(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン９残基〜１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物。
【請求項２】
アルギニンが１１残基である請求項１記載のペプチド化合物。
【請求項３】
請求項１または２記載のペプチド化合物からなるＮＦＡＴ活性化の阻害剤。
【請求項４】
請求項１または２記載のペプチド化合物を有効成分とする免疫抑制剤。
【請求項５】
請求項１または２記載のペプチド化合物を有効成分とする心肥大抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体膜通過シグナル配列を含有する新規ペプチド化合物に関する。さらに本発明は、数残基のアルギニンとＶＩＶＩＴからなるＮＦＡＴ活性化の阻害剤、免疫抑制剤および心肥大抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、移植手術後の拒絶反応やアトピー性皮膚炎などの免疫疾患に対して、様々な化合物が免疫抑制剤として使用されている。たとえば、シクロスポリンＡ（ＣｙｓＡ）およびＦＫ５０６は周知の免疫抑制剤であるが、それらを動物に投与した場合には腎機能低下、高血圧、インスリン分泌量の低下または神経毒性などの副作用が生じることも知られている。また、ＣｙｓＡやＦＫ５０６以外の免疫抑制剤についても、様々な副作用が生じることが調べられており、副作用のより少ない免疫抑制剤が切に望まれてきた。
【０００３】
現在では、前記合成化合物による治療のほか、外来遺伝子を含有するベクターを人間に投与するという遺伝子治療が注目を集めており、様々な疾患に関して臨床段階での検討が行われている。しかしながら、遺伝子治療に用いられるベクターには、たとえば、ベクターを人間に投与した場合の細胞内への導入効率、投与からタンパク質発現までに必要な期間および副作用など、解決されるべき問題が多く残されている。また、種々のペプチド製剤なども検討されているが、現時点では臨床で使用されているものはない。
【０００４】
心肥大は、遺伝的背景または圧負荷などによって心臓が通常より大きくなった状態であり、心不全につながる可能性がある。しかしながら、心肥大に対し、その進行を防ぐまたはその退縮を促進するといった心肥大抑制剤は、現在のところ市販されていない。これは、現在知られる心肥大抑制剤が強い副作用を有するため、実際にヒトに適用することができないからである。したがって、心肥大を抑制または改善し、かつ副作用などの問題のない薬剤が切望されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は前記のような従来の問題点を解消することであり、投与してから実際に効果を発揮するまでの期間が短く、副作用や抗原性のないペプチド化合物を提供することである。本発明はとくに、免疫疾患および心肥大に対する治療剤を提供することを目的とする。また本発明は、ＮＦＡＴ活性化の阻害剤をも提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
アルギニン９残基〜１３残基、とくにアルギニン１１残基からなるペプチドが、生体膜通過シグナル配列として非常に有効であることを特願２０００−３５８４４２に開示した。そして、さらに検討を重ねた結果、アルギニン９残基〜１３残基と核内Ｔ細胞活性化因子（Nuclear Factor Activated T cell）ＮＦＡＴの活性阻害ペプチドとを融合したペプチド化合物をインビボ系で用いた場合に、優れた免疫抑制効果が得られることを初めて見出した。そのうえ、該ペプチドを心肥大のラットに投与した場合には、心肥大の症状が極めて良好に改善されることも見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、アルギニン９残基〜１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物に関する。
【０００８】
本発明は、アルギニン９残基〜１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物からなるＮＦＡＴ活性化の阻害剤に関する。
【０００９】
また、本発明は、アルギニン９残基〜１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物を有効成分とする免疫抑制剤に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、アルギニン９残基〜１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物を有効成分とする心肥大抑制剤に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のペプチド化合物およびその用途について詳細に説明する。
【００１２】
本願発明のペプチド化合物は、数個のアルギニンが連続するアミノ酸配列および配列番号１のアミノ酸配列を含有する。
【００１３】
連続するアルギニンの残基数としては、９〜１３残基が好ましく、１１残基が最も好ましい。連続したアルギニンが８残基以下または１４残基以上である場合、本願発明のペプチド化合物の細胞への導入効率が悪くなる傾向がある。
【００１４】
本願発明のペプチド化合物はまた、ＮＦＡＴの活性阻害ペプチドＶＩＶＩＴを含有する。ＮＦＡＴとは、カルシニューリンに脱リン酸化されることによって活性化する転写調節因子であり、ＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、ＮＦＡＴ３およびＮＦＡＴ４などを含むファミリーを形成する。ＶＩＶＩＴは、ＭＡＧＰＨＰＶＩＶＩＴＧＰＨＥＥ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。ＶＩＶＩＴは、カルシニューリンのホスファターゼ活性に影響することなく、ＮＦＡＴファミリーに属するタンパク質とカルシニューリンとの相互作用を選択的に阻害する（アラムブル  Ｊ．（Aramburu, J.）ら、サイエンス（Science）、第２８５巻、２１２９〜２１３３頁、１９９９年）。配列番号１に示すアミノ酸配列において、各アミノ酸残基は、ＮＦＡＴを阻害するものであれば生物学的に同等のアミノ酸配列に置換してもよく、ＶＩＶＩＴと同等の生物学的活性を有するものであれば、数個のアミノ酸残基が付加、欠失されていてもよい。
【００１５】
また、本発明のペプチド化合物は、同等の生物学的活性を有する限り、前記の数個のアルギニンが連続するアミノ酸配列および配列番号１のアミノ酸配列に加え、数個のアミノ酸残基が付加、欠失または置換されていてもよい。
【００１６】
さらに、本願発明のペプチド化合物は、細胞内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有してもよい。マーカーはとくに限定されるものではなく、たとえばフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略称する）、ＧＦＰおよびローダミンなどの蛍光タンパク質を使用することができる。
【００１７】
本発明のペプチド化合物は、通常の人工合成法によって、または一般に市販されている人工合成機によって製造することができる。あるいは、本発明のペプチド化合物は、遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。たとえば、数個のアルギニンが連続する配列およびＶＩＶＩＴからなる配列を含むペプチド配列をコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを作製し、適当な宿主細胞に組換えベクターを導入後、その宿主細胞を培養する。ついで、培養物を回収することにより、本発明のペプチド化合物を得ることができる。本発明のペプチド化合物を製造後、得られたペプチド化合物は公知の方法で精製することもできる。これらのペプチド化合物の製造法および精製法は、本分野において一般的な手法であり、当業者により容易に実施されるものである。
【００１８】
本発明のペプチド化合物は、ＮＦＡＴ活性化の抑制剤として使用することができる。ＮＦＡＴ活性化の抑制剤は、ＮＦＡＴの活性化に起因する疾患の治療剤として用いることができる。ＮＦＡＴの活性化に起因する疾患としては、たとえば、アレルギー疾患および心肥大などを挙げることができる。
【００１９】
本発明のペプチド化合物は、免疫抑制を誘導する作用を有しており、移植の際の免疫抑制剤として用いることができる。また、本発明の免疫抑制剤は、免疫疾患などの治療剤として利用することもできる。具体的な免疫疾患としては、移植手術後の拒絶反応、アトピー性皮膚炎などが挙げられる。
【００２０】
本発明の免疫抑制剤は、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、直腸内等の非経口的に投与することができる。とくに、ペプチド化合物を直接血流に導入することによってペプチド化合物の分解を防ぐことができるため、静脈内投与または皮下投与が好ましい。
【００２１】
本発明の免疫抑制剤の剤型は投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、水溶液および乳液などの液剤および軟膏を例示することができる。
【００２２】
本発明の免疫抑制剤の有効量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などを考慮して適宜設定することができ、有効成分に換算して通常は１〜１０ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、有効成分である本発明のペプチド化合物の量は変更可能であり、これらの範囲に限定されるものではない。
【００２３】
本発明の免疫抑制剤は、本発明のペプチド化合物を有効成分として含有するものであればとくに限定されず、適当な薬学的賦形剤、適当な担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ安定剤など本技術分野で通常用いられるほかの成分を添加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択され得る。
【００２４】
本発明のペプチド化合物は心肥大抑制剤として有効である。本発明の心肥大抑制剤は、静脈内、皮下、経皮、直腸内等の非経口的に投与することができる。とくに、ペプチド化合物を直接血流に導入することが、ペプチド化合物の分解を防ぐうえで重要であることから、静脈内投与が好ましい。
【００２５】
本発明の心肥大抑制剤の剤形は投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、水溶液および乳液などの液剤および軟膏を例示することができる。
【００２６】
本発明の心肥大抑制剤の投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜設定することができ、有効成分に換算して通常は０．１〜２ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、有効成分である本発明のペプチド化合物の量は変更可能であり、これらの範囲に限定されるものではない。
【００２７】
本発明の心肥大抑制剤は、本発明のペプチド化合物を有効成分として含有するものであればとくに限定されず、適当な薬学的賦形剤、適当な担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ安定剤など本技術分野で通常用いられるほかの成分を添加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択され得る。
【００２８】
以下、実施例によって、本発明のペプチド化合物をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
【００２９】
【実施例】
実施例１
連続したアルギニン１１残基、ＶＩＶＩＴおよびＦＩＴＣを含有するペプチド化合物を人工合成し（シグマ  ジェノシス  ジャパン社（Sigma Genosis Japan, Inc.）に製造依頼）、分取逆相ＨＰＬＣにより該ペプチドを精製した。以下、連続したアルギニン１１残基およびグリシン３残基を付加したＶＩＶＩＴからなるペプチドを、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴと略称する。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴのペプチド配列を配列番号２に示す。なお、ＦＩＴＣは、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴのアミノ末端側に付加されている。
【００３０】
実施例２
６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスＨ−２ｋ（クレアジャパン社（CLEA Japan, Inc.）製）に対し、実施例１で製造した１１Ｒ−ＶＩＶＩＴとＦＩＴＣとからなるペプチド化合物１０ｍｇ／ｋｇ量を溶解した０．５ｍｌのリンガー液を注射剤とする腹腔内注射を実施した。注射から６時間後、各マウスから脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓を摘出し、それぞれを３ｍｌのヒスト  プレップ（フィッシャー  サイエンティフィック社（Fisher Scientific）製）中で、−８０℃で凍結させた。次に、クリオスタット上で１０〜５０μｍの切片を作製し、ツアイス顕微鏡（ツアイス社（Zeiss）製）で分析した。なお、コントロールとして、未処理のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの切片を用いた。
【００３１】
分析の結果、複合ペプチドを投与したマウスに由来する脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓の切片では、いずれもＦＩＴＣの蛍光が観察された。一方、コントロールの切片においては、ＦＩＴＣの蛍光は観察されなかった。これは、腹腔内投与により、少なくとも脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓の細胞に１１Ｒ−ＶＩＶＩＴが導入されることを示すものである。
【００３２】
実施例３
ＩＬ−２遺伝子の転写に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの容量依存的効果を検討した。
【００３３】
１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１μＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む１ｍｌの１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ（インビトロゲン社（Invitorogen）製）を用いて、１×１０5細胞個のジャーカット細胞（Jurkat cells）を、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置（山洋電気株式会社製）において１時間培養した。ついで、２μＭのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（シグマ社（Sigma）製）および４０μＭのイオノマイシン（シグマ社製）を含む１００μｌのＲＰＭＩを添加し、さらに１２時間培養を続けた。ついで細胞を回収し、得られた細胞を用いて、下記のリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（real-time quantitative RT-PCR）によりＩＬ−２遺伝子の転写量を測定した。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子として知られるＧＡＰＤＨを内部標準物質として使用した。なお、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まない培地で培養したジャーカット細胞をコントロール細胞として用い、同様のリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００３４】
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社（QIAGEN）製）をプロトコルにしたがって使用し、細胞から全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを用い、逆転写反応を２２℃で１０分間、ついで４２℃で２０分間インキュベーションすることにより実施した。
【００３５】
つぎに、ライトサイクラー−ファーストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩキット（LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I Kit（ロッシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ社（Rhoche Molecular Biochemicals）製）を用い、２０μｌの反応混液（転写産物の１０分の１量、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４種のプライマー  各０．５μＭ、２μｌの１０×ライトサイクラーファーストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩ）を増幅反応用に調製した。ヒトＩＬ−２に対するプライマーとしては、競合定量ＲＴ−ＰＣＲキット（Competitive Quantitative RT-PCR Kit）（フナコシ株式会社製）内に含まれるプライマーを用いた。ＧＡＰＤＨに対するプライマーとしては、５′−ＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡ−３′（配列番号５）および５′−ＴＧＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧ−３′（配列番号６）を用いた（ともに、ジーンセット社製）。増幅反応は、９５℃で１０分間インキュベーションしたのち、９４℃１５秒間、５７℃５秒間および７２℃１０秒間のインキュベーションを１サイクルとし、これを６０サイクル実施した。ついで、０．２℃／秒で９５℃まで温度を上昇させた。解離カーブ解析には、ライトサイクラーソフトウェア（ロッシュモレキュラー  バイオケミカルズ社製）を使用した。解析の結果得られたＧＡＰＤＨに対する相対ＲＮＡ量を図１に示す（ｎ＝３）。
【００３６】
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴは、ＩＬ−２遺伝子の転写を未処理の場合の１２％に抑制した。ＩＬ−２遺伝子は、アレルギーや拒絶反応によりＴ細胞が活性化される場合に、転写が促進される遺伝子である。したがってこの結果は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴがＴ細胞活性化を抑制し得ることを示す。
【００３７】
比較例１
実施例１と同様にして、連続したアルギニン１１残基およびグリシン３残基を付加したＶＥＥＴからなるペプチド化合物（以下、１１Ｒ−ＶＥＥＴと略称する）を人工合成し、精製した。ＶＥＥＴは、ＭＡＧＰＰＨＩＶＥＥＴＧＰＨＶＩ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。１１Ｒ−ＶＥＥＴのペプチド配列を配列番号４に示す。以下、１１Ｒ−ＶＥＥＴを１１Ｒ−ＶＩＶＩＴのネガティブコントロールとして用いる。
【００３８】
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１００ｎＭのＦＫ５０６（藤沢薬品工業株式会社製）または１μＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを含む培地を使用したほかは実施例３と同様にして、ジャーカット細胞を培養し、得られた細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果を図１に示す。
【００３９】
１１Ｒ−ＶＥＥＴは、ＩＬ−２遺伝子の転写レベルに影響を与えなかった。
【００４０】
実施例４
Ｔ細胞における１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの半減期を、ＩＬ−２転写に対する阻害活性に基づき検討した。
【００４１】
１μＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む１ｍｌの１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩを用いて、１×１０5細胞個のジャーカット細胞を、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において１時間培養した。ついで、２μＭ  ＰＭＡおよび４０μＭのイオノマイシンを含む１００μｌのＲＰＭＩを添加し、さらに１２時間、１７時間、２３時間、３５時間または５９時間培養を続けた。なお、コントロール細胞としては、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まない１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩで前記同様に１時間培養し、２μＭ  ＰＭＡおよび４０μＭのイオノマイシンを含む１００μｌのＲＰＭＩを添加したのち、さらに１２時間、１７時間、２３時間、３５時間または５９時間培養したジャーカット細胞を用いた。
【００４２】
ついで、得られた各細胞を試料として用いたほかは実施例３と同様にして、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して解析することにより、ＧＡＰＤＨに対する相対ＲＮＡ量を測定した。結果を図２に示す（ｎ＝３）。図２に示す時間は、培養全体の時間を意味する。
【００４３】
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの半減期は、約３０時間であった。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを添加してから６０時間後には、そのＩＬ−２転写阻害活性はみられなかった。
【００４４】
比較例２
１μＭのＦＫ５０６を含む１ｍｌの１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩを用いて、１×１０5細胞個のジャーカット細胞を、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において１時間培養した。ついで、２μＭ  ＰＭＡおよび４０μＭのイオノマイシンを含む１００μｌのＲＰＭＩを添加したのち、さらに１２時間、１７時間、２３時間、３５時間または５９時間培養した。つぎに、得られた培養細胞を用いたほかは実施例３と同様の方法で、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＦＫ５０６の添加から６０時間後の相対ＩＬ−２  ｍＲＮＡレベルを、図２に示す。
【００４５】
ＦＫ５０６は６０時間後においても代謝されず、ＩＬ−２の転写を強く抑制した。
【００４６】
実施例５
Ｔ細胞の活性化および増殖に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果を、リンパ球混合試験により検討した。
【００４７】
６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスおよび６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスＨ−２ｄ（清水実験材料株式会社製）から脾臓細胞を取り出した。ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞はマイトマイシンＣ（協和醗酵工業株式会社製）で処理し、刺激細胞として用いた。
【００４８】
１ｐＭ、１ｎＭもしくは１μＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含むＲＰＭＩを、平底９６穴プレート（イワキ株式会社製）に添加した。ついで、前記刺激細胞とＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の脾臓細胞とを１：５で混合した混合細胞を、各ウェルに５×１０5個添加し、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において９０時間培養した。なお、コントロールとして、培地のみのウェルに混合細胞を添加し、同様に培養した。
【００４９】
つぎに、０．５μＣｉ／穴の3Ｈメチルチミジン（以下、［3Ｈ］ＴｄＲとする。アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社製）を添加し、６時間培養した。ついで、細胞を直径１ｃｍのフィルター紙上に置き、細胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンター（ベックマン社製）により測定した。結果を図３に示す。
【００５０】
１μＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴは、コントロールに対し、リンパ球の増殖を４３％抑制した。図３において、＊はコントロールと比較してＰ＜０．０５であることを意味し、＊＊はいずれもＰ＜０．００１であることを意味する。
【００５１】
比較例３
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１ｐＭ、１ｎＭもしくは１μＭのＦＫ５０６または１μＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを含むＲＰＭＩを用いたほかは実施例５と同様の方法により、混合細胞を培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンターにより測定した。結果を図３に示す。
【００５２】
１１Ｒ−ＶＥＥＴは、１μＭでは、リンパ球の増殖に影響を与えなかった。
【００５３】
比較例４
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まないＲＰＭＩを培地として用い、混合細胞の代わりにＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の脾臓細胞のみを用いたほかは実施例５と同様の方法により、細胞を培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンターにより測定した。結果を図３に示す。
【００５４】
実施例６
１０ｍｇ／ｋｇ量の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを溶解した０．５ｍｌのリンガー液を注射剤として用い、インビボにおけるＴ細胞の活性化および増殖に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果を検討した。
【００５５】
６週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅｎマウスに、前記注射剤を、１日１回２日間、腹腔内に注射した。
【００５６】
２回目の注射から６時間後に、脾臓を外科的に摘出した。得られた脾臓細胞（１×１０4個）を、マイトマイシンＣで処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞（１×１０5個）とともに平底９６穴プレートに添加し、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において９０時間培養した。培地は、ＲＰＭＩを使用した。なお、コントロールとして、培地のみのウェルに混合細胞を添加し、同様に培養した。
【００５７】
つぎに、０．５μＣｉ／穴の［3Ｈ］ＴｄＲを添加し、６時間培養した。ついで、細胞を直径１ｃｍのフィルター紙上に置き、細胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンターにより測定した。結果を図４に示す。図４において、＊＊はいずれもコントロールと比較してＰ＜０．００１であることを意味する。
【００５８】
インビボにおいて、１０ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴは、コントロールに対して３０％の抑制効果を示した。
【００５９】
比較例５
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１ｍｇ／ｋｇのＦＫ５０６または１０ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＶＥＥＴを用いたほかは実施例６と同様の方法により、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｎマウスに対して腹腔内注射を実施し、脾臓細胞を取り出して培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性をベータカウンターにより測定した。結果を図４に示す。
【００６０】
１１Ｒ−ＶＥＥＴは、１μＭでは、リンパ球の増殖に影響を与えなかった。
【００６１】
比較例６
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まないＲＰＭＩを培地として用い、混合細胞の代わりにＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の脾臓細胞のみを用いたほかは実施例６と同様の方法により、細胞を培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンターにより測定した。結果を図４に示す
【００６２】
実施例７
１０ｍｇ／ｋｇ量の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを溶解した０．５ｍｌのリンガー液を注射剤として用い、ベータ細胞の移植における１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果を検討した。移植の際、ドナーとして６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、レシピエントとして６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを用いた。
【００６３】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに対して２２０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾシン（シグマ−アルドリッチ  ジャパン株式会社）を１回腹腔内注射することにより、糖尿病モデルマウスを作製した。また、ストレプトゾシン注射から６日後、グルコース値が３５０ｍｇ／ｄｌを超えたマウスを高血糖症であると判断した。
【００６４】
一方、ＢＡＬＢ／ｃマウスの膵臓を取り出し、不連続フィコール密度勾配遠心を実施したのち、通常のコラゲナーゼ消化によりベータ細胞を単離した。
【００６５】
単離した約５００個のベータ細胞を、前記糖尿病モデルマウスの左腎の被膜下に移植した。移植後、毎日１回、マウスに１０ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを腹腔内注射した（ｎ＝６）。コントロールとして、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まない生理食塩水を、ベータ細胞を移植したマウスに注射した（ｎ＝４）。血糖を測定し、その値が２日間連続２００ｍｇ／ｄｌを超えた場合に移植組織拒絶とした。図５に、カプランマイヤーで評価した結果を示す。
【００６６】
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの投与により、コントロールと比較して、生存率が有意に上がった（Ｐ＜０．００５）。
【００６７】
比較例７
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１０ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＶＥＥＴを用いたほかは実施例７と同様にして、ベータ細胞の移植に対する１１Ｒ−ＶＥＥＴの効果を検討した。結果を図５に示す。
【００６８】
１１Ｒ−ＶＥＥＴは、コントロールと同様に、移植組織の生存には何の影響も与えなかった。
【００６９】
実施例８
実施例１において１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与したマウスを用い、移植したベータ細胞の機能を検討した。
【００７０】
ベータ細胞の移植から５０日後の腎臓を外科的に摘出した。ついで、凍結ミトクローム（カールツアイス社製）を用い、３０μｍの腎臓の切片を作製した。つぎに、得られた切片について、インスリンに対するポリクローナル抗体（サンタクルーズ社製）およびアビジン、ビオチンペルオキシダーゼ法（ベクター社製）を用いて免疫染色を実施した。
【００７１】
免疫染色の結果を図６に示す。図６において、１は移植されたベータ細胞であり、２はレシピエントの腎臓である。移植したベータ細胞がインスリン抗体により染色されたことから、移植細胞がインスリンを産生していることを確認した。
【００７２】
実施例９
βＴＣ６細胞によるインスリン分泌に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果を検討した。βＴＣ６細胞は、グルコース応答性でインスリンを分泌するランゲルハンス島の細胞系である。
【００７３】
βＴＣ６細胞（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（American Type Culture collection）、ＣＲＬ−１１５０６）を９６穴プレートに播種し（５×１０4細胞個／穴）、１０、１００、１０００または１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む１ｍｌの１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩを用いて３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において９６時間培養した。培地は２４時間毎に、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む新鮮な培地と交換した。９６時間後、新鮮な培地に交換してさらに１時間培養し、培養上清を回収した。コントロールとして、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まない培地を用いたほかは同様にして、βＴＣ６細胞の培養を実施した。
【００７４】
つぎに、回収した培養上清を用いて、マウスインスリンＥＬＩＳＡ（ＴＭＢ）キット（シバヤギ製）をプロトコルにしたがって使用し、分泌されたインスリンを分析した。図７（ａ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したものである。
【００７５】
βＴＣ６細胞のインスリン分泌量は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴが０〜１μＭの範囲でコントロールとほぼ同じであったが、１０μＭではコントロールの７１％であった（Ｐ＝０．０４２）。
【００７６】
比較例８
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１、１０、１００もしくは１０００ｎＭのＦＫ５０６または１０、１００、１０００もしくは１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを含む完全培地を用いたほかは実施例９と同様の方法により、βＴＣ６細胞を培養し、βＴＣ６細胞によるインスリン分泌に対する効果を検討した。その結果を図７（ｂ）および図７（ｃ）に示す。
【００７７】
βＴＣ６細胞のインスリン分泌量は、ＦＫ５０６により著しく減少され、一方、１１Ｒ−ＶＥＥＴにより影響されなかった。
【００７８】
実施例１０
βＴＣ６細胞の増殖に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果を検討した。
【００７９】
βＴＣ６細胞を９６穴プレートに播種し（５×１０4細胞個／穴）、１０、１００、１０００または１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む完全培地を用いて３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において８８時間培養した。培地は２４時間毎に、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む新鮮な培地と交換した。つぎに、１μＣｉ／穴の［3Ｈ］ＴｄＲを添加し、さらに８時間培養した。コントロールとして、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まない培地を用いたほかは同様にして、βＴＣ６細胞の培養を実施した。ついで、細胞を直径１ｃｍのフィルター紙上に置き、細胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンターにより測定した。図８（ａ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで処理された細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したものである。
【００８０】
βＴＣ６細胞の増殖に関しては、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴが０〜１μＭの範囲ではコントロールとほぼ同じであったが、１０μＭではコントロールの７３％であった（Ｐ＝０．０７５）。
【００８１】
比較例９
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１、１０、１００もしくは１０００ｎＭのＦＫ５０６または１０、１００、１０００もしくは１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを含む完全培地を用いたほかは実施例１０と同様の方法により、βＴＣ６細胞を培養し、βＴＣ６細胞の増殖に対する効果を検討した。その結果を図８（ｂ）および図８（ｃ）に示す。
【００８２】
ＦＫ５０６および１１Ｒ−ＶＥＥＴは、βＴＣ６細胞の増殖に対して阻害効果を示さなかった。
【００８３】
実施例１１
心肥大に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果を検討した。
【００８４】
心肥大モデルラットに対し、１．５ｍｇ／ｋｇ量の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを溶解した０．５ｍｌのリンガー液を隔日で皮下注射した（ｎ＝６）。なお、心肥大モデルラットは、体重２００〜２５０ｇの７週齢の雄ウィスターラット（清水実験材料株式会社製）の大動脈を結紮し心臓に圧負荷をかけることにより作製した。以下、心肥大モデルラットをＡｏＢと略称する。
【００８５】
ついで、０、１、２、３、４および５週後にラットの心臓を以下の方法で評価した。なお、コントロールとして１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与されなかった正常なラットを用いた。
【００８６】
コントロールおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与したＡｏＢに対し、超音波エコー検査（ＵＬＣ）、組織標本の作製および血液検査を、以下のようにして実施した。
【００８７】
ＵＬＣは、ラットの心室中隔および左室全壁の厚さを超音波エコー（日立株式会社製）により、小児用プローブを用いて解析した。結果を図９（ａ）および図９（ｂ）に示す。その結果、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与により、ＡｏＢにおける心室中隔壁厚および左室全壁厚はともに改善されることを確認した。
【００８８】
組織標本は、ラットの心臓を外科的に摘出し、凍結ミクロトームにより厚さ５μｍの切片を作製し、ついで得られた切片をヘマトキシリンエオジン染色法で染色することにより作製した。得られた組織標本は、顕微鏡で観察した（図１０（ｄ））。図１０において、３は左心室を示し、４は右心室を示す。その結果、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与により、正常に近い形態にまで症状が改善されることを確認した。
【００８９】
心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）およびＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の測定は、日本エスアールエル株式会社に依頼した。結果を図１１（ａ）および図１１（ｂ）に示す。その結果、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与により、ＡｏＢにおけるＡＮＰおよびＢＮＰはともに改善されることを確認した。
【００９０】
比較例１０
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与しないＡｏＢを用いたほかは実施例１１と同様にしてＵＬＣの測定、組織標本の作製および血液検査を実施した。結果を図９（ａ）、図９（ｂ）、図１０（ｂ）、図１１（ａ）および図１１（ｂ）に示す。
【００９１】
比較例１１
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに５ｍｇ／ｋｇのＣｙｓＡを用いたほかは実施例１１と同様にして、心肥大に対するＣｙｓＡの効果を検討した。結果を図９（ａ）、図９（ｂ）、図１０（ｃ）、図１１（ａ）および図１１（ｂ）に示す。
【００９２】
試験例１
肝機能および腎臓機能に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの毒性を、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与したＡｏＢを用いて検討した。
【００９３】
１．５ｍｇ／ｋｇ量の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを溶解した０．５ｍｌのリンガー液を隔日で４週間、ＡｏＢに皮下注射した（ｎ＝６）。得られたＡｏＢについて、以下の測定を日本エスアールエル株式会社に依頼した。
【００９４】
肝機能検査としてグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を測定し、腎臓機能検査としてクレアチニン（Ｃｒ）および尿素窒素（ＢＵＮ）を測定した。なお、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与しない正常ラットおよびＡｏＢをコントロールとして使用した。結果を表１に示す。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
測定の結果、本発明のペプチド化合物は肝臓および腎臓の機能に影響を与えないことが示唆された。
【００９７】
【発明の効果】
本発明のペプチド化合物は、副作用が極めて少ないＮＦＡＴの活性化に起因する疾患の治療剤として使用することができる。具体的には、たとえば免疫抑制剤および心肥大抑制剤として使用し得るため、非常に有用である。
【００９８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ、ＦＫ５０６および１１Ｒ−ＶＥＥＴを各濃度で添加して培養した細胞におけるＩＬ−２遺伝子の転写量を示すグラフである。縦軸は、ＧＡＰＤＨに対するＩＬ−２遺伝子の相対ＲＮＡ量を表す。
【図２】図２は、１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ培地のみで６０時間培養したジャーカット細胞、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ添加後１３時間、１８時間、２４時間、３６時間および６０時間培養したジャーカット細胞およびＦＫ５０６添加後６０時間培養したジャーカット細胞におけるＩＬ−２遺伝子の転写量を示すグラフである。縦軸は、ＧＡＰＤＨに対するＩＬ−２遺伝子の相対ＲＮＡ量を表す。
【図３】図３は、リンパ球混合試験において、細胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を示すグラフである。
【図４】図４は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ、ＦＫ５０６および１１Ｒ−ＶＥＥＴを投与したマウスから得られた細胞を用いたリンパ球混合試験において、細胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を示すグラフである。
【図５】図５は、移植したベータ細胞の生存率をカプランマイヤーで評価したグラフである。
【図６】図６は、移植したベータ細胞を免疫染色した結果を示す顕微鏡像である。
【図７】図７は、各処理を行った細胞によるインスリン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図７（ａ）は、各濃度の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図７（ｂ）は、各濃度のＦＫ５０６で処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図７（ｃ）は、各濃度の１１Ｒ−ＶＥＥＴで処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。
【図８】図８は、各処理を行った細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図８（ａ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで処理された細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図８（ｂ）は、ＦＫ５０６で処理された細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図８（ｃ）は、１１Ｒ−ＶＥＥＴで処理された細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。
【図９】図９は、ラットの心室中隔および左室全壁の厚さを超音波エコーにより解析した結果を示すグラフである。図９（ａ）は、コントロール、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与ＡｏＢの心室中隔壁厚を示すグラフである。図９（ｂ）は、コントロール、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与ＡｏＢのラットの左室全壁厚を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ラット心臓の組織標本の顕微鏡像である。図１０（ａ）は、正常なラットの心臓切片を示す顕微鏡像である。図１０（ｂ）は、ＡｏＢの心臓切片を示す顕微鏡像である。図１０（ｃ）は、ＣｙｓＡを投与したＡｏＢの心臓切片を示す顕微鏡像である。図１０（ｄ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与したＡｏＢの心臓切片を示す顕微鏡像である。
【図１１】図１１は、ラットの血液検査結果を示すグラフである。図１１（ａ）は、コントロール、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与ＡｏＢのＡＮＰを示すグラフである。図１１（ｂ）は、コントロール、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与ＡｏＢのＢＮＰを示すグラフである。
【符号の説明】
１  ＢＡＬＢ／ｃマウスのベータ細胞
２  糖尿病モデルマウスの腎臓
３  左心室
４  右心室
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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