(57)【要約】乳癌患者の癌組織又は乳汁から調製されたサンプル中の糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造を検出することにより、乳癌の有無はもとより、乳癌の進行度あるいは悪性度、乳癌手術後の予後診断等を高精度に効果的に行うことができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織又は体液から調製されたサンプル中の糖蛋白質の糖鎖部分の構造を検索して乳癌を診断する方法において、
糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存否を検出して、乳癌を診断することを特徴とする乳癌診断法。
【請求項２】
Ａｓｎ型糖鎖の非還元末端において、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造が検出されないか又は僅かにしか検出されない場合に乳癌と診断する請求項１の乳癌診断法。
【請求項３】
Ａｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の検出程度により乳癌の進行度あるいは悪性度を診断する請求項１又は２の乳癌診断法。
【請求項４】
乳癌患者の組織又は体液から調製されたサンプル中の糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の検出程度により手術後の予後診断を行う請求項１の乳癌診断法。
【請求項５】
サンプルが、ヒト乳房部分の組織又は乳汁から調製されたサンプルである請求項１から４のいずれかの乳癌診断法。
【請求項６】
レクチンに対する親和性により、Ａｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存否を検出する請求項１から５のいずれかの乳癌診断法。
【請求項７】
ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造を認識できる抗体により、Ａｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存否を検出する請求項１から５のいずれかの乳癌診断法。
【請求項８】
乳癌を診断するためのキットであって、糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存否を検出する試薬を含むキット。
【請求項９】
試薬がレクチンである請求項８のキット。
【請求項１０】
レクチンがＷｉｓｔａｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａアグルチニン又はそれと類似の機能を有するレクチンである請求項９のキット。
【請求項１１】
試薬がＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造を認識できる抗体である請求項８のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、乳癌診断法及びそれに用いるキットに関する。更に詳細には、ヒト乳房部分の組織、乳汁、血漿、血清などから調製されたサンプル中の糖蛋白質の糖鎖部分の構造を検索して乳癌を診断する方法であって、糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存否を検出して、乳癌を診断する診断方法に関する。本発明の診断方法によれば、乳癌の有無はもとより、乳癌の進行度あるいは悪性度、乳癌手術後の予後診断等を高精度に効果的に行うことができる。
背景技術
癌細胞では正常細胞と比べて異なる蛋白質が産生されることが知られており、このような異常蛋白質の多くは、腫瘍の診断上重要な物質と考えられ、いわゆる腫瘍マーカーとよばれている。腫瘍マーカーとしては、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、アルカリホスファターゼなどが知られている。これらの腫瘍マーカーの大部分は糖蛋白質であり、糖蛋白質の糖鎖構造解析技術の最近の進歩に伴い、近年腫瘍マーカーとしての糖鎖の研究が盛んになりつつある。
糖蛋白質の糖鎖には、Ａｓｎ型とムチン型の２種類があり、Ａｓｎ型糖鎖は、ポリペプチドのアスパラギン（Ａｓｎ）残基のアミド基に、還元末端にＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖鎖がＮ−グリコシド結合で結びついたものである。ムチン型糖鎖は、ポリペプチドのセリン又はスレオニン残基の水酸基に糖鎖がＯ−グリコシド結合で結びついたものである。
これらの糖鎖構造の変化を検出することによる癌診断の研究が、現在活発に行われつつある。Ａｓｎ型糖鎖の構造解析により癌を診断する方法として、患者の尿から調製されたサンプルを、シロバナチョウセンアサガオレクチン（Ｄａｔｕｒａｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＤＳＡ）カラムに通して、当該カラムに対する親和性により、尿中の糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖におけるＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存在を検出して、悪性絨毛性疾患である絨毛癌を診断することが報告されている（医学と薬学・第２６巻第５号・１９９１年１１月２６（５）：９７３−９８１）。
ムチン型糖鎖の構造に基づいて癌を診断する方法としては、Ｊａｃｋ  ｆｒｕｉｔから単離されたレクチン（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｉｏｌａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）を用いてムチン型糖鎖のＧａｌＮＡｃ構造を検出して乳癌を診断する方法（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  １９８９  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３（４）：２７５−２７８）などが知られている。
しかしながら、糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の構造に基づいて乳癌を診断する方法は、従来知られていない。
発明の開示
従って、本発明は、糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の構造に基づいて乳癌を特異的に高精度に診断する方法及びそれに用いるキットを提供することを目的とする。
本発明者は、糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の構造に基づいて乳癌を特異的に診断する方法を開発することを目的として鋭意研究した結果、乳癌患者の乳癌組織や乳癌細胞の糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の構造について調べたところ、正常細胞での糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖において観察される非還元末端のＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造が、乳癌患者の癌細胞での糖蛋白質では低下し、この現象は乳癌において極めて特異的であり、従ってこれらの構造に基づいて、乳癌の診断はもとより、乳癌の進行度あるいは悪性度、乳癌手術後の予後診断も正確に行うことができることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、ヒト組織又は体液から調製されるサンプル中の糖蛋白質の糖鎖部分の構造を検索して乳癌を診断する方法において、糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存否を検出して、乳癌を診断することを特徴とする乳癌診断法である。
更に本発明は、乳癌を診断するためのキットであって、糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存否を検出する試薬を含むキットである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の乳癌診断法で用いるサンプルは、ヒト乳房部分の組織、乳汁、血漿、血清、唾液、涙などのヒト組織又は体液から調製されたサンプルである。特にヒト乳房部分の組織又は乳汁から調製されたサンプルが好ましい。通常、乳癌の発症が疑われるヒトの乳房部分の組織、実際に乳癌を発症している患者の乳癌組織、あるいは乳癌が疑われるヒト又は乳癌患者の乳汁から調製されたサンプルが挙げられる。これらのサンプルは、実際には、組織あるいは乳汁から通常の方法により細胞膜蛋白質を調製してサンプルとして用いる。あるいは組織又は乳汁を、そのままサンプルとして用いることもできる。
サンプル中から検索対象である糖蛋白質を調製するには、それ自体周知の調製法によって行うことができる。例えば、サンプルに界面活性剤が添加された緩衝液を加えて糖蛋白質を可溶化し、次いで可溶化した糖蛋白質にアセトンあるいは硫酸アンモニウムを適当量添加し、遠心分離後に沈殿物中に粗精製の糖蛋白質を得ることができる。
サンプル中の糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存否を検出するには、以下のようにして行うことができる。
サンプル中の糖蛋白質からＡｓｎ型糖鎖を選択的に遊離させ、得られるＡｓｎ型糖鎖について、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造に対して親和性を有する試薬を用いて、それとの結合性を調べることによって実施できる。Ａｓｎ型糖鎖のみを選択的に遊離させるためには、例えば化学的にはヒドラジンによる分解処理、酵素的にはＡｓｎ型糖鎖を根元から切り出すことのできるＮ−グリカナーゼ処理などが挙げられる。なお、糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造は、通常ムチン型糖鎖には見られず、Ａｓｎ型糖鎖に観察されることから、糖蛋白質からＡｓｎ型糖鎖を選択的に遊離させることなく、糖蛋白質をそのまま検出に付すこともできる。
ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造に対して親和性を有する試薬としては、植物フジ由来のレクチン、具体的には、Ｗｉｓｔａｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａアグルチニン（ＷＦＡ）又はそれと同様の機能、即ち、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造に対して同様の親和性を有するレクチンが好ましい。あるいは、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造を認識できる抗体を用いることもできる。抗体としては、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→部分を、ウシ血清アルブミンなどのハプテンとして用いられる蛋白に結合させ、これを免疫抗原として動物に免疫し、得られる抗血清が挙げられる。あるいは、この免疫抗原を用いて通常の細胞融合法により作製されるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が挙げられる。
レクチン、抗体等の試薬を用いて、Ａｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造を実際に検出するには、例えばレクチン、抗体等の試薬を、パーオキシダーゼなどの酵素で標識化し標識化試薬と糖蛋白質あるいはそれから遊離されたＡｓｎ型糖鎖とを反応させ、通常の方法で可視化させて、反応生成物の有無を調べることにより実施できる。レクチン、抗体等の試薬を用いた通常のドットブロット法やウエスタンブロット法により検出することもできる。また、これらの試薬を固定したカラムを用いた通常のカラムクロマトグラフィーにより検出することもできる。あるいは、これらの試薬を用いて、乳癌が疑われるヒトの乳房部分の組織又は乳癌患者の乳癌組織から病理組織標本を作製し染色して検査する組織検査によっても検出することができる。
サンプルとして、ヒト血漿、血清、唾液又は涙から調製されたサンプルを用いる場合には、検索の対象とする糖蛋白質は、ヒト乳房部分の組織又は乳汁中に存在しかつヒト血漿、血清、唾液又は涙に存在する糖蛋白質が好ましい。実際にヒト血漿、血清、唾液又は涙から調製されるサンプルを用いる場合には、例えば酵素抗体法などによって、ヒト乳房部分の組織又は乳汁中に存在しかつヒト血漿、血清、唾液又は涙中に存在する糖蛋白質を同定し、その後に、上記した方法により、Ａｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造を検出するのが好ましい。
このような検査により、Ａｓｎ型糖鎖の非還元末端にＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造が検出されないか、あるいは僅かにしか検出されない場合には、乳癌と診断される。本発明によれば、通常、正常な組織の細胞膜には、糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖全体中で、非還元末端にＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造を有する糖鎖は約３０％存在しており、乳癌患者の癌組織の細胞中の糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖では、全体の２〜３％と低下する。従って、これらの割合を目安にして、乳癌か否かを診断することができ、また乳癌の場合には、その進行度あるいは悪性度を診断することもできる。また、乳癌が疑われるヒトの乳房部分の組織あるいは乳癌患者の乳癌組織から得られるサンプルと、同じヒトあるいは患者の摘出された組織の正常部分から得られるサンプルを用いて上記のような検出を同時に実施し、両者の結果を比較することによって、乳癌の有無、乳癌の場合のその進行度あるいは悪性度を診断することができる。また、本発明の診断法によれば、乳癌患者に対して本発明の診断を行うことによって、乳癌患者の手術後の予後診断を行うことも可能である。
本発明では、上記した診断に用いるためのキットも提供される。このようなキットは、糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖の非還元末端に発現するＧａｌＮＡｃβ１→４ＧＴｃＮＡｃβ１→構造の存否を検出する試薬を含むものである。このような試薬としては、上記したようなレクチン、抗体などが挙げられる。これらの試薬以外に、通常上記したような検出方法に用いられる発色試薬などの試薬が、必要に応じて追加される。
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
ヒト乳癌細胞株のＡｓｎ型糖鎖の構造
（１）方法
ヒト乳癌細胞株（ＭＲＫ−ｎｕ−１細胞）のＡｓｎ型糖鎖の構造解析を、木幡の方法（Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．（１９９２）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ａｌｌｅｎ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｉｓａｉｌｕｓ，Ｅ．Ｃ．，ｅｄｓ．），ｐｐ．３３−６９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）に従って解析した。
ヒト乳癌細胞株の細胞膜蛋白質を調製し、これをヒドラジン分解後、遊離したＡｓｎ型糖鎖の還元末端をＮａＢ３Ｈ４で３Ｈ−標識し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４のゲル濾過クロマトグラフィーで解析した。
（２）結果
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得られた結果を表１にまとめて示した。
表１において、糖蛋白質の欄はゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付した時の糖鎖のピークを指す。表１から明らかなように、ヒト乳癌細胞株の糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖では、３．９％と極めて低いモル比で、非還元末端にＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の存在が確認された。なお、正常ヒトの細胞の場合には、約３０％のモル比のＡｓｎ型糖鎖において非還元末端にＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造を持つ糖鎖の存在が確認された。
このことから、乳癌細胞の糖蛋白質のＡｓｎ型糖鎖では、非還元末端にＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造が検出されないか、あるいは僅かにしか検出されず、従って、これらの構造の存否を検出することにより、乳癌を診断できることが分かる。
実施例２
健常ヒトの乳汁中の糖蛋白質のレクチンブロット分析
（１）方法
健常ヒト２名から乳汁を採取し、これをアセトン処理で蛋白質を沈殿させ、レクチンブロットにて解析（１−５μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｌａｎｅ）した。即ち、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造と結合するフジ由来のレクチン（Ｗｉｓｔａｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＷＦＡ）をパーオキシダーゼで標識し、これを糖蛋白質と反応させ、ＷＦＡ結合性糖鎖を可視化した。同時にＧａｌＮＡｃを分解する酵素（Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ：ＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅ）及びＡｓｎ型糖鎖を根元から切り出す酵素（Ｎ−グリカナーゼ：Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ）でそれぞれブロット上の糖蛋白質糖鎖を消化した後にＷＦＡを反応させて可視化した。
対照として、ヒママメ由来のレクチン（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ｉ（ＲＣＡ−Ｉ））を糖蛋白質と反応させて同様に可視化した。ＲＣＡ−Ｉは、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃの構造を持つ糖鎖と結合することが知られているレクチンである。また、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で蛋白質を染色し検出した。
（２）結果
得られた結果を図１に示した。図１の結果から分かるように、ＧａｌＮＡｃを分解する酵素（ＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅ）及びＡｓｎ型糖鎖を根元から切り出す酵素（Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ）でそれぞれ糖蛋白質を消化した後にＷＦＡを反応させた場合には、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造が検出されなかった。他方、これらの酵素で処理せずそのままＷＦＡと反応させた場合には、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造が検出された。
これらのことから、健常ヒトの乳汁中の糖蛋白質では、Ａｓｎ型糖鎖において、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造が検出されることが分かる。
実施例３
乳癌組織の糖蛋白質のレクチンブロット分析
（１）方法
乳癌の進行度がステージ１の患者２名（患者１及び患者２）とステージ２の患者２名（患者３及び患者４）の患者から、外科摘出した癌部の組織（それぞれ１Ｒ、２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ）と非癌部の組織（それぞれ１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ）をアセトン処理してサンプルを調製した。これらのサンプルについて、実施例２と同様にしてレクチンブロット分析を行った。
同時に、実施例２と同様に、ＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅ及びＮ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ処理をした場合、ＲＣＡ−Ｉを用いた場合、ＣＢＢ染色した場合の実験も行った。
（２）結果
得られた結果を図２に示した。左下に示したＷＦＡで染色した結果から分かるように、非癌部の糖蛋白質ではＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造が検出されたのに対して、癌部の糖蛋白質ではこのような構造が僅かにしか検出されなかった。また、ステージ１の患者に比べてステージ２の患者からの糖蛋白質の方がより僅かしかＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造が検出されなかった。
このことから、ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→構造の検出により、乳癌の進行度あるいは悪性度を診断できる。
実施例４
ＷＦＡによる乳癌組織の染色像
（１）方法
乳癌患者から採取したステージ１、ステージ２及びステージ３の癌組織並びに良性腫瘍組織を、パラフィン固定後、パーオキシダーゼ標識ＷＦＡ（１０μｇ／ｍｌ）と反応させ、３，３’−ジアミノベンチジンと反応させ可視化した。
（２）結果
得られた結果を図３に示した。図３のａ、ｂ、ｃおよびｄは、それぞれステージ１、ステージ２、ステージ３の乳癌組織及び良性腫瘍組織についての結果を示す。癌部ではＷＦＡによる染色が低下し（ａ）又は消失し（ｂ、ｃ）、非癌部では染色した。
実施例５
乳癌組織のＷＦＡの反応性と術後の患者の余命
（１）方法
ある病院で乳癌患者から採取した乳癌組織（病理組織用）を実施例４と同様の方法で染色し、乳癌患者の手術後の余命との関係を解析した。
（２）結果
得られた結果を、図４に示した。図４において、ＷＦＡ＋は、ＷＦＡと反応したステージ１の乳癌患者３１名の手術後の余命を示し、ＷＦＡ−は、ＷＦＡとの反応性が低下または消失したステージ２及び３の乳癌患者３０名の手術後の余命を示す。１０年生存率がＷＦＡ＋で７０％、ＷＦＡ−で３８％であることが分かる。
これらの結果から、本発明の診断法により、乳癌患者の手術後の予後診断が可能であることが分かる。
産業上の利用可能性
以上に詳述したように、本発明の診断法により乳癌の有無はもとより、乳癌の進行度あるいは悪性度、乳癌手術後の予後診断等を高精度に効果的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、健常ヒトの乳汁中の糖蛋白質のレクチンブロット分析結果を示す図面である。
図２は、乳癌患者の糖蛋白質のレクチンブロット分析結果を示す図面である。
図３は、レクチンによる乳癌組織の染色像を示す。
図４は、乳癌組織のＷＦＡの反応性と術後の患者の余命との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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