(57)【要約】中枢神経系における疾患に関与する遺伝子及び蛋白質と、該蛋白質に対する活性調節剤の効率的な評価方法を提供する。配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされる電位依存性カチオンチャネル蛋白質、該ＤＮＡ配列に対するアンチセンス核酸、該蛋白質を利用した該蛋白質のチャネル機能を調節する物質の探索方法、該ＤＮＡに対するアンチセンス核酸、該蛋白質に対する特異抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号：１のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ電位依存性カチオンチャネル蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる電位依存性カチオンチャネル蛋白質。
【請求項４】
イオン選択性フィルターとしての保存アミノ酸がＥＥＫＥであることを特徴とする、請求項３に記載の蛋白質。
【請求項５】
Ｎａイオンを流入させる活性を有することを特徴とする、請求項３に記載の蛋白質。
【請求項６】
請求項３乃至５のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１または請求項６に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
【請求項９】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸。
【請求項１０】
塩基配列が、請求項１に記載のＤＮＡまたは配列番号３に記載の核酸の全部または一部に相補する配列である、請求項６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１１】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドに対する抗体。
【請求項１２】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞とカチオンとを接触させ、電流または電位変化応答を測定することを特徴とする、該蛋白質が特異的に流入させるカチオンの決定方法。
【請求項１３】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と被験物質とを接触させ、該蛋白質のチャネル機能の変化を測定することを特徴とする、該蛋白質のチャネル機能を調節する物質の探索方法。
【請求項１４】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質を発現している形質転換細胞を調製する際にヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ由来ｍＲＮＡを共導入することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項７に記載の組換えベクターまたは請求項８に記載の形質転換細胞と被験物質とを接触させ、請求項１に記載のＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡの発現調節作用を示す物質の検索方法。
【請求項１６】
ｃａｅ９５７７遺伝子組換え非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な電位依存性カチオンチャネル蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡならびに組換えベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体、該蛋白質に対する特異抗体、該蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸、及び該蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを用いた診断薬、阻害剤、医薬品などのスクリーニング方法、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
背景技術
細胞は、細胞膜、核膜その他の生体膜に様々な膜蛋白質を発現させている。これらはきわめて多数の生理活性物質とそれぞれ高度に特異的に対応し、その情報を細胞へと与えることで細胞あるいは生体全体の機能調節の役割を担っている。
この細胞の機能を調節する膜蛋白質として、生体膜においてある物質に対して特異的な通路を、膜を貫通する細孔として形成し、この膜の細孔を介した輸送を行う蛋白質であるチャネル蛋白質が知られている。チャネル蛋白質は、この細孔を開閉させることでそれぞれに特定の物質の移送を調節する。この開閉部分はゲートと呼ばれ、チャネル蛋白質は、このゲート開閉の機構に基づいて、生理活性物質の存在を感受してその開閉が行われるリガンド依存性チャネルと、膜電位に依存する電位依存性チャネルに分けられる。
チャネル蛋白質は、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）などのカチオンの移送に関与し、軸策やシナプス後膜、興奮膜のＮａチャネル、Ｋチャネル、Ｃａチャネルなど、またミトコンドリア内膜においてＡＴＰ産生に関与するプロトン（Ｈ）チャネル（Ｆ０とも呼ばれる）などが知られており、遺伝子、蛋白質、生体膜それぞれのレベルで研究が進められている。
Ｎａチャネル、Ｋチャネル、Ｃａチャネルなどの電位依存性カチオンチャネルは、興奮性細胞形質膜における活動電位やシナプス後電位の発生に関与しており、神経細胞間の興奮伝達に重要な役割を果たしていると推定されている。これらのチャネル蛋白質にはそれぞれ多くのサブタイプ蛋白質が存在することが報告されており、各カチオンチャネルに特異的なイオン選択性フィルターと呼ばれる保存アミノ酸が存在する。このイオン選択性フィルター以外では、Ｋチャネルでは６回、ＮａおよびＣａチャネルでは２４回膜貫通型という一次構造上の相同性を有しているなど、共通の特徴も認められる。
電位依存性カチオンチャネル蛋白質及びその遺伝子の報告は脳や神経組織からの例が多く、神経細胞それ自体あるいは神経細胞間のシグナル伝達に重要な機能を果たしていると推定される。特に、各チャネル蛋白質で多くのサブタイプが存在することは、各サブタイプが固有の生理的機能を有していることを推認させるものである。また、生体にはＮａ、Ｋ、Ｃａ以外にも多くのカチオンが非常に重要な生理的機能を果たしていることから、これらのカチオンチャネル蛋白質を単離しその機能を特定することは、学術的意義のみならず、かかる機能を応用した医薬開発において重要な要素となり得る。また、この電位依存性カチオンチャネル蛋白質またはこれをコードする遺伝子を用いて、効率的に医薬候補物質、特に特異的なチャネル機能調節剤を探索、評価することも可能となる。
発明の開示
このような背景から、ヒト由来の新たな電位依存性カチオンチャネル蛋白質及びこれをコードする遺伝子を見出すこと、そして該蛋白質を生産し、該蛋白質の活性を調節する物質を効率的にスクリーニングする方法、活性調節剤、特異的抗体、あるいはアンチセンス核酸の開発が切望されている。
本発明は、新規な電位依存性カチオンチャネル蛋白質、及びそれをコードするＤＮＡを提供することにある。さらに、当該蛋白質に対するチャネル機能調節剤のスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。
課題を解決するための手段
本発明は、ヒト冠動脈内皮細胞から単離された新規な遺伝子（ｃａｅ９５７７とする）、当該遺伝子にコードされる電位依存性カチオンチャネル蛋白質（ＣＡＥ９５７７とする）に関する。また、当該遺伝子を用いて形質転換した宿主細胞、該蛋白質に対する特異抗体、該蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸、ＣＡＥ９５７７に特異的なカチオンの同定方法、チャネル機能調節剤の探索方法、遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。
（核酸）
本発明は、ＣＡＥ９５７７（後に詳しく述べる）をコードする遺伝子ｃａｅ９５７７を提供する。遺伝子ｃａｅ９５７７とは具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる電位依存性カチオンチャネル蛋白質をコードするＤＮＡのことであり、配列番号１や配列番号３に示すｃＤＮＡのほか該ｃＤＮＡの由来するゲノムＤＭＡも含まれる。該遺伝子は冠動脈内皮細胞から単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。また、本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
ｃａｅ９５７７の塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。本明細書中において、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と同義である。
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質が電位依存性カチオンチャネル蛋白質である限り、塩基配列のバリエーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１または配列番号３に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ電位依存性カチオンチャネル蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号１または配列番号３に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１または配列番号３に記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するものであれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２１５；４０３−１０（１９９０））を用いることができる。また、ハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１または配列番号３に記載の核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片は、精神・神経疾患等本発明の蛋白質が関与する疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。
本発明のＤＮＡは、ＣＡＥ９５７７を大量に生産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質の発現量をｍＲＮＡ発現量を指標として確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連する疾患の診断を行うことも可能である。
また、本発明のＤＮＡの一部をプライマーとして使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法により、核酸配列上の異常あるいは多形を検査・診断することができる。
また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導入し、本発明の蛋白質の発現または活性が損なわれていることによる疾患の遺伝子治療にも使用する事ができる。
本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換蛋白質ＣＡＥ９５７７の生産方法、あるいはＣＡＥ９５７７の発現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。
本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡを組み入れることが可能である。その際、遺伝子ｃａｅ９５７７をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ｃａｅ９５７７の宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いた蛋白質ＣＡＥ９５７７の生産において好適に用いられる他、遺伝子ｃａｅ９５７７の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能となる。
例えば、任意の被験物質と遺伝子ｃａｅ９５７７を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で接触させることで、被験物質の遺伝子ｃａｅ９５７７の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あるいは評価を行うことができる。
また、本発明であるＤＮＡと公知の方法とを組み合わせてマウスまたはその他の適当な動物を基にトランスジェニック動物を調製することが出来る。本発明の遺伝子ｃａｅ９５７７を利用すれば、ヒト以外の動物からヒトｃａｅ９５７７に相当する遺伝子を破壊したいわゆるノックアウト動物を作製することも可能である。そのようにして内在性遺伝子が破壊された該動物に本発明のヒトｃａｅ９５７７を導入することにより、ヒトｃａｅ９５７７のみを有するモデル動物を作製することも可能となる。かかるトランスジェニック動物、特に本発明である遺伝子ｃａｅ９５７７あるいは蛋白質ＣＡＥ９５７７を大量に発現しているあるいは逆にこれらを欠いた動物を観察すれば、遺伝子ｃａｅ９５７７あるいは蛋白質ＣＡＥ９５７７の機能を特定することが可能となる。さらに、このモデル動物は、該導入されたヒトｃａｅ９５７７をターゲットとした薬剤の開発、評価に有用である。
遺伝子ｃａｅ９５７７あるいは蛋白質ＣＡＥ９５７７に特異的に作用しあるいは機能を補完する物質等を、生体レベルで調べることが可能となり、この様にして得た物質は、ＣＡＥ９５７７が特異的に機能する生体制御に働く薬物となることが期待される。特に本発明である遺伝子あるいは蛋白質は脳に特異的に発現が観察されることから、上述の形質転換細胞あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、脳の機能異常に起因する精神・神経疾患に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
（蛋白質ＣＡＥ９５７７）
ｃａｅ９５７７にコードされる蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＣＡＥ９５７７である。ＣＡＥ９５７７はラットからクローニングされた電位依存性カチオンチャネル蛋白質であるＲｂ２１との間で９８％の相同性を有し、Ｒｂ２１と同様２４回膜貫通構造を有するチャネル蛋白質であると推測される。このラット由来のＲｂ２１は、脳に特異的に発現していることが確認されている一方で、イオン選択性フィルターとしての保存アミノ酸（ＣａチャネルではＥＥＥＥ、ＮａチャネルではＤＥＫＡ）が保存されておらず、ＥＥＫＥとなっており、独特なイオン選択性を有すると推測されている（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌ．４４５；２３１−２３６（１９９９））。電位依存性のＣａチャネルやＮａチャネルは一般的に６回膜貫通ドメインが４回繰り返された構造をしている。各ドメイン（Ｉ〜ＩＶ）に含まれる６個の膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）の、Ｓ５と  Ｓ６の間のループ部分（ｐｏｒｅ  ｌｏｏｐとも呼ばれる）はイオン選択性フィルターとして機能する。例えばＣａチャネルのこの部分には、各ドメインにつき１つのグルタミン酸が保存されており、Ｃａイオンに対する選択性を決定している（前掲論文、蛋白質核酸酵素  Ｖｏｌ．４５：１０１３−１０２２（２０００））。各ドメインの保存アミノ酸をドメインＩ〜ＩＶの順に並べてＥＥＥＥと表記し、イオン選択性フィルターとしての保存アミノ酸と定義する。ＣＡＥ９５７７のイオン選択性フィルターとしての保存アミノ酸はＥＥＫＥであった。ｃａｅ９５７７も、Ｒｂ２１と同様に脳特異的に発現していることが確認されたことから、中枢神経系において特殊なカチオン輸送に関与するチャネル蛋白質であると推定される。ラット由来のＲｂ２１については論文中（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌ．４４５；２３１−２３６（１９９９））において電流測定が試みられているが、Ｎａイオン、Ｂａイオンいずれの流入も測定できず、Ｒｂ２１のイオン選択性については解明されていない。また、ＷＯ  ０１／８３７５２にはＩＣ２３９４９として本発明の蛋白質とアミノ酸配列において９９％の相同性を示す蛋白質が開示されているが、配列上の特徴からＩＣ２３９４９がイオンチャネルであると推測はしているものの実際に活性測定は行っておらずイオン選択性についても明らかにされていない。これに対して本発明は、ＣＡＥ９５７７の活性測定に成功し、Ｎａイオンを流入させるがＢａイオン及び／またはＣａイオンは流入させないチャネルであることを明らかにし、さらにＣＡＥ９５７７が機能的に発現している卵母細胞では生存率が上昇するという従来のＮａチャネルには認められない特徴的な性質を見出し、本発明を完成させたものである。
従って、ＣＡＥ９５７７が介在するカチオン輸送機構の解明は神経細胞におけるシグナル伝達において新たな局面を与え得ると共に、かかるチャネル蛋白質に作用するチャネル機能の調節剤は、新たな作用機序に基づく医薬としての有用性を持つと期待されることから、ＣＡＥ９５７７を用いたチャネル機能調節剤の探索は、医薬開発において重要な意義を有すると期待される。
なお、電位依存性カチオンチャネル蛋白質である限り、配列番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においてはカチオンチャネル機能、を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
従って、配列番号２に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異蛋白質が電位依存性カチオンチャネル蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。ここにいう電位依存性カチオンチャネル蛋白質とは、例えば特定のカチオンに対するチャネル蛋白質機能において配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる電位依存性カチオンチャネル蛋白質であるＣＡＥ９５７７と実質的に同質の機能を有するものをいう。従って、カチオン特異性が性質的に同質であればよく、チャネル機能の強弱の変動、または糖鎖結合の相違などによる該蛋白質の分子量の量的変化などは許容されると解されるべきである。カチオン特異性とは具体的には、Ｎａイオンを流入させること、好ましくはＮａイオンは流入させ、かつＢａイオン及び／またはＣａイオンは流入させないこと、更に好ましくはＮａイオンを流入させ、かつＴＴＸ（テトロドトキシン）に対して感受性を示し、かつＢａイオン及び／またはＣａイオンは流入させないことである。さらに本発明の電位依存性カチオンチャネル蛋白質であるＣＡＥ９５７７の特徴的な性質として、▲１▼卵母細胞に導入した際に（ｃｅａ９５７７遺伝子非導入群と比較して）卵母細胞の生存率を上昇させるという性質、▲２▼本発明の蛋白質を発現する形質転換細胞の調製に際してヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ由来ｍＲＮＡと共導入した際に機能を発揮するという性質、が挙げられる。ＣＡＥ９５７７と実質的に同質の機能を有するとは、最低限としてカチオン特異性が性質的に同質であることをいうが、それに加えて▲１▼または／及び▲２▼の性質が保持されていることが好ましい。
このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質が電位依存性カチオンチャネル蛋白質である限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは１もしくは数個以内である。
上記に述べた蛋白質は、いわゆる当業者における通常の認識の範囲にある塩の形態であっても差し支えないことは言うまでもなく、それ単独の形態のみならず、別種の蛋白質との融合蛋白質を含めた種々の形態に変換された蛋白質も含まれる。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による変換が考えられる。用いる宿主によっては発現する蛋白質への糖鎖の付加の有無あるいはその程度に相違が生ずる。かかる場合にあっても、電位依存性カチオンチャネル蛋白質として機能する限りにおいて、なお本発明であると理解されたい。
本発明の蛋白質またはその部分断片ペプチドは、該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用することが出来る。探索を通じて得られる化合物等は、本発明の蛋白質が関連する疾患対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
（特異的カチオン、チャネル機能調節剤の探索方法）
前述のように、ＣＡＥ９５７７と高い相同性を示すＲｂ２１やＩＣ２３９４９においては、それらの蛋白に輸送されるカチオンは同定されていない。チャネル蛋白質が輸送する特異的なカチオンを特定することは複雑な生体制御機構の解明をもたらし、全く新規な作用機序による医薬を導き得るものとなる。従って、ＣＡＥ９５７７に対する特異的カチオン、またチャネル機能の調節作用を有する物質（調節剤）の特定、探索、評価は重要な意義を有する。
このカチオンの決定は、遺伝子ＣＡＥ９５７７を用いて形質転換細胞を調製し、ＣＡＥ９５７７を発現している該細胞を適当な条件で培養し、ここにカチオンを共存させたときの細胞応答を確認することで行うことができる。細胞応答としては、膜電位や膜電流の変化などが考えられる。なお、形質転換細胞の調製の際にヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ由来ｍＲＮＡを共導入することが好ましい。Ｒｂ２１の論文（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌ．４４５；２３１−２３６（１９９９））においては、脳ｔｏｔａｌＲＮＡの共導入によってもＲｂ２１の電流測定は成功しなかったと書かれており、脳に特異的に発現しているからといって単に脳由来のＲＮＡを共導入しても活性測定系は確立できない。本発明者は特にヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨに注目し、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ由来ｍＲＮＡを共導入することでＣＡＥ９５７７の電流測定が可能になることを初めて見出したものである。
（抗体）
本発明はさらにＣＡＥ９５７７に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、上記蛋白質全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）２、パパインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体、ヒト化抗体やヒト抗体であってもよい。またＣＡＥ９５７７あるいはその部分ペプチドを特異的に認識するのみでなく、ＣＡＥ９５７７の活性を調節する機能を有する抗体も本発明に含まれる。これらの抗体は、ＣＡＥ９５７７の研究的あるいは臨床的な検出、ＣＡＥ９５７７によってもたらされ得る疾患の臨床治療等に有用である。
（アンチセンス核酸）
本発明は、生体内において核酸レベルでのＣＡＥ９５７７生合成を抑制することのできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるアンチセンス核酸は、ＣＡＥ９５７７をコードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ＣＡＥ９５７７の核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補する配列からなるものであってもよい。好ましくは、配列番号１または３に記載の核酸配列に相当あるいは相補する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造あるいは５’末端や３’末端に非翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有するものとなろう。
本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、ＣＡＥ９５７７の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限はない。
また本発明では、一般的には、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ましい。
この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなるものが好適である。
本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ  ｍａｘ  ｓｙｓｔｅｍ等）と  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用する系のような本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で被験物質を系に添加し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより評価することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、生体内におけるＣＡＥ９５７７の発現を抑制することが出来るので、ＣＡＥ９５７７が関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
発明の実施の最良の形態
以下に本発明における実施態様を説明するが、遺伝子工学的手法、蛋白質や細胞あるいは動物を用いた生化学的手法、クロマトグラフィーやペプチド合成機などの各種機器の原理や使用法について、特に断らない限りその利用については制限がなく、いわゆる当業者が利用可能な状態にある技術やその原理、使用方法はすべて本発明についても適用可能であって、以下の記載に限定されないと理解されるべきである。
（核酸）
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１または３に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作製し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作製するのに適した細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
本発明のＤＮＡを含む組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡの全部または一部に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。一部とは例えば本発明の蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡである。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベクターである。
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加し、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。この様に、本発明の遺伝子に対しては、遺伝子工学的手法において通常用いられる様々な要素を付加したもの、あるいは改変したものが挙げられ、それらはここに開示したものが全てではなく、いわゆる当業者が利用可能な要素や手法であれば、特に制限はないと理解されるべきである。
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、延長因子１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １α）プロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
（ｃａｅ９５７７遺伝子組換え非ヒト動物）
本発明は、ｃａｅ９５７７遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。ｃａｅ９５７７遺伝子組換え非ヒト動物には、トランスジェニック非ヒト動物およびノックアウト非ヒト動物が含まれる。ｃａｅ９５７７遺伝子組換え非ヒト動物は、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を該動物の染色体上に人為的に組み込むことにより、本発明の蛋白質の発現の程度、発現時期、発現部位等が制御されることを特徴とする。非ヒト動物としては、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ウマ、ニワトリなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。非ヒト動物の中でも非ヒト哺乳動物が好ましい。
本発明の遺伝子ｃａｅ９５７７を用いれば、トランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。該トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような定法（例、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製することができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベクターを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。
具体的には、例えば、トランスジェニックマウスの場合には、正常Ｃ５７ＢＬａｃＫ／６マウスから取得した前核期受精卵にｃａｅ９５７７遺伝子が発現可能なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的には、適切なプロモーターの下流にｃａｅ９５７７遺伝子を接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラス針を用いて直接注入する。
該受精卵を仮親として別の偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウスと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティング法にてｃａｅ９５７７遺伝子の導入の有無を確認しトランスジェニックマウスを得る。
また、ｃａｅ９５７７（またはｃａｅ９５７７のマウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノックアウトマウス」を作製することができる。本発明における「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由来の蛋白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２号公報、同５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製することができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一態様である。
または、最近中大動物においても核移植によるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本技術を用いたトランスジェニックおよびノックアウト動物の作出も実際に行われるようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の細胞に対しｃａｅ９５７７（または各動物におけるｃａｅ９５７７の相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞から核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることができる。該動物はｃａｅ９５７７（または各動物におけるｃａｅ９５７７の相同遺伝子）が失われたノックアウト動物である。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の細胞にｃａｅ９５７７（または各動物におけるｃａｅ９５７７の相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン動物を得る事によりトランスジェニック動物を作製する事も可能である。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態様である。
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、天然に発現している各種臓器から調製することができるが、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ  ジャパン株式会社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養については各種の成書（たとえは、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年、参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネースその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、電位依存性カチオンチャネル蛋白質として機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。
本発明の蛋白質は、抗体を作製するための抗原として使用したり、該蛋白質に結合する物質や該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用することができ、有用である。
ＣＡＥ９５７７が形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、適当な緩衝液に懸濁した細胞に対して、例えば超音波処理、凍結融解処理、あるいはリゾチーム処理などを行って細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で本発明の蛋白質を含有する膜画分を得、さらに該膜画分を適当な界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を調製する。そして、当該粗溶液から常法により目的蛋白質を単離、精製することができる。
（抗体）
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い、抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、それか抗体の作製に使用しうる精製度のものであれはいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れは良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作製する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製することができる。抗体を治療に使用する場合には、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１５；１４６−１５６（１９９７））を免疫することにより調製することができる。また、モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３；９９−１２１（１９９１））。
（アンチセンス核酸）
アンチセンス核酸は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｔ．ＣｒｏｏＫｅおよびＢｅＲＮＡｌｄ  Ｌｅｂｌｅｕ編、ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成したり、ＣＡＥ９５７７を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成機（たとえばアプライドバイオシステムズ  ジャパン株式会社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アンチセンス核酸を得ることができる。
本発明のＤＮＡやアンチセンス核酸を診断用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あるいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡもしくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被験物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被験物質中に、遺伝子ｃａｅ９５７７もしくはＲＮＡが含まれていれば、当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リボソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。
（スクリーニング方法）
本発明は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｃａｅ９５７７遺伝子組換え非ヒト動物を用いることを特徴とする、本発明の蛋白質が特異的に輸送するカチオン、あるいは該蛋白質の発現あるいはチャネル機能を調節する物質をスクリーニングする方法に関する。より具体的には、（１）ＣＡＥ９５７７をカチオンと共存させて電流または電位変化応答を測定する方法、（２）ＣＡＥ９５７７と被験物質とをカチオンの共存下で接触させ、該蛋白質のチャネル機能に与える該候補物質の影響を測定する方法、（３）被験物質の存在下／非存在下における本発明の蛋白質または遺伝子の発現レベルを比較し、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。（１）及び（２）の例としては、アフリカツメガエル卵母細胞または哺乳動物由来の細胞系において、ＣＡＥ９５７７を発現している生体膜あるいは細胞を用いたアッセイが考えられる。測定するチャネル機能としては電流または電位変化応答が挙げられる。これらは公知の方法でアッセイが可能である（アフリカツメガエル卵母細胞の場合は，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．５５４−５５８，１９９２を参照。哺乳動物の場合は，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｖｏｌ．２７４，ｐｐ．Ｈ１６４３−Ｈ１６５４，１９９８を参照）。さらに具体的な例としては、実施例５に示す方法を挙げることができる。（３）の例としてはｃａｅ９５７７遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポーター遺伝子の発現量を被験物質の存在下／非存在下で測定し、被験物質の転写促進活性または転写抑制活性を確認する方法が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｃａｅ９５７７遺伝子組換え非ヒト動物と被験物質を接触させる工程；被験物質添加群と被験物質無添加群とにおける本発明の蛋白質の活性または本発明のＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを検出する工程；差が認められた被験物質を本発明の蛋白質の活性調節物質または本発明のＤＮＡの発現調節物質として選択する工程を含み得る。また、本発明の蛋白質を発現している形質転換細胞の調製にあたっては、ヒト神経芽腫細胞株  ＳＫ−Ｎ−ＳＨ由来ｍＲＮＡを共導入することが好ましい。本発明の蛋白質の活性を調節する作用を示す物質とは、ＣＡＥ９５７７蛋白質の活性を増強（アゴニスト）あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を有する物質のいずれでも良い。本発明のＤＮＡの発現調節作用を示す物質とは、遺伝子ｃａｅ９５７７の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよいが、好ましくは抑制する作用を有する物質である。被験物質が本発明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現調節作用を示すかど���かは、蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系に被験物質を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡの発現レベルとは、ｃａｅ９５７７遺伝子のｍＲＮＡの発現強度、蛋白質の発現強度のいずれにより検出しても良い。また、ｃａｅ９５７７遺伝子またはＣＡＥ９５７７蛋白質自体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子の発現レベルを検出しても良い。レポーターアッセイ系は、試験したい遺伝子の発現制御領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該発現制御領域に作用する物質をスクリーニングするアッセイ系をいう。発現制御領域としては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を利用することができる。本発明の遺伝子の発現制御領域や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可能である（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１９９３年）。阻害（または抑制）する作用を有する、あるいは増強（または促進）する作用を有するとは、蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、被験物質添加群と、被験物質無添加群との間に差があることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率＝（被験物質無添加群の測定値−被験物質添加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値＊１００
ここで、阻害または増強のどちらの活性であるかについて、および測定値については蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が実施例５に示す電流測定系の場合には、測定値としては電流値を用いることができ、被験物質添加群の測定値＜被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質にはＣＡＥ９５７７蛋白質活性阻害作用があるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。
本発明である蛋白質は、脳に特異的に発現する電位依存性カチオンチャネル蛋白質であることから、上述のスクリーニング方法あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、中枢神経系における疾患に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。被験物質としては蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
実施例
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
実施例１  遺伝子ｃａｅ９５７７のクローニング
（１）オリゴキャップ法による完全長ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト冠動脈内皮細胞よりＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．）に従い、オリゴｄＴセルロースを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。次に５−１０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む緩衝液中で、１．２ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＢＡＰと略する）（ＴａＫａＲａ）と３７℃で４０分間反応させ、キャップ構造を持たないポリ（Ａ）＋ＲＮＡの脱リン酸化を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをエタノール沈殿として回収した。回収したポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎを含む緩衝液中で２０ＵのＴｏｂａｃｃｏ  ａｃｉｄ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＴＡＰと略する）（Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ  ｖｏｌ．１３８，１７１−１７４）にて３７℃で４５分間処理し、キャップ構造の除去を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出して、エタノール沈殿を行い、ＢＡＰ−ＴＡＰ処理済ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを回収した。
この回収したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２−４μｇを０．４μｇの５’オリゴマー（５’−ＡＧＣ  ＡＵＣ  ＧＡＧ  ＵＣＧ  ＧＣＣ  ＵＵＧ  ＵＵＧ  ＧＣＣ  ＵＡＣ  ＵＧＧ−３’）とライゲーション反応を行った。この反応は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＡＴＰ、２５％のＰＥＧ８０００及び１００ＵのＲＮａｓｉｎを含む緩衝液中で、２５０ＵのＲＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いて２０℃で３−１６時間行った。その後、未反応のオリゴマーを除去してｃＤＮＡ合成を行った。すなわち、２−４μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１０ｐｍｏｌのｄＴアダプタープライマー（５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−３’）と混合し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、添付の緩衝液中で４２℃、１時間反応させた。
鋳型のＲＮＡを除去するために１５ｍＭのＮａＯＨを用いて６５℃で１時間反応させた後に、ｃＤＮＡの増幅操作を行った。１μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）＋ＲＮＡより合成されたｃＤＮＡを１６ｐｍｏｌのセンスプライマー１（５’−ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＴＴＧ−３’）及びアンチセンスプライマー１（５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＧＴ−３’）と混合し、ＸＬ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて増幅した。この際のＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１０分間のサイクルを５−１０回行った。ＰＣＲ産物をフェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて抽出し、エタノール沈殿として回収した。その後、回収物をＳｆｉＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて１０００ｂｐ以上のｃＤＮＡを分離し、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）のＤｒａＩＩＩサイトに挿入した。尚、ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３のＤｒａＩＩＩサイトは非対称性となっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩサイトとなっているため、挿入したｃＤＮＡ断片は一方向性に挿入されている。
（２）ｃＤＮＡクローン塩基配列及びその推定蛋白質情報の解析
（１）の方法で作製したｃＤＮＡライブラリーより、ＰＩ−１００ロボット（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドを調製し、各クローンの塩基配列を確認し、データベース化した。塩基配列決定は、ＡｕｔｏＣｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とＲ．Ｏ．Ｂ．ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い添付のプロトコールに従ってシークエンス反応を行い、ＡＬＦ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により行った。
（１）に記載の方法で取得したプラスミドＣ−ＣＡＥ０９５７７には、配列番号５で表される３０１個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする、配列番号４で表される９０３塩基の塩基配列からなるオープンリーディングフレームを含む配列番号６で表わされる２４７１塩基対の塩基配列からなるｃＤＮＡが含まれていた。次に、この３０１個のアミノ酸配列に対して、局部的な配列の一致を検索した。相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．，３６，ｐｐ．２９０−３００（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，ｐｐ．４０３−１０（１９９０））を用いた。
推定される蛋白質配列を問い合わせ配列としてＧｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）蛋白質データベースに対しＢＬＡＳＴ相同性検索を行った。その結果、３０１残基にわたりラットｐｕｔａｔｉｖｅ  ｆｏｕｒ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＣ６８８８５）との相同性が９５％、１７０残基にわたりショウジョウバエ  ＣＧ１５１７  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＦ４８３６５）との相同性が８３％、１５５残基にわたり線虫  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＡ８１４２４）との相同性が７５％みられた。
実施例２  ＡＴＡＣ−ＰＣＲを用いた発現プロファイルの解析
Ａｄａｐｔｏｒ−ｔａｇｇｅｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ（ＡＴＡＣ−ＰＣＲ）は外部機関へ委託し、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５；４６９４−４６９６（１９９７）の方法に従って行った。また解析に用いたヒトＲＮＡは以下の通りである。ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）及び、ヒト胎盤組織から定法によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。また、ヒト末梢血由来白血球を５０μｇ／ｍｌのＰＨＡ存在下で２４時間培養した後にｔｏｔａｌ  ＲＮＡを定法により調製した。さらにヒトの肺、腎臓、膵臓、小腸、胸腺、脾臓、心臓、子宮、精巣、前立腺、骨格筋のｔｏｔａｌ  ＲＮＡをクローンテック社より、肝臓、大腸、白血球、脳のｔｏｔａｌ  ＲＮＡについてはＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより購入した。次に、これら各ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ６μｇよりオリゴｄＴプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡの合成を定法に従って行った。逆転写酵素としては  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）を用いた。また、ＰＣＲに用いたｃａｅ９５７７特異的なプライマーの配列は５’−ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＡＡ−３’である。解析した結果、ｃａｅ９５７７は脳で特異的に強く発現していた（第１図）。
実施例３  ＣＡＥ９５７７をコードするｃＤＮＡの全長クローニング
（１）ｃＤＮＡのクローニング
Ｃ−ＣＡＥ０９５７７がコードするアミノ酸配列はホモロジー検索の結果、ラットｐｕｔａｔｉｖｅ  ｆｏｕｒ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＣ６８８８５）のＣ末端側と高い相同性を示した。また、翻訳開始コドンと思われるＭｅｔの上流にも同じフレームで読み枠が続いており、この１０アミノ酸もやはりＡＡＣ６８８８５のアミノ酸配列と高い相同性を示すことから、Ｃ−ＣＡＥ０９５７７はラットｐｕｔａｔｉｖｅ  ｆｏｕｒ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌのヒトホモログ遺伝子であるが、５’端側の約４ｋｂが欠けている部分ｃＤＮＡ配列と予想された。実施例１に示したＣ−ＣＡＥ０９５７７をクローニングした手法はオリゴキャップ法と呼ばれるものであり、原理的には完全長のｃＤＮＡが得られる手法であるが、オリゴキャップ法で作製されたｃＤＮＡクローンの平均長は約２００塩基であり（実験医学  １８；１５７５−１５８０（２０００））、より長いＯＲＦを有するクローンの場合、全長を取得することは困難である。その様な場合、ホモログと考えられる遺伝子からプライマーを設計しクローニングする手法が考えられる。しかし、かかる方法でも、一般的に近隣の種間のホモログにおいても塩基配列は完全には保存されてはおらず、プライマーの設計次第では正しくクローニングすることが出来ない。
そこで、ラットｐｕｔａｔｉｖｅ  ｆｏｕｒ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＦ０７８７７９）の配列をもとに、ヒトゲノム配列をホモロジー検索し、ＣＡＥ９５７７の翻訳開始付近の配列を確認した。次に、開始コドン（ＡＴＧ）の上流３８ｂｐにセンスプライマー（５’−ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’）及び終止コドンの約２５０ｂｐ下流にアンチセンスプライマー（５’−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  Ａ−３’）を設計し、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）より調製したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲクローニングを行った。得られた約５．５ｋｂのフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入して、配列を確認した。その結果、このプラスミドは配列番号２で表される１７３８個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする、配列番号１で表される５２１４塩基よりなるオープンリーディングフレームを含んでいた。実施例１でクローニングされたＣ−ＣＡＥ０９５７７配列とあわせると、ｃａｅ９５７７のｃＤＮＡ配列の全長は、配列番号３で示される全長６７８９塩基であった。
次にこの１７３８個のアミノ酸配列に対する局部的な配列の一致を検索した。相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ（１９９３）３６：２９０−３００）を用いた。
蛋白質配列を問い合わせ配列としてＧｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）蛋白質データベースに対しＢＬＡＳＴ相同性検索を行った。その結果、１７３８残基にわたりラット  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｆｏｕｒ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＣ６８８８５）との相同性が９８％、１６３４残基にわたりショウジョウバエ  ＣＧ１５１７  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＦ４８３６５）との相同性が７１％、１６２６残基にわたり線虫ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＡ８１４２４）との相同性が６５％、みられた。
モチーフとは実験などから同定された機能部位（例えば、酵素などの活性部位やリガンドやエフェクターなどの結合部位、リン酸化などの修飾部位）のコンセンサス配列として記述されたもので、特に重要な機能部位は進化的にも保存されるケースが多いことから、ある機能を発現する蛋白質に特徴的に現れる保存配列、さらには類縁蛋白質ファミリーを特徴づける指標としても用いられる。このように、モチーフを検索することでホモロジー検索に比べてより直接的に機能に結びついた解釈が期待できる。
モチーフデータベースであるＰＲＯＳＩＴＥデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）ではモチーフを、「コンセンサス配列をパターンで標記」又は、「出現頻度などに基くスコアをモチーフ内の各位置に対してアミノ酸ごとに行列であらわしたプロファイルで標記」している。
推定される蛋白質配列の機能について、ＰＲＯＳＩＴＥデータベースに対しパターン検索した結果、２１０，２１６，８５９，１０６４，１３７１，１４４９番目のアスパラギンが糖鎖結合部位であるモチーフがみられた。
隠れマルコフモデルを用いた相同性検索プログラムであるＨＭＭＥＲ（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｋｒｏｇｈ，Ｇ．Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９８）．）を用いてタンパク質ドメインデータベースであるＰｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｆａｍ／）に検索を実施した結果、有為な相同性のあるドメインとしてアミノ酸番号３２から３２１番目、３８０から５９８番目、８８４から１１５５番目、１２０６から１４４６番目、にＩｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎドメイン［Ｐｆａｍ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＦＯ０５２０］が見出された。
イオン選択性フィルターとして重要と推測されるアミノ酸（２８０Ｅ，５５４Ｅ，１１１５Ｋ，１３８９Ｅ）はラットｐｕｔａｔｉｖｅ  ｆｏｕｒ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：  ＡＡＣ６８８８５）との間で保存されており、一般的に知られているＣａチャネル（ＥＥＥＥ）やＮａチャネル（ＤＥＫＡ）とは異なっていた。
（２）ｃａｅ９５７７のゲノム配列
（１）で取得した配列番号３の配列をもとに、ヒトゲノム配列を再度ホモロジー検索した。その結果、第１３番染色体のクローンＲＰ１１−７５Ｃ５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ３５６７７８）、ＲＰ１１−４４１７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ３５４８９１）及びＲＰ１１−４３０Ｍ１５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ１３８７０７）に相同性を示す配列を確認した。さらにＧＴ−ＡＧ則をもとにイントロン部分を確認し、エクソンの位置を検索した結果、ｃａｅ９５７７遺伝子は４３個のエクソンより成ることが明らかになった。ＲＰ１１−７５Ｃ５には１−６番目のエクソンが配座し、ＲＰ１１−４４１７には７−１２番目のエクソンが配座し、ＲＰ１１−４３０Ｍ１５には１３−４３番目のエクソンが配座していた（第２図）。また、配列番号３とゲノムのエクソン配列を比較した結果、配列番号３の４４５４番目の塩基Ｃが、ゲノム配列ではＡであった。この塩基は配列番号２の１４７２番目のＩｌｅの第３コドンであるが、ゲノム配列由来のＡであってもＩｌｅをコードしており、ｃＤＮＡより予測されるアミノ酸配列とゲノム配列より予想されるアミノ酸配列とは一致していた。また、３’非翻訳領域でにおいて５箇所で１塩基置換が、１箇所で２塩基の欠損が、１箇所で２塩基の挿入があった。
実施例４  ＣＡＥ９５７７を発現した哺乳動物細胞における電気生理学的検討
（１）発現プラスミドの構築
哺乳動物細胞においてＣＡＥ９５７７を発現させるプラスミドは以下の方法で構築した。実施例３で得られたプラスミドをＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩにて消化し、約５．４ｋｂのフラグメントを回収した。次にｐｃＤＮＡ３．１（＋）を同様にＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、先のフラグメントを挿入した。ＪＭ１０９でｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎし、発現プラスミドｐｃＤＮＡ０９５７７を得た。プラスミドｐｃＤＮＡ０９５７７は、国際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００１年１１月７日付けにて受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０３４として寄託されている。
（２）ＣＡＥ９５７７の発現及び電気生理学的検討
（１）で得られたｐｃＤＮＡ０９５７７をＣｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ由来の細胞ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−６１）へ導入する。すなわちＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌをｐｃＤＮＡ０９５７７  １２．５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加する。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一昼夜培養した後に、細胞を剥離し、カバーグラスの上に撒き直す。さらに一昼夜培養後、倒立顕微鏡のステージ上に固定したチャンバーにカバーグラスを入れ、適当なイオンを含む溶液（後述）で灌流する。パッチクランプ用ガラス管微小ピペット（パッチ電極）は、ガラス管を二段引プラーで引いた後、マイクロフォージで先端をヒートポリッシュして作製する。パッチ電極は次の組成の溶液で満たす。１３０ｍＭ  ＣｓＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、５ｍＭ  ブドウ糖、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、ＣｓＯＨ溶液でｐＨを７．３に調整する。細胞にパッチ電極を押し当ててギガシールを形成し、パッチクランプアンプを用いて全細胞記録法で電流を記録する。データの記録には市販のソフトウェア（ｐＣＬＡＭＰ７，Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用する。データは５ｋＨｚのフィルターをかけ、５０ｋＨｚのサンプリング周波数で記録する。Ｎａ電流を記録する場合、灌流する細胞外液の組成は次の通りである。１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣｏＣｌ２、１１ｍＭ  ブドウ糖、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ＣｓＯＨ溶液でｐＨ７．３に調整する。Ｃａ電流を記録する場合、灌流する細胞外液の組成は次の通りである。１０ｍＭ  ＢａＣｌ２、１４０ｍＭ  ＴＥＡ−Ｃｌ、５ｍＭ  ＣｓＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ブドウ糖、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ＴＥＡ−ＯＨ溶液でｐＨ７．３に調製する。
実施例５  ＣＡＥ９５７７を発現した卵母細胞における電気生理学的検討
（１）ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞からのｍＲＮＡの抽出
ヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＨＴＢ−１１）より、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐｏｌｙＡ  ＲＮＡを抽出した。その後、抽出ＲＮＡをセルロースカラムに通じ、フェノール及びクロロホルムにて精製しＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡとした。
（２）ＣＡＥ９５７７をコードするｍＲＮＡの調製
実施例４で作製したｐｃＤＮＡ９５７７をＢｓｓＨＩＩにて直線化し、フェノール及びクロロホルムにて精製した。次にこの直線化ＤＮＡを鋳型にＴ７プロモーターを利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行った。その後、合成産物をフェノール及びクロロホルムにて精製し、電気泳動及び吸光度測定を行い、ＲＮＡの純度と合成量を確認した。また、合成ＲＮＡの安定化の目的で、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用い、合成ＲＮＡの３’端にｐｏｌｙ（Ａ）を付加した。
（３）卵母細胞の調製
アフリカツメガエル（志木家田科学）から摘出した卵母細胞をコラゲナーゼにて、濾胞を除去し単離した。ＮＤバッファー（９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．０ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）中で、第５または第６ステージの細胞を選別した。選別後の卵母細胞は一晩、２０℃にてインキュベーションし、ｍＲＮＡをマイクロインジェクシヨンした。インジェクションしたｍＲＮＡの種類及び量は以下のとおりである。
▲１▼  ＣＡＥ９５７７  ｍＲＮＡ（実施例５−（２）にて調製）：２０ｎｇ／卵母細胞
▲２▼  ＣＡＥ９５７７  ｍＲＮＡ（実施例５−（２）にて調製）＋ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡ（実施例５−（１）にて調製）：各１０ｎｇ／卵母細胞
▲３▼  ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡ（実施例５−（１）にて調製）：２０ｎｇ／卵母細胞
インジェクション後の卵母細胞はＮＤバッファー中で、７２時間、２０℃にてインキュベーションした。また、２４、４８および７２時間後に、卵母細胞の生死判定を行った。
（４）卵母細胞における電流測定
インキュベーション７２時間後，状態の良い卵母細胞について，以下の電流測定を行った。
Ｎａ電流の測定を行う際には、細胞外液にＮａバッファー（１００ｍＭ  ＮａＯＨ、１００ｍＭ  メタンスルホン酸、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）を用いた。テトロドトキシン（ＴＴＸ、和光純薬）はＮａバッファーに溶解後、卵母細胞に直接滴下した。固定膜電位は−１００ｍｖとし、２０ｍｓの脱分極パルスを−９０ｍＶから＋８０ｍＶまで１０ｍＶおきに与えた。
Ｃａ電流の測定を行う際には、細胞外液にＢａバッファー（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、４０ｍＭ  ＢａＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）を用いた。外液のＢａなしの条件で計測する際にはＢａ／Ｃａフリーバッファー（９０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）を用いた。固定膜電位は−８０ｍＶとし、２００ｍｓの脱分極パルスを−７０ｍＶから＋４０ｍＶまで１０ｍＶおきに与えた。
（５）結果
卵母細胞の生存率
以下の表で示されたように、ＣＡＥ９５７７ｍＲＮＡ単独あるいはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡ単独を導入した細胞より，両ｍＲＮＡを同時に導入した卵母細胞の生存率が高った。この結果は、ＣＡＥ９５７７ｍＲＮＡ産物がＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡの産物に含まれる蛋白とともに機能的な蛋白を形成し、細胞の生存に関わる機能を増強するか、または、細胞死に至る何らかの過程を抑制することを示唆している。ＣＡＥ９５７７が脳由来であることを考慮すると、以上のような特性は、例えばパーキンソン病のような脳の変性性疾患の治療に有用であることを推察させる。
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Ｎａ電流測定
ＣＡＥ９５７７ｍＲＮＡ単独、及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡのみを発現させた細胞では、脱分極パルス中に発生した内向き電流はリークによるものと考えられ、チャネル様の電流は観察されなかった。一方、ＣＡＥ９５７７遺伝子とＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡを共発現させた細胞では，脱分極刺激に応答する内向き電流が認められ、そのピークは−７０ｍＶ付近に観察された。また、この電流はＴＴＸによって部分的に抑制された（第３図３−１〜３−３）。
Ｂａ電流測定
全ての細胞から電流変化を示すシグナルは得られず、既知のＣａチャネル様活性は認められなかった。（第３図３−４〜３−６）
以上の結果をまとめると、ＣＡＥ９５７７ｍＲＮＡの産物は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡの産物に含まれる蛋白とともに、Ｎａイオンを流入させるチャネルを本実施例の条件で形成したものと考えることができる。
発明の効果
本発明のＣＡＥ９５７７は、これが特異的に輸送するカチオンの同定に有用であり、かかるカチオン輸送機構を調節し得る、新たな生体制御機構に作用する薬物の開発に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、遺伝子ｃａｅ９５７７の生体内での発現分布を示す。縦軸は相対的な発現量を表す。
第２図は、遺伝子ｃａｅ９５７７のゲノム構造を表す図である。
第３図は、実施例５に示すＣＡＥ９５７７を発現した卵母細胞における電気生理学的検討の結果の図である。
第３−１図は、▲１▼ＣＡＥ９５７７ｍＲＮＡ：２０ｎｇ／卵母細胞、Ｎａ電流測定の結果である。ＣＯＮＴはＴＴＸ非存在下を意味する。
第３−２図は、▲２▼ＣＡＥ９５７７ｍＲＮＡ＋ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡ：各１０ｎｇ／卵母細胞、Ｎａ電流測定の結果である。ＣＯＮＴはＴＴＸ非存在下を意味する。
第３−３図は▲３▼ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡ：２０ｎｇ／卵母細胞、Ｎａ電流測定の結果である。ＣＯＮＴはＴＴＸ非存在下を意味する。
第３−４図は▲１▼ＣＡＥ９５７７ｍＲＮＡ：２０ｎｇ／卵母細胞、Ｃａ電流測定の結果である。ＣＯＮＴは細胞外液にＢａバッファーを用いた場合、Ｂａ  ＦＲＥＥは細胞外液にＢａ／Ｃａフリーバッファーを用いた場合を意味する。
第３−５図は▲２▼ＣＡＥ９５７７ｍＲＮＡ＋ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡ：各１０ｎｇ／卵母細胞、Ｃａ電流測定の結果である。ＣＯＮＴは細胞外液にＢａバッファーを用いた場合、Ｂａ  ＦＲＥＥは細胞外液にＢａ／Ｃａフリーバッファーを用いた場合を意味する。
第３−６図は▲３▼ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来ｍＲＮＡ：２０ｎｇ／卵母細胞、Ｃａ電流測定の結果である。ＣＯＮＴは細胞外液にＢａバッファーを用いた場合、Ｂａ  ＦＲＥＥは細胞外液にＢａ／Ｃａフリーバッファーを用いた場合を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月27日(2002.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号：１のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮａイオンを流入させる活性を有することを特徴とする電位依存性カチオンチャネル蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎａイオンを流入させる活性を有することを特徴とする電位依存性カチオンチャネル蛋白質。
【請求項４】
削除
【請求項５】
削除
【請求項６】
請求項３に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１または請求項６に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
【請求項９】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸。
【請求項１０】
塩基配列が、請求項１に記載のＤＮＡまたは配列番号３に記載の核酸の全部または一部に相補する配列である、請求項６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１１】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドに対する抗体。
【請求項１２】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞とカチオンとを接触させ、電流または電位変化応答を測定することを特徴とする、該蛋白質が特異的に流入させるカチオンの決定方法。
【請求項１３】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と被験物質とを接触させ、該蛋白質のチャネル機能の変化を測定することを特徴とする、該蛋白質のチャネル機能を調節する物質の探索方法。
【請求項１４】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質を発現している形質転換細胞を調製する際にヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ由来ｍＲＮＡを共導入することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項７に記載の組換えベクターまたは請求項８に記載の形質転換細胞と被験物質とを接触させ、請求項１に記載のＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡの発現調節作用を示す物質の検索方法。
【請求項１６】
ｃａｅ９５７７遺伝子組換え非ヒト動物。
【国際調査報告】
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