(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンを含有する蛋白質水溶液から免疫グロブリン蛋白質凝集体を、次の濾過工程：
該蛋白質凝集体を含有する蛋白質溶液を限外濾過膜を介して約１〜約１０ｐｓｉ（約６．９×１０3〜約６．９×１０4Ｐａ）の膜を横切る圧力で接線方向流れ濾過により濾過して、免疫グロブリン蛋白質のモノマーとダイマーの水溶液よりなる透過液流れと保持液流れを生成させ、
蛋白質を含まない水溶液を前記保持液流れに添加して該保持液流れの実質的に一定の容積を保持し、
実質的に一定の容積を有する前記保持液を前記接線流れに再循環させること
によって、クロマトグラフィーなどの追加の除去工程を実施することなく、除去することを特徴とする、免疫グロブリンを含有する蛋白質溶液から免疫グロブリン蛋白質凝集体を選択的に除去する方法。
【請求項２】
膜を横切る圧力が約１〜約４ｐｓｉ（約６．９×１０3〜約２．８×１０4Ｐａ）である請求項１の方法。
【請求項３】
前記濾過工程が限外濾過膜から保持された蛋白質凝集体をフラッシュすることをさらに含む請求項１の方法。
【請求項４】
前記濾過工程が限外濾過膜から保持された蛋白質凝集体をフラッシュすることをさらに含む請求項２の方法。
【請求項５】
免疫グロブリンを含有する蛋白質水溶液から免疫グロブリン蛋白質凝集体及びウイルス粒子を、次の二段階濾過工程：
（１）該蛋白質凝集体を含有する蛋白質溶液を、セルロース限外濾過膜を介して約１〜約１０ｐｓｉ（約６．９×１０3〜約６．９×１０4Ｐａ）の膜を横切る圧力で接線方向流れ濾過により濾過して免疫グロブリン蛋白質モノマーの水溶液よりなる透過液流れと保持液流れを生成させ、蛋白質を含まない水溶液を前記保持液流れに添加して該保持液流れの実質的に一定の容積を保持し、そして実質的に一定の容積を有する前記保持液を前記接線流れに再循環させること、及び
（２）前記透過液流れを約５００ｋＤ〜約１０００ｋＤの分子量カットオフを有する第二の限外濾過膜を介して濾過してウイルス粒子を少なくとも３ＬＲＶのレベルで前記第二の限外濾過膜に保持し、かつ、ウイルスを含まない免疫グロブリン蛋白質水溶液よりなる第二の透過液流れを形成させること
によって、クロマトグラフィーなどの追加の除去工程を実施することなく、除去することを特徴とする、免疫グロブリンを含有する蛋白質水溶液から免疫グロブリン蛋白質凝集体及びウイルス粒子を選択的に除去する方法。
【請求項６】
膜を横切る圧力が前記約１〜約４ｐｓｉである請求項５の方法。
【請求項７】
前記二段階濾過工程が限外濾過膜から保持された蛋白質凝集体をフラッシュすることをさらに含む請求項５の方法。
【請求項８】
前記二段階濾過工程が限外濾過膜から保持された蛋白質凝集体をフラッシュすることをさらに含む請求項６の方法。
【請求項９】
前記二段階濾過工程が第二の限外濾過膜から保持された蛋白質をフラッシュすることをさらに含む請求項６の方法。
【請求項１０】
前記二段階濾過工程が第二の限外濾過膜から保持された蛋白質をフラッシュすることをさらに含む請求項７の方法。
【請求項１１】
前記二段階濾過工程が第二の限外濾過膜から保持された蛋白質をフラッシュすることをさらに含む請求項８の方法。
【請求項１２】
第二の限外濾過膜による濾過を接線流れ濾過により実行する請求項５の方法。
【請求項１３】
第二の限外濾過膜による濾過を静止型流れ濾過により実行する請求項５の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、蛋白質溶液から蛋白質凝集体を選択的に除去する方法に関する。更に具体的には、これは、蛋白質溶液から蛋白質凝集体及びウイルスを選択的に除去する方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
ポリクローナル抗体を含む免疫グロブリン蛋白質（ＩｇＧ）のような蛋白質溶液は、蛋白質トリマー又はそれより高級のポリマーよりなる蛋白質凝集体を普通に含有する。この溶液を患者に投与するためには、まず第一にこれらの凝集体を除去して患者による毒素反応を避ける必要がある。凝集体は、通常の濾過プロセスを利用するときには好ましくない。なぜならばフィルターが、０．１〜０．２％の低い凝集体濃度でさえも凝集体により急速に目詰まりするからである。従って、高価なゲルクロマトグラフィーや寸法排除クロマトグラフィープロセスを利用して、選択的な凝集体除去をもたらすことが必要であった。
【０００３】
ウイルスはまた、全生物又は哺乳動物の細胞培養源のいずれかに由来する蛋白質を含む非経口用溶液及び他の溶液中の潜在的な汚染物質である。現在、ウイルスを不活性化するためにいくつかの化学的及び物理的方法が存在する。これらの方法は、全てのウイルスに等しく一般的なものではなく、蛋白質活性を犠牲にして作用するものもある。例えば、蛋白質の変性を安定剤の添加により最小限にすることができる溶液では、熱殺菌が使用される。バイオテクロジー産業において、ウイルスの除去能力及び蛋白質回収を最大限にするようにダウンストリームプロセスにおいていくつかの不活性化又は除去工程を組み合わせる戦略が採用されてきた。用いられる操作は、一般的には、非経口用製品を精製するように最適化された操作であり、ウイルス除去能力について有効性が確認されている。かくして、ウイルス除去は、通常の操作の副産物に由来する追加的能力である。最後に、プロセスの終わりに、クロマトグラフィー、濾過又は加熱のような工程を加えて全ウイルスの排除を高めることができる。この戦略は、２つの欠点を有する。
（１）これらの操作のウイルスの排除をアッセイすることができない推定上のウイルスに適用することはできないこと及び（２）プロセスのウイルスの排除を、継続的にモニターする必要があること。少なくとも３のログ(log)保持値（即ち、少なくとも約９９．９％の除去率）でウイルスを除去することが必要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、濾過プロセスで利用される濾過膜の早期の目詰まりを避ける濾過プロセスにより蛋白質溶液から蛋白質凝集体を除去する方法を提供することが望ましいであろう。更に、少なくとも３のログ保持値で蛋白質溶液からウイルスを除去する方法と組み合わせて利用することができる上記の方法を提供することが望ましいであろう。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、蛋白質溶液由来の蛋白質ダイマー、蛋白質トリマー及びそれより高級な蛋白質ポリマーを含む蛋白質凝集体を除去する方法を提供する。凝集体を含有する蛋白質溶液が、約５００ｋＤ〜約１０００ｋＤの分子量カットオフ（低い分極条件の下で膜により９０％阻止される溶質の分子量）を有するセルロース限外濾過膜を介して濾過される。供給物は、それが膜表面に沿って接線方向に通されて保持液流れ及び透過液流れを生じさせる接線流れ濾過により濾過される。約１〜約１０ｐｓｉ（約６．９×１０3Ｐａ〜約６．９×１０4Ｐａ）の膜を横切る圧力を用いて濾過を行う。保持液は、緩衝溶液を保持液に添加することによって、供給物中の本質的に一定の蛋白質濃度の条件下で蛋白質溶液供給物のためのリザーバーに再循環される。ウイルスを含有する蛋白質溶液を濾過するときは、利用されるフィルターはウイルス粒子を保持することができる。濾過膜は、定期的に水又は水性緩衝液で洗浄して保持された蛋白質凝集体を除去し、それにより膜の再利用が可能となる。
【０００６】
第二の濾過工程を利用して選択的にウイルスを保持するときは、濾過は、接線流れ濾過（ＴＦＦ）又は透過液流れが濃縮液流れの形成を避けながら生じるような静止型（通常）濾過（ＮＦＦ）のいずれかにより限外濾過膜を用いて行うことができる。限外濾過膜は、ウイルス粒子を保持する一方、蛋白質モノマーが膜を通過させる。ＴＦＦを利用するときは、保持液は、リザーバーに再循環され、次いで膜と実質的には全ての蛋白質が膜を通過するまで接触される。濾過工程に引き続き、膜は水又は緩衝水溶液でフラッシュして膜により保持された蛋白質を回収する。
【０００７】
蛋白質溶液から蛋白質凝集体及びウイルス粒子を除去するこの発明の２つの工程プロセスの使用は、従来技術の１工程の濾過プロセスを越える実質的な利点を提供する。膜は、凝集体を除去する第一工程に用いられる膜は水、緩衝液又は洗浄剤で洗浄して保持された凝集体を除去するので、その膜は蛋白質溶液から蛋白質凝集体を除去する同一の目的のために再使用することができる。更に、ウイルス粒子を除去する第二工程において利用される膜は、蛋白質凝集体で汚染されることがないので、膜が蛋白質凝集体で目詰まりしなくなるため、膜の有用な寿命は延びる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
発明の具体的な説明
この発明に従って、蛋白質溶液は、まず限外濾過膜により蛋白質トリマー及びそれより高級な蛋白質ポリマーを含む蛋白質凝集体を選択的に保持する一方で、蛋白質モノマーを通過させるように濾過される。蛋白質溶液中の蛋白質ダイマーの一部は膜により保持されるが、溶液状蛋白質ダイマーの一部は膜を通過する。この濾過工程は、約５００〜約１０００キロダルトン（ｋＤ）の分子量カットオフを有するセルロース限外濾過膜を利用して特定の条件の下で行われる。濾過は、約１〜約１０ｐｓｉ（約６．９×１０3Ｐａ〜約６．９×１０4Ｐａ）、好ましくは約１〜約４ｐｓｉ（約６．９×１０3〜約２．８×１０4Ｐａ）の膜を横切る圧力を利用しながら接線流れ濾過（ＴＦＦ）により行われる。これらの条件を利用するときには、実質的に完全な蛋白質凝集体の除去が行われる一方、約８５％より高い、好ましくは９０％より高い蛋白質モノマーの回収率が可能である。
【０００９】
典型的な適当なセルロース限外濾過膜は、再生セルロースから形成されるもの、例えばミリポア社（ベッドフォード、マサチューセッツ、米国）から入手可能なＶｉｒａ  Ｐｕｒａ（商標）セルロース限外濾過膜を含む。濾過は、供給蛋白質溶液を膜と並流で接触させる１又は複数の限外濾過膜で行われる。
【００１０】
蛋白質凝集体を実質的に含まない蛋白質溶液からウイルスを除去するときは、第一膜濾過工程からの透過液は、第二膜濾過工程に向けられる。第二濾過工程はまた、ＴＦＦ方式又はＮＦＦ方式のいずれかで行うことができる多くの限外濾過膜のうちの一つを利用する。いずれの方式でも、濾過は、一般に直径２０〜１００ナノメーター（ｎｍ）を有するウイルスを膜上に保持するが、蛋白質モノマー及び蛋白質ダイマーの一部を通過させるような条件下で行われる。更に、供給流れの濾過を終えたとき、膜は水又は緩衝水溶液でフラッシュされて保持された蛋白質を除去する。フラッシング工程の使用により、実質的にウイルスを含まない高収率の蛋白質溶液を得ることができる。
【００１１】
ウイルス除去工程で利用できる代表的な適当な限外濾過膜には、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリイミド、ポリ二弗化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等から形成されるものが含まれる。
【００１２】
この発明のプロセスで利用される限外濾過膜は、直径２０〜１００ｎｍのウイルスについて対象となっている寸法範囲で、ウイルス粒子及び粒子直径とともに単調に増加するその他の粒子についてログ保持値（ＬＲＶ；ふるい分け係数の負の対数）により特徴付けられる。経験的に、ＬＲＶは、粒子投影面積（粒子直径の２乗）の寸法とともに連続的に増加する。蛋白質溶液から小寸法のウイルス粒子を除去することに関わっている場合には、少なくとも約３の満足のいくＬＲＶが得られる。しかしながら、分子量カットオフを減ずるとそれにより蛋白質回収率を減ずることになる。それ故、使用者は、満足のいくＬＲＶ及び蛋白質回収率を与える膜を選択するであろう。いずれにしても、この発明のプロセスにおいて利用される膜は、ウイルスについては３のＬＲＶを生じさせることができ、ウイルス粒子寸法が１０〜１００である場合には約８倍以上もの大きさに高めることができる。更に、この発明のプロセスにおいて利用されるウイルス除去膜は、約５００〜１０００ｋＤの蛋白質分子量カットオフにより特徴付けられる。全ての場合において、粒子投影面積との経験的な関係が保持される。ウイルス粒子（溶液状の単一の溶質；蛋白質の不在）についてのログ減少値は、ウイルス粒子寸法に依存する。例えば、肝炎ウイルスのような小寸法ウイルスでは、約３よりも大きいＬＲＶを得ることができ、ＡＩＤＳウイルスのようなより大きい寸法のウイルスでは、６よりも大きいＬＲＶを得ることができる。
【００１３】
以下の例は、本発明を例示したものであって、それを限定する意図はない。
【００１４】
【実施例】
例１
図に示した２段階の濾過システムを用いて２０時間で３０００リットルの２０ｇ．ｌＩｇＧ溶液を処理するためには、第一段階は、１６ｍ2の膜面積を要求する。この膜により保持された蛋白質凝集体は、濾過後に水又は緩衝水溶液でフラッシュすることにより再生されるので、膜の有用な寿命は約１年である。ウイルス除去のための対象プロセスコストをグラム当たり１ドルと仮定すれば、この第一段階の濾過についてのグラム当たりの操作コストは、０．０４３ドルである。ウイルスを除去するための第二のシステムを付加することにより、１０ｍ2のフィルター面積が要求されるだけである。第二段階の操作コストは、０．７１ドルである。一緒にすると、全操作コストは、０．７５３ドルで、３０％の節約となる。ＩｇＧ溶液が高モノマー含有率（＞９４％）を有するときには、ミリポア社（ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手可能なＶｉｒｅｓｏｌｖｅ  １８０膜のようなＰＶＤＦ膜で通常流れの濾過を、ウイルスの排除段階のために用いることができる。質量流束５２５ｇｍ／ｈと仮定すると、第二段階の操作コストは、グラム当たり０．３４ドルで、両方の段階についてグラム当たり０．３８３ドルで、６０％の節約となる。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
この発明のプロセスの第一段階１０において、蛋白質溶液１２をリザーバー１４により保持し、ポンプ１８により導管２０及び２２を介してＴＦＦ濾過ユニット１６へ汲み出す。保持液を、濾過ユニット１６からリザーバー１４へ導管２４を介して再循環させる。濾過ユニットからの透過液を、第二段階３４において加工処理するために透過液ポンプ３０により導管２８及び導管３２を通過させる。水性緩衝液を弁３８及び導管４０を介してリザーバー１４にポンプ輸送することによりリザーバー内に本質的に一定容積を維持する。緩衝液の流れは、弁３８を制御する紫外線センサー４２を用いて蛋白質濃度を測定することにより制御する。この方法で操作することにより蛋白質凝集体を膜４４により保持する一方、蛋白質モノマーは膜４４を介して通過させる。
【００１７】
第二段階３４において透過液蛋白質溶液からのウイルス除去をＴＦＦシステム５０又はＮＦＦシステム５２のいずれかで行うことができる。
【００１８】
ＮＦＦシステム５２を利用するときは第一段階からの透過液を、導管３２から導管５４中に向け、次いで静止型濾過ユニット５６中に向ける。実質的にウイルスを含まない蛋白質溶液を導管５８を介して回収する。
【００１９】
ＴＦＦシステム５０を利用するときは導管３２からの蛋白質溶液を導管６０に向ける。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を例示する流れ図である。
【符号の説明】
１０  第一段階
１２  蛋白質溶液
１４  リザーバー
１６  ＴＦＦ濾過
１８  ポンプ
２０  導管
２２  導管
２４  導管
２８  導管
３０  透過液ポンプ
３２  導管
３４  第二段階
３８  弁
４０  導管
４２  紫外線センサー
４４  膜
５０  ＴＦＦシステム
５２  ＮＦＦシステム
５４  導管
５６  濾過
５８  導管
６０  導管
【図１】
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