(57)【要約】本発明は、クローン病の診断に有用な検査試薬、またクローン病の罹患の有無を簡便に精度よく検出する方法を提供する。本発明の検査試薬は、下記（ａ）または（ｂ）のクローン病抗体結合性ペプチドを有効成分とする：（ａ）配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列のいずれかから選ばれるアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチド。また本発明のクローン病の検査方法は、被験者の生体試料におけるヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅ、ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）、またはコメアレルゲンを認識する抗体の有無を検出することによって行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかであるクローン病抗体結合性ペプチド：
（ａ）配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列のいずれかから選ばれるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチド。
【請求項２】
上記（ｂ）に記載されるペプチドが、配列番号１〜４または配列番号７に示されるアミノ酸配列のいずれかを一部に含むペプチドである請求項１に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、配列番号５〜１４に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものである請求項１に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列のうち少なくともＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列を含むアミノ酸数６〜２２６ペプチドである請求項１に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、配列番号１５〜１９に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものである請求項１に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
【請求項６】
配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、配列番号２０〜３２に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものである請求項１に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
【請求項７】
配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、少なくとも配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸数７〜６０４のペプチドである請求項１に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
【請求項８】
配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、配列番号３３〜４８に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものである請求項１に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
【請求項９】
配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、少なくともＬ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは任意のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むアミノ酸数８〜１６５のペプチドである請求項１に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
【請求項１０】
分枝鎖のアミノ酸配列として、下記：
（ａ）配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列のいずれかから選ばれるアミノ酸配列からなるペプチド、または
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチド
のアミノ酸配列を、同一または異なって、一分子中に複数個有する分岐状多抗原性ペプチド。
【請求項１１】
（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、（ｉｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、及び（ｉｖ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物のうち、少なくとも２つの群の中から選択される２種以上の異なるクローン病抗体結合性ペプチドのアミノ酸配列を分枝鎖に有する、請求項１０に記載の分岐状多抗原性ペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載するクローン病抗体結合性ペプチド；請求項１０に記載する分岐状多抗原性ペプチド；及びヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥと、その他のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニットＣ、サブユニットＤ、１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットよりなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットとの複合体よりなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含有するクローン病の検査試薬。
【請求項１３】
上記のクローン病抗体結合性ペプチドが、（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、（ｉｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、及び（ｉｖ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物のうち、少なくとも２つの群の中から選択される２種以上のクローン病抗体結合性ペプチドであり、上記の分岐状多抗原性ペプチドが請求項１１に記載されるペプチドである、請求項１２に記載のクローン病の検査試薬。
【請求項１４】
請求項１２に記載の検査試薬をクローン病抗体結合用の抗原物質として含むクローン病の検査試薬キット。
【請求項１５】
抗ヒトＩｇＧ抗体、及び請求項１２に記載の検査試薬、並びに必要に応じて、検体希釈液、標識物質、支持体（固相）、抗ヒトＩｇＧ抗体希釈液、酵素基質液、及び反応停止液よりなる群から選択される少なくとも１つを含有する請求項１４に記載のクローン病の検査試薬キット。
【請求項１６】
被験者の生体試料中の、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅを認識する抗体を検出する工程を含むクローン病の検査方法。
【請求項１７】
上記抗体がヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥを認識する抗体である請求項１６に記載のクローン病の検査方法。
【請求項１８】
上記抗体が、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥと、その他のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニットＣ、サブユニットＤ、１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットよりなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットとの複合体を認識する抗体である請求項１６に記載のクローン病の検査方法。
【請求項１９】
上記抗体がヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥの１９９〜２１２位のアミノ酸領域を認識する抗体である請求項１６に記載のクローン病の検査方法。
【請求項２０】
ＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物、またはこれらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を同一または異なって一分子中に分岐状に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質として用い、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅを認識する抗体との抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出する工程を有する請求項１６に記載のクローン病の検査方法。
【請求項２１】
ＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列からなるペプチドまたはその同効物が、ＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列を含むアミノ酸数６〜２２７個からなるペプチドである請求項２０に記載のクローン病の検査方法。
【請求項２２】
ＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列からなるペプチドの同効物が、配列番号１、５〜１４に記載されるそれぞれのアミノ酸配列を有するペプチドよりなる群から選択されるものである請求項２０に記載のクローン病の検査方法。
【請求項２３】
ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥと、その他のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニットＣ、サブユニットＤ、１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットよりなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットとの複合体を抗原物質として用い、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅを認識する抗体との抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出する工程を有する請求項１６に記載のクローン病の検査方法。
【請求項２４】
被験者の生体試料中の、ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）を認識する抗体を検出する工程を含むクローン病の検査方法。
【請求項２５】
上記抗体がヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）の１２６〜１３８位のアミノ酸領域を認識する抗体である請求項２４に記載のクローン病の検査方法。
【請求項２６】
配列番号５１に記載するアミノ酸配列を有するペプチド若しくはその同効物、またはこれらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を、同一または異なって一分子中に分岐状に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質として用い、ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）を認識する抗体との抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出する工程を有する請求項２４に記載のクローン病の検査方法。
【請求項２７】
配列番号５１に記載するアミノ酸配列を有するペプチド若しくはその同効物が、配列番号５１に記載するアミノ酸配列を含むアミノ酸数７〜６０４個からなるペプチドである請求項２６に記載のクローン病の検査方法。
【請求項２８】
配列番号５１に記載するアミノ酸配列を有するペプチドの同効物が、配列番号３、２１〜３２に記載されるそれぞれのアミノ酸配列を有するペプチドよりなる群から選択されるものである請求項２６に記載のクローン病の検査方法。
【請求項２９】
被験者の生体試料中の、コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体を検出する工程を含むクローン病の検査方法。
【請求項３０】
上記コメアレルゲン蛋白質がａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙに属するものである請求項２９に記載のクローン病の検査方法。
【請求項３１】
上記コメアレルゲン蛋白質が、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ及びＲｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡＧ２よりなる群から選択される少なくとも１種である請求項２９に記載のクローン病の検査方法。
【請求項３２】
上記コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体が、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４の９９〜１１１位のアミノ酸領域を認識する抗体である請求項２９に記載のクローン病の検査方法。
【請求項３３】
上記コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体が、ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙの、Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＲＥＬのアミノ酸配列を有するアミノ酸領域を認識する抗体である請求項２９に記載のクローン病の検査方法。
【請求項３４】
Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは、同一または異なる、任意のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物、またはこれらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を、同一または異なって一分子中に分岐状に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質として用い、コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体との抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出する工程を有する請求項２９に記載のクローン病の検査方法。
【請求項３５】
Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは、同一または異なる、任意のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物が、アミノ酸配列：Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは、同一または異なる、任意のアミノ酸残基である）を含むアミノ酸数８〜１６６個からなるペプチドである請求項３４に記載のクローン病の検査方法。
【請求項３６】
Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは、同一または異なる、任意のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列からなるペプチドの同効物が、配列番号４、３３〜４８に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドよりなる群から選択されるものである請求項３４に記載のクローン病の検査方法。
【請求項３７】
請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチドの、クローン病の検査においてクローン病抗体と反応させる抗原物質としての使用。
【請求項３８】
請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチドの、クローン病の検査試薬の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、クローン病の診断に有用な検査試薬及びその有効成分に関する。また、本発明は血液などの生体試料を被験試料として用いて簡便に実施できるクローン病の検査方法に関する。
背景技術
クローン病は、免疫学的応答の異常状態に基づく局所の炎症性傷害として理解されている。従来、かかるクローン病の診断は、臨床症状、Ｘ線造影、内視鏡検査または病理学的検査等によって総合的に行われている。しかしながら、これらの方法は判別に経験と熟練した技術が必要であり、また患者に肉体的または精神的な苦痛を与えるといった欠点がある。このためクローン病を簡単に精度良く診断するための方法が求められている。
クローン病の病因は未だ不明であるが、食餌性抗原との関連も指摘されており、事実、抗パン酵母抗体や抗ブタアミラーゼ抗体等の特定の抗体がクローン病患者の血清中に特異的に増加していることが報告されている。このような知見から、最近ではクローン病の診断として、クローン病患者に特有に見られる抗体、例えば抗パン酵母抗体（松本譽之他，「炎症性腸疾患における血清ａｎｔｉ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ測定の意義」難治性炎症性腸管障害調査研究班，平成１０年報告書；Ｍａｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＪ，１９８８  Ｏｃｔ  ２９，２９７（６６５６）１１０５−６；Ｂａｒｎｅｓ  ＲＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０，９２（１）：９−１５；Ｇｉａｆｆｅｒ  ＭＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ．１９９２  Ａｕｇ，３３（８），１０７１−５；Ｓｅｎｄｉｄ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  Ｍａｒ，３（２），２１９−２６；Ｑｕｉｎｔｏｎ  ＪＦ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ．１９９８  Ｊｕｎ，４２（６）７８８−９１）、抗ブタアミラーゼ抗体（戸澤辰雄他，「クローン病患者血中抗ブタアミラーゼ抗体−ＥＬＩＳＡによる研究」難治性炎症性腸管障害調査研究班，平成１０年報告書、特開平１１−１９０７３４号公報）、抗Ｍパラチュバキュローシス由来タンパク抗体（Ｓｕｅｎａｇａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ．，１９９９，Ｊｕｎ，４４（６），１２０２−７；Ｋｒｅｕｚｐａｉｎｔｎｅｒ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ．１９９５  Ｓｅｐ，３７（３），３６１−６；Ｏｕｄｋｅｒｋ  Ｐｏｏｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，１９９５  Ａｐｒ，４８（４），３４６−５０）、抗好中球抗体（Ｔａｒｇａｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９６，Ａ５０５，１９８９）、抗小腸抗体（Ｂａｇｃｈｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ：Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，５５，４４−４８，１９８４）を検出することによってクローン病を診断する方法が提案されている。
ところで、コメアレルゲン蛋白質は、コメアレルギー患者におけるＩｇＥの主要抗原として単離され、遺伝子およびアミノ酸配列よりａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであることが知られている（Ｉｚｕｍｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９２  Ｍａｙ，１８；３０２（３），２１３−６；Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６  Ａｕｇ，６０（８），１２１５−２１））。前述するように、クローン病に特異的な自己抗原としてパン酵母やブタアミラーゼなどの食餌性抗原との関連は指摘されているものの、上記コメアレルゲン蛋白質との関連性については報告されていない。
また、液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅは、細胞内膜系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｖａｃｕｏｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ）に属するオルガネラに存在してオルガネラの内部を酸性に調整しているＨ＋ポンプであり、これが形成する酸性ｐＨが神経伝達物質やイオンの濃縮、タンパク質分解など、膜の動的な過程を含む多くの生命現象と密接に結びついていることが知られている（生化学、第６５巻、第６号、１９９３年６月、第４１３−４３６頁）。しかし、その生体内での詳細機能は十分に解明されてはいない。さらに、ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００（ＺＮＦ３００））は、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒドメインを有することから核内で遺伝子の発現制御に関与していると予測されているものの、未だ機能が不明な蛋白質である。当該ヒト核内蛋白質に関する報告はなく、唯一、そのアミノ酸配列及びその遺伝子配列がデータベースに登録されているに過ぎない（Ｇｏｕ  Ｄ．−ＭＥＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（２８−ＪＵＮ−２００１）ｔｏ  ｔｈｅ  ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）。
これらの蛋白質については、生体内での機能が解明されることによって新たな薬剤の開発や医療に応用できる可能性が期待されるものの、未だそれを示唆する報告はなく、またいずれもクローン病との関連性について報告された例もない。
発明の開示
本発明は、クローン病の罹患の有無を特異的に検出するのに有用な検査試薬、及びその有効成分を提供することを目的とする。また本発明は、被験者の生体試料を対象に簡便に実施できるクローン病の検査方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねていたところ、特定のペプチドがクローン病患者体内に特有に存在する抗体を特異的に認識して結合する性質を有することを見出し、これらのペプチドを１種、好ましくは２種以上組み合わせて用いることにより、被験者についてクローン病の罹患の有無を簡単に且つ精度よく検出することができることを確認した。さらに本発明者らは、上記研究の過程で、クローン病患者体内には、液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅ（特にそのサブユニットＥ）、コメアレルゲン蛋白質、またはヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００（ＺＮＦ３００））を認識する抗体が特異的に存在していることを見いだした。そして、これらの蛋白質がクローン病における特異的な自己抗原となっている可能性を確信し、被験者について上記抗体の有無を検出することにより、クローン病の罹患の有無を高い精度で調べることができることを確信した。
本発明はかかる種々の知見に基づいて開発されたものである：
第１に、本発明はクローン病の検査に有効に利用できる下記（１）〜（９）に掲げるクローン病抗体結合性ペプチドである：
（１）下記（ａ）または（ｂ）のいずれかであるクローン病抗体結合性ペプチド：
（ａ）配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列のいずれかから選ばれるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチド。
（２）上記（ｂ）に記載されるペプチドが、配列番号１〜４または配列番号７に示されるアミノ酸配列のいずれかを一部に含むペプチドである（１）に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、配列番号５〜１４に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものである（１）に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
（４）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、少なくともＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列を含むアミノ酸数６〜２２６ペプチドである（１）に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
（５）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、配列番号１５〜１９に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものである（１）に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
（６）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、配列番号２０〜３２に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものである（１）に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
（７）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、少なくとも配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸数７〜６０４のペプチドである（１）に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
（８）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、配列番号３３〜４８に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものである請求項１に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
（９）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが、少なくともＬ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは任意のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むアミノ酸数８〜１６５のペプチドである（１）に記載のクローン病抗体結合性ペプチド。
また、本発明のクローン病抗体結合性ペプチドは、一分子中に、上記（１）〜（９）に掲げる各ペプチドのアミノ酸配列を複数個有するものであってもよい。本発明はこのような形態のペプチドとして、下記（１０）〜（１１）に掲げる分岐状多抗原性ペプチドを提供する：
（１０）分枝鎖のアミノ酸配列として、下記：
（ａ）配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列のいずれかから選ばれるアミノ酸配列からなるペプチド、または
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチド
のアミノ酸配列を、同一または異なって、一分子中に複数個有する分岐状多抗原性ペプチド。
（１１）（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、（ｉｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、及び（ｉｖ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物のうち、少なくとも２つの群の中から選択される２種以上の異なるクローン病抗体結合性ペプチドのアミノ酸配列を分枝鎖に有する（１０）に記載の分岐状多抗原性ペプチド。
なお、ここで「同効物」とは、各々配列番号１〜４に記載されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドを意味する（下記の（１３）においても同じ）。
第２に、本発明はクローン病の診断に有効に利用できる下記（１２）〜（１５）に掲げるクローン病の検査試薬及びそれを含む試薬キットである：
（１２）上記（１）〜（９）のいずれかに記載するクローン病抗体結合性ペプチド；（１０）に記載する分岐状多抗原性ペプチド；及びヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥと、その他のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニットＣ、サブユニットＤ、１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットよりなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットとの複合体よりなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含有するクローン病の検査試薬。
（１３）上記のクローン病抗体結合性ペプチドが、（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、（ｉｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物、及び（ｉｖ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその同効物のうち、少なくとも２つの群の中から選択される２種以上の異なるクローン病抗体結合性ペプチドであり、分岐状多抗原性ペプチドが（１１）に記載されるペプチドである、（１２）に記載のクローン病の検査試薬。
（１４）（１２）または（１３）に記載の検査試薬をクローン病抗体結合用の抗原物質として含むクローン病の検査試薬キット。
（１５）抗ヒトＩｇＧ抗体、及び（１２）または（１３）に記載の検査試薬、並びに必要に応じて、検体希釈液、標識物質、支持体（固相）、抗ヒトＩｇＧ抗体希釈液、酵素基質液、及び反応停止液よりなる群から選択される少なくとも１つを含有する（１４）に記載のクローン病の検査試薬キット。
第３に、本発明は下記（Ａ）〜（Ｃ）に掲げるクローン病の検査方法である：
（Ａ）被験者の生体試料中のヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅを認識する抗体の有無を検出する工程を含むクローン病の検査方法。
上記クローン病の検査方法には、下記の態様が包含される：
（Ａ−１）  上記抗体がヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥを認識する抗体である（Ａ）記載のクローン病の検査方法。
（Ａ−２）  上記抗体がヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥと、その他のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニットＣ、サブユニットＤ、１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットよりなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットとの複合体を認識する抗体である（Ａ）記載のクローン病の検査方法。
（Ａ−３）  上記抗体がヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥの１９９〜２１２位のアミノ酸領域を認識する抗体である（Ａ）記載のクローン病の検査方法。
（Ａ−４）  ＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物、またはこれらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を同一または異なって一分子中に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質として用い、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅを認識する抗体との抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出する工程を有する（Ａ）〜（Ａ−３）のいずれかに記載のクローン病の検査方法。
（Ａ−５）  ＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物が、ＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列を含むアミノ酸数６〜２２７個からなるペプチドである（Ａ−４）に記載のクローン病の検査方法。
（Ａ−６）  ＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列からなるペプチドの同効物が、配列番号１及び５〜１４に記載されるそれぞれのアミノ酸配列を有するペプチドよりなる群から選択されるものである（Ａ−４）に記載のクローン病の検査方法。
（Ａ−７）  ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥと、その他のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニットＣ、サブユニットＤ、１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットよりなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットとの複合体によって生じる複合物を検出する工程を有する（Ａ）〜（Ａ−３）のいずれかに記載のクローン病の検査方法。
（Ｂ）被験者の生体試料中のヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）を認識する抗体の有無を検出する工程を含むクローン病の検査方法。
上記クローン病の検査方法には、下記の態様が包含される：
（Ｂ−１）  上記抗体がヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）の１２６〜１３８位のアミノ酸領域を認識する抗体である（Ｂ）記載のクローン病の検査方法。
（Ｂ−２）  配列番号５１に記載するペプチド若しくはその同効物、またはこれらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を同一または異なって一分子中に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原として用い、ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）を認識する抗体との抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出する工程を有する（Ｂ）または（Ｂ−１）に記載のクローン病の検査方法。
（Ｂ−３）  配列番号５１に記載するペプチド若しくはその同効物が、少なくとも配列番号５１に記載するアミノ酸配列を含むアミノ酸数７〜６０４個からなるペプチドである（Ｂ−２）に記載のクローン病の検査方法。
（Ｂ−４）  配列番号５１に記載するペプチドの同効物が、配列番号３、２１〜３２よりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである（Ｂ−２）に記載のクローン病の検査方法。
（Ｃ）被験者の生体試料中のコメアレルゲン蛋白質を認識する抗体の有無を検出する工程を含むクローン病の検査方法。
（Ｃ−１）  上記コメアレルゲン蛋白質がａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙに属するものである（Ｃ）記載のクローン病の検査方法。
（Ｃ−２）  上記コメアレルゲン蛋白質が、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ及びＲｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡＧ２よりなる群から選択される少なくとも１種である（Ｃ）または（Ｃ−１）に記載のクローン病の検査方法。
（Ｃ−３）  上記コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体が、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４の９９〜１１１位のアミノ酸領域を認識する抗体である（Ｃ）〜（Ｃ−２）のいずれかに記載のクローン病の検査方法。
（Ｃ−４）  上記コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体が、ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙの、Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＲＥＬのアミノ酸配列を有するアミノ酸領域を認識する抗体である（Ｃ）〜（Ｃ−３）のいずれかに記載のクローン病の検査方法。
（Ｃ−５）  Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは、同一または異なる、任意のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物、またはこれらのペプチド若しくはその同効物のアミノ酸配列を同一または異なって一分子中に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを抗原物質として用い、コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体との抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出する工程を有する（Ｃ）〜（Ｃ−４）のいずれかに記載のクローン病の検査方法。
（Ｃ−６）  Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは、同一または異なる、任意のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物が、少なくともＬ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは、同一または異なる、任意のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列を含むアミノ酸数８〜１６６個からなるペプチドである（Ｃ−５）に記載のクローン病の検査方法。
（Ｃ−７）  Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは、同一または異なる、任意のアミノ酸残基である）のアミノ酸配列からなるペプチドの同効物が、配列番号４、３３〜４８に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドよりなる群から選択されるものである（Ｃ−５）に記載のクローン病の検査方法。
更に本発明には、下記の発明が含まれる：
（ａ）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のペプチドの、クローン病の検査においてクローン病抗体と反応させる抗原物質としての使用。
（ｂ）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のペプチドの、クローン病の検査試薬の製造のための使用。
以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。また、本発明でいうペプチドには、アミノ酸数が１０個以下のオリゴペプチドおよびそれ以上のアミノ酸からなるポリペプチドがいずれも包含される。
「クローン病抗体」は、クローン病の罹患によって生体内で生成されるクローン病特有の抗体である。本発明では、原因となる抗原物質の別を問わず、またその認識如何に関わらず、クローン病患者に特異的に認められるクローン病患者特有の抗体を広く意味するものである。より詳細には、少なくとも健常者、潰瘍性大腸炎患者、その他の自己免疫疾患患者、十二指腸潰瘍患者及び胃潰瘍患者とクローン病患者とを対比した場合に、クローン病患者に特異的に認められる抗体を意味する。なお、クローン病抗体は、通常クローン病患者の血液（血清、血漿）、尿、汗、唾液、精液及び髄液等の各種の生体試料中に含まれる。
発明を実施するための最良の形態
（１）クローン病抗体結合性ペプチド
本発明が対象とする「クローン病抗体結合性ペプチド」（以下、単に「ＣＤ結合性ペプチド」ともいう）とは、クローン病抗体、すなわちクローン病患者に特異的に認められるクローン病特有の抗体に対して、特異的に結合するペプチドを意味する。
本発明のＣＤ結合性ペプチドとして、具体的には配列番号１〜４に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる（配列番号１：ＣＤ１ペプチド、配列番号２：ＣＤ２ペプチド、配列番号３：ＣＤ３ペプチド、配列番号４：ＣＤ４ペプチド）。これらはいずれもクローン病抗体に対して特異的に結合性を有することによって特徴づけられる。
さらに本発明のペプチドには、上記配列番号１〜４に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの他に、これらの各アミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つクローン病抗体に結合性を有するペプチドが包含される。本発明においては、これらのペプチドを配列番号１から４に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの「同効物」ということもある。
ここで、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチドが、配列番号１から４で示されるアミノ酸配列のいずれかからなるペプチド（ＣＤ１ペプチド、ＣＤ２ペプチド、ＣＤ３ペプチド、ＣＤ４ペプチド）と同様に、クローン病抗体に対して特異的結合性を有するといった特徴を備えた同効物であれば特に制限されない。アミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。なお、アミノ酸配列の改変（変異）方法は、当業者において良く知られたところである（例えば、サイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７−３８２（１９８７）；同１００，４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）〕などの遺伝子工学的手法、またはリン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）；同９１，３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０，１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）；同２４，２４５（１９８３）〕等が例示できる。）。
本発明は、このような改変や変異の原因及び手段などを問わず、クローン病抗体に対して特異的結合性を有する全ての改変ペプチドを包含するものである。
かかる同効物はディスプレイファージのライブラリー（ファージディスプレイライブラリー）、好ましくはランダムペプチドディスプレイファージのライブラリーを利用したスクリーニング手法を用いて取得することができる。該ファージディスプレイライブラリーを用いるスクリーニングは、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗体の認識するエピトープを同定するために使用されている公知の方法である。これらファージディスプレイライブラリーの作成方法及びインビトロスクリーニング法については、スコット及びスミスらの方法を参照することができる（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２２８−２５７（１９９３））。
当該ライブラリー中のランダムペプチドディスプレイファージは、クローン病抗体に特異的に結合するペプチドを選別し同定するために、スクリーニング対象とする多数のペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチド）をインビトロで発現するのに利用される。また、用いられるファージライブラリーは、通常この方法に用いられる公知のファージライブラリーのいずれであってもよく、例えばファージのコートタンパク質ｐＩＩＩ遺伝子にランダムなＤＮＡが挿入されて、ファージ外殻表面にランダムな１５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドが発現し得るように構築されたランダムペプチドディスプレイファージ（繊維状ファージ）を好適に例示することができる（特開平１０−２３７０９８号公報、特開平１０−２３７０９９号公報および石川大、瀧孝雄、細胞工学，１６（１２）１８２１−１８２８（１９９７）、特開２０００−２５３９００号公報）。
当該スクリーニング方法を利用して、上記ＣＤ１ペプチド（配列番号１）、ＣＤ２ペプチド（配列番号２）、ＣＤ３ペプチド（配列番号３）、及びＣＤ４ペプチド（配列番号４）の各々の同効物を取得する方法として、具体的には次の方法を挙げることができる：
まず、ファージミドベクターに、ランダムなＤＮＡ配列を挿入し、ファージの外殻表面に上記ＤＮＡ配列に対応してランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを発現し得るようにランダムペプチドディスプレイファージを構築する。これを、予めマイクロプレート等の固相表面上に抗ヒトＩｇＧ抗体を介して固定化したクローン病患者の血清抗体（ＩｇＧ）と反応させて、該クローン病患者の血清抗体と特異的に結合するファージを回収する（バイオパニング）。なお、ファージミドベクターに挿入するランダムなＤＮＡ配列は、同効物取得の対象となるペプチド（ＣＤ１ペプチド、ＣＤ２ペプチド、ＣＤ３ペプチドまたはＣＤ４ペプチド）のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸を欠失、置換または付加することによって改変したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を選択することができる。
ここで、マイクロプレート等に固定化させるクローン病患者の血清抗体（ＩｇＧ）としては、少なくとも抗原結合能を有するものであれば特に制限されず、例えばクローン病に罹患した患者から採取した血清そのものであってもよいし、また該血清をプロテインＡを用いて精製した精製抗体や、硫酸マグネシウム溶液で沈降処理することによって得られる精製抗体であってもよい。
またクローン病抗体と特異的に結合するファージの回収は、クローン病抗体とファージとの結合を阻害する能力を有する物質を、上記固定化抗体に対して作用させることによって行うことができる。すなわち、マイクロプレート上に抗ヒトＩｇＧ抗体を介して固定化されたクローン病抗体に特異的に結合しているファージは上記物質を加えることによりクローン病抗体から脱離溶出し、回収することができる。このようなスクリーニングを数回、好ましくは２〜３回程度繰り返すことによりクローン病抗体と特異的に結合するペプチドを発現し得るファージが選別できる。
ここで、クローン病抗体とファージとの結合を阻害する能力を有する物質としては、特に制限されないが、例えば酸性溶液やアルカリ性溶液、高濃度の塩、尿素、チオシアン等を挙げることができる。
次いで、上記の方法によって得られたファージを大腸菌に感染させて大量培養し、分離、精製して、クローン病抗体と特異的に結合するペプチド発現ファージを得る。かくして得られたファージは、抗ファージ抗体を介して支持体（固相）に固定化され、クローン病抗体と特異的に結合するファージをスクリーニングする操作に供される。かかるスクリーニングは、具体的には、上記方法で得られたファージを、任意の支持体に固定化した抗ファージ抗体と反応させて固定化し、該固定化ファージに対してクローン病患者の血清並びに対照血清として健常者の血清や潰瘍性大腸炎やその他の自己免疫疾患、胃潰瘍または十二指腸潰瘍などに罹患した患者の血清を反応させて、その反応性からクローン病患者の血清に特異的に反応するファージを選択することによって実施される。次いで、選択されたファージからＤＮＡを抽出単離し、その塩基配列を決定し、それに基づいてアミノ酸配列を決定することにより、選択されたファージが発現するペプチド、すなわちクローン病抗体と特異的に結合するＣＤ１ペプチド、ＣＤ２ペプチド、ＣＤ３ペプチド、またはＣＤ４ペプチドの各々の同効物（ＣＤ結合性ペプチド）を同定し、取得することができる。
なお、上記方法により抽出単離したＤＮＡの配列決定は、当業界で公知の方法により容易に行うことができ、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７４，５４６３−５４６７（１９７７）〕やマキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）〕等を挙げることができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いても容易に行うことができる。
例えば、上記の方法で得られるＣＤ１ペプチド（配列番号１）の同効物としては、表１に示すＣＤＰ−１ａペプチド（配列番号５）、ＣＤＰ−１ペプチド（配列番号６）、ＣＤ５ペプチド（配列番号７）、ＣＤＰ−５ａペプチド（配列番号８）、ＣＤＰ−５ペプチド（配列番号９）、ＶＡＴＥ−２０１ｃペプチド（配列番号１０）、ＶＡＴＥ−２０１ペプチド（配列番号１１）、ＣＤ１ｓペプチド（配列番号１２）、及びＣＤＰ−１ｓペプチド（配列番号１３）を例示することができる。なお、表１に示す各ペプチドについて、ＣＤ１ペプチドのアミノ酸配列と共通する部分を四角で囲み、また類似するアミノ酸残基を下線で示す（以下、表２〜４においても同様）。
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また、ＣＤ２ペプチド（配列番号２）の同効物としては、表２に示すＣＤＰ−２ペプチド（配列番号１５）、ＣＤ２ｓペプチド（配列番号１６）、ＣＤＰ−２ｓペプチド（配列番号１７）、ＣＤ２ｓ１ペプチド（配列番号１８）、及びＣＤＰ−２ｓ１ペプチド（配列番号１９）を例示することができる。
2002088175.tif 000003
さらに、ＣＤ３ペプチド（配列番号３）の同効物としては、表３に示すＣＤＰ−３ペプチド（配列番号２０）、ＣＤＰ３ペプチド（配列番号２１）、ＣＤＰ３−１ペプチド（配列番号２２）、ＣＤＰ３−２ペプチド（配列番号２３）、ＣＤＰ３−３ペプチド（配列番号２４）、ＣＤＰ３−４ペプチド（配列番号２５）、ＣＤＰ３−５ペプチド（配列番号２６）、ＣＤＰ３−６ペプチド（配列番号２７）、ＣＤＰ３−８ペプチド（配列番号２８）、ＣＤＰ３−１２ペプチド（配列番号２９）、ＣＤＰ３−１４ペプチド（配列番号３０）、及びＺ３００ペプチド（配列番号３１）を例示することができる。
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さらにまた、ＣＤ４ペプチド（配列番号４）の同効物としては、表４に示すＣＤＰ−４ペプチド（配列番号３３）、ＣＤＰ４ペプチド（配列番号３４）、ＣＤＰ４−１ペプチド（配列番号３５）、ＣＤＰ４−２ペプチド（配列番号３６）、ＣＤＰ４−３ペプチド（配列番号３７）、ＣＤＰ４−４ペプチド（配列番号３８）、ＣＤＰ４−１０ペプチド（配列番号３９）、ＣＤＰ４−１３ペプチド（配列番号４０）、ＣＤＰ４−１４ペプチド（配列番号４１）、及びＴＯ３９６５ペプチド（配列番号４２）を例示することができる。
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これらのＣＤ結合性ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、本発明で提供するアミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これらの各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
かくして得られる本発明のＣＤ結合性ペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
また、本発明でいうＣＤ結合性ペプチドには、クローン病抗体に対して特異的結合性を有する限り、上記各種のペプチドだけでなくこれらのペプチドのアミノ酸配列を一部に含むオリゴペプチドやポリペプチドも包含される。
このようなポリペプチドとしては、例えば、配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号７，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１６，配列番号１８，配列番号３１，または配列番号４２のいずれかに示されるアミノ酸配列を一部に有するポリペプチドを挙げることができる。また、上記配列番号のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列であって、且つクローン病抗体に結合性を有するアミノ酸配列を一部に有するポリペプチドであってもよい。
一般に抗原−抗体反応において抗体が認識するのに必要な最小のアミノ酸数は４個であると考えられている。従って、抗原性の観点からは、４以上のアミノ酸からなるペプチドである限り、そのアミノ酸数は特に制限されない。制限はされないが、通常４〜７００個のアミノ酸数を例示することができる。また、後述するように一分子中に当該ＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列を分枝鎖として複数個有する分岐状多抗原性ペプチドとして調製する場合には、当該分枝鎖のアミノ酸数として９〜１４の範囲を好適に例示することができる。
より具体的には、少なくとも配列番号１０に示されるアミノ酸配列のうちＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列を含むポリペプチドを例示することができる。配列番号１０に示されるアミノ酸配列は、ＣＤ１ペプチドの同効物であるＶＡＴＥ−２０１ｃペプチドのアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列（ＬＩＡＱＱＭ）を一部に含むポリペプチドとしては、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＡＴＥ−２０１ペプチド、液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅ（以下、「Ｖ−ＡＴＰａｓｅ」ともいう）、またはそのサブユニットＥを挙げることができる。なお、Ｖ−ＡＴＰａｓｅのアミノ酸配列のサブユニットＥのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
Ｖ−ＡＴＰａｓｅは、真核細胞の細胞内膜系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｖａｃｕｏｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ）に属するオルガネラ（ゴルジ体、リソソーム、分泌顆粒、シナプス小胞、酵母の液胞など）の内部を酸性に維持するために機能しているＨ＋ポンプである。当該Ｖ−ＡＴＰａｓｅは、サブユニットＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ、並びに１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットの９つのサブユニットから構成されることが知られている。これらの各サブユニットの一次構造は既に公知であり、またこれらのサブユニットから構成されるＶ−ＡＴＰａｓｅの構造も推定されている（生化学、第６５巻、第６号、１９９３年６月、第４１３−４３６頁）。
本発明のＣＤ結合性ペプチドには、これらのサブユニットから構成されるＶ−ＡＴＰａｓｅの全配列を有するポリペプチド（蛋白質）、並びにクローン病抗体との結合性を備える限り、Ｖ−ＡＴＰａｓｅの断片（各サブユニット及び各サブユニットの断片を含む）が含まれる。また、本発明のＣＤ結合性ペプチドには、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥと、その他のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニットＣ、サブユニットＤ、１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットよりなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットとの複合体も包含される。
Ｖ−ＡＴＰａｓｅの断片としては、サブユニットＥ（３３ｋＤａポリペプチド、アミノ酸数２２６個）、当該サブユニットＥ領域を含むポリペプチド（サブユニットＥを含む各種サブユニットの複合体を含む）、当該サブユニットＥのアミノ酸配列の２０２−２０８領域を含むアミノ酸数７〜２２６個のポリペプチド、またはサブユニットＥのアミノ酸配列の１９９−２１２領域を含むアミノ酸数１４〜２２６個のポリペプチドを挙げることができる。さらに、これらのＶ−ＡＴＰａｓｅ、並びにその断片（例えば、サブユニットＥを含む各種サブユニットの複合体、サブユニットＥまたはその一部）は、クローン病抗体に対して特異的結合性を有する限り、そのアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されていてもよい。これらの改変蛋白質は、それぞれＶ−ＡＴＰａｓｅ並びにその断片（例えばサブユニットＥ）の同効物として定義することができる。
また、ＣＤ結合性のポリペプチドとして、少なくとも配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを例示することができる。配列番号５１に示されるアミノ酸配列は、ＣＤ３ペプチドの同効物であるＺ３００ペプチドのアミノ酸配列（配列番号３１）にも該当する。当該アミノ酸配列を一部に含むポリペプチドとしては）ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００；以下、「ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）」ともいう）を挙げることができる。なお、ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）のアミノ酸配列を配列番号３２に示す。本発明のＣＤ結合性ペプチドには、クローン病抗体に対して特異的結合性を有する限り、配列番号３２に示すヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されていてもよい。かかる改変物としては、ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）のアミノ酸配列の１２９−１３５領域を含むアミノ酸数７〜６０４個のポリペプチド、またはヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）のアミノ酸配列の１２６−１３９領域を含むアミノ酸数１４〜６０４個のポリペプチドを挙げることができる。これらの改変物は、ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）の同効物として定義することができる。
さらに、ＣＤ結合性のポリペプチドとして、少なくともＬ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＥ（Ｄ）Ｌ（Ｘは任意のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを例示することができる。当該アミノ酸配列を一部に含むポリペプチドには、配列番号４、３３〜４２にそれぞれ示されるＣＤ４ペプチド及びその同効物が全て含まれる。また、当該アミノ酸配列を一部に含むポリペプチドとして、他にコメアレルゲン蛋白質のａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙに属するライス・シード・アレルゲンＲＡ１４（Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４）を挙げることができる。なお、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４のアミノ酸配列を配列番号４６に示す。
本発明のＣＤ結合性ペプチドは、クローン病抗体に対して特異的結合性を有する限り、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４（配列番号４６）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されていてもよい。かかる改変物としては、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４のアミノ酸配列（配列番号４６）の１０１−１０８領域を含むアミノ酸数８〜１６５個のポリペプチド、またはＲｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４のアミノ酸配列の９９−１１１領域を含むアミノ酸数１３〜１６５個のポリペプチドを挙げることができる。これらの改変物は、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４の同効物として定義することができる。
さらに本発明のＣＤ結合性ペプチドには、クローン病抗体に対して特異的結合性を有する限り、配列番号４２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されていてもよい改変アミノ酸配列を一部に含むポリペプチドも含まれる。かかるポリペプチドとしては、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４と同様にａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙに属するライス・アレルゲン（Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ）（配列番号４３）、ライス・シード・アレルゲンＲＡ５（Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５）（配列番号４４）、ライス・アレルゲンＲＡ５Ｂ・プレカーサー（Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）（配列番号４５）、ライス・アレルゲンＲＡ１４Ｂ・プレカーサー（Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）（配列番号４７）、及びライス・シード・アレルゲンＲＡＧ２（Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡＧ２）（配列番号４８）を挙げることができる。なお、これらのコメアレルゲン蛋白質もまた、クローン病抗体に対して特異的結合性を有する限り、そのアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されていてもよい。このようなコメアレルゲン蛋白質の同効物としては、例えば、各コメアレルゲン蛋白質の９５〜１１０位のアミノ酸領域に位置する少なくともＬ（Ｖ）ＧＧＩＹＲＥＬのアミノ酸配列（配列番号４９、５０）を保有する蛋白質を挙げることができる。具体的にはＲｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎのアミノ酸配列の９９−１０６領域を含むアミノ酸数８〜１５７個のポリペプチド、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５のアミノ酸配列の９９−１０６領域を含むアミノ酸数８〜１５７個のポリペプチド、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒのアミノ酸配列の１０２−１０９領域を含むアミノ酸数８〜１６０個のポリペプチド、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒのアミノ酸配列の１０２−１０９領域を含むアミノ酸数８〜１６６個のポリペプチド、及びＲｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡＧ２のアミノ酸配列の１０２−１０９領域を含むアミノ酸数８〜１６６個のポリペプチドを挙げることができる。これらの改変蛋白質は、それぞれＲｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、及びＲｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡＧ２の同効物として定義することができる。
以上、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ、そのサブユニットＥ（配列番号１４）及びこれらの同効物はＣＤ１ペプチドの同効物として、ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）（配列番号３２）及びその同効物はＣＤ３ペプチドの同効物として、並びにａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙに属する各種のコメアレルゲン蛋白質（配列番号４３〜４８）及びこれらの同効物はＣＤ４ペプチドの同効物として、いずれも本発明のＣＤ結合性ペプチドに包含される。
さらに本発明のＣＤ結合性ペプチドは、多抗原性ペプチド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ：以下「ＭＡＰペプチド」または「分岐状多抗原性ペプチド」もいう）形態であることもできる。このＭＡＰペプチドは、基本分子に、例えば配列番号１〜４に示されるペプチド（ＣＤ１ペプチド〜ＣＤ４ペプチド）またはこれらの同効物のアミノ酸配列が分枝鎖として、複数個、分岐状に結合した形態として特徴付けられる。上記ＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列を有する分枝鎖の数としては特に制限されないが、好ましくは２〜１６個、より好ましくは４〜１６個、さらに好ましくは８個を例示することができる。
ＭＡＰ形態を有する本発明のＣＤ結合性ペプチド（分岐状多抗原性ペプチド）の好適な一例としては、例えば基本分子（骨格）としてデンドリマー構造を有するものを挙げることができる。
デンドリマーとは、一般に樹枝状形状から星形の立体配置を有する球状乃至その他の構造の分子として知られている。該分子はまた複数個の機能基を有する枝（繰返し単位）を有することにより特徴付けられる（例えば、特表昭６０−５００２９５号公報；特開昭６３−９９２３３号公報；特開平３−２６３４３１号公報；米国特許第４５０７４６６号明細書；同第４５６８７３７号明細書；Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１７，ｐ．１１７（１９８５）；Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｎｇｌ．，２９，１３８−１７５（１９９０）；Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｒｅｓ，２５，ｐ．３２４７（１９９２）など参照）。
本発明に利用できるデンドリマーは、開始部分となる核構造、該開始核に結合した繰返し単位（枝）で構成される内部層（世代）および各枝に結合して存在する機能基よりなる外表面を有するものであれば、特に制限されない。該デンドリマーの大きさ、形態、反応性などは、開始核部分、世代数および各世代に用いられる繰返し単位を適宜選択することによって調節することができ、これらにも特に制限はない。適当な大きさなどを有するデンドリマーの製造は、後記する常法に従うことができ、また異なる大きさのデンドリマーは、利用される世代数を増やすことによって容易に得ることができる（例えば米国特許第４６９４０６４号明細書など参照）。
デンドリマー構造を有する本発明のＣＤ結合性ペプチド（分岐状多抗原性ペプチド））の一例としては、例えば窒素原子を開始核部分とし、該核部分に結合する−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２−構造からなる繰返し単位（枝）を有するデンドリマーの各枝の最外側末端にＣＤ結合性ペプチドの特定アミノ酸配列を、複数個結合させたものを挙げることができる。他の一例としては、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐなどのアミノ酸のいずれかを開始核部分とし、該核部分に直接結合する繰返し単位として同様の各アミノ酸を利用し、同様に各枝末端にＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列を結合させたものを挙げることができる。
上記窒素原子を開始核部分とするデンドリマーは、常法に従い製造できる。またその構造物（デンドリマー原料）は、市販品としても入手できる（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，４００  Ｖａｌｌｙ  Ｒｏａｄ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，１８９７６  Ｕ．Ｓ．Ａ．）。他方のアミノ酸を開始核部分とするデンドリマーは、例えば前記したペプチド合成法に従い製造することができる。また、例えばＦｍｏｃ８−Ｌｙｓ４−Ｌｙｓ２−Ｌｙｓ−βＡｌａ−Ａｌｋｏ樹脂（渡辺化学工業社製）などとして市販のデンドリマー原料を利用して製造することもできる。
より具体的には、上記デンドリマー原料は、次の如くして製造することができる。即ち、固相ペプチド合成用の樹脂に、スペーサーを介してまたは介さずに、２つのアミノ基を同一のまたは同一でない保護基で保護したα，ω−ジアミノ酸を縮合反応させ、ついで保護基を除去し、更に同様の保護α，ω−ジアミノ酸の縮合反応及び脱保護基反応を繰返す。
固相ペプチド合成用の樹脂としては、通常のペプチド合成に汎用されているものをいずれも使用することができる。その例としては、例えばポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ポリスチレンポリエチレングリコール樹脂などの末端にクロロメチル基、４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ基、４−（（α−２’，４’−ジメトキシフェニル）−９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノメチル）フェノキシ基などを有するものを挙げることができる。スペーサーとしては、１個または複数個のアミノ酸を挙げることができる。また、α，ω−ジアミノ酸としては、リジン、オルニチン、１，４−ジアミノ酪酸、１，３−ジアミノプロピオン酸などを挙げることができる。
保護基としては、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｚ基などを挙げることができる。機能基としては、アミノ基、カルボキシル基および水酸基を挙げることがきる。保護基の除去反応は、前述したペプチド合成法に従うことができる。枝の数は、繰返し単位の縮合と保護基の除去とをｎ回繰り返すことにより２ｎとなる。この枝数は、具体的には２から１６の範囲を好ましいものとして挙げることができる。
得られるデンドリマー原料の各枝末端の機能基に、ＣＤ結合性ペプチドの特定アミノ酸配列を結合させることにより、所望のＭＡＰ形態の本発明のペプチド（分岐状多抗原性ペプチド）を収得することができる。この結合反応は、前記したペプチド合成法に従うことができる。
ＭＡＰ形態の本発明ペプチド（分岐状多抗原性ペプチド）は、常法に従い、適当なマトリックス、例えばセファクリールＳ−３００（ファルマシア社製）などの樹脂を用いたクロマトグラフィー操作などにより精製することができる。
本発明の分岐状多抗原性ペプチドにおいて、各枝末端を構成するアミノ酸配列は、同一のものである必要はなく任意に異なるＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列を組合せたものであることもできる。異なるＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列の組合せ例としては、例えば、（ｉ）ＣＤ１ペプチド及びその同効物、（ｉｉ）ＣＤ２ペプチド及びその同効物、（ｉｉｉ）ＣＤ３ペプチド及びその同効物、及び（ｉｖ）ＣＤ４ペプチド及びその同効物よりなる４群のうち、少なくとも２群、好ましくは３群、より好ましくは４群の中から選択される異なる２種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上のペプチドのアミノ酸配列の組合せを例示することができる。このような複合型分岐状多抗原性ペプチドによれば、個々の被験者についてクローン病の罹患の有無をより高い精度で検出することができる。
本発明のＣＤ結合性ペプチドは、クローン病患者に特異的に認められるクローン病特有の抗体（クローン病抗体）を選択的に認識してそれと結合する性質を有するものである。よって、本発明のＣＤ結合性ペプチド及びそのアミノ酸配列を含む分岐状多抗原性ペプチドは、クローン病の罹患の有無、すなわちクローン病の検査及び診断に有効に利用することができる。
（２）クローン病の検査試薬及び試薬キット
以上のことから、本発明は上記のＣＤ結合性ペプチドまたは及びそのアミノ酸配列を含む分岐状多抗原性ペプチドを有効成分とするクローン病の検査試薬を提供する。
具体的には、本発明のクローン病の検査試薬は、有効成分として、前述する（ｉ）ＣＤ１ペプチドまたはその同効物、（ｉｉ）ＣＤ２ペプチドまたはその同効物、（ｉｉｉ）ＣＤ３ペプチドまたはその同効物、及び（ｉｖ）ＣＤ４ペプチドまたはその同効物からなる各種のＣＤ結合性ペプチドの中から選択される少なくとも１つのペプチド、または（ｉ）ＣＤ１ペプチドまたはその同効物、（ｉｉ）ＣＤ２ペプチドまたはその同効物、（ｉｉｉ）ＣＤ３ペプチドまたはその同効物、及び（ｉｖ）ＣＤ４ペプチドまたはその同効物からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドのアミノ酸配列を、同一または異なって一分子中に、分岐状に複数個有する分岐状多抗原性ペプチドを含むものである。
なお、上記のＣＤ１ペプチドの同効物には、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥと、その他のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニットＣ、サブユニットＤ、１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットよりなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットとの複合体が包含される。
ここで有効成分として用いるこれらのＣＤ結合性ペプチドまたは分岐状多抗原性ペプチドは、クローン病抗体に対するその特異的結合性を利用して、被験者の生体試料中に存在し得るクローン病抗体と結合してそれを捕捉または標識化する抗原物質としての役目を担うものである。
クローン病の検査試薬の有効成分として、上記のＣＤ結合性ペプチドは１種単独で使用されてもよいが、２種以上を任意に組み合わせて用いることもできる。精度（判定の信頼性）向上の点からは２種以上を組み合わせて使用することが好ましい。かかる組合せの態様は特に制限されないが、好ましくは（ｉ）ＣＤ１ペプチドまたはその同効物（例えば、ＣＤＰ−１ａペプチド，ＣＤＰ−１ペプチド，ＣＤ５ペプチド，ＣＤＰ−５ａペプチド，ＣＤＰ−５ペプチド，ＶＡＴＥ−２０１ｃペプチド，ＶＡＴＥ−２０１ペプチド，ＣＤ１ｓペプチド，ＣＤＰ−１ｓペプチド、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ，サブユニットＥまたはこれらの同効物）、（ｉｉ）ＣＤ２ペプチドまたはその同効物（例えば、ＣＤＰ−２ペプチド，ＣＤ２ｓペプチド，ＣＤＰ−２ｓペプチド，ＣＤ２ｓ１ペプチド，ＣＤＰ−２ｓ１ペプチドまたはこれらの同効物）、ＣＤ３ペプチドまたはその同効物（例えば、ＣＤＰ−３ペプチド，ＣＤＰ３ペプチド，ＣＤＰ３−１ペプチド，ＣＤＰ３−２ペプチド，ＣＤＰ３−３ペプチド，ＣＤＰ３−４ペプチド，ＣＤＰ３−５ペプチド，ＣＤＰ３−６ペプチド，ＣＤＰ３−８ペプチド，ＣＤＰ３−１２ペプチド，ＣＤＰ３−１４ペプチド，Ｚ３００ペプチド，ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）またはこれらの同効物）、及び（ｉｖ）ＣＤ４ペプチドまたはその同効物（例えば、ＣＤＰ−４ペプチド，ＣＤＰ４ペプチド，ＣＤＰ４−１ペプチド，ＣＤＰ４−２ペプチド，ＣＤＰ４−３ペプチド，ＣＤＰ４−４ペプチド，ＣＤＰ４−１０ペプチド，ＣＤＰ４−１３ペプチド，ＣＤＰ４−１４ペプチド，ＴＯ３９６５ペプチド，Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ，Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５，Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４，Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡＧ２またはこれらの同効物）の各群（ｉ）〜（ｉｖ）のうち、少なくとも２群、好ましくは３群、より好ましくは４群から任意に選択される２種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上のペプチドを組み合せて使用する態様である。
本発明のクローン病の検査試薬が、上記のようにＣＤ結合性ペプチドを２種以上含有する組成物の態様である場合、各ＣＤ結合性ペプチドの配合割合は特に制限されない。例えば、各ＣＤ結合性ペプチドを互いに等しい割合で配合してもよいし、またクローン病抗体に対する反応性（結合性）の弱いペプチド等を含む場合はそれを考慮して、該反応性の弱いペプチド等の配合割合が多くなるように配合することもできる。例えば、制限されないが、有効成分として、上記（ｉ）群、（ｉｉ）群、（ｉｉｉ）群及び（ｉｖ）群のそれぞれに属するＣＤ結合性ペプチドとして、（ｉ）ＣＤ１ペプチド、（ｉｉ）ＣＤ２ペプチド、（ｉｉｉ）ＣＤ３ペプチド、及び（ｉｖ）ＣＤ４ペプチドを用いる場合、これらは１：２：２：１の割合で用いることができる。
また、クローン病の検査試薬の有効成分として、上記の分岐状多抗原性ペプチドを用いる場合、当該多抗原性ペプチドは分枝を構成するアミノ酸配列は、同一種のＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列からなるものであってもよいが、２種以上の異なるＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列を含むものであってもよい。後者の場合、かかる分枝として用いるＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列の組合せの態様も特に制限されないが、上記各群（ｉ）〜（ｉｖ）のうち、少なくとも２群、好ましくは３群、より好ましくは４群から任意に選択される２種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上のＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列を組み合せて分岐鎖として使用する態様である。
本発明のクローン病の検査試薬は、クローン病抗体と特異的に結合する抗原物質として、クローン病抗体の捕捉や標識化に用いることができる。よってこの目的を逸脱しない限り、当該検査試薬は、有効成分として１種または２種以上のＣＤ結合性ペプチドまたは分岐状多抗原性ペプチドだけからなるものであってもよいし、また他の成分を含有するものであってもよい。また、クローン病抗体の標識に用いるためには、これらのＣＤ結合性ペプチドまたは分岐状多抗原性ペプチドは、任意の標識物質で標識されていることが好ましい。かかる標識に用いられる標識物質としては、当業界で用いられる通常の標識物質を広く用いることができ、特に制限されないが、具体的には３Ｈや１４Ｃ等の放射性同位元素；アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ（ＰＯＸ）、マイクロパーオキシダーゼ、キモトリプリノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、及びＰ−ナーゼなどの酵素；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光物質；並びに、その他１Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジル）−５Ｎ−（アスパルテート）−２，４−ジニトロベンゼン（ＴＯＰＡ）、染料ゾル、金属ゾル、ラテックス粒子等を例示することができる。なお、前述する本発明にかかるＣＤ結合性ペプチドまたは分岐状多抗原性ペプチドには、これらの標識化ＣＤ結合性ペプチドも包含される。
一般に、被験者の生体試料を被験試料として、クローン病の検査を行うには、ＣＤ結合性ペプチドまたは分岐状多抗原性ペプチドを有効成分とする上記の検査試薬を含む試薬キットを利用することが簡便である。ゆえに、また本発明はクローン病の検査（診断）に有効に利用できる試薬キットを提供する。
本発明のクローン病の検査試薬キットは、前述する検査試薬を、クローン病抗体と結合させる目的で含むものであれば、クローン病抗体の捕捉剤として含んでいても、またクローン病抗体の標識剤として含んでいてもよい。なお、上記の検査試薬をクローン病抗体の捕捉剤として利用する場合には、予め任意の支持体（固相）に固定化させた固定化物として用いることもできる。またクローン病抗体の標識剤として利用する場合には、前述するように任意の標識物質で標識されたＣＤ結合性ペプチドまたは多抗原性ペプチドを用いることが好ましい。
本発明の検査試薬キットに上記の検査試薬と組み合わせて用いられる他の成分は、クローン病の検査に利用される免疫学的測定方法の種類や採用される検出手段に応じて、常法に従って適宜選択して用いることができる。好ましくは、本発明の検査試薬キットには、ＣＤ結合性ペプチドまたは多抗原性ペプチドを有効成分とする上記の検出試薬以外の他の成分として、ヒトＩｇＧを検出するための二次抗体（例えば抗ヒトＩｇＧ抗体）を含めることができる。なお、当該抗ヒトＩｇＧ抗体は、前述する標識物質で標識化されていてもよいし、また予め任意の支持体（固相）に固定化されていてもよい。
また、検査試薬キットには、標識物質に応じた基質、または標識物質と基質との反応を検出するための検出試薬が含まれていてもよく、さらに測定の実施の便益のために適当な被験試料希釈液、二次抗体希釈液（例えば抗ヒトＩｇＧ抗体希釈液）、標準抗体、緩衝液、洗浄液、酵素基質液、反応停止液などが含まれていてもよい。さらに、上記の検査試薬または抗ヒトＩｇＧ抗体として、標識または固定化されていないものを使用する場合は、検査試薬キットの他に成分として、支持体（固相）や標識物質を含めることもできる。
すなわち、本発明のクローン病の検査試薬キットは、上記のＣＤ結合性ペプチドまたは分岐状多抗原性ペプチドを有効成分とする検出試薬（固定化または／及び標識されていてもよい）に、固定化または／及び標識されていてもよい抗ヒトＩｇＧ抗体、標識物質に応じた基質、抗体希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄液、基質溶解液、反応停止液、支持体（固相）、及び標識物質の中から任意に選択される少なくとも一つを組み合わせたクローン病の検査用の試薬セットである。簡便性、安全性、感度等の観点から、好ましくは酵素を標識物質として用いることが好ましい。この点から、本発明のクローン病の検査試薬キットは、上記のＣＤ結合性ペプチドまたは分岐状多抗原性ペプチドを有効成分とする検出試薬（固定化または／及び酵素標識されていてもよい）に、固定化または／及び酵素標識されていてもよい抗ヒトＩｇＧ抗体、酵素基質、抗体希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄液、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、支持体（固相）、及び酵素標識物質の中から任意に選択される少なくとも一つを組み合わせたクローン病の検査用の試薬セットであることができる。なお、酵素標識のための酵素標識物質としては、例えば、上記に加えて、マイクロパーオキシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、及びＰ−ナーゼなどを例示することができる
（３）クローン病の検査方法
さらに本発明はクローン病の検査方法を提供する。当該検査方法は、検査のための被験試料として被験者の生体試料を用いて、個々の被験者についてクローン病の罹患の有無を検出するものである。より具体的には、本発明のクローン病の検査方法は、クローン病患者の生体試料に特異的に存在する特定の抗体の存在を指標として、個々の被験者についてクローン病の罹患の有無を検出するものである。
ここで被験試料としては、被験者（ヒト）の血液（血清、血漿）、尿、汗、唾液、精液または髄液等の各種の生体試料、好ましくは血清を用いることができる。
クローン病の検査方法として、下記（３−１）〜（３−３）の３つの方法を挙げることができる。
（３−１）  後述する実施例に示すように、クローン病患者にはヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅを認識する抗体が特異的に存在している。
従って、本発明のクローン病の検査方法として、被験者の生体試料を対象として、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）を認識する抗体を検出する工程を含む方法を挙げることができる。上記の検出対象とする抗体は、好ましくはＶ−ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥを認識する抗体であり、より好ましくはＶ−ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥの１９９〜２１２位のアミノ酸領域を認識する抗体である。
これらの抗体の検出は、抗原−抗体反応を利用した従来公知の免疫学的測定方法を用いて行うことができる。具体的にはクローン病の罹患が疑われる被験者から、上記各種の生体試料、好ましくは血清を採取し、その生体試料と上記Ｖ−ＡＴＰａｓｅを認識する抗体に結合性を有する抗原物質を反応させて、抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出することによって実施することができる。
ここでＶ−ＡＴＰａｓｅを認識する抗体に結合性を有する抗原物質としては、Ｖ−ＡＴＰａｓｅを認識する抗体に特異的に結合するものであれば特に制限されない。好ましくはＶ−ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥを認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものであり、より好ましくはＶ−ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥの１９９〜２１２位のアミノ酸領域を認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものである。かかる性質を有するものとして、具体的にはＬＩＡＱＱＭのアミノ酸配列からなるペプチド及びその同効物を挙げることができる。ここで同効物には、上記アミノ酸配列（ＬＩＡＱＱＭ）において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加により改変されてなるペプチドであって、且つＶ−ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥを認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものが含まれる。かかるペプチドとしては、例えば配列番号１、５〜１５の各々に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド（ＣＤ１ペプチド、ＣＤＰ−１ａペプチド、ＣＤＰ−１ペプチド、ＣＤ５ペプチド、ＣＤＰ−５ａペプチド、ＣＤＰ−５ペプチド、ＶＡＴＥ−２０１ｃペプチド、ＶＡＴＥ−２０１ペプチド、ＣＤ１ｓペプチド、ＣＤＰ−１ｓペプチド、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ、Ｖ−ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥ）を挙げることができる。また、これらに限定されることなく、例えば上記アミノ酸配列（ＬＩＡＱＱＭ）を有するアミノ酸数６〜２２６、好ましくは６〜１４のポリペプチドを用いることもできる。
またＶ−ＡＴＰａｓｅを認識する抗体に結合性を有する抗原物質として、Ｖ−ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥと、その他のサブユニットＡ、サブユニットＢ、サブユニットＣ、サブユニットＤ、１１５ｋＤａサブユニット、３９ｋＤａサブユニット、２０ｋＤａサブユニット、及び１６ｋＤａサブユニットよりなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットとの複合体を用いることもできる。さらにまた、Ｖ−ＡＴＰａｓｅを認識する抗体に結合性を有する抗原物質として、上記のアミノ酸配列（ＬＩＡＱＱＭ）からなるペプチドまたはその同効物を、同一または異なって、一分子中に複数個含む分岐状多抗原性ペプチドを用いることもできる。
（３−２）  また後述する実施例６に示すように、クローン病患者にはヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００（ＨＺＦ３００））を認識する抗体が特異的に存在している。
従って、本発明のクローン病の検査方法として、被験者の生体試料を対象として、ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）を認識する抗体を検出する工程を含む方法を挙げることができる。上記の検出対象とする抗体は、好ましくはヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）の１２６〜１３８位のアミノ酸領域を認識する抗体である。
これらの抗体の検出は、抗原−抗体反応を利用した従来公知の免疫学的測定方法を用いて行うことができる。具体的にはクローン病の罹患が疑われる被験者から、上記各種の生体試料、好ましくは血清を採取し、その生体試料と上記ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）を認識する抗体に結合性を有する抗原物質を反応させて、抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出することによって実施することができる。
ここで上記ヒト核内蛋白質を認識する抗体に結合性を有する抗原物質としては、当該ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）を認識する抗体に特異的に結合するものであれば特に制限されない。好ましくはヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）の１２６〜１３８位のアミノ酸領域を認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものである。かかる性質を有するものとして、具体的には配列番号５１に記載するアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその同効物を挙げることができる。ここで同効物には、配列番号５１において１又は複数個のアミノ酸が付加してなるペプチドまたは蛋白質であって、且つヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）を認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものが含まれる。かかるペプチドとしては、例えば配列番号３及び２０〜３２の各々に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド（ＣＤ３ペプチド、ＣＤＰ−３ペプチド、ＣＤＰ３−１ペプチド、ＣＤＰ３−２ペプチド、ＣＤＰ３−３ペプチド、ＣＤＰ３−４ペプチド、ＣＤＰ３−５ペプチド、ＣＤＰ３−６ペプチド、ＣＤＰ３−８ペプチド、ＣＤＰ３−１２ペプチド、ＣＤＰ３−１４ペプチド、Ｚ３００ペプチド、ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００））を挙げることができる。また、これらに限定されることなく、例えば配列番号５１に記載するアミノ酸配列を一部に有するアミノ酸数７〜６０４のポリペプチドを用いることもできる。
さらにヒトヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）を認識する抗体に結合性を有する抗原物質として、上記の配列番号５１に記載するアミノ酸配列からなるペプチドまたはその同効物を、同一または異なって一分子中に複数個含む分岐状多抗原性ペプチドを用いることもできる。
（３−３）  また後述する実施例７に示すように、クローン病患者にはコメアレルゲン蛋白質を認識する抗体が特異的に存在している。
従って、本発明のクローン病の検査方法として、被験者の生体試料を対象として、コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体を検出する工程を含む方法を挙げることができる。なお、ここでコメアレルゲン蛋白質としては、α−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙに属するものを挙げることができ、具体的にはＲｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ（１５８ａａ）、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５（１５７ａａ）、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（１６０ａａ）、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４（１６５ａａ）、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（１６６ａａ）、及びＲｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡＧ２（１６６ａａ）を例示することができる。上記の検出対象とする抗体は、好ましくはこれらの各種のコメアレルゲン蛋白質の９５〜１１０位のアミノ酸領域に位置する少なくともＬ（又はＶ）ＧＧＩＹＲＥＬのアミノ酸配列を認識する抗体である。
これらの抗体の検出は、抗原−抗体反応を利用した従来公知の免疫学的測定方法を用いて行うことができる。具体的にはクローン病の罹患が疑われる被験者から、上記各種の生体試料、好ましくは血清を採取し、その生体試料と上記コメアレルゲン蛋白質を認識する抗体に結合性を有する抗原物質を反応させて、抗原−抗体反応によって生じる複合物を検出することによって実施することができる。
ここで上記ヒト核内蛋白質を認識する抗体に結合性を有する抗原物質としては、当該コメアレルゲン蛋白質（α−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）のｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙに属する蛋白質を認識する抗体に特異的に結合するものであれば特に制限されない。好ましくは各種のコメアレルゲン蛋白質の９５〜１１０位のアミノ酸領域に位置する少なくともＬ（又はＶ）ＧＧＩＹＲＥＬのアミノ酸配列（配列番号４９、５０）を認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものである。
かかる性質を有するものとして、具体的にはＬ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは任意のアミノ酸残基）のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその同効物を挙げることができる。ここで同効物には、上記Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは任意のアミノ酸残基）のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が付加してなるペプチドであって、且つコメアレルゲン蛋白質を認識する抗体に特異的に結合する性質を有するものが含まれる。かかるペプチドとしては、例えば配列番号４及び３３〜４８の各々に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド（ＣＤ４ペプチド、ＣＤＰ−４ペプチド、ＣＤＰ４−１ペプチド、ＣＤＰ４−２ペプチド、ＣＤＰ４−３ペプチド、ＣＤＰ４−４ペプチド、ＣＤＰ４−１０ペプチド、ＣＤＰ４−１３ペプチド、ＣＤＰ４−１４ペプチド、ＴＯ３９６５ペプチド、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、及びＲｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡＧ２）を挙げることができる。また、これらに限定されることなく、Ｌ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは任意のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を有するアミノ酸数８〜１６６、好ましくはアミノ酸数８〜１４のポリペプチドを用いることもできる。
さらにコメアレルゲン蛋白質を認識する抗体に結合性を有する抗原物質として、上記のＬ（Ｖ）ＧＧＩＹＸＤ（Ｅ）Ｌ（Ｘは任意のアミノ酸残基）のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその同効物を、同一または異なって一分子中に複数個含む分岐状多抗原性ペプチドを用いることもできる。
このような抗原物質とクローン病患者に特有の抗体との反応によって生じる抗原−抗体複合物の検出方法に関しては、特に制限されることはなく、慣用の方法を広く採用することができる。具体的には抗原物質として上記の各種のＣＤ結合性ペプチドまたはそれを含む分岐状多抗原性ペプチドを利用する各種の免疫測定法が好適に例示できる。例えば、ヒト血清を被験試料とする固相化サンドイッチ法を例にすると、目的抗体は、例えば以下の方法で測定することができる。
まず抗原物質として用いる上記ペプチドを固相化しておき（以下、これを便宜上「固相化ペプチド」という）、これに被験試料としての生体試料（例えば血清検体）を加える。その結果、固相化ペプチドと被験試料中のクローン病患者特有の抗体との間で抗原−抗体反応が起こり、被験試料中に存在する目的抗体は固相化ペプチドに結合する。次に結合した目的抗体の有無及びその抗体量（力量）を、ヒト抗体（ＩｇＧ）検出試薬を用いて検出することにより、被験試料中、すなわち被験者の生体試料（血清など）中に存在する目的抗体を検出し定量することができる。
また、上記において、ヒト抗体（ＩｇＧ）検出試薬を予め固相化し、これに被験試料を添加して生体試料中の目的抗体を捕捉させ、次いでこれに上記抗原物質を加えて、目的抗体に結合させることにより、被験試料中に存在する目的のクローン病患者特有の抗体を検出し、その抗体量（力量）を測定することもできる。また、目的抗体に結合した抗原物質にさらに該抗原物質の特異抗体を結合させることにより、該抗体を指標としてクローン病患者特有の抗体が検出でき、その抗体量（力量）を測定することもできる。これら測定手法における各種手段の選択やそれらの改変などはいずれも当業者のよく知るところであり、本発明においてはそれら各手法をいずれも採用することができる〔「臨床検査法提要」、金原出版、１９９５年等参照〕。
ここで、クローン病抗体を検出するためのヒト抗体（ＩｇＧ）検出試薬は、特に制限されることなく一般に使用されている各種の試薬を利用することができる。例えば、好適にはヒトＩｇＧに特異的に結合する抗ヒトＩｇＧ抗体などが使用できる。これらは市販品として入手できるが、常法に従い調製することもできる。
また、これらのヒト抗体（ＩｇＧ）検出試薬を指標として、目的とする抗体を検出する場合は、当該ヒト抗体（ＩｇＧ）検出試薬は標識されていることが好ましい。かかる標識に用いられる標識物質としては、具体的には３Ｈや１４Ｃ等の放射性同位元素、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼ（ＰＯＸ）などの酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光物質、並びに、その他１Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジル）−５Ｎ−（アスパルテート）−２，４−ジニトロベンゼン（ＴＯＰＡ）、染料ゾル、金属ゾル、ラテックス粒子等が例示される。なお、これらの標識物質で標識された検出試薬を用いた免疫測定法は、それぞれラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、フルオロイムノアッセイ、スピンイムノアッセイ、フロースルーアッセイ及びイムノクロマトアッセイと称される。
本発明においては、簡便性、安全性、感度等の観点から、好ましくは酵素を標識物質として用いるエンザイムイムノアッセイが採用される。酵素標識のための酵素標識物質としては、例えば、上記に加えて、マイクロパーオキシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、及びＰ−ナーゼなどを例示することができる。なお、これらの標識物質による標識方法は、自体公知の方法に従って行うことができる（「単クローン抗体」岩崎辰夫  他著、講談社サイエンティフィク、１９８４；「酵素免疫測定法」第２版、石川栄治  他著、医学書院、１９８２年など）。
また、抗原物質（ＣＤ結合性ペプチド又はそのアミノ酸配列を含む分岐状多抗原性ペプチド）を指標として目的抗体を検出し測定する場合は、抗原物質として標識されたペプチドを用いることが好ましい。かかる抗原物質の標識も、上記抗ヒトＩｇＧ抗体の標識と同様にして、常法に従って任意の標識物質で用いて行うことができる。
また、上記測定方法において、固相法を採用する場合、目的抗体を捕捉する目的で、予め抗原物質或いは抗ヒトＩｇＧ抗体を支持体（固相）に固定化して用いてもよい。ここで支持体としては不溶性、不活性担体であれば特に制限されず、通常使用されるものが広く用いられる。例えば、ガラス、セルロース粉末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体などの種々の素材からなるスティック、ビーズ、マイクロプレート、試験管等が広く用いられる。
抗原物質或いは抗ヒトＩｇＧ抗体の固相への固定化方法についても特に制限はなく、物理的結合及び化学的結合のいずれをも使用することができる。具体的には、例えば共有結合法としてジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体、カルボキシクロライド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法等）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（架橋試薬としてグルタールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナートなどを用いる。）、Ｕｇｉ反応による担体結合法などの化学的反応：或いはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法：ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法等が例示できる。
上記の測定系において使用される溶媒としては、反応に悪影響を与えないものであれば一般的に使用されるもののいずれをも用いることができる。具体的にはクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などのｐＨが約５〜９程度の緩衝液が例示される。
免疫反応（抗原−抗体反応）条件も特に制限はなく、一般にこの種の測定法で用いられる通常の条件が採用される。一般には４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃程度の温度条件下に、１〜４０時間程度を要して反応を行うことができる。
抗原−抗体反応によって生じる抗原−抗体複合物の測定は、使用する標識物質の種類に応じて慣用方法に従って行うことができる。
例えば、標識物質として酵素を利用する場合、当該酵素の活性を測定することによって行うことができる。酵素活性の測定は、使用する酵素の種類に応じて公知の方法に従って行うことができ、例えば標識酵素としてパーオキシダーゼを用いる場合は基質としてＡＢＴＳＪ２，２’−アジノービ（３’エチルベンツチアゾリンスルホン酸）を用い、またアルカリホスファターゼを用いる場合は基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて、それぞれインキュベートし、各基質の分解を分光光度計等を用いて測定する方法等が挙げられる（「酵素免疫測定法」第２版、石川栄治  他著、医学書院、１９８２年等参考）。なお、上記酵素標識の代わりに、放射性同位元素や蛍光物質による標識体を用いる場合も、自体公知の方法に従って測定することができる。
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１  クローン病抗体結合性ペプチドの選別及びその同定
（１）ファージディスプレイライブラリーの調製
フランコらの報告（Ｆｒａｎｃｏ  Ｆｅｌｉｃｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０（１９９１））に若干の変更を加え、ファージディスプレイライブラリーを作製した（１．０×１０Ｅ８クローン）。該ファージディスプレイライブラリーは、具体的にはＮＮＫ（ＮはＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔのいずれかを示し、ＫはＧ又はＴを示す。）が９回繰り返された配列を含むＤＮＡが遺伝子工学的に挿入された繊維状ファージであって、更に主要外殻タンパク質ｐＶＩＩＩ遺伝子のＮ端部分に９残基のランダムなアミノ酸からなるペプチドをコードするＤＮＡが挿入されてファージ外殻表面にランダムな９残基のアミノ酸配列を有するペプチドが発現できるように構築されている。
（２）クローン病抗体結合性ペプチド（ＣＤ結合性ペプチド）の選択
（ｉ）血清抗体の固定化
抗体として血清抗体を用いた。血清としてクローン病患者の血清２０検体、並びに対照血清検体として潰瘍性大腸炎患者の血清２０検体及び健常者の血清２０検体を用いた。
次のようにして血清中の抗体（ＩｇＧ）をマグネチックビーズに固定化した。まず、マグネチックビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｔｏｓｙｌ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）に、０．１Ｍホウ酸緩衝液で２００μｇ／ｍｌ濃度に調製した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異的抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）を加え、４℃で一晩反応させた。反応後、該マグネチックビーズを０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する（Ｄ）−ＰＢＳ（ダルベッコ式リン酸緩衝液）で洗浄し、０．１％のＢＳＡを含有する０．２Ｍトリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を用いたブロッキング、次いで０．１％のＢＳＡを含有する（Ｄ）−ＰＢＳを用いたブロッキングを行い、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異抗体固相化マグネチックビーズを調製した。
次いで、この抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異抗体固相化マグネチックビーズに、クローン病患者の血清２０検体よりランダムに選んだ３人分の血清プール２種類（ＣＤＧ１及びＣＤＧ２）、及び健常者の血清２０検体よりランダムに選んだ５人分の血清プールをそれぞれ添加し、一晩反応させて、表面に抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異抗体を介して各血清ＩｇＧ（健常者の血清ＩｇＧまたはクローン病患者の血清ＩｇＧ）を固定化したマグネチックビーズを作製した。
（ｉｉ）ＣＤ結合性ペプチドディスプレイファージの選別（バイオパニング）
健常者の血清ＩｇＧを固定化したマグネチックビーズに、約１×１０１１のファージライブラリー（Ｍ１３ファージのｐＶＩＩＩ領域にランダムな９アミノ酸をディスプレイするライブラリー）を添加して４℃で一晩反応させ、次いで結合しなかったファージをクローン病患者の血清ＩｇＧを固定化したマグネチックビーズに添加して４℃で一晩反応させた。反応後、ビーズを０．１％ＢＳＡを含む（Ｄ）−ＰＢＳを用いて洗浄し、その後、溶出緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する０．１Ｍ塩酸をグリシンにてｐＨ２．２に調整）を用いて、ビーズに結合したファージを溶出した。得られた溶出ファージを１Ｍトリスを用いて中和し、中和後のファージを大腸菌ＪＭ１０９に感染させて、これを１５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコースを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。培養後、増殖した培地上の大腸菌を全て掻き取り、ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）を感染させて、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド）及びカナマイシンを添加した後、３７℃で一晩振盪培養した。培養液を遠心分離して不溶物を除去し、この中にポリエチレングリコールを含む塩化ナトリウム溶液を加え、数回撹拌した後、再度遠心してペレットを回収し、０．０２％アジ化ナトリウムを含む（Ｄ）−ＰＢＳに溶解し、濃縮ファージ溶液を得た。
こうして得られたファージ溶液を用いて、さらに上記のようなバイオパニングを２回繰り返した。３回目のバイオパニングで得られたファージ溶液を大腸菌ＪＭ１０９に感染させ、これを１５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコースを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養した。培地上に形成された単コロニーの大腸菌を掻き取り、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃にて３時間振盪培養した後、ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）を感染させて、ＩＰＴＧ及びカナマイシンを添加した後、３７℃で一晩振盪培養した。
以上のようにして、ＣＤ結合性ペプチドディスプレイファージを単クローン化した。
（ｉｉｉ）ファージＥＬＩＳＡ
上記で単クローン化したＣＤ結合性ペプチドディスプレイファージについて、上記のバイオパニングで用いた健常者血清プール及びクローン病患者血清プール（（ｉ）参照）を用いてファージＥＬＩＳＡを行った。
ＥＬＩＳＡにあたっては、まず抗ファージ抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を９６穴マイクロタイタープレートに固定化した。固定化は、具体的には（Ｄ）−ＰＢＳにて１μｇ／ｍｌ濃度に調製した抗ファージ抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液１００μｌを各ウエルに添加し、４℃で一晩静置した後、洗浄し、３００μｌのブロッキング溶液（１％ＢＳＡ、５％ソルビトールを含む（Ｄ）−ＰＢＳ）を加えて４℃で一晩静置することによって行った。
一次反応は、ファージＥＬＩＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０％正常ヤギ血清を含む（Ｄ）−ＰＢＳ）９０μｌに上記（ｉｉ）で調製したファージ培養液を１０μｌ加え、上記の抗ファージ抗体を固定化した各ウエルに添加した後、３７℃にて一時間反応させることによって行った。一次反応終了後、４回洗浄し、二次反応を行った。二次反応は、ファージＥＬＩＳＡ緩衝液１００μｌに血清１μｌ（健常者血清またはクローン病患者血清）を加え、各ウエルに添加した後、３７℃にて一時間反応させることによって行った。次いで二次反応終了後、４回洗浄し、三次反応を行った。三次反応は、ファージＥＬＩＳＡ緩衝液で４０，０００倍に希釈したＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異的抗体（２０ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを各ウエルに添加した後、３７℃にて一時間反応させることによって行った。三次反応終了後、洗浄し、発色反応を行った。発色はＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）溶液を加えて、室温で１０分間反応させた後、停止液（１Ｎ  硫酸）を加えることによって反応を停止した。反応を停止させたプレートはプレートリーダーで吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定し、血清抗体との反応性を調べた。
これから、健常者の血清抗体とは反応しないでクローン病患者の血清抗体だけに反応性を示すファージクローンを選択した。次いで選択したファージクローンについて、上記方法と同様にしてクローン病患者血清２０検体、潰瘍性大腸炎患者血清２０検体及び健常者血清２０検体のそれぞれに対してＥＬＩＳＡを行い、その反応性からクローン病患者血清に特異性の高い５つのクローン（ＣＤ−１、ＣＤ−２、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−５）を選択した。選択した５つのクローンについて各血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清）に対する反応性（ＥＬＩＳＡ）をみた結果を図１に示す。
（３）ＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列の決定
上記各ファージＥＬＩＳＡによって選択した５つのクローン（ＣＤ−１、ＣＤ−２、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−５）のアミノ酸配列の決定を行った。まず、上記で選択されたファージクローンからＤＮＡを抽出した。具体的にはファージクローンを大腸菌ＪＭ１０９に感染させ、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、一晩培養を行い、培地上に形成されたコロニーを掻き取り、２ｍｌのアンピシリン含むＬＢ液体培地で一晩振盪培養し、キアプレップＤＮＡ抽出キット（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。
ファージＤＮＡの塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４，５４６３−５４６７（１９７７））により、アマシャム社のサイクルシークエンスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，ｃｏｄｅ；２４３８）を用いて、キットの使用説明書に従い実施した。ＤＮＡ配列はファルマシア社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＬＦ  ＤＮＡシークエンサー）を用いてシークエンスを行った。
得られた塩基配列から決定した各クローン（ＣＤ−１、ＣＤ−２、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−５）のアミノ酸配列を１文字表記として表５に示す。
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なお、表中、各ペプチドのＮ末端及びＣ末端領域に位置するそれぞれＡＥＧＥＬ及びＡＤＰＡまたはＧＤＰＡは、ファージベクターのランダムペプチドの両端に位置するアミノ酸配列に由来するものである。
ＣＤ−５クローンを除くＣＤ−１、ＣＤ−２、ＣＤ−３及びＣＤ−４クローンについて、上記ファージベクター由来のアミノ酸配列を含む１８アミノ酸を分岐状多抗原性ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＭＡＰペプチド）の形態にて合成し、以下の実験に使用した。具体的には市販のＦｍｏｃ８−Ｌｙｓ４−Ｌｙｓ−２−βＡｌａ−Ａｌｋｏ（渡辺化学工業社製）を用いて下記のアミノ酸配列を有するペプチドをペプチドＡＴＣ−３５７  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ社製）にて合成した。
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本合成法により、各分岐状多抗原性ペプチド（ＭＡＰペプチド）は、一分子中にＣＤ結合性ペプチドのアミノ酸配列を分岐状に８つ有することになる（図２）。
実施例２  ＣＤ結合性ペプチドの血清検体に対する反応性
（１）個々の分岐状多抗原性ペプチド（ＭＡＰペプチド）を抗原としたＥＬＩＳＡ
実施例１で得られた各ＭＡＰペプチド（ＣＤＰ−１、ＣＤＰ−２、ＣＤＰ−３及びＣＤＰ−４のＭＡＰペプチド：図３参照）を抗原ペプチドとして利用して、ＥＬＩＳＡにより各血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清）に対する反応性を調べた。
まず、各ＭＡＰペプチドを９６穴マイクロタイタープレートに固定化した。具体的には、固定化は、各ＭＡＰペプチドをｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ、ｐＨ９．６）にて１μｇ／ｍｌ濃度に調製してＭＡＰ溶液を調製し、プレートの各ウエルに１００μｌずつ添加し、４℃にて一晩静置し、その後洗浄して３００μｌのカゼイン溶液（０．１％カゼイン及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む（Ｄ）−ＰＢＳ）を加えて、再度４℃にて一晩静置することによって行った。
（ｉ）各ＭＡＰペプチドを固定化したＭＡＰプレートを用いて、クローン病患者血清２０検体、潰瘍性大腸炎患者血清２０検体及び健常者血清４８検体の各ＭＡＰペプチドに対する反応性をＥＬＩＳＡにより確認した。
具体的には、まず一次反応として、カゼイン溶液１００μｌに血清抗体１μｌを加えた全量をＭＡＰプレートの各ウエルに添加し、それを３７℃で１時間反応させた。一次反応終了後、４回洗浄し、このウエル中に、カゼイン溶液で２０，０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異的抗体を添加し、３７℃で一時間反応させて二次反応を行った。二次反応終了後、４回洗浄し発色反応を行った。検出は１００μｌのＴＭＢ溶液を加えて、室温で１０分間反応させた後、１００μｌのＴＭＢ停止溶液（１Ｎ硫酸）を加えることにより反応を停止し、プレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍの吸光度を測定して、各血清について各ＭＡＰプレートに対する反応性を調べた。結果を図３に示す。図３からわかるように、４種類のＭＡＰペプチド（ＣＤＰ−１、ＣＤＰ−２、ＣＤＰ−３およびＣＤＰ−４のＭＡＰペプチド）は、いずれも潰瘍性大腸炎患者の血清や健常者の血清とは殆ど反応せず、クローン病患者の血清に対して２〜４割の割合で反応性を示した。また図３からわかるように、各ＭＡＰペプチドのクローン病患者の血清に対する反応性は各ＭＡＰペプチド間でそれぞれ異なっており共通性は認められなかった。このことから、この４種類のペプチドはクローン病患者特異的に反応するそれぞれ異なるタイプのペプチドであると判断された。
（ｉｉ）次に多数の血清検体（クローン病患者血清９６検体、潰瘍性大腸炎患者血清２０検体及び健常者血清４８検体）を用いて、上記各ＭＡＰペプチド（ＣＤＰ−１、ＣＤＰ−２、ＣＤＰ−３およびＣＤＰ−４のＭＡＰペプチド）の反応性を上記（ｉ）の方法と同様にして調べ、クローン病患者血清に対する当該ペプチドの特異性を評価した。結果を表６に示す。
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表６に示すように、健常者の血清４８検体の平均ＯＤ値十５ＳＤをカットオフ値とした場合、クローン病患者血清９６検体に対する陽性率はＣＤＰ−１ペプチドが３１．３％、ＣＤＰ−２ペプチドが２７．１％、ＣＤＰ−３ペプチドが５１．０％、及びＣＤＰ−４ペプチドが３１．３％であった。また、健常者及び潰瘍性大腸炎患者の血清に対する偽陽性率はいずれのペプチドも５％以下であった。このことから、これらの各ペプチド（ＣＤＰ−１ペプチド、ＣＤＰ−２ペプチド、ＣＤＰ−３ペプチドおよびＣＤＰ−４ペプチド）はクローン病患者が有する特有の抗体（クローン病抗体）に特異的に結合し、これを利用することによって、クローン病の罹患の有無を精度よく診断できると考えられた。
（２）混合ＭＡＰペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡ
実施例１で調製したＭＡＰペプチド（ＣＤＰ−１、ＣＤＰ−２、ＣＤＰ−３およびＣＤＰ−４のＭＡＰペプチド）を混合して混合ＭＡＰペプチドを調製し、これを抗原として利用して、ＥＬＩＳＡにより多種類の血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清、十二指腸潰瘍患者血清、胃潰瘍患者血清及び健常者血清）に対する反応性を調べた。
なお、検出に使用する抗原プレートは、ＣＤＰ−１のＭＡＰペプチド及びＣＤＰ−４びＭＡＰペプチドがそれぞれ１．５μｇ／ｍｌ、ＣＤＰ−２びＭＡＰペプチド及びＣＤＰ−３のＭＡＰペプチドがそれぞれ３μｇ／ｍｌとなるように調製し、これらを等量混和したものを（１）に記載するＭＡＰプレートの調製と同様にして９６穴マイクロタイタープレートに固定化することによって調製した。
（ｉ）この混合抗原プレートを用いて、クローン病患者血清５５０検体、潰瘍性大腸炎患者血清２０検体、健常者血清１２０検体、十二指腸潰瘍患者血清２５例及び胃潰瘍患者血清１５検体について混合ＭＡＰペプチドに対する反応性をＥＬＩＳＡにより確認した。なお、ＥＬＩＳＡは二次反応に使用するＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異的抗体として、カゼイン溶液（０．１％カゼイン及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む（Ｄ）−ＰＢＳ）で１０，０００倍に希釈したものを使用する以外は、上記の（１）（ｉ）に記載する方法と同様にして行った。結果を図４及び表７に示す。
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図４及び表７からわかるように、健常者の血清１２０検体の平均ｕｎｉｔ値十３ＳＤをカットオフ値とした場合、クローン病患者血清に対する陽性率は６７．１％（３６９／５５０）であり、偽陽性率は潰瘍性大腸炎患者の血清について５％（１／２０）、健常者血清について１．７％（２／１２０）、十二指腸潰瘍患者血清並びに胃潰瘍患者血清については０％（０／２５、０／１５）であった。
この結果と（１）の結果とを比較することにより、各クローン病抗体結合性ペプチド（ＣＤＰ−１ペプチド、ＣＤＰ−２ペプチド、ＣＤＰ−３ペプチドおよびＣＤＰ−４ペプチド）を単独で使用するよりも、これらを組み合わせて用いることによりクローン病特有の抗体に対する特異性が向上し、これによってクローン病の罹患の有無が高い精度で診断できると考えられた。
（３）混合ＭＡＰペプチドとパン酵母を抗原としたＥＬＩＳＡとの比較
（２）と同様にして、実施例１で調製したＭＡＰペプチド（ＣＤＰ−１、ＣＤＰ−２、ＣＤＰ−３およびＣＤＰ−４のＭＡＰペプチド）を混合してこれを抗原として利用して、ＥＬＩＳＡにより各血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清）に対する反応性を調べた。また、クローン病との関連が指摘されているパン酵母（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｇｕｔ  １９９８，４２，ｐｐ．７８８−７９１、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９９，１１６，ｐｐ．１００１−１００３、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００１，９６  ｐｐ．７３０−７３４）についても同様に、上記各血清検体に対する反応性を調べ、両者のクローン病診断における有用性を比較した。なお、抗原プレートとして使用する混合ＭＡＰプレートは、ＣＤＰ−１のＭＡＰペプチド及びＣＤＰ−４のＭＡＰペプチドがそれぞれ１．５μｇ／ｍｌ、ＣＤＰ−２のＭＡＰペプチド及びＣＤＰ−３のＭＡＰペプチドがそれぞれ３μｇ／ｍｌとなるように調製し、これらを等量混和したものを（１）に記載するＭＡＰプレートの調製と同様にして９６穴マイクロタイタープレートに固定化することによって調製した。またパン酵母に対する反応性は、市販の測定キットであるＡｎｔｉ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ検出キット（ＡＳＣＡ  ＩｇＧ検出キット及びＡＳＣＡ  ＩｇＡ検出キット、使用抗原：パン酵母細胞膜のグリコマンナン、Ｍｅｄｉｚｙｍｅ製）を用いて測定した。
（ｉ）混合ＭＡＰプレートを用いてクローン病患者血清９６例、潰瘍性大腸炎患者血清２０例、及び健常者血清４８例について混合ＭＡＰに対する反応性をＥＬＩＳＡにより確認した。なお、ＥＬＩＳＡは上記（２）（ｉ）に記載する方法と同様に行った。
（ｉｉ）また、パン酵母に対する反応性は測定キットの操作説明書に従って行った。結果を図５に示す。図５Ａに示すように、抗原として混合ＭＡＰペプチドを用いたＥＬＩＳＡでは健常者の血清４８検体の平均ｕｎｉｔ値＋３ＳＤをカットオフ値とし、図５Ｂ及び図５Ｃに示すように、抗原としてＡＳＣＡ  ＩｇＧ及びＡＳＣＡ  ＩｇＡの測定キットを用いたＥＬＩＳＡでは操作説明書に従ってｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ（結合インデックス）＝１．０をカットオフ値として陽性率と偽陽性率を算出した。陽性率と偽陽性率の結果を表８に示す。
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これらの結果から、個々のＭＡＰペプチドを組合せて混合ＭＡＰペプチドとして用いることによって、クローン病抗体の認識抗原として指摘されているパン酵母よりも、クローン病抗体が特異的に認識でき、高い精度でクローン病の罹患の有無が検出できると考えられた。
実施例３  ＣＤ結合性ペプチドのホモロジー解析
得られたＭＡＰペプチド（ＣＤＰ−１〜ＣＤＰ−４のＭＡＰペプチド）について、クローン病との関連が報告されているタンパク〔ＣＤＸ（ｍｅａｓｌｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）〈Ｇｕｔ  ２０００  Ｆｅｂ；４６（２）：１６３−９〉、ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｌｐｈａ  ａｍｙｌａｓｅ〈Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊａｐａｎ：Ｔｈｅ  ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｗｅｌｆａｒｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，１９９９：９８−１００〉、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＨＳＰ６５（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ６５）〈Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  Ｎｏｖ；２（６）：６５７−６４〉、ｈｕｍａｎ  ＨＳＰ６０〈Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．１９９７；５８（５）：４６９−７５〉、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐ３６〈Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９  Ａｕｇ；３９（２）：１１５−９〉〕とのアミノ酸配列における相同性をＤＮＡＳＩＳソフト（日立製作所）を用いて解析した。結果を図６に示す。この結果からわかるように、それぞれのタンパクにおいて弱い相同性が認められたものの、余り高い相同性は認められなかった。
次いでこれらのアミノ酸配列について、ＦＡＳＴＡプログラム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｎｅｔサイト使用）を用いて、クローン病抗体結合性ペプチドとアミノ酸配列において相同性を有するタンパクをタンパクデータベースより検索した。検索は、Ｚ−ｓｃｏｒｅが１３０以上である相同性の高いタンパクだけが抽出されるように行った。結果を図７に示す。図７からわかるように、ＣＤ１ペプチド、ＣＤ３ペプチド及びＣＤ４ペプチドに関しては、クローン病との関与が報告されているｙｅａｓｔやｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのタンパクだけでなく、クローン病との関連性が認められていない病原性微生物や食物（Ｚｅａ  ｍｙｚｅ等）のタンパク等、細菌、動物及び植物などの多くの種にわたって相同性を有するタンパクがみられた。
実施例４
実施例１において、ファージＥＬＩＳＡで得られた各種血清に対する反応性（図１）並びにアミノ酸配列の類似性（表２）から、ＣＤ−１及びＣＤ−５クローンのアミノ酸配列を有するそれぞれのペプチド（ＣＤＰ−１ペプチド（配列番号６）、及びＣＤＰ−５ペプチド（配列番号９））は同一抗体を認識するものと考えられた。また当該ＣＤＰ−１ペプチドとＣＤＰ−５ペプチドは、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）のサブユニットＥの１９９−２１２領域に位置するペプチド（ＶＡＴＥ−２０１ペプチド：配列番号１１）とアミノ酸配列上の相同性を有している（図８）。
そこで、下記に示すペプチド（ＣＤＰ−１ａペプチド、ＣＤＰ−５ａペプチド、ＶＡＴＥ−２０１ペプチド）を、上記実施例１（３）に記載する方法と同様にしてＭＡＰ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の形態にて合成し（図９）、実施例２（１）の方法に従って、各ＭＡＰペプチドの各血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清）に対する反応性をＥＬＩＳＡによって調べた。
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血清検体としてクローン病患者の血清２０検体、並びに比較血清検体として潰瘍性大腸炎患者の血清２０検体及び健常者の血清２０検体を用いた。結果を図１０に示す。図１０からわかるように、ＣＤＰ−１ａペプチド、ＣＤＰ−５ａペプチド及びＶＡＴＥ−２０１ペプチドは互いに同様のＥＬＩＳＡ反応性を示した。
実施例５  ＶＡＴＥ−２０１ペプチドによる抗原−抗体反応の阻害試験
実施例４で得られたＶＡＴＥ−２０１の反応性を確認するために、ＶＡＴＥ−２０１ペプチドを用いてＣＤＰ−１ａペプチドとクローン病抗体との抗原−抗体反応の阻害試験を行った。血清抗体試料として、各ＭＡＰペプチド（ＣＤＰ−１ａペプチド、ＣＤＰ−５ａペプチド、ＶＡＴＥ−２０１ペプチド）に強い反応性を示したクローン病患者の血清８番、９番、及び１４番（図１１参照）を用いた。
具体的には、抗原プレートとして、ＣＤＰ−１ａのＭＡＰペプチド（図１０）をプレートに固定化したＭＡＰプレートを用い（実施例２（１）参照）、これにＶＡＴＥ−２０１のＭＡＰペプチド（反応阻害物質）を１００μｇ／ｍＬの濃度で含むカゼイン溶液（０．１％カゼイン及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む（Ｄ）−ＰＢＳ）１００μＬに血清検体１μＬを加えて３７℃で１時間反応させた溶液の全量を添加し、実施例２（１）と同様にしてＥＬＩＳＡを行った。一方、比較実験として、上記反応阻害物質として、ＶＡＴＥ−２０１のＭＡＰペプチドに代えてＣＤＰ−１ａのＭＡＰペプチドを用いて同様にＥＬＩＳＡを行った。結果を図１１に示す。
図１１のＢに示すように、反応系にＶＡＴＥ−２０１のＭＡＰペプチドを添加することによって、ＣＤＰ−１ａのＭＡＰプレートに対するクローン病患者の各血清検体（８番、９番、１４番）の反応性がすべて阻害された。また、上記ＣＤＰ−１ａのＭＡＰペプチドに代えてＣＤＰ−５ａのＭＡＰペプチドを用いて同様に行った試験においても同様の結果が得られた（結果示さず）。
以上、実施例４及び５の結果から、ＶＡＴＥ−２０１ペプチド、並びにＣＤＰ−１ａペプチド及びＣＤＰ−５ａペプチドはいずれもクローン病患者の血清中に特異的に存在する抗体を認識することがわかった。またＶＡＴＥ−２０１ペプチドとのアミノ酸配列の類似性並びに血清抗体との反応性の共通性から、ＣＤＰ−１ａペプチドおよびＣＤＰ−５ａペプチドを始めとする本発明のＣＤ１ペプチド及びその同効物は、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）のサブユニットＥを模倣するものであると考えられる。
すなわち、上記実施例の結果は、クローン病患者にはヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅサブユニットＥに対する抗体が特異的に存在していることを示すものである。このことから、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅ、特にそのサブユニットＥを認識する抗体を指標とすることによって個々の被験者についてクローン病の罹患の有無を診断することができるものと考えられる。
実施例６  ＣＤ３ペプチド及びその同効物の模倣蛋白質の探索、並びにその評価
実施例５の結果から、ＣＤ１ペプチド及びその同効物は、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）のサブユニットＥを模倣していることが分かった。そこで同様にしてＣＤ３ペプチド及びその同効物について模倣蛋白質を探索し、そのクローン病抗体への反応性について評価した。
（１）ＭＡＰペプチドの調製
ＣＤＰ３ペプチドの改変物として、ＣＤＰ３ペプチド（配列番号２１）のアミノ酸配列を基本にそれぞれ１アミノ酸残基をアラニンに置換した１４種類のペプチドを調製した（表９）。なお、ＣＤＰ３−１については１番目のアミノ酸がアラニンであるためセリンに置換した。次いで、これらの１５種類のペプチドについて、実施例１（３）の方法に従って、それぞれ１分子あたり８個のペプチドを有するＭＡＰペプチドを調製した（１アミノ酸置換ＭＡＰペプチド）。
（２）ＣＤＰ３エピトープ配列の決定
ＣＤＰペプチドのアミノ酸配列において、クローン病抗体との特異的反応性に必要な配列を決定するため、上記で調製した１アミノ酸置換ＭＡＰペプチドを反応阻害物質として用いて、下記の反応阻害試験を行った。反応血清抗体試料として、実施例２においてＣＤＰ−３ペプチドに強い反応性を示したクローン病患者の血清２番、７番及び８番を用いた（図３参照）。
具体的には、抗原プレートとして、ＣＤＰ３のＭＡＰペプチドをプレートに固定化したＭＡＰプレート（実施例２（１）参照）を用いて３段階の反応により行った。１次反応は、クローン病患者血清を、１アミノ酸置換ＭＡＰをそれぞれ１００μｇ／ｍＬ濃度で含む検体希釈液（０．５Ｍ食塩、１．５％カゼイン、２％正常ヤギ血清、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍトリス緩衝液）にて１００倍希釈した後、２５℃で１時間反応することにより行った。２次反応は、１次反応液１００μＬをＭＡＰプレートのウエルに添加した後、２５℃にて１時間反応した後、３回洗浄することにより行った。３次反応は、酵素標識抗体希釈溶液（０．１４Ｍ食塩、０．５％ＢＳＡ、５％正常ヤギ血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液）で５，０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異的抗体１００μＬを添加し、２５℃にて１時間反応した後、３回洗浄することにより行った。検出は、実施例２（１）に従い、１アミノ酸置換ＭＡＰペプチドによる反応阻害活性を測定した。結果を表９に示す。
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この結果、クローン病患者血清２番において、反応阻害物質としてＣＤＰ３−７、ＣＤＰ３−９、ＣＤＰ３−１０、ＣＤＰ３−１１及びＣＤＰ３−１３の各ＭＡＰペプチドを用いた場合、クローン病患者血清とＣＤＰ３ペプチドと反応に対する阻害活性が５０％以下であった。また、クローン病患者血清７番及び８番において、反応阻害物質としてＣＤＰ３−７、ＣＤＰ３−９、及びＣＤＰ３−１１の各ＭＡＰペプチドを用いた場合、クローン病患者血清とＣＤＰ３ペプチドと反応に対する阻害活性が５０％以下であった。以上の結果より、ＣＤＰ３のアミノ酸配列においてクローン病抗体との反応（抗体認識）に必要な配列なＱＸＤＧＱＸＱ（Ｘは、同一または異なって、任意のアミノ酸残基）（配列番号５１）であると判断された。
（３）ＣＤＰ３ペプチド模倣蛋白質の探索
上記のことから、クローン病抗体の認識に重要と思われるアミノ酸配列（ＱＸＤＧＱＸＱ（Ｘは、同一または異なって、任意のアミノ酸））を用いて蛋白質データベースとの相同性解析を行った。その結果、ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００（ＨＺＦ３００））の１２９〜１３５位のアミノ酸領域と相同性があることが確認された（図１２）。
そこで、ヒト核内蛋白質（ＨＺＦ３００）がＣＤＰ３ペプチドの模倣蛋白質であることを確認するために、その１２６〜１３８位のアミノ酸領域のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｚ３００ペプチド）をＭＡＰペプチドの形態に調製し、クローン病患者血清２０例、潰瘍性大腸炎患者血清２０例、及び健常者血清２０例を用いてＭＡＰ抗原ＥＬＩＳＡを行った。
（４）ＭＡＰ抗原ＥＬＩＳＡ
まず、ヒト血清を検体希釈液（前述）にて１０１倍に希釈し、その１００μＬをＭＡＰプレートのウエルに添加した後、実施例６（２）の２次反応以降の操作に準じて測定し、ＭＡＰペプチドと各種の血清抗体との反応性を調べた。結果を図１３に示す。その結果、ＣＤＰ３ペプチドに強い反応性を示すクローン病患者血清２、７及び８番は、Ｚ３００ペプチドに対して同様の反応性を示した。一方、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清に対して、Ｚ３００ペプチドは明確な反応性を示さなかった。
（５）抗原−抗体反応の阻害試験
Ｚ３００ペプチドのクローン病抗体への反応性を確認するために、Ｚ３００ペプチドを用いてＣＤＰ３ペプチドとクローン病抗体との抗原−抗体反応の阻害試験を行った。血清抗体試料として、ＣＤＰ３ペプチドに強い反応性を示したクローン病患者の血清２番、７番、及び８番を用いた。
具体的には、抗原プレートとして、ＣＤＰ３のＭＡＰペプチドをプレートに固定化したＭＡＰプレートを用い（実施例２（１）参照）、これにＺ３００のＭＡＰペプチド（反応阻害物質）を１００μｇ／ｍＬの濃度で含む検体希釈液（前述）１００μＬに血清検体１μＬを加えて２５℃で１時間反応させた溶液の全量を添加し、実施例６（２）と同様にしてＥＬＩＳＡを行った。一方、比較実験として、上記反応阻害物質として、Ｚ３００のＭＡＰペプチドに代えてＣＤＰ３のＭＡＰペプチドを用いて同様にＥＬＩＳＡを行った。結果を図１４に示す。
図１４のＢに示すように、反応系にＺ３００のＭＡＰペプチドを添加することによって、ＣＤＰ３のＭＡＰプレートに対するクローン病患者の各血清検体（２番、７番、８番）の反応性がすべて阻害された。
上記の結果から、Ｚ３００ペプチド及びＣＤＰ３ペプチドはいずれもクローン病患者の血清中に特異的に存在する抗体を認識することがわかった。またＺ３００ペプチドとのアミノ酸配列の類似性並びに血清抗体との反応性の共通性から、本発明のＣＤ３ペプチド及びその同効物は、ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）を模倣するものであると考えられる。
すなわち、上記実施例の結果は、クローン病患者にはヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）に対する抗体が特異的に存在していることを示すものである。このことから、ヒト核内蛋白質（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）を認識する抗体を指標とすることによって個々の被験者についてクローン病の罹患の有無を診断することができるものと考えられる。
実施例７  ＣＤ４ペプチド及びその同効物の模倣蛋白質の探索、並びにその評価
次いでＣＤ４ペプチド及びその同効物について模倣蛋白質を探索し、そのクローン病抗体への反応性について評価した。
（１）ＭＡＰペプチドの調製
ＣＤＰ４ペプチドの改変物として、ＣＤＰ４ペプチド（配列番号３３）のアミノ酸配列を基本にそれぞれ１アミノ酸残基をアラニンに置換した１５種類のペプチドを調製した（表１０）。なお、ＣＤＰ４−１については１番目のアミノ酸がアラニンであるためセリンに置換した。次いで、これらの１４種類のペプチドについて、実施例１（３）の方法に従って、それぞれ１分子あたり８個のペプチドを有するＭＡＰペプチドを調製した（１アミノ酸置換ＭＡＰペプチド）。
（２）ＣＤＰ４エピトープ配列の決定
ＣＤＰペプチドのアミノ酸配列において、クローン病抗体との特異的反応性に必要な配列を決定するため、上記で調製した１アミノ酸置換ＭＡＰペプチドを反応阻害物質として用いて、実施例６（２）と同様にして反応阻害試験を行った。なお、反応血清抗体試料として、実施例２においてＣＤＰ−４ペプチドに強い反応性を示したクローン病患者の血清３番、６番、１５番、１７番及び２０番を用いた（図３参照）。結果を表１０に示す。
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この結果、クローン病患者血清３番、６番、１５番、１７番及び２０番において、反応阻害物質としてＣＤＰ４−７、ＣＤＰ４−８、ＣＤＰ４−９及びＣＤＰ８−１２の各ＭＡＰペプチドを用いた場合、クローン病患者血清とＣＤＰ４ペプチドとの反応に対する阻害活性が３０％以下であった。また、クローン病患者血清６番、１５番、１７番及び２０番において、反応阻害物質としてＣＤＰ４−６のＭＡｐペプチドを用いた場合、クローン病患者血清とＣＤＰ３ペプチドとの反応に対する阻害活性が３０％以下であった。さらに反応阻害物質としてＣＤＰ４−５及びＣＤＰ４−１１の各ＭＡＰペプチドを用いた場合、それぞれクローン病患者血清６番及び１５番において、クローン病患者血清とＣＤＰ４ペプチドとの反応に対する阻害活性が３０％以下であった。
以上の結果より、ＣＤＰ４ペプチドのアミノ酸配列においてクローン病抗体との反応（抗体認識）に必要な配列なＬＧＧＩＹＸＤＬ（Ｘは任意のアミノ酸残基）（配列番号４９）であると判断された。
（３）ＣＤＰ４ペプチド模倣蛋白質の探索
上記のことから、クローン病抗体の認識に重要と思われるアミノ酸配列（ＬＧＧＩＹＸＤＬ（Ｘは任意のアミノ酸））を用いて蛋白質データベースとの相同性解析を行った。その結果、コメアレルゲン蛋白質と相同性があることが確認された（図１５）。図１５に示すように、コメアレルゲン蛋白質はα−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであり、ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙを形成している。これらの相互に高い相同性を持つα−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、いずれもクローン病抗体との反応（抗体認識）に重要と考えられるアミノ酸配列Ｌ（又はＶ）ＧＧＩＹＸＤ（又はＥ）Ｌ領域（配列番号４９、５０）を有していた。なお、ＬとＶは脂肪族アミノ酸、ＤとＥは酸性アミノ酸として互いに類似するアミノ酸である。
そこで、コメアレルゲン蛋白質がＣＤＰ４ペプチドの模倣蛋白質であることを確認するために、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４（図１６）の９９〜１１１番目のアミノ酸領域のアミノ酸配列を有するペプチド（ＴＯ３９６５ペプチド）をＭＡＰペプチドの形態に調製し、クローン病患者血清２０例、潰瘍性大腸炎患者血清２０例、及び健常者血清２０例を用いてＭＡＰ抗原ＥＬＩＳＡを行った。
（４）ＭＡＰ抗原ＥＬＩＳＡ
抗原プレートとして、ＴＯ３９６５のＭＡＰペプチドを固定化して調製したＭＡＰ抗原プレートを用いる以外は、実施例６（４）と同様にしてＭＡＰ抗原ＥＬＩＳＡを行った。結果を図１７に示す。その結果、ＣＤＰ４ペプチドに強い反応性を示すクローン病患者血清３、６、１５、１７及び２０番は、ＴＯ３９６５ペプチドに対しても同様の反応性を示した。一方、ＴＯ３９６５ペプチドは、ＣＤＰ４ペプチドと同様に、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清に対して、明確な反応性を示さなかった。
（５）抗原−抗体反応の阻害試験
ＴＯ３９６５ペプチドのクローン病抗体への反応性を確認するために、実施例６（５）と同様にして、ＴＯ３９６５ペプチドを用いてＣＤＰ４ペプチドとクローン病抗体との抗原−抗体反応の阻害試験を行った。血清抗体試料として、ＣＤＰ４ペプチドに強い反応性を示したクローン病患者の血清３、６、１５、１７及び２０番を用いた。結果を図１８に示す。
図１８に示すように、反応系にＴＯ３９６５のＭＡＰペプチドを添加することによって、ＣＤＰ４のＭＡＰプレートに対するクローン病患者の各血清検体（３、６、１５、１７及び２０番）の反応性がすべて阻害された。
上記の結果から、ＴＯ３９６５ペプチド及びＣＤＰ４ペプチドはいずれもクローン病患者の血清中に特異的に存在する抗体を認識することがわかった。またＴＯ３９６５ペプチドとのアミノ酸配列の類似性並びに血清抗体との反応性の共通性から、本発明のＣＤ４ペプチド及びその同効物は、コメアレルゲン蛋白質（α−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ）を模倣するものであると考えられる。
すなわち、上記実施例の結果は、クローン病患者にはコメアレルゲン蛋白質（α−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に対する抗体が特異的に存在していることを示すものである。このことから、コメアレルゲン蛋白質（α−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）のｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙを認識する抗体を指標とすることによって個々の被験者についてクローン病の罹患の有無を診断することができるものと考えられる。
産業上の利用可能性
本発明によれば、クローン病患者に特有に存在する抗体に特異的に結合するペプチドを提供することができる。かかる本発明のペプチドはクローン病の検査試薬として有用であり、かかるペプチド及びそれを含む検査試薬によれば、クローン病の罹患の有無を精度よく診断することができる。
また、本発明は、クローン病患者の体内には、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅ、特にヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥを認識する抗体、ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）を認識する抗体、コメアレルゲン蛋白質（α−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）のｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙを認識する抗体が、特異的に存在しているという新たな知見を提供する。そして、この知見に基づいて、本発明はこれらの少なくとも１つの抗体を指標として、被験者の生体試料中にその存在を検出することからなるクローン病の検査方法を提供するものである。かかる方法によれば、個々の被験者について、生体試料（例えば血清等）を対象にすることにより、簡便にかつ精度よく、クローン病の罹患の有無を診断することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１（２）の結果を示す図である。具体的には、クローン病患者血清に対する特異性から選択した５つのクローン（ＣＤ−１，ＣＤ−２、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−５）について各血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清）に対する反応性をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す。
図２は、ＣＤＰ−１、ＣＤＰ−２、ＣＤＰ−３、及びＣＤＰ−４の各ＭＡＰペプチドの構造を示す図である。
図３は、実施例２（１）の結果を示す図である。具体的には、各ＭＡＰペプチド（ＣＤＰ−１、ＣＤＰ−２、ＣＤＰ−３、ＣＤＰ−４のＭＡＰペプチド）に対する各種血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清）の反応性をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す。
図４は、実施例２（２）の結果を示す図である。具体的には、混合抗原プレートを用いて、クローン病（ＣＤ）患者血清５５０検体、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者血清２０検体、健常者血清１２０検体、十二指腸潰瘍患者血清２５例及び胃潰瘍患者血清１５検体について混合ＭＡＰペプチドに対する反応性をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す。
図５は、実施例２（３）の結果を示す図である。具体的には、図Ａは、混合ＭＡＰペプチドに対する各種血清検体（クローン病（ＣＤ）患者血清、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者血清、及び健常者血清）の反応性を示す図である。図Ｂ及びＣは、混合ＭＡＰペプチドに代えてパン酵母を抗原として、パン酵母に対する各種血清検体（クローン病（ＣＤ）患者血清、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者血清及び健常者血清）の反応性を示す（市販のＡｎｔｉ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＳＣＡ）検出キットを使用）。図ＢはＡＳＣＡ  ＩｇＧ、及び図ＣはＡＳＣＡ  ＩｇＡを使用。
図６は、クローン病患者特異的ペプチド（クローン病抗体結合性ペプチド：ＣＤ１ペプチド、ＣＤ２ペプチド、ＣＤ３ペプチド、ＣＤ４ペプチド）と、クローン病との関連が報告されているタンパク（ＣＤＸ、ｐｉｇ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｌｐｈａ  ａｍｙｌａｓｅ（ブタ膵臓α−アミラーゼ），Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＨＳＰ６５（Ｍ．パラチュバキュローシスＨＳＰ６５），ｈｕｍａｎ  ＨＳＰ６０（ヒトＨＳＰ６０），Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐ３６（Ｍ．パラチュバキュローシスｐ３６））とのアミノ酸配列における相同性を示す図である。なお、図中：はアミノ酸が一致することを、また・はアミノ酸が類似していることを示す。
図７は、タンパクデータベースよりホモロジー検索して得られた、クローン病患者特異的ペプチド（クローン病抗体結合性ペプチド：ＣＤ１ペプチド、ＣＤ３ペプチド、ＣＤ４ペプチド）とアミノ酸配列において相同性を有する各種生物（細菌、菌類、動物、節足動物、植物、藻類）に由来するタンパクを示す図である。
図８は、ヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥのアミノ酸配列と、ＣＤ１ペプチドの同効物（ＣＤＰ−１ペプチド、ＣＤＰ−５ペプチド）のアミノ酸配列との相同性を示した図である。なお、図中、‖はＶ−ＡＴＰａｓｅサブユニットＥのアミノ酸配列とＣＤＰ−１及びＣＤＰ−５ペプチドの両方またはいずれか一方のアミノ酸配列を一致することを、｜はＶ−ＡＴＰａｓｅサブユニットＥのアミノ酸配列とＣＤＰ−１及びＣＤＰ−５ペプチドの両方のアミノ酸配列とが類似することを示す。また、：はＣＤＰ−１とＣＤＰ−５ペプチドとのアミノ酸が一致することを、・はＣＤＰ−１とＣＤＰ−５ペプチドとのアミノ酸が類似することを示す。また下線部は、ファージｐＶＩＩＩ−蛋白質に由来するアミノ酸配列を示す。
図９は、ＶＡＴＥ−２０１、ＣＤＰ−１ａ及びＣＤＰ−５ａの各ＭＡＰペプチドの構造を示す図である。
図１０は、実施例４の結果を示す図である。具体的には、ＣＤＰ−１ａペプチド、ＣＤＰ−５ａペプチド、及びヒト液胞型Ｈ＋輸送性ＡＴＰａｓｅのサブユニットＥに由来するペプチド（ＶＡＴＥ−２０１ペプチド）について、各血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清に対する反応性をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す。
図１１は、実施例５の結果を示す図である。具体的には、クローン病患者の血清検体８番、９番、１４番のＣＤＰ−１ａのＭＡＰプレートに対する反応性をＣＤＰ−１ａのＭＡＰペプチド抗原（図Ａ）またはＶＡＴＥ−２０１のＭＡＰペプチド抗原（図Ｂ）用いて阻害した試験の結果を示す。図中、―■―はクローン病患者血清８番、―●―はクローン病患者血清９番、及び―▲―はクローン病患者血清１４番の結果を示す。
図１２は、ヒト核内蛋白質（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３００）のアミノ酸配列、並びにその１２６〜１３８位のアミノ酸領域のアミノ酸配列を有するＺ３００ペプチドの位置関係を示した図である。
図１３は、実施例６（４）の結果を示す図である。具体的には、ＣＤＰ３ペプチド（上段）及びＺ３００ペプチド（下段）について、各血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清に対する反応性をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す。
図１４は、実施例６（５）の結果を示す図である。具体的には、クローン病患者の血清検体２番、７番、８番のＣＤＰ３のＭＡＰプレートに対する反応性をＣＤＰ３のＭＡＰペプチド抗原（図Ａ）またはＺ３００のＭＡＰペプチド抗原（図Ｂ）用いて阻害した試験の結果を示す。図中、―■―はクローン病患者血清２番、―●―はクローン病患者血清７番、及び―▲―はクローン病患者血清８番の結果を示す。
図１５は、コメアレルゲン蛋白質（α−ａｍｙｌａｓｅ／ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）のｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙに属するＲｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ５Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｒ１４、Ｒｉｃｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４Ｂ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、及びＲｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡＧ２について、９５〜１１０位のアミノ酸領域の相同性を比較した図である。
図１６は、コメアレルゲン蛋白質（Ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ＲＡ１４）のアミノ酸配列、並びにその９９〜１１１位のアミノ酸領域のアミノ酸配列を有するＴＯ３９６５ペプチドの位置関係を示した図である。
図１７は、実施例７（４）の結果を示す図である。具体的には、ＣＤＰ４ペプチド（上段）及びＴＯ３９６５ペプチド（下段）について、各血清検体（クローン病患者血清、潰瘍性大腸炎患者血清及び健常者血清に対する反応性をＥＬＩＳＡで調べた結果を示す。
図１８は、実施例７（５）の結果を示す図である。具体的には、クローン病患者の血清検体３番、６番、１５番、１７番、２０番のＣＤＰ４のＭＡＰプレートに対する反応性をＣＤＰ４のＭＡＰペプチド抗原（図Ａ）またはＴＯ３９６５のＭＡＰペプチド抗原（図Ｂ）用いて阻害した試験の結果を示す。図中、―■―はクローン病患者血清３番、―●―はクローン病患者血清６番、―▲―はクローン病患者血清１５番、―◆―はクローン病患者血清１７番、及び―□―はクローン病患者血清２０番の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2002088175.tif 000049
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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