(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラン藻由来のフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼをコードする塩基配列を含むＤＮＡフラグメントが導入されることにより光合成産物の生産性が向上していることを特徴とする、形質転換植物。
【請求項２】
以下のタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡフラグメントが導入されることにより光合成産物の生産性が向上していることを特徴とする、請求項１記載の形質転換植物。
（ａ）  配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１−３５６で表されるアミノ酸配列
（ｂ）  フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼとしての活性を示す、（ａ）のアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【請求項３】
以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列を含むＤＮＡフラグメントが導入されることにより光合成産物の生産性が向上していることを特徴とする、請求項１記載の形質転換植物。
（ｃ）  配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち、塩基番号１−１０６８で表される塩基配列
（ｄ）  フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼとしての活性を示すタンパク質をコードする、（ｃ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
【請求項４】
以下の（ｅ）または（ｆ）に示す塩基配列を含むＤＮＡフラグメントが導入されることにより光合成産物の生産性が向上していることを特徴とする、請求項１記載の形質転換植物。
（ｅ）  配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち、塩基番号−１８０−１１７０で表される塩基配列
（ｆ）  フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼとしての活性を示すタンパク質をコードする、（ｅ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
【請求項５】
ラン藻由来のフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼが高等植物の葉緑体中で形質発現することにより光合成産物の生産性が向上していることを特徴とする、形質転換植物。
【請求項６】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が高等植物の葉緑体中で形質発現することにより光合成産物の生産性が向上していることを特徴とする、請求項５記載の形質転換植物。
（ａ）  配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１−３５６で表されるアミノ酸配列
（ｂ）  フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼとしての活性を示す、（ａ）のアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高等植物の光合成と生育を促進することによって、その収穫量を増大させ、あるいは早期に収穫できるように生産性が向上していることを特徴とする形質転換植物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
組み換えＤＮＡの技術の発展に伴い、高等植物に対して、特定の遺伝子を新たに導入したり、あるいは既に存在する遺伝子の発現を制御することが可能となってきている。しかし、乾物生産あるいは収量といった、食糧問題に直接係わる特性に影響を及ぼす例は少ない。近年、ドイツを中心として、光合成、炭水化物代謝などに関する酵素遺伝子を高等植物へとアンチセンス方向に導入し、その発現を抑制することによって、その酵素遺伝子が光合成や炭水化物代謝の律速因子として重要であることを示した例がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、組み換えＤＮＡ技術を利用して、高等植物中で特定の遺伝子を形質発現させることによって、高等植物の一次代謝である光合成の機能を改善し、その生育を促進することは、試みられてこなかった。
【０００４】
本発明の課題は、組み換えＤＮＡ技術を利用して、高等植物中で特定の遺伝子を形質発現させることによって、高等植物の一次代謝である光合成の機能を改善し、その生産性を向上させ、収量ポテンシャルを向上させ、あるいは早期に収穫可能とすることである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ラン藻由来のフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼを高等植物の葉緑体中で形質発現させる過程より成る、生産性を向上させた高等植物の製造方法に係るものである。
【０００６】
また、本発明は、ラン藻由来のフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼをコードする塩基配列を含むＤＮＡフラグメントが導入されることにより生産性が向上していることを特徴とする、形質転換植物に係るものである。
【０００７】
高等植物葉緑体のフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（fructose-1,6-bisphosphatase ：ＦＢＰａｓｅ）およびセドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ（sedoheptulose-1 ,7-bisphosphatase ：ＳＢＰａｓｅ）は、光還元力による活性調節を受ける光合成炭素還元系の律速酵素の１つである。一方、ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２遺伝子由来のフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ／ＳＢＰａｓｅ）は、原核藻類であるラン藻に広く分布する酵素であり、高等植物葉緑体のＦＢＰａｓｅおよびＳＢＰａｓｅとは、一次構造および酵素学的性質が異なっている。また、一つのタンパク質で、ＦＢＰａｓｅおよび／ＳＢＰａｓｅの２つの酵素活性を有するバイファンクショナル酵素である。
【０００８】
ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２遺伝子由来のＦＢＰａｓｅ−Ｉは、４０ｋＤａの同一のサブユニットからなる４量体で、精製酵素は１ｍＭ  Ｈ2 Ｏ2 の処理でも８０％以上の活性を保持していた。ＦＢＰａｓｅ−Ｉは、細胞質型ＦＢＰａｓｅの特異的阻害材であるＡＭＰによって阻害されたが（Ｋｉ＝０．２６ｍＭ）、フルクトース−２，６−Ｐ2 によってまったく阻害を受けなかった。至適ｐＨは８．０であり、ｐＩは４．８であった。ＦＢＰａｓｅ−Ｉは、フルクトース−１，６−ビスリン酸（Ｆｒｕ１，６−Ｐ2 ）だけでなく、セドヘプツロース−１，７−ビスリン酸（Ｓｅｄ１，７−Ｐ2 ）も加水分解した。精製酵素におけるＦｒｕ１，６−Ｐ2 およびＳｅｄ１，７−Ｐ2 に対する活性は、それぞれ、１１．７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、１２．１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、Ｋｍ値は、それぞれ、５２μＭ、１１８μＭであった。また、活性は典型的なＦＢＰａｓｅと同様、Ｍｇ2 + 濃度に依存しており、その依存曲線は葉緑体型ＦＢＰａｓｅと同様、シグモイド型を示し、Ｓ0.5 は１．４±０．１ｍＭであった。この酵素それ自体については、「Archives of Biotechnology and Biophysics, Vol. 334, No.1, pp. 27 to 36, 1996  「Molecular characterization and resistance to hydrogen peroxide of two fructose-1,6-bisphosphatase from Synechococcus PCC 7942 」に記載されている。
【０００９】
本発明者は、ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２より単離したフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼを、タバコに導入し、この際発現蛋白質が葉緑体に移行するようにした。そして、播種後７週間目におけるＦＢＰａｓｅおよびＳＢＰａｓｅ活性、および光合成能を野性株と対比した結果、野性株に比べて著しく上昇していることを見いだした。更に、一定期間栽培したところ、形質転換植物は、野性株に比べて、背丈が大きくなっていた。また、葉の面積が大きくなり、茎が太くなり、根が多くなり、長くなっていた。更に、形質転換植物は、野性株よりも、葉、茎、根におけるヘキソース、シュクロース、デンプンの量が増加していた。
【００１０】
従って、タバコ葉緑体へとラン藻由来のＦＢＰａｓｅ／ＳＢＰａｓｅを導入することにより得られた形質転換植物は、野性株よりも光合成能が強化され、この結果、糖、デンプンの合成能力が増大し、生育が促進され、かつ最終的な物質生産能も増加していた。従って、高等植物の葉緑体へのＦＢＰａｓｅ／ＳＢＰａｓｅの導入は、早生、高収量作物を作出する上で非常に有効な手段であった。
【００１１】
この作用は以下のように考えられる。種々の環境ストレスに応じて、植物に対しては光・酸素毒が様々な障害をもたらし、最終的には食物生産の大きな律速因子となっている。ラン藻由来のＦＢＰａｓｅ／ＳＢＰａｓｅは、高等植物のＦＢＰａｓｅおよびＳＢＰａｓｅとは異なり、酸素毒に対して耐性を有しており、種々の環境ストレス下でも機能するものと思われる。また、ラン藻由来のＦＢＰａｓｅ／ＳＢＰａｓｅは、高等植物には存在しない遺伝子であるので、ジーンサイレンシングによる悪影響がない。
【００１２】
本発明において、組み換えＤＮＡを作製する際のベクターとしては、例えばプラスミド、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩＮ１９、ｐＭＳＨ−１等を使用できる。また、組み換えＤＮＡを導入するための高等植物としては、広く光合成を行う有用栽培作物や樹木に利用できる。例えば、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、オート麦、粟、ひえなどの穀物類、ダイズなどの豆類、、ジャガイモ、トマトといった野菜類、ナタネ、ワタ、タバコなどのその他の有用栽培植物に加えて、樹木にも適用できる。
【００１３】
前記のアミノ酸配列において、欠失、置換、付加が行われても、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼとしての酵素学的な性質を保持する限り、本発明の範囲内である。また、前記の塩基配列のうち、酵素を発現する構造遺伝子部分は、塩基番号１−１０６８であるので、本発明に必須であるが、塩基番号−１８０−１１７０で表される塩基配列を有する遺伝子が最も好ましい。
【００１４】
【実施例】
図１に示すように、pBI101に、トマトrbcSプロモーターとトランジットペプチドのコード領域およびラン藻由来のフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ／セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ（ S. 7942 FBP/SBPase ）遺伝子 (fbp-I)を連結したプラスミドを構築した。 (fbp-I)は、ラン藻  ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓＰＣＣ７９４２遺伝子由来の、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち、塩基番号−１８０−１１７０で表される塩基配列を示す。このプラスミドを、アグロバクテリウム  ツメファシエンス  ＬＢＡ４４０４に導入し、タバコ（Nicotiana tabacum cv Xanthi ）のリーフディスクに感染させることによって、fbp-I をタバコ核遺伝子に導入した。ゲノムDNA を単離した後、PCRおよびイムノブロッティングによりfbp-I の導入を確認した。７種の形質転換株 (TFI-1 〜7)を得た。形質転換株 (T2世代) から葉緑体を単離し、ウエスタンブロッテイングにより、 S. 7942 FBP/SBPase の発現を確認した。更に、細胞分画によって、導入タンパク質が葉緑体に局在することを確認した。
【００１５】
（ＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、光合成活性）
播種後、７週間目の成葉に含まれるＦＢＰａｓｅ活性を、遺伝子導入前の野生株と比較した結果、野生株は１．０４±０．２２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇクロロフィル、形質転換植物は１．８２±０．２４μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇクロロフィルであり、野生株に比べて約１．７５倍高い活性を有していた。
【００１６】
また、ＳＢＰａｓｅ活性を比較した結果、野生株は１．３７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇクロロフィル、形質転換植物は２．４０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇクロロフィルであり、野生株に比べて約１．７５倍高い活性を有していた。
【００１７】
また、通常条件（３６０ｐｐｍ  ＣＯ2 ）下での光合成活性を比較した結果、０、１０、５０、１００μＥ／ｓ／ｍ2 の光条件下では、野生株と形質転換植物には有意な差は見られなかった。しかし、２００μＥ／ｓ／ｍ2 の光条件下では、形質転換植物の光合成活性は、野生株の光合成活性と比べて有意に上昇していた。１６００μＥ／ｓ／ｍ2 の光条件下では、野生株の１．２４倍に上昇していた。これらの結果を図３に示す。
【００１８】
（生育に及ぼす影響）
ホグラント培養液を用いて、野生株および形質転換植物について水耕栽培を行った。その条件は、400 マイクロモル／ｍ2 ／ｓであり、相対湿度は６０％であり、気温は２５℃である。栽培開始から６３日目、７２、７７、８２、８５、９０、９７、１０２、１０５、１０９、１１２日目に、植物の背丈を測定した。この結果を図２に示す。６４日目には、野生株は１４．０±４．６ｃｍ、形質転換植物は１６．６±２．９ｃｍであったが、栽培１１２日目には、野生株が５８．３±７．０ｃｍ、形質転換植物が８４．５±７．８ｃｍであり、有意に生育が促進されていた（約１．４５倍）。図４の写真において、左側に野生株を示し、右側に形質転換植物を示す。
【００１９】
生育期間の全体を通じて、形質転換植物は、野生株と比較して、葉、茎、根のいずれも発達しており、葉は肉厚で１枚当たりの面積が大きく、茎が太く、根が多く、長くなっていた。図５には、１１２日目における葉と茎との外観を示しており、左側が野生株であり、右側が形質転換植物である。図６には、１１１日目における根の外観を示しており、左側が野生株であり、右側が形質転換植物である。
【００２０】
（代謝中間体の量）
播種後、１２週間目の上葉（上から４番目）、下葉（下から３番目）、茎、根における代謝中間体（ヘキソース、シュクロース、デンプン）の量を定量し、比較した。この結果を図７に示す。形質転換植物の代謝中間体の量は、上葉、下葉、茎、根のいずれにおいても、野生株に比べて有意に増加していた。特に上葉において、ヘキソースおよびシュクロースが大幅に増加していた。また、デンプンは下葉に多く蓄積されていた。これは、上葉で合成されたシュクロースが下葉へと転流したことによる。
【００２１】
以上の結果から分かるように、本発明によって、高等植物の光合成能が強化され、この結果、糖、デンプンの合成能力が増大し、生育が促進されたものと考えられる。また、花芽形成時の乾燥重量は、野生株が１４．１±２．２ｇであり、形質転換植物が２１．０±１．９ｇと約１．５倍増加しており、最終的な物質生産能も増加していることがわかる。
【００２２】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の形質転換植物は、野性株よりも光合成能が強化され、この結果、糖、デンプンの合成能力が増大し、生育が促進され、かつ最終的な物質生産能も増加していた。従って、高等植物の葉緑体へのＦＢＰａｓｅ／ＳＢＰａｓｅの導入は、早生、高収量作物を作出する上で非常に有効な手段であった。このように、組み換えＤＮＡ技術を利用して、高等植物の一次代謝である光合成の機能を改善し、早生、収穫量の増大を可能とした類例はなく、将来の食料危機に対応する上で極めて重要な鍵となる技術である。
【００２３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  タバコ葉緑体への導入用のプラスミドを示す模式図である。
【図２】  野生株と形質転換植物との水耕栽培時の背丈を比較したグラフである。
【図３】  野生株と形質転換植物との光合成能を比較したグラフである。
【図４】  水耕栽培１１２日目における、野生株と形質転換植物との外観を比較した写真である。
【図５】  水耕栽培１１２日目における、野生株と形質転換植物との葉および茎の外観を比較した写真である。
【図６】  水耕栽培１１２日目における、野生株と形質転換植物との根の外観を比較した写真である。
【図７】  野生株と形質転換植物との代謝中間体の含量を比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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