(57)【要約】ヒトＦＧＦ２３タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡを単離し、該ｃＤＮＡに変異導入法により、１アミノ酸が置換された変異体を構築した。該変異体は、体内で発現することにより血中のリン濃度を低下させる効果を有していた。該変異体および該変異体をコードするＤＮＡは、高リン血症に対する治療薬または遺伝子治療への応用が期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載アミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミン、１７９位のアルギニンがグルタミン、または１７９位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号：２に記載アミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミン、１７９位のアルギニンがグルタミン、または１７９位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも１から１９０位までのアミノ酸配列を有する断片をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項４】
請求項１もしくは２に記載のＤＮＡ、または請求項３に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項５】
配列番号：２に記載アミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミン、１７９位のアルギニンがグルタミン、または１７９位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項６】
配列番号：２に記載アミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミン、１７９位のアルギニンがグルタミン、または１７９位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも１から１９０位までのアミノ酸配列を有する断片。
【請求項７】
請求項４に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項５または６に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項１もしくは２に記載のＤＮＡ、請求項３に記載のベクター、または請求項５もしくは６に記載のタンパク質を含有する、血中リン濃度を低下させるための医薬組成物。
【請求項９】
血中カルシウム濃度には影響を与えない、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
高リン血症の治療のための請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のＤＮＡを患者へ投与することを含む高リン血症を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血中のリン濃度を低下させるＦＧＦ２３タンパク質変異体、並びに該変異体の用途に関する。
背景技術
ＦＧＦ２３は、京都大学の伊藤らによってクローニングされた遺伝子であり、脳で発現されていることが確認されている（Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７：４９４−４９８、国際公開０１／６６５９６号公報）。また、ＬＵＥＴＨＹらは、ＦＧＦ２３遺伝子をクローニングし、該遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの作出を行い、該マウスの表現型を解析している（国際公開０１／６１００７号公報）。
一方、先天的低リン血症であるクル病患者の遺伝的家系解析によりＦＧＦ２３の突然変異（Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１７９Ｗ）が原因であるという報告がなされた（Ｔｈｅ　ＡＤＨＲ　Ｃｏｎｓｏｒｉｕｍ（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６：３４５−３４８）。
しかしながら、この報告においては、タンパク質または全長ｃＤＮＡを取得したとの記載はなく、また、ＦＧＦ２３遺伝子に見られる上記の変異と低リン血症との因果関係も明らかになっていない。
発明の開示
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は血中のリン濃度を低下させるＦＧＦ２３タンパク質の変異体および該変異体をコードするＤＮＡ、並びにそれらの用途を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、血中のリン濃度を低下させることが期待されるＦＧＦ２３タンパク質の変異体の作製を試みた。まず、ヒトＦＧＦ２３遺伝子の全長ｃＤＮＡの単離を行い、次いで、ＰＣＲ法により該変異体をコードするＤＮＡを合成し、発現ベクターへクローニングした。該発現ベクターを静脈内投与法によりマウス体内へ導入し、マウス体内で該変異体を発現させ、その後のマウスにおける血中リン濃度を測定した。その結果、ＦＧＦ２３変異体の発現により、マウス血中のリン濃度が有意に低下することを見出した。
即ち、本発明者らは、ＦＧＦ２３タンパク質変異体を作製することに成功するとともに、該変異体を利用してマウス血中のリン濃度を低下させることに成功し、これにより本発明を完成するに至った。本発明のＦＧＦ２３タンパク質変異体は、このように血中のリン濃度を低下させる能力を有することから、高リン血症の治療のための薬剤となるものと大いに期待される。
本発明は、血中のリン濃度を低下させるＦＧＦ２３タンパク質変異体、および該変異体をコードするＤＮＡ、並びにそれらの用途に関し、より具体的には、
〔１〕　配列番号：２に記載アミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミン、１７９位のアルギニンがグルタミン、または１７９位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔２〕配列番号：２に記載アミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミン、１７９位のアルギニンがグルタミン、または１７９位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも１から１９０位までのアミノ酸配列を有する断片をコードするＤＮＡ。
〔３〕　〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
〔４〕　〔１〕若しくは〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔３〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔５〕　配列番号：２に記載アミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミン、１７９位のアルギニンがグルタミン、または１７９位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
〔６〕　配列番号：２に記載アミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミン、１７９位のアルギニンがグルタミン、または１７９位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも１から１９０位までのアミノ酸配列を有する断片。
〔７〕　〔４〕に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、〔５〕または〔６〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔８〕　〔１〕もしくは〔２〕に記載のＤＮＡ、〔３〕に記載のベクター、または〔５〕もしくは〔６〕に記載のタンパク質を含有する、血中リン濃度を低下させるための医薬組成物。
〔９〕　血中カルシウム濃度には影響を与えない、〔８〕に記載の医薬組成物。
〔１０〕　高リン血症の治療のための〔８〕または〔９〕に記載の医薬組成物。
〔１１〕〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを患者へ投与することを含む高リン血症を治療する方法、を提供するものである。
本発明は、血中リン濃度を低下させるＦＧＦ２３タンパク質変異体をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡによりコードされる変異体には、配列番号：２に記載のヒトＦＧＦ２３タンパク質のアミノ酸配列において、１７６位のアルギニン残基がグルタミンへ置換された変異体、１７９位のアルギニン残基がグルタミンへ置換された変異体、および１７９位のアルギニンがトリプトファンへ置換された変異体（以下、それぞれ「Ｒ１７６Ｑ変異体」、「Ｒ１７９Ｑ変異体」、「Ｒ１７９Ｗ変異体」と称し、これらをまとめて「ＦＧＦ変異体」と称する）が含まれる。これら変異体において、好ましい変異体はＲ１７６Ｑ変異体およびＲ１７９Ｑ変異体であり、最も好ましい変異体は、Ｒ１７９Ｑ変異体である。
本発明は、また、これらＦＧＦ変異体の断片を提供する。好ましい断片は、ＦＧＦ変異体における、少なくとも１から１９０位のアミノ酸配列を含む断片である。
本発明のＦＧＦ２３変異体は、血中のリン濃度を低下させる機能を有する。従って、ＦＧＦ２３変異体は、血中における高濃度のリンの存在によって引き起こされる疾患に対して、治療および予防の効果を奏することが期待される。ＦＧＦ２３変異体の好ましい態様においては、血中カルシウム濃度には影響を与えない。
治療または予防効果が期待される疾患としては、例えば、高リン血症を挙げることができる。高リン血症は、一般的に腎からのＰＯ４排泄の減少の結果として発症する。進行した腎不仝（ＧＦＲが２０ｍＬ／分未満）は、血漿ＰＯ４の上昇を導くに足る排泄の減少をもたらす。腎不全がなくとも、偽性副甲状腺機能低下症や副甲状腺機能低下症の場合には、腎のＰＯ４排泄に障害が起こることがある。高リン血症は経口ＰＯ４の過剰投与や、ときにはリン酸塩を含有する浣腸の使いすぎからも発生することがある。高リン血症はまた、細胞内ＰＯ４の細胞外への移動の結果生じることもある。これが頻繁に起こるのは、糖尿病ケトアシドーシス（全身のＰＯ４喪失にも関わらず）や、挫傷、非外傷性横紋筋融解症、それから全身性の感染症および腫瘍溶解症候群である。高リン血症は、二次性副甲状腺機能亢進症や、長期間透析を受けている患者の腎性骨ジストロフィの発症にも決定的な役割を演じている。
本発明のＤＮＡは、後述する本発明の変異体のｉｎ　ｖｉｖｏやｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、高血中リン濃度に起因する疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明の変異体をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明の変異体をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、ヒトＦＧＦ２３　ｃＤＮＡを改変して作製することができる。ヒトＦＧＦ２３　ｃＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、ＦＧＦ２３を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＦＧＦ２３　ｃＤＮＡの配列（配列番号：１）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、ＦＧＦ２３を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、ＦＧＦ２３　ｃＤＮＡの配列（配列番号：１）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
例えば、次のようにすればよい。まず、ＦＧＦ２３を発現する細胞、組織、臓器から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（生化学工業社）等を用いて行うこともできる。また、配列番号：１に記載した配列を基にして作製したプライマー等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ　ＦＩＮＤＥＲ　ＲＡＣＥ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）に従い、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
具体的には、例えば実施例１に記載した方法により、ヒトＦＧＦ２３　ｃＤＮＡを取得することができる。
本発明のＦＧＦ２３変異体を作製するための、ヒトＦＧＦ２３　ｃＤＮＡの改変は、当業者によって一般的に行われるＤＮＡ変異導入（ＤＮＡ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）技術によって実施することができる。具体的には、例えば実施例２に示す方法によって行うことができる。
本発明は、また、上記本発明のＤＮＡによりコードされる変異体を提供する。本発明の変異体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた変異体が、血中におけるリン濃度を低下させる能力を有する限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の変異体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の変異体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加されるが、このような変異体も本発明に含まれる。
本発明の変異体は、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドであれば、本発明の変異体をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の変異体に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明の変異体をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的の変異体以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明の変異体を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールにより判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明の変異体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ　Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ　ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明の変異体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ　ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０　Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、血中における高濃度のリンの存在に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ　ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ　ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の変異体の製造や発現のための産生系として使用することができる。本発明の変異体の製造のための産生系は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ　ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯＫ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ　ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に本発明の変異体をコードするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内で該変異体を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ　Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、本発明の変異体をコードするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、本発明の変異体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、本発明の変異体をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から該変異体を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、本発明の変異体をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ　５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より本発明の変異体を得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ　Ｋ．−Ｃ．Ｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明の変異体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された変異体も包含する。
なお、本発明の変異体を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明はまた、本発明の変異体、該変異体をコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含有する血中リン濃度を低下させるための医薬組成物を提供する。
本発明の変異体を、ヒトや他の動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、変異体自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
本発明の変異体の投与量は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約１００μｇから２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
また、本発明のＤＮＡを医薬組成物として用いる場合には、上述したように本発明のＤＮＡを生体内でその発現を保証するベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入すればよい。これにより、高血中リン濃度に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。生体内への投与においては、ｅｘ　ｖｉｖｏ法やｉｎ　ｖｉｖｏ法を利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　ヒトＦＧＦ２３の全長ｃＤＮＡ（ＯＲＦ部分）のクローニング
ＦＧＦ−２３の全長ｃＤＮＡ（ＯＲＦ部分）クローニングはＰＣＲ法により行った。プライマーはＧｅｎｂａｎｋ　ｄａｔａ（アクセッションＮｏ．ＡＢＯ３７９７３）を基にし、そこにＥｃｏＲＩサイトおよびＸｈｏＩサイトを付加してデザインした（５’−ｇｇＡＡＴＴＣＴＣｇＡｇＣＣＡＣＣＡＴｇＴＴｇｇｇｇｇＣＣＣｇＣＣＴＣＡｇｇＣＴＣＴｇ−３’／配列番号：３、５’−ｇｇＡＡＴＴＣＴＣｇＡｇＣＴＡＣＴＡｇＡＴｇＡＡＣＴＴｇｇＣｇＡＡｇｇ−３’／配列番号：４）。さらに５’側のプライマーには開始コドンＡＴＧの上流にコザック配列（ＣＣＡＣＣ）を付加し、３’側の配列には終止コドンＴＧＡを二つ付加した。プライマー作製はサワディーテクノロジー社に外注した。鋳型にはｈｕｍａｎ　ｈｅａｒｔ　ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ社のＭｕｌｔｉｐｌｅ　ｃＤＮＡ　ｋｉｔ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＨ−１１０１）を使用し、ＰＣＲ反応にはＱＩＡＧＥＮ　ＰＣＲ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社　Ｃａｔ．Ｎｏ．２０１２２３）を使用した。すなわち、０．７５μｌのｈｕｍａｎ　ｈｅａｒｔ　ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ社のＭｕｌｔｉｐｌｅ　ｃＤＮＡ　ｋｉｔ）、２．５μｌのＱＩＡＧＥＮ　１０ｘＰＣＲバッファー、０．５μｌのｄＮＴＰ　ｍｉｘ（２００ｍＭ）、０．２５μｌのＱＩＡＧＥＮ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、５．０μｌの５　ｘ　Ｑ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．５μｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ、配列番号：３）、０．５μｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ、配列番号：４）、そして１５μｌのＤＤＷを加え、全量２５μｌとして、以下の条件でＰＣＲ反応をサーマルサイクラーＡＢＩ２４００を用いて行った。一次変性は９５℃で２分、そして３５サイクルの２ステップシャトルＰＣＲ（９４℃で４０秒、６０℃で１分）を行い、最後に伸長反応を７２℃で７分行い、ＰＣＲ反応を終了した。ＰＣＲ反応による増幅産物を１．０％アガロース電気泳動で確認した結果、単一の特異的バンドが約７５０ｂｐ付近で確認されたため、ＴＯＰＯ　ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５０００−０１）により、２μｌのＰＣＲ反応液を使用してＴＡベクターｐＣＲ２．１へのサブクローニングを行った。操作はキット添付のプロトコールに従って行った。そして、ＴＡクローニングされたクローン＃３の塩基配列解析をＭ１３　Ｍ４プライマー（ＴａＫａＲａ社Ｃａｔ．Ｎｏ．３８３２Ａ）、Ｍ１３　ＲＶプライマー（ＴａＫａＲａ社Ｃａｔ．Ｎｏ．３８３０Ａ）、配列番号：５に記載のプライマー（５’−ＣｇＣＡＣＣＣＣＡＴＣＡｇＡＣＣＡＴＣＴ−３’）、および配列番号：６に記載のプライマー（５’−ｇＣＡｇＴＴＣＴＣＣｇｇｇＴＣｇＡＡＡＴＡ−３’）を使用し、ＡＢＩ３７７　ＤＮＡシーケンサーにより解析を行った。その結果、クローン＃３の内部配列はヒトＦＧＦ−２３と完全に一致し、ＦＧＦ−２３のクローニングを完了した。
［実施例２］　ヒトＦＧＦ変異体（Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１７９Ｗ、Ｒ１７６Ｑ＋Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１７６Ｑ＋Ｒ１７９Ｗ）の作製
ヒトＦＧＦ−２３を鋳型にＦＧＦ−２３変異体Ｒ１７６Ｑ（Ｍ１）、Ｒ１７９Ｑ（Ｍ２）、Ｒ１７９Ｗ（Ｍ３）、Ｒ１７６Ｑ＋Ｒ１７９Ｑ（Ｍ４）、Ｒ１７６Ｑ＋Ｒ１７９Ｗ（Ｍ５）の作製を行った。ヒトＦＧＦ−２３より文献（Ａｕｔｏｓｏｍａｌ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔａｅｍｉｃ　ｒｉｃｋｅｔｓ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＦＧＦ２３　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｖｏｌ．２６　ｐ３４５−３４８．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０００）に従って、５２７Ｇ→Ａ（Ｒ１７６Ｑ）、５３６Ｇ→Ａ（Ｒ１７９Ｑ）、５３５Ｃ→Ｔ（Ｒ１７９Ｗ）の３種類およびそれらの組み合わせＭ４（Ｒ１７６Ｑ＋Ｒ１７９Ｑ）とＭ５（Ｒ１７６Ｑ＋Ｒ１７９Ｗ）の作製を行った。プライマー合成はサワディーテクノロジー社に外注した。使用したプライマーの塩基配列は次の通りである。
・５’−ＣＡＣｇｇＣＡｇＣＡＣＡＣＣＣｇｇＡｇＣ−３’（配列番号：７）
・５’−ＣＡＣｇｇＣｇｇＣＡＣＡＣＣＣＡｇＡｇＣ−３’（配列番号：８）
・５’−ＣＡＣｇｇＣｇｇＣＡＣＡＣＣＴｇｇＡｇＣ−３’（配列番号：９）
・５’−ＣＡＣｇｇＣＡｇＣＡＣＡＣＣＣＡｇＡｇＣ−３’（配列番号：１０）
・５’−ＣＡＣｇｇＣＡｇＣＡＣＡＣＣＴｇｇＡｇＣ−３’（配列番号：１１）
変異導入（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は１ｓｔ　ＰＣＲにおいて、変異導入のための部分フラグメントを作製し、２ｎｄ　ＰＣＲにより変異の入っている全長変異体の鋳型を作製し、最終的に３ｒｄ　ＰＣＲにより完全な変異体を得るという３ステップによる方法にて行った。すなわち、０．２μｌのヒトＦＧＦ−２３のクローン＃３（４０ｎｇ／μｌ）、５μｌのＴａＫａＲＡ　ＥＸ　１０ｘＰＣＲバッファー、４μｌのｄＮＴＰ　ｍｉｘ（５０μＭ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ　ＥＸ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｎｔ　ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ、配列番号：７、８、９、１０、１１）、０．５μｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ、配列番号：４）、そして３９．３μｌのＤＤＷを加え、全量５０μｌとして、以下の条件でＰＣＲ反応をサーマルサイクラーＡＢＩ２４００により行った。一次変性は９５℃で２分、そして３５サイクルの２ステップシャトルＰＣＲ（９４℃で４０秒、６０℃で３０秒）を行い、最後に伸長反応を７２℃で４分を行い、ＰＣＲ反応を終了した。ＰＣＲ反応による増幅産物を１．０％アガロース電気泳動で確認した結果、単一の特異的バンドが約２００ｂｐ付近で確認された。このゲルからそれぞれの特異的増幅フラグメント（Ｒ１７６ＱとＲ１７９Ｑ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０４）によりキット添付のプロトコールに従って精製した。その精製フラグメント（変異体部分配列）を用いて次に２ｎｄ　ＰＣＲ反応（変異体の全長の鋳型を作製）を行った。１μｌの精製フラグメントをプライマーとして使用し、０．１μｌのヒトＦＧＦ−２３のクローン＃３（４０ｎｇ／μｌ）、２．５μｌのＴａＫａＲａ　ＥＸ　１０ｘＰＣＲバッファー、２μｌのｄＮＴＰ　ｍｉｘ（５０μＭ）、０．２５μｌのＴａＫａＲａ　ＥＸ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、そして１８．１５μｌのＤＤＷを加え、全量２４μｌとして、以下の条件で２ｎｄ　ＰＣＲ反応をサーマルサイクラーＡＢＩ２４００を用いて行った。一次変性は９５℃で２分、そして５サイクルの３ステップサイクルＰＣＲ（９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分）を行い、２ｎｄ　ＰＣＲを終了した。引き続き、この反応液に０．５μｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ、配列番号：３）、０．５μｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ、配列番号：４）を加え、全量２５μｌとして、以下の条件で３ｒｄ　ＰＣＲ反応をサーマルサイクラーＡＢＩ２４００により行った。一次変性は９５℃で２分、そして３５サイクルの２ステップシャトルＰＣＲ（９４℃で４０秒、６０℃で１分）を行い、最後に伸長反応を７２℃で７分を行い、ＰＣＲ反応を終了した。最終的に得られたＰＣＲ反応による増幅産物を１．０％アガロース電気泳動で確認した結果、特異的に増幅された約７５０ｂｐ付近のバンドが確認された。
以降の解析は実施例１と同様の方法で内部配列のＴＡクローニングを行い、同様の方法で内部配列の塩基配列解析を行ったところ、各種変異体に対して目的変異を挿入されたクローンの作製に成功した。
［実施例３］　発現ベクターの作製
ＦＧＦ−２３および各種変異体（Ｍ１〜Ｍ５）の内部配列をｐＣＡＧＧＳ３に挿入し、各クローンの発現ベクターを作製した。すなわち、各クローンを制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断し、得られたＥｃｏＲＩフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０４）により精製し、ＥｃｏＲＩカットされたｐＣＡＧＧＳ３に挿入した。各ベクターをｐＣＧＦ２３、ｐＣＧＦＭ１〜５と命名した。
［実施例４］　エンドトキシンフリープラスミドの調製
プラスミドＤＮＡを直接ｉｎ　ｖｉｖｏに投与するため、エンドトキシン除去処理を加えた方法によりプラスミド精製を行った。具体的にはＥｎｄｏｆｒｅｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３６２）を使用し、ｐＣＧＦ２３、ｐＣＧＦＭ１〜５のエンドトキシンフリーのプラスミド精製を添付されたプロトコールに従って行った。
［実施例５］　ＦＧＦ−２３およびＭ２（Ｒ１７９Ｑ）のＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｑの付加
ｐＣＧＦ２３およびｐＣＧＦＭ２を鋳型に配列番号：３に記載の配列およびＦＬＡＧ配列を含む配列番号：１２に記載のプライマーを使用し、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列を含む変異体を作製した。すなわち１μｌのｐＣＧＦ２３およびｐＣＧＦＭ２（３０ｎｇ／μｌ）、２．５μｌのＴａＫａＲａ　ＥＸ　１０ｘＰＣＲバッファー、２μｌのｄＮＴＰ　ｍｉｘ（５０μＭ）、０．２５μｌのＴａＫａＲａ　ＥＸ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ、配列番号：１１）、０．５μｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ、５’−ｇｇＡＴＣＣｇＡＡＴＴＣＡＴＡＴｇＴＣＡＣＴＴＡＴＣｇＴＣｇＴＣＡＴＣＣＴＴｇＴＡＡＴＣｇＡＴＧＡＡＣＴＴｇｇＣｇＡＡｇｇ−３’／配列番号：１２）、そして１８．５μｌのＤＤＷを加え、全量２５μｌとして、以下の条件でＰＣＲ反応をサーマルサイクラーＡＢＩ２４００により行った。一次変性は９５℃で２分、そして３０サイクルの２ステップサイクルＰＣＲ（９４℃で３０秒、６０℃で１分）を行い、最後に伸長反応を７２℃で７分を行ってＰＣＲ反応を終了した。最終的に得られたＰＣＲ反応による増幅産物を１．０％アガロース電気泳動で確認した結果、特異的に増幅された約８００ｂｐ付近のバンドが確認された。以降の解析は実施例１〜４の方法に準じて行い、最終的に発現ベクターｐＣＧＦ２３−ＦおよびｐＣＧＦＭ２−Ｆを作製した。
［実施例６］　ＦＧＦ−２３及びＭ２（Ｒ１７９Ｑ）のＮ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇの付加
Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇつきＦＧＦ２３発現ベクターは、ＰＣＲ法を使い以下のように構築した。３ｎｇのｐＣＧ２３をテンプレート、それぞれ１００ｐｍｏｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐＣＲ　ｐｒｉｍｅｒと２３Ｎ　ＦＬＡＧ　Ｒ（ＧＣＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＧＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＧＣＴＣ／配列番号：１３）あるいは２３Ｒ１（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＧ／配列番号：１４）と２３Ｎ　ＦＬＡＧ　Ｆ（ＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＡＧＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＡＡＴＧ／配列番号：１５）をプライマーセットとして使い、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑとそれに添付のバッファーを使い、１段階目のＰＣＲ反応（９６℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃２分、２５サイクル）を行った。ＰＣＲ反応生成物を、ミリポア社のマイクロコン３０にかけ、プライマーを除去した後、それぞれのＰＣＲ反応生成物を混ぜ合わせたものをテンプレート、ＦＧＦ　Ｆと２３Ｒ１をプライマーセットとして使い、１段階目と同じ条件で２段階目のＰＣＲ反応を行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ反応生成物を精製し、このフラグメントをＴＯＰＯクローニングキット（インビトロージェン社製）使いクローニングしてＤＮＡ配列を読むことにより、目的の変異が導入されていることおよび不必要な変異が導入されていないことを確認した。配列の確認されたプラスミドを調整し、Ｅｃｏ　ＲＩで切断しフラグメントを回収して、あらかじめＥｃｏ　ＲＩで切断しておいたｐＣＡＧＧＳ３に組み込んだ。方向性を確認した後、最終的に発現ベクターをｐＣＧＦ２３ＮＦと命名した。
Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇつきＦＧＦ２３Ｍ２ベクターは１段階目のＰＣＲ用のテンプレートにｐＣＧＦＭ２を使った以外、上記と同様の方法で行い作製し、ｐＣＧＦＭ２ＮＦと命名した。
［実施例７］　ｎａｋｅｄ　ＤＮＡ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ動物実験用発現ベクター作製
ｎａｋｅｄ　ＤＮＡ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ法を用いてマウス成体においてＦＧＦ２３とその変異体が直接または間接的にリン代謝に影響を及ぼすかどうかを検証した。
使用した材料は以下の通りである。
ＦＧＦ２３発現ベクター（ｐＣＧＦ２３）
Ｒ１７６ＱＦＧＦ２３変異体発現ベクター（ｐＣＧＦＭ１）
Ｒ１７９ＱＦＧＦ２３変異体発現ベクター（ｐＣＧＦＭ２）
Ｒ１７９ＷＦＧＦ２３変異体発現ベクター（ｐＣＧＦＭ３）
Ｒ１７６ＱＲ１７９ＱＦＧＦ２３変異体発現ベクター（ｐＣＧＦＭ４）
Ｒ１７６ＱＲ１７９ＷＦＧＦ２３変異体発現ベクター（ｐＣＧＦＭ５）
＜対照物質（陰性対照物質）＞
ＭＯＣＫベクター（ｐＣＡＧＧＳ）
形状：　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液
保存：　−２０℃、暗所
＜調製方法＞
投与剤型は溶液であり、調製法はＴｒａｎｓＩＴ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＰａｎＶｅｒａ社）のプロトコールに従った（ＴｒａｎｓＩＴ登録商標　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎ　Ｖｅｒａ社）ｓｔａｎｄａｒｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ）。ＭＯＣＫベクターまたはＦＧＦ２３発現ベクターまたはＦＧＦ２３変異体発現ベクターを投与１匹当たり１０μｇ使用した。１０μＬのＴｒａｎｓＩＴ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎと適当量の滅菌水を加えて２００μＬとし５０ｍＬファルコンチューブ中で混合した。５分間室温に放置後、上記の２００μＬ当たり２．８ｍＬの１ｘＤｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて全量を３．０ｍＬとして投与液とした。６匹に投与する場合には７匹分の量２１ｍＬを調製した。投与液は調製当日に使い切った。
使用動物および飼育条件は、以下の通りである。
＜使用動物＞
動物種：　マウス
系統：　Ｊｃｌ：ＣＤ−１（ＩＣＲ）またはＣｒｊ：ＣＤ−１（ＩＣＲ）
性別：　雄
体重：　３５〜４０ｇ
週齢：　投与時で８〜９週齢
入手先：　日本クレアまたは日本チャールズリバー
安楽死法：　麻酔下放血
馴化期間：　約２週間
群分け法：　無作為抽出
＜飼育環境＞
室温：　２４±２℃
相対湿度：　５５±１０％
換気回数：　１０〜３０回／時
照明時間：　５：００〜１９：００
飼料：　ＣＥ−２（日本クレア株式会社）を自由摂取
飲料水：　水道水を自由摂取
＜試験方法＞
投与経路は静脈内投与、投与量は３ｍｌとし、全量を８秒以内に投与した。
＜サンプル採取＞
（１）血清
投与後４日後にエーテル麻酔下にて腹部大静脈より全採血した。採取した血液はセパラピットチューブミニ（積水化学工業）に入れ遠心（１４００×ｇ，１０分間，４℃）し、血清を分離した。血清は測定に供するまで設定温度−２０℃の冷凍庫に保存した。
（２）尿
投与後３日目にマウスをガラス製の代謝ケージ（ＭＥＴＡＢＯＬＩＣＡ，杉山元医理器）に入れ、４日目まで２４時間蓄積尿を採取した。尿は測定に供するまで設定温度−２０℃の冷凍庫に保存した。
（３）腎臓
血清採取後、両腎臓を摘出し被膜を剥離除去し、刷子縁膜小胞の精製に供した。
＜各パラメータの測定＞
血清中または尿中の無機リン（Ｐｉ）、カルシウム（Ｃａ）、尿素窒素（ＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）は自動分析装置（日立７１７０Ｅ形）にて測定した。血清中の２５−ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ　Ｄ，２４，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ　ＤはＣＰＢＡ法で，１α，２５−ｄｉｈｉｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ　ＤはＲＩＡ２抗体法で測定した。
＜統計学的解析方法＞
ＭＯＣＫベクター投与群とＦＧＦ２３発現ベクター投与群または各ＦＧＦ２３変異体発現ベクター投与群間で、対応のないｔ検定を行った。有意水準は両側５％とした。解析ソフトはＳＡＳ　ｖｅｒ．６．１２を用いた。
結果、血清生化学値に対する作用は、図１に示したようにＡＤＨＲ患者で同定された点変異を導入した３種類のＦＧＦ２３変異体発現ベクターであるＦＧＦ２３−Ｍ１、ＦＧＦ２３−Ｍ２およびＦＧＦ２３−Ｍ３を投与した群では、変異体の種類に関わらず、ＭＯＣＫ投与群に比べて有意な血中リン値の低下が観察された。しかしながら、これらの点変異を組み合わせた二重変異体発現ベクター、ＦＧＦ２３−Ｍ４、ＦＧＦ２３−Ｍ５を投与した群では同様に血清リン低下作用は観察されたものの、点変異を組み合わせたことによる相加・相乗効果は認められなかった。野生型ＦＧＦ２３（ＦＧＦ２３−Ｗｉｌｄ）を投与した群では、血清リン低下作用は認められなかった（図２）。
表１に示すように、その他の血清生化学パラメータ（カルシウム、クレアチニン、尿素窒素）ではＭＯＣＫ群とＦＧＦ２３−Ｗｉｌｄ群及びＦＧＦ２３−Ｍ２群で著明な差は認められなかった。
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また、尿中生化学値に対する作用を表す結果は、表２に示したようにＦＧＦ２３−Ｍ２投与群では、ＭＯＣＫ群に比較して一日当たりのリン排泄量が増加する傾向が見られたが、有意な差ではなかった。
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また、血清中１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３に対する作用を示す結果は、図３に示したようにＭＯＣＫ投与群に比較して、ＦＧＦ２３−Ｍ２投与群およびＦＧＦ２３−Ｗｉｌｄ群では著明に１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３量が低下していた。ＦＧＦ２３−Ｗｉｌｄ群ではＭＯＣＫ群の約半分、ＦＧＦ２３−Ｍ２投与群では測定感度以下まで低下していた。
一方、生体内の前駆体である２５（ＯＨ）Ｄ３量はＭＯＣＫ投与群、ＦＧＦ２３−Ｗｉｌｄ投与群、ＦＧＦ２３−Ｍ２投与群で有意な差は認められなかった。また２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３量はＦＧＦ２３−Ｗｉｌｄ投与群ではＭＯＣＫ投与群と差は見られなかったもののＦＧＦ２３−Ｍ２投与群では著明に低下していた（表３）。
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＜刷子縁膜小胞精製＞
刷子縁膜小胞の精製は、マグネシウム沈殿法にて行った。すなわち、採取した腎臓に氷冷したＭＥＴ　Ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ　ｍａｎｎｉｔｏｌ，１ｍＭ　ＥＧＴＡ，２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．１）を加え、ヒスコトロンで１８，０００ｒｐｍ、１分間、ホモジナイズした後に、１／１０量の１Ｍ　ＭｇＣｌ２を加えて攪拌、１５分間氷中に放置した。低速遠心（２，０００×ｇ、１５分間、４℃）にて非粉砕画分を除去後、上清を高速遠心（２４，０００×ｇ、３０分間、４℃）し、沈殿を得た。沈殿にＭＥＴ　Ｂｕｆｆｅｒを加えてテフロンホモジナイザー（１，０００ｒｐｍ、１０ストローク）で更に粉砕した。再度、１／１０量の１Ｍ　ＭｇＣｌ２を加えて攪拌、１５分間氷中後、低速遠心（２，０００×ｇ、１５分間、４℃）、上清を高速遠心（２４，０００×ｇ、３０分間、４℃）した。得られた沈殿にＴｒａｎｓｐｏｒｔ　Ｂｕｆｆｅｒ−Ｋ（１００ｍＭ　ｍａｎｎｉｔｏｌ，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）を加え、プラスチックシリンジ（針２０Ｇおよび２７Ｇ）で吸引排出を繰り返し、刷子縁膜小胞を得た。
＜リン輸送活性測定＞
刷子縁膜を用いたリン輸送活性の測定は、迅速濾過法を用いた。すなわち、２０μＬの刷子縁膜小胞と８０μＬの反応液（１００ｍＭ　ｍａｎｎｉｔｏｌ，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１２５ｍＭ　ＮａＣｌ，１２５ｎＭ　３２Ｐ−ＫＨ２ＰＯ４）を２５℃で１分間反応させ、反応停止液（１００ｍＭ　ｍａｎｎｉｔｏｌ，１００ｍＭ　ｃｈｏｌｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ，２０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）を１ｍＬ加えて反応を停止させた。反応液は、直ちにニトロセルロース膜（孔径０．４５μｍ、直径２．５ｃｍ）で吸引濾過し、ニトロセルロース膜を５ｍＬの反応停止液で洗浄した。膜上に捕獲された放射活性を液体シンチレーションカウンターＴＲＩ−ＣＡＲＢ　２７００ＴＲ（ベックマン株式会社）を用いて測定し、全リン輸送活性とした。ナトリウム非依存性リン輸送活性の測定は、反応液中の１２５ｍＭ　ＮａＣｌを１２５ｍＭのＫＣｌに変更して行った。ナトリウム依存性リン輸送活性は、全リン輸送活性とナトリウム非依存性リン輸送活性の差より算出した。いずれの活性も、刷子縁膜小胞中のタンパク量をＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて測定し、１分間に単位タンパク量が取り込んだリン量（ｐｍｏｌｅｓ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）として表示した。
結果、図４に示したようにＦＧＦ２３−Ｍ２投与群ではＭＯＣＫ投与群に対して腎臓におけるナトリウム依存性リン輸送担体（Ｎａ／Ｐｉ）活性は有意に低下していた。一方、ナトリウム非依存性リン輸送活性に変化は認められなかった。
［実施例８］　Ｃ末端欠失Ｍ２ＦＧＦ２３変異体発現ベクターの構築
Ｃ末端欠失Ｍ２ＦＧＦ２３変異体発現ベクターは、ＰＣＲ法を使い以下のように構築した。３ｎｇのｐＣＧＦＭ２ＮＦをテンプレート、それぞれ１００ｐｍｏｌのＳｐｅｃｉｆｉｃ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒとｄＣ１８８（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＡＧＴＣ／配列番号：１６）、
ｄＣ１９４（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＡＧＧＧＧ／配列番号：１７）、
ｄＣ２００（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＧ／配列番号：１８）、
ｄＣ２１０（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＣＡＧＧＡ／配列番号：１９）、
ｄＣ２１７（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＣＴＧＴＴＧＴＣＣＴＣＧＧＣＧＣＴ／配列番号：２０）、
ｄＣ２２３（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＧＧＣＴ／配列番号：２１）、
ｄＣ２４０（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＣＣＣＧＴＴＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧ／配列番号：２２）あるいは
ｄＣ２４５（ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＣＣ／配列番号：２３）をプライマーセットとして使い、Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑとそれに添付のバッファーを使い、ＰＣＲ反応（９６℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃２分、２５サイクル）を行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ反応生成物を精製し、このフラグメントをＴＯＰＯクローニングキット（インビトロジェン社製）を使いクローニングして、ＤＮＡ配列を読むことにより、目的の変異が導入されていることおよび不必要な変異が導入されていないことを確認した。配列の確認されたプラスミドを調整し、Ｅｃｏ　ＲＩで切断しフラグメントを回収して、あらかじめＥｃｏ　ＲＩで切断しておいたｐＣＡＧ　ＧＳ３に組み込んだ。これらの発現ベクターは各々、ｐＣＧｄＣ１８８（ｄＣ１８８）、ｐＣＧｄＣ１９４（ｄＣ１９４）、ｐＣＧｄＣ２００（ｄＣ２００）、ｐＣＧｄＣ２１０（ｄＣ２１０）、ｐＣＧｄＣ２１７（ｄＣ２１７）、ｐＣＧｄＣ２２３（ｄＣ２２３）、ｐＣＧｄＣ２４０（ｄＣ２４０）、ｐＣＧｄＣ２４５（ｄＣ２４５）と命名した。
［実施例９］　Ｃ末端欠失Ｍ２ＦＧＦ２３変異体たんぱく質の発現
１ｘ１０５個のＣＯＳ細胞を１ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁後、６ウェルプレートにまいた。一晩培養後、１μｇの発現ベクター（実施例８に示したｐＣＧｄｃ１８８〜ｐＣＧｄｃ２４５）を３μＬのＦｕＧｅｎｅ（ベーリンガー社製）をを使い細胞に導入した後、さらに一晩培養した。次の日培地を、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩに交換し、さらに２日培養を続けた。２日後培地を回収し、その培地中に発現している変異体たんばく質を、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）（ＳＩＧＭＡ）によりウエスタンブロッティング法により解析を行い、変異体たんぱく質の発現を確認した。
［実施例１０］　ＣＯＳ細胞によるＦＧＦ−２３変異体（Ｍ２）組み換え体の一過性発現
５ｘ１０６個のＣＯＳ細胞を４００μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁後、１０μｇの発現ベクターｐＣＧＦＭ２−Ｆを加えてエレクトロポレーションキュベット０．４ｃｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に移し、Ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて０．２６ｋｖ、抵抗値∞、９６０ｍＦの条件でエレクトロポレーションを行った。その後、３０ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）培地に細胞溶液を懸濁して、１７５ｃｍ２のフラスコ（ＦＡＬＣＯＮ）に移し、ＣＯ２イキュベーター（ＥＳＰＥＣ）に３７℃で一昼夜静地した。翌日、３０ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ）に培地交換して、３日間培養した。回収した培地を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して細胞を取り除き、その培地をａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）（ＳＩＧＭＡ）によりウエスタンブロッティング法により解析を行い、組み換え体ＦＧＦ−２３変異体（Ｍ２）−Ｆの発現を確認した。
［実施例１１］　組み換え体ＦＧＦ−２３（Ｍ２）−Ｆのアフィニティーカラムによる精製
ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体アフィニティーカラム（ＳＩＧＭＡ）を用いて組み換え体ＦＧＦ−２３変異体（Ｍ２）−Ｆの精製を行った。クロマトグラフィー操作はグラディフラックシステム（ファルマシア）を用いた。アフィニティーカラムをＰＢＳ−Ｔにより平衡化した後、実施例１０の組み換え体ＦＧＦ−２３変異体（Ｍ２）−Ｆの発現している調製培地をアプライし、グリシンＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出を行った。そしてメインピークを分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、ＣＢＢ染色レベルでほぼ均一な目的分子量付近のバンドを確認し、組み換え体の調製を終了した（図５）。
［実施例１２］　欠失変異体動物実験
投与剤の調製は、ＴｒａｎｓＩＴ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＰａｎＶｅｒａ社）のプロトコールに従った。投与１匹当たり図６に示した発現ベクター（ＭＯＣＫは、実施例７と同じ）１０μｇに１０μＬのＴｒａｎｓＩＴ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎと適当量の滅菌水を加えて２００μＬとして混合、５分間室温に放置後、２００μＬ当たり２．８ｍＬの１ｘ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて全量を３．０ｍＬとして投与液とした。６匹に投与する場合には７匹分の量２１ｍＬを調製した。投与液は調製当日に使い切った。
日本チャールズリバー社から購入した８〜９週齢の雌性ＣＤ−１（ｌＣＲ）マウス（３５−４０ｇ）を１週間馴化後、実験に供した。尾静脈から発現ベクターを含む投与剤３ｍＬを８秒以内に全量投与した。投与後４日後にエーテル麻酔下にて腹部大静脈より全採血し、採取した血液はセパラピットチューブミニ（積水化学工業）に入れ遠心（１４００×ｇ，１０分間，４℃）し、血清を分離した。
血清中の無機リン（Ｐｉ）、カルシウム（Ｃａ）、尿素窒素（ＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）は自動分析装置（日立７１７０Ｅ形）にて測定した。
結果を図６に示す。
Ｍ２ＦＧＦ２３変異体はアミノ酸２５１個で構成されているが、Ｃ末端部分を短くしていくとアミノ酸２００位までのｄＣ２００変異体でも同等の血清リン低下作用を有していた。しかしながら１９４位までのｄＣ１９４変異体、１８８位までのｄＣ１８８変異体と更に短くすると、作用は弱まり、失われていった。ＡＤＨＲ患者では１７６位もしくは１７９位のアミノ酸に変異が入るとＦＧＦ２３がタンパク分解による調節を受けにくくなり、結果的に過剰なＦＧＦ２３が血中に存在することで低リン血症になると推測されている。従って本実験結果からアミノ酸１７９位〜２００位の部分に血清リン低下作用に重要な部位があると考えられた。
［実施例１３］　ＦＧＦ２３の副甲状腺甲状腺切除ラットに対する作用
８週齢の雄性ＳＤラットを甲状腺・副甲状腺切除（ＴＰＴＸ）し、数日後、イオン化カルシウムを測定、手術の成否を確認した後に大腿静脈にカテーテルを挿入し、尿サックをしてボールマンケージに固定した。
Ｈａｒｖａｒｄ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ＰｕｍｐでＰＴＨ（１−３４）（０．３ｎｍｏｌ／ｍＬ）またはＣ−ＦＬＡＧタグ付きＭ２ＦＧＦ２３タンパク（６μｇ／ｍＬ）またはベヒクル（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　８０／Ｓａｌｉｎｅ）を１ｍｌ／ｈｒの速度で６時間、ｉｎｆｕｓｉｏｎ投与した。ｉｎｆｕｓｉｏｎ開始後４時間目から投与終了６時間目まで採尿し、投与終了後、腹部大静脈より全血採血した。３０００ｒｐｍ　ｘ　１０ｍｉｎ遠心して血清と尿の不溶画分を分離し、日立７１７０形オートアナライザーで無機リン、カルシウム、クレアチニンを測定した。結果を図７から図９に示す。
図７よりＴＰＴＸにより上昇したラットの血清リン濃度はＰＴＨ（１−３４）投与により正常化した。またＭ２ＦＧＦ２３投与によっても同様に正常化した。一方、ＴＰＴＸにより低下した血清カルシウム濃度はＰＴＨ（１−３４）投与で是正されるものの、Ｍ２ＦＧＦ２３投与では殆んど効果がなかった（図８）。このことからＭ２ＦＧＦ２３はＰＴＨを介して血清リン濃度に作用を及ぼしているのではなく、血清カルシウム濃度に作用を示さないことが明らかとなった。ＰＴＨ（１−３４）では尿中の無機リン／クレアチニン値が上昇していることから血清中のリンは尿中に排泄されたと考えられるが、Ｈ２ＦＧＦ２３では無機リン／クレアチニン値が、変化していないことから、血清中のリンは骨にハイドロキシアパタイトとして戻った可能性がある（図９）。
産業上の利用の可能性
本発明により、ＦＧＦ２３タンパク質変異体が提供された。本発明のＦＧＦ２３変異体は、血中のリン濃度を低下させる効果を有することから、高リン血症の治療および予防薬になるものと期待される。また、本発明のＦＧＦ２３変異体をコードするＤＮＡは、体内に導入し発現させることにより、血中リン濃度を低下させることから、高リン血症に対する遺伝子治療への応用が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、血清中の無機リン濃度に対するＦＧ２３変異体の効果を示すグラフである。血清中の無機リンは、ＤＮＡベクターを導入後４日間計測した。データは平均値±ＳＥＭを表す。カラム内の数値は動物の数を表す。＊Ｐ＜０．０５対ＭＯＣＫ対照（対応のないｔ検定）。
図２は、血清中の無機リン濃度に対するＦＧＦ２３の効果を示すグラフである。血清中の無機リンは、ＤＮＡベクターを導入後４日間計測した。データは±ＳＥＭを表す。カラム内の数値は動物の数を表す。＊Ｐ＜０．０５対ＭＯＣＫ対照（対応のないｔ検定）。
図３は、血清中の１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３濃度におけるＦＧＦ２３およびＦＧＦ２３変異体の効果を示すグラフである。血清中の１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、ＤＮＡベクターを導入後４日間計測した。計測には、３動物から得た血清を混合して使用した（ｎ＝２，６匹／群）。データは平均値を表す。
図４は、腎臓から単離したＢＢＭＶにおけるリン輸送活性に対するＦＧＦ２３変異体の効果を示すグラフである。ｎａｋｅｄベクターＤＮＡ導入マウスにおける腎臓刷子縁膜小胞中におけるＰｉ取込み（導入後４日間）。計測には、２動物から得た腎臓を使用した（ｎ＝３，６匹／群）。データは平均値±ＳＥＭを表す。
図５は、ＦＧＦ−２３（変異体）Ｍ２−ＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（ＣＢＢ染色）の結果を示す写真である。図中のＭは、分子量マーカー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、ブロードレンジ）を表す。
図６は、Ｃ末端欠失Ｍ２ＦＧＦ２３変異体の血清リン濃度低下作用を示すグラフである。「ＭＯＣＫ」は親ベクターであるｐＣＡＧＧＳを導入したマウスを表す。「Ｎｏｒｍａｌ」は、正常マウスを表す。
図７は、ＰＴＨ（１−３４）とＨ２ＦＧＦ２３のＴＰＴＸラット血清リン低下作用を示すグラフである。
図８は、ＰＴＨ（１−３４）とＭ２ＦＧＦ２３のＴＰＴＸラット血清カルシウムに対する作用を示すグラフである。
図９は、ＰＴＨ（１−３４）とＭ２ＦＧＦ２３のＴＰＴＸラットにおける腎リン排泄に対する作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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