(57)【要約】本発明の目的は、鎖長が短く静電的結合による固定化が難しいことが知られている合成オリゴポリヌクレオチドにおいても、充分量のポリヌクレオチドを支持体に固定することができ、スポットエリア内での均一かつ十分な強度のシグナルを得ることができるポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法を提供することである。本発明によれば、ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法において、ポリヌクレオチドを支持体に固定化する際に用いるポリヌクレオチドを溶解する溶液が、陰イオン性の電解質を実質的に含まない、水又は水と有機溶媒との混合物からなる溶液であり、かつ該溶液が水と有機溶媒との混合物からなる場合は溶液中における有機溶媒の含有率が５０体積％未満であることを特徴とする方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法において、ポリヌクレオチドを支持体に固定化する際に用いるポリヌクレオチドを溶解する溶液が、陰イオン性の電解質を実質的に含まない、水又は水と有機溶媒との混合物からなる溶液であり、かつ該溶液が水と有機溶媒との混合物からなる場合は溶液中における有機溶媒の含有率が５０体積％未満であることを特徴とする方法。
【請求項２】
水又は水と有機溶媒との混合物からなる溶液が、０〜０．１ｍｏｌ／Ｌの陰イオン性の電解質を含む溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドを水と有機溶媒との混合物からなる溶液に溶解し、該溶液中における有機溶媒の含有率が５０体積％未満である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドを水溶液に溶解する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドを２０体積％未満のジメチルスルホキシドを含む溶液に溶解する、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
陰イオン性の電解質を実質的に含まない溶液が、２０℃での蒸気圧が１２〜１００ｈＰａの溶液である、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドを陰イオン性の電解質を実質的に含まない溶液に溶解して得られるポリヌクレオチド溶液におけるポリヌクレオチド濃度が０．０１〜２．０μｇ／μｌである、請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
支持体に固定されるポリヌクレオチドが１２〜１２０塩基の長さのポリヌクレオチドである、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
支持体が陽電荷を有する支持体である、請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
支持体上へ固定するポリヌクレオチドを溶解した溶液を、０〜１０℃の温度条件下で支持体上にスポットすることを含む、請求項１から９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法の実施において用いる、温度コントロール機能を有するポリヌクレオチドマイクロアレイ作製装置。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により作製されるポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法、該方法の実施において用いるポリヌクレオチドマイクロアレイを作製するための装置、並びに該方法によって作製されるポリヌクレオチドマイクロアレイに関する。
背景技術
ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製するための装置は多数の企業から販売されており（日本レーザ電子株式会社製のＧｅｎｅＴｉｐ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｔａｍｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の  ＰｉｘＳｙｓ  ５２００／５５００、Ｇｅｎｅｔｉｘ社製のＱ−ａｒｒａｙ、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ社製のＯｍｎｉ  Ｇｒｉｄ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製の４１７  Ａｒｒａｙｅｒ、ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ社製のＭｉｃｒｏＧｒｉｄ、日立ソフト社製のＳＰＢＩＯ２０００等）、大量の遺伝子の発現プロファイルや変異点を同時に解析するために用いられている。
ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製するために広く一般的に用いられている方法は、陽電荷を有する支持体、例えばポリ−Ｌ−リジンなどで表面処理をしたスライドガラス上にポリヌクレオチド分子を固定化して作製する方法である。
従来のポリヌクレオチド固定化法では、３×ＳＳＣ（０．４５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．０４５ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）等の適当な塩類を含む溶液に溶解したポリヌクレオチド試料を、ポリ−Ｌ−リジン等で表面処理して陽電荷を有するガラス平板上に室温条件下でスポットすることにより、ポリヌクレオチド分子をガラス表面上に固定化している〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０，４６７（１９９５）；及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１，１０６１４（１９９６）〕。
上記したような従来のポリヌクレオチド固定化法では、ポリヌクレオチドを溶解した溶液の蒸発速度が速すぎる場合、ポリヌクレオチド試料をスポットしている間に溶媒が徐々に蒸発し、ポリヌクレオチド溶液の濃度が変化したり、ポリヌクレオチド試料をスポットする際に用いるピンあるいはペン上で試料が乾固したり、スポット後のスポットエリア内のポリヌクレオチド試料の濃度が不均一になる等の不具合が生じるため、後の解析に供するのに十分満足なポリヌクレオチドマイクロアレイを作製することは困難であった。
上記したような問題点を解消するためには、ポリヌクレオチドを溶解する溶液の蒸発速度をコントロールすることは重要であると考えられるが、スポットエリア内のポリヌクレオチド試料の濃度が不均一になるという不具合を完全に解消することはできない。
また、従来法では、ガラス表面に固定化されるポリヌクレオチド分子の量が少なく、十分なシグナル強度が得られないため、７０以下の塩基からなる比較的鎖長の短いオリゴヌクレオチド分子を固定化したポリヌクレオチドマイクロアレイの作製には従来法は適していなかった。
従来法では、ＰＣＲ増幅産物を固定化する場合と比較して、充分な量のオリゴＤＮＡを強固に固定化することは困難であるため、スポットするポリヌクレオチド試料の濃度を高くする等の操作により、ガラス表面上に固定化されるポリヌクレオチド量を増やす試みがなされている。しかしながら、調製できるポリヌクレオチド溶液の濃度には限界があるため、このような試みによっても十分なシグナル強度が得られる鎖長の短いポリヌクレオチドをスポットしたポリヌクレオチドマイクロアレイを作製することは困難であった。
発明の開示
本発明は、鎖長が短く静電的結合による固定化が難しいことが知られている合成オリゴポリヌクレオチドにおいても、充分量のポリヌクレオチドを支持体に固定することができ、スポットエリア内での均一かつ十分な強度のシグナルを得ることができるポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明はまた、上記本発明の方法において用いるポリヌクレオチドマイクロアレイを作製するための装置、並びに上記本発明の方法により作製されるポリヌクレオチドマイクロアレイを提供することを解決すべき課題とした。
本発明者は上記課題を解決するためにポリヌクレオチドマイクロアレイの作製法について鋭意検討を行った結果、ポリヌクレオチドを溶解する溶液として、陰イオン性の電解質を実質的に含まない、水又は水と有機溶媒の混合物からなる溶液を用いてポリヌクレオチドを支持体に固定することにより、鎖長の短い合成オリゴポリヌクレオチドについても、スポットエリア内での均一かつ十分な強度のシグナルを得ることができるポリヌクレオチドマイクロアレイを作製できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（１２）を提供するものである。
（１）  ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法において、ポリヌクレオチドを支持体に固定化する際に用いるポリヌクレオチドを溶解する溶液が、陰イオン性の電解質を実質的に含まない、水又は水と有機溶媒との混合物からなる溶液であり、かつ該溶液が水と有機溶媒との混合物からなる場合は溶液中における有機溶媒の含有率が５０体積％未満であることを特徴とする方法。
（２）  水又は水と有機溶媒との混合物からなる溶液が、０〜０．１ｍｏｌ／Ｌの陰イオン性の電解質を含む溶液である、（１）に記載の方法。
（３）  ポリヌクレオチドを水と有機溶媒との混合物からなる溶液に溶解し、該溶液中における有機溶媒の含有率が５０体積％未満である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  ポリヌクレオチドを水溶液に溶解する、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）  ポリヌクレオチドを２０体積％未満のジメチルスルホキシドを含む溶液に溶解する、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（６）  陰イオン性の電解質を実質的に含まない溶液が、２０℃での蒸気圧が１２〜１００ｈＰａの溶液である、（１）から（５）の何れかに記載の方法。
（７）  ポリヌクレオチドを陰イオン性の電解質を実質的に含まない溶液に溶解して得られるポリヌクレオチド溶液におけるポリヌクレオチド濃度が０．０１〜２．０μｇ／μｌである、（１）から（６）の何れかに記載の方法。
（８）  支持体に固定されるポリヌクレオチドが１２〜１２０塩基の長さのポリヌクレオチドである、（１）〜（７）の何れかに記載の方法。
（９）  支持体が陽電荷を有する支持体である、（１）から（８）の何れかに記載の方法。
（１０）  支持体上へ固定するポリヌクレオチドを溶解した溶液を、０〜１０℃の温度条件下で支持体上にスポットすることを含む、（１）から（９）の何れかに記載の方法。
（１１）  （１）〜（１０）のいずれかに記載の方法の実施において用いる、温度コントロール機能を有するポリヌクレオチドマイクロアレイ作製装置。
（１２）  （１）〜（１０）のいずれかに記載の方法により作製されるポリヌクレオチドマイクロアレイ。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施方法及び実施態様について詳細に説明する。
本発明によるポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法は、水又は水と有機溶媒との混合物からなる溶液に溶解したポリヌクレオチドを支持体へ固定することを含む方法であり、該溶液は陰イオン性の電解質を実質的に含まず、かつ該溶液が水と有機溶媒との混合物からなる場合は溶液中における有機溶媒の含有率が５０体積％未満であることを特徴とする。
以下、（Ａ）スポット用のポリヌクレオチド溶液の調製と（Ｂ）ポリヌクレオチドの支持体上へのスポットとについて説明する。
（Ａ）固定用ポリヌクレオチド溶液の調製
本発明で用いられるポリヌクレオチド（核酸とも称される）の種類は特に限定されず、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等を挙げることができる。ＤＮＡ及びＲＮＡの種類も特に限定されず、例えば、染色体ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、又は化学合成ＲＮＡの何れでもよく、より具体的には、ＰＣＲ増幅産物、制限酵素切断処理ＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、化学合成ＲＮＡ等の何れでもよい。本発明の方法においては、化学合成ＤＮＡとして、１２〜１２０塩基の長さの合成オリゴＤＮＡを効率良く用いることができる。
本発明で用いるポリヌクレオチドとしては、任意の生物に由来するものを使用できる。また、本発明で用いるポリヌクレオチドとしては、疾患と関連することが知られている染色体位置に由来するＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、化学合成ＤＮＡなどを挙げることができる。また、ポリヌクレオチドは、例えば、特定の遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片、あるいは、転写レベルの異常が見られるｍＲＮＡ、または該ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡでもよい。
本発明においてポリヌクレオチドを溶解するために用いる溶液は、陰イオン性の電解質を実質的に含まず、かつ  該溶液が水と有機溶媒との混合物からなる場合は溶液中における有機溶媒の含有率が５０体積％未満であることを特徴とする。
「陰イオン性の電解質を実質的に含まない」溶液とは、陰イオン性の電解質を含まない溶液を意味するのみならず、該溶液にポリヌクレオチドを溶解してガラス板などの支持体にスポットする際、ポリヌクレオチドが支持体表面に静電結合することを妨げず、良好なスポット像を得ることができる程度の量の陰イオン性の電解質を含有する溶液をも包含する意味を有する。
陰イオン性の電解質の合計濃度は好ましくは、０〜０．１ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０〜０．０１ｍｏｌ／Ｌである。
上記したような陰イオン性の電解質を実質的に含まない溶液は、溶媒に溶解する塩類の濃度を調整することにより調製することができる。
陰イオン性の電解質を実質的に含まない溶液における溶媒としては、ポリヌクレオチドを溶解することができる溶媒であれば任意の溶媒を用いることができる。該溶媒の好適な例としては、水、または水と有機溶媒との混合溶媒が挙げられる。有機溶媒としては、水と任意の比率で混合可能な有機溶媒が挙げられ、例えばエタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等を挙げることができる。水と有機溶媒との混合溶媒における該有機溶媒の含有率は５０体積％未満であり、好ましくは３０体積％以下であり、より好ましくは２０体積％以下である。
また、ポリヌクレオチドを溶解するための上記溶液は、２０℃での蒸気圧が１２〜１００ｈＰａの溶液であることが好ましい。水系溶媒の場合、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯ等の有機溶媒を添加することにより、溶液の蒸気圧を調整することができる。
ポリヌクレオチド溶液中におけるポリヌクレオチド濃度は、最終濃度として好ましくは０．０１〜２．０μｇ／μｌであり、より好ましくは０．１５〜０．３０μｇ／μｌである。
（Ｂ）ポリヌクレオチドのスポット
本発明の方法では上記（Ａ）で調製したポリヌクレオチド溶液を、支持体（好ましくは陽電荷を有する支持体）上にスポットする。
支持体としては、例えば、ガラス、膜、プラスチックなどが挙げられる。天然又は合成の多種の有機ポリマー及び無機ポリマーを支持体の固体表面の材料として使用することができる。支持体の固体表面の具体例としては、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、又はセルロースアセテート等が挙げられる。あるいはまた、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等）を使用することもできる。支持体の固体表面が多孔質である場合、種々の細孔サイズの支持体を適宜使用できる。
上記したような陽電荷を有する支持体としては、市販のものを利用することができ、例えば、松浪ガラス社製のスライドガラス（型式Ｓ９１１５）等を用いることができる。
支持体の固体表面を調製する際には、複数の異なる材料を例えばラミネートとして使用することができ、例えば、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）や巨大分子の混合物（例えば、デンハルト溶液）などを使用してシグナル検出を増進することができる。
ポリヌクレオチド溶液を支持体にスポットする際の温度環境は重要である。２０℃での蒸気圧が低いポリヌクレオチド溶液を用いる場合には、低温で支持体へのスポットを行う必要がある。例えば、水で調製したポリヌクレオチド溶液を用いる場合には、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは２〜６℃の温度環境下でスポットを行う。室温等の高い温度でスポットを行うと、水の蒸発速度が早すぎて、スポットに不均一性が生じるため好ましくない。
支持体上へのポリヌクレオチドのスポットは、ポリヌクレオチド溶液をＤＮＡマイクロアレイ作製用のピンまたはペンに付着させ、該ピンまたはペンを、好ましくは陽電荷を有する支持体表面に接触させることにより行う。
従来技術で用いられてきたようにオリゴヌクレオチドを３×ＳＳＣ溶液のような塩類を含む溶媒に溶解してオリゴヌクレオチド試料をスポットする方法では、オリゴヌクレオチドを溶解する溶媒に含まれるオリゴヌクレオチド以外の陰イオン性の電解質がオリゴヌクレオチドの支持体への固定に阻害的に働くことを、本発明者は今回初めて見出した。また、オリゴヌクレオチド溶液の蒸発速度を、温度によりコントロール可能であることも本発明において初めて見出された知見である。
本発明の方法で作製されるオリゴヌクレオチドマイクロアレイにおけるスポットの大きさは特に制限されないが、一般的には直径１ｃｍ未満であり、例えば、１μｍ〜３ｍｍ、より好ましく５μｍ〜１ｍｍである。
また、本発明の方法で作製されるオリゴヌクレオチドマイクロアレイにおけるスポットの密度は特に制限されないが、一般的には１ｃｍ２当たり５〜２０，０００スポットであり、好ましくは１０〜１０，０００スポットであり、さらに好ましくは１００〜８，０００スポットである。
オリゴヌクレオチドを支持体に高密度にスポッティングすることが好ましい場合もあり、例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて核酸の塩基配列決定を行なう場合等にはできる限り多種の核酸プローブを支持体上に配置しておくことが好ましい。また遺伝子の変異の検出を効率的に行なう場合には、それぞれの変異に対応した配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを固相上に配置させておくことが好ましい。さらに、サンプル中の標的オリゴヌクレオチドの検出や、遺伝子の変異、欠損の検出に当たっては、被験者からのサンプルの採取、具体的には血液等の採取はできる限り少量に止めておくことが好ましく、よって少量の検体でできる限り多くの塩基配列の情報を獲得できることが好ましい。これらの観点から考えるとマイクロアレイには、オリゴヌクレオチドをできるだけ高密度にスポッティングすることが好ましい。
上記の本発明の方法を用いてスポットすることにより、鎖長が短く静電的結合による固定化が難しいとされていた鎖長が２０塩基以下のオリゴヌクレオチドにおいても、スポットエリア内での均一かつ十分な強度のシグナルを得ることができるオリゴヌクレオチドマイクロアレイを作製することが可能となる。
ポリヌクレオチドの支持体への固定は、常法により行うことができ、例えば、下記の操作に基づく方法をあげることができる。
ポリヌクレオチドをスポットした支持体を気相恒温器に入れ、８０℃で１時間保温する。保温後、ＵＶクロスリンカーを用いて紫外線を照射する。該操作により、ポリヌクレオチド分子を支持体表面に固定化させることができる。
このようにしてポリヌクレオチドを固定化した支持体を用い、常法、例えばＭ．Ｓｃｈｅｎａらが報告している方法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０，４６７（１９９５）〕にしたがって、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを行った後、洗浄し、蛍光スキャナを用いて測定することにより、固定化したポリヌクレオチドと蛍光標識したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出することができる。
オリゴヌクレオチドの標識としては蛍光標識の代わりに酵素標識を用いることもできる。酵素標識としては、例えば、ＥＬＩＳＡに通常使用される酵素が挙げられ、具体的には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などが挙げられる。酵素標識を使用した場合には、ハイブリダイゼーション後に、検出可能なシグナルを付与する酵素基質を添加することによりハイブリダイゼーションを検出することができる。
標識としては一般的には、標的オリゴヌクレオチドのコピー数が少量でも検出可能であり、それによりアッセイの感度が向上し、しかもバックグラウンドシグナルを越えて検出可能である標識が好ましい。
本発明のポリヌクレオチドマイクロアレイを作製するための装置としては、ポリヌクレオチドのスポット操作を任意の温度、例えば、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは２〜６℃の温度環境下で行なうことができるような温度コントロール機能を有する装置を挙げることができる。具体的には、少なくとも装置に附属されているポリヌクレオチドをスポットするためのピン、およびポリヌクレオチドがスポットされる支持体を含む領域が、上記温度にコントロールされるよう設計されたポリヌクレオチドマイクロアレイ作製装置をあげることができる。より具体的には、上記領域が外気と仕切られており、仕切られた内部領域にはサーモスタット等の温度センサーが配されており、スポット操作が設定温度で行なわれるよう、該領域を加熱および冷却できる機能を有する装置をあげることができる。
本発明のポリヌクレオチドマイクロアレイは、上記の本発明のポリヌクレオチドマイクロアレイを作製するための装置を用いて作製することができる。また、一般に市販されているＤＮＡマイクロアレイ作製装置である日本レーザ電子株式会社製のＧｅｎｅＴｉｐ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｔａｍｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰｉｘＳｙｓ５２００／５５００、Ｇｅｎｅｔｉｘ社製のＱ−ａｒｒａｙ、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ社製のＯｍｎｉ  Ｇｒｉｄ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製の４１７  Ａｒｒａｙｅｒ、ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ社製のＭｉｃｒｏＧｒｉｄ、日立ソフト社製のＳＰＢＩＯ２０００等を用い、該装置に添付のマニュアルに記載の方法等の一般的な方法に従って、上記した本発明の方法を適用することによっても本発明のポリヌクレオチドマイクロアレイを作製することができる。
上記の市販されている装置は温度制御機能を有していないので、必要に応じて、温度管理が可能な低温室あるいは冷蔵庫に該装置を入れてスポット操作を行うことによって本発明のポリヌクレオチドマイクロアレイを作製することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例
（実施例１）本発明の方法によるＤＮＡマイクロアレイの作製
以下の方法によってＤＮＡマイクロアレイを作製した。配列番号１の塩基配列を有する合成オリゴＤＮＡを０．２μｇ／μＬとなるように水で溶解し（２０℃での蒸気圧は、２３．３７９ｈＰａ）、日本レーザ電子社製アレイアー（ＧＴＭＡＳＳ  ｓｔａｍｐｉｎｇ）で日本レーザ電子社製のピン（直径１５０μｍタイプ）を用い、４℃でガラス表面に０．５秒接触させる条件で、松浪ガラス社製のスライドガラス（型式Ｓ９１１５）上にＤＮＡ試料をスポットした。このようにしてＤＮＡ試料をスポットしたスライドガラスを、気相恒温器（Ｓｔｏｖａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ）内にて８０℃で１時間静置した状態で保温し、さらにＵＶクロスリンカー（Ｈｏｅｆｅｒ社製、ＵＶＣ５００）を用いて、１２０ｍＪの紫外線を照射し、スポットした合成オリゴＤＮＡをスライドガラス表面に固定化した。
（比較例１）３×ＳＳＣにＤＮＡ試料を溶解する方法によるＤＮＡマイクロアレイの作製
以下の方法によってＤＮＡマイクロアレイを作製した。配列番号１の塩基配列を有する合成オリゴＤＮＡを０．２μｇ／μＬとなるように３×ＳＳＣ溶液（０．４５Ｍ塩化ナトリウム、０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で溶解し、日本レーザ電子社製アレイアー（ＧＴＭＡＳＳ  ｓｔａｍｐｉｎｇ）で日本レーザ電子社製のピン（直径１５０μｍタイプ）を用い、２２℃でガラス表面に０．５秒接触させる条件で、松浪硝子社製のスライドガラス（型式Ｓ９１１５）上にＤＮＡ試料をスポットした。このようにしてＤＮＡ試料をスポットしたスライドガラスを、気相恒温器（Ｓｔｏｖａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ）内にて８０℃で１時間静置した状態で保温し、さらにＵＶクロスリンカー（Ｈｏｅｆｅｒ社製、ＵＶＣ５００）を用いて、１２０ｍＪの紫外線を照射し、スポットした合成オリゴＤＮＡをスライドガラス表面に固定化した。
（比較例２）５０体積％のＤＭＳＯ溶液にＤＮＡ試料を溶解する方法によるＤＮＡマイクロアレイの作製
以下の方法によってＤＮＡマイクロアレイを作製した。配列番号１の塩基配列を有する合成オリゴＤＮＡを０．２μｇ／μＬとなるように５０体積％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、和光純薬工業社製、＃０４３−０７２１６）溶液（２０℃での蒸気圧は、１１．９８ｈＰａ）で溶解し、日本レーザ電子社製アレイアー（ＧＴＭＡＳＳ  ｓｔａｍｐｉｎｇ）で日本レーザ電子社製のピン（直径１５０μｍタイプ）を用い、２２℃でガラス表面に０．５秒接触させる条件で、松浪硝子社製のスライドガラス（型式Ｓ９１１５）上にＤＮＡ試料をスポットした。このようにしてＤＮＡ試料をスポットしたスライドガラスを、気相恒温器（Ｓｔｏｖａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ）内にて８０℃で１時間静置した状態で保温し、さらにＵＶクロスリンカー（Ｈｏｅｆｅｒ社製、ＵＶＣ５００）を用いて、１２０ｍＪの紫外線を照射し、スポットした合成オリゴＤＮＡをスライドガラス表面に固定化した。
（実施例２）スライドガラス表面のブロッキング
実施例１、比較例１および比較例２のようにしてＤＮＡ試料をスポットしたスライドガラスをブロッキング溶液［無水コハク酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、２３９６９−０）５ｇ、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、３２８６３−４）３１５ｍｌ、０．２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）３５ｍｌからなる溶液］に浸し、数十回、激しく上下に振盪した後、室温で１時間ゆっくりと振盪させながら保温した。該溶液から取り出したスライドガラスを、９５〜９９℃の熱水に浸し、１分間激しく上下に振盪した後、そのまま熱水中に浸し、容器全体を発泡スチロール製の箱に入れ、保温しながら１時間静置した。該スライドガラスを９９％エタノールに３回出し入れした後、取り出して室温で風乾させた。
（実施例３）蛍光標識プローブの作製
配列番号２の塩基配列を有する合成オリゴＤＮＡの５’末端を蛍光色素Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシアバイオテク社製、＃ＰＡ２３０００、＃ＰＡ２５０００）で標識したものをグライナージャパン社に合成委託して購入した。それらの標識オリゴＤＮＡを、濃度を０．１μｇ／μＬとなるように調整し、それぞれの０．５μＬを１４μＬのハイブリダイゼーションバッファー（Ａｍｂｉｏｎ社製、＃８６７０）と混合し、６８℃で１５分間、静置した状態で保温した。
（実施例４）ハイブリダイゼーション
実施例３で作製したプローブ溶液を実施例２で作製したスライドガラス上のＤＮＡ試料をスポットした領域に滴下し、その上に２４×２４ｍｍのカバーガラス（松浪硝子社製、マイクロカバーグラスＮｏ．１）を被せた。これをハイブリダイゼーションカセット（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社製、ＴＨＣ−１）に入れ、気相恒温器（Ｓｔｏｖａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎで、６８℃、１５時間、静置した状態で保温した。
（実施例５）洗浄
該スライドガラスを気相恒温器から取り出し、静かに２００ｍｌの０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）に浸し、カバーガラスを剥離させた。カバーグラスを剥がした該スライドグラスを２００ｍｌの１×ＳＳＣ溶液に室温で３分間、次いで０．２×ＳＳＣ溶液に室温で３分間浸して洗浄した後、スライドガラスホルダーに入れて、低速遠心機（佐久間製作所、Ｍ２００−ＩＶＤ）を用いて５００ｒｐｍで１０秒間遠心し、水分を取り除いた。
（実施例６）ハイブリダイゼーションの検出ならびに画像化
このようにしてハイブリダイゼーションと洗浄を行ったスライドガラスを、スキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００）を用いて、波長６３５ｎｍおよび５３２ｎｍの蛍光シグナルを同時測定し、各スポットを同一画面上に画像化した。得られた結果を第１図（実施例１で作製したＤＮＡマイクロアレイを使用）、第２図（比較例１で作製したＤＮＡマイクロアレイを使用）、並びに第３図（比較例２で作製したＤＮＡマイクロアレイを使用）にそれぞれ示す。第１図から第３図の結果から分かるように、本発明の方法を用いた場合の方が比較例の場合よりもシグナルの強度が顕著に高い。
産業上の利用の可能性
本発明により、鎖長が２０塩基という短い長さのオリゴＤＮＡをガラス板にスポットした際に検出されるシグナルの強度が顕著に高くなり、また、スポットしたＤＮＡ試料の一部がスポット後の工程で失われることが原因となって起きる測定エリア内でのシグナル強度のムラが低減されたため、ハイブリダイゼーション後のシグナル検出における測定値のふれを低減することもできた。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の方法によって作製したＤＮＡマイクロアレイでのハイブリダイゼーション画像の図である。実施例１記載の方法で作製したＤＮＡマイクロアレイを用い、実施例２〜５記載の方法にしたがってハイブリダイゼーションおよび洗浄を行い、実施例６記載の方法にしたがってスキャナーを用いて画像化した。
第２図は、２２℃条件下、３×ＳＳＣ溶液に溶解したＤＮＡ試料をスポットすることによって作製したＤＮＡマイクロアレイでのハイブリダイゼーション画像の図である。比較例１記載の方法で作製したＤＮＡマイクロアレイを用い、実施例２〜５記載の方法にしたがってハイブリダイゼーションおよび洗浄を行い、実施例６記載の方法にしたがってスキャナーを用いて画像化した。
第３図は、２２℃条件下、５０％ＤＭＳＯ溶液に溶解したＤＮＡ試料をスポットすることによって作製したＤＮＡマイクロアレイでのハイブリダイゼーション画像の図である。比較例２記載の方法で作製したＤＮＡマイクロアレイを用い、実施例２〜５記載の方法にしたがってハイブリダイゼーションおよび洗浄を行い、実施例６記載の方法にしたがってスキャナーを用いて画像化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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