(57)【要約】真核生物の複製で主要な役割を担うＤＮＡポリメラーゼαの特異的阻害剤であるアフィディコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）の生産に必要な遺伝子を発見し、これら生合成遺伝子を培養法の確立した異種微生物で発現させることによって、アフィディコリンの大量生産を可能にすること。本発明は、ＤＮＡポリメラーゼα特異的阻害剤アフィディコリンの生合成に必要な、ＧＧＤＰ合成酵素、環化酵素、及び３段階の酸化を触媒する酵素をコードする遺伝子、並びにアフィディコリンの毒性に対する耐性遺伝子、及び該遺伝子にコードされるタンパク質及びアフィディコリン、並びにそれらの製造方法等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）以下の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるアフィディコラン−１６β−オール（ａｐｈｉｄｉｃｏｌａｎ−１６β−ｏｌ）合成酵素
2003000902.tif 000059
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アフィディコラン−１６β−オール合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のアミノ酸配列（ａ）において、そのＮ末端及び／又はＣ末端から４０個以内のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなり、アフィディコラン−１６β−オール合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子：
（ａ）以下の配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000060
2003000902.tif 000061
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アフィディコラン−１６β−オール合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）以下の配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素
2003000902.tif 000062
2003000902.tif 000063
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000064
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）以下の配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるチトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−１）
2003000902.tif 000065
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−１）活性を有するタンパク質。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000066
2003000902.tif 000067
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−１）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）以下の配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるトランスポータータンパク質（ＴＰ）
2003000902.tif 000068
2003000902.tif 000069
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、トランスポーター（ＴＰ）活性を有するタンパク質。
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子：
（ａ）以下の配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000070
2003000902.tif 000071
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、トランスポーター（ＴＰ）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）以下の配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるチトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−２）
2003000902.tif 000072
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−２）活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子：
（ａ）以下の配列番号１２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000073
2003000902.tif 000074
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−２）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求の範囲第１〜１１項に記載のＤＮＡ及び遺伝子から成る群から選択される２以上のＤＮＡ及び／又は遺伝子を含有するアフィディコリン生合成遺伝子クラスタ。
【請求項１３】
請求の範囲第１〜１１項のいずれか一項に記載の遺伝子を含有する組換え発現ビークル。
【請求項１４】
請求の範囲第１２項に記載のアフィディコリン生合成遺伝子クラスタを含有する組換え発現ビークル。
【請求項１５】
組換えベクターである請求の範囲第１３又は１４項に記載の組換え発現ビークル。
【請求項１６】
請求の範囲第１３項、第１４項又は第１５項に記載の発現ビークルによって形質転換された形質転換体。
【請求項１７】
大腸菌である請求の範囲第１６項に記載の形質転換体。
【請求項１８】
請求の範囲第１６項又は第１７項に記載の形質転換体を培養することを含む、請求の範囲第１〜１１項のいずれか一項に記載の遺伝子にコードされる酵素の製造方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１６項又は第１７項に記載の形質転換体を培養することを含む、アフィディコリンの製造方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載された遺伝子にコードされるアフィディコラン−１６β−オール合成酵素。
【請求項２１】
請求の範囲第４項、又は第５項に記載された遺伝子にコードされるゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素。
【請求項２２】
請求の範囲第６項、又は第７項に記載された遺伝子にコードされるチトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−１）。
【請求項２３】
請求の範囲第８項、又は第９項に記載された遺伝子にコードされるトランスポータータンパク質（ＴＰ）。
【請求項２４】
請求の範囲第１０項、又は第１１項に記載された遺伝子にコードされるチトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−２）。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼα特異的阻害剤アフィディコリンの生合成に必要な各酵素をコードする遺伝子、及び該遺伝子にコードされるタンパク質等に関する。
背景技術
アフィディコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）は真核生物の複製で主要な役割を担うＤＮＡポリメラーゼαの特異的阻害剤である。阻害は可逆的なため、例えば、同調培養系の研究等の細胞周期を問題にする細胞生理学などの分野で必須の薬剤である。
しかしながら、本化合物は特殊な糸状菌でしか生産せずその株を保持した企業しか生産できない為に、現状では特定の試薬会社より高価な試薬として供給されている。該化合物を生産する糸状菌もほかに５種以上存在するが、生産量の向上は経験的な育種に頼るほかなく、実際にこれまでにはこのように生産菌の発酵法以外による生産例はない。
アフィディコリンのようなジテルペンと呼ばれる化合物群は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ）から環化酵素によりその複雑な炭素骨格が作られる。本物質を大量生産するためにはＧＧＤＰの供給量を増大させるＧＧＤＰ合成酵素、環化酵素、３段階の酸化を触媒する酵素の各遺伝子およびアフィディコリンの毒性に対する耐性遺伝子を見出す必要がある。次にこれら生合成遺伝子を培養法の確立した異種微生物で過剰発現することにより、アフィディコリンの大量生産が可能になる。
発明の開示
本発明者は鋭意研究の結果、アフィディコリン生産に必要な上記の各酵素をコードする遺伝子を見いだすことに成功し、以下の発明を完成した。
即ち、本発明は、第一の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるアフィディコラン−１６β−オール（ａｐｈｉｄｉｃｏｌａｎ−１６β−ｏｌ）合成酵素
2003000902.tif 000002
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アフィディコラン−１６β−オール合成酵素活性を有するタンパク質。
本発明は更に、第二の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号２に示される塩基配列（２８３５ｂｐのｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅを有する）からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000003
2003000902.tif 000004
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アフィディコラン−１６β−オール合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
更に、本発明は、第三の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素
2003000902.tif 000005
2003000902.tif 000006
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
本発明は更に、第四の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号６に示される塩基配列（１０３２ｂｐのｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅを有する）からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000007
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
更に、本発明は、第五の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるチトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−１）
2003000902.tif 000008
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−１）活性を有するタンパク質。
本発明は更に、第六の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号８に示される塩基配列（１４６１ｂｐのｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅを有する）からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000009
2003000902.tif 000010
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−１）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
更に、本発明は、第七の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるトランスポータータンパク質（ＴＰ）
2003000902.tif 000011
2003000902.tif 000012
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、トランスポーター（ＴＰ）活性を有するタンパク質。
本発明は更に、第八の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号１０に示される塩基配列（１６９５ｂｐのｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅを有する）からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000013
2003000902.tif 000014
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、トランスポーター（ＴＰ）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
更に、本発明は、第九の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるチトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−２）
2003000902.tif 000015
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−２）活性を有するタンパク質。
本発明は更に、第十の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子に係る：
（ａ）以下の配列番号１２に示される塩基配列（１６２６ｂｐのｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅを有する）からなるＤＮＡ
2003000902.tif 000016
2003000902.tif 000017
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−２）浩性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明は又、以上のいずれかのＤＮＡ及び遺伝子から成る群から選択される２以上のＤＮＡ及び／又は遺伝子を含有するアフィディコリン生合成遺伝子クラスタに係る。
本発明は、更に、これら遺伝子又はＤＮＡにコードされる、アフィディコラン−１６β−オール合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−１）、トランスポータータンパク質（ＴＰ）及びチトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−２）に係る。
発明を実施するための最良の形態
本発明の遺伝子から推定されるアフィディコラン−１６β−オール合成酵素産物は、配列番号１に示される９４４個のアミノ酸からなる蛋白質（推定分子量１０６５８０）である。
本明細書において、「アフィディコラン−１６β−オール合成酵素」とは、アフィディコラン−１６β−オール合成酵素活性を有するタンパク質を含み、「アフィディコラン−１６β−オール合成酵素活性」とは、本明細書中、以下に示したような酵素反応系において、基質であるゲラニルゲラニル二リン酸を実質的に環化することのできる活性、即ち、かかる反応系において該基質から有意な量のアフィディコラン−１６β−オール（ａｐｈｉｄｉｃｏｌａｎ−１６β−ｏｌ）を合成することのできる活性を意味する。
尚、本発明のアフィディコラン−１６β−オール合成酵素はＮ末端側、Ｃ末端側と二つの機能の異なるドメインに分かれており、基質認識部位として前者はＤＸＤＤ、後者はＤＥＸＸＥというモチーフを有する。両末端のアミノ酸残基の欠失は４０個以内が許容でこれ以上の欠失は一方の活性を失うことがわかっている。置換に関しては上記モチーフが失われない限り、かなり許容するものと思われる。類似酵素の詳細な実験データから前者はゲラニルゲラニル二リン酸から遊離しない中間体ｓｙｎ−コパリル二リン酸への環化を、後者はｓｙｎ−コパリル二リン酸からアフィディコラン−１６β−オール（ａｐｈｉｄｉｃｏｌａｎ−１６β−ｏｌ）への環化を触媒するものと予想される。
従って、本発明の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる酵素をコードする遺伝子における１若しくは数個のアミノ酸の欠失又は置換は、ゲラニルゲラニル二リン酸を基質とする環化活性を有する上で、該アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端から４０個以内のアミノ酸残基に起こることが好ましい。
本発明の酵素のゲラニルゲラニル二リン酸を基質とする環化活性、又は、アフィディコラン−１６β−オール（ａｐｈｉｄｉｃｏｌａｎ−１６β−ｏｌ）の合成活性を測定する反応系は、例えば、以下の条件で行うことができる。
即ち、部分精製酵素（９８５μｌ、酵素濃度１０−１０００ｎｇ／ｍｌ）、１Ｍ塩化マグネシウム（５μｌ、最終濃度５ｍＭ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（１０μｌ、１ｍｇ／ｍｌ、シグマ社製）３０℃にて１２時間反応を行なうことが出来る。この後、反応液にヘキサン１ｍｌを加え、抽出した後、窒素気流下溶媒を溜去する。これにヘキサン１００μｌを加え溶解し、１μｌをＧＣ−ＭＳ分析に供する。
ＧＣ−ＭＳ分析は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｑｕｅｓｔ  ＧＣＱ装置にキャピラリーカラムＤＢ−１（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ）を用いて以下の条件で測定を行なう。スプリットレスモード、初期温度１００℃（保持時間２分）、昇温設定５℃／ｍｉｎ、最終温度２８０℃（保持時間２分）、ヘリウムガス流量１ｍｌ／ｍｉｎ。マス測定条件：スキャン１秒／スキャン、ソース温度２００℃、トランスファーライン温度２７５℃、フルスキャンモード４０−４５０。酵素反応生成物保持時間：２６分３０秒。
本明細書において、「ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素」とは、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を含み、「ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性」とは、本明細書中、基質であるジメチルアリル二リン酸あるいはファルネシル二リン酸とイソペンテニル二リン酸から有意な量のゲラニルゲラニル二リン酸を合成することのできる活性を意味する。
本明細書において、「チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−１）」及び「チトクロームＰ４５０水酸化酵素（Ｐ４５０−２）」とは、チトクロームＰ４５０水酸化酵素活性を有するタンパク質を含み、「チトクロームＰ４５０水酸化酵素活性」とは、本明細書中、３位、１７位および１８位に水酸基を導入することのできる活性を意味する。
本明細書において、「トランスポータータンパク質（ＴＰ）」とは、トランスポーター（ＴＰ）活性を有するタンパク質を含み、「トランスポーター（ＴＰ）活性」とは、本明細書中、アフィディコリンを菌体外に排出することのできる活性を意味する。
アフィディコラン−１６β−オール合成酵素をコードする遺伝子又はＤＮＡは以下の実施例に示すように、糸状菌由来のｍＲＮＡをテンプレートとしたＲＴ−ＰＣＲ等の方法によりクローニングし、その塩基配列を決定することによって調製することができる。かかる糸状菌の例としては、Ｐｈｏｍａ  ｂｅｔａｅ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｅｃａｎｉｉ）、Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｈａｅｒｉｃａ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ  ｏｒｙｚａｅ）、Ｈｅｒｚｉｅｌｌａ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌｌａ等を挙げることができる。
この中で、例えば、糸状菌Ｐｈｏｍａ  ｂｅｔａｅは、日本甜菜製糖（株）総合研究所（登録番号：ＰＨ−２７）、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（登録番号：６５０４、２４６３５）等から入手することが出来る。
更に、こうして得られるアフィディコラン−１６β−オール合成酵素（アフィディコリン生合成中間体合成酵素（ＡＣＳ）遺伝子）の配列をもとに染色体歩行を行なった結果得られた塩基配列をもとにデータベース上相同性検索を行ない、ＡＣＳ遺伝子の上流にＧＧＤＰ合成酵素遺伝子を、下流側に水酸化酵素（Ｐ４５０−１）、耐性（トランスポーター）、水酸化酵素（Ｐ４５０−２）の各遺伝子を見出すことに成功した。
或いは、本明細書で開示された配列情報に基づいて、当該技術分野における周知手段を用いた化学合成等によっても調製することが可能である。当業者であれば、特定のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することも、当該技術分野における周知手段を用いて容易に実施することができる。
本明細書において、特定の遺伝子又はＤＮＡは、当業者に周知の緩衝液中で、適当な温度及び塩濃度等の諸条件下のストリンジェントな条件でハイブリダイズさせることができる。
このようなストリンジェントな条件下で本発明の遺伝子又はＤＮＡとハイブリダイズし、且つ、本発明の各酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの例として、例えば、かかる遺伝子と相同性が７０％以上、好ましくは９０％以上であるようなＤＮＡを挙げることができる。
本発明の遺伝子、ＤＮＡ、又はアフィディコリン生合成遺伝子クラスタに、遺伝子組換え操作において当業者に公知である様々な配列、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどの調節因子、制限酵素部位、並びに選択マーカー（マーカー酵素等）遺伝子等が適宜結合されたＤＮＡ分子も本発明の範囲である。
更に、本発明の遺伝子、ＤＮＡ、アフィディコリン生合成遺伝子クラスタ又は上記ＤＮＡ分子を含有する組換えベクター等の発現ビークル、及び該発現ビークルを含みそれによって形質転換された大腸菌等の細菌、真核細胞等の形質転換体は、当該技術分野における公知の手段によって、容易に調製することができる。
本発明の各酵素及びアフィディコリンは、上記の発現ビークル及び形質転換体等を培養し、その後、当該技術分野における公知手段を用いて回収及び精製等の操作を施すことによって、容易に製造することができる。
従って、以上に記載した、発現ビークル、形質転換体、及び本発明酵素及びアフィディコリンの製造方法も本発明に含まれる。
実施例
以下に実施例に即して本発明を詳述するが、これら実施例は本発明の技術的範囲を如何なる意味でも何ら限定するものではない。
実施例１
以下に記載するように、アフィディコリン生合成中間体合成酵素遺伝子のｃＤＮＡをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパクとして大腸菌で発現させ、実際に生合成中間体であるアフィディコラン−１６β−オール（ａｐｈｉｄｉｃｏｌａｎ−１６β−ｏｌ）の製造を確認した。
唯一知られていたカビのジテルペン環化酵素のアミノ酸配列に基づき、縮重プライマー（１：５’−ＧＣＩＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＡＣＩＧＣＩＴＧＧＧＴ−３’（配列番号３）；２：５’−（Ａ／Ｇ）ＡＡＩＧＣＣＡＴＩＧＣＩＧＴ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）−ＴＣ−３’（配列番号４））を設計し、糸状菌Ｐｈｏｍａ  ｂｅｔａｅの菌体から抽出したｍＲＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲを行った。増幅された約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を基に３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥ法を用いてｃＤＮＡ全長の解析を行った。
ここで、ＲＴ−ＰＣＲからシークエンスまでの一連の遺伝子クローニングは全て、例えば、以下の引用文献に記載されているような、当業者に周知の一般的な方法を用いた。
Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｄｕｓｈ，Ｍ．Ｋ．，＆  Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．（１９８８）．Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｒｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５（２３），８９９８−９００２（ＲＡＣＥ法の文献）。Ｔａｂｏｒ，Ｓ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．（１９９１）ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、あるいはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ。
こうして得られた２．８ｋｂのＯＲＦ全長をプラスミドｐＧＥＸに組み込み、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換菌は０．１％グルコースおよびＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）添加ＬＢ培地（２．５ｍｌ）を用いて３０℃、１２時間、２００ｒｐｍにて撹拌下前培養を行った。これをＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）添加２ＹＴ培地（５００ｍｌ）に移し、３０℃、３時間、２００ｒｐｍにて撹拌下培養を行った。培養液を氷上に３０分放置した後、終濃度０．５ｍＭとなるようＩＰＴＧ添加し、１８℃、２０時間、２００ｒｐｍにて撹拌下培養を行った。培養液を４℃、３０分間遠心（３０００ｒｐｍ）し、上澄を捨て菌体を溶菌緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）６０ｍｌに懸濁した。懸濁液を凍結させ，再溶解した後１０分間超音波破砕を行った。得られた懸濁液を４℃、１５分間遠心（１２０００ｒｐｍ）した。上澄に終濃度０．１ＭとなるようにＮａＣｌを加えた後、あらかじめ緩衝液にて平衡化しておいたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）３ｍｌを添加した。１５℃、３０分間撹拌して吸着させ、遠心後上澄を捨てる。１ｍＭ濃度の還元型グルタチオンを添加した緩衝液を加え溶出した。必要に応じ、透析、限外ろ過により緩衝液交換および濃縮を行った。
こうして調製した酵素液を用いて、既に記載した反応条件下で、ゲラニルゲラニル二リン酸を基質として酵素反応を行ったところ、ガスクロマトグラフィー分析において合成により調製したアフィディコラン−１６β−オール（ａｐｈｉｄｉｃｏｌａｎ−１６β−ｏｌ）と同一の保持時間を有するピークを検出した。またこのピーク成分のマススペクトルは合成品のそれと完全に一致したことより、今回発現した酵素はアフィディコラン−１６β−オール合成酵素（ＡＣＳ）であることを確認した。
実施例２
アフィディコリン生産菌Ｐｈｏｍａ  ｂｅｔａｅの菌体から抽出したゲノムＤＮＡを８種の制限酵素により切断した後、市販キット付属アダプター（ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＴ）をライゲーションした。このゲノムＤＮＡ断片をテンプレートにして、実施例１で得られたアフィディコラン−１６β−オール合成酵素遺伝子の塩基配列に基づき、プライマー（５’側  １．ＣＣＡＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＣＧＡ／２．ＧＴＣＣＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＴＴＣＡＧＡＡＣＴＣＣＧＴＣＧ、３’側  １．ＣＡＡＧＣＴＡＴＣＧＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＣＧＴＴＧＧＧ／２．ＧＴＣＧＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧ）を作成し、アダプタープライマー（１．ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ／２．ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ）との間で実施例１と同様の条件下でＰＣＲを行った。
実際には、上記の５’側プライマー１とアダプタープライマー１との間で１回行った後、この反応液の一部を使って、５’側プライマー２とアダプタープライマー２との間でもう１回ＰＣＲを行うという手法を取った。２段階のＰＣＲによって得られた増幅断片の塩基配列を決定した。
ＡＣＳ遺伝子の上流および下流側の配列をこの手法を繰り返すことにより解析し、全長１５ｋｂからなる遺伝子クラスターの配列を得た。次いで解析された配列から以下に示した各種プライマーを設計し、同菌のｍＲＮＡをテンプレートとして実施例１と同様の条件下で３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥ法を用いて各ｃＤＮＡ全長の解析を行った。これによりＧＧＤＰ合成酵素（３４３ａａ）、Ｐ４５０−１（４８６ａａ）、トランスポーター（５６４ａａ）、及びＰ４５０−２（５４１ａａ）の各配列が明らかになった。
（１）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素：
2003000902.tif 000018
（２）Ｐ４５０−１：
2003000902.tif 000019
（３）ＴＰ：
2003000902.tif 000020
（４）Ｐ４５０−２：
2003000902.tif 000021
産業上の利用可能性
本発明によって、アフィディコリン生合成に必要なすべての酵素をコードする遺伝子を見いだすことができたので、これら生合成遺伝子を培養法の確立した異種微生物により発現することで、アフィディコリンの大量生産が可能になる。更に、本発明によってこの有用な薬剤の大量供給に道を開くことになる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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