーの調製方法。
【請求項５】
（ｉ）請求項１または２に記載の小型肝細胞高含有コロニーを培養すること、
（ｉｉ）前記培養された小型肝細胞高含有コロニーを含む前記培地に細胞外基質を添加すること、
（ｉｉｉ）前記細胞外基質を添加された培地で培養された小型肝細胞高含有コロニーを細胞外基質を含まない培地で更に培養すること、
を特徴とする、小型肝細胞高含有コロニーの肝組織への成熟化方法。
【請求項６】
培養開始時の小型肝細胞高含有コロニー密度が、２００〜１０００コロニー／ｃｍ２であることを特徴とする、請求項５に記載の小型肝細胞高含有コロニーの肝組織への成熟化方法。
【請求項７】
（ｉ）請求項１または２に記載の小型肝細胞高含有コロニーを生体吸収性シート上に置くこと、
（ｉｉ）前記シートをシートごと培地中に置くことにより、前記シート上の小型肝細胞高含有コロニーを培養すること、
を特徴とする、
小型肝細胞高含有コロニーの肝組織への成熟化方法。
【請求項８】
培養開始時のシート上のコロニー密度が、２００〜１０００コロニー／ｃｍ２であることを特徴とする、請求項７に記載の成熟化方法。
【請求項９】
（ｉ）請求項１または２に記載の小型肝細胞高含有コロニーを生体吸収性シート上に置くこと、
（ｉｉ）前記シートをシートごと無血清培地中に置くことにより、前記シート上の小型肝細胞高含有コロニーを培養すること、
を特徴とする、移植用肝組織調製方法。
【請求項１０】
培養開始時のシート上のコロニー密度が、２００〜１０００コロニー／ｃｍ２であることを特徴とする、請求項９に記載の移植用肝組織調製方法。
【請求項１１】
請求項５〜８の何れか１項に記載の方法により成熟化した小型肝細胞高含有コロニーと化学物質とを共存させ、前記小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において発現が誘導または抑制される遺伝子を同定および／またはその発現量を定量することにより、前記化学物質の肝機能に関連した作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定する方法。
【請求項１２】
請求項５〜８の何れか１項に記載の方法により成熟化した小型肝細胞高含有コロニーと化学物質とを共存させ、前記小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において発現が誘導または抑制される遺伝子を同定および／またはその発現量を定量し、さらに前記誘導または抑制された遺伝子発現の誘導または抑制パターンを作用が既知の化学物質に対する遺伝子発現の誘導または抑制パターンと比較し、前記パターンと類似したパターンを有する化学物質の肝機能に関連した作用を前記小型肝細胞高含有コロニーと共存させた前記化学物質の肝機能に関連した作用としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定する方法。
【請求項１３】
発現が誘導または抑制される遺伝子が薬物代謝酵素遺伝子である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法によって成熟化した小型肝細胞高含有コロニーと化学物質とを共存させ、前記化学物質が前記小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において薬物代謝酵素遺伝子の発現を誘導または抑制する能力を決定することにより、前記化学物質が肝臓において前記薬物代謝酵素の発現を誘導または抑制するかを決定する方法。
【請求項１５】
薬物代謝酵素遺伝子がチトクロームＰ４５０酵素群に属する酵素をコードする遺伝子である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬物代謝酵素遺伝子がＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ４Ａ１をコードする遺伝子から選ばれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項５〜８の何れか１項に記載の方法により成熟化した小型肝細胞高含有コロニーと化学物質とを共存させ、前記小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において発現が誘導される、または抑制される遺伝子を同定および／またはその発現量を定量することにより、前記化学物質の肝機能に関連した作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで肝組織を誘導するために適した小型肝細胞コロニー、その調製方法、前記小型肝細胞コロニーからの効率的な肝組織への誘導方法に関する。
ヒトは種々の疾患により、例えば、肝炎、肝硬変、肝癌などにより肝機能不全状態になる。現在のところ人工肝臓は実用段階にあるとは言えないため、このような疾患の根本的な治療は肝臓移植に頼らざるを得ないのが現状である。しかも、我が国を初め世界各国において、肝臓移植を必要としている患者は多数存在するにもかかわらず、臓器を提供するドナーの数は必要数の１割を満たすのがやっとである。従って、肝臓移植に使用できるような肝組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成させる方法、そのような方法に使用できる肝組織の前駆細胞コロニーおよびそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製方法が望まれている。
一方、肝臓はｉｎ  ｖｉｖｏでは再生力の高い臓器として知られているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて肝臓を再生させることは成功しているとは言えない。現在、細胞培養レベルでは、直接肝臓を構成している細胞として、肝細胞、胆管上皮細胞、などを個別に培養増殖できているに過ぎない。また、移植可能な肝組織の調製方法として、器官培養、ＥＳ細胞を用いた方法が研究されている。しかしながら、器官培養で充分な大きさの臓器を形成させることは成功しておらず、また、肝臓を形成する全ての細胞をＥＳ細胞から調製することにも成功していない。特にＥＳ細胞は有望視されてはいるものの、患者それぞれからＥＳ細胞を調製する必要があり、更に、肝臓を構成する各細胞を増殖させなければならず、その方法は未だ確立されていない。
このような研究と並行して肝細胞中には種々の薬物代謝酵素が存在することが明らかにされている。この薬物代謝酵素は、外来性および内来性の化学物質（総称して「薬物」と呼ぶ）、たとえば、発癌剤、食品添加物、殺虫剤、ステロイド、プロスタグランディンなどのエイコサノイド、脂質または脂溶性のビタミンなどの、極性が少ない物質、特に比較的脂溶性の物質に作用し、これらの物質を水酸化等の反応により極性を高めて血液中に戻して尿として排出させる、または胆汁中に分泌させることで体内から排除する過程に関与している。この過程にはフェーズＩ（ｐｈａｓｅ  Ｉ）およびフェーズＩＩ（ｐｈａｓｅ  ＩＩ）の２通り、あるいは２段階の過程が知られている。フェーズＩは、極性を増加させる置換基、主として水酸基を付加する反応である。この反応を主として触媒するのはチトクロームＰ４５０（モノオキシゲナーゼ）（ＣＹＰシップとも呼ばれる）と呼ばれる酵素群であり約１５０のアイソザイムが知られている。それらのアイソザイムは反応する物質の構造に対して特異性があり、代表的なものとしてたとえば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ４Ａ１が知られている。ヒトが摂取する薬物のおよそ５０％はチトクロームＰ４５０酵素群によって代謝されると考えられている。フェーズＩＩは、フェーズＩによって水酸化を含む改変を受けた代謝物等に更に特定の分子を付加することで水溶性を増したり、胆汁に排出され易くする過程であり、この過程に関与する酵素には、グルクロン酸、硫酸、アセテート、グルタチオンおよびアミノ酸を付加する酵素やメチル化酵素が含まれ、その具体例としては、たとえばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、γグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、グルクロノシルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼおよびエチルトランスフェラーゼが挙げられる。チトクロームＰ４５０を含むこれらの薬物代謝酵素は通常は、いわゆる「解毒」作用に関与していると考えられるが、場合によっては、特定の物質に作用して変異原性物質の生成に関与したり、複数の薬剤を併用して投与する場合に相互にそれらの薬剤の治療効果を減じる等の有害な影響を及ぼすことがある。
これらの薬物代謝酵素のなかでも、特にＰ４５０は臨床医学の立場から重要であると考えられている。たとえば、抗凝固剤のワーファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ）はＣＹＰ２Ｃ９を誘導することが知られている。ワーファリン自体も自身が誘導する薬物代謝酵素により代謝されてしまうが、てんかん発作を起こす患者にワーファリンとフェノバルビタールを投与するとフェノバルビタールによる小胞体過形成が起こりＣＹＰ２Ｃ９が増加するためにワーファリンの薬効が更に減弱し、臨床的な効果を得るためにはワーファリン単独投与の場合よりもワーファリンの投与量を増加させる必要が生ずる。逆にフェノバルビタールの投与を急に止めるとワーファリンの代謝が低下し、血中濃度が高くなるため患者は出血傾向を呈するようになってしまう。一方、逆に抗鬱剤のイミプラミンなどは薬物代謝酵素遺伝子の発現誘導を抑制するために、イミプラミン投与後に睡眠剤ペントバルビタールを投与すると、ペントバルビタールの代謝が抑制されてペントバルビタール単独投与の場合に比較してその作用時間が長くなるという現象も知られている。また、エタノールを摂取するとＣＹＰ２Ｅ１が誘導されることが知られている。この酵素は、たばこの煙やある種の溶媒などに含まれている物質を代謝することにより発癌性を持たせることがある。従って、アルコール常飲者でヘビースモーカーは癌になりやすくなるということが考えられている。さらに、ＣＹＰ４５０１Ａ１は芳香族炭化水素化合物、例えば３−メチルコラントレンなどを代謝してＤＮＡと反応する物質に換えてしまい、発癌性を持たせてしまうことも知られている。従って、チトクロームＰ４５０の種々のアイソザイムの誘導の有無は、新規薬剤の肝毒性試験などでは調べなければならない重要な項目の一つと考えられている。
一方、肝毒性試験を含む薬剤の肝機能に関する作用はｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ双方の試験が行われるが、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では実験動物の使用および管理を必要とし、さらに臓器相関性が存在するという問題点等が指摘され、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、再現性や定量性が充分でない、あるいは、通常は培養細胞または培養組織は薬物代謝酵素系を欠くため複雑な系が必要であったり、試験そのものが行えない等の問題が指摘されていた。このように、肝臓における薬剤の作用、特に肝機能と関連した作用を調べることのできる安定したｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は確立していなかった。
本発明者らは、肝細胞としての機能を充分に維持しつつ、幹細胞のように増殖能の旺盛なある種の細胞が成体肝臓内に存在することを報告し（Ｍｉｔａｋａ  Ｔ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１６，１９９２，４４０−４４７）、これを小型肝細胞と称してきた。本発明者らは、小型肝細胞はウシ胎仔血清やニコチンアミド、ＥＧＦなどを加えた培養液で培養すると、最初単層のコロニーを形成し、やがて、周囲を肝上皮細胞や星細胞等の非実質細胞に囲まれるようになることを示した。また、更に培養を続けると、グルタミン合成酵素やカルバモイルリン酸合成酵素の発現が見られ、ミトコンドリアやペルオキシゾーム、グルコーゲン顆粒が顕微鏡的に観察できるようになることを報告してきた。しかしながら、移植可能な程度の肝組織を調製するための小型肝細胞の調製方法、肝組織の誘導方法の開発はなお未解決であった。
発明の開示
本発明の目的は、移植可能な肝組織を調製する方法、そのために適した細胞コロニーおよびその調製方法を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は移植可能な肝組織を調製するために適した小型肝細胞コロニー、その調製方法、その小型肝細胞コロニーから肝組織を誘導する方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、薬物の作用、特に正常な肝機能と関連した作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定する方法を提供することである。
本発明は、細胞数にして全細胞の約７０％以上が小型肝細胞によって構成されている小型肝細胞高含有細胞コロニー、特に、約１０個〜約３０個の細胞からなり、小型肝細胞数が全細胞数の約７０％以上を構成する小型肝細胞高含有細胞コロニーである。
また、本発明は、肝臓から単離された、または、継代された培養中の小型肝細胞を培養初期に細胞コロニーとして回収することを特徴とする、移植可能な肝組織を調製するために適した小型肝細胞高含有コロニーの調製方法である。特に、本発明は、肝臓から単離された、または、継代された培養中の小型肝細胞を含む１０個〜３０個の細胞からなる細胞コロニーが形成された時点で、非酵素的に単離することを特徴とする、移植可能な肝組織を調製するために適した小型肝細胞高含有コロニーの調製方法である。
即ち、本発明は、
（ｉ）肝臓より肝細胞を分離すること、
（ｉｉ）分離された前記肝細胞を、実質細胞をより多く含む重量画分と、非実質細胞をより多く含み実質細胞をより少なく含む軽量画分とに分画し、前記軽量画分を回収すること、
（ｉｉｉ）前記軽量画分中の細胞をニコチンアミドを添加した培養液を用いて培養し、小型肝細胞コロニーを形成させること、および、
（ｉｖ）総細胞数が１０個〜３０個である小型肝細胞コロニーを回収すること、を含む、小型肝細胞高含有コロニーの調製方法である。
また、本発明は、
（ｉ）コロニーを形成している小型肝細胞に酵素を作用させ、または、作用させずに培養皿から剥がし、回収すること、
（ｉｉ）回収された前記小型肝細胞をニコチンアミドを添加した培養液を用いて継代培養し、総細胞数が１０個〜３０個であるコロニーを形成させること、および、
（ｉｉｉ）前記総細胞数が１０個〜３０個であるコロニーを回収すること、
を含む、小型肝細胞高含有コロニーの調製方法である。
更に、本発明は、上述のようにして調製された、小型肝細胞が数にして全細胞の約７０％以上を構成する細胞コロニーである。
また、本発明は、上述のように単離した小型肝細胞高含有コロニーを培養し、更に細胞外基質を添加して一定期間培養し、次に、細胞外基質を添加しない培地で培養することを特徴とする、小型肝細胞コロニーの肝組織への誘導方法である。
特に、本発明は、上述のように単離した小型肝細胞コロニーを生体適合性材質製のシート上に移し、更に一定期間培養することを特徴とする、小型肝細胞コロニーの肝組織への誘導方法である。
本発明は、上述のようにして成熟化させた小型肝細胞高含有コロニーと化学物質を共存させ、前記小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において発現が誘導される、または抑制される遺伝子を同定および／またはその発現量を定量することにより、前記化学物質の肝機能に関連した作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定する方法である。
特に、本発明は、上述のようにして成熟化させた小型肝細胞高含有コロニーと化学物質を共存させ、前記小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において発現が誘導される、または抑制される薬物代謝酵素遣伝子を同定および／またはその発現量を定量することにより、前記化学物質の肝機能に関連した作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定する方法である。
本発明は、上述のようにして成熟化させた小型肝細胞高含有コロニーと化学物質とを共存させ、前記化学物質が前記小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において薬物代謝酵素の発現を誘導または抑制する能力を決定することにより、前記化学物質が生体の肝臓において前記薬物代謝酵素の発現を誘導または抑制するかを決定する方法でもある。
また、本発明は、上述のようにして成熟化させた小型肝細胞高含有コロニーと化学物質を共存させ、前記小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において発現が誘導される、または抑制される遺伝子を同定および／またはその発現量を定量し、さらに前記発現が誘導された、または抑制された遺伝子の誘導または抑制パターンを作用が既知の化学物質に対する遺伝子発現の誘導または抑制パターンと比較し、前記パターンと類似した誘導または抑制パターンを与える化学物質の肝機能に関連した作用を前記小型肝細胞高含有コロニーと共存させた前記化学物質の肝機能に関連した作用としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定する方法である。
特に、本発明は、上述のようにして成熟化させた小型肝細胞高含有コロニーと化学物質を共存させ、前記小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において誘導される、または抑制される薬物代謝酵素の遺伝子を同定および／またはその発現量を定量し、さらに前記誘導された、または抑制された薬物代謝酵素の遺伝子の誘導若しくは抑制パターンを作用が既知の化学物質に対する薬物代謝酵素遺伝子の誘導または抑制パターンと比較し、前記パターンと類似した誘導または抑制パターンを与える化学物質の肝機能に関連した作用を前記小型肝細胞高含有コロニーと共存させた前記化学物質の肝機能に関連した作用としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで推定する方法である。
より具体的には、本発明は、薬物代謝酵素がチトクロームＰ４５０酵素群である化学物質の作用を推定する前記方法である。
発明を実施するための最良の形態
本発明は移植可能な肝組織を調製するために適した小型肝細胞コロニー、その調製方法、その小型肝細胞コロニーから肝組織を誘導する方法を提供することである。以下に、本発明のいくつかの実施態様を記載する。なお、本明細書において、「細胞コロニー」または「コロニー」とは、細胞の増殖によって形成された細胞集塊をいい、構成する細胞数とは無関係に使用する。また、「小型肝細胞コロニー」の語は、小型肝細胞を含むコロニーを意味し、コロニーを構成する細胞数およびコロニーに含まれる小型肝細胞の割合とは無関係に使用する。一方、本明細書において「小型肝細胞高含有コロニー」とは、小型肝細胞を含む細胞集塊のうち、その細胞集塊を構成する細胞総数の約７０％以上が小型肝細胞であるコロニーをいう。
本発明の方法には小型肝細胞を使用する。本明細書において、「小型肝細胞」とは、単に肝臓に由来する小型の細胞を意味するものではなく、以下に記載する方法、あるいはこれに準じた方法を用いて肝臓から単離される細胞であって、強い増殖能を有し、アルブミン、トランスフェリン、サイトケラチン（ＣＫ）８、ＣＫ１８などのマーカーについて成熟肝細胞とほぼ同様の表現型を示し、超微構造的にも肝細胞としての特徴を有する、肝臓由来の特別な種類の小型の細胞を意味する。この細胞は発明者らによって見出されたものであり、より詳しくはＭｉｔａｋａ  Ｔ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１６，４４０−４４７，（１９９２）、Ｍｉｔａｋａ，Ｔ，Ｓａｔｏ  Ｆ，Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｔら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２９，１１１−１３５（１９９９）に記載されている。
本発明に使用する小型肝細胞は、例えば以下のように調製することができる。ヒトその他の動物から採取した肝臓組織をコラゲナーゼ等を含む溶液で処理すると肝臓由来の細胞を得ることができる。この場合、通常のコラゲナーゼ肝灌流法を利用することができる。得られた細胞懸濁液は必要に応じて適当な大きさのメッシュ等を通し、未消化の組織残渣その他の組織破砕片等を除去してもよい。この細胞懸濁液をそのまま培養しても小型肝細胞コロニーを得ることもできるが、実質細胞および不要な組織破砕物等を可能な限り除去してから培養することが好ましい。実質細胞の除去は、以下のように低速遠心によって行なうことができる。低速遠心とは、実質細胞および不要な組織破砕物等を多く含む画分と、非実質細胞を多く含む軽画分とを分離するために十分な条件をいい、好ましくは、実質細胞および不要な組織破砕物等を主として含む画分と、小型肝細胞および非実質細胞を多く含み実質細胞をほとんど含まない軽画分とを分離するために十分な条件をいう。このような条件で上述したような方法で得られる肝臓由来の細胞を分画すると、小型肝細胞は前述の軽画分により多く得られる。より具体的には、例えば、この細胞懸濁液を低速遠心、例えば５０ｘｇで１分間遠心することにより、主として実質細胞を含む重い画分と、星細胞、クッパー細胞、類洞内皮細胞等の非実質細胞を主として含む比較的軽い細胞を含む軽い上清画分とに分画することができる。小型肝細胞はこの遠心条件下で上清画分に多く得られる。
加速度が大きくなるほど、また、遠心時間が長くなるほど上清画分中の実質細胞の割合は減るが、沈殿する小型肝細胞の割合も増加するため、遠心は約５０ｘｇにて約１分間以下とするのが好ましい。上清画分は更に遠心、沈殿、懸濁を繰り返して実質細胞および不要な組織破砕物等を除去することもできる。より具体的には、例えば、上清画分を、５０ｘｇで５分間遠心し、沈殿を適当な培地に懸濁し、更に５０ｘｇで５分間遠心する。沈殿を同様な培地に懸濁し、再び５０ｘｇで５分間遠心する。得られた沈殿を同様な培地に懸濁し、１５０ｘｇで５分間遠心して、沈殿した細胞を新鮮な培地に懸濁する。細胞懸濁液中の細胞数を数え、その後の培養、あるいは処理のために必要な細胞密度となるように調製することができる。通常、１ｘ１０５〜５ｘ１０５細胞／ｍｌの密度に調製される。
このようにして調製した細胞は、血清、ニコチンアミド、ビタミンＣ、抗生物質、増殖因子、その他の細胞培養に一般的に使用される添加物を更に含む基本培地、例えば、これらを添加したダルベッコ改変イーグル培地等で３７℃にて培養することができる。小型肝細胞を増殖させるあるいは維持するための培地は、ニコチンアミドを含み、更にコロニー形成促進のためにビタミンＣ、増殖因子、ＤＭＳＯ等を含むことが好ましい。ビタミンＣは通常、アスコルビン酸２リン酸として添加し、その濃度は、好ましくは０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ、より好ましくは、０．５ｍＭ〜１．０ｍＭであり、ニコチンアミドは比較的高濃度で使用され、好ましくは１〜２０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜１０ｍＭで使用する。増殖因子としては、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）等が利用でき、ＴＧＦαが特に好ましい。ＴＧＦαを添加する場合には、好ましくは１μｇ／ｌ〜１００μｇ／ｌ、より好ましくは５μｇ／ｌ〜５０μｇ／ｌの濃度で使用する。
また、初代培養においてはＤＭＳＯは培養開始４日目から好ましくは約０．１〜約２％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約０．５％〜約１．５％（ｖ／ｖ）の濃度で添加する。肝組織への誘導のためには、前述と同じ組成の培地にＤＭＳＯは継代１日目から１％の濃度で培地に添加するのが好ましい。また、小型肝細胞の初代培養および継代維持のためには、血清たとえばウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加することができるが、移植のための肝組織への誘導のためには不要なタンパク質の混入を避けるために無血清培地を使用することが好ましい。血清を用いる場合は、拒絶反応を最小限に抑えるために、移植対象の動物種由来の血清を用いることが好ましい。培地はほぼ１日おき、通常、週に３回交換する。
本発明で使用する小型肝細胞または小型肝細胞高含有コロニーの培養容器としては、通常の細胞培養に使用される培養皿を使用することができる。一般には接着細胞の培養はコラーゲン被覆をした培養皿が使用され、例えば、ウシ真皮、ラットの尾部由来のコラーゲンを被覆した種々の大きさの培養皿が商業的に入手可能であり、また必要であればそのような培養皿を調製することもできる。本発明においても小型肝細胞の培養にもそのような培養皿を使用することができるが、肝組織形成に適した小型肝細胞コロニーを調製するためにはコラーゲンを被覆しない培養皿を使用することが好ましい。なぜならば、細胞外基質が少ないほどより温和な条件で細胞が剥がれやすく、かつ、コラーゲン等で被覆しない場合には、小型肝細胞が優先的に容器から剥離する傾向があるからである。本発明においては、培養は６０ｍｍの培養皿あたり、比較的高密度、具体的には約４ｘ１０５〜９ｘ１０５個の細胞密度で開始するのが好ましい。培養には、通常の５％炭酸ガスインキュベーターを使用することができる。炭酸ガス濃度および培養温度は、通常の培養細胞に許容される範囲であれば本質的ではない。
このような条件で培養すると、約１週間程度で明瞭なコロニーが確認できるようになる。このときのコロニーを構成する細胞数は約１０〜約３０個程度である。本明細書において、培養期間について「早期」というのは、このような時期をいう。上記培養条件下で培養した場合、この時期に見られる細胞コロニーは主として小型肝細胞からなり、非実質細胞によって周囲を完全に包囲されるには至っていない。
本発明においては、小型肝細胞以外の細胞、例えば星細胞や肝上皮様細胞等を含む非実質細胞、を可能な限り含まない小型肝細胞コロニーを使用することが好ましい。具体的には、例えば、コロニーを構成する細胞総数の約７０％以上を小型肝細胞が占めるコロニーを使用することが好ましく、より好ましくは、コロニーを構成する細胞総の約８０％以上、特に好ましくは８５％以上が小型肝細胞であるコロニーが使用される。前述のような方法で肝臓から単離した小型肝細胞を前述のような培地および条件で培養した場合に生じる、細胞数が約１０〜約３０個からなるコロニーは一般にそのような条件を満たしている。従って、本発明の肝組織調製方法のために、このような早期に単離される小型肝細胞コロニーを利用することができる。
形成されたコロニーは以下のような温和な条件、例えば非酵素的方法で培養容器から剥離して、新しい培地に移すことが好ましい。例えば、金属キレート剤および種々の非酵素的剥離剤を使用して非酵素的に細胞を培養皿から剥がすのが好ましい。使用し得る金属キレート剤としては、細胞毒性の少ないものであればよく、接着細胞の剥離処理に一般的に使用されるもの、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及び／またはその塩を、それぞれについて一般的な濃度で使用することができる。ＥＤＴＡのナトリウム塩が特に好ましく、好ましくは０．０１〜０．０５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１〜０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。ＥＧＴＡナトリウム塩の場合は、約０．５ｍＭで使用するのが好ましい。処理時間は、細胞をリンスする程度（数秒間）に短くてもよいが、好ましくは約３０秒〜約１０分間、より好ましくは約１分間〜約５分間である。長時間の処理は細胞に与える損傷が大きいため、可能な限り短くすることが好ましい。
非酵素的細胞剥離剤としては、Ｃａ、Ｍｇを含まないＨａｎｋｓの緩衝液（ｐＨ７．３〜７．５）にＥＤＴＡ、グリセロール、クエン酸ナトリム等を添加した溶液が利用でき、例えばＳｉｇｍａ社からＣｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの名で調製済みの非酵素的細胞剥離剤を商業的に入手することができる。より具体的には、例えば約０．０２％のＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液を細胞上に注ぐ。数分間静置し、その後ＥＤＴＡ溶液を除いた後、Ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎのような非酵素的細胞剥離剤を注ぎ、例えば３７℃にて約５分間〜約３０分間、好ましくは約１０分間〜１５分間静置する。細胞に与える損傷を最小限にするため、非酵素的剥離剤による処理も金属キレート剤処理と同様、可能な限り短くするのが好ましい。次に、細胞に与える損傷を最小限にすべく、静かにピペッティングすることにより培養皿から小型肝細胞高含有コロニーを剥がす。本発明の小型肝細胞高含有コロニーは、酵素を使用しないこのような温和な条件でも極めて剥離しやすく、上述した方法によって早期にコロニーを単離することにより、小型肝細胞以外の細胞、特に非実質細胞の混入を更に低く抑えることができる。
必要に応じてこのコロニーを遠心、懸濁を繰り返すことにより洗浄し、最後に適切な培地等に懸濁する。場合により、位相差顕微鏡等を用いてコロニーあたりの細胞数および／または小型肝細胞の割合を測定してもよいが、上述したように早期にコロニーを単離すれば通常は不要である。コロニー数は例えばＩＰｌａｂのような画像解析プログラムを用いて計測することができる。また、コロニーを構成する細胞数は、アルブミンやサイトケラチン８染色のようなマーカーで免疫染色して位相差顕微鏡を用いて測定することができ、また、位相差顕微鏡とＣＣＤカメラを用いてコンピュータに画像を記録し、経時的に測定することもできる。
増殖維持のために継代する場合において使用する培地は、肝臓から直接得られた小型肝細胞を得る場合と同様にニコチンアミド、ビタミンＣ、増殖因子、ＤＭＳＯ等を含む培地を用いることができ、ニコチンアミド、ビタミンＣ、増殖因子、ＤＭＳＯ等の濃度も同様である。肝組織形成のために継代する場合も同等の培地が使用できるが、肝組織移植に不要なタンパク質の混入を最小限にするため、前述したように無血清とすることが好ましい。
また、このように早期に単離され、非実質細胞を約３０％未満程度しか含まない小型肝細胞コロニーは、増殖因子に対する依存性が強度に低下し、増殖因子を実質的に含まない培地でも培養可能である。従って、増殖因子が増殖のために必須でないことも本発明の小型肝細胞高含有コロニーが有する特徴の一つである。更に、単離された本発明の小型肝細胞高含有コロニーの他の特徴は、上述のような培地で継代培養した場合、肝細胞以外の細胞が少ないために成熟化がおこりにくく、平面的に増殖を続けることである。
このようにして肝臓から直接単離された細胞から形成された小型肝細胞高含有コロニーはそのまま培養を続けると、成熟化せずに増殖させることができる。増殖した小型肝細胞コロニーを上述したような非酵素的方法で単離し、さらに細胞数約１０個以下のコロニーに分割して継代培養することもできる。そのように継代されたコロニーは上述したような培地を用いて細胞数約１０個〜約３０個のコロニーを形成するまで培養することができる。この方法で形成される細胞数約１０個〜約３０個のコロニーもまた本発明の小型肝細胞高含有コロニーに含まれる。この継代操作を１以上繰り返して得られる細胞数約１０個〜約３０個のコロニーもまた本発明の小型肝細胞高含有コロニーに含まれる。
上述のように培養して形成された主として小型肝細胞からなる小型肝細胞高含有コロニーは、更に細胞外基質の存在下で短期間培養し、続いて細胞外基質を含まない培地で培養することにより生体内の肝細胞に極めて近くまで成熟化を誘導することができる。
小型肝細胞の割合が細胞数にして約７０％以上である小型肝細胞高含有コロニー、好ましくは約１０〜約３０個の細胞からなり小型肝細胞の割合が細胞数にして約７０％以上である小型肝細胞高含有コロニーを５００〜１０，０００コロニー／ｍｌ、好ましくは、１，０００〜４，０００コロニー／ｍｌ、より好ましくは１，５００〜３，０００コロニー／ｍｌの濃度で２００〜１０００コロニー／ｃｍ２、好ましくは２５０〜５００コロニー／ｃｍ２になるように培養皿に播き、前述したような培地（無血清）で培養する。肝組織への成熟化を誘導するためには、培養皿中であまり密になりすぎないように培養することが好ましい。例えば、約１０日間〜１４日間培養すると、小型肝細胞高含有コロニーは面積で約５倍、細胞数にして約６倍ほどに増殖し（図１、２）、培養皿の底面積の約２０％〜３０％程度が細胞で覆われる。細胞外基質を添加する時期としては、このような時期のコロニーが特に好ましい。成熟化の誘導は、ラミニン、コラーゲン、種々のプロテオグリカン、エンタクチン、フィブロネクチン等を含む細胞外基質を５０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で培養液に添加することによって促すことができる。
このような濃度の細胞外基質と共に約１〜３日間培養し、その後細胞外基質を含まない培地で培養を続けることにより、小型肝細胞コロニーの成熟化は顕著に進む。例えば、細胞外基質を含まない培地に戻した翌日から小型肝細胞の形態変化が明瞭に観察される。そのまま細胞外基質を含まない培地で培養すると、小型肝細胞の成熟化は更に著しく進行し、コロニーは大型化するとともに成熟化して生体内肝組織に極めて近い構造を形成する。小型肝細胞の成熟化に使用し得る細胞外基質としては、ラミニン、ＩＶ型コラーゲンを含むことが好ましく、基底膜成分（例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン）の多くを含むことがより好ましい。たとえば商業的に入手可能な、商品名マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の名称で販売されている（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）、Ｅｎｇｅｌｈｏｒｍ肉腫（ＥＨＳ）から抽出された細胞外基質調製物（ラミニン６０％、ＩＶ型コラーゲン１５％、プロテオグリカン、エンタクチン等を含む）が特に好ましい。
このようにしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された、生体内肝組織に極めて近い組織は、肝機能の種々の研究に使用することができるのみならず、肝移植に使用することができる。
本発明の小型肝細胞高含有コロニーを生体適合性であって生体吸収性または生分解性材料からなるシート上に置くことによって、肝組織移植に特に適した肝組織を形成させることができる。なお、本明細書において「生体吸収性」とは主として生体の生理作用によって代謝され若しくは細胞内に取り込まれる性質を言い、「生分解性」とは生体の生理作用によって分解される性質を言うが、両者は重複する部分もあるため厳密に区別せずに使用する。また、本明細書において「生体適合性」とは生体によって問題となるほど異物として認識されない性質を言う。
本発明に使用し得る生体適合性かつ生体吸収性シートは繊維構造を有することが好ましい。すなわち、本発明の方法において、シートの繊維構造によって形成される腔に本発明の小型肝細胞高含有コロニーが入り込み、腔内の狭い環境において自身が分泌する細胞外基質の濃度が高まるために成熟化が著しく刺激され、さらに、狭い空間のなかで細胞間の接着面積が増大するために個々の細胞の立体化が促され、それらの総合的結果として肝組織が形成される。したがって、本発明の方法に使用するシートはひだ状の構造を有するシートであることが好ましい。
本発明で利用し得る生体適合性かつ生体吸収性材料には例えば、コラーゲンシート、コラーゲンスポンジおよびポリグリコール酸シートが含まれる。商業的に入手可能なそのような材料としては、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからヘリスタット（Ｈｅｌｉｓｔａｔ）の商品名の下に販売されている吸収性コラーゲンシート、および、グンゼ社からネオヴェイル（Ｎｅｏｖｅｉｌ）の商品名の下に販売されている吸収性ポリグリコール酸フェルトが挙げられる。
本発明の小型肝細胞高含有コロニーを上述のようなシート上に置く場合は、液量を少なくするため比較的高濃度、例えば５００〜１０，０００コロニー／ｍｌ、好ましくは１，０００〜４，０００コロニー／ｍｌ、より好ましくは１，５００〜３，０００コロニー／ｍｌの濃度に調製した細胞懸濁液を、２００〜１，０００コロニー／ｃｍ２、好ましくは２５０〜５００コロニー／ｃｍ２になるようにシートに滴下する。コロニーがシートに充分接着するまで静置する。静置時間はコロニーがシートに接着するに充分であればよいが、少なくとも２０分間以上、好ましくは３０分間以上、特に好ましくは１時間以上である。その後、＋小型肝細胞の培養に適した培地を加える。この培地は、小型肝細胞を肝臓から単離する際に使用する培地でよいが、無血清であることが好ましい。実施例中の表２に記載した小型肝細胞培養液ＩＩは本発明の小型肝細胞高含有コロニーをシート上で培養するために好ましい培地である。このような条件下で培養すると、シート上の小型肝細胞コロニーの成熟化は著しく進行し、コロニーは大型化するとともに成熟化して約１０日〜約１５日で生体内肝組織にきわめて近い構造をシート上で形成する。更に培養を続けて肝組織を増殖させてもよい。しかしながら、生体吸収性または生分解性シートは培養液中で溶解する傾向があるため肝移植のためには培養期間は約３週間までとするのが取り扱い上好ましい。
本発明の小型肝細胞高含有コロニーは、生体適合性であって生体吸収性または生分解性材料からなるシート上に置き、更に細胞外基質を添加することによっても、肝組織移植に特に適した肝組織を形成させることができる。この場合の細胞外基質を添加する時期、濃度、使用できるシート、および成熟化に使用する細胞数等の条件は、細胞外基質およびシートを単独で使用する場合と同等であってよくい。しかしながら、細胞外基質の濃度は適宜低下させてもよい。例えば、コロニーがシートに充分に付着した後、すなわち、シートに載せてから約１時間後以降にラミニン、ＩＶ型コラーゲンやそれらを含むＭａｔｒｉｇｅｌ等を１００〜１，０００ｍｇ／ｌの濃度になるように培養液に加えることにより成熟化を促進させることができる。細胞外基質は１度投与すればよく、その後は細胞外基質を含まない培養液で培養してよい。
このようにしてシート上で形成された肝組織は、シートごとそのまま肝移植に使用することができる。
上述のように、細胞外基質の添加、またはシート上での培養によって成熟化したコロニーに含まれる細胞の肝細胞としての性質は種々のマーカーを解析することによって確認することができる。使用するマーカーは成熟前の小型肝細胞、例えば、単離直後の小型肝細胞高含有コロニーに比較して成熟肝細胞において顕著な差異がみられるマーカーであればよい。例えば、肝細胞特異的マーカーとして知られる種々の既知のマーカーが利用できる。
解析は例えば以下のように行なうこととができる：細胞を適当なバッファー、例えば、Ｈｅｐｅｓバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．２５Ｍシュークロース、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に懸濁し、マイクロシリンジによって機械的に細胞を破壊する。得られた細胞ライセートを密度勾配遠心等により細胞膜分画、細胞質分画、核分画に分け、各画分のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析することができる。あるいは、培地中に分泌されるアルブミンやフィブリノーゲンのような肝細胞特異的マーカーを同様に解析してもよい。
小型肝細胞の成熟化の指標となり得る肝細胞特異的マーカーとしては、例えば、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、およびトリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＯ）あるいはセリンデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）のホルモン誘導発現、トランスフェリン、α１−アンチトリプシン、フィブリノーゲン、アルブミン等が挙げられる。
シート上に形成された肝組織は取り扱いが容易であるため、シート上に形成された肝組織は肝移植の目的に特に適している。移植は、培養時に培養液面側であった方、すなわち、肝組織が主として形成されている側を臓器側にして密着させ、そのご縫合または手術用のホッチキス等で固定すればよい。必要に応じて動物にＦＫ５０６等の免疫抑制剤を投与してもよい。シートは生体吸収性であるため、通常、約１〜２週間程度で生体に吸収され、シート上に存在していた肝組織は生体内の肝臓に活着する。
また、上述した本発明の方法により、成熟化を誘導された小型肝細胞高含有コロニーは、化学物質と共存培養することにより、その化学物質に応じた遺伝子の発現、特に薬物代謝酵素遺伝子の発現を誘導することができる。たとえば、成熟化を誘導された小型肝細胞高含有コロニーに対して、特定の薬物代謝酵素を誘導または抑制する化学物質は、生体における肝臓に対してもその薬物代謝酵素遺伝子の発現を誘導または抑制すると推定することができる。また、特定の薬物代謝酵素によって代謝された結果、変異原性を獲得する可能性のある化学物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異原性試験において、あらかじめ特定の化学物質によって成熟化を誘導された小型肝細胞高含有コロニーにおいてその薬物代謝酵素の発現を誘導しておき、その後試験すべき化学物質を小型肝細胞高含有コロニー添加することができる。
ここで、「薬物代謝酵素」とは、一般に肝臓において種々の化学物質の酸化、還元および付加反応等の反応を触媒し、歴史的にはいわゆる「解毒作用」に関与する酵素群として当業者に広く認識されている酵素群をいい、「肝薬剤代謝酵素」と呼ばれることもある。
更に、本発明により、小型肝細胞高含有コロニーから成熟化を誘導されて得られた肝組織は、与えられた化学物質と共存培養し、その化学物質の小型肝細胞高含有コロニーにおける特定の遺伝子発現に対する作用、特に薬物代謝酵素遺伝子発現の誘導能または抑制能を調べることにより、その化学物質の作用、特に肝機能と関連した作用を推定するために使用することができる。肝機能と関連した作用とは、正常な肝臓の機能に対する直接の作用、たとえば薬物代謝酵素発現の誘導または抑制、および、正常な肝臓の機能によって代謝された結果生ずる生成物を介した生体内における二次的作用、たとえば、そのような生成物を介した肝臓以外の他の細胞または組織に対する作用が含まれる。たとえば、上述したような、エタノールが肝臓においてＣＹＰ２Ｅ１を誘導する作用を有する結果、生成したＣＹＰ２Ｅ１がヘビースモーカーの体内において発ガン性物質を生成させるという二次的作用が含まれる。
この薬物代謝酵素は、既に述べたように外来性および内来性の化学物質、たとえば、発癌剤、食品添加物、殺虫剤、ステロイド、プロスタグランジンなどのエイコサノイド、脂質または脂溶性のビタミンなどの物質、特に比較的極性が比較的低い物質や一般に脂溶性物質を称される物質に作用し、これらの物質を水酸化して極性を持たせて血液中に戻して尿として排出させる、または胆汁中に分泌させることで体内から排除する過程に関与している。これらには、フェーズＩに関与する、チトクロームＰ４５０アイソザイム（たとえば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ４Ａ１）、フェーズＩＩに関与する、グルクロン酸、硫酸、アセテート、グルタチオン、アミノ酸を付加する酵素やメチル化酵素、より具体的には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、γグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、グルクロノシルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼおよびエチルトランスフェラーゼが含まれる。本発明においても、これらの薬物代謝酵素遺伝子発現の誘導または抑制の有無を、与えられた薬物の作用を推定するために利用することができる。本方法により、１以上の薬剤を同時に投与する場合に、それらが生体に与える単独、または複合的な作用を推定することもできる。たとえば、特定の薬剤による治療を受けている患者に対して、新たな薬剤を投与する場合にその新たな薬剤の投与の妥当性、投与量の増減をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することができる。あるいは、その患者の生活習慣が、特定の薬剤の投与によってどのような影響を受けるかを推測するこもできる。従って、本発明においてその発現を調べるべき遺伝子としては、薬物代謝酵素をコードする遺伝子（薬物代謝酵素遺伝子）が特に好ましい。
ヒトが摂取する化学物質のおよそ５０％がチトクロームＰ４５０酵素群によって代謝されると考えられているため、チトクロームＰ４５０の種々のアイソザイム、たとえば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ４Ａ１は、本発明において誘導の有無を調べる薬物代謝酵素として特に適している。これらのチトクロームＰ４５０アイソザイムは、通常組織ではあまり強く発現しておらず、特定の化学物質を投与した場合に投与された化学物質に依存したアイソザイムが顕著に誘導されるという特性を有しているため、検査の容易さの点でも本発明の方法に適している。
本発明の方法によってその作用を推定し得る化学物質は特に限定されないが、レセプターを介せずに細胞内に取り込まれ易いと考えられる物質が好ましく、たとえば極性の比較的低い物質が好ましく、脂溶性物質がより好ましいが、更に、操作上の利便性を考慮すれば、水性媒体に可溶化または容易に分散できることが特に好ましい。生体内においては、肝臓に達する際には脂溶性物質であっても比較的低濃度または水性媒体に可溶化または分散された状態であると考えられる。従って、たとえば、脂溶性物質であっても比較的低い濃度では水性媒体に溶解する化学物質は本発明の方法に適している。また、細胞培養において顕著な害を与えないとして当業者に知られる有機溶媒、たとえばエタノール、メタノールおよびジメチルスルホキシドに可溶性であれば、それらの有機溶媒に溶解し、それらの有機溶媒の最終濃度が、やはり細胞培養において顕著な害を与えないとして当業者に知られる濃度となるような範囲で使用することもできる。このような化学物質には、エタノール等のアルコール、種々の芳香族炭化水素化合物、ステロイドを含む種々のホルモン、メチルコラントレン等の発癌物質、フェノバルビタール等の睡眠剤、抗うつ剤、アミノピリン等の解熱鎮痛剤を含む種々の化学物質が含まれる。これらの物質は、薬物代謝酵素遺伝子の発現を誘導する場合も、発現を抑制する場合もある。
一般に、本明細書において、「発現の抑制」には、既に特定の遺伝子、たとえば、薬物代謝酵素遺伝子の発現が誘導されている場合にこれを低下させる場合、特定の遺伝子の発現、たとえば、薬物代謝酵素遺伝子の発現を誘導する薬剤と共存させた場合に発現の誘導を抑制する場合が含まれる。また、本明細書において、遺伝子の「発現」は転写レベル、翻訳レベルのいずれの場合も含む。従って、本発明においては、ｍＲＮＡの量に有意な変化がなくても翻訳速度の増加により遺伝子産物が増加すれば「発現が誘導された」と考える。
本発明による化学物質の作用を推定する方法においては、本発明の方法によって成熟化した小型肝細胞高含有コロニーを、種々の濃度の作用を調べたい化学物質と共存培養し、成熟化小型肝細胞高含有コロニー中の細胞中で発現する遺伝子を同定および／またはその発現量を定量することにより特定の遺伝子の発現、たとえば薬物代謝酵素遺伝子発現の誘導の有無が調べられる。あるいは、特定の遺伝子の発現、たとえば薬物代謝酵素をコードする遺伝子の発現を誘導することが分かっている化学物質と同時に作用を調べたい化学物質と本発明の方法によって成熟化した小型肝細胞高含有コロニーとを共存培養する、または、そのような化学物質を用いて本発明の方法によって成熟化した小型肝細胞高含有コロニーにおいて前述の遺伝子の発現を誘導した後に、作用を調べたい化学物質と前述の薬物代謝酵素発現を誘導しておいた小型肝細胞高含有コロニーとを共存培養し、成熟化小型肝細胞高含有コロニー中の細胞において発現する遺伝子を同定および／またはその発現量を定量することにより、その化学物質による特定の遺伝子発現、たとえば薬物代謝酵素遺伝子の発現の抑制の有無が調べられる。
遺伝子の発現は、ｍＲＮＡレベル、あるいはタンパク質レベルで検出、同定および定量することができる。従って、上述の操作における誘導または抑制される遺伝子発現の同定および／または遺伝子発現量の定量は、特定のタンパク質、たとえば、誘導されるまたは抑制される薬物代謝酵素タンパク質（その例は上述した）自体について同定および定量してもよく、薬物代謝酵素ｍＲＮＡについて同定および定量してもよい。ｍＲＮＡおよびタンパク質の同定および／または定量は当業者に知られた一般的方法によって良く、たとえば、ｍＲＮＡについてはノーザンブロット法を使用することができ、タンパク質についてはＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動およびウェスタンブロッティング法等をもちいることができる。種々の薬物代謝酵素に対する特異的抗体は商業的に入手することも可能であり、必要であれば当業者に知られた常法に従って調製することができる。
実施例
本発明は、以下の実施例および添付の図面によってより容易に理解されるであろう。これらの実施例および図面は本発明の理解を助けるために記載されるものであり、いかなる意味でも本発明を限定するためであると解してはならない。
実施例１．小型肝細胞の分離方法
（１）肝臓組織からの小型肝細胞の単離
成熟ラット（１０〜１５週齢）の肝臓をＳｅｇｌｅｎの方法に準じて、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡを加えたＣａ、Ｍｇを含まないハンクス液で門脈から灌流した。４０ｍｌ／分の流速で前述のハンクス液を４分間流した後、０．０２％コラゲナーゼ（ヤクルト）を含むハンクス液を２０ｍｌ／分の流速で１０分間流した。消化された肝臓から常法に従って肝細胞をビーカー内にふるい落とした。細胞懸濁液を７０μｍのメッシュフィルターで濾過し、５０ｘｇで１分間遠心した。上清を集め、再び５０ｘｇで５分間遠心した。沈殿した細胞を培養液（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５、１０％ウシ胎仔血清、１０−７Ｍデキサメタゾン、０．５μｇ／ｍｌインスリンおよび抗生物質）で洗浄し、５０ｘｇで５分間遠心した。同様の操作をもう一度繰り返し、更に１５０ｘｇで５分間の遠心を２回繰り返した後、再び５０ｘｇで５分間遠心した。沈殿した細胞を新しい培養液で懸濁し、小型肝細胞とした。生細胞数を数え、細胞密度を１．０〜２．０ｘ１０５個／ｍｌに調整した。
（２）小型肝細胞の培養
（１）に記載したように調製した細胞を６０ｍｍ培養皿に約６ｘ１０５個／培養皿の割合で播いた。空気培養基で３時間静置した後、培養液を取り替えた。培養液としては、以下の表１に示す、ダルベッコ改変イーグル培地を基本とした培地（小型肝細胞培養培地Ｉ）を用いた。細胞は５％炭酸ガス培養器で３７℃にて培養し、約２日に１回の割合で培地交換を行なった。培養後約１週間経過後に小型肝細胞のコロニーが明瞭に認識できるようになった。
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実施例２．小型肝細胞高含有コロニーの単離
実施例１のようにして単離した小型肝細胞の培養後約１週間経過後、小型肝細胞のコロニーが明瞭に確認できるようになった時期に、以下のように小型肝細胞含有コロニーを調製した。
滅菌したリン酸緩衝液で細胞を２回洗浄した。その後、０．０２％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液に細胞を浸した。数分間静置した後、リン酸緩衝液を吸引した。酵素を含まない細胞剥離液（Ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ））１ｍｌを培養皿に入れ、３７℃にて１５分間静置した。次に、細胞に損傷を与えないように、細胞を静かにピペッティングすることによって培養皿から細胞を慎重に剥がした。細胞を遠心管に集め、５０ｘｇで５分間遠心した。上清を吸引した後１０％血清を含む培養液で洗い、再び遠心した。上清を吸引後、種々の量の下記の表２に記載した無血清の培養液（小型肝細胞培養培地ＩＩ）を加えて細胞懸濁液を調製し、小型肝細胞コロニーの濃度を測定した。小型肝細胞コロニーの濃度は５００〜１０，０００個／ｍｌとした。
このように調製した小型肝細胞コロニーを構成する細胞総数は、位相差顕微鏡で確認したところ１８．５±９．４個であった。また、小型肝細胞コロニーに占める小型肝細胞の割合は、約７０％〜約９０％であった。
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実施例３．小型肝細胞の肝組織への誘導（１）
実施例２で得られた小型肝細胞含有コロニーを１．５〜３．０ｘ１０３コロニー／培養皿になるようにコロニーごと培養皿（直径３５ｍｍのディッシュ）に入れた。
そのまま５％炭酸ガス培養器で３７℃にて培養した。継代後約１週間で小型肝細胞コロニーは第１日に比較して面積で平均３倍のコロニーを形成し、細胞数にして５倍まで増殖した（図１、２）。
継代後約２週間して、培養容器底面の約２０％〜約３０％がコロニーで占められるようになった時点（約２０％〜約３０％コンフルエント）で、Ｅｎｇｅｌｈｏｒｍ肉腫（ＥＨＳ肉腫）から抽出した細胞外基質（商品名マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）：基底膜成分からなり、ラミニン６０％、ＩＶ型コラーゲン１５％、プロテオグリカン、エンタクチン等を含む）を５００μｇ／ｍｌの濃度で培養液に添加した。
更に２日間培養後、培養液をＭａｔｒｉｇｅｌを含まない培養液に交換し、再び培養を続け、４８時間毎に肝細胞特異的マーカーを測定した。
その結果、Ｍａｔｒｉｇｅｌによる誘導後第２日目〜第１０日目で、成熟肝細胞のみに発現すると考えられる転写因子のＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、肝細胞核因子４（ＨＮＦ４）および肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）などが顕著に誘導された（図３〜図６）。これらの因子の誘導の確認は、２０μｇの核抽出タンパク質を電気泳動し、ウェウタンブロットを行ない、各バンドの相対強度を測定することによって行なった。陽性対照としては成熟肝細胞のタンパク質を用い（ＭＨ）、陰性対照としてはＭａｔｒｉｇｅｌを添加しない小型肝細胞高含有コロニーからの抽出タンパク質（Ｃ）を使用した（図３〜図６）。
更にこれらの転写因子によって発現が調節されると考えられているトリプトファン２−ジオキシゲナーゼ（ＴＯ）、セリンデヒドラターゼ（ＳＤＨ）のホルモン誘導が見られるようになった（図１２、１３）。誘導の確認は、以下のように行なった：小型肝細胞高含有コロニーに５００μｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌを添加し、その後、培養９日目に１０−５Ｍデキサメタゾンおよび１０−７Ｍグルカゴンを添加した。２４時間後に細胞を集め、タンパク質を抽出した。抽出したタンパク質の２０μｇをウェスタンブロット解析にかけ、各バンドの強度を測定し相対強度を測定した。陽性対照としては成熟肝細胞のタンパク質を用い（ＭＨ）、陰性対照としてはＭａｔｒｉｇｅｌを添加しない小型肝細胞高含有コロニーからの抽出タンパク質（Ｃ）を使用した。
また、アルブミン、トランスフェリン、α１−アンチトリプシン、フィブリノーゲンの培養液中の分泌も確認された（図７〜１０）。これらのタンパク質の分泌は、１μｌの培養上清を電気泳動し、ウェウタンブロットを行ない、各バンドの相対強度を測定することによって行なった。陽性対照（Ｎ）としては正常ラット血清または血漿を用い、陰性対照（Ｃ）としてはコラーゲン被覆培養皿で培養した小型肝細胞高含有コロニーの培養上清を使用した（図７〜１０）。
代表的な結果である、アルブミンの培養液中への分泌のより詳細な経時変化を特に図１１に示した。これらの結果は、小型肝細胞の成熟化、すなわち肝組織への誘導が細胞外基質によって著しく加速されることを示すものである。
細胞外基質が接触した小型肝細胞は、急速にその体積を増し、細胞質が大きくなった。しかしながら、培養皿に接している面の面積はあまり大きくならないため、増えた体積分だけ丈が高くなり隣り合う細胞との接触面が大きくなった。細胞間には、細胞間結合がよく発達し、タイト結合で強固に結合し、その間には毛細胆管が形成され、その中には胆汁に類するものも分泌可能になった。また、ギャップ結合もよく発達するようになり、細胞間コミュニケーションが良くなった。細胞質には、ミトコンドリア、ゴルジ装置、ペルオキシソームなどの細胞内小器官がよく発達し、グリコーゲン顆粒もよく見られるようになった。これらの結果は小型肝細胞が生体内の成熟肝細胞と同様の機能を持ちうることを示すものである。
実施例４．小型肝細胞の肝組織への誘導（２）
実施例２で調製された小型肝細胞コロニーを細胞コロニーごと吸収性コラーゲンシート（商品名Ｈｅｌｉｓｔａｔ）または吸収性ポリグルコール酸フェルトシート（商品名Ｎｅｏｖｅｉｌ）上に載せた。
２．５ｃｍｘ２．５ｃｍの大きさの上述のシートに、実施例２で調製された小型細胞コロニー懸濁液（１，５００〜３，０００コロニー／ｍｌ）をゆっくりと滴下した。充分な小型肝細胞コロニー（総細胞数、約２，８００〜５，０００個）を載せた後、５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて約１時間そのまま静置した。このシートに表２に示した培養液を加え、更に５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃に培養を続けた。
シートに接着した小型肝細胞はゆっくりと増殖し、シート上の培養第２日目において既に形態変化が観察された。シートの繊維の隙間や上に接着したコロニーの細胞は周りを囲むコラーゲン繊維に接着するため細胞が立方状になり盛んに分裂した。狭い空間内で細胞が増えるために細胞間の接着面が大きくなった。適当な細胞密度になると細胞は分裂を停止し細胞質が大きくなった。細胞間には、細胞間結合がよく発達し、タイト結合で強固に結合し、その間には毛細胆管が形成され、その中には胆汁に類するものも分泌可能になった。また、ギャップ結合もよく発達するようになり、細胞間コミュニケーションが良くなった。細胞質には、ミトコンドリア、ゴルジ装置、ペルオキシソームなどの細胞内小器官がよく発達し、グリコーゲン顆粒もよく見られるようになった。これらの結果は小型肝細胞が生体内の成熟肝細胞と同様の機能を持ちうることを示すものである。
細胞外基質をかけなくても成熟化が誘導されるのはこのような物理的な要因で細胞が固定されるためと考えられる。
また、シート上の培養第７日〜１５日において、１μｌの培養上清を電気泳動し、ウェスタンブロット解析にかけ、各バンドの相対強度を測定した。その結果、アルブミン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、フィブリノーゲン等の成熟肝細胞に特徴的なタンパク質の分泌が顕著に増加したことが示された（図１４〜図１７）。特にアルブミンの分泌はシート上の培養開始第２日目より顕著に見られた（図１４）。
この実験においても、コラーゲンシート上で培養した小型肝細胞コロニーはコラーゲン被覆培養皿上で培養した小型肝細胞コロニーに比較して顕著に成熟化が起こることが示された。
実施例５．小型肝細胞から誘導された肝組織の移植
実施例４に記載したように、コラーゲンシート上で小型肝細胞を１４日間培養して形成された小型肝細胞コロニー由来の肝組織をシートごと無アルブミンラットに移植した。
麻酔下にラットの腹部を切開し、肝臓を露出させその約２／３を切除した。残存肝にシート上で形成された肝組織をシートごと培養液面、すなわちコロニー側を臓器側にして載せ、手術用ホッチキスでシートを固定し、切開部を縫合した。また、ラットにはＦＫ５０６等の免疫抑制剤を投与した。
実施例６．小型肝細胞を用いた、化合物の肝薬物代謝酵素誘導能の測定
実施例２で調整された小型肝細胞コロニーを約２００〜２５０コロニー／ｃｍ２になるようにコロニーごと培養皿（直径６０ｍｍのディッシュ）に入れた。
培養液（１）（ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ、１０ｍＭニコチンアミド、１ｍＭアスコルビン酸２−リン酸、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１０−７Ｍデキサメタゾン、０．５μｇ／ｍｌインスリン、ペニシリン、ストレプトマイシン）にて１２〜２４時間培養後、血清フリーの培養液（２）（ＤＭＥＭ、１０ｍＭニコチンアミド、１ｍＭアスコルビン酸２−リン酸、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１０−７Ｍデキサメタゾン、０．５μｇ／ｍｌインスリン、ペニシリン、ストレプトマイシン、１％ＤＭＳＯ）に換えた。一日おきに培養液を交換しながら、更に１０日間培養した後、培養液で５００μｇ／ｍｌに希釈したＭａｔｒｉｇｅｌを細胞の上に載せた。Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加４８時間後培養液を交換し、ＤＭＳＯフリーの培養液（２）で更に４日間培養を続けた。Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加後６日目に下記の表３〜６に記載した薬剤を同表に示した濃度で投与し、薬剤添加２４時間後に細胞を回収した。
エタノールはアルコール代謝に関与する薬物であり、クローフィブレートは抗高脂血症剤であり、フェノバルビタールは精神安定剤であり肝発癌プロモーター作用を有することが知られており、プレグネノンはステロイドホルモンの一種で女性黄体ホルモンであるプログステロンの前駆体である。
タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ウエスタンブロッティング法により目的蛋白質を膜上に発色させた。ブロット上のバンドの濃さをデンシトメーターにより数値化した。
使用した一次抗体は、ヤギ抗−ＣＹＰ２Ｂ１抗体（３００倍希釈）、ヤギ抗−ＣＹＰ３Ａ２抗体（３００倍希釈）、ヤギ抗−ＣＹＰ２Ｅ１抗体（１０００倍希釈）およびヤギ抗−ＣＹＰ４Ａ１抗体（１０００倍希釈）（何れも第一化学薬品から購入）である。また２次抗体はＤＡＫＯ社より購入したＨＲＰ−結合抗−ヤギ／ヒツジＩｇ（５０００倍希釈）。発色用基質はＰｉｅｒｃｅ社より購入したＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ（化学発光）を使用した。
表３〜６は、成熟肝細胞における酵素の活性を１００％とした各酵素の相対活性を種々の薬剤のそれらの酵素の誘導能として示したものである。プレグネノロンは０．５％エタノールを含む溶液として、クローフィブレートは０．５％ＤＭＳＯを含む溶液として使用した。
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本発明により、移植可能な肝組織の調製に適した小型肝細胞集塊を調製すること、およびその小型肝細胞集塊からの肝組織への成熟化誘導が簡便に行なえるようになる。特に生体吸収性シート上で本発明の小型肝細胞高含有コロニーから形成された肝組織はシートごと生体肝への移植が可能であるため、本発明により、損傷を受けた肝臓の修復を容易に行なうことができる。更に、本発明により、特定の薬剤に応答した代謝酵素の誘導において、成熟肝臓組織に非常に近い機能を有する細胞塊を得ることができる。従って本発明により、動物実験を行うことなく特定の機能を有する薬剤のスクリーニングや薬剤の作用を推定することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、コロニーを剥離して新しい培地に移した後に接着しているコロニー数を位相差顕微鏡で観察した結果である。コロニーの同定は、培養皿に目印をつけて、それを指標に行なった。６つの培養皿から得られたデータの平均値と標準偏差を示した。
図２は、コロニーを構成する細胞数を示すグラフである。肝細胞マーカーであるサイトケラチン８で免疫染色した細胞数を顕微鏡下で数えた結果を示したものである。１回の実験に３枚の培養皿を使用し、２回の実験から得られたデータの平均と標準偏差を示した。
図３は、ＭａｔｒｉｇｅｌによるＣ／ＥＢＰαタンパク質の誘導を示したものである。ＭＨ：成熟肝細胞、０（日）：処理開始前、Ｃ：対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図４は、ＭａｔｒｉｇｅｌによるＣ／ＥＢＰβタンパク質の誘導を示したものである。ＭＨ：成熟肝細胞、０（日）：処理開始前、Ｃ：対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図５は、ＭａｔｒｉｇｅｌによるＨＮＦ４αタンパク質の誘導を示したものである。ＭＨ：成熟肝細胞、０（日）：処理開始前、Ｃ：対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図６は、ＭａｔｒｉｇｅｌによるＨＮＦ６タンパク質の誘導を示したものである。ＭＨ：成熟肝細胞、０（日）：処理開始前、Ｃ：対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図７は、培養液中に分泌されるアルブミン量を示したものである。Ｎ：正常ラット血清または血漿、Ｃ：対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図８は、培養液中に分泌されるトランスフェリン量を示したものである。Ｎ：正常ラット血清または血漿、Ｃ：対照（Ｍａｔｐｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図９は、培養液中に分泌されるα１−アンチトリプシン量を示したものである。Ｎ：正常ラット血清または血漿、Ｃ：対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図１０は、培養液中に分泌されるフィブリノーゲン量を示したものである。Ｎ：正常ラット血清または血漿、Ｃ：対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図１１は、培養液中に分泌されるアルブミン量の経時変化を示したものである。コロニーを分離・播種後１１日間培養し、１１日目にＭａｔｒｉｇｅｌ（５００μｇ／ｍｌ）を２日間添加した場合と添加しない場合の小型肝細胞のアルブミン分泌量を比較した。
図１２は、トリプトファンジオキシゲナーゼタンパク質の発現誘導を示したものである。ＭＨ：成熟肝細胞、０日：処理開始前、Ｃ：対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図１３は、セリンデヒドラターゼタンパク質の発現誘導を示したものである。ＭＨ：成熟肝細胞、０日：処理開始前、Ｃ：対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ無添加）、Ｍ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ添加（５００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ意味する。
図１４は、シート上で培養された小型肝細胞が分泌するアルブミン量の経時変化を示したものである。■：シート上の培養、◆：コラーゲン被覆培養皿上の培養（対照）。
図１５は、シート上で培養された小型肝細胞によって培養液中に分泌されるトランスフェリン量を示したものである。Ｎ：正常ラット血清または血漿、Ｃ：対照（コラーゲン被覆培養皿上の培養）、Ｓ：コラーゲンシート上の培養をそれぞれ意味する。
図１６は、シート上で培養された小型肝細胞によって培養液中に分泌されるハプトグロブリン量を示したものである。Ｎ：正常ラット血清または血漿、Ｃ：対照（コラーゲン被覆培養皿上の培養）、Ｓ：コラーゲンシート上の培養をそれぞれ意味する。
図１７は、シート上で培養された小型肝細胞によって培養液中に分泌されるフィブリノーゲン量を示したものである。Ｎ：正常ラット血清または血漿、Ｃ：対照（コラーゲン被覆培養皿上の培養）、Ｓ：コラーゲンシート上の培養をそれぞれ意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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