(57)【要約】中枢性グリア細胞である１型アストロサイト前駆細胞、２型アストロサイト前駆細胞及びＯ４前駆細胞を含むグリア細胞群を有効成分とする脊髄損傷治療剤、並びに、有効量の該治療剤を脊髄損傷部位に局所投与することを特徴とする脊髄損傷の治療方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１型アストロサイト以外の培養した中枢性グリア細胞の少なくとも１種を含むグリア細胞群を有効成分とする脊髄損傷治療剤。
【請求項２】
前記中枢性グリア細胞の少なくとも１種が、１型アストロサイト前駆細胞、２型アストロサイト前駆細胞及びＯ４前駆細胞の少なくとも１種である、請求項１に記載の脊髄損傷治療剤。
【請求項３】
該グリア細胞群は、２型アストロサイト前駆細胞を主成分とする、請求項１に記載の脊髄損傷治療剤。
【請求項４】
該グリア細胞群が脊髄由来の混合グリアである、請求項１乃至３のいずれかに記載の脊髄損傷治療剤。
【請求項５】
該グリア細胞群が同種異系又は自己のものである、請求項１乃至４のいずれかに記載の脊髄損傷治療剤。
【請求項６】
前記グリア細胞群を１０３〜１０６細胞／μＬの量で含む、請求項１乃至５のいずれかに記載の脊髄損傷治療剤。
【請求項７】
脊髄を損傷したヒト又は他の哺乳動物の脊髄損傷部位に、１型アストロサイト以外の培養した中枢性グリア細胞の少なくとも１種を含むグリア細胞群を、治療上有効な量を局所投与することを特徴とする、ヒト又は他の哺乳動物における脊髄損傷の治療方法。
【請求項８】
該グリア細胞群が脊髄由来の混合グリアである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該グリア細胞群が同種異系又は自己のものである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記脊髄損傷部位が脊髄を損傷した成人のものであって、投与されるグリア細胞群のうち中枢性グリア細胞の総数が１０３〜１０７細胞である、請求項７乃至９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、脊髄損傷の新規治療法及びそのための製剤に関する。詳細には、本発明は、脊髄損傷患者の損傷部位に中枢性グリア細胞を局所投与することによる脊髄損傷の治療方法、並びに中枢性グリア細胞を有効成分とする脊髄損傷治療剤に関する。
背景技術
脊髄損傷は、対麻痺（切断部より下の両下肢の麻痺）あるいは四肢麻痺、さらには呼吸麻痺といった深刻な症状を引き起こし、患者に車椅子や寝たきりの生活を余儀なくさせる。現在までのところ、脊髄損傷の有効な治療手段は見出されていない。損傷した神経路を修復して、再び自らの手を動かし、自らの脚で歩くことは、交通事故やスポーツ事故によって一瞬のうちに手足の自由を奪われた患者達にとって切実な願いである。
１９世紀末以来、哺乳類の中枢神経伝導路は再生しないか、再生したとしても微々たるもので、機能的意義を持たないと永らく信じられてきた［例えば、Ｃａｊａｌ，Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，１９５９，Ｈａｆｎｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９２８）］。しかしながら、この約２０年間の研究成果は、この通説が誤りであり、哺乳類でも機能的意義を持った再生が可能であることを明らかにした。
そこで、新たにドグマとして浸透しつつあるのが、中枢神経系の軸索環境は全体として再生軸索の伸長に対して拒絶的であり、再生に導くためにはその環境を許容的に変化させなければならないとする、いわゆる拒絶的軸索環境仮説である。Ｓｃｈｗａｂらは、中枢神経系の白質にはミエリンに関連した軸索の伸長を抑制する因子が存在することを見出し、この因子が中枢神経系の軸索環境を軸索の伸長に対して拒絶的にしていると想定した。実際に、彼等は、錐体路を切断した成熟ラットにこの因子に対する抗体を作用させると、錐体路が再生して切断部を越えて伸長することを報告している［Ｎａｔｕｒｅ，３４３（１８），２６９（１９９０）］。
一方、末梢神経が脊髄に比して再生しやすいことに着目し、これを用いて脊髄を再生させようとする試みもなされている。Ｃｈｅｎｇらは、成熟ラットの脊髄髄節を切除してその間を末梢神経で繋ぎ、機能回復が起こったことを報告した［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３（２６），５１０（１９９６）］。また、Ｇｕｅｓｔらは、末梢性グリアであるシュワン細胞の移植によって脊髄の再生が得られたことを報告した［Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．，１４８，５０２（１９９７）］。さらに、Ｌｉらは、成熟ラットの脊髄伝導路を頸髄上部で部分的に切断し、切断部に培養した嗅神経鞘細胞［＝ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；嗅球〜嗅神経に特異的に存在するグリア細胞］を移植することによって、錐体路の再生とそれによる機能回復が起こることを報告した［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７（２６），２０００（１９９７）］。
しかしながら、中枢神経系の軸索環境を許容的に変えようとするこれらの試みによって起こる再生は、量的に少なく、距離もせいぜい１０ｍｍ程度と短く、多くは本来の標的に届いていない異所性投射であった。そのため、機能回復が起こったといってもその程度は低く、後肢が辛うじて体重を支えることができる程度に過ぎなかった。従って、脊髄損傷患者を車椅子から解放し、再び自らの脚で歩くことを可能にするためには、正常と同様な投射を再構築し得るような新規の神経修復手段が切望されている。
従って、本発明の目的は、再生線維の量（投射細胞の数）、距離（軸索の延長）、経路及び終止部位において正常な投射と実質的に等しく、四肢の協調運動が可能な程度の機能回復をもたらし得る、脊髄損傷の新規治療方法並びにそのための製剤を提供することであり、それによって脊髄損傷患者及びその介護者たる家族等の肉体的・精神的負担を軽減することであり、さらに医療コストの軽減を実現して、ひいては国民経済の負担を軽減することである。
発明の開示
本発明は、「脊髄の神経再生を妨げるのは全体的な拒絶的軸索環境ではなく、損傷部の局所的条件である」とする本発明者らの仮説と、この仮説を裏付ける種々の科学的知見に基づく。本発明者らは、１月齢未満の幼若ラットの脊髄を鋭利に切断した場合、人為的操作を加えずとも、切断された伝導路の明確且つ量的に著しい再生が自然に生ずることを見出した。２〜３月齢の成熟ラットは幼若ラットに比して組織が硬く切断により不可避的に浮腫が生じるため、自然な再生は起こらなかったが、切断部に胎仔ラットの脊髄組織を移植すれば正常と同様の投射の再生が導かれた。これらの結果から、本発明者らは、中枢神経系は再生軸索の伸長に対して全体として拒絶的なのではなく、軸索を正しい経路に導き正しい標的に終止させる「手がかり」が損傷部位の近傍で攪乱されるという局所的条件の悪化が、脊髄損傷の神経修復を阻んでいるのではないかと推定した。他方、軸索環境が拒絶的であるとの前提に立って、それを許容的に変えるために抗体を投与したり、末梢神経を移植したりする試みは、再生軸索の伸長を導く「手がかり」の整合性を損なったり、履歴現象を乱したりするために、却って再生線維の伸長を量的にも距離的にも制限し、異所性投射にしているのではないかと考えた。
上記の仮説に基づいて、本発明者らは、本来の中枢神経細胞の周辺環境を再現して脊髄損傷部位における局所環境を改善すべく、培養した新生ラット脊髄由来の混合グリアを、胸髄を完全切断した成熟ラットの損傷部位に局所注入した。その結果、当該ラットは術後約３週間で正常動物と区別できない程度にまで機能が回復し、また、再生線維は量的及び距離的に正常動物と同等で、且つ正しい経路を通って正しい標的に終止していることが確認された。このように、本発明は、従来は神経再生に抑制的に作用すると考えられていた中枢性グリアを用いて、従来よりもはるかに高度な神経修復を達成することができるという、全く新しい技術的思想に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は、脊髄を損傷したヒト又は他の哺乳動物の脊髄損傷部位に、１型アストロサイト以外の培養した中枢性グリア細胞の少なくとも１種を含むグリア細胞群を、治療上有効な量局所投与することを特徴とする、ヒト又は他の哺乳動物における脊髄損傷の治療方法を提供する。
本発明はまた、本発明の治療方法において、好適に使用することができる脊髄損傷治療剤を提供する。当該治療剤は、１型アストロサイト以外の培養した中枢性グリア細胞の少なくとも１種を含むグリア細胞群を有効成分として含有することを特徴とし、医薬上許容される任意の担体をさらに含むことができる。
本発明のさらなる特徴及び本発明の利点は、以下の「発明の実施の形態」において明らかになるであろう。
発明を実施するための最良の形態
本発明の脊髄損傷治療剤は、１型アストロサイト以外の培養した中枢性グリア細胞の少なくとも１種を含むグリア細胞群を有効成分として含有することを特徴とする。中枢性グリア細胞としては、アストロサイト（１型及び２型）、オリゴデンドロサイト、ミクログリア及びそれらの前駆細胞等があるが、単一のグリア細胞種であっても、２種以上からなる混合グリアであってもよい。好ましいのは１型アストロサイト前駆細胞（以下、「１型Ａ前駆細胞」）、２型アストロサイト前駆細胞（以下、「２型Ａ前駆細胞」）及びＯ４前駆細胞の少なくとも１種を含むものであり、最も好ましいのは２型Ａ前駆細胞を主成分とするグリア細胞群である。もちろん、これらの好ましい中枢性グリア細胞を含む限り、１型アストロサイト、２型アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアをさらに含んでいる混合グリアも好ましい。さらに、上記の培養した中枢性グリア細胞を含む限り、シュワン細胞や、嗅神経鞘細胞等の他のグリア細胞をさらに含むこともできる。
本発明のグリア細胞群の由来は特に制限されず、自己（ａｕｔｏ）、同種異系（ａｌｌｏ）及び異種（ｘｅｎｏ）由来のいずれのグリア細胞も使用することができるが、好ましくは、同種異系組織又は自己組織由来のグリア細胞である。治療対象がヒトの場合、同種異系細胞の供給源としては、死産の胎児又は新生児から摘出した中枢神経組織、脳死又は心臓死患者の中枢神経組織が挙げられる。異種由来の細胞としては、ブタやサル、その他の哺乳動物の中枢神経組織由来のグリア細胞が挙げられる。中枢神経系は免疫租界といわれるように、臓器・組織の中では最も免疫拒絶反応の起こりにくいところなので、少量の免疫抑制剤の使用で異種細胞をヒトに生着させることも可能である。また、自己細胞としては、患者自身の脊髄から単離したグリア細胞や、神経幹細胞を培養・分化させて得られたグリア細胞等が挙げられる。
グリア細胞群の供給源となる哺乳動物の齢も特に制限はない。好ましくは、胎児や新生児もしくは幼若期の動物由来のものであるが、成熟動物由来のものであってもよい。
グリア細胞群の供給源となる中枢神経組織は特に限定されず、例えば、脊髄、全脳、大脳皮質、脳幹等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、脊髄由来のグリア細胞である。
本発明のグリア細胞群の調製方法も特に制限はないが、例えば、哺乳動物の脊髄や大脳皮質等を無菌的に摘出した後、トリプシン等の蛋白質分解酵素で処理して単一細胞ないし小細胞塊に分離し、血清添加培地で一定期間培養する方法が挙げられる。神経細胞は培養の比較的早期に脱落し、混合グリアが得られる。使用する培地としては、約１０〜約２０％のウシ胎仔血清を添加した最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコの改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ−１０培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられるが、これらに限定されない。培養は、ＣＯ２インキュベーター内に静置して、３〜４日毎に培地交換をしながら、約３０〜約４０℃で行うことができる。尚、長期間培養すると、増殖力の強いアストロサイトが大部分を占めるようになるので、オリゴデンドロサイトの比率を増したい場合は、無血清培地で培養してアストロサイトの増殖を抑えるか、接着性の違いを利用するか、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心で両者を分離する等の処理を行えばよい。
また、本発明のグリア細胞群は、神経幹細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から培養分化したグリア細胞であってもよい。神経幹細胞は生物学的特徴の違いから成人型、胎児型、神経上皮型に分類することができるが、そのいずれもが本発明に使用可能である。成人型は成熟動物の側脳質壁や海馬に多く分布し、例えば、成熟脳培養細胞をＥＧＦやｂＦＧＦで刺激することにより分離することができる。胎児型は、ヒトの場合、例えば、胎生約１０週前後の脳から分離した培養細胞をＥＧＦとＦＧＦ−２の両者で同時に刺激することにより、長期間自己複製が可能となり、これらの成長因子を除くとアストロサイトやオリゴデンドロサイトに分化することができる。神経上皮型は胎児型よりさらに幼若で、神経板や神経管形成期の幹細胞であり、ヒトでは胎生２４〜２５日、マウスでは胎生８日、ラットでは胎生１０日、ブタでは胎生１７〜１８日に相当する。動物から分離された神経幹細胞は、甲状腺ホルモンの１つであるＴ３の刺激によりオリゴデンドロサイトに分化させることができる。また、毛様体神経発育因子（ＣＮＴＦ）の刺激によりアストロサイトに分化させることができる。神経幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでアストロサイトに分化させる方法論はよく知られており、例えば、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１０，３１２９−３１４０（１９９６）、Ｎｅｕｒｏｎ，１８，８１−９３（１９９７）、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８，３６２０−３６２９（１９９８）等に記載されている。
ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＩＣＭの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ＥＳ細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌から胚盤胞を分離し、ペトリ皿で培養すると胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するＩＣＭを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を遊離させることによりＥＳ細胞が得られる。ＥＳ細胞からのグリア細胞の分化は、まずＥＳ細胞を三次元的に培養して胚様体（ＥＢ）と呼ばれる細胞塊を得、レチノイン酸やｂＦＧＦ等の適当な分化誘導剤で処理してグリア前駆細胞へ分化させた後、分化誘導剤を除去したり、Ｔ３やＣＮＴＦ等を添加することにより達成することができる。
本発明の脊髄損傷治療剤は、上記のようにして調製されるグリア細胞群を、上記の培養液又はＰＢＳ等の適当な緩衝液中に懸濁することにより、脊髄損傷部位への局所投与に適した形態として製剤化することができる。本製剤は、グリア細胞群の生物活性に悪影響を及ぼさない限り、医薬上許容される添加剤を任意で含有させることができる。製剤中の細胞密度としては、約１０３〜約１０６細胞／μＬ、好ましくは約１０４〜約１０５細胞／μＬが好ましく例示される。
本発明の脊髄損傷の治療方法は、上記の脊髄損傷治療剤の有効量を、患者の脊髄損傷部位に局所投与することを特徴とする。本発明において治療対象となるのは、ヒトをはじめとする哺乳動物であれば特に制限はない。損傷の程度は、部分切断及び完全切断のいずれであっても適用できる。
また、脊髄損傷の部位も特に制限はなく、延髄や頸髄等の脳に近い部位から胸髄、腰髄、仙髄等に至るまで、いかなる部位であっても適用可能である。従って、症状の重篤度にも制限はなく、軽度の麻痺はもちろん、対麻痺、四肢麻痺、あるいは呼吸麻痺を伴うような重度の患者についても適用することができる。
本発明の治療方法は、交通事故や落下事故等による外傷性の脊髄損傷に好ましく適用することができるが、例えば、脳卒中で錐体路が切断した場合のような他の疾患に起因する損傷にも同様に適用可能である。
また、本発明の治療方法は、急性期、特に受傷後約２４時間以内、好ましくは約８時間以内の急性期に行うのが望ましいが、受傷後１週間以上の慢性期、例えば、受傷後５年もしくは１０年以上経った患者であっても神経修復できる可能性がある。投射細胞は再生しなくとも、逆行性変性では死滅しにくく、例えば、ラットでは受傷後数ヶ月（ヒトに換算すると約１０年に相当する）を経ても相当な数の投射細胞が生存しているので、軸索の局所的環境が改善されれば、慢性期の中後期においても軸索を再び伸長させることが可能であると考えられる。
グリア細胞懸濁液を患者の脊髄損傷部位に局所投与する方法は、安全且つ確実に髄内にグリア細胞群を注入し得る限り、いかなる方法も使用することができるが、例えば、損傷部位の椎弓を外科的に切除して脊髄を露出させた後、注射によって露出した脊髄から髄内に細胞懸濁液を導入する方法が挙げられる。かかる外科的手技によるノウハウが蓄積されれば、ＭＲＩ画像を見ながら脳脊髄液を採取するのと同様の手法で、椎弓を切除することなく僅かな侵襲でグリア細胞懸濁液を損傷部位に注入することが可能となる。
投与されるグリア細胞群の量は、脊髄損傷の程度等に応じて適宜変動させることができるが、通常、成人患者の場合、中枢性グリア細胞の総数として約１０３〜約１０７細胞、好ましくは約１０５〜約１０７細胞が投与される。
本発明の治療方法を行うに先立って、患者に免疫抑制剤の投与を行うこともできる。投与されるグリア細胞群が異種（ｘｅｎｏ）細胞である場合は、免疫抑制剤の使用が特に重要である。免疫抑制剤は、脊髄移植や他の臓器移植において通常使用されているものを用いることができ、例えば、シクロスポリン、タクロリムス水和物（ＦＫ５０６）、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミゾリビン、メトトレキサート等が使用可能である。免疫抑制剤の使用量は、薬剤の種類、投与されるグリア細胞群の由来、患者の受容性等を考慮して、適宜調節することができる。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１  新生ラット脊髄由来の混合グリア細胞懸濁液の調製及びグリア細胞組成の分析
１〜２日齢の新生ラット［Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットにｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）を導入したトランスジェニックラット；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，４０７，３１３−３１９，１９９７参照］から無菌的に脊髄を摘出した後、蛋白質分解酵素であるトリプシン及びＤＮＡ分解酵素で処理して単一細胞〜小細胞塊に分離した。これを約５×１０６個／７５ｃｍ２ディッシュの密度で（３〜４匹ラット脊髄あたり１ディッシュ）シャーレに播種し、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００単位／ｍＬ、アンホテリシンＢ２．５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加）を用いて通常条件下で培養した。第２、６及び１０日目に培養液（上記ＤＭＥＭ培地。以下同様。）を追加した。培養開始約２週間でコンフルエントになったので、トリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコＢＲＬ社製、０．２５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて細胞をまき直し（１ディッシュ→１ディッシュ）、以後、３〜４日に１回の割合で培養液を交換しながら、さらに培養を続けた。培養開始後３週間〜１ヶ月の時点で、トリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコＢＲＬ社製、０．２５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて細胞を剥離した後、約４〜５×１０４細胞／μＬの密度となるように（１ディッシュあたり約５０μＬ）培養液を加えて細胞懸濁液を調製し、実施例２の脊髄損傷局所への投与に使用した。
一方、この混合グリア細胞の一部を用いて、特異的な抗原マーカー分子の発現を調べることにより、グリア細胞の組成を分析した。分類は、Ｎｅｕｒｏｇｌｉａ，Ｈｅｌｍｕｔ  Ｋｅｔｔｅｎｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に基づいて行った。結果を表１に示す。
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実施例２  脊髄損傷局所へのグリア細胞の注入
成熟ＳＤラット（雌、２月齢）の脊髄（下部胸髄）を鋭利に完全切断した後、実施例１で調製した細胞懸濁液を、損傷部の頭側と尾側の２箇所にハミルトンシリンジを用いて約４〜５×１０４細胞（１μＬ）ずつ注入した。術後の神経機能回復経過をＯｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ  Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ｓｃａｌｅ（ＢＢＢスケール）を用いて経時的に評価した。ＢＢＢスケールというのは完全麻痺をスコア０、正常をスコア２１とし、スコア１〜８は下肢の自発的運動はあっても体重を支えることができない段階、スコア９〜１３は体重を支えて歩ける段階、スコア１４〜２０は前肢−後肢の協調性のある歩行ができることを示す（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１２巻、１−２１、１９９５）。
その結果、該ラットは、当初完全対麻痺、尿閉、下半身汚染を認めたが、術後３〜４日目頃から後肢を僅かに動かし始め、１週間で後肢で自己の体重を支えるようになった。２週間で前肢と後肢の協調歩行が認められるようになり、３週間でほぼ正常ラットと区別できないような歩行を行えるまでに回復した。即ち、ＢＢＢスケールで１５点以上を認めた。また、再生軸索の伸長をトレーサーを用いて調べた結果、量的にも、距離・経路の点でも正常の伝導路と変わらないほどの再生線維を認め、神経終末では正常の標的にシナプスを形成していることがわかった。
実施例３  成熟ラット脊髄損傷部由来の混合グリア細胞懸濁液の調製
６０日齢の成熟ラット［Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットにｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）を導入したトランスジェニックラット；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，４０７，３１３−３１９，１９９７参照］の脊髄（下部胸髄）をナイフで部分切断し、術後１ヶ月放置した。このラットの脊髄損傷部より無菌的に脊髄を２〜３髄節摘出した後、実施例１と同じ蛋白質分解酵素で処理して単一細胞〜小細胞塊に分離した。これを約５×１０６個／７５ｃｍ２ディッシュの密度で（１〜２匹ラット脊髄あたり１ディッシュ）シャーレに播種し、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００単位／ｍＬ、アンホテリシンＢ２．５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加）を用いて通常条件下で培養した。第２、６及び１０日目に培養液を追加し、以後３〜４日に１回の割合で培養液を交換したが、新生ラット脊髄由来のグリア細胞に比して増殖スピードが遅く培養開始約３〜４週間でコンフルエントになった。ここでトリプシン−ＥＤＴＡ（前述）を用いて細胞をまき直し（１ディッシュ→１ディッシュ）、さらに２週間培養を続けた。培養開始後５〜６週の時点で、実施例１と同様に約４〜５×１０４細胞／μＬの密度の細胞懸濁液を調製し、成熟ラット脊髄損傷部由来の混合グリア細胞懸濁液として実施例４の脊髄損傷局所への投与に使用した。
実施例４  脊髄損傷局所への成熟ラット脊髄損傷部由来グリア細胞の注入
成熟ＳＤラット（雌、２月齢）の脊髄（下部胸髄）を鋭利に完全切断した後、実施例３で調製した成熟ラット脊髄損傷部由来グリア細胞懸濁液を、実施例２と同様の方法で脊髄損傷局所へ注入した。その結果、実施例２と同様の著明な機能回復を認めた。
比較例１  脊髄損傷局所への培養１型アストロサイトの注入
Ｗａｎｇ  ＪＪらによる先行研究（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｅｍｉｓｅｃｔｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６５，９７３−９８１，１９９５）と同様の方法で、新生ラット大脳由来の１型アストロサイトを分離した。この細胞懸濁液を、実施例２と同様に、成熟ＳＤラット（雌、２月齢）脊髄（下部胸髄）の完全切断損傷部の頭側と尾側の２箇所にハミルトンシリンジを用いて約４〜５×１０４細胞（１μＬ）ずつ注入した。術後の経過は実施例２と同様に、当初完全対麻痺、尿閉、下半身汚染を認めたが、後肢の運動回復は実施例２よりもはるかに劣っていた。即ち、術後１週頃よりわずかに後肢の運動を認めたが、その後自己の体重を支えるまでには至らず、ＢＢＢスケールでは８点を超えることはなかった。
比較例２  脊髄損傷局所への培養活性化マクロファージの注入
Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｍらによる先行研究（Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｒａｐｌｅｇｉｃ  ｒａｔｓ，１９９８）と同様に、坐骨神経と共培養して活性化した培養活性化マクロファージを調整した。この細胞懸濁液を、実施例２と同様に、成熟ＳＤラット（雌、２月齢）脊髄（下部胸髄）の完全切断損傷部に約１〜４×１０５細胞（１μＬ）注入した。術後の経過は実施例２と同様に、当初完全対麻痺、尿閉、下半身汚染を認めたが、後肢の運動回復は実施例２よりもはるかに劣っていた。比較例１と同様に、術後１週頃よりわずかに後肢の運動を認めたが、その後自己の体重を支えるまでには至らず、ＢＢＢスケールでは８点を超えることはなかった。
産業上の利用可能性
中枢性グリア細胞群を局所注入する本発明の治療方法によれば、投射細胞の数、再生軸索の延長、再生軸索の経路及び終止部位のいずれについても正常と区別できないほどの顕著な神経修復を極めて短期間のうちに実現でき、自己の体重を支えるだけでなく、四肢の協調運動も可能となる。従って、本発明は、これまで有効な治療方法が見出されていなかった脊髄損傷の画期的な治療手段となり得るものであり、臨床への応用が実現すれば、脊髄損傷患者及びその家族等の肉体的・精神的負担を大いに軽減するとともに、医療費の大幅な節減が可能となり、国民経済への負担を軽減することにも繋がる。
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月13日(2003.8.13)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養した２型アストロサイト前駆細胞を主成分として含むグリア細胞群を有効成分とする、脊髄の軸索損傷を治療するための治療剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
該グリア細胞群が脊髄由来の混合グリアである、請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
該グリア細胞群が同種異系又は自己のものである、請求項１または４に記載の治療剤。
【請求項６】
前記グリア細胞群を１０３〜１０６細胞／μＬの量で含む、請求項１、４及び５のいずれかに記載の治療剤。
【請求項７】
脊髄の軸索を損傷したヒト又は他の哺乳動物の脊髄損傷部位に、培養した２型アストロサイト前駆細胞を主成分として含むグリア細胞群を、治療上有効な量を局所投与することを特徴とする、ヒト又は他の哺乳動物における脊髄損傷の治療方法。
【請求項８】
該グリア細胞群が脊髄由来の混合グリアである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該グリア細胞群が同種異系又は自己のものである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記脊髄損傷部位が脊髄を損傷した成人のものであって、投与されるグリア細胞群のうち中枢性グリア細胞の総数が１０３〜１０７細胞である、請求項７乃至９のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2003018041.tif 000004
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