(57)【要約】本発明は、新規ホスホリパーゼＡ２ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体および該ホスホリパーゼＡ２ポリペプチドの製造方法に関する。本発明はまた、該ポリペプチドの利用方法、例えば、該ポリペプチドまたはその抗体を用いたアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法、並びに該ポリペプチドまたはその抗体を含む医薬に関する。さらに本発明は、ホスホリパーゼＡ２ポリペプチドのホスホリパーゼＡ２活性を阻害するポリペプチド（以下、阻害ポリペプチドと略す）、該阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該阻害ポリペプチドを含む医薬、および該阻害ポリペプチドの製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４〜６いずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを保有する形質転換体。
【請求項９】
形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞からなる群から選ばれる形質転換体である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐ５２６９＋Ｃ５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７２８１）である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項８〜１１いずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１３】
請求項４〜６いずれか１項に記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびこれらセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体からなる群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１３、１４、２８、２９、３０、３１、４６および４７記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチド誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体からなる群から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドの発現を抑制する方法。
【請求項１８】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項１９】
請求項１８記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
【請求項２０】
請求項１８記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドの免疫組織染色法。
【請求項２１】
請求項１８記載の抗体を含有する免疫組織染色剤。
【請求項２２】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドと被験試料とを接触させ、該ポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性を測定することを特徴とする、該ポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性を変動させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、該ポリペプチドの発現量を検出することを特徴とする、該ポリペプチドの発現量を変動させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項２４】
該ポリペプチドの発現量の検出が、請求項１６記載の方法を用いる請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出である、請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
該ポリペプチドの発現量の検出が、請求項１９に記載の方法を用いるポリペプチドの検出である、請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性の変動が、該ポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性の向上である、請求項２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性の変動が、該ポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性の減少である、請求項２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドの発現の変動が、該ポリペプチドの発現量の向上である、請求項２３〜２５いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドの発現の変動が、該ポリペプチドの発現量の減少である、請求項２３〜２５いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項３０】
請求項２２〜２９いずれか１項に記載の方法により得られる化合物。
【請求項３１】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を制御するプロモーターＤＮＡ。
【請求項３２】
請求項３１記載のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質転換体と被験試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物含量を測定することを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写効率を変動させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項３３】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子である、請求項３２記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写効率の変動が、該ＤＮＡの転写効率の向上である、請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写効率の変動が、該ＤＮＡの転写効率の減少である、請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２〜３５記載の方法により得られる化合物。
【請求項３７】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、該ポリペプチド活性ドメイン部位の一部または全部のアミノ酸配列を欠失したポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号３記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号３記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３７〜４０いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４２】
配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項４３】
配列番号４記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４４】
請求項４１〜４３いずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項４５】
請求項４４記載の組換えベクターを保有する形質転換体。
【請求項４６】
形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞からなる群から選ばれる形質転換体である、請求項４５記載の形質転換体。
【請求項４７】
請求項４５または４６記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項４８】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドのホスホリパーゼ活性を変動させる化合物を有効成分とする、該ポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
【請求項４９】
請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、該ポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
【請求項５０】
請求項４〜６いずれか１項に記載のＤＮＡを有効成分として含有する、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
【請求項５１】
請求項３７〜４０いずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
【請求項５２】
請求項４１〜４３いずれか１項に記載のＤＮＡを有効成分として含有する、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
【請求項５３】
請求項１３〜１５いずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
【請求項５４】
請求項１８記載の抗体を有効成分として含有する、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
【請求項５５】
請求項３０または３６記載の化合物を有効成分として含有する、請求項１〜３いずれか１項に記載のポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
【請求項５６】
該ポリペプチドが関与する疾患が、喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害の予防または治療のための医薬である、請求項４８〜５５いずれか１項に記載の医薬。
【請求項５７】
請求項２８または３４記載の方法により得られる化合物を有効成分として含有する、糖尿病の診断、予防または治療のための医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規ホスホリパーゼＡ２ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体および該ホスホリパーゼＡ２ポリペプチドの製造方法に関する。本発明はまた、該ポリペプチドの利用方法、例えば、該ポリペプチドまたはその抗体を用いたアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法、並びに該ポリペプチドまたはその抗体を含む医薬に関する。さらに本発明は、ホスホリパーゼＡ２ポリペプチドのホスホリパーゼＡ２活性を阻害するポリペプチド（以下、阻害ポリペプチドと略すこともある）、該阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該阻害ポリペプチドを含む医薬、および該阻害ポリペプチドの製造方法に関する。
背景技術
ホスホリパーゼは生体膜成分であるグリセロリン脂質のエステル結合を加水分解する酵素の総称であり、加水分解の位置によりホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、およびホスホリパーゼＤに分類される。
ホスホリパーゼＡ２はグリセロリン脂質のｓｎ−２位のエステル結合を加水分解し、脂肪酸とリゾリン脂質を生成する。遊離された脂肪酸のうち、アラキドン酸はシクロオキシゲナーゼおよび５−リポキシゲナーゼを介してそれぞれプロスタグランジンおよびロイコトリエンに代謝される。またリゾリン脂質も血小板活性化因子に代謝される。
すなわち、ホスホリパーゼＡ２はこれら脂質メディエイターの生成開始酵素と位置付けられる。シクロオキシゲナーゼおよび５−リポキシゲナーゼの阻害薬は抗炎症薬としてすでに臨床的に用いられていることから、その上流に位置するホスホリパーゼＡ２の阻害薬はこれらの生成を同時に遮断する強力な抗炎症薬になることが期待される。
ホスホリパーゼＡ２は、構造および性質から、分泌型ホスホリパーゼＡ２、細胞質ホスホリパーゼＡ２、およびＣａ２＋非依存的ホスホリパーゼＡ２の主に３つのサブファミリーに大別される［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１３０５７（１９９４）］。
細胞質ホスホリパーゼＡ２にはα、β、およびγの３つのサブタイプがすでに知られている。細胞質ホスホリパーゼＡ２α、Ａ２β、およびＡ２γはそれぞれ分子量８５キロダルトン、１１０キロダルトン、および６０キロダルトンの酵素であり、いずれもほとんどの組織で普遍的に発現している。細胞質ホスホリパーゼＡ２αの２００番目のアルギニン、２２８番目のセリン、および５４９番目のアスパラギン酸は活性に必須であり［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１９２２５（１９９６）］、細胞質ホスホリパーゼＡ２βおよびＡ２γにも保存されている。
細胞質ホスホリパーゼＡ２αおよびＡ２βは、Ｎ末端側にＣ２ドメインを持ち、本ドメインを介してＣａ２＋依存的にリン脂質膜に結合する。細胞質ホスホリパーゼＡ２γはＣ２ドメインを持っていない［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｃｍ．，２７３，２１９２６（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，８８２３（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｃｍ．，２７４，１７０６３（１９９９）］。
細胞質ホスホリパーゼＡ２αは、刺激による脂質メディエイター生成に関与していると考えられる［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１６７０９（１９９７）］。細胞質ホスホリパーゼＡ２βおよびＡ２γの生理的機能はまだ分かっていない。
炎症やアレルギー等の脂質メディエイターの産生が発症および病態の進展に関与している可能性のある疾患を予防あるいは治療するために、その疾患に関与するホスホリパーゼＡ２サブタイプに特異的な阻害薬が求められている。
逆に、膵臓ではホスホリパーゼＡ２はインスリン分泌促進に働くとの報告があり［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，１３９０，３０１，（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，２５，２１３Ｓ（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５３，１０７７（１９９７）］、ホスホリパーゼＡ２活性を向上させることにより糖尿病の予防や治療を行うことができる可能性がある。
ホスホリパーゼＡ２活性を阻害する場合または向上させる場合のいずれの場合においても、非選択的な薬物は目的としない組織および細胞におけるリン脂質の代謝への影響が問題になるので望ましくない。
しかし、細胞質ホスホリパーゼＡ２α、βおよびγの発現はすべて普遍的であり、組織あるいは細胞特異的な細胞質ホスホリパーゼＡ２は従来知られていない。
したがって、本目的を達成するためには、特定の疾患に関与するホスホリパーゼＡ２を同定し、単離しなければならない。
細胞質ホスホリパーゼＡ２の場合、該酵素の存在量が極微量であることから、組織あるいは細胞からの該酵素の精製および単離は容易ではない。古典的な酵素学的手法を用いた新規なサブタイプの単離は、現在用いられている精製法の限界および単一の精製酵素標品が得られたことを確認することの困難さにより阻まれている。
そこで、組織あるいは細胞特異的な新規ホスホリパーゼサブタイプを見出し、該ホスホリパーゼサブタイプを組換えＤＮＡ技術を用いて大量に調製することができれば、該ホスホリパーゼサブタイプを用いてより特異的かつ安全な阻害薬の開発が可能になることが期待される。
発明の開示
本発明は、新規ホスホリパーゼＡ２ポリペプチドおよび該ホスホリパーゼＡ２ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。
本発明はまた、該ホスホリパーゼＡ２ポリペプチド、該ホスホリパーゼＡ２ポリペプチド活性を阻害するポリペプチドまたは該ホスホリパーゼＡ２ポリペプチドを認識する抗体などを利用して、喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害の診断、予防または治療のための医薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、ヒト小腸からｃＤＮＡライブラリーを調製しランダムに塩基配列の解析を行った。得られた塩基配列に対して、ブラストサーチ（ＢＬＡＳＴ　ＳＥＡＲＣＨ）相同性検索ソフトウェアを用いて解析し、ヒト細胞質ホスホリパーゼＡ２β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ７８８３６）のＣ２ドメインと相同性の認められる配列を見出した。該クローンの全塩基配列を決定し、該塩基配列を基にヒト腎ｃＤＮＡライブラリーから細胞質ホスホリパーゼＡ２との相同領域を触媒ドメインも含めて完全に含むｃＤＮＡをクローン化した。該クローンの全塩基配列を決定し解析することにより本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（５７）の発明に関する。
（１）　配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２）　配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチド。
（３）　配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチド。
（４）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（５）　配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ。
（６）　配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（７）　上記（４）〜（６）いずれか１つのＤＮＡを含む組換えベクター。
（８）　上記（７）の組換えベクターを保有する形質転換体。
（９）　形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞からなる群から選ばれる形質転換体である、上記（８）の形質転換体。
（１０）　微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、上記（９）の形質転換体。
（１１）　微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐ５２６９＋Ｃ５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７２８１）である、上記（９）の形質転換体。
（１２）　上記（８）〜（１１）いずれか１つの形質転換体を培地に培養し、培養物中にホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドの製造方法。
（１３）　上記（４）〜（６）いずれか１つのＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびこれらセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体からなる群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
（１４）　配列番号１３、１４、２８、２９、３０、３１、４６および４７記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１５）　オリゴヌクレオチド誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体からなる群から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、上記（１３）のオリゴヌクレオチド。
（１６）　上記（１３）〜（１５）いずれか１つのオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
（１７）　上記（１３）〜（１５）いずれか１つのオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドの発現を抑制する方法。
（１８）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドを認識する抗体。
（１９）　上記（１８）の抗体を用いることを特徴とする、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドの免疫学的検出法。
（２０）　上記（１８）の抗体を用いることを特徴とする、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドの免疫組織染色法。
（２１）　上記（１８）の抗体を含有する免疫組織染色剤。
（２２）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドと被験試料とを接触させ、該ポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性を測定することを特徴とする、該ポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性を変動させる化合物のスクリーニング方法。
（２３）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、該ポリペプチドの発現量を検出することを特徴とする、該ポリペプチドの発現量を変動させる化合物のスクリーニング方法。
（２４）　該ポリペプチドの発現量の検出が、上記（１６）の方法を用いる上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出である、上記（２３）のスクリーニング方法。
（２５）　該ポリペプチドの発現量の検出が、上記（１９）の方法を用いるポリペプチドの検出である、上記（２３）のスクリーニング方法。
（２６）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性の変動が、該ポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性の向上である、上記（２２）のスクリーニング方法。
（２７）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性の変動が、該ポリペプチドの有するホスホリパーゼＡ２活性の減少である、上記（２２）のスクリーニング方法。
（２８）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドの発現の変動が、該ポリペプチドの発現量の向上である、上記（２３）〜（２５）いずれか１つのスクリーニング方法。
（２９）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドの発現の変動が、該ポリペプチドの発現量の減少である、上記（２３）〜（２５）いずれか１つのスクリーニング方法。
（３０）　上記（２２）〜（２９）いずれか１つの方法により得られる化合物。
（３１）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を制御するプロモーターＤＮＡ。
（３２）　上記（３１）のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質転換体と被験試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物含量を測定することを特徴とする、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡの転写効率を変動させる化合物のスクリーニング方法。
（３３）　レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子である、上記（３２）のスクリーニング方法。
（３４）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡの転写効率の変動が、該ＤＮＡの転写効率の向上である、上記（３２）または（３３）の方法。
（３５）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡの転写効率の変動が、該ＤＮＡの転写効率の減少である、上記（３２）または（３３）の方法。
（３６）　上記（３２）〜（３５）の方法により得られる化合物。
（３７）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドが有するアミノ酸配列において、該ポリペプチド活性ドメイン部位の一部または全部のアミノ酸配列を欠失したポリペプチド。
（３８）　配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（３９）　配列番号３記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチド。
（４０）　配列番号３記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチド。
（４１）　上記（３７）〜（４０）いずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（４２）　配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（４３）　配列番号４記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（４４）　上記（４１）〜（４３）いずれか１つのＤＮＡを含む組換えベクター。
（４５）　上記（４４）の組換えベクターを保有する形質転換体。
（４６）　形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞からなる群から選ばれる形質転換体である、上記（４５）の形質転換体。
（４７）　上記（４５）または（４６）の形質転換体を培地に培養し、培養物中にホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドの製造方法。
（４８）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドのホスホリパーゼＡ２活性を変動させる化合物を有効成分とする、該ポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
（４９）　上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドを有効成分として含有する、該ポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
（５０）　上記（４）〜（６）いずれか１つのＤＮＡを有効成分として含有する、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
（５１）　上記（３７）〜（４０）いずれか１つのポリペプチドを有効成分として含有する、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
（５２）　上記（４１）〜（４３）いずれか１つのＤＮＡを有効成分として含有する、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
（５３）　上記（１３）〜（１５）いずれか１つのオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
（５４）　上記（１８）の抗体を有効成分として含有する、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
（５５）　上記（３０）または（３６）の化合物を有効成分として含有する、上記（１）〜（３）いずれか１つのポリペプチドが関与する疾患の診断、予防または治療のための医薬。
（５６）　該ポリペプチドが関与する疾患が、喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害である、上記（４８）〜（５５）いずれか１つの医薬。
（５７）　上記（２８）または（３４）の方法により得られる化合物を有効成分として含有する、糖尿病の診断、予防または治療のための医薬。
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドがあげられる。
配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチド、または配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドも、本発明のポリペプチドに包含される。
配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドおよび配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１〜３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコル・イン・モレキュラ・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、国際公開ＷＯ８５／００８１７号、及びＮａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明のポリペプチドがホスホリパーゼＡ２活性を有するためには、配列番号１、２２、２６および３８記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列との相同性はＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
さらに、該ポリペプチドがホスホリパーゼＡ２α活性を有するためには、細胞質ホスホリパーゼＡ２αにおいて活性に必須であるとされる、２００番目のアルギニン、２２８番目のセリン、および５４９番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基は保存されていることが望ましい。
ただし、本発明のポリペプチドには、公知のポリペプチドは含まれない。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略す）は、上記本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであれば、どのような塩基配列を有していてもよい。該本発明のＤＮＡとしては、例えば、配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
また、配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。
上記の「配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリパーゼＡ２活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ」とは、配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列の相補配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコル・イン・モレキュラ・バイオロジー、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
ただし、本発明のＤＮＡには、公知のＤＮＡは含まれない。
本発明のポリペプチドの活性ドメインの一部、または全部を欠失したポリペプチドのなかには、本発明のポリペプチドのホスホリパーゼＡ２活性を阻害するポリペプチドが存在する。このように、ホスホリパーゼＡ２活性を阻害するポリペプチド（阻害ポリペプチド）は、ホスホリパーゼＡ２サブタイプに特異的な阻害薬として、炎症やアレルギー等の脂質メディエイターの産生が発症および病態の進展に関与している可能性のある疾患を予防あるいは治療するために有用である。
該阻害ポリペプチドは、本発明のポリペプチドの活性に必須なアミノ酸を含む活性ドメインを少なくとも一部欠失していればよい。該阻害ポリペプチドとしては、例えば、配列番号３記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドがあげられる。
また、配列番号３に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドおよび配列番号３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドも阻害ポリペプチドに包含される。このようなポリペプチドは、上記で述べた本発明のポリペプチドを取得する方法と同様な方法を用いて、例えば配列番号３記載のポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明のポリペプチドがホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するためには、配列番号３に記載のアミノ酸配列との相同性はＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡは、上記阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡであれば、どのような塩基配列を有していてもよい。該阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
また、配列番号４記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。
上記の「配列番号４記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホリパーゼＡ２活性を阻害する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ」とは、配列番号４記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡをプローブとして、本発明のＤＮＡにおける方法と同様な方法を用いることにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号４記載の塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
［１］本発明のＤＮＡの取得およびオリゴヌクレオチドの調製
ヒトホスホリパーゼＡ２β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ７８８３６）のアミノ酸配列と相同性をもつアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、遺伝子データベース、蛋白質データベースより、Ｂｌａｓｔ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法等を利用したプログラムあるいはフレームサーチ（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社製）相同性検索ソフトウェアを利用して検索する。
データベースとしてはＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｌｏｔ等の公的なデータベースを利用することができる。
また私的なｃＤＮＡライブラリー中のクローンのｃＤＮＡを、ランダムかつ大規模に塩基配列決定し、得られた配列データを集積し、作製した私的なデータベースを利用することもできる。
得られた、ヒトホスホリパーゼＡ２β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ７８８３６）の有するアミノ酸配列と相同性をもつアミノ酸配列をコードするＤＮＡが、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）のように、ＤＮＡの一部の塩基配列のみである場合は、以下のようにしてそのｃＤＮＡの全長を得ることができ、該ｃＤＮＡより本発明のＤＮＡを取得することができる。
本発明のＤＮＡの起源が特に制限されることはないが、哺乳動物が好ましく、さらに好ましくはヒト、ラットおよびマウスである。
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、適切な細胞または組織より全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを調製する。
全ＲＮＡを調製する方法として、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）〕、酸性グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）、及び実験医学９，１９３７（１９９１）〕等を用いることができる。
全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法として、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）やオリゴｄＴラテックスを用いる方法等を用いることができる。
ファースト・トラック・ｍＲＮＡ単離キット〔Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製〕、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ精製キット〔Ｑｕｉｃｋ　Ｐｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ファルマシア）社製〕等のキットを用いて組織や細胞から直接ｍＲＮＡを調製することもできる。
適切な細胞または組織として、データベースから見出されたＥＳＴ等が含まれていたｃＤＮＡライブラリーの種類を調べ、該ライブラリーを構築するために用いた細胞または組織、あるいは該組織由来の細胞株等を用いることが好ましい。
得られた全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを用い、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡライブラリー作製法として、モレキュラークローニング第２版やカレント・プロトコル・イン・モレキュラ・バイオロジー、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製〕やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（ストラタジーン）社製〕を用いる方法等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。
具体的には、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、Ｌａｍｂｄａ　ＺＡＰ　ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ〔Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クロンテック）社製）、λＥｘＣｅｌｌ〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ファルマシア）社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕等を挙げることができる。
宿主微生物としては、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに属する微生物であればいずれも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＳＯＬＲＴＭ　Ｓｔｒａｉｎ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＬＥ３９２（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いることができる。
上記方法により作製したｃＤＮＡライブラリーに加え、市販のｃＤＮＡライブラリーも利用することができる。
市販のｃＤＮＡライブラリーとして、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、ライフテックオリエンタル社等のヒト、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等由来の各臓器ｃＤＮＡライブラリーをあげることができる。
（２）　本発明のＤＮＡの取得（ｉ）
上記（１）で作製したｃＤＮＡライブラリーより、本発明のＤＮＡ又はその一部を含有するｃＤＮＡクローンを、アイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法〔モレキュラークローニング第２版〕等により選択することができる。
プローブとしては、一部明らかになっている塩基配列に基づいたプライマーを用いて、ＰＣＲ〔ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕を利用した方法でｃＤＮＡの一部を増幅した断片や、一部明らかになっている塩基配列に基づいたオリゴヌクレオチドを利用することができる。　プライマーとして、全長ｃＤＮＡの５’末端側および３’末端側の両方の塩基配列がＥＳＴ等により明らかになっている場合には、その塩基配列に基づいて調製したプライマーを用いることができる。
該ｃＤＮＡの両端にアダプターを付加し、このアダプターの塩基配列と一部明らかになっている塩基配列に基づいたプライマーでＰＣＲを行う５’−ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）および３’−ＲＡＣＥ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８（１９８８）〕により、プライマーに用いた配列よりも５’末端側および３’末端側のｃＤＮＡ断片を得ることができる。
得られたｃＤＮＡ断片を連結することにより、本発明の全長ＤＮＡを取得することができる。
また、上記ｃＤＮＡライブラリーから取得されたｃＤＮＡが完全長のポリペプチドをコードしていない場合は、以下のようにして完全長のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得ることもできる。
各種臓器または各種細胞から調製した一本鎖ｃＤＮＡライブラリーまたは上記記載の方法で作製できるｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、該ｃＤＮＡに特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、該ｃＤＮＡに対応するＤＮＡを発現する臓器や細胞を特定し、特定された臓器あるいは細胞由来のｃＤＮＡライブラリーに対し、該ｃＤＮＡをプローブにしてコロニーハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより改めて該ｃＤＮＡの全長を含むｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーから選択することができる。
各種臓器または各種細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡライブラリーは、常法または市販されているキットに従って作製することができるが、例えば以下に示す方法で作製できる。
各種臓器または各種細胞からグアニジウム　チオシアネート　フェノール−クロロホルム法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６（１９８７）〕により全ＲＮＡを抽出する。必要に応じて、全ＲＮＡをデオキシリボヌクレアーゼＩ〔Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ライフ・テクノロジーズ）社製〕で処理し、混入の可能性がある染色体ＤＮＡを分解する。得られた全ＲＮＡ各々について、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを用いてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ　Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作製できる。
上記の方法により取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素等で切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばＳａｎｇｅｒらのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいはＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ：３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、ＬＩ−ＣＯＲ社製等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
上記方法により取得された本発明のＤＮＡを含むプラスミドとして、例えば、配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡを有するプラスミドｐ５２６９＋Ｃ５をあげることができる。
プラスミドｐ５２６９＋Ｃ５を含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐ５２６９＋Ｃ５は、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７２８１として、平成１２年８月２５日付けで、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
また、上記方法で取得したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択することにより、他の組織あるいは、他の動物由来、例えばヒトおよびマウス由来の目的とするＤＮＡを取得することができる。
上記方法により得られた塩基配列情報に基づき、ＤＮＡ合成機で化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、ホスホアミダイト法を利用したＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等をあげることができる。
得られた塩基配列の新規性に関しては、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪ等の塩基配列データベースを検索することにより確認することができる。
新規な塩基配列については、アミノ酸配列に変換したのちＦＡＳＴＡ、フレームサーチ（ＦｒａｍｅＳｅａｒｃｈ）等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＰｅｐｔ、ＰＩＲ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ等のアミノ酸配列データベースを検索することにより、相同性をもつ既存のＤＮＡを検索することができる。
（ｉｉ）阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡは上記（２）−（ｉ）で取得される本発明のＤＮＡから、例えば、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の公知の方法で活性ドメイン部位と思われる部位を欠失させることにより得ることができる。
（３）本発明のオリゴヌクレオチドの調製
上述の方法で取得した本発明のＤＮＡまたはＤＮＡ断片を用いて、常法あるいは上記のＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。該オリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。
該オリゴヌクレオチドとして、例えば、配列番号１３、１４、２８、２９、３０、３１、４６または４７記載のオリゴヌクレオチドをあげることができる。
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（本明細書中では、オリゴヌクレオチド誘導体とも言う）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
［２］本発明のポリペプチドおよび阻害ポリペプチドの調製
（１）形質転換体の作製
上記［１］に記載の方法により取得した本発明のＤＮＡおよび阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させ、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドを製造するために、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコル・イン・モレキュラ・バイオロジー等に記載された方法を用いることができる。
即ち、本発明のＤＮＡまたは阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換えベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドを製造することができる。
宿主細胞としては、微生物（細菌、酵母等）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とするＤＮＡを発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡまたは阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、本発明のＤＮＡまたは阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡまたは阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御するＤＮＡが含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２〔いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ベーリンガー・マンハイム）社より市販〕、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、ｐＳＥ２８０〔Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）社製〕、ｐＧＥＭＥＸ−１〔Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）社製〕、ｐＱＥ−８〔ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン）社製〕、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ−３〔Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバジェン）社製〕、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等を挙げることができる。
プロモーターとしては、大腸菌や枯草菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ　ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡまたは阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法〔Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）〕等を挙げることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）〕、酢酸リチウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）等が用いられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはＮａｍａｌｗａ　ＫＪＭ−１細胞〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）〕、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−０００２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ・ア・ラボラトリー・マニュアル〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、モレキュラー・バイオロジー・ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換えＤＮＡ導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられるＤＮＡ導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換えＤＮＡ導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
ＤＮＡの発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドを製造することができる。
また、患者の生体内から採取した細胞に、適切な本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドを発現させるための組換えベクターを導入した後、細胞を生体内に戻すことにより、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドを患者の生体内で発現させることもできる。
（２）形質転換体の培養
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（ファーミンジェン）社製〕、Ｓｆ−９００　ＩＩ　ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
（３）発現させたポリペプチドの単離精製
上記形質転換体の培養液から、上記方法により発現させたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まない溶液あるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドあるいはその糖鎖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドをＦｌａｇペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．，４，１２８８（１９９０）〕。更に、該ポリペプチドに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
更に、本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。
また、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のポリペプチドまたは阻害ポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えばＤＮＡクローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
［３］本発明のポリペプチドを認識する抗体の調製
（１）ポリクローナル抗体の調製
上記［２］に記載の方法により取得した本発明のポリペプチドの全長または部分断片精製標品を抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ　ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリン等のキャリア蛋白質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊１９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（２）モノクローナル抗体の調製
（２−１）抗体産生細胞の調製
上記（１）において、免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（２−２）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。
例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（２−３）ハイブリドーマの作製
（２−１）で取得した抗体産生細胞と（２−２）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４（１９８８）〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの全長または部分断片精製標品を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（２−４）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株として選択する。
（２−４）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（２−３）で取得した本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。ポリペプチドの量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
［４］本発明のポリペプチドのホスホリパーゼＡ２活性の測定
上記［２］に記載の方法により、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を宿主として、本発明のポリペプチドを発現させたもの、あるいは、アフリカツメガエル卵母細胞にＤＮＡあるいはｉｎ　ｖｉｔｒｏで調製したｃＲＮＡを用いてマイクロインジェクション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０７，２２５（１９９２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５４，４５８（１９９５）〕により発現させたもの、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物等をホスホリパーゼＡ２活性の測定に用いる。ホスホリパーゼＡ２活性は検出可能な試薬（例えば、放射性試薬、蛍光試薬または比色試薬）で標識された基質（例えば、１−パルミトイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルコリン）の加水分解物（例えば、［１−１４Ｃ］アラキドン酸）あるいは残存する基質を定量することにより測定する。また、標識していない基質、分解物を定量することにより測定することもできる［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７，３（１９９１）］。
［５］本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの探索・同定および治療薬としての利用
上記［４］の活性測定に用いることのできる細胞、あるいは、後述［７］の方法で本発明のポリペプチドあるいはｍＲＮＡを発現していることの確認された組織、細胞等を含有する試料に、被験試料を添加し、上記［４］記載の方法で、ホスホリパーゼＡ２活性を測定する。
試料の形態は、該組織または、細胞等が、ホスホリパーゼＡ２活性を示すことのできる状態であればいかなる形態であってもよい。
被験試料の添加の有無における、本発明のポリペプチドのホスホリパーゼＡ２活性の比較により、被験試料の中からホスホリパーゼＡ２活性を増強する物質（アゴニスト）および阻害する物質（アンタゴニスト）をスクリーニングすることができる。
被験試料としては、合成化合物、天然に存在する蛋白質、人工的に合成された蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、これらの修飾体あるいは誘導体を、また哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物を、更に、非ペプチド性化合物、発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等をあげることができる。
上記の方法により取得される、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、治療薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いることが望ましい。
アゴニストは、糖尿病の予防薬または治療薬の成分として使用することができる。
アンタゴニストは、糖尿病も含む他の疾患、例えば、喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害等の予防薬または治療薬の成分として使用することができる。アンタゴニストには、阻害ポリペプチドも包含される。
該治療薬の投与方法としては、治療に際し最も効果的な方法を使用することが望ましく、経口投与または、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与による方法を用いることができる。
該治療薬の剤形としては、軟膏剤、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、テープ剤等をあげることができる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等をあげることができる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造することができる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用い製造することができる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、例えば、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製することができる。
座剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製することができる。
噴霧剤は、上記で取得されたアゴニストまたはアンタゴニストをそのまま噴霧剤として用いることが可能であるが、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製した噴霧剤が好ましい。
担体として、具体的には乳糖、グリセリン等を例示することができる。
上記で取得されたアゴニストまたはアンタゴニスト、および担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤を調製することが可能である。
これらの非経口剤においても、経口剤で添加剤として例示した成分を添加することができる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。他の非ヒト哺乳動物に投与する場合も同様である。
［６］本発明のポリペプチドの発現を調節する化合物（以下、発現調節化合物と略す）の探索および同定
（１）本発明の抗体を用いた発現調節化合物の探索および同定
本発明のポリペプチドを発現する細胞を被験試料と接触させた後、本発明の抗体を用いることにより、本発明のポリペプチドの発現調節化合物を探索、同定することができる。
細胞としては、本発明のポリペプチドを発現している細胞、細胞株、組織ならいかなるものでも用いることができる。
例えば、下記［７］に記載した、抗体による免疫学的な検出方法によって該ポリペプチドの発現が認められた細胞、細胞株あるいは組織を用いることができる。
好適な細胞株として、例えば、腎由来の細胞株をあげることができる。
被験試料としては上記［５］の被験試料であげたものを用いることができる。
本発明のポリペプチドを発現する細胞を、該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞と接触させた後、本発明の抗体を用い、該細胞の発現したポリペプチド含量を定量する。定量する方法としては、例えば下記の免疫細胞染色を利用した方法をあげることができる。
培養付着細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）を含むＰＢＳ緩衝液３ｍＬを加え、余分な溶液を除いた後、３７℃、５分間インキュベートすることによりフラスコより細胞を剥がす。
浮遊細胞については培養細胞をそのまま用いることができる。該細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄後、固定液に懸濁する。固定液としては例えば３．７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ緩衝液を挙げることができる。室温にて３０分間インキュベート後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し膜透過性反応液に懸濁する。膜透過性反応液としては例えば０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ緩衝液を挙げることができる。
該処理を行った細胞を免疫細胞染色用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）等に懸濁し、１〜２０×１０５個ずつ丸底９６穴プレートに分注する。
該プレートに、本発明のモノクローナル抗体を分注する。
モノクローナル抗体としては、上記［３］（２−３）で取得した本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清、上記［３］（２−４）で取得した精製モノクローナル抗体をあげることができる。更に、該モノクローナル抗体を標識した抗体も用いることができる。
モノクローナル抗体を標識した抗体としては、例えばビオチン標識した抗体をあげることができる。
ビオチン標識した抗体は公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊１９８５年）で調製することができる。
上記抗体を、免疫細胞染色用緩衝液あるいは１０％動物血清を含む免疫細胞染色用緩衝液を用いて０．１〜５０μｇ／ｍＬの濃度になるように希釈する。
該希釈抗体を２０〜５００μＬ／穴となるように上記９６穴プレートに分注し、氷冷下で３０分間放置する。
標識されていないモノクローナル抗体を用いた場合には、上記プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞を洗浄する。ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）あるいはフィコエリスリン等の蛍光色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体あるいは抗ラットイムノグロブリン抗体を０．１〜５０μｇ／ｍＬ程度の濃度で含む免疫細胞染色用緩衝液を５０〜５００μＬ／穴ほど分注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。
ビオチン標識した該モノクローナル抗体を用いた場合には、上記プレートにＦＩＴＣあるいはフィコエリスリン等の蛍光色素で標識したストレプトアビジンを５０〜５００μＬ／穴ほど分注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。
両ケースとも、放置後、プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞をよく洗浄し、蛍光顕微鏡、セルソーター等により解析する。
被験試料を添加しない系と比較し、本発明のポリペプチド含量を増加あるいは減少させる被験試料を探索することにより、発現調節化合物を同定することができる。
本発明のポリペプチド含量を増加させる物質はアゴニストと同様に使用することができる。また、本発明のポリペプチド含量を減少させる物質は、アンタゴニストとして使用することができる。
（２）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写産物定量系を用いた探索および同定
本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現する細胞を被験試料と接触させた後、該ｍＲＮＡ含量を定量することにより発現調節化合物を探索、同定することができる。
本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現する細胞としては、例えば上記［６］（１）記載の細胞株を、被験試料としては上記［５］のものを用いることができる。
本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現する細胞を、該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞中の発現した該ｍＲＮＡの含量を、通常のノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＮＡのドットブロットハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法等を用い定量する。
ハイブリダイゼーション法等に用いることのできるプローブおよびＲＴ−ＰＣＲ法等に用いることのできるプライマーとして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片をあげることができる。
具体的には、配列番号２、２３、２７および３９記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを好適に用いることができる。
被験試料を添加しない系と比較し、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ含量を増加あるいは減少させる被験試料を探索することにより、発現調節化合物を同定することができる。
本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ含量を増加させる物質はアゴニストとして使用することができる。また、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ含量を減少させる物質はアンタゴニストとして使用することができる。
（３）レポーター遺伝子を用いる探索および同定
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を制御する領域（以下、転写制御領域と略す）の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させた後、レポーター遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現量を定量することにより発現調節化合物を探索、同定することができる。
転写制御領域は、通常、ＤＮＡの５’上流に含まれることが多い。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの５’上流領域は、例えばＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒ　ｋｉｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いて調製することができる。また、該領域を適当な制限酵素を用い、適切な長さに切断した断片を転写制御領域として用いることができる。
レポーター遺伝子としては、該ＤＮＡの翻訳産物が細胞内で安定であり、該翻訳産物の存在量が容易に定量できるものであればいかなるものでも用いることができ、該ＤＮＡがコードするポリペプチドとして、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、β−グルクロニダーゼ、エクオリン、グリーンフルオレッセントプロテイン（ＧＦＰ）等をあげることができる。
該転写制御領域を含むレポータープラスミドを導入する宿主細胞としては、いかなる細胞も用いることができるが、好適には、［６］（１）記載の本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現が認められている細胞株を用いることができる。
被験試料として、上記［５］のものを用いることができる。
転写制御領域の下流に常法によりレポーター遺伝子を連結し、作製したプラスミドを用い、常法により宿主細胞を形質転換する。
また、ポジティブセレクション用マーカー（Ｇ４１８耐性遺伝子等）およびネガティブセレクション用マーカー（単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼやジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子等）をつないだジーンターゲティングベクターを作製し、本発明のポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡの一部をレポーター遺伝子で置換した細胞株を作製することもできる〔Ｎａｔｕｒｅ，３３６，３４８（１９８８）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１４，７７（１９９３）、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）〕。
該形質転換体を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現したレポーター遺伝子にコードされたポリペプチドの量を、該ポリペプチドに適した方法で検出、定量する。
検出、定量法として、ＣＡＴの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング第２版，１６章，６０頁に記載の方法を、β−ｇａｌの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング第２版，１６章，６６頁に記載の方法を、ｌｕｃの場合には、例えば、実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ４　遺伝子導入と発現・解析法，８９（１９９４）に記載の方法を、ＧＦＰの場合には、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，４６５３（１９９７）記載の方法等をあげることができる。
被験試料を添加しない系と比較し、レポーター遺伝子にコードされたポリペプチド含量を増加あるいは減少させる被験試料を探索することにより、発現調節化合物を同定することができる。
レポーター遺伝子にコードされたポリペプチド含量を増加させる物質はアゴニストとして使用することができる。また、レポーター遺伝子にコードされたポリペプチド含量を減少させる物質はアンタゴニストとして使用することができる。
［７］本発明のＤＮＡ、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニストおよび発現調節化合物の利用
（１）本発明のＤＮＡをプローブとして用いて、ヒトおよびマウスなど非ヒト哺乳動物の組織や細胞から上記［１］（１）と同様にして抽出したＲＮＡについてノーザンハイブリダイゼーションを行うことにより、その組織や細胞における本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出あるいは定量することができる。
各種の組織でそのｍＲＮＡの発現量を比較することにより本発明のポリペプチドの組織発現分布を知ることができる。
（２）本発明のオリゴヌクレオチドを本発明のＤＮＡの特異的プライマーとして用いて、ヒトおよびマウスなど非ヒト哺乳動物の組織や細胞から上記［１］（１）と同様にして抽出したＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲ〔ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ＰＣＲ；ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９０）〕を行うことにより、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出や定量を行うことができる。
ＲＮＡを定量する方法は、本発明のＤＮＡが関与する病態の診断に用いることができる。
各種病態モデル動物において、該ｍＲＮＡを定量することにより、病態における該ＤＮＡ産物の重要性を明らかにすることができる。また、薬剤の有無による該ｍＲＮＡの発現量を比較することにより薬剤を評価することができる。
（３）本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ヒトおよびマウスなど非ヒト哺乳動物の組織切片に対してｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５４，４１９（１９９５）〕を行うことにより、組織内での本発明のポリペプチドの発現細胞の特定等のより細かい発現分布を知ることができる。
これらの方法によって得られる、本発明のポリペプチドがどのような組織や細胞で発現しているかに関する情報および細胞がどのような刺激を受けたときに発現量が変化するかに関する情報は、本発明のポリペプチドの生理機能や病態への関与を解析するために有用である。
（４）本発明のＤＮＡをプローブとして用い、ゲノムＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーション〔モレキュラー・クローニング第２版〕を行うことにより、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの変異を検出することができる。
変異の検出を行うことにより、該ＤＮＡの変異が原因となっている可能性のある、例えば喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害等の疾患の診断を行うことができる。
（５）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをＰＣＲ等を用いて増幅して塩基配列を解析することにより、あるいはＤＮＡチップ等を用いて解析を行うことにより、１塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ；ＳＮＰ）などの多型を検出することができる。多型の検出を行うことにより、該ＤＮＡの多型が関連している可能性のある、例えば喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害等の疾患の診断を行うことができる。
（６）本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその誘導体）を用い、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写もしくはｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより〔化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）〕、該ＤＮＡが発症に関与している可能性のある、例えば喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害等の疾患の予防や治療に用いることができる。
上述のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０塩基と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、好ましくは本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳開始領域にある５〜６０塩基と相補的な塩基配列を基にして設計・調製し、生体内に投与する。
本発明のＤＮＡを含有する医薬は、上記［５］の本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの医薬製剤の調製法と同様な方法を用いて調製することができ、調製された該医薬製剤を上記［５］の場合と同様の方法で投与することができる。
（７）本発明のＤＮＡを用い、上記［２］記載の方法により本発明のポリペプチドを取得することができる。
本発明のポリペプチドの用途としては、喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害等の疾患の治療薬または予防薬があげられる。
本発明のポリペプチドを含有する医薬は、上記［５］の本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの医薬製剤の調製法と同様な方法を用いて調製することができ、調製された該医薬製剤を上記［５］の場合と同様の方法で投与することができる。
（８）本発明のオリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖としてレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス等のウイルスベクター、その他のベクターに組み込んで遺伝子治療用ベクターとし、遺伝子治療に用いることができる。
（９）本発明のポリペプチドを抗原として用い、上記［３］記載の方法により本発明のポリペプチドに対する抗体を製造することができる。
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、本発明のポリペプチドを免疫学的に検出または定量することができる。
具体的には、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、酵素標識抗体法や蛍光抗体法による免疫組織染色、ウェスタンブロット法等を用いた検出法をあげることができる。
具体的には、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２５Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドを認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ法等をあげることができる。
また、本発明の抗体は病理組織切片を用いた免疫組織染色にも利用できる。
本発明の抗体を用い、健常者および被験者の細胞または組織に存在する本発明のポリペプチドを免疫学的に検出または定量し、その量を健常者と被験者とで比較し、発現量が変化しているかどうかを調べることにより、被験者の喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害等の病態の診断に用いることができる。
また、本発明の抗体を用いて、各種病態モデル動物の組織および細胞に存在する該ポリペプチドを免疫学的に検出または定量し、正常動物と比較することにより、病態における該ポリペプチドの重要性を明らかにすることができる。さらに、薬剤の有無による該ポリペプチドの発現量を比較することにより薬剤を評価することができる。
（１０）本発明のポリペプチドの機能（ホスホリパーゼＡ２活性）を阻害する抗体を投与することにより、喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病または虚血再灌流障害等の疾患を治療または予防することができる。
本発明の抗体を含有する医薬は、上記［５］の本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの医薬製剤の調製法と同様な方法を用いて調製することができ、調製された該医薬製剤を上記［５］の場合と同様の方法で投与することができる。
以下により具体的な実施例をあげて説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
なお、実施例中では、ホスホリパーゼＡ２をＰＬＡ２、細胞質ホスホリパーゼＡ２をｃＰＬＡ２と略記する。
発明を実施するための最良の形態
実施例１　ヒト由来の本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローン化　以下、遺伝子操作は特に断らない限り公知のモレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に従って行なった。
（１）ヒト小腸由来ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト小腸から、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（＃２７−９２７０−０１）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出後、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８９）に記載されているＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ精製法に準じｍＲＮＡを抽出し、精製した。
それぞれのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡよりオリゴキャップ法［Ｇｅｎｅ，１３８，１７１（１９９４）］によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ　ｌｉｎｋｅｒ（配列番号５）およびＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号６）を用いて、文献［蛋白質　核酸　酵素，４１，１９７（１９９６）、Ｇｅｎｅ，２００，１４９（１９９７）］に従ってＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ　Ａｃｉｄ　Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。
次いで、５’末端側と３’末側のＰＣＲプライマー（配列番号７、８）を用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換した後、制限酵素ＳｆｉＩで切断した。該ｃＤＮＡをＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＢ００９８６４，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ，３３９２ｂｐ）に組み込み、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡは発現が可能なように一方向に組み込まれた。
（２）ランダムシークエンス
上記（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーとしての各大腸菌クローンから常法に従ってプラスミドＤＮＡを取得し、各プラスミドが含有するｃＤＮＡの５’末端の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、キット（ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７，ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。配列番号９および１０に示す塩基配列を有するＤＮＡを合成し、該合成ＤＮＡをプライマーとして使用した。
（３）相同性検索ソフトウェアを用いた解析
得られた塩基配列についてはブラストサーチ相同性検索ソフトウェアを用いて解析し、ｃＰＬＡ２に相同性の認められる塩基配列を見出した。該塩基配列を有すると思われるクローン（ｃ−ｈｓｉ０５２６９）の全塩基配列を決定した結果、プラスミドｃ−ｈｓｉ０５２６９には配列番号４に記載された約１．５ｋｂの塩基配列を有するｃＤＮＡが含まれていた。該塩基配列によりコードされる新規ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
（４）ｃＰＬＡ２との相同領域を完全に含むｃＤＮＡのクローン化
上記（３）で得られた塩基配列情報をもとに配列番号１１および配列番号１２記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計し、Ｈｕｍａｎ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、以下に示す方法によりＣ末領域をＰＣＲ増幅した。
即ち、Ｈｕｍａｎ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ２μＬ、配列番号１１記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーおよびＡＰ１（キットに添付）のプライマー各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ混合液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）０．５μＬおよび１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社製）を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１５秒間、７２℃で４分間の工程を１サイクルとして５サイクル、９４℃で１５秒間、７０℃で４分間の工程を１サイクルとして５サイクル、９４℃で１５秒間、６８℃で４分間の工程を１サイクルとして２０サイクル行なった。続いて、得られたＰＣＲ反応液の１００倍希釈液５μＬ、配列番号１２記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーおよびＡＰ２（キットに添付）のプライマー各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ混合液１μＬおよび１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液を含む反応溶液５０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１５秒間、６８℃で４分間の工程を１サイクルとして３０サイクル行なった。得られた該ＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により約２．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマニュアルに従ってＤＮＡ断片を精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとｐＣＲ２．１　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＰＬ−Ｃを得た。
プラスミドｐＰＬ−Ｃに含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を常法によって決定したところ、挿入されたＤＮＡ断片は挿入された断片中のＡｃｃＩ部位でｃ−ｈｓｉ０５２６９のＡｃｃＩ部位と連結可能であることが分かった。
プラスミドｃ−ｈｓｉ０５２６９　２μｇを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記する）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＡｃｃＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ断片（１．３ｋｂ）を精製した。
また、プラスミドｐＰＬ−Ｃ２μｇを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＡｃｃＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。
フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＡｃｃＩ−ＮｏｔＩ断片（２．２ｋｂ）を精製した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）２μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で６時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片（３．０ｋｂ）を精製した。
上記で得られたプラスミドｃ−ｈｓｉ０５２６９由来のＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ断片（１．３ｋｂ）５０ｎｇ、プラスミドｐＰＬ−Ｃ由来のＡｃｃＩ−ＮｏｔＩ断片（２．２ｋｂ）５０ｎｇおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（−）由来のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片（３．０ｋｂ）５０ｎｇをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐ５２６９＋Ｃ５を得た。該プラスミドの構築過程および制限酵素地図を第１図に示す。
該プラスミドｐ５２６９＋Ｃ５を保有する大腸菌ＪＭ１０９株は、ブダペスト条約に基づき、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐ５２６９＋Ｃ５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７２８１）として、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成１２年８月２５日付で寄託されている。
連結した塩基配列は配列番号２記載の塩基配列を有しており、配列番号１記載のアミノ酸配列を有する新規なポリペプチドをコードしていた。
また、既知タンパク質配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）に対して、該アミノ酸配列のＳｍｉｔｈ　＆　Ｗａｔｅｒｍａｎ検索を行なったところ、ｃＰＬＡ２ファミリーのポリペプチドとの相同性が強く検出された。そこで、ヒトｃＰＬＡ２αアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６０１０５）、ヒトｃＰＬＡ２βアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ７８８３６）を選択してアライメントを作製した。
第２図および第３図にヒトｃＰＬＡ２α配列、第４図および第５図にヒトｃＰＬＡ２β配列とのアライメント結果を示す。ｃＰＬＡ２に共通したアミノ酸配列であるＧＸＳＧＳ配列（配列番号１５）も認められた（第２図、第４図の下線部）。
実施例２：ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた発現解析
実施例１で決定した塩基配列の情報を基に配列番号１３記載の塩基配列を有する５’端側ＤＮＡプライマーと配列番号１４記載の塩基配列を有する３’端側ＤＮＡプライマーを設計し、合成した。
２種類のプライマー（配列番号１３および配列番号１４）各々１．０μｍｏｌ／Ｌ、ヒト各組織ｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリー２μＬ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ｔａｑ　Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）２．５単位および１×Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ（Ｍｇ　ｐｌｕｓ）緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社製）を用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で１分間、６０℃で１分間の工程を１サイクルとして３５サイクル行い、更に７２℃で８分間加熱した。
得られたＰＣＲ反応液より７μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により、予想される約０．６ｋｂのＤＮＡ断片の増幅を確認した。腎臓、肺、前立腺、胸腺、甲状腺、気管、子宮で強い発現が認められた。電気泳動結果を第６図に示す。
実施例３：ノーザンハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡの発現解析
２種類のプライマー（配列番号１３および配列番号１４）各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ｈｕｍａｎ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　２μＬ、Ａｍｐｌｉ　Ｔａｑ　Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）２．５単位および１×Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ緩衝液を含む反応溶液５０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００を用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で１分間、６０℃で１分間の工程を１サイクルとして３５サイクル行ない、更に７２℃で８分間加熱した。
得られたＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により約０．６ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付のマニュアルに従ってＤＮＡ断片を精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ　５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりノーザン解析プローブ作製用プラスミドｐ６００−Ｎを調製した。該プラスミドの構築過程および制限酵素地図を第７図に示す。
調製したプラスミドｐ４００−Ｎ　１０μｇを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴからなる緩衝液５０μＬに溶解し、３０単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で６時間消化反応を行なった。該反応液に対してフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、ＤＮＡ断片を回収した。
該ＤＮＡ断片の１μｇを、４０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、２ｍｍｏｌ／Ｌスペルミジン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＡＴＰ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣＴＰ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＧＴＰ、０．６５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＵＴＰ、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌディゴキシゲニン−１１−ＵＴＰを含む緩衝液５０μＬに溶解し、４０単位のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を添加し、３７℃で２時間ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応を行なった。
反応後、得られた反応液より、エタノール沈殿によりディゴキシゲニン標識ｃＲＮＡプローブを回収した。
該プローブを用いて、ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡフィルター〔Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔｓのフィルター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製〕に対して、以下に示す方法に従いノーザンハイブリダイゼーションを行なった。　各臓器のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡフィルターを、５０％ホルムアミド、５倍濃度のＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣの組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムおよび１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略記する）、２％ブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む緩衝液（以下、ハイブリダイゼーションバッファーと略記する）中に浸漬し、７０℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行なった。
該フィルターを、上述のディゴキシゲニン標識ｃＲＮＡプローブが１ｉｇ／ｍＬの濃度で溶解しているハイブリダイゼーションバッファーに浸漬し、７０℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行なった。
該フィルターを２倍濃度のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳよりなる緩衝液中で７０℃、１０分間浸漬する条件で１回、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳよりなる緩衝液中で７０℃、３０分間浸漬する条件で３回洗浄した。
該フィルターを１００ｍｍｏｌ／Ｌマレイン酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムよりなる緩衝液（以下、ＤＩＧ　Ｉ緩衝液と略記する）中で室温、１５分間浸漬する条件で２回洗浄し、ＳＤＳを除去した。
該フィルターを１００ｍｍｏｌ／Ｌマレイン酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１％ブロッキング試薬よりなる緩衝液（以下、ＤＩＧ　ＩＩ緩衝液と略記する）に浸漬し、１時間室温にてブロッキングを行なった。
該フィルターを、ＤＩＧ　ＩＩ緩衝液で１００００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ディゴキシゲニン抗体Ｆａｂフラグメント（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）溶液中に浸漬し、室温で３０分間抗原抗体反応を行なった。
該フィルターをＤＩＧ　Ｉ緩衝液で室温、３０分間浸漬する条件で３回洗浄し、余分な抗体を除去した後、１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ９．０）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムからなる緩衝液（以下、ＤＩＧ　ＩＩＩ緩衝液と略記する）に５分間浸漬し平衡化した。
該フィルターを、ＤＩＧ　ＩＩＩ緩衝液で１００倍に希釈した発光基質ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）溶液中に室温で１５分間浸漬し、シグナルを発光させ、ＣＣＤカメラ（富士写真フィルム社製）で検出した。
結果を第８図に示す。腎臓、肺において約３．５キロヌクレオチドおよび６キロヌクレオチドのバンドが認められた。また、骨格筋、心臓において約３．５キロヌクレオチドのバンドが認められた。
実施例４　ヒト由来の本発明のポリペプチドの昆虫細胞を用いた発現と該ポリペプチドのホスホリパーゼＡ２活性の測定
（１）バキュロウイルス作製用プラスミドの構築
上記実施例１で得られた塩基配列をもとに配列番号１６および配列番号１７に記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計し、以下の方法に従って、Ｆｌａｇタグを挿入したＮ末領域をＰＣＲ増幅した。
上記実施例１で得られたプラスミドｃ−ｈｓｉ０５２６９　１０ｎｇ、配列番号１６および配列番号１７で表される塩基配列を有するプライマー各々０．３μｍｏｌ／Ｌ、各成分を３００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、硫酸マグネシウム液１ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジー社製）混合液０．５μＬおよび１×Ｐｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社）を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１分間、６８℃で１分間の工程を１サイクルとして２５サイクル行なった後、６８℃で５分間の反応を行なった。得られたＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマニュアルに従ってＤＮＡ断片を精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＭＦ２を得た。
一方、上記実施例１で得られた塩基配列をもとに配列番号１８およびプラスミドｐＰＬ−Ｃ中の配列番号１９に記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計し、Ｃ末領域をＰＣＲにより増幅した。
即ち、プラスミドｐＰＬ−Ｃ１０ｎｇ、配列番号１８および配列番号１９に記載の塩基配列を有するプライマー各々０．３μｍｏｌ／Ｌ、各成分を３００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、硫酸マグネシウム液１ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｐｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジー社製）混合液０．５μＬおよび１×Ｐｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社）を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１分間、６８℃で１分間の工程を１サイクルとして２５サイクル行なった後、６８℃で５分間の反応を行なった。得られたＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマニュアルに従ってＤＮＡ断片を精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。組み換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＣ５ＰＣＲを得た。
プラスミドｐＭＦ２およびプラスミドｐＣ５ＰＣＲに含まれるＤＮＡ断片の塩基配列は常法によって決定し、これらの挿入されたＤＮＡ断片を挿入されたＤＮＡ断片中に存在するＡｃｃＩ部位を用いて下記条件で連結した。
即ち、プラスミドｐＭＦ２　２μｇを２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＡｃｃＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ断片（１．３ｋｂ）を精製した。
また、プラスミドｐＣ５ＰＣＲ　２μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＡｃｃＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１．４ｋｂ）を精製した。
一方、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２μｇを２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（５．４ｋｂ）を精製した。
得られたプラスミドｐＭＦ２由来のＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ断片（１．３ｋｂ）５０ｎｇと、プラスミドｐＣ５ＰＣＲ由来のＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１．４ｋｂ）５０ｎｇおよびｐｃＤＮＡ３．１由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（５．４ｋｂ）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＰＬＡＨ−３．１を得た。
続いて、プラスミドｐＰＬＡＨ−３．１　２μｇを２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＢａｍＨＩ断片（２．７ｋｂ）を精製した。
一方、プラスミドｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）２μｇを２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムからなる緩衝液３０μＬ中に溶解し、０．５単位のアルカリホスファターゼ（宝酒造社製；Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｃ７５由来）を加えて、６０℃で３０分間脱リン酸化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＢａｍＨＩ−アルカリホスファターゼ処理済み断片（９．６ｋｂ）を精製した。上記で回収したプラスミドｐＰＬＡＨ−３．１由来のＢａｍＨＩ断片（２．７ｋｂ）５０ｎｇと、プラスミドｐＶＬ１３９３由来のＢａｍＨＩ−アルカリホスファターゼ処理済み断片（９．６ｋｂ）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＰＬＡＨ−１３９３を得た。該プラスミドの構築過程および制限酵素地図を第９図に示す。
（２）組み換えバキュロウイルスの作製
ウイルスの作製方法はバキュロウイルス発現ベクターシステムマニュアル（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）に記載されている方法に従って行なった。
即ち、２×１０６個のＳｆ９細胞を直径６ｃｍシャーレに播種し、接着後、無血清培地（Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ、ライフテック社より購入）に交換した。上記（１）で作製したプラスミドｐＰＬＡＨ−１３９３またはｐＶＬ１３９３　５μｇ、Ｌｉｎｅａｌｉｚｅｄ　Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ　ＤＮＡ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１５ｎｇ、リポフェクチン液（ライフテクノロジー社製）６ｎｇを含むＤＮＡリポフェクチン混合液２４μＬを、上記の無血清培地の入ったシャーレに均一になるように添加し２７℃で４日間培養した。血清入りの培地（Ｅｓｆ９２１、旭テクノグラス社より購入）を２ｍＬ添加し、さらに２７℃で３日間培養した。細胞を回収後、８００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清を得た。得られた上清を、接着させたＳｆ９細胞に添加し、２７℃で３日間培養した。細胞を回収後、８００ｒｐｍ、５分間遠心分離してウイルスを含有する上清を得た。
（３）発現昆虫細胞可溶性画分の調製
１．５×１０６個／ｍＬの浮遊Ｓｆ９細胞２８ｍＬに上記（２）で回収したウイルスを含有する上清２ｍＬを添加し浮遊状態で２７℃にて４日間培養した。８００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により細胞を回収し、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）にて細胞を洗浄した。２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、１×ｃｏｍｐｌｅｔｅ、ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（ベーリンガーマンハイム社製）からなる緩衝液に得られた細胞を懸濁し、超音波破砕機を用い氷上で細胞を破壊した。上記抽出液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清をＰＬＡ２活性の測定に用いた。
（４）ＰＬＡ２活性の測定
１−パルミトイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルコリン（４８ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、第一化学薬品社製）（２μｍｏｌ／Ｌ）および上記で得られた上清を含有する１００μＬの反応液〔１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン（実質的に脂肪酸を含まない。シグマ社製）、８μｍｏｌ／ＬトリトンＸ−１００〕を３７℃で２時間インキュベートした後、ドール試薬（２−プロパノール／ヘプタン／硫酸を７８：２０：２の割合で含む）を添加して反応を停止した。さらにヘプタン０．３ｍＬおよび水０．２ｍＬを加え、旋回して混合した。得られた混合物を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上層のうち０．３２ｍＬをシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ６０、メルク社製）４０ｍｇを含有するチューブに移し、さらにヘプタン０．３ｍＬを添加した。そのチューブを旋回して混合した後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清のうち４００μＬを、ウルチマゴールド（Ｐａｃｋａｒｄ社製）３ｍＬを入れたシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＳ６５００）を用いて放射活性を測定した。ポリペプチドの量は、Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ法を用いて定量した。コントロールとしてプラスミドｐＶＬ１３９３から作製したウイルスを導入した昆虫細胞の可溶性画分を用いた。結果を第１０図に示す。
第１０図に示された結果から、上記実施例１で得られたヒト由来の本発明のポリペプチドは、１−パルミトイル−２−アラキドニル−ホスファチヂルコリンのｓｎ−２位のエステル結合を加水分解するＰＬＡ２活性を有することが示された。
実施例５　マウス由来の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローン化　上記実施例４でＰＬＡ２活性を有することが示されたヒト由来の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報を基にブラストサーチ相同性検索ソフトウェアを用いて解析し、相同性の認められるＥＳＴ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＢＦ２９９９４９）を見出した。該クローンを入手（コスモバイオ社）し、全塩基配列を決定した結果、プラスミドｐＢＦ２９９９４９には配列番号４に記載の塩基配列と高い相同性を有する塩基配列を有するｃＤＮＡが含まれていることがわかった。
該塩基配列情報をもとに配列番号２０および配列番号２１に記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計し、Ｍｏｕｓｅ　Ｌｕｎｇ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、以下に示す方法によりＮ末領域をＰＣＲで増幅した。
即ち、Ｍｏｕｓｅ　Ｌｕｎｇ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ２μＬ、配列番号２０記載の塩基配列を有するプライマーおよびＡＰ１（キットに添付）のプライマー各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ混合液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）０．５μＬおよび１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社）を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１５秒間、７２℃で４分間の工程を１サイクルとして５サイクル、９４℃で１５秒間、７０℃で４分間の工程を１サイクルとして５サイクル、９４℃で１５秒間、６８℃で４分間の工程を１サイクルとして２０サイクル行なった。続いて、得られたＰＣＲ反応液の１００倍希釈液５μＬ、配列番号２１記載の塩基配列を有するプライマーおよびＡＰ２（キットに添付）のプライマー各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ混合液１μＬおよび１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液を含む反応溶液５０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００を用い、９５℃で３分間加熱後、９４℃で１５秒間、６８℃で３分間の工程を１サイクルとして２５サイクル行なった。得られたＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により約０．３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマニュアルに従ってＤＮＡ断片を精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐ４３２−３を得た。
得られたプラスミドｐ４３２−３に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を常法によって決定したところ、挿入されているＤＮＡ断片はプラスミドｐＢＦ２９９９４９と連結可能であることが判明した。挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２３に示した。該塩基配列によりコードされる新規ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２２示す。
該アミノ酸配列を、解析プログラム［ＧＥＮＥＴＹＸ　ＷＩＮ　ｖｅｒ．２．１（ソフトウェア社製）］を用いてヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と比較したところ、７２．６％の一致が認められた。
アライメント解析の結果を第１１図〜第１３図に示す。第１２図は第１１図の続きであり、第１３図は第１２図の続きである。
実施例６　ラット由来の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのｃＤＮＡ断片のクローン化
ヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報を用いて２つの合成プライマーの混合物を作製した。
一方の合成プライマーの混合物は、配列番号２４に示される塩基配列において３番目、６番目および７番目の塩基がｃまたはｔ、９番目および１５番目の塩基がａ、ｃ、ｇまたはｔ、１２番目の塩基がａまたはｇである塩基配列を有するプライマーの混合物、他方のプライマーの混合物は配列番号２５に示される塩基配列において１番目の塩基がｃまたはｔ、７番目の塩基がａ、ｃ、ｇまたはｔ、４番目、１０番目および１３番目の塩基がａまたはｇである塩基配列を有するプライマーの混合物である。
該２つのプライマーの混合物各々１．０μｍｏｌ／Ｌ、ラット肺由来ｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡ２μＬ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー社製）２．５単位および１×Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ（Ｍｇ　ｐｌｕｓ）緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を含む反応溶液５０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社製）を用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で１分間、６０℃で１分間の工程を１サイクルとして３５サイクル行い、更に７２℃で８分間加熱した。
得られたＰＣＲ反応液より５μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により予想される約０．８ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認後、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマニュアルに従ってＤＮＡ断片を回収した。
上記で回収したＤＮＡ断片５０ｎｇとｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＲｐ１１−２を得た。全塩基配列を決定した結果、プラスミドｐＲｐ１１−２には配列番号２７に記載の塩基配列を有する約０．８ｋｂのｃＤＮＡが含まれていた。該塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。該アミノ酸配列を、解析プログラム［ＧＥＮＥＴＹＸ　ＷＩＮ　ｖｅｒ．２．１（ソフトウェア社製）］を用いてヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と比較したところ、７２．８％の一致が認められた。アライメント解析結果を第１４図に示す。
実施例７　ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた発現解析
上記実施例５で決定したマウス由来の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を基に配列番号２８に記載の塩基配列を有する５’端側ＤＮＡプライマーと配列番号２９に記載の塩基配列を有する３’端側ＤＮＡプライマーを設計し、合成した。また上記実施例６で決定したラット由来の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を基に配列番号３０に記載の塩基配列を有する５’端側ＤＮＡプライマーと配列番号３１に記載の塩基配列を有する３’端側ＤＮＡプライマーを設計し、合成した。同様にｃＰＬＡ２αの発現について解析するため、マウスｃＰＬＡ２αの塩基配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＭ＃００８８６９）を基に配列番号３２に記載の塩基配列を有する５’端側ＤＮＡプライマーと配列番号３３に記載の塩基配列を有する３’端側ＤＮＡプライマーを設計し、合成した。また、ラットｃＰＬＡ２αの塩基配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｕ３８３７６）を基に配列番号３４に記載の塩基配列を有する５’端側ＤＮＡプライマーと配列番号３５に記載の塩基配列を有する３’端側ＤＮＡプライマーを設計し、合成した。
コントロールとしてグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ３ＰＤＨと略記する）の発現を確認するため、マウスとラットのＧ３ＰＤＨの塩基配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｍ３２５９９、Ｍ１７７０１）を基に配列番号３６に記載の塩基配列を有する５’端側ＤＮＡプライマーと配列番号３７に記載の塩基配列を有する３’端側ＤＮＡプライマーを設計し、合成した。
２種類の組み合わせのプライマー（配列番号２８と配列番号２９、配列番号３０と配列番号３１、配列番号３２と配列番号３３、配列番号３４と配列番号３５および配列番号３６と配列番号３７の各組み合わせ）各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、マウスおよびラット各組織由来のｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡ２μＬ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ｔａｑ　Ｇｏｌｄポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）２．５単位および１×Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ緩衝液（Ｍｇ　ｐｌｕｓ）を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社製）を用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間の工程を１サイクルとしてｃＰＬＡ２αおよび本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡについては２９サイクル、Ｇ３ＰＤＨについては２２サイクル行い、更に７２℃で８分間加熱した。
得られたＰＣＲ反応液より１０μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により予想される約５００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅を確認した。電気泳動結果を第１５図に示す。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡについては肺、皮膚での強い発現が認められた。
実施例８　マウス由来の本発明のポリペプチドの昆虫細胞を用いた発現と該ポリペプチドのＰＬＡ２活性の測定
（１）バキュロウイルス作製用プラスミドの構築
上記実施例５で得られたマウス由来の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報をもとに配列番号４０および配列番号４１に記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計し、Ｎ末領域を以下の方法でＰＣＲにより増幅した。
即ち、ＢＡＬＢ／Ｃマウス皮膚由来のＲＮＡより合成したｃＤＮＡ　２μＬ、配列番号４０および配列番号４１記載の塩基配列を有するプライマー各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ混合液（クロンテック社製）１μＬおよび１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液を含む反応溶液５０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社）を用い、９５℃で２分間加熱後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の工程を１サイクルとして３２サイクル行なった後、７２℃で７分間の反応を行なった。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動し約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマニュアルに従って精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＮ３を得た。
一方、該配列情報をもとに配列番号４２および配列番号４３に記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計し、Ｃ末領域を以下の方法でＰＣＲにより増幅した。
即ち、ＢＡＬＢ／Ｃマウス皮膚由来のＲＮＡより合成したｃＤＮＡ　２μＬ、配列番号４２および配列番号４３記載の塩基配列を有するプライマー各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ混合液（クロンテック社製）１μＬおよび１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液を含む反応溶液５０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社）を用い、９５℃で２分間加熱後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の工程を１サイクルとして３２サイクル行なった後、７２℃で７分間の反応を行なった。得られた反応液をフェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ　／Ｌ　ＤＴＴからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＡｐａＩおよびＤｒａＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）２μｇを３３ｍｍｏｌ／Ｌトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、６６ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム、０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＳｍａＩ（宝酒造社製）を加えて３０℃で３時間消化反応を行なった。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴからなる緩衝液３０μＬに溶解し、１０単位のＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、約３．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
得られたＣ末のＰＣＲ増幅ＡｐａＩ−ＤｒａＩ断片（１．４ｋｂ）５０ｎｇと、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（−）由来のＳｍａＩ−ＡｐａＩ断片（３．０ｋｂ）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＣ１１を得た。
プラスミドｐＮ３およびプラスミドｐＣ１１に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列は常法によって決定し、それぞれの挿入されているＤＮＡ断片を挿入されている断片中のＳｍａＩ部位を用いて下記条件で連結した。
即ち、プラスミドｐＮ３　２μｇを３３ｍｍｏｌ／Ｌトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、６６ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム、０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＳｍａＩ（宝酒造社製）を加えて３０℃で４時間消化反応を行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動し約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
一方、プラスミドｐＣ１１　２μｇを３３ｍｍｏｌ／Ｌトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、６６ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム、０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＳｍａＩ（宝酒造社製）を加えて３０℃で４時間消化反応を行なった。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムからなる緩衝液３０Ｍｌに溶解し、０．５単位のアルカリホスファターゼ（宝酒造社製；Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｃ７５由来）を加えて、６０℃で３０分間脱リン酸化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＳｍａＩ−アルカリホスファターゼ処理済み断片（４．４ｋｂ）を精製した。
得られたプラスミドｐＮ３由来のＳｍａＩ断片（１．３ｋｂ）５０ｎｇと、プラスミドｐＣ１１由来のＳｍａＩ−アルカリホスファターゼ処理済み断片（４．４ｋｂ）とをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＮ３＋Ｃ１１を得た。連結した塩基配列を配列番号３９に示す。該塩基配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３８に示す。
該アミノ酸配列を、解析プログラム［ＧＥＮＥＴＹＸ　ＷＩＮ　ｖｅｒ．２．１（ソフトウェア社製）］を用いて配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒト由来の本発明のポリペプチドと配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するマウス由来の本発明のポリペプチドと比較した。アライメント解析結果を第１６図および１７図に示す。
続いて、該塩基配列情報をもとに配列番号４４および配列番号４５に記載の塩基配列を有するＤＮＡプライマーを設計し、Ｆｌａｇタグを挿入したＮ末領域をＰＣＲ増幅した。
即ち、プラスミドｐＮ３　１０ｎｇ、配列番号４４および配列番号４５に記載の塩基配列を有するプライマー各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ混合液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１μＬおよび１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液を含む反応溶液５０μＬを用い、下記条件下でＰＣＲを行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社）を用い、９５℃で２分間加熱後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間の工程を１サイクルとして２５サイクル行なった後、７２℃で７分間の反応を行なった。得られたＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動し約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマニュアルに従って精製した。
得られたＤＮＡ断片５０ｎｇとＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐＭＦ１１を得た。
プラスミドｐＭＦ１１に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を常法によって決定し、ＢｓｔＸＩ部位を用いてプラスミドｐＮ３＋Ｃ１１の挿入ＤＮＡ断片と下記方法で連結した。
即ち、プラスミドｐＭＦ１１　２μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢｓｔＸＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をフェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を３３ｍｍｏｌ／Ｌトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、６６ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム、０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＳｍａＩ（宝酒造社製）を加えて３０℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
プラスミドｐＮ３＋Ｃ１１　２μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＢｓｔＸＩおよびＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で７時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し約１．９ｋｂのＤＮＡ断片を、ＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
一方、プラスミドｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）２μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で３時間消化反応を行なった。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、得られた沈殿を３３ｍｍｏｌ／Ｌトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ、６６ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム、０．０１％ＢＳＡからなる緩衝液５０μＬに溶解し、１０単位のＳｍａＩ（宝酒造社製）を加えて３０℃で３時間消化反応を行なった。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、約９．６ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
得られたプラスミドｐＭＦ１１由来のＳｍａＩ−ＢｓｔＸＩ断片（０．８ｋｂ）５０ｎｇとプラスミドｐＮ３＋Ｃ１１由来のＢｓｔＸＩ−ＮｏｔＩ断片（１．９ｋｂ）５０ｎｇおよびｐＶＬ１３９３由来のＳｍａＩ−ＮｏｔＩ断片（９．６ｋｂ）５０ｎｇとをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合し、組換えプラスミドＤＮＡを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、常法によりプラスミドｐｍＰＬＡＨ−１３９３を得た。該プラスミドの構築過程および制限酵素地図を第１８図に示す。
（２）組み換えバキュロウイルスの作製
ウイルスの作製はバキュロウイルス発現ベクターシステムマニュアル（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）に記載されている方法に従って行なった。
即ち、２×１０６個のＳｆ９細胞を直径６ｃｍシャーレに播種し、接着後、無血清培地（Ｓｆ−９００ＩＩ　ＳＦＭ、ライフテック社製）に交換した。上記（１）で作製したプラスミドｐｍＰＬＡＨ−１３９３またはｐＶＬ１３９３　５μｇ、Ｌｉｎｅａｌｉｚｅｄ　Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ　ＤＮＡ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）１５ｎｇ、リポフェクチン液（ライフテクノロジー社製）６ｎｇを含むＤＮＡリポフェクチン混合液２４μＬを、上記の無血清培地の入ったシャーレに均一になるように添加し２７℃で４日間培養した。血清入りの培地（Ｅｓｆ９２１、旭テクノガラス社製）を２ｍＬ添加し、さらに２７℃で３日間培養した。細胞を回収後、８００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清を得た。得られた上清を、接着させたＳｆ９細胞に添加し、２７℃で３日間培養した。細胞を回収後、８００ｒｐｍ、５分間遠心分離してウイルスを含有する上清を得た。
（３）昆虫細胞可溶性画分の調製
１．５×１０６個／ｍＬの浮遊Ｓｆ９細胞２８ｍＬに（２）で回収したウイルスを含有する上清２ｍＬを添加し浮遊状態で２７℃で４日間培養した。８００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により細胞を回収し、ＰＢＳにて細胞を洗浄した。２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、１ｘ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（ベーリンガーマンハイム社製）からなる緩衝液に得られた細胞を懸濁し、超音波破砕機を用い氷上で細胞を破壊した。上記抽出液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清をＰＬＡ２活性の測定に用いた。
（４）ＰＬＡ２活性の測定
１−パルミトイル−２−［１−１４Ｃ］アラキドニル−ホスファチヂルコリン（第一化学薬品株式会社より入手。４８ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（２μｍｏｌ／Ｌ）および上記で得られた上清を含有する１００μＬの反応液〔１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、８ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ（実質的に脂肪酸を含まない。シグマ社製）、８μｍｏｌ／ＬトリトンＸ−１００〕を３７℃で３０分インキュベートした後、ドール試薬（２−プロパノール／ヘプタン／硫酸、７８：２０：２）を添加して反応を停止した。カルシウム濃度依存性の検討は、０、１、２、４、８、１６ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム濃度で行なった。時間依存性の検討は、反応時間を０、２、５、１０、３０、６０、９０分とした。
さらにヘプタン０．３ｍＬおよび水０．２ｍＬを加え、旋回して混合した。得られた混合物を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上層のうち０．３２ｍＬをシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０、メルク社製）４０ｍｇを含有するチューブに移し、ヘプタン０．３ｍＬを添加した。チューブを旋回して混合した後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清のうち４００μＬを、ウルチマゴールド（Ｐａｃｋａｒｄ社製）３ｍＬを入れたシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＳ６５００）を用いて放射活性を測定した。ポリペプチドの量は、Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ法を用いて定量した。
コントロールとしてプラスミドｐＶＬ１３９３から作製したウイルスを導入した昆虫細胞の可溶性画分を用いた。ポリペプチド量依存性の検討結果を第１９図、カルシウム濃度依存性の検討結果を第２０図、反応時間の検討結果を第２１図に示す。
以上の結果から、上記実施例５で得られたマウス由来の本発明のポリペプチドは１−パルミトイル−２−−ホスファチヂルコリンのｓｎ−２位のエステル結合をカルシウム濃度依存的に加水分解するＰＬＡ２活性を有することが明らかとなった。
実施例９　ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた細胞株での発現解析
ヒトｃＰＬＡ２αの塩基配列の情報（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｍ６８８７４）を基に配列番号４６に示される塩基配列を有する５’端側ＤＮＡプライマーと配列番号４７に示される塩基配列を有する３’端側ＤＮＡプライマーを設計し、合成した。
２種類のプライマー（配列番号４６と配列番号４７）各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、株化されたヒト培養細胞（Ｋ−５６２、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、２９３ＥＢＮＡ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ．ＦＧＳ）のＲＮＡから作製したｃＤＮＡ　２μＬ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ｔａｑ　Ｇｏｌｄポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）２．５単位および１×Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ（Ｍｇ　ｐｌｕｓ）緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、下記条件下でヒトｃＰＬＡ２αＣＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行なった。
即ち、サーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社製）を用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間の工程を１サイクルとして３０サイクル行ない、更に７２℃で８分間加熱した。
得られたＰＣＲ反応液より１０μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により予想される約０．６ｋｂのＤＮＡ断片の増幅を確認した。
同様にヒト由来の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのｃＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行なった。即ち、２種類のプライマー（配列番号１３と配列番号１４）各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、株化されたヒト培養細胞（Ｋ−５６２、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、２９３ＥＢＮＡ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ．ＦＧＳ）のＲＮＡから作製したｃＤＮＡ　２μＬ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ｔａｑ　Ｇｏｌｄポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）２．５単位および１×Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ（Ｍｇ　ｐｌｕｓ）緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間の工程を１サイクルとして３０サイクル行ない、更に７２℃で８分間加熱した。
得られたＰＣＲ反応液より１０μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により予想される約０．６ｋｂのＤＮＡ断片の増幅を確認した。
コントロールとして、Ｇ３ＰＤＨ　ｃＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行なった。即ち、２種類のプライマー（配列番号３６と配列番号３７）各々０．２μｍｏｌ／Ｌ、株化されたヒト培養細胞（Ｋ−５６２、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、２９３ＥＢＮＡ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ．ＦＧＳ）のＲＮＡから作製したｃＤＮＡ　２μＬ、各成分を２００μｍｏｌ／Ｌずつ含有するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合液、Ｔａｑ　Ｇｏｌｄポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）２．５単位および１×Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ（Ｍｇ　ｐｌｕｓ）緩衝液を含む反応溶液２０μＬを用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間の工程を１サイクルとして２１サイクル行ない、更に７２℃で８分間加熱した。
得られたＰＣＲ反応液より１０μＬを分取し、アガロースゲル電気泳動により予想される約０．５ｋｂのＤＮＡ断片の増幅を確認した。
ヒト由来の本発明のポリペプチドはＰＣ−３およびＬＮＣａＰ．ＦＧＳ細胞でｍＲＮＡの発現が認められた。電気泳動の結果を第２２図に示す。
実施例１０　ノーザンハイブリダイゼーションによるヒト由来の本発明のポリペプチドのヒト胎児組織での発現の解析
実施例３で作製したディゴキシゲニン標識ｃＲＮＡプローブを用いて、実施例３と同様の方法でヒト胎児心臓、腎臓、皮膚、小腸および成人肺のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡフィルター［Ｈｕｍａｎ　Ｆｅｔａｌ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｍＲＮＡ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ＩＩ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社製）］に対してノーザンハイブリダイゼーションを行なった。
結果を第２３図に示す。胎児腎、皮膚および成人肺において約３．５キロヌクレオチドおよび６キロヌクレオチドのバンドが認められた。
産業上の利用可能性
本発明により得られる新規ホスホリパーゼＡ２ポリペプチドのＤＮＡを用いることにより、喘息、虚血性疾患、関節炎、リウマチ、敗血症、皮膚の炎症、動脈硬化、痛み、パーキンソン氏病、アルツハイマー病、悪性腫瘍、腎炎、糖尿病、虚血再灌流障害の疾患の診断、予防、治療ができる。
配列表フリーテキスト
配列番号５−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐ５２６９＋Ｃ５の構築を示した図である。
第２図は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（上段：第１２１〜４７６番目）と、ヒトｃＰＬＡ２α（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６０１０５）のアミノ酸配列（下段：第１〜第３０９番目）との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。（アミノ酸残基は一文字表記で示す。）下線はＧＸＳＧＳモチーフを示す。
第３図は、第２図の続きである。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（上段：第４７７〜８４９）と、ヒトｃＰＬＡ２α（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６０１０５）のアミノ酸配列（下段：第３１０〜７２９番目）との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。（アミノ酸残基は一文字表記で示す。）
第４図は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（上段：第１〜４００番目）と、ヒトｃＰＬＡ２β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ７８８３６）のアミノ酸配列（下段：第１８１〜５７１番目）との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。（アミノ酸残基は一文字表記で示す。）下線はＧＸＳＧＳモチーフを示す。
第５図は、第４図の続きである。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（上段：第４０１〜８４９番目）と、ヒトｃＰＬＡ２β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ７８８３６）のアミノ酸配列（下段：第５７２〜１０１２番目）との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。（アミノ酸残基は一文字表記で示す。）
第６図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列情報を基にＰＣＲプライマーを設計し、ヒト各組織のｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行なった結果を示した図である。増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す。−はコントロール（ｃＤＮＡ無添加）を示す。
第７図は、プラスミドｐ６００−Ｎの構築過程および制限酵素地図を示した図である。
第８図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの一部の塩基配列（約０．６ｋｂ）をプローブとしてヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡフィルター〔Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔｓのフィルター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）〕に対してノーザンハイブリダイゼーションを行なった結果を示した図である。
第９図は、プラスミドｐＰＬＡＨ−１３９３の構築過程および制限酵素地図を示した図である。
第１０図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドを発現している昆虫細胞の可溶性画分におけるＰＬＡ２活性測定の結果を示す。１３９３はベクターのみから作製したウイルスを感染させた昆虫細胞、ＰＬＡＨは該ヒト由来の本発明のポリペプチドを発現している昆虫細胞を示す。横軸はポリペプチドの量（μｇ）、縦軸は、ＰＬＡ２活性（ｄｐｍ）を示す。
第１１図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（上段：第１〜第３００番目）と、マウス由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（下段：第１〜第２９６番目）とのアミノ酸配列の比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。（アミノ酸残基は一文字表記で示す）
第１２図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（上段：第３０１〜第５３９番目）と、マウス由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（下段：第２９７〜第５３６番目）とのアミノ酸配列の比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。（アミノ酸残基は一文字表記で示す）
第１３図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（上段：第５４０〜第８４９番目）と、マウス由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（下段：第５３７〜第８５４番目）とのアミノ酸配列の比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。（アミノ酸残基は一文字表記で示す）
第１４図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（下段）と、ラット由来の本発明のポリペプチドの断片アミノ酸配列（上段）との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。
第１５図は、マウスおよびラット由来の本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列情報を基にＰＣＲプライマーを設計し、マウスおよびラット各組織のｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった後、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す。−はコントロール（ｃＤＮＡ無添加）を示す。
第１６図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（上段：第１〜第４７３番目）、マウス由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（中段：第１〜第４７０番目）およびＢＡＬＢ／Ｃマウス由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（下段：第１〜第４６９番目）との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。（アミノ酸残基は一文字表記で示す。）
第１７図は、第１６図の続きである。ヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（上段：第４７４〜第８４９番目）、マウス由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（中段：第４７１〜第８５４番目）およびＢＡＬＢ／Ｃマウス由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（下段：第４７０〜第８５３番目）との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。（アミノ酸残基は一文字表記で示す。）
第１８図は、プラスミドｐｍＰＬＡＨ−１３９３の構築過程および制限酵素地図を示した図である。
第１９図は、ウイルスを感染させた昆虫細胞の可溶性画分におけるＰＬＡ２活性を測定した結果を示した図である。ｍ−１３９３Ｖはベクターのみから作製したウイルスを感染させた昆虫細胞、ｍ−ｃＰＬＡ２Ｈは該マウス由来の本発明のポリペプチドを発現している昆虫細胞を示す。
第２０図は、ウイルスを感染させた昆虫細胞の可溶性画分におけるＰＬＡ２活性のカルシウム濃度依存性を測定した結果を示した図である。ｍ−１３９３Ｖはベクターのみから作製したウイルスを感染させた昆虫細胞、ｍ−ｃＰＬＡ２Ｈはマウス由来の本発明のポリペプチドを発現している昆虫細胞を示す。
第２１図は、ウイルスを感染させた昆虫細胞の可溶性画分におけるＰＬＡ２活性の反応時間依存性を測定した結果を示した図である。ｍ−１３９３Ｖはベクターのみから作製したウイルスを感染させた昆虫細胞、ｍ−ｃＰＬＡ２Ｈはマウス由来の本発明のポリペプチドを発現している昆虫細胞を示す。
第２２図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、ヒトｃＰＬＡ２α、ヒトＧ３ＰＤＨの塩基配列情報を基にＰＣＲプライマーを設計し、ヒト培養細胞株（Ｋ−５６２、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、２９３ＥＢＮＡ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ．ＦＧＳ）のＲＮＡより調製したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行なった後、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。
第２３図は、ヒト由来の本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの一部の塩基配列（約０．６ｋｂ）をプローブとしてヒト胎児心臓、腎臓、皮膚、小腸および成人肺のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡフィルター［Ｈｕｍａｎ　Ｆｅｔａｌ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｍＲＮＡ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ＢｌｏｔＩＩ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社製）］に対してノーザンハイブリダイゼーションを行なった結果を示した図である。
符号の説明
ｋｂ：キロ塩基対（ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｐａｉｒｓ）
Ａｐ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｔ７：Ｔ７プロモーター
ＢＡＰ：細菌由来アルカリホスファターゼ
Ｆｌａｇ：Ｆｌａｇタグ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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