(57)【要約】本発明の目的は、標的ｍＲＮＡの高次構造に関わらず結合し、効果的に切断できるマキシザイムを提供することである。本発明によれば、ヘリカーゼ活性を有する分子と結合することを特徴とするマキシザイムが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリカーゼ活性を有する分子と結合することを特徴とするマキシザイム。
【請求項２】
ヘリカーゼ活性を有する分子と結合する領域を含有するマキシザイム。
【請求項３】
下記のヌクレオチド配列（ａ）を含むＲＮＡ分子および下記のヌクレオチド配列（ｂ）を含むＲＮＡ分子が形成する２量体の構造からなるマキシザイム。
５’Ｘ１１…Ｘ１ｈＹ１１…Ｙ１ｉＺ１１…Ｚ１ｊＢ１１…Ｂ１ｐ３’  （ａ）
５’Ｚ２１…Ｚ２ｎＹ２１…Ｙ２ｍＸ２１…Ｘ２ｋＢ２１…Ｂ２ｑ３’  （ｂ）
（配列中、Ｘ１１…Ｘ１ｈ、Ｘ２１…Ｘ２ｋ、Ｙ１１…Ｙ１ｉ、Ｙ２１…Ｙ２ｍ、Ｚ１１…Ｚ１ｊ、Ｚ２１…Ｚ２ｎ、Ｂ１１…Ｂ１ｐ及びＢ２１…Ｂ２ｑは、各々独立に、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＧのいずれかであり、ｈおよびｋは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
ｉおよびｍは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
ｊおよびｎは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
ｐおよびｑは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
Ｘ１１…Ｘ１ｈおよびＸ２１…Ｘ２ｋは、標的ＲＮＡ中の特異的配列に相補的なヌクレオチド配列であるか、または標的ＲＮＡの切断部位周辺の配列に相補的である領域および標的ＲＮＡの存在下でのみＭｇ２＋（マグネシウムオン）を捕捉する空洞を形成しうる領域を含むヌクレオチド配列であり、Ｙ１１…Ｙ１ｉおよびＹ２１…Ｙ２ｍは、ステムを形成するヌクレオチド配列であり、Ｚ１１…Ｚ１ｊおよびＺ２１…Ｚ２ｎは、標的ＲＮＡの切断部位周辺の配列に相補的である領域および標的ＲＮＡの存在下でのみＭｇ２＋を捕捉する空洞を形成しうる領域を含むヌクレオチド配列であり、Ｂ１１…Ｂ１ｐおよびＢ２１…Ｂ２ｑの一方または双方にヘリカーゼ活性を有する分子と結合する領域を含むヌクレオチド配列である。）
【請求項４】
標的ＲＮＡの存在下でのみＭｇ２＋（マグネシウムイオン）を捕捉する空洞を形成しうるヌクレオチド配列として、Ｚ１１…Ｚ１ｊが配列ＧＡＡを含むものであり、Ｚ２１…Ｚ２ｎが配列ＣＵＧＡＹｚＧＡ（ＹｚはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれかの任意のモノヌクレオチドを示す）を含むものである請求項３記載のマキシザイム。
【請求項５】
標的ＲＮＡの存在下でのみＭｇ２＋を捕捉する空洞を形成しうるヌクレオチド配列として、Ｘ２１…Ｘ２ｋの配列ＧＡＡを含むものであり、Ｘ１１…Ｘ１ｈの配列ＣＵＧＡＹｘＧＡ（ＹｘはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれかの任意のモノヌクレオチドを示す）を含むものである請求項３または４に記載のマキシザイム。
【請求項６】
ヘリカーゼ活性を有する分子がＲＮＡヘリカーゼである請求項１〜５のいずれかに記載のマキシザイム。
【請求項７】
ヘリカーゼ活性を有する分子と結合する領域が、配列番号１（ＣＴＥ）で表されるヌクレオチドである請求項６記載のマキシザイム。
【請求項８】
ヘリカーゼ活性を有する分子と結合する領域が、配列番号２（ＴＡＲ）で表されるヌクレオチドである請求項６記載のマキシザイム。
【請求項９】
ヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）のそれぞれの上流にリンカー配列およびｔＲＮＡｖａｌプロモーター配列が付加されている請求項３〜８のいずれかに記載のマキシザイム。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列（ａ）の上流に付加されているリンカー配列が下記のヌクレオチド配列（ｅ）を含み、ヌクレオチド配列（ｂ）の上流に付加されるリンカー配列が下記のヌクレオチド配列（ｆ）を含む請求項９記載のマキシザイム。
５’ＡＡＡ  ３’  （ｅ）
５’ＵＵＵ  ３’  （ｆ）
【請求項１１】
ヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）のそれぞれ上流に付加されているｔＲＮＡｖａｌプロモーター配列が配列番号３である請求項９記載のマキシザイム。
【請求項１２】
ヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）のそれぞれの下流に付加配列およびターミネーター配列が付加されている請求項９記載のマキシザイム。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列が（ａ）の下流に付加されている付加配列が下記のヌクレオチド配列（ｇ）を含み、ヌクレオチド配列（ｂ）の下流に付加されている付加配列が下記のヌクレオチド配列（ｈ）を含み、ヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）のそれぞれの下流に付加されているターミネーター配列が下記のヌクレオチド配列（ｉ）を含む請求項１２記載のマキシザイム。
５’ＡＡＡ  ３’          （ｇ）
５’ＡＡＣＣＧＵＡ  ３’  （ｈ）
５’ＵＵＵＵＵ  ３’      （ｉ）
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のマキシザイムをコードするＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載のマキシザイムとヘリカーゼ活性を有する分子との複合体。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載のマキシザイム、請求項１４に記載の発現ベクター、または請求項１５に記載の複合体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれかに記載のマキシザイム、請求項１４に記載の発現ベクター、または請求項１５に記載の複合体を用いて標的核酸を切断する方法。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれかに記載のマキシザイム、請求項１４に記載の発現ベクター、または請求項１５に記載の複合体を用いて標的核酸の生物学的機能を特異的に阻害または抑制する方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれかに記載のマキシザイム、請求項１４に記載の発現ベクター、または請求項１５に記載の複合体を用いて標的核酸を特異的に切断するかまたは標的核酸の生物学的機能を特異的に阻害し、該切断または該阻害が生物学的活性に及ぼす影響を調べることを含む、標的核酸の生物学的機能の解析方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、マキシザイムおよびその利用に関し、より詳細には、標的ＲＮＡに対して優れたＲＮＡ切断活性を示すマキシザイムおよびその利用に関する。
背景技術
１９８０年初頭、米国コロラド大学のＣｅｃｈらによるテトラヒメナのｒＲＮＡのセルフスプライシング現象の発見（Ｋ．Ｋｒｕｇｅｒ，Ｃｅｌｌ，３１，１４７−１５７（１９８２））と、米国エール大学のＡｌｔｍａｎが行ったＲＮＡとタンパク質の複合体酵素であるリボヌクレアーゼＰの解析結果（Ｃ．Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ，Ｃｅｌｌ，３５，８４９−８５７（１９８３））から、触媒機能を有するＲＮＡであるリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｃｉｄ＋ｅｎｚｙｍｅ）が見いだされた。
それ以降、様々なリボザイムが発見されてきたが、なかでもハンマーヘッド型リボザイムは最も良く研究がなされてきたリボザイムの一つである。ハンマーヘッド型リボザイムは天然においては自己切断反応（シス型）として機能するリボザイムであるが、ＵｈｌｅｎｂｅｃｋらとＨａｓｅｈｏｆｆらのグループによって２本のＲＮＡ鎖（基質領域と酵素活性保持領域）に分割（トランス化）されたことから（Ｏ．Ｃ．Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３２８，５９６（１９８７）；Ｊ．Ｈａｓｅｈｏｆｆ，Ｗ．Ｌ．Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５（１９８８））、リボザイムによる遺伝子治療への応用の可能性が示唆された。
そして、癌やエイズなどを標的とした様々な応用研究が、数多く報告され（Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，Ｍ．Ｌ．Ｂｉｍｓｔｌｅｌ，ＥＭＢＯＪ８，８６１（１９８９））、本発明者らも非常に高い基質特異性を有し、正常なｍＲＮＡには全く影響を及ぼさず異常型のジャンクション配列をもつｍＲＮＡのみを切断するマキシザイムを開発している（国際公開ＷＯ９９／４６３８８号公報）。
しかし、標的となるｍＲＮＡは２次構造や３次構造をとるため、マキシザイムの基質結合領域がステム構造等に隠れた場合、マキシザイムの標的部位への接近障害となり充分な効果が得れないという問題があった。
発明の開示
本発明の目的は、標的ｍＲＮＡの高次構造に関わらず結合し、効果的に切断できるマキシザイムを提供することにある。
本発明者らは上記目的を達成するべく鋭意研究を行った結果、マキシザイムをヘリカーゼ活性を有する分子とともに作用させることにより優れたＲＮＡ切断活性が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１９）に記載の発明に関する。
（１）  ヘリカーゼ活性を有する分子と結合することを特徴とするマキシザイム。
（２）  ヘリカーゼ活性を有する分子と結合する領域を含有するマキシザイム。
（３）  下記のヌクレオチド配列（ａ）を含むＲＮＡ分子および下記のヌクレオチド配列（ｂ）を含むＲＮＡ分子が形成する２量体の構造からなるマキシザイム。
５’Ｘ１１…Ｘ１ｈＹ１１…Ｙ１ｉＺ１１…Ｚ１ｊＢ１１…Ｂ１ｐ３’  （ａ）
５’Ｚ２１…Ｚ２ｎＹ２１…Ｙ２ｍＸ２１…Ｘ２ｋＢ２１…Ｂ２ｑ３’  （ｂ）
（配列中、Ｘ１１…Ｘ１ｈ、Ｘ２１…Ｘ２ｋ、Ｙ１１…Ｙ１ｉ、Ｙ２１…Ｙ２ｍ、Ｚ１１…Ｚ１ｊ、Ｚ２１…Ｚ２ｎ、Ｂ１１…Ｂ１ｐ及びＢ２１…Ｂ２ｑは、各々独立に、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＧのいずれかであり、ｈおよびｋは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
ｉおよびｍは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
ｊおよびｎは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
ｐおよびｑは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
Ｘ１１…Ｘ１ｈおよびＸ２１…Ｘ２ｋは、標的ＲＮＡ中の特異的配列に相補的なヌクレオチド配列であるか、または標的ＲＮＡの切断部位周辺の配列に相補的である領域および標的ＲＮＡの存在下でのみＭｇ２＋（マグネシウムオン）を捕捉する空洞を形成しうる領域を含むヌクレオチド配列であり、Ｙ１１…Ｙ１ｉおよびＹ２１…Ｙ２ｍは、ステムを形成するヌクレオチド配列であり、Ｚ１１…Ｚ１ｊおよびＺ２１…Ｚ２ｎは、標的ＲＮＡの切断部位周辺の配列に相補的である領域および標的ＲＮＡの存在下でのみＭｇ２＋を捕捉する空洞を形成しうる領域を含むヌクレオチド配列であり、Ｂ１１…Ｂ１ｐおよびＢ２１…Ｂ２ｑの一方または双方にヘリカーゼ活性を有する分子と結合する領域を含むヌクレオチド配列である。）
（４）  標的ＲＮＡの存在下でのみＭｇ２＋（マグネシウムイオン）を捕捉する空洞を形成しうるヌクレオチド配列として、Ｚ１１…Ｚ１ｉが配列ＧＡＡを含むものであり、Ｚ２１…Ｚ２ｎが配列ＣＵＧＡＹｚＧＡ（ＹｚはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれかの任意のモノヌクレオチドを示す）を含むものである（３）に記載のマキシザイム。
（５）  標的ＲＮＡの存在下でのみＭｇ２＋を捕捉する空洞を形成しうるヌクレオチド配列として、Ｘ２１…Ｘ２ｋの配列ＧＡＡを含むものであり、Ｘ１１…Ｘ１ｈの配列ＣＵＧＡＹｘＧＡ（ＹｘはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれかの任意のモノヌクレオチドを示す）を含むものである（３）または（４）に記載のマキシザイム。
（６）  ヘリカーゼ活性を有する分子がＲＮＡヘリカーゼである（１）〜（５）のいずれかに記載のマキシザイム。
（７）  ヘリカーゼ活性を有する分子と結合する領域が、配列番号１（ＣＴＥ）で表されるヌクレオチドである（６）に記載のマキシザイム。
（８）  ヘリカーゼ活性を有する分子と結合する領域が、配列番号２（ＴＡＲ）で表されるヌクレオチドである（６）に記載のマキシザイム。
（９）  ヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）のそれぞれの上流にリンカー配列およびｔＲＮＡｖａｌプロモーター配列が付加されている（３）〜（８）のいずれかに記載のマキシザイム。
（１０）  ヌクレオチド配列（ａ）の上流に付加されているリンカー配列が下記のヌクレオチド配列（ｅ）を含み、ヌクレオチド配列（ｂ）の上流に付加されるリンカー配列が下記のヌクレオチド配列（ｆ）を含む（９）に記載のマキシザイム。
５’ＡＡＡ  ３’  （ｅ）
５’ＵＵＵ  ３’  （ｆ）
（１１）  ヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）のそれぞれ上流に付加されているｔＲＮＡｖａｌプロモーター配列が配列番号３である（９）に記載のマキシザイム。
（１２）  ヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）のそれぞれの下流に付加配列およびターミネーター配列が付加されている（９）に記載のマキシザイム。
（１３）  ヌクレオチド配列が（ａ）の下流に付加されている付加配列が下記のヌクレオチド配列（ｇ）を含み、ヌクレオチド配列（ｂ）の下流に付加されている付加配列が下記のヌクレオチド配列（ｈ）を含み、ヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）のそれぞれの下流に付加されているターミネーター配列が下記のヌクレオチド配列（ｉ）を含む（１２）に記載のマキシザイム。
５’ＡＡＡ  ３’          （ｇ）
５’ＡＡＣＣＧＵＡ  ３’  （ｈ）
５’ＵＵＵＵＵ  ３’      （ｉ）
（１４）  （１）〜（１３）のいずれかに記載のマキシザイムをコードするＤＮＡを含む発現ベクター。
（１５）  （１）〜（１３）のいずれかに記載のマキシザイムとヘリカーゼ活性を有する分子との複合体。
（１６）  （１）〜（１３）のいずれかに記載のマキシザイム、（１４）に記載の発現ベクター、または（１５）に記載の複合体を有効成分として含む医薬組成物。
（１７）  （１）〜（１３）のいずれかに記載のマキシザイム、（１４）に記載の発現ベクター、（１５）に記載の複合体を用いて標的核酸を切断する方法。
（１８）  （１）〜（１３）のいずれかに記載のマキシザイム、（１４）に記載の発現ベクター、または（１５）に記載の複合体を用いて標的核酸の生物学的機能を特異的に阻害または抑制する方法。
（１９）  （１）〜（１３）のいずれかに記載のマキシザイム、（１４）に記載の発現ベクター、または（１５）に記載の複合体を用いて標的核酸を特異的に切断するかまたは標的核酸の生物学的機能を特異的に阻害し、該切断または該阻害が生物学的活性に及ぼす影響を調べることを含む、標的核酸の生物学的機能の解析方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明のマキシザイムは、ヘリカーゼ活性を有する分子と結合することを特徴とする。
本発明者らは当初マキシザイムにヘリカーゼ活性を有する分子が結合した場合、その立体障害により２量体形成が不可能であろうと推測していた。特に発現系としてｐｏｌ  ＩＩＩ系を使用した場合にあっては５’末端にｔＲＮＡｖａｌが付加されるためマキシザイムの立体障害はさらに大きくなる。しかし、驚くべきことにマキシザイムは２量体を形成し、従来のマキシザイムと比べ優れたＲＮＡ切断活性を有することが確認された。
以下本発明を詳細に説明する。
（マキシザイム）
本発明においてマキシザイムとは、二量体で機能する小型化したハンマーヘツド型リボザイムを意味する。この小型化は通常、アンチセンス領域（ｓｔｅｍＩおよびｓｔｅｍＩＩ）、活性中心領域、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐＩＩ領域からなるハンマーヘッド型リボザイムのｓｔｅｍ−ｌｏｏｐＩＩ領域を短鎖のリンカーで置き換えることによって構築する。マキシザイムは、その活性発現にＭｇ２＋（マグネシウムイオン）を必要とし、またダイマーを形成するためにはｓｔｅｍＩＩ部分のＧ−Ｃ塩基対が重要となる。なお、ハンマーヘツド型リボザイム及びマキシザイムの配列設計については、生物物理、ｐ９９−１０４，Ｖｏｌ．４０  Ｎｏ．２（２０００）にも記載されており、本文献の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用されるものとする。
マグネシウムイオンを捕捉する空洞を形成しうる部位、つまり活性中心領域は、マキシザイム１つあたりに１つであっても、２つあってもよい。活性中心領域が２つあるマキシザイムは、１つの基質に同時に２箇所結合し、その２箇所のＮＵＸトリプレット（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵであり、ＸはＡ、Ｃ又はＵである）の後で基質を切断できるものであれば基質の切断効率が高くなる。
マキシザイムはその２量体型（ダイマー）構造のため、２箇所で標的ｍＲＮＡと結合する。２量体形成の際に１種類のモノマーが２つ結合したホモダイマー型マキシザイム（図４、図５）、２種類の異なったモノマーが結合するヘテロダイマー型マキシザイム（図６）がデザインできる。ホモダイマー型マキシザイムは、設定された結合部位をもつｍＲＮＡと２箇所で結合する。この場合２つのｍＲＮＡが１つのマキシザイムに分子内で結合することになる（トランス型マキシザイム、図７）。一方ヘテロダイマー型マキシザイムは、２つの異なった配列部分に結合できることとなり、１つのｍＲＮＡ内の違う箇所に同時に結合する場合（シス型マキシザイム、図８）と、それぞれの配列部分が個別に一つのマキシザイムと分子間（２つのｍＲＮＡ）で結合する場合（トランス型マキシザイム）がある。
（ヘリカーゼ活性を有する分子）
本発明においてヘリカーゼ活性を有する分子とは、ｍＲＮＡに作用し、ＲＮＡのらせん構造を不安定化することにより、二重鎖ＲＮＡを含む高次構造を開く作用を有するものを意味し、具体的には、例えば、ＲＮＡヘリカーゼ、リボゾーム、制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、等）などを挙げることができる。このようなヘリカーゼ活性を有する分子はマキシザイムに直接結合しても、アダプター分子を介して結合してもよい。ヘリカーゼ活性を有する分子のマキシザイムへの結合部位は、マキシザイムの切断活性を損なわない場所であれば特に制限はないが、マキシザイムの３’末端近傍であることが好ましい。
マキシザイムにヘリカーゼ活性を有する分子が結合するためには、ヘリカーゼ活性を有する分子または上記アダプター分子がマキシザイムに安定に結合するように新たに結合領域を付加する必要がある。ヘリカーゼ活性を有する分子等の結合領域は、対象となるヘリカーゼ活性を有する分子またはアダプターにより異なるが、ヘリカーゼ活性を有する分子のＲＮＡ２本鎖結合領域より設計することは可能である。例えば、ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＴＥ、配列番号１、図１）、ＨＩＶ  ＴＡＲ  ＲＮＡ、ＰＯＬＹ  Ａ  ＲＮＡなどをヘリカーゼ活性を有する分子の結合領域として付加することが好ましい。
ＣＴＥとは、ウイルス構造タンパク質の発現およびパッケージングのために、スプライシングを受けていないゲノムＲＮＡを細胞質に輸送するためのシス（ｃｉｓ）作用性ウイルスＲＮＡを指す。ＣＴＥはＭａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒ  ｍｏｎｋｅｙ  ｖｉｒｕｓ（ＭＰＬＶ）などのサルＤ型レトロウイルスが本来もっているＲＮＡであり、これらのウイルスはスプライシングを受けないＲＮＡを核外輸送するためにこのＣＴＥというＲＮＡモチーフをもっていると考えられている（Ｈ．Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１４１２−１４１５；Ｊ．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７０９−７１４；Ｈ．Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：３５４０−３５５０）。
本発明の好適な実施態様においては、上記ＣＴＥ、または該ＣＴＥと実質的に同等の機能をもつＲＮＡ、または該ＣＴＥと実質的に同等の機能をもつＣＴＥ配列の変異体を使用することができる。ここで「ＣＴＥと実質的に同等の機能をもつＲＮＡ」とは、ＲＮＡヘリカーゼと結合親和性をもつＣＴＥ以外の分子、例えばＳＥＬＥＸ法で人工的に作ったヘリカーゼに結合するアプタマーなどの分子を意味する。また「変異体」とは１個または複数個のヌクレオチドの改変（置換、欠失、付加または挿入）を意味する。このような改変は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの一般的文献に記載される方法によって実施可能である。
ｐｏｌｙＡ  ＲＮＡは、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）及びＰＡＢＰと相互作用するプロテイン−１との相互作用を介してＲＮＡヘリカーゼと相互作用する。
また、ヘリカーゼ活性を有する分子の結合領域は、マキシザイム（ホモダイマー、ヘテロダイマー）の一方のモノマーのみに存在するものでも、両者に存在するものでもよい（図７）。マキシザイムの両者のモノマーに存在する場合、極めて大きな立体障害が予想されるが、本ケースにあっても優れたｍＲＮＡ切断活性が確認されている。
（ヘリカーゼ活性を有する分子と結合するマキシザイム）
本発明のヘリカーゼ活性を有する分子と結合することを特徴とするマキシザイムまたはヘリカーゼ活性を有する分子と結合する領域を含有するマキシザイムの具体例としては、例えば、ヘリカーゼまたはそれと複合体を形成する分子と結合親和性を有するマキシザイム、好ましくはＲＮＡヘリカーゼまたはそれと複合体を形成する分子（アダプター）と結合親和性を有するマキシザイム、例えばＲＮＡヘリカーゼＡと結合するＣＴＥ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ）と呼ばれるＲＮＡ配列、ＨＩＶ  ＴＡＲ  ＲＮＡ、またはＰＯＬＹ  Ａ  ＲＮＡ配列を有するマキシザイムなどであるが、これらに限定されない。
本発明のヘリカーゼ活性を有する分子と結合するマキシザイムは、通常、ヘリカーゼまたはそれと複合体を形成する分子と結合親和性を有する核酸配列と、マキシザイムの核酸配列とを直接的または間接的に結合したものからなり、例えばＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のモデル３９４など）を使用することによって化学合成することができる。両核酸配列の結合の仕方としては、ヘリカーゼまたはそれと複合体を形成する分子と結合親和性を有する核酸配列がマキシザイムの核酸配列の上流側にあってもよいしあるいは下流側にあってもよいが、好ましくはマキシザイムの核酸配列の下流側に、ヘリカーゼまたはそれと複合体を形成する分子と結合親和性を有する核酸配列が結合される。これによって、マキシザイムの活性効率がより向上する。
（マキシザイムの発現系）
本発明のヘリカーゼ活性を有する分子と結合するマキシザイムを細胞内で高発現させるには、プロモーター配列がマキシザイム配列の上流にあることが必要となってくる。ｐｏｌ  ＩＩＩの発現系を用いる場合、この発現系ではｔＲＮＡｖａｌ配列が余分な配列（マキシザイム部分以外のプロモーター配列）として付加されてくる。実際に本マキシザイムの発現ベクターを構築したのであるが、このベクターから発現する構造体は、ｔＲＮＡｖａｌ配列の下流に短鎖のリンカーを介してマキシザイムの配列がつながったものである。
図７及び図８に示すように、３’末端に結合するヘリケースと５’末端のｔＲＮＡｖａｌはマキシザイムにとって非常に大きな立体障害となっていることが予想された。しかし、ｔＲＮＡｖａｌ配列が付加したタイプのマキシザイムで明きらかな切断活件を確認することができ、本発明のマキシザイムは効率良く２量体を形成することが確認された。
（発現ベクター）
本発明のヘリカーゼ活性を有する分子と結合するマキシザイムをコードする発現ベクターは、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列及び前記マキシザイムをコードするＤＮＡを配列連結したものを適当なベクターに組み込むことにより作成することができる。
発現ベクターとしては、ｐＵＣ１９（宝酒造、京都）、ｐＧＲＥＥＮ  ＬＡＮＴＥＲＮ（ライフテックオリエンタル（株）、東京）、ｐＨａＭＤＲ（ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ６：９０５−９１５（Ｊｕｌｙ１９９５））などのプラスミドベクター、遺伝子治療用ベクターとしてのアデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどを使用できる。
上記ベクターにおいて、マキシザイムをコードするＤＮＡの上流にはプロモーター配列を含むことができる。プロモーター配列は、該ＤＮＡの発現を調節する要素であり、ウイルスプロモーター（ＳＶ４０プロモーターなど）、ファージプロモーター（λＰＬプロモーターなど）、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（ヒトｔＲＮＡプロモーター（例えばｔＲＮＡｖａｌプロモーター）、アデノウイルスＶＡ１プロモーターなど）などが含まれる。本発明では、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、特にｔＲＮＡプロモーターが好ましく使用できる。
また本発明のベクターにおいては、ヘリカーゼ活性を有する分子と結合するマキシザイムをコードするＤＮＡの下流にターミネーター配列をさらに含むことができる。ターミネーターは、転写を終結させる配列であれば、いずれの配列も使用できる。ベクターには、必要に応じて抗生物質耐性遺伝子（例えばＡｍｐｒ，Ｎｅｏｒ）、栄養要求性を相補する遺伝子などの選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子を含むことができる。
本発明のマキシザイムをコードする核酸は、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機により化学合成してもよいし、あるいは上記発現ベクターＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素の存在下にＲＮＡを合成し、生成したＲＮＡを回収することによっても得ることができる。また、本発明の発現ベクターは、細胞内に導入される場合には、相同組換えにより染色体上に組み込まれた後、本発明のヘリカーゼ活性を有する分子と結合するマキシザイムを発現することができる。相同組換えを起こすために、宿主細胞ゲノムの一部と相同な配列の内部に本発明のヘリカーゼ活性を有する分子と結合することができるマキシザイムをコードするＤＮＡを挿入したものをベクターＤＮＡに組み込むことができる。染色体への組込みは、遺伝子治療法で使用されるようなアデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターだけでなく、プラスミドベクターによっても行うことができる。
（本発明のマキシザイムとヘリカーゼ活性を有する分子との複合体）
本発明はさらに、ヘリカーゼ活性を有する分子と結合することを特徴とするマキシザイムと、ヘリカーゼ活性を有する分子との複合体も包含する。ヘリカーゼ活性を有する分子の具体例としては、ＲＮＡヘリカーゼ、リボゾーム、制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、等）などを挙げることができるが、好ましくはＲＮＡヘリカーゼである。マキシザイムと、ヘリカーゼ活性を有する分子との結合は、各成分の機能を損なわない限り、共有結合または非共有結合のいずれでもよい。非共有結合の場合には、ヘリカーゼに特異的に結合するアダプターを介してＣＴＥ又はポリＡ配列に結合することができる。また共有結合の場合には、必要によりリンカーを介して結合することができる。
（医薬組成物）
本発明はさらに、上記したマキシザイム、発現ベクターまたは複合体を有効成分として含む医薬組成物を包含する。本発明の医薬組成物は、必要により医薬上許容される担体（例えば生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。本発明の医薬組成物の適用は、マキシザイムの機能の種類に依存している。即ち、本発明の医薬組成物は、マキシザイムの標的ＲＮＡが原因となって生じる疾病を予防または治療するために使用することができる。
本発明の医薬組成物は、例えば、エイズウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス等のウイルスを原因とする疾患、アポトーシス関連疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病など）、癌、自己免疫疾患、炎症、遺伝子疾患などの疾患の予防または治療に有用である。
本発明で使用されるマキシザイムは、疾患の原因物質の核酸を切断したりまたは核酸に相補的に結合して機能阻害を起こしたり、病原タンパク質に特異的に結合して機能阻害を起こすことにより、原因物質の正常機能を損なわせることができる。
本発明のマキシザイムまたはそれをコードするＤＮＡを含有するベクターを細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法、リポソームによる方法（例えば中西守ら，タンパク質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１１，１５９０−１５９６（１９９９））などの方法がある。ベクターを使用する場合には、ベクターを細胞に上記の方法で導入することができる。例えば疾患部位の細胞を一部取り出し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接ベクターを導入することもできる。ウイルスベクターで感染させる場合のウイルスタイターは通常約１０７ｐｆｕ／ｍｌ以上である。
（本発明のマキシザイム、発現ベクター又は複合体の利用）
本発明はさらに、本発明のマキシザイム、発現ベクター又は複合体を用いて標的核酸を特異的に切断または標的核酸の生物学的機能を阻害もしくは抑制する方法を提供する。この方法は、例えば標的核酸の生物学的機能を解明するためにも使用することができる。マキシザイムの標的結合部位（ｓｔｅｍＩおよびＩＩＩ）の配列をランダム化すると、ある種の生物学的機能に必要な遺伝子を解明することもできる。
具体的には、細胞に上記のようなランダム化した標的結合部位をもつマキシザイムを導入する。例えば正常な細胞に導入した結果、癌化を引き起こしたり、あるいは異常な癌細胞に導入した結果、正常細胞に戻すことができたりした場合、これにより、癌化に関わる遺伝子を明らかにすることができる。必要に応じて、ジーンバンク等でその配列を調べることにより、その遺伝子の全配列および機能が解明できる。遺伝子が未知であった場合は、標的結合部位の配列を足がかりに標的となっていた遺伝子のクローニングを行うことにより全配列を決定できる。上記のランダムな配列がたとえ重要な遺伝子と相補的であったとしても、相手の高次構造のために、多くは標的と相互作用できず切断できないで終わってしまう。本発明においては、ヘリカーゼ活性を有する分子と結合することことができるマキシザイムを使用することにより、上記問題は回避され、効率を格段に向上することができる。
本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願２００１−１３４４６９号の明細書に開示した内容は全て、本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
本実施例においては、ヘリカーゼ活性を有する分子と結合する塩基配列を持つマキシザイムの標的ｍＲＮＡに対する細胞内での活性を評価した。本実施例ではヘリカーゼ活性を有する分子としてＲＮＡヘリカーゼＡを選択し、この分子が結合できるモチーフとしてＣＴＥ  ＲＮＡをマキシザイムの下流に連結させたマキシザイム（ＣＴＥ−Ｍｚ）を用いた。
実施例１：ヘリカーゼ活性を有する蛋白質と結合する塩基配列を持つマキシザイム発現ベクター（ＣＴＥ−Ｍｚ発現ベクター）の調製
本発明のマキシザイムを作製するにあたり、ＨＩＶ−１由来Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）遺伝子内のＴＡＲ  ＲＮＡ領域（強固な二次構造が証明されている）、及びルシフェラーゼｍＲＮＡ（定量的な評価を可能にするため）を標的部位とするようにマキシザイムの配列を決定した。
ＣＴＥ−Ｍｚ発現ベクターの調製は文献（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，１８６８−１８７７（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１８８６−１８９１（１９９９））に記載の方法に準じて行った。５’及び３’末端にそれぞれ制限サイトＣｓｐ４５Ｉ及びＳａｌＩを有し、中間に上流よりマキシザイム（配列番号４、５、６、７）をコードするＤＮＡ配列、制限サイトＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶ、３’末端にターミネーター配列（ＴＴＴＴＴ）を有する１本鎖のオリゴヌクレオチドを化学合成し、これをテンプレートとしたポリメラーゼ連鎖反応により２本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。この２本鎖オリゴヌクレオチドを制限酵素Ｃｓｐ４５Ｉ及びＳａｌＩで処理した後、同様に制限酵素Ｃｓｐ４５Ｉ及びＳａｌＩで処理したプラスミドｐＵＣ−ｄｔのｔＲＮＡｖａｌの下流に挿入した。これを制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶで処理した後、Ｓｉｍｉａｎ  ｔｙｐｅ  Ｄレトロウイルス（ＳＲＶ）遺伝子由来のｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＴＥ、図１）をコードするＤＮＡ配列を挿入し、ＣＴＥ−Ｍｚ発現ベクターを得た（図２）。
実施例２：ルシフェラーゼ活性によるＭｚ活性の評価
本評価には、Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）遺伝子とルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子を連結したキメラ遺伝子（配列番号８）を安定発現させたＨｅＬａ細胞（ＬＴＲ−Ｌｕｃ  ＨｅＬａ）を用いた。１ｘ１０５個のＬＴＲ−Ｌｕｃ  ＨｅＬａを１２穴プレートに播種し、５％炭酸ガスインキュベーター中３７℃で一晩培養した。この細胞に、実施例１で得たＣＴＥ−Ｍｚ発現ベクターＭｚＬ及びＭｚＲ各々２μｇ（ホモマキシザイムの場合はモノマーマキシザイムを４μｇ）、ＨＩＶ−１由来Ｔａｔ遺伝子発現プラスミド１００ｎｇ（ＬＴＲ−Ｌｕｃの発現にはＴａｔ蛋白質が必須である）、ｐＳＶ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０ｎｇを４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＯｐｔｉ  ｍｅｍ  Ｉ培地中（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に加え、室温で３０分以上インキュベートした後、１２穴プレート上の細胞に滴下し、トランスフェクションした。炭酸ガスインキュベーター中３７℃で２４時間培養した後、細胞を回収し、ＰｉｃａＧｅｎｅキット（東京インキ、東京、日本）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。細胞を１５０μｌの細胞溶解液（１００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４，１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１ｍＭ  ＤＴＴ；ｐＨ７．８）で溶解し、４℃において１０，０００ｘｇで１分間遠心分離を行った。その上清１０μｌを１００μｌのルシフェラーゼ活性測定試薬（２０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ，１．０７ｍＭ（ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２，２．６７ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，３３．３ｍＭ  ＤＴＴ，２７０μＭ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ，４７０μＭ  ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，５３０μＭ  ＡＴＰ）に添加し、３秒後より１０秒間の蛍光強度を蛍光光度計（Ｌｕｍａｎｔ  ＬＢ  ９５０１，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。トランスフェクション効率のルシフェラーゼ活性への影響は、同時にトランスフェクションしたｐＳＶ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ由来のβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性により補正した。
この結果を図９及び図１０に示す。コントロール（ｐＣＤ−ＳＲ  α／ｔａｔ）を作用させたときのルシフェラーゼ活性を１００％とし、その相対活性として表した。
ＬＴＲ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｍＲＮＡにＣＴＥ−Ｍｚを作用させた場合、通常のＭｚを作用させた場合と比較して著しく低いルシフェラーゼ活性を示した。すなわちＣＴＥ−Ｍｚは通常のＭｚでは切断が困難なＴＡＲ及びＬｕｃに対しても優れた切断活性を示すことが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
本発明により、標的ｍＲＮＡの高次構造に関わらず結合し、効果的に切断できるマキシザイムを提供することが可能になった。本発明のマキシザイムは医薬として有用であり、さらに標的核酸を特異的に切断する方法、及び標的核酸の生物学的機能を阻害もしくは抑制する方法においても有用であり、当該方法を用いることにより標的核酸の生物学的機能を解明することも可能である。
【配列表】
2002092821.tif 000002
2002092821.tif 000003
2002092821.tif 000004
【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＴＥ（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の２次構造を表す。
図２は、ＣＴＥ−Ｍｚの概要図を表す。
図３は、ＬＴＲ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｍＲＮＡの２次構造を表す。
図４は、Ｌｕｃ  ｈｏｍｏ  Ｍｚが２つのｍＲＮＡのＬｕｃ切断部位に結合した場合の図を表す。
図５は、Ｌｕｃ  ｈｏｍｏ  Ｍｚが２つのｍＲＮＡのＴＡＲ切断部位に結合した場合の図を表す。
図６は、Ｌｕｃ  ｈｏｍｏ  Ｍｚが１つのｍＲＮＡのＬｕｃ切断部位及びＴＡＲ切断部位に結合した場合の図を表す。
図７は、マキシザイム及びＣＴＥ−マキシザイムが１つのＬＴＲ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｍＲＮＡに結合した図を表す（シス型マキシザイム）。
図８は、マキシザイム及びＣＴＥ−マキシザイムが２つのＬＴＲ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｍＲＮＡに結合した図を表す（トランス型マキシザイム）。
図９は、ルシフェラーゼ活性の結果を表す（ホモダイマー型マキシザイム）。
図１０は、ルシフェラーゼ活性の結果を表す（ヘテロダイマー型マキシザイム）。
【図１】
2002092821.tif 000005
【図２】
2002092821.tif 000006
【図３】
2002092821.tif 000007
【図４】
2002092821.tif 000008
【図５】
2002092821.tif 000009
【図６】
2002092821.tif 000010
【図７】
2002092821.tif 000011
【図８】
2002092821.tif 000012
【図９】
2002092821.tif 000013
【図１０】
2002092821.tif 000014
【国際調査報告】
2002092821.tif 000015
2002092821.tif 000016
2002092821.tif 000017
2002092821.tif 000018