(57)【要約】転写因子と該転写因子の活性化因子との融合タンパク質を発現するベクター、および該転写因子により発現が誘導されるレポーター遺伝子を含むベクターを細胞内へ導入した。このレポーター遺伝子の発現を指標とすることにより、該転写因子が活性化している細胞を分離することができる。該レポーター遺伝子が発現した細胞と、発現しない細胞における遺伝子の発現量を比較することにより、レポーター遺伝子を発現した細胞において発現量が増大している遺伝子を、該転写因子の標的遺伝子として同定することができる。
2002029043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の転写因子の標的遺伝子を検出する方法であって、
（ａ）　転写因子と該転写因子の活性化因子との融合タンパク質を発現するベクター、および該転写因子の結合配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するベクター、を含む細胞を提供する工程、
（ｂ）　工程（ａ）の細胞について、該レポーター遺伝子を発現した細胞と発現しない細胞とに分離する工程、
（ｃ）　該レポーター遺伝子を発現した細胞における遺伝子の発現を、対照細胞における遺伝子の発現と比較し、該レポーター遺伝子を発現した細胞において有意に発現量が増大している遺伝子を同定する工程、を含む方法。
【請求項２】
特定の転写因子の標的遺伝子を単離する方法であって、
（ａ）　転写因子と該転写因子の活性化因子との融合タンパク質を発現するベクター、および該転写因子の結合配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するベクター、を含む細胞を提供する工程、
（ｂ）　工程（ａ）の細胞について、該レポーター遺伝子を発現した細胞と発現しない細胞とに分離する工程、
（ｃ）　該レポーター遺伝子を発現した細胞における遺伝子の発現を、対照細胞における遺伝子の発現と比較し、該レポーター遺伝子を発現した細胞において有意に発現量が増大している遺伝子を同定する工程、
（ｄ）　工程（ｃ）において同定された遺伝子を単離する工程、を含む方法。
【請求項３】
レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）における細胞の分離をＦＡＣＳにより行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
対照細胞として、工程（ｂ）において分離された該レポーター遺伝子を発現しない細胞を用いる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
転写活性化因子がＶＰ１６である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
転写因子と該転写因子の活性化因子との融合タンパク質を発現するベクターおよび該転写因子の結合配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するベクターを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、特定の転写因子の標的遺伝子を同定および単離する方法に関する。
背景技術
細胞内における遺伝子の発現は様々なレベルで制御されている。その中でも遺伝子の転写レベルでの制御は、遺伝子発現の制御において非常に重要な役割を担っている。細胞内において、この転写制御の中心的な役割を果たす分子が、転写因子である。
近年、多くの転写因子が同定され、その機能解析が進んでいる。例えばＣＲＥＢは、ｃＡＭＰ濃度が上昇したときに発現する一群の遺伝子のプロモーター領域にある−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−という共通配列に結合するタンパク質として精製された。ＣＲＥＢはＰＫＡ等のキナーゼによりリン酸化され、ＣＢＰと結合して転写を活性化することが明らかになった。ＣＲＥＢのノックアウトマウスは、長期記憶が失われているので、ＣＲＥＢは記憶のような高次神経機能に重要な転写因子である可能性がある（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：６６８２−６６８６，１９８６；Ｎａｔｕｒｅ　３２８：１７５−１７８，１９８７；Ｃｅｌｌ　７９：４９−６８，１９９４）。
また、レチノイン酸レセプターはレチノイン酸と結合し、ＡＧＧＴＣＡ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡという配列をプロモーターに持つ遺伝子の転写を制御する転写因子である。レチノイン酸レセプターは、発生、細胞分化に重要な働きをするだけではなく、急性前骨髄性白血病では、第５染色体のＰＬＺＦ遺伝子または第１５染色体のＰＭＬ遺伝子と転座を起こしていることから白血病発症との関わりが指摘されている（”Ｔｈｅ　Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”Ｓｐｏｒｎ，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ　ｅｄｓ，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９４；Ｃｅｌｌ　６６：６６３−６７４，１９９１）。
さらにｐ５３は、癌抑制遺伝子として同定された転写因子である。ｐ５３はＤＮＡ損傷が生じた際、細胞周期を止め修復に必要な遺伝子群の転写を制御しているものと考えられている。Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群においてｐ５３遺伝子の変異が発見されたことや、ｐ５３ノックアウトマウスでは肉腫やリンパ腫の発生が認められていることから、ｐ５３の機能消失は、癌発症と関連があるものと考えられている（Ｃｅｌｌ　７１：５８７−５９７，１９９２；Ｃｅｌｌ　７５：８１７−８２５，１９９２；Ｎａｔｕｒｅ　３５６：２１５−２２１，１９９２；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５０：１２３３−１２３８，１９９０；Ｎａｔｕｒｅ　３５１：４５３−４５５，１９９１）。
このように個々の転写因子の同定やその活性化のメカニズム等に関しては知見が次第に蓄積し、その産業上の応用が試みられてきているが、その一方で、転写因子の標的遺伝子の同定はあまり進んでいない。
個々の転写因子の標的遺伝子を同定することは、転写因子の同定と同様に産業上重要な意義を有するといえる。例えば、転写因子の標的遺伝子が明らかとなれば、標的遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングが可能となり、このような化合物は新薬開発のための重要な候補となる。特に、ｐ５３、Ｒｂ等の癌抑制遺伝子やｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ等の前癌遺伝子の標的遺伝子群が同定できれば、癌の診断や癌治療薬の開発に有用な情報をもたらすことができよう。
しかしながら、転写因子の標的遺伝子を同定するための従来の手法には様々な問題点が存在する。例えば、従来の転写因子の標的遺伝子の同定が、主にｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて行われていたため、これにより同定された標的遺伝子が、細胞内においても実際に該転写因子の標的遺伝子となっているかが疑問であった。また、転写因子の多くは単に細胞内で発現するだけでは活性化せず、リン酸化や核移行等がその活性化に必要である。従って、転写因子を単に細胞内で発現させることでは、標的遺伝子の転写誘導を行うことは難しく、このことが細胞内において転写因子の標的遺伝子を同定することを困難にしていた。さらに、転写因子を発現させるためのベクターの細胞への導入効率が用いる細胞により様々であることから、特にベクターの導入効率が低い細胞を用いる場合には、標的遺伝子の同定が困難であった。
このように、転写因子の標的遺伝子の同定は、その産業上の重要性にもかかわらず、技術的に困難な面が多く、転写因子の標的遺伝子を同定するための新たな方法の開発が望まれていた。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は転写因子の標的遺伝子を効率的に検出および単離する方法を提供することにある。
本発明者らは、まず、多くの転写因子が単に細胞内で発現するだけでは活性化しないという従来の問題点を解決するために、転写活性化因子の融合により転写因子がリン酸化などの修飾なしに転写因子を活性化することができるという報告（Ｓａｄｏｗｓｋｉ　Ｉ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３３５：５６３−５６４，１９８８）に着目し、このような融合タンパク質を細胞内で発現させることにより、転写因子の修飾などとは無関係に、細胞内で標的遺伝子の発現を誘導させることを考えた。
しかしながら、この活性化転写因子を細胞内で発現させるためには、該活性化転写因子を発現するベクターを細胞内に導入することが必要であるが、ベクターの導入効率は、細胞によって大きく変動する。このため導入効率の低い細胞を用いる場合には、活性化転写因子を発現しない細胞の混在により、標的遺伝子の同定は困難となることが予想される。そこで、本発明者等は、次に、活性化転写因子が発現している細胞のみを分離するシステムの開発につき鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、活性化転写因子の作用によりレポーター遺伝子の発現が誘導されるレポーター構築物を作製し、これを上記活性化転写因子を発現するベクターと共に細胞に導入することで、細胞内のレポーター活性を指標に、活性化転写因子を発現する細胞を検出し、分離することができると考えた。
そして、こうして活性化転写因子を発現する細胞を得ることができれば、該細胞における遺伝子の発現を、活性化転写因子を発現していない細胞における遺伝子の発現と比較し、前者で有意に高い発現を示す遺伝子を選択することにより、転写因子の標的遺伝子を効率的に同定し、単離することが可能であると考えた。
本発明者等は、このようにして構想した標的遺伝子を同定するシステムが実際に機能しうるかを検討すべく、以下の実験を行った（図１参照）。まず、転写因子ＣＲＥＢと該転写因子の活性化因子ＶＰ１６との融合タンパク質（活性化転写因子）を発現するベクターを構築した。次に該転写因子ＣＲＥＢの結合配列ＣＲＥの下流にレポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を連結したプラスミドを構築し、上記のＣＲＥＢとＶＰ１６との融合タンパク質を発現するプラスミドと共に細胞内に導入した。そして、この２つのベクターが導入された細胞においてＧＦＰの発現が認められることを確認した。このことから、ＣＲＥＢがＶＰ１６との融合により活性化転写因子として機能することを見出した。さらに、本発明者等は、この活性化ＣＲＥＢが細胞内において、ＣＲＥＢの標的遺伝子であるｃ−ｆｏｓの発現を誘導するか否かにつき、ＲＴ−ＰＣＲ法により検討を行った。その結果、活性化ＣＲＥＢがｃ−ｆｏｓの発現を長時間に渡って誘導することができることを見出した。
即ち、本発明者等は、活性化因子との融合により恒常的に活性化させた転写因子および該活性化転写因子に応答するレポーター系を利用することにより、細胞内における転写因子の標的遺伝子を効率的に同定し単離することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、より具体的には、
〔１〕　特定の転写因子の標的遺伝子を検出する方法であって、
（ａ）　転写因子と該転写因子の活性化因子との融合タンパク質を発現するベクター、および該転写因子の結合配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するベクター、を含む細胞を提供する工程、
（ｂ）　工程（ａ）の細胞について、該レポーター遺伝子を発現した細胞と発現しない細胞とに分離する工程、
（ｃ）　該レポーター遺伝子を発現した細胞における遺伝子の発現を、対照細胞における遺伝子の発現と比較し、該レポーター遺伝子を発現した細胞において有意に発現量が増大している遺伝子を同定する工程、を含む方法、
〔２〕　特定の転写因子の標的遺伝子を単離する方法であって、
（ａ）　転写因子と該転写因子の活性化因子との融合タンパク質を発現するベクター、および該転写因子の結合配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するベクター、を含む細胞を提供する工程、
（ｂ）　工程（ａ）の細胞について、該レポーター遺伝子を発現した細胞と発現しない細胞とに分離する工程、
（ｃ）　該レポーター遺伝子を発現した細胞における遺伝子の発現を、対照細胞における遺伝子の発現と比較し、該レポーター遺伝子を発現した細胞において有意に発現量が増大している遺伝子を同定する工程、
（ｄ）　工程（ｃ）において同定された遺伝子を単離する工程、を含む方法、
〔３〕　レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕　工程（ｂ）における細胞の分離をＦＡＣＳにより行う、〔３〕に記載の方法、
〔５〕　対照細胞として、工程（ｂ）において分離された該レポーター遺伝子を発現しない細胞を用いる、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕　転写活性化因子がＶＰ１６である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
〔７〕　転写因子と該転写因子の活性化因子との融合タンパク質を発現するベクターおよび該転写因子の結合配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するベクターを含む細胞、を提供するものである。
なお、本発明において「転写因子」とは、遺伝子の転写を制御する因子であって、ＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質を指す。また、「標的遺伝子」とは、細胞内において転写因子により発現が制御される遺伝子を指す。また、「活性化因子」とは、転写因子と融合させることにより、該転写因子を活性化させる能力を有する因子をさす。
本発明は、特定の転写因子の標的遺伝子を検出および単離する方法を提供する。本発明の方法においては、まず、転写因子と該転写因子の活性化因子との融合タンパク質を発現するベクター（以下、「融合蛋白質発現ベクター」と称する）、および該転写因子の結合配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有するベクター（以下、「レポーターベクター」と称する）、を含む細胞を提供する（工程（ａ））。
本発明に用いる「転写因子」としては、特に制限はなく、標的遺伝子の同定を望む任意の転写因子を用いることができる。「活性化因子」としては、本発明に用いる転写因子と融合させることにより該転写因子を活性化しうるものであれば特に制限はない。例えば、「転写因子」および「活性化因子」の組み合わせとしては、ＣＲＥＢおよびＶＰ１６が挙げられる。この場合の該転写因子と該活性化因子が融合したタンパク質の構成は、ＤＮＡ結合ドメインが哺乳動物細胞の転写因子ＣＲＥＢ、活性化ドメインが他の生物のタンパク質のＶＰ１６であるが、これとは逆に、ＤＮＡ結合ドメインに他の生物、例えば酵母のＧＡＬ４、細菌のＬｅｘＡを用い、活性化ドメインに哺乳動物細胞の転写因子、例えばＣＲＥＢ，ｆｏｓ，ＳＲＦ，ＮＦ−κＢ等を用いることもできる。
融合蛋白質発現ベクターにおいては、細胞内で融合タンパク質を発現させるために、該融合蛋白質をコードする遺伝子の上流にプロモーターを含む。プロモーターとしては、宿主細胞内で融合蛋白質の発現を保証することができるものであれば限定されない。例えば、哺乳動物のような真核生物の細胞においては、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、レトロウィルスのＬＴＲ等が有効であり、酵母のような真核生物の細胞においては、ＡＤＨ（ａｌｃｏｈｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）プロモーターが有効である。
融合蛋白質発現ベクターは、本発明に用いる宿主細胞に適した公知の発現ベクターおよびシャトルベクターを改変することによって構築することができる。例えば、転写因子としてＣＲＥＢ、その活性化因子としてＶＰ１６を用いる場合、公知のベクターｐＶＰ１６　ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した全長ＣＲＥＢ断片を、該ベクターのＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ部位にインフレームとなるように連結することにより作製することができる。
また、レポーターベクターにおける「転写因子の結合配列」としては、融合蛋白質発現ベクターから発現された転写因子が結合し、その下流のレポーター遺伝子の発現を誘導し得るものであれば特に制限はない。「転写因子の結合配列」は、本発明で使用する転写因子に応じて適宜選択される。例えば、転写因子がＣＲＥＢである場合は、結合配列としてＣＲＥと呼ばれる「ＴＧＡＣＧＴＣＡ」からなる配列を用いることができる。さらに、次のような転写因子と「転写因子の結合配列」との組み合わせを例示することができる。
転写因子　　　　　結合配列
Ｓｐ１　　　　　ＫＧＧＧＣＧＧＲＲＹ
ＮＦκＢ　　　　ＧＧＧＲＮＮＹＹＣＣ
ＳＲＦ　　　　　ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧ
Ｏｃｔ−３　　　ＡＴＴＴＧＣＡＴ
ＡＰ−１　　　　ＴＧＡＣＴＣＡ
転写因子の結合配列は、転写因子の結合能を上昇させるために、タンデムに複数個連結して用いてもよい。例えば、転写因子の結合配列としてＣＲＥ配列を用いる場合には、４〜５回の繰り返し配列を好適に用いることができる。レポーターベクターに用いる、レポーター遺伝子としては、その発現を検出し得るものであれば特に制限はなく、当業者が一般的に各種アッセイ系に使用するレポーター遺伝子を用いることができる。好適なレポーター遺伝子としては、蛍光等の色素を呈する遺伝子、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、表面抗原タンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、Ｎｅｏ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＴＲＰ３遺伝子、およびＴａｃ抗原遺伝子（ＩＬ−２　ｒｅｃｅｐｔｏｒの遺伝子）等を例示することができるが、これらに制限されない。
レポーターベクターにおいて、転写因子の結合配列の下流にレポーター遺伝子が「機能的に結合している」とは、転写因子の結合配列に、活性化した転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、該結合配列とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。レポーターベクターにおいては、レポーター遺伝子の発現を保証するために、該結合配列とレポーター遺伝子との間に、一般的に、プロモーター配列、ＴＡＴＡボックス等が挿入される。
本発明のレポーターベクターは、用いる宿主細胞に適した公知の発現ベクターおよびシャトルベクターを改変することによって構築することができる。例えば、転写因子としてＣＲＥＢ、レポーター遺伝子としてＧＦＰを使用する場合、公知のｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を鋳型としてＣＲＥ配列、ＴＡＴＡ−ｂｏｘをＰＣＲで増幅し、ｐＥＧＦＰ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄＩＩＩ，ＳａｌＩ部位に挿入することにより作製することができる。
融合蛋白質発現ベクターおよびレポーターベクターを導入する細胞としては、特に制限はない。転写因子の標的遺伝子の同定を試みようとする任意の細胞を使用することができる。本発明において、例えば、種々の組織細胞を使用することにより、それぞれの組織細胞特異的な標的遺伝子を同定することが可能である。
本発明の融合タンパク質ベクターおよびレポーターベクターの細胞内への導入は、当業者に公知の種々の方法を利用して行うことができる。代表的な方法としては、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ　９．１−９．９）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、マイクロインジェクション法等の方法が挙げられる。
本発明の方法においては、次いで、工程（ａ）の細胞について、該レポーター遺伝子を発現した細胞と発現しない細胞とに分離する（工程（ｂ））。
レポーター遺伝子を発現した細胞と発現しない細胞との分離は、レポーター活性を指標にして行うことができる。レポーター遺伝子として、ＧＦＰを用いる場合には、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ）を利用して、ＧＦＰを発現している細胞のみを分離することもできる。ＧＦＰの発現を指標に細胞を分離する方法としては、さらに、Ｍｏｓｓｅｒらの方法（Ｍｏｓｓｅｒ　Ｄ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２２：１５０−１５４，１９９７）やＩｋａｗａらの方法（Ｉｋａｗａ　Ｍ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３７５：１２５−１２８，１９９５）を用いることが可能である。
また、レポーター遺伝子として、表面抗原タンパク質をコードする遺伝子を用いる場合、細胞表面に発現する抗原と結合する抗体を用いて、蛍光抗体法、抗体カラム、またはパニング法等により分離することができる。さらに、レポーター遺伝子としてＮｅｏ遺伝子を用いる場合、Ｇ４１８耐性として細胞を分離することができる。レポーター遺伝子としてＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＴＲＰ３を用いる場合、栄養要求性を指標に分離することができる。
本発明の方法においては、次いで、該レポーター遺伝子を発現した細胞における遺伝子の発現を、対照細胞における遺伝子の発現と比較し、該レポーター遺伝子を発現した細胞において有意に発現量が増大している遺伝子を同定する（工程（ｃ））。
本発明における「対照細胞」としては、一般的には、融合蛋白質発現ベクターおよびレポーターベクターが導入される細胞と同一の細胞を用いる。対照細胞としては、活性化転写因子を発現していない細胞、例えば、ベクターを含まない細胞、空のベクター（融合蛋白質をコードする遺伝子を含まないベクター）を含む細胞、空のベクターとレポーターベクターを含む細胞などを用いることができる。対照細胞は、好ましくは、工程（ｂ）において分離されたレポーター遺伝子を発現していない細胞である。
この工程においては、転写因子の標的遺伝子を同定するために、まずレポーター遺伝子を発現した細胞と、対照細胞における遺伝子の発現の比較を行う。遺伝子の発現の比較は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ法、高密度ｃＤＮＡフィルター、ＤＮＡマイクロアレイ、およびＰＣＲ法などを用いた発現解析（実験医学Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．８，９８０−１０５６（１９９９）；村松・那波監修　細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）；村松・山本編集　実験医学別冊「新　遺伝子工学ハンドブック」（羊土社））によって実施することができる。
この工程における遺伝子発現の比較の結果、レポーター遺伝子を発現した細胞において有意に発現量が増大している遺伝子は、該転写因子の標的遺伝子であると判定される。
本発明の特定の転写因子の標的遺伝子を単離する方法においては、さらに、工程（ｃ）において同定された遺伝子を単離する（工程（ｄ））。
工程（ｃ）で同定された遺伝子のｃＤＮＡの単離は、当業者によって一般的に行われる方法によりクローニングすることができる。例えば、工程（ｃ）においてディファレンシャル・ディスプレイ法を用いた場合、ゲル上のＤＮＡバンドを切り出し、適当なベクターへクローニングを行う。また、工程（ｃ）においてＤＮＡマイクロアレイ法を用いた場合には、同定した遺伝子に由来するシグナルと対応するプラスミドよりｃＤＮＡを取得することができる。前記の方法により取得したｃＤＮＡが全長ｃＤＮＡでない場合には、当該転写因子を発現させた細胞からｃＤＮＡライブラリーを作製し、前記の方法により取得したｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングを行う。もしくは、前記の方法により取得したｃＤＮＡについて、５’−ＲＡＣＥ、および３’−ＲＡＣＥを行うことにより、全長ｃＤＮＡを得ることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　プラスミドの構築
（１）　活性化ＣＲＥＢ発現ベクター：ｐＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１），ｐｃＤＮＡ３　ＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）
ＲＴ−ＰＣＲ法により、全長マウスＣＲＥＢをマウス脳よりクローニングした。まず、マウスの全ＲＮＡ　５μｇ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）０．５μｇを混ぜ、水で１２μｌにし、７０℃で１０分間処理した。氷中に１分おいた後、５ｘ　ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）４μｌ、０．１Ｍ　ＤＴＴ　２μｌ、１０ｍＭ　ｄＮＡＴ　１μｌを加え、４２℃で５分間インキュベート後、１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を加え、４２℃で５０分反応した。７０℃で１５分間処理して反応を止めた後、１μｌのＲＮａｓｅＨを加え、３７℃で２０分間処理した。この反応産物の２μｌを用いて、５’−ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＡＴＧ　ＡＣＣ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＧＣＡ　ＧＡＣ−３’（配列番号：１）、および５’−ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣ　ＣＴＴ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　ＴＧＴ　ＧＧＣ　ＡＧＴ　ＡＡＡ　Ｇ−３’（配列番号：２）からなるプライマーを用い、ＣＲＥＢ　ｃＤＮＡをＰＣＲ反応で得た。ＰＣＲは、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１．５分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で５分処理を行った。つづいて、ＰＣＲ断片をｐＶＰ１６　ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位にｉｎ　ｆｒａｍｅでつなぎ、ｐＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）を得た。さらにｐＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）を鋳型としてＶＰ１６−ＣＲＥＢ部位をＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ３　ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐｃＤＮＡ３　ＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）を得た。ＰＣＲ反応は、５’−ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣ　ＣＧＣ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＧＧ　ＣＣＣ　ＴＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　Ｇ−３’（配列番号：３）、および５’−ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣ　ＣＴＴ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　ＴＧＴ　ＧＧＣ　ＡＧＴ　ＡＡＡ　Ｇ−３’（配列番号：４）からなるプライマーを用い、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１．５分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で５分処理を行った。ｐＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）はＳＶ４０プロモーターにより、ｐｃＤＮＡ３　ＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）はＣＭＶプロモーターにより、ＶＰ１６−ＣＲＥＢを発現する。
（２）　レポーター遺伝子：ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ，ｐＣＲＥ−ＥＧＦＰ１
ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、４つのＣＲＥ配列の下流にＴＡＴＡ−ｂｏｘとルシフェラーゼ遺伝子を持つ。ｐＣＲＥ−ＥＧＦＰ１はｐＣＲＥ−Ｌｕｃを鋳型としてＣＲＥ配列、ＴＡＴＡ−ｂｏｘをＰＣＲで増やし、ｐＥＧＦＰ１　ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄＩＩＩ，ＳａｌＩ部位に挿入して得た。ＰＣＲ反応は、５’−ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＣＣＡ　ＡＧＣ　ＴＡＧ　ＣＣＡ　ＧＣＣ　Ｔ−３’（配列番号：５）、および５’−ＧＡＧ　ＡＧＴ　ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＣ　ＴＧＧ　ＡＡＴ　Ｔ−３’（配列番号：６）からなるプライマーを用い、９４℃で３分処理後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で５分処理を行った。ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ，ｐＣＲＥ−ＥＧＦＰ１は、活性化ＣＲＥＢによりそれぞれルシフェラーゼ、ＥＧＦＰを発現する。
また、陽性対照として内因性ＣＲＥＢを活性化するＰＫＡ（ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ）を発現するｐＦＣ−ＰＫＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。また、ｐＳＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を陰性対照として、ルシフェラーゼアッセイにおいて使用した。上記の各ベクターの構造を図２に示す。ｐＣＲＥ−Ｌｕｃは４個のＣＲＥの下流に、ｐＳＲＥ−Ｌｕｃは５個のＳＲＥの下流にルシフェラーゼ遺伝子を持つ。ｐＣＲＥ−ＥＧＦＰ１は、４個のＣＲＥの下流にＥＧＦＰ遺伝子を持つ。
［実施例２］　ルシフェラーゼアッセイによる転写活性の測定
ｐＣＲＥ−ＬｕｃとｐＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）、あるいはｐｃＤＮＡ３　ＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）とを、共トランスフェクションの後、４８時間でルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクションは次のようにして行った。
ＣＯＳ７細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。トランスフェクションの約１６時間前に、細胞を３５ｍｍマルチウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に２．０×１０５細胞の密度で播いた。２μｇの上記（実施例１）ベクターと１３μｌのリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を、２００μｌの血清不含のＤＭＥＭ中で、室温で４５分間プレインキュベートした。細胞を１回ＤＭＥＭで洗浄し、最終１ｍｌになるようにＤＭＥＭで希釈したプレインキュベート混合液を細胞に加えた。３７℃で５時間細胞をインキュベートし、ＦＢＳを最終濃度１０％になるよう加えた。
また、ルシフェラーゼアッセイは、ピッカジーンＲ試薬（和光純薬工業）を用いて、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ　ＬＢ９５３測定装置（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）により測定した。
ルシフェラーゼアッセイの結果を図３に示す。いずれのベクターを導入した場合でも、ＣＲＥからのルシフェラーゼ遺伝子の転写を促進した。しかし、ＳＲＥ（陰性対照）からの転写に対しては影響を与えなかった。これらの結果は、ＶＰ１６−ＣＲＥＢが活性化ＣＲＥＢとして機能し、ＣＲＥ特異的な転写を活性化することを示している。
［実施例３］　ＥＧＦＰ１を利用した転写活性の測定
ｐＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）とｐＣＲＥ−ＥＧＦＰ１をＣＯＳ７細胞に共トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４および４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、コントロール（図４Ａ）と比較して、ＥＧＦＰ１を発現している細胞が多く見られた（図４Ｂ）。これはＶＰ１６−ＣＲＥＢがＣＲＥに作用し、ＥＧＦＰ１の発現を増強していることを示す。（図４Ｃ）はＰＫＡを用いた時のポジティブコントロールを表す。４８時間後では（Ａ）でもＥＧＦＰ１陽性の細胞が増えてくることが分かった。
［実施例４］　ＲＴ−ＰＣＲによるＣＲＥＢ標的遺伝子ｃ−ｆｏｓの発現の検出
ＶＰ１６−ＣＲＥＢをＣＯＳ７細胞内に導入し、２４、４８時間後のＲＮＡを精製し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＣＲＥＢの標的遺伝子であるｃ−ｆｏｓの発現を調べた。ＲＴ−ＰＣＲは次のようにして行った。
トランスフェクションの後、２４および４８時間のＣＯＳ７細胞からＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で全ＲＮＡを調製した。マウスｃ−ｆｏｓ、およびヒトｃ−ｆｏｓの間で保存されているｃＤＮＡ配列情報により合成されたオリゴヌクレオチド１μｇ全ＲＮＡ、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて、ｃ−ｆｏｓの発現を調べた。ＲＴ反応は、５’−ＣＡＣ　ＴＣＣ　ＡＡＧ　ＣＧＧ　ＡＧＡ　ＣＡＧ−３’（配列番号：７）、および５’−ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＣＴＣ　ＣＣＡ　ＧＴＣ　ＴＧＣ−３’（配列番号：８）からなるプライマーを用い、４５℃で３０分、９４℃で２分間行った。ＰＣＲ反応はまず９４℃で１５秒処理後、変性：９４℃、１５秒、アニーリング：５５℃、３０秒、伸長反応：７２℃、３０秒を３５サイクル行い最後に７２℃で５分処理した。ＰＣＲサイクル２０、２５、３０、３５回目でサンプリングし、アガロースゲルで流し、増幅したＤＮＡ断片をＥｔＢｒで染色した。
その結果、ＶＰ１６−ＣＲＥＢ、またはポジティブコントロールとして使用したＰＫＡの発現により、ｃ−ｆｏｓの発現は３０サイクルで検出された（図５）。３５サイクルでもｃ−ｆｏｓのシグナルはコントロールと比較して著しく大きかった。これは、ＶＰ１６−ＣＲＥＢにより内在性のＣＲＥＢの標的遺伝子であるｃ−ｆｏｓの発現が増強されたことを示す。またｃ−ｆｏｓ以外の標的遺伝子の発現も増強されている可能性を示唆する。このｃ−ｆｏｓの発現は、４８時間後でも続いていた。通常ｃ−ｆｏｓの発現は、種々の刺激後短時間で誘導され、消失する一過性のものであるが、この場合、ＶＰ１６−ＣＲＥＢが存在している限りｃ−ｆｏｓの発現は続くものと考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明により、活性化因子との融合により恒常的に活性化させた転写因子および該活性化転写因子に応答するレポーター系を利用した、細胞内における転写因子の標的遺伝子を検出し単離する方法が提供された。本発明の方法によれば、リン酸化などの細胞内における転写因子の修飾とは無関係に、細胞内で転写因子を活性化させ、標的遺伝子の発現を誘導することができる。さらに、本発明の方法によれば、ベクターの導入効率が低い細胞を用いる場合でも、活性化転写因子を発現するベクターが導入された細胞のみをレポーター活性を指標に選抜することができる。このため、ベクターが導入されない細胞の混在による標的遺伝子の検出効率の低下を防止することができ、効率的に標的遺伝子を検出し単離することが可能である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の転写因子の標的遺伝子を同定する方法の概略を示す。
図２は、各ベクターの構造を示す図である。ｐＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）はＳＶ４０プロモーターから、ｐｃＤＮＡ３　ＶＰ１６−ＣＲＥＢ（１−３４１）はＣＭＶプロモーターからＶＰ１６−ＣＲＥＢを発現する。ｐＦＣ−ＰＫＡはＣＭＶプロモーターからＰＫＡ触媒サブユニットを発現する。
図３は、ルシフェラーゼアッセイによって測定した転写活性を示す図である。「Ｍｏｃｋ」はベクターを含まない対照細胞を示す。縦軸は該対照細胞における活性を１としたときの各細胞における活性を示す。
図４は、ＥＧＦＰ１の発現を蛍光顕微鏡で観察した写真を示す。（Ａ）は対照細胞、（Ｂ）はｐＶＰ１６−ＣＲＥＢとｐＣＲＥ−ＥＧＦＰ１を有する細胞、（Ｃ）ＰＫＡを用いた時のポジティブコントロールを表す。
図５は、ｃ−ｆｏｓの発現をＲＴ−ＰＣＲによって検出した際の電気泳動写真を示す。矢印の位置に見えるバンドは、ｃ−ｆｏｓ由来のものである。Ｍは「Ｍｏｃｋ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｃは「ＶＰ１６−ＣＲＥＢ」、Ｐは「ＰＫＡ」を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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