(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるオルニチンアセチラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２に示す塩基配列の内２６３〜１６９３番目の塩基配列からなるオルニチンアセチラーゼ遺伝子、または、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオルニチンアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを含んでなる組み換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組み換えベクターを挿入してなる形質転換体。
【請求項５】
請求項３に記載の組み換えベクターを含む組み換え麹菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌のフェリクローム生合成クラスターを形成するアセチラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、プロテインキナーゼＡ、アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該遺伝子を含有する組み換え麹菌、該形質転換体を用いるアセチラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、プロテインキナーゼＡ、またはアンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質を生産させることによってフェリクローム高生産麹菌を育種する方法、蛋白質の発現を麹菌菌体内で抑制させフェリクローム非生産麹菌を育種する方法、及びフェリクローム生合成遺伝子クラスターを麹菌以外の生物に導入して生産させる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
鉄イオンは一部の乳酸菌を除く、ほとんどすべての生物にとって必須の原子である。鉄は、生体内ではＦｅ（II）やＦｅ（III）の形態で利用され、主に酸化還元に関与する酵素群の補欠因子として機能する。しかしながら、一般的に鉄は自然界において鉄鉱石として存在し、可溶化されたイオン状態としてはほとんど存在しない。さらに鉄鉱石から微生物の働きにより可溶化された鉄イオンも、すぐに不溶性の酸化物や水酸化物となるため、生物が利用できる鉄イオンはきわめて微量である。細菌や放線菌、真核微生物はこのような微量な鉄イオンを効率的に獲得するために、シデロフォアと呼ばれる分子量１５００以下の低分子の鉄イオンキレート物質を生産する。このシデロフォアに鉄イオンをキレートすることにより、貴重な鉄イオンの不溶化を防ぎ、鉄イオンを優先的に利用することを図っている。また鉄イオンは生物にとって必須のイオンであるが、過剰に存在すると遊離のラジカルの発生を促し、逆に生体に危害を加える。シデロフォアは鉄イオンの獲得と同時に、このような鉄イオンの無害化にも大きく寄与している。シデロフォアは非キレート状態では無色であるが、鉄イオンをキレートすると、赤色を示し、可視光の吸収を示すことが知られている。
【０００３】
現在までに様々なシデロフォアが同定されているが、糸状菌が生産するシデロフォアはhydroxamates familyと呼ばれ、一般に構成アミノ酸誘導体としてＮ−ヒドロキシオルニチンを含む。研究用モデル糸状菌、工業用微生物、病原性糸状菌として幅広く研究が進められているアスペルギルス属糸状菌はhydroxamates familyの中でもフェリクローム類とフザリニン類と呼ばれるシデロフォアを生産する。前者は、Ｎ−ヒドロキシオルニチンのトリペプチドにグリシン、セリン、アラニンが環状ペプチドを形成している。一方、後者では一部のＮ−ヒドロキシオルニチンのＮ位が無水メバロン酸によってアシル化されている特徴を有する。糸状菌はこのような多種多様なシデロフォアを生産することにより、鉄イオンを優先的に獲得し、自然界での生存競争に活用しているものと考えられる。
【０００４】
一方、清酒醸造では、アスペルギルス・オリゼを蒸米上に生育させて「麹」を作成し、清酒醸造の原料として利用している。この麹造りにおいてアスペルギルス・オリゼが大量のフェリクローム類（中でも主成分はフェリクリシン）を生産し、これが酒造用水の鉄イオンをキレートし、清酒が着色することが知られている。従って、清酒醸造においては、シデロフォアであるフェリクローム類が、品質劣化の原因であり、できるだけフェリクローム類を生産しない菌株の育種が進められてきた。
【０００５】
このように、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）はフェリクローム類を大量に生産することが古くから知られているが、その生合成系に関しては、ほとんど明らかになっていない。現在でも、フェリクローム低生産菌の育種は主に、スクリーニング法や変異法に頼らざるを得ない。また、近年このシデロフォアの鉄キレート力は、貧血症の医薬としても利用されるようになっている。麹菌が産生するフェリクロームも鉄イオン結合能力については非常に優れているが、その生産性の向上が困難で工業レベルでの生産の対象とはなっていない。
【０００６】
もし、フェリクローム類の生合成遺伝子が同定されれば、麹菌によるフェリクローム類の生産を自由に調節できる可能性がある。すなわち、清酒醸造においては、フェリクローム生合成に関与する遺伝子の発現が抑制できれば、全くフェリクロームを生産しない株が育種できる。また、医薬品製造においては、フェリクローム生合成に関与する遺伝子の発現をより活発に誘導させることにより、大量のフェリクローム生産が可能となる。さらに、麹菌が生産するフェリクロームは清酒や酒粕として長年摂取されており、極めて安全性の高い物質である。麹菌によりフェリクロームが大量に生産できれば、医薬品から食品まで幅広い応用が可能となる。
このように、麹菌のフェリクローム生産についてはさまざまな分野に応用が期待されるが、その生合成遺伝子が未解明なため、いまだに効率的な活用がなされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、麹菌Aspergillus oryzaeのフェリクローム生産を自由に制御するために、麹菌のフェリクローム生合成に関与するクラスター遺伝子群を提供することにある。本発明の他の目的は本遺伝子群を含有する組み換えベクターとこの組み換えベクターを含有する形質転換体を提供することにある。
【０００８】
麹菌におけるフェリクロームの生合成経路については、Ustilago maydisやAureobasidium pullulansなどの他の糸状菌におけるフェリクローム類の合成経路の研究をもとにして、我々は、既にその生合成の第一段階を担うオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）とフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）を同定するのに成功している。
【０００９】
しかし、糸状菌のフェリクローム合成では、ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子産物によるフェリクローム合成以外に、アセチラーゼによるヒドロキシオルニチンのＮ位のアシル化やフェリクローム特異的トランスポーターによる細胞外への排出などが必須となる。そこで真のフェリクローム高生産を実現するためにはａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子とクラスターを形成する上記アセチラーゼやトランスポーターの遺伝子が取得できて初めて実現する。従って、麹菌においてもこれらのクラスター遺伝子を抑制すればフェリクロームの生産は抑制され、本遺伝子の発現を上昇させれば大量のフェリクローム生産が期待できる。すなわち本発明の目的の一つは上記形質転換体を用いるフェリクローム生合成クラスター遺伝子群の麹菌体内での発現を抑制することによって、米麹を用いた固体培養でフェリクロームを生産しない麹菌を提供することにある。その結果、該麹菌を清酒、味噌、醤油、みりんなどの我が国独自の醸造産業へ利用することが可能となる。
【００１０】
本発明の他の目的は、フェリクローム生合成クラスター遺伝子群の発現を遺伝子工学的手法を用いて高めることによって、あらゆる培養条件下でフェリクロームを高生産する麹菌を提供することにある。またこうして生産されたフェリクロームを鉄キレート剤としての試薬、ならびに貧血の改善効果が期待できる機能性食品への添加に提供するのが可能となる。またさらなる目的はこれらの麹菌のフェリクローム生合成に関わる遺伝子クラスターを麹菌以外の生物に導入してフェリクローム類を生産させることにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、先ずはじめに麹菌（アスペルギルス・オリゼー：Aspergillus oryzae）について検討を行った。
【００１２】
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的醗酵産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株は、上記醗酵産業で有用な蛋白質や低分子を非常に大量に生産することが知られている。本菌株が持つ高い蛋白質生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白質生産の宿主として注目されている[Biotechnology, 6, 1419 (1988)]（特開昭６２−２７２９８８）。発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用いた異種蛋白質生産においては、アスペルギルス属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。特に、Ａ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現させた場合、非常に大量の蛋白質が生産されることを見出した（特開平１１−１５４２７１，特願２０００−３６７５４）。
【００１３】
また、Ａ．ｏｒｙｚａｅは、上記のような蛋白質、酵素のみならず、産業的にも非常に貴重な低分子成分の生産も報告されている。中でも麹菌が固体培養で生産するフェリクロームは、近年貧血などの鉄欠乏症用の機能性成分としても非常に注目されている物質である。
【００１４】
この麹菌のフェリクロームを医薬・食品に利用するためには、生産性をさらに向上させる必要があるが、変異法などの既存の菌株育種方法では、工業生産レベルにまで生産性が向上した変異株の取得はできなかった。そこで、フェリクローム生合成に関与する遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発現能を強化することによりフェリクロームの大量生産が可能であると考えた。麹菌におけるフェリクロームの生合成経路については、Ustilago maydisやAureobasidium pullulansなどの他の糸状菌におけるフェリクローム類の合成経路の研究をもとにして、我々は既にその生合成の第一段階を担うオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）とフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）を同定している。
【００１５】
しかし、糸状菌のフェリクローム合成では、ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子産物によるフェリクローム合成以外に、アセチラーゼによるヒドロキシオルニチン残基のＮ位のアシル化やフェリクローム特異的トランスポーターによる細胞外への排出などが必須となる。そこで真のフェリクローム高生産を実現するためにはａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子とクラスターを形成する上記アセチラーゼやトランスポーターの遺伝子が取得できて初めて実現する。従って、麹菌においてもこれらのクラスター遺伝子が収得できれば、フェリクロームの生産を自由に制御できる遺伝子組み換え麹菌を育種でき、フェリクロームの工業生産が可能になると考えた。以下は麹菌が生産するフェリクローム類の中でも、最も含有量の多いフェリクリシンの生産を中心に記述するが、本発明は全てのフェリクローム類に応用が可能な技術であり、フェリクリシンだけに限定するものではない。
【００１６】
我々は、清酒醸造において清酒の着色を起こす鉄イオンキレート低分子フェリクリシンを貧血改善用の機能性成分などとして大量生産させるために、フェリクリシン生合成クラスターの遺伝子クローニングを行い、フェリクリシンの工業生産に適した遺伝子組み換え麹菌を育種することを試みた。
【００１７】
麹菌におけるフェリクロームの生合成経路については、Ustilago maydisやAureobasidium pullulansなどの他の糸状菌におけるフェリクローム類の合成経路の研究をもとにして、我々は既にその生合成の第一段階を担うオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードするａｓｂ１（特願２００１−８３６４０）とフェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４１１２）を同定している。
しかし、糸状菌のフェリクローム合成では、ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子産物によるフェリクローム合成以外に、アセチラーゼによるヒドロキシオルニチン残基のＮ位のアシル化やフェリクローム特異的トランスポーターによる細胞外への排出などが必須となる。そこで真のフェリクローム高生産を実現するためにはａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子と上記アセチラーゼやトランスポーターの遺伝子が取得できて初めて実現する。
【００１８】
そこで本発明者らは、Ustilago maydisやAureobasidium pullulansのフェリクローム生合成遺伝子に着目し、広く検討した結果、麹菌においても、フェリクローム生合成は、アフラトキシン生合成遺伝子群やアミラーゼ遺伝子群と同様に、染色体上でクラスターを形成する可能性について、はじめて、その着想を得た。
【００１９】
上記のように本発明者らは、麹菌におけるフェリクローム生合成遺伝子のクラスター形成の可能性という新規着想に基づき更に検討の結果、本発明者らが麹菌から新たに単離するのに成功した新規遺伝子ａｓｂ１、ａｓｂ２においても、フェリクローム生合成遺伝子クラスター形成の可能性を推論し、遂にそれをはじめて確認するに至った。
【００２０】
すなわち、ａｓｂ１、ａｓｂ２をそれぞれプローブとしてラムダＥＭＢＬ３ファージを用いた麹菌ゲノム遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。得られた両陽性ファージクローンにおいてａｓｂ１、ａｓｂ２の周辺領域の網羅的ＤＮＡシーケンスを行った。その結果、両陽性ファージクローンはA. nidulansのプロテインキナーゼＡをコードする遺伝子ａｎｋＡと相同な遺伝子配列上の約５００ｂｐでオーバーラップ領域を含むことが明らかとなった。これはａｓｂ１とａｓｂ２の両者が麹菌染色体上でクラスターを形成していることを意味している。両陽性ファージクローンの全塩基配列を決定した結果、ａｓｂ１、ａｓｂ２周辺には少なくともアセチラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、プロテインキナーゼＡ、そしてアンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質のコーディング領域の存在が明らかとなった。アセチラーゼ遺伝子は４６２アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを含んでおり、ａｓｂ３と命名した。ＡＢＣトランスポーター遺伝子は１３２６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イントロンを含んでおらず、ａｓｂＴと命名した。プロテインキナーゼＡ遺伝子は１０６５アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを含んでおり、ａｎｋＯと命名した。アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質遺伝子は７３６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、５つのイントロンを含んでおり、ａｓｂＲと命名した。
【００２１】
単離した遺伝子は単独であるいはｍｅｌＯやｇｌａＢ遺伝子プロモーター（特願平１１−１５４２７１、特開平１１−２４３９６５）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、フェリクリシンの生産を制御しうるものである。遺伝子導入方法は、例えば宿主としてｎｉａＤ変異株を用いる公知方法により、目的遺伝子とマーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子を同時に導入する。（Ｅ．Ｓ．Ｕｎｋｌｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，ｐ．９９−１０４、１９８９）この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。ｎｉａＤ変異株（硝酸を資化できない麹菌変異株：Ｎｉｔｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株）としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  １０１３−ｎｉａＤ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７０７）を使用することができる。
以下に本発明の詳細について述べる。
【００２２】
上記のように、本発明者らは、麹菌から新たに単離した新規フェリクローム生合成遺伝子ａｓｂ１、ａｓｂ２についてのクラスター形成の可能性を新たに推論した。そこで、ａｓｂ１、ａｓｂ２それぞれをプローブとしてフルオレッセンラベル化後、ラムダＥＭＢＬ３ファージを用いた麹菌ゲノム遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。
【００２３】
本発明者らが、新たにクローニングした遺伝子断片ａｓｂ１には、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼがコードされており、また、この遺伝子を含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ａｓｂ１は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３６０として特許生物寄託センターに寄託されているので、ａｓｂ１遺伝子を保持するプラスミド（ｐＥＡＳ１）を抽出することにより適宜取得することができる（特願２００１−１７６２６４）。ａｓｂ１遺伝子の塩基配列を配列番号１３（図３４、３５）に示す。
【００２４】
また、本発明者らが、新たにクローニングした遺伝子断片ａｓｂ２には、麹菌のフェリクローム生合成に関与するペプチドシンテターゼがコードされており、また、この遺伝子を含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＡＳＢ２はＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４１として特許生物寄託センターに寄託されているので、ａｓｂ２遺伝子を保持するプラスミド（ｐＥＡＳ２）を抽出することにより適宜取得することができる（特願２００１−３２４１１２）。ａｓｂ２遺伝子の塩基配列を配列番号１４（図３６〜図４０）に示す。
【００２５】
ａｓｂ１、ａｓｂ２それぞれをプローブとしてフルオレッセンラベル化した後、アスペルギルス・オリゼー  Ｏ−１０１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５２８）のラムダＥＭＢＬ３ファージを用いた麹菌ゲノム遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることにより、目的とする遺伝子を取得することができる。
【００２６】
すなわち、プローブとして用いるａｓｂ１、ａｓｂ２については、その塩基配列、及びそれがコードする蛋白質のアミノ酸配列が本発明者らによって明らかにされているだけでなく、それらを含有する形質転換体は、いずれも、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、また、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  Ｏ−１０１３も同じく寄託されているので、本明細書の記載にしたがって各操作を行っていけば、当業者は本発明を容易に実施することができる。
【００２７】
上記のライブラリーのスクリーニングの結果、得られた両陽性ファージクローンにおいて、ａｓｂ１、ａｓｂ２の周辺領域の網羅的ＤＮＡシーケンスを行った。シーケンスの手法としては、ファージクローンのアーム領域のプライマーを用いてＬＡ−ＰＣＲにより約２０ｋｂのインサートＤＮＡを増幅した。このインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩで処理後に、ｐＵＣ１１８へサブクローニングした。任意のインサートサイズを含む各２０クローンをＭ１３フォワードプライマーとＭ１３リバースプライマーを用いてＤＮＡシーケンスした。ギャップ部分は、シーケンスプライマーを合成してファージＤＮＡを鋳型にＤＮＡシーケンスを行った。その結果、両陽性ファージクローンはA. nidulansのプロテインキナーゼＡをコードする遺伝子ａｎｋＡと相同な遺伝子配列上の約５００ｂｐでオーバーラップ領域を含むことが明らかとなった。これはａｓｂ１とａｓｂ２の両者が麹菌染色体上でクラスターを形成していることを意味するものである。
【００２８】
両陽性ファージクローンの全塩基配列を決定した結果、ａｓｂ１、ａｓｂ２周辺には少なくともアセチラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、プロテインキナーゼＡ、そしてアンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質のコーディング領域の存在が明らかとなった。
【００２９】
アセチラーゼ遺伝子は、４６２アミノ酸残基からなる蛋白質（配列番号１）をコードしており、１つのイントロンを含んでおり、ａｓｂ３と命名した。ａｓｂ３のプロモーター領域は配列番号２の１から２３５ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の２３６から１６９３ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の１６９４から２２６４ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の１２２０から１２８８ｂｐまでである。
【００３０】
ＡＢＣトランスポーター遺伝子は、１３２６アミノ酸残基からなる蛋白質（配列番号３）をコードしており、イントロンを含んでおらず、ａｓｂＴと命名した。ａｓｂＴのプロモーター領域は配列番号４の１から７０８ｂｐ、コーディング領域は配列番号４の７０９から４６８９ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号４の４６９０から５０５６ｂｐまでである。イントロンは、上述のように含まれていない。
【００３１】
プロテインキナーゼＡ遺伝子は、１０６５アミノ酸残基からなる蛋白質（配列番号５）をコードしており、１つのイントロンを含んでおり、ａｎｋＯと命名した。ａｎｋＯのプロモーター領域は配列番号６の１から５６７ｂｐ、コーディング領域は配列番号６の５６８から３８２０ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号６の３８２１から４１２４ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号６の３０３１から３０８５ｂｐまでである。
【００３２】
アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質遺伝子は、７３６アミノ酸残基からなる蛋白質（配列番号７）をコードしており、５つのイントロンを含んでおり、ａｓｂＲと命名した。ａｓｂＲのプロモーター領域は配列番号８の１から２８４ｂｐ、コーディング領域は配列番号８の２８５から２８０８ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号８の２８０９から３０６８ｂｐまでである。イントロンは、５つ含まれており、配列番号８のそれぞれ５９１から６７６ｂｐ、１４７８から１５３０ｂｐ、１６０４から１６７３ｂｐ、１９３９から１９８８ｂｐ、２１０２から２１５５ｂｐまでである。
【００３３】
上記のクローニングしたクラスター遺伝子の機能を確認するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。以前に取得した麹菌のフェリクローム生合成遺伝子であるａｓｂ１、ａｓｂ２は、鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発現が認められたことから今回得られたクラスター遺伝子の発現もａｓｂ１、ａｓｂ２と同様の発現挙動を示すことが予測された。そこで鉄制限培養した麹菌から全ＲＮＡ、ｍＲＮＡを取得し、これに対してａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲのＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲはａｓｂ１、ａｓｂ２と同様に鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発現することが明らかとなった。一方、ａｎｋＯのみは鉄制限、鉄存在下にかかわらず恒常的な発現が認められた。
【００３４】
また、クローニングしたアセチラーゼ遺伝子ａｓｂ３の機能を確認するために大腸菌での発現を試みた。鉄制限培養した麹菌より抽出したＲＮＡをもとにえられたａｓｂ３  ｃＤＮＡをｐＵＣ１１８のｌａｃＺプロモーター下流のＰｓｔＩに連結し、大腸菌ＪＭ１０９へ形質転換した。形質転換体をＩＰＴＧ誘導培養した結果、菌体内にオルニチンをアセチル化するオルニチンアセチラーゼ活性が存在することをＨＰＬＣにより確認できた。本形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＡＣＥＴＹ１と命名し、これを独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４２として寄託した。本菌株を培養することによりフェリクローム生合成のオルニチンをアセチル化するアセチラーゼ蛋白質を得ることができる。
【００３５】
以上の結果より、クローニングした遺伝子断片ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲは、麹菌のフェリクローム生合成に関与するａｓｂ１、ａｓｂ２と染色体上で約３７ｋｂのクラスターを形成していることが判明した。またａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲは、ａｓｂ１、ａｓｂ２と同様に鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発現することから、麹菌のフェリクローム生合成に関する遺伝子群であることが明らかとなった。またこれらのクラスター遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム生合成を高生産あるいは非生産させたり、また他の生物にクラスター遺伝子を導入してフェリクローム類を高生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
【００３６】
【実施例１】
ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子のクローニングと周辺領域の塩基配列の決定
現在までに麹菌から単離したフェリクローム生合成遺伝子ａｓｂ１（その塩基配列を配列番号１３（図３４、３５）に示した：特願２００１−１７６２６４）、及びａｓｂ２（その塩基配列を配列番号１４（図３６〜４０）に示した：特願２００１−３２４１１２）それぞれをプローブとして、アマシャムファルマシア社製のＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅ  ラベリングキットを用いて蛍光標識化した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｏ−１０１３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５２８）のラムダＥＭＢＬ３ファージを用いた麹菌ゲノム遺伝子ライブラリー約５０００個のスクリーニングを行った。得られた１つずつの両陽性ファージクローンにおいて、ａｓｂ１、ａｓｂ２の周辺領域の網羅的ＤＮＡシーケンスを行った。シーケンスの手法としてはファージクローンのアーム領域のプライマーＰ１：配列番号９（図３０）とＰ２：配列番号１０（図３１）を用いて、宝酒造ＬＡ‐Ｔａｑにより約２０ｋｂのインサートＤＮＡを増幅した。
【００３７】
ＰＣＲ条件は、以下に示した。
・９６℃（５分），１サイクル
・９６℃（２０秒），５０℃（３０秒），７２℃（２０分），３０サイクル
・７２℃（７分），１サイクル
【００３８】
このインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIあるいは、ＰｓｔＩで処理後に、ｐＵＣ１１８へサブクローニングした。任意のインサートサイズを含む各２０クローンをＭ１３フォワードプライマーＰ３：配列番号１１（図３２）とＭ１３リバースプライマーＰ４：配列番号１２（図３３）を用いて、ＤＮＡシーケンスした。ギャップ部分は、シーケンスプライマーを合成してファージＤＮＡを鋳型にＤＮＡシーケンスを行った。
【００３９】
その結果、両陽性ファージクローンは、A. nidulansのプロテインキナーゼＡをコードする遺伝子ａｎｋＡと相同な遺伝子配列上の約５００ｂｐでオーバーラップ領域を含むことが明らかとなった。これはａｓｂ１とａｓｂ２の両者が麹菌染色体上でクラスターを形成していることを意味している。両陽性ファージクローンの全塩基配列を決定した結果、ａｓｂ１、ａｓｂ２周辺には少なくともアセチラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、プロテインキナーゼＡ、そしてアンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質のコーディング領域の存在が明らかとなった。
【００４０】
アセチラーゼ遺伝子は、４６２アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを含んでおり、ａｓｂ３と命名した。ａｓｂ３のプロモーター領域は配列番号２の１から２３５ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の２３６から１６９３ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の１６９４から２２６４ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の１２２０から１２８８ｂｐまでである。ａｓｂ３遺伝子の塩基配列を配列番号２（図６、７）に示し、それによってコードされるアミノ酸配列を配列番号１（図４、５）に示す。
【００４１】
ＡＢＣトランスポーター遺伝子は、１３２６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イントロンを含んでおらず、ａｓｂＴと命名した。ａｓｂＴのプロモーター領域は配列番号４の１から７０８ｂｐ、コーディング領域は配列番号４の７０９から４６８９ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号４の４６９０から５０５６ｂｐまでである。イントロンは、上述のように含まれていない。ａｓｂＴ遺伝子の塩基配列を配列番号４（図１４〜１６）に示し、それによってコードされるアミノ酸配列を配列番号３（図８〜１３）に示す。
【００４２】
プロテインキナーゼＡ遺伝子は、１０６５アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを含んでおり、ａｎｋＯと命名した。ａｎｋＯのプロモーター領域は配列番号６の１から５６７ｂｐ、コーディング領域は配列番号６の５６８から３８２０ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号６の３８２１から４１２４ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号６の３０３１から３０８５ｂｐまでである。ａｎｋＯ遺伝子の塩基配列を配列番号６（図２２〜２４）に示し、それによってコードされるアミノ酸配列を配列番号５（図１７〜２１）に示す。
【００４３】
アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質遺伝子は、７３６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、５つのイントロンを含んでおり、ａｓｂＲと命名した。ａｓｂＲのプロモーター領域は配列番号８の１から２８４ｂｐ、コーディング領域は配列番号８の２８５から２８０８ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号８の２８０９から３０６８ｂｐまでである。イントロンは、５つ含まれており、配列番号８のそれぞれ５９１から６７６ｂｐ、１４７８から１５３０ｂｐ、１６０４から１６７３ｂｐ、１９３９から１９８８ｂｐ、２１０２から２１５５ｂｐまでである。ａｓｂＲ遺伝子の塩基配列を配列番号８（図２８、２９）に示し、それによってコードされるアミノ酸配列を配列番号７（図２５〜２７）に示す。
【００４４】
またこれらの遺伝子クラスターの模式図を図１（図面代用写真）に示した。得られたフェリクローム遺伝子クラスターは、約３７ｋｂからなることが明らかとなった。
【００４５】
【実施例２】
クラスター遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる発現条件の解析
上記のクローニングしたクラスター遺伝子の機能を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲによる発現条件の解析を行った。以前に取得した麹菌のフェリクローム生合成遺伝子であるａｓｂ１、ａｓｂ２は、鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発現が認められたことから今回得られたクラスター遺伝子の発現もａｓｂ１、ａｓｂ２と同様の発現挙動を示すことが予測された。そこで鉄制限培養した麹菌から全ＲＮＡを取得し、これに対してａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲのＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００４６】
具体的には、３０℃、４日間、鉄制限培地（２％グルコース、０．６％アスパラギン、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０４％塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で液体培養した麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅからニッポンジーン社ＩＳＯＧＥＮを利用して全ＲＮＡを抽出した。その全ＲＮＡから宝酒造Oligotex-dT30<Super>mRNA purification kitを用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ  ０．５μｇをもとに宝酒造のTakara RNA LA PCR kit (AMV) ver.1.1によりＲＴ−ＰＣＲを試みた。
【００４７】
その反応条件は、以下にしたがった。
ＰＣＲ条件
・３０℃（１０分），４２℃（６０分），９９℃（５分），５℃（５分），９６℃（５分），１サイクル
・９６℃（２０秒），６０℃（３０秒），７２℃（５分），３０サイクル
・７２℃（７分），１サイクル
【００４８】
その結果、図２（図面代用写真）に示したように、ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲはａｓｂ１、ａｓｂ２と同様に鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発現することが明らかとなった。一方、ａｎｋＯのみは鉄制限、鉄存在下にかかわらず恒常的な発現が認められた。
【００４９】
【実施例３】
アセチラーゼ遺伝子ａｓｂ３の大腸菌での発現
クローニングしたアセチラーゼ遺伝子ａｓｂ３の機能を確認するために、大腸菌での発現を試みた。上記のＲＴ−ＰＣＲで得られたａｓｂ３  ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）を用いて、プラスミドｐＵＣ１１８のｌａｃＺプロモーター下流のＰｓｔＩサイトに連結し、組み換えベクター（ｐＡＣＥ１）を得た。なお、その制限酵素地図を図３に示す。このようにして得た組換えベクターである該連結ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。アンピシリン含有培地で培養し、アンピシリン耐性株を選択し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＡＣＥＴＹ１と命名し、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４２として寄託した。
【００５０】
形質転換体をＬＢ培地にて３７℃でＯＤが０．６になるまで培養後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加しさらに３０℃にて３時間誘導培養した結果、菌体内にオルニチンをアセチル化するオルニチンアセチラーゼ活性が存在することをＨＰＬＣにより確認できた。具体的には大腸菌粗酵素抽出液、１０ｍＭアセチルグルタミン酸、１０ｍＭオルニチンを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．０）存在下で３５℃にて１時間反応させた。得られた反応液を逆相Ｃ１８のＯＤＳカラムによって０−５０％メタノールのグラジェントによって分離した。その結果、SIGUMA社より購入した標準物質であるＮ−アセチルオルニチンと同じ溶出位置にバンドを確認することができた。よって本大腸菌を、上記のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＣＥＴＹ１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４２として寄託した。本菌株を培養することによりフェリクローム生合成のオルニチンをアセチル化するアセチラーゼ蛋白質を得ることができる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、クローニングした遺伝子断片ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲは、麹菌のフェリクローム生合成に関与するａｓｂ１、ａｓｂ２と染色体上でクラスターを形成していることが判明した。またａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲは、ａｓｂ１、ａｓｂ２と同様に鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発現することから麹菌のフェリクローム生合成に関する遺伝子群であることが明らかとなった。またこれらのクラスター遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム生合成を高生産あるいは非生産させたり、また他の生物にクラスター遺伝子を導入してフェリクローム類を高生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
【００５２】
【配列表】
0003838421.tif 000002
0003838421.tif 000003
0003838421.tif 000004
0003838421.tif 000005
0003838421.tif 000006
0003838421.tif 000007
0003838421.tif 000008
0003838421.tif 000009
0003838421.tif 000010
0003838421.tif 000011
0003838421.tif 000012
0003838421.tif 000013
0003838421.tif 000014
0003838421.tif 000015
0003838421.tif 000016
0003838421.tif 000017
0003838421.tif 000018
0003838421.tif 000019
0003838421.tif 000020
0003838421.tif 000021
0003838421.tif 000022
0003838421.tif 000023
0003838421.tif 000024
0003838421.tif 000025
0003838421.tif 000026
0003838421.tif 000027
0003838421.tif 000028
0003838421.tif 000029
0003838421.tif 000030
0003838421.tif 000031
0003838421.tif 000032
0003838421.tif 000033
0003838421.tif 000034
0003838421.tif 000035
【図面の簡単な説明】
【図１】麹菌フェリクローム生合成遺伝子群の染色体上マップの写真である（図面代用写真）。
【図２】クラスター遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる発現条件の解析写真である。図中（−）は鉄制限培養、（＋）は鉄含有培養を示す（図面代用写真）。
【図３】アセチラーゼ遺伝子ａｓｂ３の大腸菌発現プラスミドを示す。
【図４】アセチラーゼ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】アセチラーゼ遺伝子ａｓｂ３の塩基配列を示す。
【図７】同上続きを示す。
【図８】ＡＢＣトランスポーター蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図９】同上続きを示す。
【図１０】同上続きを示す。
【図１１】同上続きを示す。
【図１２】同上続きを示す。
【図１３】同上続きを示す。
【図１４】ＡＢＣトランスポーター遺伝子ａｓｂＴの塩基配列を示す。
【図１５】同上続きを示す。
【図１６】同上続きを示す。
【図１７】プロテインキナーゼＡ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図１８】同上続きを示す。
【図１９】同上続きを示す。
【図２０】同上続きを示す。
【図２１】同上続きを示す。
【図２２】プロテインキナーゼＡ遺伝子ａｎｋＯの塩基配列を示す。
【図２３】同上続きを示す。
【図２４】同上続きを示す。
【図２５】アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図２６】同上続きを示す。
【図２７】同上続きを示す。
【図２８】アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質をコードする遺伝子ａｓｂＲの塩基配列を示す。
【図２９】同上続きを示す。
【図３０】プライマーＰ１を示す。
【図３１】プライマーＰ２を示す。
【図３２】プライマーＰ３を示す。
【図３３】プライマーＰ４を示す。
【図３４】オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子ａｓｂ１の塩基配列を示す。
【図３５】同上続きを示す。
【図３６】ペプチドシンテターゼ遺伝子ａｓｂ２の塩基配列を示す。
【図３７】同上続きを示す。
【図３８】同上続きを示す。
【図３９】同上続きを示す。
【図４０】同上続きを示す。
【図１】
0003838421.tif 000036
【図２】
0003838421.tif 000037
【図３】
0003838421.tif 000038
【図４】
0003838421.tif 000039
【図５】
0003838421.tif 000040
【図６】
0003838421.tif 000041
【図７】
0003838421.tif 000042
【図８】
0003838421.tif 000043
【図９】
0003838421.tif 000044
【図１０】
0003838421.tif 000045
【図１１】
0003838421.tif 000046
【図１２】
0003838421.tif 000047
【図１３】
0003838421.tif 000048
【図１４】
0003838421.tif 000049
【図１５】
0003838421.tif 000050
【図１６】
0003838421.tif 000051
【図１７】
0003838421.tif 000052
【図１８】
0003838421.tif 000053
【図１９】
0003838421.tif 000054
【図２０】
0003838421.tif 000055
【図２１】
0003838421.tif 000056
【図２２】
0003838421.tif 000057
【図２３】
0003838421.tif 000058
【図２４】
0003838421.tif 000059
【図２５】
0003838421.tif 000060
【図２６】
0003838421.tif 000061
【図２７】
0003838421.tif 000062
【図２８】
0003838421.tif 000063
【図２９】
0003838421.tif 000064
【図３０】
0003838421.tif 000065
【図３１】
0003838421.tif 000066
【図３２】
0003838421.tif 000067
【図３３】
0003838421.tif 000068
【図３４】
0003838421.tif 000069
【図３５】
0003838421.tif 000070
【図３６】
0003838421.tif 000071
【図３７】
0003838421.tif 000072
【図３８】
0003838421.tif 000073
【図３９】
0003838421.tif 000074
【図４０】
0003838421.tif 000075