(57)【要約】任意の標的蛋白質の情報に基づいて創製したプローブ手段を生物材料又は動物に対して適用して生物学的機能既知及び／又は未知の１又は２以上の観測分子の挙動に与える影響を測定して解析することにより、該標的蛋白質の関連する生物学的機能及び／又は疾患を推定する方法。例えば、該標的蛋白質の既知生体分子ネットワーク情報に含まれる分子との直接又は間接の関わりを解析することにより、該標的蛋白質の関連する生物学的機能及び／又は疾患を推定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の標的蛋白質に基づくプローブ手段を生物材料又は動物に適用し生物学的機能既知及び／又は未知の１又は２以上の観測分子の挙動に与える影響を測定して解析することにより、該標的蛋白質の関連する生物学的機能及び／又は疾患を推定する方法。
【請求項２】
標的蛋白質が生物学的機能未知の標的蛋白質である請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
観測分子の挙動が発現量及び／又は存在量の量的又は時間的変動であり、細胞、組織、臓器、又は動物にプローブ手段を適用する請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
【請求項４】
任意の標的蛋白質に基づくプローブ手段を用いて、生物学的機能既知の１又は２以上の観測分子の挙動に与える影響を生体応答データとして測定し、該標的蛋白質の既知生体分子ネットワーク情報に含まれる分子との直接又は間接の関わりを解析することにより、該標的蛋白質の関連する生物学的機能及び／又は疾患を推定する方法。
【請求項５】
標的蛋白質が生物学的機能未知の標的蛋白質である請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
観測分子の挙動が発現量及び／又は存在量の変動である請求の範囲第４項又は第５項に記載の方法。
【請求項７】
プローブ手段が特異的リガンド及び／又はアンチセンス分子である請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
観測分子が既知生体分子ネットワーク情報に含まれる分子であって、プローブ手段を適用することよる発現量の変動が大きい蛋白質若しくはｍＲＮＡ、及び／又は特に指定された観測分子群である請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該観測分子群ができる限り多様な生物学的機能に関わりをもつように選ばれた分子群である請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
該観測分子群が特定の疾患及び／又は生物学的機能に関連する分子群、並びに特定臓器又は特定組織で発現及び／又は機能する分子群からなる群から選ばれる請求の範囲第８項又は第９項に記載の方法。
【請求項１１】
生体分子ネットワーク情報が、生物学的機能既知の生体分子間の機能及び／又は生合成における相互作用のつながりを示す分子ネットワーク情報である請求の範囲第３項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
生体分子ネットワーク情報が、生物学的機能既知の生体分子間の機能及び／又は生合成における相互作用上のつながりを示す情報に加えて、生体分子と生体イベントとの関係の情報を含む分子ネットワーク情報である請求の範囲第３項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
標的蛋白質に対する特異的リガンドがバーチャルスクリーニングを用いて創製されたものである請求の範囲第７項ないし第１２項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
バーチャルスクリーニングが結合様式とリガンド配座の全自由度とを考慮した自動ドッキングに基づいて化合物データベースを検索する工程を含む請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
バーチャルスクリーニングが自動ドッキング法ＡＤＡＭに基づく化合物データベース検索方法である請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１６】
１の標的蛋白質に対する２以上の特異的リガンド、又は特異的リガンド及びアンチセンス分子の組み合わせを、２以上の用量又は濃度で投与して、観測分子の発現量又は存在量の変動を生体応答として測定して解析する工程を含む請求の範囲第７項ないし第１５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
標的蛋白質の情報に基づいて創製したプローブ手段を適用することによって発現が大きく変動する生物学的機能未知の別蛋白質を探索し、得られた該別蛋白質について創製したプローブ手段を適用することによって発現が大きく変動する１又は２以上の蛋白質を探索する工程を含み、発現が大きく変動する上記蛋白質の１つが既知生体分子ネットワーク情報に含まれるいずれかの分子と一致するまで上記工程を繰り返すことにより、該標的蛋白質と生体分子ネットワーク上の分子との関係を解析し、それにより該標的蛋白質について生物学的機能または疾患とのかかわりを推定する方法。
【請求項１８】
標的蛋白質及び該標的蛋白質と直接相互作用することが知られている生物学的機能未知の別蛋白質のそれぞれについて創製したプローブ手段を用い、プローブ手段の適用が観測分子の挙動に及ぼす影響を解析することにより、該標的蛋白質を含む２以上の生物学的機能未知の蛋白質について既知生体分子ネットワーク情報に含まれる分子との関係を解析し、それにより該標的蛋白質を含む２以上の蛋白質について生物学的機能または疾患とのかかわりを推定する方法。
【請求項１９】
該挙動が発現量及び／又は存在量の量的及び／又は時間的変動である請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項２０】
標的蛋白質に基づくプローブ手段の適用が観測分子の挙動に与える変動を測定し解析することにより、該標的蛋白質の創薬ターゲットとしての妥当性、標的蛋白質の医薬としての妥当性、又は標的蛋白質の抗体を医薬とした場合の妥当性を検証する請求の範囲第１項ないし第１９項に記載の方法。
【請求項２１】
生体分子ネットワーク情報に基づいて、任意の疾患の治療薬開発を目的として創薬ターゲットとなり得る蛋白質、蛋白質医薬となり得る蛋白質、又は抗体医薬の抗原とし得る蛋白質を選抜する請求の範囲第１項ないし第２０項に記載の方法。
【請求項２２】
任意の疾患について、既知生体分子ネットワーク情報に基づいて抽出した２以上の創薬ターゲット候補、蛋白質医薬候補、又は抗体医薬の抗原蛋白質候補を比較し、請求の範囲第１項ないし第２１項のいずれか１項の方法を適用することにより、適切な候補を選抜する方法。
【請求項２３】
標的蛋白質に基づくプローブ手段の適用が観測分子の挙動に与える変動を測定して解析することにより、該標的蛋白質を創薬ターゲットとして医薬を開発した場合の副作用、標的蛋白質自身を医薬として開発した場合の副作用、又は標的蛋白質の抗体を医薬とした場合の副作用を推定する請求の範囲第１項ないし第２２項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
生体分子ネットワーク情報に基づいて、任意の疾患又は症状の治療薬開発を目的として創薬ターゲットとなり得る蛋白質、蛋白質医薬となり得る蛋白質、又は抗体医薬の抗原とし得る蛋白質について副作用を推定する請求の範囲第１項ないし第２３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求の範囲第１項ないし第２１項のいずれか１項に記載の観測分子群を同時に定量及び／又は検出できる抗体のセット。
【請求項２６】
請求の範囲第２２項に記載の抗体のセットを用いて観測分子群を定量することにより、任意の疾患又は生物学的機能に関連する蛋白質をスクリーニングする工程を含む請求の範囲第１項ないし第２５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求の範囲第２２項に記載の抗体のセットを用いて観測分子群を定量することにより、任意の疾患又は症状の治療薬開発の目的で、標的蛋白質を創薬ターゲット候補、蛋白質医薬候補、又は抗体医薬の抗原蛋白質候補とすることの妥当性を検証する請求の範囲第１項ないし第２６項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、蛋白質の機能、より具体的には、蛋白質の関わる生物学的機能及び／又は疾患を推定し、創薬ターゲットとしての妥当性を確認する方法に関する。
背景技術
近年、ゲノムや遺伝子の研究から多数の蛋白質の存在が明らかになってきたが、アミノ酸配列はわかってもその生物学的機能がわからないために利用することができない蛋白質が多い。アミノ酸配列に一定の相同性がある蛋白質間では、生化学的機能も類似しているという経験則があり、配列から任意の蛋白質について機能を推定したり、ファミリーに分類することが日常的に行なわれている。例えば、蛋白リン酸化酵素については、蛋白質のリン酸化という生化学的機能や蛋白リン酸化酵素のファミリーに属する蛋白であることは、コンピュータを用いて、機能が既知な蛋白質の配列に対する相同性や特定の部分配列（モチーフ）の含有の有無を調べることにより、かなりの程度推定することができる。しかし、同じ蛋白リン酸化酵素でも、リン酸化される相手の基質蛋白質、エフェクターとなる蛋白質、機能している臓器や細胞内部位、発現の時期等によって異なる生物学的機能や生理的役割を果たしており、ヒト生体中には２０００種以上の蛋白リン酸化酵素が存在することが知られている。
したがって、新薬開発の創薬ターゲットとするためには、生物学的機能を解明することが必要であるが、この機能を解明する有効な方法はこれまでのところ確立されていない。最終的には実験的に解明するしかないが、膨大な実験を片端から試行錯誤的に行なって機能を解明することは労力と時間と費用の点から、１つの蛋白質についてさえ困難である。また、一般に蛋白質の立体構造の情報は生化学的機能の推定には有用でも、生物学的機能の解明には余り役立たない。
アミノ酸配列の情報しかない蛋白質の生物学的機能を推定する方法として、標的蛋白質をコードする遺伝子をノックアウトしたり、過発現させた動物を作成する方法がある。しかし、非常に重要な蛋白質の場合には仔が生まれてこないこともあり、また生まれてきた場合にも、正常な動物との違いが明らかでない場合が多く、生物学的機能を推定又は解明できる可能性は必ずしも大きくない。また、該蛋白質に対応するｍＲＮＡに対しアンチセンス分子を作成して蛋白発現への影響をみることも可能であるが、実験結果の解釈が困難な場合が多く、該蛋白質の生物学的機能や生体における役割を推定する有効な手段とはなっていない。
また、近年は疾患関連遺伝子や蛋白発現解析等に手法を用いて、新規創薬ターゲットの候補となりそうな蛋白質を探索することに期待が集まっており、早期に創薬ターゲットとして妥当かを判断する必要が出てきた。機能がある程度推定できる蛋白質であっても、創薬ターゲットとして新規な場合には、その蛋白質をターゲットとして医薬を開発することが、目的の疾患に有効でかつメカニズム的副作用が少ないなど適切かどうかを本格的創薬研究開始前に判断できる方法の確立が必要である。
発明の開示
本発明の課題は、任意の蛋白質の生物学的機能や疾患との関わりについてプロファイリングする方法を提供することである。より具体的には、生物学的機能解明のために定型的な簡単な実験に基づいた推定方法を提供することにあり、配列情報のみが利用可能な任意の機能未知の蛋白質について、どのような生物学的機能に関連しているか又はどのような疾患に関連しているかを簡便に推定する方法を提供することも本発明の課題の一つである。また、そのような推定を行うことにより、該標的蛋白質が創薬ターゲットとして適切か否か、更には該標的蛋白質を創薬ターゲットとした場合の副作用リスクは何かを本格的医薬品開発に入る前に知る方法を提供することも本発明の課題の一つである
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、該標的蛋白質群に対するプローブ手段（リガンド、アンチセンス、モノクロナール抗体等の投与、又は対応する遺伝子のノックアウト又はトランスジェニック操作等）を、生物材料又は動物に適用した際に引き起こされる該標的蛋白質群以外の分子群（観測分子）の挙動を測定し、解析し、比較し、既知生体分子ネットワーク情報と照合することにより上記の課題を解決できることを見出した。
より具体的には、以下の様な手順を取ることにより上記課題を解決できる。まず、標的蛋白質に対するプローブ手段を、例えば、以下のいずれかの方法により取得する。
（１）該標的蛋白質の遺伝子配列情報に基づき、該蛋白質をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴを設計し合成する。（２）結晶構造情報の利用できる場合にはその情報に基づいて、利用できない場合には類似蛋白質の構造情報を用いたホモロジーモデリングにより構築した該標的蛋白質の立体構造に基いて、コンピュータを用いたバーチャルスクリーニング等の手段により該蛋白質に対する特異的リガンドを取得する。該標的蛋白質の試料と適切な化合物ライブラリとハイスル−プットスクリーニング装置が利用できる場合には、実験的なランダムスクリーニングによって特異的リガンドを取得することも可能である。（３）該標的蛋白質をコードする遺伝子内にマーカー遺伝子を相同組換え等の手法により組み込むことなどにより遺伝子破壊するためのＤＮＡを組み込んだベクターを設計し取得する。（４）該蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを設計し取得する。（５）その他ＲＮＡ干渉、リボザイム、特異的抗体などの手法により該蛋白質機能を破壊若しくはモジュレートするための手段を取得する。
次いで、取得したプローブ手段を生体（オルガネラ、細胞、臓器、組織、動物個体等）に適用することにより、一過的または恒常的に該蛋白質機能を破壊若しくはモジュレートした状態を作り出す。そして、そのように破壊若しくはモジュレートした生体とそのような操作を施さなかった生体の両者について、該標的蛋白質以外の生体分子群（これらを「観測分子」と呼ぶ）、例えば、種々の蛋白質、ｍＲＮＡ、その他ホルモン等を含む低分子の挙動（発現量及び／又は存在量等）を測定し、該蛋白質機能の破壊又はモジュレーションにより引き起こされる量的又は時間的変動を検出する。この際、観測分子としては、生物学的機能が既に明らかで、生体分子ネットワーク情報に含まれる分子であることが望ましい。
観測分子が生体分子ネットワーク情報に含まれる場合には、得られた実験データを生体分子ネットワーク情報における各観測分子の意味付けと時間的変動を関連づけて解析することにより、該標的蛋白質の関連する生物学的機能若しくは疾患を推定することができる。この結果と、既知蛋白質との配列相同性やモチーフ配列の有無により推定できる生化学的機能に基けば、該標的蛋白質について試行錯誤でなく、効率的で的確な実験の実施が可能になり、その生物学的機能の解明に役立つ。その結果、該標的蛋白質がどのような疾患にどのような意味をもち、創薬ターゲットとして適切であるか否か、あるいは該標的蛋白質を創薬ターゲットとして医薬を開発した場合に予想される副作用としては何が考えられるかを予測することが可能となる。
観測分子が生体分子ネットワーク情報に含まれない、或いは生体分子ネットワークを利用しない場合には、生体分子ネットワークを利用した場合に比して得られる情報は少ないが、上記プローブ手段の適用によるモジュレーションの結果を、観測分子毎の独立なデータとして一定の順序で並べ、図形又は数字の大小又はバーコードなどで表現し、比較することができる。例えば、特定疾患の生物材料に特異的リガンドを投与した時のバーコード表記が、未投与の場合のバーコード表記より、正常でのバーコード表記に近いほど、創薬ターゲットとして望ましいということができる。
以下に、本発明の方法の概念的流れを模式的に示す。
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この発明の好ましい態様によれば、プローブ手段を適用することによる発現量の変動が大きい蛋白質若しくはプローブ手段を適用することによる発現量の変動が大きいｍＲＮＡに由来する蛋白質、及び／又は特に指定された観測分子群である上記の方法；該観測分子群ができる限り多様な生物学的機能に関わりをもつように選ばれた分子群である上記の方法；該観測分子群が特定の疾患及び／又は生物学的機能に関連する分子群、並びに特定臓器又は特定組織で発現及び／又は機能する分子群からなる群から選ばれる上記の方法；生体分子ネットワーク情報が、生物学的機能既知の生体分子間の機能及び／又は生合成における相互作用のつながりを示す生体分子ネットワーク情報である上記の方法；生体分子ネットワーク情報が、生物学的機能既知の生体分子間の機能及び／又は生合成における相互作用上のつながりを示す情報に加えて、生体分子と生体イベントとの関係の情報を含む分子機能ネットワーク情報である上記の方法が提供される。
さらに好ましい態様によれば、標的蛋白質に対する特異的リガンドがバーチャルスクリーニングを用いて創製されたものである上記の方法；バーチャルスクリーニングが結合様式とリガンド配座の全自由度とを考慮した自動ドッキングに基づいて化合物データベースを検索する工程を含む上記の方法；バーチャルスクリーニングが自動ドッキング法ＡＤＡＭに基づく化合物データベース検索方法である上記の方法；１の標的蛋白質に対する２以上の特異的リガンド、又は特異的リガンド及びアンチセンス分子の組み合わせを、２以上の用量又は濃度で投与して、観測分子の発現量又は存在量の変動を生体応答として測定して解析する工程を含む上記の方法が提供される。
また、本発明により、標的蛋白質の情報に基づいて取得したプローブ手段を適用することによって発現が大きく変動する生物学的機能未知の別蛋白質を探索し、得られた該別蛋白質について創製したプローブ手段を適用することによって発現が大きく変動する１又は２以上の蛋白質を探索する工程を含み、発現が大きく変動する上記蛋白質の１つが生体分子ネットワーク情報中のいずれかの分子と一致するまで上記工程を繰り返すことにより、標的蛋白質と生体分子ネットワーク情報上の分子との関係を推定する方法；及び標的蛋白質及び該標的蛋白質と直接相互作用することが知られている生物学的機能未知の別蛋白質のそれぞれに基くプローブ手段を生物材料又は動物に適用することによって観測分子の挙動に及ぼす影響を解析し、それにより該標的蛋白質を含む２以上の生物学的機能未知の蛋白質について既知生体分子ネットワーク情報中の分子との関係を推定する方法が提供される。この方法において、該挙動が発現量及び／又は存在量であり、該標的蛋白質を含む２以上の生物学的機能未知の蛋白質について生物学的機能又は疾患との関わりを推定する方法は好ましい態様である。
さらに本発明により、既知生体分子ネットワーク情報に含まれる分子群であって、特定の疾患及び／又は生体イベントに関連した分子群、特定臓器で発現及び／又は生成される分子群、特定臓器に存在して作用する分子群、並びにできる限り多数の生体イベントに関わる分子群からなる群から選ばれる分子群を含むように選ばれた観測分子群を用いる上記の方法；上記の観測分子群を同時に定量及び／又は検出できる抗体のセット；上記抗体のセットを用いて観測分子を定量することにより、目的の疾患又は生物学的機能に関連する蛋白質をスクリーニングする上記の方法；生体分子ネットワーク情報に基づいて任意の疾患に関わりを持つ蛋白質群を創薬ターゲット候補、又は蛋白質医薬の候補、又は抗体医薬の抗原蛋白質候補として選抜する方法；生体分子ネットワーク情報に基づいて任意の疾患や症状の治療薬を開発する目的に、ある蛋白質を創薬ターゲット候補、又は蛋白質医薬の候補、又は抗体医薬の抗原蛋白質候補とした場合の副作用を推定する方法；生体分子ネットワーク情報に基づいて任意の疾患や症状の治療薬を開発する目的に、２以上の創薬ターゲット候補、蛋白質医薬の候補、抗体医薬の抗原蛋白質候補から最適の候補を選抜する方法；が提供される。
本発明によって提供される代表的な方法として以下の方法を挙げることができるが、本発明の範囲はこれらに限定されることはない。
１．任意の標的蛋白質に基づくプローブ手段を生物材料又は動物に適用し、生物学的機能既知及び／又は未知の１又は２以上の観測分子の挙動に与える影響を測定して解析することにより、該標的蛋白質の関連する生物学的機能及び／又は疾患を推定する方法。
２．任意の標的蛋白質に基づくプローブ手段を生物材料又は動物に適用し、生物学的機能既知の１又は２以上の観測分子の挙動に与える影響を測定し、該標的蛋白質の既知生体分子ネットワーク情報に含まれる分子との直接又は間接の関わりを解析することにより、該標的蛋白質の関連する生物学的機能及び／又は疾患を推定する方法。
３．任意の標的蛋白質が生体内で果たしている役割又は機能を、該標的蛋白質に基づくプローブ手段が該標的蛋白質以外の他の生体分子群に及ぼす影響を測定し、表現し、比較し、及び／又は解析することにより、該標的蛋白質をプロファイリングする方法。
４．プローブ手段の適用が１又は２以上の観測分子の挙動に及ぼす影響を測定し、それらの強弱を図形又は数字の大小またはバーコードなどで表現したフィンガープリントとすることにより該標的蛋白質のプロファイルを行うことを特徴とする上記１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
５．標的蛋白質の生物学的機能が未知である上記１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
６．プローブ手段を適用する対象が、オルガネラ、細胞、組織、臓器を含む生物材料、又は動物である上記１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
７．プローブ手段が特異的リガンド又はアンチセンス分子又はモノクロナール抗体又は標的蛋白質に対応する遺伝子のノックアウト又はトランスジェニック操作である上記１ないし６のいずれか１項に方法。
８．プローブ手段の適用が、特異的リガンド、アンチセンス分子、又はモノクロナール抗体を投与する工程を含み、及び／又は標的蛋白質に対応する遺伝子のノックアウト又はトランスジェニック操作を施した動物を作成する工程を含む上記１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
９．プローブ手段を生物材料、又は動物に適用した場合の生体応答を、標的蛋白質以外の生体分子から選ばれた１ないし２以上の観測分子の挙動において測定する上記１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
１０．観測分子の挙動が、それぞれの発現量及び／又は存在量の量的又は時間的変動である上記１ないし９に記載の方法。
１１．観測分子が生物学的機能既知であるか又は生物学的機能既知の生体分子との関わりが推定される生体分子であって、生体分子ネットワーク情報に含まれる分子である上記１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
１２．観測分子が、プローブ手段を適用することによる発現量の変動が大きい蛋白質若しくはｍＲＮＡ、及び／又は特に指定された生体分子である上記１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
１３．観測分子ができる限り多様な生物学的機能に関わりをもつように選ばれた分子群である上記１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．観測分子が特定の疾患及び／又は生物学的機能に関連する分子群、並びに特定臓器又は特定組織で発現及び／又は機能する分子群からなる群から選ばれる上記１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．生体分子ネットワーク情報が、生物学的機能既知の生体分子間の機能及び／又は生合成における相互作用のつながりを示す分子ネットワーク情報である上記１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．生体分子ネットワーク情報が、生物学的機能既知の生体分子間の機能及び／又は生合成における相互作用上のつながりを示す情報に加えて、生体分子と生体イベントとの関係の情報を含む分子ネットワーク情報である上記１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
１７．生体分子ネットワーク情報が特願２０００−２７６６９９号明細書に記載の方法で作製された分子機能ネットワーク情報である上記２ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．１の標的蛋白質に対して２以上のプローブ手段を独立に適用し、観測分子の変動へのそれぞれの影響を統合的に解析する工程を含む上記１ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
１９．１の特異的リガンド又はアンチセンス分子又はモノクロナール抗体について、２以上の用量又は濃度で生物材料又は動物に投与して、観測分子の発現量、又は存在量の量的若しくは時間的変動を測定して解析する工程を含む上記１ないし１８のいずれか１項に記載の方法。
２０．標的蛋白質に基づくプローブ手段を適用することによって発現が大きく変動する蛋白質群を探索し、次にその１つに基づくプローブ手段を適用することによって発現が大きく変動する蛋白質群を探索する工程を含み、発現が大きく変動する上記蛋白質の１つが既知生体分子ネットワーク情報に含まれるいずれかの分子と一致するまで上記工程を繰り返すことにより該標的蛋白質と生体分子ネットワーク上の分子との関係付けを行ない、該関係付けに基づいて該標的蛋白質について生物学的機能または疾患とのかかわりを推定する方法。
２１．標的蛋白質及び該標的蛋白質と直接相互作用することが知られている生物学的機能未知の別蛋白質のそれぞれに基づくプローブ手段を同じ生物材料又は動物に適用し、それぞれが観測分子の挙動に及ぼす影響を統合的に解析することにより、該標的蛋白質を含む２以上の生物学的機能未知の蛋白質について既知生体分子ネットワーク情報に含まれる分子との関係付けを行い、該関係付けに基づいて該標的蛋白質を含む２以上の蛋白質について生物学的機能または疾患とのかかわりを推定する方法。
２２．標的蛋白質に基づくプローブ手段の適用が観測分子の挙動に与える変動を測定し解析することにより、該標的蛋白質の創薬ターゲットとしての妥当性、標的蛋白質の医薬としての妥当性、又は標的蛋白質の抗体を医薬とした場合の妥当性を検証する上記１ないし２１のいずれか１項に記載の方法。
２３．生体分子ネットワーク情報に基づいて、任意の疾患の治療薬開発を目的として創薬ターゲットとなり得る蛋白質、蛋白質医薬となり得る蛋白質、又は抗体医薬の抗原とし得る蛋白質を選抜する上記１ないし２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．任意の疾患について、既知生体分子ネットワーク情報に基づいて抽出した２以上の創薬ターゲット候補、蛋白質医薬候補、又は抗体医薬の抗原蛋白質候補を比較し、上記１ないし２３のいずれか１項の方法を適用することにより適切な候補を選抜する方法。
２５．標的蛋白質に基づくプローブ手段の適用が観測分子の挙動に与える変動を測定して解析することにより、該標的蛋白質を創薬ターゲットとして医薬を開発した場合の副作用、標的蛋白質自身を医薬として開発した場合の副作用、又は標的蛋白質の抗体を医薬とした場合の副作用を推定する上記１ないし２４のいずれか１項に記載の方法。
２６．生体分子ネットワーク情報に基づいて、任意の疾患又は症状の治療薬開発を目的として創薬ターゲットとなり得る蛋白質、蛋白質医薬となり得る蛋白質、又は抗体医薬の抗原とし得る蛋白質について副作用を推定する上記１ないし２５のいずれか１項に記載の方法。
２７．任意の蛋白質に対して創製した２種以上の特異リガンドを用いる上記１ないし２６のいずれか１項に記載の方法。
２８．標的蛋白質に対する特異的リガンドがバーチャルスクリーニングを用いて創製されたものである上記１ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
２９．バーチャルスクリーニングが結合様式とリガンド配座の全自由度とを考慮した自動ドッキングに基づいて化合物データベースを検索する方法である上記２８に記載の方法。
３０．バーチャルスクリーニングが自動ドッキング法ＡＤＡＭに基づく化合物データベース検索方法である上記２８に記載の方法。
３１．上記１ないし２７のいずれか１項に記載の観測分子群を同時に定量及び／又は検出できる抗体のセット。
３２．上記３１に記載の抗体のセットを用いて観測分子群を定量することにより、任意の疾患又は生物学的機能に関連する蛋白質をスクリーニングする工程を含む上記１ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
３３．上記３１に記載の抗体のセットを用いて観測分子群を定量することにより、標的蛋白質を任意の疾患又は症状の治療薬開発の目的における創薬ターゲット候補、蛋白質医薬候補、又は抗体医薬の抗原蛋白質候補とすることの妥当性を検証する上記１ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、本発明の方法の対象となる任意の蛋白質を「標的蛋白質」と呼ぶ。本発明の方法を適用するには、標的蛋白質は、アミノ酸配列の情報をもっている必要がある。本発明の方法を適用するためには、生化学的機能の情報は必ずしも必要ではないが、機能既知の蛋白質データベースを検索して、配列上の相同性や機能と関連する配列上の特徴やモチーフ配列の有無から生化学的機能及び属する蛋白質ファミリーについて推定しておくと便利である。また、近年は機能がわからないまま新規蛋白質が単離精製されており、結晶解析やｎｍｒ解析によって立体構造が解明される例が増してきた。立体構造から推定される生化学的機能や低分子リガンドが結合するサイトの有無の情報等は、生体応答データから生体分子ネットワークとの関わり方を推定するのに役立つ可能性がある。標的蛋白質の試料が利用できる場合には、特異的抗体が作成でき、プローブ手段として利用できる。標的蛋白質にモデリングの鋳型となる適切な類縁蛋白質の結晶構造（ｎｍｒにより推定される立体構造など）がない場合には、実験的ランダムスクリーニングにより得られた特異的リガンドをプローブ手段として用いることも可能である。
本明細書における用語の意味又は定義は以下の通りである。
「特異的リガンド」又は「リガンド」とは、標的の生体高分子（主として蛋白質）にある程度以上強く結合する低分子又は低分子化合物をいう。
「生体分子ネットワーク」情報とは、生体分子間の機能上又は生合成上又は代謝上のつながりを示すネットワークをいう。原則として、直接結合又は相互作用する生体分子間にはつながりがあるものとする。例えば分子Ａが分子Ｂの基質となる、分子Ａが分子Ｃに結合することによってシグナルが伝達されるなどの場合を機能上のつながりといい、分子Ａから酵素分子Ｂによって分子Ｃが生成されるなどの場合の分子ＡとＣを生合成上のつながりという。分子のつながりに注目した分子ネットワーク型データベースの代表的なものとして、代謝経路に関するものとしては、ＫＥＧＧ（金久ら、京都大学）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｔｈｗａｙｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ），ＷＩＴ（Ｒｕｓｓｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｂｉｏｆｒｏｎｔｉｅｒ（呉羽化学）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐａｔｈｗａｙ（ＡｘＣｅｌｌ），ｂｉｏＳＣＯＵＴ（ＬＩＯＮ），ＥｃｏＣｙｃ（ＤｏｕｂｌｅＴｗｉｓｔ），ＵＭ−ＢＢＤ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　Ｕｎｉｖ．）がある。
ＫＥＧＧのＰＡＴＨＷＡＹデータベースは物質代謝、エネルギー代謝に関わる一般低分子化合物の代謝経路とシグナル伝達系の蛋白質を含んでいる。シグナル伝達に関するものとしては、ＣＳＮＤＢ（国立医薬品食品衛生研究所、日本）、ＳＰＡＤ（久原ら、九州大学）、Ｇｅｎｅ　Ｎｅｔ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ　＆　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｎｏｖｏｓｉｂｉｒｓｋ，Ｒｕｓｓｉａ），ＧｅＮｅｔ（Ｍａｒｉａ　Ｇ．Ｓａｍｓｏｎｏｖａ）がある。蛋白−蛋白相互作用のデータベースとしては、ＤＩＰ（ＵＣＬＡ），ＰａｔｈＣａｌｌｉｎｇ（ＣｕｒａＧｅｎ），ＰｒｏＮｅｔ（Ｍｙｒｉａｄ）がある。本発明者らは、生体分子間のつながりの情報に加えて、生体、臓器、組織、細胞で特定の生体分子が引き起こすイベントの情報を含む分子機能ネットワークの生成方法を特許出願している（「分子機能ネットワークの生成方法」特願２０００−２７６６９９号明細書）。上記明細書に記載されたの分子機能ネットワークも本明細書の生体分子ネットワークに含まれる。
「バーチャルスクリーニング」とは、膨大な化合物ライブラリを用いた任意の蛋白質への結合や反応の阻害等による実験的スクリーニング（ＨＴＳ）の代わりに、化合物データベース中の膨大な化合物群からコンピュータ上で理論的にリガンドとなる可能性の高い化合物を選別することを意味する。化合物の構造上の特徴や部分構造の有無に基づく方法の他、標的生体高分子のリガンド結合部位へのフィットの可能性を推定する方法などがある。
「生体分子」とは、オルガネラ、細胞、組織、臓器、生物個体、又は集合体など、生物に寄生する生命体を含む生体中に存在する分子をいう。核酸、蛋白質、脂質、糖質、一般低分子化合物その他のあらゆる構造の有機分子及びその集合体を指し、金属イオン、水、プロトンを含んでいてもよい。
「生合成」とは、生体分子が生体中で作られるすべての反応又は過程を含み、低分子の代謝・化学変換のみならず、蛋白合成の全過程も含む概念として用いる。
「生体イベント」とは、生体において内因的に又は外因的に現れるすべての現象、応答、反応、症状を含む概念である。具体的な例として、転写、細胞の遊走、細胞の接着、細胞分裂、神経回路興奮、血管収縮、血圧上昇、血糖低下、発熱、痙攣、異種生物及びウイルスなど寄生体による感染その他を挙げることができる。
「生体応答」とは、任意の生体高分子に対するプローブ手段の適用によって、オルガネラ、細胞、組織、臓器、動物体等で引き起こされる全ての生物現象を包含し、最も広義に解釈されねばならない。例としては、疾患指標や病態指標の改善、観測分子の存在量の変動、蛋白発現、遺伝子発現への影響などを挙げることができる。
「蛋白質の生化学的機能」とは、酵素反応やシグナル伝達の伝達様式など、分子レベルでの蛋白質の機能をいう。蛋白質をリン酸化する酵素は蛋白リン酸化酵素、蛋白質を加水分解する酵素は蛋白加水分解酵素、膜にあって細胞外のシグナルを細胞内に伝える膜を貫通する７つのアルファヘリクスをもつ受容体は７回膜貫通型受容体、細胞核内で性ホルモン等の結合により転写を制御する核内受容体など、酵素反応様式やシグナル伝達様式で分類されている。
「蛋白質の生物学的機能」とは、細胞レベル以上で観測される機能である。例えば、アセチルコリンの受容体もオキシトシンの受容体も７回膜貫通型の蛋白質であるが、アセチルコリン受容体は神経伝達、オキシトシン受容体は子宮収縮作用という生物学的機能に関与している。アンジオテンシン変換酵素は蛋白（或いはペプチド）加水分解酵素であるが、アンジオテンシン−Ｉをアンジオテンシン−ＩＩに変換する酵素で血圧の調節という生物学的機能に関与している。
「低分子」又は「低分子化合物」とは、分子量が好ましくは２００以上１０００以下の有機化合物分子をいう。
「アンチセンス分子」とは、任意の遺伝子又はｍＲＮＡ配列と相補的な配列をもつ１０〜３０残基程度のオリゴヌクレオタイド又はオリゴリボヌクレオタイドを指し、該遺伝子やｍＲＮＡに特異的に結合して転写や蛋白発現等を抑える目的に用いられる。
「プローブ手段」とは、標的蛋白質に対して特異的に結合するリガンド、該蛋白質をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス分子、標的蛋白質遺伝子をノックアウトするためのベクター、標的蛋白質をコードする遺伝子配列を含むベクター、ＲＮＡ干渉を引き起こすための二重鎖ＲＮＡ、標的蛋白質をコードするｍＲＮＡを切断するようにデザインされたリボザイム、標的蛋白質に対する特異的抗体等、標的蛋白質の機能を阻害若しくはモジュレートする手段をいう。
「プローブ手段の適用」とは、プローブ手段を生体に作用させることにより、標的分子の機能を阻害若しくはモジュレートすることを言う。例えば、特異リガンドやアンチセンス分子やモノクロナール抗体を細胞に作用させたり、標的分子をノックアウトしたマウスを作製したり、標的分子を過剰発現させたマウスを作製したり、標的分子に対する特異抗体を細胞にインジェクションしたりすること等を意味する。
「生体応答データ」には、生体分子の発現量・存在量の変化、物理パラメータがある。前者の例としては、蛋白発現、修飾、ｍＲＮＡ発現、診断マーカー分子の存在量の変化が挙げられ、後者の例としては血圧、体温、尿量などが挙げられる。
「観測分子」とは、生体応答を観測するために選ばれる、又は特に指定した１又は２以上の分子、好ましくは２以上の分子を含む分子群をいう。観測分子は、既知の生体分子ネットワーク情報に含まれる生体分子であることが望ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。その際はｙｅａｓｔ　ｔｗｏ　ｈｙｂｒｉｄ法等の何らかの手法により、既知の生体分子ネットワーク情報に含まれる分子とのつながりが明らかになっていることが望ましい。プローブ手段の適用によって発現が大きく増減する蛋白質群又はそのような性質を有するｍＲＮＡ群など、標的蛋白質毎に異なる観測分子を設定することもできるが、多数の標的蛋白質についてある意図をもって予め指定した一定の分子群を観測分子として生体応答を測定することもできる。観測分子は、必ずしも蛋白質やｍＲＮＡに限られる訳ではなく、それ以外のあらゆるタイプの低分子、例えば、グルコース、クレアチニン等、疾患に関連する診断マーカー分子等から選択することもできる。
「生体イベント」とは、生体において内因的に又は外因的に現れるすべての現象、応答、反応、症状を含む概念とする。具体的な例として、転写、細胞の遊走、細胞の接着、細胞分裂、神経回路興奮、炎症、血管収縮、血圧上昇、血糖降下その他を挙げることができる。
「観測分子の挙動」または「生体分子の挙動」とは、観測分子または生体分子の存在量、発現量、修飾状態、局在、補助因子の結合状態等の変化のことを言う。
「生物材料」とはオルガネラ、細胞、組織、臓器等、生物個体に含まれるあらゆるレベルの試料を意味する。
以下に、本発明の実施の態様の１つである創薬ターゲットのバリデーションを目的とした方法を流れ図で詳しく説明するが、本発明の方法は下記の方法及びその細部に限定されることはない。標的蛋白質を創薬ターゲットとしてそれに特異的に結合する医薬分子の開発だけでなく、標的蛋白質自身を医薬とする場合、標的蛋白質を抗原として抗体医薬を開発する場合のバリデーションについても同様に行うことができる。
2002040990.tif 000003
工程（１）：創薬ターゲット候補蛋白質の選別
本発明を任意の蛋白質の創薬ターゲットとしての妥当性を判断するのに用いる場合、それに先立ち、創薬ターゲット候補蛋白質を以下の様な方法により選ぶこともできる。創薬ターゲット候補の蛋白質群としては、個々の蛋白質の生物学的的機能が必ずしもわかっている必要がないのが本発明の方法の特徴である。対象とする蛋白質間に関連性がある必要はなく、創薬研究者が文献上集めた互いに関連のない蛋白質群であってもよいし、特定疾患（症状）の患者と正常人の間で発現の増減が著しい蛋白質群を発現蛋白の二次元電気泳動マップから同定して選ぶこともできる。生体分子間の機能上又は生合成上の直接の関わりを示す生体分子ネットワーク情報を利用すれば、特定疾患によって発現の増減が著しい蛋白質群自身ではなく、それらと直接間接に関わりをもつ蛋白質群を容易に推定して、創薬ターゲット候補群として選ぶことが可能になる。さらに、例えば血管収縮など特定の生体分子が示す生体イベントの情報を含む生体分子ネットワーク情報を用いることにより、標的疾患の病態や症状に関連する生体イベントにつながる生体分子ネットワーク上の蛋白質群を創薬ターゲット候補として選ぶことができる。しかし、本発明は他のいかなる方法により選択された既知の生体分子ネットワーク情報に含まれない創薬ターゲット候補に対しても適用可能であることは言うまでもない。
分子ネットワークを利用して、創薬ターゲット候補の蛋白質群を選別する例を以下に示す。
2002040990.tif 000004
工程（２）：プローブ手段の取得
プローブ手段の代表的なものとしては、特異的リガンドを用いる方法とアンチセンス分子を用いる方法とモノクロナール抗体を用いる方法がある。標的蛋白質のリガンド結合ポケットその他の部位に特異的に結合して、その機能を制御するのが特異的リガンドである。特異的リガンドを創製する方法としてはいかなる方法を用いてもよいが、実験的にランダムスクリーニンダで見つける方法とバーチャルスクリーニングを用いる方法がある。実験的にリガンドを見つけるには、標的蛋白質の立体構造情報は不要であるが、蛋白質試料と膨大な化合物ライブラリを用意して、大規模なランダムスクリーニングを行う必要がある。配列情報のみが利用でき、その機能がわからない蛋白質については、遺伝子から標的蛋白を生産・精製する必要があることが多いうえに、リガンドをスクリーニングするのに酵素活性の阻害や既知リガンドの追い出しを見るスクリーニング手法が利用できないため、標的蛋白との結合を直接測定する方法を用いる必要がある。
バーチャルスクリーニングにより特異的リガンドを創製する方法としては、多様な構造のリガンドをできる限り多数見つけることができる方法であればいかなる方法を用いてもよい。標的蛋白質のリガンド結合ポケットに安定に結合する低分子という観点から、先入観を入れずに幅広い構造の新規リガンドが探索できる自動ドッキングに基づくバーチャルスクリーニング方法を用いるのが望ましい。さらに好ましくは、発明の名称「生体高分子−リガンド分子の安定複合体構造の探索方法」の自動ドッキング法（日本国特許第２６２１８４２号）を利用した化合物データベース検索法である発明の名称「三次元構造データベースから新規リガンド化合物を検索する方法」の方法（日本国特許出願８−５１４４５２号）を用いることができる。この方法によれば、各化合物につき、結合様式とリガンド配座に由来する全ての自由度を考慮して標的蛋白質との安定複合体構造を推定でき、その構造の安定性や特徴を検索条件として検索できるので、選抜した化合物が高率に目的の活性を示すことが多数の蛋白系で既に証明されている。
バーチャルスクリーニングの対象としては、いかなる化合物データベースを用いてもよい。二次元構造情報をもつ化合物データベースが利用できる場合には、構造三次元化ソフトウェアを用いて、三次元構造その他の必要な情報をもつ三次元データベースに自動変換して、上記のバーチャルスクリーニングに利用することが可能である。市販化合物のデータベースを対象にすれば、検索で選んだ有望な化合物（ヒット）を合成せずに入手して以後の実験に供することができ、便利である。市販の化合物や実在の化合物でなくても、プローブ手段として用いるリガンドとして生体応答を探るのに適当な化学構造をもつ化合物群のデータベースを対象に検索してもよい。その場合、ヒット化合物は合成する必要がある。
バーチャルスクリーニングで選んだ化合物を入手した場合、そのまま以後の実験に供してもよいが、利用するバーチャルスクリーニング法の信頼性又は標的蛋白質のリガンド結合ポケットの形状その他の状況によっては、可能であれば標的蛋白質への結合活性を実験的に確認してから、次の工程に進むのが望ましい。バーチャルスクリーニングで選び入手した化合物の標的蛋白質への結合活性は、蛋白試料を入手すれば、例えば表面プラズモン共鳴に基づく方法その他の方法で確認することができる。
特異的リガンドをバーチャルスクリーニングで創製する場合には、標的蛋白質の立体構造の情報が必要である。プロテインデータバンクその他から、標的蛋白質そのものの結晶構造又はｎｍｒ構造（各原子の三次元座標）が利用できる場合には、そのままバーチャルスクリーニングに利用することができる。該蛋白質の結晶構造が解析されていない場合又は解析されていてもその三次元座標が利用できない場合であっても、類縁蛋白質の結晶構造等の情報が利用できる場合には、その結晶構造を鋳型として側鎖を置換するなどの手法によりコンピュータ上でモデリングした構造を結晶構造と同様に用いることができる。配列相同性が高いほど立体構造が類似している可能性が高くモデリングが容易である。しかし、配列全体の相同性はさほど高くなくても、生化学的機能と関連したモチーフ配列や配列上の特徴が存在すれば、同じ蛋白ファミリーに属していて立体構造も似ていることが知られているので、そのファミリーに属する蛋白質の結晶構造が利用できれば、モデリングが可能である。また、該蛋白質と配列の相同性が高い蛋白質の立体構造情報がない場合、配列相同性以外の物性を考慮して鋳型となる蛋白構造を探索し、三次元構造をモデリングすることができる。代表的な方法としてＤ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらによる３Ｄ−１Ｄ法がある。
実験的方法、バーチャルスクリーニング法いずれの方法で創製したリガンドであっても、水溶性や脂溶性などの物性の他、顕著な細胞毒性等がないことを確認した後、生体応答データの測定実験に供することが望ましい。見つかったそのままの構造では標的への結合が弱いリガンドの場合には、必要に応じて構造修飾を行い結合活性や溶解性等の物性を改善したリガンドを用いるのが望ましい。さらに好ましくは、１の特異的リガンドではなく、構造の特徴が異なる複数の特異的リガンドについて同じ実験に用い、生体応答を比較することが推奨される。該蛋白質以外の蛋白質の発現や観測分子の存在量に及ぼす影響、或いはそれらのデータから推定される生体分子ネットワークとの関連が共通であることを確認するのが望ましい。
プローブ手段としては、特異的リガンドの代わりに、アンチセンス分子を用いることができる。一般にアンチセンス分子は１０〜３０残基程度のオリゴヌクレオタイドで、相補的な塩基配列をもつｍＲＮＡと選択的に結合し、遺伝情報の翻訳を阻害し蛋白発現を抑える目的で用いられている。特異的リガンドが標的蛋白質の発現や存在量に影響を与えずに該蛋白質の機能を直接阻害したり活性化するのに対して、アンチセンス分子は該蛋白質の蛋白合成を直接抑える効果をもつ。そこで、標的蛋白質のアミノ酸配列に対応したｍＲＮＡと相補的な塩基配列をもつアンチセンス分子を合成して投与し、該蛋白質の蛋白合成が抑えられた結果、他の生体分子が受ける影響から該蛋白質の生体中での役割を探ることができる。
したがって、特異的リガンドとアンチセンス分子とモノクロナール抗体を生体に投与した場合の生体応答は異なっており、２種又は３種を行うことは該蛋白質の関連する機能や疾患を推定する上で有用である。低分子の特異的リガンドを創製することはできない標的蛋白質の場合には、アンチセンス分子をプローブ手段として使用できる。さらに、アンチセンス分子は標的蛋白をコードするｍＲＮＡ配列さえあれば容易に合成でき、立体構造情報を必要としないという利点がある。しかし、標的蛋白質が、既に蛋白合成されている蛋白質やターンアラウンドが遅い蛋白質、或いは蛋白合成された前駆体蛋白から加水分解等の変換によって重要な生理作用をもつ蛋白質等の場合には、特異的リガンドとは顕著に異なる生体応答が生じる可能性がある。特に、アンチセンス分子と特異的リガンドに対するそれぞれの生体応答を、プローブ手段の適用後の２以上の経過時間で測定し比較することにより、標的蛋白質がどのような蛋白質かを推定する手がかりが掴める可能性が高い。したがって、本発明の方法の好ましい態様としては、プローブ手段として２以上の特異的リガンドを用意し、さらにアンチセンス分子又はモノクロナール抗体を創製する方法を挙げることができる。
工程（３）：観測分子の設定
プローブ手段の適用を細胞、組織、臓器、動物個体などに施した場合の生体応答のデータとしては、プローブ手段の適用の有無による違いが測定・比較できれば、如何なるデータでもよい。そのようなデータとしては、１）血圧、体温、脈拍、細胞の形状、増殖速度その他への影響、２）生体分子の発現や存在量への影響が考えられる。一般的に１）はデータの解釈が難しいため、測定が容易で一度に多数のデータが得られる生体分子の発現や存在量への影響を生体応答データとする２）が望ましい。２）に基づいて、プローブ手段の適用に対する生体応答を測定するための分子を「観測分子」と呼ぶ。
観測分子を選ぶ最も簡単な方法は、プローブ手段を適用することによって発現や修飾が大きく変化する蛋白質又はｍＲＮＡを選ぶことである。患者と健常者、薬剤の投与の有無等によって発現量が顕著に増減する蛋白質群のアミノ酸配列をマススペクトルで決定することは日常的な技術となっている。問題は、発現が大きく変化する蛋白質が多数あっても、互いの関連がわからないために生物学的機能を推定する有効な手段とならないことである。生物学的機能が未知の蛋白質の機能を知るには、生物学的機能や疾患を既知の蛋白質と関連づけるしかない。そこで、観測分子は、プローブ手段を適用することによって発現や修飾が大きく変化する蛋白質又はｍＲＮＡに対応する蛋白質であって、かつ生体分子間の機能上又は生合成上のつながりを示す生体分子ネットワークに含まれる分子を選ぶようにすることが望ましい。生体分子ネットワーク情報によって、プローブ手段を適用することによって発現が大きく変化する一見無関係な多数の蛋白質を直接間接に関連付けることができ、標的蛋白質を生物学的機能が既知の生体分子の中に位置付けることができる。この方法では、標的蛋白質毎に観測分子とする蛋白質の組み合わせが変わり、プローブ手段を適用することによる蛋白発現の変化を見てから、観測分子のセットを決めることになる。
この方法の好ましい態様では、蛋白発現マップ上の蛋白質をできる限り既知の生体分子ネットワーク上の分子と対応させておく。そうすることにより、どのような観測分子の組み合わせに対しても、既知の生体分子ネットワーク上の分子との対応が用意され、あらゆる標的蛋白質について、標的蛋白質と機能既知の生体分子との関係の解析が容易になる。また、観測分子を蛋白発現マップに基づかずにプローブ手段の適用によってｍＲＮＡ発現マップにおける変動の大きいｍＲＮＡとすることもできる。もっとも、蛋白発現やｍＲＮＡ発現に基づいて観測分子を選ぶ方法には、蛋白質しか対象にできないことに留意する必要がある。
観測分子を蛋白発現マップやｍＲＮＡ発現マップに基づかずに、恣意的に選んだ低分子も含む任意の生体分子群とすることもできる。これらの分子は生体分子ネットワーク情報に含まれていることが望ましく、さらに既知の生体分子ネットワーク上の分子と対応付けられていることが望ましい。
１の標的蛋白質に対して、観測分子の数は１以上、好ましくは数十以上指定されるのが望ましいが、いかなる分子の組み合わせであっても差し支えない。例えば、特定の疾患の指標となる分子又は特定疾患の患者で増減することが知られている分子群、特定疾患の患者と正常者で発現が大きく増減する蛋白質群、特定臓器又は特定組織の特定部位に特徴的に存在する分子群、受容体に結合する生体分子群、生体分子ネットワーク中のある分子経路に含まれる分子群などから、適宜１以上の分子群を選ぶことができる。例えば、特定疾患への関連や特定臓器での発現をめやすに観測分子群を選ぶ場合の例として以下のものを挙げることができる。１）免疫に関連しているとされる全ての蛋白質と低分子のセットを定量及び／又は検出するための測定系を作れば、免疫系に関わりをもつ新たな蛋白質の発見やスクリーニングが可能になり、該当分野の新規創薬ターゲットの発見が可能になる。２）脳神経系に関連しているとされる全ての蛋白質と低分子のセットを定量及び／又は検出するための測定系作れば、例えばパーキンソン病や痴呆症のための創薬ターゲット候補の蛋白質を発見し、スクリーニングすることが可能になる。
工程（４）：生体応答データの測定
培養細胞、培養組織、培養臓器、動物個体のプローブ手段の適用に対する生体応答は、投与された細胞、組織、臓器、動物個体等での観測分子の挙動、例えば発現量及び／又は存在量の変化で測定してもよいが、例えば動物個体に投与されたプローブ手段の適用への生体応答を特定の生物材料（例えば臓器、組織、細胞など）における観測分子の挙動（例えば発現量及び／又は存在量の変化など）で測定することもできる。
観測分子の検出及び／又は定量はいかなる方法で行ってもよいが、存在量の少ない分子を検出及び／又は定量するためには感度と精度が高い方法であることが望ましい。それぞれの観測分子を抗原として抗体を作成しておけば、該観測分子の存在量をＥＬＩＳＡやＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ等の手法により、感度よく容易に定量できる。多数の観測分子の同時測定も可能である。そこで、本発明の方法の好ましい態様としては、特定の意図をもって選んだ観測分子のセット（観測分子群）に対して、抗体のセットを用意しておき、目的に応じて使い分けることが望ましい。例えば、できるだけ多様な生理作用に関わる分子を含むように組み合わされた観測分子のセットを用いれば、標的蛋白質がどの分子の存在量に強い影響を与えるかによって、生理作用への関連を推定することができる。また、特定疾患に関連した分子からなる観測分子群の抗体のセットを用いれば、標的蛋白質が該セット中の分子に与える影響によって、該特定疾患に関連する蛋白質かどうかを調べられる。さらに、興味ある疾患に関連して同様に用意した１以上の抗体セットを用いて生体応答データを測定すれば、新規の創薬ターゲットを見つけることが可能になる。観測分子の挙動の測定はいかなる手段を用いて行っても良いが、例えば、ｍＲＮＡレベルの変動を測定する場合には対応するＤＮＡプローブを固相化したＤＮＡチップを用いることができ、また蛋白質レベルの変動を測定する場合には、抽出した蛋白質を二次元電気泳動や液体クロマトグラフィー等の手段で展開し、その存在量を測定する方法を用いることができる。また、電子スペクトルその他を利用して、予め測定した各観測分子の標品のスペクトルと比較し同定する方法も考えられる。
プローブ手段の適用時及び非適用時に観測分子の発現量又は存在量を測定し、その変動（差）を生体応答データとすることが可能である。生体応答データは、プローブ手段の適用後の時間を変えて、例えば５分、２０分、１時間、４時間のように、経時的に測定を行うことにより得ることができる。さらに、２以上の用量又は濃度でプローブ手段を適用して生体応答データを測定して、解析に用いるのが望ましい。さらにまた、低分子の特異的リガンドの創製が可能な蛋白質では、本発明の好ましい態様としては、アンチセンス分子と特異的リガンドの両方をプローブ手段として適用して生体応答データを測定し、また、２種以上の構造の特徴が異なる特異的リガンドについて生体応答データを測定して解析に用いることもできる。
工程（５）：生体分子ネットワーク情報を用いた解析
既知生体分子ネットワーク上の２以上の観測分子に記述される生体応答データは、生体応答の強さと変動が現れる時間である。生体応答が強いほど、変動が現れる時間が短いほど、標的蛋白質の既知生体分子ネットワーク上の分子との関連が近いと見なすことができる。つまり、既知生体分子ネットワーク中のさまざまに分岐した生体分子のつながり（分子経路）の中で、標的蛋白質はどの分子経路のどの分子に近いかが推定できる。
さらに、最も近い観測分子が受容体なのか、リガンドなのか、酵素なのか、基質なのかの情報を考慮し、モチーフ検索や立体構造等により推定される標的蛋白質の生化学的機能を勘案して、標的蛋白質と既知生体分子ネットワーク上の分子との関係を推定することができる。最も近い分子又は分子経路から、標的蛋白質が関係する生物学的機能を推定できる。生体イベント情報をもつ生体分子ネットワーク情報が利用できれば、最も近い分子経路や分子がつながる生体イベント情報に基づいて、疾患への関わりを推定できる。経由する生体分子の数や生体分子間の直接の相互作用の情報の信頼性に基づいて、評価スコアを計算できるようにすると、２以上の分子経路又は分子との関連が推定される場合に順位付けできる。
既存の生体分子のネットワーク型データベースとしては、代謝経路上の分子やシグナル伝達に関わる既知分子を対象としたＫＥＧＧ（京大、金久ら）、ＧｅｎｅＮｅｔ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ　＆　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｆ．Ａ．Ｋｏｌｐａｋｏｖ）がある。しかし、これらの既存データベースは各分子の分子レベルの作用情報（例えば、リン酸化とか受容体に結合など）を含んでいるものの、細胞レベル以上での生体イベント情報（例えば、平滑筋の収縮や血糖降下など）については含まれないため、疾患や症状や副作用との関連は何ら示唆されない。本発明の方法で利用する生体分子ネットワーク情報としては、生体分子間のつながりの情報や生化学レベルの作用情報だけでなく、生体分子がもたらす細胞レベル以上での生体応答等の生体イベントや特定分子によって該イベントが上昇するか低下するかの情報を含んでおり、標的蛋白が直接又は間接に関連する生体応答から疾患まで容易に理解できるものが便利である。そのような生体分子ネットワーク型データベースの例として、ＫｅｙＭｏｌｎｅｔ（発明の名称「分子機能ネットワークの生成方法」、日本特許出願：特願２０００−２７６６９９号）がある。
ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法その他の方法により標的蛋白質と直接相互作用する別蛋白質がわかっている場合には、標的蛋白質と同様に、該別蛋白質についてもプローブ手段を取得し生体応答データを測定して比較することにより、標的蛋白質の生体分子ネットワーク上の位置付け、機能や疾患との関連の推定を確かにすることができ、２以上の生物学的機能未知の蛋白質について機能や疾患との関連を推定することができる。
解析の結果、標的蛋白質と、生物学的機能が既知の生体分子間のつながりである生体分子ネットワークへのつながりが間接的であり、別の１以上の生体分子が介在しているらしいことが示唆される場合には、次々に別の分子に上記の工程を行うことで、既知生体分子ネットワークとの関連を明らかにすることができる。例えば、蛋白質Ａについての特異的リガンド又ばアンチセンス分子による発現の変動の大きい蛋白質Ｂについて上記の工程を行い、同様にして蛋白質Ｃについて同様の工程を行うことにより、蛋白質Ａは蛋白質Ｂと直接関係があり、蛋白質Ｂは蛋白質Ｃと直接関係があり、蛋白質Ｃが既知生体分子ネットワークのいずれかの蛋白質に一致するといったことがわかる。既知生体分子ネットワーク上の分子にたどり着くまで上記の工程を繰り返すことにより、標的蛋白質から既知生体分子ネットワーク上のどれかの分子へのつながりの情報が得られ、かつ途中に介在する生体分子を同定することができる。蛋白発現の二次元電気泳動マップ上の蛋白質はアミノ酸配列は決定できても、機能が未知なために生体分子ネットワーク情報に加えられないものが多い。そのため蛋白発現の変動が大きくてもその情報を利用することが難しいが、上記の繰り返し作業によりそれらを生体分子ネットワーク情報に加え、ネットワーク情報を拡張することができるのも本発明の方法の特徴の一つである。
工程（６）：創薬ターゲットとしての妥当性の判断
この工程は必要に応じて付加的に行うことができる。標的蛋白質の創薬ターゲットとしての妥当性の判断は、動物おける病態指標や観測分子の存在量等の改善で簡単に判断できる場合はそれで十分である。しかし、そうでない場合や蛋白発現又は対応するｍＲＮＡ発現で評価する場合には、機能上又は生合成上で該蛋白質と関連した生体分子間の関わりを示す分子ネットワークに関する情報を利用した工程５の結果を用いて行うのが望ましい。これにより分子ネットワーク上関連する蛋白の発現がプローブ手段の適用によって好ましい方向に変化しているかどうか解析できる。利用する生体分子ネットワーク情報の種類は特に限定されないが、特に「分子機能ネットワークの生成方法」（特願２０００−２７６６９９号明細書）の生体分子ネットワーク情報のように、細胞レベル以上での生体応答を生体イベント情報をとして含む生体分子ネットワーク情報であることが望ましい。創薬ターゲット候補の蛋白質から標的疾患や症状の直接原因となる生体イベント又は生体分子までの分子のつながりが明確になり、他の生体イベントへのつながりが推定できる。
副作用リスクが低いことも創薬ターゲットとしての必要条件である。副作用には創薬ターゲットの設定によって必然的にもたらされる副作用と、化合物（リガンド）の構造によっておきるものがある。生体分子ネットワーク上で全く関係のない生体高分子に結合して副作用となる後者の場合には、その後の構造修飾や全く構造の異なるリガンドの探索で回避することも可能であるが、前者の場合は回避することが難しく該蛋白質を創薬ターゲットとするのは妥当でない。前者は生体分子ネットワーク情報からある程度予測はできるが、実際に特異的リガンド及び／又はアンチセンス分子によって主作用とのバランスを確認しておくことは有用である。生体イベント付き生体分子ネットワーク情報の利用により、副作用となる生体イベントが関係する別の生体分子ネットワークの存在等が理解できるからである。
また、リガンドの構造によっては代謝によるクリアランスが非常に早い場合があり、必要に応じて代謝酵素等による分解を確認しておく。該蛋白質の遺伝子のノックアウト動物の動物、臓器、組織、細胞での実験結果が利用できる場合には、その影響を特異的リガンド及び／又はアンチセンス分子を与えた場合の影響と比較するのが望ましい。また、ＨＴＳ又はバーチャルスクリーニングにより創製した特異的リガンド群が活性の強さ又は溶解性等の物性が十分でない場合には、該リガンド群のアナログ化合物を市販化合物から探索し、又は合成して改良したものを用いてもよい。
本発明の方法の特徴は以下のように要約できる。
生物学的機能が既知の生体分子間の機能上又は生合成上のつながりを示す生体分子ネットワーク情報に関係付けることにより、配列以外の情報を利用できない標的蛋白質に関連する生物学的機能及び／又は疾患を推定することができる。
その関係付けの手段として、該蛋白質の特異的リガンド又はアンチセンス分子などをプローブ手段として、望ましくは既知生体分子ネットワーク上の分子である観測分子群の存在量が受ける影響などを生体応答データとして測定して解析する。
プローブ手段の適用によって蛋白又はｍＲＮＡの発現が大きく影響される蛋白質群を観測分子とするほか、任意に選んだ観測分子群を観測分子とすることができ、観測分子群として低分子を含めることにより、発現量の少ない蛋白質を検出及び／又は定量することが可能になる。
２以上の観測分子に対して作成した抗体をセットにして用意しておくことにより、多数の観測分子の高感度な同時測定が可能である。
観測分子群の存在量の時間変化その他の解析に基づいて、標的蛋白質の既知生体分子ネットワーク上の分子との直接的間接的つながりを推定することにより、該蛋白質が関連する生物学的機能及び／又は疾患を推定できる。
意図をもって選んだ観測分子群を観測分子とすることにより、多数の機能未知の蛋白質群から、特定疾患又は特定生物学的機能に関連した蛋白質がスクリーニングできる。
生体イベント情報を含む生体分子ネットワーク情報を使用することにより、標的蛋白質と該ネットワーク中の分子経路との関連付けから疾患との関わりが推定できる。
上記解析を実施することにより標的分子が創薬ターゲットとして適切であるか否か、また標的分子を創薬ターゲットとして医薬を開発した際の副作用は何かに関して推定できる。
本発明の方法の実施の一つの態様として、次の例を挙げることができる。
特異的リガンドを用いた場合
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アンチセンス化合物を用いた場合の実施の一例
2002040990.tif 000006
本発明の方法により推定される標的蛋白質の生物学的機能は必ずしも一つに限られず、本発明の方法を行うことによって標的蛋白質がどのような機能又はどのような疾患に関連しているかを推定できる。生化学的機能について配列情報から推定できるものは、その推定された機能を本発明の方法においても利用することが可能である。生体分子の生物学的機能は他の生体分子との関わりによって決まるものであり、その分子自身（その分子のみ）をいかに詳しく研究してもわからないが、本発明の方法では、該蛋白質の特異的リガンド又は該蛋白質の遺伝子に対するアンチセンス分子等をプローブ手段として、生体そのものや該蛋白質以外の生体分子の発現や存在量などへの影響を生体応答として測定して解析することにより、標的蛋白質の機能を簡便に推定できるという特徴がある。また、生物学的機能既知の生体分子間の機能上又は生合成上の関わりを示す生体分子ネットワーク情報を用いて、標的蛋白質がネットワーク上のどの分子に対して近い関係にあるかを解析して推定することにより、さらに効率的に機能推定を行うことが可能になる。
一般的に、生体分子の量と機能は、フィードバックコントロール等の機構により複雑に制御されており、１の分子への影響が最終的には広くおよんでしまうことがある。そこで、プローブ手段の適用後の経過時間を変えて生体応答データを測定することにより、標的蛋白質と近いつながりがあるネットワーク上の分子又は分子経路を推定することができ、その分子又は分子経路の関わる生物学的機能や疾患から、該蛋白質がどのような生物学的機能や疾患に関わっているかを大まかに推定することができる。
この様な解析を行った結果、ＨＴＳ等本格的医薬開発に取りかかる前に、該蛋白質の創薬ターゲットとしての妥当性を評価し、該蛋白質を創薬ターゲットとして医薬化合物を開発した場合の副作用リスクを評価し、その中から適切な創薬ターゲットを選ぶための情報を得ることが可能であり、本発明は創薬ターゲットのバリデーション法としても有用である。プローブ手段として特異リガンドを用いた場合には、医薬リード情報付きで創薬ターゲットの評価情報が得られ、よりいっそう有用である。
産業上の利用可能性
本発明の方法により、蛋白質の機能、より具体的には、蛋白質の関わる生物学的機能及び／又は疾患を推定することができ、例えば、該蛋白質が創薬ターゲットとして妥当であるか否かを容易に確認することができる。
【国際調査報告】
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