(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−リベチン含有溶液に１．５〜２．０Ｍの濃度になるように塩を添加した後、液性をｐＨ  ５．０〜１１．０として、γ−リベチンを２量体として、分画分子量９０〜５００ｋＤａの膜を用いて精製することを特徴とするγ−リベチンの分離精製法。
【請求項２】
膜が限外濾過膜である請求項１記載のγ−リベチンの分離精製法。
【請求項３】
塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４より選ばれる１種又は２種以上である請求項１記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は既存の分離膜を用い抗体活性を損なうことなく、卵黄水溶性蛋白質溶液中のγ−リベチンを高純度でしかも効率良く分離精製する方法を提供することを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
鶏卵卵黄中には蛋白質が約20％含まれており、卵黄脂質と結合したリポ蛋白質の状態や脂質と結合していない水溶性蛋白質の状態で存在している。この水溶性蛋白質の中には、リベチン、ホスビチン及びリボフラビン結合性蛋白質が含まれている。また、リベチンはα−リベチン、β−リベチン及びγ−リベチンに分類され、このγ−リベチンと血清中のγ−グロブリンＧは免疫学的に同等であることが証明されている。しかし、γ−リベチンは、兎等の哺乳類血清γ−グロブリンＧと比較して、分子量(E.Orlans, Immunology,14, 61-67(1968))や等電点(A.Polson et al., Immunol. Commun., 9, 495-514(1980)）等の蛋白化学的性質が異なるため、比較免疫学の分野では別異のものとして扱われている。
従来、鶏卵中のγ−リベチンを分離精製する方法として次のような方法が開示されている。卵黄中のリポ蛋白質をカラギーナン、寒天、ファーセレラン、ペクチン及びキサンタンガムの内より選ばれた一種以上を加えて凝集させ、その上清より水溶性蛋白質を得る方法（特開昭64-38098号）、同様にデキストラン硫酸とカルシウムイオンを加える方法（J.C.Jensenius, J. Immunol. Methods, 46,63-68(1981)）、同様にポリエチレングリコールを加える方法（A.Polson et  al., Immunological Communications, 9(5), 495-514 (1980)）、同様にアルギン酸、アルギン酸塩あるいはアルギン酸誘導体を加える方法（特開昭63-215699 号）、同様にカゼインナトリウム水溶液を加える方法（特開平6-116297）などがある。
【０００３】
更に溶剤を使用する方法として、卵黄液を遠心分離して得られた上清画分に、炭素数１〜４の第一級アルコールから選ばれた少なくとも一種を加えることによって生じた沈殿から、塩水溶液または緩衝液から選ばれた一種を用い水溶性画分を得る方法（特開平3ー145500）、第二級アルコールを加え、生じた沈殿を緩衝液又は塩水溶液に懸濁し不溶物を取り除くことで水溶性画分を得る方法（特開平6ー329700）等があげられる。
上記方法で卵黄中の水溶性蛋白質溶液を得た後、水溶性蛋白質溶液中のγ−リベチンは、血清蛋白質分画法と同様に塩析法、アルコール沈澱法、ポリエチレングリコール法、分別沈澱法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法を用いて精製されている。しかし、塩析法、アルコール沈澱法、ポリエチレングリコール法、分別沈澱法は蛋白質の変性による抗体の失活の恐れがあり、さらに、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法等のカラムによる分離は設備面、コスト面等を考慮すると大量スケールでの生産は困難である。
【０００４】
また、蛋白質の分離方法として膜濾過の方法も知られている。膜濾過による分離方法は操作が簡単であるため大量スケールに適しており、更に物性の変化を伴わないため非常に有効な手段であることが考えられる。
通常、濾過膜の分離性能は、分画分子量によって表される。しかし、実際夾雑蛋白質から目的の蛋白質を分離する場合、その分離能は厳密なものではなく、蛋白質分子の形やその他の性質により分離結果が異なると言われている("蛋白質I"、日本生化学会編、第10章、東京化学同人(1990)）。そのため、特に極めて分子量が近似する血漿蛋白質の分離などは非常に分離が難しく(S.Saksena and A.L.Zydney, Biotech. and Bioengineer., 46, 960-968(1994))、溶液のpHの調整を行ったり、特殊な膜を使用することが必要となる。
濾過膜を使用したグロブリンの分離精製技術として、特開昭56-81521号の既存の高分子分離膜を用い、血清蛋白混合物溶液の全蛋白質濃度及び塩濃度をそれぞれ４g/dl以下及び0.6 モル以下、液性をpH3.8 ないし4.7 とし血清中のアルブミンとグロブリンの分離をした報告や、特開平5-222091号の珪酸系の特殊な多孔質ガラス膜を用いて血清中のアルブミンとグロブリンを分離した報告がある。
【０００５】
しかし、特開昭56-81521号ではアルブミンとγ−グロブリンを既存の膜で分離するために溶液をpH3.8 ないし4.7 の酸性領域に制御しないと効率の良い分離が行えず、酸性側で不安定な(M.Shimizu et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56(2),270-274(1992))γ−リベチンはこの方法は活性を損なうため再現できない。更に、この方法における溶液の塩濃度は0.6 Ｍ以下に調整すると記されており、これを越える濃度ではアルブミンとγ−グロブリンの分離は期待できず、又、塩濃度は蛋白質が溶解している限り低ければ低いほど良いと記載されている。本発明は塩を添加することによりγ−リベチンが凝集することを利用して膜分離を行っており、従来法における塩濃度の範囲では、凝集が起こらないため分離が行えない。
また、特許（特開平5-222091号）に開示された方法では血漿中のアルブミンと二量体以上のγ−グロブリンの分離は可能であるが、アルブミンと単量体のγ−グロブリンの分離に関しては満足な結果が得られていないという問題がある。
更に、本発明はγ−リベチンの分離方法であり、上記γ−グロブリンはγ−リベチンと蛋白化学的性質が異なるため、従来の方法では同じように分離することができない。
【０００６】
【発明が解決しようとしている課題】
抗体を用いる場合、高度に精製された抗体が必要とされる。しかし、市販されている割卵機によって割卵された卵黄には卵白の混入を避けることは難しく、この中に含まれるオボアルブミンはアレルゲン性の高い蛋白質である。
このようなオボアルブミン等の夾雑蛋白質を除去し、γ−リベチンの精度を高める方法として超遠心法、カラムによる分離法等が知られているが、いずれも大量スケールでの製造には適さない。また、分子量によって分離できる濾過膜を用い特定の蛋白質を分離する技術もあるが、分子量が近い蛋白質同士は会合等の影響があるため一般的に分離は困難である(S.Saksena and A.L.Zydney, Biotech. and Bioengineer., 46, 960-968(1994))。しかし、膜による分離法は、他の分離法と比べて省エネルギー、低コスト、操作や操作性の簡便性が認められ、逆浸透法や限外濾過法など液系の膜分離技術はすでに幅広い分野で実用化されている。それ故、膜による分離精製法は安価でかつ大量に処理するのに適しておりγ−リベチンを精製する方法としての利用が期待される。
本発明は、前記卵黄水溶性蛋白質溶液に塩を添加することで、膜によってγ−リベチンを効率良く分離することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決しようとする手段】
本発明は、卵黄水溶性蛋白質溶液中のγ−リベチンを膜によって簡便に分離精製する技術である。前記のように膜による蛋白質の分離は、一般的に特殊な分離膜を用いたり、液性も特定の条件下で行わないと効率の良い分離が行えないことが知られている。しかし、本発明は、従来中性付近では分離することが不可能であった既存の膜を使用して、γ−リベチンを分離する方法である。
前記のように、溶液または血清中に複数の蛋白質が含まれている場合、蛋白質同士が複雑に会合しあい、巨大分子を作っていることが考えられる。それ故、限外濾過膜ではγ−リベチン（分子量180kDa）と夾雑蛋白質（分子量90kDa より低分子量）の両者に分子量の差があっても分離できない。しかし、γ−リベチンは、1.5 ＭのNaCl存在下で二量体として存在する（A. Polson et al., Immunological Communications, 9(5), 495-514(1980））。
このことは、哺乳類抗体とは異なり鳥類抗体特有の性質である。
卵黄水溶性蛋白質溶液中に塩を添加することでγ−リベチンのみが二量体となり、水溶性蛋白質中に含まれるα−リベチン、β−リベチンなどの蛋白質と分子量に大きな差が生じる。本発明は、この分子量の差を利用して、γ−リベチンのみを膜により分離精製することを特徴とする精製法である。この精製方法によって、割卵時の混入が危惧される卵白由来のオボアルブミンのような蛋白質の除去も可能になる。
【０００８】
本発明におけるγ−リベチン含有溶液とは、従来技術であげた方法により得られた卵黄水溶性蛋白質溶液、もしくは鶏卵又は卵黄の粉末を溶かした水溶液のことをいう。
本発明に用いられる塩の種類は特に限定されないが、例えば、NaCl、KCl 、CaCl2 、MgCl2 、NaH2PO4 、Na2HPO4 、Na2SO4、KH2PO4、K2HPO4、K2SO4 、(NH4)2SO4 、及びMgSO4 より選ばれる群よりなる１種以上のものが挙げられる。
本発明における膜は、分画分子量90〜500KDaの、好ましくは100 〜300KDaの膜である。ここで、γ−リベチンと夾雑蛋白質との分離を効果的に行う観点から、分画分子量は 90KDa以上500KDa以下が好ましい。膜の種類は、分画分子量が上記の範囲のものであれば特に限定されるものではない。具体的には、例えば限外濾過膜、透析膜、逆浸透膜等が挙げられる。
以上、具体的な操作について説明する。
膜を用いての精製の際の塩濃度は0.7 〜3.0 Ｍであるが、より好ましくは1.5 〜2.0 Ｍである。γ−リベチンが２量体になる観点から、塩濃度は0.7 Ｍ以上が好ましい。これは、γ−リベチンが２量体となると、他の蛋白質との分子量の差が大きくなり、分離が可能となるからである。また、塩の添加量に対する分離効率の観点から、3.0 Ｍ以下が好ましい。
【０００９】
また、塩の添加の態様としては、塩そのものを添加してもよく、塩の水溶液を添加してもよい。
膜を用いて精製する際の塩添加溶液のpHは、5.0 〜11.0であるが、pH5.5 〜11.0が好ましく、pH7.5 〜9.0 がより好ましく、pH8.0 〜9.0 が特に好ましい。蛋白質の変性又は失活を抑える観点から、pH5.0 よりアルカリ性側が好ましく、pH11.0より酸性側が好ましい。
精製時の塩添加溶液の水温は特に限定されないが、0 〜70℃が好ましく、0 〜20℃がより好ましく、0 〜10℃が特に好ましく、３〜６℃が最も好ましい。当該溶液が凍結するおそれがあり、そのため分離操作ができなくなるのを防ぐ観点から水温は０℃以上が好ましく、γ−リベチンの活性の失活を抑える観点から70℃以下が好ましい。
【００１０】
また、より高純度のγ−リベチンを得るために、透析液を連続的に加えて試料の液量を一定に保ちながら濾過を行うダイアフィルターレーション法を用いて精製を行ってもよい。また、その場合の透析液は、上記精製の際の塩濃度及びpH、温度のものが使用される。例えば、10ｍＭリン酸綬衝液（１.5ＭのNaCl含有）pH8.0 等が挙げられる。透析液の量は、卵黄水溶性蛋白質液１重量部に対して透析液１重量部以上が好ましい。ただし、コスト等の問題により上記蛋白質液１重量部に対して５重量部以下が好ましい。
かかるγ−リベチンは、特に限定されることなく幅広い用途に用いられる。例えば、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、飼料、その他抗体の通常用途に用いられることができるが、風味の点で優れていることより食品に好適に用いることができる。
本溶液の水温は０〜70℃が好ましく、更に好ましくは０〜20℃、特に好ましくは０〜10℃、最も好ましくは３〜６℃である。この範囲より低くなると本溶液が凍結するため膜分離操作が出来なくなり、一方高くなるとγ−リベチンの抗体活性が失活する。
【００１１】
本発明は0.7 〜3.0 Ｍの塩を添加したことで、公知技術では不可能であった既存の膜を使用して、さらに液性も中性付近においてγ−リベチンの分離を可能にした。卵黄水溶性蛋白質溶液中には、γ−リベチン、α−リベチン、β−リベチン、ホスビチン及びリボフラビン結合性蛋白質、更に卵白由来のオボアルブミンなどの蛋白質が含まれている。γ−リベチンの分子量は約180kDa、α−リベチンの分子量は約90kDa 、β−リベチンの分子量は約42kDa 、オボアルブミンの分子量は約46kDa 、ホスビチンの分子量は約36kDa 、リボフラビン結合性蛋白質の分子量は約36kDa であるが、これらを含有する卵黄水溶性蛋白質溶液は、分画分子量100kDaの限外濾過膜を使用してもγ−リベチンと他の夾雑蛋白を分離することが出来ない。これは、卵黄水溶性蛋白質中の蛋白質同士が複雑に会合し合っているため、分子ふるいを原理とする限外濾過膜では分離できない。しかし、本発明法は、0.7 〜3.0 Ｍの塩を添加することで100kDaの膜でも分離が可能となった。これは、単にγ−リベチンが二量体となったことで他の蛋白質と分子量の差が大きくなったために分離がし易くなったということだけではなく、驚くべきことに塩を添加することによって夾雑蛋白質同士の会合が解離したことが考えられる。以下、本発明についてより詳細に説明する。ただし、これらによって発明を制限するものではない。
【００１２】
【実施例】
実施例１
特異抗体含有卵黄液の調製
特定抗原として、ストレプトコッカス・ミュータンス  MT8148（以下S.mutansと言う）菌体を用い、産卵鶏を免疫した。抗原の調製はS.mutansを砂糖を５％含むブレインハートインフュージョン培地で増殖させ、3000×ｇ、10分間の遠心分離操作で集菌後、菌体を生理食塩水で十分に洗浄し、その1ml 当り約108 個のS.mutansが含まれるよう調製した。
産卵鶏１羽に対しこの抗原１mlを一週間に一度、合計４回筋肉注射した。最終の筋肉注射により３ヶ月間にわたり、鶏卵を集め、その卵黄を分離した。卵黄はホモミキサーにより均質化し、この溶液を卵黄液とした。
得られた卵黄液１kgに対し１kgの水を加え均質化し、そこに0.15％のλ−カラギーナン水溶液を４kg加え撹拌後２時間静置した。静置後、濾過助剤を用いた吸引濾過を行い約５kgの濾液を分取した。この時の濾液のpHは6.5 であった。この濾液を卵黄水溶性蛋白質溶液とした。
【００１３】
実施例２
NaCl添加した時のγ−リベチン濃縮液の調製
実施例１の方法により得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルに、NaClを87.66g(1.5Ｍ) 添加して撹拌を行った後、比較例１と同様に分画分子量100kDa又は300kDaの限外濾過膜を使用して液量が200ml になるまで濃縮（５倍濃縮）し、試料を得た。
比較例１
γ−リベチン濃縮液の調製
実施例１の方法により得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルを、分画分子量100kDa又は300kDaの限外濾過膜（膜面積：3,500cm2、材質：ポリエーテルスルフォン、ミニセットシステム（富士フィルター工業））を使用して液量が200ml になるまで濃縮（５倍濃縮）し、試料を得た。
【００１４】
試験例１
γ−リベチンの濃縮効果の比較
比較例１及び実施例２で得られた各試料中のγ−リベチン量は、SRID（一元放射免疫拡散）法(G.Mancini et al., Immunochemistry, 2, 235(1965)）を用い、抗ニワトリIgＧウサギ血清（コスモバイオ）を４％加えた２％寒天プレート上にできる沈降輪の大きさを測定してγ−リベチン濃度を求め、その値に溶液の体積量を乗じて求めた。更に、比較例１及び実施例１で得られた各試料中の蛋白質量は、Lowly 法(M.K.Markwell et al., Anal. Biochem., 87, 206(1978))を用いて濃度を求め、その値に溶液の体積量を乗じて求めた。このγ−リベチンと蛋白質量を用い、γ−リベチンの純度（％）は次式
0003761929.tif 000002
と定義した。
又、γ−リベチンの回収率を
0003761929.tif 000003
と定義した。
比較例１と実施例２で得られた各試料中のγ−リベチンの純度と回収率を求めた結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
表１より明らかなように、塩無添加の場合、分画分子量100kDaの膜では、γ−リベチンの回収率は良かったが純度は濃縮の前後でほとんど変わらず、濃縮出来ないことが示唆された。また、分画分子量300kDaの膜を使用したときは、回収率も純度も低い値であり、このことから夾雑蛋白質と一緒にγ−リベチンも膜を通り抜けてしまい濃縮できないことが示唆された。しかしNaCl添加の場合は分画分子量100kDa,300kDa のどちらの膜を使用しても、γ−リベチンの回収率もよく更に濃縮後のγ−リベチンの純度も約40％を越えており、濃縮可能であることが示された。
実施例３
様々な膜を用いたγ−リベチン精製液の調製
更に純度の高いγ−リベチンを得るため、透析液を連続的に加えて試料の液量を一定に保ちながら濾過を行うダイアフィルトレーション法を用いた。ダイアフィルトレーション用の透析液には1.5 ＭのNaCl水溶液を用いた。実施例２と同様に卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルにNaClを87.66g(1.5Ｍ) 添加した後、分画分子量100kDaの限外濾過膜を用い、10リットル（卵黄水溶性蛋白質溶液に対して10倍量）の透析液によりダイアフィルトレーションを行い１リットルの試料を得た。又、膜の種類による精製効率を調べるため、上記同様の方法で分画分子量300kDaの限外濾過膜、透析膜、逆浸透膜、それぞれの膜を使用してダイアフィルトレーションを行い各１リットルの試料を得た。更に透析液量に対する純度を調べるため、各試料に加えた透析液量が１、２、５、８、10リットルの時の卵黄水溶性蛋白質溶液を採取し試料とした。
試験例２
膜の種類による精製効率の比較
実施例３で得られた試料を用い、試験例１に従ってγ−リベチンの純度を測定した。その結果を表２で示す。
【００１７】
【表２】
0003761929.tif 000005
【００１８】
表２より明らかなように、分画分子量100kDa及び300kDaの限外濾過膜どちらを使用しても、10リットル（卵黄水溶性蛋白質溶液に対して10倍量）の透析液を用いて精製を行えば、純度が約80％のγ−リベチン精製液が得られることが示された。更に透析膜や逆浸透膜による精製は、限外濾過膜と比較して精製効率は下回るが、1.5 Ｍの濃度になるようNaClを添加していれば可能であることが示された。
試験例３
特異抗体活性回収率の比較
実施例１により得られた卵黄水溶性蛋白質溶液と、実施例3により得られたγ−リベチン精製液のS.mutansに対する特異的抗体力価を、酵素免疫測定法（以下ELISA 法という）により測定し特異抗体活性回収率の比較を行った。各試料液を100 μl ／ウエルの割合で、抗原として用いたS.mutansを固相へコーティングしたELISA プレート(96 穴, ヌンク社製) へ添加し、25℃、２時間静置することにより、抗原と特異的抗体の反応を行った。各ウエルをPBS-Tween で充分洗浄した後、抗ニワトリIgG ウサギIgG −アルカリホスファターゼコンジュゲート（ザイメット社）のPBS-Tween 希釈液(2000 倍) を100 μl / ウエルの割合で添加した。25℃で１時間放置することにより、抗原と反応した特異的抗体と上記コンジュゲートの反応を行った。各ウエルをPBS-Tween で充分洗浄した後、0.1% P−フェニルジソジウムホスフェート溶液(0.1Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液pH9.6 に溶解）を基質として100 μl ／ウエルの割合で添加し、25℃、15分間酵素反応を行った。反応の停止は２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を50μl ／ウエル添加することにより行い、405nm における各ウエルの吸光度をプレートリーダーにより測定した。なお、対照としては試料の代わりにPBS-Tween を用いた。各試料につき、４ウエルを用いた。各試料の示す吸光度の平均値から対照の示す吸光度を引き、それぞれの試料重量を乗じた値（総吸光度）を各試料の総抗体活性とした。実施例１により得られた処理前の卵黄水溶性蛋白質溶液と実施例３により得られたγ−リベチン精製液は、ほぼ同じ抗体活性が得られた。それ故、本発明法による抗体活性の失活はないことが示された。
【００１９】
試験例４
各pHによる抗体活性の安定性と精製効率の比較
実施例１の方法で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルにHCl もしくはNaOHを数適添加して、pH3.0 、4.0 、4.5 、5.0 、5.5 、6.0 、6.5 、7.0 、7.5 、8.0 、8.5 、9.0 、10.0、11.0、12.0の各溶液を調整した。各溶液の特異抗体活性の安定性を試験例３の方法で測定し、液性を調整する前の抗体活性を100%として調整後の抗体活性を求めた。その結果を表３で示す。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
表３より明らかなように、液性がpH5からpH11の範囲内では特異抗体活性はほとんど失活しないが、この範囲外では失活することが確認された。
更に調整した各溶液を１リットル用いて、実施例２と同様にNaClを87.66g(1.5Ｍ) 添加し、分画分子量300kDaの限外濾過膜により各溶液の濃縮を行い200ml(５倍濃縮）の試料を得た。
得られた試料中のγ−リベチンの純度は試験例１の方法を用いて求めた。その結果を表３で示す。その結果、液性がpH5.5 からpH6.5 もしくはpH7.5 からpH9.0 の範囲の時、γ−リベチンの純度は中性付近の液性で分離するより上昇した。また、最も精製効率が良かったのは液性をpH８に調整したときであった。
試験例５
液性をpH８にした時の精製効率
実施例１で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルにNaClを87.66g(1.5Ｍ) 添加した後、３ＮNaOHを用い溶液がpH８になるように調整した。調整した溶液を用い、実施例２と同様に分画分子量300kDaと100kDaの限外濾過膜を使用しγ−リベチン分離精製を行った。精製時に用いる透析液には1.5 ＭのNaClを含んだpH８の20ｍＭリン酸緩衝液５リットルを用い、試料に加えた透析液量が１、２、５リットルの時の卵黄水溶性蛋白質溶液を採取し試料とした。得られた各試料を用い、試験例１に従ってγ−リベチンの純度を測定した。その結果を表４で示す。
【００２２】
【表４】
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【００２３】
pH無調整の時、γ−リベチンの純度を約80％にするためには透析液を10リットル必要としたが、表４より明らかなように液性をpH８に調整した時、同レベルの精製液は透析液を２リットル用いれば得られ、このことより濃縮効率が約５倍良くなったことが示された。又、pH８の条件で透析液を５リットル用いて精製を行うと、分画分子量300kDaと100kDaの限外濾過膜のどちらでも純度98％以上のγ−リベチンが得られることが示唆された。
更に、本方法でで得られたγ−リベチンの精製液をゲル濾過法（カラム：superdex200HR 10/30(Pharmacia)、移動相：50mMリン酸緩衝液(0.05 Ｍ Na2HPO4 , 1.5Ｍ NaCl ,pH8.0) ）により分析した結果、γ−リベチンは二量体として存在することが確認された。
又、このγ−リベチン精製液１リットルに水を約５リットル加え脱塩を行い、得られた水溶液を同様のゲル濾過法で分析した結果、γ−リベチンは単量体に戻ることが示唆された。
比較例２
従来法による精製γ−リベチンの調製
実施例１で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルに170g（17％W/V)の硫酸ナトリウムを添加して塩析物を20ｍＭのリン酸緩衝液pH8.0 に溶解し、DEAE-Sepharoseカラムによりγ−リベチンのみを吸着させた後、 200ｍＭのリン酸緩衝液をカラムに流しγ−リベチンを溶出して、精製γ−リベチン液とした。
【００２４】
試験例６
従来法との特異抗体活性の回収率比較
試験例５で得られた本発明によるγ−リベチン精製液と比較例２で得られた精製γ−リベチン液を試験例3に従い総特異抗体活性を測定し、精製前の卵黄水溶性蛋白質溶液の総特異抗体活性を100%として特異抗体活性の回収率を算出した。その結果、比較例２による精製γ−リベチン液には特異抗体活性の回収率が83％であったが、試験例５で得られた本発明によるγ−リベチン精製液では、特異抗体活性は98％回収できた。
これは、従来法の比較例２では、塩析によってγ−リベチンが変性し、活性が損なわれたが、本発明の試験例５の方法では、全く活性が損なわれなく、活性を維持したγ−リベチンを得ることに成功したためと考えられる。
試験例７  精製に用いる塩の種類と濃度の影響
実施例１で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルに、NaCl、KCl 、CaCl2 、 MgCl2、NaH2PO4 、Na2HPO4 、KH2PO4、K2HPO4、Na2SO4、(NH4)2SO4 、MgSO4 、K2SO4 より選ばれる一種または二種以上の塩を0.6 〜4.0 Ｍの濃度となるように添加し攪拌した。この溶液を用い、実施例２の方法により分画分子量300kDaの限外濾過膜でγ−リベチンを精製した。その結果、全ての塩について、塩の添加が0.7 Ｍ以上でγ−リベチンの精製が可能であった。又、全ての塩について、塩の添加が3.0 Ｍ以上であってもγ−リベチンの分離効率の向上が認められなかったため、0.7 Ｍ〜3.0 Ｍの塩濃度が有効であると考えられる。
【００２５】
本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下の通りである。
（１）γ−リベチン含有溶液に0.7 〜3.0 Ｍの濃度になるように塩を添加し、液性をpH5.0 〜11.0とし、分画分子量90〜500kDaの膜を用いて精製することを特徴とするγ−リベチンの分離精製法。
（２）膜が限外濾過膜である前記(1) 記載のγ−リベチンの分離精製法。
（３）膜が透析膜である前記(1) 記載のγ−リベチンの分離精製法。
（４）膜が逆浸透膜である前記(1) 記載のγ−リベチンの分離精製法。
（５）膜の孔径が0.006 μｍより大きく0.01μｍ未満である前記（１）記載のγ−リベチンの分離精製法。
（６）塩がNaCl、KCl 、CaCl2 、MgCl2 、NaH2PO4 、Na2HPO4 、KH2PO4、K2HPO4より選ばれる１種又は２種以上である前記（１）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（７）塩がNaCl、KCl 、CaCl2 、MgCl2 、NaH2PO4 、Na2HPO4 、KH2PO4、K2HPO4より選ばれる１種又は２種以上である前記（２）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（８）塩がNaCl、KCl 、CaCl2 、MgCl2 、NaH2PO4 、Na2HPO4 、KH2PO4、K2HPO4より選ばれる１種又は２種以上である前記（３）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（９）塩がNaCl、KCl 、CaCl2 、MgCl2 、NaH2PO4 、Na2HPO4 、KH2PO4、K2HPO4より選ばれる１種又は２種以上である前記（４）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
【００２６】
（１０）塩がNa2SO4、(NH4)2SO4 、MgSO4 、K2SO4 より選ばれる１種又は２種以上である前記（１）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（１１）塩がNa2SO4、(NH4)2SO4 、MgSO4 、K2SO4 より選ばれる１種又は２種以上である前記（２）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（１２）塩がNa2SO4、(NH4)2SO4 、MgSO4 、K2SO4 より選ばれる１種又は２種以上である前記（３）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（１３）塩がNa2SO4、(NH4)2SO4 、MgSO4 、K2SO4 より選ばれる１種又は２種以上である前記（４）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（１４）塩がNaClである前記（１）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（１５）塩がNaClである前記（２）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（１６）塩がNaClである前記（３）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
（１７）塩がNaClである前記（４）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。
【００２７】
【発明の効果】
本発明は、鳥類由来抗体の利点を最大限に生かし、初めて簡便に高純度のγ−リベチンを連続的に得ることを可能にした製造法を与えるものである。
従来純度の高い抗体は少量しか利用できなかったが、本発明において今後、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、飼料、その他抗体の通常用途に用いられる分野において純度の高い抗体を大量に供給でき、各種産業への貢献は大きい。