(57)【要約】ヒト細胞、植物細胞、酵母にオリゴ糖プライマーを与えることを特徴とするオリゴ糖鎖の生産方法、又は高密度培養法で培養した細胞（ＣＯＳ−７を除く）にオリゴ糖プライマーを与えることを特徴とするオリゴ糖鎖の生産方法に関する。このオリゴ糖は、薬、医療、診断薬、糖鎖チップなどへ応用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞、植物細胞、酵母にオリゴ糖プライマーを与えることを特徴とするオリゴ糖鎖の生産方法。
【請求項２】
高密度培養法を用いて培養した細胞（ＣＯＳ−７を除く）にオリゴ糖プライマーを与えることを特徴とするオリゴ糖鎖の生産方法。
【請求項３】
細胞が酵母である請求項２に記載のオリゴ糖鎖の生産方法。
【請求項４】
細胞が動物細胞あるいは植物細胞である請求項２に記載のオリゴ糖鎖の生産方法。
【請求項５】
動物細胞がヒト細胞である請求項２記載のオリゴ糖鎖の生産方法。
【請求項６】
ヒト細胞がヒト組織由来正常細胞である請求項２記載のオリゴ糖鎖の生産方法。
【請求項７】
ヒト組織由来正常細胞が２倍体線維芽細胞あるいは血管内皮細胞である請求項２記載のオリゴ糖鎖の生産方法。
【請求項８】
細胞が糖鎖生合成系酵素をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを含む請求項１あるいは請求項２記載のオリゴ糖鎖の生産方法。
【請求項９】
糖鎖生合成酵素がヒト型である請求項１あるいは請求項２記載のオリゴ糖鎖の生産方法。
【請求項１０】
高密度培養法がマイクロキャリアー培養法、細胞固定用デイスクを用いた培養槽、中空糸モジュールを用いた培養システム又は浮遊細胞のサスペンジョンカルチャーである請求項２に記載のオリゴ糖鎖の生産方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は医薬・医療・糖鎖チップなどに利用されるオリゴ糖鎖の生産法に関する。
背景技術
生体における細胞は、受精・発生・分化・増殖・細胞死などのあらゆる過程で特異的な糖鎖を発現しており、細胞の機能と密接に関係している。また、糖鎖は多くの毒素、ウイルスおよびバクテリアなどの受容体であり癌のマーカーとしても注目されおり、最近では癌細胞の転移やアルツハイマー病の原因と考えられているアミロイド蛋白質との相互作用も報告されている。
動物細胞は、それぞれ異なった種類の糖鎖を発現しており、それらの機能についても近年明らかにされつつある。例えば、Ｂ１６メラノーマ細胞はＧＭ３型の糖鎖を（Ｋｏｍｏｒｉ；Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ；３７４，２９９−３０２，１９９５）、ＰＣ１２細胞はＧｂ３型の糖鎖を（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３．２４，１２１２４−１２１２８，１９９８）、ＣＯＳ−７細胞はｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  Ａ系列の糖鎖（安養寺久栄他、２０００年度日本化学会年会予稿集）を発現している。Ｇｂ３型糖鎖はベロ毒素の受容体となり、シアリールガラクトースを有するオリゴ糖鎖及びＧＭ１型オリゴ糖鎖はそれぞれインフルエンザウイルスおよびコレラ毒素の受容体であることが知られている。
また、ＧＤ１ａ型オリゴ糖鎖は細胞接着に関与することから、癌の転移との関連も論じられている。このように糖鎖には多くの機能があり、糖鎖の機能解析はこれからの医薬、医療や病気の診断などに欠かせないことから、多種類の糖鎖からなる糖鎖ライブラリーの構築が望まれている。現在までに糖鎖合成は合成技術が律速となって糖鎖ライブラリーを構築できる程には至っていない。
一方、生産性の優れた有用物質の生産宿主として酵母が活用されているが、酵母もまた、糖鎖生合成系を持ち、各種糖鎖が合成される。しかし、酵母により生産される糖蛋白質には、いわゆる高マンノース型と呼ばれる糖鎖が結合し、これが人体において抗原性があるため医薬品には不適とされている。
また、各種キノコを中心に植物には多糖類と呼ばれる食物繊維の一種、β−グルカンが含まれている。このβ−グルカンには免疫増強作用があることが知られている。
糖鎖の合成法には化学合成および酵素を用いた方法がある。化学合成では一つの天然型のオリゴ糖鎖を得るのに、多くの反応ステップと特殊な技術を必要とし、膨大な時間と人件費を必要とするが、その割には収率が低いために、合成手法により得られたオリゴ糖鎖は天然からの抽出に比べてコストが高い欠点がある。
また、酵素反応によるオリゴ糖鎖の作製には加水分解酵素と糖転移酵素を用いる方法があるが、いずれも使える酵素には制限があり、望みのオリゴ糖鎖を自由に作ることは現在ではほとんど不可能である。また、反応の原料に制限があったり、非常に高価であるなど、糖鎖ライブラリーを作るための実用的な段階には至っていない。
動物細胞を用いた糖鎖合成では、簡単な構造の糖鎖プライマーを培養細胞に投与すると糖鎖伸長が起き、作られたオリゴ糖鎖が培養液中に放出され、培養細胞の種類を変えると異なった構造のオリゴ糖鎖が合成されることが既に知られている（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２４，１４８−１５６（１９９８）；）。この方法では、培養細胞に安価で大量にしかも簡単に合成できる糖鎖プライマーを投与するだけで、生体内で機能しているオリゴ糖鎖だけを作り出すことが出来るため、糖鎖ライブラリーのプールとしては非常に質の高いものを得ることができる利点がある。しかし、現在、これらの糖鎖産生実験は培養皿を用いた平面単層培養で行われており、糖鎖ライブラリーを構築するだけの量的な供給が難しい。
これまで動物細胞を用いた有用生理活性物質の生産は、大量培養技術が難しく、特に接着依存細胞の大量培養化は難航してきた。最近になり、小スケールマイクロキャリアー培養法を用いてＣＯＳ−７細胞を培養し、オリゴ糖プライマーを投与してオリゴ糖鎖を産生させる試みが報告されたが、ＣＯＳ−７のような接着依存性の強い癌細胞以外は、細胞機能を維持した大量培養化は非常に難しく、全ての細胞に適用できる状況ではない。
発明の開示
本発明は医薬、医療、診断薬、糖鎖チップなどへの応用の可能性のある有用な糖鎖ライブラリーを動物細胞から効率的に生産する方法を提供する事を目的とする。
これまでの単層培養では、細胞に作られたオリゴ糖鎖の分析はできるものの、オリゴ糖鎖を素材として工業的に提供したり、さらには糖鎖ライブラリーの構築のための多種多様なオリゴ糖鎖を量的に提供するのは困難である。そのためには、簡便な高密度大量培養技術が必要である。
実際に工業的に応用可能な高密度大量培養法を用いて糖鎖プライマーを投与する実験系を行うことが出来れば、有用オリゴ糖鎖の大量生産が可能になり、さらに糖鎖ライブラリーの構築を行うことができる。あるいは、各種動物の癌細胞などの大量培養または高密度培養を用いることで、一度に多種類のオリゴ糖鎖を同時に作ることができるので、省エネルギーで効率の良い糖鎖生産ができる。最近、社会的に必要性の高い環境に低負荷型の物質生産という観点においても、糖鎖プライマーの合成と生成物の抽出の過程においては一部有機溶剤を用いるが、それ以外の操作の過程では有機溶剤を使用しないため、他の手法に比べて環境に優しい物質生産を可能にする。
動物細胞を用いた物質生産で重要な課題となっている大量培養は、特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞や株化された浮遊細胞などはスケールアップが可能なタンク培養である程度可能であるが、ヒト２倍体正常細胞や他の接着依存性細胞の大量培養化は装置やスケールアップのための継代技術が難しく、細胞機能を維持した接着依存性細胞の大量培養技術の確立が強く望まれている。
上記目的は以下の本発明により達成される。本発明は、ヒト細胞、植物細胞、酵母にオリゴ糖プライマーを与えることを特徴とするオリゴ糖鎖の生産方法、及び高密度培養法を用いて培養した細胞（ＣＯＳ−７を除く）にオリゴ糖プライマーを与えることを特徴とするオリゴ糖鎖の生産方法である。
ヒト細胞としてはヒト組織由来正常細胞、特に２倍体線維芽細胞あるいは血管内皮細胞が好ましい。
糖鎖生合成系酵素をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを含む細胞も用いることができる。糖鎖生合成酵素としてはヒト型が好ましい。
また、上記高密度培養法はマイクロキャリアー培養法、細胞固定用デイスクを用いた培養槽、中空糸モジュールを用いた培養システム又は浮遊細胞のサスペンジョンカルチャーであるのが好ましい。
発明の実施の形態
本発明におけるオリゴ糖鎖の生産に用いる細胞には、動物細胞、植物細胞、あるいは酵母があり、動物細胞としては、各種動物由来細胞、ヒト組織由来正常細胞、ヒト癌細胞などが挙げられる。また、糖鎖合成酵素、特にヒト型をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを含む各種細胞が用いられるが、これらに限定されるものではない。
酵母を用いた糖鎖の生産には、酵母特有の高マンノース型糖鎖合成経路を断ち切り、高マンノース型糖鎖（アスパラギン結合型糖鎖）合成系を利用するのが好ましい。
本発明に用いる細胞の高密度培養方法には、マイクロキャリアー培養法、細胞固定用デイスクを用いた培養槽、中空糸モジュールを用いた培養システム、浮遊細胞のサスペンジョンカルチャー、多段式培養装置やローラーボトルを用いる方法又はマイクロカプセルに細胞を固定化培養する方法などがあるが、マイクロキャリアー培養法、細胞固定用デイスクを用いた培養装置、中空糸モジュールを用いた培養システム又は浮遊細胞のサスペンジョンカルチャーを用いる方法が好ましく用いられる。
マイクロキャリアーとしては、マトリックス素材はコラーゲン、ゼラチン、セルロース、架橋デキストラン又はポリスチレンのような合成樹脂からなり、荷電基としてジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノエチル、トリメチルハイドロキシアミノプロピル又は負電荷が付加されているものが好ましく用いられる。また、マトリックス素材をコラーゲンやゼラチンでコートしたものも使用される。市販品としては、架橋デキストランにジメチルアミノエチルを付加した“Ｃｙｔｏｄｅｘ−１、ファルマシア社”、”Ｃｙｔｏｄｅｘ−３、ファルマシア社”がある。中空糸としては、修飾セルロースを使用したものがある（”Ｖｉｔａｆｉｂｅｒ”、アミコン社）。
マイクロカプセルは水透過性のあるゲルを形成するコラーゲンやアルギン酸ソーダを用いて、内部に細胞を包埋して作製する方法が知られている（Ａ．Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１，７３６，１９８３）。
マイクロキャリアーの小スケール培養は、スピナーフラスコにマイクロキャリアーを含むＰＢＳ（−）を入れ、高圧蒸気滅菌したあと、培養液に培地交換し、細胞を接種して培養を開始する。適度な間隔を置いて培地交換し、細胞がマイクロキャリアー上にコンフルエントに増殖してから糖鎖プライマー投与を行う。ヒト血管内皮細胞など増殖生存に増殖因子を必要とする細胞は、内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）や線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などを培養液に添加するが、内皮細胞の大量培養化は難しいとされている。
マイクロキャリアー培養では、２００ｍＬスケールの培養瓶１本で内径１００ｍｍのシャーレの１００枚分に相当する細胞数が得られ、しかも単位液量当たりの細胞数は約４倍の高密度培養であるために、オリゴ糖プライマーの投与量も少なく、またシャーレの細胞では確認出来ない新規なオリゴ糖鎖が検出できる利点がある。
本発明に用いるオリゴ糖プライマーは生体内で糖脂質糖鎖の合成プレカーサーになるラクトシルセラミドの構造を模倣して作られたラクトースもしくはガラクトースに疎水鎖を付けたアナログ、又はＮ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミンなどを有する糖鎖プライマーが用いられるがこれらに限定されるものでない。糖鎖プライマーの調製方法については、特開２０００−２４７９９２に記載されているが、これに限定されるものではない。
培養細胞からオリゴ糖鎖を作らせるには、コンフルエントに増殖した細胞に、無血清あるいは低血清培地を用いて１０〜１００μＭの糖鎖プライマーを投与し、３７℃で１〜５日間培養することにより伸長した糖鎖を含む産生原液を得ることができる。培養上清をハーベストし、濃縮、分離、構造解析を行い、多種類のオリゴ糖鎖のライブラリーを得ることが出来る。細胞の種類によって糖鎖プライマーの種類と投与量、培養液、培養日数が異なるので、細胞毎に培養の最適条件を見出すことは、オリゴ糖鎖の効率的な生産に繋がる。
ハーベスト液に含まれるオリゴ糖鎖は、アフィニテイークロマトグラフ、限外濾過、あるいは硫安沈殿などを用いて濃縮分離し、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで構造解析を行う。未知物質については高速薄層クロマトグラフィーにブロッティング後、酵素処理を行い、得られた物質の組成分析から構造の推定を行う。
実施例
実施例１．ヒト正常線維芽細胞を用いたオリゴ糖鎖の産生
平面培養による糖鎖合成実験は、ヒト正常線維芽細胞細胞を７５ｃｍ２の培養フラスコにウシ胎児血清１０％を含むイーグルＭＥＭを用いて増殖させ使用した。マイクロキャリアー培養は、０．３ｗ／ｖ％に調製したＣｙｔｏｄｅｘ−１（ファルマシア）２００ｍＬを入れた５００ｍＬ用スピナーフラスコに平面培養で増殖させた４ｘ１０７個の細胞を接種し、回転数１００−１５０ｒｐｍで撹拌培養した。７５ｃｍ２のフラスコおよびマイクロキャリアー培養でコンフルエントに増殖した時の細胞数はそれぞれ５ｘ１０６個／フラスコおよび４ｘ１０８個／ボトルであった。
培養液をフェノールレッドおよび血清不含のイーグルＭＥＭ培地に替え、５０μＭオリゴ糖プライマーＧａｌ−Ｇｌｃ−Ｃ１２により細胞を処理した。さらに培養を続け４日後の培養上清をハーベストし、Ｃ１８カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で濃縮後、ＨＰＴＬＣとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで糖鎖の構造を解析した。図１にＨＰＴＬＣの泳動パターン（バンド）を示し、そして図２及び図３に各バンドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析結果を示した。マイクロキャリアー培養を用いて、ラクドシドプライマー（Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃ１２）から得られたオリゴ糖鎖の構造を表１に示した。平面培養では（Ｘ１）及び（Ｘ３）のオリゴ糖鎖のみが確認された。
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実施例２．ヒト血管内皮細胞を用いたオリゴ糖鎖の産生
ヒト臍帯静脈より分離した内皮細胞をコラーゲンコートフラスコ（２５ｃｍ２，７５ｃｍ２）を用いて培養し、平面培養によるオリゴ糖鎖合成実験に使用した。培養液はＭ１９９培地にウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％及び添加して用いた。内皮細胞のマイクロキャリアー培養は、コラーゲンコートフラスコで増殖させた細胞をゼラチンコートしたマイクロキャリアー（Ｃｙｔｏｄｅｘ−３，ファルマシア）を０．６ｇ入れて滅菌したスピナーフラスコ（２００ｍＬ培養）に約１．５ｘ１０５個／ｍＬで接種し、平面培養と同じ培養液を用いて２００ｒｐｍの撹拌速度で培養した。
ヒト内皮細胞のマイクロキャリアー培養における増殖曲線を図４に示した。細胞がコンフルエントに増殖後、フェノールレッド不含のＭ１９９培地（ＦＣＳ１％）に変え、糖鎖プライマーＧａｌ−Ｇｌｃ−Ｃ１２を処理して４８時間後に培養上清をハーベストした。培養上清をＣ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣで濃縮し、ＨＰＴＬＣとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて構造解析を行った。その結果を表２に示した。平面培養では（１）及び（４）のオリゴ糖鎖のみが確認された。
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実施例３．ラットＰＣ１２を用いたオリゴ糖鎖の産生
ラットＰＣ１２細胞を７５ｃｍ２フラスコおよびＣｙｔｏｄｅｘ−１，Ｃｙｔｏｄｅｘ−３を用いたマイクロキャリアー培養法で培養し、オリゴ糖プライマーＧａｌ−Ｇｌｃ−Ｃ１２を投与して糖鎖合成を行った。図５に培養液画分の高速薄層クロマトグラフィーの泳動パターンを示した。これらのバンドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる構造解析の結果を図６に示した。マイクロキャリアー培養で得られた画分の分析から得られた糖鎖構造を表３に示した。
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平面培養とマイクロキャリアー培養で合成されたオリゴ糖鎖２種の産生量を、ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ／ＨＣｌ染色した薄層クロマトグラフィーのデンシトメーターによる解析で定量し、結果を図７に示した。マイクロキャリアー培養では、オリゴ糖鎖の合成量が平面培養に比較して単位液量当たり２〜５倍増加していることが明らかになった。
実施例４．ＣＯＳ−７を用いたオリゴ糖鎖の産生
ＣＯＳ−７細胞を径１００ｍｍの培養シャーレ、並びにＣｙｔｏｄｅｘ−１およびＣｙｔｏｄｅｘ−３を用いたマイクロキャリアー法で培養し、オリゴ糖プライマーＧａｌ−Ｇｌｃ−Ｃ１２を投与して糖鎖合成を行った。細胞はダルベッコウＭＥＭにウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％を添加した培養液を用いて培養した。マイクロキャリアー培養は、スピナー培養フラスコにＣｙｔｏｄｅｘ−１、Ｃｙｔｏｄｅｘ−３をそれぞれ０．６ｇ入れて滅菌し、２００ｍＬの培養液を入れて平面培養で増殖させた細胞を約２ｘ１０５個／ｍＬの濃度で接種した。細胞がコンフルエントに増殖後、培養液を血清およびフェノールレッド不含の培地に換え、オリゴ糖プライマー、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃ１２を５０μＭ投与して培養を続けた。培養上清をハーベストし、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣで濃縮し、ＨＰＴＬＣとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで産生オリゴ糖鎖の解析を行った。表４にＣｙｔｏｄｅｘ−１を用いたマイクロキャリアー培養で得られたオリゴ糖鎖の分析結果を示した。図８培養液画分のＨＰＴＬＣの泳動パターンを示した。また、図９にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析結果を示した。図１０に合成されたオリゴ糖鎖ＧＭ３タイプの産生量を平面培養（シャーレ）とマイクロキャリアー培養（Ｃｙｔｏｄｅｘ−１，Ｃｙｔｏｄｅｘ−３）で比較した結果を示した。
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実施例５．ラクトシド型プライマーの調製
下記の反応スキームに沿って糖鎖プライマー１−Ｏ−ｄｏｄｅｃｙｌ−４−Ｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを合成した。
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（ａ）Ｌａｃｔｏｓｅ  ｏｃｔａａｃｅｔａｔｅ（１）の合成
ラクトース１０ｇ（２９ｍｍｏｌ，Ｓｉｇｍａ）、無水酢酸１６０ｍＬ（１．８ｍｏｌ，ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、ピリジン１６０ｍＬ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を三角フラスコに入れ、室温で一晩撹拌した。ＴＬＣで反応が進行したことを確認し、氷上の蒸留水に反応液をあけ（褐色粘稠体が沈殿した）、一晩撹拌した。生じた沈殿を蒸留水で洗浄し、上清が中性になったことをｐＨ試験紙で確認後、沈殿を真空乾燥して白色粉末を得た。
収量１２．４ｇ（６３％）
（ｂ）１−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｏ−（２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ）−２，３，６−ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２）の合成
化合物（１）１２ｇ（１８ｍｍｏｌ）と２５％臭化水素／酢酸溶液２０ｍＬ（Ｗａｋｏ）、脱水ジクロロメタン（Ｗａｋｏ）を氷冷下１時間撹拌した。ＴＬＣで反応が進行したことを確認し、クロロホルムを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。クロロホルム層を水で洗浄し芒硝乾燥後、溶液をエバポレート、真空乾燥した（フラスコの壁に白色固体が生じた）。酢酸エチルで固体を溶解し、ヘキサンを滴下することで生じた白色固体を回収し、真空乾燥して白色粉末を得た。
収量７．６ｇ（６１％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ２．２−２．２（ｍ，２１Ｈ，Ｏ−Ａｃｅｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ），３．９−４．２（ｍ，６Ｈ，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−６，Ｈ’−５，Ｈ’−６，Ｈ’−６’），４．４８（ｍ，１Ｈ，Ｈ’−６’），４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｈ’−１，Ｊ１２＝７．８Ｈｚ，β−ａｎｏｍｅｒ），４．８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２），５．０（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ’−３），５．１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ’−２），５．４（ｄ，１Ｈ，Ｈ’−４），５．６（ｔ，１Ｈ，Ｈ−３），６．５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ１２＝３．２Ｈｚ，α−ａｎｏｍｅｒ）
（ｃ）１−Ｏ−ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−４−Ｏ−（２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙ
１）−２，３，６−ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３）の合成
活性化モレキュラーシーブ４Ａ３．０ｇ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、化合物（２）５．０ｇ（６．８ｍｍｏｌ）、脱水ジクロロメタン５０ｍＬ（Ｗａｋｏ）をナスフラスコに入れ、Ａｒ雰囲気下２時間撹拌した。同時に、遮光したナスフラスコにモレキュラーシーブ４Ａ５．０ｇ、ｎ−ドデカノール１．９ｇ（１０ｍｍｏｌ，ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、過塩素酸銀１．４ｇ（１０．０ｍｍｏｌ，ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、炭酸銀１．９ｇ（１０．０ｍｍｏｌ，Ｗａｋｏ）、脱水ジクロロメタン５０ｍＬを入れ、Ａｒ雰囲気下２時間撹拌した。その後、ｉｃｅ  ｂａｔｈ上で化合物（２）が入っているフラスコの中身を遮光しているフラスコに移し、そのままＡｒ雰囲気下１５時間撹拌した。セライト濾過でモレキュラーシーブと銀塩を除き、ろ液をエバポレートした。精製はオープンカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０，Ｍｅｒｃｋ，Φ５ｘ２０ｃｍ，ｅｌｕｅｎｔ；ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ＝５５：４５→５０：５０）で行った。目的物を含むフラクションを集め濃縮し、黄色粘稠体を得た。
収量１．８ｇ（３２％）
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産業上の利用可能性
本発明により、動物細胞、植物細胞あるいは酵母にオリゴ糖プライマーを与えることによるオリゴ糖鎖の生産、あるいは高密度培養法を用いて培養した細胞（ＣＯＳ−７を除く）にオリゴ糖プライマーを与えることによるオリゴ糖鎖の生産が可能になった。
オリゴ糖鎖を細胞に作らせることにより、生体に存在するあらゆる機能性のオリゴ糖鎖を手に入れることが出来る。オリゴ糖鎖は、発生・分化・増殖・細胞死、あるいは毒素・ウイルス・バクテリアの感染、さらには癌のマーカーや転移に関係している。最近ではアルツハイマーの原因物質であるアミロイド蛋白質の受容体も糖鎖であると考えられている。素材として糖鎖ライブラリーを利用して、それらの阻害剤として、最も活性の高いオリゴ糖鎖を探し出すことができる。
あるいは糖鎖ライブラリーを構築してマイクロプレートに固定化することで糖鎖チップを作成することも可能である。このような糖鎖チップの作製は、生化学・分子生物学・細胞工学・ウイルス学の分野での受容体解析などを初めとする分子機能の解析のみならず、臨床分野では癌のマーカーや毒素の検出のための検査用の試薬として、あらゆるバイオ分野の研究・開発への応用が考えられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１において生成したオリゴ糖の高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）の泳動パターンを示す写真である。
図２は、図１および表１に示すオリゴ糖Ｘ１、Ｘ２およびＸ４、並びに基質サッカライドプライマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析結果を示すチャートである。
図３は、図１および表１に示すオリゴ糖Ｘ３およびＸ５、並びに基質サッカライドプライマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析結果を示すチャートである。
図４は、実施例２における、基質サッカライドプライマーを添加するまでの、ヒト血管内皮細胞のマイクロキャリアー培養における培養経過を示すグラフである。
図５は、実施例３において生成したオリゴ糖の高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）の泳動パターンを示す写真である。レーン１は基質サッカライドプライマーを示し、レーン２〜４およびレーン５〜７はそれぞれＣｙｔｏｄｅｘ−１およびＣｙｔｏｄｅｘ−３を用いた場合の結果を示し、これらのレーンにおいて、レーン２および５は２４時間、レーン３および６は４８時間、レーン４および７は７２時間の培養後の結果を示す。レーン８は、４８時間平面培養した場合の結果を示す。
図６は、図５および表３に示すオリゴ糖Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる構造解析の結果を示すチャートである。
図７は、実施例３における、１００ｍｍ径培養皿における平面培養、並びにそれぞれＣｙｔｏｄｅｘ−１およびＣｙｔｏｄｅｘ−３を用いた培養において生成したオリゴ糖Ｘ１（Ｇｂ３−Ｃ１２）およびＸ２（Ｇａｌ−Ｇｂ３−Ｃ１２）の相対量を示すグラフである。
図８は、実施例４においてＣｙｔｏｄｅｘ−１（レーン４）またはＣｙｔｏｄｅｘ−３（レーン５）を用いてマイクロキャリヤー培養した場合の上清、および単層平面培養した場合（レーン３）の上清、の濃縮物の高速薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。レーン１はガングリオサイド標準を示し、レーン６は基質サッカライドプライマーを示す。
図９は、実施例４において生成した、表４に示すオリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析結果を示すチャートである。
図１０は、実施例４における、１００ｍｍ径培養皿における平面培養、ならびにＣｙｔｏｄｅｘ−１およびＣｙｔｏｄｅｘ−３を用いた培養において生成したオリゴ糖Ｘ１（ＧＭ３タイプ）相対量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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