(57)【要約】本発明は、子宮癌患者ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化するヒトパピローマウイルス抗原上のエピトープおよびそのエピトープにより活性化された子宮癌病変および子宮癌前病変特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞の提供をその目的とする。本発明によるエピトープは、（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列または（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入からなる群から選択される１以上の改変を有し、かつ子宮癌病変および子宮癌前病変特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化できる配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるものである。
2002100889.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列を含んでなるペプチド：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入からなる群から選択される１以上の改変を有し、かつ子宮癌病変および子宮癌前病変特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化できる配列番号１のアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドとＩＬ−１２とを含んでなる培地において末梢血単核球を培養することによって得ることができる、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞。
【請求項３】
子宮癌病変および子宮癌前病変に対する腫瘍細胞障害を誘導できる、請求項２に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞。
【請求項４】
子宮癌病変および子宮癌前病変がパピローマウイルスにより生じたものである、請求項２に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞。
【請求項５】
末梢血単核球が子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離されたものである、請求項２〜４のいずれか一項に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドとＩＬ−１２とを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養することによって得ることができる、ヒトパピローマウイルス１６のＥ７タンパク質が発現している子宮癌病変および子宮癌前病変に対する腫瘍細胞障害を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドを含んでなる培地において末梢血単核球を培養することによって得ることができる、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞。
【請求項８】
子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的な抗体の産生を誘導できる、請求項７に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞。
【請求項９】
子宮癌病変および子宮癌前病変がパピローマウイルスにより生じたものである、請求項７に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞。
【請求項１０】
末梢血単核球が子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離されたものである、請求項７〜９のいずれか一項に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養することによって得ることができる、ヒトパピローマウイルス１６のＥ７タンパク質が発現している子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的な抗体の産生を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞。
【請求項１２】
請求項２〜６のいずれか一項に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞および／または請求項７〜１１のいずれか一項に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞を含んでなる、子宮癌の治療および予防用医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍療法に用いられる請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
子宮癌の治療および予防に用いられる医薬の製造のための、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞および／または請求項７〜１１のいずれか一項に記載のＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の使用。
【請求項１５】
請求項１に記載のペプチドとＩＬ−１２とを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養し、培養物からＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞を採取し、次いでそのＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞を患者の体内に戻す工程を含んでなる、子宮癌の治療および予防法。
【請求項１６】
請求項１に記載のペプチドを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養し、培養物からＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞を採取し、次いでそのＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞を患者の体内に戻す工程を含んでなる、子宮癌の治療および予防法。
【請求項１７】
請求項１に記載のペプチドとＩＬ−１２とを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養し、次いでＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞を回収する工程を含んでなる、子宮癌病変および子宮癌前病変に対する腫瘍細胞障害を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の製造法。
【請求項１８】
請求項１に記載のペプチドを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養し、次いでＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞を回収する工程を含んでなる、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的な抗体の産生を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の製造法。
【請求項１９】
請求項１に記載のペプチドを含んでなる、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の腫瘍細胞障害誘導能活性化剤。
【請求項２０】
ＩＬ−１２と組み合わせて用いられる、請求項１９に記載の活性化剤。
【請求項２１】
請求項１に記載のペプチドを含んでなる、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の抗体産生誘導能活性化剤。
【請求項２２】
子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の腫瘍細胞障害誘導能活性化剤の製造のための、請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項２３】
子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の抗体産生誘導能活性化剤の製造のための、請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項２４】
請求項１に記載のペプチドとＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞とをＩＬ−１２存在下で接触させる工程を含んでなる、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の腫瘍細胞障害誘導能を活性化する方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のペプチドとＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞とを接触させる工程を含んでなる、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の抗体産生誘導能を活性化する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明はヒトパピローマウイルスＥ７抗原のエピトープに関し、更に詳細には、子宮癌に特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞の細胞障害誘導能および抗体産生誘導能を活性化するＥ７抗原エピトープに関する。本発明は更に、ヒトパピローマウイルスのＥ７抗原エピトープにより活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた子宮癌の治療および予防にも関する。
背景技術
免疫担当細胞と言われる細胞のうちＴ細胞は感染から生体を守るための外来抗原の排除や癌細胞除去の為の細胞障害活性などの重要な働きを持つ。これらのＴ細胞は抗原ペプチドのアミノ酸配列を厳密に認識してＴ細胞自身を活性化する。その際に抗原ペプチドを認識する構造をＴ細胞レセプターと呼び、そのＴ細胞レセプターと結合する特異的アミノ酸配列を「抗原決定基：エピトープ」と呼ぶ。このエピトープがＴ細胞に認識されなければＴ細胞依存性の免疫反応は開始されないため、抗原において最も重要な部分であると考えられる。したがって、腫瘍制御や感染制御など治療を目的とした研究においては抗原のエピトープを決定することが第一の目的となる。
腫瘍を免疫学的に排除するためには、免疫担当細胞のうち抗原提示細胞とＴ細胞および両細胞に結合する抗原（これを癌を引き起こす抗原と区別するために「癌隔絶抗原」と呼ぶ）を同定しなければならない。動物実験での解析報告はあるものの、実際の患者において細胞障害性Ｔリンパ球（以下ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の認識する癌隔絶抗原を同定することは困難である。その理由として、担癌患者では既にＣＴＬとともに癌抗原に結合する主要組織適合性複合体（以下ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ分子が癌細胞ではその発現が減弱していること、およびＣＴＬは癌隔絶抗原に対してトレランス（免疫寛容）が成立していることが挙げられる。このように癌が進行した生体では細胞性免疫にはトレランスの成立が認められる。しかし一方では、液性免疫は保たれており、癌抗原に対する抗体を産生し続ける。これはＣＤ４陽性Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示された抗原を認識する機構が保たれていることを示している。
ところで、ヒトパピローマウイルス（以下ＨＰＶ）は子宮頸部上皮基底層に持続感染する。子宮癌患者の手術標本を観察した報告によると癌病変の８０％からＨＰＶウイルスが検出される。さらに子宮頸部の前癌病変においても５０％以上の頻度でＨＰＶウイルスＤＮＡが検出される。また、このウイルスのＤＮＡを用いた研究ではウイルスの産生するＥ６とＥ７タンパクがヒト子宮由来線維芽細胞をトランスフォーメーションすることや癌抑制遺伝子産物のｐ５３の作用を抑制することが知られている。この様にＨＰＶは子宮癌の病因物質のひとつであることが知られている（ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ  Ｈ．Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９１；１８４：９−１３．）。
ＨＰＶ由来の抗原を使用したＣＴＬやＮＫ細胞による癌の細胞治療法が試みられてきたが、ＭＨＣクラスＩの発現低下やＴ細胞のトレランスが障害となっていた（Ｈｉｌｄｅｒｓ  ＣＧ．Ｍｕｎｏｚ  ＩＭ．Ｎｏｏｙｅｎ  Ｙ．Ｆｌｅｕｒｅｎ  ＧＪ．Ａｌｔｅｒｅｄ  ＨＬＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ，１９９５．５７：３６６−３７５；１６．Ｋｏｎｏ  Ｋ．Ｒｅｓｓｉｎｇ  ＭＥ．Ｂｒａｎｄｔ  ＲＭ．Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ．Ｐｏｔｋｕｌ  ＲＫ．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ  Ｍ．Ｋａｓｔ  ＷＭ．Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ  Ｒ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｚｅｔａ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９６，２：１８２５−１８２８．）。一方、ＣＤ４陽性細胞ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞はトレランスに陥らないものの、抗体産生に関してのみ機能するとされてきた。近年、動物実験等による解析が進み、Ｔｈ細胞もＴＮＦαやＦａｓリガンドなど細胞障害活性を持つことが明かとなった。さらに、Ｔｈ細胞の一群であるＴｈ１タイプＴ細胞はＴｈ２タイプＴ細胞よりもＴＮＦαの発現が強く、ＩＦＮγやＩＬ−１２といったサイトカインを介して、抗原提示細胞とＣＴＬの活性化やＴｈ１タイプＴ細胞の活性化の相乗効果を発揮することも明かとなっており、腫瘍細胞に対する治療効果への期待がＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＤ８陽性Ｔ細胞からＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＣＤ４陽性Ｔ細胞に移行しつつある（Ｙａｓｕｋａｗａ  Ｍ．Ｏｈｍｉｎａｍｉ  Ｈ．Ｋａｎｅｋｏ  Ｓ．Ｙａｋｕｓｈｉｊｉｎ  Ｙ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ．Ｉｎｏｋｕｃｈｉ  Ｋ．Ｍｉｙａｋｕｎｉ  Ｔ．Ｎａｋａｏ  Ｓ．Ｋｉｓｈｉ  Ｋ．Ｋｕｂｏｎｉｓｈｉ  Ｉ．Ｄａｎ  Ｋ．Ｆｕｊｉｔａ  Ｓ．ＣＤ４（＋）ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ  ｂ３ａ２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｕｇｍｅｎｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒ  ｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｂ３ａ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ＨＬＡ−ＤＲ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｍａｎｎｅｒ．Ｂｌｏｏｄ．１９９８，９２：３３５５−３３６１．）。
このような状況の下、いくつかのＭＨＣ分子ではＭＨＣ分子に結合しやすいと想定されるアミノ酸配列が、分子生物物理学的手法を使って解析され、その共通モチーフは既に報告されている（Ｈａｍｍｅｒ  Ｊ，Ｖａｌｓａｓｎｉｎｉ  Ｐ，Ｔｏｌｂａ  Ｋ，Ｂｏｌｉｎ  Ｄ，Ｈｉｇｅｌｉｎ  Ｊ，Ｔａｋａｃｓ  Ｂ，Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ  Ｆ．Ｐｒｏｍｉｓｃｕｓ  ａｎｄ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｃｈｏｒｓ  ｉｎ  ＨＬＡ−ＤＲ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｐｔｉｄｅｓ．Ｃｅｌｌ，１９９３，７４，１９７−２０３；Ｆｕｊｉｓａｏ  Ｓ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｓ．Ｎｉｓｈｉ  Ｔ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＲ９（ＤＲＢ１＊０９０１）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｆＵＳＥ５  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，４５：１３１−１３６）。しかし、ＨＰＶに関してＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＣＤ４陽性細胞の認識する癌隔絶抗原のエピトープはこれまで同定されていない。
発明の概要
本発明者らは、子宮癌の原因のひとつであるヒトパピローマウイルスＥ７抗原の中にヒトＴｈ２タイプＴ細胞（Ｔｈ２細胞）をインビトロで活性化できる新規配列を見いだした。
本発明者らはまた、この特定されたアミノ酸配列に基づいてペプチドを合成し、これとＩＬ−１２を用いて患者末梢血単核球をインビトロで刺激することにより腫瘍細胞傷害を誘導できるヒトＴｈ１タイプＴ細胞（Ｔｈ１細胞）を誘導することに成功した。このＴ細胞はＩＦＮγとＴＮＦαとＦａｓリガンドを産生しており、これらの因子を産生するＴ細胞はヒトパピローマウイルスが持続感染しＥ７タンパクを発現している子宮癌病変あるいは子宮癌前病変に対する細胞治療に有効な細胞である。
本発明は子宮癌患者ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化するヒトパピローマウイルス抗原上のエピトープを提供することをその目的とする。
本発明はまた、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞およびその製造法、腫瘍療法に用いられる子宮癌の治療および予防用医薬組成物、並びにＣＤ４陽性Ｔ細胞の腫瘍細胞障害誘導能および抗体産生誘導能を活性させるための組成物の提供をその目的とする。
本発明によるヒトパピローマウイルス抗原のエピトープは、下記のアミノ酸配列を含んでなるものである：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入からなる群から選択される１以上の改変を有し、かつ子宮癌病変および子宮癌前病変特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化できる配列番号１のアミノ酸配列。
本発明による子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞は、本発明によるエピトープとＩＬ−１２とを含んでなる培地において末梢血単核球を培養することによって得ることができるものである。
本発明による子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞は、本発明によるエピトープを含んでなる培地において末梢血単核球を培養することによって得ることができるものである。
発明の具体的説明
Ｅ７抗原エピトープ
本発明によるＥ７エピトープは配列番号１のアミノ酸配列またはその改変配列を含んでなるものである。改変配列中の改変数は、１〜数個であることができる。
本発明において、「子宮癌病変および子宮癌前病変特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化できるアミノ酸配列」とは、当業者により子宮癌病変および子宮癌前病変特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化できると評価されるアミノ酸配列をいい、例えば、実施例４と同様の条件においてヒトパピローマウイルス１６のＥ７タンパク質が発現している子宮癌病変または子宮癌前病変に対する抗体の産生を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の増殖が認められたアミノ酸配列や、実施例５と同様の条件においてヒトパピローマウイルス１６のＥ７タンパク質が発現している子宮癌病変または子宮癌前病変に対する腫瘍細胞障害を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の増殖が認められたアミノ酸配列を意味するものとする。
本発明において「子宮癌」とは子宮体癌および子宮頸癌を含む意味で用いられる。
本発明において「子宮癌病変および子宮癌前病変」は、肉眼により、細胞診により、または生検組織診により子宮癌病変または子宮癌前病変と認められたものをいう。子宮癌病変および子宮癌前病変はパピローマウイルス、特にヒトパピローマウイルス１６、により生じたものであることができる。
「子宮癌病変」としては、例えば、上皮内癌（ＣＩＳ）および進行癌（ＩＣ）が挙げられる。
「子宮癌前病変」としては、例えば、病変の異形度が低い症例（ＣＩＮ１、ＣＩＮ２）および前癌状態（ＣＩＮ３）が挙げられる。
本発明において「パピローマウイルス」は、ヒトパピローマウイルスであることができ、より具体的には、ヒトパピローマウイルス１６、ヒトパピローマウイルス１８、およびヒトパピローマウイルス３３であることができる（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｈ，Ｋａｗａｎａ  Ｔ，Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｋ，Ｍｉｚｕｎｏ  Ｍ，Ｙｏｓｈｉｋｕｒａ  Ｈ，Ｉｗａｍｏｔｏ  Ａ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９１；８２：５２４−５３１；Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｈ，Ｏｎｄａ  Ｔ，Ｋａｗａｎａ  Ｔ，Ｉｗａｍｏｔｏ  Ａ，Ｔａｋｅｔａｎｉ  Ｙ．Ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９６；７８：１９３５−１９４１）。
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化
本発明によるエピトープはＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の抗体産生誘導能を活性化させるだけでなく（実施例４）、免疫寛容が成立したＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の腫瘍細胞障害誘導能をＩＬ−１２の存在下で活性化させることができる（実施例５）。
従って本発明によれば、本発明によるエピトープとＩＬ−１２とを含んでなる培地において末梢血単核球を培養することによって得ることができる、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞が提供される。
本発明によればまた、本発明によるエピトープを含んでなる培地において末梢血単核球を培養することによって得ることができる、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞が提供される。
本発明によれば、本発明によるエピトープを含んでなるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の腫瘍細胞障害誘導能活性化剤および本発明によるエピトープを含んでなるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の抗体産生誘導能の活性化剤が提供される。
本発明によればまた、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の腫瘍細胞障害誘導能活性化剤の製造のための本発明によるエピトープの使用、並びに子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の抗体産生誘導能活性化剤の製造のための本発明によるエピトープの使用が提供される。
本発明によれば更に、本発明によるエピトープとＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞とをＩＬ−１２存在下で接触させる工程を含んでなる子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の腫瘍細胞障害誘導能を活性化する方法、並びに本発明によるエピトープとＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞とを接触させる工程を含んでなる子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的なＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の抗体産生誘導能を活性化する方法が提供される。
Ｔ細胞がＣＤ４陽性であるか否かは、Ｔ細胞の細胞表面マーカーのＣＤ４分子とサイトカインあるいはリンホカインを組み合わせて検出することにより決定できる（Ｏｐｅｎｓｈａｗ  Ｐ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＥＥ，Ｈｏｓｋｅｎ  ＮＡ，Ｍａｉｎｏ  Ｖ，Ｄａｖｉｓ  Ｋ，Ｍｕｒｐｈｙ  Ｋ，Ｏ’Ｇａｒｒａ  Ａ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １  ａｎｄ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ２  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９５，１８２：１３５７−１３６７）。
本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞およびＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞はヒトパピローマウイルス１６のＥ７タンパク質、特に配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、を特異的に認識できる（実施例４）。以下の理論に拘束されるわけではないが、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合した本発明によるエピトープが抗原提示細胞上に提示され、提示されたエピトープによりＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞が活性化される。
従って、本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞は、子宮癌病変および子宮癌前病変に対する腫瘍細胞障害を誘導できる。「腫瘍細胞障害」とは、細胞障害性因子による腫瘍細胞障害のみならず、ナチュラルキラー細胞等の細胞障害性細胞による腫瘍細胞障害も含む。腫瘍細胞障害の誘導は、例えば、実施例５に記載のようにＴＮＦαやＦａｓリガンドの生産により確認することができる。
また、本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞は、子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的な抗体の産生を誘導できる。特異的な抗体産生の誘導は、例えば、実施例４に記載のようにして確認できる。
本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞は、本発明によるエピトープとＩＬ−１２とを含んでなる培地において子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養し、次いでＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞を採取することによって製造できる（実施例４参照）。
また、本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞は、本発明によるエピトープを含んでなる培地において子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養し、次いでＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞を採取することによって製造できる（実施例５参照）。
培地は末梢血単核球の培養に通常用いられているものを用いることができ、例えばＲＰＭＩ培地やダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）が挙げられる。培地には必要に応じて抗生物質やサイトカインを添加してもよい。
本発明によるエピトープは、最終濃度１０〜５０ｎｍｏｌの割合で培地に添加することができる。
ＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の製造の場合には、本発明によるエピトープに加えてＩＬ−１２を添加する。ＩＬ−１２は、例えば、最終濃度０．２ｎｇ／ｍｌの割合で培地に添加することができる。
本発明において使用できるＩＬ−１２としては、ヒトやマウス等の生体から単離されたＩＬ−１２、遺伝子組換えＩＬ−１２、およびこれらの生物学的機能上の同等物が挙げられ、市販のものを使用できる。組換えＩＬ−１２は、そのヒトＩＬ−１２遺伝子（例えば、Ｗｏｌｆ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，ｐ３０７４（１９９１））やマウスＩＬ−１２遺伝子（例えば、Ｓｃｈｏｅｎｈａｕｔ  Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，ｐｐ３４３３−３４４０（１９９２））を適当な宿主中において発現させることにより製造してもよい。
培養は末梢血単核球の培養に通常用いられている条件下で行うことができ、例えば約３７℃で１２〜６０時間培養することができる。
本発明において「末梢血単核球」は、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いのある者の血液から単離することができる。
本発明において「子宮癌患者」とは、子宮癌病変または子宮癌前病変が子宮体部または子宮頸部において肉眼的に、細胞診により、あるいは生検組織診により確認された者をいう。
本発明において「子宮癌患者の疑いがある者」とは、例えば、子宮癌病変および子宮癌前病変が診察により認められないが、子宮体部または子宮頸部から採取された組織においてヒトパピローマウイルス、特にヒトパピローマウイルス１６、の感染が確認された者をいう。ヒトパピローマウイルスに感染しているかどうかは例えば実施例１に記載の方法に従って決定することができる。
腫瘍細胞障害を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞はＩＮＦγ、ＴＮＦα、および／またはＦａｓリガンドの生産を指標にして選択し、回収できる。特異的抗体の産生を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞はＩＮＦγの生産を指標にして選択し、回収できる。いずれの場合も、選択および回収はフローサイトメトリーにより実施できる。
本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の具体的な例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドとＩＬ−１２とを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養することによって得ることができる、ヒトパピローマウイルス１６のＥ７タンパク質が発現している子宮癌病変および子宮癌前病変に対する腫瘍細胞障害を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞が挙げられる。
本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の具体的な例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養することによって得ることができる、ヒトパピローマウイルス１６のＥ７タンパク質が発現している子宮癌病変および子宮癌前病変に特異的な抗体の産生を誘導できるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞が挙げられる。
活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞による腫瘍療法
本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞およびＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞は、それぞれ、腫瘍細胞障害および腫瘍に特異的な抗体の産生を誘導できることから、子宮癌の治療および予防に用いることができる。具体的には本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞およびＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞を患者の体内に戻すことにより子宮癌を治療および予防することができる。
従って本発明によれば、本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞を含んでなる、子宮癌の治療および予防用医薬組成物、並びに子宮癌の治療および予防に用いられる医薬の製造のための本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞の使用が提供される。
本発明によればまた、本発明によるエピトープとＩＬ−１２とを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養し、培養物からＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞を採取し、次いでそのＣＤ４陽性Ｔｈ１細胞を患者の体内に戻す工程を含んでなる子宮癌の治療および予防法が提供される。
上記治療法および予防法においては、細胞を患者の体内に戻す前にＴｈ１細胞を洗浄する工程を含んでいてもよい。
上記方法ＩＬ−１２の生体への直接投与を伴わないで腫瘍細胞障害を誘導できる点で有利である。すなわち、サイトカインの一種であるＩＬ−１２には抗腫瘍効果があることが報告されている（西村孝司、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞と抗腫瘍免疫−癌治療にはＴｈ１・Ｔｈ２のいずれの細胞が有効か−、医学の歩み、２０００、１９４：１２３０−１２３６）が、ＩＬ−１２の直接生体への投与は肝障害などの副作用の観点から避けることが好ましい。本発明による方法によれば、採血（連続遠心単核球分離装置を用いる）により体外に一旦取り出した患者のＴ細胞に特異的な抗原刺激を与えてＩＬ−１２レセプターを発現させ、ＩＬ−１２を作用させた後、洗浄した目的の細胞を生体に戻す治療方法がとれることから、サイトカインの直接投与よりも安全性を確保しながら、治療上の有用性が期待できる治療を行うことができる。
本発明によれば、本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞を含んでなる子宮癌の治療および予防用医薬組成物、並びに子宮癌の治療および予防に用いられる医薬の製造のための本発明によるＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞の使用が提供される。
本発明によればまた、本発明によるエピトープを含んでなる培地において、子宮癌患者または子宮癌患者の疑いがある者の血液から単離された末梢血単核球を培養し、培養物からＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞を採取し、次いでそのＣＤ４陽性Ｔｈ２細胞を患者の体内に戻す工程を含んでなる子宮癌の治療および予防法が提供される。
上記治療法および予防法においては、細胞を患者の体内に戻す前にＴｈ２細胞を洗浄する工程を含んでいてもよい。
上記方法は特に子宮癌の早期治療に有効であると考えられる。実施例４によるとＨＰＶに感染はしているものの病変の進行が妨げられているＣＩＮ１あるいはＣＩＮ２の症例では癌抗原特異的なＴｈ２細胞の頻度が高く、進行癌症例の４倍から３６倍以上の頻度で存在していることがわかった。つまり、Ｔｈ２細胞の頻度と病変の進行には逆相間が認められた。したがって、このようなＴ細胞を人為的に増加させることは子宮癌の治療に有効であると考えられる。
得られたＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞を患者体内に戻す工程は、細胞を生理食塩水やリンゲル液等に懸濁し、懸濁液を持続静注、静注、皮内投与、皮下投与、リンパ節投与および病巣局所への局注により実施できる。細胞は必要に応じて薬学上許容される製剤用添加剤とともに患者に投与することができる。
実  施  例
埼玉医大総合医療センター婦人科を受診し、子宮頸部癌検査を希望した女性のうち本研究に協力することを文書をもって同意し、病理学的な診断の結果子宮頸部に異形成病変が認められ、しかも、無名化して扱われた症例１２５名の病変組織を以下の実施例において用いた。また、上記１２５名の患者うちさらに末梢血の提供にも協力が得られた１０５名の患者のリンパ球および１２名分のＴ細胞を以下の実施例において用いた。
実施例１：ＨＰＶ  ＤＮＡの検出とＨＰＶのタイピング
ＨＰＶの検出とタイピングはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染に起因した症例を選択するための予備的検討である。検討には従来報告されている方法を用いた（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｈ，Ｏｎｄａ  Ｔ，Ｋａｗａｎａ  Ｔ，Ｉｗａｍｏｔｏ  Ａ，Ｔａｋｅｔａｎｉ  Ｙ．Ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９６；７８：１９３５−１９４１．）。すなわち、組織から抽出したＤＮＡをＨＰＶのＬ１領域の共通した配列を元にデザインしたプライマーＬ１Ｃ１；ＣＧＴＡＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＣＴＡＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号２）、Ｌ１Ｃ２；ＴＡＣＣＣＴＡＡＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＧ（配列番号３）、およびＬ１Ｃ２Ｍ；ＴＡＣＣＣＴＡＡＡＴＡＣＣＣＴＡＴＡＴＴＧ（配列番号４）を用いて増幅したのち、ＤｄｌｅＩおよびＲｓａＩを用いてＤＮＡを消化切断した。このＤＮＡを４％アガロースゲル上で電気泳動しＤＮＡ断片の長さに基づいてＨＰＶの型を決定する。ＰＣＲによる増幅が認められないものはＨＰＶ陰性と判定した。
その結果、１２５病変組織のうち１０５組織からＨＰＶ  ＤＮＡが検出された。この内の６５例が子宮頸癌の病因に最も関与すると言われているウイルスタイプのＨＰＶ１６タイプであった。
実施例２：ＨＬＡの解析（ヒトＭＨＣクラスＩとクラスＩＩアリル）
子宮頸癌および前癌状態病変とＭＨＣクラスＩＩの関係に関しては、欧米あるいは日本の子宮頸癌および前癌状態病変を持つ患者のＨＬＡアリル頻度の解析結果が報告されている。それによると、病変の進行と特定のＨＬＡアリルとくにＭＨＣクラスＩＩアリルの頻度に関連があることが明らかになっている。このことはＨＰＶが感染した場合、抗原提示細胞とＴ細胞を介したＭＨＣに依存する細胞性免疫反応においてＨＰＶの排除に関してアリル毎に差があり、結果として癌化する頻度に影響しているものと考えられる（Ｎａｗａ  Ａ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｙ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｗａｋａｈａｒａ  Ｙ，Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｔ，Ｋｉｋｋａｗａ  Ｆ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂ１＊０３  ｗｉｔｈ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｗｏｍｅｎ  ａｇｅｄ  ３５  ｙｅａｒｓ  ａｎｄ  ｙｏｕｎｇｅｒ．１９９５  Ｃａｎｃｅｒ；７５：５１８−５２１；Ｏｄｕｎｓｉ  Ｋ，Ｔｅｒｒｙ  Ｇ，Ｈｏ  Ｌ，Ｂｅｌｌ  Ｊ，Ｃｕｚｉｃｋ，Ｇａｎｅｓａｎ  ＴＳ．Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｉｎｔｒａ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｉｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＨＬＡ  ＤＲ−ＤＱ  ａｌｌｅｌｅｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９６；６７：５９５−６０２；Ｍｏｎｔｏｙａ  Ｌ，Ｓａｉｚ  Ｉ，Ｒｅｙ  Ｇ，Ｖｅｌａ  Ｆ，  Ｃｌｅｒｉｃｉ−Ｌａｒｒａｄｅｔ  Ｎ．Ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＬＡ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｐａｎｉｓｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８；２５：３２９−３３７；Ａｌｌｅｎ  Ｍ，Ｋａｌａｎｔｓｒｉ  Ｍ，Ｙｌｉｔａｌｏ  Ｎ，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  Ｂ，Ｈａｇｍａｒ  Ｂ，Ｓｃｈｅｉｂｅｎｐｈｌｕｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．ＨＬＡ  ＤＱ−ＤＲ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＰＶ  １８．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  １９９６；４８：３２−３７）。
本実施例におけるＨＬＡ解析は、実施例１で特定された６５名の患者のＨＬＡタイプと癌の症例との関係を事前に確認しておくための試験である。試験は既に報告されている方法に準じて行った（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｋｉ  Ｋ，Ｉｓｌａｍ  ＭＭ，Ｈｉｒａｔａ  Ｒ，Ｍａｅｄａ  Ｈ．Ｕｎｉｑｕｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＨＬＡ−Ｂ  ａｎｄ  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４  ｇｅｎｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  １９９３；４２：４９７−５０１）。すなわち、ＨＰＶ１６陽性の症例６４例のＨＬＡ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ：ヒト白血球抗原）（ＭＨＣ）クラスＩ：Ａ，ＢとｃｌａｓｓＩＩ  ＤＲＢ１およびＤＱＢ１を、末梢血単核球由来のＤＮＡを現在標準的と考えられるＨＬＡ検査法、つまりＰＣＲ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ＳＳＯ  ｍｅｔｈｏｄとＰＣＲ−ＳＳＣＰによって決定した。結果は表１に示される通りであった。
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表１に６５例のＨＬＡアリル頻度の解析の結果を示した。ＣＩＮ１およびＣＩＮ２は子宮頸部病変の異形度が低い症例群、ＣＩＮ３、ＣＩＳ、およびＩＣは、それぞれ前癌状態、上皮内癌、および進行癌を示した進行病変症例群である。ＨＬＡ  ＤＲＢ１＊０４０５アリル頻度は健常人の頻度と比較して進行病変群に低く、ＨＬＡ  ＤＲＢ１＊０９０１は進行病変群に高く、ＨＬＡ  ＤＲＢ１＊１３０２は両群ともに少なかった。尚、ＨＬＡ  ＤＱＢ１の頻度はＤＲＢ１との連鎖不平衡により頻度が増減している。また、クラスＩのアリル頻度には有意差は認められなかった。
実施例３：癌抗原に対する液性免疫の存在の確認
症例の血清中に癌抗原に対する特異的抗体が存在するかどうかを解析するために、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された小細胞肺癌樹立細胞（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ：ＣＲＬ−２０７８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の可溶性タンパク分画と症例の血清との反応をウェスタンブロット法にて検討した。この方法はニトロセルロースメンブレン上で抗原抗体反応をおこすもので、生物化学解析法として標準的な方法である。この解析は市販のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｋｉｔ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて行った。結果は表２に示される通りであった。
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その結果、様々な進行度の患者においてＥ６／Ｅ７タンパクに対して陽性の反応が認められ、抗体の存在が確かめられた（表２）。
実施例４：抗原特異的なＴ細胞の検出
Ｅ７タンパクをコードするアミノ酸配列（配列番号５）のうち実施例２の結果から本疾患に関係の疑われるＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲＢ１＊０４あるいはＤＲＢ１＊０９に結合する可能性をもつ配列の候補を合成アミノ酸にて１２種類を作製した（表３および４参照）。
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これらを患者末梢血単核球とともに２日間培養し、Ｔ細胞表面上のＩＬ−４とＣＤ４をフローサイトメトリー法にて解析した。ＩＬ−４とＣＤ４が陽性でペプチドを認識するＴ細胞はＴｈ２タイプの抗原特異的Ｔ細胞と認定できる。このＴ細胞を検出するために以下の手順で解析を行った。
（１）細胞の調製
対象者から１０％ヘパリン２ｍｌを加えた採血管に静脈血を２０ｍｌ採血した。この血液から単核球を比重遠心法にて分離した。この細胞を生理食塩水に浮遊させた状態で細胞数をカウントし、総数として１．８×１０７個以上の単核球を準備した。つぎに単核球浮遊液をＲＰＭＩ１６４０培養液（イワキガラム社製）に１０％仔牛血清（ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ，ＮＹ，ＵＳＡ）、ストレプトマイシン（明治製菓社製）０．１ｇ／ｌ、およびペニシリンＧ（明治製菓社製）１０万単位／ｌを混合したものに置換し、その際に、細胞数を１×１０６個／ｍｌに調整した。この細胞を１２ウェルの培養用プラスチックプレートに蒔いた。比較の為Ｔｈ１タイプＴ細胞が産生するＩＦＮγとＴｈ２タイプＴ細胞が産生するＩＬ−４それぞれを独立して検出するために２種類のプレートを作製した。さらに各プレートを抗原ペプチドの有無、ＩＬ−２、ＩＬ−１２の添加の有無にて細分化して、３７℃  ５％ＣＯ２条件下で細胞培養装置にて４８時間培養した。陰性コントロールは抗原ペプチドを加えない群とし、陽性コントロールはＨＡ抗原（インフルエンザウイルスヘマグルチニンペプチド；ＨＡ３０７−３１９，ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ，カスタム合成ペプチド；サワデーテクノロジー、東京）（Ｎｏｂｕｓａｗａ  Ｅ，Ａｏｙａｍａ  Ｔ，Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ，Ｔａｔｅｎｏ  Ｙ，Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｋ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｍｏｎｇ  １３  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｅｍａｇｕｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９１，１８２：４７５−４８５）を添加した群とした。尚、加えたリコンビナントＩＬ−２（大日本製薬、東京）の濃度は１０μｌ／１ｍｌ、被験ペプチド濃度は１０、２０、５０ｎｍｏｌ、リコンビナントＩＬ−１２（大日本製薬、東京）は０．２ｎｇ／１ｍｌ／１ウェルとした。
（２）抗原の準備
抗原ペプチドはヒトＨＰＶ１６のＥ６とＥ７タンパクのアミノ酸配列の中から、今回対象とした症例のなかで、ＨＬＡＤＲＢ１アリルの頻度が健常人と比較して少なかったＨＬＡ  ＤＲＢ１＊０４０５分子とＨＬＡ  ＤＲＢ１＊０９０１分子に親和性が高いと考えられる、いわゆるＭＨＣ  クラスＩＩコンセンサスモチーフ（表３参照）（Ｈａｍｍｅｒ  Ｊ，Ｖａｌｓａｓｎｉｎｉ  Ｐ，Ｔｏｌｂａ  Ｋ，Ｂｏｌｉｎ  Ｄ，Ｈｉｇｅｌｉｎ  Ｊ，Ｔａｋａｃｓ  Ｂ，Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ  Ｆ．Ｐｒｏｍｉｓｃｕｓ  ａｎｄ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｃｈｏｒｓ  ｉｎ  ＨＬＡ−ＤＲ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｐｔｉｄｅｓ．Ｃｅｌｌ，１９９３，７４，１９７−２０３；Ｆｕｊｉｓａｏ  Ｓ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｓ．Ｎｉｓｈｉ  Ｔ．  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＲ９（ＤＲＢ１＊０９０１）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｍｏｔｉｆｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｆＵＳＥ５  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，４５：１３１−１３６）に示されたアグレトープを一部でも含むと推定されるアミノ酸配列の全てのパターンを９アミノ酸残基数から２０アミノ酸残基数の間で化学合成した（表３参照）。ペプチドの合成は自動合成機により単アミノ酸試薬を化学的に結合させるもので、すでに任意のアミノ酸配列を受託し、これを合成した製品（カスタム合成ペプチド；サワデーテクノロジー、東京）を用いた。
（３）ＩＦＮγ、ＩＬ−４サイトカインとＣＤ４の検出
サイトカインの検出にはサイトカインを認識するモノクローナル抗体に蛍光物質、例えばＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）あるいはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）で修飾したものを用いて、フローサイトメトリーにて解析した。抗体は生細胞内に細胞膜を越えて到達できないため細胞膜を透徹して細胞内に達するように市販の検出キットとモノクローナル抗体を組み合わせて行った。具体的には、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）とＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩＬ−４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｄ４−８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ），Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｄ４−８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ），ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ−４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｌａｎｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ−８  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｌａｎｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて染色した後、フローサイトメトリー機器；ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で陽性細胞を検出した。
より具体的には培養時間の最後の２時間に  Ｇｏｌｇｉ装置におけるタンパク産生をとめるためにブレフェルディンＡを０．７μｌ／１ｍｌ／１ウェル添加し、２時間、３７℃で抗原刺激を加えた細胞を処理した。培養プレートを氷上に置き、４℃  ＰＢＳを加えて反応を停止させた。４℃のＰＢＳで洗うようにして，細胞を１５ｍｌチューブに移し、１６００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除いた。次に細胞表面抗原の染色を行うために、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４あるいはＣＤ８モノクローナル抗体を１０μｌ添加し、４℃で３０分間反応させた。その後、４℃の０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを適量入れて、細胞をほぐすようにし、さらに４℃で０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを入れ１６００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し上清を除いた。
次に細胞の固定と細胞膜透過作業を行った。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ液２５０μｌに細胞を浮遊させ、４℃で２０分間反応させた。この細胞に前述のＩＦＮγあるいはＩＬ−４抗体を１０μｌ添加し、４℃で３０分間反応させた。その後、４℃の０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ液を適量入れて、細胞をほぐすようにし、さらに、４℃の０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを入れ１６００ｒｐｍ、１０分、４℃、遠心し上清を除き洗浄した後、ＰＢＳに浮遊させてＦＡＣｓｃａｎ装置にて解析した（渋谷和子。細胞内サイトカインの検出。フローサイトメトリー自由自在；中内啓光監修、ｐｐ７５−８５、１９９９、秀潤社、東京）。細胞にレーザーを照射して、励起する蛍光を捕らえて、目的とする抗体が結合した細胞の存在をコンピューター上で計算して表示させた。コントロールと比較して陽性細胞頻度を算出した。
（４）Ｔ細胞エピトープの同定
ＩＬ−４とＣＤ４が陽性のＴ細胞頻度の解析はＨＬＡ  ＤＲＢ１＊０９０１あるいはＤＲＢ１＊０４０５を持つ症例を中心に１２例について行われた。ポリペプチド毎の比較ではＥ７−４．１：ＨＰＶ  Ｅ７  ６１−８０：ＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥに対して高い陽性反応が認められた。また、Ｅ７−５．１：ＨＰＶ  Ｅ７  ８２−９５：ＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳに対して低い頻度ながらも陽性細胞が検出された。しかし、その他のペプチドには反応はみとめられなかったことからＥ７−４．１  ＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥにはＴ細胞の認識するエピトープ部位とＨＬＡ  ＤＲＢ１＊０９０１あるいはＤＲＢ１＊０４０５に結合するアグレトープが内包されていると認定された。
Ｅ７−４．１刺激時の陽性Ｔ細胞の頻度は全体の末梢血単核球の細胞数の０．３％から３．６％であった（表５：全結果、図１：典型例）。
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病変の進行度と陽性細胞率の関係を見ると健常人女性では陽性率は０．１％未満。ＣＩＮ１では３例中３例が１．０％以上、ＣＩＮ２では２例中１例が１．２％と高かった（表６）。
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また、陽性症例の反応性はＥ７−４．１ペプチド抗原の濃度に依存した反応性を示した（図２）。
尚、健常人を対象としたインフルエンザ抗原のＨＡを用いた解析ではインフルエンザ既感染者のＩＬ−４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞のペプチド刺激により検出される頻度は０．１から０．５％（参考；ＣＤ４陽性のＩＦＮγ陽性Ｔ細胞の頻度は０．７〜３．０％）であった。これら全ての解析結果は、刺激を加えない状態で陽性となるＴ細胞頻度０．１〜０．３％をバックダラウンド値としてあらかじめ差し引いている。また、解析上の陽性コントロール細胞はキットに附属のものを用いて計測の再現性を保っている。
実施例５：Ｔｈ１タイプＴ細胞の誘導
上記のヒトパピローマウイルスポリペプチドＥ７−４．１；ＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥと患者単核球を培養する際に、ＩＬ−１２を加えるとＣＤ４陽性でＩＦＮγを産生するＴ細胞つまりＴｈ１タイプのＴ細胞の増殖が認められた（図３および図４）。このＴｈ１タイプのＴ細胞は、上記のＴｈ２タイプのＴ細胞と同様のエピトープを認識していると推定される。また、Ｔｈ１タイプＴ細胞はＴｈ２細胞よりも強くＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ：腫瘍壊死因子アルファ）を産生しており、抗原特異的に癌細胞に集積して細胞障害活性を発揮して腫瘍細胞制御に働く可能性がある。得られた細胞から実際にＴＮＦαおよび細胞障害活性因子のＦａｓリガンドが検出された。図３はＣＤ４とＴＮＦαの二色フローサイトメトリー（ｔｗｏ  ｃｏｌｏｒ  ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ）、図４はＦａｓリガンドの一色フローサイトメトリー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｒ  ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ）を示す。
【配列表】
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2002100889.tif 000010
2002100889.tif 000011
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例４におけるＨＰＶ  Ｅ７−５．１抗原刺激（左図）およびＨＰＶ  Ｅ７−４．１抗原刺激（右図）を加えた場合の二色フローサイトメトリーの結果を示した図である。縦軸はＣＤ４の相対的蛍光強度を、横軸はＩＬ−４の相対的蛍光強度を示す。図中の数字はＣＤ４陽性でＩＬ−４を産生しているＨＰＶ抗原エピトープ特異的Ｔｈ２細胞の頻度を示している。
図２は、実施例４におけるＣＤ４陽性症例の頻度とＨＰＶ  Ｅ７−４．１ペプチド抗原の濃度との関連を示した図である。
図３は、実施例５におけるＩＬ２およびＩＬ−１２の存在下でのＨＰＶ  Ｅ７−４．１抗原刺激によるＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴＮＦα産生への影響を示した図である。左図は抗原刺激がなされなかった場合の結果、右図は抗原刺激がなされた場合の結果を示す。縦軸はＣＤ４の相対的蛍光強度を、横軸はＴＮＦ−αの相対的蛍光強度を示す。図中の数字はＣＤ４陽性でＴＮＦαを産生しているＨＰＶ抗原エピトープ特異的Ｔ細胞の頻度を示している。
図４は、実施例５におけるＩＬ−１２存在下でのＨＰＶ  Ｅ７−４．１抗原刺激後のＦａｓリガンドの発現を示した図である。左図は抗原刺激がなされなかった場合の結果、右図は抗原刺激がなされた場合の結果を示す。縦軸はＦａｓリガンドの相対的蛍光強度を示す。図中の数字はＦａｓリガンド陽性Ｔ細胞の頻度を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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