(57)【要約】要約書なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンギオポエチンをコードするベクターまたはアンギオポエチンを血管新生遺伝子をコードするベクターまたは血管新生遺伝子がコードする蛋白投与前に投与処置することを特徴とした局所投与治療方法。
【請求項２】
局所投与が筋肉内投与である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管新生遺伝子がＶＥＧＦ１２１または１６５である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アンギオポエチンがアンギオポエチン１である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アンギオポエチンを血管新生遺伝子の前に発現または投与させることにより正常な血管新生を促進させる遺伝子治療に関する。
背景技術
近年、血管新生を誘導する増殖因子を用いた虚血疾患に対する治療の関する研究が進められている。例えば、心筋梗塞や急性虚血肢に対して、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）（Ｂａｆｆｏｕｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１６（２）：１８１−９１，１９９２）や内皮細胞増殖因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＣＧＦ）（Ｐｕ，Ｌ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５４（６）：５７５−８３，１９９３）の投与による治療効果が調べられている。より最近では、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ／ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＰＦ）が、心筋虚血および肢虚血の動物モデルにおいて、血管形成を促進することが示されている（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０（５  Ｐｔ  ２）：ＩＩ２２８−３４，１９９４；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３（２）：６６２−７０，１９９４）。
ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）は血管内皮細胞に特異的な増殖因子またＶＰＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ）血管透過性亢進因子として１９８９年に報告され現在ＶＥＧＦ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅに分類されている。ＶＥＧＦ  Ａはさらに６種類のサブタイプに分けられそのうち可溶性のＶＥＧＦ１２１，１６５が特に強い血管増殖能を持つとされ現在臨床応用されている。その作用は胎生期の血管形成にも関与し低酸素のもと増強され、さらにはＮＯの合成、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞の遊走にまで幅広い作用が報告されている。また一方で、ＶＥＧＦの過剰発現は血管新生シグナルのバランスを崩し、血管腫様の脆弱毛細管を形成する可能性が考えられる（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．６，１１０２−１１０３（２０００））。また、ＶＥＧＦをｉｎ  ｖｉｖｏで血管壁へ遺伝子導入した場合、血管腫様の内皮増殖により新生内膜の顕著な肥厚をもたらし、赤血球の血管外遊出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を引き起こし得る（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５，３１３−３２３（１９９６））。またレトロウイルスを用いて心筋に恒常的にＶＥＧＦを過剰発現させた場合でも同様の病理所見が観察されている（Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２，８９８−９０１（２０００））。
主幹動脈が急性に閉塞することにより発症する急性重症虚血肢は主に血栓性閉塞に起因し、血管新生治療の対象となる重要な虚血疾患の一つで、急性重症虚血肢の後期治療の成績は極めて不良であり、多くの場合肢切断に至る。さらに肢切断に至った患者の生命予後も不良であり、１年生存率は５０％と低い。このため胚性幹細胞（ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ−１陽性細胞）から血管を再生する手法が研究されている（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８（２）：９２−９６，２０００）。血管は内皮細胞と壁細胞（ペリサイトと平滑筋細胞）から成り、生体内では血管新生と退縮という動的な恒常性が維持されている。現在のところ、萌出（ｓｐｒｏｕｒｉｎｇ）、分岐（Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）、融合（ｆｕｓｉｏｎ），嵌入（ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｏｎ）などの複雑な変化がどのような分子機構で派生し、内皮細胞が移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、離解（ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）、接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）などをタイミング良く機能的に実現するのかは明らかになっていない（須田年生  実験医学５月号  １９（７）：８２６−８２９（２００１））。
また、血管新生を誘導する増殖因子を用いたヒト遺伝子治療の臨床試験が開始され、これを重症の虚血肢の血管新生治療に対して臨床応用する研究が進められている。内皮細胞特異的な増殖因子である血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）はこの目的にかなう治療遺伝子と見なされている。閉塞性動脈硬化症やバージャー病に代表される末梢性血管疾患は、歩行時疼痛（間歇性跛行）、安静時疼痛、下肢の組織障害（壊死）などの臨床症状を示す。現在、末梢血管閉塞による安静時疼痛や虚血性潰瘍のある患者に対する有効な治療はなく、血管拡張術および外科的血行再建術が困難な場合、下肢切断が余儀なくされている。そこで、血管新生因子による側副血行路形成による新しい治療法−治療的血管新生（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）−が提唱された。
実際、ＩｓｎｅｒらはＶＥＧＦ遺伝子を用いた血管新生を報告し、プラスミドベクターを用いたヒトへの遺伝子導入において比較的良好な治療効果が報告されている（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７，１１１４−１１２３（１９９８）；Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２８，９６４−９７３（１９９８））。Ｉｓｎｅｒらは２つの異なった遺伝子治療臨床研究、１）カテーテルによる血管壁へのＶＥＧＦ遺伝子導入、２）注射器によるＶＥＧＦ遺伝子の筋肉内への投与、を開始している。特に、後者では、７０−８０％の救肢率が報告されている。また血管内遺伝子導入および筋肉内遺伝子導入は、臨床試験においていかなる免疫反応による毒性も示さず、すでに１００人以上の患者の治療が終了し、良好な成績が報告されている。ＶＥＧＦの筋中遺伝子投与の有害な副作用や毒性レベルについては、現在のところほとんど報告がない。しかしながら、最近の報告によれば、トランスジェニック（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，２５１１−２５１４（１９９９））またはアデノウイルス（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．６，４６０−４６３（２０００））によるＶＥＧＦの過剰発現が、遺伝子を導入された動物において異常な血管形成を起すこと、さらにプラスミドによる筋中へのＶＥＧＦ遺伝子導入が、ヒトの虚血肢において一過的な浮腫を起すことが示されている（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７，１１１４−１１２３（１９９８）；Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２８，９６４−９７３（１９９８）Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．；１３２，８８０−８８４，（２０００））。
これまでに、ＶＥＧＦ単独投与による血管新生治療の欠点である血管透過性の亢進を改善する具体的かつ実用的な方法は全く知られていなかった。
発明の開示
本発明は、遺伝子治療または薬物治療においてＶＥＧＦ単独投与による血管新生治療の欠点である血管透過性の亢進を防止するために、アンギオポエチンをＶＥＧＦの前に投与することにより、浮腫の副作用が起こらず、高い血管新生誘導効果が得られる方法を提供する。
ＶＥＧＦファミリーと同様に血管内皮に特異的に作用する調節因子としてアンギオポエチン１（Ａｎｇ１）およびアンギオポエチン２（Ａｇｎ２）とその受容体Ｔｉｅ２が知られている。アンギオポエチンはＴｉｅ−２チロシンキナーゼ受容体のリガンドであり血管新生の際の血管成熟に関与しているとされ、現在知られているサブタイプは４種類で１，２がＴｉｅ−２レセプターに結合する。Ａｎｇ２はＡｎｇ１の内在性のアンタゴニストとして働くことが推定されている（Ｓａｉｔｏ，Ｔ．Ｎ．；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ  ３７６，７０−７４，（１９９５））。Ａｎｇ２はＶＥＧＦの働きにより選択的に誘導されることも知られている（Ｏｈ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１５７３２−１５７３９（１９９９））。Ａｎｇ１のＶＥＧＦとの違いは血管内皮細胞の増殖能がなく、血管周皮細胞の結合に関与し、ＶＥＧＦにみられる血管透過性の亢進が認められない点である。血管新生において内皮−周皮細胞の相互作用が重要な調節機構として働くことが知られている。周皮細胞は内皮細胞と接着することにより内皮細胞の分化や増殖抑制に働く。この機構にはＴＧＦ−βの活性化や囲い込みによる物理的バリアの形成が関与していると考えられている（Ｄ’Ａｍｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４５４４＋４５４８（１９８９））。
本発明者等はＫｏｕ−Ｇｉ  Ｓｈｙｕらによるアンギオポエチンの効果検討の報告で、プラスミドｐＡｎｇ１またはｐＡｎｇ２をウサギモデルに投与しｐＡｎｇ１でＡＧ  ｓｃｏｒｅ、血流、血管径、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｅｎｓｉｔｙの改善をみたとの報告がある（Ｋｏｕ−Ｇｉ  Ｓｈｙｕ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．９８，２０８１−２０８７（１９９８））ことを参考にして、ＶＥＧＦの働きが開始される前に、周皮細胞間の相互作用をあらかじめ誘導することの新生血管形成に対する有効性を独自に推定し実験をはじめ、その有効性を実証した。
一方、Ｔｈｕｒｓｔｏｎらはアデノウイルスベクターを用いたアンギオポエチン１の導入がＶＥＧＦによる透過性亢進をおさえることをＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅを用いた血管透過性評価モデルで示している（Ｇａｖｉｎ  Ｔｈｕｒｓｔｏｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，Ｖｏｌ  ６，Ｎｏ  ４，４６０−４６３，（２０００））。しかしながら別の研究によるとプラスミドｐＡｎｇ１とｐＶＥＧＦのウサギモデルへの同時投与による評価の結果、ｐＶＥＧＦプラスミド単独投与との差はほとんどないことが知られている。（Ｃｈａｅ  ＪＫ，Ａｒｔｅｒｉｏ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏ．２０，２５７３−２５７８（２０００））
本発明者等は両遺伝子の発現時期に注目し、アンギオポエチンをＶＥＧＦ投与の前に投与することにより、浮腫の副作用が起こらず、高い血管新生誘導効果が得られる局所投与手順を見いだした。
即ち、アンギオポエチンをＶＥＧＦの前に投与することにより、浮腫の副作用が起こらず、高い血管新生誘導効果が得られる方法に関し、より具体的には、
（１）アンギオポエチンをコードするベクターまたはアンギオポエチンを血管新生遺伝子をコードするベクターまたは血管新生遺伝子がコードする蛋白投与前に投与処置することを特徴とした局所投与治療方法、
（２）局所投与が筋肉内投与である、（１）に記載の方法、
（３）血管新生遺伝子がＶＥＧＦ１２１または１６５である、（１）または（２）に記載の方法、
（４）アンギオポエチンがアンギオポエチン１である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法を、提供するものである。
なお、本発明において「血管新生遺伝子」とは血管構成に関与する細胞の発生、遊走、増殖、成熟に直接、あるいは間接的に関わる遺伝子を意味する。
本発明者等は比較的安全性の高いプラスミドベクターを使用し、且つあらかじめＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１を、次いでＶＥＧＦ１６５をウサギの下肢虚血モデルに筋肉内注射することにより血管透過性の少ない血管新生を鋭意検討し、治療効果を実証した。治療対象疾患としては、例えば１）末梢の血管疾患、閉塞性動脈硬化症など、２）心疾患、狭心症・心筋梗塞など、３）腎疾患、腎炎など、４）肺疾患、神経疾患等があげられるが、その他血管新生の誘導が有効な疾患であれば特に制限はない。治療対象は虚血組織以外にも、厳密には必ずしも虚血組織とは言えなくても、機能の良い血管が新たに形成または再編成されることで治療効果が得られるような病態や疾病をすべて含んでも良い。たとえば腎炎、糖尿病性の腎症。難治性の潰瘍。骨髄炎などの難治性の慢性ないし急性の感染。脳神経外科領域のモヤモヤ病、その他の脳神経外科領域の血管性疾患などがあげられる。投与部位となる筋肉は骨格筋、心筋、平滑筋、など、筋肉の種類を問わない。さらに投与部位は、筋肉に限定されない。皮膚（表皮、真皮）、動脈、静脈（門脈を含む）、リンパ管、腎臓、漿膜、骨膜、結合組織、骨髄、などへの投与を含む。局所投与により治療効果を実質的に実現する方法は、ベクターないし蛋白の直接投与、ないし、キャリア及び担体を用いた投与が挙げられる。担体は、生理的に許容できるもので、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などがあげられる。更に担体はこれらの生理的に許容される材料の混合組成物でも良い。注入手段は通常の医療用注射器または、体外および体内に留置される持続注入器などの工業製品があげられる。用いるベクターは生理的に許容されるベクターならば特に制限はなく、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、あるいは非ウイルスベクターも含めて、どんなベクターでも利用しうる。またベクターはベクターにより処理された患者自身の細胞の形態で利用することを含む。
発明を実施するための最良の形態
実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、本実施例においては、以下の文献に基本的に従って実験を行った。
１、Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ  ９３，６６２−６７０，１９９．
２、Ｙｕｋｉｏ  Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９６；９４：３２８１−３２９０．ウサギ下肢モデルを確立しｐＶＥＧＦの投与によってＡＧ  ｓｃｏｒｅ、ＢＰＲ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｅｎｓｉｔｙが改善されるのを示した。さらに上記に血流改善もとりいれた評価方法。
３、Ｉｒｉｓ  Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２０００；１３２，８８０−８８４．実際９０人にｐＶＥＧＦを投与し下肢の浮腫についての評価方法。
４、Ｋｏｕ−Ｇｉ  Ｓｈｙｕ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９８；９８，２０８１−２０８７．ｐＡｎｇ１またはｐＡｎｇ２をウサギモデルに投与しｐＡｎｇ１でＡＧ  ｓｃｏｒｅ，血流、血管径、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｅｎｓｉｔｙの改善についての評価方法。
５、Ｇａｖｉｎ  Ｔｈｕｒｓｔｏｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，Ｖｏｌ  ６，Ｎｏ  ４，２０００，４６０−４６３．
６、Ｇ．Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ２８６，１９９９，２５１１−２５１４．Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅを用いた血管透過モデルでアデノを用いたＡｎｇ１の導入がＶＥＧＦによる透過性亢進をおさえる改善についての評価方法。
７、Ｌｉｏｕｂｏｖ  Ｐｏｌｉａｋｏｖａ，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １９９９；１１８，３３９−３４７．アデノによるＶＥＧＦを導入したウサギモデルの陰嚢サイズと下腿周径の変化を経時的評価方法。
また、本実施例においては、データは平均±ＳＥＭとして表した。統計比較はＡＮＯＶＡに続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とみなした。
［実施例１］  使用プラスミド
（１）ＶＥＧＦをコードするＤＮＡは、ヒトグリオーマＵ２５１細胞から抽出したＲＮＡを鋳型として、＃１１９１：ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴ（配列番号：１）、および＃１１９２：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡ（配列番号：２）のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで得た。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切って、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ＋のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイトへクローニングし、プラスミドを得た。このプラスミドの塩基配列を確認したあと、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をきりだし、ｐＣＡｃｃ（図１）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩへクローニングし、ｐＣＡｈＶＥＧＦ（図２）を得た。対照ベクターｐＣＡｃｃ（Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９７）は、以前に報告されたｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａら、１９９１）に由来する。
（２）アンギオポエチン１（ＧｅｎＢａｎｋのＨＳＵ８３５０８（Ｕ８３５０８））をコードするＤＮＡは、ヒト骨髄細胞（骨髄穿刺して得た細胞のうち、ディシュに付着する細胞、いわゆる骨髄ストローマ細胞）から抽出したＲＮＡを鋳型として、＃１４３５：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧ（配列番号：３）、および＃１４３６：ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＡＴＣＡ（配列番号：４）のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで得た。得られたＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩで切断して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ＋のＢｇｌＩＩサイトへクローニングし、プラスミドを得た。このプラスミドの塩基配列を確認したあと、ＢｇｌＩＩ断片をきりだし、ｐＣＡｃｃ（図１）のＢｇｌＩＩサイトへクローニングし、ｐＣＡｃｃｈＡｎｇ１ａ（図３）を得た。クローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号：５示す。
また、ｐＣＡｃｃｈＡｎｇ１ａのアンギオポエチンｃＤＮＡ断片を鋳型にして、＃１６４１：ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣ（配列番号：６）、および＃１６３８：ＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＣＧ（配列番号：７）のプライマーを用いてＰＣＲを行なった。これで得られた断片をＥｃｏＲＩで切って、ｐＣＡｃｃｈＡｎｇ１ａのＥｃｏＲＩ断片と入れ替えた。これによりコザックコンセンサス配列を持つヒトアンギオポエチンｃＤＮＡを発現するｐＣＡｃｃｈＡｎｇ１を得た。クローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号：８示す。
［実施例２］  動物モデル
Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔ（ｍａｌｅ，３．０−３．５ｋｇ）を使用した。ケタラール（三共）３ｍｌ＋キシラジン（第一製薬）１ｍｌによる麻酔導入後、左大腿部鼠径靱帯より膝にかけて皮切をおき大腿動脈を露出した。分枝を全て結紮切離し大腿動脈を切除した。これを１０日おいたものを慢性下肢虚血モデル、すなわちウサギ下肢虚血モデル（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ  ９３，６６２−６７０，１９９４）とした。比較検討は３群について行われモデル作成日（ＯＰＥ  ｄａｙ）の１０日後（Ｄａｙ  １０）、もしくは１０日後（Ｄａｙ  １０）と１５日後（Ｄａｙ  １５）にプラスミドの筋肉内投与を行った。投与方法は各々のプラスミド５００ｕｇをＰＢＳ  ２．５ｍｌに溶解し虚血側の大腿内側に小切開をおき内側広筋、内転筋、半膜様腱筋（内側広筋に２ケ所、内転筋に２ケ所、半膜様筋に１ケ所）に直接注入した。２７Ｇ針によって一ケ所に５００ｕｌ、計５箇所にゆっくりとおこなった。
動物モデルをプラスミドの投与スケジュール（図４）に従って以下の６群に分けた。
１．対照ウサギ（Ｃ群）、Ｄａｙ  １０にプラセボ（ｐＣＡｃｃ）を５００μｇ投与（ｎ＝８）。
２．ＶＥＧＦ単独（Ｖ群）、Ｄａｙ  １０にＶＥＧＦを５００μｇ投与（ｎ＝１０）。
３．Ａｎｇ１単独（Ａ群）、Ｄａｙ  １０にＡｎｇ１を５００μｇ投与（ｎ＝７）。
４．Ａ＋Ｖ群、Ｄａｙ  １０にＡｎｇ１とＶＥＧＦの両方をそれぞれ５００μｇ投与（ｎ＝７）。
５．Ａ−Ｖ群、Ｄａｙ  １０にＡｎｇ１を５００μｇ投与した後、Ｄａｙ  １５にＶＥＧＦを５００μｇ投与（ｎ＝１０）。
６．Ｖ−Ａ群、Ｄａｙ  １０にＶＥＧＦを５００μｇ投与した後、Ｄａｙ  １５にＡｎｇ１を５００μｇ投与（ｎ＝７）。
［実施例３］  浮腫評価
ＶＥＧＦの主な副作用の一つである浮腫を陰嚢面積（Ｓｃｒｏｔｕｍ  ｓｉｚｅ）、下肢周径を測定することにより評価した。患側陰嚢をＤａｙ  １０，１５，２０，４０にデジタルカメラにて撮影しＤａｙ  １０の面積を１００％としその変化をみた。下肢周径も同様に患側膝下の周径をＤａｙ  １０，１５，２０，４０に測定しその変化をみた。
ＶＥＧＦ単独投与による浮腫の代表的所見を図５に示すが、これには静脈拡張を伴う陰嚢面積の増加が認められる。プラスミドＤＮＡを投与したすべての群で、陰嚢浮腫は壊死などの炎症性変化の後に起こったものではなかった。Ｄａｙ  １０にプラスミドＤＮＡの筋肉内注射を行う前の平均陰嚢サイズは７．１４±１．０６ｃｍ２であり、Ｄａｙ  １０の値と比較した陰嚢サイズの変化率を表１に示した。
【表１】
2002100441.tif 000002
ａｐ＜０．０５（対照群との比較）、ｂｐ＜０．０１（対照群との比較）である。
Ｄａｙ  １５には、Ｖ群（１４０．１±１１．１％、ａｐ＜０．０１）およびＶ−Ａ群（１１７．９±４．４％、ａｐ＜０．０５）で、Ｃ群（１０１．６±２．７％）に比べて浮腫の統計学的に有意な増加が認められた。Ｖ群とＶ−Ａ群では浮腫サイズの増加がＤａｙ  ２０，４０にも続いていたが、これらの増加の有意性は境界域であった。この実験でＡ−Ｖ群には試験期間を通じて陰嚢サイズの増加は認められなかった。以上の結果は、Ｖ群およびＶ−Ａ群では遺伝子注入後１０日間という短い期間にわたって全身浮腫が生じたことを示している。これに対して、アンジオポエチン−１を前投与するとＶＥＧＦによって誘導される全身浮腫が予防されたように思われる。さらに、後肢下部における局所浮腫の指標として後肢周囲長の変化も評価した。Ａ−Ｖ群には限局性浮腫の増加は認められなかったが、Ｖ群、Ａ＋Ｖ群およびＶ−Ａ群ではＣ群と比較して限局性浮腫の増加が認められた。
［実施例４］  新生血管密度測定
Ｄａｙ  １０，４０に患側のＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ染色による内腸骨動脈血管造影を施行、血管新生の評価をＡｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｃｏｒｅ（ＡＧ  ｓｃｏｒｅ）として評価した。血管造影は麻酔導入後、右内頚動脈より２．７Ｆｒのインフージョンカテーテルを挿入し患側の内腸骨動脈に選択的に挿入した。ニトロール０．２５ｍｇ注入の後、造影剤３ｍｌ（造影剤３ｍｌを５秒間で注入）による血管造影を行った。ＡＧ  ｓｃｏｒｅは大腿部に５ｍｍ四方のグリッドを５ｍｍ間隔に置いて血管がグリッド内にある場合１とし、なければ０とした。ＡＧ  ｓｃｏｒｅは血管があるグリッドの総数／グリッド総数とした。
Ｄａｙ  １０には、Ｃ群、Ｖ群、Ａ群、Ａ＋Ｖ群、Ａ−Ｖ群およびＶ−Ａ群の間にＡＧ  ｓｃｏｒｅの差はなかった（それぞれ０．０８±０．０２、０．１１±０．０２、０．０７±０．０４、０．０８±０．０３、０．０７±０．０２および０．０８±０．０２）。しかしＤａｙ  ４０には、Ｖ群、Ａ群およびＡ−Ｖ群のＡＧ  ｓｃｏｒｅは対照群よりも高かった（Ｃ群：０．２９±０．０５、Ｖ群：０．６４±０．０５ａ、Ａ群：０．５２±０．０３ａ、Ａ−Ｖ群：０．５８±０．０２ａ；ａｐ＜０．０１）（表２）。５つの投与群の間に有意差は認められなかった。図６に示した代表的な血管造影所見は、この６群における大腿内側での新生血管形成の差を数および内径に関して示している。実際に、尾部臀動脈の近位側の内径に関してはＡ−Ｖ群の方が対照群よりも大きかった（Ｃ群：０．７７±０．０２ｍｍ、Ａ−Ｖ群：１．０１±０．０３ｍｍａ；ａｐ＜０．０１）（表２）。さらに、Ａ−Ｖ群の血管内腔はＶ群（０．７６±０．０５ｍｍ）に比べて大きく（ｐ＜０．０１）、アンジオポエチン−１の前投与がより太い血管の形成をもたらした可能性が示唆された。また、Ｖ群では血管形成数が多い傾向が認められ、Ａ−Ｖ群では大腿中部に形成された血管内径が太い傾向が認められた。
【表２】
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ＡＧ  ｓｃｏｒｅは、血管造影ｓｃｏｒｅを示す。ａｐ＜０．０１（対照群との比較）、ｂｐ＜０．０１（Ｖ群との比較）である。
［実施例５］  血圧比測定
Ｄａｙ  １０，４０に施行。両側後頸骨動脈をドップラーによって探し、血圧を測定。患側圧／健側圧をＢＰＲ（Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｒａｔｉｏ）とし体循環の指標とした。
血行動態の改善は、選択的血管造影、腓腹部血圧（ＣＢＰ）および安静時血流（ＲＢＦ）により、Ｄａｙ  １０，４０に評価した。具体的には、以前の記載の通りに（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、１９９４）、血圧計に接続したドップラー流量計（Ｄａｔａｓｃｏｐｅ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ）とカフを用いて、Ｄａｙ  １０，４０に各モデルの両側後肢で腓腹部体血圧（ＣＢＰ）を測定した。各モデルに対して、虚血肢／正常肢の収縮期ＣＢＰの比としてＣＢＰ比を評価した。
プラスミドＤＮＡの筋肉内注射（Ｄａｙ  １０）の前には全群間にＣＢＰ比の差はなく、重症虚血が術側後肢に生じたことが示された。しかしＤａｙ  ４０のＣＢＰ比は、Ａ−Ｖ群（８６．０±８．１％、ａｐ＜０．０１）がＣ群（５１．７±６．９％）よりも有意に高かった（表３）。
局所組織における血液潅流の改善に関する評価も行った。具体的には、内転筋である大内側筋および半膜様筋に経皮的プローブ（Ｐ−４３０、ＬＡＳＥＲＦＬＯ  ＢＰＭ２、Ｖａｓａｍｅｄｉｃｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を装着することにより、Ｄａｙ  １０，４０に虚血肢の安静時血流（ＲＢＦ）を調べた。虚血肢のＲＢＦは上記の領域の４箇所での平均ピーク速度と定義し、ＲＢＦ比はＤａｙ  ４０のＲＢＦをＤａｙ  １０の値で割ったものと定義した。Ｄａｙ  １０には術側肢のＲＢＦに関して６群間に差はみられなかった。Ｄａｙ  ４０の血流予備能の変化を表３に示す。Ｄａｙ  ４０のＲＢＦとＤａｙ  １０のＲＢＦとの比の算出値から、Ａ−Ｖ群（２３４．８±１２．５％、ａｐ＜０．０１）ではＣ群（１３９．６±１０．４％）に比べて有意な改善が認められたが、他の群における血液潅流の程度はＡ−Ｖ群よりも低かった。
【表３】
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ＣＢＰ比は腓腹部血圧比を示し、局所ＲＢＦ比は安静時局所血流比を示す。ａｐ＜０．０１（対照群との比較）である。
［実施例６］  組織血流測定
組織血流計を用いてＤａｙ  １０，４０に施行。患側内側広筋２ケ所、内転筋２ケ所の組織血流を測定し合計値をＤａｙ  １０を１００％とし評価した（ＢＰＭ２）。ＢＰＲ、ＢＰＭ２ではＣｏｎｔｒｏｌ群にくらべＡｎｇ１前投与群で有意に改善がみられた。
［実施例７］  ＶＥＧＦ蛋白の測定
ＶＥＧＦの血清中濃度を、Ｄａｙ  ０，１０，１５，２０，４０に固相酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ヒトＶＥＧＦイムノアッセイキット（Ｔｅｃｈｎｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて測定した。本アッセイの感度は９．０ｐｇ／ｍＬであった。いずれの群でもＶＥＧＦの蛋白レベルは中程度に過ぎず、Ｄａｙ  １５にはすべての実験群で高くても１０〜３０ｐｇ／ｍｌであった。
［実施例８］  組織学的評価
Ｄａｙ  ４０に、組織分析のために虚血肢から内転筋のブロック試料を２つ採取した。１つの試料は毛細血管密度の測定用のアルカリホスファターゼ染色のため、ＯＣＴコンパウンド中に包埋した後に液体窒素中で急速凍結し、もう１つの試料は細動脈密度の測定用の平滑筋細胞α−アクチン染色のため、ホルマリン中で４８時間浸漬固定を行った後にパラフィン包埋を行った。クリオスタットで多数の凍結切片を作製し（１０μｍ厚）、以前の記載の通りに（Ｚｉａｄａら、１９８４）、毛細血管内皮細胞を検出する目的でインドキシル−テトラゾリウム法を用いてアルカリホスファターゼ染色を行った。毛細血管密度は１ｍｍ２当たりの平均毛細血管数と定義した。免疫組織化学に関しては、平滑筋α−アクチン抗体（１Ａ４、Ｄａｋｏ  Ｊａｐａｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を一次抗体として用いて、ビオチン化抗マウス血清とペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いるＨＩＳＴＦＩＮＥ  ＳＡＢ−ＰＯ  Ｋｉｔ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって検出した。細動脈を同定して毛細血管や細静脈と区別する目的で、３つの異なる切片から１５の異なる顕微鏡視野を選択し、陽性平滑筋細胞を同じやり方で算定した。細動脈密度は視野１つ当たりの平均細動脈数として表した。
毛細血管（直径１０μｍ未満）レベルの新生血管形成として毛細血管密度（毛細血管数／ｍｍ２）を評価した。この密度はＡ−Ｖ群が高かった（Ｃ群：１６９．９±８．５、Ａ−Ｖ群：２７３．２±２５．８ａ、ａｐ＜０．０１、Ｃ群との比較）（表４）。アルカリホスファターゼ染色切片の代表的な顕微鏡写真を図７に示す。血管中膜でのα−アクチンの免疫組織化学染色により、血管新生の後期に生じる、直径１０〜５０μｍの範囲の明確な血管である細動脈レベルの新生血管形成が認められた。Ａ＋Ｖ群およびＡ−Ｖ群における細動脈密度（細動脈数／視野）は対照群よりも有意に高かった（Ｃ群：４．８±０．５、Ａ＋Ｖ群：１０．４±１．７ａ、Ａ−Ｖ群：１２．４±１．４ａ、ａｐ＜０．０１）が、Ｖ群（６．１±０．８）およびＡ群（６．３±１．３）における増加の有意性は境界域であった（表４）。さらに、Ａ−Ｖ群における増加はＶ群（ｂｐ＜０．０１）およびＡ群（ａｐ＜０．０１）よりも大きかった。α−アクチン染色切片の代表的な顕微鏡写真も図８に示している。アルカリホスファターゼ染色および平滑筋細胞α−アクチン染色を用いた以上の定量分析から、サイトカインの併用、特にアンジオポエチン−１の前投与により、単独投与スケジュールよりも多くの機能的な血管の形成が得られたことが示された。
【表４】
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ａｐ＜０．０１（対照群との比較）、ｂｐ＜０．０１（Ｖ群との比較）、ｃｐ＜０．０１（Ａ群との比較）である。
治療的血管新生では、虚血病変に十分な血流を供給するために機能的な血管の生成が必要である。しかし、いくつかの研究により、臨床試験で広く用いられているＶＥＧＦを、機能的血管新生を促進するために単独で用いた場合の価値は明確でないことが示されている。
この点の考察に関しては２つの理由が考えられる。第一に、狭窄や閉塞は主動脈で生じて末梢虚血の誘因となり、転写因子である低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）の発現および活性化を招く。ＨＩＦ−１の発現は、一酸化窒素合成酵素およびＶＥＧＦなどをコードするものをはじめとする多くの血管新生性遺伝子の転写増加を招き、血管新生カスケードが進行する（Ｒｏｙｅｎら、２００１）。ＶＥＧＦ遺伝子産物のみの投与によって機能的な血管形成が実現するか否かははっきりしていない。最近のある研究は、ＶＥＧＦは毛細血管の出芽を刺激するように思われるが、この反応は側副流の有意な改善にはつながらないと言及している（Ｈｅｒｓｈｅｙら、２００１）。さらに、ウサギ後肢虚血における虚血病変のＨＩＦ−１α／ＶＰ１６投与による改善を検討したある研究では、ＶＥＧＦ遺伝子のみの投与よりも改善効果が大きかったことが示されている（Ｖｉｎｃｅｎｔら、２０００）。第二に、虚血性疾患の治療にＶＥＧＦ遺伝子を用いた多くの臨床試験の評価がなされ、好ましい結果が報告されているものの、有意な改善が示されなかった研究もいくつかある（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎら、２００１）。実際に本実施例では、ＶＥＧＦ単独投与は毛細血管数の増加を誘導したが、血行動態は改善されず、血管成熟も媒介されないことが示された。以上の研究を蓄積した結果として、この治療によって臨床的に有益な血管新生または動脈新生が得られるのであれば、増殖因子併用療法またはマスタースイッチ遺伝子の理解をさらに深めることが必要である（Ｂｌａｕら、２００１；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ、２０００；Ｓｉｍｏｎｓら、２０００）。
本実施例では、Ａｎｇ１の前投与が、Ａｎｇ１やＶＥＧＦの単独投与または他の投与スケジュールよりも、血行動態、血管新生後期における血管成熟、および血漿漏出に対する血管保護を改善する効果が大きいことが示された。本発明者等のデータから、Ａｎｇ１の前投与による刺激によって血管新生が早期、後期ともに促進されて血管成熟をもたらし、それが血行動態と血管保護の改善の原因となったという可能性が示唆される。
このモデルでＡｎｇ１の前投与が早期、後期ともに血管新生の促進をもたらした機序としては２つが考えられる。第一に、外因性Ａｎｇ１遺伝子によって生じた流血中の内皮前駆細胞（ＣＥＰ）がＶＥＧＦ誘発性血管新生を増強する可能性がある。ＣＥＰは出生後の血管新生の原因となり（Ａｓａｈａｒａら、１９９９）、最近の１件の研究ではＡｎｇ１遺伝子の投与がＶＥＧＦ投与に比べてＣＥＰの移動を延長したことが報告されている（Ｈａｔｔｏｒｉら、２００１）。アデノウイルスベクターによるマウスでのＶＥＧＦ１６５の過剰発現はＣＥＰの末梢血液への移動を引き起こし、これはＤａｙ  ２にピークを迎え、Ｄａｙ  １４までには対照レベルに回復した。これに対して、Ａｎｇ１の過剰発現はＣＥＰレベルの上昇をもたらし、そのピークはＤａｙ  ７〜１４にあり、Ｄａｙ  ２８までに対照レベルに回復した。したがって、ＶＥＧＦ遺伝子とＡｎｇ１遺伝子の併用療法によって得られる血管新生の効果は、これらの２つの遺伝子の投与によって生じるＣＥＰ移動の各ピークが同じ時期に起こることから、Ａｎｇ１を前投与した場合に高くなると考えられる。さらに、Ｙａｍａｓｈｉｔａらは、ＥＣと壁細胞（周皮細胞および血管平滑筋細胞）が共通の前駆細胞に由来する可能性があることを示した（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、２０００）。彼らはＶＥＧＦはＥＣの分化には必要であるが、壁細胞の分化は外因性増殖因子とは独立して起こりうると結論している（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、２０００）。したがって、Ｄａｙ  １５まで外因性ＶＥＧＦがない状態でＡｎｇ１遺伝子の前投与を行うことにより、ＣＥＰおよび流血中壁前駆細胞（ＣＭＰ）から構成される流血中前駆細胞（ＣＰ）の移動を促進することが可能と考えられる。Ａｎｇ１前投与スケジュールにおけるＣＰ集団のＣＭＰ比は、ＶＥＧＦ投与（ＣＥＰを増加させる）の時期が他の併用よりも遅く、より多くの成熟血管の生成をもたらすため、他の投与スケジュールによるものに比べて高いと思われる。第二に、Ａｎｇ１遺伝子の前投与に続いてＶＥＧＦ遺伝子を投与することにより、重要な血管新生誘発因子であるＡｎｇ２の明らかな遺伝子スイッチングが刺激され、新生血管形成が増強される可能性がある。Ａｎｇ２の発現は成体の血管新生に必要であり、この因子は血管新生部位で初期に役割を果たす（Ｍａｌｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、１９９７）。また、Ｍａｎｄｒｉｏｔａらは、Ａｎｇ２  ｍＲＮＡレベルがＶＥＧＦ投与によって上昇し、Ａｎｇ１投与によって低下することを示している（Ｍａｎｄｒｉｏｔａら、１９９８）。以上の所見を総合すると、Ａｎｇ１遺伝子前投与スケジュールでは、他の併用スケジュールよりも明瞭に内因性Ａｎｇ２への血管新生性スイッチングが起こり、Ａｎｇ２の発現によって血管新生がより長期的に促進される可能性が示唆される。同時投与スケジュールにおけるＡｎｇ２の発現は、ＶＥＧＦとＡｎｇ１がこの遺伝子の発現に相反する影響を及ぼすため、より低いと考えられる。また、後投与スケジュールでは、Ａｎｇ１の投与がＤａｙ  １５となるため、Ａｎｇ２の発現期間は前投与の場合よりも短いと考えられる。
本発明者等は陰嚢サイズを用いてＶＥＧＦ誘発性浮腫を評価した。ウサギの陰嚢は体幹から隔たっていて組織支持が弱く、結合組織間隙が大きいために血管外浸出液の蓄積が起こりやすいことから、陰嚢サイズの変化率は浮腫を評価する感度が高い。本実施例では、浮腫を予防したのは前投与スケジュールのみであった。Ａｎｇ１は内皮細胞の周囲のマトリックスおよび細胞との強固な接着を促進し、種々の刺激によって生じる血管透過性の予防をもたらしたと思われる（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、１９９９）。Ａｎｇ１が接着を誘導する分子機構に関してはさらに解明を要するが、Ａｎｇ１はインテグリンを介して細胞接着を直接支持しうることが最近の研究で示されている（Ｃａｒｌｓｏｎら、２００１）。Ｔｈｕｒｓｔｏｎらは、アデノウイルスベクターによるラットへのＡｎｇ１遺伝子導入から４８時間以内に血管漏出に対する抵抗性が生じ、これは同じモデルで７日後にＶＥＧＦを注入して確認されたと報告している（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、２０００）。実際に、本発明者等の所見は、ＶＥＧＦによって誘導される血管透過性を前投与スケジュールが阻止したことを示している。これに対して、他の投与スケジュールでは、Ａｎｇ１によって誘導される透過抵抗性が生じてＶＥＧＦによる血管透過性を予防するだけの時間がないために、浮腫が生じた。
以上をまとめると、ＶＥＧＦとＡｎｇ１の３種類の併用スケジュールのうち、虚血病変で効果的な改善を示したのはＡｎｇ１遺伝子の前投与スケジュールのみであった。本実施例では、Ａｎｇ１遺伝子の前投与によって、虚血肢の血圧の有意な上昇、虚血病変における血流の改善、成熟血管の形成、さらに浮腫の予防がもたらされた。このため、Ａｎｇ１遺伝子投与による準備刺激は、ＶＥＧＦ遺伝子療法における治療的血管新生に有用と思われる。
産業上の利用の可能性
本発明によって、アンギオポエチンをＶＥＧＦの前に投与することにより、浮腫の副作用が起こらず、高い血管新生誘導効果が得られる方法が提供された。このことから、ＶＥＧＦ単独投与による血管新生治療の欠点である血管透過性の亢進を防止できる遺伝子治療が可能となった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＣＡｃｃの構成を示す図である。
図２は、プラスミドｐＣＡｈＶＥＧＦの構成を示す図である。
図３は、プラスミドｐＣＡｈＡｎｇ１の構成を示す図である。
図４は、ウサギ下肢虚血モデルに対する遺伝子導入のプロトコールを示す図である。
図５は、虚血側のウサギ陰嚢を示す写真である。これらの写真から、Ｖ群では陰嚢浮腫と静脈拡張が遺伝子投与後のＤａｙ  １５に生じたが、Ａｎｇ１前投与はＶＥＧＦによって誘導される陰嚢浮腫を予防したことが示された。
図６は、６つの投与スケジュール群のＤａｙ  ６０での選択的内腸骨血管造影写真である。（Ａ）、対照；（Ｂ）、Ｖ群；（Ｃ）、Ａ群；（Ｄ）、Ａ＋Ｖ群；（Ｅ）、Ｖ−Ａ群；（Ｆ）、Ａ−Ｖ群。
図７は、虚血大腿筋におけるアルカリホスファターゼ染色によって多数の毛細血管ＥＣが認められた代表的な顕微鏡写真である。（Ａ）、対照；（Ｂ）、Ｖ群；（Ｃ）、Ａ群；（Ｄ）、Ａ＋Ｖ群；（Ｅ）、Ｖ−Ａ群；（Ｆ）、Ａ−Ｖ群：バー＝５０μｍ。ＥＣ＝内皮細胞。
図８は、虚血大腿筋における平滑筋細胞α−アクチン染色によって平滑筋細胞に覆われた細動脈が認められた代表的な顕微鏡写真である。（Ａ）、対照；（Ｂ）、Ｖ群；（Ｃ）、Ａ群；（Ｄ）、Ａ＋Ｖ群；（Ｅ）、Ｖ−Ａ群；（Ｆ）、Ａ−Ｖ群：バー＝５０μｍ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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