(57)【要約】抗腫瘍作用を有する新規なキサントン系化合物を提供すること。式（Ｉ）2002027010.tif 000012で表されるキサントン系化合物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
2002027010.tif 000009
で表されるキサントン系化合物。
【請求項２】
式（ＩＩ）
2002027010.tif 000010
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ水素又はメチル基であり、−Ａ−は下記式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）
2002027010.tif 000011
で示される基である。］で表されるキサントン系化合物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗腫瘍作用を有する新規なキサントン系化合物に関する。
背景技術
本発明のキサントン系化合物と構造が近似するものとしては、リソリピンＸ（特開平２−１６７０９２号）など抗腫瘍作用を有する数種の化合物が知られている。いずれも含窒素環に縮合する部分が芳香環であり、この部分が本発明の化合物のように脂環式のものは知られていない。
本発明の目的は、抗腫瘍作用を有する新規なキサントン系化合物を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、多数の菌株を土壌および植物より分離し、その菌株の代謝産物について種々検討した結果、ある種の菌株が強い抗腫瘍作用を有する新規なキサントン系化合物を生産することを見出した。さらに、本発明者らは、この新規物質を化学修飾し、強い抗腫瘍作用が維持されたその誘導体を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、式（Ｉ）
2002027010.tif 000002
で表されるキサントン系化合物、及び式（ＩＩ）
2002027010.tif 000003
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ水素又はメチル基であり、−Ａ−は下記式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）
2002027010.tif 000004
で示される基である。］で表されるキサントン系化合物である。
式（Ｉ）の化合物（以下、ＷＳＳ２１３８という）を生産する菌株は、本発明者らが自然界から新たに分離した菌株であり、微生物の名称を「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＴＡ−０４１０」として独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（あて名：〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に寄託されている。その微生物寄託番号は「ＦＥＲＭ　Ｐ−１７９９９」であり、寄託日は２０００年８月２５日である。
この菌株の菌学的性状を以下に示す。
Ａ．形態的性質
基生菌糸は良く発達し、不規則に分岐しているが分断は見られない。胞子形成気菌糸は貧弱に形成され、胞子鎖の形態は通常先端が１〜３巻きのループ状もしくは緻密な螺旋状（１０〜２０胞子）である。胞子の大きさは幅が０．６〜０．７μｍ、長さが１．０〜０．５μｍ、形は円筒形であり、表面は平滑である。寒天培地中での胞子形成は観察されない。また、胞子嚢や菌核の形成及び胞子の運動性も観察されない。
Ｂ．培養的性質
各種培地上で、２８℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察結果を表１に示す。色の表示は日本規格協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引用した。
2002027010.tif 000005
Ｃ．生理学的性質
生理学的性質を表２に示す。生育温度試験は１週間、炭素源の資化性試験は２週間、その他の試験は３週間の培養後に観察した。
2002027010.tif 000006
Ｄ．化学分類学的性質
本菌株の細胞壁構成アミノ酸を分析した結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出された。またメナキノン組成分析ではＭＫ−９（Ｈ６）、ＭＫ−９（Ｈ８）が主成分として検出された。
以上の結果から本菌株はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属することが明かとなった。そこで、本菌株をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＴＡ−０４１０と命名した。
ＷＳＳ２１３８の生産は大略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地でＴＡ−０４１０を好気的条件下で培養することにより行う。
培地は主として液体培地を用い、炭素源、窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先駆物質および消泡剤を加えることができ、ｐＨは７前後に調整する。炭素源としては、例えばグルコース、シュウクロース、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独又は混合して用いる。窒素源としては、例えば肉エキス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトン、コーン・スティープ・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独又は混合して用いる。無機塩としては、例えばリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを、単独又は混合して用いる。消泡剤としてはアデカノール、シリコン化合物などを用いることができる。
培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気的培養が適しており、ｐＨ４〜１０、２５〜３５℃で２〜５日間、望ましくはｐＨ６〜８、２５〜２８℃で４日間培養する。
この培養により生産されたＷＳＳ２１３８を単離するには、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行えばよい。例えば次のような方法が効果的である。すなわち、培養終了後、遠心分離又は濾過により培養濾液を得、ダイヤイオンＨＰ−２０（商品名、三菱化学社製）などのポリスチレン樹脂に吸着させた後、低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。菌体は低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出する。次いでこの菌体抽出液および吸着樹脂からの溶出液を合わせて減圧濃縮し、有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ブタノールなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状とする。このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび逆層分配用ＯＤＳを充填したカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーに付すことにより本発明化合物を精製単離することができる。
以上の精製法によって得られたＷＳＳ２１３８は、その分子量、紫外線吸収スペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル等の解析により、式（Ｉ）の通り構造が決定された。
ＷＳＳ２１３８の理化学的性質を以下に示す。
（ａ）外観：黄色粉末
（ｂ）融点：＞３００℃
（ｃ）分子量：５５１
（ｄ）分子式：Ｃ２７Ｈ１８ＣｌＮＯ１０
（ｅ）ＨＲＦＡＢマススペクトル：
実測値：５９０．０２６７
理論値：５９０．０２５６（Ｃ２７Ｈ１８ＣｌＮＯ１０Ｋ）として計算
（ｆ）比旋光度：［α］Ｄ２５：３０３．８８（ｃ　０．５３，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｇ）紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ　ｎｍ（ｌｏｇ　ε）ｄｉｏｘａｎｅ：３９４．０（４．０３），３１２．０（４．１２），２７１．５（４．４７），２４４．５（４．５４）
（ｈ）赤外吸収スペクトル：
ＫＢｒ法で測定した結果を図１に示す。
（ｉ）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。
（ｊ）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。
（ｋ）溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｌ）呈色反応：
陽性：Ｈ２ＳＯ４、モリブデン酸アンモニウム硫酸、アニスアルデヒド
陰性：ニンヒドリン
（ｍ）塩基性、酸性、中性の区別：塩基性
次に式（ＩＩ）で表されるＷＳＳ２１３８誘導体の製造法について述べる。
ＷＳＳ２１３８メチル化体は、ＷＳＳ２１３８とメチル化剤を塩基の存在下に反応させることにより製造することができる。通常、メチル化剤としては、ヨウ化メチル、ジメチル硫酸、メタンスルホン酸メチル等が用いられ、塩基としては、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、酸化銀、トリエチルアミン等が用いられ、反応溶媒としては、反応に悪影響を及ぼさない有機溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、アセトニトリルが用いられる。反応温度は通常−７０℃〜１５０℃程度で行われ、望ましくは−３０℃〜８０℃で行われる。反応時間は通常数１０分から数１０時間反応させる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例および試験例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１
可溶性澱粉２．５％、グルコース１％、フィッシュミール０．５％、ファーマメディア０．３％、ＮＺケース０．３％、酵母エキス０．２％、炭酸カルシウム０．２％を含む液体培地６０ｍｌを３００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２気圧で２０分滅菌した。次いで、この無菌培地にＴＡ−０４１０株を接種し、２８℃、２００ｒｐｍで３日間回転振とう培養し、種培養とした。次に、オートミール２％、グルコース１％、デキストリン２．５％、ファーマメディア１％、フィッシュミール０．５％、モラセス０．５％、エビオス０．２％、炭酸カルシウム０．３％からなる無菌液体培地１００ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに入れ、これに前記種培養液４ｍｌを加えたものを１００本用意し、２８℃、２００ｒｐｍで６日間回転振とう培養した。
培養終了後、得られた培養液１０Ｌを遠心分離により菌体と上清に分けた。菌体は５Ｌのアセトンで抽出した。また上清は５００ｍｌのＨＰ−２０（商品名：三菱化学社製）に吸着させ、水で洗浄した後３Ｌのアセトンで溶出した。続いて両者を合わせ、減圧濃縮したものを４Ｌのｎ−ブタノールにて抽出し、減圧濃縮して、褐色のｎ−ブタノール抽出エキス１０．５４ｇを得た。
得られたブタノールエキスを、クロロホルム約５０ｍｌに溶解し、クロロホルム−メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ　Ｇｅｌ　６０（Ｍｅｒｃｋ社製）４００ｍｌ：カラム管φ３５ｍｍ）で粗分画をしたところ、クロロホルム４００ｍｌで洗浄した後、クロロホルム−メタノール１９：１溶出画分（１．２〜２．８Ｌ）に目的成分が含まれていたので、これを集めて濃縮し、９８４．２ｍｇの褐色油状物を得た。次いでこの油状物をＯＤＳに吸着させた後、アセトン−水１：１を溶出溶媒とするオープンＯＤＳカラムクロマトグラフィー（クロマトレックス（センシュー科学社製）２００ｍｌ：カラム管φ２５ｍｍ）に付した。２０ｍｌずつ分取し、フラクション３５〜８０を集めて濃縮し、ＷＳＳ２１３８を３５５．２ｍｇ単離した。
実施例２
ＷＳＳ２１３８（２１．９ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．０ｍｌ）に溶解後、酸化銀（１８．２ｍｇ）を添加した。これにヨウ化メチル（１００μｌ）を添加し、２５℃　にて３０分攪拌した。ＴＬＣにて原料消失を確認した後、セライト濾過により酸化銀を除いた。続いて濾液を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を減圧濃縮した。これをクロロホルム−メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｂｏｎｄｅｌｕｔｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）１０ｇ）に付した。クロロホルム２０ｍｌ、クロロホルム−メタノール１００：１を８０ｍｌ用いて洗浄した後、クロロホルム−メタノール９：１で溶出させた画分（０〜４０ｍｌ）を濃縮し、これをクロロホルム−メタノールを展開溶媒とする分取ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社製）に付し、Ｒｆ値０．４５〜０．４０部分を掻き取り、クロロホルム−メタノール４：１にて洗浄し、１７．８ｍｇ（収率８０．０％）を得た（以下、この画分をＷＳＳ８０２８という）。またＲｆ値０．５５〜０．５０部分を同様にして、２．３ｍｇ（収率１０．０％）を得た（以下、この画分をＷＳＳ８００３という）。
ＷＳＳ８０２８：１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｃ；１９３．６（ｓ），１９２．６（ｓ），１７４．７（ｓ），１５９．５（ｓ），１５４．０（ｓ），１４８．９（ｓ），１４７．０（ｓ），１４６．１（ｓ），１４４．９（ｓ），１４２．８（ｓ），１３８．３（ｓ），１３３．５（ｓ），１２８．５（ｓ），１２５．５（ｄ），１２５．５（ｓ），１２２．４（ｓ），１２１．２（ｄ），１１９．４（ｓ），１１５．１（ｓ），１００．５（ｄ），９１．６（ｔ），７５．７（ｓ），６８．９（ｄ），６４．３（ｑ），６１．６（ｑ），５４．９（ｄ），３２．２（ｑ），２２．４（ｔ），２２．２（ｑ）．
ＷＳＳ８００３：１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｃ；１９７．３（ｓ），１９２．４（ｓ），１７４．６（ｓ），１５９．３（ｓ），１５３．８（ｓ），１４８．９（ｓ），１４７．５（ｓ），１４６．１（ｓ），１４４．９（ｓ），１４２．８（ｓ），１３８．１（ｓ），１３３．５（ｓ），１２８．５（ｓ），１２６．１（ｓ），１２５．５（ｄ），１２２．４（ｓ），１２１．２（ｄ），１１９．３（ｓ），１１５．２（ｓ），１０１．１（ｄ），９１．７（ｔ），７７．３（ｓ），６９．２（ｄ），６４．２（ｑ），６１．６（ｑ），５６．１（ｓ），３２．１（ｑ），３１．７（ｔ），２２．２（ｑ），２１．３（ｑ）。
これらのＮＭＲスペクトル等から、ＷＳＳ８０２８及びＷＳＳ８００３は、それぞれ、式（ＩＩ）において、Ｒ１が水素、Ｒ２がメチル基、−Ａ−が式（ＩＩＩ）の構造及びＲ１がメチル基、Ｒ２がメチル基、−Ａ−が式（ＩＩＩ）の構造であると決定された。
実施例３
ＷＳＳ２１３８（１９．７ｍｇ）をクロロホルム（２．０ｍｌ）に溶解後、酸化銀（１５．８ｍｇ）を添加した。これにヨウ化メチル（１００μｌ）を添加し、２５℃にて１時間攪拌した。ＴＬＣにて原料消失を確認した後、セライト濾過により酸化銀を除いた。続いて濾液を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を減圧濃縮した。これをクロロホルム−メタノール１００：１を展開溶媒とする分取ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社製）により精製した。Ｒｆ値０．３５〜０．４５部分を掻き取り、クロロホルム−メタノール４：１にて充分洗浄し、１２．３ｍｇ（収率５９．４％）を得た（以下、この画分をＷＳＳ８０２９という）。また、Ｒｆ値０．３０〜０．３５部分より２．３ｍｇ（収率１１．４％）を得た（以下、この画分をＷＳＳ８０３０という）。
ＷＳＳ８０２９：１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｃ；１９４．７（ｓ），１９３．１（ｓ），１８１．３（ｓ），１６３．８（ｓ），１６２．４（ｓ），１４９．９（ｓ），１４９．０（ｓ），１４５．２（ｓ），１４３．８（ｓ），１４３．１（ｓ），１３５．０（ｓ），１３３．４（ｓ），１３１．５（ｓ），１２５．９（ｄ），１２０．５（ｄ），１２０．２（ｓ），１１５．５（ｓ），１１２．９（ｄ），１１１．３（ｓ），１０７．５（ｄ），９１．６（ｔ），７６．１（ｓ），６９．４（ｄ），６１．７（ｑ），５５．１（ｑ），５４．７（ｄ），２４．９（ｑ），２３．４（ｔ）．
ＷＳＳ８０３０：１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｃ；１９３．５（ｓ），１９３．０（ｓ），１７４．６（ｓ），１６３．３（ｓ），１６２．５（ｓ），１４８．９（ｓ），１４７．０（ｓ），１４４．９（ｓ），１４３．２（ｓ），１４２．８（ｓ），１３８．４（ｓ），１３３．５（ｓ），１２８．３（ｓ），１２５．５（ｄ），１２５．１（ｓ），１２２．４（ｓ），１２１．２（ｄ），１１５．０（ｓ），１１３．３（ｓ），１１１．１（ｄ），９１．７（ｔ），７５．９（ｓ），６８．８（ｄ），６４．０（ｑ），６１．６（ｑ），５４．７（ｄ），２４．９（ｑ），２２．６（ｔ）。
これらのＮＭＲスペクトル等から、ＷＳＳ８０２９及びＷＳＳ８０３０は、それぞれ、式（ＩＩ）においてＲ１が水素、Ｒ２が水素基、−Ａ−が式（ＩＶ）の構造及びＲ１が水素、Ｒ２がメチル基、−Ａ−が式（ＩＶ）の構造であると決定された。
試験例１
ＫＢ細胞に対する増殖抑制試験
（検体）
ＷＳＳ２１３８を１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解し、滅菌水で目的濃度となるように希釈したものを用いた。
（試験細胞）
ヒト鼻咽腔癌細胞ＫＢ
（試験方法）
平底の９６穴プレートにＫＢ細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％　ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後、目的濃度の薬物溶液０．１ｍｌを添加して４８時間追加培養した。（最終ＤＭＳＯ濃度０．５％）。培養後、ＭＴＴ［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ］試薬５０μｌ（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに４時間追加培養した。５４０ｎｍの吸光度を測定し、薬物添加群とコントロール群の吸光度の比（Ｔ／Ｃ％）を求め、抑制率を求めた。また、対照薬としてアドリアマイシンを用いた。結果を表３に示す。
Ｔ／Ｃ（％）＝薬物添加群の吸光度／コントロール群の吸光度×１００
抑制（％）＝１００−Ｔ／Ｃ（％）
2002027010.tif 000007
試験例２
ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制試験
（検体）
ＷＳＳ２１３８、ＷＳＳ８００３、ＷＳＳ８０２８、ＷＳＳ８０２９、ＷＳＳ８０３０を１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解し、滅菌水で目的濃度となるように希釈したものを用いた。
（試験細胞）
ヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０
（試験方法）
９６穴プレートに目的濃度の薬物溶液を１０μｌ添加した後、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＨＬ−６０細胞を撒いた（ＤＭＳＯ最終濃度０．１％）。これを３７℃で２日間インキュベートした後、１０μｌのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（和光純薬社製）を添加し、４時間インキュベートした後、蛍光強度をＡｒｖｏ（ｗａｌｌａｃ社製）にて測定した（励起波長：５３０ｎｍ、測定波長：５９０ｎｍ）。細胞の生存率は以下の式にて求めた。結果を表４に示す。
抑制率（％）＝１００−［｛（薬物未添加群の値−薬物添加群の値）／薬物未添加群の値｝Ｘ１００］
2002027010.tif 000008
産業上の利用可能性
本発明の化合物はＫＢ細胞やＨＬ−６０細胞に対して増殖抑制作用を有するので、抗腫瘍剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１はＫＢｒ法で測定したＷＳＳ２１３８の赤外線吸収スペクトルを示す。
図２は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２１３８の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図３は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２１３８の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
2002027010.tif 000013
【図２】
2002027010.tif 000014
【図３】
2002027010.tif 000015
【国際調査報告】
2002027010.tif 000016
2002027010.tif 000017
2002027010.tif 000018
2002027010.tif 000019