(57)【要約】血管系に対する副作用が少ない有用な肝疾患治療剤として、α１サブユニットのタイプがα１Ｃであるカルシウムチャネルに対する親和性が低く、α１サブユニットのタイプがα１Ｄのカルシウムチャネルに対する親和性が高いカルシウムチャネル拮抗剤を肝疾患治療剤として用いる。
2002028431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに選択的に作用するカルシウムチャネル拮抗剤を有効成分として含有する肝疾患治療剤。
【請求項２】
α１サブユニットのタイプがα１Ｃであるカルシウムチャネルに対する親和性が低く、α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに対する親和性が高い、カルシウムチャネル拮抗剤を有効成分として含有する肝疾患治療剤。
【請求項３】
α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルを発現させた媒体の肝疾患治療剤をスクリーニングするための使用。
【請求項４】
カルシウム拮抗作用を有する薬物について、薬物とα１サブユニットのタイプがα１Ｃであるカルシウムチャネルとの親和性を測定し、薬物とα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルとの親和性を測定し、次いで両者の親和性の強度を比較することで、α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに選択的に作用する薬物を得ることを特徴とする血管系への副作用が少ない肝疾患治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は肝疾患治療剤及びそのスクリーニング方法に関する。
背景技術
電位依存性のカルシウムチャネルは、細胞内へのカルシウムイオンの流入を調整するとともにホメオスタシスをはじめとする様々な生理機能の調節を行っている。
現在、かかる電位依存性のカルシウムチャネルは電気生理学的、薬理学的性質の違いにより、Ｌ、Ｎ、Ｐ／Ｑ、Ｒ及びＴ型に分類されている。
このうちＬ型はニフェジピン等のジヒドロピリジン系薬物、ジルチアゼム、ベラパミル等のカルシウムチャネル拮抗剤に対し感受性であることが知られている。（脳の科学　第２０巻５号４８９−４９５頁、１９９８年）
またこのＬ型のカルシウムチャネルは５種のサブユニットが存在し、α１，α２，β、γ、δと呼ばれている。さらに最近の研究からこのチャネルを構成するα１サブユニットには、α１Ｃ、α１Ｄ、α１Ｆ及びα１Ｓのサブタイプが存在することが明らかになってきた。
同じくＮ型、Ｐ／Ｑ型及びＲ型のカルシウムチャネルを構成するα１サブユニットとしてそれぞれα１Ｂ、α１Ａ及びα１Ｅのサブタイプの存在が、そしてＴ型のカルシウムチャネルを構成するα１サブユニットとしてα１Ｇ、α１Ｈ及びα１Ｉのサブタイプの存在が報告されている。
関連文献
α１Ａ：Ｍｏｒｉ　Ｙ．　Ｎａｔｕｒｅ　３５０：３９８，１９９１
α１Ｂ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ＭＥ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７；３８９，
１９９２
α１Ｃ：Ｓｏｌｄａｔｏｖ　ＮＭ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２２；７７，
１９９４
Ｓｃｈｕｌｔｚ　Ｄ．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
９０；６２２８，１９９８
α１Ｄ：Ｓｅｉｎｏ　Ｓ．　Ｐｒｏｃ．Ｍａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９；
５８４，１９９２
Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ＭＥ．　Ｎｅｕｒｏｎ　８；７１，１９９４
Ｙａｍａｄａ　Ｙ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２７；３１２，１９９５
α１Ｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ＭＥ．　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９；
２２３４７，１９９４
α１Ｆ：Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＥ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４５；３４０，１９９７
Ｓｔｒｏｍ　ＴＭ．　Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９；２６０，１９９８
α１Ｇ：Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｕｅｓ　Ｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　３９１；８９６，
１９９８
α１Ｈ：Ｃｒｉｂｂｓ　ＬＬ．　Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３；１０３，１９９８
α１Ｉ：Ｍｉｔｔｍａｎ　Ｓ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２６９；
１２１，１９９９
α１Ｓ：Ｔａｎａｂｅ　Ｔ．　Ｎａｔｕｒｅ　３２８：３１３，１９８７
Ｐｔｒａｃｅｋ　ＬＪ．　Ｃｅｌｌ；８６３，１９９４
ところで特表平９−５０２１８８には、公知のカルシウムチャネル拮抗剤であるジルチアゼムの肝疾患治療剤への応用が記載されており、また特開平１０−１８２４６２には、同じくカルシウム拮抗剤である（＋）−（Ｒ）−１，４−ジヒドロ−５−イソプロポキシ−２−メチル−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−１，６−ナフチリジン−３−カルボン酸エチルがサイトカイン産生抑制剤及び肝疾患治療剤として有用であるとの記載がある。
しかしながらこれらの文献にはカルシウムチャネル拮抗剤のうち、特にα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに選択性に作用するカルシウムチャネル拮抗剤が血管系に対する副作用の少ない肝疾患治療剤として使用できること、並びにかかる血管系に対する副作用の少ない肝疾患治療剤をスクリーニングする方法についての記載はない。また現在、カルシウムチャネル拮抗剤は臨床において肝疾患治療剤として用いられていない。
副作用が少ない有用な肝疾患治療剤を提供することが求められている。
発明の開示
本発明者らはヒト肝臓に発現しているカルシウムチャネル・タイプの研究を行ったところ、血管系には発現していないα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルがヒト肝臓において強く発現していることを見いだし本発明を完成した。
即ち、本発明はα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに選択的に作用するカルシウムチャネル拮抗剤を有効成分として含有する肝疾患治療剤に関する。
また本発明はα１サブユニットのタイプがα１Ｃであるカルシウムチャネルに対する親和性が低く、α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに対する親和性が高いカルシウムチャネル拮抗剤を有効成分として含有する肝疾患治療剤に関する。
また本発明はα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルを発現させた媒体の肝疾患治療剤をスクリーニングするための使用に関する。
さらにまた本発明はカルシウム拮抗作用を有する薬物について、薬物とα１サブユニットのタイプがα１Ｃであるカルシウムチャネルとの親和性を測定し、薬物とα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルとの親和性を測定し、次いで両者の親和性の強度を比較することで、α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに選択的に作用する薬物を得ることを特徴とする血管系への副作用が少ない肝疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。
発明を実施するための最良の形態
肝臓におけるネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）やアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）には肝細胞内におけるカルシウム依存性のＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎがその経路に関与することが指摘されている。（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．　２６３：３８７−３９４，１９９２）
また肝細胞内のカルシウムの流入及び流出はｒｅｃｅｐｔｏｒを介して行われ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７４８６−１７４９２，１９９０）、さらに公知のカルシウムチャネル拮抗剤であるジルチアゼムが肝細胞内カルシウム濃度を調整することが報告されている。（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２５３：Ｒ５４５−５４９，１９８７）
これらの知見から、カルシウムチャネル拮抗剤は肝障害における肝細胞内へのカルシウムの流入を遮断し、ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎを抑制することによりネクローシスやアポトーシスを抑制すると考えられる。
ところで抗Ｆａｓ抗体誘発肝障害はヒトＣ型肝炎ウイルスによって誘発されるＣ型肝炎の肝障害誘発機構の一部を反映していると考えられている。本発明者らの実験（後記実施例１）により公知のカルシウムチャネル拮抗剤であるニフェジピンがこれらの肝障害を抑制したことは、ニフェジピンがヒト慢性肝炎における肝障害を抑制することが期待される。
一方、特表平９−５０２１８８には四塩化炭素を投与されたラットにおける肝疾患の進行を少量のジルチアゼムを投与することで著しく抑制できたこと、また特開平１０−１８２４６２にはカルシウムチャネル拮抗剤の（＋）−（Ｒ）−１，４−ジヒドロ−５−イソプロポキシ−２−メチル−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−１，６−ナフチリジン−３−カルボン酸エチルがコンカナバリン　Ａ投与により誘発されたマウス肝臓障害モデルにおいて、血清中ＧＯＴ，ＧＰＴの増加を有意に抑制し、肝疾患治療剤として有用であるとの記載がある。
従って、これらの知見を総合して鑑みるとカルシウムチャネル拮抗剤は肝疾患治療剤としての応用が期待される。
しかしながら、公知のＬ型のカルシウムチャネル拮抗剤は全身の血圧を降下させる為、肝疾患の治療剤として使用することは困難である。
即ち、Ｌ型のカルシウムチャネル拮抗剤のうち、α１サブユニットのタイプがα１Ｃであるカルシウムチャネルは心筋、平滑筋、脳、肺、大動脈、腎臓で、α１Ｄは中枢神経系、腎臓、膵臓、卵巣で、α１Ｆは網膜で、そしてα１Ｓは骨格筋で発現することが報告されている。
（参考文献）
脳の科学（１９９９年増刊号）　２７−３４，１９９９
脳の科学　２０：４８９−４９５，１９９８
α１Ｃ：Ｓｏｌｄａｔｏｖ　ＮＭ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２２；７７，
１９９４
Ｓｃｈｕｌｔｚ　Ｄ．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
９０；６２２８，１９９８
α１Ｄ：Ｓｅｉｎｏ　Ｓ．　Ｐｒｏｃ．Ｍａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９；
５８４，１９９２
Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ＭＥ．　Ｎｅｕｒｏｎ　８；７１，１９９４
Ｙａｍａｄａ　Ｙ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２７；３１２，１９９５
α１Ｆ：Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＥ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４５；３４０，１９９７
Ｓｔｒｏｍ　ＴＭ．　Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９；２６０，１９９８
α１Ｓ：Ｔａｎａｂｅ　Ｔ．　Ｎａｔｕｒｅ　３２８：３１３，１９８７
Ｐｔｒａｃｅｋ　ＬＪ．　Ｃｅｌｌ；８６３，１９９４
本発明者らの研究によりヒト肝臓ではα１サブユニットのタイプがα１Ｃ、α１Ｄ、α１Ｇ、α１Ｈ及びα１Ｓの発現が確認され、特にα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルが強く発現していることが判明した。（後記実施例２）
α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルは血管には存在しないので、α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに親和性の高いカルシウムチャネル拮抗剤を創設することにより、α１サブユニットのタイプがα１Ｃであるカルシウムチャネルに作用するカルシウムチャネル拮抗剤のような全身の血圧に影響を与えることなく、肝障害を抑制する薬物を提供することができる。
従って、本発明の肝疾患治療剤はα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに選択的に作用するカルシウムチャネル拮抗剤であり、好ましくはα１サブユニットのタイプがα１Ｃであるカルシウムチャネルに対する親和性が低く、α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに対する親和性が高いカルシウムチャネル拮抗剤であり、更に好ましくはα１サブユニットのタイプがα１Ｃ及びα１Ｓであるカルシウムチャネルに対する親和性が低く、α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに対する親和性が高いカルシウムチャネル拮抗剤である。
ここで親和性が高いとは薬物（カルシウムチャネル拮抗剤）のカルシウムチャネルに対する親和性（解離定数）が１００マイクロモル以下であること意味し、好ましくは１０マイクロモル以下、更に好ましくは１マイクロモル以下であることを意味する。一方、親和性が低いとは親和性が１０００マイクロモルを越えること（両者が結合しない場合も含む）を意味する。
本発明の肝疾患治療剤にはウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変等の治療剤が含まれる。尚、本発明の肝疾患治療剤は、単独投与の他、インターフェロン、グリチルリチンなどの他の肝疾患治療剤と併用して使用することもできる。
α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルを発現させた媒体は肝疾患治療剤をスクリーニングするために使用できる。
かかる媒体としてはアフリカツメガエルの卵母細胞や動物等の培養細胞等を挙げることができる。
α１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルに選択的に作用する肝疾患治療剤のスクリーニング方法としては、カルシウム拮抗作用を有する薬物について、薬物とα１サブユニットのタイプがα１Ｃであるカルシウムチャネルとの親和性を測定し、並びに薬物とα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルとの親和性を測定し、これらの親和性を比較することで行うことができる。
たとえば、α１サブユニットのタイプがα１ＤであるカルシウムチャネルのｍＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞にマイクロインジェクションし、カルシウムチャネルを発現させる。次いで電気生理学的方法を用いて薬物のスクリーニングを行うか、あるいはα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルを多く発現している膵臓などの組織を用いてカルシウムチャネル拮抗剤のアッセイを電気生理学的に行うことによりなされる。
また培養細胞上にカルシウムチャネルを発現させ、あるいはα１サブユニットのタイプがα１Ｄであるカルシウムチャネルを多く発現している膵臓などの組織を用いて、これらと薬物とのバインディングアッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ）を行うこと等の公知方法を用いて行うこともできる。
参考文献　特表平９−５０１０５１
特開平２０００−２６３１５
次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例
【実施例１】
抗Ｆａｓ抗体誘発肝障害に対するニフェジピンの効果
（実験方法）
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに抗Ｆａｓ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社より入手）を静脈より投与し、３．５時間後に採血を行い、Ｋａｒｍｅｎ法により血漿中のＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を測定した。ニフェジピン（１００ｍｇ／ｋｇ）は抗Ｆａｓ抗体投与１時間前に１％メチルセルロースに懸濁し、経口投与した。比較として公知の肝疾患治療剤薬であるグリチルリチン（２００ｍｇ／ｋｇ）を同様に懸濁し、抗Ｆａｓ抗体投与１時間前に腹腔内投与した。
（実験結果）
試験結果を次の表１に示す。
【表１】
2002028431.tif 000003
表１から明らかなようにニフェジピンはマウス抗Ｆａｓ抗体により誘発されたマウス肝障害モデルにおいて、ＡＬＴ上昇を有意に抑制した。
【実施例２】
ヒト肝臓より得られたカルシウムチャネルＲＮＡの発現
（試験方法）
ヒトの肝臓より抽出した全ＲＮＡ（（株）サワディー・テクノロジー　ＨＴ−１００５）よりｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡの合成を行った。
カルシウムチャネルのα１サブユニット１０種類のタイプを以下のプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。
2002028431.tif 000004
2002028431.tif 000005
ＰＣＲ条件
上記のＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒを用いて、熱変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）：９５℃、２０秒、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）：５５℃、３０秒、相補鎖合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）：７２℃、３０秒の条件で３３サイクル及び３５サイクルの増幅を行った。ＰＣＲプロダクトは１．２％アガロースゲルを用い電気泳動により分離した。
（実験結果）
電気泳動パターンを撮影した写真を図１に示す。
図１から明らかなように、ヒト肝臓においては、カルシウムチャネルのα１サブユニットのうちα１Ｃ、α１Ｄ、α１Ｇ、α１Ｈ及びα１ＳタイプのＲＮＡの発現が確認され、特にα１Ｄが強く発現していることが判明した。
なお、図１は、ＰＣＲによる３５サイクル増幅後の電気泳動像の写真で、図中１〜１０はそれぞれカルシウムチャネルのα１サブユニットα１Ａ、α１Ｂ、α１Ｃ、α１Ｄ、α１Ｅ、α１Ｆ、α１Ｇ、α１Ｈ、α１Ｉ及びα１Ｓを示し、そして１１は対照として用いたβアクチンを示す。
産業上の利用可能性
カルシウムチャネルのα１サブユニットがα１Ｄタイプのカルシウムチャネルは血管には存在しないことから、α１Ｄタイプのカルシウムチャネルに親和性の高いカルシウムチャネル拮抗剤を創設することにより、全身の血圧には影響が少なく肝障害を抑制する薬物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１はＰＣＲ増幅後の電気泳動像の写真である。
【図１】
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【国際調査報告】
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