(57)【要約】キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体を提供することである。キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子をクローニングして、ＤＮＡ塩基配列及びそれから予想されるアミノ酸配列を決定した。この遺伝子がコードするタンパク質は、６３７残基からなる分子量７１ｋＤａのタンパク質であることが判明し、β−ラクタムアシラーゼ活性を有していた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項３】
配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項４】
キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離された請求の範囲１〜３記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項９】
キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離された請求の範囲５〜８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号５で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有する組換えタンパク質。
【請求項１３】
請求の範囲１〜４記載の遺伝子に含まれる転写調節配列。
【請求項１４】
請求の範囲１〜４記載の遺伝子に含まれる翻訳調節配列。
【請求項１５】
転写及び／又は翻訳調節配列を含むレギュロンの制御下にある請求の範囲１〜４のいずれかに記載の遺伝子であって、当該調節配列の一方又は両方がそれぞれ同じ又は異なる生物から得られた他の転写及び／又は翻訳調節配列に置き換えられている遺伝子。
【請求項１６】
請求の範囲１〜４記載の遺伝子を１以上含む組換えベクター。
【請求項１７】
請求の範囲１６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１８】
形質転換宿主がグラム陰性微生物である請求の範囲１７記載の形質転換体。
【請求項１９】
形質転換宿主がグラム陽性微生物である請求の範囲１７記載の形質転換体。
【請求項２０】
請求の範囲１７〜１９記載の形質転換体を培養し、アシラーゼを回収することからなるアシラーゼの製造方法。
【請求項２１】
請求の範囲５〜９記載のポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列からなるアシラーゼ。
【請求項２２】
請求の範囲１７〜１９記載の形質転換体を培養し、その菌体混合培養液もしくは菌体の破砕物を固定化してなる固定化アシラーゼ。
【請求項２３】
請求の範囲１６記載の組換えベクターを調製し、当該ベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体をクローン化し選択することからなる、形質転換体中でアシラーゼを産生する又はその産生を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼをコードするＤＮＡを有する遺伝子、当該遺伝子の塩基配列から予想されるタンパク質、当該遺伝子によりコードされたアシラーゼ、当該遺伝子を有する組換えベクター、および当該組換えベクターを含む形質転換体を提供する当該酵素の製造方法に関する。
背景技術
β−ラクタム系抗生物質の基本となる物質は、原理的に発酵により得られる。ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属およびセファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属等の菌類が、ペニシリンＧ（ＰｅｎＧ）、ペニシリンＶ（ＰｅｎＶ）およびセファロスポリンＣ等のβ−ラクタム系抗生物質の原料物質の製造に利用される。これら発酵生成物は、ほとんど全ての一般的に販売されているペニシリン類およびセファロスポリン類に対する出発物質となっている。ＰｅｎＧ、ＰｅｎＶあるいはセファロスポリンＣからアミド結合を開裂（脱アシル化）し、半合成ペニシリン及びセファロスポリンの工業的生産の最も重要な中間体である６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）あるいは７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を生成するために、ペニシリンＧアシラーゼ（ペニシリンＧアミダーゼとも称されるベンジルペニシリンアミドヒドロラーゼ、ＥＣ３．５．１．１１）が産業上使用されている。この酵素は、ＰｅｎＧから通常化学的に製造されるフェニルアセチル−７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸から、７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）への生産にも工業的に使用されている。これらβ−ラクタム母核である６−ＡＰＡ、７−ＡＣＡ、７−ＡＤＣＡと側鎖化合物との化学反応による合成により製造された半合成ペニシリン類およびセファロスポリン類が、β−ラクタム系抗生物質の重要な市場を形成している。
従来β−ラクタム母核生産での脱アシル化において有用な加水分解酵素は、化学反応の形態に基づくと加水分解酵素として分類されるが、当該分野においては通常「アシラーゼ」もしくは「アミダーゼ」と呼ばれている。しかし、全てのアシラーゼがβ−ラクタム系抗生物質を基質として認識するわけではないので、さらに「β−ラクタムアシラーゼ」として特定されている。アシラーゼの活性とは、アシル基が水に転化される場合には加水分解（脱アシル）活性をさし、可逆反応として活性化された側鎖基質から求核物質へのアシル基の転移を触媒する場合には転移活性をさす。この化学的形態は次の一般式によって表される。即ち、アシラーゼによって基質として受け入れられる化合物：Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙにおける当該化学的形態ＸおよびＹの特性は、該当するアシラーゼの基質特異性によって決定される。Ｘは側鎖を表し、一方Ｙはアシルアクセプタ基を表している。例えば、ＰｅｎＧの場合Ｘ−ＣＯ−はフェニルアセチル側鎖を表し、かつ−ＮＨ−Ｙは６−ＡＰＡを表している。これを認識するβ−ラクタムアシラーゼは、脱アシル化／アシル基転移の両方を触媒することより、現在β−ラクタム系抗生物質の生産におけるアシル基転移反応工程を化学合成から酵素法への転換での利用が注目されている。
β−ラクタムアシラーゼは、基質特異性や分子的特徴において以下のように分類されている（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，１３１，１９９２、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１２９，１９９４）。β−ラクタムアシラーゼは大きく分けて、ペニシリンアシラーゼとセファロスポリンアシラーゼに分類され、さらにペニシリンアシラーゼはペニシリンＶアシラーゼとペニシリンＧアシラーゼとアンピシリンアシラーゼに細分類され、セファロスポリンアシラーゼは、セファロスポリンアシラーゼとグルタリル−７−ＡＣＡ（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼに細分類される。
一般的にペニシリンＶアシラーゼは分子量３５ＫＤａのサブユニットの４量体を形成している。ペニシリンＧアシラーゼは小サブユニット（α：１６−２６ｋＤａ）と大サブユニット（β：５４−６６ｋＤａ）からなるヘテロ２量体を形成している。アンピシリンアシラーゼは分子量７２ｋＤａのホモ２量体を形成している。一方ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼもヘテロ２量体を形成していることが知られている。
これらアシラーゼのうちペニシリンＧアシラーゼをコードしている微生物のアシラーゼ遺伝子配列が明らかにされている。即ち、イー  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４（１４），５７１３，１９９６）、クルイベラ  シトロフィリア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）（Ｇｅｎｅ，４９，６９，１９８６）、アルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（特開平４−２２８０７３）、プロビデンシア  レテゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）（ＤＮＡ  ｓｅｑ．，３，１９５，１９９２）、アリスロバクター  ビスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，２６０３，１９８８）、アーケオグロバス  フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，３６４，１９９７）、バチルス  メガテリウム（Ｂａｔｉｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２５，２８７，１９９５）等である。また、ヘテロ２量体構造を持つＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼは、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７，５９１，１９９４）、セファロスポリンアシラーゼはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６３，１２２２，１９８５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５８２１，１９８７）等が明らかにされている。しかしながら、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）のβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子配列は報告されていない。
キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）が持つβ−ラクタムアシラーゼは、α−アミノ酸化合物に基質特異性が高いことから、α−アミノ酸エステルヒドロラーゼとも呼ばれている（Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，３０Ｓ，Ｓ−２３０，１９７７、特開昭４７−２５３８８）。この酵素は分子量７２ｋＤａの単量体をサブユニットに持つ２８０ｋＤａのホモ４量体構造をとることが既に報告されている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，１０６９，１９８０）が、いまだその遺伝子配列は報告されていない。即ち、ペニシリンＧアシラーゼやセファロスポリンアシラーゼのように、１本の前駆体ポリペプチド鎖が最初に翻訳され、その後酵素消化されることによってα，βのヘテロ２量体構造を示す酵素は、多くの微生物から遺伝子が単離されているが、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）のホモ４量体構造をとる酵素についてはアミノ酸配列やＤＮＡ配列の報告はない。また、シュードモナス  メラノゲナム（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｍ）アシラーゼについても、ホモ２量体構造をとることが報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０４０，１２，１９９０）が、タンパク化学的報告にとどまり、そのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列に関する報告はない。さらにバチラス  ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）のＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼがクローニングされており（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，７８４８，１９９１）、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼと同グループを形成する可能性が示されているが、サブユニット構造からの推測にすぎず、これら情報によりアシラーゼ遺伝子がクローニングされた報告はない。一方、ヘテロ２量体構造をとるアシラーゼは、数多く報告されている。即ち、イー  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４（１４），５７１３，１９９６）、クルイベラ  シトロフィリア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ｇｅｎｅ，４９，６９，１９８６）、アルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（特開平４−２２８０７３）、プロビデンシア  レテゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＤＮＡ  ｓｅｑ．，３，１９５，１９９２）、アリスロバクター  ビスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，２６０３，１９８８）、アーケオグロバス  フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）ペニシリンアシラーゼ（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，３６４，１９９７）、バチルス  メガテリウム（Ｂａｔｉｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２５，２８７，１９９５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｃ４２７  ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７，５９１，１９９４）、シュー���モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＧＫ１６セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６３，１２２２，１９８５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ８３セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５８２１，１９８７）。これらは、遺伝子ファミリーとしてＤＮＡレベルで明らかにされているため、ＤＮＡプローブ設計から簡単に遺伝子クローニングができ、また、微生物ゲノムライブラリーの酵素活性を指標にした方法にスクリーニングによっても容易にこれらＤＮＡを取得できる。
発明の要約
本発明が解決しようとする課題は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼタンパク質、当該アシラーゼタンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体を提供することである。
本発明のキサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼ酵素は、報告されているイー  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４（１４），５７１３，１９９６）、クルイベラ  シトロフィリア（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ｇｅｎｅ，４９，６９，１９８６）、アルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（特開平４−２２８０７３）、プロビデンシア  レテゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＤＮＡ  ｓｅｑ．，３，１９５，１９９２）、アリスロバクター  ビスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，２６０３，１９８８）、アーケオグロバス  フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）ペニシリンアシラーゼ（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，３６４，１９９７）、バチルス  メガテリウム（Ｂａｔｉｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１２５，２８７，１９９５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｃ４２７  ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７，５９１，１９９４）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＧＫ１６セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６３，１２２２，１９８５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ８３セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５８２１，１９８７）の遺伝子配列と特徴的な相同性を示さない。また、これら相同的プローブを用いて実施したキサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼに関するＤＮＡ配列ならびにアミノ酸配列に関する報告はない。
我々はキサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）ゲノムライブラリーから通常のアシラーゼ酵素活性測定スクリーニングも試みたが、報告されているヘテロ２量体アシラーゼやバチラス  ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ等と異なり、活性を示す陽性クローンを得ることはできなかった。この酵素活性測定スクリーニングにおいて、宿主大腸菌内でのコピー数が異なるプラスミドを用いてライブラリーを作成し、スクリーニングを実施した。即ちｐＢＲ３２２プラスミドを用いたゲノムライブラリーでは、平均約６Ｋｂｐのゲノム断片が挿入された１．９万コロニーをスクリーニングして理論上１１０Ｍｂｐのゲノムについてスクリーニングを行い、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドを用いたライブラリーでは、平均約６−７Ｋｂｐのゲノム断片が挿入された２万コロニーをスクリーニングし、理論上１２０−１４０Ｍｂｐのゲノムについてスクリーニングを行った。一般的にはゲノムライブラリーのスクリーニングでは全ゲノム長の１０倍の長さをスクリーニングする必要があるといわれているが、今回は１００倍近い長さを網羅しており、スクリーニングする長さとして十分であったと考えられたが、いずれのライブラリーからも陽性株を取得することは出来なかった。これは、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼの宿主大腸菌内での発現が非常に弱いことが考えられた。そこで、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼタンパク質の精製を行い、アミノ酸配列を決定することを試みたが、Ｎ末端配列を決定することができなかった。これは、なんらかの末端アミノ酸修飾でブロックされていると考えられた。このようなアシラーゼの取得の困難性より、これまでキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼ遺伝子についての報告はなされていない。
本発明者らは、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を明らかにすることによる産業的意義は大きいと考え、β−ラクタムアシラーゼの内部アミノ酸配列を決定し、その配列を用いたスクリーニングによる鋭意研究を重ねた結果、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子をクローニングして配列番号１で示されるＤＮＡ塩基配列を決定した。当該遺伝子のオープンリーディングフレームは１９１４塩基からなり、配列番号２で示される６３７アミノ酸配列からなる分子量７１ｋＤａのタンパク質をコードしていることが判明した。さらに、当該遺伝子を宿主中で発現させ、アシル化活性を有することを確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関し、また、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関し、さらに、配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関する。また、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離された上記遺伝子に関する。
また、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離された上記ポリヌクレオチド；配列番号５で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに関する。
さらに、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質；配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。
また、本発明は、上記遺伝子に含まれる転写調節配列；上記遺伝子に含まれる翻訳調節配列；転写及び／又は翻訳調節配列を含むレギュロンの制御下にある上記遺伝子であって、当該調節配列の一方又は両方がそれぞれ同じ又は異なる生物から得られた他の転写及び／又は翻訳調節配列に置き換えられている遺伝子に関する。
さらに、本発明は、上記遺伝子を１以上含む組換えベクター；上記組換えベクターを含む形質転換体；形質転換宿主がグラム陰性微生物である上記形質転換体；形質転換宿主がグラム陽性微生物である上記形質転換体に関する。
また、本発明は、上記形質転換体を培養し、アシラーゼを回収することからなるアシラーゼの製造方法；上記ポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列からなるアシラーゼ；上記形質転換体を培養し、その菌体混合培養液もしくは菌体の破砕物を固定化してなる固定化アシラーゼ；上記組換えベクターを調製し、当該ベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体をクローン化し選択することからなる、形質転換体中でアシラーゼを産生する又はその産生を増強する方法に関する。
発明の詳細な開示
以下、本発明を詳細に説明する。
ここで述べる遺伝子とは、アミノ酸をコードする領域と、５’上流および３’下流でＲＮＡに転写される領域、さらにこの領域外の部分でも転写および翻訳の実行や効率に関わる調節領域を含む領域のことを示す。
また、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）由来の本発明の遺伝子をキサントモナス  シトリβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子（ｘｃａｃｙ）、ｘｃａｃｙ遺伝子の発現ポリペプチドをＸＣＡＣＹと略する。
本発明の一つの形態によると、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質が提供される。
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを有する遺伝子、及び、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ＤＮＡ変異体」と称することもある）を有する遺伝子が提供される。
当該遺伝子は、好ましくはキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離されたものである。より好ましくはキサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）、さらに好ましくはキサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株から単離されたものである。
ここで、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」とは、活性が性質的に同質なタンパク質をコードしており、配列番号２で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上であるアミノ酸配列を意味する。
また、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されることを意味する。
つまり、本発明において、ＤＮＡ変異体は、当該分野において既知の方法によって、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡから調製することができる。このような操作としては、例えば、部位特異的突然変異誘発、点変異、欠失、重複、逆位、転座、遺伝コードの縮重等により、アミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを変更する保存的変更が挙げられる。
アシラーゼ活性とは、アシル基が水に転化される場合には加水分解（脱アシル）活性をさし、可逆反応として活性化された側鎖基質から求核物質へのアシル基の転移を触媒する場合には転移活性をさす。なお、加水分解活性の場合は、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）の加水分解を触媒する酵素量とし、また、転移活性の場合は、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのアモキシシリンを合成する酵素量とし、ＨＰＬＣ等を用いて定量を行うことができる。
さらに、本発明の遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。つまり、配列番号１で示される塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸をコードするＤＮＡを含有するものである。
また、本発明は、以下のポリヌクレオチドを提供するものである。配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離された上記ポリヌクレオチド；配列番号５で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
さらに、本発明の組換えタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質であってもよいし、また、配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有する組換えタンパク質（以下、「変異タンパク質」とも称する）であってもよい。
この際、変異タンパク質としては、上述のようなＤＮＡ変異体によってコードされるタンパク質、さらには、基本的なβ−ラクタムアシラーゼ活性は変化させずにアミノ酸配列が保存的あるいは半保存的に変更（例えば、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン等の脂肪族鎖を有するアミノ酸同士の置換や、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等の芳香族鎖を有するアミノ酸同士の置換）されたタンパク質等が挙げられる。
また、本発明は、上述の本発明の遺伝子に含まれる転写調節配列、及び、翻訳調節配列を提供する。当該転写調節配列としては、配列番号１の１６４番目から１６９番目のｔｔｇａｃａを含む配列、１９４番目から１９９番目のｔａｃａｇｔを含む配列である。また、翻訳調節配列としては、配列番号１の２２１番目から２２９番目のｃｇｇａｇｔｃｇｔを含む配列である。
さらに、本発明は、転写及び／又は翻訳調節配列を含むレギュロンの制御下にあり、当該調節配列の一方又は両方が、それぞれ同じ又は異なる生物から得られた他の転写及び／又は翻訳調節配列に置き換えられている遺伝子を提供する。
ここで、同じ又は異なる生物から得られた他の転写調節配列及び翻訳調節配列としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に制限されることはなく、当該分野において既知のものが使用される。
本発明の別の形態によると、上述の本発明の遺伝子を１以上含む組換えベクターが提供される。また、当該組換えベクターを含む形質転換体も提供される。
この組換えベクターは、本発明の遺伝子を適当な制限酵素で切断された発現用ベクター中に連結させることによって調製される。
また、形質転換体の作製に用いられる形質転換宿主としては、特に限定されないが、例えば、グラム陰性微生物、グラム陽性微生物等が挙げられる。グラム陰性微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等が挙げられ、グラム陽性微生物としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等が挙げられる。
さらに、本発明は、上述した制御配列（転写及び／又は翻訳調節配列）に関して操作された、アシラーゼ遺伝子を含むベクター、および当該ベクターを含む形質転換体を提供する。
本発明の別の形態によると、上記形質転換体を培養し、アシラーゼを回収することからなるアシラーゼの製造方法、つまり、アシラーゼをコードされた形質転換体を培養し、単離形態のアシラーゼを回収することからなるアシラーゼの製造方法を提供する。
また、上記ポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列からなるアシラーゼ；上記形質転換体を培養し、その菌体混合培養液もしくは菌体の破砕物を固定化してなる固定化アシラーゼを提供する。さらに、上記組換えベクターを調製し、当該ベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体をクローン化し選択することからなる、形質転換体中でアシラーゼを産生する又はその産生を増強する方法を提供する。
形質転換株は、通常の栄養培地で培養することにより、導入した組換えＤＮＡの形質を発現させることができる。組換え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由来の性質が付与されている場合は、その性質に合わせて培地に薬剤（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン等）を補ってもかまわない。
このようにして得られた形質転換株を酵素源として得るには、通常の培地を用いて培養を行えばよいが、必要に応じてＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）等の添加等の、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
形質転換株の培養のために用いられる培地としては、通常、炭素源（例えば、グルコースやシュークロース等の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類等）、窒素源（例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩等）および無機イオン（例えば、リン酸イオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン等）を含有する普通の培地等が挙げられる。これに、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。
さらに本発明の別の形態によると、前記アシラーゼ酵素を作用させる様態としては、当該転換株の培養液、菌体、菌体処理物、固定化菌体、菌体から抽出した酵素、固定化酵素等を挙げることができる。これらは、大規模なアシル化またはアシル基転換化工程で使用することができる。
菌体処理物としては、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥体、アセトン乾燥体、リゾチームで処理した菌体、超音波破砕した菌体が挙げられる。
さらに、これら菌体、菌体処理物、無細胞酵素抽出物、精製酵素は、公知の手段で固定化することができる。固定化は、当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法等で行うことができる。なお、固定化法については、例えばＷＯ９６／２０２７５に示される方法が参考になる。
固定化に使用される支持体としては、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ５６８またはＤＳ１７１８６（ローム・アンド・ハース社：登録商標）等のフェノールホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ９３５、ＩＲＡ９４５、ＩＲＡ９０１（ローム・アンド・ハース社：登録商標）、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＯＣ１０３７（バイエル社：登録商標）、Ｄｉａｉｏｎ  ＥＸ−０５（三菱化学：登録商標）等のポリスチレン樹脂のような、各種アミンやアンモニウム塩あるいはジエタノールアミン型の官能基を持つ各種陰イオン交換樹脂が適している。その他、ＤＥＡＥ−セルロース等の支持体も使用することができる。
さらに、酵素の吸着をより強固かつ安定にするため、通常、架橋剤を用いるが、好適な例としてグルタルアルデヒド等を挙げることができる。使用する酵素は、精製酵素だけでなく、菌体、菌体処理物、無細胞酵素抽出物等、種々の精製度のものが使用できる。固定化菌体あるいは固定化酵素の調整は、菌体液あるいは酵素液に、支持体を加えて攪拌して吸着させた後、架橋処理をする等の通常の調整法が使用できる。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例により本発明をさらに説明する。つまり、本発明の遺伝子、タンパク質、組換えベクター、形質転換体等の実施態様を以下に説明するが、本発明は下記実施態様に制限されるものではない。
材料及び方法
アシラーゼ遺伝子のクローニング
全体的な遺伝子操作およびクローニング法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているように行った。ＤＮＡ操作に使用した酵素、プラスミド及びイー  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニング宿主は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用した。
培地
Ｂ培地：  ペプトン  ５ｇ／ｌ、イーストエクストラクト  ５ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２ｇ／ｌ、シュークロース  ２０ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １ｇ／ｌ、グルタミン酸ナトリウム  ２ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／ｌ、ｐＨ７．２
ＬＢ培地：  バクトトリプトン  １０ｇ／ｌ、イーストエクストラクト  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０
緩衝液
１×ＳＳＣ：  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ
３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）：  ３０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整
５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ５．０）：  ５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ＫＯＨでｐＨ５．０に調整
菌株
キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株を、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の供与株として使用した。
イー  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株、イー  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を組換えプラスミドの宿主として使用した。
アシラーゼ活性
アシラーゼの活性とは、アシル基が水に転化される場合には加水分解（脱アシル）活性をさし、可逆反応として活性化された側鎖基質から求核物質へのアシル基の転移を触媒する場合には転移活性をさす。
加水分解活性の場合、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）の加水分解を触媒する酵素量とする。
転移活性の場合、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのアモキシシリンを合成する酵素量とする。
それぞれの反応条件は以下に示し、定量はＨＰＬＣにより行った。
ＨＰＧＯＭｅ加水分解反応
ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌを３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ８．０）に０．５％になるように溶かして基質液とした。菌体あるいは粗酵素液を基質液に懸濁し、３０℃で４時間振とうしながら反応させた。１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。
アモキシシリン合成反応
６−ＡＰＡ、ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌを３０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）に０．５％になるように溶かして基質液とした。菌体あるいは粗酵素液を基質液に懸濁し、３０℃で４時間振とうしながら反応させた。１Ｎ  ＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いた検出
菌体反応、粗酵素反応における、アモキシシリンの検出を薄層クロマトグラフィーで行った。反応液を遠心して上清を回収してシリカゲル薄層プレートに微量スポットし、酢酸エチル：酢酸：水＝６０：２０：２０の展開溶媒にて展開させ、溶媒除去後、ニンヒドリン反応にてアモキシシリンを検出した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた検出
反応液を遠心して上清を回収し、移動相で１０倍希釈してＨＰＬＣで測定した。分析条件は、カラムはコスモシル５Ｃ１８  ＡＲ（ナカライテスク社）を用い、移動相は１％アセトニトリル／５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ５．０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３５℃、測定波長２２５ｎｍで行った。ピークは標準品を用いて同定し、アモキシシリンの標準品として、アモキシシリン三水和物（和光純薬）を用いた。保持時間は、ＨＰＧ（Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン）１．８ｍｉｎ、６−ＡＰＡ  ５．９ｍｉｎ、アモキシシリン  ７．５ｍｉｎ、ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ  ９．４ｍｉｎであった。
（実施例１）  キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株のβ−ラクタムアシラーゼの精製
キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株をＢ培地で３０℃で増殖させた。以下の操作は、４℃で行った。細胞を遠心分離により回収し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、ＥＤＴＡ・２Ｎａを４．７ｇ／ｌ、リゾチームを０．１３ｇ／ｌになるよう添加し、一晩撹拌した。ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを３．１３ｇ／ｌ、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼＩ（ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ）を０．０６ｍｇ／ｌになるように添加して一晩反応させ、菌体を超音波破砕し、上清を遠心分離で回収した。Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯＨ）２・Ｈ２Ｏを２２．９ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４を２２．９ｇ／ｌになるよう添加し、上清を遠心分離で回収した。透析後、陽イオン交換ゲルクロマトグラフ（ＣＭセファロースＣＬ−６Ｂ）を３回、ゲル濾過クロマトグラフ（セファクリル−３００）を１回用いて精製を行った（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４（５），１０６９，１９８０）。カラムから溶出された画分はＴＬＣによりアモキシシリン合成活性を確認し、次の精製段階へ進めた。得られたＸＣＡＣＹタンパク質は、約７０ｋＤａのサブユニットからなることが分かった。
（実施例２）  キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株のβ−ラクタムアシラーゼのアミノ酸配列の決定
上記実施例１の精製法で得られたＸＣＡＣＹタンパク質を、リジルエンドペプチダーゼにより限定分解し、ペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。ＸＣＡＣＹタンパク質をバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、４Ｍ  Ｕｒｅａ）に懸濁して、リジルエンドペプチダーゼをＸＣＡＣＹタンパク質の１／５０量になるよう添加し、３７℃で６時間反応させた。逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ワイエムシィ社））にてペプチドを分取し、Ｍｏｄｅｌ  ４９Ｘプロテインシークエンサー（アプライド・バイオシステム社）で解析を行った。得られたアミノ酸配列を、配列番号３に示した。
（実施例３）  キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株のβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子のクローニング
キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株のゲノムＤＮＡを単離してＥｃｏＲＩで消化した１０−２０ｋｂｐのフラクションを、ＥｃｏＲＩおよびアルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）処理したｐＵＣ１９プラスミドにクローニングしたものを、イー  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に形質転換し、Ｌ−Ａｍｐプレート（ＬＢ培地にバクトアガー  １５ｇ／ｌ、アンピシリン  ５０ｍｇ／ｌになるよう添加したもの）にまき、３７℃で一晩培養した。このプレートのコロニーをナイロンメンブレンにレプリカし、コロニーが適当な大きさになるまで培養した後、菌体を溶菌してフィルターを作成した。配列番号３に含まれるアミノ酸配列で、配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４：Ｘ１オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  ３’−ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ（アマシャム  ファルマシア  バイオテック社）でＸ１オリゴヌクレオチドの３’末端を蛍光ラベルし、５０℃のハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、２０倍希釈ｌｉｑｕｉｄ  ｂｌｏｃｋ（アマシャム  ファルマシア  バイオテック社）、０．５％  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ）中で一晩ハイブリダイズさせた。室温の５×ＳＳＣ溶液（０．１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、次いで４２℃の１×ＳＳＣ溶液（０．１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）中でメンブレンを洗浄し、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ（アマシャム  ファルマシア  バイオテック社）で検出を行い、陽性クローンを得た。このクローンより得られたプラスミドをｐＵＣＸＣ４（図１）とした。
（実施例４）  β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の配列決定
上記で得られた陽性クローンの配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アプライド・バイオシステム社）を用いたデオキシ配列決定によりシークエンシング反応を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステム社）で解析を行った。得られたβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子配列を配列番号１に、予測されたアミノ酸配列を配列番号２に示した。
（実施例５）  β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の組換えベクターの構築
ｐＵＣ１９プラスミドのｌａｃ  Ｚ遺伝子の開始コドン部位にＮｄｅＩサイトを作製するプライマーを作製してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ｐＵＣ１９プラスミドにＮｄｅＩサイトを１カ所加えたｐＵＣＮｄｅプラスミドを作製した。ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャム  ファルマシア  バイオテック社）プラスミドも同様にＰＣＲを行い、ＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変えたｐＴｒｃＮｄｅプラスミドを作製した。ｐＵＣＮｄｅプラスミドをＮｄｅＩ、ＳｓｐＩで切断した２．０ｋｂｐ断片と、ｐＴｒｃＮｄｅプラスミドをＮｄｅＩ、ＳｓｐＩで切断した０．６ｋｂｐ断片をライゲーションして、ｐＵＣＮＴプラスミドを作製した。
ｐＵＣＮＴプラスミドをＣｒｆ１０Ｉ、ＳｓｐＩで切断した１．８ｋｂｐの断片と、ｐＫＣ７プラスミド（Ｇｅｎｅ，７，７９，１９７９）をテンプレートとしてカナマイシン耐性遺伝子をＣｒｆ１０Ｉ、ＳｓｐＩサイトを持つようにＰＣＲで１．２ｋｂｐの断片を作製し、ライゲーションしてｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５（ｋａｍｒ）プラスミドを作製した。
ｐＵＣＸＣ４プラスミドをテンプレートとし、Ｘ４５−ＮｄｅＩプライマー（ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣ）とＸ３８−ＢａｍＨＩプライマー（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＧＴＡＣＣＧＧＣＡＧＡＣＴＧＡ）を用いて、ＰＣＲを行ってＣＤＳ断片を増幅した。このＣＤＳ断片をｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５（ｋａｍｒ）プラスミドベクターのＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトにクローニングし、ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣとした。この組換えベクターの構築を図２に示した。
（実施例６）  β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の発現
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１に形質転換した株（ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣ／ＨＢ１０１）を、ＬＢ培地にカナマイシンを５０ｍｇ／ｌになるよう添加したものにまき、３０℃で一晩培養した。菌体を遠心分離で回収し、３０ｍＭ  ＫＰＢに懸濁した後、超音波破砕して、上清を遠心分離で回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ったところ、約７０ｋＤａのバンドが確認され、β−ラクタムアシラーゼが発現されていることが確認された。
（実施例７）  β−ラクタムアシラーゼ活性の確認
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣ／ＨＢ１０１株を実施例６と同様に一晩培養後、１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加してさらに３時間培養した。菌体をＬｙｓｏｚｙｍｅ  ０．４４ｍｇ／ｍｌで１５分間氷上で処理し、超音波破砕遠心した上清を粗酵素液とした。粗酵素液の総タンパク質量はブラッドフォード法にて定量した。基質（０．５％  ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ，０．５％  ６−ＡＰＡ）２００μｌに２５μｇのタンパク質を添加し、３０℃で１時間振とうしながら反応させ、１０倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣで分析し、アモキシシリンのピークを検出した。これにより、ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５プラスミドにクローニングされたＸ．ｃｉｔｒｉ  β−ラクタムアシラーゼ遺伝子が大腸菌ＨＢ１０１株で発現され、活性を持つことが確認された。
（実施例８）  β−ラクタムアシラーゼの樹脂への固定化
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣ／ＨＢ１０１株を実施例７と同様に培養後、菌体破砕処理を行い、粗酵素液を調整した。これに、０．１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で平衡化したＤｕｏｌｉｔｅＡ−５６８（ローム・アンド・ハース社）を、総タンパク質４０ｍｇに対して樹脂１ｇになるように添加し、窒素シール下、４℃で２０時間攪拌し、吸着させた。この吸着樹脂を０．１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）および１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で洗浄後、０．２％グルタルアルデヒド、０．１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）を用いて、４℃で１０分間反応させてタンパク質を架橋し、固定化樹脂を作製した。基質（０．５％  ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ，０．５％  ６−ＡＰＡ）２００μｌに１ｍｇの当該固定化樹脂を添加し、３０℃で４時間振とうしながら反応させ、１０倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣで分析し、アモキシシリンのピークを検出した。
産業上の利用可能性
キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）由来のβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子を発現用ベクターに結合して組換えベクターを得、形質転換を行い、発現させることにより、効率よくβ−ラクタムアシラーゼを調製することができる。このβ−ラクタムアシラーゼを単離あるいは粗精製の状態で、大量の脱アシル化／アシル基転換化の工程に使用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、キサントモナス  シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼの遺伝子領域を含むｐＵＣＸＣ４の制限酵素地図を示す。
図２は、組換えベクターの構築を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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