(57)【要約】試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、信頼性に優れる測定値が得られる測定方法を提供する。前記酸化還元反応に先立ち、界面活性剤存在下、試料にテトラゾリウム化合物を添加して、前記試料中に含まれるヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定する。この方法によれば、界面活性剤とヘモグロビンとの混在による濁りを防止できるため、図１に示すように、濁りによる吸光度の上昇が抑制される。前記界面活性剤としては、ポリオキシエチレンエーテル等が使用できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、前記酸化還元反応に先立ち、界面活性剤の存在下、試料にテトラゾリウム化合物を添加して前記試料中の還元物質の影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定する測定方法。
【請求項２】
試料がヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物を含む試料であって、前記試料中のヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響を排除する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項３】
酸化還元反応による測定が、前記反応により生じた発色物質の吸光度測定である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項４】
発色物質が、酸化還元酵素を用いて、還元物質または酸化物質と発色性基質とを酸化還元反応させることにより発色した発色性基質である請求の範囲３記載の測定方法。
【請求項５】
吸光度測定における測定波長が、６５０〜９００ｎｍの範囲である請求の範囲３記載の測定方法。
【請求項６】
吸光度測定における主波長が６５０〜８００ｎｍの範囲であり、副波長が前記主波長より大きくかつ７３０〜９００ｎｍの範囲である請求の範囲３に記載の測定方法。
【請求項７】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、アルキル硫酸塩および高分子化合物からなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン鎖と炭化水素鎖とがエーテル結合したポリオキシエチレンエーテルである請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項９】
ポリオキシエチレン鎖の重量平均重合度が８〜２３の範囲であり、炭化水素鎖の炭素数が８〜１８の範囲である請求の範囲８記載の測定方法。
【請求項１０】
炭化水素鎖が、アルキル基およびアルキルフェニル基の少なくとも一方の基から構成される請求の範囲８記載の測定方法。
【請求項１１】
炭化水素鎖が、分岐鎖を有する請求の範囲８記載の測定方法。
【請求項１２】
高分子化合物が、水溶性ゼラチン、プルラン、ポリエチレングリコールおよびポリビニルピロリドンからなる群から選択された少なくとも一つの化合物である請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項１３】
界面活性剤を、試料１ｍＬあたり０．０５〜５ｍｏｌの範囲になるように添加する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１４】
界面活性剤を、テトラゾリウム化合物１ｍｏｌ当たり０．２〜１５ｍｏｌの範囲になるように添加する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１５】
テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも一つの官能基を有する請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１６】
テトラゾリウム化合物が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１７】
測定対象物由来の酸化物質が過酸化水素であり、発色性基質として酸化により発色する発色性基質を使用し、前記過酸化水素と前記発色性基質とを酸化還元酵素によって酸化還元反応させる請求の範囲３記載の測定方法。
【請求項１８】
測定試料が血球を含む請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項１９】
測定対象物が、糖化タンパク質である請求の範囲１記載の測定方法。
【請求項２０】
測定対象物が、糖化ヘモグロビンである請求の範囲１記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法に関する。
背景技術
従来から、酸化還元反応を利用して、試料中の測定対象物の量を測定することは、広く実施されており、例えば、生化学分析や臨床検査等における糖化タンパク質の測定にも適用されている。
例えば、血液中の糖化タンパク質、特に赤血球中の糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このような赤血球中の糖化タンパク質は、前記酸化還元反応を用いて、例えば、以下に示すようにして測定されている。
まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）で処理し、糖化タンパク質の糖化部分に作用させて過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、この試料に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。この時、前記還元剤として、酸化されることにより発色する発色性基質を用いれば、その発色の測定により前記過酸化水素量を測定でき、この結果、赤血球中の糖化タンパク質量を知ることができる。
しかし、血液中には、通常、アスコルビン酸（ＡｓＡ）、ビリルビン等の各種還元物質が存在し、赤血球中には、さらに、グルタチオン（ＧＳＨ）等の各種還元物質が存在する。これらの還元物質により、例えば、発生させた前記過酸化水素が還元されたり、前記酸化還元反応が阻害されたり、前記発色性基質が酸化により発色しても、再度還元され退色するおそれがある。このため、赤血球中の糖化タンパク質量を正確に測定することが困難であるという問題があった。
また、試料ごとによって、含まれる前記還元物質の濃度も一定ではないため、測定精度が劣るという問題もあった。
このような問題を回避するために、例えば、種々の酸化剤を前記試料に添加するという方法がある。例えば、特開昭５６−１５１３５８号公報には、酸化剤としてヨウ素酸や過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物を用いる方法が開示されており、特開昭５７−１３３５７号公報、特開昭５７−１６１６５０号公報、特開昭５９−１９３３５４号公報、特開昭６２−１６９０５３号公報、特開平３−３０６９７号公報には、酸化剤としてコバルト、鉄、セリウム等の金属錯体を用いる方法が開示されている。
発明の開示
しかしながら、このように改良された従来の方法でも、試料によっては測定精度が十分に向上しない場合もある。また、前述のように、血液中の糖化タンパク質は、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされているため、これを測定するための酸化還元反応を用いた測定方法においても、更なる測定精度の向上が望まれている。
そこで、本発明の目的は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、信頼性に優れる測定値が得られる測定方法の提供である。
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、前記酸化還元反応に先立ち、界面活性剤の存在下、試料にテトラゾリウム化合物を添加して前記試料中の還元物質の影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定することを特徴とする。前記テトラゾリウム化合物とは、テトラゾール環構造を有する化合物である。なお、本発明において、「測定対象物由来の還元物質または酸化物質」とは、測定対象物そのもの、もしくは、その中の酸化還元物質、または測定対象物から酸化還元酵素等を用いて発生した酸化還元物質の双方を意味する。
本発明者らは、前記従来の方法では、前記ＧＳＨやＡｓＡのような低分子量還元物質の影響は排除されるが、タンパク質等のような高分子量還元物質による影響が排除されておらず、一方、前記テトラゾリウム化合物で処理すれば、前記低分子量還元物質だけでなく、前記高分子量還元物質、特にヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物（以下、両者あわせて「ヘモグロビン」という）の還元物質としての影響を排除できることを見出した。なお、これについて、本出願人は別途出願している（特開２０００−２１０１００号公報）。しかしながら、この方法では、例えば、ヘモグロビン等の高分子量還元物質による影響も排除されたにもかかわらず、十分に測定精度が向上しないこと、また、よりいっそうの測定精度の向上が望まれていることから、本発明者らは、さらに鋭意研究を行った。その結果、前記テトラゾリウム化合物の処理によって、例えば、ヘモグロビン等の高分子量還元物質による影響は排除できるが、前記両者を混在させることにより、反応液に濁りが生じることを突き止め、さらに、この濁りの発生を界面活性剤によれば防止できることを見出し、本発明に到達した。このような本発明の測定方法によれば、テトラゾリウム化合物によって還元物質の影響を排除し、かつ、前記テトラゾリウム化合物処理による濁りの発生も抑制するため、還元物質および濁りの両方による測定の妨害を防止でき、よりいっそう高精度な測定が可能となる。このため、本発明の測定方法は、前述のような臨床医療等における各種検査に有用であり、特に糖化ヘモグロビンの測定に適用すれば、糖尿病診断等の指標としての信頼性も向上する。
本発明の測定方法において、前記試料がヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物を含む試料であって、前記試料中のヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響を排除することが好ましい。特に、試料中のヘモグロビンの還元物質としての影響を排除し、かつ前記両者による濁りも排除できるからである。したがって、後述のような血液試料について有用な測定であるといえる。
本発明の測定方法において、試料にテトラゾリウム化合物を添加してから、濁りが発生した混合液にさらに界面活性剤を添加してもよいが、濁りの発生自体を抑制できることから、前記両者を同時に添加したり、予め界面活性剤を添加した試料にテトラゾリウム化合物を添加することが好ましい。
本発明の測定方法において、前記酸化還元反応による測定が、前記反応により生じた発色物質の吸光度測定であることが好ましい。
前記吸光度測定を行う場合、通常、二波長測定が主流である。前記二波長測定は、例えば、測定する対象物（例えば、発色性基質等の発色物質）の極大吸収を示す波長を主波長として前記対象物を測定し、さらに前記主波長と異なる波長を副波長とし、電気的ノイズ、試料の濁り、光量の変化等を測定して、前記主波長における測定値を校正する。したがって、副波長は、例えば、他の混在する物質が吸収を示さない波長であり、かつ、主波長とは約８０ｎｍ以上離して設定することが好ましい。そこで、本発明者らはさらに研究を重ねた結果、界面活性剤非存在下でＨｂをテトラゾリウム化合物処理すると、これらの反応物により約７００〜９００ｎｍ、特に約７６０ｎｍ〜９００ｎｍの波長に吸収が見られるようになり、この波長での測定が困難であるが、界面活性剤存在下でテトラゾリウム化合物処理すれば、前記波長では吸収が見られないことを見出した。したがって、この約７００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収波長に、前記発色物質の測定波長（主波長や副波長）を設定すれば、前記濁りを防止することだけでなく、さらにＨｂの吸収による影響を受けることなく、吸光度測定を精度よく行うことができる。
本発明の測定方法において、前記発色物質の吸光度測定の測定波長としては、６５０〜９００ｎｍの範囲が好ましく、より好ましくは６５０〜８００ｎｍの範囲であり、特に好ましくは、６９０〜７６０ｎｍの範囲である。また、前記波長を主波長とする場合、副波長は、前記主波長よりも大きいことが好ましく、例えば、７３０〜９００ｎｍの範囲が好ましく、より好ましくは８００〜９００ｎｍの範囲であり、特に好ましくは、８００〜８５０ｎｍの範囲である。
本発明の測定方法において、前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、アルキル硫酸塩および高分子化合物からなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤であることが好ましい。
前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル等があげられ、好ましくは、ポリオキシエチレンエーテルである。
前記ポリオキシエチレンエーテル［ＣＬＨＭ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ＮＨ］は、ポリオキシエチレン鎖と炭化水素鎖とがエーテル結合しており、前記炭化水素鎖としては、例えば、アルキル基、アルキルフェニル基等があげられる。前記ポリオキシエチレン鎖の重量平均重合度（Ｎ）は８〜２３の範囲であり、他方の炭化水素鎖の炭素数（Ｌ）は８〜１８の範囲であることが好ましく、より好ましくは前記重量平均重合度（Ｎ）が８〜１５の範囲であり、炭化水素鎖の炭素数（Ｌ）が８〜１６の範囲であり、特に好ましくは前記重量平均重合度（Ｎ）が８〜１０の範囲であり、炭化水素鎖の炭素数（Ｌ）が８〜１４の範囲である。また、前記炭化水素鎖は、例えば、直鎖でもよく、分岐鎖を有していてもよい。前記ポリオキシエチレンエーテルの具体例としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコール（１０）ラウリルエーテル、ポリエチレングリコール（９）ラウリルエーテル等があげられる。
前記ソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル等があげられる。
前記アルキル硫酸塩としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、２，４−ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウム等があげられる。
前記高分子化合物としては、例えば、水溶性ゼラチン、プルラン等の生体高分子化合物や、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子化合物が使用できる。ポリエチレングリコールの重量平均重合度は、例えば、１００〜３０，０００の範囲であり、好ましくは６００〜６０００の範囲である。プルランとは、多糖類であり、マルトトリオース残基がα１−６結合で連なった水溶性α−グルカンをいう。
本発明の測定方法は、前記界面活性剤を、試料１ｍＬあたり０．０５〜５ｍｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．１〜３ｍｍｏｌの範囲であり、より好ましくは０．２〜１．５ｍｍｏｌの範囲である。また、前記界面活性剤を、テトラゾリウム化合物１ｍｏｌあたり０．２〜１５ｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．５〜１０ｍｏｌの範囲であり、より好ましくは０．７〜５ｍｏｌの範囲である。
本発明の測定方法において使用する前記テトラゾリウム化合物としては、例えば、テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有することが好ましく、より好ましくは、３箇所に環構造置換基を有する構造である。
前記テトラゾリウム化合物が、前述のように、前記テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位および３位に有することが好ましい。また、テトラゾリウム化合物が３箇所に環構造置換基を有する場合は、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位、３位および５位に有することが好ましい。
また、少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。また、ベンゼン環以外の環構造置換基としては、例えば、環骨格にＳまたはＯを含み、かつ共鳴構造である置換基があげられ、例えば、チエニル基、チアゾイル基等である。
前記テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の少なくとも３箇所に環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。
少なくとも１つの環構造置換基が官能基を有することが好ましく、前記官能基の数が多いことがより好ましい。
前記官能基としては、電子吸引性の官能基が好ましく、例えば、ハロゲン基、エーテル基、エステル基、カルボキシ基、アシル基、ニトロソ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基等があげられる。この他にも、例えば、ヒドロペルオキシ基、オキシ基、エポキシ基、エピジオキシ基、オキソ基等の酸素を含む特性基や、メルカプト基、アルキルチオ基、メチルチオメチル基、チオキソ基、スルフィノ基、ベンゼンスルホニル基、フェニルスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、ｐ−トリルスルホニル基、トシル基、スルファモイル基、イソチオシアネート基等の硫黄を含む特性基等があげられる。これらの電子吸引性官能基の中でも、好ましくは、ニトロ基、スルホ基、ハロゲン基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基である。また、前記電子吸引性の官能基の他に、例えば、フェニル基（Ｃ６Ｈ５−）、スチリル基（Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨ−）等の不飽和炭化水素基等もあげられる。なお、前記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。
前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を有することが好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇所（ｏｒｔｈｏ−、ｍｅｔａ−、ｐｒａ−）に前記官能基を有してもよい。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を有しても、異なる官能基を有してもよい。
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前記テトラゾール環の２位、３位および５位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジル）−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム塩および２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム塩等があげられる。
また、前記テトラゾリウム化合物は、前述のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム塩、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル　カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，２’−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩および３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等があげられる。
また、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリウム化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム塩等があげられる。
前述のテトラゾリウム化合物の中でも、前述のように、環構造置換基を３つ有する化合物が好ましく、より好ましくは、環構造がベンゼン環である置換基を３つ有し、かつ電子吸引性官能基を多く有するものであり、特に好ましくは、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である。
なお、このようなテトラゾリウム化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態等であってもよい。また、一種類には限られず、二種以上を併用してもよい。
本発明の測定方法において、前記テトラゾリウム化合物の添加量は、特に制限されず、例えば、試料の種類や前記試料に含まれるヘモグロビンやその他の還元物資の量により適宜決定できる。具体的には、例えば、試料１μＬ当たり、前記テトラゾリウム化合物を、０．００１〜１００μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．００５〜１０μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０１〜１μｍｏｌの範囲である。
本発明の測定方法において、前記試料が全血の場合、前記テトラゾリウム化合物を、全血１μＬ当たり、０．００１〜１０μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．００５〜５μｍｏｌの範囲、特に好ましくは０．０１〜２μｍｏｌの範囲である。なお、全血の血球濃度は、通常、５０重量％と推定できる。具体的には、前記テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩の場合は、全血１μＬ当たり、０．０２〜１０μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５〜３μｍｏｌの範囲、特に好ましくは０．１〜２μｍｏｌの範囲である。
なお、前記界面活性剤の添加量は、テトラゾリウム化合物の添加量に応じて、例えば、前述のようなモル比となるように調整できる。
本発明において、前述のような酸化還元反応により生じた発色物質の吸光度測定とは、例えば、酸化還元酵素を用いた前記還元物質または酸化物質と発色性基質との酸化還元反応により、発色した前記発色性基質（すなわち発色物質）の吸光度測定であることが好ましい。
具体的には、前記測定対象物由来の酸化物質が過酸化水素であり、前記発色性基質として酸化により発色する発色性基質を使用し、前記過酸化水素と前記発色性基質とを酸化還元酵素によって酸化還元反応させることが好ましい。
前記酸化還元酵素としては、特に制限されないが、例えば、ＰＯＤが好ましく、前記酸化により発色する発色性基質としては、高感度に検出可能であることから、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムが好ましい。
本発明の測定方法において、前記測定試料は、特に制限されないが、全血、血漿、血清、血球等の血液試料の他に、例えば、尿、髄液、唾液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等もあげられる。また、血球内成分を測定する場合は、例えば、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。
本発明の測定方法において、前記測定対象物は、前記酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されないが、例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分等もがあげられ、好ましくは赤血球内成分である。また、具体的には、例えば、糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられ、より好ましくは糖化タンパク質であり、特に好ましくは糖化ヘモグロビンである。
本発明の測定方法において、測定対象物が糖化タンパク質の場合、前記糖化タンパク質の糖化部分をＦＡＯＤで酸化分解することにより過酸化水素を生成させることが好ましい。また、測定対象物が前記糖化ペプチド、糖化アミノ酸の場合も、同様にＦＡＯＤを作用させることが好ましい。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、必要に応じて、前記ＦＡＯＤ処理前に、プロテアーゼ処理することが好ましい。
前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
2002027331.tif 000003
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
2002027331.tif 000004
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
2002027331.tif 000005
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。
2002027331.tif 000006
前記式（４）において、Ｒ５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ５は
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−
である。
また、前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
2002027331.tif 000007
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
2002027331.tif 000008
発明を実施するための最良の形態
つぎに、本発明の測定方法について、血球中の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により分離した血球画分を溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用でき、この中でも前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
溶血用の界面活性剤としては、特に制限されないが、操作の簡便性の点から、後述するテトラゾリウム化合物による前処理と同様の界面活性剤を使用することが好ましい。前記溶血処理の条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０１〜５重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよい。
つぎに、界面活性剤存在下において、前記溶血試料に対し前記テトラゾール環構造を有するテトラゾリウム化合物を添加し、前記溶血試料の前処理を行なう。
前記界面活性剤としては、前述のような界面活性剤が使用できる。具体的には、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルである市販のＴｒｉｔｏｎ系界面活性剤等、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである市販のＴｗｅｅｎ系界面活性剤等、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである市販のＢｒｉｊ系界面活性剤等が使用できる。この他に、例えば、ポリオキシエチレン（１０）ラウリルエーテル、商品名Ｎｉｋｋｏｌ　ＢＬ−９ＥＸ（ポリオキシエチレンの重量平均重合度Ｎが９：和光純薬工業社製）等のようなポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル、商品名Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　ＮＰＸ（ポリオキシエチレンの重量平均重合度Ｎが約１０．５：ナカライテスク社製）および商品名Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　ＮＰ−４０（ポリオキシエチレンの重量平均重合度Ｎが２０：ナカライテスク社製）等のようなポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等も使用できる。
前記界面活性剤の添加割合は前述と同様である。具体的には、前処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、界面活性剤濃度２〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、特に好ましくは１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。なお、前記溶血試料の調製（溶血処理工程）において、この前処理と同様の界面活性剤を使用する場合、前記溶血処理工程において、予め、この前処理に必要な濃度になるように前記界面活性剤を添加しておいてもよい。また、溶血処理前の試料に、テトラゾリウム化合物および前記界面活性剤を共に添加して、溶血処理と前処理とを同時に行ってもよい。
前記テトラゾリウム化合物としては、前述のようなものが使用でき、その添加割合は、例えば、前処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、濃度０．０２〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．４〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。具体的に、前記テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩の場合、濃度０．０２〜８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．２〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
前記テトラゾリウム化合物は、そのまま使用してもよいが、操作の簡便性や処理効率等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液として使用することが好ましい。前記溶液の濃度は、テトラゾリウム化合物の種類（例えば、分子量等）等により適宜決定でき、例えば、０．０１〜１２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、より好ましくは０．２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記溶媒としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が使用でき、前記緩衝液としては、例えば、後述の緩衝液等が使用できる。
この前処理は、通常、緩衝液中で行われる。前記緩衝液としては、例えば、アミン系緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ならびにＣＨＥＳ、ＣＡＰＳおよびＣＡＰＳＯ等のグッド緩衝液等が使用でき、好ましくはアミン系緩衝液およびＣＨＥＳ緩衝液である。前記アミン系緩衝液の緩衝剤としては、例えば、グリシン、エチルアミン、ジエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリスヒドロキシアミノメタン、トリエタノールアミン、グリシンアミド等があげられ、好ましくは、グリシン、グリシンアミド、トリエタノールアミンである。
前記緩衝液のｐＨは、ｐＨ７〜１２の範囲が好ましく、より好ましくはｐＨ８〜１１の範囲であり、特に好ましくはｐＨ８〜１０の範囲である。
この前処理の条件は、特に制限されないが、通常、温度１０〜３７℃の範囲であり、処理時間１０秒〜６０分の範囲である。
つぎに、この前処理済み溶血試料に対し、プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用するＦＡＯＤを測定対象物の糖化部分に作用し易くするためである。
前記プロテアーゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ等が使用でき、具体的には、メタロプロテアーゼ、トリプシン、プロテナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ペプシン等が使用できる。
また、糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合は、前記糖化Ｈｂを選択的に分解する、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼ等が好ましく、より好ましくはメタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロテイナーゼである。このように、選択的に分解するプロテアーゼを使用すれば、糖化Ｈｂ分解物を選択的に調製でき、他の糖化タンパク質が分解され難いため、測定精度をさらに向上できるからである。前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｌｓ由来プロテアーゼとしては、商品名プロテアーゼＮ（例えば、フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタロプロテイナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）（例えば、東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。
プロテアーゼ処理の条件は、例えば、使用するプロテアーゼの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
具体的には、例えば、前記プロテアーゼとしてプロテアーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜３０，０００ｍｇ／Ｌ（１ＫＵ／Ｌ〜２５０ＭＵ／Ｌ）、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。このプロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われる。前記緩衝液としては、例えば、前記前処理と同様の緩衝液が使用できる。
また、例えば、前記プロテアーゼとしてメタロプロテアーゼを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度０．０２ｇ〜６ｇ／Ｌ（４０ＫＵ／Ｌ〜４０ＭＵ／Ｌ）、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素を、酸化還元酵素および前記酸化により発色する発色性基質を用いて酸化還元反応により測定する。
前記酸化還元酵素としては、例えば、ＰＯＤ等が使用できる。
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげらる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげらる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、前述のように、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中の酸化還元酵素濃度１０〜１００，０００ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間６秒〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
この測定方法において、前記テトラゾリウム化合物による前処理工程は、前述のように、酸化還元反応が実質的に生じる前であれば、特に制限されないが、前記ＦＡＯＤ処理後に過酸化水素が発生することから、前記ＦＡＯＤ処理前に行なうことが好ましい。また、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合わせで同時に行ってもよい処理工程がある。
１：溶血処理＋前処理
２：溶血処理＋前処理＋プロテアーゼ処理
３：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
４：ＦＡＯＤ処理＋発色反応
５：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋発色反応
また、テトラゾリウム化合物と界面活性剤の添加順序や、前記ＦＡＯＤ、酸化還元酵素および発色性基質の添加順序も特に制限されない。
このような方法によれば、前記試料にテトラゾリウム化合物を接触させることにより、ＧＳＨ、ＡｓＡ、ジチオスレイトール、システイン、Ｎ−アセチル−システイン等の低分子量還元物質だけでなく、特にヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響を十分に排除することができる。そして、併せて、テトラゾリウム化合物とヘモグロビンとの混在による濁りの発生を防止できる。このため、例えば、前述の吸光度測定になんら影響与えることなく、高精度で測定を行うことができる。
また、前記テトラゾリウム化合物による前処理工程において、例えば、前記テトラゾリウム化合物以外の酸化剤を、さらに併用してもよい。前記酸化剤としては、例えば、ヨード酢酸ナトリウム、ヨーソ酸、過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物、ＥＤＴＡ−Ｆｅ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等が使用できる。このような酸化剤の添加量は、例えば、試料１μＬ当たり０．００１〜０．１ｍｇの範囲である。
本発明の測定方法において、測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限されず、前記糖化タンパク質の他に、前述のように、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。
過酸化水素を発生させて、前記各測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコースにはグルコースオキシダーゼを、前記コレステロールにはコレステロールオキシダーゼを、前記尿酸にはウリカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンオキシダーゼを、前記サルコシンにはサルコシンオキシダーゼを、前記グリセロールにはグリセロールオキシダーゼを、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして行なうことができる。また、糖化ペプチド、糖化アミノ酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして測定できる。
また、前記テトラゾリウム化合物による試料中のヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の処理後、測定対象物由来の還元物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から、前記測定対象物の量を決定する場合は、例えば、以下に示すようにして測定を行なうことができる。
例えば、前記測定対象物がグルコースの場合、例えば、ＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋等の存在下、グルコースデヒドロゲナーゼを用いて、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の還元物質を発生させる。そして、前記測定対象物由来の還元物質であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを、例えば、ジアホラーゼと、還元により発色する基質とを用いて、酸化還元反応により測定する。そして、前述のように、この測定対象物由来の還元物質の濃度と検量線等とを用いて、試料中の測定対象物の量を求めることができる。また、例えば、測定対象物がコレステロールの場合はコレステロールデヒドロゲナーゼを、サルコシンの場合は、サルコシンデヒドロゲナーゼをそれぞれ使用できる。
前記還元により発色する基質としては、特に制限されないが、例えば、前記試料中のヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の影響を排除するために添加した発色性のテトラゾリウム化合物を用いてもよい。また、各測定波長に応じて、前記試料の前処理に使用したものとは違う種類の発色性のテトラゾリウム化合物を使用してもよい。前記発色性のテトラゾリウム化合物の他には、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等も使用できる。なお、より優れた信頼性の測定値を得るために、例えば、前記測定対象物由来の還元物質を測定する前に、予め吸光度を測定しておくことが好ましい。
（実施例）
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
（実施例１）
この実施例は、各種界面活性剤存在下、血球試料をテトラゾリウム化合物で前処理し、濁りの有無を調べた例である。以下に、使用した試料、試薬および方法を示す。
（試料の調製）
健常人の全血を採取し、これを遠心分離（１５００Ｇ（３０００ｒｐｍ）、３分間）して血球を回収し、この血球に３１倍体積量の精製水を添加して希釈および溶血を行ったものを測定試料とした。
（界面活性剤溶液）
下記表１に示す各種界面活性剤を精製水に溶解し、２．４重量％の界面活性剤溶液をそれぞれ調製した。
下記表１に示す界面活性剤において、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｂｒｉｊ３５、商品名Ｎｉｋｋｏｌ　ＢＬ−９ＥＸおよび２，４−ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムは和光純薬工業社製、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、商品名ＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、商品名Ｔｗｅｅｎ２０、商品名Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　ＮＰＸ、商品名Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　ＮＰ−４０、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、商品名ＰＥＧ１０００および商品名ＰＥＧ６０００はナカライテスク社製、商品名Ｂｒｉｊ５８、商品名Ｂｒｉｊ９８および商品名Ａｒｌａｓｏｌｖｅ　２００はＳＩＧＭＡ社製、商品名プルランＰＩ−２０は林原研究所社製である。
（緩衝液）
ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）　　　　　　０．２ｍｏｌ／Ｌ
（ＷＳＴ−３溶液　：以下同じ）
濃度が１．６６ｍｍｏｌ／Ｌになるように、下記化学式（７）に示す２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム　モノナトリウム塩（商品名　ＷＳＴ−３、同仁化学研究所社製）を精製水に溶解して調製した。
2002027331.tif 000009
（濁りの確認方法）
測定試料３４５μＬ、界面活性剤溶液１５０μＬ、緩衝液３００μＬおよびＷＳＴ−３溶液９００μＬを混合し、３７℃で５分間インキュベートした後、この混合液の濁りを目視により確認し、下記評価基準により評価した。なお、比較例として、界面活性剤の代わりに精製水を添加した以外は同様に調製した混合液についても、同様に評価を行った。これらの結果を下記表１に示す。
（濁りの評価）
○：　　　　　　濁りが生じない
×：　　　　　　濁りが生じた
2002027331.tif 000010
前記表１に示すように、界面活性剤存在下でＷＳＴ−３処理することによって、濁りの発生を防止できた。
（実施例２、比較例２）
この実施例は、界面活性剤の添加量を変えて、テトラゾリウム化合物処理を行った例である。以下に使用した試料、試薬および方法等を示す。
（測定試料の調製）
前記実施例１と同様にして回収した血球（ヘモグロビン濃度約３００ｇ／Ｌ）に２２倍体積量の精製水を添加して、希釈および溶血を行い、測定試料（ヘモグロビン濃度約１３．６ｇ／Ｌ）を調製した。
（界面活性剤溶液）
実施例１と同じ界面活性剤を所定の濃度（１．０重量％および２．４重量％）になるように、それぞれ０．２ｍｏｌ／Ｌ　ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。
前記測定試料を精製水で２倍希釈した希釈液２５μＬ、界面活性剤溶液１５μＬおよびＷＳＴ−３溶液４５μＬを混合し、３７℃で３分間インキュベートした。混合液中の界面活性剤の終濃度は、０．１７６重量％および０．４２４重量％である。インキュベート後、前記混合液について、波長８８４ｎｍにおける吸光度の測定および前記実施例１と同様にして濁りの評価を行った。また、比較例２として、界面活性剤無添加の条件下、前述と同様にして吸光度測定および濁りの評価を行った。この結果を下記表２に示す。
2002027331.tif 000011
また、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０およびポリオキシエチレングリコールラウリルエーテルをそれぞれ用いた実施例について、８８４ｎｍ、８４５ｎｍおよび８０５ｎｍにおける吸光度を測定したタイムコースを図１〜図３に示す。図１はＴｒｉｔｏｎＸ−１００のタイムコース、図２はＴｗｅｅｎ２０のタイムコース、図３はポリオキシエチレングリコールラウリルエーテルのタイムコースを示す。比較例として、界面活性剤無添加の条件におけるタイムコースを図４に示す。
前記表２に示すように、界面活性剤存在下でＷＳＴ−３処理すれば、濁りを生じることがなく、また、界面活性剤無添加の場合に比べて、吸光度は低く保たれていた。また、図４の比較例におけるタイムコースでは、吸光度の増加が顕著に見られるのに対して、界面活性剤を添加した図１〜図３の実施例のタイムコースでは、十分に吸光度が減少し、濁りによる影響が排除されたことがわかる。
（実施例３、比較例３）
この実施例は、界面活性剤存在下で、糖化アミノ酸を添加した溶血試料をＷＳＴ−３処理し、前記糖化アミノ酸の測定を行った例である。
（酸化還元反応試薬）
ＰＯＤ（東洋紡社製）　　　　　　　　　　　　　　１３２ＫＵ／Ｌ
ＦＡＯＤ（旭化成社製）　　　　　　　　　　　　　　４４ＫＵ／Ｌ
商品名ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）　　０．０８８ｍｍｏｌ／Ｌ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）　　　　　　０．２ｍｏｌ／Ｌ
（糖化バリン溶液の調製）
従来公知の方法により糖化バリン（以下、「ＦＶ」という）を作製し、これを精製水に溶解して糖化バリン溶液を調製した。
（界面活性剤溶液）
商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｎｉｋｋｏｌ　ＢＬ−９ＥＸおよび商品名Ｔｗｅｅｎ２０を、所定の濃度（１．０重量％および２．４重量％）になるように、それぞれ０．２ｍｏｌ／Ｌ　ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。
（試料の調製）
実施例１と同様にして回収した血球に、２２倍体積量となるように前記ＦＶ溶液を添加して、希釈および溶血を行い、これを試料とした。なお、試料は、Ｈｂ濃度およびＦＶ濃度の異なる下記４種類（ａ〜ｄ）を調製した。
2002027331.tif 000012
（測定方法）
前記試料１２．５μＬに精製水１２．５μＬを加え、さらに界面活性剤溶液１５μＬを添加してから、前記ＷＳＴ−３溶液４５μＬを添加して、３７℃で３分間インキュベートした。この混合液に前記酸化還元反応試薬２５μＬ添加して１分間反応させ、反応後の吸光度（主波長７５１ｎｍおよび８８４ｎｍ）を測定した。この反応溶液中における界面活性剤の最終濃度は、０．１１４重量％と０．２７３重量％である。また、比較例３として、界面活性剤の代わりに前記ＣＨＥＳ緩衝液を用いて同様に吸光度測定を行った。これらの結果を下記表３に示す。
下記表中において、界面活性剤濃度の単位％は重量％を示す。また、表中のかっこ内の数値（％）は、試料ｂおよびｄ（Ｈｂ濃度１３．６ｇ／Ｌ）の吸光度を、それぞれ試料ａおよびｃ（Ｈｂ濃度６．８ｇ／Ｌ）の吸光度で割った値（ｂ／ａ、ｄ／ｃ）の百分率（％）を示し、１００％に近い程測定精度に優れることになる。つまり、試料中のＦＶ量は一定であるため、Ｈｂ量が二倍になってもＦＶに依存する吸光度（発色量）が同程度であり、１００％に近ければ、濁りの発生を十分に防止し、ＦＶを高精度に測定できたといえる。
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前記表３に示すように、界面活性剤存在下でＷＳＴ−３処理した実施例３では、濁りの発生が防止され、また、特に８８４ｎｍにおけるＨｂの吸収が低減された。このため、界面活性剤非存在下の比較例３に比べてかっこ内の値（％）が高く、高精度で測定できたことがわかる。
産業上の利用可能性
以上のように、本発明の測定方法は、界面活性剤存在下で、前記テトラゾリウム化合物を試料に添加することにより、試料中の還元物質の影響を排除でき、かつ、テトラゾリウム化合物とヘモグロビン等の還元物質との混在による濁りの発生も防止できるため、信頼性に優れた測定を行なうことができる。したがって、本発明の測定方法は、例えば、臨床医療における各種分析に適用でき、特に、糖尿病診断において重要である、赤血球中の糖化ヘモグロビン等の糖化タンパク質の測定に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の測定方法の一実施例において、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下で溶血試料とＷＳＴ−３とを反応させた時の吸光度の経時変化を示すグラフである。
図２は、本発明の測定方法の前記実施例において、Ｔｗｅｅｎ２０存在下で溶血試料とＷＳＴ−３とを反応させた時の吸光度の経時変化を示すグラフである。
図３は、本発明の測定方法の前記実施例において、ポリオキシエチレングリコールラウリルエーテル存在下で溶血試料とＷＳＴ−３とを反応させた時の吸光度の経時変化を示すグラフである。
図４は、比較例において、界面活性剤無添加の条件下で溶血試料とＷＳＴ−３とを反応させた時の吸光度の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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