(57)【要約】本発明は、Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチド、オリゴマー形成能を有するペプチドおよび組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドを含むＦａｓに結合する融合蛋白質を提供する。また、ＦＬＡＧ様ペプチドを、組換え蛋白質の産生量増加の目的で使用する方法、およびロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質との融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる目的で使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチド、（ｂ）オリゴマー形成能を有するペプチドおよび（ｃ）組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドを含み、Ｆａｓに結合することを特徴とする融合蛋白質。
【請求項２】
前記（ａ）Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも１部を有するペプチドが、（ａ−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ａ−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１０３〜２８１番目のアミノ酸配列からなるペプチド、（ａ−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１３０〜２８１番目のアミノ酸配列からなるペプチド、（ａ−４）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１４５〜２８１番目のアミノ酸配列を少なくとも含むペプチド、および（ａ−５）（ａ−１）〜（ａ−４）のいずれかに記載のペプチドにおいて１または数個以下のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆａｓに結合する活性を有するペプチド、からなる群より選択され；
前記（ｂ）オリゴマー形成能を有するペプチドが、（ｂ−１）ロイシンジッパー、（ｂ−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、および（ｂ−３）配列番号２のアミノ酸配列において１または数個以下のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、オリゴマー形成能を有するペプチド、からなる群より選択され；
前記（ｃ）組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドが、（ｃ−１）ＦＬＡＧ様ペプチド、（ｃ−２）アミノ酸配列がＡｓｐ−Ｂ−Ｚ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（但し、Ｂ−ＺはＴｙｒ−ＬｙｓまたはＬｅｕ−Ｔｙｒである）からなるペプチド、および（ｃ−３）アミノ酸配列がＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｘ１−ｎ−Ｒ（但し、ＲはＬｙｓ、Ａｒｇ、ＭｅｔまたはＡｓｎであって、Ｘ１−ｎはＬｙｓ、Ａｒｇ、ＭｅｔおよびＡｓｎ以外のいずれかのアミノ酸を意味する）からなるペプチド、からなる群より選択される；
請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
Ｆａｓを発現している細胞にアポトーシスを誘導する活性を有することを特徴とする請求項２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
前記Ｆａｓを発現している細胞にアポトーシスを誘導する活性が、ＷＳＴ−１アッセイにおいて該融合蛋白質を３ｎｇ／ｍＬ添加したときの細胞生存率が５０％以下であることを特徴とする請求項３に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
Ｎ末端側より前記（ｃ）のペプチド、前記（ｂ）のペプチド、および前記（ａ）のペプチド、の順に連結された請求項２ないし４のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項６】
更にシグナル配列を含んでなる請求項２ないし５のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項７】
以下の（ｄ）または（ｅ）の蛋白質；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個以下のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆａｓに結合する活性を有する蛋白質。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
所望の蛋白質をＦＬＡＧ様ペプチドとの融合蛋白質として産生させ、該蛋白質の産生量を増加させることを特徴とする組換え蛋白質を産生する方法。
【請求項１２】
前記所望の蛋白質が膜貫通型蛋白質である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記所望の蛋白質が膜貫通型蛋白質の細胞外ドメインである請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記所望の蛋白質がオリゴマー形成能を有するペプチドと膜貫通型蛋白質の融合蛋白質である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記所望の蛋白質がオリゴマー形成能を有するペプチドと、膜貫通型蛋白質の細胞外ドメインの融合蛋白質である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴマー形成能を有するペプチドがロイシンジッパーであり、膜貫通型蛋白質がＦａｓリガンドである請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
所望の蛋白質をコードする塩基配列とＦＬＡＧ様ペプチドをコードする塩基配列を読み枠を合わせた状態で連結したＤＮＡ断片を含む発現ベクターを作製し、宿主にその発現ベクターを導入し、得られた形質転換体を発現に適切な条件で培養し、その培養混合物から組換え蛋白質を回収、精製する工程を含み、該所望の蛋白質の産生量を増加させることを特徴とする組換え蛋白質の製造方法。
【請求項１８】
ロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質の融合蛋白質を作製する際に、該融合蛋白質にさらにＦＬＡＧ様ペプチドを連結することにより該融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる方法。
【請求項１９】
ロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質の細胞外ドメインの融合蛋白質を作製する際に、該融合蛋白質にさらにＦＬＡＧ様ペプチドを連結することにより該融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｆａｓリガンドとしての生物学的活性を有する融合蛋白質、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供する。本発明は、また、該融合蛋白質の産生に有用であり、かつ、組換え蛋白質全般に応用可能な組換え蛋白質の産生量増加方法およびロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質との融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる方法を提供する。
背景技術
Ｆａｓは、ＴＮＦレセプターファミリーに属する分子量約４５ｋＤのＩ型膜貫通型蛋白質であり、抗Ｆａｓ抗体（Ｙｏｎｅｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７４７，１９８９）やＡＰＯ−１抗体（Ｔｒａｕｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６７：１４５６，１９８９）によって認識され、アポトーシスのシグナルを細胞に伝達する細胞表面抗原である。
ヒトＦａｓリガンドは、Ｆａｓを発現する細胞に対してアポトーシスを誘導する生体内分子として、長田等のグループにより最初に報告されたＴＮＦファミリーに属する分子量約４０ｋＤのＩＩ型の膜貫通型蛋白質で（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　６：１５６７，１９９４）、ＴＮＦと同様、生体内で３量体を形成すると考えられている（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．　１４：１１２９、１９９５）。また、ラットＦａｓリガンド（Ｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　７５：１１６９，１９９３）やマウスＦａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　７６：９６９，１９９４）と細胞外領域において高いホモロジーを有しており、ヒトＦａｓのみでなくマウスＦａｓをも認識し、アポトーシスを誘導することができる。同様にラットＦａｓリガンドおよびマウスＦａｓリガンドも、ヒトＦａｓを認識してアポトーシスを誘導することができる。
一方、Ｆａｓを介するアポトーシスの細胞内シグナル伝達機序に関しても研究が進んでおり、Ｆａｓの細胞内領域、特にデスドメイン（Ｄｅａｔｈ　ｄｏｍａｉｎ）と呼ばれる領域と相互作用してシグナルを伝達または抑制する因子の同定およびクローニングが報告されている他、Ｃａｓｐａｓｅと呼ばれる一連のシステインプロテアーゼがＦａｓを介するアポトーシスのシグナル伝達に寄与していることが報告されている。
近年、アポトーシス、特にＦａｓを介するアポトーシスと種々の疾患および生理現象との関連が示唆されている。たとえば、ウイルス性劇症肝炎における肝細胞死およびある種の自己免疫疾患等において、Ｆａｓを介するアポトーシスの異常が関与する可能性が示唆されている。また、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系はアポトーシス以外の機能、たとえば、好中球に作用して起炎性に働く作用等も担っている可能性が示唆されている（榧垣等、臨床免疫　２８：６６７，１９９６）。
組換え蛋白質技術において、形質転換体を用いて適切な三次および四次構造を有する生物学的に活性な組換え蛋白質を発現させることはしばしば重要な課題となっている。特に興味の対象となっているのは、膜貫通型蛋白質を生物学的活性を有する可溶性蛋白質として発現させることである。可溶性蛋白質は、高度に精製された蛋白質を大量に必要とする医薬品への適用において有用である。
膜貫通型蛋白質の可溶性形態は、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインを削除し、そして適切なシグナルペプチドを添加してその蛋白質の可溶性形態の分泌を可能にさせることにより調製されている（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８：１７０４，１９８７；Ｔｒｅｉｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：４０９９，１９８６）。Ｆａｓリガンドの場合では、ＣＤ８シグナル配列およびその細胞外ドメインとヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインの融合蛋白質が開示されている（米国特許第６，００１，９６２号）。しかし一般的に、可溶型のＦａｓリガンドは全長型のＦａｓリガンドに比して生物学的活性が低いことが知られており、医薬の分野で利用できる程度の高い活性を有するＦａｓリガンドの提供はこれまでなされていない。Ｆａｓリガンドと同様、三量体を形成することが活性に重要であると考えられているＴＮＦファミリーの一員であるＣＤ４０リガンドにおいては、ロイシンジッパーを用いて三量体ＣＤ４０リガンドを調製する方法が開示されている（米国特許第５，７１６，８０５号）。しかしながら、融合蛋白質がロイシンジッパーのようなオリゴマー形成能を有するペプチドを含む場合は、機能が保持された可溶性蛋白質の収量が著しく低下する場合があり、産生量を確保するのに困難が生じることがある（Ｐａｃｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６：２８，１９９５）。
ＦＬＡＧ様ペプチドは、融合蛋白質の生物学的活性を変化させず、特異的モノクローナル抗体により認識されるエピトープを提供するが、このことにより、発現される融合蛋白質の迅速な検出および容易な精製が可能になる。従来、ＦＬＡＧ様ペプチドは精製用のタグとしてのみ用いられてきた。近年、ＦＬＡＧペプチドを膜結合型蛋白質の膜結合ドメインに融合することにより融合蛋白質を可溶性形態として調製したのち、ＦＬＡＧペプチドをエンテロキナーゼを用いて除去すると膜結合活性が回復することが示された（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７：１３６４３，１９９８）。しかし、ＦＬＡＧ様ペプチドが組換え蛋白質の産生量を増加させる効果およびロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質との融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる効果を有することは、これまで知られていなかった。
本発明の目的は、高い生物学的活性を有するＦａｓリガンド融合蛋白質を簡便かつ大量に供給することにある。また、そのために用いることのできる、組換え蛋白質の産生量を簡便に増加させる方法およびロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質との融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる方法もあわせて提供される。高い生物学的活性を有するＦａｓリガンド融合蛋白質を簡便かつ大量に供給することは、Ｆａｓを介したアポトーシスが関与する疾患の治療薬の開発につながる。また、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド結合により惹起される細胞内情報伝達経路の解明や、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド相互作用を制御する新規因子の探索においても必須であり、医療をはじめ、多くの分野で渇望されている。
医薬の分野において有用なＦａｓリガンドを提供するためには、高い生物学的活性を保証することおよび高い産生量を確保することが重要であると考えられるが、本発明以前にそのような提案はなされていない。
発明の開示
本発明者は、高い生物学的活性を有するＦａｓリガンドを高産生量で取得するべく鋭意研究を重ねてきた。その結果、ＦａｓリガンドをロイシンジッパーおよびＦＬＡＧ様ペプチドとの融合蛋白質とすることにより、高活性かつ高産生量で取得することに成功した。本発明において、ＦＬＡＧ様ペプチドが組換え蛋白質の産生量を増加させる効果およびロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質との融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる効果を有することが開示される。
本発明第１の態様は、Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドと、オリゴマー形成能を有するペプチド、および組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドからなり、Ｆａｓに結合する融合蛋白質である。本発明第２の態様は、本発明第１の態様の融合蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。本発明第３の態様は、本発明第２の態様のＤＮＡを含む発現ベクターである。本発明第４の態様は、本発明第３の態様の発現ベクターで形質転換された形質転換体である。
本発明第５の態様は、所望の蛋白質をＦＬＡＧ様ペプチドとの融合蛋白質として産生させることを特徴とする組換え蛋白質の産生量増加方法である。本発明第６の態様は、所望の蛋白質をコードする塩基配列とＦＬＡＧ様ペプチドをコードする塩基配列を読み枠を合わせた状態で連結したＤＮＡ断片を含む発現ベクターを作製し、宿主となる適切な細胞や微生物にその発現ベクターを導入し、得られた形質転換体を発現に適切な条件で培養し、その培養混合物から組換え蛋白質を回収、精製する工程を含み、該所望の蛋白質の産生量を増加させる組換え蛋白質製造方法である。本発明第７の態様は、ロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質の融合蛋白質を作製する際に、該融合蛋白質にさらにＦＬＡＧ様ペプチドを連結することにより該融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる方法である。
発明を実施するための最良の形態
以下に詳細に本発明を説明する。
まず、本発明第１の態様の融合蛋白質について説明する。本明細書中の説明において、Ｆａｓリガンドとは、少なくともその生物学的活性として、Ｆａｓに結合する活性を有する物質のことである。より好ましくは、Ｆａｓを発現する細胞にアポトーシスを誘導する活性を有する物質である。すなわち、本明細書中の説明においてＦａｓリガンドに関する生物学的活性とは、Ｆａｓに結合する活性のことであり、より好ましくはＦａｓを発現する細胞にアポトーシスを誘導する活性を意味する。Ｆａｓリガンドによるアポトーシスの誘導は、Ｆａｓリガンドが細胞表面のＦａｓに結合し、Ｆａｓを介して、アポトーシスのシグナルが細胞に伝達されるためと考えられている。ここでいうＦａｓあるいはＦａｓリガンドは例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ネコ、イヌ、マーモット等のいかなる動物種由来のものであってもよいが、好ましくはヒト由来のものである。
本発明第１の態様の（ａ）Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドとは、好ましくは配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の全体を有するペプチド、および、そのアミノ酸配列の任意の長さからなる任意の一部分を有するペプチドであり、Ｆａｓリガンドとしての生物学的活性を有するものを意味する。もちろん、そのアミノ酸配列の任意の一部に加え、そのＮ末端、Ｃ末端のいずれか一方、もしくはその両方に、例えばＭｅｔ等の任意の１つ以上のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列で規定されるペプチド、あるいはアミノ酸配列中の任意の位置に１つ以上のアミノ酸の変異、付加、欠失、置換が生じたものであってもＦａｓリガンドとしての生物学的活性を有する限りにおいては、これに含まれる。例えばラットやマウスのＦａｓリガンドのアミノ酸配列はヒトのＦａｓリガンドのアミノ酸配列に複数の置換、欠失が生じているものと位置づけることができるが、いずれもＦａｓリガンドとしての生物学的活性を有することが知られている。同様に、アカゲザル（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５９：５９９，１９９８）やモルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ネコ、イヌ、マーモット等の他の動物種由来のＦａｓリガンドであっても、Ｆａｓリガンドとしての生物学的活性を有する限りにおいては本発明第１の態様のＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドに含まれる。Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドの最も好適な一例は、Ｆａｓリガンドの細胞外ドメインである。Ｆａｓリガンドの細胞外ドメインは、配列表の配列番号１に記載のヒトのＦａｓリガンドでは１０３〜２８１アミノ酸部分に相当する。また他の好適な例としては、生体内で膜型ヒトＦａｓリガンドからプロテアーゼ切断によって遊離される可溶型ヒトＦａｓリガンドに相当する１３０〜２８１アミノ酸部分が挙げられる。本発明第一の態様の融合蛋白質は、Ｆａｓに結合する活性を有する限りにおいてはアポトーシスを誘導する活性のあるものであってもないものであってもよい。Ｆａｓに結合し、かつアポトーシスを誘導しない場合には、生体内のＦａｓリガンドに拮抗する物質として、アポトーシスを人為的に抑制するために使用することができる。しかしながら、本発明第一の態様の融合蛋白質はアポトーシスを誘導する活性を有するものであることが好ましい。ヒトのＦａｓリガンドにおいてはＮ末端から１４５〜２８１アミノ酸部分がアポトーシス誘導活性に必要であることが知られている。したがって、本発明第一の態様の融合蛋白質はＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部として、ヒトのＦａｓリガンドの１４５〜２８１アミノ酸部分を含有するものが好ましい。しかしアポトーシス誘導活性がより強いものとしては、ヒトのＦａｓリガンドの１４４番目以降のアミノ酸配列に対応する配列を含有するものが好ましい。
（ｂ）オリゴマー形成能を有するペプチドとは、二量体、三量体、或いはそれより高度のオリゴマーへと自己会合する能力があるペプチドのことであり、多くの場合、α−ヘリックスやβ−シートのような２次構造をとりうる。ロイシンジッパーが好適な１例として提供される。
ロイシンジッパーは、数々の蛋白質における保存ドメインとして存在する、（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎ（ｎは４あるいは５）と表示される反復性７残基モチーフを意味するのに用いられる用語である。式中、ａおよびｄは一般的にロイシンあるいはイソロイシンのような疎水性残基であり、これらはヘリックスの同一面に並んでいる（ＭｃＬａｃｈｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：２９３，１９７５）。位置ｄに存在するロイシン残基は大きな疎水性安定化エネルギーの一因となっており、そしてこれは二量体形成にとって重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓ．３８：２２９，１９９１）。また、ロイシンジッパーの上記式ａおよびｄ残基に対応するアミノ酸置換がロイシンジッパーのオリゴマー形成特性を変化させることが見いだされた（Ｈａｒｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６２：１４０１，１９９３）。位置ａの全ての残基がイソロイシンに代わる場合には、ロイシンジッパーは依然として平行二量体を形成する。この変化に加え、位置ｄのロイシン残基が全てイソロイシンに代わる場合には、得られるペプチドは溶液中において自発的に三量体平行らせん状コイルを形成する。位置ｄの全てのアミノ酸をイソロイシンで、そして位置ａの全てのアミノ酸をロイシンで置換すると四量体を形成する。オリゴマー形成のメカニズムが同一であるかぎり、これらの置換を含むペプチドは依然としてロイシンジッパーとして引用される。ロイシンジッパーのもっとも好適な１例は、配列番号２に記載される配列を有するものであるがオリゴマー形成能を有するかぎりにおいてはこれに限定されるものではない。オリゴマー形成能を有するペプチドの他の例としては、ｐ５３の四量体化に関与する配列、血小板因子４、ヒストンＨ３およびＨ４蛋白質の一部の配列などが知られている（これらは、特表平１１−５０８１２６号公報に詳細に記載され、本明細書はこれを引用として明細書の内容とする。）。ここで、アミノ酸配列中の任意の位置に１つ以上のアミノ酸の変異、付加、欠失、置換が生じたものであってもロイシンジッパーとしての生物学的活性を有する限りにおいては、これに含まれる。
（ｃ）組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドとは、例えば哺乳動物細胞に融合蛋白質を産生させる際に培養上清から回収できる融合蛋白質量を増加させる効果や、大腸菌に融合蛋白質を産生させる際に菌体のライセートから回収できる融合蛋白質量を増加させる効果を有するペプチドを意味する。組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドの好適な１例として本発明者は初めてＦＬＡＧ様ペプチドを見出した。本明細書中の説明においてＦＬＡＧ様ペプチドとは、好ましくはＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓという８アミノ酸からなるＦＬＡＧペプチドのことである（Ｈｏｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１２０４，１９８８；米国登録商標登録番号第１５５７４８５号）。しかし、組換え蛋白質の産生量を増加させる効果を有し、より好ましくはロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質との融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる効果を有する限りにおいては、そのアミノ酸配列の任意の一部に加え、そのＮ末端、Ｃ末端のいずれか一方、もしくはその両方に、例えばＭｅｔ等の任意の１つ以上のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列で規定されるペプチド、あるいはアミノ酸配列中の任意の位置に１つ以上のアミノ酸の変異、付加、欠失、置換が生じたものであっても、これに含まれる。このようなペプチドをＦＬＡＧ様ペプチドと呼ぶ。例えば、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓというアミノ酸配列からなるペプチドも、前述の８アミノ酸からなる配列と同等の機能を有するものとして使用されている。すなわち、ＦＡＬＧ様ペプチドの好ましい一形態は、アミノ酸配列がＡｓｐ−Ｂ−Ｚ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（但し、Ｔｙｒ−ＬｙｓまたはＬｅｕ−Ｔｙｒである）からなるペプチドと表すことが出来る。また別の一形態としては、特公平７−４２５５に記載されているように、アミノ酸配列がＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｘ１−ｎ−Ｒ（但し、ＲはＬｙｓ、Ａｒｇ、ＭｅｔまたはＡｓｎであって、Ｘ１−ｎはＬｙｓ、Ａｒｇ、ＭｅｔおよびＡｓｎ以外のいずれかのアミノ酸を意味する。）からなるペプチドと表すことが出来る。ここで、ｎは特に限定されないが好ましくは３〜５である。
本発明の融合蛋白質はＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチド、オリゴマー形成能を有するペプチドおよび組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドから構成されるが、少なくともＦａｓと結合するという性質を保持しており、より好ましくはＦａｓを発現している細胞にアポトーシスを誘導する活性を保持している限りにおいては、３種のペプチドはいかなる順序で連結されてもよいし、任意のリンカー配列やシグナル配列を含むこともできる。Ｆａｓリガンドの場合、Ｃ末端側においてＦａｓと相互作用することが知られているので、オリゴマー形成能を有するペプチドおよび組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドはＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドのＮ末端側に連結されることが好ましい。リンカー配列は、当技術分野において周知である。シグナル配列の例としては、マウスＴリンパ球抗原ＣＤ８シグナル配列、バキュロウイルスｇｐ６７蛋白シグナル配列、Ｇ−ＣＳＦシグナル配列、ヒトＦａｓシグナル配列のような蛋白質の分泌を促すシグナル配列が挙げられる。
本発明の融合蛋白質の好適な１例は、Ｎ末端側からＦＬＡＧ様ペプチド、ロイシンジッパー、ヒトＦａｓリガンドの細胞外ドメインの順に連結された融合蛋白質である。最も好適な１例は配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するものであり、Ｎ末端側からヒトＦａｓシグナル配列、ＦＬＡＧペプチド、ロイシンジッパー、ヒトＦａｓリガンドの細胞外ドメインの順に連結された融合蛋白質である。配列番号４のアミノ酸配列の任意の一部に加え、そのＮ末端、Ｃ末端のいずれか一方、もしくはその両方に、例えばＭｅｔ等の任意の１つ以上のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列で規定されるペプチド、あるいはアミノ酸配列中の任意の位置に１つ以上のアミノ酸の変異、付加、欠失、置換が生じたものであっても、本発明の融合蛋白質に含まれる。
本発明の融合蛋白質の生物学的活性、すなわちＦａｓとの結合能あるいはアポトーシス誘導活性の検定には実施例に示されているＷＳＴ−１アッセイのほかに通常用いられるアッセイを用いることができる。ＷＳＴ−１アッセイは宝酒造株式会社のＰｒｅｍｉｘ　ＷＳＴ−１　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍに従って行うことが出来る。Ｆａｓ発現細胞としては、ヒトＴ細胞由来株化培養細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を用いることが好ましい。ＷＳＴ−１アッセイ以外のアッセイとしては、例えばＦａｓとの結合能を調べるには、Ｆａｓと本発明の融合蛋白質とで免疫沈降を行う方法や、該融合蛋白質を認識する抗体を蛍光標識したうえで、Ｆａｓを発現している細胞に結合した該融合蛋白質をフローサイトメトリーで調べることができる。またアポトーシス誘導活性の検定にはルービエ等の方法を用いることができる（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１９５，１９９３）。本発明の融合蛋白質のアポトーシス誘導活性は、実施例に示されているＷＳＴ−１アッセイにおいて該融合蛋白質を３ｎｇ／ｍＬ添加したときの細胞生存率が５０％以下であることが好ましい。同アッセイにおいて細胞生存率が低いほど、該融合蛋白質のアポトーシス誘導活性は高いと評価できる。高いアポトーシス誘導活性を有する本発明の融合蛋白質は、医薬品に適用する際に、治療に有効な投与量を低く押さえることができるため副作用の軽減や製造コストの低価格化につながり有用である。本発明の融合蛋白質のより好ましい例は、同アッセイにおいて該融合蛋白質を３ｎｇ／ｍＬ添加したときに達する細胞生存率が２０％以下であるアポトーシス誘導活性を有するものである。
本発明の融合蛋白質は、ＦＬＡＧ様ペプチドとロイシンジッパーの両方を用いることにより、Ｆａｓリガンドとしての活性を増大させ、かつ融合蛋白質の産生量も増大させた点に特徴がある。生体内で多量体構造をとりうるＦａｓリガンドのような分子の場合、ロイシンジッパーとの融合蛋白質とすれば組換え蛋白質で活性を有するものが取得できるであろうことは予測可能であったが、驚くべきことにロイシンジッパーにＦＬＡＧペプチドを組み合わせることによって、ロイシンジッパーのみを使用した場合に比べて活性が上昇し、また産生量も増大した。すなわち、本発明の融合蛋白質は、ロイシンジッパーのみとの融合蛋白質とした場合に比べて、産生量が少なくとも１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、更に好ましくは２０倍以上、特に好ましくは３０倍以上であり、かつＦａｓリガンドとしての生物学的活性が１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、更に好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上であることを特徴とするものである。
本発明第１の態様の融合蛋白質は、組換え型蛋白質として遺伝子工学的に生産される。該融合蛋白質を遺伝子工学的に生産する例には、後述する本発明第２の態様の新規ＤＮＡ、もしくは第３の態様の発現ベクターを用いて、適当な宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して培養混合物を回収し、該融合蛋白質を精製する。また、該ＤＮＡや組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．１９８９）で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。遺伝子工学的に融合蛋白質を製造する好ましい方法については本発明第６の態様で説明する。
次に本発明の第２の態様のＤＮＡについて説明する。該ＤＮＡは本発明第１の態様の融合蛋白質をコードする塩基配列を有する。該融合蛋白質はＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチド、オリゴマー形成能を有するペプチドおよび組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドから構成されるので、該ＤＮＡはそれら３種のペプチドをコードする塩基配列を読み枠を合わせた状態で連結したものである。該ＤＮＡがコードする融合蛋白質が少なくともＦａｓと結合するという性質を保持しており、より好ましくはＦａｓを発現している細胞にアポトーシスを誘導する活性を保持している限りにおいては、３種のペプチドをコードする塩基配列はいかなる順序で連結されてもよいし、任意のリンカー配列やシグナル配列をコードする塩基配列を含むこともできる。Ｆａｓリガンドの場合、Ｃ末端側においてＦａｓと相互作用することが知られているので、オリゴマー形成能を有するペプチドおよび組換え蛋白質の産生量を増加させるペプチドをコードする塩基配列はＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドをコードする塩基配列の５’末端側に連結されることが好ましい。
一般に、同一の機能を有するポリペプチドに対するＤＮＡは、動物種や個体が異なっていても互いに相同性があり、互いにハイブリダイズすることが多い。アミノ酸の多様性も、それらをコードするＤＮＡが互いにハイブリダイズする範囲で生じることが多い。例えばハイブリダイゼーション法によるＤＮＡのクローニングは、異なるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが互いにハイブリダイズすることを示している。互いにハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、実質的に同一の機能を有すると考えられる。
従って、本発明の融合蛋白質は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列にハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含有するものでＦａｓに結合する活性を有するものとしても特徴づけることができる。
３種のペプチドそれぞれをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片は、いかなる方法で得られたものでもよい。すなわち、化学合成されたものであってもよく、適当なＤＮＡライブラリーからクローニングされたものであってもよい。また、該配列を有する別の組換えＤＮＡから制限酵素処理により切り出し調製したものであってもよいし、別の組換えＤＮＡを鋳型にして適当なプライマーをもちいてＰＣＲ法により増幅して調製したものでもよい。それらのＤＮＡ断片は公知のライゲーション方法によりつなぎあわせるか、断片の混合物を鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により連続したＤＮＡ断片とすることができる。
次に、本発明第３の態様の発現ベクターについて説明する。本発明第３の態様の発現ベクターは、上述した本発明第２の態様のＤＮＡを含む。このＤＮＡ断片を、哺乳類、微生物、ウイルス、もしくは昆虫遺伝子から得られるもののような適切な転写および／または翻訳調節塩基配列に機能可能なように連結させる。調節配列の例には、遺伝子発現における調節的役割を有する配列（例えば、転写プロモーターもしくはエンハンサー）、転写を制御するためのオペレーター配列、ｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびに転写および翻訳の開始および停止を制御する適切な配列が含まれる。これらの塩基配列の必要性は、発現ベクターの使用目的によって決定される。
本発明の第３の態様の発現ベクターは、本発明の第２の態様のＤＮＡを任意のベクターに導入して得ることができる。必要であれば、該ＤＮＡを他の塩基配列とともに任意のベクターに導入してもよい。ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．１９８９）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等いかなるものでもよい。たとえば、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＰＩＣ９Ｋ、λＺａｐＩＩ、λｇｔ１１、ｐＥＦ−ＢＯＳ等から適宜選択して使用することができる。該発現ベクターは、本発明第２の態様のＤＮＡに加えて大腸菌複製開始点、マーカー遺伝子、ポリＡ付加配列を有していることが好ましい。これらに加えて、大腸菌で機能するｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、もしくは酵母で機能するアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）１のプロモーター、もしくは昆虫細胞で機能するポリヘドリンプロモーター、もしくは動物細胞で機能するＳＶ４０のプロモーターやＳＲαのプロモーター、ヒトエロンゲーションファクター１α（ＥＦ１α）のプロモーターを有するものも該発現ベクターの好適な例として挙げられる。
次に、本発明の第４の態様の形質転換体について説明する。本発明の第４の態様の形質転換体は、本発明の第３の態様の発現ベクターで形質転換される。すなわち、本発明第４の態様の形質転換体は、宿主となる適当な細胞や微生物に、本発明第３の態様の発現ベクターを直接導入する事によって形質転換される。本発明の第３の態様の発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるがいずれの方法を用いても構わない。本発明の形質転換体は、本発明の第２の態様のＤＮＡ分子を大量に製造する目的でも使用することができる。また、本発明の第２の態様のＤＮＡが、宿主細胞の適当なプロモーターの下流に組み込まれた場合には、該形質転換体は、本発明第１の態様の融合蛋白質を生産する。従って、このような形質転換体は、本発明の第１の態様の融合蛋白質を製造する目的等に使用できる。本発明第４の態様の形質転換体は、原核細胞、真核細胞のいずれであってもよい。原核細胞の代表的な例としては、大腸菌と枯草菌があげられる。真核細胞の代表的な例としてはＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞等の哺乳動物細胞の他、Ｓｆ細胞等の昆虫細胞や酵母等があげられる。好ましくは、該形質転換体は、本発明の融合蛋白質を産生するものがよく、より好ましくは、本発明の融合蛋白質を培地中に分泌するものがよい。もっとも好適な例の１つとしてはＣＯＳ−１細胞が挙げられる。
次に、本発明の第５の態様である、所望の蛋白質をＦＬＡＧ様ペプチドとの融合蛋白質として産生させることを特徴とする組換え蛋白質の産生量増加方法について説明する。組換え蛋白質の産生量を増加させるとは、例えば哺乳動物細胞に融合蛋白質を産生させる際に培養上清から回収できる蛋白質量が増加することや、大腸菌に融合蛋白質を産生させる際に菌体のライセートから回収できる蛋白質量が増加することを意味する。
本方法の特徴は、ＦＬＡＧ様ベプチドを従来のように精製用のタグとしてのみ用いてるのではなく、組換え蛋白質の産生量を増加させる配列として使用しているところにある。従来知られている組換え蛋白質の産生量を増加させるような配列としては、分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナルペプチドは細胞からの蛋白質の分泌を容易にする。ＦＬＡＧ様ペプチドは分泌シグナル配列ではないが、組換え蛋白質の産生量を増加させる効果を有することを本発明者は新たに見出した。実施例２に示されるように、ＣＯＳ−１細胞にてＦａｓリガンドの細胞外ドメインを産生する際に、Ｆａｓリガンドの細胞外ドメインのＮ末端側にＦＬＡＧペプチドを連結すると産生量が約３倍に増加した。一方、生物学的活性を上昇させるためにＦａｓリガンドの細胞外ドメインのＮ末端側にロイシンジッパーを連結した場合では、ロイシンジッパーの存在により発現量が著しく減少したが、ＦＬＡＧペプチドをさらに連結すると産生量が２０〜３５倍上昇した。サイトカインのようなオリゴマーの形成が活性に重要な蛋白質を、オリゴマー形成能を有するペプチドとの融合蛋白質として産生させると産生量が著しく低下するという問題が生じることがある。このような場合にＦＬＡＧ様ペプチドをさらに融合し産生量を増大させることができる。所望の蛋白質をＦＬＡＧ様ペプチドとの融合蛋白質として産生させる方法については本発明第６の態様で説明する。
次に、本発明第６の態様である、所望の蛋白質をコードする塩基配列とＦＬＡＧ様ペプチドをコードする塩基配列を読み枠を合わせた状態で連結したＤＮＡ断片を含む発現ベクターを作製し、宿主となる適切な細胞や微生物にその発現ベクターを導入し、得られた形質転換体を発現に適切な条件で培養し、その培養混合物から組換え蛋白質を回収、精製する工程を含み、該所望の蛋白質の産生量を増加させる組換え蛋白質製造方法について説明する。
該ＤＮＡ断片は、ＦＬＡＧ様ペプチドによる産生量増大効果が認められる限りにおいては、所望の蛋白質をコードする塩基配列とＦＬＡＧ様ペプチドをコードする塩基配列がいかなる順序で連結されてもよいし、任意のリンカー配列やシグナル配列をコードする塩基配列を含むこともできる。発現ベクターについては本発明第３の態様に説明されている。形質転換体については本発明第４の態様に説明されている。
形質転換体の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換体の培養については各種の成書（「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年、等）があるので、それらを参考にして行うことができる。また、遺伝子の増幅や発現誘導の方法および必要性は、宿主となる細胞の種類や、使用するプロモーターによって異なる。例えは、プロモーターがｔｒｐプロモーターである時には３β−インドールアクリル酸で、ＭＭＴＶプロモーターである場合にはデキサメサゾンで、ＡＯＸ１プロモーターであればメタノールで誘導することが可能である。ＤＨＦＲ（葉酸脱水素酵素）遺伝子を含む発現ベクターを用いた時にはメトトレキセートで遺伝子の増幅を行うことが可能である。
本発明第６の態様において、培養混合物とは、培養上清もしくは細胞のことである。すなわち、形質転換体が、該組換え蛋白質を細胞外に分泌する場合にはその培養上清を材料として該蛋白質を回収、精製する。一方、該組換え蛋白質が宿主細胞内に蓄積される場合には、リゾチーム、界面活性剤、凍結融解、加圧等の手段を用いて細胞を破砕した後、遠心分離して上清を回収し、濾過等により不要な細胞断片等を取り除いた後に、それを材料として該組換え蛋白質を精製する。使用する形質転換体が大腸菌であり、産生された該蛋白質がペリプラズムに蓄積される場合は、ウィルスキー等の方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２７：５９５，１９７６）等が使用できる。培養混合物から該組換え蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。好適な一例としては実施例４に示す方法が挙げられる。他の好適な一例としては、ＦＬＡＧ様ペプチドに対する特異抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられ、その方法は米国特許第５，０１１，９１２号において開示されている。Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓというアミノ酸配列を含むＦＬＡＧ様ペプチドはエンテロキナーゼを用いて切除することが可能であり、該組換え蛋白質をＦＬＡＧ様ペプチドを除去したかたちで取得することもできる。本発明の第５および第６の態様において、「蛋白質の産生量の増加」とは、ＦＬＡＧ様ペプチドとの融合蛋白質としない場合に比べて、産生量が少なくとも１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、更に好ましくは２０倍以上、特に好ましくは３０倍以上であることを意味する。蛋白質の産生量の測定は、実施例２に示すような目的の蛋白質に特異的な抗体を用いたＥＩＡ系を使用できるほか、当業者が用い得る一般的な方法を用い得る。
次に、本発明第７の態様である、ロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質の融合蛋白質を作製する際に、該融合蛋白質にさらにＦＬＡＧ様ペプチドを連結することによりＦＬＡＧ様ペプチドが融合されている該融合蛋白質の膜貫通型蛋白質としての生物学的活性を上昇させる方法について説明する。ロイシンジッパーについては、本発明第１の態様で説明されている。膜貫通型蛋白質の例としては、ＴＮＦα、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０リガンドなどが属するＴＮＦファミリーやＴＮＦレセプター、Ｆａｓ、ＤＲ４などが属するＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーが挙げられ、他にヘモポイエチンレセプターファミリー、インターフェロンレセプターファミリー等のサイトカインレセプターも挙げられる。これら膜貫通型蛋白質の生物学的活性とは、少なくとも、レセプターの場合は対応するリガンドに、リガンドの場合は対応するレセプターに結合する活性を意味する。膜貫通型蛋白質は一般的に細胞内へシグナルを伝達する機能を有するが、両者が結合する活性を有している限りにおいては、両者の結合により細胞内へシグナルを伝達する活性を有するものでも有しないものであってもよい。結合するがシグナルを伝達しない場合には、シグナルに応じた細胞の表現系の変化を抑制するために使用することができる。しかし、両者の結合により細胞内へシグナルが伝達され、シグナルに応じた細胞の表現系の変化を惹起する活性を有することが好ましい。
本発明第７の態様の方法で作製される融合蛋白質は、ＦＬＡＧ様ペプチド、ロイシンジッパー、膜貫通型蛋白質から構成されるが、該膜貫通型蛋白質の生物学的活性が保持されている限りにおいては３種のペプチドはいかなる順序で連結されてもよいし、任意のリンカー配列やシグナル配列を含むこともできる。また膜貫通型蛋白質は、その生物学的活性が保持されている限りにおいてはそのアミノ酸配列全体を有するペプチド、そのアミノ酸配列の任意の長さからなる任意の一部分を有するペプチド、そのアミノ酸配列の任意の一部に加え、そのＮ末端、Ｃ末端のいずれか一方、もしくはその両方に、例えばＭｅｔ等の任意の１つ以上のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列で規定されるペプチド、あるいはアミノ酸配列中の任意の位置に１つ以上のアミノ酸の変異、付加、欠失、置換が生じたものであってもよい。もちろん、膜貫通型蛋白質の細胞外ドメインもこれに含まれる。
本発明第７の態様の方法が適用できる好適な１例として、膜貫通型蛋白質としてＦａｓリガンドの細胞外ドメインを用いた場合が挙げられる。実施例３に示すように、ＦＬＡＧペプチド−ロイシンジッパー−ヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインの順で連結された融合蛋白質は、ＦＬＡＧペプチドが連結されていないロイシンジッパー−ヒトＦａｓリガンド細胞外ドメイン融合蛋白質に比して約１０倍のアポトーシス誘導活性を有していた。すなわち、ＦＬＡＧペプチドを連結することによりロイシンジッパーとＦａｓリガンドとの融合蛋白質のＦａｓリガンドとしての生物学的活性を上昇させることに成功した。本発明の第７の態様において、「生物学的活性の上昇」とは、ＦＬＡＧ様ペプチドとの融合蛋白質としない場合に比べて、少なくとも１つの活性等の値が、少なくとも大であること、例えば１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、更に好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上であることを意味する。活性値等の比較は一般的な方法が用いられるが、単位量あたりの活性量、即ち比活性で比較することが出来る。比活性は、通常５０％阻害濃度（ＩＣ５０）または５０％有効用量（ＥＤ５０）等によって求められる。
［実施例］
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、該分野における慣用略号に基づくものである。
（実施例１）ヒトＦａｓリガンド融合蛋白質発現ベクターの作製
（１）ロイシンジッパーとヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインの融合蛋白質を発現するプラスミドｐＭ１８０７を以下に示す方法で作製した。
センスプライマー１（ＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＴＡＣＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴ）、アンチセンスプライマー１（ＡＴＴＴＣＴＴＣＧＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧ）、センスプライマー２（ＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＧＡＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＣＡＴＣＧＡＡＡＡＴＧＡＧ）、アンチセンスプライマー２（ＧＣＧＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡＴＴＴＴＣＧＡＴＧＴＧＡＴＡＧＡ）、センスプライマー３（ＴＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧ）、アンチセンスプライマー３（ＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＡＡＴＴＴＣ）、センスプライマー４（ＧＧＣＧＡＡＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧ）およびアンチセンスプライマー４（ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＡ）を化学合成機にて合成した。このセンスプライマー１はヒトＦａｓシグナル配列をコードする配列を含んでいる。アンチセンスプライマー１はヒトＦａｓシグナル配列をコードする配列の３’末端領域とイソロイシンジッパーをコードする配列の５’末端領域を含んでいる。センスプライマー２はロイシンジッパーをコードする配列の中間領域を含んでいる。アンチセンスプライマー２はロイシンジッパーをコードする配列の３’末端領域を含んでいる。センスプライマー３はヒトＦａｓシグナル配列をコードする配列の５’末端領域とＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ）を含んでいる。アンチセンスプライマー３はロイシンジッパーをコードする配列の３’末端領域、ＰｓｔＩサイト（ＣＴＧＣＡＧ）およびヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインのＮ末端側をコードする塩基配列を含んでいる。センスプライマー４はロイシンジッパーをコードする配列の３’末端領域、ＰｓｔＩサイト（ＣＴＧＣＡＧ）およびヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインのＮ末端側をコードする塩基配列を含んでいる。アンチセンスプライマー４はヒトＦａｓリガンドのＣ末端側をコードする配列、ＴＡＡ終止コドンおよびＫｐｎＩサイト（ＧＧＴＡＣＣ）を含んでいる。
得られたセンスプライマー１およびアンチセンスプライマー１またはセンスプライマー２およびアンチセンスプライマー２をそれぞれ５０ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ１０ｎｍｏｌ、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社）を１．２５ユニットおよび添付の１０×Ｐｆｕバッファー５μＬを含む５０μＬの溶液を調製した。ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＣＲシステム９６００、ＰＥバイオシステムズ社）を使用して；９４℃で３０秒；５５℃で３０秒；７２℃で１分を１サイクルとするＰＣＲを３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ０．５μＬ、センスプライマー３およびアンチセンスプライマー３をそれぞれ５０ｐｍｏｌを含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、上記と同様にＰＣＲを行った。
一方、センスプライマー４およびアンチセンスプライマー４をそれぞれ５０ｐｍｏｌ、鋳型としてヒトＦａｓリガンドをコードする配列を含むプラスミドｐＢＸ−ｈＦＬ１（国際公開番号ＷＯ９５／１３２９３）を１ｎｇ含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同様にＰＣＲを行った。さらに、センスプライマー３およびアンチセンスプライマー３を用いて得られたＰＣＲ産物とセンスプライマー４およびアンチセンスプライマー４を用いて得られたＰＣＲ産物をそれぞれ０．５μＬ、センスプライマー３およびアンチセンスプライマー４をそれぞれ５０ｐｍｏｌを含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同様にＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化した。一方、ＥＦプロモーター下にヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインをコードする配列を持ちＤＨＦＲ遺伝子を含む発現プラスミドｐＭ１０７０（国際公開番号ＷＯ９５／１３２９３）をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化し、アガロース電気泳動に供した後、約７ｋｂｐの断片を回収し精製した。このベクター側断片に上述のＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したＰＣＲ産物の断片を組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１８０７と命名した。
（２）ＦＬＡＧペプチドとヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインの融合蛋白質を発現するプラスミドｐＭ１８０９を以下に示す方法で作製した。
アンチセンスプライマー５（ＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧＡＡＣＣ）、センスプライマー５（ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧ）を化学合成機にて合成した。このアンチセンスプライマー５はヒトＦａｓシグナル配列をコードする配列の３’末端領域とＦＬＡＧペプチドをコードする配列を含んでいる。センスプライマー５はＦＬＡＧペプチドをコードする配列とヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインのＮ末端側をコードする塩基配列を含んでいる。
得られたアンチセンスプライマー５と実施例１（１）で作製したセンスプライマー３をそれぞれ５０ｐｍｏｌ、鋳型としてセンスプライマー１を０．０５ｐｍｏｌ含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、実施例１（１）と同様にＰＣＲを行った。一方、センスプライマー５および実施例１（１）で作製したアンチセンスプライマー４をそれぞれ５０ｐｍｏｌ、鋳型として実施例１（１）で使用したｐＢＸ−ｈＦＬ１を１ｎｇ含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同様にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ０．５μＬ、センスプライマー３およびアンチセンスプライマー４をそれぞれ５０ｐｍｏｌを含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同様にＰＣＲを行った。
こうして得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化し、実施例１（１）と同様にｐＭ１０７０のＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化したベクター側断片に組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１８０９と命名した。
（３）プラスミドｐＵＣ−ＩＺＦＬを以下に示す方法で作製した。ｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社）をＰｓｔＩで消化し、ＤＮＡ　Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ（宝酒造株式会社）を用いて末端を平滑化した後ライゲーションを行うことで、ＰｓｔＩサイトをつぶしたｐＵＣ１１８を得た。このプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化し、実施例１（１）で作製したロイシンジッパーおよびヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインを含むＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化した断片を組み込み、得られたプラスミドをｐＵＣ−ＩＺＦＬと命名した。
（４）ＦＬＡＧペプチドとロイシンジッパーとヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインの融合蛋白質（配列番号４）を発現するプラスミドｐＭ１８１５を以下に示す方法で作製した。
アンチセンスプライマー６（ＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡ）、センスプライマー６（ＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＣ）を化学合成機にて合成した。このアンチセンスプライマー６はＦＬＡＧペプチドをコードする配列とロイシンジッパーをコードする配列の５’末端領域を含んでいる。センスプライマー６はＦＬＡＧペプチドをコードする配列の３’末端領域とロイシンジッパーをコードする配列の５’末端領域を含んでいる。
得られたアンチセンスプライマー６と実施例１（１）で作製したセンスプライマー３をそれぞれ５０ｐｍｏｌ、鋳型として実施例１（２）で作製したｐＭ１８０９を１ｎｇ含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、実施例１（１）と同様にＰＣＲを行った。一方、センスプライマー６および実施例１（１）で作製したアンチセンスプライマー３をそれぞれ５０ｐｍｏｌ、鋳型として実施例１（１）で作製したｐＭ１８０７を１ｎｇ含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同様にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ０．５μＬ、センスプライマー３およびアンチセンスプライマー３をそれぞれ５０ｐｍｏｌを含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同様にＰＣＲを行った。
こうして得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで二重消化した。一方、実施例１（３）で作製したｐＵＣ−ＩＺＦＬをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで二重消化し、アガロース電気泳動に供した後、約３．７ｋｂｐの断片を回収し精製した。このベクター側断片に上述のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したＰＣＲ産物の断片を組み込み、プラスミドを得た。このプラスミドを更にＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化し、実施例１（１）と同様にｐＭ１８０７のＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化したベクター側断片に組み込み、得られたプラスミドをｐＭ１８１５と命名した。本発明者はプラスミドｐＭ１８１５を、平成１２年５月１２日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託し（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１７８５３）、さらに平成１３年５月８日付で原寄託から国際寄託に移管した（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５７５）。
（実施例２）ヒトＦａｓリガンド融合蛋白質の発現
（１）ＣＯＳ−１細胞を用いたヒトＦａｓリガンド融合蛋白質の発現を以下に示す方法で行った。
実施例１で作成したｐＭ１８１５、ｐＭ１８０９、ｐＭ１８０７、およびｐＭ１０７０（国際公開番号ＷＯ９５／１３２９３）をＣＯＳ−１細胞へ導入しその上清中に該蛋白質を発現、分泌させた。すなわち、１μｇのプラスミドを２μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液に溶解した。これらに、それぞれ０．２ｍｇ／ｍＬ　ＤＥＡＥ−デキストランおよび５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有するＤ−ＭＥＭ（日水製薬株式会社）０．７ｍＬを添加し、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を作製した。６ウエルプレート内でセミコンフルエントまで単層培養したＣＯＳ−１細胞にＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を滴下し、ＣＯ２インキュベータ中で、３７℃にて培養した。４時間後、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を除去し、１０％ＦＢＳ（ギブコ社）を含有するＤ−ＭＥＭに交換し、さらに９６時間培養した。プラスミドを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清を回収し、以下の（２）および実施例３に使用した。
（２）ＣＯＳ−１細胞培養上清中のヒトＦａｓリガンド融合蛋白質の定量を以下に示す方法で行った。培養上清中のヒトＦａｓリガンド融合蛋白質の定量は、Ｆａｓリガンド特異的な抗体（固相化抗体としてＦ９１８−２０−２、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体としてＦ９１９−９−１８、各抗体の詳細は国際公開番号ＷＯ９７／０２２９０に記載されている）を用いたＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ）にて実施した（Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　２２：７５１，１９９８）。表１に示すようにｐＭ１０７０により発現されるヒトＦａｓリガンド細胞外ドメイン（ｓｈＦａｓＬ）に比べて、それにＦＬＡＧペプチドを融合したプラスミドｐＭ１８０９により発現される融合蛋白質ＦＬＡＧ−ｓｈＦａｓＬは約３倍の産生量を有していた。また、ロイシンジッパーを融合したＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬ（ｐＭ１８０７）は産生量が著しく減少したが、さらにＦＬＡＧペプチドを融合させたＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬ（ｐＭ１８１５）は約３０倍の発現量を有していた。
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（実施例３）細胞の培養上清添加による各種Ｆａｓリガンド融合蛋白質のアポトーシス誘導活性の検討を以下に示すＷＳＴ−１アッセイで行った。ヒトＴ細胞由来株化培養細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬株式会社）に懸濁し、それを９６ウェルプレートに５０ｕＬ／ｗｅｌｌ（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ植え込んだ。次に実施例２で得られた各種Ｆａｓリガンド融合蛋白質を含むＣＯＳ−１細胞培養上清を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて検定する濃度に希釈した。この溶液を５０ｕＬ／ｗｅｌｌとなるように先の細胞を植え込んだウエルに添加し３７℃のＣＯ２インキュベータ中で約２０時間培養後、アポトーシス誘導活性を測定した。測定にはミトコンドリアの酵素活性を指標に生存細胞数を検定するＷＳＴ−１試薬（Ｐｒｅｍｉｘ　ＷＳＴ−１　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ，宝酒造株式会社）を１０ｕＬ／ｗｅｌｌ添加し３７℃のＣＯ２インキュベータ中で０．５〜２時間培養後、吸光度（４５０ｎｍ−６２０ｎｍ）を測定することで実施した。アポトーシス誘導活性の判定はバックグランドとして細胞を植え込んでいないウエルの値を差し引いた後、Ｆａｓリガンド融合蛋白質を全く含まない培地で同様に測定したウエルの値を１００％として算出し結果を図１に示した。
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図１に示すように、ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬは用量依存的にＪｕｒｋａｔ細胞に対して障害活性を示した。しかも、ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬはＦＬＡＧペプチドの融合されていないＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬに比して約１０倍のアポトーシス誘導活性を有しており、ロイシンジッパーやＦＬＡＧペプチドも融合されていないｓｈＦａｓＬに比して約１００倍のアポトーシス誘導活性を有していた。また、これらのアポトーシス誘導活性は抗ヒトＦａｓリガンド中和抗体であるＦ９１９−９−１８（詳細は、国際公開番号ＷＯ０９７／０２２９０に記載されている）によって完全に抑制され、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系特異的な活性であることが示された。
（実施例４）ヒトＦａｓリガンド融合蛋白質の精製
実施例２（１）の手法で調製したＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬを含むＣＯＳ−１細胞培養上清を用いて、抗Ｆａｓリガンド抗体Ｆ９１９−９−１８（国際公開番号ＷＯ０９７／０２２９０号公報に記載）を固相化したセファロース４Ｂ担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより以下の通り精製した。すなわち、ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬを含むＣＯＳ−１細胞培養上清２９，４２０ｍＬを０．４５μｍ孔径のフィルター（ミリパック６０：ミリポア社）に通し、ろ過液を回収し、精製出発材料とした。冷所にて予めｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ−）で平衡化されたＦ９１９−９−１８−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ＦＦカラム（φ３．２ｃｍ×６．２ｃｍ）に精製出発材料を流速１０ｍＬ／ｍｉｎにてアプライした。出発材料をアプライした後、カラムにＰＢＳ−を１５．３ｍＬ／ｍｉｎにて流し（洗浄１）、次いでカラムに１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ／ＰＢＳ−を同条件下に流し洗浄操作（洗浄２）とした。引き続いてカラムに５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ１１）を１０ｍＬ／ｍｉｎにて流し、溶離操作をおこなった。各溶離画分４０ｍＬあたり１０ｍＬの１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を速やかに加え、冷所に保存した。各画分のＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬの量を実施例２に記載の方法により測定し、ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬが含まれる画分を回収した。
表２に定量結果を示す。
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表２に示すように、ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬは溶離画分にのみ認められた。Ｆ９１９−９−１８−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ＦＦカラムクロマトグラフィーにより８４％の回収率で精製ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬを得ることが出来た。精製品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、銀染色（２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩ第一：第一化学薬品）を行ったところ、単一バンドとして検出された（図３）。精製品の細胞障害活性を実施例３に示す方法で確認した。その結果、精製品は精製前の培養上清とほぼ同等の活性を示した。
産業上の利用の可能性
本発明により、Ｆａｓリガンドとしての生物学的活性を有する融合蛋白質が提供される。本発明が提供するＦａｓリガンド融合蛋白質は、オリゴマー形成能を有するペプチドおよび組換え蛋白質の産生量を増加させ、かつロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質の融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる効果を有するペプチドとの融合蛋白質であるため、高い生物学的活性と高い産生量が確保される。該Ｆａｓリガンド融合蛋白質は、Ｆａｓを介したアポトーシスが関与する疾患の治療薬として開発する事ができる。本発明は、また、該融合蛋白質の産生に有用であり、かつ、組換え蛋白質全般に応用可能な組換え蛋白質の産生量増加方法およびロイシンジッパーと膜貫通型蛋白質との融合蛋白質の生物学的活性を上昇させる方法を提供する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する各種Ｆａｓリガンド融合蛋白質のアポトーシス誘導活性を示す図である。
図２は、各種ヒトＦａｓリガンド融合蛋白質の一次構造を模式化した図である。
図３は、精製ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬを電気泳動後、銀染色を行った図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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