(57)【要約】キメラオリゴヌクレオチドプライマーを利用した核酸増幅反応により大量に供給される核酸を、その核酸に固相へ固定化するための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有する形で作製し、高い効率をもって固相に固定化することで高品質の核酸固定化物を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を包含する核酸増幅方法で得られる増幅核酸であって、当該増幅核酸が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有することを特徴とする増幅核酸：
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、デオキシリボヌクレオチド３リン酸の一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸であり、そして／またはデオキシリボヌクレオチドの一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドであり；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程。
【請求項２】
固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドが固相の官能基と共有結合可能な官能基を有する修飾デオキシリボヌクレオチドである請求項１に記載の核酸増幅物。
【請求項３】
反応混合物がさらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とする請求項１記載の増幅核酸。
【請求項４】
デオキシリボヌクレオチドの一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドである請求項１記載の増幅核酸。
【請求項５】
デオキシリボヌクレオチド３リン酸の一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸である請求項１記載の増幅核酸。
【請求項６】
増幅核酸がリボヌクレオチドを含有する増幅核酸である請求項１記載の増幅核酸。
【請求項７】
増幅核酸がリボヌクレオチドを含有しない増幅核酸である請求項１記載の増幅核酸。
【請求項８】
ＲＮａｓｅＨが大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーモトガ属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーマス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、及びバチルス属細菌由来ＲＮａｓｅＨから選択されるＲＮａｓｅＨである請求項１記載の増幅核酸。
【請求項９】
ＲＮａｓｅＨが大腸菌由来のＩ型ＲＮａｓｅＨである請求項１記載の増幅核酸。
【請求項１０】
ＲＮａｓｅＨがピロコッカス  フリオサスあるいはピロコッカス  ホリコシイ由来のＩＩ型ＲＮａｓｅＨである請求項１記載の増幅核酸。
【請求項１１】
請求項１記載の増幅核酸を、固相の予め定められた領域に固定化し、整列させたことを特徴とする増幅核酸固定化物。
【請求項１２】
固定化が共有結合による請求項１１記載の増幅核酸固定化物。
【請求項１３】
下記工程を包含する方法によって得られる増幅核酸固定化物：
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、２種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで一方のプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、デオキシリボヌクレオチドの一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、他方のプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同であり固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しないキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
（ｃ）工程（ｂ）において得られる増幅核酸を、固相の予め定められた領域に固定化し、整列させる工程、および
（ｄ）固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しないキメラオリゴヌクレオチドプライマーの伸長鎖のみを遊離させる工程。
【請求項１４】
工程（ｃ）の固定化が共有結合による請求項１３記載の増幅核酸固定化物。
【請求項１５】
下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー：
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドアナログであって少なくとも１以上は固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドである、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよい）
【請求項１６】
ｃが０である請求項１５に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１７】
デオキシリボヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドである請求項１５記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１８】
下記工程を包含することを特徴とする固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有する増幅核酸の製造方法：
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、デオキシリボヌクレオチド３リン酸の一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸であり、そして／またはデオキシリボヌクレオチドの一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドであり；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程。
【請求項１９】
下記工程を包含することを特徴とする増幅核酸固定化物の製造方法：
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、デオキシリボヌクレオチド３リン酸の一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸であり、そして／またはデオキシリボヌクレオチドの一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドであり；
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られる増幅核酸を固相の予め定められた領域に固定化し、整列させる工程。
【請求項２０】
下記工程を包含することを特徴とする増幅核酸固定化物の製造方法：
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、２種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで一方のプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、デオキシリボヌクレオチドの一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、他方のプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同であり固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しないキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
（ｃ）工程（ｂ）において得られる増幅核酸を、固相の予め定められた領域に固定化し、整列させる工程、および
（ｄ）固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しないキメラオリゴヌクレオチドプライマーの伸長鎖のみを遊離させる工程。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、遺伝子解析の分野で有用な高感度ＤＮＡチップに関する。
背景技術
核酸が固定化された担体、例えばＤＮＡチップは、遺伝子機能解析プロジェクトを飛躍的に進展させるためのツールとして開発され、すでに酵母の全遺伝子や培養細胞、あるいは臓器における遺伝子の発現解析に広く使用されている。ＤＮＡチップ（あるいはＤＮＡアレイ）作製方法としては、例えばチップ固相上のあらかじめ定められた領域で１本鎖ＤＮＡを合成する方法、あるいはあらかじめ調製された１本鎖ＤＮＡあるいは２本鎖ＤＮＡをチップ固相上のあらかじめ定められた領域にスポッティングする方法が知られている。上記前者のＤＮＡチップとしては、米国特許第５４４５９３４号、米国特許第５７４４３０５号あるいは米国特許第５７００６３７号に記載の高密度オリゴヌクレオチドアレイが例示される。また、上記後者の方法としては、米国特許第５８０７５２２号あるいは国際公開公報９８／１８９６１号パンフレットに記載のスポッティングアレイが例示される。該方法を用いれば、チップ固相上のあらかじめ定められた領域にスポッティングすることで作製することができる。たとえば、ポリＬ−リジンコーティングやシラン化など、特殊加工したスライドガラスなどの固相基板上に、ＤＮＡ断片をピン先で物理的にスポットしていく。この場合、固相基板とＤＮＡ断片との結合は静電的に行なわれるものであり、固相基板のコーティングの状態によりその結合の効率に違いが認められる。一方、上記高密度オリゴヌクレオチドアレイにおいては、高密度での固相合成法のための大規模な装置が必要となる。また、該方法では長鎖のヌクレオチド鎖を合成することが、合成収率の観点からも困難である。
さらに、いずれの作製方法においても固定化する核酸を大量に合成する必要がある。核酸を増幅する方法は、オリゴヌクレオチドのような短鎖のＤＮＡの合成を除けば、そのほとんどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）があるが、それは米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号に詳細に記述されている。もう一つの例としては、トレンズ  イン  バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第１０巻、１４６〜１５２頁（１９９２）に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）が挙げられる。上記の方法の開発により、ＤＮＡから、若しくはＲＮＡから目的とする領域を増幅することが可能になった。
これらのＤＮＡ合成方法は、目的とするＤＮＡ領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、もしくは、”シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸  酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６））と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施される。
さらに、別法としては、１９８９年６月１４日に公開された欧州特許出願第３２０，３０８号に記述されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、あるいはＰＣＲ  プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，１９９０）２４５〜２５２頁に記述されている転写増幅システム（ＴＡＳ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）法が挙げられる。上記４法は、次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生するために、高温及び低温の反応を何回も繰り返す必要がある。このように温度によって反応が制約されるため、反応系は不連続な相またはサイクルで行なう必要がある。従って、上記の方法には広い温度範囲で、かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうため設定温度にするために要する時間が必要であり、そのロス時間はサイクル数に比例して増大していく。
そこで、上記問題点を解決すべく等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、日本国第２０７６０９６号あるいは第２０８７４８７号特許公報に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、自立複製（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許番号第２６５０１５９号に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許番号第２７１０１５９号に記載のＱβレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第５，８２４，５１７号、国際公開パンフレット第９９／０９２１１号、国際公開パンフレット第９５／２５１８０号あるいは、国際公開第９９／４９０８１号等に記載の種々の改良ＳＤＡ法が挙げられる。米国特許番号第５，９１６，７７７号には等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。これらの等温核酸増幅法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物（または元の標的配列）へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こる。
これらの等温核酸増幅法のうち最終的にＤＮＡが増幅される系、例えば、ＳＤＡ法は、ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼを介する二本鎖の置換による、試料中の標的核酸配列（およびその相補鎖）の増幅法であるが、該方法では、増幅に使用するプライマーは４種類必要であり、その内の２種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要がある。また、該方法では、ＤＮＡ合成のための基質として、修飾されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸、例えばα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子（Ｓ）に置換された（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチド３リン酸を大量に用いる必要があり、ルーチンワークで反応を行なう遺伝子検査等においては、そのランニングコストが深刻な問題となってくる。さらに該方法では、増幅されたＤＮＡ断片中に上記の修飾ヌクレオチド、たとえば（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅後のＤＮＡ断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析に供しようとする場合に、該断片が制限酵素で切断できないことがある。
また、米国特許番号第５，８２４，５１７号記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、少なくとも３’末端にＤＮＡが配置された構造を必須要件とするキメラプライマーを使用するＤＮＡ増幅方法である。また、国際公開パンフレット第９９／０９２１１号に記載の改良ＳＤＡ法は、３’突出末端を生じさせる制限酵素が必要である。また、国際公開パンフレット第９５／２５１８０号に記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマー対を必要とする。さらに、国際公開パンフレット第９９／４９０８１号に記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマーと少なくとも１種類の修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸を必要とする。一方、米国特許番号第５，９１６，７７７号は、オリゴヌクレオチドを合成するために、３’末端にリボヌクレオチドを有するプライマーを使用してＤＮＡを合成し、反応終了後にエンドヌクレアーゼによりプライマー伸長鎖中のプライマーと伸長鎖の間にニックをいれて分離させ、テンプレートを消化し、さらにプライマーを回収して再利用するというものである。該方法では、プライマーを再利用する際には反応系よりプライマーを単離したうえで鋳型を再度アニーリングさせる必要がある。また、国際公開パンフレット第００／２８０８２号に記載のＬＡＭＰ法は増幅に４種類のプライマーを必要とし、また、増幅産物は増幅の標的とされた領域が繰り返された、サイズの一定しないＤＮＡである。
以上のように、従来の核酸増幅法では核酸固定化担体用の核酸を大量に製造し供給することは困難であった。大量の核酸を製造する方法及び低コストの核酸固定化物及びその製造方法として国際公開パンフレット第００／５６８７７号に記載のＩＣＡＮ法があるが、該方法においては得られる増幅断片中にリボヌクレオチドが含まれる場合があり、該増幅断片を固相に固定化した場合、後処理の条件によっては、固定化された核酸が分解、遊離するという問題があった。
発明の目的
本発明の主な目的は、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを利用した核酸増幅反応により大量に供給される核酸を、その核酸に固相へ固定化するための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有する形で作製し、高い効率をもって固相に固定化することで高品質の核酸固定化物を得ることにある。
発明の概要
本発明者らは、鋭意研究の結果、リボヌクレオチドが３’末端もしくは３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマー、エンドリボヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下に目的とする領域のＤＮＡを増幅する核酸増幅法であるＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法を用いた核酸固定化物作製用核酸の製造方法を構築した。
さらに本発明者らは、増幅核酸を固相に固定するための修飾を行なったプライマーあるいは修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸を用いて上記ＩＣＡＮ法を行い、修飾デオキシリボヌクレオチドを含有する形のＩＣＡＮ反応産物を得ることができた。こうして得られた修飾デオキシリボヌクレオチドを含有する形のＩＣＡＮ反応産物を固相に固定し、核酸固定産物を作製する方法を構築し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の第１の発明は、下記工程を包含する核酸増幅方法で得られる増幅核酸であって、当該増幅核酸が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有することを特徴とする増幅核酸に関する。
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、デオキシリボヌクレオチド３リン酸の一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸であり、そして／またはデオキシリボヌクレオチドの一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドであり；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程。
本発明の第１の発明において、固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドは、固相の官能基と共有結合可能な官能基を有する修飾デオキシリボヌクレオチドであってもよく、さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用してもよい。また、本発明の第１の発明に用いる核酸増幅方法は
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、該デオキシリボヌクレオチドの一部は固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドであり；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含してもよい。
また、本発明の第１の発明に用いる核酸増幅方法は、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、デオキシリボヌクレオチド３リン酸の一部は固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸であり；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含してもよい。
さらに、本発明の第１の発明によって、リボヌクレオチドを含有する増幅核酸、あるいはリボヌクレオチドを含有しない増幅核酸のいずれもが好適に調製できる。
本発明の第１の発明において使用するＲＮａｓｅＨは、特に限定はされないが例えば、大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーモトガ属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーマス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、及びバチルス属細菌由来ＲＮａｓｅＨから選択することができる。特に、大腸菌由来のＩ型ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス  フリオサスあるいはピロコッカス  ホリコシイ由来のＩＩ型ＲＮａｓｅＨのいずれもが好適に使用できる。
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明で得られた増幅核酸を用いて、固相の予め定められた領域に固定化し、整列させたことを特徴とする増幅核酸固定化物に関する。該増幅核酸固定化物において、増幅核酸は固相の予め定められた領域に共有結合で固定化されていてもよい。
また本発明の第２の発明の増幅核酸固定化物は、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同であり固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しないキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して得られる本発明の第１の発明の増幅核酸を、固相の予め定められた領域に固定化し、整列させたのち、固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しないキメラオリゴヌクレオチドプライマーの伸長鎖のみを遊離させて得られる増幅核酸固定化物であってもよい。
さらに本発明の第２の発明の増幅核酸固定化物は、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同であり固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しないキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して得られる本発明の第１の発明の増幅核酸を、固相の予め定められた領域に共有結合で固定化し、整列させたのち、固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しないキメラオリゴヌクレオチドプライマーの伸長鎖のみを遊離させて得られる増幅核酸固定化物であってもよい。
本発明の第３の発明は、下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドアナログであって少なくとも１以上は固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドである、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよい）
本発明の第３の発明において、上記一般式のｃは、０のキメラオリゴヌクレオチドプライマーであってもよく、デオキシリボヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。
本発明の第４の発明は、本発明の第１の発明の増幅核酸の製造方法に関する。
本発明の第５の発明は、本発明の第２の発明の増幅核酸固定化物の製造方法に関する。
発明の詳細な説明
本明細書において、デオキシリボヌクレオチド（本明細書中ではｄＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
さらに、本明細書において、固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドとは、固相への固定化に適した修飾を付したデオキシリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドアナログをいい、たとえばアミノ基、アルデヒド基あるいはアシル基等の官能基の付加又はビオチン付加等の修飾がされているデオキシリボヌクレオチドやデオキシリボヌクレオチドアナログを含む。このような固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドも上記デオキシヌクレオチドに包含される。
本明細書においてリボヌクレオチド（本明細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載する］やこの他の誘導体等も含まれる。
本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するプライマーのことを言う。該プライマーはデオキシリボヌクレオチドアナログおよび／または修飾デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有していてもよい。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーの３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において核酸鎖が伸長でき、エンドヌクレアーゼで切断でき、鎖置換反応を行うことができるものであれば、いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含される。
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より３’末端にかけての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分を指す。
本明細書においてエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡに作用して、該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するものであればよい。
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素のことを言い、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素としては、例えば鎖置換（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマー
本発明の方法において使用されるプライマーは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。該プライマーには未修飾デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾デオキシリボヌクレオチド、未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプライマーも含まれる。さらに、該プライマーは、デオキシリボヌクレオチドアナログを含有してもよい。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、その３’末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能であり、さらに、その３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドが配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。当該プライマーは通常、増幅しようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅しようとする領域に対応する塩基配列の３’側部分に相補的に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となる核酸（ＤＮＡ）にアニーリング可能な塩基配列を意味する。
「実質的に相同な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となる核酸（ＤＮＡ）の相補鎖にアニーリング可能な範囲で、鋳型となる核酸（ＤＮＡ）に相同な塩基配列のことをいう。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは１以上の修飾リボヌクレオチドを含有するものであってもよい。即ち、本明細書においてリボヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、エンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるものであれば、未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドのいずれであってもよく、そのような未修飾あるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含される。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用することができ、さらにこれらを組合せて使用することができる。このような修飾リボヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）リボヌクレオチドや、リボースの２位の水酸基がメトキシ基に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、米国特許第５，００３，０９７号記載の硫化反応試薬（グレンリサーチ社製）を用いた方法で調製した（α−Ｓ）リボヌクレオチド３リン酸、あるいは２−ＯＭｅ−ＲＮＡ−ＣＥ  ホスホアミダイド試薬（グレンリサーチ社製）を用いて作製することができる。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、特に限定するものではないが、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さのものが好ましい。さらに好ましくは、約１５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さのプライマーである。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。該プライマーは、後に示す段階で使用されるエンドヌクレアーゼにより認識される配列を３’末端又は３’末端側に含む。
本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーよりＤＮＡポリメラーゼで伸長されたＤＮＡ鎖（プライマー伸長鎖）に含まれるリボヌクレオチド含有部位がエンドヌクレアーゼで認識あるいは切断されるような構造を有しており、当該リボヌクレオチドはその３’末端又は３’末端側に配置されている。本発明を特に限定するものではないが、例えば、鋳型核酸にアニーリングした、上記の一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡにＲＮａｓｅＨを作用させた場合には、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーのリボヌクレオチド部分が切断され、上記オリゴヌクレオチドプライマーと伸長により合成されたＤＮＡ鎖の間にニックの入った二本鎖ＤＮＡが生じる。さらに、該ニックの入った部位からＤＮＡポリメラーゼにより鎖置換反応がおこる。従って、プライマーの３’末端から核酸鎖を伸長させることができ、エンドヌクレアーゼにより切断されることができ、そしてＤＮＡポリメラーゼにより鎖置換反応ができるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは全て本発明の方法に使用することができる。
さらに本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、上記のリボヌクレオチドが配置された部位の５’側に１以上の修飾デオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドアナログを含有するものであってもよい。即ち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で修飾デオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該修飾デオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該修飾デオキシヌクレオチドとしては、特に限定されないが、アミノ基の導入された修飾デオキシリボヌクレオチドが挙げられ、デオキシリボヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチドあるいは７−デアザグアニンのような修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドアナログが挙げられる。
本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、特に限定はされないが例えば、下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適である。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドアナログであって少なくとも１以上は固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドである、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよい）
特に限定はされないが、例えばｂが１以上の整数、ｃが１以上の整数であれば、５’−ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’型のキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。
上記一般式のｃは、０のキメラオリゴヌクレオチドプライマーであってもよく、デオキシリボヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。
また、担体への固定化のために使用する官能基（例えば、アミノ基、アルデヒド基あるいはアシル基等）又はビオチン等の付加は、ｄＮａ部分及び／又はｄＮｃ部分のいずれかのヌクレオチドに付加されているものが好適に使用できる。特に限定はされないが、５’側のｄＮａ部分のいずれかのヌクレオチドにアミノ基が付加したキメラオリゴヌクレオチドプライマー、３’側のｄＮｃ部分のいずれかのヌクレオチドにアミノ基が付加したキメラオリゴヌクレオチドプライマーならびに５’側のｄＮａ部分のいずれかのヌクレオチド及び３’側のｄＮｃ部分のいずれかのヌクレオチドにアミノ基が付加したキメラオリゴヌクレオチドプライマーが好適に使用できる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド  バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
（２）本発明で使用されるエンドヌクレアーゼ
本発明で使用されるエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記（１）に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーによりＤＮＡの伸長を行なって生成した二本鎖ＤＮＡに作用して、鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断しうるものであればよい。すなわち、上記二本鎖ＤＮＡのうちのキメラオリゴヌクレオチドプライマー部分にニックを生成しうる酵素である。たとえば、リボヌクレアーゼが使用でき、特にＤＮＡとＲＮＡとから形成された二本鎖核酸のＲＮＡ部分に作用するエンドリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）が好適に使用できる。また、該リボヌクレアーゼには、上記作用を有するものであれば、常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼのいずれもが好適に本発明に使用できる。例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来のＲＮａｓｅＨや、耐熱性リボヌクレアーゼとしてはサーモトガ属細菌由来のＲＮａｓｅＨ、サーマス属細菌由来のＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来のＲＮａｓｅＨ、バチルス属細菌由来のＲＮａｓｅＨ等も好適に使用できる。本発明の方法においてＲＮａｓｅＨは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型のいずれもが使用できる。
特に限定はされないが、例えばピロコッカス属細菌由来のＲＮａｓｅＨのうち、ピロコッカス  フリオサス或いはピロコッカス  ホリコシイ由来のＩＩ型ＲＮａｓｅＨは、上記（１）記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーが実質的に相補的である核酸にアニーリングし伸長して得られたキメラ二本鎖核酸に含まれるＲＮＡとＤＮＡのジャンクション部分のＲＮＡの５’部分を特異的に切断し、ＲＮＡが一つである場合にも切断する。すなわち、ＩＣＡＮ反応では上記（１）記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに含まれるＲＮＡ部分がその３’側より順に切断され最終的に得られるＩＣＡＮ産物にＲＮＡが含まれない形となる。該増幅産物は、本発明の核酸固定化物のための固定化用核酸として好適に使用できる。
（３）本発明で使用されるＤＮＡポリメラーゼ
本発明には、ＤＮＡの鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。また、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが特に好適に使用することができる。
本発明において、「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）することができる活性のことをいう。
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、バチルス  カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉと称す）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのラージ  フラグメント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。
Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、このような酵素の例として、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）等が挙げられる。
なお、ＤＮＡポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、ＲＮａｓｅＨ活性を有するものが知られている。このようなＤＮＡポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。すなわち、該ＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現されるような条件下、例えばＭｎ２＋の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様においては、上記ＲＮａｓｅＨを添加することなく本発明の方法を実施することができる。本発明者らは、Ｍｎ２＋を含有する緩衝液中で上記のＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼがＲＮａｓｅＨ活性を示すことを初めて明らかにし、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素を含有しない反応液中で本発明の核酸増幅法が実施できることを実証した。なお、上記の態様はＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、ＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つことが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼ、例えばサーマス  サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用することができる。
（４）本発明に使用されるデオキシリボヌクレオチド３リン酸
本発明に使用される伸長反応の基質となるデオキシリボヌクレオチド３リン酸は、ＰＣＲ法等に使われるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。当該ｄＮＴＰは、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、ｄＮＴＰのアナログ、たとえば７−デアザ−ｄＧＴＰ等を含んでいてもよい。また、同じく使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、ＩＣＡＮ反応により得られるＩＣＡＮ産物を固相に固定化するための修飾デオキシヌクレオチド３リン酸、たとえばＡｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰ、ビオチン標識デオキシヌクレオチド（いずれもシグマ社製）等を含んでいてもよい。
（５）本発明の核酸増幅方法
本発明の核酸増幅方法は、上記（１）に示されたオリゴヌクレオチドプライマーを少なくとも１種類使用し、さらに上記（２）に示されたエンドヌクレアーゼおよび上記（３）に示されたＤＮＡポリメラーゼ、上記（４）で示されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸を組み合わせて反応を行うことにより得ることができる。
このＩＣＡＮ法では、反応に使用されるプライマーがほぼ１００％利用され、目的とする領域の増幅量がこれまでの増幅反応たとえばＰＣＲ法に比べると数倍得ることができ、また経時的な温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、大容量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。
本発明の方法において鋳型となる核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮＡには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。さらに、逆転写用プライマーとして、逆転写後のｃＤＮＡを鋳型とした本発明の核酸増幅法を行う際に鎖置換反応のためのプライマーとして使用可能なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。このようなプライマーは、上記（１）に記載された性質を有し、かつＲＮＡからの逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はない。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。例えば、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。
また、別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含むＤＮＡあるいはＲＮＡをあらかじめ複製した後、本発明の増幅核酸を得る方法の鋳型となる核酸として用いてもよい。該複製の方法としては、特に限定はされないが、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターで適当な宿主を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養して、上記増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターを抽出して使用する方法が例示される。該ベクターは、宿主内で安定して複製されるものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、宿主は、使用されるベクターを保持することができるものであれば特に限定はなく、例えば、培養が容易な大腸菌等が例示される。
さらに、上記複製方法の別態様としては、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼで該塩基配列を有するＲＮＡを転写した後、該ＲＮＡをそのまま、あるいは逆転写反応によりｃＤＮＡとして本発明の方法の鋳型に用いてもよい。上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片はＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有していれば特に限定はなく、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するベクターに挿入されたものでもよいし、末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するアダプターあるいはカセットをライゲーションさせたものでもよいし、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するプライマーと適切な鋳型を用いて酵素的に合成したものであってもよい。すなわち、上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を、上記のように配置されたＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を用いて、ＲＮＡの形で複製、増幅することができる。上記ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、該ベクターは、環状のままあるいは直鎖状に処理したもののいずれもが好適に使用できる。さらに、上記の複製、増幅方法に用いられるＲＮＡポリメラーゼは特に限定はなく、例えば、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼあるいはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ等が好適に使用できる。
このような形で本発明の増幅核酸を得るための鋳型となる核酸を作製すれば、限られた種類の上記（１）に示されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して非常に多種類の増幅核酸を得ることができる。すなわち、ＤＮＡチップに固定化するためのＤＮＡ断片のような多種類で大量のＤＮＡ断片を本発明の増幅核酸の形で得ることができる。
上記鋳型の長さは、標的配列がその断片中に完全に含まれるか、または標的配列の十分な部分が少なくとも断片中に存在することにより、上記（１）に示されたオリゴヌクレオチドプライマー配列の十分な結合を提供するようなものがよい。
以上のようなゲノムＤＮＡや増幅核酸断片のような二本鎖ＤＮＡ、および全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡのいずれもが本発明の増幅核酸を得るための鋳型ＤＮＡとして好適に使用できる。上記二本鎖ＤＮＡの場合は、一本鎖ＤＮＡに変性する工程（デネーチャー）を施してもよく、また該変性の工程を不要とするＲＮａｓｅＨを組み合わせてもよい。該ＲＮａｓｅＨとしては、Ｐ．ｆｕ或いはＰ．ｈｏ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨが例示される。
本発明の増幅核酸を得る場合、特に限定するものではないが、例えば鋳型ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合にはそれらを変性して一本鎖にすることにより鋳型ＤＮＡ鎖へのプライマーの結合を可能にさせることができる。二本鎖ＤＮＡが変性する温度、例えば約９５℃で保持することは好ましい変性法である。他の方法はｐＨの上昇を含むが、オリゴヌクレオチドプライマーを標的物に結合させるためには、増幅反応時にｐＨを低下させる必要がある。上記のような二本鎖を一本鎖ＤＮＡに変性する工程、もしくは、鋳型がＲＮＡの場合、逆転写反応によりｃＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）を調製する工程の後、等温条件下において、連続的に核酸が増幅される。ここで、「連続的に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応が進行していることを意味する。また、本明細書において「等温」とは、酵素および核酸鎖が上記各工程において機能する、実質的に一定の温度条件のことを意味する。
本発明の増幅核酸を得るための核酸増幅反応は、例えば、クレノウ断片のような常温性ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより常温（例えば３７℃）でも実施できるが、耐熱性を有する酵素（エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して高温、例えば５０℃以上で、さらに例えば６０℃以上で実施することができる。この場合、プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、ＤＮＡ増幅の特異性が向上し、また鋳型ＤＮＡの二次構造が解消されることによりＤＮＡポリメラーゼの伸長性も向上する。さらに該方法においては、逆転写反応および核酸の増幅を連続して行なう態様も可能であり、上記反応に逆転写酵素を組み合わせて、あるいは逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡ由来の配列を有するＤＮＡを増幅することができる。
特に限定するものではないが、本発明の増幅核酸を得る反応の各態様において、好ましくは、まず一本鎖の鋳型ＤＮＡに該ＤＮＡに相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせる。次にＤＮＡポリメラーゼの作用により、当該プライマーの３’末端より鋳型ＤＮＡの残りの配列に沿って鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ（プライマー伸長鎖）を伸長させて二本鎖ＤＮＡを合成する。エンドヌクレアーゼは当該二本鎖ＤＮＡに作用してプライマー伸長鎖のプライマー部分からの新たなＤＮＡの伸長を開始させる。エンドヌクレアーゼは上記の二本鎖ＤＮＡにニックを入れるニッキング酵素として作用するか、あるいはキメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ構造を変化させるが、理論によって限定はされない。さらに、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼがニックの入った二本鎖ＤＮＡのニックの３’末端からＤＮＡ鎖を再伸長して新たなプライマー伸長鎖を生成し、同時にニックの３’末端から下流のＤＮＡを遊離させる。
本発明の増幅核酸を得るための核酸増幅方法は、鋳型核酸に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、置換鎖に相補的なもう１種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの２種のプライマーを使用して実施することができる。この場合、一方のプライマーは鋳型となるＤＮＡ鎖に結合して鎖置換反応を起し、そして他方のプライマーは上記の鎖置換反応によって遊離した置換鎖に結合し、新たな鎖置換反応を開始する。この態様を使用すると、各反応産物が他のプライマーのための鋳型として機能できることは明らかである。このように鋳型量が増加することにより、非直線的に増幅産物が増加する。この時、キメラオリゴヌクレオチドの一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドであることにより、本発明の増幅核酸を得ることができる。
二本鎖ＤＮＡを鋳型に用いて本発明の増幅核酸を得るための核酸増幅方法を実施する場合には、二本鎖のそれぞれにアニーリングするキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、両方の鎖を増幅反応の鋳型とすることができる。二本鎖ＤＮＡを変性した後に反応を開始する場合には、変性する前または後に、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、４種のデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを反応液に添加する。熱処理により二本鎖ＤＮＡを変性し、かつ耐熱性の酵素を使用しない場合には、変性後に酵素を添加することが好ましい。この時、デオキシリボヌクレオチド３リン酸の一部が固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸であることにより、本発明の増幅核酸を得ることができる。
二本鎖の鋳型ＤＮＡと２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する本発明の増幅核酸を得る核酸増幅方法の態様においては、反応の条件等にもよるが、各プライマーから伸長反応中のそれぞれの鋳型−伸長鎖中間体の間で鋳型の交換が起こり、合成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成することがある。この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有しており、次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することができる。この反応の結果、一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。さらに、この反応中に鋳型の交換が起こった場合には前記と同様な二本鎖核酸が再度生成される。
本発明の増幅核酸を得るには、鎖置換反応中に上記の鋳型交換反応を行う能力を有するＤＮＡポリメラーゼが好適に使用でき、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。当該酵素はＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）として市販されており、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７２０；平成３年５月１０日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託）より日本特許第２９７８００１号に記載の方法によって調製することもできる。
本発明の増幅核酸を得るための増幅方法において、キメラオリゴヌクレオチドプライマー伸長鎖のリボヌクレオチド含有部位が切断される際に、当該切断によって生じる５’側の断片（プライマー部分）がリボヌクレオチドを含有しないように切断される場合がある。こうして生じたプライマー部分から伸長されたプライマー伸長鎖はもはやエンドヌクレアーゼにより切断されず、この結果、末端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。
上記のように、本発明の増幅核酸を得るための核酸増幅方法においてはプライマーの配列を含まない増幅産物の他、一端、もしくは両端にプライマーの配列を有する産物が生成しうる。これらの産物も本発明の増幅核酸に包含される。
本発明の増幅核酸を得るための方法に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、プライマー部分の３’末端から下流への伸長鎖合成に伴い、先に伸長されたＤＮＡ鎖の置換を行う必要がある。そして重要なことは置換鎖を分解する可能性のある５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことである。このようなＤＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損変異体であるクレノウ断片、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ由来の同様の断片（ニューイングランドバイオラブス社製）、Ｂ．ｃａ由来のＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）が有用である。シークエネース１．０およびシークエネース２．０（米国バイオケミカル社）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第９７巻、１３〜１９頁（１９９１）記載のＴ５  ＤＮＡポリメラーゼおよびφ２９  ＤＮＡポリメラーゼも使用することができる。通常は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼであっても、その活性が適当な阻害剤の添加により阻害することが可能な場合は、本発明の増幅核酸を得るためのＤＮＡ合成方法に使用できる。
本発明の増幅核酸を得るための核酸の増幅方法は、変温で行ってもよく、又は等温で行ってもよい。ここで変温とは、各工程の反応を妨げない範囲で各工程の反応温度を変化させることを意味する。すなわち、例えば、プライマーのアニーリング、相補鎖の合成反応、相補鎖のニッキング、そして置換反応のそれぞれに適した温度に変化させる場合のことをいう。
次に等温とは、各工程の反応温度を変化させず、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。いずれの場合においても、最適の反応条件となるように温度を設定するのは当然である。
本発明の増幅核酸を得るための増幅方法の１つの特徴としては、核酸の合成方法において温度を上げ下げする必要がないことにある。従来の多くの核酸増幅法は、温度を上下することにより合成鎖から標的物を解離する必要があり、例えばサーマルサイクラーのような特別な反応装置を必要とするが、この方法においては一定温度を保持できる装置のみでも実施することができる。このように、この方法は、単一の温度で実施することができる。好ましくは、プライマーの非特異的なアニーリングが低減され、かつ鋳型となる核酸にプライマーが特異的にアニーリングするように反応温度、ストリンジェンシーのレベルを設定して実施される。特に限定するものではないが、上記のように耐熱性の酵素を用いて本発明の方法を高温条件下で行う事ができる。さらに、反応の効率を高く保つ観点から、本発明の方法は使用する酵素の活性が十分に保持される適当な温度で行うことが好ましい。従って、使用する酵素にもよるが、好ましい反応温度は、約２０℃〜約８０℃であり、さらに好ましくは約３０℃〜約７５℃であり、特に好ましくは、約５０℃〜約７０℃である。特に高温条件下で反応を行う場合には、常温で反応を行う場合よりも鎖長の長いプライマーを使用することが好ましい。各反応温度に適したプライマーの配列及び長さの設定については、例えば、そのＴｍ値を参考にしてもよく、あるいは市販のプライマー設計ソフト、例えば、ＯＬＩＧＯＴＭＰｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）を使用してもよい。例えば、反応温度を５５℃から６０℃あるいは６５℃に設定した場合、該方法に使用するプライマーの長さとしては、特に限定するものではないが、例えば１２ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは１４ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さのプライマーが使用できる。このように反応温度を上げることの効果としては、鋳型ＤＮＡの二次構造を解消できることが挙げられ、ＧＣ含量の高い鋳型核酸を使用した場合にも所望の核酸が増幅される。また、長鎖長の領域を増幅する場合においても同様の効果がある。該効果は、約６０ｂｐ〜約２０ｋｂｐの範囲で、さらに約１１０ｂｐ〜約４．３ｋｂｐの範囲で、特に約１３０ｂｐ〜約１５００ｂｐの範囲で認められる。
さらに、鋳型となる核酸のＧＣ含量に応じて反応温度を調節し、増幅効率を向上させることができる。例えば、鋳型となる核酸としてＧＣ含量の低いものを使用する場合には、増幅する鎖長やプライマーのＴｍ値にもよるが、５０〜５５℃で増幅反応を行うことができる。
また、この方法において逆転写酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程（逆転写反応）を含むＲＮＡ由来の核酸の増幅を簡便に実施することができる。また、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を独立させて行い、その生成物（ｃＤＮＡ）を本発明の増幅核酸を得るための方法に鋳型ＤＮＡとして使用することもできる。
また、本発明の増幅核酸を得るための方法は、リン酸、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝液中で行うことにより所望の核酸配列領域を増幅することができる。
さらに、この核酸の増幅方法には経時的な温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、大容量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。したがって、本発明の増幅核酸の工業的大量製造が可能である。
本発明の増幅核酸を得るための増幅方法では、使用するプライマーの利用効率がほぼ１００％であり、従来の方法、例えばＰＣＲ法の利用効率に比べて５倍〜１０倍高くすることができる。
（６）本発明の増幅核酸の製造方法
上記のように、鋳型となる核酸、固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸を含むデオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製し、反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートすることによって、本発明の増幅核酸を得ることができる。
言い換えれば、固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸は本発明の方法で用いるＤＮＡポリメラーゼが基質として取り込むことが可能な修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸であれば、特に限定はされない。該修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸は、本発明の方法により調製された核酸を固定化するのに可能な官能基を有しているものが好適に使用でき、特に限定はされないが例えば、水酸基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、エポキシ基、アシル基を有する修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸あるいはビオチン標識デオキシリボヌクレオチド３リン酸等が例示される。該修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸としては、Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰが好適に使用できる。
さらに、本発明の方法の別態様としては、増幅核酸が、固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含むキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有することを特徴とする増幅核酸の製造方法であってもよい。すなわち、鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製し、該反応混合物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベーションすることを含む増幅核酸の製造方法が挙げられる。この場合、上記プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、該デオキシリボヌクレオチドの一部は、固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドである。
上記方法において、特に限定はされないが例えば使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、固相への固定化のための官能基を該プライマーの５’末端側及び／又は３’末端側に有してもよい。この場合、官能基とプライマーの５’末端側及び／又は３’末端側の間にスペーサーを有していてもよい。即ち、固相への固定化ができ、本発明の方法において増幅を阻害しないような官能基であれば、特に限定はされない。該修飾プライマーは、本発明の方法により調製された核酸を固定化するのに可能な官能基を有しているものが好適に使用でき、特に限定はされないが例えば、水酸基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、エポキシ基、アシル基を５’末端に有する修飾プライマーが例示される。該修飾プライマーとしては、アミノ基導入用試薬（パーキン・エルマー社製）を用いた５’アミノリンクプライマーが好適に使用できる。
すなわち、ＰＣＲ法では反応混合物の温度を経時的に変化させる必要があるため、反応のスケールは温度制御が可能な容量（通常、２００μｌ以下）に限られ、スケールアップは困難である。一方、本発明の方法にはこのような制約はなく、反応混合物の容量を増加させることにより大量の核酸を製造することが可能である。本発明の方法は１分子の鋳型から多数の相補鎖分子が合成され、さらにこれらの相補鎖分子を鋳型とした核酸の合成も可能であることから、鋳型ならびにプライマーを適切に設定することにより、所望の核酸を効率よく、大量に製造することができる。さらにまた、本発明の方法がＰＣＲ法のような特殊な装置、頻繁な温度変化を必要としないことは設備、エネルギーのコスト面からも有利であり、工業的な核酸の大量製造方法としても優れている。
本発明の製造方法は、ＤＮＡチップに固定化するためのＤＮＡ断片のような多種類、かつ大量のＤＮＡ断片を供給する方法として有用である。すなわち、１つの態様としては、単純な反応工程でＤＮＡ断片を大量に得ることができる。
（７）本発明の増幅核酸の固定化物
核酸固定化物としては、特に限定はされないが例えば、ＤＮＡチップが挙げられる。該ＤＮＡチップは、多数の異なる遺伝子あるいはＤＮＡの断片をスライドグラス等の固相担体上の所定の領域あるいは所定の位置に整列させて固定化した核酸固定化物であり、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡアレイ）とも呼ばれる。上記所定の領域、所定の位置あるいはあらかじめ定められた領域とは、その領域あるいはその位置にどの増幅核酸が固定化されているかがわかっていることを言う。この場合、その位置にどの増幅核酸が固定化されているかがわかればよく、該増幅核酸の塩基配列は、未知あるいは既知のいずれであってもよい。
上記ＤＮＡチップは、試料より調製した核酸試料、好ましくは標識された核酸試料と接触させてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸試料中に存在する、ＤＮＡチップ上の所定の領域に整列させて固定化されたＤＮＡと相補的な配列を有する核酸の存在を調べる目的で使用される。試料中の多数の核酸を一度の操作で検出、定量できることから、ＤＮＡチップは遺伝子の発現解析や変異あるいは多型解析を飛躍的に加速させる手段として非常に有用である。二本鎖核酸が所定の領域に整列させて固定化されたＤＮＡチップは適切な変性処理の後にハイブリダイゼーション工程に使用されるが、検出しようとする標的核酸に相補的な一本鎖ＤＮＡが所定の領域に整列させて固定化されたＤＮＡチップは、標的核酸の検出に特に好適である。
得られたＤＮＡを所定の領域に整列させて固定する担体は不溶性のものであれば特に限定はなく、ガラス、プラスチック等で作製された板状の担体の他、ニトロセルロースやナイロン製の膜状の担体が好適に使用される。また、その固定化にあたっては公知の核酸固定化方法が使用できる。上記のＤＮＡはそのまま担体に固定化を行う他、適当なリンカーを介して、または複数分子のＤＮＡをライゲーションさせたうえで固定化してもよい。
特に限定はされないが、ガラスの担体を使用する場合、ガラスそのものは電荷が少なくそのままではＤＮＡとの結合力が弱いため、コーティングを行なったものを使用する。コーティングとしては、ポリ−Ｌ−リジン、シリレン化、シラン化、グルタルアルデヒド化、アミノ化などが用いられ、特に限定されるものではない。こうしてコーティング処理を行なったガラス担体に、得られたＤＮＡを静電力により固定化することができる。
本発明の増幅核酸は、固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しており、たとえば、上記のようなガラス担体との静電力による固定化とは異なる形で担体への固定化が可能である。すなわち、ガラス担体にコーティングされた官能基と、本発明の増幅核酸中に含まれる修飾デオキシリボヌクレオチドとの化学反応による共有結合を利用した固定化が可能である。
また、この共有結合を利用して、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同であり固相への固定化のための修飾デオキシリボヌクレオチドを含有しないキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して本発明の増幅核酸を作製し、この増幅核酸を官能基をコーティングしたガラス担体の予め定められた領域に化学反応により共有結合を生じさせることで固定化し、整列させた後に、修飾デオキシリボヌクレオチドプライマーを含まない伸長鎖のみを変性操作を行なうことで遊離させて、担体上に一本鎖となるＤＮＡが結合されている核酸固定化物を得ることが可能である。
例えば、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨを使用して得られた本発明の増幅核酸は、リボヌクレオチド部分が残っているため、変性処理後上記の修飾デオキシリボヌクレオチドプライマーを含まない伸長鎖のみを遊離させる操作の過程でそのリボヌクレオチドの結合が切断されてしまうことがある。しかしながら、下記のような本発明の変性条件下で変性操作を行うことにより、二本鎖核酸間の水素結合を切断するが同一鎖中のリボヌクレオチドの結合を切断しない条件で変性処理を行なうことができる。その結果、その増幅核酸中の修飾デオキシリボヌクレオチドによる共有結合を利用した担体上にリボヌクレオチドを含む一本鎖核酸が結合されている核酸固定物を得ることができる。
上記の増幅核酸の変性条件は、特に限定はされないが変性温度は１０℃〜６５℃の範囲、アルカリ溶液濃度は０．１Ｎ〜２．０Ｎの範囲、変性処理時間は５分〜３０分の範囲が変性条件として好適である。特に増幅核酸を末端で固相上に固定化した場合、２０℃、０．２Ｎ  ＮａＯＨで５分間、もしくは２０℃、０．５Ｎ  ＮａＯＨで５分間の条件が好適である。
また、例えば増幅核酸を該増幅核酸中の修飾デオキシリボヌクレオチドで固相上に固定化した場合、６０℃、０．２Ｎ  ＮａＯＨで３０分間の条件が好適である。
さらに、ピロコッカス  フリオサスあるいはピロコッカス  ホリコシイ由来のＩＩ型ＲＮａｓｅＨを使用して得られた本発明の増幅核酸は、該酵素の持つ特性によりリボヌクレオチド部分が含まれない増幅核酸を得ることができる。従って、この場合は、上記二本鎖核酸間の水素結合を切断するが同一鎖中のリボヌクレオチドの結合を切断しない条件以上の強い変性条件下であっても、担体上に一本鎖核酸が結合されている核酸固定化物を得ることができる。
上記の増幅核酸の変性条件は、例えば６０℃、０．２Ｎ  ＮａＯＨで３０分間の条件が好適である。
これらのアルカリ変性処理以外の方法、特に限定はされないが例えば、熱変性処理を行ってもよい。該熱変性処理の場合、例えば９５℃で３分間の条件が挙げられる。
すなわち、大腸菌由来あるいはパイロコッカス  フリオサスあるいはピロコッカス  ホリコシイ由来のＩＩ型ＲＮａｓｅＨを用いた場合のいずれにおいても、一本鎖核酸が末端であるいは該核酸に含まれる修飾核酸の部位で固相に固定化された本発明の増幅核酸固定化物を得ることができる。
また、二本鎖核酸が予め定められた所定の領域に整列させて固定化された核酸固定化物の場合は、適切な変性処理の後にハイブリダイゼーション工程に使用されるが、本発明の固定化物は検出しようとする標的核酸に相補的な一本鎖ＤＮＡが所定の領域に整列されて固定化されているため、上記変性処理なしに標的核酸の検出に利用することができる。すなわち、本発明の増幅産物を用いて作製された担体上に一本鎖となるＤＮＡが結合されているＤＮＡチップは、従来よりも簡便な操作で、かつ、高感度、高再現性で標的核酸を検出することができる。
また、本発明においては、５’−ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’タイプのキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができ、その場合、その５’末端側及び／又は３’末端側のＤＮＡ部分のいずれかのヌクレオチドに担体への固定化のための官能基を導入することによって、固定化される核酸の使用率を高めることができる。従って、固定化する核酸の使用ロスを低下させることができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
参考例１
（１）ピロコッカス  フリオサス  ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ４  ０．００３％、ＮａＣｌ  ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｏＳＯ４  ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＺｎＳＯ４  ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２  ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ４  ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．２５ｐｐｍの組成の培地２Ｌを２Ｌ容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス  フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ３６３８）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス  ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）の全ゲノム配列が公開されており〔ＤＮＡ  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｉｃｈ），第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列表の配列番号１、日本国  経済産業省  製品評価技術センター  ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）。
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子と一部公開されているピロコッカス  フリオサスのゲノム配列（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ，Ｕｔａｈ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｈｔｍｌ）でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常にホモロジーの高い配列が見つかった。得られた配列をもとに配列表の配列番号２及び３に記載のプライマー１６５０Ｎｄｅ及び１６５０Ｂａｍを合成した。
上記（１）で得たピロコッカス  フリオサスＤＮＡ  ２００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌの１６５０Ｎｄｅ及び２０ｐｍｏｌの１６５０Ｂａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＦＵ２２０を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記（２）で得られたｐＰＦＵ２２０の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号４に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。
なお、プラスミドｐＰＦＵ２２０で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＰＦＵ２２０と命名、表示され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０２０として平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、平成１３年７月９日（移管日）より受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５４として移管されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
上記（２）で得られたｐＰＦＵ２２０で大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、得られたｐＰＦＵ２２０を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を６６．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、６１．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分６０．０ｍｌをバッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。このＲＮａｓｅＨＩＩ画分２．０ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、１７キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
参考例３の方法に従ってＲＮａｓｅＨ活性を測定した。その結果、Ｐｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
参考例２  ピロコッカス  ホリコシイのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ピロコッカス  ホリコシイ  ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ４  ０．００３％、ＮａＣｌ  ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｏＳＯ４  ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＺｎＳＯ４  ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２  ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ４  ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．２５ｐｐｍの組成の培地２ｌを２ｌ容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス  ホリコシイＯＴ３（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、理化学研究所より購入：ＪＣＭ９９７４）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス  ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）は全ゲノム配列が公開されており〔ＤＮＡ  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号１、日本国  独立行政法人  製品評価技術基盤機構  ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）。
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子（配列番号５１）の配列をもとにプライマーＰｈｏＮｄｅ（配列番号２）及びＰｈｏＢａｍ（配列番号３）を合成した。
参考例２−（１）で得たピロコッカス  ホリコシイＤＮＡ  １００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＰｈｏＮｄｅＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＰｈｏＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲ行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＨＯ２３８を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
参考例２−（２）で得られたｐＰＨＯ２３８の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号５１に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号５２に示す。
なお、プラスミドｐＰＨＯ２３８で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＰＨＯ２３８と命名、表示され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２２２として平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、平成１３年８月２日（移管日）より受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９２として移管されている。（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例２−（２）で得られたｐＰＨＯ２３８で大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、得られたｐＰＨＯ２３８を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１ｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３４．３ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を８０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、３３．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分３５．０ｍｌををバッファーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕２Ｌを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液３４．５ｍｌをバッファーＢで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（ファルマシア  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５５ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
この画分４．０ｍｌにＮａＣｌ濃度が５０ｍＭになるようにバッファーＢを添加し、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約１６０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分６．９ｍｌをセントリコン−１０（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を２回に分けて１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、２４．５キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｈｏＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＰｈｏＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、参考例３に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＰｈｏＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
参考例３  耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性の測定
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム  ファルマシア  バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
次に、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセロールを含む４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようポリ（ｒＡ）溶液を、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるようポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定した。その後、ＥＤＴＡ非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。ＲＮａｓｅＨの１単位は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ２６０を１０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。なお、酵素液を希釈した場合は、下記式の値を希釈率で補正した。
単位（ｕｎｉｔ）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）］／０．０１５２
実施例１
本発明のリボヌクレオチドを含有する２本鎖キメラオリゴヌクレオチドの１本鎖への変性条件について検討した。まず、配列表の配列番号６〜９に記載の塩基配列を有し、さらに５’末端にアミノ基を有する４０ｍｅｒから４３ｍｅｒのキメラオリゴヌクレオチド、ＩＣＡＮ（６）／Ｍ１３−４７、ＩＡＣＮ（６）／Ｒ１／Ｍ１３−４７、ＩＣＡＮ（６）／Ｒ２／Ｍ１３−４７、ＩＣＡＮ（６）／Ｒ３／Ｍ１３−４７を合成した。すなわち、配列表の配列番号７、８、９に記載の塩基配列を有するキメラオリゴヌクレオチドは、それぞれ１、２、３個のリボヌクレオチドを中央部分に有し、その５’側に１６塩基、３’側に２４塩基の共通配列を有する。また、配列番号６のオリゴヌクレオチドはこれらの配列を組み合わせたもので、リボヌクレオチドを含有しないものである。以後、５’側の配列をＩＣＡＮ（６）配列、３’側の配列をＭ１３−４７配列と呼ぶことにする。これらのオリゴヌクレオチドに加え、陰性コントロールとして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ジーンバンク登録番号：Ｘ００９８０）の部分配列で、配列表の配列番号１０に記載の配列を有する５’末端をアミノ基で修飾したオリゴヌクレオチド（４０ｍｅｒ）をＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製）にて合成した。
上記の各キメラオリゴヌクレオチドを、終濃度が０．１ｍＭになるように、０．２％シュークロースモノラウレート（同仁化学社製）を含有する４０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に溶解し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４１７  アレイヤー（アフィメトリックス社製）を用いて、国際公開第０１／０２５３８号パンフレット記載の方法により作製した活性化カルボキシル基導入スライドグラスガラスであるＭｉｒｕｓ−Ｅスライドグラスに、各サンプル１０スポットずつスポットした。スポット後のスライドグラスを０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で２回洗浄し、その後、以下に示した４つの異なる変性条件でスライドグラスの処理を行った。
１．コントロール：蒸留水で洗浄後のスライドグラスを、そのまま低速遠心によって乾燥させた。
２．０．２Ｎ  ＮａＯＨ（２０℃）：２０℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で５分間処理した後、蒸留水で５分間洗浄し、乾燥させた。
３．０．５Ｎ  ＮａＯＨ（２０℃）：２０℃の０．５Ｎ  ＮａＯＨ中で５分間処理した後、蒸留水で５分間洗浄し、乾燥させた。
４．０．２Ｎ  ＮａＯＨ（６５℃）：６５℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で３０分間処理した後、蒸留水で５分間洗浄し、乾燥させた。
５．０．５Ｎ  ＮａＯＨ（６５℃）：６５℃の０．５Ｎ  ＮａＯＨ中で３０分間処理した後、蒸留水で５分間洗浄し、乾燥させた。
また、アレイ上のオリゴヌクレオチド配列を検出するためのプローブとして、配列表の配列番号１１に記載の配列を有し、５’末端がＣｙ３（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ１と、配列番号１２の配列を有し、５’末端がＣｙ５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ２をＤＮＡ合成機で合成した。オリゴヌクレオチドプローブ１はＩＣＡＮ（６）配列に、オリゴヌクレオチドプローブ２はＭ１３−４７配列にそれぞれ相補的である。
次に、市販のインテリジーン（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ；宝酒造社製）の取扱説明書記載のプレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液を調製し、該溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った。まず、上記アレイを２０℃にて２時間プレハイブリダイゼーション処理を行った。その後、上記の標識プローブをそれぞれ１０ｐｍｏｌ／ｕｌの濃度で含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、これを９５℃で２分間加熱した後ＤＮＡアレイに滴下し、カバーガラスをかけて周辺をペーパーボンド（コクヨ社製）で密封した。これを４２℃で１３時間保持した後、カバーガラスを除き、４５℃の２×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳを含む溶液で１０分間洗浄した後、２０℃の０．０５×ＳＳＣでリンスし、遠心分離によって乾燥させた。これをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４１８  アレイスキャナー（アフィメトリックス社製）を用いて、Ｃｙ３（励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍ）とＣｙ５（励起波長：６３５ｎｍ、検出波長：６７０ｎｍ）のそれぞれの蛍光画像を取得し、各スポットのシグナル強度を、発現データ解析ソフトウエア、ＩｍａＧｅｎｅ  ４．０（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）を用いて定量した。その後、ＩＣＡＮ（６）配列由来のシグナルに対するＭ１３−４７配列由来のシグナルの割合、すなわち、Ｃｙ５の蛍光シグナル値のＣｙ３の蛍光シグナル値に対する比率を求めた。その結果を表１に示す。表１は、各スライドグラスについて、ＩＣＡＮ（６）／Ｍ１３−４７オリゴヌクレオチド（配列表の配列番号６）の上記比率を１００％とした場合の各オリゴヌクレオチドの比率について、１０個のスポットの平均値である。なお、陰性コントロールのスポットからは全く蛍光シグナルが検出されなかったことから、各オリゴヌクレオチドのスポットのシグナルは、配列の特異性に起因するものであることが確認できた。
2002062993.tif 000002
表１に示したように、２０℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨで５分間、もしくは２０℃の０．５Ｎ  ＮａＯＨで５分間処理したスライドグラスにおいては、リボヌクレオチドの個数が増加することによる比率の低下が、処理無しのスライドグラスと同等であった。このことから、温度は、１０℃〜４０℃の範囲、アルカリ溶液濃度は、０．１Ｎ〜２．０Ｎの範囲、処理時間は、５分〜３０分の範囲が、固相上でキメラオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチド部分をほとんど切断しない条件であることが確認できた。特に２０℃、０．２Ｎ  ＮａＯＨで５分間、もしくは２０℃、０．５Ｎ  ＮａＯＨで５分間というアルカリ変性処理が好適であることが確認できた。
実施例２
実施例１で見出した変性条件下における、実際のＩＣＡＮ法により増幅した２本鎖増幅核酸を固定化したアレイについて検討した。
本実施例では、大腸菌Ｋ−１２株の２個のオープン  リーディング  フレーム（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍ：ＯＲＦ）に対応する増幅産物を調製した。当該ＯＲＦは、ＯＲＦ  ＩＤＮｏ．１３１＃６とＯＲＦ  ＩＤＮｏ．２１４＃１であり、これらはＧｅｎｏＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｌｉ．ａｉｓｔ−ｎａｒａ．ａｃ．ｊｐ／）としてインターネット上で公開されている。従って、該ＯＲＦの塩基配列とその発現産物についての情報は、上記データベースより入手した。
ＩＣＡＮ法による核酸の増幅条件を以下に示した。すなわち、大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列表の配列番号１３と１４、１５と１６に記載の配列を有するプライマー対により、それぞれ１３１＃６と２１４＃１の増幅断片をＰＣＲ法により調製した。当該増幅断片（３００ｂｐ）をｐＵＣ１９ベクター（宝酒造社製）にクローニング後、配列表の配列番号１７と１８に記載の塩基配列を有するプライマーでＰＣＲ増幅した。次に、配列表の配列番号１９と２０に記載の塩基配列を有する、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー対、ならびに鋳型として１００ｎｇの上記ＰＣＲ増幅産物、最終濃度０．０１％プロピレンジアミンを含む混合液２０μｌを調製した。この混合液を９８℃  ２分保持後、氷上に置いた。該混合液に最終濃度がそれぞれ２０ｍＭ  ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、０．０１％  ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、１％  ジメチルスルオキシド、４ｍＭ  酢酸マグネシウム、各０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、６０Ｕの大腸菌由来のＩ型ＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）を含む最終容量が１００μｌの反応液を調製した。上記反応液を均一に混合し、６０℃で６０分間保温した。なお、配列番号１９に記載の配列を有するプライマーは、５’末端がアミノ基で修飾されているものと未修飾のものを用いた。この結果、各ＯＲＦについて、プライマー中にアミノ基を含有する２本鎖核酸（ＩＣＡＮ産物１と称す）と、アミノ基を含有しない２本鎖核酸（ＩＣＡＮ産物２と称す）を得た。
次に、ＰＣＲ法を用いて２本鎖核酸を増幅した。すなわち、大腸菌Ｋ−１２  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列表の配列番号１３と１４、１５と１６に記載の塩基配列を有するプライマー対により、それぞれ１３１＃６と２１４＃１の断片をＰＣＲ増幅した。当該増幅断片をｐＵＣ１９ベクターにクローニング後、これを鋳型として配列表の配列番号２１と２２に記載の塩基配列を有するプライマーでＰＣＲ増幅した。なお、配列番号２１に記載の配列を有するプライマーとして、５’末端がアミノ基で修飾されているものと未修飾のものを用いた。その結果、各ＯＲＦについて、アミノ基を含有する２本鎖核酸（ＰＣＲ産物１と称す）と、アミノ基を含有しない２本鎖核酸（ＰＣＲ産物２と称す）を得た。
以上の計４種類の２本鎖増幅核酸を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付のプロトコールに従い精製した。これらを終濃度が０．３μｇ／μｌになるように、０．１％シュークロースモノラウレート含有４０ｍＭ  炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に溶解し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４１７  アレイヤーを用いて活性化カルボキシル基導入スライドグラスであるＭｉｒｕｓ−Ｅスライドグラスに、各サンプル１０スポットずつスポットした。その後、０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で２回洗浄して乾燥させた後、以下に示した４つの異なる条件でスライドグラスの処理を行った。
１．未処理
２．２０℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で５分間処理した後、蒸留水で５分間洗浄し、乾燥させた。
３．２０℃の０．５Ｎ  ＮａＯＨ中で５分間処理した後、蒸留水で５分間洗浄し、乾燥させた。
４．６５℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で３０分間処理した後、蒸留水で５分間洗浄し、乾燥させた。
次に、すべての増幅産物に含まれるｐＵＣ１９部分の共通配列に相補的な、配列表の配列番号２３に記載の配列を有する５’末端をＣｙ５で標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅの取扱説明書に記載のプロトコールに従い、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥操作を行った。その後、スキャニングしてＣｙ５の波長で蛍光画像を取得し、次いで各スポットのシグナル強度とその周辺のバックグラウンドの強度をＩｍａＧｅｎｅ  ４．０を用いて定量した。各スポットのシグナル強度の結果を表２に示す。なお、表の値は、すべて１０スポットの値を平均したものである。
2002062993.tif 000003
まず、ＩＣＡＮ増幅産物とＰＣＲ増幅産物の間でシグナル強度を比較すると、表２に示したように、１本鎖処理を行わないスライドと２０℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨで５分間のアルカリ処理を行ったスライド、熱変性を行ったスライドにおいては、ＩＣＡＮ産物１のシグナル強度はＰＣＲ産物１のそれと実質的に同等であった。このことから、アミノ基で修飾された２本鎖のＩＣＡＮ産物および部分的に１本鎖になったＩＣＡＮ産物は、共有結合タイプのマイクロアレイを作製するための固定化用核酸として好適に使用できることが確認できた。一方、６５℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で３０分間処理したスライドグラスにおいては、ＩＣＡＮ産物１のシグナル強度はＰＣＲ産物１のそれより実質的に低かった。これは、実施例１で調べたように、当該変性条件下でＩＣＡＮ産物中のプライマーのリボヌクレオチド部分が分解を受けたためであると考えられた。
次に、ＩＣＡＮ産物１とＰＣＲ産物１について、未処理のスライドグラスと１本鎖変性処理を行ったスライドグラスとの間でシグナル強度を比較すると、表２に示したように、２０℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨで５分間のアルカリ処理を行ったスライドと熱変性を行ったスライドにおいては、未処理のスライドに比べてシグナル強度が高かった。このことから、ＩＣＡＮ産物とＰＣＲ産物の両方について、固相上において２本鎖の状態よりも１本鎖の状態の方がプローブを補足する効率が高い、すなわちハイブリダイゼーションの効率が高いことが確認できた。一方、６５℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で３０分間処理したスライドグラスにおいても、ＰＣＲ産物１のみならずＩＣＡＮ産物１のスポットのシグナル強度も、未処理のスライドグラスのそれと比較して高かった。これは、リボヌクレオチド部分が分解されて剥離したことによる核酸量の低下を、１本鎖にすることによるハイブリダイゼーション効率の上昇が補ったためであると考えられた。
実施例３
実施例２に記載した、固相に共有結合により固定化した１本鎖もしくは２本鎖のＩＣＡＮ産物からなるマイクロアレイと、２本鎖のＰＣＲ産物を静電結合により固相に固定化する従来タイプのマイクロアレイとの間で、ハイブリダイゼーションによって得られるシグナル強度を比較した。
従来タイプのマイクロアレイは、以下のように作製した。すなわち、実施例２で増幅・精製した各ＯＲＦ４種類の２本鎖核酸を終濃度が０．３μｇ／μｌになるように、０．０５％シュークロースモノラウレート含有４０ｍＭ  炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に溶解し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４１７  アレイヤーを用いて活性化アミノ基導入スライドグラスであるＭＡＳコートスライドグラス（松浪硝子工業社製）に、各サンプル１０スポットずつスポットした。スポット後のスライドグラスを、３７℃の保湿器内に１時間保持し、６０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線照射を行った。その後、０．２％ＳＤＳ溶液で洗浄し、蒸留水で３回洗浄した。次いで、使用直前に調製したブロッキング溶液（２．７５ｇの無水コハク酸を１６０ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解し、さらに１５ｍｌの１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１５ｍｌ加えた溶液）に該スライドグラスを２０分間浸漬処理することにより遊離のアミノ基をブロックした。最後にスライドグラスグラスを蒸留水で２回洗浄した後、遠心により水分を除去し、デシケーター中に保存した。
作製した従来タイプのマイクロアレイについて、各増幅産物のｐＵＣ１９部分の共通配列に相補的で、配列表の配列番号２３に記載した配列を有する、５’末端をＣｙ５で標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅの取扱説明書に記載のプロトコールに従い、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥操作を行った。その後、スライドグラスをＣｙ５の波長でスキャニングして蛍光画像を取得し、各スポットのシグナル強度とその周辺のバックグラウンド強度をＩｍａＧｅｎｅ４．０を用いて定量した。そして、Ｍｉｒｕｓ−ＥスライドグラスとＭＡＳコートスライドグラスとの間で比較を行うため、実施例２の表２の結果とともに、シグナル強度のバックグラウンド強度に対する比率（以下Ｓ／Ｎ比と称す）算出した。その結果を表３に示す。
2002062993.tif 000004
表３に示したように、実施例２の１本鎖処理を行わないスライドグラスと、３種類の１本鎖処理を行ったスライドグラスにおける、ＩＣＡＮ産物１のスポットのシグナル強度は、従来タイプのマイクロアレイにおけるＰＣＲ産物１のスポットのシグナル強度より若干低い程度であった。このことから、１本鎖もしくは２本鎖のＩＣＡＮ産物を共有結合により固定化した核酸固定化物は、従来タイプの静電結合による２本鎖ＰＣＲ産物の固定化物と同様に、マイクロアレイとして好適に使用できることが確認できた。
実施例４
Ｐｆｕ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨならびにＰｈｏ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨを用いて得られたＩＣＡＮ産物の特性について検討した。ＩＣＡＮ増幅は、以下のようにして行った。すなわち、ｐＵＣ１９プラスミドを鋳型として配列表の配列番号４９及び５０に記載の塩基配列を有するｕｐｐｅｒ１５０及びｌｏｗｅｒの各プライマーを用いてＰＣＲを行って、約１５０ｂｐの増幅断片を得た。該増幅断片を精製し、ｐＵＣ１９プラスミドにクローニングして得られたプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１９−１５０と称す）をＩＣＡＮ反応の鋳型とした。
次に、プライマーとして配列表の配列番号２４〜２５記載の配列を有するＩＣＡＮ（６）−Ｍ４プライマーおよびＩＣＡＮ（６）−ＲＶプライマーの組合せ、および配列表の配列番号２６〜２７記載の配列を有するＩＣＡＮＶＦＮ３−Ｍ４プライマーおよびＩＣＡＮＶＦＮ３−ＲＶＭプライマーの組合せよりＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を鋳型とし、プライマーとして配列表の配列番号２８記載の配列を有するＩＣＡＮ（６）キメラオリゴヌクレオチドプライマーあるいは配列表の配列番号２９記載の配列を有するＶＦＮ３キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＩＣＡＮ反応を行なった。各ＩＣＡＮ反応の条件を以下に示す。
（１）１００ｐｍｏｌのＩＣＡＮ（６）プライマー、０．０１％プロピレンジアミン、ＩＣＡＮ（６）−Ｍ４プライマーおよびＩＣＡＮ（６）−ＲＶプライマーの組合せで得られたＰＣＲ反応液１μｌを添加し、１０μｌに調製した。この混合液をサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造）にて９８℃  ２分間、６０℃  １分間保温後、氷上に置き、最終濃度３２ｍＭ  ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．０１％ウシ血清アルブミン、４ｍＭ  酢酸マグネシウム、各５００μＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．０１５６μｇ  Ｐｆｕ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨと２ＵのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼの組合せあるいは５ＵのＰｈｏ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨと８ＵのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼの組合せを含む混合液を添加し５０μｌとした。この反応液を、あらかじめ６０℃に設定したサーマルサイクラーにセットし、６０分間保持した。
（２）１００ｐｍｏｌのＶＦＮ３プライマー、０．０１％プロピレンジアミン、ＩＣＡＮＶＦＮ３−Ｍ４プライマーおよびＩＣＡＮＶＦＮ３−ＲＶＭプライマーの組合せで得られたＰＣＲ反応液１μｌを添加し、１０μｌに調製した。この混合液をサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造）にて９８℃  ２分間、５５℃  １分間保温後、氷上に置き、最終濃度３２ｍＭ  ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１％ジメチルスルホキシド、０．０１％ウシ血清アルブミン、４ｍＭ  酢酸マグネシウム、各５００μＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．０３１２μｇのＰｆｕ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨと４ＵのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼの組合せあるいは５ＵのＰｈｏ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨと８ＵのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼの組合せを含む混合液を添加し、５０μｌとした。この反応液を、あらかじめ５５℃に設定したサーマルサイクラーにセットし、６０分間保持した。
（３）さらに対照として、大腸菌由来ＲＮａｓｅＨを使用して反応を行なった。すなわち、３０Ｕの大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ及び５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ以外は上記（１）及び（２）記載の反応液組成と同様のものを調製し、使用した。
反応終了後、各反応液１．５μｌを３％ヌシーブ３：１アガロース（宝酒造社製）に供し、電気泳動により増幅産物を確認した。今回予想される増幅産物は約３００ｂｐである。増幅産物を確認した後、反応液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−１００スピンカラム（宝酒造社製）により精製を行ない、精製液を吸光光度計によりその濃度を測定した。
こうして得られた精製ＩＣＡＮ産物約１μｇをチューブに取り、それぞれ最終濃度１Ｎ  ＮａＯＨとなるようにＮａＯＨ溶液を加え、６０℃で一時間アルカリ処理を行なった。処理後、それぞれの処理液６μｌを４％変性アクリルアミドゲル電気泳動に供した。
その結果、ＩＣＡＮ産物は、電気泳動を行なうと両端にプライマーを有する産物、片側にのみプライマーを有する産物、両端ともプライマーの無い産物の３本の産物が認められるが、大腸菌由来ＲＮａｓｅＨにより得られたＩＣＡＮ産物はＩＣＡＮ（６）プライマーによる産物、ＶＦＮ３プライマーによる産物ともアルカリ未処理の産物と比較すると、アルカリ処理を行なうことによりその両端にプライマーを有する産物が消失することが確認された。一方、Ｐｆｕ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨあるいはＰｈｏ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨにより得られたＩＣＡＮ産物はＩＣＡＮ（６）プライマーによる産物、ＶＦＮ３プライマーによる産物とも未処理の産物と比べてアルカリ処理による変化は認められなかった。
以上のように、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨによるＩＣＡＮ産物には、ＩＣＡＮに使用しているキメラプライマーの持つＲＮＡ部分を含んでいるが、Ｐｆｕ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨあるいはＰｈｏ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨにより得られたＩＣＡＮ産物には、ＩＣＡＮに使用しているキメラプライマーの持つＲＮＡ部分がないことが確認された。
実施例５
（１）ＰＣＲによるＩＣＡＮ反応用テンプレートの作製
マウス脳由来ポリＡ＋ＲＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ社製）を用いて、ｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）により二本鎖ｃＤＮＡを作製した。この二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として配列表の配列番号３０〜４３記載の塩基配列を有するプライマーの組合せで増幅した各々のＰＣＲ断片を、ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）にＴＡクローニングしてプラスミドクローンを得た。作製した各プラスミドクローン（１ｎｇ）１μｌと各１０ｐｍｏｌの配列表の配列番号４４〜４５記載の塩基配列を有するＭＣＳ−Ｆ及びＭＣＳ−Ｒプライマー、１．２５ＵのＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）、５μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）および０．２ｍＭのｄＮＴＰ  合物を含む全量５０μｌをＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で２分間、続いて９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間を１サイクルとする反応を３０サイクル行い、得られたＤＮＡ増幅断片をＩＣＡＮ反応の鋳型とした。
（２）ＰＣＲ産物を鋳型にしたＩＣＡＮ法によるＤＮＡ断片の増幅
ＩＣＡＮ増幅産物にアミノ基をいれるため、Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰ（シグマ社製）を用いてＩＣＡＮ反応を行った。その際、ｄＴＴＰ量とＡｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰ量の割合を１０：０、９：１、８：２、７：３、６：４とかえてＩＣＡＮ反応を行い、ＩＣＡＮ増幅産物にいれるアミノ基の割合を検討した。反応は、以下のようにして行った。
まず、上記（１）で調製したＰＣＲ反応液１μｌと各５０ｐｍｏｌの配列表の配列番号４７〜４８記載の塩基配列を有するプライマーＭＦ２Ｎ３（２４）とＭＲ１Ｎ３（２４）と２μｌの０．０５％  プロピレンジアミン水溶液を含む全液量１０μｌをＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｐｅｒｓｏｎａｌを用いて、９８℃で２分間の加熱処理、続いて６５℃で３０秒、氷上で急冷の処理を行い鋳型にプライマーをアニーリングさせた。次に、熱処理をした各溶液に各０．６２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ混合液、０．６２５ｍＭのｄＴＴＰ＋Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰ混合液、３２ｍＭ  ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、５．０ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．６Ｕの大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）、２．７５ＵのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量４０μｌの反応液を添加し、サーマルサイクラーで６５℃、１時間保温した。
この反応液５０μｌに５０μｌのイソプロパノール、５μｌの３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を添加して−８０℃で２０分放置後、遠心して上清除いた。続いて７０％エタノール溶液  ２００μｌを添加後、遠心により上清を除去して風乾した。得られたＤＮＡを水で再溶解してＯＤ２６０／２８０を測定し産物量を求めた。
（３）ＩＣＡＮ増幅産物へのＡｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰ導入の確認
ＩＣＡＮ産物にアミノ基が入っていることの確認は、５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｉｌ  ｅｓｔｅｒ（モレキュラープローブ社製）を用いてＩＣＡＮ産物のアミノ基を蛍光ラベルすることにより行った。前記ＤＮＡ溶液の一部を２μｇ／５０μｌになる様に希釈し、２０μｌの１Ｍ  炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた後、濃度が１０ｍＭになるようにＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解したＦＩＴＣ（ナカライテスク社製）を４μｌ添加し、２０℃で１６時間反応させた。市販のスピンカラムで過剰なＦＩＴＣを除去後、２．０％アガロースゲルに１０μｌアプライして電気泳動を行った。電気泳動後、ＦＭ−ＢＩＯで蛍光色素を確認、さらにＥｔＢｒ染色を行いＩＣＡＮ増幅断片の確認を行った。その結果、Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰを用いてＩＣＡＮを行うことで、ＩＣＡＮ増幅産物にアミノ基を入れることができる事が確認できた。
（４）Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰを導入したＩＣＡＮ産物のＤＮＡマイクロアレイへの応用
ＨＰＲＴ遺伝子と同様にマウス由来の６種類の遺伝子（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１８，ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ４，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ，ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ３−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）について、上記の操作を行ないアミノ基の入ったＩＣＡＮ産物を作製し、続いて作製したＤＮＡ溶液を９μｇになるように９６穴アッセイブロック（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）に入れ凍結乾燥を行なった。該ＩＣＡＮ産物を用いて、ＤＮＡマイクロアレイを作製した。作製方法を以下に示す。すなわち、上記ＩＣＡＮ産物の最終濃度を０．３μｇ／μｌになるように、０．１％シュークロースモノラウレート含有４０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に溶解し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４１７  アレイヤーを用いて活性化カルボキシル基導入スライドグラスガラスであるＭｉｒｕｓ−Ｅスライドグラスに、各サンプルを２スポットずつスポットした。スポット後のスライドグラスを０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で２回洗浄し、その後以下に示した４つの異なる条件下でスライドグラスの処理を行なった。
処理１：コントロール：蒸留水で洗浄後のスライドグラスを、そのまま低速遠心により乾燥させた。
処理２：０．２Ｎ  ＮａＯＨ（２０℃）：２０℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で５分間処理した後、蒸留水で５分間洗浄を二回行い、乾燥させた。
処理３：０．２Ｎ  ＮａＯＨ（６５℃）：６５℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で３０分間処理した後、蒸留水で５分間洗浄を二回行い、乾燥させた。
処理４：熱処理（沸騰水中で３分間処理）した後、氷冷しておいた９９．５％エタノール中で急冷し、乾燥させた。
こうして各変性操作を行なったＩＣＡＮ産物のＤＮＡマイクロアレイに対し、配列表の配列番号４６に記載の５’末端をＣｙ５標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅの取扱説明書に記載のプロトコールに従い、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥操作を行った。なお、このオリゴヌクレオチドプローブは、各ＩＣＡＮ増幅産物中に含まれる共通配列であるベクター部分の、ＩＣＡＮプライマーＭＦ２Ｎ３（２４）からの伸長鎖に相補的な配列を有するものである。その後、スライドグラスをＣｙ５の波長でスキャニングして蛍光画像を取得し、各スポットのシグナル強度をＩｍａＧｅｎｅ４．０を用いて定量した。その結果を表４〜表１０に示す。すなわち、表４〜表１０は、ｄＴＴＰとａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰの混合比と上記の各処理後のＤＮＡマイクロアレイの蛍光シグナル測定値（表中「ｓｉｇｎａｌ」）及びＮＨ２比（ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰを含まない場合の蛍光シグナルを１とした場合の各混合比における蛍光シグナルの値）を示す表である。
2002062993.tif 000005
2002062993.tif 000006
2002062993.tif 000007
2002062993.tif 000008
2002062993.tif 000009
2002062993.tif 000010
2002062993.tif 000011
表４〜表１０に示したように、変性操作未処理の場合全体的にシグナルが弱く、プローブのハイブリダイズ効率が低いことが確認された。しかし、Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰを用いてＩＣＡＮ反応を行うことで得られた産物でのシグナル強度は、Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰを含まない産物に比べＡｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰの混合割合が増えていくにしたがって増大しており、導入されたアミノ基の存在によって、ＩＣＡＮ増幅核酸のスライドグラスへの固定化率が上昇していることが示唆された。
また、変性操作を行うことにより、未変性の場合に比べてシグナル強度は上昇しており、変性操作を行うことによりプローブのハイブリダイゼーション効率が上昇することが確認された。シグナル強度は０．２Ｎ  ＮａＯＨ（２０℃）＜熱処理  ＜  ０．２Ｎ  ＮａＯＨ（６５℃）の順に高くなっており、ポリヌクレオチドの場合、６５℃の０．２Ｎ  ＮａＯＨ中で３０分間というアルカリ変性処理が好適に使用できることが確認できた。また、変性操作未処理での場合と同じくＡｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰを用いてＩＣＡＮ反応を行うことで得られた産物でのシグナル強度は、Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰを含まない産物に比べＡｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｄＵＴＰの混合割合が増えていくにしたがって増大しており、このことからも導入されたアミノ基の存在によって、ＩＣＡＮ増幅核酸のスライドグラスへの固定化率が上昇していること、その導入されるアミノ基の割合が多いほど固定化率が上昇していることが確認された。
実施例６
５’−ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’型キメラオリゴヌクレオチドプライマーについて５’末端および／または３’末端側のＤＮＡ部分にアミノ基を導入したプライマーを用いて、実施例１で見出した変性条件下における、実際のＩＣＡＮ法により増幅した２本鎖増幅核酸を固定化したアレイについて検討した。
（１）ＰＣＲによるＩＣＡＮ反応用テンプレートの作製
マウス脳由来ポリＡ＋ＲＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ社製）を用いて、ｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）により二本鎖ｃＤＮＡを作製した。この二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として配列表の配列番号５３及び５４記載の塩基配列を有するマウス  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１８  Ｆ及びＲプライマー、配列表の配列番号５５及び５６記載の塩基配列を有するマウス  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ｆ及びＲプライマーならびに配列表の配列番号５７及び５８記載の塩基配列を有するマウス  β−ａｃｔｉｎ  Ｆ及びＲプライマーの３種類のＰＣＲプライマー対のそれぞれを用いて、３４０ｂｐの増幅産物をＰＣＲ法により調製した。次にこれらの増幅産物を鋳型として、配列表の配列番号５９及び６０記載の塩基配列を有するＰＣＲプライマー対により、それぞれ４２２ｂｐの増幅産物をＰＣＲ法により調製した。こうして得られたＤＮＡ増幅断片をＩＣＡＮ反応の鋳型とした。
（２）ＰＣＲ産物を鋳型としたＩＣＡＮ法によるＤＮＡ断片の増幅
配列表の配列番号６１〜６２記載の塩基配列を有するＩＣＡＮ（２）、ＩＣＡＮ（６）６ｄＮ−Ｍ４キメラオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。各プライマーとアミノ基の導入位置について表１１に示す。
2002062993.tif 000012
表１１中において、例えば、ＮＨ２−ＩＣＡＮ（６）６ｄＮ−Ｍ４  ２５Ｔ−ＮＨ２／ＩＣＡＮ（２）は、ＩＣＡＮ（６）６ｄＮキメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端と２５番目のＴにアミノ基が付加されているプライマーと、ＩＣＡＮ（２）キメラオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせであることを示す。
上記プライマー対をそれぞれ１００ｐｍｏｌ、鋳型として上記（１）のＰＣＲ増幅産物１００ｎｇ、並びに最終濃度０．０１％プロピレンジアミンを含む混合液１０μｌを調製した。この混合液を９８℃、２分保持した後、氷上においた。該混合液に最終濃度２８ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、０．０１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、１％ジメチルスルホキシド、４ｍＭ  酢酸マグネシウム、各０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、８ＵのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（寶酒造社製）、５Ｕの参考例２記載の方法で調製したＰｈｏ  ＩＩ型ＲＮａｓｅＨを含む最終容量が５０μｌの反応液を調製した。上記反応液を均一に混合し、６０℃で６０分間保温した。
この反応液５０μｌに５０μｌのイソプロパノール、５μｌの３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を添加して室温で１５分放置後、遠心して上清を除いた。続いて７０％エタノール溶液２００μｌを添加し遠心して上清を除き風乾した。得られたＤＮＡを水で再溶解し、ＯＤ２６０／２８０を測定して産物量を求めた。
（３）ＩＣＡＮ増幅産物を用いたＤＮＡアレイの作製
上記ＩＣＡＮ産物を終濃度０．３μｇ／μｌとなるように、０．１％シュークロースモノラウレート含有４０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に溶解し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４１７アレイヤーを用いて活性化カルボキシル基導入スライドグラスである  Ｍｉｒｕｓ−Ｅスライドグラスに、各サンプルを３スポットずつスポットした。その後、０．２％  ＳＤＳ、次いで蒸留水で２回洗浄して乾燥させた後、実施例２（２）記載の条件で処理した。
（４）ハイブリダイゼーション、検出
マウス全ＲＮＡを用いて、ＲＮＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（Ｍ−ＭＬＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）（宝酒造社製）により蛍光標識ｃＤＮＡを調製した。この蛍光標識ｃＤＮＡをプローブとして用い、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅの取扱説明書に記載のプロトコールに従い、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥操作を行なった。その後、スキャニングしてＣｙ５の波長で蛍光画像を取得し、次いで書くスポットのシグナル強度とその周辺のバックグラウンドをＩｍａＧｅｎｅ４．０を用いて定量した。その結果、アミノ基を導入することにより、固定化する核酸の使用率が向上し、高固定化率で増幅核酸を固定化することができることを確認した。特にＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡタイプのキメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合、その５’側ならびに３’側のＤＮＡ部分にアミノ基を導入することにより固定化する核酸の使用率が高まることを確認した。
産業上の利用の可能性
本発明により、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを利用した核酸増幅反応により大量の固相への固定化用増幅核酸を提供することができる。また、本発明の方法により、増幅核酸の末端あるいは該核酸中の修飾デオキシリボヌクレオチドで固相に固定化することができる増幅核酸を提供することができる。さらに本発明の方法により、リボヌクレオチドを含む１本鎖核酸あるいはデオキシリボヌクレオチドで構成された１本鎖核酸の固定化物を提供することができる。本発明の方法により低コスト、高感度の増幅核酸固定化物を提供することができる。
2002062993.tif 000013
2002062993.tif 000014
2002062993.tif 000015
2002062993.tif 000016
2002062993.tif 000017
【配列表】
2002062993.tif 000018
2002062993.tif 000019
2002062993.tif 000020
2002062993.tif 000021
2002062993.tif 000022
2002062993.tif 000023
2002062993.tif 000024
2002062993.tif 000025
2002062993.tif 000026
2002062993.tif 000027
2002062993.tif 000028
2002062993.tif 000029
2002062993.tif 000030
2002062993.tif 000031
2002062993.tif 000032
2002062993.tif 000033
2002062993.tif 000034
2002062993.tif 000035
2002062993.tif 000036
2002062993.tif 000037
2002062993.tif 000038
2002062993.tif 000039
2002062993.tif 000040
2002062993.tif 000041
2002062993.tif 000042
2002062993.tif 000043
2002062993.tif 000044
2002062993.tif 000045
2002062993.tif 000046
【国際調査報告】
2002062993.tif 000047
2002062993.tif 000048
2002062993.tif 000049
2002062993.tif 000050