(57)【要約】本発明の目的は、ストレス抑制のために使用することができる新規な抗ストレス剤を提供することである。本発明によれば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含む抗ストレス剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含む抗ストレス剤。
【請求項２】
ストレスに起因する医学的症状を予防又は改善するため、請求項１に記載の抗ストレス剤。
【請求項３】
ストレスに起因する免疫機能の低下を予防又は改善するための、請求項１又は２に記載の抗ストレス剤。
【請求項４】
ストレスに起因する潰瘍又は腫瘍を予防又は改善するための、請求項１又は２に記載の抗ストレス剤。
【請求項５】
疾患患者のストレスに対する生存率を向上させるための、請求項１又は２に記載の抗ストレス剤。
【請求項６】
ポリ乳酸中における反復単位である乳酸が実質的にＬ−乳酸から成る、請求項１から５の何れか１項に記載の抗ストレス剤。
【請求項７】
縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が、乳酸を不活性雰囲気下で脱水縮合し、得られた反応液のエタノールおよびメタノール可溶分を逆相カラムクロマトグラフィーに付し、ｐＨ２〜３の２５〜５０重量％のアセトニトリル水溶液で溶離後、ｐＨ２〜３の９０重量％以上のアセトニトリル水溶液で溶離した画分である、請求項１から６の何れか１項に記載の抗ストレス剤。
【請求項８】
脱水縮合を窒素ガス雰囲気下、段階的減圧及び昇温により行う、請求項７に記載の抗ストレス剤。
【請求項９】
逆相カラムクロマトグラフィーを、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより行う請求項７又は８に記載の抗ストレス剤。
【請求項１０】
請求項１から９の何れかに記載の抗ストレス剤を含む、ストレス抑制のための飲食品。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗ストレス剤に関する。より詳細には、本発明は、ストレスによって生じる精神的及び身体的疾患を予防または軽減するのに有効な医薬品、特定保健用食品、健康食品等として用いることができる抗ストレス剤に関する。
背景技術
現代社会は、科学技術が高度化・複雑化し、社会情勢も激動する環境下になっており、人々は様々なタイプの物理・化学的、心理的、社会的ストレスに曝されている。特に、国際化された社会においては、複雑な人間関係が形成されており、精神的ストレスが起因となって引き起こされる様々な症状について報告がなされている。
精神的ストレスは、循環系、免疫系等に大きな影響を及ぼすことが知られている。ストレスの科学的概念及び定義は未だ不明確な点もあり、ストレスの評価に関しては多くの問題が残されているが、近年、医学的見地からの検討がなされている。
例えば、ストレスを受けるとアンジオテンシンＩＩ等が増加し、ナトリウム再吸収による体内ナトリウムが過剰となり、血圧の上昇を引き起こすことが報告されている（茂原治ら：代謝，２８，２，３２３，１９９１）。さらに、このような知見をもとに、高血圧治療薬として使用されているアンジオテンシン変換酵素阻害剤であるエナラプリル及びアラセプリルのストレスによる高血圧に対する効果が研究されている（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ；６８，１５，１３６２（１９９１），Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；３２，９，６９１（１９９３））。
また、心理的ストレスが大脳で感知されると、広範な脳部位でノルアドレナリンの放出が亢進し、それが引金となって不安や緊張といった精神症状を引き起こすことが報告されている（田中正敏：代謝、Ｖｏｌ．２６，ｐ１２２−１３１，１９８９）。これらのメカニズムとして、視床下部から副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）が放出され、それに呼応して下垂体から副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）の分泌が増加し、ＡＣＴＨは副腎皮質のコルチコイドを分泌することにより、生体防御機構が働くことが報告されている（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｖｏｌ．１０，ｐ２３９−２５２，１９８０）。
一方、視床下部は自律神経の中枢でもあるから、交感神経が刺激されてノルアドレナリンが分泌される。交感神経は副腎髄質にも分布しており、その刺激により、アドレナリンが血中に放出され、これらのカテコールアミンの作用により、心拍数や血圧の上昇、顔面の紅潮などの身体的変化が出現すると考えられている（Ｄｉｍｓｄａｌｅ，ＪＥ．，Ｍｏｓｓ，Ｊ．：Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｏｌ．２４３，ｐ３４０−３４２，１９８０）。
ストレスが強力であったり、長期間続いたりすると、全身の諸臓器に影響を及ぼし、その結果重篤な心身症、すなわち、消化性潰瘍、虚血性心疾患、脳血管障害、高血圧、抗脂血症などを引き起こすこともある。
現在ストレスにより生じる精神的・身体的症状の軽減及び予防剤としては、精神安定剤、抗不安剤及び睡眠薬等の化学合成薬剤が使用されている。しかし、これらの薬剤は、習慣性や副作用の問題があり、ストレスにより生じる精神的、身体的症状予防の目的で日常的に使用するのは好ましくない。また、軽度精神的疲労の対処療法としては、リラクゼーションやアロマテラピーなどが知られているが、個人差が大きく長期間にかつ継続的に行う必要がある。
そのため、日常的に連用可能で、安全性の問題を含まない、ストレスにより生じる精神的・身体的症状の軽減及び予防効果を示す抗ストレス剤の開発が求められている。
これまでの研究により、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリＬ−乳酸混合物は、抗悪性腫瘍剤として有用であることが報告されている（特開平９−２２７３８８号公報および特開平１０−１３０１５３号公報）。しかＬながら、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物がストレス抑制作用を発揮するかどうかの評価については報告されていない。
発明の開示
本発明は、ストレス抑制のために使用することができる新規な抗ストレス剤を提供することを解決すべき課題とした。より具体的には、本発明は、日常的に連用可能で、安全性が高く、ストレスにより生じる精神的・身体的症状を軽減及び予防できる抗ストレス剤を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、ストレス抑制のための飲食品を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決することを目的とした検討を行うために、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物をラットに投与して、水浸拘束ストレス誘起胃粘膜損傷の発生の程度を検討した。その結果、ポリ乳酸混合物の投与により胃粘膜損傷の発生は有意に抑制されることが判明した。
本発明者らはまた、寒冷ストレスに暴露した糖尿病モデルマウスの生存率に及ぼすポリ乳酸混合物の効果を調べた。その結果、ポリ乳酸混合物を投与した場合の方が糖尿病モデルマウスの生存率が高くなることが判明した。
さらに本発明者らは、ストレス下においたマウスのリンパ球数、腫瘍の形成、および嫌気的酵素活性を測定した。その結果、ポリ乳酸混合物の投与によりストレスに伴うリンパ球数の減少や嫌気的酵素活性の亢進が抑制され、抗腫瘍効果が奏されることが実証された。
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含む抗ストレス剤が提供される。
本発明の抗ストレス剤は、例えば、ストレスに起因する医学的症状を予防又は改善するために使用することができ、より具体的には、ストレスに起因する免疫機能の低下の予防又は改善、ストレスに起因する潰瘍又は腫瘍の予防又は改善、並びに疾患患者のストレスに対する生存率の向上のため等に使用することができる。
好ましくは、ポリ乳酸中における反復単位である乳酸は実質的にＬ−乳酸から成る。
好ましくは、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、乳酸を不活性雰囲気下で脱水縮合し、得られた反応液のエタノールおよびメタノール可溶分を逆相カラムクロマトグラフィーに付し、ｐＨ２〜３の２５〜５０重量％のアセトニトリル水溶液で溶離後、ｐＨ２〜３の９０重量％以上のアセトニトリル水溶液で溶離した画分である。
好ましくは、脱水縮合を窒素ガス雰囲気下、段階的減圧及び昇温により行う。
好ましくは、逆相カラムクロマトグラフィーを、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより行う。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の抗ストレス剤を含む、ストレス抑制のための飲食品が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、抗ストレス剤又はストレス抑制のための飲食品の製造における、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の使用が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の有効量をヒトなどの哺乳動物に投与することを含む、ストレスを抑制するための方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施態様および実施方法について詳細に説明する。
本発明の抗ストレス剤は、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を有効成分として含み、ストレスにより生じる精神的・身体的症状を軽減及び予防するために使用することができる。
本発明の抗ストレス剤の使用の対象となるストレスの原因（ストレッサー）は特に限定されない。ストレッサーとしては、例えば、物理的環境要因（温度、騒音、地震等）、社会・文化的状況（戦争、経済危機、政変等）、個人の環境条件（家庭、学校、職場等）の変動（転居、転校、転勤、退職等）、人間関係の軋轢、葛藤等の他、過労、外傷、身体病等の生物学的要因も含まれる。これらのストレッサーは、今日見られる多くの心身症において、その直接の発症要因となっているか、又はその発症に重要な作用を果たしていると考えられている。
ストレスとは、上記したようなストレスの原因（例えば、痛み、発熱などの疾病や障害などの身体的な刺激、社会や家庭における人間関係から生ずる緊張、不安、恐怖などの精神的刺激、さらに騒音とか気象変化などの物理的環境因子などが挙げられる）が生体に加わった際に、精神や身体に生ずるひずみと考えられている。
生体は何らかの障害を与えるような刺激に対し、その刺激に特有な反応を示すと同時に、刺激の種類に関係なく、共通の反応として交感神経−副腎髄質系と下垂体−副腎皮質系の活動が高まり、アドレナリンが分泌され、血圧が上昇し、脈拍数や呼吸数が増加する一方、副腎皮質からのコルチゾールというホルモンの分泌が増加し、生体が防御あるいは適応しようとする反応を示す。この反応はストレス反応と呼ばれ、次のようなしくみによって発生することが知られている。すなわち生体に身体的あるいは精神的ストレッサーが加わると、その情報は中枢神経系に達し、視床下部に及ぶ。ここからストレス反応の指令が出るが、その伝達は大きく二つの経路を介して行われる。その一つは交感神経系を介するもので、大部分は交感神経そのものが生体内の種々の器質に達し、神経末梢からノルアドレナリンを放出して効果を発揮する。またその一部分は副腎髄質に達し、刺激によりアドレナリンを分泌せしめる。もう一つのストレス情報伝達経路は、視床下部から下垂体のＡＣＴＨというホルモン分泌を刺激するホルモン（ＣＲＨ）を放出することにより、下垂体からＡＣＴＨが分泌され、これが血液により副腎皮質に運ばれて、副腎皮質を刺激して、コルチゾールというホルモンの分泌を促進する。
ストレス反応は、生体にとって防御反応という有用的な役割を担っているが、反応時にコルチゾールやアドレナリンが過剰に分泌されるため、多くの器質に対し有害に作用し、生体の恒常性が維持できなくなってストレス病が引き起こされると考えられている。すなわちコルチゾールの過剰により、胃や十二指腸の粘膜が破壊されて胃・十二指腸潰瘍が引き起こされたり、免疫機能を抑制するので、感染抵抗が低下したり、ガンが起こり易くなる。アドレナリンの過剰は、高血圧や循環器疾患を引き起こし易くする。
本発明の抗ストレス剤を被検者に投与した場合、ストレスの負荷に応答して発生する免疫機能の低下等の生理的な指標の変化が、非投与時の場合と比べて小さくなる。従って、本発明の抗ストレス剤は、被検者のストレスを低減する効果があると考えられ、日常生活で感じる様々なストレスに起因する医学的症状の発症を防止したり、その症状を軽減、緩和させることができる。
ストレスに起因する医学的症状としては、免疫機能の低下、潰瘍又は腫瘍の発生、疾患患者の生存率の低下などが挙げられる。
ストレスに起因するより具体的な医学的症状としては、動脈硬化症、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞）、本態性高血圧、心臓神経症、不整脈などの循環器系疾患や、気管支喘息、過呼吸症候群、神経性咳嗽などの呼吸器系疾患や、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、神経性食欲不振症、神経性嘔吐症、腹部膨満症、空気嚥下などの消化器系疾患や、肥満症、糖尿病、心因性多飲症、バセドウ病などの内分泌代謝系疾患や、偏頭痛、筋緊張性頭痛、自律神経失調症などの神経系疾患や、夜尿症、インポテンツ、過敏性膀胱などの泌尿器系疾患や、慢性関節リウマチ、全身性筋痛症、脊椎過敏症などの骨筋肉系疾患や、神経性皮膚炎、円形脱毛症、多汗症、湿疹などの皮膚系疾患や、メニエール症候群、咽喉頭部異物感症、難聴、耳鳴り、乗物酔い、失声吃音などの耳鼻咽喉科領域の疾患や、原発性緑内症、眼精疲労、眼瞼けいれん、眼ヒステリーなどの眼科領域の疾患や、月経困難症、無月経、月経異常、機能性子宮出血、更年期障害、不感症、不妊症などの産婦人科領域の疾患や、起立性調節障害、再発性臍疝痛、心因性の発熱、夜驚症などの小児科領域の疾患や、腸管癒着症、ダンピング症候群、頻回手術症（ポリサージャリー）、形成手術後神経症などの手術前後の状態や、特発生舌痛症、ある種の口内炎、口臭症、唾液分泌異常、咬筋チェック、義歯神経症などの口腔領域の疾患や、神経症、うつ病、並びに腫瘍形成などを挙げることができる。
本発明の抗ストレス剤は、ストレスを受ける前に予め摂取しておくと、ストレスを受けにくく、また、ストレスを受けても医学的症状の発症を防止しやすいという予防的作用を有する。従って、本発明の抗ストレス剤は、健康食品や医薬品として日頃から摂取しておくことも好ましい。
本発明の抗ストレス剤、及びストレス抑制のための飲食品においては、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が有効成分として用いられる。
本明細書で言う「ポリ乳酸混合物」とは、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸が任意の割合で存在する混合物を意味する。即ち、「混合物」という用語は、縮合度３〜２０の何れかを有するポリ乳酸の混合物であることを意味すると同時に、環状および鎖状のポリ乳酸の混合物を含む概念としても用いられる。このような「ポリ乳酸混合物」は、本明細書中以下に述べるように、乳酸を脱水縮合し、適当な方法で精製することにより得ることができる。なお、本明細書では便宜上「ポリ乳酸混合物」という用語を用いたが、この中には一定の縮合度を有する環状のポリ乳酸または一定の縮合度を有する鎖状のポリ乳酸といった単一成分から成るポリ乳酸も含まれる。
縮合度とは、ポリ乳酸中における反復単位である乳酸単位の数を意味する。例えば、環状のポリ乳酸は下記の構造式を有することが推測されるが、式中のｎが縮合度を表す（即ち、ｎ＝３〜２０）。
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本明細書で単に「乳酸」と称する場合、この乳酸にはＬ−乳酸、Ｄ−乳酸またはこれらの任意の割合の混合物の全てが包含される。本発明においては好ましくは、乳酸は実質的にＬ−乳酸から成る。ここで言う「実質的に」とは、ポリ乳酸混合物中におけるＬ−乳酸単位の比率［即ち、（Ｌ−乳酸単位数／Ｌ−乳酸単位数＋Ｄ−乳酸単位数）×１００］が、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であることを意味する。なお、ポリ乳酸混合物中におけるＬ−乳酸単位の比率は、出発物質として使用する乳酸中に存在するＬ−乳酸とＤ−乳酸の比率に依存する。
縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、特開平９−２２７３８８号公報、特開平１０−１３０１５３号公報、または特願平１１−３９８９４号明細書（これらの特許明細書に記載の内容は全て引用により本明細書の開示として含める。）などに記載の製造方法により得ることができる。
より具体的には、例えば、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、下記の方法Ａにより得ることができる。
方法Ａ：
先ず、乳酸（好ましくは、実質的にＬ−乳酸から成る乳酸）を不活性雰囲気下で脱水縮合させる。不活性雰囲気としては、例えば、窒素ガス、アルゴンガスなどが挙げられるが、窒素ガスを用いるのが好ましい。
脱水縮合反応は、常圧〜１ｍｍＨｇ程度の減圧下、１１０〜２１０℃、好ましくは１３０〜１９０℃の温度で行われるが、段階的減圧および段階的昇温によって行うのが特に好ましい。反応時間は適宜設定できるが、例えば１〜２０時間反応を行うことができる。段階的減圧および段階的昇温を用いる場合には、反応時間を２以上から成る部分的な反応時間に分け、それぞれの部分において圧力と温度を設定して反応を行う。段階的減圧を用いる場合は、例えば、常圧→１５０ｍｍＨｇ→３ｍｍＨｇと減圧することができ、段階的昇温を用いる場合は、例えば、１４５℃→１５５℃→１８５℃と昇温することができる。実際には、これらを組み合わせて、例えば、１４５℃で常圧で３時間、１４５℃で１５０ｍｍＨｇで３時間、１５５℃で３ｍｍＨｇで３時間そして１８５℃で３ｍｍＨｇで１．５時間反応を行うことができる。
次いで、この脱水縮合反応により得られた反応混合物にエタノールおよびメタノールを加え、濾過して濾液を乾燥してエタノールおよびメタノール可溶分が得られる。即ち、本明細書で言う「エタノールおよびメタノール可溶分」とはエタノールとメタノールの混合液に可溶な画分を意味する。なお、エタノールおよびメタノール可溶分を得る際には、脱水縮合反応の反応混合物をエタノールおよびメタノールと混合するが、その際のエタノールとメタノールの比率は適宜設定することができ、例えばエタノール：メタノール＝１：９である。なお、反応混合物にエタノールとメタノールを添加する順番、方法などは限定されず、適宜選択することができ、例えば、脱水縮合反応の反応混合物に先ずエタノールを添加し、次いでメタノールを添加することができる。
上記で得られたエタノール・メタノール可溶分を逆相カラムクロマトグラフィー、特にオクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラムを用いたクロマトグラフィーに付し、まずｐＨ２〜３の２５〜５０重量％のアセトニトリル水溶液で溶離する画分を除去し、次いでｐＨ２〜３の９０重量％以上のアセトニトリル水溶液、好ましくは９９重量％以上のアセトニトリル水溶液で溶離してくる画分を採取すると、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が得られる。
上記のようにして得られた環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、水酸化ナトリウムなどのアルカリ物質で中和し、減圧乾燥後、常法により下記に述べるような所望の形態に製剤化することができる。
本発明で用いる縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を製造するための別法としては、例えば、特願平１１−２６５７１５号明細書に記載された方法（方法Ｂとする）または特願平１１−２６５７３２号明細書に記載された方法（方法Ｃとする）を挙げることができる（これらの特許明細書に記載の内容は全て引用により本明細書の開示として含める。）。以下、方法Ｂおよび方法Ｃについて具体的に説明する。
方法Ｂ：
この方法は、ラクチドをＲＹＬｉ（式中、Ｒは脂肪族基又は芳香族基を示し、Ｙは酸素原子又はイオウ原子を示す）で表されるリチウム化合物の存在下で重合させることによって環状乳酸オリゴマーを製造する方法である。重合反応を実施する場合、リチウム化合物（ＲＹＬｉ）の使用割合は、ラクチド１モル当たり、１〜０．１モル、好ましくは０．２〜０．３モルの割合である。反応温度は−１００〜０℃、好ましくは−７８〜−５０℃である。反応は、−７８〜−５０℃の温度で開始し、徐々に室温にまで昇温させるように実施するのが好ましい。反応は、好ましくは反応溶媒の存在下で実施される。反応溶媒としては、テトラヒドロフラン等の環状エーテルの他、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン等を用いることができる。反応雰囲気としては、窒素ガスやアルゴン等の不活性ガス雰囲気が用いられる。反応圧力は特に制約されず、好ましくは常圧である。
なお、上記のようにして得られる乳酸オリゴマーの組成（即ち、環状乳酸オリゴマーと鎖状乳酸オリゴマーの混合比率）は、反応助剤として用いるリチウム化合物によって変動する。リチウム化合物として炭素数１〜３のアルキルアルコールのリチウム化合物（ＲＯＬｉ）（式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキル基）を用いる場合には、環状乳酸オリゴマーと鎖状オリゴマーとの混合物（環状乳酸オリゴマーの割合：８０〜８５重量％）が得られる。一方、リチウム化合物としてｔ−ブチルアルコール等の炭素数４以上のアルキルアルコールのリチウム化合物や、チオフェノール化合物を用いるときには、実質的に環状乳酸オリゴマーのみを選択的に得ることができる。
方法Ｃ：
この方法は、（ｉ）乳酸を３５０〜４００ｍｍＨｇの圧力条件で１２０〜１４０℃の範囲の温度に加熱し、脱水縮合反応させるとともに、ラクチドを留出させずに副生水のみを留出除去する第１加熱工程、
（ｉｉ）該第１加熱工程終了後、反応生成物を１５０〜１６０℃の温度に加熱し、該反応圧力を降圧速度０．５〜１ｍｍＨｇ／分で１５〜２０ｍｍＨｇまで降下させるとともに、その降圧に際し、ラクチドの留出を回避させながら副生水のみを留出除去し、該反応圧力が１５〜２０ｍｍＨｇに降下後、同圧力条件及び反応温度１５０〜１６０℃においてさらに反応を継続して鎖状乳酸オリゴマーを主成分とする脱水縮合物を生成させる第２加熱工程、
（ｉｉｉ）該第２加熱工程終了後、０．１〜３ｍｍＨｇの圧力条件で１５０〜１６０℃で加熱して該鎖状乳酸オリゴマーを環化させ、環状オリゴマーを生成させる第３加熱工程、
からなることを特徴とする方法である。
この方法では先ず、第１加熱工程において、減圧下において乳酸を加熱し、脱水縮合反応させる。この場合の反応時間は３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。この第１加熱下での反応は、その反応を円滑に進行させるために、乳酸の脱水縮合により生成する副生水を留去させるが、この場合、乳酸２分子の脱水縮合物であるラクチドが留去しないように実施する。このためには、反応圧力を減圧、好ましくは３００〜５００ｍｍＨｇ、より好ましくは３５０〜４００ｍｍＨｇに保持し、この圧力条件下において、１００〜１４０℃、好ましくは１３０〜１４０℃の範囲に加熱するのがよい。この第１加熱工程での反応により、主に、乳酸の３〜２３分子の脱水縮合物を主成分とする反応生成物が生じる。
上記第１加熱工程の終了後、第２加熱工程において、高められた平均重合度のオリゴマーが得られるように、前記第１加熱工程における反応温度よりも高められた温度、好ましくは１４５〜１８０℃、より好ましくは１５０〜１６０℃の温度に加熱するとともに、反応圧力を１０〜５０ｍｍＨｇ、好ましくは１５〜２０ｍｍＨｇの圧力に降下させてさらに脱水縮合反応を継続する。
この反応も、前記第１加熱工程の反応の場合と同様に、反応を円滑に進行させるために副生水を留去させるが、ラクチドが留去しない条件で実施する。反応圧力を前記範囲の圧力にまで降下させる速度（降圧速度）は、ラクチドの留出を回避し、且つ反応効率を高めるためには、０．２５〜５ｍｍＨｇ／分、好ましくは０．５〜１ｍｍＨｇ／分の範囲に保持することが通常は必要である。前記範囲より低い降圧速度では、その所定圧まで降圧させるのに必要な時間が長くなるため好ましくなく、一方、前記範囲より高い降圧速度では、ラクチドが副生水とともに留去するようになるので好ましくない。
反応圧力が所定圧力にまで降下後、この反応圧力において、さらに反応を継続する。この場合の加熱時間は、３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。
前記第２加熱工程での反応により、平均重合度が３〜３０、好ましくは３〜２３の乳酸オリゴマーが得られるが、この場合のオリゴマー中の環状オリゴマーの割合は、通常、７０〜８０重量％程度である。
上記第２加熱工程終了後、第３加熱工程において、反応圧力を０．２５〜５ｍｍＨｇ、好ましくは０．５〜１ｍｍＨｇに保持し、１４５〜１８０℃、好ましくは１５０〜１６０℃の温度でさらに反応を継続する。反応時間は３〜１２時間、好ましくは５〜６時間である。この場合に生じる副生水も留去させる。この場合、ラクチドの留去も回避させることが好ましいが、反応生成物にはラクチドは殆んど含まれないので、その降圧速度を格別遅くする必要はない。
前記第３加熱工程での反応により、平均重合度３〜３０、好ましくは３〜２３で、かつ環状オリゴマーの割合が９０重量％以上、好ましくは９９重量％以上の乳酸オリゴマーが生成される。
なお、上記方法Ａ、ＢおよびＣは本発明で用いるポリ乳酸混合物の製造方法の具体例の一部を示したものにすぎず、本発明においては他の方法で製造されたポリ乳酸混合物を用いることもできる。
本発明の抗ストレス剤の効果は、例えば実験動物を使用し、水浸拘束ストレス誘起法により胃粘膜損傷を生じさせることにより確認することができる。具体的には、実験動物（例えば、ラットなど）をストレスケージに入れ、１０時間で２２〜２３℃の水槽に劍状突起の高さまで浸し、ストレス負荷する。薬物はストレス負荷する前に投与する。次いで、実験動物をエーテル麻酔下に開腹し、胃を摘出し、噴門部結紮後２％ホルマリン液を十二指腸より胃内に注入し、固定する。また漿膜側からも同液中に浸すことにより固定する。その後、大弯に沿って切開し、胃粘膜損傷の長さを測定する。胃粘膜損傷の大きさが対照群よりも小さくなることにより、本発明の抗ストレス剤の効果を確認できる。
本発明の抗ストレス剤の効果は、閉所拘束ストレスを付与した実験動物におけるリンパ球数の変動を測定することによっても確認することができる。具体的には、実験動物（例えば、マウスなど）をアクリルケースに収容して飼育し、抗ストレス剤を含む固形食を摂取させる。固形食の投与開始後、毎週１回、マウスを細い円筒の中に一定時間入れて閉所拘束ストレスを４週間（４回）与える。拘束を終了した後、直ちにジエチルエーテル麻酔下で尾静脈から血液を採血し、光学顕微鏡下でリンパ球数を計測する。ストレスによるリンパ球数の減少が抑制されることにより、本発明の抗ストレス剤の効果を確認できる。
本発明の抗ストレス剤は、前記の必須成分に加えてさらに必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲内で、医薬品類、医薬部外品類などの製剤に使用される成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができる。本発明の抗ストレス剤は、単独の医薬品類として使用できる以外に、医薬品類や医薬部外品類などに配合して用いることもできる。
本発明の抗ストレス剤の形態は特に限定されず、経口投与又は非経口投与用の製剤形態の中から目的に最も適した適宜の形態のものを選択することが可能である。
経口投与に適した製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、ドリンク剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤、チュアブル剤などを挙げることができ、非経口投与に適する製剤形態としては、例えば、注射剤（皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射など）、外用剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
経口投与に適当な液体製剤、例えば、溶液剤、乳剤、又はシロップ剤などは、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを用いて製造することができる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などの固体製剤の製造には、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いることができる。
非経口投与に適当な注射用又は点滴用の製剤は、好ましくは、受容者の血液と等張な滅菌水性媒体に有効成分である上記の物質を溶解又は懸濁状態で含んでいる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、ブドウ糖溶液、又は塩水とブドウ糖溶液との混合物からなる水性媒体などを用いて溶液を調製することができる。腸内投与のための製剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪、又は水素化カルボン酸などの担体を用いて調製することができ、座剤として提供される。また、噴霧剤の製造には、有効成分である上記の物質を微細な粒子として分散させることができ、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分の吸収を容易ならしめる担体を用いることができる。担体としては、具体的には、乳糖又はグリセリンなどが例示される。有効成分である物質及び使用する担体の性質に応じて、エアロゾル又はドライパウダーなどの形態の製剤が調製可能である。これらの非経口投与用製剤には、グリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種又は２種以上の飲食品を添加することもできる。
本発明の抗ストレス剤の投与量及び投与回数は、投与の目的、投与形態、摂取者の年齢、体重又は性別などの条件などを含む種々の要因により適宜設定することができるが、一般的には、有効成分の投与量として一日当り１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０〜２０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０〜２００ｍｇ／ｋｇである。上記投与量の製剤を一日１〜４回程度に分けて投与することが好ましい。
本発明の抗ストレス剤の投与時期は特に限定されず、ストレス負荷が予想される時、またはストレス負荷時に服用して、ストレスの予防または軽減を計る他、常用により、ストレスを予防または軽減することができる。
本発明はさらに、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含むストレス抑制のための飲食品にも関する。即ち、本発明で用いる縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物は、上記したような単独の製剤の形態で使用するのみならず、飲食品の中に配合して用いることができる。
本発明のストレス抑制のための飲食品は、ポリ乳酸混合物を分解させることなく配合し得るものであれば、その配合形態には特に制限はない。
本発明によるストレス抑制のための飲食品の製品の具体例としては、清涼飲料、ドリンク剤、健康食品、特定保健用食品、機能性食品、機能活性型食品、栄養補助食品、サプレメント、飼料、飼料添加物などと一般に呼称される、飲料を含む健康食品または補助食品が挙げられる。
飲食品の具体例としては、例えば、チューインガム、チョコレート、キャンディー、錠菓、ゼリー、クッキー、ビスケット、ヨーグルト等の菓子類、アイスクリーム、氷菓等の冷菓類、茶、清涼飲料（ジュース、コーヒー、ココア等を含む）、栄養ドリンク剤、美容ドリンク剤等の飲料、パン、ハム、スープ、ジャム、スパゲティー、冷凍食品など任意の飲食品を挙げることができる。あるいは、本発明で用いるポリ乳酸混合物は調味料又は食品添加剤などに添加して用いることもできる。本発明の飲食品を摂取することによりストレス抑制効果が発揮され、実質的に有害な副作用を示さない安全な飲食品を提供することができる。
本発明のストレス抑制のための飲食品は、ポリ乳酸混合物を、食品に使われる一般的な原料に直接混合、分散したのち、公知の方法により所望の形態に加工することによって得ることができる。
本発明のストレス抑制のための飲食品はあらゆる形態の飲食品を包含するものであり、その種類は特に制限されず、上記したような各種飲食物、あるいは各種栄養組成物、例えば各種の経口又は経腸栄養剤や飲料等に、本発明の抗ストレス剤を配合して飲食品として提供することができる。このような飲食品の組成としては、縮合度３〜２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物の他に、蛋白質、脂質、糖質、ビタミン及び／又はミネラル類などを含めることができる。飲食品の形態は特に限定されず、摂取しやすい形態であれば、固形、粉末、液体、ゲル状、スラリー状等のいずれであってもよい。
飲食品中におけるポリ乳酸混合物の含有量は特には限定されないが、一般的には０．１〜２０重量％、より好ましくは０．１〜１０重量％程度である。
飲食品に含まれるポリ乳酸混合物の量は、本発明の目的とするストレス抑制作用を発揮できる程度に含まれることが好ましく、好ましくは摂取される飲食物１食中に０．１ｇから１０ｇ程度、より好ましくは０．５ｇから３ｇ程度である。
なお、本出願が主張する優先権の基礎となる日本特許出願である特願２００１−１６１４５号の明細書に記載の内容は全て、本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によっていかなる点においても限定されることはない。
実施例
製造例１：ポリ乳酸混合物（以下、ＣＰＬとも称する）の製造
マントルヒーターに収めたセパラブルフラスコにＬ−乳酸（Ｄ−乳酸も混入しているもの）５００ｍｌを入れた。窒素ガス３００ｍｌ／分の流入及び撹拌を行い、溜出水は保温した下降型接続管を経て還流冷却器付フラスコに導きながら、１４５℃で３時間加熱した。更に１５０ｍｍＨｇに減圧して同温度で３時間加熱した後、３ｍｍＨｇの減圧下１５５℃で３時間、最後に３ｍｍＨｇの減圧下１８５℃で１．５時間加熱し、反応生成物であるポリ乳酸を得た。
得られたポリ乳酸は１００℃に保ち、エタノール１００ｍｌに続いてメタノール４００ｍｌをそれぞれ加えた後放冷した。これをメタノール５００ｍｌ中に加え、よく撹拌して静置した後濾過して精製した。その濾液を減圧乾燥してアセトニトリルに溶解し、全量を２００ｍｌ（原液）とした。
この原液を、予め平衡化した逆相ＯＤＳカラム（ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ）にかけ、０．０１Ｍ塩酸を含む３０％、５０％および１００％アセトニトリル（ｐＨ２．０）でステップワイズに溶離し、アセトニトリル１００％溶出画分であるポリ乳酸（縮合度３〜２０）を得た。得られた物質の質量スペクトルを図１に示す。図１中の規則的なフラグメントイオンピークから明らかなように、得られたポリ乳酸の混合物は、環状縮合体を主体とし、直鎖状縮合体が少量混在した状態になっている。
試験例１：モデルラットにおける水浸拘束ストレス誘起胃粘膜損傷に対するＣＰＬの効果
（材料及び方法）
実験には６週令の雄性Ｄｏｎｒｙｕ系ラット（日本ＳＬＣ、実験時体重１８０〜２００ｇ）を使用した。
ＣＰＬは４０℃に加温したグリセリンで溶解させた後、プロピレングリコールを加えて１００ｍｇ／ｍｌに調整した。その後、蒸留水で希釈し、５０ｍｇ／ｋｇの用量にした。薬物は体重２００ｇあたり１ｍｌの割合で１日に１回ずつ１０日間経口投与した。対照群として溶媒のみを同用量で経口投与した。
水浸拘束ストレス誘起胃粘膜損傷を以下の通り作製した。ラットは実験開始前１８時間は絶食し、水の摂取は実験開始２時間前までは自由とし、以後絶水した。ラットを東大薬作型ストレスケージ（夏目製作所）に入れ、１０時間で２２〜２３℃の水槽に劍状突起の高さまで浸し、ストレス負荷することにより作製した。なお薬物はストレス負荷する３０分前に再び投与した。
胃損傷面積の測定は以下の通り行なった。エーテル麻酔下に開腹し、胃を摘出した。噴門部結紮後２％ホルマリン液８ｍｌを十二指腸より胃内に注入し１０分間固定した。また漿膜側からも同液中に１０分間浸すことにより固定した。その後、大弯に沿って切開し、実体顕微鏡に損傷の長さ（ｍｍ）を測定した。
結果は平均値±標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．；Ｎ＝１０〜１１）で表示した。統計学的有意性の検討はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用い、Ｐ＜０．０５を有意とした。
（結果）
測定結果を以下の表１および図２に示す。
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表１及び図２に示す通り、ストレス負荷することにより誘起される損傷の総和の平均は１７．９±１．６ｍｍであったのに対し、ＣＰＬの１０日間連続投与により水浸拘束ストレス誘起胃粘膜損傷の発生は有意に抑制され、損傷の総和の平均は１３．１±１．３ｍｍであった。
試験例２：寒冷ストレスに暴露した糖尿病モデルマウスの生存率に及ぼすＣＰＬの効果
（方法）
日本クレア株式会社に委託し、栄養素の含有率は標準固形食ＣＥ２と同じで、ＣＰＬを１％含む特別固形食（１％ＣＰＬ食）を作製した。
日本クレア株式会社より６週令のＩＩ型糖尿病発症マウス（Ｃ５７−ｄｂ／ｄｂ）の雌を購入した。購入後直ちに標準固形食ＣＥ２を食べさせるＣＥ２群と、特別食（１％ＣＰＬ食）を食べさせるＣＰＬ群の２群に分けた。水は水道水を自由摂取させた。床敷きは日本クレア社製の実験動物用床敷熱乾燥「クリーンチップ」を用い、毎日交換した。
血糖値の測定の前日の１８：００に餌を抜き、当日の０８：３０〜０９：３０の間に採血した。採血後０．０１ｍｌの血液に０．１２ｍｌの５％−ＴＣＡを加えて撹拌し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して得られた上清を試料とした。グルコースをｏ−トルイジン−ホウ酸法で測定することにより血糖値の測定を行なった。
熱量計として電子科学株式会社製全身熱量計ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ  ＢＤＣ−２００を用いて放出熱量の測定を行なった。マウスを０９：００に全身熱量計に入れ、翌日の１７：００に取り出した。熱量測定中も餌と水は自由に取らせた。
（結果）
寒冷ストレスに暴露した糖尿病モデルマウスの生存率に及ぼすＣＰＬの効果を図３に示す。ＣＥ２群は飼育開始後９２日に実施した熱量測定による３１時間の寒冷暴露で６例中４匹が死亡し、残る２匹も、飼育開始後１８１日と２５４日に死亡した。ＣＰＬ群は飼育開始後８２日に実施した熱量測定による３１時間の寒冷暴露で６例中１匹が死亡し、飼育開始２４２日に１匹が死亡したが、４匹が現存している。
空腹時血糖値の測定結果を図４に示す。現存しているＣＰＬ群の４匹の飼育開始後３１０日の平均空腹時血糖値は２１０ｍｇ／ｄｌ、飼育開始後４３２日の平均空腹時血糖値は１７０ｍｇ／ｄｌであった。
現存しているＣＰＬ群４個体の空腹時血糖値を表２に示す。４個体中３個体の飼育開始後４７２日の空腹時血糖値は、飼育開始後７８日の空腹時血糖値よりも大幅に低下していた。特にｄｂ／ｄｂ▲４▼と▲６▼の空腹時血糖値は正常値を示した。この２個体は摂食後でも尿糖は検出されなかった。
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また、放出熱量に及ぼすＣＰＬの効果を表３に示す。飼育開始後１４０日のＣＰＬ群の平均放出熱量は３２．０ｋＪ／日で、ｄｂ／−群の７７％であった。飼育開始後４８０日の平均放出熱量は４１．５ｋＪ／日で、飼育開始後１４０日のｄｂ／−群の値と同じであった。
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上記の通り、ＣＰＬを含まない標準食で飼育していたｄｂ／ｄｂマウスの生存期間は短く、６匹全てが生後約１０ヶ月で死んだ。１％ＣＰＬ含有餌飼育群では６匹中４匹が生存している。生存しているマウス４匹中２匹の空腹時血糖値は正常範囲であり、尿糖も検出されなかった。すなわち、ＩＩ型糖尿病が治癒していた。４匹中１匹の高血糖もほぼ正常値にまで改善され、尿糖は検出されたが、わずかであった。
試験例３：閉所拘束ストレスを付与したマウスにおけるリンパ球数の変動に及ぼすＣＰＬの効果
（方法）
４週齢の雄ＣＢＡ／ＪＮＣｒマウスをアクリルケースに収容して飼育した。マウスは、標準固形食ＣＥ２（日本クレア株式会社より入手）を自由摂取させたコントロール群とし、上記標準固形食に０．１％重量のポリ乳酸混合物（ＣＰＬ）を含む標準固形食ＣＥ２（日本クレア株式会社に依頼して入手）を自由摂取させたＣＰＬ群とにわけた。ＣＰＬ投与開始後、毎週１回、マウスを細い円筒（直径２．７ｃｍ、奥行き９．５ｃｍ）の中に１９時間（１７：００〜翌朝９：００）入れて閉所拘束ストレスを４週間（４回）与えた。拘束を終了した後、直ちにジエチルエーテル麻酔下で尾静脈から０．００５ｍｌの血液を採血し、光学顕微鏡下でリンパ球数を計測した。
（結果）
リンパ球数を計測した結果を表４に示す。表４に示すようにコントロール群のリンパ球数は閉所拘束ストレス開始後、３週目まで直線的に減少し、実験開始前の約３０％に低下し、４週目でもその値に変動は認められなかった。ＣＰＬ群では、１回目の閉所拘束ストレス実験後コントロール群と同様、リンパ球の減少が認められたが、その後閉所拘束ストレスを繰り返してもリンパ球数はほぼ同等の数を維持した。
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試験例４：ストレス下におけるＣＰＬによる発癌抑制効果
試験例３で使用したマウスは、肺胞上皮過形成を自然発癌する系統のマウスである。これまでの研究から、腫瘍組織は嫌気的解糖系に依存してエネルギーを得ているが、ＣＰＬはこの解糖系を抑制することにより上記発癌を抑制する効果を有する物質であることが認められている（第５６回日本癌学会総会記事第６０５頁；日本癌治療学会誌第３２巻第５号第１６５頁；第５７回日本癌学会総会記事第６４６頁；日本癌治療学会誌第３３巻第３号第２２２頁）。そこで、試験例３と同様の条件下でマウスを飼育し、本ストレス下における発癌抑制効果を検討した。
実験群は、標準固形食ＣＥ２（日本クレア株式会社より入手）を自由摂取させた群をコントロールとし（ストレス群）、上記標準固形食に０．１％重量のＣＰＬを含む標準固形食ＣＥ２（日本クレア株式会社に依頼して入手）を自由摂取させた群（ストレスＣＰＬ群）に対して試験例１と同様の閉所拘束ストレスを加えた。さらに、ストレスを与えない条件下でＣＥ２を与えて飼育した群（ＣＥ２群）、ＣＰＬを含むＣＥ２を与えて飼育した群（ＣＰＬ群）も対照とした。
上記４群を３０週目まで飼育し、２０週目と３０週目にジエチルエーテル麻酔下で安楽死させ、肺を摘出した。肺の組織切片を作成し、肺胞上皮過形成の割合を光学顕微鏡で観察した結果を表５と表６に示す。表５は、投与開始後２０週目に肺における腫瘍範囲を比較した表である。各群６個体（１個体当たり５〜８ヶ所）の組織病理切片中に含まれる腫瘍範囲を観察した結果を％で示す。表６は、投与開始後３０週目に肺における腫瘍範囲を比較した表である。各群６個体（１個体当たり５〜８ヶ所）の組織病理切片中に含まれる腫瘍範囲を観察した結果を％で示す。
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表５の結果から、ＣＥ２を与えて飼育したマウスは、ストレス条件下では腫瘍範囲が拡大した。しかし、ＣＰＬを与えて飼育したマウスでは、ストレスの有無による腫瘍範囲の違いは認められなかった。つまり、腫瘍範囲が５０％を超えるものの割合は、ＣＥ２を摂取した場合、ストレスを与えることによって５．４％が３６．９％に増加したのに対し、ＣＰＬを摂取した場合には、ストレスを与えても８．３％であった。
また、表６の結果から、３０週間ＣＥ２を与えて飼育したマウスにおいて、５０％を超える腫瘍範囲の割合は、２０週目に比べ３．２５倍の１８．２％であった。この飼料を与えたマウスをストレス条件下で飼育すると６０％に増加したが、ＣＰＬを投与した場合には２３．６％であった。
さらに、３０週目に安楽死させたマウスの肺をホモジェナイズした試料を遠心分離して上清を作成し、嫌気的解糖系の酵素活性、つまり、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）、ホスフォフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を測定した。その結果を表７に示す。
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この結果から分かるように、閉所拘束ストレスによって肺における糖代謝の律速酵素活性が有意に上昇した。しかしながら、ＣＰＬ投与によってこれらの酵素活性はいずれもＣＥ２群との間に有意差はなかった。
試験例３および試験例４の結果から、ＣＰＬ投与によってストレスに伴うリンパ球数の減少や嫌気的酵素活性の亢進が抑制され、抗腫瘍効果が奏されることが実証された。
産業上の利用の可能性
本発明の抗ストレス剤は、各種ストレスの軽減又は予防のために使用することができる。また、本発明において有効成分として用いられるポリ乳酸混合物は、生体成分に由来する乳酸の低縮合体であることから、生体適合性が高く、副作用が少ない。従って、本発明の抗ストレス剤は、安全性に優れ、使用に際して特別な制限がなく、例えばドリンク剤等としてストレスを予防および／または軽減するために、日常的に用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、製造例１で得られたポリ乳酸混合物の質量スペクトルを示す。
図２は、ラットにおける水浸拘束ストレス誘起胃粘膜損傷の発達に及ぼすＣＰＬの影響を示すグラフである。
図３は、寒冷ストレスに暴露した糖尿病モデルマウスの生存率に及ぼすＣＰＬの効果を示すグラフである。
図４は、糖尿病モデルマウスの空腹時血糖値の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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