(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物を基質とする酵素の生産方法であって、
少なくとも水洗したイグサを粉末にし、
該イグサ粉末を殺菌し培養基質として糸状菌を培養すること
を特徴とするイグサを用いた酵素の生産方法。
【請求項２】
前記培養基質に、
ペクチンを含ませること
を特徴とする請求項１に記載のイグサを用いた酵素の生産方法。
【請求項３】
前記培養によって、
ペクチナーゼを得ること
を特徴とする請求項１に記載のイグサを用いた酵素の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、酵素製剤等の医薬料または食料品の加工等に用いる酵素の生産方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細菌または酵母等の酵素の製造方法としては、一般的に液状物（ゼリー状の物質を含む）を基質にした液体培養による生産方法が用いられているが、糸状菌または一部の放線菌等の酵素については固体を基質にした固体培養による生産方法が用いられている。この固体を基質にした酵素の固体培養による生産方法においては、小麦ふすま、またはミカン搾汁カス等からなる天然の植物等を基質としたもの等が公知である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、小麦ふすま、またはミカン搾汁カス等からなる天然の植物においては、一般的にタンパク質を多く含有しているため、得られる酵素の比活性が低く、目的とする酵素を精製することが困難であったり、または、共存するプロテアーゼによって、目的とする酵素が切断されることもあり、酵素の生産性が悪いという問題点を有している。
【０００４】
従って、従来の植物を基質にした酵素の固体培養による生産方法においては、微生物が繁殖しやすく、且つタンパク質の含有量が少ない培養基質の開発し生産性を向上させることに解決しなければならない課題を有している。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記した従来例の課題を解決する具体的手段として本発明は、植物を基質とする酵素の製造方法であって、少なくとも水洗したイグサを粉末にし、該イグサ粉末を殺菌し培養基質として糸状菌を培養することを特徴とするイグサを用いた酵素の生産方法を提供するものである。
【０００６】
この発明において、前記培養基質に、ペクチンを含ませること；及び前記培養によって、ペクチナーゼを得ることを付加的な要件として含むものである。
【０００７】
本発明に係るイグサを用いた酵素の生産方法は、食物繊維及びミネラル成分を多量に含有し、且つタンパク質の含有量が少ないイグサを使用するもので、そのイグサを粉末にしたものを培養基質として用いることによって、微生物を繁殖させやすくし、目的とする酵素を培養して効率よく生産することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
次に、本発明を具体的な実施の形態に基づいて詳しく説明する。
本発明においては、酵素を培養する際の基質として、イグサを用いるものである。イグサは、その成分の略６３％が食物繊維からなり、自然界に属する植物の中においても、その食物繊維の含有率が比較的多い植物の一つであり、その内部は多孔質のいわゆるスポンジ状を呈している。
【０００９】
このように、イグサの内部は多孔質のスポンジ状であるため、その内部には多くの空気を含有しており、酸素を好む微生物、即ち、好気性の菌類にとって適した環境なのである。
【００１０】
このような特性をもつイグサを用いて、いわゆる植物を基質とする酵素の生産方法であって、その使用に際しては、刈り取って乾燥したイグサを水洗して付着物を除去し、更に乾燥させてから適宜の手段によりイグサを粉砕し粉末にする。この場合の粉末は、均一でなくても良いのであり、例えば、粗いものと細かいものとが混じり合った状態のもので良いのである。
【００１１】
このようなイグサ粉末に所要量の純水と、ペクチンとを加えて加熱処理することにより殺菌し、室温にまで冷ました状態で培養の基質とするものであり、この基質は水分を含んだパン状を呈する培地となり、その培地に培養しようとする酵素、例えば、糸状菌（液状）を接種し所定の温度を維持して数日間培養するのである。この場合に、培養する酵素の種類によって、例えば、７日〜３０日またはそれ以上の日数を掛けて培養することもある。
【００１２】
イグサを使用した培地は、区画された平たい容器内に所定厚さの層状を呈して形成されるものであるが、全体として比較的拡がりをもった薄い層に形成した方が菌類の繁殖に好ましいものである。但し、培養しようとする酵素の種類によっては、例えば、深さのある瓶状の容器内に比較的厚い層をもって培地を形成することもある。
【００１３】
このようにして目的とする酵素を培養した後に、容器に所要量（培地の容積の２倍以上）の純水または滅菌水を投入し、室温を維持した状態で略一昼夜放置した後、所定の濾過手段によりイグサと水分とを濾過し、その濾液が酵素抽出液となるものであり、その後において、酵素抽出液は所定の手段により精製されるのである。
【００１４】
また、イグサには、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、及び鉄等のミネラル分が多く含有されており、微生物が生育する上で必須の成分を豊富に含有しているのである。そこで、イグサに含有されるミネラル成分の含有量を表１に示す。
【表１】
0003798336.tif 000002
注：財団法人日本食品分析センター調べ
【００１５】
更に、イグサはタンパク分をあまり含まないことも培養基質としての利点の一つである。イグサのタンパク分は、１００ｇあたり約４ｇ程度であり、このようにタンパク分の少ないものを培養基質として用いた場合に、比活性の高い酵素が生産できると考えられる。つまり、含有されているタンパクのほとんどが生産された目的酵素になるということである。
【００１６】
このように、イグサは、他の植物、例えば、小麦、またはミカンと比較して、タンパク分の含有量が少ないため、生産された酵素の比活性が高くなり精製が容易になると共に、混在する不純タンパク質によって、培養させる目的である酵素を切断したり、または培養の働きを低下させたりすることがなくなるのである。
【００１７】
培養前の糸状菌株に含有されるペクチナーゼの一種である活性したポリガラクツロナーゼのそれぞれの含有量を表２に示す。
【表２】
0003798336.tif 000003
注：ＩＦＯ３０１０２、ＩＦＯ３１１２５、ＩＦＯ５２３８はAspergillusであり、その他についてはRhizopusである。
【００１８】
ペクチナーゼは、果汁、果実酒の清澄化、植物性繊維の精錬等に広く一般的に使用され、植物の組織中に含有されるペクチンに作用する酵素の一つである。ポリガラクツロナーゼは、ペクチナーゼの一種であり、ポリガラクツロン酸をガラクツロン酸に分解する酵素である。
【００１９】
（実験例１）
この実験例１においては、糸状菌の一つであるRhizopus oryzae  ＩＦＯ４６９７株をポリガラクツロン酸生産菌として使用した。使用菌株をポテトデキストロース寒天培地を用い、略３０℃程度の温度で７日間培養したものを実験に使用した。培養した斜面に滅菌水を３ｍｌ加えたものを胞子懸濁液にし、接種液とした。
【００２０】
国産（熊本県八代地方産）の泥染めイグサを水洗し乾燥したものを略８ｍｍの長さに切断し、ミキサー（Hamilton Beach：Model ９１１：１５７００ｒｐｍ）で粉末にしたものを培養の基質として使用した。
【００２１】
酵素の培養については、培地には、前記粉末にしたイグサ５ｇと、純水１７ｍｌと、ペクチン（Nacalai tesque社製）０．５ｇとを三角フラスコに入れて綿栓をし、１２１℃の温度で略２０分間程度オートクレーブ（殺菌）したものを使用した。
【００２２】
殺菌後のイグサ培地、即ち、三角フラスコに前記接種液を滴下し、直射日光を避けた室内において、略２５〜３０℃の温度に維持し３日間に渡って培養した。
【００２３】
このように培養した後、前記三角フラスコに純水を略４０ｍｌ入れて、室温にて一昼夜放置した後に濾過して、酵素抽出液を得た。
【００２４】
（比較例１）
この比較例１においては、実験例１の粉末にしたイグサに換えて、固体を基質にする場合に一般的に用いられている小麦ふすまを培養の基質として使用し、その他については、実験例１と同様にして酵素抽出液を得た。
【００２５】
実験例１と比較例１とのポリガラクツロナーゼの含有量における比較については、夫々１ｇあたりのポリガラクツロナーゼ活性と比活性の含有量を比較した。
【００２６】
酵素抽出液に含有される活性した酵素を測定する方法としては、ペクチン酸溶液（Nacalai tesque社製）の１％溶液（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）０．５ｍｌに、前記酵素抽出液を０．５ｍｌ加えて、４０℃の温度で略１５分間反応させた。
【００２７】
次に、前記反応させた液体を沸騰した水浴中で略５分間加熱して反応を停止させて、遊離したガラクツロン酸量をＤＮＳ試薬によって測定した。
【００２８】
このＤＮＳ試薬においては、４．５％の水酸化ナトリウム水溶液３００ｍｌ中に、１％のＤＮＳ試薬８８０ｍｌと、ロッセル塩２５５ｇとを加え、該ロッセル塩が溶解されるまで撹拌して、溶液Ａを得る。また、これとは別に、１０％の水酸化ナトリウム水溶液２２ｍｌ中に、結晶フェノール１０ｇと、水とを加えて、１００ｍｌにし、この１００ｍｌから６９ｍｌを取って、その６９ｍｌ中に炭酸水素ナトリウム６．９ｇを加えて、溶液Ｂを得る。これらの溶液Ａ、Ｂを混合して、２日間放置して濾過したものを前記ＤＮＳ試薬として用いた。
【００２９】
前記反応液に、前記ＤＮＳ試薬１ｍｌを入れて撹拌した後、沸騰した水浴中で略１０分間加熱し、その後、１０分間氷冷させ、これを遠心分離機（３０００回転、５分間）にかけて、その上清を水で１０倍に希釈し、分光光度計（HITACHI：Ｕ−１１００）によって、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３０】
このようにして得られた吸光度と、あらかじめ作成しておいた検量線とを用いて還元糖濃度を算出した。その際に、酵素単位（Ｕ）は、１分間に酵素溶液１ｍｌがガラクツロン酸１ｍｇを遊離する量（ｍｇ−ガラクツロン酸／ｍｉｎ）を１（Ｕ）として規定した。
【００３１】
実験例１と比較例１とに含有されるポリガラクツロナーゼの含有量を表３に示す。
【表３】
0003798336.tif 000004
【００３２】
表３から明らかなように、比較例１の小麦ふすまを基質として使用した場合よりも、実験例１のイグサを粉末にしたものを基質にした方が、比活性の高い酵素を大量に得ることができることが解る。
【００３３】
（実験例２）
この実験例２においては、実験例１の培地に使用した量をそれぞれ２０倍、即ち、イグサ１００ｇと、純水３４０ｍｌと、ペクチン（Nacalai tesque社製）１０ｇとを使用し、その他については、実験例１と同様にして培養した。
【００３４】
このようにして培養した実験例２に含有されるポリガラクツロナーゼの含有量を測定したところ、イグサ１ｇあたりのポリガラクツロナーゼ活性は４７２０Ｕ／ｇ−igusaであり、ポリガラクツロナーゼ比活性は５３００Ｕ／ｍｇ−protein・g-igusaであった。
【００３５】
この結果より明らかなように、実験例１のポリガラクツロナーゼの活性または比活性の含有量よりも、実験例２の方がそれぞれ増加していることから、培養させる効率が高くなっていることが解る。
【００３６】
一般的な固体の基質を使用した糸状菌の培養においては、培地の量を増加させることによって、その培養できる量が減少することもあるが、本発明の実験例２から明らかなように、イグサを基質にして糸状菌を培養した場合には、培地を増加させることによって、その培養できる量を増加させることができるため、ポリガラクツロナーゼを大量に培養する際にその効果が大きくなることが解る。
【００３７】
なお、実験例においては、泥染めイグサを用いたが、本発明に係るイグサを用いた酵素の培養方法はこれに限定されるものではなく、例えば、無染イグサまたは新芽イグサ等を用いても良い。
【００３８】
更に、イグサは微生物の成育にとって好ましい環境であるため、その利用は酵素の培養に限定されるものではなく、例えば、医薬品工業等における微生物による代謝物の生産においても、利用することができるのである。
【００３９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係るイグサを用いた酵素の生産方法は、植物を基質とする酵素の培養方法であって、少なくとも水洗したイグサを粉末にし、該イグサ粉末を殺菌し培養基質として糸状菌を培養するようにしたことにより、イグサは食物繊維及びミネラル成分を多量に含有するため微生物が繁殖しやすく、且つイグサはタンパク質の含有量が少ないため、この粉末を培養の基質にすることによって、得られる酵素の比活性が高く、目的とする酵素を精製することが容易であると共に、共存するプロテアーゼによって目的とする酵素が切断されることがなく、さらに、酵素を大量に培養し生産する際に、培地を多くすることで効率よく培養量を多くできるという優れた効果を奏する。