(57)【要約】アレルギー性疾患、皮膚炎、特にアトピー性皮膚炎の予防あるいは治療に関与する遺伝子及び／または蛋白質を提供する。配列番号１の塩基配列からなるＥＳＴ断片、（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは（ｂ）配列番号２のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤＮＡ結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡにコードされる蛋白質を提供する。また本発明は上記のＤＮＡ配列に対するアンチセンス核酸や上記ＤＮＡの発現や蛋白質の活性を制御し得る物質の探索方法、アレルギー性疾患の検査用試薬及び検査方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤＮＡ結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質。
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合活性を有する蛋白質。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載の蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸。
【請求項６】
核酸配列が、請求項１または請求項２に記載のＤＮＡの全部または一部に相補する配列である、請求項５に記載のアンチセンス核酸。
【請求項７】
請求項１または請求項２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
【請求項９】
請求項３又は請求項４に記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドに対する抗体。
【請求項１０】
請求項３又は請求項４に記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している請求項８に記載の形質転換細胞と被験物質とを接触させ、該蛋白質のＤＮＡ結合活性の変化を検出することを特徴とする、被験物質からの該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の組換えベクターまたは請求項８に記載の形質転換細胞と被験物質とを接触させ、請求項２に記載のＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、被験物質からの請求項２に記載のＤＮＡの発現調節作用を示す物質の検索方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の形質転換細胞において請求項３または請求項４に記載の蛋白質を発現させることを特徴とする、該蛋白質の発現に伴って発現量が変動する遺伝子の検索方法。
【請求項１３】
請求項３または請求項４に記載の蛋白質が発現している請求項８に記載の形質転換細胞と被験物質とを接触させ、該蛋白質の発現に伴って発現量が変動する遺伝子の発現レベル変化を検出することを特徴とする、被験物質からの該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。
【請求項１４】
配列番号２および配列願号４のいずれかに記載の塩基配列、またはその相補配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも１５塩基の鎖長を有するＤＮＡからなるアレルギー性疾患検査用試薬。
【請求項１５】
被験者より採取した試料中における請求項２に記載のＤＮＡの発現レベルを請求項１４に記載の試薬を用いて検出することを特徴とするアレルギー性疾患の検査方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、アトピー性皮膚炎の発症に関与する、ヒト脾臓由来ｃＤＮＡライブラリーから単離同定したＤＮＡ結合活性をコードする遺伝子及び蛋白質に関する。
従来の技術
アトピー性皮膚炎は、増悪・完解を繰り返すかゆみのある湿疹を主病変とする疾患であり、患者の多くはアトピー素因を持つ。アトピー素因とは、気管支喘息、アレルギー性鼻炎・結膜炎、アトピー性皮膚炎、ＩｇＥ抗体を産生しやすい素因をいう。最も大切な臨床症状はかゆみである。アトピー性皮膚炎のかゆみは発作的に激烈になる事が多く、かゆみのそう破のために皮疹はさらに悪化し、さらにかゆみが増しそう破するという悪循環を繰り返して、慢性化した皮膚の湿疹病変となる。そのため長期の治療が必要である。
近年では先進国ではアトピー性皮膚炎を初めとするアレルギー疾患が増加しており、環境因子が原因であると考えられている。特に成人のアトピー性皮膚炎が急増し、その治療の確立が急務となっている。
アトピー性皮膚炎の治療薬としては、外用ステロイド剤による治療が最も有効であるとされ、皮膚症状の種類と程度、部位、年齢などにより、ｗｅａｋ、ｍｅｄｉｕｍ、ｓｔｒｏｎｇ、ｖｅｒｙ　ｓｔｒｏｎｇ、ｓｔｒｏｎｇｅｓｔに分類される効果の強さの異なる種々のステロイド剤が使用されている。しかし、ステロイド剤にはリバウンド、すなわちステロイド使用後に皮膚炎が再発しその離脱が困難となるという欠点がある。また、アトピー性皮膚炎の治療法は、臨床効果に個人差が大きい事や多種の民間療法などが存在する事で複雑化しており、治療に対する患者の不信、不安特にステロイド剤への恐怖心がある。
ステロイド剤以外で決定的な薬物はないが、最近はタクロリムス（ＦＫ５０６）が使用されている。タクロリムスには、ステロイド外用薬の副作用である皮膚萎縮、毛細血管拡張効果がなく、ステロイド外用剤に比べて依存性、中止後のリバウンドが少ない、正常な皮膚からは吸収されない、目の周囲にも比較的安全に使用することができる、などの利点がある。
しかしながら、タクロリムスには強力な免疫抑制作用があるため、皮膚ウイルス感染症に注意が必要であり、紫外線療法を実施中の患者への処方は禁忌である。また長期連用の際の皮膚癌の発生などの安全性が確立していない、などの欠点を持ち、難治性の患者にしか用いられない。
その他の薬剤として、皮膚のかゆみに抗ヒスタミン剤（Ｈ１受容体拮抗薬）や抗アレルギー剤が用いられる。後者は、外用ステロイド剤の使用量や強さのランクを下げる事が期待されるが、投与開始から効果発現まで２〜４週間必要である。またアトピー性皮膚炎では皮膚表面に黄色ぶどう球菌が存在しており、特にびらん面などの炎症病巣には多数存在している。この様な意味から抗菌剤の塗布も行われる。
アトピー性皮膚炎モデルでは、ＮＣ／Ｊｉｃマウスにおける自然発症皮膚炎と単純ハプテン塗布の２つの方法が主である。ＮＣ／Ｊｉｃマウスは、近藤ら（実験動物、６、１０７−１１２、１９５７）により純化されたマウスであり、空気中微生物のコントロールされていない環境下で飼育するとアトピー性皮膚炎類似の症状を発症することが知られている。ＮＣ／Ｊｉｃマウスは、高ＩｇＥ血症、かゆみ、湿疹様病変、乾燥皮膚のアトピー性皮膚炎の特徴をすべて呈する。またＮＣ／Ｊｉｃマウスへのハプテン反復塗布も皮膚炎発生に有効であると報告されている。
以上述べてきたように、アトピー性皮膚炎は近年急増しており、より安全で有効な薬物が求められている。そしてヒト類似のアトピー性皮膚炎が自然発生するＮＣマウスでは何らかのアトピー発症に関与する遺伝子が存在していると考えられている（日本免疫学会１９９９年）。つまりアトピー性皮膚炎関連遺伝子が同定される事により、アトピー性皮膚炎に有効な薬物のスクリーニング方法および当該遺伝子のアンチセンスを提供できる。またその遺伝子の発現メカニズムを解析しアトピー性皮膚炎の素因を明らかにすることにより、種々の診断方法が新たに開発され得る。
発明が解決しようとする課題
本発明は、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症に関連して誘導される遺伝子をクローニングし、これによりアレルギー性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニング方法、アレルギー性疾患のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび遺伝子を用いた治療薬、さらに診断用のプローブを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
本発明は、アトピー性皮膚炎発症マウスであるＮＣ／Ｊｉｃマウスから単離した、皮膚炎発症に伴い誘導される、配列番号１に記載のＥＳＴ断片（ＥＳＴ−ＡＤ１４）である。該ＥＳＴ断片は、皮膚炎時に特異的に発現誘導され、また自然発症アトピー性皮膚炎組織においても特異的に誘導される。また本発明は、該ＥＳＴ断片に対して非常に相同性の高い塩基配列を一部に有する、ヒト脾臓由来の完全長ｃＤＮＡライブラリーから単離された配列番号２に記載のヒト由来遺伝子ａｓ０３９、ならびに該ｃＤＮＡにコードされたアレルギー性疾患に関与する有用な、配列番号３に記載の蛋白質ＡＤ１４である。さらに、これらのＥＳＴ断片、ヒト遺伝子あるいは蛋白質を利用したアレルギー性疾患治療作用を有する化合物の検索方法、アンチセンス核酸、特異抗体、アレルギー性疾患の検査用試薬及び検査方法も提供される。
＜ＥＳＴ−ＡＤ１４＞
ＥＳＴ−ＡＤ１４は、アトピー性皮膚炎発症マウスとして知られるＮＣ／Ｊｉｃマウスに対してハプテン塗布を行い、これにより生じる皮膚炎に伴って特異的に誘導される遺伝子をＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ法（Ｔ．Ｉｔｏら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３５１巻、２３１頁、１９９４年）を用いて単離することのできる断片である。ＥＳＴ−ＡＤ１４は、ピクリン酸塗布で発症する皮膚炎組織及び自然発症したＮＣ／Ｊｉｃマウスの皮膚炎組織において発症に伴い誘導されるが、正常皮膚においてはその発現は検出できなかった。また、ＮＣ／Ｊｉｃマウス以外の系統のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮膚炎発症でも誘導される（第１図）。
ＥＳＴ−ＡＤ１４はマウスの皮膚炎発症時のみにその発現が認められることから、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症に伴い誘導される皮膚炎関連蛋白質をコードする遺伝子の一部に相当する断片であると考えられる。従って、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片は、アレルギー性疾患、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。
＜ヒト由来遺伝子ａｓ０３９＞
本発明は、蛋白質ＡＤ１４（後に詳しく述べるが、この蛋白質は皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症時に誘導されるＤＮＡ結合活性を有する蛋白質である）をコードする遺伝子ａｓ０３９を提供する。配列番号２に記載のヒト由来遺伝子ａｓ０３９は、Ｏｈａｒａらの方法（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４，ｐ５３，１９９７）によりヒト脾臓由来として構築されサイズ分画されたｃＤＮＡライブラリーの中の、ＥＳＴ−ＡＤ１４と高い相同性を有するクローンＡＳ０００３９に存在する遺伝子である。公共データベースによる相同性検索により、ヒト由来遺伝子ａｓ０３９は新規の遺伝子であることが明らかとなった。また、同様の方法により取得したヒト脳由来のクローンの中にも、ヒト由来遺伝子ａｓ０３９の一部に相同性を有する新規クローンであるＫＩＡＡ１５５４（Ｇｅｎ　Ｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０４６７７４）が存在している。
該遺伝子は上記の様にｃＤＮＡライブラリーから単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。
また、ａｓ０３９の塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。本明細書中において、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と読み換えることもできる。
なお、本発明のＤＮＡには、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
すなわち、配列番号２に示したＤＮＡ配列とハイブリダイズしかつヒト蛋白質ＡＤ１４と実質的に同等な機能を有する蛋白質、中でも皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症に伴い誘導される皮膚炎関蛋白質としてのＤＮＡ結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、本発明の範囲内に含まれると理解されるべきである。また、いわゆるコドン縮重の存在により、ＡＤ１４と同一の蛋白質をコードし、かつ配列番号２に記載の配列とは異なる配列からなる核酸が存在し得るが、これも本発明の範囲内であることは言うまでもない。
換言すれば、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡが配列番号２に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒト蛋白質ＡＤ１４あるいは該蛋白質と実質的に同等な機能を有する蛋白質、中でも皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症に伴い誘導される皮膚炎関連蛋白質としてのＤＮＡ結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号２に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内に含まれると理解されるべきである。
上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号２に記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するものであれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５；４０３−１０（１９９０））を用いることができる。また、ハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ　Ｎｏ．１１７５０３３）でプロープをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ　Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号２に記載の核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
配列番号２に記載の塩基配列からなる　ＤＮＡの一部、特に１〜４１９番目の塩基配列は、配列番号１に記載のＥＳＴ−ＡＤ１４と塩基配列レベルで７３．６％と高い相同性を有していることから、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片、特に１〜４１９番目の塩基配列に相当する断片は、アレルギー性疾患、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。また、配列番号２または４いずれかに記載の塩基配列、またはその相補配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも１５塩基の鎖長を有するＤＮＡは、アレルギー性疾患の検査用のプローブまたはプライマーとして有用であり、検査用試薬として用いることができる。ストリンジェントな条件とは、上述のとおりである。また、ＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ　Ｎｏ．１６０３５５８）のマニュアルに従って、配列のＧＣ含有率から適当な条件を算出することが可能である。アレルギー性疾患の検査を行うには、被験者から試料を採取し、該試料そのものもしくは試料から調製したＲＮＡに対して、上述のプローブまたはプライマーを用いてハイブリダーゼーションまたはＰＣＲ反応を行い、被験者試料中のａｓ０３９遺伝子の発現を検出または定量し、健常者の場合と比較する。健常者に比べてａｓ０３９遺伝子の発現量が多い（発現レベルが高い）場合、アレルギー性疾患を発症しているまたはアレルギー素因を有するものと判断することができる。ここで、対象となる被検試料は限定されず、動物、特にヒトの体液あるいは、組織、細胞および菌体ならびにそれらの抽出液、培養上清、塗末標本および切片が挙げられる。体液としては血液、血漿、血清、尿、髄液、リンパ液、唾液、胸水が挙げられる。細胞としては、末梢血リンパ球などを用いることができる。
アレルギー性疾患とは、アレルゲンとの接触によりひきおこされるアレルギー反抗の関与する疾患である。代表的なアレルギー性疾患としては気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症等が挙げられる。アレルゲンとしては花粉、ダニ、ハウスダスト、動物の体毛、金属、化学物質等を例示することができる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査には、例えば、アレルギー性疾患様の症状がアレルギー反応に起因するものであるかどうかを判断するための検査や、アレルギー素因を有するか否かを判断するための検査が含まれる。
本発明のＤＮＡは、蛋白質ＡＤ１４を大量に生産するために使用することができる。当該ＤＮＡはまた、酵素等で標識して組織における本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、当該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質の発現量をｍＲＮＡ発現量を指標として確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞や細胞の培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連する疾患の診断を行うことも可能である。
また、本発明のＤＮＡの一部をプライマーとして使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法により、核酸配列上の異常あるいは多型を検査・診断することができる。
また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導入し、本発明の蛋白質の発現または活性が損なわれていることによる疾患の遺伝子治療にも使用する事ができる。
本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換蛋白質ＡＤ１４の生産方法、あるいは遺伝子ａｓ０３９の発現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。
本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡを組み入れることが可能である。その際、遺伝子ａｓ０３９をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ａｓ０３９の宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いた蛋白質ＡＤ１４の生産において好適に用いられる他、遺伝子ａｓ０３９の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能となる。
例えば、任意の被験物質と遺伝子ａｓ０３９を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で接触させることで、被験物質の遺伝子ａｓ０３９の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あるいは評価を行うことができる。
また、本発明であるＤＮＡと公知の方法とを組み合わせてマウスまたはその他の適当な動物を基にトランスジェニック動物を調製することが出来る。かかるトランスジェニック動物を用いても、上記の形質転換細胞と同様の探索あるいは評価を行うことができる。特に本発明である遺伝子ａｓ０３９あるいは蛋白質ＡＤ１４は皮膚炎特にアトピー性皮膚炎発症に関連することから、上述の形質転換細胞あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、アレルギー性疾患、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
また、本発明のＥＳＴ−ＡＤ１４、遺伝子ａｓ０３９は、アレルギー性疾患、各種皮膚疾患、喘息、乾癬、ウイルス性疾患、膵炎、気管支炎、腎炎、炎症性腸疾患、動脈硬化症、慢性関節リウマチなどの疾患の診断用のプローブとして、またはこれらの研究、予防および治療に役立つ。
＜蛋白質ＡＤ１４＞
ヒト由来遺伝子ａｓ０３９にコードされる蛋白質ＡＤ１４の推定アミノ酸配列は配列番号３に示されるとおりである。この蛋白質の２２２番目〜２６０番目のアミノ酸配列部分にはＤＮＡ結合活性に重要なＣ３ＨＣ４タイプのＺｉｎｃフィンガードメインが、また１０８７番目から１１０８番目のアミノ酸配列部分にはロイシンジッパーモチーフが存在している。また、この蛋白質のＮ末端に相当する約１２０アミノ酸残基に相当する塩基配列がＥＳＴ−ＡＤ１４と相同性が高いことから、ヒト蛋白質ＡＤ１４はヒトにおける皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症時に誘導されるＤＮＡ結合活性を有する蛋白質、例えば転写調節蛋白質であると考えられる。
この様に、ヒト蛋白質ＡＤ１４は、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎発症に伴い発現が誘導される、炎症部で発現し炎症を調節する、細胞内の遺伝子発現の変化を生じさせるなどの機能を有しており、特に転写調節活性またはＤＮＡ結合活性を有するものである。
蛋白質ＡＤ１４のＤＮＡ結合活性は、例えば、実施例５に示す方法でＡＤ１４の結合ＤＮＡ配列を決定し、実施例６に示す方法を用いることにより該結合配列を含むプローブＤＮＡとＡＤ１４との結合を測定することができる。このほか、蛋白質ＡＤ１４のＤＮＡ結合活性の測定には、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）（Ｇａｒｎｅｒ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．９：３０４７−３０６０（１９８１））や、ＭｃＫａｙアッセイ（ＭｃＫａｙ，ＲＤ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１４５：４７１−４８８（１９８１））など通常当業者が用い得る方法を適宜使用することが可能である。蛋白質ＡＤ１４の転写調節活性は、例えば、ＡＤ１４を誘導発現することが可能な組換え細胞において、ＡＤ１４誘導発現前と誘導発現後における細胞内の遺伝子発現の変化をマイクロアレイ法などによって検出することにより測定することが可能である。
なお、上記に示したような蛋白質ＡＤ１４と機能的に同等の、特に皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症に伴い誘導される皮膚炎関連蛋白質としてのＤＮＡ結合活性を有する限り、これら配列番号３に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなる蛋白質も、本発明の範囲内である。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においては皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症に伴い誘導される皮膚炎関連蛋白質としてのＤＮＡ結合活性、を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
従って、配列番号３に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異がヒト蛋白質ＡＤ１４と機能的に同等、中でも皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症に伴い誘導される皮膚炎関連蛋白質としてのＤＮＡ結合活性を有する蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。
機能的に同等とは、少なくともＡＤ１４の結合ＤＮＡ配列と同一の配列に結合する活性を有していることである。活性の強さとしては、例えば約０．１〜１００倍、好ましくは約０．５〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍である。
このようなアミノ酸の変化は、異なる生物種間に認められる配列の多様性あるいはいわゆる遺伝子多形などの様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に発生させることができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質が転写調節活性を保持する限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは１もしくは数個以内である。
本発明の蛋白質は、該蛋白質に結合する物質や該蛋白の活性を調節する物質の探索に使用することができる。探索を通じて得られる化合物等は、本発明の蛋白質が関連するアレルギー性疾患、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
＜抗体＞
本発明はさらに、本発明の蛋白質ＡＤ１４に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、蛋白質ＡＤ１４全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）２、パパインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体であってもよい。これらの抗体は、ＡＤ１４の研究的あるいは臨床的な検出、ＡＤ１４によってもたらされ得る疾患の臨床治療等に有用である。また、本発明の蛋白質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明の蛋白質を検出するために使用することができる。
＜アンチセンス核酸＞
本発明は生体内において核酸レベルでの蛋白質ＡＤ１４生合成を抑制することのできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるアンチセンス核酸は、蛋白質ＡＤ１４をコードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ａｓ０３９の核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補する配列からなるものであってもよい。好ましくは配列番号２または配列番号４に記載の核酸配列に相当あるいは相補する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造あるいは５’末端や３’末端に被翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有するものとなろう。
本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、ＡＤ１４の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限はない。
また本発明では、一般的には、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ましい。
この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなるものが好適である。
本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果は、公知の手法、例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ　ｍａｘ　ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用した翻訳段階の阻害活性、あるいは５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域、５’翻訳領域を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを用いたレポーター遺伝子の発現量などを測定して評価することができる。
本発明のアンチセンス核酸はＡＤ１４の活性発現を抑制し得る機能を有するので、本発明の蛋白質が関与するアレルギー性疾患、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
発明の実施の最良の形態
＜核酸＞
本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１または２に記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１又は２に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作成し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ　Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成するのに適した細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
本発明のＤＮＡを有する組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベクターである。
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨ０５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
＜蛋白質＞
本発明の蛋白質は、天然に発現している各種臓器から調製することができるが、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ　ジャパン株式会社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養については各種の成書（例えば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年を参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネースその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。また、本発明の蛋白質が有するＤＮＡ結合活性を利用すれば、該蛋白質の精製はより簡便に行うことができる。
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、蛋白質ＡＤ１４と機能的に同等な蛋白質である限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。
＜トランスジェニック動物＞
本発明の遺伝子ａｓ０３９を用いれば、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。このトランスジェニック非ヒト哺乳動物も本願の発明に属する。該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような定法（例、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製することができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベクターを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。
具体的には、例えば、トランスジェニックマウスの場合には、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスから取得した前核期受精卵にａｓ０３９遺伝子が発現可能なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的には、適切なプロモーターの下流にａｓ０３９遺伝子を接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラス針を用いて直接注入する。
該受精卵を仮親として別の偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウスと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティング法にてａｓ０３９遺伝子の導入の有無を確認しトランスジェニックマウスを得る。
また、ａｓ０３９（またはａｓ０３９のマウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノックアウトマウス」を作製することができる。本発明における「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由来の蛋白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２号公報、同５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製することができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一態様である。
または、最近中大動物においても核移植によるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本技術を用いたＴＧおよびＫＯ動物の作出も実際に行われるようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の細胞に対しａｓ０３９（または各動物におけるａｓ０３９の相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞から核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることができる。該動物はａｓ０３９（または各動物におけるａｓ０３９の相同遺伝子）が失われたノックアウト動物である。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の細胞にａｓ０３９（または各動物におけるａｓ０３９の相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン動物を得る事によりＴＧ動物を作製する事も可能である。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態様である。
＜抗体＞
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、それか抗体の作製に使用しうる精製度のものであれはいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れは良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製することができる。抗体を治療に使用する場合には、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例　Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５；１４６−１５６（１９９７））を免疫することにより調製することが出来る。また、モノクローナル抗体の超可変領域を用いてヒト化抗体を遺伝子工学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２０３；９９−１２１（１９９１））。
＜アンチセンス核酸＞
アンチセンス核酸、アレルギー性疾患検査試薬用のＤＮＡは、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ　Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅおよび　Ｂｅｒｎａｌｄ　Ｌｅｂｌｅｕ編、ｉｎ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成したり、ａｓ０３９を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸、アレルギー性疾患検査試薬用のＤＮＡを得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成機（たとえばアプライドバイオシステムズ　ジャパン株式会社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ　Ｍｏｄｅｌ　８９０９）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アンチセンス核酸、アレルギー性疾患検査試薬用のＤＮＡを得ることができる。
本発明のＤＮＡの一部またはアンチセンス核酸を診断や検査用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あるいは発光物質等で標識する。次に、検体試料からＤＮＡもしくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被検物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中に、遺伝子ａｓ０３９もしくはＲＮＡが含まれていれば、当該プローブはそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。
＜スクリーニング方法＞
本発明は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞または本発明のＤＮＡにより組換えたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とし、本発明の蛋白質の活性またはＤＮＡの発現を調節する物質をスクリーニング方法に関する。
より具体的には、（１）被験物質の存在下／非存在下におけるＡＤ１４のＤＮＡ結合活性を評価する方法、例えば本発明の蛋白質と該蛋白質の標的核酸配列を含む核酸とを共存させ、該蛋白質の該核酸への結合の増強または阻害を適当なバインディングアッセイを通じて検出し、被験物質の該蛋白質のＤＮＡ結合活性に対する促進または抑制効果を確認する方法、（２）本発明の遺伝子が転写される環境下で被験物質と該遺伝子とを共存させ、該遺伝子の転写の促進または抑制を適当な方法で検出して被験物質の転写促進または抑制活性を確認する方法、（３）本発明の組換えベクターまたは形質転換細胞を用いて、本発明の蛋白質を強制発現させた際の遺伝子発現の変化をマイクロアレイ法等により検出し、本発明の蛋白質の発現に伴って発現量が変動する遺伝子、即ちＡＤ１４により転写制御を受ける遺伝子を検索する方法、（４）前記（３）の系に更に被験物質を共存させ、被験物質の存在下／非存在下で遺伝子発現の変化を比較し、本発明の蛋白質の転写制御機能に関与する物質を検索する方法などが挙げられる。
本発明の蛋白質の活性を調節する作用を示す物質とは、換言すれば蛋白質ＡＤ１４のアゴニストまたはアンタゴニストのことである。本発明の蛋白質の活性調節作用を示す物質は蛋白質ＡＤ１４のＤＮＡ結合活性を増強（アゴニスト）あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を有する物質のいずれでも良いが、アレルギー性疾患の治療効果が期待できるという点ではアンタゴニストが好ましい。本発明のＤＮＡの発現調節作用を示す物質とは、遺伝子ａｓ０３９の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよく、好ましくは発現を抑制する物質である。被験物質が本発明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系に被験物質を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡの発現レベルとは、ａｓ０３９遺伝子のｍＲＮＡの発現強度、蛋白質の発現強度のいづれにより検出しても良い。また、ａｓ０３９遺伝子または蛋白質ＡＤ１４自体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子の発現レベルを検出しても良い。阻害または抑制する作用を有するとは、蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、被験物質添加群では、被験物質無添加群と比べて低値であることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害（抑制）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
阻害（抑制）率（％）＝（無添加群の測定値−被験物質添加群の測定値）／無添加群の測定値＊１００
ここで、測定値は蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が実施例６に示す方法の場合には、放射活性を用いることができる。ＤＮＡの発現を確認できる系が実施例９に示す方法の場合には、蛍光強度を用いることができる。
実施例９に示す方法は、レポーターアッセイ系である。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する物質をスクリーニングするアッセイ系をいう。転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を利用することができる。遺伝子ａｓ０３９の転写調節領域は公知の方法に従って取得することが可能であり、方法の一例を実施例７に示す。
本発明である遺伝子あるいは蛋白質は、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症に伴い誘導される皮膚炎関連遺伝子及び蛋白質であることから、上述のＤＮＡ、蛋白質、形質転換細胞あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、アレルギー性疾患、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
被験物質としては蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、有機低分子化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
実施例
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
実施例１　ＥＳＴ−ＡＤ１４のクローニング
（１）ＮＣ／Ｊｉｃマウスを用いた皮膚炎発症モデル
ＮＣ／Ｊｉｃマウスの腹部を毛刈した後、初回のみ５％塩化ピクリルを含むアセトン・エタノール（１：３）溶液（２００μＬ）、２回目からは１％塩化ピクリルを含むオリーブ油（２００μＬ）を週２回（２または３日おき）塗布し、皮膚症状を観察した。皮膚症状を客観的に評価するため以下の基準でスコア化した。
０．５：軽度の湿疹
１．０：重度の湿疹、
１．５：紅斑を伴う湿疹、
２．０：出血を伴う湿疹
初回塗布後に軽度〜重度の皮膚炎が発症し、その後一次治癒するが３週目から再度皮膚炎を発症した（第２図）。一方、溶媒のみを塗布した対照群のマウスでは皮膚炎の発症は認められなかった。なお、塩化ピクリル塗布マウスの皮膚病変および対照群マウスの皮膚は６０日目に切除し、−８０℃で凍結保存した。
（２）皮膚検体からのＲＮＡ調製
マウス皮膚検体からの全ＲＮＡの調製はＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）を用い、原則として添付のマニュアルに従った。凍結保存していた皮膚組織を８ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬中で電動ホモジナイザーを用いて完全に破砕した。遠心により不溶物を除去した後、１．６ｍＬのクロロホルムを加え激しく撹拌した。遠心操作により水相を分離した。水相を回収後、等量のイソプロパノールを加え遠心操作により全ＲＮＡの沈殿を得た。この沈殿は７５％のエタノールで洗浄後、ＤＥＰＣ処理水に溶解し濃度を測定した。
（３）全ＲＮＡのＤＮａｓｅＩ処理
皮膚組織から調製した全ＲＮＡからＤＮＡを除くため、ＤＮａｓｅ処理を行った。反応はＭｅｓｓａｇｅ　Ｃｌｅａｎ　ｋｉｔ（フナコシ）を用い、添付のマニュアルに従い行った。反応は４０μｇの全ＲＮＡおよび１０ｕｎｉｔのＤＮａｓｅ　Ｉを含む５７μＬの１×ＤＮａｓｅＩバッファー（キット付属）中で行った。これを３７℃、３０分間インキュベートした後、等量のフェノール：クロロホルム（３：１）を加え、ボルテックスした。１５０００ｒｐｍで室温、５分間遠心し、上層（水層）を新しい１．５ｍＬチューブに移した。１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加え、３倍量の１００％エタノールおよびエタ沈メイト（Ｅｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ、ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社）１μｌを加えて、転倒混和させた。１５０００ｒｐｍで４℃、１５分間遠心し、上清を除去し、７５％エタノールで洗浄後、１０分間乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水に溶解させた。濃度を測定し、使用まで−８０℃に保存した。
（４）皮膚組織から調製した全ＲＮＡを用いたディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）解析
皮膚組織から調製した全ＲＮＡを用いた蛍光ディファレンシャルディスプレイ（以下ＦＤＤと略記する）解析は文献（Ｔ．Ｉｔｏら，１９９４、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３５１：２３１−２３６）に記載の方法を参考に行った。ＤＮａｓｅ　Ｉ処理した皮膚組織全ＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを得た。１反応あたり２０ｎｇ全ＲＮＡ相当のｃＤＮＡを用いてＦＤＤ−ＰＣＲを行った。反応液の組成は以下の通りである。
ｃＤＮＡ（１０ｎｇ全ＲＮＡ相当／μＬ）　　　　　　　　２μｌ
１０×ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄバッファー　　　　　　　２μｌ
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６μＬ
ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（５Ｕ／μＬ）　　　　　　　　０．１μＬ
任意プライマー（３０μＭ）　　　　　　　　　　　　　　２μＬ
アンカープライマー（３０μＭ）　　　　　　　　　　　　２μＬ
ｄＨ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．２μＬ
総　量　　　　２０μＬ
ＰＣＲの反応条件は、９４℃で５分、４０℃で５分、６８℃で５分を１サイクル、９４℃で２分、４０℃で５分、６８℃で５分を２サイクル、続いて９４℃で１分、６０℃で１分、６８℃で２分を３０サイクルの後、６８℃で２７分、その後連続的に４℃にした。使用したプライマー対はアンカープライマーであるＢａｍＴ１５Ａ（ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ）、ＢａｍＴ１５Ｃ（ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ）、およびＢａｍＴ１５Ｇ（ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ）に対して任意プライマーを組み合わせ、計５０組の反応をおこなった。なお、任意プライマーとしてはＴｍ値６０℃の２５ヌクレオチドからなるオリゴマーを設計し合成して用いた。ゲル電気泳動は、６％変性ポリアクリルアミドゲルを作製し、３μＬの試料をアプライし、１５ｍＡで１５０分間泳動した。ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮで染色後、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒＳＩ（モレキュラーダイナミクス社）を用いてゲル板をスキャンし、蛍光検出によって泳動画像を得た。
（５）ＤＤ解析で切り出したバンドの増幅と配列決定
皮膚炎病変と正常皮膚の間で差のあるバンドを選択し、バンドをゲルから切り出した。切り出したバンドの１つ（バンド１）についてさらに解析を進めた。バンド１はアンカープライマーとしてＢａｍＴ１５Ａ（ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ）を、任意プライマーとしてＰＲＭＢＡ−０１（ＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧ）を用いたＤＤ解析によって見出され、バンド１の発現は２個体の皮膚病変で発現が認められ、正常皮膚では発現は認められなかった。バンド１の塩基配列を決定するために、バンド１を含むゲルを切り出し、ＴＥ溶液に保存し９９℃、１０分加温してＤＮＡをゲルから溶出させた。このＴＥ溶液を鋳型としてＦＤＤ法と同じプライマーを用いて９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分で３０サイクルのＰＣＲを実施し、６１３ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）にてクローニングし、常法に従いＤＮＡ断片（ＥＳＴ−ＡＤ１４）の塩基配列を決定した。その配列を配列番号１に示す。この断片は蛋白質翻訳領域の一部であり、本断片内にはＮ末端およびＣ末端は含まれないことがわかった。
（６）ＥＳＴ−ＡＤ１４の相同性解析
相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ．、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｅｖｏｌ．、３６、ｐｐ．２９０−３００（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ．、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．、２１５、ｐｐ．４０３−４１０（１９９０））を用いて、局部的な配列の一致を検索した。ＥＳＴ−ＡＤ１４配列は問い合わせとする配列の順方向、逆方向の塩基配列に対して相同性検索をおこなうｂｌａｓｔｎプログラムを用いてＧｅｎｂａｎｋ遺伝子データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対し相同性検索を実施した。この方法によりＥＳＴ−ＡＤ１４と有為な相同性の認められる遺伝子配列は認められなかった。よってＥＳＴ−ＡＤ１４は新規な配列であることがわかった。
（７）ＥＳＴ−ＡＤ１４の発現特異性解析
ＮＣ／Ｊｉｃマウス皮膚での発現特異性を確認した。ＦＤＤ法に用いたマウスとは別個体のＮＣ／Ｊｉｃマウス皮膚検体から全ＲＮＡを調製した。これらを鋳型としてＥＳＴ−ＡＤ１４遺伝子配列より作製した特異的プライマーをもちいてＲＴ−ＰＣＲを実施した。この結果、塩化ピクリル（ハプテン）塗布で発症する皮膚炎組織（第１図、レ
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炎組織（第１図、レーン▲６▼）において発症に伴い誘導されるが、
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出できなかった（第１図）。これによりＦＤＤの結果が再現された。また同様に塩化ピクリルを塗布したＢａｌｂ／Ｃマウスの皮膚（第１図、レーン▲３▼▲４▼）においてもＥＳＴ−ＡＤ１４の発現が認められた。
実施例２　ヒト由来遺伝子ａｓ０３９のクローニング
（１）ヒト脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築
ヒト脾臓由来ｃＤＮＡライブラリーの構築は、Ｏｈａｒａらの方法（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４、ｐｐ．５３−５９（１９９７））に従った。即ち、具体的にはＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ１５）；インビトロジェン社）をプライマーとして、ヒト脾臓ｍＲＮＡ（クロンテック社）を鋳型にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（ギブコＢＲＬ社）をｃＤＮＡとライゲーションした。その後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融点アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。
精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋プラスミドとライゲーションした。大腸菌ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ　ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社）にエレクトロポーレーション法によりこの組換えプラスミドを導入した。次いで、こうして構築したｃＤＮＡライブラリーから、約２，０００個の組換え体を選択し、これらのクローンの両末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、新規遺伝子を含む約１００個のクローンのｃＤＮＡに関しての全塩基配列の決定を行った。
配列決定には、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列は、ショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。この様にして得られた完全長ｃＤＮＡ配列をデータベースに登録し、これをヒト脾臓完全長ｃＤＮＡ配列データベースとした。
（２）ヒト完全長ｃＤＮＡライブラリーデータベースとの相同性解析
ＥＳＴ−ＡＤ１４に相同性を有する配列を含んでいるｃＤＮＡを得るため、ヒト脾臓完全長ｃＤＮＡ配列データベースに対して相同性検索を実施した。検索はＥＳＴ−ＡＤ１４塩基配列の順方向、逆方向すべての読み枠を翻訳して相同性検索をおこなうｂｌａｓｔｘプログラムを用いた。この結果、ＥＳＴ−ＡＤ１４の１３８〜５６８塩基とヒトｃＤＮＡクローンナンバーＡＳ０００３９（プラスミド　ｐＡＳ３９）の１〜４１９塩基が７３．６％と高い相同性を示した（第３図）。クローンＡＳ０００３９には、配列番号３で表される１４３２個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする配列番号２で表される４２９９塩基の塩基配列からなるオープンリーディングフレームを含む、配列番号４に示される４６１６塩基の塩基配列からなるｃＤＮＡが含まれていた。配列番号３で表される１４３２個のアミノ酸からなる新規な蛋白質ヒトＡＤ１４のアミノ酸配列をモチーフ解析した結果、２２２〜２６０アミノ酸残基部分にはＣ３ＨＣ４タイプのＺｉｎｃフィンガードメインが認められた。また、１０８７〜１１０８アミノ酸残基部分にはロイシンジッパードメインが認められた。このことから、ヒトＡＤ１４蛋白質は新規なＤＮＡ結合活性を有する蛋白質であると考えられた。プラスミドｐＡＳ３９は、国際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、平成１２年１２月１４日付けで受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８１４０として寄託され、平成１３年１２月１２日付け受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７８２４として国際寄託に移管された。
実施例３　ヒト由来遺伝子ａｓ０３９の発現特異性解析
ヒト由来遺伝子ａｓ０３９の組織発現特異性の解析を実施した。ヒト各臓器ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、遺伝子ａｓ０３９の塩基配列から作製した特異的プライマー（センスプライマー：５’−ＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＧＣＧＧＡ−３’、アンチセンスプライマー：５’−ＡＡＡＧＧＣＡＣＣＡＧＴＣＣＡＴＧＡＴＣ−３’）を用いてＰＣＲを行った。この結果、脾臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、胎盤で強い発現が認められ、胸腺、末梢血リンパ球、心臓、小腸、卵巣で弱い発現が認められた。また脳、大腸、前立腺、骨格筋、精巣では発現は認められなかった（表１）。
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実施例４　哺乳動物細胞での発現
（１）発現プラスミドｐＨＡＳ３９の構築
ヒトＡＤ１４蛋白質を哺乳細胞で発現させるためのプラスミドを以下の方法で作製した。
ヒト完全長ｃＤＮＡライブラリー構築で作製したｐＡＳ３９プラスミドを制限酵素ＡｐａＩおよびＮｏｔＩで消化した。得られた約４．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ　ｂｌｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化した。次にｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭＡＸ　Ａ（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、アルカリホスファターゼにより脱リン酸化し、アガロースゲル電気泳動にて約５．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をベクターとして回収した。このベクター断片に先に回収した４．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を定法によりライゲーションし、ＪＭ１０９コンピテント細胞（宝酒造社製）を形質転換し、目的のプラスミド（ｐＨＡＳ３９）を得た。
（２）ＣＯＳ−１細胞を用いたヒトＡＤ１４蛋白質の発現確認
発現プラスミドｐＨＡＳ３９を下記の方法でＣＯＳ−１細胞に導入し、蛋白質の発現を行った。すなわち３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度でＣＯＳ−１細胞を６ウェルプレートに植え込み、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で１昼夜培養した。翌日、１ウェルあたり６μｌのＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）と１μｇのｐＨＡＳ３９とを添付プロトコールに従い混合し、ＣＯＳ−１細胞に添加した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下でさらに７２時間培養した後に、上清を除去し、ＰＢＳ−で細胞を洗浄し、１００μｌ／ｗｅｌｌのＥｌｅｃｔｒｏＰｕｒｅ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（２倍濃度）（第一化学薬品）で細胞を溶解させた。次にその溶解液１０μｌを５−２０％グラジエントＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、Ｐａｌｌ　ＦｌｕｏｒｏＴｒａｎｓ　Ｗ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に蛋白を転写し、ウェスタンブロッティングを行った。尚、一次抗体にはＰｅｎｔａ・Ｈｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ）を、二次抗体にはＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ）を用いた。またＥＣＬ検出試薬（アマシャムバイオテク社）によりケミルミネッセンス検出を行った。その結果、約１５０ｋＤａの蛋白質の発現が確認できた。
（３）ＣＯＳ−１細胞を用いたヒトＡＤ１４蛋白質の精製
発現プラスミドｐＨＡＳ３９を下記の方法でＣＯＳ−１細胞に導入し、蛋白質の発現を行った。
ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０ｍＬを上記プラスミドＤＮＡ１２．５ｍｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ−１細胞に添加した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７２時間培養した後に細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ−に懸濁後、電動ホモジナイザーにより破砕し、遠心分離により可溶性画分を細胞質画分として分離した。これを市販のニッケルカラムＰｒｏＢｏｎｄにてヒスチジンタグアフィニティカラムクロマトグラフィーを行った。平衡化は、２０ｍＭリン酸バッファー＋５００ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．８で十分に行い、その後、透析後の培養上清をニッケルカラムにアプライした。多くの細胞質蛋白質は素通りし、十分に洗浄後、２０ｍＭリン酸バッファー＋５００ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ４．０でグラージェント溶出した。続いて溶出画分を市販のエンテロキナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ｃａｐｕｔｕｒｅ　ｋｉｔ；Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と２０℃で終夜反応させ、活性型と考えられるヒトＡＤ１４蛋白質を得た。同サンプルは、上記アフィニティカラムに供し、素通りした画分をＰＢＳ−に透析後、濃縮し活性型ＰＡＳ３９精製標品とした。本標品は銀染色にて、分子量約１５０ｋＤａの位置にバンドを示した。
実施例５　ヒトＡＤ１４結合ＤＮＡ配列の探索
ヒトＡＤ１４蛋白質のアミノ酸配列の２２２〜２６０アミノ酸残基部分にはＣ３ＨＣ４タイプのＺｉｎｃフィンガードメインが認められた。また、１０８７〜１１０８アミノ酸残基部分にはロイシンジッパードメインが認められた。これはヒトＡＤ１４がＤＮＡに結合し、転写因子として働いている可能性を示唆するものである。ヒトＡＤ１４が認識する結合配列を決定することができれば、ヒトＡＤ１４が制御する遺伝子群を明らかにすることができる。
ヒトＡＤ１４の結合ＤＮＡ配列はＰＣＲ−ｂａｓｅｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（Ｋｏｅｒｉｎｇ　ｅｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００、２８、２５１９−２５２６）により明らかにすることができる。即ち、ＧＴＡＣＧＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣ（Ｎ１０）ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡ（ＮはＧ、Ｃ、Ａ、Ｔの混合塩基）という配列をもつ４０塩基のオリゴヌクレオチドをビオチン標識したヒトＡＤ１４蛋白質と混合する。これによりヒトＡＤ１４の結合配列を持つオリゴヌクレオチドはヒトＡＤ１４蛋白質と複合体を形成する。ストレプトアビジンを結合した担体も用いてオリゴヌクレドチド−ＡＤ１４複合体を回収し、同時に回収されたオリゴヌクレドチドをＰＣＲにより増幅する。このプロセスを繰り返すことによりヒトＡＤ１４結合配列を持つオリゴヌクレオチドを濃縮し塩基配列を決定する。
実施例６　ＡＤ１４−ＤＮＡ結合阻害剤のスクリーニング
ＡＤ１４−ＤＮＡ結合阻害剤は以下の方法によりスクリーニングできる。すなわち、ｐＨＡＳ３９プラスミドをＣＯＳ−１細胞に導入することにより組換えＡＤ１４タンパク質を発現させ、ニッケルカラムにて精製する。続いて、精製したＡＤ１４タンパク質をビオチンタンパクラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてビオチン標識する。また、ＡＤ１４の結合配列を含む１０〜数十塩基対程度の鎖長のＤＮＡを用意し、これを３２Ｐ標識してプローブＤＮＡとする。ビオチン標識ＡＤ１４、プローブＤＮＡおよび阻害剤被験物質をストレプトアビジンでコートした９６ｗｅｌｌプレート上でインキュベーションし、界面活性剤を含む緩衝液で洗浄後、プレートに残存する放射活性を測定する。残存放射活性が低下した物質を結合阻害物質としてスクリーニングする。
実施例７　ＡＤ１４プロモーター領域のクローニング
ＡＤ１４のプロモーター領域のクローニングはｃＤＮＡの５’末端のＤＮＡ断片をプローブとしてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより実施する。即ち、ｐＨＡＳ３９を制限酵素ＡｐａＩ−ＳａｃＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収する。回収したＤＮＡ断片をランダムプライマーラベリングキット（宝酒造社製）を用いて３２Ｐ標識し、プローブＤＮＡとする。また、ヒトゲノムライブラリー（クロンテック社製）を定法に従い軟寒天上でプラーク形成させ、ナイロン膜状にファージ粒子を移し取り固定化させる。ファージを固定化したナイロン膜とプローブＤＮＡをラピッドハイブリバッファー（アマシャムバイオテク社）中、６５℃でインキュベーションし、洗浄後、ＢＡＳ２５００（富士フィルム）にて残存放射能を検出する。陽性プラークを単離後、塩基配列を決定し、翻訳開始点上流の配列を持つＤＮＡ断片をＡＤ１４プロモーター領域としてクローニングする。
実施例８　レポータージーンアッセイ用プラスミドｐＨＡＳ３９−Ｇの構築
上記で得られたＡＤ１４プロモーター領域ＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し、ｐＧｌｏｗ−ＴＯＰＯ　ｖｅｃｔｏｒ（フナコシ）と定法に従いライゲーションする。ＪＭ１０９コンピテント細胞（宝酒造社製）を形質転換し、目的のプラスミド（ｐＨＡＳ３９−Ｇ）を得る。
実施例９　ＡＤ１４の転写を調節する物質のスクリーニング
上記で作製したプラスミドｐＨＡＳ３９−ＧをＣＯＳ−１細胞にＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてトランスフェクションし、９６ｗｅｌｌプレート上、被験物質の存在下でインキュベーションする。インキュベーション後、各ｗｅｌｌの蛍光強度を測定し、薬物無添加群と比較して蛍光強度を変化させた薬物をＡＤ１４の転写を調節する薬物としてスクリーニングする。
発明の効果
当該遺伝子はヒト皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の発症に伴い誘導される皮膚炎関連遺伝子であり、当該遺伝子の発現を抑制する薬物はアレルギー性疾患、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の治療剤となりうることから、本発明はこれら治療薬のスクリーニングに用いることができる。また当該遺伝子のアンチセンス核酸あるいは該核酸を発現するベクターも、同様にアレルギー性疾患、皮膚炎特にアトピー性皮膚炎の治療剤となり得る。さらに当該遺伝子は、診断用のプローブとして用いることができる。すなわち、アレルギー性疾患、各種皮膚疾患、喘息、乾癬、ウイルス性疾患、膵炎、気管支炎、腎炎、炎症性腸疾患、動脈硬化症、慢性関節リウマチなどの疾患の研究、予防および治療に役立つ。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＮＣ／Ｊｉｃマウス及びＢａｌｂ／Ｃマウスで皮膚炎を発症させたときのＥＳＴ−ＡＤ１４の発現状態の解析結果を示す。
第２図は、実施例１においてＮＣ／Ｊｉｃマウスに塩化ピクリルを塗布したときの皮膚炎発症の結果を示す。
第３図は、ＥＳＴ−ＡＤ１４の塩基配列と、それに相当する部分のヒト由来ａｓ０３９遺伝子の塩基配列とのアライメントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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