(57)【要約】天然型核酸とのハイブリダイゼーション反応による二本鎖化おいて、グアニン塩基と特異的に２本の水素結合を形成するシトシン誘導体及び／又はシトシン塩基と特異的に２本の水素結合を形成するグアニン誘導体を含むプローブを利用する。これにより、多数のハイブリダイゼーション反応を一括・同調させて行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアニン塩基と特異的に二本の水素結合を形成しうるシトシン誘導体、及びシトシン塩基と特異的に二本の水素結合を形成しうるグアニン誘導体を含むプローブであって、天然型核酸とのハイブリダイゼーション反応の際に、該プローブにおける実質上すべての塩基が二本の水素結合を形成しうるプローブ。
【請求項２】
シトシン誘導体が、以下の式（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかの式で表される化合物であり、且つ、
2002086160.tif 000016
2002086160.tif 000017
（式中、Ｘ１はＮＲ２、ＮＨＡｃ、Ｒ、ＯＲ、ＯＡｃ、ＳＲ、ＳＡｃ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを表し、Ｗ１、Ｗ２、及びＷ３はＯ、又はＮＨを表し、Ｘ３はＣＨ、又はＣＲを表し、Ｚ５はＣＨ２、又はＣＨＲを表し、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、Ｚ２、Ｙ３、Ｚ３、Ｘ４、Ｙ４、Ｘ５、及びＹ５はＣＨ、ＣＲ、又はＮを表す。但し、Ｒはシトシン誘導体とグアニンとの間の２本の水素結合を阻害しない置換基を表す。）
グアニン誘導体が、以下の式ＶＩ〜Ｘのいずれかの式で表される化合物である請求の範囲第１項記載のプローブ。
2002086160.tif 000018
2002086160.tif 000019
（式中、Ｘ６、及びＸ８はＮＲ２、ＮＨＡｃ、Ｒ、ＯＲ、ＯＡｃ、ＳＲ、ＳＡｃ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを表し、Ｙ６、Ｙ７、及びＺ８はＯ、又はＮＨを表し、Ｙ８、及びＺ１０はＣＨ２、ＣＨＲ、Ｏ、又はＳを表し、Ｘ９、及びＸ１０はＮＨ２、又はＯＨを表し、Ｖ６、Ｗ６、Ｚ６、Ｖ７、Ｗ７、Ｘ７、Ｚ７、Ｕ８、Ｖ８、Ｗ８、Ｗ９、Ｙ９、Ｚ９、Ｖ１０、Ｗ１０、及びＹ１０はＣＨ、ＣＲ、又はＮを表す。但し、Ｒはシトシンとグアニン誘導体との間の２本の水素結合を阻害しない置換基を表す。）
【請求項３】
プローブの主鎖がデオシキリボースリン酸エステル鎖である請求の範囲第１及び２項記載のプローブ。
【請求項４】
プローブの主鎖がペプチド鎖である請求の範囲第１及び２項記載のプローブ。
【請求項５】
すべてのプローブが請求の範囲第１〜４項に記載されたプローブから選ばれているプローブセット。
【請求項６】
請求の範囲第５項に記載されたプローブセットを含むプローブ固定化担体。
【請求項７】
請求の範囲第５項に記載されたプローブセットを含むＤＮＡチップ。
【請求項８】
請求の範囲第５項に記載されたプローブセット、請求の範囲第６項に記載されたプローブ固定化担体、又は請求の範囲第７項に記載されたＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーション方法。
【請求項９】
請求の範囲第８項に記載されたハイブリダイゼーション方法を用いたＳＮＰ解析方法。
【請求項１０】
請求の範囲第８項に記載されたハイブリダイゼーション方法を用いたＤＮＡ塩基配列決定方法
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、相補的一本鎖核酸同士の二本鎖核酸へのハイブリダイゼーション反応に適したプローブに関する。
従来の技術
ハイブリダイゼーション反応とは、二本鎖核酸の変性及び相補鎖再会合特性に基づく反応である。このハイブリダイゼーション反応は、核酸の相補的な鎖の間で生じるため、核酸の精製や分析等に利用されている。
ハイブリダイゼーション反応を用いた分析は、基本的には、標的配列を含む被検試料を調製後、標識された標的の配列に相補的なプローブとハイブリダイゼーションさせ、標識プローブとハイブリダイズした標的配列をスクリーニングするものである。被検試料の調製方法、プローブ（クローン化ＤＮＡあるいは合成核酸）の種類、標識法の違い、分析手段の種類等により、ハイブリダイゼーション反応を利用した分析法の種類及び／又は用途は多岐に渡る。
例えば、サザンハイブリダイゼーション法やノーザンハイブリダイゼーション法は、クローン化された遺伝子ＤＮＡ等をプローブとして標識し、被検試料として各種組織、細胞由来遺伝子ＤＮＡやｍＲＮＡを用い、相補もしくは類似遺伝子の存在を確認及び／又は定量する方法である。
ＰＣＲ法も、その基本部分は合成オリゴＤＮＡプライマーとのハイブリダイゼーション反応とＤＮＡ複製反応の組み合わせである。
他に、ハイブリダイゼーション反応を利用した分析手法としては、特定多数の遺伝子が一括解析出来るＤＮＡチップ法（あるいはＤＮＡマイクロアレイ法）が開発され注目を集めている。ＤＮＡチップとは、１〜数ｃｍ２の平面基盤片上に、多数のＤＮＡ断片がプローブとして高密度に整列固定化されたものであり、鎖長の揃ったオリゴ核酸が平板上にｉｎ  ｓｉｔｕで化学合成されたものや、天然由来のｃＤＮＡが固定されたものがある。いずれのＤＮＡチップを用いた方法でも、研究対象細胞の発現遺伝子等を適当な方法で増幅、蛍光物質等で標識し、それらを平面基盤片上に固定化されたプローブとハイブリダイゼーション反応後、チップ表面を高速レーザースキャナー等で測定し、数千〜万におよぶ多種の遺伝子発現量を一括定量したり、検体間で発現量の相対比較を行ったりすることが出来る。オリゴ核酸の場合、特定の配列を持ったプローブセットを配することで、特定遺伝子上の変異を検出したり配列解析の目的に使用されることもある（ＳＢＨ法；Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法。Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：１１４−１２８（１９８９），Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１６４９−１６５２（１９９３））
発明が解決しようとする課題
ハイブリダイゼーション法により分析をする場合には、反応温度や塩濃度等のハイブリダイゼーション条件の違いにより、標的配列とどの程度ミスマッチした相補性のプローブがハイブリダイズするかが異なり、目的の緊縮度（ミスマッチを許す度合い）に応じ、ハイブリダイゼーション条件が設定されている。そして、このハイブリダイゼーション条件は、通常、プローブと標的配列との融解温度Ｔｍを考慮して設定するが、Ｔｍは、ハイブリダイゼーションを起こす領域の塩基組成、グアニン塩基（Ｇ）及びシトシン塩基（Ｃ）の含量に依存することが知られている。
ところが、ＤＮＡチップ法のように、多数のハイブリダイゼーション反応を一括して、同条件で行う必要がある場合は、不適当なプローブを除く以外には、プローブのＧＣ含量を揃えることしか有効な方法は存在しなかった。プローブのＧＣ含量を揃える場合には、対象とする遺伝子配列の中でもプローブとして利用出来る領域が極めて限られたものになってしまうという問題を有していた。
発明の開示
課題を解決するための手段
本発明者らは、ハイブリダイゼーション反応で形成される２種のプリン：ピリミジン塩基対、即ち３本の水素結合によるグアニン：シトシン塩基対、及び２本の水素結合によるアデニン：チミン（ＲＮＡの場合ウラシル）塩基対において、塩基対間の結合特異性を損なわず水素結合本数を等しくする核酸塩基誘導体を用いれば、プローブの塩基配列の違いに基づく融解温度Ｔｍ値等のハイブリダイゼーション特性値を均一化することが可能と考えた。本発明は、プローブの塩基配列を考慮することなく、多数のハイブリダイゼーション反応を一括して、同条件で行う方法を提供することを目的とする。
シトシン塩基と特異的に２本の水素結合を形成するグアニン誘導体、及びグアニン塩基と特異的に２本の水素結合を形成するシトシン誘導体を合成し、それらを含むプローブを使用することにより、一括して、同一条件でハイブリダイゼーション反応を実施することが可能となる。
発明の実施の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のプローブは、天然型核酸とのハイブリダイゼーション反応の際に二本鎖化に用いるプローブにおいて、グアニン塩基と特異的に二本の水素結合を形成するシトシン誘導体、及びシトシン塩基と特異的に二本の水素結合を形成するグアニン誘導体を含み、Ｔｍ値がハイブリダイゼーション条件として同一視できる程度に、実質上すべての塩基対が二本の水素結合によりハイブリダイゼーションすることを特徴とするプローブである。実質上全てとは、ハイブリダイゼーションする配列中のＣＧの内、望ましくは、８０％以上、更に望ましくは、９５％以上、更に好適には全てのＣＧが上記のグアニン誘導体又はシトシン誘導体に置換されていることが望ましい。
本発明において用いるシトシン誘導体は、以下の式（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかの式で表される化合物であり、シトシン中のグアニンと水素結合をする３つの部位（即ち、４位のアミノ基、３位の窒素、２位のケトン）のうち、いずれか一つが水素結合できないような構造のものである。このような化合物としては、４位のアミノ基との水素結合が阻害される式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物、３位の窒素との水素結合が阻害される式（ＩＩＩ）の化合物、２位のケトンとの水素結合が阻害される式（ＩＶ）及び（Ｖ）の化合物を例示することができる。
2002086160.tif 000002
（式中、Ｘ１はＮＲ２、ＮＨＡｃ、Ｒ、ＯＲ、ＯＡｃ、ＳＲ、ＳＡｃ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを表し、Ｗ１、Ｗ２、及びＷ３はＯ、又はＮＨを表し、Ｘ３はＣＨ、又はＣＲを表し、Ｚ５はＣＨ２、又はＣＨＲを表し、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、Ｚ２、Ｙ３、Ｚ３、Ｘ４、Ｙ４、Ｘ５、及びＹ５はＣＨ、ＣＲ、又はＮを表す。但し、Ｒはシトシン誘導体とグアニンとの間の２本の水素結合を阻害しない置換基を表す。）
また、グアニン誘導体は、以下の式ＶＩ〜Ｘのいずれかの式で表される化合物であり、グアニン中のシトシンと水素結合をする３つの部位（即ち、２位のアミノ基、１位の窒素、６位のケトン）のうち、いずれか一つが水素結合できないような構造のものである。このような化合物としては、２位のアミノ基との水素結合が阻害される式（ＶＩ）及び式（ＶＩＩ）の化合物、１位の窒素との水素結合が阻害される式（ＶＩＩＩ）の化合物、６位のケトンとの水素結合が阻害される式（ＩＸ）及び（Ｘ）の化合物を例示することができる。
2002086160.tif 000003
2002086160.tif 000004
（式中、Ｘ６、及びＸ８はＮＲ２、ＮＨＡｃ、Ｒ、ＯＲ、ＯＡｃ、ＳＲ、ＳＡｃ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを表し、Ｙ６、Ｙ７、及びＺ８はＯ、又はＮＨを表し、Ｙ８、及びＺ１０はＣＨ２、ＣＨＲ、Ｏ、又はＳを表し、Ｘ９、及びＸ１０はＮＨ２、又はＯＨを表し、Ｖ６、Ｗ６、Ｚ６、Ｖ７、Ｗ７、Ｘ７、Ｚ７、Ｕ８、Ｖ８、Ｗ８、Ｗ９、Ｙ９、Ｚ９、Ｖ１０、Ｗ１０、及びＹ１０はＣＨ、ＣＲ、又はＮを表す。但し、Ｒはシトシンとグアニン誘導体との間の２本の水素結合を阻害しない置換基を表す。）
これらシトシン誘導体及びグアニン誘導体は、常法に従って合成することができる。
本発明におけるプローブ主鎖は、ハイブリダイゼーションが起こるものであればその構造は限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（糖リン酸エステル鎖を電荷のないペプチド鎖としたもの、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１９８５（１９９２））、ＬＮＡと呼ばれる核酸アナログ（核酸ヌクレオシドを構成するフィラノース環の２位の酸素と４位の炭素との間にメチレン架橋を導入したもの。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１１（２）２２８−３８（２０００））を含むもの等が例示できる。また、プローブの調製は常法に従って、核酸自動合成装置や、自動ペプチド合成装置を用いて行うことが出来る。
本発明において、プローブセットとは、プローブの集合体を示す。プローブセットは、検出の目的に応じて集合体を設定することができる。例えば、ガン関連遺伝子検出用のプローブ集合体、糖尿病関連遺伝子検出用のプローブ集合体、あるいは、微生物、酵母、植物等の生物種遺伝子検出用のプローブ集合体等を例示することができる。
本発明においてそれらプローブセットは、個々のプローブが識別可能となるように、樹脂、ガラスビーズ、ゲル等の適当な担体にプローブ別に固定化される。また、基盤上に整列させてＤＮＡチップとされる。
本発明においてハイブリダイゼーション反応の確認は、一般的に行われるような方法で行うことが出来る。例えば、プローブと相補的なＤＮＡとのハイブリダイゼーションでは、温度を変化させながら紫外吸収を測定することでハイブリダイゼーションの有無を確認することが出来る。また、紫外吸収曲線の変極点から融解温度（Ｔｍ）を求めることができる。ＤＮＡチップ化したプローブ等の場合には次のようにして行うことが出来る。ある生物由来のサンプルから調製したｍＲＮＡから逆転写酵素によってｃＤＮＡを作成し、蛍光ラベル化する（以下、ラベル化検体）。このラベル化検体を、ＳＳＣバッファー中で５０〜６０℃で１０〜２０時間、ＤＮＡチップ上でインキュベート、その後、洗浄操作を行って、マイクロアレイ用スキャナ等を使用してハイブリダイズしたスポットを検出することが出来る。
本発明のプローブは、ＤＮＡチップによる多量一括的な遺伝子発現解析及び検出の他、今後の重要性が指摘されているＳＮＰ解析や、ハイブリダイゼーションによる遺伝子配列解析（ＳＢＨ法）等に用いることが可能である。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明は必ずしもこれら実施例のみに限定されるものではない。
［実施例１］核酸型プローブの合成
（１）シトシン誘導体（デオキシリボース−６−アザ−３−デアザシトシン）ホスホロアミダイトの合成；
無水ヒドラジンとムコクロロ酸（ｍｕｃｏｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）を反応させ、ジクロロピリダジノンを合成する。アンモニアで４位クロロ基をアミノ化し化合物１を合成する。
化合物１（２．２ｇ）のメタノール（９０ｍｌ）−ジメチルホルムアミド（９０ｍｌ）懸濁液に水酸化ナトリウム（０．６０４ｇ）、１０％パラジウム炭素（０．９ｇ）を加え、水素ガス置換下、常圧で７日間攪拌する。パラジウム炭素を濾過し、反応溶媒を減圧留去する。得られた残渣を精製水で再結晶して化合物２（０．８３５ｇ）を得る。
化合物２（１．０ｇ）の無水ピリジン（５０ｍｌ）懸濁液を、水浴で冷却し、アルゴンガス置換下、塩化ベンゾイル（２．０９ｍｌ）を滴下する。アルゴンガス置換下、室温で１日攪拌した後、反応溶媒を減圧留去する。得られた残渣に精製水（１０ｍｌ）を加え、４Ｍ塩酸でｐＨ１に調整する。析出結晶をろ取し、精製水で洗浄する。減圧乾燥後、その結晶に無水エタノール（１０ｍｌ）を加え、１０分間程煮沸する。１０℃まで冷却した後、結晶をろ取し、エーテルで洗い、化合物３；６−アザ−デアザシトシン（１．３９９ｇ）が得られる。
化合物３（１．００ｇ）と炭酸カリウム（０．７０ｇ）のジメチルホルムアミド（１２．９ｍｌ）懸濁液に、常法により別途合成した１−クロロデオキシリボースのｐ−トルオイル保護体（２．０ｇ）を加え、アルゴンガス置換下、室温で２日間攪拌する。不溶物をろ去し、ろ液の反応溶媒を減圧留去する。得られた残渣に精製水（５ｍｌ）を加えた後、氷浴下、４Ｍ塩酸（０．１７５ｍｌ）を加え、１５分間攪拌する。結晶をろ取し、精製水で洗いα及びβ体の混合した化合物４（２．８ｇ）が得られる。それを、Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００  １５０ｇを充填したカラムクロマトグラフィーに供して、塩化メチレンと酢酸エチルの混合溶媒で分画し、β体画分を集めて濃縮し、化合物５（１．２ｇ）が得られる。
化合物５（１．０ｇ）と炭酸カリウム（０．６ｇ）のジメチルホルムアミド（１１ｍｌ）懸濁液を混合し、３０℃で１時間攪拌する。不溶物をろ去し、ろ液を減圧濃縮する。得られた残渣に精製水（５ｍｌ）を加えた後、氷冷下、４Ｍ塩酸（０．１ｍｌ）を加え、１５分間攪拌する。結晶をろ取し、この析出結晶をメタノールで再結晶し化合物６（０．４ｇ）が得られる。
この化合物６（０．３ｇ）を無水ピリジンで減圧下共沸脱水した後、無水ピリジン（１ｍｌ）に溶解し臭化４，４’−ジメトキシトリチル（０．６ｇ）を加え６０℃で撹拌する。２時間後加熱を止め、室温に戻してから水（２ｍｌ）を加え、ジクロルメタン（２ｍｌで２回）で抽出、乾燥、濃縮し残渣をトルエンで２回共沸し、ピリジンを完全に除く。トルエンを加え析出した結晶を洗浄し、減圧乾燥する事でトリチル保護体（化合物７）（０．５ｇ）が得られる。
化合物７（０．４ｇ）を、無水ピリジンと無水トルエンで各々２回減圧下共沸脱水した後、ジクロルメタン（５ｍｌ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（１．６ｍｌ）を加え０℃に冷却し、クロロ−２−シアノエトキシジイソプロピルアミノホスフィン（０．３ｇ）を加えて室温で撹拌する。１時間後ジクロルメタン（５ｍｌ）を加え、５％重曹水溶液（３ｍｌ）で２回洗浄、無水硫酸ソーダで乾燥、濃縮後残分をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してデオキシリボース−６−アザ−３−デアザシトシンホスホロアミダイト（０．５ｇ）（化合物８）が得られる。
2002086160.tif 000005
Ｂｚ：ベンゾイル基、Ｔｏｌ：トリル基、ＤＭＴｒ：ジメトキシトリチル基
（２）グアニン誘導体（デオキシリボースオキサニン）ホスホロアミダイトの合成；
デオキシリボースを糖部分に有するオキサノシンは文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４，９３１（１９８３））記載の方法に従って合成する。
2002086160.tif 000006
このデオキシリボースオキサニン（０．５ｇ）（化合物９）を無水ピリジンで減圧下共沸脱水した後、無水ピリジン（５ｍｌ）に溶解し臭化４，４’−ジメトキシトリチル（０．６ｇ）を加え６０℃で撹拌する。２時間後加熱を止め、室温に戻してから水を加え、ジクロルメタン（５ｍｌで２回）で抽出、乾燥、濃縮し残渣をトルエンで２回共沸し、ピリジンを完全に除く。トルエンを加え析出した結晶を洗浄し、減圧乾燥する事でトリチル保護体（０．８ｇ）（化合物１０）が得られる。
トリチル保護体（０．７ｇ）を、無水ピリジンと無水トルエンで各々２回減圧下共沸脱水した後、ジクロルメタン（５ｍｌ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２．０ｍｌ）を加え０℃に冷却し、クロロ−２−シアノエトキシジイソプロピルアミノホスフィン（１．０ｇ）を加えて室温で撹拌する。１時間後ジクロルメタン（５ｍｌ）を加え、５％重曹水溶液（３ｍｌ）で２回洗浄、無水硫酸ソーダで乾燥、濃縮後残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してデオキシリボースオキサニンホスホロアミダイト（０．９ｇ）（化合物１１）が得られる。
2002086160.tif 000007
（３）プローブの調製；
合成したシトシン誘導体ホスホロアミダイト（デオキシリボース−６−アザ−３−デアザシトシンホスホロアミダイト）化合物８及びグアニン誘導体ホスホロアミダイト（デオキシリボースオキサニンホスホロアミダイト）化合物１１を用いてオリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドの合成はＰＥバイオシステムズ社の自動合成機ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ｍｏｄｅｌ３９４）を用いて行う。
［実施例２］  ペプチド核酸の合成
（１）シトシン誘導体（化合物１５）の合成；
化合物１（２．２ｇ）のメタノール（９０ｍｌ）−ジメチルホルムアミド（９０ｍｌ）懸濁液に水酸化ナトリウム（０．６０４ｇ）、１０％パラジウム炭素（０．９ｇ）を加え、水素ガス置換下、常圧で７日間攪拌する。パラジウム炭素を濾過し、反応溶媒を減圧留去する。得られた残渣を精製水で再結晶して化合物２（０．８３５ｇ）を得る。
化合物２（１．０ｇ）の無水ピリジン（５０ｍｌ）懸濁液を、水浴で冷却し、アルゴンガス置換下、塩化ベンゾイル（２．０９ｍｌ）を滴下する。アルゴンガス置換下、室温で１日攪拌した後、反応溶媒を減圧留去する。得られた残渣に精製水（１０ｍｌ）を加え、４Ｍ塩酸でｐＨ１に調整する。析出結晶をろ取し、精製水で洗浄する。減圧乾燥後、その結晶に無水エタノール（１０ｍｌ）を加え、１０分間程煮沸する。１０℃まで冷却した後、結晶をろ取し、エーテルで洗い、化合物３（１．３９９ｇ）を得る。
化合物３（１．００ｇ）と炭酸カリウム（０．７０ｇ）のジメチルホルムアミド（１２．９ｍｌ）懸濁液にブロモ酢酸メチル（０．４８ｍｌ）を加え、アルゴンガス置換下、室温で２日間攪拌する。不溶物をろ去し、ろ液の反応溶媒を減圧留去する。得られた残渣に精製水（４．５ｍｌ）を加えた後、氷浴下、４Ｍ塩酸（０．１７５ｍｌ）を加え、１５分間攪拌する。結晶をろ取し、精製水で洗い、メチルエステル（化合物１２）を得る。この化合物１２に精製水（６．７５ｍｌ）と２Ｍ水酸化ナトリウム（３．３８ｍｌ）を加え、３０分間攪拌する。この反応液を０℃に冷やした後、不溶物をろ去する。得られたろ液に４Ｍ塩酸（１．９７ｍｌ）を加え、析出結晶をろ取する。この析出結晶をメタノールで再結晶し化合物１３（０．７７９ｇ）を得る。化合物１３（０．６０１ｇ）、ｔｅｒ−Ｂｕｔｙｌ  Ｎ−［２−（Ｎ−９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎａｔｅ（１．０４７ｇ）、ＨＯＢｔ（０．３３７ｇ）及びＤＩＥＡ（０．７６６ｍｌ）のＤＭＦ（２０ｍｌ）溶液にＴＢＴＵ（０．７０６ｇ）を加え室温で１２時間撹拌する。反応溶媒を減圧留去したのち残渣にジクロロメタン（１５０ｍｌ）を加え、精製水（１００ｍｌｘ３）、４％炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌｘ３）、４％硫酸水素カリウム水溶液（１００ｍｌｘ３）、精製水（１００ｍｌｘ３）で順次洗浄する。ジクロロメタン層を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧留去し得られた結晶を酢酸エチルーｎ−ヘキサンの混液で再結晶し化合物１４（１．３１ｇ）を得る。
化合物１４（０．３０ｇ）をジクロロメタン（３ｍｌ）とＴＦＡ（４ｍｌ）の混液に加え０℃で３０分間攪拌後、室温でさらに３時間撹拌する。反応溶媒を減圧留去したのちドライエーテル（５ｍｌ）を加え析出した結晶を酢酸エチルーｎ−ヘキサンの混合溶媒で再結晶し化合物１５（０．２５６ｇ）を得る。
ＤＩＥＡ：ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ
ＴＦＡ：ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ
ＨＯＢｔ：１−ｈｙｄｒｏｘｙ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ
ＴＢＴＵ：２−（１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ
2002086160.tif 000008
（２）グアニン誘導体（化合物２１）の合成；
５−ａｍｉｎｏ−３Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｄ］［１，３］ｏｘａｚｉｎ−７−ｏｎｅ  １６と炭酸カリウムのジメチルホルムアミド懸濁液にブロム酢酸メチルを加え、アルゴンガス置換下、室温で２４時間攪拌する。不溶物をろ去し、ろ液の反応溶媒を減圧留去した。得られた残渣に精製水を加え析出結晶をろ取したのちジメチルホルムアミドーエタノールの混合溶媒で再結晶しメチルエステル（化合物１７）を得る。
化合物１７の無水ピリジン懸濁液を、水浴で冷却し、アルゴンガス置換下、ベンゾイルクロライドを滴下する。アルゴンガス置換下、室温で１日攪拌した後、反応溶媒を減圧留去する。得られた残渣に精製水を加え、氷浴下１Ｍ塩酸水溶液でｐＨ１に調整する。析出結晶をろ取し、ジメチルホルムアミドーエタノールの混合溶媒で再結晶して化合物１８を得る。
化合物１８を２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に加え、３０分間攪拌する。この反応液を０℃に冷やした後、不溶物をろ去する。氷浴下得られたろ液を４Ｍ塩酸水溶液を加えｐＨ３とし、析出結晶をろ取する。この析出結晶をジメチルホルムアミドーエタノールの混合溶媒で再結晶し化合物１９を得る。化合物１９、ｔｅｒ−Ｂｕｔｙｌ  Ｎ−［２−（Ｎ−９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎａｔｅ、ＨＯＢｔ及びＤＩＥＡのＤＭＦ溶液にＴＢＴＵを加え室温で１２時間撹拌する。反応溶媒を減圧留去したのち残渣にジクロロメタン（２００ｍｌ）を加え、精製水（１００ｍｌｘ３）、４％炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌｘ３）、４％硫酸水素カリウム水溶液（１００ｍｌｘ３）、精製水（１００ｍｌｘ３）で順次洗浄する。ジクロロメタン層を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧留去し得られた結晶をエタノールーｎ−ヘキサンの混合溶媒で再結晶し化合物２０を得る。化合物２０をジクロロメタンとＴＦＡの混液に加え０℃で３０分間攪拌後、室温でさらに３時間撹拌する。反応溶媒を減圧留去したのちドライエーテル（５ｍｌ）を加え析出した結晶をエタノールーｎ−ヘキサンの混合溶媒で再結晶し化合物２１を得る。
2002086160.tif 000009
（３）プローブの調製；
化合物１５及び化合物２１を用いてオリゴペプチド核酸を合成する。オリゴペプチド核酸の合成は東京理化器械社の手動式パーソナル有機合成装置ＣＣＳ−６００Ｖを用いて行う。
［実施例３］  （ハイブリダイゼーション）
【核酸型プローブ；シトシン誘導体及びグアニン誘導体】
オリゴＤＮＡ２種（オリゴＤＮＡ  Ａ及びＤＮＡ  Ｂ）において、６−アザ−３−デアザシトシンをシトシンの代わりに、オキサニンをグアニンの代わりに用いて、それぞれに対応するオリゴＤＮＡ（Ａ’及びＢ’）を作製する。
オリゴＤＮＡ  Ａ及びＢよりもＧＣ含量の低いオリゴＤＮＡ  Ｅを作製した。オリゴＤＮＡ  Ｅにおいて、６−アザ−３−デアザシトシンをシトシンの代わりに、オキサニンをグアニンの代わりに用いたオリゴＤＮＡ  Ｅ’を作製する。
また、オリゴＤＮＡ  Ｅに相補的なオリゴＤＮＡ  Ｆを作製する。
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（ａ，ｔ，ｃ，ｇはそれぞれアデニン、チミン、シトシン、グアニンを表す。ｄは６−アザ−３−デアザシトシンを表す。ｅはオキサニンを表す。）
紫外吸収を測定により、オリゴＤＮＡ  Ａ’（６−アザ−３−デアザシトシン及びオキサニン置換ＤＮＡ）／オリゴＤＮＡ  Ｃの二本鎖ＤＮＡの融解温度を調べると、オリゴＤＮＡ  Ａ／オリゴＤＮＡ  Ｃのそれに比べて低下していることが分かる。オリゴＤＮＡ  Ｂ’／オリゴＤＮＡ  Ｄの二本鎖ＤＮＡの融解温度も、オリゴＤＮＡ  Ｂ／オリゴＤＮＡ  Ｄのそれに比べて低下していることが分かる。オリゴＤＮＡ  Ａ’／オリゴＤＮＡ  Ｃの二本鎖ＤＮＡとオリゴＤＮＡ  Ｂ’／オリゴＤＮＡ  Ｄの二本鎖ＤＮＡの融解温度は同程度であることが分かる。オリゴＤＮＡ  Ｅ’（６−アザ−３−デアザシトシン及びオキサニン置換ＤＮＡ）／オリゴＤＮＡ  Ｆの二本鎖ＤＮＡの融解温度は、オリゴＤＮＡ  Ｅ／オリゴＤＮＡ  Ｆの二本鎖ＤＮＡのそれに比べて低下していることが分かる。また、オリゴＤＮＡ  Ａ’／オリゴＤＮＡ  Ｃの二本鎖ＤＮＡは、オリゴＤＮＡ  Ｂ’／オリゴＤＮＡ  Ｄの二本鎖ＤＮＡと比較し、ＧＣ含量が大きく異なるにも関わらず、融解温度は、同程度であることが分かる。
【ペプチド核酸；シトシン誘導体及びグアニン誘導体】
オリゴペプチド核酸２種（オリゴペプチド核酸Ａ及びＢ）において、６−アザ−３−デアザシトシンをシトシンの代わりに、オキサニンをグアニンの代わりに用いて、それぞれに対応するオリゴペプチド核酸（Ａ’及びＢ’）を作製する。
オリゴペプチド核酸Ａ及びＢよりもＧＣ含量の低いオリゴペプチド核酸Ｅを作製する。オリゴペプチド核酸Ｅにおいて、６−アザ−３−デアザシトシンをシトシンの代わりに、オキサニンをグアニンの代わりに用いたオリゴペプチド核酸Ｅ’を作製する。
また、オリゴペプチド核酸Ｅに相補的なオリゴＤＮＡ  Ｆを作製する。
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（ａ，ｔ，ｃ，ｇはそれぞれアデニン、チミン、シトシン、グアニンを表す。ｄは６−アザ−３−デアザシトシンを表す。ｅはオキサニンを表す。）
紫外吸収測定により、オリゴペプチド核酸Ａ’（６−アザ−３−デアザシトシン及びオキサニン置換ペプチド核酸）／オリゴＤＮＡ  Ｃの二本鎖の融解温度を調べたところ、オリゴペプチド核酸Ａ／オリゴＤＮＡ  Ｃのそれに比べて低下していることが分かる。オリゴペプチド核酸Ｂ／オリゴＤＮＡ  Ｄの二本鎖の融解温度も、オリゴペプチド核酸Ｂ’／オリゴＤＮＡ  Ｄのそれに比べて低下していることが分かる。オリゴペプチド核酸Ａ’／オリゴＤＮＡ  Ｃの二本鎖とオリゴペプチド核酸Ｂ’／オリゴＤＮＡ  Ｄの二本鎖の融解温度は同程度であることが分かる。
オリゴペプチド核酸Ｅ’（６−アザ−３−デアザシトシン及びオキサニン置換ペプチド核酸）／オリゴＤＮＡ  Ｆの二本鎖の融解温度は、オリゴペプチド核酸Ｅ／オリゴＤＮＡ  Ｆの二本鎖のそれに比べて低下する。また、オリゴＤＮＡ  Ａ’／オリゴＤＮＡ  Ｃの二本鎖ＤＮＡは、オリゴＤＮＡ  Ｂ’／オリゴＤＮＡ  Ｄの二本鎖ＤＮＡと比較し、ＧＣ含量が大きく異なるにも関わらず、融解温度は、同程度であることが分かる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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