(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的活性のある上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を有効成分とし、カルボキシビニルポリマーを基剤として含む安定した外用剤組成物。
【請求項２】
生物学的活性のあるＥＧＦが、天然資源から分離するかまたはＤＮＡ組換技術を用いて製造した請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項３】
ＥＧＦの含有量が製剤の総量に対して、濃度が０．００１ないし１０００μｇ／ｇである請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項４】
ＥＧＦの含有量が製剤の総量に対して、濃度が０．１ないし１００μｇ／ｇである請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項５】
水溶液中の組成物のｐＨが４ないし８の範囲である請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項６】
カルボキシビニルポリマーがカルボマー９３４、カルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４０、カルボマー９４１またはカルボマー９４７Ｐからなる群より選択された請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項７】
カルボキシビニルポリマーの含有量が組成物の総量に対し、０．００１ないし５０重量%である安定した請求項１に記載の外用剤組成物。
【請求項８】
カルボキシビニルポリマーの含有量が組成物の総量に対し、０．００５ないし２５重量%である請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項９】
カルボキシビニルポリマーの含有量が組成物の総量に対し、０．０１ないし１０重量%である請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項１０】
点眼剤である請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項１１】
クリーム剤である請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項１２】
軟膏剤である請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項１３】
ゲル剤である請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項１４】
パッチ剤である請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項１５】
組成物が、綿、ガーゼ等に塗布または貼着させたものである請求項１に記載の安定した外用剤組成物。
【請求項１６】
カルボキシジニルポリマーを基剤として用いることによって生物学的活性のあるＥＧＦを有効成分として含む組成物を安定化させる方法。
【請求項１７】
生物学的活性のあるＥＧＦを含む組成物を安定化させるためのカルボキシビニルポリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor, EGF）を有効成分として含有する安定した組成物に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、生物学的に活性を持つＥＧＦ及び水溶液でＥＧＦの安定性を著しく増加させることができるカルボキシビニルポリマーを基剤として含む安定した組成物に関するものである。
【従来の技術】
【０００２】
ＥＧＦは、ウロガストロン（urogastrone）として知られており、５３個のアミノ酸と３個の二硫化物（disulfide）結合を持つ分子量６０４５のポリペプチドである。ＥＧＦは、上皮細胞と間葉(messenchymal)細胞とを含む各種細胞に対し、類似分裂の促進、細胞成長の促進及び胃酸分泌の抑制などの活性が良好であるため、皮膚または角膜の創傷治療剤または胃潰瘍の治療剤として使用することが出来るものとして知られている（参照：米国特許第１４０９９８号；Carpenter, Experimental Cell Research. 164:1~10, 1986）。
【０００３】
しかし、ＥＧＦは、試験管内では優れた上皮細胞分化促進機能を表わしているが、ＥＧＦを実際の創傷部位に適用したときには、創傷治癒に若干の効果のみあるものの、ＥＧＦを用いた皮膚または角膜の創傷治療用の外用剤の開発は非常に難しかった。
【０００４】
ＥＧＦは、生物学的に不安定だけでなく、物理学的においても不均質であるため治療効果を減少させ、分解産物によるアレルギーが発生される。従って、ＥＧＦは生体に直接適用する場合においては創傷治癒効果を十分に表わすことが出来なかった。ＥＧＦは、常温で、特に水分の存在下で非常に不安定であり、創傷部位において細胞がＤＮＡを合成できるように誘導するために、約８ないし１２時間程度の潜伏期（lag time）を必要とする一方、ＥＧＦの半減期は約１時間程度に非常に短く、目的とする効果を表わすことが出来ない。ＥＧＦは長期保管時、室温だけでなく冷蔵保管状態においても物理学的に変性してしまう。ＥＧＦを皮膚に適用すると、創傷部位に存在する蛋白質分解酵素によって、ＥＧＦが変性、分解、凝集及び沈殿される過程によって生物学的活性を喪失する（参照：Manning et al., Pharmaceutical Res., 6:903~917, 1989）。
【０００５】
ＥＧＦの短所のうち、生物学的不安定を克服し、十分な治療効果を表わすために、創傷回復に最も重要な最初の数日間ＥＧＦを創傷部位に随時に適用し、有効濃度が持続的に維持されるようにすることが報告されている（参照：Franklin et., J. Lab. Clin. Med., 108:103~108,1986）。これによって、今までＥＧＦを創傷部位に持続的に供給できる徐放性ＥＧＦ製剤を開発するための研究が行われてきた。
【０００６】
かかる研究の結果として、米国特許第４，９４４，９４８号は中性リン脂質と陰に荷電されたリン脂質及びコレステロールを用いてＥＧＦを創傷部位に持続的に供給するＥＧＦ／リポソームゲル剤形を開示している。また、ヨーロッパ特許公報第３１２２０８号は、薬剤学的に許容される多様な水溶性または水膨潤性ポリマーを開示している。
【０００７】
しかし、これらの文献は、ＥＧＦを１２時間以上持続的に放出する剤形を提示しているが、これらのＥＧＦは、長期保管中の安定性が確保されていないため、工業的生産に不適合である。したがって、ＥＧＦが薬剤として創傷に対し十分な治療効果を表わすためには、長期間生物学的活性が維持されるだけではなく、純度及び均質性などの物理学的安定性をも維持すべき必要性が絶えず要求されてきた。
【０００８】
かかる物理化学的安定性を維持してＥＧＦ活性の減少を防ぐための方法として、ヨーロッパ特許公報第２０５０５１号は、０．０００１ないし０．００５重量％のＥＧＦ、１ないし１０重量％の界面活性剤、５ないし４５重量％の脂肪質及び０．３ないし０．８重量％の防腐剤を含有する皮膚または眼科用クリーム形態の薬剤学的組成物を開示している。ヨーロッパ特許公報第267015号及び米国特許第４，７１７，７１７号は、ＥＧＦに水溶性セルロース誘導体を添加して安定化されたＥＧＦ含有組成物を記述している。また、ヨーロッパ特許公報第３９８６１５号及び米国特許第５，１３０，２９８号は、ＥＧＦに薬剤学的に許容される亜鉛などの金属陽イオンを添加し、ＥＦＧが亜鉛とイオン結合され、水溶液中でのＥＧＦの分解を防ぎ、ＥＧＦを安定化させる方法を開示している。
【０００９】
しかし、上述した安定化剤を添加しても、ＥＧＦの安定性は４℃において略2ヶ月間維持される。従って、ＥＧＦを皮膚外用剤として製剤化して創傷に直接適用する場合、創傷治癒効果が十分に出ていないか、且つ製剤の安定性が低いため、実際産業化に適用しにくいのが実情である。
【００１０】
従って、特別な治療剤のない皮膚潰瘍や角膜損傷のような難治性病理等に効果的に用いられるＥＧＦを、十分な治療効果が発揮されながら、保管時に安定的にＥＧＦを保護し、適用時には担体から創傷部位へとＥＧＦを迅速に移行するＥＧＦ製剤を開発すべき必要性が台頭してきた。
【００１１】
このようなことから、本発明者らは、十分な創傷治癒及び良好な安定性を持つＥＧＦ外用剤を開発するために、鋭意研究を続けた結果、ＥＧＦを有効成分とし、酸性高分子であるカルボキシビニルポリマーを基剤として用いて外用剤を製造する場合に、従来の技術において基剤として用いられたセルロース系列の高分子や中性高分子より創傷治療効果を十分に発揮するとともに、優れた安定性が確保できることを明らかにした。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ＥＧＦを有効成分とし、カルボキシビニルポリマーを基剤として含め、ＥＧＦの生物学的及び物理学的に安定したＥＧＦ含有組成物を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る組成物は、ＥＧＦを有効成分に、またはカルボキシビニルポリマーを基剤として含む。活性成分であるＥＧＦは、天然型ＥＧＦから分離するか、組換ＤＮＡ技術を用いて製造できる。組成物中のＥＧＦ含有量は、ＥＧＦが薬理学的に有効に作用できるように、製剤の総量に対して０．００１ないし１，０００μｇ／ｇ、望ましくは、０．１ないし１００μｇ／ｇの範囲である。本発明に係る組成物のｐＨは水溶液においてＥＧＦが変性されずに溶解された状態に維持出来るようにするために、望ましくは４ないし８の範囲、さらに望ましくは、５ないし７の範囲である。
【００１４】
本発明において基剤として用いられるカルボキシビニルポリマーは分子量１×１０６ないし４×１０６程度のホモポリマーである。アクリル酸とアリールサッカロースとの架橋結合物であるカルボキシビニルポリマーは、１％水溶液への分散時において、ｐＨ２．５ないし３．０を示す酸性高分子であり、１％未満の低い濃度においても広い範囲の粘度を有するので、経口用懸濁剤や、ローション、クリーム及びゲル剤に広く用いられている基剤である。また、カルボキシビニルポリマーは、カルボマー（Carbomer）９３４、カルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４０、カルボマー９４１またはカルボマー９４７Ｐのように、その種類に関係なく５６．０ないし６８．０％の比でカルボキシ基を含む。カルボキシビニルポリマーの含有量は、組成物の総量に対し、０．００１ないし５０重量％、望ましくは、０．００５％ないし２５％、さらに望ましくは、０．０１ないし１０重量％の範囲である。
【００１５】
本発明に係る組成物は、製薬上許容され得る添加剤、たとえば、安定化剤、賦形剤、等方剤、保湿剤、ｐＨ調整剤などを追加して含有することができる。
【００１６】
本発明者らは、本発明に係るカルボキシビニルポリマーを含有するＥＧＦ製剤と、その他の高分子を基剤として含有するＥＧＦ製剤を４℃及び２５℃において６ヶ月間保管しながら安定性比較試験を行った。このとき、１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解させたＥＧＦを対照群として用いており、また、ＥＧＦの含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。その結果、本発明に係るカルボキシビニルポリマーを基剤として含有するＥＧＦの製剤の場合に、広い濃度の範囲内で、他の基剤を含有するＥＧＦ製剤に比べて優れた安定性を見せているだけではなく、リン酸緩衝液に溶解させたＥＧＦよりも優れた安定性を見せた。かかる結果から、本発明に係るＥＧＦ製剤において、ＥＧＦは、カルボキシビニルポリマー基剤の含有量に関係なくカルボキシビニルポリマーを添加して安定化させることが出来、また、このポリマーは、使用目的に応じて基剤として粘度調整して用いるか、安定化剤として添加出来ることが確認された。
【００１７】
本発明に係るＥＧＦ含有組成物は、治療目的に応じて眼科製剤や、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、パッチ剤などの皮膚外用剤として応用でき、また、綿、ガーゼに塗布または貼付させて使用でき、必要に応じて凍結乾燥し保管して置き、適切な溶剤に溶解させて使用することが出来る。また、皮膚外用製剤は化粧品剤形に有用に用いられる。
【００１８】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されないものとして理解されるべきであろう。
【００１９】
【実施例】
実施例１：０．１％カルボマー含有点眼製剤
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通常の方法によって、上述した成分を指定された比率の量を用いて、製剤を製造した。具体的には、マンニトール、パラオキシ安息香酸メチル及びパラオキシ安息香酸プロピルを適当量の注射用蒸留水に溶解させた。カルボマー９３４Ｐ（BFGoodrich，U.S.A）を溶液に加え攪拌して分散させる。次いで、溶液を水酸化ナトリウムでｐＨを調節して滅菌した後、注射用蒸留水に溶解させたＥＧＦ（Daewoong Pharm., Korea）のろ過滅菌液を混合し、１００gの製剤を得た。
【００２０】
実施例２：ＥＧＦ含有１０ｍＭリン酸緩衝液
0003761816.tif 000003
通常の方法によって、上述した成分を指定された比率の量を用いて、製剤を製造した。具体的には、リン酸水素ナトリウムと塩化ナトリウムを適当量の注射用蒸留水に溶解させ、２０％のリン酸溶液でｐＨを調節して滅菌した液に、注射用蒸留水に溶解させたＥＧＦのろ過滅菌液を混合し、１００ｇの製剤を得た。
【００２１】
実施例３：０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム含有点眼製剤
0003761816.tif 000004
通常の方法によって、上述した成分を指定された比率の量を用いて、製剤を製造した。具体的には、ソルビトールとパラオキシ安息香酸メチルを適当量の注射用蒸留水に溶解させた後、カルボキシメチルセルロースナトリウムを溶液に加え攪拌して分散させる。溶液を水酸化ナトリウムでｐＨを調節した後滅菌し、注射用蒸留水に溶解させたＥＧＦのろ過滅菌液を混合し、１００ｇの製剤を得た。
【００２２】
実施例４：１％カルボマー含有外用ゲル剤
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通常の方法によって、上述した成分を指定された比率の量を用いて、製剤を製造した。具体的には、パラオキシ安息香酸メチルを適当量の注射用蒸留水に溶解させ、カルボマー９３４Ｐを溶液に加え攪拌して分散させる。次いで、溶液のｐＨを水酸化ナトリウムで調節し後、溶液をプロピレングリコールを混合して加熱滅菌した。ここへ注射用蒸留水に溶解させたＥＧＦのろ過滅菌した液を混合し、１００ｇの製剤を得た。
【００２３】
実施例５：１５％ポロキサマー含有外用製剤
0003761816.tif 000006
通常の方法によって、上述した成分を指定された比率の量を用いて、製剤を製造した。具体的に、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム及びリン酸を前記比率の量を用いてリン酸塩緩衝液を製造し、防腐剤であるパラオキシ安息香酸メチルを溶解させた後、ポロキサマー４０７（BASF, Germany）を溶液に加え攪拌して分散させる。次いで、溶液をプロピレングリコールと混合し活性成分であるＥＧＦを加え、１００gの製剤を得た。
【００２４】
実施例６：０．１％カルボマー含有クリーム製剤
0003761816.tif 000007
通常の方法によって、上述した成分を指定された比率の量を用いて、製剤を製造した。具体的には、グリセリン及びパラオキシ安息香酸メチルを適当量の注射用蒸留水に溶解させた後、カルボマー９４０（BF Goodrich，U.S.A）を溶液に加え攪拌して分散させる。その後、パラオキシ安息香酸プロピル及び残りの原料を溶液に加えて溶かしながら乳化し、トリエタノールアミンでｐＨを調節して溶液を滅菌した後、注射用蒸留水に溶解させたＥＧＦ（Daewoong Pharm., Korea）のろ過滅菌液を混合し、１００gの製剤を得た。
【００２５】
実施例７：０．１％カルボマー含有軟膏製剤
0003761816.tif 000008
通常の方法によって、上述した成分を指定された比率の量を用いて、製剤を製造した。具体的に、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、カルボマー９４０Ｐ（BF Goodrich，U.S.A）を適当量の注射用蒸留水に溶解または分散させる。その後、残りのワックス類原料を溶液に加えて加温しながら、乳化した。次いで溶液に乳化滅菌した後、注射用蒸留水に溶解させたＥＧＦ（Daewoong Pharm., Korea）のろ過滅菌液を混合し、１００gの製剤を得た。
【００２６】
実施例８：１％カルボマー含有パッチ製剤
0003761816.tif 000009
通常の方法によって、上述した成分を指定された比率の量を用いて、製剤を製造した。具体的には、カルボマー９４０（BF Goodrich，U.S.A）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ＰＥＧ４００、グリセロールを適当量の注射用蒸留水に溶解または分散させる。その後、溶液を加温して均質化した後、注射用蒸留水に溶解させたＥＧＦ（Daewoong Pharm., Korea）のろ過滅菌液を混合し、１００gの製剤を得た。その後、溶液をモールドに注いでパッチ形態に製造した。
【００２７】
実験例１：眼科用製剤の安定性試験
実施例１において製造したカルボマー含有点眼剤の安定性試験のためにＥＧＦ安定化作用があるものとして知られた実施例２のカルボキシメチルセルロース含有製剤と比較し、４℃または２５℃で保管しながら２、４、８及び１８週の時間経過に伴いＥＧＦの含有量変化を測定した。このとき、実施例2の１０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させた試料を標準液とし、ＥＧＦ含有量は、Quantikine EGF FLISA kit（R&D, U.S.A.）を用いてＥＬＩＳＡ法で定量した。
【００２８】
表１は、４℃でのＥＧＦ点眼剤の安定性を標準液と比較した結果を示しており、表２は、２５℃でのＥＧＦ含有点眼剤の安定性を標準液と比較した結果を示している。
【００２９】
【表１】
0003761816.tif 000010
【００３０】
表１に示すように、４℃条件下において、リン酸緩衝液中のＥＧＦ含有量は、８週目に約１０％まで低下されたが、カルボマー製剤とカルボキシメチルセルロース製剤は、8週までＥＧＦ含有量の低下はなかった。しかし、４℃条件下で１８週間保管した場合、リン酸緩衝液及びカルボマー製剤のＥＧＦ含有量は８週まで変化がないのに比べ、カルボキシメチルセルロース製剤の場合は、１８週目に８７．３％までＥＧＦの含有量が低下された。
【００３１】
【表２】
0003761816.tif 000011
【００３２】
表２に示されるように、同一の製剤を２５℃において保管する場合、リン酸緩衝液製剤でＥＧＦ含有量は、２週目に約２０％まで低下されており、カルボキシメチルセルロース製剤の場合にも４週目から含有量が低下し始めて継続的なＥＧＦの含有量低下を見せている。しかし、実施例１の製剤においてＥＧＦ含有量は８週目までも殆ど変化がなかった。実施例１の製剤を常温で１８週間保管したときのＥＦＧ含有量は、約１３％のみ低下した。従って、カルボマー製剤の場合、常温保管でＥＧＦの安定性が著しく増加していることを確認することが出来た。
【００３３】
試験例２：外用ゲル剤の安定性試験
実施例４において製造されたカルボマー外用ゲル剤の安定性試験のために、水溶液での誘電率（dielectric  constant）を低めて蛋白質の安定化に寄与し、また、天然高分子である外用剤の基剤として広く用いられるポロキサマー外用剤と比較し、４℃または２５℃において保管しながら１８週間外用ゲル剤の含有量変化を推定した。このとき、１０ｍMリン酸緩衝液に溶解させた液を標準液に使用し、ＥＧＦ含有量は、Quantikine EGF ELISA kit（R&D.  U. S. A.）のＥＬＩＳＡ法で評価した。
【００３４】
表３は、４℃での外用ゲル剤の安定性を示しており、表４は、２５℃での外用ゲル剤の安定性を示したものである。
【００３５】
【表３】
0003761816.tif 000012
【００３６】
【表４】
0003761816.tif 000013
【００３７】
表３に示すように、カルボマーやポロキサマー製剤、いずれも８週間の冷蔵保管時には、ＥＧＦ含有量の低下が殆ど観察されていないのに比べ、１８週目にポロキサマー製剤は、約１０％のＥＧＦ含有量低下を表した。しかし、表４に示すように、１％カルボマー製剤の場合、１８週目までＥＧＦ含有量の低下が殆ど観察されないが、プロキサマー製剤やリン酸緩衝液製剤は、いずれも８週目に約２０％のＥＧＦ含有量低下が表われており、１８週目にも続けて含有量低下が表われたが、その程度は、プロキサマーのほうが大きかった。点眼剤の場合からわかるように、ポリマーを基剤として用いる場合、時間の経過びよる含有量低下の程度がリン酸緩衝液より増加しており、その原因はポリマーが長期保管時に、ＥＧＦの分解をさらに促進するためである。従って、カルボマーを基剤として用いた製剤の場合のみに、ＥＧＦの安定性を著しく向上させることを確認出来た。
【００３８】
試験例３：クリーム剤、軟膏剤、パッチ剤の安定性試験
実施例６、実施例７及び実施例８において製造されたカルボマー含有剤の安定性試験のために、４℃または２５℃において保管しながら、２、４、８及び１８週の時間変化に伴い製剤のＥＧＦ含有量変化を測定した。このとき、実施例２の１０ｍＭの燐酸緩衝液に溶解させた試料を標準液に用い、ＥＧＦの含有量は、Quantikine EGF ELISA kit（R&D, U.S.A）のＥＬＩＳＡ法で定量した。
【００３９】
表５及び表６は、４℃でのクリーム剤、軟膏剤、パッチ剤の安定性を示したものである。
【００４０】
【表５】
0003761816.tif 000014
【００４１】
【表６】
0003761816.tif 000015
【００４２】
表５に示すように、ＥＧＦ含有量の低下が殆ど観察されず、表６に示すように、室温保管においてもＥＧＦ含有量低下が殆ど観察されなかった。従って、剤形に関係なくカルボマーを基剤として用いて製剤のＥＧＦ安定性を改善出来ることを確認した。
【００４３】
【発明の効果】
前記試験結果からわかるように、本発明は、生物学的に活性であるＥＧＦにカルボキシビニルポリマーを基剤として含有し、生物学及び物理学的安定性を維持する安定したＥＧＦ組成物を提供する。