(57)【要約】本発明の目的は、環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物が示す抗腫瘍作用を評価することにより、新規な抗腫瘍剤を提供することである。本発明によれば、縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物を含む、抗腫瘍剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物を含む、抗腫瘍剤。
【請求項２】
ポリ乳酸混合物が鎖状ポリ乳酸を実質的に含有しないことを特徴とする、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物が、
（ｉ）乳酸を加熱により脱水縮合する工程であって、ラクチドの留出を回避しつつ副生水を留出除去するような圧力及び温度条件下で脱水縮合する第１加熱工程；及び
（ｉｉ）該第１加熱工程の反応生成物を、第１加熱工程より高い温度において、ラクチドの留出を回避しつつ副生水を留出除去するような圧力及び温度条件下で圧力を１００ｍｍＨｇ以下まで降下させ、該降下した圧力において加熱下においてさらに反応を継続して乳酸の脱水縮合物を生成させる第２加熱工程；
を含む製造方法により製造されるポリ乳酸混合物である、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
請求項１から３の何れかに記載の抗腫瘍剤を含む、飲食品。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は抗腫瘍剤、より詳細には、環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物を含む抗腫瘍剤に関する。本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍縮小効果および転移抑制効果を発揮し、癌の治療に有用である。
背景技術
環状ポリ乳酸を含むポリ乳酸混合物が癌細胞の嫌気的解糖系を抑制し、抗腫瘍効果を発揮することは、自然発癌マウスを使った発癌抑制効果と移植癌組織（ルイス肺癌細胞）を用いた腫瘍増殖と転移抑制効果を中心として検討が進められてきた（長戸ら：第５６回日本癌学会総会、１９９７年９月；及び高田ら：第５７回日本癌学会総会、１９９８年９月）。
ポリ乳酸混合物についてはさらに、Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ効果、抗癌剤や放射線照射との併用効果投与方法や投与量についても検討が重ねられ、高用量投与実験からは顕著な抗腫瘍効果が認められなかった。また、これまでに用いられてきたポリ乳酸混合物には環状物以外の物質（例えば、鎖状のポリ乳酸など）が含まれていた。即ち、従来使用されてきたポリ乳酸混合物には、重合度（縮合度とも言う）の異なる環状物と鎖状物が含まれていることが明らかであり、環状物と鎖状物の割合や特定の重合度（縮合度）のオリゴマーについても定量化はなされていない。このような状況に鑑み、環状ポリ乳酸のみを選択的に合成する試みがなされてきた。
発明の開示
本発明は、環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物が示す抗腫瘍作用を評価することにより、新規な抗腫瘍剤を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、上記抗腫瘍剤を利用した飲食品を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物（以下の実施例ではＡＤ−３と称する）と従来の製法で製造した環状物と鎖状物を含むポリ乳酸混合物（以下の実施例ではＣＰＬと称する）の抗腫瘍効果を比較する実験を行い、前者の有用性を確認することに成功した。特に、環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物は低用量でも十分な抗腫瘍効果を発揮できることが判明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物を含む、抗腫瘍剤が提供される。
好ましくは、本発明で用いるポリ乳酸混合物は、鎖状ポリ乳酸を実質的に含有しない。
好ましくは、縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物は、
（ｉ）乳酸を加熱により脱水縮合する工程であって、ラクチドの留出を回避しつつ副生水を留出除去するような圧力及び温度条件下で脱水縮合する第１加熱工程；及び
（ｉｉ）該第１加熱工程の反応生成物を、第１加熱工程より高い温度において、ラクチドの留出を回避しつつ副生水を留出除去するような圧力及び温度条件下で圧力を１００ｍｍＨｇ以下まで降下させ、該降下した圧力において加熱下においてさらに反応を継続して乳酸の脱水縮合物を生成させる第２加熱工程；
を含む製造方法により製造されるポリ乳酸混合物である。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の抗腫瘍剤を含む、飲食品が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、抗腫瘍剤又は抗腫瘍のための飲食品の製造における、縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物の使用が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物の有効量をヒトなどの哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を抑制するための方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施方法及び実施態様について詳細に説明する。
本発明の抗腫瘍剤及び飲食品においては、縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物が有効成分として用いられる。
本明細書で言う「ポリ乳酸混合物」とは、縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸が任意の割合で存在する混合物を意味する。なお、本明細書では便宜上「ポリ乳酸混合物」という用語を用いたが、この中には一定の縮合度を有する環状ポリ乳酸の単一成分から成るポリ乳酸も含まれる。
縮合度とは、ポリ乳酸中における反復単位である乳酸単位の数を意味する。例えば、環状のポリ乳酸は下記の構造式を有することが推測されるが、式中のｍが１である場合は縮合度は３であり、ｍが１８である場合は縮合度は２０となる。
2003007937.tif 000002
（式中、ｍは１〜１８の整数を示す）
本明細書で単に「乳酸」と称する場合、この乳酸にはＬ−乳酸、Ｄ−乳酸またはこれらの任意の割合の混合物の全てが包含される。本発明においては好ましくは、乳酸は実質的にＬ−乳酸から成る。ここで言う「実質的に」とは、ポリ乳酸混合物中におけるＬ−乳酸単位の比率［即ち、（Ｌ−乳酸単位数／Ｌ−乳酸単位数＋Ｄ−乳酸単位数）×１００］が、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であることを意味する。なお、ポリ乳酸混合物中におけるＬ−乳酸単位の比率は、出発物質として使用する乳酸中に存在するＬ−乳酸とＤ−乳酸の比率に依存する。
本発明の抗腫瘍剤は腫瘍の抑制のために広く使用することができる。腫瘍の抑制とはより具体的には、腫瘍発生の防止、腫瘍増大の抑制、腫瘍の退縮、並びに腫瘍の転移の抑制などが含まれ、臨床的には癌及び／又は腫瘍の予防及び／又は治療の全てを包含することを意味する。
本発明の抗腫瘍剤を用いることができる癌の種類は特には限定されず、良性腫瘍及び悪性腫瘍の全てを包含する。癌の具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（Ａ）本発明で用いるポリ乳酸混合物の製造方法
本発明の抗腫瘍剤は、縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物を有効成分として含む。
（Ａ−１）第１の製造方法
本発明で用いるポリ乳酸混合物の製造方法の第１の方法としては、
（ｉ）乳酸を加熱により脱水縮合する工程であって、ラクチドの留出を回避しつつ副生水を留出除去するような圧力及び温度条件下で脱水縮合する第１加熱工程；及び
（ｉｉ）該第１加熱工程の反応生成物を、第１加熱工程より高い温度において、ラクチドの留出を回避しつつ副生水を留出除去するような圧力及び温度条件下で圧力を１００ｍｍＨｇ以下まで降下させ、該降下した圧力において加熱下においてさらに反応を継続して乳酸の脱水縮合物を生成させる第２加熱工程、
を含む方法が挙げられる。
本発明で用いる原料乳酸には、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸及びＤＬ−乳酸の何れでもよく、これらを単独で用いても２種以上を組み合わせ用いてもよい。
第１加熱工程は、乳酸を加熱により脱水縮合する工程であって、ラクチドの留出を回避しつつ副生水を留出除去するような圧力及び温度条件下で脱水縮合する工程である。この第１加熱工程の反応は、その反応を円滑に進行させるために、乳酸の脱水縮合により生成する副生水を留去させるが、この場合、乳酸２分子の脱水縮合物であるラクチドの留去を回避するように圧力及び温度を設定する。
反応圧力は常圧でも減圧でもよく、好ましくは減圧である。反応圧力は具体的には１０〜７６０ｍｍＨｇ、好ましくは３００〜５００ｍｍＨｇ、より好ましくは３５０〜４００ｍｍＨｇである。また、反応温度は圧力条件にもよるが、通常は１００℃から１５０℃、好ましくは１２０〜１４０℃の範囲内である。
第１加熱工程の反応時間は特に限定されないが、通常、３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。
第１加熱工程の反応により、３〜２３分子の乳酸の脱水縮合物を主成分とする反応生成物が生成する。
前記第１加熱工程の終了後、第２加熱工程において、高められた平均重合度のオリゴマーが得られるように、前記第１加熱工程における反応温度よりも高められた温度、例えば、１４５℃以上、好ましくは１５０℃〜１８０℃、より好ましくは１５０〜１６０℃の温度に加熱するとともに、反応圧力を１００ｍｍＨｇ以下、好ましくは１０〜８０ｍｍＨｇ、より好ましくは１５〜２０ｍｍＨｇの圧力に降下させて、さらに脱水縮合反応を継続する。
この反応も、前記第１加熱工程の反応の場合と同様に、反応を円滑に進行させるために副生水を留去させるが、ラクチドの留去を回避するような条件で実施する。
反応圧力を前記範囲（即ち、１００ｍｍＨｇ以下）の圧力にまで降下させる速度（降圧速度）は、ラクチドの留出を回避し、且つ反応効率を高めるには、５ｍｍＨｇ／分未満に維持することが必要である。降圧速度は好ましくは０．２５ｍｍＨｇ／分以上５ｍｍＨｇ／分未満であり、より好ましくは０．２５ｍｍＨｇ／分以上４ｍｍＨｇ／分以下、さらに好ましくは０．５ｍｍＨｇ／分以上３ｍｍＨｇ／分以下、特に好ましくは０．５ｍｍＨｇ／分以上１ｍｍＨｇ／分以下の範囲である。前記範囲より低い降圧速度では、その所定圧まで降圧させるのに必要な時間が長くなるため好ましくなく、５ｍｍＨｇ／分以上の降圧速度では、ラクチドが副生水とともに留去するようになるので好ましくない。
反応圧力が１００ｍｍＨｇ以下の圧力まで降下した後、この反応圧力において、さらに反応を継続する。この場合の反応時間は、３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。
前記第２加熱工程での反応により、平均重合度が３〜３０、好ましくは３〜２３の乳酸オリゴマーが得られる。第２加熱工程の反応生成物中の全乳酸オリゴマーに対する環状乳酸オリゴマーの割合は通常、７０重量％以上であり、例えば、７０〜８０重量％程度である。
好ましくは、前記の第２加熱工程の終了後に、第３加熱工程を実施する。第３加熱工程は、第２加熱工程の反応生成物を該第２加熱工程よりさらに低い圧力下で加熱することにより反応生成物中の鎖状乳酸オリゴマーを環化して環状乳酸オリゴマーを生成させる工程である。
第３加熱工程の反応圧力は、好ましくは０．１〜５ｍｍＨｇ、より好ましくは０．２５〜５ｍｍＨｇ、さらに好ましくは０．５〜３ｍｍＨｇ、特に好ましくは０．５〜１ｍｍＨｇである。第３加熱工程の反応温度は好ましくは１４５〜１８０℃であり、より好ましくは１５０〜１６０℃である。
このような圧力及び温度条件下で反応を継続する。反応時間は３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。この場合に生じる副生水も留去させる。この場合、ラクチドの留去も回避させることが好ましいが、反応生成物にはラクチドは殆んど含まれないので、その降圧速度を格別遅くする必要はない。
第３加熱工程での反応により、平均重合度３〜３０、好ましくは３〜２３の環状乳酸オリゴマーが生成される。第３加熱工程の反応生成物中の全乳酸オリゴマーに対する環状乳酸オリゴマーの割合は通常、９０重量％以上であり、好ましくは９９重量％以上である。
（Ａ−２）第２の製造方法
本発明で用いるポリ乳酸混合物の製造方法の第２の方法としては、ラクチドを下記一般式（２）：
2003007937.tif 000003
（式中、Ｒは脂肪族基、芳香族基、−Ｓｉ（Ｒ１０）（Ｒ１１）（Ｒ１２）、−ＣＨ（Ｒ２０）ＣＯＮＲ２１Ｒ２２、又は−ＣＨ（Ｒ３０）ＣＯＯＲ３１を示し、ここでＲ１０、Ｒ１１及びＲ１２は各々独立に脂肪族基又は芳香族基を示し、Ｒ２０は脂肪族基を示し、Ｒ２１及びＲ２２は各々独立に水素原子、脂肪族基又は芳香族基を示し、Ｒ３０は脂肪族基を示し、Ｒ３１は水素原子、脂肪族基又は芳香族基を示す。
Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ４０−を示し、ここでＲ４０は水素原子、脂肪族基又は芳香族基を示す。
Ｍｅはアルカリ金属を示す。）
で表されるアルカリ金属化合物の存在下で重合させる方法が挙げられる。
原料としては、乳酸２分子が脱水縮合したラクチド（３，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン）を使用し、このラクチドを上記一般式（２）で表されるアルカリ金属化合物の存在下で反応させる。以下、一般式（２）：
2003007937.tif 000004
について説明する。
一般式（２）において、Ｒは脂肪族基、芳香族基、−Ｓｉ（Ｒ１０）（Ｒ１１）（Ｒ１２）、−ＣＨ（Ｒ２０）ＣＯＮＲ２１Ｒ２２、又は−ＣＨ（Ｒ３０）ＣＯＯＲ３１を示し、ここでＲ１０、Ｒ１１及びＲ１２は各々独立に脂肪族基又は芳香族基を示し、Ｒ２０は脂肪族基を示し、Ｒ２１及びＲ２２は各々独立に水素原子、脂肪族基又は芳香族基を示し、Ｒ３０は脂肪族基を示し、Ｒ３１は水素原子、脂肪族基又は芳香族基を示す。
本明細書で言う脂肪族基としては、炭素数１から１２、好ましくは１から６の直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせの飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、オクチル、ドデシル等のアルキル基、シクロプロピル、シクロブチル、シクロオクチル、シクロドデシル等のシクロアルキル基が挙げられる。脂肪族基は二重結合または三重結合を有する不飽和の炭化水素基でもよい。
本明細書で言う芳香族基としては、炭素数は６〜３０、好ましくは６〜２０、より好ましくは６〜１２、さらに好ましくは６〜１０のアリール基及びアリールアルキル基が挙げられる。アリール基としては、フェニル、トリル、ナフチル等が挙げられ、アリールアルキル基としては、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等が挙げられる。
脂肪族基および芳香族基は１以上の置換基を有していてもよい。置換基の種類は特に限定されないが、例えば、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルキル基、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルケニル基、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルキニル基、アリール基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、カルボンアミド基、スルホンアミド基、カルバモイル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、Ｎ−アシルスルファモイル基、Ｎ−スルファモイルカルバモイル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、アミノ基、アンモニオ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルホ基、メルカプト基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ウレイド基、複素環基（例えば、窒素、酸素およびイオウ等を少なくとも１個以上含み、３ないし１２員環の単環、縮合環）、複素環オキシ基、複素環チオ基、アシル基、スルファモイルアミノ基、シリル基、ハロゲン原子などが挙げられる。上記においてアルキル、アルケニル、アルキニル及びアルコキシの炭素数は一般的には１から１２であり、好ましくは１から６であり、アリールの炭素数は一般的には６から２０であり、好ましくは６から１０である。
一般式（２）において、Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ４０−を示し、ここでＲ４０は水素原子、脂肪族基又は芳香族基を示す。好ましくは、Ｙは−Ｏ−又は−Ｓ−である。Ｒ４０で表される脂肪族基又は芳香族基は上記した通りである。
一般式（２）において、Ｍｅはアルカリ金属を示す。アルカリ金属としては、例えば、Ｌｉ、Ｎａ又はＫが挙げられ、好ましくはＬｉである。
一般式（２）で表される化合物で不斉炭素を有するものは、各々（Ｒ）体、（Ｓ）体、（Ｒ），（Ｓ）体の何れでもよい。
一般式（２）で表されるアルカリ金属化合物の入手方法は特に限定されず、当業者であれば適宜入手でき、例えば、ｎ−ブチルリチウム等のアルキル化アルカリ金属にＲ−ＹＨを反応させることによって得ることができる。
本発明の方法に従いラクチドを一般式（２）で表されるアルカリ金属化合物の存在下で重合させる場合、アルカリ金属化合物（Ｒ−Ｙ−Ｍｅ）の使用量は、ラクチド１モル当たり好ましくは１〜０．１モルであり、より好ましくは０．２〜０．３モルである。
上記反応の反応温度は、反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくは−１００℃〜室温であり、より好ましくは−７８〜−５０℃である。反応は−７８〜−５０℃の温度で開始し、徐々に室温にまで昇温させるように実施するのが好ましい。
上記した方法におけるラクチドの重合反応は、好ましくは反応溶媒の存在下で実施される。反応溶媒は反応に不活性な溶媒であれば特に制限されないが、好ましくはテトラヒドロフラン等の環状エーテル、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン等を用いることができる。反応雰囲気としては、窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガス雰囲気を使用することができる。反応圧力は特に制約されず、好ましくは常圧である。
上記した方法で得られる乳酸オリゴマーの組成は、反応助剤として用いるアルカリ金属化合物によって変化する。アルカリ金属化合物として、例えば、炭素数１〜３のアルキルアルコールのアルカリ金属化合物（好ましくはリチウム化合物）を用いる場合には、環状乳酸オリゴマーと鎖状オリゴマーとの混合物（環状乳酸オリゴマーの割合：８０〜８５重量％）が得られる。一方、アルカリ金属化合物としてｔ−ブチルアルコール等の炭素数４以上のアルキルアルコールのアルカリ金属化合物や、チオフェノール等のアルカリ金属化合物を用いるときには、実質的に環状乳酸オリゴマーのみを選択的に得ることができる。あるいは、アルカリ金属化合物として、一般式（２）においてＲが−ＣＨ（Ｒ２０）ＣＯＮＲ２１Ｒ２２であり、ここでＲ２０は脂肪族基を示し、Ｒ２１及びＲ２２は各々独立に水素原子、脂肪族基又は芳香族基を示す化合物、より具体的には例えば、下記一般式（３）：
2003007937.tif 000005
で表される乳酸アミドを用いることによっても、実質的に環状乳酸オリゴマーのみを選択的に得ることができる。本明細書で言う「実質的に環状乳酸オリゴマーのみを選択的に得る」とは、反応生成物中に鎖状乳酸オリゴマーが実質的に生成しないことを意味し、具体的には、反応生成物中における全乳酸オリゴマーに対する鎖状乳酸オリゴマーの比率が一般的には１０重量％以下、好ましくは５重量％以下、特に好ましくは３重量％以下であることを意味する。
上記したような第１の方法及び第２の方法で製造される環状乳酸オリゴマーは以下の化学構造を有することが予想される。
2003007937.tif 000006
（式中、ｍは１〜３０の整数を示す）
上記した方法の反応生成物は、通常、ｍが１〜３０、例えば１〜２８、１〜２５、１〜２１、又は１〜１８等の整数を示す環状乳酸オリゴマーの混合物である。
好ましい実施態様によれば、実質的に鎖状乳酸オリゴマーが生成されることなく、環状乳酸オリゴマーを選択的に製造することができる。ここで言う「実質的に鎖状乳酸オリゴマーが生成されることがない」とは、反応生成物中における全乳酸オリゴマーに対する環状乳酸オリゴマーの割合が８０重量％以上、好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、特に好ましくは９９重量％以上であることを意味する。
本発明の抗腫瘍剤は、上記した製造方法により製造することができる環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物を有効成分として含む。
本発明で用いるポリ乳酸混合物は、鎖状ポリ乳酸を実質的に含有しないことヶ好ましい。ここで言う「実質的に含有しない」とは、全ポリ乳酸に対する鎖状ポリ乳酸の割合が２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは５重量％以下、特に好ましくは１重量％以下であることを言う。
（Ｂ）本発明の抗腫瘍剤の製造方法及び使用方法
本発明の抗腫瘍剤は、他の抗腫瘍剤および／または免疫療法剤と併用することもできる。他の抗腫瘍剤としては、マイトマイシン、アドリアマイシン、シスプラチン、ビンデシン、ビンクリスチン、サイクロフォスファミド、イフォマファミド、ブレオマイシン、ペプレオマイシンもしくはエトポシドなどが挙げられる。また他の免疫療法剤としては、微生物もしくは細菌細胞壁骨核成分；免疫活性多糖天然型もしくは遺伝子工学手法で得られるサイトカイン；またはコロニー刺戟因子のようなものが挙げられ、上記免疫活性多糖としてはレンチナンもしくはシゾフィラン等が、細菌細胞壁骨核成分としてはムラミルジペプチド誘導体等が、微生物としては乳酸菌等が、また天然型もしくは遺伝子工学手法で得られるサイトカインとしてはインターフェロン等が挙げられる。
本発明の抗腫瘍剤は、前記の成分に加えてさらに必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲内で、医薬品類、医薬部外品類などの製剤に使用される成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができる。本発明の抗腫瘍剤は、単独の医薬品類として使用できる以外に、医薬品類や医薬部外品類などに配合して用いることもできる。
本発明の抗腫瘍剤の形態は特に限定されず、経口投与又は非経口投与用の製剤形態の中から目的に最も適した適宜の形態のものを選択することが可能である。
経口投与に適した製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、ドリンク剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤、チュアブル剤などを挙げることができ、非経口投与に適する製剤形態としては、例えば、注射剤（皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射など）、外用剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
経口投与に適当な液体製剤、例えば、溶液剤、乳剤、又はシロップ剤などは、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを用いて製造することができる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などの固体製剤の製造には、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いることができる。
非経口投与に適当な注射用又は点滴用の製剤は、好ましくは、受容者の血液と等張な滅菌水性媒体に有効成分である上記の物質を溶解又は懸濁状態で含んでいる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、ブドウ糖溶液、又は塩水とブドウ糖溶液との混合物からなる水性媒体などを用いて溶液を調製することができる。腸内投与のための製剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪、又は水素化カルボン酸などの担体を用いて調製することができ、座剤として提供される。また、噴霧剤の製造には、有効成分である上記の物質を微細な粒子として分散させることができ、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分の吸収を容易ならしめる担体を用いることができる。担体としては、具体的には、乳糖又はグリセリンなどが例示される。有効成分である物質及び使用する担体の性質に応じて、エアロゾル又はドライパウダーなどの形態の製剤が調製可能である。これらの非経口投与用製剤には、グリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種又は２種以上の飲食品を添加することもできる。
本発明の抗腫瘍剤の投与量及び投与回数は、投与の目的、投与形態、摂取者の年齢、体重又は性別などの条件などを含む種々の要因により適宜設定することができるが、一般的には、有効成分の投与量として一日当り１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０〜２０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０〜２００ｍｇ／ｋｇである。上記投与量の製剤を一日１〜４回程度に分けて投与することが好ましい。本発明の抗腫瘍剤の投与時期は特に限定されない。
本発明はさらに、上記した縮合度３〜２０の環状ポリ乳酸を主成分として含むポリ乳酸混合物を含む飲食品にも関する。即ち、本発明で用いる縮合度３〜２０の環状のポリ乳酸の混合物は、上記したような単独の製剤の形態で使用するのみならず、飲食品の中に配合して用いることができる。
本発明の飲食品は、ポリ乳酸混合物を分解させることなく配合し得るものであれば、その配合形態には特に制限はない。
本発明の飲食品の製品の具体例としては、清涼飲料、ドリンク剤、健康食品、特定保健用食品、機能性食品、機能活性型食品、栄養補助食品、サプレメント、飼料、飼料添加物などと一般に呼称される、飲料を含む健康食品または補助食品が挙げられる。また、本発明の抗腫瘍剤は、獣医薬、餌飼料等として用いることもできる。
飲食品の具体例としては、例えば、チューインガム、チョコレート、キャンディー、錠菓、ゼリー、クッキー、ビスケット、ヨーグルト等の菓子類、アイスクリーム、氷菓等の冷菓類、茶、清涼飲料（ジュース、コーヒー、ココア等を含む）、栄養ドリンク剤、美容ドリンク剤等の飲料、パン、ハム、スープ、ジャム、スパゲティー、冷凍食品など任意の飲食品を挙げることができる。あるいは、本発明で用いる環状ポリ乳酸混合物は調味料又は食品添加剤などに添加して用いることもできる。本発明の飲食品を摂取することにより抗腫瘍効果が発揮され、実質的に有害な副作用を示さない安全な飲食品を提供することができる。
本発明の飲食品は、ポリ乳酸混合物を、食品に使われる一般的な原料に直接混合、分散したのち、公知の方法により所望の形態に加工することによって得ることができる。
本発明の飲食品はあらゆる形態の飲食品を包含するものであり、その種類は特に制限されず、上記したような各種飲食物、あるいは各種栄養組成物、例えば各種の経口又は経腸栄養剤や飲料等に、本発明の抗腫瘍剤を配合して飲食品として提供することができる。このような飲食品の組成としては、縮合度３〜２０の環状のポリ乳酸混合物の他に、蛋白質、脂質、糖質、ビタミン及び／又はミネラル類などを含めることができる。飲食品の形態は特に限定されず、摂取しやすい形態であれば、固形、粉末、液体、ゲル状、スラリー状等のいずれであってもよい。
飲食品中におけるポリ乳酸混合物の含有量は特には限定されないが、一般的には０．１〜２０重量％、より好ましくは０．１〜１０重量％程度である。
飲食品に含まれるポリ乳酸混合物の量は、本発明の目的とする抗腫瘍作用を発揮できる程度に含まれることが好ましく、好ましくは摂取される飲食物１食中に０．１ｇから１０ｇ程度、より好ましくは０．５ｇから３ｇ程度である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によっていかなる点においても限定されることはない。
実施例
合成例１：ポリ乳酸混合物（以下、ＣＰＬとも称する）の製造
マントルヒーターに収めたセパラブルフラスコにＬ−乳酸（Ｄ−乳酸も混入しているもの）５００ｍｌを入れた。窒素ガス３００ｍｌ／分の流入及び撹拌を行い、溜出水は保温した下降型接続管を経て還流冷却器付フラスコに導きながら、１４５℃で３時間加熱した。更に１５０ｍｍＨｇに減圧して同温度で３時間加熱した後、３ｍｍＨｇの減圧下１５５℃で３時間、最後に３ｍｍＨｇの減圧下１８５℃で１．５時間加熱し、反応生成物であるポリ乳酸を得た。
得られたポリ乳酸は１００℃に保ち、エタノール１００ｍｌに続いてメタノール４００ｍｌをそれぞれ加えた後放冷した。これをメタノール５００ｍｌ中に加え、よく撹拌して静置した後濾過して精製した。その濾液を減圧乾燥してアセトニトリルに溶解し、全量を２００ｍｌ（原液）とした。
この原液を、予め平衡化した逆相ＯＤＳカラム（ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ）にかけ、０．０１Ｍ塩酸を含む３０％、５０％および１００％アセトニトリル（ｐＨ２．０）でステップワイズに溶離し、アセトニトリル１００％溶出画分であるポリ乳酸（縮合度３〜２０）を得た。得られた物質の質量スペクトルを図１に示す。図１中の規則的なフラグメントイオンピークから明らかなように、得られたポリ乳酸の混合物は、環状縮合体と直鎖状縮合体とが混在した状態になっている。
合成例２：環状ポリ乳酸混合物（以下、ＡＤ−３とも称する）の製造
（ｓ）−（＋）−乳酸１０．０ｇを内容積１００ｍｌのナス型フラスコに入れ、これをロータリーエバポレータにセットする。フラスコ内の圧力を３５０〜４００ｍｍＨｇに調節し、１４０℃まで加熱し、同圧力及び同温度で６時間反応を続ける（第１加熱工程）。この反応により生成した副生水はこれを留去した。また、前記反応条件下では、ラクチドは殆んど系外へ留去しなかった。
次に、反応温度を１５０〜１６０℃に上昇させ、反応圧力を約６時間かけて４００ｍｍＨｇから徐々に下げ、１５〜２０ｍｍＨｇまで降下させた（降圧速度：１ｍｍＨｇ／分）。この降圧速度の条件では、副生水は留去されたが、ラクチドは殆んど留去されなかった。その後、圧力を１５〜２０ｍｍＨｇに保ち、６時間反応を継続した（第２加熱工程）。
次に、圧力を３０分かけて１〜３ｍｍＨｇにまで下げ、１６０℃の反応温度で５時間反応を続けた（第３加熱工程）。
前記反応終了後、反応生成物を分析した結果、平均重合度が３〜２１の環状オリゴマー６．８０ｇ（収率８５％）が得られた。
合成例２で得られた反応生成物のＭＳスペクトルを図２に示す。また、合成例２で得られた反応生成物のＮＭＲの全体図を図３に、図３の一部分の拡大図を図４及び図５に示す。
実施例１：
（Ａ）材料と方法
（１）実験動物と腫瘍細胞の移植
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）の右大腿部皮下に１．０×１０４個のルイス肺癌細胞を移植した。
（２）被検物質の投与
マウスを、対照群（溶媒投与群）、ＡＤ−３（合成例２で調製したもの）投与群（本発明）およびＣＰＬ（合成例１で調製したもの）投与群（比較例）に分けた。ＡＤ−３投与群とＣＰＬ投与群は、各個体に投与する１回あたりの量に応じて４群、つまり０．２ｍｇ、０．４ｍｇ、１．０ｍｇおよび４．０ｍｇ投与群、に分けた。
移植２日後から溶媒投与群ＡＤ−３投与群およびＣＰＬ投与群には、溶媒（グリセリンとプロピレングリコールの混合液）、溶媒に懸濁したＡＤ−３、あるいはＣＰＬの腹腔内投与を開始し、投与開始後、１７〜１９日目に安楽死させるまで隔日投与を継続した。
（３）移植組織の採取と計測：
深麻酔後、開胸して左心室からＰＢＳを還流した。その後、移植した腫瘍組織を摘出し、直径・短径および厚さを計測するとともに重量を測った。腫瘍組織は、表層の腫瘍細胞が密集する腫瘍細胞層と深部で血液が充満する海綿状の組織に分かれていた。そこで重量を計測した後、海綿状組織を取り除き、表層の腫瘍細胞層の重量を測定した。
（４）肺転移コロニーの観察：
両肺を摘出した後、各葉表面に存在する転移コロニーの数を計測した。
（５）移植組織の組織像：
組織学的手法に従って腫瘍組織の組織切片を作製し、Ｈ・Ｅ染色を施して検鏡した。
（Ｂ）結果とまとめ
結果を図６から図８に示す。
（１）腫瘍組織
ＣＰＬ群における腫瘍組織重量は、０．４ｍｇ投与群では対照群よりも増加したが、その他の投与量群では変化がなかった。これに対し、ＡＤ３投与群では１．０ｍｇ投与群で約６５％に減少するなどＣＰＬ群に比べ腫瘍抑制効果は顕著であった（図６及び７）。
（２）腫瘍組織像
組織切片を観察した結果、ＡＤ３投与群では実質性組織と海綿状組織の境界領域、あるいは実質性組織内部に多数の好中球の浸潤が認められた。実質性組織内の好中球は、毛細血管周辺に認められた。また、このＡＤ３群における好中球の浸潤は、ＣＰＬ投与群に比べると圧倒的な領域で認められ、その差は顕著であった。また、この浸潤はＡＤ３群でも最も腫瘍縮小効果が認められた１．０ｍｇ投与群で顕著であり、腫瘍縮小効果との関連性も示唆される。
（３）肺転移コロニー
ＡＤ−３投与群の転移コロニーの数は、対照群やＣＰＬ群に比べると少ないことがわかった。中でも１．０ｍｇ投与群では、対照群の約１／３程度であった。これらの観察結果から、移植腫瘍組織の増殖と転移の抑制効果は、選択的環状乳酸オリゴマーであるＡＤ３の方が有効であり、その効果は１．０ｍｇ投与群で最も顕著であった（図８）。
（４）まとめ
選択的環状乳酸オリゴマー合成法で得られたＡＤ−３の抗腫瘍効果を従来の加熱縮合法によるＣＰＬと比較した。投与量を変えて検討した結果、ＡＤ−３の腫瘍縮小効果、および転移抑制効果はＣＰＬよりも優れていることが明らかになった。
また、ＡＤ−３によって、腫瘍組織内において血行性に好中球の浸潤が認められた。ＡＤ−３ならびにＣＰＬの抗腫瘍効果の要因が、嫌気的解糖系が抑制に基づいていることは既に示唆されているが、今回の結果は、環状乳酸オリゴマーには嫌気的解糖系の抑制による抗腫瘍効果のほかに免疫系を介しての腫瘍抑制効果があることが示唆された。
ＡＤ−３投与群の中では、１．０ｍｇ投与群で顕著な効果が認められた。従来、ＣＰＬの腹腔投与では、４ｍｇで効果が認められていたことから至適濃度の違いも明らかになった。
実施例２：
（Ａ）材料と方法
（１）実験動物と腫瘍細胞の移植
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）３１匹の右大腿部皮下に１．０×１０４個のルイス肺癌細胞を移植した。
（２）環状ポリ乳酸混合物の投与
移植２日後、マウスを無処置群とＡＤ−３（合成例２で合成したもの）投与群（０．１ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇおよび１．０ｍｇ投与群）に分けた。ＡＤ−３投与群には隔日に溶媒（プロピレングリコール）に懸濁したＡＤ−３を腹腔投与し、投与開始後１６日目に安楽死させた。
（３）移植組織の採取と計測
深麻酔後、開胸して左心室からＰＢＳを還流した。その後、移植した腫瘍組織を摘出し、長径・短径および厚さおよび重量を測った。腫瘍組織は、表層で腫瘍細胞が密集する領域（実質性組織）と深部で血液が充満する海綿状の組織に分かれていた。そこで重量を計測した後、海綿状組織を除去し、表層の実質性組織の重量を測定した。
（４）嫌気性解糖系の酵素活性
海綿状組織を取り除いた実質性組織（腫瘍組織）と肺組織でヘキソキナーゼ（ＨＫ）、ホスフォルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定した。
（５）肺転移コロニーの観察
両肺を摘出した後、各葉表面に存在する転移コロニーを特大・大・中および小の４段階に分類し、その数を計測した。
（６）組織学的検討
腫瘍組織を組織学的方法に従って固定した後、親水性メタクリル樹脂に包埋し、薄切した切片にＨ−Ｅ染色を施して観察した。
（Ｂ）結果とまとめ
（１）腫瘍組織重量
各群の腫瘍組織の重量は、表１に示す。また、それぞれの群における実質性組織と海綿状組織の割合は図９にまとめた。図１０では、対照群の重量を１００にした場合の投与群の腫瘍重量、実質性組織重量および海綿状組織重量を表した。
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その結果、投与量の増加に従って腫瘍組織全体と実質性組織重量の減少が認められ、実質性組織が腫瘍全体に占める割合も減少傾向を示した。また、ＡＤ−３投与群は、いずれも海綿状組織の重量が対照群に比べ約２００％前後で推移し、明らかに増加していることが認められた。
（２）嫌気的解糖系の酵素活性
各群の腫瘍組織において、嫌気的解糖系の酵素活性を測定した結果、０．１ｍｇ、０．２５ｍｇ、および０．５ｍｇ投与群で酵素活性の有意な低下が認められた（表２）。しかしながら、肺組織でＨＫ・ＰＦＫ・ＰＫおよびＬＤＨ活性を測定したところいずれの投与群でも対照群と比べて有意な差は認められなかった。
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（３）腫瘍組織の組織学的観察
組織切片を検鏡した結果、実質性組織には、細胞分裂像を含む腫瘍細胞の集団が認められた。また、海綿状組織は細胞の壊死像で占められ好中球などの浸潤が認められた。両者の境界域には、膨化した空胞を多数含む細胞が観察された。
（４）まとめ
ＡＤ−３の抗腫瘍作用について検討した結果、移植した腫瘍組織の縮小、壊死した癌細胞が占める割合の増加、および嫌気的解糖系の抑制効果が認められた。
ＣＰＬを含むこれまでの物質による研究では、発癌や移植癌組織の増殖が抑制され、この現象が癌細胞の嫌気的解糖系の抑制と密接に関連していることが明らかになっている。今回の実験では、従来報告されているものよりもさらに低用量の投与によって、抗腫瘍効果を認めた。また、腫瘍組織内の細胞壊死の領域（海綿状組織）の増加が観察され、細胞壊死の進行が加速していることも示唆された。この現象は、腫瘍の大きさや重量に有意差がない０．２５ｍｇや０．５ｍｇ投与群の場合でも認められた。これらの群では、嫌気的解糖系は抑制されており、腫瘍組織の活性は低下していると考えられ、このような腫瘍内の海綿状組織の増加は、ＣＰＬの抗腫瘍作用の重要な指標となる。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規な抗腫瘍剤、並びにそれを利用した飲食品を提供することが可能になった。本発明の抗腫瘍剤は低用量でも十分な抗腫瘍効果を発揮できる。また、本発明において有効成分として用いられるポリ乳酸混合物は、生体成分に由来する乳酸の低縮合体であることから、生体適合性が高く、副作用が少ない。
【図面の簡単な説明】
図１は、合成例１で得られたポリ乳酸混合物の質量スペクトルを示す。
図２は、合成例２で得られた反応生成物のＭＳスペクトルを示す。
図３は、合成例２で得られた反応生成物のＮＭＲの全体図を示す。
図４は、図３の一部分の拡大図を示す。
図５は、図３の一部分の拡大図を示す。
図６は、実施例１における腫瘍組織重量の比較を示す。
図７は、実施例１におけるＡＤ−３投与群の腫瘍組織（実質性組織・海綿状組織）重量を示す。
図８は、実施例１におけるＡＤ−３投与群の肺転移コロニー数の比較を示す。
図９は、実施例２における腫瘍組織の割合の比較を示す。
図１０は、実施例２における各組織重量の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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