(57)【要約】ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外領域に特異的に反応し、ヒト血小板に反応性を示さないヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片、ＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に反応し、ＣＣＲ４発現細胞に対し細胞障害活性を示すヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片、および該抗体および該抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する医薬、治療薬、診断薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外領域に特異的に反応し、ヒト血小板に反応性を示さないヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外領域に特異的に反応し、ＣＣＲ４発現細胞に対し細胞障害活性を示すヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項３】
ＣＣＲ４発現細胞に対し細胞障害活性を示す請求の範囲１記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項４】
細胞外領域が、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６および２７１〜２８４番目からなる群から選ばれる細胞外領域である請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項５】
細胞外領域が、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の２〜２９番目に存在するエピトープである請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項６】
細胞外領域が、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の１３〜２９番目に存在するエピトープである請求の範囲１〜５のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項７】
細胞外領域が、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目に存在するエピトープである請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項８】
ＣＣＲ４発現細胞に特異的に反応する請求の範囲１〜７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項９】
ＣＣＲ４発現細胞に対し、非ヒト動物由来ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体よりも高い細胞障害活性を示す請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１０】
細胞障害活性が抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性である請求の範囲２〜９のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１１】
ＡＤＣＣ活性がＣＣＲ４発現細胞の細胞死を誘導することによるものである請求の範囲１０記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１２】
ＣＣＲ４発現細胞を除去する作用を示す抗体である請求の範囲１〜１１のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１３】
ＣＣＲ４発現細胞がＴｈ２細胞である請求の範囲８〜１２のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１４】
Ｔｈ２細胞が産生するサイトカイン産生を抑制する活性を示す請求の範囲１〜１３のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１５】
サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１３である請求の範囲１４記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１６】
ヒト抗体ＩｇＧ型に属する請求の範囲１〜１５のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１７】
ＣＣＲ４に対するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求の範囲１〜１６のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１８】
ＣＣＲ４に対するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、請求の範囲１〜１７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項１９】
ＣＣＲ４に対するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）、ならびにヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）およびＬ鎖Ｃ領域を含む、請求の範囲１〜１８のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２０】
それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、請求の範囲１〜１９のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２１】
それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、請求の範囲１〜２０のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２２】
それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、請求の範囲１〜２１のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２３】
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＬｙｓ、４４番目のＧｌｙ、７６番目のＬｙｓ、および９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜２２のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２４】
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号３８で示されるアミノ酸配列のうち、２８番目のＴｈｒおよび９７番目のＡｌａのうち少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜２２のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２５】
抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目Ｇｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜２４のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２６】
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＬｙｓ、４４番目のＧｌｙ、７６番目のＬｙｓ、および９７番目のＡｌａ、ならびに抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜２３および２５のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２７】
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号３８で示されるアミノ酸配列のうち、２８番目のＴｈｒおよび９７番目のＡｌａ、ならびに抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜２２、２４および２５のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２８】
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号４、９、１０、１１、３８、３９、４０および４１から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜２２および２５のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項２９】
抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号８、１２、１３および１４から選ばれるアミノ酸配列を含む請求の範囲１〜２４および２８のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項３０】
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号４、９、１０、１１、３８、３９、４０および４１から選ばれるアミノ酸配列、ならびに抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号８、１２、１３および１４から選ばれるアミノ酸配列を含む請求の範囲１〜２２のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項３１】
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号９または１０で示されるアミノ酸配列、および抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む請求の範囲１〜２２のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項３２】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化可変領域（Ｖ領域）断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求の範囲１〜３１のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項３３】
形質転換株ＫＭ８７５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２９）またはＫＭ８７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３０）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項３４】
請求の範囲１〜３３のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片を生産する形質転換株。
【請求項３５】
形質転換株が、ＫＭ８７５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２９）またはＫＭ８７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３０）である請求の範囲３４記載の形質転換株。
【請求項３６】
請求の範囲３４または３５記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求の範囲１〜３３のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とするヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片を生産する形質転換株の製造方法。
【請求項３７】
請求の範囲１〜３３のいずれか１項に記載されたヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片が、放射性同位元素、蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合しているヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
【請求項３８】
請求の範囲１〜３３のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項３９】
請求の範囲３８記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項４０】
請求の範囲３９記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項４１】
請求の範囲１〜３３および３７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する医薬。
【請求項４２】
請求の範囲１〜３３および３７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＣＣＲ４関連疾患の治療薬。
【請求項４３】
ＣＣＲ４関連疾患が癌または炎症性疾患である請求の範囲４２記載の治療薬。
【請求項４４】
癌が血液癌である請求の範囲４３記載の治療薬。
【請求項４５】
血液癌が白血病またはリンパ腫である請求の範囲４４記載の治療薬。
【請求項４６】
炎症性疾患が、急性あるいは慢性の気道過敏性または気管支喘息、アトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症である請求の範囲４３記載の治療薬。
【請求項４７】
請求の範囲１〜３３および３７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＣＣＲ４関連疾患の診断薬。
【請求項４８】
ＣＣＲ４関連疾患が癌または炎症性疾患である請求の範囲４７記載の診断薬。
【請求項４９】
癌が血液癌である請求の範囲４８記載の診断薬。
【請求項５０】
血液癌が白血病またはリンパ腫である請求の範囲４８記載の診断薬。
【請求項５１】
炎症性疾患が、慢性気道過敏性喘息、気管支喘息、アトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症である請求の範囲４８記載の診断薬。
【請求項５２】
請求の範囲１〜３３および３７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＴｈ２介在性免疫疾患の治療薬。
【請求項５３】
Ｔｈ２介在性免疫疾患が、慢性気道過敏性喘息、気管支喘息、アトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症である請求の範囲５２記載の治療薬。
【請求項５４】
請求の範囲１〜３３および３７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＴｈ２介在性免疫疾患の診断薬。
【請求項５５】
Ｔｈ２介在性免疫疾患が、慢性気道過敏性喘息、気管支喘息、アトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症である請求の範囲５４記載の診断薬。
【請求項５６】
請求の範囲１〜３３および３７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を免疫学的に検出する方法。
【請求項５７】
請求の範囲１〜３３および３７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出する方法。
【請求項５８】
請求の範囲１〜３３および３７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を減少または除去する方法。
【請求項５９】
請求の範囲１〜３３および３７のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片を用いて、Ｔｈ２細胞が産生するサイトカインを抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトのＣＣケモカイン受容体４（以下、ＣＣＲ４と表記する）の細胞外領域に対して特異的に反応し、血小板に反応性を有さないヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片に関する。また、本発明は、ヒトのＣＣＲ４の細胞外領域に対して特異的に反応し、ＣＣＲ４リガンドであるＴＡＲＣまたはＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害する活性を有さないヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片に関する。さらに、本発明は細胞傷害活性、Ｔｈ２細胞によるサイトカイン産生抑制を示し、特定の相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）を含む、ＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片に関する。さらに、本発明は上記の抗体およびその抗体断片をコードするＤＮＡ配列に関する。さらに、本発明は、該ＤＮＡ配列を含んでなるベクターおよび該ベクターにより形質転換された形質転換体に関する。さらに、本発明は該形質転換体を用いた上記の抗体およびその抗体断片の製造方法、ならびに該抗体およびその抗体断片を用いるアレルギー性疾患を始めとするＴｈ２介在性免疫疾患の治療または診断剤等の医薬に関する。さらに、本発明は、該抗体およびその抗体断片を用いる白血病、リンパ腫等の血液癌を始めとする癌疾患の治療または診断剤等の医薬に関する。
背景技術
気管支喘息を始めとするアレルギー疾患には好酸球や肥満細胞、ＩｇＥなど様々な因子が関与している。好酸球は炎症局所に浸潤し、脱顆粒によりＭＢＰ（ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等の細胞傷害性塩基性蛋白質を放出して周囲の組織傷害を誘発する。肥満細胞は、Ｂ細胞から産生されたＩｇＥと抗原との免疫複合体と結合することでヒスタミンを放出し、即時型アレルギー反応を誘発する。アレルギー反応をコントロールしているのはサイトカイン・ケモカイン等の生体機能分子である。生体機能分子は細胞間の情報伝達を担っている。ＩＬ−５は好酸球を分化誘導し、寿命を延長させ、さらに脱顆粒を誘発する。ＩＬ−４はＢ細胞を活性化し、ＩｇＥを生産させる。生産されたＩｇＥは、抗原との免疫複合体となり肥満細胞の脱顆粒を促す。また肥満細胞から生産されるＩＬ−４、ＩＬ−１３などは、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生に寄与することが判明している（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１５２，２０５９（１９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１５，１９（１９９４））。このように炎症性細胞間には巧妙なサイトカイン・ケモカインネットワークが存在し、複雑にバランスを保っている。
これらサイトカイン・ケモカインを産生するのは細胞表面にＣＤ４を発現しているヘルパーＴ細胞（以下、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞と表記する）である。実際に、気管支喘息患者の気道炎症局所にはヘルパーＴ細胞の浸潤が顕著に見られること、そのうちのかなりのＴ細胞は活性化していること、喘息の重症度または気道過敏性の程度と活性化Ｔ細胞数とが相関すること、さらに喘息患者の末梢血中にも活性化Ｔ細胞が増加していることなどが明らかにされている（Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１４５，Ｓ２２（１９９２））。
ヘルパーＴ細胞は、産生されるサイトカインによってＴｈ１細胞とＴｈ２細胞に分類される（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，１４５（１９８９））。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３などを産生する。Ｔｈ２細胞が産生するサイトカインをＴｈ２サイトカインと称する。
アトピー性疾患患者より分離した抗原特異的Ｔ細胞クローンは、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で刺激するとＴｈ２サイトカインを放出する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４５３８（１９９１））。また、喘息患者の気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ：以下ＢＡＬと表記する）や気道粘膜にはＴｈ２細胞が存在する（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２６，２９８（１９９２）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１４４５（１９９３））。アレルギー性炎症動物モデルでのＢＡＬ中細胞の種々のサイトカインのｍＲＮＡ発現を調べると、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５のｍＲＮＡの発現が上昇している（Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，７５，７５（１９９５））。さらに、マウス静脈内および鼻腔内にＴｈ２細胞を投与した場合、肺に抗原特異的な喘息様炎症症状が誘導され（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１８６，１７３７（１９９７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６０，１３７８（１９９８））、好酸球増多症を引き起こす（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１，３１２８（１９９８））。喘息患者の気道粘膜組織、アトピー性皮膚炎患者の病変部においてはＩＬ−５の発現が認められ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８７，１５４１（１９９１）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，７７５（１９９１））、通年性鼻アレルギー患者粘膜のＩＬ−５の発現量は、ＩＬ−１３の発現量、血清総ＩｇＥ値および抗原特異的ＩｇＥ値とよく相関する（治療学，３２，１９（１９９８））。
ケモカインとは、生体内で産生される白血球遊走・活性化作用を有する塩基性のヘパリン結合性蛋白質の総称であり、それらは一次構造上よく保存されたシステイン残基の位置によって、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ、およびＣＸ３Ｃのサブファミリーに分類される。現在までに１６種類のケモカイン受容体が同定されており（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，６２６（１９９９））、また、各種ケモカイン受容体は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞などの白血球により発現が異なる（細胞工学，１７，１０２２（１９９８））。
ヒトＣＣＲ４は、ヒト未熟好塩基球細胞株ＫＵ−８１２からＫ５−５としてクローニングされたＧ蛋白共役型の７回膜貫通型受容体である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１９４９５（１９９５）、ＷＯ９６／２３０６８）。ＣＣＲ４の膜貫通領域はアミノ酸配列４０〜６７番目、７８〜９７番目、１１３〜１３３番目、１５１〜１７５番目、２０７〜２２６番目、２４３〜２７０番目、２８５〜３０８番目、細胞外領域はアミノ酸配列１〜３９番目、９８〜１１２番目、１７６〜２０６番目、２７１〜２８４番目、細胞内領域はアミノ酸配列６８〜７７番目、１３４〜１５０番目、２２７〜２４２番目、３０９〜３６０番目であると推定されている。クローニング当時はＣＣＲ４のリガンドがＭＩＰ−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１α）、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、もしくはＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であると報告されていた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１８，３３７（１９９６）、ＷＯ９６／２３０６８）。しかし、その後刺激したヒト末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）や胸腺細胞から産生される  ＴＡＲＣ（ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２１５１４（１９９６））がＣＣＲ４に特異的に結合することが判明した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５０３６（１９９７））。さらにマクロファージから単離されたＭＤＣ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，１５９５（１９９７））、別名ＳＴＣＰ−１（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２５２２９（１９９７））がＴＡＲＣよりも強くＣＣＲ４に結合することも報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１７６４（１９９８））。
ＣＣＲ４は、サイトカイン・ケモカイン産生能を持つＣＤ４＋Ｔｈ細胞に発現していることが示され（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５０３６（１９９７））、さらにＣＤ４＋Ｔｈ細胞の中でもＴｈ２細胞に選択的に発現していることが報告された（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７，１２９（１９９８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１，５１１１（１９９８））。さらに、エフェクター／メモリーＴ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋）集団中にＣＣＲ４＋細胞が確認され、ＣＣＲ４＋細胞を刺激するとＩＬ−４、ＩＬ−５を産生するがＩＦＮ−γは産生されない（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，８１（１９９９））。またメモリーＴ細胞中のＣＬＡ（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）陽性、α４β８インテグリン陰性集団にＣＣＲ４＋細胞が属しており、ＣＣＲ４は腸管免疫ではなく、皮膚などの全身性免疫に関わるメモリーＴ細胞に発現していることが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６（１９９９））。以上のことから、炎症が誘発された場合にメモリーＴ細胞は活性化されてＣＣＲ４を発現し、ＣＣＲ４のリガンドであるＭＤＣまたはＴＡＲＣによってメモリーＴ細胞が炎症局所に遊走して、他の炎症性細胞を活性化する可能性が強く示唆される。
最近になって、ヒトではナチュラルキラー細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４，４０４８−４０５４（２０００）、Ｂｌｏｏｄ，９７，３６７−３７５（２００１））や血小板（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０１，２７９−２８９（２００１）、Ｂｌｏｏｄ，９６，４０４６−４０５４（２０００）、Ｂｌｏｏｄ，９７，９３７−９４５（２００１））にもＣＣＲ４が発現されていることが明らかになった。
ＣＣＲ４のリガンドであるＴＡＲＣまたはＭＤＣの拮抗剤、すなわちＣＣＲ４アンタゴニストは、血小板凝集を阻害することが知られている（ＷＯ９９／１５６６６）。このようにＣＣＲ４の機能に影響を与える薬剤は、血小板機能に対しても影響を及ぼすことが、知られている。
血小板にはＣＣＲ４の発現が認められる。例えば、Ａｄｒｉａｎら（Ｂｌｏｏｄ，９７，９３７−９４５（２００１））、Ａｂｉ−Ｙｏｕｎｅｓら（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０１，２７９−２８９（２００１）、ＷＯ００／４２０７４、ＷＯ００／４１７２４）はいずれもヒト血小板でのＣＣＲ４の発現を抗ＣＣＲ４抗体により検出している。これまでにＣＣＲ４に反応性を有するが、ヒト血小板に結合しない抗体はこれまで知られていない。
また、血小板に結合する自己抗体が出現すると、自己免疫性血小板減少症を引き起こすことが知られている（Ｂｌｏｏｄ，７０，４２８−４３１（１９８７）、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９，２４５−２５１（１９９８））。血小板減少や血小板機能に影響を与える薬剤は、出血、血栓形成など重篤な副作用を発現し易く、一般的には医薬品としては好ましくない。特に、抗体は血中半減期が長いことから、血小板機能に影響を与える性質を有する抗体は、医薬品として開発することは困難である。例えば、自己免疫疾患治療薬として開発されていた抗ＣＤ４０リガンド抗体は、活性化血小板上に発現している抗原を認識することに起因すると思われる副作用の出現により開発が中断されている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６，１１４（２０００）、ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ａ８  ｏｆ  １８（２００２．０６．２０））。
タンパク質は、翻訳後様々な修飾反応を受けることが知られている。修飾反応の一つにチロシン残基の硫酸化反応が知られている。今まで多くのタンパク質がチロンシン残基の硫酸化を受けることが報告されている（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，Ｒ５７−Ｒ６１（２０００））。硫酸化を受けるチロシン残基に関しては、近傍に酸性アミノ酸残基が多いことが特徴とされ、硫酸化を受ける可能性のあるタンパク質とその部位に関して示唆もされている（Ｃｅｌｌ，９６，６６７−６７６（１９９９））。ＣＣＲ４に関しても、Ｎ末端近くに４残基のチロシン残基が存在するが、これらのチロシン残基が硫酸化を受けるという報告はされていない。
現在のＴｈ２介在性免疫疾患に対する治療法としては、▲１▼サイトカイン・ケモカインに対する拮抗剤、例えば、ヒト化抗ＩＬ−５抗体（ＳＢ−２４０５６３：スミス・クラインビーチャム社、Ｓｃｈ−５５７００（ＣＤＰ−８３５）：シェーリング・プラウ／セルテック社）、ヒト化抗ＩＬ−４抗体（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９１４，１１０）、可溶性ケモカイン受容体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，６２４（１９９８））など、▲２▼サイトカイン・ケモカイン産生抑制剤、例えば、ＩＬ−５産生阻害剤（特開平８−５３３５５）、レチノイドアンタゴニスト（ＷＯ９９／２４０２４）、トシル酸スプラタスト（ＩＰＤ−１１５１Ｔ、大鵬薬品工業社製）など、▲３▼好酸球や肥満細胞などの最終的な炎症性細胞を対象としたもの、例えば、ヒト化抗ＩＬ−５受容体抗体（ＷＯ９７／１０３５４）、ＣＣケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）拮抗剤（特開平１１−１４７８７２）など、▲４▼炎症性生体機能分子阻害剤、例えば、ヒト化抗ＩｇＥ抗体（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１５７，１４２９（１９９８））など、が開発されているが、これらは複雑なサイトカイン・ケモカイン・炎症性細胞間のネットワークの一部を阻害するだけであり、根治的ではない。Ｔ細胞を制御するものとしては抗ＣＤ４抗体があり、重度のステロイド依存性喘息に効果をあげている。しかしＣＤ４分子は免疫担当細胞に広く発現しているため、特異性に欠け、強い免疫抑制作用を伴うという欠点を有する（Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８，１３３（１９９９））。
このことから、これらすべてを抑制するためには、アレルギー反応の上流部、すなわちＴｈ２細胞の制御が必要となる。
現在の重度のＴｈ２介在性免疫疾患患者に対する主な治療法はステロイド投与であるが、ステロイドによる副作用を免れることは出来ない。また、ステロイド投与を中止した場合には、患者の病態はまた元に戻り、長期間のステロイド投与は耐性を獲得するなどの欠点を有する。
これまで、ＣＣＲ４を発現している細胞を検出でき、かつ、ＣＣＲ４発現細胞に対して細胞障害活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片は確立されていない。さらに、Ｔｈ２サイトカインの産生を抑制するヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片はこれまでに知られていない。
白血病患者においても腫瘍細胞にＣＣＲ４が発現している例があることが報告されているが（Ｂｌｏｏｄ，９６，６８５（２０００））、それらＣＣＲ４を発現している白血病細胞を障害し、治療効果を有するようなヒト型ＣＤＲ移植抗体及びその抗体断片はこれまでに報告されていない。
一般にヒト以外の動物の抗体、例えばマウス抗体などをヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＡＭＡ）が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２，８８１（１９８４）、Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８０，９３２（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，１２４２（１９８５））、マウス抗体の体内からの消失を速め（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６，１０１１（１９８５）、Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８０，９３７（１９８８））、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０（１９８５）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４６，６４８９（１９８６））。
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型ＣＤＲ移植抗体にすることが試みられている。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２（１９８６））。このようなヒト型ＣＤＲ移植は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体に比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，１１１８，１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８（１９９５））。すなわち、ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒトにおいて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。
また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）（Ｈ鎖Ｃ領域を、ＣＨと表記する）としてγ１サブクラスを使用すれば、抗体依存性細胞障害（以下、ＡＤＣＣと表記する）活性などのエフェクター機能の高いヒト化抗体を作製することができ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６））、かつ、マウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８（１９９５））。特にＣＣＲ４発現細胞数を減少させる治療においては、抗体のＦｃ領域（抗体重鎖のヒンジ領域以降の領域）を介した補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）やＡＤＣＣ活性等の細胞障害活性の高さがその治療効果に重要であるために、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のほうがマウス抗体等のヒト以外の動物の抗体より望ましいことを明確に示している。
さらに、ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと表記する）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８））、２量体化Ｖ領域断片（以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，６２９（１９９７））、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖと表記する）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９（１９９５））、ＣＤＲを含むペプチド（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９６６（１９９６））などの、分子量の小さい抗体断片としても作製でき、これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ、標的組織への移行性に優れている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２，３４０２（１９９２））。
以上の事実は、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体よりもヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片の方が望ましいことを示している。
これまで述べてきたように、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片は、単独の使用によっても診断およびその治療の効果が期待されるが、更に他の分子との併用により、それらの効果をより高めることが検討されている。例えば、該他の分子の一つとしてサイトカインが用いられている。サイトカインは免疫反応における細胞間相互作用を司る種々の液性因子の総称である。抗体の細胞障害活性には、ＣＤＣ活性やＡＤＣＣ活性等が知られているが、ＡＤＣＣ活性は単核球、マクロファージ、ＮＫ細胞のようなＦｃ受容体を細胞表面に有するエフェクター細胞によって担われている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，１９９２（１９８７））。種々のサイトカインはこれらのエフェクター細胞を活性化することから、抗体のＡＤＣＣ活性を高める目的で、抗体と組み合せて投与することが行われている。
発明の開示
本発明は、以下の（１）〜（５９）に関する。
（１）ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外領域に特異的に反応し、ヒト血小板に反応性を示さないヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２）ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外領域に特異的に反応し、ＣＣＲ４発現細胞に対し細胞障害活性を示すヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（３）ＣＣＲ４発現細胞に対し細胞障害活性を示す上記（１）記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（４）細胞外領域が、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６および２７１〜２８４番目からなる群から選ばれる細胞外領域である上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（５）細胞外領域が、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の２〜２９番目に存在するエピトープである上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（６）細胞外領域が、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の１３〜２９番目に存在するエピトープである上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（７）細胞外領域が、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目に存在するエピトープである上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（８）ＣＣＲ４発現細胞に特異的に反応する上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（９）ＣＣＲ４発現細胞に対し、非ヒト動物由来ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体よりも高い細胞障害活性を示す上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１０）細胞障害活性が抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性である上記（２）〜（９）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１１）ＡＤＣＣ活性がＣＣＲ４発現細胞の細胞死を誘導することによるものである上記（１０）記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１２）ＣＣＲ４発現細胞を除去する作用を示す抗体である上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１３）ＣＣＲ４発現細胞がＴｈ２細胞である上記（８）〜（１２）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１４）Ｔｈ２細胞が産生するサイトカイン産生を抑制する活性を示す上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１５）サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１３である上記（１４）記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１６）ヒト抗体ＩｇＧ型に属する上記（１）〜（１５）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１７）ＣＣＲ４に対するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、上記（１）〜（１６）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１８）ＣＣＲ４に対するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、上記（１）〜（１７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（１９）ＣＣＲ４に対するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）、ならびにヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）およびＬ鎖Ｃ領域を含む、上記（１）〜（１８）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２０）それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、上記（１）〜（１９）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２１）それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、上記（１）〜（２０）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２２）それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、上記（１）〜（２１）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２３）抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＬｙｓ、４４番目のＧｌｙ、７６番目のＬｙｓ、および９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（２２）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２４）抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号３８で示されるアミノ酸配列のうち、２８番目のＴｈｒおよび９７番目のＡｌａのうち少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（２２）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２５）抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目Ｇｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（２４）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２６）抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＬｙｓ、４４番目のＧｌｙ、７６番目のＬｙｓ、および９７番目のＡｌａ、ならびに抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（２３）および（２５）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２７）抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号３８で示されるアミノ酸配列のうち、２８番目のＴｈｒおよび９７番目のＡｌａ、ならびに抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（２２）、（２４）および（２５）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２８）抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号４、９、１０、１１、３８、３９、４０および４１から選ばれるアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（２２）および（２５）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（２９）抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号８、１２、１３および１４から選ばれるアミノ酸配列を含む上記（１）〜（２４）および（２８）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（３０）抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号４、９、１０、１１、３８、３９、４０および４１から選ばれるアミノ酸配列、ならびに抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が、配列番号８、１２、１３および１４から選ばれるアミノ酸配列を含む上記（１）〜（２２）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（３１）抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号９または１０で示されるアミノ酸配列、および抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む上記（１）〜（２２）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（３２）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化可変領域（Ｖ領域）断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドから選ばれる抗体断片である上記（１）〜（３１）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（３３）形質転換株ＫＭ８７５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２９）またはＫＭ８７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３０）が生産するヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（３４）上記（１）〜（３３）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片を生産する形質転換株。
（３５）形質転換株が、ＫＭ８７５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２９）またはＫＭ８７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３０）である上記（３４）記載の形質転換株。
（３６）上記（３４）または（３５）記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に上記（１）〜（３３）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とするヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片を生産する形質転換株の製造方法。
（３７）上記（１）〜（３３）のいずれか１項に記載されたヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片が、放射性同位元素、蛋白質または薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合しているヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片。
（３８）上記（１）〜（３３）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡ。
（３９）上記（３８）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（４０）上記（３９）記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（４１）上記（１）〜（３７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する医薬。
（４２）上記（１）〜（３３）および（３７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＣＣＲ４関連疾患の治療薬。
（４３）ＣＣＲ４関連疾患が癌または炎症性疾患である上記（４２）記載の治療薬。
（４４）癌が血液癌である上記（４３）記載の治療薬。
（４５）血液癌が白血病またはリンパ腫である上記（４４）記載の治療薬。
（４６）炎症性疾患が、急性あるいは慢性の気道過敏性または気管支喘息、アトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症である上記（４３）記載の治療薬。
（４７）上記（１）〜（３３）および（３７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＣＣＲ４関連疾患の診断薬。
（４８）ＣＣＲ４関連疾患が癌または炎症性疾患である上記（４７）記載の診断薬。
（４９）癌が血液癌である上記（４８）記載の診断薬。
（５０）血液癌が白血病またはリンパ腫である上記（４８）記載の診断薬。
（５１）炎症性疾患が、慢性気道過敏性喘息、気管支喘息、アトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症である上記（４８）記載の診断薬。
（５２）上記（１）〜（３７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＴｈ２介在性免疫疾患の治療薬。
（５３）Ｔｈ２介在性免疫疾患が、慢性気道過敏性喘息、気管支喘息、アトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症である上記（５２）記載の治療薬。
（５４）上記（１）〜（３７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するＴｈ２介在性免疫疾患の診断薬。
（５５）Ｔｈ２介在性免疫疾患が、慢性気道過敏性喘息、気管支喘息、アトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症である上記（５４記載の診断薬。
（５６）上記（１）〜（３３）および（３７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を免疫学的に検出する方法。
（５７）上記（１）〜（３３）および（３７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出する方法。
（５８）上記（１）〜（３３）および（３７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片を用いて、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を減少または除去する方法。
（５９）上記（１）〜（３３）および（３７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片を用いて、Ｔｈ２細胞が産生するサイトカインを抑制する方法。
本発明におけるＣＣＲ４関連疾患としては、癌、炎症性疾患などを包含する。
本発明における癌としては、血液癌、特に白血病、リンパ腫などを包含する。
本発明における炎症性疾患としては、急性あるいは慢性の気道過敏性または気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症などを包含する。
本発明におけるＴｈ２介在性免疫疾患としては、Ｔｈ２細胞を介在する免疫疾患であればいずれでもよいが、急性あるいは慢性の気道過敏性または気管支喘息、アトピー性皮膚炎などのアトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症、間質性肺炎、肺繊維症、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患を包含する。
本発明におけるＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体（抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体）およびその抗体断片（以下、両者を総称して本発明の抗体と表記することもある）は、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に反応し、ヒト血小板に反応性を有さないヒト型ＣＤＲ移植抗体またはその抗体断片であればいかなるものでもよい。ヒト血小板に反応性を示さないとは、抗体がヒト血小板と実質的に結合性を示さないことをいい、具体的には、フローサイトメーターによる測定で結合性を示さないことをいう。
また、本発明の抗体は、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に反応し、ＣＣＲ４発現細胞に対し細胞障害活性を示す抗体である。
細胞障害活性としては、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性があげられる。
また、本発明の抗体として、好ましくは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６または２７１〜２８４番目を含む領域、より好ましくは配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２〜２９番目（配列番号３６）、さらに好ましくは配列番号４８に示されるアミノ酸配列の１２〜２９番目（配列番号３７）、特に好ましくは配列番号４８に示されるアミノ酸配列の１２〜２５番目に、特異的に反応する抗体があげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＣＣＲ４に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬと表記する）をコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択方法としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられる。
本発明の抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、γ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明の抗体としては、それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片などがあげられる。
好ましくは、抗体のＶＨが配列番号４または３８、および／またはＶＬが配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
より好ましくは、
抗体のＶＨが、配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＬｙｓ、４４番目のＧｌｙ、７６番目のＬｙｓ、および９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、
抗体のＶＨが、配列番号３８で示されるアミノ酸配列のうち、２８番目のＴｈｒおよび９７番目のＡｌａのうち少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、
抗体のＶＬが、配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、
抗体のＶＨが、配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、４０番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＬｙｓ、４４番目のＧｌｙ、７６番目のＬｙｓ、および９７番目のＡｌａ、ならびに抗体のＶＬが、配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、
抗体のＶＨが、配列番号３８で示されるアミノ酸配列のうち、２８番目のＴｈｒおよび９７番目のＡｌａ、ならびに抗体のＶＬが、配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、などがあげられる。
これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述した性質を有するＣＣＲ４と特異的に反応する抗体または抗体断片も本発明の範囲に包含される。
本発明のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはＳ−Ｓ結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、ＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、例えば、ＣＣＲ４に特異的に反応する２価のＤｉａｂｏｄｙは、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、３〜１０残基のポリペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＤｉａｂｏｄｙを発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることにより製造することができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするｃＤＮＡを構築し、該ｃＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体は、本発明の抗体に放射性同位元素、蛋白質または薬剤などを化学的にあるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の抗体の誘導体は、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応する抗体または抗体断片のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、抗体または抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、蛋白質あるいは薬剤などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、（株）地人書館（１９９４））により結合させることにより製造することができる。
または、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応する抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入する。以上のような遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉ等があげられ、例えば、クロラミンＴ法等により、抗体に結合させることができる。
薬剤としては、低分子のものが好ましく、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社（１９９６））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２））などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２（以下、ｈＩＬ−２と表記する）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＧＭ−ＣＳＦと表記する）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＭ−ＣＳＦと表記する）、ヒトインターロイキン１２（以下、ｈＩＬ−１２と表記する）等があげられる。また、癌細胞を直接障害するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体ついては、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
以下に、本発明のＣＣＲ４に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体およびその抗体断片の作製方法、活性評価方法およびそれらの使用方法について説明する。
１．ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０））、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４））、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，１５２７（１９８１））、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０））、ｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３））などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７））、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５））とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３））などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４））。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８））などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下の様にして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、それらの中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）や目的のヒト以外の動物の抗体の塩基配列を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００〜２００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも４本もしくは６本程度の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
（３）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１））。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１））。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７））あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４））などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項１の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流に、本項１の（２）および（３）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項１の（２）および（３）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングすることができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項１の（４）に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト型ＣＤＲ移植抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１））。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１））、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３（１９８７））などがあげられる。
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト型ＣＤＲ移植抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））などにより測定できる。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体の安定発現
本項１の（４）に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））などがあげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６（１９８０））、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＹＢ２／０細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、ヒト型ＣＤＲ移植抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（Ｇ４１８；ＳＩＧＭＡ社製）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４））。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などの各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡなどにより測定できる。また、形質転換株は、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト型ＣＤＲ移植抗体の発現量を上昇させることができる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４））。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、形質転換株の培養上清よリプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））やウエスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １２（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））などで測定することができる。
２．抗体断片の作製
抗体断片は、本項１に記載のヒト化抗体を元に遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５））。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５））。また、Ｆａｂは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、本項１の（２）および（３）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１（１９８８））などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２））。
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５））。また、本項２の（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサン等のようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢで処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９９６））。
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することができる。例えば、本項１の（２）および（３）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６３（１９９２））などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラム等を用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９９６））。
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、本項１の（２）および（３）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、１２残基以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡを介して連結し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製する。作製したＤＮＡをｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、Ｐｈｆａ（Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，５，４８（１９９４））などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９９６））。
（５）Ｄｉａｂｏｄｙの作製
Ｄｉａｂｏｄｙは、上記のｓｃＦｖを作製する際のポリペプチドリンカーを３〜１０残基程度にすることで、作製することができる。１種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合には、２価のＤｉａｂｏｄｙを、２種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合は、２特異性を有するＤｉａｂｏｄｙを作製することができる（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５３，１６４（１９９９）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７，７６３（１９９８））。
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することができる。まず、本項１の（２）および（３）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＶＨおよびＶＬを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））。
（７）ＣＤＲを含むペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＣＤＲを含むペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＣＤＲを含むペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））。
３．本発明の抗体の活性並びに性質の評価
（１）抗原に対する結合性の評価
本発明の抗体の抗原との結合性は免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３））、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ等を用いた表面プラズモン共鳴等により測定できる。具体的には、ＣＣＲ４の部分配列を有する合成ペプチドを作製し、これとウシ血清アルブミンなどのキャリアー蛋白質とを化学的に結合させたコンジュゲートを作製する。このコンジュゲートをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、本発明の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定することにより、本発明の抗体のＣＣＲ４結合活性を測定することができる。
（２）ＣＣＲ４発現細胞に対する反応性
ＣＣＲ４発現細胞に対する反応性を検討するためには、細胞表面に発現されているＣＣＲ４を効率よく検出する方法を用いることが好ましい。方法としては、蛍光抗体法を用いたフローサイトメーター、グルタールアルデヒドなどによる検定などがあげられる。更に、血小板などの生体由来の細胞などとの反応性を検討する際には、出来る限り生体内に近い条件で検討を行うことが好ましい。これらの理由から、本発明の抗ＣＣＲ４抗体の反応性を検討する際には、蛍光抗体法を用い、フローサイトメーターにより検討を行うことが最も好ましい。
蛍光抗体法に用いる抗体としては、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ビオチンなどにより標識された抗体であっても、標識をされていない抗体であってもよい。用いた抗体の標識の有無、その種類により、蛍光標識アビジン、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体などを使用する。反応性は、十分量の抗ＣＣＲ４抗体（通常最終濃度が０．１〜１０μｇ／ｍｌ）を検体に加えて行い、陰性対照抗体、陽性対照抗体の反応性との比較を行うことにより評価することができる。
（３）細胞障害活性
ＣＣＲ４発現細胞に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定し、評価する事が出来る（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３））。産生サイトカイン量の変化はサイトカインに対する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法等により測定できる。
（４）リガンド結合阻害活性
ＣＣＲ４に結合性を有するリガンドであるＴＡＲＣやＭＤＣの標識体とＣＣＲ４発現細胞あるいはその細胞膜画分を用いる事により、本発明の抗ＣＣＲ４抗体のリガンド結合阻害活性を検討する事が出来る。ＴＡＲＣやＭＤＣの標識には、検出可能なものであればどのような手法を用いても良く、例えば、蛍光標識、酵素標識、放射線標識などが挙げられる。具体的な手法としては、例えばＷＯ００／４２０７４に放射標識体を用いる結合阻害活性の測定方法があげられる。
また、ＣＣＲ４へのリガンドの結合によって引き起こされる細胞応答を指標とし、本発明の抗ＣＣＲ４抗体のリガンド結合阻害活性を検討する事が出来る。細胞応答としては、ＣＣＲ４発現細胞にリガンドを接触させる事により引き起こされるものであれば如何なるものでも良く、例えば細胞内カルシウム濃度の変化、細胞遊走などをあげることができる。具体的な手法としては、例えば、ＷＯ００／４２０７４にＣＣＲ４リガンドによって引き起こされるＣＣＲ４発現細胞の遊走阻害を測定する方法があげられる。
（５）認識配列の検討
本発明の抗体の認識するアミノ酸配列の決定は、対応する抗原タンパク質の一次配列に基づいて設計された合成ペプチドを用いることにより調べることが出来る。
合成ペプチドの一次配列は、抗原タンパク質の一次配列に基づいて設計される。合成ペプチドとキャリアー蛋白質とを架橋させたタンパク質を作製する為、合成ペプチドのカルボキシル末端あるいはアミノ末端にシステイン残基を付加することもできる。こうして作製されたタンパク質は、後述するＥＬＩＳＡに用いることが出来る。また、必要に応じ合成ペプチドのＮ末端はアセチル化することもでき、Ｃ末端はアミド化することもできる。
ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，１６１−２１４（１９９０）、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８９、Ｇｒｅｇｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９７）、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３５，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４））。
また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、以後ＡＣＴ社と略称する）製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、ノバビオケム社（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）、渡辺化学（株）、ＡＣＴ社、アナスペック社（ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ．）、またはペプチド研究所（株）等から入手することができる。
合成ペプチドを用いて、本発明の抗体の認識するアミノ酸配列を決定する方法としては、合成ペプチドと該抗体の結合を検出することが出来る方法であれば如何なる手法を用いることもできる。例えば、合成ペプチドを蛍光物質、放射性物質などで標識し、得られた標識ペプチドと抗体との結合性を調べることにより、抗体の認識するアミノ酸配列を決定することができる。あるいは、合成ペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質と架橋し、得られたタンパク質の抗体との反応性をＥＬＩＳＡ法などの方法により評価することにより行うこともできる。さらには、抗原タンパクなど、抗体が結合することが確認されている物質を用い、その物質に対する抗体の結合を阻害する合成ペプチドを調べることにより、本発明の抗体の認識するアミノ酸配列を決定することもできる。
４．本発明の抗体を用いたＣＣＲ４の検出および定量法
本発明は、本発明の抗体を用いて、ＣＣＲ４またはＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出および定量する方法に関する。
本発明の抗体を用いて、ＣＣＲ４、ＣＣＲ４を細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、上記に記した酵素免疫測定法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法、東京化学同人（１９８６））などがあげられる。
蛍光抗体法とは、分離した細胞あるいは組識などに、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質でラベルした抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）とは、分離した、細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、分離した、細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
免疫細胞染色法、免疫組織染色法とは、分離した、細胞あるいは組織などに、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、本発明の抗体で、抗原認識部位の異なる２種類の抗体のうち、あらかじめ一方の抗体はプレートに吸着させ、もう一方の抗体はＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗体吸着プレートに、分離した、細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させた後、標識した抗体を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である。
５．ヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片の使用方法
本発明の抗体は、培養細胞株に発現しているＣＣＲ４と特異的に結合し、かつＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性等の細胞障害活性を示すため、Ｔｈ２介在性免疫疾患等のＣＣＲ４が関与する疾患の診断、治療において有用であると考えられる。また、ヒト以外の動物の抗体やキメラ抗体に比べ、ほとんどがヒト抗体のアミノ酸配列に由来するため、ヒト体内において高い効果を示し、かつ、免疫原性が低く、その効果が長期間に渡り持続することが期待される。
また、本発明の抗体を、被験者の細胞あるいは組織に投与することにより、Ｔｈ２等のＣＣＲ４を発現している細胞が産生するサイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等の産生を抑制することができる。
本発明に係るＣＣＲ４を発現している細胞としてはＴｈ２細胞などがあげられる。Ｔｈ２細胞としては、好ましくは、活性化Ｔｈ２細胞またはメモリーＴｈ２細胞などがあげられる。具体的には、ＣＤ４５ＲＡ−またはＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４＋の性質を有する細胞があげられる。
本発明の抗体が有する細胞障害活性は、Ｔｈ２細胞等のＣＣＲ４発現細胞に本発明の抗体が結合し、当該細胞にアポトーシスを誘導することなどにより生ずる。また、アポトーシスを誘導することにより当該細胞に障害を与え、除去することができる。
また、Ｔｈ２介在性免疫疾患、癌疾患等のＣＣＲ４関連疾患の診断方法としては、被験者の細胞あるいは組織に存在するヒトＣＣＲ４陽性細胞を、上述した免疫学的に検出する方法があげられる。
また、本発明の抗体は、Ｔｈ２介在性免疫疾患、癌疾患等のＣＣＲ４関連疾患、また異常なＣＣＲ４発現細胞の増加・減少により病態が進行する疾患の診断薬として用いることができる。
さらに、本発明の抗体はその細胞障害活性によりヒトＣＣＲ４発現細胞を減少もしくは除去できるため、本発明の抗体を用いるＴｈ２介在性免疫疾患、癌疾患等のＣＣＲ４関連疾患の診断方法あるいは治療方法、本発明の抗体を有効成分とする、Ｔｈ２介在性免疫疾患、癌疾患等のＣＣＲ４関連疾患の治療薬および予防薬が提供される。
Ｔｈ２介在性免疫疾患とは、軽度・重度に関わらず、急性あるいは慢性の気道過敏性や気管支喘息、アトピー性皮膚炎を含むアトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症などの炎症性疾患、Ｔｈ２細胞から放出されるサイトカイン・ケモカインによって増殖もしくは活性化し得る好酸球や肥満細胞などの炎症担当細胞、ならびにＴｈ２細胞から放出されるサイトカイン・ケモカインによって産生されるＩｇＥ等の生体機能分子に基づく疾患、また異常なＴｈ２細胞の変動により病態が進行する免疫疾患を示す。
本発明の抗体は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は本発明の抗体そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体または抗体断片を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。本発明の抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
以下に、本発明の実施例を示すが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１
ＣＣＲ４に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製：
１．ＣＣＲ４に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの設計
（１）ＣＣＲ４に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列の設計
まず、ＣＣＲ４に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体（抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体）のＶＨのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。参考例１で作製された抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，８１（１９９９））を使用し、配列番号１、２、および３に示したＶＨのＣＤＲ１、２、および３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。配列解析システムとしてＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用いて、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベースをＢＬＡＳＴＰ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７））によりＫＭ２１６０と相同性の高いヒト抗体を検索した。相同性スコアと実際のアミノ酸配列の相同性を比較したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースアクセッションナンバーＰ０１７８１、Ｉｇ  Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  Ｖ−ＩＩＩ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｇａｌ（Ｈｏｐｐｅ．Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３５４，１５０５−１５０９（１９７３）；以下、Ｇａｌと称す）が８２．５％を示し、最も相同性の高いヒト抗体であったため、この抗体のＦＲのアミノ酸配列を選択した。ただしデータベース上のＧａｌのＦＲのアミノ酸配列中には、アミノ酸残基が一義的に決定されていない部分（分泌型抗体のＮ末端から２８番目、３０番目）やヒト抗体の配列では出現頻度の低いアミノ酸残基（Ｖ領域の最後の残基であるＴｈｒ）が認められた。そこで、２８番目と３０番目については、マウス抗体ＫＭ２１６０に見られる残基であるＩｌｅとＳｅｒを選択し、Ｖ領域の最後のＴｈｒについては、Ｓｅｒへ置換した。これらのアミノ酸残基は、任意のヒト抗体の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）においても高頻度に認められることから、ヒト抗体の配列から逸脱するものではない。
以上のようにして決定したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に配列番号１、２、および３に示した抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＶＨのＣＤＲ１、２、および３のアミノ酸配列を移植し、配列番号４に記載の抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列Ｇａｌ０を設計した。配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号４９に示した。
また、カバットらによって分類された共通配列を基に抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計した。
カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性から３種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられる。そこで、活性の高い抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＨの３種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ２１６０のＶＨのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。第１表には、ヒト抗体のＶＨの各サブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列とＫＭ２１６０のＶＨのＦＲのアミノ酸配列との間の相同性の検索結果を示した。第１表に示した様に、ＫＭ２１６０のＶＨ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＩＩと最も高い相同性を有していた。
2003018635.tif 000002
以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号３８に記載の抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０を設計した。配列番号３８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号５７に示した。
（２）ＣＣＲ４に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列の設計
次に、抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。配列番号５、６、および７に示した抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＶＬのＣＤＲ１、２、および３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＶ）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。そこで、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ２１６０のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。第１表には、ヒト抗体のＶＬの各サブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列とＫＭ２１６０のＶＬのＦＲのアミノ酸配列との間の相同性の検索結果を示した。第１表に示した様に、ＫＭ２１６０のＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＩと最も高い相同性を有していた。
2003018635.tif 000003
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に配列番号５、６、および７に示した抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＶＬのＣＤＲ１、２、および３のアミノ酸配列を移植し、配列番号８に記載の抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０を設計した。配列番号８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号５３に示した。
（３）ＣＣＲ４に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬの改変
上記で設計した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列Ｇａｌ０、ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列であるが、一般に、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、マウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは活性が低下してしまうことが多く、それを回避するため、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をＣＤＲのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本実施例においても、活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を同定することを検討した。
まず、上記で設計した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列Ｇａｌ０、ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０よりなる抗体Ｖ領域（Ｇａｌ０ＬＶ０およびＨＶ０ＬＶ０）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）あるいはＲａｓＭｏｌ（Ｇｌａｘｏ社製）を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、Ｇａｌ０ＬＶ０またはＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列において、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０と異なっている残基について順次、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０の相当する位置に見られる残基へ改変したアミノ酸配列からなる三次元構造モデルを同様にして構築し、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０、Ｇａｌ０ＬＶ０またはＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較した。
その結果、Ｇａｌ０ＬＶ０またはＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の活性に影響を与えると考えられる残基として、Ｇａｌ０では４０番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＬｙｓ、４４番目のＧｌｙ、７６番目のＬｙｓ、および９７番目のＡｌａを、ＨＶ０では、２８番目のＴｈｒおよび９７番目のＡｌａを、ＬＶ０では、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、５０番目のＧｌｎ、および８８番目のＶａｌを選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上をマウス抗体ＫＭ２１６０に見られるアミノ残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。
まず、ＶＨについては、例えばＧａｌ０の９７番目のＡｌａを改変した配列番号９で示したＧａｌ１、Ｇａｌ０の４２番目のＧｌｙ、４４番目のＧｌｙを改変した配列番号１０で示したＧａｌ２、Ｇａｌ０の９７番目のＡｌａ、４２番目のＧｌｙ、４４番目のＧｌｙを改変した配列番号１１に示したＧａｌ３、ＨＶ０の２８番目のＴｈｒを改変した配列番号３９に示したＨＶ１、ＨＶ０の９７番目のＡｌａを改変した配列番号４０で示したＨＶ２、およびＨＶ０の２８番のＴｈｒ、９７番目のＡｌａを改変した配列番号４１で示したＨＶ３をそれぞれ設計した。さらにＶＬについては、例えば２番目のＩｌｅを改変した配列番号１２に示したＬＶ１、３番目のＶａｌを改変した配列番号１３に示したＬＶ２、２番目のＩｌｅおよび３番目のＶａｌを改変した配列番号１４に示したＬＶ３を設計した。配列番号９〜１１、３９〜４１および１２〜１４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、それぞれ配列番号５０〜５２、５８〜６０、５４〜５６に示した。
２．抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のｃＤＮＡの構築
（１）抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
実施例１の１項（１）で設計した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列Ｇａｌ０をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に配列番号１５に記載の抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖の分泌シグナル配列を繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、および２１の６本の合成オリゴヌクレオチドを合成した（ＧＥＮＳＥＴ社製）。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む反応液に加え、さらに０．４μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）、０．４μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ３（ＧＥＮＳＥＴ社製）および２．５単位のＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、合計５０μｌとし、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７４℃６０秒間のサイクルを３０サイクル、その後７４℃１０分間を１サイクルで行った。該反応液をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製し、最終的に滅菌水に溶解した。１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の３μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られた抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＨのＰＣＲ産物のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列の解析を行った。塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有する第１図に示したプラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７０９として寄託されている。
次に、実施例１の１項（３）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は以下のように行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、マウス抗体ＫＭ２１６０で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
９７番目のＡｌａをＧｌｙに改変する際には、本項で作製したプラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０の２５ｎｇを鋳型とし、配列番号２２と２３に記載の塩基配列を有する変異導入のための合成ＤＮＡ（ＧＥＮＳＥＴ社製）をプライマーとしてそれぞれ終濃度０．４μＭとなるように加え、２．５単位のＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付の取扱説明書に従い、５０μｌの系でまず９４℃で２分間加熱した後、９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、６８℃４０秒間の条件で３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。該反応液をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製し、最終的に滅菌水に溶解した。全量を１０単位の制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、１０単位の制限酵素ＤｒａＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５８ｋｂのＰｓｔＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を回収した。
次に、プラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０の３μｇを１０単位の制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、１０単位の制限酵素ＤｒａＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．７ｋｂのＰｓｔＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたＰＣＲ産物由来のＰｓｔＩ−ＤｒａＩＩＩ断片とプラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０由来のＰｓｔＩ−ＤｒａＩＩＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列の解析を行った。塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有する第２図に示したプラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ１を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ１で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ１は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１０として寄託されている。
４２番目のＧｌｙをＡｓｐに、また４４番目のＧｌｙをＡｒｇに改変する際には、ＰＣＲプライマーとしては配列番号２４に記載の塩基配列を有する変異導入のための合成ＤＮＡ（ＧＥＮＳＥＴ社製）とＭ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）をプライマーとする以外は、基本的には上記と同様の方法で実施し、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ２を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ２で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ２は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１１として寄託されている。
また上記３残基全ての改変は、以下のようにして構築した。得られたｐＫＭ２１６０Ｇａｌ１とｐＫＭ２１６０Ｇａｌ２を各約０．５μｇ用いて、１０単位のＮｈｅＩ（宝酒造社製）で３７℃で１時間反応させた後、更にＳｃａＩ（宝酒造社製）で３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ１由来の約１．３ｋｂのＮｈｅＩ−ＳｃａＩ断片と、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ２由来の約２．０ｋｂの断片を回収した。得られた２種類の断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列の解析を行った。塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有する第３図に示したプラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ３を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ３で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ３は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１２として寄託されている。
次に、実施例１の１項（１）で設計した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に配列番号１５に記載の抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖の分泌シグナル配列を繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号１６、４２、４３、４４、４５、および２１の６本の合成オリゴヌクレオチドを合成し（ＧＥＮＳＥＴ社製）、本項に記載したｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０と同様の方法でｐＫＭ２１６０ＨＶ０を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０ＨＶ０で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０ＨＶ０は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２７日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１８として寄託されている。
２８番目のＴｈｒをＩｌｅに改変する際には、配列番号４２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号６９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、また配列番号４３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号４６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて上記のプラスミドｐＫＭ２１６０ＨＶ０の構築と同様の反応を行うことにより、目的の塩基配列を有するｐＫＭ２１６０ＨＶ１を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０ＨＶ１で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０ＨＶ１は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２７日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１９として寄託されている。
２８番目のＴｈｒをＩｌｅに、および９７番目のＡｌａをＧｌｙに改変する際には、配列番号４２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号６９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、また配列番号４３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号４６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、また配列番号４５に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号４７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて上記のプラスミドｐＫＭ２１６０ＨＶ０の構築と同様の反応を行うことにより、目的の塩基配列を有するｐＫＭ２１６０ＨＶ３を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０ＨＶ３で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０ＨＶ３は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２７日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７２１として寄託されている。
９７番目のＡｌａをＧｌｙに改変する際には、以下の様にして構築した。得られたｐＫＭ２１６０ＨＶ０とｐＫＭ２１６０ＨＶ３を各約０．５μｇ用いて、１０単位のＮｈｅＩ（宝酒造社製）で３７℃で１時間反応させた後、更にＳｃａＩ（宝酒造社製）で３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ｐＫＭ２１６０ＨＶ３由来の約１．３ｋｂのＮｈｅＩ−ＳｃａＩ断片と、ｐＫＭ２１６０ＨＶ０由来の約２．０ｋｂの断片を回収した。得られた２種類の断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列の解析を行った。塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有するプラスミドｐＫＭ２１６０ＨＶ２を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０ＨＶ２で形質転換された大腸菌株である  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０ＨＶ２は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２７日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７２０として寄託されている。
（２）抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
実施例１の１項（２）で設計した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０をコードするｃＤＮＡをＶＨと同様にＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。ただし、分泌シグナル配列としては、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＬ鎖の配列を用いた。
まず、配列番号２６、２７、２８、２９、３０および３１に記載の塩基配列を有する６本の合成オリゴヌクレオチドを合成した（ＧＥＮＳＥＴ社製）。各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に５０μｌの反応液に加えて、０．４μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）、０．４μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）もしくは配列番号３２に示したＭ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ３（ＧＥＮＳＥＴ社製）、および２．５単位のＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。この際の反応条件は９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７４℃６０秒間のサイクルを３０サイクル、その後７２℃で１０分間を１サイクルとした。該反応液をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製し、最終的に滅菌水に溶解した。１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の３μｇを１５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および１５単位の制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を回収した。
次に、上記で得られた抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＶＬのＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列の解析を行った。塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有する第４図に示したプラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ０を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ０で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０ＬＶ０は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１３として寄託されている。
次に、実施例１の１項（３）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は以下に示す方法で行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、マウス抗体ＫＭ２１６０で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
２番目のＩｌｅをＶａｌに改変する際には、配列番号２７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号３３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて上記のプラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ０の構築と同様の反応を行うことにより、目的の塩基配列を有する第５図に示したプラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ１を得た。プラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ１で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０ＬＶ１は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１４として寄託されている。
同様にして３番目のＶａｌをＬｅｕに改変する際には、配列番号２７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号３４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、また上記２残基をすべて改変する際には、配列番号２７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号３５に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることで目的のプラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ２、ｐＫＭ２１６０ＬＶ３をそれぞれ得た。プラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ２で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０ＬＶ２およびプラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ３で形質転換された大腸菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＫＭ２１６０ＬＶ３は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１３年８月２２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１５およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７７１６としてそれぞれ寄託されている。
（３）抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，１０３５（２０００））と実施例１の２項（１）および（２）で得られたプラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０およびｐＫＭ２１６０ＬＶ０を用いて抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｇａｌ０ＬＶ０を以下の様にして構築した。
実施例１の２項（２）で得られたプラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ０の３μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４４ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の３μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．７５ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたｐＫＭ２１６０ＬＶ０由来ＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、第６図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０ＬＶ０を得た。
次に、実施例１の２項（１）で得られたプラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０の３μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０ＬＶ０の３μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０ＬＶ０由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて、添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製した。
得られたプラスミドを用い、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされている第６図に示した発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｇａｌ０ＬＶ０が得られたことを確認した。
また、ＨＶ０を含め、その他ＦＲのアミノ酸残基に改変を加えたＶＨおよびＶＬについても同様の方法を用いて発現ベクターを作製した。
具体的には、実施例１の２項（１）で作製したｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ１、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ２、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ３、ｐＫＭ２１６０ＨＶ０、ｐＫＭ２１６０ＨＶ１、ｐＫＭ２１６０ＨＶ２およびｐＫＭ２１６０ＨＶ３と、実施例１の２項（２）で作製したｐＫＭ２１６０ＬＶ０、ｐＫＭ２１６０ＬＶ１、ｐＫＭ２１６０ＬＶ２およびｐＫＭ２１６０ＬＶ３とをそれぞれ組み合せて以下の発現ベクターであるｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０ＬＶ０、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０ＬＶ１、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０ＬＶ２、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０ＬＶ３、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ１ＬＶ１、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ１ＬＶ３、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ２ＬＶ１、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ２ＬＶ３、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ３ＬＶ１、ｐＫＭ２１６０Ｇａｌ３ＬＶ３、ｐＫＭ２１６０ＨＶ０ＬＶ０、ｐＫＭ２１６０ＨＶ０ＬＶ１、ｐＫＭ２１６０ＨＶ０ＬＶ２、ｐＫＭ２１６０ＨＶ０ＬＶ３、ｐＫＭ２１６０ＨＶ１ＬＶ０、ｐＫＭ２１６０ＨＶ１ＬＶ１、ｐＫＭ２１６０ＨＶ１ＬＶ２、ｐＫＭ２１６０ＨＶ１ＬＶ３、ｐＫＭ２１６０ＨＶ２ＬＶ０、ｐＫＭ２１６０ＨＶ２ＬＶ３、ｐＫＭ２１６０ＨＶ３ＬＶ０およびｐＫＭ２１６０ＨＶ３ＬＶ３の２２種類の発現ベクターを作製した。
実施例２  抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体の動物細胞による発現
１．ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）を用いた抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体の一過性発現
（１）ＣＯＳ−７細胞での一過性発現
１×１０５細胞／ｍｌのＣＯＳ−７細胞を１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（ギブコ社製）にて６ウェルプレート（岩城硝子社製）に２ｍｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で一晩培養した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（ギブコ社製）１００μｌに対してＦｕ−ＧＥＮＥＴＭ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）３μｌを加え、さらに実施例１の２項（３）で得られた２２種類の抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体発現ベクター１μｇをそれぞれ加えて室温で１５分間放置し、ＤＮＡ−リポソーム複合体を形成させた。該反応液を前述したＣＯＳ−７細胞にそれぞれ滴下し、よく混合した後に３７℃で培養した。培養後、７２時間の時点で培養上清を回収し、培養上清中の抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体の活性評価を行った。
（２）抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のヒトＣＣＲ４に対する反応性評価
得られた２２種類の抗体の培養上清を以下の方法にて活性評価を行った。
参考例２で作製された形質転換体ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４）が生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０が反応し得るヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして化合物１（配列番号３７）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００ｍｌに、１００ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌ  ＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル）（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液をｖｏｒｔｅｘ下で滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍｌ  ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムなどのゲルろ過カラムに反応液１ｍｌをアプライし、１．５ｍｌのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（Ａ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０ｍｌ  ＰＢＳを加え、次いで２５０ｍｌ  ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ  １．２５ｍｇ分）をｖｏｒｔｅｘ下で添加して３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２ｍｍフィルターでろ過した後ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．０５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、形質転換株の培養上清を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１リットルの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液）を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、２０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μｌ／ウェル加えて反応を停止した。その後４１５ｎｍの吸光度を測定した。
また、培養上清中のヒトＩｇＧ抗体の産生濃度を比較するためには抗原としてヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）をＰＢＳで２０００倍希釈したものを使用した。
その結果を第７図と第８図に示した。各ヒト型ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体はヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０とほぼ同等の活性を示した。
２．抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現
上記実施例１の２項（３）で得られた抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを用いて抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現を以下の様にして行った。
（１）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）での安定発現
各ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現プラスミドを制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で消化して直線状化した後、１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））により導入後、４０ｍｌのＨ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）培地（牛胎児血清（ＦＢＳ）を５％添加）に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜３日間培養した後、Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を１ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養し、Ｇ４１８耐性の形質転換株を得た。
Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４ヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を実施例２の１項（２）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する：Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになる様に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ＣＣＲ４ヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を実施例２の１項（２）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＣＣＲ４ヒト型ＣＤＲ移植抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を１ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４ヒト型ＣＤＲ移植抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、抗ＣＣＲ４ヒト型ＣＤＲ移植抗体の発現の最も高い形質転換細胞クローンを得た。平成１４年７月３０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｇａｌ１ＬＶ３を遺伝子導入して得た抗体生産細胞であるＫＭ８７６０はＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３０として、また発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｇａｌ２ＬＶ３を遺伝子導入して得た抗体生産細胞であるＫＭ８７５９はＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２９としてそれぞれ国際寄託されている。
（２）抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体の培養上清からの精製
Ｇ４１８耐性を示す形質転換株が出現し、コンフルエントになった時点でＤａｉｇｏ’ｓ  ＧＦ２１（和光純薬社製）を５％の濃度で含むＨ−ＳＦＭ  ３００〜１１００ｍｌのＨ−ＳＦＭ培地に交換し、さらに３〜５日間培養した。コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約３００〜１１００ｍｌよりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体を精製し、精製蛋白質を取得した。
３．精製抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体の活性評価
Ｇａｌ０ＬＶ０、Ｇａｌ０ＬＶ１、Ｇａｌ０ＬＶ３、Ｇａｌ１ＬＶ１、Ｇａｌ１ＬＶ３、Ｇａｌ２ＬＶ１、Ｇａｌ２ＬＶ３、Ｇａｌ３ＬＶ１およびＧａｌ３ＬＶ３の発現ベクターをＹＢ２／０へ導入して得られた抗体生産細胞由来の抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体（以下、それぞれ単にＧａｌ０ＬＶ０、Ｇａｌ０ＬＶ１、Ｇａｌ０ＬＶ３、Ｇａｌ１ＬＶ１、Ｇａｌ１ＬＶ３、Ｇａｌ２ＬＶ１、Ｇａｌ２ＬＶ３、Ｇａｌ３ＬＶ１およびＧａｌ３ＬＶ３と称する）を用いて活性評価を行った。
（１）抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のヒトＣＣＲ４に対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
実施例２の１項（２）に記載の方法と同様に行った。その結果を第９図に示した。どの抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体もヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０とほぼ同程度の活性を示した。
（２）抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のヒトＣＣＲ４高発現細胞との反応性（蛍光抗体法）
参考例３で得られたＣＣＲ４高発現細胞であるＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞を２×１０５個以上、９６ウェルプレートに分注した。各精製抗体をＦＡＣＳ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３）にて１０μｇ／ｍｌに、さらに非特異的な染色を防ぐためにヒトイムノグロブリン（ウェルファイド社製）を３．７５ｍｇ／ｍｌにそれぞれ希釈した抗体溶液を１００μｌ／ウェルとして加え、氷中で３０分間反応させた。陰性対照としては、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＬ−５受容体α鎖抗体（ＷＯ９７／１０３５４）を用いた。ＦＡＣＳ用緩衝液にて２００μｌ／ウェルで２回洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（コールター社製）を１００倍希釈したものを５０μｌ／ウェル加えた。遮光し氷中で３０分間反応後、ＦＡＣＳ用緩衝液２００μｌ／ウェルで３回洗浄した後、反応物を５００μｌＦＡＣＳ用緩衝液に懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。その結果を第１０図に示した。どの抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体もヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０とほぼ同程度の活性を示した。
（３）抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のヒトＣＣＲ４に対する結合活性の測定（ＢＩＡｃｏｒｅ法）
さらに詳細な結合活性を測定するために、精製した各種抗体の結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて以下のように測定した。なお、試料の希釈及び測定中の緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を使用した。まずセンサーチップＳＡ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）にビオチン化したＣＣＲ４部分ペプチドである化合物１の０．０５μｇ／ｍｌの溶液５μｌを５μｌ／分の流速で添加し、センサーチップに固定化した。
作製したビオチン化した化合物１の固定化センサーチップに、精製した抗体の４μｇ／ｍｌの溶液の２０μｌを５μｌ／分の流速で添加し、添加終了後、４分間にわたり解離反応をモニターした後、１０ｍＭのＨＣｌの５μｌを２回添加してセンサーチップ表面を再生した。こうして化合物１に対する結合反応曲線（センサーグラム）を得た。
その結果を第１１図に示した。縦軸は、レゾナンス（共鳴）ユニット（ＲＵ）を表し、センサーチップ上の質量変化を意味する。例えば、１０００ＲＵは蛋白質の約１ｎｇ／ｍｍ２の質量変化に相当する。ＫＭ２７６０は、化合物１に対して時間依存的な結合活性を示し、その結合は、解離反応においてほとんど解離が認められないことから、極めて安定、かつ、高い結合活性を有することが示された。一方、各種抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体は、ヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０とほぼ同程度の解離反応を示したが、ＣＣＲ４部分ペプチドである化合物１への結合反応において若干の活性低下が認められた。ＣＤＲのみを移植した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体Ｇａｌ０ＬＶ０は、最も低い結合活性を示し、ＦＲのアミノ酸残基の改変により、結合活性は上昇した。以上の結果は、マウス抗体ＫＭ２１６０のＣＤＲを適切なヒト抗体のＦＲに移植することにより、マウス抗体の抗原結合活性および結合特異性を維持した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体を作製可能であること、さらに、抗体Ｖ領域の三次元構造等を基に結合活性に重要なＦＲのアミノ酸残基を同定し、それらをＣＤＲとともに移植することで、より結合活性の高い抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体を作製できることを示したものである。本実施例で作製した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体は、ＣＣＲ４に対する高い結合活性を有し、かつ、ヒトにおいてマウス抗体、さらには、ヒト型キメラ抗体よりも免疫原性が低下し、高い安全性と高い治療効果を示すことが期待される。
４．抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
上記実施例２の２項（２）で得られた精製抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下に示す方法に従い、ＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
参考例３で得られたヒトＣＣＲ４高発現細胞ＣＣＲ４／ＥＬ−４を０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養し、１×１０６細胞／０．５ｍｌとなる様に調製し、放射性物質であるクロム酸ナトリウム（Ｎａ２５１ＣｒＯ４）（第一化学薬品社製）を１．８５ＭＢｑ当量加えて３７℃で１．５時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁及び遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を５ｍｌ加え、２×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
ヘパリンナトリウム注射液（武田薬品社製）を２００単位（２００μｌ）入れた注射筒を用いて、健常人ヒト末梢血６０ｍｌを採取した。その全量を等量の生理食塩液（大塚製薬社製）にて２倍に希釈し、１２０ｍｌとした。１５ｍｌ容量の遠心管（住友ベークライト社製）１２本にリンフォプレップ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）を５ｍｌずつ分注し、その上から希釈した末梢血を１０ｍｌずつ重層し、８００×ｇ、２０分間、室温で遠心分離した。血漿層とリンフォプレップ層の間にあるＰＢＭＣ画分を全ての遠心管より採取して１％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩと称す）に懸濁し、４００×ｇ、５分間、４℃で２回遠心洗浄して５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（５×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体を各最終濃度０．１ｎｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌとなる様に加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。
2003018635.tif 000004
その結果を第１２図に示した。第１２図に示した様に、抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体は抗体濃度依存的に強い細胞傷害活性を示した。
５．ヒトＰＢＭＣからのサイトカイン産生抑制効果
抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体であるＧａｌ１ＬＶ３、キメラ抗体であるＫＭ２７６０について、サイトカイン産生抑制効果を検討した。陰性対照として抗ＩＬ−５Ｒ抗体を用いた。
実施例２、４項（２）と同様にしてＰＢＭＣを分離し、９６ウェルＵ字底プレートに１×１０６細胞／ウェルで分注し、さらに評価抗体を最終濃度１μｇ／ｍｌとなるように添加して、合計２００μｌ／ウェルとした。３７℃、５％ＣＯ２気流下、２４時間共培養することでＡＤＣＣ活性を誘導した。培養後、上清を１００μｌ除去し、代わりに１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ホルボール・ミリステート・アセテート）と２μｇ／ｍｌのイオノマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を含んだ培地１００μｌを加え、最終濃度をＰＭＡが５０ｎｇ／ｍｌ、イオノマイシンが１μｇ／ｍｌとし、細胞を刺激してサイトカイン産生を誘導させた。各刺激剤導入後、２４時間培養した後、培養上清を回収してサイトカイン測定キット（バイオソース社製）にてＩＬ−４、ＩＬ−１３、インターフェロン（ＩＦＮ）−γを測定した。産生抑制率は、抗体非添加の場合の各サイトカイン産生量を、抑制率０％として算出し、結果を第１３図に示した。第１３図に示すように、抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＧａｌ１ＬＶ３抗体添加群では、キメラ抗体のＫＭ２７６０と同様に、著明にＴｈ２サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−１３の産生を抑制し、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γにはほぼ影響しなかった。
以上の結果は、各抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体が効率よくヒトのエフェクター細胞を活性化してＣＣＲ４を発現したＴｈ２細胞を減少もしくは除去でき、その結果Ｔｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生抑制効果を惹起でき、気管支喘息やアトピー性皮膚炎などのヒトのＴｈ２介在性免疫疾患の診断もしくは治療に有用であることを示している。
６．ヒト血小板に対する反応性の解析
（１）ヒト血小板の分離
ヒト健常人より採取した血液に３．２％クエン酸ナトリウムを１／１０量添加し、よく混合した。該血液を５ｍｌずつ１５ｍｌチューブ（グライナー社製）に分注し、９０×ｇ、１０分間、室温で遠心分離を行った。上清を採取し、更に１９５０×ｇ、１０分間、室温で遠心分離を行った。上清を除去し、ペレットをＦＡＣＳ用緩衝液に懸濁した後、１１９０×ｇ、５分間、室温で遠心分離を行い、ペレットを洗浄した。再度ＦＡＣＳ用緩衝液にて懸濁し、同様に遠心操作を行った後、ＦＡＣＳ用緩衝液にてペレット状の血小板を約１×１０７個／ｍｌの濃度に調製した。
（２）血小板の染色
上記６項（１）で得られた血小板懸濁液１００μｌに、実施例２の３で得られた精製抗ＣＣＲ４ヒト型ＣＤＲ移植抗体をそれぞれ１０μｇ／１００μｌになるように添加し、室温、暗所で３０分間反応させた。比較対照として抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体であるＫＭ２７６０、抗ＣＣＲ４マウス抗体である１Ｇ１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）をそれぞれ同濃度で血小板懸濁液１００ｍｌに反応させた。反応後、ＦＡＣＳ用緩衝液２ｍｌをそれぞれの１５ｍｌチューブへ添加し攪拌後、８４０×ｇ、５分間、４℃で遠心分離を行い、洗浄した。上清を除去後、再度同様の操作を行った。各ヒト型ＣＤＲ移植抗体とＫＭ２７６０を反応させたサンプル入りチューブには、さらにＦＡＣＳ用緩衝液で５０倍に希釈したＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）をそれぞれ２０μｌ添加し、室温、暗所で３０分間反応させた。１Ｇ１抗体を反応させたサンプル入りチューブについては、さらに５０倍希釈したＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）をも２０μｌ添加し、室温、暗所で３０分間反応させた。
反応後、ＦＡＣＳ用緩衝液をそれぞれ２ｍｌ添加して攪拌した後、８４０×ｇ、５分間、４℃で遠心分離し、洗浄した。上清を除去後、再度同様の操作を行った。ＦＡＣＳ用緩衝液で５００μｌに懸濁した後、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬ（ベックマン・コールタ社製）で蛍光強度を測定した。
その結果を第１４図に示した。比較対照である１Ｇ１抗体は血小板に反応性を示したが、いずれの抗ＣＣＲ４ヒト型ＣＤＲ移植抗体も抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０と同様、ヒト血小板に対して特異的な反応性を示さなかった。
参考例１
マウス抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の作製：
以下の手順に従い、マウス抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体、ＫＭ２１６０（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，８１（１９９９））を産生するハイブリドーマ細胞を作製した。
（１）抗原の調製
ヒトＣＣＲ４（以下、ｈＣＣＲ４と表記する）蛋白質のアミノ酸配列（配列番号４８）をＧｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃを用いて解析し、親水性の高い部分、Ｎ末端、Ｃ末端のなかから抗原として適当と考えられる部分配列として、化合物２（配列番号３６）を選択した。
（２）免疫原の調製
参考例１の（１）のｈＣＣＲ４部分ペプチドは、免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（カルビオケム社）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌに調整し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＳ（ナカライテスク社）を滴下して、３０分間撹拌反応させた。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢ２．５ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、ＰＢＳで透析した。
（３）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
参考例１の（２）で調製したペプチド−ＫＬＨコンジュゲート１００μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに５週令雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に投与し、２週間後より１００μｇのコンジュゲートを１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。最終投与後３日目のマウスより脾臓を摘出し、ＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で裁断し、ピンセットを用いて解した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して上清を除去後、３ｍｌのトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し、赤血球を除いた。更に、ＭＥＭ培地で３回洗浄した後、細胞融合に供した。
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９７）（以下、Ｐ３−Ｕ１と表記する）を培養し、細胞融合における親株として用いた。
（５）ハイブリドーマ細胞の作製
参考例１の（３）および（４）で得られた脾細胞と骨髄腫細胞を１０：１になる様に混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して上清を除去後、沈殿した細胞群に３７℃の条件下でポリエチレングリコール溶液（２ｇのポリエチレングリコール−１０００、２ｍｌのＭＥＭ培地および０．７ｍｌのＤＭＳＯからなる溶液）を１０８個の脾細胞あたり０．５ｍｌ加え、よく懸濁した。更に、１〜２分間毎にＭＥＭ培地を１〜２ｍｌずつ数回加え、最終的にＭＥＭ培地で全量を５０ｍｌとした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）して上清を除去後、１００ｍｌのＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注して５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１０〜１４日間培養した。融合細胞の増殖が見られたウェルについて、培養上清中ｈＣＣＲ４部分ペプチド（化合物２）に対する結合活性をＥＬＩＳＡ法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）等）により測定した。活性の認められたウェルについては、培地をＨＴ培地に変えて１回、更に、培地を正常培地に変えて１回、の計２回の限界希釈法によるクローン化を行った。この様にして、マウス抗体ＫＭ２１６０を生産するハイブリドーマ細胞ＫＭ２１６０を得た。ＫＭ２１６０はｈＣＣＲ４部分ペプチド（化合物２）に特異的に反応した。
参考例２
抗ＣＣＲ４キメラ抗体の作製
１．抗ＣＣＲ４マウス抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析：
（１）抗ＣＣＲ４マウス抗体生産ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
参考例１に記載されたハイブリドーマ細胞ＫＭ２１６０よりｍＲＮＡを回収した。ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマ細胞ＫＭ２１６０の８×１０７細胞よりｍＲＮＡを約４８μｇ調製した。
（２）抗ＣＣＲ４マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製  参考例２の１項（１）で取得したＫＭ２１６０のｍＲＮＡの５μｇから、ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。作製したｃＤＮＡを２０μｌの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧ型抗体のＨ鎖に対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκ型のＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてそれぞれ回収した。次に、λＺＡＰＩＩ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、各々の約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇと、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで末端を脱リン酸化したλＺＡＰＩＩベクター１μｇを、添付の使用説明書に従い、連結した。連結後の各々の反応液のうち２．５μｌをＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングした後、適当量を大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５，３７６（１９８７））に感染させて、ＫＭ２１６０のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして９．３×１０４個、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして７．４×１０４個のファージクローンを取得した。次に各々のファージを、添付の使用説明書に従って、ナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）上に固定した。
（３）抗ＣＣＲ４マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
参考例２の１項（２）で作製したＫＭ２１６０のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブリーのナイロンメンブレンフィルターを、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のＣ領域のｃＤＮＡ（Ｈ鎖はマウスＣγ１ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，２０４７（１９８４））、Ｌ鎖はマウスＣκｃＤＮＡのＨｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（Ｃｅｌｌ，２２，１９７（１９８０））をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖、Ｌ鎖各１０クローン取得した。次に、λＺＡＰＩＩ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の使用説明書に従い、ｉｎ ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により解析した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ２１６０Ｈ４およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ２１６０Ｌ６を得た。
（４）抗ＣＣＲ４マウス抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドｐＫＭ２１６０Ｈ４に含まれていたＨ鎖Ｖ領域の全塩基配列を配列番号６１に、それから推定されたＨ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を配列番号６２に、プラスミドｐＫＭ２１６０Ｌ６に含まれていたＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を配列番号６３に、それから推定されたＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を配列番号６４にそれぞれ示す。既知のマウス抗体の配列データ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１））との比較および精製した抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（島津製作所社製：ＰＰＳＱ−１０）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０をコードする完全長ｃＤＮＡであり、Ｈ鎖については配列番号１５に示したアミノ酸配列の１から１９番目が、Ｌ鎖については配列番号２５に示したアミノ酸配列の１から１９番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
次に、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域のアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベースをＢＬＡＳＴＰ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７））により検索した。その結果、Ｈ鎖、Ｌ鎖ともに完全に一致する配列は認められず、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は新規なアミノ酸配列であることが確認された。
また、抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ＣＣＲ４マウス抗体ＫＭ２１６０のＨ鎖のＶ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１、２および３に、Ｌ鎖のＶ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５、６および７にそれぞれ示した。
２．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１）抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒトＩｇＧ１、κ型の抗体を発現できるヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と参考例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ２１６０Ｈ４およびｐＫＭ２１６０Ｌ６を用いて抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を以下の様にして構築した。
ＫＭ２１６０のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって得るために配列番号６５と６６に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを、Ｌ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを得るために配列番号６７と６８に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを設計した。それぞれの合成ＤＮＡは５’末端にｐＫＡＮＴＥＸ９３へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでおり、ＤＮＡの合成はジェンセット社に委託した。参考例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ２１６０Ｈ４の２０ｎｇを５０μｌのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号１１と１２に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５８℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行った。同様に、参考例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ２１６０Ｌ６の２０ｎｇを５０μｌのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号６７と６８に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、上記の方法でＰＣＲ反応を行なった。該反応液１０μｌをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４６ｋｂのＨ鎖Ｖ領域ＰＣＲ産物、約０．４３ｋｂのＬ鎖Ｖ領域ＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）で消化して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μｌとし、ＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）７．５μｌ、制限酵素ＳｍａＩ０．３μｌを加えて２２℃で一晩反応させた。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する第１５図に示したプラスミドｐＫＭ２１６０ＶＨ４１およびｐＫＭ２１６０ＶＬ６１を得た。
次にヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と上記で得られたｐＫＭ２１６０ＶＨ４１の３μｇをそれぞれ３０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴからなる緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、１０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．０１％トライトンＸ−１００からなる緩衝液に加え、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ｐＫＡＮＴＥＸ９３の約１２．７５ｋｂ、ｐＫＭ２１６０ＶＨ４１の約０．４４ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をそれぞれ回収した。得られた２種類の断片をＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡ各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４４ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片が挿入された第１６図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｈを得た。
次に上記で得られたｐＫＡＮＴＥＸ２１６０ＨとｐＫＭ２１６０ＶＬ６１の３μｇを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡからなる緩衝液に加え全量を３０μｌとし、１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて５５℃で１時間反応させた後、更に制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｈの約１３．２０ｋｂ、ｐＫＭ２１６０ＶＬ６１の約０．４１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片をそれぞれ回収した。得られた２種類の断片をＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片が挿入された第１７図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を得た。該プラスミドに関して、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した結果、目的のＫＭ２１６０Ｈ鎖およびＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
（２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
参考例２の２項（１）で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を用いて抗ＣＣＲ４キメラ抗体の動物細胞での発現を以下の様にして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で消化して直線状化した後、１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））により導入後、４０ｍｌのＨ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）培地（ＦＣＳを５％添加）に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌになる様に添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を参考例２の２項（３）に示すＥＬＩＳＡ法（二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体を使用）により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍｌ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する：Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになる様に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を実施例２の２項（３）に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を１ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞クローンをＫＭ２７６０と命名した。ＫＭ２７６０の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現量は約５μｇ／１０６細胞／２４時間であった。また、ＫＭ２７６０の抗体Ｈ鎖Ｃ領域はヒトＩｇＧ１サブクラスである。なお、ＫＭ２７６０は平成１２年２月２４日付で、通商産業省  工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（現住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４として国際寄託されている。
参考例３
ｈＣＣＲ４高発現細胞の確立：
（１）動物細胞用発現ベクターＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３の構築
動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）のプロモーター領域をサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）からＣＡＧ（ＡＧ（モディファイドチキンβアクチン）プロモーターウィズＣＭＶ−ＩＥエンハンサー）に変更した発現ベクター（ＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３）を作製し、ＣＣＲ４遺伝子を組み込むことで発現ベクターを以下のように構築した。
５μｇのｐｃＤＮＡ３を制限酵素ＮｒｕＩ（宝酒造社製）で３７℃、１時間反応させた後、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。次に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で３７℃、１時間反応させ、アガロースゲル電気泳動にて分画後、ＣＭＶプロモーター領域を含まない約５．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。３μｇのＣＡＧプロモーター（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２３，３８１６（１９９５））領域を有するプラスミドＣＡＧ−ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）をＳａｌＩ（宝酒造社製）で３７℃、１時間反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）にて平滑末端化し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、１時間反応してアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＣＡＧプロモーター領域を含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。それぞれ回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎし、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３を得た。
（２）ｈＣＣＲ４発現ベクターの構築
参考例３の（１）で得られたＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３とｈＣＣＲ４  ＤＮＡの組込まれたｐｃＤＮＡ３（ＣＣＲ４／ｐｃＤＮＡ３）とを用いて以下のようにｈＣＣＲ４発現ベクターを構築した。ＣＡＧ−ｐｃＤＮＡ３、ＣＣＲ４／ｐｃＤＮＡ３共にＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、１時間反応させ、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。次にＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）で３７℃、１時間反応させ、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＣＡＧプロモーター領域を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片とｈＣＣＲ４遺伝子領域を含む約５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。以下、両ＤＮＡ断片を参考例３の（１）と同様の方法を用いて、プラスミドＣＡＧ−ＣＣＲ４／ｐｃＤＮＡ３を得た。
（３）動物細胞におけるｈＣＣＲ４の発現
動物細胞へのプラスミドの導入は、参考例２の２項（２）と同様にエレクトロポレーション法にて行った。ＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−３９）をＰＢＳ（−）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にて１×１０７個／５００μｌに懸濁し、参考例３の（２）で得られたＣＡＧ−ＣＣＲ４／ｐｃＤＮＡ３を１０μｇ加えて氷中で１０分間放置した後、専用キュベット（バイオラッド社製）に入れ、２６０Ｖ、５００μＦＤで遺伝子導入を行った。さらに１０分間氷中にて放置した後、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地２００ｍｌに懸濁し、９６ウェル細胞培養用プレートに２００μｌ／ウェルづつ分注した。２４時間後に培養上清を１００μｌ／ウェル除去し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地を１００μｌ／ウェルづつ分注し、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとした。２週間後、数十株のシングルクローンを選択して拡大培養した。
（４）ｈＣＣＲ４高発現細胞の選択
参考例１の（５）で作製されたハイブリドーマ細胞ＫＭ２１６０が生産するマウス抗体ＫＭ２１６０を用いて、蛍光抗体法で選択した。選択した数十株の遺伝子導入細胞各２×１０５個を９６ウェルＵ字プレートに分注した。公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊（１９８５））でビオチン標識したＫＭ２１６０をＦＡＣＳ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．４）で５μｇ／ｍｌに、また非特異的な染色を防ぐために、ヒトＩｇＧ（ウェルファイド社製）を３．７５ｍｇ／ｍｌにそれぞれ希釈した抗体溶液を２００μｌ／ウェルとして加え、氷中で３０分間反応させた。陰性対象としては、ビオチン化抗ＩＬ−５Ｒ抗体（ＷＯ９７／１０３５４）を同濃度で用いた。緩衝液にて２００μｌ／ウェルで２回洗浄後、ストレプトアビジン−ＰＥ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）を２０μｌ／ウェル加えた。遮光し氷中で３０分間反応後、２００μｌ／ウェルで３回洗浄し、最終的に５００μｌに懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定し、最も強い蛍光強度の株を１種類選択した。このｈＣＣＲ４高発現細胞をＣＣＲ４／ＥＬ−４とする。
産業上の利用可能性
本発明により、ヒトＣＣＲ４に特異的に結合し、ＣＣＲ４に対する新規なＣＤＲを含む、遺伝子組換え抗体およびその抗体断片が提供される。本発明の抗体はＣＣＲ４関連疾患の診断あるいは治療に有用である。とくに免疫細胞染色におけるヒトＴｈ２細胞等のＣＣＲ４発現細胞の免疫学的検出、気管支喘息、アトピー性皮膚炎を始めとするすべてのＴｈ２介在性免疫疾患等のＣＣＲ４関連疾患や異常なＴｈ２細胞等のＣＣＲ４発現細胞のバランスにより病態が進行する疾患、白血病のような血液癌を始めとする癌疾患の診断あるいは治療に有用である。
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【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ０の造成工程を示した図である。
第２図は、プラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ１の造成工程を示した図である。＊は、アミノ酸残基を改変するための変異遺伝子コドンの位置を示している。
第３図は、プラスミドｐＫＭ２１６０Ｇａｌ３の造成工程を示した図である。＊は、アミノ酸残基を改変するための変異遺伝子コドンの位置を示している。
第４図は、プラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ０の造成工程を示した図である。
第５図は、プラスミドｐＫＭ２１６０ＬＶ１の造成工程を示した図である。＊は、アミノ酸残基を改変するための変異遺伝子コドンの位置を示している。
第６図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０ＬＶ０およびプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｇａｌ０ＬＶ０の造成工程を示した図である。
第７図は、各抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体の発現ベクターをＣＯＳ−７細胞に一過性発現させ、得られた培養上清中のＣＣＲ４部分ペプチドへのＥＬＩＳＡ法における反応性を示した図である。
第８図は、別のＦＲを用いて作製した各抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体の発現ベクターをＣＯＳ−７細胞に一過性発現させ、得られた培養上清中のＣＣＲ４部分ペプチドへのＥＬＩＳＡ法における反応性を示した図である。
第９図は、精製した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＣＣＲ４部分ペプチドへのＥＬＩＳＡ法における反応性を示した図である。
第１０図は、精製した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＣＣＲ４高発現細胞（ＣＣＲ４／ＥＬ−４）に対する反応性を示した図である。
第１１図は、精製した抗ＣＣＲ４ＣＤＲ移植抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する親和性を表面プラズモン共鳴センサーを用いて測定した図である。
第１２図は、ＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞に対するＡＤＣＣ活性による細胞傷害性を示した図である。
第１３図は、ヒトＰＢＭＣからのＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ産生抑制効果を示した図である。
第１４図は、ヒト血小板に対する各抗体の結合活性を示した図である。
第１５図は、プラスミドｐＫＭ２１６０ＶＨ４１とｐＫＭ２１６０ＶＬ６１の造成工程を示した図である。
第１６図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０Ｈの造成工程を示した図である。
第１７図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の造成工程を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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