(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内面と対称軸とを有する試験管内の細胞懸濁液を洗浄するための装置であって、
ａ）フレームと、
ｂ）前記フレーム上に回転可能に配置され、前記試験管を回転させるのに充分に前記試験管の内面に摩擦係合するためのストッパ手段と、
ｃ）前記ストッパ手段と前記試験管とを、前記対称軸を中心に回転させるための回転手段と、
ｄ）前記ストッパ手段内に位置付けられ、前記軸を中心とする前記試験管の回転中に前記試験管内の前記細胞懸濁液に洗浄溶液を加え、且つ前記試験管内の前記細胞懸濁液から過剰な洗浄溶液と廃液とを除去するための洗浄手段とを含む、装置。
【請求項２】
前記軸は垂直である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記装置は、回転移動機構又はラックによって前記装置に提供される前記試験管を有するようになっており、前記装置は、前記試験管がそのように提供されている場合に、前記ストッパ手段を前記試験管に挿入し且つ引き抜くための挿入および取り出し手段をさらに含む、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記挿入および取り出し手段は、挿入および取り出し手段がストッパ手段を試験管から引き抜いている際に試験管をその位置に制止するための保持手段をさらに含む、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記挿入および取り出し手段は、前記ストッパ手段の前記試験管への挿入且つ取り出しを提供するフレームの垂直運動を提供するための直線状アクチュエータとフレームに配置されたガイドとを含む、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記ストッパ手段は、前記試験管を支持して回転させるのに充分な前記試験管内面の摩擦把持を提供するために前記ストッパ手段の周囲のＯリング座に配置されたＯリングをさらに含む、請求項１、２、３または４に記載の装置。
【請求項７】
前記ストッパ手段は、前記ストッパ手段と前記支持された試験管とを回転させるための回転可能なスピンドル・アセンブリ手段を含み、前記回転可能なスピンドル・アセンブリ手段は内径環状壁を有しており、前記洗浄手段は洗浄溶液導入および除去手段を含み、前記洗浄溶液導入および除去手段は、一つの円形導管および二つの環状導管、すなわち、前記ストッパを通じて前記試験管内に洗浄溶液を導入するための円形の洗浄溶液導入導管を形成する第１の固定された内側の洗浄流体導入チューブ、前記内側の洗浄流体導入チューブと同軸で、前記ストッパを通じて前記試験管内に制御可能な空気流を導入するための環状の通気導管を提供する第２の固定された中間の通気チューブおよび第３の外側の環状の廃液排出導管を形成している、前記スピンドル・アセンブリに配置された二つの同軸チューブを含む、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記スピンドル・アセンブリ手段は、前記スピンドル・アセンブリ手段の予め定められた外径に位置する出口通路を含み、前記試験管が回転されて前記出口通路に真空が付与されると、廃液を含み得る過剰の洗浄流体が前記出口通路を通って排出され、前記細胞懸濁液を含む一定の再現可能な体積の洗浄流体が、前記試験管の内壁径と、前記出口通路が位置する前記スピンドル・アセンブリ手段の外径との間に位置して規定される円筒環状体内に保持されるようになっており、前記第３の外側の環状の廃液排出導管は、前記試験管から過剰の洗浄流体と廃液とを除去するために前記出口通路と流体的に連通している、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記第３の外側の環状の廃液排出導管と流体的に連通している真空手段をさらに含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記スピンドル・アセンブリ手段は、前記第２の固定された中間の通気チューブと前記スピンドル・アセンブリとの間に配置されたスピンドル軸受およびシールアセンブリをさらに含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
粒子懸濁液中の液体を除去する方法であって、前記粒子懸濁液は、第１の沈殿速度を有する第１の粒子と、第２の沈殿速度を有する第２の粒子とを含み、前記第１の沈殿速度は前記第２の沈殿速度よりも速く、前記方法は、
ａ．予め定められた体積の粒子懸濁液を試験管容器内に配置するステップと、
ｂ．粒子懸濁液の全部とある体積の空気とを前記容器内に保持するよう位置付けられた弾性的なストッパ上に、容器を配置するステップと、
ｃ．前記第１の粒子が遠心力によって容器の内壁へ追いやられるものの、前記第２の粒子が容器の内壁に達するには回転速度および継続時間が不充分な継続時間にわたって、容器を予め定められた回転速度で対称軸を中心に回転させるステップと、
ｄ．非汚染液体を予め定められた流量で容器内に導入するステップと、
ｅ．非汚染液体が、容器の内壁に位置する粒子上を流れて、前記第２の粒子を含む汚染液体をストッパの方へ動かすようにするステップと、
ｆ．ストッパ内の導管を通して、汚染液体を容器から除去するステップとを含む、方法。
【請求項１２】
ｇ．除去された汚染液体を廃液場所へ運ぶステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｈ．容器への非汚染液体の流れを停止し、容器からの汚染液体の流れを停止して、ある体積の非汚染液体と粒子とが容器内に残るようにするステップと、
ｉ．容器の回転を停止することにより、容器中の粒子を非汚染液体中に再懸濁させ、依然として回転している液体が回転していない容器の表面から粒子を洗い流すようにするステップとをさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｆは、前記容器の回転中に、ストッパ内の前記導管を通して前記容器内に真空を作り出すステップを含む、請求項１１、１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｄは、液体を容器内に導入する前に、界面活性剤を非汚染液体と組み合わせるステップを含む、請求項１１、１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
界面活性剤は細胞との使用に好適である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
粒子を再懸濁させるステップは、予め定められた体積の非汚染液体中に粒子を再懸濁させるステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
粒子は細胞であり、汚染液体は溶解した試薬用薬品と細胞の破片とを含む、請求項１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
粒子は白血球である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップａの後の全ステップは、自動制御装置によって制御される、請求項１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
同じ自動制御装置によって制御されるアクチュエータにより、ステップｂが自動的に行なわれ、ステップｉの後でのストッパからの容器の取り外しが自動的に行なわれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
粒子を再懸濁させる際、容器の回転速度は制御されて、容器内の最終的な体積を調整する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
粒子を再懸濁させるステップは、容器の回転を停止させることによって行なわれる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、自動化された機器に適合し得るバイオ細胞(biological cells)の洗浄方法と装置に関する。
発明の背景
分析のためのバイオ細胞の準備に関する多くの方法は、対象とする細胞から未反応の試薬や細胞の破片を分離することを必要としている。従来から、この分離を行うのに、バッチ式遠心分離法が採用されている。しかし、バッチ式遠心分離法を、自動化されたサンプル準備システムに適用することは容易ではない。
多くの自動化されたサンプル準備装置は、使い捨て試験管の円形又は長方形の列を利用している。これらの試験管は、各試験管において種々の操作が順次にそして別個に行われるように、適宜な位置に搬送される。多くのサンプル準備方法において、各操作の間の時間は、信頼性のある再現性のよい結果が得られるように注意深く制御されねばならない。しかし、従来技術における遠心分離法による細胞洗浄は、バッチ式の操作である。このバッチ式操作は、各試験管に対し順次に且つ別個に行うことは不可能である。このバッチ操作の存在は、当然に当該バッチ操作の前と後の操作のタイミングを狂わせることになる。
バッチ式遠心分離法は、各試験管内の液量を実質的に同じにして遠心分離ロータのバランスをとることを必要とするが、これは自動化されたサンプル準備システムにおいては必ずしも望ましいことではない。バッチ式遠心分離法は、遠心分離ロータを回転させて装填／取り出しシステムに一致させることを必要とし、このことは遠心分離装置の駆動を更に複雑なものとする。遠心分離の後にこの回転的一致が得られたことを証明するために、サンプル識別の積極的な表示も必要である。最後に、この遠心分離ロータと装填／取り出し装置のために、システムのサイズ、重量及び複雑性が増加する。
これらの問題点はあるが、バッチ式遠心分離法を利用した自動化サンプル取扱システムは存在している。Automedから市販されているASHSシステムは、ロボットを使用して従来型の遠心分離法の装填／取り出しを自動化したものである。しかし、このシステムは大型で高価であり、大規模な研究所にのみ適したものである。
この機器の別の種類は、特許第5,405,308、4,983,158、4,668,214、4,300,717及び4,086,924号に記載されているように、血液の洗浄と処理用に開発されたものである。一般的に、これらの機器は、血液や洗浄溶液をボウルに導入するための中央供給チューブを具えたボウル・アセンブリと、ボウルへの導入供給ラインとボウルからの送出ラインとをもたらす供給チューブおよびシール・アセンブリと、到来する流体に角速度を与えるコア・アセンブリとで構成されている。これらの機器は、希釈されていない大量（約５００ｍｌ）の血液の処理を円滑に行えるように特別のボウル／コア構造を必要とするので、自動化されたサンプル準備装置における細胞洗浄には適していない。
多くの会社が自動細胞洗浄器を市販している。その中の一つのＩＥＣによって市販されているCentra-W自動細胞洗浄器は、表面浮遊物の吸入と希釈剤の添加を自動化しているが、サンプル容器を遠心分離ロータに装填しそして取り出すのには、なお人手を必要としている。その結果、これらのタイプの機器は、自動化されたサンプル準備装置には適合していない。
自動化されたサンプル準備装置に適した細胞洗浄方法と装置が求められている。この方法と装置は、サンプルに対して行われる他の作業と同期することができるように、各サンプル毎に別々に操作が行われる必要がある。
円形又は直線状軌道のサンプル準備ステーションの周囲の離散的な処理ステーションとして構成可能な装置が望まれている。
更に、自動化されたサンプル準備分析装置で共通に使用される同じ使い捨ての試験管内で洗浄ステップを行うことが望まれいてる。
この細胞洗浄器が望ましくない細胞破片や未反応の試薬を効果的に洗浄し、所望の細胞を集中させることが望まれている。
最後に、細胞洗浄装置に対してサンプル容器を出し入れするのに精巧なシステムを用いなくても作業が可能な細胞洗浄装置が望まれている。
発明の概要
ここに述べる発明は、使い捨ての試験管に入った細胞懸濁液から、細胞の破片及び未反応の試薬を除去する改良された装置と方法を提供するものである。この細胞洗浄器の発明は、当業者に判り易い種々の好適な取扱いシステム実施例によって、様々なサンプル処理システムに具体化され得る。
洗浄対象の細胞懸濁液の入った使い捨て試験管を、その長手方向の中心軸の周りに所定の速度で回転させ、細胞懸濁液を試験管の内壁に沿って上昇させる。この一般に１ｍｍ未満の薄膜は試験管と同軸に設けられたスピンドル・アセンブリの端部近傍のＯリングによって保持される。このＯリングは、スピンドルからのトルクを試験管に伝達してこれを回転させる働きも有する。
２〜３秒間回転させると、遠心力の作用によって大きくて密度の高い細胞は半径方向に試験管の内壁の方に移動する。この時点で、細胞に適した洗浄流体が外部のタンクから試験管内に供給される。この洗浄流体が、小さくて密度の低い細胞、細胞の破片及び未反応の試薬が含まれている流体を、スピンドルに設けられた半径方向の通路を通って上方に移動させ、適宜な通路を経て外部の廃液タンクに排出する。このようにして、洗浄流体は好ましくない表面浮遊細胞懸濁流体を移動させて除去し、細胞の洗浄を行う。このプロセスは所望の細胞洗浄度に達するまで続けられる。洗浄流体と廃液は、試験管の内部に真空を発生させる適宜なポンプによって動かされる。好適実施例においては、システムが簡単で空気及び洗浄流体の導入と除去が容易なので、真空を発生させるポンプが使用されている。
スピンドル・アセンブリの環状排出通路は、試験管の内径と連携して細胞懸濁流体の半径方向の厚さを規定する外径を有している。最終的な懸濁液の体積は、スピンドルの回転速度によって制御される。洗浄サイクルの終期になって回転速度が低下しない場合には、最終的な懸濁液の体積は、スピンドルの外径との間の環状体積で表される。洗浄流体を導入しながらスピンドルの回転速度が低下する場合には、回転速度の低下によって洗浄流体は放物面を形成し、最終的な懸濁液の体積は増大する。このようにして、サンプルの最終的な懸濁液の体積を制御することができる。
細胞が適正に洗浄され、再懸濁液の体積が決まった後、洗浄流体の流れは停止される。次に、機械的又は電気的のいずれかの制動によって駆動モータが急速に停止される。永久磁界型直流モータによる発電制動が、構造が簡単で便利であり、磨耗する部品が不要なので好ましい。試験管の回転が急速に停止しても、試験管の内部の流体はなお回転を続けて試験管の内壁に付着した細胞を洗い流し、その細胞を再懸濁させる。試験管の回転の一回の急速停止ではすべての細胞が再懸濁しないので、試験管の回転・停止を数回繰り返して細胞の回収率を高めてもよい。洗浄流体中に細胞に適合した界面活性剤を使用して、細胞が試験管に付着しないようにすることもできる。
この時点で、細胞洗浄と懸濁は完了する。試験管内部の真空は解放され、スピンドルは試験管から離れる。そして、細胞洗浄器は次の試験管と係合して洗浄に備える。
【図面の簡単な説明】
図１は細胞洗浄器の断面図であり、装置に試験管が装着されている状態を示す。
図２は、図１の２−２線に沿う断面図である。
図３は本発明の真空システムを示す。この図は、図１に示す部分１３の拡大図である。
図４は本発明の洗浄流体供給システムを示す。この図は、図１に示す部分１４の拡大図である。
図５は本発明の空気供給システムを示す。この図は、図１の部分３０の拡大図である。
好適実施例の説明
図１において、回転移動機構２９が、洗浄対象の細胞懸濁液の入った試験管１を細胞洗浄スピンドル２の真下に位置決めする。次に制御システム１５が、アクチュエータ１２によってスピンドル２を下降させる。ガイド・ハウジング１９内のスピンドル支持体２１とガイド・ロッド１８が、アクチュエータ１２の直線運動をスピンドル２に伝える。スピンドル２は、Ｏリング４が試験管１の内壁と接触してシールを形成し、スピンドル２の端部が試験管１の底の上方の所望の高さ位置に来るように下降する。Ｏリング４と試験管１の間の摩擦によって、アクチュエータ１２は試験管１を回転機構２９から僅かに持ち上げる。次に、制御システム１５はモータ６を駆動して、歯車３１と３２を介してスピンドル２と試験管１を所定の速度で回転させ、符号９ａで示す内径を有する細胞懸濁液の環状円筒体を急速に形成させる。Ｏリング４は、細胞懸濁液が試験管１の内壁をそれ以上上昇しないように防ぐ。
試験管１は、懸濁液中の大きくて密度の高い細胞は試験管１の内壁に接触するが、未反応の試薬、小さくて密度の低い細胞及び細胞の破片の大部分が内径９ａを有する液体７の前記環状円筒体内に残るような時間だけ回転せしめられる。
次いで、制御システム１５によって図３の常閉の電磁弁３５に通電され、流出導管５と流出通路３を経て試験管１の内部が真空源に接続される。小さくて密度の低い細胞、細胞の破片及び未反応の試薬を含む液体は、前記流出通路３を通って前記流出導管５まで吸い上げられ、真空アキュムレータ３６に達し、真空ポンプ３８を経て廃液タンク３９に排出される。図２に示すように、流出導管５は回転するスピンドル２の内径と回転しない通気導管チューブ２５の外径との間に形成されている。流出面シール２３が回転スピンドル２の天面と非回転ハウジング２２との間を密閉している。
空気が、図５のフィルタ５７と流れ抵抗器５６を通り、通気ハウジング２４を経て、通気導管３３を下って試験管の内部まで達する。図２に示すように、通気導管３３は、非回転通気導管チューブ２５の内径と非回転洗浄チューブ導管２８の外径との間に形成されている。この通気導管チューブ２５は、その排出端を軸受１０によって支持され、スピンドル２のシール１１によって密閉されている。通気導管３３は、上部通気導管シール２７と下部通気導管シール２６とによって大気に対して密閉されている。
通気導管３３を通って流れる空気は、真空システム１３を経て試験管１から引き出される液体と置換される。液体は、液体の環状円筒体の内径が９ａから９ｂに移動するまで流出導管５を通って流れる。この時点で、真空システム１３は通気導管３３によって供給された空気を流出通路３を経て吸引し始める。次に液体は流出導管５へ、そこから真空アキュムレータ３６へ、最後に廃液タンク３９へと引かれる。流出通路３と流出導管５では殆ど圧力低下が無いので、試験管１内の真空は真空アキュムレータ３６内の値とほぼ同じになる。
直径９ｂによって規定される環状体積は、直径９ａによって規定される体積の半分から１／１０までであり、これによって、洗浄前の懸濁液に比べて、洗浄後の懸濁液の細胞濃度は好ましく増加する。
試験管が回転して試験管１の環状体積が直径９ｂで規定された体積まで減少した後、図４の電磁弁４７は制御システム１５によって開かれ、一方、図３の電磁弁３５は開放状態に維持されているので、洗浄流体は洗浄流体タンク４６から真空ポンプ３８によって引き出され、洗浄流体導管８を経て試験管１内に入る。この洗浄流体は、洗浄流体導管チューブ２８の下端から試験管１の底部まで実質的に固体流として流れ込む。
液体の環状円筒の内径９ｂは、この洗浄流体の添加によって僅かに試験管１の中心の方に移動する。内側への液体の移動によって流出通路３が閉鎖されると、通気導管３３を介して試験管１に流れ込む空気は試験管１内の圧力を上昇させ、一方、流出導管５内の真空は実質的に一定に保たれている。これによって、流出通路３に圧力差が生じる。流出通路３に充分な圧力差が生じて、流出通路３内の流体に働く遠心力によって生じる圧力に打ち克つと、液体は流出導管５を通じて流出する。こうして、空気供給システム３０によって供給された空気は、液体の流出通路３と導管５を清掃し、試験管１内の真空は再び増加する。洗浄流体の流入によって液体の環状円筒体の内径９ｂは再び減少する。このサイクルは、洗浄流体が洗浄流体導管８によって供給され、真空が流出導管５に付与され、空気が通気導管３３を通じて流れるまで、繰り返される。
各サイクルにおいて除去される液体の体積と各サイクルの長さは、流れ抵抗器４８のサイズ、流れ抵抗器５６のサイズ、真空アキュムレータ３６内の真空レベル、スピンドル２の回転速度に応じて決まる。真空アキュムレータ３６内の真空レベルを制御するために、真空センサ３７が真空アキュムレータ３６内の真空を検出する。真空制御電子装置４０が真空アキュムレータ３６内の真空を予め設定された基準レベルと比べて、真空ポンプ３８に供給される動力を制御して所望の真空を維持する。
各サイクルに関連する液体の体積を直径９ｂによって規定された液体の環状円筒体の体積の２〜３％に限定して、洗浄サイクルの終期に正確な再現可能な液体の体積が試験管１に残るようにすることが望ましい。
本発明による未反応の試薬の希釈は試験管のサイズによって限定されないが、従来の遠心分離法による未反応の試薬の希釈は試験管のサイズによって限定される。本発明においては、未反応の試薬を含む流体は洗浄流体によって動かされ、環状液体７中には、試験管壁において速度ゼロであり、環状液体７の内径９ｂにおいて最大上向き速度になる層流の速度分布が形成される。拡散と混合が行われないので、洗浄サイクルの後に残った未反応の試薬だけがくさび型の環状液体中に含まれる。このくさび型環状液体の下部の幅はゼロで、上部の幅は、試験管１の内壁と洗浄サイクルの際に上向き速度が流出通路５に達するのに丁度充分になるところの円との間の距離によって規定される。
例えば、初めの細胞懸濁液が１．０ｍｌ、最後の細胞懸濁液が０．５ｍｌ、洗浄流体が１．０ｍｌ／秒の流量で１５秒間供給され、環状液体７の高さが２．０ｃｍ、試験管１の直径が１．０ｃｍの場合には、流体の平均上向き速度は４．０ｃｍ／秒となる。試験管壁から０．００１２５ｃｍの点においては、速度は０．１３ｃｍ／秒となり、これは洗浄サイクルの際に流出通路に達するのに要する最小速度である。このくさび型環状液体に含まれる流体の体積は、０．００３９ｍｌとなり、したがって本発明による未反応試薬の希釈は１２０倍になり、細胞濃度係数は２倍となる。従来の遠心分離法の場合は、同じ１．０ｍｌの初期体積と０．５ｍｌの最終体積に対して、遠心分離して浮遊物を除去した後に０．１ｍｌの体積の液体が残ったと仮定すると、希釈は５倍に過ぎず、細胞濃度係数は２倍である。
充分な洗浄時間が経過した後、スピンドル２の回転速度を減少させてサンプルの最終懸濁液の体積を増加させる。回転速度が低下すると、懸濁液は内外の円筒状壁を有する環状体から円筒状外壁と放物面状内壁とを有する環状体に形を変える。洗浄流体はこの期間中にも導入され続けている。
充分な洗浄時間が経過した後に図４の電磁弁４７が閉じられ、そして洗浄流体の流れが停止される。次に電磁弁４９は短時間だけ開かれ、フィルタ６０、流れ抵抗器５０、洗浄流体導管８を経て試験管１に空気が入り、洗浄流体の導管８を清掃する。次に、システム制御器１５によってモータ６が急速に停止させられる。流体の環状体７は試験管壁に対して回転を続けているので、試験管１の壁に付着した細胞は壁から洗い流され、再懸濁される。洗浄流体中に適宜な界面活性剤を入れると、試験管１の内壁への細胞の付着が減少し、細胞の再懸濁が容易となる。更に、モータ６が１、２回急速に加減速され、試験管１の内壁から更に完全に細胞を除去する。次にモータ６は停止され、電磁弁３５は閉ざされる。次に、アクチュエータ１２がスピンドル支持体２１を介してスピンドル２を上昇させる。スピンドル２が上昇するにつれて、保持部材１７が試験管１を保持し、試験管をスピンドル２から分離する。スピンドル２が試験管１から完全に離れる前に、スピンドルは低速で回され、スピンドルの底部に付着している液体を除去する。これによって、更に多くの流体と細胞の回収が促進され、サンプルの持ち出しが少なくなる。スピンドル２が完全に試験管１から解放された後、回転移動機構２９は回転して別の試験管を細胞洗浄位置に位置決めする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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