(57)【要約】本発明は、抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質を用いて所望の性質を有する抗体、該方法で精製された抗体を有効成分とする医薬、および抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質を用いる各種疾患の診断または予防方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質を用いることを特徴とする、所望の性質を有する抗体を精製する方法。
【請求項２】
糖鎖が、Ｎ−グリコシド結合糖鎖である、請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
Ｎ−グリコシド結合糖鎖が、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン、フコースまたはガラクトースが結合した糖鎖である、請求の範囲２記載の方法。
【請求項４】
糖鎖に対し親和性を有する物質が、レクチンであることを特徴とする、請求の範囲１記載の方法。
【請求項５】
レクチンが、コンカナバリンＡ、小麦胚芽レクチン、レンズマメレクチンおよびインゲンマメレクチンＥ４からなる群から選ばれる少なくとも１種類のレクチンである、請求の範囲４記載の方法。
【請求項６】
糖鎖に対し親和性を有する物質が、担体と結合していることを特徴とする、請求の範囲１記載の方法。
【請求項７】
担体が、合成樹脂のポリマーであることを特徴とする、請求の範囲６記載の方法。
【請求項８】
小麦胚芽レクチンまたはインゲンマメレクチンＥ４が固定化されたカラムを用いることを特徴とする、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンが結合した糖鎖構造を有する抗体を精製する方法。
【請求項９】
小麦胚芽レクチンまたはインゲンマメレクチンＥ４が固定化されたカラムを用いることを特徴とする、抗体依存性細胞障害活性の高い抗体を精製する方法。
【請求項１０】
レンズマメレクチンが固定化されたカラムを用いることを特徴とする、フコースが結合した糖鎖構造を有する抗体を精製する方法。
【請求項１１】
レンズマメレクチンが固定化されたカラムを用いることを特徴とする、抗体依存性細胞障害活性の高い抗体を精製する方法。
【請求項１２】
疎水性クロマト用担体を用いることを特徴とする、ガラクトースが結合した糖鎖構造を有する抗体を精製する方法。
【請求項１３】
疎水性クロマト用担体を用いることを特徴とする、補体依存性細胞障害活性または抗体依存性細胞障害活性の高い抗体を精製する方法。
【請求項１４】
疎水性クロマト用担体に、フェニル基が結合している、請求の範囲１３記載の方法。
【請求項１５】
請求の範囲１〜１４のいずれか１項に記載の方法を組み合わせて、所望の性質を有する抗体を精製する方法。
【請求項１６】
抗体がヒトＩｇＧである、請求の範囲１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＩｇＧのサブクラスがＩｇＧ１である、請求の範囲１６記載の方法。
【請求項１８】
請求の範囲１〜１７のいずれか１項に記載の方法で精製された抗体を有効成分とする医薬。
【請求項１９】
抗体がヒトＩｇＧである、請求の範囲１８記載の医薬。
【請求項２０】
ヒトＩｇＧのサブクラスがＩｇＧ１である、請求の範囲１９記載の医薬。
【請求項２１】
抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質を用いることを特徴とする、各種疾患の診断方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、所望の性質を有する抗体を精製する方法に関する。また、本発明の精製方法により得られた抗体を有効成分とする医薬、および、抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質により得られた抗体を用いた、各種疾患の治療方法に関する。
背景技術
糖蛋白質のうち、糖鎖構造が一般には蛋白質の外側に向かって配位している糖蛋白質については、糖鎖に結合するレクチンを固定化したカラムを用いて精製することが出来る。レクチンは、特定の糖鎖構造に対して特異的に結合する性質を有する。レクチンの例としては、小麦胚芽レクチン、レンズマメレクチンなどがあげられる。
小麦胚芽レクチンと、糖鎖または糖ペプチドとの結合活性を調べたところ、小麦胚芽レクチンは、Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、ハイブリッド型糖鎖あるいはシアル酸を有する糖鎖または糖ペプチドとの結合性が高いことが示唆された［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６，４４２６，１９７７、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２５４，４０００，１９７９］。また、小麦胚芽レクチンは、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖構造を有する糖ペプチドに対し、より強い結合活性を有することが示唆された［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０，５８９４，１９８１］。
レンズマメレクチン（以下、ＬＣＡとも表記する）は、単糖であるα−Ｄ−マンノース、α−Ｄ−グルコースを認識することが知られている［ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２６８，７６６８，１９９３］。また、ＬＣＡが、Ｎ−グリコシド結合糖鎖のアスパラギンに最も近いＮ−アセチルグルコサミン残基にＬ−フコースがα１，６−結合した糖鎖構造を有する糖ペプチドに対して、強い結合性を示すことが知られている［カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），４０，１１１，１９７５、カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１１０，２８３，１９８２］。
しかしながら、これらは、糖鎖または糖鎖構造を含んだペプチドとレクチンとが結合することを示しているにすぎない。
抗体は、そのＦｃ領域（抗体重鎖のヒンジ領域以降の領域）に結合した糖鎖構造を有しており、その糖鎖構造はＦｃ領域に埋もれた形、すなわち抗体の立体構造において糖鎖構造が抗体の内側に向いた形で存在する［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２６４，４１５−４２０，１９７６］。
ノセ（Ｎｏｓｅ）らは、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）担体にＬＣＡを固定化したカラムを用いたが、マウスＩｇＧ２ａを分離することができなかった。この結果より、彼らはハイブリドーマ細胞（１２−６細胞）で生産させた通常のマウスＩｇＧ２ａの糖鎖がＦｃ領域に埋もれているためであると考察した。また、彼らは培地中にＮ型糖鎖の成熟化を阻害する薬剤であるスワインソニンを添加させた後にハイブリドーマ１２−６細胞を培養し、ＩｇＧ２ａタイプのモノクローナル抗体を生産させ、該培養物をＬＣＡ固定化セファロースカラムに通塔したところ、モノクローナル抗体をカラムに結合させることができた。しかしながら、これはマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域に存在する糖鎖がスワインソニンの影響によりコンプレックス型糖鎖からハイブリッド型糖鎖に変換した結果、糖鎖が抗体のＦｃ領域より外に露出したためと考察されている［ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），１４５，９１０−９１４，１９９０］。
以上のように糖鎖構造を人為的に変化させることにより抗体を精製した方法は知られているが、糖鎖構造を変化させることなく、糖鎖構造に着目して抗体を精製する方法はこれまでのところ知られていない。
ところで、抗体のＦｃ領域に存在する糖鎖構造は、抗体の有する活性、具体的には抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性とも表記する）、補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性とも表記する）または生体内の安定性などに関与している。
糖鎖構造の非還元末端にガラクトース残基が付加されると、抗体のＣＤＣ活性が上昇すること［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３２，１３１１，１９９５；ＷＯ９８／５８９６４］、抗体のＦｃ領域のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン結合糖鎖含量を増加させることにより、抗体のＡＤＣＣ活性が上昇すること（ＷＯ９９／５４３４２）、シアル酸の含量を増加させると体内での安定性が高まること［ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１７，１１１６，１９９９］などが知られている。しかしながら、これらの活性に相関する糖鎖構造に着目し、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性などのエフェクター活性、または体内における安定性などの所望の性質を有する抗体の精製方法はこれまでのところ知られていない。
また、自己免疫疾患であるリウマチでは、患者の血中ＩｇＧのガラクトース量が減少することが知られている［グライココンジュゲート・ジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ），１５，９２９−９３４，１９９８］。これまでのリウマチの診断方法としては、レクチンによるレクチンブロット法が用いられているが、生体内の抗体を変性させる工程などを含めて、操作が複雑である。
発明の開示
本発明の目的は、抗体をＦｃ領域に結合する糖鎖構造の相違により精製し、所望の性質を有する抗体を高純度で得ることにある。また、このような手法により、生体内の抗体を精製し、各種疾患の診断に用いることが期待される。さらに、動物細胞等で生産した抗体から、所望の性質を有する抗体を精製することができる。特に本発明の方法により精製されたＡＤＣＣ活性が高い抗体は、生体内の免疫系をより活性化できることが期待され、抗腫瘍効果をはじめとする、ヒトの各種疾患の治療上の有用性が期待される。
本発明は以下の（１）から（２１）に関する。
（１）　抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質を用いることを特徴とする、所望の性質を有する抗体を精製する方法。
（２）　糖鎖が、Ｎ−グリコシド結合糖鎖である、上記（１）記載の方法。
（３）　Ｎ−グリコシド結合糖鎖が、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン、フコースまたはガラクトースが結合した糖鎖である、上記（２）記載の方法。
（４）　糖鎖に対し親和性を有する物質が、レクチンであることを特徴とする、上記（１）記載の方法。
（５）　レクチンが、コンカナバリンＡ、小麦胚芽レクチン、レンズマメレクチンおよびインゲンマメレクチンＥ４からなる群から選ばれる少なくとも１種類のレクチンである、上記（４）記載の方法。
（６）　糖鎖に対し親和性を有する物質が、担体と結合していることを特徴とする、上記（１）記載の方法。
（７）　担体が、合成樹脂のポリマーであることを特徴とする、上記（６）記載の方法。
（８）　小麦胚芽レクチンまたはインゲンマメレクチンＥ４が固定化されたカラムを用いることを特徴とする、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンが結合した糖鎖構造を有する抗体を精製する方法。
（９）　小麦胚芽レクチンまたはインゲンマメレクチンＥ４が固定化されたカラムを用いることを特徴とする、抗体依存性細胞障害活性の高い抗体を精製する方法。
（１０）　レンズマメレクチンが固定化されたカラムを用いることを特徴とする、フコースが結合した糖鎖構造を有する抗体を精製する方法。
（１１）　レンズマメレクチンが固定化されたカラムを用いることを特徴とする、抗体依存性細胞障害活性の高い抗体を精製する方法。
（１２）　疎水性クロマト用担体を用いることを特徴とする、ガラクトースが結合した糖鎖構造を有する抗体を精製する方法。
（１３）　疎水性クロマト用担体を用いることを特徴とする、補体依存性細胞障害活性または抗体依存性細胞障害活性の高い抗体を精製する方法。
（１４）　疎水性クロマト用担体に、フェニル基が結合している、上記（１３）記載の方法。
（１５）　上記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法を組み合わせて、所望の性質を有する抗体を精製する方法。
（１６）　抗体がヒトＩｇＧである、上記（１）〜（１５）のいずれか１項に記載の方法。
（１７）　ヒトＩｇＧのサブクラスがＩｇＧ１である、上記（１６）記載の方法。
（１８）　上記（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法で精製された抗体を有効成分とする医薬。
（１９）　抗体がヒトＩｇＧである、上記（１８）記載の医薬。
（２０）　ヒトＩｇＧのサブクラスがＩｇＧ１である、上記（１９）記載の医薬。
（２１）　抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質を用いることを特徴とする、各種疾患の診断方法。
ここで、抗体の補体依存性細胞障害活性または抗体依存性細胞障害活性が高いとは、精製後の抗体が、カラムに通塔する前の抗体や抗体組成物よりも、高いＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性を有することを意味する。
抗体は、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に生産される糖蛋白質であり、抗原と特異的に結合する活性を有する。
本発明で精製される抗体としては、動物に抗原を免疫することにより得られた抗血清、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌するモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などいかなるものでもよい。また、抗体のＦｃ領域を融合させた融合タンパク質なども本発明では抗体として含まれる。
具体的には、マウスに免疫したのち脾臓細胞から得られるマウス抗体、マウス抗体とヒト抗体の遺伝子を任意に組込んだ宿主細胞を用いて生産されるヒト型キメラ抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１，１９８４）またはヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２，１９８６）などがあげられる。
抗体としては、好ましくはヒトＩｇＧ（イムノグロブリン）があげられる。さらに好ましくはサブクラスがＩｇＧ１であるヒトＩｇＧである。
抗体のＦｃ領域には、後述するＮ−グリコシド結合糖鎖がそれぞれの重鎖に１か所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖としては、化合物（Ｉ）で示されるいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グリコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。したがって、これまでの精製抗体とは、アミノ酸配列の観点からは同一抗体分子であるが、それらの精製抗体のＦｃ領域に結合した糖鎖構造には種々の糖鎖がみられる点で抗体組成物といえる。
2002030954.tif 000002
糖鎖としては、直鎖または分岐したオリゴ糖または多糖であればいずれも包含されるが、例えば蛋白質との結合様式により、アスパラギンと結合するＮ−グリコシド結合糖鎖、セリン、スレオニンなどと結合するＯ−グリコシド結合糖鎖に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、ハイマンノース型、コンプレックス型、ハイブリッド型の３つの種類があげられる。
オリゴ糖は、単糖または単糖の置換誘導体が２〜１０個脱水結合して生じたものをいう。さらに多数の単糖が結合している糖質を多糖という。多糖は、構成糖の種類によって異なるが、ウロン酸やエステル硫酸を多く含む糖質を酸性多糖、中性糖のみのものを中性多糖という。多糖のうち、ムコ多糖とよばれる一群の多糖は、ほとんどが蛋白質と結合しており、プロテオグリカンという。
単糖とは、糖鎖の構成単位となるもので、加水分解によってそれ以上簡単な分子にならない基本的物質である。単糖は、カルボキシル基などの酸性側鎖を有する酸性糖、ヒドロキシル基がアミノ基で置換されたアミノ糖、それ以外の中性糖の３つに大別される。生体内に存在する単糖としては、酸性糖はＮ−アセチルノイラミン酸やＮ−グリコリルノイラミン酸（以下、Ｎｅｕ５Ｇｃと略記する）などのシアル酸や、ウロン酸など、アミノ糖はＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃと略記する）やＮ−アセチルガラクトサミンなど、中性糖はグルコース、マンノース、ガラクトース、フコースなどがあげられる。
抗体に結合する糖鎖としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の３つの型のいずれも包含する。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、以下に示す基本となる共通のコア構造を有する。
2002030954.tif 000003
上記の構造において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
本発明における糖鎖に親和性を示す物質としては、糖鎖と結合する性質を有する物質であればいかなるものでもよい。具体的には、蛋白質、抗体、低分子化合物などがあげられる。
糖鎖に親和性を示す蛋白質としては、マンノース結合タンパク質、繊維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子などの糖結合蛋白質、レクチン、レクチン様物質などがあげられる。
レクチンとは、動植物をはじめとして微生物などあらゆる生物中に存在する、糖質に親和性を有する蛋白質の総称である。レクチンは、以下▲１▼〜▲３▼のように定義されている。
▲１▼糖質に結合し、細胞を凝集あるいは複合糖質を沈降させる。
▲２▼非免疫学的な産物である。
▲３▼細胞や複合糖質との結合は、単糖またはオリゴ糖により阻止される。
複合糖質は、糖質を含む生体分子の総称で、糖蛋白質、プロテオグリカン、糖脂質を意味する。
レクチンとしては、ナタ豆（英名Ｊａｃｋ　ｂｅａｎ、学名Ｃｏｎａｖａｌｉａ　ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）由来のコンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｒｉｎ　Ａ：以下ＣｏｎＡと表記する）、小麦胚芽（英名Ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ、学名Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来の小麦胚芽レクチン（以下ＷＧＡと表記する）、レンズマメ（学名Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）由来のＬＣＡ、インゲンマメ（学名Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のインゲンマメレクチンＥ４（以下、ＰＨＡ−Ｅ４と表記する）、ヒマ豆（英名Ｃａｓｔｅｒ　ｂｅｅｎ、学名Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）由来のヒマ豆レクチン（以下ＲＣＡと表記する）などがあげられる。
ＣｏｎＡは、α−Ｄ−マンノース、α−Ｄ−グルコースを認識する。Ｎ−グリコシド結合糖鎖に強く結合するため、最も汎用されているレクチンである。
ＷＧＡは、ハイブリッド型糖鎖やシアル酸をもつ糖蛋白質との結合性が高く、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの存在により強く結合する。
バイセクティングＧｌｃＮＡｃとは、上記の式（Ｉ）において、β１，４結合でマンノース残基に結合しているＧｌｃＮＡｃを指す。
ＬＣＡは、α−Ｄ−マンノース、α−Ｄ−グルコースを認識する。Ｎ−グリコシド結合糖鎖のアスパラギンに最も近いＧｌｃＮＡｃ残基にＬ−フコースがα１，６結合した構造に強い結合性を示す。
ＰＨＡ−Ｅ４は、２本鎖、３本鎖のアスパラギン結合型糖鎖に結合し、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの存在により強く結合する。
ＲＣＡは、β−Ｄ−ガラクトースを認識し、非還元末端にβ−ガラクトースを有するＯ−グリコシド結合糖鎖またはＮ−グリコシド結合糖鎖に結合する。特に、ガラクトースβ１−４ＧＬＣＮＡＣ構造を有するコンプレックス型糖鎖には強い親和性を有する。
糖鎖に親和性を示す抗体としては、動物に糖鎖を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する糖鎖に対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体から抗体遺伝子を取得し、該抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを宿主細胞へ導入し、該宿主細胞から生産することにより取得された、糖鎖に親和性を示す遺伝子組換え体抗体などがあげられる。
具体的には、マウスに免疫したのち脾臓細胞から得られるマウス抗体、マウス抗体とヒト抗体の遺伝子を任意に組込んだ宿主細胞を用いて生産されるヒト型キメラ抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体、およびそれらの抗体フラグメントであるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、一本鎖抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３，１９８８）、２量体化可変領域断片（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，６２９，１９９７）、ジスルフィド抗体断片（ジスルフィド安定化可変領域断片）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９，１９９５）、ＣＤＲを含むペプチド（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９６６，１９９６）などがあげられる。
さらに、ファージディスプレイなどの手法によって得られる、糖鎖に親和性を示すペプチド、蛋白質も包含される。
糖鎖に親和性を示す低分子化合物としては、セロトニン、フェニルホウ酸等があげられる。また、糖鎖に親和性を有する官能基を結合させた担体なども包含される。セロトニンは、シアル酸に親和性を有する低分子化合物である。
長い糖鎖を有している抗体は、水酸基数が多くなるために疎水性が低くなり、短い糖鎖を有している抗体は、水酸基数が少なくなるために疎水性が高くなる。糖鎖に親和性を有する官能基としては、フェニル基、ブチル基、オクチル基など疎水性官能基があげられる。これらの官能基を結合させた担体を用いることにより、上記の式（Ｉ）で示された非還元末端側の糖の付加が少ない糖鎖構造を有する抗体を精製し、取得することができる。
糖鎖に対し親和性を有する物質を、樹脂、膜等の担体に直接または間接的に結合させた器材を用いて、クロマトグラフィー等を行うことにより所望の性質を有する抗体を精製することができる。
担体としては、合成樹脂ポリマー、好ましくはアクリル系合成樹脂ポリマーまたはビニル系合成樹脂ポリマー、より好ましくはアクリル酸エステルがあげられる。
本発明における所望の性質としては、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性など抗体のエフェクター活性または体内における安定性などがあげられる。
ＣＤＣ活性とは、抗原に結合した抗体に補体が結合して膜障害性蛋白複合体を形成し、微生物などの膜に穴をあけたり、マクロファージや好中球に捕食されるように働く活性を意味する。ＡＤＣＣ活性とは、腫瘍細胞等に結合した抗体が、抗体のＦｃ領域とキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性を意味する。
また、所望の性質には、抗体の有する糖鎖構造の均一性なども含まれる。
以上にあげた所望の性質は、抗体の有する糖鎖構造に起因する。抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が、還元末端のＧｌｃＮＡｃへα１，６結合するフコースを持たない糖鎖構造、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖構造である割合が高いほど抗体のＡＤＣＣ活性が高い。また、抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が、ガラクトースを有する糖鎖構造である割合が高いほど、抗体のＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性が高い。シアル酸の含量を増加させた糖鎖構造を有する割合が高いほど、抗体の体内での安定性がよい。また、シアル酸うち、Ｎｅｕ５Ｇｃを持たない糖鎖構造を有する割合が高いほど、抗体の免疫原性が低い。
したがって、これらの糖鎖構造を特異的に認識する物質を用いて精製を行うことにより、所望の性質を有する抗体を精製することができる。
また、本発明の精製方法を組合わせることによって、所望の性質を有する抗体をさらに精製することができる。
本発明の精製方法では、血清などの体液、抗体を生産する細胞を培養した培養液などから抗体を精製することができる。該培養液はあらかじめ細胞を除去して得られる溶液が好ましく、他の糖蛋白質が共存しない溶液がより好ましい。具体的には、従来の抗体の精製方法、例えばプロテインＡなどによる精製で予め粗精製された溶液などがあげられる。さらに、抗体を生産する細胞を培養した培養液としては、無血清または無蛋白質の培地で培養した培養液が好ましい。
以下、本発明の精製、評価および使用方法について具体的に例示する。
１．抗体の精製
（１）レクチンクロマトグラフィーによる精製
レクチンクロマトグラフィーは、レクチンが糖鎖と特異的に結合する性質を利用した、アフィニティークロマトグラフィーである。
所望の性質を有する抗体を精製するために用いるレクチンの種類としては、抗体の糖鎖構造により選択することができる。
所望の性質がＣＤＣ活性の場合には、ガラクトースに親和性を有するレクチンを用いることができる。ガラクトースに親和性を有するレクチンとしては、ＲＣＡがあげられ、好ましくはＲＣＡ１２０があげられる。
所望の性質がＡＤＣＣ活性の場合には、フコースまたはバイセクティングＧｌｃＮＡｃに親和性を有するレクチンを用いることができる。フコースに親和性を有するレクチンとしては、ＬＣＡがあげられ、好ましくはＬＡ−ＬＣＡ４（ホーネンコーポレーション社製）があげられる。バイセクティングＧｌｃＮＡｃに親和性を有するレクチンとしては、ＷＧＡ、ＰＨＡ−Ｅ４などがあげられ、好ましくはＬＡ−ＷＣＡ４、ＬＡ−ＰＨＡ−Ｅ４（ともにホーネンコーポレーション社製）があげられる。
所望の性質を有する抗体の糖質構造が明らかな場合には、上述したレクチンの特異性を参考にしてレクチンを選択する。
所望の性質を有する抗体の糖質構造が不明な場合は、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等で標識されたレクチンを用いて、ドットブロット法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０４（１），１９８，１９９２］やウエスタンブロット法［法医学の実際と研究，３７，１５５，１９９４］等を行うことにより、結合性のあるレクチンを選択することができる。
１分子に複数本の糖鎖が存在する糖蛋白質では、レクチンとの結合がより強固になり、カラムから溶出しにくい場合がある。その場合、溶出液の糖濃度を高くすることにより溶出されやすくなるが、糖蛋白質との結合の弱い別のレクチンを選択する方が好ましい。
レクチンクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、具体的には、ＨｉＴｒａｐ　ＣｏｎＡ、ＨｉＴｒａｐ　Ｌｅｎｔｉｌ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＣＡ）、ＨｉＴｒａｐ　Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＷＧＡ）、（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。また、微生物、植物、動物等の生体試料から単離したレクチンを、担体に固定化したカラムを用いてもよい。担体としては、アガロース、アクリル系合成樹脂のポリマー等があげられ、好ましくはアクリル酸エステルのポリマーがあげられる。高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと表記する）システムを使用する場合は、一般に市販されているＨＰＬＣシステムであればいかなるものでもよい。例えば、ＬＣ−６Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）などがあげられる。
ＨＰＬＣシステムを使用した精製方法の一例を示す。溶離液は、１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌトリス−硫酸緩衝液、１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液などを用いる。ｐＨは７〜８程度の間が好ましい。まず、１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌトリス−硫酸緩衝液または１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液などの初期緩衝液でカラムを充分に平衡化する。ＨＰＬＣシステムにより試料を通塔し、溶出糖を含む１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌトリス−硫酸緩衝液または１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を用いて溶出させる。溶出糖はレクチンによって異なる。例えば、ＣｏｎＡカラムの場合は、溶出糖として０．０２〜０．５ｍｏｌ／ｌメチルα−Ｄ−グルコシドや０．０２〜０．５ｍｏｌ／ｌメチルα−Ｄ−マンノシドを用いる。溶出はステップワイズ法またはグラジエント法により溶出する。蛋白質は、例えば紫外線吸収、電気泳動などの方法により検出することができる。
（２）疎水性クロマトグラフィーによる精製
疎水性クロマトグラフィーは、蛋白質の疎水性の違いにより分離する手法である。一般的には、目的蛋白質と夾雑蛋白質との疎水性の違いを利用して、目的蛋白質を分離する場合に用いられている。
同一蛋白質の疎水性クロマトグラフィーを行う場合、溶出時間の違いによって蛋白質の有する糖鎖構造の違いや、二量体含量の相違が見られる場合がある。これは、蛋白質の立体構造が変化することにより、疎水性に差異が生じるためである。
疎水性クロマトグラフィーに使用するカラムとしては、一般には市販されている疎水性クロマトグラフィーのカラムであればいかなるものでもよい。例えば、ＨｉＴｒａｐ　１６／１０　Ｐｈｅｎｙｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（ＴＯＳＯＨ社製）などがあげられる。
ＨＰＬＣシステムを使用する場合は、一般に市販されているＨＰＬＣシステムであればいかなるものでもよい。例えば、ＬＣ−６Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）などがあげられる。
ＨＰＬＣシステムを使用した精製方法の一例を示す。溶離液には、１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌクエン酸−グリシン緩衝液または１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液などを用いる。ｐＨは５〜８程度の間、好ましくはｐＨ７前後とする。まず、硫酸アンモニウム（以下、硫安と表記する）０．５〜１ｍｏｌ／ｌ程度を含む１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌクエン酸−グリシン緩衝液または１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液などの初期溶離液で充分カラムを平衡化する。ＨＰＬＣシステムにより試料を通塔し、１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌクエン酸−グリシン緩衝液または１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液などの溶出緩衝液で溶出させる。溶出はステップワイズ法またはグラジエント法により溶出する。蛋白質は、例えば紫外線吸収、電気泳動などの方法により検出することができる。
２．抗体の評価方法
上記１の方法により得られた抗体の活性測定、また抗体に結合する糖鎖の分析については下記の方法を用いることができる。
（１）抗体の活性評価
上記１で精製された抗体と抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３，１９９３］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定し、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３，１９９３］。更にヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
（２）抗体の糖鎖の分析方法
抗体の糖鎖構造の解析方法としては、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３，１９８８、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］があげられる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖の結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７，１９８４］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。さらに、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３，１９８８］上にプロットし、糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される糖鎖構造を確認することができる。
３．抗体の使用方法
（１）本発明の精製方法で取得された抗体を有効成分として含有する医薬
上記１の方法で精製された抗体を、上記２の評価方法により抗体の性質を確認する。
ＬＣＡはＧｌｃＮＡｃ残基にＬ−フコースがα１，６結合した構造に親和性を有する。そこで、ＬＣＡを用いた抗体の精製により、抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が、還元末端側のＧｌｃＮＡｃにα１，６結合するフコースを有するか、または有しない抗体を分離し、精製することができる。
また、ＷＧＡおよびＰＨＡ−Ｅ４はバイセクティングＧｌｃＮＡｃに対し親和性を有する。そこで、ＷＧＡまたはＰＨＡ−Ｅ４を用いた抗体の精製により、抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が、非還元末端側にバイセクティングＧｌｃＮＡｃを有するか、または有しない抗体を分離し、精製することができる。
ＬＣＡによる精製で得られる還元末端側のＧｌｃＮＡｃにフコースが結合していない糖鎖構造を有する抗体、ＷＧＡまたはＰＨＡ−Ｅ４による精製で得られる非還元末端側にバイセクティングＧｌｃＮａｃを持つ糖鎖構造を有する抗体は、ＡＤＣＣ活性が高い。
このような性質を有する抗体は、癌、アレルギー、循環器疾患、またはウイルスあるいは細胞感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いＡＤＣＣ活性を有していれば癌細胞を傷害することにより癌を治療することができるので、通常の抗癌剤よりも有用である。
アレルギー反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応をおさえることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化の治療方法の一つにバルーンカテーテルがあるが、これにより動脈細胞が増殖し、再狭窄が発生することがある。高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて動脈細胞の増殖を抑制することにより、循環器疾患を予防および治療することができる。
高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いてウイルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を抑制することにより、ウイルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療することができる。
上記１（１）のＬＣＡを用いて精製される抗体のうち、還元末端のＧｌｃＮＡｃへα１，６結合するフコースを有する糖鎖構造を有する抗体は、上述した抗体よりもＡＤＣＣ活性が低くなる。このように、ＡＤＣＣ活性が抑制された抗体は、自己免疫疾患において亢進された免疫反応を押さえるという観点から、自己免疫疾患の予防および治療において有用である。
上記１（２）の疎水クロマトグラフィーによって精製される抗体のうち、ガラクトースを有する糖鎖構造を多くを有する抗体は、ＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性が高い。したがって、このような性質を有する抗体は、癌、アレルギー、循環器疾患、またはウイルスあるいは細胞感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
上記１（２）の疎水クロマトグラフィーによって精製される抗体のうち、ガラクトースを有する糖鎖構造が少ない抗体は、精製する前の抗体よりもＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性が低くなる。このように、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性が抑制された抗体は、自己免疫疾患において亢進された免疫反応を押さえるという観点から、自己免疫疾患の予防および治療において有用である。
また、これらの糖鎖構造、ならびに糖鎖構造に起因する抗体の性質は、混合されていてもよい。そのような抗体を精製する手法としては、具体的には、糖鎖に親和性を示す物質を固定化したカラムを組み合わせたり、糖鎖への結合特異性が異なる物質を同一カラム内に混合して作製したカラムを用いる方法があげられる。
上記の精製された抗体は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は本発明の抗体そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体または抗体断片を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。本発明の抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
（２）抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質を用いた診断方法
糖鎖に親和性を示す物質を用いて、ヒト体内から生体試料を抽出し、該生体試料中の抗体の検出または定量を行うことにより、各種疾患の診断を行うことができる。また、ヒト体内の抗体の検出または定量を行うことにより、ヒトの生理機能の変化、疾患の進行状況等を診断することができる。
方法としては、本発明における抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質を結合させた担体をカラムに充填する。該カラムにヒト体内から採取した生体試料を通塔させ、抗体に結合する種々の糖鎖構造の割合を検出または定量する。抗体に結合する糖鎖に対し親和性を有する物質を結合させた担体を充填したカラムに、抗体を特異的に吸着させる性質を有するプロテインＡを充填したカラムを組み合わせることにより、リウマチ等の疾患などを、より特異的に、かつ簡便に診断することができる。
具体的には、自己免疫疾患であるリウマチの診断があげられる。
以下に、本発明の実施例を示すが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１：フコース結合糖鎖を多く含む抗体の分画
（１）レクチンクロマトグラフィーによる抗体の分画
フコースを有する糖鎖に結合するレクチンを用いて、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。
まず、ＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って作製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターを、ラットミエローマＹＢ２／０細胞へ導入して抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する細胞を取得した。該細胞を培地中に培養した後、培養培地より抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体をＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って精製した。
次に、上記で精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を含む溶液を、レクチンカラム（ＬＡ−ＬＣＡ、４．６×１５０ｍｍ、ホーネンコーポレーション社製）に通塔した。ＨＰＬＣシステムとしてはＳｈｉｍａｄｚｕ社製ＬＣ−６Ａを用いて、流速０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温でカラムへ溶液を通塔した。カラムを５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化し、精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を注入後、５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ７．３）中０Ｍから０．２Ｍのα−メチルマンノシド（ナカライテスク社製）によるリニアグラジエント（６０分間）にて溶出した。抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を非吸着画分と吸着画分とに分画した（第１図）。
（２）結合活性測定（ＥＬＩＳＡ法）
第１図中に示した非吸着画分、吸着画分の一部をとり、ｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。ＷＯ９７／１０３５４に記載の抗ｈＩＬ−５Ｒαマウス抗体ＫＭ１２５７をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した溶液の５０μｌを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、４℃で２０時間反応させた。反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＷＯ９７／１０３５４に記載の可溶性ｈＩＬ−５Ｒαを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した溶液を５０μｌ／ウェルで加え、４℃で２０時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、形質転換株の培養上清或いは精製したヒト型ＣＤＲ移植抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液）を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４１５）を測定した。
測定の結果、非吸着画分と吸着画分の一部は、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と同様の結合活性を示した（第２図）。
（３）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
非吸着画分と吸着画分の一部のＡＤＣＣ活性を測定した。まず、標的細胞溶液の調製を行った。ＷＯ９７／１０３５４に記載のｈＩＬ−５Ｒα鎖及びβ鎖を発現しているマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）をＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で培養し、１×１０６細胞／０．５ｍｌとなる様に調製し、放射性物質であるＮａ２５１ＣｒＯ４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１．５時間反応させ、細胞を放射標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で懸濁及び遠心分離操作より３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地を５ｍｌ加え、２×１０５細胞／ｍｌに調製し、標的細胞溶液とした。
次に、エフェクター細胞溶液の調製を行った。健常人静脈血５０ｍｌを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．５ｍｌを加え穏やかに混ぜた。これをＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ　Ｐｈａｒｍａ　ＡＳ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ　１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で３回遠心分離して洗浄後、培地を用いて９×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに、調製した標的細胞溶液の５０μｌ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで調製したエフェクター細胞溶液を１００μｌ（９×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は９０：１となる）添加した。更に、各種抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を各最終濃度０．００１〜０．１μｇ／ｍｌとなる様に加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに１規定塩酸を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。
2002030954.tif 000004
その結果を第３図に示した。非吸着画分は分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体よりＡＤＣＣ活性が高く、吸着画分の一部は分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を示した。
（４）糖鎖分析
非吸着画分および吸着画分の一部をヒドラジン分解により糖鎖を蛋白質から切断した［メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３，１９８２］。ヒドラジンを除去した後、酢酸アンモニウム水溶液と無水酢酸加えてＮ−アセチル化を行った。凍結乾燥後、ＰＡによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５，１９７，１９８４］。蛍光標識した糖鎖群（ＰＡ化糖鎖群）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＨＲ　１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて過剰な試薬と分離した。糖鎖画分を遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖群とした。次に、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて、精製ＰＡ化糖鎖群の逆相ＨＰＬＣ分析を行った（第４図）。ＰＡ化糖鎖群は、３９分から７５分の範囲に溶出した。ピーク面積から計算すると、非吸着画分はフコースのない糖鎖が１００％、吸着画分の一部はフコースのない糖鎖が１８％であった。分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体ではフコースのない糖鎖が３７％であった。このことから、フコースを有する糖鎖に結合するレクチンカラムを用いて、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体よりもフコースのない糖鎖の含量が多い抗体とフコースのない糖鎖の含量が少ない抗体とを分離・精製することができた。
実施例２：バイセクティングＧｌｃＮＡｃ結合糖鎖を多く含む抗体の分画
（１）レクチンクロマトグラフィーによる抗体の分画
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖に結合するレクチンを用いて、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。
まず、ＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って作製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターを、ラットミエローマＹＢ２／０細胞へ導入して抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する細胞を取得した。該細胞を培地中に培養した後、培養培地より抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体をＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って精製した。
次に、上記で精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を含む溶液をレクチンカラム（ＬＡ−ＷＧＡ、４．６×１５０ｍｍ、ホーネンコーポレーション社製）に通塔した。ＨＰＬＣシステムとしてはＳｈｉｍａｄｚｕ社製ＬＣ−６Ａを用いて、流速０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温でカラムへ溶液を通塔した。５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化し、精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を注入後、５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ７．３）中０Ｍから０．２ＭへのＧｌｃＮＡｃ（純正化学社製）によるリニアグラジエント（６０分間）にて溶出した。抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を、２〜５分間に溶出された画分と８〜１２分間に溶出された画分に分離した。
（２）糖鎖分析
早く溶出された画分および遅く溶出された画分の抗体の糖鎖分析を、実施例１の（４）項に示す方法で行った。ＰＡ化糖鎖群は、２０分から５０分の範囲に溶出した。その結果、遅く溶出された画分の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、精製・分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と比較して、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖の含量が、６％から１２％に増加した（第５図）。
実施例３：フコースを有する糖鎖が少なく、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ結合糖鎖を多く含む抗体の分画
（１）レクチンクロマトグラフィーによる抗体の分画
実施例２で得られた、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ結合糖鎖を多く含む抗体組成物を、実施例１の（１）項と同様の方法を用いて、非吸着画分と吸着画分の一部に分離した。
（２）糖鎖分析
非吸着画分と、吸着画分の一部の糖鎖分析を、実施例１の（４）項に示す方法で行った。ＰＡ化糖鎖群は、１８分から４５分の範囲に溶出した。その結果、吸着画分の一部は、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と比較して、フコースのない糖鎖の含量が２９％から１５％に減少し、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ結合糖鎖が５％から１８％に増加した（第６図）。
実施例４：ガラクトース結合糖鎖を多く含む抗体の分画
（１）疎水性クロマトグラフィーによる抗体の分画
疎水性クロマトグラフィーを用いて、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。
まず、ＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って作製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターを、ラットミエローマＹＢ２／０細胞へ導入して抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する細胞を取得した。該細胞を培地中に培養した後、培養培地より抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体をＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って精製した。
次に、上記で精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を含む溶液を、疎水性カラムであるＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（東ソー社製）に通塔した。ＨＰＬＣシステムはＳｈｉｍａｄｚｕ社製ＬＣ−６Ａを用い、流速は１ｍｌ／分、カラム温度は室温で行った。１Ｍ硫安を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し、精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を注入後、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）へのリニアグラジエント（６０分間）にて溶出した。抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を、早く（４〜６分間）溶出された画分と遅く（２０〜２５分間）溶出された画分とに分離した。
（２）糖鎖分析
早く溶出された画分および遅く溶出された画分の糖鎖解析を、実施例１の（４）項に示す方法で行った。ＰＡ化糖鎖群は、３３分から７０分の範囲に溶出した。その結果、早く溶出された画分はガラクトース結合糖鎖の含量が５３％、遅く溶出された画分は、ガラクトース結合糖鎖の含量４４％であった（第７図）。
実施例５：フコース結合糖鎖を多く含む抗体の分画
（１）レクチンクロマトグラフィーによる抗体の分画
フコースを有する糖鎖に結合するレクチンを用いて、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。
まず、ＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って作製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターを、マウスミエローマＮＳＯ細胞へ導入して抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する細胞を取得した。該細胞を培地中に培養した後、培養培地より抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体をＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って精製した。
精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を含む溶液を、実施例１の（１）項と同様の方法を用いて、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を非吸着画分と吸着画分とに分画した。
（２）結合活性測定（ＥＬＩＳＡ法）
非吸着画分、吸着画分の一部をとり、ｈＩＬ−５Ｒαに対する結合活性を、実施例１の（２）項と同様の方法で測定した。非吸着画分と吸着画分の一部は、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と同様の結合活性を示した（第８図）。
（３）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
非吸着画分と吸着画分の一部のＡＤＣＣ活性を、実施例１の（３）項と同様の方法で測定した。非吸着画分は分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体よりＡＤＣＣ活性が高く、吸着画分の一部は分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を示した（第９図）。
（４）糖鎖分析
非吸着画分、吸着画分の一部の糖鎖分析を、実施例１の（４）項と同様の方法で行った（第１０図）。ＰＡ化糖鎖群は、１５分から５５分の範囲に溶出した。ピーク面積から計算すると、非吸着画分はハイマンノース型糖鎖が８４％、フコースのないコンプレックス型糖鎖が１６％であった。吸着画分の一部は、ハイマンノース型糖鎖が５％、フコースのないコンプレックス型糖鎖が７％であった。分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体では、ハイマンノース型糖鎖が７％、フコースのないコンプレックス型糖鎖が８％であった。このことから、フコースを有する糖鎖に結合するレクチンカラムを用いることによって、ハイマンノース型、コンプレックス型糖鎖にかかわらず、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体よりもフコースのない糖鎖の含量が多い抗体と、フコースのない糖鎖の含量が少ない抗体とを分離・精製することができた。
実施例６：バイセクティングＧｌｃＮＡｃ結合糖鎖を多く含む抗体の分画
（１）レクチンクロマトグラフィーによる抗体の分画
バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖に結合するレクチンを用いて、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を精製した。
まず、ＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って作製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体発現ベクターを、マウスミエローマＮＳＯ細胞へ導入して抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を生産する細胞を取得した。該細胞を培地中に培養した後、培養培地より抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体をＷＯ９７／１０３５４記載の方法に従って精製した。
次に、上記で精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を含む溶液をレクチンカラム（ＬＡ−ＰＨＡ−Ｅ４、４．６×１５０ｍｍ、ホーネンコーポレーション社製）に通塔した。ＨＰＬＣシステムとしてはＳｈｉｍａｄｚｕ社製ＬＣ−６Ａを用いて、流速０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温でカラムへ溶液を通塔した。５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し、精製された抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を注入後、５０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）中０Ｍから０．１ＭへのＫ２Ｂ４Ｏ７（ナカライ社製）によるリニアグラジエント（６０分間）にて溶出した。抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を、早く（５〜８分）溶出された画分と遅く（１８〜３０分）溶出された画分に分離した。
（２）糖鎖分析
遅く溶出された画分と、分離前の抗体の糖鎖分析を、実施例１の（４）項に示す方法で行った。ＰＡ化糖鎖群は、２６分から５５分の範囲に溶出した。その結果、遅く溶出された画分の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体は、精製・分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と比較して、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖の含量が、４％から２１％に増加した（第１１図）。
実施例７：フコースを有する糖鎖が少なく、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ結合糖鎖を多く含む抗体の分画
（１）レクチンクロマトグラフィーによる抗体の分画
実施例６（１）で得られた、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ結合糖鎖を多く含む抗体を、実施例１の（１）項と同様の方法を用いて、非吸着画分と吸着画分の一部に分離した。
（２）糖鎖分析
非吸着画分と、吸着画分の一部の糖鎖分析を、実施例１の（４）項に示す方法で行った。ＰＡ化糖鎖群は、２５分から５５分の範囲に溶出した。その結果、吸着画分の一部は、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と比較して、フコースのない糖鎖の含量が２７％から１０％に減少し、かつバイセクティングＧｌｃＮＡｃ結合糖鎖が４％から３１％に増加した（第１２図）。
産業上の利用可能性
本発明により、所望の性質を有する抗体を精製することができる。また、本発明の精製方法により得られた抗体を有効成分とする医薬は、所望の活性を有するため、ヒトの各種疾患の診断に有用である。また、生体試料から抗体を精製する方法と同様の方法を用いることにより、各種疾患を診断することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体を、フコースを持つ糖鎖に結合するレクチンが固定化されたカラムによって分離した溶離図を示したものである。縦軸にＵＶ２８０ｎｍにおける吸光度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第２図は、フコースを持つ糖鎖に結合するレクチンによって分画した非吸着画分、吸着画分の一部と、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒαとの結合活性を、抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はｈＩＬ−５Ｒαとの結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。◇が非吸着画分、□が吸着画分の一部、△が分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体をそれぞれ示す。
第３図は、フコースを持つ糖鎖に結合するレクチンによって分画した非吸着画分、吸着画分の一部と、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の、ｈＩＬ−５Ｒ発現マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。◇が非吸着画分、□が吸着画分の一部、△が分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体をそれぞれ示す。
第４図は、フコースを持つ糖鎖に結合するレクチンによって分画した非吸着画分、吸着画分の一部と、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。上図に非吸着画分の溶離図、中央図に吸着画分の一部、下図に分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。図中「−Ｆｕｃ」はフコースを持たない糖鎖群、「＋Ｆｕｃ」はフコースが結合した糖鎖群を示す。
第５図は、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖に結合するレクチンを用いたクロマトグラフィーにおいて、遅く溶出される画分から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。上図に分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体、下図に遅く溶出される画分の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。図中の「バイセクティング」はバイセクティングＧｌｃＮＡｃが結合した糖鎖群を示す。
第６図は、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体と、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖に結合するレクチンを用いたクロマトグラフィーにおいて遅く溶出され、さらにフコースを持つ糖鎖に結合するレクチンを用いたクロマトグラフィーを行って分画した抗体のうち、吸着画分の一部から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。上図に分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体、下図に遅く溶出される画分の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。図中「−Ｆｕｃ」はフコースを持たない糖鎖群、「バイセクティング」はバイセクティングＧｌｃＮＡｃが結合した糖鎖群を示す。
第７図は、早く溶出される画分、遅く溶出される画分から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。左図に早く溶出される画分、右図に遅く溶出される画分をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。図中斜線で示すピークはガラクトースを持たない糖鎖群、黒塗りで示すピークはガラクトースが結合した糖鎖群を示す。
第８図は、フコースを持つ糖鎖に結合するレクチンによって分画した非吸着画分、ならびに吸着画分の一部と、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体のｈＩＬ−５Ｒαとの結合活性を、抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はｈＩＬ−５Ｒαとの結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。◇が非吸着画分、□が吸着画分の一部、△が分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体をそれぞれ示す。
第９図は、フコースを持つ糖鎖に結合するレクチンによって分画した非吸着画分、ならびに吸着画分の一部と、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の、ｈＩＬ−５Ｒ発現マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２（ｈ５Ｒ）に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。◇が非吸着画分、□が吸着画分の一部、△が分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体をそれぞれ示す。
第１０図は、フコースを持つ糖鎖に結合するレクチンによって分画した非吸着画分、吸着画分の一部と、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。上図に非吸着画分の溶離図、中央図に吸着画分の一部、下図に分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。図中「−Ｆｕｃ」はフコースを持たない糖鎖群、「＋Ｆｕｃ」はフコースが結合した糖鎖群、「ハイマンノース」はハイマンノース型糖鎖群を示す。
第１１図は、ＰＨＡ−Ｅ４レクチンを用いたクロマトグラフィーにおいて、遅く溶出される画分、ならびに分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。上図に分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体、下図に遅く溶出される画分の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。図中の「バイセクティング」はバイセクティングＧｌｃＮＡｃが結合した糖鎖群を示す。
第１２図は、ＰＨＡ−Ｅ４レクチンを用いたクロマトグラフィーにおいて１８〜３０分に溶出された画分を、さらにＬＣＡレクチンを用いたクロマトグラフィーを行って分画した抗体のうち、吸着画分の一部から調製したＰＡ化糖鎖と、分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。上図に分離前の抗ｈＩＬ−５ＲαＣＤＲ移植抗体、下図に２種類のレクチンクロマトグラフィーで分離した画分の溶離図をそれぞれ示す。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。図中「−Ｆｕｃ」はフコースを持たない糖鎖群、「バイセクティング」はバイセクティングＧｌｅＮＡｃが結合した糖鎖群を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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