(57)【要約】本発明は、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖の製造に用いることのできるポリペプチド、及び当該ポリペプチドをコードするＤＮＡとその用途を提供することを課題とし、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体、当該ポリペプチドの製造方法とその用途を確立することにより前記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてα−１，６グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表に於ける配列番号１、２、若しくは３に示すアミノ酸配列、若しくはそれらのアミノ酸配列に於いて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記の理化学的性質を有する請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７４，０００乃至約１６０，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（２）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下、約４０乃至約５０℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約４５乃至約５５℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下、６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６５℃に至適温度を有する。
（３）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応の条件下、ｐＨ約６．０乃至８．４の温度範囲内に至適ｐＨを有する。
（４）　温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件下、約４５℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ８．０、６０分間反応の条件下、５５℃以下に温度安定域を有する。または、
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
（５）　ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件下、ｐＨ約５．０乃至約１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
【請求項３】
請求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表に於ける配列番号４、５、若しくは６に示す塩基配列若しくはそれらの塩基配列に於いて、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列、又は、それらに相補的な塩基配列若しくはそれらの塩基配列に於ける１若しくは複数個の塩基を、遺伝子の縮重に基づき、それがコードするアミノ酸配列を変えることなく他の塩基で置換した塩基配列を有する請求の範囲第３項記載のＤＮＡ。
【請求項５】
遺伝子の縮重に基づき、配列表における配列番号１、２又は３に示すアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号４、５、若しくは６に示す塩基配列における塩基の１若しくは複数個の塩基を他の塩基で置換した塩基配列を有する請求の範囲第３項又は第４項記載のＤＮＡ。
【請求項６】
バチルス属の微生物に由来する請求の範囲第３項、第４項又は第５項記載のＤＮＡ。
【請求項７】
アルスロバクター属の微生物に由来する請求の範囲第３項、第４項又は第５項記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求の範囲第３項乃至第７項のいずれかに記載のＤＮＡと、自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項９】
自律複製可能なベクターがプラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）である請求の範囲第８項記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１０】
請求の範囲第８項又は第９項記載の複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項１１】
宿主が大腸菌である請求の範囲第１０項記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求の範囲第１０項又は第１１項記載の形質転換体を栄養培地中で培養し、その培養物から請求項１又は２記載のポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項１３】
培養物中の請求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチドを、遠心分離、濾過、濃縮、塩析、透析、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる１種又は２種以上の方法により採取することを特徴とする請求項１２記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチドを、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に作用させ、前記糖質の還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてα−１，６グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成させる方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチドを、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に作用させ、前記糖質の還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてα−１，６グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質の製造方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチドを、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に作用させ、前記糖質の還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてα−１，６グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成させ、次いで、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−、４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する酵素を作用させて、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成させ、これを採取することを特徴とする環状四糖の製造方法。
【請求項１７】
環状四糖を結晶化させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１６項記載の環状四糖の製造方法。
【請求項１８】
環状四糖がシラップ又は結晶であることを特徴とする請求の範囲第１６項又は第１７項記載の環状四糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド（以下、特に断りがない限り、「本発明のポリペプチド」と言う。）及び遺伝子組換え技術による当該ポリペプチドの製造方法とその用途に関する。
背景技術
グルコースを構成糖とする糖質、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物としては、アミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端のいずれか一方が非還元末端で他方が還元末端であり、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・イクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ＝ＤＥ）として表される。この値の大きいものは、通常、低分子、低粘度、甘味で、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を有する物質とアミノカルボニル反応を起し易く、褐変して悪臭を発生し、得られる製品の品質を劣化し易いとの欠点があることが知られている。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、『ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ）』、第７１巻、３５３乃至３５８頁（１９４９年）に開示されているように、澱粉にマセランス　アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ　ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシル結合したα−、β−またはγ−環状デキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれら環状デキストリンが工業的規模で生産され、それらが有する非還元性、無味性、包接能などの特性を生かして、各種用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特開平７−１４３８７６号公報及び特開平７−２１３２８３号公報などに開示したように、マルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物に、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグルコースがα、α−結合したトレハロースを生成させる方法も知られている。現在では、このトレハロースは澱粉から工業的規模で生産され、その非還元性で、温和で高品質な甘味特性などを生かしての用途に利用されている。このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース、グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−環状デキストリンが工業的規模で生産され、それらの特性を生かして各種用途に利用されているものの、斯かる非還元性糖質の種類には限りがあり、更に多種多様な非還元性糖質乃至低還元性糖質の確立が待たれている。
一方、近年、グルコースを構成糖とする新たな環状の四糖類が報告された。即ち、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８（１９９４年）には、主として、グルコース残基がα−１，３結合とα−１，６結合とが交互に連なっているアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に、加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることにより、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（本明細書では特に断らない限り、本糖質を「環状四糖」と略称する。）が生成し、これをメタノール共存下で晶出させることが示されている。
斯かる環状構造を有する環状四糖は、非還元性の糖質で、包接能を示し、揮発性有機物を安定化する作用やアミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく、各種用途に利用、加工できるものと期待されている。
しかしながら、環状四糖の製造に必要な原料のアルテルナンや酵素のアルテルナナーゼの入手が困難であるばかりでなく、斯かる酵素を産生する微生物も容易に入手できる状態にはない。
斯かる状況下、本発明者等は、先に、国際特許出願公開第ＷＯ　０１／９０３３８　Ａ１号で開示したように、非還元末端の結合様式として、α−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質（本明細書においては、本糖質を「α−イソマルトシルグルコ糖質」と略称することもある。）を原料とし、これに、本糖質のα−イソマルトシル部分とそれ以外のグルコ糖質部分とを特異的に切断し、このα−イソマルトシル部分を転移して環状四糖を生成するα−イソマルトシル転移酵素を作用させて、環状四糖を生成させることに成功した。このα−イソマルトシル転移酵素は、α−イソマルトグルコ糖質からα−イソマルトシル転移することによって環状四糖を生成する酵素であって、詳細には、下記の理化学的性質を有するα−イソマルトシル転移酵素である。
（１）　作用
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する。
（２）　分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約８２，０００乃至約１３６，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（３）　等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐｌ約３．７乃至約８．３の範囲に等電点を有する。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の反応条件下、約４５乃至約５０℃の温度範囲内に至適温度を有する。
（５）　至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の反応条件下、ｐＨ約５．５乃至約６．５の温度範囲内に至適ｐＨを有する。
（６）　温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件において、約４５℃以下に温度安定域を有する。
（７）　ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で下、ｐＨ約３．６乃至約１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
しかしながら、環状四糖の原料糖質についてみると、豊富で安価に供給される澱粉からの生産が望まれるものの、実際には、α−イソマルトシル転移酵素が澱粉に直接作用しないことから、予め、澱粉を前述の特定構造を有するα−イソマルトシルグルコ糖質、例えば、パノースやイソマルトシルマルトースなどの比較的低分子のイソマルトオリゴ糖に変換させ、次いで、これにα−イソマルトシル転移酵素を作用させて環状四糖を生成させる手法が採用されている。一方、原料からの環状四糖の収率についてみると、パノースを用いる場合、原料パノース重量当たりの収率は約４４％である。同様に、イソマルトシルマルトースを用いる場合の収率は、約３１％であるのに対して、澱粉を用いる場合には、予め、α−アミラーゼ、澱粉枝切り酵素、β−アミラーゼ及びα−グルコシダーゼなどを作用させてパノースなどの比較的低分子のイソマルトオリゴ糖を生成させる必要があるだけでなく、環状四糖の収率も約１５％と極めて低いことが判明している。澱粉からの環状四糖の生産は、このように低い生成率でも可能であるものの、コスト高が懸念され、澱粉を原料として、環状四糖の収率を向上させた新規製造方法の確立が望まれていた。
斯かる状況下、本発明者等は、澱粉を原料とし、澱粉から環状四糖の収率を著しく向上させることのできるα−イソマルトシルグルコ糖質を生成する新規な酵素に期待を込めて、微生物を広く検索してきた。その結果、意外にも、国際特許出願公開第ＷＯ　０１／９０３３８　Ａ１号で開示した土壌からの分離菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属するα−イソマルトシル転移酵素産生微生物Ｃ９株、Ｃ１１株、Ｎ７５株およびＡ１９株が、新規なα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をも併せて産生することを見出し、澱粉部分分解物をはじめとする比較的高分子のグルコ糖質に、この新規α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを作用させることにより、目指していた環状四糖の収率を著しく向上させることのできることを見出し、このα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の諸性質を明らかにすると共に、その製造方法を確立し、更には、当該酵素によるα−グルコシル転移反応方法、α−イソマルトシルグルコ糖質の製造方法、及び当該酵素とα−イソマルトシル転移酵素とを併用した環状四糖又はこれを含む糖質及びその製造方法、併せて、これら方法により得られる環状四糖、又はこれを含む糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立した。しかしながら、これら微生物は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素産生能が充分でなく、α−イソマルトシルグルコ糖質や環状四糖を大規模に製造する場合、斯かる当該酵素の供給源としての微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
この点、今日では分子生物学が進展し、酵素の本質がポリペプチドであり、それを構成するアミノ酸配列がその酵素活性の発現を左右するものであり、そのアミノ酸配列は、遺伝子ＤＮＡに暗号化されていることが知られている。したがって、ポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、そのポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを適宜微生物や動植物細胞に導入し、得られる形質転換体を適宜栄養培地中で培養することにより、比較的容易に所望量のポリペプチドが取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、上記酵素の本質であるポリペプチドをコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
発明の開示
本発明の第一の目的は、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを創製することである。
本発明の第二の目的は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
本発明の第三の目的は、前記ＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
本発明の第四の目的は、前記組換えＤＮＡを導入した形質転換体を提供することにある。
本発明の第五の目的は、前記形質転換体を用いる、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの製造方法を提供することにある。
本発明の第六の目的は、前記ポリペプチドの用途を提供することにある。
本発明は、前記第一の目的を下記の理化学的性質を有するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドにより解決するものである。
（１）作用非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてα−１，６グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する。
（２）　分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７４，０００乃至約１６０，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下、約４０乃至約５０℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約４５乃至約５５℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下、６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６５℃に至適温度を有する。
（４）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応の条件下、ｐＨ約６．０乃至約８．４の温度範囲内に至適ｐＨを有する。
（５）　温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件下、約４５℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ８．０、６０分間反応の条件下、５５℃以下に温度安定域を有する。または、
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
（６）　ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件下、ｐＨ約５．０乃至約１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
本発明は、前記第二の目的を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。
本発明は、前記第三の目的を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能なＤＮＡにより解決するものである。
本発明は、前記第四の目的を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
本発明は、前記第五の目的を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物からポリペプチドを採取してなるポリペプチドの製造方法により解決するものである。
本発明は、前記第六の目的を、前記ポリペプチドの種々の用途を確立することにより解決するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のポリペプチドとは、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する酵素活性を有するポリペプチド全般を意味する。本発明のポリペプチドは、通常、解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表に於ける配列番号１に示すアミノ酸配列、若しくはそのアミノ酸配列に於いて、１若しくは複数個のアミノ酸、即ち、１個又は２個以上、場合によっては、１乃至５０個、或いは、１乃至３０個、若しくは、１乃至１０個のアミノ酸が欠失したり、他のアミノ酸で置換されたり、更には付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを例示することができる。尚、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地成分、組成や培養温度、ｐＨなどのよっては、宿主内外酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の理化学的性質は保持しているものの、配列表に於ける配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１若しくは複数個、即ち、１個又は２個以上、場合によっては、１乃至５０個、１乃至３０個、或いは、１乃至２０個、若しくは、１乃至１０個欠失したり、他のアミノ酸と置換されたり、更にはＮ末端に１個または２個以上、場合によって、１乃至３０個、或いは、１乃至２０個、若しくは、１乃至１０個のアミノ酸が新たに付加した変異体が生成することがある。斯かる変異体であっても、それが所期の理化学的性質を具備している限り、当然、本発明のポリペプチドに包含されることは言うまでもない。
本発明のポリペプチドは、本発明のＤＮＡを適宜宿主に導入し、得られる形質転換体の培養液から採取することができる。本発明で使用する形質転換体としては、例えば、配列表における配列番号４、５、又は６に示す５′末端からの塩基配列若しくは、それらの塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列、または、それらに相補的な塩基配列若しくはそれらの塩基配列における１若しくは複数個を、遺伝子の縮重に基づき、それがコードするアミノ酸配列を変えることなく他の塩基で置換した塩基配列からなるＤＮＡを含む形質転換体を例示できる。また、上記塩基配列として、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１若しくは複数個、即ち、１個または２個以上、場合によっては、１乃至１５０個、１乃至９０個、或いは１乃至６０個、若しくは、１乃至３０個を他の塩基で置き換えたものを例示できる。
本発明のＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列である限り、天然由来のものであろうと、人為的に合成されたものであろうとその由来は問わない。天然の給源としては、例えば、平成１２年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４３として寄託されているバチルス　グロビスポルスＣ９株、平成１２年４月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４として寄託されているバチルス　グロビスポルスＣ１１株、及び平成１３年５月１６日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１として寄託されているバチルス　グロビスポルスＮ７５株を含むバチラス属、または、平成１３年５月１６日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９０として寄託されているアルスロバクター・グロビホルミスＡ１９株を含むアルスロバクター属の微生物が挙げられる。これら微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１乃至約３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。この際、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を用いたり、ＳＤＳなどの界面活性剤の存在下で凍結融解することもできる。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理など斯界に於ける通常一般の方法を適用することにより目的のＤＮＡを得ることができる。一方、本発明のＤＮＡを人為的に、合成するには、例えば、配列表に於ける配列番号４、５、又は６に示す塩基配列に基づいて化学合成すればよい。又、当該ＤＮＡを含む遺伝子を鋳型として、適当なプライマーとなる得る化学合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
これらＤＮＡを用いて本発明のポリペプチドを工業的に大量に、安価にかつ容易に製造することができる。即ち、当該ＤＮＡを、通常、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入し、得られる形質転換体を適宜栄養培地中で培養し、その培養物から菌体を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含む組換えＤＮＡを得、これを、通常、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換し、得られる形質転換体を適宜栄養培地中で培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。前記組換えＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが入手できさえすれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。又、前記ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。このうち、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。
本発明に係るＤＮＡを前記ベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ　３ＡＩ、Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、Ｂａｍ　ＨＩ、Ｓａｌ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｓａｃ　Ｉ、Ｐｓｔ　Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母等の適宜宿主に導入して形質転換体とし、これら形質転換体から所望の形質転換体をクローニングし、これを培養することにより容易かつ大量に複製可能である。前記クローニングに際しては、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質を含む栄養培地で培養し、該糖質より、非還元末端の結合様式としてα−１，６結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する形質転換体を選択すればよい。
これらクローニングにより得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該ポリペプチドを産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖源が、又、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に接種し、栄養培地を温度２０乃至４０℃、ｐＨ２乃至１０に保ちつつ、通気攪拌などによる好気的条件下で約１乃至約６日間培養すれば、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。この培養物は本発明のポリペプチドを含む粗ポリペプチドとしてそのまま使用可能であるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出したり、超音波や細胞溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより本発明のポリペプチドを菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には斯界に於いてポリペプチドを精製するために用いられる通常の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などから選ばれる１種又は２種以上の方法を適宜組合わせて適用すればよい。
本発明のポリペプチドは、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する酵素活性を有しており、詳細には、下記の理化学的性質を有する。
（１）　作用
非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７４，０００乃至約１６０，０００ダルトンの範囲内に分子量を有する。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下、約４０乃至約５０℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ６．０、６０分間反応の条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約４５乃至約５５℃の温度範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下、６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応の条件下において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６５℃に至適温度を有する。
（４）至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応の条件下、ｐＨ約６．０乃至８．４の温度範囲内に至適ｐＨを有する。
（５）　温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件下、約４５℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ８．０、６０分間反応の条件下、５５℃以下に温度安定域を有する。または、
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件において、１ｍＭＣａ２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
（６）　ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件下、ｐＨ約５．０乃至約１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
本発明のポリペプチドが作用する基質としては、澱粉、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲンなどのα−１，４グルコシル結合を含む多糖や、それらをアミラーゼ又は酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖などの部分分解物が用いられる。これらα−１，４結合を含むグルコ糖質を、更にブランチングエンザイムなどの枝付け酵素（ＥＣ　２．４．１．１８）で処理した糖質を用いることも随意である。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ａｍｙｌａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ』、パーガモン・プレス社（東京）（１９８８年）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ　３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ　３．２．１．２）、マルトトリオース生成アミラーゼ（ＥＣ　３．２．１．１１６）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ　３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ　３．２．１．９８）などのアミラーゼで分解した部分分解物を用いることができる。更には、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ　３．２．１．６８）などの澱粉枝切り酵素を作用させることも随意である。基質としての澱粉は、とうもろこし、小麦、米などの穀類に由来する地上澱粉であっても、また馬鈴薯、さつまいも、タピオカなどの地下澱粉であってもよく、好ましくは、澱粉を糊化及び／又は液化した溶液として用いられる。その澱粉の部分分解の程度は低い程、環状四糖の生成率が高くなることから、ＤＥ約２０以下、望ましくは約１２以下、更に望ましくは約５以下が好適である。基質濃度は特に限定されない。例えば、基質濃度０．１％（ｗ／ｗ）（以下、本明細書では、特に断らない限り、「％（ｗ／ｗ）」を単に「％」と略称する）の低濃度溶液として用いた場合でも、本発明の酵素反応は進行するが、工業的には、１％以上が好適である。又、基質溶液中に、完全に溶けきらない不溶性基質を含有するものであってもよい。望ましくは、濃度４０％以下、更に望ましくは２０％以下が好適である。反応温度は反応が進行する温度、即ち、６５℃付近までの温度、好ましくは３０乃至５５℃付近の温度で実施すればよい。反応ｐＨは、通常、４．５乃至８の範囲に調整すればよい。好ましくはｐＨ約５．５乃至７の範囲に調整する。反応時間は酵素反応の進行により適宜選択する。
本発明のポリペプチドをその基質に作用させて生成したα−イソマルトシルグルコ糖質にα−イソマルトシル転移酵素を作用させることにより、斯界に於いて有用な環状四糖を大量かつ容易に製造することができる。α−イソマルトシル転移酵素を作用させる時期は、本発明のポリペプチドを作用させ、当該ポリペプチドを失活させた後に作用させてもよい。しかしながら、好適には、本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素とを併用して作用させるのがよい。具体的には、澱粉又はその部分分解物やグリコーゲンの水溶液に本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素とを併用することにより、澱粉又はその部分分解物からは環状四糖が固形物当たり約３０％以上の収率で、また、グリコーゲンの場合は固形物当たり約８０％以上もの収率で環状四糖を得ることができる。本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素との併用する場合の環状四糖の生成メカニズムは、両者の反応特性から以下のように推察される。
（１）　本発明のポリペプチドは、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質、例えば、澱粉、グリコーゲン、又はこれらの部分分解物などの糖質の非還元末端のα−１，４グルコシル基に作用し、グルコース基を他の非還元末端グルコース基の６位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にα−イソマルトシル基を有する糖質が生成する。
（２）　α−イソマルトシル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有する糖質に作用し、そのイソマルトシル基を、他の非還元末端に位置するイソマルトシル基を有する糖質の非還元末端グルコース基の３位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有する糖質を生成する。
（３）　α−イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を有する糖質に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を糖質から切り離し、これを環状化して環状四糖を生成する。
（４）（３）に於いて、イソマルトシル−１，３−イソマルトシル基を切り離された後の糖質は、再度、（１）から（３）の反応を経由することによって、環状四糖を生成し、更にこれらの反応が繰返されて著量の環状四糖が生成し蓄積される。
以上、説明したように、本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素の併用により、上記したように、両者がそれぞれの基質に繰り返し作用し、環状四糖の収率が著しく向上するものと推察される。
又、この環状四糖の生成反応に於いて、他の転移酵素を更に併用して、環状四糖の収率を向上させることも有利に実施できる。即ち、例えば、濃度約１５％の澱粉部分分解物に、本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素とを併用して作用させることにより、基質固形物当たり約５５％の収率で環状四糖が得られるところ、同じ条件で本発明のポリペプチドとα−イソマルトシル転移酵素並びにシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの三者を併用して作用させることにより、基質固形物当たりの環状四糖の収率を更に約５乃至約１０％高めて約６０乃至約６５％にまで高めることができる。
上記の反応によって得られた溶液は、環状四糖又はこれを含有する糖質を含む溶液としてこのまま用いることも可能である。しかしながら、一般的には、これら糖質は適宜手法により精製して用いられる。精製方法としては、公知の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭での脱色、精製、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂での脱塩、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、アミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ（ＥＣ　３．２．１．３）などやα−グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２０）などの酵素を用いて残存する他の糖質を分解する方法、酵母による発酵処理、アルカリ処理などによる残存する還元性糖質の分解除去などの各種精製方法を１種又は２種以上組み合せて精製することができる。とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーが好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去することにより、高純度の環状四糖又はこれを含む糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
このようにして得られた環状四糖又はこれを含む糖質は、更に濃縮し、シラップ状製品とするか、乾燥して非晶質の環状四糖又はこれを含む粉末状糖質製品にすることも随意である。
又、環状四糖結晶を製造するには、例えば、有機溶媒存在下又は非存在下、固形物純度約５０％以上、固形物濃度約３０％乃至約９０％の環状四糖高含有液を助晶缶にとり、固形物当たり、０．１乃至２０％の環状四糖種結晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは、１０乃至９０℃の範囲で、攪拌条件下、高温から低温に徐冷し、環状四糖結晶を含有するマスキットを製造する。マスキットから環状四糖結晶又はこれを含有する糖質を製造する方法としては、例えば、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などの公知の方法、又は含蜜結晶を製造する方法としては、分蜜方法などを適宜採用すればよい。
斯くして得られる環状四糖は、上品で低甘味を有する非還元性の白色粉末又はシラップで、安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸含有物質と混合し、加工しても、褐変することも、異臭を発生することも、又、混合した他の素材の物性を損なうことも殆どない。又、環状四糖は包接能を有していることから、香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化を防止し、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れている。この際、必要ならば、シクロ（環状）デキストリン類、分岐シクロデキストリン類、シクロデキストラン類、シクロフラクタン類などの他の環状糖質を併用することにより、包接能による各種成分の安定化を更に高めることも有利に実施できる。前記環状四糖以外にシクロデキストリン類などの環状糖質は、高純度のものに限る必要はなく、低純度の環状糖質、例えば、多量のマルトデキストリンとともに各種のシクロデキストリンを含有した澱粉部分分解物であっても用いることができる。
更に、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖は、アミラーゼやα−グルコシダーゼによって実質的に分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、又、腸内細菌によって醗酵されにくく、極めて低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができ、虫歯誘発菌などによっても、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料として、更には、粉末状物の付着、固結防止剤としても利用することができる。更に、斯かる環状四糖自体は、無毒、無害の天然甘味料であり、安全で安定な甘味料である。環状四糖結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤、糖衣錠に利用することも有利に実施できる。又、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性・他の糖の結晶防止性、難醗酵性などの有用な性質をも具備している。
従って、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
又、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、乳糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース（α，α−トレハロース、α，β−トレハロース、β，β−トレハロース）、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロース、グリシン、アラニンなどの他の甘味料と併用することも、又、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と併用することもできる。とりわけ、エリスリトール、キシリトール、マルチトールなどの低カロリー甘味料やα−グリコシルステビオシド、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ及びスクラロースなどの１種又は２種以上の高甘味度甘味料と併用して、低カロリー甘味料又はダイエット甘味料などとして好適に利用することができる。
更に、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質は、そのままで、又は必要に応じて、他の増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して用いることも随意である。
又、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタれ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。又、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。又、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止��子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類又はローヤルゼリーなどの各種生理活性物質、更には、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペーストなどの有効成分や活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状又は固状の健康食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。
以上述べたような各種組成物に、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。含有させる環状四糖の量は、通常０．１％以上、望ましくは、１％以上とするのが好適である。
以下、バチルス　グロビスポルスＣ１１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４）、バチルス　グロビスポルスＮ７５株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１）、及びアルスロバクター・グルビホルミスＡ１９株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９０）が産生するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質の解明、及び、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの解明、更に、そのＤＮＡを利用した組換え型α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの調製方法を実験例に基づいて説明する。
実験例１　バチルス　グロビスポルスＣ１１株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの調製
実験例１−１　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス　グロビスポルス　Ｃ１１株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１％（ｖ／ｖ）を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．５５単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．８単位／ｍｌであった。この培養物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．５１単位／ｍｌ（総活性約９，１８０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．７単位／ｍｌ（総活性約３０，４００単位）であり、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型酵素であることが判明した。
尚、前記に種類の酵素活性は次のようにして測定した。即ち、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性の測定は、マルトトリオースを濃度２％（ｗ／ｖ）となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中のマルトース含量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ法で定量することによって行った。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量と定義した。尚、ＨＰＬＣは、『Ｓｈｏｄｅｘ　ＫＳ−８０１』カラム（昭和電工（株）製）を用い、カラム温度６０℃、溶離液として水の流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ水の条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー（株）製）を用いて行なった。
又、α−イソマルトシル転移酵素活性の測定は、パノースを濃度２％（ｗ／ｖ）となるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応停止液中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量することにより行った。α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量と定義した。
実験例１−２　部分精製酵素標品の調製
実験例１−１の方法で得た培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約８，４４０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約２８，０００単位含んでいた。この粗酵素液を『セファビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル（三菱化学（株）製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分、α−イソマルトシル転移酵素活性成分は、何れも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルには吸着せずに、両酵素活性は非吸着画分に検出された。この非吸着画分を回収し、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエント、これに続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭに濃度上昇するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシル転移酵素活性成分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は分離して溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は硫安リニアグラジエント濃度が約０．３Ｍ付近の画分に検出され、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエント濃度が約３０ｍＭ付近の画分に検出された。そこで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とα−イソマルトシル転移酵素活性画分とを個別に回収し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品としてそれぞれ回収し、これら酵素標品を別々に精製した。
実験例１−３　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの精製
実験例１−２の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー（株）製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素活性成分は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素活性成分が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。再度、この回収画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
2002055708.tif 000002
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
実験例１−４　α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの精製
実験例１−２の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー（株）製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素活性成分は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度減少するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で溶出した。この本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
2002055708.tif 000003
2002055708.tif 000004
精製したα−イソマルトシル転移酵素活性有する酵素標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動によりその純度を検定したところ、その蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
実験例２　バチルス　グロビスポルスＮ７５株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの調製
実験例２−１　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス　グロビスポルス　Ｎ７５株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１％（ｖ／ｖ）を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．３４単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．１単位／ｍｌであった。この培養物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．３３単位／ｍｌ（総活性約５、９４０単位）で、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．１単位／ｍｌ（総活性約１９，８００単位）であり、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型酵素であることが判明した。
実験例２−２　部分精製酵素標品の調製
実験例２−１の方法で得た培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約４，７１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約１５，７００単位含んでいた。この粗酵素液を『セファビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル（三菱化学（株）製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、『セファビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルには吸着し、α−イソマルトシル転移酵素活性成分は、『セファビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルには吸着せずに非吸着画分に検出された。続いて、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、ＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．２５Ｍ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とα−イソマルトシル転移酵素活性画分とを個別に回収し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品としてそれぞれ回収し、これら酵素標品を別々に精製した。
実験例２−３　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの精製
実験例２−２の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、この透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエント、これに続いて、マルトテトラオース０ｍＭから１００ｍＭに濃度上昇するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエント濃度が約３０ｍＭ付近の画分に検出された。そこで、本酵素活性画分を回収した。この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー（株）製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表３に示す。
2002055708.tif 000005
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
実験例２−４　α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの精製
実験例２−２の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近の画分に本酵素活性が検出された。そこで、本酵素活性画分を回収した。この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー（株）製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素活性成分は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度減少するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で溶出した。この本酵素活性を示す画分を集め回収した。この回収液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『スーパーＱ−トヨパール（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｃ』ゲル（東ソー（株）製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本酵素は、『スーパーＱ−トヨパール（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｃ』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出し、得られた溶出画分を回収し、精製酵素標品とした。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表４に示す。
2002055708.tif 000006
精製したα−イソマルトシル転移酵素活性有する酵素標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動によりその純度を検定したところ、その蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
実験例３　アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの調製
実験例３−１　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１％（ｖ／ｖ）を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至９．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約１．１単位／ｍｌで、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．７単位／ｍｌであった。この培養物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約１．０６単位／ｍｌ（総活性約１９，１００単位）で、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．６単位／ｍｌ（総活性約２８，８００単位）であり、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型酵素であることが判明した。
尚、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定は、基質のための緩衝液として１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いた以外、実験例１に記載の方法と同様に行った。
実験例３−２　部分精製酵素標品の調製
実験例３−１の方法で得た培養上清約１８Ｌを６０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約８５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約８，２１０単位、α−イソマルトシル転移酵素活性を約１５，７００単位含んでいた。この粗酵素液を『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』ゲル（東ソー（株）製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。両酵素活性は、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』ゲルゲルには吸着し、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、ＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．２Ｍ付近で溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性成分は、ＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．３Ｍ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とα−イソマルトシル転移酵素活性画分とを個別に回収し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品としてそれぞれ回収し、これら酵素標品を別々に精製した。
実験例３−３　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの精製
実験例３−２の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、この透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、硫安のリニアグラジエント濃度が約０．２Ｍ付近の画分に検出された。そこで、本酵素活性画分を回収し、精製酵素標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
2002055708.tif 000007
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。
実験例３−４　α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの部分精製
実験例３−２の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品を、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０Ｍ付近の画分に本酵素活性が検出された。そこで、本酵素活性画分を回収し、部分精製酵素標品とした。この精製の各ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表６に示す。
2002055708.tif 000008
部分精製したα−イソマルトシル転移酵素活性有する酵素標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動によりその純度を検定したところ、メインの蛋白バンド以外に、３種のマイナーな蛋白バンドが認められた。
実験例４−１　各種糖質への作用
各種糖質を用いて、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチドの基質になりうるかどうかの試験をした。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシドを含む溶液を調製した。
これらの溶液に、実験例１−３の方法で得たバチルス　グロビスポルスＣ１１株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品、又は実験例２−３の方法で得たバチルス　グロビスポルスＮ７５株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品、実験例３−３の方法で得たアルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を２％（ｗ／ｖ）になるように調整し、これを３０℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来の酵素の場合、ｐＨ８．４）で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液中の糖質を調べるため、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略す。）を行なった。展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとして『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ、メルク社製）を用い２回展開した後、硫酸−メタノール法で糖質を発色し検出し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表７に示す。
2002055708.tif 000009
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表７の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、試験した各種糖質の内、グルコース重合度が３以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質によく作用することが判明した。又、グルコース重合度が２の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも僅かに作用することが判明した。
実験例４−２　マルトオリゴ糖からの生成物
最終固形物濃度１％のマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース又はマルトペンタオース水溶液に、実験例１−３の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを、固形物グラム当たり２単位（マルトース及びマルトトリオース水溶液の場合）、０．２単位（マルトテトラオース水溶液の場合）、０．１単位（マルトペンタオース水溶液の場合）加えて、３５℃、ｐＨ６．０で８時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成をＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、『ＹＭＣ　Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＱ３０３』カラム（（株）ワイエムシー製）を用い、カラム温度４０℃、溶離液としての水の流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー（株）製）を用いて行なった。その結果を表８に示す。
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表８の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させた結果、基質としてのマルトースからは、主にグルコースとα−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース）とが生成し、基質としてのマルトトリオースからは、主にマルトースとα−イソマルトシルマルトース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）とが生成し、その他、少量ながらグルコース、マルトテトラオース、α−イソマルトシルグルコース（別名、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース）、及び生成物Ｘが生成することが判明した。基質としてのマルトテトラオースからは、主にマルトトリオースと生成物Ｘとが生成し、その他、少量ながらマルトース、マルトペンタオース、α−イソマルトシルマルトース（別名、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース）、及び生成物Ｙが生成することが判明した。基質としてのマルトペンタオースからは、主にマルトテトラオースと生成物Ｙとが生成し、その他、少量ながらマルトトリオース、マルトヘキサオース、生成物Ｘ、及び生成物Ｚが生成することが判明した。
次いで、基質としてのマルトテトラオースからの主生成物である生成物Ｘと、基質としてのマルトペンタオースからの主生成物である生成物Ｙの精製と単離を行った。分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ　Ｒ３５５−１５Ｓ−１５　１２Ａ』（（株）ワイエムシイ製）を用いて生成物Ｘ、Ｙを精製し単離することにより、上記マルトテトラオースからの反応物から、純度９９．９％以上の生成物Ｘ標品を固形物収率約８．３％で、また上記マルトペンタオースからの反応物から、純度９９．９％以上の生成物Ｙを固形物収率約１１．５％で単離した。
これら生成物Ｘ及び生成物Ｙについて、常法に従ってメチル化分析とＮＭＲ分析とを行なった。メチル化分析結果は表９にまとめた。ＮＭＲ分析の結果については、生成物Ｘと生成物Ｙの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを第１図および第２図にそれぞれ示した。又、生成物Ｘと生成物Ｙの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを第３図及び第４図にそれぞれ示し、それらの帰属を表１０にまとめた。
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これらの結果から、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドによるマルトテトラオースからの生成物Ｘは、マルトテトラオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコース基がα−結合した５糖で、構造式１で表わされるα−イソマルトシルマルトトリオース（別名、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース）であることが判明した。
構造式１
α−Ｄ−Ｇｌｃρ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃρ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃρ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃρ−（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃρ
又、マルトペンタオースからの生成物Ｙは、マルトペンタオースの非還元末端グルコースの６位水酸基にグルコシル基がα結合した６糖で、構造式２で表わされるα−イソマルトシルマルトテトラオース（別名、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオース）であることが判明した。
構造式２
α−Ｄ−Ｇｌｃρ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃρ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃρ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃρ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃρ−（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃρ
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以上のことから、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドのマルトオリゴ糖に対する作用を以下のように判断された。
１）　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、基質として、非還元末端の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に作用し、その非還元末端のグルコシル残基を他の分子の非還元末端のグルコシル残基の６位に転移する作用を有する分子間の６−グルコシル転移を触媒して、非還元末端に６−Ｏ−α−グルコシル基を有するグルコース重合度が１増加したα−イソマルトシルグルコ糖質（別名、６−Ｏ−α−グルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
２）　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、４−グルコシル転移も僅かに触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が１増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が１減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
実験例４−３　還元力生成試験
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドが、還元力生成能を有するか否かを調べることを目的として以下の試験を行った。即ち、最終濃度１％のマルトテトラオース水溶液に、実験例１−３の方法で得たバチルス　グロビスポルスＣ１１株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品、又は実験例２−３の方法で得たバチルス　グロビスポルスＮ７５株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品、実験例３−３の方法で得たアルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来の精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を、基質固形物１グラム当たり０．２５単位加え、３５℃、ｐＨ６．０（アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来の酵素の場合、ｐＨ８．４）で作用させ、その反応液の一部を経時的に採り、１００℃で１０分間保持して反応を停止し、反応液の還元力を測定した。即ち、その酵素反応前後の溶液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で測定し、また、同時にその酵素反応前後の溶液の全糖量をアントロン硫酸法で測定し、還元力生成率（％）は以下の計算式を用いて算出した。
計算式：
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結果を表１１に示す。
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表１１の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、マルトテトラオースを基質として作用させると、反応物の還元力は増加しないことがわかり、当該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは加水分解作用を示さない若しくは検出できないほど僅かなものであることが判明した。
実験例４−４　分子量
実験例１−３の方法で精製して得たバチルス　グロビスポルスＣ１１株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、実験例２−３の方法で精製して得たバチルス　グロビスポルスＮ７５株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、または、実験例３−３の方法で精製して得たアルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５％（ｗ／ｖ）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）と比較して当該酵素ポリペプチドの分子量を測定した。Ｃ１１株由来の当該ポリペプチドの分子量は約１３７，０００±２０，０００ダルトンで、Ｎ７５株由来の当該ポリペプチドの分子量は約１３６，０００±２０，０００ダルトンで、Ａ１９株由来の当該ポリペプチドの分子量は約９４，０００±２０，０００ダルトンであった。
実験例４−５　等電点
実験例１−３の方法で精製して得たＣ１１株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、実験例２−３の方法で精製して得たＮ７５株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、または、実験例３−３の方法で精製して得たＡ１９株由来α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを、２％（ｗ／ｖ）アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、電気泳動後の蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して当該酵素ポリペプチドの等電点を求めた。その結果、Ｃ１１株由来の当該ポリペプチドの等電点はｐｌ約５．２±０．５で、Ｎ７５株由来の当該ポリペプチドの等電点はｐｌ約７．３±０．５で、Ａ１９株由来の当該ポリペプチドの等電点はｐｌ約４．３±０．５で、あった。
実験例４−６　作用温度及びｐＨ
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性に及ぼす温度とｐＨの影響について、各種温度、ｐＨ条件下、実験例１−１に示すα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定法に準じて調べた。温度の影響については、Ｃａ２＋非存在下と１ｍＭ存在下で測定した。これらの結果を第５図［温度の影響（Ｃ１１株由来ポリペプチド）］、第６図［温度の影響（Ｎ７５株由来のポリペプチド）］、第７図［温度の影響（Ａ１９株由来のポリペプチド）］、第８図［ｐＨの影響（Ｃ１１株由来ポリペプチド）］、第９図［ｐＨの影響（Ｎ７５株由来のポリペプチド）］、第１０図［ｐＨの影響（Ａ１９株由来のポリペプチド）］に示した。その結果、Ｃ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で、約４５℃（Ｃａ２＋非存在）又は約５０℃（１ｍＭＣａ２＋存在）で、その至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０で、Ｎ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で、約５０℃（Ｃａ２＋非存在）又は約５５℃（１ｍＭＣａ２＋存在）で、その至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約６．０で、Ａ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの至適温度は、ｐＨ８．４、６０分間反応で、約６０℃（Ｃａ２＋非存在）又は約６５℃（１ｍＭＣａ２＋存在）で、その至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約８．４であった。
実験例４−７　安定性
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの温度安定性は、当該ポリペプチド含有溶液［２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０（Ａ１９株由来のポリペプチドの場合、２０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．０）］をＣａ２＋非存在下または１ｍＭＣａ２＋存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０（Ａ１９株由来のポリペプチドの場合、ｐＨ８．０）に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を第１１図［温度安定性（Ｃ１１株由来のポリペプチド）］、第１２図［温度安定性（Ｎ７５株由来のポリペプチド）］、第１３図［温度安定性（Ａ１９株由来のポリペプチド）］、第１４図［ｐＨ安定性（Ｃ１１株由来ポリペプチド）］、第１５図［ｐＨ安定性（Ｎ７５株由来のポリペプチド）］、第１６図［ｐＨ安定性（Ａ１９株由来のポリペプチド）］に示した。Ｃ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋非存在）又は約４５℃まで（１ｍＭＣａ２＋存在）で、当該ポリペプチドのｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０で、Ｎ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの温度安定性は約４５℃まで（Ｃａ２＋非存在）又は約５０℃まで（１ｍＭＣａ２＋存在）で、当該ポリペプチドのｐＨ安定性は約５．０乃至９．０で、Ａ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの温度安定性は約５５℃まで（Ｃａ２＋非存在）又は約６０℃まで（１ｍＭＣａ２＋存在）で、当該ポリペプチドのｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。
実験例５　部分アミノ酸配列
実験例５−１　Ｎ末端アミノ酸配列
実験例１−３の方法で精製して得たＣ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、実験例２−３の方法で精製して得たＮ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、または、実験例３−３の方法で精製して得たＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドについて、そのＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー『モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、Ｃ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは配列表に於ける配列番号７に示すアミノ酸配列を有し、Ｎ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは配列表に於ける配列番号１９に示すアミノ酸配列を有し、Ａ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは配列表に於ける配列番号２６に示すアミノ酸配列を有することが判明した。
実験例５−２　Ｃ１１株由来のポリペプチドの内部アミノ酸配列
実験例１−３の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、得られた透析液を同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのトリプシン（和光純薬（株）販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。即ち、『マイクロボンダパックＣ１８カラム』（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ（株）製）を用い、室温下、流速０．９ｍｌ／分の条件で、０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液の１２０分間かけて移行するリニアグラジエント条件下、ペプチドをカラム分画した。カラムから溶出してくるペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した１０ペプチド［Ｐ８（保持時間約８分）、Ｐ２０（保持時間約２０分）、Ｐ５６（保持時間約５６分）、Ｐ６０（保持時間約６０分）、Ｐ６２（保持時間約６２分）、Ｐ６４（保持時間約６４分）、Ｐ７５（保持時間約７５分）、Ｐ８２（保持時間約８２分）、Ｐ８８（保持時間約８８分）、Ｐ９９（保持時間約９９分）］を分取し、それぞれのペプチド含有画分を真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した後、個々のペプチドをプロテインシーケンサーに供し、それぞれアミノ酸配列を分析したところ、配列表に於ける配列番号８乃至１７に示すアミノ酸配列が得られた。
実験例５−３　Ｎ７５株由来ポリペプチドの内部アミノ酸配列
実験例２−３の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、得られた透析液を同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に２０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬（株）販売）を加え、３０℃、２４時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。即ち、『マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム』（直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ（株）製）を用い、室温下、流速０．９ｍｌ／分の条件で、０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−３６％アセトニトリル溶液の１２０分間かけて移行するリニアグラジエント条件下、ペプチドをカラム分画した。カラムから溶出してくるペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した５ペプチド［ＰＮ４７（保持時間約４７分）、ＰＮ５９（保持時間約５９分）、ＰＮ６７（保持時間約６７分）、ＰＮ８７（保持時間約８７分）、ＰＮ８９（保持時間約８９分）］を分取し、それぞれのペプチド含有画分を真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した後、個々のペプチドをプロテインシーケンサーに供し、それぞれアミノ酸配列を分析したところ、配列表に於ける配列番号２０乃至２４に示すアミノ酸配列が得られた。
実験例５−４　Ａ１９株由来のポリペプチドの内部アミノ酸配列
実験例３−３の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、得られた透析液を同緩衝液で約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この試料液（１ｍｌ）に２０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬（株）販売）を加え、３０℃、２４時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行なった。即ち、『マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム』（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ（株）製）を用い、室温下、流速０．９ｍｌ／分の条件で、０．１％トリフルオロ酢酸−１６％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−３６％アセトニトリル溶液の１２０分間かけて移行するリニアグラジエント条件下、ペプチドをカラム分画した。カラムから溶出してくるペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した５ペプチド［ＰＡ３９（保持時間約３９分）、ＰＡ８１（保持時間約８１分）、ＰＡ８６（保持時間約８６分）、ＰＡ９２（保持時間約９２分）、ＰＮ１０４（保持時間約１０４分）］を分取し、それぞれのペプチド含有画分を真空乾燥した後、２００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液に溶解した後、個々のペプチドをプロテインシーケンサーに供し、それぞれアミノ酸配列を分析したところ、配列表に於ける配列番号２７乃至３１に示すアミノ酸配列が得られた。
実験例６　バチルス　グロビスポルスＣ１１株由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製
実験例６−１　染色体ＤＮＡの調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．０％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス　グロビスポルス　Ｃ１１株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。その後、遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
実験例６−２　形質転換体ＢＧＣ２の調製
実験例６−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ　３ＡＩを約３５単位加え、３７℃で２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）』（ストラタジーン・クローニング・システム（株）製）を常法により制限酵素Ｂａｍ　ＨＩを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを『ＤＮＡライゲーション・キット』（宝酒造（株）製）を用いて、添付の説明書にしたがって操作し連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』（ストラタジーン・クローニング・システム（株）製）を１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。得られた遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム塩１００ｍｇ／Ｌ、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０ｍｇ／Ｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約５，０００個をアマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に固定した。別途、実験例５−２の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号１６に示すアミノ酸配列における第４番目より第１１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＧＮＴＴＹＡＴＧＡＡＹＴＴＹＡＧＲＴＧＧＧＡ−３′で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブ１としての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーにつき、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適応して２種類の形質転換体を選択した。常法により、これら２種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表に於ける配列番号１７に示すアミノ酸配列における第４番目より第１１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＡＹＧＣＮＴＧＧＡＴＧＴＴＹＧＧＮＧＡＹＴＧＧ−３′で表わされる塩基配列のプローブ２を化学合成し、同様に同位体標識後、通常のサザーン・ハイブリダイズを適応して、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、当該形質転換体を『ＢＧＣ２』と命名した。
実験例６−３　ＤＮＡ配列の解明
実施例６−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＣ２』を常法に従い、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、バチルス　グロビスポルスＣ１１株に由来する、鎖長５２９４塩基対の、配列表に於ける配列番号１８に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。第１７図に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｘｂａ　Ｉによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号１８に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例５−１の方法で確認された本発明のポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列及び実験例５−２の方法で明らかにされた中間部部分アミノ酸配列である、配列表に於ける配列番号７及び配列番号８乃至１７に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号７に示すアミノ酸配列は、配列番号１８に併記したアミノ酸配列に於ける第３６乃至４４番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表に於ける配列番号１８に併記したアミノ酸配列に於ける第８２３乃至８３２番目、第５７６乃至５８９番目、第８７４乃至９０４番目、第１１１７乃至１１４１番目、第６５７乃至６７０番目、第３６７乃至３９９番目、第９７０乃至９９３番目、第９３８乃至９５３番目、第２７９乃至２９５番目及び第６３２乃至６５１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。尚、配列表に於ける配列番号１８に於ける第４７８３乃至４７８５番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（５′−ＴＡＡ−３′）をコードしていることから、本発明のポリペプチドのＣ末端は、その直前のグルタミン酸（配列表に於ける配列番号１８に於ける第１２８４番目のアミノ酸）であることが判明した。
これらの結果は、本発明のポリペプチドが配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、本発明のポリペプチドは、バチルス　グロビスポルスＣ１１株に於いては、配列表における配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号１８に併記したアミノ酸配列における第１乃至３５番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表に於ける配列番号１８に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号１８に示す塩基配列にコードされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＢＧＣ２』と命名した。
実験例７　バチルス　グロビスポルスＮ７５株由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製
実験例７−１　染色体ＤＮＡの調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．０％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス　グロビスポルス　Ｎ７５株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。その後、遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
実験例７−２　形質転換体ＢＧＮ２の調製
実験例７−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｋｐｎ　Ｉを約２００単位加え、３７℃で１６時間反応させて染色体ＤＮＡを分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）』（ストラタジーン・クローニング・システム社製）を常法により制限酵素Ｋｐｎ　Ｉを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを『ＤＮＡライゲーション・キット』（宝酒造（株）製）を用いて、添付の説明書にしたがって操作し連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』（ストラタジーン・クローニング・システム社製）を１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。得られた遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム塩１００ｍｇ／Ｌ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０ｍｇ／Ｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約２，５００個をナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』（アマシャム製）上に固定した。別途、実験例５−３の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号２４に示すアミノ酸配列における第４番目より第１１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＡＹＧＣＮＴＧＧＡＴＧＴＴＹＧＧＮＧＡＹＴＧＧ−３′で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブ１としての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーにつき、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適応して３種類の形質転換体を選択した。常法により、これら３種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表に於ける配列番号２３に示すアミノ酸配列における第１４番目より第２１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＴＮＡＡＹＣＡＲＡＡＹＣＡＹＴＧＧＴＴＹＴＡ−３′で表わされる塩基配列のプローブ２を化学合成し、同様に同位体標識後、通常のサザーン・ハイブリダイズを適応して、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、当該形質転換体を『ＢＧＮ２』と命名した。
実験例７−３　ＤＮＡ配列の解明
実施例７−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＮ２』を常法に従い、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、バチルス　グロビスポルスＮ７５株に由来する、鎖長４９９１塩基対の、配列表に於ける配列番号２５に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。第１８図に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｋｐｎ　Ｉによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号２５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例５−１の方法で確認された本発明のポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列及び実験例５−３の方法で明らかにされた中間部部分アミノ酸配列である、配列表に於ける配列番号１９及び配列番号２０乃至２４に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号１９に示すアミノ酸配列は、配列番号２５に併記したアミノ酸配列に於ける第３６乃至４３番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号２０、２１、２２、２３、及び２４に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表に於ける配列番号２５に併記したアミノ酸配列に於ける第９０７乃至９２５番目、第３６７乃至３８６番目、第１０３４乃至１０５８番目、第９９６乃至１０２０番目、及び第６３２乃至６４２番目のアミノ酸配列と完全に一致した。尚、配列表に於ける配列番号２５に於ける第４２９４乃至４２９６番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（５′−ＴＡＡ−３′）をコードしていることから、本発明のポリペプチドのＣ末端は、その直前のグルタミン（配列表に於ける配列番号２５に於ける第１２８６番目のアミノ酸）であることが判明した。
これらの結果は、本発明のポリペプチドが配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、本発明のポリペプチドは、バチルス　グロビスポルスＮ７５株に於いては、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号２５に併記したアミノ酸配列における第１乃至３５番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表に於ける配列番号２５に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号２５に示す塩基配列にコードされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＢＧＮ２』と命名した。
実験例８　アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製
実験例８−１　染色体ＤＮＡの調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．０％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。その後、遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
実験例８−２　形質転換体ＡＧＡ１の調製
実験例８−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｋｐｎ　Ｉを約１０単位加え、３７℃で３０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約４，０００乃至８，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）』（ストラタジーン・クローニング・システム（株）製）を常法により制限酵素Ｋｐｎ　Ｉを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを『ＤＮＡライゲーション・キット』（宝酒造（株）製）を用いて、添付の説明書にしたがって操作し連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』（ストラタジーン・クローニング・システム（株）製）を１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。得られた遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム塩１００ｍｇ／Ｌ、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０ｍｇ／Ｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約６，０００個をナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』（アマシャム（株）製）上に固定した。別途、実験例５−４の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号２７に示すアミノ酸配列における第１番目より第１１番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＣＡＲＧＡＲＴＧＧＡＡＹＹＴＮＡＣＮＧＧＮＧＡＹＣＣＮＴＧＧＡＣ−３′で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブ１としての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーにつき、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適応して２種類の形質転換体を選択した。常法により、これら３種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表に於ける配列番号２９に示すアミノ酸配列における第６番目より第１６番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＴＧＧＡＣＮＣＡＲＣＣＮＧＡＲＧＣＮＧＧＮＧＣＮＧＴＮＴＴＧＣＡ−３′で表わされる塩基配列のプローブ２を化学合成し、同様に同位体標識後、通常のサザーン・ハイブリダイズを適応して、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、当該形質転換体を『ＡＧＡ１』と命名した。
実験例８−３　ＤＮＡ配列の解明
実施例８−２の方法で得た形質転換体『ＡＧＡ１』を常法に従い、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株に由来する、鎖長５８１１塩基対の、配列表に於ける配列番号３２に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。第１９図に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｋｐｎ　Ｉによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号３２に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例５−１の方法で確認された本発明のポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列及び実験例５−４の方法で明らかにされた中間部部分アミノ酸配列である、配列表に於ける配列番号２６及び配列番号２７乃至３１に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号２６に示すアミノ酸配列は、配列番号３２に併記したアミノ酸配列に於ける第３７乃至４９番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号２７、２８、２９、３０、及び３１に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表に於ける配列番号３２に併記したアミノ酸配列に於ける第２２７乃至２３９番目、第３４５乃至３７４番目、第４０１乃至４３０番目、第８９乃至１１５番目、及び第６４１乃至６６７番目のアミノ酸配列と完全に一致した。尚、配列表に於ける配列番号３２に於ける第４５５０乃至４５５２番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（５′−ＴＧＡ−３′）をコードしていることから、本発明のポリペプチドのＣ末端は、その直前のフェニルアラニン（配列表に於ける配列番号３２に於ける第９６５番目のアミノ酸）であることが判明した。
これらの結果は、本発明のポリペプチドが配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有し、本発明のポリペプチドは、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９０）に於いては、配列表における配列番号６に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号３２に併記したアミノ酸配列における第１乃至３６番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表に於ける配列番号３２に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号３２に示す塩基配列にコードされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＡＧＡ１』と命名した。
実験例９　本発明の形質転換体によるポリペプチドの産生
実験例９−１　形質転換体ＢＧＣ２
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験例６−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＣ２』を接種し、２７℃で約４８時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリペプチドの有無を調べるために、常法にしたがい、この培養物を遠心分離して培養上清と菌体とに分離して個別に回収した。菌体については、超音波破砕法による細胞からの全抽出物と、浸透圧ショック法による細胞ペリプラズムからの抽出物とを別々に調製した。前記超音波破砕法は、菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモゲナイザー（『モデルＵＨ−６００』）（（株）エスエムテー製）で細胞を破砕し、その破砕物を細胞全抽出物とする方法を採用した。前記浸透圧ショック法は、菌体を３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄した後、洗浄菌体を２００ｇ／ｌスクロース及び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む３３ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）に懸濁し２７℃で２０分間振盪し、続いて、遠心分離して菌体を回収し、その菌体を、予め約４℃に冷却しておいた０．５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液に懸濁し、氷水中で２０分間振盪して細胞ペリプラズムから抽出する方法を採用した。その後、遠心分離して、上清を回収し、その上清を細胞ペリプラズム抽出物とした。
このようにして得た培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリプラズム抽出物それぞれについて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。結果を表１２に示す。
2002055708.tif 000018
表１２の結果から明らかなように、形質転換体『ＢＧＣ２』は本発明のポリペプチドを細胞内に産生し、その大部分は細胞ペリプラズムに分泌されることが判明した。尚、第一の対照として、大腸菌『ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外は全て上記形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、バチルス　グロビスポルスＣ１１株を、アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上記形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物ともα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清及び菌体破砕物にはα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性が認められたが、この場合は、それぞれ、培養物当り約０．３７単位、約０．０２単位であり、形質転換体『ＢＧＣ２』の場合に比較して明らかに低い値であった。
上記で得た細胞ペリプラズム抽出物を、更に実験例１の方法に準じて、塩析、透析し、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲル、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、本発明のポリペプチドを実験例１に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量約１３７，０００±２０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点約５．２±０．５、α−イソマルトシル転移酵素活性の至適温度約４５℃（Ｃａ２＋イオン非存在）、約５０℃（Ｃａ２＋イオン存在）、至適ｐＨ約６．０、温度安定性は約４０℃まで（Ｃａ２＋イオン非存在）、約５０℃（Ｃａ２＋イオン存在）、ｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０であった。これらの結果から、本組換え型ポリペプチドは、実験例１の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。
実験例９−２　形質転換体ＢＧＮ２
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験例７−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＮ２』を接種し、２７℃で約４８時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリペプチドの有無を調べるために、実験例９−１の方法と同様に培養上清と細胞全抽出物と細胞ペリプラズム抽出物とを別々に調製した。培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリプラズム抽出物それぞれについて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。結果を表１３に示す。
2002055708.tif 000019
表１３の結果から明らかなように、形質転換体『ＢＧＮ２』は本発明のポリペプチドを培養上清及び細胞内に産生し、その細胞内のうちの大部分は細胞ペリプラズムに分泌されることが判明した。尚、第一の対照として、大腸菌『ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外は全て上記形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、バチルス　グロビスポルスＮ７５株を、アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上記形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物ともα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清及び菌体破砕物にはα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性が認められたが、この場合は、それぞれ、培養物当り約０．２１単位、約０．０１単位であり、形質転換体『ＢＧＮ２』の場合に比較して明らかに低い値であった。
上記で得た培養上清と細胞ペリプラズム抽出物との混合物を、更に実験例２の方法に準じて、塩析、透析し、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲル、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、本発明のポリペプチドを実験例２に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量約１３６，０００±２０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点約７．３±０．５、α−イソマルトシル転移酵素活性の至適温度約５０℃（Ｃａ２＋非存在下）、約５５℃（Ｃａ２＋存在下）、至適ｐＨ約６．０、温度安定性は約４５℃まで（Ｃａ２＋非存在下）、約５０℃（Ｃａ２＋存在下）、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。これらの結果から、本組換え型ポリペプチドは、実験例２の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。
実験例９−３　形質転換体ＡＧＡ１
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験例８−２の方法で得た形質転換体『ＡＧＡ１』を接種し、２７℃で約４８時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリペプチドの有無を調べるために、実験例９−１の方法と同様に培養上清と細胞全抽出物と細胞ペリプラズム抽出物とを別々に調製した。培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリプラズム抽出物それぞれについて、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。結果を表１４に示す。
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表１４の結果から明らかなように、形質転換体『ＡＧＡ１』は本発明のポリペプチドを培養上清及び細胞内に産生し、その細胞内のうちの大部分は細胞ペリプラズムに分泌されることが判明した。尚、第一の対照として、大腸菌『ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外は全て上記形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株を、アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上記形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物ともα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清及び菌体破砕物にはα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性が認められたが、この場合は、それぞれ、培養物当り約０．３３単位、約０．０１単位であり、形質転換体『ＡＧＡ２』の場合に比較して明らかに低い値であった。
上記で得た培養上清と細胞ペリプラズム抽出物との混合物を、更に実験例３の方法に準じて、塩析、透析し、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、本発明のポリペプチドを実験例３に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量約９４，０００±２０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点約４．３±０．５、α−イソマルトシル転移酵素活性の至適温度約６０℃（Ｃａ２＋非存在下）、約６５℃（Ｃａ２＋存在下）、至適ｐＨ約８．４、温度安定性は約５５℃まで（Ｃａ２＋非存在下）、約６０℃（Ｃａ２＋存在下）、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。これらの結果から、本組換え型ポリペプチドは、実験例３の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。
これらの結果から、本発明のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって製造できると共に、ポリペプチドの生産性も著しく向上することが判明した。
以下、実施例により、本発明のポリペプチドの製造方法と、本発明のポリペプチドっを用いた環状四糖又はそれを含む糖質の製造方法について具体的に説明する。
実施例１　本発明のポリペプチドの製造
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩を１００μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実験例５−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＣ２』を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。次に、３０ｌ容ファーメンターに上記と同じ組成の液体培地を約１８ｌとり、同様に滅菌し、３７℃まで冷却後、アンピシリンナトリウム塩を５０μｇ／ｍｌ加え、種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、２７℃で４８時間通気培養した。培養物を遠心分離して菌体を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去して上清を得た。この上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当り、約１，１００単位の酵素活性が検出された。この上清を用いて実験例１の方法により精製したところ、比活性約１３．５単位／ｍｇ蛋白質の本発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約６１単位含む水溶液が約７０ｍｌ得られた。
実施例２　本発明のポリペプチドの製造
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩を１００μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実験例６−２の方法で得た形質転換体『ＢＧＮ２』を接種し、３７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。次に、３０ｌ容ファーメンターに上記と同じ組成の液体培地を約１８ｌとり、同様に滅菌し、２７℃まで冷却後、アンピシリンナトリウム塩を５０μｇ／ｍｌ加え、種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、２７℃で４８時間通気培養した。培養物を遠心分離して培養上清を得た。この培養上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１Ｌ当り、約７５０単位の酵素活性が検出された。この上清を用いて実験例２の方法により精製したところ、比活性約１２．６単位／ｍｇ蛋白質の本発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約７２単位含む水溶液が約７５ｍｌ得られた。
実施例３　環状四糖を含むシラップ状物の製造
タピオカ澱粉を濃度約２５％澱粉乳とし、これにα−アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業（株）製）を澱粉固形物グラム当り０．２％加え、８５乃至９０℃で約２０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得た本発明のポリペプチドと、実験例１−４の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素を澱粉固形物グラム当りそれそれ２．２単位と６．６単位の割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（（株）林原生物化学研究所製）を澱粉固形物グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ　Ｌ「アマノ」』、天野製薬（株）製）を固形物１グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）を固形物１グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たり収率約９０％で得た。
本シラップは、固形物当り、グルコース３８．４％、環状四糖５８．１％、その他の糖質を３．５％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
実施例４　環状四糖結晶性粉末の製造
とうもろこし澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約３５℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得たポリペプチドと実験例１−４の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素を澱粉固形物グラム当りそれそれ２．５単位と７．０単位の割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（（株）林原生物化学研究所製）を澱粉固形物グラム当り１０単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度３５で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ　Ｌ「アマノ』、天野製薬（株）製）を固形物グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）を固形物グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物当り、グルコース３４．２％、環状四糖６２．７％、その他の糖質を３．１％含有する濃度６０％の環状四糖含有シラップを得た。
この環状四糖含有シラップを、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ−１３１０（Ｎａ型）』、オルガノ（株）製）を用いたカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５％（ｖ／ｖ）加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターし、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、固形物当たり約９８％の環状四糖を含有する環状四糖高含有液を得た。
本溶液を濃度約７０％に濃縮した後、助晶缶にとり、種晶として環状四糖５乃至６含水結晶約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマスキットを得た。本マスキットを乾燥搭上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ２の高圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥搭の上部より送風し、底部に設けた移送用金網コンベア上に結晶粉末を捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥搭外に徐々に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成搭に充填して温風を送りつつ、１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、原料澱粉固形物当たり収率約２０％で環状四糖５乃至６含水結晶粉末を得た。
本品は、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
実施例５　環状四糖結晶性粉末の製造
とうもろこし澱粉を濃度約３０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』（ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約５１℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実施例２の方法で得たポリペプチドと実験例２−４の方法で得たα−イソマルトシル転移酵素を澱粉固形物グラム当りそれそれ２．４単位と８．０単位の割合加え、更にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（（株）林原生物化学研究所製）を澱粉固形物グラム当り３単位になるように加え、ｐＨ５．５、温度５１℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ　Ｌ「アマノ」』、天野製薬（株）製）を固形物グラム当たり３００単位加え、２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）を固形物グラム当たり３０単位加え、１７時間反応させ、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物当り、グルコース４６．８％、環状四糖４４．０％、その他の糖質を９．８％含有する濃度６０％の環状四糖含有シラップを得た。得られた環状四糖含有シラップを原糖液とし、環状四糖の含量を高めるため、実施例５の方法に準じて強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なって、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、濃縮し、噴霧乾燥して、環状四糖含有粉末を原料澱粉固形物当たり収率約４５％で得た。
本品は、固形物当たり、グルコース３．７％、環状四糖８０．５％、及びその他の糖質を１５．８％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
本発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義ある発明と言える。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、マルトテトラオースにα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させたときに生成する生成物Ｘの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第２図は、マルトペンタオースにα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させたときに生成する生成物Ｙの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第３図は、マルトテトラオースにα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させたときに生成する生成物Ｘの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４図は、マルトペンタオースにα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させたときに生成する生成物Ｙの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第５図は、バチルス　グロビスポルスＣ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第６図は、バチルス　グロビスポルスＮ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第７図は、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
第８図は、バチルス　グロビスポルスＣ９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第９図は、バチルス　グロビスポルスＮ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第１０図は、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
第１１図は、本発明のバチルス　グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第１２図は、バチルス　グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第１３図は、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
第１４図は、バチルス　グロビスポルスＣ１１株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第１５図は、バチルス　グロビスポルスＮ７５株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第１６図は、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
第１７図は、本発明による組換えＤＮＡ『ｐＢＧＣ２』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルス　グロビスポルスＣ１１由来の本発明のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
第１８図は、本発明による組換えＤＮＡの『ｐＢＧＮ２』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルス　グロビスポルスＮ７５由来の本発明のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
第１９図は、本発明による組換えＤＮＡの『ｐＡＧＡ１』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、アルスロバクター　グロビホルミスＡ１９株由来の本発明のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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