(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の配列（Ｉ）を含むミニリボザイム。
【化１】
0003735695.tif 000010
〔（Ｉ）中、Ａはアデニンモノリボヌクレオチド、Ｇはグアニンモノリボヌクレオチド、Ｃはシトシンモノリボヌクレオチド、Ｕはウラシルモノリボヌクレオチドを示し、
Ｘは標的ＲＮＡの配列に相補的な配列から選ばれるモノヌクレオチドであって、アデニンモノリボヌクレオチド（Ａ）、グアニンモノリボヌクレオチド（Ｇ）、シトシンモノリボヌクレオチド（Ｃ）、ウラシルモノリボヌクレオチド（Ｕ）、アデニンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＡ）、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＧ）、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＣ）、又はチミンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＴ）を示し、
ｍは、５以上の整数を示し、
ｎは、４以上の整数を示し、
Ｙは、アデニンモノリボヌクレオチド（Ａ）、グアニンモノリボヌクレオチド（Ｇ）、シトシンモノリボヌクレオチド（Ｃ）、ウラシルモノリボヌクレオチド（Ｕ）のいずれか任意のモノリボヌクレオチドを示し、
塩基配列上段の数字は、ミニリボザイム中のモノヌクレオチドの位置を示す番号である。〕
【請求項２】
第７番のＹがウラシルモノリボヌクレオチド（Ｕ）である、請求項１のミニリボザイム。
【請求項３】
第７番のＹがグアニンモノリボヌクレオチド（Ｇ）又はアデニンモノリボヌクレオチド（Ａ）である、請求項１のミニリボザイム。
【請求項４】
Ｘが、アデニンモノリボヌクレオチド（Ａ）、グアニンモノリボヌクレオチド（Ｇ）、シトシンモノリボヌクレオチド（Ｃ）又はウラシルモノリボヌクレオチド（Ｕ）である、請求項１〜３のいずれかのミニリボザイム。
【請求項５】
Ｘが、アデニンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＡ）、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＧ）、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＣ）、又はチミンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＴ）である、請求項１〜３のいずれかのミニリボザイム。
【請求項６】
請求項１〜５のミニリボザイム中のモノヌクレオチドであって、その活性に影響を及ぼさないモノヌクレオチドのリン酸エステル基又はリボース部分の水酸基が他の安定な基で置き換わってなる、安定化ミニリボザイム。
【請求項７】
一つ又は複数のＸのリン酸エステル基が、チオリン酸エステル基で置き換わってなる、請求項６の安定化ミニリボザイム。
【請求項８】
第３番のＣ、第４番のＵ、又は第７番のＹのモノリボヌクレオチドのうちの少なくとも一つの３´側のリン酸エステル基が、チオリン酸エステル基で置き換わってなる、請求項６の安定化ミニリボザイム。
【請求項９】
標的ＲＮＡを請求項１〜５のいずれかのミニリボザイム、又は請求項６〜８のいずれかの安定化ミニリボザイムと、インビトロで反応させることを特徴とする、標的ＲＮＡの切断又は不活化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、リボザイムの活性を維持したまま、標的ＲＮＡを特異的に切断できる超短鎖ミニリボザイム（超ミニザイム）、この安定性を高めた安定化ミニリボザイム、それらを用いる標的ＲＮＡの切断方法、及びそれらを有効成分とする医療用、動物用もしくは農薬用薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
チェック（Ｔ．  Ｃｈｅｃｈ）は、酵素活性を有するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムを１９８１年に初めて発見した。
また、ハセロフ（Ｊ．  Ｈａｓｅｌｏｆｆ）とジャーラック（Ｗ．  Ｌ．  Ｇｅｒｌａｃｈ）は、数種の植物ウィルスのリボザイムの間で共通に保存されている塩基配列に着目し、リボザイム分子の大きさがわずか２２ヌクレオチド（但し、標的ＲＮＡ結合領域を除く。）で構成された短鎖リボザイム（ハセロフとジャーラックのリボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ−Ｇｅｒｌａｃｈ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、又はハンマーヘッド型リボザイムという。）を作製することに成功した（Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３３４，  ｐ．５８５−５９１（１９８８）；特表平３−５０２６３８号公報）。
【０００３】
図１はハンマーヘッド型リボザイムの２次構造と作用部位、分子内領域の最近の命名法と番号付けシステムを説明する図である。リボザイムは、標的であるＲＮＡ分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合領域（ヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩ）と、触媒活性部位及びヘリックスＩＩを有する領域から構成されており、標的ＲＮＡは標的ＲＮＡ中のＧＵＣの３’側（図１中、矢印で示す。）で切断される。なお、標的ＲＮＡが切断される部位ＧＵＣ配列は、他の配列（ＮＵＺ；但し、ＮはＡ、Ｕ、Ｇ又はＣを示し、ＺはＡ、Ｕ又はＣを示す。）でも切断されることが知られている。
【０００４】
一方、リボザイムの活性を維持させたままで、ハセロフとジャーラックのリボザイムよりも更に短いリボザイムが得られれば、リボザイムの基礎研究及び応用面で有用であるため、その研究・開発が盛んになされている。
例えば、マッコール（Ｍ．  Ｊ．  ＭｃＣａｌｌ）らは、ハンマーヘッド型リボザイムのステムＩＩを完全に欠いても、４又は５個のヌクレオチド（３個以下のヌクレオチドでは活性が著しく低い。また、ヌクレオチドはＲＮＡよりもＤＮＡがほうが好ましい。）から成るループ構造があれば、ハンマーヘッド型リボザイムと同様の活性があると報告している（Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９，  ５７１０−５７１４，１９９２）。すなわち、マッコール（Ｍ．  Ｊ．  ＭｃＣａｌｌ）らが作製したミニリボザイム（ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、いわゆる、ミニザイム（ｍｉｎｉｚｙｍｅ）の大きさは、最小のもので１４ヌクレオチド（但し、標的ＲＮＡ結合領域を除く。）で構成されている。しかし、マッコール（Ｍ．  Ｊ．  ＭｃＣａｌｌ）らの作製したリボザイムは、すべてＲＮＡから成る天然型リボザイムではその活性が著しく低く、またロング（Ｄ．  Ｍ．  Ｌｏｎｇ）らは、ステムＩＩの代わりに４塩基置換したミニザイムの切断活性は低いと報告している（Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ６９７７−６９８１，  １９９４）。
【０００５】
また、トシュル（Ｔ．  Ｔｕｓｃｈｌ）らは、ループＩＩの長さを４塩基とし、ステムＩＩの長さ及びループＩＩの塩基配列の相違がリボザイム活性にどう影響するかを検討した結果、ステムＩＩは２塩基対まで短くすることができたが、１塩基対又はそれ以下にするとリボザイム活性は著しく減少すること、リボザイムの活性の発揮にＧ（１０．１）＊Ｃ（１１．１）塩基対は必須であること、更にこのときの活性なリボザイムの大きさは最小のもので１８ヌクレオチド（但し、標的ＲＮＡ結合領域を除く。）であることを報告している（Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  ６９９１−６９９４，  １９９３）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
リボザイム活性を維持したまま、更にヌクレオチド鎖の短いリボザイムを得ることは、前記したように基礎研究、すなわち、リボザイムの活性発現に必要な構造解明や作用メカニズム等の研究に役立つばかりではなく、ヌクレオチド鎖が短かければ化学合成時の高収量が期待できるし、また細胞内への取り込みの容易さやヌクレアーゼに対する安定性も期待でき、医療用途で大きな利点がある。本発明の目的は、リボザイム活性を維持したまま、従来のリボザイムよりも更に小さいリボザイム（超ミニリボザイム又は超ミニザイム）を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本明細書において用いた記号・略号は下記の意味である。
Ａ：アデニンモノリボヌクレオチド
Ｇ：グアニンモノリボヌクレオチド
Ｃ：シトシンモノリボヌクレオチド
Ｕ：ウラシルモノリボヌクレオチド
ｄＡ：アデニンモノデオキシリボヌクレオチド
ｄＧ：グアニンモノデオキシリボヌクレオチド
ｄＣ：シトシンモノデオキシリボヌクレオチド
ｄＴ：チミンモノデオキシリボヌクレオチド
＊：ワトソン−クリック型塩基対
┬：チオリン酸エステル結合
【０００８】
本発明者らは、活性をもつリボザイムであって、従来知られているリボザイムよりも更に短いリボザイム、あるいはその安定化リボザイムを得るため種々検討し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記の（１）〜（５）の超ミニリボザイム（ミニザイム）である。
（１）次の配列（Ｉ）を含むミニリボザイム。
【化２】
0003735695.tif 000002
〔（Ｉ）中、Ａはアデニンモノリボヌクレオチド、Ｇはグアニンモノリボヌクレオチドは、Ｃはシトシンモノリボヌクレオチド、Ｕはウラシルモノリボヌクレオチドを示し、
Ｘは標的ＲＮＡの配列に相補的な配列から選ばれるモノヌクレオチドであって、アデニンモノリボヌクレオチド（Ａ）、グアニンモノリボヌクレオチド（Ｇ）、シトシンモノリボヌクレオチド（Ｃ）、ウラシルモノリボヌクレオチド（Ｕ）、アデニンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＡ）、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＧ）、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＣ）、又はチミンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＴ）を示し、
ｍは、２以上の整数を示し、
ｎは、３以上の整数を示し、
Ｙは、アデニンモノリボヌクレオチド（Ａ）、グアニンモノリボヌクレオチド（Ｇ）、シトシンモノリボヌクレオチド（Ｃ）、ウラシルモノリボヌクレオチド（Ｕ）のいずれか任意のモノリボヌクレオチドを示し、
塩基配列上段の数字は、リボザイム中のモノヌクレオチドの位置を示す番号である。〕
【０００９】
（２）第７番のＹがウラシルモノリボヌクレオチド（Ｕ）である上記（１）のミニリボザイム、すなわち、下記配列（II）のミニリボザイム。
【化３】
0003735695.tif 000003
〔（II）におけるＸ、ｍ及びｎは、（Ｉ）中における意味と同じである。〕
（３）第７番のＹがグアニンモノリボヌクレオチド（Ｇ）又はアデニンモノリボヌクレオチド（Ａ）である上記（１）のミニリボザイム、すなわち、下記配列（III）又は（III'）のミニリボザイム。
【化４】
0003735695.tif 000004
〔（III）及び（III'）におけるＸ、ｍ及びｎは、（Ｉ）中における意味と同じである。〕
【００１０】
（４）Ｘが、アデニンモノリボヌクレオチド（Ａ）、グアニンモノリボヌクレオチド（Ｇ）、シトシンモノリボヌクレオチド（Ｃ）又はウラシルモノリボヌクレオチド（Ｕ）である、上記(１)〜(３)のいずれかのミニリボザイム。
（５）Ｘが、アデニンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＡ）、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド(ｄＧ)、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＣ）、又はチミンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＴ）である、上記(１)〜(３)のいずれかミニリボザイム。
【００１１】
また本発明は、安定で、かつ活性を維持している下記（６）〜（８）の安定化ミニリボザイムである。
（６）上記（１）〜（５）のミニリボザイム中のモノヌクレオチドであって、その活性に影響を及ぼさないモノヌクレオチドのリン酸エステル基又はリボース部分の水酸基が他の安定な基で置き換わってなる、安定化ミニリボザイム。
【００１２】
（７）一つ又は複数のＸのリン酸エステル基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕が、チオリン酸エステル基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕で置き換わってなる、上記（６）の安定化ミニリボザイム。
【００１３】
（８）第３番のＣ、第４番のＵ、又は第７番のＹのモノリボヌクレオチドのうちの少なくとも一の３’側のリン酸エステル基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕が、チオリン酸エステル基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕で置き換わってなる、上記（６）の安定化ミニリボザイム。
【００１４】
更にまた、本発明は、
（９）標的ＲＮＡを上記(１)〜(５)のいずれかのミニリボザイム、又は上記（６）〜（８）のいずれかの安定化ミニリボザイムと反応させることを特徴とする標的ＲＮＡの切断又は不活化方法、である。
【００１６】
本発明の配列（Ｉ）のミニリボザイムが、標的ＲＮＡと塩基対を形成したときの２次構造を図２に示した。この図から分かるように、本発明のミニリボザイムは、ステムII及びループIIのいずれをも持たない特異な短鎖リボザイムである。また、このミニリボザイムは、その特定塩基配列を有する領域の大きさがわずか１２ヌクレオチド（但し、標的ＲＮＡ結合領域を含まない。）である。
【００１７】
本発明の配列（Ｉ）のミニリボザイムは、その３'−又は５'−末端の水酸基はリン酸化されたものであっても、遊離のものであってもいずれでもよい。
【００１８】
また、本発明の配列（Ｉ）のミニリボザイムにおけるｍは、２以上、好ましくは３〜１５、更に好ましくは４〜１０の整数である。ｎは、３以上、好ましくは４〜１５、更に好ましくは４〜１０の整数である。ｍが２未満、及びｎが３未満では、ミニリボザイムの標的ＲＮＡへの特異性が悪くなり、ｍ及びｎが２０を越えると、切断反応後の標的ＲＮＡとリボザイムの解離が悪くなったり、本発明の目的であるリボザイム短鎖化に逆行し、好ましくない。
また、本発明の配列（Ｉ）のミニリボザイムにおける結合領域のヌクレオチド、すなわち、Ｘ、Ｘm 又はＸn は、ＲＮＡであっても、あるいはＤＮＡであってもよい。
また、Ｘに代えて、下記（化５）
【化５】
0003735695.tif 000005
（化５中、Ｂは、アデニン、シトシン、グアニン又はチミンを示す。）のペプチド核酸（ＰＮＡ）とすることもできる。
【００１９】
また、本発明の配列（Ｉ）のミニリボザイムにおける第７番のＹは、ハセロフとジャーラックのリボザイムに一致したＵであるときに活性は最も高いが、血中に多量含まれるＲＮase Ａ型のリボヌクレアーゼの攻撃から保護するため、これをＧ又はＡとしてもよい。
【００２０】
本発明の配列（Ｉ）のミニリボザイムを安定化させる手段としては、上記のように配列の一部をＲＮＡからＤＮＡへ替える方法が有効な手段のひとつであるが、そのような方法のほかにモノヌクレオチドのリン酸エステル基又はリボース部分の水酸基を他の安定な基に置き換えることが有効である。
具体的には、モノヌクレオチドのリン酸エステル基をチオリン酸エステル基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕やメチルホスホネート基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＣＨ3）−Ｏ−〕等で置き換えたり、モノヌクレオチドのリボース部分の水酸基をメトキシやアリロキシ等のアルコキシ基、アミノ基、又はフッ素原子等で置き換える。
【００２１】
第３番のＣ、第４番のＵ、又は第７番のＣもしくはＵのモノリボヌクレオチドの３'側のリン酸エステル基はＲＮase Ａ型のリボヌクレアーゼにより分解を受けやすい部位なので、この部分のリン酸エステル基をチオリン酸エステル基やメチルホスホネート基等で置き換えることは、特に有効である。
【００２２】
本発明のミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムの製造は、基本的にはいわゆる固相化学合成法のうちの、ベータシアノエチルホスホアミダイト法に基礎を置く方法で合成できる。メチルホスホアミダイトを用いた場合もチオフェノールによる処理を追加するだけで、安定化ミニリボザイムの製造が可能である。
また、天然型ミニザイムは、ミニザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを化学合成し、これをベクターに挿入し、転写することによっても得ることができる。
【００２３】
核酸塩基の活性基としては例えばアミノ基があり、この保護基としては例えば、ベンゾイル基、アニソイル基、イソブチリル基等がある。
固相から５'−水酸基の保護基をはずすには、ジクロロ酢酸又はトリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液等を用いることができる。
２'−水酸基の保護基には例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル基等があり、また５'−水酸基の保護基には例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、トリチル基等がある。
【００２４】
未反応の５'−水酸基のアセチル化は１−メチルイミダゾールもしくはジメチルアミノピリジンを含む無水酢酸等によって、行うことができる。
固相の洗浄は、通常、アセトニトリルを用いて行う。
酸化剤としては、リン酸エステル結合を生成させるときは、ヨウ素、水、ピリジン及びテトラヒドロフラン含有液等を用い、チオリン酸エステル結合を生成させるときは、テトラエチルチウラムジサルファイド、３Ｈ，１，２−ベンゾジチオール−１，１−ジオキサイド等を用いる。
【００２５】
固相から目的のミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムを切り出すにはアルカリ溶液、例えば２８％アンモニア水とエタノールの３：１混合溶液が用いられる。
このようにして合成したミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムは、逆相、イオン交換等のカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等の核酸精製によく用いられる慣用の方法の一つ、又はそれらの組合せにより精製する。
【００２６】
また、本発明の安定化ミニリボザイムのチオリン酸エステル結合にはＲ型及びＳ型の立体異性体が存在するが、いずれでもよく、ＲＳ混合型であってもよい。
【００２７】
本発明のミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムは標的ＲＮＡを切断又は不活化するので、医療用、動物用もしくは農薬用薬剤等として有効に利用される。
標的ＲＮＡとしては、種々病原性のウィルス由来のＲＮＡ、ガン遺伝子由来のＲＮＡ、細胞の増殖・分化に関係する遺伝子由来のＲＮＡ等がある。
切断又は不活化の反応は、適宜好適な条件を選べばよいが、例えば、５〜５００ｍＭのマグネシウム又はマンガンイオンの存在下、ｐＨ８．０±３．０、温度２０〜７０℃で行うとよい。
【００２８】
医薬としては例えば、エイズ、白血病、各種悪性腫瘍、流行性結膜炎等の治療用医薬がある。
動物薬としては例えば、牛、豚、ニワトリ、イヌ、ネコ等の各種ウィルス病の治療用動物薬がある。
農薬としては例えば、タバコモザイク病、イネ萎縮病、キュウリモザイク病等の各種植物ウィルス病に対する農薬等がある。
【００２９】
【実施例】
以下実施例により、本発明を詳細に説明する。
実施例１  下記配列のミニリボザイム（配列番号：９）の合成
【化６】
0003735695.tif 000006
【００３０】
ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（アプライドバイオシステムズ社製、３８０Ｂ型）にＣ−ＣＰＧカラム（シトシン量:１μｍｏｌ）を装着した後、バージョン１．３４のプログラムを用いて、以下の（1）〜（5）の手順で、配列番号：９のミニリボザイム（塩基数が２２のミニザイム(Minizyme)で -Ｇ10−Ｃ11- であるところから、Ｍ２２-ＧＣとも略す。）を合成した。
【００３１】
（1）２％(ｗ／ｖ)トリクロル酢酸のジクロルメタン溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで５０秒間カラムに流して、５'−水酸基のジメトキシトリチル基を外す。
（2）アセトニトリルでカラムを洗浄した後、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−Ｎ2−イソブチリル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイトのアセトニトリル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）及び４％（ｗ／ｖ）テトラゾールのアセトニトリル溶液の１：１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液したのち、１０分間保持し、反応を起こさせてホスファイト結合を形成させる。
（3）アセトニトリルでカラムを洗浄後、１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸及び１０％（ｖ／ｖ）２，６−ルチジンを含むテトラヒドロフラン溶液と１６％（ｖ／ｖ）１−メチルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の１：１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで２０秒間流し、未反応の５'−水酸基をアセチル化する。
（4）アセトニトリルで洗浄後、３％（ｗ／ｖ）ヨウ素、２０％(ｖ／ｖ)ピリジン、及び２％（ｖ／ｖ）Ｈ2Ｏを含むテトラヒドロフラン溶液を１．６ml/minで２５秒間流し、２０秒間放置し、ホスファイト結合をホスフェート結合に酸化したのち、再びアセトニトリルで洗浄する。
（5）上記の（1）〜（4）の工程を、配列番号：９の３’側から数えて３番目以降の核酸塩基配列に従って繰り返す。
【００３２】
ここで、手順（2）のアミダイト試薬は、
Ａの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−Ｎ6−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
Ｇの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−Ｎ2−イソブチリル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
Ｃの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−Ｎ4−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
Ｕの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、を用いる。
【００３３】
すべてのアミダイト試薬の反応を終えた後、５'−水酸基の保護基を手順（1）と同様の方法で除去し、２８％アンモニアとエタノールの３：１（容量比）混合液を１８秒間流し、１５分間放置したのちカラムから合成物を切り出した。この切り出しの操作は更に３回繰り返した。次に合成物を、５５℃で８時間処理し、核酸塩基及びリン酸基の保護基を外した。アンモニアとエタノールを減圧して除去後、適量の水に溶解し、波長２６０ｎｍの吸光度を測定し、水を減圧除去した後、１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン溶液（以下、ＴＢＡＦと略す）に溶解し、室温で１２時間放置し、２'−水酸基の保護基を除去した。加えたＴＢＡＦと同容量の０．１Ｍのトリエチルアンモニウム−酢酸緩衝液（以下、ＴＥＡＡと略す）を加え、ペレット状になるまで凍結乾燥した。
【００３４】
次に、このペレットをＯＰＣカラム（アプライドバイオシステムズ社製）で精製した。すなわち、カラムを先ず、５ｍｌのアセトニトリル、次いで５ｍｌの２Ｍ ＴＥＡＡの順で洗浄し、これに予め０．１Ｍ ＴＥＡＡ１ｍｌで溶解したペレット溶解液を１〜２滴／秒の速さで流し、通過液を再び同様にカラムに流して目的物を吸着させた。５ｍｌの０．１Ｍ ＴＥＡＡ、続いて１０ｍｌの脱イオン水の順でカラムを洗浄後、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１．８ｍｌを１〜２滴／秒で流し、目的物を溶出した。
【００３５】
溶出液は更にＦＰＬＣ（ファルマシア社製）で精製した。すなわち、カラムはＰｅｐＲＰＣ  ＨＲ１０／１０、カラム温度は４０℃、流速は２ｍｌ／ｍｉｎとし、移動相は初期濃度が１０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルを含む０．１Ｍ ＴＥＡＡとして、カラムに溶出液を負荷後、移動相中のアセトニトリル濃度を１時間かけて１０％（ｖ／ｖ）から６０％（ｖ／ｖ）に直線的に増加させ、目的物を溶出した。なお、目的物の溶出位置は２５４ｎｍの吸光度を測定し、モニターした。
【００３６】
実施例２  配列（IＶ）の安定化ミニリボザイムの合成
【化７】
0003735695.tif 000007
【００３７】
ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置にｄＣ−ＣＰＧカラム（シトシン量:１μｍｏｌ）を装着した後、バージョン１．３４のプログラムを用いて、以下の（1）〜（5）の手順で、配列（IＶ）の安定化ミニリボザイムを合成した。
【００３８】
（1）２％(ｗ／ｖ)トリクロル酢酸のジクロルメタン溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで５０秒間カラムに流して、５'−水酸基のジメトキシトリチル基を外す。
（2）アセトニトリルでカラムを洗浄した後、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−Ｎ2−イソブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノエチルホスホアミダイトのアセトニトリル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）及び４％（ｗ／ｖ）テトラゾールのアセトニトリル溶液の１：１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液し、３０秒間保持し、縮合反応を起こさせてホスファイト結合を形成させる。
（3）アセトニトリルでカラムを洗浄後、１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸及び１０％（ｖ／ｖ）２，６−ルチジンを含むテトラヒドロフラン溶液と１６％（ｖ／ｖ）１−メチルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の１：１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで２０秒間流し、未反応の５'−水酸基をアセチル化する。
（4）アセトニトリルで洗浄後、３％（ｗ／ｖ）ヨウ素、２０％(ｖ／ｖ)ピリジン、及び２％（ｖ／ｖ）Ｈ2Ｏを含むテトラヒドロフラン溶液を１．６ml/minで２５秒間流し、２０秒間放置し、ホスファイト結合をホスフェート結合に酸化し、再びアセトニトリルで洗浄する。
（5）配列（IＶ）に示した３’側からの３番目以降の核酸塩基配列に従って、ＤＮＡの場合には上記の（1）〜（4）の工程を、ＲＮＡの場合には前記実施例１の(1)〜(4)の工程を繰り返す。
【００３９】
ここで、手順（2）のアミダイト試薬は、
Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵの場合、前記実施例１で述べたそれぞれのアミダイト試薬と同じであり、また、
ｄＡの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン−Ｎ6−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
ｄＧの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−Ｎ2−イソブチリル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
ｄＣの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−Ｎ4−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイトを、それぞれ用いた。アミダイト試薬の糖部分がデオキシリボースの場合は上記(2)に記載の方法で、リボースの場合はアミダイト試薬のアセトニトリル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）と４％（ｗ／ｖ）テトラゾールのアセトニトリル溶液の１：１（容量比）混合液を用いて１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液した後、１０分間保持し、縮合反応を起こさせホスファイト結合を形成させた。
【００４０】
すべてのアミダイト試薬の反応を終えた後、実施例１と同様な方法で、切り出し、脱保護基、凍結乾燥、ＯＰＣカラムによる精製及びＦＰＬＣによる精製を行なった。
【００４１】
実施例３  配列（Ｖ）の安定化ミニリボザイムの合成
【化８】
0003735695.tif 000008
〔（ＶI）中、┬はチオリン酸結合を示す。〕
【００４２】
ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置にｄＣ−ＣＰＧカラム（シトシン量:１μｍｏｌ）を装着した後、バージョン１．３４のプログラムを用いて、以下の（1）〜（5）の手順で、配列（Ｖ）の安定化ミニリボザイムを合成した。
【００４３】
（1）２％(ｗ／ｖ)トリクロル酢酸のジクロルメタン溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで５０秒間カラムに流して、５'−水酸基のジメトキシトリチル基を外す。
（2）アセトニトリルでカラムを洗浄した後、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−Ｎ2−イソブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノエチルホスホアミダイトのアセトニトリル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）及び４％（ｗ／ｖ）テトラゾールのアセトニトリル溶液の１：１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液し、３０秒間保持し、縮合反応を起こさせてホスファイト結合を形成させる。
（3）アセトニトリルでカラムを洗浄後、１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸及び１０％（ｖ／ｖ）２，６−ルチジンを含むテトラヒドロフラン溶液と１６％（ｖ／ｖ）１−メチルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の１：１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで２０秒間流し、未反応の５'−水酸基をアセチル化する。
（4）アセトニトリルで洗浄後、１５％テトラエチルチウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を１.６ ml／minで２３秒間流し、１５分間放置し、ホスファイト結合をチオリン酸結合に酸化し、再びアセトニトリルで洗浄する。
（5）配列（Ｖ）に示した３’側からの３番目以降の核酸塩基配列に従い、またその配列がＤＮＡであるかＲＮＡであるか、及びホスフェート結合であるかチオリン酸結合であるかに対応させて、上記（1）〜（4）の工程又は実施例１もしくは２の（1）〜（4）の工程を、繰り返す。
【００４４】
ここで、手順（2）のアミダイト試薬は、
Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵの場合、前記実施例１で述べたそれぞれのアミダイト試薬と同じであり、また、
ｄＡ、ｄＧ及びｄＣの場合、前記実施例2で述べたそれぞれのアミダイト試薬と同じである。アミダイト試薬の糖部分がデオキシリボースの場合は上記(2)に記載の方法で、リボースの場合はアミダイト試薬のアセトニトリル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）と４％（ｗ／ｖ）テトラゾールのアセトニトリル溶液の１：１（容量比）混合液を用いて１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液した後、１０分間保持し、縮合反応を起こさせホスファイト結合を形成させた。
【００４５】
また、チオリン酸結合ではなく、ホスフェート結合を形成させる場合は、手順（4）の「１５％テトラエチルチウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで２３秒間流し、１５分間放置」する代わりに、「３％（ｗ／ｖ）ヨウ素、２０％(ｖ／ｖ)ピリジン、及び２％（ｖ／ｖ）Ｈ2Ｏを含むテトラヒドロフラン溶液を１．６ml/minで２５秒間流し、２０秒間放置」し、ホスファイト結合をホスフェート結合に酸化した。
【００４６】
すべてのアミダイト試薬の反応を終えた後、実施例１と同様な方法で、切り出し、脱保護基、凍結乾燥、ＯＰＣカラムによる精製及びＦＰＬＣによる精製を行なった。
【００４７】
試験例１  ミニリボザイムによる標的ＲＮＡ切断活性
標的となるＲＮＡのＳ−１１（５’末端を32Ｐ標識した５’−ＧＣＣＧＵＣＣＣＣＣＧ−３’）１ｎＭの基質を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にリボザイム〔本発明のミニリボザイム（M22-GC、配列番号：９）、ハンマーヘッド型リボザイム（陽性対照、Ｒ３２−ＧＡＡＡ、配列番号：１）、又は他のミニリボザイム、配列番号：２〜８〕を５０μＭの濃度で加え、90℃で１分間、加熱し、徐冷した（コンプレックスの形成）。これを３７℃に保ったのち、ＭｇＣｌ2を２５ｍＭとなるように加えてリボザイムによる切断反応を開始させ、反応開始後、１、２、３、４、１０、２０、３０及び６０分後にサンプリングし、それぞれに反応停止液（９Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール、及び０．１％ブロモフェノールブルーを含む）を加えて、分析するまで−８０℃に保存した。分析時、これらのサンプルを室温で融解後、２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素の変性ゲル中で電気泳動を行ない、イメージアナライザを用いて分析した。
横軸に時間（ｍｉｎ）をとり、縦軸に基質分解物の量（％）をとってプロットし、グラフから分解速度係数ｋobs(min-1)を求めた。図３は、Ｍ２２−ＧＣによる基質Ｓ−１１の分解の時間的変化を示し、表１は種々のリボザイムの分解速度係数ｋobs及びこれらの相対比較値を示す。
表１から、本発明の配列番号：９のミニザイムはハンマーヘッド型リボザイム（R32-GAAA、配列番号：１）の６５％の切断活性があることが分かる。
【００４８】
【表１】
0003735695.tif 000009
【００４９】
【発明の効果】
本発明のミニリボザイムは、活性を保有する最小のリボザイムである。
本発明の安定化ミニリボザイムは、リボザイム活性を保持しながら種々のＲＮアーゼに対して安定性をもつ。
本発明のミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムにより、ＲＮＡが原因で起こる疾患の治療用医薬、動物薬あるいは農薬に利用できる。
【００５０】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＲＮＡ
配列
CGGGGCUGAU GAGGCCGAAA GGCCGAAACG GC                                   32
【００５１】
配列番号：２
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＲＮＡ
配列
CGGGGCUGAU GAUGACGAAA CGGC                                            24
【００５２】
配列番号：３
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＲＮＡ
配列
CGGGGCUGAU GAGTTCGAAA CGGC                                            24
【００５３】
配列番号：４
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＲＮＡ
配列
CGGGGCUGAU GAGUAAGAAA CGGC                                            24
【００５４】
配列番号：５
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＲＮＡ
配列
CGGGGCUGAU GAUGAGAAAC GGC                                            23
【００５５】
配列番号：６
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＲＮＡ
配列
CGGGGCUGAU GAGCCGAAAC GGC                                            23
【００５６】
配列番号：７
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＲＮＡ
配列
CGGGGCUGAU GACGGAAACG GC                                              22
【００５７】
配列番号：８
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＲＮＡ
配列
CGGGGCUGAU GAGAGAAACG GC                                              22
【００５８】
配列番号：９
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＲＮＡ
配列
CGGGGCUGAU GAGCGAAACG GC                                              22
【図面の簡単な説明】
【図１】番号付けシステムを含むリボザイムの２次構造を示す模式図である。
【図２】本発明のミニリボザイムの２次構造を示す模式図である。
【図３】基質（Ｓ−１１）にミニザイムＭ２２−ＧＣを反応させたときの、基質分解物（5'-P）の時間的変化を示すグラフである。
【図１】
0003735695.tif 000011
【図２】
0003735695.tif 000012
【図３】
0003735695.tif 000013