(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペンタペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ。
【請求項２】
ペンタペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペンタペプチドを含有する血小板凝集阻止剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大麦若葉抽出物からの新規ペプチドの単離とその特性化に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒト血小板凝集を阻害する大麦若葉抽出物から得られる新規なペプチドの単離及び特性化に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
大麦は食糧として広く使用されている。大麦若葉抽出物及びその凍結真空乾燥物は、栄養補助食品として日本及び他の国で広く使用されている。大麦若葉抽出物はビタミン及び微量元素を含んでいるが、多様な生物活性が主張されている、大部分が定義されていない分子の複雑な混合物を含有している。
【０００３】
最近の研究によれば、加熱及び非加熱の大麦葉抽出物は、成長ホルモン（ＨＧ）及びプロラクチンの放出を、ＧＨ放出因子 (ＧＲＦ）またはチロトロピン放出ホルモン (ＴＲＨ）のみの場合に達成し得る放出を越えて強化することができる分子を含有することが立証された。（ＧＲＦ及びＴＲＨはそれぞれ成長ホルモン及びプロラクチンの天然の刺激剤である。）［Ｂａｄａｍｃｈｉａｎ，ｅｔ  ａｌ  “Ｉｍｍｕｎｅ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂａｌｅｙ  Ｌｅａｆ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＬＥ）：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ  Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  Ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ”，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，５，Ａ５６７（１９９１）．］
大麦若葉は、酸化防止剤や抗癌剤などの生物活性物質を含有することが報告されている。今日までに大麦若葉抽出物の多様な免疫調節性、例えば、ラットにおける試験管内抗炎症及び抗白血病活性、ならびに潰瘍性外傷の治癒時間の短縮も報告されている。［Ｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ“Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｙｏｕｎｇ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂａｒｌｅｙ  Ｌｅａｖｅｓ”，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４０，１１３５−１１３８（１９９２）；Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ“Ｓｔｕｄｙ  Ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｏｆ  Ｇｒｅｅｎ  Ｊｕｉｃｅ  Ｐｏｗｅｒ  Ｏｆ  Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  Ｐｌａｎｔｓ”，Ｔｈｅ  ９８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（１９７８）；Ｋｕｂｏｔａ，ｅｔ  ａｌ“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒｏｍ  Ｂａｒｌｅｙ  Ｌｅａｖｅｓ”，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊ．Ｉｎｆｌａｍ．，３，４（１９８３）］。
Ｂａｄａｍｃｈｉａｎ，ｅｔ  ａｌ“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  Ａｎａｌｏｇ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂａｒｌｅｙ  Ｌｅａｆ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｔｈａｔ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｆ  Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  Ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｔ  Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ”，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４，Ｖｏｌ．５，Ｍａｒｃｈ，ｐｐ．１４５−１５０は、α−トコフェロールスクシネートが、試験管内でラットの下垂体前葉細胞からの成長ホルモン及び／又はプロラクチンの放出を促進する大麦若葉抽出物の活性要素であるとして開示している。神経内分泌活性の発現因子（ｓｏｕｒｃｅ）としてα−トコフェロールスクシネート分子を単離し、化学的に同定するために、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及び高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）が用いられた。
【０００４】
Ｂａｄａｍｃｈｉａｎ，ｅｔ  ａｌ“α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ  Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ，Ｂｕｔ  Ｎｏｔ  α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ  Ｏｒ  Ｏｔｈｅｒ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｎ  Ｒａｔ  Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ”，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９５，Ｖｏｌ．６，Ｊｕｎｅ，ｐｐ．１−５は、α−トコフェロールスクシネートのみが試験管内でラットの下垂体前葉細胞からのプロラクチンの放出を有意に増加させ、α−トコフェロールの他の商業的に入手可能な形態（例えば、α−トコフェロール、δ−トコフェロール、α−トコフェロールアセテート及びα−トコフェロールニコチネート）又はコハク酸（例えば、コハク酸二ナトリウム塩及びコハク酸（ブタン二酸））は増加させないことを開示している。
【０００５】
本発明は、若い大麦からの抽出物中に存在する種々の分子の生物活性を評価する継続的な試みに基づくものである。
【０００６】
【発明の概要】
本発明の目的は、大麦に由来する生物活性材料を提供することである。
【０００７】
１つの実施態様において、本発明は新規なペンタペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ及びＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎを提供する。
【０００８】
他の実施態様において、本発明はペンタペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ及び薬学的に許容され得るそのための担体を含む血小板凝集の阻害のための組成物を提供する。
【０００９】
別の実施態様において、本発明はペンタペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ及び薬学的に許容され得るそのための担体を含む血小板凝集の阻害のための組成物を提供する。
【００１０】
さらに別の実施態様において、本発明は血小板凝集阻害有効量のペンタペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎを患者に投与することを含む、血小板凝集を阻害する処置を必要とする患者における血小板凝集を阻害する方法を提供する。
【００１１】
さらに別の実施態様において、本発明は血小板凝集阻害有効量のペンタペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎを患者に投与することを含む、血小板凝集を阻害する処置を必要とする患者における血小板凝集を阻害する方法を提供する。
【００１２】
本発明の他の側面は、本発明の詳細な記載を精査することにより明らかになるであろう。
【００１３】
【発明の詳細な記述】
本発明は、若い大麦に由来する生物活性分子を提供する。
【００１４】
大麦の若葉は発育の直後、例えば約２週間で収穫する。葉を凍結真空乾燥し、続いて均一な微粉末に粉砕する。（典型的な場合としては粉末は２ｍｍメッシュ篩を通過するが、これよりも大きいか又は小さい粉末寸法のものも使用することができる）。
【００１５】
このように調製された粉末を水に懸濁させ（典型的には１ｍｌのＨ2Ｏ当たり約５０ｍｇの粉末を用いる）、室温ないし約１００℃において数分から数時間攪拌する (温度が高い程、必要な時間は短い）。比較的大きい粉末寸法の場合又は粉末の相対的量が少ない場合には、粉末から材料を有効に抽出するために比較的長時間及び／又は高温を必要とし得る。
【００１６】
次いで混合物を遠心分離及び／又は濾過し、そこから固体成分を除去することができる。(そのようにして調製された抽出物を直ちに使用しない場合は、低温、例えば０℃、好ましくは−２０℃で保存することができる。）
そのようにして調製された抽出物を高性能液体クロマトグラフィー (すなわち逆相高性能液体クロマトグラフィー）にかけ、疎水性が順に増大する画分に抽出物を分離することができる（例えば、溶離剤Ａはトリフルオロ酢酸の水溶液であることができ、溶離剤Ｂはトリフルオロ酢酸の有機溶媒（例えばアセトニトリル）溶液であることができ、０〜８０％Ｂの直線勾配を流すことができる）。これらの画分を凍結真空乾燥し、水で希釈して生物活性に関して検定することができる（本発明の場合、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）−誘導血小板凝集の阻害に関して）。生物活性を示す画分をさらに逆相高性能液体クロマトグラフィーにかけ、活性材料をさらに精製することができる。
【００１７】
次いで活性材料の同定を、定性及び定量分析に関してそれ自体周知の方法により行うことができる。
【００１８】
そのような方法を用い、試験管内でＡＤＰ−誘導血小板凝集を阻害する２つのペンタペプチドＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ及びＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎが単離された。
【００１９】
これらの試験管内の研究で示された活性に基づき、これらのペンタペプチドを血小板凝集阻害を必要とする患者に有効量（例えば体重１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇ）で投与すると、そのような血小板凝集は有効に阻害されると思われる。もちろん有効量は年齢及び患者の全身的健康状態、ならびに他の因子により変動する。
【００２０】
ペンタペプチドの投与は直接の注射または静脈内点滴を用いて行うことができる。
【００２１】
ペンタペプチドと共に用いるための製薬学的に許容され得る担体は、蒸留水（無菌）及び緩衝食塩水（無菌）等を含む。
【００２２】
また、本発明のペンタペプチドは各種の飲食品に配合することもできる。
【００２３】
【実施例】
次の実施例は本発明の新規なペプチドの調製、分離及び特性化を説明するものである。
【００２４】
抽出法
（ｉ）大麦若葉粉末の調製
大麦若葉を発芽後２週間で収穫した。この大麦の葉を凍結乾燥機（Ｍｏｄｅｌ５０−ＳＲＣ−５（Ｖｉｒｔｉｓ  Ｃｏ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．））において３日間凍結乾燥した。続いて凍結乾燥された葉をふるい（メッシュ寸法２ｍｍ）が装備されたＷｉｌｅｙ  ｍｉｌｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｏｄｅｌ  ３（Ａｒｔｈｕｒ  Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて粉砕し、抽出のための均一な微粉末を形成した。
【００２５】
（ｉｉ）大麦葉抽出物（ＢＬＥ）
上記のようにして調製された大麦若葉粉末を水に懸濁させ（５０ｍｇ／ｍｌ）、室温で１時間撹した。次いで混合物をベンチ−トップ遠心分離機を用いて３，０００ｘｇにおいて３０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上澄液を３０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。次いで上澄液を３０,０００ｘｇで３０分間遠心分離した。次いでそれを０．４５μｍの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を通して濾過し、高性能液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）または生物学的アッセイのために−２０℃で保存した。
【００２６】
（ｉｉｉ）加熱大麦葉抽出物（Ｈ−ＢＬＥ）
上記のようにして調製された大麦若葉粉末を水に懸濁させ（５０ｍｇ／ｍｌ）、室温で１時間撹した。次いで混合物をベンチ−トップ遠心分離機を用いて３，０００ｘｇにおいて３０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上澄液を３０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。次いで上澄液を１０分間煮沸し、次いで３０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。次いでそれを０．４５μｍの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を通して濾過し、高性能液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）または生物学的アッセイのために−２０℃で保存した。
【００２７】
高性能液体クロマトグラフィー
ＢＬＥ又はＨ−ＢＬＥの分画のための逆相クロマトグラフィー条件の最適化を、２１４ｎｍ及び２８０ｎｍに設定されたＭｏｄｅｌ  ４９０多重波長検出器セット（ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｅｔ）及び３００ｘ３．９ｍｍ  Ｄｅｌｔａ  Ｐａｋ  ３００Å  １５μｍ  Ｃ18カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）を装備したＭｏｄｅｌ  ４４０  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）において行った。溶離剤Ａは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の０．１重量％水溶液であり、溶離剤Ｂは０．１重量％のＴＦＡを含有するアセトニトリルであった。０〜８０％のＢの直線勾配を１ｍｌ／分の流量で６０分間流した。図１ＡはＢＬＥの逆相ＨＰＬＣを示し、図１ＢはＨ−ＢＬＥの逆相ＨＰＬＣを示す。
【００２８】
Ｈ−ＢＬＥ（３００ｍｇ）の調製用逆相クロマトグラフィーを２１４ｎｍに設定されたＭｏｄｅｌ  ４４１吸光度検出器（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ｗａｔｅｒｓ）及び３００ｘ１９ｍｍ  Ｄｅｌｔａ  Ｐａｋ  ３００Å，１５μｍ  Ｃ１８カラムを装備したＭｏｄｅｌ  ６００  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）において行った。これは、ＢＢＬＥ又はＢＬＥにおけるすべてのペプチド／分子の分画のための最初の段階として選ばれた。溶離剤Ａはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の０．１重量％水溶液であり、溶離剤Ｂは０．１重量％のＴＦＡを含有するアセトニトリルである。０〜８０％のＢの直線勾配を５ｍｌ／分の流量で６０分間流した。図２はＨ−ＢＬＥの調製用逆相ＨＰＬＣを示す。
【００２９】
１分間の画分を集めて凍結乾燥し、１ｍｌのＨ2Ｏで希釈した。アデノシン二リン酸−誘導血小板凝集に対する各画分の効果を試験した。この試験の結果は、１０μｌの画分１４（Ｆ１４）及び画分１３（Ｆ１３）がＡＤＰ−誘導血小板凝集に有意な効果を有することを示した。図３及び４を参照されたい。従ってＦ１３及びＦ１４をさらなる精製に供した。
【００３０】
Ｆ１３及びＦ１４の分析用逆相クロマトグラフィーを、３．９ｍｍｘ３０ｃｍＤｅｌｔａ  Ｐａｋ  ３００Å，５μｍ，Ｃ18カラムにおいて行った。溶離液ＡはＴＦＡの０．１重量％水溶液であり、溶離液ＢはＴＦＡの０．１重量％を含有するアセトニトリルであった。０〜５％Ｂの直線勾配を２０分間、続いて５〜２０％Ｂの直線勾配を５分間、１ｍｌ／分の流量で流した。検出は２１４及び２１８ｎｍにおいて行った。３０秒間の画分を集め、ＡＤＰ−誘導血小板凝集に関してアッセイした。図５Ａ及び５Ｂはそれぞれ画分Ｆ１３及びＦ１４の分離を示している。表１はペプチドＭＢ−Ｆ１３及びペプチドＭＢ−Ｆ１４の回収をタンパク質濃度と乾燥重量により示したものである。図６及び７はそれぞれＦ１３及びＦ１４によるＡＤＰ−誘導血小板凝集の投薬量依存性阻害を示す。
【００３１】
【表１】
0003757256.tif 000002
【００３２】
たんぱく質濃度は、標準としてＢＳＡを用い、Ｌｏｗｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイにより測定した。
【００３３】
血小板凝集アッセイ
各実験に関し、絶食、禁煙した健康な検体から２シリンジ法(two syringe technique)を用い、３．８重量％のクエン酸ナトリウムを含有するポリプロピレン管中に９ｍｌの血液を集めた。試料をそれぞれ２ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水で希釈した。血液を室温において２０００ＲＰＭで３分間遠心分離することにより血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）を調製した。ＰＲＰを取り出した後、試料を再度２７００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、血小板の少ない血漿（ＰＰＰ）を調製した。ＰＲＰ及びＰＰＰの両方を用い、ＰＲＰがゼロ及びＰＰＰが１００％の光の透過率を与えるようにアグレゴメーター（ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）を校正した。各実験において、開始時の１回、中間の１回及び最後の１回の３回のコントロール実験を行った。各コントロール実験の場合に、４００μｌのＰＲＰ試料を４μｌの１μＭ  ＣａＣｌ2と共に１分間インキュベートし、次いで水を加えて（試料の体積に等しい量）２分間インキュベートした。次いで５〜２０μｌの１〜１０μＭ  アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を試料に加え、１００％凝集を得た。
【００３４】
図８Ａは上に述べたように、コントロールの血小板凝集の誘導に対するＡＤＰ（１μモル）の効果を示す。２相応答（ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（第１及び第２凝集）に注意されたい。図８ＢはＡＤＰ−誘導血小板凝集への４０μｌ（２ｍｇ）のＨ−ＢＬＥの効果を示す。
【００３５】
図９は、Ｈ−ＢＬＥによるＡＤＰ−誘導血小板凝集の投薬量依存性阻害を示す。
【００３６】
以下の表２は、種々の濃度の活性成分を含有するＨ−ＢＬＥの種々の画分によるＡＤＰ−誘導血小板凝集の阻害に関する追加の実験を示す。
【００３７】
【表２】
0003757256.tif 000003
【００３８】
アミノ酸分析
（ｉ）組成
ペプチドＭＢ−Ｆ１３及びＭＢ−Ｆ１４のアミノ酸分析をＰｉｃｏ−Ｔａｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）において行った。この方法は酸加水分解されたタンパク質からのアミノ酸のフェニルチオカルバミル誘導体の生成を基礎とするものである。特に、ペプチドＭＢ−Ｆ１３及びＭＢ−Ｆ１４（１〜５μｇ）の試料をＰｉｃｏ−Ｔａｇワークステーションにおいて、一定に沸騰する２００μｌのＨＣｌ含有１％（体積／体積）フェノール中で、１１０℃において、２４、４８、７２及び１２０時間加水分解した。加水分解物を室温において２０分間、フェニルイソチオシアナートを用いて誘導体化し、対応するフェニルチオカルバミル誘導体を得た。これらの誘導体をアミノ酸の標準混合物を用いてあらかじめ校正されたＰｉｃｏ−Ｔａｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍで分析した。表３に、ペプチドＭＢ−Ｆ１３とＭＢ−Ｆ１４のアミノ酸組成を示す。
【００３９】
【表３】
0003757256.tif 000004
【００４０】
（ｉｉ）配列
ペプチドＭＢ−Ｆ１３及びＭＢ−Ｆ１４のアミノ酸配列分析をＢｅｃｋｍａｎＬＦ  ３４００  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）において行った。自動化エドマン分解（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｄｍａｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に用いられたすべての化学薬品は高感度の配列決定用試薬であり：低濃度フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）（〈１％ＰＩＴＣ／ヘプタン）；ジソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）塩基；純粋なトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；酢酸エチル及びＤＴＴ；２５ ％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；ＰＴＨアミノ酸標準（Ｐｉｅｒｃｅ）２０ピコモル／２００μｌ及びアセトニトリル／Ｈ2Ｏから成る。配列データはＢｅｃｋｍａｎ  １２６勾配ポンプ系（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｕｍｐ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  １６８  Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，カラムヒーター（ｃｏｌｕｍｎ  ｈｅａｔｅｒ），インジェクター（ｉｎｊｅｃｔｏｒ），タンパク質配列決定ソフトウエアーを有するＳｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄソフトウェアー及び２．１×１５ｃｍ  ３μｍ，Ｍｉｃｒｏ  ＰＴＨカラムを装着したオン−ラインＨＰＬＣを有するＢｅｃｋｍａｎ  ＬＦ  ３４００  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒから得られた。
【００４１】
ペプチドＭＢ−Ｆ１３及びＭＢ−Ｆ１４はそれぞれ５個のアミノ酸残基より構成され、以下のアミノ酸配列を有した。
【００４２】
ＭＢ−Ｆ１３  ：Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ
ＭＢ−Ｆ１４  ：Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
ＵＶスペクトル
図１０Ａは、ペプチドＭＢ−Ｆ１４のＵＶスペクトルを示し、図１０ＢはペプチドＭＢ−Ｆ１３のＵＶスペクトルを示す。容易に確認できるように、２１０〜２１８ｎｍに極大吸収があり、２６０ｎｍにおいては吸収を示さない。２１０〜２１８ｎｍにおける吸収はペプチド結合の指標であり、２６０ｎｍに吸収が認められないことは、ペプチド中における芳香環または芳香族アミノ酸の不在の指標である。
【００４３】
質量分析
（ｉ）装置
線形時間−飛行型質量分析装置（Ｌｉｎｅａｒ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（ＴＯＦ  １０１，Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，Ｉｎｃ．，Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｔｅｎｎ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）を２つのレーザー口（ｌａｓｅｒ  ｐｏｒｔｓ）、対物口（ｖｉｅｗｐｏｒｔ）及び最高３０ｋＶの高い加速電圧に対応するように修正した。圧力はイオン源領域において一貫して１０-8ミリバール未満であった。プローブ先端の上において、１ｃｍの加速領域に続いて大きな直径のイオンレンズ（７．１３  ｃｍ）を設置し、透過を最大にした。レンズ素子の連動する設計は場の侵入（ｆｉｅｌｄ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を除去し、優れた場の均一性（ｆｉｅｌｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）を与える。２１５ｃｍの飛行経路（ｆｌｉｇｈｔ  ｐａｔｈ）の末端においてイオンは、−１８００Ｖにバイアスされた２状態ミクロチャンネルプレートアセンブリ（ｔｗｏ  ｓｔａｔｅ  ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ  ｐｌａｔｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）により検出された。分析イオンの質量が比較的低いので、加速電圧は研究の間を通じて１０．００ｋＶに保たれた。２つの高安定電力供給装置（ｈｉｇｈ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｐｏｗｅｒ  ｓｕｐｐｌｉｅｒ（Ｓｅｒｉｅｓ  ２０５Ｂ，Ｂｅｒｔａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）は高イオン流運転の間でさえ、波のない運転を与えた。
【００４４】
このシステムは２つのレーザー源：３３７ｎｍの波長で発光する窒素レーザー（ＶＳＬ−３３７ＮＤ，Ｌａｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）及び色素レーザー（ＬＰＤ  ３０００，Ｌａｍｂｄａ  Ｐｈｙｓｉｋ，Ｇｏｅｎｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を装備していた。色素レーザー（Ｃｏｕｍａｒｉｎ  ５４０Ａ色素）の二重出力は２７５〜２９０ｎｍの領域で調整することができる。高速フォトダイオードをパルス幅の測定とレーザーの正しい操作を監視するために使用する。パルスエネルギーを焦電ジュールメーター（ｐｙｒｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｊｏｕｌｅ  ｍｅｔｅｒ）によって記録する。窒素レーザーは最大５％のショット間の（ｓｈｏｔ−ｔｏ−ｓｈｏｔ）強度変動を持つ５ｎｓ  ＦＷＨＭパルスにおいて、最高１１０μＪを放射する（ｄｅｌｉｖｅｒｓ）。しかし、１２８ショットの平均の変動はわずか約１．４％であった。かくして平均強度の変動における変化は脱離過程についての情報を有することができる。二重色素レーザーの出力は厳密に調整されたとき、１２ｎｓパルス幅で４００μＪを越える。レーザー輻射照度を可変減衰器（９３５−５−ＯＰＴ，  Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｕｎｔａｉｎ  Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）により調節し、２５４ｍｍの焦点距離の石英レンズにより４５oにおいて試料プローブ上に集光した。
【００４５】
１０ｘの高速予備増幅器（ｆａｓｔ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒ）（Ｍｏｄｅｌ  ９３０５，ＥＧ＆Ｇ  ＯＲＴＥＣ，Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｔｅｎｎ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）に続いて可変増加増幅モジュール（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｇａｉｎ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  ｍｏｄｕｌｅ）を設置し、検出の動的範囲を拡大した。２つの増幅状態の後に、イオン流を高速過渡数値化機（ｆａｓｔ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｄｉｇｉｔｉｚｅｒ）（ＴＲ８８２８Ｄ，Ｌｅｃｒｏｙ，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により記録した。データの収集と分析を４８６Ｄ／３３  ＭＨｚのパーソナルコンピューターにおいて、特注のソフトウェア（ＴＯＦＷＡＲＥ，Ｉｌｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．）を動かして行った。
【００４６】
均一なイオン化状態を与えるために、臨界装置パラメーター−加速電圧、レーザー輻射照度、検出器バイアス−を本研究を通じて一定に保った。レーザー輻射照度を最低応答分析物に関する閾値より幾分上に設定し、この値を全ての試料に関して一貫して保った。
【００４７】
（ｉｉ）試料の調製
試験は、３，５−ジメトキン−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸（シナピニン酸、ＳＡ，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をマトリックスとして用いて行った。ＤＨＢは最初の製品中に存在する過剰量のナトリウム塩を除去するために２回再結晶をしなければならなかった。マトリックス溶液は、ＨＰＬＣ級のアセトニトリルと脱イオン水の７：３（ｖ／ｖ）の混合物中で毎日新しく調製した。分析物はＳｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。
【００４８】
ペプチドの原液は、５ｘ１０-4Ｍの濃度を得るように０．１％三フッ化酢酸（ＴＦＡ）溶液中で調製した。この試験においては、試料の２μｌのアリコートをプロベチップ（直径５ｍｍ）上で１０μｌのマトリックス溶液と混合し、マトリックス対試料の比率を１０００より高くした。（予備混合の効果を試験するために、微量遠心分離管中で渦流混合した後、コントロール実験を行った。乾燥過程中のマトリックス及び試料の自然混合と渦流予備混合は同じ結果を与えた。）冷空気流を用いて溶剤を除去し、プロベチップ上における均一な結晶の分布を与えた。
（ｉｉｉ）結果
ペンタペプチドの質量分析は、ペプチドＭＢ−Ｆ１３及びＭＢ−Ｆ１４に関し、それぞれ５９２．３及び５９２．８においてＭ＋１イオンピークを与えた。このデータは分子量が５９１．３と５９１．８であることを示唆している。アミノ酸組成と配列分析から計算される分子量はペンタペプチドＭＢ−Ｆ１３とＭＢ−Ｆ１４に関してそれぞれ５９１．５と５９１．７であった。図１１ＡはペプチドＭＢ−Ｆ１３の高分解能ＦＡＢ−ＭＳである。図１１Ｂは、ペンタペプチドＭＢ−Ｆ１４の高分解能ＦＡＢ−ＭＳである。
【００４９】
高性能毛管電気泳動
高性能毛管電気泳動をＢｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５０１０において行った。ペプチドＭＢ−Ｆ１３とＭＢ−Ｆ１４の分離を内径７５μｍ及び外径３７５μｍの５７ｃｍの管（検出器に対して５０ｃｍ）中で、室温、２０ＫＶの電圧、１００ｍＭ硼酸塩  ｐＨ８．３の緩衝、及び２１４ｎｍにおける検出において行った。
【００５０】
図１２Ａは、ペプチドＭＢ−Ｆ１４の電気泳動図であり、図１２Ｂは、ペプチド  ＭＢ−Ｆ１３の電気泳動図である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは、日本産大麦葉抽出物の逆相高性能液体クロマトグラムであり、Ｂは、日本産加熱大麦葉抽出物の逆相高性能液体クロマトグラムである。
【図２】日本産加熱大麦葉抽出物の調製的分離の逆相高性能液体クロマトグラムである。
【図３】アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）−誘導血小板凝集に対する画分１３（Ｆ１３）の効果を示すグラフである。
【図４】ＡＤＰ−誘導血小板凝集に対する画分１４（Ｆ１４）の効果を示すグラフである。
【図５】Ａは、画分１３（Ｆ１３）の逆相高性能液体クロマトグラムを示し、Ｂは、画分１４（Ｆ１４）の逆相高性能液体クロマトグラムを示す。
【図６】画分１３（Ｆ１３）によるＡＤＰ−誘導血小板凝集の投薬量依存性阻害を示すグラフである。
【図７】画分１４（Ｆ１４）によるＡＤＰ−誘導血小板凝集の投薬量依存性阻害を示すグラフである。
【図８】Ａは、ＡＤＰ−誘導血小板凝集を示すグラフであり、Ｂは、加熱大麦葉抽出物（Ｈ−ＢＬＥ）によるＡＤＰ−誘導血小板凝集の阻害を示すグラフである。
【図９】加熱大麦葉抽出物（Ｈ−ＢＬＥ）によるＡＤＰ−誘導血小板凝集の投薬量依存性阻害を示すグラフである。
【図１０】Ａは、画分１４（Ｆ１４）のペプチドのＵＶスペクトルを示し、Ｂは画分１３（Ｆ１３）のペフチドのＵＶスペクトルを示す。
【図１１】Ａは、画分１３（Ｆ１３）のペプチドの高分解能−高速原子衝撃−質量スペクトルを示し、Ｂは画分１４（Ｆ１４）のペプチドの高分解能−高速原子衝撃−質量スペクトルを示す。
【図１２】Ａは画分１４（Ｆ１４）のペプチドの高性能毛管電気泳動チヤートを示し、Ｂは画分１３（Ｆ１３）のペプチドの高性能毛管電気泳動チヤートを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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