(57)【要約】本発明の目的は、チオールプロテアーゼＤ３の活性を低下させることなく自己消化の速度を速めることにより、活性化処理の時間を短縮化することである。本発明は、ｉ）チオールプロテアーゼＤ３のＮ末端プロ配列の全てを含むｐｒｏＤ３のＮ末端プロ配列の一部を欠失させた配列を有するΔｐｒｏＤ３またはその類似体を酸性条件に置くこと、および、ｉｉ）工程ｉ）で得られる産物であって、プロテアーゼ活性を有するタンパク質を回収すること、を特徴とする、成熟型チオールプロテアーゼＤ３または成熟型チオールプロテアーゼＤ３類似体の製造方法である。また本発明は、上記製造方法に適した、Ｄ３のプロ配列の一部を削除させたΔｐｒｏＤ３およびその類似体、およびこれをコードする核酸分子、その核酸分子を含む組換え核酸分子、特に適切な宿主内でΔｐｒｏＤ３を発現し得る組換え核酸分子である。
2002081708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）チオールプロテアーゼＤ３のＮ末端プロ配列の全てを含むｐｒｏＤ３のＮ末端プロ配列の一部を欠失させた配列を有するΔｐｒｏＤ３またはその類似体を酸性条件下に置くこと、および、
ｉｉ）工程ｉ）で得られる産物であって、プロテアーゼ活性を有するタンパク質を回収すること、
を特徴とする、成熟型チオールプロテアーゼＤ３またはその類似体の製造方法。
【請求項２】
ｉ）チオールプロテアーゼＤ３のＮ末端プロ配列の全てを含むｐｒｏＤ３のＮ末端プロ配列の一部を欠失させた配列を有するΔｐｒｏＤ３またはその類似体を、それらをコードする配列を含む核酸分子を導入した適切な宿主を培養することによって産生させること、
ｉｉ）前記ΔｐｒｏＤ３またはその類似体を酸性条件に置くこと、および、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られる産物であって、プロテアーゼ活性を有するタンパク質を回収すること、
を特徴とする、成熟型チオールプロテアーゼＤ３またはその類似体の製造方法。
【請求項３】
ｉ）チオールプロテアーゼＤ３のＮ末端プロ配列の全てを含むｐｒｏＤ３のＮ末端プロ配列の一部を欠失させた配列を有するΔｐｒｏＤ３またはその類似体を、それらをコードする配列を含む核酸分子を導入した適切な宿主を培養することによってタンパク質封入体として産生させること、
ｉｉ）前記タンパク質封入体を回収すること
ｉｉｉ）前記回収したタンパク質封入体を可溶化および巻き戻してΔｐｒｏＤ３またはその類似体を得ること、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られたΔｐｒｏＤ３またはその類似体を酸性条件に置くこと、および、
ｖ）工程ｉｖ）で得られる産物であって、プロテアーゼ活性を有するタンパク質を回収すること、
を特徴とする、成熟型チオールプロテアーゼＤ３またはその類似体の製造方法。
【請求項４】
ｉ）チオールプロテアーゼＤ３のＮ末端プロ配列の全てを含むｐｒｏＤ３、またはｐｒｏＤ３からＮ末端プロ配列を一部欠失させた配列を有するΔｐｒｏＤ３、またはこれらの類似体を酵素消化し、前記ｐｒｏＤ３、またはΔｐｒｏＤ３、またはこれらの類似体のＮ末端プロ配列由来の配列を一部欠失させること、
ｉｉ）工程Ｉ）で得られた産物を酸性条件に置くこと、および、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られる産物であって、プロテアーゼ活性を有するタンパク質を回収すること、
を特徴とする、成熟型チオールプロテアーゼＤ３またはその類似体の製造方法。
【請求項５】
ｉ）チオールプロテアーゼＤ３のＮ末端プロ配列の全てを含むｐｒｏＤ３、またはｐｒｏＤ３からＮ末端プロ配列の一部を欠失させた配列を有するΔｐｒｏＤ３、またはこれらの類似体を、それらをコードする配列を含む核酸分子を導入した適切な宿主を培養することによって産生させること、
ｉｉ）前記産生されたｐｒｏＤ３、またはΔｐｒｏＤ３、またはこれらの類似体を酵素消化し、前記ｐｒｏＤ３、またはΔｐｒｏＤ３、またはこれらの類似体のＮ末端プロ配列由来の配列の一部を欠失させること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた産物を酸性条件に置くこと、および、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られる産物であって、プロテアーゼ活性を有するタンパク質を回収すること、
を特徴とする、成熟型チオールプロテアーゼＤ３またはその類似体の製造方法。
【請求項６】
ｉ）チオールプロテアーゼＤ３のＮ末端プロ配列の全てを含むｐｒｏＤ３、またはｐｒｏＤ３からＮ末端プロ配列の一部を欠失させた配列を有するΔｐｒｏＤ３、またはこれらの類似体を、それらをコードする配列を含む核酸分子を導入した適切な宿主を培養することによってタンパク質封入体として産生させること、
ｉｉ）前記タンパク質封入体を回収すること、
ｉｉｉ）前記回収したタンパク質封入体を可溶化および巻き戻すこと、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られたｐｒｏＤ３、またはΔｐｒｏＤ３、またはこれらの類似体を酵素消化し、前記ｐｒｏＤ３、またはΔｐｒｏＤ３、またはこれらの類似体のＮ末端プロ配列由来の配列の一部を欠失させること、
ｖ）前記消化物を酸性条件に置くこと、および、
ｖｉ）工程ｖ）で得られる産物であって、プロテアーゼ活性を有するタンパク質を回収すること、
を特徴とする、成熟型チオールプロテアーゼＤ３またはその類似体の製造方法。
【請求項７】
成熟型チオールプロテアーゼＤ３が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列の１番のＡｓｐ残基をＮ末端とし、２４７番のＳｅｒ残基をＣ末端とするアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ΔｐｒｏＤ３が配列番号２に記載されるアミノ酸配列の−８７番のＭｅｔ残基から２４７番のＳｅｒ残基までのアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ΔｐｒｏＤ３が配列番号２に記載されるアミノ酸配列の−８９番のＭｅｔ残基から２４７番のＳｅｒ残基までのアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ΔｐｒｏＤ３が配列番号２に記載されるアミノ酸配列の−９４番のＴｈｒ残基から２４７番のＳｅｒ残基までのアミノ酸配列のＮ末端にＭｅｔを付加したアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ｐｒｏ配列が配列番号２に記載されるアミノ酸配列の−１０７番のＴｙｒ残基から２４７番のＳｅｒ残基までのアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
酵素がサチライシンである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
酸性条件がｐＨ３．５〜６．５の範囲のｐＨである、請求項１〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
酸性条件に置く時間が３０分以下である、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列の−９５番のＡｒｇ残基から−８７番のＭｅｔ残基のうちいずれかをＮ末端とし、２４７番のＳｅｒ残基をＣ末端とするアミノ酸配列を有するタンパク質、または残基配列において１以上のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、酸性条件にて自己消化によってプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生じさせ得る、活性型プロテアーゼＤ３前駆体または活性型プロテアーゼＤ３類似体の前駆体。
【請求項１６】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列の−８７番のＭｅｔ残基から２４７番のＳｅｒ残基までのアミノ酸配列を有するタンパク質、または前記配列において１以上のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、酸性条件にて自己消化によってプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生じさせ得る活性型プロテアーゼＤ３前駆体または活性型プロテアーゼＤ３類似体の前駆体。
【請求項１７】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列の−８９番のＭｅｔ残基から２４７番のＳｅｒ残基までのアミノ酸配列を有するタンパク質、または前記配列において１以上のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、酸性条件にて自己消化によってプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生じさせ得る活性型プロテアーゼＤ３前駆体または活性型プロテアーゼＤ３類似体の前駆体。
【請求項１８】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列の−９４番のＴｈｒ残基から２４７番のＳｅｒ残基までのアミノ酸配列のＮ末端にＭｅｔを付加したアミノ酸配列を有するタンパク質、または前記配列において１以上のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、酸性条件にて自己消化によってプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生じさせ得る活性型プロテアーゼＤ３前駆体または活性型プロテアーゼＤ３類似体の前駆体。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする配列を含む核酸分子。
【請求項２０】
配列番号１に記載の配列において１３６番のアデニン残基から１１３７番のシトシン残基までの配列を含む核酸分子。
【請求項２１】
配列番号１に記載の配列において１３０番のアデニン残基から１１３７番のシトシン残基までの配列を含む核酸分子。
【請求項２２】
配列番号１に記載の配列において１１５番のアデニン残基から１１３７番のシトシン残基までの配列を含む核酸分子。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の核酸分子を含み、適切な宿主中で前記核酸分子にコードされるタンパク質を発現させ得る組換え核酸分子。
【請求項２４】
ｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｃ、λＰＬおよびＴ７からなる群から選ばれるプロモーターを含む、請求項２３に記載の組換え核酸分子。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の組換え核酸分子によって形質転換された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、ダイズ由来のチオールプロテアーゼＤ３の製造方法に関する。また本発明は、前記方法に適した核酸分子、前記核酸分子を含有する組換え核酸分子、前記組換え核酸分子により形質転換された形質転換体に関する。
ダイズ由来チオールプロテアーゼＤ３は、ダイズの発芽時に発現する酵素であり、種子中の貯蔵タンパク質を効率的に分解することができるプロテアーゼである。本発明者らは、このチオールプロテアーゼと同様に、ペプチダーゼ類（酸性アミノ酸含有ペプチドを効率的に分解するアミノペプチダーゼＧＸ、およびロイシンアミノペプチダーゼ群）を発芽ダイズ子葉より見出し、それらを用いることにより、ダイズタンパク質の効率的な加水分解を行うことに成功した（特開平９−２９４５８３）。更に、チオールプロテアーゼＤ３を単独でタンパク質に作用させ分解することにより、遊離アミノ酸量が少なく、苦味の弱いペプチドを得ることに成功した（特開平２０００−８３６９５）。
しかしながら、このチオールプロテアーゼＤ３の発芽ダイズ子葉中での含量は微量であるため、当該酵素を発芽ダイズ子葉抽出液より大量に調製することは困難であった。そこで、チオールプロテアーゼＤ３の製造方法として、遺伝子組換え技術による大量発現法が考え出された。この方法は、大腸菌の細胞内にＤ３を不活性封入体として発現させた後、この封入体をタンパク質変性剤で可溶化し、脱変性剤処理（巻戻し）を経た後に、ｐＨを酸性にシフトして活性化処理をすることにより活性を有する成熟型Ｄ３を生産する方法（特開平９−１２１８７０）である。この方法は活性のあるプロテアーゼＤ３の大量調製を可能とするものであるが、タンパク質封入体からの可溶化・巻戻し・活性化の時間を短縮することが更に望まれていた。特にこの方法においては活性化に数時間から１日以上要する場合があり、活性化に要する時間の更なる短縮が望まれていた。
チオールプロテアーゼは一般的にプロ配列を有しており、このようなプロテアーゼの生産においては、これらはプロ体として組換え生産された後、巻戻し・活性化される工程を含むという共通の特徴がある。中でもカテプシンＬは特によく研究されており、プロ配列の機能に関しては、正しい三次構造をとるのにプロ配列が不可欠であることが知られており、プロ配列を欠失させると活性を失う例が多く報告されている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４：２０４８７−２０４９５（１９８９））。
一方、カイコのチオールプロテアーゼにおいて、プロ配列をＮ末から２７アミノ酸残基欠失させることにより、活性化の速度が速まるが活性が約２５％に低下してしまうことが報告されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ４２；１６７−１７８（１９９９））。このカイコチオールプロテアーゼは、プロ配列のＮ末から２７アミノ酸残基目のところで、切断されたものが活性化の際の中間体であると考えられている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．４２；５９１−６００（１９９７））。
発明の開示
チオールプロテアーゼＤ３は、そのプロ体（ｐｒｏＤ３）の水溶液のｐＨを酸性にシフトさせると、成熟型Ｄ３のＮ末端側にある配列（プロ配列）が自己消化により除去され、成熟型Ｄ３に変換されることが知られている。
本発明の目的は、チオールプロテアーゼＤ３の活性を低下させることなく自己消化の速度を速めることにより、活性化処理の時間を短縮化することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために、ｐｒｏＤ３封入体を可溶化・巻戻した後の巻戻しｐｒｏＤ３について、種々のプロテアーゼを作用させプロ配列の一部を消化させた後自己消化させることにより、活性を低下させることなく活性化の速度が速まることを見いだした。
更に、あらかじめプロ配列を一部削除したもの（ΔｐｒｏＤ３）を遺伝子組換え技術により発現させたところ、発現したタンパク質封入体を可溶化および巻戻し（立体構造の再変換）した後、ｐＨを酸性にシフトさせることによって活性を低下させることなく活性化の時間が大幅に短縮化されることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。
従って、本発明は、
ｉ）チオールプロテアーゼＤ３のＮ末端プロ配列の全てを含むｐｒｏＤ３のＮ末端プロ配列の一部を欠失させた配列を有するΔｐｒｏＤ３またはその類似体を酸性条件に置くこと、および、
ｉｉ）工程ｉ）で得られる産物であって、プロテアーゼ活性を有するタンパク質を回収すること、
を特徴とする、成熟型チオールプロテアーゼＤ３または成熟型チオールプロテアーゼＤ３類似体の製造方法である。
また、本発明は、
ｉ）チオールプロテアーゼＤ３のＮ末端プロ配列の全てを含むｐｒｏＤ３のＮ末端プロ配列の一部を欠失させた配列を有するΔｐｒｏＤ３またはその類似体を、それらをコードする配列を含む核酸分子を導入した適切な宿主を培養することによって産生させること、
ｉｉ）前記ΔｐｒｏＤ３またはその類似体を酸性条件に置くこと、および、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られる産物であって、プロテアーゼ活性を有するタンパク質を回収すること、
を特徴とする、成熟型チオールプロテアーゼＤ３または成熟型チオールプロテアーゼＤ３類似体の製造方法である。
また、本発明は、上記製造方法に適した、Ｄ３のプロ配列の一部を削除させた、自己消化容易な活性型プロテアーゼＤ３の前駆体およびその類似体、およびこれをコードする核酸分子、その核酸分子を含む組換え核酸分子、特に適切な宿主内でΔｐｒｏＤ３を発現し得る組換え核酸分子である。
また本発明は上記の核酸分子によって形質転換された形質転換体である。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、「プロテアーゼ」とは、成熟型アミノ酸配列を有するプロテアーゼ、更にプロ配列を有するプロテアーゼ、プレプロ配列を有するプロテアーゼを含み、タンパク質分解活性を有する一切の物質を含む。特に区別する必要がある場合は、「プロテアーゼ」の語に「プロ」若しくはｐｒｏ、または「成熟型」等の修飾語を付加する。特に本明細書において、チオールプロテアーゼＤ３は、配列表配列番号２に記載されるアミノ酸配列の−１３２番目のＭｅｔ残基から始まり３３２番目のＡｌａ残基に至る配列の全長あるいはその一部からなるタンパク質、またはその前駆体を総称する。成熟型Ｄ３とは、配列表配列番号２に記載されるアミノ酸配列の残基番号１のＡｓｐから始まり、２４７番のＳｅｒ残基に至る配列からなるプロテアーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、プロテアーゼ活性とは、本明細書中の実施例において記載される方法に準じた条件によって測定される酵素活性をいう。
本明細書において、文脈上明らかな場合はチオールプロテアーゼＤ３はプロテアーゼＤ３または単にＤ３と略記することがある。特に、本明細書においてｐｒｏＤ３は、チオールプロテアーゼＤ３のプロ配列の全てを有するチオールプロテアーゼＤ３誘導体、すなわち、配列表配列番号１に記載されるアミノ酸配列の残基番号−１０７のＴｙｒ残基から始まり、残基番号２４７のＳｅｒ残基に至る配列からなるものであり、ΔｐｒｏＤ３とは、前記ｐｒｏＤ３のＮ末端から１部のアミノ酸を更に削除した配列からなるタンパク質をいう。また、これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換のあるタンパク質であって、チオールプロテアーゼ活性を有するタンパク質も本発明に含まれる。特に本明細書において、成熟型チオールプロテアーゼＤ３のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換のあるアミノ配列を有するタンパク質であって、チオールプロテアーゼ活性を有するタンパク質を「成熟型チオールプロテアーゼＤ３類似体」、上記ｐｒｏＤ３のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換を有する配列を有し、酸性条件に置くことによりチオールプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生じさせ得るタンパク質を「ｐｒｏＤ３類似体」といい、同様にΔｐｒｏＤ３において、１以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換を有し、かつｐｒｏＤ３と同一のプロ配列を有しないタンパク質であって、酸性条件に置くことによりチオールプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生じさせ得るタンパク質を「ΔｐｒｏＤ３類似体」という。
本発明の、チオールプロテアーゼＤ３またはその類似体の製造法は、前記タンパク質またはその前駆体を発現させ得る組換え核酸分子を適切な宿主に導入して形質転換体を得、その形質転換体を培地中で培養してチオールプロテアーゼ活性を有するタンパク質またはその前駆体を生産させ、これを回収することを特徴とする。特に、本発明のチオールプロテアーゼＤ３の製造方法は、Ｎ末端の一部が欠失したプロ配列を有するΔｐｒｏＤ３を発現させ得る組換え核酸分子を微生物に導入して形質転換体を得、その形質転換体を培養することによりＮ末端の一部が欠失したプロ配列を有するΔｐｒｏＤ３を発現させ、産生されたΔｐｒｏＤ３を回収し、これを酸処理により活性化して活性チオールプロテアーゼＤ３を得ることを特徴とする。
本発明において使用し得る核酸分子は上記タンパク質、特に上記ΔｐｒｏＤ３タンパク質を発現する組換えＤＮＡである。このタンパク質において特定のアミノ酸をコードする核酸の欠失、あるアミノ酸をコードする核酸の置換または挿入された核酸配列であって、該核酸配列がチオールプロテアーゼ活性を有するタンパク質あるいはその前駆体をコードするものも本発明に含まれる。このような核酸分子うち、プロモーターとしてｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｃ、λＰＬおよびＴ７からなる群から選ばれるプロモーターを有する組換えＤＮＡ分子が好ましい。また、この組換えＤＮＡ分子はｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ２９９のような多コピーのベクター、特に多コピーの発現ベクターであることが好ましく、更にプロモーターとしてｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｃ、λＰＬおよびＴ７からなる群から選ばれるプロモーターを有する多コピー発現ベクターが最も好ましい。このような例として、ｐＵＣ１９に本発明のＤＮＡ分子を組み込んで得られる組換えＤＮＡ分子ｐＵＣＴＲＰＭΔ１３ｐｒｏＤ３、ｐＵＣＴＲＰΔ１８ｐｒｏＤ３、ｐＵＣＴＲＰΔ２０ｐｒｏＤ３が挙げられる。
宿主としては、前述のような多コピーベクターを用いて形質転換された形質転換体が好ましく、微生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌、酵母、麹菌等が好ましい。更に、タンパク質分泌能を利用してＤ３を培地中へ生産させることができる宿主およびベクターの組合せがより好ましい。例えば酵母を宿主とした場合、Ｄ３自身のシグナル配列を用いれば、Ｄ３を培地中に分泌生産することが可能であるし、酵母のシグナル配列を用いてもよい。微生物宿主の中でも大腸菌に属する微生物が特に好ましい。そのような大腸菌宿主の例として、ＪＭ１０９株（ｒｅｃＡ、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）／Ｆ’［ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺΔＭ１５］）が挙げられる。
本発明のチオールプロテアーゼＤ３またはその類似体の製造方法において使用されるΔｐｒｏＤ３の生産は、プロ配列の一部を欠失させた遺伝子を構築してこれを大腸菌のような適切な宿主で発現させることによってもよく、完全なｐｒｏＤ３またはプロ配列の一部を有するΔｐｒｏＤ３を前述のような適切な宿主で発現させ、発現されたｐｒｏＤ３またはΔｐｒｏＤ３タンパク質を更に酵素的に切断することによってもよい。
遺伝子を改変してプロ配列の一部を削除する場合は、その削除は、既に公知となっているＤ３の塩基配列を元に、Ｄ３遺伝子の全長あるいは一部分に対してＰＣＲ法を用いて行なってもよいし、市販の遺伝子の部位特異変異導入キットを用いる方法や改変部分の配列を制限酵素処理等により合成ＤＮＡ断片と交換する方法等などにより容易に実現しうる。あるいは、塩基配列から予測されるＤ３のアミノ酸配列をコードするよう設計してＤＮＡを合成することによってもプロ配列の一部を削除することができる。このようなアミノ酸配列をもとにした遺伝子の合成は、ＤＮＡ自動合成機を利用して合成したオリゴヌクレオチドをアニール後に連結すること等により容易に行うことができる。特に、本実施例において行なったように、ＰＣＲ法によりプロ配列の一部を削除することができる。削除されるプロ配列の長さは１３から２０残基が好ましい。
このようにして得たＤＮＡを適切なプロモーター、ターミネーター等を含む発現ベクターに組み込んで組換え発現ベクターを作成することができる。用いるベクターは、特に限定されるものではないが、宿主細胞内で自律的に複製可能であって、上記ＤＮＡすなわちＤ３遺伝子を組み込み得る挿入部位をもち、更にこの組み込んだＤＮＡを宿主細胞内で発現せしめることを可能とする領域を有することが好ましい。特にチオールプロテアーゼＤ３に関しては、特開平９−１２１８７０号に、「新規チオールプロテアーゼをコードするＤＮＡおよびこれを用いた該チオールプロテアーゼの製造方法」が記載されており、この文献に記載されているプロモーター、ターミネータ等の制御配列領域およびそれに組み込まれているｐｒｏＤ３をコードする領域を出発材料として利用することができる。また、前記文献には組換え体Ｄ３として、Ｄ３−αとＤ３−βが記載されているが、どちらも本発明の遺伝子構築物の作製のために使用できる。
また、異種タンパク質との融合タンパク質として、例えばｐＧＥＸシステム（ファルマシア社製）などを用いて、ΔｐｒｏＤ３またはその類似体をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉで生産させることもできる。この場合、異種タンパク質との融合部分に特定の切断酵素の認識部位を組み込むことにより、その酵素での切断が可能である。発現したタンパク質が封入体を形成した場合でも、後述するような方法で可溶化・巻戻し作業を行ってから、切断酵素により切断した後に、活性化処理を行うことによって活性のあるＤ３を得ることができる。
Ｄ３遺伝子を発現させるプロモーターとして通常異種タンパク質生産に用いられる強力なプロモーターを用い、Ｄ３遺伝子の下流にはターミネーターを挿入するのが好ましい。例えば、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｃ、λＰＬ、Ｔ７等のプロモーター、ｔｒｐＡ、ｌｐｐ、Ｔ４等のターミネーターが挙げられる。ｔｒｐプロモーターは強力なプロモーターであり、例えば、マダイ・トランスグルタミナーゼ（ＴＧ）遺伝子を高発現したプラスミドｐＴＴＧ２−２２（特開平６−２２５７７５）は、ｔｒｐプロモーターを用いており、マダイＴＧ遺伝子の上流の配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて異種タンパク質が高発現するようデザインされている。また、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）遺伝子を高発現したプラスミドｐＵＣＴＲＰＭＴＧ（＋）Ｄ２（特開平１１−７５８７６）は、このマダイＴＧ発現プラスミドのｔｒｐプロモーターを含む上流配列を用いており（配列番号３）、更に多コピープラスミドｐＵＣ１９に組み込むことにより、ＭＴＧが高発現するようになっている。従って、Ｄ３−β  ｃＤＮＡ、および上述したプラスミドに含まれるｔｒｐプロモーター領域を含む多コピープラスミドベクターは本発明の方法において利用し得る核酸構築物の作製に適している。更に、翻訳の効率化のために、宿主のコドン使用頻度を考慮してコドンを改変し、あるいはＳＤ配列の種類、数、ＳＤ配列と開始コドンの間の領域の塩基組成、配列、長さをＤ３遺伝子の発現に最適になるようにしてもよい。Ｄ３発現に必要なプロモーターからターミネーターにわたる領域は、従来公知のＰＣＲ法や化学合成法等により調製することができる。
このようにして作製した発現ベクターを、適切な宿主細胞内へ導入し形質転換体を得ることができる。宿主への核酸分子の導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。コンピテントセル法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等、種々のものが挙げられる。用いる宿主は、前述したようにＥ．ｃｏｌｉ、枯草菌、酵母、麹菌の微生物の他、カイコ培養細胞等の細胞を用いてもよく、特にＥ．ｃｏｌｉが好ましい。適切な宿主−ベクター系は当業者によく知られたものである。
得られた形質転換体を適切な培地で培養することにより、ΔｐｒｏＤ３またはその類似体を発現させることができる。産生されたΔｐｒｏＤ３またはその類似体を公知の方法で単離し、場合によっては精製することにより、ΔｐｒｏＤ３またはその類似体が得られ、さらに後述するように酸性条件に置くことにより目的とする成熟型プロテアーゼＤ３またはその類似体が得られる。
形質転換体を培養するための培地は公知であり、例えばＥ．ｃｏｌｉでは２ｘＹＴ培地やＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最少培地に炭素源、窒素源、ビタミン源などを添加して用いることができる。形質転換体の培養は、宿主に応じて、通常１６−４２℃、好ましくは２５−３７℃で５−１６８時間、好ましくは８−７２時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌や通気を行うのが好ましい。また、Ｄ３遺伝子発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、適切な時点において培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行う。例えば、ｔｒｐプロモーターを使用した組換え体では、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば３−β−インドールアクリル酸のような薬剤を加えてもよい。また、必要に応じて培養液中にグルコースやカザミノ酸などの成分を追加してもよい。更に、組換えＥ．ｃｏｌｉを選択的に増殖させるために、プラスミド中に保持されている薬剤耐性等の遺伝子に応じて耐性を示す薬剤（アンピシリン等）を添加してもよい。
Ｅ．ｃｏｌｉを宿主とした場合に、本明細書に開示した組換え核酸分子および方法によってΔｐｒｏＤ３またはその類似体を発現させると、これらは一般に不活性な会合体、すなわちタンパク質封入体として得られる。タンパク質封入体としてＤ３遺伝子産物を得ることは本発明のＤ３製造方法において特に好ましい。タンパク質封入体としてＤ３遺伝子を発現させた場合の利点として、産物を封入体として簡便に単離できる、Ｄ３活性の宿主への影響を軽減できる、等の点が挙げられる。タンパク質封入体としてＤ３遺伝子産物を回収した後、目的タンパク質を抽出し、適当な方法で活性化することができる。培養菌株からのタンパク質封入体の抽出は、培養後、菌体を集め菌体を緩衝液に懸濁し、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などの処理後、菌体を破壊した後、遠心分離により上清と沈殿に分離することによって行なうことができる。封入体は沈殿に分離されるので、沈殿をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（例えば０．５％）等の界面活性剤を含む緩衝液で洗浄し、更に緩衝液で洗浄して界面活性剤を除くことができる。これを変性剤等で可溶化後、変性剤を除去し、分離・精製を行うことができる。生産されたタンパク質封入体を可溶化させる変性剤として、例えば、尿素（例えば８Ｍ）、グアニジン塩酸（例えば６Ｍ）などが挙げられる。これらの変性剤を透析等により除くと、ｐｒｏＤ３またはその類似体を再生させることができる。この操作を「巻き戻し」と呼ぶ。透析に用いる透析溶液としては、リン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液などを用いればよい。また、変性剤除去の方法としては、透析法の他、希釈法、限外濾過法などが利用できる。巻き戻しの際のｐＨは、タンパク質が再変性しない限り特に限定されないが、ｐＨ７．５以上が好ましく、ｐＨ７．５〜ｐＨ１１がより好ましく、ｐＨ９．０〜１１が特に好ましい。
こうして得られたΔｐｒｏＤ３またはその類似体溶液のｐＨを酸性側にシフトすることにより、ΔｐｒｏＤ３またはその類似体を活性化し、成熟型チオールプロテアーゼＤ３とすることができる。プロ配列を一部削除することにより、この過程が短縮化される。この活性化は、ΔｐｒｏＤ３またはその類似体の溶液を酸、例えば塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、ギ酸、酒石酸、フタル酸、アコニチン酸、ジメチルグルタル酸、フェニル酢酸、コハク酸、カコジル酸、マレイン酸など、またはこれらの酸を含むバッファー、特に好ましくは酢酸ナトリウムバッファーまたはクエン酸バッファーを用いてｐＨ３〜７、好ましくは、ｐＨ３．５〜６．５、特に好ましくはｐＨ４．０〜５．０に調製し、好ましくは約４℃〜約５０℃、より好ましくは約２０℃〜４５℃、特に好ましくは３０℃〜４０℃にて約１分間〜数日間、好ましくは約１分間〜約４日間、特に好ましくは約５分間〜１日間静置することによって行なうことができる。特に、前述の通りΔｐｒｏＤ３またはその類似体の活性化に要する時間はｐｒｏＤ３に比べて大幅に短縮されるため、酸性条件に置く時間が３０分以下でも成熟型チオールプロテアーゼＤ３またはその類似体を得ることが可能である。場合により、前述のバッファーには１００ｍＭ程度の塩化ナトリウムを含ませてもよい。酸の添加は局所的に大きなｐＨ変化が生じないように行なうのが好ましい。例えば、タンパク質の変性を生じさせない程度にΔｐｒｏＤ３またはその類似体溶液を撹拌しながら酸を添加してもよい。
ΔｐｒｏＤ３またはその類似体は活性化前に公知の方法で分離精製してもよいし、活性化後、活性型Ｄ３またはその類似体を分離精製してもよい。これらのタンパク質の精製は、形質転換体の抽出物から公知の方法、例えば、塩析、等電点沈殿法または溶媒沈殿法等の沈殿法、透析、限外濾過またはゲル濾過等の分子量差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の疎水度の差を利用する方法やその他アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法、等電点電気泳動法等、および、これらの組み合わせによって行なうことができる。
得られたプロテアーゼＤ３またはその類似体のプロテアーゼ活性は、適切なバッファー中で適当な基質、例えばＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて測定することができる。Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質とする場合は、例えば、約１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む約５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）中で、３７℃にて反応させ、１分間あたりに遊離してくる７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を測定することによって酵素活性を測定してよい。本明細書に記載した実施例においては、１分間あたりに１μｍｏｌのＡＭＣを遊離させる酵素活性を１ユニット（１Ｕ）と定義したが、他の定義によってもよい。
本発明の別の実施態様において、ｐｒｏＤ３またはΔｐｒｏ３またはこれらの類似体中のプロ配列の一部を酵素的に切断することによって本発明の成熟型プロテアーゼＤ３またはその類似体の製造に適した前駆体を作製することができる。そのような目的に使用し得る、ｐｒｏＤ３またはΔｐｒｏＤ３またはこれらの類似体を切断する酵素としては、プロ配列中の一部を切断する酵素であれば特に限定されるものではない。そのような酵素の例としては、例えばサチライシンが挙げられる。サチライシンは、プロテアーゼＤ３中の配列のアミノ酸配列番号−９６位のＬｅｕとアミノ酸配列番号−９５位のＡｒｇの間を切断することができる。ｐｒｏＤ３またはΔｐｒｏＤ３またはこれらの類似体を活性化前にあらかじめサチライシンで処理すると、この部位で切断され、その後、ｐＨを酸性にシフトさせると速やかに成熟型Ｄ３またはその類似体が生成される。このように、酵素により完全なプロ配列の一部を消化することによってもｐｒｏＤ３またはΔｐｒｏＤ３またはこれらの類似体が活性化するまでに要する時間を数時間から数十分に短縮させることができる。この場合の活性化条件、すなわち酸処理条件は前述したものと同じでよい。またこの実施態様において基質となるｐｒｏＤ３またはΔｐｒｏＤ３またはこれらの類似体を発現させるための組換えＤＮＡ、形質転換体およびその形質転換体からのタンパク質の調製法は前述した方法と同様である。
実施例
実施例１．  ｐｒｏＤ３発現用遺伝子構築物の作製
発芽ダイズ子葉より得たｍＲＮＡより作製したｃＤＮＡライブラリーから常法に従いクローニングしたＤ３−βｃＤＮＡの一部を、Ｅ．ｃｏｌｉで機能する発現ベクターに組み込んだ。以下にその方法を詳述する。
（１）ｔｒｐプロモーターとＤ３遺伝子との連結
Ｄ３遺伝子は、Ｄ３−βｃＤＮＡ全長を組み込んだクローンｐＵＣａ（特開平９−１２１８７０号、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８７、平成６年１２月６日付けで、現、独立行政法人産業技術研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、郵便番号３０５−８５６６に寄託され、平成１３年１２月２１日付けで同センターにおいてＦＥＲＭ  ＢＰ７８３５としてブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管された。）を用いた。Ｄ３遺伝子を転写するプロモーターは、培地中にトリプトファンの欠乏で容易に転写が誘導されるｔｒｐプロモーターを用いた。
Ｄ３−βｃＤＮＡの上流に、ｔｒｐプロモーターを結合させるために、ＰＣＲによりＤＮＡフラグメントの結合を行った。まず、図１のように、ＭＴＧ発現プラスミドｐＵＣＴＲＰＭＴＧ（＋）Ｄ２（特開平１１−７５８７６）のｔｒｐプロモーターを含む領域（配列番号３）と、ｐＵＣａのＤ３  ｃＤＮＡの部分領域をＰＣＲにて増幅した。ｔｒｐプロモーター増幅用のプライマーはＴＲＰ−Ｎ２（配列番号４）、ＴＲＰ−Ｃ２（配列番号５）、Ｄ３部分増幅用プライマーは、Ｄ３−Ｎ（配列番号６）、Ｄ３−Ｃ（配列番号７）であり、ＴＲＰ−Ｎ２、Ｄ３−Ｎはセンスプライマー、ＴＲＰ−Ｃ２、Ｄ３−Ｃはアンチセンスプライマーである。また、Ｄ３−Ｎは、ｔｒｐ  ｐｒｏｍｏｔｅｒを含む配列と結合させるための１１塩基の配列と開始コドンＡＴＧを、Ｄ３の配列番号１のアミノ酸配列番号−１０７位のＴｙｒ（プロ配列の開始と推定される）をコードするＴＡＣ以下の配列に付加させるようデザインしてあり、この配列は、ＴＲＰ−Ｃ２中の配列と相補的である。Ｄ３−Ｃには、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを導入した。
まず、ｐＵＣＴＲＰＭＴＧ（＋）Ｄ２に対してプライマーＴＲＰ−Ｎ２とＴＲＰ−Ｃ２、ｐＵＣａに対してプライマーＤ３−ＮとＤ３−Ｃで、ＰＣＲをそれぞれ９４℃で３０秒、５５℃１分、７２℃で２分の条件で３５サイクル行った。各ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルムで抽出した後、エタノール沈殿を行い、１００μＬのＨ２Ｏに溶解した。
各ＰＣＲ産物から１μＬずつとって混ぜ、９４℃で１０分間熱変性した後、プライマーＴＲＰ−Ｎ２とＤ３−Ｃで、ＰＣＲを９４℃で３０秒、５５℃１分、７２℃で２分の条件で３５サイクル行った。
２回目のＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿したものを、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＵＣ１８にサブクローニングし、ｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３−Ｎを得（図１）、塩基配列を確認した。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号３：ｐＵＣＴＲＰＭＴＧ（＋）Ｄ２のプロモーター領域
配列番号４、５：ｔｒｐプロモーター領域増幅のためのＰＣＲプライマー
配列番号６，７：Ｄ３領域を増幅するためのＰＣＲプライマー
（２）Ｃ末配列への終始コドン導入
Ｄ３−βのＣ末端に、終始コドンを導入するために、ＰＣＲにより行った。プライマーは、センスプライマーＤ３−Ｎ２（配列番号８）、アンチセンスプライマーＤ３−Ｃ２（配列番号９）を用いた。なお、Ｄ３−Ｃ２は、配列番号１のアミノ酸配列の２４８番目のＣｙｓをコードするＴＧＴを終始コドンであるＴＧＡに変異させるためのプライマーである。
ｐＵＣａに対してプライマーＤ３−Ｎ２とＤ３−Ｃ２で、ＰＣＲを９４℃で３０秒、５５℃１分、７２℃で２分の条件で３５サイクル行った。各ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルムで抽出した後、ｐＵＣ１８のＳｍａＩサイトにクローニングし、ｐＵＣ−Ｄ３−Ｃを得（図２）、シークエンスを確認した。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号８、９：Ｃ−末端における終止コドン導入のためのＰＣＲプライマー
（３）ｐｒｏＤ３発現プラスミドの構築
このようにして得られたプラスミドの部分断片を用いて、ｔｒｐプロモーターによるｐｒｏＤ３発現プラスミドを完成させた。すなわち、ｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３−ＮのＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（大）とｐＵＣ−Ｄ３−ＣのＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（小）を結合し、ｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３を得た（図３）。
実施例２．  Ｎ末端の一部が欠失した短縮型ｐｒｏＤ３発現用遺伝子構築物の作製
実施例１で得られたｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３をもとに、ＰＣＲによりプロ配列をそれぞれ１３、１８、２０残基削除してＭΔ１３ｐｒｏＤ３、Δ１８ｐｒｏＤ３、Δ２０ｐｒｏＤ３発現プラスミドを作製した。
即ち、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３はＴｙｒから１３アミノ酸残基を削除した−９４位のＴｈｒ以下の配列のＮ末端に開始Ｍｅｔが付加するような配列をコードするように、Δ１８ｐｒｏＤ３はＴｙｒから１８アミノ酸残基を削除した−８９位のＭｅｔ以下の配列をコードするように、Δ２０ｐｒｏＤ３はＴｙｒから２０アミノ酸残基を削除した−８７位のＭｅｔ以下の配列をコードするように、各プラスミドを作製した。実施例１と同様に、ｔｒｐプロモーターを結合させるために、ＰＣＲによりＤＮＡフラグメントの結合を行った。
ＰＣＲを行う際に用いるセンスプライマーには、それぞれＭΔ１３−Ｎ（配列番号１０）、Δ１８−Ｎ（配列番号１１）、Δ２０−Ｎ（配列番号１２）を、アンチセンスプライマーにはＤ３−Ｃ（配列番号７）を用いた。ＭΔ１３−Ｎは、Ｄ３アミノ酸配列番号−９４位のＴｈｒコドンの前に開始Ｍｅｔコドン（ＡＴＧ）と更にその前にｔｒｐプロモーターを含む配列を結合させるための１４塩基の配列を付加させるようにデザインしてある。Δ１８−Ｎは、Ｄ３アミノ酸配列番号−８９位のＭｅｔコドン（ＡＴＧ）の前にｔｒｐプロモーターを含む配列を結合させるための１１塩基の配列を付加させるようにデザインしてある。Δ２０−Ｎは、Ｄ３アミノ酸配列番号−８７位のＭｅｔコドン（ＡＴＧ）の前にｔｒｐプロモーターを含む配列を結合させるための１１塩基の配列を付加させるようにデザインしてある。
まず、ｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３に対してプライマーＴＲＰ−Ｎ２とＴＲＰ−Ｃ２、およびプライマーＭΔ１３−ＮとＤ３−Ｃまたは、プライマーΔ１８−ＮとＤ３−Ｃまたは、プライマーΔ２０−ＮとＤ３−ＣでＰＣＲを９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の条件で３５サイクル行った。各ＰＣＲ産物（それぞれ、ＴＲＰ、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３−Ｎ、Δ１８ｐｒｏＤ３−Ｎ、Δ２０ｐｒｏＤ３−Ｎとする。）をフェノール／クロロホルムで抽出した後、エタノール沈殿を行い、１００μＬのＨ２Ｏに溶解した。
更に、ＴＲＰとＭΔ１３ｐｒｏＤ３−Ｎ、またはＴＲＰとΔ１８ｐｒｏＤ３−Ｎ、またはＴＲＰとΔ２０ｐｒｏＤ３−Ｎの組み合わせで各ＰＣＲ産物から１μＬずつとって混ぜ、９４℃で１０分間熱変性し、伸長反応を行った後、プライマーＴＲＰ−Ｎ２とＤ３−ＣでＰＣＲを９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の条件で３５サイクル行った。
２回目の各ＰＣＲ産物（それぞれＴＲＰ−ＭΔ１３−Ｎ、ＴＲＰ−Δ１８−Ｎ、ＴＲＰ−Δ２０−Ｎとする。）をフェノール／クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿した。次いで、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵＣ１８にサブクローニングし、ｐＵＣＴＲＰＭΔ１３ｐｒｏＤ３−Ｎ、ｐＵＣＴＲＰΔ１８ｐｒｏＤ３−ＮおよびｐＵＣＴＲＰΔ２０ｐｒｏＤ３−Ｎを得（図４）、シークエンスを確認した。
このようにして得られた部分断片プラスミドを用いて、ｔｒｐプロモーターによるＭΔ１３ｐｒｏＤ３およびΔ１８ｐｒｏＤ３およびΔ２０ｐｒｏＤ３発現プラスミドを完成させた。すなわち、ｐＵＣＴＲＰＭΔ１３ｐｒｏＤ３−ＮのＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（大）、ｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３のＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（小）、またはｐＵＣＴＲＰΔ１８ｐｒｏＤ３−ＮのＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（大）、ｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３のＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（小）、またはｐＵＣＴＲＰΔ２０ｐｒｏＤ３−ＮのＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（大）、ｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３のＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（小）の各二断片を結合し、ｐＵＣＴＲＰＭΔ１３ｐｒｏＤ３（図５）、ｐＵＣＴＲＰΔ１８ｐｒｏＤ３（図６）およびｐＵＣＴＲＰΔ２０ｐｒｏＤ３を得た（図７）。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１０：１３アミノ酸欠失のためのＰＣＲプライマー
配列番号１１：１８アミノ酸欠失のためのＰＣＲプライマー
配列番号１２：２０アミノ酸欠失のためのＰＣＲプライマー
実施例３．  ｐｒｏＤ３、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３、Δ１８ｐｒｏＤ３、Δ２０ｐｒｏＤ３発現プラスミドを用いたＥ．ｃｏｌｉ形質転換体の作製と培養
コンピテントセル法によりｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３、ｐＵＣＴＲＰＭΔ１３ｐｒｏＤ３、ｐＵＣＴＲＰΔ１８ｐｒｏＤ３、ｐＵＣＴＲＰΔ２０ｐｒｏＤ３、ｐＵＣ１８をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む寒天培地で選択した。形質転換体を１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬの２ｘＹＴ培地に接種し、３７℃で約１０時間培養した。この前培養液１ｍＬを１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５０ｍＬのＭ９−カザミノ酸培地に移し、本培養とした。本培養は３７℃で約２０時間行った。目的のｐｒｏＤ３、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３、Δ１８ｐｒｏＤ３、Δ２０ｐｒｏＤ３はそれぞれタンパク質封入体として菌体内に蓄積した。
実施例４．  タンパク質封入体の単離、可溶化・巻戻し
実施例３のようにして培養した各菌体を集菌後、超音波破砕し、遠心分離によってタンパク質封入体を回収した。このタンパク質封入体を洗浄後、可溶化溶液（８Ｍ尿素−１０ｍＭジチオスレイトール−５０ｍＭトリス・塩酸−５ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液（ｐＨ８））に、タンパク質濃度が約１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解した。
この可溶化ｐｒｏＤ３、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３、Δ１８ｐｒｏＤ３、Δ２０ｐｒｏＤ３をそれぞれＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけ、巻戻し溶液（１ｍＭ還元型グルタチオン−０．１ｍＭ酸化型グルタチオン−５０ｍＭリン酸カリウム−５ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液（ｐＨ１０．５））により溶出した。この溶出液を濃縮し、更に保存液（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ１０．５））に置換し、それぞれ巻戻しｐｒｏＤ３、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３、Δ１８ｐｒｏＤ３、Δ２０ｐｒｏＤ３を得た。
実施例５．  自己触媒的活性化
巻戻したｐｒｏＤ３、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３、Δ１８ｐｒｏＤ３、Δ２０ｐｒｏＤ３を、塩化ナトリウムを０−２００ｍＭ含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中、３７℃でそれぞれインキュベートし、活性化させた。Ｄ３活性は、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４）中で、１０μＭのＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質として反応させて測定した。この時に、１分間に１μｍｏｌの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を遊離させる酵素量を１Ｕとして表した。
その結果、塩化ナトリウムを含まない溶液中では、ｐｒｏＤ３は、２４時間後でも活性化しなかったが、Δ１８ｐｒｏＤ３、Δ２０ｐｒｏＤ３は、約１０分後に比活性約４０００Ｕ／ｍｇの活性体へと変換した。また、塩化ナトリウムを１００ｍＭ含む溶液中では、ｐｒｏＤ３は活性化したが、活性化するまでに要する時間が３−６時間程かかったのに対して、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３は約２時間で、Δ１８ｐｒｏＤ３、Δ２０ｐｒｏＤ３は、約５分ほどで活性化した（図８）。
実施例６．  各活性体によるダイズタンパク質の分解
ダイズタンパク質には調製ダイズタンパク質アジプロンＳＵ（味の素（株）社製）を用いた。活性体Ｄ３は、実施例３の様に調製したｐｒｏＤ３およびΔ２０ｐｒｏＤ３由来の活性体を濃縮後、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ１０．５）に置換したものを用いた。１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌したアジプロンＳＵ水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を５００μＬ、５００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）を１００μＬ、活性化Ｄ３溶液を５０μｇ分（Ｓ：Ｅ比＝１００：１）を混合し、３７℃で１時間から４日間反応させた。分解の進行は特開平８−２６４号に記載のとおり、４−ニトロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）試薬（ＫＩｍａｉ，ａｎｄ  Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ．，１３０，３７７−３８３（１９８３））によるアミノ態・イミノ態窒素の定量により検出した。
その結果、表１に示すように、ｐｒｏＤ３とΔ２０ｐｒｏＤ３を活性化させたものによるアジプロンＳＵの分解は同程度に進んでいることが確認された。
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実施例７．  ｐｒｏＤ３によるダイズタンパク質の分解
各ｐｒｏＤ３を活性化処理を行わずに、ダイズタンパク質に作用させて分解を行った。ダイズタンパク質には実施例４と同様に、アジプロンＳＵを用いた。反応液の組成は実施例４と同様であるが、塩化ナトリウムを０または２００ｍＭ（終濃度）含むものについて比較した。また、各ｐｒｏＤ３は、５００μｇ分（Ｓ：Ｅ比＝１０：１）を添加した。
その結果、Δ２０ｐｒｏＤ３ではｐｒｏＤ３に比べてダイズタンパク質の分解が速く進むことが確認された。Δ２０ｐｒｏＤ３では、特に、塩化ナトリウムを添加しない場合（表２）でも、添加した場合（表３）と同様に反応開始後１時間から分解が進んでいたが、ｐｒｏＤ３の場合は、塩化ナトリウムを添加しないと、１８時間後でもほとんど分解が見られなかった。
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実施例８．  プロ配列の酵素による切断と活性化
実施例３及び４のようにして、ｐｒｏＤ３を得た。このｐｒｏＤ３（５ｍｇ／ｍＬ）に対してサチライシンを１００：１になるように添加し、４０℃で１０分インキュベートした。この後、Ｎ末端アミノ酸を確認したところ、ｐｒｏＤ３のＮ末端から１２アミノ酸残基が削れた配列に相当するＡｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−・・・であった。これを実施例５と同様に活性化処理を行ったところ、約１０分後には比活性４０００ｍＵ／ｍｇの活性体へと変換していた。このことより、自己消化によらず、他の酵素処理によってプロ配列の一部を切断して活性化の時間を短縮することも可能であることが確認された。
本発明により、活性型のダイズ由来チオールプロテアーゼＤ３製造のための時間が著しく短縮される。従って、本発明により、呈味性の優れたタンパク質分解物を生じさせ得るチオールプロテアーゼＤ３を従来以上に安価かつ迅速に供給できるようになる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３−Ｎの構築図である。
図２は、プラスミドｐＵＣ−Ｄ３−Ｃの構築図である。
図３は、Ｄ３発現プラスミドｐＵＣＴＲＰｐｒｏＤ３の構築図である。
図４は、プラスミドｐＵＣＴＲＰＭΔ１３ｐｒｏＤ３−Ｎ、ｐＵＣＴＲＰΔ１８ｐｒｏＤ３−Ｎ、ｐＵＣＴＲＰΔ２０ｐｒｏＤ３−Ｎの構築図である。
図５は、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３発現プラスミドｐＵＣＴＲＰＭΔ１３ｐｒｏＤ３の構築図である。
図６は、Δ１８ｐｒｏＤ３発現プラスミドｐＵＣＴＲＰΔ１８ｐｒｏＤ３の構築図である。
図７は、Δ２０ｐｒｏＤ３発現プラスミドｐＵＣＴＲＰΔ２０ｐｒｏＤ３の構築図である。
図８は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ存在下でｐｒｏＤ３、ＭΔ１３ｐｒｏＤ３、Δ１８ｐｒｏＤ３、Δ２０ｐｒｏＤ３の活性化を経時的に表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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