(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナライトの量を測定するための微粒子増強光分散凝集測定法であって、アナライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する強い光分散性の大きい粒子と、アナライトに対して低反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する弱い光分散性の小さい粒子の混合物を使用することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
微粒子の平均径は、３０〜６００ｎｍである、請求項１に記載の測定法。
【請求項３】
微粒子の平均径は、５０〜５００ｎｍである、請求項２に記載の測定法。
【請求項４】
小さい粒子の平均径に対する、大きい粒子の平均径の比率が、１．５〜４．０である、請求項１から３のいずれかに記載の測定法。
【請求項５】
小さい粒子の平均径に対する、大きい粒子の平均径の比率が、１．７〜３．２である、請求項４に記載の測定法。
【請求項６】
混合物中における、小さい粒子の濃度に対する、大きい粒子の濃度の比率が、０．０１〜５である、請求項１から５のいずれかに記載の測定法。
【請求項７】
混合物中における、小さい粒子の濃度に対する、大きい粒子の濃度の比率が、０．０５〜２である、請求項６に記載の測定法。
【請求項８】
高反応性の結合パートナーと低反応性の結合パートナーで独立にコーティングした、同じサイズかつ同じ材料の微粒子を用いて行った測定法の検出限界の、低反応性の結合パートナーの場合に対する高反応性の結合パートナーの場合の比率は、０．０１〜０．５である、請求項１から７のいずれかに記載の測定法。
【請求項９】
高反応性の結合パートナーと低反応性の結合パートナーで独立にコーティグした、同じサイズかつ同じ材料の微粒子を用いて行った測定法の検出限界の、低反応性の結合パートナーの場合に対する高反応性の結合パートナーの場合の比率は、０．０３〜０．４である、請求項８に記載の測定法。
【請求項１０】
アナライトは核酸であり、結合パートナーはオリゴヌクレオチド捕捉プローブである、請求項１から９のいずれかに記載の測定法。
【請求項１１】
アナライトは抗原性であり、結合パートナーは免疫学的結合パートナーである、請求項１から９のいずれかに記載の測定法。
【請求項１２】
低反応性の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数に対する、高反応性の免疫学的結合パートナーに対する見かけの解離定数の比率は０．０１〜０．５である、請求項１１に記載の測定法。
【請求項１３】
低反応性の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数に対する、高反応性の免疫学的結合パートナーに対する見かけの解離定数の比率は０．０５〜０．２である、請求項１２に記載の測定法。
【請求項１４】
結合パートナーはモノクローナル抗体またはその断片である、請求項１１から１３のいずれかに記載の測定法。
【請求項１５】
抗原性アナライトは繰り返し性エピトープを持たず、高反応性の少なくとも２つの結合パートナーと低反応性の少なくとも２つの結合パートナーを使用する、請求項１４の測定法であって、強い光分散性の大きい粒子は、それぞれの粒子が２つの高反応性の結合パートナーで同時にコーティングされているか、または、強い光分散性の大きい粒子の一部が、２つの高反応性の結合パートナーのうちの１つでコーティングされ、他の残りの強い光分散性の大きい粒子は、他の１つの高反応性の結合パートナーでコーティングされており、弱い光分散性の小さい粒子は、それぞれの粒子が２つの低反応性の結合パートナーで同時にコーティングされているか、または、弱い光分散性の小さい粒子の一部が、２つの低反応性の結合パートナーのうちの１つでコーティングされ、他の残りの弱い光分散性の小さい粒子は、他の１つの低反応性の結合パートナーでコーティングされており、２つの高反応性の結合パートナーは、互いに異なるエピトープに向かっており、２つの低反応性の結合パートナーは、互いに異なるエピトープに向かっている、ことを特徴とする、上記方法。
【請求項１６】
測定法は、濁度法またはネフェロメトリー法である、請求項１から１５のいずれかに記載の測定法。
【請求項１７】
アナライトの量を測定するための微粒子増強光分散凝集測定法のための微粒子試薬であって、アナライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する強い光分散性の大きい粒子と、アナライトに対して低反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する弱い光分散性の小さい粒子を含む、直径３０〜６００ｎｍの微粒子の混合物を含んでなる、上記試薬。
【請求項１８】
小さい粒子の平均径に対する、大きい粒子の平均径の比率が、１．５〜４．０である、請求項１７に記載の試薬。
【請求項１９】
小さい粒子の平均径に対する、大きい粒子の平均径の比率が、１．７〜３．２である、請求項１８に記載の試薬。
【請求項２０】
混合物中における、小さい粒子の濃度に対する、大きい粒子の濃度の比率が、０．０１〜５である、請求項１７から１９のいずれかに記載の試薬。
【請求項２１】
混合物中における、小さい粒子の濃度に対する、大きい粒子の濃度の比率が、０．０５〜２である、請求項２０に記載の試薬。
【請求項２２】
高反応性の結合パートナーと低反応性の結合パートナーで独立にコーティングした、同じサイズかつ同じ材料の微粒子を用いて行った測定法の検出限界の、低反応性の結合パートナーの場合に対する高反応性の結合パートナーの場合の比率は、０．０１〜０．５である、請求項１７から２１のいずれかに記載の試薬。
【請求項２３】
高反応性の結合パートナーと低反応性の結合パートナーで独立にコーティグした、同じサイズかつ同じ材料の微粒子を用いて行った測定法の検出限界の、低反応性の結合パートナーの場合に対する高反応性の結合パートナーの場合の比率は、０．０３〜０．４である、請求項２２に記載の試薬。
【請求項２４】
結合パートナーはオリゴヌクレオチド捕捉プローブである、請求項１７から２３のいずれかに記載の試薬。
【請求項２５】
結合パートナーは免疫学的結合パートナーである、請求項１７から２３のいずれかに記載の試薬。
【請求項２６】
低反応性の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数に対する、高反応性の免疫学的結合パートナーに対する見かけの解離定数の比率は０．０１〜０．５である、請求項２５に記載の試薬。
【請求項２７】
低反応性の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数に対する、高反応性の免疫学的結合パートナーに対する見かけの解離定数の比率は０．０５〜０．２である、請求項２６に記載の試薬。
【請求項２８】
結合パートナーはモノクローナル抗体またはその断片である、請求項２５から２７のいずれかに記載の試薬。
【請求項２９】
少なくとも２つの高反応性の結合パートナーと少なくとも２つの低反応性の結合パートナーを含む、請求項１７の試薬であって、強い光分散性の大きい粒子は、それぞれの粒子が２つの高反応性の結合パートナーで同時にコーティングされているか、または、強い光分散性の大きい粒子の一部が、２つの高反応性の結合パートナーのうちの１つでコーティングされ、他の残りの強い光分散性の大きい粒子は、他の１つの高反応性の結合パートナーでコーティングされており、弱い光分散性の小さい粒子は、それぞれの粒子が２つの低反応性の結合パートナーで同時にコーティングされているか、または、弱い光分散性の小さい粒子の一部が、２つの低反応性の結合パートナーのうちの１つでコーティングされ、他の残りの弱い光分散性の小さい粒子は、他の１つの低反応性の結合パートナーでコーティングされており、２つの高反応性の結合パートナーは、互いに異なるエピトープに向かっており、２つの低反応性の結合パートナーは、互いに異なるエピトープに向かっている、ことを特徴とする、上記試薬。
【請求項３０】
濁度法またはネフェロメトリー法における、請求項１７から２９のいずれかに記載の試薬の使用。
【請求項３１】
請求項１７から２９のいずれかに記載の試薬の調製法であって、強い光分散性を有しかつアナライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する、直径３０〜６００ｎｍの大きい粒子と、弱い光分散性を有しかつアナライトに対して低反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する、直径３０〜６００ｎｍの小さい微粒子とを、混合することを特徴とする、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アナライトの量を測定するための新しい微粒子増強光分散凝集測定法(microparticle enhanced light scattering agglutination assay）、およびその測定法を実施するための微粒子試薬に関する。
【０００２】
微粒子凝集試験は、広範囲のサイズを有する均一なラテックス粒子を生産するための信頼できる生産法が出現してから、ジェイ・シンガーとシー・プロッツ（Singer J. and Plotz C.）、１９５６、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．２１、８８８−８９２により、リウマチ因子の検出のために、最初に記載された。次に濁度法とネフェロメトリー法による凝集反応の検出により、ジー・デゼリック（Dezelic G.）ら、１９７１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０、５５３−５６０とジェイ・グランゲ(Grange J.）ら、１９７７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８、３６５−７５により記載されたような、真に定量的な微粒子増強光分散凝集試験の開発が可能になった。
【０００３】
微粒子増強光分散凝集測定試験は、準均一的であり、分離および洗浄工程を全く必要としない。すなわちこれは、通常使用される臨床化学分析機または専用のネフェロメトリー装置を用いる自動化のための要件を満たしている。このような試験法は、微粒子を使用しない直接凝集試験と比較して、２〜３オーダーの高感度（１０-11mol/lのアナライトまで）を有し、さらにマトリックスの妨害が少なく、柔軟性が高い。
【０００４】
前記のような好ましい特徴のために、微粒子増強光分散凝集測定試験は、現在腫瘍マーカーのようなタンパク質（例えば、エス・エダ（Eda S.）ら、１９９３、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２、９９−１０３、または１９９２、「臨床生化学の進歩(Progress in Clinical Biochemistry）」、ケー・ミヤイ（K. Miyai）ら、２６５−２６７頁、エルセビア・パブリッシャーズ(Elsevier Publishers）、アムステルダム、オランダ、を参照）、特異的タンパク質（例えば、ジェイ・ダブリュー・ウィンケス(Winkes J.W.）ら、１９８９、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５／２、３０３−３０７、またはエル・チロ(Chirot L.）ら、１９９２、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｉｍ．５０、１４３−１４７を参照）、乱用薬物（drugs of abuse）（例えば、ディー・アムブルスター（Ambruster D.）ら、１９９２、Ｊ．Ａｎａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１６、１７２−１７５を参照）および治療用薬剤（例えば、「ＲＤＳ法マニュアルコバス（登録商標）インテグラ（登録商標）１９９６；ジゴキシン」、エフ・ホフマン−ラ・ロッシュ・エー・ジー(F. Hoffmann-La Roche A.G.）、バーゼル、スイス、を参照）の定量に日常的に使用されている。
【０００５】
しかし、微粒子増強光分散凝集測定法の欠点は、そのダイナミックレンジが狭いことである。検出限界に対する上の測定上限の比として定義されるダイナミックレンジは、これらの測定法については通常わずかに２オーダーの大きさである。このダイナミックレンジが狭いことのため、最初の試験は失敗になることがしばしばあり、試料の希釈の程度を変更して再検査することになる。従ってこのダイナミックレンジの狭さは、余分な費用と時間を必要とし、いずれもこれらの測定を実施している検査室にとっては決定的に重要である。
【０００６】
従って本発明が取り組むべき問題は、微粒子増強光分散凝集測定法を提供し、これまで知られている微粒子増強光分散凝集試験より広いダイナミックレンジを提供するこの測定法を実施するための微粒子試薬を提供することである。
【０００７】
米国特許第４，５９５，６６１号は、不均一サンドイッチ免疫測定法について記載し、その中で、フック作用（すなわち、高い抗原濃度でシグナルが低下することとして定義される）は、不溶性の捕捉抗体以外に、抗原に対して異なる親和性と異なる特異性を有する２つの可溶性トレーサー抗体を使用することにより、避けられることを記載している（親和性の弱い抗体は、抗原濃度の高いところでのみ大きく寄与し、従ってフック作用が避けられる）。この特許は、その発明の例示された２つの測定法は、先行技術の測定法と同じダイナミックレンジを有すると述べている（カラム６の４２〜４３行、およびカラム８の１４〜１５行を参照）。
【０００８】
ＰＣＴ特許公報８９／１１１０１号は、フローサイトメトリーによる測定法に関し、これは、同じアナライトに対して特異性は同じであるが親和性が異なる免疫学的結合パートナーの固相担体として、２つの区別可能な粒子（例えば、異なるサイズの粒子）を使用している。異なるサイズの担体粒子は、光分散性が異なるため、２つの標準曲線を作成することが可能であり、フローサイトメトリーアナライザーのキャピラリー中で、分離後区別される。この公報およびその発明者の以後の文献、ティー・リンドモ(T. Lindmo）、１９９０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２６、１８３−１８９は、同じエピトープに対してそれぞれ高親和性抗体かまたは低親和性抗体、および別のエピトープに対する結合体として可溶性の標識された第３の抗体でコーティングされた、直径７μｍまたは１０μｍの粒子を使用する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定法を具体的に記載している。フローサイトメーターは、両方の型の粒子に結合した結合体の蛍光強度を記録し、２つの別々の標準曲線をプロットする。この系は、２つの免疫測定法（１つは、高親和性抗体でコーティングされた直径７μｍの粒子を用いて、好ましくは最初に抗原に結合し、その標準曲線は低濃度のアナライトで作用するもの、他の１つは、低親和性抗体でコーティングされた直径１０μｍの粒子を用いて、その標準曲線は、最初の標準曲線が平坦になってから作用するもの）が平行して独立に実施されたように、データを解析することを可能にする、高性能の装置および注意深く設計された強力な分析ソフトウェアを使用して、広いダイナミックレンジを達成する。
【０００９】
フローサイトメトリーと微粒子増強光分散凝集測定法による測定法は、全く異なる原理に依存する。フローサイトメトリーによる測定法では、微粒子の凝集はなく、可溶性標識抗体の量は、粒子が分離されるため各粒子について個々に測定され、例えば異なるサイズのために区別できるような特徴があるなら、フローサイトメーターにより区別される。区別できる特徴があるため、多くの較正曲線が作成される。微粒子増強光分散凝集測定法では、濁度法又はネフェロメトリー法のように、各粒子の個々の寄与を測定することなく、または区別できる特徴を有する粒子の間を区別することなく、微粒子およびアナライトに結合した結合パートナーの凝集が全体として測定され、その結果１つの較正曲線のみが作成される。
【００１０】
上記問題は、添付の特許請求の範囲のセットで定義される本発明により解決される。
【００１１】
本発明は、アナライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する強い光分散性の粒子と、アナライトに対して低反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する弱い光分散性の粒子の混合物を使用することからなる、アナライトの量を測定するための微粒子増強光分散凝集測定法を提供する。本発明の測定法は、予想外に広いダイナミックレンジ（ＤＲ）を示す。
【００１２】
「強い光分散性の粒子」および「弱い光分散性の粒子」という表現は、任意のサイズおよび任意の材料の微粒子を意味し、粒子あたりの光の分散は、後者の粒子より前者の粒子にとって実質的により重要である。微粒子は通常、狭いサイズの分布を有してほぼ球形であり、そのサイズを代表するものはその平均直径である。光分散の法則（ディー・ジェイ・ニューマン（D.J.Newman）ら、１９９２，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９，２２−４２）に従うと、強い光分散性は、大きい粒子サイズおよび／または粒子と媒体との屈折率の高い比率に由来し、弱い光分散性は、小さい粒子サイズおよび／または粒子と媒体との屈折率の低い比率に由来する。例えばレイリー（Rayleigh）の光分散の法則（ディー・ジェイ・ニューマン（D.J.Newman）ら、上記引用文献）は、確かに以下の式で表される：
【００１３】
【数１】
Ｉ＝Ｉ0 １６π4 Ｒ4 （（ｎ2 −１）／（ｎ2 ＋２））2 ／ｒ2 λ4 、
【００１４】
式中、
Ｉは、検出器で測定した光強度であり、
Ｉ0 は、媒体中の光強度であり、
λは、媒体中の波長であり、
Ｒは、微粒子の半径であり、
ｒは、検出器と分散機の間の距離であり、
ｎは、ｎ1 ／ｎ0 であり、
ｎ1 は、粒子の屈折率であり、ｎ0 は、媒体の屈折率である。
【００１５】
微粒子のサイズおよび／または屈折率比は、これらは凝集した微粒子の検出に使用される波長で光の分散を引き起こすようなものである。このサイズは、一般に波長より実質的に小さいかまたはわずかに小さくなるように選択される。検出波長は、通常３００nm〜１２００nmである。微粒子の平均経は、３０〜６００nmが適切であり、好ましくは５０〜５００nmである。
【００１６】
強い光分散性の粒子は、弱い光分散性の粒子より好ましくは大きいサイズおよび／または大きい屈折率を有する。
【００１７】
本発明の１つの好適な実施態様によれば、「強い光分散性の粒子」と「弱い光分散性の粒子」は、同じサイズの粒子であるが異なる材料でできており、前者の粒子の材料は、後者の粒子の材料より実質的に大きな屈折率を有する。強い光分散性の粒子の屈折率と弱い光分散性の粒子の屈折率の比率は、適切には少なくとも１．２であり、好ましくは少なくとも１．５である。
【００１８】
本発明の好適な実施態様によれば、「強い光分散性の粒子」と「弱い光分散性の粒子」は、同じ材料の粒子であるが異なるサイズの微粒子であり、前者の粒子（以後、「大きい粒子」と呼ぶ）のサイズは、後者の粒子（以後、「小さい粒子」と呼ぶ）のサイズより実質的に大きい。
【００１９】
大きい粒子の平均経は、適切には１６０〜６００nmであり、好ましくは１９０〜５００nmである。大きい粒子の平均経と小さい粒子の平均経の比率は、適切には１．５〜４．０であり、好ましくは１．７〜３．２である。
【００２０】
混合物中の微粒子の総濃度は、微粒子由来の吸光度値が正確な測定に影響を与えないが、微粒子の濃度がシグナルの発生を得るのに充分に高くなるように、微粒子増強光分散免疫測定法の分野で公知の方法に従って、選択されるであろう。大きい粒子の濃度と小さい粒子の濃度の比率(w/w）は、適切には０．０１〜５であり、好ましくは０．０５〜２である。
【００２１】
微粒子の材料は、微粒子増強光分散測定法に適した任意の無機、有機、またはポリマー材料である。そのような材料は、例えばセレン、炭素、金；炭素、珪素、またはゲルマニウムの窒化物、例えばＳｉ3 Ｎ4 ；鉄、チタンまたは珪素の酸化物、例えばＴｉＯ2 またはＳｉＯ2 ；およびポリマー材料、例えばポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、エポキシ樹脂、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（アルファナフチルメタクリレート）、ポリ（ビニルナフタレン）、またはこれらの共重合体、特にスチレンの共重合体、および共重合可能なエチレン性不飽和化合物、例えばスチレン−（メタ）アクリレート共重合体がある。ポリマー性材料、ならびにスチレンから重合された内部のコアとスチレンと共重合可能な不飽和化合物との共重合により形成された外部のシェルからなるコアーシェル粒子から作成された微粒子（米国特許第４，２１０，７２３号）が特に適している。
【００２２】
本発明の測定法は、任意のタイプの微粒子増強光分散凝集試験、特に濁度試験またはネフェロメトリー試験である。
【００２３】
本発明の測定法は、微粒子増強光分散測定法により測定可能な任意のアナライト、すなわち、アナライトを特異的に認識する微粒子に結合可能な結合パートナーが存在する任意のアナライトの量の測定に使用できる。本発明の測定法により測定できるアナライトは、抗原性アナライト、従って結合パートナーは適切には免疫学的結合パートナー、および核酸、従って結合パートナーは適切にはハイブリダイゼーションが起きるのに充分な配列相補性を示すオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、を含む。
【００２４】
抗原性アナライトは、モノマーでもポリマーでもよく、繰り返しエピトープがあってもなくてもよい。適切な抗原性アナライトには、以下のものがある。
【００２５】
（ａ）特異的タンパク質、例えば、アルファ−１−酸性糖タンパク質（ＡＡＧＰ）、アルファ−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、血清中アルブミン（ＡＬＢＳ）、ミクロアルブミン（ＡＬＢＵ）、アポリポプロテインＡ−１（ＡＰＯＡ）、アポリポプロテインＢ（ＡＰＯＢ）、アンチストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、アンチトロンビンIII （ＡＴIII ）、補体Ｃ３ｃ（Ｃ３Ｃ）、補体Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン（ＦＩＢＧ）、フィブロネクチン（ＦＩＢＲ）、ハプトグロブリン（ＨＡＰＴ）、免疫グロブリンＡ、Ｇ、Ｍ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、リポプロテインａ（ＬＰＡ），リウマチ因子（ＲＦ）、トランスフェリン（ＴＲＳＦ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）；
【００２６】
（ｂ）腫瘍マーカー、例えば、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、絨毛性性腺刺激ホルモンベータサブユニット（β−サブユニット）、ベータ−２−ミクログロブリン、炭水化物抗原（例えば、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、ムチン様癌関連抗原（ＭＣＡ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；
【００２７】
−（ｃ）心血管または血栓溶解マーカー、例えば脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）、フィブリンおよびフィブリノゲン分解生成物（ＦＤＰ）、ＦＤＰ  Ｄ−ダイマー、トロポニン、ミオグロビン、グリコヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）；
【００２８】
（ｄ）ウイルスマーカー、例えばインフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）；
【００２９】
（ｅ）免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、インスリン、シスタチンＣ。
【００３０】
適切な核酸アナライトには、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらの誘導体があり、その量の測定は診断分野または薬学分野において重要である。本発明の測定法を使用して測定されるそのような核酸の例には、ＨＩＶ１−ＲＮＡ、ＨＩＶ２−ＲＮＡ、ＨＣＶ−ＲＮＡ、エンテロウイルスＲＮＡ、ＨＴＬＶ−ＤＮＡ、ＣＭＶ−ＤＮＡ、およびマイコバクテリウム・ツベルキュローシス（Mycobacterium tuberculosis）ＤＮＡがある。
【００３１】
核酸アナライトは、多くの場合に体液中に微量に存在する。従って、核酸増幅反応、例えばポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、リガーゼチェイン反応（ＬＣＲ）、転写増幅または自立性配列複製は、一般に本発明の測定法によりアナライトの量を測定する前に行われる。好ましくはこの増幅は、以下の工程を含むＰＣＲ（「ＰＣＲプロトコール：方法と応用へのガイド（PCR Protocols: A Guide to Medhods and Applications）」、エム・エー・イニス（M.A. Innis）ら、１９９０、アカデミックプレス(Academic  Press）、ニューヨーク、アメリカ合衆国）により行われる：（１）増幅される配列の末端を決定するオリゴヌクレオチドプライマーを、試料中の１本鎖核酸にアニーリングさせ、（２）核酸ポリメラーゼはアニーリングしたプライマーの３’末端を伸長して、プライマーがアニーリングされる核酸に配列が相補的な核酸鎖を作成する、（３）得られる２本鎖核酸を変性させて、２つの２本鎖核酸を作成し、そして（４）プライマーアニーリング、プライマー伸長および生成物変性を充分な回数だけ繰り返して、プライマーにより規定される容易に同定され測定される量の配列を作成する。
【００３２】
変性後の２本鎖の増幅された核酸は、本発明の測定法により定量される。
【００３３】
「アナライトに対して高反応性の結合パートナー」および「アナライトに対して低反応性の結合パートナー」という表現は、結合複合体を形成するようにアナライトと反応することができる結合パートナーを意味し、測定法の条件下での反応性は、後者の結合パートナーより前者の結合パートナーについて高い。
【００３４】
微粒子増強光分散測定法の条件下での結合パートナーの反応性を反映する便利なパラメータは、その結合パートナーでコーティングされる粒子を用いる測定法の検出限界（ＤＬ）である。ＤＬとは、一定の確率で標準物質０または陰性対照から区別可能なアナライトの最小濃度と定義される。このパラメータは、多くの用量応答曲線の繰り返しに基づき、例えばディー・エー・アームスブルスター（D.A. Armsbruster）ら、１９９４、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０、１２３３−１２３８が記載した２ＳＤまたは３ＳＤ法を使用して、統計的に計算される。
【００３５】
高反応性の結合パートナーと低反応性の結合パートナーで独立にコーティングされた、同じサイズかつ同じ材料の微粒子を用いて行われる測定法の検出限界の比率は、適切には０．０１〜０．５であり、好ましくは０．０３〜０．４である。
【００３６】
結合パートナーの反応性を決定する他の方法はまた、アナライトと結合パートナーの性質に依存して使用される。
【００３７】
核酸アナライトと結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチド捕捉プローブについて、後者の反応性は、一般にプローブの長さおよび標的核酸との相補性の程度の選択により、これらの公知の可能な変種を考慮して、確実に調節される。高反応性のオリゴヌクレオチド捕捉プローブおよび低反応性のオリゴヌクレオチド捕捉プローブは、それぞれ強い光分散性の粒子と弱い光分散性の粒子に、直接にまたはスペーサーを介して共有結合する。
【００３８】
抗原性アナライトおよび免疫学的結合パートナーについて、後者の機能的親和性はまた、一般に微粒子増強光分散測定法の条件下でその反応性の良好な近似値を与える便利なパラメータでもある。抗原性アナライトに対する結合パートナーの機能的親和性は、当該分野で公知の通常使用される方法、特にアイ・エム・ロイトとエム・イー・デベイ（I.M. Roit and M.E. Devey）、「エンサイクロペジア・オブ・イムノロジー（Encyclopedia of Immunology）」、１９９２、３３−３５、アイ・エム・ロイトとピー・ジェイ・デルベス(I.M. Roit and P.J. Delves）編、アカデミックプレス（Academic Press）、ロンドン、英国、またはエム・ダブリュー・スチュワード（M.W. Steward）ら、１９８６、「ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロジー(Handbook of Experimental Immunology）、第１巻、２５章、１−３０頁、ディー・エム・ウェイア(D.M. Weir）編、オックスフォード：ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ(Blackwell Scientific Publications）、オックスフォード、英国、に記載のような、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商標）装置（ファルマシア(Pharmacia）、スエーデン）、平衡透析、ＥＬＩＳＡ系における相対的親和性力価測定により、その見かけの解離定数を決定することにより測定できる。「見かけの」という用語は、アナライトの可能な繰り返しエピトープを考慮することなく、単純化されたＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデルを意味する（エル・ジー・フェーゲルスタム(L.G. Faegerstam）ら、１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５９７、３９７−４１０）。
【００３９】
高反応性の免疫学的結合パートナーと低反応性の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数の比率は、適切には０．０１〜０．５であり、好ましくは０．０５〜０．２である。
【００４０】
本発明の測定法で使用できる免疫学的結合パートナーは、任意の種のポリクローナル抗体、任意の種のモノクローナル抗体（キメラ抗体、および／または組換え抗体を含む）またはこれらの断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 断片を含む。無制限な量で同一のものが産生できるため、モノクローナル抗体またはその断片が一般に好適である。
【００４１】
繰り返しエピトープを持たない抗原性アナライトについて、免疫学的結合パートナーとしてモノクローナル抗体またはその断片を使用する時、少なくとも２つの高反応性の結合パートナーおよび２つの低反応性の結合パートナーを使用することが必要であり、ここで、２つの高反応性の結合パートナーは、互いに異なるエピトープに向かっており、かつ２つの低反応性の結合パートナーは、互いに異なるエピトープに向かっており、そのため、両方の高反応性の結合パートナー間、および両方の低反応性の結合パートナー間で、サンドイッチ複合体免疫凝集物が形成される。強い光分散性の粒子は、２つの高反応性の結合パートナーで同時コーティングされるか、または粒子の一部がこれらの結合パートナーのうちの１つでコーティングされ、粒子の残りの部分は他の１つで別々にコーティングされる。弱い光分散性の粒子は、２つの低反応性の結合パートナーで同時コーティングされるか、または粒子の一部がこれらの結合パートナーのうちの１つでコーティングされ、粒子の残りの部分は他の１つで別々にコーティングされる。
【００４２】
繰り返しエピトープを有する抗原性アナライトについて、免疫学的結合パートナーとしてモノクローナル抗体またはその断片を使用する時、強い分散性を有する粒子上にコーティングされた１つの高反応性の結合パートナー、および弱い分散性を有する粒子上にコーティングされた低反応性の結合パートナーを使用することが一般に充分である。いずれの場合もアナライトの繰り返しエピトープのためにサンドイッチ複合体免疫凝集物が形成され易いため、高反応性の結合パートナーと低反応性の結合パートナーは、同じかまたは異なるエピトープに向かうことができる。
【００４３】
免疫学的結合パートナーの調製
ポリクローナル抗体は、当該分野で公知の方法、例えば、エム・ダブリュー・チェース(Chase, M.W.）、１９６７、「免疫学および免疫化学の方法(Methods of Immunology and Immunochemistry）」中、エー・ウィリアムズ（Williams, A.）編、１９７−２０９頁、アカデミックプレス（Academic Press）、ニューヨーク、に記載のような方法により調製できる。簡単に説明すると、ある腫の動物（ウサギ、ヤギまたはヒツジ）を、適切アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント）中の精製抗原で繰り返し免疫する。免疫後、動物を出血させ、ポリクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、および／または親和性クロマトグラフィーのような方法により精製する。
【００４４】
モノクローナル抗体は、当該分野で公知の方法、特にジー・ケーラー（G. Koehler）ら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５、ジー・ガルフレ(G. Galfre）ら、１９８１、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３、３−４６、またはアール・ケネット(R. Kennet）、１９８０、「ハイビリドーマ：生物学的分析における新次元(Hybridomas:a new dimension in biological analysis）」中、アール・ケネット(R. Kennet）ら、プレヌム・プレス（Plenum press）、ニューヨーク・アンド・ロンドン、に記載したような方法により調製することができる。簡単に説明すると、例えば、ポリエチレン融合法を使用して、免疫マウスまたはラットからの脾臓細胞または末梢血細胞を、ミエローマ細胞株と融合する。融合後、細胞を培養プレートで増殖させ、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）選択を使用して、正しく融合した細胞を選択する。抗体産生細胞株は、ＥＩＡ、ＲＩＡ、または凝集測定法のような方法により同定される。抗体産生細胞株の同定後、細胞を限界希釈法により繰り返し継代して、１つの細胞から新しい増殖する細胞株が得られることを確保する。
【００４５】
キメラ抗体は、当該分野で公知の方法、例えばジー・エル・ブリアン（G.L. Boulianne）ら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、６４３−６４５に記載の方法により得られる。この方法は簡単に説明すると以下の通りである。１つの種のモノクローナル抗体からの抗原結合部位のＤＮＡまたはその一部を、異なる種の別の抗体の抗体フレームワークのＤＮＡにトランスフェクションする。この新しい作製体を発現ベクターにクローン化し、これを対応する発現系に移して、抗体を産生する。
【００４６】
組換え抗体は、動物ビヒクルを使用せずに、当該分野で公知の方法、例えばジー・ウィンター(G. Winter）ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９、２９３、またはジェイ・エスハストン(J.S. Huston）ら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５８７９に記載の方法により得ることができる。これらの方法は、以下の工程を含む：抗体またはその断片をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）を宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli）、真菌、酵母、植物または真核生物細胞に導入、所望の特異性と親和性を有する抗体の選択、および対応する発現系での抗体またはその断片の発現。
【００４７】
任意の種のポリクローナル抗体のＦａｂ−、Ｆａｂ’−、およびＦ（ａｂ’）2 −断片、任意の種のモノクローナル抗体（キメラ抗体および／または組換え抗体を含む）は、当該分野で公知の方法、例えばエー・ニッソノフ（A. Nissonoff）ら、１９６０、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ、８９、２３０、またはアール・ピー・ポーター（R. P. Porter）ら、１９５９、ＢｉｏｃｈｅｍＪ、７３、１１９、またはイー・ハーロー（E.Harlow）ら、１９８８、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies−A Laboratory  Manual）」、６２６−６３１、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク、アメリカ合衆国、に記載のような方法により調製することができる。
【００４８】
アナライトに対して異なる反応性の免疫学的結合パートナーの選択
結合パートナーとしてモノクローナル抗体またはその断片を使用する時、高反応性および低反応性の免疫学的結合パートナーの選択は、各免疫学的結合パートナーを同じ材料およびサイズの微粒子上に別々にコーティングし、次に、凝集を引き起こすのに２つの高反応性の免疫学的結合パートナーと２つの低反応性の免疫学的結合パートナーが必要になるかも知れないため、交互にある一定の比率、例えば１／１ v/vで微粒子試薬を混合することにより行われる。同じ条件下で微粒子試薬の較正曲線を作成した後、低濃度のアナライトについて得られる較正曲線の勾配が、免疫学的結合パートナーの反応性の最初の指標を与える。
【００４９】
結合パートナーとしてポリクローナル抗体を使用する時、高反応性および低反応性ポリクローナル抗体の調製は、当該分野で公知の方法により、ゲルマトリックスに共有結合した抗原性アナライトを有する、親和性クロマトグラフィーカラムにポリクローナル抗体を導入することにより行われる。溶出緩衝液の濃度勾配を用いると、低反応性のポリクローナル抗体画分は最初にカラムから溶出し、次に徐々に高反応性の画分が続く（エス・ヤマモト(S. Yamamoto）ら、１９９３、「獣医免疫学および免疫病理学(Veterinary Immunology and Immunopathology）」、３６、２５７−２６４、エルセビア・サイエンス・パブリッシャーズ・ビー・ブイ（Elsevier Science Publishers B.V.）、アムステルダム、を参照）。次に画分の反応性を、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商標）装置によるか、またはこれらを同じサイズかつ同じ材料の微粒子の上に独立にコーティングし、対応する較正曲線を作成することにより、チェックすることができる。
【００５０】
抗体の選択は、上記方法によりこれらを微粒子にコーティングし、次に上記の検出限界解析または上記の機能的親和性の測定により、行われる。高反応性の結合パートナーと低反応性の結合パートナーで独立にコーティングされた、同じサイズかつ同じ材料の微粒子を用いて行なった測定法の検出限界の比率は、適切には０．０１〜０．５であり、好ましくは０．０３〜０．４である。高反応性の免疫学的結合パートナーと低反応性の免疫学的結合パートナーの見かけの解離定数の比率は、適切には０．０１〜０．５であり、好ましくは０．０５〜０．２である。
【００５１】
免疫学的結合パートナーによる微粒子のコーティング
微粒子への免疫学的結合パートナーのコーティングは、使用される材料の性質を満足する当該分野で公知の方法に従って、吸着または共有結合により行われる。
【００５２】
本発明は、また上記で定義した測定法を行うのに適した微粒子試薬に関する。この試薬は、アナライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する強い光分散性の粒子と、アナライトに対して低反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する弱い光分散性の粒子を含む、直径３０〜６００nmの微粒子の混合物を含む。この混合物は、通常、界面活性剤（例えば、ツイーン（登録商標）２０またはトリトン（登録商標）１００）、および、例えばアジ化ナトリウムまたはアジ化カリウムのような抗菌剤を含む緩衝液中の懸濁物で維持される。
【００５３】
本発明はまた、強い光分散性を有し、アナライトに対して高反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する、直径３０〜６００nmの微粒子と、弱い光分散性を有し、アナライトに対して低反応性の少なくとも１つの結合パートナーを有する、直径３０〜６００nmの微粒子とを、混合することを特徴とする、上記微粒子試薬の調製方法に関する。
【００５４】
本発明を、以下の例によりさらに説明する。以下の説明は、以下の図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２，３Ａ、３Ｂおよび４を参照することによりさらに理解できるであろう。
【００５５】
図１Ａは、以下の微粒子試薬［低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子の１／１混合物（「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」）、および高反応性抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径１２４nmの粒子の１／１混合物（「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」）］の混合物のダイナミックレンジ（ＤＲ）の変動を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数として示す。
【００５６】
図１Ｂは、以下の微粒子試薬［低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子の１／１混合物（「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」）、および高反応性抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子の１／１混合物（「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」）］の混合物のＤＲの変動を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数として示す。
【００５７】
図１Ｃは、微粒子試薬［低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径８９nmの粒子の１／１混合物（「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」）、および高反応性抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子の１／１混合物（「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」）］の混合物のＤＲの変動を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数として示す。
【００５８】
図１Ｄは、低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５および１６Ｂ１で同時コーティングした直径８９nmの粒子の微粒子試薬（「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」）、および高反応性抗体３６Ｇ１２および４７Ｆ１０で同時コーティングした直径２２１nmの粒子の微粒子試薬（「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」）の混合物のＤＲの変動を、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数として示す。
【００５９】
図２は、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」、「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」、およびこれらの７５／２５(v/v）混合物の較正曲線を示す。
【００６０】
図３Ａは、異なる反応性のＣＲＰに対する抗体でコーティングした直径１２４nmの粒子の混合物の、高反応性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした粒子の微粒子試薬（「高反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２」）の％(v/v）の関数としての、ＤＲの変動を示す。
【００６１】
図３Ｂは、ＣＲＰに対する低反応性抗体でコーティングした直径８９nmの粒子（「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ１２」）と、ＣＲＰに対する高反応性抗体でコーティングした直径２２１nmの粒子（「高反応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」）の微粒子試薬の混合物の、後者の微粒子試薬の％(v/v）の関数としての、ＤＲの変動を示す。
【００６２】
図４は、「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ１２」、「高反応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」、およびこれらの７５／２５(v/v）混合物の較正曲線を示す。
【００６３】
例１
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の微粒子増強光分散免疫凝集測定法のダイナミックレンジの上昇
【００６４】
１）方法と試薬
ａ）異なる親和性を有するＰＳＡの異なるエピトープに対するモノクローナル抗体の調製
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、前立腺癌を追跡するために臨床的に広く使用されている血清成分である。ＰＳＡは、血清中で遊離でまたはアンチキモトリプシンと複合体を形成して現れる１本のポリペプチド鎖からなる３４kDa の糖タンパク質である。
【００６５】
ＰＳＡに対するモノクローナル抗体は、当該分野で公知の方法、例えばハーロー（E.Harlow）ら、１９８８、「抗体：実験室マニュアル (Antibodies−A Laboratory Manual)」のセクション６、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク、アメリカ合衆国、に記載のような方法により調製した。ヒトＰＳＡは、センサバウ（Sensabaugh）ら、１９９０、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  １４４，１５２３に記載のように、ヒト精漿から単離した。マウスを規則的な間隔で、ＲＡＳ（リビ・アジュバント・システム（RIBI adjuvant system）中の５０μg のヒトＰＳＡを４回注射した。最初の注射の４ヶ月後、免疫マウスの脾臓から単離したリンパ球を、ジー・ガルフレ(G. Galfre）ら、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．７３、３−４６に記載のポリエチレングリコール法を使用して、ミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４と融合させた。
【００６６】
ＰＳＡに対する抗体を分泌するハイブリドーマを、以下のスクリーニングＥＬＩＳＡで同定した：マイクロタイタープレートを、ウサギ抗ヒトＰＳＡ免疫グロブリンでコーティングした；この固層に結合したＰＳＡを、ハイブリドーマ培養物の上清とともにインキュベートした。ＰＳＡに結合したモノクローナル抗体を、抗マウス免疫グロブリンペルオキシダーゼ結合体を使用して検出した。
【００６７】
ヒトＰＳＡの少なくとも７つの異なるエピトープに対する抗体を分泌する１３０個のハイブリドーマが単離できた。約２５の異なるモノクローナル抗体を精製し、さらに詳細に性状解析した。
【００６８】
ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商標）バイオセンサー技術（ファルマシア(Pharmacia）、スエーデン）を使用して、エピトープ結合を行い、見かけの解離定数について、抗体の相対的反応性を測定した。後者は、表面プラスモン共鳴技術（ジェイ・エル・ダイス（J.L. Daiss）ら、１９９４、「方法：酵素学の方法の友(Methods: A Companion to Methods in Enzymology）」、６、１４３−１５６、アカデミックプレス社(Academic Press Inc.）、ニューヨーク、アメリカ合衆国、を参照）に基づき、生体分子反応の動力学と化学量論を追跡することを可能にする。細胞培養物の上清から出発して、モノクローナル抗体をポリクローナルウサギ抗マウスＦｃ抗体を介して、バイオセンサー表面に結合させた。抗原ＰＳＡのモノクローナル抗体への会合と解離を追跡した。データは、単純なＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデル（エル・ジー・フェーゲルスタム(L.G. Faegerstam）ら、１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５９７、３９７−４１０）に基づく、固有のＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して解析した。
【００６９】
それぞれ見かけの解離定数が０．６nMと０．５nMを有する高親和性モノクローナル抗体の対３６Ｇ１２と４７Ｆ１０と、見かけの解離定数が３．７nMと５．６nMを有する低親和性モノクローナル抗体の対６３Ｃ５と１６Ｂ１の対を、微粒子へのコーティングのために選択した。モノクローナル抗体３６Ｇ１２と６３Ｃ５は、モノクローナル抗体４７Ｆ１０と１６Ｂ１が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識する（これらのエピトープはすべて、遊離型およびＰＳＡの複合体型の両方で存在する）。モノクローナル抗体３６Ｇ１２、４７Ｆ１０、６３Ｃ５、および１６Ｂ１を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約に従って、１９９７年６月２日にＤＳＭＺに、それぞれＡＣＣ２３１４、ＡＣＣ２３１５、ＡＣＣ２３１６、およびＡＣＣ２３１３で寄託した。
【００７０】
ｂ）微粒子試薬の調製
使用したコーティング法は、セラダイン社（Seradyn Inc.）、インディアナポリス、アメリカ合衆国、の刊行物「微粒子試薬最適化：微粒子の専門家からの実験室参照マニュアル（Microparticle Reagent Optimization: a Laboratory Reference Manual from the Authority on Microparticles）、１９９４、６６−７３、に記載の方法を修飾したものである。
【００７１】
直径がそれぞれ８９、１２４、または２２１nmを有するカルボキシ修飾ポリスチレン球形粒子（セラダイン社（Seradyn Inc.）、インディアナポリス、アメリカ合衆国、から、参照番号Ｃ９５５３／２０、２２８０および５３２Ｇで入手できる）を、２０mMの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ６．１）で２％ w/v懸濁液に希釈し、この緩衝液で遠心分離して２回洗浄した。
【００７２】
各粒子サイズについて、７５０μｌの洗浄溶液を、チップソニケーターで３０秒間超音波処理（氷浴、１０秒間隔）し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｓ−ＮＨＳ）を用いて、３０mMのＥＤＣと３０mMのｓ−ＮＨＳの溶液３０μｌを添加して活性化した。反応混合物を、ローラーで２０℃で１時間インキュベートした。微粒子懸濁液を、２０mM  ＭＥＳ（ｐＨ６．１）で遠心分離して２回洗浄した。各遠心分離工程後に、微粒子のペレットを、氷上で３０秒間チップ超音波処理で再懸濁した。
【００７３】
モノクローナル抗体を、２０mM  ＭＥＳ（ｐＨ６．１）で３mg/ml に希釈した。コーティングのために、この溶液７５０μｌを、上記で得られた活性化微粒子懸濁液と混合し、激しくボルテックス混合し、ローラーで２０℃で２時間インキュベートした。
【００７４】
３０μｌの２Ｍグリシン（ｐＨ１１）を加えて、コーティング反応を停止させ、１５分間インキュベートした。微粒子懸濁液を、０．０３％トリトンＸ−１００と０．１％ＮａＮ3 を含有する５０mMグリシン（ｐＨ８）で遠心分離して２回洗浄した。各遠心分離工程後に微粒子のペレットを、３０秒間チップ超音波処理して再懸濁した（１０秒間隔、強度２０ミクロン）。最後の遠心分離工程後、微粒子のペレットを、チップ超音波処理で前記したように再懸濁し、微粒子のサイズに従って使用濃度に希釈した。すなわち、直径８９nmについては０．５％(w/v) （すなわち、０．５ｇ／１００ml）、直径１２４nmについては０．２％(w/v) 、そして直径２２１nmについては０．１％(w/v) 。この使用濃度は、サイクル５で光学密度（ＯＤ）ブランクが０．３５と０．４５（下記ｃ）を参照）の間になるように選択した。
【００７５】
ｃ）較正曲線の決定と検出限界（ＤＬ）、測定上限（ＵＭＬ）、およびダイナミックレンジ（ＤＲ）の計算
免疫凝集反応のすべての測定は、コバス（登録商標）ミラエス（COBAS MIRA S）臨床化学分析機（エフ・ホフマン−ラ・ロッシュ・エー・ジー(F. Hoffmann-La Roche A.G.）、バーゼル、スイス）で波長５５０nmで、以下の組成の反応緩衝液（２０mMトリス／塩酸（ｐＨ７．４）、２０mM  ＣａＣｌ2 、３００mM  ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン（登録商標）２０、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および０．１％ＮＡＮ3 ）と、以下のパラメータの設定［（ａ）サイクル１で、１２０μｌの反応緩衝液および７０μｌの微粒子懸濁液を２０μｌの水とともにピペットでキュベットに入れた；（ｂ）２．１分プレインキュベート後、サイクル６で１５μｌの標準溶液（または試料）と３５μｌの水の添加で凝集反応が開始する；そして（ｃ）５分間の反応後、サイクル１８で終点を読む］を使用して行なった。結果は、サイクル１８で測定したシグナルとサイクル５の試薬ブランクの差として計算される。
【００７６】
用量応答曲線は、１回ずつの測定で作成し、データはエクセル（登録商標）５．０ソフトウェアで処理しプロットした。
【００７７】
検出限界（ＤＬ）と測定上限（ＵＭＬ）の測定のためには、１１重測定値の用量応答曲線の測定を行なった。約２ｍＯＤの標準偏差が存在した。
【００７８】
検出限界（ＤＬ）はここでは、確率９５％で標準物質０と区別できる最小のアナライト濃度として定義される。このパラメータは、ディー・エー・アムブルスター（D.A. Ambruster）ら、１９９４，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０、１２３３−１２３８に記載の２つのＳＤ法を使用して統計計算される。
【００７９】
用量応答曲線の測定上限（ＵＭＬ）はここでは、その前の標準物質に対して２０ｍＯＤのシグナルの差を越えるかまたは等しい最後の標準物質として定義される。
【００８０】
ダイナミックレンジ（ＤＲ）は、ＵＭＬとＤＬの比である。
【００８１】
以下に詳述する実験では、３６Ｇ１２、４７Ｆ１０、６３Ｃ５、および１６Ｂ１から選択される１つのみのモノクローナル抗体を、特定の直径の粒子のコーティングに使用した。
【００８２】
２）較正曲線への微粒子サイズの影響
ＰＳＡに対する同じ量の同じ抗体（すなわち、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２と４７Ｆ１０のうちの１つ、または低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５と１６Ｂ１のうちの１つ）でコーティングした直径８９、１２４または２２１nmの粒子の微粒子試薬について、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを決定した。
【００８３】
下表１ａと１ｂは、２つのそのような微粒子試薬［その１つは高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０（その５０／５０w/v 混合物）でコーティングした直径８９nmの粒子であり、他の１つは高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２と４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子である］、およびこれらの９０／１０(v/v）混合物について、ＰＳＡ濃度の関数として測定した光学密度（ＯＤ）（すなわち、較正曲線データ）、およびＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲをそれぞれ示す。
【００８４】
直径８９nmの粒子と直径２２１nmの粒子については表１ｂに示すように、レイリー（Rayleigh）の分散理論から予測されるように、粒子サイズとともにＤＬとＵＭＬの両方が減少した。直径２２１nmの粒子は、好ましい低検出限界の０．８６ng/ml ＰＳＡを示したが、測定中の微粒子の濃度が限定されているため、ＵＭＬとＤＲは欠如している。濃度を増加させることは現実的でなく、ブランク値が許容できないほど高くなるであろう。
【００８５】
直径８９nmと直径２２１nmの粒子を混合すると、８９nm粒子と２２１nm粒子の９０／１０(v/v）混合物比（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−８９nm／２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と呼ぶ）で得られる最大値１２７５のように、ＤＲがわずかに上昇し、比較的高い検出限界の１４．６２ng/ml を示す。
【００８６】
３）較正曲線への抗体反応性の影響
微粒子試薬（以後、「高反応性試薬−１２４nm−ＰＳＡ−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」および「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と呼ぶ）は、それぞれ、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２でコーティングした直径１２４nmの粒子の微粒子試薬と、高反応性モノクローナル抗体４７Ｆ１０でコーティングした直径１２４nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合し、低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５でコーティングした直径１２４nmの粒子の微粒子試薬と、低反応性モノクローナル抗体１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合して、調製した。
【００８７】
「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００／０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬について、較正曲線（表２ａの生データを参照）をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
【００８８】
「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」の間の較正曲線のＤＬの比率は、０．０７であった（表２ｂを参照）。
【００８９】
図１Ａは、％(v/v）「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の関数としてのＤＲの変動を示す。
【００９０】
以下の表２ｂは、「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径１２４nmの粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子の濃度で表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。ＤＲの最適の結果は、５０／５０(v/v）「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」を含有する微粒子試薬で得られ、ここで「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」に比較したＤＲの上昇の係数は、それぞれ約１１３０／３６０と約１１３０／１５２、すなわち約３．１と７．１であった。５０／５０(v/v）の「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」を含有する試薬については、ＤＬは約１６．６ng/ml であった。
【００９１】
４）異なる反応性の抗体でコーティングされた異なるサイズの粒子の本発明による混合
【００９２】
ａ）高反応性抗体でコーティングされた直径２２１nmの粒子と低反応性抗体でコーティングされた直径１２４nmの粒子の混合
微粒子試薬（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と呼ぶ）は、それぞれ、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２でコーティングした直径２２１nmの粒子の微粒子試薬と、高反応性モノクローナル抗体４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合し、低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５でコーティングした直径１２４nmの粒子の微粒子試薬と、低反応性モノクローナル抗体１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合して、調製した。
【００９３】
「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００／０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬について、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
【００９４】
以下の表３ａは、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子の濃度で表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
【００９５】
図１Ｂは、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）の関数としてのＤＲの変動を示す。
【００９６】
表３ａと図１Ｂに含まれるデータは、異なる反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子を本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき高い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の約７５％(v/v）の混合物については、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」に関してＤＲの上昇係数は、それぞれ約８６００／２００と約８６００／１５２、すなわち約４３と約５７であることを示す。従って、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」の各試験と比較して、ＤＲは有意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径１２４nmの粒子と、高親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合して得られるものより有意に高い（上記のように約３．１と約７．１）。同時に、約７５％(v/v）の「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の混合物は、約１．０７ng/lＣＲＰのＤＬを与え、すなわち、低親和性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした１２４nm粒子と高親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合した時得られるもの（上記のように約１６．６ng/l）より約１５倍低い。
【００９７】
ｂ）高反応性抗体でコーティングした直径２２１nmの粒子および低反応性抗体でコーティングした直径８９nmの粒子の混合
微粒子試薬（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」と呼ぶ）は、それぞれ、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２でコーティングした直径２２１nmの粒子の微粒子試薬と、高反応性モノクローナル抗体４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合し、低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５でコーティングした直径８９nmの粒子の微粒子試薬と、低反応性モノクローナル抗体１６Ｂ１でコーティングした直径８９nmの粒子の微粒子試薬とを等量混合して、調製した。
【００９８】
「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００／０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬について、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
【００９９】
以下の表３ｂは、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」％(v/v）、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径８９nmの粒子の濃度、で表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
【０１００】
図１Ｃは、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の％(v/v）の関数としてのＤＲの変動を示す。
【０１０１】
表３ｂと図１Ｃに含まれるデータは、異なる反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子を本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき高い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の約７５％(v/v）の混合物については、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」に関してＤＲの上昇係数は、それぞれ約１７３００／２００と約１７３００／６５０、すなわち約８６．５と約２７であることを示す。従って、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」の各試験と比較して、ＤＲは有意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径１２４nmの粒子と、高親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合して得られるものより有意に高い（上記のように約３．１と約７．１）。同時に、約７５％(v/v）の「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」の混合物は、約１．０７ng/lＣＲＰのＤＬを与え、すなわち、低親和性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした１２４nm粒子と高親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合した時得られるもの（上記のように約１６．６ng/l）より約１５倍低い。
【０１０２】
図２は、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２／４７Ｆ１０」、「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−６３Ｃ５／１６Ｂ１」、および７５／２５(v/v）混合物の較正曲線を示す。この図は、これらの各微粒子試薬の有利な性質（高反応性モノクローナル抗体でコーティングした直径２２１nmの粒子の高ＤＬに対応する低濃度のＰＳＡの急勾配の曲線、および低反応性モノクローナル抗体でコーティングした直径８９nmの粒子の微粒子試薬についての高ＵＭＬに対応する高濃度のＰＳＡの急勾配の曲線）がいかに驚くほど組合さっているかを示す。
【０１０３】
５）一対の高反応性抗体で同時コーティングした大きい粒子と、一対の低反応性抗体で同時コーティングした小さい粒子の本発明による混合
高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２と４７Ｆ１０で同時コーティングした直径２２１nmの粒子の微粒子試薬（以後、「高反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と呼ぶ）と低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５と１６Ｂ１で同時コーティングした８９nm粒子の微粒子試薬（以後、「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」と呼ぶ）を、上記１）ｂ）のように調製したが、コーティングにおいて単一のモノクローナル抗体の代わりに、一対の高反応性モノクローナル抗体または低反応性モノクローナル抗体の等量混合物を使用した点が異なる。
【０１０４】
「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」を、以下の比率(v/v）：１００／０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、０／１００で混合して調製した微粒子試薬について、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
【０１０５】
以下の表３ｃは、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」の％(v/v）、高反応性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径２２１nmの粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径８９nmの粒子の濃度、で表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
【０１０６】
表３ｃに含まれるデータは、異なる反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子を本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき高い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」の約７５％(v/v）の混合物については、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−８９nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」に関してＤＲの上昇係数は、それぞれ約１０２００／１５４と約１０２００／２５０、すなわち約６６と約４１であることを示す。従って、「高反応性試薬ＰＳＡ−２２１nm−３６Ｇ１２−ｃｏ−４７Ｆ１０」と「低反応性試薬ＰＳＡ−１２４nm−６３Ｃ５−ｃｏ−１６Ｂ１」の各試験と比較して、ＤＲは有意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和性モノクローナル抗体３６Ｇ１２または４７Ｆ１０でコーティングした直径１２４nmの粒子と、高親和性モノクローナル抗体６３Ｃ５または１６Ｂ１でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合して得られるものより有意に高い（上記のように約３．１と約７．１）。
【０１０７】
例２
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の微粒子増強光分散免疫凝集測定法のダイナミックレンジの上昇
【０１０８】
１）方法と試薬
ａ）異なる親和性を有するＣＲＰに対するモノクローナル抗体の調製
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、局所性または全身性炎症をスクリーニングし、治療の正確性を追跡するために臨床的に使用されている、急性相血清成分である。ＣＲＰは、閉じた円形の５つの同一の２３kDa サブユニットからなる１１５kDa の非グリコシル化タンパク質である。
【０１０９】
ＣＲＰに対するモノクローナル抗体は、当該分野で公知の方法、例えばハーロー(E. Harlow）ら、１９８８、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies−A  Laboratory Manual）」のセクション６、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク、アメリカ合衆国、に記載のような方法により調製した。ディー・エム・ビグシ（D.M. Vigushi）ら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１、１３５１−１３５７に記載のように、カルシウム依存性親和性クロマトグラフィー、逆相親和性クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む方法により得た５０μg の精製ヒトＣＲＰを、マウスに規則的な間隔で４回注射した。最初の注射の３ヶ月後、免疫マウスの脾臓から単離したリンパ球を、ジー・ガルフレ(G. Galfre）ら、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．７３、３−４６に記載のポリエチレングリコール法を使用して、ミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５８１）と融合させた。
【０１１０】
ＣＲＰに対する抗体を分泌するハイブリドーマを、以下のスクリーニングＥＬＩＳＡで同定した：マイクロタイタープレートを、ウサギ抗ヒトＣＲＰ免疫グロブリンでコーティングした。この固層に結合したＣＲＰを、ハイブリドーマ培養物の上清とともにインキュベートした。ＣＲＰに結合したモノクローナル抗体を、抗マウス免疫グロブリンペルオキシダーゼ結合体を使用して検出した。
【０１１１】
こうして、ヒトＣＲＰの少なくとも３つの異なるエピトープに対する抗体を分泌する５個のハイブリドーマが単離できた。これらのエピトープのうちの１つは、カルシウムの存在下でのみ利用できた。モノクローナル抗体を精製し、さらに詳細に性状解析した。
【０１１２】
ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商標）バイオセンサー技術（ファルマシア(Pharmacia）、スエーデン）を使用して、エピトープ結合解析を行い、見かけの解離定数について、抗体の相対的反応性を測定した。後者は、表面プラスモン共鳴技術（ジェイ・エル・ダイス（J.L. Daiss）ら、１９９４、「方法：酵素学の方法の友(Methods: A Companion to Methods in Enzymology）」、６、１４３−１５６、アカデミックプレス社(Academic Press Inc.）、ニューヨーク、アメリカ合衆国、を参照）に基づき、生体分子反応の動力学と化学量論を追跡することを可能にする。細胞培養物の上清から出発して、モノクローナル抗体をポリクローナルウサギ抗マウスＦｃ抗体を介して、バイオセンサー表面に結合させた。抗原ＣＲＰのモノクローナル抗体への会合と解離を追跡した。データは、抗原ＣＲＰの５つの繰り返しエピトープは考慮せずに、単純なＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデル（エル・ジー・フェーゲルスタム(L.G. Faegerstam）ら、１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５９７、３９７−４１０）に基づく、固有のＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して解析した。
【０１１３】
見かけの解離定数が０．１３nMの高親和性モノクローナル抗体３６Ｆ１２と、見かけの解離定数が１．２nMの低親和性モノクローナル抗体８Ａ１２を、微粒子へのコーティングのために選択した。これらのモノクローナル抗体は、ＣＲＰの非重複エピトープを認識する。モノクローナル抗体３６Ｆ１２と８Ａ１２を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約に従って、１９９７年６月２日にＤＳＭＺに、それぞれＡＣＣ２３１１とＡＣＣ２３１２で寄託した。
【０１１４】
ｂ）微粒子試薬の調製
直径がそれぞれ８９、１２４、または２２１nmを有する上記モノクローナル抗体とカルボキシ修飾ポリスチレン球形粒子について、例１の１）ｂ）と同じコーティング法を使用した（セラダイン社（Seradyn Inc.）、インディアナポリス、アメリカ合衆国、から、参照番号Ｃ９５５３／２０、２２８０および５３２Ｇで入手できる）
【０１１５】
最後の遠心分離工程後に微粒子のペレットを、チップ超音波処理で前述の緩衝液に再懸濁し、微粒子のサイズに従って使用濃度に希釈した。すなわち、直径８９nmについては０．５％(w/v) 、直径１２４nmについては０．２％(w/v) 、そして直径２２１nmについては０．１％(w/v) 。例１の１）ｂ）のように、この使用濃度は、サイクル５で光学密度（ＯＤ）ブランクが０．３５と０．４５の間になるように選択した。
【０１１６】
ｃ）較正曲線の決定とＤＬ、ＵＭＬ、およびＤＲの計算
免疫凝集反応のすべての測定は、コバス（登録商標）ミラエス（COBAS MIRA S）臨床化学分析機（エフ・ホフマン−ラ・ロッシュ・エー・ジー(F. Hoffmann-La Roche A.G.）、バーゼル、スイス）で、例１の１）ｂ）と同じ緩衝液とパラメータ設定を使用して行なった。
【０１１７】
ＤＬ、ＵＭＬ、およびＤＲは、例１の１）ｂ）のように統計的に求めた。
【０１１８】
２）較正曲線への微粒子サイズの影響
ＣＲＰに対する同じ量の同じ抗体（すなわち、高反応性モノクローナル抗体３６Ｆ１２、または低反応性モノクローナル抗体８Ａ１２）でコーティングした直径８９、１２４または２２１nmの粒子の微粒子試薬について、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを決定した。
【０１１９】
下表４ａと４ｂは、それぞれ２つのそのような微粒子試薬［その１つは高反応性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径８９nmの粒子であり、他の１つはモノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径２２１nmの粒子］、およびこれらの２５／７５(v/v）混合物について、ＣＲＰ濃度の関数として測定した光学密度（ＯＤ）（すなわち、較正曲線データ）、およびＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲをそれぞれ示す。
【０１２０】
直径８９nmの粒子と直径２２１nmの粒子について表４ｂに示すように、レイリー（Rayleigh）の分散理論から予測されるように、粒子サイズとともにＤＬとＵＭＬの両方が減少した。直径２２１nmの粒子は、好ましい低検出限界の０．０１６mg/lＣＲＰを示したが、測定中の微粒子の濃度が限定されているため、ＵＭＬとＤＲは不充分である（濃度を増加させると、ブランク値が許容できないほど高くなるであろう）。
【０１２１】
直径８９nmと直径２２１nmの粒子を混合すると、８９nm粒子と２２１nm粒子の２５／７５(v/v）混合物（以後、「高反応性試薬ＣＲＰ−８９nm／２２１nm−３６Ｆ１２」と呼ぶ）で得られる最大値約２０５のように、直径８９nmの粒子で得られる値と比較してＤＲがわずかに上昇し、比較的高い検出限界の約０．０９mg/lを示す。
【０１２２】
３）較正曲線への抗体反応性の影響
微粒子試薬（以後、「高反応性試薬−１２４nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」および「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」と呼ぶ）は、それぞれ、高反応性モノクローナル抗体３６Ｆ１２で直径１２４nmの粒子をコーティングし、そして低反応性モノクローナル抗体８Ａ１２で直径１２４nmの粒子コーティングして調製した。「高反応性試薬−１２４nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」は、以下の比率(v/v）：１００／０、９０／１０ｙ、７５／２５、５０／５０、２５／７５、０／１００で混合した。
【０１２３】
較正曲線（表５ａの生データを参照）をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
【０１２４】
「高反応性試薬１２４nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」の間の較正曲線のＤＬの比率は、０．２９であった（表５ｂを参照）。
【０１２５】
図３Ａは、「高反応性試薬１２４nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」の％(v/v）の関数としてのＤＲの変動を示す。
【０１２６】
以下の表５ｂは、「高反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２」の％(v/v）、高反応性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径１２４nmの粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体８Ａ１２でコーティングした直径１２４nmの粒子の濃度、で表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを示す。ＤＲの最適の結果は、２５／７５(v/v）「高反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２」を含有する微粒子試薬（以後、「混合反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２／８Ａ１２」と呼ぶ）で得られ、ここで「高反応性試薬ＣＲＰ−８９／２２１nm−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−８Ａ１２」に比較したＤＲの上昇の係数は、それぞれ約４４４／１８６と４４４／１６４、すなわち約２．４と２．７であった。「混合反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２／８Ａ１２」は、約０．０８mg/lＣＲＰのＤＬを示した。
【０１２７】
４）異なる反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子の本発明による混合
【０１２８】
微粒子試薬（以後、「高反応性試薬２２１nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ１２」と呼ぶ）は、それぞれ、直径２２１nmの粒子をモノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングし、直径８９nmの粒子を低反応性モノクローナル抗体８Ａ１２でコーティングして調製した。「高反応性試薬２２１nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ１２」を、以下の比率(v/v）：１００／０、９０／１０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、０／１００で混合した。
【０１２９】
低反応性モノクローナル抗体８Ａ１２でコーティングした８９nmの粒子の微粒子試薬（「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ１２」）と、高反応性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした２２１nmの粒子の微粒子試薬（「高反応4 試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」）を、以下の比率(v/v）：１００／０、５０／５０、２５／７５、１０／９０、０／１００で混合して得られた微粒子試薬について、較正曲線をプロットし、ＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを求めた。
【０１３０】
以下の表６は、「高反応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」の％(v/v）、高反応性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径２２１nmの粒子の濃度、および低反応性モノクローナル抗体８Ａ１２でコーティングした直径８９nmの粒子の濃度、で表された上記混合比についてのＤＬ、ＵＭＬおよびＤＲを与える。
【０１３１】
図３Ｂは、「高反応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」の％(v/v）の関数としてのＤＲの変動を示す。
【０１３２】
表６と図３Ｂに含まれるデータは、異なる反応性の抗体でコーティングした異なるサイズの粒子を本発明に従って混合することにより、ＤＲの驚くべき高い上昇が得られることを示す。「高反応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」の約７５％(v/v）の混合物については、「高反応性試薬ＣＲＰ−８９nm／２２１nm−３６Ｆ１２」と「低反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２」に関してＤＲの上昇係数は、それぞれ約１６４０／２００と約１６４０／４４４、すなわち約８．２と約３．７であることを示す。従って、「高反応性試薬ＣＲＰ−８９nm／２２１nm−３６Ｆ１２」と「高反応性試薬ＣＲＰ−１２４nm−３６Ｆ１２」の各試験と比較して、ＤＲは有意に延長しており、ＤＬの上昇計数は、低親和性モノクローナル抗体８Ａでコーティングした直径１２４nmの粒子と、高親和性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合して得られるものより有意に高い（上記のように約２．４から約２．７）。同時に、約７５％(v/v）の「高反応性試薬ＣＲＰ−２２１nm−３６Ｆ１２」の混合物は、約０．０２２mg/lＣＲＰのＤＬを与え、すなわち、低親和性モノクローナル抗体８Ａ１２でコーティングした直径１２４nmの粒子と高親和性モノクローナル抗体３６Ｆ１２でコーティングした直径１２４nmの粒子を混合した時得られるもの（上記のように約０．０８mg/l）よりほとんど４倍低い。
【０１３３】
図４は、「高反応性試薬２２１nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」、「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ１２」、および本発明のこれらの７５／２５(v/v）混合物の較正曲線を示す。この図は、これらの各試薬の有利な性質（「高反応性試薬２２１nm−ＣＲＰ−３６Ｆ１２」についての高ＤＬに対応する低濃度のＣＲＰの急勾配の曲線、および「低反応性試薬ＣＲＰ−８９nm−８Ａ１２」についての高ＵＭＬに対応する高濃度のＣＲＰの急勾配の曲線）がいかに予測できないほど組合さっているかを示す。
【０１３４】
【表１】
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【０１３５】
【表２】
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【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
【表４】
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【０１３８】
【表５】
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【０１３９】
【表６】
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【０１４０】
【表７】
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【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
【表９】
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【０１４３】
【表１０】
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【０１４４】
【表１１】
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【０１４５】
【表１２】
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【０１４６】
【表１３】
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【０１４７】
【表１４】
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【０１４８】
【表１５】
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【０１４９】
【表１６】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの変動を示す。
【図１Ｂ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの変動を示す。
【図１Ｃ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの変動を示す。
【図１Ｄ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの変動を示す。
【図２】本発明の試薬の較正曲線を示す。
【図３Ａ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの変動を示す。
【図３Ｂ】本発明の微粒子試薬のダイナミックレンジの変動を示す。
【図４】本発明の試薬の較正曲線を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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