(57)【要約】（１）新規なポリペプチであるプロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）受容体、（２）そのポリペプチドをコードするｃＤＮＡおよびその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント、（３）そのＤＮＡからなる複製または発現ベクター、（４）その複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞、（５）その宿主細胞を培養する前記ポリペプチドの製造方法、（６）前記ポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体、（７）前記ポリペプチドまたは前記抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または抗体を含有する薬学的組成物、（８）前記ポリペプチドまたは前記宿主細胞を用いるＥＰ１アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法。本発明のポリペプチドは、ＰＧＥ２の過剰産生によって生ずる鎮痛剤、解熱剤、頻尿等の疾患の治療剤として用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
請求の範囲１記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２で示される塩基配列を有する請求の範囲２記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントＤＮＡ。
【請求項４】
請求の範囲２または３記載のＤＮＡを含む複製または発現ベクター。
【請求項５】
請求の範囲４記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
請求の範囲１記載のポリペプチドを発現させるための条件下で請求の範囲５記載の宿主細胞を培養することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求の範囲１記載のポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
【請求項８】
請求の範囲１記載のポリペプチドまたは請求の範囲７記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または抗体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項９】
請求の範囲１記載のポリペプチドを用いることを特徴とするＥＰ１アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求の範囲５記載の宿主細胞を用いることを特徴とするＥＰ１アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規なポリペプチドであるプロスタグランジンＥ（以下、ＰＧＥと略記する。）受容体に関する。
さらに詳しく言えば、本発明は（１）新規なポリペプチド、（２）そのポリペプチドをコードするｃＤＮＡおよびその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント、（３）そのＤＮＡからなる複製または発現ベクター、（４）その複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞、（５）その宿主細胞を培養する前記ポリペプチドの製造方法、（６）前記ポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体、（７）前記ポリペプチドまたは前記抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または抗体を含有する薬学的組成物、（８）前記ポリペプチドを用いるＥＰ１アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法、および（９）前記宿主細胞を用いるＥＰ１アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
プロスタグランジン（ＰＧ）、トロンボキサン（ＴＸ）およびロイコトリエン（ＬＴ）のようなプロスタノイドは、アラキドン酸の酸化代謝物のひとつのファミリーであり、生体内で局所ホメオスタシスを維持するために種々の生理作用を発揮している（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｒａｌｌ，Ｔ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｍｕｒａｄ，Ｆ．，ｅｄｓ）７ｔｈ  Ｅｄ．，ｐｐ６６０，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）参照のこと）。それらの生理作用はそれぞれのプロスタノイドに特有の細胞膜受容体によって制御されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘ．，１０，２１３（１９８９）、Ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，ｐｐ６４３（１９９０），Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ参照）。
プロスタノイドの一員であるプロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）、とりわけプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、消化管の収縮、弛緩、胃酸の分泌、平滑筋の弛緩、神経伝達物質の遊離等に広く関与している。ＰＧＥ２の生理作用と薬理作用、およびその作用部位を解析した結果からＰＧＥ２の受容体として、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４の４つのサブタイプ受容体が存在し（Ｎｅｇｉｓｈｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，１２，３７９−３９１（１９９５））、それぞれ異なった情報伝達に関与しているものと考えられている。
このうち、ＥＰ１は、発痛、発熱、利尿に関与していることが知られている（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９４，１１２，７３５−４０、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５２（１９８８）２７３−２７９、Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，Ｓｅｐ１９９２，２３（５）ｐ８０５−８０９参照。）。そのため、この受容体に拮抗することは、鎮痛剤、解熱剤、頻尿の治療剤として有効であると考えられる。これらの点を明確にするためには、ＥＰ１受容体の構造、シグナリングおよびその組織分布を解析することが必須である。
特許第３０９０４７２号明細書には、ＥＰ１受容体のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＣ３７５３９．１）およびそれをコードする塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ２２６４７）が開示されている。しかしながら、それらの配列を詳細に検討してみると、塩基配列で４箇所、アミノ酸配列で２箇所、本発明のヒトＥＰ１受容体のそれらと異なっていることが判明した。
スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ２．０）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を有しているものはまったく無かった。さらに、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ７０．０）に登録されている塩基配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従って、本発明のポリペプチドは新規なものであることが確認された。
発明の開示
本発明者らは、ヒトＥＰ１受容体のｃＤＮＡのクローニングに成功し、それを細胞に発現にさせて分析した結果、それがヒトＥＰ１受容体をコードしていることを明らかにして本発明を完成した。
さらに、後記実施例で明らかなように、本発明のヒトＥＰ１受容体発現細胞では、極めて高い［３Ｈ］−ＰＧＥ２の特異的結合が見られ、ＰＧＥ２依存的な細胞内Ｃａ濃度上昇も認められるのに対し、特許第３０９０４７２号明細書に記載されているヒトＥＰ１受容体発現細胞では、［３Ｈ］−ＰＧＥ２の特異的結合は認められたが、ＰＧＥ２依存的な細胞内Ｃａ濃度上昇は全く認められないことが判明した。
本発明は、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）前記（１）項に記載されたポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、
（３）配列番号２で示される塩基配列を有する前記（２）項に記載されたＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントＤＮＡ、
（４）前記（２）あるいは（３）のいずれかの項に記載のＤＮＡを含む複製または発現ベクター、
（５）前記（４）項記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
（６）前記（１）項記載のポリペプチドを発現させるための条件下で前記（５）記載の宿主細胞を培養することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法、
（７）前記（１）項記載のポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体、
（８）前記（１）項記載のポリペプチドまたは前記（７）項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および／または抗体を含有することを特徴とする薬学的組成物、
（９）前記（１）項記載のポリペプチドを用いることを特徴とするＥＰ１アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法、
および
（１０）前記（５）項記載の宿主細胞を用いることを特徴とするＥＰ１アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
発明の詳細な説明
配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくとも１００個、好ましくは、少なくとも１５０個、例えば、２００、２５０または３００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明のＤＮＡとして記載される。
ハイブリダイズするＤＮＡには、相補配列も含まれる。ハイブリダイズの条件は、ストリンジェントであることが望ましい。
配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明のＤＮＡは遺伝子組み換え法、合成法あるいは当業者に公知の方法の方法によって取得することができる。
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡを含む複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。
さらに、本発明には、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するもの以外に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部が欠損したもの（例えば、成熟蛋白中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
（２）で特定される本発明のＤＮＡには、配列番号１で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
（３）の配列番号２で特定されるＤＮＡは、（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。
すなわち、
（ｉ）本発明のポリペプチドが産生される細胞からｍＲＮＡを分離し、
（ｉｉ）該ｍＲＮＡからファーストストランド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド（２本鎖ＤＮＡ）を合成し（ＤＮＡの作製）、
（ｉｉｉ）該ＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、
（ｉｖ）得られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換し（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、
（ｖ）得られたｃＤＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ含有プラスミドを単離し、
（ｖｉ）目的とするＤＮＡの塩基配列を決定することによって作製することができる。
より詳細に説明すると、工程（ｉ）は、ヒトの組織中、ＥＰ１受容体を発現していると考えられる組織、好ましくは脳、胎盤、神経芽腫由来（Ｔ９８Ｇ等）、赤白血病（Ｈｅｌ等）等の組織細胞または細胞株より、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ）等の方法［Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）に記載］、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．等の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８，５２９４（１９７９）に記載］等の方法に従って行なわれる。
（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変したＧｕｂｌｅｒ  ＆  Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｅｎｅ，２５，２６３（１９８３）に記載］に準じて行なわれる。
（ｉｉｉ）の工程で用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機能するλ−ＺＡＰＩＩが用いられる。
（ｉｖ）の工程で用いられる宿主細胞は既に多くのものが知られており、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコンピテントセル［Ｇｅｎｅ，９６，２３（１９９０）記載の方法により調整される。］である。
最近では、各動物の種々の組織のｃＤＮＡライブラリーが既に市販されている。これらの市販のｃＤＮＡライブラリーも好適に用いられる。
工程（ｖ）は、それ自体公知であり、例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法［Ｇｅｎｅ，１０，６３（１９８０）に記載］等によって行なわれる。また、適当なプローブとしては、異種動物のＥＰ１受容体のＤＮＡまたはそのフラグメントまたは該ＤＮＡとホモロジーを有するＤＮＡが用いられる。
工程（ｖｉ）はそれ自体公知であり、例えばジデオキシ・ターミネーター（ｄｉｄｅｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）法やマキサム・ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法により行なわれる。
配列番号２で示される塩基配列が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ法によって、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
本発明のポリペプチド（配列番号１）を取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ポリペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２で示される塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズマ中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョン・プロテイン（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を生産することもできる。
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号２で示される塩基配列をコードするＤＮＡを適当なベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
本発明は、本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体も含む。さらに本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法も含む。モノクローナル抗体は、本発明のペプチド、またはその断片を抗原として用い、通常のハイブリドーマの技術により製造することができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができる。
本発明には、本発明のポリペプチド、その抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
本発明のＤＮＡは、上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入することでアンチセンスＲＮＡを製造することもできる。このようなアンチセンスＲＮＡは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御することに用いることもできる。
［医薬品への適用］
鎮痛剤、解熱剤、頻尿の治療剤等に使用するために、本発明のポリペプチド、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体は通常、全身的又は局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。好ましくは、経口投与、静脈内投与および脳室内投与である。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一人あたり、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。
もちろん前記したように、投与量は、種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
本発明化合物を投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれる。
このような固体組成物においては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アスパラギン酸等）を含有していてもよい。
錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、また２以上の層で被膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール等）を含んでいてもよい。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第２，８６８，６９１号および同第３，０９５，３５５号明細書に詳しく記載されている。
本発明による非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等が挙げられる。
このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいてもよい。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドは、それ自体、ＰＧＥ２と特異的に結合するのでＰＧＥ２の過剰産生によって生ずる疾患、例えば、鎮痛剤、解熱剤、頻尿の治療剤等として用いることができる。また、ＥＰ１受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する物質のスクリーニングに用いられる。
さらに、本発明のポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって本発明のポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１：本発明のヒトＥＰ１受容体のｃＤＮＡクローニング
Ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，ＨＥＬ  ｃｅｌｌｓを培養し、常法に従って調製したＨＥＬｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ反応は２段階で行なった（２ｓｔｅｐ  ＰＣＲ）。逆転写反応による１ｓｔストランドＤＮＡ合成後、以下の反応液を調製した。
反応液：ＨＥＬｃＤＮＡｓ（１μｌ）、プライマー１（０．５μＭ）、プライマー２（０．５μＭ）、ＰＣＲバッファ（ｂｕｆｆｅｒ）（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３，１０ｍＭ），ＫＣｌ（５０ｍＭ），ＭｇＣｌ２（１．５ｍＭ））、ｄＮＴＰｓ（０．２５ｍＭ、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰの等モル混合物）、Ｔａｑポリメラーゼ（０．５ｕｎｉｔ／μｌ）、１０％ＤＭＳＯ。
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ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである。
１段階目：［（９４℃，１分），（６２℃，２分），（７２℃，３分）］×２５サイクル、
２段階目：［（９４℃，１分），（５５℃，２分），（７２℃，３分）］×２５サイクル。
ＰＣＲ反応の生成物をアガロースゲル電気泳動したところ、目的長に合致したバンド（１２５０ｂｐ）が得られた。バンドを精製し、ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入（以下、ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  ｈＥＰ１と略す。）し、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）等のジデオキシターミネーター法に基づいた、ＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）の蛍光ダイターミネーターを用いるサイクルシークエンス法によって、挿入部分のｃＤＮＡに対して塩基配列を決定した。シークエンスの読み取りには、ＡＢＩ社のＤＮＡシークエンサーを用い、塩基配列を決定した。ｈＥＰ１受容体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、それによって翻訳されるアミノ酸配列を配列番号１に示した。
ここで、本発明で得られたヒトＥＰ１受容体の塩基配列およびアミノ酸配列と、特許第３０９０４７２号明細書に記載されているものと比較してみた（以下、各塩基およびアミノ酸の右肩の数字は、それぞれ翻訳開始コドン、ＡＴＧの“Ａ”、および翻訳開始アミノ酸である“Ｍｅｔ”を起点として数えた時の位置を示している）。
本発明の塩基配列中、Ｇ２１１は、特許第３０９０４７２号明細書の記載では、“Ａ”となっている。以下、これを“Ｇ２１１→Ａ”と示す。同様に、Ｔ６８９→Ａ、Ａ６９０→ＴおよびＡ９９９→Ｇの計４箇所で異なっていることがわかる。また、これらの塩基配列の違いから、アミノ酸配列もＡｌａ７１→Ｔｈｒ、およびＬｅｕ２３０→Ｈｉｓの２箇所で異なっていることが判明した。
実施例２：ヒトＥＰ１受容体発現細胞を用いた受容体結合実験
１）ＣＨＯ細胞への遺伝子導入およびヒトＥＰ１受容体発現細胞クローンの単離  ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  ｈＥＰ１からＥｃｏＲＩ消化によって、挿入断片を切り出し、発現用ベクターｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒのＥｃｏＲＩサイトへ方向を合わせて挿入した。約２５〜５０μｇの発現用プラスミドを適当な制限酵素（ＳａｌＩ，ＳａｃＩＩ等）で完全消化し、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）／ＣＩＡＡ抽出・ＣＩＡＡ抽出・エタノール沈殿にて精製後、５０μｌの滅菌水で溶解した。宿主として用いたＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）細胞は、１．０〜１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／０．８ｍｌになるようにＰＢＳｕｃバッファ（ｂｕｆｆｅｒ）（スクロース（２７２ｍＭ），Ｋ＋ＰＯ４２−バッファ（ｂｕｆｆｅｒ）（７ｍＭ，ｐＨ７．４），ＭｇＣｌ２（１ｍＭ））で懸濁した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６５−２０８８）中に細胞懸濁液０．８ｍｌとプラスミドＤＮＡ１０μｌを加えて１０分間氷冷し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用いて２５μＦ／２００〜５００Ｖのパルス電圧を加えた。さらに１０分間氷冷の後、約１０ｍｌの培養液（許容培地；１００×ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を所定濃度含み、ペリシニン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および１０％ｄｉａｌｙｚｅｄ  ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むα−ＭＥＭ（大日本製薬社製））で懸濁して培養フラスコ（７５ｃｍ２）に移し、ＣＯ２インキュベーター中で約４８時間培養した。この後トリプシン処理で細胞を回収し、選択培地（非許容培地；ペリシニン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および１０％ｄｉａｌｙｚｅｄ  ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むα−ＭＥＭ）で懸濁して、さらに培養を続けた。
シングルコロニーを単離するために、数日〜一週間培養を続けた後、活発に増殖しているコロニー（２０〜３０ｃｅｌｌｓ／ｃｏｌｏｎｙ）が現れてきた時点で次のようにコロニーの単離培養を行なった。培養フラスコの培養液を除去しＰＢＳで軽く洗浄後、コロニーの上に濾紙を５ｍｍ角ぐらいに細断してオートクレーブし、トリプシン液に浸した濾紙をのせ３７℃／３分間処置し、濾紙で細胞を擦り取って２４ｗｅｌｌｓ−プレートに入れた。１ｍｌ／ｗｅｌｌの選択培地を加えさらに培養を続け、細胞の形態や増殖能等から有望なクローンを選択した。
あるいは限界希釈法を用いた。約一週間培養を続けた後、細胞が活発に増殖している適当な時期で細胞を２〜５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌｓ−プレート数枚に播種し、細胞の形態や増殖能等から有望なクローンを選別して２４ｗｅｌｌｓ−プレートに移した。
２）膜標品の調製
上記方法によって得られたヒトＥＰ１受容体を発現しているＣＨＯ細胞クローンを培養し、以下の方法によって、膜標品を調製した。
ペリシニン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および１０％ｄｉａｌｙｚｅｄ  ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むα−ＭＥＭ（大日本製薬社製）を使用し、５００ｃｍ２トレイ（住友ベークライト社製）で大量培養した。ＰＢＳ（−）で洗浄後、セルスクレイパーで細胞を回収し、１，０００ｒｐｍで３分間遠心した後、細胞ペレットを−８０℃で凍結保存した。
以下、細胞膜調製の操作は４℃以下で行なった。トレイ５０〜１５０枚分のペレットを合わせ、１０倍量の氷冷バッファＡ（ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）を加え、ポッターホモジナイザーで破砕した（１，０００ｒｐｍ，５ｓｔｒｏｋｅｓ）。１，０００×ｇで１０分間の遠心で得られた上清を１００，０００×ｇで１５分間遠心した。得られた沈殿はバッファＢ（ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）を用いて懸濁し、膜標品とし、使用時まで−８０℃で保存した。
バッファＡ（ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）：
ＥＤＴＡ（１ｍＭ），ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ），ＰＭＳＦ（０．１ｍＭ），ペプスタチンＡ（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ）（１０μＭ），ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）（１０μＭ）およびインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）（２０μＭ）を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）；
バッファＢ（ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）：
ＥＤＴＡ（１ｍＭ），ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびＮａＣｌ（０．１Ｍ）を含有するＫＰｉ（ｐＨ６．０，１０ｍＭ）。
結合実験
上記方法によって調整したヒトＥＰ１受容体由来膜画分および各濃度の［３Ｈ］−ＰＧＥ２を含む反応液（２００μｌ）を一定時間室温下でインキュベートし、セルハーベスター（Ｂｒａｎｄｅｌ社製）を用いて吸引ろ過し、膜画分をガラスフィルター上に回収し、氷冷バッファー（１回当たり１〜２ｍｌ）で洗浄後、液体シンチレーターを用いて総結合量を測定した。なお、非特異的結合量はＰＧＥ２（１０μＭ）の存在下で上記と同様の操作により測定した。総結合量から非特異的結合量を差し引くことにより、特異的結合量を算出した。
以上の方法により得られた特異的結合量のデータをスキャッチャードプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｐｌｏｔｓ）にて解析し、Ｋｄ値（ｎＭ）およびＢｍａｘ値（ｆｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。本発明ヒトＥＰ１受容体発現細胞を用いた結果を図１に、特許第３０９０４７２号明細書記載のヒトＥＰ１受容体発現細胞を用いた結果を図２にそれぞれ示した。なお、図１、２に用いたヒトＥＰ１受容体発現細胞におけるｈＥＰ１ｍＲＮＡ発現量は定量的ＰＣＲで検討した結果、相違を認めずほぼ同レベルのヒトＥＰ１受容体が発現するものと考えられた。
実施例３：ヒトＥＰ１受容体発現細胞を用いた細胞内Ｃａ濃度の測定
５００ｃｍ２トレイを用いてコンフレントになるまで培養した後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、氷冷しながらＰＢＳ（−）中でピペッティングにより細胞をはがした。８００ｒｐｍ、３分間の遠心で得られた細胞ペレットをミディアムＡ（ｍｅｄｉｕｍ  Ａ）（１５ｍｌ）に懸濁し、３７℃で５０分間、室温で１０分間インキュベートした後、再び遠心で得られたペレットをミディアムＢ（ｍｅｄｉｕｍ  Ｂ）に懸濁（１〜２×１０６／ｍｌ）してアッセイに用いた。なお、Ｆｕｒａ２−ＡＭ（同仁社製）の存在する場合、アルミホイルで遮光して操作を行なった。ＣＡＭ−２２０Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（日本分光工業（株）社製）を用い、上記細胞懸濁液４００μｌを６００ｒｐｍで撹拌しながら３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの蛍光強度の変化ならびにその比をモニターし、細胞内Ｃａ濃度の変化を測定した。
ミディアムＡ（ｍｅｄｉｕｍ  Ａ）：
ｆｕｒａ２−ＡＭ（５μＭ）、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）（１０μＭ）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４，１０ｍＭ）および１０％ＦＣＳを含有するα−ＭＥＭ、
ミディアムＢ（ｍｅｄｉｕｍ  Ｂ）：
インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）（１μＭ）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４，１０ｍＭおよび０．１％ＢＳＡを含有するα−ＭＥＭ。
本発明および特許第３０９０４７２号明細書記載のヒトＥＰ１受容体発現細胞を用いた細胞内Ｃａ濃度の変化を以下の図３に示した。なお、図３中、比較とは、特許第３０９０４７２号明細書記載のヒトＥＰ１受容体発現細胞を用いた実験結果を意味する。
上記実施例２および３から明らかなように、本発明のヒトＥＰ１受容体発現細胞では、極めて高い［３Ｈ］−ＰＧＥ２の特異的結合が見られ、ＰＧＥ２依存的な細胞内Ｃａ濃度上昇も認められた。
一方、特許第３０９０４７２号明細書に記載されているヒトＥＰ１受容体発現細胞では、［３Ｈ］−ＰＧＥ２の特異的結合は認められたが、ＰＧＥ２依存的な細胞内Ｃａ濃度上昇は全く認められなかった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は本発明のヒトＥＰ１受容体発現細胞を用いた結合実験のスキャッチャードプロットである。
図２は特許第３０９０４７２号明細書記載のヒトＥＰ１受容体発現細胞を用いた結合実験のスキャッチャードプロットである。
図３は本発明および特許第３０９０４７２号明細書記載のヒトＥＰ１受容体発現細胞を用いた細胞内Ｃａ濃度の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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