(57)【要約】本発明によれば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を用いてＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、およびＮ−アセチルガラクトサミン含有糖質を製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン　４−エピメラーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼと略す）活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと略す）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと略す）を生成蓄積させ、該水性媒体中からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを採取することを特徴とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
【請求項２】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、受容体糖質、Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、ＧａｌＮＡｃと略す）転移酵素およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＧａｌＮＡｃ含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からＧａｌＮＡｃ含有糖質を採取することを特徴とするＧａｌＮＡｃ含有糖質の製造法。
【請求項３】
ウリジン−５’−三リン酸（以下、ＵＴＰと略す）の前駆物質と糖とからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＵＴＰの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを生成蓄積させ、該水性媒体中からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを採取することを特徴とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
【請求項４】
ＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、ＧａｌＮＡｃ転移酵素およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＵＴＰの前駆物質、糖および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＧａｌＮＡｃ含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からＧａｌＮＡｃ含有糖質を採取することを特徴とするＧａｌＮＡｃ含有糖質の製造法。
【請求項５】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
受容体糖質が、非還元末端にシアル酸、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、グルクロン酸またはイズロン酸を有するオリゴ糖を含む複合糖質であることを特徴とする、請求項２または４に記載の製造法。
【請求項７】
非還元末端にシアル酸、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、グルクロン酸またはイズロン酸を有するオリゴ糖が、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、グロボトリオース、シアリルラクトース、シアリル　Ｎ−アセチルラクトサミン、ルイスＸ、ルイスａ、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、Ｈ　ｔｙｐｅ　１（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）またはＨ　ｔｙｐｅ　２（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）であることを特徴とする請求項６に記載の製造法。
【請求項８】
受容体糖質が、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、グロボトリオース、シアリルラクトース、シアリル　Ｎ−アセチルラクトサミン、ルイスＸ、ルイスａ、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、Ｈ　ｔｙｐｅ　１（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）またはＨ　ｔｙｐｅ　２（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃであることを特徴とする、請求項２または４に記載の方法。
【請求項９】
前駆物質が、オロット酸、オロチジン、ウラシル、ウリジンまたはウリジン−５’−−リン酸である請求項３または４に記載の製造法。
【請求項１０】
糖が、グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンである請求項３または４に記載の製造法。
【請求項１１】
ＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生成する能力を有する微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、およびサッカロマイセス属に属する微生物から選ばれる１以上の微生物である請求項３または４に記載の製造法。
【請求項１２】
エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリである請求項１１に記載の製造法。
【請求項１３】
コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである請求項１１に記載の製造法。
【請求項１４】
サッカロマイセス属に属する微生物が、サッカロマイセス・セレビシエである請求項１１に記載の製造法。
【請求項１５】
形質転換体が、微生物に組換え体ＤＮＡを導入して得られる形質転換体である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の製造法。
【請求項１６】
微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、およびサッカロマイセス属に属する微生物から選ばれる微生物である請求項１５に記載の製造法。
【請求項１７】
エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリである請求項１６に記載の製造法。
【請求項１８】
コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである請求項１６に記載の製造法。
【請求項１９】
サッカロマイセス属に属する微生物が、サッカロマイセス・セレビシエである請求項１６に記載の製造法。
【請求項２０】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質が、バチルス属あるいはナイセリア属に属する微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２１】
バチルス属に属する微生物が、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、およびバチルス・ステアロサーモフィラスから選ばれる微生物である請求項２０に記載の製造法。
【請求項２２】
ナイセリア属に属する微生物が、ナイセリア・ゴノリーアまたはナイセリア・メニンギティディスである請求項２０に記載の製造法。
【請求項２３】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である請求項１〜４、および２０〜２２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２４】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である請求項１〜４、および２０〜２２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２５】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１〜４、および２０〜２２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２６】
組換え体ＤＮＡが、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請求項１５に記載の製造法。
【請求項２７】
組換え体ＤＮＡが、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ（以下、ｇａｌＥタンパク質と略す）をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請求項１５に記載の製造法。
【請求項２８】
ｇａｌＥタンパク質が、バチルス属またはナイセリア属に属する微生物由来のｇａｌＥタンパク質である請求項２７に記載の製造法。
【請求項２９】
バチルス属に属する微生物が、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、およびバチルス・ステアロサーモフィラスから選ばれる微生物である請求項２８に記載の製造法。
【請求項３０】
ナイセリア属に属する微生物が、ナイセリア・ゴノリーアまたはナイセリア・メニンギティディスである請求項２８に記載の製造法。
【請求項３１】
組換え体ＤＮＡが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請求項１５に記載の製造法。
【請求項３２】
組換え体ＤＮＡが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請求項１５に記載の製造法。
【請求項３３】
組換え体ＤＮＡが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請求項１５に記載の製造法。
【請求項３４】
組換え体ＤＮＡが、配列番号３または配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請求項１５に記載の製造法。
【請求項３５】
組換え体ＤＮＡが、配列番号３または４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請求項１５に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミン含有糖質の製造法に関する。Ｎ−アセチルガラクトサミン含有糖質には、ガン細胞などで特異的に発現するものが存在するため、ガンワクチンなどガン治療に有用である。また、Ｎ−アセチルガラクトサミン含有糖質は脳に多く存在していることから、脳機能改善への応用が期待されている。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンはＮ−アセチルガラクトサミン含有糖質の合成基質などとして有用である。
背景技術
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと略す）の製造法に関しては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓの無細胞抽出液あるいは粗精製酵素を用いた方法［米国特許第４，５６９，９０９号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４，２８０１（１９５９）、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，１７４１（１９７３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１，３９２（１９８１）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０，１０８５（１９８６）、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，６０３（１９８５）］等が知られているが、上記製造法によるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの生産量は低く、またＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン　４−エピメラーゼ（ＥＣ　５．１．３．７、以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼと略す）、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼをコードする遺伝子自体は未だ特定されていない。
微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼに関しては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＷｂｐＰタンパク質がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有しているとの報告［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１９０６０（２０００）］があるが、該タンパク質および該タンパク質をコードするＤＮＡを用いたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造に関する報告はない。
一方、ＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ（ＥＣ　５．１．３．２）については、ハムスターおよびヒト由来の該酵素がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをも基質とすることが知られている［Ｃｅｌｌ，４４，７４９（１９８６）］が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，１４，７７０５（１９８６）］が、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有しているとの報告はない。また、上記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＷｂｐＰタンパク質は既知のＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼとは相同性はない。
また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｅｒｗｉｎｉａ　ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．、Ａｚｏｓｐｉｒｉｕｍ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．ＮＲＣ−１、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ　ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｃａｒｎｏｓｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等由来のタンパク質において、既知のＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼのアミノ酸配列と相同性が高いことからＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ（ｇａｌＥ）とされているタンパク質、またＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ等の微生物由来のタンパク質において、既知のＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼのアミノ酸配列と相同性は高いが、未だその機能付けがされていないタンパク質が知られているが、これらのタンパク質がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有し、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの生産に利用できることについては知られていない。
発明の開示
本発明は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミン含有糖質の製造法を提供することを目的とする。
本発明者らは、既知のＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼのアミノ酸配列と相同性が高いことからＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ（ｇａｌＥ）とされているタンパク質、または既知のＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼのアミノ酸配列と相同性は高いが、未だその機能付けがされていないタンパク質が、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン　４−エピメラーゼ活性を有すること、および該酵素を用いてＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンとＮ−アセチルガラクトサミン含有糖質を効率的に生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（３５）に関する。
（１）　ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン　４−エピメラーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼと略す）活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと略す）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと略す）を生成蓄積させ、該水性媒体中からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを採取することを特徴とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
（２）　ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、受容体糖質、Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、ＧａｌＮＡｃと略す）転移酵素およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＧａｌＮＡｃ含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からＧａｌＮＡｃ含有糖質を採取することを特徴とするＧａｌＮＡｃ含有糖質の製造法。
（３）　ウリジン−５’−三リン酸（以下、ＵＴＰと略す）の前駆物質と糖とからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＵＴＰの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを生成蓄積させ、該水性媒体中からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを採取することを特徴とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
（４）　ＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、ＧａｌＮＡｃ転移酵素およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＵＴＰの前駆物質、糖および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＧａｌＮＡｃ含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からＧａｌＮＡｃ含有糖質を採取することを特徴とするＧａｌＮＡｃ含有糖質の製造法。
（５）　培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の製造法。
（６）　受容体糖質が、非還元末端にシアル酸、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、グルクロン酸またはイズロン酸を有するオリゴ糖を含む複合糖質であることを特徴とする（２）または（４）に記載の製造法。
（７）　非還元末端にシアル酸、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、グルクロン酸またはイズロン酸を有するオリゴ糖が、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、グロボトリオース、シアリルラクトース、シアリル　Ｎ−アセチルラクトサミン、ルイスＸ、ルイスａ、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、Ｈ　ｔｙｐｅ　１（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）またはＨ　ｔｙｐｅ　２（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）であることを特徴とする（６）に記載の製造法。
（８）　受容体糖質が、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、グロボトリオース、シアリルラクトース、シアリル　Ｎ−アセチルラクトサミン、ルイスＸ、ルイスａ、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、Ｈ　ｔｙｐｅ　１（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）またはＨ　ｔｙｐｅ　２（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃであることを特徴とする（２）または（４）記載の方法。
（９）　前駆物質が、オロット酸、オロチジン、ウラシル、ウリジンまたはウリジン−５’−−リン酸である（３）または（４）に記載の製造法。
（１０）　糖が、グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンである（３）または（４）に記載の製造法。
（１１）　ＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生成する能力を有する微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、およびサッカロマイセス属に属する微生物から選ばれる１以上の微生物である（３）または（４）に記載の製造法。
（１２）　エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリである（１１）に記載の製造法。
（１３）　コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである（１１）に記載の製造法。
（１４）　サッカロマイセス属に属する微生物が、サッカロマイセス・セレビシエである（１１）に記載の製造法。
（１５）　形質転換体が、微生物に組換え体ＤＮＡを導入して得られる形質転換体である、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の製造法。
（１６）　微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、およびサッカロマイセス属に属する微生物から選ばれる微生物である（１５）に記載の製造法。
（１７）　エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリである（１６）に記載の製造法。
（１８）　コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである（１６）に記載の製造法。
（１９）　サッカロマイセス属に属する微生物が、サッカロマイセス・セレビシエである（１６）に記載の製造法。
（２０）　ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質が、バチルス属あるいはナイセリア属に属する微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である（１）〜（４）のいずれか１つに記載の製造法。
（２１）　バチルス属に属する微生物が、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、およびバチルス・ステアロサーモフィラスから選ばれる微生物である（２０）に記載の製造法。
（２２）　ナイセリア属に属する微生物が、ナイセリア・ゴノリーアまたはナイセリア・メニンギティディスである（２０）に記載の製造法。
（２３）　ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である（１）〜（４）、および（２０）〜（２２）のいずれか１つに記載の製造法。
（２４）　ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である（１）〜（４）、および（２０）〜（２２）のいずれか１つに記載の製造法。
（２５）　ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である（１）〜（４）、および（２０）〜（２２）のいずれか１つに記載の製造法。
（２６）　組換え体ＤＮＡが、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである（１５）に記載の製造法。
（２７）　組換え体ＤＮＡが、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ（以下、ｇａｌＥタンパク質と略す）をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである（１５）に記載の製造法。
（２８）　ｇａｌＥタンパク質が、バチルス属またはナイセリア属に属する微生物由来のｇａｌＥタンパク質である（２７）に記載の製造法。
（２９）　バチルス属に属する微生物が、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、およびバチルス・ステアロサーモフィラスから選ばれる微生物である（２８）に記載の製造法。
（３０）　ナイセリア属に属する微生物が、ナイセリア・ゴノリーアまたはナイセリア・メニンギティディスである（２８）に記載の製造法。
（３１）　組換え体ＤＮＡが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである（１５）に記載の製造法。
（３２）　組換え体ＤＮＡが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである（１５）に記載の製造法。
（３３）　組換え体ＤＮＡが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである（１５）に記載の製造法。
（３４）　組換え体ＤＮＡが、配列番号３または配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである（１５）に記載の製造法。
（３５）　組換え体ＤＮＡが、配列番号３または４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである（１５）に記載の製造法。
本発明の製造法に用いられるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質としては、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質であれば、いずれのタンパク質も用いることができるが、例えば以下の（１）〜（６）のタンパク質をあげることができる。
（１）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するｇａｌＥタンパク質
（２）ｇａｌＥタンパク質のアミノ酸配列と相同性が高いことからｇａｌＥタンパク質の機能を有するとされているタンパク質であって、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質
（３）ｇａｌＥタンパク質のアミノ酸配列と５０％以上の相同性があるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質
（４）配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（５）配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質
（６）配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するｇａｌＥタンパク質としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｇａｌＥタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ９９３３９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のｇａｌＥタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｚ２１５５０８）などをあげることができる。
また、公知のｇａｌＥタンパク質のアミノ酸配列と同性が高いことからｇａｌＥタンパク質とされているタンパク質としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＰ００１５１０、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ５７３１５、Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｕ７８０８９、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＬ０７８４６８、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０８３４６７、Ｅｒｗｉｎｉａ　ａｍｙｌｏｖｏｒａ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ７６１７２、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｚ４７７６７、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＣＪ１１１６８Ｘ４、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０１６８４４、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＥ００４４０５、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２４８５８４、Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｕ３１５４４、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ８３９２７、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ３３６８１、Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＪ００５０８１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＥ００４５６８、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＪ０１１６５３、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＥ０００７２１、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｄ９０９１０、Ａｚｏｓｐｉｒｉｕｍ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｕ０９３４９、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ５８１２６、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ９６５０７、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＥ０００８４４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｚ４９８２３、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２２１９５１、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２７７００２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＬ３５９９８９、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ１８９５３、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＥ００２０５３、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２５３３１１、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＥ００１７２７、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ９４９６４、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｕ６７４７７、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．ＮＲＣ−１由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＥ００４９７５、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＰ０００００７、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＪ２４８２８４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ００９９６２２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ８６５０５、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＥ００１９２７、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ　ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＥ００１０７９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｃａｒｎｏｓｕｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ１０９２９５およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ３８１７５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をあげることができる。
ｇａｌＥタンパク質のアミノ酸配列と５０％以上の相同性があるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ由来のＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ８０３３８に記載のタンパク質、およびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ等の微生物由来のタンパク質をあげることができる。
ｇａｌＥタンパク質のアミノ酸配列と５０％以上の相同性があるアミノ酸配列を有するタンパク質としては、ｇａｌＥタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しているアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
さらに、本発明の製造法に用いられるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質として、より具体的には、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラスなどのバチルス属、あるいはナイセリア・ゴノリーア、ナイセリア・メニンギティディスなどのナイセリア属に属する微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質が例示される。
１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ．（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。
欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の方法により欠失、置換、挿入または付加できる程度の数であり、１個〜数十個、好ましくは１個〜２０個、より好ましくは１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個である。
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の製造法に用いられるタンパク質がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するためには、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記した条件下で計算したときに、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
本発明の製造法に用いられるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、上記（１）〜（６）のタンパク質をコードするＤＮＡをあげることができる。
具体的には、配列番号３または配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載のタンパク質をコードするＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記条件下で計算したときに、配列番号３または配列番号４で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明の製造法に用いられるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換株は、例えば上記方法により作製した該タンパク質をコードするＤＮＡをモレキュラー・クローニング第２版記載の方法に従ってベクターＤＮＡと連結することで組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを用いてモレキュラー・クローニング第２版記載の方法に従って宿主細胞を形質転換することにより取得することができる。
以下に、本発明の製造法に用いられるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換体の作製について説明する。
（１）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの調製
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、該酵素活性を有する生物であればいずれの生物由来のＤＮＡを用いても調製できる。例えば、好ましくは微生物、より好ましくはバチルス属またはナイセリア属に属する微生物、さらに好ましくはバチルス・サチルスＭＩ１１２（ＡＴＣＣ　３３７１２）またはナイセリア・ゴノリーア（ＡＴＣＣ　３３０８４）等由来のＤＮＡをあげることができる。
バチルス属およびナイセリア属に属する微生物は、公知の方法により培養できる。培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む断片は、ＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ（ＥＣ　５．１．３．２）活性を有するとされているタンパク質をコードする、公知のＤＮＡの塩基配列に基づいたプライマーセットを調製し、該染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈａｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）］により取得することができる。該塩基配列としては、配列番号１で表されるバチルス・サチルス由来または配列番号２で表されるナイセリア・ゴノリーア由来の塩基配列を例示することができる。
また、公知の塩基配列に基づいて設計された合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法などにより目的とするＤＮＡを取得することもできる。
また、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを合成ＤＮＡを用いて常法［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈａｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）］に従ってＰＣＲ法などにより、人工的に合成することも可能である。
（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡのクローン化と塩基配列の確認
上記（１）で調製した本発明の製造法に用いられるＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに連結する。
該ＤＮＡを連結するベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製可能なベクターであればファージベクター、プラスミドベクター等いずれも使用可能であるが、具体的には、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［ストラタジーン社製、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ　ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）］、λ　ＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
該ベクターに（１）で取得した本発明の製造法に用いられるＤＮＡを連結して得られる組換え体ＤＮＡの宿主に用いるエシェリヒア・コリは、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができるが、具体的には、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’［ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｙ１０８８［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記のようにして得られた形質転換体から組換え体ＤＮＡを抽出し、該組換えＤＮＡに含まれる本発明のＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］または３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いることができる。
上記のようにして取得した組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体として、例えば配列番号３で表される塩基配列を有するプラスミドＤＮＡを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ７３、または配列番号４で表される塩基配列を有するプラスミドＤＮＡを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ２４をあげることができる。
（３）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の作製
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体の作製は、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、行うことができる。
即ち、上記で取得されたＤＮＡを基にして、必要に応じて該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を作製することができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体ＤＮＡ中への組込が可能で、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ＰＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＧＨＡ２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＧＫＡ２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ　１プロモーター、ｇａｌ　１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ　１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃ含有糖質の調製に用いられる上記で作製された形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の製造法に用いられる形質転換体がエシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリン、テトラサイクリンやクロラムフェニコール等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
このようにして得られた形質転換体の培養物および該培養物を種々処理した培養物の処理物を酵素源として用い、水性媒体中でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ含有糖質を製造することができる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体のタンパク質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃあるいはＧａｌＮＡｃ含有糖質の生成において用いられる酵素源は、３７℃で１分間に１μｍｏｌのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃあるいはＧａｌＮＡｃ含有糖質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１０，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃあるいはＧａｌＮＡｃ含有糖質の生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養物を水性媒体として用いることができる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃあるいはＧａｌＮＡｃ含有糖質の生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ＧａｌＮＡｃ含有糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。
界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃ含有糖質の生成において用いられるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、市販品の他、微生物等の活性を利用して生成した反応液あるいは該反応液から精製したものを用いることができる。微生物としては、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、サッカロマイセス属に属する微生物をあげることができる。より具体的には、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、サッカロマイセス・セレビシエなどを例示することができる。これらの微生物は単独で用いてもよいし、２種類以上の微生物を組み合わせて用いてもよい。該糖ヌクレオチド基質は０．１〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは、上記酵素源、およびＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＵＴＰの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを生成蓄積させ、該水性媒体中からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを採取することにより製造することができる。
当該製造法において用いられるＵＴＰの前駆物質としてはオロット酸、オロチジン、ウリジン、ウラシル、ウリジン−５’−−リン酸等をあげることができる。該前駆物質は、精製品および該前駆物質の塩ならびに夾雑物が反応を阻害しない限り、微生物により生産された該前駆物質を含有する培養物および該培養物からの粗精製物などを用いることができる。該前駆物質は０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜１．０ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．５ｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。
当該製造法において用いられる糖としてはグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン等をあげることができる。該糖は、精製品を用いてもよいし、これらを含有するもので、夾雑物が反応を阻害しないものであればいずれも用いることができる。糖は反応開始時に一括して添加してもよいし、反応中分割して、あるいは連続的に添加することもでき、０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜２．０ｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。
ＧａｌＮＡｃ含有糖質は、上記酵素源、およびＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生成する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物およびＧａｌＮＡｃ転移酵素を酵素源に用い、該酵素源、ＵＴＰの前駆物質、糖および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＧａｌＮＡｃ含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からＧａｌＮＡｃ含有糖質を採取することにより製造できる。
ＧａｌＮＡｃ含有糖質の生成において用いられる受容体糖質としては、ＧａｌＮＡｃ転移酵素の基質となるものであればいずれも用いることができ、例えば、非還元末端にシアル酸、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、グルクロン酸、またはイズロン酸などを有するオリゴ糖を含む受容体糖質を例示することができる。上記の非還元末端にシアル酸、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、グルクロン酸、またはイズロン酸などを有するオリゴ糖の具体的例としては、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、グロボトリオース、シアリルラクトース、シアリル　Ｎ−アセチルラクトサミン、ルイスＸ，ルイスａ、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、Ｈ　ｔｙｐｅ　１（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）またはＨ　ｔｙｐｅ　２（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を例示することができる。より好適な受容体糖質としては、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、グロボトリオース、シアリルラクトース、シアリル　Ｎ−アセチルラクトサミン、ルイスＸ，ルイスａ、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、Ｈ　ｔｙｐｅ　１（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）またはＨ　ｔｙｐｅ　２（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を例示することができる。
該受容体糖質は０．１〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いる。
上記ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃ含有糖質の生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２等の無機塩、β−メルカプトエタノール等を添加することができる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃ含有糖質の生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。
水性媒体中に生成したＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃ含有糖質の定量は公知の方法に準じて行うことができる［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０，１０８５（１９８６）、化学と工業，４３，９５３（１９９０）］。
反応液中に生成したＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃ含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができ、例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃにおいてはＡｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，１７４１（１９７３）記載の方法に準じて、またＧａｌＮＡｅ含有糖質においてはＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４７，５４１６（１９８２）記載の方法に準じて行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼを生産する形質転換体の造成
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１２株（ＡＴＣＣ　３３７１２）をＬＢ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ）２０ｍｌの入った３００ｍｌ容フラスコに植菌し、３７℃で１６時間培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載されている方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓのＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするとされているｇａｌＥ遺伝子の塩基配列［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４２，３１１３（１９９６）］に基づき、配列番号５および配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡをパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成し、該ＤＮＡをプライマーセットとして用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として以下の方法によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ　０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）４μｌ、ｄｅｏｘｙ　ＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃で３分間を１工程とする反応を３０回繰り返すことにより行い、約１．０ｋｂのＰＣＲ産物を取得した。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］に溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ社製）によりＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ遺伝子を含む１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＰＡＣ３１　０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＧＴ７３を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）。
実施例２　Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼを生産する形質転換体の造成
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ　３３０８４）を公知の方法（ＵＳＰ　５，５４５，５５３）に従って培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載されている方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製した。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするとされているｇａｌＥ遺伝子の塩基配列［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，８９１（１９９３）］に基づき、配列番号７および配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡをパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成し、該ＤＮＡをプライマーセットとして用いて、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＡＴＣＣ　３３０８４）の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件によりＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂのＰＣＲ産物を取得した。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットによりＵＤＰ−グルコース　４−エピメラーゼ遺伝子を含む１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＰＡＣ３１　０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＧＴ２４を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第２図）。
実施例３　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素を生産する形質転換体の造成
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ（ＡＴＣＣ　４３４４６）を公知の方法［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，２０４９（１９９８）］に従って培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載されている方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製した。
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ（ＡＴＣＣ　４３４４６）のβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，３８９６（２０００）］に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した配列番号９および１０で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用いて、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ（ＡＴＣＣ　４３４４６）の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件によりＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ社製）によりβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子を含む１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
また、配列番号１１および１２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用いてｐＰＡＣ３１を鋳型として前述と同一の条件によりＰＣＲ反応を行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットによりＰＬプロモーターを含む０．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＰＡＣ３１　０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂ、０．３ｋｂおよび５．２ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＧＴ８７を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第３図）。
実施例４　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来α１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素を生産する形質転換体の造成
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ（ＡＴＣＣ　４３４４６）のα１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子をコードする遺伝子の塩基配列［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，２０４９（１９９８）］に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用いて、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ（ＡＴＣＣ　４３４４６）の染色体ＤＮＡを鋳型として実施例３と同一の条件によりＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂのＰＣＲ産物を取得した。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットによりα１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子を含む１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＰＡＣ３１　０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＣＪ２を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第４図）。
実施例５　ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの生産（１）
実施例１で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ７３株およびガラクトキナーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを生産するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５株（ＷＯ９８／１２３４３）をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養物１２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＴＢ培地［グルコース１０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　２．３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４　１２．５ｇ／ｌ（ｐＨ無調整）］２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で３０℃で４時間培養した後、４０℃で３時間培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて培養物のｐＨを７．０に維持し、必要に応じてグルコースを添加した。該培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１１７０株をグルコース５０ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル酵母社製）１０ｇ／ｌ、尿素５ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４　５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４　３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１　５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸５ｍｇ／ｌ、およびビオチン３０ｍｇ／ｌ（１０ｍｏｌ／ｌ　ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２５ｍｌの入った３００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。
該培養物２０ｍｌを上記と同一組成の液体培地２５０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍ条件で、２４時間培養した。得られた培養物を種培養物として用いた。
該種培養物２５０ｍｌを、グルコース１５０ｇ／ｌ、肉エキス（極東製薬社製）５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　１０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４　１０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　２０ｍｇ／ｌ（別殺菌）、β−アラニン１５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、ビオチン１００ｍｇ／ｌ、尿素２ｇ／ｌ、およびビタミンＢ１　５ｍｇ／ｌ（別殺菌）（１０ｍｏｌ／ｌ　ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２．２５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で２４時間培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養物のｐＨを６．８に維持した。
該培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５株湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ７３株湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１１７０株湿菌体１５０ｇ／ｌ、フラクトース１００ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン５０ｇ／ｌ、オロット酸１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５　４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２７時間反応を行った。反応中、４ｍｏｌ／ｌ　ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ＫＨ２ＰＯ４を添加した。
反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣを用いて分析し、反応液中に９．６ｇ／ｌのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが生成蓄積していることを確認した。
実施例６　ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの生産（２）
実施例２で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ２４株およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５株（ＷＯ９８／１２３４３）を実施例５と同様の方法で培養し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１１７０株を実施例５と同様の方法で培養し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５株湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ２４株湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１１７０株湿菌体１５０ｇ／ｌ、フラクトース１００ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン５０ｇ／ｌ、オロット酸１０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５　４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２７時間反応を行った。反応中、４ｍｏｌ／ｌ　ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ＫＨ２ＰＯ４を添加した。
反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣを用いて分析し、反応液中に５．５ｇ／ｌのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが生成蓄積していることを確認した。
実施例７　ＧＭ２糖鎖〔ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡｃα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ〕の生産
実施例１で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ７３株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５株（ＷＯ９８／１２３４３）および実施例４で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ８７株を実施例５と同様の方法で培養し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１１７０株を実施例５と同様の方法で培養し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５株湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ７３株湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ８７株湿菌体１００ｇ／ｌ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１１７０株湿菌体１５０ｇ／ｌ、フラクトース１００ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン５０ｇ／ｌ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン５０ｇ／ｌ、３’−シアリルラクトース３３ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５　４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２７時間反応を行った。反応中、４ｍｏｌ／ｌ　ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、３’−シアリルラクトース、ＫＨ２ＰＯ４を添加した。
反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣを用いて分析し、反応液中に７．７ｇ／ＬのＧＭ２糖鎖が生成蓄積していることを確認した。
実施例８　ＮＯＳ−α（ＧａｌＮＡｃα１，４Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）の生産
実施例２で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ２４株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５株（ＷＯ９８／１２３４３）および実施例５で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＣＪ２株を実施例５と同様の方法で培養し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１１７０株を実施例５と同様の方法で培養し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５株湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＧＴ２４株湿菌体２５ｇ／ｌ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＣＪ２株湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１１７０株湿菌体１５０ｇ／ｌ、フラクトース１００ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン１００ｇ／ｌ、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース２００ｇ／ｌ、オロット酸５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５　４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で３５時間反応を行った。反応中、４ｍｏｌ／ｌ　ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ２ＰＯ４を添加した。
反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣを用いて分析し、反応液中に２．４ｇ／ｌのＮＯＳ−αが生成蓄積していることを確認した。
産業上の利用可能性
本発明により、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＮ−アセチルガラクトサミン含有糖質を効率的に製造することができる。
「配列フリーテキスト」
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
2002050267.tif 000002
2002050267.tif 000003
2002050267.tif 000004
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2002050267.tif 000007
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2002050267.tif 000009
2002050267.tif 000010
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2002050267.tif 000012
【図面の簡単な説明】
第１図　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現するプラスミドｐＧＴ７３の構築過程を示す図である。
第２図　Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現するプラスミドｐＧＴ２４の構築過程を示す図である。
第３図　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子を発現するプラスミドｐＧＴ８７の構築過程を示す図である。
第４図　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のα１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子を発現するプラスミドｐＣＪ２の構築過程を示す図である。
第１〜４図の符号の意味は以下の通りである。
ＰＬ：ＰＬプロモーター
ｃＩ８５７：ｃＩ８５７リプレッサー遺伝子
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ｇａｌＥ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）：Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
ｇａｌＥ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ　４−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
ｂｅｔａ　１，４−ＧａｌＮＡｃ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子
ａｌｐｈａ　１，４−ＧａｌＮＡｃ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のα１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子
【図１】
2002050267.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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