(57)【要約】絶縁基板上に形成された作用電極、対極および場合により参照電極よりなる電極系；及び該電極系上に形成され、ジアフォラーゼ（ＤＩ）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤ）及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼ（ＮＡＤＳ）を含む反応層を包含し、該反応層の少なくとも一部が該作用電極上に位置し、該反応層中に含まれるＤＩ、１２α−ＨＳＤ及びＮＡＤＳが該作用電極の表面に固定されていて、該反応層中で発生した化合物が該作用電極の表面に到達しうるように構成されてなる酵素電極、該酵素電極を用いたアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度を測定する方法、及びその濃度を測定するためのシステムが開示される。
2002025262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）絶縁性基板およびその上に形成された作用電極、対極および場合により参照電極よりなる電極系；および
（ｂ）該電極系上に形成され、ジアフォラーゼ（ＤＩ）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤ）およびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼ（ＮＡＤＳ）を含む反応層
を包含し、
該反応層の少なくとも一部が該作用電極上に位置し、該反応層中のその部分に含まれるＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが該作用電極の表面に固定されていて、該反応層中で発生した化合物が該作用電極の表面に到達し得るように構成されてなる
ことを特徴とする酵素電極。
【請求項２】
親水性高分子層を更に含み、該親水性高分子層が、該作用電極と該反応層の間に位置し、且つ該作用電極と該反応層の両者と接触していることを特徴とする、請求項１に記載の酵素電極。
【請求項３】
該反応層中の該作用電極上に位置する部分に関し、
蛋白質の総含有量が１ｃｍ２あたり２．５ｍｇ以下であり、
酵素活性で表わしたＤＩの含有量が１ｃｍ２あたり０．２５Ｕ以上であり、
酵素活性で表わした１２α−ＨＳＤの含有量が１ｃｍ２あたり０．６３Ｕ以上であり、
酵素活性で表わしたＮＡＤＳの含有量が１ｃｍ２あたり０．０６３Ｕ以上である
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の酵素電極。
【請求項４】
該反応層中の該作用電極上に位置する部分に関し、
蛋白質の総含有量が１ｃｍ２あたり１．５ｍｇ以下であり、
酵素活性で表わしたＤＩの含有量が１ｃｍ２あたり１．０Ｕ以上であり、
酵素活性で表わした１２α−ＨＳＤの含有量が１ｃｍ２あたり２．５Ｕ以上であり、
酵素活性で表わしたＮＡＤＳの含有量が１ｃｍ２あたり０．２５Ｕ以上であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項５】
該反応層中の該作用電極上に位置する部分に関し、
蛋白質の総含有量が１ｃｍ２あたり１．１ｍｇ以下であり、
酵素活性で表わしたＤＩの含有量が１ｃｍ２あたり２．５Ｕ以上であり、
酵素活性で表わした１２α−ＨＳＤの含有量が１ｃｍ２あたり６．２５Ｕ以上であり、
酵素活性で表わしたＮＡＤＳの含有量が１ｃｍ２あたり０．６２５Ｕ以上である
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項６】
試料中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度を測定する方法であって、
アンモニアおよびアンモニウムイオンよりなる群から選ばれる少なくとも１種、ニコチン酸−アデニンジヌクレオチド、胆汁酸塩並びに電子伝達物質を含む水溶液を、試料と混合して試料溶液を得；
該試料溶液を、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素電極の該作用電極、該対極および場合により該参照電極に接触させて、該試料溶液を介して電気回路を形成し；
該酵素電極の作用電極と対極、または作用電極と参照電極の間に電圧を印加して、該作用電極の表面で該電子伝達物質の酸化反応を行いながら、該作用電極における電流を測定し、但し、該酵素電極が参照電極を有しない場合は、該電圧を該作用電極と該対極の間に印加し、該酵素電極が参照電極を有する場合は、該電圧を該作用電極と該参照電極の間に印加するように構成されており；そして
該作用電極における該電流の測定値からＡＴＰの量を算出する
ことを含む方法。
【請求項７】
アンモニアおよびアンモニウムイオンよりなる群から選ばれる少なくとも１種、ニコチン酸−アデニンジヌクレオチド、胆汁酸塩並びに電子伝達物質を用いて、試料中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度を測定するためのシステムであって、
請求項１〜５のいずれかに記載の酵素電極；
該酵素電極の作用電極と対極、または作用電極と参照電極の間に、該電子伝達物質が該作用電極の表面において酸化反応を起こすのに十分な電圧を印加する手段；および
該作用電極における電流を測定する手段
よりなるシステム。
【請求項８】
該作用電極における該電流の測定値からＡＴＰの量を算出する手段を更に含むことを特徴とする、請求項７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酵素電極に関する。より詳細には、本発明は、（ａ）絶縁性基板およびその上に形成された作用電極、対極および場合により参照電極よりなる電極系；および（ｂ）該電極系上に形成され、ジアフォラーゼ（ＤＩ）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤ）およびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼ（ＮＡＤＳ）を含む反応層を包含し、該反応層の少なくとも一部が該作用電極上に位置し、該反応層中のその部分に含まれるＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが該作用電極の表面に固定されていて、該反応層中で発生した化合物が該作用電極の表面に到達し得るように構成されてなることを特徴とする酵素電極に関する。
また本発明は、上記の酵素電極を用いるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度の測定方法、および上記の酵素電極を含むＡＴＰの濃度を測定するためのシステムにも関する。
本発明の酵素電極を用いると、ＡＴＰ濃度測定装置を小型化することができる上、試料の煩雑な前処理を行うことなく、試料中のＡＴＰの濃度の測定を、高感度で、簡便且つ迅速に行うことができるので、極めて有用である。
従来技術
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は多くの生物中にほぼ普遍的に存在する化合物である。
生体内で起こる種々の化学反応には、ＡＴＰが加水分解されてアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）となる際に放出されるエネルギーを利用して行われるものが多い。またＡＴＰは、生体内においてリボ核酸（ＲＮＡ）の前駆体、生体内リン酸化反応におけるリン酸基供与体などとしても利用される。
このように、ＡＴＰは生体において極めて重要な役割を果たす化合物であるため、ＡＴＰの定量分析は種々の分野において重要である。
例えば、食品衛生の分野においては、細菌などの微生物や、微生物による汚染の温床となる食物残渣などによる汚染の程度の指標としてＡＴＰ濃度が利用される。
食品や、食器、調理器具、食品加工機器等の器具に微生物や食物残渣が付着していると、その微生物や食物残渣に由来するＡＴＰの量が増加する。このことに基づき、上記の食品や器具に由来する試料についてＡＴＰの定量分析を行い、試料中のＡＴＰの濃度が高いほど、微生物や食物残渣による汚染の程度が高いと見なす。
この場合、試料中に含まれるＡＴＰは微量なので、高感度且つ正確なＡＴＰ濃度測定法が必要である。そのような測定法として、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用したＡＴＰ濃度測定法が知られている。この方法では、試料から抽出したＡＴＰにルシフェリン及びルシフェラーゼを作用させて発光させ、この発光量から試料の汚染度を測定する。
この汚染度の測定は、複数個の汚染度既知の標準試料について上記の操作を行い、発光量と汚染度の関係を示す検量線を作成し、その検量線を用いて行う。
しかし、この方法で用いられる測定装置は高価なうえ、通常大型で、移動が困難である。このため上記の方法は、測定装置を移動する必要のある用途には向いていないという問題がある。例えば、実地での検査、即ち、屋外や、微生物による汚染の防止を要する実際の場所などに測定装置を持ち込み、その場で行う検査には、移動が困難な測定装置を必要とする上記の方法は不向きである。
また、この方法ではＡＴＰを光学的な手法によって検出しているため、測定装置の消費電力が大きいという問題がある。
更に、一般に、光学的な手法による分析方法は濁りのある試料には適用が困難である。従って上記の方法では、牛乳や血液のような濁度の高い試料は、そのままでは分析に供することが困難で、希釈したり、濁りの原因となっている試料中の不溶性の微粒子を除去または溶解するための処理を施した後に分析に供することが必要である。この結果、分析の操作が煩雑となったり、分析の感度が低下してしまうという問題がある。
そこで、小電力で駆動可能であり、小型で、濁度の高い試料も直接測定できる測定装置として、ＡＴＰ定量分析用の酵素電極が注目されている。
酵素電極とはいわゆるバイオセンサーの一種であり、酵素反応による物質の量の変化を、電気化学的な手法により電気信号に変換する装置である。この電気信号を利用して、特定の物質の検出や定量を行うことができる。
上記のような酵素電極を用い、試料中の特定の物質の濃度を測定する方法は良く知られている。このような方法は迅速性、簡便性、経済性などの利点があるため近年注目され、臨床検査等の分野で広く使用されつつある。
酵素電極を用いる分析では、光学的な手法による分析と異なり、濁りのある試料を希釈などせずそのまま使用できるので、分析の操作を極めて簡便に行うことができる。
酵素電極の例として特に良く知られているものは、血液試料中のグルコース濃度を測定するための酵素電極である（日本国特許第２５１７１５３号を参照）。この酵素電極は、絶縁性基板およびその上にスクリーン印刷などの方法で形成された作用電極および対極からなる電極系、該電極系上に形成された電気絶縁層（この電気絶縁層により、各電極の露出表面積が一定となる）および該作用電極上に形成された、親水性高分子、酸化還元酵素および電子伝達物質を含む酵素反応層を包含してなる。
ＡＴＰ定量分析用の酵素電極としては、グルコースオキシダーゼとヘキソキナーゼを用いる酵素電極が提案されている（日本国特開昭６０−１７３４７号明細書（米国特許第４，７１１，２４５号および第４，７５８，３２３号に対応）およびＡｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、１９９７年、第３４０巻、第１０９〜１１３頁を参照）。
グルコースオキシダーゼはグルコースの酸化反応を促進し、ヘキソキナーゼはＡＴＰをリン酸基供与体とするグルコースのリン酸化反応を促進する。これら２種の酵素はいずれもグルコースを基質としているので、上記の酵素電極を使用するときは上記２つの酵素反応が同時に進行するが、試料中のＡＴＰの量が増加するにつれて、後者の反応がより多く起こるようになる。上記の酵素電極はこのことを利用している。
他の形式のＡＴＰ定量分析用酵素電極として、ＡＴＰ加水分解酵素（ＡＴＰａｓｅ）と水素イオン感応性電界効果型トランジスター（ｐＨ−ＩＳＦＥＴ）を利用した酵素電極が知られている（日本国特開昭６１−１２２５６０号明細書および日本国特開昭６１−２６９０５８号明細書を参照）。
ｐＨ−ＩＳＦＥＴは、水素イオン濃度の変化を電気信号に変換する機能を有する半導体素子である。
ＡＴＰがＡＴＰａｓｅにより加水分解される際には水素イオンが生成し、その結果水素イオン濃度が増加する。上記の酵素電極は、この水素イオン濃度の増加をｐＨ−ＩＳＦＥＴにより電気信号に変換する装置であり、この電気信号を利用してＡＴＰの定量を行う。
しかし、これらの酵素電極は測定感度が１０−４〜１０−５Ｍ程度に過ぎず（日本国（株）フジ・テクノシステム発行（１９７６年）「普及版センサ技術」第３３２頁を参照）、実用に耐えるものではなかった。
実用的な感度を有するＡＴＰ定量分析用酵素電極の例としては、ピルベートキナーゼ、ヘキソキナーゼおよびグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いる酵素電極を挙げることができる（Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ、１９９１年、第３巻、第６５９〜６６３頁）。
この酵素電極では、ピルベートキナーゼとヘキソキナーゼを用いてＡＴＰ／ＡＤＰ系の酵素的サイクリングを行い、測定感度を向上させている。酵素的サイクリングとは、２種以上の酵素反応を組み合わせて物質の量の変化を増幅し、測定感度を向上させる方法である。
この酵素電極では、ヘキソキナーゼによりグルコースとＡＴＰからグルコース６−リン酸とＡＤＰを生成させ、このグルコース６−リン酸の量の変化を電気信号に変換する。
一方、この反応で生成したＡＤＰからピルベートキナーゼによりＡＴＰを再生させ、そのＡＴＰを上記のヘキソキナーゼによる酵素反応に付す。
これを繰り返すことにより、試料中のＡＴＰの量に対応して、酵素反応により生成するグルコース６−リン酸の量が増加する。この結果、測定感度が向上し、より少量のＡＴＰの定量分析が可能となる。この酵素電極を用いた際のＡＴＰの測定感度は１０−９Ｍ程度と報告されている。
しかし、この酵素電極には次のような問題があった。
この酵素電極において用いられるヘキソキナーゼはアロステリック酵素であり、その酵素活性が基質以外の物質に影響されやすく、酵素反応速度の制御が難しい。このため、特に試料中のＡＴＰ濃度が低い場合、定量分析が困難になる。
また、この酵素電極ではゼラチン膜を用いる包括法によって酵素を固定している。この場合、試料溶液を均一にし、且つ酵素を含むゼラチン膜中への試料溶液の浸透を補助するため、攪拌装置を用いて試料溶液の流れを作る必要がある。このため、測定装置の小型化が困難である。
更に、上記した通り、この酵素電極ではＡＴＰ／ＡＤＰ系の酵素的サイクリングを行う。この酵素的サイクリングにはＡＴＰとＡＤＰの両者が関与するので、この酵素電極を用いる分析は試料中のＡＤＰの濃度に影響される。従って、この酵素電極を用いてＡＴＰとＡＤＰの両者を含む試料中のＡＴＰのみを選択的に定量する場合には、試料中のＡＤＰを選択的に除去するための煩雑な前処理が必要である。
以上から明らかなように、試料中のＡＴＰの濃度を高感度で、簡便且つ迅速に測定することを可能とする酵素電極は、従来知られていなかった。
発明の概要
このような状況下において、本発明者らは試料の煩雑な前処理を行うことなく、試料中のＡＴＰの濃度を、高感度で、簡便且つ迅速に測定することを可能とする酵素電極を開発すべく鋭意研究を行った。その結果意外にも、ＡＴＰの濃度を測定するための酵素電極の反応層としてジアフォラーゼ、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼを含む反応層を用いると、試料中のＡＴＰの濃度を高感度で且つ迅速に測定することができることを見出した。
また本発明者らは、そのような酵素電極を用いるＡＴＰ濃度の測定方法は、共存するＡＤＰなどに影響されず、従って試料の煩雑な前処理を行う必要がないので、極めて簡便な操作により実施することができることを見出した。
これらの知見に基づき、本発明を完成した。
従って、本発明の１つの目的は、試料中のＡＴＰの濃度を高感度で、且つ簡便に測定することを可能とする酵素電極を提供することにある。
本発明の他の１つの目的は、上記の酵素電極を用いて試料中のＡＴＰの濃度を測定する方法を提供することにある。
本発明の更に他の１つの目的は、上記の酵素電極を含む、試料中のＡＴＰの濃度を測定するためのシステムを提供することにある。
本発明の上記及び他の諸目的、諸特徴ならびに諸利益は、添付の図面を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲から明らかになる。
発明の詳細な説明
本発明によれば、
（ａ）絶縁性基板およびその上に形成された作用電極、対極および場合により参照電極よりなる電極系；および
（ｂ）該電極系上に形成され、ジアフォラーゼ（ＤＩ）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤ）およびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼ（ＮＡＤＳ）を含む反応層
を包含し、
該反応層の少なくとも一部が該作用電極上に位置し、該反応層中のその部分に含まれるＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが該作用電極の表面に固定されていて、該反応層中で発生した化合物が該作用電極の表面に到達し得るように構成されてなる
ことを特徴とする酵素電極が提供される。
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的諸特徴および好ましい態様を列挙する。
１．（ａ）絶縁性基板およびその上に形成された作用電極、対極および場合により参照電極よりなる電極系；および
（ｂ）該電極系上に形成され、ジアフォラーゼ（ＤＩ）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤ）およびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼ（ＮＡＤＳ）を含む反応層
を包含し、
該反応層の少なくとも一部が該作用電極上に位置し、該反応層中のその部分に含まれるＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが該作用電極の表面に固定されていて、該反応層中で発生した化合物が該作用電極の表面に到達し得るように構成されてなる
ことを特徴とする酵素電極。
２．親水性高分子層を更に含み、該親水性高分子層が、該作用電極と該反応層の間に位置し、且つ該作用電極と該反応層の両者と接触していることを特徴とする、前項１に記載の酵素電極。
３．該反応層中の該作用電極上に位置する部分に関し、
蛋白質の総含有量が１ｃｍ２あたり２．５ｍｇ以下であり、
酵素活性で表わしたＤＩの含有量が１ｃｍ２あたり０．２５Ｕ以上であり、
酵素活性で表わした１２α−ＨＳＤの含有量が１ｃｍ２あたり０．６３Ｕ以上であり、
酵素活性で表わしたＮＡＤＳの含有量が１ｃｍ２あたり０．０６３Ｕ以上である
ことを特徴とする、前項１または２に記載の酵素電極。
４．該反応層中の該作用電極上に位置する部分に関し、
蛋白質の総含有量が１ｃｍ２あたり１．５ｍｇ以下であり、
酵素活性で表わしたＤＩの含有量が１ｃｍ２あたり１．０Ｕ以上であり、
酵素活性で表わした１２α−ＨＳＤの含有量が１ｃｍ２あたり２．５Ｕ以上であり、
酵素活性で表わしたＮＡＤＳの含有量が１ｃｍ２あたり０．２５Ｕ以上であることを特徴とする、前項１〜３のいずれかに記載の酵素電極。
５．該反応層中の該作用電極上に位置する部分に関し、
蛋白質の総含有量が１ｃｍ２あたり１．１ｍｇ以下であり、
酵素活性で表わしたＤＩの含有量が１ｃｍ２あたり２．５Ｕ以上であり、
酵素活性で表わした１２α−ＨＳＤの含有量が１ｃｍ２あたり６．２５Ｕ以上であり、
酵素活性で表わしたＮＡＤＳの含有量が１ｃｍ２あたり０．６２５Ｕ以上である
ことを特徴とする、前項１〜４のいずれかに記載の酵素電極。
６．試料中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度を測定する方法であって、
アンモニアおよびアンモニウムイオンよりなる群から選ばれる少なくとも１種、ニコチン酸−アデニンジヌクレオチド、胆汁酸塩並びに電子伝達物質を含む水溶液を、試料と混合して試料溶液を得；
該試料溶液を、前項１〜５のいずれかに記載の酵素電極の該作用電極、該対極および場合により該参照電極に接触させて、該試料溶液を介して電気回路を形成し；
該酵素電極の作用電極と対極、または作用電極と参照電極の間に電圧を印加して、該作用電極の表面で該電子伝達物質の酸化反応を行いながら、該作用電極における電流を測定し、但し、該酵素電極が参照電極を有しない場合は、該電圧を該作用電極と該対極の間に印加し、該酵素電極が参照電極を有する場合は、該電圧を該作用電極と該参照電極の間に印加するように構成されており；そして
該作用電極における該電流の測定値からＡＴＰの量を算出する
ことを含む方法。
７．アンモニアおよびアンモニウムイオンよりなる群から選ばれる少なくとも１種、ニコチン酸−アデニンジヌクレオチド、胆汁酸塩並びに電子伝達物質を用いて、試料中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度を測定するためのシステムであって、
前項１〜５のいずれかに記載の酵素電極；
該酵素電極の作用電極と対極、または作用電極と参照電極の間に、該電子伝達物質が該作用電極の表面において酸化反応を起こすのに十分な電圧を印加する手段；および
該作用電極における電流を測定する手段
よりなるシステム。
８．該作用電極における該電流の測定値からＡＴＰの量を算出する手段を更に含むことを特徴とする、前項７に記載のシステム。
以降、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵素電極は、
（ａ）絶縁性基板およびその上に形成された作用電極、対極および場合により参照電極よりなる電極系；および
（ｂ）該電極系上に形成され、ジアフォラーゼ（ＤＩ）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤ）およびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼ（ＮＡＤＳ）を含む反応層
を包含する。
そして、上記反応層の少なくとも一部が上記作用電極上に位置し、上記反応層中のその部分に含まれるＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが上記作用電極の表面に固定されていて、上記反応層中で発生した化合物が上記作用電極の表面に到達し得るように構成されている。
まず、電極系（ａ）につき説明する。
電極系（ａ）を構成する絶縁性基板は、電気絶縁性材料を平板状に成形することによって得られる。絶縁性基板の形状に特に制限はなく、任意に選択することができる。
上記電気絶縁性材料は、耐水性、耐熱性および耐薬品性に優れていることが好ましい。更に、後述する電極やリードの原料である導電性材料との密着性に優れていることが特に好ましい。
上記電気絶縁性材料の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ボリエチレンナフタレート、ポリエチレンサルファイド、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリエーテルサルファイド、ポリイミド、尿素樹脂などの絶縁性樹脂、ガラス、石英、セラミックス、紙等を挙げることができる。
上記絶縁性基板上に、作用電極、対極および場合により参照電極を形成することにより、上記電極系（ａ）を得ることができる（以降、これらの電極をしばしば単に「電極」と称する）。
本発明の酵素電極においては、通常参照電極は不要であり、作用電極と対極のみで十分な機能を発揮する。しかし、本発明の酵素電極が参照電極を有するものであると、より正確なＡＴＰ濃度測定が可能となる。
本発明においては、通常上記絶縁性基板上に形成した導電性材料の薄膜を電極として用いる。
導電性材料の例としては、カーボン、金、白金、銀、塩化銀、鉄、亜鉛、ニッケル、パラジウム等を挙げることができ、これらは単独で用いてもよく、複数種を組み合わせて用いてもよい。
これらの電極を形成する方法としては、スパッタリング法、イオンプレーティング法、フォトリソグラフィー、真空蒸着法、化学蒸着（ＣＶＤ）法、電解法等を挙げることができる。
また、微粒子状の導電性材料を含むペースト等を、絶縁性基板の表面に塗布することによっても、これらの電極を形成することができる。特に、微粒子状の導電性材料を含むペーストインク（例えば、カーボンペーストインク又は銀ペーストインクなど）を用いて、スクリーン印刷等の手法により絶縁性基板上に印刷を行う方法は、多数の電極系を迅速且つ安価に製造することができるので好ましい。このとき、カーボンなどの安価な材料を導電性材料として使用すると、酵素電極の製造コストを更に低減することができるので、特に使い捨て型の酵素電極の製造等において好適である。
後述するように、本発明の酵素電極を用いて試料中のＡＴＰの濃度を測定する際、上記作用電極と対極（または作用電極と参照電極）の間に電圧を印加する。従って、それらの電極の形状を、電圧を印加する手段と導線などにより接続することができるよう適宜選択する。
所望により、電極の形成に用いたものとは異なる導電性材料を用いて電極と接続されたリードを絶縁性基板上に形成し、このリードに導線などを介して電圧を印加する手段を接続するように構成することもできる。
リードは、上記した電極の形成と同様の方法で形成することができる。
また所望により、電極の露出部分（後述する試料溶液と接触する部分）の面積を一定に保つことや、短絡を防ぐことを目的として、電極系（ａ）に絶縁層を形成することができる。絶縁層の原料としては、通常熱硬化性ポリエステルなどの電気絶縁性樹脂を用いる。
絶縁層の形状の例を図１（ｃ）および図２に示す。これらの図から明らかなように、この例ではリード２の末端部、作用電極３および対極４を除く電極系（ａ）のほぼ全体が絶縁層で覆われている。リード２の末端部が絶縁層で覆われておらず露出しているのは、この部分に電圧を印加する手段を接続するための導線などを接続するためである。
所望により、電極に対して洗浄、研磨、プラズマエッチングなどの表面処理を行うことができる。
電極の表面を洗浄する場合、その方法としては、超音波洗浄器を用いて洗浄する方法や、適当な洗浄液を用いて洗浄する方法を用いることができ、これらの方法を併用することもできる。
上記洗浄液としては、電極や絶縁性基板を損傷させないものが好ましく、通常有機溶媒や酸等が用いられる。有機溶媒としては極性溶媒が好ましく、アセトン等のケトン類や、イソプロピルアルコール等のアルコール類が特に好ましい。酸としては、希硫酸等が好ましい。
また、上記洗浄液として電解カソード水を用いることもできる。電解カソード水とは、純水等を電気分解した際に陰極側に生成される水性液体である。電解カソード水は中性乃至弱アルカリ性でありながら高い還元性を有しており、絶縁性基板や電極を損傷することなく、基板の表面およびそれに付着した粒子の表面をいずれも負に帯電させることにより、一度基板の表面から脱着した粒子が再度付着することを抑制することができるので、洗浄液として好ましく用いることができる。
電極の表面を研磨する方法の例としては、アルミナ懸濁液を用いて研磨する方法や、エタノールなどの極性有機溶媒を含浸させた不織布により研磨する方法などを挙げることができる。
また、プラズマエッチングによる表面処理は、電極表面の浄化と共に、電極表面の濡れ性も向上させ、後述する酵素の固定を容易にするので好ましい。
次に、反応層（ｂ）につき説明する。
上記したように、本発明において用いられる反応層（ｂ）は、ジアフォラーゼ（ＥＣ　１．６．９９．２）（以降「ＤＩ」と称する）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．１７６）（以降「１２α−ＨＳＤ」と称する）およびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼ（ＥＣ　６．３．１．５）（以降「ＮＡＤＳ」と称する）を含む。
ＤＩは、還元型のニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素として、種々の化合物を還元する（特に、リポ酸誘導体を対応するジヒドロリポ酸誘導体に還元する）活性を有する酵素である。
ＤＩは、ウシ、ラットなどの哺乳類、酵母、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｉｓｃｈｅｒｉなどの細菌など、種々の生物に由来するものが知られているが、特に細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに由来するものを用いることが好ましい。
１２α−ＨＳＤは、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を補酵素として、胆汁酸（およびその誘導体）の１２α位の水酸基をケト基に酸化する活性を有する酵素である。
１２α−ＨＳＤは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｎｔｕｍなどの細菌をはじめとする種々の生物に由来するものが知られているが、特に細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓに由来するものを用いることが好ましい。
ＮＡＤＳは、ＡＴＰを加水分解してＡＭＰとし、そのときに放出されるエネルギーを利用してアンモニアおよび／またはアンモニウムイオンとニコチン酸−アデニンジヌクレオチド（デアミドＮＡＤ＋）からＮＡＤ＋を生成する酵素である。
ＮＡＤＳは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉなどの細菌をはじめとする種々の生物に由来するものが知られているが、特に細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものを用いることが好ましい。
従来の酵素電極のうち、複数の酵素を利用するものの中には、複数の反応層を有し、それら複数の酵素が各々別々の反応層に含まれているものが多く知られている。このような酵素電極は構成が複雑なため、複雑な製造工程によって製造する必要があり、その結果製造コストも増大する。
これに対し、本発明の酵素電極では、ＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが同一の反応層に含まれている。従って、本発明の酵素電極は構成が比較的簡単であるため、容易且つ安価に製造することができる。
ＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが同一の反応層に含まれている酵素電極は従来知られていなかった。日本国特開平６−８８８０５号明細書および日本国特開平９−２２９８９５号明細書には、作用電極上に位置する３種類の酵素を含む反応層を有する酵素電極が開示されているが、これらの酵素電極は試料中のＡＴＰ濃度の測定を目的とするものではなく、またこれらの酵素電極において用いられる酵素はＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳのいずれでもない。
反応層中のＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳの含有量には特に制限はないが、酵素電極の感度を高めるという観点からは、反応層中の作用電極上に位置する部分に関し、蛋白質の総含有量が１ｃｍ２あたり２．５ｍｇ以下であり、酵素活性で表わしたＤＩの含有量が１ｃｍ２あたり０．２５Ｕ以上であり、酵素活性で表わした１２α−ＨＳＤの含有量が１ｃｍ２あたり０．６３Ｕ以上であり、酵素活性で表わしたＮＡＤＳの含有量が１ｃｍ２あたり０．０６３Ｕ以上であることが好ましい（「反応層の少なくとも一部が上記作用電極上に位置する」という点については後述する）。これは以下の理由による。
後述するように、本発明の酵素電極を用いて試料中のＡＴＰの濃度を測定する際には、試料溶液中のＡＴＰは反応層中に拡散し、反応層中でＮＡＤＳにより加水分解されＡＤＰとなる必要がある。
この反応層中に蛋白質が多く含まれていると、試料溶液中のＡＴＰの反応層中への拡散速度が低下する（単位時間あたりに反応層中に拡散するＡＴＰの量が減少する）ため、迅速な分析が困難となり、また検出感度も低下する。
特に、本発明の酵素電極を用いる分析の対象となる試料溶液のＡＴＰ濃度はμＭ（１０−６Ｍ）以下のレベル、通常ｎＭ（１０−９Ｍ）レベルと極めて低いため、試料溶液中のＡＴＰの反応層中への拡散が本質的に遅い。その上、本発明の酵素電極を用いる分析では、試料溶液の攪拌など拡散を促進する操作を行わないので、反応層中の蛋白質によるＡＴＰの拡散の阻害の影響は大きい。
従って本発明の酵素電極においては、反応層、特に反応層中の作用電極上に位置する部分に関し、蛋白質の総含有量が一定の量を超えないことが好ましい。
本発明の酵素電極において、反応層中の該作用電極上に位置する部分の蛋白質の総含有量は、１ｃｍ２あたり、好ましくは２．５ｍｇ以下であり、より好ましくは１．５ｍｇ以下であり、更に好ましくは１．１ｍｇ以下である。
蛋白質の総含有量は、酵素電極から反応層を取り出し、公知の蛋白定量法、例えばビュレット法、ＢＣＡ法などの比色法により測定することができる。
上記の日本国特開平６−８８８０５号明細書および日本国特開平９−２２９８９５号明細書（上記したように、これらの文献には作用電極上に位置する３種類の酵素を含む反応層を有する酵素電極が開示されている）には、使用する酵素の含有量の下限については記載されているが、上限については記載されていなかった。
これらの酵素電極を用いる分析の対象となる試料では、分析対象物質の濃度が比較的高いために、これらの酵素電極に要求される測定感度も比較的低く、このことが、酵素の含有量が測定感度に及ぼす影響が考慮されなかった原因の一つと考えられる。
また、分析対象物質の濃度が比較的高いことに伴い、分析対象物質の反応層への拡散速度が十分高かったため、試料を攪拌することなく短時間で測定する場合でも、酵素の含有量が高すぎることに起因する拡散速度の低下と、それに伴う測定感度の低下が問題とされることがなかったと考えられる。
一方、反応層中の酵素の量が少なすぎると、ＡＴＰの量に対応する電気信号が小さくなりすぎて、バックグラウンドノイズとの差が小さくなってしまう。その結果、酵素電極の測定感度が低下してしまう。
従って本発明の酵素電極においては、反応層、特に反応層中の作用電極上に位置する部分に関し、酵素活性で表わしたＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳの含有量が、それぞれ一定の量以上であることが好ましい。
本発明の酵素電極において、反応層中の該作用電極上に位置する部分の酵素活性で表わしたＤＩの含有量は、１ｃｍ２あたり、好ましくは０．２５Ｕ以上であり、より好ましくは１．０Ｕ以上であり、更に好ましくは２．５Ｕ以上である。
ＤＩの酵素活性は、電子伝達物質（後述）の存在下、３７℃、ｐＨ８．０で単位時間当たりにＤＩにより酸化されるＮＡＤＨのモル数で定義され、１分あたり１μｍｏｌのＮＡＤＨが酸化されるときの酵素活性を１Ｕとする。
このとき、ＮＡＤＨの酸化は電子伝達物質の還元と同時に起こり、酸化されるＮＡＤＨのモル数は、還元によって生じる還元型電子伝達物質のモル数に等しい。そのため便宜上、ＤＩの酵素活性の測定は、酵素反応の結果として生じた還元型電子伝達物質のモル数を測定することにより行う。
本発明の酵素電極における、反応層中の該作用電極上に位置する部分の酵素活性で表わした１２α−ＨＳＤの含有量は、１ｃｍ２あたり、好ましくは０．６３Ｕ以上であり、より好ましくは２．５Ｕ以上であり、更に好ましくは６．２５Ｕ以上である。
１２α−ＨＳＤの酵素活性は、３７℃、ｐＨ８．０で単位時間に酸化されるデオキシコール酸（胆汁酸の一種）のモル数で定義され、１分あたり１μｍｏｌのデオキシコール酸が酸化されるときの１２α−ＨＳＤの酵素活性を１Ｕとする。
デオキシコール酸の酸化はＮＡＤ＋の還元によるＮＡＤＨの生成と同時に起こり、生成するＮＡＤＨのモル数は、酸化されるデオキシコール酸のモル数に等しい。このＮＡＤＨを、上記の如く電子伝達物質（後述）の存在下でＤＩにより酸化すると、同時に電子伝達物質の還元が起こり、酸化されるＮＡＤＨのモル数は、還元によって生じる還元型電子伝達物質のモル数に等しい。
そこで、１２α−ＨＳＤの酵素活性の測定は、２００Ｕ／ｍｌのＤＩおよび電子伝達物質の存在下で、１２α−ＨＳＤによるデオキシコール酸の酸化を行ない、この反応により生じたＮＡＤＨをＤＩにより酸化し、生じた還元型電子伝達物質のモル数を測定することによって行う。
本発明の酵素電極における、反応層中の該作用電極上に位置する部分の酵素活性で表わしたＮＡＤＳの含有量は、１ｃｍ２あたり、好ましくは０．０６３Ｕ以上であり、より好ましくは０．２５Ｕ以上であり、更に好ましくは０．６２５Ｕ以上である。
ＮＡＤＳの酵素活性は、３７℃、ｐＨ９．５で単位時間あたりに生成するＮＡＤ＋のモル数で定義され、１分あたり１μｍｏｌのＮＡＤ＋が生成するときのＮＡＤＳの酵素活性を１Ｕとする。
ＮＡＤＳの酵素活性の測定は、２００Ｕ／ｍｌの３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下でＮＡＤＳの生成反応を行ない、生成したＮＡＤ＋を３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いて還元し、生じたＮＡＤＨを３４０ｎｍの吸光度で定量することによって行なう。
本発明の酵素電極においては、その性能に悪影響を及ぼさない範囲で、上記３種の酵素以外のタンパク質、例えばウシ血清アルブミン、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼなどが反応層に含まれていてもよい。
本発明の酵素電極は、上記反応層の少なくとも一部が上記作用電極上に位置し、上記反応層中のその部分に含まれるＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが上記作用電極の表面に固定されていて、上記反応層中で発生した化合物が該作用電極の表面に到達し得るように構成されている。
以降、上記反応層（ｂ）の形成につき説明する。
反応層の形成方法については、ＤＩ、１２α−ＨＳＤ及びＮＡＤＳを含む均一な皮膜を形成できる方法であれば特に制限されない。通常、反応層の形成はＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳの作用電極の表面への固定を兼ねている。
酵素の作用電極表面への固定は、作用電極の表面に酵素を直接結合させる方法による固定のみではなく、作用電極表面と酵素の直接的な結合を伴わない固定も含む。
反応層の形成方法（酵素の固定方法）としては公知の方法、例えば、
（１）グルタルアルデヒドのような架橋剤を用いて、ＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳを作用電極の表面に直接固定する
（２）適当な官能基を表面に有する皮膜を作用電極の表面に形成し、その官能基にＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳを直接または架橋剤を用いて結合させる
（３）作用電極の表面に親水性高分子層を形成し、その上にＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳを含む水溶液を滴下し、乾燥させる
（４）作用電極の表面に網目状構造を有する高分子（例えば架橋されたアルブミン）の皮膜を形成し、この皮膜中にＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳを取り込ませる
などの方法を用いることができる。
上記（２）の方法における皮膜の具体的な例としては、窒素原子を有するモノマーをプラズマ重合により重合させることにより形成される、アミノ基を表面に有する皮膜や、アミノシラン類、ビニルシラン類、エポキシシラン類などの、官能基を有するシランカップリング剤の溶液をスピンコートなどの方法により塗布し、乾燥して得られる皮膜を挙げることができる。後者の皮膜を用いる場合、作用電極に対する密着性や、ＡＴＰの分析に関与する物質の選択的透過性の観点から、アミノシランの一種であるγ−アミノプロピルトリエトキシシランをシランカップリング剤として用いることが好ましい。この際、シランカップリング剤の濃度は１％（ｖ／ｖ）程度とすることが好ましい。
また上記（３）の方法は、タンパク質の電極系への吸着など、タンパク質と電極系の不必要な相互作用を防止することができる点で好ましい。
親水性高分子層は、親水性高分子の０．０５〜２％（ｗ／ｗ）水溶液を作用電極上に塗布し、乾燥させることによって形成することが好ましい。
親水性高分子の例としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシエチルメチルセルロース、エチルセルロース等の水溶性セルロース誘導体；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルコール；ゼラチン及びその誘導体；ポリアクリル酸およびその塩；デンプンおよびその誘導体；無水マレイン酸の重合体およびその塩；ポリアクリルアミド；メタクリレート樹脂；ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどを挙げることができる。
酵素溶液の塗布方法としては、滴下法、スピンコート法、ディップ法（浸漬法）等が用いられ、このうち膜厚制御性に優れるスピンコート法が好ましい。
乾燥は、酵素の活性が損なわれない範囲の温度で行うことが好ましく、室温（２５℃）〜４０℃の範囲とすることが好ましい。乾燥時間は、温度にもよるが、通常、０．５〜２４時間とする。乾燥は空気中で行っても良いが、窒素等の不活性ガス中で乾燥させてもよい。例えば、窒素を基板に吹き付けながら乾燥させる窒素ブロー法を用いることもできる。
以上のようにして得られる本発明の酵素電極を用いると、試料の煩雑な前処理を行うことなく、試料中のＡＴＰの濃度の測定を、高感度で、簡便且つ迅速に行うことができる。
以降、本発明の酵素電極を用いて試料中のＡＴＰの濃度を測定する方法につき説明する。
本発明において、試料中のＡＴＰの濃度の測定は、
アンモニアおよびアンモニウムイオンよりなる群から選ばれる少なくとも１種、ニコチン酸−アデニンジヌクレオチド（デアミドＮＡＤ＋）、胆汁酸塩並びに電子伝達物質を含む水溶液を、試料と混合して試料溶液を得；
該試料溶液を、上記の酵素電極の該作用電極、該対極および場合により該参照電極に接触させて、該試料溶液を介して電気回路を形成し；
該酵素電極の作用電極と対極、または作用電極と参照電極の間に電圧を印加して、該作用電極の表面で該電子伝達物質の酸化反応を行いながら、該作用電極における電流を測定し、但し、該酵素電極が参照電極を有しない場合は、該電圧を該作用電極と該対極の間に印加し、該酵素電極が参照電極を有する場合は、該電圧を該作用電極と該参照電極の間に印加するように構成されており；そして
該作用電極における該電流の測定値からＡＴＰの量を算出する
ことを含む方法によって行う。
アンモニアおよびアンモニウムイオンよりなる群から選ばれる少なくとも１種は、ＮＡＤＳの基質である。通常、これらの試料溶液中の濃度は、アンモニア水や、無機または有機アンモニウム塩を試料に添加することにより２〜２００ｍＭとする。
デアミドＮＡＤ＋もまた、ＮＡＤＳの基質となる化合物である。通常、デアミドＮＡＤ＋の試料溶液中の濃度は、２μＭ〜２ｍＭとする。
胆汁酸塩は１２α−ＨＳＤの基質となる化合物であり、コール酸、デオキシコール酸など、１２α位に水酸基を有する胆汁酸の、ナトリウム塩、カリウム塩などを用いることができる。通常、胆汁酸塩の試料溶液中の濃度は、０．２〜２０ｍＭとする。
電子伝達物質はＤＩの基質となる化合物であり、酸化型と還元型の２つの状態を取り得る。酸化型は、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の存在下、ＤＩによって還元されて還元型となる。還元型は、酵素電極が参照電極を有しない場合は作用電極と対極の間に、酵素電極が参照電極を有する場合は作用電極と参照電極の間に十分な電圧を印加すると、作用電極表面において電気化学的に酸化され、作用電極に電子を供給して酸化型となる。この電圧は電子伝達物質の種類等により異なるが、通常１００〜６００ｍＶである。
電子伝達物質の例としては、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム等の鉄シアノ錯体類；１，４−ベンゾキノン、トルキノン、１，４−ナフトキノン、ビタミンＫ３、２，５−ジクロロベンゾキノン、デュロキノン、２，５−ジメチルベンゾキノン、２，６−ジメチルベンゾキノン等のキノン類；リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド等のフラビン類；４−アミノフェノール、４−メチルアミノフェノール、２，６−ジクロロフェノール、インドフェノール等のフェノール類；フェナジンメトサルフェート等のフェナジニウム誘導体；メチレンブルー等のフェノチアジニウム誘導体；ヒドロキシメチルフェロセン、１−ヒドロキシエチルフェロセン、フェロセニウム六フッ化リン酸塩やフェロセニウム四フッ化ホウ酸塩等のフェロセン類；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン等のフェニレンジアミン類等を挙げることができる。これらのうち、鉄シアノ錯体類やフェロセン類が好ましい。
これらの電子伝達物質は、単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。通常、電子伝達物質の試料溶液中の濃度は、０．１〜１００ｍＭとする。
また、上記試料溶液には、反応層に含まれるＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが十分な酵素活性を示すように、緩衝剤を添加するのが好ましい。
緩衝剤の例としては、グリシン、リン酸、酢酸、ホウ酸、クエン酸、フタル酸やその塩（水素塩を含む）などを挙げることができる。また、いわゆるグッドの緩衝液に用いられる試薬、例えばＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳなどを用いても良い。
これらの緩衝剤は、単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
緩衝剤の種類と量は、ＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳが十分な酵素活性を示すよう、主にＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳの至適ｐＨを考慮して適宜選択するが、緩衝剤の種類によっては、緩衝剤が反応層内で及ぼす影響（例えば好ましくない副反応など）を考慮して選択すべきである。
緩衝剤の使用により達成されるｐＨの範囲は、好ましくは６．０〜１０．０であり、特に好ましくは８．０〜９．５である。試料溶液中の緩衝剤の濃度は、好ましくは１０〜１０００ｍＭ、より好ましくは２５〜４００ｍＭである。
所望により、試料溶液は上記以外の試薬、例えば塩類や界面活性剤などを更に含んでいてもよい。
試料を他の試薬類を含む水溶液と混合する方法や、それらの試薬類の性状には特に制限はない。従って、例えば固体（乾燥）状態の試薬類を酵素電極中の適当な位置に固定し、溶液状の試料を酵素電極に接触させる際に、試薬類が試料に溶解するようにする、という方法も用いることができる。
上記の試料溶液が酵素電極の作用電極に接触すると、作用電極上に位置する反応層の少なくとも一部に試料溶液が浸透し、試料溶液中のデアミドＮＡＤ＋およびアンモニアおよび／またはアンモニウムイオンから、ＮＡＤＳの作用により、試料溶液のＡＴＰ濃度に対応する量の酸化型ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）が生成する。このＮＡＤ＋を、１２α−ＨＳＤとＤＩを組み合わせた酵素的サイクリングにより検出する。
生成したＮＡＤ＋から、１２α−ＨＳＤの作用により還元型ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が生成し、同時に試料溶液中の胆汁酸塩が酸化される。
生成したＮＡＤＨから、ＤＩの作用により、ＮＡＤ＋が復元され、同時に酸化型の電子伝達物質が還元され、還元型の電子伝達物質となる。
ここで、酵素電極が参照電極を有しない場合は作用電極と対極の間に、酵素電極が参照電極を有する場合は作用電極と参照電極の間に十分な電圧を印加すると、上記したように、還元型の電子伝達物質は作用電極表面において電気化学的に酸化され、作用電極に電子を供給して酸化型の電子伝達物質に復元される。
このように、ＮＡＤＨの酸化／ＮＡＤ＋の還元と、電子伝達物質の酸化／還元が繰り返される。その間、作用電極表面における還元型電子伝達物質の電気化学的酸化に伴い作用電極への電子の供給が継続される。
このとき、作用電極への電子の供給の速さ、即ち作用電極における電流は試料溶液中のＡＴＰの濃度に比例するので、作用電極における電流を測定することにより、試料中のＡＴＰの濃度を求めることができる。
即ち、予めＡＴＰ濃度既知の標準溶液を用いてＡＴＰの濃度と作用電極における電流の関係を示す検量線を作成し、次いでＡＴＰ濃度未知の試料に関し、本発明の酵素電極を用いて求めた作用電極における電流を測定し、その測定値から、上記の検量線を用いてＡＴＰの濃度を容易に算出することができる。
ＤＩと１２α−ＨＳＤの組み合わせによるＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ系の酵素的サイクリングは、単位時間あたりの反応数が多い（反応回転数が高い）ので、一定量のＡＴＰに対応して作用電極に流れる電流が多い。この結果、本発明の酵素電極を用いると、測定感度が極めて高く、また迅速に分析を行うことができる。
電圧の印可は、通常０．５〜２分間行なえばよい。
なお本発明の酵素電極は、主としてＡＴＰの定量分析に使用されるが、デアミドＮＡＤ＋の定量分析や、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオンの定量分析にも使用することができる。
デアミドＮＡＤ＋の定量分析を行う場合には、上記のＡＴＰ濃度測定方法において、デアミドＮＡＤ＋の代わりにＡＴＰを用いる。また、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオンの定量分析を行う場合には、上記のＡＴＰ濃度測定方法において、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオンの代わりにＡＴＰを用いる。
試料中のＡＴＰの量に対応する量のＮＡＤ＋を生成させ、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ系酵素的サイクリングにより検出する方法は既に公知であったが（日本国特開平８−３３６３９７号明細書を参照）、この方法ではテトラゾリウム塩などの発色、即ち光学的手段により定量を行っており、酵素電極に関する開示はない。また、ここで用いられている酵素的サイクリングは、ＤＩと１２α−ＨＳＤの組み合わせによるものではなく、またこの組み合わせを示唆するものでもない。
また、ＤＩと１２α−ＨＳＤを組み合わせたＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ系酵素的サイクリングを電極上に形成した反応層中で実施できることは公知であり、これを利用した酵素電極も開示されているが（日本国特開２０００−１８９１８８号明細書を参照）、この酵素電極では、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨのみを分析の対象としており、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを生成させるための他の反応を電極近傍で実施することに関する開示はない。
本発明の酵素電極を用いるＡＴＰ濃度測定は、
上記の酵素電極；
上記の酵素電極の作用電極と対極、または作用電極と参照電極の間に、電子伝達物質が作用電極の表面において酸化反応を起こすのに十分な電圧を印加する手段；
作用電極における電流を測定する手段；
よりなるシステムを用いて行うことができる。
電圧を印加する手段や電流を測定する手段は公知のものが種々知られており、適当な市販品を使用することができる。これらの手段は別々の装置であってもよく、電圧を印加する機能と電流を測定する機能の両方を有する単一の装置であってもよい。
本発明の酵素電極は使い捨て型の酵素電極として使用しうるよう構成されているので、酵素電極の交換が容易であることが好ましい。このため上記のシステムは、本発明の酵素電極を容易に着脱可能な構造を有していることが好ましい。その例としては、
酵素電極のみが着脱自在になっている構造
酵素電極とその他の部分（例えば酵素電極と他の部分とを接続する配線）からなる部位が着脱自在になっている構造
などを挙げることができる。
また上記のシステムは、作用電極における電流の測定値からＡＴＰの量を算出する手段を更に含むことが好ましい。
このような手段として適当な、電流の測定値をアナログ／またはデジタル電気信号に変換し、この電気信号を電子計算機等により処理してＡＴＰの量（濃度）を算出するためのデータ処理装置が種々知られており、このような手段を用いることにより、より容易にＡＴＰの量（濃度）を知ることができる。
発明を実施するための最良の形態
以降、実施例および参考例によって本発明を説明するが、本発明はこれらの例によってなんら制限されるものではない。
参考例１
ジアフォラーゼ（ＤＩ）、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤ）およびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼ（ＮＡＤＳ）を含む反応層が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度測定用酵素電極の反応層として利用しうることを確認するための実験を行った。
３２００Ｕ／ｍｌのＤＩ（日本国旭化成株式会社製、カタログ番号Ｔ−０６）、９６００Ｕ／ｍｌの１２α−ＨＳＤ（日本国旭化成株式会社製、カタログ番号Ｔ−２９）および８８０Ｕ／ｍｌのＮＡＤＳ（日本国旭化成株式会社製、カタログ番号Ｔ−６７）を含む２５％（ｗ／ｖ）トレハロース水溶液０．５μｌを、１％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド水溶液０．２５μｌと混合し、得られた混合物を、鏡面仕上げした直径３ｍｍのガラス状カーボン電極（日本国ビー・エー・エス株式会社製、カタログ番号１１−２０１２）上に塗布して、室温（２５℃）で２時間静置し、上記の酵素を上記電極表面上に固定することにより、上記電極表面上にＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳを含む反応層を形成した。この反応層１ｃｍ２あたりの、蛋白質の総含有量は１．１６ｍｇであり、酵素活性で表わしたＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳの含有量はそれぞれ２２．６Ｕ、６７．９Ｕおよび６．２Ｕであった。
この電極（作用電極）を、飽和カロメル電極（参照電極）（日本国ビー・エー・エス株式会社製、カタログ番号１１−２０５５）および白金電極（対極）（日本国ビー・エー・エス株式会社製、カタログ番号１１−２２３０）と共にＭＣＡマイクロセルキット（日本国ビー・エー・エス株式会社製、カタログ番号１１−１０６５）に取り付け、ＢＡＳ−１００Ｂ型ポテンシオスタット（日本国ビー・エー・エス株式会社製）（このポテンシオスタットは、作用電極における電流を測定するための電流計の機能を有する。）に接続した。
一方、以下の組成を有する標準溶液１〜５を調製した。
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　上記ＭＣＡマイクロセルキットのサンプルホルダー（日本国ビー・エー・エス株式会社製、カタログ番号１１−２２２８）に、上記標準溶液１を２００μｌ注入し、これに上記作用電極を浸漬し、作用電極と参照電極の間に０．２ボルトの電圧を３０℃で３０分間印加した。
その後、サンプルホルダー内の標準溶液１を、上記標準溶液２に交換し、作用電極と参照電極の間に０．２ボルトの電圧を３０℃で１０分間印加し、上記ポテンシオスタットにて作用電極における電流を測定した。
次いで、標準溶液２に代えて上記標準溶液３〜５を用い、上記と同様の操作を行った。
更に、標準溶液２に代えて水を用い、上記と同様の操作を行った（これを「空試験」と称する）。
標準溶液２〜５を試料としたときの作用電極における電流の測定値から、空試験における電流の測定値を減じた値は、各々１５０、３９１、５０３および７３５ｎＡであった。
これらの数値と、標準溶液２〜５のＡＴＰ濃度の関係を図３に示す。
図３から明らかなように、上記の系では作用電極に試料中のＡＴＰ濃度に対応する電流が流れるので、この電流の測定値から試料中のＡＴＰ濃度を算出することができる。このことから、ＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳを含む反応層を、ＡＴＰ濃度測定用の酵素電極の反応層として利用しうることがわかった。
実施例１
図１（ｃ）に示す絶縁層５を有する電極系をスクリーン印刷により作成した。
厚さ１８８μｍのＰＥＴフィルムメリネックスＳ（日本国デュポン株式会社製）を絶縁性基板１として用い、その上に銀ペースト（日本国藤倉化成株式会社製、カタログ番号ＦＡ−３５３）およびレジスト（日本国藤倉化成株式会社製、カタログ番号ＸＣ−１０１Ｇ）を用いるスクリーン印刷によりリード２を形成した（図１（ａ）を参照）。
その上に、カーボンペースト（日本国藤倉化成株式会社製、カタログ番号ＦＣ−４１５）および上記レジストを用いるスクリーン印刷により作用電極３および対極４を形成した（図１（ｂ）を参照）。作用電極３の形状は、４ｍｍ角の正方形とした。
更に、リード２の末端部、作用電極３および対極４以外の部分に絶縁層５として熱硬化性ポリエステルの皮膜を形成し、電極系を得た（図１（ｃ）を参照）。
その後、作用電極３の表面をアルミナ懸濁液を用いて研磨した。
参考例１で用いたものと同様の、ＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳを含む２５％（ｗ／ｖ）トレハロース水溶液５μｌを、１％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド水溶液２．５μｌと混合し、得られた混合物を上記作用電極上に塗布して、室温（２５℃）で２時間静置し、上記の酵素を上記作用電極表面上に固定することにより、上記作用電極表面上にＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳを含む反応層を形成し、酵素電極を作成した。この反応層の形状は６ｍｍ角の正方形で、上記作用電極全体を覆っており、この反応層１ｃｍ２あたりの、蛋白質の総含有量は２．１５ｍｇであり、酵素活性で表わしたＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳの含有量はそれぞれ４４．４Ｕ、１３３．３Ｕおよび１２．２Ｕであった。
この酵素電極の作用電極および対極を、参考例１で用いたものと同じポテンシオスタットに接続した。
一方、以下の組成を有する標準溶液６〜１１を調製した。
2002025262.tif 000004
　上記作用電極の表面全体が上記標準溶液６に浸るまで、標準溶液６を作用電極上に滴下し、作用電極と参照電極の間に０．２ボルトの電圧を２２℃で３０分間印加した。
その後、作用電極上の標準溶液６を、上記標準溶液７に交換し、作用電極と参照電極の間に０．２ボルトの電圧を２２℃で１０分間印加し、上記ポテンシオスタットにて作用電極における電流を測定した。
次いで、標準溶液７に代えて上記標準溶液８〜１１を用い、上記と同様の操作を行った。
更に、標準溶液７に代えて水を用い、上記と同様の操作を行った（これを「空試験」と称する）。
標準溶液７〜１１を試料としたときの作用電極における電流の測定値から、空試験における電流の測定値を減じた値は、各々１７３、２９０、４１３、５９４および７９１ｎＡであった。
これらの数値と、標準溶液７〜１１のＡＴＰ濃度の関係を図４に示す。
図４から明らかなように、上記の系では作用電極に試料中のＡＴＰ濃度に対応する電流が流れるので、この電流の測定値から試料中のＡＴＰ濃度を算出することができる。
実施例２
作用電極３上に形成した反応層の形状を４ｍｍ角の正方形（従って、反応層の面積は作用電極の面積と同じで０．１６ｃｍ２）とした以外は、実施例１で作成したものと同様の電極系を作成した。
上記作用電極上に０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液３μｌを滴下して乾燥することにより、ＣＭＣ層を形成した。
このＣＭＣ層上に、２．１ｍｇ／ｍｌ（１００Ｕ／ｍｌ）のＤＩ（参考例１で用いたものと同じ）、４．６ｍｇ／ｍｌ（１０００Ｕ／ｍｌ）の１２α−ＨＳＤ（参考例１で用いたものと同じ）、１．５ｍｇ／ｍｌ（５０Ｕ／ｍｌ）のＮＡＤＳ（参考例１で用いたものと同じ）および２．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む水溶液６μｌを滴下して乾燥し、上記の酵素を上記作用電極表面上に固定することにより、上記作用電極表面上にＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳを含む反応層を形成し、酵素電極を作成した。この反応層１ｃｍ２あたりの、蛋白質の総含有量は０．４０ｍｇであり、酵素活性で表わしたＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳの含有量はそれぞれ３．７５Ｕ、３７．５Ｕおよび１．８７５Ｕであった。
この酵素電極の作用電極および対極を、参考例１で用いたものと同じポテンシオスタットに接続した。
一方、以下の組成を有する標準溶液１２〜１８を調製した。
2002025262.tif 000005
　上記標準溶液１２を１００μｌ上記作用電極上に滴下し、作用電極と参照電極の間に４００ｍＶの電圧を２５℃で３０秒印加し、上記ポテンシオスタットにて作用電極における電流を測定した（これを「空試験」と称する）。
次いで、標準溶液１２に代えて上記標準溶液１３〜１７を用い、上記と同様の操作を行った。
標準溶液１３〜１７を試料としたときの作用電極における電流の測定値から、空試験における電流の測定値を減じた値は、各々３９、７３、１５４、３０１および７５３ｎＡであった。
これらの数値と、標準溶液１２〜１７のＡＴＰ濃度の関係を図５に示す。
図５から明らかなように、上記の系では作用電極に試料中のＡＴＰ濃度に対応する電流が流れるので、この電流の測定値から試料中のＡＴＰ濃度を算出することができる。
参考例２
反応層中の作用電極上に位置する部分に関する蛋白質の総含有量が、酵素電極の測定感度に及ぼす影響を調べた。
（Ａ）
ＣＭＣ層上に塗布する水溶液として、１２．４ｍｇ／ｍｌ（５３０Ｕ／ｍｌ）のＤＩ（参考例１で用いたものと同じ）、５．９ｍｇ／ｍｌ（１３００Ｕ／ｍｌ）の１２α−ＨＳＤ（参考例１で用いたものと同じ）および５．９ｍｇ／ｍｌ（１３０Ｕ／ｍｌ）のＮＡＤＳ（参考例１で用いたものと同じ）を含む水溶液を用い、反応層１ｃｍ２あたりの、蛋白質の総含有量が０．９１ｍｇとなり、酵素活性で表わしたＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳの含有量が２０Ｕ、５０Ｕおよび５Ｕとなるようにし、また標準溶液１３〜１７に代えて標準溶液１２に５００ｎＭのＡＴＰを加えた溶液である標準溶液１８を用いる以外は、実施例２と同様の操作を行った。
（Ｂ）
一方、ＣＭＣ層上に塗布する水溶液として、１５．５ｍｇ／ｍｌ（６７０Ｕ／ｍｌ）のＤＩ（参考例１で用いたものと同じ）、７．４ｍｇ／ｍｌ（１７００Ｕ／ｍｌ）の１２α−ＨＳＤ（参考例１で用いたものと同じ）および７．４ｍｇ／ｍｌ（１７０Ｕ／ｍｌ）のＮＡＤＳ（参考例１で用いたものと同じ）を含む水溶液を用い、反応層１ｃｍ２あたりの、蛋白質の総含有量が１．１４ｍｇとなり、酵素活性で表わしたＤＩ、１２α−ＨＳＤおよびＮＡＤＳの含有量が２５Ｕ、６２．５Ｕおよび６．２５Ｕとなるようにする以外は、上記（Ａ）と同様の操作を行った。
上記（Ａ）および（Ｂ）に関し、作用電極における電流の測定値から、空試験における電流の測定値を減じた値を比較すると、後者は前者の７３％であった。
このことから、反応層中の作用電極上に位置する部分に関する蛋白質の総含有量が最適量よりも高いと、反応層中の酵素活性で表わした酵素の含有量が増加しても、酵素電極の測定感度が低下することがわかった。
参考例３
反応層中の作用電極上に位置する部分に関する蛋白質の総含有量が、酵素電極の測定感度に及ぼす影響を調べた。
（Ｃ）
ＣＭＣ層上に塗布する水溶液として、１５．５ｍｇ／ｍｌ（６７０Ｕ／ｍｌ）のＤＩ（参考例１で用いたものと同じ）、７．４ｍｇ／ｍｌ（１７００Ｕ／ｍｌ）の１２α−ＨＳＤ（参考例１で用いたものと同じ）、７．４ｍｇ／ｍｌ（１７０Ｕ／ｍｌ）のＮＡＤＳ（参考例１で用いたものと同じ）および９．３５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む水溶液を用い、反応層１ｃｍ２あたりの、蛋白質の総含有量が１．４９ｍｇとなるようにする（このとき、酵素活性は参考例２の（Ｂ）と同じ）以外は、参考例２の（Ａ）と同様の操作を行った。
（Ｄ〜Ｆ）
また、ＢＳＡの濃度を１８．８ｍｇ／ｍｌ、２５．０ｍｇ／ｍｌおよび５０．０ｍｇ／ｍｌとし、反応層１ｃｍ２あたりの、蛋白質の総含有量が１．８４ｍｇ、２．０７ｍｇおよび３．０１ｍｇとなるようにする（このとき、酵素活性は参考例２の（Ｂ）と同じ）以外は、上記（Ｃ）と同様の操作を行った。
参考例２の（Ａ）および上記（Ｃ）〜（Ｆ）に関し、作用電極における電流の測定値から、空試験における電流の測定値を減じた値を比較すると、上記（Ｃ）〜（Ｆ）の測定値はそれぞれ参考例２の（Ａ）の測定値の５７％、３８％、２２％および５％であった。
このことから、反応層中の作用電極上に位置する部分に関する蛋白質の総含有量がある範囲を超えると、蛋白質の総含有量が高いほど酵素電極の測定感度が低下することがわかった。
参考例４
反応層中の作用電極上に位置する部分に関する、酵素活性で表わした酵素の含有量が、酵素電極の測定感度に及ぼす影響を調べた。
（Ｇ〜Ｊ）
ＣＭＣ層上に塗布する水溶液を、２倍、４倍、１６倍および８０倍に希釈して用いる（従って、酵素活性で表わした酵素の含有量は、反応層中の各々参考例２の（Ａ）の１／２、１／４、１／１６および１／８０）以外は、参考例２の（Ａ）と同様の操作を行った。
参考例２の（Ａ）および上記（Ｇ）〜（Ｊ）に関し、作用電極における電流の測定値から、空試験における電流の測定値を減じた値を比較すると、上記（Ｆ）〜（Ｉ）の測定値はそれぞれ参考例２の（Ａ）の測定値の６３％、４７％、３３％および４％であった。
このことから、反応層中の作用電極上に位置する部分に関する、酵素活性で表わした酵素の含有量が低いほど、酵素電極の測定感度が低下することがわかった。
産業上の利用可能性
本発明の酵素電極を用いると、ＡＴＰ濃度測定装置を小型化することができる上、試料の煩雑な前処理を行うことなく、試料中のＡＴＰの濃度の測定を、高感度で、簡便且つ迅速に行うことができるので、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
図１（ａ）〜（ｃ）は、実施例１および２、並びに参考例２〜４において使用した電極系の製造工程を示す図である。
図１（ａ）は、絶縁性基板１の表面にリード２を形成したものを示す。
図１（ｂ）は、図１（ａ）中のリード２に重なるように、作用電極３と対極４を形成したものを示す。
図１（ｃ）は、図１（ｂ）中のリード２の末端、作用電極３および対極４以外の部分に絶縁層５を形成したものを示す。
図２は、実施例１および２、並びに参考例２〜４において使用した電極系における、絶縁性基板１、リード２、作用電極３、対極４および絶縁層５の、厚み方向の相対的な位置関係を示す図である。
図３は、参考例１における試料中のＡＴＰ濃度と電流の測定値の関係を示すグラフである。
図４は、実施例１における試料中のＡＴＰ濃度と電流の測定値の関係を示すグラフである。
図５は、実施例２における試料中のＡＴＰ濃度と電流の測定値の関係を示すグラフである。
符号の説明
図１（ａ）〜（ｃ）および図２において、参照番号は次の意味を有する。
１：絶縁性基板
２：リード
３：作用電極
４：対極
５：絶縁層
【図１（ａ）】
2002025262.tif 000006
【図１（ｂ）】
2002025262.tif 000007
【図１（ｃ）】
2002025262.tif 000008
【図２】
2002025262.tif 000009
【図３】
2002025262.tif 000010
【図４】
2002025262.tif 000011
【図５】
2002025262.tif 000012
【国際調査報告】
2002025262.tif 000013
2002025262.tif 000014
2002025262.tif 000015
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