(57)【要約】ＨＫ３３蛋白質がＡＲＦ蛋白質に結合することを見出した。ＨＫ３３遺伝子の発現によりＡＲＦ蛋白質の核移行が阻害され、ｐ５３依存性の転写が抑制された。さらに不死化された細胞では、ＨＫ３３遺伝子の発現が有意に上昇していた。本発明はＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質の相互作用を利用した抗腫瘍作用を持つ薬剤のスクリーニング方法、ＨＫ３３蛋白質を標的としてＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を調節する方法およびそのために用いられる分子、および腫瘍等の疾患における検査のためのＨＫ３３蛋白質およびＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子の利用を提供する。本発明により、抗腫瘍作用を持つ新たな薬剤を、ＨＫ３３蛋白質をＡＲＦ蛋白質との相互作用を指標としてスクリーニングすることが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＫ３３遺伝子の発現を上昇または下降させることにより、ＡＲＦを介するシグナル伝達を阻害または促進する方法。
【請求項２】
ＨＫ３３遺伝子の発現を上昇または下降させることにより、ｐ５３を介するシグナル伝達を阻害または促進する方法。
【請求項３】
ＨＫ３３遺伝子の発現を上昇または下降させることにより、細胞増殖を促進または阻害する方法。
【請求項４】
ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を上昇または下降させることにより、ＡＲＦを介するシグナル伝達を阻害または促進する方法。
【請求項５】
ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を上昇または下降させることにより、ｐ５３を介するシグナル伝達を阻害または促進する方法。
【請求項６】
ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を上昇または下降させることにより、細胞増殖を促進または阻害する方法。
【請求項７】
細胞が腫瘍細胞である、請求項３または６に記載の方法。
【請求項８】
ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下でＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、該相互作用を調節する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項９】
ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との結合を指標に検出する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞系を用いて行う、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ＨＫ３３遺伝子を内因的に保持する細胞に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）ＨＫ３３遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合と比較して、該発現を調節する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１２】
ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ＨＫ３３遺伝子の内因的転写制御配列の下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を有するベクターが導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現を調節する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１３】
請求項８から１２のいずれかに記載の方法により単離されうる化合物。
【請求項１４】
ＨＫ３３遺伝子の発現を調節する化合物、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物を含む、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の薬剤：
（ａ）ＡＲＦを介するシグナル伝達の調節剤。
（ｂ）ｐ５３を介するシグナル伝達の調節剤。
（ｃ）細胞増殖調節剤。
【請求項１５】
ＨＫ３３遺伝子の発現を調節する化合物、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１６】
抗腫瘍剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、あるいはＨＫ３３蛋白質に結合する抗体を含む、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の検査試薬：
（ａ）ＡＲＦを介するシグナル伝達の異常の検査試薬。
（ｂ）ｐ５３を介するシグナル伝達の異常の検査試薬。
（ｃ）細胞増殖異常の検査試薬。
（ｄ）細胞増殖性疾患の検査試薬。
（ｅ）細胞増殖性疾患が腫瘍である、（ｄ）の検査試薬。
【請求項１８】
下記（ａ）または（ｂ）の工程を含む、ＡＲＦを介するシグナル伝達の異常、ｐ５３を介するシグナル伝達の異常、細胞増殖異常、細胞増殖性疾患、または腫瘍の検査方法：
（ａ）々者由来の被検試料中におけるＨＫ３３遺伝子の発現量を検出し、健常者と比較する工程。
（ｂ）ＨＫ３３蛋白質または該蛋白質をコードする核酸における変異を検出する工程。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質の相互作用を利用した抗腫瘍作用を持つ薬剤のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、該相互作用、またはＨＫ３３遺伝子の発現を調節することによりＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達、および細胞の増殖を調節する方法に関する。本発明はさらに、腫瘍等の疾患における検査のためのＨＫ３３蛋白質およびＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子の利用にも関する。
背景技術
細胞周期の調節に深く関わっている因子として、癌抑制因子であるｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ｐＲｂ）とｐ５３があげられる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．（１９９５）Ｃｅｌｌ，８１，３２３−３３０；Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．（１９９７）Ｃｅｌｌ，８８，３２３−３３１；Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１６７２−１６７７）。ｐＲｂおよびｐ５３はそれぞれ、別の経路で細胞周期を調節していると考えられている。二つの作用の違いは、ｐＲｂはｃｙｃｌｉｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅｓ（ｃｄｋｓ）の作用によってＧ１期からＳ期へと移行させ細胞増殖抑制へと導くのに対して、ｐ５３は化学物質やＤＮＡ障害によって発現することにより、ｐ２１の転写を促進し細胞周期を抑制すると言われている。また、ｐ５３はＭＤＭ２との結合によって分解されるため、ＭＤＭ２の発現によりｐ５３の増殖制御の解除が起こると考えられている（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ．Ｍ．Ｆ．ａｎｄ　Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１２８７，７７−１０２；Ｍｏｍａｎｄ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６９，１２３７−１２４５；Ｋｕｂｂｕｔａｔ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８７，２９９−３０３）。
一方、ＩＮＫ４ａ　ｇｅｎｅ　ｌｏｃｕｓの不活性化は多くの腫瘍において見いだされており、その染色体上に存在する遺伝子の腫瘍との関係が深く研究されてきた。近年、このＩＮＫ４ａ　ｇｅｎｅ　ｌｏｃｕｓに存在するＩＮＫ４ＡとＡＲＦはそれぞれ同一の遺伝子上にあり、異なったスプライシングフォームとして翻訳され、どちらの因子もＧ１期に細胞周期をアレストし、細胞増殖抑制活性を持つことが明らかにされた。二つの因子の機能の違いとしては、ＩＮＫ４ａはサイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）を不活性化し、基質の中でも特に前述したＲｂのリン酸化を阻害し、このリン酸化阻害によって細胞周期をアレストする。一方、ＡＲＦは核内においてＭＤＭ２と結合することによってＭＤＭ２によるｐ５３の分解を抑え、ｐ５３蛋白質の安定性を高め、細胞周期をアレストしていると考えられている（Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６６，７０４−７０７；Ｑｕｅｌｌｅ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，７，１５５９−１５７１）。
ＨＫ３３遺伝子は、１９９４年にＡｎｄｒｅｅａｓ　Ｂｒａｕｎらによって発見された遺伝子で、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ膜に存在する。ＨＫ３３は酵母Ｐｅｘ１９ｐのヒト相同遺伝子として知られ、その産物はファルネシル化される蛋白質でありペルオキシソームにおける生合成に関与することが示唆されている（Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４５，２００−２１；Ｂｒａｕｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ，１４６，２９１−２９５）。また近年、Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒ症候群の原因遺伝子として報告された（Ｍａｔｓｕｚｏｎｏ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：２１１６−２１，１９９９）。しかしＡＲＦまたはｐ５３との関係は全く知られていない。
発明の開示
本発明はＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質の相互作用を利用した抗腫瘍作用を持つ薬剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。本発明はまた、該相互作用、またはＨＫ３３遺伝子の発現を調節することによりＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達、特に細胞周期および細胞分裂を調節するための方法、およびそのために用いられる分子を提供することを課題とする。本発明の方法は腫瘍細胞の増殖抑制に有用である。本発明はさらに、腫瘍等の疾患における検査のためのＨＫ３３蛋白質およびＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子の利用を提供することを課題とする。
本発明らは、上記課題を解決するために、酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法によりｐ１９ＡＲＦと相互作用する蛋白質をコードする遺伝子の単離を試みた。その結果、ＨＫ３３遺伝子と呼ばれるファルネシル化蛋白質（Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４５，２００−２１；Ｂｒａｕｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ，１４６，２９１−２９５）が、ｐ１９ＡＲＦ蛋白質と結合することを見出した。ＨＫ３３蛋白質とｐ１９ＡＲＦ蛋白質との相互作用を哺乳動物細胞においても確認するために、ＣＯＳ７細胞を用いたｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法により実験を行った。その結果、ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法においても、これら二つの蛋白質の相互作用が確認された。また、ｐ１９ＡＲＦ１−８０、及びｐ１９ＡＲＦ８１−Ｓｔｏｐをコードしたミュータントｐ１９ＡＲＦを用いた酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法実験においては、ｐ１９ＡＲＦ１−８０はＨＫ３３蛋白質とは結合せず、ｐ１９ＡＲＦ８１−Ｓｔｏｐにおいてのみ相互作用が確認できた。そのため、ＨＫ３３蛋白質は、ｐ１６ＩＮＫ４ａと共有した部位とは結合せずに、ｐ１９ＡＲＦ特異的な部位と相互作用することが示された。さらに、免疫沈降法によっても、相互作用を再度確認した結果、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との有意な相互作用が見られた。一方、細胞内におけるｐ１９ＡＲＦの局在性をＧＦＰ−ＨＫ３３とｐ１９ＡＲＦｍｙｃの共遺伝子導入、あるいはｐ１９ＡＲＦｍｙｃ単独、もしくはＧＦＰ−ＨＫ３３単独で遺伝導入し、それぞれの蛋白質の局在性を観察したところ、ＨＫ３３蛋白質によってｐ１９ＡＲＦｍｙｃの核への移行が有意に阻害されることが示された。また、ｐ５３反応性のレポーター遺伝子を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験を行った結果、ＨＫ３３はｐ１９ＡＲＦによるｐ５３依存性の転写活性を有意に阻害することを見いだした。さらに、不死化する過程のヒト細胞を用いたＨＫ３３遺伝子の発現解析を行った結果、老化によるクライシスを乗り越えた不死化細胞においてＨＫ３３遺伝子の発現が高まることを見いだした。この結果は、ｐ１９ＡＲＦアンチセンス遺伝子導入によってｐ１９ＡＲＦを不活性化した細胞が細胞寿命の延長を引き起こすという報告と一致する結果である。これらの結果から、ＨＫ３３自身が不死化を引き起こす因子である可能性が示唆された。すなわち、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を抑制する薬剤のスクリーニングを行うことは、ＡＲＦの不活性化による細胞増殖を抑制したり、あるいは不死化した前癌状態の細胞の増殖を抑制できる新規の薬剤開発を可能とする。
このように、ＨＫ３３蛋白質およびこれをコードする遺伝子は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を制御するために有用であり、また、癌などの疾患の診断・検査のための指標として、また、これら疾患の病理機構の解明のためのツールとして、さらには、これら疾患に対する医薬品開発のための標的として利用することができる。
すなわち本発明は、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質の相互作用を利用した抗腫瘍作用を持つ薬剤のスクリーニング方法に関する。また本発明は、該相互作用またはＨＫ３３遺伝子の発現を調節することによりＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達および細胞の増殖を調節する方法に関する。さらに本発明は、腫瘍等の疾患における検査のためのＨＫ３３蛋白質およびＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子の利用に関する。本発明は、より具体的には、
（１）ＨＫ３３遺伝子の発現を上昇または下降させることにより、ＡＲＦを介するシグナル伝達を阻害または促進する方法、
（２）ＨＫ３３遺伝子の発現を上昇または下降させることにより、ｐ５３を介するシグナル伝達を阻害または促進する方法、
（３）ＨＫ３３遺伝子の発現を上昇または下降させることにより、細胞増殖を促進または阻害する方法、
（４）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を上昇または下降させることにより、ＡＲＦを介するシグナル伝達を阻害または促進する方法、
（５）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を上昇または下降させることにより、ｐ５３を介するシグナル伝達を阻害または促進する方法、
（６）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を上昇または下降させることにより、細胞増殖を促進または阻害する方法、
（７）細胞が腫瘍細胞である、（３）または（６）に記載の方法、
（８）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下でＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、該相互作用を調節する化合物を選択する工程、を含む方法、
（９）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との結合を指標に検出する、（８）に記載の方法、
（１０）細胞系を用いて行う、（８）または（９）に記載の方法、
（１１）ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ＨＫ３３遺伝子を内因的に保持する細胞に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）ＨＫ３３遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合と比較して、該発現を調節する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１２）ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ＨＫ３３遺伝子の内因的転写制御配列の下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を有するベクターが導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現を調節する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１３）（８）から（１２）のいずれかに記載の方法により単離されうる化合物、
（１４）ＨＫ３３遺伝子の発現を調節する化合物、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物を含む、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の薬剤：
（ａ）ＡＲＦを介するシグナル伝達の調節剤、
（ｂ）ｐ５３を介するシグナル伝達の調節剤、
（ｃ）細胞増殖調節剤、
（１５）ＨＫ３３遺伝子の発現を調節する化合物、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物を有効成分とする医薬組成物、
（１６）抗腫瘍剤である、（１５）に記載の医薬組成物、
（１７）ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、あるいはＨＫ３３蛋白質に結合する抗体を含む、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の検査試薬：
（ａ）ＡＲＦを介するシグナル伝達の異常の検査試薬、
（ｂ）ｐ５３を介するシグナル伝達の異常の検査試薬、
（ｃ）細胞増殖異常の検査試薬、
（ｄ）細胞増殖性疾患の検査試薬、
（ｅ）細胞増殖性疾患が腫瘍である、（ｄ）の検査試薬、
（１８）下記（ａ）または（ｂ）の工程を含む、ＡＲＦを介するシグナル伝達の異常、ｐ５３を介するシグナル伝達の異常、細胞増殖異常、細胞増殖性疾患、または腫瘍の検査方法：
（ａ）患者由来の被検試料中におけるＨＫ３３遺伝子の発現量を検出し、健常者と比較する工程、
（ｂ）ＨＫ３３蛋白質または該蛋白質をコードする核酸における変異を検出する工程、に関する。
本発明においてＨＫ３３遺伝子とは、ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ＨＫ３３（Ｂｒａｕｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　１４６：２９１−２９５，１９９４）、その相同遺伝子、アイソフォーム、およびそれらの誘導体が含まれる。ＨＫ３３はＰＸＦまたはＰＥＸ１９ｐとも称される。ＨＫ３３遺伝子はヒト遺伝子であってもよく、また、ヒト以外の真核生物由来の遺伝子であってもよい。哺乳動物のＨＫ３３相同遺伝子としては、ヒトＰＸＦ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｘ７５５３５，Ｌｏｃｕｓ　ＨＳＰＸＦ）、マウスＰｘＦ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｙ０９０４６，Ｌｏｃｕｓ　ＭＭＰＸＦＢＡＬＢ）、ラットＰｘＦ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｙ０９０４９，Ｌｏｃｕｓ　ＲＲＰＸＦＰＲＴ）などが挙げられる。また、他の真核生物のＨＫ３３相同遺伝子としては、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓのＰｅｘ１９（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＡＦ１３３２７１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰｅｘ１９（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｑ０７４１８）などが知られている。
本発明においてＡＲＦ遺伝子とは、ＡＲＦ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）（Ｑｕｅｌｌｅ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　８３：９９３−１０００，１９９５）、その相同遺伝子、アイソフォーム、およびそれらの誘導体が含まれる。ＡＲＦはｐ１９ＡＲＦまたはｐ１４ＡＲＦとも称される。ＡＲＦは染色体ＩＮＫ４ａ部位にコードされていることが知られている。哺乳動物のＡＲＦ遺伝子としては、ヒトｐ１４−ＣＤＫ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｐ１４ＡＲＦ）（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｕ１７０７５，Ｌｏｃｕｓ　ＨＳＵ１７０７５）、マウスｐ１９　ＡＲＦ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｌ７６０９２，Ｌｏｃｕｓ　ＭＵＳＡＲＦ）などが知られている。
本発明において蛋白質間の「相互作用」とは、蛋白質の結合、修飾、活性の変化、構造変化の誘導、安定性の変化の誘導などを含む、蛋白質間の作用を言う。
本発明において「ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達」とは、ＡＲＦ蛋白質が媒介する作用を言う。また、本発明において「ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達」とは、ｐ５３蛋白質が媒介する作用を言う。これらの作用には、ＡＲＦ蛋白質またはｐ５３蛋白質が関与する様々な蛋白質の局在変化、修飾、構造変化（活性化、不活性化を含む）、安定性変化、遺伝子発現、および細胞の表現型変化などが含まれる。
本発明は、ＨＫ３３蛋白質がＡＲＦ蛋白質と相互作用し、ｐ５３蛋白質の機能を調節するという新たな知見に基づく。実施例に示したように、ＨＫ３３蛋白質はＡＲＦ蛋白質に結合する活性を示し、ＨＫ３３蛋白質の発現によりＡＲＦ蛋白質の核局在が阻害される。ＡＲＦは細胞周期に関連するシグナル伝達を調節している因子の一つであり、ＭＤＭ２に結合し、ＭＤＭ２によるｐ５３の分解を抑制することが知られている。また、ＡＲＦ蛋白質はｐ５３と直接相互作用することによりｐ５３の機能を修飾することも示唆されている。ＨＫ３３遺伝子の発現によりＨＫ３３蛋白質がＡＲＦ蛋白質と結合し、ＡＲＦの核局在化が阻害されることにより、ＡＲＦの細胞内における活性が抑制され、ＡＲＦを介するシグナル伝達が抑制される。実際、ＨＫ３３の発現はｐ５３依存性の転写活性を有意に阻害した。
これらのことから、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用、またはＨＫ３３遺伝子の発現を上昇させることによりＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を阻害することが可能であり、逆にＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用、またはＨＫ３３遺伝子の発現を低下させることにより、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を促進することが可能である。
ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用には、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との結合および修飾などが含まれる。ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用は、両者の蛋白質の結合を検出したり、あるいは、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用により生じるＡＲＦの機能またはシグナル伝達（ＡＲＦ核移行、ＭＤＭ２とＡＲＦとの相互作用、ｐ５３の安定化、ｐ５３を介するシグナル伝達の促進などを含む）などの阻害を指標に検出することが可能である。ＨＫ３３遺伝子の発現は、その転写産物または蛋白質を検出することにより測定することができる。
例えばＨＫ３３遺伝子の発現を上昇させるには、例えばＨＫ３３遺伝子を発現するベクターを細胞に導入してＨＫ３３蛋白質の細胞内発現を上昇させればよい。これにより、細胞内におけるＨＫ３３蛋白質の発現レベルが上昇し、ＨＫ３３蛋白質の細胞内における活性を上昇させることができる。逆にＨＫ３３遺伝子の発現の低下は、例えばＨＫ３３　ｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡの発現、またはＨＫ３３　ｍＲＮＡを切断するようなリボザイムの発現などにより行うことができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＨＫ３３の転写調節領域の一部を含むデコイ型核酸の投与などによっても実施できる。また、ＨＫ３３遺伝子に変異を導入してもよい。
また、ＨＫ３３蛋白質のアンタゴニストを作用させてＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を低下させることができる。ＨＫ３３蛋白質のアンタゴニストは、ＨＫ３３に対する抗体またはその断片などであり得る。また、ＡＲＦ蛋白質の部分ペプチドであり得る。マウスＡＲＦ蛋白質のアミノ酸８１番目以降の部分ペプチドは、ＨＫ３３蛋白質と結合する活性を有している。このような、ＨＫ３３蛋白質に結合する活性を有するＡＲＦ蛋白質の部分ペプチドは、ＨＫ３３蛋白質への結合を通して、インタクトなＡＲＦ蛋白質へのＨＫ３３蛋白質の相互作用を抑制し得る。ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物、およびＨＫ３３遺伝子の発現を調節する化合物は、以下に述べるように、ＡＲＦを介するシグナル伝達の調節剤、ｐ５３を介するシグナル伝達の調節剤、および細胞増殖調節剤として用いることが可能である。
ＡＲＦを介するシグナル伝達の調節には、ＡＲＦ蛋白質の活性の調節が含まれる。ＡＲＦ活性としては、例えばＭＤＭ２蛋白質との結合などの、ＡＲＦ蛋白質が持つ活性が挙げられる。また、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の調節には、ＡＲＦ蛋白質から下流のシグナル伝達分子の活性の変化およびそれに伴う形質の変化などの調節が含まれる。すなわち、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の促進としては、ＭＤＭ２蛋白質とｐ５３蛋白質との相互作用等のＭＤＭ２活性の抑制、ＭＤＭ２活性の抑制によるｐ５３蛋白質の安定化、その安定化によるｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達の活性化（ｐ５３依存性転写の促進、細胞分裂および細胞増殖の抑制、アポトーシス誘導などを含む）等が挙げられる。特にｐ５３蛋白質は細胞機能の調節に重要な機能を果たす蛋白質であり、癌抑制遺伝子としても知られる。ＨＫ３３遺伝子の発現、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を上昇または下降させることにより、このｐ５３を介するシグナル伝達をそれぞれ阻害または促進することが可能である。ＨＫ３３遺伝子の発現、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を上昇させれば、ｐ５３の活性は抑制され、細胞分裂および細胞増殖の促進、アポトーシスの抑制などがもたらされ得る。逆にＨＫ３３遺伝子の発現、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を低下させれば、ｐ５３の活性が促進され、細胞増殖の抑制、アポトーシスの誘導を行い得る。ＨＫ３３蛋白質の細胞内における活性の抑制は、特に腫瘍に対する治療に有用である。実際、実施例に示すように、セルクライシスを乗り越えた不死化細胞においてはＨＫ３３遺伝子の発現レベルの上昇が観察された。この事実は、細胞の不死化および癌化にＨＫ３３蛋白質が関与していることを示唆するものであり、ＨＫ３３蛋白質の活性を低下させることが腫瘍の増殖を抑制するために重要であることを示している。
以上のことから、ＨＫ３３遺伝子の発現、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節（上昇または下降）する化合物は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を調節するために有用である。本発明は、ＨＫ３３遺伝子の発現、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節（上昇または下降）する化合物を含む、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の調節剤を提供する。またこれらの化合物は、ｐ５３を介するシグナル伝達の調節剤として、さらに、細胞増殖調節剤として有用である。また、これらの化合物は癌化剤（または細胞の不死化剤、発癌剤など）あるいは腫瘍抑制剤（抗癌剤）としても使用される。
上記の化合物には、ＨＫ３３蛋白質が持つ生化学的活性（例えばＡＲＦとの結合活性など）を調節する化合物の他、細胞内または組織内におけるＨＫ３３遺伝子の発現レベルを調節する化合物などが含まれる。ＨＫ３３遺伝子の発現、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を上昇させる化合物としては、例えばＨＫ３３蛋白質、および該蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。例えば、ＨＫ３３蛋白質を発現するベクターを細胞に導入することによりＨＫ３３の発現レベルを上昇させることができる。本発明は、ＡＲＦ蛋白質またはｐ５３を介するシグナル伝達、あるいは細胞増殖を調節するための、ＨＫ３３蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡを含むベクターの使用に関する。
ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡは、公知の方法により調製することが可能である。例えば、ヒトＨＫ３３蛋白質のアミノ酸配列、およびＨＫ３３蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列は既に知られている（Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４５：２００−２１０，１９９７；Ｂｒａｕｎ，Ａ．Ｇｅｎｅ　１４６：２９１−２９５，１９９４）。ＨＫ３３をコードするＤＮＡは、例えばこの塩基配列を基に作製したプローブを用いたハイブリダイゼーション、あるいはこの塩基配列を基に作製したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）により調製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）。ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ブタなどがコードする蛋白質）等から単離し得る。ＨＫ３３は様々な組織に発現しており、これらの組織から調製したｃＤＮＡをハイブリダイゼーションまたはＰＣＲを用いたスクリーニングに適用することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。例えば低ストリンジェントな条件、通常の条件、またはストリンジェントな条件で行うことができる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えばハイブリダイゼーション後の洗浄において、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられ、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。またより好ましくは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このように、既知のＨＫ３３蛋白質をコードするｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードする蛋白質であって、ＡＲＦ蛋白質の核移行を阻害する蛋白質は、本発明においてＨＫ３３蛋白質に含まれる。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする蛋白質は、通常、ヒトＨＫ３３蛋白質（Ｂｒａｕｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　１４６：２９１−２９５，１９９４）または他の生物における相同蛋白質とアミノ酸配列に対し高い相同性を有する。これらの蛋白質と高い相同性を有する蛋白質において、ＡＲＦ蛋白質の核移行を阻害する活性を有する蛋白質は、本発明においてＨＫ３３蛋白質に含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも４０％以上の同一性、好ましくは６０％以上の同一性、さらに好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性を指す。蛋白質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
また、天然のＨＫ３３蛋白質の変異体を用いることもできる。このような変異は人為的であってもよく、また自然界においても生じうる。ある蛋白質の変異体を調製するための、当業者によく知られた方法としては、蛋白質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ　１５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ　Ｗ．，ａｎｄ　Ｆｒｉｔｚ　Ｈ．Ｊ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、天然のＨＫ３３蛋白質のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、変異蛋白質を調製することができる。このように、天然のＨＫ３３蛋白質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、ＡＲＦ蛋白質の核移行を阻害する活性を有する蛋白質もまた本発明でいうＨＫ３３蛋白質に含まれる。
このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、２０アミノ酸以内であり、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内（例えば１アミノ酸）であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異すれば、蛋白質の活性への影響を少なくできると期待される。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの性質が似たアミノ酸内の置換を保存的置換と言う。本発明においてＨＫ３３蛋白質には、アミノ酸の保存的置換を受けた蛋白質が含まれる。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆　Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
ＨＫ３３蛋白質としては、例えば天然のＨＫ３３蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白質であってもよい。このような融合蛋白質は、天然のＨＫ３３蛋白質と他のペプチド又は蛋白質とが融合したものであり、本発明におけるＨＫ３３蛋白質に含まれる。融合蛋白質を作製する方法は、ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡと他のペプチド又は蛋白質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。融合に付される他のペプチド又は蛋白質としては、特に限定されない。
融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４〜１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ　ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、融合に付される他の蛋白質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合蛋白質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡをＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合蛋白質を調製することができる。
後述する蛋白質を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、生産させた蛋白質のアミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた蛋白質が、ＡＲＦ蛋白質の核移行を阻害する活性を有している限り、本発明においてＨＫ３３蛋白質に含まれる。例えば、ＨＫ３３蛋白質を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の蛋白質のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加されるが、このような蛋白質も包含される。
ＨＫ３３蛋白質は、当業者に公知の方法により、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として調製することが可能である。組み換え蛋白質であれば、ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡ（例えばヒトＨＫ３３　ｃＤＮＡについてはＢｒａｕｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　１４６：２９１−２９５，１９９４を参照）を適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいはＨＫ３３蛋白質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、ＨＫ３３蛋白質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換え蛋白質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換え蛋白質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて融合蛋白質のうち、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然の蛋白質であれば、当業者に周知の方法、例えば、ＨＫ３３蛋白質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述するＨＫ３３蛋白質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡは、ＨＫ３３蛋白質のｉｎ　ｖｉｖｏやｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される。また、ＨＫ３３蛋白質の活性を上昇させるための遺伝子治療などへの応用も考えられる。ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡは、ＨＫ３３蛋白質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、ＨＫ３３蛋白質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、ＨＫ３３蛋白質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＨＫ３３　ｃＤＮＡ（例えばヒトＨＫ３３　ｃＤＮＡについてはＢｒａｕｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　１４６：２９１−２９５，１９９４を参照）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、ＨＫ３３蛋白質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、ＨＫ３３　ｃＤＮＡ配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ＨＫ３３蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、ＨＫ３３蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。同様に、ＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子の内因的転写制御配列を得ることもできる。例えば、これまでにヒトＨＫ３３遺伝子の転写制御領域が報告されている（Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４５：２００−２１０，１９９７）。
具体的には、次のようにすればよい。まず、ＨＫ３３蛋白質を発現する細胞、組織、臓器からｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いそ行うこともできる。また、５’−Ａｍｐｌｉ　ＦＩＮＤＥＲ　ＲＡＣＥ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法や３’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）にしたがい、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡは、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−７４）。また、市販のキットや公知の方法によってＤＮＡ配列を改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡを用いてＨＫ３３蛋白質を発現させるためには、例えば発現ベクターを構築し、宿主細胞に導入する。ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。ＨＫ３３蛋白質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ　Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ　ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅ１Ｂシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、ＨＫ３３蛋白質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ　ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０　Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内でＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡを発現させる方法としては、該ＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、ＨＫ３３遺伝子の変異に起因する疾患、またはＨＫ３３遺伝子の発現により治療可能な疾患等に対する遺伝子治療を行うことも可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへのＨＫ３３　ｃＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ　ｖｉｖｏ法またはｉｎ　ｖｉｖｏ法であり得る。ＨＫ３３蛋白質をコードするこれらのベクターは、本発明においてＨＫ３３遺伝子の発現を上昇させる薬剤として用いることができる。
ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡにより宿主細胞を形質転換し、形質転換された細胞を培養することにより、ＨＫ３３蛋白質をｉｎ　ｖｉｔｒｏで生産することができる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液としては、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭなどを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の真核細胞などを用いることが可能である。真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ　Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥテキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）が知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
一方、ｉｎ　ｖｉｖｏで蛋白質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内で蛋白質を産生させ、回収する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ　Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギヘ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の蛋白質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ　５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ　Ｋ．−Ｃ．Ｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られたＨＫ３３蛋白質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。蛋白質の分離、精製は、通常の蛋白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば蛋白質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。これらの精製方法を用い、ＨＫ３３蛋白質を高度に精製することもできる。
なお、蛋白質を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
また、本発明は、ＨＫ３３遺伝子の発現、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を低下させる化合物に関する。また本発明は、該化合物の、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の調節、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達の調節、細胞増殖調節、並びに腫瘍の予防または治療のための使用にも関する。このような化合物としては、例えば、ＨＫ３３遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチド等が挙げられる。アンチセンスヌクレオチドは、ＨＫ３３蛋白質をコードするヌクレオチドに相補的な領域を含むヌクレオチドである。好ましくは、アンチセンスヌクレオチドはＨＫ３３蛋白質をコードするヌクレオチドに相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、相補的ヌクレオチド領域が完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。アンチセンスヌクレオチドは、ＡＲＦを介するシグナル伝達の調節剤、ｐ５３を介するシグナル伝達の調節剤、および細胞増殖の調節剤として有用である。すなわち、ＨＫ３３に対するアンチセンスヌクレオチドは、ＡＲＦを介するシグナル伝達を促進し、ｐ５３を介するシグナル伝達を促進し、さらに細胞増殖を抑制する。また、ＨＫ３３に対するアンチセンスヌクレオチドは、後述の本発明の検査にも利用され得る。
このようなヌクレオチドには、ＨＫ３３遺伝子の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡ等）が含まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＨＫ３３遺伝子のゲノム上のＤＮＡ配列、または該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの配列のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは該ＨＫ３３遺伝子配列またはｍＲＮＡ配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが該ＨＫ３３遺伝子配列またはｍＲＮＡ配列にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＨＫ３３蛋白質の産生細胞に作用して、該蛋白質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、ＨＫ３３遺伝子の発現を抑制することにより結果的にＨＫ３３蛋白質の活性を抑制する効果を有する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはＨＫ３３遺伝子の発現を阻害し、従ってＨＫ３３蛋白質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、ＨＫ３３蛋白質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。ＨＫ３３遺伝子のアンチセンス核酸は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の調節剤、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達の調節剤、および細胞増殖の調節剤となる。また本発明は、ＡＲＦ蛋白質またはｐ５３を介するシグナル伝達、あるいは細胞増殖を調節するための、ＨＫ３３遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチドの使用にも関する。
また、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を低下させる化合物としては、例えばＨＫ３３蛋白質に対する抗体が挙げられる。ＨＫ３３蛋白質に対する抗体は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の調節剤、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達の調節剤、および細胞増殖の調節剤となり得る。すなわち、ＨＫ３３蛋白質に対する抗体によりＨＫ３３蛋白質の活性を阻害すれば、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を促進し、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達を促進し、さらに細胞増殖を抑制することができる。本発明は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達、および細胞増殖を調節するための、ＨＫ３３蛋白質に対する抗体の使用にも関する。また、ＨＫ３３蛋白質に対する抗体は、後述の本発明の検査にも使用される。
ＨＫ３３蛋白質に対する抗体は、公知の方法により作製することができる。抗体の形態には特に制限はない。ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に抗原蛋白質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される蛋白質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来の蛋白質が好ましく、特にヒト由来の蛋白質が好ましい。ヒト由来のＨＫ３３蛋白質は、上述のようにして調製することができる。
本発明において、感作抗原として使用される蛋白質は、完全な蛋白質であってもよいし、また、蛋白質の部分ペプチドであってもよい。蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、蛋白質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。また、ＡＲＦ蛋白質との結合領域が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とは蛋白質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
ＨＫ３３蛋白質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的の蛋白質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、蛋白質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成したＨＫ３３蛋白質を感作抗原として使用してもよい。短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンなどのキャリア蛋白質と適宜結合させて抗原とすることができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、モノクローナル抗体の作製においては細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、ある蛋白質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、抗原に用いた蛋白質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、抗原蛋白質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで蛋白質、蛋白質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、抗原とした蛋白質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。得られる抗体は、ＨＫ３３蛋白質の検出に用いられる他、ＨＫ３３蛋白質のアンタゴニストの候補になる。ＨＫ３３蛋白質に対する抗体は、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を抑制する薬剤の候補となる。
抗体は、ヒト抗体またはヒト型抗体であってもよい。例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となる蛋白質、蛋白質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いて蛋白質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ　Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ　ｂｙ　ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ　ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ　ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。
さらに、ＨＫ３３蛋白質に結合する限り、抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ，ａｎｄ　Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ　Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明で言う「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、抗体は公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ　Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
抗体の抗原結合活性を測定する方法としては、例えば、吸光度の測定、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、抗体を固相化したプレートにＨＫ３３蛋白質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。蛋白質としてＨＫ３３蛋白質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片等を使用してもよい。抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することもできる。
ＨＫ３３蛋白質またはＡＲＦ蛋白質の部分ペプチドは、本来のＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との結合を阻害することにより、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節し得る。従って、ＨＫ３３蛋白質またはＡＲＦ蛋白質の部分ペプチドは、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物となり、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の調節剤、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達の調節剤、細胞増殖調節剤、抗腫瘍剤等の上記の各種調節剤として使用することができる。このような部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいはＨＫ３３蛋白質またはＡＲＦ蛋白質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
また本発明は、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法の一つは、
（ａ）被検試料の存在下でＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該相互作用を調節する化合物を選択する工程、を含む方法である。このスクリーニングにより、ＡＲＦ蛋白質またはＨＫ３３蛋白質の活性を調節する化合物を単離することもできる。
ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用の検出は、両者の蛋白質の結合を直接的に検出することにより、または両者の蛋白質の相互作用により生じる変化を検出することにより間接的にＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用の検出を行い得る。このようなスクリーニング系は、試験管内または細胞内等で構築することが可能である。細胞内で行う場合、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質を発現する細胞を被検試料存在下でインキュベートすることにより、細胞内で発現したＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質が接触し、両者の相互作用の検出を通してスクリーニングを行うことができる。細胞系を用いたスクリーニング方法は上記に記載したスクリーニング方法に含まれるが、より具体的には、（ａ）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質とを発現する細胞に、被検試料を接触させる工程、（ｂ）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を検出する工程、および（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該相互作用を調節する化合物を選択する工程、を含む。細胞を用いたこのスクリーニング方法は、以下に述べるＴｗｏハイブリッド法によるスクリーニング等の他、後述するＡＲＦ蛋白質またはｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達を指標とするスクリーニング方法を含む。
本発明のＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物のスクリーニング方法の一態様は、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との結合を指標に検出する方法である。具体的には、このスクリーニング方法は、（ａ）被検試料の存在下でＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質とを接触させる工程、（ｂ）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との結合を検出する工程、および（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該相互作用を調節する化合物を選択する工程、を含む方法である。
スクリーニングに用いられるＨＫ３３蛋白質およびＡＲＦ蛋白質は組換え蛋白質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。蛋白質の由来に制限はなく、ヒトおよび他の動物を含む真核生物由来の蛋白質を用いることができる。好ましくは、ヒト由来の蛋白質が用いられる。また蛋白質は変異体、部分ペプチド、または他のペプチドとの融合蛋白質であってもよい。蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、他の蛋白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態として、または膜画分としてスクリーニングに用いることができる。実施例に示すように、１−８０アミノ酸を欠失させたマウスＡＲＦ蛋白質はＨＫ３３蛋白質との結合能を保持している。従って、ＡＲＦ蛋白質の８１番以降の部分ペプチドを用いて本発明のスクリーニングを行うことができる。
被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞紬出物、真核単細胞抽出物又は動物細胞抽出物あるいはそれらのライブラリー、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。
蛋白質同士の結合を調節する化合物をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このような方法は、例えば酵母または動物細胞などを用いた２ハイブリッド法を用いて行うことができる（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ　Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ　Ｓ，ａｎｄ　Ｔｒｅｉｓｍａｎ　Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＡＰ−１，ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ　ｂｙ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃ−ｆｏｓ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ　６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ　Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））。
酵母２−ハイブリッドシステムにおいては、ＨＫ３３蛋白質またはＡＲＦ蛋白質のどちらか一方の蛋白質またはその部分ペプチドをＳＲＦ　ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４　ＤＮＡ結合領域等と融合させた融合蛋白質を発現するベクター、そして他方の蛋白質またはその部分ペプチドをＶＰ１６またはＧＡＬ４等の転写活性化領域と融合させたベクターを構築し、これらを、レポーター遺伝子をコードするベクターと共に酵母細胞に導入して、被検化合物を含む試料の存在下でレポーター活性を指標に化合物のアッセイを行う。ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との結合によりレポーター遺伝子の発現が誘導されるが、被検化合物により両者の蛋白質の結合が阻害されると、レポーター遺伝子の発現が抑制される。レポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。レポーター遺伝子として、細胞毒性のある遺伝子を発現させることもできる。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
また、例えば免疫沈降を用いてスクリーニングを行うことも可能である。被検化合物を含む試料の存在下で、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質とを発現する細胞を培養し、細胞を回収後、一方の蛋白質に対する抗体等で複合体を回収したのち、他方の蛋白質を、その蛋白質に対する抗体等を用いて検出することにより、両者の蛋白質の結合を評価することができる。両者の蛋白質は細胞が内因的に発現する蛋白質であってもよいが、どちらかまたは両者の蛋白質を外来的に細胞で発現させることもできる。
動物細胞内で蛋白質を外来的に発現させる場合、例えば、ＨＫ３３蛋白質および／またはＡＲＦ蛋白質をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ　Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ，Ｉｎ　Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１　α　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋｉｍら，Ｇｅｎｅ　９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　１０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ　ＬＴＲ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７）），ＳＲ　α　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ　ａｎｄ　Ａｒｕｆｆｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０　ｌａｔｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ　ａｎｄ　Ｆｉｅｒｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｌａｔｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ　ＴＫ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ　ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．，Ｃｅｌｌ　７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＨＫ３３および／またはＡＲＦ蛋白質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合蛋白質とすることができる。用いるエピトープー抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医��　１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、イムノグロブリン定常領域、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などとの融合蛋白質を発現することができるベクターが市販されている。
融合蛋白質にする場合に、元の蛋白質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合蛋白質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（例えば６×Ｈｉｓまたは１０×Ｈｉｓなど）、インフルエンザ凝集素ＨＡの断片、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖蛋白質（ＶＳＶ−ＧＰ）の断片、Ｔ７　ｇｅｎｅ１０蛋白質の断片（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質の断片（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ　ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃの断片等の公知のエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、上記のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学　１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＨＫ３３蛋白質、ＡＲＦ蛋白質、および抗体を含む。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＨＫ３３蛋白質またはＡＲＦ蛋白質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。これらの抗体は、上記のように、例えば目的の蛋白質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させた蛋白質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合蛋白質を調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して免疫複合体を形成させることができる。免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
また、細胞系を使わずにプルダウンアッセイを利用して本発明のスクリーニングを行うこともできる。例えば、被検化合物を含む試料の存在下で、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質とをインビトロでインキュベートし、一方の蛋白質に対する抗体、またはこれらの蛋白質に融合させたタグに対する抗体等で複合体を回収したのち、他方の蛋白質を、その蛋白質に対する抗体または該蛋白質に付加したタグに対する抗体等を用いて検出することにより、両者の蛋白質の結合を評価することができる。また、一方の蛋白質を支持体に結合させておき、他方の蛋白質を結合させ、そこに被検試料を適用する。結合していた蛋白質が解離するかを検出することにより被検試料の効果を調べることができる。また、ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングを行うことも可能である。
さらに、結合した蛋白質を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、蛋白質間の相互作用を微量の蛋白質試料を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることによりＨＫ３３蛋白質およびＡＲＦ蛋白質の結合を評価することが可能である。さらに、コンビナトリアルケミストリーを利用したハイスループットスクリーニング（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ　ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ　ＦＸ；Ｃｈａｎｇ　Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ　ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ　ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ　ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ　ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ　ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ　ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ　ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　ｐｏｔｅｎｔ　ｍｉｍｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ　ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ　２６　１９９６，２７３　ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ　ＧＬ．，Ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ　７　１９９６，３８４　ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ　ＪＣ　Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ　７　１９９６，３８４　ｐ１７−９）などにより本発明のスクリーニングを行うことも可能である。
以上の方法により同定される、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質の結合を促進または抑制する化合物は、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用をそれぞれ促進または抑制する化合物と判定される。これらの化合物は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達、および細胞増殖を調節するために使用され得る。また、後述のように抗腫瘍剤などの医薬としても使用され得る。
上記のＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物のスクリーニングにおいて、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用の検出を、ＡＲＦ蛋白質の核移行を指標として行うことも可能である。実施例に示すように、ＨＫ３３蛋白質はＡＲＦ蛋白質の核移行を阻害する。従って、ＨＫ３３蛋白質によるＡＲＦ蛋白質の核移行の阻害を調節する化合物をスクリーニングすることにより、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物を得ることができる。このスクリーニング方法は、（ａ）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質とを発現する細胞に、被検試料を接触させる工程、（ｂ）ＡＲＦ蛋白質の核局在を検出する工程、および（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合（対照）と比較して、ＨＫ３３蛋白質によるＡＲＦ蛋白質の核局在の阻害を調節（促進または低減）する化合物を選択する工程、を含む。ＨＫ３３蛋白質によるＡＲＦ蛋白質の核局在の阻害を促進させる化合物は、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を促進する化合物と判断され、また、ＨＫ３３蛋白質によるＡＲＦ蛋白質の核局在の阻害を低減させる化合物は、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を抑制する化合物と判断される。ＡＲＦ蛋白質やＨＫ３３蛋白質は、内因的蛋白質であってもよく、また外来的に発現させてもよい。用いられる細胞としては、ＨＫ３３蛋白質によりＡＲＦ蛋白質の核移行が阻害される限り制限はない。例えば実施例で用いられたＮＩＨ３Ｔ３またはＣＯＳ細胞等が用いられ得る。ＡＲＦ蛋白質の核移行は、例えばＡＲＦ蛋白質に対する抗体を用いた免疫細胞化学的手法により検出することが可能である。抗体は、例えば蛍光標識される。また、ＧＦＰ蛋白質などを融合させたＡＲＦ蛋白質を外来的に細胞で発現させれば、ＡＲＦ蛋白質の細胞内局在を容易に検出することができる。
上記のＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物のスクリーニング方法の他の態様は、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を指標に検出する方法である。ＡＲＦ蛋白質は細胞周期調節に関連するシグナル因子であり、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナルはＭＤＭ２、ｐ５３、およびその下流のｐ２１などの他の分子に伝達される。従って、これらのシグナル伝達の変化を指標にしてスクリーニングを行うことにより、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物を得ることができる。
このようなスクリーニングは細胞系を用いて行うことができる。このスクリーニングは、例えば、（ａ）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質とを発現する細胞に、被検試料を接触させる工程、（ｂ）ＡＲＦを介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を検出する工程、および（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該抑制を調節（増強または低減）する化合物を選択する工程、を含む方法である。このようなスクリーニングも、本発明のスクリーニングに含まれる。スクリーニングに用いる被検試料は特に制限はない。ＡＲＦ蛋白質やＨＫ３３蛋白質は、内因的蛋白質であってもよく、また外来的に発現させてもよい。用いられる細胞としては、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達経路を持つ多くの細胞が用いられ得る。例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏなどが挙げられる。親細胞に比べＨＫ３３遺伝子の発現が有意に上昇した細胞を好適に用いることができる。
ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達は、以下の指標により検出することが可能である。
・ＡＲＦ蛋白質とＭＤＭ２蛋白質との結合
・ＭＤＭ２蛋白質とｐ５３蛋白質との結合
・ｐ５３蛋白質の修飾（ユビキチン化など）
・ｐ５３蛋白質の分解
・ｐ５３蛋白質活性
・ｐ５３蛋白質が標的とする遺伝子の発現（例えばｐ５３依存的転写など）
・ＤＮＡ合成、細胞周期、細胞分裂、細胞増殖、アポトーシス
ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の流れは以下のようになっている。ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用によりＡＲＦ蛋白質の核移行が阻害されると、ＡＲＦ蛋白質とＭＤＭ２蛋白質との結合が抑制される。ＡＲＦ蛋白質とＭＤＭ２蛋白質との結合の抑制は、ＭＤＭ２蛋白質の活性を促進し、これによりＭＤＭ２蛋白質とｐ５３蛋白質との結合が促進され、ｐ５３蛋白質のユビキチン化を含むｐ５３蛋白質の分解を誘導する修飾を促進する。結果としてｐ５３蛋白質の分解が促進され、ｐ５３蛋白質の安定性が低下することにより細胞内におけるｐ５３蛋白質の活性は低下し、ｐ５３蛋白質が持つＧ１停止およびアポトーシスの誘導などの機能が抑制される。その結果、ＤＮＡ合成の上昇、アポトーシスの抑制、および／または細胞分裂の促進がもたらされ、細胞増殖が促進される。これらの指標は、公知の方法により検出することが可能である。以上のようなＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の流れに基づき、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達における各段階を指標に、該シグナル伝達を促進または抑制する化合物をスクリーニングすることによって、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用をそれぞれ抑制または促進する化合物を得ることが可能である。
具体的には、例えばＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の活性化によりｐ５３蛋白質が活性化して誘導されるｐ２１等のｐ５３の標的遺伝子の発現を抗体で確認するウエスタンブロッティング法によりスクリーニングすることができる。また、ｐ２１等の標的遺伝子のｍＲＮＡをノーザンブロッティングまたはＲＴ−ＰＣＲにより検出してスクリーニングすることもできる。あるいは、ｐ２１等の標的遺伝子の発現制御配列の下流にレポーター遺伝子を結合したＤＮＡを細胞に組み込み、レポーター活性を指標にスクリーニングを行うこともできる。ｐ５３の標的遺伝子の発現を促進する化合物は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を低減する化合物と判断される。逆に、標的遺伝子の発現を抑制する化合物は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を促進する化合物と判断される。あるいは、細胞増殖の抑制を指標にスクリーニングすることができる。このスクリーニングは、細胞数の計測による増殖測定、またはＷＳＴ試薬（ロシュダイアゴニスティック社）等を用いた細胞増殖測定により実施することができる。これらの方法を用いて、ＡＲＦの活性を抑制しているＨＫ３３の活性を、加えた被検試料がキャンセルすることによる細胞増殖抑制を上記の方法により計測し、これを指標にスクリーニングを行うことができる。細胞増殖を促進する化合物は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を促進する化合物と判断される。逆に、細胞増殖を抑制する化合物は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を低減する化合物と判断される。これらのスクリーニングは、以下に述べるｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を調節する化合物のスクリーニングにおいても同様に実施することができる。
本発明において、ＨＫ３３蛋白質の発現が、ｐ５３依存性の転写を抑制することが示された。このことは、ＨＫ３３蛋白質がｐ５３の活性を抑制することを示している。細胞周期の調節因子として中心的な役割を果たすｐ５３蛋白質の活性をＨＫ３３蛋白質が制御していることは重要である。本発明のスクリーニング方法の他の態様は、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を調節する化合物を選択することによりスクリーニングを行う方法である。このスクリーニング方法は、（ａ）ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質とを発現する細胞に、被検試料を接触させる工程、（ｂ）ｐ５３を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を検出する工程、（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該抑制を調節（増強または低減）する化合物を選択する工程、を含む方法である。これらのスクリーニングは細胞系で行うことが好ましい。スクリーニングに用いる被検試料は特に制限はない。細胞としては、上記のＡＲＦ蛋白質のシグナル伝達を指標としたスクリーニングと同様の細胞が用いられ得る。親細胞に比べＨＫ３３遺伝子の発現が有意に上昇した細胞を好適に用いることができる。
ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達は、上記に示したようにｐ５３蛋白質またはその作用を検出することにより評価することができる。具体的には、例えばｐ５３蛋白質とＭＤＭ２蛋白質との結合、ｐ５３蛋白質の修飾、ｐ５３蛋白質の安定性、ｐ５３蛋白質の標的遺伝子の発現、アポトーシス、ＤＮＡ合成、細胞分裂、細胞増殖などを指標とすることができる。このスクリーニングにより得られる化合物は、上記のＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物と同様、細胞増殖の調節剤として、また抗腫瘍剤として利用され得る。従ってこのスクリーニング方法は、上記に記載したＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質のと相互作用を調節する化合物のスクリーニング方法と同様、細胞増殖を調節する化合物を得るために用いることができる他、抗腫瘍剤を得るためにも好適に用いられる。
具体的には、例えば上記のｐ２１等のｐ５３の標的遺伝子の発現を抗体で確認するウエスタンブロッティング法またはノーザンブロッティングやＲＴ−ＰＣＲ等によりスクリーニングすることができる。ｐ５３の標的遺伝子の発現を促進する化合物は、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を低減する化合物と判断される。逆に、標的遺伝子の発現を抑制する化合物は、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を促進する化合物と判断される。また上記と同様に、細胞増殖の抑制を指標にスクリーニングすることができる。細胞増殖を促進する化合物は、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を促進する化合物と判断される。逆に、細胞増殖を抑制する化合物は、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達のＨＫ３３蛋白質による抑制を低減する化合物と判断される。
以上に記載したスクリーニングにおいて細胞系を用いる場合は、被検化合物を含む試料は、例えば細胞の培地に添加される。また、遺伝子を被検試料として用いる場合は、これを細胞へ導入する。導入には、例えは発現ベクター等を用いた公知の遺伝子導入法により行い得る。個体を用いたインビボ系におけるスクリーニングにおいては、被検化合物を含む試料を適当な経路で投与する。試料の投与は、例えば経皮、腹腔内、筋肉内、経腸、静脈注射等により行い得る。また、発現ベクター等により遺伝子を投与することもできる。
細胞内において発現する、ＨＫ３３蛋白質またはＡＲＦ蛋白質、あるいはこれらの蛋白質から下流の各種のシグナル伝達分子は、内因性であっても、外来的に発現させたものであったもよい。例えば、ＡＲＦ遺伝子を欠損する細胞を用いて、この細胞と、これに外来的にＡＲＦ遺伝子を導入した細胞とを用いて被検化合物のアッセイを行えば、化合物のＡＲＦ蛋白質に対する特異性を検証することが可能である。このための最も簡便な細胞として、ＡＲＦの存在するＩＮＫ４ａ部位を欠損したＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いることが適当である。
また、本発明は、ＨＫ３３遺伝子の発現を調節する化合物の選択により、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の調節剤をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニングは、ＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子またはその発現制御領域を利用して、細胞内、生体内、またはｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現系等においてＨＫ３３遺伝子の発現（転写または翻訳など）を調節しうる化合物を選択する工程を含む方法である。このスクリーニングは、例えば、ＡＲＦ蛋白質またはｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達の調節剤、細胞増殖調節剤、アポトーシス調節剤、あるいは発癌剤、細胞の不死化試薬、または抗腫瘍剤のスクリーニングにも利用し得る。
上記のスクリーニング方法は、例えば（ａ）ＨＫ３３遺伝子を内因的に発現する細胞に被検試料を接触させる工程、（ｂ）ＨＫ３３遺伝子の発現を検出する工程、および（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該発現を調節（促進または阻害）する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法により実施しうる。ここで遺伝子の発現には、転写および翻訳が含まれる。
例えば、ＨＫ３３遺伝子を発現している細胞を被検試料と共に培養し、該遺伝子の発現をノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法などのｍＲＮＡを検出する方法、あるいはウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡなどの蛋白質を検出する方法、またはこれらを改良した方法により検出し、被検試料を添加しない場合と比較して、該遺伝子の発現を促進あるいは阻害する化合物を選択することにより、目的の化合物をスクリーニングすることができる。
スクリーニングに用いる細胞に特に制限はないが、癌治療の観点からはＨＫ３３遺伝子の発現を抑制することが治療につながると予想されるため、ＨＫ３３遺伝子の発現亢進が見られる種々の癌細胞株または不死化細胞等を用いて、ＨＫ３３遺伝子の発現を抑制する化合物をスクリーニングすることが考えられる。逆に発現を上昇させる化合物のスクリーニングを目的とした場合は、ＨＫ３３遺伝子の発現レベルが低い正常細胞等を用いることができる。
また、ＨＫ３３遺伝子の発現制御領域の活性化または不活性化を指標とする方法によって、生体内または細胞内においてＨＫ３３遺伝子の発現を調節しうる化合物をスクリーニングすることも考えられる。このスクリーニングは、（ａ）ＨＫ３３遺伝子の内因的転写制御配列の下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を有するベクターが導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現を検出する工程、および（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター遺伝子の発現を調節（促進または阻害）する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法により実施しうる。
ここで「内因的転写制御配列」とは、ＨＫ３３遺伝子を天然に保持している細胞において、該遺伝子の転写を制御している配列のことを言う。このような配列は、プロモーター、エンハンサー、および／またはリプレッサーなどが含まれる。これら配列としては、例えば、ＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子の上流領域のＤＮＡを用いることができる。例えば、ＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子の転写開始点（または翻訳開始コドン）からその上流数ｋｂまでのＤＮＡ断片には、該遺伝子の内因的転写制御配列が含まれていると考えられる。この断片をレポーター遺伝子と連結することで、レポーター遺伝子の発現を、ＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子の転写制御下に置くことが可能である。上流領域は適宜欠失または変異を導入して転写制御活性を測定し、転写制御に関与している配列を特定してその断片を用いることも可能である。現在、転写制御に関与する転写因子が結合する多くの転写制御配列が知られている。ＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子の上流域から、これら既知の転写制御配列を同定することで、内因的転写制御配列を特定することも考えられる。通常、遺伝子の転写を制御している配列は、１つの遺伝子に複数存在しているが、本発明のスクリーニングにおいては、それらのいずれか、またはその組み合わせを用いることができる。内因的転写制御配列は、他のプロモーターとのキメラにしてもよい。キメラプロモーターは、転写制御の試験においてはよく用いられている。キメラプロモーターの作製に用いる他のプロモーターとしては、例えばＳＶ４０初期プロモーター由来の最小プロモーターなどが挙げられる。なお、「機能的に結合された」とは、該転写制御配列の活性化に応答して、その下流に結合されたレポーター遺伝子が発現しうるように、該転写制御配列とレポーター遺伝子が結合していることを指す。
具体的には、例えば、ＨＫ３３蛋白質をコードする配列若しくはその一部をプローブとしたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、ＨＫ３３遺伝子の転写制御領域（プロモーター、エンハンサーなど）をクローニングし、これを適当なレポーター遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）の上流に挿入した発現ベクターを作製し、これを哺乳動物細胞に導入する。次いで、被検試料を該細胞に接触させ、レポーター活性を検出し、被検試料を接触させない細胞におけるレポーター活性と比較して、レポーター活性を増加または減少させる化合物を選択することにより、細胞内において本発明の遺伝子の発現を調節しうる化合物をスクリーニングすることができる。このスクリーニングは、ＨＫ３３遺伝子の発現を、レポーター活性を指標として検出するため、上記したノーザン解析などの直接的な検出と比較して、簡便であるという特徴を有する。
ヒトＨＫ３３遺伝子の転写制御配列は既にクローニングされており、レポーター遺伝子を連結させ転写解析が行われている（Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４５：２００−２１０，１９９７）。ヒトＨＫ３３遺伝子の転写制御領域には、Ｓｐ１配列などの既知の転写因子結合配列が見出された。ＨＫ３３遺伝子の転写制御配列中のこれらの配列を含む領域を用いて本発明のスクリーニングを行うことができる。
以上に記載した本発明のスクリーニング方法により単離され得る化合物は、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を調節する化合物、ＨＫ３３遺伝子の発現を調節する化合物、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を調節する化合物、およびｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達を調節する化合物などを含む。ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を抑制する化合物およびＨＫ３３遺伝子の発現を抑制する化合物等は、ＡＲＦ蛋白質の細胞内における活性を上昇させ、ｐ５３を安定化し細胞分裂の停止を引き起こし細胞分裂および細胞増殖を抑制する。またアポトーシスを誘導し得る。逆にＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を促進する化合物およびＨＫ３３遺伝子の発現を促進する化合物等は、ＡＲＦ蛋白質の細胞内における活性を低下させ、ｐ５３の分解を促進し細胞分裂の停止を解除し細胞分裂および細胞増殖を促進する。またアポトーシスを抑制し得る。従って、本発明の上記のスクリーニングは、細胞増殖を調節する化合物を評価したり、または該化合物を単離するために有用である。特に、細胞増殖を抑制する化合物は抗腫瘍剤としての利用が期待される。従って、本発明のスクリーニング方法は、抗腫瘍剤の評価または単離のために好適に用いられる。
上記のＨＫ３３蛋白質の活性を調節する化合物、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を調節する化合物、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達を調節する化合物、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達を調節する化合物、および細胞増殖を調節する化合物等は試薬および／または医薬として利用することができる。また、上記スクリーニングにより単離しうる化合物も、同様に試薬および／または医薬として利用することができる。本発明のスクリーニング方法を用いて単離しうる化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される化合物も、本発明のスクリーニングにより単離され得る化合物に含まれる。このような化合物も同様に試薬および／または医薬として利用することができる。これらの化合物は、例えばＡＲＦ活性調節剤またはｐ５３活性調節剤などの薬剤として有用である。薬剤には、試薬および医薬が含まれる。またこれらの化合物は、細胞増殖を調節するための薬剤として用いられ得る。該化合物は、例えば細胞増殖性疾患や細胞増殖を制御することにより治療可能な疾患の治療への応用が考えられる。特に、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を抑制する化合物およびＨＫ３３遺伝子の発現を抑制する化合物などのＨＫ３３蛋白質の作用を抑制する化合物は、腫瘍の抑制剤としての利用が期待される。
また、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を促進する化合物は例えばアポトーシスの抑制剤としての利用が考えられる。また、細胞増殖促進剤としても有用である。ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を促進する化合物は、ＡＲＦ蛋白質により負に制御されている細胞増殖の抑制機構を阻害する事ができるため、臓器再生等での利用なども考えられる。またこれらの化合物は、腫瘍細胞モデルの作製や腫瘍の病態解析に有用である。
ＨＫ３３遺伝子の発現を調節する化合物、またはＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を調節する化合物等の上記化合物をヒトや哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
化合物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
本発明は、ＨＫ３３蛋白質に結合する抗体、あるいはＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む検査試薬を提供する。ＨＫ３３遺伝子の発現の亢進は、ＡＲＦ蛋白質の細胞内における活性を抑制し、ｐ５３蛋白質の機能を低下させ細胞増殖を亢進させる。逆にＨＫ３３遺伝子の発現の低下は、ＡＲＦ蛋白質の活性を上昇させ、ｐ５３の機能を上昇させ細胞増殖を抑制しアポトーシスを誘導し得る。従って、細胞におけるＨＫ３３遺伝子の変異や発現異常を検査することにより、細胞増殖およびアポトーシス等の検査を行うことができる。具体的には、本発明の検査試薬は、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達の異常の検査、ｐ５３蛋白質を介するシグナル伝達の異常の検査、細胞増殖異常の検査、アポトーシスの検査等に有用である。また疾患の検査にも有用である。すなわち、ＨＫ３３遺伝子の発現またはＡＲＦ蛋白質に対する相互作用の低下は、細胞増殖の低下またはアポトーシスを伴う疾患を引き起こしている可能性を示唆し、ＨＫ３３遺伝子の発現または該相互作用の亢進は細胞増殖の亢進を伴う疾患を引き起こしている可能性を示唆する。実際、腫瘍化した細胞においてＨＫ３３遺伝子の発現は有意に亢進していた。これは、ＨＫ３３遺伝子またはＨＫ３３蛋白質が腫瘍の検査に利用できることを示している。例えば、被検試料において、ＨＫ３３蛋白質または該蛋白質をコードするｍＲＮＡを検出することにより、腫瘍細胞の存在、腫瘍の進行度、腫瘍の悪性度、腫瘍の種類等を検査することが可能である。
本発明において「腫瘍の検査」とは、ＨＫ３３遺伝子の変異（構造的または発現量の変異）に起因して腫瘍を形成している患者の検査のみならず、被験者がＨＫ３３遺伝子の発現量の異常または遺伝子の変異に起因して癌にかかりやすいか否かを判断するために行う、ＨＫ３３遺伝子の発現量の検査、および遺伝子の変異の検査も含まれる。すなわち、ＨＫ３３遺伝子の発現の亢進や、ＨＫ３３対立遺伝子の片方に活性型の変異が生じることなどにより、表面上は未だ症状を発現していない場合においても、癌にかかる危険性が増大しているものと考えられる。
本発明の検査は、例えばＨＫ３３蛋白質に結合する抗体、あるいはＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用して行うことができる。該ポリヌクレオチドは、例えばＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡの検出、増幅、該ＤＮＡの発現の検出に有用である。ここで、ＤＮＡの検出には、ＤＮＡの変異の検出も含まれる。ここで「相補鎖」とは、上記と同様、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、相補的ヌクレオチド領域が完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。このポリヌクレオチドをプローブまたはプライマー等として用い、ＨＫ３３遺伝子の発現または変異を検出することにより、細胞増殖の異常または腫瘍等の細胞増殖性疾患の検査を行うことができる。すなわち本発明は、ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを用いて、ＨＫ３３遺伝子の発現量または構造の異常を検出する工程を含む、（ａ）ＡＲＦを介するシグナル伝達の異常、（ｂ）ｐ５３を介するシグナル伝達の異常、（ｃ）細胞増殖異常、（ｄ）細胞増殖性疾患、または（ｅ）腫瘍の検査方法を提供する。遺伝子の発現はｍＲＮＡを検出しても蛋白質を検出してもよい。また、遺伝子の構造の変異は、染色体ＤＮＡおよびｍＲＮＡのどちらを用いて調べてもよい。
ＨＫ３３蛋白質に結合する抗体による検査は、この抗体をＨＫ３３蛋白質が含まれると予想される試料と接触せしめ、該抗体と該蛋白質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、ＨＫ３３蛋白質の検出又は測定方法により実施することができる。ＨＫ３３蛋白質の発現の亢進は、細胞増殖の亢進、または細胞の癌化を示唆する。従って、例えばＨＫ３３遺伝子の発現量を検査することにより、細胞増殖の異常または腫瘍等の細胞増殖性疾患の検査を行うことができる。すなわち本発明は、ＨＫ３３蛋白質に結合する抗体を用いて、ＨＫ３３蛋白質の発現量または構造の異常を検出する工程を含む、（ａ）ＡＲＦを介するシグナル伝達の異常、（ｂ）ｐ５３を介するシグナル伝達の異常、（ｃ）細胞増殖異常、（ｄ）細胞増殖性疾患、または（ｅ）腫瘍の検査方法を提供する。
これらの抗体やポリヌクレオチドを検査試薬として用いる場合は、適宜安定剤、保存剤、塩、緩衝剤などの溶質と、それを溶かすものとしての水や生理食塩水などを組み合わせることができる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡチップやマイクロアレイの作製に利用することもできる。これらのＤＮＡチップやマイクロアレイは、本発明の検査に用いられ得る。
本発明の検査方法の一つは、被検試料中におけるＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡの発現量を検出する工程を含む方法である。このような検査方法は、（ａ）患者由来のＲＮＡ試料にＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを接触させる工程、（ｂ）該ＲＮＡ試料への該ポリヌクレオチドの結合を検出する工程、を含む方法が含まれる。このような検査は、例えばノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲなどにより行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲを利用した検査は、具体的には（ａ）患者由来のＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成する工程、（ｂ）合成したｃＤＮＡを鋳型に、上記ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行う工程、（ｃ）ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを検出する工程、を含む。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲは、公知の遺伝子工学技術により行うことができる。また、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイによる検出も可能である。
また、本発明の検査方法には、患者由来の被検試料中におけるＨＫ３３蛋白質量を検出する工程を含む方法が含まれる。このような検査は、例えばＨＫ３３蛋白質に対する抗体を用いて行うことができる。ＨＫ３３に対する抗体を用いた検査は、具体的には、（ａ）患者由来の蛋白質試料にＨＫ３３蛋白質に結合する抗体を接触させる工程、（ｂ）該蛋白質試料への該抗体の結合を検出する工程、を含む。蛋白質の検出は、ＨＫ３３蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡなどにより行うことができる。
これらの検査は、具体的には、例えばバイオプシーにより採取した組織に対して、免疫組織染色あるいはｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の方法で発現を調べる事によりＨＫ３３遺伝子の発現異常を起した病巣を特定することが考えられる。ＨＫ３３遺伝子の発現の亢進は、例えば癌の発症および／または進展の可能性を示唆する。また、癌などの疾患は、種々の原因で起こっていると考えられる。例えば癌においてＨＫ３３遺伝子の発現の亢進が認められた場合、ｐ５３経路が抑制されていることが予測される事から、この経路を標的とした治療法を施行する、と云ったテーラーメード療法を行う際の診断に利用することが考えられる。
本発明の検査は、また、ＨＫ３３蛋白質における変異または該蛋白質をコードするＤＮＡにおける変異を検出することによって行うことも考えられる。ＨＫ３３遺伝子は癌の発症および／または進展に関与していると考えられることから該蛋白質および該ＤＮＡの変異は、癌の発症や進展の危険を示唆する。
ＨＫ３３蛋白質の変異には、構造的変異および機能的変異が含まれる。例えば、ＨＫ３３蛋白質に対する抗体を用いて、患者由来の蛋白質試料のウェスタンブロット等により蛋白質の分子量を健常者由来の蛋白質と比較することにより、蛋白質の構造的変異を検査することができる。また、蛋白質の修飾の変化、ＨＫ３３蛋白質と結合する蛋白質または抗体の結合性の変化などを指標に、ＨＫ３３蛋白質の変異を検出することもできる。これらの検査には、例えばＨＫ３３蛋白質に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法などを利用することができる。
本発明の検査は、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との結合を検出することにより行うこともできる。ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との結合の亢進は、癌の発症や進展に寄与していると考えられる。蛋白質の結合は、例えばＨＫ３３蛋白質またはＡＲＦ蛋白質に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法などにより評価することができる。
ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡにおける変異の検出には、ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが利用され得る。該ヌクレオチドは、ＨＫ３３蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列、およびゲノムＤＮＡ配列（エキソン、イントロン、および内因性転写制御配列を含む）の塩基配列、またはその相補鎖と相補的なポリヌクレオチド（プローブおよびプライマー）である。なお、変異の検査には、ＨＫ３３対立遺伝子の片方のアレルに変異を持つ患者（キャリアー）を特定するための検査も含まれる。また、一塩基多型（ＳＮＰ）の型を決定するための検査も含まれる。ＨＫ３３遺伝子の多型は、癌の罹りやすさに関連する可能性がある。
プライマーとして用いられる場合、ポリヌクレオチドは、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、ＨＫ３３遺伝子またはその発現を調節する領域の少なくとも一部を増幅しうるものであればいかなるものでもよい。このような領域としては、例えば、ＨＫ３３遺伝子のエキソン領域、イントロン領域、プロモーター領域、エンハンサー領域が含まれる。
一方、プローブとしてのポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドであれば、通常、少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。プラスミドＤＮＡなどのベクターに組み込んだクローンから得た二本鎖ＤＮＡをプローブとして用いることも可能である。プローブとしては、ＨＫ３３遺伝子またはその発現を調節する領域の少なくとも一部の塩基配列またはそれらの相補鎖に相補的であればいかなるものでもよい。プローブがハイブリダイズする領域としては、例えば、ＨＫ３３遺伝子のエキソン領域、イントロン領域、プロモーター領域、エンハンサー領域が含まれる。プローブとして用いる場合、ポリヌクレオチドあるいは二本鎖ＤＮＡは適宜標識して用いられる。標識する方法としては、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてポリヌクレオチドの５’端をラジオアイソトープの３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法や、クレノウ酵素などのＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドなどをプライマーとして３２Ｐなどのラジオアイソトープや、蛍光色素あるいはビオチンなどによって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法など）が挙げられる。
ＨＫ３３遺伝子の変異を検出する方法の一つの態様は、患者のＨＫ３３遺伝子の塩基配列を直接決定する方法である。例えば、上記ヌクレオチドをプライマーとして、ＨＫ３３遺伝子の変異に起因する疾患の疑いのある患者から単離したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法などにより、患者のＨＫ３３遺伝子の一部もしくは全部（例えばエキソン、イントロン、プロモーター、エンハンサーを含む領域）を増幅し、その塩基配列の決定を行う。これを健常者のＨＫ３３遺伝子の配列と比較することにより、ＨＫ３３遺伝子の変異に起因する疾患を検査することができる。
本発明の検査方法としては、このように直接患者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に種々の方法が用いられる。その一つの態様は、（ａ）患者からＤＮＡ試料を調製する工程、（ｂ）ＨＫ３３蛋白質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをプライマーとして患者由来のＤＮＡを増幅する工程、（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程、（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程、および（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、を含む。
このような方法として、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｏｎｙｍｏｕｓ　Ａｌｕ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｏｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２　Ｊａｎ　１；１２（１）：１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒｓ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１　Ａｕｇ　１；６（８）：１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ　ＰＣＲ−ＳＳＣＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．１９９５　Ａｐｒ　１；４（５）：２７５−２８２．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また試料の量も少なくてすむなどの利点を有するため、特に多数のＤＮＡサンプルをスクリーニングするのに好適である。その原理は以下の如くである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入などによる変異が存在することを検出することができる。
具体的には、まず、ＨＫ３３遺伝子の一部、あるいは全部をＰＣＲ法などによって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。また、増幅される領域としては、ＨＫ３３遺伝子の全てのエキソン、全てのイントロンの他、ＨＫ３３遺伝子のプロモーター、エンハンサーなどが挙げられる。ＰＣＲによる遺伝子断片増幅の際、３２Ｐなどのラジオアイソトープ、あるいは蛍光色素やビオチンなどによって標識したプライマーを用いるか、あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐなどのラジオアイソトープ、あるいは蛍光色素やビオチンなどによって標識した基質塩基を加えてＰＣＲを行うことによって合成されるＤＮＡ断片を標識する。あるいはＰＣＲ後にクレノウ酵素などを用いて３２Ｐなどのラジオアイソトープ、あるいは蛍光色素やビオチンなどによって標識した基質塩基を合成されたＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識されたＤＮＡ断片を、熱を加えることなどにより変性し、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析する。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することにより、バンドを検出することができる。
本発明の検査方法の他の態様は、（ａ）患者からＤＮＡ試料を調製する工程、（ｂ）上記ポリヌクレオチドをプライマーとして用いて患者由来のＤＮＡを増幅する工程、（ｃ）増幅したＤＮＡを切断する工程、（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程、（６）分離したＤＮＡ断片に対し、検出可能な標識プローブでハイブリダイズさせる工程、および（ｆ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、健常者の対照と比較する工程、を含む。
このような方法としては、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などが挙げられる。ＤＮＡを切断する酵素としては、通常、制限酵素を用いる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入、または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが健常者と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、プローブを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも患者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後サザンブロッティングを行うこともできる。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＨＫ３３遺伝子の一部、あるいは全部を増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることもできる。
また、患者から調製したＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いても同様に検出を行うことが可能である。このような方法は、（ａ）患者からＲＮＡ試料を調製する工程、（ｂ）大きさに応じて調製したＲＮＡを分離する工程、（ｃ）分離したＲＮＡに対し、検出可能な標識をした上記ポリヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイズさせる工程、および（ｄ）検出されたＲＮＡの大きさを、健常者の対照と比較する工程、を含む。具体的な方法の一例としては、患者から調製したＲＮＡを電気泳動し、プローブを用いてノーザンブロッティングを行い、移動度の差を検出する。
本発明の検査方法の他の態様は、（ａ）患者からＤＮＡ試料を調製する工程、（ｂ）上記ポリヌクレオチドをプライマーとして患者由来のＤＮＡを増幅する工程、（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、および（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、を含む方法である。
このような方法としては、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）が挙げられる。ＨＫ３３遺伝子の一部あるいは全部を、上記ポリヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ法などによって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、健常者と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
これら方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法などにより検出できる。また、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、ＨＫ３３遺伝子の一部あるいは全部をＰＣＲ法などによって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだＨＫ３３　ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィーなどで検出することによって変異の存在を検出することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］　ｃＤＮＡのクローニングとシークエンス
酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法によりマウスＡＲＦ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする遺伝子の単離を試みた。具体的には、マウスｐ１９ＡＲＦをコードする遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ７６０９２）を酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ用ベクターｐＯＤＢ８に組み込み、酵母株ＰＪ６９／２Ａに遺伝子導入した。遺伝子導入した酵母は、トリプトファンを除いた基礎培地で選択し、クローニングした。このｐ１９ＡＲＦを導入した酵母とプレトランスフォームドライブラリー酵母（クロンテック社）とを接合させ、トリプトファン、ロイシンを除いた基礎培地で生育する酵母を単離した。単離した酵母より、遺伝子断片を摘出し、ＤＮＡ配列をジデオキシチェーンターミネーション法により、ＡＢＩ３７７自動塩基配列決定機を用い分析した結果、単離された遺伝子断片の配列は、ＤＮＡ配列データバンク内に登録されているヒトＨｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅ　３３（ＨＫ３３）として知られている遺伝子と１００％の同一性を有していた。
［実施例２］　遺伝子導入によるＣＯＳ７細胞での相互作用の確認
ｐ１９ＡＲＦおよびマウスＨＫ３３遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｙ０９０４６）をコードした配列を哺乳動物用Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄベクターに組み換え、ＣＯＳ７細胞にＧＡＬ４−レポーター遺伝子と共にそれぞれのＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄベクターと遺伝子導入することによって、相互作用を確認した。相互作用の確認にはレポーター蛋白であるルシフェラーゼの活性によって測定した。測定には、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイシステム（プロメガ社）を用いた。実験の結果、これら二つの蛋白質は有意に相互作用していることが確認された（図１）。
［実施例３］　免疫沈降法による相互作用の確認
実際に二つの蛋白質が相互作用をしているかどうかを確認するために、ｐ１９ＡＲＦｍｙｃ、ＧＦＰ−ＨＫ３３発現ベクターをＣＯＳ７細胞に遺伝子導入、蛋白質発現させ、モノクローナルｍｙｃ抗体によって蛋白質複合体を沈降させた。さらに、この複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、モノクローナルＧＦＰ抗体で相互作用を検出した（図２）。対照として、ＧＳＴ　Ｔｅｓｍｉｎ、ＬＫＢ　Ｍｙｃ、ＭＰＤ　Ｍｙｃを組み合わせて用いた。この実験の結果、ｐ１９ＡＲＦ蛋白質によりＧＦＰは免疫沈降しなかったが、ＧＦＰ−ＨＫ３３蛋白質においては免疫沈降された。この結果から、ＧＦＰ−ＨＫ３３蛋白質とｐ１９ＡＲＦ蛋白質の相互作用が免疫沈降法によっても確認された。
［実施例４］　ｐ１９ＡＲＦ結合部位の同定
ｐ１９ＡＲＦ１−８０、及びｐ１９ＡＲＦ８１−Ｓｔｏｐをコードしたミュータントｐ１９ＡＲＦをｐＯＤＢ８ベクターに組み換えクローニングし、ｐＡＣＴ−２ベクターに組み込んだＨＫ３３遺伝子を酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法によって相互作用を確認した。その結果、ｐＡＣＴ−２／ＨＫ３３遺伝子産物とｐ１９ＡＲＦ１−８０クローンではレポーターのβ−ＧＡＬ活性はネガティブであったが、ｐ１９ＡＲＦ８１−Ｓｔｏｐ遺伝子産物においてはβ−ＧＡＬ活性がポジティブであった（図３）。この結果より、ＨＫ３３蛋白質は、ｐ１９ＡＲＦ中のｐ１６ＩＮＫ４ａと共有した部位とは結合せずに、ｐ１９ＡＲＦ特異的な部位と相互作用することが示された。
［実施例５］　細胞内での局在
哺乳動物細胞発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にｐ１９ＡｋＦにｍｙｃタグを付加した遺伝子を、また、ＧＦＰ蛋白と融合させて発現させるベクター（ｐＥＧＦＰＣ１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にＨＫ３３遺伝子をそれぞれ組み込み、蛋白質発現ベクターＧＦＰ−ＨＫ３３、およびｐ１９ＡＲＦｍｙｃを構築した。ｐ１９ＡＲＦｍｙｃ、ＧＦＰ−ＨＫ３３、ｐ１９ＡＲＦｍｙｃ＋ＧＦＰ−ＨＫ３３をＮＩＨ３Ｔ３細胞に遺伝子導入し、蛍光レーザー顕微鏡（オリンパス社）を用いて細胞内での局在を調べた。ｐ１９ＡＲＦｍｙｃの検出にはｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社）で反応させ、その抗体をテキサスレッド結合二次抗体で反応させ検出した。一方、ＨＫ３３蛋白質はＧＦＰ自身の発光により検出した。実験の結果、ＧＦＰ−ＨＫ３３は細胞質に局在していることが示され、ｐ１９ＡＲＦ蛋白質単独では核小体に蓄積する事が明らかとなった。一方、ｐ１９ＡＲＦ＋ＧＦＰ−ＨＫ３３の共遺伝子導入においては、ｐ１９ＡＲＦが核では検出されず、細胞質に局在していることが示された。この結果より、ＧＦＰ−ＨＫ３３とｐ１９ＡＲＦの結合によって、ｐ１９ＡＲＦの核移行を阻害することを明らかにした（図４）。
［実施例６］　Ｐｏｓｔｃｒｉｓｉｓ、Ｐｒｅｃｒｉｓｉｓ細胞におけるＨＫ３３遺伝子の発現
正常ヒト細胞にＳＶ４０遺伝子を導入し、不死化させる過程（ＢＦＴ、ＢＥＴ、ＲＫＦ−Ｔ＊Ｌｉｆｒｏｕｍａｎｉ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｐ５３欠損細胞、それぞれの不死化前と不死化中）の細胞からトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは６５℃で変性させた後、リバーストランスクリプターゼ：スーパースクリプト２（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社）を用いｃＤＮＡを作成した。これらのｃＤＮＡをテンプレートに用い、ＨＫ３３の反応には、配列番号：１および２のオリゴプライマーを用い、９４℃１分，５５℃２分，７２℃３分を３２サイクルの条件で、ＧＡＰＤＨの反応には配列番号：３および４のオリゴプライマーを用い、９４℃１分，５８℃２分，７２℃３分を３０サイクルの条件で解析した。ＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ　Ａｎｔｉｇｅｎの遺伝子を導入し、老化状態である細胞Ｐｒｅｃｒｉｓｉｓ細胞と、老化状態からセルクライシスを逃れた細胞Ｐｏｓｔｃｒｉｓｉｓ細胞とのＨＫ３３遺伝子発現量を比較した。その結果、繊維芽細胞、血管内皮細胞、ＲＫＦ−Ｔ＊Ｌｉｆｒｏｕｍａｎｉ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｐ５３欠損細胞において、それぞれ有意にＰｏｓｔｃｒｉｓｉｓ細胞において発現が亢進した。この結果より、細胞老化から逃れた不死化細胞においてＨＫ３３によるｐ１９ＡＲＦの不活性化が起きている可能性が考えられた（図５）。この知見はｐ１９ＡＲＦの不活性化が細胞寿命延長を引き起こすという報告と一致する（Ｃａｒｎｅｒｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．（３）：１４８−５５）。
［実施例７］　ＨＫ３３遺伝子の強制発現によるｐ５３依存性転写活性の抑制
本実施例にはメタロチオネインプロモーターに亜鉛イオンが働くことによって、ＨＡタグが付加されたｐ１９ＡＲＦ（ＨＡ−ｐ１９ＡＲＦ）の発現を制御できるようにした細胞ＮＩＨ／ＡＲＦ細胞を用いた（Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１８：２７１８−２７，１９９９参照）。Ｘｐｒｅｓｓタグを付加した発現ベクター（ｐｃＤＮＡ４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＨＫ３３遺伝子のセンスまたはアンチセンスを結合させＨＫ３３発現ベクターとして用いた。ｐ５３蛋白質の分解活性のポジティブコントロールとして、ＭＤＭ２発現ベクターを用いた。また、ｐ５３依存性転写活性の指標としてｐＧ１３Ｌｕｃベクター、遺伝子導入効率のコントロールとしてｐＲＬ−ＴＫベクター（プロメガ社）を共に遺伝子導入し、細胞溶解後ルシフェラーゼによってｐ５３依存性転写活性を測定した。細胞に遺伝子を導入し、２４時間後に、１．０ｍＭのＺｎ２＋を加えた培地あるいは、培地のみのもので培地交換し、２４時間後に細胞を溶解し、蛋白質の発現解析とレポーター活性の測定を行った。ウエスタンブロッティング法により、センスにおいてＨＫ３３蛋白質が発現し、アンチセンスによってはＨＫ３３蛋白質が発現していないことが確認された。また、Ｚｎ２＋によってＨＡタグが付加されたｐ１９ＡＲＦの発現が誘導されたことがウエスタンブロッティングによって示された（図６上パネル）。さらに、ｐ５３のレポーター活性の解析の結果、ＭＤＭ２によるｐ５３分解活性をわずかにＨＡ−ｐ１９ＡＲＦが抑制することが判明した。またＨＫ３３遺伝子のセンスを導入したとき、アンチセンスに比べて有意にｐ１９ＡＲＦによるｐ５３の発現上昇を抑制することが示された。この実験結果より、ＨＫ３３蛋白質の発現によって有意にｐ１９ＡＲＦによるｐ５３依存性転写活性を抑制できることを示した。
産業上の利用の可能性
本発明者らは、ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質とが相互作用すること、またその相互作用によってＡＲＦ蛋白質の核移行が阻害され、ＡＲＦの機能を阻害することを明らかにした。さらに、ＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ　Ａｎｔｉｇｅｎの遺伝子導入により細胞老化を逃れるステージに達した不死化細胞（Ｐｏｓｔｃｒｉｓｉｓ細胞）において、不死化前のステージの細胞（Ｐｒｅｃｒｉｓｉｓ細胞）に比べてＨＫ３３遺伝子の発現上昇が起こることを示した。本発明により、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質の相互作用を利用した抗腫瘍作用を持つ薬剤のスクリーニングが可能となる。また、本発明により、該相互作用またはＨＫ３３遺伝子の発現を調節することにより、ＡＲＦ蛋白質を介するシグナル伝達、特に細胞周期や細胞増殖を調節するための方法、およびそのために用いられる分子が提供された。また本発明により、ＨＫ３３蛋白質またはＨＫ３３蛋白質をコードする遺伝子を利用して、腫瘍等の疾患の検査を行うことが可能となった。ＨＫ３３蛋白質とＡＲＦ蛋白質との相互作用を抑制する薬剤のスクリーニングは、ＡＲＦ蛋白質の不活性化による細胞増殖、あるいは不死化した前癌状態の細胞の増殖を抑制できる新規の薬剤開発を可能とすると考えられる。
【配列表】
2002020770.tif 000002
2002020770.tif 000003
2002020770.tif 000004
【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＯＳ７細胞を用いた哺乳動物Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ系により、ＡＲＦ蛋白質とＨＫ３３蛋白質との相互作用を確認した結果を示す図である。二つの蛋白質は有意に相互作用していることが確認された。
図２は、ｐ１９ＡＲＦｍｙｃおよびＧＦＰ−ＨＫ３３発現ベクターを導入したＣＯＳ７細胞の細胞抽出液を用いた免疫沈降により、ｐ１９ＡＲＦｍｙｃ蛋白質とＧＦＰ−ＨＫ３３蛋白質との相互作用を確認した結果を示す写真である。ＧＦＰ−ＨＫ３３蛋白質とｐ１９ＡＲＦ蛋白質の相互作用が免疫沈降法によっても確認された。
図３は、ｐ１９ＡＲＦ１−８０、及びｐ１９ＡＲＦ８１−Ｓｔｏｐをコードしたｐ１９ＡＲＦ欠失体とＨＫ３３蛋白質との相互作用を酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法によって確認した結果を示す図である。ＨＫ３３蛋白質は、ｐ１９ＡＲＦ８１−Ｓｔｏｐと相互作用することが示された。
図４は、ｐ１９ＡＲＦｍｙｃ蛋白質とＧＦＰ−ＨＫ３３蛋白質をＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現させ、細胞内局在を調べた結果を示す写真である。ＧＦＰ−ＨＫ３３単独では細胞質に局在しており、ｐ１９ＡＲＦ蛋白質単独では核小体に蓄積していた。一方、ｐ１９ＡＲＦ＋ＧＦＰ−ＨＫ３３の共発現においては、ｐ１９ＡＲＦが核では検出されず、細胞質に局在していることが示された。この結果より、ＧＦＰ−ＨＫ３３とｐ１９ＡＲＦの結合によって、ｐ１９ＡＲＦの核移行が阻害されることが明らかになった。
図５は、正常ヒト細胞にＳＶ４０遺伝子を導入し、不死化させる過程（ＢＦＴ、ＢＥＴ、ＲＫＦ−Ｔ＊Ｌｉｆｒｏｕｍａｎｉ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｐ５３欠損細胞、それぞれの不死化前と不死化中）の細胞におけるＨＫ３３遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す写真である。上段がＨＫ３３遺伝子、下段がコントロールとして検出したＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を表す。ＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ　Ａｎｔｉｇｅｎの遺伝子を導入し、老化状態である細胞Ｐｒｅｃｒｉｓｉｓ細胞と、老化状態からセルクライシスを逃れた細胞Ｐｏｓｔｃｒｉｓｉｓ細胞とのＨＫ３３遺伝子発現量を比較した。繊維芽細胞、血管内皮細胞、ＲＫＦ−Ｔ＊Ｌｉｆｒｏｕｍａｎｉ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｐ５３欠損細胞において、それぞれ有意にＰｏｓｔｃｒｉｓｉｓ細胞において発現が亢進していることが判明した。
図６は、ＨＫ３３遺伝子の強制発現によるｐ５３依存性転写活性の抑制を示す写真および図である。ＨＡタグが付加されたｐ１９ＡＲＦ（ＨＡ−ｐ１９ＡＲＦ）の発現を亜鉛イオンの添加により制御できるようにしたＮＩＨ／ＡＲＦ細胞に、マウスＨＫ３３遺伝子のセンス（Ｈｉｓ−ｍａｘ／ｍＨＫ３３−Ｓ）またはアンチセンス（Ｈｉｓ−ｍａｘ／ｍＨＫ３３−ＡＳ）を発現させた。ｐ５３蛋白質の分解活性のポジティブコントロールとして、ＭＤＭ２発現ベクターを用いた。また、ｐ５３依存性転写活性の指標としてｐＧ１３Ｌｕｃベクターを用いて、ルシフェラーゼによってｐ５３依存性転写活性を測定した。上パネルは細胞に遺伝子を導入し、２４時間後に、１．０ｍＭのＺｎ２＋を加えた培地あるいは加えない培地で培地交換し、２４時間後の細胞のマウスＨＫ３３（ｍＨＫ３３）およびＨＡ−ｐ１９ＡＲＦ（ＨＡ−ｐ１９）蛋白質の発現を、それぞれＸｐｒｅｓｓ抗体およびＨＡポリクローナル抗体によるウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。下パネルは、ｐ５３レポーター活性の解析結果を示す。
【図１】
2002020770.tif 000005
【図２】
2002020770.tif 000006
【図３】
2002020770.tif 000007
【図４】
2002020770.tif 000008
【図５】
2002020770.tif 000009
【図６】
2002020770.tif 000010
【国際調査報告】
2002020770.tif 000011
2002020770.tif 000012
2002020770.tif 000013
2002020770.tif 000014