(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌に対する抗菌性を有し、ブラキバクテリウム属に属する微生物を有効成分とすることを特徴とする動物の乳頭除菌剤。
【請求項２】
前記ブラキバクテリウム属に属する微生物が、下記の菌学的性質を有する新規微生物である請求項１の動物の乳頭除菌剤。
１．形態                       ：多形性桿菌
２．グラム染色性               ：＋
３．胞子                       ：−
４．運動性                     ：−
５．酸素に対する態度           ：好気性
６．オキシダーゼ               ：−
７．カタラーゼ                 ：＋
８．集落の色調                 ：黄色系
９．抗酸性                     ：−
１０．桿状‐球状  サイクル       ：＋
１１．集落の周辺細胞の伸長       ：−
１２．細胞壁のジアミノ酸         ：メソ‐ジアミノピメリン酸
１３．グリコリル試験             ：−（アセチル型）
１４．細胞壁のアラビノ・ガラクタンポリマー：−
１５．ミコール酸                 ：−
１６．キノン系                   ：ＭＫ−７，−８
１７．菌体内ＤＮＡのＧＣ含量     ：７２ｍｏｌ％
１８．硝酸塩の還元               ：＋
１９．脱窒反応                   ：＋
２０．メチルレッド試験           ：−
２１．V−P反応                  ：−
２２．インドールの生成           ：−
２３．硫化水素の生成
ＴＳＩ寒天               ：−
酢酸鉛寒天               ：−
２４．デンプンの加水分解         ：＋
２５．クエン酸塩の利用
コーサー（Koser）の培地            ：−
クリステンセン（Christensen）の培地：−
２６．無機窒素源の利用
硝酸塩                   ：−
アンモニウム塩           ：微弱
２７．色素の生成                 ：＋(黄色系)
２８．ウレアーゼ                 ：−
２９．オキシダーゼ               ：−
３０．生育の範囲
pH                      ：６．０〜１０．０
温度                     ：９〜４２℃
３１．酸の生成
Ｄ−アラビノース         ：−
Ｌ−アラビノース         ：＋
Ｄ−キシロース           ：＋
Ｄ−グルコース           ：＋
Ｄ−マンノース           ：＋
Ｄ−フラクトース         ：＋
Ｄ−ガラクトース         ：＋
マルトース               ：＋
シュークロース           ：＋
ラクトース               ：＋
トレハロース             ：＋
Ｄ−ソルビトール         ：−
Ｄ−マンニトール         ：＋
イノシトール             ：−
グリセリン               ：＋
デンプン                 ：＋
メレチトース             ：−
Ｄ−リボース             ：−
３２．ガスの生成
Ｌ−アラビノース         ：−
Ｄ−キシロース           ：−
Ｄ−グルコース           ：−
Ｄ−マンノース           ：−
Ｄ−フラクトース         ：−
Ｄ−ガラクトース         ：−
マルトース               ：−
シュークロース           ：−
ラクトース               ：−
トレハロース             ：−
Ｄ−ソルビトール         ：−
Ｄ−マンニトール         ：−
イノシトール             ：−
グリセリン               ：−
デンプン                 ：−
【請求項３】
搾乳前の乳頭の浸漬消毒剤として用いられる請求項１または２の動物の乳頭除菌剤。
【請求項４】
布または紙により担持された請求項１または２の動物の乳頭除菌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物の乳頭除菌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳牛の乳頭消毒は、乳房炎防除の最も重要な予防対策の１つであり、英国のＤｏｄｄらが１９５２年に乳頭消毒剤を開発・実施し、我が国では昭和４０年頃より乳質改善事業の一環として使用が実施されるようになり、今日では４０％の普及率となっている。
【０００３】
現在一般に実施されている乳頭消毒は、搾乳後に乳頭を薬液に浸漬する方法（所謂ポストディッピング）であり、乳頭皮膚表面に付着する乳房炎起因菌を殺菌消毒しさらに保湿剤によりひび割れ等の乳頭皮膚の状態を改善し、乳頭表面の細菌の増殖を抑制することにより乳房炎を予防することにあり、市場では多数の製品が市販されている。
【０００４】
しかしながら、米国のｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｄａｉｒｙｉｎｇにより実施された試験において、ポストディッピング実施乳牛群の１２ヶ月間での新たな感染は５０％減少したものの、それは既に感染していた乳房の全体からみると１４％の僅かな減少でしかなかった。このことから、既存菌による亜臨床型感染が持続したことが伺えたと報告している。すなわち、このポストディッピングは、伝播性の乳房炎起因菌による新たな感染の率は減少させるけれども、いわゆる環境性乳房炎の起因菌に対する防除効果は期待できないということである。
【０００５】
上記環境性乳房炎は、乳頭皮膚に付着して先端に移行した乳房炎起因菌が、ミルカー搾乳時の乳汁逆流現象によって乳頭口を通じて乳頭槽へ侵入すること等の原因で発生する乳房炎である。
【０００６】
搾乳後の消毒（ポストディッピング）のみでは、その効果持続期間（例えば適用後１〜２時間）が比較的短く、次の搾乳までに殺菌効果が消失するため、環境性の起因菌に対しては効果に限界があった。
【０００７】
このように、搾乳後の消毒（ポストディッピング）には既存菌に対する感染への効果が期待できない問題があり、さらに環境性乳房炎に対する効果にも限界がある。
【０００８】
かかる従来の問題点を解決すべく提案された技術が、乳牛の搾乳前の乳頭の殺菌消毒（プレディッピング）である。
【０００９】
中川、古川、中島らは、プレディッピング実施農家はタオルによる洗浄を行った農家と比較して黄色ブドウ球菌、環境性連鎖球菌が有意に低く、乳質を衛生的に維持するため、プレディッピングは有効であると思われたと発表している。
【００１０】
このように、搾乳前の乳頭の浸漬消毒（以下プレディッピングと称する）は、乳房炎の予防に効果ありとの文献がある一方で、プレディッピングは搾乳前の浸漬であるので、ポストディッピング剤をプレディッピング用として使用した場合、粘稠性が高く、ヨウ素が乳頭にいつまでも付着し、それが搾乳時にミルク中に移行しヨウ素のミルク残留が問題とされた。そのためプレディッピング後の乳頭に付着した薬剤の拭き取りを充分実施する必要があるとの報告がなされている。
【００１１】
そこで、残効性（粘稠性）の低い、ヨウ素濃度の低い製品の開発が待たれた。したがって、搾乳前と後に使用するディッピング剤は、当然夫々の目的にかなった製品を使用しなければならないものの、我が国では未だプレディッピング剤として使用できる製品が存在しなかった。
【００１２】
しかし酪農家にとって乳牛の乳房炎発生は深刻な問題であり、乳房炎を予防するためにポストディッピング剤がプレディッピング用として使用され、動物用医薬品であるポストディッピング剤の用途外使用、ミルク中へのヨウ素移行などの問題が発生していると思考される。これらの問題を解決するために、プレディッピング剤として有効に使用することができ乳頭の殺菌消毒剤の出現が望まれている。
【００１３】
ところで、ブラキバクテリウム属に属する細菌としては、現在のところ下記のようなものが知られている。
Brachybacterium conglomeratum
Brachybacterium faecium
Brachybacterium nesterenkovii
Brachybacterium paraconglomeratum
Brachybacterium rhamnosum
しかしながら、これらのブラキバクテリウムについては、その産業的利用性については、全く研究がなされていないのが現状である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本願の発明者らは、ブラキバクテリウムについて鋭意研究を重ねたところ、ブラキバクテリウムは、乳房炎起因菌である黄色ブドウ球菌に対する抗菌性を持つことを知見した。
本発明の課題は、この知見に基づくものであり、上記ブラキバクテリウムを含有する動物の乳頭除菌剤を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、本発明の下記構成（１）〜（４）のいずれかにより達成することができる。
（１）  黄色ブドウ球菌に対する抗菌性を有し、ブラキバクテリウム属に属する微生物を有効成分とすることを特徴とする動物の乳頭除菌剤。
（２）  前記ブラキバクテリウム属に属する微生物が、下記の菌学的性質を有する新規微生物である上記（１）の動物の乳頭除菌剤。
１．形態                       ：多形性桿菌
２．グラム染色性               ：＋
３．胞子                       ：−
４．運動性                     ：−
５．酸素に対する態度           ：好気性
６．オキシダーゼ               ：−
７．カタラーゼ                 ：＋
８．集落の色調                 ：黄色系
９．抗酸性                     ：−
１０．桿状‐球状  サイクル       ：＋
１１．集落の周辺細胞の伸長       ：−
１２．細胞壁のジアミノ酸         ：メソ‐ジアミノピメリン酸
１３．グリコリル試験             ：−（アセチル型）
１４．細胞壁のアラビノ・ガラクタンポリマー：−
１５．ミコール酸                 ：−
１６．キノン系                   ：ＭＫ−７，−８
１７．菌体内ＤＮＡのＧＣ含量     ：７２ｍｏｌ％
１８．硝酸塩の還元               ：＋
１９．脱窒反応                   ：＋
２０．メチルレッド試験           ：−
２１．V−P反応                  ：−
２２．インドールの生成           ：−
２３．硫化水素の生成
ＴＳＩ寒天               ：−
酢酸鉛寒天               ：−
２４．デンプンの加水分解         ：＋
２５．クエン酸塩の利用
コーサー（Koser）の培地            ：−
クリステンセン（Christensen）の培地：−
２６．無機窒素源の利用
硝酸塩                   ：−
アンモニウム塩           ：微弱
２７．色素の生成                 ：＋(黄色系)
２８．ウレアーゼ                 ：−
２９．オキシダーゼ               ：−
３０．生育の範囲
pH                      ：６．０〜１０．０
温度                     ：９〜４２℃
３１．酸の生成
Ｄ−アラビノース         ：−
Ｌ−アラビノース         ：＋
Ｄ−キシロース           ：＋
Ｄ−グルコース           ：＋
Ｄ−マンノース           ：＋
Ｄ−フラクトース         ：＋
Ｄ−ガラクトース         ：＋
マルトース               ：＋
シュークロース           ：＋
ラクトース               ：＋
トレハロース             ：＋
Ｄ−ソルビトール         ：−
Ｄ−マンニトール         ：＋
イノシトール             ：−
グリセリン               ：＋
デンプン                 ：＋
メレチトース             ：−
Ｄ−リボース             ：−
３２．ガスの生成
Ｌ−アラビノース         ：−
Ｄ−キシロース           ：−
Ｄ−グルコース           ：−
Ｄ−マンノース           ：−
Ｄ−フラクトース         ：−
Ｄ−ガラクトース         ：−
マルトース               ：−
シュークロース           ：−
ラクトース               ：−
トレハロース             ：−
Ｄ−ソルビトール         ：−
Ｄ−マンニトール         ：−
イノシトール             ：−
グリセリン               ：−
デンプン                 ：−
（３）  搾乳前の乳頭の浸漬消毒剤として用いられる上記（１）または（２）の動物の乳頭除菌剤。
（４）  布または紙により担持された上記（１）または（２）の動物の乳頭除菌剤。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の乳頭除菌剤は、ブラキバクテリウム属に属する微生物を含有する。ブラキバクテリウム属に属する微生物としては、上記したすでに知られているBrachybacterium conglomeratum、Brachybacterium faecium、Brachybacterium nesterenkovii、Brachybacterium paraconglomeratum、およびBrachybacterium rhamnosumの他、下記する新規なブラキバクテリウム属に属する微生物であってよい。
この新規ブラキバクテリウムの菌学的性質の試験および分類は、下記の文献に従い行なった。
【００１７】
▲１▼  インターナショナル  ジャーナル  システマティック  バクテリオロジー（International  Journal  Systematic  Bacteriology）、第３８巻、第４５〜４８ページ  （１９８８）
▲２▼  インターナショナル  ジャーナル  システマティック  バクテリオロジー（International  Journal  Systematic  Bacteriology）、第４２巻、第７４〜７８ページ  （１９９２）
▲３▼  インターナショナル  ジャーナル  システマティック  バクテリオロジー（International  Journal  Systematic  Bacteriology）、第４６巻、第８１〜８７ページ  （１９９６）
▲４▼  インターナショナル  ジャーナル  システマティック  バクテリオロジー（International  Journal  Systematic  Bacteriology）、第４５巻、第１６０〜１６８ページ  （１９９５）
【００１８】
その結果、その微生物は、多形成を示す無芽胞のグラム陽性桿菌であることからブラキバクテリウムであると同定されたが、菌体成分の分析結果が、上記の文献に記載されているいずれの菌種とも一致せず、ブラキバクテリウムに属する新菌であることが確認された。当該微生物は、ブラキバクテリウム（Brachybacterium）菌株AAA−a（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８４８）として工業技術院生命工学工業技術研究所微生物寄託センターに寄託されている。
【００１９】
以下、このブラキバクテリウムに属する新規微生物の菌学的性質を説明する。
0003834460.tif 000002
0003834460.tif 000003
0003834460.tif 000004
【００２０】
この新規微生物は一般栄養培地であるならいかなる培地でも良好に成育する。
【００２１】
培養は、好ましくは５〜３０℃、最も好ましくは１８〜２７℃程度で良好に増殖する。
【００２２】
この新規微生物の形態的性質は下記の通りである。
（１）細胞の形及び大きさ：
▲１▼  肉汁寒天培地を用いて培養した場合
・３０℃、６時間培養では１．２〜１．４×１．５〜１．９ミクロンの多形性の短桿菌である。
・３０℃、２４時間培養では１．２〜１．４×１．２〜１．５ミクロンの球菌様を示す。
▲２▼  肉汁液体培地を用いて培養した場合
・３０℃、２４時間培養で１．０〜１．２×１．３〜１．４ミクロンの球菌様を示す。
（２）細胞の多形性：
多形性、及び、桿状−球状  サイクルを認める（図１および２を参照）。
（３）運動性は認められない。
（４）胞子の形成は認められない。
【００２３】
各培地におけるこの新規微生物の培養的性質は下記の通りである。
（１）肉汁寒天平板培地を用いて培養した場合：
・集落は平滑、全縁で光沢が認められる。
・黄色系の集落色素の生成が認められる。
（２）肉汁液体培地を用いて培養した場合：
・培地全体における生育及び沈殿が認められる。
・表面皮膜の形成は認められない。
（３）肉汁ゼラチン穿刺を用いて培養した場合：
・培地の上部に生育が認められるが、液化は認められない。
（４）リトマス・ミルクを用いて培養した場合：
・培地全体に生育が認められるが、凝固及び液化は認められない。
・酸の生成がわずかに認められる。
【００２４】
この新規微生物を含むブラキバクテリウム属に属する微生物は、ブイヨン培地等により、培養することができ、その培養液自体を乳頭除菌剤とすることができるほか、この培養液を蒸留水または生理的食塩水で希釈して、あるいは濃縮して乳頭除菌剤として用いることができる。これらの場合、グリセリン等の保湿剤を添加することもできる。さらには、上記培養液を遠心分離して、菌体のみを取り出し、それを乾燥させてパウダー状乳頭除菌剤として用いることもできる。
【００２５】
上記の乳頭除菌剤は、デッピング（プレおよびポスト共に有効である）、スプレー、塗布のような態様で、動物の乳頭に施すことができる。
【００２６】
本発明の動物の乳頭除菌剤は、黄色ブドウ球菌に対して、制菌作用をなす他、乳頭における先住菌となり、他の菌がそこに住み着くのを防止する。以上により、本発明の乳頭除菌剤は、牛等の乳房炎の予防剤としての作用をなす。
【００２７】
上記したブラキバクテリウム属に属する微生物は、牛舎等の動物の畜舎の菌環境改善にも用いることができる。
この場合には、ブラキバクテリウム属に属する微生物微生物群を担体に固定し、取扱を容易にした担体固定化微生物群として用いる。
【００２８】
微生物群を固定する担体としては、微生物の保持容量が大きく、また微生物の活性化が容易であることが好ましい。
【００２９】
担体としては、岩石（例えば、真珠岩、珪藻土）またはその粉砕物、砂利、砂、プラスチックス、セラミックス（例えば、アルミナ、シリカ、天然ゼオライト、合成ゼオライト）、タルク等も好ましく、特に、多孔質セラミックス、多孔質プラスチックスのような連続通気孔を有する多孔質材料が好ましい。例えば、真珠岩の粉砕物を高温高圧で保持し熱処理した後、急激に減圧して多孔質にした微細粉（商品名：パーライト）は、菌類を着生させる性質があるため、好適である。このような多孔質材料において、通気孔の径は、２〜１０μｍ程度であることが好ましい。また、このような担体の性状（形状）としては、塊状物、粒体、粉体、微粉末または板状物、針状物等いかなるものでもよいが、好ましくは平均粒径が２ｍｍ以下、特に５０μｍ〜１ｍｍ程度の粉粒体がよい。なお、このような担体固定化微生物群は、必要に応じて、布やネット等の通水性や通気性のよい容器に収納して使用してもよい。
【００３０】
上記担体としては、これらの他、リボン状やシート状の織布や不織布あるいは紙を用いることができる。
【００３１】
このような担体に微生物群を担持させるには、担体と本発明の微生物群分散液とを混合した後、乾燥すればよいが、担体で直接微生物群を培養してもよい。
【００３２】
担体の微生物群の担持量は、担持させるときの条件によっても異なるが、好ましくは、５個〜２００億個／ｃｍ３、更に好ましくは１０個〜１００億個／ｃｍ３である。
【００３３】
担体として、多孔質材料を用いる場合には、そのまま床に散布したり、壁や柱の塗装材中に含有させる。一方、担体として、リボン状やシート状の織布や不織布あるいは紙を用いる場合には、動物の背中等に掛ける覆い体として用いることができる。また、上記布や紙を動物の生活環境中に配置、畜舎の壁に掛けたり、床に敷いたりすることにより、動物の生活環境中でブラキバクテリウム属に属する微生物が先住菌となり、他の菌の繁殖を抑制し、動物の菌環境の改善を図ることができる。
このように動物の生活環境にブラキバクテリウム属に属する微生物を用いてた場合には、該生活環境における黄色ブドウ球菌等の病原菌の除菌に有効であり、菌環境の改善を図ることができる。また、牛舎等において、脱臭効果が確認された。
【００３４】
上記ブラキバクテリウムＡＡＡ−ａの安全性は、マウスによる下記急性毒性試験および皮膚刺激性試験により確認された。
【００３５】
急性毒性試験
１．試験概要：ブラキバクテリウムＡＡＡ−ａをブイヨン液体培地で培養し、その菌体を含む培養液のマウスに対する急性毒性試験を実施した。
２．試験方法：
（１）使用菌株：ブラキバクテリウムＡＡＡ−ａ
（２）菌液の調製：ブイヨン培地（Bacto-peptone 1％，Beef extract 0.5％，
Sodium chloride 0.5％）で３０℃、１８時間振とう培養した培養液（約１０９／ml個）を「菌液」とした。
また、培養液を遠心分離（10,000rpm，15min）して菌体を除いた液を「上澄み液」とした。
（３）試験操作：マウス（九動（株）、Hr／Kud・５週令）の雄・雌を３頭ずつ夫々次の３群に分けて、各ケージで飼育し、各個体の体重を１週間毎に測定した。
飼育環境は、室温：２５℃、湿度：約５０％で、給水給餌は自由摂取させた。＜摂水量：４〜６ｇ／日・匹、摂餌量：４〜６ｇ／日・匹＞
▲１▼対照区：水（水道水）
餌（市販固形ペレット配合飼料＊）
＊トウモロコシ：30％、魚粉：５％、大豆粕：12％、小麦粉：35％、フスマ：８％、アルファルファ：３％、酵母：３％、食塩：0.5％、ビタミンミックス1.8％、ミネラルミックス：0.2％、炭酸カルシウム：1.5％（合計：                      100％）をペレット化した餌。
▲２▼上澄み液区：水（水道水）＋「上澄み液」10％添加
餌（市販固形ペレット配合飼料）
▲３▼菌液区：水（水道水）
餌（市販固形ペレット配合飼料）＋「菌液」10％含浸・乾燥３．試験結果：図３の表１に示すように、▲１▼〜▲３▼のいずれの試験区においても、各マウスの成長および外観的にも有為な差が認められなかった。
すなわち、ブラキバクテリウムＡＡＡ−ａの菌体および培養液は本試験マウスの生育に対して、５週間の期間にわたっても影響が認められなかったことから、急性毒性は全くないと考えられる。
【００３６】
皮膚刺激性試験
１．試験概要：ブラキバクテリウムＡＡＡ−ａをブイヨン液体培地で培養し、その菌体を含む培養液のマウスに対する皮膚刺激性試験を実施した。
２．試験方法：
（１）使用菌株：ブラキバクテリウムＡＡＡ−ａ
（２）菌液の調製：ブイヨン培地（Bacto-peptone 1％，Beef extract 0.5％，          Sodium chloride 0.5％）で３０℃、１８時間振とう培養した培養液（約１０９／ml個）を「菌液」とした。
（３）試験操作：マウス（九動（株）、Hr／Kud・５週令）の雄・雌を３頭ずつ夫々次の２群に分けて、各ケージで飼育し、１日に１回、各個体の背中の左右に100μｌずつ「菌液」を塗布（対照は同様な操作で水を塗布）し、２週間にわたっての皮膚に対する刺激性を観察した。
飼育環境は、室温：２５℃、湿度：約５０％で、給水給餌は自由摂取させた。＜摂水量：４〜６ｇ／日・匹、摂餌量：４〜６ｇ／日・匹＞
▲１▼対照区：♂＜３頭：Ａ〜Ｃ＞、♀＜３頭：Ｄ〜Ｆ＞
水（水道水）
餌（市販固形ペレット配合飼料）
▲２▼菌液区：♂＜３頭：ａ〜ｃ＞、♀＜３頭：ｄ〜ｆ＞
水（水道水）
餌（市販固形ペレット配合飼料）＋「菌液」10％含浸・乾燥
３．試験結果：図４の表２に示すように、▲１▼、▲２▼のいずれの試験区においても、各マウスの皮膚および鼻、口の回りの皮膚には異常は全く認められなかった。
すなわち、ブラキバクテリウムＡＡＡ−ａの菌体および培養液は本試験マウスの皮膚に対して、２週間の期間にわたっても全く異常は認められず、皮膚刺激性は全くないと考えられる。
【００３７】
【実施例】
次に、本発明の実施例について説明する。
まず、次のような組成の培地を作成した。
【００３８】
培地
ペプトン          ５ｇ
肉エキス          ５ｇ
水            ５００ｍ１
培地のｐＨ    ６．８±０．２
以上の組成の培地にブラキバクテリウム菌株AAA−aを接種し、３０℃にて振とう培養を行った。対数期に達した培地すなわち培養液を滅菌した蒸留水にて希釈し、生菌数約１×１０８／ｍｌになるように調整し、この調整液をデッピング液として用い常法により牛の乳頭にポストデッピングを行ったところ、乳頭皮膚表面の黄色ブドウ球菌の菌数が減少した。上記の他のブラキバクテリウムについても同様の実験を行ったところ、上記新規菌株よりは機能が劣るものの、ほぼ同様の効果が得られた。
【００３９】
また、上記培養液を蒸留水にて１００倍希釈し、これを担体に付着させ、乾燥してパウダーとした。担体としては、珪藻土を焼いて粉砕したものを用いた。
【００４０】
このパウダー状のブラキバクテリウム菌株AAA−aを、牛舎に１平方メートル当たり５０ｇ程度散布した。このとき、パウダー１ｇ当たりの総菌数は、１０５個程度であった。この状態で、２４時間経過後、床の土の黄色ブドウ球菌の菌数を測定したところ、明らかに減少していた。また、脱臭効果も確認された。
【００４１】
以上から、本発明の効果が明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図面代用写真であって、本発明で用いた新規微生物の形態を示す顕微鏡写真である。
【図２】図面代用写真であって、本発明で用いた新規微生物の形態を示す顕微鏡写真である。
【図３】ブラキバクテリウム属に属する新規微生物を用いてのマウスによる急性毒性試験の結果を示す図である。
【図４】ブラキバクテリウム属に属する新規微生物を用いてのマウスによる皮膚刺激性試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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