(57)【要約】エラスターゼ１に対する異なる特異性を有する２種類のモノクローナル抗体を担持した異なる粒径の２種類のラテックス粒子を含む、エラスターゼ１の免疫分析用試薬を開示する。また、エラスターゼ１に対する異なる特異性を有する２種類のモノクローナル抗体を担持した異なる粒径のラテックス粒子と被検試料とを接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集程度を分析する、エラスターゼ１の免疫分析方法を開示する。更に、前記免疫分析方法によりエラスターゼ１を分析する、膵疾患の検出方法を開示する。本発明によれば、ＲＩＡのように特別な施設を必要とすることなく簡便に、且つ短時間（例えば、１０分間）で、エラスターゼ１を分析することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスターゼ１に対する異なる特異性を有する２種類のモノクローナル抗体を担持した異なる粒径の２種類のラテックス粒子を含む、エラスターゼ１の免疫分析用試薬。
【請求項２】
エラスターゼ１に対する第１のモノクローナル抗体を担持した第１のラテックス粒子と、
前記第１モノクローナル抗体と異なる特異性を有するエラスターゼ１に対する第２のモノクローナル抗体を担持した、前記第１ラテックス粒子と異なる粒径の第２のラテックス粒子と
を含む、エラスターゼ１の免疫分析用試薬。
【請求項３】
エラスターゼ１に対する異なる特異性を有する２種類のモノクローナル抗体を担持した異なる粒径のラテックス粒子と、被検試料とを接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集程度を分析する、エラスターゼ１の免疫分析方法。
【請求項４】
エラスターゼ１に対する第１のモノクローナル抗体を担持した第１のラテックス粒子と、
前記第１モノクローナル抗体と異なる特異性を有するエラスターゼ１に対する第２のモノクローナル抗体を担持した、前記第１ラテックス粒子と異なる粒径の第２のラテックス粒子と、
被検試料と
を接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集程度を分析する、エラスターゼ１の免疫分析方法。
【請求項５】
ｐＨ６〜８．５の条件下で、ラテックス粒子と被検試料との接触を実施する、請求項３又は４に記載の免疫分析方法。
【請求項６】
請求項３又は４に記載の免疫分析方法によりエラスターゼ１を分析する、膵疾患の検出方法。
【請求項７】
請求項５に記載の免疫分析方法によりエラスターゼ１を分析する、膵疾患の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、エラスターゼ１の免疫分析用試薬及び免疫分析方法並びに膵疾患の検出方法に関する。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
背景技術
膵エラスターゼには、エラスターゼ１とエラスターゼ２とが存在する。前者のエラスターゼ１は、膵臓に存在し、血中でその９０％がα１−アンチトリプシンと結合しており、血中濃度の測定が臨床的に有用なのはエラスターゼ１の方である。エラスターゼは、白血球、血小板、及び脾などにも存在し、急性炎症などの情報となる顆粒球エラスターゼと膵エラスターゼとは免疫学的に区別される。膵エラスターゼは、血中では結合組織の弾性線維エラスチンを特異的に加水分解する膵外分泌酵素で、膵の腺房細胞にプロエラスターゼとして局在し、腸に分泌されてトリプシンより活性化される。エラスターゼ１は、膵癌（特に膵頭部）に伴う膵炎を反映して、比較的早期から高頻度に異常高値を示すことから、膵疾患の診断の指標又は経過観察に有用である。膵疾患には各種検査法が存在しており、古くから血清アミラーゼが測定されていた。しかし、アミラーゼは膵以外の臓器からも産生されるため、膵疾患の検査としては特異性に欠けていたが、エラスターゼ１は膵疾患に対する特異性が高いため、それを正確に測定することは医療現場において殊更重要である。
エラスターゼ１の測定は、その酵素活性を測定する方法が開発されたが、感度及び精度が不充分で、現在はエラスターゼ１をタンパク量として測定する免疫学的測定が汎用されており、広くＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が採用されている。具体的には、検体中のエラスターゼ１と一定量の放射性物質標識エラスターゼ１とを、エラスターゼ１抗体に対して競合的に反応させ、抗体と反応した放射能を測定する、いわゆる競合法で血中エラスターゼ１を分析している。しかし、ＲＩＡでは、低値の測定値にばらつきが大きく、測定操作が煩雑であり、長時間を要する。更に、放射線同位元素を用いるため、試薬の安定性（６０日間しか安定性がない）、放射性物質を取り扱う特殊な測定設備、及び廃棄物処理などの問題がある。また、ＲＩＡを実施可能な施設は限られているため、通常の医療施設では測定するのが困難であり、外部への検査依頼が必要であり、即日に結果を得ることができない。このため、急性膵炎の有用な診断項目でありながら、緊急検査に対応することができないという極めて大きな欠点があった。また、放射性物質に換えて酵素を標識したＥＩＡ法も提唱されているが、操作性及び迅速性の面で同様に緊急検査には不向きであり、低値における測定精度面ではＲＩＡ法より劣るという欠点を有し、実質ＲＩＡ法に置き換わる状況に至っていない。すなわち、現時点では、エラスターゼ１の測定は種々の問題を抱えつつもＲＩＡ法によって測定せざるを得ない状況であるといえる。
エラスターゼ１は膵癌等で高値を示すが、膵特異的な酵素であるため、アミラーゼに代わって慢性膵炎をモニタリングする指標としても期待されており、そのためにも低値の変動を正確に把握することができない従来法の改良が重要である。
発明の開示
本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、特別な施設を必要とすることなく簡便に、且つ緊急検査に対応し得るように短時間で分析可能であり、しかも、低濃度領域から高濃度領域まで広範囲にわたって定量的に分析可能な、エラスターゼ１の免疫分析用試薬及び免疫分析方法を提供することにある。
本発明は、エラスターゼ１に対する異なる特異性を有する２種類のモノクローナル抗体を担持した異なる粒径の２種類のラテックス粒子を含む、エラスターゼ１の免疫分析用試薬に関する。
また、本発明は、エラスターゼ１に対する異なる特異性を有する２種類のモノクローナル抗体を担持した異なる粒径のラテックス粒子と、被検試料とを接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集程度を分析する、エラスターゼ１の免疫分析方法に関する。
更に、本発明は、前記免疫分析方法によりエラスターゼ１を分析する、膵疾患の検出方法に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の免疫分析用試薬は、エラスターゼ１に対する異なる特異性を有する２種類のモノクローナル抗体を担持した異なる粒径の２種類のラテックス粒子、好ましくは、（１）エラスターゼ１に対する第１のモノクローナル抗体を担持した第１のラテックス粒子と、（２）前記第１モノクローナル抗体と異なる特異性を有するエラスターゼ１に対する第２のモノクローナル抗体を担持した、前記第１ラテックス粒子と異なる粒径の第２のラテックス粒子とを少なくとも含む。
本発明において用いるラテックス粒子は、通常の免疫分析用試薬に使用可能なラテックス粒子である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレン、又はスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体などを挙げることができる。
ラテックス粒子の平均粒径は、測定対象物の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０５〜０．５μｍであることができる。本発明では、異なる粒径のラテックス粒子を使用することにより、特に低値から高値までを正確に分析することができる。なお、本発明におけるラテックス粒子の平均粒径とは、電子顕微鏡により測定した値を意味する。
小粒径のラテックス粒子としては、例えば、０．０５〜０．３μｍのものを用いることが好ましく、０．０５〜０．２５μｍのものを用いることがより好ましい。また、大粒径のラテックス粒子としては、例えば、０．２〜０．５μｍのものを用いることが好ましく、０．２５〜０．５μｍのものを用いることがより好ましい。このような粒径のラテックス粒子を組み合わせて用いることにより、低値側の検出限界を向上させ、且つ、良好な再現性も可能とする。また、高値側では、高濃度エラスターゼ１であっても凝集能の低下による誤認（過度な高濃度によって凝集能が低下し、見かけ上凝集が減少してしまい、実際の値より少ない測定結果となってしまう、いわゆる地帯現象）を防ぐことができる。
本発明においては、ラテックスに担持させる抗エラスターゼ１抗体として、反応特異性の異なる２種類のモノクローナル抗体、すなわち、認識するエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を使用する。本発明では、特異的に結合する部位が異なる抗エラスターゼ１モノクローナル抗体である限り、特に限定されるものではない。血中のエラスターゼ１は、通常、α１−アンチトリプシンと複合体を形成しているので、本発明においては、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体に対して特異的に結合する部位が異なるモノクローナル抗体であって、ラテックス粒子に結合した場合、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体のみを凝集させることができる抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を用いることが好ましく、更には、単独（遊離）のエラスターゼ１を凝集させることがない抗エラスターゼ１モノクローナル抗体を用いることがより好ましい。
更に付言すれば、本発明における一方のモノクローナル抗体（以下、「本発明における第１のモノクローナル抗体」と称することがある）と、それと組み合わせて用いるもう一方のモノクローナル抗体（以下、「本発明における第２のモノクローナル抗体」と称することがある）とは、エピトープが異なり、しかも、両エピトープ間の距離が、ラテックス試薬として使用した際に立体障害を引き起こさない距離である必要がある。
本発明においては、２種類のモノクローナル抗体と粒径の異なる２種類のラテックス粒子とを適宜組み合わせて使用する。粒径の異なる２種類のラテックス粒子それぞれに２種類のモノクローナル抗体を担持させることもできるし、あるいは、本発明における第１のモノクローナル抗体を、粒径の異なる２種類のラテックス粒子の一方（以下、第１のラテックス粒子と称することがある）に担持させ、本発明における第２のモノクローナル抗体を、もう一方のラテックス粒子（以下、第２のラテックス粒子と称することがある）に担持させることもできる。これらの構成は、使用するラテックス粒子のサイズ、その量比、及び／又はモノクローナル抗体の特性（例えば、反応速度）等を考慮し、最も好適な条件を設定することができる。
また、大粒径のラテックス粒子と小粒径ラテックス粒子とを混合する割合は、特に限定されるものではないが、例えば、１０：１〜１：１０の範囲内で適宜選択することができる。
モノクローナル抗体を担持するラテックスは、公知方法、例えば、物理的又は化学的結合により感作させることにより、調製することができる。なお、前記抗体は、免疫グロブリン分子自体のほか、抗体断片、例えば、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２等であることができ、Ｆ（ａｂ’）２を用いることが好ましい。抗体断片ではなくＩｇＧそれ自体を、モノクローナル抗体として使用した場合には、患者検体によっては飛び値（実際のエラスターゼ１量より、極端に高い値を示すこと）現象が認められることがあり、Ｆ（ａｂ’）２を用いることにより、飛び値現象を抑制することができる。
本発明の免疫分析用試薬は、モノクローナル抗体担持ラテックス粒子以外にも、ラテックス試薬に添加可能な種々の添加剤、例えば、緩衝液、凝集促進剤（例えば、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子）、非特異的反応抑制剤（例えば、アルカリ金属塩又は糖類等）、又はタンパク質［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］等を更に含有することができる。
前記緩衝液としては、ｐＨ６〜８．５に緩衝能を有する緩衝液が好ましい。ｐＨ６〜８．５の緩衝液は、従来周知の緩衝液であり、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、又はグッド緩衝液等が挙げられる。
本発明の免疫分析用試薬において、例えば、トリス緩衝液を用いる場合には、トリス緩衝液中のトリス濃度は、それを使用する際に、ラテックス凝集反応を実施する系において、以下に説明する所定のトリス濃度を達成することができる濃度である限り、特に限定されるものではないが、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
ラテックス凝集反応を実施する系におけるトリス濃度は、ラテックス粒子の自己凝集反応を抑制することのできる濃度である限り、特に限定されるものではなく、共存する塩、タンパク質、及び／又は糖類等の添加物の濃度によって適宜選択することができる。ラテックス凝集反応を実施する系におけるトリス濃度は、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．２〜０．３ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。０．１ｍｏｌ／Ｌ未満であると、ラテックス粒子が自己凝集反応を起こすことがあり、０．５ｍｏｌ／Ｌを越えると、抗原抗体反応を抑制してしまい、検出感度が悪くなることがある。
また、緩衝液のｐＨは、６〜８．５であることが好ましい。ｐＨがこの範囲外であると、ラテックス粒子が自己凝集したり、測定精度の面で不都合が生じることがある。
本発明の免疫分析用試薬が、ｐＨ６〜８．５の緩衝液を含有する場合には、その使用時におけるラテックス凝集反応の際に、抗体を担持したそれぞれのラテックス粒子、ｐＨ６〜８．５の緩衝液、及び被検試料が接触することができる限り、免疫分析用試薬中における各モノクローナル抗体担持ラテックス粒子及びｐＨ６〜８．５の緩衝液の状態は特に限定されるものではない。すなわち、この場合、本発明の免疫分析用試薬の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、各モノクローナル抗体担持ラテックス粒子とｐＨ６〜８．５の緩衝液との両方を含む１液系の試薬であることもできるし、あるいは、各モノクローナル抗体担持ラテックス粒子を含む第１試薬と、ｐＨ６〜８．５の緩衝液である第２試薬とで構成される２液系の試薬であることもできる。
本発明の免疫分析方法では、好ましくはｐＨ６〜８．５の条件下にて、抗体を担持したそれぞれのラテックス粒子と、被検試料とを接触させることにより、抗原抗体反応及びそれによって生じるラテックス凝集反応を行わせ、その凝集程度を分析することにより、被検試料中のエラスターゼ１を分析することができる。
本発明の免疫分析方法を適用することのできる被検試料は、エラスターゼ１を含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生体試料、より具体的には、血清、血漿、尿、膵液、又は体液などを挙げることができる。
本発明の免疫分析方法において、ｐＨ６〜８．５の緩衝液を用いてｐＨ６〜８．５の条件下でラテックス凝集反応を実施する場合には、各モノクローナル抗体担持ラテックス粒子と、ｐＨ６〜８．５の緩衝液と、被検試料とを接触させる際には、ｐＨ６〜８．５の緩衝液不在下で抗原抗体反応が進行することがない（すなわち、各モノクローナル抗体担持ラテックス粒子と被検試料とを先に接触させない）限り、その接触順序は特に限定されるものではない。例えば、各モノクローナル抗体担持ラテックス粒子とｐＨ６〜８．５の緩衝液とを予め接触させておき、その混合物と被検試料とを接触させることもできるし、あるいは、被検試料とｐＨ６〜８．５の緩衝液とを予め接触させておき、その混合物と各モノクローナル抗体担持ラテックス粒子とを接触させることもできる。
本発明の免疫分析方法における抗原抗体反応の条件は、通常の免疫学的ラテックス比濁分析方法の実施条件と同様であることができる。例えば、反応のｐＨは、６〜８．５で実施することが好ましい。反応温度は０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応時間は、適宜決定することができ、例えば、汎用自動分析機では１０〜１５分間で測定を完了することができる。
抗原抗体反応により生じた凝集の程度は、公知の分析方法、例えば、光学的分析方法により分析することができる。前記光学的分析方法としては、例えば、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を分析する方法を挙げることができ、より具体的には、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて分析を行なうことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。前記光学機器を用いた分析では、公知の方法に従って、用いるラテックス粒子の大きさ及び／又は濃度の選択、並びに反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより実施することができる。また、これらの方法を併用することも可能である。
本発明による膵疾患の検出方法では、被検試料として血清又は血漿を用い、本発明の免疫分析方法により前記被検試料中のエラスターゼ１を分析することによって、膵疾患（特には急性膵炎）の検出（診断）を行なうことができる。すなわち、血清又は血漿中のエラスターゼ１量が４００ｎｇ／ｄＬ以上であれば、膵疾患（特には急性膵炎）であると判定することができる。
従来の膵疾患マーカーに比べ、エラスターゼ１を測定することには意義がある。例えば、急患ではなく腹痛を自覚後、数日を経て来院の場合、従来のマーカーであるアミラーゼやリパーゼを測っても既に正常化しているケースが多い。一方、エラスターゼ１は血中での生物学的半減期がかなり長いので、前記来院時にエラスターゼ１が異常値であれば、少なくとも数日前に膵（膵管）異常があった証拠（ｌａｔｅ  ｍａｒｋｅｒ）であり、膵ガンの可能性を含め、更に精密な検査、診療、及び治療が必要となる。すなわち、急性症状沈静後に正常値まで落ちる時間は、アミラーゼやリパーゼに比べて、エラスターゼ１が早くて１週間、長ければ１ヶ月と長く（アミラーゼ又はリパーゼは数日）、この点においても、迅速、簡便、及び高感度にエラスターゼ１を測定することができる本発明の有用性は極めて高いものである。
例えば、急性膵炎の有無を見極めるためには、前記濃度（４００ｎｇ／ｄＬ）付近を正確に測定する必要があり、ＥＩＡ法ではこの濃度を正確に測定することは不可能であり、従来はＲＩＡ法しか選択肢が無かった。しかし、ＲＩＡ法においても当該濃度域では測定精度（再現性）が不充分であった。本発明方法はこれらを全て解決することができ、ラテックス法であるが故にエラスターゼ１を広範囲濃度で正確に測定でき、膵疾患を的確に診断しうるという格別なる効果を有するものである。
また、本発明により、更に低値のエラスターゼ１を正確に測定することができるようになったことで、膵特異的とはいえなかったアミラーゼの測定に頼らざるを得なかった慢性膵炎のモニタリングを、より正確に行なうことも可能となり、膵疾患を広く判断することができる。従来技術では正確に測定できなかったエラスターゼ１の低値から高値までを、本発明では検体の希釈や添加量の増加といった余分な操作をすることなく、簡便且つ短時間に測定することができるようになった。このことは、臨床検査の分野に対し、その効果は計り知れないほど高いものである。
以上のように、本発明によるラテックス凝集反応系でエラスターゼ１を測定する試薬は初めてであり、ラテックス凝集試薬を適用して正確にエラスターゼ１を測定することで、膵疾患の診断がより正確に把握できるようになる。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：本発明の免疫分析用試薬（２液系）の調製
本実施例では、２液系の試薬、すなわち、ｐＨ６〜８．５の緩衝液からなる第１試薬と、第１モノクローナル抗体担持第１ラテックス粒子及び第２モノクローナル抗体担持第２ラテックス粒子からなる第２試薬とから構成される本発明の免疫分析用試薬を調製した。
（１）抗エラスターゼ１モノクローナル抗体の調製
免疫原として、エラスターゼ１を使用し、スクリーニング用抗原として、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体、及びエラスターゼ１を用いること以外は、常法に従って、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体を認識することのできる抗体を産生するハイブリドーマを選択した。更に、その中から、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体のみとラテックス凝集反応することのできる抗体を選択し、免疫分析試薬用のＦ（ａｂ’）２抗エラスターゼ１抗体を調製した。
操作の詳細は以下のとおりである。
すなわち、エラスターゼ１の免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝１．０）を等量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混和し、その混合液０．１ｍＬをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった（第１回免疫）。３０日経過後、そのマウスに前記と同様の方法で腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から、２１日経過後、エラスターゼ１免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝１．０）を等量の生理的食塩水で希釈し、その希釈液０．１ｍＬをマウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４約２×１０７個に１×１０８個の上記脾臓細胞を加え、４０％ポリエチレングリコール４０００存在下で細胞融合を行なった。９６穴細胞培養ウェルに各０．１ｍＬずつを分注し、ＨＡＴ培地で２週間培養した後、培養上清中の抗体を検定した。抗体産生ハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングを行ない、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体と反応する抗体産生株を８クローン得た。なお、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体は、それぞれの溶液を３７℃で３時間混和し、４℃で一晩放置することで調製した。
得られた各ハイブリドーマ１×１０７個を、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させ、抗エラスターゼ１抗体をそれぞれ得た。これら各モノクローナル抗体をポリスチレンラテックス粒子に担持し、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体とのみ凝集反応する抗体として、２種類の抗エラスターゼ１抗体Ｅ１及びＥ４を選択した。得られた各モノクローナル抗体に、２．５％ペプシンを加え、３７℃の孵卵器中で１６時間消化反応を行なった。その後、トリス溶液でｐＨを８に上げて消化反応を止め、セファクリルＳ−２００カラムを用いたゲルろ過により、抗体Ｆ（ａｂ’）２分画をプールした。
なお、免疫原として、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体を用いることもできる。
（２）抗エラスターゼ１モノクローナル抗体感作ラテックス液の調製
前記実施例１（１）で調製した抗エラスターゼ１抗体Ｅ１のＦ（ａｂ’）２分画を０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した液９ｍＬに、平均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％）１ｍＬを添加し、室温にて６０分間攪拌した。次いで、この液にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．５重量％を含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、室温にて６０分間攪拌した後、この混合液を２００００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗エラスターゼ１抗体（Ｅ１）感作ラテックス液を調製した。
抗体として、前記実施例１（１）で調製した抗エラスターゼ１抗体Ｅ４のＦ（ａｂ’）２分画を用いたこと、そして、ポリスチレンラテックスとして、平均粒径０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％）を用いたこと以外は、前記操作を繰り返すことにより、抗エラスターゼ１抗体（Ｅ４）感作ラテックス液を調製した。この２種類のラテックス液を混合し、７００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）が約２になるようにトリス緩衝液で希釈し、抗エラスターゼ１モノクローナル抗体感作ラテックス液とした。
（３）トリス緩衝液の調製
０．２ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液に、ＢＳＡを５．０量％の濃度になるように溶解した後、ｐＨを８．２に調整した。
比較例１：比較用免疫分析用試薬の調製
抗体として、前記実施例１（１）で調製した抗エラスターゼ１抗体Ｅ４のＦ（ａｂ’）２分画を用いたこと以外は、前記実施例１（２）に記載の抗エラスターゼ１抗体（Ｅ１）感作ラテックス液の調製操作を繰り返すことにより、抗エラスターゼ１抗体（Ｆ４）感作ラテックス液を調製した。このラテックス液（ラテックス粒径＝０．２μｍ）と、前記実施例１（２）で調製した抗エラスターゼ１抗体（Ｅ１）感作ラテックス液（ラテックス粒径＝０．２μｍ）とを混合し、７００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）が約２になるようにトリス緩衝液で希釈し、ラテックス粒径が１種類の抗エラスターゼ１モノクローナル抗体感作ラテックス液とした。
また、トリス緩衝液としては、前記実施例１（３）で調製したものを使用した。
評価
（１）ＲＩＡ法と本発明の免疫分析方法との相関性の確認
ＲＩＡ法によりエラスターゼ１含量を予め測定しておいたヒト血清及び血漿８０サンプルについて、実施例１で調製した本発明の免疫分析用試薬を用いて、以下に説明する手順に従って、エラスターゼ１含量を測定した。
すなわち、各ヒト血清及び血漿５μＬに、実施例１（３）で調製したトリス緩衝液１９５μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例１（２）で調製した抗エラスターゼ１モノクローナル抗体感作ラテックス液６５μｌを添加攪拌し、この後、５分後の波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行なった。
なお、ＲＩＡ法は、以下の手順で実施した。すなわち、各ヒト血清及び血漿１００μＬに、ヨウ化エラスターゼ１液１００μＬ及び第１抗体（抗ヒトエラスターゼ１ウサギ抗体）１００μＬを加えた。３７℃で３時間インキュベートした後、更に、前記第１抗体に特異的に反応する第２抗体（抗ウサギＩｇＧヤギ抗体）５００μＬを加え、混和した。室温で２０分間遠心分離（１５００〜２２００Ｇ）を行ない、上清を除去した後、沈殿の放射能を測定することにより、エラスターゼ１含量を決定した。
結果を図１に示す。相関式として、式（１）：
ｙ＝１．０６３９ｘ−１２９．２９                （１）
が得られ、Ｒ２値（Ｒ：相関係数）として０．９６７４が得られた。この結果から明らかなように、ＲＩＡ法と本発明の免疫分析方法とは良好な相関性を示した。
（２）本発明の免疫分析方法における最小検出感度（実効感度）の確認
エラスターゼ１抗原を１００ｎｇ／ｄＬ濃度で含むヒト血清を、標準エラスターゼ１抗原液として使用した。この標準エラスターゼ１抗原液を、０ｎｇ／ｄＬ、１０ｎｇ／ｄＬ、２０ｎｇ／ｄＬ、３０ｎｇ／ｄＬ、４０ｎｇ／ｄＬ、５０ｎｇ／ｄＬ、６０ｎｇ／ｄＬ、７０ｎｇ／ｄＬ、８０ｎｇ／ｄＬ、及び９０ｎｇ／ｄＬとなるように希釈し、各希釈濃度につき１０回ずつ、エラスターゼ１濃度を測定した。なお、測定は、ヒト血清１０μＬの代わりに各希釈液１０μＬを使用したこと以外は、評価欄（１）に記載の操作に基づいて実施した。
各希釈液における、エラスターゼ１濃度の１０回の測定値の平均値（単位＝ｎｇ／ｄＬ）を図２に、前記測定値から算出した変動係数（ＣＶ；単位＝％）を図３に示す。なお、図２には、前記平均値に、標準偏差（ＳＤ）を２．６倍した値を、それぞれ加えた値及び引いた値、すなわち、「平均値±（２．６×ＳＤ）」の値を同時に示す。図２に示す各縦棒の上端、中央部、及び下端に位置する各横棒は、それぞれ、「平均値＋（２．６×ＳＤ）」、「平均値」、及び「平均値−（２．６×ＳＤ）」を表わす。
一般に、最小検出感度（測定下限）は、エラスターゼ１を含まない対照液の「平均値±（２．６×ＳＤ）」の範囲と、「平均値±（２．６×ＳＤ）」の範囲とが重ならない［すなわち、対照液の「平均値＋（２．６×ＳＤ）」の値よりも、「平均値−（２．６×ＳＤ）」の値が大きくなる］最小濃度から設定することができる。図２に示すように、実施例１で調製した本発明の免疫分析用試薬の最小検出感度（測定下限）は、３０ｎｇ／ｄＬであることが判明した。
（３）本発明の免疫分析方法における同時再現性の確認
エラスターゼ１含量の異なる３種類の実検体を用いて、本発明の免疫分析方法により、各実検体毎にエラスターゼ１濃度を測定した。
また、比較のために、前記比較例１で調製した比較用免疫分析用試薬を用いて、各実検体毎にエラスターゼ１濃度を測定した。更に、後述の比較例２に示す手順に従って、ＥＩＡ法によっても、各実検体毎にエラスターゼ１濃度を測定した。
結果を、各実検体毎に表１〜表３に示す。表１〜表３において、最上列の「実施例１」、「比較例１」、及び「比較例２」は、それぞれ、実施例１で調製した本発明の免疫分析用試薬を用いた結果、比較例１で調製した比較用免疫分析用試薬を用いた結果、及びＥＩＡ法により測定した結果であることを示す。また、表１に示す結果は、エラスターゼ１濃度が約９０ｎｇ／ｄＬの実検体の結果であり、以下、同様に、表２及び表３の結果は、それぞれ、エラスターゼ１濃度が約９００ｎｇ／ｄＬ及び約２１００ｎｇ／ｄＬの実検体の結果である。
表１〜表３に示すように、本発明方法によれば、低値から高値にわたり再現性よく測定値が得られた。一方、粒径が１種類のラテックス粒子を用いたラテックス凝集法（比較例１）又はＥＩＡ法（比較例２）では、全体的に再現性が劣り、特に低値においては正確な値が得られなかった。すなわち、異なる粒径のラテックス粒子（この場合は小粒径を組み合わせる）の組み合わせでないと、広範な範囲で精度良く定量することができないことが判明した。
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（４）本発明の免疫分析方法における希釈直線性の確認
エラスターゼ１抗原を６０００ｎｇ／ｄＬ濃度で含むヒト血清を、標準エラスターゼ１抗原液として使用した。この標準エラスターゼ１抗原液を、表４に示す種々の濃度となるように希釈し、各希釈濃度につき３回ずつ、エラスターゼ１濃度を測定した。なお、測定は、ヒト血清５μＬの代わりに各希釈液５μＬを使用したこと以外は、評価欄（１）に記載の操作に基づいて実施した。
結果を表４に示す。また、理論値と実測値との相関関係を、図４及び図５に示す。図４は、理論値が０〜６０００ｎｇ／ｄＬである場合の結果を示し、図５は、理論値が０〜６００ｎｇ／ｄＬである場合の結果を示す。図４の結果から、相関式として、式（２）：
ｙ＝１．０２１７ｘ−１９．７３４                （２）
が得られ、Ｒ２値として０．９９９７が得られた。また、図５の結果から、相関式として、式（３）：
ｙ＝１．１２２９ｘ−１５．０１５                （３）
が得られ、Ｒ２値として０．９９８８が得られた。図４及び図５から明らかなように、本発明の免疫分析方法では、良好な希釈直線性が得られた。
以上、評価（１）〜（４）から明らかなように、本発明の免疫分析方法は、ＲＩＡとの相関性に優れ、ＲＩＡ法より測定範囲が広く、再現性が良好であった。
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（５）本発明の免疫分析用試薬の反応性の確認
本評価例では、種々の状態のエラスターゼ１に対する、実施例１で調製した本発明の免疫分析用試薬の反応性（凝集の程度）を評価した。結果を表５に示す。表５に示す結果は、エラスターゼ１・α１−アンチトリプシン複合体に対する反応性を１００％としたときの相対値で示す。表５に示す「ＰＭＳＦ」は、フェニルメタンスルホニルフルオリドである。表５に示すように、本発明の免疫分析用試薬は、エラスターゼ１とα１−アンチトリプシンとの複合体を凝集させたが、単独（遊離）のエラスターゼ１を凝集させなかった。
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比較例２：ＥＩＡ法によるエラスターゼ１濃度の測定
本比較例では、前記評価（２）で使用した各実検体のエラスターゼ１濃度を、ＥＩＡ法により測定した。ＥＩＡ法は、以下の手順に従って実施した。すなわち、Ｆ（ａｂ’）２抗エラスターゼ１抗体Ｅ１を固定化した９６穴プラスチックウェルに、検体１０μＬを添加して３７℃で２時間反応させ、リン酸緩衝液で洗浄後、パーオキシダーゼ標識化Ｆ（ａｂ’）２抗エラスターゼ１抗体Ｅ４を添加して３７℃で１時間反応させた。リン酸緩衝液で洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンの過酸化水素溶液を加えて１５分間反応させ、硫酸溶液で反応を停止させて波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
産業上の利用可能性
本発明の免疫分析用試薬又は免疫分析方法によれば、ＲＩＡのように特別な施設を必要とすることなく簡便に、且つ短時間（例えば、１０分間）で、エラスターゼ１を分析することができる。また、本発明の免疫分析用試薬又は免疫分析方法によれば、低濃度領域から高濃度領域まで広範囲にわたって定量的に、エラスターゼ１を分析することができる。また、本発明による膵疾患の検出方法によれば、簡便に、且つ短時間で、膵疾患（特に急性膵炎）を検出することができ、緊急検査に対応可能である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＩＡ法と本発明の免疫分析方法との相関性を示すグラフである。
図２は、本発明の免疫分析方法における最小検出限界値を示すグラフである。
図３は、本発明の免疫分析方法における実効感度を示すグラフである。
図４は、本発明の免疫分析方法において、理論値が０〜６０００ｎｇ／ｄＬである濃度範囲における希釈直線性を示すグラフである。
図５は、本発明の免疫分析方法において、理論値が０〜６００ｎｇ／ｄＬである濃度範囲における希釈直線性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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