(57)【要約】癌細胞に耐性を付与する既知の輸送体タンパク質によっては輸送されるという報告のない独自構造の抗癌剤を用いて、該抗癌剤に耐性な細胞株を樹立し、該耐性株に高度に発現しているタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離することに成功した。この遺伝子とタンパク質を利用することにより、抗癌剤耐性細胞の検出及び癌患者に投与できる抗癌剤の選択が可能となる。更に、該輸送体に対する阻害候補化合物のスクリーニングが可能となり、得られた阻害剤を該抗癌剤と併用することにより抗癌剤耐性癌細胞の感受性を増強することができる。
2002028894.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のアミノ酸配列からなり、かつ哺乳動物細胞に癌化学療法剤耐性を付与するタンパク質：
（Ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号：２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加したアミノ酸配列。
【請求項２】
前記癌化学療法剤が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲１に記載のタンパク質：
2002028894.tif 000038
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項３】
請求の範囲１または２に記載のタンパク質の部分ペプチド。
【請求項４】
請求の範囲１から３のいずれかに記載のタンパク質もしくは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列が、配列番号：１に表されるＤＮＡ配列のコード領域またはその相補的な配列の、少なくとも一部分からなることを特徴とする請求の範囲４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物に対する耐性を有する哺乳動物細胞を検出するために用いることを特徴とする請求の範囲４または５に記載のポリヌクレオチド：
2002028894.tif 000039
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項７】
配列番号：１で表されるＤＮＡ配列において１４８９番目の塩基（Ｇ）を含む１５〜１００の連続したＤＮＡ配列またはその相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求の範囲４または５に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項９】
請求の範囲８に記載の組換えベクターを保持する形質転換体。
【請求項１０】
請求の範囲９に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたタンパク質または部分ペプチドを回収する工程を含む、請求の範囲１から３のいずれかに記載のタンパク質または部分ペプチドの製造方法。
【請求項１１】
請求の範囲１から３のいずれかに記載のタンパク質または部分ペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１２】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物に対して耐性を有する哺乳動物細胞を検出するために用いる、請求の範囲１１記載の抗体。
2002028894.tif 000040
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項１３】
請求の範囲１または２記載のタンパク質の発現を抑制するアンチセンスヌクレオチド。
【請求項１４】
請求の範囲１または２記載のタンパク質の発現を指標とすることにより癌患者の癌化学療法剤に対する耐性を予測する方法。
【請求項１５】
前記癌化学療法剤が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲１４記載の方法。
2002028894.tif 000041
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項１６】
請求の範囲１または２記載のタンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記タンパク質と、癌化学療法剤と、候補化合物とを接触させる工程、及び
（ｂ）前記タンパク質の活性を抑制する候補化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記タンパク質の活性が、前記癌化学療法剤を基質として、該基質との結合活性、該基質結合時のＡＴＰ分解活性、または該基質の膜輸送活性である請求の範囲１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求の範囲１または２記載のタンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求の範囲１または２記載のタンパク質を発現する哺乳動物細胞に、癌化学療法剤、及び候補化合物を接触させる工程、及び
（ｂ）前記癌化学療法剤が有する前記哺乳動物細胞に対する毒性を増強する候補化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求の範囲１６から１８のいずれかに記載の方法によって得られる阻害剤。
【請求項２０】
請求の範囲１９に記載の阻害剤により、請求の範囲１に記載のタンパク質の機能を阻害する方法。
【請求項２１】
請求の範囲１１または１２に記載の抗体により、請求の範囲１に記載のタンパク質の機能を阻害する方法。
【請求項２２】
請求の範囲１３記載のアンチセンスヌクレオチドにより、請求の範囲１に記載のタンパク質の発現を阻害する方法。
【請求項２３】
請求の範囲２０から２２のいずれかに記載の方法により請求の範囲１に記載のタンパク質の機能または発現を阻害することを特徴とする、癌患者の化学療法剤に対する感受性を高める方法。
【請求項２４】
前記癌化学療法剤が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲２３に記載の方法。
2002028894.tif 000042
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は医薬の分野で有用であり、より具体的には癌化学療法剤を排出し細胞に耐性を付与する新規タンパク質、それをコードするＤＮＡ、癌化学療法剤耐性細胞の検出方法、患者における癌化学療法剤の選択指標および癌化学療法剤耐性を克服する為の阻害剤のスクリーニング方法等に関するものである。
背景技術
癌化学療法剤に対する耐性は、従来の細胞毒性薬剤による癌治療における主要な問題である。腫瘍は最初は化学療法剤に良く反応するが、後には様々な薬剤に対しても耐性になり再発がおこる。このような化学療法剤耐性の主要な原因として、薬剤排出による細胞内薬剤濃度の減少があげられる。これは癌細胞において化学療法薬剤を細胞外へ排出する輸送体の発現に依存した機構であり、該輸送体の代表例としてＭＤＲ１遺伝子にコードされるＰ−糖タンパク質（以下、Ｐ−ｇｐと称する）及びＭＲＰ遺伝子にコードされる多薬剤耐性関連タンパク質（以下、ＭＲＰと称する）が報告されている。Ｐ−ｇｐは多くの腫瘍タイプの多剤耐性に関係するとして古くから知られた分子ポンプであり、またＭＲＰは最初に肺癌における多剤耐性に関係することから判明し、後に他の癌タイプでも発現することが判明した（Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８，１６５０−１６５４（１９９２））（Ｓｌｏｖａｋ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，３２２１−３２２５（１９９３））輸送体である。
これらの遺伝子はいずれもＡＢＣ輸送体スーパーファミリー（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）の一員であり、細胞膜に局在しＡＴＰの加水分解を利用して基質を輸送する一群の分子である。
近年、新たなＡＢＣファミリー分子が次々と発見され、Ｐ−ｇｐやＭＲＰの他にも薬剤耐性への関与が示唆される分子ポンプが明らかになりつつある。このような分子の一つとして、ＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ／ＭＸＲ／ＡＢＣＰ）と称されるサブファミリーがある。このサブファミリーには胎盤特異的に発現する遺伝子としてＡＢＣＰ（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，５３３７−５３３９（１９９８））、アドリアマイシンで選択した耐性細胞株から取得された遺伝子としてＢＣＲＰ（Ｄｏｙｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１５６６５−１５６７０（１９９８））、及びミトキサントロンで選択した耐性細胞株から取得された遺伝子としてＭＸＲ（Ｍｉｙａｋｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，８−１３（１９９９））が各々報告された。これら３種の遺伝子は各遺伝子間で塩基置換に由来する１ないし４アミノ酸の相違がみとめられる。
ＢＣＲＰとして報告された配列をＭＣＦ−７細胞に導入、発現させた細胞株の解析から、この遺伝子の発現がミトキサントロンやアドリアマイシンに耐性を付与することが示され、新たな多剤耐性因子として注目されている（Ｄｏｙｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１５６６５−１５６７０（１９９８））（ＷＯ９９／４０１１０）。
しかしながら、それらの報告ではアドリアマイシン、ダウノルビシン及びミトキサントロン等のアンスラキノン骨格を持つ抗癌化学療法剤と該遺伝子との関連についてのみ開示されているだけである。さらに、該遺伝子のアミノ酸置換と基質特異性との関連については何の開示も示唆もなされていない。
最近、ＡＢＣＧ２サブファミリー（ＢＣＲＰ／ＭＸＲ／ＡＢＣＰ）の発現と前記アンスラキノン骨格を有さないトポテカンに対する耐性現象との相関が示唆される報告（Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，４５５９−４５６３（１９９９））がなされたが明確な証明はなされていない。
一方、下記の一般式（Ｉ）
2002028894.tif 000003
［式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す］で表される化合物（以下、インドロカルバゾール系化合物と称する）に対する薬剤耐性機構に関しては、化合物−Ａ（前記一般式（Ｉ）において、Ｘ１は１−ヒドロキシ基、Ｘ２は１１−ヒドロキシ基、Ｒはホルミルアミノ基、Ｇはβ−Ｄ−グルコピラノシル基を示す。）において、種々の細胞に対する細胞生育阻害効果と、その細胞内での該化合物−Ａの蓄積量との相関が報告（Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５，１３１０−１３１５（１９９５）および、Ｋａｎｚａｗａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５，２８０６−２８１３（１９９５））されている。
しかしながら、該報告では細胞内蓄積量の変化による耐性が前記Ｐ−ｇｐとは関係無い作用によって起こることが開示されているにすぎず、上記の全ての報告を含め、過去に該インドロカルバゾール系化合物の細胞内蓄積量若しくは薬剤耐性に関与する因子を明らかにした報告は無い。
発明の課題
アンスラキノン骨格を持つ癌化学療法剤（アドリアマイシン、ドキソルビシン及びミトキサントロン等）に関しては、前記Ｐ−ｇｐ、前記ＭＲＰ及び前記ＢＣＲＰによる耐性が考えられるので好ましい癌化学療法剤とはいえない。このような状況下において、Ｐ−ｇｐ等で輸送されない特徴をもつ抗癌剤の開発が望まれている。
上述したインドロカルバゾール骨格を有する化合物は、前記Ｐ−ｇｐ、前記ＭＲＰ及び前記ＢＣＲＰによる耐性が報告されておらず、トポイソメラーゼ阻害剤である化合物−Ａ（Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５，１３１０−１３１５（１９９５））、化合物−Ｂ（前記一般式（Ｉ）において、Ｘ１は２−ヒドロキシ基、Ｘ２は１０−ヒドロキシ基、Ｒは（１−ヒドロキシメチル−２−ヒドロキシ）エチルアミノ基、Ｇはβ−Ｄ−グルコピラノシル基を示す。）（Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，４２７１−４２７５（１９９９））及びタンパク燐酸化酵素阻害剤であるＵＣＮ−０１（Ａｋｉｎａｇａ，，Ｓ．．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１，４８８８−４８９２（１９９１））が新規な抗癌剤の候補として期待されている。しかしながら、前記Ｙｏｓｈｉｎａｒｉの開示からインドロカルバゾール系化合物の細胞内蓄積量変化が何によって起こるかを究明することは重要である。
従って、本発明は、インドロカルバゾール系化合物の細胞内蓄積に関連するタンパク質とそれをコードするポリヌクレオチドを提供することを課題とする。また、本発明はこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドや該タンパク質の抗体を用いて癌細胞や癌患者における当該遺伝子の発現の検出方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は該遺伝子及びタンパク質を利用した抗癌剤耐性克服剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
発明の開示
本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、本発明者等は前記化合物−Ａに耐性となる細胞株の樹立を行った。これは具体的にはマウスＬＹ細胞株、ヒトＨＣＴ１１６細胞株、ヒトＰＣ−１３細胞株を長期間化合物−Ａ存在下に培養することにより達成した。得られた化合物−Ａ耐性細胞株、すなわちＬＹ／ＮＲ２，ＨＣＴ１１６／ＮＲ１，ＰＣ−１３／ＮＲ１３，または自然耐性株ＨｅＬａ＃７ではいずれにおいても化合物−Ａ等のインドロカルバゾール系化合物に対し５０〜数千倍の耐性を示す一方、カンプトテシン、アドリアマイシン、ミトキサントロンなどの他の抗癌剤にはせいぜい２０倍程度の交差耐性しか示さなかった為、これらの耐性細胞株においてインドロカルバゾール系化合物特異的な耐性メカニズムの存在が考えられた。またこれらの耐性細胞株において化合物−Ａ等のインドロカルバゾール系化合物の細胞内蓄積が低下していることを見出したことから、耐性株においてインドロカルバゾール系化合物の細胞内濃度を下げ、耐性をもたらしてる因子の存在が予想された。
次に、本発明者はＤＮＡチップを用いてマウス化合物−Ａ耐性細胞株ＬＹ／ＮＲ２と親株ＬＹ細胞における全既知遺伝子転写産物の発現の比較を行い、その結果最も耐性株特異的に発現が上昇している遺伝子として、ＡＢＣトランスポーターの一員であるＡＢＣＧ２サブファミリーと高いホモロジーを有する遺伝子配列（本発明のＡＢＣＧ２）を見出した。
ノーザン解析により該遺伝子がマウスＬＹ／ＮＲ２細胞のみならず、取得されたすべてのヒト由来耐性細胞でも過剰発現しているのが見出された。従って、すべての化合物−Ａ耐性細胞で本発明のＡＢＣＧ２遺伝子が高発現しているという事実と、前記ＢＣＲＰ等が抗癌剤排出に関与しているという従来の知見から、本発明の遺伝子産物がインドロカルバゾール系化合物に対する耐性を付与する因子であることが強く示唆された。
そこで本発明者等はヒト自然耐性細胞株ＨｅＬａ＃７より従来のヒトＡＢＣＧ２の配列をもとにデザインしたプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により本発明の全長ｃＤＮＡを単離し、塩基配列の解析から、本発明の遺伝子の配列がこれまで報告されてきたどのＡＢＣＧ２の配列とも異なる新規なものであるということを発見した。即ち本発明の遺伝子はＢＣＲＰとして報告されているアミノ酸配列の４８２番目のスレオニンをコードしているコドン配列が一塩基置換によりアルギニンをコードする配列に変化していた。さらに本発明者は、ヒト正常組織、すなわち胎盤および腎臓由来のｃＤＮＡから本発明者の得たＡＢＣＧ２配列と既存のＡＢＣＧ２配列、即ちＢＣＲＰ、ＭＸＲと異なる配列を示す部分に注目して塩基配列を決定したところ、ヒト正常組織では本発明者がＨｅＬａ＃７から得た配列と同じアミノ酸配列のタンパク質が発現していることが明かとなった。
本発明者等は、本発明の遺伝子がインドロカルバゾール系化合物に対する耐性を細胞に付与する能力があるかどうかを検討した。即ち、ＨｅＬａ＃７から単離した全長遺伝子を発現ベクターに繋ぎ、ＰＣ−１３細胞で強制発現させた安定形質発現株を作成した。その結果、本発明のＡＢＣＧ２を強制発現させた細胞では化合物−Ａ等のインドロカルバゾール系化合物に対し約１０〜２０倍耐性となったことから、本発明の遺伝子がインドロカルバゾール系化合物に対する耐性因子であることが判明した。同時に、本発明者は本発明の遺伝子発現細胞が前記ＢＣＲＰで報告されたミトキサントロン耐性及びアドリアマイシン耐性にはならないことを見出し、本発明の一アミノ酸異なる遺伝子が新規な活性をもつ、新しいタイプの遺伝子であることを証明した。
さらに本発明者等は本発明のＡＢＣＧ２とＢＣＲＰとして報告されている配列（Ｄｏｙｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１５６６５−１５６７０（１９９８））（ＷＯ９９／４０１１０）との間にみられる、一アミノ酸の違いと各薬剤に対する耐性の関係を明らかにするために、本発明のＡＢＣＧ２と、アミノ酸置換の導入によりＢＣＲＰとして報告されているコドン４８２番目がスレオニンをコードするようになったＡＢＣＧ２（ＡＢＣＧ２−４８２Ｔ）をそれぞれＭＣＦ−７細胞に導入して、性質を比較した。
その結果、ＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入した細胞はインドロカルバゾール系化合物である化合物−Ｂの他にミトキサントロンやアドリアマイシンに対して耐性を示したのに対して、本発明のＡＢＣＧ２を導入したものは化合物−Ｂのみに強い耐性を示し、インドロカルバゾール化合物に選択的な耐性を示すことが明らかとなった。また細胞内へのこれらの化合物の蓄積に関しても、同様な選択性の違いが認められ、本発明のＡＢＣＧ２がもたらすインドロカルバゾール選択的耐性がこの分子の基質特異的な輸送によるものであることが示唆された。これにより、かつてＢＣＲＰとして報告されていたＡＢＣＧ２と本発明のＡＢＣＧ２の性質に関して明確な違いが見いだされ、またその違いがコドン４８２の１アミノ酸の違いに基づいたものであることが示された。
従って、本発明者等は本発明のＡＢＣＧ２遺伝子がインドロカルバゾール系化合物選択的な耐性を細胞に付与するという証明から、本発明の遺伝子、タンパク及びそれらの断片、或いは抗体が、癌患者での該遺伝子の発現検出や、がん患者がインドロカルバゾール系化合物に対して選択的に耐性であるか否かの予測等に応用可能であり、更には、該遺伝子の発現調節物質若しくは該遺伝子産物であるタンパク質の活性を調節するような物質のスクリーニング及びこれらの物質による薬剤耐性克服等へ応用しうることを見出した。
すなわち本発明は、哺乳動物細胞に癌化学療法剤に対する耐性を付与するヒトＡＢＣＧ２タンパク質（以下本発明のＡＢＣＧ２と呼ぶ）及びそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド，並びにそれらの製造および用途に関し、より具体的には、
（１）  下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のアミノ酸配列からなり、かつ哺乳動物細胞に癌化学療法剤耐性を付与するタンパク質：
（Ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加したアミノ酸配列、
（２）  前記癌化学療法剤が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする（１）に記載のタンパク質：
2002028894.tif 000004
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す、
（３）  （１）または（２）に記載のタンパク質の部分ペプチド、
（４）  （１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質もしくは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的な配列からなるポリヌクレオチド、
（５）  前記ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列が、配列番号：１に表されるＤＮＡ配列のコード領域またはその相補的な配列の、少なくとも一部分からなることを特徴とする（４）に記載のポリヌクレオチド、
（６）  上記一般式（Ｉ）で表される化合物に対する耐性を有する哺乳動物細胞を検出するために用いる、（４）または（５）に記載のポリヌクレオチド、
（７）  配列番号：１で表されるＤＮＡ配列において１４８９番目の塩基（Ｇ）を含む１５〜１００の連続したＤＮＡ配列またはその相補的な配列からなるポリヌクレオチド、
（８）  （４）または（５）に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター、
（９）  （８）に記載の組換えベクターを保持する形質転換体、
（１０）  （９）に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたタンパク質または部分ペプチドを回収する工程を含む、（１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質または部分ペプチドの製造方法、
（１１）  （１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質または部分ペプチドに特異的に結合する抗体、
（１２）  上記一般式（Ｉ）で表される化合物に対して耐性を有する哺乳動物細胞を検出するために用いる、（１１）記載の抗体、
（１３）  （１）または（２）記載のタンパク質の発現を抑制するアンチセンスヌクレオチド、
（１４）  （１）または（２）記載のタンパク質の発現を指標とすることにより癌患者の化学療法剤に対する耐性を予測する方法、
（１５）  前記癌化学療法剤が、上記一般式（Ｉ）で表される化合物である（１４）に記載の方法、
（１６）  （１）または（２）記載のタンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記タンパク質と、癌化学療法剤と、候補化合物とを接触させる工程、及び
（ｂ）前記タンパク質の活性を抑制する候補化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法、
（１７）前記タンパク質の活性が、前記癌化学療法剤を基質として、該基質との結合活性、該基質結合時のＡＴＰ分解活性、または該基質の膜輸送活性である（１６）に記載のスクリーニング方法、
（１８）  （１）または（２）記載のタンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（１）または（２）記載のタンパク質を発現する哺乳動物細胞に、癌化学療法剤、及び候補化合物を接触させる工程、及び
（ｂ）前記癌化学療法剤が有する前記哺乳動物細胞に対する毒性を増強する候補化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法、
（１９）  （１６）から（１８）いずれかに記載の方法によって得られる阻害剤、
（２０）  （１９）記載の阻害剤により、（１）記載のタンパク質の機能を阻害する方法、
（２１）  （１１）または（１２）記載の抗体により、（１）記載のタンパク質の機能を阻害する方法、
（２２）  （１３）記載のアンチセンスヌクレオチドにより、（１）記載のタンパク質の発現を阻害する方法、
（２３）  （２０）から（２２）のいずれかの方法により（１）に記載のタンパク質の機能または発現を阻害することを特徴とする、癌患者の化学療法剤に対する感受性を高める方法、
（２４）  （２３）記載の化学療法剤が上記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする方法、に関する。
発明の実施の形態
本発明は、新規な薬剤耐性関連遺伝子とその遺伝子産物に関する。本発明者らにより単離された哺乳動物細胞に癌化学療法剤耐性を付与するタンパク質「本発明のＡＢＣＧ２」（ヒトＡＢＣＧ２）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡによりコードされる「本発明のＡＢＣＧ２」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。本発明のＡＢＣＧ２のｃＤＮＡ配列はインドロカルバゾール系化合物の一種である化合物−Ａ耐性細胞で高発現している遺伝子のスクリーニングを基に見出されたものであり、ＡＢＣ輸送体スーパーファミリーに属する前記ＡＢＣＧ２サブファミリーのうちＢＣＲＰとして開示された遺伝子配列と２塩基違いの配列を有する。それに伴い、本発明のＡＢＣＧ２のｃＤＮＡは該ＢＣＲＰと１アミノ酸違いのタンパク質を形成する新規アミノ酸配列をコードしている。
しかしながら、本発明の課題解決の過程において、本発明のＡＢＣＧ２若しくはＢＣＲＰとして開示された遺伝子を形質導入した細胞株では、種々の薬剤に対する耐性度や細胞内薬剤蓄積量が異なる事が確認され、本発明のＡＢＣＧ２を過剰発現若しくは形質導入した細胞株では、インドロカルバゾール系化合物に対し選択的に耐性を示すことが見出された。すなわち、本発明のＡＢＣＧ２は１アミノ酸異なることにより上記ＢＣＲＰとは異なる性質を有するタンパク質をコードする新規な薬剤耐性関連遺伝子であることが判明した。
本発明において「哺乳動物細胞」とは哺乳類に属する動物の生体を構成している組織、細胞、又はそれらの細胞を体外培養したものを意味する。
本発明において「癌化学療法剤」とは癌の治療の目的で用いられる薬剤を意味し、合成化合物、植物若しくは微生物由来の天然化合物、または前記天然化合物をもとに合成される半合成化合物が含まれる。好ましくは、下記一般式（Ｉ）
2002028894.tif 000005
［式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す］で表される化合物（以下、インドロカルバゾール系化合物と総称する）を意味し、さらに好ましくは該一般式（Ｉ）において、［式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、ハロゲン原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇはアミノ基によって置換を有されてもよい六炭糖基を示す］で表される化合物を意味する。上記のインドロカルバゾール系化合物の製造方法等については、先の特許出願・特許（ヨーロッパ特許公開公報  ０５２８０３０Ａ１、米国特許第５５９１８４２号明細書、米国特許第５６６８２７１号明細書、米国特許第５８０４５６４号明細書、ＷＯ９５／３０６８２、ＷＯ９６／０４２９３、ＷＯ９８／０７４３３、特開平１０−２４５３９０）で開示されている。
「癌化学療法剤耐性」とは前記癌化学療法剤の治療効果に動物細胞が抵抗性を示すことを意味し、癌細胞の、該癌化学療法剤の細胞外排出の亢進による耐性、標的酵素の変異による耐性、体内で活性化を受けて薬効を発揮する薬剤についての薬剤活性化機構の低下による耐性、または障害修復機構の亢進による耐性等のうちいずれをも意味するが、好ましくは癌細胞の該癌化学療法剤排出の亢進によって細胞内薬剤濃度が低下することに起因する耐性を意味する。
「癌化学療法剤に対する耐性を哺乳動物細胞に付与する」とは、前記癌化学療法剤の細胞外排出能力亢進を哺乳動物細胞に付与することを意味し、好ましくはこの細胞外排出能力の亢進が、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリー（ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリー：Ｈｉｇｇｉｎ，Ｃ．Ｆ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８．，６７−１１３）に属しＡＢＣＧ２サブファミリーに属する本発明のＡＢＣＧ２遺伝子の増加、本発明のＡＢＣＧ２遺伝子の転写産物の増加、または本発明のＡＢＣＧ２遺伝子の翻訳産物の過剰発現により付与されることを意味する。さらに「癌化学療法剤に対する耐性を哺乳動物細胞に付与する」とは、本発明のＡＢＣＧ２遺伝子産物の作用により、哺乳動物細胞内に取り込まれた該癌化学療法剤が細胞外に排出され結果的に該癌化学療法剤の細胞内の濃度が減少することにより該癌化学療法剤に対する耐性を哺乳動物細胞に付与することを意味する。
本発明の「ＡＢＣＧ２タンパク質」は、天然のタンパク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製したものをも含む。天然のタンパク質は、例えば、本発明のヒト「ＡＢＣＧ２」タンパク質が発現していると考えられる胎盤など組織の抽出液に対し、後述する「抗ＡＢＣＧ２抗体」を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、後述するように本発明のヒトＡＢＣＧ２タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。また、当業者であれば、公知の方法を用いて本発明のヒトＡＢＣＧ２タンパク質（配列番号：２）中のアミノ酸の置換などの修飾を行い、本発明のタンパク質と同等の機能、すなわちインドロカルバゾール系化合物との結合活性またはインドロカルバゾール系化合物の輸送活性等を有する改変タンパク質を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加などにより天然型のタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、天然型のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も本発明のＡＢＣＧ２タンパク質に含まれる。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７））、ダブルプライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３２９−３５０（１９８７））、カセット変異法（Ｗｅｌｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４，３１５−２３（１９８５））、メガプライマー法（Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８，４０４−４０７（１９９０））が挙げられる。タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位はその機能が保持される限り制限はないが、機能的に同等なタンパク質におけるアミノ酸の変異数は、通常、全アミノ酸の１０％以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは本発明のタンパク質のアミノ酸配列において４８２番目のアミノ酸がアルギニンであり且つ変異数が３アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）である。
また、本発明は、上記本発明のヒトＡＢＣＧ２タンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質のＡＴＰ結合領域を含む部分ペプチド（アミノ酸６１−２７０）、本発明のタンパク質のアミノ酸配列において４８２番目のアミノ酸であるアルギニンを含む部分ペプチド、インドロカルバゾール系化合物との結合活性を有する部分ペプチド及び細胞表面に発現させた場合にインドロカルバゾール系化合物を細胞外へ排出する活性を有する部分ペプチド等が挙げられるがこれに限定されない。これら部分ペプチドは上記の本発明のＡＢＣＧ２タンパク質同様、例えば抗体の調製または後述する医薬品候補化合物のスクリーニングもしくはインドロカルバゾール系化合物で表される化合物の治療効果を高める物質のスクリーニングに利用することができる。また、インドロカルバゾール系化合物との結合活性を有するが細胞外への薬剤排出活性を有しない部分ペプチドは、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質の競合阻害剤になり得る。このような本発明の部分ポリペプチドは、少なくとも１５アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸以上の鎖長を有すると考えられる。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、或いは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断する事によって作成することができる。
また、本発明は、上記本発明のタンパク質又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明で使用する「ポリヌクレオチド」とは一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡおよびそれらの断片などが挙げられ、それらの長さは特に限定しない。
「タンパク質もしくは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド」とは本発明のＡＢＣＧ２タンパク質やその部分ペプチドをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれ、該ポリヌクレオチドとしては、例えば、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。本発明のＡＢＣＧ２タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー又は合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明のヒトＡＢＣＧ２タンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えば、配列番号：１に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質が発現している組織（例えば、胎盤）由来のｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、適当な組織（例えば、胎盤）由来のｃＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号：１に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、ゲノムＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ゲノムＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。一方、合成ＤＮＡは、例えば、配列番号：１に記載のｃＤＮＡの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、アニーリングさせて二本鎖にし、ＤＮＡリガーゼで結合させることにより調製することができる（Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５６５−５７０（１９７６）；Ｇｏｅｄｄｅｌ  Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６，１０６−１０（１９７９））。
また、本発明のポリヌクレオチドは、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物に対する耐性を有する哺乳動物細胞を検出するために用いることができる。すなわち、検体となる哺乳動物細胞のｍＲＮＡを一般的な方法で抽出し、本発明のポリヌクレオチドをプローブとしたノーザンハイブリダイゼーションによって、或いは、抽出ＲＮＡを本発明のポリヌクレオチドの配列上にハイブリダイズする事ができるをプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行う等、何らかの方法により該ＡＢＣＧ２ｍＲＮＡ量を測定し、ｍＲＮＡ量の過剰発現を指標として前記の一般式（Ｉ）で表される化合物に対する耐性を有する哺乳動物細胞を検出することができる。
また、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質に特徴的なｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するために、ＡＢＣＧ２タンパク質の４８２番目のアルギニン残基のコドンに対応する多型を検出することができる。このような多型を検出する方法には、例えば、配列番号：１に表される塩基配列において、１４８９番目の塩基（Ｇ、多型部位）を含む１５〜１００の連続したＤＮＡ配列またはその相補的な配列からなるポリヌクレオチドを固定化したＤＮＡチップ等を用いて、特定の癌細胞から抽出したｍＲＮＡ等とハイブリダイズさせ上記多型部位の塩基配列を検出することができる。
本発明のＤＮＡは、組換えタンパク質の生産に有用である。即ち、上記本発明のＡＢＣＧ２タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１に記載のｃＤＮＡ）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより本発明のヒト由来ＡＢＣＧ２タンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するこことを特徴とする組換えベクターに関する。「組換えベクター」とは外来性ＤＮＡを組み込み、宿主細胞で増えることのできるＤＮＡを指し、これらは自己複製能のあるプラスミド、ファージ、ウイルスなどを改良して作られる。本発明の組換えベクターを作製するために用いるプラスミド等としては、挿入したポリヌクレオチドを安定に保持するもので有れば特に制限されず、例えば、宿主が大腸菌エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合、プラスミドベクターｐＥＴ−３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６，１２５−３５（１９８７））、ｐＧＥＸ−１（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ  ６７，３１−４０（１９８８））などが用いられる。宿主が分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の場合には、プラスミドベクターｐＥＳＰ−１（Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２００，１３５−１４４（１９９７））などが用いられる。宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８／９（クロンテク社）などが用いられる。一方、宿主が哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ、ヒトＨｅＬａ細胞などの場合、ｐＭＳＧ（アマシャム・ファルマシア社）、ｐｃＤＮＡ（インビトロジェン社）などのベクターが用いられる。
また、本発明は、本発明の組換えベクターを保持する形質転換体に関する。「形質転換体」とは組換えベクターにより宿主細胞に外来ＤＮＡが組み込まれた細胞であり、本発明の組換えベクターが導入される宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であっても良く、例えば細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞など本発明の目的で使用できるならいずれの細胞であっても良い。具体的には次のような方法で組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を得ることができる。大腸菌の形質転換は、Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９８３））、電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，６１２７−６１４５（１９８８））などで行う。酵母の形質転換は、例えば、スフェロプラスト法（Ｂｅａｃｈ，Ｄ．ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０，１４０（１９８１））、酢酸リチウム法（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，６４８５−６４８９（１９９０））などにより行われる。昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８０））などに記載の方法に従って行うことができる。哺乳動物細胞への組換えＤＮＡの導入は、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４１−１６４３（１９８４））、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３−７４１７（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１，８４１−８４５（１９８２））などで行われる。
また、本発明は、本発明の形質転換体を用いた、本発明のタンパク質又はその部分ペプチドの製造方法に関する。形質転換体において発現させた組換えタンパク質は、該形質転換体又はその培養上清からこの分野の標準的な方法に従い単離することができる。ここで言う標準の方法とは、硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなど）、電気泳動などを包含する。また、例えば、Ｎ末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを結合した融合タンパク質の形で合成し、金属キレート樹脂、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより精製することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７２１１−７２１５（１９８８））。例えば、ベクターとしてｐＥＳＰ−１を用いた場合、目的のタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として合成されるため、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることより組換えタンパク質を精製できる。融合タンパク質から目的タンパク質を分離するには、例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａなどで切断する。
また、本発明は、本発明のヒトＡＢＣＧ２タンパク質に結合する抗体に関する。本発明のタンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ポリクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫動物に適量の本発明のヒトＡＢＣＧ２タンパク質もしくはその部分ペプチドを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。本発明のＡＢＣＧ２タンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。これにより調製された抗体は、本発明のヒトＡＢＣＧ２タンパク質のアフィニティー精製のために用いられる他、本発明のヒトＡＢＣＧ２タンパク質の発現量の検出などに利用することが可能である。また、該抗体により哺乳動物細胞での該ヒトＡＢＣＧ２タンパク質の発現量を検出し、その過剰発現を指標として前記の一般式（Ｉ）で表される化合物に対する耐性を有する哺乳動物細胞を検出することができる。また、この抗体による癌細胞や癌患者におけるヒトＡＢＣＧ２タンパク質の検出は該タンパク質の過剰発現に起因する疾患や薬剤耐性の診断に利用でき、更にこの抗体はそれらの疾患や薬剤耐性に対する抗体治療にも利用することが可能である。
抗体治療に用いる場合、ヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。ヒト型抗体は、例えば、マウス・ヒトキメラ抗体であれば、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのＨ鎖定常部をヒトＩｇＥ  Ｈ鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌに導入することにより調製できる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，２６８−２７０（１９８５））。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスに本発明のＡＢＣＧ２タンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
また、本発明は、本発明のタンパク質の発現を抑制するアンチセンスヌクレオチドに関する。本発明の「アンチセンスヌクレオチド」は本発明のＡＢＣＧ２タンパク質およびその部分ペプチドをコードするｍＲＮＡの任意の部分、或いは、ｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域の任意の部分と特異的にハイブリダイズし、ｍＲＮＡの翻訳を防止できる配列を有するものである。アンチセンスヌクレオチドは本発明のＡＢＣＧ２タンパク質およびその部分ペプチドをコードするｃＤＮＡ配列の任意の部分と特異的にハイブリダイズしうる配列を有し得る。具体的には、配列番号：１に示すヌクレオチド配列に基づいてアンチセンスヌクレオチドをデザインすることができる。示した配列のコード領域または非翻訳領域の任意の部分の配列に対して相補的な配列を有するアンチセンスヌクレオチドをデザインすることができる。本発明のアンチセンスヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）であっても良く、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良い。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体などが挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、ＡＢＣＧ２タンパク質の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＡＢＣＧ２タンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該アンチセンスヌクレオチド自体は公知の各種の方法で細胞に適用できる。例えば、該アンチセンスヌクレオチドはリポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものを付加された形態で与えられることができ、培養細胞だけに限らず遺伝子治療にも適用可能である。また、該アンチセンスヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを上記のように外から投与する方法に限らず、生体内で該アンチセンスヌクレオチドを発現させる事が可能であるベクターなどを投与する方法でも良い。特表平１１−５１１９６５では多剤耐性関連タンパク質をコードするヒトＭＤＲ１およびＭＲＰ遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、多剤耐性細胞の薬剤に対する感受性増加が示されている。また、該先行技術中に記載されている方法に準じて好ましい標的部位を選択し本発明のアンチセンスヌクレオチドの配列を設計することができる。本発明のアンチセンスヌクレオチドは本発明のＡＢＣＧ２タンパク質を高発現している薬剤耐性癌細胞および癌患者に投与することにより、それらのインドロカルバゾール系化合物に対する感受性を増強するために用いることができる。
また、本発明は、本発明のタンパク質の発現を指標にすることにより、癌患者の化学療法剤に対する耐性を予測する方法に関する。「発現を指標とすること」という表現における「発現」とは、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写され、更にポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるいずれのプロセスをも含む。
「タンパク質の発現を指標とする」とは、被検体中に存在する該タンパク質のｍＲＮＡ量または該タンパク質（ポリペプチド）自体の量を周囲正常組織のそれや、既知の耐性度が明らかとなっている細胞株におけるそれと比較して、どの程度の量の発現が認められるかを指標にすることを意味する。ｍＲＮＡ量で比較を行う場合は、具体的には哺乳動物細胞、癌患者の癌細胞、組織標本、組織検体などから一般的な方法でＲＮＡを抽出し、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分配列からなるＤＮＡ断片をプローブとし、実施例４に示すごとくノーザンハイブリダイゼーションによって測定を行う。或いは、上記の抽出ＲＮＡを、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列上にハイブリダイズすることができるプライマーセットを用い、文献（Ｎｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ．ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７，７１６０−４及びＦｕｔｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｗ．，ｅｔ．ａｌ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９３）２１３，４１４−２１）に準じてＲＴ−ＰＣＲを行うことによって、該タンパク質のｍＲＮＡ量の測定を行うが、該ｍＲＮＡ量の測定方法はこれらに限らない。
また、該タンパク質（ポリペプチド）自体の量で測定および比較を行う場合は、先に述べた「抗体」を用い、文献（Ｂｅｃｋ，Ｗ．Ｔ．，ｅｔ．ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９６）５６，３０１０−２０）に準じた方法で哺乳動物細胞、癌患者の癌細胞あるいは組織切片などの免疫組織化学染色法によってコントロールとの比較を行うか、あるいは被検体のタンパク成分を抽出したものについて、一般的な方法でウエスタンブロッティングを行っても良いが、これらの方法に限定されない。
上記および上記以外のいずれの方法によっても、コントロールに比較し被検体において該タンパク質の「過剰発現」が認められた場合、その検体の由来する細胞或いは患者は化学療法剤耐性を有すると判断する。
また、本発明は、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質の作用に対する阻害剤をスクリーニングする方法をも包含し、これは次の何れかの活性をもつ物質を探索することからなる方法である。（イ）本発明のＡＢＣＧ２タンパク質とその基質化合物の結合を阻害する物質。（ロ）本発明のＡＢＣＧ２タンパク質が有するＡＴＰａｓｅ活性の基質化合物による活性化を阻害する物質。（ハ）本発明のＡＢＣＧ２タンパク質による基質化合物の膜輸送を阻害する物質。（ニ）本発明のＡＢＣＧ２タンパク質の基質化合物が有する細胞毒性を増強する物質。
（イ）の物質を探索することからなる本発明のスクリーニング方法は、（ａ）候補化合物の存在下で本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドに基質化合物を接触させ、該タンパク質またはその部分ペプチドと基質化合物との結合活性を検出する工程、および（ｂ）工程（ａ）で検出された結合活性を、該候補化合物非存在下での結合活性と比較し、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質もしくはその部分ペプチドと基質化合物との結合活性を低下させる物質を選択する工程を含む。該候補化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。スクリーニングに用いる本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドは精製された状態のみならず、例えば、アフィニティーカラムに結合した形態、該タンパク質もしくはその部分ペプチドを細胞膜に発現した所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）の膜小胞（Ｌｅｉｅｒ  Ｉ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６９（４５）：２７８０７−１０，１９９４の方法に準じて調製できる）、あるいは精製した該タンパク質またはその部分ペプチドをリポソーム上に再構成した形態（Ａｎｂｕｄｋａｒ，Ｓ．Ｖ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：８４７２−８４７６の方法に準じて調製できる）などであってもよい。スクリーニングに利用する基質化合物は特に限定しないが、好ましくはインドロカルバゾール系化合物、例えば化合物−Ａが用いられ、これらは必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識、光親和性標識などが挙げられるが、これらに制限されない。本発明のヒトＡＢＣＧ２タンパク質と基質化合物との結合活性は、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質に結合した化合物に付された標識により検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）することができるほか、光親和性標識の場合は文献（Ｃｏｒｎｗｅｌｌ  ＭＭ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：３８４７−５０，１９８６）の方法に準じ、該タンパクまたはその部分ペプチドと光親和性標識化合物が共有結合したものをＳＤＳポリアクリルアミドゲル等で分離し、オートラジオグラフィで光親和性標識化合物の放射活性を測定することによって検出することもできる。検出の結果、該候補化合物の存在下における結合活性が、該候補化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、該候補化合物は、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドと基質化合物との結合を阻害する活性を有すると判定される。
（ロ）の物質を探索することからなる本発明のスクリーニング方法は、（ａ）候補化合物の存在下で本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドに基質化合物を接触させた時に生じるＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程、および（ｂ）工程（ａ）で検出されたＡＴＰａｓｅ活性を、該候補化合物非存在下でのＡＴＰａｓｅ活性と比較し、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質が有するＡＴＰａｓｅ活性の基質化合物による活性化を阻害する物質を選択する工程を含む。該候補化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。スクリーニングに用いる本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドは該タンパク質もしくはその部分ペプチドを細胞膜に発現した所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）の膜小胞、あるいは精製した該タンパク質またはその部分ペプチドをリポソーム上に再構成した形態などであってもよい。スクリーニングに利用する基質化合物は特に限定しないが、好ましくはインドロカルバゾール系化合物、例えば化合物−Ａが用いられる。ＡＴＰａｓｅ活性は一般的な方法、例えばＡＴＰの加水分解によって生じる無機リン酸の量を比色定量する（Ａｄａｍ  Ｂ．Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６９：３７４５−３７５４，１９９４参照）方法などにより測定することができる。該候補化合物の存在下におけるＡＴＰａｓｅ活性が、該候補化合物の非存在下におけるＡＴＰａｓｅ活性（対照）より低い値を示した場合には、該候補化合物は本発明のＡＢＣＧ２タンパク質が有するＡＴＰａｓｅ活性の基質化合物による活性化を阻害する活性をもつと判定する。
（ハ）の物質を探索することからなる本発明のスクリーニング方法は、大きく３つの方法に分けられる。
第一の方法は本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドを細胞膜に発現した所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）の膜小胞、あるいは精製した該タンパク質またはその部分ペプチドをリポソーム上に再構成した小胞を用い、（ａ）候補化合物の存在下でこれらの小胞に該タンパク質の基質化合物を接触させ、小胞中に輸送された該基質化合物量を測定する工程、および（ｂ）工程（ａ）で測定された小胞中に輸送された該基質化合物量を、該候補化合物非存在下での輸送された該基質化合物量と比較し、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドによる該基質化合物の膜輸送活性を阻害する物質を選択する工程を含む。具体的には、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９．２７８０７−１０（１９９４）の記載に準じた方法によって実施することが可能である。スクリーニングに利用する基質化合物は特に限定しないが、好ましくはインドロカルバゾール系化合物、例えば化合物−Ａが用いられ、これらは必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられ、小胞内に輸送された基質化合物量は、これらの標識により検出（例えば、放射活性や蛍光強度により検出）する。検出の結果、該候補化合物存在下における小胞内の該基質化合物量が、該候補化合物の非存在下における小胞内の該基質化合物量（対照）より低い値を示した場合に、該候補化合物は、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドによる該基質化合物の膜輸送活性を阻害する活性を有すると判定される。
第二の方法は本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドを細胞膜に発現した所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）を用い、（ａ）候補化合物の存在下これらの細胞に該タンパク質の基質化合物を一定時間接触させたのち、細胞内に蓄積された該基質化合物量を測定する工程、および（ｂ）工程（ａ）で測定された細胞中に蓄積された該基質化合物量を、該候補化合物非存在下で細胞中に蓄積された該基質化合物量と比較し、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質もしくはその部分ペプチドによる細胞外への膜輸送（排出）活性を低下させる物質を選択する工程を含む。
第三の方法は本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドを細胞膜に発現した所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）を用い、（ａ）細胞に該タンパク質の基質化合物を接触させ、細胞内に基質化合物を蓄積させる工程、（ｂ）候補化合物の存在下、工程（ａ）で得られた細胞を一定時間培養し細胞内に残留している該基質化合物量を測定する工程、および（ｃ）工程（ｂ）で測定された細胞内残留該基質化合物量を、該候補化合物非存在下での培養後の細胞内残留該基質化合物量と比較し、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質もしくはその部分ペプチドによる細胞外への膜輸送（排出）活性を低下させる物質を選択する工程を含む。第二、第三の方法は、Ｂｒｕｉｎ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ．Ｌｅｔ．１４６．１１７−２６（１９９９）の記載に準じて実施することが可能である。第二、第三のいずれの方法においても、利用する基質化合物は特に限定しないが、細胞内に透過しなおかつ本発明のＡＢＣＧ２タンパク質によって輸送され得る蛍光物質、あるいはインドロカルバゾール系化合物、例えば化合物−Ａが用いられ、これらは必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられ、細胞内に蓄積又は残留した基質化合物量はこれらの標識により検出（放射標識の場合は放射活性量を測定し、蛍光標識の場合は蛍光強度をフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡および蛍光光度計などで測定）することができる。検出の結果、該候補化合物の存在下における該基質化合物の細胞内蓄積又は残留量が、該候補化合物の非存在下における細胞内蓄積量又は残留量（対照）より高い値を示した場合に、該候補化合物は、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドによる該基質化合物の膜輸送活性を阻害する活性を有すると判定される。また、第一、第二、第三のいずれのスクリーニング方法においても、該候補化合物として、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。
（ニ）の物質を探索することからなる本発明のスクリーニング方法は、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質またはその部分ペプチドを細胞膜に発現した所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）を用い、（ａ）該細胞を候補化合物の存在下で該タンパク質の基質化合物と一定時間培養し生存細胞数を測定する工程、および（ｂ）工程（ａ）で測定された生存細胞数を、該候補化合物非存在下で該基質化合物と一定時間培養した場合の生存細胞数と比較し、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質の該基質化合物が有する細胞毒性効果を増強する物質を選択する工程を含む。該候補化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。スクリーニングに利用する基質化合物は特に限定しないが、好ましくはインドロカルバゾール系化合物、例えば化合物−Ａなどの細胞毒性効果を有するものが用いられる。生存細胞数の測定は、それらのタンパク質量あるいはミトコンドリアにおける還元酵素の活性の測定などに置き換えられることは当業者であれば公知の事実である。
以上に示したような、本発明のスクリーニング方法によって得られた阻害剤は、薬剤が本発明のＡＢＣＧ２タンパク質によって細胞外へ排出されることによって生じる該薬剤に対する耐性を有する細胞や患者に対し、該薬剤への耐性を抑制する、つまり感受性増強剤として有用である。また、これらの化合物は、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質が関与する細胞膜を通した物質輸送に起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる阻害剤は、本発明のＡＢＣＧ２タンパク質の活性を阻害する化合物であり、具体的には、このＡＢＣＧ２タンパク質に高い親和性で結合し、競合的に、または非競合的にこの分子による基質の輸送を阻害するものである。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。このような化合物を、このＡＢＣＧ２タンパク質を発現している細胞に対してＡＢＣＧ２タンパク質の基質となる抗癌剤と同時に投与することにより、この抗癌剤の効果を増強することができる。このような方法は、このＡＢＣＧ２タンパク質を発現することにより抗癌剤に対して耐性になったような癌に対して特に有効であり、耐性克服のための医薬品として有効である。
実施例
以下に実施例及び参考例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
［実施例１］化合物−Ａ耐性細胞株の樹立：
複数の独立した細胞株から化合物−Ａ耐性細胞株を樹立するために、以下のようにマウス繊維芽細胞株ＬＹ細胞、ヒト肺大細胞癌細胞株ＰＣ−１３細胞、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞の合計３細胞株を化合物−Ａ存在下で長期間培養することにより樹立した。
（実施例１−１）マウス化合物−Ａ耐性細胞株ＬＹ／ＮＲ１細胞株の樹立：
ＬＹ細胞を初め０．１μＭ  化合物−Ａ存在下で２週間培養したのち、更に０．３μＭ  化合物−Ａ存在下で３週間培養した。この条件下で生育してきたコロニーをクローニングリング（旭テクノグラス社）を用いてを単離し、ＬＹ／ＮＲ１と名づけた。
（実施例１−２）マウス化合物−Ａ耐性細胞株ＬＹ／ＮＲ２細胞株の樹立：
ＬＹ細胞を初め０．１μＭ  化合物−Ａ存在下で２週間培養したのち、更に０．３μＭ  化合物−Ａ存在下で５週間培養し、生育してきたコロニーを前記同様単離し、ＬＹ／ＮＲ２と名づけた。
（実施例１−３）ヒト化合物−Ａ耐性細胞株ＰＣ−１３／ＮＲ１３細胞株の樹立：
ＰＣ−１３細胞を１．１μＭの化合物−Ａ存在下で５週間培養して単離された耐性細胞細胞株ＰＣ−１３Ｘ１３を、さらに２０μＭの化合物−Ａ存在下で４週間培養し、生育してきたコロニーを単離し、ＰＣ−１３／ＮＲ１３と名づけた。
（実施例１−４）ヒト化合物−Ａ耐性細胞株ＨＣＴ１１６／ＮＲ１細胞株の樹立：
ＨＣＴ１１６細胞を１．１μＭの化合物−Ａ存在下で５週間培養して単離された耐性細胞細胞株ＨＣＴ１１６Ｘ１３を、さらに２０μＭの化合物−Ａ存在下で４週間培養し、生育してきたコロニーを単離し、ＨＣＴ１１６／ＮＲ１と名づけた。
（実施例１−５）化合物−Ａ自然耐性細胞株の取得：
化合物−Ａに自然耐性を示すＨｅＬａ細胞（子宮頸癌細胞）から限界希釈法によりシングルクローンを得、ＨｅＬａ＃７細胞株と名づけた。また、同じＨｅＬａ細胞から派生したとされる既存のＨｅＬａＳ３細胞株を化合物−Ａ感受性の細胞としてＨｅＬａ＃７との比較実験に用いた。
［実施例２］化合物−Ａ耐性細胞株の各種抗癌剤に対する薬剤感受性の測定：
樹立された化合物−Ａ耐性細胞株の化合物−Ａ、化合物−Ｂおよび各種抗癌剤に対する感受性をＳＲＢ法を用いて以下のように測定した。
対数増殖期の細胞を１×１０３個／ｗｅｌｌとなるように９６穴プレートに播き、２４時間ＣＯ２インキュベータ中で培養後、段階希釈した薬剤を細胞に加えた。さらに７２時間培養したのち、細胞をＴＣＡで固定し、細胞中のタンパク質を０．４％スルホローダミン−Ｂ溶液で染色した。これを１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌで１時間溶出し、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ２５０吸光度計（モレキュラー・デバイス社）にて測定波長５６０ｎｍ、対象波長４５０ｎｍで測定した。ＩＣ５０は細胞の増殖を５０％阻害する薬剤濃度として定義し、相対耐性度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）はある薬剤の耐性細胞株に対するＩＣ５０値をその薬剤の親細胞株に対するＩＣ５０値で除することによって求めた。
この結果ヒト由来の化合物−Ａ耐性細胞株はいずれも化合物−Ａと化合物−Ｂに百倍以上の高度耐性を示した（表１）。またマウス由来のＬＹ／ＮＲ１細胞株は化合物−Ａに対し１２倍、化合物−Ｂに対し１７倍と中程度の耐性を示し、ＬＹ／ＮＲ２細胞株は化合物−Ａに対し６４倍、化合物−Ｂに対し２１０倍と高度耐性を示した（表２）。
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［実施例３］
（実施例３−１）ＬＹ、ＬＹ／ＮＲ１、ＬＹ／ＮＲ２からのＲＮＡの調製：
ＬＹ、ＬＹ／ＮＲ１、ＬＹ／ＮＲ２からのＲＮＡの調製は以下の方法で行った。約１×１０７の細胞をトリプシン処理によってはく離、遠心操作によって回収した。その後、細胞をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（キアゲン社）によってホモジナイズし、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社）によりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
（実施例３−２）ｃＲＮＡの調製：
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ画分３２μｇにプライマーとしてＴ７−（ｄＴ）２４（配列番号：３／ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧ−（ｄＴ）２４）を加え、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩの逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バッファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物は大腸菌ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＢＲＬ社）、大腸菌ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ（ＢＲＬ社）、大腸菌ＲＮａｓｅＨ（ＢＲＬ社）を添加後、添付のバッファーを用いて２時間１６℃で反応を行った後、Ｔ４  ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＢＲＬ社）を添加し２本鎖ＤＮＡを合成した。この反応液はフェノール：クロロホルム（１：１）で処理し、エタノール沈殿を行った後、１２μｌの蒸留水に溶解した。ｃＤＮＡ画分２．５μｌにＴ７  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＥＮＺＯ社）、ビオチン化したＵＴＰ、ＣＴＰ（ＥＮＺＯ社）を添加する事によってｃＲＮＡを合成し、酸処理によって断片化を行った。
（実施例３−３）ＤＮＡマイクロアレーへのハイブリダイゼーション、洗浄及び染色：
このｃＲＮＡ１５μｇを１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ［Ｎａ＋］、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むバッファーに溶解しジーンチップＭｕ１１ＫＳｕｂＡ、ＳｕｂＢ、Ｍｕ１９ＫＳｕｂＡ、ＳｕｂＢ、ＳｕｂＣのＤＮＡマイクロアレー（アフィメトリックス社）に１６時間、４５℃においてハイブリダイゼーションを行った。ＤＮＡマイクロアレーの洗浄はＤＮＡマイクロアレーで定められたフルイディックスステーション（アフィメトリックス社）の条件にしたがって行った。その後各々のＤＮＡマイクロアレーは抗体蛍光増幅法によって染色を行った。まず、ＤＮＡマイクロアレーにＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎによって修飾されたＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（モレキュラープローブ社）を加え１次染色を行いその後ヤギＩｇＧ（シグマ社）、ビオチン化されたヤギ抗Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ抗体（ベクターラボラトリー社）と反応を行いＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎによって修飾されたＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎによって再度染色を行った。
（実施例３−４）ＤＮＡマイクロアレーデータの解析：
ハイブリダイゼーション、洗浄及び染色後のＤＮＡマイクロアレーはジーンチップスキャナー（ヒューレットパッカード社）によって蛍光強度の測定を行った。スキャンニングは２度行い、その平均によって結果を画像データーとして保存した。発現量の定量化及び比較の解析はジーンチップ発現解析ソフトウェア（アフィメトリックス社）によって画像データの解析をすることによって行った。発現量の比較は上記ソフトウェアのＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ解析によって行いＬＹとＬＹ／ＮＲ２、ＬＹとＬＹ／ＮＲ１の発現量を比較して行った。
その結果、発現を解析した約３００００種類の遺伝子の中でＬＹと比較したときに、最もＬＹ／ＮＲ２細胞選択的に発現が上昇していたのがＡＢＣトランスポーターファミリーのＡＢＣＧ２遺伝子であり、親株のＬＹ細胞に比べ３１倍の発現上昇を示した（表３）。各細胞の化合物−Ａ耐性度とこの遺伝子の発現上昇に相関があることが示唆された。
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［実施例４］ノーザンブロット解析：
ＤＮＡマイクロアレーによって検出されたＡＢＣＧ２のＬＹ／ＮＲ１、ＬＹ／ＮＲ２耐性細胞株選択的発現を確認するためにマウスＡＢＣＧ２のｃＤＮＡ断片をプローブとして、またヒト由来化合物−Ａ耐性細胞おけるヒトＡＢＣＧ２の発現を検出するために、本発明のヒトＡＢＣＧ２のｃＤＮＡ断片をプローブとしてノーザン解析を行った。
（実施例４−１）ブロットの作成：
ＬＹ、ＬＹ／ＮＲ１、ＬＹ／ＮＲ２、ＨｅＬａＳ３、ＨｅＬａ＃７、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６／ＮＲ１、ＰＣ−１３、及びＰＣ−１３／ＮＲ１３細胞からＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社）を用いグアニジンイソチオシアネート法によりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。続いて得られたＴｏｔａｌＲＮＡからファストトラック２．０キット（インビトロジェン社）を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。得られた各細胞由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ０．８μｇをホルムアルデヒドアガロース変性ゲルで泳動した。泳動後、ゲルからＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレン（アマシャム・ファルマシア社）に２０×ＳＳＣバッファーを介して一晩転写した。転写後、メンブレンを風乾したのちメンブレン上の核酸をＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（ストラタジーン社）にてＵＶ固定した。
（実施例４−２）プローブの調製とハイブリダイゼーション：
マウスＡＢＣＧ２の検出においては、プローブとして用いるマウスＡＢＣＧ２のｃＤＮＡ断片を得るために以下の操作を行った。実施例３で調製されたＬＹ／ＮＲ２のｃＤＮＡ  ２μｌを鋳型として使用し、マウスＡＢＣＧ２のＤＮＡ配列をもとに合成した上流ＤＮＡプライマー（配列番号：４／ＣＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＴＴＧＣＴＣＧＧＧＡＡＣＣ）と下流ＤＮＡプライマー（配列番号：５／ＣＡＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＡＡ）を用いてＰＣＲによる増幅を行った。反応液の組成は、合成ＤＮＡプライマー各２００ｎＭ、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造株式会社）０．５μｌおよび酵素に付属のバッファー５μｌで、総反応溶液量は５０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用い、９５℃・３０秒、６０℃・１分、７０℃・２分のサイクルを２９回繰り返した。次に、得られた増幅産物を希釈した後に、この増幅産物の配列にアニールする上流ＤＮＡプライマー（配列番号：６／ＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧ）と下流ＤＮＡプライマー（配列番号：７／ＡＡＡＡＧＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴ）を用いてさらにＰＣＲによる増幅を行った。増幅のためのサイクルは９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・２分のサイクルを３５回繰り返した。増幅産物の確認は１％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって行った。このマウスＡＢＣＧ２  ｃＤＮＡ断片をキアクイックＰＣＲピューリフィケイションキット（キアゲン社）で精製の後、マルチプライム・ラベリングキット（アマシャム・ファルマシア社）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、プローブとした。
一方、ヒトＡＢＣＧ２の検出においては実施例５に示した本発明のヒトＡＢＣＧ２全長ｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型に、上流ＤＮＡプライマー（配列番号：８／ＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＡＧＣ）と下流ＤＮＡプライマー（配列番号：９／ＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＧＡＴＣＣＣＡＴＴＧ）を用いてＰＣＲによる増幅後、マウスの場合と同様の方法で標識し、プローブとした。これら各々のプローブとサケ精子ＤＮＡ１ｍｇをＱｕｉｋＨｙｂ  ハイブリダイゼーション・ソリューション（ストラタジーン社）中で６５℃、３０分プレハイブリダイズさせたメンブレンに添加し、６５℃、一時間ハイブリダイゼーションを行った。その後、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温３０分、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで室温で１５分洗浄を行った後、最終的に０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃１０分洗浄を行った。洗浄したメンブレンの放射活性をＢＡＳ５０００イメージアナライザー（富士写真フィルム）で測定、画像化した。また、各サンプルＲＮＡがほぼ等量泳動されていることを示すために、各ブロットをさらにＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）プローブでハイブリダイズした。即ち、ＡＢＣＧ２プローブをハイブリダイズしたメンブレンを沸騰させた０．５％ＳＤＳ溶液中に１分浸しそのまま室温まで放置することによりメンブレン上のプローブを剥がした。この後、ヒトＧＡＰＤＨ断片をプローブとして、ＡＢＣＧ２プローブの時と同じ条件でハイブリダイゼーション及び洗浄を行い、測定を行った。
この結果、まずマウスＬＹ、ＬＹ／ＮＲ１、ＬＹ／ＮＲ２細胞ではＤＮＡチップの解析で見られたように、耐性度の上昇と相関するようなＡＢＣＧ２の発現上昇が認められた。また、ＨＣＴ１１６／ＮＲ１、ＰＣ−１３／ＮＲ１３、ＨｅＬａ＃７の全てのヒト化合物−Ａ耐性株でＡＢＣＧ２遺伝子が選択的に過剰発現しているのが認められ、本発明の遺伝子が化合物−Ａ及び化合物−Ｂ耐性に関与しているのが強く示唆された［図１］。
［実施例５］ＨｅＬａ＃７細胞からのヒトＡＢＣＧ２全長ｃＤＮＡの単離：
（実施例５−１）既存のＡＢＣＧ２配列をもとにした合成ＤＮＡプライマー配列の作製：
ＡＢＣＰのｍＲＮＡとして報告されている配列（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＦ１０３７９６）をもとに開始コドンと終始コドンをはさむようにＰＣＲ用の合成ＤＮＡプライマー配列を作製した。
５’プライマー（配列番号：８／ＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＡＧＣ）
３’プライマー（配列番号：１０／ＧＡＡＴＴＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴ）
５’プライマーはＡＢＣＰの配列に加えて５’末端に制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩによる切断に必要な配列を８塩基付加した。
（実施例５−２）ＨｅＬａ＃７細胞からのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成：
ヒト培養細胞株ＨｅＬａ＃７細胞よりＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社）を用いグアニジンイソチオシアネート法によりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。次にＴｏｔａｌ  ＲＮＡ画分２．５μｇにプライマーとして１８塩基長のｏｌｉｇｏ  ｄＴを加え、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩの逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バッファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。
（実施例５−３）ＨｅＬａ＃７細胞由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるＡＢＣＧ２遺伝子の増幅と塩基配列の決定：
実施例５−２でＨｅＬａ＃７細胞より調製したｃＤＮＡ  １μｌ（１２５ｎｇ）を鋳型として使用し、合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲによる増幅を行った。反応液の組成は、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：８および配列番号：１０）各３００ｎＭ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造株式会社）２μｌおよび酵素に付属のバッファー５μｌで、総反応溶液量は５０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用い、９４℃・３０秒、５５℃・１分、７２℃・４分のサイクルを３０回繰り返した。増幅産物の確認は１％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって行った。
（実施例５−４）ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の決定：
実施例２で行ったＰＣＲ後の反応産物は１％のアガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカミソリで切り出した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡはｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより３’末端にＡを付加した後、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）の処方に従い、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯへサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（インビトロジェン社）に導入して形質転換したのち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。出現したコロニーを滅菌した妻楊枝を用いて分離し、個々のクローンについてプラスミドベクターのマルチクローニングサイトをはさむプライマーセットによるＰＣＲを行い、予想される大きさのＰＣＲ産物が挿入されたクローンを選択した。目的とするＰＣＲ産物が挿入されたクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  ８  Ｔｕｒｂｏ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。
これらの結果、ＨｅＬａ＃７細胞より単離したＡＢＣＧ２の完全長ｃＤＮＡの配列はこれまでに報告されたものとほぼ一致したが、幾つかの重要な違いが認められた。
本発明のヒトＡＢＣＧ２の塩基配列を配列番号：１に示し、この完全長ｃＤＮＡをクローニングした大腸菌株（「Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＥＬａｂｃｇ２」と表記）を、下記の通り寄託した。
（イ）  寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（旧通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１２年９月２５日
（ハ）寄託番号：生命研菌寄託第１８０５３号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０５３）
（ニ）国際寄託への移管日：平成１３年９月５日
（ホ）国際寄託についての受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７２６
これまで全長の配列が報告されているＡＢＣＧ２遺伝子は２種類で、ＡＢＣＰとして報告されたものとＢＣＲＰとして報告されたものがあるが、その中で両者の配列に違いが見られる。その違いは、アミノ酸置換を伴うものに限定すると、２４番目のアミノ酸をコードする部分（ＡＢＣＰはバリン、ＢＣＲＰはアラニンをコード）、１６６番目のアミノ酸をコードする部分（ＢＣＲＰはグルタミン、ＡＢＣＰはグルタミン酸をコード）、２０８番目のアミノ酸をコードする部分（ＢＣＲＰはフェニルアラニン、ＡＢＣＰはセリンをコード）、４８２番目のアミノ酸をコードする部分（ＢＣＲＰはスレオニン、ＡＢＣＰはアルギニンをコード）である。
本発明者等の得た配列は、２４番目、１６６番目、２０８番目のアミノ酸をコードする部分についてはＢＣＲＰと同じ、即ち、それぞれアラニン、グルタミン、フェニルアラニンをコードし、逆に４８２番目のアミノ酸をコードする部分についてのみＡＢＣＰと同じアルギニンをコードしているというものであった。言い換えると、本発明者等の得た配列はＢＣＲＰとして報告されている配列と４８２番目のアミノ酸について一アミノ酸異なる配列である。
［実施例６］ヒト正常組織由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるＡＢＣＧ２遺伝子ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定：
ＨｅＬａ＃７細胞から得られたＡＢＣＧ２遺伝子の配列がＡＢＣＰあるいはＢＣＲＰの配列と異なる部分について、ヒト正常組織由来のＡＢＣＧ２  ｃＤＮＡの配列を直接塩基配列決定法によって決定した。
Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣＴＭ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ（クローンテック社）に含まれる胎盤および腎臓由来のｃＤＮＡ２．５μｌ（〜０．５ｎｇ）を鋳型として使用し、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：８／ＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＡＧＣ、配列番号：１１／ＡＧＡＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＴＴＴＡＣＣＡ）を用いてＰＣＲによる増幅を行った。反応液の組成は、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：８および配列番号：１１）各２００ｎＭ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．５μｌおよび酵素に付属のバッファー５μｌで、総反応溶液量は５０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用い、９４℃・１分の処理後、９４℃・３０秒、５５℃・１分、７２℃・３分のサイクルを３５回繰り返した。増幅産物の確認は１％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって行った。ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した後、直接塩基配列の決定に用いた。塩基配列の決定のための反応は（実施例５−４）と同様にＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。
これらの結果、ヒト胎盤および腎臓由来のＡＢＣＧ２  ｃＤＮＡにおいて、２４番目、１６６番目、２０８番目及び４８２番目アミノ酸をコードする部分について、それぞれ、アラニン、グルタミン、フェニルアラニン、アルギニンをコードしていることが明かとなり、本発明者等がＨｅＬａ＃７細胞から得た配列と同じ配列がヒト正常組織においても発現していることが示唆された。
［実施例７］ヒトＡＢＣＧ２発現細胞の作製：
実施例５に示したように、ＨｅＬａ＃７細胞から得たヒトＡＢＣＧ２の全長ｃＤＮＡを動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）へ組み込んだ。このＡＢＣＧ２発現プラスミドをＰＣ―１３細胞にエフェクテン・トランスフェクション・リエージェント（キアゲン社）を用いて遺伝子導入した。実験操作は添付のマニュアルに従った。また対照として、ＡＢＣＧ２配列を含まないベクターのみの導入も行い、以後平行して実験を行った。トランスフェクション操作の２日後にジェネティシン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）０．２ｍｇ／ｍｌを含む選択培地と交換し、以後この条件で長期間培養することにより、プラスミドが導入された安定形質導入細胞株を選抜した。導入２週間後に出現してきたコロニーを単離し、ノーザンブロット解析によりＡＢＣＧ２の発現を調べた。ＡＢＣＧ２を高レベルで発現しているクローンＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−２、ＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−３等の数種類を選び、以後の解析に用いた。ノーザンブロットは、各細胞からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）により調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ８μｇを実施例４と同様にホルムアルデヒドアガロース変性ゲルで分離した後、本発明のヒトＡＢＣＧ２のｃＤＮＡ断片をプローブとして解析を行った。
この結果、クローンＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−２とＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−３において本発明のＡＢＣＧ２の転写産物の高発現が認められ、その発現量はクローンＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−２において耐性細胞株ＰＣ−１３／ＮＲ１３の約３５％、クローンＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−３において、耐性細胞株ＰＣ−１３／ＮＲ１３の約２０％であった［図２］。
［実施例８］ヒトＡＢＣＧ２発現細胞の各種化学療法剤に対する感受性の測定：  ＰＣ−１３細胞にＡＢＣＧ２発現プラスミドを導入した安定形質発現細胞の薬剤感受性を実施例２に記載したＳＲＢ法で行った。
この結果、ベクターのみを導入したＰＣ−１３細胞はこの２つの化合物に対して耐性を示さなかった。これに対し、導入ＡＢＣＧ２の発現量の最も高かったクローンであるＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−２は、ベクターのみを導入したＰＣ−１３細胞に比べ化合物−Ａに対し２２倍、化合物−Ｂに対し１７倍の耐性度を示し、また、次に発現量の高かったクローンＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−３はベクターのみを導入したＰＣ−１３細胞に比べ化合物−Ａに対し９倍、化合物−Ｂに対し１１．７倍の耐性度を示し、ＡＢＣＧ２の過剰発現によってこれらインドロカルバゾール系化合物に耐性が付与されることが強く示唆された。また、これらのＡＢＣＧ２を導入したＰＣ−１３細胞株は他の薬剤、すなわちカンプトテシン、トポテカン、ミトキサントロン、エトポシドには顕著な耐性を示さなかった（表４）。ミトキサントロンに対するＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−２とＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−３の耐性度はそれぞれ０．４２倍と、０．６０倍であり、これはＢＣＲＰをＭＣＦ−７に導入発現したときに約３０倍耐性になるという報告（Ｄｏｙｌｅ、Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５、１５６６５−１５６７０（１９９８））とは大きく異なるものである。
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［実施例９］本発明のＡＢＣＧ２発現細胞内でのインドロカルバゾール系化合物の蓄積の解析：
ＰＣ−１３細胞にＡＢＣＧ２発現プラスミドを導入した安定形質発現細胞における化合物−Ｂの細胞内蓄積量を以下の方法で測定した。
まず、細胞を２５ｃｍ２培養フラスコに１．５×１０６個を播き込み一晩培養した。翌日に５０μＭの［１４Ｃ］化合物−Ｂを含む培地と交換し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター中で１２０分培養し、ラベル体を細胞中に取り込ませた。１２０分経過後細胞を直ちに氷上に起き、ＰＢＳで細胞を洗浄した後に２．５％トリプシンで細胞を剥離し４００×ｇ、４℃で３分遠心して細胞を回収した。再度細胞をＰＢＳに懸濁し、細胞数を計測した後に同じ条件で遠心して細胞を再び回収した。この細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に溶解させ、２０００×ｇ、４℃で１５分遠心して膜及び細胞質画分を上清として回収し、沈殿した核画分を０．２ＮのＮａＯＨに溶解した。得られた上清サンプルと核画分サンプルそれぞれにクリアゾルＩ（半井化学社）を加えて液体シンチレーション測定機、ＴＲＩＣＡＲＢ２３００（パッカード社）で測定し、上清サンプルと核画分サンプルの値を合計したものを細胞内蓄積量とした［図３］。
この解析の結果、ＡＢＣＧ２発現プラスミドを導入したＰＣ−１３／ＡＢＣＧ２−２細胞における化合物−Ｂの蓄積量は化合物−Ａ耐性細胞ＰＣ−１３／ＮＲ１３株とほぼ同様の値を示し、ベクターのみを導入した細胞の約１／４であった。この結果から本発明者等が得た配列をもつＡＢＣＧ２が発現している細胞において化合物−Ｂの蓄積が顕著に低下していた。これにより本願遺伝子によるインドロカルバゾール系化合物の排出が強く示唆された。
［実施例１０］塩基置換導入によるＡＢＣＧ２−４８２Ｔ配列の作製：
４８２番目のコドンがアルギニンをコードする本発明のＡＢＣＧ２（配列番号：１）と、前述のＤｏｙｌｅ等の報告による４８２番目のコドンがスレオニンをコードするＢＣＲＰとして報告されているものとの活性の違いを明らかにするために、実施例５にてクローニングされたＡＢＣＧ２遺伝子のｃＤＮＡ配列をもとに、以下のように１塩基置換を導入してＢＣＲＰ型の全長ＡＢＣＧ２・ｃＤＮＡを作成しＡＢＣＧ２−４８２Ｔとした（配列番号：１２）。なお、この配列はアミノ酸配列に関してははＢＣＲＰとして登録されているものと同じであるが、塩基配列に関して、アミノ酸置換を伴わない１塩基の違いがもう一カ所存在する。
（実施例１０−１）ＡＢＣＧ２−４８２Ｔ配列に変換するための塩基置換を導入した合成ＤＮＡプライマー配列の作製：
まず、本発明のＡＢＣＧ２遺伝子のｃＤＮＡ配列をもとに、ＡＢＣＧ２の４８２番目のコドンの塩基配列をＢＣＲＰとして報告されている塩基配列の相同部分に置き換えた配列を持ち、ＡＢＣＧ２・ｃＤＮＡの相補的なそれぞれの鎖にアニールする２つのＰＣＲ用ＤＮＡプライマーを合成した［図４−（ａ）参照］。なおそれぞれのプライマー配列中の小文字は、置換を導入した塩基を示す。
５’プライマー（配列番号：１４／ＣＣＡＴＧＡｃＧＡＴＧＴＴＡＣＣＡＡＧＴＡＴＴ）
３’プライマー（配列番号：１５／ＡＡＣＡＴＣｇＴＣＡＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＡＴＣ）
（実施例１０−２）２段階のＰＣＲによる塩基置換の導入：
次に、実施例５にて作製したＡＢＣＧ２遺伝子ｃＤＮＡをもつプラスミドを鋳型とし、変異を導入する部分を含めた上流側のｃＤＮＡ断片と、下流側のｃＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲにて作製した。
上流側のｃＤＮＡ断片は５’プライマー（配列番号：１６／ＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＴＡＴＴＣＣＡ）と実施例１０−１にて作製した３’プライマー（配列番号：１５／ＡＡＣＡＴＣｇＴＣＡＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＡＴＣ）を用いてＰＣＲ増幅した。下流側のｃＤＮＡ断片は実施例１０−１にて作製した５’プライマー（配列番号：１４／ＣＣＡＴＧＡｃＧＡＴＧＴＴＡＣＣＡＡＧＴＡＴＴ）と３’プライマー（配列番号：１７／ＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡ）を用いてＰＣＲ増幅した［図４−（ｂ）、１ｓｔ．ＰＣＲ］。
さらに、これら２つのｃＤＮＡ断片を連結するために、２つのｃＤＮＡを混合し、５’プライマー（配列番号：１６／ＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＴＡＴＴＣＣＡ）と、３’プライマー（配列番号：１７／ＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡ）を用いてＰＣＲによる増幅を行い［図４−（ｂ）、２ｎｄ．ＰＣＲ］、塩基置換部分を内部に含むＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ後の反応産物は１％のアガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカミソリで切り出した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡはｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより３’末端にＡを付加した後、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロゲン社）の処方に従い、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（インビトロゲン社）に導入して形質転換したのち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。出現したコロニーを滅菌した爪楊枝を用いて分離し、個々のクローンについてプラスミドベクターのマルチクローニングサイトをはさむプライマーセットによるＰＣＲを行い、予想される大きさのＰＣＲ産物が挿入されたクローンを選択した。目的とするＰＣＲ産物が挿入されたクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  ８  Ｔｕｒｂｏ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読して塩基置換が導入されていることを確認した。
（実施例１０−３）全長ＡＢＣＧ２−４８２Ｔ・ｃＤＮＡの作成とその動物発現プラスミドへの組み込み：
実施例１０−２にて作製した塩基置換を導入したｃＤＮＡ断片をその内部を切断する二つの制限酵素、Ｐｖｕ  ＩＩ、Ｎｃｏ  Ｉを用いて切断し、塩基置換を導入した領域を含む断片を切り出した。この断片を、実施例５にてクローニングしたＡＢＣＧ２遺伝子ｃＤＮＡをＰｖｕ  ＩＩ、Ｎｃｏ  Ｉを用いて切断したものと連結することによって、コドン４８２部分を含む領域が、変異の導入された断片と置き換わったＡＢＣＧ２遺伝子の全長ｃＤＮＡが得られ、これをＡＢＣＧ２−４８２Ｔとした。
このＡＢＣＧ２−４８２ＴｃＤＮＡをプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓに挿入し、動物細胞発現プラスミドを作製した。これを大腸菌ＴＯＰ１０  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（インビトロゲン社）に導入して形質転換したのち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。出現したコロニーを滅菌した爪楊枝を用いて分離し、個々のクローンについてプラスミドベクターのマルチクローニングサイトをはさむプライマーセットによるＰＣＲを行い、予想される大きさのＰＣＲ産物が挿入されたクローンを選択した。目的とするＰＣＲ産物が挿入されたクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  ８  Ｔｕｒｂｏ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読しＡＢＣＧ２−４８２Ｔの配列であることを確認した。
［実施例１１］本発明のＡＢＣＧ２若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔを発現するＭＣＦ−７細胞の作成：
実施例５で調製した本発明のヒトＡＢＣＧ２の全長ｃＤＮＡ、若しくは実施例１０で調製したＡＢＣＧ２−４８２ＴｃＤＮＡをそれぞれ組み込んだ動物細胞発現プラスミドをヒト乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞にエフェクテン・トランスフェクション・リエージェント（キアゲン社）を用いて遺伝子導入した。実験操作は添付のマニュアルに従った。また対照として、ＡＢＣＧ２配列を含まないベクターのみの導入も行い、以後平行して実験を行った。トランスフェクション操作の２日後にジェネティシン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）９００μｇ／ｍｌを含む選択培地と交換し、以後この条件で長期間培養することにより、プラスミドが導入された安定形質導入細胞株を選抜した。導入２〜３週間後に出現してきたコロニーを単離し、ノーザンブロット解析によりＡＢＣＧ２の発現を調べた。ノーザンブロットは、各細胞からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）により調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ８μｇを実施例４と同様にホルムアルデヒドアガロース変性ゲルで分離した後、本発明のヒトＡＢＣＧ２のｃＤＮＡ断片をプローブとして解析を行った。
その結果、本発明のＡＢＣＧ２を導入した細胞クローンからはＭＣＦ−７／Ｒ７が、アミノ酸置換体であるＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入した細胞クローンからはＭＣＦ−７／Ｔ８がそれぞれ導入遺伝子を高レベルで発現しており、以後これらを解析に用いた。またこの２つの細胞株におけるＡＢＣＧ２発現量はほぼ同程度であった（図５）。
［実施例１２］本発明のＡＢＣＧ２若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔを発現するＭＣＦ−７細胞の各種化学療法剤に対する感受性の測定：
ＭＣＦ−７細胞に、ＡＢＣＧ２発現プラスミド若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔ発現プラスミドを導入した安定形質発現細胞の薬剤感受性を実施例２に記載したＳＲＢ法で測定し、各導入細胞株の薬剤に対する感受性を、ベクターのみの導入細胞株に対する相対耐性度として表した［図６］。
この結果、ＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入したＭＣＦ−７／Ｔ８は化合物−Ｂに対して１２倍の耐性を示した以外に、ミトキサントロン、アドリアマイシン及びダウノルビシンにそれぞれ、２５倍、９．６倍、５．１倍と、種々の化合物に対して耐性を示した。即ち、以前にＢＣＲＰとして報告された通り、４８２番目のコドンがスレオニンをコードするタイプの遺伝子を発現させた細胞は、インドロカルバゾールの他に、様々な化合物に対して耐性を示す多剤耐性因子的な性質を持つことが示された。
これに対し、本発明のＡＢＣＧ２を導入したＭＣＦ−７／Ｒ７は、化合物−Ｂに２２倍と高い耐性を示した以外には、ミトキサントロンに対してわずか３．８倍の耐性を示すのみで、アドリアマイシン及びダウノルビシンに対しては全く耐性にならなかった。即ち、４８２番目のコドンがアルギニンをコードしている本発明のＡＢＣＧ２発現細胞は化合物−Ｂに選択的に耐性となることが示された。
以上よりＢＣＲＰとして報告されていたタイプのＡＢＣＧ２が広い範囲の化学療法剤に対し耐性を与えるのに対し、それと一アミノ酸異なる本発明のＡＢＣＧ２がインドロカルバゾール選択的な耐性を付与することが示された。
［実施例１３］本発明のＡＢＣＧ２若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔを発現するＭＣＦ−７細胞におけるインドロカルバゾール系化合物の蓄積の解析：
ＭＣＦ−７細胞に本発明のＡＢＣＧ２、若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入した安定形質発現細胞における化合物−Ｂの細胞内蓄積量を以下の方法で測定した。
まず、６ウェル培養プレートに細胞を８×１０５個／ｗｅｌｌ播き込み一晩培養した。翌日に７μＭの［１４Ｃ］化合物−Ｂを含む培地と交換し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター中で１８０分培養し、ラベル体を細胞中に取り込ませた。１８０分経過後細胞を直ちに氷上に起き、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した後に、この細胞に２ＮのＮａＯＨを加え、４０℃で６０分震盪して溶解させた。得られたサンプルの一部をブラッドフォード法にてタンパク定量をし、溶液のタンパク質濃度を求めた。残りのサンプルにハイオニックフロー（パッカード社）を加えて液体シンチレーション測定機、ＴＲＩＣＡＲＢ２５００（パッカード社）で測定し、細胞内蓄積量とした［図７−（ａ）］。
この解析の結果、ＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入したＭＣＦ−７／Ｔ８と、本発明のＡＢＣＧ２を導入したＭＣＦ−７／Ｒ７において化合物−Ｂの蓄積量は共に低下していた。これにより、ＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入した細胞でも、本願遺伝子を導入した細胞においても、インドロカルバゾール系化合物を能動的に排出していることが証明された。
［実施例１４］本発明のＡＢＣＧ２若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔを発現するＭＣＦ−７細胞におけるミトキサントロン、及びローダミンの蓄積の解析：
ＭＣＦ−７細胞に本発明のＡＢＣＧ２、若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入した安定形質発現細胞におけるミトキサントロンの細胞内蓄積量を以下の方法で測定した。
まず、６ウェル培養プレートに細胞を１．０×１０６個／ｗｅｌｌ播き込み一晩培養した。翌日に２０μＭのミトキサントロンを含む培地と交換し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター中で９０分培養し、化合物を細胞中に取り込ませた。９０分経過後細胞を直ちに氷上に起き、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した後に、２．５％トリプシンで細胞を剥離し４００×ｇ、４℃で３分遠心して細胞を回収した。細胞を１％ＢＳＡを含むＨａｎｋ‘ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓに懸濁し、フローサイトメーター、Ｅｐｉｃｓ  Ｅｌｉｔｅ（コールター社）で化合物の蛍光量を測定し、細胞内蓄積量とした［図７−（ｂ）］。
また、ＭＣＦ−７細胞に本発明のＡＢＣＧ２、及びＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入した安定形質発現細胞におけるローダミンの細胞内蓄積量は以下の方法で測定した。
まず、６ウェル培養プレートに細胞を１．０×１０６個／ｗｅｌｌ播き込み一晩培養した。翌日に５μｇ／μｌのローダミンを含む培地と交換し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター中で３０分培養し、化合物を細胞中に取り込ませた。３０分経過後細胞を直ちに氷上に起き、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した後に、２．５％トリプシンで細胞を剥離し４００×ｇ、４℃で３分遠心して細胞を回収した。細胞を１％ＢＳＡを含むＨａｎｋ‘ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓに懸濁し、フローサイトメーター、Ｆａｃｓ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）で化合物の蛍光量を測定し、細胞内蓄積量とした［図７−（ｃ）］
この解析の結果、ＭＣＦ−７／Ｔ８細胞では、ミトキサントロンの蓄積量がベクターのみを導入した細胞の約２０％程度にまで減少し、ミトキサントロンが強く排出されているが、ＭＣＦ−７／Ｒ７細胞においては、約５０％程度までしか減少しておらず、それほど排出されていないことが明らかになった。また、ＭＣＦ−７／Ｔ８細胞のローダミンの蓄積量は、ベクターのみを導入した細胞の約５０％にまで減少するが、ＭＣＦ−７／Ｒ７細胞では、ベクターのみを導入した細胞と同程度の蓄積量であり、ローダミンは全く排出されないことが明らかになった。
以上のことから、本発明のＡＢＣＧ２とＡＢＣＧ２−４８２Ｔは、１アミノ酸異なることにより基質選択性が異なることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、インドロカルバゾール系化合物を選択的に細胞外へ輸送するタンパク質及びその遺伝子が提供された。これにより該輸送体タンパク質およびそれをコードする遺伝子を利用した阻害剤のスクリーニングやどのような抗癌剤が投与するのに適当かを判断することが可能となった。さらに、得られる阻害剤を使用すれば、癌細胞の感受性を増強出来るので治療への利用が期待出来る。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、化合物−Ａ耐性細胞株における本願ＡＢＣＧ２遺伝子の転写産物の発現を示す。
図２は、本願ＡＢＣＧ２遺伝子を導入したＰＣ−１３細胞株におけるＡＢＣＧ２転写産物の発現を示す。
図３は、本願ＡＢＣＧ２遺伝子を導入したＰＣ−１３細胞株における化合物−Ｂの蓄積を示す。
図４は、二段階ＰＣＲを用いたＡＢＣＧ２遺伝子へのアミノ酸置換の導入方法を示す。（ａ）：塩基置換部位のプライマー設計。（ｂ）：二段階ＰＣＲの概略。
図５は、本願ＡＢＣＧ２若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入したＭＣＦ−７細胞における各ＡＢＣＧ２転写物の発現を示す。図中、「ベクター」はベクターのみを導入したＭＣＦ−７を、「Ｔ８」はＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入したＭＣＦ−７（ＭＣＦ−７／Ｔ８）を、「Ｒ７」は本願のＡＢＣＧ２を導入したＭＣＦ−７（ＭＣＦ−７／Ｒ７）をそれぞれ示す。
図６は、本願ＡＢＣＧ２若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入したＭＣＦ−７細胞の各種抗癌剤に対する相対耐性度を示す。図中、「Ｔ８」はＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入したＭＣＦ−７（ＭＣＦ−７／Ｔ８）を、「Ｒ７」は本願のＡＢＣＧ２を導入したＭＣＦ−７（ＭＣＦ−７／Ｒ７）をそれぞれ示す。
図７は、本願ＡＢＣＧ２若しくはＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入したＭＣＦ−７細胞における各種薬剤の蓄積量を示す。図中、「ベクター」はベクターのみを導入したＭＣＦ−７を、「Ｔ８」はＡＢＣＧ２−４８２Ｔを導入したＭＣＦ−７（ＭＣＦ−７／Ｔ８）を、「Ｒ７」は本願のＡＢＣＧ２を導入したＭＣＦ−７（ＭＣＦ−７／Ｒ７）をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年5月29日(2002.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物に対する耐性を哺乳動物細胞に付与するために用いる請求の範囲１に記載のタンパク質：
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式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項３】
（補正後）配列番号：２の少なくとも１５個の連続するアミノ酸配列からなり、前記少なくとも１５個のアミノ酸配列が配列番号：２の４８２番目のアミノ酸を含む、請求の範囲１または２に記載のタンパク質の部分ペプチド。
【請求項４】
請求の範囲１から３のいずれかに記載のタンパク質もしくは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドに相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列が、配列番号：１に表されるＤＮＡ配列のコード領域、またはその相補的な配列の少なくとも一部分からなることを特徴とする請求の範囲４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物に対する耐性を有する哺乳動物細胞を検出するために用いることを特徴とする請求の範囲４または５に記載のポリヌクレオチド：
2002028894.tif 000051
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項７】
配列番号：１で表されるＤＮＡ配列において１４８９番目の塩基（Ｇ）を含む１５〜１００の連続したＤＮＡ配列またはその相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求の範囲４または５に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項９】
請求の範囲８に記載の組換えベクターを保持する形質転換体。
【請求項１０】
請求の範囲９に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたタンパク質または部分ペプチドを回収する工程を含む、請求の範囲１から３のいずれかに記載のタンパク質または部分ペプチドの製造方法。
【請求項１１】
請求の範囲１から３のいずれかに記載のタンパク質または部分ペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１２】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物に対して耐性を有する哺乳動物細胞を検出するために用いる、請求の範囲１１記載の抗体。
2002028894.tif 000052
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項１３】
請求の範囲１または２記載のタンパク質の発現を抑制するアンチセンスヌクレオチド。
【請求項１４】
請求の範囲１または２記載のタンパク質の発現を指標とすることにより癌患者の癌化学療法剤に対する耐性を予測する方法。
【請求項１５】
前記癌化学療法剤が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲１４記載の方法。
2002028894.tif 000053
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項１６】
請求の範囲１または２記載のタンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記タンパク質と、下記一般式（Ｉ）で表される化合物と、候補化合物とを接触させる工程、及び
（ｂ）前記タンパク質の活性を抑制する候補化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法。
2002028894.tif 000054
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項１７】
前記タンパク質の活性が、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を基質として、該基質との結合活性、該基質結合時のＡＴＰ分解活性、または該基質の膜輸送活性である請求の範囲１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求の範囲１または２記載のタンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求の範囲１または２記載のタンパク質を発現する哺乳動物細胞に、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、及び候補化合物を接触させる工程、及び
（ｂ）下記一般式（Ｉ）で表される化合物が有する前記哺乳動物細胞に対する毒性を増強する候補化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法。
2002028894.tif 000055
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれる置換基によって置換されてもよい低級アルキルアミノ基であり、Ｇは五炭糖基、六炭糖基、又はアミノ基によって置換を有されてもよい五炭糖基若しくは六炭糖基を示す。
【請求項１９】
請求の範囲１６から１８のいずれかに記載の方法によって得られる阻害剤。
【請求項２０】
請求の範囲１９に記載の阻害剤により、請求の範囲１に記載のタンパク質の機能を阻害する方法。
【請求項２１】
請求の範囲１１または１２に記載の抗体により、請求の範囲１に記載のタンパク質の機能を阻害する方法。
【請求項２２】
請求の範囲１３記載のアンチセンスヌクレオチドにより、請求の範囲１に記載のタンパク質の発現を阻害する方法。
【請求項２３】
請求の範囲２０から２２のいずれかに記載の方法により請求の範囲１に記載のタンパク質の機能または発現を阻害することを特徴とする、癌患者の化学療法剤に対する感受性を高める方法。
【請求項２４】
前記癌化学療法剤が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲２３に記載の方法。
【国際調査報告】
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