(57)【要約】アポトーシスを誘導する新規のヒトアポトーシス関連蛋白質として、配列番号２、４または６のアミノ酸配列を含む蛋白質を提供する。また、この蛋白質をコードするポリヌクレオチドと、蛋白質に対する抗体等を提供する。これらの蛋白質、ポリヌクレオチドおよび抗体は、癌や自己免疫疾患等の診断および治療等に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４または６のいずれかのアミノ酸配列を有するヒトアポトーシス関連蛋白質をコードするヒトアポトーシス関連遺伝子。
【請求項２】
ｃＤＮＡが、それぞれ配列番号１、３または５の塩基配列を有する請求項１のヒトアポトーシス関連遺伝子。
【請求項３】
請求項１のヒトアポトーシス関連遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１のヒトアポトーシス関連遺伝子または請求項３の精製ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブ。
【請求項５】
請求項１のヒトアポトーシス関連遺伝子または請求項３の精製ポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するプライマーセット。
【請求項６】
請求項３のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６の組換えベクターによる形質転換細胞。
【請求項８】
請求項１の遺伝子発現産物であって、配列番号２、４または６のアミノ酸配列を有する精製ヒトアポトーシス関連蛋白質。
【請求項９】
請求項７の形質転換体によって産生される請求項８の精製ヒトアポトーシス関連蛋白質。
【請求項１０】
請求項９のヒトアポトーシス関連蛋白質の一部分からなる精製または合成されたペプチド。
【請求項１１】
配列番号２における第１−３２８アミノ酸残基の連続５以上のアミノ酸配列からなる請求項１０のペプチド。
【請求項１２】
配列番号４における第１−３２６アミノ酸残基の連続５以上のアミノ酸配列からなる請求項１０のペプチド。
【請求項１３】
配列番号４における少なくとも第３８５−３８９アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む請求項１０のペプチド。
【請求項１４】
配列番号６における第１−３０１アミノ酸残基の連続５以上のアミノ酸配列からなる請求項１０のペプチド。
【請求項１５】
請求項８の精製ヒトアポトーシス関連蛋白質に対する抗体。
【請求項１６】
請求項８の精製ヒトアポトーシス関連蛋白質のアポトーシス活性を制御する分子をスクリーニングする方法であって、請求項１３のペプチドに対する切断活性を指標として目的分子を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、アポトーシスを誘導する新規なヒトアポトーシス関連蛋白質と、この蛋白質をコードしているポリヌクレオチド、および上記蛋白質に対する抗体に関するものである。この発明の蛋白質および抗体は、各種疾患の診断、および治療に有用であり、ポリヌクレオチドは遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として有用である。また、ポリヌクレオチドは、この発明の蛋白質を大量生産するための遺伝子源として用いることが出来る。
背景技術
アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）は個体の形態形成、成体制御、成体防御等に重要な役割を有することが知られている〔Ｂｏｓｍａｎ　ＦＴ，Ｖｉｓｓｅｒ　ＢＣ，ｖａｎ　Ｏｅｖｅｒｅｎ　Ｊ．（１９９６）Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（７）：６７６−８３．〕。また、ヒトＴＧＦ−βは細胞の発生・分化・増殖・癌化の制御に関連した様々な機能を有し〔Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（１９９０）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．６：５９７−６４１〕、また、形態形成に有用な役割を示していることが知られている〔Ａｋｈｕｒｓｔ　ＲＪ，ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋ　ＤＲ，Ｇａｔｈｅｒｅｒ　Ｄ，Ｌｅｈｎｅｒｔ　ＳＡ，Ｍｉｌｌａｎ　ＦＡ．Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｓ．（１９９０）２（３）：１５３−６８〕。従って、ヒトＴＧＦ−βによって発現誘導され、アポトーシスを引き起こす蛋白質は形態形成、癌や免疫系等の疾病の発症・進行に関与していると考えられる。
アポトーシスを誘導する蛋白質は細胞の分化、およびアポトーシスを目的とする低分子医薬品を開発するためのターゲット蛋白質としての可能性を秘めており、出来るだけ多くのアポトーシス関連蛋白質を得ることが望まれている。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、医薬品などの開発に有用な、細胞のアポトーシスを誘導する新規なアポトーシス関連蛋白質遺伝子と、この遺伝子の発現産物である精製アポトーシス関連蛋白質を提供することを課題としている。またこの出願の発明は、この蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび蛋白質に対する抗体などの遺伝子操作材料を提出することを課題としている。
発明の開示
この出願の発明は、配列番号２、４または６のいずれかのアミノ酸配列を有するヒトアポトーシス関連蛋白質をコードするヒトアポトーシス関連遺伝子を提供する。これらの遺伝子から連写されるｍＲＮＡからは、それぞれ配列番号１、３または５の塩基配列を有するｃＤＮＡが合成される。
この発明はまた、前記のヒトアポトーシス関連遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチドを提供する。
またこの出願は、前記のヒトアポトーシス関連遺伝子または精製ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブと、遺伝子またはポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するプライマーセットを提供する。
この発明はさらに、前記のポリヌクレオチドを保有する組換えベクターと、この組換えベクターによる形質転換細胞を提供する。
この発明はまたさらに、前記のヒトアポトーシス関連遺伝子の発現産物であって、配列番号２、４または６のアミノ酸配列を有する精製ヒトアポトーシス関連蛋白質を提供する。この精製ヒトアポトーシス関連蛋白質は、前記の形質転換体によって産生される蛋白質であることを一つの態様としている。
また、この発明は、前記のヒトアポトーシス関連蛋白質の一部分からなる精製または合成されたペプチドを提供する。このペプチドは、配列番号２における第１−３２８アミノ酸残基の連続５以上のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４における第１−３２６アミノ酸残基の連続５以上のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４における少なくとも第３８５−３８９アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド、および配列番号６おける第１−３０１アミノ酸残基の連続５以上のアミノ酸配列からなるペプチドを好ましい態様としている。
またさらにこの発明は、前記の精製ヒトアポトーシス関連蛋白質に対する抗体を提供する。
さらにこの発明は、前記の精製ヒトアポトーシス関連蛋白質のアポトーシス活性を制御する分子をスクリーニングする方法であって、前記の配列番号４における少なくとも第３８５−３８９アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドに対する切断活性を指標として目的分子を特定する方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
この発明のヒトアポトーシス関連遺伝子（以下、ＴＡＩＰ遺伝子と記載することがある）は、ヒト３番染色体、２番染色体および１２番染色体から同定されたゲノム遺伝子であって、それぞれ、配列番号２、４および６のアミノ酸配列を有する３種類の蛋白質（以下、ＴＡＩＰ蛋白質または各々ＴＡＩＰ−３、ＴＡＩＰ−２、ＴＡＩＰ−１２と記載することがある）をコードしている。そして、ＴＡＩＰ−３遺伝子は、そのｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有し、ＴＡＩＰ−２遺伝子のｃＤＮＡは配列番号３、ＴＡＩＰ−１２のｃＤＮＡは配列番号５の塩基配列を有している。
このＴＡＩＰ遺伝子には蛋白質コード領域に対する発現制御領域（プロモーター／エンハンサー、サプレッサー配列等）が含まれる。これらの発現制御配列は、例えば、ＴＡＩＰ蛋白質のｉｎ　ｖｉｖｏ発現を制御する物質をスクリーニングするための材料として有用である。
ＴＡＩＰ遺伝子は、それぞれこの発明によって提供されるプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。プローブは、例えばこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）の一部配列（１５ｂｐ以上）またはその相補配列を利用することができる。プローブによるスクリーニングは、ゲノムＤＮＡとプローブとの特異的なハイブリダイゼーションを可能とする「ストリンジェントな条件下」で行うことができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によって規定される。例えば、米国特許Ｎｏ．６，１００，０３７等に開示されている条件を採用することができる。
ＴＡＩＰ遺伝子はまた、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって増幅することもできる。プライマーセットは、この発明によって提供される精製ポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）から選択した一部配列（１５ｂｐ以上）の２以上の組合せによって作成することができる。また、ｃＤＮＡの５’側の１プライマーを用いた５’ＲＡＣＥ法によって遺伝子の上流を、ｃＤＮＡの３’側の１プライマーを用いた３’ＲＡＣＥ法によって遺伝子の下流領域をＰＣＲ増幅することもできる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ　ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
このようにして得られた全長ゲノム遺伝子は、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
そして、このＴＡＩＰゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡから精製ポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）を調製することができる。例えば、ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として合成することができる。ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良い。ｃＤＮＡは、公知の方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２，１６１−１７０，１９８２；Ｊ．Ｇｅｎｅ　２５，２６３−２６９，１９８３；Ｇｅｎｅ，１５０，２４３−２５０，１９９４）を用いて合成することができる。あるいは、この発明によって提供されるプライマーセットを用いて、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。このようにして調製されるｃＤＮＡは、具体的には配列番号１、３および５のそれぞれの塩基配列を有している。これらのポリヌクレオチドは、ＴＡＩＰ蛋白質の遺伝子工学的な製造に使用することができる。
なお、一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号１、３または５において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているポリヌクレオチドもこの発明の範囲に含まれる。同様に、これらの変更によって生じる、１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明の蛋白質の範囲に含まれる。
この発明の組換えベクターはクローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてＴＡＩＰ蛋白質を生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、ＴＡＩＰ遺伝子のゲノムＤＮＡをインサートとする場合には、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。
この発明の形質転換細胞は、例えば、ＴＡＩＰ蛋白質を大量製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
この発明のＴＡＩＰ蛋白質は、ヒトの臓器、細胞株などから単離する方法、配列番号２、４または６のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡまたはその翻訳領域）を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができるが、組換えＤＮＡ技術で取得する方法が好ましく用いられる。例えば、前記のポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで蛋白質を発現できる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、ポリヌクレオチドがコードしている蛋白質を大量に発現させることができる。
ＴＡＩＰ蛋白質をインビトロ翻訳でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、ＴＡＩＰ蛋白質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７　１８、ｐＴ７／３　１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩなどが例示できる。
ＴＡＩＰ蛋白質を、大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、このポリヌクレオチドがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ることができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによってこのポリヌクレオチドがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
ＴＡＩＰ蛋白質を、真核細胞でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、ＴＡＩＰ蛋白質を真核細胞内で生産することができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質として発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、ＴＡＩＰ蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
ＴＡＩＰ蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
なお、以上の方法によって得られる組換えＴＡＩＰ蛋白質には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、前記発明（１）の蛋白質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾された蛋白質も前記発明（１）の蛋白質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
この発明のペプチドは、ＴＡＩＰ蛋白質の一部分からなるペプチド断片である。これらのペプチドは、前記のＴＡＩＰ蛋白質を任意の制限酵素で切断することによって調製することができる。また、配列番号２、４または６のアミノ酸配列に基づき、公知のペプチド合成法によって作成することもできる。このようなペプチドは、例えばこの発明の抗体作製のための抗原として利用することができる。
さらに、この発明のペプチドとしては、配列番号２における第１−３２８アミノ酸残基の連続５以上のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４における第１−３２６アミノ酸残基の連続５以上のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号６における第１−３０１アミノ酸残基の連続５以上のアミノ酸配列からなるペプチドを好ましい態様としている。すなわち、後記実施例６で示したように、各ＴＡＩＰ蛋白質はそれぞれＮ末端側にアポトーシス誘発活性を有している。具体的には、ＴＡＩＰ−３は配列番号２における第１−３２８アミノ酸残基のペプチド、ＴＡＩＰ−２は配列番号４における第１−３２６アミノ酸残基、ＴＡＩＰ−１２は配列番号６における第１−３０１アミノ酸残基のペプチドがアポトーシス活性を有している（図３、４、５）。従って、これら領域の連続５アミノ酸残基以上のペプチドは、例えばＨＩＶ−ＴＡＴのような細胞膜貫通ペプチドを結合することによって、アポトーシス誘発剤等の薬剤成分として利用することができる。
また、この発明のペプチドの別の態様は、配列番号４における少なくとも第３８５−３８９アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドである。すなわち、このアミノ酸配列（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）は牛エンテロキナーゼの認識配列であることが知られており（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６（１５）：３３５４−３３６０，１９７７）、この配列を含むペプチドをレポーターとして、ヒトエンテロキナーゼファミリーをスクリーニングすることによって、ヒトアポトーシス関連蛋白質ＴＡＩＰの活性を制御する分子を特定することができる。
この発明の抗体は、前記の精製ヒトＴＡＩＰ蛋白質を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。具体的には、それぞれの精製ＴＡＩＰ蛋白質やその部分ペプチドを抗原として調製された抗体である。この発明の抗体には、各ＴＡＩＰ蛋白質のエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、前記のＴＡＩＰ蛋白質やペプチドを抗原として用いて動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞をミエローマと融合させてハイブリドーマを作製すれば、モノクローナル抗体を産生することができる。これらの抗体は、例えば、ＴＡＩＰ遺伝子の発現を検出するためになどに使用することができる。
実施例
次に実施例を示しこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合にはライフテックオリエンタル社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
実施例１
ＴＡＩＰ−３のクローニング
文献［Ａｋｉｙａｍａ　Ｎ．ｅｔ．ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｐ．３２６６−３２７３，（２０００）］に記載されている方法に従って、ヒト肺がん細胞（Ａ５４９）にジーントラップ法を用いてＴＧＦ−βによって発現が増強されている細胞クローンを選択し、当該細胞からジーントラップされているｃＤＮＡクローン（ＴＡＩＰ−３）の５’−非翻訳領域と３’−非翻訳領域の遺伝子シークエンスを得た。
この情報を元に２７ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号７のオリゴヌクレオチド）と３０ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号８のオリゴヌクレオチド）を用い、ヒトファイブロブラストＭＲＣ−５細胞から抽出したｍＲＮＡから調整したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＴ４ポリメラーゼで平滑化した後、Ｔ４ポリヌクレオチナーゼで５’リン酸化を行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ−のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、宿主大腸菌ＤＨ−５αＦＴ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）に形質転換を行った。得られたクローンの塩基配列を決定し、逆転写反応、およびＰＣＲ反応中に増幅エラーが生じなかったクローンを選択した。得られたクローンＴＡＩＰ−３は全長２５９３ｂｐからなり、１０６ｂｐの５’−非翻訳領域、１７６７ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、７２０ｂｐの３’−非翻訳領域からなる構造を有していた（配列番号１）。ＯＲＦは５８９アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた（配列番号２）。
実施例２
ＴＡＩＰ−２のクローニング
実施例１で決定したＴＡＩＰ−３のｃＤＮＡ（配列番号１）を用いてヒトゲノムデータベースをサーチしたところ、２番染色体のゲノムＤＮＡのクローン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣ０２３８６７）と相同性を示していた。相同性を有する領域を増幅する２８ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号９のオリゴヌクレオチド）と３０ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号１０のオリゴヌクレオチド）を用い、市販のヒト胎児脳から調整したライブラリー（ＰｒｏＱｕｅｓｔ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｅｔａｌ　Ｂｒａｉｎ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ：Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１１３８６−０１８）から抽出したプラスミドＤＮＡを鋳型として相同性を示すｃＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ産物をＴ４ポリメラーゼで平滑化した後、Ｔ４ポリヌクレオチナーゼで５’リン酸化を行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ−のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、宿主大腸菌ＤＨ−５αＦＴ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に形質転換を行った。得られたクローンの塩基配列を決定し、逆転写反応、およびＰＣＲ反応中に増幅エラーが生じなかったクローンを選択した。得られたクローンＴＡＩＰ−２−ｐａｒｔは全長３０１ｂｐであり、データベースのクローン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣ０２３８６７）の部分シークエンスと一致した。得られたインサートをプローブとして、ヒト胎児脳から調整した市販のライブラリー（ＰｒｏＱｕｅｓｔ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｅｔａｌ　Ｂｒａｉｎ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ：Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：１１３８６−０１８）をラジオアイソトープを用いたハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、クローン（ＴＡＩＰ−２）を得た。得られたクローンＴＡＩＰ−２は全長２９７５ｂｐからなり、２６３ｂｐの５’−非翻訳領域、１７５５ｂｐのＯＲＦ、９５７ｂｐの３’−非翻訳領域からなる構造を有していた（配列番号３）。ＯＲＦは５８５アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた（配列番号４）。
実施例３
ＴＡＩＰ−１２のクローニング
実施例１で決定したＴＡＩＰ−３のｃＤＮＡ（配列番号１）を用いてヒトゲノムデータベースをサーチしたところ、１２番染色体のゲノムＤＮＡのクローン（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＣ０２３６４８）が相同性を示していた。このゲノムクローンの５’側の配列の情報を用いてヒトＥＳＴデータベースを再度検索したところクローン（ＡＡ３０５１９４）が予想される相同性を示すｃＤＮＡの５’−非翻訳領域を含んでいると考えられた。
また１２番染色体のゲノムＤＮＡのクローン（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＣ０２３６４８）とＴＡＩＰ−３と相同性を有する領域の中でＯＲＦの下流に向かう２つの遺伝子選択的な３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（配列番号１１と配列番号１２）を用いてヒト肺癌細胞Ａ５４９から抽出したｍＲＮＡから調整したｃＤＮＡを鋳型として３’−ＲＡＣＥを文献［Ａｋｉｙａｍａ　Ｎ．，ｅｔ　ａｌ　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｐ．３２６６−３２７３，（２０００）］に記載の方法に従って行った。これらの得られたシークエンスから全てのＯＲＦを含む領域を増幅するため、３０ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号１３のオリゴヌクレオチド）と２９ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号１４のオリゴヌクレオチド）を合成し、このプライマーを用いてヒトファイブロブラストＭＲＣ−５細胞から抽出したｍＲＮＡを用いて調整したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＴ４ポリメラーゼで平滑化した後、Ｔ４ポリヌクレオチナーゼで５’リン酸化を行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ−のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、宿主大腸菌ＤＨ−５αＦＴ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）に形質転換を行った。得られたクローンの塩基配列を決定し、逆転写反応、およびＰＣＲ反応中に増幅エラーが生じなかったクローンを選択した。得られたクローンＴＡＩＰ−１２は全長１６８２ｂｐからなり、２７ｂｐの５’−非翻訳領域、１６２９ｂｐのＯＲＦ、２６ｂｐの３’−非翻訳領域からなる構造を有していた（配列番号５）。ＯＲＦは５４３アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた（配列番号６）。
実施例４
ヒト細胞におけるタグ融合蛋白質の発現によるアポトーシスの確認
実施例１、２および３で特定したＴＡＩＰ−３、ＴＡＩＰ−２およびＴＡＩＰ−１２のそれぞれのｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲプライマーは、ＴＡＩＰ−３の場合は、ＢａｍＨＩサイトを付加した３６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号１５のオリゴヌクレオチド）とＸｈｏＩサイトを最終コドン直後に付加した３３ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号１６のオリゴヌクレオチド）、ＴＡＩＰ−２の場合は、ＢａｍＨＩサイトを付加した３６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号１７のオリゴヌクレオチド）とＸｈｏＩサイトを最終コドン直後に付加した３３ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号１８のオリゴヌクレオチド）、ＴＡＩＰ−１２の場合は、ＢａｍＨＩサイトを付加した３６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号１９のオリゴヌクレオチド）とＳａｌＩサイトを最終コドン直後に付加した３３ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号２０のオリゴヌクレオチド）をそれぞれ用いた。
ＰＣＲ産物を精製し、プライマーにぞれぞれの認識部位を付加した制限酵素で切断した。タグ融合蛋白質発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ｂ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＮｈｅＩサイトからＡｆｌＩＩサイトのタグおよびマルチクローニングサイトを配列番号２１のポリヌクレオチドに置換した改変ベクター（ｐＦＭＨ−３．１）のユニークサイトであるＢａｍＨＩサイトからＸｈｏＩサイトに、得られたインサートを挿入後、宿主大腸菌ＤＨ−５αＦＴ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に形質転換を行った。塩基配列を確認し、各ｃＤＮＡのＯＲＦのＣ末端ににＭｙｃタグとＨｉｓタグが融合した蛋白質として発現されるクローンを選択した。このクローンをＬＢ培地で３７℃、１６時間培養し、発現プラスミドＤＮＡを精製した。
このプラスミドをヒト肺癌由来細胞株Ａ５４９細胞、ヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３、ヒトテラトカルシノーマ細胞株ＮＴＥＲＡ−２にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）の添付説明書に従って、細胞内に導入し、２４時間後にアポトーシス検出試薬であるＦＩＴＣ蛍光標識したアネキシン　Ｖ（医学生物学研究所）と死細胞の標識色素であるＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ）で細胞を処理して、１５分後に蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞がアポトーシスを起こしていることを確認した（図１、図２）。
実験例５
緑色蛍光蛋白質（ＧＥＰ）と完全長蛋白質との融合蛋白質発現による
アポトーシスの確認
実施例１、２および３で特定したＴＡＩＰ−３、ＴＡＩＰ−２およびＴＡＩＰ−１２のそれぞれのｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲプライマーは、ＴＡＩＰ−３の場合は、Ｋｏｚａｋ翻訳開始配列およびＢａｍＨＩサイトを付加した４６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号２２のオリゴヌクレオチド）とＸｈｏＩサイトを最終コドン直後に付加した３３ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号２３のオリゴヌクレオチド）、ＴＡＩＰ−２の場合は、Ｋｏｚａｋ翻訳開始配列およびＢａｍＨＩサイトを付加した４３ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号２４のオリゴヌクレオチド）とＸｈｏＩサイトを最終コドン直後に付加した３３ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号２５のオリゴヌクレオチド）、ＴＡＩＰ−１２の場合には、Ｋｏｚａｋ翻訳開始配列とＢａｍＨＩサイトを付加した４３ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号２６のオリゴヌクレオチド）とＳａｌＩサイトを最終コドン直後に付加した３４ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号２７のオリゴヌクレオチド）を用いた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーにそれぞれの認識部位を付加した制限酵素で切断した。ＧＦＰ発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ３：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＢｇｌＩＩサイトからＳａｌＩサイトに、得られたインサートを挿入後、宿主大腸菌ＤＨ−５αＦＴ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）に形質転換を行った。塩基配列を確認し、各ｃＤＮＡのＯＲＦのＣ末端にＧＦＰが融合した蛋白質として発現されるクローンを選択した。このクローンをＬＢ培地で３７℃、１６時間培養し、発現プラスミドＤＮＡを精製した。
このプラスミドをヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３、ヒトテラトカルシノーマ細胞株ＮＴＥＲＡ−２にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）の添付説明書に従って、細胞内に導入し、２４時間後に蛍光顕微鏡で観察したところ、この融合蛋白質が発現している細胞がアポトーシスの典型像を示していることを確認した（図３、４、５）。
実験例６
緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）と各蛋白質のＮ末側またはＣ末側領域蛋白との
域融合蛋白質発現によるアポトーシスの確認
実施例１、２および３で特定したＴＡＩＰ−３、ＴＡＩＰ−２およびＴＡＩＰ−１２のそれぞれのｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりそれぞれのＮ末側およびＣ末側を増幅した。ＴＡＩＰ−３のＮ末端領域（配列番号２のアミノ酸位置１−３２８）に関しては、Ｋｏｚａｋ翻訳開始配列とＢａｍＨＩサイトを付加した４６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号２２のオリゴヌクレオチド）とＸｈｏＩサイトを付加した３４ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号２８のオリゴヌクレオチド）を用い、Ｃ末端領域（配列番号２の位置３２８−５８９）に関してＫｏｚａｋ翻訳開始配列とＢａｍＨＩサイトを付加した４６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号２９のオリゴヌクレオチド）とＸｈｏＩサイトを最終コドン直後に付加した３３ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号２３のオリゴヌクレオチド）を用いた。ＴＡＩＰ−２のＮ末端領域（配列番号４の位置１−３２６）に関してＫｏｚａｋ翻訳開始配列とＢａｍＨＩサイトを付加した４３ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号２４のオリゴヌクレオチド）とＸｈｏＩサイトを付加した３４ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号３０のオリゴヌクレオチド）を用い、ＴＡＩＰ−２のＣ末端領域（配列番号４の位置３２７−５８５）に関してＫｏｚａｋ翻訳開始配列とＢａｍＨＩサイトを付加した４６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号３１のオリゴヌクレオチド）とＸｈｏＩサイトを最終コドン直後に付加した３４ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号２５）を用いた。さらに、ＴＡＩＰ−１２のＮ末端領域（配列番号６の位置１−３０１）に関してＫｏｚａｋ翻訳開始配列とＢａｍＨＩサイトを付加した４３ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号２６のオリゴヌクレオチド）とＳａｌＩサイトを付加した３４ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号３２のオリゴヌクレオチド）を用い、Ｃ末端領域（配列番号６の位置３０２−５４３）に関してＫｏｚａｋ翻訳開始配列とＢａｍＨＩサイトを付加した４６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号３３のオリゴヌクレオチド）とＳａｌＩサイトを最終コドン直後に付加した３４ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号２７のオリゴヌクレオチド）を用いた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーにそれぞれ認識部位を付加した制限酵素で切断し、ＧＦＰ発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ３：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＢｇｌＩＩサイトからＳａｌＩサイトに、得られたインサートを挿入後、宿主大腸菌ＤＨ−５αＦＴ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）に形質転換を行った。塩基配列を確認し、各蛋白質のＣ末側領域、もしくはＮ末側領域のＣ末端にＧＦＰが融合した蛋白質として発現されるクローンを選択した。このクローンをＬＢ培地で３７℃、１６時間培養し、発現プラスミドＤＮＡを精製した。
各プラスミドをヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３、ヒトテラトカルシノーマ細胞株ＮＴＥＲＡ−２にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）の添付説明書に従って、細胞内に導入し、２０時間後に蛍光顕微鏡で観察したところ、Ｎ末側領域とＧＦＰとの融合蛋白が発現された細胞にアポトーシスの典型像を示していることを確認した。また、Ｃ末側領域とＧＦＰとの融合蛋白が発現した細胞では、アポトーシスの典型像が生じていない事を確認した。これらの結果より各蛋白質のＮ末側領域の部分ポリペプチドでもアポトーシスを誘導する機能があることが判明した（図３、４、５）。
実施例７
ＴＧＦ−βによる発現誘導
Ａ５４９細胞（１×１０８個）をＴＧＦ−βで４８時間処理した細胞と比較として、非処理の細胞からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析を行った。ＴＡＩＰ−３　ｃＤＮＡ（配列番号１）の開始コドンから始まる３０ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号３４のオリゴヌクレオチド）と停止コドン直前までを含む３０ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号３５のオリゴヌクレオチド）を用い、ＴＡＩＰ−３　ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅し、得られた増幅物をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行い、Ａ５４９細胞では約３ｋＤａのｍＲＮＡが発現していることを確認し、ＴＧＦ−β処理によってＴＡＩＰ−３の発現が増強されていることが確認された。
実施例８
ＴＡＩＰの発現局在
ヒト組織やヒト癌細胞から抽出したｍＲＮＡがブロットしてあるナイロンフィルター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、［３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いてラベルしたＴａｉｐ−２、３、１２のＣ末側領域蛋白をコードしたポリヌクレオチドをプローブとしてｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行い、ヒト組織やヒト癌細胞での発現レベルで調べた。
その結果、Ｔａｉｐ−３は、肺や末梢血中のリンパ球、副腎、乳腺で発現が高く、Ｔａｉｐ−１２は、ほぼ全ての組織やガン細胞で発現しているものの、特に脳、心臓、骨格筋、腎臓、胎盤、副腎で高い発現がみられた。Ｔａｉｐ−２は、調べたどの組織でも発現が認められなかった（図６）。
実施例９
ＴＡＩＰ発現によるＤＮＡ分解
Ｔａｉｐ−２、３、１２の全長、Ｎ末側領域蛋白およびＣ末側領域蛋白をコードしたプラズミドをヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）の添付説明書に従って、トランスフェクションした細胞を、ＦＡＣＳを用いてＤＮＡ解析を行った。
その結果、全長、Ｎ末側領域蛋白を発現している細胞では、ＤＮＡの分解が起こっている事が確認された（図７）。
実施例１０
ＴＡＩＰ発現によるＣａｓｐａｓｅ−３の活性化
Ｔａｉｐ−２、３、１２のＮ末側領域蛋白をコードしたプラズミドをヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）の添付説明書に従って、トランスフェクションした細胞を２４時間後に集め可溶化して、抗Ｃａｓｐａｓｅ−３抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてウエスタンブロット法にて活性型Ｃａｓｐａｓｅ−３を調べた。その結果、Ｃａｓｐａｓｅ−３が活性化していることが確認された（図８）。
実施例１１
抗ＴＡＩＰ−３抗体と、ＴＧＦ−β誘導によるＴＡＩＰ−３量の測定
配列番号３６のペプチドを抗原として、常法により抗ＴＡＩＰ−３ポリクローナル抗体を作成した。この抗体を用いて、ＴＧＦ−βによるＴＡＩＰ−３蛋白の細胞内の量をウエスタンブロット法にて調べた。
その結果、ＴＧＦ−β添加前は、ＴＡＩＰ−３蛋白は確認されなかったが、Ａ５４９ヒトアデノカルシノーマ細胞や正常ヒト肝細胞において、ＴＧＦ−β添加後３〜６時間で発現が確認できるようになった（図９）。ＴＧＦ−βによりアポトーシスを起こさないＡ５４９細胞では、２４時間後に発現は減少していたが（図９上）、アポトーシスを起こす正常ヒト肝細胞では６０時間後でも発現が持続していた（図９下）。
実施例１２
ＴＧＦ−β誘導によるＴＡＩＰ−３の細胞内局在
Ａ５４９細胞、正常ヒト細胞およびヒトの肝癌細胞ＨＬＦ（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入）を、それぞれＴＧＦ−βで処理した後、抗ＴＡＩＰ−３抗体とＣｙ３標識された二次抗体で細胞内のＴＡＩＰ−３蛋白を標識した後、ＴＡＩＰ−３の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡で調べた。Ａ５４９細胞ではＴＧＦ−βの添加から１２時間後に核の周辺にＴＡＩＰ−３蛋白が集まり（図１０上）、その後、徐々に確認できなくなった。一方、正常ヒト肝細胞やヒト肝癌細胞ＨＬＦでは、ＴＧＦ−β添加の４８時間後に核の周囲に集まったＴＡＩＰ−３蛋白が瘤状になり、細胞の形態もまるくなって（図１０下）、アポトーシスを起こした。
実施例１３
Ｃａｓｐａｓｅ−３活性化細胞におけるＴＡＩＰ−３発現
ヒト正常細胞およびＨＬＦヒト肝癌細胞をＰｈｉＰｈｉＬｕｘＴＭＧ１Ｄ２ｋｉｔ（Ｏｎｃｏｌｍｍｕｎｉｎ社製）で処理後、添付説明書に従いＦＡＣＳでＣａｓｐａｓｅ−３が活性化していることを確認した（図１１）。このＣａｓｐａｓｅ−３が活性化している肝細胞では、ＴＡＩＰ−３蛋白の発現していることを、ＴＡＩＰ−３ポリクローナル抗体を用いて上記と同様にウエスタンブロット法で確認した（図１２上）。ウエスタンブロットに使用したフィルター上の蛋白が図１２下に示してある。
以上の実施例１１−１３に示した結果（図９−１２）から、ＴＡＩＰ−３の発現がＴＧＦ−βによるアポトーシス誘導と深く関わっていることが確認された。
実施例１４
抗ＴＡＩＰ−２抗体と、脳疾患組織におけるＴＡＩＰ−２発現
配列番号３７のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として、常法により抗ＴＡＩＰ−２ポリクローナル抗体を作成した。この抗体を用いて、脳疾患患者（脳卒中患者）からの脳組織切片におけるＴＡＩＰ−２の存在を免疫染色法（Ｄａｋｏ社製）で調べた。その結果、免疫前血清では、顕著な染色はみられなかったが、抗ＴＡＩＰ−２ポリクローナル抗体では、明らかな斑点状の染色がみられた（図１３）。この結果から、脳疾患組織においてＴＡＩＰ−２蛋白が発現することが確認された。また、抗ＴＡＩＰ−２抗体が脳疾患を引き起こすアポトーシスを認識し、診断への応用が可能であることが確認された。
産業上の利用可能性
以上に詳しく説明したとおり、この発明によって、癌や自己免疫疾患等の診断および治療等に有用な新規なヒトアポトーシス関連蛋白質とその抗体が提供される。また、この発明のポリヌクレオチドを利用することによって、前記蛋白質を大量に製造することが出来る。そして、この蛋白質と結合する低分子化合物をスクリーニングすることによる、新しい型の抗腫瘍剤などの医薬を探索することが可能になる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、配列番号２、４および６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有するベクター（それぞれＴＡＩＰ−３、ＴＡＩＰ−２およびＴＡＩＰ−１２）と、空のプラスミド（Ｖｅｃｔｏｒ）をトランスフェクトし、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣで処理したヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３の蛍光顕微鏡像である。左側が明視野の像、右側が暗視野の像である。
図２は、ヒトテラトカルシノーマ細胞株ＮＴＥＲＡ−２を用いたことを除き、図１と同様の蛍光顕微鏡像である。
図３の上段は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを保有するベクターをトランスフェクトしたヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３の蛍光顕微鏡像である。下段は、配列番号４のアミノ酸配列の全長（Ｆｕｌｌ）、Ｎ末側半分（Ｎ−ｈａｌｆ）およびＣ末側半分（Ｃ−ｈａｌｆ）のそれぞれとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するベクターをトランスフェクトしたヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３の蛍光顕微鏡像である。左側が明視野の像、右側が暗視野の像である。
図４は、配列番号２のアミノ酸配列の全長（Ｆｕｌｌ）、Ｎ末側半分（Ｎ−ｈａｌｆ）およびＣ末側半分（Ｃ−ｈａｌｆ）のそれぞれとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するベクターをトランスフェクトしたヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３の蛍光顕微鏡像である。左側が明視野の像、右側が暗視野の像である。
図５は、配列番号６のアミノ酸配列の全長（Ｆｕｌｌ）、Ｎ末側半分（Ｎ−ｈａｌｆ）およびＣ末側半分（Ｃ−ｈａｌｆ）のそれぞれとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するベクターをトランスフェクトしたヒト胎児肝細胞株ＨＥＫ２９３の蛍光顕微鏡像である。左側が明視野の像、右側が暗視野の像である。
図６は、ヒトの組織とガン細胞由来のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをブロットしたフィルター（クローンテック社製）をＴＡＩＰ−３、−１２のＣ末領域をコードしているポリヌクレオチドを放射線標識したプローブを用いて解析したノーザンブロットの写真である。ＴＡＩＰ−３、−１２の転写産物（各々約３．３ｋｂ，４．３ｋｂ）が示してある。
図７は、様々なサイズのＴＡＩＰ蛋白と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを保有するベクターをヒト胎児肝細胞株２９３にトランスフェクトし、２４時間後にＧＦＰを発現している細胞のＤＮＡをＦＡＣＳで解析したグラフである。
図８は、各ＴＡＩＰ蛋白質と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを保有するベクターをヒト胎児肝細胞株２９３にトランスフェクトし、２４時間後に細胞を可溶化し、２０％ポリアクリルアミドゲルで展開した後、抗Ｃａｓｐａｓｅ−３抗体を用いて活性型のＣａｓｐａｓｅ−３（１７ｋＤａ）を確認したウエスタンブロットの結果である。
図９上は、Ａ５４９ヒトアデノカルシノーマ細胞にＴＧＦ−β添加後、０、３、６、１２、２４時間後に細胞を集めて可溶化し、抗ＴＡＩＰ−３抗体を用いてウエスタンブロット法にて、ＴＡＩＰ−３蛋白の発現を確認した結果である。下は、ヒト正常肝細胞にＴＧＦ−β添加後、０、３、６、１２、３６、６０時間後に細胞を集めて可溶化し、抗ＴＡＩＰ−３抗体を用いてウエスタンブロット法にて、ＴＡＩＰ−３蛋白の発現を確認した結果である。
図１０上は、Ａ５４９ヒトアデノカルシノーマ細胞にＴＧＦ−βの添加１２時間後に細胞を固定し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で膜透過処理をした後、抗ＴＡＩＰ−３抗体とＣｙ３標識二次抗体を反応させ、共焦点レーザー顕微鏡で観察した写真である。下は、ＨＬＦヒト肝がん細胞にＴＧＦ−βの添加４８および６０時間後に細胞を固定し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で膜透過処理をした後、抗ＴＡＩＰ−３抗体とＣｙ３標識二次抗体を反応させた、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した写真である。
図１１は、ヒト正常肝臓細胞にＴＧＦ−β添加２４時間後、ＰｈｉＰｈｉＬｕｘＴＭＧ１Ｄ２ｋｉｔで処理し、ＦＡＣＳでＣａｓｐａｓｅ−３の活性を測定した結果である。青色はＴＧＦ−β添加前、赤はＴＧＦ−β添加後のＣａｓｐａｓｅ−３活性を示している。
図１２は、ＨＬＦヒト肝がん細胞にＴＧＦ−β添加２４時間後、丸くなった細胞を培養液で静かに集め（Ｒ）、残された細胞はトリプシン処理して剥がし（Ｆ）、無処理の細胞（Ｎ）、ＴＧＦ−β処理２４時間後の細胞（Ｔ）とともに可溶化し、抗ＴＡＩＰ−３抗体を用いてウエスタンブロット法にて、ＴＡＩＰ−３蛋白の発現を確認した結果である。
図１３は、脳卒中患者の脳切片をスライドカラス上に貼り付け、免疫前血清（左）または抗ＴＡＩＰ−２ポリクローナル抗体（右）で処理し、ＬＳＡＢキット（ＤＡＫＯ社製）で抗体の検出を行った結果を示す写真である。赤茶色に見えるのが抗体で認識された部位である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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