(57)【要約】水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の表面糖蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ蛋白質でシュードタイプ化したサル免疫不全ウイルスベクター（ＳＩＶ）を用いて、霊長類由来胚性幹細胞に高い効率で遺伝子を導入することに成功した。本発明は、霊長類胚性幹細胞への遺伝子導入のためのサル免疫不全ウイルスベクターを提供する。本発明のベクターを用いた霊長類由来胚性幹細胞への遺伝子導入は、霊長類における発生学的研究、疾患研究、臨床応用、実験モデルなどに有用である。また、胚性幹細胞から所望の分化細胞または分化組織を得るのに有用な、組織または細胞の特異的分化を行なうための遺伝子や試薬のアッセイやスクリーニングに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化されている、霊長類胚性幹細胞へ遺伝子を導入するための組み換えサル免疫不全ウイルスベクター。
【請求項２】
組み換えサル免疫不全ウイルスベクターがａｇｍ株由来である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
組み換えサル免疫不全ウイルスベクターが自己不活性化型である、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
霊長類が旧世界霊長類オナガザル科マカカ属である、請求項１から３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
外来遺伝子を発現可能に保持する、請求項１から４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
外来遺伝子が、グリーン蛍光蛋白質、β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼから選ばれる蛋白質をコードする遺伝子である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の組み換えサル免疫不全ウイルスベクターを霊長類胚性幹細胞に接触させる工程を含む、該細胞に遺伝子を導入する方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の組み換えサル免疫不全ウイルスベクターが導入された霊長類胚性幹細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の霊長類胚性幹細胞の増殖および／または分化により生成した細胞。
【請求項１０】
ＥＳ細胞の増殖または分化に対する遺伝子導入の効果を検出する方法であって、
（ａ）請求項１から６のいずれかに記載のベクターを霊長類胚性幹細胞に導入する工程、
（ｂ）該胚性幹細胞の増殖または分化を検出する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、霊長類胚性幹細胞への遺伝子導入のためのサル免疫不全ウイルスベクターに関する。
背景技術
胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞ともいう）とは、多分化能と自己複製能を有する未分化細胞である。また、ＥＳ細胞は損傷後の組織修復力を有することが示唆されている。このため、ＥＳ細胞は、各種疾患の治療用物質のスクリーニング、再生医療分野において有用であるとして、さかんに研究されている。特にサル由来のＥＳ細胞は、マウスのＥＳ細胞に比べてよりヒトに近縁であるため、ヒトの疾患のモデルに利用するにあたって好適であり、期待されている。
将来、ＥＳ細胞をさまざまな疾患治療や損傷治療に応用していくには、ＥＳ細胞の遺伝子操作がきわめて重要になる。ＥＳ細胞の増殖能や分化能などの細胞特性や薬剤感受性などを変更するためには、ＥＳ細胞のゲノムに安定した遺伝子導入が必要になることが多い。安定した遺伝子導入のためには、宿主ゲノムに組み込まれるレトロウイルスベクターが一般的に用いられる。ＥＳ細胞のように増殖・分化を繰り返す細胞を標的にする場合、導入遺伝子がゲノムに組み込まれなければ、細胞が分裂する度にベクターが希釈されてしまうからである。しかし、遺伝子導入に従来広く用いられているモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するレトロウイルスベクターでは、マウスＥＳ細胞への遺伝子導入効率は低い上（数％程度）、その遺伝子発現は時間経過とともに減弱する。最近、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来のレトロウイルスベクターを用いてマウスＥＳ細胞への遺伝子導入効率の改善が図られたが（５０％以上）、遺伝子発現が時間経過とともに減弱する問題は解決されていない（Ｃｈｅｒｒｙ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：７４１９，２０００）。最近、ゲノムに組み込まれるもう一つのベクターであるレンチウイルスベクターを用いると、マウスＥＳ細胞にさらに効率よく（８０％以上）遺伝子導入できることが示された（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０７７８，２０００）。しかし、この報告では導入遺伝子発現の観察期間は数日から２週間程度と短く、導入遺伝子の長期発現についての記載はない。
以上のＥＳ細胞への遺伝子導入の報告は、すべてマウスＥＳ細胞を用いたものである。霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入に関しての報告文献は今のところ皆無である。ただし、学会での発表から、霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入はマウスＥＳ細胞への遺伝子導入に比べてさらに困難であると指摘されている。霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入効率は、たとえばＭｏＭＬＶベクターでは１％前後、ＭＳＣＶベクターでは、５〜１０％前後と言われている（ＩＭＳＵＴ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ  ２０００；Ｋｅｙ  Ｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｉａ，Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｕｒａｎｇｏ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ，２００１）。
発明の開示
本発明は、霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入のためのサル免疫不全ウイルスベクターを提供することを課題とする。本発明のベクターを用いた霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入は、ヒトを含む霊長類における発生学的研究、疾患研究、臨床応用、実験モデルなどに有用である。また、ＥＳ細胞から所望の分化細胞または分化組織を得るのに有用な、組織または細胞の特異的分化を行なうための遺伝子や試薬のアッセイやスクリーニングに有用である。
本発明者らは、霊長類ＥＳ細胞に遺伝子を導入できるベクターを開発し、これを用いて効率的に外来遺伝子を霊長類ＥＳ細胞に導入する方法を確立するために、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＳＩＶ）ベクターを用いて鋭意研究を行った。その結果、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ）の表面糖蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ蛋白質によりシュードタイプ化したＳＩＶベクターが、霊長類ＥＳ細胞に有意に高い効率で遺伝子を導入する能力を有することを見出した。サルＥＳ細胞に対するＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ＳＩＶベクターの遺伝子導入効率は、マウスＥＳ細胞と比較して数倍〜１０倍以上高かった（図８）。ＳＩＶベクターのＥＳ細胞へのトランスダクション効率は、多重感染度（ＭＯＩ）に依存して増加し、高ＭＯＩではほとんどすべてのＥＳ細胞に遺伝子が導入された（図５）。ＣＭＶプロモーターの下流に連結したレポーター遺伝子を含むＳＩＶベクターを導入されたカニクイザルＥＳ細胞において導入遺伝子は長期間安定に発現し、２ヶ月後も発現レベルの低下はほとんど見られなかった（図６）。
このように、本発明者らは霊長類ＥＳ細胞に遺伝子を導入できるシュードタイプ化ＳＩＶベクターを開発し、これを用いて霊長類ＥＳ細胞に遺伝子を導入する方法を確立することに成功した。本発明は、霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入のためのサル免疫不全ウイルスベクターに関し、より具体的には
（１）ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化されている、霊長類胚性幹細胞へ遺伝子を導入するための組み換えサル免疫不全ウイルスベクター、
（２）組み換えサル免疫不全ウイルスベクターがａｇｍ株由来である、（１）に記載のベクター、
（３）組み換えサル免疫不全ウイルスベクターが自己不活性化型である、（１）または（２）に記載のベクター、
（４）霊長類が旧世界霊長類オナガザル科マカカ属である、（１）から（３）のいずれかに記載のベクター、
（５）外来遺伝子を発現可能に保持する、（１）から（４）のいずれかに記載のベクター、
（６）外来遺伝子が、グリーン蛍光蛋白質、β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼから選ばれる蛋白質をコードする遺伝子である、（５）に記載のベクター、
（７）（１）から（６）のいずれかに記載の組み換えサル免疫不全ウイルスベクターを霊長類胚性幹細胞に接触させる工程を含む、該細胞に遺伝子を導入する方法、
（８）（１）から（６）のいずれかに記載の組み換えサル免疫不全ウイルスベクターが導入された霊長類胚性幹細胞、
（９）（８）に記載の霊長類胚性幹細胞の増殖および／または分化により生成した細胞、
（１０）ＥＳ細胞の増殖または分化に対する遺伝子導入の効果を検出する方法であって、
（ａ）（１）から（６）のいずれかに記載のベクターを霊長類胚性幹細胞に導入する工程、
（ｂ）該胚性幹細胞の増殖または分化を検出する工程、を含む方法、に関する。
本発明において「ウイルスベクター」とは、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子を指す。「サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ベクター」とは、ベクターがＳＩＶのバックボーンを有することを指す。「ＳＩＶのバックボーンを有する」とは、該ベクターを構成するウイルス粒子に含まれる核酸分子がＳＩＶゲノムに基づくことを言う。例えば、ウイルス粒子に含まれる核酸分子がＳＩＶゲノム由来のパッケージングシグナル配列を有するベクターは、本発明においてＳＩＶウイルスベクターに含まれる。本発明においてサル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＳＩＶ）には、ＳＩＶの全ての株およびサブタイプが含まれる。ＳＩＶ単離株としては、ＳＩＶａｇｍ、ＳＩＶｃｐｚ、ＳＩＶｍａｃ、ＳＩＶｍｎｄ、ＳＩＶｓｍ、ＳＩＶｓｎｍ、ＳＩＶｓｙｋ等が例示できるがこれらに制限されない。「組み換え」ウイルスベクターとは、遺伝子組み換え技術により構築されたウイルスベクターを言う。ウイルスゲノムをコードするＤＮＡとパッケージング細胞を用いて構築したウイルスベクターは、組み換えウイルスベクターに含まれる。
ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ベクターとは、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ）の表面糖蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ蛋白質を有するベクターを言う。ＶＳＶ−Ｇ蛋白質は、任意のＶＳＶ株に由来するものであってよい。例えばＩｎｄｉａｎａ血清型株（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：５１９−５２８（１９８１））由来のＶＳＶ−Ｇ蛋白を用いることができるが、これに限定されない。また、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質は、天然由来の蛋白質から１または複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加などにより改変されていてもよい。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ベクターは、ウイルスの産生時にＶＳＶ−Ｇ蛋白質を共存させることにより製造することができる。例えば、ＶＳＶ−Ｇ発現ベクターのトランスフェクションや、宿主染色体ＤＮＡに組み込んだＶＳＶ−Ｇ遺伝子からの発現誘導により、パッケージング細胞内でＶＳＶ−Ｇを発現させることにより、この細胞から産生されるウイルス粒子がＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化される。ＶＳＶ−Ｇ蛋白質は１種類の糖蛋白が安定な３量体を形成して膜上に存在するため、精製過程でのベクター粒子の破壊が起こりにくく、遠心による高濃度の濃縮が可能となる（Ｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ：Ｓｅｐ，６（９），１２０３−１３．１９９５）。
本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質をさらに含むことができる。例えば、このような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質などが挙げられる。レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）４０７０Ａ株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、ＭｕＭＬＶ  １０Ａ１由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばｐＣＬ−１０Ａ１（Ｉｍｇｅｎｅｘ）（Ｎａｖｉａｕｘ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１−５７０５（１９９６））。また、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇｐ８５蛋白質、ＥＢウイルスのｇｐ３５０、ｇｐ２２０蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ蛋白質などが挙げられる。
サル免疫不全ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ，ＳＩＶ）はサルにおけるＨＩＶ類似ウイルスとして発見され、ＨＩＶとともにＰｒｉｍａｔｅｓ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓグループを形成している（井戸栄治，速水正憲，サル免疫不全ウイルスの遺伝子と感染・病原性．蛋白質  核酸  酵素：Ｖｏｌ．．３９，Ｎｏ．８．１９９４）。このグループはさらに大きく４つのグループに分類され、１）ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）の原因となるＨＩＶ−１とチンパンジーより分離されたＳＩＶｃｐｚを含むＨＩＶ−１グループ、２）スーティーマンガベイＣｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｔｙｓより分離されたＳＩＶｓｍｍとアカゲザルＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａより分離されたＳＩＶｍａｃ、およびヒトに対し低頻度ではあるが病原性を示すＨＩＶ−２（Ｊａｆｆａｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．，１６（５），３２７−３２，１９９７）よりなるＨＩＶ−２グループ、３）アフリカミドリザルＣｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓから分離されたＳＴＶａｇｍに代表されるＳＩＶａｇｍグループ、４）マンドリルＰａｐｉｏ  ｓｐｈｉｎｘから分離されたＳＩＶｍｎｄに代表されるＳＩＶｍｎｄグループからなっている。
このうち、ＳＩＶａｇｍおよびＳＩＶｍｎｄでは自然宿主における病原性の報告はなく（Ｏｈｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１５，４１（１），１１５−２２，１９８８；Ｍｉｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．，１８（３−４），２５５−９，１９８９；速水正憲，日本臨床，４７，１，１９８９）、特に本実施例で用いたＳＩＶａｇｍの一種であるＴＹＯ−１株は自然宿主でも、カニクイザルＭａｃａｃａ  ｆａｃｉｃｕｌａｒｉｓ、アカゲザルＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａに対する実験感染でも病原性を示さないことが報告されている（Ａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１（６），：３６７−８４，１９９４；Ｈｏｎｊｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．，１９（１），９−２０，１９９０）。ＳＩＶａｇｍのヒトに対する感染、発症については報告がなく、ヒトに対する病原性は知られていないが、一般に霊長類におけるレンチウイルスは種特異性が高く、自然宿主から他種に感染、発症した例は少なく、その発症も低頻度あるいは進行が遅いという傾向がある（Ｎｏｖｅｍｂｒｅ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１（５），４０８６−９１，１９９７）。従って、ＳＩＶａｇｍ、特にＳＩＶａｇｍ  ＴＹＯ−１株をベースとして作製したウイルスベクターは、ＨＩＶ−１や他のレンチウイルスをベースとしたベクターと比べて安全性が高いと考えられ、本発明において好適に用いられ得る。
本発明のサル免疫不全ウイルスベクターは、他のレトロウイルスのゲノムＲＮＡ配列の一部を有していてもよい。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルスＦｅｌｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ（ＦＩＶ）（Ｐｏｅｓｃｈｌａ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（３），３５４−７，１９９８）、ヤギ関節炎脳炎ウイルスＣａｐｒｉｎｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ（ＣＡＥＶ）（Ｍｓｅｌｌｉ−Ｌａｋｈａｌ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４３（４），６８１−９５，１９９８）などの他のレンチウイルスのゲノム配列の一部をサル免疫不全ウイルスのゲノムの一部と置換したキメラ配列を有するベクターも、本発明のサル免疫不全ウイルスベクターに含まれる。
本発明のレトロウイルスベクターとしては、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）に改変を加えることもできる。ＬＴＲはレトロウイルスに特徴的な配列であり、ウイルスゲノムの両端に存在している。５’ＬＴＲはプロモーターとして働き、プロウイルスからのｍＲＮＡの転写を促す。したがって、ウイルス粒子内にパッケージングされるウイルスＲＮＡゲノムをコードするジーントランスファーベクターの５’ＬＴＲのプロモーター活性をもつ部分を別の強力なプロモーターと置換すれば、ジーントランスファーベクターのｍＲＮＡ転写量が増大し、パッケージング効率が上昇、ベクター力価を上昇させる可能性がある。さらに、例えばレンチウイルスの場合、５’ＬＴＲはウイルス蛋白質ｔａｔによる転写活性の増強を受けることが知られており、５’ＬＴＲをｔａｔ蛋白質に依存しないプロモーターに置換することで、パッケージングベクターからｔａｔを削除することが可能となる。また、細胞に感染し細胞内に侵入したウイルスＲＮＡは逆転写された後、両端のＬＴＲを結合させた環状構造となり、結合部位とウイルスのインテグラーゼが共役して細胞の染色体内にインテグレートされる。プロウイルスから転写されるｍＲＮＡは５’ＬＴＲ内の転写開始点より下流、３’ＬＴＲのｐｏｌｙＡ配列までであり、５’ＬＴＲのプロモーター部分はウイルス内にパッケージングされない。したがって、プロモーターを置換したとしても標的細胞の染色体に挿入される部分には変化が無い。以上のことから、５’ＬＴＲのプロモーターの置換は、より高力価で安全性の高いベクターを作製することにつながると考えられる。従って、ジーントランスファーベクターの５’側プロモーターの置換を行い、パッケージングされるベクターの力価を上昇させることができる。
また、３’ＬＴＲの配列を部分的に削除し、標的細胞から全長のベクターｍＲＮＡが転写されることを防止する自己不活性化型ベクター（Ｓｅｌｆ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ：ＳＩＮベクター）の作製により、安全性を上昇させることも可能である。標的細胞の染色体に侵入したレンチウイルスのプロウイルスは、３’ＬＴＲのＵ３部分を５’端に結合した形となる。したがってジーントランスファーベクターの転写産物は、逆転写後、標的細胞の染色体に組み込まれた状態では５’端にＵ３が配置され、そこからジーントランスファーベクターからの転写産物と同様の構造を持つＲＮＡが転写されることになる。仮に、標的細胞内にレンチウイルスあるいはその類似の蛋白質が存在した場合、転写されたＲＮＡが再びパッケージングされ、他の細胞に再感染する可能性がある。また３’ＬＴＲのプロモーターにより、ウイルスゲノムの３’側に位置する宿主由来の遺伝子が発現されてしまう可能性がある（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，Ｐ．，Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｌｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，４７５−５８５，１９９７）。この現象はレトロウイルスベクターにおいてすでに問題とされ、回避の方法としてＳＩＮベクターが開発された（Ｙｕ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３（１０），３１９４−８，１９８６）。ジーントランスファーベクター上の３’ＬＴＲのＵ３部分を欠失させることにより、標的細胞内では５’ＬＴＲや３’ＬＴＲのプロモーターが無くなるため、全長のＲＮＡや宿主遺伝子の転写が起こらない。そして、内部プロモーターからの目的遺伝子の転写のみが行われることになり、安全性が高く、高発現のベクターとなることが期待される。このようなベクターは、本発明において好適である。ＳＩＮベクターの構築は、公知の方法または実施例１〜４に記載の方法などに従えばよい。
レトロウイルスベクターなどそのゲノムにＬＴＲ配列を含むウイルスベクターを用いた遺伝子治療の問題点の一つに導入遺伝子の発現が次第に低下することがある。これらのベクターは宿主ゲノムに組み込まれると、宿主側の機序によりそのＬＴＲがメチル化され、導入遺伝子の発現が抑制されてしまうことが原因の一つと考えられている（Ｃｈａｌｌｉｔａ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ  Ｋｏｈｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２５６７，１９９４）。自己不活性化（ＳＩＮ）型ベクターでは、宿主ゲノムに組み込まれるとＬＴＲ配列の大部分を失うため、ＬＴＲのメチル化による遺伝子発現の減弱を受けにくい利点がある。実施例に示すように、ジーントランスファーベクターの３’ＬＴＲのＵ３領域を他のプロモーター配列に置換して製造した自己不活性化型ベクターは、霊長類ＥＳ細胞に導入後、２ヵ月以上にわたって安定した発現を維持することが判明した。このように、ＬＴＲ  Ｕ３領域の改変により自己不活性化するように設計されたＳＩＮベクターは、本発明において特に好適である。具体的には、３’ＬＴＲのＵ３領域の１または複数の塩基が置換、欠失、および／または付加により改変されたベクターは、本発明に含まれる。このＵ３領域は、単に欠失させてもよいし、あるいはこの領域に他のプロモーターを挿入してもよい。このようなプロモーターとしては、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、またはＣＡＧプロモーターなどを挙げることができる。
また、本発明のベクターにコードされる外来遺伝子は、ＬＴＲ以外のプロモーターにより転写されるように設計することが好ましい。例えば、上記のようにＬＴＲ  Ｕ３領域を非ＬＴＲプロモーターと置換した場合には、この改変ＬＴＲにより外来遺伝子の発現を駆動することが好ましい。あるいは、実施例において示されるように、ＬＴＲ領域とは別の位置に非ＬＴＲプロモーターを配置し、その下流に外来遺伝子を連結することにより、ＬＴＲに依存せずに外来遺伝子の発現を誘導することができる。本発明において、外来遺伝子の発現を非ＬＴＲプロモーターにより駆動するように構築されたＳＩＶベクターは、ＥＳ細胞においてこの外来遺伝子を長期間安定に発現することが示された。従って、外来遺伝子に上流に非ＬＴＲプロモーターが連結されており、このプロモーターから該外来遺伝子が転写されるようなベクターは本発明において特に適している。非ＬＴＲプロモーターとしては、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、またはＣＡＧプロモーターが挙げられ、特にＣＭＶプロモーターが好適である。このようなベクターは、特に上記の自己不活性化（ＳＩＮ）型ベクターにおいて構築することで高い効果を発揮する。
ＨＩＶベクターをはじめとするレンチウイルスベクターは、宿主ゲノムがＨＩＶプロウイルスをすでに保持している場合、外来ベクターと内因性プロウイルスの間で組み換えが生じ、複製可能ウイルスが発生しないかという危惧が指摘されている。これは、将来実際にＨＩＶ感染患者にＨＩＶベクターを用いる時には確かに大きな問題になろう。今回使用したＳＩＶベクターは、ＨＩＶとの相同配列はほとんどない上、ウイルス由来の配列を８０．６％取り除いた複製不能ウイルスであり、この危険性は極めて小さく、他のレンチウイルスベクターに比べて安全性が高い。本発明のＳＩＶベクターは、好ましくは、このベクターが由来するＳＩＶのゲノム配列の４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上が取り除かれた複製不能ウイルスである。
レトロウイルスの産生には、宿主細胞でパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターＤＮＡを転写させ、ｇａｇ，ｐｏｌ蛋白質およびエンベロープ蛋白質の存在下でウイルス粒子を形成させる。ジーントランスファーベクターＤＮＡにコードされるパッケージングシグナル配列は、この配列により形成される構造を保持できるように可能な限り長く組み込むことが好ましい一方で、該ベクターＤＮＡ上のパッケージングシグナルと、ｇａｇ，ｐｏｌ蛋白質を供給するパッケージングベクターとの間で起こる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度を抑制するためにはこれらベクター間の配列の重複を最小限にする必要がある。従って、ジーントランスファーベクターＤＮＡの構築においては、パッケージング効率および安全性の両者を満足させるために、パッケージングに必要な配列を含むできる限り短い配列を用いることが好ましい。
例えば、実施例で用いたＳＩＶａｇｍ由来のパッケージングベクターの場合は、ＨＩＶベクターはパッケージングされないため、用いられるシグナルの由来としてはＳＩＶのみに制限されると考えられる。但し、ＨＩＶ由来のパッケージングベクターを用いた場合、ＳＩＶ由来のジーントランスファーベクターもパッケージングされるので、組換えウイルスの出現頻度を低下させるために、異なるレンチウイルス由来のジーントランスファーベクターとパッケージングベクターとを組み合わせてベクター粒子を形成させることが可能であると考えられる。このようにして製造されたＳＩＶベクターも、本発明のベクターに含まれる。この場合、霊長類のレンチウイルスの間の組み合わせ（例えば、ＨＩＶとＳＩＶ）であることが好ましい。
ジーントランスファーベクターＤＮＡでは、ｇａｇ蛋白質が発現しないように改変されていることが好ましい。ウイルスｇａｇ蛋白質は、生体にとって異物として認識され、抗原性が現れる可能性がある。また、細胞の機能に影響を及ぼす可能性もある。ｇａｇ蛋白質を発現しないようにするためには、ｇａｇの開始コドンの下流に塩基の付加や欠失等によりフレームシフトするように改変することができる。また、ｇａｇ蛋白質のコード領域の一部を欠失させることが好ましい。一般にウイルスのパッケージングには、ｇａｇ蛋白質のコード領域の５’側が必要であるとされている。従って、ジーントランスファーベクターにおいては、ｇａｇ蛋白質のＣ末側のコード領域を欠失していることが好ましい。パッケージング効率に大きな影響を与えない範囲でできるだけ広いｇａｇコード領域を欠失させることが好ましい。また、ｇａｇ蛋白質の開始コドン（ＡＴＧ）をＡＴＧ以外のコドンに置換することも好ましい。置換するコドンは、パッケージング効率に対する影響が少ないものを適宜選択する。これにより構築されたパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターＤＮＡを、適当なパッケージング細胞に導入することにより、ウイルスベクターを生産させることができる。生産させたウイルスベクターは、例えばパッケージング細胞の培養上清から回収することができる。
パッケージング細胞に使われる細胞としては、一般的にウイルスの産生に使用される細胞株であれば制限はない。ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると、細胞の由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられる。パッケージング細胞として使用されうるヒト細胞株としては、例えば２９３細胞、２９３Ｔ細胞、２９３ＥＢＮＡ細胞、ＳＷ４８０細胞、ｕ８７ＭＧ細胞、ＨＯＳ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＴ−４細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＴＥ６７１細胞などが挙げられる。サル由来細胞株としては、例えば、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＭＴ１０細胞などが挙げられる。
ベクターが保持する外来遺伝子としては特に制限はなく、蛋白質をコードする核酸であってもよく、また、例えば、アンチセンスまたはリボザイムなどの蛋白質をコードしない核酸であってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、他の蛋白質との融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および可溶型細胞表面分子などであってよい。また、外来遺伝子としては、遺伝子の導入効率や発現安定性等を評価するためのマーカー遺伝子であってもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、グリーン蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰともいう）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどをコードする遺伝子が挙げられる。とりわけ、ＧＦＰをコードする遺伝子が好ましい。
本発明のシュードタイプウイルスベクターは、実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルター濾過、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法により行うことができる。例えば、ベクター溶液を０．４５μｍのフィルターにて濾過後、４２５００×ｇ、９０分、４℃で遠心を行うことで、ベクターを沈殿・濃縮することができる。
本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターは、必要に応じて薬学的に許容される所望の担体または媒体と適宜組み合わせて組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。具体的には、例えば滅菌水、生理食塩水、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などと適宜組み合わせることが考えられる。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターを含む組成物は試薬または医薬として有用である。例えば、ＥＳ細胞に対する遺伝子導入試薬として、または遺伝子治療のための医薬として、本発明の組成物を用いることができる。
本発明のベクターを、ヒトを含む霊長類のＥＳ細胞に接触させることにより、該ベクターが含む核酸を該ＥＳ細胞に導入することができる。本発明は、本発明のベクターを霊長類ＥＳ細胞に接触させる工程を含む、該細胞に遺伝子を導入する方法に関する。また本発明は、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化されている組み換えサル免疫不全ウイルスベクターの霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入のための使用に関する。導入の対象となる霊長類ＥＳ細胞に特に制限はなく、例えば所望のサルＥＳ細胞を用いることができる。世界中でおよそ２００種類のサルが知られている。高等霊長類は、以下の２グループに大別される：
（１）新世界霊長類（Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ）
マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）が広く知られ、実験用霊長類の一つとして用いられている。新世界霊長類の発生は、胚や胎盤の構造が旧世界霊長類のものと異なる面もあるが、基本的には類似する。
（２）旧世界霊長頼（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ）
旧世界霊長類はヒトに極めて近縁な霊長類である。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）やカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）が知られている。ニホンザル（Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ）はカニクイザルと同じ属（マカカ属）である。旧世界霊長類の発生は、ヒトの発生に酷似する。
本発明に用いられる「サル」とは、霊長類、具体的には、新世界霊長類及び旧世界霊長類をいう。本発明のベクターによる遺伝子導入の対象となるサル由来のＥＳ細胞としては特に制限はないが、例えばマーモセットＥＳ細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５，２５４−２５９，（１９９６））、アカゲザルＥＳ細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，７８４４−７８４８，（１９９５））、カニクイザルＥＳ細胞（実施例参照）などが挙げられる。旧世界霊長類は、ヒトに極めて近縁な霊長類であり、かつヒトの発生に類似しているので、ヒトに近い疾患モデルや種々の疾患治療剤のスクリーニング系として利用されることが期待される。したがって、本発明のベクターの導入対象としては、旧世界霊長類が望ましく、特にニホンザル、アカゲザル、カニクイザルなどのマカカ属のサル由来のＥＳ細胞が好ましい。
霊長類からのＥＳ細胞の調製は、公知の方法または実施例に記載の方法に従ってまたは準じて行うことができる。例えば、胚盤胞期胚を発生させ、ここからＥＳ細胞を得ることができる〔例えば、国際公開第９６／２２３６２号パンフレット等参照〕。具体的には、例えば胚盤胞期胚より得られる内部細胞塊をフィーダー細胞上または白血球増殖抑制因子［ＬＩＦ、分化阻害因子（ＤＩＦ）とも表記される］中で培養することによりＥＳ細胞を樹立することができる。
フィーダー細胞としては、妊娠１２日〜１６日目のマウス胎児の線維芽細胞の初代培養細胞、マウスの胎児線維芽細胞株であるＳＴＯ細胞などをマイトマイシンＣやＸ線処理して得られた細胞などが挙げられる。このようなマウス由来のフィーダー細胞は、大量に調製できる点で実験などに有利である。フィーダー細胞の作製は、例えば、後述の実施例に記載の方法などにより行なうことができる。フィーダー細胞は、例えばＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）を用いて、ゼラチンコートした培養容器に播種する。フィーダー細胞は、培養容器を隙間無く覆う程度まで播種すればよい。内部細胞塊は、フィーダー細胞が播種された培養容器中のＭＥＭ培地をＥＳ細胞培養用の培地（実施例６表３参照）に交換したフィーダー細胞上に播種する。
本発明のベクターを用いた霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入においては、その操作は該ベクターを霊長類ＥＳ細胞に接触させる工程を含む方法により行われる。すなわち、例えば遺伝子導入したいＥＳ細胞をフィーダー細胞で被われた培養皿に播種し、そこにＳＩＶベクターを添加する。この際、例えば８μｇ／ｍｌ程度のポリブレンを併せて添加することにより、導入効率を向上させることができる。導入時のＭＯＩ（多重感染度）（細胞あたりの感染ウイルス粒子数）は、例えば０．１〜１０００、より好ましくは１〜１００、さらに好ましくは２〜５０（例えば５〜１０）で行うことができる。通常、ベクター添加を複数回行わなくても、１回のベクター添加によって、ほとんどのＥＳ細胞へ遺伝子を導入することができる。本発明のベクターにおいては、レトロネクチンを用いなくてもきわめて高い遺伝子導入効率が得られるという利点を有する。
また本発明は、本発明のＶＳＶ−Ｇシュードタイプウイルスベクターが導入された霊長類ＥＳ細胞、および該細胞の増殖および／または分化により生成した細胞に関する。ＥＳ細胞の分化の誘導は、例えばサイトカインなどの公知の分化・増殖因子や細胞外マトリクスなどの基質の添加、他の細胞との共培養、個体への移入などにより行うことができる（丹羽仁史「ＥＳ細胞の分化運命決定機構」蛋白質核酸酵素４５：２０４７−２０５５，２０００；Ｒａｔｈｊｅｎ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ，１０：３１−４７，１９９８）。
例えば、胚体外組織起源の細胞種の分化誘導は以下のような方法で行うことができる：
胚体外内胚葉        胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）形成
栄養外胚葉          Ｏｃｔ−３／４発現抑制
また、未分化細胞起源の細胞種の分化誘導法としては以下のような方法が挙げられる：
2002101057.tif 000002
外胚葉起源の細胞種の分化誘導法としては以下のような方法が挙げられる：
2002101057.tif 000003
神経堤細胞などに起源を有する細胞種の分化誘導法としては以下のような方法が挙げられる：
2002101057.tif 000004
中胚葉起源の細胞種の分化誘導法としては以下のような方法が挙げられる：
2002101057.tif 000005
内胚葉起源の細胞種の分化誘導法としては以下のような方法が挙げられる：
インスリン産生細胞  胚様体形成
本発明のシュードタイプウイルスベクターにより遺伝子導入したＥＳ細胞、および該ＥＳ細胞から分化させた細胞、組織、臓器等は、各種薬剤のアッセイやスクリーニングに有用である。例えば霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入を通して、組織または細胞、特に好ましくは霊長類由来の組織または細胞の特異的分化を行なうための遺伝子や薬剤等の効果を評価したり、スクリーニングすることができる。本発明には、組織または細胞の特異的分化を行なうための遺伝子または薬剤のスクリーニング方法を提供する。本発明は、ＥＳ細胞の増殖または分化に対する遺伝子導入の効果を検出する方法であって、（ａ）本発明のベクターを霊長類ＥＳ細胞に導入する工程、（ｂ）該ＥＳ細胞の増殖または分化を検出する工程、を含む方法を提供する。ベクターのＥＳ細胞への導入は、本発明の組み換えサル免疫不全ウイルスベクターを目的の霊長類ＥＳ細胞に接触させる工程により実施することができる。ＥＳ細胞の増殖は、細胞数の計数やＭＴＴアッセイなどのミトコンドリア活性の測定などの公知の方法により検出することができる。またＥＳ細胞の分化は、公知の分化マーカー遺伝子の発現の検出、あるいは細胞や組織等の形態学的または生化学的測定などにより検出することができる（丹羽仁史「ＥＳ細胞の分化運命決定機構」蛋白質核酸酵素  ４５：２０４７−２０５５，２０００；Ｒａｔｈｊｅｎ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．１０：３１−４７，１９９８）。導入ベクターには、効果を検出したい所望の外来遺伝子保持させることができる。また、例えば陰性対照などとして、ＥＳ細胞へのベクター自身の導入による効果を検出する場合においては、外来遺伝子を含まないベクターを用いることができる。上記の検出方法を用いて、霊長類ＥＳ細胞の増殖または分化に影響を与え得る遺伝子を評価したりスクリーニングすることが可能である。スクリーニングは、上記の検出方法の工程（ａ）および（ｂ）に続いて、（ｃ）該ＥＳ細胞の増殖または分化を調節する活性を有する導入遺伝子を選択する工程、を含む方法により実施することができる。このようなスクリーニング方法も、上記本発明の遺伝子導入の効果を検出する方法に含まれる。
このような方法を用いたスクリーニングの一例として、霊長類ＥＳ細胞から機能細胞を分化させる遺伝子のスクリーニングを挙げることができる。
例えば霊長類ＥＳ細胞から膵臓β細胞を分化させる際において、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのうちどれが必要か、どの組み合わせがもっともふさわしいか、また、どの順番で遺伝子導入するのがもっとも適切かを調べる際には、これらの遺伝子を霊長類ＥＳ細胞に効率良くしかも簡単に導入する技術が有用である。本ベクターはその要求を満たす。例えば、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを発現する本発明のベクターを構築し、これを種々の組み合わせや順序で霊長類ＥＳ細胞またはその分化細胞に導入する。遺伝子が導入された細胞の分化を検出することにより、遺伝子導入の効果を知ることができる。
また、例えばある遺伝子を体内に投与する遺伝子治療における副作用の予見に本発明のベクターを利用することも有用である。
遺伝子Ｘの各臓器や組織への毒性や副作用は、マウスやサル個体への投与実験である程度は把握できる。しかし遺伝子Ｘが各組織幹細胞へいかなる影響を及ぼしうるかは今までの方法では検出できない。この遺伝子Ｘはある特定の組織幹細胞から機能細胞への分化を障害する可能性がある。例えば、肝臓幹細胞の分化を障害する場合は、肝炎に罹患した時や肝臓切除術を施行された時に、初めてその障害が明らかになる。すなわち遺伝子Ｘによって肝臓幹細胞の分化が障害され、必要な時に肝臓の再生が進まないという深刻な事態が起こりうる。こうした問題は通常の動物実験では必ずしも予見できない。本ベクターを用いれば、きわめて効率良く遺伝子Ｘを霊長類ＥＳ細胞へ導入でき、この遺伝子導入ＥＳ細胞をさまざまな組織幹細胞やさらに機能細胞まで分化させることによって、遺伝子Ｘの安全性をさまざまな分化段階で検出できるようになる。
本発明のベクターを利用したアッセイおよびスクリーニングは、霊長類、特にヒトやサルにおける発生学的研究、疾患研究、臨床応用、実験モデルなどに有用であり、かつ所望の分化細胞または分化組織を得るのに有用な遺伝子および試薬をスクリーニングすることができるという優れた効果を発揮する。
上記のスクリーニング法において、ＥＳ細胞から所望の組織または細胞への特異的分化は、例えば、所望の組織または細胞に特異的なマーカーの発現を指標として評価されうる。前記所望の組織または細胞に特異的なマーカーとしては、組織または細胞特異的抗原が挙げられ、例えば、神経系前駆細胞のマーカーとしては、中間径フィラメントであるネスチンなどが挙げられる。このような特異的マーカーは、該マーカーに対する抗体を用い、慣用のＥＬＩＳＡ、免疫染色等により検出してもよく、該マーカーをコードする核酸を用い、慣用のＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡアレイハイブリダイゼーション等により検出してもよい。なお、「核酸」とは、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡなどを意味する。本スクリーニング法により得られた遺伝子および試薬は本発明の範囲に包含される。
また、本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターが導入されたＥＳ細胞、および該ＥＳ細胞から分化した分化細胞または分化組織も本発明の範囲に含まれる。分化細胞及び分化組織は、前記組織又は細胞に特異的なマーカーの発現、形態学的特徴の観察により同定することができる。
本発明のウイルスベクターは、霊長類の任意の遺伝性疾患の遺伝子治療にも応用が可能である。対象となる疾患は特に制限されない。例えば、対象となり得る疾患とその単一原因遺伝子としては、ゴーシェ病においてはβ−セレブロシダーゼ（第２０染色体）、血友病においては血液凝固第８因子（Ｘ染色体）および血液凝固第９因子（Ｘ染色体）、アデノシンデアミナーゼ欠損症においてはアデノシンデアミナーゼ、フェニルケトン尿症においてはフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（第１２染色体）、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーにおいてはジストロフィン（Ｘ染色体）、家族性高コレステロール血症においてはＬＤＬレセプター（第１９染色体）、嚢ほう性繊維症においてはＣＦＴＲ遺伝子の染色体への組み込み等が挙げられる。それら以外の複数の遺伝子が関与していると思われている対象疾患としては、アルツハイマー、パーキンソン病等の神経変性疾患、虚血性脳障害、痴呆、またエイズ等の難治性の感染症等が考えられる。
また、遺伝子導入したＥＳ細胞から分化させた細胞、組織、臓器を疾患治療のために用いることも考えられる。例えば、遺伝子の欠損や不足によって発症する疾患に対して、霊長類ＥＳ細胞の染色体に当該遺伝子を導入し、これを体内に移植することによって欠損する遺伝子を補い、体循環する酵素、成長因子等の不足を補充する治療が考えられる。また、臓器移植に関連する遺伝子治療に関しては、ヒト以外の動物ドナーの組織適合性抗原をヒト型に変えることが考えられる。これにより、異種移植の成功率を高める応用が可能となる。
また、本ベクターを用いて遺伝子を導入したＥＳ細胞がサル由来のものである場合は、当該ＥＳ細胞を疾患モデルサルに移植することにより、ヒトの疾患の治療モデルとして有用な系を提供することができる。ヒトの疾患のモデルとして様々な疾患モデルサルが知られており、例えば、ヒトのパーキンソン病のモデルサルは人工的に作出可能であり、ヒトの糖尿病の忠実なモデルとして自然発症の糖尿病サルが多く飼育され、また、サルのＳＩＶ感染症がヒトのＨＩＶ感染症の忠実なモデルとしてよく知られている。このような疾患において、ヒトＥＳ細胞を用いた臨床応用を行う前に、前臨床試験としてサルＥＳ細胞を疾患モデルサルに移植する系は、非常に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書全体を通じて引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  ＳＩＶベクターの構築
ベクター系の構築には、非病原性のアフリカミドリザル免疫不全ウイルスのクローンであるＳＩＶａｇｍＴＹＯ１を用いた。図１にベクターシステムの概要を示す。ヌクレオチドの番号は以下すべてウイルスＲＮＡの転写開始点を＋１として表記した。ＳＩＶａｇｍＴＹＯ１を組み込んだプラスミドとしてはｐＳＡ２１２（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，ｖｏｌ．６４，ｐｐ３０７−３１２，１９９０）を用いた。また、ライゲーション反応は、すべてＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡）を用い添付説明書に従って行った。
ａ．パッケージングベクターの構築
まず、ｖｉｆとｔａｔ／ｒｅｖの第１エクソンを含む領域（５３３７−５７７０）に相当するＤＮＡ断片をプライマー１Ｆ（配列番号：１）と１Ｒ（配列番号：２）を用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲにより得た。ＰＣＲプライマーに制限酵素部位であるＥｃｏＲＩ部位を付加することでＤＮＡ断片の３’端にＥｃｏＲＩ部位をもつ断片を調製した。ＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩにより切断した後、アガロースゲル電気泳動とＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。以上のようにして得たＤＮＡ断片と、ｇａｇ／ｐｏｌ領域をコードするＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ（３５６）部位からＢｇｌＩＩ（５３３８）部位までを含む）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位へライゲーションした。次に、Ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＲＲＥ）とｔａｔ／ｒｅｖの第２エクソンを含む領域（６９６４−７９９３）に相当するＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。上記のＰＣＲ断片と同様にプライマー２Ｆ（配列番号：３）と２Ｒ（配列番号：４）を用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲにより３’端にＮｏｔＩ部位を付加し、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断後に精製し、ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖを組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位へ組み込んだ。
さらに、スプライシングドナー（ＳＤ）部位を含むＤＮＡ断片を合成した（配列３Ｆ（配列番号：５）と３Ｒ（配列番号：６））。合成時に５’端にＸｈｏＩ部位、３’端にＳａｌＩ部位を付加し、上記のｇａｇ−ＲＲＥ−ｔａｔ／ｒｅｖを組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＸｈｏＩ部位へ組み込んだ。得られたプラスミドをＸｈｏＩとＮｏｔＩにより切断し、ＳＤ〜ｔａｔ／ｒｅｖを含む断片を精製し、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ１９３−２００，１９９１）のＥｃｏＲＩ部位にＸｈｏＩ／ＮｏｔＩリンカー（配列４Ｆ（配列番号：７）と４Ｒ（配列番号：８））を組み込んだプラスミドのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位へ組み込んだ。以上の方法により得られたプラスミドをパッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）として使用した。
ｂ．ジーントランスファーベクターの構築
ＳＩＶａｇｍＴＹＯ１由来の５’ＬＴＲ領域（８５４７−９０５３＋１−９８２、５’端にＫｐｎＩ部位、３’端にＥｃｏＲＩ部位を付加）はプライマー５−１Ｆ（配列番号：９）と５−１Ｒ（配列番号：１０）を、ＲＲＥ（７３８０−７９９３、５’端にＥｃｏＲＩ部位、３’端にＳａｃＩＩ部位を付加）はプライマー５−２Ｆ（配列番号：１１）と５−２Ｒ（配列番号：１２）を、３’ＬＴＲ（８５２１−９１７０、５’端にＮｏｔＩとＢａｍＨＩ部位、３’端にＳａｃＩ部位を付加）はプライマー５−３Ｆ（配列番号：１３）と５−３Ｒ（配列番号：１４）をそれぞれ用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲにより増幅した。ｐＥＧＦＰＣ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＣＭＶプロモーター領域と強化グリーン蛍光蛋白質（以下、ＥＧＦＰともいう）をコードする領域（１−１３３０、５’端にＳａｃＩＩ部位、３’端にＮｏｔＩ部位とＢａｍＨＩ部位と翻訳ストップコドンを付加）をプライマー６Ｆ（配列番号：１５）と６Ｒ（配列番号：１６）を用いてｐＥＧＦＰＣ２をテンプレートとしたＰＣＲにより増幅した。４種のＰＣＲ断片をそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩとＳａｃＩＩ、ＢａｍＨＩとＳａｃＩ、ＳａｃＩＩとＢａｍＨＩ切断した後に精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＫｐｎＩ−ＳａｃＩの間に５’ＬＴＲ→３’ＬＴＲ→ＲＲＥとＣＭＶプロモーターＥＧＦＰの順にライゲーションして組み込んだ（ｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を挿入するため、上記のようにしてＰＣＲにより調製した５’ＬＴＲ領域と３’ＬＴＲ領域を含むＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩとＳａｃＩで切断した後に精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ−ＳａｃＩにそれぞれ組み込んだプラスミド（ｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＷＴ３’ＬＴＲ）ＮｏｔＩ部位にｐＣＭＸ／−β（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のβ−ガラクトシダーゼをコードする領域を含むＮｏｔＩ断片（８２０−４２９４）を組み込んだ（ｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／β−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。次にプラスミドｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／β−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位に、プライマー７−１Ｆ（配列番号：１７）と７−１Ｒ（配列番号：１８）を用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲにより増幅したＲＲＥ配列（６９６４−８１７７、５’端にＥｃｏＲＩ部位、３’端にＮｏｔＩ部位を付加）を組み込んだ（ｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥ６／ｔｒ／β−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）後にＲＲＥ配列をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩで切り出し、プライマー７−２Ｆ（配列番号：１９）と７−２Ｒ（配列番号：２０）を用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲにより増幅したＲＲＥ配列（７３８０−７９９３、５’端にＥｃｏＲＩ部位、３’端にＮｈｅＩ部位を付加）を組み込んだ。以上の方法で得られたプラスミド（ｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／β−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）をＮｈｅＩとＳｍａＩで切断し平滑末端化した後、ｐＥＧＦＰＮ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＣＭＶプロモーター領域（８−５９２、ＡｓｅＩ−ＮｈｅＩ断片を平滑末端化）を組み込んだ（ｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。平滑末端化反応はすべてＢｌｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して添付説明書に従って行った。プラスミドｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲとｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲをそれぞれＫｐｎＩ−ＳａｃＩで切断して５’ＬＴＲ−３’ＬＴＲを含むＤＮＡ断片を調製し、ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位へ組込み、ジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲまたはｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲ）として使用した。
［実施例２］  ５’ＬＴＲの改変
レンチウイルスの５’ＬＴＲの転写活性は一般にウイルス由来の因子であるＴａｔ蛋白質の存在に依存している。そこで、Ｔａｔに対する依存性を解消するため、さらに、より転写活性の強いプロモーター配列に置換することでベクター力価を高めるために、５’ＬＴＲのプロモーター配列であるＵ３領域を他のプロモーター配列に置換したＳＩＶａｇｍジーントランスファーベクターを作製した（図２）。
５’ＬＴＲのキメラプロモーターへの置換は、以下のようにして行った。５’ＬＴＲのＴＡＴＡボックスの下流〜ｇａｇ領域（９０３９−９１７０＋１−９８２）を含む断片をプライマー９−１Ｆから３Ｆ（配列番号：２１〜２３）と９Ｒ（配列番号：２４）を用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲで増幅した。また、ＣＭＶＬプロモーター（ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）由来、１−７２１）、ＣＭＶプロモーター（ｐＥＧＦＰＮ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来、１−５６８）、ＥＦ１αプロモーター（ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１８，ｐ５３２２，１９９０）の２２４０−２７４０）、ＣＡプロモーター（ｐＣＡＧＧＳの５−６５０）を含む断片をそれぞれプライマー１０−１Ｆ（配列番号：２５）と１０−１Ｒ（配列番号：２６）、１０−２Ｆ（配列番号：２７）と１０−２Ｒ（配列番号：２８）、１０−３Ｆ（配列番号：２９）と１０−３Ｒ（配列番号：３０）、１０−４Ｆ（配列番号：３１）と１０−４Ｒ（配列番号：３２）を用いてそれぞれｐＣＩ、ｐＥＧＦＰＮ２、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＣＡＧＧＳをテンプレートとしたＰＣＲで増幅した。増幅後に５’ＬＴＲを含む断片と上記の各プロモーターを含む断片とを混合し、それぞれのプロモーターの５’側のプライマー（１０−１Ｆ（配列番号：２５）、１０−２Ｆ（配列番号：２７）、１０−３Ｆ（配列番号：２９）、１０−４Ｆ（配列番号：３１））と、５’ＬＴＲの３’側のプライマー（９Ｒ）を添加し、更に１０サイクルのＰＣＲ反応を行うことで、４種のプロモーターと５’ＬＴＲとのキメラプロモーターのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片は、ジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ部位に組み込んだ（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ、ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ、ｐＧＬ３Ｃ／ＥＦ１α．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ、ｐＧＬ３Ｃ／ＣＡＧ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。
［実施例３］  ３’ＬＴＲの改変
３’ＬＴＲの配列を部分的に削除し、標的細胞から全長のベクターｍＲＮＡが転写されることを防止する、安全性が向上した自己不活性化（ＳＩＮ）型ベクターを構築した。レンチウイルスベクターにおいては、３’ＬＴＲ領域に含まれるプロモーター配列であるＵ３領域が、標的細胞中で逆転写される時に５’ＬＴＲのＵ３プロモーター領域へ組み込まれるため、標的細胞のゲノム内では、ジーントランスファーベクタープラスミドの３’ＬＴＲ領域に含まれるＵ３領域が、遺伝子発現に関与する５’ＬＴＲのＵ３プロモーターとなることが明らかとなっている（図３）。そこでＳＩＶａｇｍジーントランスファーベクターの３’ＬＴＲのＵ３領域を他のプロモーター配列へ置換したベクターを作製した（図３）。また、同時に標的細胞中で５’ＬＴＲに存在するプロモーター配列を欠失させうるかを検討することが可能な、ＳＩＶａｇｍジーントランスファーベクターの３’ＬＴＲのＵ３領域を欠失させたベクターも作製した。
３’ＬＴＲのＵ３プロモーター配列の改変と欠失は、以下のように行った。３’ＬＴＲのＵ３を含まないＤＮＡ断片をプライマー１１Ｆ（配列番号：３３）と１１Ｒ（配列番号：３４）を用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲで増幅した。また、Ｕ３領域を他のプロモーターへ置換した３’ＬＴＲはプライマー１２−１Ｆから３Ｆ（配列番号：３５から３７）と１２Ｒ（配列番号：３８）を用いて、実施例２に記載の方法で得られたキメラプロモーターを組み込んだベクタープラスミドであるｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ、ｐＧＬ３Ｃ／ＥＦ１α．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ、ｐＧＬ３Ｃ／ＣＡＧ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲをそれぞれテンプレートとしてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片はＳａｌＩとＳａｃＩで切断後に精製し、ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲのＳａｌＩ−ＳａｃＩ部位へ組込み込んだ（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／３’ＬＴＲΔＵ３、ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＣＭＶＬ．Ｒ、ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＥＦｌα．Ｒ、ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＣＡＧ．Ｒ）。
また、ＥＧＦＰをレポーターとして有するＳＩＮベクター（ｐＧＣＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＥＧＦＰ／３’ＬＴＲΔＵ３）（図４）を構築するため、ｐＧＣＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／３’ＬＴＲΔＵ３のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨＩ処理により、β−ｇａｌを含む断片を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして、ＥＧＦＰＦＧ２Ｅｃｏ（ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴ／配列番号：３９）およびＥＧＦＰＲｓｔｏＮＢ（ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣ／配列番号：４０）をプライマーにしたＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と組み換え、さらにＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩＩサイトにプライマー５−２Ｆ（配列番号：１１）および５−２Ｒ（配列番号：１２）にてｐＳＡ２１２をテンプレートとして増やしたＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩＩ断片を組み換えた。
［実施例４］  ＳＩＶの大量調製
トランスフェクション：ヒト胎児腎細胞由来細胞株２９３Ｔ細胞（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ８３９２−８３９６，１９９３）を１枚あたり２．５×１０６になるように１５ｃｍディッシュ５０枚に播種し、１０％非動化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）にて４８時間培養した。培地量は１５ｃｍディッシュあたり２０ｍｌとした。２日間培養したところで、ジーントランスファーベクター：ｐＧＣＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＥＧＦＰ／３’ＬＴＲΔＵ３、３００μｇ、パッケージングベクター：ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ、１５０μｇ、ＶＳＶ−Ｇ発現ベクター：ｐＶＳＶ−Ｇ、５０μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）７５ｍｌに希釈し、２ｍｌのＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を入れ、攪拌後室温にて１５分静置した。別に７５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに３ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を混ぜ、それをさらに先程のＤＮＡ混合液と混ぜ合わせ１５分間室温で静置した。
これを１枚あたり１０ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに置き換えた２９３Ｔ細胞に３ｍｌずつ滴下し、３時間３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。２０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを１０ｍｌずつ加え２１時間培養を続けた。トランスフェクション２４時間後、１枚あたり１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ２０ｍｌに置換しさらに２４時間培養した。
ベクターの回収および濃縮：培養上清を回収し、０．４５μｍのフィルターにて濾過後４２５００Ｇ、９０分、４℃にて遠心を行った。ペレットは１０ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  Ｓｐｅｒｍｉｎｅ、０．３ｍＭ  Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１００μＭ  ｄＮＴＰ添加ＴＢＳに溶解後３７℃にて２時間反応させた。さらに４２５００Ｇ、４℃にて２時間遠心し、ペレットを５％ＦＣＳ、２μｇ／ｍｌポリブレン添加ＰＢＳ、１ｍｌにて懸濁し−８０℃にて凍結させ保存した。
［実施例５］  サルの胚盤胞期胚作製
ＥＳ細胞を樹立するために好適な胚盤胞期胚を得るため、体外受精法及び顕微授精法により受精を行い、その後、体外培養法によって胚盤胞期胚に発生させる操作を行った。
（１）卵巣刺激法
カニクイザルのメス（４〜１５齢）にゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）〔商品名：リュープリン（Ｌｅｕｐｌｉｎ）、武田薬品工業（株）社製；又は商品名：スプレキュア（Ｓｐｒｅｃｕｒ）、ヘキスト・マリオン・ルセル（株）社製〕１．８ｍｇを皮下投与した。ＧｎＲＨ投与２週間後から、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）〔商品名：セロトロピン（Ｓｅｒｏｔｒｏｐｉｎ）、帝国臓器製薬（株）社製〕を２５ＩＵ／ｋｇ、ヒト閉経期尿性ゴナドトロピン（ｈＭＧ）〔パーゴナル（Ｐｅｒｇｏｎａｌ）、帝国臓器製薬（株）社製〕１０ＩＵ／ｋｇ又は卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）〔フェルティノーム（Ｆｅｒｔｉｎｏｒｍ）、セローノ・ラボラトリーズ社製〕３ＩＵ／ｋｇを１日１回一定時刻に９日間連続で、本実施例では夕刻）に筋肉内投与した。投与５日後に、腹腔鏡（外径３ｍｍ）を用いて卵巣の観察を行い、卵胞の発育の有無を確認した。
ついで、ＰＭＳＧ、ｈＭＧ又はＦＳＨを投与し卵胞の発育が十分あることを確認した後、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）〔商品名：プベローゲン（Ｐｕｂｅｒｏｇｅｎ）、三共（株）社製〕４００ＩＵ／ｋｇを１回筋肉内投与した。ｈＣＧ投与４０時間後に、採卵した。
採卵は、卵巣を腹腔鏡（外径１０ｍｍ）観察下において、約０．５ｍｌの１０％ＳＳＳ（Ｓｅｒｕｍ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓａｌｅｓ  Ｉｎｃ．製）を含むα−ＭＥＭ（α−Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＩＣＤ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．製）溶液を入れた６０ｍｍの１９Ｇ又は２０Ｇのカテラン針を付けた２．５ｍｌの注射筒を用いて、卵胞を穿刺し吸引して卵胞液と共に卵子を回収することにより行なった。
回収後、直ちに実体顕微鏡下で卵丘細胞に包まれた成熟卵子を分離し、０．３％ＢＳＡ含有ＴＡＬＰ（以下、ＢＳＡ／ＴＡＬＰと示す）中に移し、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２、３７℃の炭酸ガス培養器中にて３〜４時間前培養した。
（２）精子の採取
（ｉ）精巣上体からの採取法
オスのカニクイザル（１０〜１５齢）の精巣上体を採取後、直ちに２３Ｇの針を付けた１ｍｌの注射筒を精管に挿入して、０．３％ＢＳＡを含むＢＷＷ（以下、ＢＳＡ／ＢＷＷと示す）をゆっくり注入し、精巣上体尾部を切断し流出する精液を採取した。
（ｉｉ）電気刺激法による採取法
ｉ）直腸法
塩酸ケタミン＋塩酸キシラジン（それぞれ、５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ）でオスのカニクイザル（１０〜１５齢）に麻酔を施し、仰臥位においた。電気刺激器に取り付けた棒状直腸電極にケラチンクリームを塗布し、該電極を前記サルの直腸に静かに挿入した。陰茎を滅菌生理食塩水で洗浄し、ペーパータオルなどでふき取り、陰茎の先を試験管（５０ｍｌ）の中にいれた。ついで、電気刺激器を交流電圧、５Ｖにセットして、通電を行なった。通電を３〜５秒間行なった後、５秒間休止した。これを最大３回まで繰り返した。射精が見られた時は、その時点で終了した。射精が見られないときは、電圧を１０Ｖにして同様の操作を行なった。さらに、射精が見られないときは、１５Ｖ、２０Ｖで実施した。
ｉｉ）陰茎法
無麻酔下で、ケージ前面にオスのカニクイザル（１０〜１５齢）の四肢を保定し、陰茎を保持しやすい位置に設置した。手術用ゴム手袋を装着し、陰茎を無菌生理食塩水で洗浄し、ペーパータオルなどで拭き取った。電気刺激器を準備し、電極を陰茎にセットし、クリップで接続した。通電は、まず直流の電圧５Ｖで１秒間隔でＯＮ−ＯＦＦを繰り返しながら、徐々にその間隔を短くしていく操作とした。射精が見られない時は、同様の操作を１０Ｖ、１５Ｖ、２０Ｖで行なった。さらに、射精が見られないときは、交流で同様の操作を繰り返した。
（３）精液採取後の処理と凍結保存法（Ｔｏｒｉｉ，Ｒ．，Ｈｏｓｏｉ，Ｙ．，Ｉｒｉｔａｎｉ，Ａ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｎｉｇｉ，Ｈ．（１９９８）．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｍｏｎｋｅｙ（Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ），Ｊｐｎ．Ｊ．Ｆｅｒｔｉｌ．，４３（２），１２５−１３１）
直腸法又は陰茎法で採取した精液を、３７℃炭酸ガス培養器内で約３０分間静置した。液状成分のみを採取し、０．３％ＢＳＡ含有ＢＷＷ（Ｂｉｇｇｅｒｓ，Ｗｈｉｔｔｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｉｎｇｈａｍｓ）（ＢＳＡ／ＢＷＷ）培養液を約１〜２ｍｌ加えて精子溶液を調製した後、８０％パーコール（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．製）２．５ｍｌと６０％パーコール２．５ｍｌの液の上に静かに重層した。得られたものを１，４００ｒｐｍで２０分、室温で遠心分離した後、試験管内の底部の約０．５ｍｌを残して、上層を吸引除去した。さらに、ＢＳＡ／ＢＷＷを約１０ｍｌ添加して軽く混合した。得られた混合物を１，４００ｒｐｍで３分、室温で遠心分離した後、底部の約０．５ｍｌを残して上層を吸引除去した。
得られた精子に、精子数約５×１０７〜１．０×１０８個／ｍｌになるようにＢＳＡ／ＢＷＷを適量加えて精子溶液を調製した後、４℃で約６０〜９０分間静置した。その後、氷水中で精子溶液の１／５量のＴＴＥ−Ｇ溶液〔終濃度１２％のグリセロールを含むＴＴＥ培地（培地１００ｍｌ中の組成：Ｔｅｓ  １．２ｇ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．２ｇ、グルコース２ｇ、ラクトース２ｇ、ラフィノース０．２ｇ、卵黄２０ｍｌ、ペニシリン−Ｇ  １０，０００ＩＵ、ストレプトマイシン硫酸塩５ｍｇ）を静かに滴下し、５分間静置した。なお、前記のＴＴＥ−Ｇ溶液の滴下及び静置の操作を５回繰り返した。
氷水中で６０〜９０分間放置した後、得られた精子溶液を０．２５又は０．５ｍｌのストローに入れた。ストローを液体窒素の容器の上部で約５分間維持した後、液体窒素上面でさらに５分間維持した。前記ストローを液体窒素中に投入し、保存した。
（４）体外受精用精子の調製
液体窒素から出したストローを一旦室温で３０秒間保持した後、３７℃の温浴中に３０秒間投入して保存精子溶液を融解した。ついで、前記ストローに、１ｍＭカフェイン（シグマ社製）と１ｍＭ  ｄｂＣ−ＡＭＰ（シグマ社製）とを含有したＢＳＡ／ＢＷＷ  １０ｍｌを加え、３０分間３７℃の炭酸ガス培養器（５％ＣＯ２）でインキュベートして、受精能獲得を行なった。
その後、１，０００ｒｐｍ（２００×ｇ）で２分間、精子溶液を遠心分離し、上清を捨てた。ついで、新たに１ｍＭカフェインと１ｍＭ  ｄｂＣ−ＡＭＰとを含有したＢＳＡ／ＢＷＷ約０．５〜１ｍｌを精子に加えた。得られた精子溶液を、３７℃の炭酸ガス培養器（５％ＣＯ２）にて、６０分間静置し、Ｓｗｉｍ  Ｕｐした精子を集めて、精子の運動性と精子数とを確認した。これにより体外受精用精子を得た。
（５）受精方法
１）体外受精法
プラスチックディッシュ内のミネラルオイルで覆われた５０μｌのＢＳＡ／ＢＷＷのドロップ中に、卵丘細胞に包まれた卵子１〜５個をいれた。ついでドロップ中に５．０×１０５〜１．０×１０６個（精子）／ｍｌになるように精子懸濁液を移した。ドロップをミネラルオイルで覆い、ついで媒精を行なった。
その後、受精後の卵子を３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の炭酸ガス培養器にて培養した。媒精５時間後、ＢＷＷ液からＴＡＬＰ液に交換し、受精の確認を行なった。その結果、約４５％の高い受精率で受精卵が得られた。受精が確認された卵子について、約２０時間培養して、その後ＣＭＲＬ−１０６６液に移し培養を継続した。
なお、ＣＭＲＬ−１０６６液は以下のように調製した。１０ｍｌのＡ液〔ペニシリンＧ（１０００単位）、ゲンタマイシン硫酸塩（１０ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌ、ＣＭＲＬ−１０６６（１０×）（ＮａＨＣＯ３及びＬ−グルタミン無）１０ｍｌ、ＮａＨＣＯ３  ０．２１８ｇ、乳酸ナトリウム（２９０ｍＯｓｍｏｌ’ｓ  ｓｔｏｃｋ）６．７ｍｌ、水で１００ｍｌにメスアップ〕にＬ−グルタミン０．０１４６１５ｇ（１ｍＭ）を溶解した。ついで、得られた溶液を濾過滅菌した。滅菌後の溶液１ｍｌにＡ液９ｍｌを添加し、全量１０ｍｌのＢ液を得た。ピルビン酸ナトリウム０．００５５ｇ（終濃度５ｍＭ）をＢ液に加えて溶解し、Ｃ液を得た。Ｃ液８ｍｌとＢＣＳ（子牛血清）２ｍｌとを混合した。得られた混合物を濾過滅菌して、ＣＭＲＬ−１０６６液を得た。
２）顕微授精法
（ｉ）卵子の調製
回収された卵母細胞を、ミネラルオイル（シグマ社製）で覆われた５０μｌの０．３％ＢＳＡを含むＴＡＬＰ（ＢＳＡ／ＴＡＬＰ）溶液スポット中に集めた後、約２〜４時間、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の条件下で前培養した。
卵子の成熟状態を確認するため、０．１％のヒアルロニダーゼ（シグマ社製）を含むＴＡＬＰ−ＨＥＰＥＳ溶液中に卵母細胞培養物を１分間さらした後、ピペッティングで卵丘細胞を除去した。回収した卵子は、倒立顕微鏡下で、以下のＣｌａｓｓ−１〜４の４種類に分類した。
Ｃｌａｓｓ−１：極体（ＰＢ）を持つ成熟卵子、
Ｃｌａｓｓ−２：ＰＢと卵核胞（ＧＶ）が観察されない成熟途上卵子、
Ｃｌａｓｓ−３：ＧＶが観察される未成熟卵子、
Ｃｌａｓｓ−４：形状の変形が著しいか、細胞質が変成、退行的変化を示している卵子
Ｃｌａｓｓ−１の卵子については、確認後、すぐに、顕微授精に供試した。Ｃｌａｓｓ−２とＣｌａｓｓ−３の卵子については、更にミネラルオイルで覆われた５０μｌのＢＳＡ／ＴＡＬＰ溶液スポット中に集めた後、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の条件下で継続培養した。培養後２４時間で、卵子の成熟状態を確認した。成熟した卵子については、その時点で、顕微授精に供試した。残りの未成熟卵子とＣｌａｓｓ−４の卵子とについては、受精には供試しなかった。
（ｉｉ）精子の調製
体外受精に準じた方法で行なった。
（ｉｉｉ）顕微授精法
顕微授精を、ナリシゲ社製のマイクロマニピュレーターを装備したオリンパスＩＸ７０倒立顕微鏡下で行なった。
１５ｃｍディッシュに、スポット１：希釈精子を１５μｌ、スポット２：１０％ポリビニルピロリドンＰＢＳ培養液〔ＰＶＰ：平均分子量約３６０，０００、ナカライ  テスク（株）社製〕５μｌ×３個とスポット３：卵子操作用のＴＡＬＰ−ＨＥＰＥＳ（最終濃度３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）溶液５μｌ×３個を順に置き、表面をミネラルオイルで覆い乾燥を防ぎ、顕微授精用のワーキング・フィールドとした。なお、本実施例では、操作温度の変化には留意せず、加温ステージを用いなかったが、加温ステージを用いてもよい。
注入用のニードルとしては、ヒト顕微授精用の傾斜角度３０度のニードル（外径７〜８μｍ、内径５〜７μｍ、メディー・コンインターナショナル社製）を用いた。前記ニードルを動作精度の高いアルカテルシリンジに接続した。
卵子保持用ニードルとしては、同じくヒト顕微授精用の傾斜角度３０度のニードル、あるいはマグネティック・プラー（商品名：ＰＮ−３０、ナリシゲ社製）により作製した外径約１００μｍ、先端の内径約１５μｍのニードルを用いた。前記ニードルは、２０００μｌのエアータイトシリンジを付けたナリシゲのインジェクターに接続した。
スポット１でヒト顕微授精の基準に従い運動性のある精子を選んで吸引して、得られた精子をスポット２へ移し、排出した。スポット２においては、ＰＶＰの粘性により、精子の運動性が低下した。前記精子尾部をインジェクションニードルでこすりつけ、膜の一部を破壊し、精子の運動を停止させる。該精子を粘性の高い溶液とともに吸引し、スポット３へ移した。
成熟卵子をスポット３に入れ、保持用ニードルを用いて、極体の下にある染色体が注入用ニードルで壊されないように、６時又は１２時の位置に固定した。その後、注入用のニードルの先端に精子を置き、該精子を卵子へ刺し込んだ。ニードルが透明帯を通過したことを確認した後、卵細胞膜を吸引した。膜の断裂が起こったことを確認した後、注入用ニードル内の内容物（精子と卵子の細胞質）を注入した。精子と卵子の細胞質の注入に関する一連のこれらの操作を繰り返し行なった。一回の操作で２〜３個卵子に顕微授精を行なうが、精子や卵細胞質により先端の内側が汚れた場合は、スポット２で洗浄する。
顕微授精された卵子を、すぐに培養器へ戻し、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２、９０％Ｎ２の条件下で培養を開始した。顕微授精後、すぐ、６ｃｍノンコート培養ディッシュに、５０μｌのＣＭＲＬ−１０６６溶液のスポットを作り、それをパラフィンオイルでカバーした。なお、スポットと気相の平衡は、原則的には、３時間以上行なった。顕微授精後２４時間で、ＴＡＬＰ溶液から前記ＣＭＲＬ−１０６６溶液のスポットに移し、炭酸ガス培養器中で３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２、９０％Ｎ２の条件下で密封のまま８日間培養した。その結果、約７５〜８５％の高い受精率で受精卵が得られた。
（６）培養方法
体外受精及び顕微授精において、受精を確認した後は、培養を行なうにあたって、温度と炭酸ガス濃度の急激な変化を避けるため、ヒトでは通常行なわれず、マウスやウサギ等の実験動物で広く採用されている、ミネラルオイルで培地をカバーする微少懸滴培養法を採用した。また、培養経過を観察することにより、温度やｐＨの変化による不要なストレスを与えることを避けるため、体外受精では培養開始後７日間、顕微授精では培養開始後８日間、胚盤胞期胚の出現が予測されるまで培養器の扉の開閉を行なわず、密閉して培養を行なった。
ここで用いた培養液、培養温度、培養気相は以下の通りである。
培養液：ＴＡＬＰ  ＆  ＣＭＲＬ−１０６６
通常、マウスで用いられるＢＷＷやヒトで用いられるＰ１（ナカメディカル社製）、Ｂｌａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ナカメディカル社製）及び新たに開発されたＨＦＦ（ｈｕｍａｎ  ｆｏｉｌｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ、扶桑薬品（株）社製）を用いた結果、受精と分割までは順調に進むが桑実胚までの発生にとどまることが判る。受精確認後、ＴＡＬＰとＣＭＲＬ−１０６６の培養液と組み合わせて用いることにより、胚盤胞期胚への発生がみられ、かつその率は受精胚の４０〜４６％と極めて高率にみられることが判明した。培養器外の操作で、リン酸緩衝液系のＰＢＳを使わずＨＥＰＥＳ緩衝液系のＴＡＬＰを用いたことにより、卵子への悪影響を減らしたと思われる。
培養温度：３８℃
マウスやヒトでは、通常３７℃で行なうが、この温度では、発生が遅く、かつ桑実胚以降への発生は全くなかった。そこで、３８．５℃で胚培養を行なうウシなどと同様に、３８℃とやや高い温度で培養を行なうことにより、体外受精では７日後に、顕微授精では８日後に胚盤胞期胚を得た。
培養気相：５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２
通常用いられる５％ＣＯ２、９５％空気の条件下では、桑実胚までの発生にとどまったが、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２で培養を行なうことにより、胚盤胞期胚への発生率が高い率で見られるようになった。
ＴＡＬＰ液及びＴＡＬＰ−ＨＥＰＥＳ液は、下記のように調製した。
2002101057.tif 000006
ここで、ＴＡＬＰ液調製の直前に、
2002101057.tif 000007
を調製し、得られた試薬をフィルターで濾過滅菌した。一方、ＴＡＬＰ−ＨＥＰＥＳ液調製の直前に、
2002101057.tif 000008
を調製し、得られた試薬をフィルターで濾過滅菌した。
なお、ＴＡＬＰ−ＨＥＰＥＳ液を調製する際、５０ｍｌ  ＮａＣｌとＮａ−ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、フェノールレッド、ペニシリンＧを先に溶解させた。得られた溶液に、それぞれのストック溶液を規定量加え、最後にＮａＣｌストック溶液で１００ｍｌまでメスアップした。ついで、得られた溶液のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。乳酸ナトリウムストック溶液は、原液（６０％シロップ）と水とを１：３５で混合した。得られた混合物に、１ｍｇ／ｍｌのフェノールレッドを加えた後、得られた溶液のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．６に調整し濾過滅菌した。得られた試薬は、４℃で１週間保存可能である。ＮａＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ２８ｍｇは、１０ｍｌのグルコース溶液に溶解し、濾過滅菌した。得られた溶液は４℃で１週間保存可能である。
ついで、表２にＢＷＷ（Ｂｉｇｇｅｒｓ，Ｗｈｉｔｔｅｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ）液の組成を示す。
2002101057.tif 000009
［実施例６］  サルＥＳ細胞樹立法
（１）フィーダー細胞の作製
１２．５日齢のマウス胚から得た初代胚線維芽細胞（以下、ＭＥＦともいう）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地でコンフルエントになるまで、初代〜３代目の間で培養した。ついで、最終濃度１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を含むＭＥＭ培地でＭＥＦを２〜３時間培養し、細胞分裂を不活性化した。その後、ＭＭＣを含む培地を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。トリプシン処理（０．０５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）により、洗浄後の細胞を培養ディッシュから剥がし、細胞数をカウントした。
ゼラチンコートした２４穴培養ディッシュの各ウエルに、２×１０４個のＭＭＣ処理されたＭＥＦを播種した。
得られた細胞について、実際にディッシュ上に播種し、適した細胞数であることを確認した上で、マウスＥＳ細胞を培養し、性質を調べた。その結果、増殖能が良好であり、未分化状態が維持されていたため、得られた細胞がフィーダー細胞として適していることが示された。また、３代目以下（初代〜３代目）までの培養のフィーダー細胞が、好適であった。
（２）サル胚盤胞期胚からの内部細胞塊の分離
透明体除去のためにサル胚盤胞期胚を最終濃度０．５％プロナーゼまたはタイロードを含むＭ２培養液〔例えば、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒら編、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ４  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ第２版（１９９５）などを参照のこと〕に移し、３７℃で１０分インキュベートした。なお、透明体が残っている胚盤胞期胚について、さらに３７℃で５分のプロナーゼ処理を行なった。透明体の除去を確認後、得られた胚盤胞期胚をＰＢＳで２回洗浄した。
ついで、ウサギ抗カニクイザルリンパ球血清をＭ１６培養液〔前記ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ４  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈなどを参照のこと〕で２０倍に希釈した溶液中に胚盤胞期胚を移し、３７℃で３０分インキュベートした。その後、得られた胚盤胞期胚をＰＢＳで３回洗浄した。補体をＭ１６培養液で５０倍に希釈した溶液中に胚盤胞期胚を移し、３７℃で３０分インキュベートした。得られた胚盤胞期胚をＰＢＳで３回洗浄した。胚盤胞期胚の栄養外胚葉が完全に除去出来ない場合は、ガラス針を用いて顕微鏡下で物理的に栄養外胚葉を除去した。これにより、内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ；ＩＣＭ）を分離した。
（３）サル内部細胞塊の培養
（１）で得られたフィーダー細胞を播種した２４穴培養ディッシュからＭＥＭ培地を除き、ウエルごとにＥＳ細胞培養用の培地〔ＥＳ細胞培地、表３〕を８００μｌずつ加えた。
ついで、（２）で得られたＩＣＭをマイクロピペットを用いて各ウエルに１個ずつ移し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間培養した。ＩＣＭの着床を阻害しないために、培養開始から３日間は培地の交換を行なわず、毎日顕微鏡下で着床状況を観察した。
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培養７日目にＩＣＭの解離を行なった。ウエルからＥＳ細胞培地を除き、ＰＢＳで１回洗浄した。３００μｌの０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡをウエルに加え、直ちに取り除いた。ついで、２４穴培養ディッシュを３７℃で１分インキュベートした。顕微鏡下で細胞の解離を確認した後に、ウエルに５００μｌのＥＳ細胞培地を加えピペットマンでよくピペッティングした。
フィーダー細胞を予め播種した新しい２４穴培養ディッシュのウエルに、上記の全細胞を移した。３００μｌのＥＳ細胞培地を加えて、あわせて８００μｌの培養量にした後に、細胞の播きムラが無いようによく混合した。２日に１回、ＥＳ細胞培地を交換した。解離後、７日以内にＥＳ細胞と思われる細胞集団が増殖し、コロニーとして出現するため、毎日観察した。
ＥＳ細胞のコロニーが出現したら、２４穴培養ディッシュ上の細胞をトリプシン処理し、継代増殖を繰り返した。この間、毎日または２日に１回の頻度でＥＳ細胞培地を交換した。その結果、カニクイザルの胚盤胞期胚から複数のＥＳ細胞株を得た。
（４）サルＥＳ細胞の評価
核型（ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）：
染色体数が正常（起源としたサルの染色体数と同じ数：２ｎ＝４２）であるか否かを調べた。この結果、樹立したＥＳ細胞株は、正常の核型を保持していた。
多分化能：
１×１０６個のカニクイザルＥＳ細胞を、８週齢のＳＣＩＤマウスの鼠径部に皮下注射した。注射後５ないし１２週後に、腫瘤の形成が認められた。該腫瘤をブアン液又はパラホルムアルデヒド液で固定後、薄切し、ヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）または免疫染色を施し、組織学的検査を行った。なお、免疫染色においては、利用できるサル組織特異抗体が極めて少ないことから、ヒトのニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、グリア線維性酸性蛋白（ＧＦＡＰ）、Ｓ−１００蛋白及びデスミンに対する抗体を用いた。
その結果、該腫瘤は、外胚葉（ニューロン、グリア）、中胚葉（筋肉、軟骨、骨）及び内胚葉（線毛上皮、腸管上皮）由来の細胞群で構成されるテラトーマであることがわかった。また、免疫組織学的検査において、ニューロンはＮＳＥ、グリアはＮＳＥ及びＧＦＡＰ、末梢神経はＮＳＥ、軟骨はＳ−１００蛋白、筋肉はデスミンに対する抗体によってそれぞれ検出された。以上の結果から、カニクイザルＥＳ細胞が多分化能（三胚葉性分化能）を有することが明らかとなった。
形態学的特徴：
１．高い核／細胞質比、顕著な核小体、コロニー形成を呈した。
２．マウスＥＳ細胞に比べて、コロニー形態が扁平であった。
細胞表面マーカーの発現：
ＥＳ細胞の特徴づけに用いられる細胞表面マーカーであるＳｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ（ＳＳＥＡ）の有無を確かめるために、ＳＳＥＡ−１（陰性対照）、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４の各細胞表面マーカーに対する抗体を用いて免疫染色を行なった。これらの抗体は、Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔより入手した。ＳＳＥＡの各細胞表面マーカーについて、下記操作により評価した：４％パラホルムアルデヒドで固定した細胞と１次抗体とを反応させた。ついで、次にアミノ酸ポリマーにペルオキシターゼと２次抗体を結合させた標識ポリマー（シンプルステインＰＯ、ニチレイ社製）を反応させた後、シンプルステインＤＡＢ溶液（ニチレイ社製）を加えて検出した。その結果、ＳＳＥＡ−１は検出されず、ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４が検出された。
アルカリホスファターゼ活性：
Ｆａｓｔ−Ｒｅｄ  ＴＲ  ＳａＨを基質として、アルカリホスファターゼ活性をＨＮＰＰ（ロッシュ社製）を用いて測定した。その結果、アルカリホスファターゼが検出された。
［実施例７］  サルＥＳ細胞の培養
Ｉ）フィーダー細胞の作製
上記実施例６と同様に、１２．５日齢のマウス胚から得たＭＥＦを、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地でコンフルエントになるまで、初代〜３代目の間で培養した。ついで、最終濃度１０μｇ／ｍｌのＭＭＣを含むＭＥＭ培地でＭＥＦを２〜３時間培養し、細胞分裂を不活性化した。その後、ＭＭＣを含む培地を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。トリプシン処理（０．０５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）により、細胞を回収し、細胞数をカウントした。
ゼラチンコートした２４穴培養ディッシュの各ウエルに２×１０４個のＭＭＣ処理されたＭＥＦを播種した。
ＩＩ）サルＥＳ細胞（ＣＭＫ−１株）の培養
実施例６に従ってＥＳ細胞培地を調製した。上記Ｉ）により作製したフィーダー細胞上にＥＳ細胞のＣＭＫ−１株（以下、ＣＭＫ−１ともいう）を播種した。このときＥＳ細胞は１個１個に解離せず、５〜１０個の細胞塊を播種するようにした。培地は、毎日または２日に１回の頻度で交換した。継代は４〜６日おきに行った。
継代においては、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、０．２５％トリプシン／ＰＢＳまたは０．１％コラゲナーゼ／ＤＭＥＭを加え、３７℃２〜１０分インキュベートした。ＥＳ細胞培地で細胞を懸濁し、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。この細胞を、１：２〜１：４の比率で、新しく用意したフィーダー細胞上に播種した。細胞を保存する際には、１０〜２０％ＤＭＳＯ／ＤＭＥＭまたは市販の細胞凍結保存液を使用した。
［実施例８］  サルＥＳ細胞（ＣＭＫ−１株）を用いた遺伝子導入実験
＜サルＥＳ細胞（ＣＭＫ−１株）への遺伝子導入＞
上記で作製したＥＧＦＰを発現するＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ＳＩＶベクター［自己不活性化（ＳＩＮ）型ベクター］（図４）を用いて、サルＥＳ細胞への遺伝子導入を行った。Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔｉｔｅｒ（有効力価）１．９×１０９／ｍｌのベクター溶液を用いた。
遺伝子導入前日にＣＭＫ−１を７．５×１０４個／ｍｌとなるようにフィーダー細胞（２．５×１０５個／ｍｌ）上に播種した。遺伝子導入当日（Ｄａｙ  ０）に、上記で調整した細胞を基準にしてＭＯＩ  １，１０，１００となるように上記ＳＩＶベクターをＥＳ細胞培地（実施例６）で希釈した。ポリブレン８μｇ／ｍｌを添加し、トランスダクションは１回行った。１０時間後に培地を交換した。翌日（Ｄａｙ  １）からは、５〜６日おきに１：３〜１：４の比率でフィーダー細胞上に継代した。
ＥＳ細胞（ＣＭＫ−１株）への遺伝子導入効率は、ＦＡＣＳｃａｎで求めたＥＧＦＰ発現率から以下の方法で計算した。ＣＭＫ−１はフィーダー細胞上で培養しているため、トリプシンで回収したサンプルにはＣＭＫ−１とフィーダー細胞が混在している。また、ＳＩＶベクターは、ＣＭＫ−１だけでなくマイトマイシンＣで処理したフィーダー細胞にも遺伝子導入が可能なので、ＥＧＦＰ発現細胞にはＣＭＫ−１とフィーダー細胞との両細胞が含まれている。ＣＭＫ−１だけのＥＧＦＰ発現率は、下記“１）フィーダー細胞のＥＧＦＰ発現率の測定”、および下記“２）ＣＭＫ−１とフィーダー細胞の細胞比測定”を用い、以下の補正式に従い求めた。
＜ＣＭＫ−１の遺伝子導入効率の補正式＞
各ＦＡＣＳサンプルにおけるＣＭＫ−１のＥＧＦＰ発現率をＥｃ、フィーダー細胞のＥＧＦＰ発現率をＥｆ、ＣＭＫ−１、フィーダー細胞全体のＥＧＦＰ発現率をＥｂとする。ＣＭＫ−１の細胞数をｃ、フィーダー細胞の細胞数をｆとすると、
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これより
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の補正式を得た。
１）フィーダー細胞のＥＧＦＰ発現率の測定
フィーダー細胞だけにＳＩＶベクターをＭＯＩ  １，１０，１００となるように遺伝子導入し、上記と同じ条件でＦＡＣＳ解析および継代を行った。
２）ＣＭＫ−１とフィーダー細胞の細胞比測定
ＣＭＫ−１とフィーダー細胞の識別は以下の方法で行った。ヒトの抗体である抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ  Ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−ＡＢＣ：ＲＰＥ，Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ．）はマウス細胞であるフィーダー細胞には反応しないが、カニクイザル細胞であるＣＭＫ−１には反応する。この抗体をＣＭＫ−１とフィーダー細胞の細胞懸濁液に反応させ、ＦＡＣＳを用いてＣＭＫ−１とフィーダー細胞の細胞比を測定した。
ＳＩＶベクターによるサルＥＳ細胞への遺伝子導入効率を測定した（図５）。ＣＭＫ−１への遺伝子導入効率は、上記の“ＣＭＫ−１の遺伝子導入効率の補正式”で示す方法によってフィーダー細胞の混入分の影響を除外した。遺伝子導入２日後にはＭＯＩ  １００で９０％以上、ＭＯＩ  １０で約８０％、ＭＯＩ  １で約６０％と、ＭＯＩ依存性の極めて高い遺伝子導入効率が認められ、しかもこの高い遺伝子導入効率は約２ヶ月以上持続した。また、ＥＧＦＰ遺伝子を導入されたＣＭＫ−１における平均蛍光強度の時間経過を調べたところ、約２ヶ月以上にわたりＥＧＦＰ発現細胞の平均蛍光強度はほとんど低下することはなかった（図６）。ＳＩＶベクターによってＥＧＦＰ遺伝子を導入したＣＭＫ−１（“ｇｒｅｅｎ”ＥＳ  ｃｅｌｌ）の顕微鏡写真を図７に示した。
［実施例９］  ＳＩＶベクターによるサルＥＳ細胞およびマウスＥＳ細胞への遺伝子導入効率
ＳＩＶベクターによる遺伝子導入効率がＥＳ細胞の種により異なるかどうか検討するため、マウスＥＳ細胞（Ｄ３株）に実施例８と同様の方法で遺伝子導入を行った。
具体的には、遺伝子導入前日にＣＭＫ−１を７．５×１０４個／ｍｌとなるようにフィーダー細胞（２．５×１０５個／ｍｌ）上に播種した。遺伝子導入当日（Ｄａｙ  ０）に、上記で調整した細胞を基準にしてＭＯＩが１、１０，１００となるように上記ＥＧＦＰを発現するＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ＳＩＶベクター［自己不活性化（ＳＩＮ）型ベクター］（図４）をＥＳ細胞培地（実施例６）で希釈した。ポリブレン８μｇ／ｍｌを添加し、遺伝子導入は１回のみ行った。１０時間後に培地を交換した。翌日（Ｄａｙ  １）からは、５〜６日おきに１：３〜１：４でフィーダー細胞上に継代した。マウスＥＳ細胞（Ｄ３株）は、遺伝子導入前日に１×１０５個／ｍｌの細胞をほぼ同数のフィーダー細胞上に播種した。フィーダー細胞はＣＭＫ−１のときと同じものを用いた。播種翌日に上記ＳＩＶベクターをＭＯＩが１０となるように培地に添加した。ポリブレン８μｇ／ｍｌを添加し、遺伝子導入は１回のみ行った。翌日（Ｄａｙ  １）から１日おきに１：８から１：１０でフィーダー細胞上で継代した。
ＭＯＩを１０でトランスダクションを行った各ＥＳ細胞における遺伝子導入効率を図８に示した。サルＥＳ細胞の遺伝子導入効率のほうがマウスＥＳ細胞のそれよりも高いことが認められた（図８）。ＳＩＶをベースとするベクターを用いる場合は、ＳＩＶが自然宿主とするサルなどの霊長類の細胞のほうが、マウスなどの異種の細胞に比べて、効率良く遺伝子導入されるものと考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明の霊長類由来ＥＳ細胞導入用のＶＳＶ−Ｇシュードタイプサル免疫不全ウイルスベクターは、ヒトを含む霊長類における発生学的研究、疾患研究、臨床応用、実験モデルにおいて有用である。また、本発明のベクターは、ＥＳ細胞からの組織または細胞の特異的分化を制御する遺伝子および試薬等のスクリーニングを可能にする。このスクリーニング方法によれば、所望の分化細胞または分化組織を得るのに有用な、組織または細胞の特異的分化を行なうための遺伝子および試薬等をスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、サル免疫不全ウイルスクローンＳＩＶａｇｍＴＹＯ１を用いたレンチウイルスベクターシステムの概要を示す図である。
図２は、５’ＬＴＲのプロモーター配列であるＵ３領域を他のプロモーター配列に置換したＳＩＶａｇｍジーントランスファーベクターの構造を示す図である。
図３は、ＳＩＶａｇｍジーントランスファーベクターの３’ＬＴＲのＵ３領域を他のプロモーター配列へ置換したベクターの構造と、それが標的細胞で逆転写された結果生じると予想される、５’ＬＴＲのＵ３プロモーター領域の構造を示した図である。
図４は、ＥＧＦＰをレポーターとして有するＳＩＮベクター（ｐＧＣＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＥＧＦＰ／３’ＬＴＲΔＵ３）の構造を示した図である（“ＳＩＮ−ＧＦＰ／ＳＩＶ”、または“ＳＩＮ  ＣＭＶ  ＥＧＦＰ”とも略記する）。３’Ｕ３を削り、自己不活性ベクター（Ｓｅｌｆ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ；ＳＩＶ  ｖｅｃｔｏｒ）化した。
図５は、ＳＩＶベクターによってＥＧＦＰ遺伝子を導入したＥＳ細胞（ＣＭＫ−１株）におけるＥＧＦＰ発現の時間経過を示す図である。横軸は遺伝子導入当日をＤａｙ  ０としその後の日数を示す。縦軸はＣＭＫ−１におけるＥＧＦＰ発現細胞の割合（％）を示す。ＣＭＫ−１の遺伝子導入効率は、実施例に記載の“ＣＭＫ−１の遺伝子導入効率の補正式”で示す方法によってフィーダー細胞混入分の影響を除外した数字を示してある。遺伝子導入２日後にはＭＯＩ  １００で９０％以上、ＭＯＩ  １０で約８０％、ＭＯＩ  １で約６０％と、ＭＯＩ依存性の極めて高い遺伝子導入効率が認められ、しかもこの高い遺伝子導入効率は約２ヶ月以上持続した。
図６は、ＳＩＶベクターによってＥＧＦＰ遺伝子を導入したＥＳ細胞（ＣＭＫ−１株）におけるＥＧＦＰ平均蛍光強度の時間経過を示す図である。横軸は遺伝子導入当日をＤａｙ  ０としその後の日数を示す。縦軸はＦＡＣＳ解析で得られたＥＧＦＰ平均蛍光強度（−）を示す。約２ヶ月以上にわたりＥＧＦＰ発現細胞の平均蛍光強度はほとんど低下することはなかった。
図７は、ＳＩＶベクターで遺伝子導入したＥＳ細胞（ＣＭＫ−１株）のＥＧＦＰ発現の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
上パネル：遺伝子導入後２１日経過（ｄａｙ  ２１）したＥＳ細胞の、蛍光顕微鏡による観察。ＥＧＦＰ蛍光を発しているＣＭＫ−１が島状に浮かび上がっている。
下パネル：遺伝子導入後６２日経過（ｄａｙ  ６２）したＥＳ細胞の、蛍光顕微鏡による観察。依然としてＥＧＦＰ蛍光を発しているＣＭＫ−１が島状に浮かび上がっている。
図８は、ＳＩＶベクターによるマウス及びサルＥＳ細胞（ＣＭＫ−１株）への遺伝子導入効率を示す図である。縦軸はフィーダー細胞の混入分の影響を除外したＥＳ細胞の遺伝子導入効率（％）を示した。サルＥＳ細胞の遺伝子導入効率のほうがマウスＥＳ細胞のそれよりも高いことが認められた。ＳＩＶをベースとするベクターを用いる場合は、ＳＩＶが自然宿主とするサルなどの霊長類の細胞のほうが、マウスなどの異種の細胞に比べて、効率良く遺伝子導入されるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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