(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼで卵黄を処理し、分画分子量２００００以下とした、またはリパーゼで卵黄を処理し、分画分子量１００００以下とした、卵黄由来のシアル酸含有ウイルス性下痢用治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はシアル酸及びシアル酸誘導体含有組成物を添加することを特徴とする下痢治療用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルス性の下痢症は、ヒト及び家畜において頻繁に起こる疾病のひとつであり、特に哺乳期において脱水症などと合併症を引き起こす深刻な症状である。その原因とされるウイルスとしてアデノウイルス、アストロウイルス、カリシウイルス、ロタウイルスなどが知られているが、多くのものはロタウイルスに起因するものであることがわかっている。
【０００３】
下痢症は、家畜やヒトの哺乳期において感染率が高く発展途上国においては医療技術の不備や低栄養状態のため年間数百万人以上の子供が死亡していると言われている。
このウイルス性下痢症に対して弱毒性ウイルスを用いたワクチンの研究開発もなされてきているが、いまだ有効なワクチン開発の成功には至っていない。
また、シアル酸及びシアル酸誘導体含有組成物の生物学的機能はインフルエンザウイルスによる赤血球凝集反応、去痰効果（特開昭６１ー６８４１８）、感染防御剤（特開昭６３ー２８４１３３）などが報告されている。
しかしながら、シアル酸及びシアル酸誘導体含有組成物が、ウイルス性下痢抑制作用に関して優れた抑制作用を有していることはいまだ知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ウイルス性の下痢症は、ヒト及び家畜において頻繁に起き、多大な被害を及ぼしている。ウイルス性の下痢症の治療薬として現在のところ有効なワクチンがなく、ワクチンでは解決できない。
本発明は、ウイルス性の下痢症に対して有効なウイルス性下痢治療用組成物に関する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前述の課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、シアル酸及びシアル酸誘導体含有組成物を含有して成るウイルス性下痢治療用組成物を確立するに至った。
即ち、シアル酸及びシアル酸誘導体含有組成物より成る群から選択される１種または２種以上を含有して成るウイルス性下痢治療用組成物に関する。
【０００６】
以下に本発明を詳述する。
本発明のシアル酸誘導体含有組成物とは、シアル酸結合タンパク、シアル酸結合オリゴ糖、シアル酸結合脂質及びシアル酸塩から選ばれる１種または２種以上の化合物を含むものすべてを指す。
【０００７】
シアル酸及びシアル酸誘導体含有組成物の製造方法は、合成法、天然抽出法（原料：鶏卵、大腸菌から得られるコロミン酸、乳原料等）等が挙げられるが、いずれの方法を用いてもよく、好ましくは、その原料の安価な点及び供給量の安定性の点から鶏卵を用いる天然抽出方法が望ましい。
【０００８】
鶏卵から得られるシアル酸及びシアル酸誘導体含有組成物の純度は精製の度合いにより自由にコントロールできるので用法、用途、剤状、その他目的に応じて精製すればよい。
以下に実施例を示し本発明をさらに詳細に説明する。
【０００９】
【実施例】
実施例１．シアル酸
カラザ４０kgを水３００リットルに懸濁させ、次いで６Ｎ硫酸を加えpH 1.4 に調整、８０℃で６０分間ゆるく撹拌しながら酸加水分解を行った後、飽和水酸化バリウム溶液を加え、pH 5.0に調整した。これを加圧濾過機にて、不溶物を除去し、減圧濃縮しシアル酸2.7 kgを得た。TBA 法でシアル酸含量を測定したところ 41.4 ％であった。
【００１０】
実施例２．高純度シアル酸
脱脂卵黄 100 kg を水 600リットルに懸濁しホモミキサーでよく撹拌後、４Ｎ塩酸を加えpH1.4 に調整、９０℃で６０分間ゆるく撹拌しながら酸加水分解を行った後、３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加え、pH 5.0に調整した。これを加圧濾過機にて、濾液を得た。得られた濾液は、ダウエックス 50W×２（Ｈ型, ５リットル）を充填したカラムに通液し、さらにダウエックス１×８（ギ酸型, ５リットル）を充填したカラムにシアル酸を吸着させた。その後、水1000リットルで夾雑物を洗浄した。０〜２Ｎのギ酸を溶出液に用い、シアル酸をグラジェント溶出した。さらに、この乾固物を水500mlに溶解させ凍結乾燥を行いシアル酸125gを得た。シアル酸の純度をTBA 法で測定したところ98.6％であった。
【００１１】
実施例３．シアリルオリゴ糖
卵黄粉末（サノボ社製）３トンにエタノール８トン添加しよく撹拌後スクリューデカンターにて固形分側に脱脂卵黄１トンを得た。脱脂卵黄１トンに水５トン加え、ホモミキサーにて、撹拌しながら５０℃まで加温した。均一に分散させた後、プロテアーゼ B（天野製薬社製）５kgを添加し８時間酵素反応を行った。酵素反応液を９０℃まで加熱し酵素失活させた後、フィルタープレスにより不溶物を取り除いた。
濾液５トンを分画分子量20,000の膜（日東電工社製）により限外濾過を行い、シアル酸の発色分析法であるレゾルシノール法にて確認をしながら、シアル酸含有組成物の９０％以上を回収し、限外濾過の操作を終了させた。
限外濾過で得た透過液５トンを脱塩処理するため、陽イオン樹脂（ダウエックス50W×８）５００リットルで処理しよく撹拌後、陽イオン樹脂および陽イオン脂に吸着されたペプチドと塩を除いた。
脱塩処理した液６トンを減圧濃縮装置で蒸発乾固させ、シアル酸含有組成物３００kg得た。シアル酸含有組成物の分析を行ったところ。遊離シアル酸として7.5％ペプチドとして２５％、オリゴ糖として７３％であった。
【００１２】
実施例４
卵黄１トンに水５トン加え、ホモミキサーにて、撹拌しながら６０℃まで加温した。均一に分散させた後、リパーゼ（上田化学社製）８kgを添加し１６時間酵素反応を行った。酵素反応液は８５℃まで加熱し酵素を失活させた後、スクリューデカンターにより不溶物を取り除いた。
濾液５トンを分画分子量１0,000の膜（三井東圧化学製）により限外濾過を行い、シアル酸の発色分析法であるレゾルシノール法にて確認をしながら、シアル酸含有組成物の９０％以上を回収し、限外濾過の操作を終了させた。
【００１３】
限外濾過で得た透過液５トンを脱塩処理するため、ＲＯ膜濃縮装置にて濃縮脱塩を行った。さらに、陽イオン樹脂（ダイヤイオン SK 1B）５００リットルを詰めたカラムに通液し陽イオン樹脂に吸着したペプチドと塩を除いた。
カラム処理した液７トンを減圧濃縮装置で蒸発乾固させ、シアル酸含有組成物２２０Kg得た。シアル酸含有組成物の分析を行ったところ。遊離シアル酸として１２％、ペプチドとして１５％であった。
【００１４】
以上のように本発明品であるシアル酸及びシアル酸誘導体含有組成物が得られた。
その使用形態としては、特に限定されるものではないが同組成物を含む錠剤、顆粒剤、経口輸液への添加の可能であり、腸溶性のカプセルの形態も考えられる。ウイルス性下痢症は乳児のみでなく牛、ブタ、馬といった家畜においてもその被害は深刻であり、したがって、ヒト以外の家畜用飼料あるいは飲料への添加も考えられる。
以下に試験例を示す。
【００１５】
試験例
MA104 細胞を試験管内にて単層となるまで培養後、 M.O.I=0.05 の多重度でヒトロタウイルス(MO 株）を３７℃、１時間吸着させ感染させた。１時間後MEM 培地にて洗浄後実施例１、２、３、４で得られたそれぞれ 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 mg/ml の濃度のサンプルを、コントロールとして生理食塩水を添加し、３７℃、３日間回転培養した。
得られた培養上清を蛍光抗体法により、ロタウイルスの力価を求めサンプル無添加に対する増殖抑制活性を調べた。その結果、図１からも明らかなようにいずれの試験区においても劇的な効果を示すとともに特に実施例２、３、４、で得られたサンプルが強い活性を示した。
【００１６】
試験例２
実施例１、２、３、４で得たサンプルをそれぞれ 1.0, 5.0 mg/ mlに溶解した溶液を調製した。それらを生後５日齢のｄｄｙマウスに 50 μｌずつ経口投与した。サンプル投与１時間後同マウスにロタウイルス４×１０７FCFU/ml を含む培養上清液 50 mlずつ与え経口感染させた。その後５日間下痢発生の有無を観察した。その結果を図２に示した。
【００１７】
図２から明らかなように、実施例１、２、３、４で得たサンプルいずれの群でも著しい下痢予防効果が認められ、特に、実施例２、３、４で得たサンプルでは、その効果が高いことが明かとなった。
また、対照として、ロタウイルスの経口感染のみの群、それぞれのサンプルのみの群、ならびに水のみを与えた群を試験したところ、ロタウイルスの経口感染のみの群だけが１００％下痢発生が見られ、それぞれのサンプルのみの群、ならびに水のみを与えた群では、下痢発生が見られなかった。
【００１８】
【発明の効果】
本発明は、ウイルス性下痢症に対して、効果的な治療剤を提供するものである。これまで、効果的な治療薬がなく、ウイルス性下痢症に乳幼児の過半数が疾患し症状がひどい場合には、死亡も確認されることもあった。特に、開発途上国においては、その衛生事情から深刻な問題であった。
本発明は上記の問題点を解決し、産業上多大なる貢献をする発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ロタウイルス増殖抑制効果の図である。
【図２】乳飲み子マウスに対する下痢症予防効果の図である。
【図１】
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【図２】
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