(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来の多糖類、微生物由来の多糖類、及び非ほ乳類由来の動物
多糖類から選択された少なくとも一種の多糖類の骨格と、加熱により凝集性を有するセグメントとが結合している温度応答性材料であって、前記凝集性を有するセグメントが、（ａ）アクリルアミド又はその誘導体、及びＮ−ビニルアシドアミドから選択された少なくとも一種の単量体の重合体、並びに（ｂ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ，Ｐｈｅ、及びＴｒｐから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基を有するペプチド単位から選択された少なくとも一種のユニットで構成されており、前記材料が、３０℃以上の温度で、溶液状からゲル状に変化する温度応答性を有する温度応答性材料。
【請求項２】
多糖類が水に可溶である請求項１記載の温度応答性材料。
【請求項３】
凝集性を有するセグメントが、３０℃以上の温度で凝集性を有しており、多糖類の骨格に側鎖として結合している請求項１記載の温度応答性材料。
【請求項４】
多糖類が、澱粉、セルロース、ペクチン、アルギン酸、カラゲナン、デキストラン、プルラン、およびキトサンから選択された少なくとも一種である請求項１記載の温度応答性材料。
【請求項５】
多糖類が、植物性多糖類である請求項１記載の温度応答性材料。
【請求項６】
凝集性を有するセグメントが、下記（ａ）及び（ｂ）から選択された少なくとも一種のユニットで構成されている請求項１〜５のいずれかの項に記載の温度応答性材料。
（ａ）アクリルアミド、Ｎ−Ｃ１−６アルキルアクリルアミド、及びＮ−ビニルＣ１−１０アシルアミドから選択された少なくとも一種の単量体の単独又は共重合体
（ｂ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、及びＨｉｓから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基を有するペプチド単位
【請求項７】
凝集性を有するセグメントが、下記式（I）
−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−      （I）
（式中、Ｘは、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅから選ばれるアミノ酸残基を表し、ｎは１以上の整数を表す）で表されるペプチド単位、および下記式（II）
−ＣＯ−Ｒ１−ＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｒ２−ＮＨ−      （II）
［式中、Ｒ１，Ｒ２は、同一又は異なって、アルキレン基、シクロアルキレン基、アリーレン基を示し、Ｙは、−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−（Ｘ，ｎは前記に同じ），Ｓａｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅより選ばれるアミノ酸残基を表す］で表されるペプチド共重合体単位から選択された少なくとも一種のユニットで構成されている請求項１〜６のいずれかの項に記載の温度応答性材料。
【請求項８】
式（II）において、Ｒ１，Ｒ２がＣ２−６アルキレン基である請求項７記載の温度応答性材料。
【請求項９】
凝集性を有するセグメントが、（１）少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミドで構成された単量体の重合体；（２）少なくともＮ−ビニルイソ酪酸アミドで構成された単量体の重合体；（３）Ｈ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ）−ＮＨ２（式中、Ｘは、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅから選ばれるアミノ酸残基を表し、ｎは２以上の整数を表す。）；（４）（Ｎ’α，Ｎ’ε，Ｎ”α，Ｎ”ε−テトラ（Ｈ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ）−Ｎα，Ｎε−ジリジル）リジル−β−アラニン（式中、Ｘおよびｎは前記に同じ）；（５）（Ｎ’α，Ｎ’ε，Ｎ”α，Ｎ”ε−テトラ（Ｈ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ）−Ｎα，Ｎε−ジリジル）リジル−β−アラニン（式中、Ｘおよびｎは前記に同じ）；（６）−ＣＯ−Ｒ１−ＣＯ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−ＮＨ−Ｒ２−ＮＨ−（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１およびＲ２は前記に同じ）；（７）−ＣＯ−Ｒ１−ＣＯ−Ｓａｒ−ＮＨ−Ｒ２−ＮＨ−（式中、Ｒ１およびＲ２は前記に同じ）；（８）−ＣＯ−Ｒ１−ＣＯ−Ｘ−ＮＨ−Ｒ２−ＮＨ−（式中、Ｘ、Ｒ１およびＲ２は前記に同じ）から選択された少なくとも一種のユニットである請求項１〜８のいずれかの項に記載の温度応答性材料。
【請求項１０】
凝集性を有するセグメントの割合が、全体の３〜９０重量％である請求項１〜９のいずれかの項に記載の温度応答性材料。
【請求項１１】
凝集性を有するセグメントが、Ｈｉｓ残基を１〜５個の範囲で含むｐＨ応答性セグメントを含み、かつ中性付近で加水分解促進活性を示す請求項１〜１０のいずれかに記載の温度応答性材料。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかの項に記載の温度応答性材料を含む温度応答性組成物。
【請求項１３】
癒着防止材、組織接着材、創傷被覆材、止血材および塞栓材から選択された少なくとも一種である請求項１２記載の温度応答性組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な温度応答性材料（特に温度応答性生体材料）及びそれを含む温度応答性組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、生体に適用後、温度に応答して溶液状からゲル状に変化して、塗布部にゲル状皮膜を形成可能な温度応答性生体材料に関する。本発明の材料は、癒着防止材、組織接着材、創傷被覆材、止血材、塞栓材などの構成成分として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
術後の癒着防止、組織接着や縫合などには、ポリ乳酸、酸化セルロースなどの生分解性高分子が使用されている。しかし、これらの生分解性高分子は術部又は患部への保持性が低いため、確実かつ効率よく癒着を防止することができない。
【０００３】
特定の成分の分離、吸着や放出性を示す温度応答性を示す高分子として、ポリ−Ｎ−アルキルアクリルアミド誘導体が知られている。特開２０００−３４４８３５号公報には、溶液中で温度応答性を示す高分子として、少なくともヒドロキシアルキルアクリルアミドを単量体とする重合体が提案されている。この文献には、温度変化などの物理的刺激により極性変化と共に伸縮・凝集性を示すことを利用して、上記重合体を、物質の分離、吸着、放出機能材料として利用することも記載されている。
【０００４】
特開平９−１６９８５０号公報には、ポリイソプロピルアクリルアミドなどのポリアクリルアミド誘導体のブロックＡと、ポリビニル誘導体のブロックＢとのＡＢ型ブロック共重合体で構成され、低温側ではミセル形成、高温側では沈殿生成を可逆的に生じさせる温度応答性高分子又は温度応答性ミセルが提案されている。特開平８−１４３６３１号公報には、Ｎ−ビニルイソ酪酸アミドなどのＮ−ビニルＣ3-9アシルアミドと、Ｎ−ビニルアセトアミドなどのＮ−ビニルＣ1-3アシルアミドとの共重合体で構成された温度応答性高分子材料が提案されている。
【０００５】
Prog. Biophys. molec. Biol., Vol. 57, pp.23-57(1992)には、-Val-Pro-Gly-X-Gly-（Xは、Tyr、Phe、Glu、Lys、Gly、Val、Leuより選ばれるアミノ酸残基を表す）の繰返し配列を有する温度応答性ポリペプチドが報告されている。さらに、米国特許第５，５１９，００４号明細書には、-R1-Pro-Gly-R2-Gly-（R1は、Ala、Glyから選ばれ、R2は、Gly、Alaから選ばれるか、又は直接結合を示す）のペンタ／テトラペプチドの繰返し配列からなり、生物材料の接着を阻害する弾性ポリペプチドが提案されている。
【０００６】
しかし、これらの温度応答性高分子又はペプチドは、温度に応答して溶液とゲルとを可逆的に形成できない。すなわち、上記高分子やペプチドは溶液から沈殿物へと変化し、皮膜を形成しない。また、化学的又は物理的に架橋した高分子やペプチドはゲル状皮膜を形成するものの、もはや溶液とはならない。
【０００７】
特開２０００−８０１５８号公報には、分子量が１００〜１００００のポリオキシアルキレン単位を繰返し単位として含む脂肪族ポリエーテルエステルで構成された温度応答性ハイドロゲルが開示されている。しかし、このハイドロゲルを生体に適用すると、ポリオキシアルキレン鎖に由来する毒性が懸念される。
【０００８】
大屋章二らは、「人工臓器」２９（２），４４６−４５１（２０００）において、生体由来ムコ多糖類であるヒアルロン酸に、イニファタ（重合開始−連鎖移動−重合停止剤として機能する分子）であるベンジルジチオカルバメート基を導入し、リビングラジカル重合法を利用してＮ−イソプロピルアクリルアミドをグラフト重合することにより、加温により析出可能な感温性ヒアルロン酸が得られることを報告している。この文献には、前記感温性ヒアルロン酸が、細胞非接着マトリックスとして機能し、加温により白濁し、光線透過率で低下することも報告されている。しかし、この感温性ヒアルロン酸を生体に適用すると、動物性のヒアルロン酸に由来する感染の危険性がある。
【０００９】
Macromol Chem. Phys., 201，613-619（2000）には、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの共重合体をデキストランにグラフトした温度応答性高分子が報告されている。しかし、この高分子はゲル状物を形成できない。
【００１０】
さらに、温度に応答して凝集性を示す前記重合体を、切開部などの患部や組織間に適用しても、高い安全性で、組織の癒着を有効に防止したり、組織を保護することが困難である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、新規な温度応答性材料（温度応答性高分子、又は温度応答性重合体）を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、生体への適用により、温度に応答して溶液状からゲル状に可逆的に変化し、塗布部にゲル状の皮膜を形成可能であるとともに、安全性の高い温度応答性材料（又は生体適合性重合体）を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、患部に適用するのに有用な温度応答性組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、癒着防止材、組織接着材、（創傷）被覆材、止血材、塞栓材などとして有用な温度応答性組成物を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するため鋭意検討の結果、非動物性多糖類と、加温により凝集又は析出可能なセグメントとを組み合わせると、生体適合性及び安全性に優れるとともに、温度に応じて溶液の形態とゲルの形態とを可逆的に形成することを見いだし、本発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明の温度応答性材料（又は温度応答性重合体）は、非動物性多糖類（植物由来の多糖類、微生物由来の多糖類、及び非ほ乳類由来の動物多糖類から選択された少なくとも一種の多糖類）の骨格と、加熱により凝集性を有するセグメント（３０℃以上の温度で凝集性を有する側鎖など）とが結合しており、前記凝集性を有するセグメントは、（ａ）アクリルアミド又はその誘導体、及びＮ−ビニルアシドアミドから選択された少なくとも一種の単量体の重合体、並びに（ｂ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ，Ｐｈｅ、及びＴｒｐから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基を有するペプチド単位から選択された少なくとも一種のユニットで構成されている。前記材料は、３０℃以上の温度で、溶液状からゲル状に変化する温度応答性を有している。前記多糖類は、水に可溶であってもよい。また、前記凝集性を有するセグメントは、３０℃以上の温度で凝集性を有しており、多糖類の骨格に側鎖として結合していてもよい。前記多糖類には、例えば、澱粉、セルロース、ペクチン、アルギン酸、カラゲナン、デキストラン、プルラン、キトサンなどが例示できる。非動物性多糖類は、通常、植物性多糖類である。凝集性を有するセグメントは、種々のセグメント、例えば、下記（ａ）及び（ｂ）などのユニットを包含する。
（ａ）アクリルアミド、Ｎ−Ｃ１−６アルキルアクリルアミド、及びＮ−ビニルＣ１−１０アシルアミドから選択された少なくとも一種の単量体の単独又は共重合体
（ｂ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、及びＨｉｓから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基を有するペプチド単位
前記凝集性セグメントのペプチド単位（ｂ）は、例えば、下記式（I）で表されるペプチド単位
−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−      （I）
（式中、Ｘは、Ｖａｌ、ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅから選ばれるアミノ酸残基を表し、ｎは１以上の整数を表す）
下記式（II）で表されるペプチド共重合体単位
−ＣＯ−Ｒ１−ＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｒ２−ＮＨ−      （II）
［式中、Ｒ１，Ｒ２は、同一又は異なって、アルキレン基、シクロアルキレン基、アリーレン基を示し、Ｙは−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−（Ｘ，ｎは前記に同じ），Ｓａｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅより選ばれるアミノ酸残基を表す］などのユニットで構成できる。凝集性を有するセグメントの割合は、全体の３〜９０重量％程度であってもよく、Ｈｉｓ残基を１〜５個の範囲で含むｐＨ応答性セグメントを含み、かつ中性付近で加水分解促進活性を示すセグメントであってもよい。前記材料は、温度に応答して溶液−ゲル状態を可逆的に形成してもよい。
【００１７】
本発明には、前記温度応答性材料を含む温度応答性組成物も含まれる。この組成物は、癒着防止材、組織接着材、被覆材（創傷被覆材など）、止血材、塞栓材などとして利用できる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本明細書において、各種アミノ酸残基は次の略号で記述する。
【００１９】
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｎｌｅ：Ｌ−ノルロイシン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓａｒ：サルコシン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−トレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
また、本明細書では、常法に従って、ペプチドのアミノ酸配列を、そのＮ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸残基が右側に位置して記述する。
【００２０】
［温度応答性材料又生体適合性重合体］
本発明の温度応答性材料は、非動物性多糖類の骨格と、この多糖類に結合した凝集性セグメントとで構成されており、凝集性セグメントは、加熱又は加温により凝集又は析出する性質を有している。
【００２１】
非動物性多糖類は、植物や藻類、菌類などの非動物由来の多糖類であり、多糖類からの誘導体、化学的に合成された多糖類であってもよい。動物由来の多糖類は、ウイルスや細菌、プリオンなどの既知の病原体に加えて、未知の病原体による種を超えた感染が懸念されている。また、種間の距離が近いほど、種を越えた感染の危険性が増大することが指摘されている。従って、ヒトに適用する材料は、できるだけヒトとの距離が離れた種由来の多糖類が好ましい。すなわち、本発明における多糖類は、非動物性であり、植物（海藻類を含む）由来の多糖類、微生物由来の多糖類、非哺乳類由来の動物多糖類（特に植物由来の多糖類）であるのが好ましい。
【００２２】
多糖類は、ホモグリカン（グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコサミンなどを単糖とする多糖類）、ヘテログリカン（グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、グルクロン酸などを構成糖とする多糖類）のいずれであってもよい。
【００２３】
多糖類としては、植物由来の多糖類（セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、イヌリン、レバン、キシラン、マンナン、ガラクタン、ペクチン、デンプン、ガラクトマンナン（又はグアーガム）、グルコマンナン（又はコンニャクマンナン）、ローカストビーンガム、タマリンドガム、アラビアガム、ゲランガム、トラガカントガム、カラヤガム、アラビノガラクタン、寒天、カラギーナン（又はカラゲナン）、アルギン酸など）、微生物由来の多糖類（キサンタンガム、プルラン、エルウィナガム、スクレログルカン、ガラクトグルカンなど）、非哺乳類の動物由来の多糖類（キチンなど）、それらの誘導体（デキストリン、シクロデキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルセルロースなどのセルロースエーテル、セルロースアセテートフタレートなどのセルロースエステル、セルロースエーテルエステル、メトキシ化ペクチン、カルボキシメチル化デンプン、キトサンなど）などが例示できる。これらの多糖類は単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００２４】
植物由来の多糖類又はその誘導体のうち、澱粉、セルロース、ペクチン、アルギン酸、カラゲナン、デキストランなどが繁用され、微生物由来の多糖類又はその誘導体のうちプルランなどが繁用され、非哺乳類の動物由来多糖類としてキトサンなどが繁用される。特に、植物由来の植物性多糖類（澱粉、セルロース、アルギン酸など）が好ましい。
【００２５】
多糖類の分子量は特に制限されず、例えば、数平均分子量５００〜１００×１０4、好ましくは１０００〜７０×１０4（特に１×１０4〜５０×１０4）程度の範囲から適当に選択できる。
【００２６】
凝集性を有するセグメント（又はフラグメント，側鎖）の種類は、水溶液の形態で、加熱により凝集性を有する限り特に制限されず、例えば、温度３０℃以上（好ましくは３０〜５０℃、さらに好ましくは３３〜４５℃、特に３５〜４４℃程度）で凝集性又は析出性を有するセグメントなどが例示できる。このようなセグメントでは、通常、水素結合に関与し、かつ低温で安定な結合を形成する官能基と、疎水結合に関与し、かつ高温側で安定な結合を形成する官能基とがバランスよく配置されており、前記官能基の割合により凝集温度を制御可能である(Prog. Biophys. molec. Biol., Vol.57, pp.23-57(1992))。すなわち、水素結合に関与する官能基数が多くなると凝集温度が高くなり、疎水結合に関与する官能基が多くなると凝集温度が低くなる。水素結合の数と疎水性基に含まれる炭素原子の数との割合（以下、単に水素結合／炭素原子の割合という場合がある）は、所望する凝集温度に応じて適当に選択でき、通常、前者／後者＝２／８〜５／５、好ましくは２．５／７．５〜４．５／５．５程度である。
【００２７】
なお、水素結合を形成する基としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、メルカプト基などが例示でき、疎水性基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチル基などのアルキル基（Ｃ1-6アルキル基など）、シクロヘキシル基などのシクロアルキル基（Ｃ4-8シクロアルキル基など）、フェニル基などのアリール基（Ｃ6-12アリール基など）、ベンジル基などのアラルキル基（フェニル−Ｃ1-4アルキル基など）、窒素、酸素及び硫黄原子から選ばれた少なくとも１つのヘテロ原子を含む５又は６員複素環基（ピロリジニル基、イミダゾリル基など）、縮合複素環基（インドリル基など）などが例示できる。
【００２８】
凝集性を有するセグメント（又は側鎖）としては、例えば、（ａ）疎水性基と水素結合性基とを有する高分子セグメント（以下、単に凝集性高分子という）、（ｂ）疎水性基と水素結合性基とを有するペプチドセグメントなどが例示でき、この凝集性ペプチドセグメント（ｂ）は、（b1）疎水性アミノ酸残基と水素結合性アミノ酸残基とを有するペプチドセグメント（以下、単に凝集性ペプチドという）、（b2）アミノ酸又はペプチド残基を有するペプチド共重合体セグメント（以下、単に凝集性ペプチド共重合体という）などであってもよい。さらに、（ａ）凝集性高分子、（b1）凝集性ペプチド、（b2）凝集性ペプチド共重合体は、直鎖状であってもよくアミノ基などの活性点から鎖が分岐して伸長した分岐鎖状であってもよい。これらの凝集性セグメントは単独で又は二種以上組み合わせて前記多糖類の骨格に導入できる。
【００２９】
（ａ）前記凝集性高分子としては、例えば、アクリルアミド又はその誘導体［アクリルアミド、Ｎ−Ｃ1-6アルキルアクリルアミド（Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−イソブチルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ヘキシルアクリルアミドなど）など］、Ｎ−ビニルアシルアミド（Ｎ−ビニルホルミルアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルイソ酪酸アミド、Ｎ−ビニルバレリル酸アミド、Ｎ−ビニルイソバレリル酸アミドなどのＮ−ビニルＣ1-10アシルアミド）から選択された単量体の重合体が例示できる。これらの単量体は単独で又は組み合わせて使用でき、重合体は単独重合体又は共重合体であってもよい。好ましい単量体は、通常、イソプロピル基などの分岐鎖状Ｃ3-5アルキル基を有している。さらに、必要であれば、他の単量体（スチレンなどの芳香族ビニル単量体、（メタ）アクリル系単量体、ビニルエステル系単量体、ビニルアルキルエーテル系単量体など）との共重合体であってもよい。
【００３０】
より具体的には、前記凝集性高分子（ａ）としては、例えば、（a1）少なくともＮ−Ｃ1-6アルキルアクリルアミドを単量体成分とする単独又は共重合体、特に少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミドで構成された単量体の重合体（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド系重合体）、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（水素結合／炭素原子の割合＝２．９／７．１）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリルアミド共重合体など；（a2）少なくともＮ−ビニルＣ1-10アシルアミドを単量体成分とする単独又は共重合体、特に少なくともＮ−ビニルイソ酪酸アミドで構成された単量体の重合体（Ｎ−ビニルイソ酪酸アミド系重合体）、例えば、ポリ−Ｎ−ビニルアセトアミドの他、ポリ−Ｎ−ビニルイソ酪酸アミド（水素結合／炭素原子の数の比が＝２．９／７．１）、Ｎ−ビニルアセトアミド−Ｎ−ビニルイソ酪酸アミド共重合体などが例示できる。
【００３１】
（ｂ）凝集性ペプチドセグメントは、アミノ酸残基として、アルキル基（例えば、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｎ−ブチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基などのＣ1-6アルキル基）、同素又は複素環基（例えば、シクロヘキシル基などのＣ4-8シクロアルキル基、フェニル基などのアリール基、ベンジル基などのフェニル−Ｃ1-4アルキル基、ピロリジニル基、イミダゾリル基などの１又は複数のヘテロ原子（窒素、酸素及び硫黄原子）を含む５又は６員複素環基、インドリル基などの縮合複素環基）を有していてもよい。特に、凝集性ペプチドセグメントは、通常、バルキー又は嵩高い基、例えば、イソプロピル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｎ−ブチル基などの直鎖又は分岐鎖状Ｃ3-5アルキル基（特に分岐鎖状Ｃ3-4アルキル基）、フェニル基、ベンジル基、５又は６員複素環基、縮合複素環基を有している。
【００３２】
すなわち、好ましい凝集性ペプチドセグメントは、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ，Ｐｈｅ、Ｔｒｐなどのアミノ酸残基（特に、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ）を有している。ペプチドセグメントは、これらアミノ酸残基のうち単一のアミノ酸残基を含んでいてもよいが、通常、複数のアミノ酸残基（例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ，Ｐｈｅ、Ｔｒｐから選択された複数のアミノ酸残基）を含んでいる。複数のアミノ酸残基の組合せとしては、例えば、ＶａｌとＰｒｏとの組合せ、Ｖａｌ及び／又はＰｒｏとＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅから選択された少なくとも一種との組合せ、ＶａｌとＨｉｓとの組合せ、ＰｒｏとＨｉｓとの組合せ、ＨｉｓとＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅから選択された少なくとも一種との組合せなどが例示できる。
【００３３】
凝集性セグメントを構成するペプチドは、ラセミ体であってもよく、アミノ酸残基が立体配置して、Ｒ体やＳ体を形成し、光学活性を有していてもよい。
【００３４】
（b1）凝集性ペプチドは、通常、下記式（I）
−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）n−      （I）
（式中、Ｘは、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅから選ばれるアミノ酸残基を表し、ｎは１以上の整数を表す）で表されるペプチド単位又ペプチドユニットを有している。なお、係数ｎは、例えば、１〜１００（例えば、２〜１００）、好ましくは１〜５０（例えば、２〜５０）、さらに好ましくは２〜３０程度であり、通常、２〜２５（例えば、２〜１０）程度であってもよい。
【００３５】
このようなペプチド単位を有する凝集性ペプチドとしては、例えば、下記式で表されるペプチドが例示できる。
【００３６】
（1）Ｈ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−ＮＨ２
（Ｘおよびｎは前記に同じ。水素結合／炭素原子の割合＝３．８／６．２）
（2）（Ｎ’α，Ｎ’ε，Ｎ”α，Ｎ”ε−テトラ（Ｈ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ）−Ｎα，Ｎε−ジリジル）リジル−β−アラニン（式中、Ｘおよびｎは前記に同じ）
（3）（Ｎ’α，Ｎ’ε，Ｎ”α，Ｎ”ε−テトラ（Ｈ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ）−Ｎα，Ｎε−ジリジル）リジル−β−アラニン（式中、Ｘおよびｎは前記に同じ）
（Ｘおよびｎは前記に同じ。水素結合／炭素原子の割合＝３．８／６．２〜４．３／５．７）
（b2）凝集性ペブチド共重合体は、前記凝集性ペプチドセグメントと同様のアルキル基や、同素又は複素環基を有していてもよく、Ｎ−アルキルアミノ基（Ｎ−Ｃ１−４アルキルアミノ基など）を有していてもよい。
【００３７】
ペプチド共重合体は、通常、下記式（II）
−ＣＯ−Ｒ1−ＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｒ2−ＮＨ−      （II）
［式中、Ｒ1，Ｒ2は、同一又は異なって、アルキレン基、シクロアルキレン基、アリーレン基を示し、Ｙは−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）n−（Ｘ，ｎは前記に同じ），Ｓａｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅより選ばれるアミノ酸残基を表す］で表されるペプチド共重合体単位又はユニットを有している。
【００３８】
アルキレン基としては、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、３，３−ジメチルトリメチレン、ヘキサメチレン基などの直鎖状又は分岐鎖状Ｃ1-8アルキレン基などが例示できる。シクロアルキレン基としては、シクロヘキシレン基などのＣ4-8シクロアルキレン基などが例示でき、アリーレン基としては、フェニレン基、ナフチレン基などが例示できる。好ましい基Ｒ1，Ｒ2は、生体内で分解可能な共重合体を形成するアルキレン基、例えば、Ｃ2-6アルキレン基、特にＣ2-4アルキレン基である。
【００３９】
このようなペプチド共重合体は、例えば、下記式で表される共重合ユニットを有している。
【００４０】
（1）−ＣＯ−Ｒ1−ＣＯ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）n−ＮＨ−Ｒ2−ＮＨ−
（2）−ＣＯ−Ｒ1−ＣＯ−Ｓａｒ−ＮＨ−Ｒ2−ＮＨ−
（3）−ＣＯ−Ｒ1−ＣＯ−Ｘ−ＮＨ−Ｒ2−ＮＨ−
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ1およびＲ2は前記に同じ）
これらの凝集性ペブチド共重合体は単独で又は二種以上組み合わせて利用できる。なお、凝集性ペプチド共重合体を複数の共重合ユニット（例えば、前記共重合ユニット(1)〜(3)）で構成する場合、各共重合ユニットに対応する成分を、それぞれ５〜９０モル％、好ましくは１０〜８０モル％、さらに好ましくは２５〜７５モル％程度の範囲から選択して総量を１００モル％とし、共重合することにより調製してもよい。このような共重合において、通常、前記共重合ユニット(1)及び／又は(3)の割合は、凝集性ペプチド共重合体全体の５〜１００モル％、好ましくは１０〜１００モル％、さらに好ましくは２５〜１００モル％程度（例えば、３０〜９５モル％）程度となるように調整するのが好ましい。
【００４１】
なお、必要であれば、多糖類には他のセグメント（例えば、非凝集性高分子、非凝集性ペプチド、非凝集性ペプチド共重合体などの非凝集性セグメント）が結合していてもよい。前記凝集性セグメントは、多糖類に結合するセグメント全体の１０〜１００モル％、好ましくは２０〜１００モル％、さらに好ましくは３０〜１００モル％程度の範囲から選択できる。
【００４２】
凝集性セグメントの分子量は、プルラン換算で、重量平均分子量３０００〜２０×１０4程度であり、通常、５０００〜１０×１０4、好ましくは１×１０4〜８×１０4、さらに好ましくは２×１０4〜６×１０4（例えば、２×１０4〜４×１０4）程度である。
【００４３】
凝集性セグメントの割合は、水溶液の形態で加熱により凝集性が発現する限り特に制限されず、例えば、重合体全体に対して、３〜９０重量％、好ましくは５〜９０重量％、さらに好ましくは１０〜８５重量％程度であり、１５〜８０重量％（例えば、２０〜８０重量％）程度であってもよい。
【００４４】
前記凝集性セグメントにおいて、Ｈｉｓ残基を含む凝集性ペプチドセグメント（特にペプチドユニット又はペプチド共重合体ユニット中に１〜５，好ましくは１〜３，さらに好ましくは２〜３程度の範囲でＨｉｓ残基を含むペプチドセグメント）は、ｐＨ応答性を示す。すなわち、ｐＨの変化に応じてＨｉｓ残基の側鎖イミダゾリル基の解離状態が変化するｐＨ応答性を有しており、特に、ｐＨ６以下の酸性ではイミダゾリル基がプロトン化されて正電荷を有するが、ｐＨ６〜７の範囲では脱プロトン化され、ｐＨ７以上では中性型となる。さらに、Ｈｉｓ残基を含む凝集性ペプチドセグメントは、中性付近（例えば、ｐＨ６〜８程度）で加水分解促進活性を示す。すなわち、ｐＨ６以下の酸性で存在するプロトン化されたイミダゾリル基は、糖鎖のグリコシド結合を加水分解する活性を示さないが、中性付近で存在するイミダゾリル基は、窒素原子上の不対電子対によるグリコシド結合を加水分解する活性を有する。そのため、Ｈｉｓ残基を含む凝集性セグメントを利用すると、ｐＨに応答して分解性を促進することができ、生体に適用する材料として適している。
【００４５】
前記凝集性高分子（ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドやポリ−Ｎ−ビニルイソ酪酸アミドなど）は、慣用の重合法、例えば、対応する単量体（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ビニルイソ酪酸アミドなど）を、ラジカル重合開始剤（アゾビスイソブチロニトリルなどのアゾ化合物や過酸化ベンゾイルなどの過酸化物など）を用いて重合することにより得ることができる。さらに、前記凝集性高分子は、慣用の方法により、多糖類に導入できる。例えば、前記重合において、反応性基を有する連鎖移動剤（メルカプトエチルアミン、３−メルカプトプロピオン酸などのアミノ基やカルボキシル基などを有する連鎖移動剤）の共存下で重合することにより、反応性基を凝集性高分子末端に導入し、これらの反応性基を介してアミド形成反応などにより多糖類の骨格に結合することができる。なお、凝集性高分子の分子量又は長さは、単量体、重合開始剤、連鎖移動剤のモル比などにより制御できる。
【００４６】
好ましい方法では、高分子の合成と多糖類の骨格への結合とを同時に行うことができる。例えば、多糖類の骨格にＣｅイオンを作用させて炭素ラジカルを生成させ、ラジカル機構を利用して前記単量体を重合することができる。具体的には、前記単量体と、ラジカルが生成した多糖類とを混合することにより、多糖類のラジカル部位から高分子鎖が成長し、凝集性高分子の側鎖と多糖類との結合を同時に行うことができる。
【００４７】
他の方法としては、多糖類に重合性基を導入し、前記単量体と重合することにより、凝集性高分子鎖を多糖類に導入する方法が例示できる。例えば、多糖類と、ビニル基や（メタ）アクリロイル基などの重合性基を有する酸無水物（無水（メタ）アクリル酸、無水マレイン酸など）とを反応させて、エステル結合により重合性基を導入し、前記単量体との重合に供することにより、多糖類に凝集性高分子の側鎖を導入できる。この方法においても、凝集性高分子鎖の長さは、多糖類に導入した重合性基と単量体とのモル比などにより制御できる。
【００４８】
なお、導入された高分子側鎖の分子量又は長さは、多糖類の骨格を酸（例えば、１Ｍ硫酸など）で加水分解し、残存する側鎖の分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィなどで測定することにより求めることができる。
【００４９】
前記凝集性ペプチドは、通常のペプチド合成法、例えば、固相合成法および液相合成法のいずれもの方法でも調製できる。好ましい方法は、操作が簡便な固相合成法である［例えば、日本生化学編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学（下）」昭和６２年５月２０日  （株）東京化学同人発行、第６４１頁〜第６９４頁参照］。
【００５０】
固相合成法では、反応溶媒に不溶の重合体又は担体（クロロメチル化、オキシメチル化などにより修飾されたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体（クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル−樹脂など）、ベンズヒドリルアミン樹脂（４−メチルベンズヒドリルアミン−樹脂など）、マルチデタッチャブル（multi-detachable）樹脂など）が使用される。これらの重合体又は担体を利用したペプチド合成法は慣用の方法、例えば、重合体又は担体に、目的とするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸のうちα−カルボキシル基を結合させ、目的とするペプチドのＮ末端の方向に向かって、アミノ酸又はペプチド断片（遊離のカルボキシル基を有し、かつアミノ基などが保護されたアミノ酸やペプチド断片）を順次縮合させる操作と、アミノ基の保護基を脱離する操作とを繰り返してペプチド鎖を伸長させて、所定のペプチド鎖を形成し、前記重合体からペプチド鎖を脱離させ、保護基を除去することにより目的ペプチドを生成させ、精製することにより、ペプチドを合成できる。
【００５１】
なお、保護基の種類、縮合反応、保護基の脱離には慣用の方法が利用できる。例えば、アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基（Z）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基などの置換ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基（Boc）、フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、イソボルニルオキシカルボニル基（Iboc）などが例示でき、カルボキシル基の保護基としては、ベンジルエステル（OBzl）、置換ベンジルエステル、メチルエステル（OMe）、エチルエステル（OEt）、ｔ−ブチルエステル（OBut）、フェナシルエステル（OPac）、シクロヘキシルエステル（OcHex）などが例示できる。また、アミノ酸の側鎖も慣用の保護基で保護できる。
【００５２】
縮合反応には、種々のカップリング法、例えば、Ｃ端活性化法（ｐ−ニトロフェニルエステル（ONp）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ONSu）などを利用した活性エステル化法、混合酸無水物、ジフェニルホスホリルアジド（DPPA）などを用いるアジド法、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPC）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（WSCI）又はその塩酸塩、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（BOP）などの縮合剤を用いるカップリング試薬法など）などが利用できる。カップリング法においては、縮合剤を単独で用いてもよく、他の成分と組み合わせて使用してもよい。例えば、ＤＣＣ（又はＷＳＣＩ）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（HONSu）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（HOObt）などから選択された成分とを組み合わせて用いてもよい。なお、これらの試薬は非水溶性であってもよく、ＷＳＣＩ又はその塩酸塩などのように、水溶性であってもよい。
【００５３】
保護基の脱離には、慣用の方法、例えば、接触還元、酸（トリフルオロメタンスルホン酸などのスルホン酸類、トリフルオロ酢酸、フッ化水素など）又はアルカリなどが利用できる。ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を制御する観点から好ましい。また、ペプチドの精製は、慣用の方法、例えば、イオン交換樹脂、各種クロマトグラフィなどを利用して行うことができ、逆相液体クロマトグラフィーやゲルパーミエイションクロマトグラフィーで行うのが効果的である。
【００５４】
さらに、凝集性ペブチド共重合体も種々の方法で調製できる。例えば、式Ｈ−Ｙ−ＯＨ（Ｙは前記に同じ）で表されるペプチド又はアミノ酸と、基Ｒ1に対応するジカルボン酸又はその酸無水物とを反応させてＨＯ−ＣＯ−Ｒ1−ＣＯ−Ｙ−ＯＨ（Ｙは前記に同じ）を生成させ、基Ｒ2に対応するジアミンと反応させることにより前記共重合体が得られる。
【００５５】
Ｒ1に対応するジカルボン酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸などのＣ2-10脂肪族ジカルボン酸又はその酸無水物（無水コハク酸など）、シクロヘキサンジカルボン酸などのＣ4-8シクロアルカン−ジカルボン酸、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸などの芳香族ジカルボン酸又はその酸無水物などが例示できる。
【００５６】
Ｒ2に対応するジアミンとしては、例えば、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンなどのＣ2-6アルキレンジアミン、ジエチレントリアミンなどのポリアルキレンポリアミン、シクロヘキサンジアミン、イソホロンジアミンなどのＣ4-8脂環族ジアミン，フェニレンジアミン、キシリレンジアミンなどの芳香族ジアミンなどが例示できる。
【００５７】
なお、ペプチド又はアミノ酸と、ジカルボン酸又はその酸無水物（無水コハク酸又はコハク酸など）、ジアミン（エチレンジアミンなど）との反応には、前記活性エステル法などの種々のカップリング反応が利用できる。例えば、ペプチド共重合体（１）：−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）n−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（Ｘ及びｎは前記に同じ）、（２）：−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−Ｓａｒ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−、（３）：−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−Ｘ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（Ｘは前記に同じ）は、（1a）Ｈ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）n−ＯＨ（Ｘ及びｎは前記に同じ）、（2a）Ｈ−Ｓａｒ−ＯＨ、（3a）Ｈ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｈ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｈ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｈ−Ｎｌｅ−ＯＨを、それぞれ無水コハク酸と反応させて、（1b）ＨＯ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）n）−ＯＨ（Ｘ及びｎは前記に同じ）、（2b）ＨＯ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−Ｓａｒ−ＯＨ、（3b）ＨＯ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−Ｖａｌ−ＯＨ、ＨＯ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−Ｌｅｕ−ＯＨ、ＨＯ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−Ｉｌｅ−ＯＨ、ＨＯ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−Ｎｌｅ−ＯＨを生成させる。次いで、各成分（1b）〜（3b）とエチレンジアミンとを、それぞれ、適当な範囲、例えば、５〜９０モル％の範囲で混合した水溶液に、カップリング剤（水溶性カルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなど）を加えて脱重縮合することにより得られる。
【００５８】
［材料又は生体高分子の製造方法］
非動物性多糖類の骨格と凝集性セグメント（フラグメント又は側鎖）とを結合する方法は、多糖類の骨格に含まれる官能基の種類と、凝集性セグメントに含まれる官能基の種類との組み合わせによって適宜選択される。例えば、非動物性多糖類がカルボキシル基を有し、凝集性セグメントがアミノ基を有する場合には、通常のアミド基生成反応により多糖類と凝集性セグメントとを結合できる。具体的には、カップリング試薬（カルボジイミド（ＤＣＣ、ＤＩＰＣ、ＷＳＣＩ又はその塩酸塩など）、ＢＯＰなどの縮合剤単独、ＤＣＣ（又はＷＳＣＩ）−HONSu、ＤＣＣ（又はＷＳＣＩ）−ＨＯＢｔ、ＤＣＣ（又はＷＳＣＩ）−ＨＯＯｂｔなどのカップリング試薬の組合せなど）による脱水縮合反応、活性エステル化法によりカルボキシル基を活性エステルに変換した後、アミノ基とのアミド結合形成反応を行うことなどの方法が挙げられる。
【００５９】
また、多糖類の官能基がヒドロキシル基である場合には、アルカリ存在下、多糖類とハロカルボン酸（クロロ酢酸など）とを反応させてカルボキシル基を導入し、通常のアミド基生成反応により凝集性セグメントとの結合を行うことができる。さらに、多糖類に含まれるヒドロキシル基を酸化してアルデヒド基を生成させ、凝集性セグメントのアミノ基とシッフ塩基形成反応を経ることにより、凝集性セグメントと結合させることができる。
【００６０】
本発明の温度応答性材料（温度応答性重合体）は、温度に応答して溶液状からゲル状に変化する温度応答性を有しており、通常、加熱により溶液からゲルへ変化する。好ましい温度応答性重合体は、温度に応答して溶液の形態とゲルの形態とに可逆的にあるいは不可逆的に変化する。ゲルは、通常、白濁又は透明である。上記応答温度は、適当に選択できるが、通常、３０℃以上（好ましくは３０〜５０℃、さらに好ましくは３３〜４５℃、特に３５〜４４℃程度）である。
【００６１】
さらに、温度応答性材料は、非動物性の多糖類骨格を有しているため、生体適合性及び安全性が高く、ウイルスや細菌、プリオンなどの既知又は未知の病原体による感染のおそれが少ない。特に植物由来の多糖類は安全性が高い。さらには、生体内での分解及び／又は吸収・排泄も期待される。なお、高分子量の凝集性高分子は通常、生体内での分解効率が低下するが、重合度が低い場合には排泄が可能である。特に、多糖類骨格と、凝集性ペプチド鎖、および凝集性ペブチド共重合体の鎖は、生体内で分解され、分解生成物の毒性も低く、安全に吸収・排泄される。
【００６２】
［温度応答性組成物］
本発明の温度応答性材料は、溶液とゲルとの可逆的な変化を利用して生体に適用する温度応答性組成物の構成成分として有用である。温度応答性組成物は、前記温度応答性材料単独で構成してもよいが、通常、生理学的に許容される担体と組み合わせて使用される。
【００６３】
温度応答性組成物の剤形は、特に制限されず、粉体、散剤などの固形剤であってもよいが、温度応答性材料は、通常、液体と組み合わせることにより液剤として利用される。すなわち、液剤の担体としては、水、生理食塩水、緩衝液（リン酸緩衝液など）、アルコール水溶液（エタノール水溶液など）、多価アルコール水溶液（５％グリセリン水溶液、エチレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液など）、糖水溶液（５％グルコース水溶液、ブドウ糖水溶液など）、アルブミン水溶液（５％アルブミン溶液など）などが例示できる。なお、液剤は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、エアゾール剤、貼付剤（パスタ剤、パップ剤）などであってもよい。液剤中の温度応答性材料（又は温度応答性重合体）の濃度は、重合体の溶液粘度などに応じて、例えば、０．１〜９０重量％、好ましくは０．５〜５０重量％、さらに好ましくは１〜３０重量％（例えば、１〜１５重量％）、特に１〜１０重量％程度の範囲から選択できる。
【００６４】
温度応答性組成物（又は製剤）は、生理的又は薬理的に許容される種々の添加剤、例えば、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体（セルロースエーテル類など）などの高分子、保存剤、安定剤、乳化剤や懸濁化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、薬剤（殺菌剤、消毒剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、鎮痛剤、止血剤など）などを含んでいてもよい。
【００６５】
本発明の温度応答性組成物は、皮膚、筋肉組織や内臓組織などの種々の患部（切開部、切断部、創傷部、剥離部、破砕部など）に適用でき、例えば、患部の組織面の間に介在し、組織の癒着を防止するための癒着防止材、縫合部などの患部に適用し、組織を接着させるための組織接着材、創傷部などの患部を被覆して保護するための（創傷）被覆材、切開部や創傷部などの患部に適用して止血するための止血材や塞栓材などとして利用できる。患部に対する温度応答性組成物の適用量は、患部の部位や面積、ゲル形成が必要とされる時間又は期間などに応じて、患部を被覆可能な範囲から選択できる。
【００６６】
本発明の材料は、慣用の方法、例えば、前記成分を混合し、必要により滅菌処理し、所定の容器に充填し、滅菌処理することにより調製できる。例えば、患部に容易に適用するため、注出可能な容器（注射器状の容器など）に充填したり、噴射剤と共にスプレーボトルに充填することも可能である。また、貼付剤は、前記組成物を基材に塗布し、塗布層を剥離可能な保護シートで被覆することにより調製できる。
【００６７】
本発明の材料及び組成物は、患部の温度に応答して加温され、溶液状からゲル状に変化するため、患部にゲル膜を形成できる。そのため、ヒトの他、種々の哺乳類（特に、家畜、ペットなどの温血動物）にも適用できる。
【００６８】
【発明の効果】
本発明の材料（又は重合体）および組成物は、温度に応答して液体からゲルへ変化するとともに、非動物性多糖類を骨格として含むため、安全性が高い。そのため、生体（例えば、患部など）への適用により、塗布部にゲル状の皮膜を形成できる。本発明の組成物は、癒着防止材、組織接着材、創傷被覆材、止血材、塞栓材などの主たる構成成分として有用である。
【００６９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００７０】
実施例１
［デンプン−ＰＮＩＰＡＭ共重合体の調製］
馬鈴薯澱粉（三和澱粉工業（株））０．１ｇとＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（和光純薬工業（株））０．０７１ｇを含む水溶液４ｍｌに、窒素ガスを３０分間吹き込むことにより脱気し、硝酸二アンモニウムセリウム（IV）（和光純薬工業（株））３．４ｍｇを１Ｎ硝酸水溶液１００μｌに溶解して加えた。窒素雰囲気下、３０℃で一晩重合した。得られた水溶液にアセトンを加えて、馬鈴薯澱粉の骨格にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）の側鎖が結合した重合体を得た。さらに、重合体を水に溶解してアセトンで沈殿する操作を数回繰り返して精製した（収量：約０．１２ｇ、収率：約７０％）。
【００７１】
［評価試験］
得られた重合体を、１０ｍＭリン酸塩緩衝液（０．１５ＭのＮａＣ１を含む。ｐＨ７．４）に溶解し、５重量％の溶液を調製した。この溶液は室温（約２５℃）では透明な液体であったが、３７℃に加温すると白色のゲル状物を形成した。また、このゲル状物を室温まで冷却すると透明な液体となった。
【００７２】
一方、対照としてのポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単独重合体（ＰＮＩＰＡＭ）の５重量％溶液は、室温では透明な液体であり、３７℃で白色の沈殿を生成したが、ゲルを形成しなかった。また、澱粉単独では同濃度で緩衝液に溶解しなかった。
【００７３】
実施例２
［デキストラン−ＰＮＩＰＡＭ共重合体の調製］
デキストラン（平均分子量約３０万、和光純薬工業（株））０．１ｇをホルムアミド５ｍｌに溶解し、種々の量の無水メタクリル酸（アルドリッチ社）と、トリエチルアミン１４０μｌとを加え、遮光しながら２５℃で２４時間反応した。得られた反応液を水に対して２４時間透析（分子量カット１２０００）し、メタクリル酸を除去した後、凍結乾燥した。メタクリレートの導入率を、ＮＭＲにおけるメチルプロトンの面積から求めたところ、糖残基当たり導入率（グルコース単位当たりの平均置換度）が、（ａ）０．２６のメタクリル酸エステル化物、（ｂ）０．０７のメタクリル酸エステル化物、（ｃ）０．０１のメタクリル酸エステル化物が得られた。
【００７４】
メタクリル酸でエステル化された各デキストラン（ａ）〜（ｃ）について、それぞれ３つの１重量％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ）溶液３ｍｌを調製した。各溶液に、（１）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）の１０重量％ＤＭＳ溶液３ｍｌ、（２）ＮＩＰＡＭの１０重量％ＤＭＳ溶液１．８ｍｌ及びＤＭＳ１．２ｍｌ、（３）ＮＩＰＡＭの１０重量％ＤＭＳ溶液０．６ｍｌ及びＤＭＳ２．４ｍｌをそれぞれ加えた。さらに、アゾイソブチロニトリルの５重量％ＤＭＳ溶液１７４μｌをそれぞれに加え、凍結と融解を交互に３回繰り返して脱気した後、窒素雰囲気下で、７０℃に４時間保温した。
【００７５】
得られた反応生成物を、水に対して２４時間透析（分子量カット１２０００）し、ＤＭＳを除去した後、凍結乾燥を行った。さらに、水に対して１００時間透析（分子量カット３０万）し、デキストランに結合しなかったポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）を除去した後、凍結乾燥を行い、デキストランの骨格にＰＮＩＰＡＭの側鎖が結合した重合体を得た。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより精製度と分子量を測定した。
【００７６】
［評価試験］
得られた重合体について実施例１と同様の試験を行ったところ、（１）ＮＩＰＡＭの１０重量％ＤＭＳ溶液３ｍｌ、（３）ＮＩＰＡＭの１０重量％ＤＭＳ溶液０．６ｍｌを加えて得られた重合体は、３７℃で白色のゲル状物を与えた。また、（２）ＮＩＰＡＭの１０重量％ＤＭＳ溶液１．８ｍｌを加えて得られた重合体は、３７℃で透明なゲル状物を与えた。これらの重合体の溶液は、すべて、室温に冷却することにより再び透明な液体状となった。さらに、これらの溶液−ゲル挙動は、糖残基あたりのメタクリル酸によるエステルの導入率（ａ）〜（ｃ）に依存しなかった。
【００７７】
実施例３
［デンプン−ペプチド重合体の調製］
式（１）：Val  Pro  Gly  Val  Gly  Val  Pro  Gly  Val  Gly  Val  Pro  Gly  Val  Gly  Val  Pro  Gly  Val  Gly-NH2（配列番号：１）で示されるペプチドを、ペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル）−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−エチル基を０．６２ミリモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比＝９９：１］からなる粒状樹脂［米国アプライド・バイオシステムズ社製、Ｆｍｏｃアミドレジン］０．１ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。
【００７８】
結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−フルオレニルメトキシカルボニル］−Ｌ−バリン［Ｆｍｏｃバリン］、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン［Ｆｍｏｃプロリン］、Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル−グリシン［Ｆｍｏｃグリシン］を各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。
【００７９】
得られたペプチド樹脂を５容量％の水を含むトリフルオロ酢酸１０ｍｌで２時間脱離処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加え、生成した沈殿物をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアジャパン）で精製し、式（１）で示すペプチドを得た。得られた精製ペプチドをＨＰＬＣ［ファルマシアバイオテク（株）製，AKTA explorer10XT、カラム：ミリポアウオーターズ（株）製，ノバパックC18 3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水との混合溶媒（アセトニトリル濃度を３０分間で５容量％から５０容量％に直線的に変化させた）、流速１．０ｍｌ／分］に付したところ、１８．５分に単一のピークが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は１６５５であった（理論値：１６５５．０）。
【００８０】
クロロ酢酸（アルドリッチ社）３ｇをメタノール４０ｍｌに溶解し、この溶液に、３．５ｇの水酸化ナトリウム（和光純薬工業（株））を溶解した水溶液７ｍｌを加えた。さらに、混合液に、攪拌しながら馬鈴薯澱粉（三和澱粉工業（株））１０ｇを加え、４０℃で４８時間攪拌を続けた。その後、氷酢酸約２ｍｌで反応液をｐＨ６．５に調整し、メタノールを加えてカルボキジメチル化された澱粉を沈殿物として回収した。回収された沈殿物をメタノールでさらに５回洗浄した後、減圧乾燥し、約１０ｇのカルボキシメチル化澱粉を得た。
【００８１】
カルボキシメチル化澱粉０．０５ｇを水２５ｍｌに溶解し、式（１）で示すペプチド８３ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ペプチド研究所）１１４ｍｇ、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、ペプチド研究所）１９８ｍｇを順次加えて溶解し、室温で一晩攪拌した。反応混合液を、水に対して４８時間透析（分子量カット３０００）して副生成物を除去して、澱粉の骨格に式（１）で示すペプチドの側鎖が結合したデンプン−ペプチド（１）重合体を得た。
【００８２】
［評価試験］
得られたデンプン−ペプチド重合体について、実施例１と同様に試験したところ、３７℃で白色のゲル状物を与え、室温に冷却することにより再び透明な液体状となり、溶液−ゲル挙動は３７℃で可逆的であった。
【００８３】
実施例４
［アルギン酸−ペプチド重合体の調製］
式（２）：（Ｎ’α，Ｎ’ε，Ｎ”α，Ｎ”ε-テトラ（Ｈ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）４）−Ｎα，Ｎε−ジリジル）リジル-β-アラニンおよび式（３）：（Ｎ’α，Ｎ’ε，Ｎ”α，Ｎ”ε-テトラ（Ｈ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）２）−Ｎα，Ｎε−ジリジル）リジル−β−アラニンで示されるペプチドを、実施例３と同様の方法で合成した。
【００８４】
ただし、Ｆｍｏｃアミドレジンの代わりに（Ｎ’α，Ｎ’ε，Ｎ”α，Ｎ”ε−テトラフルオレニルメトキシカルボニル−Ｎα，Ｎε−ジリジル）リジル−β−アラニル基を０．１４ミリモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベンゼンとの構成モル比＝９９：１］からなる粒状樹脂［米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＦｍｏｃＭＡＰレジン４ブランチ］０．０２５ミリモルを用い、式（３）で示されるペプチドの場合には、結合反応において、実施例３に示したアミノ酸以外に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン［Ｆｍｏｃグルタミン］、Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−ＮIm−トリチル−L−ヒスチジン［Ｆｍｏｃヒスチジン］を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。
【００８５】
さらに式（３）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドの場合には、５容量％の水を含むトリフルオロ酢酸１０ｍｌの代りに、２．５容量％エタンジチオール（東京化成（株））と２．５容量％の水を含むトリフルオロ酢酸１０ｍｌを用いて、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。
【００８６】
実施例３と同様のＨＰＬＣに付したところ、式（２）で示される精製ペプチドでは２２．６分に、式（３）で示される精製ペプチドでは１７．８分にそれぞれ単一のピークが示された。
【００８７】
アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）：１級、１重量％水溶液の粘度（温度２０℃）５００〜６００ｃｐ）２０ｍｇを１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌに溶解し、式（２）で示すペプチド３５ｍｇ、あるいは式（３）で示すペブチド３１ｍｇをそれぞれ加えて溶解した。さらにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド１２ｍｇと前記水溶性カルボジイミド１０ｍｇとを順次加えて溶解し、室温で一晩攪拌した。反応液を水に対して４８時間透析（分子量カット３０００）して副生成物を除去し、アルギン酸の骨格に式（２）で示すペプチドの側鎖が結合したアルギン酸−ペプチド（２）重合体と、アルギン酸の骨格に式（３）で示すペプチドの側鎖が結合したアルギン酸−ペプチド（３）重合体を得た。
【００８８】
［評価試験］
得られたアルギン酸−ペプチド重合体について、実施例１と同様に試験したところ、いずれも３７℃で白色のゲル状物を与えた。また、アルギン酸−ペプチド（２）重合体は室温に冷却することにより再び透明な液体状となり、溶液−ゲル挙動は３７℃で可逆的であった。一方、アルギン酸−ペプチド（３）重合体は室温に冷却しても液体とならず、不可逆的なゲル化を示した。
【００８９】
実施例５
［アルギン酸−ペプチド重合体の調製］
式（４）：Val  Pro  Gly  Val  Gly  Val  Pro  Gly  Val  Gly  Val  Pro  Gly  Val  Gly  Val  Pro  Gly  Val  Gly（配列番号：２）で示されるペプチドを実施例３と同様の方法で合成した。ただし、Ｆｍｏｃアミドレジンの代りに４−（Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−グリシル）−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を０．８０ミリモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベンゼンとの構成モル比＝９９：１］からなる粒状樹脂［米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン］０．１ミリモルを用いた。
【００９０】
実施例３と同様のＨＰＬＣに付したところ、式（４）で示される精製ペプチドでは１８．６分に単一のピークが示された。
【００９１】
式（４）で示されるペプチド、またはサルコシン（和光純薬工業（株））、イソロイシン（和光純薬工業（株））を水に溶解し、それぞれ等モルの無水コハク酸を加え、攪拌しながら１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより、反応系のｐＨを略７．０に保った。反応により、略１００％の収率でコハク酸化ペプチド又はコハク酸化アミノ酸が得られた。
【００９２】
コハク酸化された式（４）で示すペプチドと、コハク酸化サルコシンと、コハク酸化イソロイシンと、エチレンジアミン（和光純薬工業）とを、１：１．５：４．５：７のモル比で水に溶解した後、前記水溶性カルボジイミドをモル比で３５、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ペプチド研究所）をモル比１６の割合で加えて溶解し、室温で２４時間攪拌した。反応生成物をＰＤ１０カラムで精製した。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定した平均分子量は約５５０００であった。
【００９３】
アルギン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）、１級、１重量％水溶液の粘度（温度２０℃）５００〜６００ｃｐ）２０ｍｇを１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌに溶解し、上記得られた式（４）で示すペプチドを含む共重合体２０ｍｇを加えて溶解した。さらにＮ−ヒドロキシコハク酸イミド１２ｍｇと前記水溶性カルボジイミド１９ｍｇとを順次加えて溶解し、室温で一晩攪拌した。反応液を水に対して４８時間透析（分子量カット３０００）して副生成物を除去し、アルギン酸の骨格に式（４）で示すペプチドを含む共重合体の側鎖が結合したアルギン酸−ペブチド（４）重合体を得た。
【００９４】
［評価試験］
得られたアルギン酸−ペプチド（４）重合体について、実施例１と同様に試験したところ、３７℃で透明のゲル状物を与え、室温に冷却することにより再び透明な液体となった。
【００９５】
【配列表】
【００９６】
【配列表フリーテキスト】
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