(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩類溶液と、変性液体ゼラチンと、ヒト血清アルブミンを含有する生物材料の凍結用培地。
【請求項２】
塩類溶液が血漿に対する等張塩類溶液であることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
塩類溶液が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及び乳酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求項２に記載の培地。
【請求項４】
塩類溶液が塩化ナトリウム２〜５ｇ／ｌ、塩化カリウム０．０５〜０．５ｇ／ｌ、塩化マグネシウム０．０５〜０．２ｇ／ｌ及び乳酸ナトリウム０．５〜４ｇ／ｌを含むことを特徴とする請求項３に記載の培地。
【請求項５】
塩類溶液が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求項２に記載の培地。
【請求項６】
塩類溶液が乳酸リンゲル液であることを特徴とする請求項５に記載の培地。
【請求項７】
変性液体ゼラチンが医薬的用途に適合可能な化学的に変性されたコラーゲンの水解物であることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項８】
変性液体ゼラチンが１０ｋＤ〜１００ｋＤ、好ましくは１５ｋＤ〜４０ｋＤの平均分子量をもつことを特徴とする請求項７に記載の培地。
【請求項９】
水解物が無水コハク酸、無水シトラコン酸、無水イタコン酸、無水アコニット酸又は無水マレイン酸との反応により変性されることを特徴とする請求項８に記載の培地。
【請求項１０】
変性液体ゼラチン３０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５．３８２ｇ／ｌ、塩化マグネシウム０．１４３ｇ／ｌ、塩化カリウム０．３７３ｇ／ｌ、乳酸ナトリウム３．３６０ｇ／ｌ及び全量が１０００ｍｌになるまでの注射製剤用水から構成される溶液とヒト血清アルブミンを含む生物材料の凍結用培地。
【請求項１１】
ヒト血清アルブミンが血漿に由来することを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１２】
ヒト血清アルブミン／ゼラチン重量比が０．５〜１００であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１３】
ヒト血清アルブミン／ゼラチン重量比が０．７４〜６０であることを特徴とする請求項１２に記載の培地。
【請求項１４】
ヒト血清アルブミン／ゼラチン重量比が０．７４、１．６６、３．３、６．６６、１３．４、２６．６６又は６０であることを特徴とする請求項１２に記載の培地。
【請求項１５】
好ましくはグリシン、グリセロール、サッカロース又はグルコースから選択される生体適合性細胞安定剤０．５〜５重量％を更に含むことを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１６】
遺伝子改変細胞集団と請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地を含む組成物。
【請求項１７】
血球集団と請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地を含む組成物。
【請求項１８】
血小板と請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地を含む組成物。
【請求項１９】
骨髄細胞集団と請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地を含む組成物。
【請求項２０】
ウイルス粒子と請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地を含む組成物。
【請求項２１】
ウイルス粒子が欠損組換えウイルス粒子であることを特徴とする請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ウイルス粒子産生細胞集団と請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地を含む組成物。
【請求項２３】
生物に注入できることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２４】
生物材料の投与に使用可能な組成物であって、前記生物材料と、変性液体ゼラチン３０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５．３８２ｇ／ｌ、塩化マグネシウム０．１４３ｇ／ｌ、塩化カリウム０．３７３ｇ／ｌ、乳酸ナトリウム３．３６０ｇ／ｌ及び全量が１０００ｍｌになるまでの注射製剤用水から構成される溶液と、ヒト血清アルブミンを含む前記組成物。
【請求項２５】
生物材料の貯蔵方法であって、前記生物材料を請求項１に記載の培地の存在下に置くことを特徴とする前記方法。
【請求項２６】
前記生物材料を変性液体ゼラチン３０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５．３８２ｇ／ｌ、塩化マグネシウム０．１４３ｇ／ｌ、塩化カリウム０．３７３ｇ／ｌ、乳酸ナトリウム３．３６０ｇ／ｌ及び全量が１０００ｍｌになるまでの注射製剤用水から構成される溶液とヒト血清アルブミンの存在下に置くことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
接触により生成した組成物を凍結することを特徴とする請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
凍結及び解凍後の生存可能な細胞の百分率が５０％以上であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
凍結及び解凍後の生存可能な細胞の百分率が６０％以上であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
凍結及び解凍後の生存可能な細胞の百分率が７０％以上であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は動物細胞やウイルス粒子等の生物材料の保存及び凍結保存用培地として、生物に直接注入可能又は再注入可能な培地に関する。本発明はより詳細には、塩類溶液と、変性液体ゼラチンと、ヒト血清アルブミンを含有する生物材料の保存用培地に関する。
細胞治療又は遺伝子治療と輸血又は骨髄移植に伴う主要な問題の１つは生物材料の保存の問題である。実際に、工業的規模の製造及び貯蔵に適合可能であり、所定の試験を実施できるように十分長期間にわたって生物材料を良好な生存可能条件下で保存することが重要である。最も一般に使用されている保存方法は材料の凍結である。しかし、例えば細胞の凍結時に細胞は特に外方浸透現象と細胞の内部の氷の形成により非常に大きなストレスを受ける。これらの現象は凍結時だけでなく解凍時にも多数の細胞溶解を引き起こす。細胞が溶解しなくても、その分裂又は分化能が不可逆的に変化している場合もある。生体に注入すべき細胞（例えば輸血、骨髄移植又は細胞治療）については解凍後に高い生存率を獲得できることが極めて重要であり、実際に死滅又は損傷細胞を再注入するのは無益である。再培養すべき細胞の場合も全く同様に生存率は高いことが重要である。現在まで、細胞溶解を阻止する凍結保護剤が培地に添加されていた。最もよく使用され、最良の結果を与えている保護剤は、注入不能な保存剤であるジメチルスルホキシド即ちＤＭＳＯである。ＤＭＳＯは細胞膜に浸透し、細胞膜を安定化することができる。ＤＭＳＯはこうして細胞の破壊を防ぐ。このような系は多数の分裂可能な生存細胞及び生存可能細胞を解凍時にもつことができる。しかし、この方法はこれらの細胞を生物に導入又は再導入すべき場合に重大な問題がある。実際に、ＤＭＳＯは周囲温度では細胞に毒性の物質である。ＤＭＳＯは膜に浸透して細胞死をもたらす。従って、改変細胞の自己移植片の場合には細胞を再移植する前、例えば骨髄細胞等の異種移植片の場合には移植前、あるいは血球の場合には輸血を実施する前にＤＭＳＯを除去しなければならない。ＤＭＳＯの除去は解凍後に一般にＤＭＳＯを含まない培地１０容量でサンプルを希釈後、遠心分離して上清を除去することにより実施される。この操作はＤＭＳＯがほぼ完全に除去されるまで数回繰り返される。この処理は時間を浪費し、操作を繰り返すことにより、外部病原物質による汚染と前記生物材料の損失の危険が増す。
ＤＭＳＯの存在下では、解凍後の生存細胞百分率は追って定義するような最適凍結／解凍条件下で７０％を上回る。ＤＭＳＯの不在下ではこの百分率は２０％を下回る。現在までＤＭＳＯの存在下の凍結は最も有効な方法であり、従って、最もよく使用されていた。
本願出願人は高い生存細胞百分率を維持しながら解凍後の操作を不要にできる新規種の培地に注目した。このために、本願出願人はＤＭＳＯ又は他の細胞毒性凍結保存剤を使用せずに解凍時に高い生存率を得ることが可能な凍結／保存培地を開発した。このような培地の利点は、他の操作を必要とせずに解凍直後に溶液を注入できることに起因する。従って、手術室で直後解凍できるようになり、解凍から使用までの時間が短縮し、常に無菌培地に維持できるため、外部汚染の危険を最小限にできる。
本発明の第１の目的は、塩類溶液と、変性液体ゼラチンと、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する生物材料の保存及び／又は凍結用培地に関する。
上述のように、この培地は毒性物質を全く含まず、生物に直接投与することができる。この培地はウイルス、細胞、血小板等の種々の生物材料を場合により凍結形態で保存するために使用することができる。
本発明の培地の組成に含まれる第１の成分は塩類溶液である。塩類溶液はより詳細には血漿に対する等張液である。この溶液の組成に含まれる塩類は種々のものであり得る。溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び／又は塩化マグネシウム等の塩化物と、例えば乳酸ナトリウム等の乳酸塩を含有するものが有利である。より特定的には、等張塩類溶液は一般に塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム及び乳酸ナトリウムを含有する。別の態様によると、塩化マグネシウムを塩化カルシウムに置き換える。この場合には、塩類溶液の塩類濃度は「乳酸リンゲル」液と等価又はほぼ等価である。このような溶液は、例えば脱水や生理的液体の損失を補償するために潅流で一般に使用されている。
本発明の特定態様によると、塩類溶液は主にＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＫＣｌ及び乳酸塩から構成され、培地中の夫々の最終濃度は下表１に示す通りである。
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ゼラチンは本発明の培地の組成に含まれる第２の成分である。ゼラチンは古典的ペプチド結合を与えるように隣接アミノ基及びカルボニル基により結合した種々のアミノ酸から構成されるタンパク質である。ゼラチンの分子量は特徴的で高く（平均分子量値は約１０，０００〜１００，０００である）、所与のゼラチン種又は品質でかなり不均一である。ゼラチンは白色結合組織中のポリペプチド残基の長鎖の加水分解の結果として不斉又は棒状型分子から構成される。実験の結果、これらの鎖の反応部位の所々でコラーゲンの一次加水分解が生じ、理想的な非分解類縁ゼラチン分子を生成することが判明した。これは二次加水分解で理想的ゼラチン分子の低反応性結合上に不揃いな間隔で可変程度まで続く。これは、分解反応が特定ゼラチンサンプルの無作為不均一分子式に如何に関与しているかを説明するものである。また、ゼラチンを構成する各タンパク質は規定等電点をもち、この等電点において電離、従って物理的及び化学的反応性は最小である。これらの性質は特に溶解度、粘度及びコロイド浸透圧である。従って、ゼラチン分子の不斉性は本発明の培地用に調製されるゼラチン溶液に不均一分子式と共にゲル形成及び粘度の固有性質を与える。
所謂ゼラチン（発熱及び抗原物質を除去した滅菌ゼラチン）は血漿代用品として既に使用されているが、周囲温度でゲル化するため、特にその保存に関して多くの問題があった。そこで、ゼラチンから誘導され、特にこれらの欠点を解決することが可能なる他の化合物（変性液体ゼラチンと総称する）に着目した。
変性液体ゼラチンとしては、例えばゼラチンをグリオキサールと重合し、Ｈ2Ｏ2で酸化することにより得られるオキシポリゼラチンを挙げることができる。他の変性液体ゼラチンは、仏国特許第１２９１５０２号に記載されているように、（好ましくは約１５，０００〜３６，０００の分子量範囲をもつ）ゼラチンを無水コハク酸、無水シトラコン酸、無水イタコン酸、無水アコニット酸、無水マレイン酸、塩化スクシニル又は塩化フマリルと反応させることにより得られる。これらの全ゼラチン誘導体は医薬的用途に適合可能であり、等張塩類溶液で直接血流に導入することができる。変性液体ゼラチンは米国特許第２，５２５，７５３号、２，８２７，４１９号及び３，１０８，９９５号にも記載されている。
より一般には、本発明による変性液体ゼラチンは医薬的用途に適合可能な化学的に変性されたコラーゲン水解物から構成される。好ましくは平均分子量１０ｋＤ〜１００ｋＤ、より好ましくは１５ｋＤ〜４０ｋＤをもつ物質である。例えば仏国特許第１，２９１，５０２号の教示に従い、所望用途に適した流動性をもつ最終生成物を得るように酸無水物を反応させることにより変性することが好ましい。酸無水物は、無水コハク酸、無水シトラコン酸、無水イタコン酸、無水アコニット酸又は無水マレイン酸が好ましい。特に有利な変性液体ゼラチンは無水コハク酸との反応により変性した平均分子量１５ｋＤ〜４０ｋＤのコラーゲン水解物から構成される。本発明による変性液体ゼラチンは、特に上記特許に記載されている当業者の技術により製造することができる。
本発明の培地の組成に含まれる第３の成分はヒト血清アルブミンである。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は５８５アミノ酸からなる分子量６６ｋＤの非グリコシル化モノマータンパク質である。その球状構造は９個の二重螺旋の連続系を生成する１７個のジスルフィド架橋により維持される（Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｒ．，“Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ”，Ｒｏｓｅｎｏｅｒ，Ｖ．Ｍ．ら（編）Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９７７）２７−５１）。ＨＳＡをコードする遺伝子は高度に多形性であることが知られており、種々の条件下の電気泳動分析により３０種を越える明白に異なる遺伝変異体が同定されている（Ｗｅｉｔｋａｍｐ，Ｌ．Ｒ．ら，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３７（１９７３）２１９−２２６）。ＨＳＡの遺伝子は１４個のイントロン配列により１５個のエキソンに分割され、推定「キャッピング」部位から第１のポリ（Ａ）付加部位までの１６９６１ヌクレオチドを含む。
ヒトアルブミンは肝細胞で合成された後、血流中に分泌される。この合成はまず最初に、生成されたポリペプチドを分泌経路に導く１８アミノ酸のシグナル配列を含む前駆物質であるプレプロＨＳＡを生じる。
ＨＳＡは血液に最も豊富なタンパク質であり、血清１リットル当たり約４０ｇの濃度で存在する。従って、人体には常に約１６０ｇのアルブミンが循環している。ＨＳＡの最も重要な役割は血流の正常な浸透圧を維持することである。ＨＳＡは更に種々の物質に対して顕著な結合能があり、疎水性分子（例えばステロイドや胆汁酸塩）の内在輸送と種々の治療物質の輸送に役割を果たし、こうして夫々の作用部位にこれらの治療物質を輸送することができる。更に、ＨＳＡは最近ではプロスタグラジンの異化作用に関係付けられている。
本発明の範囲で使用されるＨＳＡは天然起源（精製ＨＳＡ）でも組換え起源（ｒＨＳＡ）でもよい。
この点では、天然ＨＳＡは一般にヒト起源の生物材料から精製することにより製造される。特に、献血からの血漿の慣用分画技術（Ｃｏｈｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８（１９４６）４５９頁）又はＪ．Ｌｉａｕｔａｕｄらにより記載されている技術（第１３回国際ＩＡＢＳ会議、ブダペスト；Ａ：“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ”，Ｋａｒｇｅｒ（編），Ｂａｌｅ，２７（１９７３）１０７頁）によるヒト胎盤からの抽出により得られる。本発明の範囲で使用する精製アルブミンは血漿アルブミンが好ましい。具体的には、市販血漿アルブミン溶液を使用することができる。
遺伝子工学と新規抽出及び精製技術の発達は、高純度の改良物質をウイルス汚染（例えばＢ型肝炎及びＡＩＤＳ）の危険なしに最良の安定性で廉価に得る可能性を開いた。ＨＳＡの市場の重要性に鑑み、組換え経路によりこのタンパク質を製造する可能性が広く研究された。こうして、組換えＨＳＡの製造用として多数の発現系が研究された。
より詳細に説明すると、細菌宿主については初期の遺伝子工学実験では宿主生物として大腸菌が使用された。例えばヨーロッパ特許第２３６２１０号、２００５９０号、１９８７４５号又は１９２９号は種々の発現ベクター、種々の転写プロモーター及び種々の分泌シグナルを使用することにより大腸菌でＨＳＡを製造する方法を記載している。その後、枯草菌におけるＨＳＡの分泌に関する研究も行われた（Ｓａｕｎｄｅｒｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（１９８７）２９１７）。真核宿主については、宿主生物として酵母を使用することによりＨＳＡの製造方法が開発された。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでケラチンのプロモーターの制御下のＨＳＡの産生を立証することができた（Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４（１９８６）７２６）。ＨＳＡの産生は発酵後方法を使用することによりビールの製造時にビール酵母でも言及されている（ＥＰ２０１２３９）。より最近では、ヨーロッパ特許出願第３６１９９１号がプラスミドｐＫＤ１から誘導されるベクターで形質転換したＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母を宿主生物として使用した特に高性能のシステムを記載している。このシステムによると、培地に分泌される特に高レベルのＨＳＡを得ることができた。更に、組換えＨＳＡの製造はＰｉｃｈｉａｐａｓｓｔｏｒｉｓでも報告されている（ＥＰ３４４４５９）。更に、ＨＳＡの精製も多数の研究の対象になっている（ＥＰ３１９０６７）。
所定の品質基準（均一性、純度、安定性）を満たす組換え又は天然ＨＳＡを使用すると有利である。例えば薬局方は血漿アルブミン溶液について所定数のパラメーター即ちｐＨ値、タンパク質濃度、ポリマー及び凝集物濃度、アルカリホスファターゼ濃度並びに所定のタンパク質組成を定めている。更に、所定の吸光度、無菌性試験、発熱及び毒性試験適格も定めている（“Ａｌｂｕｍｉｎｉ  ｈｕｍａｎｉ  ｓｏｌｕｔｉｏ”ヨーロッパ薬局方（１９８４）２５５参照）。必ずしも必須ではないが、これらの基準に合致するアルブミンを使用することが特に好ましい。
本発明による組成物は精製ヒト血漿アルブミン又は好ましくは真核宿主で製造された組換えヒトアルブミンを含むものが有利である。更に、ＨＳＡなる用語は本発明の意味ではこのタンパク質の多形性に起因するヒトアルブミンの全天然変異体を含む。ＨＳＡの等価物即ちＨＳＡの性質を維持する任意のＨＳＡ誘導体を使用することも可能である。これらの誘導体は特にＨＳＡのＮ末端フラグメントであり得る。
本発明による培地は種々の方法で製造することができる。各成分を同時に混合した後、混合物に生物材料を加えてもよい。１又は２種の成分を生物材料を混合した後、これらの１又は２種の成分を加えてもよい。３種の成分を含む培地を調製後、これに生物材料を加えるのが好ましい。培地の調製及び生物材料の添加は無菌条件下で実施される。特定態様によると、変性液体ゼラチンを塩類溶液に加えた後、ＨＳＡを培地に加える。この点で好ましい１態様は血漿の代用品であるプラスミオン（ＦＲ２０４２３８１）と同一組成をもつ特定混合物を使用し、これに後でＨＳＡを加える。プラスミオンは塩類溶液と変性液体ゼラチンから構成される市販溶液である。その組成は以下の通りである。
−変性液体ゼラチン    ３０ｇ／ｌ
−塩化ナトリウム      ５．３８２ｇ／ｌ
−塩化マグネシウム    ０．１４３ｇ／ｌ
−塩化カリウム        ０．３７３ｇ／ｌ
−乳酸ナトリウム      ３．３６０ｇ／ｌ
−注射製剤用水        全量が１０００ｍｌになるまで。
プラスミオンは循環血液容量の回復における血管充填溶質として、あるいは血液粘度の低下による血液希釈及び微小循環の改善、更にはイオン平衡の回復とアシドーシスの予防に一般に使用されている。本発明の好ましい目的は、塩類溶液と変性液体ゼラチンの混合物の代わりにプラスミオンを使用した生物材料の保存及び／又は凍結用培地に関する。このような培地はプラスミオンとヒト血清アルブミンを含む。
本発明による培地の成分の夫々の割合は該当生物材料に応じて当業者により変更できる。実施例に示すように、所定の濃度範囲が好ましいが、割合を変えてもよい。この点では、好ましい塩濃度範囲は上記表１に示した通りである。ゼラチンと血清アルブミンについては、アルブミン／ゼラチン重量比を０．５〜１００とするのが好ましい。この比はより好ましくは０．５〜６０、特に好ましくは３〜１５である。具体的には、０．７４、１．６６、３．３、６．６６、１３．４、２６．６６及び６０の比を挙げることができる。これらの種々の比は市販プラスミオン溶液１０〜９０容量％と、２０％ヒト血清アルブミン９０〜１０容量％を含む本発明の培地に対応する。下表２に種々の組成を例示する。
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一般に、本発明による培地はプラスミオンと２０％ヒト血清アルブミン溶液を夫々１０〜９０容量％含有する。特定態様は、プラスミオンと２０％ヒト血清アルブミン溶液を夫々２０〜８０容量％、より好ましくはプラスミオンと２０％ヒト血清アルブミン溶液を夫々３３〜６７容量％含有する培地である。本発明の別の特定態様は５０／５０ｖ／ｖ比のプラスミオンと２０％ヒト血清アルブミン溶液の混合物からなる。ＨＳＡ／ゼラチン重量比は２〜７が有利である。約３の比で特に優れた結果が得られた。
更に、本発明による培地に補助成分を加えてもよい。特に、例えばグリセロール群の化合物（グリシン、グリセロール、サッカロース、グルコース等）等の生体適合性細胞安定剤を加えることができる。これらの化合物は５重量％未満の量で本発明の培地中に存在する。好ましくは、本発明による培地は０．５〜５重量％のグリシン又はグリセロールを含む。
本発明による培地は生物材料の貯蔵、保存及び凍結に使用される。生物材料とは一般に、自己増殖可能又は生物系で増殖可能な遺伝情報を含む任意材料を意味する。前記生物材料はより詳細には細胞又はウイルス粒子あるいはその両者から構成され得る。凍結可能な細胞としては、例えば血球、骨髄細胞、ウイルス粒子産生細胞（「パッケージング」系）又は遺伝子改変細胞を挙げることができる。
本発明に特に関連するウイルス粒子は遺伝子治療で利用可能なものである。多数のウイルスのゲノムを改変し、感染能を維持しながら増殖能を失うようにしたり、感染細胞で発現される着目治療核酸配列をゲノムに挿入するようにできる。これらのウイルスとしては、特にアデノウイルス、ＡＡＶ、レトロウイルス、ヘルペスウイルス等を挙げることができる。
最もよく使用されているウイルスはアデノウイルスである。構造と性質が少しずつ異なる種々の血清型のアデノウイルスが特性決定されている。これらの血清型のうち、遺伝子治療の範囲では２もしくは５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）又は動物起源のアデノウイルス（国際出願公開第ＷＯ９４／２６９１４号参照）を使用するのが好ましい。使用可能な動物起源のアデノウイルスのうちでは、イヌ、ウシ、マウス（例えばＭａｖ１，Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（１９９０）８１）、ヤギ、ブタ、トリ又はサル（例えばＳＡＶ）起源のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）］である。ヒトもしくはイヌ起源のアデノウイルス又は混合アデノウイルスを使用するのが好ましい。
欠損アデノウイルスはＩＴＲとパッケージングを可能にする配列と着目核酸を含む。これらのアデノウイルスのゲノムにおいて、少なくともＥ１領域は非機能的である。該当ウイルス遺伝子は当業者の公知の任意の方法、特に完全抑圧、置換、部分欠失、又は該当遺伝子に１個以上の塩基を付加することにより非機能的にすることができる。このような修飾は、例えば遺伝子工学技術又は突然変異誘発物質で処理することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ（単離したＤＮＡで）又はｉｎ  ｓｉｔｕで得られる。特にＥ３（ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）及びＬ５（ＷＯ９５／０２６９７）等の他の領域も修飾してもよい。アデノウイルスはＥ１領域に欠失を含んでいてもよく、このレベルにＥ４領域と着目治療核酸を挿入する（ＦＲ９４  １３３５５参照）。
欠損組換えアデノウイルスは当業者に公知の任意の技術により作製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ  １０１（１９９１）１９５，ヨーロッパ特許第１８５５７３号；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ  Ｊ．３（１９８４）２９１７）。特に、アデノウイルスと特に着目ＤＮＡ配列をもつプラスミド相同組換えにより作製することができる。相同組換えは適当な細胞系に前記アデノウイルスとプラスミドを同時トランスフェクション後に生じる。使用する細胞系は、好ましくは（ｉ）前記要素により形質転換可能であり、（ｉｉ）組換えの危険を避けるために好ましくは組込み形態で欠損アデノウイルスのゲノムの部分を相補することが可能な配列を含んでいるべきである。
その後、増殖したアデノウイルスを一般には塩化セシウム勾配上で慣用分子生物学技術により回収精製する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小寸法のＤＮＡをもつウイルスであり、これに感染する細胞のゲノムに安定且つ部位特異的に組込まれる。アデノ随伴ウイルスは細胞増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染することができる。また、ヒトで疾病に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムはクローニングされ、配列及び特性を決定されている。前記ゲノムは約４７００塩基を含み、ウイルスの複製起点として機能する約１４５塩基の逆方向反復領域（ＩＴＲ）を各末端に含む。ゲノムの残余はパッケージング機能をもつ２つの主領域に分けられ、ゲノムの左側部分はウイルス複製のウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。
ＡＡＶから誘導されるベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ遺伝子導入に利用することは文献に記載されている（特に国際出願公開第ＷＯ９１／１８０８８号、ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、５，１３９，９４１号、ヨーロッパ特許第４８８５２８号参照）。これらの文献は、ＡＡＶから誘導され、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を欠失し、着目遺伝子で置換された種々の構築物と、前記着目遺伝子を（培養細胞に）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は（生物に直接）ｉｎ  ｖｉｖｏ導入するためのその使用について記載している。欠損組換えＡＡＶは、ヒト補助ウイルス（例えばアデノウイルス）に感染させた細胞系に、ＡＡＶの２つの逆方向反復領域（ＩＴＲ）で挟まれた着目核酸配列を含むプラスミドと、ＡＡＶのパッケージング遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をもつプラスミドを同時トランスフェクトすることにより作製することができる。使用可能な細胞系は例えば２９３系である。生成した組換えＡＡＶをその後、慣用技術により精製する。
ヘルペスウイルスとレトロウイルスに関しては、組換えベクターの構築について文献に広く記載されており、特にＢｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３（１９９１）２０３；ヨーロッパ特許第４５３２４２号及び１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３（１９８５）６８９等を参照されたい。特に、レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感染する組込みウイルスである。従って、癌に適用するのに有利なベクターである。レトロウイルスのゲノムは主に２つのＬＴＲと、パッケージング配列と、３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。レトロウイルスから誘導される組換えベクターは、一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を完全又は部分的に欠失しており、着目異種核酸配列で置換されている。これらのベクターは種々の型のレトロウイルスから作製することができ、特にＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」、別称ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）又はフレンドウイルス等のレトロウイルスが挙げられる。
着目治療核酸を含む欠損組換えレトロウイルスを構築するためには、特にＬＴＲとパッケージング配列と前記核酸を含むプラスミドを構築した後、このプラスミドを使用して、欠損レトロウイルス機能をプラスミドにトランス導入することが可能なパッケージング系と呼ばれる細胞系にトランスフェクトする。従って、一般にパッケージング系はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現させることができる（下記参照）。
本発明による培地では、一般に組換え体であり（着目核酸を含む）且つ欠損性の（自律複製できない）ウイルス粒子を保存することができる。一般に、ウイルス粒子（アデノ、ＡＡＶ、レトロ等）は精製形態で使用した後、本発明による培地で好ましくは凍結形態で保存するためにパッケージする。一般に、無菌容器で本発明による培地１ｍｌ当たりウイルス粒子１０4〜１０14個をパッケージすることができる。好ましくは培地１ｍｌ当たりウイルス１０5〜１０10個、より好ましくは１０8又は１０9個を使用する。
上述したパッケージング系と呼ぶ細胞系はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（移植後）で欠損組換えウイルスの製造に使用される細胞系である。アデノウイルス製造用系の例としては、特にアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）をそのゲノムに組込んだヒト胎児腎細胞２９３系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）や、特に国際出願公開第ＷＯ９４／２６９１４号及びＷＯ９５／０２６９７号に記載されているようなＥ１及びＥ４基を相補することが可能な系を挙げることができる。レトロウイルス又はヘルペスウイルスの製造について記載されているパッケージング細胞系、特にＰＡ３１７系（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ９０／０２８０６）及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９／０７１５０）又はＭ１１系（ＷＯ９４／１３８２４）等の組換えレトロウイルス産生誘導系も挙げることができる。実施例に記載するように、本発明の培地はウイルス粒子産生細胞の保存に特に適している。
本発明による培地で有利に保存できる別種の生物材料は遺伝子改変細胞から構成される。遺伝子改変細胞は特に遺伝子治療用の細胞であり、着目核酸配列が導入されている。数年来、これらの細胞の数は絶えず増加しており、例えば造血細胞系（ＷＯ８８／０８４５０、ＷＯ９３／２０１９５、ＷＯ９３／０９８１５、ＷＯ９３／１１２３０）、上皮細胞（ＷＯ８９／０５３４５、ＷＯ９０／０６７５７、ＷＯ９２／０９２２２）、筋芽細胞（ＷＯ９３／０３７６８、ＷＯ９３／２４１５１、ＷＯ９４／０１１２９）、繊維芽細胞（米国特許第５，２１９，７４０号、ＷＯ８９／０２４６８、ＷＯ９３／０７９０６）、肝細胞（ＷＯ８９／０７１３６、ＷＯ９２／１２２４２、ＷＯ９３／０３１４２）、星状細胞（ＷＯ９４／０１１３５）、神経芽細胞（ＷＯ９４／１０２９２、ＷＯ９４／１６０５９）、ケラチノサイト（ＷＯ９４／１１０１１）、マクロファージ（ＦＲ９３／１０２２２）を挙げることができる。これらの細胞は一般に着目治療物質を産生する能力をもち、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植することができる。血球のうちては、例えば赤血球、好中性、好塩基性及び好酸性顆粒球、Ｂ及びＴリンパ球、特にＣＤ４リンパ球、細胞毒性リンパ球（ＣＤ８  ＣＴＬ）、腫瘍浸潤性リンパ球及びＬＡＫ、単球及びマクロファージ、樹状細胞、巨核細胞並びに血小板を挙げることができる。新規治療性質を獲得するようにこれらの細胞を更に遺伝子改変してもよい。
本発明による培地は更に細胞の初代培養物及び腫瘍細胞又は腫瘍生検の保存にも使用することができる。この種の材料は、腫瘍を患者から取り出して種々の免疫強化剤で処理（リンホカイン又は腫瘍抗原を発現する遺伝材料の導入）した後、患者に再投与する免疫養子治療臨床試験で現在研究中である。困難な段階の１つは患者から取り出すか又は再注入前に改変した細胞の保存である。本発明の培地はこれらの材料を高い生存率で良好に保存できるという利点がある。
本発明による培地を使用すると、これらの細胞を保存することができ、治療タンパク質又は場合によってはウイルスを産生する能力を損なわずに、遠心分離又は洗浄段階なしに良好な生存率で生物に直接注入することができる。
この点で、本発明は本発明による保存培地と生物材料を含む製剤及び生物材料の貯蔵方法にも関する。前記生物材料は本発明の培地で直接パッケージすることができる。細胞の場合には、本発明による培地でパッケージする前に培地を予め除去（例えば遠心分離し、沈渣を集めて緩衝液で洗浄）しておくと有利である。増殖細胞の場合には指数増殖期に亜集密で使用するのが好ましい。実施例に示すように、これらの条件下で最良の生存率結果を得ることができる。但し、集密又は集密後に細胞を使用することも可能である。一般に、培地１ｍｌ当たり細胞１０5〜１０9個、より好ましくは１０6〜１０8個をパッケージする。接着細胞の場合には、細胞を予め慣用処理により引きはがし、懸濁後、本発明の培地でパッケージする。細胞を引きはがすために使用する処理は酵素処理（例えばトリプシン）、化学処理（洗浄剤）又は機械的処理であり得る。化学処理又は酵素処理の場合には、処理後に細胞を遠心分離及び洗浄して酵素又は洗浄剤を除去してから凍結する。一般に、凍結前に細胞の生存率と無菌性を検査する。ウイルスの場合には予め上述のように精製する。（例えば塩化セシウム勾配上で遠心分離、クロマトグラフィー等）。１ｍｌ当たり粒子１０4〜１０14個、好ましくは１０5〜１０10個の割合でパッケージすることができる。その後、生物材料を適当な容器で本発明による培地でパッケージすることができる。容器はアンプル、管、特にクリオチューブ、袋、フラスコ、平型びん等を利用できる。容器は予め滅菌し、パッケージ操作は無菌条件で実施する。
本発明による培地は高生存率条件下で生物材料の凍結と解凍を可能にする。本発明による培地は特に−２００〜−４℃の温度で生物材料の凍結を可能にする。材料は工業用ストックの保存を確保するに十分長期間（例えば１年間まで）特に液体窒素中又はそれよりも高温で保存することができる。解凍後の生存細胞百分率は生存細胞数／合計増殖細胞数／１００として定義される。本発明による培地中のこの生存百分率は５０％を上回ると有利である。この百分率は６０％を上回ることが好ましい。この百分率が７０％を上回ると最も好ましい。
本発明の他の利点は以下の実施例に明示されるが、これらの実施例は例示に過ぎず、発明を限定するものではない。
材料と方法
細胞生存率試験
細胞の生存率はトリパンブルー法により測定した。トリパンブルーは死滅細胞のみに浸透する色素である。Ｍａｌａｓｓｅｚセル又はＫｏｖａスライドの非常に均一な碁盤目を観察すると、碁盤目全体の小方眼内に存在する細胞は非常に厳密な１μｌの容量に相当する。以下の原則に従ってこれらの細胞を計数する。
−碁盤目の外側境界に存在する細胞は、左上端（縁）又は右下端（赤）以外のものは数えない。
−計数を有意にするために、２回計数して平均する。
死滅細胞数は青色細胞数に対応する。生存細胞数は屈折白色細胞数に対応する。生存率は（生存細胞数）／（生存細胞数＋死滅細胞数）の比により表す。
当然のことながら、他の細胞生存率計算又は決定方法を使用してもよい。
使用した細胞
実施例で使用した細胞はウイルス粒子を産生することが可能な遺伝子改変繊維芽細胞である。具体的には、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに参照番号Ｉ−１２７８で寄託されているＭ１１細胞系である。この細胞系はＰｓｉＣＲＩＰ細胞に由来する。
等価細胞は例えばＡｍ１２細胞系（ＷＯ８９／０７１５０）である。当然のことながら、記載する方法は初代培養物であるか樹立細胞系であるかを問わずに特にヒト由来の他の細胞系にも直接適用できる。
アルブミン
実施例の範囲で使用したアルブミンはＡｒｍｏｕｒ社から商品名Ａｌｂｕｍｉｎ  Ａで市販されているもの即ち２０％ヒト血漿アルブミンである。当然のことながら、他の任意のアルブミン源も利用できる。
プラスミオン
プラスミオンは市販品である（Ｒｏｇｅｒ  Ｂｅｌｌｏｎ、フランス）。
実施例
実施例１：生物材料の凍結プロトコール
細胞の凍結には、指数増殖期の亜集密細胞を使用するのが好ましい。また、生物材料の生存を改善するために、本発明による凍結培地と接触後の細胞懸濁液のクリオチューブへの分注及び凍結はできるだけ迅速に実施する。更に、操作は無菌条件下（例えば層流フード下）で実施する。
本実施例はより詳細には細胞（遺伝子改変細胞、血球、ウイルス産生細胞等）の凍結プロトコールに関する。当然のことながら、当業者はこのプロトコールをウイルス又は他の材料の凍結に応用できる。
凍結しようとする細胞を入れた培養フラスコをインキュベーターから取り出し、顕微鏡に載せ、培養物の外観を調べる。１個以上のフラスコが不適格外観（細胞脱落、集密、培養液の濁り、細胞非屈折、フラスコ損傷等）を示す場合には、凍結に使用しない。
次に、適格フラスコを層流フード下に移す。細胞が接着細胞であるときには、凝集物を引きはがすか及び／又は溶解するように処理する。このためには、トリプシン又は他の任意の解離媒体（洗浄剤等）を使用することができる。次に細胞懸濁液を滅菌フラスコに集め、ピペット吸入により温和に均質化する。１ｍｌアリコートを分取して計数する。培養物の生存率が８０％未満の場合には細胞懸濁液を廃棄する。
次に、懸濁液を偶数の遠心管に（例えばピペットで）均等に分注し、４００Ｇで１０分間遠心分離する。
アルコール凍結容器と＋４℃の凍結培地のフラスコをフード下に移す。生存細胞１０7個／ｍｌの細胞濃度を得るために必要な容量の凍結培地を滅菌フラスコに入れる。
遠心分離後、上清を捨て、次いで沈渣を冷温の凍結培地のアリコートに戻す。懸濁液を均質化し、凍結培地を入れたフラスコに戻し、再び均質化する。無菌性試験サンプルを採取する。
次に、細胞懸濁液をクリオチューブに分注した後、クリオチューブを直ぐにアルコール凍結容器に入れる。容器を１時間＋４℃にした後、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間−８０℃のチャンバー内におく。凍結から少なくとも２４時間後にアンプルをアルコール容器から取り出し、液体窒素容器に入れて保存する。
実施例２：生物材料の解凍プロトコール
Ａ．使用した物質
−トリパンブルー
−滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ），ｐＨ７．２
−７０％エタノール
−培養培地
−ウシ胎児血清（ＢＦＳ）
−３７℃±０．５℃の滅菌水（５０〜２００ｍｌ）
Ｂ．プロトコール
解凍は無菌条件下、例えばフード下で実施すると有利である。
解凍しようとする（アンプルの）ロットの容量の９／１０に対応する容量の２０％ＢＦＳ培養培地を５０ｍｌ容滅菌管で調製する（解凍培地）。例えば１ｍｌ容アンプルの場合には、培養培地７ｍｌとＢＦＳ２ｍｌを準備する。
解凍しようとするアンプルを氷塊が消滅するまで約３７℃の滅菌水に温和に撹拌しながら含浸させずに浸漬する。直ぐに７０％エタノールでアンプルを拭く。アンプルの内容物をピペットで吸引し、解凍培地を入れた管に移した後、ピペットを交換せずに同一容量を再吸引し、アンプルを１回濯ぐ。懸濁液を温和に均質化し、滅菌管に１ｍｌを分取して計数する。計数の結果に応じて、培養物１ｍｌ当たり生存細胞２．０〜３．０×１０5個の初期細胞濃度を得るために必要な量の解凍培地で希釈し、細胞懸濁液を培養フラスコに移す。
解凍後の細胞生存率を経時的に追跡するために、培養フラスコを次に３７℃±０．５でＣＯ２下のインキュベーターに入れるか、又は緩衝培地ＨＥＰＥＳの場合には３７℃±０．５の温室に入れる。
治療用途の場合には、１本のアンプルの内容物のアリコートのみを細胞生存率及び無菌性試験に使用する。適格の場合には、解凍したアンプルの内容物を直接注入することができる。
実施例３：本発明の種々の培地によるレトロウイルス産生細胞の凍結及び解凍後の生存百分率の試験
本実施例で使用した細胞は組換えレトロウイルス産生細胞系Ｍ１１の細胞である。細胞は指数増殖期に使用する。実施例１に記載した一般プロトコールに従って細胞を凍結した。このために、Ｔ７５には３ｍｌ、Ｔ１６０又はＴ２２５には５ｍｌの解離用培地（１ＸＰＢＳ；ＥＤＴＡ  ０．０２％）を用いて細胞を培養皿から引きはがした。細胞をこの培地中で温和に撹拌しながら５分間インキュベートした後、Ｆａｌｃｏｎ管に回収する。アリコートを使用して細胞を計数する。次に、懸濁液を２０℃で１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次いで、本発明による培地１ｍｌを入れた凍結アンプルに細胞を１０7個／ｍｌの割合で分注する。試験した種々の培地については後述する（表３）。実施例１に記載したプロトコールに従ってアンプルを凍結させる。所定日に、実施例２に記載したプロトコールに従ってアンプルを解凍し、細胞懸濁液を３７℃、５％ＣＯ2の培養フラスコに移す。材料と方法の項に記載したように細胞生存率を測定する。得られた結果を下表４〜１０に示す。これらの結果は本発明の培地の存在下の高い生存百分率を明白に示す。例えば、所定の本発明の培地では７０％を越える細胞が生存可能である。一般に、細胞生存率は常に５０％を上回る。本発明の培地の如何なる成分も単一では２５％を越える安定性を得られないことに留意すべきである。
７カ月間の凍結後に各ロットで生存率と再培養の検査を行った。即ち、６７％プラスミオン／３３％ＨＳＡ溶液（実施例１参照）で凍結した４個の細胞アンプルを７カ月後に実施例２のプロトコールに従って解凍した。これらの４個のアンプルを７５ｃｍ2のフラスコで培養した。生存率と再培養を測定し、表１１に報告する。
これらの結果は高い生存百分率と良好な細胞再培養を示す。細胞は正常な接着と正常な屈折外観を示す。継代Ｐ１及びＰ２（１７５ｃｍ2）は正常培養条件下で行われた。
実施例４：再培養の改善
本発明により処理した細胞の再培養を検討するために、細胞安定剤、特に種々の濃度のグリセロールを補充した種々の培地で試験を行った。
４．１．培地の調製
上記プロトコールに従って調製後、下表に示す濃度のグリセロール又は対照としてＤＭＳＯを加える。要約すると、６７％プラスミオン、３３％ＨＳＡ及び２．５％グリセロールを含有する凍結培地１０ｍｌ容量につき、成分の容量濃度は以下の通りである。
ＨＳＡ／プラスミオン培地：９．７５ｍｌ
グリセロール：０．２５ｍｌ即ちグリセロール０．３２１ｇ
ＨＳＡ／プラスミオン培地１０ｍｌ→プラスミオン６．７ｍｌ
ＨＳＡ／プラスミオン培地９．７５ｍｌ→プラスミオン６．５３ｍｌ
ＨＳＡ／プラスミオン培地１０ｍｌ→ＨＳＡ３．３ｍｌ
ＨＳＡ／プラスミオン培地９．７５ｍｌ→ＨＳＡ３．２１ｍｌ。
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４．２．細胞生存率の検討
実施例１に記載した条件で凍結を行った。７日目に解凍後に得られた結果を表１３に示す。これらの結果から明らかなように、約５％未満の割合のグリセロールの存在下で解凍後に観察される平均細胞生存率は７０％を上回る。特に、１％のグリセロールの存在下では８４％の平均生存率が観察される。
４．３．再培養の検討
再培養は解凍後の増殖細胞の状態を表す変数である。本実施例では、細胞が集密に達するために必要な時間により評価する。このパラメーターを測定するために、解凍後に細胞濃度を２．５×１０5〜３．５×１０5個／ｍｌに調整した後、細胞を培養保存する。得られた結果を表１４に示す。これらの結果から明らかなように、グリセロールを補充しない培地（４〜５日）よりもグリセロールを補充した培地（３．５〜４日）で細胞を保存したほうが再培養は迅速に生じる。これらの結果は更に、０．５〜２．５％の割合で細胞安定剤を加えると有利であることも示している。
実施例５：プログラム凍結試験
凍結パラメーターを最良に制御することによって生物材料の品質を管理できるか否かを調べるために、プログラム凍結試験を実施した。特に、培地の過融解を避けることが可能な凍結プロトコールを試験した。このために、Ｆｌｏｂｉｏ社製液体窒素冷凍庫Ｋｒｙｏｓａｖｅ  ｐｌａｎｅｒを用いて凍結試験を実施し、実施例１によるアルコール（イソプロパノール）凍結試験と比較した。凍結は６７％プラスミオン、３３％ＨＳＡ及び２．５％又は１％グリセロールを含有する凍結培地で実施する。このシステムの利点は細胞（又は材料）の迅速な凍結と、細胞及び培地の制御下の降温を実現し、凍結した培地の融点に達しないようにできることである。このために、アルコール凍結時にその温度状況を経時的に観測することにより融点を予め測定する。本実施例では、材料の融点がこのレベルであり、培地が０℃付近に再上昇したので、１０分間に−８℃から−４０℃まで温度を低下させた。７日目に解凍後、２４時間後に細胞生存率と再培養を測定する。得られた結果を表１５及び１６に示す。
これらの結果は、試験した本発明の全方式及び培地で高い細胞生存率を明白に示す。更に、特に１％のグリセロールを含有する培地では良好な細胞再培養を示す。実際にこの場合には解凍から２４時間後に７０％を越える収率が観察される。更に、制御下のプログラム凍結（ｋｒｙｏｓａｖｅ）の場合には、２４時間後に観察される細胞層は良好であり、非常に少数の死滅細胞しか認められない。
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