(57)【要約】Ｄ型肝炎ウイルス抗原（以下ＨＤＶ抗原という）のアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド（以下ＨＤＶ抗原ポリペプチドという）とＲＮＡポリメラーゼＩＩとを含む系中に被験化合物を添加し、該ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合量を測定し、該結合量と被験化合物無添加の結合量とを比較して、該結合を抑制している化合物を選択する。また、ＨＤＶ抗原ポリペプチドを含む系中に被験化合物を添加し、該ＨＤＶ抗原ポリペプチドと結合する被験化合物を選択する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ型肝炎ウイルス抗原（以下ＨＤＶ抗原という）のアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド（以下ＨＤＶ抗原ポリペプチドという）とＲＮＡポリメラーゼＩＩとを含む系中に被験化合物を添加し、該ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合量を測定し、該結合量と被験化合物無添加の結合量とを比較して、該結合を抑制している化合物を選択することを特徴とするＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項２】
ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、ＨＤＶ抗原のアミノ酸配列の全部を含むポリペプチドである請求項１記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項３】
ＨＤＶ抗原が、配列番号１、２および３記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項２記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項４】
ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、ＨＤＶ抗原のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチド（以下ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体という）である請求項１記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項５】
ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体が、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の群から選ばれるものである請求項４記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
【請求項６】
ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、請求項２〜５のいずれかに記載のポリペプチドに、さらにタグペプチド、マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれる一つ以上のペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するものである請求項１記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項７】
マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである請求項６記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項８】
ＨＤＶ抗原ポリペプチドを含む系中に被験化合物を添加し、該ＨＤＶ抗原ポリペプチドと結合する被験化合物を選択することを特徴とするＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項９】
ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、ＨＤＶ抗原のアミノ酸配列の全部を含むポリペプチドである請求項８記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項１０】
ＨＤＶ抗原が、配列番号１、２および３記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項９記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項１１】
ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、ＨＤＶ抗原のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチド（以下ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体という）である請求項８記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項１２】
ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体が、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の群から選ばれるものである請求項１１記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
【請求項１３】
ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、請求項９〜１２のいずれかに記載のポリペプチドに、さらにタグペプチド、マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれる一つ以上のペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するものである請求項８記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項１４】
マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである請求項１３記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
【請求項１５】
請求項２〜７、９〜１４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１５記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ該ＤＮＡがコードするポリペプチドがＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１５または１６記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１７記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【請求項１９】
請求項１８記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とするＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
請求項２〜７、９〜１４のいずれかに記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項２１】
請求項１５または１６に記載のＤＮＡの塩基配列を記録した電子媒体。
【請求項２２】
請求項２〜７、９〜１４のいずれかに記載のポリペプチド配列を記録した電子媒体。
【請求項２３】
配列番号４〜９に記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドであるＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域。
【請求項２４】
配列番号４〜９記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドであるＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域誘導体。
【請求項２５】
配列番号４〜９記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドであるＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域誘導体。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれかに記載のポリペプチドに、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドであるＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域誘導体。
【請求項２７】
タグペプチド、マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである請求項２６記載のＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域誘導体。
【請求項２８】
請求項１〜１４のいずれかに記載の探索方法により得られる化合物。
【請求項２９】
請求項２８記載の化合物を有効成分として含有するＤ型肝炎の治療剤。
【請求項３０】
Ｄ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドを有効成分として含んでなる、遺伝子の発現促進剤。
【請求項３１】
上記遺伝子が、組織、器官または細胞特異的遺伝子である請求項３０に記載の遺伝子発現促進剤。
【請求項３２】
上記の組織、器官または細胞が、肝臓もしくは肝細胞、神経もしくは神経細胞、筋肉もしくは筋肉細胞、脂肪細胞、血管もしくは血管内皮細胞または胚性肝細胞である請求項３０または３１に記載に遺伝子発現促進剤。
【請求項３３】
前記遺伝子が、肝細胞特異的なα−フェトプロテイン遺伝子、ＨＮＦ−３β遺伝子、ＨＮＦ−４α遺伝子、インスリンレセプター遺伝子もしくはＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子；神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ遺伝子、ＮＲＳＦ遺伝子、ＳＣＧ１０遺伝子、シナプシン遺伝子もしくはＥＬＡＶ遺伝子；筋肉細胞特異的なＭｙｏＤ遺伝子、マイオジェニン遺伝子、Ｍｙｆ５遺伝子、ＭＲＦ４遺伝子もしくはミオシン重鎖遺伝子；または脂肪細胞特異的なＰＰＡＲγ遺伝子、ＵＣＰ１遺伝子、ＰＧＣ−１遺伝子、リポプロテインリパーゼ遺伝子もしくはアポリポプロテイン遺伝子である、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の遺伝子発現促進剤。
【請求項３４】
器官または組織の再生医療用である請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の遺伝子発現促進剤。
【請求項３５】
前記のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドが、
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；または
（ｉｖ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
である、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の遺伝子発現促進剤。
【請求項３６】
Ｄ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドをコードするＤＮＡを有効成分として含んでなる、遺伝子の発現促進剤。
【請求項３７】
上記遺伝子が、組織、器官または細胞特異的タンパク質である請求項３６に記載の遺伝子発現促進剤。
【請求項３８】
上記の組織、器官または細胞が、肝臓もしくは肝細胞、神経もしくは神経細胞、筋肉もしくは筋肉細胞、脂肪細胞、血管もしくは血管内皮細胞または胚性肝細胞である請求項３６または３７に記載に遺伝子発現促進剤。
【請求項３９】
前記遺伝子が、肝細胞特異的なα−フェトプロテイン遺伝子、ＨＮＦ−３β遺伝子、ＨＮＦ−４α遺伝子、インスリンレセプター遺伝子もしくはＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子；神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ遺伝子、ＮＲＳＦ遺伝子、ＳＣＧ１０遺伝子、シナプシン遺伝子もしくはＥＬＡＶ遺伝子；筋肉細胞特異的なＭｙｏＤ遺伝子、マイオジェニン遺伝子、Ｍｙｆ５遺伝子、ＭＲＦ４遺伝子もしくはミオシン重鎖遺伝子；または脂肪細胞特異的なＰＰＡＲγ遺伝子、ＵＣＰ１遺伝子、ＰＧＣ−１遺伝子、リポプロテインリパーゼ遺伝子もしくはアポリポプロテイン遺伝子である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の遺伝子発現促進剤。
【請求項４０】
器官または組織の再生医療用である請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の遺伝子発現促進剤。
【請求項４１】
前記のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドが、
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；または
（ｉｖ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
である、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の遺伝子発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はＤ型肝炎治療剤の探索方法に関する。
背景技術
Ｄ型肝炎ウイルス（以下ＨＤＶという）は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）存在下でのみ増殖し単独で増殖することはない不完全なウイルスであり、ＨＤＶの増殖はＢ型肝炎ウイルス（以下ＨＢＶという）に依存している。そこで、これまで、ＨＤＶ伴性Ｂ型肝炎（「Ｄ型肝炎」と略す）の治療には、ＨＤＶ非伴性Ｂ型肝炎の治療と同様に、ＨＢＶを標的とした治療法が応用されてきた。
現在行われているＨＢＶを標的としたＢ型肝炎の予防、治療法としては、ＨＢＶに対するワクチン、抗体、インターフェロンα、インターフェロンβ、ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ、ｆａｍｉｃｉｃｌｏｖｉｒ、ｌｏｂｕｃａｖｉｒ、ａｃｙｃｌｏｖｉｒ、ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ、ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ、ｒｉｖａｖｉｒｉｎ等のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤等の投与によるものが挙げられる（今日の治療薬’９９  ｐ．８５−９７、ｐ６７５−６８７）。ＤＮＡワクチンを含むワクチン、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤や、ＩＬ−１２やｔｈｙｍｏｓｉｎ等の免疫機能亢進剤、アンチセンスやリボザイム等の遺伝子を用いた治療法等の開発研究が現在進行中である（明日の新薬  ２００１年２月株式会社テクノミック）。
ＨＢＶに対するワクチンは、肝炎の予防には一定の成果を挙げているが、すでに感染している患者に対しては有効ではない（２０００医療用医薬品データーブックＮｏ．１  株式会社富士経済）。インターフェロンは、慢性肝炎に対して用いられ、３０〜４０％の患者に治療効果を挙げているが、高価な療法である。また、副作用も強い（今日の治療薬’９９  ｐ．８５−９７、ｐ６７５−６８７、２０００医療用医薬品データーブックＮｏ．１  株式会社富士経済、Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６，２１５，１９９６）。ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、インターフェロンが無効な患者に対して一定の治療効果を挙げているが、副作用も強く、高価な療法である（Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６，２１５，１９９６）。Ｂ型肝炎の治療に主に用いられている既存薬であるＤＮＡポリメラーゼ阻害剤やインターフェロンは、Ｄ型肝炎の治療に有効ではないことが最近報告されている（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３０，５４６、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ．７，４２８、２０００）。
ＨＤＶの感染は、ＨＢＶの悪性化に関与していることが知られている。即ち、ＨＤＶ非伴性ＨＢＶ肝炎では、急性肝炎の中でも特に重篤な激症肝炎の発症率は１パーセント程度だが、Ｄ型肝炎では、激症肝炎の発症率は２〜２０パーセントに上昇する。また、慢性肝炎が肝硬変や肝癌に進行する割合は、ＨＤＶ非伴性Ｂ型肝炎よりもＤ型肝炎の方が高い（Ｐｏｌｉｓｈ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６，２１１−２２９，１９９３）。
上述のごとく、ＨＤＶの感染は、ＨＢＶの悪性化に関与しているが、有効な治療法は知られていない。ＨＤＶを標的とした開発研究も、唯一Ｃｈｉｒｏｎ社が、ＨＤＶワクチンの利用に関する研究を報告していたが、１９９３年以降、報告が無い（明日の新薬  ２００１年２月株式会社テクノミック）。
ＨＤＶのゲノムはＤ型肝炎ウイルス抗原タンパク質のみをコードすること、ＨＤＶゲノムの複製は、宿主のＲＮＡポリメラーゼＩＩ酵素によって触媒されること、Ｄ型肝炎ウイルス抗原タンパク質はＨＤＶゲノムと結合し、ＨＤＶの増殖に不可欠であることなどが報告されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，２５９，１９９５）。しかし、Ｄ型肝炎ウイルス抗原がどのような働きによってウイルス増殖を支持しているかについては、現在までほとんど解明されていない。
これらの既存の知識を基にＤ型肝炎治療剤を探索するとすれば、ＨＢＶ，ＨＤＶの両方が感染した細胞を用いる探索系が考えられるが、作業者への感染した場合には、重篤な肝疾患を引き起こす確立が高く、大変危険な作業となるとともに、非感染細胞が有する正常な転写機能をも阻害する被験化合物を選択してしまう可能性のある効率の悪い探索方法である。また、ＨＤＶのＲＮＡゲノムを発現するプラスミドを導入した哺乳動物細胞を被験薬剤で処理し、被験薬剤によるＨＤＶのＲＮＡの転写の抑制やＨＤＶ抗原タンパク質の発現の抑制を検出する系も考えられる［Ｋｕｏ，Ｍ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，１９４５−１９５０（１９８９）］が、上記の系と同様に、非感染細胞が有する正常な転写機能をも阻害する被験化合物を選択してしまう可能性のある効率の悪い探索方法であるとともに、依然として、Ｐ２レベルの封じ込め環境下で探索作業を行わねばならず、危険で、作業性の悪い探索系である。
ＨＤＶには３種類の亜種が知られており、その塩基配列は亜種によって著しく異なる［Ｃａｓｅｙ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，９０１６−９０２０（１９９３）、Ｃａｓｅｙ  Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｇｅｒｉｎ  Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，２８０６−２８１４（１９９８）］。また増殖の過程で様々な変異を起こすため、単離株によってもその塩基配列は大きく異なる。そこで、安全を確保しつつ、上記のＨＢＶ，ＨＤＶの両方が感染した細胞を用いる探索系を用いても、該探索系に用いた亜種にしか作用しない化合物を選択してしまう可能性が高い。
また、一般にウイルスは増殖の過程で、様々な変異を起こし、薬剤に対する耐性株が出現することが知られている。そこで、安全を確保しつつ、上記のＨＢＶ，ＨＤＶの両方が感染した細胞を用いる探索系を用いても、耐性株が容易に出現する可能性が高い。
安全な探索方法として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの阻害剤を探索する方法も考えられるが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは宿主細胞内において幅広い役割を担っており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに作用する化合物は、非感染細胞にも副作用を及ぼす可能性が高い。
発明の開示
本発明の目的は、Ｄ型肝炎治療剤の安全で効率的な探索方法を提供することにある。
発明者らは、鋭意検討の結果、ＨＤＶの増殖に必須なウイルスタンパク質であるＤ型肝炎ウイルス抗原が宿主のＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合すること、Ｄ型肝炎ウイルス抗原はＤ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端領域を介して、宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合すること、Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端領域は、亜種間および単離株間での保存性が特に高いことを見出した。さらに、以下（ａ）〜（ｅ）の知見を得、本発明を完成した。
（ａ）Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合を阻害することによってＨＤＶの増殖を抑制できる。
（ｂ）Ｄ型肝炎ウイルス抗原に結合する化合物を探索すること、或いは、Ｄ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域に結合する化合物を探索することによって、ＨＤＶ感染細胞においてのみ作用を発揮し、非感染細胞に副作用を及ぼさない化合物を選択できる。
（ｃ）Ｄ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域に結合する化合物を探索することによって、ＨＤＶの亜種に広く作用する可能性、および、耐性株の出現を抑制できる可能性が高い化合物が選択できる。
（ｄ）Ｄ型肝炎ウイルス抗原に結合する化合物を探索すること、或いは、Ｄ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域に結合する化合物を探索することによって選択された化合物を、Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を阻害すること、あるいは、細胞内におけるＨＤＶの増殖抑制剤を探索する方法によって更に有効な化合物を絞り込むことができる。
（ｅ）Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を阻害すること、あるいは、細胞内におけるＨＤＶの増殖抑制剤を探索する方法によって選択された化合物を、Ｄ型肝炎ウイルス抗原に結合する化合物を探索すること、あるいは、Ｄ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域に結合する化合物を探索することによって更に有効な化合物を絞り込むことができる。
従って、本発明は以下（１）〜（４１）の発明に関する。
（１）  Ｄ型肝炎ウイルス抗原（以下ＨＤＶ抗原という）のアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド（以下ＨＤＶ抗原ポリペプチドという）とＲＮＡポリメラーゼＩＩとを含む系中に被験化合物を添加し、該ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合量を測定し、該結合量と被験化合物無添加の結合量とを比較して、該結合を抑制している化合物を選択することを特徴とするＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（２）  ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、ＨＤＶ抗原のアミノ酸配列の全部を含むポリペプチドである（１）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（３）  ＨＤＶ抗原が、配列番号１、２および３記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドである（２）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（４）  ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、ＨＤＶ抗原のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチド（以下ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体という）である（１）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（５）  ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体が、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の群から選ばれるものである（４）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（６）  ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、（２）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチドに、さらにタグペプチド、マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれる一つ以上のペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するものである（１）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（７）  マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである（６）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（８）  ＨＤＶ抗原ポリペプチドを含む系中に被験化合物を添加し、該ＨＤＶ抗原ポリペプチドと結合する被験化合物を選択することを特徴とするＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（９）  ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、ＨＤＶ抗原のアミノ酸配列の全部を含むポリペプチドである（８）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（１０）  ＨＤＶ抗原が、配列番号１、２および３記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドである（９）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（１１）  ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、ＨＤＶ抗原のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチド（以下ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体という）である（８）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（１２）  ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体が、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の群から選ばれるものである（１１）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（１３）  ＨＤＶ抗原ポリペプチドが、（９）〜（１２）のいずれかに記載のポリペプチドに、さらにタグペプチド、マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれる一つ以上のペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するものである（８）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（１４）  マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである（１３）記載のＤ型肝炎治療剤の探索方法。
（１５）  （２）〜（７）、（９）〜（１４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１６）  （１５）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ該ＤＮＡがコードするポリペプチドがＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１７）  （１５）または（１６）記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１８）  （１７）記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（１９）  （１８）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とするＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドの製造方法。
（２０）  （２）〜（７）、（９）〜（１４）のいずれかに記載のポリペプチドを認識する抗体。
（２１）  （１５）または（１６）に記載のＤＮＡの塩基配列を記録した電子媒体。
（２２）  （２）〜（７）、（９）〜（１４）のいずれかに記載のポリペプチド配列を記録した電子媒体。
（２３）  配列番号４〜９に記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドであるＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域。
（２４）  配列番号４〜９記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドであるＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域誘導体。
（２５）  配列番号４〜９記載のアミノ酸配列から選ばれる一つのアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドであるＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域誘導体。
（２６）  （２３）〜（２５）のいずれかに記載のポリペプチドに、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドであるＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域誘導体。
（２７）  タグペプチド、マーカーペプチドまたはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである（２６）記載のＤ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領域誘導体。
（２８）  （１）〜（１４）のいずれかに記載の探索方法により得られる化合物。
（２９）  （２８）記載の化合物を有効成分として含有するＤ型肝炎の治療剤。
（３０）  Ｄ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドを有効成分として含んでなる、遺伝子の発現促進剤。
（３１）  上記遺伝子が、組織、器官または細胞特異的遺伝子である（３０）に記載の遺伝子発現促進剤。
（３２）  上記の組織、器官または細胞が、肝臓もしくは肝細胞、神経もしくは神経細胞、筋肉もしくは筋肉細胞、脂肪細胞、血管もしくは血管内皮細胞または胚性肝細胞である（３０）または（３１）に記載に遺伝子発現促進剤。
（３３）  前記遺伝子が、肝細胞特異的なα−フェトプロテイン遺伝子、ＨＮＦ−３β遺伝子、ＨＮＦ−４α遺伝子、インスリンレセプター遺伝子もしくはＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子；神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ遺伝子、ＮＲＳＦ遺伝子、ＳＣＧ１０遺伝子、シナプシン遺伝子もしくはＥＬＡＶ遺伝子；筋肉細胞特異的なＭｙｏＤ遺伝子、マイオジェニン遺伝子、Ｍｙｆ５遺伝子、ＭＲＦ４遺伝子もしくはミオシン重鎖遺伝子；または脂肪細胞特異的なＰＰＡＲγ遺伝子、ＵＣＰ１遺伝子、ＰＧＣ−１遺伝子、リポプロテインリパーゼ遺伝子もしくはアポリポプロテイン遺伝子である、（３０）〜（３２）のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。
（３４）  器官または組織の再生医療用である（３０）〜（３３）のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。
（３５）  前記のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドが、
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；または
（ｉｖ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
である、（３０）〜（３４）のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。
（３６）  Ｄ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドをコードするＤＮＡを有効成分として含んでなる、遺伝子の発現促進剤。
（３７）  上記遺伝子が、組織または器官特異的タンパク質である（３６）に記載の遺伝子発現促進剤。
（３８）  上記の組織、器官または細胞が、肝臓もしくは肝細胞、神経もしくは神経細胞、筋肉もしくは筋肉細胞、脂肪細胞、血管もしくは血管内皮細胞または胚性肝細胞である（３６）または（３７）に記載に遺伝子発現促進剤。
（３９）  前記遺伝子が、肝細胞特異的なα−フェトプロテイン遺伝子、ＨＮＦ−３β遺伝子、ＨＮＦ−４α遺伝子、インスリンレセプター遺伝子もしくはＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子；神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ遺伝子、ＮＲＳＦ遺伝子、ＳＣＧ１０遺伝子、シナプシン遺伝子もしくはＥＬＡＶ遺伝子；筋肉細胞特異的なＭｙｏＤ遺伝子、マイオジェニン遺伝子、Ｍｙｆ５遺伝子、ＭＲＦ４遺伝子もしくはミオシン重鎖遺伝子；または脂肪細胞特異的なＰＰＡＲγ遺伝子、ＵＣＰ１遺伝子、ＰＧＣ−１遺伝子、リポプロテインリパーゼ遺伝子もしくはアポリポプロテイン遺伝子である、（３６）〜（３８）のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。
（４０）  器官または組織の再生医療用である（３６）〜（３９）のいずれか記載の遺伝子発現促進剤。
（４１）  前記のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドが、
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；または
（ｉｖ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
である、（３６）〜（４０）のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。
発明の実施の形態
以下、本発明について、詳細に説明する。
Ｄ型肝炎治療剤の探索方法には、▲１▼ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を抑制する化合物を探索する方法、▲２▼ＨＤＶ抗原ポリペプチドに結合する化合物を探索する方法がある。▲２▼で選択された化合物を▲１▼の方法で絞り込むこと、▲１▼で選択された化合物を▲２▼で絞り込むこともできる。更に、必要に応じて、従来の技術に記載した公知の方法で、絞り込むことができる。
以下に、▲１▼、▲２▼の方法を詳述する。
▲１▼ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を抑制する化合物を探索する方法では、ＨＤＶ抗原或いはＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体とＲＮＡポリメラーゼＩＩを調製し、両者の結合を検出する系に、被験化合物を加え、被験化合物による該結合の抑制を指標に、ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を抑制する化合物を選択する。
▲２▼ＨＤＶ抗原ポリペプチドに結合する化合物を探索する方法では、ＨＤＶ抗原あるいはＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体を調製し、被験化合物と接触させ、被験化合物の結合を指標に、ＨＤＶ抗原ポリペプチドと結合する被験化合物を選択する。
ここで用いるＲＮＡポリメラーゼＩＩは、本法に使える限り、公知のいかなる方法を用いて調製しても良く、例えば「蛋白質・酵素の基礎実験法」、Ｒｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄ．ａｎｄ  Ｒｏｅｄｅｒ  Ｒ．Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，３３１０−３３２１（１９８７）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｎ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｒ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７４，５１３−５２６（１９９６）、Ｌｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，１０００４−１０００８（１９９１）などに記載の方法を用いて、調製することができる。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、真核生物の組織、細胞を破砕し、未精製画分、部分精製画分、精製画分として調製することができる。真核生物としては、公知のいかなる生物でも良いが、哺乳類が好ましい。組織としては、公知のいかなる組織でも良いが、胸腺等の組織が好ましい。細胞としては、公知のいかなる細胞でも良いが、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、２９３細胞等の細胞が好ましい。組織、細胞の破砕方法としては、公知のいかなる破砕方法でも良いが、組織からは、ワーリング  ブレンダー（Ｗａｒｉｎｇ  ｂｌｅｎｄｅｒ）やポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）等の装置を用いた機械的破砕、界面活性剤を用いた可溶化、遠心分離等の操作を組み合わせることによって、細胞核抽出液を調製することができる。培養細胞からは、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイザー等を用いた機械的破砕や界面活性剤を用いた可溶化、遠心分離等の操作を組み合わせることによって、細胞核抽出液を調製することができる。細胞核抽出液からＲＮＡポリメラーゼＩＩを精製する方法としては、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性クロマトグラフィー等によって分画する方法や、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製する方法がある。
前者の方法の場合、ホスホセルロースカラム、ヘパリンアガロースカラム、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム、ＴＳＫ−フェニルカラム、ｍｏｎｏ  Ｑカラムなどを用い、塩濃度やｐＨを変化させることによって、タンパク質の混合物を分画することができる。分画した画分に含まれるＲＮＡポリメラーゼＩＩの量は、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体を用いた免疫ブロット法等によって測定することができる。分画した画分に含まれるＲＮＡポリメラーゼＩＩの活性は、Ｋｉｍ，Ｗ．Ｙ．ａｎｄ  Ｄａｈｍｕｓ，Ｍ．Ｅ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１８８８０−１８８８５（１９９８）記載の方法等を用いて評価することができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩが多く含まれ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの活性が高い画分をまとめて、部分精製されたＲＮＡポリメラーゼＩＩとする。３ないし６種類程度の異なるカラムを用いて以上の操作を繰り返すことによって、高度に精製されたＲＮＡポリメラーゼＩＩを調製することができる。
後者の方法の場合、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体、例えばモノクローナル抗体８ＷＧ１６（Ｂａｂｃｏ社製）やポリクローナル抗体Ｃ−２１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）等を、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９９）記載の方法等を用いてクロマトグラフィー担体と架橋し、アフィニティーカラムを調製する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｎ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｒ．Ｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７４，５１３−５２６（１９９６）記載の方法等により、このカラムを用いて、細胞核抽出液やＲＮＡポリメラーゼＩＩ部分精製画分からＲＮＡポリメラーゼＩＩを精製することができる。
ＨＤＶ抗原とは、配列番号１、２、及び３記載のアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体とは、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の群から選ばれるポリペプチドである。
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド。
本発明に用いられるタグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドは、融合ポリペプチドとなった場合にもＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合活性を維持できるポリペプチドであればよい。具体的には、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチド等を挙げることができる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
Ｄ型肝炎ウイルス抗原誘導体をコードするＤＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入し、必要に応じて、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドの配列をコードするＤＮＡを挿入することにより、取得することができる。
ＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体の欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明に用いられるＨＤＶ抗原ポリペプチド誘導体がＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合活性を有するためには、配列番号１〜９記載のアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕等を用いて計算したときに（相同性の％を定義するための計算手段・方法等を記載する）、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
本発明に用いられるＨＤＶ抗原ポリペプチドは、本発明のＨＤＶ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて、或いは宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系としては、公知の方法［Ｋｉｇａｗａ  Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，６，１２９（１９９８）、Ｓｐｉｒｉｎ  Ａ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）、Ｋｉｇａｗａ  Ｔ．＆  Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）］に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いることができる。すなわち、ＨＤＶ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより大量のＨＤＶ抗原ポリペプチドＲＮＡをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばウサギ網状赤血球ライセートやコムギ胚芽抽出液を用いた翻訳系を利用して、ＨＤＶ抗原ポリペプチドを生産することができる。
また、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のＨＤＶ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
また、必要に応じて、本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは本発明のポリペプチドの効率的製造に有用である。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
すなわち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明のポリペプチドを製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
動物個体を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明のポリペプチドを生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドをＦｌａｇペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，４，１２８８（１９９０）〕。更に、該ポリペプチドに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、例えば、配列番号１〜９記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびそれらの誘導体をあげることができる。
また、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの反応方法、結合量の検出方法は、該ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの細胞内での結合を反映する既知の方法であれば、いかなる方法でも良い。
例えば、ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩいずれか一方の分子をマルチウエルプレートやクロマト担体やラテックス等のビーズ、表面プラズモン共鳴測定用のチップ、質量測定用のターゲット等の固相に、物理的吸着や、ＨＤＶ抗原ポリペプチドあるいはＲＮＡポリメラーゼＩＩを認識する抗体等や、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドを特異的に認識する分子を介した結合により固定化し、必要に応じて非特異吸着を抑制する処理を施した後、他方の分子を添加し、更に未吸着な他方の分子を洗浄除去後、他方の分子のＨＤＶ抗原ポリペプチドあるいはＲＮＡポリメラーゼＩＩ部分やタグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドの酵素活性、結合特性、表面プラズモン共鳴の発生、質量分析の信号強度等、を生かして、結合した他方の分子を検出することにより、ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合量を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いてタグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドを特異的に検出することもできる。β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン等は、その酵素活性を指標に、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）等は、その蛍光を指標に、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン等は、その特異的結合分子との結合を指標に、ｍｙｃポリペプチド、Ｓペプチド、Ｔａｃ抗原、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープ等は、その特異的抗体との結合を指標に、検出できる。
β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン等もそれらの特異的抗体との結合を指標に検出することもできる。
また、ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩのいずれか或いは双方をビオチン等の結合に特異性を有する分子や蛍光試薬、ＲＩ標識試薬等により修飾後、上記の反応系に用いることによって、ビオチン等の結合特異性を生かして固相に結合させたり、ビオチン等の結合特異性や蛍光、放射性等を指標に相互作用を検出することもできる。
さらに、ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの双方を適切な蛍光色素でラベル化し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により、Ｄ型肝炎ウイルス抗原誘導体とＲＮＡポリメラーゼＩＩが結合しているときのみ発する蛍光を利用して、溶液系でＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの相互作用を検出することができる。
ＨＤＶ抗原ポリペプチドと被験化合物の反応方法、結合量の検出方法は、既知の方法であれば、いかなる方法でもよい。
例えば、ＨＤＶ抗原ポリペプチドをマルチウエルプレートやクロマト担体やラテックス等のビーズ、表面プラズモン共鳴測定用のチップ、質量測定用のターゲット等の固相に、物理的吸着や、ＨＤＶ抗原ポリペプチドを認識する抗体等や、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドを特異的に認識する分子を介した結合により固定化し、必要に応じて非特異吸着を抑制する処理を施した後、被験化合物と接触させ、更に未吸着な被験化合物を洗浄除去後、被験化合物を表面プラズモン共鳴の発生、質量分析の信号強度等により、検出することができる。或いは、ＨＤＶ抗原ポリペプチドに結合した被験化合物を溶出し、分光スペクトル、蛍光スペクトル、質量分析等の手法を用いて検出することができる。また、ＨＤＶ抗原ポリペプチドをビオチン等の結合に特異性を有する分子等により修飾後、上記の反応系に用いることによって、ビオチン等の結合に特異性を生かして結合させることもできる。
ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を抑制する化合物を探索する方法としては、例えば、下記の具体的方法があげられる。
１）ＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原組換えタンパク質を大腸菌などにて発現させる。該大腸菌を集め、破砕し、得られたＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原組換えタンパク質１ｎｇ〜５００μｇ好ましくは１μｇ〜５００μｇを含む大腸菌破砕液の上清を、グルタチオン固定化担体０．１μＬ〜１０００μＬ好ましくは１μＬ〜１００μＬに結合させ、親和性ビーズとする。該親和性ビーズを１ｎＭ〜５００μＭ好ましくは１μＭ〜１００μＭの被験化合物の存在下、非存在下、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ  １ｎｇ〜５００μｇ好ましくは１μｇ〜５００μｇを含む細胞抽出液またはＲＮＡポリメラーゼＩＩ  １ｎｇ〜５００μｇ好ましくは１μｇ〜５００μｇの精製標品を含む溶液５μＬ〜５ｍＬ好ましくは、１０μＬから１ｍＬと混合し、上清を除く。洗浄後、該親和性ビーズから、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルバッファーとともに煮沸して、結合したＲＮＡポリメラーゼＩＩを溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、例えば、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写後、結合したＲＮＡポリメラーゼＩＩの量を、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体を用いたウェスタンブロッティングなどの方法によって検出できる。
２）大腸菌発現系や試験管内翻訳系を用いて、［３５Ｓ］で標識したＤ型肝炎ウイルス抗原組換えタンパク質を調製できる。該Ｄ型肝炎ウイルス抗原組換えタンパク質１ｎｇ〜５００μｇ好ましくは１μｇ〜５０μｇを含む溶液を１ｎＭ〜５００μＭ好ましくは１μＭ〜１００μＭ被験化合物存在下、非存在下、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ  １ｎｇ〜５００μｇ好ましくは１μｇ〜５０μｇを含む細胞抽出液またはＲＮＡポリメラーゼＩＩ  １ｎｇ〜５００μｇ好ましくは１μｇ〜５０μｇの精製標品と混合し、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体およびプロテインＧ固定化担体などを用いて免疫沈降させ、沈降物中のＤ型肝炎ウイルス抗原タンパク質量を、オートラジオグラフィーなどの方法によって検出することによって、ＨＤＶ抗原ポリペプチドとＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を抑制する化合物を探索することができる。
３）例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの精製標品１ｎｇ〜５００μｇ好ましくは１μｇ〜５０μｇを９６穴マイクロタイタープレートの１穴に添加し、直接固定化するか、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体１ｎｇ〜５００μｇ好ましくは１μｇ〜５０μｇを９６穴マイクロタイタープレートの１穴に添加し、固定化した上で、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを間接的に固定化することができる。そこに１ｎＭ〜５００μＭ好ましくは１μＭ〜１００μＭの被験化合物存在下、非存在下、大腸菌などにて発現させたＤ型肝炎ウイルス抗原組換えタンパク質、例えば、ＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原組換えタンパク質１ｎｇ〜５００μｇ好ましくは１μｇ〜５０μｇを添加し反応させ、洗浄後、結合したＤ型肝炎ウイルス抗原を、ＧＳＴの酵素活性を指標にして、簡便に測定することができる。例えば、ＧＳＴの基質としてグルタチオンとＣＤＮＢ（１−ｃｈｌｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）を添加すると、３４０ナノメートルに最大吸収を持つ反応産物が合成され、これをプレートリーダー装置にて測定することができる。また、ＨＤＶ抗原ポリペプチドに結合する化合物を探索する方法では、例えば、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ好ましくは１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのＨｉｓ−ｔａｇ配列融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原Ｃ末端領含有タンパク質を、ＢＩＡＣＯＲＥ装置（ＢＩＯＣＯＲＥ社製）用のセンサーチップＮＴＡ上に流して固定化後、１ｎＭ〜５００μＭ好ましくは１μＭ〜１００μＭの被験化合物を含有する溶液を流し、センサーグラムを観察することによって、Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端領域に結合する化合物を探索することができる。
本発明に用いられるポリペプチドを認識する抗体は、本発明のＨＤＶ抗原ポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドの精製標品を用いて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等として作製することができる。
（１）ポリクローナル抗体の作製
本発明のＨＤＶ抗原ポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドの精製標品を抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
低分子ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／ｌ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明のポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。ポリペプチド量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
本発明で得られた化合物を含有する医薬製剤は、活性成分として化合物単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤などがある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
本発明で得られた化合物の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人一人当り０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．０５〜５０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人一人当り０．００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
本発明のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドは、各種の器官、組織または細胞、例えば動物細胞、例えば肝臓もしくは肝細胞、神経もしくは神経細胞、筋肉もしくは筋肉細胞、脂肪細胞、血管もしくは血管内皮細胞または胚性肝細胞、などに存在する遺伝子の転写を促進することにより、各種のタンパク質の産生を促進することが出来る。転写が促進される遺伝子は、特に、その細胞が属する組織または器官で特異的に発現される遺伝子であるが、それに限定されない。
組織、器官または細胞特異的に発現される遺伝子としては、例えば肝細胞特異的なα−フェトプロテイン遺伝子、ＨＮＦ−３β遺伝子、ＨＮＦ−４α遺伝子、インスリンレセプター遺伝子もしくはＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子；神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ遺伝子、ＮＲＳＦ遺伝子、ＳＣＧ１０遺伝子、シナプシン遺伝子もしくはＥＬＡＶ遺伝子；筋肉細胞特異的なＭｙｏＤ遺伝子、マイオジェニン遺伝子、Ｍｙｆ５遺伝子、ＭＲＦ４遺伝子もしくはミオシン重鎖遺伝子；または脂肪細胞特異的なＰＰＡＲγ遺伝子、ＵＣＰ１遺伝子、ＰＧＣ−１遺伝子、リポプロテインリパーゼ遺伝子もしくはアポリポプロテイン遺伝子などが挙げられる。
更に、必ずしも器官または組織特異的ではない遺伝子としては、例えばヒストンＨ１遺伝子、ヒストンＨ３遺伝子、ＲＰＢ１遺伝子、ＲＰＢ２遺伝子、βアクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＤＳＩＦｐ１６０遺伝子、ＤＳＩＦｐ１４遺伝子、ＮＥＬＦ−Ａ遺伝子またはＮＥＬＦ−Ｅ遺伝子などが挙げられる。
従って本発明のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドは、特定の組織または器官において、特定のまたは種々の遺伝子の発現が望まれる場合、例えば肝臓、神経、筋肉、、血管、などの再生医療などにおいて特に有用である。
また、上記の用途においては、本発明のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド自体を投与してもよいが、必ずしもその必要はなく、上記のポリペプチドをコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡ）を、対象となる組織や器官の細胞に導入して、遺伝子治療として用いてもよい。細胞への目的遺伝子の挿入は常用の技法を用いて行うことができる。
従って、本発明は、一つの態様において、本発明のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドを有効成分として含んでなる、遺伝子の発現促進剤を提供する。上記タンパク質は特に組織、器官または細胞特異的タンパク質である。上記の組織、器官または細胞は、例えば肝臓もしくは肝細胞、神経もしくは神経細胞、筋肉もしくは筋肉細胞、脂肪細胞、血管もしくは血管内皮細胞または胚性肝細胞などである。本願発明の組成物は前記の器官または組織の再生医療において特に有用である。
本発明はまた、他の態様において、本発明のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドをコードするＤＡＮを有効成分として含んでなる、遺伝子の発現促進剤を提供する。上記タンパク質は特に組織、器官または細胞特異的タンパク質である。上記の組織、器官または細胞は、例えば肝臓もしくは肝細胞、神経もしくは神経細胞、筋肉もしくは筋肉細胞、脂肪細胞、血管もしくは血管内皮細胞または胚性肝細胞などである。本願発明の組成物は前記の器官または組織の再生医療において特に有用である。
本発明のＤ型肝炎ウイルス抗原（ＨＤＶ抗原）のアミノ酸配列の全部または一部分を含み、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチドとしては、例えば、
（ｉ）ＨＤＶ抗原のＣ末端からＮ末端に向かって１００残基以内のＣ末端アミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；または
（ｉｖ）配列番号１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合するポリペプチド；
である。
実施例
参考例．Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの相互作用の検出
ＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原組換えタンパク質を作製するため、ＨＤＶのゲノム断片が挿入されたプラスミドＰＸ９（Ｍａｋｉｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，３４３−３４６（１９８７））を用い、配列番号１０および配列番号１１の配列を有する鋳型オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行ない、Ｄ型肝炎ウイルス抗原の遺伝子断片を増幅した。
このＰＣＲ断片を大腸菌用発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ１（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にクローニングし、組換えＤＮＡを大腸菌ＢＬ−２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＰ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に形質転換した。この大腸菌をアンピシリンを含む培養液で増殖させ、培養液にイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドを添加することで組換えタンパク質の発現を誘導した。この大腸菌を回収し、超音波破砕することで、組換えタンパク質を含む大腸菌溶解液を調製した。
Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの相互作用を検出するため、適当量の大腸菌溶解液とＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を混合し、ＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原、約１マイクログラムをＳｅｐｈａｒｏｓｅ粒子に結合させた。そこに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを含むＨｅＬａ細胞核抽出液、約５００マイクログラムを添加し混合した。非結合画分を除去した後、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ粒子にバッファーを加えて再度ＢＦ分離した。この操作を数回繰り返すことによって、特異的吸着成分を選別した。吸着成分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、それらをＰＶＤＦ膜上に転写した。ＰＶＤＦ膜上のＲＮＡポリメラーゼＩＩを、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体（Ｂａｂｃｏ社製）を用いた免疫ブロッティングにより検出した。結果を図１に示す。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩは全長のＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原を固定化した親和性カラムとは結合した（図１のレーン２、１４）が、ＧＳＴ部分のみを固定化した親和性カラムとはほとんど結合しなかった（図１のレーン７、９）。従って、Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩは特異的に結合することが示唆された。次に、Ｄ型肝炎ウイルス抗原の欠損変異体を融合したＧＳＴタンパク質を用いたところ、カルボキシ末端領域のわずか８アミノ酸の欠失がＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合を損なわせたのに対し（図１のレーン３〜６）、アミノ末端の１〜１２９番目のアミノ酸の欠失はＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合にほとんど影響しなかった（図１のレーン１０〜１３）。従って、この実験条件下では、Ｄ型肝炎ウイルス抗原の１３０〜１９５番目のアミノ酸の領域がＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合に必要であることが示された。
実施例１．Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合を阻害するタンパク質の探索
Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの相互作用を調べる反応系に図２記載のタンパク質を加え、Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を阻害するタンパク質を探索した。
図２記載のＤ型肝炎ウイルス抗原の野生体または様々な変異体、またはＤ型肝炎ウイルス抗原以外のタンパク質をコードする遺伝子をプラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、これらの組換えＤＮＡを鋳型とした転写、翻訳反応を行ない、［３５Ｓ］で標識されたタンパク質の単品または混合物を調製した。
これらのタンパク質を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを含むＨｅＬａ細胞核抽出液、約５００マイクログラムと混合し、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩ抗体とＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて免疫沈降した。沈降物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ゲルをオートラジオグラフィーすることによって、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合したタンパク質を検出した。結果を図２に示す。
１倍量の野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原を単独で結合実験に用いた場合、野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合が確認できた（図２のレーン１２）。ここに５倍量の野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原をさらに加えても、野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合は阻害されず、むしろ総結合量は増加した（図２のレーン７）。しかし、１倍量の野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原に５倍量の変異型Ｄ型肝炎ウイルス抗原ΔＣ８またはΔＣ３１を加えると、野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合はほとんど確認できなかった（図２のレーン８、９）。一方、１倍量の野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原に５倍量の変異型Ｄ型肝炎ウイルス抗原ΔＮ８８またはルシフェラーゼタンパク質を加えても、野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合はほとんど阻害されなかった（図２のレーン１０、１１）。従って、調べたタンパク質のうち、変異型Ｄ型肝炎ウイルス抗原ΔＣ８とΔＣ３１は野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を阻害する働きを持つことが示された。
Ｄ型肝炎ウイルス抗原は多量体構造をとることが報告されている（Ｘｉａ，Ｙ．Ｐ．ａｎｄ  Ｌａｉ，Ｍ．Ｍ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，６６３１−６６４８（１９９２））。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合活性を持たないΔＣ８とΔＣ３１は、野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原とヘテロ多量体を形成することで、野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を阻害していると推定される。
試験例１．実施例１で選ばれたタンパク質によるＨＤＶ複製の抑制
実施例１で選ばれたタンパク質を細胞内で発現させ、ＨＤＶの複製阻害を検出した。
野生型ＨＤＶゲノムを発現するプラスミドｐＳＶＬ（Ｄ３）（Ｋｕｏ，Ｍ．Ｙ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，１９４５−１９５０（１９８９））を、様々なタンパク質をコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ３に挿入したプラスミド（上述）と共に、リン酸カルシウム法によってＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡをセパゾール試薬（ナカライテスク社製）を用いて抽出し、そのうちの１０マイクログラムを、ホルムアミド変性アガロースゲル電気泳動により分離した。分離したＲＮＡをナイロン膜上に転写し、ナイロン膜上に存在するＨＤＶ−ＲＮＡ量をノーザンブロッティングにより定量した。ＨＤＶ−ＲＮＡの検出には、ＨＤＶ−ＲＮＡ特異的な配列番号１２の配列を持つオリゴヌクレオチドプローブを用いた。結果を図３に示す。
野生型ＨＤＶゲノムを導入した細胞では、複製したＨＤＶ−ＲＮＡが検出できた（図３のレーン１）。しかし、野生型ＨＤＶゲノムと共に変異型Ｄ型肝炎ウイルス抗原ΔＣ８またはΔＣ３１を発現させると、ＨＤＶ−ＲＮＡの複製は著しく抑制された（図３のレーン３、４）。一方、対象実験として、野生型ＨＤＶゲノムと共に野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原や変異型Ｄ型肝炎ウイルス抗原ΔＮ８８、ルシフェラーゼタンパク質を発現させても、ＨＤＶ−ＲＮＡの複製にはほとんど影響しなかった（図３のレーン２、５、６）。従って、ΔＣ８とΔＣ３１は野生型ＨＤＶゲノムの複製を阻害する働きを持つことが示された。
実施例２．Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの相互作用を阻害する低分子化合物の探索
ＲＮＡポリメラーゼＩＩに富むＨｅＬａ細胞核画分のタンパク質を９６穴マイクロタイタープレート上に固定化した。各穴に、ＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原を含んだ大腸菌溶解液と低分子化合物ライブラリーＬＯＰＡＣ（Ｓｉｇｍａ−ＲＢＩ社製）に含まれる化合物を添加し、反応させた。各穴をバッファーで洗浄して非結合タンパク質と低分子化合物を除去した後、ＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原の残存量を、ＧＳＴの酵素活性を指標にして測定した。ＧＳＴの酵素活性は、ＧＳＴの基質であるＣＤＮＢ（１−ｃｈｌｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）を各穴に添加し、生成される３４０ｎｍに最大吸収を持つ反応産物をプレートリーダー装置を用いて測定することにより求めた。
約６００種類の低分子化合物ライブラリーをスクリーニングした結果、８種類の化合物がマイクロタイタープレート上に残存するＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原量を減少させた。この結果を図４に示す。マイクロタイタープレート上に残存するＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原量を減少させた化合物ａ〜ｈはそれぞれ、ａ：ｂｅｎｓｅｒａｚｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｂ：Ｒ（−）−ｎｏｒａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ、ｃ：ＮＳ１０２、ｄ：（＋／−）−５−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏｕｒａｃｉｌ、ｅ：１−（３−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｆ：ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｇ：ｓｕｌｆａｐｈｅｎａｚｏｌｅ、ｈ：ｓａｎｇｕｉｎａｒｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅだった。２種類の化合物がマイクロタイタープレート上に残存するＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原量を増加させた。その他の約５９０種類の化合物はほとんど影響を及ぼさなかった。
マイクロタイタープレート上に残存するＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原量を減少させた８種類の化合物ａ〜ｈがＤ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの相互作用に影響するこを確認するため、ＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原を固定化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ粒子をＲＮＡポリメラーゼＩＩを含むＨｅＬａ細胞核抽出液およびこれらの化合物と混合し、ＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原に結合したＲＮＡポリメラーゼＩＩ量を免疫ブロッティングにより測定した。ＧＳＴ融合Ｄ型肝炎ウイルス抗原と結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩの量は、化合物ａ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈの添加によってそれぞれ減少した。この結果を図５に示す。
試験例２．実施例２で選ばれた化合物によるＤ型肝炎ウイルス抗原による転写活性化の抑制
細胞内には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を抑制するタンパク質因子ＤＳＩＦ（ＤＲＢ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）とＮＥＬＦ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、そしてその抑制を解除するタンパク質因子Ｐ−ＴＥＦｂ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂ）が含まれている。Ｐ−ＴＥＦｂはＤＲＢ感受性のタンパク質リン酸化酵素であり、その酵素活性を通じてＤＳＩＦとＮＥＬＦによる転写抑制を解除する。Ｄ型肝炎ウイルス抗原による転写活性化には２つの側面がある。第１に、Ｄ型肝炎ウイルス抗原はＮＥＬＦとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの相互作用を妨げることでＤＳＩＦとＮＥＬＦによる転写抑制を解除する。第２に、Ｄ型肝炎ウイルス抗原はＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用することで転写を直接促進する。つまり、Ｐ−ＴＥＦｂとＤ型肝炎ウイルス抗原は異なる機構でＤＳＩＦとＮＥＬＦによる転写抑制を解除している。
ＨｅＬａ細胞の核抽出液を用いた試験管内転写反応においては、Ｐ−ＴＥＦｂが活性な状態にあり、ＤＳＩＦとＮＥＬＦによる抑制がもともと解除されているため、Ｄ型肝炎ウイルス抗原による転写促進効果がわずかしか認められない。Ｐ−ＴＥＦｂが持つ酵素活性の特異的阻害剤ＤＲＢを転写反応に加えると、Ｄ型肝炎ウイルス抗原による著しい転写活性化が認められる。
化合物ａ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈを試験管内転写反応に加え、Ｄ型肝炎ウイルス抗原による転写促進効果の阻害を検出した。
試験管内の転写反応は、ＨｅＬａ細胞核抽出液２０マイクログラムと鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＴＦ３−６Ｃ２ＡＴ（Ｗａｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２，３４３−３５６）０．１２５マイクログラムを混合し、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよび［α−３２Ｐ］ＵＴＰを添加することによって行なった。必要に応じて、さらにＤ型肝炎ウイルス抗原と低分子化合物を反応に加えた。合成された転写産物は尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、その合成量は画像解析装置ＳＴＯＲＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて定量した。結果を図６に示す。
Ｄ型肝炎ウイルス抗原および実施例２で選ばれた化合物を反応に加えないとき、ＤＲＢの添加によって転写は約１／１０に抑制された。ＤＲＢ非存在下においてＤ型肝炎ウイルス抗原を加えると、転写は約１．５倍に促進された。ここにさらに実施例２で選ばれた化合物を加えたところ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原によって促進された転写は抑制された。一方、ＤＲＢ存在下においてＤ型肝炎ウイルス抗原を加えると、転写は約１０倍に促進された。ここにさらに実施例２で選ばれた化合物を加えたところ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原によって促進された転写は抑制された。
別途、これらの化合物によるＲＮＡポリメラーゼＩＩの直接的な活性抑制を検討するため、上記反応系で、Ｄ型肝炎ウイルス抗原を添加せずに、ＤＲＢ存在下、非存在下で、各化合物を添加したところ、化合物ａ、ｆ、ｈは転写をほぼ完全に抑制し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を直接的に抑制していることが判明した。そこで、化合物ｅ、ｇがＤ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合を阻害することによって、Ｄ型肝炎ウイルス抗原による転写促進効果を阻害することが判明した。
実施例３．
精製されたＲＮＡポリメラーゼＩＩとデオキシシチジンテイル化ＤＮＡを用いて、Ｄ型肝炎ウイルス抗原がＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長反応に与える効果を試験管内で測定した。デオキシシチジンテイル化ＤＮＡは特殊な末端を持つ線状ＤＮＡである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩはデオキシシチジンテイル化ＤＮＡを鋳型とした転写反応において、転写開始反応をスキップして、転写伸長反応を行なうことができる。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩとデオキシシチジンテイル化ＤＮＡを混合し、ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰおよび〔α−３２Ｐ〕ＵＴＰを加えて、８分または１６分反応させた。必要に応じて、さらにＤ型肝炎ウイルス抗原とα−アマニチンを加えた。合成された転写産物は尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、その合成量は画像解析装置ＳＴＯＲＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて定量した。結果を図７に示す。
Ｄ型肝炎ウイルス抗原非添加時において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは低い速度でＲＮＡを合成した（レーン１，２）。野生型Ｄ型肝炎ウイルス抗原を加えると、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは高い速度でＲＮＡを合成した（レーン５，６）。一方、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合しない変異型Ｄ型肝炎ウイルス抗原を加えると、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは低い速度でＲＮＡを合成した（レーン９，１０）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩの阻害剤であるα−アマニチンを加えると、いずれの場合でもＲＮＡ合成は完全に阻害された。従って、Ｄ型肝炎ウイルス抗原自体にＲＮＡ合成活性があるわけではなく、観察されたＲＮＡ合成はＲＮＡポリメラーゼＩＩに由来することが分かった。そして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合型のＤ型肝炎ウイルス抗原はＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長反応を著しく活性化することが分かった。
Ｄ型肝炎ウイルス抗原が遺伝子発現に及ぼす効果を検討した。Ｄ型肝炎ウイルス抗原をウイルスベクターを用いてヒト肝癌由来のＨｕｈ７細胞に導入し、Ｄ型肝炎ウイルス抗原を恒常的に発現する細胞を調製した。この細胞および元のＨｕｈ７細胞からそれぞれＲＮＡを調製し、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて遺伝子発現解析を行なった。結果の一部を下記表に示す。
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元のＨｕｈ７細胞細胞と比較して、Ｄ型肝炎ウイルス抗原発現細胞ではプロニューロテンシン遺伝子、ＰＰＨα遺伝子、α−フェトプロテイン遺伝子、グルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＴＳＣ５０１遺伝子の発現量がそれぞれ２１．０倍、１５．５倍、１３．４倍、１１．９倍、９．５倍、８．０倍増加していた。従って、Ｄ型肝炎ウイルス抗原は肝臓特異的遺伝子のみならず、様々な遺伝子の発現に対して活性化作用を示すことが分かった。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写反応は一連の素過程、すなわち開始、伸長、そして終結、から構成されている。このうちの転写伸長反応には数分から１日を要する。その所要時間はそれぞれの遺伝子の長さに依存している。遺伝子長の長い遺伝子や迅速な発現制御を必要とする遺伝子にとって、転写伸長反応は重要な律速段階となっている。
Ｄ型肝炎ウイルス抗原はＲＮＡポリメラーゼＩＩと結合し、転写伸長反応を著しく活性化する。その活性化作用は比較的幅広い遺伝子に及ぶ。従って、Ｄ型肝炎ウイルス抗原を適当な発現系を用いて細胞内で発現させることによって、様々な遺伝子の発現を転写伸長段階において促進することができる。また、Ｄ型肝炎ウイルス抗原を塩基配列特異的なＤＮＡ結合ドメインまたはＲＮＡ結合ドメインと融合させたタンパク質を利用すれば、Ｄ型肝炎ウイルス抗原を特定の遺伝子上に結合させ、特定の遺伝子の発現制御に利用することができる。
産業上の利用可能性
本発明により、Ｄ型肝炎治療剤の安全かつ効率的な探索方法を提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｄ型肝炎ウイルス抗原タンパク質上のＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合領域の同定を示す。
図２は、タンパク質によるＤ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合阻害を示す。
図３は、Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を阻害するタンパク質による、Ｄ型肝炎ウイルスによる転写活性化の阻害を示す。
図４は、Ｄ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合阻害剤の探索を示す。
図５は、探索された化合物によるＤ型肝炎ウイルス抗原とＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合阻害を示す。
図６は、探索された化合物による、Ｄ型肝炎ウイルス抗原による転写活性化の阻害を示す。
図７は、Ｄ型肝炎ウイルス抗原の、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する促進効果を示す電気泳動図である。
符号の説明
ＧＳＴ−ＨＤＡｇ：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＤ型肝炎ウイルス抗原の融合タンパク質
ＧＳＴ−ΔＣ８：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＤ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端８残基が欠失したタンパク質との融合タンパク質
ＧＳＴ−ΔＣ１６：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＤ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端１６残基が欠失したタンパク質との融合タンパク質
ＧＳＴ−ΔＣ２４：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＤ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端２４残基が欠失したタンパク質との融合タンパク質
ＧＳＴ−ΔＣ３１：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＤ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端３１残基が欠失したタンパク質との融合タンパク質
ＧＳＴ：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
ＧＳＴ−ΔＮ１４５：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＤ型肝炎ウイルス抗原のＮ末端１４５残基が欠失したタンパク質との融合タンパク質
ＧＳＴ−ΔＮ１２９：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＤ型肝炎ウイルス抗原のＮ末端１２９残基が欠失したタンパク質との融合タンパク質
ＧＳＴ−ΔＮ１０７：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＤ型肝炎ウイルス抗原のＮ末端１０７残基が欠失したタンパク質との融合タンパク質
ＧＳＴ−ΔＮ８８：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＤ型肝炎ウイルス抗原のＮ末端８８残基が欠失したタンパク質との融合タンパク質
ΔＣ８：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端８残基が欠失したタンパク質
ΔＣ１６：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端１６残基が欠失したタンパク質
ΔＣ２４：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端２４残基が欠失したタンパク質
ΔＣ３１：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端３１残基が欠失したタンパク質
ΔＮ１４５：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＮ末端１４５残基が欠失したタンパク質
ΔＮ１２９：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＮ末端１２９残基が欠失したタンパク質
ΔＮ１０７：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＮ末端１０７残基が欠失したタンパク質
ΔＮ８８：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＮ末端８８残基が欠失したタンパク質
ＨＤＡｇΔＣ８：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端８残基が欠失したタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター
ＨＤＡｇΔＣ３１：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＣ末端３１残基が欠失したタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター
ＨＤＡｇΔＮ８８：Ｄ型肝炎ウイルス抗原のＮ末端８８残基が欠失したタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター
ＤＲＢ：５，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ
５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンジミダゾール
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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