(57)【要約】本発明は、粒子形成能または細胞傷害性が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの検査方法および製造方法を提供する。（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを導入した細胞で発現するＭ蛋白質の局在が低下または消失することにより、該細胞におけるウィルス様粒子形成を抑制できることを見出した。本発明は、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの検査方法、スクリーニング方法、および粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの製造方法を提供する。ウィルス様粒子形成が低下または消失したベクターはベクターを導入した細胞からのウィルス２次放出による細胞障害や免疫誘導が惹起されないため、遺伝子治療用ベクターとして極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの粒子形成能を検査する方法であって、該ベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出する工程を含む方法。
【請求項２】
粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターをスクリーニングする方法であって、
（ａ）該ベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出する工程、
（ｂ）該局在が低下または消失したベクターを選択する工程、を含む方法。
【請求項３】
Ｍ蛋白質の局在が、Ｍ蛋白質の細胞表面の凝集である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの粒子形成能を低下または消失させる遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出する工程、
（ｂ）該局在を低下または消失させる遺伝子を選択する工程、を含む方法。
【請求項５】
Ｍ蛋白質の局在が、Ｍ蛋白質の細胞表面の凝集である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被検遺伝子が、（−）鎖ＲＮＡウィルスのＭ、Ｆ、およびＨＮ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の変異体である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの製造方法であって、請求項４から６のいずれかに記載の方法により同定または単離され得る遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、該遺伝子によるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件下で再構成させる工程、を含む方法。
【請求項８】
粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの製造方法であって、Ｍ遺伝子の欠損または変異により該Ｍ遺伝子の発現産物の局在が低下または消失する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、機能的Ｍ蛋白質が持続的に発現する条件下で再構成させる工程、を含む方法。
【請求項９】
前記工程が、細胞表面における遺伝子産物の凝集が低下または消失する温度感受性変異Ｍ遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、許容温度で再構成させる工程である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
温度感受性変異Ｍ遺伝子が、センダイウィルスＭ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、およびＡ１８３からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白質をコードする遺伝子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程が、Ｍ遺伝子が欠損している（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、再構成を行う細胞の染色体に組み込まれたＭ遺伝子が発現する条件下で再構成させる工程である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターが、さらにＨＮおよび／またはＦ遺伝子が欠損しているか、または温度感受性変異ＨＮおよび／または温度感受性変異Ｆ遺伝子を保持する、請求項７から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
温度感受性変異ＨＮ遺伝子が、センダイウィルスＨＮ蛋白質のＡ２６２、Ｇ２６４、およびＫ４６１からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された（−）鎖ＲＮＡウィルスＨＮ蛋白質をコードする遺伝子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターが、さらにＰおよび／またはＬ遺伝子に変異を保持する、請求項７から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
Ｐ遺伝子の変異が、センダイウィルスＰ蛋白質のＥ８６および／またはＬ５１１に相当する（−）鎖ＲＮＡウィルスＰ蛋白質のアミノ酸部位が他のアミノ酸に置換された変異である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｌ遺伝子の変異が、センダイウィルスＬ蛋白質のＮ１１９７および／またはＫ１７９５に相当する（−）鎖ＲＮＡウィルスＬ蛋白質のアミノ酸部位が他のアミノ酸に置換された変異である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ベクターの再構成を３５℃以下で行う工程を含む、請求項７から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
（−）鎖ＲＮＡウィルスがパラミクソウィルスである、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項７から１９のいずれかに記載の方法により製造された、粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクター。
【請求項２１】
組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスであって、機能的Ｍ蛋白質を有するが、該ウィルスのゲノムにおいてＭ蛋白質をコードする配列が欠損しているウィルス。
【請求項２２】
下記（ａ）から（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの性質を有する組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルス。
（ａ）該ウィルスのゲノムにコードされるＭ蛋白質において、センダイウィルスＭ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、およびＡ１８３からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている。
（ｂ）該ウィルスのゲノムにコードされるＨＮ蛋白質において、センダイウィルスＨＮ蛋白質のＡ２６２、Ｇ２６４、およびＫ４６１からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている。
（ｃ）該ウィルスのゲノムにコードされるＰ蛋白質において、センダイウィルスＰ蛋白質のＥ８６またはＬ５１１のアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている。
（ｄ）該ウィルスのゲノムにコードされるＬ蛋白質において、センダイウィルスＬ蛋白質のＮ１１９７および／またはＫ１７９５のアミノ酸あるいは他の（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白質の相同部位のアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている。
【請求項２３】
少なくとも（ａ）および（ｂ）の性質を有する、請求項２２に記載のウィルス。
【請求項２４】
少なくとも（ｃ）および（ｄ）の性質を有する、請求項２２に記載のウィルス。
【請求項２５】
（ａ）から（ｄ）の全ての性質を有する、請求項２２に記載のウィルス。
【請求項２６】
該ウィルスのゲノムにおいてスパイク蛋白質をコードする配列の少なくとも１つをさらに欠損する、請求項２１から２５のいずれかに記載のウィルス。
【請求項２７】
スパイク蛋白質がＦ蛋白質である、請求項２６に記載のウィルス。
【請求項２８】
（−）鎖ＲＮＡウィルスがパラミクソウィルスである、請求項２１から２７のいずれかに記載のウィルス。
【請求項２９】
パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、請求項２８に記載のウィルス。
【請求項３０】
遺伝子導入における細胞傷害性を減弱させるために用いる、請求項２１から２９のいずれかに記載の組み換えウィルス。
【請求項３１】
遺伝子導入における導入遺伝子の発現レベルの低下を抑制するために用いる、請求項２１から３０のいずれかに記載の組み換えウィルス。
【請求項３２】
遺伝子導入においてウィルスを導入した細胞からのウィルス様粒子（ＶＬＰ）の放出を抑制するために用いる、請求項２１から３１のいずれかに記載の組み換えウィルス。
【請求項３３】
請求項２１から３２のいずれかに記載の組み換えウィルスを１０６ＣＩＵ／ｍｌ以上で含む水溶液。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの検査方法および製造方法に関する。
背景技術
近年、センダイウィルス（ＳｅＶ）を含む（−）鎖ＲＮＡウィルスの組み換え技術の開発により、遺伝子導入ベクターとしての利用が広がっている（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０）。しかし、これらのベクターが持つ問題点の１つに、標的細胞へのベクター導入後に起こる細胞からのウィルスの２次放出がある。複製型ウィルスを感染させた細胞ではビリオンが形成され娘ウィルスが放出されるが、複製能を持たないＦ欠損ＳｅＶを導入した細胞等からもウィルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）の放出が観察されている。このようなＶＬＰを生産しないウィルスベクターの開発が望まれる。
発明の開示
本発明は、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの検査方法および製造方法を提供する。
Ｍａｔｒｉｘ（Ｍ）蛋白はビリオン形成に中心的な役割をしていることが、センダイウィルス（ＳｅＶ）や、他の（−）鎖ＲＮＡウィルスで報告されている。例えば、ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＶＳＶ）のＭ蛋白の強発現のみでウィルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）の発芽が観察されており（Ｊｕｓｔｉｃｅ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９；３１５６−３１６０（１９９５））、またＰａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓの場合もＭ蛋白のみの強発現でＶＬＰが生じることが報告されている（Ｃｏｒｏｎｅｌ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３；７０３５−７０３８（１９９９））。このようなＭ蛋白単独でのＶＬＰ形成に関しては、全ての（−）鎖ＲＮＡウィルスで観察されているわけではないが、Ｍ蛋白がビリオン形成のｃｏｒｅになっていることは、全ての（−）鎖ＲＮＡウィルスで共通していると認識することができる（Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２；１１７１−１１９０（１９９８））。
ビリオン形成に対するＭ蛋白の具体的な役割に関して主に以下のようにまとめることができる。ビリオン形成の場となるのは細胞膜上のリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）と呼ばれている場（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｋ．ａｎｄ  Ｉｋｏｎｅｎ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８７；５６９−５７２（１９９７））であり、元々はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤に不溶性の脂質画分として同定された（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｒｏｓｅ，Ｊ．Ｋ．Ｃｅｌｌ  ６８；５３３−５４４（１９９２））。インフルエンザウィルス（Ａｌｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４；８７０９−８７１９（２０００））、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ；ＭｅＶ：Ｍａｎｉｅ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４；３０５−３１１（２０００））及びＳｅＶ（Ａｌｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｎａｙａｋ，Ｄ．Ｐ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６；２８９−３０３（２０００））等でリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）でのビリオン形成が証明されており、そこでＭ蛋白はエンベロープ蛋白（ｓｐｉｋｅ蛋白とも表記される）やｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＮＰ）を濃縮しビリオン形成を促進する、即ちウィルスアセンブリと出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）の駆動力となっていると考えられる（Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７；３８９９−３９０８（１９９８），Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３；２４２−２５０（１９９９））。実際に、Ｍ蛋白はｓｐｉｋｅ蛋白のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌと結合することが、インフルエンザウィルス（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４；４６３４−４６４４（２０００））及びＳｅＶ（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７；６５１−６６３（１９９３））等で示されており、またＲＮＰとの結合もインフルエンザウィルス（Ｒｕｉｇｒｏｋ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７３；３１１−３１６（１９８９））や、パラインフルエンザウィルス及びＳｅＶ（Ｃｏｒｏｎｅｌ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５；１１１７−１１２３（２００１））等で示されている。更に、Ｍ蛋白自身のオリゴマー形成への関与がＳｅＶ（Ｈｅｇｇｅｎｅｓｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９；６２３２−６２３６（１９８２）及び水疱性口内炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ：Ｇａｕｄｉｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０６；２８−３７（１９９５），Ｇａｕｄｉｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７４；８１６−８２５（１９９７））等で報告され、これら多くのウィルスコンポーネント及び脂質との結合能がウィルスアセンブリと出芽の駆動力としての役割を担わせていると考えることができる。
これらの知見から本発明者らは、２次放出粒子、即ちＶＬＰ放出抑制を目的とした改変の為には、Ｍ蛋白に着目すべきであると考えた。また、エンベロープ蛋白（ｓｐｉｋｅ蛋白）に関しても改変によりＶＬＰ放出抑制に繋がる可能性も既に幾つか示唆されている。ビリオン形成が実際に減少した具体的な報告として以下の実験例がある。狂犬病ウィルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ；ＲＶ）の場合、Ｇ蛋白欠失型においてＶＬＰ形成が１／３０に減少し（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８４；９４１−９５１（１９９６））、Ｍ蛋白欠失型においては１／５００，０００以下に減少したと報告されている（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３；２４２−２５０（１９９９））。また、麻疹ウィルス（ＭｅＶ）の場合、Ｍ蛋白欠失型においてｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌの融合が亢進し（Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７；３８９９−３９０８（１９９８））、これはビリオン形成が抑制された為であると考えることができる。また、同様の融合亢進がＦ或いはＨ蛋白のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ（細胞質側のテール）の変異によっても生じている（Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２；１２２４−１２３４（１９９８））。特にＳｅＶにおいては以下の点も明らかになっている。ＳｅＶのＦ及びＨＮが分泌経路に載っている間（即ちゴルジ体等に存在している間）、それぞれ（Ｆ及びＨＮ）のＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌがＭ蛋白と結合していることが示されている（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７；６５１−６６３（１９９３），Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８；６９−７６（１９９４））。即ち、本発明者らは、ビリオン形成の場である細胞膜上のリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  Ｒａｆｔｓ）へＭ蛋白が効率的に運搬されるためには、Ｆ及びＨＮのＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌとの結合が重要であり、Ｍ蛋白は細胞質に存在しながらＦ及びＨＮと結合することで、Ｆ及びＨＮの分泌経路に乗った形で細胞膜へ運搬されていると捉えた。
本発明者らは、実際に２次放出粒子、即ちＶＬＰ放出抑制を目的とした改変を行う場合、ｃｏｒｅであるＭ蛋白を欠失させることが最も効果的である可能性が高いと考えた。但し、改変したウィルスを遺伝子治療等の産業上に利用しようとした場合、ウィルスを生産する過程を考慮しなければならず、上記のようにＲＶ（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３；２４２−２５０（１９９９））及びＭｅＶ（Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７；３８９９−３９０８（１９９８））で既に報告されているシステム、即ちｖａｃｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ（ＶＶ）でｄｒｉｖｅしたＴ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで発現を誘導するシステムでは高タイターのウィルスは得られ難く、また発現誘導に利用したＶＶが、調製したＭ欠失型ウィルス溶液中へ混入することは避けられないこともあり、実応用可能なウィルスの生産は困難である。
Ｍ蛋白の欠失以外に効果的である方法として、Ｍ蛋白を細胞膜上のリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  Ｒａｆｔｓ）へ運搬する役割が考察されているＦ及びＨＮ蛋白を欠失させるか、あるいはそれらのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌのみを欠失させる変異を導入することが考えられる。但し、特にＳｅＶの場合はＦ欠失型（ＷＯ００／７００７０）或いはＨＮ欠失型（Ｓｔｒｉｃｋｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２；１７０３−１７０７（１９９１））において多くのＶＬＰが存在することが報告されている。即ち、効果は大きくはないと予想される。現在までの所、ｓｐｉｋｅ蛋白に関してｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ以外でＶＬＰ形成に影響すると予想される領域は同定されていない。またＭ蛋白質に関しても同様であり、明確にＶＬＰ形成に影響すると予想される領域は同定されていない。更に、産業上の利用の為にはウィルス生産に関して考慮する必要があり、デザインは容易ではない。
本発明者らはまず、ＶＬＰ放出が抑制されたベクターを構築するための一つの解決法として、ウィルス遺伝子の温度感受性変異の利用を考えた。低温で生育するが高温では増殖できない幾つかの変異型ウィルスが報告されている。本発明者らは、特に高温でのビリオン形成が抑制されるような変異蛋白質、特にＭ蛋白或いはｓｐｉｋｅ蛋白に変異を有するものを利用すれば、低温で（例えば３２℃）ウィルス生産を行い、遺伝子治療等の実応用時はそれよりは高温（例えば３７℃）で行うことにより、ＶＬＰ形成を抑制できる可能性があると考えた。この目的のために、本発明者らはＭ蛋白質およびＨＮ蛋白質で報告されている、それぞれ３つ、計６つの温度感受性変異を持つ変異ＭおよびＨＮ蛋白質をコードするＦ遺伝子欠損型の組み換えセンダイウィルスベクターを構築した。このウィルスのＶＬＰ放出を調べたところ、野生型ウィルスに比べ約１／１０またはそれ以下であることが判明した。さらに、ＶＬＰ放出が抑制されたセンダイウィルスベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を、抗Ｍ抗体を利用した免疫染色により解析した結果、野生型ウィルスを導入した細胞では見られる細胞表面のＭ蛋白質の凝集が、ＶＬＰ放出抑制型ウィルスの場合は有意に減少しており、特に高温（３８℃）においてＭ蛋白の濃縮像が極端に減少していた。温度感受性変異Ｍ遺伝子を含むこのＳｅＶを感染させた細胞におけるＭ蛋白質およびＨＮ蛋白質の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡により詳しく調べたところ、低温（３２℃）においても細胞表面でのＭ蛋白の局在は有意に低下しており、微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の形態に近い形で観察された。さらに、高温（３７℃）ではＭ蛋白は微小管の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）に局在して存在していた。微小管脱重合剤を添加すると、温度感受性Ｍ遺伝子を持つＳｅＶのみならず、野生型Ｍ遺伝子を持つＳｅＶにおいても、Ｍ蛋白質の局在構造が破壊されたことから、Ｍ蛋白質は実際に微小管に沿って局在して機能している可能性が高いと判断された。以上の知見から、温度感受性変異導入ウィルスで二次放出粒子が減少しているのは、粒子形成の中心的な役割を担っていると考えられているＭ蛋白の細胞内局在の不全であると断定された。従って、Ｍ蛋白質の正常な細胞内局在を妨げることにより、ＶＬＰの形成を効果的に抑制することができると考えられる。また、Ｍ蛋白質の機能には微小管との相互作用が重要であり、例えばＭ蛋白質がゴルジ体から微小管に沿って細胞内移動することを阻害するような遺伝子変異や薬剤を開発することにより、Ｍ蛋白の細胞内局在の不具合を生じさせ、結果的に二次放出粒子の減少を達成することが可能と判断される。すなわち本発明者らは、Ｍ蛋白質の局在に欠陥を生じさせるような変異を有する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを調製することによって、粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを得ることができることを見出した。
例えば、Ｍ遺伝子、あるいはＦ遺伝子およびＨＮ遺伝子といったスパイク蛋白質をコードする遺伝子に変異を加え、これら変異遺伝子を持つウィルスベクターについてＭ蛋白質の局在に異常を持つベクター、特にＭ蛋白質の細胞表面の凝集が低下または消失しているものをスクリーニングすることによって、効果的に粒子形成能が低下または消失した組み換えウィルスベクターを得ることが可能となる。これにより、例えばｓｐｉｋｅ蛋白のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌまたはそれ以外の任意の領域の改変によるＶＬＰ産生の抑制を試験することが可能である。さらに、Ｍ蛋白への改変も含め、多くの変異型ウィルスをＭ蛋白の細胞膜への局在の有無でスクリーニングすることもできる。これらの方法は、ＳｅＶだけではなく、他の（−）鎖ＲＮＡウィルスで共通して適用することが可能である。
さらに本発明者らは、Ｐ遺伝子およびＬ遺伝子に変異を導入することによってウィルスの２次放出を抑制するとともに、細胞傷害性を低下させ、挿入遺伝子をより長期に発現できるＦ欠損型ベクターを構築した。具体的には、Ｅ８６ＫまたはＬ５１１Ｆの置換変異を有するＳｅＶ  Ｐ蛋白質遺伝子、ならびにＮ１１９７ＳおよびＫ１７９５Ｅの置換変異を有するＳｅＶ  Ｌ蛋白質遺伝子を用いた。ＰおよびＬ遺伝子の両者に変異を導入することで、これらの遺伝子に変異のないベクターに比べ、細胞にベクターを導入した後における、導入遺伝子を発現する細胞数の減少が有意に抑制され、細胞傷害性およびウィルス様粒子の２次放出も明確に低下した。また本発明者らは、このＰ蛋白質およびＬ蛋白質の変異と、上記のＭ蛋白質およびＨＮ蛋白質の温度感受性変異とを組み合わせ、Ｍ、ＨＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質の４種の蛋白質に変異を有するウィルスを構築した。その結果、この変異組み換えウィルスは細胞傷害性の顕著な減弱が認められた。特にＬ５１１のアミノ酸が置換置換されたＰ蛋白質遺伝子を持つＳｅＶは２次放出粒子が顕著に減少した。
また本発明者らは、Ｍ遺伝子をウィルスから欠失させることによって、ウィルスを導入した細胞におけるＭ蛋白質の細胞表面の凝集が完全に欠如したウィルスの構築を試みた。この目的のために、本発明者らはＭ欠失型ウィルスの生産に利用可能なＭ蛋白持続発現細胞を初めて構築した。この細胞を利用することにより、高タイターで他のウィルスの混入を否定した遺伝子治療用ベクターの生産が初めて可能になった。持続発現細胞を利用したＭ蛋白質のトランス供給を行う、本発明のＭ欠失型ＳｅＶ生産システムにおいて初めて、実用に適したＭ欠失型の（−）鎖ＲＮＡウィルスが提供された。Ｍ遺伝子を欠失した感染性ウィルス粒子は産生細胞の培養上清中に１０７ＣＩＵ／ｍｌ以上の力価で回収され、このウィルスを導入した細胞では、ウィルス様粒子の２次放出はほとんど抑制され、細胞傷害性も低下した。さらに本発明者らは、Ｍ／Ｆ両蛋白質を発現するヘルパー細胞を新たに作出し、これを用いてＭ／Ｆ両遺伝子を欠失した感染性ウィルス粒子を初めて回収することに成功した。ウィルスは産生細胞の培養上清中に最大１０８ＣＩＵ／ｍｌ以上の力価で回収され、得られたウィルスの２次粒子形成能はほとんど消失していた。またＭ／Ｆ両遺伝子を欠失したウィルスベクターは、それぞれ単独の遺伝子を欠失させた場合に比べ細胞傷害性が顕著に低下していることが確認された。このウィルスベクターは、神経細胞に対してインビボおよびインビトロで効率良く遺伝子を導入できることが示され、非分裂細胞を含む多くの細胞に感染能を有する遺伝子導入ベクターとしての利用が期待される。
本発明は、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの検査方法および製造方法に関し、より具体的には、
（１）（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの粒子形成能を検査する方法であって、該ベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出する工程を含む方法、
（２）粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターをスクリーニングする方法であって、
（ａ）該ベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出する工程、
（ｂ）該局在が低下または消失したベクターを選択する工程、を含む方法、
（３）Ｍ蛋白質の局在が、Ｍ蛋白質の細胞表面の凝集である、（１）または（２）に記載の方法、
（４）（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの粒子形成能を低下または消失させる遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出する工程、
（ｂ）該局在を低下または消失させる遺伝子を選択する工程、を含む方法、
（５）Ｍ蛋白質の局在が、Ｍ蛋白質の細胞表面の凝集である、（４）に記載の方法、
（６）被検遺伝子が、（−）鎖ＲＮＡウィルスのＭ、Ｆ、およびＨＮ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の変異体である、（４）または（５）に記載の方法、
（７）粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの製造方法であって、（４）から（６）のいずれかに記載の方法により同定または単離され得る遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、該遺伝子によるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件下で再構成させる工程、を含む方法、
（８）粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの製造方法であって、Ｍ遺伝子の欠損または変異により該Ｍ遺伝子の発現産物の局在が低下または消失する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、機能的Ｍ蛋白質が持続的に発現する条件下で再構成させる工程、を含む方法、
（９）前記工程が、細胞表面における遺伝子産物の凝集が低下または消失する温度感受性変異Ｍ遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、許容温度で再構成させる工程である、（８）に記載の方法、
（１０）温度感受性変異Ｍ遺伝子が、センダイウィルスＭ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、およびＡ１８３からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白質をコードする遺伝子である、（９）に記載の方法、
（１１）前記工程が、Ｍ遺伝子が欠損している（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、再構成を行う細胞の染色体に組み込まれたＭ遺伝子が発現する条件下で再構成させる工程である、（８）に記載の方法、
（１２）（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターが、さらにＨＮおよび／またはＦ遺伝子が欠損しているか、または温度感受性変異ＨＮおよび／または温度感受性変異Ｆ遺伝子を保持する、（７）から（１１）のいずれかに記載の方法、
（１３）温度感受性変異ＨＮ遺伝子が、センダイウィルスＨＮ蛋白質のＡ２６２、Ｇ２６４、およびＫ４６１からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された（−）鎖ＲＮＡウィルスＨＮ蛋白質をコードする遺伝子である、（１２）に記載の方法、
（１４）（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターが、さらにＰおよび／またはＬ遺伝子に変異を保持する、（７）から（１３）のいずれかに記載の方法、
（１５）Ｐ遺伝子の変異が、センダイウィルスＰ蛋白質のＥ８６および／またはＬ５１１に相当する（−）鎖ＲＮＡウィルスＰ蛋白質のアミノ酸部位が他のアミノ酸に置換された変異である、（１４）に記載の方法、
（１６）Ｌ遺伝子の変異が、センダイウィルスＬ蛋白質のＮ１１９７および／またはＫ１７９５に相当する（−）鎖ＲＮＡウィルスＬ蛋白質のアミノ酸部位が他のアミノ酸に置換された変異である、（１４）または（１５）に記載の方法、
（１７）ベクターの再構成を３５℃以下で行う工程を含む、（７）から（１６）のいずれかに記載の方法、
（１８）（−）鎖ＲＮＡウィルスがパラミクソウィルスである、（１）から（１７）のいずれかに記載の方法、
（１９）パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、（１８）に記載の方法、
（２０）（７）から（１９）のいずれかに記載の方法により製造された、粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクター、
（２１）組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスであって、機能的Ｍ蛋白質を有するが、該ウィルスのゲノムにおいてＭ蛋白質をコードする配列が欠損しているウィルス、
（２２）下記（ａ）から（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの性質を有する組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルス、
（ａ）該ウィルスのゲノムにコードされるＭ蛋白質において、センダイウィルスＭ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、およびＡ１８３からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、
（ｂ）該ウィルスのゲノムにコードされるＨＮ蛋白質において、センダイウィルスＨＮ蛋白質のＡ２６２、Ｇ２６４、およびＫ４６１からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、
（ｃ）該ウィルスのゲノムにコードされるＰ蛋白質において、センダイウィルスＰ蛋白質のＥ８６またはＬ５１１のアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、
（ｄ）該ウィルスのゲノムにコードされるＬ蛋白質において、センダイウィルスＬ蛋白質のＮ１１９７および／またはＫ１７９５のアミノ酸あるいは他の（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白質の相同部位のアミノ酸部位に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、
（２３）少なくとも（ａ）および（ｂ）の性質を有する、（２２）に記載のウィルス、
（２４）少なくとも（ｃ）および（ｄ）の性質を有する、（２２）に記載のウィルス、
（２５）（ａ）から（ｄ）の全ての性質を有する、（２２）に記載のウィルス、
（２６）該ウィルスのゲノムにおいてスパイク蛋白質をコードする配列の少なくとも１つをさらに欠損する、（２１）から（２５）のいずれかに記載のウィルス、
（２７）スパイク蛋白質がＦ蛋白質である、（２６）に記載のウィルス、
（２８）（−）鎖ＲＮＡウィルスがパラミクソウィルスである、（２１）から（２７）のいずれかに記載のウィルス、
（２９）パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、（２８）に記載のウィルス、
（３０）遺伝子導入における細胞傷害性を減弱させるために用いる、（２１）から（２９）のいずれかに記載の組み換えウィルス、
（３１）遺伝子導入における導入遺伝子の発現レベルの低下を抑制するために用いる、（２１）から（３０）のいずれかに記載の組み換えウィルス、
（３２）遺伝子導入においてウィルスを導入した細胞からのウィルス様粒子（ＶＬＰ）の放出を抑制するために用いる、（２１）から（３１）のいずれかに記載の組み換えウィルス、
（３３）（２１）から（３２）のいずれかに記載の組み換えウィルスを１０５ＣＩＵ／ｍｌ以上で含む水溶液、に関する。
本発明は、（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出する工程を含む、該ベクターの粒子形成能を検査する方法を提供する。本発明者らは、ベクター産生細胞におけるＭ蛋白質の局在が、（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの粒子形成能と密接に関連することを実証した。粒子形成が行われる細胞では、Ｍ蛋白質は細胞表面に強く検出され、より厳密には細胞表面に凝集して存在している。しかし、粒子形成能が低下したベクターを感染させた細胞では、細胞表面へのＭ蛋白質の局在は減少し、細胞質中により多く検出されるようになる。さらに粒子形成能が喪失する条件では、Ｍ蛋白質は核の近くに濃縮する。この場合、Ｍ蛋白質はゴルジ体付近と予想される部位に濃縮しており、微小管が関与するＭ蛋白質輸送に異常を来していることが示唆される。すなわち、細胞におけるＭ蛋白質の局在は、ベクターの粒子形成能と相関しており、Ｍ蛋白質の局在を検出することによりベクターの粒子形成能を検査することができる、本発明の検査では、ベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出し、Ｍ蛋白質の局在を粒子形成能と関連付けることにより行う。すなわち細胞におけるＭ蛋白質の局在が低下または消失するベクターは粒子形成能が低く、その程度が重篤であるほど粒子形成能が低下する。具体的には、上記のように、Ｍ蛋白質の細胞表面における凝集が低下するほど、該ベクターの粒子形成能は低いと判断され、特にＭ蛋白質の細胞表面における凝集が消失したベクターは、粒子形成能が喪失していると判断される。また、より巨視的には、細胞表面に局在するＭ蛋白質が減少するほどベクターの粒子形成能は低いと判断され、細胞表面に局在する代わりに細胞質や核周辺にＭ蛋白質が局在するようなベクターの粒子形成能は低い。特に核付近に濃縮してＭ蛋白質が局在したり、ゴルジ体領域にＭ蛋白質が凝縮している場合は、ベクターの粒子形成能はほとんどまたは完全に喪失していると判断される。細胞におけるＭ蛋白質の局在、特に細胞表面のＭ蛋白質の凝集が抑制されたベクターを開発することにより、感染細胞からのウィルス様粒子の放出を抑制することができる。
本発明において細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失とは、例えば細胞におけるＭ蛋白質の局在の欠陥である。すなわち、粒子形成能またはＶＬＰ形成能を有するパラミクソウィルス（例えば野生型パラミクソウィルスおよびＶＬＰ形成能を有するスパイク蛋白質遺伝子欠損型パラミクソウィルスなど）を感染させた細胞におけるＭ蛋白質の局在（これをＭ蛋白質の正常な局在とも言う）が有意に破壊されることである。具体的には細胞におけるＭ蛋白質の局在の欠陥とは、粒子形成能またはＶＬＰ形成能を持つベクターを感染させた細胞におけるＭ蛋白質の局在の変化または消失である。正常な粒子形成能またはＶＬＰ形成能を持つパラミクソウィルスを感染させた細胞では、Ｍ蛋白質は細胞表面付近に局在し、より詳細には細胞表面に凝集して存在している。本発明においてこのようなＭ蛋白質の正常な局在が変化または消失することを、それぞれＭ蛋白質の局在の低下または消失と言う。本発明においてＭ蛋白質の局在の欠陥には、例えばＭ蛋白質が異常な（Ｍ蛋白質の正常な局在とは違った）局在を示すことであってよく、例えば細胞表面における凝集の低下および喪失、細胞表面への発現量の低下、細胞質におけるＭ蛋白質レベルの上昇、細胞質内での凝縮（例えば核周辺での凝縮）、ならびに細胞全体におけるＭ蛋白質量の低下および喪失などを、本発明におけるＭ蛋白質の局在の欠陥として特に挙げることができる。
細胞におけるＭ蛋白質の局在の検出は、細胞分画による方法、および免疫染色によりＭ蛋白質の局在を直接検出する方法などで実施することができる。免疫染色では、例えば蛍光標識された抗体を用いてＭ蛋白質を染色し、共焦点レーザー顕微鏡下で観察することができる。また、細胞を溶解後、公知の細胞分画法により細胞画分を得て、Ｍ蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降またはウェスタンブロッティング等によりＭ蛋白質が含まれる画分を同定することにより局在を調べることができる。粒子形成能を持つベクターを感染させた細胞では、Ｍ蛋白質は主に細胞膜に存在する。細胞膜におけるＭ蛋白質の局在が低下していれば、そのウィルスは、粒子形成が低下していると判断される。本発明の方法においては、特に細胞表面のＭ蛋白質の凝集を検出することによりＭ蛋白質の局在を調べることが好ましい。
細胞表面のＭ蛋白質の凝集を検出するには、細胞分画による方法、および免疫染色により、Ｍ蛋白質の細胞内局在を直接検出する方法などが考えられる。ビリオン形成の場となるのは細胞膜上のＬｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓと呼ばれている場であり、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤に不溶性の脂質画分である。Ｍ蛋白質はｓｐｉｋｅ蛋白、ＲＮＰ及びＭ蛋白自身更には脂質との結合能により、このリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）でウィルスコンポーネントを凝集すると考えられていることから、リピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）分画後、電気泳動等で検出されるＭ蛋白は凝集したＭ蛋白質を反映していると捉えることができる。すなわち、検出されるＭ蛋白質量が低下していれば、細胞表面のＭ蛋白質の凝集が低下していると判断される。一方、本発明者らが利用した細胞免疫染色により細胞内局在を検出する方法では、細胞膜上のおそらくはリピッドラフト（Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ）でのＭ蛋白の凝集を直接観察することが可能である。この場合、細胞免疫染色に利用可能な抗Ｍ抗体の取得が必須となる。この方法で検出した場合、Ｍ蛋白質が凝集していれば、細胞膜近傍に強い濃縮像が観察され、Ｍ蛋白の凝集がなければ濃縮像はなく細胞膜の輪郭が明確でなくなり、細胞質全体が薄く染色される。このように濃縮像が少ない或いは濃縮像がなく、さらに好ましくは細胞膜の輪郭がぼやけて観察され、細胞質全体が薄く染色された場合に、細胞表面のＭ蛋白質の凝集が低下していると判断される。Ｍ蛋白質の細胞表面における凝集が低下しているこれらのウィルスは、粒子形成が抑制されている。
上記の検出方法を利用することによって、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターをスクリーニングすることが可能である。このスクリーニング方法は、（ａ）該ベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出する工程、および（ｂ）該局在が低下または消失した（すなわち正常なＭ蛋白質の局在が変化した）ベクターを選択する工程、を含む方法である。局在の低下または消失は、上記のようにＭ蛋白質の正常な局在が有意に破壊されることを言う。また局在の低下または消失には、局在の完全な喪失や、Ｍ蛋白質自体が喪失している場合なども含む。局在の低下または消失は、全ての細胞において局在が低下または消失する場合のみならず、一部の細胞において局在が低下または消失する場合、細胞内の一部において局在が低下または消失する場合なども含む。さらに、特定の条件下で局在が低下または消失する場合も含む。例えば、特定の温度以下では野生型と同等の局在が起こるが、その温度より高い温度において野生型よりも局在性が低下または消失する場合などを含む。温度条件については、哺乳動物体内に相当する約３７〜３８℃において野生型ウィルスに比べ局在が低下または消失することが好ましい。例えば種々のウィルス変異株等を細胞に感染させ、この細胞においてＭ蛋白質の局在を検出する。Ｍ蛋白質の局在が低下または消失するウィルス株を選択すれば、粒子形成能が低下または消失したウィルスを単離することができる。
特に本発明のスクリーニングにおいては、Ｍ蛋白質の細胞表面の凝集を指標にした検出方法を利用することによって、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターをスクリーニングすることが好ましい。このスクリーニング方法は、（ａ）該ベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の細胞表面の凝集を検出する工程、および（ｂ）該凝集が低下または消失したベクターを選択する工程、を含む方法である。凝集の低下とは、凝集が有意に低下することを言う。また凝集の低下には、凝集の完全な喪失や、Ｍ蛋白質自体が喪失している場合なども含む。凝集の低下または消失は、全ての細胞において凝集が低下または消失する場合のみならず、一部の細胞の細胞表面において凝集が低下または消失する場合、細胞表面の一部において凝集が低下または消失する場合なども含む。さらに、特定の条件下で凝集が低下または消失する場合も含む。例えば、特定の温度以下では野生型と同等の凝集が起こるが、その温度より高い温度において野生型よりも凝集が低下または消失する場合などを含む。温度条件については、哺乳動物体内に相当する約３７〜３８℃において野生型ウィルスよりも凝集が低下または消失することが好ましい。例えば種々のウィルス変異株等を細胞に感染させ、この細胞においてＭ蛋白質の細胞表面における局在を検出する。Ｍ蛋白質の細胞表面における凝集が低下または消失しているウィルス株を選択すれば、粒子形成能が低下または消失したウィルスを単離することができる。
本発明において粒子形成能とは、ウィルスベクターを感染させた細胞において、感染性ウィルス粒子および非感染性ウィルス粒子（これをウィルス様粒子という）を放出（これを２次放出という）するベクターの能力を言う。本発明において粒子形成能の低下および抑制とは、粒子形成能が有意に低下することを言う。また粒子形成能の低下には、粒子形成能が完全に消失する場合を含む。粒子形成能の低下または消失は、ウィルスベクターの平均的な粒子形成能が低下している場合が含まれ、例えば一部の感染細胞において感染したウィルスの粒子形成能が低下または消失する場合、一部の感染ウィルスにおいて粒子形成能が低下または消失する場合なども含む。さらに、特定の条件下で粒子形成能が低下または消失する場合も含む。例えば、特定の温度以下では野生型と同等の粒子形成が起こるが、その温度より高い温度において野生型よりも粒子形成能が低下または消失する場合などを含む。温度条件については、哺乳動物体内に相当する約３７〜３８℃（例えば３７℃）において野生型ウィルスよりも粒子形成能が低下または消失することが好ましい。
ウィルスの粒子形成能の低下は、例えば統計学的に有意（例えば有意水準５％またはそれ以下の％値）に低下している。統計学的な検定は、例えばスチューデントのｔ検定またはマンホイットニーＵ検定などにより行うことができる。粒子形成能は、１／２以下、より好ましくは１／５以下、より好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／３０以下、より好ましくは１／５０以下、より好ましくは１／１００以下、より好ましくは１／３００以下、より好ましくは１／５００以下に低下している。
また、粒子形成能の消失には、量的または機能的に粒子形成が消失することを含む。粒子形成能の量的な消失は、例えば、ＶＬＰが検出限界以下であることを言う。このような場合、ＶＬＰは１０３／ｍｌ以下、好ましくは１０２／ｍｌ以下、より好ましくは１０１／ｍｌ以下である。粒子形成能の機能的な消失は、例えばＶＬＰが含まれる可能性のある試料を細胞にトランスフェクションしても検出可能な感染価を示さないことを言う。ウィルス粒子は、電子顕微鏡等で直接確認することができる。あるいは、ウィルスに含まれる核酸または蛋白質を指標に検出および定量することが可能である。例えば、ウィルス粒子中に含まれるゲノム核酸をＰＣＲ等の一般的な核酸検出法で検出および定量してもよい。あるいは、外来遺伝子を持つウィルス粒子は、これを細胞に感染させ該遺伝子の発現を検出することにより定量することができる。感染性を持たないウィルス粒子（ＶＬＰ等）は、トランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入し、遺伝子発現を検出することにより定量することができる。具体的には、例えばＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ  Ｎｏ．１８１１１６９）などのリポフェクション試薬を用いて行うことができる。ウィルス粒子を含むあるいは含まない溶液１００μｌにＤＯＳＰＥＲ  １２．５μｌを混合し、室温で１０分放置後、６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントに培養した細胞に１５分毎に振盪しながらトランスフェクションする。２日後に感染細胞の有無を検出することでＶＬＰの検出が可能である。ウィルス粒子または感染価は、また、例えばＣＩＵ測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）の測定することにより決定することができる（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆  Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）。トランスフェクションは、例えばリポフェクション試薬を用いて行うことができる。トランスフェクションは、例えばＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ  Ｎｏ．１８１１１６９）を用いて行うことができる。ＶＬＰを含むあるいは含まない溶液１００μｌにＤＯＳＰＥＲ  １２．５μｌを混合し、室温で１０分放置後、６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントに培養した細胞に１５分毎に振盪しながらトランスフェクションする。２日後に感染細胞の有無を検出することでＶＬＰの検出が可能である。
スクリーニングに用いる被検ウィルスは、天然に存在する変異株などであってもよく、あるいは人為的に作出した変異体であってもよい。スクリーニングにより選択されたウィルスは、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターとして用いることができる。
また、上記の検出方法を利用することによって、（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの粒子形成能を低下または消失させる遺伝子をスクリーニングすることが可能である。このスクリーニング方法は、（ａ）被検遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白賀の局在を検出する工程、および（ｂ）該局在を低下または消失させる遺伝子を選択する工程、を含む。局在の低下または消失は、上記したように検出すればよい。例えば、局在として細胞表面におけるＭ蛋白質の凝集を指標とするスクリーニング方法は、（ａ）被検遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の細胞表面の凝集を検出する工程、および（ｂ）該凝集を低下または消失させる遺伝子を選択する工程、を含む。例えば種々のウィルス遺伝子変異体やその他の遺伝子を挿入したウィルスベクターを作製し、これを細胞に感染させ、この細胞において感染させたウィルスから発現されるＭ蛋白質の細胞表面における局在を検出する。Ｍ蛋白質の細胞表面における凝集が低下または消失しているウィルスベクターが保持する遺伝子を選択すれば、粒子形成能を低下または消失させる遺伝子を単離することができる。スクリーニングに用いる被検遺伝子に特に制限はなく、ウィルスや細胞に由来する遺伝子、あるいは天然に存在するまたは人為的に作出したそれらの変異遺伝子などであってよい。好適には、被検遺伝子として（−）鎖ＲＮＡウィルスのＭ、Ｆ、およびＨＮ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の変異体を用いる。また、これらと同等の機能を有する遺伝子として、（−）鎖ＲＮＡウィルスの中で、Ｍ遺伝子はＭ１、ＦおよびＨＮ遺伝子はそれぞれＧおよびＨを表記される場合もある。本発明においてＭ遺伝子にはＭ１遺伝子が、ＦおよびＨＮ遺伝子にはそれぞれＧおよびＨ遺伝子が含まれる。変異体とは、例えば野生型遺伝子産物に対して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、および／または挿入などを有する蛋白質をコードする遺伝子などである。被検遺伝子として変異Ｍ遺伝子を用いる場合には、工程（ａ）において被検変異Ｍ遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを導入した細胞における該変異Ｍ遺伝子の発現産物の局在を検出する。被検遺伝子として変異Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子を用いる場合には、工程（ａ）において被検変異変異Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを導入した細胞において、該ベクターから発現されるＭ蛋白質の局在を検出する。細胞におけるＭ蛋白質の局在を検出し、Ｍ蛋白質の局在を低下または消失させる遺伝子を選択する。例えば、Ｍ蛋白質の局在として細胞表面の凝集を指標とする場合には、細胞表面のＭ蛋白質の凝集を検出し、Ｍ蛋白質の凝集が低下または消失するような遺伝子を選択する。また、被検遺伝子として、例えばＭ、Ｆ、またはＨＮ蛋白質等のウィルス遺伝子産物に相互作用し得る蛋白質をコードする他の遺伝子を用いて、同様のスクリーニングを行うこともできる。得られた遺伝子は、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを製造するために用いることができる。
ここで「細胞におけるＭ蛋白質の局在を低下または消失させる遺伝子」とは、該遺伝子に依存してＭ蛋白質の細胞における局在を低下または消失させる（すなわちＭ蛋白質の正常な局在を変化させる）遺伝子を言う。例えば該遺伝子を発現させた場合にＭ蛋白質の局在に欠陥が生じる場合、および該遺伝子を発現させ、さらにその他の環境を変化させる（例えば、ｐＨ、塩濃度、温度、化合物の添加、他の遺伝子の共発現など）ことにより、Ｍ蛋白質の局在が低下または消失する場合などが含まれる。
また、このスクリーニングを利用すれば、上記の粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターのスクリーニングにおいて単離されたウィルスから、粒子形成能の低下または消失に関与する遺伝子を特定することもできる。すなわち、単離されたウィルスが持つ遺伝子を被検遺伝子として用いて上記の粒子形成能を低下または消失させる遺伝子のスクリーニングを行う。得られた遺伝子は、粒子形成能が低下または消失した組み換えウィルスの製造に用いられ得る。
上記で単離された遺伝子を用いて粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを製造する場合、本発明者らは、該遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、該遺伝子によるＭ蛋白質の局在の低下または消失、例えばＭ蛋白質の細胞表面の凝集の低下または消失を、持続的に相補する条件下で再構成させる工程、を含む方法により効率的に製造できることを見出した。本発明の方法により製造された、粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、標的細胞導入後にウィルス様粒子を放出しないという利点がある。
「持続的に相補する条件」とは、（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを再構成させるのに十分の時間相補する条件を言う。通常、少なくとも２日間、好ましくは４日間以上、より好ましくは７日間以上、さらに好ましくは１０日間以上、最も好ましくは１４日間以上、細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失、例えばＭ蛋白質の細胞表面の凝集の低下または消失を持続的に相補する条件を言う。
例えば、ある条件下で細胞表面の凝集が低下する変異を有するＭ遺伝子を有するベクターを製造するには、細胞表面の凝集の低下を抑制する条件を持続的に維持してウィルスの再構成を行う。例えば、変異形質が現れない条件下で再構成を行ってもよいし、あるいは細胞において野生型Ｍ遺伝子を持続的に発現させ、Ｍ変異を相補してもよい。また、例えば、Ｍ遺伝子を欠損するベクターを製造する場合においても、野生型Ｍ遺伝子を細胞で持続的に発現させて再構成を行う。
本発明において、ウィルスベクターの再構成を低温で行うと、Ｍ蛋白質の正常な局在の低下または消失が抑制され、ウィルス再構成の効率が有意に上昇することが判明した。特に粒子形成能が低下する変異遺伝子（または遺伝子欠失）を有するベクターの再構成においては、３７℃および３８℃での再構成の効率は低く、細胞傷害性も観察され、３５℃以下好ましくは３２℃において初めて効率的な再構成が可能となった。従って、本発明におけるウィルスベクターの再構成にあたっては、温度を３５℃以下で行うことが好ましい。ウィルス再構成は、より好ましくは３４℃以下、さらに好ましくは３３℃以下、最も好ましくは３２℃またはそれ以下で行う。
特に本発明は、このような方法の１つとしてＭ遺伝子が欠損または変異した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを再構成する方法を提供する。すなわち本発明は、粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの製造方法であって、Ｍ遺伝子の欠損または変異によりＭ蛋白質の局在が低下または消失する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクター、具体的には例えばＭ蛋白質の細胞表面の凝集が低下または消失する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、機能的Ｍ蛋白質が持続的に発現する条件下で再構成させる工程、を含む方法に関する。「機能的Ｍ蛋白質」とは、野生型Ｍ蛋白質またはそれと同等の機能を有する蛋白質を言う。具体的には、細胞表面の凝集を起こし、（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの粒子形成を支持する活性を有する蛋白質を言う。
この方法の特に好ましい一態様としては、細胞における遺伝子産物の局在が低下または消失する温度感受性変異Ｍ遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、許容温度で再構成させる工程を含む方法が挙げられる。温度感受性変異とは、低温（例えば３２℃）に比べ、高温（例えば３７℃）において有意に活性が低下する変異を言う。具体的には、例えば細胞表面における遺伝子産物の凝集が低下または消失する温度感受性変異Ｍ遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、許容温度で再構成させる工程を含む方法である。Ｍ遺伝子の温度感受性変異としては特に限定されるものではないが、例えばセンダイウィルスのＭ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、およびＡ１８３からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは任意に選択される２つ、さらに好ましくは３つすべてのアミノ酸部位、あるいは他の（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白質のそれらと相同な部位に変異を含むものを好適に用いることができる。ここでＧ６９とはＭ蛋白質の６９番目のアミノ酸Ｇｌｙ、Ｔ１１６とはＭ蛋白質の１１６番目のアミノ酸Ｔｈｒ、Ａ１８３とはＭ蛋白質の１８３番目のアミノ酸Ａｌａを指す。
Ｍ蛋白質をコードする遺伝子（Ｍ遺伝子）は、（−）鎖ＲＮＡウィルスで広く保存されており、ウィルスのヌクレオカプシッドとエンベロープの両者に相互作用する機能を有することが知られている（Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１７−１９０（１９９８）；）。また、ＳｅＶ  Ｍ蛋白質においてａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  α−ｈｅｌｉｘと予想されている１０４−１１９（１０４−ＫＡＣＴＤＬＲＩＴＶＲＲＴＶＲＡ−１１９／配列番号：３８）は粒子形成に重要な領域として同定されている（Ｇｅｎｅｖｉｅｖｅ  Ｍｏｔｔｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：２９７７−２９８６（１９９９））が、当該領域は（−）鎖ＲＮＡウィルス間で良く保存されている。Ｍ蛋白質のアミノ酸配列は（−）鎖ＲＮＡウィルスで類似しており、特にパラミクソウィルス亜科においては既知のＭ蛋白質は共通して全長約３３０〜３８０アミノ酸からなる塩基性蛋白質であり、全領域にわたって類似性があるが、特にＣ端側半分での類似性が高い（Ｇｏｕｌｄ，Ａ．Ｒ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．４３：１７−３１（１９９６）、Ｈａｒｃｏｕｒｔ，Ｂ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１：３３４−３４９（２０００））。従って、例えばＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、及びＡ１８３と相同なアミノ酸は容易に同定することが可能である。
ＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、及びＡ１８３と対応する他の（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白質の相同な部位のアミノ酸は、当業者であれば、例えばＢＬＡＳＴなどのアミノ酸配列のホモロジー検索プログラム（アライメント作成機能を持つもの）またはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗなどのアライメント作成プログラムを用いてＳｅＶ  Ｍ蛋白質のアミノ酸と整列化することにより同定することができる。例えばＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＧ６９に相当する各Ｍ蛋白質の相同部位としては、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）（括弧は略称）であればＧ６９、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）であればＧ７３、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）およびｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）であればＧ７０、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）であればＧ７１、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、およびｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）であればＧ７０、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）であればＧ８１、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）であればＧ７０、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）およびｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）であればＥ４７、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）であればＥ７２が挙げられる（文字と番号はアミノ酸とその位置を表す）。また、ＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＴ１１６に相当する各Ｍ蛋白質の相同部位としては、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）であればＴ１１６、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）でればＴ１２０、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）およびｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）であればＴ１０４、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）であれはＴ１０５、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）およびｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）であればＴ１０４、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）であればＴ１２０、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）およびｓｉｍｉａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５（ＳＶ５）であればＴ１１７、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）およびｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）であればＴ１２１、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）であればＴ１１９、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）であればＳ１２０が挙げられる。ＳｅＶ  Ｍ蛋白質のＡ１８３に相当する各Ｍ蛋白質の相同部位としては、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒ���ｓ−１（ＨＰＩＶ−１）であればＡ１８３、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）であれなＦ１８７、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）およびｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）であればＹ１７１、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）であればＹ１７２、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）およびｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）であれはＹ１７１、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）であればＹ１８７、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）であれはＹ１８４、ｓｉｍｉａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５（ＳＶ５）であればＦ１８４、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）およびｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）であれはＦ１８８、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）であればＦ１８６、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）であればＹ１８７が挙げられる。ここに挙げたウィルスにおいて、それぞれのＭ蛋白質に上記の３つの部位のいずれか、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異Ｍ蛋白質をコードするゲノムを有するウィルスは、本発明において好適できる。
アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などのグループに分類することができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、２０種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。例えばセンダイウィルスＭ蛋白質におけるＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、およびＡ１８３Ｓからなる群より選択される変異あるいはそれらと相同な変異を含むものを好適に用いることができる。ここでＧ６９Ｅとは、Ｍ蛋白質の６９番目のアミノ酸ＧｌｙがＧｌｕに置換された変異、Ｔ１１６Ａとは、Ｍ蛋白質の１１６番目のアミノ酸ＴｈｒがＡｌａに置換された変異、Ａ１８３Ｓとは、Ｍ蛋白質の１８３番目のアミノ酸ＡｌａがＳｅｒに置換された変異を言う。すなわち、センダイウィルスＭ蛋白質のＧ６９、Ｔ１１６、およびＡ１８３あるいは他のウィルスＭ蛋白質の相同部位を、それぞれＧｌｕ（Ｅ）、Ａｌａ（Ａ）、およびＳｅｒ（Ｓ）へ置換することができる。これらの変異は組み合わせて有していることが好ましく、特に上記３変異の全てを保持していることがより好ましい。Ｍ遺伝子への変異の導入は、公知の変異導入方法に従って実施することができる。例えば実施例に記載のように目的の変異を入れたオリゴヌクレオチドを用いて導入することが可能である。
また、例えば麻疹ウィルスにおいては、Ｍ蛋白のモノクローナル抗体に対するエピトープが変化している温度感受性株のＰ２５３−５０５（Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｔａｓａｔｏ  Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，６４；１５−３０（１９９１））のＭ遺伝子配列を導入することが想定される。また、ＳｅＶ  Ｍ蛋白質の１１６番目のＴｈｒに対応する麻疹ウィルスＭ蛋白質の１０４番目のＴｈｒ、またはムンプスウィルスのＭ蛋白質の１１９番目のＴｈｒを他のアミノ酸（例えばＡｌａ）に置換してもよい。
また、上記本発明の方法の特に好ましい他の１つの態様としては、Ｍ遺伝子が欠損している（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、再構成を行う細胞の染色体に組み込まれたＭ遺伝子が発現する条件下で再構成させる工程を含む方法が挙げられる。Ｍ遺伝子が欠損するとは、機能的Ｍ蛋白質をコードする配列が欠損していることをいい、機能欠失型の変異を有するＭ遺伝子を持つ場合およびＭ遺伝子を欠失する場合を含む。Ｍ遺伝子の機能欠失型変異は、例えＭ遺伝子の蛋白質コード配列を欠失させたり、他の配列を挿入することにより作製することができる。例えば、Ｍ蛋白質コード配列の途中に停止コドンを設計することができる（ＷＯ００／０９７００）。Ｍ遺伝子欠損型のベクターは、最も好ましくはＭ蛋白質のコード配列を完全に欠失している。Ｍ蛋白質のＯＲＦを欠失したベクターは、温度感受性変異Ｍ蛋白質をコードするベクターとは違い、任意の条件においてウィルス粒子を形成する能力を失っている。本発明において、ベクター再構成に用いる宿主細胞の染色体にＭ遺伝子を組み込み、これを発現させて持続的にＭ蛋白質を供給することによって、効率的な組み換えウィルス産生が可能となることが見出された。Ｍ遺伝子が染色体に組み込まれた細胞は、例えば実施例に記載の方法により得ることができる。Ｍ遺伝子は恒常的に発現していてもよいし、ウィルス再構成時に誘導的に発現させてもよい。また、驚くべきことに、野生型Ｍ蛋白質の存在下で再構成を行う場合においても、再構成を低温で行うことによりベクター産生の効率が顕著に上昇することが判明した。従って、ベクターの再構成は低温、すなわち３５℃以下、より好ましくは３４℃以下、さらに好ましくは３３℃以下、最も好ましくは３２℃またはそれ以下で行うことが好ましい。
Ｍ遺伝子の欠損または変異によりＭ蛋白質の局在が低下または消失する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを、機能的Ｍ蛋白質が持続的に発現する条件下で再構成させる工程、を含む粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの製造方法においては、さらに（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターがＨＮおよび／またはＦ遺伝子が欠損しているか、または温度感受性変異ＨＮおよび／またはＦ遺伝子を保持することが好ましい。特に、Ｍ遺伝子の欠損または変異に加えてＨＮ遺伝子に温度感受性変異を有するベクターは、非許容温度における粒子形成能が極めて低くなることが判明した。ＨＮ遺伝子の温度感受性変異としては特に限定されるものではないが、例えばセンダイウィルスのＨＮ蛋白質のＡ２６２、Ｇ２６４、およびＫ４６１からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは任意に選択される２つ、さらに好ましくは３つすべてのアミノ酸部位、あるいは他の（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白質のそれらと相同な部位に変異を含むものを好適に用いることができる。ここでＡ２６２とはＨＮ蛋白質の２６２番目のアミノ酸Ａｌａ、Ｇ２６４とはＨＮ蛋白質の２６４番目のアミノ酸Ｇｌｙ、Ｋ４６１とはＨＮ蛋白質の４６１番目のアミノ酸Ｌｙｓを指す。アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、上記のＭ蛋白質の変異と同様、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えば、上記したように異なるグループのアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、例えばセンダイウィルスＨＮ蛋白質におけるＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、およびＫ４６１Ｇからなる群より選択される変異あるいはそれらと相同な変異を含むものを好適に用いることができる。ここでＡ２６２Ｔとは、ＨＮ蛋白質の２６２番目のアミノ酸ＡｌａがＴｈｒに置換された変異、Ｇ２６４Ｒとは、ＨＮ蛋白質の２６４番目のアミノ酸ＧｌｙがＡｒｇに置換された変異、Ｋ４６１Ｇとは、ＨＮ蛋白質の４６１番目のアミノ酸ＬｙｓがＧｌｙに置換された変異を言う。すなわち、センダイウィルスＨＮ蛋白質のＡ２６２、Ｇ２６４、およびＫ４６１あるいは他のウィルスＨＮ蛋白質の相同部位を、それぞれＴｈｒ（Ｔ）、Ａｒｇ（Ｒ）、およびＧｌｙ（Ｇ）へ置換することができる。これらの変異は組み合わせて有していることが好ましく、特にこれらの３つの変異の全てを保持していることがより好ましい。
また、例えば、ムンプスウィルスにおいては、温度感受性の性質を示しワクチンとして使用されているＵｒａｂｅ  ＡＭ９株（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，６７；４９−５７（２０００））を参考に、ＨＮ蛋白の４６４及び４６８番目のアミノ酸に変異導入することは本発明において好ましい。これと相同な位置のアミノ酸の変異は、他の（−）鎖ＲＮＡウィルスにも適用することができる。
特に、温度感受性Ｍ遺伝子を保持する（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターにおいては、Ｆ遺伝子を欠損していることが好ましい。また、温度感受性Ｍ遺伝子を保持するＦ遺伝子欠損型ベクターは、さらにＨＮ遺伝子に温度感受性変異を有することがより好ましい。本発明において、温度感受性Ｍおよび温度感受性ＨＮ遺伝子を保持するＦ遺伝子欠失型（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、Ｆ蛋白質発現ヘルパー細胞を用いて許容温度でウィルスベクターを再構成させることにより、高力価のベクターを製造することが可能であり、製造されたベクターは、ウィルス様粒子の放出が有意に減少していることが実証された。なお、本発明において遺伝子の「欠損」とは、該遺伝子の機能的な遺伝子産物（蛋白質をコードする遺伝子であれば蛋白質）が実質的に発現されないことを言う。対象遺伝子に関してｎｕｌｌの表現型を示す場合は、該遺伝子を欠損していることに含まれる。遺伝子欠損には、遺伝子が欠失していること、転写開始配列等の変異により当該遺伝子が転写されないこと、フレームシフトまたはコドンの変異等により機能的蛋白質が産生されないこと、アミノ酸変異等により発現される蛋白質の活性が実質的に失われる［または非常に（例えば１／１０以下に）低下する］こと、および蛋白質への翻訳が起こらない［または非常に（例えば１／１０以下に）低下する］ことなどが含まれる。
また本発明は、（−）鎖ＲＮＡウィルスのＰ遺伝子またはＬ遺伝子に持続感染を促進する変異を有する組み換えウィルスに関する。このような変異としては、具体的には、ＳｅＶ  Ｐ蛋白質の８６番目のＧｌｕ（Ｅ８６）の変異、ＳｅＶ  Ｐ蛋白質の５１１番目のＬｅｕ（Ｌ５１１）の他のアミノ酸への置換、または他の（−）鎖ＲＮＡウィルスＰ蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、上記と同様、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えば、上記したように異なるグループのアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、Ｅ８６のＬｙｓへの置換（Ｅ８６Ｋ）、Ｌ５１１のＰｈｅへの置換（Ｌ５１１Ｆ）などが例示できる。またＬ蛋白質においては、１１９７番目のＡｓｎ（Ｎ１１９７）および／または１７９５番目のＬｙｓ（Ｋ１７９５）の他のアミノ酸への置換、または他の（−）鎖ＲＮＡウィルスＬ蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。Ｌ蛋白質のこれら２つの変異の両方を有するＬ蛋白質遺伝子は特に好ましい。アミノ酸変異は、やはり所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、上記と同様、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えば、上記したように異なるグループのアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、Ｎ１１９７のＳｅｒへの置換（Ｎ１１９７Ｓ）、Ｋ１７９５のＧｌｕへの置換（Ｋ１７９５Ｅ）などが例示できる。Ｐ遺伝子とＬ遺伝子の変異は、両方持っていることで、持続感染性、２次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、上記のＨＮ蛋白質および／またはＭ蛋白質の温度感受性変異遺伝子を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。Ｍおよび／またはＨＮ遺伝子に温度感受性変異の少なくとも１つを、そしてＰおよび／またはＬ遺伝子に持続感染型の変異の少なくとも１つを有する組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスが好ましく、特にＭ、ＨＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子の４遺伝子の全てに変異を有するウィルスがより好ましい。特にＭおよびＨＮ遺伝子のそれぞれに上記の３箇所のアミノ酸（ＳｅＶにおいてはＭのＧ６９、Ｔ１１６、およびＡ１８３、ＨＮのＡ２６２、Ｇ２６４、およびＫ４６１）に変異を、かつＰ遺伝子に上記の２箇所の変異（ＳｅＶにおいてはＥ８６またはＬ５１１）のうち少なくともどちらかを、さらにＬ遺伝子に上記の２箇所の変異（ＳｅＶにおいてはＮ１１９７およびＫ１７９５）を持つウィルスは最も好ましい。また、これらのＰ遺伝子および／またはＬ遺伝子に変異を有する組み換えウィルスは、（−）鎖ＲＮＡウィルスのスパイク蛋白質遺伝子、例えばＦ遺伝子を欠損することが好ましい。Ｆ遺伝子を欠失させ、Ｆ蛋白質を発現するＦヘルパー細胞を用いてウィルスを製造することによって、標的細胞に感染後に増殖せず、２次粒子形成が劇的に抑制され、細胞傷害性が低下したウィルスベクターを得ることが可能である。このベクターは、野生型のＰまたはＬ遺伝子を持つベクターに比べ、導入遺伝子をより長期間にわたって発現できる。これら本発明のウィルスは、遺伝子導入における細胞傷害性を減弱させるために、また遺伝��導入における導入遺伝子の発現レベルの低下を抑制するために、また遺伝子導入においてウィルスを導入した細胞からのウィルス粒子およびウィルス様粒子（ＶＬＰ）の放出を抑制するために有用である。
本発明は、本明細書に記載した、ウィルス遺伝子（例えばＭ、ＨＮ、Ｐ、またはＬ遺伝子あるいはそれらの組み合わせ）に変異または欠損を有するウィルスを細胞に導入する工程を含む、遺伝子導入における細胞傷害性を減弱させる方法を提供する。また本発明は、該ウィルスを細胞に導入する工程を含む、遺伝子導入における導入遺伝子の発現レベルの低下を抑制する方法を提供する。さらに本発明は、該ウィルスを細胞に導入する工程を含む、遺伝子導入においてウィルスを導入した細胞からのウィルス様粒子（ＶＬＰ）の放出を抑制する方法を提供する。細胞傷害性は、例えば実施例に記載したようなＬＤＨの放出を定量することにより測定することができる。また導入遺伝子の発現レベルは、導入遺伝子断片をプローブまたはプライマーに用いたノーザンハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲ、または導入遺伝子産物に対する抗体を用いた免疫沈降またはウェスタンブロット解析、あるいは導入遺伝子産物の活性の測定などにより決定することができる。ウィルス様粒子（ＶＬＰ）の放出は、例えば実施例に示したＨＡ活性の測定で知ることができるほか、細胞外液を回収し、細胞へのトランスフェクションしてＶＬＰに含まれる遺伝子を発現を測定することにより、溶液中に含まれるウィルス様粒子を定量することができる。細胞傷害性の減弱、導入遺伝子の発現レベルの低下、およびウィルス様粒子（ＶＬＰ）の放出の抑制は、当該変異または欠損がないウィルスと比べて、例えば統計学的に有意（例えば有意水準５％またはそれ以下の％値）に低下（または抑制）していることが好ましい。統計学的な検定は、例えばスチューデントのｔ検定またはマンホイットニーＵ検定などにより行うことができる。好ましくは、該抑制または低下は元のウィルスに比べ９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、または６０％以下に抑制または低下されているものであり、より好ましくは１／２以下、さらに好ましくは１／３以下、１／５以下、または１／８以下に抑制または低下している。
また本発明は、本明細書に記載したウィルス遺伝子に変異または欠損を有するウィルスの、遺伝子導入における細胞傷害性を減弱させるための使用、遺伝子導入における導入遺伝子の発現レベルの低下を抑制するための使用、および遺伝子導入においてウィルスを導入した細胞からのウィルス様粒子（ＶＬＰ）の放出を抑制するための使用を提供する。これらのウィルスは、遺伝子導入における細胞傷害性を減弱させるために用いるウィルス、遺伝子導入における導入遺伝子の発現レベルの低下を抑制するために用いるウィルス、または遺伝子導入においてウィルスを導入した細胞からのウィルス様粒子（ＶＬＰ）の放出を抑制するために用いるウイルスとなる。
本発明において、（−）鎖ＲＮＡウィルスとは、（−）鎖をゲノムに持つＲＮＡウィルスを言う。本発明において（−）鎖ＲＮＡウィルスは、好ましくは非分節型（−）鎖ＲＮＡウィルス、すなわち（−）鎖をゲノムに持つ一本鎖ＲＮＡウィルスである。（−）鎖ＲＮＡウィルスとしては、例えばパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のセンダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウィルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウィルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、オルトミクソウィルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のインフルエンザウィルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ラブドウィルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）の水疱性口内炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウィルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。本発明において、（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、より好ましくは非分節型の（−）鎖ＲＮＡウィルスであり、さらに好ましくはパラミクソウィルスである。
本発明において特に好ましい（−）鎖ＲＮＡウィルスには、例えばＳｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）、ｓｉｍｉａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５（ＳＶ５）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）、およびＮｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）などが含まれる。より好ましくは、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）からなる群より選択されるウィルスが例示できる。
これらのウィルスがコードするウィルス遺伝子は知られている。アクセッション番号を例示すれば、Ｎ遺伝子については、ＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｘ７５９６１；ＨＰＩＶ−１，Ｄ０１０７０；ＨＰＩＶ−２，Ｍ５５３２０；ＨＰＩＶ−３，Ｄ１００２５；Ｍａｐｕｅｒａ，Ｘ８５１２８；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７２；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ０６４０９１；ＰＤＰＲ，Ｘ７４４４３；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｘ０００８７；ＳＶ５，Ｍ８１４４２；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｐ遺伝子については、ＣＤＶ，Ｘ５１８６９；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１，Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｘ０４７２１；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｍ５５９７５；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｍ５５９７６；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７３；ＭＶ，Ｍ８９９２０；ＮＤＶ，Ｍ２０３０２；ＰＤＶ，Ｘ７５９６０；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｍ３０２０２；ＳＶ５，ＡＦ０５２７５５；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｃ遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１．Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｄ０００４７；ＭＶ，ＡＢ０１６１６２；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，ＡＢ００５７９６；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｍ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ１２６６９；ＤＭＶ  Ｚ３００８７；ＨＰＩＶ−１，Ｓ３８０６７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６２７３４；ＨＰＩＶ−３，Ｄ００１３０；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ１０２４１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ１０２４２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７１；ＭＶ，ＡＢ０１２９４８；ＮＤＶ，ＡＦ０８９８１９；ＰＤＰＲ，Ｚ４７９７７；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｍ３４０１８；ＳｅＶ，Ｕ３１９５６；およびＳＶ５，Ｍ３２２４８、Ｆ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ２１８４９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０４；ＨＰＮ−１．Ｍ２２３４７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６０１８２；ＨＰＩＶ−３．Ｘ０５３０３，ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ４９８２１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ４９８２２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１６９；ＭＶ，ＡＢ００３１７８；ＮＤＶ，ＡＦ０４８７６３；ＰＤＰＲ，Ｚ３７０１７；ＰＤＶ，ＡＪ２２４７０６；ＲＰＶ，Ｍ２１５１４；ＳｅＶ，Ｄ１７３３４；およびＳＶ５，ＡＢ０２１９６２、ＨＮ（ＨまたはＧ）遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ１１２１８９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０５；ＨＰＩＶ−１，Ｕ７０９４９８；ＨＰＩＶ−２．Ｄ０００８６５；ＨＰＩＶ−３，ＡＢ０１２１３２；ＨＰＩＶ−４Ａ，Ｍ３４０３３；ＨＰＩＶ−４Ｂ，ＡＢ００６９５４；Ｍｕｍｐｓ，Ｘ９９０４０；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ２０４８７２；ＰＤＰＲ，Ｚ８１３５８；ＰＤＶ，Ｚ３６９７９；ＲＰＶ，ＡＦ１３２９３４；ＳｅＶ，Ｕ０６４３３；およびＳＶ−５，Ｓ７６８７６が例示できる。但し、各ウィルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
本発明においてパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウィルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウィルスは、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウィルスのグループの１つで、パラミクソウィルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（レスピロウィルス属（パラミクソウィルス属とも言う）、ルブラウィルス属、およびモービリウィルス属を含む）およびニューモウィルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウィルス属およびメタニューモウィルス属を含む）を含む。本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、例えばパラミクソウィルス科のセンダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウィルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウィルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウィルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウィルス１，２，３型等が挙げられる。本発明のウィルスは、好ましくはパラミクソウィルス亜科（レスピロウィルス属、ルブラウィルス属、およびモービリウィルス属を含む）に属するウィルスであり、より好ましくはレスピロウィルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウィルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウィルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウィルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウィルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウィルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も、本発明のウィルスベクターを製造するための材料として使用することができる。（−）鎖ＲＮＡウィルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、ＤＮＡフェーズを持たないため染色体への組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は起こらない。このため染色体異常による癌化や不死化などの安全面における問題が生じない。この特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、ＳｅＶを連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２，４５７−４６６（１９９７））。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる���入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。ＳｅＶベクターは、外来遺伝子を４ｋｂ以上導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事が可能である。
また、センダイウィルスは齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、ヒトに対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウィルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５３３−５４０，１９９７）。更に特筆すべき利点として以下の２点、すなわち「高感染性」及び「高発現量」を挙げることができる。ＳｅＶベクターは細胞膜蛋白糖鎖のシアル酸に結合して感染するが、このシアル酸はほとんどの細胞で発現しており、このことが感染スペクトルを広くする、則ち高感染性に繋がっている。ＳｅＶのレプリコンをベースにした複製型ベクターは放出されたウィルスが周囲の細胞にも再感染し、感染細胞の細胞質で多コピーに複製されたＲＮＰが細胞の分裂に伴い娘細胞にも分配されるため持続発現が期待される。また、ＳｅＶベクターは非常に広い組織適用範囲を持つ。広範な感染性を有するということは、様々な種類の抗体治療（及び解析）に利用可能であることを示している。また、細胞質のみでの転写・複製という特徴的な発現機構であることから、搭載遺伝子の発現量が非常に高いことが示されている（Ｍｏｒｉｙａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２５（１）１０５−１１１（１９９８）；ＷＯ００／７００７０）。
本発明においてベクターとは、核酸を細胞に導入する担体である。また本発明において「（−）鎖ＲＮＡウィルスベクター」とは、（−）鎖ＲＮＡウィルスに由来し核酸を細胞に導入するベクター（担体）を指す。本発明の（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、感染力を持つウィルス粒子であってよい。ウィルス粒子とは、ウィルス蛋白質の働きにより細胞から放出される、核酸を含む微小粒子を言う。ウィルス粒子の形状はウィルスの種類により球状、棍棒状など様々であってよいが、細胞より十分に小さく、その大きさは通常１０ｎｍ〜８００ｎｍ程度である。パラミクソウィルスのウィルス粒子は、ゲノムＲＮＡとウィルス蛋白質を含む上記ＲＮＰが細胞膜由来の脂質膜（エンベロープという）に含まれた構造をしている。アミノ酸置換を含む変異ウィルス蛋白質（実施例に記載の変異Ｍ、ＨＭ、Ｐ、またはＬ蛋白質など）をコードする遺伝子をゲノムに持つウィルスにおいては、ウィルスベクターは（−）鎖ＲＮＡウィルスのゲノムＲＮＡとウィルス蛋白質からなる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）であってよい。ＲＮＰは、例えば所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて標的とする細胞に導入することができる。このようなＲＮＰは、具体的には（−）鎖ＲＮＡウィルスのゲノムＲＮＡ、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質を含む複合体である。ＲＮＰは細胞内に導入されると、ウィルス蛋白質の働きによりゲノムＲＮＡからウィルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘ＲＮＰが形成される。ゲノムＲＮＡの複製は、該ＲＮＡのコピー数の増加をＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーション等により検出することにより確認することができる。「感染力」とは、組換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターが細胞への接着能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベクター内部の遺伝子を導入することのできる能力のことを言う。好ましい態様では、（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、外来遺伝子を発現することができるように保持する。本発明における（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、Ｍ蛋白質の細胞表面の凝集が低下または消失し、粒子形成が抑制されるため、野生型ウィルスのような複製能を有さない。「複製能」とは、ウィルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウィルスが複製され、感染性ウィルス粒子が産生される能力を指す。宿主細胞としては、例えばＬＬＣ−ＭＫ２またはＣＶ−１等が挙げられる。
（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、（−）鎖ＲＮＡウィルスのゲノムＲＮＡを含んでいる。ゲノムＲＮＡとは、（−）鎖ＲＮＡウィルスのウィルス蛋白質と共にＲＮＰを形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、該核酸が複製して娘ＲＮＰが形成される機能を持つＲＮＡを言う。（−）鎖ＲＮＡウィルスは（−）鎖（ネガティブ鎖）ＲＮＡをゲノムに持つウィルスであるので、このようなＲＮＡは搭載遺伝子をアンチセンスとしてコードしている。一般に（−）鎖ＲＮＡウィルスのゲノムは、３’リーダー領域と５’トレイラー領域の間に、ウィルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のＯＲＦの間には、転写終結配列（Ｅ配列）−介在配列（Ｉ配列）−転写開始配列（Ｓ配列）が存在し、これにより各遺伝子のＯＲＦをコードするＲＮＡが別々のシストロンとして転写される。本発明のウィルスに含まれるゲノムＲＮＡは、該ＲＮＡにコードされる遺伝子群の発現およびＲＮＡ自身の自律的な複製に必要なウィルス蛋白質であるＮ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、およびＬ（ラージ）あるいはこれらの変異蛋白質をアンチセンスにコードしている。好ましい態様では、該ＲＮＡは、ウィルス粒子の形成に必要なＭ（マトリックス）蛋白質をコードしていないか、あるいは変異Ｍ蛋白質をコードしている。さらに該ＲＮＡは、ウィルス粒子の感染に必要なスパイク蛋白質をコードしていてもよく、していなくてもよい。好ましい態様では、該ＲＮＡはスパイク蛋白質の少なくとも１つに変異を有するか、あるいは少なくとも１つの蛋白質をコードしていない。パラミクソウィルスのスパイク蛋白質としては、細胞膜融合を起こす蛋白質であるＦ（フュージョン）蛋白質および細胞への接着に必要なＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）蛋白質が挙げられる。
「組み換え」体とは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成した化合物または組成物を言う。組み換えポリヌクレオチドとは、自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。すなわち、人為的にポリヌクレオチド鎖がつなぎ替えられたり、あるいは合成されたポリヌクレオチドなどが含まれる。本明細書において、「組み換え」（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターとは、遺伝子操作により構築された（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターまたはそれを増幅して得られる（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを言う。組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、例えば、組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを再構成して生成することができる。
例えばパラミクソウィルスのウィルス蛋白質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子が挙げられる。「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
2003025570.tif 000002
例えばパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のレスピロウィルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。
本発明において「遺伝子」とは遺伝物質を指し、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸が含まれる一般に、遺伝子は蛋白質をコードしてもよく、また蛋白質をコードしていなくてもよい。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするＯＲＦをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。
本発明において検査または製造される（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターとしては、特に制限はない。好適な（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターとして、例えば、Ｍ蛋白質の細胞表面の凝集の低下または消失が持続的に相補される条件下で複製能を示し、自立的に増殖するようなベクターが挙げられる。例えば、一般に天然型パラミクソウィルスのゲノムは、３’の短いリーダー領域に続き、Ｎ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、Ｍ（マトリックス）、Ｆ（フュージョン）、ＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）、およびＬ（ラージ）蛋白質をコードする６つの遺伝子が並んでおり、短い５’トレイラー領域を他端に有する。これと同様の構造を有するゲノムを設計することにより、自律複製可能なパラミクソウィルスベクターを製造することができる。例えばこれらの遺伝子のいずれかに変異や欠失を有することによりＭ蛋白質の局在を低下または消失させるウィルスのゲノムや、またはＭ蛋白質の局在を低下または消失させる他の遺伝子を持つウィルスゲノムを構築し、これを相補する条件下でゲノムを転写させてウィルスの再構成を行う。ゲノム内に外来遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子を発現するベクターを製造することができる。なお、本発明における（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、ベクター上のウィルス遺伝子の配置は野生型ウィルスから改変されていてもよい。
本発明における粒子形成能が低下または消失したウィルスベクターは、保持するウィルス遺伝子をさらに欠失させたりまたは変異させてもよい。例えば、Ｍ遺伝子に温度感受性変異を有していたり、あるいはＭ遺伝子が欠失することにより粒子形成能が低下または消失したウィルスベクターは、さらにＨＮおよび／またはＦ遺伝子、あるいはその他のウィルス遺伝子に変異を有していたり、あるいは欠失していることもできる。例えば、実施例に記載のように、温度感受性Ｍ遺伝子を持つベクターにおいて、ＨＮ遺伝子および／またはＦ遺伝子等にも温度感受性変異を有していたり、あるいはＦおよび／またはＨＮ遺伝子が欠失しているベクターを、本発明に従って製造することができる。また、Ｍ遺伝子を欠失したベクターにおいて、さらにＦおよび／またはＨＮ遺伝子を欠失していたり、あるいはＦおよび／またはＨＮ遺伝子に温度感受性変異等の変異を有するベクターを製造することもできる。これらのベクターを再構成させるには、温度感受性変異を持つ場合においては許容温度において再構成を行う。また、遺伝子を欠失または欠損する場合においては、正常な機能を有する遺伝子産物をトランスに供給して再構成を行う。例えば、これらの遺伝子産物をコードする遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞にベクターゲノムをコードする発現ベクターを導入して発現させ、該宿主細胞内において該遺伝子産物を供給してベクターの再構成を行うことができる。これらの遺伝子産物のアミノ酸配列は、ウィルス由来の配列そのままでなくとも、産生されるウィルスベクターの核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウィルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、ベクターゲノムが由来するウィルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むベクターを作製することもできる。例えば、ウィルス再構成の際に、ベクターのベースとなるウィルスのゲノムがコードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有するウィルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。例えば、他のウィルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明における（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターには、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質などのように、ゲノムが由来するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウィルスベクターが含まれる。
また、本発明における（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウィルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。これらはウィルスゲノムにコードされていてもよいし、ウィルスベクターの再構成時に、ウィルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体などの遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また、本発明における（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、例えばベクターに由来するウィルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウィルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されたものであってもよい。具体的には、例えばパラミクソウィルスベクターにおいては、複製因子であるＮＰ遺伝子、Ｐ／Ｃ遺伝子およびＬ遺伝子の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、膜融合に関わるＦ蛋白質を改変することにより、膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質やＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウィルスベクターを作製することもできる。
また本発明における（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子導入用ウィルスベクターとして特に好適である。
本発明のウィルスベクターは、ゲノムＲＮＡ中に外来遺伝子をコードし得る。外来遺伝子を含む組換えウィルスベクターは、上記のウィルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、標的とする細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、また天然型蛋白質と同等の機能を有する蛋白質をコードする限り、欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。あるいは、天然型蛋白質の欠失型や人工的な蛋白質などであってもよい。例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、該ウィルスベクターＤＮＡに対象となる疾患の治療用遺伝子を挿入する。ウィルスベクターＤＮＡに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウィルスベクターＤＮＡにおいては、転写終結（Ｅ）配列と転写開始（Ｓ）配列との間などに、６の倍数の塩基数を有する配列を挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，１９９３，ｐ．４８２２−４８３０）。外来遺伝子は、ウィルスの各遺伝子（例えばＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子）の前および／または後ろに挿入することができる。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜Ｅ−Ｉ−Ｓ配列（転写開始配列−介在配列−転写終結配列）またはその部分を挿入し、各遺伝子の間にＥ−Ｉ−Ｓ配列のユニットが配置されるようにする。あるいは、ＩＲＥＳを介して外来遺伝子を挿入し得る。
挿入した遺伝子の発現量は、その遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（国際公開番号ＷＯ０１／１８２２３）。また、遺伝子挿入の位置、および遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、センダイウィルスにおいては、挿入位置がウィルスゲノムのネガティブ鎖ＲＮＡの３’端に近いほど（野生型ウィルスのゲノム上の遺伝子配置においては、ＮＰ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が高い。挿入遺伝子の高い発現を得るためには、挿入遺伝子をＮＰ遺伝子の上流（マイナス鎖においては３’側）またはＮＰ遺伝子とＰ遺伝子の間など、上流領域（ネガティブ鎖ゲノムにおいて３’側）に挿入することが好ましい。逆に、挿入位置がネガティブ鎖ＲＮＡの５’端に近いほど（野生型ウィルスのゲノム上の遺伝子配置においては、Ｌ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も５’側、すなわち野生型ウィルスゲノムにおいてはＬ遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の５’隣接部位）、またはＬ遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の３’隣接部位）に外来遺伝子を挿入する。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。例えば、高力価ウィルスベクターの投与による導入遺伝子の高発現が毒性を示す場合は、投与するウィルス力価を制限することができる他、例えばベクターにおける挿入遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖ゲノムのなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、個々のウィルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な治療効果が得られるようにすることも可能である。
一般に、細胞毒性を示さない限りにおいて、外来遺伝子の高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。好適なベクターの例としては、外来遺伝子が、（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターのネガティブ鎖ゲノムにおいて、該ウィルスが持つウィルス蛋白質遺伝子のいずれよりも３’側に配置されているベクターが挙げられる。例えばＮ遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてＮ遺伝子コード配列の３’側）に外来遺伝子が挿入されたベクターが好ましい。あるいは、Ｎ遺伝子のすぐ下流に挿入してもよい。Ｍおよび／またはＦ遺伝子等のウィルス遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域に外来遺伝子を挿入することができる。
外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、ゲノムをコードするベクターＤＮＡ中の挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。また、本発明における（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、このように挿入した以外の位置に他の外来遺伝子を保持するものでもよい。
（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを製造するには、哺乳動物細胞において（−）鎖ＲＮＡウィルスのゲノムＲＮＡを含むＲＮＰの再構成に必要なウィルス蛋白質、すなわちＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下、（−）鎖ＲＮＡウィルスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを転写させる。転写によりネガティブ鎖ゲノム（すなわちウィルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはポジティブ鎖（ウィルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウィルスＲＮＰを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはポジティブ鎖を生成させる。ＲＮＡ末端は、天然のウィルスゲノムと同様に３’リーダー配列と５’トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の５’端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を利用し、該ＲＮＡポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の３’端を制御するには、例えば転写産物の３’端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に３’端が切り出されるようにすることができる（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）。
例えば外来遺伝子を有する組み換えセンダイウィルスベクターは、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
外来遺伝子を組み込む場合は、まず、目的の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、外来遺伝子を、ＮｏｔＩ部位を利用してウィルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡに挿入する場合を例にとって説明する。目的とするｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅回収する。２つのプライマーの５’部分にＮｏｔＩ部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端をＮｏｔＩ部位とする。ウィルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子のＯＲＦとその両側のウィルス遺伝子のＯＲＦとの間にＥ−Ｉ−Ｓ配列のユニットが配置されるように、プライマー中にＥ−Ｉ−Ｓ配列（または挿入部位によってはその部分）を含めるようにする。
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、Ｅ−Ｉ−Ｓ配列を含む最終的なＰＣＲ増幅産物のＮｏｔＩ断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ  ｏｆ  ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。さらに挿入断片の３’側にセンダイウィルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１）、Ｉ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＡＡＧ−３’、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：２）、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終始コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とする。
ＰＣＲは、例えば、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくはＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）、より好ましくはＰｆｕポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて行い、増幅した目的断片はＮｏｔＩで消化した後、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、ゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組み換えセンダイウィルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウィルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６，１９９７；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７）。例えば、まずＮｏｔＩ制限部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）（配列番号：３）を、クローニングされたセンダイウィルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮ蛋白質をコードするＯＲＦとの間に挿入し、デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム鎖（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒａｎｄ）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）。
例えば、Ｍ遺伝子を欠損させたり、あるいはＭ遺伝子へ温度感受性変異を導入する場合、（−）鎖ＲＮＡウィルス全長ゲノムｃＤＮＡを制限酵素で消化して、Ｍ遺伝子を含むフラグメントを回収し、適当なプラスミドにクローニングする。Ｍ遺伝子の変異またはＭ遺伝子欠損部位の構築はこのプラスミド上で行う。変異導入には、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）などを利用してＫｉｔに記載の方法に従って実施することができる。Ｍ遺伝子の欠損または欠失のためには、例えばＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、Ｍ遺伝子のＯＲＦ全部または一部を欠失させ、適宜適当なスペーサー配列で連結することができる。目的のＭ遺伝子の変異体または欠損体が得られたら、これを含むフラグメントを回収し、もとの全長ゲノムｃＤＮＡのＭ遺伝子と置換することにより、温度感受性変異Ｍ遺伝子を持つウィルスゲノムｃＤＮＡなどを調製することができる。同様の方法で、例えばＦおよび／またはＨＮ遺伝子等に変異を導入することができる。
（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターのゲノムをコードするＤＮＡを転写させ、細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件下でベクターを再構成させることにより、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを製造することができる。本発明は、本発明の粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの製造方法に適用するための、（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターのゲノムをコードするＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明の粒子形成能が低下または消失した組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの製造方法に適用するための、該ベクターのゲノムをコードするＤＮＡの使用に関する。ウィルスベクターＤＮＡからのウィルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（国際公開９７／１６５３９号；国際公開９７／１６５３８号；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダーペストウィルス、センダイウィルスなどを含む（−）鎖ＲＮＡウィルスまたはウィルス成分となるＲＮＰをＤＮＡから再構成させることができる。
組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、具体的には、（ａ）（−）鎖ＲＮＡウィルスに由来するネガティブ鎖ＲＮＡまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするベクターＤＮＡを、ＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞（ヘルパー細胞）で転写させる工程、（ｂ）該細胞あるいは該細胞から得られたウィルスベクターまたはそのＲＮＰ成分を導入した細胞を、細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失（例えばＭ蛋白質の細胞表面の凝集の低下または消失）を持続的に相補する条件下で培養し、その培養上清からウィルス粒子を回収する工程、により製造することができる。ベクターＤＮＡから転写されたＲＮＡはＮＰ、Ｌ、およびＰ蛋白質とＲＮＰ複合体を形成し、さらに工程（ｂ）においてエンベロープ蛋白質を含む外殻に包まれたウィルス粒子が形成する。本発明においては、工程（ｂ）における培養を低温、すなわち３５℃以下、より好ましくは３４℃以下、さらに好ましくは３３℃以下、最も好ましくは３２℃またはそれ以下で行うことが好ましい。
上記の細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件で培養するとは、具体的には、温度感受性変異蛋白質を用いる場合であれば許容温度で培養することである。また、遺伝子欠損（または欠失）変異を持つウィルスの製造であれば、例えば、その遺伝子の野生型またはそれと同等の機能を有する遺伝子を持続的に発現させた条件下で培養すること、より具体的には、例えばヘルパー細胞の染色体に組み込まれた該遺伝子の野生型またはそれと同等の機能を有する遺伝子が発現する条件下で培養することである。
ヘルパー細胞で発現させる、ウィルスゲノムをコードするＤＮＡ（ベクターＤＮＡ）は、ゲノムのマイナス鎖（ネガティブ鎖ＲＮＡ）またはその相補鎖（ポジティブ鎖ＲＮＡ）をコードしている。例えば、ネガティブ鎖ＲＮＡまたはその相補鎖をコードするＤＮＡをＴ７プロモーターの下流に連結させ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡに転写させる。プロモータとしては、Ｔ７ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させたＲＮＡをヘルパー細胞にトランスフェクトしてもよい。細胞内で転写させる鎖は、ウィルスゲノムのポジティブ鎖でもネガティブ鎖でもよいが、ポジティブ鎖が転写されるようにすることが再構成の効率を上げるためには好ましい。
例えば、ベクターＤＮＡを細胞内に導入する方法には、次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％  ＣＯ２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＢ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｄ−９８８５  Ｍ．Ｗ．５×１０５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼や▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのＤＮＡの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ  Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられるが、これらに制限されない。
ｃＤＮＡからのウィルスベクターの再構成は具体的には例えば次のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿等で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２を７０〜８０％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ  ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下ＵＶ照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）を２ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間は適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜２０μｇの粒子形成能が低下または消失した組換えセンダイウィルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、ウィルスＲＮＰの生成に必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド（０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５〜１２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ、より好ましくは例えば１μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする発現ベクターの量比は２：１：２とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５〜２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ程度で適宜調整する。粒子形成させるために必要な遺伝子を、ここで共にトランスフェクションすれば、形成したウィルス粒子がヘルパー細胞に再感染してウィルスをより増幅させることができる。トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＲＮＰを含む破砕物を再度ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションして、細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件下で培養する。この過程では、ウィルス粒子形成が遂行し、ウィルスが増幅する。または、培養上清を回収し、ウィルス産生用細胞の培養液に添加して感染させ培養する。細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件下で培養３〜７日後に培養液を回収する。
ＲＮＰのトランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。
エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損したウィルスベクターを再構成させるには、エンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞をエンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞に重層し、細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件下で培養することによってウィルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。あるいは、上記の凍結融解による細胞破砕物を１０日齢の発育鶏卵の尿膜内へ接種し、細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件下で維持し、約３日後に、尿液を回収してもよい。培養上清または尿液に含まれるウィルス力価は赤血球凝集活性（ＨＡ）を測定することにより決定することができる。ＨＡは「ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ希釈法」（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆  Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）により決定することができる。混入し得るＴ７ポリメラーゼ発現ワクシニアウィルスを除去するために、得られた尿液試料を適宜希釈（例えば１０６倍）して、細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件下で鶏卵で再増幅させることができる。再増幅は、例えば３回上繰り返すことができる。得られたウィルスストックは−８０℃で保存することができる。
回収されたウィルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｕｎｉｔ）測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）の測定することにより決定することができる（ＷＯ００／７００７０；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆  Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）。また、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーの指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばＧＦＰ−ＣＩＵとして）。このようにして測定した力価は、ＣＩＵと同等に扱うことができる（ＷＯ００／７００７０）。
ウィルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウィルスベクター等の再構成においては、サル腎由来ＬＬＣ  ＭＫ２細胞およびＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、その蛋白質をエンベロープに含む感染性ウィルス粒子を得ることもできる。また、大量にウィルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウィルスベクターを発育鶏卵に感染させ、細胞におけるＭ蛋白質の局在の低下または消失を持続的に相補する条件下で該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウィルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウィルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウィルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、増幅する組み換えウィルスにより変わり得る。その後、ウィルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのウィルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウィルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。
具体的には、例えば細胞におけるＭ蛋白質の局在が低下または消失する温度感受性変異Ｍ遺伝子を保持する組み換え（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを再構成させるには、（ａ）該（−）鎖ＲＮＡウィルスに由来するネガティブ鎖ＲＮＡまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするベクターＤＮＡを、ＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞（ヘルパー細胞）で転写させる工程、（ｂ）該細胞あるいは該細胞から得られたウィルスベクターまたはそのＲＮＰ成分を導入した細胞を、許容温度以下で培養し、その培養上清からウィルス粒子を回収する工程、により製造することができる。本発明においては、特に工程（ｂ）における培養を許容温度以下であり、かつ３５℃以下、より好ましくは３４℃以下、さらに好ましくは３３℃以下、最も好ましくは３２℃またはそれ以下で行うことが好ましい。
また、Ｍ蛋白質を欠失した（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことができる。
〈１〉Ｍ欠失型（−）鎖ＲＮＡウィルスゲノムｃＤＮＡおよびＭ発現プラスミドの構築
（−）鎖ＲＮＡウィルス全長ゲノムｃＤＮＡを制限酵素で消化して、Ｍ遺伝子を含むフラグメントを回収し、ｐＵＣ１８にクローニングする。Ｍ欠損部位の構築はこのプラスミド上で行う。Ｍ遺伝子の欠損は、ＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＭ遺伝子のＯＲＦを除いて適当なスペーサー配列で連結し、Ｍ欠失型ゲノムｃＤＮＡを構築する。Ｍ遺伝子の上流および下流のゲノムをコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、これらを連結して全長Ｍ欠失型（−）鎖ＲＮＡウィルスゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドを得る。外来遺伝子は、例えばＭ欠失部位にある制限酵素部位に挿入することができる。
〈２〉（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
例えば（−）鎖ＲＮＡウィルスのＭ遺伝子の誘導的な発現が可能なベクターを構築するため、誘導性プロモーターまたはＣｒｅ／ｌｏｘＰなどの組み換えによる発現制御系などを利用する。（−）鎖ＲＮＡウィルスのＭ遺伝子を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築は（−）鎖ＲＮＡウィルスＭ遺伝子をＰＣＲで増幅し、例えば、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，１９９８，ｐ１１１５−１１２１）のユニークサイトＳｗａＩ部位に増幅産物を挿入する。
Ｍ欠損ゲノムから感染ウィルス粒子を回収するため、Ｍ蛋白を持続的に高発現可能なヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞等を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％  ＣＯ２で培養する。Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼによりＭ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入を行う。
例えば、１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのＭ発現プラスミドをトランスフェクション後、１０ｍｌの１０％  ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ  １枚、２ｍｌ  ２枚、０．２ｍｌ  ２枚に蒔き、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
ヘルパー細胞においてＭ蛋白質が高発現することが、高力価のウィルスを回収するためには重要である。そのためには、例えば上記のＭ発現細胞の選択を２回またはそれ以上行うことが好ましい。例えばある薬剤耐性マーカー遺伝子を持つＭ発現プラスミドをトランスフェクションし、その薬剤を用いてＭ遺伝子を保持する細胞を選択した後、別の薬剤耐性マーカー遺伝子を持つＭ発現プラスミドを再度、この細胞にトランスフェクションしこの別の薬剤耐性マーカーで細胞を選択することにより、１回目のトランスフェクションで選択された細胞よりも、さらにＭ蛋白質を高発現できる細胞を選択することが可能である。このように、２回のトランスフェクションを経て構築されたＭヘルパー細胞を好適に用いることができる。Ｍヘルパー細胞は、同時にＦ遺伝子も発現することにより、ＦおよびＭ遺伝子の両方を欠損する感染性ウィルス粒子を産生させることができる（実施例参照）。この場合、Ｆ遺伝子の発現プラスミドも２回以上トランスフェクションし、Ｆ蛋白質の発現誘導レベルをより高めることが好ましい。
Ｍ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、例えば、アデノウィルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１（１９９５）；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））により、好ましくはｍｏｉ＝３程度で感染させて行う。
〈３〉Ｍ欠失ウィルスの再構築及び増幅
野生型Ｍ蛋白質またはそれと同等の蛋白質を発現する細胞（Ｍヘルパー細胞）を用いて組み換えＭ欠失型（−）鎖ＲＮＡウィルス粒子を産生させるには、この細胞内にＭ欠失型（−）鎖ＲＮＡウィルスのＲＮＰを導入または形成させればよい。ＲＮＰの導入は、例えばＲＮＰを含む細胞溶解物などをＭヘルパー細胞にトランスフェクションしてもよいし、あるいはＲＮＰを産生する細胞とＭヘルパー細胞とを共培養することによっても、細胞融合によりＭヘルパー細胞にＲＮＰを導入することができる。あるいは、Ｍヘルパー細胞内で、ゲノムＲＮＡを転写させ、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下でＲＮＰを新規に形成させてもよい。Ｍ欠失型（−）鎖ＲＮＡウィルスゲノムｃＤＮＡからの組み換えウィルスベクターの再構成は、具体的には、（ａ）（−）鎖ＲＮＡウィルスに由来する、Ｍ遺伝子を欠失したネガティブ鎖ＲＮＡまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするベクターＤＮＡを、ＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞（ヘルパー細胞）で転写させる工程、（ｂ）該細胞あるいは該細胞から得られたウィルスベクターまたはそのＲＮＰ成分を導入した細胞を、該細胞あるいは該導入細胞の染色体に組み込まれたＭ遺伝子が発現する条件下で培養し、その培養上清からウィルス粒子を回収する工程、により製造することができる。本発明においては、特に工程（ｂ）における培養を許容温度以下であり、かつ３５℃以下、より好ましくは３４℃以下、さらに好ましくは３３℃以下、最も好ましくは３２℃またはそれ以下で行うことが好ましい。温度感受性変異Ｍ蛋白質を用いたベクター産生では、ウィルス粒子産生過程を許容温度以下で行うことが必要であるが、驚くべきことに、野生型Ｍ蛋白質を用いた本方法においても、ウィルス粒子を形成させる過程を低温で行うことで効率的な粒子形成を行わせることが可能であることが判明した。工程（ａ）においてＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現させるには、例えばこれらの蛋白質をコードする発現プラスミドを細胞にトランスフェクションすればよい。また、工程（ａ）において、Ｍ蛋白質を（Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子欠損型ウィルスの場合は、これらの遺伝子も）、ヘルパー細胞で発現させてもよい（実施例参照）。あるいは、工程（ｂ）で用いるＭ遺伝子が染色体に組み込まれた細胞を工程（ａ）において使用することも可能である。工程（ａ）で産生されたＲＮＰを工程（ｂ）の細胞の導入するには、例えば工程（ａ）の細胞を凍結融解により破砕し、これを工程（ｂ）の細胞に公知のトランスフェクション試薬を用いて導入することができる。
具体的には、例えば上記Ｍ欠失型（−）鎖ＲＮＡウィルスゲノムをコードするプラスミドを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりゲノムＲＮＡの転写を行わせる場合には、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍペトリ皿に蒔き、２４時間培養後、ソラレンと長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））に室温で１時間感染させる（ｍｏｉ＝２）（ｍｏｉ＝２〜３、好適にはｍｏｉ＝２が用いられる）。ワクシニアウィルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブを５本が装備されたＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ  ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），ストラタジーン社，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いる。細胞を３回洗浄してからゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、およびＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質（選択的にＭ蛋白質等も）を発現するプラスミドをＯｐｔｉＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（１μｇ  ＤＮＡ／５μｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を入れて混合し、室温で１０分間放置後、最終的に３％  ＦＢＳを含むＯｐｔｉＭＥＭ  ３ｍｌに入れ、細胞に添加して培養する。あるいは、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、およびそれぞれＮ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミド適当なリポフェクション試薬と用いてこの細胞にトランスフェクトしてもよい。プラスミドの量比は、例えば順に６：２：１：２：２：２とすることができるがこれに限定されない。３〜５時間培養後、細胞を、血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド  ４０μｇ／ｍｌ（ＡｒａＣ，Ｓｉｇｍａ），トリプシン  ７．５μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）を含むＭＥＭで２４〜７０時間培養する。ここで、約８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＭ蛋白を持続発現する細胞（Ｍヘルパー細胞）を重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養してもよい。これらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁する（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。凍結融解を３回繰り返してｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ）と混合し（１０６ｃｅｌｌｓ／２５μｌ  ＤＯＳＰＥＲ）室温で１５分放置した後、上記でクローニングしたＭ発現ヘルパー細胞にトランスフェクション（１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  １２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ  ＡｒａＣ，７．５μｇ／ｍｌ  トリプシンを含む）で培養し（好ましくは低温で）、上清を回収する。このとき、Ｌｉｐｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＤＯＳＰＥＲなどのトランスフェクション試薬の添加なしにトランスフェクションが可能である。さらにＦおよび／またはＨＮ蛋白質を欠失したウィルスベクターは、ゲノムからＦおよび／またはＨＮ遺伝子を欠失させ、ヘル���ー細胞でＦおよび／またはＨＮ蛋白質を共発現させることにより製造することができる。
本発明の方法によれば、本発明のウィルスベクターは、例えば１×１０５ＣＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上の力価でウィルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウィルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７（１），６５−７４（１９９０）；ＷＯ００／７００７０）。
Ｍ欠失型（−）鎖ＲＮＡウィルスゲノムｃＤＮＡから組み換えウィルスベクターを再構成させるためのより好ましい一態様としては、以下のような方法が挙げられる。すなわち、（ａ）（−）鎖ＲＮＡウィルスに由来する、Ｍ遺伝子を欠失したネガティブ鎖ＲＮＡまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするベクターＤＮＡを、感染性ウィルス粒子の形成に必要なウィルス蛋白質群（すなわちＮＰ、Ｐ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質）を発現する細胞（ヘルパー細胞）で転写させる工程、（ｂ）該細胞と、染色体に組み込まれたＭ遺伝子が発現する細胞（Ｍヘルパー細胞）を共培養する工程、（ｃ）該培養から細胞抽出物を調製する工程、（ｄ）該抽出物を染色体に組み込まれたＭ遺伝子が発現する細胞（Ｍヘルパー細胞）に導入して培養する工程、および（ｅ）該培養上清からウィルス粒子を回収する工程、を含む方法である。工程（ｄ）は上記の低温条件にて行うことが好ましい。得られたウィルス粒子は、再度Ｍヘルパー細胞に感染させて（好ましくは低温で）増幅することができる。具体的には、実施例の記載に従ってウィルスを再構成させることができる。
ウィルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウィルスゲノム上で欠損しているウィルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウィルス蛋白質が、他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、ウィルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウィルス遺伝子欠損型ウィルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウィルスは、ウィルス遺伝子が欠損しているため、ウィルス遺伝子を欠損していないウィルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
回収した（−）鎖ＲＮＡウィルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウィルスが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウィルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。（−）鎖ＲＮＡウィルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウィルスベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明の方法により製造されたウィルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与による遺伝子発現、間接（ｅｘ  ｖｉｖｏ）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。外来遺伝子としては特に制限はなく、蛋白質をコードする核酸に加え、例えば、アンチセンスまたはリボザイムなどの蛋白質をコードしない核酸であってもよい。
本発明の方法により製造された（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターは、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせて組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈して組成物とすることができる。（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターであれば、投与されるベクター量は好ましくは約１０５ＣＩＵ／ｍｌから約１０１１ＣＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０７ＣＩＵ／ｍｌから約１０９ＣＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は２×１０５ＣＩＵ〜２×１０１０ＣＩＵが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。（−）鎖ＲＮＡウィルスベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］温度感受性変異導入Ｆ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築
下記記載の温度感受性変異導入Ｆ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築のスキームを図１に表した。Ｆ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ：Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）をＮａｅＩで消化し、Ｍ遺伝子を含む断片（４９２２ｂｐ）をアガロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）で回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングした（ｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰの構築）。Ｍ遺伝子への温度感受性変異導入はこのｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰ上で、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。Ｍ遺伝子上への変異導入の種類はＫｏｎｄｏらが報告しているＣｌ．１５１  ｓｔｒａｉｎ（Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１９２４−２１９３０（１９９３））の配列を利用し、Ｇ６９Ｅ，Ｔ１１６Ａ及びＡ１８３Ｓの３箇所の変異導入を行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、Ｇ６９Ｅ（５’−ｇａａａｃａａａｃａａｃｃａａｔｃｔａｇａｇａｇｃｇｔａｔｃｔｇａｃｔｔｇａｃ−３’／配列番号：４，５’−ｇｔｃａａｇｔｃａｇａｔａｃｇｃｔｃｔｃｔａｇａｔｔｇｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｔｃ−３’／配列番号：５）、Ｔ１１６Ａ（５’−ａｔｔａｃｇｇｔｇａｇｇａｇｇｇｃｔｇｔｔｃｇａｇｃａｇｇａｇ−３’／配列番号：６，５’−ｃｔｃｃｔｇｃｔｃｇａａｃａｇｃｃｃｔｃｃｔｃａｃｃｇｔａａｔ−３’／配列番号：７）及びＡ１８３Ｓ（５’−ｇｇｇｇｃａａｔｃａｃｃａｔａｔｃｃａａｇａｔｃｃｃａａａｇａｃｃ−３’／配列番号：８，５’−ｇｇｔｃｔｔｔｇｇｇａｔｃｔｔｇｇａｔａｔｇｇｔｇａｔｔｇｃｃｃｃ−３’／配列番号：９）である。
Ｍ遺伝子上に３箇所の変異を有するｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰをＳａｌＩで消化後ＡｐａＬＩで部分消化を行い、全Ｍ遺伝子を含むフラグメント（２６４４ｂｐ）を回収した。一方でｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＡｐａＬＩ／ＮｈｅＩで消化してＨＮ遺伝子を含む断片（６２８７ｂｐ）を回収し、この２種の断片をＬｉｔｍｕｓ３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｌＩ／ＮｈｅＩサイトにサブクローニングした（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ＭｔｓΔＦＧＦＰの構築）。ＨＮ遺伝子への温度感受性変異導入はこのＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ＭｔｓΔＦＧＦＰ上で、Ｍ遺伝子への変異導入時と同様にＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。ＨＮ遺伝子上への変異導入の種類はＴｈｏｍｐｓｏｎらが報告しているｔｓ２７１  ｓｔｒａｉｎ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：１−８（１９８７））の配列を利用し、Ａ２６２Ｔ，Ｇ２６４Ｒ及びＫ４６１Ｇの３箇所の変異導入を行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、Ａ２６２Ｔ／Ｇ２６４Ｒ（５’−ｃａｔｇｃｔｃｔｇｔｇｇｔｇａｃａａｃｃｃｇｇａｃｔａｇｇｇｇｔｔａｔｃａ−３’／配列番号：１０，５’−ｔｇａｔａａｃｃｃｃｔａｇｔｃｃｇｇｇｔｔｇｔｃａｃｃａｃａｇａｇｃａｔｇ−３’／配列番号：１１）、及びＫ４６１Ｇ（５’−ｃｔｔｇｔｃｔａｇａｃｃａｇｇａａａｔｇａａｇａｇｔｇｃａａｔｔｇｇｔａｃａａｔａ−３’／配列番号：１２，５’−ｔａｔｔｇｔａｃｃａａｔｔｇｃａｃｔｃｔｔｃａｔｔｔｃｃｔｇｇｔｃｔａｇａｃａａｇ−３’／配列番号：１３）である。今回はＭ或いはＨＮ遺伝子への変異導入を別々のベクター上で行ったが、ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化し得られるＭ及びＨＮ遺伝子を含むフラグメント（８９３１ｂｐ）をＬｉｔｍｕｓ３８のＳａｌＩ／ＮｈｅＩサイトにサブクローニングして得られるプラスミド（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰ）を利用して、Ｍ及びＨＮ遺伝子への全変異を導入することは可能である。このようにして順次変異導入を行い、Ｍ遺伝子上に３箇所、ＨＮ遺伝子上に３箇所の計６箇所の温度感受性変異を導入した（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ＭｔｓＨＮｔｓΔＦＧＦＰの構築）。
ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ＭｔｓＨＮｔｓΔＦＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したフラグメント（８９３１ｂｐ）と、またｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したＭ及びＨＮ等遺伝子を含まないフラグメント（８２９４ｂｐ）をライゲーションして、Ｍ及びＨＮ遺伝子に６箇所の温度感受性変異を有し、Ｆ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ）を構築した（図２）。
更に、搭載遺伝子発現量の定量を行う為に、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＢＡＰ）遺伝子を搭載したｃＤＮＡの構築も行った。即ち、ＳＥＡＰ遺伝子の下流に終止シグナル−介在配列−開始シグナルを有するＳＥＡＰ断片（ＷＯ００／７００７０）をＮｏｔＩで切り出し（１６３８ｂｐ）、電気泳動後回収・精製し、ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ及びｐＳｅＶ１８＋ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰのＮｏｔＩサイトに組み込んだ。それぞれ、ｐＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ及びｐＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰとした（図２）。
［実施例２］温度感受性変異導入ウィルスの再構成と増幅
ウィルスの再構成はＬｉらの報告（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）に従って行った。Ｆ欠失型であるのでＦ蛋白のヘルパー細胞を利用するが、当該ヘルパー細胞作製にはＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムを利用している。当該システムはＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１１１５−１１２１（１９８８））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２３，３８１６−３８２１（１９９５），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））で感染させて挿入遺伝子を発現させる。ＳｅＶ−Ｆ蛋白の場合、Ｆ遺伝子を有する同トランスフォーマント細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７と記載し、ＡｘＣＡＮＣｒｅで誘導後Ｆ蛋白を持続発現している細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａと記載することにする。
温度感受性変異導入ウィルスの再構成は以下のように行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））を室温で１時間感染させた（ｍ．ｏ．ｉ．２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６））をそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に懸濁し、１μｇ  ＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％  ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ  β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＦ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ：Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）を重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した（Ｐ０）。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁した。凍結融解を３回繰り返えした後、ライゼートをそのままＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａにトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した（Ｐ１）。５〜７日後培養上清の一部をとり、新たに調製したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａに感染させ、同４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した（Ｐ２）。３〜５日後に新たに調製したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａに再度感染させ、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎのみを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で３〜５日間培養した（Ｐ３）。回収した培養上清に終濃度１％になるようにＢＳＡを添加し−８０℃にて保存した。保存ウィルス液を解凍し、その後の実験に供した。
この方法で調製した各ウィルス溶液のタイターはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰでそれぞれ、３×１０８，７×１０７，１．８×１０８及び８．９×１０７ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬ（ＧＦＰ−ＣＩＵの定義はＷＯ００／７００７０に記載）であった。これらのタイターを測定する際、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰについて、Ｆ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）に感染後のプラークの広がりを３２℃及び３７℃で観察した。感染６日後の写真を図３に示したが、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰは３２℃ではある程度プラークの広がりがあるものの３７℃では激減しており、ビリオン形成の減少が示唆された。
［実施例３］ウィルス再構成における培養温度（３２℃）の効果
実施例２で示した温度感受性導入ウィルスの再構成実験において、Ｐ１以降の温度を３２℃で行った。これは温度感受性変異を導入するにあたって変異の参考にしたウィルスが３２℃での生育が良い（Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１９２４−２１９３０（１９９３），Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｏｌｏｇｙ  １６０：１−８（１９８７））ことから試みたものであるが、当該実験条件を詳細に観察することで、ＳｅＶ再構成にあたっては（温度感受性変異導入ウィルス以外でも）、Ｐ１以降で３２℃で行うことで再構成効率が上昇し、従来取れ難かったものでも回収できるようになる可能性が高いことが明らかになった。
３２℃でウィルス再構成効率が上昇する理由として２点考えられる。まず、ワクシニアウィルスの増幅を抑制する為に添加しているＡｒａＣによる細胞毒性が、３２℃での培養の方が抑制されていると考えられる点である。再構成時の条件である、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用いてＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを培養した場合、３７℃では３−４日後で既に細胞障害が惹起され剥がれた細胞が増えてくるのに対し、３２℃で培養した場合は７−１０日は十分に培養継続が可能であり細胞が維持されている。転写複製効率の良くない或いは感染性ビリオン形成効率の良くないＳｅＶを再構成する場合、培養継続期間は再構成の可否に直接反映されると考えられる。２点目は３２℃で培養した場合にはＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／ＡにおけるＦ蛋白の発現が維持されている点である。Ｆ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）を６ｗｅｌｌプレートに１０％  ＦＢＳを含むＭＥＭでコンフルエントになるまで３７℃で培養後、７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭに置換し３２℃或いは３７℃で培養し、経時的にセルスクレーパーで細胞を回収した後、抗Ｆ抗体（マウスモノクローナル）を利用したＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行うことで、細胞内のＦ蛋白質を半定量的に解析した。３７℃では２日間は発現が維持されているもののそれ以降は減少していたが、３２℃では少なくとも８日間はＦ蛋白の発現が維持されていた（図４）。この点からも３２℃での再構成（Ｐ１以降）の有効性が確認された。
上記Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇは以下の方法で行った。６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌから回収した細胞を−８０℃で凍結保存後、１ｘに希釈したＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（Ｒｅｄ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐａｃｋ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１００μＬで溶解し、９８℃で１０分間加熱した。遠心後、上清１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（マルチゲル１０／２０；Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にロードした。１５ｍＭで２．５時間泳動後、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）にセミドライ法にて１００ｍＡで１時間転写した。転写膜をブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ；Ｓｎｏｗ  Ｂｒａｎｄ  Ｍｉｌｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）で４℃１時間以上放置した後、１０％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含み抗Ｆ抗体を１／１０００容量添加した一次抗体溶液に浸し、４℃で一晩放置した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で３回、更にＴＢＳで３回洗浄した後、１０％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含みＨＲＰを結合した抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｇｏａｔ  Ｆ（ａｂ’）２  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ＋ＩｇＭ，ＨＲＰ；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を１／５０００容量添加した二次抗体溶液に浸し、室温で１時間振盪した。ＴＢＳＴで３回、ＴＢＳで３回洗浄した後、化学発光法（ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により検出した。
［実施例４］温度感受性変異導入ウィルスの２次放出粒子定量（ＨＡ  ａｓｓａｙ，Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰと共に、全てのウィルス蛋白を有する自立複製型でＮｏｔＩ部位にＧＦＰ遺伝子とその下流に終止シグナル−介在配列−開始シグナルを有するＧＦＰ断片（７８０ｂｐ）を搭載したＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ：図２）を用いて比較を行った。
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにおいてコンフルエントに増殖させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞に、３×１０７ＣＩＵ／ｍＬの各ウィルス溶液を１ｗｅｌｌあたり１００μＬを添加して（ｍ．ｏ．ｉ．３）１時間感染し、ＭＥＭで洗浄後、１ｗｅｌｌあたり１ｍＬの血清を含まないＭＥＭを添加して３２℃，３７℃及び３８℃の各温度で培養した。１日毎にサンプリングし、サンプリング後直ぐに血清を含まない新しいＭＥＭ１ｍＬを添加して経時的に培養・サンプリングを行った。感染３日後に蛍光顕微鏡下でＧＦＰ発現の観察を行った所３種のウィルス共に、また３２℃，３７℃及び３８℃の全ての条件において、ほぼ同程度に感染し、また類似したＧＦＰの発現があると予想された（図５）。
２次放出粒子は赤血球凝集活性（ＨＡ活性）で定量し、Ｋａｔｏらの方法（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌ  １，５６９−５７９（１９９６）））に倣って行った。即ち、丸底の９６穴プレートを使用し、ウィルス液を段階的にＰＢＳで希釈し各ｗｅｌｌ  ５０μＬの２倍希釈系列を作製した。その５０μＬに１％濃度にＰＢＳで希釈したニワトリ保存血（コスモバイオ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）５０μＬを混合し、４℃で１時間放置し赤血球の凝集を観察し、凝集したもののうち最もウィルス希釈率の高いものの希釈率をＨＡ活性として判定した。また、１ＨＡＵを１×１０６ウィルスと換算して、ウィルス数で表した（図６）。ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰで２次放出粒子がかなり減少し、３７℃でＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰの約１／１０に減少していると判断された。また、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰは、３２℃でもウィルス粒子形成は減少しているが、少ないながらもある程度は粒子がでるので、生産が可能になっていると考えられた。
別の観点からの２次放出粒子の定量として、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇによる定量を行った。上記と同じようにＬＬＣ−ＭＫ２細胞にｍ．ｏ．ｉ．３で感染後、感染２日後に培養上清と細胞を回収し、培養上清は４８，０００ｇで４５分間遠心しウィルス蛋白を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、抗Ｍ抗体で検出した。抗Ｍ抗体は新たに調製したポリクローナル抗体であり、ＳｅＶ−Ｍ蛋白質の１−１３（ＭＡＤＩＹＲＦＰＫＦＳＹＥ＋Ｃｙｓ／配列番号：１４），２３−３５（ＬＲＴＧＰＤＫＫＡＩＰＨ＋Ｃｙｓ／配列番号：１５）及び３３６−３４８（Ｃｙｓ＋ＮＶＶＡＫＮＩＧＲＩＲＫＬ／配列番号：１６）の合成ペプチドを３種混合して免疫したウサギ血清から調製したものである。Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇは実施例３に記載の方法で行い、一次抗体の抗Ｍ抗体は１／４０００希釈、二次抗体のＨＲＰを結合した抗ラビットＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｇｏａｔ）Ｈ＋Ｌ  ｃｏｎｊ．；ＩＣＮ  Ｐ．，Ａｕｒｏｌａ，ＯＨ）は１／５０００容量に希釈したものを使用した。ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰでは、細胞中にはＭ蛋白が同程度に多く発現しているのに対しｖｉｒｕｓの蛋白量が減少しており（図７）、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇの手法によっても、当該ウィルスに於いて２次放出粒子が減少していることが確認された。
［実施例５］温度感受性変異導入ウィルスの搭載遺伝子発現量（ＳＥＡＰ  ａｓｓａｙ）
ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰにおいて２次放出粒子が減少しているが、それと同時に搭載遺伝子の発現量が減少していては遺伝子発現ベクターとしては意味のない改変になってしまうので、その発現量について検証を行った。ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２細胞にｍ．ｏ．ｉ．３で感染後、経時的に（感染１２，１８，２４，５０，１２０時間後）培養上清を回収し、上清中のＳＥＡＰ活性をＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＳＥＡＰ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。ＳＥＡＰ活性は両者間での差が殆どなかった（図８）。また同サンプルについて赤血球凝集活性（ＨＡ活性）を測定したが、ＨＡ活性はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰでやはり約１／１０に減少していた（図９）。また、同サンプルのウィルスを４８，０００ｇで４５分間遠心しウィルス蛋白を回収した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇで抗Ｍ抗体を利用して半定量的に解析した。この場合も、上清中のウィルス蛋白の減少が確認された（図１０）。温度感受性変異の導入によって、搭載遺伝子の発現量を殆ど減少することなく、２次放出粒子を約１／１０に減少できたと判断された。
［実施例６］温度感受性変異導入ウィルスの細胞障害性（ＬＤＨ  ａｓｓａｙ）
ＳｅＶ感染によって細胞が障害を受ける場合も多い。この点に関して、変異導入による影響を調べた。ＬＬＣ−ＭＫ２，ＢＥＡＳ−２Ｂ及びＣＶ−１細胞をそれぞれ２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播き培養した。培養にはＬＬＣ−ＭＫ２及びＣＶ−１には１０％  ＦＢＳを含むＭＥＭを、ＢＥＡＳ−２Ｂには１０％  ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ及びＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の１：１混合液を使用した。２４時間培養後、１％  ＢＳＡを含むＭＥＭで希釈したＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ溶液を５μＬ／ｗｅｌｌで添加し感染させ、６時間後ウィルス液を含む培地を除き、１０％  ＦＢＳを含む或いは含まない各培地に置き換えた。ＦＢＳを含まない培地の場合は感染３日後に、ＦＢＳを含む培地の場合は感染６日後に培養上清をサンプリングし、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って細胞障害性の定量を行った。ＬＬＣ−ＭＫ２では両者ともに細胞障害は観察されなかった。またＣＶ−１及びＢＥＡＳ−２Ｂにおいては、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰの細胞障害性はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰと同等以下であると判断された（図１１）。即ち、温度感受性変異導入での２次放出粒子の抑制による細胞障害性の惹起はないと結論した。
［実施例７］２次放出粒子抑制メカニズムの検討
温度感受性変異導入によって２次粒子抑制が可能となったメカニズムの一端を調べる為に、Ｍ蛋白の細胞内局在について調べた。各ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ）をＬＬＣ−ＭＫ２細胞にそれぞれ感染し、３２℃、３７℃或いは３８℃で培養し２日後に抗Ｍ抗体を利用して免疫染色を行った。免疫染色は以下の方法で行った。培養細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、−２０℃に冷却したメタノールを添加し４℃で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、２％  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍ及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ溶液で室温１時間Ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。再度ＰＢＳで３回洗浄後、２％  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍを含む一次抗体溶液（１０μｇ／ｍＬ抗Ｍ抗体）で３７℃３０分間反応した。ＰＢＳで３回洗浄後、２％  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍを含む二次抗体溶液（１０μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で３７℃１５分間反応した。最後にＰＢＳで３回洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察した。自立複製型でＦ，ＨＮ両蛋白を有するＳｅＶ１８＋ＧＦＰでは、検討した何れの温度においても細胞表面でのＭ蛋白の濃縮像が観察された（図１２）。このようなＭ蛋白の濃縮像に関しては既に報告されており（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：１４３−１６１（１９７６））、ビリオン形成の場所を反映していると考えられている。即ちＳｅＶ１８＋ＧＦＰにおいては、何れの温度においてもＭ蛋白の細胞表面への局在が正常であり、十分量のビリオンが形成していることを示していると考えられる。一方ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰでは、３８℃においてＭ蛋白の濃縮像が極端に減少した。Ｍ蛋白はＦ及びＨＮ蛋白のそれぞれのＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌに結合して、細胞表面へ局在すると考えられており（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：６９−７６（１９９４）、Ａｌｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６：２８９−３０３（２０００））、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰではその一方のＦ蛋白を欠失している為、Ｍ蛋白の局在に影響していると考えられる。また、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰではその影響が強く出て、３７℃でさえＭ蛋白の局在に支障が出て、結果的に２次放出粒子減少に繋がったものと予想された。
［実施例８］２次放出粒子抑制メカニズムの検討（２）
細胞内におけるＳｅＶ蛋白の細胞内局在をより詳細に調べるために、共焦点レーザー顕微鏡（ＭＲＣ１０２４；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）による解析を実施した。ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをＡ−１０細胞（ｒａｔｍｙｏｂｌａｓｔ）にそれぞれ感染し（ｍ．ｏ．ｉ．１）、３２℃或いは３７℃で１０％血清を含むＭＥＭで培養し、１日後及び２日後に抗Ｍ抗体及び抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行った。免疫染色は以下の方法で行った。培養感染細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、−２０℃に冷却したメタノールを添加し４℃で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、２％  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍ，１％  ＢＳＡ及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ溶液で室温１時間ブロッキングを行った。２％  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍを含むＭの一次抗体溶液（１０μｇ／ｍＬ抗Ｍ抗体）で３７℃３０分間反応し、更にＨＮの一次抗体溶液（１μｇ／ｍＬ抗ＨＮ抗体（ＩＬ４−１））で３７℃３０分間反応した。ＰＢＳで３回洗浄後、２％  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍを含む二次抗体溶液（１０μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ及び１０μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で３７℃１５分間反応した。ＰＢＳで３回洗浄後、核を染色するために１／４０００に希釈したＴＯ＿ＰＲＯ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を添加後室温で１５分間放置し、最後に消光を抑えるために、Ｓｌｏｗ  Ｆａｄｅ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の溶液に置換し、共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。感染１日後の結果を図１３に示したが、赤色がＭ蛋白、緑色がＨＮ蛋白の局在を示し、共存している場合には黄色に表される。また遠赤色を色変換しているので青色が核である。ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰの場合は、３２℃，３７℃何れの温度においても各蛋白の局在に大きな違いはなく、細胞表面へのＭ蛋白及びＨＮ蛋白の局在が観察されている。一方ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰの場合は、両温度ともに各蛋白質の局在にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰの場合と比べ違いがあり、細胞表面でのＭ蛋白の局在がほとんどない。特に３７℃の場合は、Ｍ蛋白とＨＮ蛋白がほぼ完全に分離し、Ｍ蛋白は微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）とも予想される部分に局在して存在している。感染後２日間培養した場合も同様の結果が得られており、特にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ感染細胞においては、Ｍ蛋白の細胞内局在に感染１日後と変化がなく（図１４）、それぞれの位置で移動が止まっているように見える。この結果によっても、温度感受性変異導入ウィルスで二次放出粒子が減少しているのは、粒子形成の中心的な役割を担っていると考えられているＭ蛋白の局在不全であると断定された。
また、ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ感染後３２℃で培養した場合、Ｍ蛋白が微小管の形態に近い形で染色されている（図１３）。実際に微小管の関与を証明するために、微小管の脱重合を促進する薬剤を添加し、Ｍ蛋白（及びＨＮ蛋白）の局在の変化を調べた。ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをＡ−１０にｍ．ｏ．ｉ．１で感染後、直後に脱重合試薬であるｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ（Ｎａｋａｒａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）或いはｃｏｌｃｅｍｉｄｅ（Ｎａｋａｒａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を終濃度１μＭ添加し、３２℃で培養した。感染２日後に上述と同じ方法で、Ｍ蛋白、ＨＮ蛋白の細胞内局在を観察した。脱重合試薬を添加しない場合は、Ｍ蛋白は微小管様形態に似た分布を示した（図１３）のに対し、脱重合試薬を添加することで、その構造が壊れ、大きな繊維状構造体として検出された（図１５）。この構造は、Ｍ蛋白そのもが凝集したものか或いは脱重合した微小管の残骸にＭ蛋白が結合している可能性があるが、何れにしても図１３に見られる、ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ感染後３２℃で培養した場合のＭ蛋白は、微小管に沿って局在している可能性が高いと判断された。
上記の微小管へのＭ蛋白の局在が温度感受性ウィルスの特有のものか否かを調べるために、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰの両ウィルスについて、感染後のＭ蛋白（及びＨＮ蛋白）の局在変化に対する微小管脱重合試薬（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）の影響を調べた。ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをＡ−１０にｍ．ｏ．ｉ．１で感染後、直後に脱重合試薬であるｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅを終濃度１μＭ添加し、３２℃或いは３７℃で培養した。感染２日後に上述と同じ方法で、Ｍ蛋白（及びＨＮ蛋白）の細胞内局在を観察した。結果を図１６に示すが、両ウィルス感染細胞共に類似の現象を示した。即ち、感染後３２℃で培養した場合は図１５と同様に大きな繊維状構造体として観察された。ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰの場合もＭ蛋白は微小管と共存している可能性が示唆された。更に、３７℃においては特にＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰ感染細胞において、ゴルジ体付近と予想される部位に局在して観察された。
以上の結果から、以下のことが推察される。Ｍ蛋白はゴルジ体付近で合成され、主にＦ及びＨＮ蛋白のそれぞれのＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌに結合した状態（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：６９−７６（１９９４）、Ａｌｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６：２８９−３０３（２０００））で微小管に沿って（例えばキネシンのようなモーター蛋白に結合して）細胞内を移動し、細胞表面へ局在し粒子形成が達成される。温度感受性変異を導入したウィルスにおいては、３２℃においては微小管に沿った細胞内移動までは正常であるが、微小管から細胞表面へ局在する段階で不具合が生じ、微小管に沿っての局在が観察されていると考えることができる。３７℃においては微小管に沿った細胞内移動さえ不具合が生じ、ゴルジ体付近で局在が観察されていると捉えることができる。Ｍ蛋白質の合成の場としては、ゴルジ体付近と予想されるが、凝集が観察されるのがその付近ということであって、合成の場そのものは別である可能性がある。但し、過去の報告例によると、微小管のコンポーネントであるｔｕｂｕｌｉｎはＳｅＶの転写・複製活性に関与し、転写・複製を促進することが報告されており（Ｍｏｙｅｒ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，５４０５−５４０９（１９８６）；Ｏｇｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３５９９９−３６００８（１９９９））、またゴルジ体は、そのｔｕｂｕｌｉｎが多く存在すると予想される中心体付近に局在することから、微小管の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）で合成されると予想できる。更に、ＳｅＶの変異株であるＦ１−Ｒ  ｓｔｒａｉｎはＭ遺伝子に変異を有しているが、感染後微小管を変化させて、Ｆ１−Ｒ  ｓｔｒａｉｎの細胞の極性に依存しない粒子形成を可能にしていると考えられている（Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５９０２−５９１０（１９９３））。即ち、ｔｕｂｕｌｉｎに沿ったＭ蛋白の細胞内移動を想定することで、本実施例の結果も説明できる。このように予想されるメカニズムにおいて、Ｍ及びＨＮ遺伝子へ当該温度感受性変異を導入することで、Ｍ蛋白の細胞内局在の不具合を生じ、結果的に二次放出粒子の減少が達成されていると判断された。
［実施例９］Ｐ及びＬ遺伝子へ変異を導入したＦ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築
Ｆ欠失型ＳｅＶベクターへのさらなる変異導入による二次放出粒子抑制（及び細胞障害性減弱）を目的として、持続感染ＳｅＶで同定されている遺伝子構造（Ｂｏｓｓｏｗ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２０００  Ｐ１５７）をもとにした改変を行った。実際のデザインは次の２種について行った。何れも上記持続感染ＳｅＶの解析で同定されたものであり、Ｐに一ケ所（２種で異なる）、Ｌに二ケ所（２種で同じ）の変異を導入した。具体的には、Ｐ（Ｅ８６Ｋ），Ｌ（Ｎ１１９７Ｓ／Ｋ１７９５Ｅ）及びＰ（Ｌ５１１Ｆ），Ｌ（Ｎ１１９７Ｓ／Ｋ１７９５Ｅ）の２種類である。これらの変異を有する同定された変異株は、転写・複製がそれぞれ１／４−１／８及び１／２−１／３に減少し、ｖｉｒｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅは約１％にまで減少していたと報告されていた（Ｂｏｓｓｏｗ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２０００  Ｐ１５７）。
変異導入のスキームを図１７に示した。Ｆ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ：Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）をＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化しＮＰ遺伝子を含む断片（８２９４ｂｐ）を回収し、合成オリゴＤＮＡを利用してマルチクローニングサイトを導入した（ｐＳｅＶ／ΔＳａｌＩＮｈｅＩｆｒｇ−ＭＣＳの構築）。マルチクローニングサイト導入に使用した合成オリゴの配列は（５’−ｔｃｇａｃａｃｃａｇｇｔａｔｔｔａａａｔｔａａｔｔａａｔｃｇｃｇａｇ−３’／配列番号：１７，５’−ｃｔａｇｃｔｃｇｃｇａｔｔａａｔｔａａｔｔｔａａａｔａｃｃｔｇｇｔｇ−３’／配列番号：１８）である。構築したｐＳｅＶ／ΔＳａｌＩＮｈｅＩｆｒｇ−ＭＣＳを用いてＬ遺伝子への変異導入を行った。変異導入にはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。Ｌ遺伝子のＮ１１９７Ｓの変異導入に使用した合成オリゴの配列は（５’−ｇｔｔｃｔａｔｃｔｔｃｃｔｇａｃＴＣｔａｔａｇａｃｃｔｇｇａｃａｃｇｃｔｔａｃ−３’／配列番号：１９，５’−ｇｔａａｇｃｇｔｇｔｃｃａｇｇｔｃｔａｔａＧＡｇｔｃａｇｇａａｇａｔａｇａａｃ−３’／配列番号：２０）、Ｋ１７９５Ｅの変異導入に使用した合成オリゴの配列は（５’−ｃｔａｃｃｔａｔｔｇａｇｃｃｃｃｔｔａｇｔｔｇａｃＧａＡｇａｔａａａｇａｔａｇｇｃｔａ−３’／配列番号：２１，５’−ｔａｇｃｃｔａｔｃｔｔｔａｔｃＴｔＣｇｔｃａａｃｔａａｇｇｇｇｃｔｃａａｔａｇｇｔａｇ−３’／配列番号：２２）である。Ｐ遺伝子への変異導入は、ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したＰ遺伝子を含むフラグメント（８９３１ｂｐ）をＬｉｔｍｕｓ３８の同サイトへライゲーションして得られているＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ  ΔＦ−ＧＦＰを用いて行った。Ｐ遺伝子のＥ８６Ｋの変異導入に使用した合成オリゴの配列は（５’−ｃａａｇａｔａａｔｃｇａｔｃａｇｇｔＡａＡｇａｇａｇｔａｇａｇｔｃｔｃｔｇｇｇａｇ−３’／配列番号：２３，５’−ｃｔｃｃｃａｇａｇａｃｔｃｔａｃｔｃｔｃＴｔＴａｃｃｔｇａｔｃｇａｔｔａｔｃｔｔｇ−３’／配列番号：２４）、Ｌ５１１Ｆの変異導入に使用した合成オリゴの配列は（５’−ｃｔｃａａａｃｇｃａｔｃａｃｇｔｃｔｃＴｔＴｃｃｃｔｃｃａａａｇａｇａａｇｃ−３’／配列番号：２５，５’−ｇｃｔｔｃｔｃｔｔｔｇｇａｇｇｇＡａＡｇａｇａｃｇｔｇａｔｇｃｇｔｔｔｇａｇ−３’／配列番号：２６）である。変異導入後、Ｐ遺伝子にそれぞれ一ケ所の変異を有するプラスミド（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ  ΔＦ−ＧＦＰ）をＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したフラグメント（８２９４ｂｐ）と、また、Ｌ遺伝子に二ケ所の変異を有するプラスミド（ｐＳｅＶ／ΔＳａｌＩＮｈｅＩｆｒｇ−ＭＣＳ）をＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したＬ遺伝子を含むフラグメント（８９３１ｂｐ）をライゲーショ��して、ｐＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ（Ｐ（Ｅ８６Ｋ），Ｌ（Ｎ１１９７Ｓ／Ｋ１７９５Ｅ）の変異を有する）及びｐＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ（Ｐ（Ｌ５１１Ｆ），Ｌ（Ｎ１１９７Ｓ／Ｋ１７９５Ｅ）の変異を有する）を構築した（ｐＳｅＶ１８＋／ＰＬｍｕｔ  ΔＦ−ＧＦＰと総称する）。
更に、搭載遺伝子発現量の定量を行う為に、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を搭載したｃＤＮＡの構築も行った。即ち、ＳＥＡＰ遺伝子の下流に終止シグナル−介在配列−開始シグナルを有するＳＥＡＰ断片（ＷＯ００／７００７０）をＮｏｔＩで切り出し（１６３８ｂｐ）、ｐＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びｐＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰの＋１８位のＮｏｔＩサイトに組み込んだ。それぞれ、ｐＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ，及びｐＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰとした。
［実施例１０］持続感染ＳｅＶの配列をＰ／Ｌへ導入したＦ欠失型ＳｅＶの再構成と増幅
ウィルスの再構成はＬｉらの報告（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ−７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）に従って行った。詳細は本明細書の実施例２に記載の方法で行った。同方法で調整した各ウィルス溶液のタイターはＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰでそれぞれ、４．０ｘ１０８，２．８ｘ１０８，３．７ｘ１０８及び２．０ｘ１０８ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬ（ＧＦＰ−ＣＩＵの定義はＷＯ００／７００７０に記載）であった。
［実施例１１］持続感染ＳｅＶの配列をＰ／Ｌへ導入したＦ欠失型ＳｅＶの２次放出粒子定量
２次放出粒子の定量は感染細胞の培養上清を用いたＨＡ活性の測定により行った。この時、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰとの比較を行った。実験方法の詳細は上記の実施例４に記載しているが、簡単に記すと、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにおいてコンフルエントに増殖させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞に、１ｘ１０７ＣＩＵ／ｍＬ或いは５ｘ１０７ＣＩＵ／ｍＬの各ウィルス溶液を１ｗｅｌｌあたり１００μＬを添加して（それぞれ、ＭＯＩ  １或いはＭＯＩ  ５）１時間感染し、ＭＥＭで洗浄後、１ｗｅｌｌあたり１ｍＬの血清を含まないＭＥＭを添加して３７℃で培養した。１日毎にサンプリングし、サンプリング後直ぐに血清を含まない新しいＭＥＭ  １ｍＬを添加して経時的に培養・サンプリングを行った。
ＨＡ活性の測定はＫａｔｏらの方法（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌ  １，５６９−５７９（１９９６）））に倣って行った。即ち、丸底の９６穴プレートを使用し、ウィルス液を段階的にＰＢＳで希釈し各ｗｅｌｌ  ５０μＬの２倍希釈系列を作製した。その５０μＬに１％濃度にＰＢＳで希釈したニワトリ保存血（コスモバイオ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）５０μＬを混合し、４℃で１時間放置し赤血球の凝集を観察し、凝集したもののうち最もウィルス希釈率の高いものの希釈率をＨＡ活性として判定した。
ＭＯＩ  １で感染した場合もＭＯＩ  ５で感染した場合も、Ｐ及びＬへ持続感染ＳｅＶの配列を導入したベクターの感染細胞では２次放出粒子量が僅かに減少していた（図１８）。則ち、Ｐ及びＬへの変異導入によって、２次放出粒子形成を僅かながら減少できたと判断される。但し、抑制の程度はそれ程大きくはない。特徴的なのは感染後期において、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞では徐々に２次放出粒子量は減少しているのに対して、ＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞では、その減少がほとんど無いことである。この点はＰ及びＬへの変異導入によって、細胞傷害性が減弱化し、感染後期においてもＳｅＶベクターの転写・複製が維持され、２次放出粒子形成の維持が観察されていると予想された。
［実施例１２］持続感染ＳｅＶの配列をＰ／Ｌへ導入したＦ欠失型ＳｅＶの細胞傷害性
細胞傷害性に関しては、ＣＶ−１細胞においてＳｅＶ感染依存的な顕著な細胞傷害性が観察できることから、このＣＶ−１細胞を利用して評価した。またコントロールとして、Ｐ／Ｌへの変異導入のないＦ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）を使用した。実験方法の詳細は実施例６に記載している。簡単に記すと、ＣＶ−１細胞を２．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播き培養した。培養には１０％  ＦＢＳを含むＭＥＭを使用した。２４時間培養後、１％  ＢＳＡを含むＭＥＭで希釈したＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ溶液を５μＬ／ｗｅｌｌで添加し感染させ、６時間後ウィルス液を含む培地を除き、ＦＢＳを含まないＭＥＭ培地に置き換えた。感染３日後に培養上清をサンプリングし、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って細胞傷害性の定量を行った。ＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰにおいてＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰよりも明らかな細胞傷害性の減弱が観察された（図１９）。
同実験時における、ＧＦＰ陽性細胞を経時的にカウントした。Ｐ及びＬへ持続感染ＳｅＶの配列を導入した二種のベクターの感染ＣＶ−１細胞でＧＦＰ陽性細胞の数が維持されていた（図２０）。ＣＶ−１細胞はＳｅＶ感染依存的な細胞傷害を受け易く、感染細胞は容易に剥がれてしまう。Ｐ及びＬへ持続感染ＳｅＶの配列を導入したベクターの感染細胞が良く維持されていることは、これらのベクターで細胞傷害性が減弱していることを強く支持している。
同感染（ＭＯＩ  １０）ＣＶ−１細胞の感染３日後及び６日後の蛍光顕微鏡写真を図２１に示した。同様にＰ及びＬへ持続感染ＳｅＶの配列を導入したベクターの感染細胞の数も多く、状態も良いことが視覚的にも確認された。特に、ＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ感染ＣＶ−１細胞は増殖しているようにも見える。則ち、これらの結果は、Ｐ及びＬへ持続感染ＳｅＶの配列を導入することで、ＳｅＶ感染依存的な細胞傷害性を減弱化可能であることを示している。
［実施例１３］持続感染ＳｅＶの配列をＰ／Ｌへ導入したＦ欠失型ＳｅＶの搭載遺伝子発現量定量
ＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰの２次放出粒子減少及び細胞傷害性減弱の性質は、初めに同定された変異株における、転写・複製の減弱（それぞれ１／４−１／８及び１／２〜１／３と報告：Ｂｏｓｓｏｗ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２０００  Ｐ１５７）に起因する可能性がある。その時、転写・複製の減弱によって、搭載遺伝子の発現量も抑制し、その低下が大きい場合はＳｅＶベクターの利点の一つを消失することになる。そこで、持続感染ＳｅＶの配列をＰ／Ｌへ導入したＳｅＶベクターについても＋１８位にＳＥＡＰ遺伝子を挿入したものを作製し、感染細胞からのＳＥＡＰ発現量を経時的に測定した。
実験方法の詳細は実施例５に記載している。筒単に記すと、ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２細胞にｍ．ｏ．ｉ．１０で感染後、経時的に（２４時間毎に）培養上清を回収し、上清中のＳＥＡＰ活性をＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＳＥＡＰ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。ＳＥＡＰ活性値は全てのベクター間でほとんど同じだった（図２２）。則ち、持続感染ＳｅＶの配列をＰ／Ｌへ導入したベクターでも発現量の低下はほとんどないと判断された。
また、ＳＥＡＰ遺伝子を搭載した各ベクターについても、感染細胞からの２次放出粒子量及び細胞傷害性の指標として感染細胞培養上清中のＬＤＨ量を定量した。２次放出粒子量ではＳＥＡＰ遺伝子の搭載の影響が大きく反映されて、持続感染ＳｅＶの配列をＰ／Ｌへ導入した２種のベクターともに、２次放出粒子量が約１／１０に減少した（図２３）。Ｐ／Ｌへの変異導入の効果がより反映されていると判断される。また、細胞傷害性に関しては、ＳＥＡＰ遺伝子の搭載のないベクターの場合と同様に、持続感染ＳｅＶの配列をＰ／Ｌへ導入したことで細胞傷害の減弱が観察された（図２４）。
［実施例１４］温度感受性変異及びＰ／Ｌ変異の両者を有するＦ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築
Ｍ蛋白及びＨＮ蛋白への温度感受性変異の導入とＰ蛋白及びＬ蛋白への持続感染ＳｅＶ由来配列の導入を組み合わせることによって、それぞれの変異単独の場合よりも更に二次放出粒子抑制（及び細胞障害性減弱）の効果が得られる可能性がある。そこで、温度感受性変異である６種類の変異（Ｍ：Ｇ６９Ｅ，Ｔ１１６Ａ，Ａ１８３Ｓ、ＨＮ：Ａ２６２Ｔ，Ｇ２６４Ｒ，Ｋ４６１Ｇ）及び持続感染ＳｅＶ由来の変異（Ｐ：Ｅ８６Ｋ或いはＬ５１１Ｆ、Ｌ：Ｎ１１９７Ｓ，Ｋ１７９５Ｅ）の合計９種類の変異を有する２種類のＦ欠失型ＳｅＶベクター（図２５：ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓＰ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓＰ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ）の構築を行った。
変異導入のスキームを図２６に示した。温度感受性変異を有するＦ欠失型センダイウィルスベクターゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  ΔＦ−ＧＦＰ：実施例１参照）をＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化しＰ遺伝子を含むフラグメント（８９３１ｂｐ）をＬｉｔｍｕｓ３８の同サイトへライゲーションして得られるＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ  ＭｔｓＨＮｔｓ・ΔＦ−ＧＦＰを用いて行った。実施例１に記載の方法で行い、Ｐ遺伝子のＥ８６Ｋの変異導入には（５’−ｃａａｇａｔａａｔｃｇａｔｃａｇｇｔＡａＡｇａｇａｇｔａｇａｇｔｃｔｃｔｇｇｇａｇ−３’／配列番号：２３，５’−ｃｔｃｃｃａｇａｇａｃｔｃｔａｃｔｃｔｃＴｔＴａｃｃｔｇａｔｃｇａｔｔａｔｃｔｔｇ−３’／配列番号：２４）の配列の合成オリゴを使用し、Ｌ５１１Ｆの変異導入には（５’−ｃｔｃａａａｃｇｃａｔｃａｃｇｔｃｔｃＴｔＴｃｃｃｔｃｃａａａｇａｇａａｇｃ−３’／配列番号：２５，５’−ｇｃｔｔｃｔｃｔｔｔｇｇａｇｇｇＡａＡｇａｇａｃｇｔｇａｔｇｃｇｔｔｔｇａｇ−３’／配列番号：２６）の配列の合成オリゴを使用した。変異導入後、Ｐ遺伝子にそれぞれ一ケ所の変異を有するプラスミド（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ  ＭｔｓＨＮｔｓ  ΔＦ−ＧＦＰ）をＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したフラグメント（８２９４ｂｐ）と、また、実施例１で構築した、Ｌ遺伝子に二ケ所の変異を有するプラスミド（ｐＳｅＶ／ΔＳａｌＩＮｈｅＩｆｒｇ−ＭＣＳ）をＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したＬ遺伝子を含むフラグメント（８９３１ｂｐ）をライゲーションして、ｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓＰ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ（温度感受性変異及びＰ（Ｅ８６Ｋ），Ｌ（Ｎ１１９７Ｓ／Ｋ１７９５Ｅ）の変異を有する）及びｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓＰ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ（温度感受性変異及びＰ（Ｌ５１１Ｆ），Ｌ（Ｎ１１９７Ｓ／Ｋ１７９５Ｅ）の変異を有する）を構築した（ｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓＰＬｍｕｔ  ΔＦ−ＧＦＰと総称する）。
更に、搭載遺伝子発現量の定量を行う為に、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を搭載したｃＤＮＡの構築も行った。即ち、ＳＥＡＰ遺伝子の下流に終止シグナル−介在配列−開始シグナルを有するＳＥＡＰ断片（ＷＯ００／７００７０）をＮｏｔＩで切り出し（１６３８ｂｐ）、ｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びｐＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰの＋１８位のＮｏｔＩサイトに組み込んだ。それぞれ、ｐＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ，及びｐＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰとした。
［実施例１５］温度感受性変異及びＰ／Ｌ変異の両者を有するＦ欠失型ＳｅＶの再構成と増幅
ウィルスの再構成はＬｉらの報告（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）に従って行った。詳細は本明細書の実施例２に記載の方法で行った。同方法で調整した各ウィルス溶液のタイターはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＣＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰでそれぞれ、８．６ｘ１０８，４．２ｘ１０８，１．７ｘ１０８及び１．７ｘ１０８ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬ（ＧＦＰ−ＣＩＵの定義はＷＯ００／７００７０に記載）であった。
［実施例１６］温度感受性変異及びＰ／Ｌ変異の両者を有するＦ欠失型ＳｅＶの２次放出粒子定量
２次放出粒子の定量は感染細胞の培養上清を用いたＨＡ活性の測定により行った。この時、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰとの比較を行った。実験方法の詳細は実施例４及び実施例１１に記載しているが、簡単に記すと、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにおいてコンフルエントに増殖させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞に、１ｘ１０７ＣＩＵ／ｍＬ或いは３ｘ１０７ＣＩＵ／ｍＬの各ウィルス溶液を１ｗｅｌｌあたり１００μＬを添加して（それぞれ、ＭＯＩ  １或いはＭＯＩ  ３）１時間感染し、ＭＥＭで洗浄後、１ｗｅｌｌあたり１ｍＬの血清を含まないＭＥＭを添加して３７℃で培養した。１日毎にサンプリングし、サンプリング後直ぐに血清を含まない新しいＭＥＭ  １ｍＬを添加して経時的に培養・サンプリングを行った。
ＨＡ活性の測定はＫａｔｏらの方法（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌ  １，５６９−５７９（１９９６）））に倣って行った。即ち、丸底の９６穴プレートを使用し、ウィルス液を段階的にＰＢＳで希釈し各ｗｅｌｌ  ５０μＬの２倍希釈系列を作製した。その５０μＬに１％濃度にＰＢＳで希釈したニワトリ保存血（コスモバイオ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）５０μＬを混合し、４℃で１時間放置し赤血球の凝集を観察し、凝集したもののうち最もウィルス希釈率の高いものの希釈率をＨＡ活性として判定した。
ＭＯＩ  １で感染した場合もＭＯＩ  ３で感染した場合も、温度感受性変異及びＰ／Ｌ変異の両者を有するＦ欠失型ＳｅＶベクターの感染細胞では変異のないＦ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）の感染細胞よりも２次放出粒子量が減少していた（図２７）。特に、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰにおいては、Ｐ／Ｌ変異のないＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  ΔＦ−ＧＦＰよりもさらに２次放出粒子が減少し、Ｐ／Ｌ変異導入による相加的な効果が確認された。但し、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰにおいてはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  ΔＦ−ＧＦＰよりも２次放出粒子量が増加し、この場合は相加的効果が観察されなかった。２次放出粒子の抑制という観点に絞れば、ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰは非常に優れていると判断された。
［実施例１７］温度感受性変異及びＰ／Ｌ変異の両者を有するＦ欠失型ＳｅＶの細胞傷害性
細胞傷害性に関しては、ＣＶ−１細胞を利用して評価した。またコントロールとして、Ｐ／Ｌへの変異導入のないＦ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）、温度感受性変異のみを有するＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  ΔＦ−ＧＦＰ）及びＰ／Ｌ変異のみを有する２種のＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、ＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ）を使用した。実験方法の詳細は実施例６及び実施例１２に記載している。簡単に記すと、ＣＶ−１細胞を２．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播き培養した。培養には１０％  ＦＢＳを含むＭＥＭを使用した。２４時間培養後、１％  ＢＳＡを含むＭＥＭで希釈したＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ溶液を５μＬ／ｗｅｌｌで添加し感染させ、６時間後ウィルス液を含む培地を除き、ＦＢＳを含まないＭＥＭ培地に置き換えた。感染３日後に培養上清をサンプリングし、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って細胞傷害性の定量を行った。温度感受性変異を導入することで（ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ・ΔＦ−ＧＦＰにおいて）、ある程度の細胞傷害性の減弱があり、Ｐ／Ｌ変異を導入することで（ＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰにおいて）同様に細胞傷害性の減弱が観察されているが、この両者を組み合わせることで（ｓｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰにおいて）相加的に作用し顕著な細胞傷害性の減弱が達成された（図２８）。
［実施例１８］温度感受性変異及びＰ／Ｌ変異の両者を有するＦ欠失型ＳｅＶの搭載遺伝子発現量定量
ＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰについても、＋１８位にＳＥＡＰ遺伝子を挿入したものを作製し、感染細胞からのＳＥＡＰ発現量を経時的に測定した。
実験方法の詳細は実施例５及び実施例１３に記載している。簡単に記すと、ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＭＯＩ  １或いはＭＯＩ  ３で感染後、経時的に（２４時間毎に）培養上清を回収し、上清中のＳＥＡＰ活性をＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＳＥＡＰ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って測定した。感染初期において発現量の低下が僅かに観察されるものの、ＳＥＡＰ活性値は全てのベクター間でほとんど同じだった（図２９）。則ち、温度感受性変異及びＰ／Ｌ変異の両者を導入したベクターでも発現量の低下はほとんどないと判断された。
また、ＳＥＡＰ遺伝子を搭載した各ベクターについても、細胞傷害性の指標として感染細胞培養上清中のＬＤＨ量を定量した。ＳＥＡＰ遺伝子の搭載のないベクターの場合と同様に、温度感受性変異及びＰ／Ｌ変異の両者を導入したことによる、細胞傷害性の顕著な減弱が観察された（図３０）。
［実施例１９］ＥＧＦＰ遺伝子を有するＭ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築  構築にはＭ遺伝子を欠失したＭ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＭ：ＷＯ００／０９７００）を利用した。構築のスキームを図３１に表した。ｐＳｅＶ１８＋／ΔＭのＭ欠失部位を含むＢｓｔＥＩＩ断片（２０９８ｂｐ）を、予めＳａｌＩ／ＸｈｏＩで消化後ライゲーションしてＥｃｏＲＶ認識部位を欠失したｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＢｓｔＥＩＩサイトにサブクローニングした（ｐＳＥ−ＢｓｔＥＩＩｆｒｇの構築）。ＧＦＰ遺伝子を有するｐＥＧＦＰ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）をＡｃｃ６５Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化しＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）での５’末端のｆｉｌｌ  ｉｎにより末端の平滑化を行い、ＥｃｏＲＶで消化後ＢＡＰ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）処理を行ったｐＳＥ−ＢｓｔＥＩＩｆｒｇにサブクローニングした。このＥＧＦＰ遺伝子を含むＢｓｔＥＩＩフラグメントをもとのｐＳｅＶ１８＋／ΔＭに戻し、Ｍ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＭ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）を構築した。
［実施例２０］Ｍ及びＦ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築
下記記載の構築のスキームを図３２に表した。Ｆ欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ：Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）のＮａｅＩ断片（４９２２ｂｐ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングして構築したｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＦＧＦＰを用いてＭ遺伝子の欠失を行った。Ｍ遺伝子直後のＡｐａＬＩサイトを利用してＭ遺伝子を切り出すようにデザインした。即ち、切り出すｆｒａｇｍｅｎｔが６ｎとなるようにＰ遺伝子直後にＡｐａＬＩ認識配列を導入した。変異導入はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は５’−ａｇａｇｔｃａｃｔｇａｃｃａａｃｔａｇａｔｃｇｔｇｃａｃｇａｇｇｃａｔｃｃｔａｃｃａｔｃｃｔｃａ−３’／配列番号：２７，５’−ｔｇａｇｇａｔｇｇｔａｇｇａｔｇｃｃｔｃｇｔｇｃａｃｇａｔｃｔａｇｔｔｇｇｔｃａｇｔｇａｃｔｃｔ−３’／配列番号：２８）である。変異導入後、ＡｐａＬＩで部分消化し（３７℃，５分）、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）で回収した後そのままライゲーションを行った。再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔでＤＮＡを回収し、ＢｓｍＩ及びＳｔｕＩで消化後ＤＨ５αへ形質転換してＭ遺伝子（及びＦ遺伝子）を欠失したＤＮＡ（ｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＭΔＦＧＦＰ）を調製した。
Ｍ（及びＦ遺伝子）を欠失したｐＢｌｕｅＮａｅＩｆｒｇ−ΔＭΔＦＧＦＰをＳａｌＩ及びＡｐａＬＩで消化を行い、Ｍ欠失部位を含むフラグメント（１４８０ｂｐ）を回収した。一方でｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＡｐａＬＩ／ＮｈｅＩで消化してＨＮ遺伝子を含む断片（６２８７ｂｐ）を回収し、この２種の断片をＬｉｔｍｕｓ３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｌＩ／ＮｈｅＩサイトにサブクローニングした（ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ΔＭΔＦＧＦＰの構築）。ＬｉｔｍｕｓＳａｌＩ／ＮｈｅＩｆｒｇ−ΔＭΔＦＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したフラグメント（７７６７ｂｐ）と、またｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＳａｌＩ／ＮｈｅＩで消化して回収したＭ及びＨＮ等遺伝子を含まないフラグメント（８２９４ｂｐ）をライゲーションして、Ｍ及びＦ遺伝子を欠失しその欠失部位にＥＧＦＰ遺伝子を搭載したＭ及びＦ欠失型センダイウィルス全長ゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）を構築した。構築したＭ欠失型（及びＭ及びＦ欠失型）ウィルスの構造を図３３に表した。
［実施例２１］ＳｅＶ−Ｆ及びＭ蛋白を発現するヘルパー細胞の作製
Ｍ蛋白（及びＦ蛋白）を発現するヘルパー細胞作製の為にＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムを利用した。当該システムはＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１１１５−１１２１（１９８８））を利用したものであり、Ｆ蛋白のヘルパー細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞）作製の時にも同システムを利用している（Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，６５６４−６５６９（２０００），ＷＯ００／７００７０）。
〈１〉Ｍ発現プラスミドの構築
Ｆ及びＭ蛋白を同時発現誘導するヘルパー細胞の作出の為には、既に作製している上記ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞を利用し、この細胞に同システムでのＭ遺伝子導入を行うこととした。但し、Ｆ遺伝子導入時に使用したｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆはｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を有している為、同細胞を利用する為には別の耐性遺伝子の導入が必須であり、まず図３４に記載のスキームでＭ遺伝子搭載プラスミド（ｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｍ：ｐＣＡＬＮｄＬｗのＳｗａＩサイトにＭ遺伝子導入）のｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子に置き換えた。即ち、ｐＣＡＬＮｄＬｗ／ＭをＨｉｎｃＩＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化しＭ遺伝子を含む断片（４７３７ｂｐ）をアガロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで回収した。同時に、同ｐＣＡＬＮｄＬｗ／ＭをＸｈｏＩで切断、ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含まない断片（５９４１ｂｐ）を回収後、更にＨｉｎｃＩＩで切断し１７７９ｂｐの断片を回収した。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子はｐｃＤＮＡ３．１ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をテンプレートにｈｙｇｒｏ−５’（５’−ｔｃｔｃｇａｇｔｃｇｃｔｃｇｇｔａｃｇａｔｇａａａａａｇｃｃｔｇａａｃｔｃａｃｃｇｃｇａｃｇｔｃｔｇｔｃｇａｇ−３’／配列番号：２９）及びｈｙｇｒｏ−３’（５’−ａａｔｇｃａｔｇａｔｃａｇｔａａａｔｔａｃａａｔｇａａｃａｔｃｇａａｃｃｃｃａｇａｇｔｃｃｃｇｃｃｔａｔｔｃｃｔｔｔｇｃｃｃｔｃｇｇａｃｇａｇｔｇｃｔｇｇｇｇｃｇｔｃ−３’／配列番号：３０）の２種のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで回収した後ＸｈｏＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化して調製した。これら３種の断片をライゲーションしｐＣＡＬＮｄＬｗ−ｈｙｇｒｏＭを作製した。
〈２〉ＳｅＶ−Ｍ（及びＦ）蛋白を誘導発現するヘルパー細胞のクローニング
トランスフェクションにはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いプロトコールに記載の方法で行った。即ち以下の方法をとった。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで６０ｍｍシャーレに播き、１０％  ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭで２４時間培養した。ｐＣＡＬＮｄＬｗ−ｈｙｇｒｏＭの５μｇをＦＢＳ及び抗生物質を含まないＤ−ＭＥＭに希釈し（総量で１５０μＬ）、撹拌後Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ３０μＬを添加、再度撹拌し室温で１０分間放置した。放置後、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭを１ｍＬ添加し撹拌後、ＰＢＳで１回洗浄したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞へこのトランスフェクション混合液を添加した。３７℃，５％  ＣＯ２インキュベーターで３時間培養後、トランスフェクション混合液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄、１０％  ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭを５ｍＬ添加し２４時間培養した。培養後、トリプシンで細胞を剥がし、９６ｗｅｌｌプレートに約５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割り合いで希釈し、１５０μｇ／ｍＬのｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含む１０％  ＦＢＳ入りのＤ−ＭＥＭで約２週間培養した。単一の細胞から広がったクローンを６ｗｅｌｌプレートまで拡大培養した。このようにして調製した合計１３０クローンについて以下解析を行った。
〈３〉ＳｅＶ−Ｍ（及びＦ）蛋白を誘導発現するヘルパー細胞クローンの解析
得られた１３０種のクローンについて、Ｍ蛋白の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇで半定量的に解析した。各クローンを６ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの状態で、５％  ＦＢＳを含むＭＥＭで希釈したＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２３，３８１６−３８２１（１９９５），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））でｍ．ｏ．ｉ．５で感染させた。３２℃で２日間培養後、培養上清を除去しＰＢＳで１回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がして細胞を回収した。１ｌａｎｅあたりこの１／１０量をアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、抗Ｍ抗体を利用して実施例３及び４に記載の方法でＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。１３０クローンの中で比較的Ｍ蛋白の発現量の多かったものに関して、抗Ｆ抗体（ｆ２３６：Ｓｅｇａｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３，１０６４−１０７２（１９９８））を利用したＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果と併せて図３５に記載した。
［実施例２２］Ｍ欠失型ＳｅＶのウィルス再構成
Ｍ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）の再構成は、実施例２１記載のクローンの評価を絡めて実施した。即ち、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのＰ０  ｌｙｓａｔｅを各クローンに添加し、ＧＦＰ蛋白の広がりが観測されるか（Ｍ蛋白のトランス供給が達成されるか）否かについて検証した。Ｐ０  ｌｙｓａｔｅの調製は実施例２に記載の方法に倣い以下のように行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７を室温で１時間感染させた（ｍ．ｏ．ｉ．２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ，ｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ及びｐＧＥＭ／Ｍをそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁し、１μｇ  ＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％  ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁、凍結融解を３回繰り返えしてＰ０  ｌｙｓａｔｅを調製した。一方で１０種のクローンを２４ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの時にＡｘＣＡＮＣｒｅをｍ．ｏ．ｉ．５で感染し、感染後３２℃で２日間培養した細胞を準備した。この細胞にＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのＰ０  ｌｙｓａｔｅを各２００μＬ／ｗｅｌｌでトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した。＃１８及び＃６２のクローンでＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰによるＧＦＰ蛋白の広がりが観察された（図３６）。特に、＃６２の方で広がりが早く、以下の実験にはこの＃６２を使用した。当該細胞についてＡｘＣＡＮＣｒｅ誘導前のものをＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２と記載し、誘導後のものでＦ及びＭ蛋白を持続発現しているものをＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａと記載することにする。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａを利用してＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰの調製を継続し、Ｐ２の感染６日後に９．５×１０７，Ｐ４の感染５日後に３．７×１０７ＧＦＰ−ＣＩＵのウィルスを調製した。
本実験においても、実施例３に示した「Ｐ１以降を３２℃で培養する」という改善点があったからこそＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのウィルス回収が可能になったと考えられる。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰにおいてＭ蛋白を発現細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａ）からトランスに供給していることが原因と考えられるが、広がりが非常に遅くＰ１の感染７日後でようやく広がりが見られている（図３６）。即ち、当該ウィルスの再構成実験においても、「Ｐ１以降を３２℃で培養する」ことが転写複製効率の良くない或いは感染性ビリオン形成効率の良くないＳｅＶを再構成する場合に非常に有効であることを支持している。
［実施例２３］Ｍ欠失型ウィルスの生産性
このウィルスの生産性の面での検討も行った。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａを６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播き３７℃で培養した。ほぼコンフルエントの状態で３２℃に移行させ、１日後にＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．０．５で感染し、経時的に培養上清を回収し新たな培地を添加した。回収した上清についてＣＩＵとＨＡＵを求めた。感染４〜６日後で最も多くのウィルスが回収された（図３７）。ＨＡＵは感染６日後以降も維持されているが、この時点では細胞障害性が強く出ており、ウィルスパーティクル由来では無く、細胞断片に結合している或いは遊離しているＨＡ蛋白による活性が出ているものと予想された。即ち、ウィルスを回収するには感染５日後までの培養上清を回収すべきであると考えられる。
［実施例２４］Ｍ欠失型ＳｅＶのウィルスの構造確認
ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのウィルス遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで、ウィルス蛋白をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した。ＲＴ−ＰＣＲはＰ２の感染６日後のウィルスを利用した。ウィルス溶液からのＲＮＡの回収はＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を利用し、またｃＤＮＡ調製はＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を利用して、両システムともに添付のプロトコールに記載の方法で行った。ｃＤＮＡ調製時のプライマーにはキットに添付のｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒを使用した。また、ＲＮＡからの産物であることの確認として、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅの有無で同反応を行った。調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰ遺伝子上のＦ３５９３（５’−ｃｃａａｔｃｔａｃｃａｔｃａｇｃａｔｃａｇｃ−３’／配列番号：３１）とＦ遺伝子上のＲ４９９３（５’−ｔｔｃｃｃｔｔｃａｔｃｇａｃｔａｔｇａｃｃ−３’／配列番号：３２）の組み合わせと、同じくＰ遺伝子上のＦ３２０８（５’−ａｇａｇａａｃａａｇａｃｔａａｇｇｃｔａｃｃ−３’／配列番号：３３）とＲ４９９３の組み合わせの２種でＰＣＲを行った。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰの遺伝子構造から予想されたように、前者及び後者からそれぞれ１０７３ｂｐ及び１４５８ｂｐの増幅が観察された（図３８）。ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ無し（ＲＴ−）の場合は当該遺伝子の増幅はなく、またＧＦＰ遺伝子ではなくＭ遺伝子が挿入している場合（ｐＳｅＶ１８＋ＧＦＰ）はそれぞれ１４００ｂｐ及び１７８５ｂｐなので明らかに大きさが異なり、本ウィルスはＭ欠失型の遺伝子構造であることを支持した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより蛋白側からの確認を行った。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３でＬＬＣ−ＭＫ２に感染し、感染３日後に培養上清と細胞を回収し、培養上清は４８，０００ｇで４５分間遠心しウィルス蛋白を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、抗Ｍ抗体、抗Ｆ抗体及び主にＮＰ蛋白を認識するＤＮ−１抗体（ラビットポリクローナル）で検出した。実施例３及び実施例４に記載の方法で行った。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ感染細胞ではＭ蛋白が観測されずＦ或いはＮＰは観測されたことから、蛋白側からもＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰの構造であることが確認された（図３９）。この時、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞ではＦ蛋白が観測されず、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰでは調べた全てのウィルス蛋白質が観測された。また、培養上清のウィルス蛋白に関しては、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰにおいてはＮＰの観測量が非常に少なく、二次放出粒子が無いか或いは非常に少ないと予想された。
［実施例２５］Ｍ欠失型ＳｅＶの２次放出粒子の有無に関する定量的解析
実施例２４記載のようにＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３でＬＬＣ−ＭＫ２に感染し、感染３日後に培養上清を回収し、０．４５μｍ径のフィルターを通した後４８，０００ｇで４５分間遠心し、回収したウィルス蛋白を用いてＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、半定量的に培養上清中のウィルス蛋白を検出した。対照としてＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰを同様に感染して調製したサンプルを使用した。それぞれの希釈系列を作製しＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行いＤＮ−１抗体（主にＮＰ蛋白認識）で検出した。ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ感染細胞上清中のウィルス蛋白はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞のものの約１／１００であると判断された（図４０）。また、同サンプルのＨＡ活性はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ（６４ＨＡＵ）なのに対しＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ（＜２ＨＡＵ）であった。
同実験を再度経時的に行った。即ち、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３でＬＬＣ−ＭＫ２に感染し、経時的に（一日毎に）培養上清を回収し、ＨＡ活性を測定した（図４１）。感染４日後以降に少ないながらもＨＡ活性が観測された。但し、同サンプルについて細胞障害性の指標となるＬＤＨ活性を測定した所、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ感染細胞では感染４日後以降明らかな細胞障害性が惹起しており（図４２）、ＨＡ活性の上昇はウィルス様パーティクルに起因するのでは無く、細胞断片に結合している或いは遊離しているＨＡ蛋白による活性が出ている可能性が高いと予想された。更に、感染５日後の培養上清について、カチオニックリポソームであるＤｏｓｐｅｒ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて検証した。即ち、培養上清１００μＬとＤｏｓｐｅｒ  １２．５μＬを混合し室温で１０分放置後、６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントに培養したＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションした。２日後に蛍光顕微鏡下で観察した所、二次放出粒子の存在するＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞の培養上清では、多くのＧＦＰ陽性細胞が観察されるのに対し、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ感染細胞の培養上清ではＧＦＰ陽性細胞は僅かには存在したが殆ど観察されなかった（図４３）。以上の結果より、Ｍ蛋白を欠失することで、二次放出粒子はほとんど抑制可能であると結論できた。
［実施例２６］Ｆ及びＭ両欠失型ＳｅＶのウィルス再構成
Ｆ及びＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）の再構成は、実施例２２記載のＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰの再構成と同様の方法で行った。即ち、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７を室温で１時間感染させた（ｍ．ｏ．ｉ．２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ，ｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ及びｐＧＥＭ／Ｍをそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁し、１μｇ  ＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％  ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａを重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁、凍結融解を３回繰り返えしてＰ０  ｌｙｓａｔｅを調製した。一方でＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａを２４ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの時に３２℃に移し１日間培養した細胞を準備した。この細胞にＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰのＰ０  ｌｙｓａｔｅを各２００μＬ／ｗｅｌｌでトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した。Ｐ０では良く広がったＧＦＰ陽性細胞が観察された。また、Ｐ１でも非常に弱いながら広がりが観察された（図４４）。しかし、検出可能な力価を含むウィルス溶液としては回収できなかった。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／ＡにＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰを感染させた場合、両ウィルスの場合でＧＦＰ陽性細胞の順調な広がりが観察された（図４５）。Ｆ／Ｍ両発現細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａ）を用い、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰまたはＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．０．５で感染後、３日後及び６日後にサンプリングし、１／６．５容の７．５％  ＢＳＡを混合し（終濃度１％）、保存したサンプルについてタイターを測定することによってベクターの生産性を調べたところ、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰで１０８ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬ以上、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰで１０７ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬ以上のウィルス溶液として回収可能であった（表１）。即ち、Ｍ及びＦ蛋白質は、両方ともトランス供給が成功していることが示された。
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［実施例２７］ＳｅＶ−Ｆ及びＭ蛋白を発現するヘルパー細胞の改良
ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／ＡのＭ／Ｆ発現ヘルパー細胞を利用した場合、Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）のウィルス粒子は回収出来なかった。しかし、Ｆ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）及びＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）の両者の再構成・生産が可能であったことから、同ヘルパー細胞に利用したＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムの基本的な能力として、Ｍ及びＦ両蛋白質のトランス供給は十分可能であると考えられた。則ち、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムの利用は効果的であり、Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶの再構成を可能にするには、同システムを用いて発現するＭ及びＦ蛋白量を更に増やす必要があると判断した。
〈１〉Ｍ及びＦ発現プラスミドの構築
Ｍ及びＦ蛋白を同時に発現誘導するヘルパー細胞の改良の為には、既に作製している上記ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２細胞を利用し、この細胞に同システムでのＭ及びＦ遺伝子の再導入を行うこととした。但し、Ｆ遺伝子導入時に使用したｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆはｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を有し、Ｍ遺伝子導入時に使用したｐＣＡＬＮｄＬｗ／ｈｙｇｒｏＭはｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を有している為、同細胞を利用する為には別の耐性遺伝子の導入が必須であり、まず図４６に記載のスキームでＦ遺伝子搭載プラスミド（ｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆ：ｐＣＡＬＮｄＬｗのＳｗａＩサイトにＭ遺伝子導入）のｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子に置き換えた。即ち、ｐＣＡＬＮｄＬｗ／ＦをＳｐｅＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化しＦ遺伝子を含む断片（５４７７ｂｐ）をアガロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで回収した。同時に、同ｐＣＡＬＮｄＬｗ／ＦをＸｈｏＩで切断、ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含まない断片（６６６３ｂｐ）を回収後、更にＳｐｅＩで切断し１７６１ｂｐの断片を回収した。Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子はｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をテンプレートにｚｅｏ−５’（５’−ＴＣＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＣＧＧＴＡＣＧａｔｇｇｃｃａａｇｔｔｇａｃｃａｇｔｇｃｃｇｔｔｃｃｇｇｔｇｃｔｃａｃ−３’／配列番号：３４）及びｚｅｏ−３’（５’−ＡＡＴＧＣＡＴＧＡＴＣＡＧＴＡＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣｔｃａｇｔｃｃｔｇｃｔｃｃｔｃｇｇｃｃａｃｇａａｇｔｇｃａｃｇｃａｇｔｔｇ−３’／配列番号：３５）の２種のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで回収した後ＸｈｏＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化して調製した。これら３種の断片をライゲーションしｐＣＡＬＮｄＬｗ−ｚｅｏＦを作製した。次にＸｈｏＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔで薬剤耐性遺伝子を含む断片を組み換えることでｐＣＡＬＮｄＬｗ−ｚｅｏＭ遺伝子を構築した。
〈２〉ヘルパー細胞のクローニング
トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いプロトコールに記載の方法で行った。即ち以下の方法をとった。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２細胞を５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで６０ｍｍシャーレに播き、１０％  ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭで２４時間培養した。ｐＣＡＬＮｄＬｗ−ｚｅｏＦ及びｐＣＡＬＮｄＬｗ−ｚｅｏＭのそれぞれ１μｇ（計２μｇ）をＦＢＳ及び抗生物質を含まないＤ−ＭＥＭに希釈し（総量で２４２μＬ）、撹拌後ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ  ８μＬを添加、再度撹拌し室温で１５分間放置した。放置後、予めＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ｒｅａｇｅｎｔ  １２μＬをＦＢＳ及び抗生物質を含まないＤ−ＭＥＭに希釈したものを（総量で２５０μＬ）添加し室温で１５分間放置した。放置後、ＦＢＳ及び抗生物質を含まないＤ−ＭＥＭを２ｍＬ添加し撹拌後、ＰＢＳで１回洗浄したＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２細胞へこのトランスフェクション混合液を添加した。３７℃，５％  ＣＯ２インキュベーターで３時間培養後、トランスフェクション混合液を除去することなく、２０％  ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭを２．５ｍＬ添加し２４時間培養した。培養後、トリプシンで細胞を剥がし、９６ｗｅｌｌプレートに約５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ或いは２５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割り合いで希釈し、５００μｇ／ｍＬのｚｅｏｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含む１０％  ＦＢＳ入りのＤ−ＭＥＭで約２週間培養した。単一の細胞から広がったクローンを６ｗｅｌｌプレートまで拡大培養した。このようにして調整した合計９８クローンについて解析を行った。
得られた９８クローンについて、Ｍ蛋白及びＦ蛋白の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇで半定量的に解析した。各クローンを１２ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの状態で、５％  ＦＢＳを含むＭＥＭで希釈したＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２３，３８１６−３８２１（１９９５），Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））でＭＯＩ  ５で感染させた。３２℃で２日間培養後、培養上清を除去しＰＢＳで１回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がして細胞を回収した。１ｌａｎｅあたりこの１／５量をアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、抗Ｍ抗体及び抗Ｆ抗体（ｆ２３６：Ｓｅｇａｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３，１０６４−１０７２（１９９８））を利用してＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。評価した約９８クローンの中の９クローンについての結果を図４７に示した。
［実施例２８］Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶのウィルス再構成（２）
Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）の再構成は、実施例２７記載のクローンの評価を絡めて実施した。則ち、Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ再構成のＰ０  ｌｙｓａｔｅ（トランスフェクションした細胞のライセート）を利用して、再構成が可能か否かの評価を行った。Ｐ０  ｌｙｓａｔｅの調製は実施例２に記載の方法に倣い以下のように行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７を室温で１時間感染させた（ＭＯＩ  ２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ，ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ，ｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ及びｐＧＥＭ／Ｍをそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁し、１μｇ  ＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％  ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを重層し、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した。これらの細胞を回収し、ペレットを２ｍＬ／ｄｉｓｈあたりのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁、凍結融解を３回繰り返えしてＰ０  ｌｙｓａｔｅを調製した。一方で新たにクローニングした細胞を２４ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの時にＡｘＣＡＮＣｒｅをＭＯＩ  ５で感染し、感染後３２℃で２日間培養した細胞を準備した。この細胞にＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰのＰ０  ｌｙｓａｔｅを各２００μＬ／ｗｅｌｌでトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬのＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した。評価した中の２０クローンについて、ＧＦＰ蛋白の広がりが観察され、Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶの回収に成功した。その中の数クローンでの再構成の様子を示したが（図４８）、特に、クローン＃３３（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／＃３３）ではｐ３（継代３回目）の段階で１０８ＧＦＰ−ＣＩＵ／ｍＬ以上の感染ウィルス粒子が回収され、生産細胞として非常に有望な細胞であると認識される。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２の細胞にＭ及びＦ両遺伝子を導入すると、高頻度でＭ／Ｆ両欠失型ＳｅＶの回収が可能な細胞が調整できたことになる。解釈として、ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２細胞の時点で、発現量としては非常に良い状態にあり、（Ｍ及びＦ両遺伝子を導入し）Ｍ／Ｆ両蛋白の発現を僅かに底上げすることによって、Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶの回収が可能になったと判断された。
［実施例２９］Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶのウィルス生産性
このウィルスの生産性の面での検討も行った。ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／＃３３を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播き３７℃で培養した。ほぼコンフルエントの状態でＡｘＣＡＮＣｒｅをＭＯＩ  ５で感染し（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／＃３３／Ａ）、感染後３２℃で２日間培養した。その後、ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰをＭＯＩ  ０．５で感染し、経時的に培養上清を回収し新たな培地を添加した。回収した上清についてＣＩＵとＨＡＵを求めた。感染２日目以降、継続して１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上のウィルスが回収された（図４９）。また、ＣＩＵとＨＡＵの変化がパラレルであり、生産している多くのｐａｒｔｉｃｌｅは感染性を有しており、効率的に生産されていると考えられた。
［実施例３０］Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶのウィルス構造確認
ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰのウィルス遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで、ウィルス蛋白をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇで確認した。ＲＴ−ＰＣＲはＰ２の感染５日目（Ｐ２ｄ５）のウィルスを利用した。ウィルス溶液からのＲＮＡの回収はＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を利用し、またｃＤＮＡ調整からＲＴ−ＰＣＲはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を利用して、両システムともに添付のプロトコールに記載の方法で行った。ｃＤＮＡ調製及びＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして、Ｐ遺伝子上のＦ３２０８（５’−ａｇａｇａａｃａａｇａｃｔａａｇｇｃｔａｃｃ−３’／配列番号：３３）とＧＦＰ遺伝子上のＧＦＰ−ＲＶ（５’−ｃａｇａｔｇａａｃｔｔｃａｇｇｇｔｃａｇｃｔｔｇ−３’／配列番号：３６）、及び同Ｆ３２０８とＨＮ遺伝子上のＲ６８２３（５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ−３’／配列番号：３７）の組み合わせの２種でＰＣＲを行った。ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰの遺伝子構造から予想されたように、前者及び後者からそれぞれ６４４ｂｐ及び１４９５ｂｐの増幅が観察された（図５０）。また、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰから調整したものでは、それぞれ予想される大きさの遺伝子の増幅が観察され、明らかにＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰからのものとは大きさが異なった。以上のことから、本ウィルスはＭ／Ｆ両欠失型の遺伝子構造であることを支持した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより蛋白側からの確認を行った。ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋ＧＦＰをＭＯＩ  ３でＬＬＣ−ＭＫ２に感染し、感染２日後に細胞を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、抗Ｍ抗体、抗Ｆ抗体及び主にＮＰ蛋白を認識するＤＮ−１抗体（ラビットポリクローナル）で検出した。実施例３及び実施例４に記載の方法で行った。ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ感染細胞ではＭ蛋白及びＦ蛋白ともに観測されずＮＰは観測されたことから、蛋白側からもＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰの構造であることが確認された（図５１図）。この時、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞ではＦ蛋白が観測されず、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ感染細胞ではＭ蛋白が観測されず、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰでは調べた全てのウィルス蛋白質が観測された。
［実施例３１］Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶの２次放出粒子の有無に関する定量的解析
同実験を再度経時的に行った。即ち、ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰをＭＯＩ  ３でＬＬＣ−ＭＫ２に感染し、経時的に（一日毎に）培養上清を回収し、ＨＡ活性を測定した（図５２）。感染４日後以降に少ないながらもＨＡ活性が観測された。但し、このＨＡ活性の上昇は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰの場合と同じく、ウィルス様パーティクルに起因するのでは無く細胞断片に結合している或いは遊離しているＨＡ蛋白による活性が出ている可能性が高いと予想された。更に、感染５日後の培養上清について、カチオニックリポソームであるＤｏｓｐｅｒ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて検証した。即ち、培養上清１００μＬとＤｏｓｐｅｒ  １２．５μＬを混合し室温で１０分放置後、６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントに培養したＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションした。２日後に蛍光顕微鏡下で観察した所、二次放出粒子の存在するＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞の培養上清からのものでは、多くのＧＦＰ陽性細胞が観察されるのに対し、ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＰＰ感染細胞の培養上清からのものではＧＦＰ陽性細胞は殆ど観察されなかった（図５３）。以上の結果より、ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰは、感染細胞からの二次放出粒子をほとんど消失していると結論できた。
［実施例３２］Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ及びＭ欠失型ＳｅＶのウィルス感染能評価（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
非分裂細胞への導入及び発現効率については遺伝子導入ベクターの性能を評価する上で重要な項目であり、評価は必須である。そこで、胎生１７日ラット脳より大脳皮質神経細胞を調整し初代培養を行い、非分裂細胞における感染能を調べた。
ラット大脳皮質初代培養神経細胞の調整は以下の方法で行った。妊娠ＳＤラットを胎齢１７日において、エーテル麻酔下断頭を行った。イソジン及び８０％エタノールにより腹部を消毒後、子宮を１０ｃｍシャーレに取り出し、子宮より胎児を取り出す。次に、胎児の頭部の頭皮及び頭蓋骨をＩＮＯＸ５ピンセットで裂き、脳を採取、３５ｍｍシャーレに集めた。小脳及び脳幹の一部を眼科用ハサミで除き、大脳を半球に分け、脳幹の残りを除き、嗅球をピンセットでつまんで除き、髄膜をピンセットで除いた。最後に、間脳及び海馬を眼科用ハサミで取り除いた後に、皮質をシャーレに集め、手術用メス刃にて小片にし、１５ｍｍ遠心管に集めた。０．３ｍｇ  ｐａｐａｉｎ／ｍＬにて３７℃で１０分間処理、５ｍＬの血清入り培地で処理、洗浄し、細胞を分散した。７０μｍ  ｓｔｒａｉｎｅｒを通し、遠心により細胞を集めた後、緩やかにピペッティングし細胞を分散し、細胞の計数を行った。ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）ｃｏａｔｅｄ  ２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２ｘ１０５或いは４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種し、２日後にＭ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）及びＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）をＭＯＩ  ３で感染した。感染３６ｈｒ後に神経細胞特異的マーカーであるＭＡＰ２で免疫染色を行い、ＧＦＰ発現細胞（ＳｅＶ感染細胞）と重合せをして感染細胞の同定を行った。
ＭＡＰ２による免疫染色は以下のように行った。感染細胞をＰＢＳで洗浄後、室温で１０分間４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄後、２％のｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍを含むＰＢＳ溶液を用いて室温で６０分間Ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。１／２００に希釈したＡｎｔｉ−ＭＡＰ２抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を３７℃で３０分間反応し、ＰＢＳで洗浄後、１／２００に希釈した二次抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ５６８：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を３７℃で３０分間反応した。ＰＢＳで洗浄後、蛍光顕微鏡（ＤＭ  ＩＲＢ−ＳＬＲ：Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下、細胞の蛍光を観察した。
Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）及びＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）の両者において、ＭＡＰ２陽性細胞のほとんどがＧＦＰに陽性であった（図５４）。則ち、調整した神経細胞のほとんどの細胞で効率的にＳｅＶが感染しており、Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ及びＭ欠失型ＳｅＶともに非分裂細胞への導入及び発現効率が良いことが確認された。
［実施例３３］Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ及びＭ欠失型ＳｅＶのウィルス感染能評価（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ｉｎ  ｖｉｖｏでの感染能を評価した。Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）及びＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）５μＬ（１×１０９ｐ．ｆ．ｕ．／ｍｌ）をスナネズミの左側能室にステレオ法により脳室内投与した。投与２日後に解剖し脳を摘出し、凍結切片を作製した。蛍光顕微鏡下で観察し、ＧＦＰの蛍光強度により感染の有無を調査した。Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）及びＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）の両者において、左右側脳室の上衣細胞等において、多くの陽性細胞が観察された（図５５）。則ち、Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ及びＭ欠失型ＳｅＶともにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて効率的な遺伝子導入及び発現が可能であることが確認された。
［実施例３４］Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶ及びＭ欠失型ＳｅＶの細胞傷害性評価
細胞傷害性に関しては、ＳｅＶ感染依存的な細胞傷害性が観察できる、ＣＶ−１細胞及びＨｅＬａ細胞を利用して評価した。またコントロールとして、付加型ＳｅＶ（天然型：ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ）（複製能を持つ）及びＦ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）について同時に測定した。実験方法の詳細は実施例６、実施例１２及び実施例１７に記載している。簡単に記すと、ＣＶ−１細胞或いはＨｅＬａ細胞を２．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播き培養した。培養には両細胞ともに１０％  ＦＢＳを含むＭＥＭを使用した。２４時間培養後、１％  ＢＳＡを含むＭＥＭで希釈したＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ溶液を５μＬ／ｗｅｌｌで添加し感染させ、６時間後ウィルス液を含む培地を除き、ＦＢＳを含まないＭＥＭ培地に置き換えた。感染３日後に培養上清をサンプリングし、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を利用してＫｉｔに記載の方法に従って細胞傷害性の定量を行った。付加型ＳｅＶと比較すると、Ｍ或いはＦ遺伝子を欠失することで（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰにおいて）細胞傷害性の減弱があり、この両欠失を組み合わせることで（ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰにおいて）相加的に作用しより細胞傷害性が減弱した（図５６）。
以上のように、本明細書において初めて再構成に成功した「Ｍ／Ｆ両欠失型ＳｅＶベクター」は、非分裂細胞を含む多くの細胞への感染能を有し、２次放出粒子をほとんど消失し、更に細胞傷害性の減弱した汎用性の高い遺伝子導入ベクターであると考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明により、粒子形成能が低下または消失した（−）鎖ＲＮＡウィルスの検査方法、スクリーニング方法、および製造方法が提供された。本発明により製造されるウィルスは、遺伝子導入細胞から２次放出（ＶＬＰ放出）による細胞障害や免疫誘導が低減されるため、宿主に対して副作用の少ない遺伝子導入ベクターとして有用である。特に本発明により提供されるベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療用ベクターとして様々な適用が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｍ遺伝子に温度感受性変異を導入したＦ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築スキームを示す図である。
図２は、Ｍ遺伝子への温度感受性変異導入による２次放出粒子抑制を目的として構築したウィルス遺伝子及びその変異導入の効果を比較検討する為に構築した或いは使用したウィルス遺伝子の構造を示す図である。
図３は、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをＦ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）に感染し、３２℃及び３７℃で６日間培養後のＧＦＰ発現を示す顕微鏡像を示す写真である。
図４は、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を持続発現する細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ）について、３２℃或いは３７℃でｔｒｙｐｓｉｎ及び血清を含まないＭＥＭで培養し経時的にＦ蛋白の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇで半定量的に観測した結果を示す写真である。
図５は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し３２℃，３７℃或いは３８℃で培養し３日後のＧＦＰ発現を示す顕微鏡像を示す写真である。
図６は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し３２℃，３７℃或いは３８℃で培養し経時的にサンプリング（同時に新しい培地に交換）した培養上清の赤血球凝集活性（ＨＡ活性）を示す図である。
図７は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、３７℃で培養２日後の培養上清及び細胞を回収して、１ｌａｎｅ当り６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ培養１ｗｅｌｌ分の１／１０相当量を用いて、抗Ｍ抗体を利用したＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより求めた、細胞内とウィルス様パーティクル（ＶＬＰ）間のＭ蛋白の存在比率を示す写真である。
図８は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、培養１２，１８，２４，５０，１２０時間後にサンプリングした培養上清を用いて測定したＳＥＡＰ活性を示す図である。
図９は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、培養２４，５０，１２０時間後にサンプリングした培養上清のＨＡ活性を示す図である。
図１０は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、培養５日後にサンプリングした培養上清について遠心後ウィルスを回収し、１ｌａｎｅ当り６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ培養１ｗｅｌｌ分の１／１０相当量を用いて、抗Ｍ抗体を利用したＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより求めたウィルス様パーティクル量を示す写真である。
図１１は、ＬＬＣ−ＭＫ２，ＢＥＡＳ−２Ｂ或いはＣＶ−１細胞にＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０で感染し、血清を含まない或いは１０％  ＦＢＳを含む培地で培養し、血清を含まない培地の場合は感染３日後に、１０％  ＦＢＳを含む培地の場合は感染６日後に、培地中に放出されたＬＤＨ量から見積った細胞障害性を示す図である。
図１２は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ，ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、３２℃，３７℃或いは３８℃で培養し、培養２日後に抗Ｍ抗体を利用して免疫染色を行うことにより求めたＭ蛋白の細胞内局在を示す写真である。
図１３は、Ａ−１０細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、３２℃或いは３７℃で培養し、培養１日後に抗Ｍ抗体および抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したＭ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在を示す写真である。ステレオ立体画像で示した。
図１４は、Ａ−１０細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、３２℃或いは３７℃で培養し、培養２日後に抗Ｍ抗体および抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したＭ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在を示す写真である。ステレオ立体画像で示した。
図１５は、Ｍ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在に及ぼす微小管脱重合試薬の効果を示す写真である。Ａ−１０細胞にＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、直後に微小管の脱重合試薬であるコルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）或いはコルセミド（ｃｏｌｃｅｍｉｄｅ）を終濃度１μＭになるように添加し、３２℃で培養した。培養２日後に抗Ｍ抗体及び抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したＭ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在を観察した。ステレオ立体画像で示した。
図１６は、Ｍ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在に及ぼす微小管脱重合試薬の効果を示す写真である。Ａ−１０細胞にＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓΔＦ−ＧＦＰをｍ．ｏ．ｉ．１で感染し、直後に微小管の脱重合試薬であるｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅを終濃度１μＭになるように添加し、３２℃或いは３７℃で培養した。培養２日後に抗Ｍ抗体及び抗ＨＮ抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したＭ蛋白及びＨＮ蛋白の細胞内局在を観察した。ステレオ立体画像で示した。
図１７は、ＰおよびＬ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築スキームを示す図である。
図１８は、ＰおよびＬ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶを感染させた細胞からのウィルス２次放出を調べた結果を示す図である。「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ、「Ｐ８６」はＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「Ｐ５１１」はＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図１９は、ＰおよびＬ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶの細胞障害性を調べた結果を示す図である。「Ｐ８６」はＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「Ｐ５１１」はＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ＤＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図２０は、ＰおよびＬ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶを導入したＣＶ−１細胞における導入遺伝子（ＧＦＰ）を発現する細胞数の変化を示す図である。「Ｐ８６」はＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「Ｐ５１１」はＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図２１は、ＰおよびＬ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶを導入したＣＶ−１細胞における導入遺伝子（ＧＦＰ）の発現を示す写真である。「Ｐ８６」はＳｅＶ１８＋／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「Ｐ５１１」はＳｅＶ１８＋／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ΔＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ、を表す。
図２２は、ＰおよびＬ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶを導入した細胞における導入遺伝子（ＳＥＡＰ）の発現レベルの持続性を示す図である。「ＮＣ」はベクター導入を行わない陰性対照、「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ、「ｐ８６」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ｐ５１１」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図２３は、ＰおよびＬ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶ（ＳＥＡＰ遺伝子搭載型）のウィルス２次放出を調べた結果を示す図である。「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ、「ｐ８６」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ｐ５１１」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図２４は、ＰおよびＬ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶ（ＳＥＡＰ遺伝子搭載型）の細胞障害性を調べた結果を示す図である。「ｄＦ＋ＳＥＡＰ」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ、「ｐ８６＋ＳＥＡＰ」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ｐ５１１＋ＳＥＡＰ」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図２５は、ＭおよびＨＮ遺伝子に温度感受性変異を有し、さらにＰおよびＬ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶのゲノム構造を示す図である。
図２６は、Ｍ／ＨＮ遺伝子に温度感受性変異、Ｐ／Ｌ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶのゲノムｃＤＮＡの構築スキームを示す図である。
図２７は、Ｍ／ＨＮ遺伝子に温度感受性変異、Ｐ／Ｌ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶのウィルス２次放出を調べた結果を示す図である。「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ、「ｔｓ」はＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  ΔＦ−ＧＦＰ、「ｔｓ＋８６」はＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ｔｓ＋５１１」はＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図２８は、Ｍ／ＨＮ遺伝子に温度感受性変異、Ｐ／Ｌ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶの細胞障害性を調べた結果を示す図である。「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ、「ｔｓ」はＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  ΔＦ−ＧＦＰ、「ｔｓ＋８６」はＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ｔｓ＋５１１」はＳｅＶ１８＋／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図２９は、Ｍ／ＨＮ遺伝子に温度感受性変異、Ｐ／Ｌ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶ（外来遺伝子搭載型）の外来遺伝子発現レベルを経時的に調べた結果を示す図である。「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ、「ｔｓ＋８６」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ｔｓ＋５１１」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図３０は、Ｍ／ＨＮ遺伝子に温度感受性変異、Ｐ／Ｌ遺伝子に変異を有するＦ欠失型ＳｅＶ（外来遺伝子搭載型）の細胞障害性を経時的に調べた結巣を示す図である。「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ΔＦ−ＧＦＰ、「ｄＦ／ｔｓ＋Ｐ８６Ｌ」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ８６Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰ、「ｄＦ／ｔｓ＋Ｐ５１１Ｌ」はＳｅＶ１８＋ＳＥＡＰ／ＭｔｓＨＮｔｓ  Ｐ５１１Ｌｍｕｔ・ΔＦ−ＧＦＰを表す。
図３１は、ＥＧＦＰ遺伝子を有するＭ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築スキームを示す図である。
図３２は、Ｆ及び両欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡの構築スキームを示す図である。
図３３は、構築したＦおよび／またはＭ欠失型ＳｅＶ遺伝子の構造を示す図である。
図３４は、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を有するＭ遺伝子発現プラスミドの構築スキームを示す図である。
図３５は、クローニングしたＭ（及びＦ）蛋白を誘導発現する細胞について、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（ＡｃＣＡＮＣｒｅ）を感染後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇによるＭ及びＦ蛋白の半定量的な発現比較を示す写真である。
図３６は、ヘルパー細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ）クローン＃１８及び＃６２を用いたＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ）のウィルス再構成を示す写真である。
図３７は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのウィルス生産性（ＣＩＵとＨＡＵの経時変化）を示す図である。
図３８は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのビリオン中の遺伝子構造確認の為のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真および図である。
図３９は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰのウィルス構造を蛋白の視点から確認する為に、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に感染後の細胞及び培養上清中のウィルス蛋白についてＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰとの比較結果を示す写真である。
図４０は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ及びＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞培養上清中のウィルス由来蛋白の定量比較（希釈系列を作製してＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を示す写真である。抗ＳｅＶ抗体（ＤＮ−１）を用いた。
図４１は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２にｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、経時的に回収した培養上清中のＨＡ活性を示す図である。
図４２は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２にｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染５日後の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
図４３は、ＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２にｍ．ｏ．ｉ．３で感染し、感染５日後に回収した培養上清について、カチオニックリポソーム（Ｄｏｓｐｅｒ）を用いてＬＬＣ−ＭＫ２にトランスフェクションした２日後の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
図４４は、Ｆ及びＭ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰ）のウィルス再構成を示す写真である。
図４５は、Ｍ及びＦ両発現細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ｍ６２／Ａ）にＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ或いはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰを感染し、感染３日後及び５日後の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
図４６は、ｚｅｏｃｉｎ選択マーカーを持つ、ＭまたはＦ遺伝子の誘導発現ベクターの構築スキームを示す図である。
図４７は、Ｍ／Ｆ発現ヘルパー細胞におけるＭ蛋白質およびＦ蛋白質の発現を調べた結果を示す写真である。
図４８は、ＧＦＰ遺伝子を持つＭ／Ｆ欠失型ＳｅＶを導入した細胞におけるＧＦＰの発現を示す写真である。
図４９は、ＧＦＰ遺伝子を持つＭ／Ｆ欠失型ＳｅＶの産生細胞からのウィルスの産生を調べた結果を示す図である。
図５０は、Ｍ／Ｆ欠失型ＳｅＶのゲノム構造をＲＴ−ＰＣＲにより確認した結果を示す写真である。「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ、「ｄＭ」はＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ、「ｄＭｄＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰを表す。
図５１は、Ｍ／Ｆ欠失型ＳｅＶを導入した細胞におけるＭ蛋白質およびＦ蛋白質の発現の欠失を確認した結果を示す写真である。
図５２は、Ｍ／Ｆ欠失型ＳｅＶを導入した細胞からのウィルス２次放出の有無をＨＡ活性により調べた結果を示す図である。
図５３は、Ｍ／Ｆ欠失型ＳｅＶを導入した細胞からのウィルス２次放出の有無を、培養上清のトランスフェクションにより調べた結果を示す写真である。
図５４は、Ｍ／Ｆ欠失型ＳｅＶおよびＭ欠失型ＳｅＶの大脳皮質神経細胞への感染能を調べた結果を示す写真である。
図５５は、Ｍ／Ｆ欠失型ＳｅＶおよびＭ欠失型ＳｅＶのスナネズミ脳へのインビボ投与後の導入遺伝子の発現を示す写真である。
図５６は、Ｍ／Ｆ欠失型ＳｅＶおよびＭ欠失型ＳｅＶの感染価依存的な細胞障害性を調べた結果を示す図である。「付加」は複製能を持ったＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ）、「ｄＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ、「ｄＭ」はＳｅＶ１８＋／ΔＭ−ＧＦＰ、「ｄＭｄＦ」はＳｅＶ１８＋／ΔＭΔＦ−ＧＦＰを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【国際調査報告】
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