(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性ｐＨで水に可溶で、０℃以下の温度で安定に保存可能な、水溶液中での酸化分解で変性させたペプシン処理したコラーゲンまたはゼラチンから成る未架橋で且つ架橋可能な外科用接着剤として使用されるの粉末。
【請求項２】
１〜10-5Ｍの濃度の過沃素酸またはその塩の水溶液を用いて酸化したコラーゲンまたはゼラチンからなる請求項１に記載の粉末。
【請求項３】
０℃以下で保存される請求項１または２に記載の粉末。
【請求項４】
−10℃〜−80℃で保存される請求項３に記載の粉末。
【請求項５】
コラーゲンまたはゼラチンがヒトまたは動物由来のものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の粉末。
【請求項６】
以下の１）〜４）の工程から成ること特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の粉末の製造方法：
１）  ペプシン処理したコラーゲンの酸性水溶液を調製し、
２）  得られた酸性水溶液を室温で１〜10-5Ｍ濃度の過沃素酸またはその塩の水溶液で酸化し、
３)  塩を加え、ｐＨを酸性にすることによって未架橋の酸化コラーゲンを沈澱させ、
４）  酸化分解で変性させた未架橋のペプシン処理したコラーゲンを単離し、濃縮し、脱水して反応性酸性粉末の状態で回収し、
5） 得られた反応性酸性粉末を凍結し、０℃以下の温度で保存する。
【請求項７】
未架橋の酸化コラーゲンを酸性ｐＨで塩を添加して沈澱させる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヒトまたは動物由来のコラーゲンを使用する請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
沃素またはその誘導体を実質的に含まず、０℃以下の温度で安定に保存可能な、酸化分解で変性させた未架橋で且つ架橋可能なペプシン処理したコラーゲンまたはゼラチンの、外科用接着剤組成物を作るための、高濃度の反応性酸性溶液。
【請求項１０】
酸化分解で変性させた未架橋で且つ架橋可能なペプシン処理したコラーゲンまたはゼラチンの粉末を酸性ｐＨの水に溶解して調製される請求項９に記載の溶液。
【請求項１１】
コラーゲンまたはゼラチンの濃度が５〜30重量％である請求項９または１０に記載の溶液。
【請求項１２】
０℃以下の温度で保存される請求項９〜１０のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項１３】
−10℃〜−80℃で保存される請求項１２に記載の溶液。
【請求項１４】
下記の１）〜７）の工程を有することを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の反応性酸性溶液の製造方法：
1)  未架橋で且つ架橋可能なペプシン処理したコラーゲンまたはゼラチンの殺菌済み粉末を調製し、
2)  この粉末を水に溶解させて酸性の反応性溶液を作り、
3）  得られた反応性溶液を室温で１〜10-5Ｍの濃度の過沃素酸またはその塩の水溶液を用いて酸化し、
4)  塩を加え、ｐＨを酸性にすることによって未架橋で酸化したペプシン処理したコラーゲンを沈澱させ、
5）  酸化分解で変性させた未架橋のペプシン処理したコラーゲンを単離し、濃縮し、脱水して反応性酸性粉末の状態で回収し、
6） 得られた反応性酸性粉末を４０〜８０℃の温度に加熱した水に溶解し、
7）  得られた反応性溶液を冷却し、０℃以下の温度で保存する。
【請求項１５】
酸化分解で変性させた未架橋コラーゲンまたはゼラチンの粉末をほぼ５重量％（重量／重量）の濃度で滅菌水に溶解する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
下記（1）〜（3）から成ることを特徴とする生物適合性と生体吸収性とを有する無毒な、生体組織相互または生体組織と埋め込んだバイオ材料とを接合させるための外科用接着キット：
（1）  沃素またはその誘導体を実質的に含まず、０℃以下の温度で安定に保存可能な、酸化分解で変性させた未架橋で且つ架橋可能なペプシン処理したコラーゲンまたはゼラチンの反応性酸性溶液、
（2）  中和化溶液、および
（3）  上記２つの溶液を混合するための混合手段。
【請求項１７】
反応性酸性溶液が酸化分解で変性させた未架橋で且つ架橋可能なコラーゲンまたはゼラチンの濃縮した反応性酸性溶液である請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
反応性酸性溶液が０℃以下の温度で保存される請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
反応性酸性溶液が−10℃〜−80℃の温度で保存される請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
反応性酸性溶液が下記１）〜７）の工程で得られたものである請求項１６に記載のキット：
1)  未架橋で且つ架橋可能なペプシン処理したコラーゲンまたはゼラチンの殺菌済み粉末を調製し、
2)  この粉末を水に溶解させて酸性の反応性水溶液を作り、
3）  得られた反応性水溶液を室温で１〜10-5Ｍの濃度の過沃素酸またはその塩の水溶液を用いて酸化し、
4)  塩を加え、ｐＨを酸性にすることによって未架橋の酸化したペプシン処理したコラーゲンを沈澱させ、
5）  酸化分解で変性させた未架橋のペプシン処理したコラーゲンを単離し、濃縮し、脱水して反応性酸性粉末の状態で回収し、
6）  得られた反応性酸性粉末を４０〜８０℃の温度に加熱した水に溶解し、
7）  得られた反応性溶液を冷却し、０℃以下の温度で保存する。
【請求項２１】
中和化溶液が、反応性酸性溶液と混合した後のｐＨを６〜10にする緩衝液である請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
緩衝液が炭酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムから成る請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
混合手段が複式注射器からなり、一方の注射器に酸化分解で変性させた未架橋で且つ架橋可能なペプシン処理したコラーゲンまたはゼラチンの反応性酸性溶液を収容し、他方の注射器に中和化溶液を収容した請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は外科的用途で用いられる接着性組成物に関するものであり、特に、酸化分解(coupurage oxydative) で変性した酸性媒質に可溶な非架橋のコラーゲンまたはゼラチンをベースとした生体適合性と生体吸収性のある生きた組織を含む生体組織間の結合または生体組織と移植したバイオ材料との結合を行うための無毒な接着性組成物に関するものである。
本発明は、さらに、上記接着性組成物を製造するための中間体と、その製造方法と、緊急外科処置で使用する接着キットとに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
外科用の組織接着剤に関しては何十年も前から多くの研究と実験が行われている。例えば、1960年代〜1980年代にはゼラチン、レゾルシノールおよびホルムアルデヒドからなる接着性組成物（ＧＲＦ）が使用されていた。この組成物の接着性能はホルムアルデヒドによるゼラチンの重合によるものであり、レゾルシノール（フェノール) は接着剤の溶解を抑えるために用いられる。しかし、この接着材の組織に対する毒性の問題と接着力不足の問題が多くの研究で報告されている(Braunwald達、Surgery, 59: 1024-1030, 1966, Bachet達、J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 83: 212-217, 1982)。また、ホルムアミドは塩析し易く、毒性があるため現在では外科用組成物にホルムアミドは使用されていない。
【０００３】
ムール貝の足から単離されたポリペプチドから開発された接着剤系（海の蛋白接着材）も公知である(Waite達、Biochem., 24: 5010-5014, 1985)。この蛋白は当初はムール貝から抽出されたが、その後は合成または遺伝子工学で作られている（欧州特許第 242,656号、国際特許第 WO88/03953 号、Marumo達、 Biochem. Biophys. Acts, 872, 98-103, 1986、 Swerdloff達 Int. J. Peptide  Protein Res.,  33, 313, 1989を参照) 。この蛋白質はヒドロキシル化可能なチロシンとプロリン残基を豊富に含むことを特徴とするデカペプチドより成る繰り返し単位の鎖で構成され、強い接着性を与えるＤＯＰＡ（3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン）を含んでいる。この接着剤は概念としては有望であるが、開発が難しく、ある種のデカペプチドは毒性を有するため利用できない。この接着剤系に関しては多くの特許が出されている（国際特許第 WO92/10567 号、欧州特許第 243,818号および第 244,688号、米国特許第 4,808,702号、第 4,687,740号およびオーストラリア特許第AU-8,824,972号を参照) 。
【０００４】
しかし、組織用接着剤の利用分野で実質的な発展をしたのはフィブリノーゲンとトロンビンとをベースとした接着剤であった。
フィブリノーゲンを接着剤用バイオ材料として使用することは1940年代初頭に遡る (Young, Medawar, Lancet II : 126-132, 1940)。神経吻合術における最初に結果(Tarlov et Benjamin, Surg. Gynecol. Obstet, 76, 366-374, 1943)以降のこの接着剤系の結果は十分ではなかった。このことは使用したプラスマのフィブリノーゲン濃度の薄さから分かる。
【０００５】
1970年代には、低温沈澱物を使用してフィブリノーゲンを高濃度で含有する接着剤を用いるという考えが再度導入された (Madras達、Wien Klin. Wochenschr.87: 495-501, 1972)。この形式の接着剤はイムノ(IMMUNO)社からティッシュコル(TISSUCOL 登録商標) 、ベーリングウェルケ(BEHRINGWERKE)社からベリプラスト(BERIPLAST  登録商標) 、バイオトランスフュージョン（BIOTRANSFUSITON)社からバイオコル(BIOCOL 登録商標）の名称で発売された。これらはファクターXIIIとフィブロネクチンとを含む高濃度のフィブリノーゲン溶液（70-140 mg/ml) であり、その重合はトロンビン溶液（４〜400 I.U.) によって混合物中で直ちに起こる。フィブリノーゲンが重合してフィブリンとなって凝固物を形成し、この凝固物が接触する組織と確実に接着する。
【０００６】
これらの製品およびその成分に関する主たる問題点および欠点は、フィブリノーゲン溶液の各成分（ファクターXIII、フィブロネクチン、アプロチニン）が完全に特徴付けされておらず、それぞれの量に再現性がないことと、外被を有しないウィルス、例えばＡＴＮＣ(Agent Transmissibles Non Conventionnel)に対してこれらの製品を完全に不活性するのが難しいことにある。そのため国によっては（例えば米国) 、これらの製品の大規模な使用は制限されている。
【０００７】
最近公開された欧州特許第0 466 383 号 (Bausch & Lomb Incorporated) には天然の架橋コラーゲンより成る外科用接着性組成物が記載されている。この組成物は、外科的用途を考えた場合に必要となる流動性および濃度をコラーゲン溶液中の架橋割合で調節している。すなわち、この特許では、強度に架橋した天然コラーゲン溶液とそれよりも架橋度の低い天然コラーゲンの溶液とを混合して所望の流動性および濃度にする。実際には、好ましくは加熱して流動性を上げた上記混合物を組織へ塗布し、放冷することによって生体組織を接合する。
【０００８】
しかし、架橋コラーゲンをベースとしたこの種の接着性組成物の取扱いは容易ではなく、このような組成物に十分な流動性を与えるのは困難で、問題が生じることがある。実際、架橋コラーゲンの比率が高い程、生体組織に正確に塗布するのに必要な流動性を達成するのが困難になる。また、組成物中に架橋度の低いコラーゲンを存在させて混合物の流動性を良くし、塗布状態を良くするため、機械的強度が悪くなる。
事実、コラーゲンの機械的強度と生物分解性とは基本的に架橋度と架橋の仕方とに依存するということが分かっている。
【０００９】
欧州特許第 87 401 573.8 号には、化学分子の共有結合を加えずに全体を均質に架橋することが可能なコラーゲンの架橋方法が記載されている。この場合の架橋は過沃素酸または過沃素酸ナトリウムの溶液を用いて室温、酸性媒体中でコラーゲンを注意深く酸化し、次いで中性または塩基性ｐＨの処理で行われる。この方法を用いると優れた機械的特性と生物分解性とを有する非溶解性の架橋コラーゲン製品（ゲル、フィルム、粉末、レンズまたは埋め込み用の骨製品）を製造することができるが、この方法は流動性のある液体製品を製造するには適していない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生物適合性と生体吸収性とを有する無毒な外科用接着性組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、生体組織に正しく塗布するのに必要な流動性を有し、経時的に安定な接着性を維持し、使用が容易で、注射器やカテーテルで注入可能な接着剤組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、有毒物が残らない優れた機械的強度と生物分解性とを同時に満たす接着性組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、上記組成物の製造方法と、使用が簡単で実用的な外科的用接着キットとを提案することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の対象は、酸性ｐＨで水に可溶で、０℃以下の温度で安定に保存可能な、水溶液中での酸化分解で変性させた未架橋で且つ架橋可能な外科用接着剤として使用されるペプシン処理したコラーゲンまたはゼラチンの粉末にある。
【００１２】
本発明の他の対象は、酸化分解で変性させた未架橋のコラーゲンまたはゼラチンをベースとする反応性酸性溶液および粉末にあり、これらは上記接着性組成物を製造するための中間生成物であり、その製造方法も本発明の対象である。
上記粉末は酸化分解で変性させた未架橋かつ架橋可能なコラーゲンまたはゼラチンの粉末であり、酸性ｐＨで可溶性である。
この粉末は下記工程で製造できる：
1)  コラーゲンの酸性水溶液を調製し、
2)  酸性水溶液を室温で濃度１〜10-5Ｍの過沃素酸またはその塩の溶液で注意深く酸化し、
4)  酸性ｐＨで未架橋の酸化コラーゲンを沈澱させ、
5)  酸化分解で変性させた未架橋のコラーゲンを単離し、濃縮し、脱水して反応性酸性粉末の状態で回収する。
【００１３】
上記反応性酸性溶液は酸化分解で変性させた未架橋のコラーゲンまたはゼラチンの高濃度酸性溶液である。これは過沃素酸による酸化で生じた沈澱物を再溶解して直接濃縮するか、上記粉末を酸性ｐＨで水溶液にして得られる。
この反応性酸性溶液は下記方法で製造するのが好ましい：
1)  酸化分解で変性させた未架橋で且つ架橋可能な酸性ｐＨで可溶なコラーゲンまたはゼラチンの無菌の粉末を調製し、
2)  この粉末の必要量を、約40℃〜80℃に加熱しながら滅菌水に溶解させる。
【００１４】
本発明のさらに他の対象は下記で構成されることを特徴とするを生物適合性と生体吸収性とを有する無毒な生体組織相互または生体組織と埋め込んだバイオ材料とを接合させるための外科用接着キットにある：
1)  酸化分解で変性させた未架橋で且つ架橋可能なコラーゲンまたはゼラチンの酸性の反応性溶液、
2)  中和化溶液、および
3)  上記２つの溶液を混合するための混合手段
この接着キットは混合器を備えた複式注射器の形をしているのが好ましい。
【００１５】
本発明のさらに他の対象は下記工程よりなる接着性組成物をインビトロで生体組織または埋め込まれたバイオ材料上に塗布する方法にある：
1)  組織および／またはバイオ材料上に塗布するのに適した流動性を有する酸化分解で変性させた未架橋のコラーゲンまたはゼラチンの反応性酸性溶液を調整し、
2)  コラーゲンまたはゼラチンのこの反応性酸性溶液と中和化溶液とを混合してｐＨを６〜10にし、
3)  中和された流動性を有する反応性混合物が架橋する前に、直ちに、接合すべき生体組織および／またはバイオ材料上に塗布し、
4)  人の温度で架橋重合させる。
【００１６】
【作用】
本発明者は驚くべきことに、酸化されたコラーゲンが潜在的に接着性があるということを見出した。そして、この酸化コラーゲンをその場(in situ) で架橋させることによって生体組織相互または生体組織と埋め込まれたバイオ材料とを接合することができ、その接合は機械的強度および生物分解性を示すということを見出した。
すなわち、本発明者は酸化分解で変性させた未架橋のコラーゲンは酸性ｐＨで凍結保存して使用時に接着剤にすることができ、この処置をすることによってコラーゲンの接着性を保持しながらコラーゲンの架橋を防止することができるということを見出した。
【００１７】
本発明では「コラーゲン」という用語は加熱操作またはその他任意の方法で得られる任意のコラーゲンまたはゼラチンを意味する。
本発明はその場(in situ) で架橋するような制御下に加熱された未架橋の酸化コラーゲンをベースとする接着剤を提供する。
本発明では「その場(in situ) で架橋」とは、生体組織に塗布した後および／または組織内に拡散した後に未変性の反応性コラーゲンが架橋することを意味する。これは、従来法とは逆である。すなわち、従来法では予め架橋した天然コラーゲンを塗布する推めており、生体組織上に塗布した後に架橋剤を添加せずに共有結合性の架橋を行うことは予測していない。
【００１８】
酸化コラーゲンは過沃素酸またはその塩で処理して得られる。この処理でコラーゲン中に切断が起こり、反応サイトができる。この処理は濃度 0.1〜50ｇ／リットルの酸性コラーゲン溶液を用いて行われる。コラーゲンの濃度は５ｇ／リットルであるのが好ましい。
ここで、「コラーゲン」という用語は人または動物由来の任意のコラーゲン、例えばＩ型を多く含むヒトコラーゲン、III 型を多く含むヒトコラーゲン、Ｉ＋III 型またはIV型のヒトコラーゲンあるいはＩ型またはＩ＋III 型の動物コラーゲンなどを表す。
【００１９】
酸性媒体中のコラーゲンを過沃素酸またはその塩の溶液（濃度１〜10-5Ｍ、好ましくは５×10-3〜10-1Ｍ）と混合する。反応は10分〜72時間（好ましくは約２時間）室温で行う。その後コラーゲンを架橋させずに注意深く酸化する。
【００２０】
本発明は粉末または溶液の中間生成物を単離・保存する方法を提供する。
実際には、上記の酸性溶液に塩、特に塩化ナトリウムを添加して最終的架橋時に有用な反応サイトを有する酸化コラーゲンを沈澱させる。連続して複数回洗浄した後、エタノールまたはアセトンに再懸濁させ、無菌条件下で脱水し、粉末状の酸化コラーゲンを得る。この粉末は酸性媒体に可溶である。
脱水も当該分野で工業的に利用されている公知方法に従って無菌状態での凍結乾燥で行うことができる。
本発明の別の実施例では、過沃素酸による酸化で生じた沈澱物を濃縮し、有機溶媒を除去するために高温または減圧下で再溶解して反応性の高濃度酸性溶液を得る。
【００２１】
本発明では、反応性の酸化コラーゲンの高濃度溶液または粉末を比較的大量に製造することができ、その形態で凍結保存することができる。保存温度は約−10℃〜−80℃の間で選択する。保存条件は簡単で、しかも、変性コラーゲンの反応性も維持される。
上記の粉末および高濃度酸性溶液は本発明接着性組成物を製造するための中間生成物である。
本発明では、未架橋かつ架橋可能な酸化コラーゲンの粉末を酸性媒体に溶解することによって反応性の酸性溶液を製造することができる。そのためには、酸化コラーゲンの粉末を40〜80℃に加熱した滅菌水に溶解させる。加熱によって酸化コラーゲンの溶解が促進されて比較的高濃度となる。この濃度は５〜30重量％にすることができる。
【００２２】
酸化コラーゲンは段階的に添加するのが好ましく、例えば一度に５重量％ずつ添加するのが好ましい。１回分の分量がほぼ完全に溶解するのを待って、次の粉末を導入するのが有利である。
添加速度は酸化コラーゲン粉末に応じて通常10分〜６時間である。そうすることによって均質な溶液が得られる。
本発明の未架橋かつ架橋可能な酸化コラーゲンの反応性酸性溶液は−10℃〜−80℃の温度で凍結状態で保存するのが好ましい。この反応性酸性溶液はこの条件下で安定である。この溶液は本発明接着性組成物を調製するための中間生成物になる。
【００２３】
この保存法は簡単であり、しかも使用する瞬間までコラーゲンの反応性が保持される。
酸性ｐＨにある酸化コラーゲンの架橋はｐＨを単純に中性または塩基性の値に変化させることによって行われる。そのためには酸化コラーゲンの酸性反応性溶液と混合した後のｐＨ値が６〜10となるような緩衝溶液を用いる。この緩衝溶液は炭酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムにするのが好ましい。
【００２４】
本発明はさらに他の対象は外科用接着用キット、例えば組織相互または組織と埋め込まれたバイオ材料との接合を行うためのキットにある。このキットは上記の反応性酸性溶液、中和化溶液およびこれら２つの溶液をその場で混合するための混合手段とで構成される。このキットは酸化コラーゲンの反応性とその接着性を保つためにマイナスの温度、好ましくは−10℃〜−80℃で保存される。
【００２５】
本発明の好ましい実施例では、接着キットが混合手段を備えた複式注射器の形をしており、一方の注射器には酸化コラーゲンの反応性酸性溶液が収容され、他方の注射器には中和化緩衝液が収容されている。この複式注射器は貯蔵および保存中は凍結されているのが好ましい。
本発明では中和操作を接合すべき生体組織、場合によっては埋め込まれたバイオ材料に酸化コラーゲンの反応性酸性溶液を塗布する前にその場で行うのが好ましい。
反応性酸性溶液と中和化溶液とから得られる反応性混合物が架橋するのに必要な時間は十分に長いので、架橋によって重合が起こる前に反応性混合物を組織および／またはバイオ材料上に塗布することができる。
【００２６】
中和された混合物を組織全体に行き渡らせて正しく塗布するために混合物に十分な流動性を与えるのが有利である。そのためには、例えば上記キットからの反応性酸性溶液と中和化溶液とを温度30℃〜60℃、好ましくは42℃〜50℃に再加熱し、その後混合手段を用いてこの再加熱された２つの溶液を混合する。そして、上記温度の中和された反応性混合物を、架橋が起こる前に、所望の接着位置に正しく保たれた生体組織上に塗布する。その後、架橋させて数分間組織を結合させたままにしておく。架橋時および接合時に冷却する必要はない。冷却は実験条件によって課される。
当然、中和した反応性混合物を予め患者または動物の体温にして塗布することもできる。
【００２７】
再加熱されて組織および／またはバイオ材料に塗布された上記２つの溶液の混合物は急速に反応して（例えば数分で）組織相互または組織と埋め込まれたバイオ材料とを接合させる接着性のゲルを形成する。当然ながら架橋時間はコラーゲンの酸化率、反応性酸性溶液中の酸化コラーゲン濃度、反応温度、混合物のｐＨ等によって変化する。特に、温度を上げる、８よりもアルカリ側のｐＨを採用することによって反応が促進される。
【００２８】
本発明の別の実施例、特に組成物の作用が迅速でなくともよい場合には、反応性酸性溶液を（例えば）皮膚にスプレーで塗布し、その後、この場合には皮膚という媒体によって中和を起こさせることができる。さらに、カテーテルを用いて患者または動物の体内に反応性酸性溶液を導入し、同様に患者／動物自身の器官という媒体によって中和を行わせることもできる。しかし、迅速に所望の効果を得なければならない場合には、カテーテルを用いて反応性混合物を導入することもできる。
【００２９】
本発明で得られる接着材料は組織全体で均質に架橋が行われるために優れた機械的特性を示すが、生物分解性にも優れている。
また、コラーゲンを変性させる際に毒性源となる危険性ある異物の化学物質を添加しないため、この材料は無毒である。本発明の組成物と製品はその接着性によって外科的に多くの重要な分野で使われる。各分野および用途では種々の作用が利用され、例えば接合、止血、液体・気体の遮断（気密性）、癒着、埋込み、外科的接合の予防、塞栓症(embolisation)、薬効成分の局所的放出システムなどで用いられる。
【００３０】
酸性反応性溶液は液体であり、それが塗布された生体組織に浸透し、架橋後に接着した組織を固定するゲルを形成し、特に組織を接合させて確実に癒着させることができる。さらに、生体組織の一方を圧定布またはパッチ等のバイオ材料で置換することもできる。
接着性は偶然に発見された固有の特性であって、塗布時のこの物質の流動性は架橋が最小限であって潜在的に反応性で架橋可能であるが反応性酸性溶液の段階では安定であるというモノマー分子の構造に起因している。
【００３１】
さらに、本発明の組成物を用いて、例えば傷ついた２つの神経の先端を固定して神経の微細構造の代用をしたり、あるいは急性大動脈弓解離症において大動脈の皮膜の二箇所を接合することができる。
反応性酸性溶液または本発明の反応性混合物の高い流動性、組織内への浸透性およびその場で架橋する性質によって、本発明接着性組成物は、血液流、血液以外の液体流または生体内の空洞から空洞へあるいは生体外への気体の流れを制限するために使用することもできる。
【００３２】
酸化コラーゲンがその場で架橋して形成される接着性材料はカスケード状凝集の開始に対するコラーゲン分子の作用の他に、機械的バリヤを形成する作用を有している。
この特性によって本発明組成物は止血機能を有する。この場合には、本発明組成物は単独で塗布されるか、圧定布または止血用製品あるいは従来の結紮または電気凝固技術と組み合わせて塗布されて、バイオプシー、切開または血管の多い器官（肝臓、腎臓、脾臓）の実質（柔組織）を切除する場合の切断面の出血を止めるために使用される。本発明組成物はさらに、外傷性疾患、切開または部分切除を受けた各種組織表面の出血または周囲への滲出を止めるのに使用される。
【００３３】
本発明組成物はさらに、リンパ系(lymphostase) 掻爬の際の気密性（気体および液体を漏らさない性質）、器官または内臓相互の二箇所を抱合して行う吻合、特に器官が生体液を包含している場合（脳の硬膜、目の角膜、消化器、血管）の気密性、組織の気密性を確実にして瘻孔（フィステル）の発生を防ぐために吻合の癒着を最高の状態とするための気密性（内臓、血管、食道吻合）、さらには気体の圧力下にある気密が困難な肺の吻合における気密性を確実にする。
【００３４】
本発明組成物は、例えば上記のＧＲＦ接着剤とは反対に、その内部で毒性成分を含まないコラーゲンマトリックスを生じるもので、細胞や血管が侵入して次第に内生の結合組織によって置き換えられることが可能である。まず始めに、架橋した酸化コラーゲンのゲルがその下にある組織に強固に結合したマトリックスを作り、漏れを完全に防ぐ機械的バリヤとなる。次にその場所と本発明製品の内部に形成された結合組織によって気密性が完全となり、最終的な修復（再生）が行われる。
【００３５】
劣化時間すなわち主接着性および埋め込みにおける機能は反応性酸性溶液中のコラーゲン濃度またはその酸化、特に架橋結合密度の度合いによって調節することができる。反応性酸性溶液はその接着性によって、組織相互または組織とバイオ材料（例えばコラーゲンの圧定布またはパッチ）とを結合する能力を内在的に有しており、従って、埋め込みおよび損傷した組織の癒着に必要なマトリックスを補完することができる。
本発明組成物は、さらに、腫瘍または膿疱を切除した後にその壁面に塗布されるか、腫瘍または膿疱の掻爬または切除手術によってくり抜かれた窪みを埋めるために使用される。
また、本発明組成物は器官または組織の血管の孔を確実に塞いで血管新生（分布）を廃止または制限して、これを後退または消滅させるために使用される。
【００３６】
さらに、本発明組成物は脳の動脈および静脈の奇形による塞栓症または髄膜種あるいは肝臓病型の腫瘍の塞栓症にも適用される。
本発明組成物は、外科的な癒着(adherences chirurgicales)の防止分野で傷ついた組織に正しい癒着面を再形成させ、より注意深い止血を行い、気密性を最良の状態にし、組織面を最大限分離して、その後の外科的な癒着すなわち自然な状態では分離しているはずの２つの組織または２つの器官を接合してしまう乱れた異常組織接合を抑える。
従って、本発明組成物は腱の修復手術または消化器の吻合手術の癒着において自然回復による接合の発生を抑えるために用いられる。
【００３７】
さらに、本発明組成物はその接着性と同時に薬効成分の局所的な放出システムを構成することができる。
実際、本発明組成物は活性成分のリザーバとして使用されるコラーゲンマトリックス成分を形成する。活性成分は２度に渡って放出拡散され、一度目は活性成分のうち接着性ゲル間にある可溶画分が液体の拡散によって放出される。２度目はコラーゲン分子中に埋め込まれた、またはそれに結合している活性成分がマトリックスが次第に漸減する段階でさらに広がる。
【００３８】
結果的に、本発明は消化器外科および外科全般、肝臓−胃および膵臓外科、神経外科、泌尿器科および腎臓科、産科婦人科外科、耳鼻咽喉科外科、頭蓋骨−顔面に関する外科、形成外科および復元外科(reconstructrice) 、心血管外科、肺疾患および胸郭に関する外科、眼科、整形外科、歯科−歯周病学に関する外科等の分野に適用できる。
【００３９】
既に述べたように、本発明組成物の各機能は複数の分野と用途があり、それぞれの外科的用途において複数の機能を使用することができるが、これらの機能をそれが必須であるかまたは補足的なものであるかによって等級化する。第１の機能は組成物固有の特性すなわち接着性、生体適合性、吸収性という性質および無毒性に由来し、求められている機能がいかなるものであっても、本発明組成物の機能において主要なものである。第２の機能はこれら基本特性から生じるものである。
【００４０】
以下の実施例は本発明組成物の製造方法およびその中間生成物の単離方法を具体的に説明するものである。また、実施例では本発明の好ましい接着剤キットの製造方法と、本発明組成物の接着特性とを具体的に説明する。
【００４１】
【実施例】
Ｉ．製造方法
実施例１
過沃素酸を用いた酸化分解で変性された非架橋コラーゲン粉末の調製
20ｇの粉末を製造するために牛ペプシンで処理したコラーゲンＩ（乾燥し灰分を含まないもの(sans cendre))20ｇを、温度４〜８℃で最低８時間、攪拌しながら0.012 Ｎの塩酸20リットルに溶解させて酸性のコラーゲン溶液を調製する。
次いで、この溶液を無菌条件下で濾過し、濾液を滅菌フラスコに回収する。その後、濾液に攪拌しながら4.1 リットルの滅菌済みの塩化ナトリウム溶液(240ｇ／リットル）を添加し、約10分間攪拌を継続する。８時間以上接触させる。
【００４２】
次いで、この懸濁液を無菌条件下に滅菌済みの遠心分離容器に移し、約15℃で15分間、約 8000 r.p.m の遠心分離する。
沈澱物を回収し、過沃素酸を用いて注意深く酸化する。そのためには、沈澱物を滅菌済みの0.012 Ｎ塩酸溶液に再懸濁してコラーゲンの濃度を0.5 ％に調節する。約４℃〜８℃で最低８時間攪拌する。
媒質の温度を再び約20℃にし、攪拌しながら0.4 Ｍの滅菌済みの過沃素酸溶液80mlを添加する（コラーゲン１ｇあたり365mg の過沃素酸）。
遮光しながら約２時間攪拌を続け、その後さらに約５分間攪拌を続けながら滅菌済みの塩化ナトリウム溶液（240 ｇ／リットル）を 0.8リットル添加する。
懸濁液を約30分間静置した後、滅菌済みの遠心分離容器に移し、約20℃で15分間、8500 r.p.m. で遠心分離する。
【００４３】
沈澱物を回収し、4800mlの滅菌済みの塩化ナトリウム（41ｇ／リットル）と塩酸 (0.012 Ｎ) 溶液とに再懸濁する。約１時間攪拌を続けた後、懸濁液を滅菌済みの遠心分離容器へ移し、約20℃で15分間、約 8500r.p.m. で遠心分離する。
沈澱物を回収し、同様の方法で２回目の洗浄を行う。２回目の洗浄で得られる沈澱物を回収し、上記の洗浄と同様にして再度懸濁液を作る。
次いで、この懸濁液を約４〜８℃で８時間攪拌する。その後、懸濁液を遠心分離容器へ移し、温度20℃で15分間、8500 r.p.m. で遠心分離する。
回収された沈澱物を再び90％のアセトン水溶液に懸濁する。約15分間攪拌した後、ナイロン布上で濾過して沈澱物を回収する。得られた沈澱物を80％のアセトンで３回、100 ％のアセトンで３回洗浄する。得られたアセトン性沈澱物を、無菌気流下で、重量一定になるまで脱水する。収率はほぼ100 重量％である。
得られた酸化コラーゲン粉末を保存するために無菌フラスコに入れて−80℃で冷凍する。
【００４４】
実施例２
過沃素酸で酸化分解した変性させた未架橋コラーゲンの反応性酸性溶液の調製
上記で得られた未架橋の酸化コラーゲン粉末の必要量を限外濾過した滅菌水に溶解する。反応性酸性溶液 100ｇ（Ｐs ）を調製するのに必要な粉末量（Ｐp ）は以下の式で算出される：
Ｐp ＝  Ｐs ×ｃ／（100 −ｈ）
(ここで、Ｐs は調製される反応性酸性溶液の量を表し、ｃは反応性酸性溶液中のコラーゲンの最終濃度を表し、ｈは未架橋の酸化コラーゲン粉末中の残留水分を表す)
限外濾過した水の量（Ｐe ）は以下の式で算出される：
Ｐe ＝Ｐs −Ｐp 
【００４５】
従って、14.5％の残留水分を含有する粉末から15％の反応性酸性溶液 100ｇを調製する場合には、Ｐp ＝17.54 ｇ、Ｐe ＝82.46 ｇであり、同じ粉末から20％の反応性酸性溶液 100ｇを調製する場合には、Ｐp ＝23.39 ｇ、Ｐe ＝76.61 ｇになる。
実際には、限外濾過された水の温度を約60℃に調節し、攪拌しながら、実施例１で得られたコラーゲン粉末を１回に３分の１ずつ分割して添加する。添加するたびに流動性の液体が得られるまで攪拌を続ける。
調節しながら加熱を行うことによって、コラーゲンはその螺旋構造を失ってゼラチンに変化する。
酸化コラーゲンの粉末全量を添加した後、わずかに粘性の均質な溶液が得られるまで攪拌を続ける。
得られた反応性酸性溶液を保存するために、滅菌フラスコに入れて−20℃で冷凍する。
【００４６】
実施例３
外科用の接着剤キットの作製
攪拌器を備えた複式注射器の形のキットの場合には、実施例２で調製された未架橋の酸化コラーゲンの反応性酸性溶液を一方の注射器に入れ、別の注射器に緩衝液を入れる。15％の反応性酸性溶液 100ｇ当たり 0.41 Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液 27.5 ｇを使用する。
【００４７】
II. インビトロ反応性試験
下記の生理学的使用条件下で反応性酸性溶液が架橋してゲルとなるのに要する時間を測定した：
1)  15％の反応性酸性溶液１ｇを２〜３分間約42℃に加熱し、
2)  0.41Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液 275マイクロリットルを添加し、
3)  この混合物をヘラを用いて約15秒間攪拌し、
4)  得られた生成物の外観を60秒ごとに観察する。
結果は以下の通り：
第１段階：0.5 分後：粘性流体状態
第２段階：1.5 分後：半ゲル化状態
第３段階：2.5 分後：固体状ゲル化状態
【００４８】
III   接着性試験：体外(EX VIVO) 評価
本発明組成物の接着特性評価を兎の筋肉組織（背肉）を用いて行った。組織を生理食塩水中で最大48時間、４℃に保持する。電動ナイフを用いて兎の組織を腺維の方向に切断し（切断片の厚さ：2.5 ±0.5 mm）、次いで、得られた薄片から25mm×25mm  の正方形を切り出す。
試験は通常の引張装置、例えば 100Ｎの力のセンサーを備えたアダメル−ローマジィ(Adamel Lhomargy) のＤＹ34型の引張り装置で行う。この装置では力−移動距離曲線が得られ、また最大剥離力（Ｆmax ) とヤング(Young) 係数が得られる。使用エネルギーは曲線の下の面積から計算する。
【００４９】
各試験ではシアノアクリル系接着剤（例えば、商品名「ロクタイトスーパーグリュ(Loctite superglue) 」として市販、液体またはゲル）を用いて２つの兎の組織サンプルをそれより寸法の大きな不活性で剛性のあるガラスまたはボール紙の支持体に固定した。測定は１または４Ｎの力を加えててから３分後に行う。
組成物は複式注射器を用いて、実施例３の濃度15％でコラーゲンサンプル当たり 400マイクロリットルの割合で塗布する。
【００５０】
各接着剤を接触させた後３分後の測定値を記録する：
a)  本発明接着性組成物、圧力４Ｎ：
平均最大接着力      2.5 Ｎ（±0.36）；（ｎ＝３）
平均接着エネルギー  10.1mJ（±3.7 ）；（ｎ＝３）
b)  本発明接着剤組成物、圧力１Ｎ：
平均最大接着力      3.2 Ｎ（±1.7 ）；（ｎ＝３）
平均接着エネルギー  5.4mJ （±3.3 ）；（ｎ＝３）
c)  参照 (フィブリン(Fibrine) 接着剤) 、圧力４Ｎ：
平均最大接着力      2.5 Ｎ（±1.6 ）；
平均接着エネルギー  3.8mJ （±2 ）
上記結果から、本発明の接着性組成物が示す生体外（ex vivo)接着力の値は、参照として使用したフィブリン(Fibrine) 接着剤の値と同じかそれ以上であることが分かる。
【００５１】
IV  インビポでの接着性試験
皮膚片の貼合せ用標準モデルによってインビポでの本発明組成物の接着力を測定する。
予め麻酔・剪毛したＯＦＡ型またはスプラーグドウレイ(Sprague Dawley)型のラットで、ラット脊柱の正中線に対して左右の脇腹に２箇所同じ傷口を付ける。この傷口は長さ２〜３センチメートルの傷口３つで構成されている。また、切り口を脇腹の頭部側、背中および後部に付ける。頭部の切り口はラットの鼻先から約13センチメートルの所に付ける。
【００５２】
傷口形成後、傷口に複式注射器を用いて本発明組成物を0.2 〜0.4 ml塗布した後、皮膚片を位置決めし、その位置を１〜２分間固定したままに維持する。
傷の縁部は本発明組成物によって正しく維持され、剥がれることはなく、強固に固定され状態を維持する。本発明組成物を用いない場合または別の種類のコラーゲン（例えば加熱された非酸化コラーゲン）を用いた場合には、傷口の縁部は正しく維持されず、再度開いてしまう。反対側の傷口は同様にして参照として使用したフィブリンの接着剤（TISSUCOLまたはBIOCOL) 用いて接合した。
【００５３】
試験では、下記によって本発明組成物の一次接着特性 (すなわち縁部を正しい位置に維持するために、塗布した瞬間の接着効果) を評価する：
1)  手術中では、１〜２分間傷口を保持した後に観察する。
2)  手術後では、動物が麻酔下にある最初の２時間と動物が覚醒して活動している最初の２日に観察する。
【００５４】
さらに、この初期保持作用は組織の通常の癒着プロセスに引き継がれ、それによって傷口縁部は確実に結合される。この作用は二次接着とよばれる。
試験では、下記規準で、動物が目覚めた後、24、48および72時間後に接合縁部を観察して、良好な保持が成されているか否かを評価した：
1)  接着剤が生理学的に正しい接着をし得ない場合には、皮膚片は剥がれて傷口が開く。
2)  接着剤が一次接着および二次接着特性を正しく発揮すれば、皮膚片は正しい接合状態を維持し、確実に癒着する。
図１は本発明組成物を塗布した後の状態の変化を示すものである。参照としてフィブリン接着剤を用いて比較試験も行った。
【００５５】
試験では、正しく接合した状態を維持している傷口の縁部の数を３日間、毎日数えた。結果は傷口の合計数に対する正しく接合している傷口の数で表した。
下記の〔表１〕〔表２〕は別々に行った２回の試験結果を示し、参照としてそれぞれTISSUCOLおよびBICOL （フィブリン接着剤）を用いたものである。
この結果から、本発明接着性組成物で３日間で観察される接着力は参照として用いた接着剤BIOCOLおよびTISSUCOLと同じかそれ以上であることが分かる。
接着性を用いない場合の正しく接合される傷口はゼロである。
【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
（＊：１匹が３日目に死亡したため、観察対象の傷の数が３個減っている。ただしこれは本発明組成物とは無関係の原因である）
この試験結果は、本発明組成物はフィブリン接着剤と同等な接着性が得られることを証明している。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明組成物を塗布した後の状態の変化を示すグラフである。
【図１】
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