(57)【要約】本発明は、有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含有するアポトーシス誘導剤に関する。
2002028399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を含有するカスペースカスケード活性化剤。
【請求項３】
アルキルカルボニルの炭素数が１０〜２０、アルカノールアミンの炭素数が１〜６である請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
アルキルカルボニルの炭素数が１０〜２０、アルカノールアミンの炭素数が１〜６である請求項２記載のカスペースカスケード活性化剤。
【請求項５】
有効成分が、ジミリストイルホスファチリジコリンである請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項６】
有効成分が、ジミリストイルホスファチリジコリンである請求項２記載のカスペースカスケード活性化剤。
【請求項７】
請求項１、３又は５記載のアポトーシス誘導剤により腫瘍細胞をアポトーシスさせる制癌剤。
【請求項８】
請求項２、４又は６記載のカスペースカスケード活性化剤によりカスペースカスケードを活性化させることにより腫瘍細胞をアポトーシスさせる制癌剤。
【請求項９】
ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を含有してなる分子集合体により腫瘍細胞のカスペースカスケードを活性化させることにより腫瘍細胞をアポトーシスさせる制癌剤。
【請求項１０】
分子集合体がリポソームである請求項９記載の制癌剤。
【請求項１１】
ジミリストイルホスファチジルコリンと医薬上許される担体及び／又はアジュバントとからなる制癌剤。
【請求項１２】
ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を有効成分とする、細胞増殖性疾患、奇形又は自己免疫疾患のいずれかに対する予防剤又は治療剤。
【請求項１３】
ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を有効成分とする、急性白血病、慢性白血病、悪性黒色腫、肺癌、肝臓癌、胃癌、悪性脳腫瘍の予防剤又は治療剤。
【請求項１４】
アポトーシス誘導剤を製造するためのジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物の使用。
【請求項１５】
カスペースカスケード活性化剤を製造するためのジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物の使用。
【請求項１６】
制癌剤を製造するためのジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物の使用。
【請求項１７】
有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を、腫瘍細胞に接触させて腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する方法。
【請求項１８】
有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を、腫瘍細胞に接触させて腫瘍細胞のカスペースカスケードを活性化する方法。
【請求項１９】
有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を、細胞増殖性疾患、奇形又は自己免疫疾患のいずれかの疾病の患者に投与することを含む、これらの疾病の予防又は治療方法。
【請求項２０】
有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を、急性白血病、慢性白血病、悪性黒色腫、肺癌、肝臓癌、胃癌、悪性脳腫瘍のいずれかの疾病の患者に投与することを含む、これらの疾病の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、新規アポトーシス誘導剤、カスペースカスケード活性化剤及び制癌剤に関する。
アポトーシスの概念が最初に提唱されたのはＫｅｒｒ、Ｗｙｌｌｉ．Ｃｕｒｒｉｅによる１９７２年の報告である（Ｋｅｒｒ　Ｊ．Ｆ．Ｒ．，Ｗｙｌｌｉｅ　Ａ．Ｈ．ａｎｄ　Ｃｕｒｒｉｅ　Ａ．Ｒ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２６，２３９〜２５７（１９７２））。アポトーシスは、細胞の縮小、クロマチンの凝縮、ＤＮＡのヌクレオソーム単位（約１８０ｂｐ）での断片化などの著しい形態変化によって特徴付けられ、ネクローシス（壊死）が外部刺激の物理的作用による突発的な細胞死であるのに対し、個体維持のために遺伝子に制御された細胞死として定義される。
アポトーシスのメカニズムは、誘導、決定、実行の３つの経路を経ると考えられている。アポトーシスのメカニズムにおいて主要な役割を果たしている決定過程は２つの伝達経路を有している。その１つは、ミトコンドリアを介する経路でありＢｃｌ−２ファミリーがこの経路を制御している。もう１つは、カスペースによる自己分解および、カスペースカスケードの下位のカスペースの限定分解による伝達経路、いわゆるカスペースカスケードである。
このアポトーシスの分子メカニズムは、Ｈｏｒｖｉｔｚ、Ｙｕａｎらが線虫を用いて調べた。彼らは線虫を構成する細胞のアポトーシスに関与する合計１４の遺伝子を発見し、アポトーシス実行因子としてｃｅｄ−３、ｃｅｄ−４、抑制因子としてｃｅｄ−９が特に重要であることを見出した。遺伝子同定の結果、ｃｅｄ−３がヒトＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）というシスティンプロテアーゼと相同性が高いことが判明した（Ｙｕａｎ　Ｊ．，Ｓｈａｈａｍ　Ｓ．，Ｌｅｄｏｕｘ　Ｓ．，Ｅｌｌｉｓ　Ｈ．Ｍ．ａｎｄ　Ｈｏｒｖｉｔｚ　Ｈ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，７５，６４１〜６５２（１９９３））。さらに、ＩＣＥの過剰発現によりアポトーシスが誘導されることが確認されたことより、ＩＣＥは、ヒトにおいてもアポトーシス実行因子として働いているのではないかと考えられるようになった。しかし、その後報告されたＩＣＥノックアウトマウスでは、アポトーシスの機能に殆ど影響はなかった。また、その後、アポトーシスに特徴的なポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの分解が、ＩＣＥでは起こらないにもかかわらず、ＩＣＥに似たシスティンプロテアーゼによって起こることも明かにされた。これらより、ヒトにおけるアポトーシス実行因子はＩＣＥそのものではなく、ＩＣＥ様の別の酵素ではないかと推測され、ＩＣＥ以外のＩＣＥ様酵素がヒトに存在するものと考えられた。
以上から、ＩＣＥ様酵素の同定がＹｕａｎらの報告以降試みられ、ＩＣＥを含めヒトには１０種類程度のＩＣＥ様酵素があることがわかった。同定されたＩＣＥ様酵素は、Ａｓｐ特異的システィンプロテアーゼということで、酵素名が「カスペース（ｃａｓｐａｓｅ）」に統一され、報告順にカスペース−１（ＩＣＥ）〜カスペース−１０など番号を付け命名され、一般にカスペースファミリープロテアーゼと呼称されるようになった。
現在、カスペースは基質特異性から大きく３つに分類され、カスペース−１を中心とするＩ群はインターロイキンの生成と分泌に関与していると考えられ、カスペース−３を中心とするＩＩ群はアポトーシスの実行分子の中心と考えられ、カスペース−８／−９に代表されるＩＩＩ群はカスペースのタンパク質分解カスケードの上流に位置し、アポトーシスのための細胞死シグナルを伝える働きがあると考えられている。
カスペースファミリーは共通の活性中心シークエンスにより、Ａｓｐ（Ｄ）のＣ末端側を切断する活性を持ち、それぞれ若干異なる基質特異性を持つ。一般にカスペースは、不活性の前駆体として作られ、活性化酵素により２つのサブユニットに切断され、活性型カスペースとなるが、前駆体の活性化における切断部位は、カスペース分子内のＡｓｐ残基のＣ末端側であり、カスペースの基質認識部位と一致している。従って、カスペース自身が別のカスペースを活性化するメカニズムが働いていると推測される。Ｆａｓにより誘導されるアポトーシスでは、カスペース−１の活性化の後、カスペース−３様の活性が増大するという現象が見られ、カスペース−３がカスペース−１の下流域に位置することが知られている（Ｅｎａｒｉ　Ｍ．，Ｔａｌａｎｉａｎ　Ｒ．Ｖ．，Ｗｏｎｇ　Ｗ．Ｗ．ａｎｄ　Ｎａｇａｔａ　Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８０，７２３〜７２６（１９９６））。このことから、アポトーシスの実行過程では、いくつかのカスペースが連続的に活性化される、いわゆるカスペースカスケードを形成していることが推定される。また、カスペースは、細胞内のタンパク質を分解することにより、アポトーシスの実行過程においても重要な働きをしている。
このように、ヒトで多数のカスペースが存在するのは興味深く、個体を維持するため、複雑なカスペースネットワークが形成されていると考えられている。
しかし、実際にはどのようなメカニズムでカスペースカスケードが活性化されるか、現在のところ未解明の部分が多い。
上述したように、生体内で重要な役割を果たすアポトーシス及びカスペースカスケードは、医薬品の開発においても重要であり、アポトーシス及びカスペースカスケードのメカニズムを利用することにより、アポトーシス誘導のメカニズムが正常に機能しない癌など、細胞増殖性疾患の治療薬を開発することが考えられている。
例えば、特開２０００−１４３５３２号公報には、薬理活性成分として環状ＲＧＤ配列を持つ薬剤により、カスペースカスケードを活性化し、アポトーシスを誘導することで細胞増殖性疾患を治療することが示されている。しかしながら、ジミリストイルホスファチジルコリンを有効成分とするようなアポトーシス誘導剤及びカスペースカスケード活性化剤については、これまでに知られていない。
一方、脂質成分を用いた制癌剤は、幾つか知られている。一般に脂質成分を用いた制癌剤は、リポソームや乳剤などの形態で、薬物を運ぶ担体として脂質成分を用いることが殆どであり、脂質成分そのものが制癌剤として作用するとしたものは少ない。脂質成分の癌に対する有効性を示した公報を以下に列挙する。特開平６−２５６１８１号公報には、トコフェロールを有効成分とする細胞分化誘導剤が示され、癌の治療・改善剤として有効であることが記載されている。特開平１−２０３３３０号公報には、ドコサヘキサエノイル−リゾホスファチジルコリンを有効成分とする制癌剤が記載されている。特開平１−２０３３２２号公報にはドコサヘキサエノイルモノグリセリドを有効成分とする制癌剤が記載されている。特開平１−２０３３３１号公報には１，２−ジドコサヘキサエノイル−ホスファチジルコリンを有効成分とする制癌剤が記載されている。特開平３−１６３０３１号公報にはリン脂質とミセル界面活性剤によって形成した混合分子集合体に抗癌剤を加えた液体膜制癌剤が記載されている。特開平２−１１５１６号公報にはリン脂質の一種を有効成分とした制癌剤が記載されている。既知のリン脂質を利用した制癌剤について、その制癌メカニズムについてはまったく解明されておらず、ましてや制癌活性がアポトーシスによるものであるとしたような研究は知られていなかった。
発明の開示
本発明の第一の目的は、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン等を有効成分として含有する新規アポトーシス誘導剤を提供することにある。
本発明の第二の目的は、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン等を有効成分として含有する新規カスペースカスケード活性化剤を提供することにある。
本発明の第三の目的は、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン等を有効成分として利用する副作用のない制癌剤を提供することにある。
本発明者らは、リン脂質の一種として良く知られるジミリストイルホスファチジルコリン等のグリセロリン脂質に注目し、意外にもこれらの化合物がアポトーシス誘導剤、及びカスペースカスケード活性化剤として作用することを見出し、これが従来の制癌剤と比較して、副作用が無く安全性が高い制癌剤として利用できるという新たな知見を得て本発明を完成した。
即ち、本発明は、有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含有することを特徴とするアポトーシス誘導剤を提供する。
本発明はまた、有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含有することを特徴とするカスペースカスケード活性化剤を提供する。
本発明また、これらのアポトーシス誘導剤又はカスペースカスケード活性化剤により腫瘍細胞をアポトーシスさせることを特徴とする制癌剤を提供する。
本発明また、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン等を有効成分として含有してなる分子集合体により腫瘍細胞のカスペースカスケードを活性化させることにより腫瘍細胞をアポトーシスさせることを特徴とする制癌剤を提供する。
本発明はさらに、ジミリストイルホスファチジルコリンと医薬的に許される担体及び／又はアジュバントからなる制癌剤を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、「アポトーシスさせる」とは、細胞の縮小、クロマチンの凝縮、ＤＮＡのヌクレオソーム単位（約１８０ｂｐ）での断片化などの著しい形態変化によって特徴付けられた、医学および生物学において形態学的、生化学的に定義された変化を細胞に生じせしめることであり、ネクローシス（壊死）と異なったプログラム細胞死に至らせることをいうものである。細胞がアポトーシスしているかどうかは、電気泳動によるＤＮＡラダーの観測や、光学顕微鏡による形態観察など、公知の方法によって確認することができる。
また、本明細書において、「カスペースカスケードを活性化させる」とは、カスペースと呼ばれるＡｓｐ特異的システィンプロテアーゼ（アスパラギン酸のＣ末端を加水分解する酵素）により細胞内に構築されるアポトーシスのシグナル伝達ネットワークのなかで、いずれかのカスペースを活性化された状態に至らしめ、カスペースカスケードを活性化させることをいうものであり、必ずしも細胞内の全ての種類のカスペースを活性化させることをいうのではない。また、多様なカスペースのうち、いずれが活性化するかは、細胞の種類や条件などにより異なる場合がある。
カスペースの活性化は、カスペース阻害剤を用いたフローサイトメーターでの阻害実験や、ウエスタンブロット法によるカスペース分解物の検出などの公知の方法を用いることにより推定・確認することができる。
また、本明細書において「腫瘍細胞」とは、いわゆる癌などを構成する細胞、またはそれに由来・関連する細胞であって、一般に腫瘍細胞といわれる細胞であるなら特に限定されない。また、疾患として器官組織内にある細胞だけでなく、ホモジネートした組織から分離したり、また試験用細胞として一般に供される培養細胞や、これら腫瘍細胞由来のハイブリドーマなども含み、ヒト細胞だけに限定されるわけでもない。このような腫瘍細胞としては、例えば、急性白血病、慢性白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症などの造血器腫瘍や、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、胆嚢・胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、胎児性横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫などの固形腫瘍を形成する細胞があげられる。
本明細書において、「医薬上許される担体及び／又はアジュバント」という用語は、ジミリストイルホスファチジルコリンと一緒に患者に投与することができ、ジミリストイルホスファチジルコリンの薬理学的活性を損なわない無毒性の担体又はアジュバントを表す。
まず、本発明の第一の態様について説明する。
本発明の第一の態様は、有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含有するアポトーシス誘導剤に関する。
本発明のアポトーシス誘導剤は、正常なアポトーシスの機能が抑制されていることによって生ずる種々の疾患の予防又は治療に有効である。このような疾患としては、細胞増殖性疾患、奇形、自己免疫疾患等があげられる。特に、アポトーシスのメカニズムが直接的または間接的に関与している癌などを構成する腫瘍細胞をアポトーシスさせることにより、癌などの細胞増殖性疾患の予防または治療に対して有効である。
従って、本発明はまた、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を有効成分とする、細胞増殖性疾患、奇形又は自己免疫疾患のいずれかに対する予防剤又は治療剤に関する。
本発明はまた、アポトーシス誘導剤を製造するためのジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物の使用に関する。
本発明はまた、有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を腫瘍細胞に接触させて腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する方法に関する。
本発明はまた、有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を、細胞増殖性疾患、奇形又は自己免疫疾患のいずれかの疾病の患者に投与することを含む、これらの疾病の予防又は治療方法に関する。
本発明で用いる有効成分に含まれる２つのアルキルカルボニルは、同じでも異なっていても良いが、同じであるのが好ましい。アルキルカルボニル基の炭素数は１０〜２０であるのが好ましく、１０〜１８であるのがより好ましく、さらに好ましくは１２〜１６、特に好ましくは１４である。また、アルキルカルボニル基におけるアルキル基部分は直鎖でも分岐鎖でもよい。
本発明で用いる有効成分がジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミンの場合、アルカノール部分の炭素数は１〜６であるのが好ましく、１〜３がより好ましく、特に２であるのが好ましい。
本発明で用いる好ましい有効成分は、以下の一般式（１）で表される。
2002028399.tif 000003
一般式（１）において、Ｒ１は、ＣＨ３（ＣＨ２）ｍ−２である。ここで、ｍは、１０〜１８、好ましくは１２〜１６、より好ましくは１４の整数である。
Ｒ２は、ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ、又は下記式（２）
2002028399.tif 000004
で表される基である。
本発明で用いる有効成分としては、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリンが好ましい。
一般式（１）で表される化合物として最も好ましいのは、下記一般式（３）で表されるジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）である。
2002028399.tif 000005
なお、ジミリストイルホスファチジルコリンは、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）又はレシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ）と呼ばれるリン脂質の中の、更にその一種類であり、正式には１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンと呼ばれる。ジミリストイルホスファチジルコリンは、ジミリストイルレシチンやＬ−α−ジミリストイルホスファチジルコリンと称されることもある。
本発明で用いる有効成分は、単独又は二種以上を混合して使用することができる。二種以上を混合して使用する場合、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、特に、ＤＭＰＣと他の有効成分とを併用するのが好ましい。
本発明で用いられるジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン等の有効成分は、天然物由来であっても化学合成品由来であってもよい。天然物由来である場合、動物、植物、微生物などの原料、例えば脳、肝臓、卵黄、大豆、酵母などから公知の方法により抽出・分離・精製して得ることが出来る。また市販のレシチンを原料として、脂肪酸鎖長の違いを利用した公知の分離方法を利用することによりこれらの有効成分を得ることもできる。化学合成品由来の場合、公知の合成化学の知識を駆使することにより、容易にこれらの有効成分を合成することができるが、例えばジミリストイルホスファチジルコリンの場合、グリセロホスフォコリンにミリスチン酸を公知の方法で導入するなどの手法により得ることも出来る。また、市販品を利用してもよく、医薬品グレードの高純度のものが特に好ましい。例えば、ＤＭＰＣとして、日本油脂株式会社（ＮＯＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からコートソームＭＣ−４０４０（ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＭＣ−４０４０）の商品名で市販されている。
本発明のアポトーシス誘導剤は、有効成分をそれ自体公知の薬理的に許容される担体、賦形剤、崩壊剤、矯正剤、増量剤、希釈剤、溶解補助剤などと混合し、公知の方法に従って医薬組成物、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、丸剤、溶剤、ドリンク剤、注射剤、点滴剤、座剤などの形態に製剤化することができる。このような製剤は経口的もしくは非経口的に投与することができる。
本発明のアポトーシス誘導剤を疾患の治療等に使用する場合の投与量は、投与対象、投与経路、症状などによっても異なるが、血中に投与する場合、一回量として有効成分を１×１０−１〜１×１０−６Ｍの濃度で含む溶液０．０１〜１００ｍｌ／ｋｇ体重を１日１〜３回程度投与するのが好適である。有効成分を５×１０−２〜５×１０−４Ｍの濃度で含む溶液１〜５０ｍｌ／ｋｇ体重を１日１〜３回程度投与するのがより好ましい。
次に、本発明の第二の態様について説明する。
本発明の第二の態様は、有効成分としてジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含有するカスペースカスケード活性化剤に関する。
本発明のカスペースカスケード活性化剤は、正常なカスペースカスケード活性化の機能が抑制されていることによって生ずる種々の疾患の予防または治療に有効である。このような疾患としては、細胞増殖性疾患、奇形、自己免疫疾患等があげられる。特に、カスペースカスケードを活性化させることにより、アポトーシスのメカニズムの正常化を促し、癌などを構成する腫瘍細胞等の細胞増殖性疾患の予防または治療に対して有効である。
従って、本発明はまた、カスペースカスケード活性化剤を製造するためのジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物の使用に関する。
本発明はまた、有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を腫瘍細胞に接触させて腫瘍細胞のカスペースカスケードを活性化する方法に関する。
本発明のカスケード活性化剤として用いられる有効成分としては、アポトーシス誘導剤に関して記載したのと同じである。
本発明のカスペースカスケード活性化剤は、有効成分をそれ自体公知の薬理的に許容される、担体、賦形剤、崩壊剤、矯正剤、増量剤、希釈剤、溶解補助剤などと混合し、公知の方法に従って医薬組成物、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、丸剤、溶剤、ドリンク剤、注射剤、点滴剤、座剤などの形態に製剤化することができる。このような製剤は経口的もしくは非経口的に投与することができる。
本発明のカスペースカスケード活性化剤を疾患の治療等に使用する場合の投与量は、投与対象、投与経路、症状などによっても異なるが、注射剤または点滴剤として投与する場合、一回量として有効成分を１×１０−１〜１×１０−６Ｍの濃度で含む溶液０．０１〜１００ｍｌ／ｋｇ体重を１日１〜３回程度投与するのが好ましい。有効成分を５×１０−２〜５×１０−４Ｍの濃度で含む溶液１〜５０ｍｌ／ｋｇ体重を１日１〜３回程度投与するのがより好ましい。
最後に、本発明の第三の態様について説明する。
本発明の第三の態様は、有効成分としてジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を利用する制癌剤に関する。本発明の制癌剤として用いられる有効成分としては、アポトーシス誘導剤に関して記載したのと同じである。
本発明の制癌剤は、正常なカスペースカスケードの活性化の機能が抑制されている腫瘍細胞等に有効に作用することによって、そのカスペースカスケードを活性化させ、該腫瘍細胞等をアポトーシスさせることにより癌を予防または治療することができる。本発明の制癌剤の対象疾患は、いわゆる癌であるならばこれらに限定されないが、上記、造血器腫瘍や固形腫瘍に分類される癌、特に急性白血病、慢性白血病、悪性黒色腫、肺癌、肝臓癌、胃癌、悪性脳腫瘍の予防または治療に対して本発明の制癌剤は特に優れている。
従って、本発明はまた、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を有効成分とする、急性白血病、慢性白血病、悪性黒色腫、肺癌、肝臓癌、胃癌、悪性脳腫瘍の予防剤又は治療剤を提供する。
本発明はまた、制癌剤を製造するためのジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物の使用に関する。
本発明はまた、有効成分として、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる化合物を、急性白血病、慢性白血病、悪性黒色腫、肺癌、肝臓癌、胃癌、悪性脳腫瘍のいずれかの疾病の患者に投与することを含む、これらの疾病の予防又は治療方法に関する。
本発明の制癌剤は、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルアルカノールアミン、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルイノシトール、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルセリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を、それ自体公知の薬理的に許容される担体、賦形剤、崩壊剤、矯正剤、増量剤、希釈剤、溶解補助剤などと混合し、公知の方法に従って医薬組成物、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、丸剤、溶剤、座剤などの形態に自由に製剤化することができる。このような製剤は経口的もしくは非経口的に投与することができる。特に、ドリンク剤、注射剤または点滴剤として用いるのが好ましい。
注射剤または点滴剤、ドリンク剤として投与するとき、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリン等の有効成分を分子集合体に含有させて投与せしめることが好ましく行われる。これらの有効成分を含有させる分子集合体の例としては、脂肪乳剤、高分子ミセル、アルブミンなどのタンパクとの複合体、リポソームなどが挙げられるが、有効成分が水性溶媒中でそれ自身、リポソームを形成する機能を持つなどの理由から、リポソームが最も好ましく挙げられる。
リポソームを形成する場合、有効成分濃度を５×１０−４〜１．０×１０−１Ｍとするのが好ましく、１×１０−２〜５×１０−２Ｍとするのがより好ましい。
本発明におけるリポソームは、公知のいかなる方法によって形成してもよい。例えば薄膜法、逆相蒸発法、凍結融解法、エタノール注入法、高圧乳化法、超音波分散法、透析法、エクストルージョン法など、公知の製造方法を適宜利用することができ、更には特開平９−８７１６８号公報に記載される方法などを利用してもよい。
リポソーム調製に使用できる水性溶媒としては、単なる水を用いても良いし、少量のエタノールなどを含む水性混合溶媒であってもよく、また血漿などであってもよいが、好ましくは局方注射用水や蒸留水、超純水などが用いられる。水性溶媒に公知の生理活性物質や、蛋白質、緩衝物質や各種の塩、血漿、糖などを溶解させ、溶液状としたものを用いてもよい。
このようにして得られるリポソームは、限外濾過、遠心分離、ゲル濾過等の方法によって精製してよく、また濃縮や希釈等の操作を自由に行ってもよい。
また、本発明におけるリポソームには、本発明の目的に反しない程度に、公知のリポソーム構成成分を含有させて用いてもよい。具体的には、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ホスファチジルグリセロールなどのリン脂質が挙げられる。
またリポソームの膜安定成分として少量のコレステロールを用いることもできるが、多量のコレステロールは、ジミリストイルホスファチジルコリンの制癌活性を減ずる恐れがあることから好ましくない。また、荷電物質としてホスファチジン酸や脂肪酸を加えても良い。
さらに、分散安定剤としてポリオキシエチレンドデシルエーテルに代表される、炭素数１０〜２０のアルキルＰＥＧやトライトン、プルロニックなどの商品名で知られる界面活性剤を加えることができる。このうち炭素数１２〜１４のアルキルＰＥＧが好ましい。特に、ジ（アルキルカルボニル）ホスファチジルコリンとミセルを形成する界面活性剤とから形成されるハイブリッドリポソームを用いるのが好ましい。中でも、ＤＭＰＣと炭素数１０〜１６、ＥＯ数２〜３０のアルキルＰＥＧ（好ましくは炭素数１２〜１４、ＥＯ数２〜２４）とを組み合わせるのが好ましい。
また、本発明において、糖をリポソームの分散安定化に寄与し制癌活性を高める目的で水性溶媒中に特に好ましく添加することができる。利用できる糖としては単糖、二糖、オリゴ糖、多糖など公知の糖を目的に応じて特に制限されることなく自由に使用することができるが、特に、蔗糖やトレハロースなどが好ましい。またその添加量も適宜選択されて良い。また、酸化防止剤としてα−トコフェロールなどをリポソームに加えても良い。
調製されるリポソームの直径は、医学的に許容される範囲内であればいかなる直径であってもよいが、２０ｎｍ〜１μｍ程度が好ましく、より好ましくは３０ｎｍ〜３００ｎｍ程度、さらに好ましくは制癌活性を高めるなどの理由から４０ｎｍ〜１８０ｎｍ程度がよい。リポソームは、水性溶媒中に均一に分散するよう調製されるのがよく、沈殿、凝集などが見られる場合、主に物理的な理由から制癌剤として用いるのが困難になるので好ましくない。
本発明の制癌剤を疾患の治療等に使用する場合の投与量は、投与対象、投与経路、症状などによっても異なるが、血中に投与する場合、一回量として有効成分を１×１０−１〜１×１０−６Ｍの濃度で含む溶液０．０１〜１００ｍｌ／ｋｇ体重、好ましくは有効成分を５×１０−２〜５×１０−４Ｍの濃度で含む溶液１〜５０ｍｌ／ｋｇ体重を１日１〜３回程度投与するのがよい。
実施例
以下に実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１
＜リポソームを用いたアポトーシス誘導実験＞
１−１．リポソームの調製
ハイブリッドリポソーム液は、所定量のジミリストイルホスファチジルコリン（商品名コートソームＭＣ−４０４０、日本油脂株式会社製）及びポリオキシエチレンドデシルエーテル（市販品、シグマ社製）とをＰＢＳの入ったナス型フラスコ中にはかりとり、バス型超音波照射器（商品名ＢＲＡＮＳＯＮＩＣ　ＭＯＤＥＬ　Ｂ２２１０：９０Ｗ）で４５℃、１ｍｌ／１ｍｉｎの条件で超音波照射し、更に得られた溶液を０．４５μｍフィルター（商品名，ＡＤＶＡＮＴＥＣ　ＤＩＳＭＣ−１３ｃｐ）で濾過して調製した。
１−２．電気泳動によるＤＮＡラダーの観測結果及び蛍光顕微鏡による細胞断片化観察
１−１で調製したハイブリッドリポソームを用いて、ヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０、理化学研究所細胞銀行より購入したもの）を処理し、そのＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡラダーの観測をした。また、断片化ＤＮＡ−染色法を用いて、蛍光顕微鏡により細胞断片化を観察した。結果をそれぞれ図１及び図２に示す。
実施例２
＜フローサイトメーターによるカスペース−９阻害実験＞
１−１．試薬の調製
・ＲＮａｓｅ溶液は、ＲＮａｓｅ（（市販品、ａｍｒｅｓｃｏ製）を、０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように−ＰＢＳに溶解し、調製した。使用まで冷凍保存した（使用時は室温に戻した）。
・ＰＩ溶液は、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ（市販品、フナコシ株式会社製、ＰＩと略称する）を、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように−ＰＢＳに溶解し、調製した。使用まで遮光冷蔵保存した（使用時は室温に戻した）。
・７０％エタノールは、９９％エタノール（市販品、ナカライテスク株式会社製）と−ＰＢＳを７対３の割合で混合して得た。使用まで冷凍保存した（使用時は室温に戻した）。
・カスペース−９阻害剤（Ａｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｈ、市販品、株式会社ペプチド研究所製、Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＣＨＯと略称することもある）は、１１．０ｍｇはかりとり、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、市販品）４０４μｌに溶解した。使用までサンプル容器の外部を乾燥させた状態で冷凍保存した（使用時は室温に戻した）。
ハイブリッドリポソーム液は、ジミリストイルホスファチジルコリン（商品名コートソームＭＣ−４０４０、市販品、日本油脂株式会社製、ＤＭＰＣと略称することもある）が１．５×１０−２Ｍの濃度になり、分散剤のポリオキシエチレンドデシルエーテル（Ｃ１２（ＥＯ）１０、市販品、シグマ社製）が１．６７×１０−３Ｍの濃度になるように緩衝水溶液である−ＰＢＳの入ったナス型フラスコ中にはかりとり、バス型超音波照射器（商品名ＢＲＡＮＳＯＮＩＣ　ＭＯＤＥＬ　Ｂ２２１０：９０Ｗ）で４５℃、１ｍｌ／１ｍｉｎの条件で超音波照射し、更に得られた溶液を０．４５μｍフィルター（商品名ＡＤＶＡＮＴＥＣ　ＤＩＳＭＣ−１３ｃｐ）で濾過して調製した。また、このようにして得られたジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液は、電気泳動光散乱光度計（商品名Ｐｈｏｔａｌ　ＥＬＳ−８０００、ＯＴＵＫＡ　ＥＲＥＣＴＲＯＮＩＣＳ社製）を用いた動的光散乱法により粒子径測定したところ、リポソームの直径がおよそ７６ｎｍであり、経時変化測定では１ケ月以上安定なことを確認した。
１−２．カスペース阻害実験
１−１で調製した試薬を用いて次の実験を行った。まずヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０、理化学研究所細胞銀行より購入したもの）の懸濁液（５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）１２ｍｌにカスペース−９阻害剤を０〜１２０μｌを段階添加した複数のサンプルを準備し、９０分インキュベートした後、それぞれにジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液２ｍｌを添加し、さらに３時間インキュベートした。これを２ｍｌの−ＰＢＳで洗浄した後、７０％エタノール５ｍｌを加え、氷温で１時間放置し組織固定を行った。さらにこれを２ｍｌの−ＰＢＳで洗浄した後、ＲＮａｓｅ溶液６ｍｌを加え、３０分インキュベートした。次にＰＩ溶液６７０μｌを加え、アルミホイルで遮光し、氷温、暗所で３０分放置しＰＩ染色を行った。ＰＩ染色後、２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上澄みを除去した後、沈殿を５００μｌの−ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーター（商品名ＣＯＵＬＴＥＲ　ＥＰＩＣＳ−ＸＬ）によるＤＮＡ含量測定を行った。
阻害効果は、コントロール（カスペース−９阻害剤を添加せず、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液のみを添加した）のＤＮＡ断片化率に対する、カスペース−９阻害剤を段階添加したサンプルのＤＮＡ断片化率の比で評価し、結果を図３に示した。
１−３．結果
図３から明らかなように、カスペース−９阻害剤により、ほぼ濃度依存的なＤＮＡ断片化率の減少が観察されたことから、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液によるヒト前骨髄性白血病細胞のＤＮＡ断片化には、カスペース−９の活性化が関与することが示唆された。
カスペース−９阻害剤を添加せず、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液のみを添加したコントロールでは、ヒト前骨髄性白血病細胞に明確なＤＮＡ断片化が観察され、アポトーシスが誘導されていることが確認された。
実施例３
＜フローサイトメーターによるプロカスペース−３分解酵素阻害実験＞
２−１．試薬の調製
・プロカスペース−３分解酵素阻害剤（Ａｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｈ、市販品、株式会社ペプチド研究所製、Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯと略称することもある）は、５．４ｍｇはかりとり、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、市販品）３５５μｌに溶解した。使用までサンプル容器の外部を乾燥させた状態で冷凍保存した（使用時は室温に戻した）。
２−２．カスペース阻害実験
実施例１の１−１で調製したカスペース−９阻害剤のかわりに２−１で調製したプロカスペース−３分解酵素阻害剤を用いた以外は、実施例１の１−２と同様に行った。結果を図４に示した。
２−３．結果
図４から明らかなように、プロカスペース−３分解酵素阻害剤により、ほぼ濃度依存的なＤＮＡ断片化率の減少が観察されたことから、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液によるヒト前骨髄性白血病細胞のＤＮＡ断片化には、カスペース−３の活性化が関与することが示唆された。
実施例４
＜フローサイトメーターによるカスペース−１，４阻害実験＞
３−１．試薬の調製
・カスペース−１，４阻害剤（Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｈ、市販品、株式会社ペプチド研究所製、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯと略称することもある）は、５．７ｍｇはかりとり、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、市販品）３８２μｌに溶解した。使用までサンプル容器の外部を乾燥させた状態で冷凍保存した（使用時は室温に戻した）。
３−２．カスペース阻害実験
実施例１の１−１で調製したカスペース−９阻害剤のかわりに３−１で調製したカスペース−１，４阻害剤を用いた以外は、実施例１の１−２と同様に行った。結果を図５に示した。
３−３．結果
図５から明らかなように、カスペース−１，４阻害剤により、ほぼ濃度依存的なＤＮＡ断片化率の減少が観察されたことから、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液によるヒト前骨髄性白血病細胞のＤＮＡ断片化には、カスペース−１または−４の活性化が関与することが示唆された。
実施例５
＜ウェスタンブロット法によるカスペース−３基質分解物の検出＞
４−１．ウェスタンブロッティング法によるカスペース−３基質分解物の検出について
ＤＴＴなどの還元剤を用いてジスルフィド結合を切断したタンパク質試料に、陰イオン界面活性剤であるＳＤＳを添加することにより、タンパク質は変性され、タンパク質にＳＤＳが定量的に結合することで、電気泳動によりタンパク質を分子量により分離することができる。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に電気的にブロッティングし、カスペース−３の基質の一つであるｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰと略称する）の分解物に特異的に結合する一次抗体（Ａｎｔｉ−ＰＡＲＰ　ｐ８５　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙを結合させた後、アルカリホスファターゼ標識した二次抗体（Ｄｏｎｋｅｙ　Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｋａｌｉｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を結合させ、これにアルカリホスファターゼの基質であるＢＣＩＰ及びＮＢＴを添加することで、ＢＣＩＰのリン酸の切断とＮＢＴの還元により不溶性の紫色の沈殿を生じ、抗体を検出することができる。
４−２．ウェスタンブロッティング法による基質分解物の検出試薬の一覧
・Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（１．０Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），４０％ＳＤＳ，２５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ，０．１３Ｍ　ＤＴＴ）
・Ｔｒａｎｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ，０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ，１０％Ｍｅｔａｎｏｌ）
・ＴＢＳＴ（０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ，１０％Ｔｗｅｅｎ２０，０．０５Ｍ　ＮａＣｌ）
・Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳＴ＋５％スキムミルク）
・Ａｎｔｉ−ＰＡＲＰ　ｐ８５　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｐＡｂ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
・Ｄｏｎｋｅｙ　Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
・Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
・Ｇｌｙｃｉｎｅ（ａｍｒｅｓｃｏ社製）
・メタノール特級（ナカライテスク株式会社製）
・スキムミルク（雪印社製）
・Ｓｏｄｉｕｍ　Ｌａｕｌｙｌ　Ｓｕｌｆａｔｅ（ナカライテスク株式会社製）
・Ｂｌｏｔ　Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ　ＢＳＡ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
・Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ナカライテスク株式会社製、Ｔｒｉｓと略称する）
・Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ（和光純薬株式会社製）
・Ｈｙｄｒｏｃｈｏｒｉｃ　Ａｃｉｄ（ナカライテスク株式会社製）
・Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）
・ジチオスレイトール（ナカライテスク株式会社製、ＤＴＴと略称する）
・Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、１０×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
・ＣＢＢ　Ｒ−２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
・ＣＢＢ　Ｒ−２５０脱色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
・Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ　ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
・ＲＥＡＤＹ−ＧＥＬＳ　Ｊ　ｆｏｒ　Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
・Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｕｅ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏｒ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
４−３．ウェスタンブロッティング法によるカスペース−３基質分解物の検出実験操作
４−２の試薬を用いて次の実験を行った。まずヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０、理化学研究所細胞銀行より購入したもの）の懸濁液（５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）１２ｍｌにジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液（［ＤＭＰＣ］＝１．５×１０−２Ｍ，［Ｃ１２（ＥＯ）１０］＝１．６７×１０−３Ｍ）を２ｍｌ添加し、３時間インキュベートした。これを２ｍｌの−ＰＢＳで洗浄した後、２０００ｐｐｍで６分間、遠心分離し、上澄みを除去した後、−ＰＢＳ（４００μｌ）及び５×Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（１００μｌ）を加えた。その後、ポリトロン（商品名ＰＯＬＹＴＲＯＮ　ＰＴ３１００、ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ　ＡＧ社製）乳化器でヒト前骨髄性白血病細胞を破砕（１５０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）し、更に、バス型超音波照射機で３７℃、１０分間超音波照射してホモジネートを作製した。その後、１００℃の湯浴で５分間暖め、１５０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離した。上澄みをｗｅｌｌに１５μｌづつ注入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２００Ｖ，４５ｍｉｎ）によりタンパクを分離した後、ニトロセルロース膜にタンパク質をブロッティング（５０Ｖ，５０ｍｉｎ）し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて３７℃で３０分、ブロッキングを行った。これに一次抗体を転写面に添加し、室温で９０分反応させた後、ＴＢＳＴ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、続いて二次抗体を一次抗体結合面に添加し、室温で９０分反応させた。その後、ＴＢＳＴ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、更に、脱イオン水で洗浄した後、発色基質を添加し、ＰＡＲＰ分解物の検出を行った。結果を図４に示した。
４−４．カスペース−３基質分解物の検出実験の結果
カスペース−３は、アポトーシスシグナルにおいてカスペースカスケード活性化の末端で活性化され、多くの基質を分解することによりアポトーシスを誘導する。４−３の実験により、カスペース−３の基質の一つであるＰＡＲＰの分解物をウェスタンブロッティング法を用いて検出し、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液によるヒト前骨髄性白血病細胞内でのカスペース−３の活性化について検討できた。即ち、図６から明らかなように、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液で処理したものではＰＡＲＰ分解物が検出されたが、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液未添加においては検出されなかった。このことから、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液によりヒト前骨髄性白血病細胞内で、カスペース−３が活性化されることが示唆された。
実施例６
＜ＤＭＰＣのメラノーマに対する抗腫瘍実験＞
５−１．ＤＭＰＣ分散液の調製
ＤＭＰＣ（商品名コートソームＭＣ−４０４０、市販品、日本油脂株式会社製）を所定量秤量し、緩衝水溶液として−ＰＢＳを加え、バス型超音波照射器（商品名ＢＲＡＮＳＯＮＩＣ　ＭＯＤＥＬ　Ｂ２２１０：９０Ｗ）で４５℃、１ｍｌ／１ｍｉｎの条件で超音波照射し、更に得られた溶液を０．４５μｍフィルター（商品名ＡＤＶＡＮＴＥＣ　ＤＩＳＭＣ−１３ｃｐ）で濾過してＤＭＰＣ分散液を調製した。尚、このときＤＭＰＣ秤量時の量をかえることによりＤＭＰＣの濃度が、５．０×１０−２Ｍ、５．０×１０−３Ｍ、５．０×１０−４Ｍの３種のＤＭＰＣ分散液を調製した。
５−２．担癌マウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ治療実験
動物は、Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウス（５週齢、日本チャールスリバーより購入）を５日間の検疫馴化後、６週齢より１群６匹で実験に使用した。飼育環境は、室温２４±２℃、湿度５５±１０％で、水及び餌は自由に摂取させた。
マウスは癌細胞移植当日の体重をもとに層別連続無作為化法により１群６匹づつに群わけを行った。Ｂ１６−Ｆ０メラノーマ細胞（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ）をマウスの腹腔内に移植し、担癌マウスを作成した。ＤＭＰＣ分散液（５−１で調製したもの）の投与方法は、腹腔内投与とし、実験スケジュールは、癌移植当日（移植１時間後）から１２日目まで計１３回投与（２０ｍｌ／ｋｇ体重）を行う実験を行った。投与終了後は、全ての動物が死亡するまで観察を行い、マウスの生存日数を測定し、治療群の平均生存日数を未治療群の平均生存日数で除して得た値に１００を剰じて、延命率（％）を算出した。結果を図７に示し、治療効果を検討した。
以上の結果から、ＤＭＰＣ分散液は、担癌マウスに対して顕著な治療効果を持つことが明かとなった。ＤＭＰＣ単一成分の分散液が、このような癌治療効果を示すことはこれまで報告がなく、驚くべきことである。従って、新しい発見として、リン脂質の一種であるＤＭＰＣが、高い癌治療効果を有することが初めて明かとなり、まったく副作用のない新しい癌治療薬として期待できることがわかった。
本発明アポトーシス誘導剤は、通常の状態ではアポトーシスのメカニズムが正常に機能しない腫瘍細胞に、アポトーシスを誘導することができる。また、本発明のカスペースカスケード活性化剤は、通常の状態ではアポトーシスのメカニズムが正常に機能せず、従ってカスペースカスケードも活性化していない腫瘍細胞に、アポトーシスを誘導することによりカスペースカスケードを活性化させ、アポトーシスを実行することができる。
更に、本発明の制癌剤は、副作用のない安全な制癌剤として極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ハイブリッドリポソームにより処理したＨＬ−６０細胞由来のＤＮＡのアガロースゲル電気泳動である。
図中、Ａはコントロールであり；ＢはＤＭＰＣであり；ＣはＣ１２（ＥＯ）４であり；ＤはＤＭＰＣ／１０モル％Ｃ１２（ＥＯ）４であり；ＥはＣ１２（ＥＯ）１０であり；ＦはＤＭＰＣ／１０モル％Ｃ１２（ＥＯ）１０であり；ＧはＣ１２（ＥＯ）１２であり；ＨはＤＭＰＣ／１０モル％Ｃ１２（ＥＯ）１２であり；ＩはＣ１２（ＥＯ）２３であり；ＪはＤＭＰＣ／１０モル％Ｃ１２（ＥＯ）２３であり；ＫはＤＮＡマーカーである。
図２は、ＤＭＰＣ／１０モル％Ｃ１２（ＥＯ）１０のハイブリッドリポソームで処理したＨＬ−６０細胞の蛍光顕微鏡観察である。
図３は、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液によるカスペース−９阻害効果を示す図である。
図４は、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液によるカスペース−３阻害効果を示す図である。
図５は、ジミリストイルホスファチジルコリン含有リポソーム液によるカスペース−１／−４阻害効果を示す図である。
図６は、ウエスタンブロット法によるカスペース−３基質分解物の検出を示す図である。ＤＭＰＣとＣ１２（ＥＯ）１０とのハイブリッドリポソームで処理したＨＬ−６０細胞のウェスタン分析である。
図７は、ＤＭＰＣ分散液による担癌マウスの治療実験結果を示す図である。Ｂ１６−Ｆ０メラノーマ細胞を接種後、ＤＭＰＣリポソームで処理（０〜１２日）したマウスの生存曲線である。
図中、●はコントロール、△は［ＤＰＭＣ］＝５．０×１０−２Ｍ、■は［ＤＰＭＣ］＝５．０×１０−３Ｍ、◇は［ＤＰＭＣ］＝５．０×１０−４Ｍを表す。
【図１】
2002028399.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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