(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にプローブを固定化した固定化微粒子を前記プローブの種類ごとに決められた順序で配列させ、マーカーとなる微粒子を前記決められた順序の間に一定間隔で配置したことを特徴とするプローブアレー。
【請求項２】
前記マーカーとなる微粒子は、有色ビーズであることを特徴とする請求項１に記載のプローブアレー。
【請求項３】
表面にプローブを固定化した複数の微粒子を、大きさの異なる微粒子を分離隔壁として用い、前記プローブの種類ごとに区分して保持することを特徴とするプローブアレー。
【請求項４】
種々のプローブを固定化した微粒子を穴を持つシートを用いて捕捉し、溝を有する基板もしくはキャピラリーと前記シートとを相対的に移動させ、前記穴に捕捉された微粒子を前記溝もしくは前記キャピラリーへ移送し、前記微粒子を前記プローブの種類に従って決められた配列で並べることを特徴とするプローブアレーの作製方法。
【請求項５】
１の種類の前記プローブを固定化した複数の微粒子を、前記シート上に供給して前記穴に移送する工程と、前記穴に入らなかった微粒子を除去する工程とを有することを特徴とする請求項４に記載のプローブアレーの作製方法。
【請求項６】
プローブを固定化した微粒子を前記プローブの種類ごとに異なる区画に保持する工程と、前記区画の壁面に設けられた穴に前記微粒子を保持する工程と、前記穴に保持された微粒子を基板に設けられた溝に移送させ、前記微粒子を定められた順序で配列させる工程とを有することを特徴とするプローブアレーの作製方法。
【請求項７】
種々のプローブを固定化した微粒子を捕捉する穴を具備するシートと、
前記微粒子を納めるための、溝を有する基板もしくはキャピラリーと、
前記溝を有する基板もしくは前記キャピラリーと前記シートとを相対的に移動させる手段とを有することを特徴とするプローブアレーの作製装置。
【請求項８】
１の種類の前記プローブを固定化した複数の微粒子を、前記シート上に供給する手段と、前記穴に入らなかった微粒子を除去する手段とをさらに有することを特徴とする請求項７に記載のプローブアレーの作製装置。
【請求項９】
壁面に穴を設けられ、かつプローブを固定化した微粒子を前記プローブの種類ごとに保持する複数の区画を具備する容器と、
壁面に穴を設けられ、かつ前記容器から移送した前記微粒子を納める微粒子保持容器と、
前記微粒子を定められた順序で配列して納めるための溝を有する基板もしくはキャピラリーとを有し、
前記穴は前記微粒子を捕捉し、前記穴に捕捉された微粒子は前記溝もしくは前記キャピラリーに移送されて前記順序で配列することを特徴とするプローブアレーの作製装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体関連物質の検出、診断、およびＤＮＡをはじめとする生体関連物質の分析に用いるプローブアレーおよびその作製方法と作製装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡの分析やDNA検査あるいは診断には微量のDNAを増幅する方法、得られたDNA断片を分離検出する方法等が必要である。DNAの増幅にはＰＣＲ（polymerase chain reaction)が広く用いられている。此れによれば非常にわずかな量のＤＮＡでもそのコピー数を数桁増やして検出できる。一方、種々DNAの分離検出にはゲル電気泳動と蛍光検出を組み合わせたDNAシーケンサーやフラグメントアナライザー等が用いられている。しかし、検体数が多くなったり、検査項目が多くなると電気泳動による方法では手間がかかる難点があり、DNAプローブを用いた簡便な方法が注目されはじめている。特に、プローブを固体表面に多種類固定したプローブアレーを作製し、検体との間でハイブリダイゼーションを起こさせて特定のＤＮＡだけを固体表面にトラップして検出するDNAチップが注目されはじめている( Nature Medicine 2, 753 (1996)）。
一方、蛋白質やペプチド、あるいはこれらと相互作用する種々生体関連物質の分析でもプローブ検出が用いられ、DNAチップに相当するペプチドチップなどが用いられ始めている。
【０００３】
このように固体表面にペプチドやＤＮＡを固定して検体との間でハイブリダイゼーションを行い、分離検出する方法は、放射性標識をもちい、メンブレン上に固定したプローブで目的DNAなどの存在を調べるブロッティング法として昔から用いられてきた。しかし、ガラスあるいはシリコンといった固体表面の小さな領域（１cm2）に沢山のプローブを固定したDNAチップは試料の節約ができると同時に非常に多くの種類のプローブを用いて検査できる等の利点がある。 これらDNAチップの作製法には大別して２つがある。第一は半導体などで用いる光マスクの方法を用いて固体の区画された狭い領域（0.05mm-0.2mm四方）にDNAプローブを一塩基づつ光化学反応により合成していく方法である（Science 251, 767(1991)）。 第２は合成したDNAあるいはPCR増幅したDNA、クローニングで得たDNAを固体表面の小さな区画にプローブの区画ごとに固定していく方法である（Nature Biotech 16, 27 (1998)）。 この方法では必要なプローブを持ったペプチドチップやDNAチップを比較的に簡単につくれる利点があり、多くのベンチャー企業が採用している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
DNAをはじめとする生体物質のプローブチップは期待のおおきな検査技術であるが、実用化には １）少量多品種を安く作れる事、２）プローブ固定の均一度が良い事、３）データーの再現性が良い事、くりかえし使用できる事、４）非特異的吸着を除くため加熱できること、などが必要である。しかし、プローブを固体表面に液滴としてのせて固定化するので、区画毎にばらつきが出る、作るのに手間がかかる、プローブの位置を決めることと固体表面に固定する事を同時に行っているのであまり細かいプローブ固定区画はつくれない、プローブの均一度も良くない、などの問題点がある。また、これらの多くは吸着などにより固定されており、固体との結合力が弱く、加熱によりプローブが表面から剥離したりすることがある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、プローブの固体表面への固定と、プローブの配列を別工程にした。これにより、均一に固体表面にDNAプローブを作製することができる。プローブの固定は共有結合で行うことができるので熱に強く、非特異的吸着などを加熱除去するのに適している。微粒子をプローブを固定する固体として用い、それらを並べる事で目的にあった区画サイズのプローブアレーを作製する。配列するプローブ付き微粒子を交換することで容易に目的のプローブアレーを作製することができる。これら微粒子を並べる方法は微粒子が直径0.3mm程度のサイズではピンセットでつまんで並べることができるが、0.1mm以下になると困難である。そこで、微細な穴をもったシートを用い、この穴に微粒子を保持して運び、キャピラリーあるいは平板にもうけた溝等に並べることによりプローブアレーを作製する方法およびその作製装置を提供する。また、別の方法として液体フロー中に微粒子を一個づつ制御しながら流し込んでそれをキャピラリーに受けることでプローブアレーとする。本明細書において、「アレーとする」とは、プローブ付き微粒子を一次元または二次元に配列させてプローブアレーの構成とすることを意味する。さらに、計測の再現性等を高めるために複数のプローブ付き微粒子をプローブ毎に複数個ならべて検査のばらつきなどを確認して信頼度の高いデーターが得られるようにした。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（１８）を提供する。
（１）プローブの種類ごとに複数の微粒子にプローブを固定化し、複数のプローブに対する該微粒子を定められた個数ずつ集めてアレーとしたことを特徴とするプローブアレー。
【０００７】
（２）微粒子表面にプローブを固定化し、該固定化微粒子をプローブの種類ごとに決められた順序で一次元あるいは二次元に配列させて生体関連物質のプローブアレーを構成することを特徴とするプローブアレーであって、マーカーとなる微粒子を一定間隔で配置したことを特徴とする、上記プローブアレー。
（３）プローブごとに複数の微粒子をプローブアレーホルダーに保持せしめ、種類の異なるプローブを区分するためにサイズの異なる微粒子を分離隔壁として用いたことを特徴とするプローブアレー。
【０００８】
（４）種々のプローブを固定化した微粒子をプローブの種類に従って決められた配列でキャピラリーまたは光学セル内に並べる方法において、微粒子よりも大きな穴をもつシートと、該シートに接触し、キャピラリーを保持するか、または溝を有する基板とを相対的に移動可能とし、シートの穴にトラップした微粒子の位置を制御移動し、前記のキャピラリーまたは溝に上記微粒子を順次移送することを特徴とする、プローブアレーの作製方法。
【０００９】
（５）単一種類のプローブを固定化した微粒子を穴付きシート上に散布して穴の部分に落とし込む工程と、穴に入らなかった余剰の微粒子を除去する工程と、穴部分に保持された微粒子をキャピラリーまたは溝に移送する工程とを繰り返すことを特徴とする、上記（４）に記載のプローブアレーの作製方法。
【００１０】
（６）複数の異なるプローブをそれぞれ固定化した複数の微粒子をシート上の異なる穴に保持し、プローブアレーホルダーまたは該プローブアレーホルダーにつながるキャピラリーへ種類ごとに定められた順序で移送することを特徴とする、上記（４）に記載のプローブアレーの作製方法。
【００１１】
（７）プローブを固定化した微粒子をプローブの種類に従って決められた配列でキャピラリーまたは光学セル内に並べる方法において、微粒子を導入細管に保持し、溶液と共に微粒子をひとつずつ制御しながら溶液流中に放出し、キャピラリー管内に導入することで種々のプローブ付き微粒子を決められた順序で配列保持してプローブアレーを作製する方法。
【００１２】
（８）プローブを固定化した微粒子をプローブの種類ごとに異なる区画に分割保持し、その区画の底面にある穴に微粒子を保持し、これを別の基板平面に掘られた溝に落とし込むことによりプローブ付き微粒子を定められた順序で配列させ、ついで別途キャピラリー、溝または光学セルに移送すると同時に間隔を密集させてプローブアレーを作製する方法。
【００１３】
（９）プローブを固体表面に固定化する手段と、プローブを定められた順序で配列させる手段とを独立して有することを特徴とするプローブアレーの作製装置。
（１０）種々のプローブを固定化した微粒子をプローブの種類にしたがって決められた配列でキャピラリーあるいは光学セル内に並べるプローブアレー作製装置において、微粒子よりも大きな穴をもつシートと、該シートに接触し、キャピラリーを保持するか、または溝を有する基板とを相対的に移動可能とする手段と、シートの穴にトラップした微粒子の位置を制御移動し、前記のキャピラリーまたは溝に上記微粒子を順次移送する手段とを有することを特徴とする、プローブアレーの作製装置。
【００１４】
（１１）単一種類のプローブを固定化した微粒子を穴付きシート上に散布して穴の部分に落とし込む手段と、穴に入らなかった余剰の微粒子を除去する手段と、穴部分に保持された微粒子をキャピラリーまたは溝に移送する手段とを有する、上記（１０）に記載のプローブアレーの作製装置。
（１２）複数の異なるプローブをそれぞれ固定化した複数の微粒子をシート上の異なる穴に保持する手段と、プローブアレーホルダーまたは該プローブアレーホルダーにつながるキャピラリーへ種類ごとに定められた順序で移送する手段とを有することを特徴とする、上記（１０）に記載のプローブアレーの作製装置。
【００１５】
（１３）プローブを固定化した微粒子をプローブの種類に従って決められた配列でキャピラリーまたは光学セル内に並べるプローブアレーの作製装置において、微粒子を導入細管に保持し、溶液と共に微粒子をひとつづつ制御しながら溶液流中に放出する手段と、キャピラリー管内に導入する手段と、導入された種々プローブ付き微粒子を決められた順序で配列保持する手段とを有することを特徴とする、プローブアレーの作製装置。
【００１６】
（１４）プローブを固定化した微粒子をプローブの種類ごとに異なる区画に分割保持する手段と、その区画の底面にある穴に微粒子を保持する手段と、これを別の基板平面に掘られた溝に落とし込むことによりプローブ付き微粒子を定められた順序で配列させる手段と、キャピラリー、溝または光学セルに移送すると同時に間隔を密集させる手段とを有する、プローブアレーの作製装置。
【００１７】
（１５）微粒子表面にプローブを固定化し、該固定化微粒子をプローブの種類ごとに決められた順序で一次元あるいは二次元に配列させ、生体関連物質のプローブアレーを構成することを特徴とするプローブアレーを有する分析装置。
（１６）上記プローブアレーが、プローブの種類ごとに微粒子に固定化し、該微粒子を複数集めてアレーとしたものであることを特徴とする、上記（１５）に記載の分析装置。
【００１８】
（１７）一次元あるいは二次元に分布し、微粒子を保持できる穴を有するセルと、少なくとも各セルを区画している壁と、微粒子のサイズよりも小さな間隔におかれた光学的に透明な部材とで形成された微粒子アレーホルダーからなるプローブアレー。
（１８）上記（１）〜（３）、及び（１７）のいずれかに記載のプローブアレーを用いた分析装置。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下本発明を実施例を用いて説明する。本発明はDNA、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド他の生体関連物質のプローブアレーに共通であるがここではDNAを例に説明する。
【００２０】
本発明によるDNAプローブアレーは、キャピラリー管中に一次元的に保持する場合と狭い間隙の光学セル内に固体プローブを２次元的に保持する場合とがあるが、説明の都合で主としてキャピラリー管を用いた例で説明する。微粒子として、球形のビーズを用いた例で説明するが、矩形あるいは他の形状のものでもよい。ビーズのサイズは１-３００ミクロンまで使用可能であるが、ここでは20ミクロンのビーズを用いた例を中心に説明する。なお、ビーズの材質にはガラスあるいはプラスチックのものが普通に利用できるが金等の金属も利用可能である。ここではプラスチックを用いた。
【００２１】
［実施例１］
図１は本発明によるプローブアレーの例である。プローブを保持したプローブビーズ１０５の直径は20ミクロンであり、キャピラリー１０３の内径は25ミクロンである。この例では両端にダミーのビーズ１０６を約２０個並べその内側にビーズを９９９個並べた。１０個ごとに黒色のマーカービーズ１０４を入れ、１００個目は赤色とした。マーカービーズ１０４の数は９９個なので、プローブビーズ１０５の数は９００個となる。すなわち９００種類のプローブをならべて検査できる。これらは密集すると２mmの幅の中に入るが、ハイブリダイゼーション反応のこと等を考え、やや荒い密度で５mmの領域にこれらを保持した。領域の長さはもっと長くても短くても良いが、長すぎるとサンプルが多く必要となり、短いと取り扱いが厄介である上、十分なハイブリダイゼーションを行うだけのサンプルが確保できない場合もある。反応領域の体積は約2.3nlである。両端はストッパーが置かれており、ビーズが流出しないようにできている。サンプルおよび洗浄液は注入口１０１から注入され、出口１０２から排出される。プローブ数が１万個でも反応領域の長さは20-30ｍｍで良いため、コンパクトで扱い易い利点がある。
【００２２】
これに用いる蛍光検出装置は図２に示した様なもので、レーザー光源２０９から、ミラー及びレンズ２０５を介して照射されるレーザービーム２０６とプローブアレー保持キャピラリー２０２を相対的にスキャンして得られる蛍光を測定する。相対的移動は、ミラーの調節および／またはプローブアレー移動板２０３によって行い、検出位置２０４にレーザーを照射する。検出位置２０４からの発光は、レンズ２０５、光学フィルター２０７、レンズ２０８を介して検出器２１０で検出し、データー処理および検出器コントローラー２１１で処理し、表示装置２１２に表示する。本発明において、プローブビーズ２０１の１０個毎にマーカービーズが入っており、各ビーズの順番に従ってプローブの種類を容易に知る事ができる。マーカービーズを色分けしておき何番目か容易にわかるようにしてもよいし、マーカービーズの代わりにプローブをつけたビーズに色をつけておき、１０個ごとに色が変わるようにしてもよい。この場合、色は蛍光検出の障害とならない波長のものを採用する必要がある。
【００２３】
［実施例２］
次の実施例はビーズを一つずつ定められた順序でキャピラリー内に並べる方法および装置に関するものである。図３及び４はビーズアレー作製方法及び装置の一例である。説明の都合上一本のキャピラリー３０６にビーズアレーを作製する例で説明するが、実用上はこのようなシート上の穴とキャピラリーが多数並んだものを使用する。ステップ１（図3-a）：ビーズ供給用ノズル３０９から、第一のプローブが付いたプローブビーズ３０４（第一のプローブビーズ）を溶液注入口３０２から注入された溶媒とともにビーズ捕捉用穴３０５を有するシートを底面に持つセル内に導入する。ビーズを沈殿させ前後左右に液を移動させると、ビーズのうち一つがビーズ捕捉用穴３０５の中に落ち込む。ステップ２(図3-b)：次いで残りのビーズを溶媒とともに排出口３０１から除去し、洗浄する。穴３０５に落ちたビーズ３０８だけがセルの中に残る。この場合、シートに垂直の方向から穴３０５に向かって溶媒を噴出させ、穴３０５の近傍のビーズを除去して、ステップ３でキャピラリーに取り込まれるビーズを穴に落ちたビーズ３０８だけになるようにしてもよい。穴の底面はキャピラリー保持基板３０７でふさがれた状態にある。このキャピラリー保持基板３０７には配列用キャピラリー３０６が固定されているが、ステップ１、２ではキャピラリー軸と穴３０５は一致しておらず、ビーズは穴３０５に保持された状態にある。ステップ３(図3-c)：キャピラリー保持基板３０７とシートを相対的に動かし、キャピラリー軸と穴３０５を一致させる。キャピラリー３０６の他端から吸引あるいは溶液側から圧力をかけプローブビーズ１をキャピラリー内に導入する。この場合移動は穴３０５のサイズ程度でよく、圧伝素子を使用すると便利である。ステップ４(図4-d)：キャピラリー保持基板３０７とシートを相対的に動かし、再びキャピラリー軸が穴とずれるようにする。ステップ５(図4-e)：第２のプローブのついたビーズ（第二のプローブビーズ）をセルに導入し、ビーズの内一つを穴３０５に落とし込む。ステップ６(図4-f)：ステップ２と同様に穴３０５にあるビーズ以外の余剰のビーズをセル内から除去する。ステップ７(図4-g)：キャピラリー保持基板３０７とシートを相対的に動かし、キャピラリー軸と穴を一致させ、第二のプローブビーズをキャピラリー３０６の中に導入する。この結果、キャピラリー３０６内にはプローブ１のついたビーズ（第一のプローブビーズ）とプローブ２の付いたビーズ（第二のプローブビーズ）が並ぶ。以下同様のことを繰り返してプローブ付きのビーズアレーを望む配列でつくる。尚、３０３はカバー板、３１０はストッパーである。
【００２４】
ここで用いたキャピラリーを取り外して計測時のプローブアレーホルダーとして用いてもよいが、別に用意したプローブアレーホルダーをキャピラリーの下部に取り付け、そこにビーズアレーを移して用いてもよい。プローブアレーホルダーとしては、キャピラリーあるいは溝などが挙げられる。ここでは図５に示すプローブアレーホルダーを用いた。図中左端の注入口４０３からサンプルを注入する。十分ハイブリダイゼーションを行った後、注入口４０３から洗浄液をいれて、排出口４０２から未反応のサンプルを除去する。ストッパー４０６により、ビーズの排出は阻止される。計測ユニットに装着して、ビーズ配列用溝４０４に配列させた各プローブビーズ４０５にレーザーを照射して発する蛍光を検出する。上部ウィンドー４０７を透明部材で構成すれば、検出が容易である。もちろん、レーザーを照射して蛍光を得る代わりに化学発光試薬を用いて発光させ、その光を受光してもよい。検出はハイブリダイゼーションの有無が分るものであれば何でもよい。
【００２５】
ここでは一つのキャピラリーをキャピラリー保持基板に固定した例で説明したが、複数のキャピラリーを用いて同時に大量のプローブアレーをつくる事も可能である。 この場合、キャピラリーの数に応じてシートに設けた穴の数を増やす必要があるのは言うまでもない。
【００２６】
［実施例３］
本実施例はタイタープレートに入れられたプローブビーズを含む溶液を種類ごとに決められた順番で順次穴付きシートのある部位（捕捉部位）に送り込み、キャピラリーあるいは平板に掘られた溝に並べていく装置の例である（図６）。ピペッター５０１でプローブビーズ５０８をタイタープレート５０２のウェル５０３から吸い込み、トランスファー用のビーズ保持ウェル５０５に移す。ウェル５０５の底面には捕捉用の穴があいている。捕捉部位に注入されたプローブビーズ５０８のうち１つ（穴を複数設けた場合は複数個）が穴に落ち込む（５０９）。各穴にビーズが落ち込んだ事を光学的に確認する。ついで洗浄液を流し余剰のビーズを回収または除去する。ビーズ捕捉穴とビーズアレー配列用溝５０７あるいはキャピラリーの間には圧電素子５１０などで駆動できる弁５１１が設けてあり、これを動かすことでビーズを溝５０７あるいはキャピラリー側に移動できるようにする。実際の移動は液体のフローを利用する。穴付きビーズホルダー５０４を動かし穴と溝５０７あるいはキャピラリーの中心を一致させ、捕捉したビーズを溝あるいはキャピラリーに移動させてもよい。ビーズの移動が終了後に弁５１１を動かすか、または穴とキャピラリーをずらし、ビーズを穴に捕捉できるようにする。次のプローブ付きビーズをピペッター５０１で捕捉部位に導入する。以下同様のことを繰り返してビーズアレーを作製する。作製したビーズアレーはそのままあるいは別の容器に配列を保った状態で移動してプローブアレーとして用いる。尚、５０６は配列したプローブビーズ、５１２は保持基板である。
このような操作は複数の穴をもったシステムで行い、アレー作製の時間を短縮したり、同一アレーを複数同時に作製する事もできる。
【００２７】
［実施例４］
実施例２ではセルはひとつで一回に一種類のプローブビーズを扱ったが、この例は複数のセルをもち複数種のプローブを区分けして保持する事で作製効率をあげた例である。図７に示すように回転円盤６０１に矩形のセル６０３を複数個配置する。各セル６０３の底面には実施例１と同様の穴付きシートが具備されている。シートを具備した回転円盤の下部はキャピラリーを保持した基板と接触しており、穴に捕獲されたビーズが落下しないようになっている。回転円盤６０１を移動させ穴とキャピラリー軸が一致するようになると前例と同様にしてプローブビーズをキャピラリーの中に移行する。穴はキャピラリー数に応じた数だけある。穴の配置はキャピラリーの配置に一致させてあるが回転移動時にずれることを防ぐため、CD-ROMと類似のトラッキング技術を用いてキャピラリー付きのブロックを回転円盤６０１の回転軸６０２方向に移動して調整する機構を具備している。実施例では直径１６cmの回転板を用いた。中心から５cmのところに幅１mm長さ３０mmのセルを配置してある。セルのピッチは２mmであり、円周上に１５０ほどのセルを作ることができる。セルの下面には穴付きシートが張ってあり穴のピッチは２mmである。この例では合計１０個の穴を並べ一度に１０個のキャピラリーにプローブビーズアレーを作ることができる。もちろんキャピラリーの数、一度に作製できるプローブアレーの数は必要に応じて変えられる。尚、６０４はセル６０３に設けられたビーズ保持用穴である。
【００２８】
回転板は高速回転モードとゆっくりであるが高精度で回転するモードの二つがある。セル内にビーズを溶液とともにいれる。円盤をゆするとともに穴から溶液を排出し、ビーズを穴に落とし込む。次いで高速回転モードになり、遠心力と溶液の流れで余剰のビーズをセル先端のビーズ溜に移動させる。回転を停止し、プローブビーズ１がキャピラリーの位置にあうように高精度回転モードでセットする。底面部のシャッターを開き、キャピラリー管を保持したブロックを回転板に接触させ溶液の流れと共にビーズをキャピラリー内へ移す。次いで回転板を高精度モードで回転させプローブビーズ２を含むセルがキャピラリーの位置にくるようにする。以下順次ビーズをキャピラリーに移行し、定められた順序でプローブビーズアレーを作製する。円盤を交換するか各セルに入れるプローブビーズを交換して同じ事を繰り返して多くのプローブビーズをキャピラリーに配置しながら保持できる。セルに入れるビーズの色を１０個ごとに変えておくと作製したプローブビーズアレーのプローブの位置を確認するうえで都合が良い。
【００２９】
［実施例５］
次の実施例は、液体フローを用いてプローブビーズを一つずつ定められた順序でキャピラリー内に並べる方法および装置に関するものである。図８はこの概要を示した。プローブビーズ７０２は、ビーズ溶液溜７０１から、移送管７０３、シースフローセル７０４を介してポンプでキャピラリーに運ばれる。キャピラリーの先端部は移送液７０５の流れの中に入れられ、移送用キャピラリー７０６の先端からビーズをひとつずつ液体流中に放出する。ほぼ一定の時間間隔でビーズは液体流中に放出されるが、これを安定化するためにビーズを保持したキャピラリー７０７にはキャピラリーの軸に沿って節ができるように超音波が加えられている。超音波の強度等の条件をコントロールすることで一定時間毎にビーズを一つづつ液体の流れの中に放出する。尚、７０８は保持基板、７０９は溶液排出管である。
【００３０】
［実施例６］
これまでの例ではプローブ一種類に対して一個のビーズを対応させたが、ハイブリダイゼーション反応のばらつきを見たり検出感度を高めるには一つのプローブあたり複数個のビーズを対応させると都合がよい。各プローブで対応するビーズの個数は必ずしも同じである必要はない。この場合異なるプローブビーズ８０２の間に目印となる色またはサイズの異なる区分用ビーズ８０３を入れる必要がある。図９はこの例である。作製に要する装置は基本的には前述のものと一致するが、プローブ保持用キャピラリー８０４の内径をプローブビーズ８０２のサイズよりも数倍以上大きくして複数のビーズが穴にトラップされるようにする。以下の動作は前と同じである。尚、８０１はダミービーズ、８０５は溶液排出管である。
【００３１】
なお、前の例で述べたフローシステムを用いるとビーズアレーの作製は楽になる。ビーズ溜から少量のビーズをピペットで分取し、液体フロー中に注入する。注入されたビーズの数は確定できないが順次キャピラリーへ収納できる。別の種類のビーズを注入するまえにアイソレータとして色つきビーズあるいはサイズの違う区分用ビーズ８０３を注入することで、注目しているのが何番目のビーズでどんなプローブを持っているのか識別することができる。
【００３２】
［実施例７］
前実施例のプローブアレー作製法はキャピラリーの中に配列させる例であったが、図１０に、平面上に設けた溝にビーズを配列させ、それを密集させてプローブアレーとして用いたり、キャピラリーの中に移動してプローブアレーとして用いるための方法および装置を開示する。まず平面上に複数の溝を持つビーズアレー作製用ホルダー９０５を用意する。この溝９０６にプローブビーズ９０７を並べてキャピラリーなどに配列を保ったままビーズを移動してプローブアレーを作製するが、複数の溝９０６に入れられて配列したプローブビーズ９０７はそれぞれ異なるキャピラリー９０８に導入され、プローブアレーとして使用される。ビーズアレー作製用ホルダー９０５の上にはビーズを穴にトラップして保持し上記溝９０６まで移動するための穴付きシート９０４が置かれている。この穴付きシート９０４は図１０に示したようにビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６と直行するように作られた細溝保持板９０１の溝（ビーズ溜９０２）とその底に開けられたビーズ保持用の穴９０３を持っている。やはり複数の溝を持つがこれらにはそれぞれ異なるプローブ付きビーズが注入され、その穴に溝ごとに異なるプローブビーズ９０７を保持させるための物である。これら２つのシートあるいは平板は密着して使用されるが相互にスライドできる。まず、穴付きシート９０４の穴９０３とビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６の位置がずれた状態におかれる。プローブビーズ９０７を穴付きシート９０４の各溝にプローブの種類ごとに区分けされた状態で補給される。穴には一つのプローブビーズ９０７が入るがこの状態で底面は塞がれているのでここに保持される。穴付きシート９０４の穴９０３とビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６の位置を合わせるとビーズがそれぞれの穴９０３から１つずつ溝９０６に落ち込む。各溝９０６にはそれぞれのプローブビーズ９０７が１つずつ落ち込むので種々のプローブビーズ９０７が各溝９０６に保持される。ビーズの置かれた間隔は穴付きシート９０７のビーズ溜９０２の間隔とほぼ一致しており、この例では2mmである。ビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６に落とし込まれたプローブビーズ９０７の数はこの例では合計５０個である。また、同時に作製されるビーズアレーは１０個であるが必要に応じて増やすことができる。ビーズを落とし込んだら再び穴付きシート９０４の穴９０３とビーズアレー作製用ホルダー９０５の溝９０６の位置をずらして溝を密封型とし、溶液と共にビーズをキャピラリー９０８へ導く。プローブビーズ９０７の種類を多くする場合には上記の操作を繰り返すことで達成される。
上記実施例では一次元に配列したプローブビーズアレーを開示したが、これらを複数個並べたり、２次元に配列させることでより多くの種類のプローブを持ったプローブアレーを作れることはいうまでもない。
【００３３】
［実施例８］
本実施例はプローブビーズアレーホルダーが一次元あるいは二次元に分布した穴付きプレートとカバーグラスで構成されるセルを用いる例である。これは非常に小さなタイタープレートに似たものである。図１１に示すように、プローブビーズ１００４を入れたタイタープレートからビーズを少量マイクロピペットを用いて分取しマイクロタイタープレート１００１の穴（セル１００３）に移す。１００２はスペーサーである。ビーズについているプローブの種類とプレート上の穴の位置を対応させてプローブビーズを保持したマイクロタイタープレートに似たビーズアレーを作る。ビーズを入れたあとで光学的に透明で蛍光計測あるいは化学発光計測に支障のないカバーガラス１００５をかぶせてセルアレーとし、例えばレーザー光１００８を照射して、発光をレンズ１００９を介して検出器１０１０で検出する。カバーガラス１００５とマイクロタイタープレート状のセルアレーの各セルをしきっている壁とのあいだはビーズサイズより小さくビーズは相互に移動しない。反応液などは溶液排出口１００６及び溶液注入口１００７から自由に移動できる。使用に当たってはセルを反転させガラス面が下になるようにしてもちいる。この場合、セルの深さに関わりなくガラス面にあるビーズは反応液と十分接触してプローブはターゲットとハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００３４】
【発明の効果】
以上述べた様に本発明によれば、ペプチドやDNAのプローブアレーを簡便に大量につくることができる。プローブを固体表面に固定するプロセスとプローブを配列するプロセスを分けることにより、それぞれを最適化して行うことができる。このため、均一で固体表面から剥がれにくい固定プローブを作る事ができ、定められた順番に並べることにより簡単に、必要な種類のプローブを持ったアレーを作ることができる。ビーズのサイズを小さくすることにより従来の方法では作製困難な微細なプローブアレーを作ることもできる。必要なDNAプローブを作製し、ビーズ表面に固定化して作製装置にセットするだけで新しい構成のプローブアレーを作製することができるので、ユーザーのほしい物をいつでも提供できる。同一プローブを持つビーズを複数個配列することにより統計平均を取ることができ再現性、定量性等をあわせて調べる事が出来、信頼のおける測定が実行できる。また、平面保持のDNAチップ等によるプローブアレーと異なり表面積がおおきく、反応をより速やかに行う事が出来るとともに高感度がえられる。ビーズのサイズは１ミクロンから３００ミクロンまで変える事ができるので、高密度のプローブアレーが必要な時でも容易に作る事ができる。たとえば、６ミクロンのビーズを用いると、キャピラリー１０ｍｍあたり１５００個のプローブを保持する事ができ、二次元のプローブアレーホルダーを用いると１平方センチあたり１００万個以上のプローブを並べる事ができる。
作製するときに同じプローブ配列をもったアレーを複数個同時に作製することは非常に容易であり、量産にも向いている。
【図面の簡単な説明】
【図１】キャピラリー内に配列したプローブビーズからなるプローブアレーチップの概念図である。
【図２】キャピラリーなどに保持されたプローブビーズアレーを計測する検出システムの概念図である。
【図３】ビーズ配列装置の部分断面図である。
ａ）オフライン状態でのビーズ供給の概念図である
ｂ）穴にビーズをトラップした状態の概念図である
ｃ）ビーズをキャピラリーなどに移行する状態の概念図である
【図４】ビーズ配列装置の部分断面図である。
ｄ）キャピラリーにビーズが１個保持された状態の図
ｅ）第２のプローブビーズを捕獲する穴に落とし込んだ状態の図
ｆ）余分なビーズの除去
ｇ）捕獲されたビーズをキャピラリーに導入する図
【図５】溝型ビーズ配列治具の概念図である。
ａ）外観図
ｂ）断面図
【図６】溝と可動弁を用いたビーズアレー作製方法の概念図である。
ａ）プローブビーズの溜からビーズを吸い取り、溝に並べていくプロセスの概念図
ｂ）ビーズを１個ずつ捕獲するデバイスの断面図
【図７】円盤型プローブビーズ移送システムの概念図である。
【図８】液体フロー式ビーズアレー作製法の概念図である。
【図９】多数のプローブビーズを区分ビーズで分離したタイプのビーズアレーの概念図である。
【図１０】穴付きシートを用いたプローブビーズ配列方法の概念図である。
【図１１】マイクロタイタープレート型のビーズアレーホルダーの概念図である。ａ）概念見取り図
ｂ）断面図
ｃ）計測時の概念図
【符号の説明】
１０１：溶液および試料注入口、１０２：出口、１０３：キャピラリー、１０４：マーカービーズ、１０５：プローブビーズ、１０６：ダミーのビーズ
２０１：プローブビーズ、  ２０２：プローブアレー保持キャピラリー、２０３：プローブアレー移動板、２０４：検出位置、２０５：レンズ、２０６：照射レーザー、２０７：光学フィルター、２０８：レンズ、２０９：レーザー光源、
２１０：検出器、２１１：データー処理および検出器コントローラー、２１２：表示装置
３０１：排出口、  ３０２：溶液注入口、  ３０３：カバー板、
３０４：プローブビーズ、  ３０５：ビーズ捕捉用穴、  ３０６：配列用キャピラリー、３０７：キャピラリー保持基板、３０８：捕捉されたビーズ、
３０９：ビーズ供給用ノズル、  ３１０：ストッパー
４０１：プローブアレーホルダー、  ４０２：排出口
４０３：注入口、  ４０４：ビーズ配列用溝
４０５：プローブビーズ、  ４０６：ストッパー
４０７：上部ウィンドー
５０１：ピペッター、  ５０２：タイタープレート、  ５０３：ウェル、  ５０４：  穴付きビーズホルダー
５０５：ビーズ保持ウェル、  ５０６：配列したプローブビーズ、５０７：ビーズアレー配列用溝、  ５０８：プローブビーズ、５０９：穴に捕獲されたプローブビーズ
５１０：圧電素子、  ５１１：弁、  ５１２：保持基板
６０１：回転円盤、  ６０２：回転軸
６０３：セル、  ６０４：ビーズ保持用穴
７０１：ビーズ溶液溜、  ７０２：プローブビーズ、  ７０３：移送管
７０４：シースフローセル、  ７０５：移送液、  ７０６：移送用キャピラリー管
７０７：キャピラリー、  ７０８：支持基板
７０９：溶液排出管
８０１：ダミービーズ、８０２：プローブビーズ、８０３：区分用ビーズ、８０４：プローブ保持用キャピラリー、８０５：試料流路
９０１：細溝保持板、  ９０２：ビーズ溜、  ９０３：穴
９０４：穴付きシート、  ９０５：ビーズアレー作製用ホルダー、  ９０６：溝、  ９０７：プローブビーズ、  ９０８：キャピラリー
１００１：マイクロタイタープレート、
１００２：スペーサー、  １００３：セル、  １００４：プローブビーズ、１００５：カバーガラス、  １００６：溶液排出口、  １００７：溶液注入口、
１００８：レーザー光、  １００９：レンズ、１０１０：検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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