(57)【要約】本発明は、光学活性１，２−ジオールおよびハロゲノヒドリンの合成に有用な酸化的脱ハロゲン化酵素遺伝子およびその大量発現法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなるハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ遺伝子。
【請求項２】
配列番号２及び３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号２及び３において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
ハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ活性が、下記式（１）〜（３）：
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（式中、Ｒは、アルキル基又はアリール基であり、Ｘは、Ｃｌ又はＢｒであり、ＰＭＳは、フェナジンメトサルフェートを表す）
に示す立体構造を有する１，２−ジオール化合物及びハロゲノヒドリン化合物のいずれかに対して、立体選択的なアルコールデヒドロゲナーゼ活性又は立体選択的な酸化的脱ハロゲン化活性である、請求の範囲第３項記載の遺伝子。
【請求項５】
ハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ活性が、上記式１に示す立体構造を有するハロゲノヒドリン化合物に対して、立体選択的な酸化的脱ハロゲン化活性である、請求の範囲第３項記載の遺伝子。
【請求項６】
ハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ活性が、上記式２及び３に示す立体構造を有する１，２−ジオール化合物に対して、立体選択的なアルコールデヒドロゲナーゼ活性である、請求の範囲第３項記載の遺伝子。
【請求項７】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項８】
組換えベクターが、プラスミドｐＵＣ−ＨＤＤ１である、請求の範囲第７項記載のベクター。
【請求項９】
請求の範囲第７項〜第８項に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
【請求項１０】
宿主が、大腸菌である、請求の範囲第９項に記載の形質転換体。
【請求項１１】
宿主が、アルカリゲネス属である、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１２】
宿主が、サッカロミセス属、キサントモナス属、アセトバクター属、シュードモナス属、グルコノバクター属、アゾトバクター属、リゾビウム属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、又はサルモネラ属から選択される、請求の範囲第９項に記載の形質転換体。
【請求項１３】
産生されるタンパク質１ｍｇ当たりのハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ活性が、遺伝子供与体によって産生される当該活性の１．１〜１．９倍である、請求の範囲第９項〜第１２項のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求の範囲第９項〜第１３項のいずれか１項に記載の形質転換体を用いるハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬、農薬、及び強誘電性液晶などに使用される光学活性化合物またはその中間体の合成において、有用なキラルビルディングブロックと成りうる光学活性１，２−ジオールおよびハロゲノヒドリンの製造において有用な生体触媒である酸化的脱ハロゲン化酵素（ハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ：ＨＤＤ）をコードする遺伝子とその遺伝子組換え微生物を用いる該ポリペプチドの大量製造に関するものである。すなわち、その酸化的脱ハロゲン化酵素ＨＤＤをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された形質転換体及びその形質転換体を用いる該酵素の製造方法に関する。
光学活性１，２−ジオール類の化学的な製法に関しては、古くは化学的方法として光学活性アミノ酸から１，２−ジオールに還元する製法（日本化学雑誌、９１巻、ｐｐ．２６５，１９７０）と光学活性１，２−エポキシグリシジル誘導体を相当する光学活性１，２−ジオールへ開環する製法（特開平１−１４６８３４）が知られている。最近ではＢｉＮＡＰ触媒（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．３２，ｐｐ．４１６３−４１６６，１９９１）やコバルトサレーン触媒（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７７，ｐｐ．９３６−９３８，１９９７）などの化学触媒を用いる製法が知られているが、高光学純度をもつ原料が必要であったり、反応条件が高温・高圧であったり、高価な触媒を必要とするなど、工業的に安価で経済的な製法とはいい難い。
生物学的製法ではＬｅｅとＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓによるグリセロールデヒドロゲナーゼを用いた還元反応による（Ｒ）体１，２−プロパンジオールおよび（Ｒ）体１，２−ブタンジオールの製法が知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５１，ｐｐ．２５−３６，１９８６。その他、真菌類のリパーゼを用いた３−クロロ−１，２−プロパンジオールとトリグリセリドとのエステル交換反応による光学活性３−クロロ−１，２−プロパンジオールとそのエステルの製法が知られている（特開平３−５３８８５）。また、安価なラセミ体化合物を原料とする微生物を用いた立体選択的な資化分割法では、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールより一方のエナンチオマーを資化させ、残存するもう一方のエナンチオマーを回収する製法が知られている（微生物資化法、特許公報平４−７３９９９）。しかし微生物による資化法は、反応に際して長時間を必要とするなどの問題が残されている。
このような点を解決するものとして、既に本発明者らは土壌より分離したアルカリゲネス属に属する細菌であるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３０９８）より、下記式（１）及び（２）に示すような、ハロゲノヒドリンに対する高立体選択的酸化的脱ハロゲン反応を触媒する酵素である、ハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ（以下、ＨＤＤと略す）を見出した（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．２７０−２７９，１９９４）。また、ＨＤＤは、下記式（３）に示す１，２−ジオール化合物に対する高立体選択的アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有することも見出した。以後、このユニークな酵素活性をＨＤＤ活性と省略する。ＨＤＤは、大小２つのポリペプチド（それぞれ分子量５８ｋＤａと１６ｋＤａ）からなる分子量７０ｋＤａのタンパク質である。
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したがって、ＨＤＤを使用することによって、そのＨＤＤ活性による触媒作用により、安価なラセミ体１，２−ジオールまたはハロゲノヒドリンから、（Ｓ）体１，２−ジオールまたは（Ｓ）もしくは（Ｒ）体ハロゲノヒドリンが選択的に分解除去され、残存する（Ｒ）体１，２−ジオール、または（Ｒ）もしくは（Ｓ）体ハロゲノヒドリンが回収される（特開平７−１４７９９３号公報，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｖｏｌ．５，ｐｐ．２３９−２４６，１９９４）。
本発明者等は、アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株から電気泳動分析において単一な酵素標品を得ることができたことにより、種々の遺伝子工学的手法を駆使してＨＤＤ遺伝子を単離し、その塩基配列ならびにアミノ酸の一次構造を決定することに成功し、本発明を完成するに至った。
発明の開示
本発明は、光学活性１，２−ジオールおよびハロゲノヒドリンの合成に有用な酸化的脱ハロゲン化酵素遺伝子およびその大量発現法を提供する。
本発明は、配列番号１の塩基配列からなるハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ遺伝子に関する。
また、本発明は、配列番号２及び３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子にも関する。
また、本発明は、配列番号２及び３において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子にも関する。
また、本発明は、上記の遺伝子を含有する組換えベクター、この組換えベクターを導入した形質転換体及びその形質転換体を用いるハロヒドリンデヒドロデハロゲナーゼの製造方法にも関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号１に示すＨＤＤ遺伝子は、例えばアルカリゲネスに属する微生物ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３０９８）の染色体ＤＮＡから分離することができる。その遺伝子供与体からのＨＤＤ遺伝子をもつＤＮＡ断片の取得は、例えば精製酵素ＨＤＤのポリペプチド鎖の部分アミノ酸配列をもとに行なうことができる。即ち、プロテインシークエンサーによりアミノ酸配列の一部を決定し、これをもとにしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用プライマーを合成する。次いでアルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行ない、ＨＤＤ遺伝子の一部を増幅して、その塩基配列を明らかにする。得られたＨＤＤ遺伝子の部分塩基配列をプローブとして、遺伝子供与体の染色体ＤＮＡから常法により作製したＤＮＡライブラリーよりハイブリダイゼーション法を用いて目的のＨＤＤをコードする遺伝子のＤＮＡ断片を得ることができる。
取得したＨＤＤ遺伝子のＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法としては、例えばジデオキシシークエンス法が挙げられる。この方法には、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する方法や核酸分解酵素により欠失させる方法などの、遺伝子工学分野で慣用される様々な手法が含まれる。これらの方法により、配列番号１で示される目的のＤＮＡ塩基配列中に大サブユニットと小サブユニットの全アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が確認できる。
本発明のＨＤＤをコードするＤＮＡは、ＨＤＤ活性を有するアミノ酸配列が実質的に配列番号２，３に示されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むことを特徴とする。ここで、ＨＤＤ活性を有する限り、配列番号２および配列番号３に示したアミノ酸配列についてアミノ酸の１個又は数個の欠失、挿入、置換等があってもよい。例えば、ＤＮＡがコードするアミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、挿入、置換等を生じるようにＤＮＡを改変することは、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法などの周知の方法で適宜行うことができる。また、配列番号１に示したＤＮＡまたは該ＤＮＡを適宜改変したＤＮＡを鋳型にして、Ｍｎ２＋イオンの存在下（通常０．５〜１０ｍＭの濃度）、または特定のヌクレオチドの濃度を低くしてＰＣＲ法を行うことによってランダムに変異が導入されたＤＮＡを得ることができる。
ＨＤＤの遺伝情報を担うＤＮＡ断片から必要な部分をベクターに組み込むことにより、宿主細胞に導入し形質転換体を得ることができる。導入された宿主細胞内で発現させるために用いられるベクターとしては、適当な宿主細胞内で、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に制限なく使用できる。
このようなベクターとしては、宿主細胞中で自律複製可能であり、さらに組換え宿主細胞のみを選別できるような適当な選択マーカーなどが付与されたものがあげられる。さらに、このようなベクターは公知のベクター等から公知の技術を用いて業者が容易に製造し得るようなものであってもよいし、商業的に販売されているものでも良い。
具体的なベクターとしては、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターがあげられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよいし、ランナウェイベクターやスリーパーベクターなどの遺伝子産物の発現効率を向上せしめるために特別に工夫されたものであってもよい。本発明のＤＮＡを微生物中で発現させるためには、それが有する遺伝情報を転写、翻訳させる必要がある。そのために本発明のＤＮＡを用いるベクターＤＮＡの適当な位置、かつ適当な方向に組み込む必要がある。また本ＤＮＡは、ＨＤＤの大小各サブユニットをコードする配列から、ヘテロ二量体として発現させなければならない。例えば大小各サブユニットをコードする配列がオペロンを形成している本ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡを適当な同制限酵素で消化切断し、５′−側上流にプロモーターを、３′−側下流にターミネーターがくるよう組み込めばよい。プラスミドベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に組み込んだｐＵＣ−ＨＤＤ１は効果的である。
更に本発明は、アミノ酸配列が配列番号２および配列番号３に示されているポリペプチドをコードするＤＮＡにより形質転換された、ＨＤＤ活性を有する酵素の産生能を有する微生物を提供する。
用いられる宿主細胞としては、得られた組換えベクターでもって形質転換され、かつ本遺伝子を発現させることができるようなものであれば特に制限なく使用することができる。このような宿主細胞としては、本発明の目的に沿って本遺伝子の発現を達成し得る限り、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用できる。
具体的に本発明で使用することのできる宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス属、サッカロミセス属、キサントモナス属、アセトバクター属、シュードモナス属、グルコノバクター属、アゾトバクター属、リゾビウム属、クレブシエラ属、サルモネラ属及びセラチア属から選ばれる微生物が挙げられる。特に好ましいのは大腸菌ＪＭ１０９株である。
形質転換体は、適当な栄養培地中で培養を行なうことにより大量に得ることができる。培養に用いられる培地は微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地であれば何でも良い。例えば炭素源としてグルコース，フラクトース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、プロピレングリコール等のアルコール類、酢酸，クエン酸，リンゴ酸，マレイン酸，フマル酸，グルコン酸とその塩類などの有機酸、またはそれらの混合物を用いることが出来る。窒素源として硫酸アンモニウム，硝酸アンモニウム，リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物および尿素，ペプトン，カゼイン，酵母エキス，肉エキス，コーンスチープリカー等の有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無機塩としてリン酸塩，マグネシウム塩，カリウム塩，マンガン塩，鉄塩，亜鉛塩，銅塩など、更に必要に応じてビタミン類を加えてもよい。また、高酵素活性を持った形質転換菌体を得るための酵素誘導添加物として、上記培地およびペプトン培地、ブイヨン培地等の栄養培地に使用する菌株に応じて、効果的に目的のＤＮＡを発現させるためにアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加してもよいし、イソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等のプロモーターの活性化誘導剤を用いることもできる。培養は好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜６０℃の任意の範囲に制御して１〜５日間培養を行えばよいが、用いる形質転換体により最適な条件で培養すると更に効果的である。
得られたＨＤＤ産生形質転換体の細胞から本酵素の抽出は次の方法で行うことが出来る。１）フレンチプレスや超音波破砕による機械的（物理的）方法、２）リゾチームなどの酵素処理方法、３）自己溶解法、４）浸透圧を利用した抽出法などの方法によって形質転換体を破壊して行うことができる。酵素の単離精製にあたっては、特開平７−１４７９９３号に記載の種々のカラムクロマトグラフィーを利用した方法が使用できる他、タグ付きのベクターを用いて親和性カラムによりアフィニティークロマトグラフィーを利用して簡便に行なうこともできる。
本方法で産生される酵素は、起源のアルカリゲネス属におけるＨＤＤのポリペプチド配列と一致するもののみに限定されず、塩基配列変換や遺伝子変換などの遺伝子組換え手法を利用して得られるポリペプチドで、ＨＤＤ活性を示すものと解すべきである。すなわちペプチド配列中のアミノ酸の１個又は数個が欠損したもの、あるいはそのペプチド配列中のアミノ酸の１個又は数個が他のアミノ酸で置き換えられたものをも包含する。
本発明に使用される形質転換体とは、上記の宿主細胞をＨＤＤ遺伝子で形質転換した細胞のことであり、好ましくは組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行なった組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）を挙げることができる。
実施例
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１  遺伝子のクローニング
（１）アルカリゲネス属からの染色体ＤＮＡの調製
アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３０９８）をＰＹＧ培地（１％ポリペプトン、１％酵母エキス、１％グリセリン）８ｍｌ中で２０時間培養し、遠心分離により菌体を回収した。菌体を４９０μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、１０％ＳＤＳを３０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫを５０μｌ添加し、５０℃で１時間インキュベートした。その後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）による抽出を行なった後、０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を添加し、０．６倍量の２−プロパノールを静かに重層した。その結果、界面に生じたＤＮＡをガラス棒で糸状に巻きつけて回収した。
得られたＤＮＡを５００μｌのＴＥ溶液に溶解させた。約１．７ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。
（２）プローブの作製
アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株からのＨＤＤを、鈴木等の方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．２７０−２７９，１９９４）にしたがって単離精製した。この精製ＨＤＤの２量体の各サブユニットをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、アクリルアミドゲルより回収した。大サブユニットについてＮ末端部分アミノ酸配列（配列番号４に示す）と、キモトリプシン処理を行ない、得られたペプチド断片の部分アミノ酸配列（配列番号５に示す）をアミノ酸シークエンサーで決定した。配列番号４及び５のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列をコドン縮重を考慮してＰＣＲプライマーを合成し（配列番号７及び８に示す）、上記（１）で抽出した全染色体ＤＮＡ５０ｎｇを鋳型にしてＰＣＲ反応（熱変性９６℃、３０秒、アニーリング４８℃、１分、伸長反応７２℃、１分）を４０サイクル行ない、４℃まで冷却後アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認し、ＤＮＡ断片を常法によりアガロースゲルより回収した。次いで、そのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８にサブクローニングし、塩基配列をＤＮＡシークエンサーで決定した。その結果、決定したＤＮＡ塩基配列中に、あらかじめ決定した大サブユニットの部分アミノ酸配列（配列番号４及び５）をコードする領域を確認できたので、得られた増幅ＤＮＡを常法に従って３２Ｐでラベルし、プローブＤＮＡとした。
（３）制限酵素地図の作成
上記で決定したＤＮＡ塩基配列の一部配列より合成したＰＣＲプライマー（配列番号９に示す）と、小サブユニットのＮ末端アミノ酸配列（配列番号６に示す）より合成した縮重プライマー（配列番号１０に示す）とを用いて上記反応と同様の方法でＰＣＲを行なったところ、ＤＮＡの増幅がアガロース電気泳動により確認できた。その結果、大サブユニットをコードする塩基配列（オープンリーディングフレーム：ＯＲＦ）のすぐ３′下流に小サブユニットのＯＲＦが存在することがわかった。次いで、抽出したＤＳ−Ｓ−７Ｇ株の染色体ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ない、染色体ＤＮＡに由来する塩基配列であることを確認すると共に、大、小それぞれのポリペプチドに相当するＯＲＦとその周辺の塩基配列について制限酵素地図を作成した。
（４）ゲノムライブラリーからの遺伝子のクローニング
作製した制限酵素地図から目的とするＨＤＤ遺伝子の全長が含まれることを考慮して、ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株の染色体ＤＮＡをＮｏｔＩ，ＰｓｔＩで切断後、約５３００塩基対に相当する多種類のＤＮＡ断片をｌａｃプロモーターとは逆向きにプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳの同制限酵素部位に挿入したゲノムライブラリーを作製した。これを大腸菌ＤＨ５α株に導入して得られた形質転換体３２０個体から、上記で作製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションにより８個体の陽性株を得た。挿入されていたＨＤＤ遺伝子の全長を図１に示す。
（５）塩基配列の決定
上記陽性株の一株から常法によりプラスミドを抽出し、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびマングマメのエンドヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）により挿入遺伝子断片を種々欠失させ、それぞれの試料の塩基配列をジデオキシ法により決定した。決定した塩基配列とその塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。配列番号４〜６に示す精製ＨＤＤの部分アミノ酸配列は、陽性株由来の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列から推定されるアミノ酸配列中に存在し、その部分アミノ酸配列が完全に一致した。
〔実施例２〕組換えプラスミドの作製
上記で抽出したプラスミドについて、ｌａｃプロモーターの支配下になるようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫのＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入し、組換えプラスミドｐＳＫ−ＨＤＤを得た。また、配列番号１に示した目的とする構造遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳのマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ部位にｌａｃプロモーターの支配下になるように挿入し、組換えプラスミドｐＫＳ−ＨＤＤ１を得た。また同様にｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、組換えプラスミドｐＵＣ−ＨＤＤ１を得た（図２）。
〔実施例３〕組換え大腸菌の作製
常法により実施例２で得た組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行ない、組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳＫ−ＨＤＤ）、ＪＭ１０９（ｐＫＳ−ＨＤＤ１）、ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）を得た。なお、宿主に大腸菌ＤＨ５αを用いた場合、形質転換体を得ることはできなかった。
〔実施例４〕組換え大腸菌におけるＨＤＤの発現
（１）組換え大腸菌で発現したＨＤＤの評価
実施例３で得た形質転換体ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）を試験管に５ｍｌ入ったＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）で、１６時間、３０℃で好気的に種培養し、１ｍｌを３００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに入った新しいＬＢ培地５０ｍｌに移植した。Ｏ．Ｄ．が０．５になるまで培養し、１ｍＭのＩＰＴＧによる２時間誘導後、形質転換体を集菌した。また、アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株については、同三角フラスコに入ったＰＹＧ培地（１％ポリペプトン、１％酵母エキス、１％グリセリン）を２０時間３０℃で好気的に種培養したものを集菌した。各々の試料を５ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁して超音波破砕（２０ｋＨｚ、２０Ｗ）により破砕し、遠心操作により不要物を除去して細胞抽出液を得た。これをポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ）に供し、泳動後にＨＤＤ活性による活性染色を行った。反応液として、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に０．５ｍＭフェナジンメソサルフェート（ＰＭＳ）、０．５ｍＭテトラニトロテトラゾリウムブルー、基質として０．２％（ｖ／ｖ）（Ｒ）体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを添加した溶液を調製し、電気泳動後のゲルを２０分間浸してＨＤＤ活性を基にした活性染色を行なった（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｖｏｌ．５，ｐｐ．２３９−２４６，１９９４）。
その結果、ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）からの抽出液では、アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来のＨＤＤのものと同じ位置に染色バンドが観察されたのに対し、ベクタープラスミドのみの形質転換体ＪＭ１０９（ｐＵＣ１８）では染色バンドはみられなかった。したがって、組換えプラスミドによって形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）が産生するＨＤＤは、ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来のものと同一のものであることが明らかになった（図３）。
（２）組換え大腸菌におけるＨＤＤ活性の測定
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に０．２５ｍＭフェナジンメソサルフェート（ＰＭＳ）、０．２５ｍＭ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、０．２％（ｖ／ｖ）各種基質を加えた反応液を調製し、この２．７ｍｌに実施例４の（１）と同様の方法で調製したＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）細胞抽出液３００μｌを加え、３０℃で１０分間反応させた。ＨＤＤ活性は、ＤＣＩＰの還元による６００ｎｍの吸光度の減少を利用した比色定量により行なった（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｖｏｌ．５，ｐｐ．２３９−２４６，１９９４）。基質の２，３−ジクロロ−１−プロパノールは、式（１）に、３−クロロ−１，２−プロパンジオールは、式（２）に、１，２−プロパンジオール、１，２，４−ブタントリオールは、式（３）の反応式の基質に相当する。その結果、組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）の細胞抽出液は、アルケリゲネスＤＳ−Ｓ−７Ｇ株同様に各々の基質に対して立体選択性を有し、さらにタンパク質１ｍｇ当たりの活性は、ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株の約１．１〜１．９倍であった。その結果を表１に示す。なお、１Ｕは、３０℃で１分間あたりに１μモルのＤＣＩＰを還元する酵素量を表わし、結果はタンパク質１ｍｇ当たりの活性として表した。タンパク質の定量は、ブラッドフォード法により行った。
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また、組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳＫ−ＨＤＤ）、ＪＭ１０９（ｐＫＳ−ＨＤＤ１）についても同様に（Ｒ）体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを基質としてＨＤＤ活性を測定したところ、活性はＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）より低かった（表２）。
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（３）組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）由来ＨＤＤの熱安定性の評価
実施例４の（１）と同様の方法で調製したＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）の細胞抽出液３００μｌを３０℃〜６０℃で１５分静置後（２）と同様の方法で（Ｒ）体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを基質として３０℃で反応させた。その結果、４０℃以上でアルケリゲネスＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来の細胞抽出液と比較して組換え大腸菌由来の細胞抽出液のＨＤＤ活性は熱安定性が増していた。３０℃での活性に対する相対活性が５０％に減少する温度は、アルケリゲネスＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来の酵素では４４℃、また組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）由来の酵素では５０℃であった（表３）。
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アルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株は、ＨＤＤ活性を約５倍上昇させるタンパク質を有していることが確認されている（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．２７０−２７９，１９９４）。これに対して、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）由来細胞抽出液のタンパク質１ｍｇあたりのＨＤＤ比活性は、ＨＤＤ遺伝子発現のみでアルカリゲネス属ＤＳ−Ｓ−７Ｇ株由来の抽出液よりも１．１〜１．９倍高活性であり、熱安定性も向上した。ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４０３として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、医薬、農薬、及び強誘電性液晶などに使用される光学活性化合物またはその中間体の合成において、有用なキラルビルディングブロックとなりうる光学活性１，２−ジオールおよびハロゲノヒドリンの製造を効率よく実施することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳにクローニングされたＨＤＤ遺伝子を含む領域の制限酵素地図、ならびに大小２つのサブユニットのＯＲＦを示す図である。ＯＲＦを挟むＥｃｏＲＩ部位間で塩基配列の決定を行なった。
第２図は、ｐＵＣ−ＨＤＤ１の制限酵素地図である。クローニングされたＨＤＤ遺伝子のＯＲＦを挟むＥｃｏＲＩ部位間をｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。
第３図は、Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ活性染色後のゲル写真である。左のレーンから、１）ＤＳ−Ｓ−７Ｇ（アルカリゲネス属）、２）ＪＭ１０９（ｐＵＣ−ＨＤＤ１）、３）ＪＭ１０９（ｐＵＣ１８）を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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