(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエータンパク質濃縮物をカラムクロマトグラフィーにかけてグリコマクロペプチドに富む画分を得、該画分をさらにゲルろ過にかけて分子量３万以上の物質を除去し、次いで陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて溶出画分を得、ゲルろ過による測定で約19,500又は約16,000の分子量を示す画分を選択することによって得られる、以下の理化学的性質を有する免疫賦活物質。
(1) ゲルろ過による測定で約19,500又は約16,000の分子量を示す。
(2) マイトジェン活性を有する。
(3) レクチンに対して反応性を有する。
(4) リンを含有する。
【請求項２】
ゲルろ過による測定で示される前記分子量が約16,000である、請求項１に記載の免疫賦活物質。
【請求項３】
陰イオン交換クロマトグラフィーが１ＭのＮａＣｌ溶液を用いて溶出するものである請求項１又は２記載の免疫賦活物質。
【請求項４】
カラムクロマトグラフィーが多段式カラムクロマトグラフィーである請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫賦活物質。
【請求項５】
ホエータンパク質がカゼインホエータンパク質又はチーズホエータンパク質である請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫賦活物質。
【請求項６】
レクチンが、ヒママメレクチン、小麦胚芽レクチン、タチナタマメレクチン、インゲンマメレクチン、ピーナッツレクチン及びレンチルレクチンから選ばれる少なくとも一つである請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫賦活物質。
【請求項７】
リンの含有量が免疫賦活物質１ｍｇ当たり0.1〜100μｇである請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫賦活物質。
【請求項８】
ホエータンパク質濃縮物をカラムクロマトグラフィーにかけてグリコマクロペプチドに富む画分を得、該画分をさらにゲルろ過にかけて分子量３万以上の物質を除去し、次いで陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて溶出画分を得、ゲルろ過による測定で約19,500又は約16,000の分子量を示す画分を選択することを特徴とする、以下の理化学的性質を有する免疫賦活物質を調製する方法。
(1) ゲルろ過による測定で約19,500又は約16,000の分子量を示す。
(2) マイトジェン活性を有する。
(3) レクチンに対して反応性を有する。
(4) リンを含有する。
【請求項９】
ゲルろ過による測定で示される前記分子量が約16,000である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン交換クロマトグラフィーが１ＭのＮａＣｌ溶液を用いて溶出するものである請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
カラムクロマトグラフィーが多段式カラムクロマトグラフィーである請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ホエータンパク質がカゼインホエータンパク質又はチーズホエータンパク質である請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
レクチンが、ヒママメレクチン、小麦胚芽レクチン、タチナタマメレクチン、インゲンマメレクチン、ピーナッツレクチン及びレンチルレクチンから選ばれる少なくとも一つである請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
リンの含有量が免疫賦活物質１ｍｇ当たり0.1〜100μｇである請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ホエータンパク質濃縮物に含まれる免疫賦活物質に関する。
本発明の免疫賦活物質は、これまでに知られているラクトフェリン、免疫グロブリン、リゾチーム等と同様、乳由来の生理活性物質であり、調製粉乳をはじめ各種栄養食品および医薬品に使用できる。
【０００２】
【従来の技術】
ホエータンパク質濃縮物中には、ラクトフェリンや免疫グロブリンなどのいわゆる生理活性物質を豊富に含むことが知られている。かかる生理活性物質の免疫細胞に対する活性に関し、ラクトフェリンは前単球に結合し、細胞の増殖を高めることが報告されている（R. Oria et al., J. Dairy Res., 60, 363, 1993）。また、免疫グロブリンについては、牛乳より単離されたIgG1が脾臓リンパ細胞に対してマイトジェン活性を有することが明らかにされている（T. Saito et al., Anim. Sci. Technol. (Jpn.), 65, 105, 1994）。しかし、ホエータンパク質濃縮物中には、前記生理活性物質以外のまだ未同定の微量成分の存在が示唆されており、その免疫賦活活性については何の情報も得られていないのが現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ホエータンパク質濃縮物中に含まれる免疫賦活作用を有する生理活性物質を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記の現状を踏まえ、上記課題に基づいて乳由来のホエータンパク質濃縮物中の微量成分の中からさらに有用成分を分離精製することを課題として取り上げ、鋭意研究に取り組んだ。その結果、ホエータンパク質濃縮物を多段式カラム処理し、得られるグリコマクロペプチドに富む画分をさらにゲルろ過、次いでイオン交換クロマトグラフィーにかけることにより、分子量が25,000以下の強いマイトジェン活性を有する物質を分離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、ホエータンパク質濃縮物をカラムクロマトグラフィーにかけてグリコマクロペプチドに富む画分を得、該画分をさらにゲルろ過、次いでイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって得られ、以下の理化学的性質を有する免疫賦活物質である。
(1) 分子量25,000以下。
【０００６】
(2) マイトジェン活性を有する。
(3) レクチンに対して反応性を有する。
(4) リンを含有する。
上記イオン交換クロマトグラフィーとしては、例えば１ＭのＮａＣｌ溶液を用いて溶出するものが挙げられ、カラムクロマトグラフィーとしては、例えば多段式カラムクロマトグラフィーが挙げられ、ホエータンパク質としては、例えばカゼインホエータンパク質又はチーズホエータンパク質が挙げられる。ここで、「レクチンに対して反応性を有する」とは、本発明の免疫賦活物質がレクチンと結合して凝集反応を起こすことをいい、レクチンとしては、例えばヒママメレクチン、小麦胚芽レクチン、タチナタマメレクチン、インゲンマメレクチン、ピーナッツレクチン及びレンチルレクチンから選ばれる少なくとも一つのものが挙げられる。また、免疫賦活物質のリンの含有量は、免疫賦活物質１ｍｇ当たり0.1 〜100 μgである。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、ホエータンパク質濃縮物を原料とする。ここで、ホエータンパク質濃縮物（以下「ＷＰＣ」という）とは、乳を酸処理又はキモシン処理することにより得られるホエー画分、例えばカゼインホエータンパク質又はチーズホエータンパク質等をいい、ラクトフェリン、免疫グロブリン又はEGFなどの各種成長因子が含まれるものである。
【０００８】
乳は通常牛乳を用いるが、その他の獣乳（たとえば、ヤギ乳、羊乳など）および人乳を用いることができ、また、これらの乳は初乳および常乳のいずれでもよい。さらに、実用的には市販のＷＰＣを直接用いることもできる。
そして、上記ＷＰＣを公知の方法、例えば多段式カラムを用いたクロマトグラフィーにかけることによりβ−ラクトグロブリンやα−ラクトアルブミンなどを大部分除去したグリコマクロペプチドに富む画分を得る（食品産業ハイセパレーション・システム技術研究組合・平成４年10月27日発行「機能性食品素材の高度分離・精製と開発」P196参照）。この場合、カラム１段当たり例えばDEAE-Sephadex A25若しくは DEAE-Sephacel（ファルマシア社製）、Chitopearl EP-03若しくは Chitopearl EP-05 （富士紡績社製）又はDEAE-Toyopearl 650s （東ソー社製）等を充填した複数段（例えば５段式）カラムに試料を通液することにより行うことができる。
【０００９】
このようにして、ホエー画分中の主要蛋白質であるβ−ラクトグロブリンやα−ラクトアルブミンの予備的な分画が可能である。
次に、ゲルろ過モードのカラム、例えば、Sephadex G-200若しくはSephacryl S-200（ファルマシア社製）、Bio-Gel P-200(バイオラッド社製）、Toyopearl HW-55(東ソー社製）又はCellulofine GC-700（生化学工業社製）等により、分子量３万以上の物質の除去を行う。この方法は、ラクトフェリン又は免疫グロブリン等の分子量が数万以上の既知生理活性物質を除くために必要、かつ重要である。
【００１０】
そして最後に、イオン交換モードのカラム、例えば、DEAE-Sephacel、DEAE-Sephadex 、DEAE-Sepharose若しくはMono Q（ファルマシア社製）、DEAE-Cellulofine（生化学工業社製）、DEAE-Bio-GelA(バイオラッド社製) 又はDEAE-Toyopearl（東ソー社製) 等を用いて目的物質の精製を行う。この場合、上記カラムに通常使用されるいずれの溶出溶液をも用いることができるが、１ＭのＮａＣｌ溶液を用いて溶出するのが好ましい。この過程により、得られる画分の単位重量当たりのマイトジェン活性は数十倍以上に高まり、最終目的物の回収が可能となる。
【００１１】
最終的に得られた目的物質の分子量については、例えばAsahipak GS-320 HQ上で低分子量の検量線キットを用いることにより測定することができる。また、最終的に得られた目的物質の生理活性（マイトジェン活性）については、マウス等から採取した脾細胞の分裂の有無を、 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込みを指標として測定すればよい。かかる生理活性の指標には刺激係数を用いる。刺激係数とは、各種試料存在下での 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込み量を試料無添加時の 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込み量で割った値（Stimulation Index；以下「ＳＩ」という）をいう。
【００１２】
さらに、上記目的物質のレクチンとの反応性については、公知方法、例えば標識レクチンキット（例えばペルオキシダーゼレクチンキットＢ；ホーネンコーポレーション社）を用いて測定することができる。また、上記目的物質のリン含量については、例えば発光分光分析装置等を用いて測定することができ、タンパク質１mg当たり0.1〜100μg 含有する。
【００１３】
本発明の免疫賦活物質は、ＷＰＣ原料1,000 ｇ当たり１〜100 mg（収率10-4〜10-2％）得られる。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。
〔実施例１〕
原料物質を市販のＷＰＣであるチーズホエー（商品名：Calpro 75, Calpro Ingredients, USA 社製）とした。このＷＰＣを脱イオン水に溶解し、５％（W/V)濃度の溶液を調製した。この溶液のpHを4.4に調整し、60℃で60分間加熱後、3000×Ｇで15分間遠心分離して得られた上清を回収した。
【００１５】
次に、この上清を内径50mm，高さ200mmのアクリル製カラム１段当たり150mlのDEAE-Sephadex A25(ファルマシア社製）を充填した５段式カラムに下向流のみで通液した。初期流速：SVを３h-1、カラム頂部圧力上限を約0.5kgf/cm2とし、それを越えた場合は流速調節を行った。通液終了後、ベッド容量（bed volume) の２倍量の脱イオン水でカラム内を水洗し、0.1N NaOH水溶液を延べベッド容量の６倍量循環させてグリコマクロペプチド（以下「ＧＭＰ」という）に富む画分を溶離させた。さらに、カラム内に残存した溶離液をベッド容量の２倍量の水で押し出し、得られた溶離液を限外ろ過法で濃縮および電気透析法で脱塩後、凍結乾燥した。ここで得られたものをＧＭＰに富む画分と呼び、以下の実験に用いた。
【００１６】
すなわち、まずＧＭＰに富む画分（４ｇ）をゲルろ過法で分離させた。分離にはSephacryl S-200(ファルマシア社製）を充填したカラム（XK50/100）を用いた。緩衝液としてPBS(pH7.2)を使用し、流速は16ml/hとし、８mlずつ流出液を分取した。
結果を図１に示す。この時のクロマトグラフィーのパターンから、低分子量の画分１〜４を回収した。
【００１７】
次に、画分１〜４のうち、図１に示した画分２及び４（下線を付して表示）それぞれを、さらに陰イオン交換法で分離した。分離にはベッド容量６mlのQ Sepharose樹脂（ファルマシア社製）を充填したカラム（直径２cm，長さ30cm）を用い、得られた試料（図１に記載の画分２及び４）を吸着させた後、５種類の緩衝液、すなわち 0.01Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)（以下「buffer T」という）、0.12M NaClを含んだbuffer T、0.25M NaClを含んだbuffer T、1M NaClを含んだbuffer T及び6Mグアニジン−塩酸を流した。流した量はそれぞれ20、30、30、30および20mlであり、流速は0.5ml/minとし、３mlずつ流出液を分取した。
【００１８】
この時のクロマトグラフィーのパターンを図２に示す。図２において、（ａ）で示すパターンは図１に示す画分２のものであり、（ｂ）で示すパターンは図１に示す画分４のものである。最終的に求める物質は画分２および４を１M NaClで溶出した場合に得られるピーク成分（以下、それぞれ「Ｐ２」、「Ｐ４」という）であった。そして、Ｐ２及びＰ４から得られた本発明の免疫賦活物質は、それぞれ８mg及び2.8 mgであった。
【００１９】
〔実施例２〕
実施例１で得られた物質Ｐ２及びＰ４の分子量をAsahipak GS-320HQ上で低分子量のゲルろ過検量線キットを用いて推定した。対照分子量マーカーとして、オボアルブミン（分子量45,000）、キモトリプシノーゲンＡ（分子量25,635）及びリボヌクレアーゼＡ（分子量13,680）を用いた。
【００２０】
その結果を図３に示す。Ｐ２は約19,500、Ｐ４は約16,000の分子量を持つことが示された。
〔実施例３〕
実施例１で得られた図１に示す画分である画分２（Ｆ２）および４（Ｆ４）、並びに図２に示す画分であるＰ２およびＰ４のマイトジェン活性を測定した。
【００２１】
マイトジェン活性は８週令のBALB/Cマウス（日本チャールズリバー社）より回収した脾臓リンパ細胞を96穴の細胞培養プレート（Falcon社製）に１穴あたり２×105 個まき、実施例１で得られた各種試料の存在下で３〜５日間培養した。培地には100U/mlのペニシリン（Gibco社）、100μg/mlストレプトマイシン（Gibco社）、５×10-5 Mの２−メルカプトエタノール、５％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640(Gibco社) を用いた。
【００２２】
培養の最終20時間における 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込み量を測定した。ＳＩについては、各種試料存在下での 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込み量を試料無添加時の 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込み量で割った値で示した。Ｆ２およびＦ４は図１の分画で得られたものを１mlの培地に溶かして１穴あたり100μl 用い、Ｐ２及びＰ４は図２の分画で得られたものを１mlの培地に溶かして１穴あたり100μl 用いた。ＧＭＰについては実施例１で分画する前の試料１mgを培地１mlに溶かして１穴あたり100μl 用いた。その他の試料は、市販品（Sigma社）を、１穴あたりConAおよびLPSについてはそれぞれ２μg、α−ラクトアルブミン（alpha-La）およびβ−ラクトグロブリン（beta-Lg）についてはそれぞれ50μg加えて培養した。
【００２３】
結果を図４および図５に示す。
Ｆ２およびＦ４はもとのＧＭＰより活性が上昇することが図４より認められた。さらに、その活性はイオン交換法による精製で極めて顕著になり、Ｆ２及びＦ４それぞれからの画分であるＰ２及びＰ４は、既知のマイトジェン（ConAおよびLPS）活性のレベルと同等になった（図５）。
【００２４】
〔実施例４〕
Ｐ２およびＰ４の腸管隣接リンパ組織に対するマイトジェン活性を既知のマイトジェンConAおよびLPSと比較した。ConAは２μg/ml、LPSは20μg/mlで用いた。腸管隣接リンパ組織としては、８週令のBALB/Cマウス（日本チャールズリバー社）より回収したパイエル板リンパ細胞を用いた。３日間、腸管隣接リンパ組織を各試料とともに培養し、ＳＩ値を測定した。その他の実験条件は実施例３と同様とした。
【００２５】
その結果、Ｐ２及びＰ４のいずれもConA及びLPS とほぼ同様のＳＩ値を示した（表１参照）。
【００２６】
【表１】
0003859747.tif 000002
表１より、本発明で得られた物質は既知のマイトジェン物質と同様に腸管免疫系を活性化する効果を有することが明らかとなった。
【００２７】
〔実施例５〕
実施例１で得られた物質Ｐ２及びＰ４を１mg/ml になるようにリン酸緩衝液（0.15M, pH7.2) に溶解した。これらの溶液をPVDF膜にドットブロッティングした後、標識レクチンキット（ペルオキシダーゼ−レクチンキットＢ，ホーネンコーポレーション社）を用いて反応性を測定した。
【００２８】
結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
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Ｐ２及びＰ４は、ヒママメレクチン(RCA120: Ricinus communis agglutinin) 、小麦胚芽レクチン(WGA: wheat germ agglutinin)、タチナタマメレクチン(ConA: concanavalin A)、インゲンマメレクチン(PHA-E4: Phaseolus vulgaris)、ピーナッツレクチン(PNA: penut agglutinin)及びレンチルレクチン(LCA: Lens culinaris agglutinin)から選ばれる少なくとも一つに対して反応性を有することが示された。
【００３０】
〔実施例６〕
実施例１で得られた物質Ｐ４をタンパク質濃度が0.16mg/ml になるように蒸留水に溶解した。タンパク質濃度はPierce社のタンパク質アッセイ試薬にて測定した。この溶液0.1mlを0.1N HNO3 ５mlに加え、分析試料とした。これをSeiko SPS-1200VR ICP発光分光分析装置を用い、リン含量を測定した。
【００３１】
結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
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平均値（0.10μg/ml) に希釈率(50)を乗ずると原液のリン含量は5.0μg/mlとなり、これよりＰ４はタンパク質１mg当たりリンを約31μg 含むことが明らかにされた。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、ホエータンパク質濃縮物からの免疫賦活物質が提供された。
本発明によれば、これまで微量成分であるためその生理機能が全く不明であった乳由来のホエー画分中の新規物質について、食品および医薬品への有効利用を図ることができる。そして、乳が潜在的に有する免疫賦活などの生体調節機能をより具体的な形で商品開発に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ゲルろ過の結果を示す図である。
【図２】イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図３】分子量の測定結果を示す図である。
【図４】脾臓リンパ細胞に対するマイトジェン活性を示す図である。
【図５】脾臓リンパ細胞に対するマイトジェン活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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