(57)【要約】本発明の課題は、生体試料について６フォスフォグルコン酸を生成しうる反応系を用いて被検物質を測定する場合に、正確な測定値を得るための測定方法を提供することである。補酵素でグルコースを測定する反応系の最終生成物は６フォスフォグルコン酸であり、血球中の６ＰＧＤＨ（６フォスフォグルコン酸脱水素酵素）がＮＡＤＰを補酵素として反応し、結果としての測定値に正誤差を与えることに着目した。生体試料について６フォスフォグルコン酸を生成しうる反応系を用いて被検物質の測定する場合において、６フォスフォグルコン酸脱水素酵素を反応系外におくことで、上記課題が解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料について６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて被検物質の測定する場合において、６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におくことを特徴とする被検物質測定方法。
【請求項２】
６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におく手段が、反応系において６ホスホグルコン酸脱水素酵素とは反応しない補酵素を用いることを特徴とする請求の範囲１に記載の被検物質測定方法。
【請求項３】
６ホスホグルコン酸脱水素酵素とは反応しない補酵素としてＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤを用いることを特徴とする請求の範囲２に記載の被検物質測定方法。
【請求項４】
６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におく手段として、６ホスホグルコン酸脱水素酵素活性阻害剤を用いることを特徴とする請求の範囲１に記載の被検物質測定方法。
【請求項５】
６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におく手段として、抗６ホスホグルコン酸脱水素酵素抗体を用いることを特徴とする請求の範囲１に記載の被検物質測定方法。
【請求項６】
さらに乳酸脱水素酵素を反応系外に置くことを特徴とする請求の範囲１〜５のいずれか１に記載の被検物質測定方法。
【請求項７】
乳酸脱水素酵素を反応系外におく手段としてシュウ酸若しくはオキサミン酸、またはそれらの塩類を含ませることを特徴とする請求の範囲６に記載の被検物質測定方法。
【請求項８】
被検物質が、グルコースを生成する反応系を用いて測定可能な物質であることを特徴とする請求の範囲１〜７のいずれか１に記載の測定方法。
【請求項９】
被検物質が、少なくともヘキソース、中性脂肪、無機リン、クレアチンキナーゼ若しくはそのアイソザイムまたはアミラーゼ若しくはそのアイソザイムから選ばれる１または２以上の物質であることを特徴とする請求の範囲１〜８のいずれか１に記載の測定方法。
【請求項１０】
溶血によって生じる６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におくことを特徴とする溶血干渉の回避方法。
【請求項１１】
請求の範囲１〜９のいずれか１に記載の方法に必要な試薬をキット化または単品で構成してなる試薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体試料について酵素反応を利用した測定反応系を用いて被検物質を測定する場合に、試料に含まれる溶血成分によって生じる測定誤差を回避した測定方法に関する。
背景技術
臨床検査の分野では、補酵素（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＨ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰＨ）の変化量を吸光度変化として捕らえ、目的成分を定量する方法がよく用いられる。検体としては一般的に血清を使用するが、血清取得のための採血時に物理的衝撃が加わったり、人為的な誤操作で血球が破裂することがあり、溶血する場合がある。また、溶血性疾患を持つ患者から採血した場合には、該疾患により溶血を認める場合もある。さらに、最近では検査時間の短縮のために全血を検体として用いた測定の試みもあり、このような検体にも溶血を認める場合がある。
血球が破裂して溶血状態になると、赤血球中の成分であるミオキナーゼ（アデニル酸キナーゼ（以下「ＭＫ」と略す。））、グルコース６リン酸脱水素酵素（以下「Ｇ６ＰＤＨ」と略す。）等の酵素が血清に混入することになる。臨床検査項目によっては、これらの酵素が測定値に影響を与えるため、それぞれの酵素に対する対策が図られてきた。例えば、グルコース成分を測定する場合の溶血による測定誤差を回避するために、ＮａＦ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨ２ＰＯ４および抗凝固剤の混合物からなる臨床検査用解糖防止剤を用いることが報告されており（特開平５−１２６８３４公報）、またＭＫ活性に対してはＡＰ５Ａが報告されている。
しかし、酵素反応を利用した臨床検査の測定において、試料に含まれる赤血球中の成分によって生じる測定誤差、すなわち溶血干渉の問題は未だ十分に解決された状況とはいえない。
発明の開示
本発明の課題は、生体試料について６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて被検物質を測定する場合に、正確な測定値を得るための測定方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、補酵素でグルコースを測定する反応系の最終生成物は、６ホスホグルコン酸（以下「６ＰＧ」と略す。）であることに着目し、血球中の６ＰＧ脱水素酵素（以下「６ＰＧＤＨ」と略す。）がＮＡＤＰを補酵素として反応し、グルコース測定系の結果としての６ＰＧ値に正誤差を与えることを見出した。
そこで、補酵素でグルコースを測定する反応系において、６ＰＧＤＨを反応系外におくことにより、正確なグルコースの測定値を得る方法を見出した。従来は溶血時の６ＰＧＤＨ活性の影響は報告されておらず、本発明者が初めて見出したものである。これまでは溶血の影響をＭＫ活性や血球中のグルコース、リン酸として考えて問題にしていなかったと考えられる。
すなわち本発明は、
１．生体試料について６ＰＧを生成しうる反応系を用いて被検物質の測定する場合において、６ＰＧＤＨを反応系外におくことを特徴とする被検物質測定方法、
２．６ＰＧＤＨを反応系外におく手段が、反応系において６ＰＧＤＨとは反応しない補酵素を用いることを特徴とする前項１に記載の被検物質測定方法、
３．６ＰＧＤＨとは反応しない補酵素としてＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤを用いることを特徴とする前項２に記載の被検物質測定方法、
４．６ＰＧＤＨを反応系外におく手段として、６ＰＧＤＨ活性阻害剤を用いることを特徴とする前項１に記載の被検物質測定方法、
５．６ＰＧＤＨを反応系外におく手段として、抗６ＰＧＤＨ抗体を用いることを特徴とする前項１に記載の被検物質測定方法、
６．さらに乳酸脱水素酵素を反応系外に置くことを特徴とする前項１〜５のいずれか１に記載の被検物質測定方法、
７．乳酸脱水素酵素を反応系外におく手段としてシュウ酸若しくはオキサミン酸、またはそれらの塩類を含ませることを特徴とする前項６に記載の被検物質測定方法、
８．被検物質が、グルコースを生成する反応系を用いて測定可能な物質であることを特徴とする前項１〜７のいずれか１に記載の測定方法、
９．被検物質が、少なくともヘキソース、中性脂肪、無機リン、クレアチンキナーゼ若しくはそのアイソザイムまたはアミラーゼ若しくはそのアイソザイムから選ばれる１または２以上の物質であることを特徴とする前項１〜８のいずれか１に記載の測定方法、
１０．溶血によって生じる６ＰＧＤＨを反応系外におくことを特徴とする溶血干渉の回避方法、
１１．前項１〜９のいずれか１に記載の方法に必要な試薬をキット化または単品で構成してなる試薬、からなる。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、生体試料について６ＰＧを生成しうる反応系を用いて被検物質を測定する場合とは、例えば上記試料について酵素反応を利用して、補酵素でヘキソースまたはリン酸化したヘキソースを測定する反応系が挙げられる。ここでヘキソースとは六炭糖をいい、代表的なものとしてグルコースが挙げられる。このような測定系を用いて測定する臨床検査項目として、グルコース（ＧＬＵ）、中性脂肪（ＴＧ）、無機リン（ＩＰ）、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、シュークロース、イヌリン、尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニンなどが挙げられる。
例えば、第１図および第２図に示すように、グルコースや中性脂肪について測定を行うに際し、グルコースを生成する反応系を用いた最終生成物は６ＰＧである。
補酵素でヘキソースまたはリン酸化したヘキソースを測定する反応系では、試料に溶血があった場合に、測定値に正誤差を与える現象があり、このような現象を溶血干渉という。
これは溶血により、血球中の６ＰＧＤＨが測定系にてＮＡＤＰを補酵素として６ＰＧと反応し、その結果、６ＰＧの正確な測定値が得られず、干渉作用を起こすものと考えられた。本発明は、溶血により生じる６ＰＧＤＨが、干渉作用をおこすこと、さらに上記測定系において６ＰＧＤＨを測定反応系外におくことにより、溶血により生じる干渉作用が回避されることを見出したことである。
この６ＰＧＤＨを反応系外におく手段としては、反応系では６ＰＧＤＨとは反応しない補酵素を用いること、６ＰＧＤＨの活性阻害剤を用いること、６ＰＧＤＨの抗体を添加すること若しくは、６ＰＧＤＨを免疫除去すること等が例示される。さらに、本発明者は、６ＰＧＤＨはＮＡＤＰを補酵素として反応するがＮＡＤは補酵素として認識しないことをつきとめ、ＮＡＤで反応系を組むことにより、６ＰＧＤＨを測定反応系外におくことになることを見出し、溶血の影響を回避した新規測定方法の発明を行った。
また、ＮＡＤまたはＮＡＤＨは試料中の脱水素酵素、特に乳酸脱水素酵素（以下「ＬＤＨ」という。；ＮＡＤ依存）の影響を受けるが、シュウ酸、オキサミン酸またはそれらの塩類を含ませることで完全にＬＤＨの影響も回避できるので、この測定方法と組み合わせることができる。
また、本発明の補酵素でヘキソースまたはリン酸化したヘキソースを測定する反応系は、補酵素以外に、ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、ヘキソース、Ｇ６Ｐから選ばれる酵素又は糖を一つまたは二つ以上組み合わせて用いられる。これらの酵素法によるグルコースの測定法は広く公知である。
（実施例）
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
採血管で採血した後、血液を３０００ｒｐｍで遠心して人赤血球を得た。この赤血球を−２０℃で凍結し、更に室温で溶解した。このことにより血球が破裂、溶血成分を得た。これを生理的食塩水で希釈し、ヘモグロビンとして５００ｍｇ／ｄＬとした。以下に示す試薬を調製した。
０．１Ｍ  トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）にＮＡＤＰ  ２．０ｍＭ、６ＰＧ  １．０ｍＭを溶解した試薬溶液（試薬Ａ）０．１Ｍ  トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）にＮＡＤ  ２．０ｍＭ、６ＰＧ  １．０ｍＭを溶解した試薬溶液（試薬Ｂ）を調製した。
試薬Ａならびに試薬Ｂを３７℃で５分間加温後、溶血した試料を１５μＬ添加し、波長３４０〜７５０ｎｍにおける吸光度を１分おきに測定した。この溶血液を測定したところ、第３図に示すようにＮＡＤを用いたときには吸光度の上昇は認められなかった。一方、第４図に示すようにＮＡＤＰを補酵素として反応させたときにはＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける吸光度が上昇した。この結果、ＮＡＤを用いることにより溶血干渉が回避されることが示唆された。
（実施例２）
以下に示す試薬を調製し、グルコース（ＧＬＵ）の測定に供した。
［第１試薬］
2002064819.tif 000002
［第２試薬］
2002064819.tif 000003
また、上記の試薬組成でβ−ＮＡＤの代わりにβ−ＮＡＤＰを用いた試薬も調製した。
［操作方法］
試料５μＬに第１試薬２１０μＬ、第２試薬を７０μＬ添加し、主波長３４０ｎｍの条件で日立７１７０型自動分析装置を用いてエンドポイントアッセイを行い、予め作成した検量線よりグルコース濃度を算出した。
溶血液を、ヘモグロビン濃度が０、１００、２００、３００、４００、５００ｍｇ／ｄＬとなり、人血清成分濃度は一定になるように試料を調製した。第５図に示すように、ＮＡＤＰを補酵素とした試薬Ａはグルコース測定値がヘモグロビン濃度依存的に上昇したが、ＮＡＤを用いたときには測定値の上昇が観られず、溶血による正誤差を生じなかった。ヘモグロビン濃度が０ｍｇ／ｄＬのときのグルコースは８０ｍｇ／ｄＬであった。
（実施例３）
以下に示す試薬を調製し、中性脂肪（ＴＧ）の測定に供した。
［第１試薬］
2002064819.tif 000004
［第２試薬］
2002064819.tif 000005
また、上記の試薬組成でβ−ＮＡＤの代わりにβ−ＮＡＤＰを用いた試薬も調製した。
測定操作は、グルコース測定と同様に行い、中性脂肪を測定した。
溶血液を、ヘモグロビン濃度が０、１００、２００、３００、４００、５００ｍｇ／ｄＬとなり、人血清成分濃度は一定になるように試料を調製した。第６図に示すように、ＮＡＤＰを補酵素とした試薬Ｂは中性脂肪測定値がヘモグロビン濃度依存的に上昇したが、ＮＡＤを用いたときには測定値の上昇が観られず、溶血による正誤差を生じなかった。ヘモグロビン濃度が０ｍｇ／ｄＬのときの中性脂肪の濃度は９５ｍｇ／ｄＬであった。
産業上の利用分野
以上説明したように、生体試料について６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて被検物質の測定する場合において、６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におくことで、溶血干渉が防止でき、被検物質の正確な測定値を得ることができた。
【図面の簡単な説明】
第１図は、グルコース測定に際し、６ＰＧを生成しうる反応系を示す図である。
第２図は、中性脂肪（ＴＧ）測定に際し、６ＰＧを生成しうる反応系を示す図である。
第３図は、ＮＡＤ反応系での溶血液の吸光度の変動を示す図である（実施例１）。
第４図は、ＮＡＤＰ反応系での溶血液の吸光度の変動を示す図である（実施例１）。
第５図は、グルコース測定値の変動を示す図である（実施例２）。
第６図は、中性脂肪測定値の変動を示す図である（実施例３）。
【図１】
2002064819.tif 000006
【図２】
2002064819.tif 000007
【図３】
2002064819.tif 000008
【図４】
2002064819.tif 000009
【図５】
2002064819.tif 000010
【図６】
2002064819.tif 000011
【国際調査報告】
2002064819.tif 000012
2002064819.tif 000013
2002064819.tif 000014