(57)【要約】本発明は、抗原刺激によるＴ細胞からのＩＬ−５産成を指標とする気管支喘息の、原因抗原の同定方法、原因抗原同定用キット、ならびに治療剤または予防剤を提供するものである。さらに本発明は、気管支喘息の原因抗原の検出方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の刺激によるＴ細胞からのＩＬ−５産生量を測定し、被検物質による刺激を行っていないＴ細胞の場合と比較して、当該ＩＬ−５産生量の増加が認められた時、当該被検物質は気管支喘息の原因抗原であると同定される、気管支喘息の原因抗原の同定方法。
【請求項２】
（ａ）被検物質の存在下にＴ細胞を培養する工程、ならびに（ｂ）Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を測定する工程、
を含み、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を被検物質の非存在下でＴ細胞を培養した場合と比較して、その差が１０ｐｇ／ｍｌ以上の時、当該被検物質は気管支喘息の原因抗原であると同定される、請求項１記載の同定方法。
【請求項３】
気管支喘息が非アトピー型気管支喘息である請求項１又は２記載の同定方法。
【請求項４】
刺激によりＴ細胞からのＩＬ−５産生量を増加させ得る抗原を含有してなる、気管支喘息の原因抗原同定用キット。
【請求項５】
気管支喘息が非アトピー型気管支喘息である請求項４記載のキット。
【請求項６】
気管支喘息の原因抗原の全部または一部を有効成分として含有してなる非アトピー型気管支喘息の治療剤または予防剤。
【請求項７】
気管支喘息の原因抗原が請求項１〜３いずれか記載の同定方法により同定されたものである請求項６記載の治療剤または予防剤。
【請求項８】
抗真菌剤を有効成分として含有してなる非アトピー型気管支喘息の治療剤または予防剤。
【請求項９】
被検試料と接触させたＴ細胞におけるＩＬ−５産生量を測定し、被検試料と接触させていないＴ細胞の場合と比較して、当該ＩＬ−５産生量の増加が認められた時、当該被検試料中に気管支喘息の原因抗原が存在すると判定される、気管支喘息の原因抗原の検出方法。
【請求項１０】
（ａ）被検試料の存在下にＴ細胞を培養する工程、ならびに（ｂ）Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を測定する工程、
を含み、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を被検試料の非存在下でＴ細胞を培養した場合と比較して、その差が１０ｐｇ／ｍｌ以上の時、当該被検試料中に気管支喘息の原因抗原が存在すると判定される、請求項９記載の検出方法。
【請求項１１】
気管支喘息が非アトピー型気管支喘息である請求項９又は１０記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、気管支喘息の、原因抗原の同定方法、原因抗原同定用キット、ならびに治療剤または予防剤に関する。さらに本発明は、気管支喘息の原因抗原の検出方法に関する。
背景技術
気管支喘息は、主として小児期に発症して、ダニなどの抗原に対するＩｇＥ抗体を有するアトピー型の患者群が約２／３を占め、成人発症型に多いとされる、ＩｇＥ抗体の認められない非アトピー型（内因型、感染型とも呼ばれていた）の患者群が約１／３を占める。
アトピー型気管支喘息は、抗原に対するＩｇＥ抗体とマスト細胞によって引き起こされる即時型過敏症として認識されている。アトピー型気管支喘息では、ステロイド薬や抗アレルギー薬等の抗炎症薬や気管支拡張薬の投薬といった気道過敏性を抑制するための治療の他、患者由来のＩｇＥ抗体と結合する抗原の同定、更に皮膚テストによる原因抗原の同定により、原因因子と特定された抗原の回避、抗原を用いた減感作療法を行うのがより有効である。一方、非アトピー型気管支喘息では、原因因子の同定方法は未だ知られておらず、対症療法的に気道過敏性を抑制するための治療が行われているに過ぎない。
また、アトピー性の気管支喘息や皮膚炎へのカンジダ、ダニ抽出物、ハウスダスト等の抗原の関与は良く知られている。アトピー型気管支喘息の原因因子として、内在性のカンジダ菌が検討され、酸性プロテアーゼが原因抗原である場合も報告されている。さらに、アトピー性皮膚炎に対しては、抗真菌剤が有効であることが報告されている。このように、アトピー性の疾患については、その原因因子等に関する種々の知見が得られている。しかしながら、非アトピー型気管支喘息に対するこれらの知見の有用性、ならびにその原因因子に関する知見については全く報告されていない。
ところで、気管支喘息は、上記のような単なる一過性の即時型過敏症ではなく、持続性の好酸球性炎症に本態があると認識されている。すなわち、気管支喘息患者の気道粘膜には、好酸球の集積を特徴とする細胞浸潤、炎症所見が認められる。細菌感染などの単球・マクロファージや好中球などの集積を特徴とする通常の炎症と異なって、好酸球が選択的に集積することから、特に好酸球性炎症と呼ばれている。気管支喘息患者の気道炎症局所には、活性化ヘルパーＴ細胞の浸潤が顕著にみられることや気道粘膜に浸潤する好酸球数とＴ細胞数が相関することなどから、気管支喘息の好酸球性炎症は、ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞と関連がある可能性を示唆する報告がある〔Ｋａｙ  ＡＢ．『アレルギーと喘息における「ヘルパー」（ＣＤ４＋）Ｔ細胞と好酸球』Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１９９２；１４５：Ｓ２２−６〕。しかしながら、このような視点からの気管支喘息の原因抗原の同定および同定方法に関する報告はない。
発明の開示
本発明は、気管支喘息、特に非アトピー型気管支喘息の原因抗原を同定することができる気管支喘息の原因抗原の同定方法、気管支喘息の原因抗原の同定を簡便かつ迅速に行うことができる気管支喘息の原因抗原同定用キット、ならびに気管支喘息の原因抗原を含んでなる、特に非アトピー型気管支喘息の治療剤または予防剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、被検試料中の気管支喘息の原因抗原の存在を検出することができる気管支喘息の原因抗原の検出方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、
〔１〕  被検物質の刺激によるＴ細胞からのＩＬ−５産生量を測定し、被検物質による刺激を行っていないＴ細胞の場合と比較して、当該ＩＬ−５産生量の増加が認められた時、当該被検物質は気管支喘息の原因抗原であると同定される、気管支喘息の原因抗原の同定方法、
〔２〕  （ａ）被検物質の存在下にＴ細胞を培養する工程、および
（ｂ）Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を測定する工程、
を含み、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を被検物質の非存在下でＴ細胞を培養した場合と比較して、その差が１０ｐｇ／ｍｌ以上の時、当該被検物質は気管支喘息の原因抗原であると同定される、前記〔１〕記載の同定方法、
〔３〕  気管支喘息が非アトピー型気管支喘息である前記〔１〕又は〔２〕記載の同定方法、
〔４〕  刺激によりＴ細胞からのＩＬ−５産生量を増加させ得る抗原を含有してなる、気管支喘息の原因抗原同定用キット、
〔５〕  気管支喘息が非アトピー型気管支喘息である前記〔４〕記載のキット、
〔６〕  気管支喘息の原因抗原の全部または一部を有効成分として含有してなる非アトピー型気管支喘息の治療剤または予防剤、
〔７〕  気管支喘息の原因抗原が前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の同定方法により同定されたものである前記〔６〕記載の治療剤または予防剤、
〔８〕  抗真菌剤を有効成分として含有してなる非アトピー型気管支喘息の治療剤または予防剤、
〔９〕  被検試料と接触させたＴ細胞におけるＩＬ−５産生量を測定し、被検試料と接触させていないＴ細胞の場合と比較して、当該ＩＬ−５産生量の増加が認められた時、当該被検試料中に気管支喘息の原因抗原が存在すると判定される、気管支喘息の原因抗原の検出方法、
〔１０〕  （ａ）被検試料の存在下にＴ細胞を培養する工程、ならびに（ｂ）Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を測定する工程、
を含み、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を被検試料の非存在下でＴ細胞を培養した場合と比較して、その差が１０ｐｇ／ｍｌ以上の時、当該被検試料中に気管支喘息の原因抗原が存在すると判定される、前記〔９〕記載の検出方法、ならびに
〔１１〕  気管支喘息が非アトピー型気管支喘息である前記〔９〕又は〔１０〕記載の検出方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、これまでに、その原因抗原の同定に関して全く報告されていない非アトピー型の気管支喘息（以下、単に喘息という）の原因抗原の同定を可能にするべく、非アトピー型喘息とは持続性の好酸球性炎症であると推定し、好酸球の集積に関与するサイトカインに注目し研究を行った。
まず、非アトピー型喘息患者由来のＴ細胞を各種抗原で刺激した際に誘導されるサイトカインを検索した。その結果、カンジダ抗原、ダニ抗原で刺激した場合にＩＬ−５産生が起こることを見出した。また、それらのＩＬ−５を産生させた抗原は、その患者に対する吸入負荷試験および皮内反応において好酸球性炎症を起こさせた。さらに、カンジダ粗抗原によりＩＬ−５産生される患者において、カンジダ由来の精製酸性プロテアーゼは同患者に対する吸入負荷試験および皮内反応において好酸球性炎症を起こすことを明らかにした。すなわち、意外にも、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生を誘導し得る抗原は好酸球性炎症を誘発し得ることが明らかとなった。かかる事実より、本発明者らは、抗原刺激によるＴ細胞からのＩＬ−５産生を指標として、非アトピー型喘息の原因抗原を同定することが可能であることを見出した。
一方、アトピー型喘息はＩｇＥ抗体が関与〔さらには、ＩｇＥ抗体の関与する即時型喘息反応（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＩＡＲ）の発生〕する点で非アトピー型喘息と区別され、現在のところ一般に疾患の成り立ちが全く異なるものとして把握されているが、アトピー型喘息においても、非アトピー型喘息と同様、遅発型喘息反応（ｌａｔｅ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＬＡＲ）として把握される好酸球性炎症が認められる。また、アトピー型喘息の原因抗原はＩｇＥ抗体産生とＩＬ−５産生を共に生じさせることが知られている。すなわち、アトピー型喘息患者においてＩＬ−５産生を起こさせる抗原は、アトピー型喘息の原因抗原であるということができる。従って、抗原刺激によるＴ細胞からのＩＬ−５産生を指標として、アトピー型喘息の原因抗原をも同定することが可能である。
以上の知見に基づき、本発明者らは、抗原刺激によるＴ細胞からのＩＬ−５産生を指標とすることにより、アトピー型および非アトピー型の区別なく、喘息本態の抗原を同定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明の喘息の原因抗原の同定方法によれば、これまで全く異なる疾患であると捉えられ、アトピー型および非アトピー型の２つの病型に区別されていた喘息の原因抗原を、かかる区別を要することなく、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生を指標として、簡易かつ確実に同定することができる。特に、ＩｇＥ抗体の産生の無い、いわゆる非アトピー型喘息と診断された個体（たとえば、患者）由来のＴ細胞からのＩＬ−５産生を調べることにより、これまで不可能であった非アトピー型喘息の原因抗原の同定が可能になるため、その技術的意義は極めて大きい。
具体的には、本発明の喘息の原因抗原の同定方法は、被検物質の刺激によるＴ細胞からのＩＬ−５産生量を測定し、被検物質による刺激を行っていないＴ細胞の場合と比較して、当該ＩＬ−５産生量の増加が認められた時、当該被検物質を喘息の原因抗原であると同定することからなる。
本明細書において、「被検物質」とは、Ｔ細胞に対するＩＬ−５産生作用に関して評価される対象物質をいい、喘息の発症に関与すると推定されるあらゆる物質が含まれ、特に限定されるものではない。たとえば、ダニ、ハウスダスト、真菌類、花粉類、ペット表皮類、ならびにこれらに含有される成分等を挙げることができる。被検物質には、これまでにアトピー型喘息の原因抗原であるとして知られる物質も含まれるが、本発明の同定方法によれば、非アトピー型喘息の原因抗原を同定することができるので、かかる物質を被検物質とした場合には、さらに非アトピー型喘息の原因抗原であるか否かについての知見を得ることができる。
また、「Ｔ細胞」とは、個体由来の生体組織標本（たとえば、末梢血、脾臓等）に由来するＴ細胞をいい、好ましくは、好酸球性炎症の発症に関与することが報告されている、末梢血由来のＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞をいう。なお、Ｔ細胞は、本発明の同定方法の精度の観点から、生体組織標本から単離されていることが好ましいが、必ずしも単離されている必要はなく、たとえば、末梢血、好ましくは末梢血単核球をそのまま本発明の同定方法において使用することができる。
「個体」とは、好ましくは哺乳動物（たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒト）であり、より好ましくはヒトである。
被検物質によるＴ細胞の刺激は、たとえば、公知の方法に従ってＴ細胞を含む末梢血単核球を個体から採取し、それに被検物質を加え、被検物質の存在下に、好ましくは３５〜３８℃において１時間〜７日間程度インキュベートすることにより行うことができる。一方、被検物質を加えず、当該被検物質による刺激を行わずに、同様にして前記末梢血単核球を培養し、対照とする。
次いで、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を測定する。かかる測定は、ＩＬ−５タンパク質量を測定するＥＬＩＳＡ法の他、ｍＲＮＡ量を定量するＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンハイブリダイゼーション等によって実施することができる。特に本発明を限定するものではないが、ＥＬＩＳＡ法によって定量することが好ましい。測定の結果、対照と比較して、被検物質で刺激を行ったＴ細胞からのＩＬ−５産生量（ｐｇ／ｍｌ）の増加が、実質的な差として認められた時、当該被検物質は喘息の原因抗原であると同定される。当該ＩＬ−５産生量の差を具体的数値により表わすと、好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２０ｐｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは５０ｐｇ／ｍｌ以上である。前記ＩＬ−５産生量の差が１０ｐｇ／ｍｌ未満の場合は、個体差やＩＬ−５産生量の測定方法自体の測定限界等の影響により、必ずしも実質的な差を示しているとは認められない場合を含むが、いずれにしても、前記ＩＬ−５産生量の差が１０ｐｇ／ｍｌ以上の場合には明確に喘息の原因抗原を同定し得る。
従って、本発明の喘息の原因抗原の同定方法として、好ましくは
（ａ）被検物質の存在下にＴ細胞を培養する工程、ならびに
（ｂ）Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を測定する工程、
を含み、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を被検物質の非存在下でＴ細胞を培養した場合と比較して、その差が１０ｐｇ／ｍｌ以上の時、当該被検物質は喘息の原因抗原であると同定される方法を挙げることができる。かかる方法においては、対照におけるＴ細胞からのＩＬ−５産生量（Ｓ１）と、被検物質の存在下に培養を行ったＴ細胞からのＩＬ−５産生量（Ｓ２）とをそれぞれ測定し、Ｓ２からＳ１を差し引き、差し引いた値が１０ｐｇ／ｍｌ以上である場合、当該被検物質は喘息の原因抗原であると同定される。なお、Ｔ細胞の培養に好適な温度ならびに期間は前記同様であり、より具体的な培養条件等については公知のものに従えばよい。
本発明の喘息の原因抗原の同定方法におけるより好ましい態様においては、非アトピー型喘息に特異的な原因抗原を同定することができる。本態様では、従来の喘息の病型の判定に従い、非アトピー型喘息と診断された個体由来のＴ細胞を用いればよい。
以上の同定方法により、たとえば、喘息患者、特にこれまでに知られていない非アトピー型喘息患者の原因抗原が明らかになるので、全ての喘息患者に対し抗原の回避や減感作療法を効果的に実施することができるようになる。特に、非アトピー型喘息に特異的な抗原は、当該喘息の治療または予防に非常に有効である。
また、本発明の別の一態様として、喘息の原因抗原の同定を簡便かつ迅速に行うことができる喘息の原因抗原同定用キットを提供する。かかるキットは、刺激によりＴ細胞からのＩＬ−５産生量を増加させ得る抗原を含む。当該抗原としては、その刺激によりＴ細胞からのＩＬ−５産生量を増加させ得るものであれば特に限定されるものではないが、好ましくは、前記本発明の喘息の原因抗原の同定方法により同定された抗原である。当該抗原としては、たとえば、後述の実施例において記載する、カンジダ由来抗原、カンジダ由来酸性プロテアーゼ、ダニ抽出物、ならびにＤｅｒｆ１、ＤｅｒｆＩＩ、ハウスダストからなる群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。抗原は、保存に適する観点から、たとえば、凍結乾燥され、個装されているのが好ましい。当該抗原は、使用前に適当な担体中で復元して使用することができる。
上記キットに含有される抗原は、Ｔ細胞の培養に使用される培地中に０．１〜１０００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加が可能であれば、その形態、含量、濃度に特に限定はない。たとえば、本発明のキットに含有され得る凍結乾燥された抗原や高濃度の抗原溶液は、それぞれ適切な濃度に溶解、希釈の上、上記の濃度範囲となるように培地に添加すればよい。
当該キットには、さらに任意に、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を測定するために用いられる試薬が含まれていてもよい。また、たとえば、比色法によりＴ細胞からのＩＬ−５産生量の測定を行うことを意図するような場合には、検量のために使用する各種濃度のＩＬ−５を含んでいてもよい。
当該キットによる喘息の原因抗原の同定は、前記本発明の喘息の原因抗原の同定方法に準じて行うことができる。すなわち、キットを用いて原因抗原を同定する場合は、キットに含まれる抗原を被検物質と同様に扱い、前記同定方法と同様にして喘息の原因抗原を同定する。キットには、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生を増加させ得る種々の抗原が予め含まれているため、たとえば、喘息患者について当該キットを用いて原因抗原の同定を行うことにより、当該患者に特異的な原因抗原が容易に同定される。特に、当該キットに含まれる抗原が、非アトピー型喘息に特異的である場合には、喘息患者が非アトピー型喘息患者であること、ならびに当該喘息に特異的な原因抗原が同時に同定されることになり、より効率的な喘息の予防または治療手段を採ることができるようになるので好ましい。かかる態様においては、本発明のキットは、非アトピー型喘息の診断用キットとしても機能し得る。
また本発明の別の一態様としては、喘息の原因抗原の全部または一部を有効成分として含有する非アトピー型喘息の治療剤または予防剤を提供する。かかる原因抗原としては、前記喘息の原因抗原の同定方法により同定されたものが好ましく、中でも、非アトピー型喘息に特異的な原因抗原が好ましい。本発明の治療剤または予防剤において好適に使用し得る原因抗原としては、具体的には、前記キットにおいて例示した抗原を挙げることができる。
なお、以下において「原因抗原」の語は、原因抗原の全部または一部を意味する。本明細書において「原因抗原の一部」とは、少なくとも当該抗原の抗原抗体反応の特異性および免疫原性を決定している構造を含む原因抗原の一部分をいい、好ましくはエピトープまたは抗原決定基を含む原因抗原の一部分をいう。また、原因抗原としては、適当な担体に結合させたハプテンであってもよい。
本発明の治療剤または予防剤として原因抗原そのものを用いることも可能ではあるが、それらは医薬組成物として提供することが好ましい。たとえば、かかる組成物としては、原因抗原と、薬学的に許容され得る１以上の公知の担体（たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ等）、さらに所望により他の治療または予防成分を含むものを挙げることができる。
前記組成物には、経口（好ましくは、吸入）、経鼻、および非経口（たとえば、皮下、経皮、皮内、筋内、静脈内、および直腸内等）投与に適したものが含まれ、当該組成物の投与を必要とする個体の症状等に応じて適宜、調整することができる。組成物は、所望により単位用量形態で提供されてもよいし、製薬分野の公知のあらゆる方法で製造することができる。
経口および／または経鼻投与に適した組成物は、たとえば、それぞれ所定量の原因抗原を有効成分として含むカプセル、錠剤、粉末または顆粒として、溶液または水性液体もしくは非水性液体の懸濁液、あるいは水中油型液体乳濁液または油中水型液体乳濁液等として提供され得る。吸入のための組成物は、有効であることが知られているあらゆる手法〔例えば、計量用量吸入器（ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ  ｉｎｈａｌｅｒｓ）〕で提供され得る。さらに上記組成物は、公知のアジュバント（たとえば、コレラトキシン、コレラトキシンＢサブユニット、ならびにその改変体等）を含有することもできる。
非経口投与のための組成物としては、たとえば、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、投薬対象の個体の血液と等張にする溶質を含有し得る水溶性および非水溶性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増量剤を含み得る水溶液および非水溶液滅菌懸濁液等を挙げることができる。該組成物は、例えば、封止されたアンプルおよび水薬瓶等の単回用量または多数回用量容器に入れられて提供されてもよく、また使用直前に例えば注射用水等の滅菌液体担体を加えるだけでよい凍結乾燥された状態で提供されてもよい。また、直腸内投与のための組成物としては、たとえば、ポリエチレングリコール等の通常の担体と一緒にされて坐薬として提供され得る。
当該組成物における喘息の原因抗原の含有量は特に限定されるものではなく、所望により適宜調整することができる。たとえば、組成物中における好適な原因抗原含有量は、好ましくは０．０１〜５０μｇ／ｍｌである。
本発明の治療剤または予防剤の投与量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。一般的には、たとえば、ヒトの場合、好ましくは成人１日当たり０．２ｎｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重の原因抗原の有効投与量範囲内で経口的にまたは非経口的に投与する。しかしながら、各個体において、喘息の種類、程度や、個体差（年齢、性別等）があるため、有効成分としての原因抗原の投与量はかかる範囲のみに限定されるものではない。また、投与方法、投与回数、投与期間等も特に限定されるものではない。
本発明の治療剤または予防剤によれば、投与される原因抗原に対して抗体を産生させることにより、個体における喘息の発症に関わる抗原、特に非アトピー型喘息に特異的な抗原の中和を促すことができるので、これまでには有効に実施することができなかった非アトピー型喘息の治療または予防を効果的に行うことができる。たとえば、本発明の治療剤または予防剤を投与することによりＩｇＡやＩｇＧが鼻汁や口腔内に産生され、気管支周辺の抗原除去に有効に働き得る。従って、本発明の治療剤または予防剤は粘膜免疫治療用として有効である。また、本発明の治療剤または予防剤に有効成分として含まれる原因抗原が非アトピー型喘息に特異的である場合には、当該治療剤または予防剤は、非アトピー型喘息の診断用組成物としても機能し得る。
さらに、前記本発明の喘息の原因抗原の同定方法の結果を参照することにより、さらに有効な非アトピー型喘息の治療剤または予防剤を提供することができる。たとえば、原因抗原がカンジダ菌由来の抗原であると同定された場合、カンジダ菌の殺傷に対して有効な抗真菌剤（たとえば、フルコナゾール、イトラコナゾール、アンフォテリシンＢ等）を有効成分として含有する非アトピー型喘息の治療剤または予防剤を提供することができる。当該治療剤または予防剤によれば喘息の根本原因を直接的に排除することが可能となるため、非常に優れた治療または予防効果が得られる。当該治療剤または予防剤も本発明に包含される。なお、当該治療剤または予防剤は、抗真菌剤のみを有効成分として含むものであってよいが、喘息全般にわたる治療または予防効果を期待する観点から、有効成分としてさらに喘息の原因抗原、中でも非アトピー型喘息の原因抗原を共に含むものが好ましい。治療剤または予防剤における抗真菌剤の含有量は特に限定されるものではなく、それぞれの抗真菌剤により異なり、適宜選択することが可能であるが、剤型や投与の経路に応じて所望の効果を得ることができる含有量であればよい。また、抗真菌剤の投与量としては、一般的には、たとえば、ヒトに静注する場合、好ましくは成人１日当たり１μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重である。その他、当該治療剤または予防剤の製造方法、投与方法等は前記と同様である。
さらに本発明の一態様として、被検試料中における喘息の原因抗原の検出方法が提供される。当該検出方法は、具体的には、被検試料と接触させたＴ細胞におけるＩＬ−５産生量を測定し、被検試料と接触させていないＴ細胞の場合（対照）と比較して、当該ＩＬ−５産生量の増加が認められた時、当該被検試料中に喘息の原因抗原が存在すると判定される、喘息の原因抗原の検出方法である。
かかる検出方法は、本発明の喘息の原因抗原の同定方法に準じて行うことができる。すなわち、被検試料とＴ細胞との接触は、前記同定方法における、被検物質によりＴ細胞の刺激を行う工程において、被検物質の代わりに被検試料を用いて該工程を実施することにより行うことができる。なお、被検試料とは、前記被検物質の存在が予想されうるものであれば特に限定されるものではない。たとえば、食品、飲料水、生活用水、ハウスダスト、室内外の空気中の浮遊物等を挙げることができる。次いで、同様にしてＴ細胞からのＩＬ−５産生量を測定する。測定の結果、対照と比較して、被検試料と接触させたＴ細胞からのＩＬ−５産生量の増加が、実質的な差として認められた時、当該被検試料中に喘息の原因抗原が存在すると判定される。当該ＩＬ−５産生量の差の具体的数値についても前記同定方法の場合と同様である。従って、本発明の喘息の原因抗原の検出方法の好ましい態様として、さらに
（ａ）被検試料の存在下にＴ細胞を培養する工程、ならびに（ｂ）Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を測定する工程、
を含み、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生量を被検試料の非存在下でＴ細胞を培養した場合（対照）と比較して、その差が１０ｐｇ／ｍｌ以上の時、当該被検試料中に喘息の原因抗原が存在すると判定される、喘息の原因抗原の検出方法、
が提供される。
また、従来の喘息の病型の判定に従い非アトピー型喘息と診断された個体由来のＴ細胞を用いれば、被検試料中における、非アトピー型喘息に特異的な原因抗原の存在を検出することができる。
これらの検出方法によれば、飲食品や環境中に存在する喘息の原因抗原を高い特異性で検出するという優れた効果が奏され、前記抗原との接触に伴う喘息の発症を防止するという点で特に優れた効果が発揮される。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
実施例１  非アトピー型喘息患者の末梢血単核球に対する抗原によるＩＬ−５産生誘導と各抗原による吸入誘発試験
３０９名の喘息患者について静脈血を採取し、フィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）比重遠心法により、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）を分離した。２×１０６細胞／ウェルにて、ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）に懸濁し、２４ウェルプレート（コーニング社製）にて培養した。ここに抗原〔カンジダエキス（鳥居薬品製）〕の生理食塩水溶液を当該抗原の最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように加え、刺激した。なお、対照においては、抗原の生理食塩水溶液の代わりに生理食塩水のみを加えた。６日間培養後、培養上清を採取してＩＬ−５量をＥＬＩＳＡ法にて測定し、抗原による刺激を行った場合と対照の場合との差を調べた。
この結果、２５４名（Ａ群）ではカンジダエキス刺激によるＩＬ−５産生量の増加が２０ｐｇ／ｍｌ未満であったのに対し、５５名（Ｂ群）では２０ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−５産生量の増加を示した。なお、Ａ群の患者の平均年齢は４７．０±１．１歳、ＩＬ−５増加量の平均は９．７±０．６ｐｇ／ｍｌ、またＢ群の患者の平均年齢は４６．２±２．２歳、ＩＬ−５増加量の平均は１４２．３±３４．９ｐｇ／ｍｌであった。
Ｂ群の患者のうち、血清中の抗原特異的ＩｇＥ抗体測定により、正常値（ＲＡＳＴ値０．３５ＰＲＵ／ｍｌ以下）の患者（６名）について、再度静脈血を採取し、フィコール−パック比重遠心法により、ＰＢＭＣを分離した。２×１０６細胞／ウェルにて、ＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、２４ウェルプレートにて培養した。各種抗原〔カンジダエキス、ダニエキス（鳥居薬品製）、カンジダ・アルビカンス由来分泌型酸性プロテアーゼ（カンジダ酸性プロテアーゼ、宝酒造製）〕を生理食塩水溶液として、それぞれ抗原の最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように加え、刺激した。なお、対照においては、抗原の生理食塩水溶液の代わりに生理食塩水のみを加えた。６日間培養後、培養上清を採取してＩＬ−５量をＥＬＩＳＡ法にて測定し、抗原による刺激を行った場合と対照の場合との差を調べた。結果を表１に示す。なお、表１においては、当該差を単にＩＬ−５（ｐｇ／ｍｌ）と記載する。
吸入誘発試験は日本アレルギー学会標準法に準拠して行った。被験者の負荷前の呼吸機能をピークマン８（チェスト技研製）を用いて最大呼気努力の下で測定した。吸入はネブライザー（Ｄｅｖｉｌｂｉｓｓ社製）を用いて５Ｌ／ｍｉｎの圧縮空気を流して２分間吸入させることにより行った。対照として生理食塩水のみを吸入させ呼吸機能の低下がみられないことを確認した後、カンジダ酸性プロテアーゼについては１μｇ／ｍｌ、ダニエキスおよびカンジダエキスについては１万倍希釈水溶液をそれぞれ２分間吸入せしめ、１０分後に呼吸機能を測定した。１５％以上の呼吸機能低下のみられない時にさらに１０倍濃い抗原溶液を吸入負荷し、同様に呼吸機能を測定した。カンジダ酸性プロテアーゼ１００μｇ／ｍｌ、ダニエキス１００倍、カンジダエキス１００倍希釈水溶液まで吸入負荷した。
抗原溶液の吸入負荷１０分後に呼吸機能を測定し、以後１時間ごとに遅発型喘息反応につき呼吸機能測定を行った。結果を表１に併記する。なお、ＩＡＲ、ＬＡＲいずれの場合も＜５％の時、当該反応が認められないと判定される。
表１に明らかなように、ＩｇＥ抗体の存在しない喘息患者において、抗原反応性として、対照との比較においてＴ細胞からのＩＬ−５産生量の増加が実質的な差として認められた場合、当該抗原の吸入にひきつづいて明らかなＬＡＲが認められた。また、その抗原は別途行った皮膚テストにおいても遅延型反応を起こした。これらの結果より、Ｔ細胞からのＩＬ−５産生を指標として喘息の原因抗原を同定することが可能であることが分かる。
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実施例２  非アトピー型喘息患者のＰＢＭＣに対するカンジダ由来抗原によるＩＬ−５産生誘導とリンパ球（Ｔ細胞）増殖反応
ダニ抗原に対してＩｇＥ抗体を有しておらず、非アトピー型喘息と診断される患者より、静脈血を採取し、フィコール−パック比重遠心法により採取したＰＢＭＣを２×１０６細胞／ウェルとなるようにＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、２４ウェルプレートにて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。各カンジダ由来抗原〔カンジダエキス、カンジダ酸性プロテアーゼ、カンジダマンナンＡ（カンジダ・アルビカンス由来細胞壁ｔｙｐｅＡマンナン、宝酒造製）〕の生理食塩水溶液を各抗原の最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように加え、刺激した。対照においては抗原の生理食塩水溶液の代りに生理食塩水のみを加えた。６日間培養後、培養上清を採取してＩＬ−５量をＥＬＩＳＡ法にて測定し、抗原による刺激を行った場合と対照の場合との差を調べた。カンジダ由来抗原に対して反応する８例（カンジダマンナンＡについてはそのうちの５例）についての結果を第１図に示す。なお、第１図においては、当該差をＩＬ−５産生量（ｐｇ／ｍｌ）と記載する。
また、ＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁したＰＢＭＣを１×１０５細胞／ウェルとなるように９６ウェルプレートに入れた。抗原を１０μｇ／ｍｌとなるように加え、６日間培養後、３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を加えた。１８時間培養後、細胞を回収し、Ｔ細胞増殖の指標として細胞への３Ｈ−チミジン取り込み量を測定した。対照においては抗原の生理食塩水溶液の代りに生理食塩水のみを加えた。カンジダ由来抗原に対して反応する８例（カンジダマンナンＡについてはそのうちの５例）についての結果を第２図に示す。
第１図および第２図から明らかなように、カンジダエキスおよびカンジダ酸性プロテアーゼで刺激した際にはＴ細胞からのＩＬ−５の明らかな産生誘導、およびＴ細胞の増殖による３Ｈ−チミジンの取り込みが見られた。一方、カンジダマンナンＡによる刺激では、ＩＬ−５産生誘導およびＴ細胞増殖に関し、対照との比較において実質的な差であると認めるに足るデータは得られなかった。いずれにしても、これらの結果より、カンジダ酸性プロテアーゼは少なくともこれらの喘息患者にとっての原因抗原であると同定される。
実施例３  喘息の原因抗原同定用キットの製造
以下の成分をそれぞれ個装し、喘息の原因抗原同定用キットを製造する。
〔抗原〕カンジダ・アルビカンス由来酸性プロテアーゼ（凍結乾燥品）：１ｍｇ
〔担体〕生理食塩水                                              ：１ｍｌ
当該キットの使用においては、上記抗原の全量を生理食塩水１ｍｌに溶解して得られた抗原溶液を培地に対し１／１００量添加し、当該培地をＴ細胞の培養に用いる。
実施例４  非アトピー型喘息の治療剤の製造
以下のようにして各成分をそれぞれ混合し、公知の方法に従って非アトピー型喘息の治療剤（減感作治療用抗原）を製造する。
すなわち、カンジダ・アルビカンス由来酸性プロテアーゼ（凍結乾燥品）１ｍｇを０．５％フェノールを添加した生理食塩水に溶解し、これを減感作治療用抗原の原液とする。治療においては、上記原液を適宜希釈の上、使用する。
産業上の利用可能性
本発明によれば、喘息、特に非アトピー型喘息の原因抗原を同定することができる喘息の原因抗原の同定方法が提供される。また、喘息の原因抗原の同定を簡便かつ迅速に行うことができる喘息の原因抗原同定用キットが提供される。また、前記同定方法等により同定され得る喘息の原因抗原を含んでなる、特に非アトピー型喘息の治療剤または予防剤が提供される。さらに、被検試料中の喘息の原因抗原の存在を検出することができる喘息の原因抗原の検出方法が提供される。
従って、本発明は、喘息、特に非アトピー型喘息の治療および予防に関する産業の分野において非常に有用な技術を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、カンジダ由来抗原によるＴ細胞からのＩＬ−５産生誘導の結果を示すグラフである。横軸には各カンジダ由来抗原を記載し、縦軸には抗原による刺激を行った場合と対照の場合との差をＩＬ−５産生量（ｐｇ／ｍｌ）として示す。また、グラフ中の数字は、平均ＩＬ−５産生量±Ｓ．Ｅ．（８例の測定平均値）である。
第２図は、カンジダ由来抗原によるＴ細胞増殖誘導の結果を示すグラフである。横軸には各カンジダ由来抗原を記載し、縦軸にはＴ細胞増殖による３Ｈ−チミジン取り込み量を対照に対する相対値として３Ｈ−ＴｄＲ取り込み量（Ｓ．Ｉ．）で示す。また、グラフ中の数字は、平均３Ｈ−ＴｄＲ取り込み量±Ｓ．Ｅ．（８例の測定平均値）である。なお、３Ｈ−ＴｄＲ取り込み量は以下の式により求めた：
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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