(57)【要約】本発明は、ＧＡＧ高分子とコラーゲン等の細胞接着性タンパク質とを組み合わせて細胞外マトリクスに類似した環境を構成し、細胞の分化増殖などをコントロールできる新規な材料を提供することを目的とする。本発明は、ビニル系高分子主鎖にグリコサミノグリカン基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖を導入したグリコサミノグリカン機能化高分子を、細胞接着性タンパク質に担持せしめてなることを特徴とするグリコサミノグリカン機能化高分子タンパク質複合体、並びに当該複合体を含んでなる細胞培養基材及び組織再生治療材を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビニル系高分子主鎖にグリコサミノグリカン基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖を導入したグリコサミノグリカン機能化高分子をタンパク質に担持せしめてなることを特徴とするグリコサミノグリカン機能化高分子タンパク質複合体。
【請求項２】
前記タンパク質がコラーゲンであることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記グリコサミノグリカン機能化高分子が、下記の一般式（１）：
−（ＣＷＸ−ＣＹＺ）ｎ−        （１）
（上記式中、Ｗは糖鎖を表し、Ｘ、Ｙ及びＺは水素原子を含む任意の置換基を表し、ｎは１以上の繰り返し単位数を示す）
で表されることを特徴とする請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
前記糖鎖が、ヘパリン／ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、あるいはそれらの部分的脱硫酸化修飾体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
前記グリコサミノグリカン機能化高分子を介して成長因子又はサイトカインをさらに固定化したことを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の複合体を含んでなることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の複合体を含んでなることを特徴とする組織再生治療材。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、グリコサミノグリカン類とコラーゲン等の細胞接着性タンパク質とを組み合わせてなる複合材料に関する。特に、グリコサミノグリカン類が有する細胞成長を制御する機能、あるいは、それらの中でもヘパリン／ヘパラン硫酸に特徴的である各種細胞成長因子やサイトカイン等と結合することで細胞増殖・分化等をコントロールする作用を強調したことを特徴とするグリコサミノグリカン構造を有するビニル系高分子とコラーゲン等の細胞接着性タンパク質とを組み合わせてなる複合材料及びその医療への応用に関する。
背景技術
ヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸等を含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）類と呼ばれる酸性多糖類群は、コアタンパク質と共有結合的に集合化してプロテオグリカン（ＰＧ）を形成し、結合組織や細胞膜などに存在している。ＰＧはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、トロンボスポンジン等の細胞接着性のタンパク質とともに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を構成し、細胞が生存し生物学的機能を果たすために広く分布している。特に、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）はほとんどの動物組織に存在し、細胞の接着、形態形成、機能維持に極めて重要な役割を果たしている。
ＰＧに含まれるヘパリン／ＨＳは、様々な細胞成長因子と相互作用し、細胞の分化や増殖を制御することに深く関わっていることが明らかになってきた。例えば線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）はヘパリン／ＨＳと高親和性を有するＦＧＦファミリー（現在ＦＧＦ１〜ＦＧＦ１０程度まで報告されている）を構成しており、そのタイプによって血管内皮細胞、カポジ肉腫細胞、表皮角化細胞等に特異的に作用する。これらのＦＧＦの活性は、細胞表面のＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）と特異的に結合することにより起こるものと考えられている。膜を貫通して存在するヘパリン／ＨＳは細胞の近傍で不安定なＦＧＦ分子を安定な状態で保持・蓄積し、タンパク質分解酵素や酸化的分解からＦＧＦを保護しながら必要に応じてＦＧＦＲへの結合をサポートするものである。ＦＧＦがＦＧＦＲに結合することにより増殖シグナルが送られて細胞増殖が促進されることになる。このような作用は、ヘパリン／ＨＳが存在しなければＦＧＦとＦＧＦＲとが結合できないことを示唆した多くの研究によって証明されている（例えば、Ｍ．Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，８１７−８２４（１９９４）参照）。
一方、コンドロイチン硫酸は、軟骨組織中のヒアルロン酸リッチな巨大ＰＧ骨格の中に豊富に存在し、骨形成の制御に密接な関わりを持つ。このように、ＧＡＧ類は、様々な組織中でその機能に応じた分布や構成を持ち、特徴的な細胞成長の制御を担っている。
本願発明者等は、このような多彩な機能を持つヘパリン／ＨＳを含むＧＡＧ類の基礎研究や医療への応用等について研究を進めており、ビニル系高分子主鎖にＧＡＧ類の基本骨格を結合せしめたグリコサミノグリカン機能化高分子を合成し、その細胞培養基材や抗腫瘍剤等としての用途に関して特許出願した（国際特許出願公開ＷＯ００／５９９６７号公報）。このような機能化によって、ＧＡＧ類が有する細胞成長に対する基本的な活性を効率よく強調することが可能となった。
一方、ＰＧとともに細胞外マトリクスを構成する主要成分である細胞接着性タンパク質、中でもコラーゲンは、その細胞接着特性に基づいて細胞培養基材や人工臓器等に広く応用されている。例えば、繊維芽細胞、内皮細胞、及び好中球を含む種々の細胞型が、コラーゲンのみからなるマトリクスに接着して成長、泳動することが示されている。また、これらの接着は、インテグリンファミリーのメンバーといった細胞表面レセプターの数に依存することが示されている（Ｍｙｌｅｓ，Ｊ．Ｌ．，等，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．，１１：６９−８６（２０００））。
最近特に注目されている再生医療の分野では、生体外において様々な細胞の分化／増殖を制御する試みがなされている。一般に、分化は細胞増殖を抑制した状態で細胞特有の機能発現を優先するのに対し、増殖（脱分化）は機能よりも増えることを優先する。組織再生においては、増えること（脱分化）と分化によって特有の機能発現をすることのバランスが重要である。概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養では、コラーゲンは脱分化を誘導しやすいとされている。
発明の開示
本発明者等は、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質と上記ＧＡＧ機能化高分子とを組み合わせて、コラーゲン及びＰＧからなる細胞外マトリクスに類似した環境を構成することにより、そこにおける細胞の分化／増殖をコントロールするというバイオミメティックな観点から研究を行った。このような、細胞外マトリクス構造を人工的な材料を用いて再現しようとする試みは、これまでに行われていない。その結果、上記ＧＡＧ機能化高分子が天然ヘパリンより強固にコラーゲン等の細胞接着性タンパク質上に吸着されること、そしてＧＡＧ機能化高分子を吸着させたコラーゲン基質にＦＧＦ−２やＶＥＧＦ１６５等のヘパリン結合性成長因子が有効に固定化されることを見出した。加えて、ＧＡＧの中でもコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸は軟骨組織中に多く含まれて骨形成の制御に深く関与していることが示唆されていることに鑑み、これを同様に機能化高分子としてコラーゲン等と複合化することにより軟骨形成が促進されることも見出し、本発明をなすに至った。
よって本発明は、ビニル系高分子主鎖にグリコサミノグリカン基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖を導入したグリコサミノグリカン機能化高分子を、細胞接着性タンパク質に担持せしめてなることを特徴とするグリコサミノグリカン機能化高分子タンパク質複合体を提供する。
本発明のグリコサミノグリカン機能化高分子タンパク質複合体（以下「ＧＡＧタンパク質複合体」とする）は、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質とプロテオグリカン（ＰＧ）からなる細胞外マトリクスに類似の構成を有し、成長因子やサイトカインの接着及び細胞増殖・分化のコントロールについてグリコサミノグリカン機能化高分子（以下「ＧＡＧ高分子」とする）が天然ＰＧと同等以上に作用し、複合体表面に種々の成長因子やサイトカインを濃縮し保持でき、さらに軟骨組織等の誘導を促進することができる。特に、ヘパリン／ヘパラン硫酸系のＧＡＧ高分子では、成長因子やサイトカインとの強化された相互作用によって細胞増殖・分化のコントロールを効率化し、軟骨組織等の誘導を促進することができる。
発明を実施するための好ましい形態
本発明のＧＡＧタンパク質複合体は、ビニル系高分子主鎖にグリコサミノグリカン類の基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖を導入したグリコサミノグリカン機能化高分子（ＧＡＧ高分子）を細胞接着性タンパク質に担持せしめてなる。
本発明のＧＡＧ高分子の主鎖として用いられるビニル系高分子は、重合性のモノマーから構成され、例えば、化学便覧（５６１頁、応用化学編Ｉ、日本化学会、丸善（昭和６１年））に記載された付加重合系、縮重合系、重付加系、付加縮合系、開環重合系のモノマーから任意に選択したモノマーを含むホモポリマー又はコポリマーでよく、特に限定されない。好ましくは、少なくとも１つの不飽和結合を有する付加重合系のモノマー、例えばエチレン、プロピレン、スチレン、酢酸ビニル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド等の１又はそれ以上から形成されるポリマーが挙げられ、それらは任意に置換されていてもよい。
このような高分子主鎖にグリコサミノグリカン基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖が結合している本発明のＧＡＧ高分子は、下記一般式（１）で表される単位を少なくとも１つ含む。
−（ＣＷＸ−ＣＹＺ）ｎ−      （１）
上記式中、Ｗは糖鎖を表し、Ｘ、Ｙ及びＺは、水素原子又は例えばメチル、エチル等のアルキル基、アセチル等のアシル基、アルコキシ基、アリール基、アラルキル基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、シアノ基などの任意の置換基を表し、ｎは１以上、好ましくは２〜１０００、より好ましくは５〜５００、さらに好ましくは１０〜３００の繰り返し単位数を示す。
本発明のＧＡＧ高分子を構成する糖鎖は、ヘパリン／ＨＳ、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸などのＧＡＧ類を構成する基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を有し、その構成二糖体の数が２〜５０個以上、より好ましくは４〜２５個の二糖類以上のオリゴ糖類もしくは多糖類である。例えば、ヘパリン／ＨＳに含まれる３−Ｏ−硫酸基を有する特徴的な構造ドメインに相当する５糖配列以上からなる糖鎖は、血液凝固を阻害するアンチトロンビンＩＩＩと特異的に結合し、２−Ｏ−硫酸基と６−Ｏ−硫酸基を豊富に含む１０糖配列以上の構造ドメインに相当する糖鎖はＦＧＦ−１及びＦＧＦ−４の活性発現に関与する。一方、成長因子結合に重要であることが知られた硫酸基を有するＧＡＧ類のみならず、硫酸基を持たないヒアルロン酸構造を有するＧＡＧ高分子も好ましく用いられる。
前記糖鎖は、例えばＮ−硫酸基を持つ場合にはそれを選択的に脱硫酸化したものを含む修飾体、あるいは化学的に合成したものでも天然のものでもよい。ただし、天然グリコサミノグリカンの化学分解によって得られる分解糖鎖であり、当該分解糖鎖が、その化学分解によって生じた官能基を介して高分子主鎖に結合するものが製造上好ましい。
硫酸基を有する天然ＧＡＧ類としては、ヘパリン／ＨＳ、コンドロイチン硫酸（例えば、生化学工業（株）から市販されているコンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅ等の、様々な４−硫酸／６−硫酸構造比率を有するもの、二糖二硫酸構造を有するものを含む）、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸などが挙げられるが、特に構成糖の硫酸化のパターンが豊富なヘパリン／ＨＳがより好適に用いられるが、他のＧＡＧ類でも何ら支障はなく、例えばコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸は軟骨組織の再生に適している。また、セルロース、アミロース、ラミナラン、アガロース、カラゲナン、イヌリン、レバン、キシラン、マンナン、キチン、ペクチン、アミロペクチン、ガラクタン、トリチシン、アラビナン、コロミン酸などのホモ多糖類や、グルコマンノグリカン、ガラクトグルコマンノグリカン、グアゴム、アラビノガラクトグリカン、アラビアゴム、トラガント酸、アルギン酸などのヘテロ多糖類に対し酵素的あるいは化学合成的に硫酸基を導入したものを用いてもよい。
前記天然グリコサミノグリカンの化学分解は、例えば、上記の多糖類を、ｐＨ６．５〜８．０以外の非生理的な条件、好ましくはｐＨ５以下またはｐＨ１０以上の酸及び／またはアルカリ性領域で、亜硝酸や過ヨウ素酸などを用いて糖鎖結合を切断して分画糖鎖を得ることによって好ましく調製される。また、ヘパラナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ケラタナーゼなどの選択的な糖鎖分解酵素や、場合によっては、熱、プラズマ放電、あるいはラジカル反応性試薬に基づく化学的な分解等で得られた分画糖鎖を用いることもできる。
本発明のＧＡＧ高分子における糖鎖は、共有結合によって高分子主鎖に結合している。その結合は特に限定されることはなく、高分子主鎖及び糖鎖が有する官能基の組み合わせに従って、適当な反応条件で、任意に触媒などを用いて両者の官能基同士をカップリングさせる。また、高分子主鎖を構成するモノマーと糖鎖とを結合させて糖鎖誘導モノマーとし、そのモノマーを重合させても、反応性基を有する高分子に糖鎖を結合させてもよいが一分子中の糖鎖含有量を調節できることから、糖鎖誘導モノマーを重合するのが好ましい。中でも、分画された親水性の糖鎖を疎水性のモノマー単位に導入し、それを重合して得られたＧＡＧ高分子（ホモポリマー）は、一つの分子中に高密度の糖鎖を有するのに加えて、水溶性のポリマーでありながら疎水性の樹脂製品に容易に吸着できる特性を有する。
一実施態様として、本発明のＧＡＧ高分子における糖鎖の導入は、ビニルベンジルアミン等のアミノ基を有するモノマーに対して、例えば、化学的に分解されたＧＡＧ類に生成したアルデヒド基やカルボニル基を介したシッフ結合により行うことができる。他の実施態様としては、酸クロリド基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基、あるいはエポキシ基などを有するカップリング剤を使用してビニルモノマーと糖鎖の官能基とを結合する方法等も好適に用いられ得る。特に、化学的な分解によってＧＡＧ類に生成したアルデヒド基を用いる方法は、簡便でＧＡＧ類の活性を保存しやすいという点で好ましく用いることができる。
このような本発明のＧＡＧ高分子は、天然のＧＡＧ類の活性ドメインを立体的構造をなす一分子中に複数個含有することにより、その活性ドメインが有する生理活性が一層強化される（クラスター効果）。例えば、ヘパリン／ＨＳ構造を持つＧＡＧ高分子では、特に各種細胞成長因子やサイトカインに対する相互作用が向上し、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸構造を有するＧＡＧ高分子では軟骨細胞誘導活性が一層強化される。一分子中の活性ドメイン数が最大となるのは糖鎖を導入したビニルモノマーを単独重合したホモポリマーであるが、目的や用途に応じて糖鎖を持たない他のモノマーと共重合したコポリマーとすることも可能であり、その調整は当業者の通常の技量の範囲内である。
一方、本発明のＧＡＧタンパク質複合体を構成する細胞接着性タンパク質は、天然の細胞外マトリクスを構成するタンパク質類から好ましく選択され、コラーゲン、エラスチン等の繊維性タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等の糖タンパク質を含む。好ましくはコラーゲン、ラミニン、又はフィブロネクチン、中でもコラーゲンが入手の容易さや産業上の汎用性等から好ましく用いられる。
本発明のＧＡＧタンパク質複合体は、前記細胞接着性タンパク質からなる基材に、前記ＧＡＧ高分子を担持させることにより調製される。上述したように、本発明のＧＡＧ高分子はビニル系の疎水性高分子主鎖に親水性（水溶性）の糖鎖が複数結合しているため、水溶液中では高分子主鎖をコアとし、その周囲に糖鎖を広げた形で存在しているものと思われ、その結果、ＧＡＧ高分子全体としては水溶性となりうる。従って、コラーゲン基質等にＧＡＧ高分子水溶液を適用し、必要ならば余分な水溶液を吸引などにより除去し、所定時間放置することにより容易に吸着固定化することができる。場合によっては、ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＢＳＡ−ＰＢＳ）等で洗浄する。
本発明で使用するＧＡＧ高分子は、高分子主鎖に基づく疎水性により、医療用に広く用いられている合成樹脂製品、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエステル製品などの疎水的樹脂表面に吸着することを特徴とする。しかし驚くべきことに、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質表面にも極めて強固に吸着固定化されることが見出された。特に、ヘパリン／ＨＳ系ＧＡＧ高分子では、その吸着力は水溶性の天然ヘパリン分子よりも強いことが実験的にも確認された。本発明者等は、この強固な吸着力は、本発明のＧＡＧ高分子が単なる静力学的吸着のみならず、ＧＡＧ高分子の疎水性主鎖と細胞接着性タンパク質内に存在する疎水性部分との疎水性相互作用にも基づいているものと考えている。ＧＡＧ高分子の吸着量は特に制限されず、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質の形態（フィルム状、厚みを持つ膜状あるいは立体的なスポンジ状など）にも依存するが、使用するＧＡＧ高分子水溶液の濃度や量、洗浄の有無や程度等によって容易に調節できる。例えば、１〜１０００μｇ／１００μｌ程度の濃度のＧＡＧ高分子水溶液を用いた場合には、細胞接着性タンパク質フィルムの表面１ｃｍ２当たりに担持されるヘパリン等のＧＡＧ分子の量は、約１〜１００μｇ程度とすることができる。また、ＧＡＧ高分子水溶液の濃度を１０〜２００μｌ／１００μｌ程度とすれば、固定化されるＧＡＧ分子の量は、洗浄後に約５〜５０μｇ程度となる。
本発明のＧＡＧタンパク質複合体は、実質的に基材となる細胞接着性タンパク質の形状に基づく形態をとり、その表面あるいは立体的形状の多孔体などではその内部にもＧＡＧ高分子が担持された構造をなす。基材となる細胞接着性タンパク質は、その目的や用途に応じて如何なる形状としてもよい。例えば、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質のみからなる材料を適宜成形して基材とすることもでき、他の材料表面に細胞接着性タンパク質を保持させて基材とすることもできる。例えば、実質的にコラーゲンのみからなるコラーゲン膜やコラーゲンスポンジ等は前者の例であり、シャーレ、プレート、ビーズなどの器具表面をコラーゲン等の細胞接着性タンパク質で被覆したものは後者の例である。言い換えれば、平面的なコラーゲン被覆プレートから幾分の厚みを持ったコラーゲン膜、さらには立体的なコラーゲンスポンジを基材とし、その表面にＧＡＧ高分子を担持させることにより、二次元に近い構造から三次元構造まで変化させることが可能である。
かくして得られたＧＡＧタンパク質複合体は、そのまま様々な形状の細胞培養基材等として供することができる。よって本発明は、上記ＧＡＧタンパク質複合体を含んでなることを特徴とする細胞培養基材も提供する。このような細胞培養基材は、シャーレ、プレート、ビーズなどの器具表面に本発明のＧＡＧタンパク質複合体を配したものでもＧＡＧタンパク質複合体のみから構成されるものでもよい。これらの細胞培養基材表面には、高密度にＧＡＧ類が吸着固定化されている。従って、効率よく各種細胞成長因子又はサイトカインが接着、濃縮かつ保持されるとともに、組織特異性の高いコンドロイチン硫酸等の活性を強調することができる。
例えばヘパリン／ＨＳを含むＧＡＧ類は、繊維芽成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢＥＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、及びＩＬ−８）、インターフェロンγ、及びマクロファージ炎症タンパク質−１（ＭＩＰ−１）等を含む様々な成長因子及びサイトカインに結合することは良く知られている。従って、これらのヘパリン結合性成長因子やサイトカインは本発明のＧＡＧタンパク質複合体表面に有効に結合する。後述の実施例に記載するように、本発明のＧＡＧタンパク質複合体表面には、ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ１６５に加えて、ＦＧＦ−１、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＴＧＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−３がＨＣＰＳ結合コラーゲン表面に有効に濃縮固定化されることが観察された。即ち、本発明のＧＡＧタンパク質複合体は、ヘパリン結合性のものを含む種々の成長因子及びサイトカインを固定化及び保持するための優れた生体材料を提供する。
本発明のＧＡＧタンパク質複合体を細胞培養基材として使用する場合、上記の成長因子やサイトカインは、本発明のＧＡＧタンパク質複合体及び対象とする細胞を含む系に遊離した状態で存在させてもよいし、当該ＧＡＧタンパク質複合体上に固定化してもよい。本発明者らは、細胞接着性タンパク質であるコラーゲン又は本発明のＧＡＧタンパク質複合体と遊離の繊維芽細胞成長因子ＦＧＦ−２とが共存する系においては、ＧＡＧタンパク質複合体を用いた方がコラーゲンのみの基材を用いた場合に比較して、より低濃度の成長因子でヒト臍静脈内皮細胞等の細胞成長が促進されることを見出した。さらに、コラーゲンのみの基材にＦＧＦ−２等の成長因子を固定化した場合には、成長因子濃度を変化させても細胞増殖の促進効果に僅かな変化しか無いのに対し、本発明のＧＡＧタンパク質複合体に成長因子を固定化した場合は、細胞増殖が成長因子の濃度依存的に促進され、いずれの成長因子濃度でもコラーゲンのみの基材を用いた場合より優れていることも見出した。よって、本発明のＧＡＧタンパク質複合体の一態様では、当該複合体上に成長因子又はサイトカインが高密度で固定化されている。この態様のＧＡＧタンパク質複合体も、そのまま上記のような細胞培養基材として使用できることは言うまでもない。
成長因子やサイトカインの使用量は特に限定されないが、一般に、系に遊離した状態で存在せしめる場合には、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０５ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ程度とし、複合体に固定化する場合の濃度としては、少なくとも約０．０１ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ以上とする。複合体への固定化量は、使用する成長因子やサイトカインの濃度に依存して単純増加するが、固定化される飽和量は複合体の形状や表面積などによって簡単に増加させることができる。
さらに本発明者等は、本発明のＧＡＧタンパク質複合体が、驚くべきことに成長因子の不存在下でも細胞増殖や分化等を促進することを見出した。例えば、成長因子結合性のヘパリン／ＨＳに基づくＧＡＧタンパク質複合体にヘパリン結合性成長因子などが高度に濃縮され、繊維芽細胞や内皮細胞の増殖を促進するのは上述した通りであるが、成長因子を添加しない場合においても、細胞接着性タンパク質であるコラーゲンのみの基材上で培養した場合に比較して細胞増殖を有意に促進する。さらに、例えばコンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸に基づくＧＡＧ高分子を用いて軟骨細胞を培養した場合も、コラーゲンのみの場合よりも成長因子の無い系における軟骨細胞の増殖性が顕著に向上した。
即ち、種々の成長因子及びサイトカインと組み合わせたＧＡＧタンパク質複合体と同様に、成長因子やサイトカインを含まない本発明のＧＡＧタンパク質複合体は、細胞及び組織工学分野において、増殖及び分化などの細胞成長をコントロールする新規な生体材料として提供されるものである。
このような材料は必要に応じて如何なる形態とすることもできる。即ち、例えばスポンジ又はシート状のコラーゲン基材にＧＡＧ高分子を吸着させたＧＡＧタンパク質複合体は生体内に埋め込むのに適しており、生体内で人工的に再現されたＰＧ類似構造体を実現できる。このような構造体においては、ＧＡＧ結合性を有する成長因子が接着し、当該成長因子によって刺激される細胞増殖が促進される。例えば、ＦＧＦが高度に接着及び濃縮された環境においては、軟骨細胞等の分化・増殖が促進され、やがて軟骨組織等が再生される。よって本発明は、上記のＧＡＧタンパク質複合体からなる組織再生治療材も提供するものである。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
１．ヘパリン担持ポリスチレンの調製
ＧＡＧ高分子としてのヘパリン担持ポリスチレン（ＨＣＰＳ）を、Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｍ．，等，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，５０：１４４−１５２（２０００）に記載されているように調製した。簡潔に説明すると、ブタの腸からのヘパリン（２５ｇ）を、０．１ＭのＮａＩＯ４を含有する０．０５Ｍの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５）４００ｍｌに溶解させ、４℃で３日間撹拌した。次いで、未反応のＮａＩＯ４をグリセロール（２５ｍｌ）の添加により中和し、引き続いて反応混合物を透析して凍結乾燥させた。生成物（過ヨウ素酸酸化したヘパリン）をアルカリ溶液（ｐＨ１２）中、室温で３０分間分解させ、透析及び凍結乾燥の後、分解生成物を過ヨウ素酸酸化−アルカリ分解（ＩＯ４−ＬＭＷ）−ヘパリンとして回収した。
このＩＯ４−ＬＭＷ−ヘパリン（５００ｍｇ）及びＮ−ｐ−ビニルベンジルアミン（２５０ｍｇ）を５０ｍＭのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチル−エチレンジアミン（ｐＨ４．７５）２０ｍｌに溶解させ、その後１ｍｌの０．８ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、透析及び凍結乾燥して、白色粉末（ヘパリン担持モノスチレン）を得た。この粉末（１００ｍｇ）及び２ｍｇの過酸化硫酸カリウムを１ｍｌの蒸留水に溶解させて、乾燥Ｎ２下、６０℃で２４時間重合を行った。反応溶液を過剰量のエタノールに投入して、ポリマーを析出物として得た。水溶性の不純物は、析出物から限外濾過を用いて除去し、凍結乾燥の後にＨＣＰＳを白色粉末として得た。
２．コラーゲン被覆培養プレート及びコラーゲン膜へのＨＣＰＳの結合性
９６ウェル及び２４ウェルの懸濁培養プレート（住友ベークライト社製）を、各々５０及び２００μｌの酸性水（ｐＨ３）中０．０３重量％のＩ型コラーゲン（コウケン社製）で、４℃において終夜被覆した。残りのコラーゲン溶液を吸引によりウェルから除去し、プレートをリン酸塩バッファー（ＰＢＳ）で２回洗浄した。次いで各コラーゲン被覆プレートを、５０μｌ（９６ウェルプレート）及び２００μｌ（２４ウェルプレート）のＨＣＰＳ水溶液（例えば０．１重量％）で、４℃において終夜被覆した。続いて残りのＨＣＰＳ溶液を吸引によりウェルから除去し、プレートを、１重量％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＢＳＡ−ＰＢＳ）中の０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で２回、ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄した。コラーゲン被覆プレート上に固定化されたＨＣＰＳの量は、カルバゾールアッセイ（Ｂｉｔｔｅｒ  Ｔ．，等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４：３３０−３３４（１９６２））を用いて見積もった。
また、２４ウェル組織培養プレート中のコラーゲン膜（６４ｍｍ２、コウケン社製）も、同様に１００μｌのＨＣＰＳ水溶液（例えば０．１重量％）で、４℃において終夜被覆した。ＨＣＰＳ結合コラーゲン膜を、次いでＢＳＡ−ＰＢＳ中の０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で２回、ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄した。コラーゲン膜上に固定化されたＨＣＰＳの量は、カルバゾールアッセイを用いて見積もった。
上記の方法により、種々の濃度のＨＣＰＳ水溶液を用いてコラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜にＨＣＰＳを結合させたところ、ＨＣＰＳ濃度の上昇に伴ってコラーゲン上に結合するＨＣＰＳ量は増加し、やがて平衡に達した（図１）。コラーゲン上に結合したＨＣＰＳ量は、３７℃での３日間のインキュベーション後でも変化しなかった（データは示さず）。一方、対照としての（種々の型のコラーゲンとの相互作用が知られている）天然ヘパリン分子は、コラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜に結合したものの、結合したヘパリン量はＨＣＰＳより少なかった（図１）。さらに、結合したヘパリンの多くがＰＢＳ−ＢＳＡ中の０．５ＭのＮａＣｌ溶液でのリンスで脱離してしまった。
これらの結果は、ＨＣＰＳのコラーゲン表面への強力な結合性が、ヘパリン鎖のコラーゲンへの特異的結合のみではなく、ＨＣＰＳとコラーゲンとの間の立体構造上のマッチングなどにも依存することを示唆している。一般的に、ＨＣＰＳ結合コラーゲン膜を調製するのに１００μｇ／１００μｌのＨＣＰＳ水溶液を用いた場合、洗浄後にコラーゲン表面１ｃｍ２当たりに１０〜２０μｇのヘパリン分子が固定されると見積もられた。このようにして、本実施例のＧＡＧタンパク質複合体が形成された。
３．ＧＡＧタンパク質複合体への成長因子の担持
１００μｌのＢＳＡ−ＰＢＳ中の種々の濃度のＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ１６５を、上記で作成したＧＡＧタンパク質複合体（ＨＣＰＳ結合したコラーゲン被覆９６ウェルプレート及びコラーゲン膜）上に添加し、４℃で終夜インキュベートした。プレート及びコラーゲン膜をＢＳＡ−ＰＢＳで４回洗浄し、続いてＢＳＡ−ＰＢＳで１：５００に希釈した１００μの抗−ＦＧＦ−２又は抗−ＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加して、室温で１時間緩やかに振盪させて混合した。次いでプレート又はコラーゲン膜をＢＳＡ−ＰＢＳで４回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０００に希釈した１００μｌの抗−ＩｇＧ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）複合物を添加し、さらに１時間混合した。次に、プレート及びコラーゲン膜をＢＳＡ−ＰＢＳで４回洗浄し、１００μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ基質溶液（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．社製）を添加して室温で１時間混合することにより発色させた。各ウェルのＯＤを、イムノミニプレートリーダー（Ｎｕｎｃ  ＩｎｔｅｒＭｅｄ製）を用いて４１４ｎｍで読み取った。
ヘパリンと特異的結合性を有し、内皮及び繊維芽細胞の増殖を刺激する成長因子であるＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ１６５のＧＡＧタンパク質複合体への結合性について、上記に従って一般的なＥＬＩＳＡ法を用いて試験した。ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ１６５の両方とも、濃度依存的にＧＡＧタンパク質複合体上に固定化されることがわかった（図２）。固定化されたＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ１６５の量は、３７℃で３日間インキュベートした後でも変化しなかった。一方、これら２つの成長因子が、対照としてのコラーゲンのみ及び天然ヘパリンで処理したコラーゲンに結合する量は、ＧＡＧタンパク質複合体への結合量に比較して有意に少なかった。
４．細胞培養及び細胞接着アッセイ
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びヒト皮膚繊維芽細胞をＴａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。この実験に使用した細胞は、４〜８継代の間である。ＨＵＶＥＣを、１０％の不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｌ／ｍｌストレプトマイシン）及び１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＦＧＦ−２（ｈｒＦＧＦ−２、Ｒ＆Ｄシステムズ製）を添加した１９９培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｏｒｉｅｎｔａｌ）中で培養した。繊維芽細胞は、１０％の熱不活性化ＦＢＳ及び抗生物質（上記と同様）を添加したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｏｒｉｅｎｔａｌ）中で培養した。
細胞接着アッセイを行うに当たり、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で処理することにより細胞を培養ディッシュから遊離させ、各培地で細胞密度２５ｘ１０４細胞／ｍｌで懸濁させた。細胞懸濁液（プレートに対しては０．５ｍｌ、膜に対しては０．３ｍｌ）を複数のコラーゲン被覆２４ウェルプレート及びコラーゲン膜（ＧＡＧタンパク質複合体及び対照品）に添加し、所定時間インキュベートした。次いで、各被覆ウェル及びコラーゲン膜をＰＢＳで３回洗浄した。被覆ウェル及びコラーゲン膜に結合した細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で処理することにより遊離させた。遊離した細胞数をヘモサイトメーター（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｓｃｈ社製）で数えた。
前記細胞接着アッセイの結果を図３に示す。本発明のＧＡＧタンパク質複合体及びコラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜は、両方の細胞型で１及び３時間後において類似の接着挙動を示したが、未被覆のプレートはいずれの細胞型についても接着性が極めて低かった。一方、ＨＣＰＳ被覆したのみのプレートも、両方の細胞型に良好な接着性を示したが、コラーゲン基質よりは（ＨＣＰＳ固体化有無に関わらず）低かった。即ち、ＨＣＰＳは両方の細胞の接着を促進するものの、ＨＵＶＥＣ及び繊維芽細胞の初期的接着ではコラーゲン基質との相互作用が優先することが解った。
５．細胞増殖アッセイ
（１）遊離の成長因子を用いた場合
ＨＵＶＥＣ増殖アッセイにおいては、９６ウェル被覆プレート上に６，０００細胞／ウェルの初期密度、あるいは（２４ウェル培養プレートについて）１５，０００細胞／コラーゲン膜の密度で、所定濃度のＦＧＦ−２又はＶＥＧＦ１６５の何れかを含有せしめた１０％の非動化ＦＢＳと抗生物質を添加した１９９培地中の細胞を蒔き、３日間培養した。インキュベーションの後、使用した培地を除去し、１０μｌのＷＳＴ−１試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ、同仁化学研究所製）を含む新鮮培地を各ウェルに添加した。次いで、１時間のインキュベーションの後に、イムノミニプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおけるＯＤを読み取った。
繊維芽細胞増殖アッセイにおいては、９６ウェル被覆プレート上に３，０００細胞／ウェルの初期密度、あるいは７，０００細胞／コラーゲン膜で、所定濃度のＦＧＦ−２を含有せしめた１％の非動化ＦＢＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭ培地中の細胞を蒔いた。細胞を４日間培養し、インキュベーションの後に、各ウェル又は膜のＯＤを上記のように測定した。
培養培地中にＦＧＦ−２又はＶＥＧＦ１６５が存在する場合のＨＵＶＥＣ（各々、図４Ａ及びＢ）並びにＦＧＦ−２が存在する場合の繊維芽細胞（図６Ａ）の増殖を、各成長因子の濃度の関数として示した。本発明のＧＡＧタンパク質複合体以外に、対照としてコラーゲン被覆プレート、コラーゲン膜、及び未被覆（コラーゲン無し）プレート上にＨＣＰＳのみを被覆したものを試験した。その結果、ＨＣＰＳが存在することにより、まず、ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ１６５の不存在下でのＨＵＶＥＣ成長が幾分促進された（図４）。さらにＦＧＦ−２は、未被覆プレート以外の全ての基質において濃度依存的にＨＵＶＥＣ増殖を刺激するのに有効であることがわかった。特に、ＨＵＶＥＣ増殖は、ＧＡＧタンパク質複合体（プレート及び膜）において低濃度のＦＧＦ−２（０．１３、０．２５、０．５ｎｇ／ｍｌ）を用いても有意に刺激された。同様に、繊維芽細胞増殖も、ＧＡＧタンパク質複合体において刺激された（図６Ａ）。ＨＵＶＥＣ増殖の刺激に対してＶＥＧＦ１６５はＦＧＦ−２より効果は顕著ではないものの、ＶＥＧＦ１６５のマイトジェン活性に類似する刺激が低濃度において観察された。
（２）成長因子を固定化した場合
１９９培地中のＨＵＶＥＣを、ＦＧＦ−２又はＶＥＧＦを予め固定化したＧＡＧタンパク質複合体（プレート及び膜）に蒔いた。細胞を１９９培地中で成長因子無しに３日間培養し、上記のようにしてＯＤを測定した。さらに、ＤＭＥＭ中のヒト皮膚繊維芽細胞を、ＦＧＦ−２が固定化されたＧＡＧタンパク質複合体（プレート及び膜）に蒔いた。細胞をＤＭＥＭ中でＦＧＦ−２無しに４日間培養してＯＤを測定した。
ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ１６５の固定化は上述のように実施した。ＨＵＶＥＣを、ＦＧＦ−２（図５Ａ）又はＶＥＧＦ１６５（図５Ｂ）の何れかを固定化したＧＡＧタンパク質複合体（被覆プレート又は膜）上で、（成長因子を含まない）１９９培地中で培養した。ＨＵＶＥＣの増殖は、ＧＡＧタンパク質複合体（プレート及び膜）において、予め固定化したＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ１６５の濃度依存的に刺激されたが、（ＨＣＰＳを担持していない）コラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜におけるＨＵＶＥＣ増殖は、予め固定化した成長因子の濃度によって変化しなかった。同様に、繊維芽細胞の成長も、ＧＡＧタンパク質複合体において予め固定化したＦＧＦ−２の濃度依存的に促進された（図６Ｂ）。即ち、本発明のＧＡＧタンパク質複合体（ＨＣＰＳ結合コラーゲン基質）は、ヘパリン結合性成長因子を保持し内皮及び繊維芽細胞増殖を刺激する優れた基質を提供したといえる。
（実施例２）
実施例１と同様にしてＨＣＰＳを用いてＧＡＧタンパク質複合体を作成し、その上にＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＴＧＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−３という他の成長因子が有効に固定化されることを観察した。
（実施例３）
１．コンドロイチン硫酸担持ポリスチレン（ＰＶ−ＣｏＣ）の調製
ＧＡＧ高分子としてのコンドロイチン硫酸担持ポリスチレンは、ヘパリンをコンドロイチン硫酸Ｃに換えて実施例１と同様にして調製した。
２．軟骨細胞の接着アッセイ
軟骨細胞（ウサギ）について、実施例１の内皮細胞及び繊維芽細胞と同様の細胞接着アッセイを実施した。基材としては、未被覆プレート、ＰＶ−ＣｏＣ又はＨＣＰＳ又はコラーゲンのみを被覆したプレート、コラーゲン膜、及びコラーゲン被覆プレート又はコラーゲン膜にＨＣＰＳを固定化したＧＡＧタンパク質複合体を用いた。結果を図７に示す。図７に見られるように、軟骨細胞の場合、細胞接着性タンパク質であるコラーゲン（被覆プレート及び膜）上に最も良く接着し、ＰＶ−ＣｏＣを固定化したＧＡＧタンパク質複合体でも実施例１と同様にＨＣＰＳを固定化したコラーゲン基質と殆ど同様の接着性が見られた。しかしながら、コラーゲンを含まない基材では極めて低い接着性しか示さなかった。即ち、軟骨細胞の初期接着においても、ＰＶ−ＣｏＣもＨＣＰＳと同様にコラーゲンへの細胞の接着を阻害せずコラーゲンとの相互作用を優先することがわかった。
３．軟骨細胞の増殖アッセイ
基材としてハニカム構造のコラーゲンスポンジ（コウケン社製）を用い、その表面にＧＡＧ高分子であるＨＣＰＳ又はＰＶ−ＣｏＣを固定化したＧＡＧタンパク質複合体を作成した。これらのＧＡＧタンパク質複合体及びコラーゲンスポンジに成長因子ＦＧＦ−２又はＴＧＦ−β１を固定化し、そこにおける軟骨細胞の増殖アッセイを行った。ＨＣＰＳ被覆は上記の通り０．１％水溶液を用いて終夜実施し、ＰＶ−ＣｏＣ被覆もそれに準じた。次いで、得られたＧＡＧタンパク質複合体又はコラーゲンスポンジにＦＧＦ−２又はＴＧＦ−β１で終夜被覆し、０．５ＭのＮａＣｌ／ＰＢＳで１時間洗浄した。培地中の軟骨細胞懸濁物を添加して４日間インキュベートした後の軟骨細胞の増殖性を測定した。結果を下記の表１に示す。表１中、増殖性は、ＧＡＧ高分子を固定化しないコラーゲンスポンジ（対照）を用いた場合の増殖性を１とした場合の比率で示した。
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表１において注目すべき点は各成長因子を添加しない場合（添加量＝０）であり、このとき、コンドロイチン硫酸構造を持つＧＡＧ高分子に基づくＧＡＧタンパク質複合体では、コラーゲン単独の場合に比較して軟骨細胞の増殖性が約３割向上している。この値は、成長因子接着性のヘパリン／ＨＳ構造を持つＨＣＰＳの増殖促進効果よりも大きい。
また成長因子が存在する場合には、細胞の拡張を促進するＦＧＦの場合は軟骨細胞様の形態を維持しながらＦＧＦの濃度依存的に増殖が増大し、細胞分化やＥＣＭ合成を促進するＴＧＦの場合はＴＧＦの存在によって大型の細胞形態を維持しながら増殖性が若干低下しており、細胞の組織化が支障なく進行していると考えられる。また、対象のコラーゲンのみでは、線維芽細胞状の形態を維持した。
なお、低分子のヘパリン又はコンドロイチン硫酸を用いた場合には、それらは洗浄過程において殆ど洗い落とされてしまい、未被覆のコラーゲンスポンジの場合と同等の結果しか得られなかった。
【図面の簡単な説明】
図１は、コラーゲン被覆２４−ウェルプレート（Ａ）及びコラーゲン膜（Ｂ）へのＨＣＰＳ及び天然ヘパリンの結合性を示すグラフである。横軸に表示した濃度の水溶液を用いて４℃で終夜被覆した。次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄した後に結合しているＨＣＰＳ（○）及びヘパリン（●）の量、及び０．５ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ−ＢＳＡで同様に洗浄した後に結合しているＨＣＳＰ（△）及びヘパリン（▲）の量を示す。図中のデータは、３回の実験の平均±ＳＤで表した。
図２は、ＨＣＰＳ有無のコラーゲン被覆プレート（Ａ）及びコラーゲン膜（Ｂ）への成長因子（ＶＥＧＦ１６５及びＦＧＦ−２）の固定化を示すグラフである。横軸に示した濃度の成長因子水溶液１００ｍｌを各基材に添加した。ＨＣＰＳ担持コラーゲン被覆プレート又はコラーゲン膜へのＶＥＧＦ１６５（○）及びＦＧＦ−２（●）、天然ヘパリン処理したコラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜へのＶＥＧＦ１６５（△）及びＦＧＦ−２（▲）、並びにコラーゲン被覆プレート及びコラーゲン膜へのＶＥＧＦ１６５（□）及びＦＧＦ−２（■）の固定化について比較して示す。図中のデータは、３回の実験の平均±ＳＤで表した。
図３は、ＨＣＰＳ有無のコラーゲン被覆プレート（Ａ）及びコラーゲン膜（Ｂ）へのＨＵＶＥＣ及び繊維芽細胞の接着性を示すグラフである。対照としてＨＣＰＳのみを被覆したプレート及び未被覆プレートについても示した（Ａ）。３７℃で１時間（黒棒）及び３時間（白棒）のインキュベーションをした後の値である。図中のデータは、３回の実験の平均±ＳＤで表した。
図４は、遊離したＦＧＦ−２（Ａ）又はＶＥＧＦ１６５（Ｂ）が存在する系でのＨＵＶＥＣ細胞増殖に対するＨＣＰＳ担持の影響を示すグラフである。ＨＵＶＥＣは、ＨＣＰＳ担持コラーゲン被覆プレート（●）、コラーゲン被覆プレート（○）、ＨＣＰＳ担持コラーゲン膜（▲）、コラーゲン膜（△）、ＨＣＰＳのみ被覆したプレート（■）及び未被覆プレート（□）に蒔いた。培地には、横軸に表示した濃度のＦＧＦ−２（Ａ）又はＶＥＧＦ１６５（Ｂ）を含有せしめて３日間培養した。図中のデータは、３回の実験の平均±ＳＤで表した。
図５は、ＦＧＦ−２（Ａ）又はＶＥＧＦ１６５（Ｂ）を固定化した系でのＨＵＶＥＣ細胞増殖に対するＨＣＰＳ担持の影響を示すグラフである。ＨＣＰＳ担持コラーゲン被覆プレート（●）、コラーゲン被覆プレート（○）、ＨＣＰＳ担持コラーゲン膜（▲）、コラーゲン膜（△）、ＨＣＰＳのみ被覆したプレート（■）及び未被覆プレート（□）を横軸に表示した濃度のＦＧＦ−２（Ａ）又はＶＥＧＦ１６５（Ｂ）で処理して固定化し、成長因子を含有しない培地中のＨＵＶＥＣを３日間培養した。図中のデータは、３回の実験の平均±ＳＤで表した。
図６は、遊離した（Ａ）又は固定化したＦＧＦ−２が存在する系での繊維芽細胞増殖に対するＨＣＰＳ担持の影響を示すグラフである。繊維芽細胞は、ＨＣＰＳ担持コラーゲン被覆プレート（●）、コラーゲン被覆プレート（○）、ＨＣＰＳ担持コラーゲン膜（▲）、コラーゲン膜（△）、ＨＣＰＳのみ被覆したプレート（■）及び未被覆プレート（□）に表示した濃度のＦＧＦ−２を含有する培地中で（Ａ）、又は上記プレートを表示した濃度のＦＧＦ−２で処理して固定化した後に成長因子を含まない培地中で４日間培養した。図中のデータは、３回の実験の平均±ＳＤで表した。
図７は、ＧＡＧ高分子（ＨＣＰＳ又はＰＶ−ＣｏＣ）有無のコラーゲン被覆プレート又はコラーゲン膜への軟骨細胞の接着性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年2月27日(2003.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ビニル系高分子主鎖にグリコサミノグリカン基本骨格の少なくとも一部に相当する構造を含む糖鎖を導入したグリコサミノグリカン機能化高分子を細胞接着性タンパク質に担持せしめてなることを特徴とするグリコサミノグリカン機能化高分子タンパク質複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前記細胞接着性タンパク質がコラーゲンであることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【国際調査報告】
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