(57)【要約】軟骨形成促進作用を有する低分子化合物と、ＭＥＫ１阻害活性化合物とを含むことを特徴とする軟骨形成促進剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨形成促進作用を有する低分子化合物と、ＭＥＫ１阻害活性化合物とを含むことを特徴とする軟骨形成促進剤。
【請求項２】
軟骨形成促進作用を有する前記低分子化合物が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩であることを特徴とする請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤。
2002087620.tif 000022
｛式中、Ｒ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、低級アルキルチオ基、アシル基、カルボキシル基、メルカプト基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し；Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、−ＳＲ５、または−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、低級アルコキシ基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ６，Ｒ７は一緒になって−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）１ＮＲ８（ＣＨ２）ｋ−（式中ｋ，ｌ，ｍはそれぞれ１〜８の整数を示し、Ｒ８は水素原子または低級アルキル基を示す）で表される基を構成してもよい）で表される基を示し；Ｘ，Ｙは同一でも異なっていてもよく、−ＣＨ２−、−ＮＨ−または−Ｏ−を示し、ｎは０〜４の整数を示す｝
【請求項３】
一般式（Ｉ）で表される前記化合物が、下記式で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲２記載の軟骨形成促進剤。
2002087620.tif 000023
【請求項４】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤を有効成分とすることを特徴とする軟骨修復剤。
【請求項５】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤を有効成分とすることを特徴とする軟骨細胞形質維持剤。
【請求項６】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤を有効成分とすることを特徴とする骨折修復促進剤。
【請求項７】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤を有効成分とすることを特徴とする軟骨関連疾患の治療または予防剤。
【請求項８】
軟骨関連疾患が、変形性関節症、慢性関節リウマチ、離断性骨軟骨炎、関節軟骨の損傷、椎間板ヘルニア、無耳症及び小耳症軟骨欠損からなる群より選ばれる疾患であることを特徴とする請求の範囲７記載の治療または予防剤。
【請求項９】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤を含有することを特徴とする、軟骨の生物学的、物理学的、または化学的研究用の試薬。
【請求項１０】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤を含有することを特徴とする軟骨細胞移植用薬剤。
【請求項１１】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤の有効量を患者に投与することを特徴とする軟骨形成促進方法。
【請求項１２】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤の有効量を患者に投与することを特徴とする軟骨関連疾患の治療または予防方法。
【請求項１３】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を有効成分とすることを特徴とする、ＭＥＫ１阻害活性化合物と併用のための、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物。
2002087620.tif 000024
｛式中、Ｒ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、低級アルキルチオ基、アシル基、カルボキシル基、メルカプト基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し；Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、−ＳＲ５、または−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、低級アルコキシ基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ６，Ｒ７は一緒になって−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）１ＮＲ８（ＣＨ２）ｋ−（式中ｋ，ｌ，ｍはそれぞれ１〜８の整数を示し、Ｒ８は水素原子または低級アルキル基を示す）で表される基を構成してもよい）で表される基を示し；Ｘ，Ｙは同一でも異なっていてもよく、−ＣＨ２−、−ＮＨ−または−Ｏ−を示し、ｎは０〜４の整数を示す｝
【請求項１４】
一般式（Ｉ）で表される前記化合物が、下記式で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲１３記載の軟骨形成促進作用を有する低分子化合物。
2002087620.tif 000025
【請求項１５】
請求の範囲１３記載の軟骨形成促進作用を有する低分子化合物と、ＭＥＫ１阻害活性化合物とを同時に、或いは、実質的に併用効果が発現する間隔内で、患者に投与することを特徴とする軟骨関連疾患の治療または予防方法。
【請求項１６】
請求の範囲１４記載の軟骨形成促進作用を有する低分子化合物と、ＭＥＫ１阻害活性化合物とを同時に、或いは、実質的に併用効果が発現する間隔内で、患者に投与することを特徴とする軟骨関連疾患の治療または予防方法。
【請求項１７】
軟骨関連疾患が、変形性関節症、慢性関節リウマチ、離断性骨軟骨炎、関節軟骨の損傷、椎間板ヘルニア、無耳症及び小耳症軟骨欠損からなる群より選ばれる疾患であることを特徴とする請求の範囲１２、１５又は１６記載の治療または予防方法。
【請求項１８】
請求の範囲１３又は１４記載の軟骨形成促進作用を有する低分子化合物を収容するための第１の容器と、ＭＥＫ１阻害活性化合物を収容するための第２の容器と、を備えることを特徴とするキット。
【請求項１９】
軟骨形成促進作用を有する前記低分子化合物と前記ＭＥＫ１阻害活性化合物とを患者に投与するための指示書を更に備えることを特徴とする請求の範囲１８記載のキット。
【請求項２０】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤と軟骨細胞とを共存させて培養させることにより、軟骨細胞の増殖した軟骨細胞を得ることを特徴とする軟骨細胞の増殖方法。
【請求項２１】
軟骨細胞の増殖と共に軟骨細胞外基質の合成がされた軟骨細胞を得ることを特徴とする請求の範囲２０記載の軟骨細胞の増殖方法。
【請求項２２】
軟骨細胞の増殖した前記軟骨細胞は、軟骨細胞移植に用いるためのものであることを特徴とする請求の範囲２０記載の軟骨細胞の増殖方法。
【請求項２３】
前記軟骨細胞移植が、自家軟骨細胞移植であることを特徴とする請求の範囲２２記載の軟骨細胞の増殖方法。
【請求項２４】
請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤と未分化間葉系細胞とを共存させて培養させることにより、前記未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化を促進させて軟骨細胞を得ることを特徴とする軟骨細胞の生産方法。
【請求項２５】
未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化と共に軟骨細胞外基質の合成がされた軟骨細胞を得ることを特徴とする請求の範囲２４記載の軟骨細胞の生産方法。
【請求項２６】
未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化を促進させてなる前記軟骨細胞は、軟骨細胞移植に用いるためのものであることを特徴とする請求の範囲２４記載の軟骨細胞の生産方法。
【請求項２７】
前記軟骨細胞移植が、自家軟骨細胞移植であることを特徴とする請求の範囲２６記載の軟骨細胞の生産方法。
【請求項２８】
請求の範囲２０記載の軟骨細胞の増殖方法により得られたことを特徴とする軟骨細胞。
【請求項２９】
請求の範囲２１記載の軟骨細胞の増殖方法により得られたことを特徴とする軟骨細胞。
【請求項３０】
請求の範囲２４記載の軟骨細胞の生産方法により得られたことを特徴とする軟骨細胞。
【請求項３１】
請求の範囲２５記載の軟骨細胞の生産方法により得られたことを特徴とする軟骨細胞。
【請求項３２】
軟骨細胞増殖能を有することを特徴とする請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤。
【請求項３３】
細胞外基質合成能を有することを特徴とする請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤。
【請求項３４】
未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化促進能を有することを特徴とする請求の範囲１記載の軟骨形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、軟骨形成促進剤に関する。
背景技術
軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）は、生体において、一般に、特殊化した結合組織の一つである軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、繊維細胞、およびこれらを埋め込んだ無定形・ゲル状の礎質からなり、生体の支持組織の一部をなすものである。
軟骨は、ヒトを始めとする温血動物においては、骨格、関節、気管、耳介、鼻などを形成している。すなわち、軟骨は成長時の骨の鋳型（成長軟骨）、円滑な関節の運動（関節軟骨）、呼吸（気管軟骨、鼻軟骨）、聴覚（耳介軟骨）など、温血動物の生存上不可欠な機能において中心的役割を果たしている。したがって、これらの軟骨が変性あるいは破壊された場合、変性あるいは破壊の部位ないし程度に応じて、生体に種々の障害がもたらされることとなる。
例えば、軟骨が関与する上記した機能（成長、関節、呼吸、聴覚等）の中でも、特に、円滑な関節の運動は、慢性関節リウマチや変形性関節症などの疾患において関節軟骨が変性あるいは破壊されることで損なわれる傾向がある。この関節軟骨の変性あるいは破壊は、これらの疾患による歩行困難の重要な原因であると考えられている。
他方、慢性関節リウマチや変形性関節症などの疾患の治療法として、関節の変性・破壊の抑制や、軟骨形成の促進が採用可能であることが指摘されている（Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．２２（１），Ｓｕｐｐｌ．４３：１３６〜１３９，１９９５，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８（２）：１３３〜１４２）。
軟骨形成を促進、あるいは軟骨細胞を増殖する効果がある物質としては、種々の生体由来物質ないし低分子物質が知られている。従来より、例えば、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒβ）などの成長因子、ＢＭＰ−２（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７９−Ａ（１０）：１４５２〜１４６３，１９９７）、レクチンの１種であるコンカナバリンＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０１２５〜１０１３１，１９９０）、あるいはオステオゲニン（ＢＭＰ−７）、ビタミンＤ誘導体（１α，２５−Ｄ３）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：５４３５〜５４４２，１９８９）、ビタミンＡ誘導体（レチノイン酸）（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１３０：７６７〜７７３，１９８８）、ヴァナデート（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０４：３１１〜３１９，１９８７）、ベンズアミド（Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．，８５：１６３〜１７５，１９８５）、ベンジル  β−Ｄ−キシロサイド（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２４：９７７〜９８８，１９８４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１１：４６２〜４６８，１９８２）、プロスタグランジン誘導体（ＰＧＥ２，Ｕ４４０６９）（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ，１９：３９１〜４０６，１９８０）、ｄｂｃＡＭＰ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｌ．，１００：６３〜７６，１９７９）、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｌ．，１００：６３〜７６，１９７９）、ＴＡＫ−７７８（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，２６１：１３１〜１３８，１９９９）等の低分子物質が、軟骨形成促進効果を有することが報告されている。また、国際公開００／４４７２２号公報には、特定の構造を有するインドリン−２−オン誘導体が軟骨形成促進作用を有することが開示されている。
上記した生体由来物質ないし低分子物質のうち、最も有用な治療薬となることが期待されたＴＧＦ−βに関して、ＴＧＦ−βのアイソフォームの一つであるＴＧＦ−β１は、これを関節内に投与した際に軟骨形成を促進することが報告されている（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１（２）：２７９〜２９０，１９９４）。また、このＴＧＦ−β１は、実験的に関節炎を生じさせたモデル動物において、関節炎による関節軟骨のプロテオグリカンの消失を抑制する、換言すれば、関節内投与時の関節軟骨への同化的作用により関節軟骨の破壊を抑制するため、リウマチなどの関節疾患の有用な治療薬としての可能性が示唆されている（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８（２）：１３３〜１４２，１９９８）。
しかしながら、このように最も有用な治療薬となることが期待されたＴＧＦ−βにおいても、該物質は軟骨形成を促進する一方で顕著な滑膜炎を惹起することが報告されており、前述した軟骨疾患の治療薬として大きな問題点を有しているため（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１（２）：２７９〜２９０，１９９４）、該疾患の治療薬として実用化されるに至っていない。すなわち、軟骨形成の促進に基づく実用的な治療薬は、現在のところ存在しない。
一方、損傷した軟骨の修復には、生体内より採取した細胞の移植が有用であることが知られており、すでに臨床に応用されている。移植に用いる細胞には、軟骨細胞（Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．３６７Ｓ：Ｓ１４７〜Ｓ１５５，１９９９）や間葉系前駆細胞（Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．３６７Ｓ：Ｓ１５６〜Ｓ１６２，１９９９）があり、特に自家軟骨細胞移植は最近実用化され一定の成績を収めている。しかしながら、採取した軟骨細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して増殖させる際に、軟骨細胞が脱分化して軟骨細胞としての形質を失い、その結果修復組織の質が低下することが問題となっている。すなわち、現時点は細胞移植による治療においても、軟骨欠損を機能的に完全な硝子軟骨で修復することは困難である。
ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ）は細胞の増殖と分化に重要な役割を果たしているシグナル伝達系で、細胞外からのさまざまな刺激、例えば成長因子や物理化学的ストレスに応答して活性化され、遺伝子発現の調節を行っている。主なＭＡＰＫにはｐ４４／４２（Ｅｒｋ）、ｐ３８、ＪＮＫがあり、それぞれ特異的なシグナルを伝達している。ＭＥＫ１とは、このなかでｐ４４／４２ＭＡＰＫの上流に位置するＭＡＰＫＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ）で、成長因子に応答してｐ４４／４２ＭＡＰＫを活性化する役割を担う。ここでいう活性化とは蛋白質のリン酸化である。ＭＥＫ１が直接軟骨形成を制御しているという報告はないが、ＭＥＫ１の下流のｐ４４／４２ＭＡＰＫは、軟骨形成作用を持つＴＧＦ−βやＢＭＰのシグナル伝達分子であるＳｍａｄを負に制御しているという報告（Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：６１８〜６２２，１９９７）があり、マウスの軟骨前駆細胞に対するＴＧＦ−βやＢＭＰの軟骨分化誘導作用をＭＥＫ１阻害剤が増強することが報告されている（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５０：３５１〜３６３，１９９９）。ＭＥＫ１阻害剤として知られている化合物には、ＰＤ９８０５９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７４８９〜２７４９４，１９９５）や、Ｕ０１２６（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８６２３〜１８６３２，１９９８）などが知られている。しかし、ＭＥＫ１阻害剤単独での軟骨形成促進作用は充分とはいえず、なお十分な効果を発揮する薬剤が望まれている。
発明の開示
本発明の目的は、上記従来技術による薬剤に比較して、特に優れた軟骨形成促進作用を発揮する軟骨形成促進剤を提供することにある。
本発明の目的は、また、かかる軟骨形成促進剤を含む、軟骨修復剤、軟骨細胞形質維持剤、骨折修復促進剤、軟骨関連疾患の治療または予防剤、軟骨の生物学的、物理学的または化学的研究用の試薬、および、軟骨細胞移植用薬剤を提供することにある。本発明の目的は、さらに、上記軟骨形成促進剤を用いた軟骨形成促進方法、軟骨関連疾患の治療または予防方法を提供することにある。加えて、本発明は、上記軟骨形成促進剤の成分である低分子化合物、かかる低分子化合物を用いる軟骨関連疾患の治療または予防方法、及び上記軟骨形成促進剤のキットを提供することを目的とする。さらには、本発明の目的は、上記軟骨形成促進剤を用いた、軟骨細胞の増殖方法及び生産方法、並びにかかる方法により得られる軟骨細胞を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物（例えば、特定の構造を有するインドリン−２−オン誘導体を含む低分子化合物など）とＭＥＫ１阻害活性化合物との組合せが、予期し得ない劇的な相乗的軟骨形成促進作用を有することを見い出し、かかる知見に基づいて本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物と、ＭＥＫ１阻害活性化合物とを含む軟骨形成促進剤を提供する。
軟骨形成促進作用を有する上記低分子化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩であることが好ましい。
2002087620.tif 000002
｛式中、Ｒ１はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、低級アルキルチオ基、アシル基、カルボキシル基、メルカプト基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し；Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、置換基を有していてもよい低級アルキニル基、置換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または置換基を有していてもよい複素環基を示し；Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、−ＳＲ５、または−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、低級アルコキシ基、または置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ６，Ｒ７は一緒になって−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）１ＮＲ８（ＣＨ２）ｋ−（式中ｋ，ｌ，ｍはそれぞれ１〜８の整数を示し、Ｒ８は水素原子または低級アルキル基を示す）で表される基を構成してもよい）で表される基を示し；Ｘ，Ｙは同一でも異なっていてもよく、−ＣＨ２−、−ＮＨ−または−Ｏ−を示し、ｎは０〜４の整数を示す｝
一般式（Ｉ）で表される上記化合物は、下記式で表される化合物（インドリン−２−オン誘導体、以下に述べる化合物Ａ）であることが好ましい。
2002087620.tif 000003
本発明は、また、上記軟骨形成促進剤を有効成分とする軟骨修復剤、軟骨細胞形質維持剤、骨折修復促進剤、および、軟骨関連疾患の治療または予防剤を提供する。
本発明は、さらに、上記軟骨形成促進剤を含有する、軟骨の生物学的、物理学的、または化学的研究用の試薬、および、軟骨細胞移植用薬剤を提供する。
本発明は、また、上記軟骨形成促進剤の有効量を患者に投与することを特徴とする軟骨形成促進方法、および、上記軟骨形成促進剤の有効量を患者に投与することを特徴とする軟骨関連疾患の治療または予防方法を提供する。
本発明は、さらに、上記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を有効成分とすることを特徴とする、ＭＥＫ１阻害剤と併用のための、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物を提供する。ここで、一般式（Ｉ）で表される化合物としては、上記化合物Ａが好ましい。
本発明は、また、上記軟骨形成促進作用を有する低分子化合物と、ＭＥＫ１阻害活性化合物とを同時に、或いは、実質的に併用効果が発現する間隔内で、患者に投与することを特徴とする軟骨関連疾患の治療または予防方法を提供する。
本発明は、上記に加えて、軟骨形成促進作用を有する上記低分子化合物を収容するための第１の容器と、ＭＥＫ１阻害活性化合物を収容するための第２の容器と、を備えることを特徴とするキット、並びに、かかるキットに、軟骨形成促進作用を有する上記低分子化合物と上記ＭＥＫ１阻害活性化合物とを患者に投与するための指示書を更に備えることを特徴とするキットを提供する。
なお、上記軟骨関連疾患としては、変形性関節症、慢性関節リウマチ、離断性骨軟骨炎、関節軟骨の損傷、椎間板ヘルニア、無耳症又は小耳症軟骨欠損が挙げられる。
本発明は、また、上記本発明の軟骨形成促進剤と軟骨細胞とを共存させて培養させることにより、軟骨細胞の増殖した軟骨細胞を得ることを特徴とする軟骨細胞の増殖方法、及び、かかる増殖方法において、軟骨細胞の増殖と共に軟骨細胞外基質の合成がされた軟骨細胞を得ることを特徴とする軟骨細胞の増殖方法を提供する。この場合において、軟骨細胞の増殖した前記軟骨細胞は、軟骨細胞移植に用いることができ、かかる軟骨細胞移植には、自家軟骨細胞移植が含まれる。なお、軟骨細胞の増殖した軟骨細胞は増殖前の軟骨細胞に比較して２倍以上の軟骨細胞を有していることが好ましい。
本発明は、さらに、上記本発明の軟骨形成促進剤と未分化間葉系細胞とを共存させて培養させることにより、前記未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化を促進させて軟骨細胞を得ることを特徴とする軟骨細胞の生産方法、及び、かかる生産方法において、未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化と共に軟骨細胞外基質の合成がされた軟骨細胞を得ることを特徴とする軟骨細胞の生産方法を提供する。この場合において、未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化を促進させてなる前記軟骨細胞は、軟骨細胞移植に用いることができ、かかる前記軟骨細胞移植には、自家軟骨細胞移植が含まれる。
本発明は、また、上記本発明の軟骨細胞の増殖方法により得られたことを特徴とする軟骨細胞、及び、上記発明の軟骨細胞の生産方法により得られたことを特徴とする軟骨細胞を提供する。
本発明は、さらに、上記本発明の軟骨形成促進剤であって、軟骨細胞増殖能、細胞外基質合成能若しくは未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化促進能、を有することを特徴とする軟骨形成促進剤を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、「軟骨形成促進作用を有する」とは、軟骨分化誘導能あるいは軟骨基質産生亢進能を有することを意味するが、本発明の「軟骨形成促進作用を有する低分子化合物」において「軟骨形成促進作用を有する」との用語が用いられるときには、特に、ＭＥＫ１阻害作用以外の機序により軟骨分化誘導能あるいは軟骨基質産生亢進能を有することを意味する。軟骨形成促進作用は、例えば軟骨細胞や軟骨前駆細胞を処理したときにＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：４０〜４６，１９７７に記載の方法による３５Ｓ硫酸の取り込みを測定することによって調べることができる。具体的には上記測定方法により、対照群と比べて２倍程度以上の作用を有していることが好ましい。
本発明において、「軟骨形成促進作用を有する低分子化合物」とは、かかる作用を有するあらゆる低分子化合物（ここで、低分子化合物とは、当該分野で低分子とされる化合物一般をいい、例えば、分子量が約１０００以下の有機化合物などが含まれる）が含まれ、例えば、上記一般式（Ｉ）で示されるインドリン−２−オン誘導体またはその塩、これらと類似の軟骨形成促進作用を有する低分子有機化合物、その他２−ベンゾチオピランや３−ベンゾチエピン誘導体などが挙げられ、なかでも、上記一般式（Ｉ）で示されるインドリン−２−オン誘導体またはその塩、これらと同一または類似の軟骨形成促進作用を有する低分子有機化合物（ここで、上記一般式（Ｉ）で示されるインドリン−２−オン誘導体と「同一または類似の軟骨形成促進作用を有する」か否かは、例えば上記３５Ｓ硫酸の取り込みや、あるいはＣｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．９：２４７〜２４８，１９８２に記載の方法による硫酸化グリコサミノグリカンの産生量を測定することによって判断することができる。例えば上記方法によりインドリン−２−オン誘導体と同程度以上、すなわち、３５Ｓ硫酸の取り込みや硫酸化グリコサミノグリカンの産生量が、上記一般式（Ｉ）で示されるインドリン−２−オン誘導体またはその塩の５０％以上の作用を示せば同一または類似と判断できる。）が好ましく、特に、上記一般式（Ｉ）で示されるインドリン−２−オン誘導体またはその塩が好ましい。
一般式（Ｉ）で表される化合物は、国際公開９４／１９３２２号公報に記載されており、同公報にはこの化合物がＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体拮抗薬であることが記載されている。さらに、国際公開００／４４７２２号公報には、一般式（Ｉ）で表される化合物が軟骨形成促進作用を有することが記載されている。
本発明の軟骨形成促進作用を有する低分子化合物と、ＭＥＫ１阻害活性化合物とは、軟骨形成促進において相乗的な効果を発揮する。ここで、相乗的とは、２種類の薬剤の併用効果が、それぞれの薬剤の単独効果の和よりも大きくなることを意味する。
ＭＥＫ１阻害活性化合物とは、ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ）シグナル伝達系の中でｐ４４／４２ＭＡＰＫの上流のＭＡＰＫＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ）、即ち、ＭＥＫ１を阻害する作用を有する化合物をいい、低分子化合物、高分子化合物、タンパクなど、かかる作用を有する限り全て本発明における定義に含まれる。ＭＥＫ１阻害活性は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８６２３〜１８６３２，１９９８に記載の方法により、ｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化を検出することにより測定することができる。
本発明においては、例えば、ＩＣ５０が１０μｍｏｌ／Ｌ程度の阻害活性を有する化合物であれば軟骨形成促進作用を有する低分子有機化合物との相乗作用を発揮するに十分であるが、ＩＣ５０が１〜０．１μｍｏｌ／Ｌ程度の化合物がより好ましい。ＭＥＫ１阻害活性化合物としては、具体的には、例えば、Ｕ０１２６（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８６２３〜１８６３２，１９９８）、ＰＤ９８０５９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７４８９〜２７４９４，１９９５）、ＳＬ−３２７（国際公開００／２０２０９７）、およびＢＡＹ４３−９００６（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：２１９−２２５、２００１）などが挙げられ、これらを単独または２種以上を組み合わせて用いることができる。
軟骨修復剤とは、軟骨欠損や変形性関節症などの軟骨関連疾患の治療に用いられ得る薬剤をいう。
軟骨細胞形質維持剤とは、軟骨細胞移植において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞を培養する際、アジュバント（培地添加物）として用い、軟骨細胞の分化形質を維持する薬剤をいう。
即ち、本発明においては、間葉系前駆細胞の軟骨分化を誘導、あるいは成熟した軟骨細胞の分化形質を促進することが可能な軟骨修復剤が提供される。また、本発明においては、成熟した軟骨細胞の分化形質を維持することが可能な、軟骨細胞移植にアジュバントとして用いられる軟骨細胞形質維持剤が提供される。本発明によれば、軟骨を生物学的、物理学的ならびに化学的に研究する際に有用な、強力な軟骨形成促進作用を有する試薬を提供することができる。
一般式（Ｉ）で示される化合物の定義において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
低級アルキル基とは、直鎖または分岐鎖状の、炭素数１〜６のアルキル基を示し、たとえばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等があげられる。
低級アルケニル基とは、直鎖または分岐鎖状の炭素数２〜６のアルケニル基を示し、たとえばビニル基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等があげられる。
低級アルキニル基とは、直鎖または分岐鎖状の炭素数２〜６のアルキニル基を示し、たとえばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等があげられる。
低級アルコキシ基とは、直鎖または分岐鎖状の炭素数１〜６のアルコキシ基を示し、たとえばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペントキシ基、ヘキソキシ基等があげられる。
アシル基とは、水素原子や置換基を有していてもよい、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アミノ基等で置換されたカルボニル基を示し、たとえばアセチル基、プロピオニル基、ピバロイル基、シクロヘキサンカルボニル基等のアルキルカルボニル基およびベンゾイル基、ナフトイル基、トルオイル基等のアリールカルボニル基があげられる。
アリール基とは、芳香族炭化水素から水素原子１個を除いた１価の基を示し、たとえばフェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基などがあげられる。
低級アルキレン基とは直鎖または分岐鎖状の、炭素数１〜６のアルキレン基を示し、たとえばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基等があげられる。
シクロアルキル基とは、炭素数３〜８の環状飽和炭化水素基を示し、たとえばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基などがあげられ、置換基を有するシクロアルキル基としてはメンチル基、アダマンチル基などがあげられる。
複素環基とは、１個以上のヘテロ原子を有する芳香族複素環基を示し、たとえばピリジル基、フリル基、チエニル基、イミダゾリル基、ピラジニル基、ピリミジル基などがあげられる。
上記した低級アルキル基、低級アルケニル基、アルキニル基、低級アルコキシ基、アシル基、アリール基、シクロアルキル基、複素環基は、必要に応じて、１以上の種々の置換基により置換されていてもよい。このような置換基の例としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、水酸基、低級アルコキシ基（この低級アルコキシ基は、ハロゲン原子で置換されていてもよい）、アリールオキシ基、低級アルキルチオ基、複素環基、ホルミル基（このホルミル基はアセタールとして保護されていてもよい）、低級アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、アミノ基（このアミノ基は、低級アルキル基等を有していてもよい）、イミノ基、チオアセタール基、ニトロ基、ニトリル基、トリフルオロメチル基などがあげられる。
一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、またはニトロ基であることが好ましい。
ｎは０または１であることが好ましく、特に０であることが好ましい。
Ｒ２としては、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル基、または置換基を有していてもよいアリール基であることが好ましく、軟骨形成促進剤ないし軟骨修復剤としての活性の点からは、更には置換基（この置換基は、ハロゲン原子で置換されていてもよい）を有していてもよい低級アルキル基であることが好ましい。
中でも、Ｒ２は２つの低級アルコキシ基（この低級アルコキシ基は、１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい）または−Ｏ−Ｚ−Ｏ−基（式中、Ｚは１〜１０個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す）が同一炭素上に置換されている低級アルキル基であることが好ましく、更には一般式（ＩＩ）
2002087620.tif 000004
（式中、Ｒ１０，Ｒ１１は同一でも異なっていてもよく、それぞれ１〜５個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキル基を示し、少なくとも一方は１〜５個のハロゲン原子を有する低級アルキル基であることが好ましい）、
または一般式（ＩＩＩ）
2002087620.tif 000005
（式中、Ｚは１〜１０個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す）で表される基であることが好ましい。
このようなＲ２としては、より具体的には、２，２−ジエトキシエチル基、２，２−ジメトキシエチル基、２，２−ジイソプロポキシエチル基、２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル基、または２，２−ビス（２−クロロエトキシ）エチル基が好ましく、中でも、２，２−ジエトキシエチル基、または２，２−ビス（２−フルオロエトキシ）エチル基がより好ましく、２，２−ジエトキシエチル基が特に好ましい。
Ｒ３としては、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、または置換基を有していてもよいアリール基であることが好ましく、中でも置換基を有していてもよいアリール基がより好ましい。このような置換基としては、低級アルキル基（好ましくは、メチル基、エチル基；より好ましくはメチル基）または低級アルキル基を有していてもよいアミノ基が好ましく、前記Ｒ３としては、４−メチルフェニル基が好ましい。
Ｒ４としては、置換基を有していてもよい低級アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよい複素環基、−ＯＲ５、または−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は前記と同義）で表される基であることが好ましく、更には−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子または置換基を有していてもよいアリール基を示す）で表される基であることがより好ましい。
中でも、Ｒ４が−ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６，Ｒ７は同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、あるいはアリール基（このアリール基は、低級アルキル基またはアミノ基（このアミノ基は、さらに低級アルキル基を有していてもよい）を有している）で表される基であることが好ましく、更には−ＮＨＲ７（式中、Ｒ７は４−メチルフェニル基、４−エチルフェニル基、または４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル基）で表される基であることが特に好ましい。
Ｘとしては、−ＣＨ２−、−ＮＨ−または−Ｏ−が好ましい。
Ｙとしては、−ＣＨ２−または−ＮＨ−が好ましい。
中でも、軟骨形成促進剤としての活性の点からは、Ｘ，Ｙは同一でも異なっていてもよく、−ＣＨ２−または−ＮＨ−を示すことがより好ましく、Ｘが−ＮＨ−、Ｙが−ＣＨ２−であることが特に好ましい。
一般式（Ｉ）で示される化合物としては、具体的には、たとえば国際公開９４／１９３２２号公報の実施例に記載されている化合物、すなわち下記（表１）〜（表９）に示す化合物番号１〜２０１の化合物などが挙げられる。（表１）〜（表９）中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｘ、Ｙおよびｎは、前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。
2002087620.tif 000006
2002087620.tif 000007
2002087620.tif 000008
2002087620.tif 000009
2002087620.tif 000010
2002087620.tif 000011
2002087620.tif 000012
2002087620.tif 000013
2002087620.tif 000014
一般式（Ｉ）で示される化合物としては、下記の化合物Ａ〜Ｇが好ましく、化合物Ａが特に好ましい。
（化合物Ａ）
2002087620.tif 000015
（化合物Ｂ）
2002087620.tif 000016
（化合物Ｃ）
2002087620.tif 000017
（化合物Ｄ）
2002087620.tif 000018
（化合物Ｅ）
2002087620.tif 000019
（化合物Ｆ）
2002087620.tif 000020
（化合物Ｇ）
2002087620.tif 000021
一般式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、りん酸塩等の無機塩類、コハク酸塩、マロン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、安息香塩、サリチル酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩等の金属塩が挙げられる。更に、一般式（Ｉ）で示される化合物は、光学活性体であってもよい。光学活性体である場合には、その３位の絶対配置がＲ配置であるものが好ましい。
本発明の軟骨形成促進剤は、該薬剤の軟骨形成促進効果が有効に利用可能な限り、種々の用途に特に制限なく使用可能であるが、特に、軟骨の変性・破壊による軟骨機能不全を伴う軟骨疾患、外傷や手術による軟骨の損傷・切除、先天的な軟骨の低形成や奇形の治療に有用である。また細胞移植による軟骨欠損修復においては未分化前駆細胞からの軟骨誘導あるいは軟骨細胞の形質維持に有用である。このような軟骨疾患の例としては、例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、離断性骨軟骨炎、外傷による関節軟骨の損傷、椎間板ヘルニアなどがあげられる。また先天的な軟骨の低形成や奇形の例としては、例えば、無耳症、小耳症などがあげられる。
本発明の軟骨形成促進剤を含有する薬剤は、経口的にまたは非経口的に投与することができるが、投与した部位以外での、必要でない軟骨形成促進を回避する点、もしくは効果の点からは、非経口投与が好ましい。投与に際しては、それぞれの投与方法に適した製剤に調製することができる。また、細胞移植においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未分化前駆細胞あるいは軟骨細胞を培養する際、培地成分として用いることができる。
本発明の軟骨形成促進剤は、軟骨修復剤、軟骨細胞形質維持剤又は骨折修復促進剤として用いられる他、軟骨関連疾患の治療または予防剤としても用いられる。そして、かかる用途においては、投与（生体外での使用を含む。以下同様）の前に軟骨形成促進作用を有する低分子化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物とを混合して合剤とし、かかる合剤を投与してもよく、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物とから合剤を作製することなくそれらを同時に投与してもよい。
更には、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物及びＭＥＫ１阻害活性化合物のうち、一方を先に投与して他方を後に投与してもよい。この場合には、両者の実質的な併用効果が発現する間隔内で投与を行う。ここで、実質的に併用効果が発現する間隔は、それぞれの化合物の生体内における消失速度にあわせて適宜決定すればよい。なお、一方を先に、他方を後に投与する場合は、一方の全量を一度に投与する必要はなく、例えば、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物の投与とＭＥＫ１阻害活性化合物の投与とをそれぞれ複数回に分けて行ってもよい。
軟骨形成促進作用を有する低分子化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物と別々に投与するために、本発明は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を有効成分とすることを特徴とする、ＭＥＫ１阻害活性化合物と併用のための、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物を提供する。なお、一般式（Ｉ）で表される化合物は、上記インドリン−２−オン誘導体（上記化合物Ａ）であることが好ましい。
これにより、上記軟骨形成促進作用を有する低分子化合物と、ＭＥＫ１阻害活性化合物とを同時に、或いは、実質的に併用効果が発現する間隔内で、患者に投与することを特徴とする軟骨関連疾患の治療または予防方法の実施が可能になる。
かかる方法の実施のために、本発明は、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物を収容するための第１の容器と、ＭＥＫ１阻害活性化合物を収容するための第２の容器と、を備えることを特徴とするキットを提供する。なお、かかるキットは、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物とを患者に投与するための指示書を更に備えていてもよい。
第１の容器と第２の容器は同一種類でも異なる種類でもよく、例えば、注射筒、バイアル、錠剤やカプセル剤を包装したＰＴＰ包装が挙げられる。また、上記指示書は、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物との投与の要領、実質的に併用効果が発現する間隔等が記載されていることが好ましい。
本発明においては、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物とを併用することにより相乗的な軟骨形成促進作用を示す。上述のように軟骨形成促進作用を有する低分子化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物とは別々に使用することが可能であるため、上記それぞれの化合物は、それぞれに製剤化しても、これらを混合してひとつの製剤として製剤化してもよい。投与の一態様としては、例えば、これら化合物は個々に製剤化され、それぞれが臨床的に使用されるのと同様な方法で投与されるが、単独で使用されるよりも低い用量で所望の効果を期待できる。
軟骨形成促進作用を有する低分子化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物とを含有する医薬組成物は、通常の製剤化技術を用いて製剤化することができ、用途に応じてカプセル剤、顆粒剤、クリーム剤、散剤、シロップ剤、錠剤、注射剤、および軟膏剤等の、固体および液体の種々の製剤として使用することができる。製剤用の担体や賦形剤としては、固体または液体状の物質が挙げられる。これらの例としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、スターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、エチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、コラーゲンスポンジなどやその他、常用のものが例示される。
かかる製剤中の軟骨形成促進剤の含有量は、その剤型によって異なるが、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物としては、一般に０．００００１〜８０重量％の濃度で含有していることが好ましく、ＭＥＫ１阻害活性化合物としては、一般に０．００００１〜８０重量％の濃度で含有していることが好ましい。また、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物と、ＭＥＫ１阻害活性化合物の重量比（または投与量の比）は、当該発明による相乗効果が期待できる範囲で、疾患の種類、年齢、症状の軽重、投与経路、医師の診断などに応じて、広範囲に変えることができるが、一般に、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物：ＭＥＫ１阻害活性化合物が、１０００：１〜１：１００の範囲で使用され得る。例えば、自家軟骨細胞移植におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系で培地添加物として用いる場合には、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物が０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、ＭＥＫ１阻害活性化合物が０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用され得る。
経口投与の場合は、一般に、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物は１日あたり０．０１〜２ｇ／ｋｇ、ＭＥＫ１阻害活性化合物も一日あたり０．０１〜２ｇ／ｋｇ、非経口投与の場合は、一般に、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物は１日あたり０．００００００１〜０．０１ｇ／ｋｇ、ＭＥＫ１阻害活性化合物は一日あたり０．００００００１〜０．０１ｇ／ｋｇ、の用量で使用される。また、上記投与量は、１〜７日あたり１回または数回に、まとめて又は分けて投与することができ、症状の軽重、医師の判断により、適宜変更することができる。
以下の実施例に示したように、本発明の薬剤、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物（特に一般式（Ｉ）で表される化合物）とＭＥＫ１阻害活性化合物をラットから採取した関節軟骨細胞に添加した場合、優れた軟骨基質産生促進作用が現れることが確認された。この事実は、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物を含む低分子化合物あるいはこれと類似の作用を有する化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物からなる薬剤の関節疾患の治療薬としての有用性、および、これら化合物を併用することからなる関節疾患の治療方法の有用性を示したものである。
ラット関節軟骨細胞を、軟骨形成促進作用を有する低分子化合物（一般式（Ｉ）で表される化合物あるいはこれに類似の作用を有する化合物など）とＭＥＫ１阻害活性を有する化合物を含む軟骨形成促進剤で処理することで、あるいはこれら化合物の組合せにより処理することで、軟骨細胞（軟骨細胞を処理した場合はより多くの軟骨細胞）、その細胞外基質または軟骨様組織を得ることができる。これらの軟骨形成促進剤は、関節軟骨、気管軟骨、椎間板、耳介軟骨、胸骨等の欠損の修復剤としても有用な治療薬となることを示したものである。
また、本作用は軟骨形成促進作用を有する低分子化合物（一般式（Ｉ）で表される化合物あるいはこれに類似の作用を有する化合物など）とＭＥＫ１阻害活性化合物を含む軟骨形成促進剤が、軟骨細胞移植による軟骨欠損修復時に軟骨細胞の形質維持剤として有用であることを示している。さらに、一般式（Ｉ）で表される化合物を含む低分子化合物あるいはこれに類似の作用を有する化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物を含む軟骨形成促進剤は軟骨細胞の細胞外基質代謝や軟骨細胞への分化の機構（以上が生物学的項目）、細胞外基質の構成成分の分析（化学的項目）、粘弾性などの物性（物理的項目）の解析に用いることができる。
さらに、本発明の強力な軟骨形成促進作用を有する一般式（Ｉ）で表される薬剤あるいは類似の作用を有する化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物を含有する薬剤は、その軟骨形成促進作用による石灰化軟骨形成の促進が起こり得るため、その場合、最終的に軟骨形成促進剤の軟骨内骨化を介した骨折治療促進作用を想起することができる。すなわち、上記軟骨形成促進剤は骨折の修復促進剤としても有用となることが期待できる。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」および「％」は、特に断らない限り重量基準とする。
（実施例１：ラット関節軟骨細胞における化合物ＡとＭＥＫ１阻害活性化合物Ｕ０１２６の相乗的軟骨基質産生促進作用）
５週令の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールス・リバー社製）を安楽死させた後、大腿骨を摘出し、メスを用いて大腿骨の膝関節面から関節軟骨層を剥離した。得られた関節軟骨は０．１５％トリプシン（ＤＩＦＣＯ社製）／０．０５％ＥＤＴＡ（関東化学社製）で３７℃、１時間処理した後、０．１５％コラゲナーゼ（ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ社製）溶液中で３７℃、３時間攪拌しながら基質を分解し、細胞懸濁液を得た。得られた軟骨細胞はＩ型コラーゲン（新田ゼラチン社製）で被膜した培養用２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に１穴あたり１５０００個の細胞密度で播き、１０％ウシ胎児血清（ＲＥＨＡＴＵＩＮ社製）、抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社製）中で培養した（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．１９：１７９〜１８７，１９７５）。コンフルエント後、培地に５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（和光純薬社製）を加え、さらに、５ｘ１０−７〜２ｘ１０−６ｍｏｌ／Ｌの化合物Ａと１０−７〜１０−５ｍｏｌ／ＬのＭＥＫ１阻害活性化合物Ｕ０１２６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）またはその両方を添加して１週間培養した。溶媒対照として０．１２％のＤＭＳＯ（和光純薬社製）を用いた。培地交換は２ないし３日毎に行い、その度に上記薬剤を添加した。
培養終了後、細胞層は４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬社製）で室温で２時間固定し、蒸留水およびｐＨ１．０の５％酢酸で洗浄した後、アルシアンブルー液ｐＨ１．０（和光純薬社製社製）で室温で２時間軟骨基質を染色した。５％酢酸および蒸留水で洗浄して乾燥させた後、細胞層に６ｍｏｌ／Ｌのグアニジン塩酸（ナカライテスク社製）溶液を加えて色素を抽出し、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社製）にて６３０ｎｍの吸収を測定した。
培養終了時点での細胞の形態（位相差顕微鏡写真）を図１〜４に示す。図１〜４の結果から明らかなように、溶媒対照（図１）に比べて、化合物Ａを加えて培養した軟骨細胞は基質産生が亢進し、形態が丸く変化した（図２）。ＭＥＫ１阻害活性化合物Ｕ０１２６単独でも若干軟骨細胞の分化が亢進した（図３）が、化合物ＡとＵ０１２６を共存させた場合は、劇的に基質の産生が亢進し、対照群に比べて細胞間の間隙が明らかに広がった典型的な成熟軟骨細胞様の形態を示した（図４）。
アルシアンブルー染色強度を図５および６に示す。図５は、化合物Ａ及びＵ０１２６を加えずＤＭＳＯを加えた場合、化合物Ａを加えずにＵ０１２６をそれぞれ１×１０−７、１×１０−６、１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ加えた場合、化合物Ａのみを２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ加えた場合、２×１０−６ｍｏｌ／Ｌの化合物Ａを加え、さらにＵ０１２６をそれぞれ１×１０−７、１×１０−６、１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ加えた場合、の結果を示している。なお、図は各群３ウェルのアルシアンブルー染色強度の平均値±標準偏差を表す。
一方、図６は、化合物Ａ及びＵ０１２６を加えずＤＭＳＯを加えた場合、Ｕ０１２６を加えずに化合物Ａをそれぞれ５×１０−７、１×１０−６、２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ加えた場合、Ｕ０１２６のみを１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ加えた場合、１×１０−５ｍｏｌ／ＬのＵ０１２６を加え、さらに化合物Ａをそれぞれ５×１０−７、１×１０−６、２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ加えた場合、の結果を示している。なお、図は各群３ウェルのアルシアンブルー染色強度の平均値±標準偏差を表す。
また、Ｕ０１２６、化合物Ａそれぞれ単独処理が溶媒対照に対してアルシアンブルー染色強度に差があるかどうか、また、両薬物を共存させた時それぞれの単独処理に対してアルシアンブルー染色強度に差があるかどうか、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較両側検定にて検証した。
図５及び６中の＊は、それぞれ各濃度のＵ０１２６および化合物Ａが、単独で溶媒対照に対して有意（ｐ＜０．０５）にアルシアンブルー陽性の軟骨基質の産生を促進したことを意味する。また、図５中の＃は、２×１０−６ｍｏｌ／Ｌの化合物Ａ存在下の各濃度のＵ０１２６が、化合物Ａ単独処理に対して有意（ｐ＜０．０５）にアルシアンブルー陽性の軟骨基質の産生を促進したことを意味する。そして、図６中の＊＊は、１×１０−５ｍｏｌ／ＬのＵ０１２６存在下の各濃度の化合物Ａが、Ｕ０１２６単独処理に対して有意（ｐ＜０．０５）にアルシアンブルー陽性の軟骨基質の産生を促進したことを意味する。
図５および図６の結果から明らかなように、化合物ＡまたはＵ０１２６単独でも軟骨基質産生を有意に促進したが、両者を共存させた場合は相乗的な軟骨基質産生の促進効果が認められた。
（実施例２：ラット関節軟骨細胞における化合物ＡとＭＥＫ１阻害活性化合物ＰＤ９８０５９の相乗的軟骨基質産生促進作用）
５週令の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールス・リバー社製）を安楽死させた後、大腿骨を摘出し、メスを用いて大腿骨の膝関節面から関節軟骨層を剥離した。得られた関節軟骨は０．１５％トリプシン（ＤＩＦＣＯ社製）／０．０５％ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）で３７℃、１時間処理した後、０．１５％コラゲナーゼ（ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ社製）溶液中で３７℃、３時間攪拌しながら基質を分解し、細胞懸濁液を得た。得られた軟骨細胞はＩ型コラーゲン（新田ゼラチン社製）で被膜した培養用２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に１穴あたり２００００個の細胞密度で播き、１０％ウシ胎児血清（ＲＥＨＡＴＵＩＮ社製）、抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社製）中で培養した（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．１９：１７９〜１８７，１９７５）。コンフルエント後、培地に５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（和光純薬社製）を加え、さらに、２×１０−６ｍｏｌ／Ｌの化合物Ａと２×１０−６〜５×１０−５ｍｏｌ／ＬのＭＥＫ１阻害活性化合物ＰＤ９８０５９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）またはその両方を添加して１週間培養した。溶媒対照として０．１２％のＤＭＳＯ（純正化学社製）を用いた。培地交換は２ないし３日毎に行い、その度に上記薬剤を添加した。
培養終了後、細胞層は４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬社製）で室温で２時間固定し、蒸留水およびｐＨ１．０の５％酢酸で洗浄した後、アルシアンブルー液ｐＨ１．０（和光純薬社製社製）で室温で２時間軟骨基質を染色した。５％酢酸および蒸留水で洗浄して乾燥させた後、細胞層に６ｍｏｌ／Ｌのグアニジン塩酸（ナカライテスク社製）溶液を加えて色素を抽出し、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社製）にて５９５ｎｍの吸収を測定した。
アルシアンブルー染色後の細胞の形態（位相差顕微鏡写真）を図７に示す。図７に示されるように、溶媒対照に比べて、化合物ＡまたはＰＤ９８０５９を加えて培養した細胞はそれぞれアルシアンブルー陽性細胞の占める割合が増加したが、化合物ＡとＰＤ９８０５９を共存させた場合は、ほぼすべての細胞がアルシアンブルー陽性となった。
アルシアンブルー染色強度を図８に示す。図８は、化合物ＡもＰＤ９８０５９も加えない場合（培地）、化合物Ａ及びＰＤ９８０５９を加えずＤＭＳＯを加えた場合、化合物Ａのみを２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ加えた場合、ＰＤ９８０５９のみを５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ加えた場合、２×１０−６ｍｏｌ／Ｌの化合物Ａを加え、さらにＰＤ９８０５９をそれぞれ２×１０−６、１×１０−５、５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ加えた場合、の結果を示している。なお、図は各群３ウェルのアルシアンブルー染色強度の平均値±標準偏差を表す。
また、ＰＤ９８０５９、化合物Ａそれぞれ単独処理が溶媒対照に対してアルシアンブルー染色強度に差があるかどうか、また、両薬物を共存させた時それぞれの単独処理に対してアルシアンブルー染色強度に差があるかどうか、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較両側検定にて検証した。
図８中の平行軸に記載された＋は化合物Ａ（２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）の存在を意味し、−は化合物Ａの非存在を意味する。また、同図中の＃は、それぞれ各濃度のＰＤ９８０５９および化合物Ａが、単独で溶媒対照に対して有意（対応のないｔ検定、ｐ＜０．０５）にアルシアンブルー陽性の軟骨基質の産生を促進したことを意味する。同図中の＊は、２×１０−６ｍｏｌ／Ｌの化合物Ａ存在下の各濃度のＰＤ９８０５９が、化合物Ａ単独処理に対して有意（ｐ＜０．０５）にアルシアンブルー陽性の軟骨基質の産生を促進したことを意味する。
図８から明らかなように、化合物ＡまたはＰＤ９８０５９単独でも軟骨基質産生を有意に促進したが、両者を共存させた場合は相乗的な軟骨基質産生の促進効果が認められた。
これらの結果により、化合物ＡとＭＥＫ１阻害活性化合物が軟骨基質産生を相乗的に増加させる作用を有することが確認された。従って、一般式（Ｉ）で表される軟骨形成促進剤を含む低分子化合物またはこれらに類似の作用を有する化合物とＭＥＫ１阻害活性化合物とを含有する薬剤は、変形性関節症、慢性関節リウマチ、離断性骨軟骨炎、外傷による関節軟骨の損傷の修復のみならず、自家軟骨細胞移植など軟骨細胞移植における、移植前および移植後の軟骨細胞の細胞外基質合成能または増殖能を促進させる薬剤として利用することができる。
産業上の利用可能性
本発明によれば、従来にない強力な作用を有する軟骨形成促進剤が提供される。また、かかる軟骨形成促進剤を含む、軟骨修復剤、軟骨細胞形質維持剤、骨折修復促進剤、軟骨関連疾患の治療または予防剤、軟骨の生物学的物理学的または化学的研究用の試薬、および、軟骨細胞移植用薬剤が提供される。さらに、上記軟骨形成促進剤を用いた軟骨形成促進方法、軟骨関連疾患の治療または予防方法が提供される。加えて、上記軟骨形成促進剤の成分である低分子化合物、かかる低分子化合物を用いる軟骨関連疾患の治療または予防方法、及び上記軟骨形成促進剤のためのキットが提供される。さらには、本発明の目的は、上記軟骨形成促進剤を用いた、軟骨細胞の増殖方法及び生産方法、並びにかかる方法により得られる軟骨細胞が提供される。
本発明の軟骨形成促進剤は、ヒトを始めとする温血動物において軟骨形成を促進して、リウマチや変形性関節症、または外傷による軟骨損傷などの軟骨疾患の優れた治療薬となることが期待され、かつ自家軟骨細胞移植における軟骨細胞の優れた形質維持剤となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、溶媒対照（０．１２％ＤＭＳＯ）を加えて１週間培養したラット関節軟骨細胞の位相差顕微鏡写真に対応する図である。
図２は、化合物Ａ（２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）を加えて１週間培養したラット関節軟骨細胞の位相差顕微鏡写真に対応する図である。
図３は、ＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６（１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）を加えて１週間培養したラット関節軟骨細胞の位相差顕微鏡写真に対応する図である。
図４は、化合物Ａ（２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）とＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６（１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）を加えて１週間培養したラット関節軟骨細胞の位相差顕微鏡写真に対応する図である。
図５は、ＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６（１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）の存在下または非存在下、化合物Ａ（５×１０−７〜２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）を加えて１週間培養したラット関節軟骨細胞の細胞層に含まれる軟骨基質の量を示した図である。
図６は、化合物Ａ（２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）の存在下または非存在下、ＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６（１×１０−７〜１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）を加えて１週間培養したラット関節軟骨細胞の細胞層に含まれる軟骨基質の量を示した図である。
図７は、溶媒対照（０．１２％ＤＭＳＯ）または化合物Ａ（２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）またはＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）または化合物Ａ（２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）とＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）を加えて１週間培養し、アルシアンブルーで染色したラット関節軟骨細胞の顕微鏡写真に対応する図である。
図８は、化合物Ａ（２×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）の存在下、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９（２×１０−６〜５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）を加えて１週間培養したラット関節軟骨細胞の細胞層に含まれる軟骨基質の量を示した図である。
【図１】
2002087620.tif 000026
【図２】
2002087620.tif 000027
【図３】
2002087620.tif 000028
【図４】
2002087620.tif 000029
【図５】
2002087620.tif 000030
【図６】
2002087620.tif 000031
【図７】
2002087620.tif 000032
【図８】
2002087620.tif 000033
【国際調査報告】
2002087620.tif 000034
2002087620.tif 000035
2002087620.tif 000036
2002087620.tif 000037
2002087620.tif 000038
2002087620.tif 000039
2002087620.tif 000040