(57)【要約】本発明は、微生物触媒を用いた反応において、反応生成物の生産速度を長期間一定にできる、工業的に有利な物質生産方法を提供することを目的とする。α−ヒドロキシニトリル類を相当するα−ヒドロキシ酸アミド類やα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換しうるアースロバクター属等の休止菌体などの微生物触媒を用いた反応において、一定速度で基質を添加し、微生物の触媒の反応液中濃度を一定とし、反応中に微生物触媒の酵素活性が低下した時点で反応温度を上昇させ反応速度を一定に保持するという昇温コントロールを実施することにより、一定速度で物質生産を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物触媒を用いた反応において、反応温度を昇温コントロールすることにより、一定速度で物質生産を行うことを特徴とする微生物触媒を用いた物質生産方法。
【請求項２】
微生物触媒を用いた反応において、微生物触媒の基質を一定速度で添加し、反応温度を昇温コントロールすることにより、一定速度で物質生産を行うことを特徴とする微生物触媒を用いた物質生産方法。
【請求項３】
微生物触媒の反応液中の濃度が一定であることを特徴とする請求項１又は２記載の微生物触媒を用いた物質生産方法。
【請求項４】
微生物触媒の反応液中の濃度を一定とするために、反応槽から排出した反応液中の微生物触媒を分離回収し、再度反応槽に戻すことを特徴とする請求項３記載の微生物触媒を用いた物質生産方法。
【請求項５】
昇温が５〜２５℃から選択される温度範囲であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の微生物触媒を用いた物質生産方法。
【請求項６】
微生物触媒がニトリラーゼ発現微生物触媒であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の微生物触媒を用いた物質生産方法。
【請求項７】
ニトリラーゼ発現微生物がアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であることを特徴とする請求項６記載の微生物触媒を用いた物質生産方法。
【請求項８】
微生物触媒を用いた反応が、一般式　ＲＣＮ（式中、Ｒは、水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいアリール基、又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるニトリル化合物を、微生物の触媒作用により水性溶媒中で加水分解して、一般式　ＲＣＯＮＨ２（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表されるアミド化合物、又は一般式　ＲＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表されるカルボン酸ないしはそのアンモニウム塩化合物に変換する反応であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の微生物触媒を用いた物質生産方法。
【請求項９】
微生物触媒を用いた反応が、一般式　Ｒ’ＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒ’は、水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリル化合物を微生物の触媒作用により水性溶媒中で加水分解して、一般式　Ｒ’ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＮＨ２（式中、Ｒ’は前記と同一の意味を示す。）で表されるα−ヒドロキシ酸アミド化合物、又は一般式　Ｒ’ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ（式中、Ｒ’は前記と同一の意味を示す。）で表されるα−ヒドロキシ酸ないしはそのアンモニウム塩化合物に変換する反応であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の微生物触媒を用いた物質生産方法。
【請求項１０】
微生物触媒を用いた反応が、一般式　Ｒ”ＣＨ（ＮＨ２）ＣＮ（式中、Ｒ”は、水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−アミノニトリル化合物を微生物の触媒作用により水性溶媒中で加水分解して、一般式　Ｒ”ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＮＨ２（式中、Ｒ”は前記と同一の意味を示す。）で表されるα−アミノアミド化合物、又は一般式　Ｒ”ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（式中、Ｒ”は前記と同一の意味を示す。）で表されるα−アミノ酸ないしはそのアンモニウム塩化合物に変換する反応であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の微生物触媒を用いた物質生産方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野：
本発明は、微生物触媒を用いたα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩等の有用な化学物質を一定速度で生産する方法に関する。
背景技術：
従来、微生物触媒を用いた物質生産において、生産速度を一定に維持する方法として、新鮮な微生物触媒を追加する方法が知られている（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＶＣＨ，１９９５，ｐ１４８）。
他方、α−ヒドロキシニトリル類から微生物によってα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩又はα−ヒドロキシ酸を製造する方法も知られている（特公昭５８−１５１２０号公報、特開昭６３−２２２６９６号公報、特開昭６４−１０９９６号公報、特開平４−４０８９７号公報、特開平４−４０８９８号公報、特表平１０−５０７６３１号公報等）。
発明の開示：
工業的に物質生産を行う上で、反応槽あたりの生産量を一定に維持することは、製品の安定出荷、反応コントロールの簡便さという点で、きわめて有利である。一方、微生物触媒を用いた連続反応においては、反応槽と分離機を組み合わせた反応装置が用いられ、微生物触媒を連続的に回収して再使用すると同時に、生成物を分離ろ液として連続排出する方式が採用されている。微生物触媒は連続使用すると一般にその活性が徐々に低下するため、生産速度を一定に維持するためには、従来、新鮮な微生物触媒を追加する方法が採用されていた。しかし、微生物触媒の製造コストは一般に高価であり、新たな微生物触媒の追加使用は好ましくない。また、微生物触媒の追加により反応槽の微生物触媒濃度が上昇すると、分離機の負担が増加し、反応をコントロールする上で問題がある。
本発明の課題は、微生物触媒を用いた反応において、反応生成物の生産速度を長期間一定にできる、工業的に有利な物質生産方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、微生物触媒の温度に対する活性変化を詳しく解析した結果、微生物触媒を初期添加量のみの所定濃度としたまま、基質を一定速度で連続的に添加し、生成物を一定速度で生産する昇温コントロール法を見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、微生物触媒を用いた反応において、反応温度を昇温コントロールすることにより、一定速度で物質生産を行うことを特徴とする微生物触媒を用いた物質生産方法や、微生物触媒を用いた反応において、微生物触媒の基質を一定速度で添加し、反応温度を昇温コントロールすることにより、一定速度で物質生産を行うことを特徴とする微生物触媒を用いた物質生産方法に関する。
また本発明は、微生物触媒の反応液中の濃度が一定であることを特徴とする上記微生物触媒を用いた物質生産方法や、微生物触媒の反応液中の濃度を一定とするために、反応槽から排出した反応液中の微生物触媒を分離回収し、再度反応槽に戻すことを特徴とする上記微生物触媒を用いた物質生産方法や、昇温が５〜２５℃から選択される温度範囲であることを特徴とする上記微生物触媒を用いた物質生産方法や、微生物触媒がニトリラーゼ発現微生物触媒であることを特徴とする上記微生物触媒を用いた物質生産方法や、ニトリラーゼ発現微生物がアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であることを特徴とする上記微生物触媒を用いた物質生産方法に関する。
さらに本発明は、微生物触媒を用いた反応が、ニトリル化合物を微生物の触媒作用により水性溶媒中で加水分解して、アミド化合物、又はカルボン酸ないしはそのアンモニウム塩に変換する反応であることを特徴とする上記の微生物触媒を用いた物質生産方法に関し、さらに詳しくは、微生物触媒を用いた反応が、一般式　ＲＣＮ（式中、Ｒは、水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいアリール基、又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるニトリル化合物を、微生物の触媒作用により水性溶媒中で加水分解して、一般式　ＲＣＯＮＨ２（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表されるアミド化合物、又は一般式　ＲＣＯＯＨ（式中、Ｒは前記と同一の意味を示す。）で表されるカルボン酸ないしはそのアンモニウム塩化合物に変換する反応であることを特徴とする上記の微生物触媒を用いた物質生産方法や、微生物触媒を用いた反応が、一般式　Ｒ’ＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中、Ｒ’は、水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリル化合物を微生物の触媒作用により水性溶媒中で加水分解して、一般式　Ｒ’ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＮＨ２（式中、Ｒ’は前記と同一の意味を示す。）で表されるα−ヒドロキシ酸アミド化合物、又は一般式　Ｒ’ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ（式中、Ｒ’は前記と同一の意味を示す。）で表されるα−ヒドロキシ酸ないしはそのアンモニウム塩化合物に変換する反応であることを特徴とする上記の微生物触媒を用いた物質生産方法、または、微生物触媒を用いた反応が、一般式　Ｒ”ＣＨ（ＮＨ２）ＣＮ（式中、Ｒ”は、水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−アミノニトリル化合物を微生物の触媒作用により水性溶媒中で加水分解して、一般式　Ｒ”ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＮＨ２（式中、Ｒ”は前記と同一の意味を示す。）で表されるα−アミノアミド化合物、又は一般式　Ｒ”ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（式中、Ｒ”は前記と同一の意味を示す。）で表されるα−アミノ酸ないしはそのアンモニウム塩化合物に変換する反応であることを特徴と上記の微生物触媒を用いた物質生産方法に関する。
本発明の微生物触媒を用いた物質生産方法は、微生物触媒を用いた反応において、反応温度を昇温コントロールすることにより、好ましくは、微生物触媒の基質を一定速度で添加し、微生物触媒の反応液中の濃度を一定とし、反応温度を昇温コントロールすることにより、一定速度で物質生産を行うことを特徴とする。
本発明において微生物触媒とは、ニトリラーゼ活性をはじめとする加水分解酵素活性、酸化還元酵素活性、転移酵素活性、異性化酵素活性、分裂酵素活性、結合酵素活性等の酵素活性を有する微生物由来のものであればどのようなものでもよく、微生物菌体や、固定化微生物、粗酵素、固定化酵素等の微生物処理物を例示することができる。また、微生物触媒が微生物菌体や固定化微生物などの場合、生菌体であっても死菌体であっても特に限定されるものではない。
かかる微生物触媒としては、微生物触媒の酵素活性低下率と反応速度の温度依存率との関係において、昇温による反応速度の上昇率が活性低下率を上回る微生物触媒が好ましく、その具体例としては、α−ヒドロキシニトリル類を相当するα−ヒドロキシ酸アンモニウム塩に変換しうるアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＮＳＳＣ１０４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１５４２４）の休止菌体を挙げることができる。
また、微生物触媒における微生物としては、上記アースロバクターｓｐ．ＮＳＳＣ１０４以外のアースロバクター属に属する微生物や、カゼオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ）属、バクテリジウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を例示することができる。
本発明に用いる基質となる化合物は、各微生物触媒が行う反応に用いることができるものであれば特に制限はない。
本発明において一般式　ＲＣＮ、　Ｒ’ＣＨ（ＯＨ）ＣＮ、または　Ｒ”ＣＨ（ＮＨ２）ＣＮにおいて、Ｒ、Ｒ’、Ｒ”のそれぞれの置換基が有していてもよい置換基としては、水酸基、メルカプト基、カルボキシ基、カルバモイル基、カルバミジノ基、水酸基等で置換されていてもよいフェニル基、インドリル基、イミダゾリル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルチオ基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、アリールオキシ基、ベンジル等のアラルキル基を挙げることができる。
本発明に関するニトリル化合物としては、各種α−アミノ酸、またはその類縁体であるα−ヒドロキシ酸のそれぞれに対応するニトリル化合物を挙げることができる。
具体的なニトリル化合物としては、アセトニトリル、プロピオニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ｉ−ブチロニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ベンゾニトリル、シアノピリジン、マロノニトリル、サクシノニトリル、フマロニトリル、ラクトニトリル、３−ヒドロキシプロピオニトリル、アミノアセトニトリル、２−アミノプロピオニトリル、３−アミノプロピオニトリル、２−アミノフェニルプロピオニトリル、２−メチルチオブチオニトリル、フェニルグリシノニトリル、ｐ−ヒドロキシフェニルグリシノニトリル、ｏ−ヒドロキシフェニルグリシノニトリル、２−アミノ−３−ヒドロキシプロピオニトリル、２−アミノ−３−フェニルプロピオニトリル、２−アミノ−４−フェニルブチロニトリル、２−アミノ−３−メチルバレロニトリル、２−アミノ−４−メチルバレロニトリル、２−アミノ−３−ブチロニトリル、２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリル、ラクトニトリル、マンデロニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル等を挙げることができる。
本発明における微生物触媒を用いた反応は、水性溶媒下で休止菌体反応として実施することが好ましい。また、休止菌体反応の場合、微生物触媒の反応液中濃度は、生産物の種類、微生物触媒の特性により、任意に選択することができ、通常乾燥菌体として、０．１〜１０．０重量％の範囲から選択されるが、微生物触媒の反応液中の濃度が一定であることが、物質生産コストや生産操作上好ましい。例えば、反応槽から排出した反応液中の微生物触媒を分離回収し、この回収された微生物触媒を再度反応槽に戻すことにより、微生物触媒の反応液中の濃度を一定とすることができる。微生物触媒の製造コストは一般に高価であり、また、微生物触媒の追加により反応槽の微生物触媒濃度が上昇すると、分離機の負担が増加し、微生物触媒反応のコントロールが複雑となる。
微生物触媒反応のｐＨは、微生物触媒の種類により異なるが、通常ｐＨ５〜１０の範囲から選択され、反応液に酸やアルカリを添加することにより、反応液のｐＨは所定の一定値に保たれるが、微生物触媒によっては反応中のｐＨを必ずしも一定に保たなくてもよい場合がある。
本発明において反応温度の昇温コントロールとは、反応温度を昇温することで、微生物触媒の酵素活性を一定にコントロールすることをいい、反応温度を昇温コントロールすることにより、一定速度で物質生産を行うことが可能となる。また、昇温コントロール条件は、酵素活性低下率と反応速度の温度依存率を解析することにより決定することができるが、反応液中の基質濃度や生成物濃度を測定することにより具体的に求めることができる。そして、反応温度の昇温の程度は、微生物触媒の種類や特性及び生産速度維持期間により適宜選択することができるが、通常５〜２５℃であり、その中でも１０〜２０℃が好ましい。また、微生物触媒反応は、０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃から選択される温度範囲内の所定の範囲で行われる。
本発明において、一定速度で物質生産を行うとは、反応速度を実質的に一定とし、反応液単位体積当たりの生成物の生産速度を実質的に一定に保持して物質生産を行うことをいい、一定速度で物質生産を行うことにより、工業的に物質生産を行う上で、反応槽あたりの生産量を一定に維持することが可能となり、製品の安定出荷、反応コントロールの簡便さという点できわめて有利である。そして、酵素反応における反応速度は原料（基質）濃度が高い程最大反応速度に近くなるが、原料（基質）が高い程反応液中の残存率も高くなることから、生成物の収率等の生産性の点から原料（基質）濃度を決定することが好ましい。
次に、攪拌型反応槽と分離機を組み合わせた反応装置を用いる場合を例にとって、本発明の微生物触媒を用いた物質生産方法について説明する。反応槽中の水性溶媒に微生物触媒を所定濃度となるように投入し、次いで一定速度で原料基質の添加を開始する。原料基質の添加と同時に反応が始まり、生成物が所望の濃度まで反応液中に蓄積したところで、分離機の運転を開始し、微生物触媒と生成物の分離処理が行われる。分離処理により、回収された微生物触媒は、連続的に反応槽へ全量戻され、一方反応液中の生成物は、一定速度で連続的に系外に排出されていく。この分離処理の開始時には、一定速度での基質の添加を継続すると同時に、生成物蓄積濃度を一定に維持するための濃度調整用に、水又は有機溶媒含有水溶液からなる水性溶媒を一定速度で添加することが好ましい。
微生物触媒反応を継続する過程で、反応液中の微生物触媒は反応条件に依存したある速度で活性が低下するので、この活性低下分を反応温度を上昇させることで補い、反応温度を昇温コントロールすることが一定速度で物質生産を行う上で必要である。反応温度の昇温コントロールは、分離処理後の生成物含有溶液中の残存基質濃度及び生成物蓄積濃度を、高速液体クロマトグラフィー等により連続的又は間欠的に検知し、この値が一定になるように反応槽の温調システムをプログラムすることにより行われる。反応速度が一定に保てる期間は、微生物触媒の活性低下分が反応温度上昇による反応速度増加で相殺しうる期間継続可能であり、微生物触媒それぞれの特性により異なるが、通常１０日〜３ヵ月程度である。
また、生成物と微生物触媒の分離に用いられる前記分離機としては、膜分離機や遠心分離機等を用いることができる。生成物と微生物触媒の分離において、生成物が水性溶媒中に溶解している場合は、遠心分離機又は精密ろ過膜や限外ろ過膜等の膜分離機で容易に分離することができる。生成物が水性溶媒中に溶解していない場合は、微生物触媒の粒径と生成物の粒径の中間の孔径を有するろ過膜を使用することにより両者を分離することができる。なお、反応装置としては、上記攪拌型反応槽と分離機を組み合わせたものの他に、攪拌型反応槽と分離機が一体化された膜型リアクター等のプラグフローリアクターも採用することができる。
生成物含有溶液からの生成物の分離は、生成物が水性溶媒に溶解している場合は、例えば水性溶媒を蒸発濃縮することにより、また、生成物が水性溶媒に溶解していない場合は、固液分離機等を用いて行うことができる。さらに、精製が必要な場合は、有機溶媒抽出、蒸留、再結晶等、通常の精製手段を用いて行うことができる。
次に、本発明の微生物触媒を用いた物質生産方法を実生産に適用する場合の物質生産プラントの一例を図１として示す。この物質生産プラントは反応槽１と反応槽１に具備さられた温調システム２と膜分離機３とろ液貯槽４と洗浄槽５と廃菌体貯槽６と遠心分離機７と複数個のポンプ８と三方弁９とそれらを連結する配管１０とから構成されており、前述のように、温調システム２によって昇温コントロールができる反応槽１と膜分離機３で連続反応を行い、膜分離機３によりろ液と分離された微生物触媒は回収されて反応槽１に戻され、他方ろ液はろ液貯槽４に回収される。反応が終了すると、反応液はすべて洗浄槽５に移送され、反応液中の微生物触媒は膜分離機３によりろ液と分離され、洗浄槽５において水洗浄され、洗浄水は上記ろ液と同様にろ液貯槽４に回収される。洗浄後の廃菌体は遠心分離機７で脱水され、廃菌体貯槽６に送られる。
発明を実施するための最良の形態：
以下、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、生成物の収量は、得られた生成物重量又は生成物を含有する水性溶媒溶液容量を測定し、更に高速液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィー等で、残存基質濃度と生成物濃度を測定することにより求めた。アンモニア分はＮＡＤＨ〜グルタミン酸脱水素酵素を用いる紫外部吸光度測定法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　Ｈ．Ｕ．ｅｄ．，３ｒｄ　ｅｄ．，ｖｏｌ．８，ｐｐ．４５４−４６１）により定量した。
［実施例１］
限外ろ過（ＵＦ）膜分離機、自動希釈装置、オートインジェクター付きのオンライン高速液体クロマトグラフィー装置、ｐＨコントローラーを備えた３００ｍｌ容攪拌型反応槽に、微生物触媒としてあらかじめ培養しておいたＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．ＮＳＳＣ１０４の３５％湿菌体２４５．４ｇ（乾燥重量として１７．２ｇ）を添加し、さらに水２９．８ｍｌで希釈した。この反応槽に基質として２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを０．２２７ｇ／ｍｉｎの速度で連続的に添加し、反応温度２１℃で反応を開始し、合計で５１．８ｇ加え終わった時点から、水を０．９４５ｇ／ｍｉｎの速度で連続的添加を開始した。
２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの０．２２７ｇ／ｍｉｎによる連続添加を継続しながら、反応槽から反応液を膜分離機に導き、反応液中の微生物触媒を膜分離機で分離回収して反応槽に戻すと同時に、膜分離機からの透過ろ液を１．１７３ｇ／ｍｉｎの速度で排出した。また反応中を通して、ｐＨを７．０に保つように、２８％アンモニア水を添加した。この連続反応の間、生成物である２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム塩の生成速度が一定となるように、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの反応液中濃度をオンライン高速液体クロマトグラフィーにより検知し、約０．２重量％を越えるとその都度反応温度を上昇させ、約０．２重量％になるように昇温コントロールを実施した。かくして、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム塩を約２２重量％含有する膜透過ろ液が、上記一定速度で排出され、２７日間の連続反応を通じて、全量で４７．３ｋｇの膜透過ろ液を回収した。また、反応温度は最終日までに１４℃昇温して３５℃となっていた。生産速度と反応温度の経時変化を図２に示す。
この２７日間の連続反応終了後、反応槽及び反応配管系に存在する滞留液を膜濃縮洗浄し、５３４．５ｇの洗浄膜透過ろ液を別途回収した。高速液体クロマトグラフィーにより、連続反応中に得られた膜透過ろ液及び別途回収した洗浄膜透過ろ液中の、基質である２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの濃度を分析したところ、それぞれ０．２５重量％及び０．１２重量％残存し、同様に生成物である２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸の濃度を分析したところ、それぞれ２０．００重量％及び９．３５重量％存在し、また同様に副生物である２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アミドの濃度を分析したところ、それぞれ０．０７重量％及び０．０３重量％存在していた。用いた基質２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの純度が９５．０重量％であったころから、生成物のモル収率及び基質の残存率を計算すると、それぞれ９５．０％及び１．３５％であった。なお、膜透過ろ液及び洗浄膜透過ろ液中のアンモニア分を酵素法で測定したところ、それぞれ２．２８重量％及び１．０７重量％であった。
上記で得られた膜透過ろ液及び洗浄膜透過ろ液を合体し、１０分の１量のトルエンで洗浄した後、水層部分をロータリーエバポレーターを用いて、５０〜７０ｍｍＨｇ、バス温５０℃で、１３．５ｋｇまで濃縮した。この濃縮液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、基質である２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルが０．０６重量％残存し、生成物である２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸が７０．４４重量％存在し、副生物として２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アミドが０．２３重量％、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸の２分子縮合エステル体である鎖状ダイマーが０．１５重量％存在した。この濃縮後における、生成物のモル収率及び基質の残存率を計算すると、９５．０％及び０．０９％であった。なお、アンモニア分は酵素法で測定したところ、７．１８重量％であった。この値から、基質の２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルは濃縮操作で分解留去することが確認された。
産業上の利用可能性：
本発明によると、高価な微生物触媒を新たに追加することなく、反応開始時に添加した微生物触媒を全量回収し、反応温度の昇温コントロールにより、反応槽あたりの生成物生産速度を長期間一定に維持することができ、高価な微生物触媒を有効に利用し、有用物質を高収率で生産することができるばかりでなく、工業的に有利な安定生産を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の微生物触媒を用いた物質生産方法を実生産に適用する場合の物質生産プラントを示す模式図である。
第２図は、本発明の実施例１における２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸アンモニウム塩の生産速度と反応温度の経時変化を示した図である。
【図１】
2002052027.tif 000002
【図２】
2002052027.tif 000003
【国際調査報告】
2002052027.tif 000004
2002052027.tif 000005
2002052027.tif 000006