(57)【要約】角膜治療に有効であり且つ利便性に優れ、容易に角膜治療を行うことのできる角膜治療用積層体を提供する。このような角膜治療用積層体は、角膜に載置可能な曲面を有する基材と、該基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた細胞層と、を有している。本角膜治療用積層体は、角膜接触側の面に細胞層を有する角膜治療用積層体は、コラーゲンシールドの内側に口腔粘膜上皮細胞を播種して１４日間培養し、口腔粘膜上皮細胞から構成される細胞層を角膜接触側の面に形成させて作製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜に載置可能な曲面を有する基材と、該基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた細胞層と、を有する角膜治療用積層体。
【請求項２】
前記基材は、生体吸収性の材料により構成されている請求項１記載の角膜治療用積層体。
【請求項３】
前記生体吸収性材料が、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン又はアルギン酸の少なくとも１つを含む請求項２記載の角膜治療用積層体。
【請求項４】
前記基材の角膜接触側の面に、細胞と基材との接着性を高める表面加工処理が施されている請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の角膜治療用積層体。
【請求項５】
前記表面加工処理は、前記基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に対して細胞接着性因子を配置する処理である請求項４のいずれかに記載の角膜治療用積層体。
【請求項６】
前記細胞接着性因子は、プロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカンの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項５に記載の角膜治療用積層体。
【請求項７】
前記細胞は角膜上皮細胞、皮膚上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、羊膜上皮細胞及び内皮細胞のいずれか１つを含有する請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の角膜治療用積層体。
【請求項８】
角膜に載置可能な曲面を有する基材と、該基材の角膜接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた第１細胞層と、前記基材の角膜非接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた第２細胞層と、を有する請求項１記載の角膜治療用積層体。
【請求項９】
前記第１細胞は内皮細胞を含み、前記第２細胞は角膜上皮細胞、皮膚上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、羊膜上皮細胞のいずれか１つを含むことを特徴とする請求項８に記載の角膜治療用積層体。
【請求項１０】
前記細胞層を構成する細胞を角膜に移植するために使用される請求項１乃至請求項９のいずれかに記載の角膜治療用積層体。
【請求項１１】
角膜治療用積層体の製造方法であって、
前記角膜治療用積層体は、角膜に載置可能な曲面を有する基材と、該基材の角膜接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた細胞層と、を有するものであり、当該方法は、
前記基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に細胞を播種する播種工程と、
該細胞を基材上で培養して、該角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面の少なくとも一部に、少なくとも一層の細胞層を設ける細胞層形成工程と、
を含む角膜治療用積層体の製造方法。
【請求項１２】
前記播種工程の前に、前記基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に対して、細胞接着性を高める表面加工処理を施す加工工程を含む請求項１１に記載の角膜治療用積層体の製造方法。
【請求項１３】
前記加工工程は、前記基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に対して、細胞接着性因子を配置する工程である請求項１２に記載の角膜治療用積層体の製造方法。
【請求項１４】
前記細胞接着性因子は、プロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカンの少なくとも１つを含む請求項１３に記載の角膜治療用積層体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は患者眼の角膜治療に利用される角膜治療用積層体及びその製造方法に関する。
背景技術
従来、角膜炎、結膜炎等の炎症や、角膜上皮損傷のような角膜疾患に対して、点眼剤や軟膏剤が利用されている。しかしながら、これらの薬剤は比較的軽度の角膜疾患が治療対象となっている。
これに対し、瘢痕性角結膜症では、角結膜上皮下瘢痕組織を除去した後、露出した強膜又は角膜実質上に羊膜組織を逢着することによる治療が行われている。逢着後は、人工涙液、自己血清、ヒアルロン酸、フィブロネクチン等の点眼を行い、涙液の分泌低下を伴うようなものには治療用ソフトコンタクトレンズ、涙点閉鎖・涙点プラグ、瞼板縫合などの処置を行っている。同様の術式による対象疾患としては、スティーブンス−ジョンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）症候群、眼類天庖蒼、化学傷・熱傷、翼状片等が考えられる。
一方、手術後の眼を保護するなどを目的とした角膜用包帯として、生体適合性材料によるコンタクトレンズが開発されている。特にコラーゲンシールド（コラーゲン製の角膜用包帯）は、涙液に含まれる酵素により分解されるので、ドライアイに対する処置や、特定の薬剤のデリバリーシステム（ＤＤＳ）として利用することも行われている。
しかしながら、羊膜組織などを角膜治療に応用する際には、組織移植の手技が必要であり、熟練した術者でないと困難であるという問題がある。また充分な量の羊膜組織を入手することが困難である。さらに、眼球保護を目的としたコンタクトレンズでは、術後に装着する手間がかかる上に根本的な治療を行うことを目的としたものではない。
本発明は上記従来技術の問題点を鑑み、角膜治療に有効であり且つ、利便性に優れ、容易に角膜治療を行うことのできる角膜治療用積層体及びその製造方法を提供することを課題とする。
発明の開示
本発明の角膜治療用積層体は、角膜に載置可能な曲面を有する基材と、該基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた細胞層と、を有するものである。
本発明の他の角膜治療用積層体は、上記積層体において、前記基材は、生体吸収性の材料により構成されていることを特徴としている。
本発明の他の角膜治療用積層体は、上記積層体において、前記生体吸収性材料が、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン又はアルギン酸の少なくとも１つを含むことを特徴としている。
本発明の他の角膜治療用積層体は、上記積層体において、前記基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に、細胞と基材との接着性を高める表面加工処理が施されていることを特徴としている。
本発明の他の角膜治療用積層体は、上記積層体において、前記表面加工処理は、前記基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に対して細胞接着性因子を配置する処理であることを特徴としている。
本発明の他の角膜治療用積層体は、上記積層体において、前記細胞接着性因子は、プロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカンの少なくとも１つを含むことを特徴としている。
本発明の他の角膜治療用積層体は、上記積層体において、前記細胞は角膜上皮細胞、皮膚上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、羊膜上皮細胞及び内皮細胞のいずれか１つを含有することを特徴としている。
本発明の更に他の角膜治療用積層体は、上記積層体において、前記細胞層を構成する細胞を角膜に移植するために使用されることを特徴としている。
本発明の更に別の角膜治療用積層体は、上記積層体において、角膜に載置可能な曲面を有する基材と、該基材の角膜接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた第１細胞層と、前記基材の角膜非接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた第２細胞層と、を有することを特徴としている。
本発明の更に別の角膜治療用積層体は、上記積層体において、前記第１細胞は内皮細胞であり、前記第２細胞は角膜上皮細胞、皮膚上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、羊膜上皮細胞のいずれか１つを含むことを特徴とする。
本発明の角膜治療用積層体の製造方法は、前記角膜治療用積層体が、角膜に載置可能な曲面を有する基材と、該基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた細胞層と、を有するものであり、この場合に、前記基材の角膜接触側の面に細胞を播種する播種工程と、該細胞を基材上で培養して、該角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面の少なくとも一部に、少なくとも一層の細胞層を設ける細胞層形成工程と、を含むものである。
本発明の他の角膜治療用積層体の製造方法は、上記製造方法において、前記播種工程の前に、前記基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に対して、細胞接着性を高める表面加工処理を施す加工工程を含むことを特徴としている。
本発明の他の角膜治療用積層体の製造方法は、上記製造方法において、前記加工工程は、前記基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に対して、細胞接着性因子を配置する工程であることを特徴としている。
本発明の角膜治療用積層体の製造方法は、上記製造方法において、前記細胞接着性因子は、プロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカンの少なくとも１つを含むことを特徴としている。
発明を実施するための最良の形態
本発明の角膜治療用積層体は、角膜に載置可能な曲面を有する基材と、該基材の角膜接触側及び／又は角膜非接触側の面の少なくとも一部に直接的に又は間接的に設けられた細胞層と、を有する。
以下に本角膜治療用積層体について説明する。
本発明の、基材の角膜接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に細胞層が設けられた角膜治療用積層体は、角膜治療用積層体を角膜上に載置すると同時に細胞層を角膜上に載置することができ、また、細胞層と基材とが一体化されているので、従来のようにシート状の細胞片を角膜上に載置した後に保護用の基材で改めて被覆する又は細胞片を基材に貼り付けるなどの手間を省いて、簡便に装着することができる。また、細胞層が角膜接触側の面に配置されているので、これらの細胞から細胞性因子として生理活性物質が接触している角膜に直接放出され、この生理活性物質によって、角膜の上皮化が促進され、角膜障害や角膜疾患を効率的に治療することができる。
本発明の角膜治療用積層体の細胞層を構成する細胞には、角膜治療に有効な細胞であればよく、特に角膜上皮細胞の再生促進作用のある上皮細胞が好ましい。このような上皮細胞には、角膜上皮細胞、皮膚上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、羊膜上皮細胞、他の消化管上皮細胞等、全ての上皮細胞が挙げられる。中でも、角膜上皮細胞は、角膜組織に対する親和性が高いため、また口腔粘膜上皮細胞は、容易に採取可能であることに加えて、例えば表皮細胞（皮膚上皮細胞）と比較して細胞の増殖速度が速く免疫原性も低いという特性も備えているため、それぞれ特に好ましい。殊に、口腔粘膜上皮細胞の１種で、歯肉溝の一部を形成する口腔内縁粘膜上皮細胞は、通常の口腔粘膜上皮細胞と比べても分裂能が高い上に、拒絶反応が起こり難いので、更に好ましい。
また上皮細胞と同様に内皮細胞も好ましく使用される。このような内皮細胞としては、角膜内皮細胞等を挙げることができ、このうち角膜内皮細胞が、角膜を本来的に構成する細胞のひとつであるので角膜組織に対する親和性が高く、本発明において特に好ましく使用できる。このように、基材の角膜接触側に内皮細胞の細胞層を設けた場合には、基材の内皮細胞層が患者の内皮細胞が位置する場所に配置されるように角膜欠損部に埋植して使用することが好ましい。これにより、基材の内皮細胞層から産生される生理活性物質により、患者の内皮細胞が活性化され、効率的に治療が促進される。
更に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）も同様に使用することができる。この場合、幹細胞をそのまま基材に播種して幹細胞層として使用してもよいが、上皮又は内皮細胞に分化させてから基材上に播種してもよく、基材に播種した後に培養して上皮又は内皮細胞に分化させてもよい。
これらの細胞は、いずれも適当な生体から採取することができる。
例えば、口腔粘膜細胞は、粘膜下組織ごと健常者の口腔内から採取することができる。採取された粘膜組織には粘膜細胞以外に結合組織などが含まれているため、粘膜細胞を分離する必要がある。粘膜細胞の分離では、採取された粘膜組織から結合組織や真皮を除去するために、適当な酵素、例えばディスパーゼ、トリプシンなどが用いられる。また、ナイロンメッシュなどを用いてデブリスなどを除去する。
皮膚上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、内皮細胞、間葉系幹細胞などは、角膜治療を行う患者自身から直接採取することが可能である。このような患者自身から直接採取された場合（自家）には、免疫拒絶反応を回避することができ、より長期間にわたり角膜上皮細胞と一体化できる。このため、同部位における治癒促進作用が期待でき、また移植用途の観点からも、特に好ましい。
本発明の角膜治療用積層体は、上記のような細胞の層を少なくとも一層有している。この細胞層は、少なくとも一層あればよいが、二層以上に重層化させた多層構成となっていることが、生理活性物質の産生量の観点から好ましい。
またこの細胞層は、基材の角膜接触側の面の少なくとも一部に設けられている。このため、角膜接触側に細胞層を有する本発明の角膜治療用積層体を角膜上に載置すれば、細胞層が角膜と直に接触する。ここで細胞層は、基材の角膜接触側の面の少なくとも一部に形成されていればよいが、角膜接触側の面全体の１０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％で配置されていることが、生理活性物質の産生量や治療効率の観点から好ましい。
なお、細胞層は、上記の通り基材の角膜接触側の面の少なくとも一部に設けられていればよく、基材上に直接的に設けられていても、基材と細胞層との間に他の層、例えば後述する表面加工処理により形成された層を介して間接的に設けられていてもよい。
本発明の角膜治療用積層体における基材は、角膜に載置可能な曲面を有するものである。ここで基材は、角膜に載置可能であれば、如何なる硬さのものであってもよく、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）のような硬質のものであっても、ＰＭＭＡとＨＥＭＡ（ヒドロキシエチルメタクリレート）の重合体のような軟質のものであってもよい。このような基材としては、市販のハード／ソフトコンタクトレンズを使用することができる。
本発明における基材は、治療のために角膜に載置後、除去するという手間を考慮すると生体吸収材料で構成されたものであることが好ましい。また、本角膜治療用積層体を埋植して使用するような場合においても、基材が生体吸収性材料で構成されていることが好ましい。ここで使用可能な生体吸収材料としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギン酸等を挙げることができる。殊に分解生成物が炎症反応を起こさないような、生体親和性の高いものが好ましい。このような基材としては、角膜用包帯として利用されている市販のコラーゲンシールドを使用することができる。
また本発明における基材は、角膜に載置可能な曲面を有するものである。ここで角膜に載置可能な曲面とは、ベースカーブが６〜１０ｍｍ程度のものをいい、適用する角膜表面の形状や埋植時の移植床の形状に応じて種々の値のものを使用することができる。殊に柔軟性を有するソフトコンタクトレンズやコラーゲンシールドでは、載置時に角膜に密着するため、より好ましい。
さらにまた、本発明における基材は、生物由来の角膜実質組織であってもよい。この場合、凍結工程によって抗原性を低下させた後に利用することが好ましく、角膜実質組織は同種であっても、異種であってもよい。本発明に適用する場合には、角膜実質組織は、ケラトームなどを使用して適切な形状に調整する方法や、曲面を有する培養容器上で培養する方法などにより、所定の曲面を保持させてから使用することが好ましい。
本発明の角膜治療用積層体における基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面には、細胞と基材との接着性を高めるために表面加工処理が施されていることが好ましい。このような表面加工処理を施すことによって、基材が曲面を有していても細胞層をこの曲面上で容易に形成することができる。また細胞層と基材との一体性を高めることができるので、細胞層と基材とを容易に一体化することができ、また継続して使用しているときの基材と細胞層との一体化を確実にすることができる。これにより角膜載置時に細胞層がずれたりすることを防ぐことができる。このような表面加工処理の実施は、基材の種類に応じて選択される。
基材に対して施される表面加工処理には、当業界で既知の化学的、物理的、生物学的に接着効率を高めることができる如何なる処理も挙げることができ、例えば接着性コーティング処理、粗面加工処理、細胞接着性因子の配置処理が挙げられる。接着性コーティングとしては、ポリスチレン、ＰＶ  Ｓｕｇｅｒ等の接着性の高い材質のものをコーティングすることが挙げられる。粗面加工処理には、プラズマ処理、電子線処理、レーザ処理等を挙げることができる。また細胞接着性因子の配置処理に用いられる細胞接着性因子としては、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン等を挙げることができ、これらの細胞接着因子は、塗布、付着など通常用いる方法で基材上に配置される。これらの処理は、単独で又は組み合わせて用いることができ、これらの処理を組み合わせることによって接着性をより一層向上させることも可能である。
本発明の角膜治療用積層体は、角膜治療に際して必要な大きさであればよく、基材の角膜接触側に細胞層を設けた角膜治療用積層体を、角膜表面に載置して使用する際には、治療対象となる角膜の領域の一部又は全体を被覆できると共に、角膜上に載置されたときに患者に対して過剰な負担とならない大きさであればよい。例えば、治療部位の大きさに合わせて適宜大きさを変更して適用することもできる。
また、この場合の本角膜治療用積層体は、治療対象となる角膜の少なくとも一部を被覆できればよいが、幹細胞が存在する角膜輪部を被覆できることが、治療効率及び安定性の観点から好ましい。最も好ましくは、角膜全体を被覆できるように基材の角膜接触側の面全体に細胞層が形成されていることである。
本角膜治療用積層体では、装着感や患者に対する抵抗性の観点から全体の厚みを適宜決定すればよい。この場合、細胞層は、単層であってもよいが、生理活性物質の産生量の観点から重層化させることが好ましく、上述したように装着感等も鑑みて細胞層の厚みを決定するとよい。
また、本発明の角膜治療用積層体は、細胞層を該基材の角膜非接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けたものであることができる。この角膜治療用積層体は、細胞層を外部へ向け、基材を角膜側へ向けた状態で、角膜欠損部に埋植して使用することが好ましい。このような角膜治療用積層体では、細胞層が基材の凸面（角膜非接触面）に形成されているので、欠損した角膜表面を角膜治療用積層体の細胞層が補って角膜表面を形成すると共に、欠損部周囲の角膜上皮細胞の遊走を促進させることにより、早期に治療ができ、重度の疾患にも対応することができる。
この場合、細胞層としては上皮細胞が好適に使用され、基材としては、高い生体吸収性及び／又は生体親和性を有し、周囲からの角膜実質を構成する細胞侵入を容易にするものが好ましい。また、基材が直接角膜欠損部に接触することから、フィブロネクチンなどの細胞接着因子を用いて基材の角膜接触側（細胞層とは反対側）の接着性を向上させてもよい。
さらに、本発明の角膜治療用積層体は、前記基材の角膜接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた第１細胞層と、角膜非接触側の面の少なくとも一部に直接的又は間接的に設けられた第２細胞層とを有するものであることができる。この場合、角膜欠損部に対して埋植して使用することが好ましい。このような構成とすることによって、基材の両面にそれぞれ細胞層が配置される。このため、角膜接触面側の第１細胞層からの生理活性物質の放出などによって角膜内皮細胞の遊走を促進することができると共に、角膜非接触側の第２細胞層による角膜の上皮化を促進することができる。この結果、より一層効果的に角膜治療を行うことができると共に早期に生着可能な移植片を提供することができる。
角膜接触側の第１細胞層を構成する細胞としては、内皮細胞、特に角膜内皮細胞等であることが好ましく、角膜非接触側の第２細胞層を構成する細胞としては、角膜上皮細胞、皮膚上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞又は羊膜上皮細胞であることが好ましい。特に、第１細胞層を角膜内皮細胞とし、第２細胞層を、角膜上皮細胞又は口腔粘膜上皮細胞とすることが好ましい。角膜内皮細胞及び口腔粘膜上皮細胞の組合せにすることによって、適用部位である角膜に対して親和性を高くすることができ、角膜内皮細胞及び角膜上皮細胞の組合せにすることによって、角膜に対する親和性を一層高いものにすることができる。
本発明の角膜治療用積層体は、角膜治療用積層体の基材に生体吸収性材料や角膜実質組織を使用した場合には、疾病や事故などにより欠失した角膜上皮組織に対する移植片として上述のような埋植などによって使用することができる。この場合には、簡単な操作で細胞層を角膜に移植することができ、重度の疾患、特に、角膜深部に及ぶ傷害、すなわち上皮のみの欠損でなく角膜実質の欠損を来した症例に用いることが好ましい。また、細胞層から産生される細胞性因子、例えばＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）などが安定して供給され、角膜上皮細胞の再生を促進させ、治癒能力を向上させる。さらに、角膜欠損部を補うと共に細胞の遊走を促進させるので、移植片として有効である。
さらにまた、基材に抗菌剤や抗炎症剤等の抗生物質を保持させることで、これらの薬理効果を得ることができる。このため、このような角膜治療用積層体では、移植片と、生理活性物質や抗生物質等のデリバリーシステムとしての双方の役割を果たすことができる。移植用途に用いる場合には、本発明の角膜治療用積層体における細胞層を構成する細胞として、自己の角膜上皮細胞を選択することが特に好ましい。
また本発明の角膜治療用積層体は、単に、角膜疾患に有効な生理活性物質のデリバリーシステムとしても使用することができる。この場合、角膜治療用積層体を装着するだけで角膜疾患に対して有用な生理活性物質を、細胞層から継続的に且つ安定して供給する。このような用途に用いる場合には、細胞層を構成する細胞として、例えば角膜上皮細胞や口腔粘膜上皮細胞、羊膜上皮細胞、内皮細胞等を選択することができる。また基材には、必要な期間にわたって生理活性物質を供給するために、分解期間の異なる生体吸収性材料を目的に応じて適宜選択することもできる。この場合においても、移植片としての利用と同様に、基材に抗菌剤や抗炎症剤等の抗生物質を保持させることで、これらの薬理効果を得ることができる。
次に本発明の角膜治療用積層体の製造方法について説明する。
本発明の角膜治療用積層体は、基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に細胞を播種する播種工程と、細胞を基材上で培養して、基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に、少なくとも一層の細胞層を設ける細胞層形成工程と、を含む製造方法により製造される。
この方法によれば、細胞を基材上で培養するだけで、角膜治療用積層体を製造することができ、従来のように基材上に細胞シートを貼り付けたりするなどの他の工程を設ける必要がない。これにより、曲面を有する基材と細胞層とが一体化した角膜治療用積層体を簡単に製造することができる。
播種工程では、基材上に細胞を播種する。細胞の播種密度は、細胞の種類及び増殖速度によって異なるが、支持細胞を使用する場合には、１×１０３〜１×１０５個／ｃｍ２が好ましく、５×１０３〜１×１０４個／ｃｍ２がより好ましい。この場合、培養細胞と支持細胞の比率は１：１程度が好ましい。支持細胞を使用しなかったり、無血清培地を利用したりする場合には、５×１０４〜１×１０５個／ｃｍ２以上となるように、支持細胞を使用する際に比して、高密度で播種することが好ましい。支持細胞としては、増殖能が抑制されたマウス線維芽細胞、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、３Ｔ３Ｊ２、スイス３Ｔ３等が好適に利用される。
播種工程で播種するための細胞数が十分でない場合には、播種工程に先立って、細胞数を確保するための予備培養工程を設けることができる。これにより、少量しか採取できない細胞であっても、目的とする角膜治療用積層体を充分に作製することができる。この予備培養工程では、採取された細胞を所定の成育培地を用いて増殖させる。ここで用いられる成育培地には、各種の細胞に対して使用することが既知の如何なる成育培地であってもよい。
また、予備培養においては、細胞を高効率で成育させるために、支持細胞を用いてもよい。支持細胞には、前記同様に線維芽細胞、例えばマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、３Ｔ３Ｊ２、スイス３Ｔ３等が含まれ、得られる導入細胞の層の厚みや、播種対象となる細胞の支持細胞上での増殖速度の観点から、３Ｔ３Ｊ２細胞が好ましい。支持細胞は、播種対象細胞の成育を干渉しないように増殖能が抑制される。増殖能の抑制は、当技術分野において周知の方法、例えば、マイトマイシンＣによる処理や放射線照射によって行うことができる。また、培養は、通常のプラスチックディッシュや培養フラスコのような培養容器を用いて行う。
細胞層形成工程では、細胞を基材上で培養して角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に、少なくとも一層の細胞層を設ける。
細胞を基材上で層状に成育させるためには、細胞を層状に成育可能であることが知られている成育培地のいずれをも選択できる。成育培地中での培養によって、細胞は容易に層を形成する。なお、基材自体が細胞の増殖の足場となるため、特別な支持細胞を必要とせずに細胞層を基材上に形成させることもできる。特に、基材上に細胞との接着性を高める表面加工処理が施されている場合には、細胞層の形成を効率よく行うことができる。
また、生理活性物質の産生量を考慮すると細胞数が多い方が好ましいので、細胞層は重層化させた方がよい。この場合、支持細胞の存在下で細胞を培養することによって、容易に細胞を重層化させることができる。また、層の数の調整は、培養期間を調整することにより容易に行うことができる。
細胞層形成工程での培養で使用される成育培地には、シート形成能がある上皮シート形成培地（ＥＦＭ）を用いることが好ましい。ＥＦＭは、通常、表皮細胞を層状に成育させるために用いられている培地であり、ＤＭＥＭとハムＦ−１２培地の３：１混合液で構成され、５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌのインシュリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、２×１０−９Ｍのトリヨードサイロニン、１×１０−９Ｍのコレラ毒素、０．４μｇ／ｍｌのハイドロコルチゾン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのカナマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリチンＢ及び１０ｎｇ／ｍｌのヒト  リコンビナント上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）等を補充することができる。また表皮細胞選択培地（ＫＧＭ）も細胞層形成工程での培養に使用することができる。このＫＧＭは、クラボウから市販の正常ヒト表皮角化細胞増殖用無血清液体培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２）として市販されている。
細胞の播種工程の前に、基材の角膜接触側の面及び／又は角膜非接触側の面に対して、細胞接着性を高める表面加工処理を施す加工工程を設けることが、曲面上での層形成を容易にし、基材と細胞層との一体化を確実にする観点から好ましい。加工工程は、適用する表面加工処理に応じた既知の処理方法に従う。
なお、角膜接触側と非接触側の両方に細胞層を有する角膜治療用積層体の製造方法としては、上述したように培養を行って片方に細胞層を設けた後、他方に細胞を播種して培養すること又は細胞シートを貼り付けることによって容易に作製することができる。或いは、係合可能な２つの基材の係合面とは異なる面にそれぞれ細胞層を設けた後、係合面をフィブリン等の生体接着性材料によって接着することで作製することも可能である。
実施例
実施例１：口腔粘膜上皮細胞
以下、本発明について細胞層を構成する細胞として口腔粘膜上皮細胞を利用したものを一実施例として挙げ、図面に基づいて説明する。ここで用いられる基材には、生体吸収特性を有するコラーゲンにより構成されたコラーゲンシールド（Ｖｅｔ  Ｓｈｉｅｌｄ（商品名：ＯＡＳＩＳ社製））を使用し、その大きさは、ベースカーブが９ｍｍ、厚みが０．１５〜０．２０ｍｍ、直径が１４．５ｍｍであった。このコラーゲンシールドは生体適用後、７２時間で生体に吸収され始め、最終的には完全に吸収される特性を有しており、水和によって透明性かつ柔軟性を有する。
このコラーゲンシールドの内面（角膜接触側）には、接着細胞因子を塗布することで接着性を向上させた。具体的には、１ｍｇのフィブロネクチンを２０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝液）に溶かして接着細胞因子溶液を調製した後、これをコラーゲンシールド内面に３００μｌ滴下し、１時間静置した後、ピペットにて接着細胞因子溶液を吸引除去することで、コラーゲンシールド内面に細胞接着因子を塗布した。
播種細胞となる口腔粘膜上皮細胞は、患者の口腔内から容易に採取することができる。例えば、口腔内を引掻くことにより採取したり、抜歯手術後の歯に付着した細胞から採取したりすることができる。採取した組織を酵素処理し、口腔粘膜上皮細胞を分離する。分離した口腔粘膜上皮細胞をＥＦＭに混合し、２×１０６個／ｍｌとなるように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液には支持細胞となる３Ｔ３細胞を、口腔粘膜上皮細胞と同等な割合となるように混合した。
次いで、細胞懸濁液３００μｌを基材の内面に播種し、２日間静置することで細胞を基材に接着させた。この後、コラーゲンシールドの内面に満たされている細胞懸濁液をピペットで除去し、口腔粘膜上皮細胞と３Ｔ３細胞が接着しているコラーゲンシールドを１２穴プレートに移した。１２穴プレートでは、３日に１回の割合で培地を交換し、支持細胞の存在下においてコラーゲンシールド内面上で口腔粘膜上皮細胞の培養を１４日間行った。培地にはＥＦＭを使用した。
図１は１４日間の培養後に、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色処理による角膜治療用積層体の染色断面像、図２は、図１の拡大図である。角膜治療用積層体の角膜接触側となる面に、播種した口腔粘膜上皮細胞による細胞層が形成されていることが解る。この積層体は、細胞層が厚く形成されているため、細胞層の重さによりコラーゲンシールドがその形状を維持できず、細胞層が基材の凸面に形成されたように見えるが、角膜治療用積層体を眼に装着すれば、眼の曲面に沿って細胞層が眼角膜と接触する。
以上のような工程により作製した角膜治療用積層体は、患者眼角膜との接触面に細胞層が形成されており、治療適用時には細胞層からＥＧＦのような種々のサイトカイン（生理活性物質）が放出されるので、患者眼角膜の上皮化が促進され、治癒能力が向上する。
また細胞層の厚みは培養期間を変更することによって容易に調整することができる。図３は、図１の上記角膜治療用積層体の場合よりも短い培養期間で培養した場合の角膜治療用積層体である。図３では、基材として使用したコラーゲンシールドが形状（凹面）を維持しているのが確認できる。
実施例２：角膜上皮細胞
以下、本発明について培養細胞として角膜上皮細胞を利用したものを一実施例として挙げ、図面に基づいて説明する。基材には、実施例１と同様にコラーゲンシールド（Ｖｅｔ  Ｓｈｉｅｌｄ（商品名：ＯＡＳＩＳ社製））を使用し、細胞接着因子を塗布した。
播種細胞となる角膜上皮細胞は、患者やドナーの角膜から採取することができる。例えば、角膜輪部から約１ｍｍ２程度を採取する。採取した組織を酵素処理し、角膜上皮細胞を分離する。
最初、分離した角膜上皮細胞を十分な量まで培養増殖させる（予備培養）。この工程では、φ３５ｍｍのシャーレにマイトマイシン処理により不活性化させたマウスの３Ｔ３細胞と、角膜上皮細胞を播種した後、液体培地を加えて、略コンフルエントな状態になるまで培養する。このときの液体培地には、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル最小必須培地）を使用した。
予備培養により十分な量まで細胞を増殖させた後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液による酵素処理により角膜上皮細胞を分散させ、ＥＦＭと混合させて細胞懸濁液を、２×１０６個／ｍｌとなるように調製した。この細胞懸濁液には支持細胞として、３Ｔ３細胞も角膜上皮細胞と同程度の密度になるように混合した。次いで、細胞懸濁液３００μｌをコラーゲンシールド内面に滴下し、２日間静置した。静置後、コラーゲンシールド内の細胞懸濁液を除去し、コラーゲンシールドを１２穴プレートに移した。１２穴プレートでは３日毎に培地を交換し、１４日間培養した。培地にはＥＦＭを使用した。
このように、採取できる組織が少量の場合であっても、予備培養として通常の培養容器で細胞数を増加させることによって、基材に高密度で細胞を播種することができ、基材内面に容易に細胞層を形成させることができる。
実施例３
図４は、角膜接触側に内皮細胞層を、角膜非接触側に上皮細胞層を、それぞれに有する角膜治療用積層体が示されている。この角膜治療用積層体は、角膜接触側及び角膜非接触側の両面に細胞層を有しているので、角膜欠損部へ埋植した場合には、細胞からの細胞因子が角膜へ直接放出されると共に、欠損部周囲の細胞の遊走を促進する。
本角膜治療用積層体は、角膜接触側に内皮細胞層を培養によって設けた後、角膜非接触側で上皮細胞を培養することで作製したが、細胞シート層を貼り付けて形成させてもよい。
また、図５に示されるように、片側のみ細胞層を有する２つの基材を、細胞接着因子などを使用して貼り合わせてもよい。この場合、基材間の結合のために、他の接着剤などを含む第３層を設けてもよい。基材間の結合は、細胞接着因子及び接着剤等に限らず、物理的な結合であってもよい。また、基材間の結合は、結合面全体で結合するものであることが好ましいが、使用感に影響がなく、基材が装着時に分離しないものであれば、面の一部で結合するものであってもよい。このような物理的な結合としては、凹部又は貫通孔と凸部とをそれぞれ面全体又は端部に設けて嵌合させるものや、一方の基材の表面又は端部に係合部を設けて他方の基材の表面又は端部を係合させるものなどを挙げることができる。なお、このような結合の態様によっては、基材のサイズを異なるものとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実施例に係る角膜治療用積層体の培養開始後１４日目の染色断面像である。
図２は、本発明の実施例に係る角膜治療用積層体の培養開始後１４日目の拡大染色断面像である。
図３は、本発明の実施例に係る他の角膜治療用積層体の拡大染色断面像である。
図４は、本発明の実施例に係る角膜接触側及び角膜非接触側の両側に細胞層を有する他の角膜治療用積層体の拡大染色断面像である。
図５は、本発明の実施例に係る両側に細胞層を有する角膜治療用積層体の他の作製方法の概念図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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