(57)【要約】Ｓ−１００β阻害剤を有効成分とするβアミロイド起因疾患の治療および／または予防剤。Ｓ−１００β阻害剤はβアミロイド産生を抑制する作用を有するため、βアミロイドを起因物質とする疾患、すなわち神経変性疾患、ダウン症、ボクサー症、進行性核上麻痺、星状膠細胞腫、脳卒中や脳外傷後の神経機能障害、多発性硬化症、痴呆、精神分裂症、てんかん、不安、嘔吐、偏頭痛、神経細胞死、うつ病、睡眠障害、食欲不振などの摂食障害、尿失禁、低酸素症、脳梗塞、脳腫瘍、高酸素痙攣および高酸素毒症、炎症性もしくは神経障害性疼痛、髄膜炎等の治療および／または予防剤として有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−１００β阻害剤を有効成分とするβアミロイド起因疾患の治療および／または予防剤。
【請求項２】
Ｓ−１００β阻害剤が以下の（１）〜（６）の少なくともひとつから選択される機構に作用してβアミロイド産生を抑制する請求の範囲１記載のβアミロイド起因疾患治療および／または予防剤：
（１）βセクレターゼおよびγセクレターゼによるβアミロイド産生、
（２）αセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質の代謝、
（３）中性エンドペプチダーゼによるβアミロイドの代謝、
（４）Ｓ−１００βの細胞内への取り込み機構、
（５）糖付加、
（６）タンパク質成熟化。
【請求項３】
βアミロイドに起因する疾患が、神経変性疾患、ダウン症、ボクサー症、進行性核上麻痺、星状膠細胞腫、脳の神経機能障害、多発性硬化症、痴呆、精神分裂症、てんかん、不安、嘔吐、偏頭痛、神経細胞死、うつ病、睡眠障害、摂食障害、尿失禁、低酸素症、脳梗塞、脳腫瘍、高酸素痙攣および高酸素毒症、炎症性もしくは神経障害性疼痛、髄膜炎である請求の範囲１に記載のβアミロイド起因疾患治療および／または予防剤。
【請求項４】
ヒト由来グリア細胞に（１）Ｓ−１００βを添加しβアミロイド産生を亢進させた条件下において、被験化合物を添加して、細胞から放出されたβアミロイドを検出するか、または（２）被験化合物を添加し、Ｓ−１００βを添加して、細胞から放出されたβアミロイドを検出することによって、被験化合物のβアミロイド産生抑制作用を決定することを特徴とするβアミロイド産生抑制作用を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項５】
βアミロイド産生抑制作用が以下の作用から選択される請求の範囲４記載のスクリーニング方法；
（１）βセクレターゼまたはγセクレターゼ阻害作用、
（２）αセクレターゼ活性化作用、
（３）中性エンドペプチダーゼ活性化作用、
（４）Ｓ−１００β取り込み阻害作用、
（５）糖付加阻害作用、
（６）タンパク質成熟化阻害作用。
【請求項６】
請求の範囲４記載のスクリーニング方法によって得られた化合物。
【請求項７】
請求の範囲６記載の化合物を有効成分とする請求の範囲１記載のβアミロイド起因疾患の治療および／または予防剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｓ−１００β阻害剤を有効成分とするβアミロイド起因疾患の治療剤に関する。
背景技術
中枢神経系の実質を構成する細胞には神経細胞とグリア細胞があり、細胞数はグリア細胞が神経細胞よりはるかに多い。グリア細胞は神経細胞の働きを支持する役割を担っている。グリア細胞の一種であるアストロサイトは、神経細胞の支持細胞として細胞外のイオンおよび神経伝達物質の恒常性維持（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｐｐ．１９３−２２８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３））や神経栄養因子の供給（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｐｐ．２６７−３０８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３））などの機能を有していることから、脳機能を制御する重要な役割を演じていると考えられる。
従来、神経変性疾患（アルツハイマー病、筋萎縮性側策硬化症など）の成因は主に神経細胞の異常にあると考えられてきた。しかし、近年神経細胞を取り囲むグリア細胞、特にアストロサイトの機能的異常にあるとの考えが有力になってきた。
βアミロイドは神経変性疾患の一つであるアルツハイマー病の病理学的特徴の一つである老人斑の主構成物である。βアミロイドは正常人の脳内にも存在するが速やかに分解されるものと考えられている。このタンパクはアミロイド前駆体タンパク質の代謝過程においてβセクレターゼおよびγセクレターゼにより副次的に生成される。アミロイド前駆体タンパク質は通常αセクレターゼによって分解されるが、この場合βアミロイドは産生されないことが知られている。βアミロイドにはβアミロイド１−４０とβアミロイド１−４２（４３）の二つのアイソフォームが存在するが、転写レベルではなくβセクレターゼおよびγセクレターゼによってアミロイド前駆体タンパク質代謝段階で生成されると考えられている。脳で産生されるβアミロイドのほとんどはβアミロイド１−４０だが、難溶性のβアミロイド１−４２（４３）の方が凝集・沈着しやすく、現在のところどちらが病態に深く関与するのかは解明されていない。また産生されたβアミロイドは中性エンドペプチダーゼによって分解されることが知られている。
アルツハイマー病において、βアミロイドが凝集して不溶性の繊維形成がなされて脳に沈着し老人斑を形成する。現在、アルツハイマー病の根治的治療法としてアミロイド前駆体タンパク質およびβアミロイドの代謝系を制御しβアミロイド産生を抑制する方法が注目されている。
神経細胞傷害時、活性化したアストロサイトにおいてアミロイド前駆体タンパク質発現が増大していることが知られている（Ｎｅｕｒｏｎ，３，２７５−２８５，（１９８９））。またβアミロイドは神経毒性を示すことから、アミロイド前駆体タンパク質の異常代謝によるβアミロイドの過剰産生、蓄積がアルツハイマー病の発症および進展に関与していると考えられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，４１７−４２０，（１９８９））。さらに、βアミロイドの神経毒性においてＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体と一酸化窒素合成酵素を介した活性酸素産生亢進の関与が報告されている（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７６（４），１０５０−１０５６，（２００１））。したがって、βアミロイドが活性酸素起因疾患に関与している可能性が考えられる。
Ｓ−１００βはアストロサイト特異的タンパク質であり、カルシウム結合部位を有し細胞内カルシウム濃度の調節、種々の細胞骨格蛋白と結合し細胞の形態変化や神経伝達物質の遊離等に関与している（ＴＩＢＳ，１３，４３７−４４３，（１９８８））。Ｓ−１００βはアストロサイトの活性化により産生され細胞外に放出される。放出されたＳ−１００βは、神経細胞に対し栄養因子的な作用および傷害因子的な作用（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４６，７１−８２，（１９９５））を示し、またアストロサイトに対しては増殖促進作用や誘導型一酸化窒素合成酵素の発現作用を有することが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，２５４３−２５４７，（１９９６））。
また、Ｓ−１００βは脳傷害時、活性化されたアストロサイトにおいて過剰発現することが知られている。アルツハイマー患者の脳内でＳ−１００β量が増加しており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７６１１−７６１５，（１９８９））、その増加量はアルツハイマー患者の脳における老人斑密度と相関があることが報告されている（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，３９，３９８−４０４，（１９９４））。さらにアルツハイマー患者の脳における老人斑近傍にはＳ−１００βの過剰発現を伴った活性化したアストロサイトが存在し、その発現強度は神経の異常突起伸展との間に相関が見られることが報告されている（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５，２７３−２７９，（１９９６））。その他にも、脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ，３０，１１９０−１１９５，（１９９９））、頭部外傷（Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，４５，４７７−４８３，（１９９９））、多発性硬化症（Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃａｎｄ，９６，１４２−１４４，（１９９７））、ダウン症（Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，１１６，２８１−２８５，（１９９８））などの患者の血清中もしくは脳髄液中でＳ−１００β量の増加がみられる。
これまでに、Ｓ−１００β、βアミロイドおよびアミロイド前駆体タンパク質の関係については以下のことが報告されている。
１）ラット神経細胞において、Ｓ−１００βはアミロイド前駆体タンパク質とそれをコードするｍＲＮＡ量を増加させた（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７１（４），１４２１−１４２８，（１９９８））。
２）トランスジェニックマウス（アミロイド前駆体タンパク質が過剰発現した家族性アルツハイマー病マウス）において、βアミロイド斑が出現する前にＳ−１００βが過剰発現した（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７４（１），２９５−３０１，（２０００））。
３）ラット神経細胞において、βアミロイドはＳ−１００βの遺伝子発現を増加させた（Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，３４（１），１１８−１２６，（１９９５））。
アルツハイマー病などの神経変性疾患において、βアミロイドおよびＳ−１００βの過剰発現が確認されている。しかしながら、これらのタンパク質の相互関係には諸説がありいまだ明らかになっていない。
発明の開示
アルツハイマーをはじめとする神経変性疾患の治療における最終目標は、脳内病理過程の進行を遮断し、発症および進行を完全に抑制することにある。しかし、現在使用されている治療薬はコリンエステラーゼ阻害剤などの対症療法薬である。また現在臨床応用検討中の抗炎症薬や女性ホルモンなども内在する病変悪化を修正する根治治療ではない。したがって、神経変性疾患の原因を解明し、根治治療薬を提供することが急務である。
本発明者らは、神経変性疾患におけるＳ−１００βの発現とβアミロイドの生成との関係について種々検討を行った結果、Ｓ−１００βがβアミロイド産生量を増加させることを明らかにし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は下記のβアミロイド起因疾患の治療および／または予防剤、被験化合物のβアミロイド産生抑制作用を測定することによる化合物のスクリーニング方法、およびその方法により得られる化合物を提供する。
１．Ｓ−１００β阻害剤を有効成分とするβアミロイド起因疾患の治療および／または予防剤。
２．Ｓ−１００β阻害剤が以下の（１）〜（６）の少なくともひとつから選択される機構に作用してβアミロイド産生を抑制することを特徴とする前項１記載のβアミロイド起因疾患治療および／または予防剤：
（１）βセクレターゼおよびγセクレターゼによるβアミロイド産生、
（２）αセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質の代謝、
（３）中性エンドペプチダーゼによるβアミロイドの代謝、
（４）Ｓ−１００βの細胞内への取り込み機構、
（５）糖付加、
（６）タンパク質成熟化。
３．βアミロイドに起因する疾患が、神経変性疾患、ダウン症、ボクサー症、進行性核上麻痺、星状膠細胞腫、脳の神経機能障害、多発性硬化症、痴呆、精神分裂症、てんかん、不安、嘔吐、偏頭痛、神経細胞死、うつ病、睡眠障害、摂食障害、尿失禁、低酸素症、脳梗塞、脳腫瘍、高酸素痙攣および高酸素毒症、炎症性もしくは神経障害性疼痛、髄膜炎である前項１に記載のβアミロイド起因疾患治療および／または予防剤。
４．ヒト由来グリア細胞に（１）Ｓ−１００βを添加しβアミロイド産生を亢進させた条件下において、被験化合物を添加して、細胞から放出されたβアミロイドを検出するか、または（２）被験化合物を添加し、Ｓ−１００βを添加して、細胞から放出されたβアミロイドを検出することによって、被験化合物のβアミロイド産生抑制作用を決定することを特徴とするβアミロイド産生抑制作用を有する化合物のスクリーニング方法。
５．βアミロイド産生抑制作用が以下の作用から選択される前項４記載のスクリーニング方法；
（１）βセクレターゼまたはγセクレターゼ阻害作用、
（２）αセクレターゼ活性化作用、
（３）中性エンドペプチダーゼ活性化作用、
（４）Ｓ−１００β取り込み阻害作用、
（５）糖付加阻害作用、
（６）タンパク質成熟化阻害作用。
６．前項４記載のスクリーニング方法によって得られた化合物。
７．前項６記載の化合物を有効成分とする前項１記載のβアミロイド起因疾患の治療および／または予防剤。
以下、本発明を詳細に説明する。
従来技術によれば、ラット神経細胞においてはＳ−１００βはアミロイド前駆体タンパク質とそれをコードするｍＲＮＡ量を増加させることが報告されている。しかし、本発明者らの実験によってヒト由来グリア細胞においては、意外にもＳ−１００βはアミロイド前駆体タンパク質をコードするｍＲＮＡ量を変化させず、Ｓ−１００βはアミロイド前駆体タンパク質量には影響を与えないことが確認された。すなわち、アミロイド前駆体タンパク質量は変化せずβアミロイド量のみが増加していることから、アミロイド前駆体タンパク質が代謝されβアミロイドを産生する過程もしくはβアミロイドが代謝される過程でＳ−１００βが作用することが新たに示唆された。
アミロイド前駆体タンパク質代謝過程においては、α、βおよびγセクレターゼの関与が知られており、βアミロイドはβおよびγセクレターゼの作用により産生され、αセクレターゼで代謝された場合産生されないことが知られている。したがって、Ｓ−１００βは（１）βおよびγセクレターゼを活性化もしくは（２）αセクレターゼを抑制していると考えられる。また産生されたβアミロイドは中性エンドペプチダーゼで代謝されることが報告されていることから、Ｓ−１００βが（３）中性エンドペプチダーゼを阻害していることも考えられる。さらに、アミロイド前駆体タンパク質の糖付加や成熟化を抑制すると、βアミロイド産生が抑制されることが知られている。したがって、Ｓ−１００βが（４）糖付加またはタンパク質成熟化を促進している可能性も考えられる。アルツハイマーをはじめとする神経変性疾患の根治的治療において、アミロイド前駆体タンパク質およびβアミロイド代謝過程を制御しβアミロイド産生を抑制することが注目されてきた。しかしながら、Ｓ−１００βがアミロイド前駆体タンパク質およびβアミロイド代謝過程に作用する事実は今回本発明者らが実験により初めて確認したことであり、神経変性疾患の根治治療薬を開発するうえで有用な事実である。
βアミロイドは、先に述べたように神経変性疾患等に関与している。今回、Ｓ−１００βが（１）βおよびγセクレターゼ活性化、（２）αセクレターゼ抑制、（３）中性エンドペプチダーゼ阻害、（４）糖付加促進、（５）タンパク質成熟化促進の中から選ばれる少なくともひとつの作用によってβアミロイドの発現を促進することが本発明者らによって明らかにされた。したがって、Ｓ−１００βを阻害することによりβアミロイドの過剰発現が関与していると考えられる疾患、特に神経細胞の欠落を特徴とする神経変性疾患等の治療に用いることができると考えられる。
すなわち、Ｓ−１００β阻害剤はβアミロイドに起因する疾患の治療に用いることができると考えられる。βアミロイドに起因する疾患とはβアミロイドが増加することによって起こる疾患であり、具体的にはアルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患（アルツハイマー病、クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病、ハンチントン病、オリーブ橋小脳萎縮症、筋萎縮性側策硬化症等）、ダウン症、ボクサー症、進行性核上麻痺、星状膠細胞腫、脳卒中や脳外傷後の神経機能障害、多発性硬化症、痴呆、精神分裂症、てんかん、不安、嘔吐、偏頭痛、神経細胞死、うつ病、睡眠障害、食欲不振などの摂食障害、尿失禁、低酸素症、脳梗塞、脳腫瘍、高酸素痙攣および高酸素毒症、炎症性もしくは神経障害性疼痛、髄膜炎などが考えられる。
また、本発明にはＳ−１００βで処置したヒト由来細胞を用いてβアミロイドを検出することを特徴とするβアミロイド起因疾患治療剤のスクリーニング方法も含まれる。
現在までに知られている一般的なβアミロイド抑制作用測定方法は、サイトカイン、ケモカインおよびＣ−キナーゼ等によってβアミロイド産生を亢進させる方法であるが、今回Ｓ−１００βとβアミロイドの関係が明らかとなったことにより本発明のβアミロイド起因疾患治療剤のスクリーニングが可能となった。
より具体的には、ヒト由来グリア細胞にＳ−１００βを添加し、βアミロイド産生を亢進させ、被験化合物を添加して、一定時間後細胞培養上清中のβアミロイド量を測定することにより、βアミロイドの産生を抑制することのできる化合物を選択することができる。
ラットにはアミロイド前駆体タンパク質代謝酵素であるセクレターゼがほとんど存在しないことからβアミロイドの検出が不可能である。このような動物種によるタンパク質発現の差を考慮すると、本発明のスクリーニング方法では、ヒト由来細胞を用いることが好ましい。またスクリーニングのための細胞は、ヒト由来のグリア細胞であれば何でもよい。具体的には、ヒトグリオブラストーマ、アストロサイトーマ由来細胞株であるＵ−３７３ＭＧ、ヒトグリオブラストーマ由来細胞株のＴ９８Ｇ、Ａ−１７２、ヒトアストロサイトーマ由来細胞株のＣＣＦ−ＳＴＴＧ１等があるが、種々検討した結果、ヒトグリオブラストーマ、アストロサイトーマ由来細胞株であるＵ−３７３ＭＧ細胞が好ましい。
被験化合物は、Ｓ−１００β添加直前、直後または同時に加えてもよく、場合に応じて化合物の添加タイミングを変更してもよい。
βアミロイド検出方法は、βアミロイドを検出することができればどのような方法を用いてもよいが、例えば酵素免疫測定法、放射免疫測定、ウエスタンブロット等が挙げられる。
さらに本発明には前記のスクリーニング方法によって得られる化合物が含まれる。本スクリーニング系によりβアミロイド産生を抑制する化合物、具体的にはβおよびγセクレターゼを抑制する化合物、αセクレターゼを活性化する化合物、中性エンドペプチダーゼを活性化する化合物、糖付加を阻害する化合物、またはタンパク質成熟化を阻害する化合物などが選定できる。またアストロサイトの活性化によって産生され細胞外に放出されたＳ−１００βは、アストロサイトの特定部位によって再取り込みされアストロサイト自身に作用する。したがって本スクリーニング系ではＳ−１００βの取り込みを抑制する化合物をインビトロの系で簡便に選定することができる。これまでに、Ｓ−１００βがアストロサイトに作用することを阻害する化合物は報告されておらず、本発明によって初めてβアミロイド産生を抑制する化合物として認識されるものである。
発明を実施するための最良の形態
以下にＳ−１００βがアミロイド前駆体タンパク質の遺伝子量を変化させずβアミロイド量を増加させることを確認した実験例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
実験例１：Ｓ−１００βによるβアミロイド産生量測定
１）Ｓ−カルボキシメチル化Ｓ−１００β調製
ヨード酢酸を用い、ラットリコンビナントＳ−１００β（東洋紡績（株））をＳ−カルボキシメチル化した。
すなわち５０ｍＬチューブ内でリコンビナントＳ−１００β溶液３４．５ｍＬ（リコンビナントＳ−１００β含量：１００ｍｇ）に炭酸水素ナトリウム１．４５ｇを溶解した。次に，１−プロパノール１１．５ｍＬを加えよく撹拌した（１−プロパノール最終濃度２５％）。さらにトリブチルホスフィン５０μＬを加え撹拌した後，室温で１時間静置した。その後、ヨード酢酸試薬（ヨード酢酸を１ｍｏｌ／Ｌとなるように１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムに溶解、用時調製）を１ｍＬ加え、遮光下、室温で１時間３０分静置した。
反応液を透析膜（三光純薬）に移し、あらかじめ冷やしておいたトリスバッファー（４０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で４℃下透析を行なった。６時間以上経過した後、バッファー交換を行ない透析した。
透析回収サンプルをセントリプラスＹＭ−１０（アミコン）を用い濃縮した。濃縮後、０．２２μｍフィルター（ミリポア）を通してろ過滅菌した。これをＳ−カルボキシメチル化Ｓ−１００β（以下、ＣＭ−Ｓ−１００βと略記することがある。）とし、−８０℃で保存した。
２）ラットリコンビナントＳ−１００βの調製
ラットリコンビナントＳ−１００β（以下、ｒＳ−１００βと記すことがある。）は、東洋紡績（株）より入手したものを、透析を行ない濃縮およびろ過滅菌したものを使用した。操作は前記の「１）Ｓ−カルボキシメチル化Ｓ−１００β調製」に準じて行なった。
３）Ｓ−１００βによるβアミロイド産生量測定
ヒトグリオブラストーマ、アストロサイトーマ由来細胞株であるＵ−３７３ＭＧ細胞（住商ファーマインターナショナル（株））を１０％ウシ胎児血清含有高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清、２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｍｏｌ／Ｌのストレプトマイシンを添加した培地。以下、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭと記す。）にて、３７℃５％ＣＯ２下７５ｃｍ３のフラスコで継代培養した。
培養細胞をトリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）により剥離した。剥離した細胞は遠心後、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地で希釈し、２４穴プレートに１ｍＬ／ｗｅｌｌで播種した。播種した細胞は３７℃５％ＣＯ２下で培養した。
播種後二日目の細胞を無血清のＤＭＥＭ１ｍＬで洗浄後、無血清のＤＭＥＭ３６０μＬに培地を置換した。次にトリス緩衝溶液で既知の濃度に希釈したＣＭ−Ｓ−１００βあるいはｒＳ−１００β溶液を４０μＬ添加し、３７℃５％ＣＯ２下で培養した。
Ｓ−１００β処置４８時間後に２４穴プレートより培養上清を３００μＬ回収した。回収した培養上清は、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して上清を回収し、測定用サンプルとした。サンプルは測定時まで氷上に保存した。
サンプル中のβアミロイド１−４０およびβアミロイド１−４２の蓄積量をそれぞれヒューマンβアミロイド１−４０イライザキット（バイオスコア）、ヒューマンβアミロイド１−４２イライザキット（バイオスコア）を用いて測定した。測定法はキットの説明書に従った。その際サンプルはキット付属の希釈液を用い希釈した。それぞれのスタンダードの検量線よりβアミロイド１−４０およびβアミロイド１−４２量を算出した。その結果を表１および図１〜２に示す。
ＣＭ−Ｓ−１００βおよびｒＳ−１００βは１０および３０μｍｏｌ／ＬでＵ−３７３ＭＧ細胞においてβアミロイド１−４０の蓄積量をビヒクル処置群と比較して有意に増加させた（図１、表１）。同様に、ＣＭ−Ｓ−１００βは１０および３０μｍｏｌ／Ｌで、またｒＳ−１００βは３、１０および３０μｍｏｌ／Ｌでβアミロイド１−４２蓄積量を有意に増加させた（図２、表１）。
この結果から、Ｓ−１００βはβアミロイド産生促進作用を有していることが確認された。
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実験例２：アミロイド前駆体タンパク質ｍＲＮＡ発現量測定
１）ｍＲＮＡサンプルの調製
前記と同様にＳ−１００β処置したプレートを作成した。細胞上清を回収した後の細胞からクイックプレップｍＲＮＡ精製キット（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いてｍＲＮＡを精製し、アミロイド前駆体タンパク質（以下、ＡＰＰと略記することがある。）ｍＲＮＡ発現量測定用サンプルとした。ｍＲＮＡサンプルは−８０℃で保存した。
２）ｃＤＮＡの調製
８０ｎｇのｍＲＮＡからファースト−ストランド  ｃＤＮＡ合成キット（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いてｃＤＮＡを合成し、さらに蒸留水で３倍希釈した後ｃＤＮＡサンプルとした。
３）ＲＴ−ＰＣＲ法
表２に示すＰＣＲ反応溶液を調製し、変性を９８℃１秒、アニーリングを６８もしくは７０℃１５秒の条件でＰＣＲを行なった。反応液の一部を１％アガロースゲルで電気泳導を行なった。
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使用したプライマーの塩基配列を表３に示す。
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４）結果
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０）のｍＲＮＡ発現量を検討した。その結果を対照（βアクチンの発現量変化）と共に図３に示す。図３中、（１）はＣＭ−Ｓ−１００βによるβアクチン（陰性対照）発現量変化、（２）はＣＭ−Ｓ−１００βによるＡＰＰ７７０発現量変化、（３）はＣＭ−Ｓ−１００βによるＡＰＰ７５１発現量変化、（４）はＣＭ−Ｓ−１００βによるＡＰＰ６９５発現量変化、（５）はｒＳ−１００βによるβアクチン（陰性対照）発現量変化、（６）はｒＳ−１００βによるＡＰＰ７７０発現量変化、（７）はｒＳ−１００βによるＡＰＰ７５１発現量変化、（８）はｒＳ−１００βによるＡＰＰ６９５発現量変化を示す。
図３から明らかなように、ＣＭ−Ｓ−１００βおよびｒＳ−１００βいずれの処置においてもｍＲＮＡ発現量に変化はみられなかった。したがって、前記のＳ−１００β処置群におけるβアミロイド産生量増加にその前駆体であるアミロイド前駆体タンパク質の発現量増加は関与していないことが示唆された。このことから、Ｓ−１００βは転写レベルではなく、βセクレターゼおよびγセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質代謝の過程に作用している可能性が推定された。
実験例３：βアミロイド産生量測定による化合物評価
前記の実験例１と同様にＵ−３７３ＭＧ細胞を調製し、２４穴プレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう１ｍＬ／ｗｅｌｌで播種した。播種した細胞は３７℃５％ＣＯ２下で培養した。
播種後二日目の細胞を無血清のＤＭＥＭ１ｍＬで洗浄後、無血清のＤＭＥＭ３２０μＬに培地を置換し、化合物の濃縮液（処置濃度の１０倍濃度）を４０μＬ添加した。次にトリス緩衝溶液で既知の濃度に希釈したｒＳ−１００β溶液を４０μＬ添加し、３７℃５％ＣＯ２下で培養した。
前記の実験例１と同様に、測定用サンプルを作成し、サンプル中のβアミロイド１−４０の蓄積量を測定した。スタンダードの検量線よりβアミロイド１−４０量を算出した。その結果を表４に示す。
ｒＳ−１００β処置における化合物存在下のβ−アミロイド１−４０産生作用を検討したところ，γ−セクレターゼ阻害剤１により抑制作用が認められた。また、抑制作用はＡＥＢＳＦ（β−セクレターゼ阻害作用）、ＰＭＡ（α−セクレターゼ活性化作用）、ツニカマイシン（糖付加阻害剤）、ブレフェルジンＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）、モネシン（ゴルジ、小胞体におけるタンパク質成熟化阻害作用）でも認められた。一方、中性エンドペプチダーゼ阻害剤のホスホラミドンでは増強作用が認められた。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１（Ａ）はＵ−３７３ＭＧ細胞におけるＣＭ−Ｓ−１００βのβアミロイド１−４０産生促進作用を示し、（Ｂ）はＵ−３７３ＭＧ細胞におけるｒＳ−１００βのβアミロイド１−４０産生促進作用を示す。
図２（Ａ）はＵ−３７３ＭＧ細胞におけるＣＭ−Ｓ−１００βのβアミロイド１−４２産生促進作用を示し、（Ｂ）はＵ−３７３ＭＧ細胞におけるｒＳ−１００βのβアミロイド１−４２産生促進作用を示す。
図３（１）〜（４）は、各々ＣＭ−Ｓ−１００βによる、βアクチン（陰性対照）発現量変化、ＡＰＰ７７０発現量変化、ＡＰＰ７５１発現量変化、およびＡＰＰ６９５発現量変化を示し、（５）〜（８）は、各々ｒＳ−１００βによる、βアクチン（陰性対照）発現量変化、ＡＰＰ７７０発現量変化、ＡＰＰ７５１発現量変化、およびＡＰＰ６９５発現量変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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