(57)【要約】１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質を、植物と接触させることを含む、植物に耐ストレス性を付与する新規方法及び新規の植物用耐ストレス性付与剤を開示する。
2002005624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を、植物と接触させることを特徴とする、植物に耐ストレス性を付与する方法。
【請求項２】
１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を、植物と接触させることを特徴とする、植物体内において適合溶質を誘導する方法。
【請求項３】
１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする、植物用耐ストレス性付与剤。
【請求項４】
１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする、植物用適合溶質誘導剤。
【請求項５】
１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種と、担体又は希釈剤とを含有することを特徴とする、植物に耐ストレス性を付与するための組成物。
【請求項６】
１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種と、担体又は希釈剤とを含有することを特徴とする、植物に適合溶質を誘導するための組成物。
【請求項７】
１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種の、植物用耐ストレス性付与剤としての使用。
【請求項８】
１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種の、植物用適合溶質誘導剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物への耐ストレス性付与方法、植物用耐ストレス性付与剤、植物に耐ストレス性を付与するための新規組成物、及び植物用耐ストレス性付与剤における新規使用に関する。
背景技術
グリシンベタイン［ｇｌｙｃｉｎｅｂｅｔａｉｎｅ；（ＣＨ３）３Ｎ＋ＣＨ２ＣＯＯ−］は、例えば、浸透圧（塩又は乾燥）又は低温等のストレス状態に応答して植物内で形成される適合溶質（ｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として、オオムギにおいて非常に重要な成分である（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４，３５７−３８４，１９９３）。グリシンベタイン合成系の誘導は、高濃度の塩（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３１，７９７−８０３，１９９０）、乾燥及び水分不足（Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．，２２，４７−５４，１９８２）、並びに低温ストレス（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．，１７，８９−９５，１９９４）によって生じることが知られている。現在の研究においては、培地中のイオン状態と、誘導過程との相互作用に注意が向けられており、前記の刺激に代わる多くの誘導性化合物が見出されている。
グリシンベタインはコリンから合成される。大腸菌のような細菌はコリンを合成することができないが、環境から有効にコリンを摂取することができる。大腸菌においては、ｂｅｔＡ遺伝子によりコードされている膜結合型コリンデヒドロゲナーゼが、コリンをベタインアルデヒドに、更に、ほぼ同じ速度で、このアルデヒドをグリシンベタインに酸化する。或る細菌（例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）では、酵素コリンオキシダーゼが、一段階でコリンをグリシンベタインに変換する（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１２、１３３−１４２，１９９７）。
高等植物では、グリシンベタインは、中間物質としてベタインアルデヒドを経由する２段階で合成される。双子葉植物（例えば、ホウレンソウ）では、葉緑体に局在する興味深い酵素であるコリンモノオキシゲナーゼにより、第１の工程が行なわれる。コリンモノオキシゲナーゼは、フェレドキシン［すなわち、ＰＳＩ（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉ）］由来の電子を使用し、酸化を促進する（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９０，３２２−３２９，１９８９）。穀類においては、第１工程に関与する酵素及びその遺伝子はまだ発見されていない。
第２工程の酵素については、双子葉植物では、葉緑体のベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）がこれを行なうことがわかっている。また、オオムギでは、第２工程の酵素として、ペルオキシゾーム型ともう１つのアイソザイム（サイトゾル型）があることが知られているが、そのどちらがグリシンベタイン合成に関与するかは明らかにされていない。
オオムギでは、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼが単離されており、ＮａＣｌストレスにより高レベルにまで誘導されることが、ノーザンブロット解析により示されている（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７，３０７−３１５，１９９５）。２つのＢＡＤＨ遺伝子が発見されており、その遺伝子産物の１つは、塩ストレスにより発現が増加し、おそらくは細胞質に局在する（Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，ＩＶ，３０３１−３０３４，１９９８）。もう一方のＢＡＤＨは、ペルオキシゾーム内に存在している（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１１，１１１５−１１２０，１９９７）。しかしながら、穀類では、コリンを酸化する酵素も、ホウレンソウのコリンモノオキシゲナーゼに相当するｃＤＮＡも、まだ発見されていない。
最初に述べたように、種々のストレスによりグリシンベタインの合成が誘導されることが知られている一方、グリシンベタインの蓄積が植物に耐ストレス性を付与することも知られている。
例えば、イネでは、本来、グリシンベタインの蓄積はみられないが、外部からグリシンベタインを与えると、根から吸収され、オオムギと同程度のグリシンベタインが植物内に蓄積され、その結果として種々の耐ストレス性が向上することが知られている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０（２），３６６−３６８，１９９６）。
また、オオムギのＢＡＤＨ遺伝子をイネに導入したトランスジェニックイネでは、グリシンベタインの蓄積が新たに認められるだけでなく、耐塩性、耐低温性、及び耐高温性が向上することが知られており、強光下ではストレスからの保護が顕著であることも知られている（Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２３，１０７−１１４，２０００）。
更に、一般的に植物のタンパク質にダメージを与えるようなストレスを与えると、グリシンベタインは、あたかもシャペロンのように機能することが知られている（Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３９，４２５−４３２，１９９８）。
なお、耐乾燥性は、耐塩性と共に水分ストレス（Ｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ）とされており、グリシンベタインは耐乾燥性も付与すると考えられている。
また、イネ、シバ、又はトマト等の多くの植物では、プロリンが植物内に蓄積すると、種々の耐ストレス性が向上することが知られている。
本発明者は、グリシンベタインやプロリンなどの適合溶質を誘導させることによって植物に耐ストレス性を付与することを目的に、適合溶質誘導物質を鋭意探索したところ、複数の特定の物質がこのような活性を有することを新たに見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。
従って、本発明の課題は、植物に耐ストレス性を付与する新規方法、新規の植物用耐ストレス性付与剤、植物に耐ストレス性を付与するための新規組成物、及び植物用耐ストレス性付与剤における新規使用を提供することにある。
発明の開示
前記課題は、本発明による、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質（以下、適合溶質誘導物質と称する）少なくとも１種を、植物と接触させることを特徴とする、植物に耐ストレス性を付与する方法により解決することができる。
また、本発明は、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を、植物と接触させることを特徴とする、植物体内において適合溶質を誘導する方法に関する。
本発明における好ましい適合溶質誘導方法であるグリシンベタイン誘導方法においては、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を、グリシンベタインを適合溶質とする植物と接触させる。
本発明における別の好ましい適合溶質誘導方法であるプロリン誘導方法においては、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を、プロリンを適合溶質とする植物と接触させる。
また、本発明は、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする、植物用耐ストレス性付与剤に関する。
また、本発明は、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする、植物用適合溶質誘導剤に関する。
本発明の好ましい植物用適合溶質誘導剤である植物用グリシンベタイン誘導剤においては、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を有効成分として含有する。
本発明の別の好ましい植物用適合溶質誘導剤である植物用プロリン誘導剤においては、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を有効成分として含有する。
また、本発明は、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種と、担体又は希釈剤とを含有することを特徴とする、植物に耐ストレス性を付与するための組成物に関する。
また、本発明は、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種と、担体又は希釈剤とを含有することを特徴とする、植物に適合溶質を誘導するための組成物に関する。
本発明における好ましい適合溶質誘導用組成物であるグリシンベタイン誘導用組成物においては、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種と、担体又は希釈剤とを含有する。
本発明における別の好ましい適合溶質誘導用組成物であるプロリン誘導用組成物においては、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種と、担体又は希釈剤とを含有する。
また、本発明は、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種の、植物用耐ストレス性付与剤としての使用に関する。
更に、本発明は、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種の、植物用適合溶質誘導剤としての使用に関する。
本発明の好ましい使用においては、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を、グリシンベタインを適合溶質とする植物用のグリシンベタイン誘導剤に使用する。
本発明の別の好ましい使用においては、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質少なくとも１種を、プロリンを適合溶質とする植物用のプロリン誘導剤に使用する。
本明細書において、用語「耐ストレス性」における「ストレス」とは、植物体に対して有害な作用（例えば、生長の遅延若しくは抑制、停止、又は枯死）を与える外界因子を意味する。前記「耐ストレス性」には、例えば、耐塩性、耐乾燥性、耐高温性、耐低温性、又は耐強光性が含まれる。
本明細書において「適合溶質」とは、植物がその生体内に蓄積することによって耐ストレス性を示すことになる物質を意味し、例えば、オオムギなどのグリシンベタインや、イネなどのプロリンを挙げることができる。なお、特定の化合物が「適合溶質」として同定されていない植物においても、生体内に蓄積されることによって耐ストレス性を発現する化合物は、本明細書の「適合溶質」に含まれる。
また、本明細書において「適合溶質誘導物質」とは、耐ストレス性を付与すべき対象となる植物において、その植物に特有の適合溶質の発現を誘導し、生体内に蓄積させる化合物を意味する。
発明を実施するための最良の形態
本発明において使用することのできる１価又は２価の金属イオンとしては、適合溶質（例えば、グリシンベタイン又はプロリン）を誘導することのできる１価又は２価の金属イオンである限り、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンを挙げることができる。
前記アルカリ金属イオンとしては、適合溶質を誘導することのできるアルカリ金属イオンである限り、特に限定されるものではないが、例えば、ナトリウムイオン又はカリウムイオンを挙げることができる。前記アルカリ土類金属イオンとしては、適合溶質を誘導することのできるアルカリ土類金属イオンである限り、特に限定されるものではないが、例えば、マグネシウムイオン又はカルシウムイオンを挙げることができる。
本発明において使用することのできる過酸化水素／一酸化窒素誘導物質としては、適合溶質を誘導することのできる過酸化水素／一酸化窒素誘導物質である限り、特に限定されるものではないが、例えば、オキシダント、ペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸塩、又はサリチル酸化合物を挙げることができる。なお、本明細書において、「過酸化水素／一酸化窒素誘導物質」とは、過酸化水素又は一酸化窒素（ＮＯ）を植物内で発生させることができる化合物を意味する。
前記オキシダントとしては、適合溶質を誘導することのできるオキシダントである限り、特に限定されるものではないが、例えば、過酸化物［例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、あるいは、有機過酸化物、例えば、クメンヒドロペルオキシド（ＣｕＨＰ）、過酸化ジアルキル（例えば、過酸化ジエチル）、過酸化アシル（例えば、過酸化アセチル又は過酸化ベンゾイル）］、又はハロゲン化合物［例えば、次亜塩素酸若しくは次亜塩素酸塩（例えば、次亜塩素酸カルシウム又は次亜塩素酸ナトリウム）、臭化水素酸塩（例えば、臭化水素酸カリウム）、又は過ヨウ素酸若しくは過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸カリウム）］を挙げることができ、特には、過酸化水素又はクメンヒドロペルオキシドを挙げることができる。なお、前記次亜塩素酸又は次亜塩素酸塩は、例えば、サラシ粉の形で植物と接触させることができる。
前記ペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸塩としては、適合溶質を誘導することのできるペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸塩である限り、特に限定されるものではないが、例えば、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）を挙げることができる。
前記サリチル酸化合物としては、適合溶質を誘導することのできるサリチル酸化合物である限り、特に限定されるものではないが、例えば、サリチル酸又はアセチルサリチル酸（アスピリン）を挙げることができる。
本発明において使用することのできるカルモジュリンアンタゴニストとしては、適合溶質を誘導することのできるカルモジュリンアンタゴニストである限り、特に限定されるものではないが、特には、ポリミキシンＢ（Ｐｍｘ  Ｂ）又はトリフルオペラジンを挙げることができる。
本発明において使用することのできるベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ発現誘導物質としては、適合溶質を誘導することのできるベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ発現誘導物質である限り、特に限定されるものではないが、例えば、アブシジン酸（ＡＢＡ）又はコリンを挙げることができる。
本発明において使用することのできるポリアルキレングリコールとしては、適合溶質を誘導することのできるポリアルキレングリコールである限り、特に限定されるものではないが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコールを挙げることができる。
本発明において使用する適合溶質誘導物質としては、過酸化水素、アセチルサリチル酸、又はマグネシウムイオンが好ましく、過酸化水素が特に好ましい。
本発明の耐ストレス性付与方法又は本発明の適合溶質誘導方法では、前記適合溶質誘導物質の少なくとも１つを、植物と接触させる。
植物では、適合溶質の蓄積により耐ストレス性が付与又は向上することがよく知られている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０（２），３６６−３６８，１９９６；Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２３，１０７−１１４，２０００）。従って、本発明により、適合溶質誘導物質を植物と接触させると、適合溶質誘導物質接触量依存的に、適合溶質が植物体内に蓄積され、その適合溶質の蓄積により植物に耐ストレス性を付与することができる。
一方、適合溶質誘導物質を植物と接触させると、後述する実施例に示すように、ストレス症状［例えば、葉のしおれ、葉緑素の損失、ＴＢＡＲＳ（ＴｈｉｏＢａｒｂｉｔｕｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅａｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の増加、あるいは、％水不足の増加］も、前記適合溶質蓄積と一緒に引き起こされることがある。
例えば、誘導物質として、ＭｇＣｌ２（図５及び図６参照）、クメンヒドロペルオキシド（図１１参照）、又はサリチル酸若しくはアセチルサリチル酸（図１２及び図１３参照）を使用した場合には、適合溶質誘導物質接触量依存的に、ストレス症状が引き起こされる。あるいは、誘導物質として、ＮａＣｌ（図２参照）又はＨ２Ｏ２（図７〜図９参照）を使用した場合には、前記適合溶質誘導物質が低濃度であれば、ストレス症状はみられないが、ある濃度を越えると、適合溶質誘導物質接触量依存的に、ストレス症状が引き起こされる。
従って、本発明の耐ストレス性付与方法又は本発明の適合溶質誘導方法においては、適合溶質誘導物質を植物と接触させた場合に、耐ストレス性付与作用又は適合溶質誘導作用を示す量であって、しかも、ストレス症状を引き起こさない量、あるいは、ストレス症状を引き起こしたとしても軽いストレス症状にとどまる量の適合溶質誘導物質を、植物と接触させる。このような適合溶質誘導物質の使用量の範囲は、例えば、処理対象となる植物の種類、あるいは、使用する適合溶質誘導物質の種類に応じて変動するので一概には決まらないが、例えば、予備実験により、適合溶質誘導物質量と適合溶質蓄積量との関係、及び適合溶質誘導物質量とストレス症状の程度との関係をそれぞれ検討することにより、その好適範囲を容易に決定することができる。
本発明を適用することのできる植物としては、適合溶質を蓄積することのできる植物である限り、特に限定されるものではなく、双子葉植物又は単子葉植物のいずれであることもできるが、特には有用植物、例えば、芝草類、穀類植物、野菜類、果樹類、飼料作物、観賞植物、造園用植物、環境保護用植物、又は街路樹を挙げることができる。
前記芝草類としては、例えば、イネ科芝草［例えば、スズメガヤ亜科（例えば、シバ類又はバーミューダーグラス類）、ウシノケグサ亜科（例えば、ベントグラス類、ブルーグラス類、フェスク類、又はライグラス類）、又はキビ亜科］、カヤツリグサ科芝草、キク科芝草、又はマメ科芝草を挙げることができる。
前記穀類植物としては、例えば、イネ科植物、例えば、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、モロコシ、サトウキビ、ソルガム、トウモロコシ、ハトムギ、又はイネを挙げることができる。
前記野菜類としては、例えば、ホウレンソウ、サトウダイコン、アマランサス、ヒマワリ、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、又はゴマを挙げることができる。
前記果樹類としては、例えば、ミカン、オレンジ、モモ、スモモ、ブドウ、カキ、又はパパイヤを挙げることができる。
前記飼料作物としては、例えば、アカザ科のアトリプリックス類を挙げることができる。
前記観賞植物としては、例えば、キク、アッケシソウ、又はアカシアを挙げることができる。
前記造園用植物としては、例えば、バラ、チューリップ、コスモス、マーガレット、又はユリを挙げることができる。
前記環境保護用植物としては、例えば、マングローブの１種（ヒルギダマシ）を挙げることができる。
前記街路樹としては、例えば、ポプラ、クヌギ、ヤナギ、シラカバ、又はコナラを挙げることができる。
前記の適合溶質がグリシンベタインであることが知られている植物は、例えば、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ホウレンソウ、サトウダイコン、アッケシソウ、アマランサス、ヒマワリ、キク、アトリプリックス類、又はヒルギダマシである。
前記の適合溶質がプロリンであることが知られている植物としては、例えば、イネ、シバ、タバコ、ナス、ジャガイモ、又はトマトを挙げることができる。一般に、一部の塩生植物を除くほとんどの植物では、プロリンが適合溶質である。
本発明を適用する際の植物の状態も、特に限定されるものではなく、任意の状態、例えば、種子、苗、又は成熟体の状態にある植物に対して、本発明を適用することができる。
本発明の耐ストレス性付与方法又は本発明の適合溶質誘導方法において適合溶質誘導物質を植物に接触させる方法は、その方法により前記適合溶質誘導物質を植物に接触させた場合に耐ストレス性付与作用又は適合溶質誘導作用を示す方法である限り、特に限定されるものではない。例えば、適合溶質誘導物質をそのままで、又は適当な液体（例えば、水）で希釈した形で、植物体に直接散布することもできるし、あるいは、土壌に散布するか、又は水耕栽培の水培地に添加することにより、植物の根から吸収させることもできる。前記の植物体への直接散布としては、例えば、種子又は根を適合溶質誘導物質の希釈液に浸漬させる方法、あるいは、葉、茎、又は根に適合溶質誘導物質の希釈液又は適合溶質誘導物質を散布する方法を挙げることができる。
本発明の植物用耐ストレス性付与剤又は本発明の植物用適合溶質誘導剤は、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質（すなわち、適合溶質誘導物質）を少なくとも１つ、有効成分として含み、必要により担体又は希釈剤［特には、植物用の各種製剤（例えば、植物生長促進剤又は有害生物防除剤など）において従来から通常、使用されている担体又は希釈剤］を含むことができる。
本発明における、植物に耐ストレス性を付与するための組成物又は植物に適合溶質を誘導するための組成物は、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質（すなわち、適合溶質誘導物質）を少なくとも１つと、担体又は希釈剤［特には、植物用の各種製剤（例えば、植物生長促進剤又は有害生物防除剤など）において従来から通常、使用されている担体又は希釈剤］とを含む。
本発明において使用する適合溶質誘導物質、すなわち、１価又は２価の金属イオン、過酸化水素／一酸化窒素誘導物質、カルモジュリンアンタゴニスト、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導物質、及びポリアルキレングリコールからなる群から選んだ物質は、植物において、適合溶質の合成を誘導する作用を有する。植物では、適合溶質の蓄積により耐ストレス性が付与又は向上することがよく知られている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０（２），３６６−３６８，１９９６；Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２３，１０７−１１４，２０００）。従って、本発明において使用する前記適合溶質誘導物質は、植物に耐ストレス性を付与する作用を有する。
後述する実施例に示すように、水耕培養におけるオオムギ苗（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）を用いて、他の誘導物質、すなわち、他のカチオン（ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２）、ＡＢＡ、オキシダント（Ｈ２Ｏ２、クメンヒドロペルオキシド、ニトロプルシドナトリウム）、及び有機化合物（ポリミキシンＢ及びサリチル酸）の性質を確認した。高い濃度のＮａＣｌは、しおれ（ｗｉｌｔｉｎｇ）、葉緑素の損失、及びＴＢＡＲＳの増加も引き起こす。２〜１０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋イオンは、これらのストレス症状を減少させる一方、アルカリ金属イオン（Ｎａ＋又はＫ＋）によるグリシンベタインの誘導を増強する。また、グリシンベタインのほぼ最大レベルを誘導するのに充分なＮａＣｌ及びＨ２Ｏ２（１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ）は、ストレス症状を引き起こさない。１０〜２０ｍｍｏｌ／ＬのＭｇ２＋は、ストレス症状及びグリシンベタインの両方を誘導する［但し、低濃度（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）Ｃａ２＋においてのみ］。オキシダント（Ｈ２Ｏ２、又はクメンヒドロペルオキシド）又はニトロプルシドナトリウムによるグリシンベタインの誘導は、カタラーゼインヒビター（例えば、３−アミノトリアゾール）により増強される。カルモジュリンアンタゴニスト（例えば、ポリミキシンＢ）はそれ自体、強力なグリシンベタイン誘導物質であるが、カルモジュリンアンタゴニスト（例えば、ポリミキシンＢ）とアルカリ金属イオン（例えば、Ｎａ＋）とを一緒に使用すると、カルモジュリンアンタゴニスト（例えば、ポリミキシンＢ）はアルカリ金属イオン（例えば、Ｎａ＋）による誘導を増強する傾向がある。光合成のための光が、葉及び根の両方におけるグリシンベタイン蓄積にとって必要である。ＡＢＡ、しおれ、及びＰＥＧのいずれも、分離した葉においてグリシンベタインを誘導するが、ＮａＣｌ、Ｈ２Ｏ２、及びそれ以外では誘導しない。このことは、ストレス剤の初期認識において、あるいは、その経路における必要な成分を供給するのに、根が必要とされることを示唆する。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
被処理植物の調製及び培地
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ；品種名：Ｈａｒｕｎａ  ｎｉｊｏ）の種子を、非撹拌の水耕培養により、３種類の容器（１Ｌ若しくは４２０ｍＬ容量のプラスチック製ボックス、又は底部が円錐形の５０ｍＬ容量の遠心チューブ）内の１つを使用し、その上で生長させた。種子及びバーミキュライトは、ガーゼとプラスチック製メッシュで支えた。
液体培地としては２種類使用した。一方は、窒素源、リン酸源、及びカリウム源を含有する植物栄養混合物［ハイポネックス（ｈｙｐｏｎｅｘ）；（株）ハイポネックスジャパン社］を補った水道水からなる培地（以下、「ハイポネックス培地」と称する）を使用した。これらの条件下では、カルシウム、マグネシウム、及びイオウの含有量は非常に低かった。
もう一方の培地（以下、「規定培地」と称する）は、公知の培地（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０４，４３０−４３４，１９８６）をわずかに改変した培地であって、２ｍＭ−Ｃａ（ＮＯ３）２、２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭリン酸塩（ｐＨ６）、４．５ｍＭ−ＫＮＯ３、２．０ｍＭ−Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ−ＮＨ４Ｃｌ、０．０５ｍＭ−ＦｅＥＤＴＡ、及び微量栄養素を含有する。
微生物の生長を助ける可能性のある有機化合物（例えば、サリチル酸）を適合溶質誘導物質として用いた場合には、制菌調製物［Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（以下、「ＰＰＭ」と称する）；Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．］を１：１０００の希釈率で含有する培地を使用した。試験した幾つかの材料によるグリシンベタイン誘導において、ＰＰＭが不都合な結果を与えないことは、予め試験により確認した（後述の表１参照）。
表１に示す実験では、規定培地において種子吸水を６時間実施した後、規定培地において、通常、７〜１０日間（１日おきに培地交換）生長させ、続いて、表１に示す各種の適合溶質誘導物質とＣａＣｌ２とを含有する規定培地において、各種の適合溶質誘導物質との接触を４日間（１日おきに培地交換）行なった。なお、コントロールとして、各種の適合溶質誘導物質とＣａＣｌ２とを含有する規定培地の代わりに、ＣａＣｌ２を含有する規定培地を用いること以外は、前記操作を繰り返した。グリシンベタイン量は、後述の測定方法（２）に示す方法により測定した。また、ＰＰＭ効果（％）は、ＰＰＭなしの場合のグリシンベタイン量に対する、ＰＰＭ有りの場合のグリシンベタイン量の増加割合で示した。
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表１において、培地中のＣａ２＋濃度は、誘導物質としてＭｇＣｌ２を用いた場合に０．２ｍｍｏｌ／Ｌであったことを除いて、２ｍｍｏｌ／Ｌであった。また、ＰＰＭは、１：１０００に希釈して使用した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としては、分子量４０００〜６０００のポリエチレングリコールを使用した。
測定方法
（１）％水不足
回収した直後の葉の重量［以下、ＦＷ（ｆｒｅｓｈ  ｗｅｉｇｈｔ）と称する］を測定した後、葉を脱イオン水に３〜５時間浸漬させ、葉の表面に付着した水分を口紙で挟んで除去し、完全に含水させた状態の重量［以下、ＴＷ（ｔｕｒｇｉｄ  ｗｅｉｇｈｔ）と称する］を測定した。本明細書において［％水不足（％  ｗａｔｅｒ  ｄｅｆｉｃｉｔ；％ｗｄ）」とは、式：
％ｗｄ＝｛（ＴＷ−ＦＷ）／ＴＷ｝×１００
で規定した値を意味する。グリシンベタイン、葉緑素（クロロフィル）、ＴＢＡＲＳ、又はＮａ＋含量を測定する場合には、これらの値は、完全に含水させた状態の重量（すなわち、ＴＷ）１ｇ当たりの量で表わす。
（２）グリシンベタイン量
グリシンベタイン測定のための葉サンプルの調製は、公知方法（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３１，７９７−８０３，１９９０）に由来する変法により実施した。すなわち、遠心チューブ内の葉サンプル（約１．０ｇ）を液体窒素で冷やした後、乳棒で葉を小片にまで破砕した。１．０Ｎ−Ｈ２ＳＯ４（２．０ｍＬ）を用いて抽出を一晩実施した。抽出したサンプルを、ファイバーグラスフィルターに通し、新しい１．０Ｎ−Ｈ２ＳＯ４（０．５ｍＬ）で２回すすぎ、完全に溶出した。澄んだ流体を、底部が円錐形の目盛付きプラスチックチューブ（１５ｍＬ容量）に集め、容量を測定した。その内、１ｍＬの分量をエッペンドルフチューブに移し、Ｉ２／Ｋｌ溶液０．４ｍＬを添加した。０℃で２時間又はそれ以上経過した後、ヨウ素と第四級アンモニウム化合物及び他の化合物との沈澱複合体を遠心（４℃）により回収した。上清溶液を吸引除去した後、６５℃の加熱ブロックにチューブを１時間放置することにより沈澱を乾燥させた。なお、前記乾燥の際には、ファンによりチューブの先端上部に空気を吹き込んだ。沈澱をＤ２Ｏ２００μＬに再懸濁し、再び６５℃で５時間蒸発させた。最終的な沈澱をＤ２Ｏ７００μＬに再懸濁し、内部標準としてｔ−ブチルアルコールを加えた。遠心により沈澱を除去した後、上清をチューブに移し、５００ＭＨｚのＮＭＲ装置において生成されたピークエリアの積分による測定用に使用した。
（３）葉緑素
葉の葉緑素の測定のために、破砕した凍結葉を１００％メタノールで一晩抽出し、抽出液について６５２及び６６５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（４）ＴＢＡＲＳ
チオバルビツル酸（ＴＢＡ）を用いる脂質酸化物の測定のために、前項（２）で得られた破砕した凍結葉を、１０％トリクロロ酢酸２ｍＬで抽出した。抽出液０．４ｍＬを１２×７５ｍｍのガラスチューブに移し、１０％トリクロロ酢酸中の０．５％ＴＢＡ０．４ｍＬを添加し、９５℃で３０分間加熱した。冷却後、得られた溶液をｎ−ブタノール１．０ｍＬで抽出し、この抽出液の光学密度を測定した。ブタノール中の抽出物において濁りがみられなかったので、６００ｎｍにおける吸光度を差し引く必要はなかった。すべてのケースにおいて、マロンジアルデヒドと思われる５３５ｎｍにおける吸収の小さな肩がみられたが、主要な吸収は４６０ｎｍ又は４４０ｎｍのいずれかに現われた。前記の主要な吸収は、植物に与えたストレスに依存していた（後述の図１参照）。これらのブタノール抽出液は、きれいなピンク色というよりは、むしろオレンジ色であった。前記加熱工程においてＴＢＡを添加しなかった場合には、抽出物はむしろ紫がかった色となり、吸収スペクトルは明瞭なピークをもたなかった。元の吸収（すなわち、ＴＢＡを添加した場合の吸収）からこの吸収（すなわち、ＴＢＡを添加しなかった場合の吸収）を差し引いても、５２０ｎｍのピークは強調されず、より高い波長（５６０ｎｍ以上）において、負の吸収が現われた（後述の図１参照）。マロンジアルデヒドのピークエリアは、主要なピークの重なりにより、程度は不明であるが、変更されていたので、４４０／４６０ｎｍピーク範囲の面積を、初期ストレスの指標として用いた。この面積は、４４０及び／又は４６０ｎｍにピークを示す物質［ＴＢＡＲＳ（ＴｈｉｏＢａｒｂｉｔｕｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅａｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）］の検出合計量を意味する。前記ピーク範囲は、ブタノール中に完全に分配されたので、別の脂質酸化物を表わしているのかもしれない。
各吸収スペクトルを図１に示す。図１において、曲線ａは、ＴＢＡを添加した場合の吸収スペクトルであり、曲線ｂは、ＴＢＡを添加しなかった場合の吸収スペクトルであり、曲線ｃは、曲線ａと曲線ｂとの差スペクトルである。
（５）ナトリウムイオン
葉中のナトリウムイオンは、液体イオンクロマトグラフィー（島津製作所）又はＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ａｒｇｏｎ  Ｐｌａｓｍａ）装置により、酸抽出物を用いて測定した。
実施例１：オオムギの葉における高濃度のＮａＣｌに対する応答
規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、２００〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ含有規定培地に、４日間さらす（１日おきに培地交換）と、多くの現象が観察された。例えば、葉がしおれ、この状態が持続した。また、％水不足の上昇が観察された。また、培地からの水分消失がほとんど、あるいはまったく見られず、気孔はほとんど閉じたままであった。また、根が、部分的に茶色に変色したのが観察された。
更には、葉緑素の分解が観察され、酸抽出物におけるＴＢＡＲＳレベルも上昇した。これらの結果は、予想されたように、培地中のＮａＣｌ濃度に依存した（後述の表２参照）。これらは、一般的なストレス効果を示しており、グリシンベタイン合成の誘導量と必ずしも関連していない（後述の図２参照）。Ｃａ２＋及びＭｇ２＋をそれぞれ２ｍｍｏｌ／Ｌ含有する規定培地を用いた実験では、具体的なデータは示さないが、２２５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌにおける葉緑素の減少は、それほどではなく、ＴＢＡＲＳの増加もそれほど極端ではなかった。しかしながら、葉のしおれ具合、％水不足の増加、及びグリシンベタインの蓄積については、前記の場合と同様に観察された。
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表２に、一連の異なる濃度のＮａＣｌを含有する規定培地を用いた場合の結果、すなわち、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、０〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ含有規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）結果を示し、その数値に基づいて作成したグラフを図２に示す。図２において、折れ線ａは、グリシンベタイン量を示し、折れ線ｂは、％水不足を示し、折れ線ｃは、ＴＢＡＲＳレベルを示す。１００ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ濃度において、グリシンベタインの大量の蓄積がみられたが、ＴＢＡＲＳレベルの上昇は、２００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ濃度まで起きなかった。％水不足レベルは、中間の濃度依存性を示した。これらの指標によれば、グリシンベタインを形成させるＮａＣｌからのシグナルは、より一般的なストレス状態を引き起こすのに必要なシグナルと比べて、より特異的である。
実施例２：オオムギにおけるＮａ＋以外のカチオンのグリシンベタイン誘導効果
（１）Ｋ＋
ＮａＣｌに代えてＫＣｌを用いた場合の結果、すなわち、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、０〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ含有規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）結果を図３に示す。なお、ＮａＣｌを用いた場合の結果も併せて示す。図３において、折れ線ａは、ＫＣｌを用いた場合の結果を示し、折れ線ｂは、ＮａＣｌを用いた場合の結果を示す。各数値は、２つの葉サンプルの平均値である。
図３に示すように、ＫＣｌも、ＮａＣｌとほとんど同じような濃度曲線で、グリシンベタインを誘導することが確認された。ＮａＣｌの場合と同様に、グリシンベタインの誘導は、ＴＢＡＲＳレベルの増加が生じる濃度よりも低い濃度で生じる。
（２）Ｃａ２＋
ハイポネックス培地又は規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＮＯ３と０〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌとを含有するハイポネックス培地又は規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）ところ、２０ｍｍｏｌ／Ｌまでのカルシウムイオン濃度は、それ自体、グリシンベタインを誘導しなかったが、ＮａＣｌの効果を増強させた。ハイポネックス培地又は規定培地において生長させた植物では、Ｃａ２＋濃度が高い方が、ＮａＣｌにより引き起こされる一般的なストレス効果（葉緑素の減少及びＴＢＡＲＳの上昇）を減少させた。また、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｃａ２＋濃度では、％水不足の増加も減少させた。しかしながら、更にＣａ２＋を添加すると、ＮａＣｌにより誘導されるグリシンベタインレベルが増加した（後述の表３参照）。規定培地では、グリシンベタインレベルの実際の増加はほとんど生じなかったが、高濃度のＣａによる誘導における減少も確かに生じなかった。多くの実験によれば、Ｃａ２＋の高レベルの必要性は、誘導物質としてＫＣｌを用いた場合に、ＮａＣｌを用いた場合と比較して、より高かった。結果を図４に示す。
図４に示す実験では、規定培地を使用し、塩に４日間さらした。より具体的には、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、０．２、２．０、又は１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２と７．５又は２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌとを含有する規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）。
カルシウムの効果の１つは、Ｎａ＋の取り込みを抑制し、細胞中のＫ＋／Ｎａ＋比をより良好な値に維持するものと考えられる。この点を、オオムギの葉において本質的に確認することができた。すなわち、多くの実験において、高レベルのＮａＣｌ及び追加のＣａ２＋を含有する培地における植物の葉へのナトリウムの取り込みが、明らかに減少した（後述の表４参照）。
以下に示すように、種々の他の化合物が、グリシンベタイン蓄積を誘導することが確認された。ＮａＣｌ及びＫＣｌ、並びにおそらくはアブシジン酸においては、グリシンベタインの量が低濃度のＣａ２＋により制限されたのに対して、それ以外のほとんどの化合物では影響を受けなかった（後述の表５参照）。
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表３に示す実験では、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、０、０．５、２、又は１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｃａ（ＮＯ３）２と０又は２２５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌとを含有する規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）。
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表４に示す実験１〜３では、ＮａＣｌ濃度は２２５ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＣａＣｌ２濃度及びＭｇＣｌ２濃度はそれぞれ１０ｍｍｏｌ／Ｌであった。より具体的には、ハイポネックス培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、表４に示す各種塩を含有するハイポネックス培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）。更に、葉の酸抽出物中のナトリウムイオンは、液体イオンクロマトグラフィー（島津）により測定した。
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表５において、各実験は、それぞれ、２つの葉サンプルについて実施した。具体的には、発芽してから１０日後のオオムギの葉を、表５に示す各種誘導物質と０．２又は２．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２とを含有する規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）。「低濃度／高濃度Ｃａ２＋比」は、２つの葉サンプルからそれぞれ得られた２つの測定値の平均値に基づいて算出した。
（３）Ｍｇ２＋
ＮａＣｌの代わりにＭｇＣｌ２を用いた場合の結果、すなわち、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、０．２又は２．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２と０〜２５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２とを含有する規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）結果を、図５及び図６に示す。図５及び図６において、折れ線ａは、Ｃａ２＋濃度が０．２ｍｍｏｌ／Ｌである場合の結果であり、折れ線ｂは、Ｃａ２＋濃度が２．０ｍｍｏｌ／Ｌである場合の結果である。
高濃度のＭｇ２＋によりカルシウム効果を倍増させることが可能であるかの試験において、Ｍｇイオンそれ自体がグリシンベタインの非常に有効な誘導物質であることが見出された。しかしながら、Ｍｇによる誘導は、非常に低いＣａ２＋レベル（すなわち、培地中のＭｇ／Ｃａ比が５０：１又はそれ以上の場合）においてのみ生じる（図５参照）。Ｎａ＋及びＫ＋の場合と異なり、Ｍｇ２＋によるグリシンベタインの誘導は、ＴＢＡＲＳの上昇と密接に関連した（図６参照）。これらの結果は、グリシンベタイン誘導を引き起こすＭｇ２＋イオンに対するより特異的な受容体の存在を示唆しない。
実施例３：オオムギにおけるオキシダントのグリシンベタイン誘導効果
多くのストレス状態（高濃度の塩、低温、及び高温、並びに、水を与えないか、あるいは、ポリエチレングリコールの使用による乾燥）は、オオムギにおいて、グリシンベタインの誘導を引き起こし、これらはどれも、光合成を阻害する。光合成が阻害されると、励起状態の葉緑素が活性酸素種の形成を引き起こす。従って、我々は、酸化ストレスそれ自体が、グリシンベタイン誘導を導くシグナル伝達経路の一部となりうるのではないかと考えた。活性酸素種のいくつかの潜在的ドナーとして、Ｈ２Ｏ２、クメンヒドロペルオキシド、及びニトロプルシドナトリウムをテストしたところ、以下のとおり、誘導効果を確認した。
（１）Ｈ２Ｏ２
ＮａＣｌの代わりにＨ２Ｏ２を用いた場合の結果、すなわち、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｈ２Ｏ２を含有する規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）結果を、図７〜図９に示す。
規定の栄養培地において、Ｈ２Ｏ２は、１５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌで、ほとんど最大のグリシンベタイン蓄積を引き起こす（図７及び図８参照）。しかしながら、ＴＢＡＲＳの上昇は、Ｈ２Ｏ２濃度に従って増加するが、１００又は１５０ｍｍｏｌ／Ｌまで最大レベルに到達しない（図９参照）。葉のしおれ及び％水不足の増加は、かなり高い濃度（葉の基部が白くなり、膨圧が完全に不足し、葉が落ちる濃度）まで生じなかった。この状態が過酷になると、水ストレスとなる。
過酸化水素では、２ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋イオンを必要とせず、０．２ｍｍｏｌ／Ｌでも同様の誘導が生じる（前記表５参照）。培地中のＥＧＴＡ（他の誘導物質による誘導を阻害する）は、Ｈ２Ｏ２により引き起こされる誘導を、実際に増大させるようにみえた。結果を図１０に示す。
図１０に示す実験では、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、図１０に示す各種化合物（ＥＧＴＡを除く）を含有し、しかも、ＥＧＴＡ含有又はＥＧＴＡ不含の規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）。図１０において、黒棒は、ＥＧＴＡ不在下の結果であり、白棒は、ＥＧＴＡ存在下の結果である。また、図１０において、ＣａＣｌ２濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＥＧＴＡ濃度は２ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＮａＣｌ濃度は２２５ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＡＢＡ濃度は５０μｍｏｌ／Ｌであり、Ｈ２Ｏ２濃度は１．２５ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＰＥＧ濃度は２０％であり、Ｐｍｘ  Ｂ濃度は５０μｍｏｌ／Ｌであった。
Ｈ２Ｏ２の特性は、オオムギの根における高いグリシンベタインレベルの誘導を全く引き起こさないという観察にある（なお、ＮａＣｌ、ＰＥＧ、及びＡＢＡは、このような誘導を引き起こす）（後述の表６参照）。表６に示す実験では、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、ＮａＣｌ又はＨ２Ｏ２含有の規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）。
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オオムギ種子を蒸留水に浸した後、暗所で２日間置き、発芽させた。発芽の進行状態がほぼ同じ種子を選んで、１０粒ずつポットに蒔き、窒素源、リン酸源、及びカリウム源を含有する植物栄養混合物（ハイポネックス）を水道水で１０００倍に希釈した培地（すなわち、ハイポネックス培地）を用いて水耕栽培を行なった。前記水耕栽培は、温度２５℃及び湿度６０％で、１２時間の明所（光強度＝２００μＥｍ−２ｓ−１）と１２時間の暗所とを交互に繰り返す条件下で行なった。
水耕栽培を開始してから１０日間経過した後に、生育の進行状態がほぼ同じ植物を選び、０ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、及び４０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｈ２Ｏ２で２日間処理した。各処理群をそれぞれ、更に２群に分け、一方を３００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ存在下で、もう一方をＮａＣｌ不在下で、３日間置いた後、各群における植物体（各群当たり１０個）の新鮮重量（単位＝ｇ）を測定した。
以上の実験を３回繰り返して得られた新鮮重量の平均値を、表７に示す。表７において、新鮮重量の後に示す括弧内の数字は、Ｈ２Ｏ２未処理の場合の新鮮重量を１００とした場合の相対値である。なお、各実験間の誤差は、５〜７％以内であった。
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表７に示すように、塩ストレスの無い状態でも、１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｈ２Ｏ２処理によって、６〜７％の生育促進がみられた。しかし、４０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｈ２Ｏ２処理では、Ｈ２Ｏ２未処理の場合と比較して、２％の新鮮重量の減少がみられた。
一方、塩処理（３００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ）をした場合には、３日間で新鮮重量が著しく減少し、葉の黄化も進行していた。Ｈ２Ｏ２処理によって、最大３５％の新鮮重量の増大がみられると共に、葉の黄化も抑制された。これらの結果は、Ｈ２Ｏ２処理によって、ストレス耐性システム（例えば、活性酸素消去系及びグリシンベタインの蓄積等）が誘導されたためと考えられる。Ｈ２Ｏ２濃度は１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌが最適と考えられ、それ以上の濃度では効果が減少した。
（２）クメンヒドロペルオキシド（ＣｕＨＰ）
ＮａＣｌの代わりに、クメンヒドロペルオキシドを用いた場合の結果、すなわち、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、０〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌクメンヒドロペルオキシドを含有する規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）場合の結果を、図１１に示す。図１１において、白三角形及び黒三角形は、２回の繰り返し実験におけるグリシンベタイン量をそれぞれ示し、白丸は、ＴＢＡＲＳレベルを示す。なお、ＴＢＡＲＳレベルについては、グリシンベタイン量のスケールと一致するように、実際の吸光度の値に０．２８を掛けた値を用いてグラフ化した。
図１１に示すように、酸化的ストレスの別の誘導は、クメンヒドロペルオキシドにより引き起こされる誘導において見出された。この化合物は、０．２５〜１ｍｍｏｌ／Ｌで有効であり、Ｈ２Ｏ２における必要濃度よりもかなり低い。しかしながら、Ｈ２Ｏ２又はＮａＣｌの場合と異なり、ＴＢＡＲＳレベルの上昇は、クメンヒドロペルオキシドの最も低い有効濃度においてさえ生じた（図１１参照）。
（３）ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）
ニトロプルシドナトリウムは、クメンヒドロペルオキシドより少ないが、再現性のあるグリシンベタイン誘導を引き起こした。なお、ニトロプルシドナトリウムは、一酸化窒素及び他の酸化生成物の推定上のドナーである。
ニトロプルシドナトリウム及びＨ２Ｏ２によるグリシンベタイン誘導は、カタラーゼのインヒビターである３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）の添加により、増強された（後述の表８参照）。また、クメンヒドロペルオキシドによる誘導も、３−アミノトリアゾールにより増強された。
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表８において、Ｈ２Ｏ２の濃度は５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＳＮＰの濃度は２ｍｍｏｌ／Ｌであった。より具体的には、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、Ｈ２Ｏ２又はＳＮＰを含有し、しかも、３−ＡＴ含有又は３−ＡＴ不含の規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）。「Δグリシンベタイン」は、誘導物質を用いた場合のグリシンベタイン量から、誘導物質を用いない場合（対照）のグリシンベタイン量（「３−ＡＴなし」の場合には０．２５であり、「３−ＡＴ有り」の場合には０．９０であった）を差し引いた値である。
オオムギ種子を蒸留水に浸した後、暗所で２日間置き、発芽させた。発芽の進行状態がほぼ同じ種子を選んで、１０粒ずつポットに蒔き、ハイポネックス培地を用いて水耕栽培を行なった。前記水耕栽培は、温度２５℃及び湿度６０％で、１２時間の明所（光強度＝２００μＥｍ−２ｓ−１）と１２時間の暗所とを交互に繰り返す条件下で行なった。
水耕栽培を開始してから１０日間経過した後に、生育の進行状態がほぼ同じ植物を選び、０μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、及び１００μｍｏｌ／Ｌニトロプルシドナトリウムで２日間処理した。各処理群をそれぞれ、更に２群に分け、一方を３００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ存在下で、もう一方をＮａＣｌ不在下で、３日間置いた後、各群における植物体（各群当たり１０個）の新鮮重量（単位＝ｇ）を測定した。
以上の実験を３回繰り返して得られた新鮮重量の平均値を、表９に示す。表９において、新鮮重量の後に示す括弧内の数字は、ニトロプルシドナトリウム未処理の場合の新鮮重量を１００とした場合の相対値である。なお、各実験間の誤差は、５〜７％以内であった。
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表９に示すように、１〜１０μｍｏｌ／Ｌニトロプルシドナトリウム処理によって、塩ストレス（３００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ）下での新鮮重量の増加がみられた。ニトロプルシドナトリウムは、一酸化窒素（ＮＯ）の発生試薬であり、一酸化窒素によってストレス耐性システムが誘導され、Ｈ２Ｏ２と同じような効果が得られたものと考えられる。オオムギはグリシンベタインを合成することのできる作物である。
実施例４：オオムギにおけるカチオン及びオキシダント以外の化合物によるグリシンベタイン誘導効果
（１）アブシジン酸
これまで述べた他の誘導物質と比較すると、アブシジン酸は、ＴＢＡＲＳの上昇、葉のしおれ、あるいは、％水不足の増加を引き起こすことなく、誘導を生じさせる点で、ユニークである（表１０参照）。
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表１０に示す実験では、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、表１０に示す各種誘導物質を含有する規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）。
（２）サリチル酸及びその誘導体
ＮａＣｌの代わりに、サリチル酸及びアセチルサリチル酸（アスピリン）を用いた場合の結果、すなわち、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、サリチル酸又はアセチルサリチル酸を含有する規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）結果を、図１２及び図１３に示す。図１２及び図１３において、折れ線ａは、サリチル酸の結果を示し、折れ線ｂは、アセチルサリチル酸の結果を示す。また、この実験では、微生物増殖を制御するためにＰＰＭ含有の規定培地を使用した。なお、アスピリンはエタノールに溶解して使用したが、エタノール単独でも、最も高い濃度では誘導効果がみられるので、エタノール効果の分を補正した。
サリチル酸及びアセチルサリチル酸は、０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で、グリシンベタイン蓄積を誘導した。どちらの化合物も、約３ｍｍｏｌ／Ｌ以降にグリシンベタイン蓄積の減少がみられる至適曲線を示す（図１２参照）。アセチルサリチル酸（アスピリン）は、おそらく、根への浸入がより効率的であるので、より低い濃度でも有効である可能性がある。これらの化合物では、ＴＢＡＲＳの上昇は、グリシンベタイン誘導を引き起こすのと同じ濃度で起こる（図１３参照）。
（３）ポリミキシンＢ
ＮａＣｌの代わりに、ポリミキシンＢを用いた場合の結果、すなわち、規定培地において１０日間（１日おきに培地交換）生長させたオオムギの根を、ポリミキシンＢを含有し、しかも、ＮａＣｌ含有又はＮａＣｌ不含の規定培地に、４日間さらした（１日おきに培地交換）結果を、図１４に示す。
ポリミキシンＢは、幾つかの系におけるカルモジュリンアンタゴニストであり、０．２０ｍｇ／ｍＬにおいて、グリシンベタインの強力な誘導物質であった（図１４参照）。ポリミキシンＢとＮａＣｌとを一緒に使用すると、ポリミキシンＢも、ＮａＣｌによる誘導を増強する傾向があった。
実施例５：イネにおけるオキシダントの耐塩性付与効果
（１）Ｈ２Ｏ２
イネ種子を蒸留水に浸した後、暗所で２日間置き、発芽させた。発芽の進行状態がほぼ同じ種子を選んで、１０粒ずつポットに蒔き、ハイポネックス培地を用いて水耕栽培を行なった。前記水耕栽培は、温度２７℃及び湿度６０％で、１２時間の明所（光強度＝２００μＥｍ−２ｓ−１）と１２時間の暗所とを交互に繰り返す条件下で行なった。
水耕栽培を開始してから２週間経過した後に、生育の進行状態がほぼ同じ植物を選び、０ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、及び４０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｈ２Ｏ２で２日間処理した。各処理群をそれぞれ、更に２群に分け、一方を１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ存在下で、もう一方をＮａＣｌ不在下で、８日間置いた後、各群における植物体（各群当たり１０個）の新鮮重量（単位＝ｇ）を測定した。
以上の実験を３回繰り返して得られた新鮮重量の平均値を、表１１に示す。表１１において、新鮮重量の後に示す括弧内の数字は、Ｈ２Ｏ２未処理の場合の新鮮重量を１００とした場合の相対値である。なお、各実験間の誤差は、５〜７％以内であった。
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イネはグリシンベタインを蓄積しない作物であるが、オオムギと同様に、耐塩性を付与するのに有効であった。すなわち、塩による生育阻害が抑制されると共に、黄化も著しく抑制された。これらの結果は、酸化剤であるニトロプルシドナトリウムが、所定の低濃度条件で、種々のストレス耐性システムを誘導するためと考えている。
（２）ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）
Ｈ２Ｏ２で処理する代わりに、０μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、及び１００μｍｏｌ／Ｌニトロプルシドナトリウムで処理すること以外は、前記実施例５（１）に記載の手順を繰り返した。結果を表１２に示す。
また、Ｈ２Ｏ２で処理する代わりに、０μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ、及び１０００μｍｏｌ／Ｌニトロプルシドナトリウムで処理すること以外は、前記実施例５（１）に記載の手順を繰り返した。ＮａＣｌ不在下で８日間置いた後の状態を図１５に、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ存在下で８日間置いた後の状態を図１６に示す。図１５及び図１６において、左から右に向かって順に、０μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ、及び１０００μｍｏｌ／Ｌニトロプルシドナトリウムでそれぞれ処理したイネである。なお、図１５及び図１６の左端に示すスケールの目盛り単位は「ｃｍ」である。
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表１２並びに図１５及び図１６から明らかなように、塩による生育阻害が抑制されると共に、黄化も著しく抑制され、オオムギと同様に、耐塩性を付与するのに有効であった。これらの結果は、酸化剤であるニトロプルシドナトリウムが、所定の低濃度条件で、種々のストレス耐性システムを誘導するためと考えている。
産業上の利用可能性
本発明によれば、植物に耐ストレス性を付与することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、オオムギの葉の酸抽出物［脂質酸化物（ＴＢＡＲＳ）］の吸収スペクトルを示すグラフである。
図２は、誘導物質としてＮａＣｌを用いた場合のグリシンベタイン量（折れ線ａ）、％水不足（折れ線ｂ）、及びＴＢＡＲＳ（折れ線ｃ）を示すグラフである。
図３は、誘導物質としてＫＣｌ（折れ線ａ）又はＮａＣｌ（折れ線ｂ）を用いた場合のグリシンベタイン量を示すグラフである。
図４は、異なるＣａ２＋濃度において、誘導物質としてＫＣｌを用いた場合のグリシンベタイン量を示すグラフである。
図５は、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ（折れ線ａ）又は２ｍｍｏｌ／Ｌ（折れ線ｂ）のＣａ２＋濃度において、誘導物質としてＭｇＣｌ２を用いた場合のグリシンベタイン量を示すグラフである。
図６は、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ（折れ線ａ）又は２ｍｍｏｌ／Ｌ（折れ線ｂ）のＣａ２＋濃度において、誘導物質としてＭｇＣｌ２を用いた場合のＴＢＡＲＳを示すグラフである。
図７は、誘導物質としてＨ２Ｏ２を用いた場合のグリシンベタイン量を示すグラフである。
図８は、誘導物質としてＨ２Ｏ２を低濃度で用いた場合のグリシンベタイン量を示すグラフである。
図９は、誘導物質としてＨ２Ｏ２を用いた場合のＴＢＡＲＳを示すグラフである。
図１０は、グリシンベタイン誘導におけるＥＧＴＡの効果を示すグラフである。
図１１は、誘導物質としてクメンヒドロペルオキシドを用いた場合のグリシンベタイン量及びＴＢＡＲＳを示すグラフである。
図１２は、誘導物質としてサリチル酸（折れ線ａ）又はアセチルサリチル酸（折れ線ｂ）を用いた場合のグリシンベタイン量を示すグラフである。
図１３は、誘導物質としてサリチル酸（折れ線ａ）又はアセチルサリチル酸（折れ線ｂ）を用いた場合のＴＢＡＲＳを示すグラフである。
図１４は、誘導物質としてポリミキシンＢを用いた場合のグリシンベタイン量を示すグラフである。
図１５は、Ｈ２Ｏ２で処理した後、ＮａＣｌ不在下で生育させたイネの状態を示す写真である。
図１６は、Ｈ２Ｏ２で処理した後、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ存在下で生育させたイネの状態を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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