(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト遠位グリア細胞株由来の神経栄養因子（GDNF）プロモーター機能を有し、図3A〜3Bの-62位から-1位（配列番号:1のヌクレオチド1575から1636に相当）に記載のヌクレオチド配列、または図3A〜3Bの配列に沿って5’側へ延長された図3A〜3Bの-62位から-1位（配列番号:1のヌクレオチド1575から1636に相当）に記載のヌクレオチド配列からなるDNA。
【請求項２】
レポーター遺伝子に機能的に結合された請求項1記載のDNA。
【請求項３】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ヒト成長ホルモン、および緑色蛍光タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項2記載のDNA。
【請求項４】
請求項1から3のいずれか一項記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】
請求項1から3のいずれか一項記載のDNAまたは請求項4記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
哺乳動物細胞である請求項5記載の宿主細胞。
【請求項７】
GDNFを発現することができる請求項6記載の宿主細胞。
【請求項８】
請求項1から3のいずれか一項記載のDNAが宿主細胞の染色体DNAに組み込まれている、請求項5から7のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項９】
ヒト遠位グリア細胞株由来の神経栄養因子(GDNF)の発現を調節することができる化合物の同定方法であって、下記の段階を含む方法：
(a)  請求項2または3記載のDNAを細胞に導入する段階、
(b)  試験化合物を該細胞と混合し、レポーター遺伝子が発現しえる条件下で該細胞を培養する段階、
(c)  試験化合物の存在下および非存在下において、発現されたレポーター遺伝子産物のレベルを比較する段階であって、レポーター遺伝子産物の発現レベルの変化により該試験化合物がGDNF発現のレベルを調節することができることが示される段階。
【請求項１０】
宿主細胞が、GDNFを発現する哺乳動物細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物細胞が、U-87  MG細胞およびSK-N-AS細胞からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ヒトグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)の発現を調節することのできる化合物を同定することを目的とする、請求項2または3記載のDNAの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は広く神経栄養因子に関する。さらに詳しくは、本発明はヒトグリア細胞株由来の神経栄養因子(GDNF)プロモーター、ヒトGDNFプロモーターを含むリポーター遺伝子構築物、およびパーキンソン病または他の中枢および末梢神経変性疾患の治療において治療上有効な化合物をスクリーニングするために、その構築物を用いる方法に関する。
【０００２】
パーキンソン病は、アメリカにおいて推定60万人から100万人が罹患している原因不明の進行性神経変性疾患である。この病気は明確な階級または人種の選択性がなく、男女共に罹患する。パーキンソン病は、筋振せん、筋脱力、強直、姿勢および平衡の変化に伴う遅い動き（運動緩徐）のような症状を特徴とする。治療しなければ、罹患した人は５〜10年の間に、恒常的なケアを必要とする硬直した無動症へと進行的に悪化する。運動性の欠如から起こる合併症によりしばしば死に至る。現在のところ、パーキンソン病の診断法はなく、あらゆる治療はむしろ病気を治すというよりも一時的に軽減するといったものである。病理生理学からみると、パーキンソン病では、黒質緻密部内の色素沈着ドーパミン作動神経、ならびに青斑核および迷走神経背側運動核のメラニン含有ニューロンが重度に失われている。パーキンソン病の主な神経病理的病変は、ドーパミン作動神経が失われて線条体におけるドーパミン作動神経末端が枯渇することである。この選択的なニューロンの損失により、線条体内で神経伝達物質ドーパミンの濃度が減少する。
【０００３】
現在、パーキンソン病の症状を緩和する最も有効な治療は、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼの末梢的に作用する阻害剤と併用してL-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）を経口投与することである。L-DOPAは、ドーパミンと異なり、血液脳関門を通して、ドーパミン作動神経のシナプス前細胞終末へと能動的に輸送されるが、その際L-DOPAが脱炭酸されてドーパミンとなり、輸送タンパク質によって貯蔵小胞に隔離される。特に疾患過程の初期に治療を開始した場合には、L-DOPA治療はパーキンソン病の全症状を軽減する。
【０００４】
トランスフォーミング増殖因子-―(TGF-―)スーパーファミリーの遠戚メンバーに当たる、グリア細胞株由来の神経栄養因子（GDNF）は本来、胚腹側中脳（embryonic ventral midbrain）のドーパミン作動性神経の培養において、ドーパミン取り込みおよび細胞生存の誘発能があることから単離された。GDNFはラットB49グリア細胞の条件培地(conditioned media)から精製され、シークエンシングされており(リン（Lin）ら (1993), Science 260, 1130)、ラットGDNF cDNAはクローニングされて、ヒトゲノムライブラリーからその遺伝子のタンパク質コード部分を単離するために用いられている（国際特許公開番号、国際公開公報第93/06116号; GenBank 寄託番号L19062およびL19063）。
【０００５】
GDNFは、その天然型がホモダイマーとして存在する約39 kDのグリコシル化タンパク質である。ヒトおよび齧歯類では、一個の遺伝子から異なるスプライシング型を生じる。いずれの型も、タンパク分解プロセシングのためのコンセンサスシグナルペプチド配列およびコンセンサス配列を含む。タンパク分解的切断によって同一の成熟した134個のアミノ酸残基型が得られる。
【０００６】
GDNFは、哺乳類神経系の発生および分化に重大な役割を担っている。GDNFは、胚中脳ドーパミン作動神経のドーパミン取り込みおよび細胞生存ならびに、広範にわたる中枢・末梢神経系および非神経系細胞集団の生存および/または分化を促進する。中枢神経系では、インビトロ研究によって、中脳のドーパミン作動神経、小脳プルキンエ神経、ならびに頭蓋および脊髄運動神経の生存におけるGDNFの発生的役割が裏付けられている。末梢神経系では、GDNFは、交感、副交感、知覚および自律神経を含む、多くの神経細胞集団の発生をサポートする。
【０００７】
GDNF mRNA転写産物がGDNF感受性神経標的領域に局在することは、標的由来神経栄養因子としてのインビボにおけるGDNFの機能と一致している。さらに、GDNF欠損マウスを使った研究により、末梢神経細胞発生におけるGDNFの多面的役割ならびに、胚発生の際の、腎臓の発生にGDNFが不可欠な役割をもつことが確認されている。
【０００８】
発生の際のGDNFの重要性は充分明らかにされているが、成人におけるGDNFの役割はあまり明確ではない。臨床的な重要性については、外因性GDNFは、成体ラット脳の軸索切除による変性、および齧歯類における黒質ドーパミン作動神経の1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)誘発変性に対して、中脳のドーパミン作動神経を保護している。さらに、MPTPにより誘発されたパーキンソン病様症状を示すアカゲザルにGDNFを脳内投与すると、運動緩徐、筋強直および姿勢不安定性に有意な改善を示す。少なくとも一部これらの結果に基づき、パーキンソン病の治療に関して組換えGDNFを投与する臨床試験が行われている。
【０００９】
GDNF発現を調節する細胞および分子の働きについてはほとんど知られていない。細胞レベルにおいて、GDNF mRNAは神経細胞および星状細胞の双方に存在し、多くの神経栄養因子と同様、損傷組織ではその発現が上昇する。GDNF mRNAレベルは、興奮性アミノ酸に応答して、海馬神経、および海馬ならびに線条体の一次星状細胞において上昇する。
【００１０】
その相対的に大きいサイズのため、GDNFは血液脳関門を通過せず、脳内への直接投与が唯一の実行可能な投与手段となっている。このため、GDNFは脳内へ脳定位固定的（stereotaxic）に注入するか、またはGDNFを脳室内(intracerebroventricular: ICV)投与する必要があり、それによってGDNFの治療上の有用性は著しく制限される。一方、黒質神経を細胞死から保護する非侵襲的療法、例えば、内因性GDNFレベルおよび/またはその放出を特異的に増加させることを目的とした小分子は好ましいであろう。理想的には、そのような小分子を何らかの簡便な経路により投与して血液脳関門を通過させ、そしてGDNFの局所合成を増やすことができれば、それによってドーパミン作動神経の標的集団をパーキンソン病の危険にさらさないようにすることができる。そうした療法は、GDNFの実質内注射やICV注射、あるいはクモ膜下注射よりも脈動性が少なく、また侵襲性も低いであろう。
【００１１】
当技術分野ではGDNFの組織濃度を増加させる代替手段が求められている。そのような方法の一つは、転写レベルでGDNFの遺伝子発現を誘導することによって、内因性のGDNFレベルを高めることである。
【００１２】
従って、ヒトGDNF遺伝子から近位プロモーターおよび遠位プロモーターが初めて、同定され、シークエンシングされ、特徴付けされ、そしてクローニングされた。遠位および近位プロモーターは、真核細胞遺伝子調節エレメントに特徴的な配列をもっている。例えば、これらプロモーターは転写因子結合部位コンセンサス配列を含む。特定の態様において、遠位プロモーターは図3A〜3B(配列番号：1)の-62から-1位に記載のプロモーターヌクレオチド配列、図3A〜3B(配列番号：1)の-363から-1位に記載のプロモーターヌクレオチド配列、または図3A〜3B(配列番号：1)の-1635から-1位に記載のプロモーターヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
さらに、プロモーターが、当技術分野で周知の様々な手法のいずれかにより検出可能なポリペプチドをコードするリポーター遺伝子に機能的に結合された組換え構築物が作製された。この構築物を、ヒト神経細胞およびグリア細胞にトランスフェクトさせ、プロモーターの制御下で遺伝子発現を刺激するか否かについて、候補化合物をスクリーニングすることができる。このようにして、本発明は、インビボでGDNF遺伝子発現を誘導できる化合物が同定される手段および方法を提供する。そのような化合物は、許容される薬学的製剤において哺乳類被験者に投与した場合、中枢および末梢神経変性疾患ならびに腎疾患、泌尿生殖器疾患、胃腸疾患、そして物理的神経外傷の神経変性後遺症の治療に有用である。
【００１４】
さらに、本発明はGDNFの発現を調節する化合物を同定する方法を提供する。本方法は、(a)リポーター遺伝子に機能的に結合されたヒト遠位GDNFプロモーターを含むDNA断片を細胞に導入する段階；(b)試験化合物を細胞と混合して、細胞をリポーター遺伝子が発現し得る条件下で培養する段階；そして(c)リポーター遺伝子産物の発現レベルが変化すれば、試験化合物がGDNF発現レベルを調節できることが示される、試験化合物の存在下および非存在下において発現されたリポーター遺伝子産物のレベルを比較する段階を含む。
【００１５】
本発明のこれらおよび他の態様は、本明細書の開示を鑑みて、当業者には容易に想起されると思われる。
【００１６】
本発明の実施には、特記しない限り、当業者の技術内にある通常のタンパク質化学および生化学手法、分子生物学、微生物学および組換えDNA技術が使用される。そのような手法は文献に詳記されている。例えば、サムブルック（Sambrook）ら, 「分子のクローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 第2版(1989)；「DNAクローニング（DNA Cloning）」、第I巻、第II巻(グローバー（D.N. Glover）編、1985)；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」 (ゲイト（M.J. Gait）編1984)；「核酸のハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization ）」(ハームス（B.D. Hames）およびヒギンス（S.J. Higgins）編、1984)；「動物細胞培養（Animal Cell Culture）」 (フレッシュネイ（R.K. Freshney）編、1986)；シュライフ（Schleif）、「分子生物学の実際の方法（Practical Methods in Molecular Biology ）」(Springer-Verlag, NY, 1981)；「固定細胞と酵素（Immobilized Cells and Enzymes）」 (IRL Press, 1986); 「PCR：実際のアプローチ（PCR: A Practical Approach）」 (マクファーソン（McPherson）ら編、(1991) IRL Press); パーバル（Perbal, B.）、「分子クローニングの実際の手引き（A Practical Guide to Molecular Cloning）」 (1984); 叢書Methods In Enzymology (クロウィック（S. Colowick）およびカプラン（N. Kaplan）編、Academic Press, Inc.)。
【００１７】
本明細書に挙げた、上記および下記の特許、特許出願および刊行物はすべて参照として本明細書に組み入れられる。
【００１８】
I.  定義および命名法
本発明を詳細に開示・記載する前に、本発明は特定のアッセイ形式、材料または試薬に限定されず、当然それらは変更可能であることを理解しておくべきである。本明細書に使用する用語は特定の態様だけを説明する目的のためであり、限定する意図ではないことも理解するべきである。
【００１９】
本明細書および特許請求の範囲において使用される、単数形(「a」「an」および「the」)は、文脈中で明らかにそうではないことを明記していない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「GDNFプロモーター（a GDNF promoter）」を含むプラスミドまたはベクターと記載した場合、この用語にはそのようなプロモーターを複数含む複数のプラスミドまたは複数のベクターが含まれ、「ヒト細胞株（a human cell line）」と記載した場合、これはそのような細胞株を１以上含むことを意味し、「転写開始部位（a transcription initiation site）」と記載した場合、これは転写開始部位を1つ以上含むことを意味する。
【００２０】
本明細書および特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義される多数の用語が使用される。
【００２１】
「GDNFプロモーター」とは、RNAポリメラーゼに結合し、下流（3'方向）のコード配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。本発明の目的のためのGDNFプロモーターは、一般に、転写開始起点の上流の5'隣接DNAにおける約50〜約200 bpまたはそれ以上のDNA断片である。このプロモーターはRNAポリメラーゼと開始複合体を形成して下流配列の転写を開始および推進する。開始複合体は、「エンハンサー」と呼ばれるエレメントを活性化することにより、または「サプレッサー」と呼ばれるエレメントを阻害することにより、改変することができる。「プロモーター」なる語は、特に断って明記しない限り、エレメントを活性化することおよび阻害することを含む。本発明の目的のため、プロモーター配列は、バックグラウンド以上の検出可能なレベルの転写を開始するのに必要な最小限の塩基またはエレメントを含む断片を含むように、その3'末端で転写開始部位（1または2以上）に結合し（しかし必ずしも異種5'-UTRによって提供可能な開始部位を含むとは限らない）、上流（5'方向）に伸びる。
【００２２】
さらに、本明細書で使用される「GDNFプロモーター」は、そのプロモーターがバックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始する能力を維持する限り、天然の配列に対して、欠失、付加および置換のような修飾を含む配列を意図する。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発を通じてのように意図的であってもよいし、あるいは天然の突然変異事象やPCR増幅によるエラーを通してなど偶発的なものであってもよい。
【００２３】
例えば、以下の実施例に記載するように、また、添付図面に示すように、多数の転写因子に対するコンセンサス結合部位は、本明細書に記載のGDNFプロモーター中に見出されており、上皮増殖因子受容体転写因子（ETF）、egr1およびegr2（例えば、リウ（Liu）ら、(1996), Crit. Rev. Oncogen. 7, 101参照)のような 初期増殖応答（early growth response: egr）ファミリーメンバー、 Sp1（例えば、ダイナン（Dynan）ら(1983) Cell 35, 79; ブリッグス（Briggs）ら、 (1986), Science 234, 47; ハーゲン（Hagen）ら、 EMBO J. 13, 3843参照)、CREB/ATFファミリーメンバー（例えば、パラバッシリオウ（Papavassiliu） (1994), Anticancer Res. 14, 1801参照)、AP-2（例えば、ミッチェル（Mitchell）ら、(1987), Cell 50, 847; イマガワ（Imagawa）ら (1987), Cell 51, 251;ウィリアムス（Williams）ら、(1988), Genes Dev. 2, 1557参照)、核因子κB(NF-κB)（例えば、バエウエール（Baeuerle）ら、(1996), Cell 87, 13; バルディン（Baldwin）ら、(1996), Ann. Rev. Immunol. 14, 649参照)、yin-yang-1 (YY-1)およびGC因子（GCF）に対する結合部位が挙げられる。ETF、GCFおよびYY-1のようなこれら因子のうちのある因子は転写を抑制する。従って、プロモーター配列に機能的に結合された遺伝子の転写を高めるためには、これら因子の結合部位を含む一またはそれ以上の領域の欠失または変異（図3A〜3Bおよび4A〜4Cに明記されている）が望ましい場合がある。
【００２４】
例えば、遠位プロモーターに関して、図7に示すように、そして実施例に記載のように、エキソンIに関して番号を付した-62位で末端を切断したプロモーター配列（例えば、図7の-62から-1位の配列を含む）は、ヒト神経芽細胞腫SK-N-AS細胞において使用すると、高い活性を維持する。従って、本発明の目的のための遠位GDNFプロモーターは、そのプロモーターが所定の細胞株においてバックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始する能力を保持している限り、図7に記載された欠失のどれを含んでいてもよいし、並びに、例えば、-63、-194、-308、-363などの位置で末端を切断したプロモーター配列のような介在トランケーション（末端切断）を含んでもよい。本明細書に使用される「GDNFプロモーター」の定義から具体的に除外されるのは、エキソンIで始まり、エキソンIの上流に続くヒトGDNF配列に対応するマウスGDNF配列部分と完全に一致する配列である（例えば、GenBank登録番号D88350S1参照）。
【００２５】
「遠位」GDNFプロモーターは、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIに直ちに隣接し、かつ、その上流にあるGDNFプロモーターである。「中位」GDNFプロモーターは、遠位GDNFプロモーターの下流にあって、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIIへ直ちに隣接し、かつ、その上流にあるGDNFプロモーターである。「近位」GDNFプロモーターは、エキソンIIの下流にあって、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIIIa+IIIb（本明細書では「エキソンIII」ともいう）の上流にあるGDNFプロモーターである。本明細書に使用するように、「近位GDNFプロモーター」なる語句は、別の意味であると明記されない限り、中位GDNFプロモーターおよび近位GDNFプロモーターの両方を含むと解釈される。ヒトGDNF遺伝子とプロモーターのマッピングについては以下に詳細に記載する。
【００２６】
「リポーター遺伝子」は、発現の際、適当な条件で細胞を同定することができるように、リポーター遺伝子を発現する細胞に表現型を与える遺伝子である。例えば、リポーター遺伝子は、通常のアッセイ法で容易に検出または測定できるポリペプチド産物を産生してもよい。この特徴を与える当技術分野に既知の適当なリポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT活性)、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ヒト成長ホルモン、緑色蛍光タンパク質（GFP）のような蛍光タンパク質などをコードする遺伝子が含まれる。実際、例えば、酵素免疫測定法（ELISA）のようなイムノアッセイにより、または、検出可能な生成物に基質を酵素的に変換することにより容易に測定できるタンパク質または酵素をコードする遺伝子であって、かつ、宿主細胞では実質的に発現されない（バックグラウンドなしの特異的発現）遺伝子であれば、プロモーター活性を調べるリポーター遺伝子として使用することができる。本発明において使用される他のリポーター遺伝子としては、本質的な細胞機能を阻害する化学物質または他の物質の存在下または非存在下での増殖能に基づいて細胞を選択できる遺伝子が含まれる。従って、適当なマーカーとしては、薬剤耐性もしくは薬剤感受性を与えるか、または、適当な選択培地でその細胞を増殖させる場合に、リポーター遺伝子を発現するそれら細胞の抗原特性を変化させるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、リポーター遺伝子には、一またはそれ以上の細胞傷害抗体または薬剤含有培地で増殖する能力によって細胞を選択する細胞傷害性および薬剤耐性マーカー；特定の栄養源または添加剤の添加または無添加による、定められた培地での増殖能によって細胞を選択する栄養要求性マーカー；および例えば、唯一の炭素源として適当な糖を含有する特定の培地での増殖能によって細胞を選択する代謝マーカーが含まれる。これらのリポーター遺伝子およびその他のリポーター遺伝子は当技術分野では周知である。
【００２７】
「リポーター遺伝子産物レベルの変化」は、候補化合物に暴露されない細胞で発現されたリポーター遺伝子産物のレベル、および/または、対照化合物に暴露された細胞に対して、候補化合物に暴露された細胞中のリポーター遺伝子産物の発現レベルを比べることにより示される。このレベルの変化は、例えば、分光光度計、蛍光分光光度計、発光計（luminometer）などを用いて測定することにより定量的に測定することができ、一般にバックグラウンドに対するレベルの統計的に有意な増加または減少を表す。しかしながら、そのような変化は定量的な測定を行うことなく、可視化することによって簡単に知ることもでき、それは、例えば、リポーター遺伝子が発色性基質によって着色コロニーを形成する能力を細胞に与えるような場合である。
【００２８】
本明細書に使用する「発現」という用語は、転写および翻訳プロセスの両方、すなわち、メッセンジャーRNAの産生および/またはそれからタンパク質を産生することの両方を意図する。
【００２９】
「パーキンソン病様症状」とは、筋振せん、筋脱力、強直、運動緩徐、姿勢および平衡の変化、痴呆および一般にパーキンソン病または他の神経変性疾患に伴う同様の症状を含む。
【００３０】
本明細書に使用する「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであって、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー体を意味する。この用語は、分子の一次構造を指すにとどまる。従って、この用語には、二本鎖および一本鎖DNAならびに二本鎖および一本鎖RNAが含まれる。この用語はさらに、メチル化および/またはキャップ形成によるような改変、およびポリヌクレオチドの未改変形態も含む。
【００３１】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」およびその他単細胞体として培養される微生物、または、より高等な真核細胞株を指すそのような用語は、そのDNAが細胞に導入される方法またはその後の細胞処理によらず、組換えベクターまたは他のトランスファーDNAのレシピエントとして用いることができる、もしくは用いられていた細胞を指す。この用語はトランスフェクトされているもとの細胞の子孫を含む。初代培養の細胞ならびに卵母細胞のような細胞もまたレシピエントとして用いることができる。
【００３２】
「ベクター」とは、付着セグメントの複製および/または発現を生じるような、もう一つのポリヌクレオチドセグメントが付いているレプリコンである。この用語には発現ベクター、クローニングベクターなどが含まれる。
【００３３】
「コード配列」とは、mRNAに転写されポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、5'末端の翻訳開始コドンおよび3'末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、mRNA、cDNA、合成DNAおよび組換えポリヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定しない。またコード配列がイントロンによって中断しているゲノムDNAも含まれる。
【００３４】
「機能的に結合された」とは、記載された成分がその意図されたやり方でそれらを機能させ得る関係にある状況を指す。従って、例えば、コード配列と「機能的に結合された」プロモーターのような制御配列は、制御配列と適合可能な条件下、コード配列が発現されるように配置される。コード配列は、ポリヌクレオチドの転写を指示する制御配列と機能的に結合されていてもよく、それによってポリヌクレオチドが宿主細胞で発現される。制御配列は、その発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、介在する未翻訳転写配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、そのプロモーター配列は、それでもなおコード配列と「機能的に結合されている」と考えられる。機能的に結合されたGDNFプロモーターは、適当なリーディングフレームでこれと結合した核酸分子の転写に指示を与える。
【００３５】
「トランスフェクション」という用語は、挿入に使用される方法、または挿入されたポリヌクレオチドの分子形態とは関わりなく、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを指称する。この中には、ポリヌクレオチド自体の挿入および外因性ポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターの挿入が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは、その細胞により直接転写・翻訳され、非組み込みベクターとして、例えば、プラスミドとして維持されるか、または、宿主ゲノムへ安定に組み込まれてもよい。
【００３６】
「トランスフェクション」は一般に、真核細胞に関して使用されるのに対し、「形質転換」なる用語は、原核細胞へのポリヌクレオチドの挿入を指すのに使用される。
【００３７】
「単離された」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する場合、表記の分子が他の同様な生物学的マクロ分子を実質的に欠如する状態で存在することを意図するものである。本明細書に使用する「単離」なる用語は、組成物の少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも85重量%、さらに好ましくは少なくとも95重量%、そして最も好ましくは少なくとも98重量%が単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであることを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離ポリヌクレオチド」とは、対象ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まないポリヌクレオチドを指称する。しかしながら、その分子は、本明細書に定義するように、機能的および/または構造的に保存的突然変異を含んでもよい。
【００３８】
二個のポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の二個の断片またはセグメントは、ヌクレオチドの少なくとも約65重量%、好ましくは少なくとも約75重量%、より好ましくは少なくとも約80〜85重量%、そして最も好ましくは少なくとも約90〜95重量%以上が分子の規定の長さにわたってマッチする場合、「実質的に相同」である。本明細書において使用するように、実質的な相同体はまた、特定のポリヌクレオチド配列に対する同一性を示す配列をいう。実質的に相同であるポリヌクレオチド配列は、例えば、その特定の系に合わせて規定されたストリンジェントな条件下、サザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を定めることは当技術分野の範囲内である。例えば、上記サムブルック（Sambrook）ら；「DNAクローニング（DNA Cloning）」、第I巻、第II巻、前記；「核酸のハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）」、前記参照。
【００３９】
核酸配列の同一性を決定する他の技術は当技術分野において周知であり、対象とするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定し、これを第二の塩基配列と比較することを含む。ウイスコンシン配列分析パッケージ第8版（ウィスコンシン州マジソンのGenetics Computer Groupから入手可）で利用できるプログラム、例えば、BESTFIT、FASTAおよびGAPプログラムは、二つのポリヌクレオチド間の同一性を計算することができる。さらに、データベース検索ツールBLAST (アルツシュル（Altschul）ら (1990)、J. Mol. Biol. 215, 403-410)を使用して、遺伝子データベースを検索し、所定の配列とデータベースに存在する配列との同一性パーセントを決定してもよい。配列間の同一性または類似性を計算する他のプログラムは当分野に既知である。
【００４０】
GDNFプロモーター配列と「機能的に同等な」配列とは、対応するGDNFプロモーターと同じ方法で機能する配列である。従って、本明細書に記載されている、例えば、遠位GDNFプロモーターに対して「機能的に同等な」プロモーター配列は、バックグラウンドのレベル以上において適当なリーディングフレームにおいて結合する核酸分子の転写を指示できる配列である。
【００４１】
II.  一般的な方法
本発明において提供されるのは、ヒト遠位GDNFプロモーターおよび近位GDNFプロモーターとを含む単離DNA、およびGDNFプロモーターを含むリポーター遺伝子構築物である。本発明はまた、前記構築物を用いてGDNFプロモーター誘導活性について化合物をスクリーニングする方法、この構築物で形質転換またはトランスフェクトされた細胞、ヒトGDNFプロモーター誘導物質として同定される化合物、およびヒトGDNFプロモーター誘導物質として同定された化合物の投与により、パーキンソン病様症状を示す被験者を治療する方法も含むものである。
【００４２】
実施例1で詳細に述べるように、ヒトGDNF遺伝子（図1参照）のエキソンIおよびその上流にある遠位プロモーターは、以下の一般的な構成に従って、同定、増幅、クローニング、そしてシークエンシングを行うことができる。ヒト組織にGDNF mRNAが存在することは、ラットGDNF cDNAの5'末端に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「RT-PCR」）によって証明される。ヒトGDNF遺伝子配列のPCR同定は、ヒトゲノムまたはcDNAライブラリーからの配列を増幅することを伴う。PCR用の縮重または非縮重オリゴヌクレオチドは、ラットGDNFの配列またはヒトGDNFの一部と実質的に相同であることが分かっている哺乳類のGDNF配列に基づいて作ることができる。そのようなPCR反応産物は、ゲル電気泳動によりサイズに従って選択し、適当なベクターにクローニングし、クローニングしたDNAをシークエンシングしてGDNFプロモーター配列を同定してもよい。
【００４３】
さらに詳細には、PCRはDNA分子内の望ましい配列の反対末端がマッチする短いオリゴヌクレオチドプライマー（一般に長さ10〜20個のヌクレオチド）を使用する。プライマー間の配列が分かっている必要はない。最初の鋳型はRNAかDNAのどちらかであってもよい。RNAを使用する場合、まずcDNAへ逆転写する。次いで加熱のような周知技術を用いてcDNAを変性し、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを過剰モル添加する。
【００４４】
プライマーを相補標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせた後、デオキシヌクレオチド三リン酸またはヌクレオチド同族体の存在下、DNAポリメラーゼを用いてプライマー伸長を行う。得られた生成物には、元の鎖の新しく合成された相補体と5'末端で共有結合したそれぞれのプライマーが含まれる。複製された分子を再び変性し、プライマーとハイブリダイズすること等を生成物が充分に増幅されるまで行う。そのようなPCR法は、例えば、米国特許第4,965,188号、第4,800,159号、第4,683,202号および第4,683,195号に記載されており、参照としてその全文が本明細書に組み入れられる。PCR産物をクローニングし、プライマー伸長鎖の分離により誘導される増幅DNAを含むクローンを選択する。選択は、元のプライマーをハイブリダイゼーションプローブとして用いて行うことができる。
【００４５】
上記の方法を用いると、遺伝子の当該部分の翻訳起点のすぐ上流にあるヒト遺伝子配列（本発明では「エキソンIII」とよぶ）が、スプライス連結部アクセプター部位が認められる点まで、ラットおよびマウスcDNAと相同性であることが判明した。しかしながら、スプライス連結部アクセプター部位上流のヒトcDNA配列の多様性から、本明細書ではエキソンIという他のエキソン（1または複数）が存在することが示された。エキソンIの場所は、PCRにより、エキソンIII開始の約5 kb上流であることが分かった。約9.4 kbのEcoRI断片は、サザンブロット分析を用いて、エキソンIとエキソンIIIの両方を含むと同定された。約9.4 kbのEcoRI断片をクローニングし、ベクターpBK-CMVで増殖させ、それから切り出した後シークエンシングを行った。本断片のヌクレオチド配列分析は、(1)ラットGDNF cDNAの5'末端に対し90%よりも高い相同性をもつエキソンI配列が存在すること、(2)エキソンI配列の3'末端にある5'スプライス供与体部位、(3)エキソンIがエキソンIII起点の約5 kb上流にあること、そして(4)該断片は、マウスGDNF遺伝子の限定された領域と約79%一致するエキソンIの上流にある領域をもっていること（エキソンIからエキソンIの上流140 bpまで、GenBank登録番号D88350S1）を示した。GDNFプロモーター転写起点はGDNF cDNAの5'末端分析により決定した。
【００４６】
ヒト近位GDNFプロモーターは、前記と同様にして単離することができる。特に近位プロモーター由来のcDNAは、実施例4で詳細に記載するように、ヒトGDNFをコードするDNAに基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ヒト胎児腎、脳または骨格筋のポリA+ RNAからRT-PCR分析により同定・増幅することができる。
【００４７】
一旦産生されたDNAは次に、適当な宿主細胞に複製のためのベクターに組み込んでもよい。ヒト遠位GDNFプロモーター、ヒト近位GDNFプロモーターおよびヒト遠位・近位両方のGDNFプロモーターは、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子のようなリポーター遺伝子の上流にある適当なベクターにクローニングしてもよい。GDNFプロモーターとルシフェラーゼとの構築物をそれぞれヒト細胞株にトランスフェクトし、これはこの後にプロモーター調節ルシフェラーゼ発現を調べるために、およびルシフェラーゼ産生を指標とするヒトGDNFプロモーター誘導活性について候補化合物をスクリーニングするために使用することができる。もちろん、ベクター構築の他の方法ならびに種々のリポーターおよび細胞株も、本発明のプロモーター活性の測定に使用することができる。
【００４８】
特に、ベクター構築には当分野で既知の方法が使用される。一般に、部位特異的なDNA切断は、適当な制限酵素を用いて、通常これら市販の酵素のメーカーが指定する条件下で処理することによって行われる。制限酵素とのインキュベーション後、タンパク質を変性・抽出して、沈降によりDNAを回収する。切断断片は、当業者に知られている方法に従い、例えば、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動法を用いて、分離してもよい。
【００４９】
粘着末端切断断片は、混合物中に存在する適当なデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）の存在下、大腸菌のDNAポリメラーゼ1（クレノウ）を用いて平滑末端化することができる。S1ヌクレアーゼによる処理を使用してもよく、これによって一本鎖DNA部分の加水分解を生じる。
【００５０】
ライゲーションは、T4 DNAリガーゼおよびATPを使用して、標準的な緩衝液および温度条件とを用いて行う。あるいは、望まない断片の制限酵素消化を用いてライゲーションを防止することができる。ライゲーション反応混合物を適当な宿主に形質転換またはトランスフェクトし、成功したトランスフェクタント/トランスフォーマント（形質転換細胞）を薬剤耐性またはその他のマーカーにより選択する。
【００５１】
例えば、標準的なベクター構築物には、一般にリポーターおよび/または選択マーカーエレメントが含まれる。そのようなエレメントは、適当な条件でその細胞を同定することができるように、マーカーを発現する細胞に表現型を与える遺伝子である。一般に、リポーター遺伝子および選択マーカーは、基本的な細胞機能を阻害する化学物質または他の作用物質の存在下または非存在下での増殖能に基づいて、形質転換細胞を選択する。従って、適当なマーカーには、薬剤耐性もしくは感受性を与えたり、色を与えたり、または、適当な選択培地で細胞が増殖する時に選択マーカーを発現するそれら細胞の抗原特徴を変化させたりするタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。例えば、選択マーカーには、一つ以上の細胞傷害物質、抗生物質または薬剤を含有する培地での増殖能によって細胞を選択する細胞傷害性マーカー、抗生物質マーカーおよび薬剤耐性マーカー；特定の栄養源または添加剤の添加または無添加で、定められた培地での増殖能によって細胞を選択する栄養要求性マーカー；例えば、唯一の炭素源として適当な糖を含有する定められた培地での増殖能によって細胞を選択する代謝性マーカー；または、色素産生基質上での着色コロニー形成能を細胞に与えるかまたは細胞に蛍光を生じさせるマーカーが含まれる。
【００５２】
次に、当業者に公知の方法に従って、トランスフェクタント/トランスフォーマント（形質転換細胞）からプラスミドを作製し、クレウェル（Clewell）ら(1972), J. Bacteriol. 110, 667に報告されているように、通常その後にクロラムフェニコール増幅を行うことができる。DNAを単離して、通常は制限酵素分析および/またはシークエンシングにより分析を行う。シークエンシングは、さらにメッシング（Messing）ら(1981), Nucleic Acid Res. 9, 309にも記載されている、サンガー（Sanger）ら(1977),  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74、5463の周知のジデオキシ法、または、マキサム（Maxam）ら、(1980), Meth. Enzymol. 65, 499に報告された方法によって行ってもよい。
【００５３】
次いで、宿主細胞を本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクトする。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってよい。宿主細胞は、プロモーターの活性化、トランスフォーマント/トランスフェクタントの選択等に適するよう通常の栄養培地を改変した培地で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、一般に選択された宿主細胞についてこれまで使用されている条件と同様であり、当業者には既知である。
【００５４】
原核宿主細胞および真核宿主細胞の双方を望ましいオリゴヌクレオチド断片のクローニングに用いることができる。例えば、原核宿主細胞のなかでは大腸菌がしばしば用いられる。しかしながら、望ましい場合には、バシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）菌株などのような原核宿主細胞を使用してもよい。原核宿主細胞適合性トランスファーベクターは、例えば、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を与えるオペロンを含むプラスミドpBR322由来のもの、および抗生物質耐性マーカーを与える配列も含む種々のpUCベクターであることができる。これらのマーカーを使用して、選択により成功した形質転換体を得ることができる。
【００５５】
真核宿主細胞には培養系の酵母および哺乳類細胞が含まれる。通常使用される酵母宿主は、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）およびS.カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis）である。酵母と適合するベクターは、栄養要求性変異体に原栄養要求性を、または野生型株に重金属抵抗性与えることによって、成功した形質転換体を選択できるマーカーをもっている。酵母適合性ベクターとしては、2-_複製起点（ブローチ（Broach）、(1983), Meth. Enzymol. 101, 307)、GEN3とARS1との組合せ、または、適当な断片を宿主細胞ゲノムに組み込んだ結果生じる配列のような、複製を確実にする他の手段を使用することができる。
【００５６】
クローニング用宿主として利用可能な哺乳類の細胞株は当分野に既知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのような寄託機関から入手することができる。これらは、ヒトグリオブラストーマ細胞、神経芽細胞腫細胞、HeLa細胞、ヒト胎児腎(HEK)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎(BHK)細胞などを含むが、これらに限定されない。哺乳類細胞において発現される遺伝子は、上記のサムブルック（Sambrook）らに記載のSV40から由来するもののような、転写終了配列およびポリアデニル化配列、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列を必要とすることがある。発現を増加させるエンハンサー配列も含んでもよく、リポーター遺伝子を増幅させる配列もまた望ましい。これらの配列は当技術分野に既知であり、例えば、コード配列に隣接するマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)遺伝子が含まれる。次に、細胞を、dhfr-欠損細胞におけるメトトレキセート耐性に関して選択を行うことができる。例えば、ウルラウブ（Urlaub）ら、（1980),  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220; リンゴールド（Ringold）ら、(1981), J. Mol. and Appl. Genet. 1, 165〜175参照。哺乳類細胞での複製に適当なベクターは、ウイルスレプリコンまたは、GDNFプロモーターおよびリポーター遺伝子をコードする配列を含む適当な配列を宿主ゲノムへ確実に組み込む配列を含んでもよい。
【００５７】
ポリヌクレオチドを導入する方法は、当分野に周知の方法を用いて両生動物細胞のような系、サマーズ＆スミス（Summers & Smith）、Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)に記載の方法を用いて昆虫細胞のような系などに、導入する方法が知られているように、他の真核細胞系もまた既知である。
【００５８】
形質転換またはトランスフェクションは、当事者に既知の、宿主細胞によるポリヌクレオチドの直接取り込みによってウイルスにポリヌクレオチドをパッケージングし、そのウイルスで宿主細胞を形質導入することなどを含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する既知方法のいずれで行ってもよい。そのような方法としては、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリリジン-もしくはポリオルニチン媒介トランスフェクション、または、リン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含む珪酸アルミニウム、酸化クロム、珪酸マグネシウム、タルクなど、その他不溶性無機塩を用いる沈殿法、エレクトロポレーション、ソノポレーション、プロトプラスト融合法、リポフェクション、ペプトイド輸送またはマイクロインジェクションがある。細胞を形質転換しトランスフェクトする手法の検討については、例えば、上記サムブルック（Sambrook）らを参照のこと。選択された形質転換またはトランスフェクション技法は一部、使用する宿主細胞に依存し、当業者により日常的に決定されるものである。
【００５９】
組換え宿主細胞の中に発現されたりまたはそれから単離されるヒトGDNFプロモーター・リポーター遺伝子構築物は、化合物がリポーター遺伝子産物発現を刺激することができるか否か、およびGDNFのインビボ発現を刺激することができるか否かを調べる候補化合物のスクリーニングに使用することができる。ヒトGDNFプロモーター制御リポーター遺伝子発現を刺激する化合物を同定する好ましい一方法は、リポーター遺伝子と機能的に結合されたGDNFプロモーターを含むDNA構築物を細胞に導入する段階、供試化合物をこの細胞と混合する段階、およびリポーター遺伝子産物の発現レベルを測定する段階を含む。リポーター遺伝子産物の発現レベルが変化すれば、その化合物がGDNF発現レベルを調節できることを示している。リポーター遺伝子構築物は、好ましくは細胞の染色体DNAへ安定に組み込まれるが、染色体外エレメントの形では本明細書に開示した目的において機能的でもある。細胞は真核細胞、好ましくは哺乳類の細胞、より好ましくはヒト細胞、さらにより好ましくはGDNFを発現するヒト細胞、または、哺乳類遺伝子プロモーターの調節的影響下、構造遺伝子を発現するために必要なエレメントを含む如何なる細胞であってもよい。本明細書の実施例では、プロモーター/リポーター構築物の宿主として、ヒトグリオブラストーマU-87 MGおよびヒト神経芽細胞腫SK-N-AS細胞を用いたが、その理由はこれらの細胞が、ELISAによる定量ではGDNFを生成し、従ってRT-PCRによって確認するとGDNF mRNAを産生したためである。
【００６０】
従って、例えば、供試化合物は、ルシフェラーゼ発現の調節能について、またはヒトGDNFプロモーター・ルシフェラーゼ遺伝子構築物によってトランスフェクトした哺乳類宿主細胞において、例えば、フォースコリン(forskolin)などのヒトGDNF誘導化合物によってリポーター遺伝子発現の調節を干渉することができるかまたは増強することができるかについて評価する。
【００６１】
リポーター遺伝子に機能的に結合されたヒトGDNFプロモーターの活性化をもたらす細胞内シグナルの発生により、候補化合物がリポーター遺伝子発現を誘発するか否かを評価するには、無処理細胞のほうが好ましいが、候補化合物の有効性を調べるためには透過細胞を使用してもよい。ヒトGDNFプロモーター・リポーター遺伝子構築物をもつ宿主細胞の透過化は当分野に周知の方法により行われる。
【００６２】
候補化合物はまた、ハームス（Hames）ら編、「遺伝子の転写：実際のアプローチ（Gene Transcription: A Practical Approach）」 (IRL Press, 1993)における、シエラ（Sierra）ら「分化組織からの核抽出物によるインビトロ転写(In Vitro transcription with nuclear extracts from differentiated tissues)」125〜152頁に記載のインビトロ転写アッセイにおいて、GDNFプロモーター遺伝子構築物を用いてGDNF発現を調節するか否かを評価してもよい。
【００６３】
GDNFプロモーターまたはその断片と結合することによってGDNF発現を調節する化合物は、例えば、ゴッテスフェルド（Gottesfeld）ら(1997), Nature 387, 202〜205およびヘグイ（Heguy）ら(1995), Gene Expression 4, 337〜344に記載の手法を用いて評価することができる。
【００６４】
従って、ヒトGDNFプロモーター・リポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされた細胞においてリポーター遺伝子の発現を刺激することが分かっている物質(agents)は、パーキンソン病、筋萎縮性軸索硬化症、てんかん、アルツハイマー病、あるいはその他、天然GDNFの欠如またはレベルの低下が病因となる症状または病気を含むが、これらに限定しないいくつかの神経変性疾患の有望な治療剤と考えられる。さらに、そのようなは物質(agents)は、出生前の末梢神経発生ならびに胎児発生期の腎発生をサポートする有望な治療剤である。治療剤の有効性は、当分野に既知である多数の上記疾患動物モデルのいずれかで試験されている。
【００６５】
例えば、最も広く使われているパーキンソン病の動物モデルでは、通常、毒素の投与によってドーパミン作動神経の神経変性を模倣している。6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)をマウスまたはラットの黒質に一側性に注入すると、同側の線条体および黒質緻密部には神経の損失が生じるが、反対側半球にはほとんど変化がない。同様に、メタンフェタミン誘発神経傷害性は、ドーパミン作動神経およびセロトニン作動神経の神経変性を生じ、これは、当業者によればヒトの状態と密接に関連すると考えられている。薬剤の有効性は、アポモルフィン誘発旋回行動を用いた行動結果により評価される。
【００６６】
もう一つのパーキンソン病モデルは、神経毒N-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)を用いて構築される。マウス、ラットおよびサルにMPTP を投与した。サルにMPTPを投与すると、黒質緻密部および線条体においてドーパミン作動性およびセロトニン作動神経の損失が起こるばかりでなく、無動や硬直姿勢のような、ヒトパーキンソン病患者に見られるそれと同様な行動的症状が起こる。
【００６７】
上記パーキンソン病の動物モデルに対し、ドーパミン作動神経細胞数が徐々に減少することが証明されている多数のマウス近交系を利用することができる。例えば、その行動特性がパーキンソン病に罹った患者と類似するD2受容体欠損マウスは、相同組換えによって作出された。フィッツジェラルド（Fitzgerald）ら、(1993), Brain Res. 608, 247-258。第二の例は、40%までの間中、中脳のドーパミン作動神経の数が時と共に40％まで減少するウィーバー（weaver）変異マウスである。ベリナ（Verina）ら、(1997), Exp. Brain Res. 113, 5-12;アーデルブレヒト（Adelbrecht）ら、(1996), Mol. Brain Res. 43, 291-300; ミツモト（Mitsumoto）ら、(1994), Science 265, 1107-1110。
【００６８】
他の神経変性疾患の動物モデルも記載されており、本明細書に記載する通り、ヒトGDNFプロモーター・リポーター遺伝子でトランスフェクトした細胞においてリポーター遺伝子の発現を調節することが分かっている作用物質の治療効果を評価するために有用である。例えば、マーチン（Martin）ら、(1995), Brain Res. 683, 172-178には、てんかんの動物モデルが記載されており、マテソン（Matheson）ら(1997), NeuroReport 8, 1739-1742およびオッペンハイム（Oppenheim）ら、(1995), Nature 373, 344-346には、物理的外傷から起こる神経変性モデルが記載されており、さらに、サゴット（Sagot）ら、(1996), J. Neurosci. 16, 2335-2341には動物の運動神経変性モデルが記載されている。
【００６９】
このように同定された作用物質は、液体の溶液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末剤、軟膏、坐剤、ポリマーマイクロカプセルまたは微小胞体、リポソーム、および注射可能または持続注入可能な溶液などの様々な剤形で治療組成物に処方することができるが、これらに限定されない。好ましい剤形は、投与方法および標的とされる疾病のタイプに依存する。組成物は好ましくは、ヒト血清アルブミン、イオン交換剤、アルミナ、レシチン、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムおよび硫酸プロタミンなどの塩または電解質のような当分野に周知の薬学的に許容される溶媒、担体またはアジュバントも含む。適当な溶媒は例えば、水、生理食塩水、デキストローズ、グリセロール、エタノールなど、およびその組合せである。そのような組成物を実際に製造する方法は既知であり、当業者には明らかであろう。例えば、「レミントンの薬剤化学(Remington's Pharmaceutical Sciences), マック出版社(Mack Publishing Company)、ペンシルバニア州イーストン、第18版、1990年参照。
【００７０】
上記組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、リンパ内または皮下投与など通常の投与形態を用いて投与することができるが、これらに限定しない。
【００７１】
治療的有効量は、当業者により容易に決定されるものであり、また、疾病の重篤度および進行度、患者の健康および治療に対する応答、ならびに治療する医者の判断に依存するであろう。
【００７２】
パーキンソン病のような神経変性疾患の治療に有用な作用物質を同定するためにリポーター遺伝子構築物にヒトGDNFプロモーターDNAを使用することに加え、ヒトGDNFプロモーターは、例えば、診断目的のためにヒトGDNF発現に影響を及ぼす変異を検出するオリゴヌクレオチドプローブをデザインするために使用することができる。本明細書に用いられるように、「プローブ」なる用語は、上に定義したように、標的ポリヌクレオチドに存在する核酸配列と相補性の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む構造を指す。プローブのポリヌクレオチド領域はDNA、および/またはRNA、および/または合成ヌクレオチド同族体を含んでもよい。そのようなプローブは、インビトロのハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ヒトGDNF野生型プロモーターをその変異体と識別するため、およびGDNFプロモーターにおける欠損の有無をスクリーニングするために有用であり、パーキンソン病または他の中枢性および末梢性神経変性疾患の診断薬となる可能性がある。
【００７３】
プローブは通常参照ポリヌクレオチドの約6〜8から約75個の隣接核酸を含み、一般には約10〜12から約50個の隣接核酸、そして好ましくは参照配列の約15〜20から約30個の隣接核酸を含む。特に、GDNFプロモーターのプローブはハイブリダイゼーションによって非反復配列を検出できる長さである。
【００７４】
従って、単離したヒト遠位GDNFプロモーターまたは単離した近位GDNFプロモーターの既定の一部を用い、切り出しのような慣用の標準的な方法を用いて、または、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成法により、そのプロモーターとハイブリダイズする約6〜8以上のヌクレオチドのオリゴマーを作出することができる。そのようなオリゴマーは、例えば、パーキンソン病発症のリスクを有する人において変異GDNFプロモーターの有無をスクリーニングするために、または同様に異常な末梢神経発生または腎発生のリスクを有する胎児の出生前スクリーニングとして、有用である。
【００７５】
オリゴヌクレオチドプローブを診断試薬として使用する場合、血液、血清または羊水などの分析対象となる試験試料は、その核酸分画を抽出するように処理することができる。試料から得られた核酸は、ゲル電気泳動またはその他のサイズ分離法に付すことができ、または、核酸試料をサイズ分離することなくドットブロット法に供してもよい。次に、試料を検出可能な標識を付けたオリゴヌクレオチドプローブに暴露する。適当な標識およびプローブに標識を付ける方法は当分野に既知であり、ニックトランスレーションまたはキナーゼ化(kinasing)によって組み込まれる放射性標識、ビオチン、蛍光および化学発光プローブ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼのように検出可能な生成物の産生を触媒する酵素などが含まれるが、これらに限定しない。次に、試料から抽出した核酸を適当なハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件下、標識プローブで処理する。
【００７６】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、処理時間およびホルムアミド濃度を含む、洗浄工程の際の多数の要因によって左右される(上記サムブルック（Sambrook）ら参照)。ハイブリダイゼーションは多くの手法により行うことができる。試料核酸の増幅は、必要ならば、例えば、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Q-ベータレプリカーゼまたは当技術分野に周知の方法により行うことができる。次に、増幅された核酸は、これも当技術分野において周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出することができる。
【００７７】
GDNFプロモーターポリヌクレオチドまたはその一部は診断用キットに供することができる。例えば、GDNFプロモーターポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズできるオリゴマープローブは、標識していてもよいプローブ核酸配列を含む診断用キットにパッケージ化することができる。または、プローブを標識しない状態で提供することができ、標識用成分をキットに含めることができる。キットはまた、特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要であるまたは望ましい他の適した同封の試薬および物質、例えば、標準物質ならびにそのアッセイを行うための説明書を含んでもよい。
【００７８】
本発明は、好ましい特定の態様に関連して説明したが、上記説明ならびに以下の実施例は本発明を例示するものであって本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は本発明が属する技術分野の当業者には明らかであろう。
【００７９】
III.  実験
以下の実施例において、使用する数字(例えば、量、温度など)については正確を期すよう努めたが、なんらかの実験誤差はあると考えなければならない。特記しない限り、温度は常に摂氏で表し、圧力は大気圧かまたはほぼ大気圧である。
【００８０】
ポリヌクレオチドにおける所定の位置でヌクレオチド対のどちらか一方の選択的な存在を示すため、全体を通して以下の一文字ヌクレオチド略号を用いた。R = GまたはA；Y = CまたはT；S = CまたはG；W = AまたはT；M = AまたはC；そしてK = GまたはTである。
【００８１】
実施例1
ヒト遠位GDNFプロモーターのクローニング
A.  ヒト組織からのGDNF cDNAの証明
ヒトGDNF cDNAは、シャール（Schaar）ら、(1994), Exp. Neurol. 130, 387-393に記載の方法に従い、ラットGDNF cDNAの配列に基づくプライマー対を用いて、胎児脳、胎児腎、成人骨格筋のcDNAライブラリーから、PCRによって増幅した。センスおよびアンチセンスプライマー対はそれぞれ以下の通りであった。
5'-GGT CTA CGG AGA CCG GAT CCG AGG TGC-3'（配列番号：3）
および
5'-TCT CTG GAG CCA GGG TCA GAT ACA TC-3'（配列番号：4）
これらの結果は、少なくとも一つのヒトGDNF cDNAがラットGDNF cDNAと実質的に相同の5'末端をもっていることを示す。
【００８２】
ヒト胎児腎（huGDNF）からのPCRにより増幅したそのようなcDNA一個をpCR II(Invitrogen)にクローニングしてシークエンシングしたところ、以下に示す配列が得られた。
【００８３】
0003761152.tif 000002
0003761152.tif 000003
【００８４】
ヌクレオチド配列1〜27および675〜700はプライマー配列と相同である。ヌクレオチド50〜674間の配列は、GenBank登録番号L19062およびL19063と同一である。
【００８５】
B.  ヒトゲノムDNAのPCRウオーキング
ヒトゲノムDNAのDNAウオーキングは、遺伝子特異的プライマー1および2としてそれぞれoutGDNF1プライマー(5'-CAG CAC CAG GCA GAC AGC-3' (配列番号：6))およびinGDNF1 (5'-GCC ACG ACA TCC CAT AAC TT-3' (配列番号：7))を用い、プロモーター・ファインダー（PromoterFinder）DNAウオーキングキット(Clontech Laboratories, Palo Alto, Calif., USA)によって行った。5%ジメチルスルホキシドの存在下、メーカーの指示に従ってPCRを行った。増幅したDNAをpCR II(Invitrogen, San Diego, Calif., USA)にクローニングしてシークエンシングした。増幅したセグメントのヌクレオチド配列を以下に示す。
【００８６】
0003761152.tif 000004
0003761152.tif 000005
【００８７】
ヌクレオチド699〜721（太字）は翻訳された配列を表し、ヌクレオチド702〜721はプライマーinGDNF1と相同である。ヌクレオチド671〜721は、ラットおよびマウスのGDNF cDNA(それぞれGenBank登録番号L15305およびU37372)に認められるヌクレオチドとの相同性が高い。本配列はヌクレオチド671から上流で分岐する。配列(YYYYYYYNY AGG)(配列番号：9)で示すスプライス連結部アクセプターと思われる部位は、ヌクレオチド671の上流近くにあり、そこでこの配列はラットおよびマウスのcDNAと分かれる。これはもう一つのエキソンがこの配列の前に存在することを示している。
【００８８】
C.  ヒトGDNFのエキソンIおよびGDNFプロモーターのクローニングおよび同定  シンデルハウアー（Schindelhauer）、(1995), Genomics 28, 605〜607に記載されているように、プライマーGDNFg246F (5'-TAT GCC AGA GGA TTA TCC TGA TCA G-3' (配列番号：10))およびプライマーGDNFg246R (5'-TAG CCC AGA CCC AAG TCA GTG AC-3' (配列番号：11))を用いたPCRによって、P1バクテリオファージベクターpAd10sacBII (Du Pont Merck Pharmaceutical Company、ヒト包皮繊維芽細胞P1ライブラリー番号 1;スターンバーグ（Sternberg）、(1992), Trends in Genetics 8, 11-16)におけるヒトゲノムライブラリをプールしてスクリーニングし、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIVを含むヒトゲノムクローンを同定した。
【００８９】
クローンDMPC-HFF#1-0575-F3、DMPC-HFF#1-0994-A6およびDMPC-HFF#1-1332-H5を同定して大腸菌NS3516株に形質転換した。これらのクローンからDNAを単離した後、その中にエキソンIIIが存在することを、プライマー番号 5188 (5'-CCC TGC TTG AAA CTC TGA CC-3' (配列番号：12)、実施例1Bに示す配列のヌクレオチド400〜419)およびプライマーinGDNF1 (上記実施例1B)を用いて、PCRにより以下のように確認した。反応混合物は、50 mM KCl、10 mM トリス-HCl (pH 8.3, 20℃)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、各プライマー1μMおよび50 U/ml Taq DNAポリメラーゼ(Boehringer/Mannheim)を含んでいた。増幅用鋳型DNAは、ルリア・ベルタニ(LB)寒天に25μg/mlカナマイシンを添加したプレート上で、単離されたコロニーから得た、対象とするP1クローンを含む細菌に反応混合物50μｌずつを接種することにより得られた。反応混合物をミネラルオイルで重層し、以下の構成を用いて増幅した。最初の変性段階、94℃で4分間；94℃で1分間変性、60℃で1分間アニーリングそして72℃で1分間プライマー伸長を30サイクル；最後の伸長段階を72℃で10分間。各クローンは、アガロースゲル電気泳動により予想された約322 bpの生成物を生じた。ベクターのみを含む菌はこのサイズのシグナルを示さず、各クローンにエキソンIIIが存在することが確認された。
【００９０】
メーカーが勧める緩衝液の存在下、ゲノムクローンDMPC-HFF#1-0575-F3、DMPC-HFF#1-0994-A6およびDMPC-HFF#1-1332-H5のDNAをそれぞれ制限酵素SmaI、NarI、EcoRI、SalI、BamHIおよびBglII(いずれもBoehringer/Mannheimより)で消化して得られた断片をトリス/ホウ酸/EDTA緩衝0.5%アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミドで染色した。ゲル中のDNAを変性・中和し、一晩かけて毛細管移動によりナイロンメンブランへ移した。紫外光でDNAをナイロンメンブランとクロスリンクさせ、メーカーが勧める通り、2% w/vブロック試薬(Boehringer/Mannheim、5X SSC緩衝液(20X SCC緩衝液は水1リットル中NaCl 175グラム、クエン酸ナトリウム88グラムである)、0.1% N-ラウロイルサルコシン、0.02%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および50%ホルムアミドの組成をもつ緩衝液中42℃で16時間プレハイブリダイゼーションを行った後、プレハイブリダイゼーションと同様の緩衝液中、42℃で16時間、実施例1Aに記載の通り、サザンブロットをジゴキシゲニン標識ヒトGDNF cDNA 10 ng/mlとハイブリダイズした。0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む2X SSC中室温で15分間、メンブランを2回洗浄した後、0.1% SDSを含む0.1X SSCで60℃30分間洗浄を行った。特異的ハイブリダイゼーションは、メーカー(Boehringer/Mannheim)提供の試薬および手順で検出した。約9.4 kb、2.7 kbおよび0.7 kbのEcoRIバンドが、ヒトGDNF cDNAプローブとハイブリダイズすることが観察された。
【００９１】
上記シャール（Schaar）らに記載のGDNFセンス配列およびエキソンIII上流の配列(実施例1B参照)に基づいてPCRプライマーをデザインし、エキソンIIIに対する推定エキソンIの位置をマッピングした。プライマー番号5231 (5'-GGT CTA CIG AGA CCG GAT CCG AGG T-3' (配列番号：13))は、その3'末端でコンセンサススプライス連結部供与体部位の一部を含むようにデザインされ、かつ、そうでなければプライマー内に生成されるはずの予想される安定なヘアピンループを不安定にする一個の2'-デオキシイノシン残基を含む、GDNFセンス配列の末端切断型である。プライマー番号5230 (5'-CGG CCC AAG CAA GGA CGG TGT TTC T-3' (配列番号：14))は、エキソンIII起点の約480 bp上流にある実施例1Bに示す配列のヌクレオチド191〜215と相同である。PCR増幅反応混合物は、0.2 mM dNTPs、各プライマー番号5230と5231をそれぞれ0.6 _Mずつ、Expand DNA ポリメラーゼ52.5 U/ml、そしてポリメラーゼのメーカー(Boehringer/Mannheim)が提供する1X濃度の専用緩衝液を含んでいた。増幅用の鋳型DNAは、ヒトゲノムDNA(Boehringer/Mannheim)200 ng、クローンDMPC-HFF#1-0575-F3 0.1 ng、または、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIV内のEcoRI部位から約1.75 kb下流のSalI部位から始まる挿入DNAの約半分を切除するこのクローンのSalI欠失体0.1 ngのいずれかであった。各50μlの反応混合物をミネラルオイルで重層し、以下の構成を用いて増幅した。最初の変性段階、95℃で3分間；95℃で1分間変性、30秒間で60℃まで、60℃で1分間アニーリング、30秒間で72℃まで、そして72℃で4分間プライマー伸長を20サイクル；伸長時間を各サイクルにおいて15秒間ずつ増やす以外は同様の時間・温度で15サイクル；最後の伸長段階を72℃で10分間。各PCR反応混合物からのアリコットを電気泳動したところ、鋳型DNAが存在する各レーンでは約4.5 kbの生成物を示したが、鋳型DNAが存在しない場合、生成物は生成しなかった。これらの結果は、エキソンIがプライマー番号5230のハイブリダイゼーション位置から約4.5 kb上流にあるか、または、エキソンIIIの起点の約5.0 kb上流にあることを示した。
【００９２】
プライマー5230/5231からのPCR増幅産物を精製し、その約100 ngを32P-dCTP(Pharmacia Biotechのオリゴ標識キット)で標識した。先にジゴキシゲニン標識ヒトGDNF cDNAとハイブリダイズしたサザンブロットを前記と同様の緩衝液中42℃で一晩、放射標識生成物1 x 106 CPM/mlとハイブリダイズした。前記のように洗浄後、各P1ゲノムクローンの約9.4 kb EcoRI断片だけがオートラジオグラフィで検出された。これらの結果は、ヒトGDNF遺伝子のエキソンIおよびエキソンIIIが共に、互いに約5.0 kb離れて同じ約9.4 kb EcoRI断片内にあることを示している。
【００９３】
まずEcoRI処理およびウシ腸アルカリフォスファターゼ処理Zap Expressベクターアーム(Stratagene)にクローニングすることにより、約9.4 kbのEcoRI断片をベクターpBK-CMVにクローニングした。P1ヒトゲノムクローンDMPC-HFF#1-0575-F3 10μgをEcoRIで完全に切断した。断片を0.5%アガロースゲルで分離して、ゲルから精製した。EcoRI断片をEcoRI-およびウシ腸アルカリフォスファターゼ-処理Zap Expressベクターアームにライゲーションした。ライゲーション混合物をGigapack II Goldパッケージング抽出物(Stratagene)によってバクテリオファージラムダ粒子にパッケージングした。メーカー(Stratagene)の指示に従い、パッケージ化したDNAを、NZY寒天プレートに0.7%NZY寒天を上層したプレートにおいて、XL-1ブルーMRF'宿主細胞と共に播種した。単離プラーク11個を抜き取り、ファージ粒子を一晩SM緩衝液0.25 mlに溶出し、メーカーの指示によりXL-1ブルーMRF'細胞を組換えラムダファージおよびExAssist f1ヘルパーファージに共感染させることにより、ラムダファージからプラスミドを切り出した。XLOLR細胞を繊維状ファージ粒子としてパッケージングされた熱処理した切り出されたpBK-CMVファージミドとインキュベートし、LB寒天 + 50μg/mlカナマイシン寒天プレート上に播種することにより、切り出したファージミドを繊維状ファージ粒子から回収した。37℃で一晩プレートのインキュベーション後、単離したコロニーをつまみとり、LB + 50μg/mlカナマイシン中で増殖させた培養液からプラスミドDNAを作出した。一個のプラスミドpRBSEco9.4#8の特徴付けをさらに行った。
【００９４】
D.  クローニングした9.4 kb EcoRI断片のシークエンシング
まず始めにプライマー番号5231を利用して、プラスミドpRBSEco9.4#8（図2参照)をシークエンシングした。導出された配列に基づいて合成した他のプライマーを用いて、さらにシークエンシングを行った。最初のシークエンシングから以下に示す配列が明らかになった。
【００９５】
0003761152.tif 000006
【００９６】
さらに詳しくシークエンシングを行ったところ、図3A〜3B (配列番号：1)に示す配列が明らかになった。この配列は、メーカーが提案するデフォルトパラメーターをもつBESTFITプログラム（ウイスコンシン州マジソン、Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group)を用いて、マウスGDNF遺伝子の限定された領域(エキソンIからエキソンIの140 bp上流まで、GenBank登録番号#D88350S1)と79%同一であることが分かった。
【００９７】
E.  GDNF cDNAの5'末端分析による遠位GDNFプロモーターの転写開始部位の決定
RACE(cDNA末端の迅速増幅)変法(PCR Protocols (PCRプロトコール）(Academic Press, San Diego)におけるフローマン（Frohman）、(1989), 28-38))において、CapFinder PCR cDNA合成キット(Clontech Laboratories)を出発点として使用し、GDNF cDNA 5'末端に富むcDNAライブラリーを形成した。cDNA合成をランダム6量体(Gibco/BRL) 1μl(50 ng/μl)でプライミングした以外は、指示通りに(CapFinderキット、Clontech Laboratories)、ヒト胎児腎、胎児脳または成人骨格筋ポリA+ RNAの0.5μgについて第一ストランドcDNA合成を行った。PCRは指示通りに行ったが、ただし、プライマーは、供給されたCapFinder PCRプライマーおよびGDNFアンチセンスに関してそれぞれ0.4μMずつであり、最初の変性を94℃で3分間、そして、94℃で1分間の変性、58℃で1分間アニーリング、72℃で1分間プライマー伸長を行うサイクルを24回、最後の伸長を72℃で10分間行った。
【００９８】
一次PCR反応物を滅菌蒸留水で1000倍に希釈した後、CapFinder PCRプライマー0.2μMおよびプライマー番号5191 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3' (配列番号：16))0.4μMの存在下、同じ温度プログラムを25サイクル行ったこと以外は、先に使用したのと同様の反応混合物中でアリコット1μlを二次増幅した。PCR反応のアリコットのサザンブロットを、アガロースゲル電気泳動により分離して32P-ATP標識outGDNF1（上記実施例1B）をプローブとして調べると、長さ100 bpの複合バンド600-1が示された。このサイズ範囲のPCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製してDNAを回収し、pCR 2.1 (Invitrogen)にライゲーションした。ライゲーション混合物を、ElectroMAX DH10B細胞(Gibco/BRL)に電気穿孔して、LB寒天+ 50 mg/mlアンピシリン+ 50 mg/mlカナマイシンプレートに播種した。37℃で一晩インキュベーション後、コロニーをナイロンメンブランに載せ、標準的な方法によって、DNAを変性、中和そしてクロスリンクさせた。実施例1Aに記載したように、フィルターを標識cDNAプローブとハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション陽性コロニーからDNAを調製してシークエンシングを行った。
【００９９】
ヒト胎児腎からの遠位プロモーター由来cDNAの配列を以下に示し、配列中、ヌクレオチド1〜174は図1に示すようにエキソンIに相当し(図3Bのヌクレオチド1〜174)、ヌクレオチド175〜351は図1に示すようにエキソンIIIbに相当し、ヌクレオチド352〜763は図1に示すようにエキソンIVに相当し、ヌクレオチド740〜762はプライマー#5191によって与えられるものであり、ヌクレオチド175〜762は上記実施例1Aで得られた配列のヌクレオチド24〜611と同一である。
【０１００】
0003761152.tif 000007
【０１０１】
実施例2
ヒト遠位GDNFプロモーター・リポーター遺伝子構築物の製造および構築物の大腸菌へのトランスフェクション
プロモーター活性を調べるため、ホタルに発現されるルシフェラーゼに対する応答の感度および直線性の理由により、ホタルルシフェラーゼリポーター遺伝子を含む市販のプラスミドpGL3-Basic (Promega, Madison, WI, GenBank登録番号U47295)を使用して、リポーター遺伝子プラスミドを作出した。実施例1に記載のようにして作ったプラスミドpRBSEco9.4#8内に含まれる遠位GDNFプロモーターを、二段階法により、図5に示すとおり、ベクターのルシフェラーゼ遺伝子から上流の、pGL3-Basicの独自のNheI制限部位へ移動させた。
【０１０２】
第一段階において、プラスミドpGL3-Basicを制限エンドヌクレアーゼNheIで切断した。65℃で20分間インキュベーションして酵素を不活性化した後、ベクターの自己ライゲーションを防止するためエビアルカリフォスファターゼで処理して、この酵素を65℃で15分間加熱し不活化した。一方、pRBSEco9.4#8をAvrII次いでNheIで消化した。740 bp断片を0.5%アガロースゲルで電気泳動により分析し、ゲルからバンドを回収した。次に、回収したプロモーターのAvrII/NheI断片は、NheI切断pGL3-Basicにライゲーションした。ライゲーション混合物はINVaF'コンピテントな大腸菌細胞(Invitrogen)に形質導入し、LBアンピシリン寒天プレートに播種した。37℃で一晩増殖後、液体LBアンピシリン培地の小さい培養において増殖した各コロニーからプラスミドDNAを作出した。pGL3-BasicにおけるAvrII/NheIプロモーター断片の方向性は、プラスミドDNA調製物のXbaIによる消化およびルシフェラーゼ遺伝子に最も近い連結部における連結部配列をシークエンシングすることによって決定した。NheI/AvrII部分的プロモーター断片をもつ中間体プラスミドはp Nhe-GDNFと命名された。
【０１０３】
遠位GDNFプロモーターをpGL3-Basicへ転移させる第二段階において、中間体プラスミドp Nhe-GDNFを制限酵素NheIおよびPstIで順次切断し、混合物をフェノール/CHCl3で抽出後、エタノールで沈澱させた。SpeI (これはゲノムDNAインサートのEcoRI挿入部位に隣接するポリリンカーで切断する)およびPstIによりプラスミドpRBSEco9.4#8を切断した。約1095 bpのSpeI/PstI断片を0.5%アガロースゲルの電気泳動により分離および精製した。次いでSpeI/PstIプライマー断片を、NheIおよびPstIで切断したpNhe-GDNFにライゲーションした。LB +アンピシリンプレートに播種して37℃で一晩増殖させた、INVaF'コンピテント大腸菌細胞(Invitrogen)に前記断片を形質導入した。単離したコロニーからプラスミドDNAを調製し、プロモーターが挿入されていることを制限酵素消化およびシークエンシングにより確認した。ヒトGDNFプロモーターを含むルシフェラーゼプロモータープラスミドはpGDNF-1635と命名された。
【０１０４】
ヒト遠位GDNFプロモーターの様々なプロモーターまたはエンハンサー領域の重要性を評価するためのpGDNF-1635の制御欠失体は容易に作出される。プラスミドp Nhe-GDNFは、pGDNF-1635からの遠位GDNFプロモーターの5'末端で約1,040 bpを欠失した欠失体の一つである。前記プロモーターの5'末端の約255 bp 欠失体は、制限エンドヌクレアーゼSacIによるpGDNF-1635の消化、酵素の不活化、そして低DNA濃度におけるベクター部分の再ライゲーションにより達成され、こうしてp Sac-GDNFが得られる。さらなる欠失体は、制限酵素による操作かまたはヘニコフ（Henikoff）(1984), Gene 28, 357に記載されているように、エキソヌクレアーゼによって産生される制御欠失体によって作製する。全長のヒトGDNF遠位プロモーターの地図およびいくつかの5'末端切断型構築物を図7に示す。
【０１０５】
実施例3
ヒト細胞へのpGDNF-1635のトランスフェクションおよびヒト遠位GDNFプロモーター活性のアッセイ
ヒトグリオブラストーマU-87 MG細胞(ATCC番号HTB-14)または神経芽細胞腫SK-N-AS細胞(ATCC番号CRL-2137)に、リポフェクション法(フェルナー（Felgner）ら、(1987),  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417)を用いて、実施例2に記載したようにして調製したプラスミドpGDNF-1635をトランスフェクトした。
【０１０６】
U-87 MG細胞は、ラット尾コラーゲンI型(Collaborative Research, カタログ番号40450)をコーティングした直径8.5 cmの培養皿で約40%コンフルエンスになるまで増殖させた。培地を取り除き、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、メーカーの指示通りに調製したOptiMEM (Gibco/BRL番号31985)6.4 ml中にDNA 15μgとlipofectAMINE(Gibco/BRL番号18324-012)100μgとを含む溶液を静かに重層した。細胞は、5% CO2湿潤大気下37℃で5時間または24時間までインキュベートした。次いでトランスフェクション溶液を除き、10%ウシ胎児血清、1%非必須アミノ酸、1%グルタミンおよび1%ピルビン酸ナトリウムを含む最小基本培地(Gibco/BRL番号11095-080)10 mlと交換した。37℃で48時間インキュベーション後、細胞を回収して細胞抽出物を調製し、ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promegaカタログ番号E1501)によってアッセイした。
【０１０７】
SK-N-AS細胞を、直径8.5 cmの培養皿で約50%コンフルエンスになるまで増殖させ、PBSで1回洗浄後、前記細胞は、上記のように調製したOptiMEM (Gibco/BRL番号31985)6.4 ml中でDNA 15μgとlipofectAMINE(Gibco/BRL番号18324-012)80μgとを含む溶液を静かに重層した。細胞は、5% CO2湿潤大気下37℃で5時間インキュベートした。次いでトランスフェクション溶液を除き、10%ウシ胎児血清、1%非必須アミノ酸を含むダルベッコ改変イーグル培地(Gibco/BRL番号11965-092)10 mlと交換した。48時間後、細胞を回収して細胞抽出物を調製し、ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promegaカタログ番号E1501)によってアッセイした。
【０１０８】
前述のトランスフェクション手法をわずかに変更して、リポーター遺伝子発現に及ぼす種々のプロモーター欠失の影響を調べた。一つのプロモーター構築物の発現を他のそれと比べる場合、二つ異なるトランスフェクション間のトランスフェクション効率の変動を考慮することが重要である。本発明では、第二の独立して測定されるリポーター酵素を少量発現するもう一つの対照プラスミドと共トランスフェクションを行うことによってこの点を考慮した。ホタルのルシフェラーゼを発現するGDNFプロモーター欠失構築物と内部対照リポータープラスミドとの混合物で共トランスフェクション後、両リポーターを独立にアッセイし、ホタルルシフェラーゼ活性を対照リポーターの酵素活性によって標準化する。各実験間のトランスフェクション変動はそれによって排除される。本明細書において利用した対照リポータープラスミドは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターの制御下、海洋生物ウミシイタケ（Renilla）由来の第二の独立してアッセイ可能なルシフェラーゼを低レベルで発現するpRL-TK(Promega #E2241)であった。別々の基質添加および緩衝液組成の条件下、細胞溶解液は、ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼ酵素活性が互いに混入しないように、異なる２つのルシフェラーゼについて順番にアッセイを行う。
【０１０９】
ヒトグリオブラストーマU-87 MG細胞は、前記のように、lipofectAMINE 100μgの存在下、図7に示すリポータープラスミド13.5μgとpRL-TK内部対照プラスミドとの混合物を24時間トランスフェクトさせた。トランスフェクション後、U-87 MG培地(10%ウシ胎児血清、1%非必須アミノ酸、1%グルタミンおよび1%ピルビン酸ナトリウムを含むMEM)中で20時間、インキュベーターにてインキュベートして細胞を回収した後、直径8.5 cm のプレートから採取して、同じ培地において、ラット尾コラーゲンをコーティング12ウエルプレート(Becton Dickinson Labware #40500)に分散した。プレートを9時間インキュベートし、その後U-87 MG培地を取り除いてOptiMEMと交換した。細胞を37℃で18時間インキュベートして培地を除去し、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、1X受動溶解緩衝液(Promega #E194A)0.25 mlを各ウエルに添加し、プレートを静かに振とうしながら室温で15分間インキュベーションすることにより、細胞溶解物をインサイチューで調製した。前記のように、SK-N-AS細胞に同じプラスミドをトランスフェクトさせた。
【０１１０】
各細胞溶解物の15μlアリコットは、Dual-Luciferaseリポーターアッセイシステムキット(Promega #E1910)の試薬を用い、ホタルルシフェラーゼ、次いでウミシイタケのルシフェラーゼについてアッセイした。ウシフェラーゼ活性は、増強モードで操作される96ウエル型ルミノメーター(Dynex Technologies, ML-3000モデル)を用いて定量した。各細胞溶解物の測定は3回繰り返し、所定の処置の結果はすべて6回の繰り返し処置の平均値から得た。
【０１１１】
可能性のあるエンハンサーおよびサイレンサーエレメントならびに基本プロモーター自体の位置をマッピングするために、pGDNF-1635の5'欠失変異体を構築し、トランスフェクトしてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図7に示す。U-87 MGグリオブラストーマ細胞において、最も5'側の120 bp (-1516)の欠失により、プロモーター活性が30%減少し、これは、-1635と-1516との間にエンハンサーエレメントが存在することを示している。さらに-1304までの欠失によりプロモーター活性は2倍増加して、-1378と-1304との間にサイレンサーエレメントが存在することを示唆している。次の170 bp から-1134までを欠失しても、U-87 MG細胞に明白な影響を認めなかった。さらに-1134から-366までの欠失によって、プロモーター活性は徐々に失われ、これはエンハンサーエレメントの領域が広いことを示している。興味深いことに、egr2およびAP-2のコンセンサス結合部位を含む領域である-744から-593までのこの領域内の欠失によって、プロモーター活性はより顕著に減少し、このことは、egr2および/またはAP-2が調節活性に重要であることを示唆している。これに対し、コンセンサスNF-κB結合部位を含む領域である-366と-307間を欠失しても、U-87 MG細胞のプロモーター活性に何の変化も生じなかった。最後に、-307から-193までを欠失すると、プロモーター活性は約5倍増加したのに対し、さらに-62までを欠失しても、活性はわずかに増えただけであった。これは、この領域に強いサイレンサーエレメント(一または複数)が存在することを示している。
【０１１２】
SK-N-ASニューロブラストーマ細胞における調節領域の欠失は、U-87 MG細胞で得られた結果と比べ、顕著な違いを生じた。図7は、U-87 MG細胞についてこれまでに述べた結果と同様、最初の120 bpにエンハンサーが存在すること、その後にSK-N-AS細胞の-1378から-1304にサイレンサーが存在することを示している。しかしながら、領域-1304から-1134の欠失はU-87 MG細胞では何の影響も与えなかったが、SK-N-AS細胞では減少を生じたことから、この領域に細胞型特異的エンハンサーが存在することが示唆される。転写因子AP-2の一対のコンセンサス結合部位がこの領域で見つかった。これら二つの細胞株間のもう一つの違いは-1134と-853間に見られる。U-87 MG細胞においてエンハンサーであることが既に分かっているこの領域の欠失により、SK-N-AS細胞ではルシフェラーゼ発現の増加を生じた。CREBのコンセンサス結合部位はこの領域内に見出された。-852と-593との間の近位欠失により、U-87 MG細胞に認められた効果と同様、SK-N-AS細胞においてもエンハンサー領域が存在することが判明した。さらに、-593と-366間および-366と-307間の欠失により、SK-N-AS細胞ではルシフェラーゼ活性がそれぞれ3倍および2倍まで増加し、これはこの細胞株においてサイレンサーが存在することを示すものである。これに対し、U-87 MG細胞では、-593から-366の領域がエンハンサーとして機能するように思われるのに対し、明らかなNF-κB結合部位を含む-366から-307までの領域は全く影響を示さなかった。以上を総合すると、これらの結果は、細胞型特異的エレメントが本プロモーターの活性を変化させる可能性があることを示唆している。
【０１１３】
実施例4
ヒト中位および近位GDNFプロモーターのクローニングおよび特徴付け
A.  ヒト胎児腎からの中位プロモーター由来cDNA
RACE変法の出発点としてCapFinder PCR cDNA合成キット(Clontech Laboratories)を用いて、GDNF cDNAの5'末端に富むcDNAライブラリーを作製した。ヒト胎児腎、胎児脳または成人骨格筋ポリA+ RNA(Clontech Laboratories)の0.5 _gについての第一ストランドcDNA合成は、cDNA合成をランダム6量体(Gibco/BRL) 1μl(50 ng/μl)でプライミングした以外は、メーカーの指示(CapFinderキット、Clontech Laboratories)に従って行った。PCRは、プライマーは供給されたCapFinder PCRプライマーおよびGDNFアンチセンスがそれぞれ0.4μMずつであったことを除いては、指示通りに行った。PCRプログラムは、最初の変性を94℃で3分間、そして、94℃で1分間の変性、58℃で1分間アニーリング、および72℃で1分間プライマー伸長のサイクルを24回、72℃で10分間の最後の伸長であった。
【０１１４】
一次PCR反応液を滅菌蒸留水で1000倍に希釈した。希釈反応液それぞれの1μlアリコットを、CapFinder PCRプライマー0.2μMおよびプライマー番号5191 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3' (配列番号：18))0.4μMの存在下、同じ温度プログラムを25サイクル行ったこと以外は、先に使用したそれと同様の反応混合物において二次増幅させた。二次PCR反応液アリコットのサザンブロットをアガロースゲル電気泳動により分離して、32P-ATP標識outGDNF1（上記実施例1B）をプローブとして調べたところ、長さ100 bpの複合バンド600-1が示された。このサイズ範囲のPCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製してDNAを回収し、プラスミドpCR 2.1 (Invitrogen)にライゲーションした。ライゲーション混合物を、ElectroMAX DH10B細胞(Gibco/BRL)に電気穿孔し、LB寒天+ 50 μg/mlアンピシリン+ 50 μg/mlカナマイシンを含むプレートに播種した。37℃で一晩インキュベーション後、コロニーをナイロンメンブランに写し、標準的な方法を用いて、DNAを変性、中和そして紫外光に暴露することによりメンブランとクロスリンクさせた。フィルターを標識cDNAプローブ(上記実施例1AのhuGDNF)とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション陽性コロニーからDNAを調製してシークエンシングを行った。ヒト胎児腎由来のそのようなcDNAの配列を以下に示す。
【０１１５】
0003761152.tif 000008
【０１１６】
上記配列において、ヌクレオチド585〜607はプライマー番号5191によって与えられ、ヌクレオチド1〜97 (エキソンII、図1参照)およびヌクレオチド98〜146は、実施例1Bに記載のヒトゲノムDNAのPCRウオーキングフラグメントのうち、それぞれヌクレオチド5〜101およびヌクレオチド673〜721と相同であり、ヌクレオチド98〜607は実施例1Aに記載のcDNA配列において、ヌクレオチド122〜201間に78 bpの欠失をもつ塩基24〜611と相同である。
【０１１７】
B.  ヒト胎児脳からの近位プロモーター由来のcDNA
ランダムプライミングしたヒト胎児脳ポリA+ RNA (Clontech Laboratories)および、内側(nested)のプライマーセットを利用する2ラウンドのPCR増幅とを用いて、5'-AmpliFINDER RACEキット(Clontech Laboratories)によって5' RACEを行った。一次PCR増幅は、メーカーが提案する条件に従い、アンカープライマー(5'-CCT CTG AAG GTT CCA GAA TCG ATA G-3' (配列番号：20)および遺伝子特異的プライマー1 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3' (配列番号：16))によって、アニーリング温度54℃を用いて40サイクルを行った。蒸留水で100倍希釈後、希釈した一次PCR産物1μlを、プライマー番号3442 (5'-GGA ACC TCG AGA ATC GAT AGT GAA TTC GTG-3' (配列番号：21))および遺伝子特異的プライマー2 (5'-TCG TAC GTT GTC TCA GCT GCA TC-3' (配列番号：22))または遺伝子特異的プライマー3 (5'-ACC TTT TCC TCT GGA ATT CTC TG-3' (配列番号：23))のどちらかによって、さらに30サイクル増幅した。PCRの条件は、57℃のアニーリング温度を使ったこと以外、一次PCR増幅と同様であった。増幅されたPCR産物をベクターpCR2.1 (Invitrogen)にクローニングした後シークエンシングした。プライマー番号3442および遺伝子特異的プライマー2による二次増幅から得られた産物を以下に示す。
【０１１８】
0003761152.tif 000009
【０１１９】
上記配列において、ヌクレオチド1〜30および513〜535は、それぞれ、プライマー番号3442および遺伝子特異的プライマー2によって与えられ、ヌクレオチド33〜166は、実施例1Bに記載されたヒトゲノムDNAのPCRウオーキングフラグメントのヌクレオチド588〜721と相同であり、そしてヌクレオチド118〜535は実施例1Aに記載のcDNA配列のヌクレオチド122〜201間に78 bpの欠失をもつヌクレオチド24〜519と相同である。
【０１２０】
C.  近位プロモーターの配列
鋳型としてプラスミドpRBSEco9.4#8を用いて、実施例1Bに記載されたヒトゲノムDNAのPCRウオーキングフラグメント配列を伸長し、図4A〜4C (配列番号：2)に示す近位プロモーターのプロモーター配列を得た。
【０１２１】
図4Bに示す配列中+6および+67の位置は、異なるゲノムDNAにおいて可変であるように思われる。+6位はAまたはGであってもよく、+67位はTまたはCのどちらでもよい。
【０１２２】
実施例5
ヒト遠位および近位GDNFプロモーターの両方を含むルシフェラーゼリポータープラスミドの構築
図6A〜6Bに示す手法に従って、ヒト近位および遠位GDNFプロモーターおよびこれに機能的に結合されたルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むリポーター遺伝子プラスミドを作製した。プラスミドpRBSEco9.4#8内に含まれる近位および遠位GDNFプロモーターを二段階で、pGL3-Basicリポータープラスミド誘導体であるpGDNF-1635の唯一のEcoRIおよびHindIII部位に移動させた。この方法をまず簡単に述べ、続けてさらに詳細な説明を行う。
【０１２３】
まず、図4A〜4Cに示す近位プロモーター配列中-10と+705間の領域をPCRによって修飾し、696〜698塩基対の翻訳開始部位を取り除く。次いでPCR産物をプラスミドpKS bluescript IIにクローニングした。そのプラスミドのポリリンカーの隣接HindIII部位およびインサート内の唯一のEcoRV部位を利用して、1個のクローンからインサートを切除。次に、HindIIIからEcoRVまでのインサート断片をEcoRV-およびHindIII-切断pRBSEco9.4#8にクローニングしてプラスミドpRBSEco9.4proxmodを得た。唯一のEcoRIおよびHindIII部位の切断によって、プラスミドpRBSEco9.4proxmodからのインサートを切除して、実施例2の記載通りに調製したEcoRI-およびHindIII-切断pGDNF-1635にクローニングし、プラスミドpGDNFprox+distを得た。
【０１２４】
エキソンIIIの翻訳開始部位を、プライマー番号5361 (5'-CCA GAT ATC CCA TAC AGG CCA A-3' (配列番号：25))および5363 (5'-ATA ACT AGA TCT TAA AGT CCC GTC C-3' (配列番号：26))を用いたPCRにより改変した。PCR反応物は、0.2 mM dNTPs、各プライマー番号5361と5363をそれぞれ0.4 _Mずつ、Expand DNA ポリメラーゼ70 U/ml、そしてポリメラーゼのメーカー(Boehringer/Mannheim)が提供する1X濃度の専用緩衝液を含んでいた。増幅用の鋳型DNAは0.1 ngのプラスミドpRBSEco9.4#8 であった。各50μlの反応物に鉱油を重層し、まず94℃で3分間変性し、94℃で1分間変性、42℃で1分間アニーリングそして72℃で1分間のプライマー伸長を5サイクル行った後、アニーリング温度を53℃とした以外は同じ時間・同じ温度で30サイクルを行い、最後の伸長を72℃でさらに10分間行った。PCR反応物からのアリコットを電気泳動したところ、約700 bpの予想生成物を示した。PCR産物を精製後(Promega MagicPrep)、EcoRV切断プラスミドpBluescript II KSにクローニングした。EcoRVおよびHindIIIで消化することにより、得られたプラスミド1個からの約700 bp のインサートが放出され、インサートを含むゲルを精製した。これを、EcoRVおよびHindIIIで切断されているpRBSEco9.4#8にクローニングした。カナマイシン含有プレートで選択し、PCRによって該プラスミドに導入されたさらなるBglII部位の有無をスクリーニングした後、得られた1個の産生物プラスミドpEco9.4proxmodを、シークエンシングおよびさらなる遺伝子操作用として選択した。
【０１２５】
プラスミドpEco9.4proxmodをEcoRVおよびHindIIIで切断して約6.8 kbの挿入物を放出した。断片をゲル精製することなく、これを、EcoRVおよびHindIIIで切断したpGDNF-1635 (唯一のEcoRI部位がその構築中に、上流ポリリンカーセグメントのすぐ内側へ導入されたため、このpGL3-Basic誘導体を使用した)にライゲーションした。アンピシリン含有プレートで形質転換体(トランスフォーマント)を選択した。所望のインサートをもつ1個のプラスミドpGDNFprox+distを次の作業に使用した。
【０１２６】
実施例6
ヒト近位GDNFプロモーターを含むルシフェラーゼリポータープラスミドの構築
pGDNFprox+distにおいてプロモーターの上流部分を除いたところ、ルシフェラーゼの発現を誘発する近位の(すなわち、中位および近位の)プロモーターだけをもつリポータープラスミドが得られた。これは、制限エンドヌクレアーゼMluIでpGDNFprox+distを切断することによって達成され、残りのプラスミドを再度ライゲーションするとpGDNFprox Mluが得られた。このプラスミド(すなわち、pGDNFprox+dist)を、MluIおよび近位プロモーター内で切断するがプラスミドの残部では切断しない他の制限酵素で切断すると、さらなる欠失体を生じる。例えば、MluIで切断後NruIで切断し、クレノウ断片プラスdNTPsによって平滑末端に変換後再びライゲーションすると、pGDNFprox Nruが得られる。
【０１２７】
実施例7
逆転写/ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)の結果
ヒト組織またはU-87 MG細胞における転写産物3個の相対量を決定するため、共通の下流プライマーならびに、遠位、中位および近位GDNF転写産物に特異的な上流プライマーを用いて、種々のRNA調製物に対してRT-PCRを行った。遠位プライマー5'-CCC AGG ATT GCG AAC TCT TGC-3' (配列番号：27)は実施例1Eに示す配列のヌクレオチド35〜55と同一であった。中位プライマー5'-TCT CCA AGT CCC TGC TAA CTT CT-3' (配列番号：27)は実施例4Aに示す配列のヌクレオチド16〜38と同一であった。近位プライマー5'-CGT GCA TTC TGC GGT TCT-3' (配列番号：29)は実施例4Eに示す配列のヌクレオチド72〜89と同一であった。エキソンII/エキソンIII連結部で起こり得る選択的スプライシングから生じる複雑さを排除するため、共通の下流プライマー5'-GAG CAG CAC CAG GCA GAC-3' (配列番号：30)が選択された。
【０１２８】
U-87 MG細胞から全RNAを調製した。U-87 MG細胞は、実施例3に記載のように、8.5 cmの培養皿でコンフルエンスになるまで増殖させた。次いで、培地を0.5%ウシ血清アルブミン添加OptiMEM (Gibco/BRL番号31985)に交換し、この培地で細胞をさらに12時間インキュベートし、その際、10 ng/ml IL-1-、10 nM ジデカノン酸ホルボール、50 ng/ml塩基性FGF(線維芽細胞増殖因子)、1 mMジブチリル-サイクリックAMP、1 Mデキサメサゾン、10 ng/ml TNF^、または無添加(培地)のいずれかで行った。さらに12時間細胞をインキュベートし、メーカーの指示(Tel-Test, Inc., Friendswood, TX)に従いRNAzol（登録商標）Bを用いて、全RNAを単離した。
【０１２９】
RNA試料に混入するゲノムDNAを除くため、試料をまずDNase Iで処理した。ヒト胎児肝、成人肝、胎児腎、胎児脳、成人脳または成人骨格筋からのポリA+ mRNA(Clontech Laboratories)1μgまたは全RNA(U-87 MG細胞)の3μgは、第一ストランドcDNA合成の前に、37℃で30分間1単位のDNase I (RQ1 RNase不含DNase, Promega #M610A)で前処理した後、70℃で20分間の加熱不活化を行った。第一ストランドcDNAは、ランダムプライマー50 ngを用い、指示された通りGibco SuperScript（登録商標）前増幅システムキット(Gibco #18089-011)で、全RNA(U-87 MG細胞)3μgまたはポリA+ RNA(ヒト組織RNAs)1μgのいずれかから合成した。ポリメラーゼを添加した緩衝液の存在下、0.2 mM dNTPs、1μMの遠位、中位、近位および共通プライマー、鋳型としてcDNAを1μl、そしてAdvantage（登録商標）KlenTaq ポリメラーゼ混合物(Clontech #8417-1)1μlを含む反応液50μl中でPCRを行った。陽性対照は、1μlのcDNA鋳型を、0.1アットモル、0.01アットモルまたは0.001アットモル（1ゼプトモル=1 x 10-21モル）の遠位、中位もしくは近位cDNA(それぞれ実施例1E、4A、4E)のうち一個を含む1μlで、または上記cDNAsのそれぞれの等モル量で置換することによって与えられたものである。陰性対照は、1μlのcDNA鋳型を、逆転写酵素を添加しない同様の反応液1μlで置換することを含む。温度サイクルのパラメーターは、最初の変性を94℃で2分間、その後94℃で30秒間の変性、66℃で30秒間のアニーリング、そして72℃で1分間の伸長を30サイクル、その後最後のインキュベーションを72℃で10分間で構成された。TBE緩衝液(FMC BioProducts #54906)中、PCR反応液のアリコート10μlを4%  NuSieve(登録商標)3 : 1アガロースゲルに載せて電気泳動により分離した。ゲルを可視化し、302 nmでトランスイルミネーター(transilluminator)を用いて写真撮影を行った。
【０１３０】
図8Aは、RT-PCRの評価結果を示す。レーン1は、実施例4Eからのクローニングされた近位転写産物0.1アットモルをプライマー混合物と共に増幅した結果である予想された114 bpと一致するサイズのバンドを示す。レーン2は、実施例4Aからのクローニングされた中位転写産物0.1アットモルをプライマー混合物と共に増幅することにより生じる、予想された150 bpの生成物と一致するバンドを示す。レーン3は、実施例1Eからのクローニングされた遠位転写産物0.1アットモルをプライマー混合物と共に増幅することから生じる、予想された208 bpの生成物と一致するバンドを示す。レーン1、2および3における生成物のバンドは、ほとんど等しい強度であり、これらの条件下では、各生成物の増幅が同様の効率で起こることが示唆される。レーン4は、鋳型を加えなければ生成物が産生されないことを示す。レーン5は、近位、中位および遠位鋳型の各0.1アットモル混合物をプライマー混合物と共に増幅した結果である。レーン6および7は、各鋳型が0.01アットモル(レーン6)または0.001アットモル(1ゼプトモル、レーン7)存在する以外はレーン5と同じである。レーン5、6および7は、これらを総合すると、各生成物の増幅は同様の効率で起こること、そして、アッセイの感度は3つの鋳型のどれに対しても1ゼプトモル以下であることを示す。中位、遠位および共通プライマーのみの存在下、0.1アットモルの近位鋳型をサイクルさせた場合、または、近位、遠位および共通プライマーのみの存在下、0.1アットモルの中位鋳型をサイクルさせた場合、または、近位、中位および共通プライマーのみの存在下、0.1アットモルの遠位鋳型をサイクルさせた場合について別々の実験を行ったところ、生成物は何も産生しなかった。これは、類似していない鋳型とプライマー間の交叉反応性が欠如していることを示す（結果図示せず）。
【０１３１】
図8Bは種々の処置後、U-87 MG細胞から単離したRNAについて、近位、中位および遠位転写産物プライマーでRT-PCRを行った結果を示す。レーン1は、各鋳型の0.1アットモル混合物を増幅した後の生成物を含む。レーン4は、培地のみの存在下、U-87 MG細胞から単離されたRNAの増幅によるRT-PCR産物を示し、一方レーン3は、逆転写酵素をcDNA合成反応液に添加していないことを除けば、同じ反応液である(-RT対照)。レーン4では、遠位および近位増幅によりほとんど等量の生成物が見られるのに対し、レーン3は何も生成せず、これは、生成物の形成が逆転写酵素の存在に依存することを示している。レーン5、6、7および8は、10 ng/ml インターロイキン-1-(IL-1-)、10 nM ジデカノン酸ホルボール(PDD)、50 ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、または1 mMジブチリル-cAMP (db-cAMP)でU-87 MG細胞を12時間処理したところ、培地のみ(レーン4)の場合に比べて、GDNFの近位および遠位転写産物の量に増加が見られたことを示す。レーン5〜8では、近位および遠位転写産物の割合はほぼ同等であったが、各レーンにおいて近位産物よりもいくらか遠位産物のほうが多いことが認められた。レーン9は、U-87 MG細胞を1 Mデキサメサゾンで12時間処理すると、培地のみの場合と比べて、GDNFの近位および遠位転写産物の量が減少することを示す。最後にレーン10は、U-87 MG細胞を10 ng/ml の腫瘍壊死細胞^(TNF^)で12時間処理すると、培地のみの場合と比べて、GDNFの近位および遠位転写産物の量が増加することを示す。従って、U-87 MG細胞では、GDNFの近位および遠位転写産物を認めるが中位転写物は認められず、これら転写産物の量は、IL-1-、PDD、bFGF、db-cAMPまたはTNF^処理によって増加させることができるが、デキサメサゾンでは転写産物が減少する。
【０１３２】
図8Cは、種々のヒト組織から単離されたRNAについて、近位、中位および遠位プライマー混合物によるRT-PCRの結果を示す。レーン3〜8は、それぞれ、胎児肝、成人肝、胎児腎、成人脳、胎児脳および成人骨格筋からのRNA増幅産物を含むものであるが、これらは、遠位転写産物由来の生成物の存在のみを示す。胎児腎(レーン5)および成人骨格筋(レーン8)はほとんど等しい、最高濃度の生成物を示すのに対し、胎児脳(レーン7)、胎児肝(レーン3)および成人肝(レーン4)では、順に生成物の量が減少した。成人脳(レーン6)は、ようやく検出できる程度の生成物を示す。cDNA合成反応から逆転写酵素を除いた対照反応では、上記の組織すべてについて生成物を産生しなかった(結果示さず)。従って、U-87 MG細胞とは対照的に、これらの組織にはGDNFの遠位転写産物のみが含まれる。
【０１３３】
図8Aに示すRT-PCRの結果は、このアッセイがGDNFの三つの転写産物に感受性であり、かつ、特異的であることを示している。図8Bの結果は、多様な方法で処理したU-87 MG細胞において、近位および遠位転写産物が共にほぼ等しい割合で容易に検出されることを示している。しかしながら、選択されたヒト組織から単離したRNAのRT-PCでRは、遠位プロモーター活性のために、ほぼ遠位転写産物に限って検出された。これらのヒト組織に他の転写産物が存在する可能性はあるが、遠位転写産物は、これらの増幅条件下で検出される唯一の産物であるため、はるかに高い濃度で存在している。さらに、U-87 MG細胞は、特定の細胞型または、この限定された組織サンプリングには存在しない発生期を表す可能性がある。本発明の結果は、遠位プロモーターがインビボにおけるGDNF発現の主要な決定因子であることを示唆している。
【０１３４】
以上、1、2または3個のプロモーターを含む、遠位および近位ヒトGDNFプロモーターおよびリポーター遺伝子の構築物を開示してきた。本発明の好ましい態様をある程度詳細に記載したが、種々の変更を行うことができること、およびそれらも請求の範囲に定義する本発明の精神および範囲に含まれることと理解される。
【０１３５】
実施例1Cで得られた大腸菌形質転換体XLOLR/pRBSEco9.4#8の生物学的に純粋な培養物は、1997年7月15日、米国メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、寄託番号98498が付与された。この寄託はブダペスト条約の規定の下で行われた。本出願に記載した配列とルーチンのシークエンシングエラーによる寄託プラスミドに含まれる対象とする遺伝子配列との間に万一相違があったとしても、寄託したプラスミド対照の配列が基準となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1A〜1Dは種々のヒトGDNFプロモーターの構造を示す。図1Aは、エキソンI、II、IIIa+IIIbおよびIVの位置、および遠位、中位、近位プロモーターを示すヒトGDNFの遺伝子地図である。図1B、1Cおよび1Dは、それぞれ、遠位GDNFプロモーター、中位GDNFプロモーターおよび近位GDNFプロモーターに由来するGDNF遺伝子転写産物を図示する概略図である。
【図２】  図２はプラスミドpRBSEco9.4#8の一覧図である。
【図３】  図3A〜3B（配列番号：1）はヒト遠位GDNFプロモーターのヌクレオチド配列および最初のイントロン部分を示す。エキソンI（nt +1から開始する）には下線を付してあり、実施例1Eのヌクレオチド1〜174と同一である。コンセンサススプライス部位(ジャンクション)供与配列は、エキソンIの最も3'側の配列の下に示す。転写因子のコンセンサス配列はDNA配列の上に示し、転写因子の略称はコンセンサス配列の上に斜体で示す。ヌクレオチドの番号付けはエキソン1の起点に対してである。
【図４】  図4A〜4C（配列番号：2）はヒト近位GDNFプロモーターのヌクレオチド配列を示す。図中、エキソンIIには下線（中間転写産物）、エキソンIIIには二重下線を付けてあり、近位転写産物（エキソンIIIaで生じる）の起点は太字で示し、推定の転写因子名はこれらコンセンサス結合部位の上に示す。番号付けはエキソン2の起点に対してである。
【図５】  図５はプラスミドpGDNF-1635を実施例2に記載のように作る方法を示す。
【図６】  図6A〜6Bは、実施例5に記載するようにプラスミドpGDNFprox+distを作る方法を示す。
【図７】  図７は、ヒトGDNF遠位プロモーターおよびその様々な5'欠失体の地図を示す。1行目は、表示の転写因子の結合部位と思われる位置と共に完全な5'隣接断片を線状に記載したものである。以下の各行は、欠失の左側の5'-隣接配列の量を直線状に示したマップを示し、最も5'-側の配列の程度を（図3A〜3Bに示すように）各サブクローンの左側に表示する。実施例に記載されているように、クローンはすべてルシフェラーゼリポーターベクターpGL3の中に存在した。異なる二種の宿主における相対ルシフェラーゼ平均値+/- sem (n=6)を、それぞれの欠失体について右側に示す。
【図８】  図8A〜8Cは、実施例7に記載されているように、三種類の異なるGDNF転写産物についてRT-PCRの結果を示す。図8Aは、クローニングしたcDNA鋳型の較正結果を示す。レーン1：近位鋳型100ゼプトモル＋全プライマー；レーン2：中位鋳型100ゼプトモル＋全プライマー；レーン3：遠位鋳型100ゼプトモル＋全プライマー；レーン4：鋳型なし；レーン5：各鋳型100ゼプトモル＋全プライマー；レーン6：各鋳型10ゼプトモル＋全プライマー；レーン7：各鋳型1ゼプトモル＋全プライマー。図8Bは、種々の処理を12時間行った後のU-87 MG細胞の結果を示す。レーン1、クローニングした各鋳型10ゼプトモル＋全プライマーの陽性対照；レーン2、マーカー100 および200 hp；レーン3、レーン4と同じであるが逆転写酵素による処理を行っていない陰性対照；レーン4、培地のみ；レーン5、IL-1- (10 ng/ml)；レーン6、PDD (10 nM)；レーン7、BFGF (50 ng/ml)；レーン8、db-cAMP (1 mM)；レーン9、デキサメサゾン(1 M)；レーン10、TNF^ (10 ng/ml)。図8Cはヒト組織の結果を示す。レーン1、クローニングした各鋳型10ゼプトモルの陽性対照；レーン2、マーカー100 および200 hp；レーン3、胎児肝；レーン4、成人肝；レーン5、胎児腎；レーン6、成人脳；レーン7、胎児脳、およびレーン8、成人骨格筋。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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