(57)【要約】本発明は、芳香族基に代表されるような大きなＵＶ吸収がなく、且つ高い不斉識別能、特に水系移動相で高い不斉識別能を有する光学異性体用分離剤を提供する。すなわち、芳香族基を有しない多糖の脂肪族環状エステル誘導体を有効成分とする光学異性体用分離剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族基を有しない多糖の脂肪族環状エステル誘導体を有効成分とする光学異性体用分離剤。
【請求項２】
多糖の脂肪族環状エステル誘導体がセルロース誘導体である請求項１記載の光学異性体用分離剤。
【請求項３】
脂肪族環状エステル誘導体がシクロアルキルカルボキシレート誘導体である請求項１又は２記載の光学異性体用分離剤。
【請求項４】
クロマトグラフィー用キラル固定相として用いられる請求項１〜３のいずれか一項に記載の光学異性体用分離剤。
【請求項５】
クロマトグラフィー用キラル固定相が、逆相系条件下で用いられる液体クロマトグラフィー用キラル固定相である請求項４記載の光学異性体用分離剤。
【請求項６】
逆相系条件が、水、アルコール又はアセトニトリルの単独、あるいはこれらから選ばれる複数の液を含む混合液を移動相とする条件である請求項５記載の光学異性体用分離剤。
【請求項７】
クロマトグラフィー用キラル固定相が薄層クロマトグラフィー用固定相である請求項４記載の光学異性体用分離剤。
【請求項８】
クロマトグラフィー用キラル固定相がキャピラリー電気泳動の泳動液に添加される、あるいはキャピラリー内に充填される不斉識別剤である請求項４記載の光学異性体用分離剤。
【請求項９】
クロマトグラフィー用キラル固定相が連続式液体クロマト分取用固定相である請求項４記載の光学異性体用分離剤。
【請求項１０】
多糖の脂肪族環状エステル誘導体がセルロース  トリス（シクロヘキシルカルボキシレート）である請求項１記載の光学異性体用分離剤。
【請求項１１】
多糖の脂肪族環状エステル誘導体がセルロース  トリス（シクロペンチルカルボキシレート）またはセルロース  トリス（シクロアダマンチルカルボキシレート）である請求項１記載の光学異性体用分離剤。
【請求項１２】
芳香族基を有しない多糖の脂肪族環状エステル誘導体を有効成分として含むキラル固定相を有するクロマトグラフィーにより光学異性体を分離する方法。
【請求項１３】
多糖の脂肪族環状エステル誘導体がセルロース  トリス（シクロペンチルカルボキシレート）またはセルロース  トリス（シクロアダマンチルカルボキシレート）である請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は光学異性体用分離剤、特にクロマトグラフィー法に好適に用いられる光学異性体用分離剤に関するものであり、特に医薬品、食品、農薬、香料等の分析において、幅広いキラル化合物を、高い分離係数をもって光学分割することができる光学異性体用分離剤に関するものである。
従来の技術
多くの有機化合物には沸点、融点、溶解度といった物理的性質、化学的性質が全く同一であるが、生物の生体に及ぼす生理活性に違いのみられる光学異性体が存在する。これは生物を構成するタンパク質や糖質自身がほとんどの場合、片方の光学異性体で構成されているために他方の光学異性体に対する作用の仕方に差異が生じ、生理活性差が現れると考えられている。特に医薬品分野においては、光学異性体間で薬効、毒性の点で顕著な差が見られる場合が往々にしてある。そのため、厚生省は医薬品製造指針において、「当該薬物がラセミ体である場合には、それぞれの異性体について、吸収、分布、代謝、排泄動態を検討しておくことが望ましい。」と記載している。
先に述べたように光学異性体間では、物理的、化学的性質は全く同一であるので、通常の分離手段では分離・分析が行えない。そのため幅広い種類の光学異性体を対象として、簡便かつ精度良い分離・分析技術の研究が精力的に行われてきた。
そしてこれらの要求に応える分析手法として、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学分割法、特にＨＰＬＣ用キラルカラムによる光学分割方法（キラル固定相法）が進歩し、広く普及した。ここで言うキラルカラムとは不斉識別剤そのもの、あるいは不斉識別剤を適当な担体上に担持させたキラル固定相を充填剤としたカラムである。
不斉識別剤としては、例えば光学活性ポリメタクリル酸トリフェニルメチル（特開昭５７−１５０４３２号公報参照）、セルロース、アミロース誘導体（Ｙ．Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｋａｗａｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｈａｔａｄａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６，５３３７，１９８４）、タンパクであるオボムコイド（特開昭６３−３０７８２９号公報）等が開発されている。そして数あるこれらＨＰＬＣ用キラル固定相の中でも、セルロース、アミロース誘導体をシリカゲル上に担持させたキラル固定相は、極めて幅広い化合物に対し、高い不斉識別能を有することが知られている。近年ではＨＰＬＣ用キラル固定相と擬似移動床法を組み合わせた工業規模での光学活性体液体クロマト分取法の検討が進められており（Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，１２，４３（１９９６））、単にベースライン分離するのみならず、クロマト分取生産性を向上させるために、分取目的化合物に対してさらによく分ける、すなわちより大きな分離係数α値をもったキラル固定相が求められている。
一方、ＨＰＬＣ用キラル固定相は、水系移動相である逆相条件下で用いられるケースが多いため、有機溶剤系移動相、水系移動相の頻繁な交換は、煩雑であり分析機器のメンテナンス上不適である。また移動相の混入による誤操作にも結びつきかねず、できればどちらかの移動相系、より好ましくは水系の移動相系での分析が望まれている。さらに最近の環境問題に関連し、移動相として排出する有機溶剤を極力減らそうとする動きがある。
逆相条件下で使用されるキラル固定相は上述のタンパク質を不斉識別剤としたタイプ、また最も幅広いラセミ体化合物を分離できる多糖誘導体を不斉識別剤としたタイプなどが開発、上市されており、さらに際立った分割特性を持った不斉識別剤が望まれている。
また最近ではキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分野での光学異性体分離、あるいはＨＰＬＣよりも簡便な分離操作で光学異性体分離を行うことの可能な光学異性体分離用薄層クロマトグラフィー（キラルＴＬＣ）が高い関心を集めている。これまでにＨＰＬＣ用キラル固定相に開発上市されてきたセルロース、アミロース誘導体系キラル固定相は、アセテート誘導体を除き、ほとんどが芳香族誘導体である。この理由は多糖誘導体の置換基と溶質との間の不斉識別においてπ−π電子間の相互作用が重要な役割を果たしていると考えられてきたからであるが（有機合成化学協会誌、５４、３４４（１９９６）、特開昭６０−１４２９３０号公報）、芳香族基のような大きなＵＶ吸収基を有する置換基をもつ不斉識別剤は、例えば上述のような薄層クロマトグラフィー法、あるいは移動相に不斉識別剤を添加する液体クロマトグラフィー分離法、キャピラリー電気泳動の一種であるミセル動電クロマトグラフィー法などには適用できないという欠点があった。
その理由は一般に広く用いられているＵＶ検出器においてバックグラウンド（薄層あるいは移動相に相当）に芳香族基に代表されるような大きなＵＶ吸収があると、目的物のＵＶ吸収が相対的に小さくなり検出不可能となるためである。従って、キラルＣＥ分野、キラルＴＬＣ分野へ対応するために、高い不斉識別能を有し、かつＵＶ吸収の小さな多糖誘導体系の不斉識別剤が望まれている。
従って、本発明の課題は、芳香族基に代表されるような大きなＵＶ吸収がなく、且つ高い不斉識別能、特に水系移動相で高い不斉識別能を有する光学異性体用分離剤を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、本発明に到達した。
即ち本発明は、芳香族基を有しない多糖の脂肪族環状エステル誘導体を有効成分とする光学異性体用分離剤である。
多糖の脂肪族環状エステル誘導体は具体的にはセルロース  トリス（シクロヘキシルカルボキシレート）、セルロース  トリス（シクロペンチルカルボキシレート）またはセルロース  トリス（シクロアダマンチルカルボキシレート）である。
さらに、本発明は芳香族基を有しない多糖の脂肪族環状エステル誘導体を有効成分として含むキラル固定相を有するクロマトグラフィーにより光学異性体を分離する方法、または芳香族基を有しない多糖の脂肪族環状エステル誘導体を光学異性体分離剤として使用する用途を提供する。
発明の詳細な説明
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の芳香族基を有しない多糖の脂肪族環状エステル誘導体は、多糖と、その水酸基と反応してエステル結合を形成しうる官能基を有する脂肪族環状化合物とを反応させることにより得られる。
本発明に用いられる多糖としては、合成多糖、天然多糖及び天然物変成多糖のいずれかを問わず、光学活性であればいかなるものでもよいが、好ましくは結合様式の規則性の高いものである。例示すればβ−１，４−グルカン（セルロース）、α−１，４−グルカン（アミロース、アミロペクチン）、α−１，６−グルカン（デキストラン）、β−１，６−グルカン（ブスツラン）、β−１，３−グルカン（例えばカードラン、シゾフィラン等）、α−１，３−グルカン、β−１，２−グルカン（Ｃｒｏｗｎ  Ｇａｌｌ多糖）、β−１，４−ガラクタン、β−１，４−マンナン、α−１，６−マンナン、β−１，２−フラクタン（イヌリン）、β−２，６−フラクタン（レバン）、β−１，４−キシラン、β−１，３−キシラン、β−１，４−キトサン、α−１，４−Ｎ−アセチルキトサン（キチン）、プルラン、アガロース、アルギン酸等であり、アミロースを含有する澱粉も含まれる。これらの中では、高純度の多糖を容易に入手できるセルロース、アミロース、β−１，４−キシラン、β−１，４−キトサン、キチン、β−１，４−マンナン、イヌリン、カードラン等が好ましく、特にセルロースが好ましい。
これら多糖の数平均重合度（１分子中に含まれるピラノースあるいはフラノース環の平均数）は５以上、好ましくは１０以上であり、特に上限はないが、１０００以下であることが取り扱いの容易さの点で望ましい。
本発明に用いられる、多糖の水酸基と反応してエステル結合を形成しうる官能基を有する脂肪族環状化合物としては、芳香族基に代表される大きなＵＶ吸収を有しない脂肪族環状構造を有する酸ハライド等のエステル結合を形成しうる官能基を有する化合物であればいかなるものでも良いが、多糖誘導体骨格や置換基を規則正しく配列させる効果を持たせるためには、３員環よりも大きな、より好ましくは５員環よりも大きな脂肪族環状化合物又は橋架け構造を有した脂肪族環状化合物が望ましい。また本発明に用いられる芳香族基に代表される大きなＵＶ吸収を持たない、多糖の脂肪族環状エステル誘導体として特に好ましいのは、１グルコースユニットあたり０．１個以上のエステル結合を有する多糖のエステル誘導体、特に多糖のシクロアルキルカルボキシレートである。具体的にはシクロヘキシルカルボキシレート、シクロペンチルカルボキシレートまたはシクロアダマンチルペンチルカルボキシレートである。
本発明の芳香族基をもたない多糖の脂肪族環状エステル誘導体は、下記に記載する担体に担持させる方法、多糖誘導体自身を破砕あるいは球状粒子化する方法のどちらの方法によっても目的とする光学異性体用分離剤とすることができる。
ここで言う担持とは担体上に多糖誘導体が固定化されていることであり、その固定化方法は多糖誘導体と担体との間の物理的な吸着、担体との間の化学結合、多糖誘導体同士の化学結合、第三成分の化学結合、多糖誘導体への光照射、ラジカル反応等どのような方法でもよい。さらにここで言う担体とは、多孔質有機担体又は多孔質無機担体があげられ、好ましくは多孔質無機担体である。多孔質有機担体として適当なものは、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート等からなる高分子物質であり、多孔質無機担体として適当なものは、シリカ、アルミナ、マグネシア、ガラス、カオリン、酸化チタン、ケイ酸塩、ヒドロキシアパタイトなどである。特に好ましい担体はシリカゲルであり、シリカゲルの粒径は、好ましくは０．１μｍ〜１０ｍｍ、更に好ましくは１μｍ〜３００μｍであり、平均孔径は、好ましくは１０Å〜１００μｍ、更に好ましくは５０Å〜５００００Åである。シリカゲルの表面は残存シラノールの影響を排除するために表面処理が施されていることが望ましいが、全く表面処理が施されていなくても問題ない。
担体上への多糖の脂肪族環状エステル誘導体の担持量は、担体１００重量部に対して１〜１００重量部が好ましく、特には５〜６０重量部が好ましい。
また多糖の脂肪族環状エステル誘導体を破砕あるいは球状粒子化する方法は従来知られた公知の方法で良い。得られた破砕状あるいは球状の多糖誘導体は、そのままあるいは分級し、粒度を揃えておくことが望ましい。
本発明の光学異性体用分離剤は、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動等のクロマトグラフィー用キラル固定相として用いるのが好ましく、更に逆相系条件下、特に水、アルコール（メタノール、エタノール等）又はアセトニトリルの単独、あるいはこれらから選ばれる複数の液を含む混合液を移動相とする逆相系条件下で用いられる液体クロマトグラフィー用キラル固定相、薄層クロマトグラフィー用固定相、ミセル動電クロマトグラフィー法、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー法等のキャピラリー電気泳動の泳動液に添加される、あるいはキャピラリー内に充填される不斉識別剤、擬似移動床方式等の連続式液体クロマト分取用固定相として用いるのが好ましい。上記逆相系条件下で用いられる移動相には、ｐＨ調整剤（例えば、リン酸等）や、過塩素酸ナトリウム、６−フッ化リン酸カリウム等を添加したものも含まれる。
発明の利点
本発明により、水系移動相を用いる逆相条件下でのＨＰＬＣ用キラル固定相として、あるいはキラルＣＥ分野、キラルＴＬＣ分野等へ好適に用いられる、高い不斉識別能力を有し、かつＵＶ吸収の小さな多糖誘導体系不斉識別剤を提供することができる。
実施例
本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお以下の例における保持係数（ｋ’）、分離係数（α）は下式で定義される。
2002070123.tif 000002
この時、デッドタイムは、アセトニトリルの溶出時間をデッドタイムとした。
実施例１：セルロース  トリス（シクロヘキシルカルボキシレート）担持型充填剤及び充填カラムの作製
▲１▼  セルロース  トリス（シクロヘキシルカルボキシレート）（ａ）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）１５ｍｌに真空乾燥を行った塩化リチウム１．５ｇを溶解させ、ＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ溶液を調製した。
窒素雰囲気下、セルロース１．０ｇに上記のＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ溶液１５ｍｌ及びピリジン１５ｍｌを添加後、１００℃の油浴につけ、２４時間の撹拌を行った。これにシクロヘキシルカルボン酸クロライド（Ｃ６Ｈ１１ＣＯＣｌ）４．８ｇ（３４ｍｍｏｌ、１．８当量）を添加し、１００℃下１６時間の反応を行った。２００ｍｌのメタノール中に滴下、再沈殿させ、遠心分離により目的のエステル誘導体を得た（２．８ｇ、９３％）。表１に得られたエステル誘導体（ａ）の元素分析値を示す。
2002070123.tif 000003
▲２▼  セルロース  トリス（シクロヘキシルカルボキシレート）が担持された充填剤の作製
▲１▼で得られたエステル誘導体０．７５ｇを１０ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させ、このエステル誘導体のＴＨＦ溶液をアミノプロピルシラン処理を施したシリカゲル３．０ｇ（粒径７μｍ、細孔径１０００Å）に均一に振りかけた後、溶剤を留去させることで、セルロース  トリス（シクロヘキシルカルボキシレート）が担持された充填剤を作製した。
▲３▼  セルロース  トリス（シクロヘキシルカルボキシレート）担持充填剤を用いた充填カラムの作製
▲２▼で作製した担持型充填剤をφ０．４６ｃｍ×Ｌ２５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により加圧、充填を行い光学異性体分離カラムを作製した。
比較例１：セルロース  トリアセテート担持型充填剤及び充填カラムの作製
▲１▼  セルロース  トリアセテートの合成
窒素雰囲気下、セルロース１．０ｇに無水酢酸４０ｍｌを加え、１００℃下で３０時間の反応を行った。反応後、室温まで放冷し、５００ｍｌのメタノールに注ぎ込むことで、セルロース  トリアセテートを析出させた。グラスフィルター濾取を行い、メタノールで良く洗った後、６０℃、５時間の真空乾燥によって目的のセルロース  トリアセテートを得た（１．６９ｇ、収率９５％）。
▲２▼  セルロース  トリアセテートが担持された充填剤の作製
▲１▼で得られたセルロース  トリアセテート１．０ｇを１０ｍｌの塩化メチレンに溶解させ、これをアミノプロピルシラン処理を施したシリカゲル３．０ｇ（粒径７μｍ、細孔径１０００Å）に均一に振りかけた後、溶剤を留去させることで、セルローストリアセテートが担持された充填剤を作製した。
▲３▼  セルロース  トリアセテート担持充填剤を用いた充填カラムの作製
▲２▼で作製された担持型充填剤をφ０．４６ｃｍ×Ｌ２５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により加圧、充填を行い、比較用の光学異性体分離カラムを作製した。
比較例２：セルロース  トリベンゾエート担持型充填剤及び充填カラムの作製
▲１▼  セルロース  トリベンゾエートの合成
窒素雰囲気下、セルロース１．０ｇにピリジン４０ｍｌを加え、ここに塩化ベンゾイル６．５ｇを加え、１００℃下で３０時間の反応を行った。反応後、室温まで放冷し、５００ｍｌのメタノールに注ぎ込むことで、セルロース  トリベンゾエートを析出させた。グラスフィルター濾取を行い、メタノールで良く洗った後、６０℃、５時間の真空乾燥によって目的のセルロース  トリベンゾエートを得た（２．４９ｇ、収率８５％）。
▲２▼  セルロース  トリベンゾエートが担持された充填剤の作製
▲１▼で得られたセルロース  トリベンゾエート１．０ｇを１０ｍｌの塩化メチレンに溶解させ、これをアミノプロピルシラン処理を施したシリカゲル３．０ｇ（粒径７μｍ、細孔径１０００Å）に均一に振りかけた後、溶剤を留去させることで、セルローストリベンゾエートが担持された充填剤を作製した。
▲３▼  セルロース  トリベンゾエート担持充填剤を用いた充填カラムの作製
▲２▼で作製された担持型充填剤をφ０．４６ｃｍ×Ｌ２５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により加圧、充填を行い、比較用の光学異性体分離カラムを作製した。
応用例１
実施例１及び比較例１〜２で作製された光学異性体分離カラムを用い、下記条件の液体クロマトグラフィー法により、下記式で表されるラセミ体１及び２の不斉識別能力の評価を行った。結果を表２に示す。
＜液体クロマトグラフィー条件＞
移動相  実施例１：Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ＝２／８（ｖ／ｖ）、
比較例１及び２：ＭｅＯＨ
流速  ０．５ｍｌ／ｍｉｎ、
温度  ２５℃
2002070123.tif 000004
2002070123.tif 000005
実施例２：セルロース  トリス（シクロペンチルカルボキシレート）担持型充填剤の製造法及び充填カラムの作製法。
▲１▼  セルロース  トリス（シクロペンチルカルボキシレート）（ｄ）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）１５ｍｌに真空乾燥を行った塩化リチウム１．５ｇを溶解させＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ溶液を調製した。
窒素雰囲気下、セルロース１．０ｇに上記のＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ溶液１５ｍｌ及びピリジン１５ｍｌを添加後、１００℃の湯浴につけ、２４時間の攪拌を行った。これにシクロペンチルカルボン酸クロリド４．４ｇ（３３ｍｍｏｌ、１．８当量）を添加し１００℃下１６時間の反応を行った。反応ドープを２００ｍｌのＭｅＯＨ中に注ぎ込み、再沈殿させ、遠心分離によって目的のエステル誘導体を得た（２．５ｇ、９０％）。表３に得られた（ｄ）の元素分析値を示す。
▲２▼  セルロース  トリス（シクロペンチルカルボキシレート）が担持された充填剤の作製
▲１▼で得られたエステル誘導体１．０ｇを１０ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させた。アミノプロピルシラン処理を施したシリカゲル、３．０ｇ（粒径７μｍ、細孔径１０００Å）にセルロースエステル誘導体のＴＨＦ溶液を均一に振りかけた後、溶剤を留去させることで、セルロース  トリス（シクロペンチルカルボキシレート）が担持された充填剤を作製した。
▲３▼  セルロース  トリス（シクロペンチルカルボキシレート）担持充填剤を用いた充填カラムの作製法
▲２▼で作製された担持型充填剤をφ０．４６ｃｍ×Ｌ２５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により加圧、充填を行い光学異性体分離カラムを作製した。
実施例３：セルロース  トリス（１−アダマンチルカルボキシレート）担持型充填剤の製造法及び充填カラムの作製法。
▲１▼  セルロース  トリス（１−アダマンチルカルボキシレート）（ｅ）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）１５ｍｌに真空乾燥を行った塩化リチウム１．５ｇを溶解させＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ溶液を調製した。
窒素雰囲気下、セルロース１．０ｇに上記のＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ溶液１５ｍｌ及びピリジン１５ｍｌを添加後、１００℃の湯浴につけ、２４時間の攪拌を行った。これに１−アダマンチルカルボン酸クロリド９．２ｇ（４６ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加し１００℃下、４８時間の反応を行った。反応ドープを２００ｍｌのＭｅＯＨ中に注ぎ込み、再沈殿させ、遠心分離によって目的のエステル誘導体を得た（３．２ｇ、８０％）。表３に得られた（ｅ）の元素分析値を示す。
▲２▼  セルロース  トリス（１−アダマンチルカルボキシレート）が担持された充填剤の作製
▲１▼で得られたエステル誘導体１．０ｇを１０ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させた。アミノプロピルシラン処理を施したシリカゲル３．０ｇ（粒径７μｍ、細孔径１０００Å）にセルロースエステル誘導体のＴＨＦ溶液を均一に振りかけた後、溶剤を留去させることで、セルロース  トリス（１−アダマンチルカルボキシレート）が担持された充填剤を作製した。
▲３▼  セルロース  トリス（１−アダマンチルカルボキシレート）担持充填剤を用いた充填カラムの作製法
▲２▼で作製された担持型充填剤をφ０．４６ｃｍ×Ｌ２５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により加圧、充填を行い光学異性体分離カラムを作製した。
2002070123.tif 000006
応用例２および３
実施例２及び３で作製された光学異性体分離カラムを用い、応用例１と同様に液体クロマトグラフィー法により応用例１に使用したラセミ体１及び２の不斉識別能力の評価を行った。結果を表４に示す。
2002070123.tif 000007
分析条件：Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ＝２／８（ｖ／ｖ）、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ、温度２５℃
【国際調査報告】
2002070123.tif 000008
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