(57)【要約】異種のｅＲＦ３をプリオン化し得るｅＲＦ３、及び異種のｅＲＦ３によってプリオン化され得るｅＲＦ３を提供する。これらを利用し、異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング、異常型ＰｒＰの検出、異常型ＰｒＰの作製、異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させる物質のスクリーニングを行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列により表されるペプチド。
【請求項２】
プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３。
【請求項３】
配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるペプチド。
【請求項４】
プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３。
【請求項５】
プリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３。
【請求項６】
以下の工程（１）〜（３）を含む異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング方法。
（１）プリオン化したｅＲＦ３を有する酵母を試験物質と接触させる工程
（２）（１）の酵母に、プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を含む酵母ｅＲＦ３を発現させる工程
（３）試験物質が、（２）で発現させた酵母ｅＲＦ３のプリオン化を阻害するか否かを確認する工程
【請求項７】
プリドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を含む酵母ｅＲＦ３が、ＹＬ  ｅＲＦ３、ＹＬＲＰ  ｅＲＦ３、又はΔ１２１ＹＬＲＰ  ｅＲＦ３である請求項６記載の異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
酵母が７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株であって、プリオン化を阻害するか否かを確認する工程が酵母が形成するコロニーの色を確認する工程である請求項６記載の異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
プリオン化を阻害するか否かを確認する工程が、酵母の細胞中に凝集体が形成される否かを確認する工程である請求項６記載の異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
以下の工程（１）及び（２）を含む異常型ＰｒＰの検出方法。
（１）プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列又はＰｒＰ配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３を含む酵母に、被検サンプルを移入する工程
（２）酵母ｅＲＦ３がプリオン化するか否かを確認する工程
【請求項１１】
プリドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列又はＰｒＰ配列を含む酵母ｅＲＦ３が、ＹＬ  ｅＲＦ３、ＹＬＲＰ  ｅＲＦ３、又はΔ１２１ＹＬＲＰ  ｅＲＦ３である請求項１０記載の異常型ＰｒＰの検出方法。
【請求項１２】
酵母が７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株であって、プリオン化するか否かを確認する工程が酵母が形成するコロニーの色を確認する工程である請求項１０記載の異常型ＰｒＰの検出方法。
【請求項１３】
プリオン化するか否かを確認する工程が、酵母の細胞中に凝集体が形成されるか否かを確認する工程である請求項１０記載の異常型ＰｒＰの検出方法。
【請求項１４】
正常型ＰｒＰと、プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３、又はプリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３とを接触させる工程を含む異常型ＰｒＰの作製方法。
【請求項１５】
プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３が、ＫＬ  ｅＲＦ３、ＣｈｉＢ、又はＣｈｉＣである請求項１４記載の異常型ＰｒＰの作製方法。
【請求項１６】
プリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３のオリゴペプチドリピート領域をポリグルタミンで置換することにより得られるペプチドである請求項１４記載の異常型ＰｒＰの作製方法。
【請求項１７】
以下の工程（１）〜（３）を含む異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させる物質のスクリーニング方法。
（１）正常型ＰｒＰと、プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３、又はプリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３とを接触させ、異常型ＰｒＰを得る工程
（２）異常型ＰｒＰと、試験物質を接触させる工程
（３）試験物質が異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させるか否かを確認する工程
【請求項１８】
プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３が、ＫＬ  ｅＲＦ３、ＣｈｉＢ、又はＣｈｉＣである請求項１７記載の異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１９】
プリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３のオリゴペプチドリピート領域をポリグルタミンで置換することにより得られるペプチドである請求項１７記載の異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させる物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、異種ｅＲＦ３間におけるプリオン化の感染に関与するペプチド、並びにそのようなペプチドを利用して異常型ＰｒＰの感染阻害物質をスクリーニングする方法、異常型ＰｒＰを検出する方法、異常型ＰｒＰを作製する方法、及び異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させる物質をスクリーニングする方法に関する。
背景技術
哺乳類のプリオン病であるＣｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＤＪ）、ｋｕｒｕ、ｓｃｒａｐｉｅや狂牛病（ＢＳＥ）はＰｒＰというタンパク質自身によって感染すると考えられている。一つの遺伝子産物が２つの異なった立体構造を持つタンパク質を作り出すことができ、病原性を持った異常型のタンパク質（ＰｒＰＳＣ）は正常型のタンパク質（ＰｒＰＣ）を異常型に変えうるという性質を持っている。このような性質を持ったタンパク質は酵母においても報告されており、酵母プリオンと呼ばれている。酵母プリオンはタンパク質としての機能という意味においてはＰｒＰとの関連は見られないが、プリオン性の特徴という意味においては多くの共通点が見られる。１）メンデル遺伝子に従わず（細胞質遺伝子）、遺伝子の変異によらずに野生型遺伝子産物が異常性質を示す。２）タンパク質の過剰発現がプリオン化を促進する。３）異常型のタンパク質がｆｉｂｅｒを形成する性質を持っている。さらに酵母プリオンの一つであるｅＲＦ３では、４）タンパク質のＮ末端にオリゴペプチドリピート（ｅＲＦ３：ＰＱＧＧＹＱＱＹＮ，ＰｒＰ：ＰＨＧＧＧＷＧＱ）が存在し、リピートの数がプリオン化の頻度に影響を与える。５）種間によって感染性の障壁（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂａｒｒｉｅｒ）が存在する、といった共通点がみられる。
このようなプリオンタンパク質としての共通性を考慮すると、酵母ｅＲＦ３とＰｒＰは、共通の機構によってタンパク質のコンフォメーション変化が行われる可能性が高い。従って、酵母ｅＲＦ３のプリオン化の過程を詳細に検討することにより、ＰｒＰのコンフォメーション変化の機構を解明することが可能になると考えられる。
本発明は、以上の技術的背景の下になされたものであり、酵母ｅＲＦ３におけるプリオン化の感染に関与する部位を特定し、その感染機構を明らかにすることを目的とする。
発明の開示
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、異種ｅＲＦ３間におけるプリオン化の感染に重要な働きを果たす配列を幾つか見出した。更に、それらの配列の中の一つを介するプリオン化の感染が、異常型ＰｒＰの感染に多くの点で類似していることを見出した。以上の知見に基づき本発明は完成されたものである。
即ち、本発明の第一は、配列番号１記載のアミノ酸配列により表されるペプチドである。
本発明の第二は、プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３である。
本発明の第三は、配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるペプチドである。
本発明の第四は、プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３である。
本発明の第五は、プリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３である。
本発明の第六は、以下の工程（１）〜（３）を含む異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング方法である。
（１）プリオン化したｅＲＦ３を有する酵母を試験物質と接触させる工程
（２）（１）の酵母に、プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を含む酵母ｅＲＦ３を発現させる工程
（３）試験物質が、（２）で発現させた酵母ｅＲＦ３のプリオン化を阻害するか否かを確認する工程
本発明の第七は、以下の工程（１）及び（２）を含む異常型ＰｒＰの検出方法である。
（１）プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列又はＰｒＰ配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３を含む酵母に、被検サンプルを移入する工程
（２）酵母ｅＲＦ３がプリオン化するか否かを確認する工程
本発明の第八は、正常型ＰｒＰと、プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３、又はプリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３とを接触させる工程を含む異常型ＰｒＰの作製方法である。
本発明の第九は、以下の工程（１）〜（３）を含む異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させる物質のスクリーニング方法である。
（１）正常型ＰｒＰと、プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３、又はプリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３とを接触させ、異常型ＰｒＰを得る工程
（２）異常型ＰｒＰと、試験物質を接触させる工程
（３）試験物質が異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させるか否かを確認する工程
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のペプチド
配列番号１記載のアミノ酸配列（Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ）により表されるペプチドは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来のｅＲＦ３のプリオンドメインに含まれるペプチドである。このペプチドは、以下のような機能を持つ。プリオン化したｅＲＦ３は正常なｅＲＦ３をプリオン化する働きを持つが、このようなプリオン化の感染は、原則として同種のｅＲＦ３間においてのみ起こり、異種のｅＲＦ３間では起こらない。しかし、感染源とするｅＲＦ３として、プリオンドメイン中にこのペプチドの繰り返し配列が組み込まれているｅＲＦ３を用いた場合には、同種のｅＲＦ３間だけでなく、異種のｅＲＦ３間においてもプリオン化の感染が起きるようになる。従って、上記ペプチド、あるいはプリオンドメイン中に上記ペプチドの繰り返し配列が組み込まれているｅＲＦ３は、異種のｅＲＦ３間におけるプリオン化の感染機構を調べるためのモデルを作製する際に使用することができる。更に、このようなモデルは異種のｅＲＦ３間におけるプリオン化の感染を妨げる物質を探索するために利用することができる。
なお、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋに登録されている（Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢＯ３９７４９）。
（Ｂ）Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のペプチド
配列番号２記載のアミノ酸配列（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ）により表されるペプチドは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のｅＲＦ３のプリオンドメインに含まれるペプチドである。このペプチドは、以下のような機能を持つ。上述のようにプリオン化の感染は、原則として同種のｅＲＦ３間においてのみ起こるが、感染させようとする正常なｅＲＦ３として、プリオンドメイン中にこのペプチドの繰り返し配列が組み込まれているｅＲＦ３を用いた場合には、異種のｅＲＦ３間の感染が起きるようになる。従って、上記と同様に、このペプチド、あるいはプリオンドメイン中にこのペプチドの繰り返し配列が組み込まれているｅＲＦ３は、異種のｅＲＦ３間におけるプリオン化の感染機構を調べるためのモデルを作製する際に使用することができる。また、このペプチドを介したプリオン化の感染の仕方は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓなどの他の酵母ｅＲＦ３の感染と多くの点で異なっており、むしろ異常型ＰｒＰの感染と共通点が多い。従って、このペプチドは、後述するような異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング方法などに利用することもできる。
なお、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋに登録されている（Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢＯ３９７５２）。
（Ｃ）異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング方法
配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を介した酵母ｅＲＦ３のプリオン化の感染は、以下の点で他の酵母ｅＲＦ３の感染と異なっており、また、異常型ＰｒＰの感染と共通している。
▲１▼  酵母ｅＲＦ３のプリオンドメインに存在する繰り返し配列は、ＡｓｎやＧｌｎを多く含むが、ＰｒＰの繰り返し配列にはこのような特徴はみられない。配列番号２記載のアミノ酸配列は、ＡｓｎやＧｌｎを含まず、この点でＰｒＰの繰り返し配列に類似している。
▲２▼  プリオン化したｅＲＦ３は、塩酸グアニジンにより正常なｅＲＦ３へ回復するが、ＰｒＰにはこのような性質は確認されていない。配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を含むｅＲＦ３がプリオン化した場合も、塩酸グアニジンによる回復はみられず、この点もＰｒＰと類似している。
▲３▼  プリオン化したｅＲＦ３は、ＨＳＰ１０４遺伝子の破壊によって正常なｅＲＦ３へ回復するが、ＰｒＰにはこのような性質は確認されていない。配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を含むｅＲＦ３がプリオン化した場合も、ＨＳＰ１０４遺伝子の破壊による回復はみられず、この点もＰｒＰと類似している。
以上のことから、配列番号２記載のアミノ酸配列を介したｅＲＦ３のプリオン化の感染は、異常型ＰｒＰと同様の機構によるものである可能性が高い。従って、以下の工程（１）〜（３）によって、プリオン化したｅＲＦ３の感染を阻害する物質をスクリーニングすることにより、異常型ＰｒＰの感染阻害物質をスクリーニングすることが可能であると考えられる。
（１）プリオン化したｅＲＦ３を有する酵母を試験物質と接触させる工程
（２）（１）の酵母に、プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を含む酵母ｅＲＦ３を発現させる工程
（３）試験物質が、（２）で発現させた酵母ｅＲＦ３のプリオン化を阻害するか否かを確認する工程
ここで使用する「プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を含む酵母ｅＲＦ３」は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａから得られたｅＲＦ３（ＹＬ  ｅＲＦ３）のように、もともとこの繰り返し配列を持っているものでも、実施例に記載したＹＬＲＰ  ｅＲＦ３、Δ１２１ＹＬＲＰ  ｅＲＦ３のようにこの繰り返し配列を後から人為的に組み込んだものでもよい。ＹＬ  ｅＲＦ３が高頻度でプリオン化することから（実施例３表３）、この繰り返し配列を含むｅＲＦ３も高い頻度でプリオン化すると予想される。このようなプリオン化し易いという性質は、異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニングを行う上で非常に有効な性質である。
酵母ｅＲＦ３のプリオン化を阻害するか否かを確認することは、公知の方法によって行うことができる。例えば、プリオン化したｅＲＦ３は凝集体を形成するので、この凝集体を蛍光標識物質や超遠心処理を用いた方法によって検出し、それによって試験物質がプリオン化を阻害したか否かを確認することができる。また、酵母株として７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株を用いた場合には、ｅＲＦ３がプリオン化しているかどうかによって酵母が形成するコロニーの色が変化するので、このコロニーの色によって、試験物質が異常化を阻害したか否かを確認することができる。
（Ｄ）異常型ＰｒＰの検出方法
上述のように、配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を介したｅＲＦ３のプリオン化の感染は、異常型ＰｒＰと同様の機構によるものである可能性が高い。従って、以下の工程（１）及び（２）によって、サンプル中の異常型ＰｒＰを検出することが可能であると考えられる。
（１）プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列又はＰｒＰ配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３を含む酵母に、被検サンプルを移入する工程
（２）酵母ｅＲＦ３がプリオン化するかどうかを確認する工程
使用する「プリオンドメイン中に配列番号２記載のアミノ酸配列の繰り返し配列を含む酵母ｅＲＦ３」は、上述の「（Ｃ）異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング方法」と同様のものでよい。また、酵母ｅＲＦ３のプリオン化の確認も、「（Ｃ）異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニング方法」と同様に、凝集体形成やコロニーの色の確認などにより行うことができる。
被検サンプルは特に限定されないが、牛の脳や脊髄液の一部あるいは牛肉などを例示することができる。
被検サンプルを移入する方法も特に限定されないが、リポフェクション法などを例示できる。
（Ｅ）異常型ＰｒＰの作製方法
プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３、及びプリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３は、他種の酵母ｅＲＦ３をプリオン化することができる。酵母ｅＲＦ３と哺乳類のＰｒＰとは幾つか共通点があるので、正常型ＰｒＰと前述した酵母ｅＲＦ３とを接触させることにより、正常型ＰｒＰを異常型ＰｒＰに変換できると考えられる。
ここで、「プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３」としては、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓから得られたｅＲＦ３（ＫＬ  ｅＲＦ３）や実施例５で作製したキメラｅＲＦ３であるＣｈｉＢ及びＣｈｉＣなどを挙げることができる。
「プリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３」としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３のオリゴペプチドリピート領域をポリグルタミンで置換することにより得られるペプチドを挙げることができる。
使用する正常型ＰｒＰは特に限定されないが、例えば、ウシやヒト由来のＰｒＰを使用することができる。
なお、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋに登録されている（Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｍ２１１２９）
（Ｆ）異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させる物質のスクリーニング方法
上述の「（Ｅ）異常型ＰｒＰの作製方法」を利用することにより、異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させる物質のスクリーニングを行うことができると考えられる。即ち、以下の（１）〜（３）の工程により、正常型ＰｒＰに回復させる物質をスクリーニングできる。
（１）正常型ＰｒＰと、プリオンドメイン中に配列番号１記載のアミノ酸配列の繰り返し配列が組み込まれている酵母ｅＲＦ３、又はプリオンドメイン中の配列の一部がポリグルタミン配列に置換されている酵母ｅＲＦ３とを接触させ、異常型ＰｒＰを得る工程
（２）異常型ＰｒＰと、試験物質を接触させる工程
（３）試験物質が異常型ＰｒＰを正常型ＰｒＰに回復させるか否かを確認する工程
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００１−１８５０３９号の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
〔実施例１〕酵母ｅＲＦ３遺伝子の単離
東京大学分子細胞生物研究所から分譲を受けたＣａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ（ＩＡＭ  Ｎｏ．１２２４７）、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ（ＩＡＭ  Ｎｏ．１２８３５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（ＩＡＭ  Ｎｏ．１２４９２）、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ＩＡＭ  Ｎｏ．４９４８）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ（ＩＡＭ  Ｎｏ．１２８７９）の５種類の酵母をＹＰＤ培地で飽和状態まで培養し、集菌後１Ｍソルビトールに懸濁し、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔ（ＫＩＲＩＮ  ＢＲＥＷＥＲＹ）を加え、３７度で１時間処理した後１％ＳＤＳを加えた。得られた試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿後ＴＥに溶解した。ゲノムＤＮＡからλＤＡＳＨＩＩを用いてジェノミックライブラリーを作製し、プラークハイブリダイゼーションによってｅＲＦ３遺伝子を単離した。プローブにはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｅＲＦ３遺伝子内のＨｐａＩ断片（７５０−１２３６ｎｔ）を使用した。得られた陽性クローンからＤＮＡを調製し、遺伝子断片をｐＵＣ１１８にサブクローニングし、塩基配列の決定を行った。その結果、全ての酵母ｅＲＦ３遺伝子はプリオン化を引き起こすために必要とされるプリオンドメイン（Ｎ末端ドメイン）を有していた（図１）。
また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｅＲＦ３との相同性をプリオンドメイン及び機能ドメイン（Ｃ末端ドメイン）のそれぞれについて求めた（図１）。図１に示すように、機能ドメインの相同性は高いのに対して、プリオンドメインの種間の相同性は非常に低かった。
〔実施例２〕酵母ｅＲＦ３のプリオンドメインの解析
酵母ｅＲＦ３のプリオンドメイン中に含まれるオリゴペプチドリピートの検索を行った。オリゴペプチドリピートの検索は、アミノ酸シークエンス中の５〜１２ベースのすべての配列に対して、それと同じ配列を持つ部位をコンピューター解析によって行った。ミスマッチは５ベースの配列では１、６〜９ベースでは２、１０〜１２ベースでは３まで許した。この結果を表１に示す。（）はコンピューター解析ではスコアーされなかったが、相同性が認められる配列を示している。
2002103019.tif 000002
2002103019.tif 000003
表１に示すように、すべての種で固有のオリゴペプチドリピートの存在が確認できた。特に、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａはＮ末端ドメイン全体を通してリピート配列に富んだ構造をしていた。
次に、各酵母ｅＲＦ３のＮ末端ドメイン中のアミノ酸残基中に占めるＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＴｙｒの比率を求めた。この結果を表２に示す。
2002103019.tif 000004
表２に示すように、Ｎ末端ドメインでは、上述のアミノ酸の占める割合が高く、これらのアミノ酸残基が全体の７０％以上を占めていた。
〔実施例３〕  酵母ｅＲＦ３のプリオン様特性の検出
ｅＲＦ３はペプチド鎖解離因子のサブユニットであり、ｅＲＦ３がプリオン化すると正常なストップコドンの認識が出来なくなり、結果として弱いナンセンスサプレッサー活性（［ＰＳＩ＋］）を有するようになる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ７４−Ｄ６９４株（Ｃｈｅｒｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）は、このサプレッサー活性を検出できる株である。この株では、アデニン合成に関わるａｄｅ１遺伝子内にナンセンスミューテーション（ａｄｅ１−１４（ＵＧＡ））があり、通常の状態ではアデニンの前駆体が細胞内に蓄積し、赤いコロニーが形成される。しかし、ｅＲＦ３がプリオン化すると、サプレッサー活性によってａｄｅ１遺伝子産物が合成されるようになり、白いコロニーが形成される。つまり、この株が形成するコロニーカラーによって、株内のｅＲＦ３がプリオン化（［ＰＳＩ＋］化）しているかどうかを判別することができる。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母のｅＲＦ３も［ＰＳＩ＋］化するかどうかを調べるため、このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ７４−Ｄ６９４株を利用し、以下の実験を行った。
まず、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ７４−Ｄ６９４株の染色体上のｅＲＦ３遺伝子を欠失させ、自身のｅＲＦ３が発現しない株（７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株）を作製した。７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株の作製は以下のように行った。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３遺伝子を含むＰｖｕＩＩ−ＸｂａＩ  ３．４ｋｂ  ＤＮＡ断片をｐＨＳＧ３９９  ＨｉｎｃＩＩ−ＸｂａＩ  ｓｉｔｅにクローニングし（ｐＨＳＧｓｕｐ３５）、この遺伝子断片中のＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ断片をＬＥＵ２のマーカーで置き換えた（ｐＨＳＧΔｓｕｐ３５：：ＬＥＵ２）。このプラスミドのクローニングされている遺伝子断片をユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、野生型ｅＲＦ３遺伝子をプラスミド（ｐＲＳ３１６）で維持している７４−Ｄ６９４株に形質転換した。ＬＥＵ＋株を選択し、ゲノミックＰＣＲによって遺伝子破壊がおこなわれていることを確認した。
次に、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に、各酵母のｅＲＦ３を発現させるプラスミドを導入した後、ＹＰＤ培地上で培養し、形成されたコロニーの色を調べた。各酵母のｅＲＦ３を発現させるプラスミドは、以下のプライマーとｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒを用いて各酵母のｅＲＦ３遺伝子をＰＣＲ法によって増幅し、増幅断片をプラスミドｐＹＸ１１２あるいはｐＲＳ３１３上でＴＰＩ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅあるいはＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅを用いてクローニングすることにより作製した。
2002103019.tif 000005
以上のような処理を行った７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株は、外来のｅＲＦ３が［ＰＳＩ＋］化した場合は白色のコロニーを形成し、［ＰＳＩ＋］化しなかった場合（［ｐｓｉ−］ともいう）は赤色のコロニーを形成する（図２）。外来のｅＲＦ３を７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株内で発現させた場合の白色コロニーの出現頻度を表３（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）に示す。また、ｅＲＦ３のプリオンドメインを過剰発現させることにより［ＰＳＩ＋］化が誘導されることが知られている（Ｔｅｒ−Ａｖａｎｅｓｙａｎ  ｅｔａｌ．，１９９３；Ｃｈｅｒｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｄｅｒｋａｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。そこで、外来のｅＲＦ３を発現させるとともに、同種のｅＲＦ３のプリオンドメインをｐＹＥＳを用いて過剰発現させ、この場合の白色コロニーの出現頻度も調べた（表３ｉｎｄｕｄｃｅｄ）。
2002103019.tif 000006
表３に示すように、プリオンドメインの過剰発現の有無にかかわらず、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３を発現させた場合には非常に高い頻度（１０−１）で［ＰＳＩ＋］化が起こった。
［ＰＳＩ＋］化した酵母のｅＲＦ３は、塩酸グアニジンの添加により、正常型へと回復することが知られている。そこで、プレート上に３ｍＭの塩酸グアニジンを添加し、その後のコロニーの色の変化を調べた。
図３の左図が外来のｅＲＦ３を発現させ、ＡＤＥ＋コロニーを選抜したプレートを示しており、図３の右図が左図のプレートに塩酸グアニジンを添加した後のプレートを示している。これらの図に示すように、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３を導入した株以外のすべての株で、コロニーの色が赤色へ変化した。このことから、コロニーの白色化は、導入したｅＲＦ３の［ＰＳＩ＋］化によってもたらされたことが確認された。なお、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３を導入した株は赤色ではなく、ピンク色のコロニーを形成した。
〔実施例４〕  酵母プリオンにおける異種間感染性の検定
ＰｒＰにおいてその異種間感染性の障壁（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂａｒｒｉｅｒ）が存在することがよく知られているが、［ＰＳＩ＋］化したｅＲＦ３においても最近種間の感染性の障壁がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（Ｋｕｓｈｎｉｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｈｅｒｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（Ｓａｎｔｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）で確認されている。
そこで、ｅＲＦ３における種間の感染性の障壁について更に詳細に調べるため、以下の実験を行った。
実施例３で、各酵母（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ）のｅＲＦ３を発現させることにより、表現型が［ＰＳＩ＋］に変化したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉのｅＲＦ３をｐＹＸ１１２を用いて発現させ、その後、ＹＰＤ培地上で培養し、形成されるコロニーの色を調べた。感染性の障壁があり、新たに発現させたｅＲＦ３が［ＰＳＩ＋］化しなければ、赤色のコロニーが形成されるが、新たに発現させたｅＲＦ３も［ＰＳＩ＋］化した場合は、白色のコロニーが形成される。
［ＰＳＩ＋］化したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３に各種酵母のｅＲＦ３を導入した株のコロニーの状態を図４Ａに、［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３に各種酵母のｅＲＦ３を導入した株のコロニーの状態を図４Ｂに、［ＰＳＩ＋］化した各種酵母のｅＲＦ３にＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３を導入した株のコロニーの状態を図４Ｃに、それぞれ示す。また、コロニー１００当たりの白色でかつ塩酸グアニジンにより赤色に変化するコロニーの数を表４に示す。
2002103019.tif 000007
表４に示すように、多くの種間で感染性の障壁が存在したが、Ｋ．ｌａｃｔｉｓとＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３には特殊な性質が見られた。Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３は今回実験に用いた全ての種のｅＲＦ３に対し、高率で［ＰＳＩ＋］化を誘導した（図４Ｂ）。一方、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３は、実験に用いた全ての種のｅＲＦ３によって高率で［ＰＳＩ＋］化が誘導された（図４Ｃ）。
〔実施例５〕Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおける異種間感染性の機構
Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３プリオンドメインにはこれといった特徴ある配列は見あたらない。［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３が示す強い感染性に関与するシスエレメントを同定するため、以下の４種類のＫ．ｌａｃｔｉｓとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとのキメラｅＲＦ３を作製した（図５）。
１）ＣｈｉＡ
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｓｕｐ３５遺伝子のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を、以下のプライマー用いて増幅させたＫ．ｌａｃｔｉｓのｓｕｐ３５遺伝子断片と置き換えることにより作製した。
2002103019.tif 000008
２）ＣｈｉＢ
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｓｕｐ３５遺伝子のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、以下のプライマーを用いて増幅させたＫ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｐ３５遺伝子断片と置き換えることにより作製した。
2002103019.tif 000009
３）ＣｈｉＣ
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｓｕｐ３５遺伝子のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、以下のプライマーを用いて増幅させたＫ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｐ３５遺伝子断片と置き換えることにより作製した。
2002103019.tif 000010
４）ＣｈｉＤ
ＣｈｉＡ遺伝子のＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片を、以下のプライマーを用いて増幅させたＫ．ｌａｃｔｉｓのｓｕｐ３５遺伝子断片と置き換えることにより作製した。
2002103019.tif 000011
以上のように作製した４種類のキメラｅＲＦ３が、異種のｅＲＦ３を［ＰＳＩ＋］化するかどうかをコロニーの色と凝集体の形成の二通りの方法で判定した。
コロニーの色による判定は以下のように行った。７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に、ｐＲＳ３１３を用いてキメラｅＲＦ３を導入し、この株の表現型を［ＰＳＩ＋］とした。この株に、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉのｅＲＦ３をｐＹＸ１１２を用いて導入した後、ＹＰＤ培地で培養し、コロニーを形成させた。白色のコロニーが形成され、そのコロニーが塩酸グアニジンの添加により、赤色に変化した場合を「感染性あり」と判定した。
凝集体の形成による判定は以下のように行った。キメラｅＲＦ３を導入し、表現型を［ＰＳＩ＋］とした７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉのｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質を発現する配列をｐＹＸ１１２を用いて導入した後、蛍光顕微鏡で細胞の状態を観察した。［ＰＳＩ＋］化したｅＲＦ３は、凝集体を形成するので、蛍光顕微鏡で蛍光の点（凝集体）が観察される場合を「感染性あり」と判定した。
なお、キメラｅＲＦ３の代わりに、Ｋ．ｌａｃｔｉｓとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３についても同様の実験を行い、対照とした。以上の結果を表５に示す。
2002103019.tif 000012
表５に示すように、ＣｈｉＢ及びＣｈｉＣの２種類のキメラｅＲＦ３が異種酵母のｅＲＦ３の［ＰＳＩ＋］化を誘導した。これらのキメラｅＲＦ３はいずれもＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３のオリゴリピートを含む断片（４３−１２６残基）を含むものである。一方、この断片を含まないＣｈｉＡ及びＣｈｉＤは、いずれも感染性を示さない。従って、異種酵母のｅＲＦ３を［ＰＳＩ＋］化するには、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３のオリゴリピートを含む断片が必須であると推定される。
〔実施例６〕  ［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３の感染性の検定  ［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３が、他のｅＲＦ３を［ＰＳＩ＋］化することを確認するため、以下の実験を行った。
まず、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に、ｐＲＳ３１３を用いてＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３遺伝子を導入し、この株の表現型を［ＰＳＩ＋］とした。次に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉのｅＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子を以下のようにして作製した。
１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｅＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子（ＮＭＳＣ−ＧＦＰ）
この遺伝子は、ｐＹＸ１１２Ｓｕｐ３５ＳＣのＨｐａＩ−ＳａｃＩ断片を、以下のプライマーを用い、ｐＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型として増幅させたＧＦＰ遺伝子断片と置き換えることにより作製した。
2002103019.tif 000013
２）Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子（ＮＭＫＬ−ＧＦＰ）
この遺伝子は、以下のプライマーを用いて増幅させたＫ．ｌａｃｔｉｓ  ｅＲＦ３のプリオンドメインをｐＹＸ１１２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ  ｓｉｔｅにクローニングし、次に、このプラスミドのＳａｌＩ−ＳａｃＩ  ｓｉｔｅに上述のＧＦＰ遺伝子断片をクローニングすることにより作製した。
2002103019.tif 000014
３）Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ  ｅＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子（ＮＭＤＨ−ＧＦＰ）
この遺伝子は、以下のプライマーを用いて増幅させたＤ．ｈａｎｓｅｎｉｉ  ｅＲＦ３のプリオンドメインをｐＹＸ１１２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ  ｓｉｔｅにクローニングし、次に、このプラスミドのＳａｌＩ−ＳａｃＩ  ｓｉｔｅに上述のＧＦＰ遺伝子断片をクローニングすることにより作製した。
2002103019.tif 000015
以上のようにして作製した遺伝子をｐＹＸ１１２を用いて上述の［ＰＳＩ＋］化した７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に導入した後、蛍光顕微鏡で観察した。
なお、［ｐｓｉ−］のｅＲＦ３を持つ７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株についても上記と同様の操作を行い、対照とした。この結果を図６Ａに示す。
図６Ａの上段が［ｐｓｉ−］の７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株を使用した場合の画像であり、図６Ａの下段が［ＰＳＩ＋］の７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株を使用した場合の画像である。これらの図が示すように、［ＰＳＩ＋］化したｅＲＦ３を持つ７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株では、発現した融合タンパク質が凝集体を形成しており、［ＰＳＩ＋］の表現型が維持されていた。
〔実施例７〕  ｅＲＦ３間の接触の確認
［ＰＳＩ＋］化したｅＲＦ３が、新たに導入されたｅＲＦ３と接触しているかどうかを、ＧＦＰとＢＦＰの二重蛍光により確認した。
まず、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質（ＫＬ−ＧＦＰ）を発現する遺伝子、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｅＲＦ３とＢＦＰの融合タンパク質（ＳＣ−ＢＦＰ）を発現する遺伝子を以下のようにして作製した。
ＳＣ−ＢＦＰ：ｐＹＸ１１２Ｓｕｐ３５ＳＣのＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片を、以下のプライマーを用い、ｐＱＢＩ５０（ＴＡＫＡＲＡ）の鋳型として増幅させたＢＦＰ遺伝子断片で置き換えることにより、作製した。
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ＫＬ−ＧＦＰ：ｐＲＳ３１３ＴＰＩｓｕｐ３５ＳＣのＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ遺伝子断片を、以下のプライマーを用いて増幅させたＫ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｐ３５遺伝子断片で置き換え、更に、Ｓａｌ−ＳａｃＩ遺伝子断片を上述のＧＦＰ遺伝子断片で置き換えることにより作製した。
2002103019.tif 000017
次に、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に、ｐＲＳ３１３を用いてＫＬ−ＧＦＰを発現する遺伝子を導入し、この株の表現型を［ＰＳＩ＋］とした。その後、ｐＹＸ１１２を用いてＳＣ−ＢＦＰを発現する遺伝子を導入した。以上の操作を行った７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ２−ＲＦＣ）で観察し、ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃ−３０３０）によりその画像を撮影した。この結果を図６Ｂの右図に示す。図の上段はＤＭＩＢフィルター（Ｏｌｙｍｐｕｓ：ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ４９０ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ５１５ｎｍ）によりＧＦＰによる蛍光のみが観察されるようにしており、図の下段はＸＥ１１３−２フィルター（ＯＭＥＧＡ  ＯＰＴＩＣＡＬ：ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３８７ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ４５０ｎｍ）によりＢＦＰによる蛍光のみが観察されるようにしている。これらの図に示すように、ＧＦＰで標識されている凝集体とＢＦＰで標識されている凝集体の位置は完全に一致していた。このことから、［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３は、直接Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３と接触していることが明らかになった。
なお、図６Ｂの左図はＫＬ−ＧＦＰを発現する遺伝子により［ＰＳＩ＋］化させた７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株の蛍光顕微鏡写真を示し、図６Ｂの中央図はＳＣ−ＢＦＰを発現する遺伝子により［ＰＳＩ＋］化させた７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５の蛍光顕微鏡写真を示す。
〔実施例８〕  感染源除去後の表現型の検定
７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株にｐＲＳ３１３を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３遺伝子を導入し、この株の表現型を［ＰＳＩ＋］にした（段階１）。この株に、ｐＹＸ１１２を用いてＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３遺伝子を導入した（段階２）。一定期間培養後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３遺伝子を含むプラスミドが脱落した株を選択した（段階３）。
段階１〜３における７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株のｌｙｓａｔｅを超遠心（１００，０００ｇ）によりｗｈｏｌｅ  ｌｙｓａｔｅ（Ｗ）とｓｕｐｅｒｎａｎｔ（Ｓ）に分離し、両画分中に含まれるｅＲＦ３を抗体を用いて検出した。この結果を図７Ａに示す。図中の［ＰＳＩ＋ＳＣ］、［ＰＳＩ＋ＳＣ＋ＹＬ］、［ＰＳＩ＋ＹＬ］がそれぞれ段階１、段階２、段階３に対応している。これらの図が示すように、段階１〜３のいずれにおいても、ｅＲＦ３はｗｈｏｌｅ  ｌｙｓａｔｅ画分においてのみ検出され、ｓｕｐｅｒｎａｎｔ画分では検出されなかった。［ＰＳＩ＋］化したｅＲＦ３は巨大な凝集体をつくるため、ｓｕｐｅｒｎａｎｔ画分には検出されない。従って、上述の結果は、段階１〜３のいずれにおいても７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株の表現型は［ＰＳＩ＋］であったことを意味する。
７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株にｐＲＳ３１３を用いてＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３遺伝子を導入し、この株の表現型を［ＰＳＩ＋］にした（段階１）。この株に、ｐＹＸ１１２を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３遺伝子を導入した（段階２）。一定期間培養後、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３遺伝子を含むプラスミドが脱落した株を選択した（段階３）。
段階１．３における７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株のｌｙｓａｔｅを上記と同様にｗｈｏｌｅ  ｌｙｓａｔｅ（Ｗ）とｓｕｐｅｒｎａｎｔ（Ｓ）に分離し、両画分中に含まれるｅＲＦ３の検出を行った。この結果を図７Ｂに示す。図中の［ＰＳＩ＋ＫＬ］と［ＰＳＩ＋ＫＬ＋ＳＣ］がそれぞれ段階１と段階２に対応している。また、Ｓｕｐ３５ＫＬ  ｓｅｇｒｅｇａｎｔｓが段階３に対応している。これらの図が示すように、段階１及び段階２においてはｅＲＦ３はｗｈｏｌｅ  ｌｙｓａｔｅ画分においてのみ検出されており、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株の表現型は［ＰＳＩ＋］に維持されている。しかし、段階３では、全体の約９５％の株でｓｕｐｅｒｎａｎｔにおいてもｅＲＦ３が検出され、表現型が［ｐｓｉ−］に変化していた。
以上のように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３を用いてＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３を［ＰＳＩ＋］化しようとする場合は、感染源であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３を取り除いた後も、［ＰＳＩ＋］の表現型は維持されるのに対し、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ｅＲＦ３を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３を［ＰＳＩ＋］化しようとする場合は、感染源であるＫ．ｌａｃｔｉｓ  ｅＲＦ３を取り除くと、表現型が［ｐｓｉ−］に変化してしまう。
これは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３が細胞内で共存するとき、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３の凝集体が核（ｃｏｒｅ）を形成し、その凝集体にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３が接触しているのではないかと考えられる（図７Ｃ）。そして、核が取り除かれると、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３の凝集は解除され、表現型が［ＰＳＩ＋］から［ｐｓｉ−］へ変化するのであろうと推測される。なお、数％の株ではＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３を取り除いた後も安定に［ＰＳＩ＋］が維持される。このことは［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓ  ｅＲＦ３にｃｒｏｓｓ−ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎの能力があることを意味している。
〔実施例９〕  ［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３の解析
［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３が、他の［ＰＳＩ＋］化したｅＲＦ３とやや異なる性質を示したため、より詳しい解析を行った。
［ＰＳＩ＋］化したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３では、その形質維持にＨＳＰ１０４の存在が必要であることが知られている（Ｃｈｅｒｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３も同様の性質を示すかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株にｐＲＳ３１４を用いてＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３遺伝子を導入した［ＰＳＩ＋］の株でｈｓｐ１０４の遺伝子破壊を行った。ｈｓｐ１０４遺伝子を破壊した７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株の作製は、ｈｓｐ１０４遺伝子を含む３．３ｋｂ  ＤＮＡ断片中のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をＨＩＳ３のマーカーで置き換えたＤＮＡ断片（Δｈｓｐ１０４：：ＨＩＳ３）を、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に導入し、ＨＩＳ＋の形質転換株を選択し、ゲノミックＰＣＲで確認することにより行った。このような処理を行った後、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株をＹＰＤ培地上で培養し、形成されるコロニーの色を調べた。また、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株のｌｙｓａｔｅをｗｈｏｌｅ  ｌｙｓａｔｅ（Ｗ）とｓｕｐｅｒｎａｎｔ（Ｓ）に分離し、両画分中に含まれるｅＲＦ３を抗体を用いて検出した。この結果を図８Ａに示す。図８Ａの右側がｈｓｐ１０４遺伝子を破壊した場合で、左側がｈｓｐ１０４遺伝子を破壊しなかった場合のコロニー等を示している。この図が示すように、ｈｓｐ１０４遺伝子を破壊した場合はコロニーは赤色で、ｓｕｐｅｒｎａｎｔ（Ｓ）画分中からもｅＲＦ３が検出された。即ち、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３もＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３と同様ＨＳＰ１０４が存在しないと、［ＰＳＩ＋］の形質を維持することができなかった。
更に、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株のｈｓｐ１０４遺伝子を破壊した後、この株にｐＲＳ３１３を用いてＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質を発現する遺伝子を導入し、その細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。この結果を図８Ｂに示す。図８Ｂの右図がｈｓｐ１０４遺伝子を破壊した細胞で、左図がｈｓｐ１０４遺伝子を破壊しなかった細胞を示している。この図が示すように、ｈｓｐ１０４遺伝子を破壊した細胞では、凝集体が形成されなかった。この結果も上記と同様、［ＰＳＩ＋］の形質維持にＨＳＰ１０４が必須であることを示すものである。
〔実施例１０〕  Ｋ．ｌａｃｔｉｓ細胞内における［ＰＳＩ＋］化の検定
以上の実験では、ｅＲＦ３の［ＰＳＩ＋］化はすべてＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅの細胞内で行ってきた。Ｋ．ｌａｃｔｉｓの細胞内でも同様にｅＲＦ３の［ＰＳＩ＋］化が起きるかどうかを確かめるため、以下の実験を行った。
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＳＡＹ１１９株（ＭＡＴａ  ｕｒａＡ１，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ａｄｅ１，ｍｅｔＡ１；Ａｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）にＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質を発現する遺伝子を導入し、過剰発現させた。このような処理を行ったＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＳＡＹ１１９株を蛍光顕微鏡で観察した。この結果、低頻度（１／１０００程度）ではあったが、図８Ｃに示すような凝集体の形成が確認された。このことは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓの細胞内でもＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３が［ＰＳＩ＋］化し得ることを強く示唆する。
Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおいては、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株のような［ＰＳＩ＋］の形質の検出に適した株は知られていない。そこで、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株のａｄｅ１−１４遺伝子をＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＳＡＹ１１９株に導入し、コロニーカラーにより［ＰＳＩ＋］化を検出できる株を作製した。このようにして作製した株にＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質を発現する遺伝子を導入し、過剰発現させた。この結果、白色のコロニーを形成した株は１０−５の頻度で出現し、そのうち３／８の株で、凝集体の形成が確認された（図８Ｄ左図）。このような凝集体を形成した株を塩酸グアニジンを含む培地で培養すると凝集体は消失した（図８Ｄ右図）。このような事実も、Ｋ．ｌａｃｔｉｓの細胞内でＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３が［ＰＳＩ＋］化し得ることを示唆する。
また、今回観察された［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３の凝集体をつくるという性質は、ＴＰＩプロモーターという強発現プロモーターを用いることによってはじめて観察できるものなのか、それとも低発現プロモーターを用いても観察できるものなのかを調べた。
７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３とＧＦＰを発現する遺伝子を、低発現ベクターであるｐＹＸ１１１（７８６プロモーター；Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて導入し、蛍光顕微鏡で細胞の状態を観察した。その結果、大きさは小さかったが、凝集体の形成が確認された（図８Ｅ右図）。凝集体が小さいのは核になるＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３の凝集体の発現量が低いためではないかと推測される。この結果から［ＰＳＩ＋］化したＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦの凝集体をつくる性質は発現量によってのみ発現するのではなく、そのアミノ酸配列に起因していることが示された。
〔実施例１１〕  Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのリピート配列の解析
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ｅＲＦ３のＮ末ドメインはリピート配列に富んでいる。中でも１８０番目の残基から始まるＧＧＡＬＫＩＧＧＤＫＰというリピートユニットの５回繰り返しは、そのリピートの長さと配列の正確な繰り返しにおいて際だっている。またこの繰り返し配列は全くＱ／Ｎを含んでいないという意味においても興味深い。Ｑ／Ｎ−ｒｉｃｈ配列というのは酵母プリオンにおいてみられる特徴であり、これは哺乳類ＰｒＰには見られない。全くＱ／Ｎを含んでいないリピート配列の解析はＰｒＰとの共通点を強調する形になり興味深い。
このような全くＱ／Ｎを含んでいないリピート配列（ＹＬＲＰ）が［ＰＳＩ＋］化を促進するかどうかをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３を用いて調べてみた。
まず、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３のオリゴペプチドリピート領域（Ｑ／Ｎを含む）を、この全くＱ／Ｎを含んでいないリピート配列で置き換えた（ＹＬＲＰｅＲＦ３；図９Ｂ）。リピート領域の置き換えは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３遺伝子のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶ遺伝子断片を、以下のプライマーによる増幅断片と置き換えることにより行った。
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次に、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５  ｐＹＸ１１２ｓｕｐ３５［ＰＳＩ＋］（［ＰＳＩ＋ＳＣ］）株に、上述のＹＬＲＰｅＲＦ３を発現する遺伝子を導入し、ＡＤＥ＋株を選択した。形成されるコロニーの色及びＹＭＰＰ−ＢＦＰ融合タンパク質の蛍光顕微鏡下での状態を観察した。この結果を図１０Ａに示す。この図が示すように、ＹＬＲＰｅＲＦ３を導入することにより、白色のコロニーが形成された。また、細胞内には、凝集体の形成が確認された。
Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔがすでに報告しているように安定した［ＰＳＩ＋］の形質を維持するためには、Ｑ／Ｎを含むリピート領域がこの領域は必要不可欠である。しかし、ＹＬＲＰｅＲＦ３は、そのようなＱ／Ｎ−ｒｉｃｈなリピート配列を含まなくても［ＰＳＩ＋］の形質を維持できることが明らかになった。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのリピート領域のＮ末端側にはＱ残基に富んだ領域がある。この領域を欠失させたΔ１２０ＹＬＲＰｅＲＦ３を作製した（図９Ｃ）。驚いたことに、この改変タンパク質は非常に高い確率で［ＰＳＩ＋］の形質に転換してしまった。この形質が［ＰＳＩ＋］であることはコロニーカラー、ＢＦＰ融合タンパク質、超遠心アッセイによって確認された（図１０Ｂ）。この現象はＱ／Ｎ−ｒｉｃｈというシークエンスによらないリピート構造のみでの［ＰＳＩ＋］形質という意味においてＰｒＰとの共通性を伺わせる。
〔実施例１２〕  ポリグルタミン置換ｅＲＦ３の感染性の検定
合成  ＤＮＡ：５’−ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧ  ＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡ  ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ  ＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡ  ＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧ  ＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣ  ＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡ  ＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧ  ＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣ  ＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡ  ＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡ  ＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣ  ＡＡＣＡＡＣＡＡＴＡ  ＣＧＧＡＴＡＴＣＣＣ  ＣＣ−３’（配列番号２８）を鋳型とし、下記の配列のプライマーを用いて増幅したＤＮＡ断片をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生型ｅＲＦ３遺伝子のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。
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この改変ｅＲＦ３遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生型ｅＲＦ３のオリゴペプチドリピート領域（４４−１１１）を、ポリグルタミン配列（Ｐｏｌｙ  Ｑ、Ｑ＝３９）で置き換えたタンパク質（ポリグルタミン置換ｅＲＦ３）をコードする（図１１）。
このポリグルタミン置換ｅＲＦ３遺伝子を７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に導入し、この株の表現型を［ＰＳＩ＋］とした。この酵母株に、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉのｅＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓとＤ．ｈａｎｓｅｎｉｉの融合タンパク質遺伝子の作製は、実施例６と同様に行った。Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ｅＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードする遺伝子は、以下のプライマーを用いて増幅させたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ｅＲＦ３のプリオンドメインをｐＹＸ１１２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ  ｓｉｔｅにクローニングし、次にこのプラスミドのＳａｌＩ−ＳａｃＩ  ｓｉｔｅに前述のＧＦＰ遺伝子断片をクローニングすることによって作製した。
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以上のようにして融合タンパク質遺伝子を導入した酵母株の状態を蛍光顕微鏡で観察した。この結果を図１２に示す。この図に示すように、いずれの種の酵母のｅＲＦ３を用いた場合も融合タンパク質の凝集体が観察され、［ＰＳＩ＋］の表現型が維持されていた。
〔実施例１３〕  ポリグルタミン置換ｅＲＦ３と異種ｅＲＦ３との接触の確認
上述のポリグルタミン置換ｅＲＦ３とＢＦＰの融合タンパク質（Ｐｏｌｙ  Ｑ−ＳＣ−ＢＦＰ）を発現する遺伝子を、実施例７と同様の方法で作製した。この遺伝子を７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株に導入し、酵母株の表現型を［ＰＳＩ＋］とした。次に、この酵母株に、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ  ｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質（ＤＨ−ＧＦＰ）を発現する遺伝子を導入し、その後、酵母株を蛍光顕微鏡で観察した（図１３）。ＤＨ−ＧＦＰ遺伝子は、ｐＲＳ３１４のＳａｃＩ  ｓｉｔｅＰＣＲ法を用いて増やしたＮＭＤＨ−ＧＦＰの遺伝子断片をクローニングすることにより作製した。
図１３に示すように、Ｐｏｌｙ  Ｑ−ＳＣ−ＢＦＰとＤＨ−ＧＦＰの凝集体の位置は完全に一致しており、両凝集体は共凝集体を形成しているものと考えられる。
〔実施例１４〕  ポリグルタミン置換ｅＲＦ３除去後の表現型の検定
Ｐｏｌｙ  Ｑ−ＳＣ−ＢＦＰ遺伝子とＤＨ−ＧＦＰ遺伝子を導入した７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株からＰｏｌｙ  Ｑ−ＳＣ−ＢＦＰ遺伝子を含むプラスミドを除去した後（プラスミドが脱落した株を選抜した）、この酵母株を実施例３と同様の方法で培養し、形成されるコロニーの色を調べた。また、この酵母株を蛍光顕微鏡で観察した。コロニーの状態を図１４に蛍光顕微鏡写真を図１５に示す。図中の左がＰｏｌｙ  Ｑ−ＳＣ−ＢＦＰ遺伝子を除去したものであり、右はＰｏｌｙ  Ｑ−ＳＣ−ＢＦＰ遺伝子の代わりに実施例５で作製したＣｈｉＣ遺伝子を導入し、除去したものである。
これらの図に示すように、Ｐｏｌｙ  Ｑ−ＳＣ−ＢＦＰ遺伝子を導入した場合は、この遺伝子が除去された後も、コロニーの色は白色で、また、凝集体形成が観察でき、［ＰＳＩ＋］の状態が維持されている。これに対し、ＣｈｉＣ遺伝子を導入した場合は、ＣｈｉＣ遺伝子除去後は、［ｐｓｉ−］の状態に変化している。
本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明は、異種ｅＲＦ３間におけるプリオン化の感染に関与するＫ．ｌａｃｔｉｓ又はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のペプチドを提供する。これらのペプチドは、異種のｅＲＦ３間におけるプリオン化の感染機構を調べるのに役立つ。
また、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のペプチドを含むｅＲＦ３は高い頻度でプリオン化し、また、その感染の仕方は、異常型ＰｒＰの感染の仕方に類似している。従って、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のペプチドを利用することにより、異常型ＰｒＰの感染阻害物質のスクリーニングや異常型ＰｒＰの検出が可能になる。
配列表フリーテキスト
配列番号１は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３に含まれるリピートモチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３に含まれるリピートモチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、Ｃ．ｍａｌｔｏｓａのｅＲＦ３遺伝子を増幅するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４は、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉのｅＲＦ３遺伝子を増幅するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３遺伝子を増幅するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号６は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのｅＲＦ３遺伝子を増幅するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉのｅＲＦ３遺伝子を増幅するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号８は、キメラｅＲＦ３であるＣｈｉＡを作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号９は、キメラｅＲＦ３であるＣｈｉＡを作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１０は、キメラｅＲＦ３であるＣｈｉＢを作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１１は、キメラｅＲＦ３であるＣｈｉＢを作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１２は、キメラｅＲＦ３であるＣｈｉＣを作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１３は、キメラｅＲＦ３であるＣｈｉＣを作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１４は、キメラｅＲＦ３であるＣｈｉＤを作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１５は、キメラｅＲＦ３であるＣｈｉＤを作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１６は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｅＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１７は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｅＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１８は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号１９は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２０は、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ  ｅＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２１は、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ  ｅＲＦ３のプリオンドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｅＲＦ３とＢＦＰの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｅＲＦ３とＢＦＰの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２４は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２５は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２６は、ＹＬＲＰｅＲＦ３を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２７は、ＹＬＲＰｅＲＦ３を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２８は、ポリグルタミン置換ｅＲＦ３を作製するために使用したＰＣＲの鋳型の塩基配列を示す。
配列番号２９は、ポリグルタミン置換ｅＲＦ３を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３０は、ポリグルタミン置換ｅＲＦ３を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３１は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３２は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ｅＲＦ３とＧＦＰの融合タンパク質を発現する遺伝子を作製するために使用したプライマーの塩基配列を示す。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＺ．ｒｏｕｘｉｉのｅＲＦ３とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３との相同性を示す図である。
第２図は、７４−Ｄ６９４Δｓｕｐ３５株を用いたコロニーアッセイ法の概要を示す図である。
第３図は、実施例３の結果を示す図である。
第４図は、実施例４の結果を示す図である。
第５図は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅＲＦ３とＫ．ｌａｃｔｉｓのｅＲＦ３とのキメラｅＲＦ３の構造を示す図である。
第６図は、実施例６及び実施例７の結果を示す図である。
第７図は、実施例８の結果を示す図である。
第８図は、実施例９及び実施例１０の結果を示す図である。
第９図は、ＳＣ  ｅＲＦ３、ＹＬＲＰ  ｅＲＦ３及びΔ１２１ＹＬＲＰ  ｅＲＦ３の構造を示す図である。
第１０図は、実施例１１の結果を示す図である。
第１１図は、ポリグルタミン置換ｅＲＦ３の構造を示す図である。
第１２図は、実施例１２の結果を示す図である。
第１３図は、実施例１３の結果を示す図である。
第１４図は、実施例１４の結果を示す図である。
第１５図は、実施例１４の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2002103019.tif 000044
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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