(57)【要約】ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３によって気道上皮細胞を刺激し、複数の細胞において発現が大きく変化するアレルギー関連遺伝子としてカテプシンＣのオータナティブスプライシングフォーム（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ−Ｃ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆｏｒｍ）を取得した。この遺伝子は、ＩＬ−４やＩＬ−１３で処理された気道上皮細胞において発現が亢進する。本発明は、生体試料におけるこの遺伝子の発現レベルを指標とする、アレルギー性疾患の検査方法や、治療に有用な化合物のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法。
ａ）被検者の生体試料における、配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）健常者の生体試料における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
【請求項２】
アレルギー性疾患が気管支喘息である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項５】
配列番号：２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列から選択された少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
【請求項６】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列から選択される連続する少なくとも７アミノ酸残基からなり、かつＮ末端から１０７位〜１３７位のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
【請求項７】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（１）配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子、および／またはこれらの遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項８】
細胞が株化気道上皮細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子、および／またはこの遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）候補化合物を投与しない対照と比較して前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項１０】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（１）配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子によってコードされる蛋白質、および／またはこの蛋白質と機能的に同等な蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項１１】
請求項７、請求項９、および請求項１０のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
【請求項１２】
配列番号：２３に記載の塩基配列を含む遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬。
【請求項１３】
配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキット。
【請求項１４】
配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体と、配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬侯補化合物をスクリーニングするためのキット。
【請求項１５】
配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子、および／またはこの遺伝子と機能的に同等な遺伝子の気道上皮細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アレルギー性疾患の検査方法に関する。
背景技術
気管支喘息は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。つまり気管支喘息は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、気管支喘息を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難であった。
しかし現在、気管支喘息は、気道における慢性の炎症性疾患として位置付けられている。そして気管支喘息の病態形成には、気道粘膜や気管支平滑筋におけるアレルギー反応の密接な関与が指摘されている。したがって、気管支喘息の診断においては、これらの組織におけるアレルギー反応の状態を把握することが重要な課題である。また気管支喘息の治療においては、アレルギー反応の制御が課題となる。
一方、アレルギー性疾患には、変異や欠損を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
さて、気管支喘息の患者の多くに、ＩｇＥ抗体の産生亢進を伴うアトピー素因が見られる。気管支喘息には、多様な原因が考えられているが、アトピー素因が多くの患者において過敏症の原因となっていることは疑いを入れない。喘息発作の気道閉塞の機序には、気管支平滑筋の収縮、あるいは気道粘膜の浮腫や気道内分泌亢進が予想されている。このような気道の変化には、病因アレルゲンへの曝露による気道でのＩ型アレルギー反応が重要な役割を果たしている。
近年、ＩＬ−４及びＩＬ−１３が気管支喘息の発症に重要な役割を持っていることが示唆されている。したがって、たとえば気道上皮細胞や気管支平滑筋において、ＩＬ−４やＩＬ−１３によって発現レベルが変化する遺伝子は、気管支喘息に関連していると考えられる。しかし、このような考えかたに基づいて、ＩＬ−４やＩＬ−１３によって特異的に発現レベルが変化する遺伝子の単離についての報告は無い。
さて、現在アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。ブリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験方法は、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性を伴った検査である。
この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
したがって、患者に対する危険が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このようなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与していると考えられるので、診断のみならず、アレルギー症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能性がある。
発明の開示
本発明は、特にアレルギー性疾患の検査を可能とする指標の提供を課題とする。さらに、本発明は該指標に基づく、アレルギー性疾患の検査方法およびアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
ＩＬ−４とＩＬ−１３がアレルギー反応に深く関与していることは、いくつかの報告により示唆されている。たとえばＩＬ−４（Ｙｓｓｅｌ，Ｈ  ａｎｄ  Ｇｒｏｕｘ，Ｈ：Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２１；１０−１８，２０００）や、ＳＴＡＴ６（Ａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７，１５３７−１５４２，１９９８）をノックアウトしたマウスでは、気道過敏性が消失する。モデルマウスにおいては、ＩＬ−１３がＩｇＥ産生やＴｈ２型に関係なく喘息様病態の形成に関与している（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２５８−２２６１，１９９８；Ｇｒｕｎｉｇ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２６１−２２６３，１９９８；Ｚｈｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０３，７７９−７８８，１９９９）。
またヒト気道上皮細胞、気管支平滑筋に、ＩＬ−４受容体及びＩＬ−１３受容体が高発現している（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９：５４９−５５９，２０００）。このことから、これらの組織はＩＬ−４及びＩＬ−１３の標的細胞と思われる。一方、ＩＬ−４受容体α及びＩＬ−１３に存在するＳＮＰが、アレルギー疾患の遺伝的要因の１つであることが示された（Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１９，１１９−１２０，１９９８；Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：１２２７−１２３１，１９９９；Ｋｒｕｓｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｉｍｍｎｏｌ．，９６，３６５−３７１，１９９９；Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９：５４９−５５９，２０００）。更に、可溶型ＩＬ−４受容体αによりＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の作用を阻害することが気管支喘息の治療として有効であることも示された（Ｂｏｒｉｓｈ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．：Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６０：９１２−９２２，１９９９）。
以上のように、ＩＬ−４とＩＬ−１３には、特に呼吸器症状を中心とするアレルギー反応との深い関係が示唆されている。つまりＩＬ−４及びＩＬ−１３によるシグナル伝達経路を構成する遺伝子は、アレルギー反応に深い関連性を有する遺伝子と言える。したがって、これらの遺伝子を単離し、アレルギー反応との関連性を明らかにすることにより、アレルギー性疾患治療の新たな標的を見出すことができる。
本発明者らは、このような考えかたに基づいて、ヒト気管支上皮細胞をＩＬ−４及びＩＬ−１３で処理したときに、発現レベルに変化を示す遺伝子を探索すれば、アレルギー反応に関連する遺伝子を単離することができるのではないかと考えた。同様のアプローチにより、ＩＬ−４やＩＬ−１３の処理によって発現レベルが変化する遺伝子の単離を試みた報告もある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０００，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｍａｙ  １２−１６，２０００）。しかし公知の探索方法においては、解析に用いた細胞のロット数が少ない上、発現レベルの変化の幅が明らかでないので、ＩＬ−４やＩＬ−１３の刺激に対する特異性が期待できない。
そこで本発明者らは、ＩＬ−４やＩＬ−１３の刺激に対してより特異的に応答する遺伝子を単離するために、解析の対象とする細胞のロット数を増やし、更に発現レベルの変動が２倍以上に及ぶものを選択した。次にこうして選択された遺伝子の、ＩＬ−４やＩＬ−１３で刺激した気道上皮細胞における発現レベルが有意に上昇することを確認した。以上のような知見に基づいて、本発明者らは、カテプシンＣ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｃ）のオータナティブスプライシングフォームが、アレルギー性疾患と密接な関連を有することを明らかにした。
以上の知見に基づいて本発明者らは、カテプシンＣのオータナティブスプライシングフォーム、並びにその塩基配列によってコードされる蛋白質を指標とすることによって、アレルギー性疾患の検査が可能となることを見出し本発明を完成した。また本発明者らは、これらの遺伝子の発現レベル、あるいはこれらの遺伝子によってコードされる蛋白質の活性を指標とすることによって、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の検査方法、並びにスクリーニング方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法。
ａ）被検者の生体試料における、配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）健常者の生体試料における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
〔２〕アレルギー性疾患が気管支喘息である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕配列番号：２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列から選択された少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔６〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列から選択される連続する少なくとも７アミノ酸残基からなり、かつＮ末端から１０７位〜１３７位のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔７〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（１）配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子、および／またはこれらの遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔８〕細胞が株化気道上皮細胞である〔７〕に記載の方法。
〔９〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子、および／またはこの遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）候補化合物を投与しない対照と比較して前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１０〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（１）配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子によってコードされる蛋白質、および／またはこの蛋白質と機能的に同等な蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕〔７〕、〔９〕、および〔１０〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１２〕配列番号：２３に記載の塩基配列を含む遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１３〕配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキット。
〔１４〕配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体と、配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキット。
〔１５〕配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子、および／またはこの遺伝子と機能的に同等な遺伝子の気道上皮細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用。
また本発明は、〔７〕、〔９〕、および〔１０〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法に関する。あるいは本発明は、〔７〕、〔９〕、および〔１０〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物の、アレルギー性疾患の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。更に本発明は、以下に記載の成分（ａ）または（ｂ）を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法に関する。あるいは本発明は、以下に記載の成分（ａ）または（ｂ）の、アレルギー性疾患の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
（ａ）配列番号：２３に記載の塩基配列を含む遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。喘息は、アトピー性疾患のうち、特に呼吸器症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、被検者の生体試料におけるカテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームの発現レベルを測定し、健常者の測定値と比較する工程を含む。両者の比較の結果、健常者よりも発現が亢進している場合には、被検者がアレルギー性疾患であると判定される。発現レベルの比較のためには、通常、たとえば健常者における前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、標準値が設定される。この標準値をもとに、たとえば±２Ｓ．Ｄ．の範囲が許容範囲とされる。指標遺伝子の測定値に基づいて、標準値や許容範囲を設定する手法は公知である。被検者における指標遺伝子の発現レベルが許容範囲よりも高ければ、その被検者はアレルギー性疾患を有すると判定される。またその発現レベルが許容範囲内であれば、アレルギー性疾患を有する可能性は低いと予想される。
本発明において、アレルギー性疾患の指標とすることができるカテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームを単に指標遺伝子と言う場合もある。
なおカテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームに相当する塩基配列配列を有する遺伝子がヒト組織に発現していることは、既に公知である。たとえば、カテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームに一致する塩基配列を有する遺伝子が、がんに関連する遺伝子として選択されている（ＷＯ９９／３８９７２）。また、カテプシンＣのホモログが単球およびマクロファージ疾患の診断薬や治療薬として有用であることが示されている。あるいは、ＩＩ型コラーゲンの治療薬や診断薬としての使用も報告されている。しかし、カテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームが、ＩＬ−４やＩＬ−１３に応答して気道上皮細胞で発現が増強することは知られていない。
更に、本発明者らの知見によれば、カテプシンＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ８７２１２）の発現レベルは、ＩＬ−４やＩＬ−１３で処理した気道上皮細胞において有意に上昇している。なおカテプシンＣの存在は既に知られているが、アレルギー性疾患との関連性については報告が無い。一方、本発明において指標遺伝子として選択されたカテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームは、カテプシンＣに比べると約２０倍高い発現レベルを示す。したがって、本発明の指標遺伝子は、たとえばカテプシンＣよりも、高い感度を期待できる。あるいは、指標とする遺伝子の発現レベルそのものが高いために、様々な測定技術を応用することができる。
本発明に基づくアレルギーの検査方法において、発現レベルや活性を測定する対象となる指標遺伝子は、カテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームである。本発明によるアレルギーの検査方法には、本発明の指標遺伝子以外のアレルギー性疾患の指標とすることができる遺伝子を組み合わせることもできる。たとえば本出願人は、アレルギーの検査方法に利用することができる次のような遺伝子を報告している。
花粉症関連遺伝子３７３（ＷＯ００／６５０４６）  花粉症関連遺伝子６２７（ＷＯ００／６５０５１）  花粉症関連遺伝子４１９（ＷＯ００／６５０４５）
花粉症関連遺伝子４４１（ＷＯ００／７３４３５）  花粉症関連遺伝子５１３（ＷＯ００／６５０４９）  花粉症関連遺伝子４６５（ＷＯ００／７３４３９）
花粉症関連遺伝子５８１（ＷＯ００／６５０４８）  花粉症関連遺伝子７８７（ＷＯ００／７３４４０）  花粉症関連遺伝子７９５（ＷＯ００／６５０５０）
これらの遺伝子は、いずれも本発明の検査方法に組み合わせることができる。あるいはその他の、アレルギー性疾患の指標とすることができる遺伝子を用いることもできる。複数の遺伝子を指標とすることによって、検査精度を高めることができる。気管支喘息患者は、ヘテロジーニアス（不均一）な集団なので、複数の遺伝子を指標とすることにより、より確実な診断を行うことができる。
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。したがって本発明によるアレルギー性疾患の検査方法は、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは前記遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、たとえばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、前記指標遺伝子の塩基配列に基づいて設定することができる。本発明者らが明らかにした前記指標遺伝子の塩基配列を配列番号：１に示す。先に述べたように、カテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームの存在は既に報告されている。しかし、ＷＯ９９／３８９７２において明らかにされている、カテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームの公知の塩基配列は、一部に未決定の塩基を含む不完全なものである。一方、本発明者らは、この遺伝子の塩基配列をより完全な形で解析した。
なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やオータナティブスプライシングによって塩基配列に変異を含む遺伝子であっても、前記指標遺伝子と同様の活性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。
プライマーあるいはプローブには、配列番号：２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
本発明の指標遺伝子を特異的に認識するには、指標遺伝子に特異的に存在する塩基配列を認識するポリヌクレオチドが重要である。配列番号：２３に、指標遺伝子に特有の塩基配列を示した。本発明において、配列番号：１に示す指標遺伝子中、配列番号：２３に示す塩基配列からなる領域、並びにその相補鎖を、「特異領域」と言うことがある。本発明において、指標遺伝子を構成する配列番号：２３に示す塩基配列からなる領域を認識するポリヌクレオチドには、以下のようなポリヌクレオチドが含まれる。
まず、配列番号：２３に記載された塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖、すなわち特異領域に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。
次に、配列番号：２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列から選択された塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドは、本発明の指標遺伝子に特有の塩基配列からなる領域と、カテプシンＣと共有する塩基配列からなる領域からなる境界領域に対してハイブリダイズすることができる。一方カテプシンＣをコードするポリヌクレオチドにおいては、このようなポリヌクレオチドがハイブリダイズに利用できるのは、オータナティブスプライシングフォームと共有する領域のみである。したがって、少なくともストリンジェントな条件下においては、結局、指標遺伝子にしかハイブリダイズすることはできないから、共有領域に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドであっても、指標遺伝子の検出に用いることは可能である。特にプライマーとして用いる場合には、その３’末端の少なくとも１塩基が、特異領域に位置するようにすることにより、指標遺伝子に特異的なプライマーとすることができる。
なおプローブやプライマーが、カテプシンＣとの間で共有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を含む場合には、その構成塩基数を１５塩基より少なくするのが望ましい。より具体的には、１４以下、通常１０以下、望ましくは８以下、より望ましくは７以下、更に望ましくは５以下となるようにする。
このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ  ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ  ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ  ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ  ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ  ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｚｉｎｎ  Ｋ，Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ  ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端を互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。以下、本明細書において、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を指標蛋白質と記載する。このような検査方法としては、例えば、これら指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いる前記指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。特に配列番号：２に記載のアミノ酸配列から選択される連続する少なくとも７アミノ酸残基からなり、かつそのＮ末端から１０７位〜１３７位のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体は、指標蛋白質の特異的な検出を可能とする抗体として有用である。配列番号：２に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１０７位〜１３７位の領域は、前記特異領域を含む塩基配列によってコードされるアミノ酸配列に相当する。つまり、指標蛋白質に特異的なアミノ酸配列と言うことができる。
本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、各蛋白質が備える生物学的な活性を言う。前記指標蛋白質の活性の検出は、公知の方法に基づいて行うことができる。
本発明の検査方法においては、通常、被検者の生体試料を試料とする。生体試料としては、気道上皮細胞等を用いることができる。気道上皮細胞を得る方法は公知である。すなわち、気管支鏡下において、かんしを用いて物理的に剥離させ採取することができる。得られた試料は、凍結させたり、ホルマリン固定させたり、培地に入れて培養することによって調製できる。また本発明における生体試料としては、血液、喀痰、鼻粘膜分泌物、気管支肺胞洗浄液、肺擦か細胞などを用いることもできる。これらの生体試料の採取方法についても、公知である。
生体試料が気道上皮細胞等の細胞である場合には、ライセートを調製すれば、前記蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。また指標蛋白質が血中に分泌されていれば、被検者の血液や血清などの体液試料に含まれる目的とする蛋白質の量を測定することによって、それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。血液、鼻粘膜分泌物、並びに気管支肺胞洗浄液のような液状の生体試料においては、必要に応じて緩衝液等で希釈して蛋白質や遺伝子の測定のための試料とすることができる。
ｍＲＮＡを測定する場合には、気道上皮細胞における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、気道上皮細胞に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例としては、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ等を挙げることができる。
本発明における指標遺伝子は、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３で刺激された複数の気道上皮細胞株において発現量の増加を示した。従って、指標遺伝子の発現レベルを指標として、気管支喘息などのアレルギー性疾患の検査を行うことができる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。気管支喘息の症状を示しながら、一般的な検査ではアレルギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えばアレルギー性疾患の患者であることが容易に判定できる。より具体的には、アレルギー性疾患が疑われる症状を示す患者における指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアレルギー性疾患である可能性が高いことを示している。気管支喘息には、アレルギー反応が原因となっているものと、そうでないものがある。両者の治療方法はまったく異なるので、いずれの原因によって気管支喘息の症状がもたらされているのかを診断することは、治療上、たいへん重要な工程である。本発明の検査方法は、気管支喘息の原因の特定において、きわめて重要な情報を提供することができる。
あるいは、アレルギー症状が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。本発明の指標遺伝子は、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３で刺激された気道上皮細胞で発現量の増加を示した。気道上皮組織は気管支喘息において、顕著な病変を示す組識である。したがって、アレルギー反応を強力に誘導するサイトカインであるＩＬ−４あるいはＩＬ−１３で刺激された気道上皮細胞において発現が変動する遺伝子は、治療効果の判定に有用である。より具体的には、アレルギー性疾患と診断された患者における指標遺伝子の発現の上昇は、アレルギーの症状が進行している可能性が高いことを示している。
また本発明は、指標遺伝子の気道上皮細胞における発現レベルを上昇させたトランスジェニック非ヒト動物のアレルギー性疾患モデル動物としての使用に関する。アレルギー性疾患モデル動物は、気管支喘息における生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギー性の気管支喘息の治療薬の評価に有用である。
本発明によって、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の刺激によって気道上皮細胞における前記指標遺伝子の発現レベルが、上昇することが明らかとなった。したがって、気道上皮細胞においてこれら遺伝子、またはこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として利用することができる。なお気道上皮細胞における発現レベルの上昇とは、気道組織全体における標的遺伝子の発現レベルの上昇を含む。すなわち、前記遺伝子の発現レベルを上昇させるのは気道上皮のみである場合のみならず、気道組織全体において、あるいは全身性に前記遺伝子の発現レベルが上昇している場合を含む。
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、各指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。たとえば本発明者らは、本発明の遺伝子のマウスにおけるカウンターパートの単離に成功している。この遺伝子は配列番号：２６の塩基配列を有し、配列番号：２７のアミノ酸配列をコードしている。ヒトとマウス塩基配列は、約７３％の相同性を示した（図８）。また、ヒトとマウスのアミノ酸配列は、約７８％の相同性を示した（図９）。したがって、配列番号：１に記載の塩基配列と７３％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子は、本発明における機能的に同等な遺伝子として望ましい。あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７８％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子は、本発明における機能的に同等な遺伝子として望ましい。
ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の刺激によって発現が増加する遺伝子は、これらのサイトカインによるシグナル伝達の経路上にある遺伝子と言うことができる。言いかえれば、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の刺激が、これらの遺伝子の発現の増強を通じて、アレルギー症状となって現われていると考えられる。つまり、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の刺激によって発現が増加する遺伝子は、気道上皮におけるアレルギーの病態形成において重要な役割を果たす遺伝子と言える。したがって、この遺伝子の発現を抑制したり、あるいは活性を阻害する薬剤は、アレルギーの治療において、単にアレルギー症状を改善するのみならず、アレルギーの病態形成の本質的な原因を取り除く作用が期待できる。
以上のように、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３で刺激した気道上皮細胞において発現が増加する遺伝子には重要な意味がある。そのため、この遺伝子の発現レベルを上昇させることによって得ることができるトランスジェニック動物をアレルギー性疾患モデル動物として使用し、遺伝子の役割や、遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。
また本発明によるアレルギー性疾患モデル動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。
たとえば本発明によるアレルギー疾患モデル動物が気管支喘息を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは宿主が備える遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すような定量的なＰＣＲにより確認することができる。また翻訳産物であるタンパク質の活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、目的とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この他のトランスジェニック動物には、たとえば遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域に変異を導入することにより、本発明の遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．ＬａｖｉｔｒａｎｏｅｔらＣｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
本発明のアレルギー性疾患モデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
更に本発明は、アレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明において、指標遺伝子は、いずれもＩＬ−４あるいはＩＬ−１３で刺激した気道上皮細胞において有意に発現レベルが上昇している。したがって、これらの遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して阻害的に作用する作用を持つ化合物である。
本発明のアレルギー性疾患治療侯補化合物のスクリーニング方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行なうこともｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。なお本発明のスクリーニング方法における指標遺伝子とは、先に指標遺伝子として挙げたものに加え、それらの遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を含む。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を投与しない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、アレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。アレルギー性疾患モデル動物は公知である。たとえばヒトの喘息に近いモデルとして、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた卵白アルブミン（以下ＯＶＡ）抗原暴露喘息モデルが報告されている。このマウスにＯＶＡとアジュバントである水酸化アルミニウムをＤａｙ０と１０に２回腹腔内に免疫し、その１０日後から４日ごとに３回ＯＶＡをネブライザーにてマウスに吸入させる。最終抗原吸入後のマウスの気道過敏性が上昇することから喘息と酷似した症状を誘発することができる。このようなモデル動物に候補化合物を投与し、本発明の指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによって本発明によるスクリーニングを実施することができる。
このようにして被験動物に薬剤候補化合物を投与し、被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出することができる。被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの検出の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを候補化合物を投与しない対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。生体試料としては、平滑筋細胞、角化細胞、鼻粘膜上皮細胞、腸上皮細胞、リンパ球、マスト細胞、好酸球、好塩基球、あるいは好中球等を利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の抑制、
指標遺伝子の転写活性の低下、
指標遺伝子の転写産物の分解の促進等、
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、これら遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明において、指標遺伝子を発現する細胞は、指標遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
指標遺伝子を発現する細胞として、ヒトの呼吸器組織から樹立された細胞株を用いることができる。たとえば、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９やヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂは、本発明のスクリーニング方法に好適である。これらの細胞は、ＡＴＣＣより購入することができる。
本発明のスクリーニングの方法は、まず前記細胞株に候補化合物を添加する。その後、該細胞株における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患治療候補化合物のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がカテプシンＣのオータナティブスプライシングフォーム、またはカテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームと機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
本発明における指標蛋白質であるカテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームが有する活性は既に述べた。この活性を指標として、その活性を促進する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、カテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームの働きを抑制する。その結果、気道上皮細胞において発現が誘導された指標蛋白質の活性阻害を通じて、アレルギー性疾患を制御することができる。
これらスクリーニングに用いる被検候補化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。あるいは、配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子の発現を抑制することができる、アンチセンスＤＮＡも、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。更に、配列番号：１に記載の塩基配列によってコードされる蛋白質を認識する抗体が、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。
配列番号：１に記載の塩基配列を含む遺伝子は、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３で刺激した気道上皮細胞において有意に発現レベルが上昇している遺伝子である。したがって、これらの遺伝子の発現の抑制、あるいはこれらの遺伝子によってコードされる蛋白質の機能を抑制することによって、アレルギー疾患の治療効果を期待することができる。
本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
あるいはアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー疾患患者のＴ細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。Ｔ細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ、あるいはｅｘ  ｖｉｖｏで行う方法が公知である。。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］ＤＮＡマイクロアレイを使った候補遺伝子の選択
１．正常ヒト気管支上皮細胞の培養とＩＬ−４あるいはＩＬ−１３刺激
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社より販売している正常ヒト気管支上皮細胞を３ロット購入した（８Ｆ１７５６，８Ｆ１５４８，８Ｆ１８０５）。１バイヤル中に入っている５ｘ１０５細胞を未刺激、ＩＬ−４刺激、ＩＬ−１３刺激用に３等分し（１．６７ｘ１０５／７５ｃｍ２ｆｌａｓｋ）、ＳＡＢＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）にて培地交換しながら約８−１０日間培養した。その際に培地にＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，ｈＥＧＦ，Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｉｎｓｕｌｉｎ，Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ，ＢＳＡ−ＦＡＦ，Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ，ＧＡ−１０００（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ／Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ−Ｂ）を添付のプロトコールに従い添加した。
細胞はサイトカイン刺激前に、ＰＢＳで洗浄後、添加因子を除いたＳＡＢＭに交換した。そこにＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−１３（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し（両者ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、２４時間培養した。経時変化（０，６，１２，２４，４８時間）を観察する場合も同様に行った。
２．正常ヒト気管支上皮細胞の他のサイトカイン刺激
ロット８Ｆ１５４８の細胞を用い、１と同様に培養した。ＩＬ−４やＩＬ−１３に代えて、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−９（すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を加え、２４時間培養した。
３．ＧｅｎｅＣｈｉｐ用ＲＮＡの調製
上記のように処理した気道上皮細胞をＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に溶解し、この溶液から、Ｉｓｏｇｅｎに添付されているプロトコルに従ってＲＮＡを分離した。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全ＲＮＡを回収した。
４．ＧｅｎｅＣｈｉｐ用のｃＤＮＡ合成
ｌｏｔ  ８Ｆ１７５６の細胞より調製した全ＲＮＡ  ５μｇから、Ｔ７−（ｄＴ）２４（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）をプライマーとして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌの方法に従いＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて逆転写し１本鎖ｃＤＮＡを作製した。Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーは、以下のようにＴ７プロモーターの塩基配列にｄ（Ｔ）２４を付加した塩基配列からなる。
2002088349.tif 000002
次に、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌに従い、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ，ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ及びＲＮａｓｅ  Ｈを加え、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出後、Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌｓに通し、エタノール沈澱し精製した。
さらに、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用い、ビオチンラベルしたｃＲＮＡを合成した。ＲＮｅａｓｙ  Ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＲＮＡを精製し、熱処理により断片化した。
そのうち１２．５μｇのｃＲＮＡをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌに従いＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌに加えた。これをアレイＨｕ３５Ｋ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に入れ、４５℃１６時間ハイブリダイゼーションした。
アレイを洗浄した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、ｎｏｒｍａｌヤギＩｇＧとビオチン化ヤギＩｇＧの抗体混合液をアレイに加えた。さらに、蛍光強度を増強する目的で、再度Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、スキャナーにセットし、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにて解析した。
５．ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析ソフトであるＳｕｉｔｅを用いてデータ解析を行った。Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓで、Ａｖｅｒａｇｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（１）とＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ａｖｅｒａｇｅ（２）を調べ、（１）から（２）を引いた、未刺激、ＩＬ−４刺激、またはＩＬ−１３刺激の３つの平均を補正値（Ｓｃａｌｅ  Ｆａｃｔｏｒ）としてＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓを行った。
まず、Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓを行い１個のチップデータの解析をした。プローブセットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比較して、ｐｏｓｉｔｉｖｅとｎｅｇａｔｉｖｅを決定した。Ｐｏｓ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ，Ｌｏｇ  Ａｖｇ，Ｐｏｓ／Ｎｅｇの値から判定されるＡｂｓｏｌｕｔｅ  ＣａｌｌであるＰ（ｐｒｅｓｅｎｔ）、Ａ（ａｂｓｅｎｔ）、およびＭ（ｍａｒｇｉｎａｌ）の３区分の判定をした。
Ｐｏｓ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅなペアの割合。
Ｌｏｇ  Ａｖｇ；パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度比の対数の平均
Ｐｏｓ／Ｎｅｇ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅペア数とＮｅｇａｔｉｖｅペア数の比
また、それぞれの遺伝子において、パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度の差の平均値であるＡｖｅｒａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ）も計算した。
次に２つのデータを比較解析（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）した。未刺激とＩＬ−４刺激あるいは未刺激とＩＬ−１３刺激で比較し、発現レベルの差を以下のようにランキングした。Ｉｎｃ／Ｄｅｃ，Ｉｎｃ  Ｒａｔｉｏ，Ｄｐｏｓ−Ｄｎｅｇ  Ｒａｔｉｏ，Ｌｏｇ  Ａｖｇ  Ｒａｔｉｏ  Ｃｈａｎｇｅの値から判定されるＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ＣａｌｌであるＩ，Ｄ，ＭＩ，ＭＤ，ＮＣの５区分の判定をした。
Ｉｎｃ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激と未刺激の対応するプローブペアについてＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激の方が増加していると判定されたペア数。
Ｄｅｃ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激の方が減少していると判定されたペア数。
Ｉｎｃ／Ｄｅｃ：Ｉｎｃと判定されたペア数とＤｅｃと判定されたペア数の比。
Ｉｎｃ  Ｒａｔｉｏ：Ｉｎｃと判定されたペア数／実際に使用されたペア数。
Ｄｐｏｓ／Ｄｎｅｇ  Ｒａｔｉｏ：Ｐｏｓ  ＣｈａｎｇｅからＮｅｇ  Ｃｈａｎｇｅを引いた数と実際に使用されたペア数の比
Ｐｏｓ  Ｃｈａｎｇｅ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓでＰｏｓｉｔｉｖｅなペア数と未刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓでＰｏｓｉｔｉｖｅなペア数の差。
Ｎｅｇ  Ｃｈａｎｇｅ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓでＮｅｇａｔｉｖｅなペア数と未刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓでＮｅｇａｔｉｖｅなペア数の差
Ｌｏｇ  Ａｖｇ  Ｒａｔｉｏ  Ｃｈａｎｇｅ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激と未刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓでのＬｏｇ  Ａｖｇの差。
増加：Ｉ（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）、
減少：Ｄ（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）、
わずかに増加：ＭＩ（Ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）、
わずかに減少：ＭＤ（Ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）、および
変化無し：ＮＣ（ｎｏ  ｃｈａｎｇｅ）
また、未刺激とＩＬ−４刺激あるいは未刺激とＩＬ−１３刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ  ＡｎａｌｙｓｉｓでのＡｖｇ  Ｄｉｆｆの比であるＦｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅの値でＩＬ−４刺激、またはＩＬ−１３刺激によって発現変動（増強あるいは減少）が認められる遺伝子として選抜した。気道上皮細胞のＬｏｔ別の発現遺伝子の絞込みの結果を表１に示した。
2002088349.tif 000003
表中、「［Ｄｉｆｆ  Ｃａｌｌ］で増加或は減少」とは、ＩＬ−４刺激、またはＩＬ−１３刺激によって発現レベルに差が見られた遺伝子の数を示す。発現レベルに差が見られた遺伝子には、前記ランキングにおいて、わずかに増加（またはわずかに減少）と判定された遺伝子を含む。各ロットごとに、ＩＬ−４とＩＬ−１３の両方に共通して差が見られた遺伝子の数を、「変動共通遺伝子」として示した。更に、「［Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ］」として、２倍以上の増減（＞２または＜−２）、および３倍以上の増減（＞３または＜−３）が見られた遺伝子の数をそれぞれ示した。
その結果、２７遺伝子がＩＬ−４及びＩＬ−１３刺激によって共通してＦｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅが３倍以上、または１／３倍以下に変動する遺伝子であった。その中で、ＩＬ−４及びＩＬ−１３刺激によって共通でも最も発現上昇の見られる配列としてＨｕ３５Ｋ  ｓｕｂｓｅｔ  Ｂのチップ上にＥＳＴとして報告されているａａ０１１３０５配列が選抜された。
６．遺伝子の解析
ａａ０１１３０５の配列内にＡＢＩ７７００による定量用のプライマーセット（ａａＦ／配列番号：４とａａＲ／配列番号：５）およびＴａｑＭａｎＰｒｏｂｅを設計した。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識されている。
前述の方法で抽出した全ＲＮＡをＤＮａｓｅ（ニッポンジーン）処理した。その後、ｒａｎｄａｍ  ｈｅｘａｍｅｒ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを鋳型とした。コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成は表２に示した。
2002088349.tif 000004
また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子、およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。
βアクチン、あるいはＧＡＰＤＨ測定用のプライマーとプローブは、ＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添付のものを用いて行った。塩基配列は以下の通りである。βアクチンにより補正した各遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／５ｎｇ全ＲＮＡ）の経時的な変化を図１に、細胞ロット別の発現量の変化を図２に示す。３ロットの気道上皮細胞を用いたＩＬ−４及びＩＬ−１３刺激実験での発現変動を確認したところ、やはりはっきりとした発現の上昇が観察された。
定量的ＰＣＲの結果、実施例１で選択した遺伝子の気道上皮細胞における発現レベルは、いずれもＩＬ−４あるいはＩＬ−１３刺激によって、３つの異なる気道上皮細胞において２倍以上に上昇した。これらの結果に基づいて、気道上皮細胞では、ＩＬ−４やＩＬ−１３に応答して、これらの指標遺伝子の発現レベルが上昇することが予測された。
アレルギー反応との密接な関連が知られているＩＬ−４やＩＬ−１３の刺激によって、本発明の指標遺伝子は、異なるロットの気管支上皮細胞で共通の挙動を示す。したがって、本発明の指標遺伝子は、アレルギー反応の進行を制御する重要な遺伝子であると考えられる。
2002088349.tif 000005
次に、発現レベルの上昇が認められた配列であるａａ０１１３０５配列をＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｌａｓｔ検索したところ、カテプシンＣ遺伝子の第２イントロンに一致することが分かった。ゲノムを増幅してしまった可能性が考えられたので、ＬｏｎｇＰＣＲによる検証を行った。すなわち、ａａ０１１３０５配列内に設計したプライマー（ａａＦおよびａａＲ）と、ａａ０１１３０５配列の含まれる第２イントロンに近接するエキソン（５’側は第２エキソン，３’側は第３エキソン）内に設計したＰＣＲプライマー（３Ｆ／配列番号：１３および３Ｒ／配列番号：１４）を用い、増幅領域が各エキソンとａａ０１１３０５配列を結ぶようなｌｏｎｇ−ＰＣＲを行った。操作は次のとおりである。
すなわち、２．５ｕｎｉｔ／μｌ  ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ）、０．２μｌ、１０ｎｇ／μｌ気道上皮細胞（ＩＬ−４刺激）由来ｃＤＮＡ  ２μｌ、１０μＭ  ｐｒｉｍｅｒ各２μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  １０．８μｌを混合し、ｔｏｔａｌ  ２０μｌとした。ＡＢＩ９７００を用いて９４℃  ２ｍｉｎの後９４℃  ３０ｓｅｃ、６０℃  ２ｓｅｃ、７４℃  １ｍｉｎ×３５ｃｙｃｌｅの増幅反応を行った。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
2002088349.tif 000006
プライマーａａＦと３Ｆを用いた５’側の増幅では、プライマー同士のゲノム配列上の距離は約８ｋｂあるのにもかかわらず、２００ｂｐ程度の増幅産物が得られた。この断片をｐＣＲ２．１ｖｅｃｔｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ通常の方法によって組み込み、ＴＯＰ１０Ｆ’（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ形質転換し、その塩基配列を解析した。その結果、ａａ０１１３０５配列よりも５’側に６９ｂｐ伸長した所で第２エキソンとつながる新規の配列が得られた（配列番号：２３として示した配列の１−２０６）。この配列は第２エキソンから既知のカテプシンＣとは異なる３１アミノ酸および終止コドンを含む新規のＯＲＦをコードしており、また、伸長した６９ｂｐをａａ０１１３０５配列に付加してＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｌａｓｔ検索したところ、カテプシンＣ遺伝子の第２イントロン内で２つの領域に分断されていた。図３に本発明のオータナティブスプライシングフォームのエキソン、カテプシンＣのエキソン、並びにＤＮＡチップ上のＥＳＴであるａａ０１１３０５のゲノムにおける位置関係を模式的に示した。また本発明のオータナティブスプライシングフォームのイントロン１およびイントロン２の、エキソンとイントロンの間の塩基配列と、ＧＴ−ＡＧルールの関係を図４に示した。見出された２つの新規エキソンと隣接するイントロンの間のＧＴ−ＡＧ規則はかなりよく保存されており、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ−Ｃ遺伝子の新規なオータナティブスプライシングフォームであると考えられた。
ａａ０１１３０５配列上のプライマーａａＲと第３エキソン上に設計したプライマー３Ｒを用いたＰＣＲでは増幅は認められなかった。また、第２エキソン・第３エキソン上のプライマー（３Ｆおよび３Ｒ）を用いた場合、および第１エキソン・第７（最終）エキソン上のプライマー（２Ｆおよび２Ｒ）を用いたＰＣＲではカテプシンＣとして既知の配列以外は得られなかった。
しかし、第１エキソンの開始コドン近傍に設計したプライマー１Ｆとａａ０１１３０５配列上のプライマーａａＦでのＰＣＲでは第１エキソンから第２エキソンを経て今回見出された新規エキソンに切り替わる配列が得られた。ａａ０１１３０５配列中に終止コドンが存在することと併せて考慮すると、今回得られたオータナティブスプライシングフォームにはａａ０１１３０５配列以降のエキソンはなく、少なくとも第１エキソンの途中から第２エキソンまでは既知の配列と同一で、第２エキソンの終わりから新規の３１アミノ酸を付加したところで終結する短いペプチドをコードしていることが示唆される。
さらに、このオータナティブスプライシングフォームの５’末端と３’末端を決定するために、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）により、ＨＬ６０由来のｍＲＮＡを用いて作成されたＭａｒａｔｈｏｎ用ライブラリーを鋳型として３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥを行った。
５’ＲＡＣＥでは、キット付属のＡＰ１プライマーと５’ＲＡＣＥ１（配列番号：１８）でＰＣＲを行った。さらに、この増幅断片を鋳型にアダプター内の配列［ＡＰ２］と５’ＲＡＣＥ２（配列番号：１９）を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。一方、３’ＲＡＣＥではキット付属のＡＰ１プライマーとプライマー３’ＲＡＣＥ１（配列番号：２０）でＰＣＲを行った。さらに、この増幅断片を鋳型にアダプター内の配列［ＡＰ２］とプライマー３’ＲＡＣＥ２（配列番号：２１）を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。
2002088349.tif 000007
この結果、ａａ０１１３０５として報告されている配列の５’端がこのオータナティブスプライシングフォームの３’端であり、３’末端から１９ｂｐに存在するｐｏｌｙＡ付加シグナルを認識しているらしいことが分かった。以上の実験で得られた新規オータナティブスプライシングフォームの全長の塩基配列を配列番号：１に、このｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
［実施例２］ノーザンハイブリダイゼーション
カテプシン遺伝子及びオータナティブスプライシングフォームがｍＲＮＡとして発現していることを確認するためにノーザンハイブリダイゼーションを行った。次のプライマーセットによる増幅産物をＲＥＣＯ  Ｃｈｉｐ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて精製し、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）により３２Ｐを用いて標識しプローブとした。鋳型には、Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ実験で得た２Ｆ／２Ｒ間の塩基配列をインサートとして持つプラスミドを用いた。
既知配列のみを認識するプローブ５５２ｂｐ
2002088349.tif 000008
既知配列及びオータナティブスプライシングフォーム双方を認識するプローブ１３０１ｂｐ
2002088349.tif 000009
メンブレンは、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＨｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ  ＩＩおよびＨｕｍａｎ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔを用いた。Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて添付使用書通りにノーザンハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った。洗浄は２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを用いて室温で約４０分、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを用いて５６℃で１０分行った。一晩イメージングプレートに暴露し画像を取得した。画像はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって取得した。
既知カテプシンＣ遺伝子の第６エキソン・第７エキソン上の配列を持ち、既知カテプシンＣ遺伝子のみを認識することが期待されるプローブ（ｘ８７ｆ／２Ｒ）と、第１エキソンから第７エキソンまでの配列を持ち、既知カテプシンＣ遺伝子及び新規オータナティブスプライシングフォーム双方を認識するプローブ（２Ｆ／２Ｒ）を用いた場合は約２ｋｂのバンドが検出された。このサイズは、報告されている既知遺伝子の１．８ｋｂとほぼ一致した。また、検出されたバンドの強度は肺・腎臓・胎盤で強く、脳で弱いという過去の報告（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７２，１０２６０−１０２６５，１９９７）と同一の結果を示した。さらに、既知カテプシンＣ遺伝子および新規オータナティブスプライシングフォーム双方を認識するプローブを用いた場合にのみ、非常に弱いシグナルではあるが１ｋｂ付近にバンドが認められ、これが前述のオータナティブスプライシングフォームであることが予測された。
オータナティブスプライシングフォームのみを検出するために、本実験で新規に得られた領域（配列番号：２３）をもとにｒｉｂｏｐｒｏｂｅによるノーザンハイブリダイゼーションを行った。プローブは次のようにして調製した。まず、プライマーａａＦ（配列番号：４）とプライマー３’ＲＡＣＥ１（配列番号：２０）を用いて増幅される領域をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込んだ。鋳型には、Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ実験で得た１Ｆ／ａａＦ間の塩基配列をインサートとして持つプラスミドを用いた。次に、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒから標的配列のａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖が読まれるクローンを選択し、プラスミドを精製した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩを用いて直鎖状とし、これを鋳型として３２Ｐ−ｒＣＴＰで標識されたａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ鎖をＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて合成し、プローブとして用いた。一連の操作は、ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｐｒｏｍｅｇａ）の指示書にしたがった。
同種のメンブランを用い、５ｘＳＳＰＥ，５０％ホルムアミド、５ｘデンハルト、０．５％ＳＤＳのハイブリソリューション中、５５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。洗浄は２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを用いて室温で約４０分、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを用いて５６℃で１時間、６０℃で１時間、７０度で３０分行った。一晩イメージングプレートに暴露し画像を取得した。画像はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって取得した。
この結果、１ｋｂ付近にシグナルが見出され、このオータナティブスプライシングフォームが実際にｍＲＮＡとして存在していることが示された。また、腎臓・胎盤・リンパ節で発現が高いことが分かった（図５）。
［実施例３］指標遺伝子の発現レベルの比較
培養気道上皮細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）におけるカテプシンＣのオータナティブスプライシングフォームの発現レベルを定量的ＰＣＲにより測定し、カテプシンＣと比較した。培養細胞としては、８Ｆ１７５６、８Ｆ１５４８、および８Ｆ１８０５の３つのロットを用いた。測定方法は、６に準じた。オータナティブスプライシングフォームのためのプライマーおよびＴａｑＭａｎＰｒｏｂｅは、［実施例１］の６で用いたａａＦ（配列番号：４）およびａａＲ（配列番号：５）、およびＴａｑＭａｎＰｒｏｂｅ（配列番号：６）である。カテプシンＣ用のプライマーとＴａｑＭａｎＰｒｏｂｅの塩基配列は以下に示す。
2002088349.tif 000010
前述の方法で抽出した全ＲＮＡをＤＮａｓｅ（ニッポンジーン）処理した。その後、ｒａｎｄａｍ  ｈｅｘａｍｅｒ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを鋳型とした。コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成も［実施例１］の６で表２に示したものと同じである。
また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子、およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。
βアクチン、あるいはＧＡＰＤＨ測定用のプライマーとプローブは、ＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添付のもの（６で用いたのと同じもの）を用いて行った。ＧＡＰＤＨにより補正した各遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／５ｎｇ全ＲＮＡ）を図６に示す。
定量的ＰＣＲの結果、カテプシンＣとそのオータナティブスプライシングフォームの発現レベルは、いずれもＩＬ−４あるいはＩＬ−１３刺激によって、３つの異なる気道上皮細胞において２倍以上に上昇していた。気道上皮細胞では、ＩＬ−４やＩＬ−１３に応答して、これらの指標遺伝子の発現レベルが上昇することが予測された。しかし、両者の発現レベルは大きく相違していた。すなわち、オータナティブスプライシングフォームの発現レベルは、カテプシンＣの約２０倍に達することが明らかとなった。
アレルギー反応との密接な関連が知られているＩＬ−４やＩＬ−１３の刺激によって、本発明の指標遺伝子は、異なるロットの気管支上皮細胞で共通の挙動を示す。したがって、本発明の指標遺伝子は、アレルギー反応の進行を制御する重要な遺伝子であると考えられる。またカテプシンＣと比べてはるかに高い発現レベルを示すオータナティブスプライシングフォームは、アレルギーに関連する遺伝子の中でも、特に高感度な測定を行うことができる指標として有用である。
［実施例４］カテプシンＣオータナティブスプライシングフォームのマウスカウンターパートのクローニング
まず、既知のマウスカテプシンＣ配列（ｕ８９２６９）の第２エキソン（ＪＢＣ，ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．１６，１０６９５−１０７０３，１９９７より）上に５’側のプライマーを、また３’側にはヒトのオータナティブスプライシングフォームの配列に基づいて縮重プライマー（表３）を作成し、マウスｃＤＮＡライブラリー（肺）を鋳型としたＰＣＲを行った。
2002088349.tif 000011
得られた断片の配列を決定したところ、ヒトの場合と同位置（エキソン２の終了点）から新規配列に切り替わる配列の存在が確認された。このことからヒトと類似のオータナティブスプライシングフォームがマウスにも存在している可能性が高いと考えられたため、前述のＰＣＲで得たオータナティブスプライシングフォームの一部と思われる配列上にＲＡＣＥ用のプライマー（表３）を設計し、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてマウスｃＤＮＡライブラリー（ｌｕｎｇ）をｔｅｍｐｌａｔｅとした５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥを行った。
この結果、開始コドンから第２エキソンまではマウスで報告されているカテプシンＣと同一だが、そこから未報告の３６２ｂｐの新規配列を付加して終結するｍＲＮＡの存在が確認された。マウスカウンターパートの塩基配列を配列番号：２６に（図７）、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２７に示す。このマウスカウンターパートはヒト遺伝子の塩基配列と高い相同性を持ち（図８）、ヒトと同様に３１アミノ酸の新規ペプチド（配列番号：２８／ＤＶＴＤＦＩＳＱＬＦＭＱＬＧＴＶＧＭＹＤＬＰＨＬＲＮＫＬＶＩＫ／ヒトと異なるアミノ酸を下線で示す）を付加する。クローニングした領域中（９３ｂｐ＋ＴＡＧ）には、３つの塩基置換が見られ、一つは同義置換、残りはＨｉｓ（ヒト）→Ｇｌｎ、Ｉｌｅ（ヒト）→Ｍｅｔの非同義置換であった。また３’ＵＴＲは、ヒトの３２４ｂｐに対してマウスでは２４６ｂｐとなっていた。
産業上の利用の可能性
本発明により、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３で刺激した気道上皮細胞において発現が増加する遺伝子が見出された。ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３で刺激した気道上皮細胞において発現が高まる遺伝子は、気管支喘息におけるアレルギー症状の本質的な原因となっている可能性が高い。したがって本発明によって提供された指標遺伝子は、気管支喘息がアレルギー症状によってもたらされたものかどうかを確実に知ることができる有用な指標となる。アレルギーによってもたらされた気管支喘息を確実に診断できることにより、的確な治療方法を早期に選択することができる。
ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３は、アレルギー反応を増強する重要な因子である。したがって、これらの因子の刺激に伴って発現が増加する遺伝子は、アレルギー症状の病態形成において重要な役割を果たしていると考えられる。しかも本発明によって提供された指標遺伝子は、いずれも複数の気道上皮細胞で、明確な発現の増強が見られた。ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の刺激に伴う遺伝子の発現レベルの変動に着目した研究は初めてではない。しかし、本発明によって提供される遺伝子は、いずれも、ここで述べたような厳しいクライテリアによって見出されたアレルギー関連遺伝子である。したがって、本発明の指標遺伝子は、類似のアプローチによって得られた公知のアレルギー関連遺伝子に比べて、アレルギー反応における重要な役割を果たしている遺伝子であると考えられる。なぜなら、本発明の指標遺伝子は、異なる細胞において、常にＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の刺激に鋭敏に応答している。このことは、アレルギー反応に本発明の指標遺伝子が欠かせない存在であることを裏付けている。
このように、本発明の指標遺伝子は、いずれもその発現亢進が病態と結びついていることから、それを抑えることがアレルギー性疾患の治療戦略のターゲットとなるとともに、そのような新しい治療法におけるモニタリングのための新しい臨床診断指標としての有用性が期待できる。特に本発明の指標遺伝子は、健常者とアレルギー性疾患の患者との間で発現レベルの違いが大きい。たとえば本発明者らは、ＩＬ−４やＩＬ−１３で処理した気道上皮細胞において、カテプシンＣの発現レベルが有意に高いことを確認している。しかし本発明の指標遺伝子の発現レベルは、カテプシンＣの発現レベルに比較して約２０倍高い。したがって、本発明の指標遺伝子は、容易に高感度な測定が可能である。このように、本発明の指標遺伝子は、診断指標としての有用性が高い。
本発明によって提供された指標遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。したがって、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明によるアレルギーの検査方法は、生体試料を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。したがって本発明によるアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味でこれらの病態関連遺伝子の診断的価値は高い。
【配列表】
2002088349.tif 000012
2002088349.tif 000013
2002088349.tif 000014
2002088349.tif 000015
2002088349.tif 000016
2002088349.tif 000017
2002088349.tif 000018
2002088349.tif 000019
2002088349.tif 000020
2002088349.tif 000021
2002088349.tif 000022
2002088349.tif 000023
2002088349.tif 000024
2002088349.tif 000025
2002088349.tif 000026
2002088349.tif 000027
2002088349.tif 000028
2002088349.tif 000029
2002088349.tif 000030
2002088349.tif 000031
2002088349.tif 000032
2002088349.tif 000033
2002088349.tif 000034
2002088349.tif 000035
【図面の簡単な説明】
図１は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３で刺激した培養気管支上皮細胞における指標遺伝子の処理後から０、６、１２、２４、および４８時間後の発現レベルの経時的な変化を示したグラフである。縦軸は遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／５ｎｇ全ＲＮＡ）を、横軸は処理したサイトカインの種類と処理ごの経過時間を示す。Ｂ２−２４−ｃ〜Ｂ２−２４−ＩＬ９で示したカラムは、サイトカインとして、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−９を用いた場合の、処理２４時間後の測定結果である。カラムは左から順に、生データ、β−アクチン補正値、およびＧＡＰＤＨ補正値を示している。
図２は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３で刺激した培養気管支上皮細胞における指標遺伝子の発現レベルを細胞ロットごとに測定した結果を示すグラフ。縦軸は遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／５ｎｇ全ＲＮＡ）を、横軸は細胞のロットと処理したサイトカインの種類を示す。カラムは左から順に、生データ、β−アクチン補正値、およびＧＡＰＤＨ補正値を示している。
図３は、本発明のオータナティブスプライシングフォームのエキソン、カテプシンＣのエキソン、並びにＤＮＡチップ上のＥＳＴであるａａ０１１３０５のゲノムにおける位置関係を模式的に示した図。
図４は、本発明のオータナティブスプライシングフォームのイントロン１およびイントロン２の、エキソンとイントロンの間の塩基配列と、ＧＴ−ＡＧルールの関係を示ず図。
図５は、ｒｉｂｏｐｒｏｂｅによるノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真。
図６は、カテプシンＣ、およびそのオータナティブスプライシングフォームの、培養細胞における発現レベル（ＧＡＰＤＨ補正値）の測定結果を示すグラフ。
図７は、カテプシンＣオータナティブスプライシングフォームのマウスカウンターパート全長配列を表す図である。開始コドン、終始コドン、ｐｏｌｙＡ付加シグナルを下線で表した。＊はエキソン２との境界を示す。
図８は、ヒトとマウスのカテプシンＣオータナティブスプライシングフォームの塩基配列を整列化した図である。ギャップは「−」で表した。▼は既知のスプライシング部位を表し、▽は新規なスプライシング部位を表し、下線はヒトのＡＡ０１１３０５のＥＳＴ配列を表す。
図９は、ヒトとマウスのアミノ酸のアライメントを表す図である。Ｂｏｘで囲った領域は、ホモロジーのある領域を表す。
【図１】
2002088349.tif 000036
【図２】
2002088349.tif 000037
【図３】
2002088349.tif 000038
【図４】
2002088349.tif 000039
【図５】
2002088349.tif 000040
【図６】
2002088349.tif 000041
【図７】
2002088349.tif 000042
【図８】
2002088349.tif 000043
【図９】
2002088349.tif 000044
【国際調査報告】
2002088349.tif 000045
2002088349.tif 000046
2002088349.tif 000047
2002088349.tif 000048