(57)【要約】本発明は、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスの抑制作用を有し、例えば、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｍｕ１−１等）、ネフ、１４−３−３蛋白質、チオレドキシン等のＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質又はそのセンスオリゴヌクレオチド、これらの発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を含む、例えば、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７に代表される神経変性疾患等の、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＳＫ１阻害物質を含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤。
【請求項２】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項３】
ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体がＫ７０９ＲまたはＫ７０９Ｍである請求項２記載の予防または治療剤。
【請求項４】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターまたはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項５】
ＡＳＫ１阻害物質がグルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ、ネフ、１４−３−３蛋白質およびチオレドキシンから選択されるＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、またはそれらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項６】
小胞体ストレスに起因する疾患が神経変性疾患である請求項１、２、３、４または５記載の予防または治療剤。
【請求項７】
神経変性疾患がポリグルタミン病である請求項６記載の予防または治療剤。
【請求項８】
神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項６記載の予防または治療剤。
【請求項９】
神経変性疾患がパーキンソン病である請求項６記載の予防または治療剤。
【請求項１０】
神経変性疾患がプリオン病である請求項６記載の予防または治療剤。
【請求項１１】
神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である請求項６記載の予防または治療剤。
【請求項１２】
神経変性疾患がＦＴＤＰ−１７である請求項６記載の予防または治療剤。
【請求項１３】
ＡＳＫ１阻害物質を有効量使用することを含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療方法。
【請求項１４】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項１３記載の予防または治療方法。
【請求項１５】
ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体がＫ７０９ＲまたはＫ７０９Ｍである請求項１４記載の予防または治療方法。
【請求項１６】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターまたはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項１３記載の予防または治療方法。
【請求項１７】
ＡＳＫ１阻害物質がグルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ、ネフ、１４−３−３蛋白質およびチオレドキシンから選択されるＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、またはそれらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項１３記載の予防または治療方法。
【請求項１８】
小胞体ストレスに起因する疾患が神経変性疾患である請求項１３、１４、１５、１６または１７記載の予防または治療方法。
【請求項１９】
神経変性疾患がポリグルタミン病である請求項１８記載の予防または治療方法。
【請求項２０】
神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項１８記載の予防または治療方法。
【請求項２１】
神経変性疾患がパーキンソン病である請求項１８記載の予防または治療方法。
【請求項２２】
神経変性疾患がプリオン病である請求項１８記載の予防または治療方法。
【請求項２３】
神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である請求項１８記載の予防または治療方法。
【請求項２４】
神経変性疾患がＦＴＤＰ−１７である請求項１８記載の予防または治療方法。
【請求項２５】
小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのＡＳＫ１阻害物質の使用。
【請求項２６】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１ドミナントネガテイブ体発現組換えベクターまたはＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体がＫ７０９ＲまたはＫ７０９Ｍである請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターまたはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項２５記載の使用。
【請求項２９】
ＡＳＫ１阻害物質がグルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ、ネフ、１４−３−３蛋白質およびチオレドキシンから選択されるＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、そのＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、またはそれらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である請求項２５記載の使用。
【請求項３０】
小胞体ストレスに起因する疾患が神経変性疾患である請求項２５、２６、２７、２８または２９記載の使用。
【請求項３１】
神経変性疾患がポリグルタミン病である請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項３０記載の使用。
【請求項３３】
神経変性疾患がパーキンソン病である請求項３０記載の使用。
【請求項３４】
神経変性疾患がプリオン病である請求項３０記載の使用。
【請求項３５】
神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である請求項３０記載の使用。
【請求項３６】
神経変性疾患がＦＴＤＰ−１７である請求項３０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、ＡＳＫ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　Ｋｉｎａｓｅ　１）阻害物質を含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤、ＡＳＫ１阻害物質を有効量使用することを含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療方法、および小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのＡＳＫ１阻害物質の使用に関するものである。
〔背景技術〕
小胞体ストレスとは、異常蛋白質が小胞体内に凝集又は蓄積する現象をいい、小胞体ストレスがポリグルタミン病、アルツハイマー病、プリオン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＦＴＤＰ−１７（１７番染色体にリンクする前側頭葉性痴呆症）等の神経変性疾患に深く関与していることが報告されている。異常蛋白質については、例えば、ポリグルタミン病においては脳内又は神経にポリグルタミンの沈着が認められ、アルツハイマー病においては脳内にβアミロイド（Ａｍｙｌｏｉｄ　β）の沈着が認められている。同様に、プリオン病においては異常型プリオン（ＰｒＰＳＣ）、パーキンソン病においてはα−シヌクレイン（α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、筋萎縮性側索硬化症においては変異型ＳＯＤ１遺伝子産物、ＦＴＤＰ−１７においてはタウ（Ｔａｕ）の沈着がそれぞれ認められている。そして、この小胞体ストレスが過剰な場合あるいは長時間持続した場合、細胞がアポトーシス様の形態変化を起こして死滅し、上記神経変性疾患は小胞体を起源とするアポトーシスであることが指摘されている。このように、小胞体ストレスは、これらの神経変性疾患の発症における由々しき危険因子であると考えられている。（Ｎｉｗａ　Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．６９１−７０２（１９９９）；Ｋａｔａｙａｍａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．４７９−７０２（１９９９）；Ｎａｋａｇａｗａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４０３，ｐｐ．９８−１０３（２０００）；垣塚彰，細胞工学，Ｖｏｌ．１８，Ｎ０．６，ｐｐ．７８２−７８８（１９９９）；今泉和則，実験医学，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１３，ｐｐ，１７８１−１７８６（２０００））
小胞体ストレスの伝達経路やその活性化のメカニズムとしては、小胞体内の異常蛋白質を認識するセンサー分子と解されるＩＲＥ１が、アダプター蛋白であるＴＲＡＦ２を介してＭＡＰキナーゼであるＪＮＫを活性化することが明らかになっている。また、システインプロテアーゼであるカスパーゼ１２のノックアウトマウスでは小胞体ストレスによるアポトーシスが抑制されたことが報告されている。（Ｕｒａｎｏ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８７，ｐｐ．６６４−６６６（２０００）；松沢厚ら，生体の科学，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．４，ｐｐ．２６６−２７２（２０００））
ＡＳＫ１はＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）ファミリーに属するキナーゼの一種であり、例えば、ヒトＡＳＫ１は１３７５個のアミノ酸により構成され（ＷＯ９７／４０１４３号公報記載の配列表配列番号１の蛋白質）、マウスＡＳＫ１は１３７９個のアミノ酸から構成されており（口腔病学会雑誌，Ｎｏ．３，ｐｐ．４５（１９９８）図１記載の蛋白質）、ヒトＡＳＫ１とマウスＡＳＫ１には９１．９％の極めて高い相同性が認められることが報告されている。同様に、ヒトＡＳＫ１のｃＤＮＡ（ＷＯ９７／４０１４３号公報記載の配列表配列番号２）やマウスＡＳＫ１のｃＤＮＡ（口腔病学会雑誌，Ｎｏ．３，ｐｐ．４５（１９９８）図１）が開示されている。ＭＡＰＫＫキナーゼは、ヒトを含む哺乳類から酵母に至るまで保存された細胞内シグナル伝達経路として知られているＭＡＰ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）キナーゼスーパーファミリーによるシグナル伝達カスケードに属するキナーゼであり、ＭＡＰＫＫキナーゼの下流には、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）およびＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）の２種類のキナーゼが存在する。（Ｉｃｈｉｊｏ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．９０−９４（１９９７）；ＷＯ９７／４０１４３号公報；飛梅圭，口腔病学会雑誌，Ｎｏ．３，ｐｐ．４２−５２（１９９８））
ＡＳＫ１についてはＴＮＦ受容体を介してＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−αにより活性化され、活性化されたＡＳＫ１が当該シグナル伝達カスケードを介して細胞のアポトーシス誘導に関与していることが確認されており、ヒトＡＳＫ１の変異体であるドミナントネガティブ体をＪｕｒｋａｔ細胞に高発現させた場合、ＴＮＦ−αにより誘導されるアポトーシスが抑制されたことが報告されている。それ故、ＡＳＫ１が悪性腫瘍治療剤または悪性腫瘍遺伝子治療剤として有用であることが開示されている。しかしながら、小胞体ストレスにおけるＡＳＫ１の関与については何ら報告されていない。（Ｉｃｈｉｊｏ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．９０−９４（１９９７）；ＷＯ９７／４０１４３号公報）
現在、小胞体ストレスによる神経変性疾患に有用な予防または治療剤は全く知られておらず、目下これらの神経変性疾患の予防または治療剤を早期に開発すべく鋭意研究が行われている。
〔発明の開示〕
本発明は、ＡＳＫ１阻害物質を含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療剤に関するものである。
また、本発明は、ＡＳＫ１阻害物質を有効量使用することを含む、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療方法に関するものである。
更には、本発明は、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのＡＳＫ１阻害物質の使用に関するものである。
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明者らは、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療に有用な薬剤を見出すべく鋭意検討した結果、ＡＳＫ１が小胞体ストレスによるアポトーシスに関与し、ＡＳＫ１阻害物質が小胞体ストレス関連疾患に有用であるという知見を得、本発明を成すに至った。
詳細に述べれば、本発明者らは、第一にＡＳＫ１ノックアウトマウスを後述した方法により作製した。作製したＡＳＫ１ノックアウトマウスより胎児線維芽細胞を採取し、小胞体ストレスを誘導する種々の誘発剤であるタプシガルギン、ツニカマイシンやジチオスレイトールを用いてアポトーシスの発生を観察した。その結果、すべてにおいて、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの胎児線維芽細胞においては野生型（正常）マウスの胎児線維芽細胞の場合と比較して有意にアポトーシスが抑制されていた。この事からＡＳＫ１は小胞体ストレスによるアポトーシス誘導に密接に関与していることが認められる。
また、ＡＳＫ１の７０９番目のリジン残基はＡＴＰ結合サイトであり、これをアルギニンまたはメチオニンに置換することによってキナーゼ触媒活性を不活化できる。この変異体ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ、Ｋ７０９Ｍ）はドミナントネガティブ（優性抑制型）体として機能する。ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体は、変異体ＡＳＫ１（例えば、Ｋ７０９Ｒ、Ｋ７０９Ｍ）をコードする塩基配列を発現ベクターに組み込み、そのベクターをリポフェクチン法やアデノウイルス感染法などにより細胞にトランスフェクションまたはインフェクションすることで、細胞内に過剰発現させることができる。過剰発現した細胞は、小胞体ストレスによるアポトーシスを顕著に抑制することができる。
即ち、ＡＳＫ１阻害物質を有効成分として含有させることにより、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療に有用な薬剤を提供することができる。また、ＡＳＫ１阻害物質を有効量使用することにより、小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療として有用な方法を提供することができる。
尚、本明細書において、特定の変異体であるドミナントネガティブ体を表す場合には、本来のアミノ酸残基（一文字表記）を最初に、位置番号を二番目に、置換された後のアミノ酸残基（一文字表記）を三番目に示し、「Ｋ７０９Ｒ」や「Ｋ７０９Ｍ」は７０９番目のアミノ酸残基であるＫ（Ｌｙｓ：リジン）がＲ（Ａｒｇ：アルギニン）またはＭ（Ｍｅｔ：メチオニン）で置換されていることを表す。
また、本明細書において、「＋／＋」は、マウスまたはマウス由来細胞において１対の相同染色体それぞれに存在する２ヶ所のＡＳＫ１遺伝子座が共に正常であること、即ち野生型であることを示し、「−／−」は、１対の相同染色体それぞれに存在する２ヶ所のＡＳＫ１遺伝子座の両方に変異が導入されており、ＡＳＫ１蛋白の発現がないホモ接合体、即ちＡＳＫ１がノックアウトされているマウスまたはマウス由来細胞であることを示す。
本発明において、小胞体ストレスに起因する疾患とは、小胞体ストレスがその病態の発症または進展に関与している疾患をいい、例えば、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、プリオン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７等の神経変性疾患を挙げることができる。
本発明において、ＡＳＫ１阻害物質とは、それ自体ＡＳＫ１阻害作用を有しているものに限定されるものではなく、生体内または培養系においてＡＳＫ１阻害作用を有しているものを産生するものを含み、例えば、アミノ酸配列において１以上のアミノ酸を付加、挿入、置換および／または欠損（例えば、９６０番目のアラニン残基の欠損）させた誘導体を含む（例えば、Ｗａｎｇ　Ｘ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．３１６０７−３１６１１（１９９６））、ヒトＡＳＫ１に対するドミナントネガティブ体（例えば、Ｋ７０９Ｒ、Ｋ７０９Ｍ；以下、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体と称する）、ヒトＡＳＫ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドと称する）、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質（例えば、グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｍｕ１−１等）、ネフ、１４−３−３蛋白質、チオレドキシンなど）（例えば、Ｓｓａｎｇ−Ｇｏｏ　Ｃｈｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．１６，ｐｐ．１２７４９−１２７５５（２００１）；Ｒｏｍａｓ　Ｇｅｌｅｚｉｕｎａｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４１０，ｐｐ．８３４−８３８（２００１）；ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．４，ｐｐ．Ａ２３５（２００１）；ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．９，ｐｐ．２５９６−２６０６（１９９８））やそのセンスオリゴヌクレオチド（それらの薬理学的に許容される塩を含む）、並びにＡＳＫ１ドミナントネガティブ体またはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列を複製し、標的組織または宿主細胞内で当該ドミナントネガティブ体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる組換えベクター（以下、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する）、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを標的組織または宿主細胞内で発現することができる組換えベクター（以下、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターまたはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する）、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞（以下、場合によりＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、またはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞と称する）等を例示することができる。
本発明のＡＳＫ１阻害物質の使用方法としては、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクター、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、またはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターや、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を生体内の標的組織に適当な方法により導入し、所望のＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを発現させることによる遺伝子的な予防または治療剤としての使用や、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質、またはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする製剤を経口または非経口的に投与させることによる薬物的な予防または治療剤としての使用を挙げることができる。
ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等を挙げることができる。
組換えベクターにおいては、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体やＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列の他に、これを実際に標的組織または宿主細胞に導入して所望の当該ドミナントネガティブ体やアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させるために、その発現を制御する塩基配列（例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列）や微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等を選択するための遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、並びにＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミンク肺上皮細胞（例えば、Ｍｖ１Ｌｕ）、リンパ球、繊維芽細胞、血液系細胞および腫瘍細胞等の動物細胞を挙げることができる。
組換えベクターの標的組織または宿主細胞への導入方法としては、ＨＶＪリポソーム法（金田，実験医学，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．２，ｐ．７８（１９９４）；森下等，実験医学，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１５，ｐ．１５８（１９９４））、ＡＳＫ１阻害物質を注射等により直接投与する方法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法（Ｔ．Ｍ．Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０，ｐｐ．２８６−２９１（１９９２））、リポフェクション法によって投与する方法（Ｎａｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４４，ｐ．１２８５（１９９０））、ベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等）を使う方法等を挙げることができる。
ＡＳＫ１阻害物質を有効成分とする製剤を実際に小胞体ストレスに起因する疾患の予防または治療において用いる場合、用法に応じ種々の製剤形態のものが使用される。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤、注射剤、直腸投与剤、座剤等を挙げることができ、経口または非経口的に投与される。
ＡＳＫ１阻害物質を含有するこれらの各種製剤は、上記ＡＳＫ１阻害物質を有効成分として、通常用いられている賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物と適宜混合または希釈若しくは溶解し、常法に従い調剤することにより製造することができる。
ＡＳＫ１阻害物質の小胞体ストレスに起因する疾患の薬物的な予防または治療における投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度や疾患の種類等を考慮して適宜決定されるが、通常成人１日当たり約０．１〜５００ｍｇ、好ましくは約０．５〜１００ｍｇ程度とするのがよく、１日一回または数回に分けて投与することができる。また、ＡＳＫ１阻害物質の小胞体ストレスに起因する疾患の遺伝的な予防または治療における投与量もこれに準じて適宜決定することができる。
本発明によれば、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列またはこれを含むベクター、またはそのベクターにより形質転換させた宿主細胞を用いて標的組織に導入することにより、神経変性疾患等の小胞体ストレスに起因する疾患の発症または進展を抑制することができる。また、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質又はそのセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤を経口または非経口的に投与することにより、神経変性疾患等の小胞体ストレスに起因する疾患の発症または進展を抑制することができる。
本発明の内容を以下の試験例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
試験例１
ＡＳＫ１ノックアウトマウスの作製
１２９／ＳｖＪマウスの染色体（ジェノミック）ＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）から、ＡＳＫ１の第１エクソンを含む幾つかの染色体ＤＮＡ断片をクローン化した。そのうちの一つのクローンを用いて、第１エクソンより上流１０ｋｂ及び下流２ｋｂを相同組換え領域とし、第１エクソン及び隣接するイントロン領域を、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）とポジティブセレクション用のネオマイシン耐性遺伝子とに置換したターゲッティングベクターを構築した。ターゲッティングベクターには、ネガティブセレクション用のＤＴ−Ａ（ジフテリアトキシンα鎖）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）を用いた。ターゲッティングベクターは、エレクトロポーレーション法によってＪ１　ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）に導入した。ネオマイシン耐性のＥＳ細胞コロニーを選択した後、更にサザンブロット法により相同組換え細胞の確認を行った。ヘテロ接合変異体ＥＳ細胞は、マイクロインジェクション法によりＣ５７ＢＬ／６Ｊの胚盤胞に導入した。生まれてきたキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの戻し交配によって、Ｆ１（第１世代）ヘテロ接合体マウスが得られた。遺伝子変異が生殖細胞に導入されているか否かをサザンブロット法により確認した後、それらＦ１ヘテロ接合体マウス同士の掛け合わせから、ＡＳＫ１のホモ接合体であるＡＳＫ１ノックアウトマウスを樹立した。
試験例２
小胞体ストレスによるアポトーシス誘導
胎生１２．５日目のＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＭＥＦｓ）を用いて、ＡＳＫ１が小胞体ストレス誘導性のアポトーシスに関与しているか否かについて検討を行った。２４ウェルプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度でＭＥＦｓを一晩培養し、刺激前２時間に無血清培地に変換後、２μＭのタプシガルギン、２．５μｇ／ｍＬのツニカマイシン又は１０ｍＭのジチオスレイトールを培地に添加することによって小胞体ストレスを誘導した。タプシガルギンは、小胞体へのカルシウム取り込みを阻害し、小胞体内のカルシウムホメオスタシスを乱すことによって小胞体ストレスを誘導する薬剤である。また、ツニカマイシンは、蛋白質糖鎖付加を阻害することにより、ジチオスレイトールは、ジスルフィド結合を阻害することにより、それぞれ小胞体ストレスを誘導する薬剤である。アポトーシスによる細胞死の検出は、ＴＵＮＥＬ（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ−メディエーティッド　ｄＵＴＰニック・エンド・ラベリング）法およびＭＴＴ（３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２−イル〕−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム　ブロマイド）法によって行った。
１）ＴＵＮＥＬ法
アポトーシスによる細胞死の大きな特徴の一つは、ＤＮＡの断片化であり、ＴＵＮＥＬ法は、その断片化されたＤＮＡを特異的に染色できる方法である。タプシガルギン添加２、６時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドによって３０分間、室温で固定し、０．１％トライトンＸ−１００で４℃、２分間処理し細胞膜透過性を亢進させた。アポトーシス細胞の染色のために、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ＴＵＮＥＬ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｉｘｔｕｒｅ（ロシュ社）を加え、室温で１時間静置した。全体の細胞数を数えるため、生細胞と死細胞の両者を染色できるＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８（１μｇ／ｍＬ）とｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（１０μｇ／ｍＬ）を用いた。全ての溶液の希釈および洗浄は、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）によって行った。染色後の細胞は、Ｍｏｗｉｏｌ（和光純薬工業（株））で包埋し、蛍光顕微鏡観察により死細胞を同定した。アポトーシス細胞の割合（％）は、全体の細胞数として少なくとも３つ以上の視野でそれぞれ１００個以上の細胞を数え、そのうちのＴＵＮＥＬ染色陽性の細胞数の割合として算出した。
２）ＭＴＴ法
ＭＴＴ法は、ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍのフォルマザンへの還元による吸光度の変化を指標に、生細胞の割合を検出するアッセイ法である。タプシガルギンを加えて８、１６、２４時間後に、また、その他の小胞体ストレス誘発剤については８時間後に、それぞれＭＴＴアッセイを行った。ＭＴＴアッセイ溶液原液（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を細胞培養液中に１０倍希釈で添加し、３７℃、１時間静置し、その培養液中の吸光度を４５０ｎｍにて測定した。無処理の細胞培養液中の吸光度値を１００％として、生細胞率（％）を計算した。
第１図は、ＴＵＮＥＬ法により、アポトーシス細胞を視覚化したものである。緑色蛍光染色されているものが、アポトーシス細胞である。細胞の全体像は、青色のＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８及び赤色のｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅによって染色されている。第１図は刺激６時間後の代表的な視野であり、更に３つ以上の視野で観察した結果をグラフにまとめたものが第２図である。野生型のＭＥＦｓ（＋／＋）と比較して、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞ＭＥＦｓ（−／−）は、タプシガルギンによる小胞体ストレス誘導性の細胞死に対して、顕著に耐性を示した。同様の結果は、ＭＴＴ法によっても確認された（第３図）。また、タプシガルギンとは別なメカニズムで小胞体ストレスを誘発する代表的な化合物であるツニカマイシンやジチオスレイトールによるアポトーシスに対しても同様に、ＡＳＫ１を欠損したＭＥＦｓ細胞は耐性を示した（第４図）。
以上の結果は、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスはＡＳＫ１によって実行されることを示している。ＡＳＫ１の欠損によって、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスが消失する事実は、ＡＳＫ１阻害物質のアポトーシス関連性疾患への有用性を顕著に証明するものである。
試験例３
神経変性蛋白質Ａｍｙｌｏｉｄ−βによる初代培養神経細胞へのアポトーシス誘導
胎生１４．５日目のＡＳＫ１ノックアウトマウス大脳由来の初代培養神経細胞を用いて、ＡＳＫ１が神経変性蛋白質Ａｍｙｌｏｉｄ−βによるアポトーシスに関与しているか否かについて検討を行った。マウス大脳半球を単離し培地中で組織をピペッティングによりほぐした後、ポリ−Ｌ−リジンおよびフィブロネクチンをコートした２４ウェルプレート上におよそ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した。培養１日目および３日目に１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｕｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）を培地に添加し、４日間培養したものを初代培養神経細胞として用いた。Ａｍｙｌｏｉｄ−βはアルツハイマー病患者の脳組織に多量に凝集する変性蛋白質であり、強い神経毒性を有し、アルツハイマー病における神経変性の原因蛋白質である。Ａｍｙｌｏｉｄ−β（２５−３５）（Ａｍｙｌｏｉｄ−β蛋白質のアミノ酸配列で２５番目から３５番目までのペプチドで、最も神経毒性の強い部分と言われている）を２５μＭの濃度で培地に加え、３日後の生存率を、試験例２記載のＭＴＴ法と同様の方法により、無処理の初代培養神経細胞に対する生細胞率（％）として計算した。
図５は、Ａｍｙｌｏｉｄ−βによる神経毒性に対する生存率を、野生型マウス由来の神経細胞（＋／＋）とＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の神経細胞（−／−）とで比較したものである。野生型の神経細胞のほとんどがＡｍｙｌｏｉｄ−β誘導性細胞死を起こすのに対して、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の神経細胞は、Ａｍｙｌｏｉｄ−βによって誘導される神経細胞死に対して、顕著に耐性を示した。
神経変性蛋白質であるＡｍｙｌｏｉｄ−βは小胞体ストレスを誘導することが分かっていることから、第５図の結果は、実際に小胞体ストレス誘導性の神経細胞アポトーシスはＡＳＫ１によって実行されることを示している。また、ＡＳＫ１の欠損によって、Ａｍｙｌｏｉｄ−β誘導性誘導性のアポトーシスが消失する事実は、ＡＳＫ１阻害物質の神経変性疾患への効果を顕著に証明するものである。
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、ＡＳＫ１を阻害することによる小胞体ストレス誘導性のアポトーシスの抑制に関するものである。本発明により小胞体ストレスに起因する疾患、特には、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、ＦＴＤＰ−１７などの神経変性疾患の予防または治療剤或いは予防または治療方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＴＵＮＥＬ法を用いて、タプシガルギンによる小胞体ストレスによって誘導されたアポトーシス細胞をＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１−／−）と野生型ＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１＋／＋）につき比較検出した写真である。小胞体ストレス誘導後６時間目の代表的な写真を示した。上段は無刺激のコントロール細胞、下段はタプシガルギン処理細胞である。４枚ずつの写真のうち、左側のＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８（青色）とｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（赤色）での染色は、細胞の全体像を示し、それらのうちアポトーシスを引き起こしている細胞の核は、右側の写真でＴＵＮＥＬ染色法により緑色を呈している。ＴＵＮＥＬ染色写真の右下の数字は、アポトーシス細胞の割合（％）である。
第２図は、第１図に示したタプシガルギンによる小胞体ストレス誘導性アポトーシス細胞の割合についてＴＵＮＥＬ法により検出した結果を、ＡＳＫ１ノックアウトマウスのＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１−／−；黒棒）と野生型ＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ＋／＋；白棒）につき比較し、経時的に（０、２及び６時間後）グラフ化したものである。データは、３つ以上の視野で、それぞれ１００個以上の細胞数を数えて、そのうちのＴＵＮＥＬ陽性細胞をアポトーシス細胞とし、その割合の平均値を示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸はアポトーシス細胞の割合（％）を、横軸は時間（時間）を示す。
第３図は、ＭＴＴ法を用い、タプシガルギンによる小胞体ストレスによって誘導される細胞死に対する耐性について、ＡＳＫ１ノックアウトマウスのＭＥＦｓ（ＡＳＫ１−／−；黒丸）と野生型ＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ＋／＋；白丸）につき比較し、経時的に（０、８、１６及び２４時間後）それぞれの細胞生存率を示したグラフである。データは、５回以上の独立した実験を行い、その平均値として示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸は細胞生存率（％）を、横軸は時間（時間）を示す。
第４図は、ＭＴＴ法を用い、タプシガルギンの他に、様々な小胞体ストレス誘発剤として、ジチオスレイトールおよびツニカマイシンによって誘導される細胞死に対する耐性について、ＡＳＫ１ノックアウトマウスのＭＥＦｓ（ＡＳＫ１−／−；黒棒）と野生型ＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ＋／＋；白棒）につき比較したグラフである。データは、５回以上の独立した実験を行い、小胞体ストレス誘導後８時間目の細胞生存率の平均値として示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸は細胞生存率（％）を、横軸は用いた小胞体ストレス誘発剤の名称を示す。
第５図は、ＭＴＴ法を用い、神経変性蛋白質Ａｍｙｌｏｉｄ−βによって誘導される神経細胞死に対する耐性について、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの初代培養神経細胞（ＡＳＫ１−／−；黒棒）と野生型初代培養神経細胞（ＡＳＫ＋／＋；白棒）につき比較し、Ａｍｙｌｏｉｄ−βを添加した当日（０日）、および３日後におけるそれぞれの神経細胞の生存率を示したグラフである。データは、５回以上の独立した実験を行い、その平均値として示した。エラー・バーは標準偏差を表す。縦軸は神経細胞生存率（％）を、横軸は時間（日）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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