(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母に異種のタンパク質を均質形（homogeneous form）で製造する方法において、Saccharomyces cerevisiae株HT393(DSM9697)、またはその誘導体であってプロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼＳおよびプロテイナーゼyscＥを欠失するものを、上記異種タンパク質の発現に使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むハイブリッドベクターで形質転換した、Saccharomyces cerevisiae株HT393(DSM9697)、またはその誘導体であってプロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼＳおよびプロテイナーゼyscＥを欠失するものを培養し、異種タンパク質を単離する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
異種タンパク質が分泌されない、請求項１記載の方法。
【請求項４】
異種タンパク質がα−インターフェロン、ハイブリッドインターフェロンおよびプラスミノーゲン活性化因子阻害因子から選択されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
異種タンパク質がハイブリッドインターフェロンＢＤＢＢまたはプラスミノーゲン活性化因子ＰＡＩ−２阻害因子である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
HT393の誘導体がcir0またはＭＡＴαである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
HT393の誘導体がＭＡＴａ、leu２−３、leu２−１１２、ura３Δ５、prb１−１、cps１−３、prc１−１、pra１−１およびpre１−１である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
Ｓ．cerevisiae株HT393(DSM9697)、またはその誘導体であってプロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼＳおよびプロテイナーゼyscＥを欠失するものが、異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列および転写停止信号を含むＤＮＡ配列に作動可能に結合したプロモーターを有する発現カセットを含んでいるプラスミドで形質転換されている、請求項１記載の方法。
【請求項９】
プロモーターがＰＨＯ５、ＡＤＲ２およびＧＡＬ／ＣＹＣ１プロモーターから選択されるものである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ターミネーターがＰＨＯ５、ＦＬＰおよびα−因子ターミネーターから選択されるものである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
発現カセットがpPAI-2A-10、pPAI-2A-20、pPAI-2B-10、pPAI-2B-20または配列番号１(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１)に含まれる組換えＤＮＡ分子を有するものである、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
プラスミドが２ミクロン、Yep２４およびpEMBLyexプラスミドから選択されるプラスミドに基づくものである、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
酵母に異種のタンパク質を均質形で製造するための、Saccharomyces cerevisiae株HT393(DSM 9697)、またはその誘導体であってプロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼＳおよびプロテイナーゼyscＥを欠失するものの使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は組換えＤＮＡ技術の分野に属し、タンパク質の遺伝子を含むハイブリッドベクターを担持する遺伝子操作した酵母細胞の助けを借りた該タンパク質の製造法に関する。
発明の背景
遺伝子工学において、原核および真核宿主のための多くのタンパク質発現システムが知られているが、既知のシステムを越える利点を有する新規方法の必要性は続いてる。
パン酵母Saccharomyces cerevisiaeにおける異種タンパク質の発現の操作において、高レベルの発現が、多くの因子、例えば、プラスミド安定性、プラスミド複製数、プロモーター強度、翻訳効率、低タンパク質分解に依存することが通常観察されている。
この状況において、非常に重要な要件の一つは、製造に使用するための酵母株である。
近年、相当な数の異種タンパク質が、酵母細胞を、例えば、α−インターフェロン(Hitzeman et al.,Nature(1981),294,717-722)、組織型プラスミノーゲン活性化因子(ＥＰ−Ａ−１４３０７１)またはあるデスルファトヒルジン(ＥＰ−Ａ−２２５６３３)のような、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む適当な発現ベクターで形質転換した後に、異なる酵母株から発現されている。しかしながら、多くの場合、異種タンパク質は純粋な形ではなく、Ｃ−またはＮ−末端短縮のような部分的に分解されたタンパク質を含む混合物として合成される。例えば、酵母中のヒト心房性ナトリウム利尿タンパク質(ｈＡＮＰ)の発現は、そのＣ−末端が異なる成熟ｈＡＮＰの二つの形の分泌をもたらす(Vlasuk et al.,J.Biol.Chem.(1986),261,4798-4796)。同様な結果が、分泌された発現生産物が、最後(Arg５３)または最後の二つ(Leu５２およびArg５３)のアミノ酸が欠失していることで異なり、完全な長さの表皮成長因子(ＥＧＦ)が生産されない、酵母中でのＥＧＦの発現(George-Nascimento et al.,Biochemistry(1988),27,797-802)後にも得られている。
α−インターフェロン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子またはデスルファトヒルジンのような完全な長さのタンパク質ならびにＣ−またはＮ−末端短縮誘導体のような部分的分解物を含む混合物の個々の成分への分離およびこれらの成分の均質までの精製は、これらの誘導体が少しでも生物学的に活性である場合、困難で時間がかかる。付随的経費を考慮して、酵母におけるデスルファトヒルジンのような均質タンパク質の経済的製造を可能にする改善された方法の必要性がある。酵母に異種のタンパク質を均質形で製造する方法が、本発明の目的である。
驚くべきことに、異種タンパク質の発現におけるSaccharomyces cerevisiae株ＨＴ３９３の使用が、他の遺伝子的に緊密に関係するSaccharomyces cerevisiae株、例えば、遺伝的に最も緊密に関係するSaccharomyces cerevisiae c13-ABYS-86(DSM 9698)と比較して、生理学的に活性で非分解形の発現異種タンパク質の収率増大を導くことが判明した。
発明の記載
本発明は、Saccharomyces cerevisiae株HT393(DSM 9697)またはその誘導体を異種タンパク質の発現に使用することを特徴とする、酵母に異種のタンパク質を均質形で製造する方法に関する。
好ましい態様において、本発明は、異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むハイブリッドベクターで形質転換したSaccharomyces cerevisiae株HT393(DSM 9697)またはその誘導体を培養し、異種タンパク質を単離することを含む、酵母に異種のタンパク質を均質形で製造するための改善された方法に関する。
HT393の誘導体は、HT393に由来し、異種タンパク質の製造に関して同じ性質を示す株である。本発明の株の使用は、例えば、発現された異種タンパク質の生物学的に活性で非分解形の増加した収率を導く。
異種タンパク質はまた、更に、例えば、グリコシル化処理できる。有用なタンパク質は、例えば、栄養物の製造および化学における酵素反応の実施に使用できる酵素もしくは、栄養物として有用で価値のあるまたはヒトまたは動物疾病の処置または予防のためのタンパク質、例えば、ホルモン、免疫調節活性、抗ウイルスおよび抗癌特性を有するポリペプチド、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝固因子、酵素阻害剤、食料品等である。
このような異種構造遺伝子は、例えば、セクレチン、チモシン、レラキシン、カルシトニン、黄体化ホルモン、副甲状腺ホルモン、アドレノアデノコルチコトロピン(adrenoadenocorticotropin)、メラノサイト刺激ホルモン、β−リポトロピン、ウロガストロンまたはインシュリンのようなホルモン、上皮成長因子、インシュリン様成長因子(ＩＧＦ)、例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II、肥満細胞成長因子、神経成長因子、グリア由来神経細胞成長因子または変換成長因子(transforming growth factor)(ＴＧＦ)、例えば、ＴＧＦαまたはＴＧＦβ、例えば、ＴＧＦβ１、β２またはβ３のような成長因子、ヒトまたはウシ成長ホルモンのような成長ホルモン、インターロイキン−１または−２のようなインターロイキン、ヒトマクロファージ遊走阻止因子(ＭＩＦ)、ヒトα−インターフェロン、例えば、インターフェロン−αＡ、αＢ、αＤまたはαＦ、β−インターフェロン、γ−インターフェロンまたはハイブリッドインターフェロン、例えば、αＡ−αＤ−またはαＢ−αＤ−ハイブリッドインターフェロン、特にハイブリッドインターフェロンＢＤＢＢのようなインターフェロン、α1アンチトリプシン、ＳＬＰＩのようなプロテイナーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子の阻害剤(ＰＡＩ−２)等のような阻害剤、Ｂ型肝炎ウイルス表面またはコア抗原またはＡ型肝炎ウイルス抗原、または非Ａ非Ｂ抗原のような肝炎ウイルス抗原、組織プラスミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼのようなプラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エンドルフィン、免疫グロブリンＤ、ＥまたはＧの軽および／または重鎖またはヒト−マウスハイブリッド免疫グロブリンのような免疫グロブリン、免疫グロブリンＥ結合因子、例えばｓＣＤ２３等のような免疫グロブリン結合因子、カルシトニン、ヒトカルシトニン関連ペプチド、第IX因子または第VIIIc因子のような血液凝固因子、エリスロポイエチン、エグリンＣのようなエグリン、デスルファトヒルジン変種ＨＶ１、ＨＶ２またはＰＡのようなデスルファトヒルジン、ヒトスーパーオキシドディスムターゼ、ウイルスチミジンキナーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラーゼをコードするものである。
好ましい遺伝子は、ヒトα−インターフェロンまたはハイブリッドインターフェロン、特にハイブリッドインターフェロンＢＤＢＢおよびプラスミノーゲン活性化因子阻害因子(ＰＡＩ−２)をコードするものである。
本発明の好ましい態様において、発現均質タンパク質は分泌されない。
Ｓ．cerevisiae株HT393(E95-1-2A)は、Heinemeyer et al.,ＥＭＢＯ Ｊ．(1991),10,555-562に記載のように、c13-ABYS-86株(DSM 9698)から得る。
Ｓ．cerevisiae株HT393の誘導体なる用語は、HT393から遺伝子工学により由来し、例えば、更に２ミクロン(２μ)ＤＮＡ(cir0)から除かれ、異なる交配型(ＭＡＴα)および／または異なる分泌マーカーを有する株を含む。好ましいものは、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼＳおよびプロテイナーゼyscＥをまた欠失するHT393およびその誘導体である。
本質的に好ましくは、少なくとも以下の遺伝的特性、ＭＡＴａ、leu２−３、leu２−１１２、ura３Δ５、prb１−１、cps１−３、prc１−１、pra１−１およびpre１−１を示すHT393およびその誘導体である。
発現カセット
好適な発現カセットは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列および転写停止信号を含むＤＮＡ配列に操作可能に結合したプロモーターを含む。
発現カセットは、更に、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列の適当な読み取り枠に結合した信号ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み得る。
好ましい態様において、プロモーター、信号配列、存在するのであればターミネーターは、酵母発現システムにより認識される。
ある宿主において発現させるのに好適なプロモーターは既知である。例は、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＣ１遺伝子(アルコールデヒドロゲナーゼＩをコード)またはＡＤＲ２遺伝子(アルコールデヒドロゲナーゼIIをコード)、酸ホスファターゼ(ＰＨＯ５)遺伝子、ＣＵＰ１遺伝子、イソチトクロームｃ遺伝子のプロモーターまたは糖分解酵素、例えば、ＴＤＨ３、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)、GAPDHの短縮版(GAPFL)、３−ホスフォクリセラートキナーゼ(ＰＧＫ)、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホプルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセフォスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、インバターゼおよびグルコキナーゼ遺伝子をコードする遺伝子のプロモーター、ａ−またはα−因子をコードする酵母交配フェロモン遺伝子のプロモーター、またはGAL/CYC1ハイブリッドプロモーター(GAL1-GAL10遺伝子／Cytochromel遺伝子の遺伝子間領域；Guarente et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(1982),79,7410-7414)である。本発明の好ましいベクターは、例えば、成長条件の変化により付けたり消したりできる転写制御を有するプロモーター、例えば、ＰＨＯ５、ＡＤＲ２またはGAL/CYC1プロモーターを含む。例えば、ＰＨＯ５プロモーターは、単に、培地中の無機リン酸濃度の増加または減少により、意のままに抑制または脱抑制できる。
信号ペプチドをコードするＤＮＡ配列(“信号配列”)、例えば、酵母信号ペプチドは、通常分泌されるタンパク質をコードする酵母遺伝子由来である。酵母信号配列は、例えば、酵母インバーターゼ(ＳＵＳ２)、α−因子、フェロモンペプチダーゼ(ＫＥＸ１)、“死滅毒素”および抑制可能酸ホスファターゼ(ＰＨＯ５)遺伝子およびAspergillus awamori由来のグルコアミラーゼ信号配列である。特別な処理信号を担持し得るプロ−またはスペーサー−配列のような付加配列をまた構築物中に含むことができ、前駆体分子の正確な処理を容易にする。例えば、処理信号は、ゴルジ膜に位置する酵母エンドペプチダーゼにより認識される、Lys-Arg残基を含む。
転写停止信号、例えば、酵母転写停止信号を含むＤＮＡ配列は、好ましくは、転写停止およびポリアデニル化の正確な信号を含む遺伝子、例えば、酵母遺伝子の３'フランキング配列である。好ましいフランキング配列は、酵母ＰＨＯ５、ＦＬＰおよびα−因子遺伝子のものである。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、制限酵素、ＰＣＲを使用した所望のフラグメントの切除のような、当分野で既知の方法により、天然宿主の遺伝子バンクから単離し得、または、例えば、宿主の好ましいコドン使用を使用して、化学的に合成し得る。
プロモーター、タンパク質をコードするＤＮＡ遺伝子および転写停止信号を含むＤＮＡ配列は互いに操作可能に結合し、すなわち、それらの通常の機能が維持される方法で、並列している。配列は、プロモーターが適切なタンパク質の発現、または、信号配列が存在する場合、適切な信号配列−タンパク質複合体の発現を果し；転写停止信号が転写およびポリアデニル化の適切な停止を果すようにする。信号配列を使用する場合、信号配列は、信号配列の最後のコドンがタンパク質の遺伝子の最初のコドンに直接結合するように、タンパク質遺伝子の適切な読み取り枠内で結合する。信号配列は、存在する場合、翻訳開始のためのそれ自体のＡＴＧを有する。これらの配列の結合は、例えば、エンドヌクレアーゼの認識配列を担持する合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーの手段により成す。関連する発現カセットの例は、例えば、ＥＰ−Ａ−３４１２１５に記載されている。
好ましい発現カセットは、ＰＨＯ５、ＡＤＲ２またはGAL/CYC1プロモーター、上記で定義のタンパク質をコードする遺伝子およびＰＨＯ５、α−因子またはＦＬＰターミネーターを含む。
特に好ましくは、例えば、pPAI-2A-10、pPAI-2A-20、pPAI-2B-10、pPAI-2B-20からなる、もしくは配列番号１またはその機能的フラグメントまたは誘導体からなる発現カセットである。
組換えＤＮＡ分子の機能的フラグメントまたは誘導体は、例えば、上記タンパク質の短縮または伸長形をコードするフラグメントまたは該タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を含む発現カセットである。
組換えプラスミド
上記の発現カセットは、通常、酵母中での異種タンパク質の発現に適当なプラスミド中に挿入されている。これらのプラスミドは、２ミクロン、すなわち、pMB354またはpEMBLyexプラスミドを基にする(CesareniおよびMurray,Genetic Engineering(1987),4,135-154)。好適な組換えプラスミドは、例えば、タンパク質発現カセットの他に、複製の起点を含む２ミクロンＤＮＡに由来するＤＮＡセグメントまたは全２ミクロンＤＮＡを含む。例えば、本発明のプラスミドは、非中断形で完全な２ミクロンＤＮＡを含み、すなわち、２ミクロンを一度制限エンドヌクレアーゼで開裂し、直鎖状にしたＤＮＡをベクターの他の成分と結合させ、その後再環化する。制限部位は、ＲＥＰ１、ＲＥＰ２およびＦＬＰ遺伝子および２ミクロンＤＮＡのＯＲＩ、ＳＴＢ、ＩＲ１およびＩＲ２部位ならびに、ＦＬＰリコンビナーゼが作用する点である各逆反復(ＩＲ)の中心の近くに位置する、小“ＦＬＰ認識標的”(ＦＲＴ)部位の正常な機能が維持されるように選択する。所望により、制限部位は、２ミクロンＤＮＡのＤ遺伝子がまた無傷で保たれるように選択する。適当な制限部位は、例えば、全ての該遺伝子および部位の外に位置する独特なHpa1およびSnaＢＩ部位である。しかしながら、同様に、発現カセットおよび更なる成分(下記参照)を、２ミクロンＤＮＡ内の異なる(例えば２つの)制限部位、特に上記の所に挿入することが可能である。
このようなプラスミド誘導体は、二つの逆に反復したＦＲＴ部位または更なる、第３のＦＲＴ部位を含み得る。前者の種のプラスミドを以後“対称２ミクロン様ハイブリッドベクター”と呼ぶ。後者の種のプラスミドを、本当の対称ではないが、それで形質転換した酵母細胞中で対称２ミクロン様ハイブリッドベクターを発生させるため、以後“対称２ミクロン様分解ベクター”と呼ぶ。
本発明の対称２ミクロン様ハイブリッドベクターは、好ましくは、細菌またはウイルスＤＮＡ、即ち、細菌ゲノムまたはプラスミドまたはウイルス由来のＤＮＡを含まない。しかしながら、本発明の２ミクロン様分解ベクターは、本分解ベクターから対称２ミクロン様ハイブリッドベクターが製造される形質転換酵母細胞中でベクターから切断される二つの直接反復したＦＲＴ部位の間に、真核起源のＤＮＡ配列を含み得る。これらのＤＮＡ配列は、下記のような細菌配列であり、ベクター必須構造的または機能的特性に提供され得、または、対称２ミクロン様ハイブリッドベクターまたは対称分解ベクターを構築するために、非対称２ミクロン様プラスミド誘導体または“非対称”分解ベクターの二つの逆に反復したＦＲＴ部位の間の二つの領域を満たす機能のみを有し得る。
好ましくは、本発明の発現ベクターは、１個またはそれ以上の、特に１個または２個の選択的遺伝子マーカー、例えば、酵母のためのマーカーおよび、細菌宿主、特にEscherichia coliのマーカーおよび(対称２ミクロン様ハイブリッドベクター以外の)複製起点を含む。
選択的遺伝子マーカーに関して、マーカー遺伝子の表現型的発現により、形質転換体の選択を容易にするマーカー遺伝子が使用できる。適当なマーカーは、例えば、抗生物質耐性を発現するもの、または、栄養要求酵母変異体の場合、宿主の障害を補足する遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば、抗生物質Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはブレオマイシンに対する耐性を付与するかまたは栄養要求酵母変異体、例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３またはＴＲＰ遺伝子に原栄養性を提供する。
発現プラスミドの増幅が原核生物、例えば、Ｅ．coliで簡便に行われるため、原核生物(例えば、Ｅ．coli)遺伝子マーカーおよび原核生物(例えば、Ｅ．coli)複製起源を有利には含む。これらは、対応する原核生物プラスミド、例えば、原核生物、例えば、Ｅ．coli複製起源およびアンピシリンのような抗生物質に耐性を付与する遺伝子マーカーを含むpBR322またはｐＵＣプラスミド、例えば、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９のようなＥ．coliプラスミドから得ることができる。
タンパク質発現カセット、複製起点および遺伝子マーカーの他に、本発明の発現プラスミドは、所望により、付加的発現カセット、例えば、１個から３個のタンパク質発現カセットを含むことができる。付加的タンパク質発現カセットは、互いに同一または異なり、ベクター中に既に存在するタンパク質発現カセットと同一または異なる。
タンパク質の単離
タンパク質は慣用の方法で単離できる。例えば、第１段階は、通常、細胞壁の融解または機械的破壊および遠心による細胞残骸の除去から成り、または、分泌型タンパク質の場合、遠心による培養液からの細胞の分離から成る。上清は、ほとんどの非タンパク質様物質を除去するようにポリエチレンイミンで処理し、硫酸アンモニウムで溶液を飽和してタンパク質を沈殿させ、または適当な溶媒で抽出して、タンパク質に富ませることができる。宿主タンパク質が、存在する場合、例えば、酢酸(例えば、０.１％、ｐＨ４−５)で酸性化してまた沈殿させ得る。他の精製段階は、例えば、淡水化、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆層ＨＰＬＣ等のようなクロマトグラフィー工程を含む。混合物の成分の分離はまた透析により、電荷に従ってゲル電気泳動または無担体電気泳動により、分子サイズに従って適当なSephadexカラムにより、例えば、抗体、特にモノクローナル抗体での親和性クロマトグラフィーにより行う。
本発明の更なる態様は、酵母に異種のタンパク質を均質形で製造するための、Saccharomyces cerevisiae株HT393(DSM 9697)またはその誘導体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
以下の実験部分において、本発明の種々の態様が添付の図面を参考にして記載されており：
図１はプラスミドpPAI-2A-10の図式的説明である。
図２はプラスミドpPAI-2A-20の図式的説明である。
図３はプラスミドpDP34R-PHO5-IFAM119の図式的説明である。
酵母株の説明
Ｓｃ７９（Priece et al.,Gene(1987),55,287-293）
XV2181（Priece et al.,Gene(1987),55,287-293）
150-2B（Baldrai et al.,EMBO(1987),6,229-293）
CGY1465（Rudolph et al.,Cell(1989),58,1333-145）
c13-ABYS-86（Heinemeyer et al.,EMBO J.(1991),10,555-562）DSM 9698 MATα、leu2-3、leu2-112、ura3Δ5、prb1-1、cps1-3、prc1-1、pra1-1、his
HT393（Heinemeyer et al.,EMBO J.(1991),10,555-562）DSM 9697 MATα、leu2-3、leu2-112、ura3Δ5、prb1-1、cps1-3、prc1-1、pra1-1、pre1-1
実施例
全ＤＮＡ操作は−特記しない限り−例えば、Sambrook et al,,Molecular Cloning:A laboratory manual,2nd Edn,Cold Spring Habor Laboratory Press,Cold Spring Habor ＮＹ,1989の記載のような標準プロトコールに従って行う。
１.プラスミノーゲン活性化因子(ＰＡＩ−２)の発現
１.１  pMB354の構築
本プラスミドは酵母／Ｅ．coliシャトルベクターYep24を基本にし、Ｓ．cerevisiae中での異種タンパク質の発現のためにＡＤＲ２プロモーターを有する。
ＡＤＲ２遺伝子に特異的なＤＮＡ配列は、BamＨＩおよびSal1制限部位がアルコールデヒドロゲナーゼIIタンパク質の本来のＡＴＧ翻訳開始コドンの上流に製造されている以外、Russell et al.(J.Biol.Chem.(1983),258,2674-2682)により発表されているものと同一である。変位EcoＲＶ／Xba1  ＤＮＡフラグメントをpMac５.８にクローンし、pMac５.８−ＡＤＲを製造し(Strassen et al.,Nucl.Acids Res.(1985),17,4441-4454に記載のように)、SmaＩおよびXba1で消化する。１１００bpフラグメントを、プラスミドをXba1およびEcoＲＩで切断することによりそこから単離する。本フラグメントをベクターYep24にクローンし、Nhe1およびPvuIIで切断し、新プラスミドpMB354を製造する。
クローンＡＤＲプロモーターの対応部位は以下の構造を有する：
0003732516.tif 000002
１.２  ＰＡＩ−２をコードするｃＤＮＡの単離
ＰＡＩ−２のｃＤＮＡは、４１５アミノ酸であり、開始メチオニンを除去した後の非グリコシル化タンパク質のMr.が４６.５４３と予測されるタンパク質をコードするＵ９３７細胞系由来である。タンパク質は恐らく３つのＮ−グリコシル化部位を有する(Antalis et al.,Proc.Natl.Acad,Sci.USA(1988),86,985-998)。ＰＡＩ−２を含む適当なBgIII／EcoＲＩフラグメントをプラスミドpBT447(Antalis et al.,Proc.Natl.Acad,Sci.USA(1988),86,985-989)から単離する。突出したBgIIIおよびEcoＲＩ末端を、ポリメラーゼＩクレノウフラグメントで平滑末端とする。
この対立遺伝子タイプをＰＡＩ−２のＡと呼ぶ(ＰＡＩ−２Ａ)。アミノ酸位
Asn120(ＡＡＴ)→Asp120(ＧＡＴ)
Asn404(ＡＡＣ)→Lys404(ＡＡＧ)および
Ser413(ＴＣＣ)→Cys413(ＴＧＣ)
で変化した３つのアミノ酸を有する他の対立遺伝子が存在し、ＰＡＩ−２のタイプＢと呼ぶ(ＰＡＩ−２Ｂ)。
１.３  ＰＡＩ−１Ａのクローニング
ＰＡＩ−２発現ベクターpPAI-2A-10およびpPAI-2A-20は、プラスミドpEMBLyex4(CesareniおよびMurray,Genetic Engineering(1987),9,135-154)に基づいている。pEMBLyex4および必要なＤＮＡ要素は、その刊行物に詳細に記載されている。
pEMBLyex4を、ポリリンカー内でSac1で開裂し、突出したSac1末端をポリメラーゼＩクレノウフラグメントで平滑末端にし、その後単離ＰＡＩ−２フラグメントとライゲートし(上記参照)、プラスミドpPAI-2A-10(図１)を得る。
同様に、ＰＡＩ−２Ａ  ｃＤＮＡをプラスミドpMB354(実施例１.１)のBamＨＩ／SaII部位にクローンし、pPAI-2A-20(図２)を製造する。
１.４  ＰＡＩ−１Ｂのクローニング
ＰＡＩ−２ＢをコードするｃＤＮＡを、ＰＡＩ−２Ａ  ｃＤＮＡのクローニングと同様に、プラスミドpEMBLyex4のポリリンカー内にクローンし(実施例１.３)、pPAI-2B-10を得、pMB354内にクローンし、pPAI-2B-20を得る。
１.５  pPAI-2A-10およびpPAI-2B-20での酵母の形質転換
プラスミドpPAI-2A-10およびpPAI-2B-20を６つの異なる株：
Ｓｃ７９（Priece et al.,Gene(1987),55,287-293）
XV2181（Priece et al.,Gene(1987),55,287-293）
150-2B（Baldrai et al.,EMBO(1987),6,229-293）
CGY1465（Rudolph et al.,Cell(1989),58,1333-145）
c13-ABYS-86（Heinemeyer et al.,EMBO J.(1991),10,555-562）DSM 9698 MATα、leu2-3、leu2-112、ura3Δ5、prb1-1、cps1-3、prc1-1、pra1-1、his
HT393（Heinemeyer et al.,EMBO J.(1991),10,555-562）DSM 9697 MATα、leu2-3、leu2-112、ura3Δ5、prb1-1、cps1-3、prc1-1、pra1-1、pre1-1
に形質転換する。
１.６  ＰＡＩ−２ＡおよびＰＡＩ−２Ｂの発現
ＰＡＩ−２は、全株の細胞抽出物の可溶性フラクション内に検出できるが、不溶性物質を含む沈降物および培養液中では検出できない。ＰＡＩ−２の発現は、ウエスタンブロッティング、ELISAおよび生物学的活性試験により分析する。
表１は、参考文献に記載されているように、振盪フラスコ内で培養した時の、異なる株でのＰＡＩ−２ＡおよびＰＡＩ−２Ｂの発現収率を記載する。
0003732516.tif 000003
株HT393は、ＰＡＩ−２Ａの発現をGAL/CYC1プロモーター制御下で行った時、他の４種の株と比較して最も良好な生産体であり、５０mgのＰＡＩ−２Ａ／1培養液を製造する。
HT393はまたＡＤＲ２プロモーター制御下でのＰＡＩ−２Ｂの発現にも最良の宿主である。
１Ｌ発酵器中で、プラスミドpPAI-2A-10の手段で得た生産物は、c13-ABYS-86では３１０mgのＰＡＩ−２／１およびHT393では６８０mgのＰＡＩ−２／１である。
２．α−インターフェロンＢ／Ｄハイブリッドの発現
２.１  α−インターフェロンサブタイプＢおよびＤのｃＤＮＡクローンの単離ならびにＢ／Ｄハイブリッドの構築
ヒトナマルバ(Namalva)細胞を、標準条件下(ＥＰ−Ａ−０７６１８９)で細胞をニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)で攻撃することにより、インターフェロン合成を誘発する。全ｍＲＮＡを単離し、ＥＰ−Ａ−２０５４０４に記載のようにシュークロース密度勾配遠心で分画する。富化フラクションをｃＤＮＡ合成に使用する。ポリ(ｄＣ)伸長ｃＤＮＡのクローニングを、Ｅ．coliベクターpBR322のPstＩ部位に行う。ＤＮＡ配列分析は、Henco et al.(J.Mol.Biol.(1985)185,227-260)に記載のように、α−インターフェロンサブタイプへの遺伝子の割り当てを可能にする。α−インターフェロンサブタイプＢおよびＤに対応するポリペプチドをコードするクローンを単離する。
サブタイプＢおよびＤの共通のエンドヌクレアーゼ制限部位の存在が、タンパク質コード領域の４つの領域への細分を可能にする。
α−インターフェロンコード領域の、その領域の分離のための制限部位：
0003732516.tif 000004
これらのサブタイプＢおよびＤ領域の組み合わせは、１４の異なるＢ／Ｄハイブリッドの入手を可能にする。構造配置：Ｂ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4はサブタイプＤの対応領域で第２領域(アミノ酸残基６１から９２)を置換されたサブタイプＢのα−インターフェロンである。この配列配置は、Ｂ遺伝子の第１領域を含む制限フラグメントと、Ｄ遺伝子の残りを含む制限フラグメントを、最初の共通の内部Sau３Ａ制限部位でライゲートすることにより得、ハイブリッドＢ1Ｄ2Ｄ3Ｄ4を得る。Ｂ／ＤハイブリッドＢ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4は、Ｂ1Ｄ2Ｄ3Ｄ4遺伝子のＮ−末端側の半分と、Ｂ遺伝子(Ｂ1Ｂ2Ｂ3Ｂ4)のＣ−末端側の半分を、共通の内部Pvu11制限部位により組み合わせることにより得る(ＥＰ−Ａ−２０５４０４)。Ｂ／ＤハイブリッドＢ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4はまたＩＦＡＭ１１９とも呼ぶ。Ｂ／Ｄハイブリッド構造は、本来のＢおよびＤ遺伝子の下位領域に特異的な制限エンドヌクレアーゼを使用した制限分析により確認される。最終の証拠は、ＤＮＡ配列分析により得る。ハイブリッド遺伝子Ｂ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4のコード領域のＤＮＡ配列データは配列番号１に示す。
２.２  発現プラスミドpDP34R/PHO5-IFAM119の構築
α−インターフェロンＢ／Ｄの発現は、培地中の無機リン酸の低い濃度により抑制される、酵母酸ホスファターゼ遺伝子(ＰＨＯ５)の制止可能プロモーターの制御下である。
ＰＨＯ５遺伝子のＡＴＧから−５４１位のBamＨＩ制限部位および遺伝子の−８位に挿入されたEcoＲＩリンカーは、５３４bp BamＨＩ−EcoＲＩ  ＰＨＯ５プロモーターフラグメントの簡便なクローニングを可能にする。ＰＨＯ５プロモーターは、以下の配列
0003732516.tif 000005
の合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーにより、α−インターフェロンＢ／Ｄのコード配列にライゲートされる。
リンカーは、ＰＨＯ５プロモーターフラグメントへのライゲーションのためのEcoＲＩ制限部位、４つの非転写ヌクレオチド、翻訳開始のためのＡＴＧおよびＡＴＧから＋１４位のDde1制限部位までの純粋なα−インターフェロンＢ／Ｄコード配列を提供する。
プラスミドpDP34R/PHO5-IFAM119のPHO5-IFAM119発現カセットは、pBR322の２７６bp Sal1−BamＨＩフラグメント、５３４bp BamＨＩ／EcoＲＩ  ＰＨＯ５プロモーターフラグメント、α−インターフェロンＢ／Ｄのコード配列(５０４bp)およびＰＨＯ５転写停止領域由来の１８１bp  ＤＮＡフラグメントから成る(図１)。カセットの３'末端はHindIII部位であり、それは反応をクレノウＤＮＡポリメラーゼで満たし、１.６kb SaII−HindIII平滑末端発現カセットの２ミクロン基本酵母ベクターｐＤＰ３４へのクローニングにおいて開裂されない(Hinnen et al.,(1989)In Barr et al.,(編)Yeast Genetic Engineering.Butterworths,Boston,pp.189-213)。
プラスミドpDP34R/PHO5-IFAM119の完全な発現カセットの配列は、Sangerに従った鎖停止法により、二本鎖ＤＮＡを配列決定により測定される。ＤＮＡ配列は、予期される配列(配列番号１)と同一である。
発現プラスミドpDP34R/PHO5-IFAM119は、完全酵母２ミクロン環、酵母ＵＲＡ３遺伝子および酵母dLEU2遺伝子から成る。dLEU2遺伝子は、それ自体のプロモーターを有せず(dLEU2≡Enhard et al.,et al.,J.Bacteriol.(1983),156,625中のleu2-d)、従って、dLEU2遺伝子の転写は５"上流２ミクロン配列の開始に依存する。プラスミド地図は図３に示す。
２.３  Ｂ／Ｄハイブリッドの発現
pDP34R/PHO5-IFAM119を、Hinnen et al.,(Proc.Natl.Acad,Sci.USA(1978),1929)の記載のように、ポリエチレングリコールの存在下、Saccharomyces cerevisiae HT393に挿入する。宿主株HT393は、ロイシンおよびウラシルに関して栄養要求である。発現プラスミドは、宿主のロイシンおよびウラシル栄養要求を補うために、dLEU2およびURA3遺伝子を含む。プラスミド含有形質転換体の選択は、ロイシン供給、ウラシル欠失培地での成育により成す。発現プラスミドpDP34R/PHO5-IFAM119は、天然培地での非選択的成育条件下でさえ、宿主中で、多いコピー数で、安定に維持される。
α−インターフェロンＢ／Ｄは、培地中の無機リン酸の低い濃度で誘発される、ＰＨＯ５プロモーターの制御下で発現される。
形質転換HT393の一つの単一コロニーを、振盪フラスコ内のウラシル欠乏酵母最小培地１０ml中に取り出して入れ、３０℃で２００rpmで２４時間成育させる。これらの細胞を最小培地で洗浄し、５００ml振盪フラスコ、２０００mlフラスコおよび３０Ｌ発酵器での、各４８時間の発酵のためのウラシル欠失培地への接種に使用する。最後に、細胞を低Ｐi−完全培地を使用した３００Ｌ発酵器中で４７時間成育させる。
製造されたインターフェロンは、細胞のサイトゾルに細胞内的に蓄積される。
２.４  α−インターフェロンＢ／Ｄの単離
細胞５g(実施例２.３から)を遠心により回収し、洗浄し、水および緩衝液(２０％ＮａＣｌ  ｗ／ｗおよび８.３％ＫＨ2ＰＯ4  ｗ／ｗ)で以下の最終組成に合わせる：
湿潤細胞重量：６０％ｗ／ｗ
ＮａＣｌ：０.５Ｍ
Ｋ−リン酸：７０mＭ。
ｐＨを７.０に合わせ、細胞を、ガラスビーズを充填したDyno Mill(商標)タイプＫＤ−５ホモジナーザーを一回通すことにより破壊する。
α−インターフェロンＢ／Ｄを、
ａ）７部の９.５％Ｋ−リン酸および１２.５％ＮａＣｌ(重量当たり)の溶液；および３部のPEG1500を含む２相システムを使用した上相への抽出；
ｂ）２０％Ｋ−リン酸および５.８％ＮａＣｌの溶液を使用した上相の洗浄
ｃ）１８.８％ＭｇＳＯ4(重量当たり)の溶液を使用した洗浄相から、下相への戻し抽出
ｄ）および続く逆相ＨＰＬＣ分析
カラム：１５０×４.６mm  Ｃ−１８(Vydac 218TP5415)
緩衝液Ａ：Ｈ2Ｏ中の０.１％トリフルオロ酢酸
緩衝液Ｂ：０.０９％トリフルオロ酢酸含有８０％アセトニトリル
流速：２.０ml／分
注入用量：５０μl
勾配：３５分での６１％溶媒Ｂから１００％溶媒Ｂ
生理学的活性α−インターフェロンＢ／Ｄの保持時間：２２分±１−２分
による、２相抽出により単離する。
単離α−インターフェロンのアミノ酸組成を、ガス相加水分解およびアミノ酸のジメチルアミノベンゼンスルホニル(ＤＡＢＳ；Knecht＆Chang,Analyt.Biochem.(1986),58,2375-2379)による誘導体化により測定した、表２参照。
0003732516.tif 000006
単離α−インターフェロンＢ／ＤのＮ−末端配列は、ガス相シークエンサー内の自動エドマン分解およびＲＰ−ＨＰＬＣによるフェニルチオ−ヒダントインアミノ酸の検出により測定する。最初の２０アミノ酸の実験的に測定した配列は、予定された配列(配列番号３)と一致する。
電子噴霧イオン化質量分光により実験的に測定した単離されたα−インターフェロンＢ／Ｄのモル当たりのアミノ酸のモル量(１９５６６.６×０.２７)は、計算値(１９５６８.６)と一致する。
単離α−インターフェロンの特異的抗ウイルス活性は、ＭＤＢＫ細胞およびＶＳＶ(ＭＤＢＫ：Madin Darbyウシ腎臓；ＶＳＶ：水疱性口内炎ウイルス)を使用して、Rubinstein et al.,(J.Viol.(1981),37,755)による標準検定で測定して、１.５−２.３×１０8ＩＵ／タンパク質mg(ＩＵ：国際単位)である。
２.５  他の酵母株との比較
pDP34R/PHO5-IFAM119をＳ．cerevisiae株c13-ABYS-86(HT393の親株)に挿入し、培養液にヒスチジンを添加する以外、上記のように培養する。製造されたα−インターフェロンを上記のように単離する(表３参照)。
0003732516.tif 000007
pDP34R/PHO5-IFAM119で形質転換されたHT393株は、pDP34R/PHO5-IFAM119で形質転換された親c13-ABYS-86株と比較して、１０倍に増加したインターフェロン発現を示す。
微生物の寄託
以下の微生物株を、ドイツ連邦共和国、デー−３８１４２ブランシュヴェイク、マシェローダー・ヴェーク１ベー番のドイッチェ・サムルンク・フォン・ミクロオルガニズメン(ＤＳＭ)に寄託した(受託番号および寄託日は)：
Saccharomyces cerevisiae HT393          DSM 9697    27.01.1995
Saccharomyces cerevisiae c13-ABYS-86    DSM9698    27.01.1995
配列表
(１)一般的上表
(ｉ)出願人
(Ａ)名称：チバ−ガイギー・アクチエンゲゼルシャフト
(Ｂ)通り：クライベックシュトラーセ１４１番
(Ｃ)都市：バーゼル
(Ｅ)国：スイス
(Ｆ)郵便番号(ＺＩＰ)：４００２
(Ｇ)電話番号：+41 61 69 11 11
(Ｈ)ファックス番号：+41 61 696 79 76
(Ｉ)テレックス：962 991
(Ａ)名称：ベーリングヴェルケ・アクチエンゲゼルシャフト
(Ｂ)通り：ポストファッハ１１４０番
(Ｃ)都市：マールブルグ
(Ｅ)国：ドイツ連邦共和国
(Ｆ)郵便番号(ＺＩＰ)：３５００１
(Ｇ)電話番号：06421390
(Ｈ)ファックス番号：06421394558
(ii)発明の名称：タンパク質の製造法
(iii)配列の数：３
(iv)コンピューター読み取り可能形式：
(Ａ)媒体タイプ：フロッピーディスク
(Ｂ)コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  互換性
(Ｃ)オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(Ｄ)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0,Version #1.30(EPO)
(２)配列番号１の情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：１５６６塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(genomic)
(ix)配列の特徴：
(Ａ)特徴を表す記号：misc_feature
(Ｂ)存在位置：2..277
(Ｄ)他の情報：／機能＝“pBR322 SalＩ−BamＨＩフラグメント”
(ix)配列の特徴：
(Ａ)特徴を表す記号：プロモーター
(Ｂ)存在位置：278..810
(Ｄ)他の情報：／表現型＝“PHO5プロモーター(位置−５４０から−８)”
(ix)配列の特徴：
(Ａ)特徴を表す記号：misc_feature
(Ｂ)存在位置：811..820
(Ｄ)他の情報：／機能＝“EcoＲＩリンカー”
(ix)配列の特徴：
(Ａ)特徴を表す記号：CDS
(Ｂ)存在位置：821..1324
(Ｄ)他の情報：／表現型＝“Metを含むアルファインターフェロンＢ/Ｄ”
(ix)配列の特徴：
(Ａ)特徴を表す記号：misc_feature
(Ｂ)存在位置：1325..1380
(Ｄ)他の情報：／機能＝“インターフェロン３'非コード配列”
(ix)配列の特徴：
(Ａ)特徴を表す記号：ターミネーター
(Ｂ)存在位置：1381..1566
(Ｄ)他の情報：／標準名＝“リンカーおよびPHO5ターミネーター”
(xi)配列の記載：配列番号１：
0003732516.tif 000008
0003732516.tif 000009
0003732516.tif 000010
(２)配列番号２の情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：１６７アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号２：
0003732516.tif 000011
(２)配列番号３の情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：１６６アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(ix)配列の特徴：
(Ａ)特徴を表す記号：タンパク質
(Ｂ)存在位置：1..166
(Ｄ)他の情報：／生産物＝“アルファインターフェロンＢ/Ｄ”
(xi)配列の記載：配列番号３：
0003732516.tif 000012
【図１】
0003732516.tif 000013
【図２】
0003732516.tif 000014
【図３】
0003732516.tif 000015