(57)【要約】本発明によれば、（ａ）単位領域ＤＮＡを任意の組み合わせで連結し、（ｂ）得られた連結単位領域ＤＮＡを、用いられるすべての連結単位領域ＤＮＡの末端の配列が少なくとも他の１種類の連結単位領域ＤＮＡの末端の配列と重複するように選択して混合し、（ｃ）該連結単位領域ＤＮＡの混合物を鋳型としてＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎを行って２以上のクローンを含むＤＮＡライブラリーを取得することを含む、ＤＮＡライブラリーの構築方法が提供される。本発明の方法によれば、任意のアミノ酸配列をコードする複数のＤＮＡ断片を様々な順序と長さで連結した遺伝子の集団を構築する方法が提供される。
2002026964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）単位領域ＤＮＡを任意の組み合わせで連結し、（ｂ）得られた連結単位領域ＤＮＡを、用いられるすべての連結単位領域ＤＮＡの末端の配列が少なくとも他の１種類の連結単位領域ＤＮＡの末端の配列と重複するように選択して混合し、（ｃ）該連結単位領域ＤＮＡの混合物を鋳型としてＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎを行って２以上のクローンを含むＤＮＡライブラリーを取得することを含む、ＤＮＡライブラリーの構築方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、連結単位領域ＤＮＡを、用いられる全ての連結単位領域の末端の配列が少なくとも他の１種類の連結単位領域ＤＮＡの末端の配列と重複し、かつ少なくとも１種類の連結単位領域ＤＮＡの５’末端あるいは３’末端のいずれかの配列が少なくとも他の２種類の連結単位領域ＤＮＡの末端と重複するように選択して混合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
連結単位領域ＤＮＡの混合物が、用いられる単位領域ＤＮＡの全ての組み合わせで２つの単位領域ＤＮＡが連結された連結単位領域の混合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
単位領域ＤＮＡがタンパク質をコードする構造遺伝子ＤＮＡをＬ個に分断したものであり（ここで、Ｌは３以上の整数である）、その連結方法が、任意の単位領域ＤＮＡの３’末端と、該単位領域より上記タンパク質においてＣ末端側に存在する単位領域ＤＮＡの５’末端とが各単位領域のアミノ酸配列が保たれるように連結するものであり、かつ連結単位領域ＤＮＡの混合物が、連結した各単位領域ＤＮＡがもとの構造遺伝子において隔てている単位領域の数であるＸ（但しＸは０以上Ｌ−２以下の整数である）を指標として分類した各連結単位領域ＤＮＡが、下記式（１）を満たす割合を指標にして混合されたものである、請求項１に記載の方法。
Ｌ−Ｘ−１ＣＭ−Ｘ　　　　（１）
（式中、ＬおよびＸは上記と同様の意味を示し、Ｍは単位領域の総数と作製する変異ＤＮＡの有する単位領域数との差を示す）
【請求項５】
単位領域ＤＮＡが、同様の３次構造を有するがそのアミノ酸配列が異なるタンパク質群をコードするＤＮＡをそれぞれＬ個の単位領域に分断したものであり（ここで、Ｌは３以上の整数である）、その連結方法が、任意の単位領域ＤＮＡの３’末端と、該単位領域より上記タンパク質群においてＣ末端側に存在する単位領域ＤＮＡの５’末端とが各単位領域のアミノ酸配列が保たれるように連結するものであり、かつ連結単位領域ＤＮＡの混合物が、連結した各単位領域ＤＮＡがもとのタンパク質群において隔てている単位領域の数であるＸ（但しＸは０以上Ｌ−２以下の整数である）を指標として分類した各連結単位領域ＤＮＡが下記式（１）を満たす割合を指標にして混合されたものである、請求項１に記載の方法。
Ｌ−Ｘ−１ＣＭ−Ｘ　　　　（１）
（式中、ＬおよびＸは上記と同様の意味を示し、Ｍは単位領域の総数と作製する変異ＤＮＡの有する単位領域数との差を示す）
【請求項６】
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎが、構築されるべきＤＮＡの両末端となるべき単位領域ＤＮＡと相補的な配列を有するプライマーの存在下で行われる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎが、共通ＤＮＡ配列を含む連結単位領域ＤＮＡと該共通ＤＮＡ配列に相補的な配列を有するプライマーの存在下で行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの方法により得られる変異ＤＮＡライブラリー。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡライブラリーを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を培養し、培養物からタンパク質を採取することにより得られるタンパク質ライブラリー。
【請求項１０】
請求項８に記載のＤＮＡライブラリーを転写することにより得られるＲＮＡライブラリー。
【請求項１１】
請求項８に記載のＤＮＡライブラリー、または請求項１０に記載のＲＮＡライブラリーを無細胞転写および／または翻訳系で発現させることを特徴とするタンパク質ライブラリーの作製方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法により得られるタンパク質ライブラリー。
【請求項１３】
請求項７に記載のＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ、または請求項９に記載のＲＮＡライブラリーに含まれるＲＮＡに該ＤＮＡ、またはＲＮＡがコードするタンパク質が結合した核酸−タンパク質連結分子ライブラリー。
【請求項１４】
請求項９、１２または１３に記載のライブラリーを用いて所望の性質を有するタンパク質を選択することを特徴とするタンパク質の取得方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法により得られるタンパク質。
【請求項１６】
（ａ）請求項１５に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを調製し、（ｂ）該ＤＮＡに変異を導入し、（ｃ）変異を導入したＤＮＡを増幅し、（ｄ）増幅されたＤＮＡを転写／翻訳させることによりタンパク質ライブラリーを作製し、（ｅ）該ライブラリーを用いて所望の性質を有するタンパク質を取得することを特徴とするタンパク質の取得方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法により得られるタンパク質。
【請求項１８】
請求項１５または１７に記載のタンパク質をコードするＤＮＡの取得方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法により得られるＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、連結単位領域ＤＮＡの混合物を鋳型としてＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下「ＰＣＲ」と称することがある。）を行うことを特徴とするＤＮＡライブラリーの構築方法に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質のモジュール、二次構造、超二次構造、モチーフなど特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、原始配列、エキソン、発現制御領域を構成するＤＮＡ、あるいは人工アミノ酸配列をコードするＤＮＡ等を連結した連結単位領域ＤＮＡの混合物を鋳型としたＰＣＲを行うことを特徴とする変異ＤＮＡライブラリーの構築方法、並びに該ＤＮＡライブラリーを転写、翻訳することにより取得されるプロテインライブラリーに関する。また、本発明は、該プロテインライブラリーを用いて所望の性質を有するタンパク質を選択することを特徴とする所望の性質を有する変異タンパク質を取得する方法、及び進化分子工学の手法を適用することにより得られる、所望の性質をさらに増大させたタンパク質にも関する。
背景技術
現在、多くの酵素が産業用のバイオプロセスに利用されている。環境問題との関連から、エネルギー効率の高いバイオプロセスは、今後さらに普及すると予想される。また、遺伝子工学の発展に伴い、医薬品やバイオセンサーとしてのタンパク質の需要も高まると考えられる。しかし、多くのタンパク質の場合、その構造安定性は低く、熱や有機溶媒などに対して変性しやすい。また製造過程における凝集は、合成物の回収率低下の原因となっている。このような変性、凝集は不可逆的であることが多く、一度変性したタンパク質を機能を持つ天然状態に再生することは困難である。
そのため、タンパク質工学あるいは進化分子工学的手法による、耐熱性や有機溶媒耐性等の向上を目指す試みがなされている。例えばタンパク質工学では、構造が既知のタンパク質について、その構造の安定化に寄与しそうな部位を推測してアミノ酸置換を行う（応用化学講座、蛋白質工学、朝倉書店、池谷克英、中村春木著、１９９１年）方法が用いられている。また、進化分子工学の技術を用いれば、部位特異的に、あるいはランダムにアミノ酸置換を行い、目的とする性質が上昇したことを指標として選択することにより機能が向上したタンパク質を取得することができる。
進化分子工学は、特定の機能を有するタンパク質を創出する優れた手法である。タンパク質の進化分子工学では、はじめに多くのタンパク質を含んだ変異体集団（以下、「変異プロテインライブラリー」と称することがある。）を構築する。次に、該ライブラリー中より目的の機能をもつ変異タンパク質を選択する。さらに選択した変異タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入してこれを発現させ、再び変異プロテインライブラリーを構築し、所望の機能がさらに増大した変異タンパク質を選択する。この操作を数回繰り返すことにより、優れた機能をもつタンパク質を得ることができる。
このような進化分子工学による変異タンパク質の取得には、変異プロテインライブラリー及びそれらをコードする変異ＤＮＡライブラリーのうち、より広大な配列空間を検索できるライブラリーが必須である。従ってその構築手法は、進化分子工学にとって極めて重要な要素技術である。
変異ＤＮＡライブラリーの構築手法は、その初期においては、ＤＮＡに対する変異剤（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９，２４２−２４７；Ｃｈｕ，Ｃ．−Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９８，１６８−１８１）や放射線（Ｂｉｌｌｉ，Ｄ．（２０００）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６，１４８９−１４９２）を用いたものに限られていたが、ＤＮＡの化学合成法（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２，４５３９−４５５７）やＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０，１３５０−１３５４）等新しい技術の進展にともない、変異の導入法も、組換え技術を利用した方法（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．＆　Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｄ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９，１１９３−１２０１）、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　１，１１−１５）、ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１，１０７４７−１０７５１）など質、量ともに、よりダイナミックなものになってきた。
Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲでは、過剰量のマンガンイオンや４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を種々の混合比で加え、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡの複製の際に点突然変異が導入される。
ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇでは、進化させたいタンパク質をコードしているＤＮＡにＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲにより点突然変異を導入した後、ＤＮａｓｅ　Ｉにより切断する。その後、プライマーの非存在下でＰＣＲを行うことにより、相同配列を介した組換えが起こり、すでに導入されている種々の点突然変異が組み合わされ、多様な変異が導入されたＤＮＡライブラリーが構築される。つまりＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲよりも点突然変異を効率よく導入することができる。またＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇでは、配列上比較的相同性の高いファミリータンパク質内の配列を親配列として用いることもできる。
上記した方法によればＤＮＡに点突然変異を導入した変異ＤＮＡライブラリーの作製は可能である。しかし、タンパク質のアミノ酸の配列空間は非常に広大である。例えば、１００残基のアミノ酸からなるタンパク質の配列は２０１００≒１０１３０通り可能である。これは、宇宙に存在する原子の数（１０７５）よりも多い。このような莫大な配列が４０億年に満たない生物進化の過程で網羅的に試行されたとは到底考えられない。すなわち、広大なタンパク質のアミノ酸配列空間の中には、地球上に存在する生物が、まだ試行していない有用な機能をもつ配列が存在している可能性が高い。
この点において、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲでは非常に少数の点突然変異しか導入できない。また、ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇでは配列上相同性の高い配列同士の点突然変異の導入しか可能でないため、このような方法により構築したライブラリーでは、変異体としての広大な配列空間を探査することは不可能である。
また、ＤＮＡへ点突然変異を導入するのではなく、相同配列を持たない任意のアミノ酸配列をコードする塩基配列をランダムに組み合わせることによる変異ＤＮＡライブラリーを効率よく構築する手法はこれまで知られていない。
このようなＤＮＡのある領域を組換える方法としては、例えば単純に任意のＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼを用いて連結する方法が考えられるが、このような連結によれば逆方向に連結されるＤＮＡ断片が２分の１の確率で出現するため、本来のＤＮＡ断片がコードしているアミノ酸配列が得られなくなる上、終始コドンが頻繁に出現するので、最小の球状タンパク質（約１００残基のアミノ酸からなる）に相当する構造遺伝子を構築することが困難となる等ライブラリーを構築する方法としては不適である。
また、ＤＮＡの方向性を保って連結する方法としては、連結しようとする各単位領域ＤＮＡの５’末端と３’末端を異なる制限酵素で消化し、その断片をＤＮＡリガーゼを用いて連結する方法が考えられる。しかし、この場合は各単位領域の方向性は保持されるが、各単位領域に制限酵素の認識部位（リンカー）を人工的に付加しなくてはならず、その結果、本来のアミノ酸配列に特定のアミノ酸が挿入される問題点が生じる。
一方、本発明者らは、単位領域レベルでの部位特異的変異の導入法の１つとして、タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを単位領域毎に分断して単離し、単離された単位領域ＤＮＡを任意の組み合わせで連結し、連結された単位領域ＤＮＡを、入れ換えようとする順序に各単位領域ＤＮＡの末端が重複するように選んで混合し、連結された単位領域ＤＮＡの混合物を鋳型とし、両末端単位領域ＤＮＡのプライマーを用いて増幅することよりなる入れ換え変異ＤＮＡの構築方法を開示している（特開平１０−０１４５７８公報）。しかしこの方法は予め決められた数の単位領域ＤＮＡの並び替えにより得られる入れ換え変異ＤＮＡを得ることを目的としており、さらに一回のＰＣＲにつき１種類の変異ＤＮＡしか得られないため多様なタンパク質の配列空間を有するライブラリーを一度のＰＣＲで構築するものではない。
発明の開示
本発明の目的は、従来の変異体集団構築手法であるＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲやＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇでは実行不可能であったタンパク質の広大な配列空間を探査するためのライブラリーを構築する方法として、タンパク質のモジュール、二次構造、超二次構造、モチーフ、原始配列、ＤＮＡのエキソンなど天然のタンパク質の一部を構成する領域、あるいは発現制御領域、人工アミノ酸配列により構成される領域を単位領域（以下「単位領域」と称することがある。）とし、それらを構成するＤＮＡを適当な組み合わせで連結した変異ＤＮＡライブラリーを効率的に構築することにある。
本発明のさらに別の目的は、進化分子工学の技術を用いた所望の性質を有するタンパク質の取得方法として、上記ＤＮＡライブラリーを転写、翻訳することによりプロテインライブラリーを作製し、該プロテインライブラリーを用いて所望の性質を有するタンパク質を選択、取得することである。
また本発明は、該プロテインライブラリーを用いて所望の性質を有するタンパク質を選択することにより所望の性質を有する変異タンパク質を取得し、さらに進化分子工学の手法を適用し、所望の性質がさらに改良されたタンパク質を取得すること等を目的とする。
さらに、本発明は、選択されたタンパク質をコードするＤＮＡを解析することにより、所望の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡを取得し、該ＤＮＡによって所望の性質を有するタンパク質の組み換え体を作製すること等を目的とする。
本発明者らは上記課題を達成すべく鋭意研究の結果、任意の２種類のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを連結させた連結単位領域ＤＮＡを複数種類調製して混合し、これを鋳型としてＰＣＲを行えば、任意のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが、ランダムに組み合わされた、種々の配列を有するＤＮＡが一度のＰＣＲで合成される（以下、これを「ランダムライブラリー」と称することがある。）ことを見出した。さらに、本発明者らは、真核生物のタンパク質合成系においては、選択的（択一的）スプライシングにより、限られたエクソンを組み合わせて複数種類のタンパク質を合成していることに着目し、タンパク質をコードする構造遺伝子ＤＮＡを任意の断片に分断して得られる単位領域ＤＮＡについて、構造遺伝子において上流から下流にむけての順序を保ったまま連結した連結単位領域ＤＮＡを作製し、それらを特定の比率で混合して鋳型ＤＮＡとし、ＰＣＲを行えば、選択的スプライシングにより生じるＤＮＡ配列群（以下、これを「選択的スプライシングライブラリー」と称することがある。）が構築できることを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　（ａ）単位領域ＤＮＡを任意の組み合わせで連結し、（ｂ）得られた連結単位領域ＤＮＡを、用いられるすべての連結単位領域ＤＮＡの末端の配列が少なくとも他の１種類の連結単位領域ＤＮＡの末端の配列と重複するように選択して混合し、（ｃ）該連結単位領域ＤＮＡの混合物を鋳型としてＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎを行って２以上のクローンを含むＤＮＡライブラリーを取得することを含む、ＤＮＡライブラリーの構築方法。
（２）　工程（ｂ）において、連結単位領域ＤＮＡを、用いられる全ての連結単位領域の末端の配列が少なくとも他の１種類の連結単位領域ＤＮＡの末端の配列と重複し、かつ少なくとも１種類の連結単位領域ＤＮＡの５’末端あるいは３’末端のいずれかの配列が少なくとも他の２種類の連結単位領域ＤＮＡの末端と重複するように選択して混合する、（１）に記載の方法。
（３）　連結単位領域ＤＮＡの混合物が、用いられる単位領域ＤＮＡの全ての組み合わせで２つの単位領域ＤＮＡが連結された連結単位領域の混合物である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）　単位領域ＤＮＡがタンパク質をコードする構造遺伝子ＤＮＡをＬ個に分断したものであり（ここで、Ｌは３以上の整数である）、その連結方法が、任意の単位領域ＤＮＡの３’末端と、該単位領域より上記タンパク質においてＣ末端側に存在する単位領域ＤＮＡの５’末端とが各単位領域のアミノ酸配列が保たれるように連結するものであり、かつ連結単位領域ＤＮＡの混合物が、連結した各単位領域ＤＮＡがもとの構造遺伝子において隔てている単位領域の数であるＸ（但しＸは０以上Ｌ−２以下の整数である）を指標として分類した各連結単位領域ＤＮＡが、下記式（１）を満たす割合を指標にして混合されたものである、（１）に記載の方法。
Ｌ−Ｘ−１ＣＭ−Ｘ　　　　（１）
（式中、ＬおよびＸは上記と同様の意味を示し、Ｍは単位領域の総数と作製する変異ＤＮＡの有する単位領域数との差を示す）
（５）　単位領域ＤＮＡが、同様の３次構造を有するがそのアミノ酸配列が異なるタンパク質群をコードするＤＮＡをそれぞれＬ個の単位領域に分断したものであり（ここで、Ｌは３以上の整数である）、その連結方法が、任意の単位領域ＤＮＡの３’末端と、該単位領域より上記タンパク質群においてＣ末端側に存在する単位領域ＤＮＡの５’末端とが各単位領域のアミノ酸配列が保たれるように連結するものであり、かつ連結単位領域ＤＮＡの混合物が、連結した各単位領域ＤＮＡがもとのタンパク質群において隔てている単位領域の数であるＸ（但しＸは０以上Ｌ−２以下の整数である）を指標として分類した各連結単位領域ＤＮＡが下記式（１）を満たす割合を指標にして混合されたものである、（１）に記載の方法。
Ｌ−Ｘ−１ＣＭ−Ｘ　　　　（１）
（式中、ＬおよびＸは上記と同様の意味を示し、Ｍは単位領域の総数と作製する変異ＤＮＡの有する単位領域数との差を示す）
（６）　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎが、構築されるべきＤＮＡの両末端となるべき単位領域ＤＮＡと相補的な配列を有するプライマーの存在下で行われる（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎが、共通ＤＮＡ配列を含む連結単位領域ＤＮＡと該共通ＤＮＡ配列に相補的な配列を有するプライマーの存在下で行われる（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）　（１）〜（７）のいずれかの方法により得られる変異ＤＮＡライブラリー。
（９）　（８）に記載のＤＮＡライブラリーを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を培養し、培養物からタンパク質を採取することにより得られるタンパク質ライブラリー。
（１０）　（８）に記載のＤＮＡライブラリーを転写することにより得られるＲＮＡライブラリー。
（１１）　（８）に記載のＤＮＡライブラリー、または（１０）に記載のＲＮＡライブラリーを無細胞転写および／または翻訳系で発現させることを特徴とするタンパク質ライブラリーの作製方法。
（１２）　（１１）の方法により得られるタンパク質ライブラリー。
（１３）　（７）に記載のＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ、または（９）に記載のＲＮＡライブラリーに含まれるＲＮＡに該ＤＮＡ、またはＲＮＡがコードするタンパク質が結合した核酸−タンパク質連結分子ライブラリー。
（１４）　（９）、（１２）または（１３）に記載のライブラリーを用いて所望の性質を有するタンパク質を選択することを特徴とするタンパク質の取得方法。
（１５）　（１４）に記載の方法により得られるタンパク質。
（１６）　（ａ）（１５）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを調製し、（ｂ）該ＤＮＡに変異を導入し、（ｃ）変異を導入したＤＮＡを増幅し、（ｄ）増幅されたＤＮＡを転写／翻訳させることによりタンパク質ライブラリーを作製し、（ｅ）該ライブラリーを用いて所望の性質を有するタンパク質を取得することを特徴とするタンパク質の取得方法。
（１７）　（１６）に記載の方法により得られるタンパク質。
（１８）　（１５）または（１７）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡの取得方法。
（１９）　（１８）に記載の方法により得られるＤＮＡ。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本明細書中において特に指定がない限りは、ランダムライブラリー、選択的スプライシングライブラリーに共通の説明である。
（１）単位領域ＤＮＡ
本発明で用いられる「単位領域」とは、タンパク質、遺伝子あるいはゲノムＤＮＡで何らかの構造的、機能的、進化的な意味を有する特定の領域単位、あるいはそのような意味を示さない任意の領域、または発現調節領域等を指す。タンパク質において特定の意味を有する領域としては、具体的には、例えばタンパク質のモジュール、二次構造、超二次構造、構造モチーフ、モチーフ、原始配列、人工アミノ酸配列等があり、また遺伝子においてはエキソン等を指す。発現調節領域としては、具体的には、コアプロモーター要素、上流制御要素、エンハンサープロモーター、エンハンサー等を指す。
ランダムライブラリーを作製する場合には単位領域は、上記のいずれも用いることができるが、選択的スプライシングライブラリーの場合にはタンパク質をコードする構造遺伝子を分断したものが用いられる。
タンパク質のモジュールとは、球状タンパク質やドメイン中で、一次構造上連続でかつ立体的にコンパクトな１０〜４０残基のアミノ酸からなる領域である。真核生物のエキソン部分がコードするポリペプチドは、モジュール構造を示す単位領域によく対応しており、モジュールは、タンパク質を構成する基本的なポリペプチドであり、生物進化の初期段階において重要な素材であったと考えられる（Ｇｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５２，９１５−９２４）。具体的には、例えばリゾチーム、ヘモグロビン、トリオースリン酸イソメラーゼ、及びバルナーゼを構成するモジュール等が挙げられる。
また、タンパク質の二次構造とは、タンパク質の立体構造において、ペプチド主鎖中のＣ＝Ｏ基とＮＨ基との間の水素結合によって形成される比較的狭い範囲（１０残基程度まで）にみられる特殊な立体構造で、α−ヘリックス、β−シート、βターン、あるいはループ構造のような繰り返しのある規則構造（Ｓａｌｅｍｍｅ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｉｎ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ．Ｚｕｂａｙ，Ｇ．，６９−１２９，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｃｏ．，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）や、カメレオン配列（Ｍｉｎｏｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８０（６５７６），７３０−７３４（１９９６））、およびＧ−ペプチド（Ｈｏｎｄａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９５（２），２６９−２７８（２０００））をいう。
タンパク質の超二次構造とは、α−ヘリックスやβ−シート構造のような二次構造単位がいくつか集まってコンパクトな立体構造を局所的につくっている単位をいう（Ｓａｌｅｍｍｅ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｉｎ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ．Ｚｕｂａｙ，Ｇ．，６９−１２９，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｃｏ．，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。具体的にはヘリックス−ループ−ヘリックス構造等が挙げられる。
タンパク質のモチーフとは、アミノ酸配列がよく似ている、あるいは機能がよく似ているタンパク質のアミノ酸配列を、同じまたは性質の似たアミノ酸配列が同じ位置に来るように並べる操作（配列アライメント）を行い、配列を比べてみて、短いが有意に保存されているアミノ酸配列をいう。言い換えれば、モチーフはタンパク質の特定の部位にあり、進化の過程で保存されてきたアミノ酸配列や塩基配列を指す。具体的には、ギリシャキーモチーフ等が挙げられ、またタンパク質のモチーフのデータベースＰＲＯＳＩＴＥ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｈｃｕｇｅ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｈｔｍｌ）等に登録されているモチーフ等が挙げられる。
原始配列とは転移ＲＮＡの特異性の並びに対応するアミノ酸配列をいう。進化の初期段階では、原始配列がタンパク質の機能の多様化に重要な役割をしたと、現存タンパク質の配列のホモロジーの比較から推測されている（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｋ．（１９９３）Ｉｎ　Ｅｎｄｏｃｙｔｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖ，ｅｄｓ．；Ｓ．Ｓａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，４０７−４１４）。
エキソンとは、真核生物の遺伝子ＤＮＡの中のタンパク質にまで翻訳される塩基配列をいう。エキソンはタンパク質にまで翻訳されない塩基配列のイントロンによって分断されている。ゲノムＤＮＡがＲＮＡに転写された後、スプライシングによりイントロンが切り取られ、エキソンだけがつなぎ合わされて、タンパク質合成の情報となる成熟したｍＲＮＡになる（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ，２７１，５０１）。
本発明で用いられる「単位領域ＤＮＡ」とは、単位領域を構成するＤＮＡを意味するが、単位領域が構造遺伝子を分断したものであるときは、元となる構造遺伝子が有する塩基配列は単一のものであり、これを分断して得られる単位領域ＤＮＡはそれぞれ単一の塩基配列を有するものが用いられる。また、単位領域が構造遺伝子を分断したものでないときは、各単位領域ＤＮＡに含まれるＤＮＡは複数の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ群を意味する。ここで、複数の相同性を有する塩基配列とは、相同性が後述のＰＣＲが可能である程度であり、かつそのＤＮＡの読み枠が保持されているものをいう。
このような単位領域ＤＮＡとは二本の相補鎖から成り、任意のＤＮＡ鎖から分断して単離し得るＤＮＡ又は化学合成したＤＮＡでもよい。また、上記したような構造を有する単位であればＤＮＡ鎖の長さ等は特に制限はないが、１０〜４０アミノ酸をコードする３０〜１２０ｂｐの長さの断片、あるいは、５’または３’末端が±３〜１５ｂｐ異なるＤＮＡ断片の混合物を用いてもよい。このような５’または３’末端が±３〜１５ｂｐ異なるＤＮＡ断片の作製法の例としては、ＰＣＲで作製する場合にそれぞれ±３〜１５ｂｐ隣接する塩基配列上でずらした配列を含むように設計した複数のプライマーを用いる方法が挙げられる。
本発明の変異ＤＮＡライブラリーの構築方法において、まずこの単位領域ＤＮＡを作製する。作製の方法は、上記した単位領域ＤＮＡが得られる方法であれば如何なるものであってもよいが、例えば目的のＤＮＡ配列を含むＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより得る方法が好ましい。
また、化学合成によって作製したＤＮＡの相補鎖をアニールさせることにより得ることもできる。
（２）連結単位領域ＤＮＡ
得られた単位領域ＤＮＡは、これをＤＮＡリガーゼ等を用いて連結し、単位領域ＤＮＡ連結体（以下、これを「連結単位領域ＤＮＡ」と称することがある）を作製し、このようにＤＮＡリガーゼ等によって連結された連結単位領域ＤＮＡについて、これを鋳型としたＰＣＲを行うことにより該連結単位領域ＤＮＡを増幅することもできる。この時、それぞれの単位領域ＤＮＡがアミノ酸の読み枠を保った方向に連結した連結単位領域ＤＮＡを増幅する必要がある。そのためには、例えば、「単位領域１」と「単位領域２」を連結した「１−２」という連結単位領域ＤＮＡを増幅する場合は、「単位領域１」の５’末端の塩基配列と相補性を有するフォワードプライマーと「単位領域２」の３’末端の負塩基配列と相補性を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲを行う。このようにしてプライマーを選択することにより、ＤＮＡリガーゼ等による連結により反転して連結された連結単位領域ＤＮＡを自動的に削除することができる。
連結単位領域ＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼ等による反応、あるいは上記のＰＣＲを行った後、この反応液をアガロースゲル電気泳動等により分離し、目的のＤＮＡが含まれている部分のゲルを切り出し、該ゲルからそれ自体既知の方法を用いて回収精製することにより取得することができる。また、上記連結単位領域ＤＮＡの全長のＤＮＡを化学合成によって作製し取得することも可能である。
連結単位領域ＤＮＡを作製するための単位領域ＤＮＡの選択方法及び連結順序については、ランダムライブラリーを作製する場合には、連結する単位領域ＤＮＡは任意の単位領域ＤＮＡを用いることができ、連結する単位領域の数も特に制限はない。しかし構築されるライブラリーの構成要素の多様化の効率等の点から２つの単位領域ＤＮＡを連結した連結単位領域ＤＮＡを作製するのが好ましい。連結する単位領域ＤＮＡ、及びその連結の順番は特に制限はないが、用いられる単位領域ＤＮＡの全ての組み合わせの連結単位領域ＤＮＡを作製すると、それを用いて後述する方法で作製するＤＮＡライブラリーにおいて、用いるすべての単位領域の組み合わせが行われたＤＮＡを得ることができる。具体的にはｎ種類の単位領域ＤＮＡを用いて、２個の単位領域を連結した連結単位領域ＤＮＡを作製する場合、最大ｎＣ２の組み合わせの連結反応を行うことができる。
また、連結する場合に、単位領域ＤＮＡ間にランダムな１〜１０個程度、好ましくは１〜５個程度のアミノ酸残基をコードするＤＮＡを挟むように連結を行ってもよい。このような連結単位領域ＤＮＡは、適当なプライマーを用いたＰＣＲにより作製することができる。
また、選択的スプライシングライブラリーを作製する場合には、連結単位領域ＤＮＡは上記（１）で単一の構造遺伝子ＤＮＡを分断した単位領域ＤＮＡのうち２つを選択して特定の順番に連結して得ることができる。選択される第１の単位領域ＤＮＡは上記（１）で単一の構造遺伝子ＤＮＡを分断した単位領域ＤＮＡ中、コードするタンパク質において最もＣ末端側に存在するものを除いて選択することができる。また該連結単位領域と結合させる第２の単位領域ＤＮＡは、これらがコードするタンパク質において上記第１の単位領域よりＣ末側に存在する単位領域をコードする単位領域ＤＮＡであればいずれのものでもよい。またその連結の順番は、第１の単位領域ＤＮＡの３’末端と、これらがコードするタンパク質においてＣ末側に存在する単位領域をコードする第２の単位領域ＤＮＡの５’末端とが単位領域中のアミノ酸配列が保たれるように行う。
上記のようにコードするタンパク質において上流から下流へむけての順序を保持するように結合させた連結単位領域は構造遺伝子をＬ個の単位領域ＤＮＡに分断したものを用いて連結単位領域ＤＮＡを作製する場合、第１の単位領域ＤＮＡとして選択されるＬ−１個の全てと、第２の連結単位領域ＤＮＡとして選択可能な全ての単位領域との組み合わせについて作製する。すなわちＬ個の単位領域ＤＮＡに構造遺伝子ＤＮＡを分断した場合、連結単位領域ＤＮＡはＬＣ２種類作製する。
（３）連結単位領域ＤＮＡの分類
作製された連結単位領域は、これを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより、本発明の変異ＤＮＡライブラリーを作製することができるが、選択的スプライシングライブラリーを作製する場合には、上記のようにして得られた連結単位領域ＤＮＡを、上記第１の単位領域ＤＮＡと第２の単位領域ＤＮＡが、それらが存在する構造遺伝子ＤＮＡにおいて何個の単位領域を隔てたものが連結されているかを指標として分類する必要がある。ここで第１の単位領域ＤＮＡと第２の単位領域ＤＮＡがそれらが存在する構造遺伝子ＤＮＡにおいて隔てている単位領域の数であるＸは、分断された単位領域がＬ個のとき、０以上Ｌ−２以下の整数である。
具体的には、あるタンパク質をコードするＤＮＡを、５個の単位領域ＤＮＡに分断した後、連結単位領域ＤＮＡを作製した場合、単位領域ＤＮＡを構造遺伝子のＮ末側から順に１、２、３、４、及び５とすると、連結単位領域ＤＮＡは１−２、１−３、１−４、１−５、２−３、２−４、２−５、３−４、３−５、４−５の１０種類が作製される。これらのうち第１の単位領域ＤＮＡと第２の単位領域ＤＮＡが、それらが存在する構造遺伝子ＤＮＡにおいて０個の単位領域を隔てたもの（Ｘ＝０）は、１−２、２−３、３−４、４−５である。同様に１個の単位領域を隔てたもの（Ｘ＝１）は、１−３、２−４、３−５、２個隔てたもの（Ｘ＝２）は１−４、２−５、３個隔てたもの（Ｘ＝３）は１−５というようにそれぞれ分類することができる。このように分類された連結単位領域ＤＮＡの各グループに属する単位領域ＤＮＡを総称して「連結単位領域ＤＮＡ群」と称することがある。
（４）連結単位領域ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
本発明の方法によれば、このようにして得られた連結単位領域ＤＮＡを混合し、これを鋳型としてＰＣＲ反応を行うことにより、単位領域ＤＮＡが適当な組み合わせで連結され、種々の配列の構造遺伝子からなる変異ＤＮＡライブラリーを一度のＰＣＲで構築することができる。
このＰＣＲにおいて鋳型とする連結単位領域ＤＮＡは、用いられる全ての連結単位領域ＤＮＡの末端の配列が少なくとも他の１種類の連結単位領域ＤＮＡの末端の配列と重複するように選択して混合する。ここで、ランダムライブラリーを作製する場合には、このＰＣＲにおいて鋳型とする連結単位領域ＤＮＡは、用いられる全ての連結単位領域ＤＮＡの末端の配列が少なくとも他の１種類の連結単位領域ＤＮＡの末端の配列と重複し、かつ少なくとも１種類の連結単位領域ＤＮＡの５’末端、あるいは３’末端のいずれかの配列が少なくとも他の２種類の連結単位領域ＤＮＡの末端の配列と重複するように選択する。本方法におけるＰＣＲに用いる連結単位領域ＤＮＡは、上記の条件を満たしていれば、その種類、及び個数は特に制限されない。
ランダムライブラリーにおいて、用いるすべての単位領域の組み合わせが行われたＤＮＡを得る目的の場合には、用いられる単位領域ＤＮＡの全ての組み合わせで連結された連結単位領域ＤＮＡを選択して混合し、これを鋳型としてＰＣＲを行えばよい。この場合、２つの単位領域ＤＮＡが連結された連結単位領域ＤＮＡを用いるのが好ましい。具体的にはｎ種類の単位領域ＤＮＡを用いて、２個の単位領域を連結した連結単位領域ＤＮＡにより、ｎ個の単位領域ＤＮＡの連結体を作製する場合、ｎ２種類の組み合わせの異なる連結単位領域ＤＮＡが存在するので、それら全ての連結単位領域ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行えば、用いられる単位領域ＤＮＡの全ての組み合わせで連結された変異ＤＮＡライブラリーを得ることができる。
ランダムライブラリーにおいて、特定の単位領域ＤＮＡの出現頻度については、その単位領域ＤＮＡを含む連結単位領域ＤＮＡの濃度によって調節することができる。具体的には、特定の単位領域ＤＮＡが他の２倍出現することを期待する場合には、その単位領域ＤＮＡを含む連結単位領域を含まないものの２倍量添加すればよい。
また、選択的スプライシングライブラリーを作製する場合、上記（３）で分類した連結単位領域ＤＮＡ群を、ＰＣＲの鋳型として用いることができる。このＰＣＲに供する連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡ量は、各連結単位領域ＤＮＡ群の合計として３００〜１５００ｆｍｏｌ、好ましくは５００〜１３００ｆｍｏｌが適当である。この鋳型ＤＮＡのうちの各連結単位領域ＤＮＡ群の占めるＤＮＡ量は、それぞれの第１の単位領域ＤＮＡと第２の単位領域ＤＮＡがそれらが存在する構造遺伝子ＤＮＡにおいて隔てている単位領域の数であるＸ、分断された単位領域の総数であるＬ、単位領域の総数と作製する変異体ＤＮＡの有する単位領域ＤＮＡの数との差であるＭについて下記式（１）
Ｌ−Ｘ−１ＣＭ−Ｘ　　　　　（１）
（式中、ＬおよびＸは上記同じ意味を示し、Ｍは単位領域の総数と作製する変異ＤＮＡの有する単位領域ＤＮＡ数との差を示す）
により算出することができる。このように算出された値は、各連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量が上記鋳型ＤＮＡの総量に占める割合を示す。また、算出された各連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量に占める各連結単位領域ＤＮＡのＤＮＡ量は分子数として等量であることが好ましい。
具体的には、分断された単位領域の総数が５個（Ｌ＝５）であり、作製しようとする変異体ＤＮＡが有する単位領域が３個（Ｍ＝３）である場合、上記で分類したＸ＝０の連結単位領域ＤＮＡ群では４Ｃ２＝６、Ｘ＝１の連結単位領域ＤＮＡ群では３Ｃ１＝３、Ｘ＝２の連結単位領域ＤＮＡ群では２Ｃ０＝１、Ｘ＝４の連結単位領域ＤＮＡ群では０Ｃ−１＝０の割合、つまりＸ＝０に分類された１−２、２−３、３−４、４−５を等量混合したＤＮＡ量の合計と、Ｘ＝１に分類された１−３、２−４、３−５を等量混合したＤＮＡ量の合計、及びＸ＝２に分類された１−４、２−５を等量混合したＤＮＡ量の合計が６：３：１となるように混合し、これを鋳型としてＰＣＲを行う。
さらに詳述すれば、例えば鋳型となるＤＮＡの総量を５００ｆｍｏｌとするとき、Ｘ＝０に分類された１−２、２−３、３−４、４−５を等量混合したＤＮＡ量の合計は３００ｆｍｏｌとなり、上記各連結単位領域ＤＮＡを７５ｆｍｏｌずつ鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲに供する。同様にＸ＝１に分類された１−３、２−４、３−５を等量混合したＤＮＡ量の合計は１５０ｆｍｏｌであり、各連結単位領域ＤＮＡを５０ｆｍｏｌずつ鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲに供する。また、Ｘ＝２に分類された１−４、２−５を等量混合したＤＮＡ量の合計は５０ｆｍｏｌとなり、各連結単位領域ＤＮを２５ｆｍｏｌずつ鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲに供する。
かくして上記式（１）を満たす値に基づき適当量混合された連結単位領域ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、これらの単位領域ＤＮＡを構造遺伝子において上流から下流にむけての順序を保ったまま、特定の単位領域ＤＮＡを選択的に削除して連結した変異ＤＮＡライブラリーを一度のＰＣＲで構築することができる。
ＰＣＲの反応緩衝液、及び酵素等はそれ自体既知の適当なものを用いることができるが、好ましくは、ランダムライブラリーを作製する場合にはＶｅｎｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社製）、また選択的スプライシングライブラリーを作製する場合にはＫＯＤ　Ｄａｓｈ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）が用いられる。
ＰＣＲに供する連結単位領域ＤＮＡ量はＤＮＡの増幅反応が起こる量であれば特に制限はない。具体的には、ＰＣＲを５０μｌの反応スケールで行う場合には、合計量で３００〜１５００ｆｍｏｌ、好ましくは５００〜１３００ｆｍｏｌが適当である。
また、ＰＣＲの条件としては、該連結単位領域ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ増幅反応が起こるものであればいかなるものであってもよい。各連結単位領域ＤＮＡの重複する配列の長さや、単位領域ＤＮＡの長さ、あるいは最終的に構築したい連結単位領域が連結されたＤＮＡの長さ等によって好ましいものを、バイオ実験イラストレイテッド３、細胞工学別冊、中山広樹著、秀潤社（１９９３）第一章、ｐ．１３−４３に記載されているようにして適宜選択、調整して用いることができる。具体的には、ＤＮＡ変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）反応を９４〜９６℃、好ましくは９５℃で１５〜６０秒、好ましくは２０〜４０秒行い、プライマー結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）を５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃で１５〜６０秒、好ましくは２０〜４０秒行い、続いてポリメラーゼ伸張（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）反応を７０〜７４℃、好ましくは７２〜７３℃で１〜５分、好ましくは２〜３分行うことを１サイクルとして、１５〜４０サイクル、好ましくは２０〜３０サイクル行うのが適当である。
上記ＰＣＲにおいてプライマーは特に必須ではないが、適当なプライマーを用いて行うこともできる。プライマーを使用してＰＣＲを行うことの利点は、プライマーと相補的な配列を両末端に有するＤＮＡが選択的に増幅されるため、構築されたＤＮＡの両末端に任意の単位領域ＤＮＡまたは共通ＤＮＡ含む単位領域を有するものを選択的に取得できることや、構築されたＤＮＡの量が増えるためＰＣＲの反応物を分離する際等に見やすいこと等が挙げられる。プライマーの量としては、フォワード、リバースプライマーがそれぞれ１０〜６０ｐｍｏｌ、好ましくは２０〜４０ｐｍｏｌが適当である。
構築されるべきＤＮＡの両末端となるべき単位領域ＤＮＡを固定した変異ＤＮＡライブラリーを構築する場合には、構築されるべきＤＮＡの両末端となるべき単位領域ＤＮＡと相補的な配列を有するプライマーの存在下で行うことが好ましい。
上記したようにＰＣＲを行うことにより、２以上のクローンを含むＤＮＡライブラリーを取得することができる。「２以上のクローンを含むＤＮＡライブラリー」とは、取得されたライブラリーに含まれるＤＮＡが異なる配列を有する２以上のクローンから成るライブラリーを意味する。
このＰＣＲ反応緩衝液に適当なマンガンイオンを存在させることにより、本発明のＤＮＡライブラリーを作製する際、同時に各ＤＮＡ配列にある頻度で塩基置換を誘起することができる。このマンガンイオン源として具体的には、塩化マンガン等が挙げられる。ＰＣＲ緩衝液中のマンガンイオン濃度は、誘起しようとする塩基置換の頻度に応じて選択される。塩基置換の頻度とマンガンイオン濃度の連関は、マンガンイオンの濃度を変えたＰＣＲを行って、得られたＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、該ＤＮＡに誘起された塩基置換率を調べることにより特定することができる。この関数として例えば、実施例３の表２に記載された値等を用いることができる。その他の方法としては、ｄＮＴＰの組成を変化させることによって、作製される変異ＤＮＡライブラリーに含まれる各ＤＮＡ配列に塩基置換を誘起することもできる。
（５）共通ＤＮＡ配列を有する連結単位領域ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
上記した連結単位領域ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの好ましい態様として、構築されるべきＤＮＡの両末端にそれぞれ異なる共通の配列が付加されるような連結単位領域ＤＮＡを選択して鋳型とし、かつ該共通ＤＮＡ配列に相補的な配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う方法が挙げられる。この方法により両末端に共通ＤＮＡ配列を有する変異ＤＮＡライブラリーを選択的に構築・取得することができる。
共通ＤＮＡ配列とは、１５〜１００塩基対程度の長さの適当な配列でよいが、構築されるＤＮＡを後述する変異プロテインライブラリーの作製に用いる場合には、５’末端の共通配列を適当なプロモーター配列とすることが好ましい。
共通ＤＮＡ配列として用いられるプロモーター配列としては、該ＤＮＡを発現させる宿主中で該ＤＮＡがコードするタンパク質が発現するものであれば特に制限は無い。具体的には、宿主微生物が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ＳＰ６、ｔａｃ、あるいはｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。
共通ＤＮＡ配列の連結単位領域ＤＮＡへの付加方法としては、単位領域ＤＮＡの１つとして共通配列を有する２本鎖ＤＮＡを上記（１）に記載した単位領域ＤＮＡの作製方法と同様の方法で作製し、これを上記（２）に記載した連結単位領域ＤＮＡの作製方法と同様の方法で連結することができる。具体的には、所望の５’末端側共通ＤＮＡ配列と単位領域ＤＮＡ、及び３’末端側共通ＤＮＡ配列と単位領域ＤＮＡを、上記連結単位領域ＤＮＡを作製したときと同様の操作で連結する。次に、得られた５’末端側共通ＤＮＡ配列と単位領域ＤＮＡの連結体、及び３’末端側共通ＤＮＡ配列と単位領域ＤＮＡの連結体については、５’側共通ＤＮＡ配列をフォーワードプライマー、それに連結された単位領域ＤＮＡの３’末端の遺伝子配列をリバースプライマーとして、３’末端側は３’側共通ＤＮＡ配列をリバースプライマー、それに連結された単位領域ＤＮＡの５’末端のＤＮＡ配列をフォーワードプライマーとしてＰＣＲを行うことにより作製される。
また、前述した連結単位領域ＤＮＡを作製するためのＰＣＲにプライマーとして５’、または３’末端に共通配列を付加した単位領域ＤＮＡの末端配列と相補性を有するプライマーを用いることによっても付加することができる。
このようにして作製した共通ＤＮＡ配列を含む連結単位領域ＤＮＡは、これを他の連結単位領域ＤＮＡと混合してＰＣＲを行う。他の連結単位領域ＤＮＡの選択方法及び混合率等は、上記（４）に記載のものと同様にして行うことができるが、詳細には以下に述べる通りである。
本発明の方法により作製する変異ＤＮＡライブラリーのうちランダムライブラリーにおいて、５’末端あるいは３’末端に共通配列を有し、かつ組換えに用いる単位領域ＤＮＡの全ての組み合わせが行われた変異ＤＮＡを得る目的の場合には、用いられる単位領域ＤＮＡの全ての組み合わせで連結された連結単位領域ＤＮＡと、用いられる全ての単位領域ＤＮＡの５’末端あるいは３’末端に共通配列を付加した連結単位領域を選択して混合し、これを鋳型としてＰＣＲを行えばよい。この場合、２つの単位領域ＤＮＡが連結された連結単位領域ＤＮＡを用いるのが好ましい。具体的にはｎ種類の単位領域ＤＮＡを用いて、２個の単位領域を連結した連結単位領域ＤＮＡにより、５’末端あるいは３’末端に共通配列を有するｎ個の単位領域ＤＮＡの連結体ＤＮＡをＰＣＲにより作製する場合、ｎ２の連結単位領域ＤＮＡ、及び２ｎ個の５’末端あるいは３’末端に共通配列を有する連結単位領域ＤＮＡを混合し、これを鋳型として用いたＰＣＲを行えば、用いられる単位領域ＤＮＡの全ての組み合わせで連結され、かつ５’末端あるいは３’末端に共通配列を有するランダムＤＮＡライブラリーを得ることができる。
また、選択的スプライシングライブラリーにおいては、共通ＤＮＡ配列を含む連結単位領域ＤＮＡは、これを特定の比率で混合しこれを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、一度のＰＣＲで構築することができる。
得られた共通ＤＮＡ配列と各単位領域ＤＮＡの連結単位領域ＤＮＡは共通ＤＮＡ配列と連結させる単位領域の間にそれらが存する構造遺伝子ＤＮＡにおいて隔てている単位領域の数（Ｘ：但しＸは、分断された単位領域がＬ個のとき、０以上Ｌ−１以下の整数である）にもとづいて上記（３）に記載したようにして混合割合を算出し、その他の連結単位領域ＤＮＡ群とともに混合してＰＣＲを行うことにより行う。
具体的にはあるタンパク質をコードするＤＮＡを５個の単位領域ＤＮＡに分断したのち連結単位領域ＤＮＡを作製した場合、単位領域ＤＮＡを構造遺伝子のＮ末側から順に１、２、３、４、及び５とし、５’共通ＤＮＡ配列をＴ、３’側共通ＤＮＡ配列をＣとすると、共通ＤＮＡ配列ＴあるいはＣと単位領域ＤＮＡが連結した連結単位領域ＤＮＡはＴ−１、Ｔ−２、Ｔ−３、Ｔ−４、Ｔ−５、１−Ｃ、２−Ｃ、３−Ｃ、４−Ｃ、５−Ｃの１０種類が作製される。これらのうち共通ＤＮＡ配列と単位領域ＤＮＡとが、それらが存在する構造遺伝子ＤＮＡにおいて０個の単位領域を隔てたもの（Ｘ＝０）は、Ｔ−１、５−Ｃである。同様に１個の単位領域を隔てたもの（Ｘ＝１）は、Ｔ−２、Ｃ−４、２個隔てたもの（Ｘ＝２）はＴ−３、３−Ｃ、３個隔てたもの（Ｘ＝３）はＴ−４、２−Ｃ、４個隔てたもの（Ｘ＝４）はＴ−５、１−Ｃであるので各Ｘの値からＰＣＲに供する該連結単位領域ＤＮＡの混合割合を算出することができる。
このように選択して混合した共通配列を有する単位領域ＤＮＡを含む単位領域ＤＮＡ群を鋳型としたＰＣＲには５’末端あるいは３’末端に付加される共通ＤＮＡ配列と相補的な配列を有するプライマーを用いることが必要である。
ＰＣＲの反応緩衝液、酵素、及び反応条件等は上記（４）に記載の方法に準じて行うことができる。ただし、共通配列を含む連結単位領域ＤＮＡについては、より好ましくは、ＰＣＲを５０μｌの反応スケールで行う場合には合計量で、５〜３０ｆｍｏｌ、好ましくは１０〜２０ｆｍｏｌを用いる。
（６）選択的スプライシングライブラリー構築方法の原理
本発明の変異ＤＮＡライブラリーのうち、選択的スプライシングライブラリーの構築方法の原理について、図３の５個の単位領域から構成されるタンパク質を例に説明する。この場合、これらを構造遺伝子において上流から下流にむけての順序を保つように２つずつ連結した連結単位領域ＤＮＡは５Ｃ２＝１０種類考えられる。これらの連結単位領域ＤＮＡは、それがコードしている単位領域によって４通りに分類される（図３ｂ）。構築しようとする選択的に適当な単位領域が削除されて連結された変異タンパク質が、５個の単位領域から選択された３個の単位領域が含まれるタンパク質である場合、その変異タンパク質の構造は５Ｃ３＝１０通りが考えられる（図３ｃ）。
次に上記に示された１０種類の配列中に見出される連結単位領域を数え上げ、それらを図３ｂに基づいて分類する。その結果、単位領域をコードするタンパク質のＮ末側から順にＮ、Ｎ＋１、Ｎ＋２、Ｎ＋３、Ｎ＋４とした場合、Ｎ−Ｎ＋１（隔てている単位領域の数（Ｘ）＝０）が１２個、Ｎ−Ｎ＋２が６個、Ｎ−Ｎ＋３が２個、Ｎ−Ｎ＋４が０個となる。
この値を参照し、５個の単位領域から構成されるタンパク質から適当な２個の単位領域を削除して連結したタンパク質の集団（本例の場合１０種類）をコードするＤＮＡライブラリーを効率よく得られるためには、連結単位領域ＤＮＡ、Ｎ−Ｎ＋１（隔てている単位領域の数（Ｘ）＝０）：Ｎ−Ｎ＋２：Ｎ−Ｎ＋３：Ｎ−Ｎ＋４＝６：３：１：０の比率で混合し、これらを鋳型としてＰＣＲを行えばよいことがわかる。
上記を一般式にあてはめると、タンパク質をコードする構造遺伝子ＤＮＡをＬ個の単位領域ＤＮＡ（但しＬは任意の整数である）に分割して、そのうちのＭ個を選択的に削除して連結した変異ＤＮＡライブラリーをＰＣＲで作製する場合、鋳型となる２個の上記単位領域ＤＮＡを構造遺伝子において上流から下流にむけての順序を保つように連結した連結単位領域ＤＮＡが構造遺伝子上で隔てている単位領域の数（Ｘ）としたとき、下記式（１）によりそのＤＮＡの割合を算出することができる。
Ｌ−Ｘ−１ＣＭ−Ｘ　　　（１）
（７）変異ＤＮＡライブラリーの精製
上記（４）または（５）に記載したＰＣＲにより増幅され構築されたＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片は、アガロースゲル等を用いた電気泳動等により確認することができる。
また、上記アガロースゲル等を用いた電気泳動により、単位領域が種々の個数で連結したＤＮＡの混合物から、任意の長さのＤＮＡのみで構成される変異ＤＮＡライブラリーを取得したり、単位領域ＤＮＡが目的の個数連結したＤＮＡが最も多く含まれる変異ＤＮＡライブラリーを取得することができる。この場合、低融点アガロースゲルを用いるのが好ましく、該ゲル中でＤＮＡを電気泳動し、任意の長さのＤＮＡが含まれる部分を切り出し、切り出したゲル中からそれ自体既知の方法を用いてＤＮＡを抽出して精製することができる。
かくして得られる変異ＤＮＡライブラリーは、タンパク質−核酸相互作用を解析するためのＤＮＡライブラリー、あるいはＲＮＡライブラリーとして用いることもできる。また、これを適当なベクターに導入し、該組換えベクターを適当な宿主に形質転換するか、あるいは転写後無細胞翻訳系において発現させる等の方法により、該ＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡがコードするタンパク質のライブラリー（以下、これを「変異プロテインライブラリー」と称することがある）を作製するのに用いられる。
（８）変異ＤＮＡライブラリーのベクターへの導入、及び変異プロテインライブラリーの作製
組換えベクターの作製に用いられるベクターとしては、宿主微生物または培養細胞中で本発明の変異ＤＮＡライブラリー中に含まれるＤＮＡを発現し得るものであれば特に制限はないが、通常宿主微生物または培養細胞に適したプロモーターが挿入されている市販のタンパク質発現用ベクターを用いることができる。一方、上述したように、変異ＤＮＡライブラリーを構築する際のＰＣＲの鋳型として用いる連結単位領域ＤＮＡの５’末端に、共通ＤＮＡ配列として適当なプロモーター配列を付加したものを用いた場合には、通常のクローニング用のベクターを用いることができる。また、上記のようなプロモーター配列ＤＮＡが５’末端に付加されていない変異ＤＮＡライブラリーであっても、これを適当なプロモーター配列ＤＮＡが５’末端に連結するように挿入すれば、通常のクローニングベクターを用いることができる。
タンパク質発現用ベクターとしては、宿主微生物が大腸菌の場合では、例えばｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（スタラタジーン社）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、また宿主が酵母の場合にはｐＥＳＰ−Ｉ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ（ストラタジーン社製）等が挙げられる。動物培養細胞を宿主として用いる場合には、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等、また昆虫細胞を用いる場合にはＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等を用いることができる。
本発明の変異ＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、宿主微生物または培養細胞が保有するプロモーターを一般的に用いることができるが、これに限られるものではない。具体的には、宿主微生物が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ＳＰ６、ｔａｃ、ｌａｃプロモーターを用いることができる。また酵母を宿主とする場合には、ｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場合にはＳＶ４０、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。
これらのベクターへの本発明の変異ＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡ断片がベクター中において上記プロモーターの下流に存在するようにＤＮＡリガーゼ等を用いて連結することにより行うことができる。
かくして得られる組換えベクターは、これをそれ自体既知の適当な方法によって適当な宿主に導入することにより、形質転換体を作製することができる。具体的な宿主への導入方法としては、ヒートショック法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４−（１９７０））、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１−（１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６−（１９８２））、電気パルス法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，７１６１（１９８４））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，５８１（１９７５））、あるいはウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ，３７，１０５３（１９８４））等が挙げられる。
この時、該ＤＮＡを導入する宿主としては、該ＤＮＡを含むタンパク質発現組換えベクターにより宿主体内で該ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能なものであればいかなるものであってもよいが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウィルス）−昆虫細胞、動物細胞、動物培養細胞等が挙げられる。
具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母ではＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）、バキュロウィルスではＡｃＮＰＶ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６（１９８８））とその宿主であるＳｆ−９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６（１９８８））等が挙げられる。また動物培養細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，２６，２９１（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７７，４２１６（１９８０））やアフリカミドリザル腎臓細胞ＣＯＳ（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）等が挙げられる。
かくして得られた形質転換体は、これをそれぞれに適した方法により、適当な培地で培養することにより変異ＤＮＡライブラリーのＤＮＡがコードするタンパク質の発現を誘導することができる。培養に用いる培地中には、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清及び耐性スクリーニングに用いられる薬剤等が含有される。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合には例えば、ＬＢ培地（ナカライテスク社製）等、酵母の場合にはＹＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１，１１７，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（１９７９））等、昆虫細胞、動物細胞、及び動物培養細胞の場合には、２０％以下のウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）等を用いることができる。
形質転換体の培養は、通常、温度が２０〜４５℃、ｐＨが５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気や攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育し、導入されたＤＮＡがコードするタンパク質が生成されれば特に制限されない。
得られた培養物から細胞あるいは菌体を遠心分離等の方法により収集し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解等のそれ自体既知の適当な方法により破壊した後、遠心分離や濾過等によりタンパク質粗精製液を得、さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製タンパク質を得ることができる。かくして、変異プロテインライブラリーが作製される。
（９）変異ＤＮＡライブラリーの無細胞翻訳系による発現、及び変異プロテインライブラリーの作製
上記したタンパク質発現組換えベクターを用いる発現方法の他に、変異ＤＮＡライブラリーを転写することにより得られるＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系に供することによりタンパク質発現を誘導し、変異プロテインライブラリーを作製することができる。該ＤＮＡライブラリーの転写は、それ自体既知の通常用いられる方法によることができるが、無細胞転写翻訳系を用いて翻訳と同時に行うことができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。
無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞及びバクテリア細胞又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられ、特に好ましい具体例としては、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ３０抽出液）に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、変異ＤＮＡライブラリーがコードするタンパク質の分離及び精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、例えばエピトープペプチド、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
（１０）変異プロテインライブラリーのスクリーニング
上記（８）または（９）で得られた変異プロテインライブラリーは所望の性質を有することを指標としたスクリーニングに供することができる。所望の性質を有するタンパク質とは、所望の標的分子に結合するタンパク質、所望の化学反応を触媒するタンパク質、上記したタンパク質の結合能、触媒能、基質特異性、熱安定性及び環境条件が改変されたタンパク質等をいう。
目的とする生物活性により所望の性質を有するタンパク質を選択する方法としては、標的分子との結合能を指標にして選択する方法と、触媒活性を指標にして選択する方法が挙げられる。これら結合能または触媒活性を指標として、例えば、親和性樹脂吸着法、免疫沈降法、電気泳動法、クロマトグラフィー法、フローサイトメトリー法等を利用して所望の性質を有するタンパク質を選択することができる。より具体的には、タンパク質、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、糖質、脂質等の標的分子を、予めマイクロプレートやビーズ等の固相に結合させておき、これに上記で構築された変異プロテインライブラリーを加え、適当な温度条件で、一定時間反応させた後に洗浄し、標的分子に結合した変異タンパク質を選択する方法が挙げられる。この方法は、既に確立しているＥｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．）に準じて行うことができる。
触媒活性を指標として所望の性質を有するタンパク質、例えば酵素タンパク質を選択する際、例えば、次の２つの方法を用いることができる。その１つは触媒抗体の場合のように、所望の触媒反応の遷移状態アナログを固定化した樹脂に結合するタンパク質を選択する方法である（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４，１５６６−１５７０）。もう１つはＲＮＡ酵素（リボザイム）の場合のように、触媒活性による分子の結合・切断によって、変異プロテインライブラリーに含まれるタンパク質が樹脂に結合・解離されるように工夫する方法である（Ｇｏｌｄ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３−７９７）。前者の選択法は酵素活性のターンオーバーを増やすことが難しいのに対して、後者の選択法は、リボザイムの多くの成功例が示しているように、結合ではなく最初から触媒活性で選択する方法であり、後者の方法が有効である。
また、触媒抗体が抗体構造によって制限されることも、天然酵素ほどの活性をもつものが得られていない理由の１つである。本発明では、リボザイム型の選択法が利用可能であり、タンパク質の構造の選択範囲も抗体に限らず自由なので、従来の触媒抗体を越えた新規触媒タンパク質の創出に大きく寄与することが期待できる。
（１１）所望の性質が改良されたタンパク質の取得
上記（１０）に記載のスクリーニング方法により選択されたタンパク質は、これをコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡに変異を導入し、変異を導入したＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを発現させ新たな変異プロテインライブラリーを作製し、該ライブラリーを用いて所望の性質を指標としてタンパク質を選択することにより所望の性質が改良されたタンパク質を取得することができる。また、このように取得されたタンパク質も、上記の操作を繰り返すことによれば所望の性質がさらに改良されたタンパク質を取得することもできる。
所望の性質を有することを指標として選択されたタンパク質がコードするＤＮＡを調製する方法としては、そのタンパク質を産出する形質転換体中からそれ自体既知の方法により回収し、ＰＣＲ等を用いて増幅する方法を用いることができる。ＰＣＲによる所望のタンパク質をコードするＤＮＡの増幅には、変異ＤＮＡを挿入したベクターの配列に相補的な配列を有するプライマー、あるいは共通ＤＮＡ配列を有する連結単位領域を用いた場合には該共通ＤＮＡ配列に相補的な配列を有するプライマーを用いればよい。
また、増幅されたＤＮＡへ変異を誘発させる方法としては、既に確立しているＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１，１１−１５）やＳｅｘｕａｌ　ＰＣＲ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１０７４７−１０７５１）を用いることができる。
このようにして得られた所望の性質がさらに改良されたタンパク質はそれ自体既知の方法により分離精製し、取得することができる。
（１２）核酸−タンパク質連結分子を利用した所望の性質が改良されたタンパク質の取得
上記（１１）に記載した所望の性質が改良されたタンパク質の取得方法は、タンパク質とそれをコードする核酸が対応づけられて連結している核酸−タンパク質連結分子を用いると更に効率よく実施することができる。核酸−タンパク質連結分子は、ファージ・ディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２８，１３１５−１３１７）、リボソーム・ディスプレイ法（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ　Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４，４９３７−４９４２）、試験管内ウィルス法（Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４１４，４０５−４０８；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ　Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４，１２２９７−１２３０２；国際公開ＷＯ９８／１６６３６号公報）、ＳＴＡＢＬＥ法（Ｄｏｉ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４５７，２２７−２３０）等の方法により調製することができる。
ファージ・ディスプレイ法は、大腸菌に感染して増殖するファージを利用する方法である。ファージ粒子はファージを構成する外被蛋白質がそれ自身をコードするＤＮＡを包み込む形態をしている。ＤＮＡをファージの外被蛋白質遺伝子に挿入しこれを発現させることにより、ファージ粒子の表面に該ＤＮＡがコードするペプチドが提示されたファージライブラリーが作製できる。つまり間接的ではあるが、ファージ粒子の表面に提示されているタンパク質とファージ体内に存在するＤＮＡとが対応つけられて存在している。提示しているペプチドのうち所望の性質を有することを指標として選択したファージ内からＤＮＡを回収することにより、提示されたペプチドをコードするＤＮＡを取得することができる。
リボゾーム・ディスプレイ法では、終止コドンを除いたｍＲＮＡを無細胞翻訳系等を用いて翻訳させる際、合成されたタンパク質をリボゾーム上にトラップさせる。この結果、タンパク質−リボゾーム−ｍＲＮＡ複合体が作製され、タンパク質−核酸連結分子として利用することができる。リボソーム上にトラップされたタンパク質のうち所望の性質を有することを指標として選択されたタンパク質を結合したリボソームから該タンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。
試験管内ウイルス法では、ｍＲＮＡを無細胞タンパク質合成系等において発現させる際、リボソーム上でｍＲＮＡとタンパク質が化学的に結合したｍＲＮＡ−タンパク質連結分子を構築することができる。さらに、そのｍＲＮＡ−タンパク質連結分子（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ）を試験管内淘汰法により淘汰し、選択されたｉｎ　ｖｉｔｒｏウイルスのｍＲＮＡ部分を逆転写ＰＣＲにより増幅して取得することができる。
ＳＴＡＢＬＥ法は、ＤＮＡに予め結合させたビオチン等のリガンド物質と特異的に結合するタンパク質、例えばストレプトアビジン等のアダプタータンパク質を、該ＤＮＡがコードするタンパク質と融合タンパク質として発現させ、このリガンドとアダプタータンパク質の結合を介してタンパク質と核酸を結合させる方法である。具体的には、例えば、予めＤＮＡの末端にビオチンを化学的に結合させておき、該ＤＮＡを無細胞転写翻訳系等で発現させる。この時、１分子のＤＮＡをマイクロカプセル等の中に隔離した状態で発現させる。生成されたタンパク質は該マイクロカプセル内に存在するＤＮＡに結合しているリガンド、例えばビオチンと融合タンパク質として発現しているアダプタータンパク質、例えばストレプトアビジンとの結合を介して結合し、タンパク質−ＤＮＡ連結分子が作製される。この連結分子のタンパク質部分が所望の性質を有することを指標として選択された連結分子のＤＮＡ部分をＰＣＲ等により増幅することにより、選択されたタンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。
このような核酸−タンパク質連結分子を用いて取得した所望の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、上記（１１）と同様にこれに変異を導入し、変異を導入したＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを発現させ新たな変異プロテインライブラリーを作製し、該ライブラリーを用いて所望の性質を有することを指標としてタンパク質を選択することにより所望の性質が改良されたタンパク質を取得することができる。また、このように取得されたタンパク質も、上記の操作を繰り返すことにより所望の性質がさらに改良されたタンパク質を取得することもできる。かくして得られた所望の性質がさらに改良されたタンパク質はそれ自体既知の上記した方法により分離精製し、取得することができる。
所望の性質を有するタンパク質のスクリーニングは、上記（１０）に記載の方法と同様に行えばよい。
（１３）所望の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡの取得
上記（１０）、（１１）あるいは（１２）に記載された所望の性質を有するタンパク質を解析し、これをコードするＤＮＡを取得することにより、該タンパク質の組み換え体を作製することができる。
タンパク質をコードするＤＮＡは、上記（１０）または（１１）に記載のスクリーニング方法により取得されたタンパク質の場合、それ自体既知の通常用いられる方法を適宜組み合わせて解析、取得することができる。具体的には、選択的スプライシングライブラリーから得られたタンパク質の場合、例えば、（１）タンパク質の分子量を質量分析計等を用いて測定し、（２）この分子量から該タンパク質に含まれる単位領域の種類及び数を計算することによって同定することができる。同定されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片は上記（２）に記載の連結単位領域ＤＮＡの作製方法と同様にして作製することができる。
また、ランダムライブラリーから得られたタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質のアミノ酸配列を公知の方法で解析し、得られたアミノ酸配列から含まれる単位領域の種類及び結合順序を同定することができる。同定されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片は上記（２）に記載の連結単位領域ＤＮＡの作製方法と同様にして作製することができる。
また、上記（１２）に記載のスクリーニング方法により取得されたタンパク質の場合、得られた核酸−タンパク質連結分子の核酸部を逆転写ＰＣＲ、またはＰＣＲ法により増幅して取得することができる。
また、本明細書において、ＤＮＡの単離、調製、連結、及び合成、あるいは形質転換の方法、プラスミドの構築、形質転換体の培養等の操作は、特に明記しない限り、Ｓｏｎｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。
本出願が主張する優先権の基礎となる日本特許出願である特願２０００−２９３６９２号及び特願２００１−２９１３８号の明細書に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例
（実施例１）
（１）単位領域ＤＮＡの作製
グルタミニル−ｔＲＮＡ合成酵素のジヌクレオチド結合部位の全領域とアクセプタドメインの一部（Ｒｏｕｌｄ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６，１１３５−１１４２）は、１５０残基のアミノ酸から構成される（Ｈｏｂｅｎ，Ｐ．ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，１１６４４−１１６５０）。このジヌクレオチド結合部位の全領域とアクセプタドメインの一部に相当する領域を６等分した２５アミノ酸残基をコードするＤＮＡ、７５塩基対を単位領域ＤＮＡとした（１〜６；配列番号：１〜６）。単位領域ＤＮＡ断片は化学合成（エスペックオリゴサービス）により作製した。また、５’共通配列としてＴ７プロモーター配列を含むＤＮＡ断片（Ｔ７；配列番号：１９）を化学合成（エスペックオリゴサービス）により作製した。同様に３’共通配列（Ｅｘ；配列番号：２０）も化学合成（エスペックオリゴサービス）により作製した。
各単位領域合成ＤＮＡ断片、及び共通配列合成ＤＮＡ断片はアニールを行い２本鎖にして、各単位領域ＤＮＡの５’側の塩基配列と相同性を有するフォワードプライマー（Ｆ１〜Ｆ６；配列番号７〜１２）と３’側の塩基配列と相同性を有するリバースプライマー（Ｒ１〜Ｒ６；配列番号８〜１８）、及び各共通配列の５’側の塩基配列と相同性を有するフォワードプライマー（ＦＴ７；配列番号２１、ＦＥｘ；配列番号：２３）と３’側の塩基配列と相同性を有するリバースプライマー（ＲＴ７；配列番号：２２、ＲＥｘ；配列番号：２４）（ダテコンセプト）を用いて増幅した。
各プライマーはＰＣＲに先立ちリン酸化した。リン酸化反応溶液（３０μｌ）は、２０μｌのＤＮＡ溶液、１０ｍＭのＡＴＰ、１ユニットのポリヌクレオチドリン酸キナーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）、および添付の１０×反応緩衝液３μｌを含む。ＰＣＲの反応液（５０μｌ）は、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓ　２００μＭ、１ユニットｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）、および添付の１０×ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液５μｌを含む。反応条件は、第１段階（１サイクル）９５℃を５分；第２段階（３０サイクル）９５℃を３０秒、６０℃を３０秒；第３段階（１サイクル）４℃を１０分で行った。ＰＣＲで増幅した６個の単位領域ＤＮＡ断片、５’共通配列ＤＮＡ断片、及び３’共通配列ＤＮＡ断片の合計８種類のＤＮＡ断片をフェノールとクロロホルムを用いて抽出した後、エタノール沈殿し、５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
（２）連結単位領域ＤＮＡの作製
上記（１）で増幅し得られた８種類のＤＮＡ断片を以下の組み合わせで連結した。
Ｔ７−１、Ｔ７−２、Ｔ７−３、Ｔ７−４、Ｔ７−５、Ｔ７−６、１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−Ｅｘ、２−３、２−４、２−５、２−６、２−Ｅｘ、３−４、３−５、３−６、３−Ｅｘ、４−５、４−６、４−Ｅｘ、５−６、５−Ｅｘ、６−Ｅｘ。
反応液は１０μｌのＤＮＡ溶液と１０μｌのｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を含む。反応は１６℃で１時間行った。この反応を行った連結単位領域ＤＮＡの含有液を「連結反応液」と称する。
上記の連結反応生成物を鋳型ＤＮＡとして、それぞれ上記（１）で用いた適当なプライマーを用いて２つの単位領域ＤＮＡが連結した連結単位領域ＤＮＡを増幅した。増幅した連結単領域ＤＮＡは、Ｔ７−１、Ｔ７−２、Ｔ７−３、Ｔ７−４、Ｔ７−５、Ｔ７−６、１−１、１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−Ｅｘ、２−１、２−２、２−３、２−４、２−５、２−６、２−Ｅｘ、３−１、３−２、３−３、３−４、３−５、３−６、３−Ｅｘ、４−１、４−２、４−３、４−４、４−５、４−６、４−Ｅｘ、５−１、５−２、５−３、５−４、５−５、５−６、５−Ｅｘ、６−１、６−２、６−３、６−４、６−５、６−６、６−Ｅｘの４８種類である。
ＰＣＲの反応液（５０μｌ）は、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓ　２００μＭ、連結反応液１μｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ユニットＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、及び添付の１０×Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を含む。反応条件は、第１段階（１サイクル）９５℃を５分；第２段階（３０サイクル）９５℃を３０秒、６０℃を３０秒；第３段階（１サイクル）４℃を１０分で行った。これらのＰＣＲ反応液をエタノール沈殿し、２０μｌの滅菌水に溶解後、低融点アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動後、目的のＤＮＡバンドを切り出し、フェノール、クロロホルムを用いて抽出した後、エタノール沈殿し、６０μｌの滅菌水に溶解した。得られた連結単位領域ＤＮＡの濃度を２６０ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。全ての連結単位領域ＤＮＡの濃度は６０〜１００ｎｇ／μｌ程度であった。
得られた４８種類の連結単位領域ＤＮＡをＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＫＩＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングした。クローニング手順はＫＩＴに添付されているプロトコール（ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｒ．Ｋ：Ｆｉｖｅ　Ｍｉｎｕｔｅｓ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｔａｑ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従った。まず、連結単位領域ＤＮＡのＰＣＲ産物４μｌとＫＩＴに添付されている塩溶液１μｌとＰＣＲ−ＴＯＰＯ　ｖｅｃｔｏｒ　１μｌを混合し、２５℃で５分間インキュベートした。次に２μｌの反応溶液とＫＩＴに添付されているコンピテントセル５０μｌを混合し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、４２℃で３０秒間インキュベートした後、ＫＩＴに添付されている２５０μｌのＳＯＣ培地に全てのコンピテントセルを加え、３７℃で３０分間培養した。その後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが添加されているＬＢプレートに５０μｌのＳＯＣを塗布した。なお、ＬＢプレートには、予め４０μｇ／ｍｌのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドガラクトース（ＩＰＴＧ）を２４μｌ、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ溶液を４０μｌ塗布したものを用いた。
上記のＬＢプレートを１２時間、３７℃でインキュベートしたのち、プレート上に２００個程度のコロニーを確認した。青色のコロニーを各連結単位領域ＤＮＡにつき３個ずつ選び、コロニーＰＣＲにより目的の連結単位領域ＤＮＡがプラスミド上に含まれているか否かを調べた。ここで、白ではなく青コロニーを選んだ理由は、全ての単位領域ＤＮＡ、及び共通配列ＤＮＡは３の倍数個の塩基対からなり、ｌａｃＺ遺伝子にフレームシフトを起こさせず、活性に影響を及ぼさないと予想したからである。コロニーＰＣＲの反応液（５０μｌ）は、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ２００μＭ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ユニットＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、および添付の１０×Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液５μｌを含む。なお、鋳型ＤＮＡとして、コロニーを滅菌水に懸濁したものを用いた。反応条件は、第１段階（１サイクル）９５℃を５分；第２段階（３０サイクル）９５℃を３０秒、６０℃を３０秒、７２℃を３０秒；第３段階（１サイクル）４℃を１０分である。コロニーＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で解析し、目的の連結単位領域ＤＮＡが増幅されていることを確認した後、生成物をＷｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製し、ＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ；ベックマンコールター社製）により塩基配列の解析を行った。この塩基配列の解析により、作製された連結単位領域ＤＮＡに置換、挿入、欠失などの変異がないことを確認し、続くＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして用いた。
（３）変異ＤＮＡライブラリーの作製
上記（２）で作製された連結単位領域ＤＮＡのすべてを混合してＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応溶液（５０μｌ）は、プライマーとしてＴ７のフォワードプライマー（配列番号：２１）とＥｘのリバースプライマー（配列番号：２４）を各２０ｐｍｏｌ、単位領域１から６を含む連結単位領域ＤＮＡ３６種を合計で７５０ｆｍｏｌ、Ｔ７およびＥｘを含む連結単位領域ＤＮＡ１２種を合計で１５ｆｍｏｌ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）を１ユニット、添付の１０×ｖｅｎｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒを５μｌ含む。反応条件は、第１段階（１サイクル）９５℃を５分；第２段階（２０サイクル）９５℃を３０秒、６０℃を３０秒、７２℃を３分；第３段階（１サイクル）４℃を１０分である。得られたＰＣＲ産物をエタノール沈殿により濃縮後、低融点アガロースゲルを用いて電気泳動することにより、１５本以上のラダー状のバンドを確認することができた（図２）。ラダーの間隔は７５塩基対相当であることから、これらのラダーは、分子量が小さい方から順に、Ｔ７−（Ｘ）−Ｅｘ、Ｔ７−（Ｘ）２−Ｅｘ、Ｔ７−（Ｘ）３−Ｅｘ、・・・・・、Ｔ７−（Ｘ）１５−Ｅｘ、・・の配列と予想される（「Ｘ」は単位領域１〜６のいずれか）。つまり、５’共通配列であるＴ７と３’共通配列であるＥｘの内部で、６個の単位領域が種々の順序と個数で連結されている可能性が示された。
（４）変異ＤＮＡライブラリーの確認
上記（２）で得られたＰＣＲ産物が上記の推測通りの配列をもつか否かを調べる目的で、Ｔ７−（Ｘ）６−Ｅｘに相当するＤＮＡバンドを切り出し、クローニング後、塩基配列を解析した。まず、Ｗｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＴ７−（Ｘ）６−Ｅｘに相当するＤＮＡバンドを精製した。続いて、Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてｄＡを３’末端に付加させた後、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＫＩＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした。クローニングの手順は、ＩＰＴＧとＸ−ｇａｌが塗布されていないＬＢプレートを用いた点以外は上記（２）に記載したものと同様である。
ＬＢプレートを１２時間、３７℃でインキュベートしたのち、プレート上に約１００個のコロニーが確認できた。すべてのコロニーについてコロニーＰＣＲを行い、インサートＤＮＡが含まれているか否かを調べた。コロニーＰＣＲの反応液（５０μｌ）は、Ｋｉｔに添付されているＭ１３のフォワードおよびリバースプライマーを各２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ　２００μＭ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ユニットＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、および添付の１０×Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液５μｌを含む。なお、鋳型ＤＮＡとして、コロニーを滅菌水に懸濁したものを用いた。反応条件は、第１段階（１サイクル）９５℃を５分；第２段階（３０サイクル）９５℃を３０秒、５５℃を３０秒、７２℃を３０秒；第３段階（１サイクル）４℃を１０分である。コロニーＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で解析した結果、６６個のコロニーがインサートＤＮＡを含んでいることが確認された。これらのコロニーＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製し、ＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ、ベックマンコールター社製）により塩基配列を解析した。
インサートＤＮＡが確認された６６個の配列を解析した結果を表１に示す。表中の数字は、１〜６のＤＮＡ断片の連結順序を示す。６６個の配列のうち６４個の配列は、５’末端にＴ７、３’末端にＥｘもち、内部の単位領域が様々な順序で連結された構造を有していた。つまり、上記の推測の通りの反応が起きていることが確認された。６６個の配列の内訳はＴ７−（Ｘ）９−Ｅｘが１個、Ｔ７−（Ｘ）７−Ｅｘが１個、Ｔ７−（Ｘ）６−Ｅｘが５０個、Ｔ７−（Ｘ）５−Ｅｘが５個、Ｔ７−（Ｘ）４−Ｅｘが４個、Ｔ７−（Ｘ）３−Ｅｘが３個、そして３’側にＥｘを持たないＴ７−（Ｘ）７の配列を持つものが２個であった。これらの中で、同じ配列を有するものは二組のみであり、６４種の異なる配列が確認された。つまり、一度のＰＣＲにおいて、６種の単位領域ＤＮＡが様々な異なる順序で連結された多くの構造遺伝子が同時に合成されたことが確認された。大腸菌を用いたクローニング後に解析された配列は、該ＰＣＲで作製されたＤＮＡのごく一部であるため、このＰＣＲにより作製された変異ＤＮＡライブラリーにはより多くの種類の構造遺伝子が構築されていると推測される。
解析した塩基配列に、Ｔ７−（Ｘ）６−Ｅｘ以外の、より長いＤＮＡや短いＤＮＡが含まれていた理由としては、低融点アガロース電気泳動に於いて切り出した、Ｔ７−（Ｘ）６−Ｅｘに相当するＤＮＡバンドに、少数の長さの異なるＤＮＡが存在していたためと考えられる。これらＤＮＡも、５’側にＴ７、３’側にＥｘをもち、その内部で単位領域ＤＮＡが様々な順序で連結された配列を有していた。
また、３’末端にＥｘをもたなかった２種の配列に於いては、内部に連結されるべき連結単位領域ＤＮＡ自身がプライマーとして働いたため生じた配列と推測される。また、Ｔ７−３−４−６−５−１−２−５−Ｅｘなる配列では、６５の間で大きな欠失が見られた。これは、単位領域ＤＮＡ６の５’側の１５番目からの配列「ｇＴＡＣｇＡＣＴ」と、単位領域ＤＮＡ５の５’側の３番目からの「ｇＴＡＣｇＡＣＴ」が同一配列であったため、それらの配列の間で組換えが起きたためと考えられる。
置換は、解析された４０２９９塩基対中９ヶ所に見られた。すなわち、置換の頻度は５０００分の１程度であり、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡ　ポリメラーゼを用いた通常のＰＣＲでの置換の頻度（Ｍａｔｔｉｌａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９，４９６７−４９７３）と比較して、２．５〜５倍高い頻度であった。しかし、この数値は進化分子工学のライブラリー構築という目的からは、充分許容できる範囲である。
本実施例におけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動において、１５本以上のラダー状のＤＮＡバンドが確認されたこと、解析したＤＮＡ配列において、大部分のものが異なった配列をもち、欠失などのフレームシフトを起こす変異が生じていなかったことなどから、６種類の単位領域を用いた場合、一度のＰＣＲで次式で表されるように、６１５≒５×１０１１種類以上のストップコドンを含まない構造遺伝子の構築が可能である。
2002026964.tif 000003
2002026964.tif 000004
（実施例２）
（１）単位領域ＤＮＡの作製
ヒトエストロゲン受容体αのリガンド結合ドメイン（以下、「ｈＥＲαＬＢＤ」と称することがある：Ｇｒｅｅｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１（４７４２），１１５０−１１５４；Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８９（６６５２），７５３−７５８）は、２５８残基のアミノ酸から構成される。このｈＥＲαＬＢＤの全領域を遺伝子のエクソン（Ｐｏｎｇｌｉｋｉｔｍｏｎｇｋｏｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ　Ｊ．，１１，３３８５−３３８８）とタンパク質の立体構造上の二次構造（Ｔａｎｅｎｂａｕｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５（１１），５９９８−６００３）の境界で１０個の単位領域領域とした。各単位領域はＮ末端側からそれぞれ、３４、３５、２９、１７、２６、３７、２４、１７、２０残基のアミノ酸をコードする（図４）ように、ｈＥＲαＬＢＤを含むプラスミドを鋳型として各単位領域ＤＮＡ断片の５’側の塩基配列と相同性を有するフォワードプライマーと３’側の塩基配列と相同性を有するリバースプライマー（ダテコンセプトに依頼して作製した）を用いたＰＣＲにより増幅して作製した（本プラスミドはシカゴ大学のＧ．Ｌ．Ｇｒｅｅｎｅ教授から分与されたものである）。
作製した単位領域はＮ末端側から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０とした。プライマーは単位領域ＤＮＡ１については、配列番号２５及び２６、単位領域ＤＮＡ２については配列番号２７及び２８、単位領域ＤＮＡ３については配列番号２９及び３０、単位領域ＤＮＡ４については、配列番号３１及び３２、単位領域ＤＮＡ５については、配列番号３３及び３４、単位領域ＤＮＡ６については、配列番号３５及び３６、単位領域ＤＮＡ７については、配列番号３７及び３８、単位領域ＤＮＡ８については、配列番号３９及び４０、単位領域ＤＮＡ９については、配列番号４１及び４２、また単位領域ＤＮＡ１０については、配列番号４３及び４４を用いた。またこれらの単位領域ＤＮＡ以外に、５’末端共通配列ＤＮＡ断片としてＴ７プロモーター配列を有するＤＮＡ断片（Ｔ７ＯＭ：配列番号４５）、及び３’末端共通配列ＤＮＡ断片（ＣＢＳＨｉｓ：配列番号４６）を化学合成により作製した（ダテコンセプト社に依頼）。この共通配列合成ＤＮＡ断片を鋳型として、各ＤＮＡ断片の５’側の塩基配列と相同性を有するフォワードプライマー（Ｔ７ＯＭ：配列番号４７；ＣＢＳＨｉｓ：配列番号４９）と３’側の塩基配列と相同性を有するリバースプライマー（ダテコンセプトに依頼して作製した）（Ｔ７ＯＭ：配列番号４８；ＣＢＳＨｉｓ：配列番号５０）を用いたＰＣＲにより増幅して共通配列ＤＮＡ断片を作製した。作製した共通配列を有するＤＮＡ断片は５’側をＴ７ＯＭ、３’側をＣＢＳＨｉｓとした。
単位領域ＤＮＡ、及び共通配列ＤＮＡ断片の作製に用いるプライマーはＰＣＲに先立ちリン酸化した。リン酸化反応液（３０μｌ）は、ＤＮＡ溶液（２０ｐｍｏｌ／μｌ）２０μｌ、１０ｍＭ　ＡＴＰ、ポリヌクレオチドリン酸キナーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）、及び添付の１０×反応緩衝液３μｌを含む。リン酸化反応は３７℃／１２時間によって行った。
リン酸化したプライマーを用いて行ったＰＣＲは、反応液（５０μｌ）としてＤＮＡ溶液（２０ｎｇ／μｌ）１μｌ、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、２．５ユニットＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、及び添付の１０×ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液５μｌを用い、反応条件が、第１段階（１サイクル）９５℃／５分、第２段階（３０サイクル）９５℃／３０秒、５６℃／３０秒、第３段階（１サイクル）４℃／１０分で行った。ＰＣＲで増幅した上記した１０個の単位領域ＤＮＡ断片、及び２個の共通配列ＤＮＡ断片はＷｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて調製し、６０μｌの滅菌水に溶解した。
（２）連結単位領域ＤＮＡの作製
上記（１）で作製した１２種類のＤＮＡ断片は以下の組み合わせでＤＮＡリガーゼにより連結させた後に、この連結単位領域ＤＮＡ断片を鋳型として第１の連結単位領域ＤＮＡの５’末端の配列と相同性を有するフォワードプライマー、及び第２の単位領域ＤＮＡの３’末端の配列と相同性を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲにより作製した。
Ｔ７ＯＭ−１、Ｔ７ＯＭ−２、Ｔ７ＯＭ−３、Ｔ７ＯＭ−４、Ｔ７ＯＭ−５、Ｔ７ＯＭ−６、Ｔ７ＯＭ−７、Ｔ７ＯＭ−８、Ｔ７ＯＭ−９、Ｔ７ＯＭ−１０、１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０、１−ＣＢＳＨｉｓ、２−３、２−４、２−５、２−６、２−７、２−８、２−９、２−１０、２−ＣＢＳＨｉｓ、３−４、３−５、３−６、３−７、３−８、３−９、３−１０、３−ＣＢＳＨｉｓ、４−５、４−６、４−７、４−８、４−９、４−１０、４−ＣＢＳＨｉｓ、５−６、５−７、５−８、５−９、５−１０、５−ＣＢＳＨｉｓ、６−７、６−８、６−９、６−１０、６−ＣＢＳＨｉｓ、７−８、７−９、７−１０、７−ＣＢＳＨｉｓ、８−９、８−１０、８−ＣＢＳＨｉｓ、９−１０、９−ＣＢＳＨｉｓ
ＤＮＡライゲースによる単位領域ＤＮＡ断片の連結のための反応液はＤＮＡ溶液（１０ｎｇ／μｌ）１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４００ユニット（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）、添付の１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液１μｌ、滅菌水６μｌを含み、反応は１６℃で１時間行った。この連結単位領域ＤＮＡ断片を鋳型としたＰＣＲの反応液（５０μｌ）は、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓ　２００μＭ、連結単位領域ＤＮＡを含む上記ＤＮＡリガーゼによる反応液１μｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）１ユニット、及び添付の１０×Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液５μｌを含む。反応条件は、第１段階（１サイクル）９５℃／５分、第２段階（３０サイクル）９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、第３段階（１サイクル）４℃／１０分により行った。
得られた上記連結単位領域ＤＮＡ断片はＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＫＩＴ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングした。クローニング手順はＫＩＴに添付されているプロトコール（ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｇ，Ｖｅｒ．Ｋ：Ｆｉｖｅ　ｍｉｎｕｔｅｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ベクターは添付のものを使用した。具体的には、まず、上記で作製した全連結単位領域ＤＮＡ断片のＰＣＲ反応液４μｌ、添付の塩溶液１μｌ、及びＰＣＲ　ＴＯＰＯ　ｖｅｃｔｏｒ　１μｌを混合し、２５℃で５分間インキュベートした。
次に２μｌの上記反応液と添付のコンピテントセル５０μｌを混合し、氷上で３０分間インキュベートした。その後４２℃で３０秒間インキュベートした後、添付のＳＯＣ培地２５０μｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。このうちの５０μｌを５０μｌ／ｍｌのアンピシリンが予め添加されているＬＢプレートに４０μｇ／ｍｌのイソプロピル−１−チオ−β−ガラクシドガラクトース（ＩＰＴＧ）を２４μｌと、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ溶液４０μｌを塗布した後、塗布した。
上記ＬＢプレートを１２時間、３７℃でインキュベートした後、プレート上に２００個程度のコロニーを確認した。青色のコロニーを各連結単位領域ＤＮＡにつき３個ずつ選択し、コロニーＰＣＲにより目的の連結単位領域がプラスミド上に含まれているかを確認した。ここで、青色のコロニーを選択した理由は、全ての単位領域ＤＮＡは３の倍数の塩基配列を有しているためｌａｃＺ遺伝子にフレームシフトを起こさせず活性に影響を及ぼさないと予想したからである。上記コロニーＰＣＲの反応液は、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＫＩＴに添付されているＭ１３プライマー、及びＭ１３Ｒｅｖ．プライマー（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製）社製）各２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓ　２００μＭ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）１ユニット、添付の１０×Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液５μｌ、及びコロニーを滅菌水に懸濁した溶液を含み、反応条件は第１段階（１サイクル）９５℃／５分、第２段階（３０サイクル）９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒、第３段階（１サイクル）４℃／１０分によりＰＣＲを行った。
このコロニーＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動により解析し、目的の連結単位領域ＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した後、生成物をＷｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製し、ＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ：ベックマンコールター社製）による塩基配列解析を行った。塩基配列を解析後、置換、挿入、欠失などの変異がないことを確認した。
ここで正しい塩基配列を有していることが確認された連結単位領域ＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、（１）に示した各連結単位領域ＤＮＡの第１の単位領域ＤＮＡの５’末端の配列と相同性を有するフォワードプライマー、及び第２の単位領域ＤＮＡの３’末端の配列と相同性を有するリバースプライマーを用いたコロニーＰＣＲにより再度連結単位領域ＤＮＡを作製した。ＰＣＲの反応液（５０μｌ）は、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓ　２００μＭ、３．７５ユニットＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、及び添付の１０×ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液５μｌを含み、反応条件は第１段階（１サイクル）９５℃／５分、第２段階（３０サイクル）９５℃／３０秒、５６℃／３０秒、第３段階（１サイクル）４℃／１０分で行った。
上記連結単位領域ＤＮＡを作製したＰＣＲ反応液から連結単位領域ＤＮＡ断片をエタノール沈殿により濃縮し、２０μｌｍの滅菌水に溶解後、低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、目的のＤＮＡのバンドを切り出した。このアガロースゲル断片からフェノール／クロロフォルムを用いてＤＮＡを抽出し、これをエタノール沈殿し、６０μｌの滅菌水に融解した。得られた各連結単位領域ＤＮＡ水溶液の濃度は２６０ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。ここで得られた連結単位領域ＤＮＡを続く変異ＤＮＡライブラリーを構築するためのＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
（３）連結単位領域ＤＮＡの分類
上記（２）で得られた全ての連結単位領域ＤＮＡはそれらがコードしている単位領域ＤＮＡによって分類した。分類は上記で作製した連結単位領域ＤＮＡの第１の単位領域ＤＮＡと第２の単位領域ＤＮＡが、それらが存在する構造遺伝子ＤＮＡにおいて何個の単位領域を隔てたものが連結されているかを指標として行った。ここで第１の単位領域ＤＮＡと第２の単位領域ＤＮＡとがそれらが存在する構造遺伝子ＤＮＡにおいて隔てている単位領域の数をＸとすると、作製した連結単位領域ＤＮＡはＸ＝０からＸ＝８の９種類に分類することができた（図５（ａ））。
（４）８個の単位領域ＤＮＡが連結された変異ＤＮＡライブラリーの構築
上記（３）で分類した連結単位領域ＤＮＡ群を鋳型として、８個の単位領域ＤＮＡが連結された変異ＤＮＡライブラリーを作製した。各連結単位領域ＤＮＡ群について、構造遺伝子を分けた連結単位領域の総数（Ｌ）を１０、単位領域の総数と作製するＤＮＡに含まれる単位領域ＤＮＡ数との差（Ｍ）を２とし、第１の単位領域ＤＮＡと第２の単位領域ＤＮＡとがそれらが存在する構造遺伝子ＤＮＡにおいて隔てている単位領域の数（Ｘ）について、下記式（１）
Ｌ−Ｘ−１ＣＭ−Ｘ　　　（１）
にあてはめて各連結単位領域ＤＮＡ群のＰＣＲに供するＤＮＡの総量に占める割合を決めた。
上記（３）の分類でＸ＝０の分類に入った連結単位領域ＤＮＡ群は３６、Ｔ７ＯＭ−１は３６、１０−ＣＢＳＨｉｓＸは３６、Ｘ＝１の連結単位領域ＤＮＡ群は８、Ｔ７ＯＭ−２は８、９−ＣＢＳＨｉｓＸは８、Ｘ＝２の連結単位領域ＤＮＡ群は１、Ｔ７ＯＭ−２は１、８−ＣＢＳＨｉｓＸは１となった。
具体的なＤＮＡ量としては、変異ＤＮＡライブラリーを作製するためのＰＣＲにはＤＮＡの総量として６７５ｆｍｏｌを用いたので、Ｘ＝０の連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量は１８０ｆｍｏｌとなり、該分類に入る連結単位領域ＤＮＡ（１−２、２−３、３−４、５−６、７−８、８−９、９−１０）を２６ｆｍｏｌずつ、Ｔ７ＯＭ−１を１８０ｆｍｏｌ、１０−ＣＢＳＨｉｓＸを１８０ｆｍｏｌ、Ｘ＝１の連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量は４０ｆｍｏｌとなるので該分類に入る連結単位領域ＤＮＡ（１−３、２−４、３−５、４−６、５−７、６−８、７−９、８−１０）を５ｆｍｏｌずつ、Ｔ７ＯＭ−２を４０ｆｍｏｌ、９−ＣＢＳＨｉｓＸを４０ｆｍｏｌ、Ｘ＝２の連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量は５ｆｍｏｌとなるので該分類に入る連結単位領域ＤＮＡ（１−４、２−５、３−６、４−７、５−８、６−９、７−１０）を０．７ｆｍｏｌずつ、Ｔ７ＯＭ−３を５ｆｍｏｌ、８−ＣＢＳＨｉｓＸを５ｆｍｏｌずつ混合してＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、プライマーとしてＴ７ＯＭのフォワードプライマーとＣＢＰＨｉｓのリバースプライマーを各２０ｐｍｏｌ、上記混合鋳型ＤＮＡを６７５ｆｍｏｌ、ｄＮＴＰｓを２００μｌ、ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を１．２５ユニット、添付の１０×ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液５μｌを含み、反応条件が第１段階（１サイクル）９５℃／５分、第２段階（２０サイクル）９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３分、第３段階（１サイクル）４℃／１０分によりＰＣＲを行った。
上記ＰＣＲ産物はエタノール沈殿により濃縮後、低融点アガロースゲル電気泳動により解析した結果、意図したとおりの分子量に相当する領域に強いＤＮＡバンドを確認することができた（図６（ａ））。
（５）５個の単位領域ＤＮＡが連結された変異ＤＮＡライブラリーの構築
上記（３）で分類した連結単位領域ＤＮＡ群を鋳型として、５個の単位領域ＤＮＡが連結された変異ＤＮＡライブラリーを作製した。各連結単位領域ＤＮＡ群について、構造遺伝子を分けた連結単位領域の総数（Ｌ）を１０、単位領域の総数と作製するＤＮＡに含まれる単位領域ＤＮＡ数との差（Ｍ）を５とし、第１の単位領域ＤＮＡと第２の単位領域ＤＮＡとがそれらが存在する構造遺伝子ＤＮＡにおいて隔てている単位領域の数（Ｘ）について、上記式（１）にあてはめて各連結単位領域ＤＮＡ群のＰＣＲに供するＤＮＡの総量に占める割合を決めた。
上記（３）の分類でＸ＝０の分類に入った連結単位領域ＤＮＡ群は１２６、Ｔ７ＯＭ−１は１２６、１０−ＣＢＳＨｉｓＸは１２６、Ｘ＝１の連結単位領域ＤＮＡ群は７０、Ｔ７ＯＭ−２は７０、９−ＣＢＳＨｉｓＸは７０、Ｘ＝２の連結単位領域ＤＮＡ群は３５、Ｔ７ＯＭ−３は３５、８−ＣＢＳＨｉｓＸは３５、Ｘ＝３の連結単位領域ＤＮＡ群は１５、Ｔ７ＯＭ−４は１５、７−ＣＢＳＨｉｓＸは１５、Ｘ＝４の連結単位領域ＤＮＡ群は５、Ｔ７ＯＭ−５は５、６−ＣＢＳＨｉｓＸは５、Ｘ＝５の連結単位領域ＤＮＡ群は１、Ｔ７ＯＭ−６は１、５−ＣＢＳＨｉｓＸは１となった。
具体的なＤＮＡ量としては、変異ＤＮＡライブラリーを作製するためのＰＣＲにはＤＮＡの総量として１２６０ｆｍｏｌを用いたので、Ｘ＝０の連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量は２１０ｆｍｏｌとなり、該分類に入る連結単位領域ＤＮＡ（１−２、２−３、３−４、５−６、７−８、８−９、９−１０）を３０ｆｍｏｌずつ、Ｔ７ＯＭ−１を２１０ｆｍｏｌ、１０−ＣＢＳＨｉｓＸを２１０ｆｍｏｌ、Ｘ＝１の連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量は１１７ｆｍｏｌとなるので該分類に入る連結単位領域ＤＮＡ（１−３、２−４、３−５、４−６、５−７、６−８、７−９、８−１０）を１４．６ｆｍｏｌずつ、Ｔ７ＯＭ−２を１１７ｆｍｏｌ、９−ＣＢＳＨｉｓＸを１１７ｆｍｏｌ、Ｘ＝２の連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量は５８ｆｍｏｌとなるので該分類に入る連結単位領域ＤＮＡ（１−４、２−５、３−６、４−７、５−８、６−９、７−１０）を８ｆｍｏｌずつ、Ｔ７ＯＭ−３を５８ｆｍｏｌ、８−ＣＢＳＨｉｓＸを５８ｆｍｏｌ、Ｘ＝３の連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量は２５ｆｍｏｌとなるので該分類に入る連結単位領域ＤＮＡ（１−５、２−６、３−７、４−８、５−９、６−１０）を４ｆｍｏｌずつ、Ｔ７ＯＭ−４を２５ｆｍｏｌ、７−ＣＢＳＨｉｓＸを２５ｆｍｏｌ、Ｘ＝４の連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量は８．３ｆｍｏｌとなるので該分類に入る連結単位領域ＤＮＡ（１−６、２−７、３−８、４−９、５−１０）を１．６ｆｍｏｌずつ、Ｔ７ＯＭ−５を８．３ｆｍｏｌ、６−ＣＢＳＨｉｓＸを８．３ｆｍｏｌ、Ｘ＝５の連結単位領域ＤＮＡ群のＤＮＡの総量は１．７ｆｍｏｌとなるので該分類に入る連結単位領域ＤＮＡ（１−７、２−８、３−９、４−１０）を０．４ｆｍｏｌずつ、Ｔ７ＯＭ−６を１．７ｆｍｏｌ、５−ＣＢＳＨｉｓＸを１．７ｆｍｏｌずつ混合してＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、プライマーとしてＴ７ＯＭのフォワードプライマーとＣＢＰＨｉｓのリバースプライマーを各２０ｐｍｏｌ、上記混合鋳型ＤＮＡを１２６０ｆｍｏｌ、ｄＮＴＰｓを２００μｌ、ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を１．２５ユニット、添付の１０×ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液５μｌを含み、反応条件が第１段階（１サイクル）９５℃／５分、第２段階（２０サイクル）９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３分、第３段階（１サイクル）４℃／１０分によりＰＣＲを行った。　上記ＰＣＲ産物はエタノール沈殿により濃縮後、低融点アガロースゲル電気泳動により解析した結果、意図したとおりの分子量に相当する領域に強いＤＮＡバンドを確認することができた。（図６（ｂ））
（６）変異ＤＮＡライブラリーの確認
上記（４）及び（５）で得られたＰＣＲ産物が意図したとおりの配列を有するか否かを調べる目的で上記低融点アガロースゲル電気泳動により得られた強いＤＮＡバンドを示す領域を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＤＮＡを抽出精製した。続いてＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用いてｄＡを３’末端に付加させた後、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＫＩＴ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて上記（２）と同様にクローニングした。この際、ＬＢプレートはＩＰＴＧとＸ−Ｇａｌを塗布していないものを用いた。
このＬＢプレートを１２時間、３７℃でインキュベートした後、プレート上に１００個以上のコロニーを確認できた。４０個以上のコロニーについて、上記（２）と同様の方法で、プラスミド内に含まれる（４）及び（５）で作製したＰＣＲ産物ＤＮＡの塩基配列を解析した。
上記（４）のＰＣＲ産物（８個の単位領域ＤＮＡが結合したもの）については、３８クローンについて塩基配列を解析した。この結果を図７に示した。また（５）のＰＣＲ産物（５個の単位領域が結合したもの）については、３３クローンについて塩基配列を解析した。この結果は図８に示した。いずれのＰＣＲでも得られたＤＮＡ断片は全て５’末端にＴ７ＯＭ配列を３’末端にはＣＢＳＨｉｓ配列を有しており、内部の単位領域ＤＮＡが構造遺伝子において上流から下流にむけての順序を保ったまま様々に連結された構造を有していた。このことは、解析した７１個のＤＮＡ断片の塩基配列中に出現した各単位領域の数が１／３９個、２／３０個、３／５２個、４／３４個、５／４０個、６／４３個、７／５６個、８／３２個、９／４３個、１０／４０個であり、用いた単位領域の出現頻度に著しい偏りがみられなかたことにより確認できた。
また、上記で解析したＤＮＡ断片のうち同じ配列を有するものは図７で示した配列中１組あるのみであった。置換については、７１クローン、４７５３３塩基のうち、置換された塩基は６０個であった。この変異率（１．３×１０−３）は充分低く、ライブラリー構築の際の障害にはならないと判断した。実際に５０箇所の置換のうち、ストップコドンがあったものは２箇所のみであった。さらに、意図せぬ領域で連結された配列が２種類存在した。１つは上記単位領域ＤＮＡ１と単位領域ＤＮＡ２の両方に共通に存在する「ａｔｇａｔｃ」での相同組換えが誘導されたことにより生じたものであった。もう１つは上記単位領域ＤＮＡ５と単位領域ＤＮＡ４両方に共通に存在する「ｃｃａｇｇｇａ」と「ｃｃａｇｔｇａ」間の相同組換えが誘導されたことにより生じたものであった。その他の配列にはフレームシフトを起こすような変異、つまり欠失や挿入は見られなかった。つまり本発明のＰＣＲによる変異ＤＮＡライブラリー中に含まれるＤＮＡの大部分は正しい読み取り枠を保っていることが示された。
図７に示した配列中には単位領域が５個連結したＤＮＡ断片が３クローン、６個連結したＤＮＡ断片が１０クローン、７個連結したＤＮＡ断片が９クローン、８個連結したＤＮＡ断片が１０クローン、９個連結したＤＮＡ断片が２クローン、１０個連結したＤＮＡ断片が１クローンであった。また、図８に示した配列中には単位領域が２個連結したＤＮＡ断片が１クローン、３個連結したＤＮＡ断片が２クローン、４個連結したＤＮＡ断片が９クローン、５個連結したＤＮＡ断片が１７クローン、６個連結したＤＮＡ断片が４クローンであった。
以上の結果は、意図した単位領域の数より多いまたは少ない数の単位領域ＤＮＡからなるＤＮＡ断片も含まれているが、目的とする数の単位領域ＤＮＡからなるＤＮＡ断片が最も多いことから、該ライブラリーを進化分子工学に適用することにより、有用なタンパク質を創出するという本発明の目的を達するに充分な変異ＤＮＡライブラリーが構築できたことを示している。
（実施例３）
Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅＰＣＲによって変異ＤＮＡライブラリーを作製した。
実施例２の（１）〜（３）及び（５）の操作と同様にして連結単位領域を混合してＰＣＲを行う際に、該ＰＣＲ反応液に塩化マンガンを０〜１ｍＭの濃度で添加した。増幅されたＤＮＡが有する塩基配列を実施例２の（６）と同様にして解析した。この結果を表２に示す。マンガンイオン濃度の増加に対して、ほぼ直線的に塩基置換の頻度が増加することが分かった。従って、任意の置換率でライブラリーを構築したい場合には、表２のデータに従ってマンガンイオンを添加すればよいことが判明した。
2002026964.tif 000005
産業上の利用の可能性
本発明の方法によれば、任意のアミノ酸配列をコードする複数のＤＮＡ断片を様々な順序と長さで連結した遺伝子の集団を構築する方法が提供され、該変異ＤＮＡライブラリーから作製される変異プロテインライブラリーにより所望のタンパク質を選択し、さらに進化分子工学を用いることにより、天然タンパク質の部品（単位領域）である二次構造、モジュール、モチーフなどを組み合わせた新しい機能をもつタンパク質を創出するのに極めて有用である。
また、本発明の選択的スプライシングライブラリーから作製される変異プロテインライブラリーからは、分子量が小型化したタンパク質を取得することができる。分子量が２万以下の比較的小さな球状タンパク質の変性は可逆的であることが知られており、一度変性しても適切な条件に戻すことによりその機能を回復することができる。また、このような性質を持つタンパク質は、リボヌクレアーゼに代表されるように、熱や有機溶媒に対する耐性が強い。またこのような酵素を用いたバイオプロセスにおける精製物の回収率も高い。本発明の選択的スプライシングライブラリーから得られる変異タンパク質は、任意のタンパク質をその機能を保持したまま小型化できるため、タンパク質としての応用性を広げるものである。
【配列表】
2002026964.tif 000006
2002026964.tif 000007
2002026964.tif 000008
2002026964.tif 000009
2002026964.tif 000010
2002026964.tif 000011
2002026964.tif 000012
2002026964.tif 000013
2002026964.tif 000014
2002026964.tif 000015
2002026964.tif 000016
2002026964.tif 000017
2002026964.tif 000018
2002026964.tif 000019
2002026964.tif 000020
2002026964.tif 000021
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の概念を示す図である。３種類の単位領域ＤＮＡをシャッフルする場合を例として示した。２つの単位領域ＤＮＡが連結した連結単位領域ＤＮＡを混合し、Ｔ７のフォワードプライマーとＥｘのリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、３種の単位領域ＤＮＡが、種々の順序で連結された多数のＤＮＡ断片が一度のＰＣＲで合成される。
図２は、ＰＣＲ産物をアガロースゲル（２％）を用いて分離した電気泳動写真である。各レーンは５０μｌのＰＣＲ産物を含む。ラダー状のＤＮＡバンドに対応する配列を右に示した。ＭはＤＮＡマーカーである。
図３は、本発明の変異ＤＮＡライブラリーの構築方法の原理を示す図である。
図４は、ヒューマンエストロゲンレセプターαのリガンド結合ドメインをエクソンと二次構造境界で分断し、１０個の単位領域に分割したことを示す構成図である。
図５は、１０個の単位領域からなる構造遺伝子から本発明の変異遺伝子ライブラリーを構築する際に用いるすべての連結単位領域ＤＮＡを示す図である。各連結単位領域ＤＮＡは、対角線に示されたように、Ｘ＝０からＸ＝８の９通りの連結単位領域ＤＮＡ群に分類できる（ａ）。ある特定の数の単位領域から構成される構造遺伝子の集団中に現れる各連結単位領域ＤＮＡ群ごとの出現頻度を示した（ｂ）。
図６は、本発明の変異ＤＮＡライブラリーを構築した際のＰＣＲ産物を分離したアガロースゲル電気泳動写真である。（ａ）、（ｂ）はそれぞれ８個、及び５個の単位領域ＤＮＡから構成される構造遺伝子の集団を構築した場合のＰＣＲ産物である。図中、Ｍはマーカーを示す。
図７は、８個の単位領域ＤＮＡから構造遺伝子を得るような条件下でＰＣＲを行い得られた本発明の変異遺伝子ライブラリーが有するＤＮＡの構造を示した図である。
図８は、５個の単位領域ＤＮＡから構造遺伝子を得るような条件下でＰＣＲを行い得られた本発明の変異遺伝子ライブラリーが有するＤＮＡの構造を示した図である。
【図１】
2002026964.tif 000022
【図２】
2002026964.tif 000023
【図３】
2002026964.tif 000024
【図４】
2002026964.tif 000025
【図５】
2002026964.tif 000026
【図６】
2002026964.tif 000027
【図７】
2002026964.tif 000028
【図８】
2002026964.tif 000029
【国際調査報告】
2002026964.tif 000030
2002026964.tif 000031
2002026964.tif 000032
2002026964.tif 000033
2002026964.tif 000034
2002026964.tif 000035
2002026964.tif 000036