(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属に属する放線菌菌体又はその産生した酵素を含有する溶液中に、１α及び２５位に水素原子を有するビタミンＤ２、または１α及び２５位に水素原子を有するビタミンＤ３を加えて、その１α位の水素原子を水酸基に置換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ２、または１α−ヒドロキシビタミンＤ３の製造方法。
【請求項２】
ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属放線菌が、ノカルディオイデス・アルブスＡ１３−２（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ａｌｂｕｓ  Ａ１３−２  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１８３）であることを特徴とする請求項１に記載の１α−ヒドロキシビタミンＤ２、または１α−ヒドロキシビタミンＤ３の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、微生物を利用したヒドロキシビタミンＤ類の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
有機化学的方法によるビタミンＤ類の１α位の直接的水酸化は、極めて困難とされており、文献上ではニワトリなどの動物の腎のホモジネートを用いる方法や、ミトコンドリア画分を用いる方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２３０巻、第２２８頁（１９７１年）。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２４７巻、第７５２８頁（１９７２年）。バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第５５１２頁（１９８６年）など］、並びに微生物を用いる方法［特開平２−２３１０８９、特開平４−１６６０９０、特開平４−３５６１９０、特公平４−６４７８］等により、原料のビタミンＤ類の１α位に水酸基を導入できることが知られている。
【０００３】
しかしながら、上記の１α位水酸化に関する報告は、いずれも２５位に水酸基を有する２５−ヒドロキシビタミンＤ類を１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ類に変換するものであり、２５位が水酸基ではなく水素原子を有する場合のビタミンＤ類の１α位を直接水酸化することは、動植物を用いた酵素化学的方法、微生物を用いた変換法などについて、その成功例は未だ報告されていない。一方、１α−ヒドロキシビミンＤ３は、慢性腎不全、骨粗鬆症などに使用される医薬品であり、その製造は現在では有機化学的手法により複雑なステップを経て合成されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
有機化学的方法による１α−ヒドロキシビタミンＤ類の合成は複雑であり、調製に困難をきたしている。本発明は、微生物を用い、より簡便な操作による１α−ヒドロキシビタミンＤ類の新規な製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明において使用される微生物は放線菌に属し、新規にビタミンＤ類の１α位の水素原子を直接水酸基に変換する能力を有する菌株であって、その具体例としては、沖縄県西表島および長野県長谷村の土壌より新たに分離した特定の微生物を利用することにより、ビタミンＤ類の１α位に直接水酸基を導入できることを見いだし、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、ビタミンＤ類を水酸化するノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属に属する放線菌菌体、若しくはそれらの産出する酵素を含有する溶液中に、１α位に水素原子を有するビタミンＤ類を加えて、その水素原子を水酸基に変換することを特徴とする１α−ヒドロキシビタミンＤ類の製造法である。即ち本発明に依れば、１α位に水素原子を有するビタミンＤ類は、その水素原子が水酸基に変換される。
【０００７】
本発明の製造方法は、ビタミンＤ類の１α位に直接１工程で水酸基を導入する方法であり、側鎖部分にはいずれの置換基を有していてもよい。従って、本発明においてビタミンＤ類とは、ビタミンＤ２、Ｄ３系の化合物であり、１αおよび２５位に水素原子を有するものである。側鎖の水素原子または水酸基が弗素などのハロゲン原子、低級アルキル基などで置換されていてもよい。
【０００８】
本発明に関与する菌株は次の菌学的性質を有する。
Ａ．ノカルディオイデス・アルブスＡ１３−２について
１）形態
栄養菌糸は合成寒天培地および天然寒天培地においてよく発達し、不規則的に分岐する。気菌糸の形成が観察されることもあるが、天然寒天培地では気菌糸は形成しにくい。寒天培地上における培養後期に、コロニーは軟化する。菌糸は稀に分断が見られ、直径０．３〜０．４μｍである。胞子形成、運動性は認められない。
２）培地上での生育状態
各種培地で３０℃、７日間培養したときの肉眼的観測結果を第１表に示す。
３）生理的性質
（１）生育温度範囲
各種天然培地上において２０〜４０℃の範囲で良好に生育する。なお５℃以下および５０℃以上の温度範囲では生育しない。
（２）生化学的性質
ａ）好気性、嫌気性の区別        好気性
ｂ）ゼラチンの液化              陰    性
ｃ）脱脂乳の凝固                陰    性
ｄ）脱脂乳のペプトン化          陽    性
ｅ）スターチの加水分解          陽    性
ｆ）メラニン様色素生成          陽    性
ｇ）硝酸還元能                  陰    性
ｈ）抗酸性                      非抗酸性
（３）炭素源の利用性
プリドハム・ゴドリーブ寒天培地により検討した結果、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、マンニトールを利用し、Ｄ−キシロース、シュクロースをわずかに利用し、イノシトール、ラフィノースは利用しない。
【０００９】
以上の菌学的性質から、本菌株が放線菌に属することは明白であり、バージー著「マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー」第２巻、日本放線菌学会編「放線菌の同定実験法」に報告されている既知菌種と上記性状を比較した結果、本菌株をノカルディオイデス・アルブスと同定し、しかも公知の菌とは相違することから新菌株と判断し、ノカルディオイデス・アルブス  Ａ１３−２（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ａｌｂｕｓ  Ａ１３−２）と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１８３として寄託した。
【００１２】
本発明の方法は、放線菌の菌体またはその生産する酵素を含む溶液中で、基質ビタミンＤ類を好気的条件下で反応させることによって行うものである。
【００１３】
反応に必要な放線菌の菌体を得るためには、好気的条件下で本菌の培養を培地中で行う。培地は主として液体培地を用い、炭素源としてグルコース、マルトース、シュクロース、スターチ、アラビノースなどを単独または混合して用いる。窒素源としては、ポリペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーおよびソイビーンミールなどを単独または混合して用いる。その他、本菌株の生育を助け、１α−ヒドロキシビタミンＤ類の生産を促進する有機物および無機物を必要により添加することが出来る。培養方法は振盪培養、通気撹拌培養などの好気培養が適しており、ｐＨ６〜８で２〜８日間培養する。
【００１４】
この培養により得られた菌体を含有する溶液を１α−ヒドロキシビタミンＤ類を生産する反応に用いる。即ち、培養中の菌体を含む培養液をそのまま用いるか、培養終了後遠心分離または濾過により分離した菌体を懸濁した溶液を用いる。また培養後に得られた菌体を破砕後、遠心分離などにより菌体を除いた溶液を用いることもできる。更にまた菌体は、κ−カラギーナンなどの多糖類などの各種固定化剤を用いて固定化してから溶液に添加してもよい。また、前記菌体の凍結乾燥したものを上記と同様に用いることも出来る。
【００１５】
本発明において用いられる反応液は、前記培地を用いて培養した培養液であるか、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリウム−コハク酸、コハク酸カリウム−コハク酸、クエン酸ナトリウム−クエン酸、リン酸塩（カリウム塩、ナトリウム塩など）、カコジル酸ナトリウム−塩酸、イミダゾール−塩酸、ホウ酸−ホウ砂などの緩衝液を単独または混合したものである。その他、溶液には目的のビタミン類の生産を促進する界面活性剤、有機物および無機物を必要により添加することが出来る。
【００１６】
本発明は、前記菌体を含有する溶液中に基質となるビタミンＤ類を適量添加し、振盪操作、通気撹拌操作など好気的条件下で行うことが適しており、ｐＨ６〜９、２０〜４０℃に保持しつつ、およそ２４〜９６時間を要する。培養中の菌体を含む培養液を用いる場合は、基質ビタミンＤ類を添加後、更に同条件下で２４〜９６時間振盪して本反応を行う。
【００１７】
以上の反応により製造された１α−ヒドロキシビタミンＤ類の単離は、反応液を有機溶媒により抽出して濃縮乾固し、これをアセトンなど適当な溶媒に再溶解し、不溶物を遠心分離または濾過などにより除いた後、シリカゲル順層カラム（例えばゾルバックスＳＩＬ：米国デュポン社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーまたはシリカゲル逆層カラム（例えばバイオシルＣ１８：米国バイオラッド社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーに付すことにより目的のヒドロキシビタミン類を単離することができる。
【００１８】
またセファデックスＬＨ−２０（スウェーデン：ファルマシア社製）などを用いたゲル濾過クロマトグラフィーやローバーカラム（スイス：メルク社製）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーなどによっても目的のヒドロキシビタミン類を単離することができる。
【００１９】
【発明の効果】
本発明の方法により、ビタミンＤ類の１α位へ直接水酸基を導入することが可能になった。即ち、本発明の微生物を用いる方法では、反応溶液などの調製に手間がかからず、しかも１段階で短時間に行うことが出来る。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コーンスチーブリカー０．５％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７の液体培地５ｍｌを直径２４ｍｍの試験管に入れ、１２０℃、２０分間加圧殺菌した。これにノカルディオイデス・アルブス  Ａ１３−２を１白金耳移植し、３０℃で２日間振盪培養した。これに１ｍｇのビタミンＤ３を２００μｌのエタノールに溶解したものと、１０ｍｇのβ−シクロデキストリンを１ｍｌの水に溶解したものを加え、さらに３０℃で２日間振盪しつつ反応させた。反応後の培養液に等量のメタノールおよびジクロロメタンを加え、撹拌後遠心分離によりジクロロメタン層を回収した。これを窒素気流下で濃縮乾固後、ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝２２：３の混合溶媒に溶解し、不溶物を濾別後、ゾルバックスＳＩＬ高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶離液：ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝９２：８
カラムサイズ：φ４．６ｍｍｘ２５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間７分付近のピーク画分を集めて濃縮し、次にバイオシルＣ１８高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶離液：メタノール：水＝９０：１０
カラムサイズ：φ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間１０．５分付近のピーク画分を集め、減圧濃縮した。これにより、精製１α−ヒドロキシビタミンＤ３０．５μｇを得た。このものは市販の１α−ヒドロキシビタミンＤ３（和光純薬工業（株）製）の標品と各種高速液体クロマトグラフィー（ゾルバックスＳＩＬ、バイオシルＣ１８）の保持時間、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致した。
極大紫外部吸収：λｍａｘ＝２６５ｎｍ（エタノール）
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４００（Ｍ＋），３８２（Ｍ＋−Ｈ２０），３６４，２８７，１９７，１７４，１５２，１３４，１０５，９５
【００２２】
実施例２
グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コーンスチーブリカー０．５％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７の液体培地５ｍｌを直径２４ｍｍの試験管に入れ、１２０℃、２０分間加圧殺菌した。ノカルディオイデス・アルブス  Ａ１３−２を１白金耳移植し、３０℃で２日間振盪培養した。これに１ｍｇのビタミンＤ２を２００μｌのエタノールに溶解したものと、１０ｍｇのβ−シクロデキストリンを１ｍｌの水に溶解したものを加え、さらに３０℃で２日間振盪しつつ反応させた。反応後の培養液に等量のメタノールおよびジクロロメタンを加え、撹拌後遠心分離によりジクロロメタン層を回収した。これを窒素気流下で濃縮乾固後、ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝２２：３の混合溶媒に溶解し、不溶物を濾別後、ゾルバックスＳＩＬ高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶離液：ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝９２：８
カラムサイズ：φ４．６ｍｍｘ２５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間７分付近のピーク画分を集めて減圧濃縮し、次にバイオシルＣ１８高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶離液：メタノール：水＝９０：１０
カラムサイズ：φ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間１０．０分付近のピーク画分を集め、減圧濃縮した。これにより、精製１α−ヒドロキシビタミンＤ２０．９μｇを得た。これはビタミンＤ類に共通する紫外部吸収パターンを示し、マススペクトル開裂パターンより、１α−ヒドロキシビタミンＤ２と同定した。
極大紫外部吸収：λｍａｘ２６５ｎｍ（エタノール）
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）  ４１２（Ｍ＋），３９４（Ｍ＋−Ｈ２０），３７６，２８７，１５２，１３４
【００２３】
実施例３
グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コーンスチーブリカー０．５％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７の液体倍地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加圧殺菌した。これにノカルディオイデス・アルブス  Ａ１３−２を１白金耳移植し、３０℃で３日間撹拌培養した。遠心分離で菌体を回収し、この菌体を、５倍量の１５ｍＭトリス−酢酸、２５ｍＭコハク酸ナトリウムおよび２ｍＭ酢酸マグネシウムからなるｐＨ７．４の緩衝液に懸濁し、この５ｍｌを直径２４ｍｍの試験管に入れた。これに１ｍｇのビタミンＤ３を２００μｌのエタノールに溶解したものと、１０ｍｇのβ−シクロデキストリンを１ｍｌの水に溶解したものを加え、さらに３０℃で２日間振盪しつつ反応させた。反応後の培養液に等量のメタノールおよびジクロロメタンを加え、撹拌後遠心分離によりジクロロメタン層を回収した。これを窒素気流下で濃縮乾固後、ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝２２：３の混合溶媒に溶解し、不溶物を濾別後、ゾルバックスＳＩＬ高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶離液：ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝９２：８
カラムサイズ：φ４．６ｍｍｘ２５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間７分付近のピーク画分を集めて濃縮し、次にバイオシルＣ１８高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶離液：メタノール：水＝９０：１０
カラムサイズ：φ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間１０．５分付近のピーク画分を集め、減圧濃縮した。この結果、精製１α−ヒドロキシビタミンＤ３０．５μｇを得た。このものは実施例１で示した精製物と全く同じ紫外部吸収パターンを示し、またマススペクトル開裂パターンも同じであったことから、１α−ヒドロキシビタミンＤ３と同定した。
【００２５】
実施例５
グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コーンスチーブリカー０．５％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７の液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加圧殺菌後、この培地２０本にノカルディオイデス・アルブス  Ａ１３−２を１白金耳移植し、３０℃で２日間撹拌培養した。この培養液を内容量３０Ｌの培養ジャーを用いて、同培地１５Ｌに移植し、３０℃で２日間通気撹拌培養した。この培養液に１．５ｇのビタミンＤ３を１０ｍｌのエタノールに溶解したものと、１５ｇのβ−シクロデキストリンを１００ｍｌの水に溶解したものを加え、さらに３０℃で２日間通気撹拌を続けた。反応後の培養液を集めて濾過し、菌体は５Ｌのアセトンに懸濁し濾過した。培養濾液は、等量のメタノールおよびジクロロメタンを加え、撹拌後ジクロロメタン層を回収し、減圧下で濃縮乾固した。これに５Ｌのアセトンを加えて溶解し、不溶物は濾別した。濾液を減圧下で濃縮乾固後、ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝２２：３の混合溶媒に再溶解し、不溶物を濾別後、ワコーゲルＣ−２００（和光純薬工業（株）製）カラムクロマトグラフィーに供した。
溶出溶媒：ジクロロメタン（１Ｌ）溶出後、ジクロロメタン：酢酸エチル＝８：２（１Ｌ）で溶出
カラムサイズ：２００ｍｌ
ジクロロメタン：酢酸エチル＝８：２（１Ｌ）溶出分を減圧下で濃縮乾固後、ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝２２：３の混合溶媒に再溶解し、ゾルバックスＳＩＬ高速液体クロマトグラフィーに数回に分けて供した。
溶離液：ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝９２：８
カラムサイズ：φ４．６ｍｍｘ２５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間７分付近のピーク画分を集めて減圧濃縮し、次にバイオシルＣ１８高速液体クロマトグラフィーに供した。
溶離液：メタノール：水＝９０：１０
カラムサイズ：φ４．６ｍｍｘ１５ｃｍ
溶出速度：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：フォトダイオードアレイ検出器ウォーターズ９９１Ｊ（日本ミリポアリミテッド社製）
溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンを示す溶出時間１０．５分付近のピーク画分を集め、減圧濃縮した。この結果、精製１α−ヒドロキシビタミンＤ２．０ｍを得た。これはビタミンＤ類に共通する紫外部吸収パターンを示し、マススペクトル開裂パターンおよびプロトンＮＭＲスペクトル分析により、１α−ヒドロキシビタミンＤ３と同定した。
【図面の簡単な説明】
【図１】１α−ヒドロキシビタミンＤ３のプロトンＮＭＲスペクトル
【図２】本実施例により得られた、精製１α−ヒドロキシビタミンＤ３のプロトンＮＭＲスペクトル
【表１】0003735393.tif 000002
【表２】0003735393.tif 000003
【図１】
0003735393.tif 000004
【図２】
0003735393.tif 000005