(57)【要約】少なくとも一種以上の脂質を水性媒体に分散させる工程と、得られた小胞体を乾燥して乾燥小胞体とする工程と、該乾燥小胞体を前記水溶性物質の水性溶液に分散させる工程と、得られた小胞体分散液をフィルターに透過させる工程を順に行い、高効率で高濃度の有用物質を封入でき、均一な粒子径を有する小胞体を高い収率で、安全に、かつ簡便に製造する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性物質を小胞体に封入し、小胞体の粒子径を制御する小胞体分散液の製造方法であって、少なくとも、一種以上の脂質を水性媒体に分散させる工程と、得られた小胞体を乾燥して乾燥小胞体とする工程と、該乾燥小胞体を前記水溶性物質の水性溶液に分散させる工程と、得られた小胞体分散液をフィルターに透過させる工程を順に行うことを特徴とする小胞体分散液の製造方法。
【請求項２】
一種以上の脂質を水性媒体に分散させる工程と、得られた小胞体を乾燥して乾燥小胞体とする工程との間に１回以上の凍結融解操作を行う、請求項１の小胞体分散液の製造方法。
【請求項３】
脂質の一種がポリエチレングリコール型脂質である請求項１または２のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項４】
ポリエチレングリコール型脂質の濃度が０．０１〜１モル％である請求項３の小胞体分散液の製造方法。
【請求項５】
乾燥小胞体は、小胞体を凍結乾燥して得る請求項１ないし４のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項６】
乾燥小胞体は、小胞体を噴霧乾燥して得る請求項１ないし４のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項７】
水溶性物質が、ヘモグロビンおよびストローマフリーヘモグロビンからなる群より選択される請求項１ないし６のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項８】
ヘモグロビンまたはストローマフリーヘモグロビンの水性溶液の濃度が１０〜５０ｇ／ｄＬである請求項７の小胞体分散液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願の発明は、小胞体に薬剤、生理活性物質、ヘモグロビンなどの有用物質を効率良く封入させ、粒子径を揃えた小胞体の分散液を短時間で簡便に製造する方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、製造時間の短縮や収率の増大が可能で、有機溶媒や界面活性剤などを使用せずに粒子径を制御でき、医薬品、香粧品、食品などの分野において、安全に小胞体を大量製造できる小胞体分散液の製造方法に関するものである。
背景技術
内水相に有用物質を封入させた小胞体やその分散液は、医薬品、香粧品、食品などの様々な分野において重要な技術である。特に粒子径や被覆層数の均一化、内包効率の向上、小胞体の高収率化は、小胞体製品の量産に必要不可欠な課題である。また、前記の各分野においては、製品の安全性も必須の条件であるが、とくに、静注用製剤等の医薬品として利用される場合には、小胞体の粒子径や有用物質の封入量などが厳密に規格化されることが要求される。
しかし一般的に生体において使用される水性媒体中では、二分子膜を構成する脂質成分は分散し難く、粒子径分布が広い多重層小胞体を形成するという問題があった。そこで、何らかの手法で粒子径を均一に揃え、有用物質の封入効率を向上させる必要があった。
小胞体に目的物質を封入する方法としては、これまで、封入させたい物質を溶解した水溶液に超音波照射、強制撹拌（ホモジナイザー）、ボルテックスミキサーにより脂質を分散させて小胞体分散液とする等の様々な方法が報告、実施されてきた。しかしこれらの方法は、いずれも、封入効率が低く、得られる小胞体の粒子径分布も広いものであった。
封入効率が高く、高分子物質の封入に好適である方法としては、封入させたい物質を溶解した水溶液に脂質を機械的撹拌によって分散させ、凍結と融解を繰り返すことにより小胞体分散液とする凍結融解法が知られているが、溶質濃度が高い場合には、溶質の凍結保護作用により凍結融解の効果が得られないという問題があった。（この出願の発明者らは、高濃度ヘモグロビン溶液（３５ｇ／ｄＬ）について小胞体分散液の凍結融解を試みたが、粒子径分布や封入効率に全く変化が認められず、効果がないことが確認された。）
一方、封入効率が比較的高く、粒子径を制御しやすい方法としては、揮発性有機溶媒に溶解させた脂質溶液を、封入させたい物質の水溶液に注入し、該有機溶媒を揮発させて小胞体分散液とする有機溶媒注入法、界面活性剤と脂質の混合ミセルから透析などの方法により界面活性剤を除去する界面活性剤除去法、水と混和しない有機溶媒に脂質を溶かし、少量の水性媒体を加えて超音波照射などによりｗ／ｏエマルジョンを形成し、減圧下で有機溶媒を除去する逆相蒸発法などが挙げられる。しかし、これらの方法は、いずれも有機溶媒や界面活性剤を使用するため、封入させたい物質、特に蛋白質において、変性や分解が起こりやすい。更に、調製後にこれらを完全に除去することが困難であるなど、安全性の面で問題が多い。
そこで、小胞体分散液における粒子径を均一に制御する好適な方法として、フレンチプレス、加圧ろ過器、あるいはエクストルーダー等を用いて、小胞体分散液を一定の大きさの孔に透過させる押出し法が報告された（特表昭６１−５０２４５２）。しかし、高濃度ヘモグロビン溶液に脂質を分散させた系にこのような押出し法を適用した場合には、透過速度が激減し、フィルターの目詰まりが発生しやすく、フィルター交換が頻繁に必要となるため、コスト高や操作の煩雑さという新たな問題が生じた。そのため、小胞体分散液の量産には好適とは言い難かったのである。これまで、界面活性剤を混合した脂質粉末をヘモグロビン溶液に分散し、界面活性剤を除去してヘモグロビン小胞体を調製する方法、脂質粉末をヘモグロビン溶液に分散して脱水した後、再分散させてヘモグロビン小胞体を調製する方法、ヘモグロビン溶液に混合脂質を分散させた溶液を細隙から高圧吐出させて粒子径をある程度制御したヘモグロビン小胞体を得る方法など、フィルターを使用せずに高濃度ヘモグロビンを封入した小胞体の分散液を得る方法が多数検討されてきた。
さらに、有機溶媒または界面活性剤を使用せず、また封入物質の乾燥を伴わないため蛋白質などの不安定な物質の封入に適した方法としては、予め水性媒体中で小胞体を形成させ、この小胞体分散液から水性媒体を除去して得られる乾燥体を目的封入物質の水溶液に分散させる方法が報告されている（特表平８−５０５８８２）。しかし、このような乾燥体を水和させるだけでは有用物質は殆ど封入されず、強制撹拌、微小流動体化（マイクロフルイダーザー）、超音波照射などによる再構成が必要で、それにより粒子径の制御が困難となってしまう。また、前記の有機溶媒注入法により小胞体構成成分を水性溶液に分散させ、凍結乾燥した混合脂質をこの水性溶液に分散させた小胞体分散液は、押出し法によるフィルターの目詰まりを起こさないことが知られている（特開平９−８７１６８）。しかし、有機溶媒を使用するため、安全性の面で静注用製剤の製造には適していない。
したがって、最終目的とする小胞体の粒子径、封入効率、フィルター透過性を考慮した前調製の条件設定はなされていない。
この出願の発明者らは、ヘモグロビン等の有用物質を封入した小胞体分散液を静注用製剤として利用するためには、厳密な粒子径の制御と、高い安全性が要求される点を考慮し、界面活性剤や有機溶媒を添加せずに粒子径の厳密な制御が可能な押出し法を基に最適な手法について検討を重ねてきた。
高濃度、高純度のヘモグロビン溶液に混合脂質乾燥体を分散させ、これを均一孔径のフィルターに順次透過させてヘモグロビン小胞体を製造する方法は、前記のとおりに、高濃度ヘモグロビン溶液自体の高粘性と操作中に僅かに生じるヘモグロビン変性体により、透過速度が低下しやすく、目詰まりが起こりやすかった。そのため、フィルター透過に長時間を要し、効率化のために膜面積を増大させた場合には、フィルターの細孔に残存する分散液が多くなり、収率が低下するという問題があった。さらに、分散液を孔径の異なるフィルターに順次透過させるため、必要なフィルターの種類も多く、フィルター交換が煩雑となり、さらなる収率の低下やコストの増大に繋がった。
発明の開示
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解決し、高効率で高濃度の有用物質を封入でき、均一な粒子径を有する小胞体を高い収率で、安全に、かつ簡便に製造する方法を提供することを課題としている。
発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして、第１には、水溶性物質を小胞体に封入し、小胞体の粒子径を制御する小胞体分散液の製造方法であって、少なくとも一種以上の脂質を水性媒体に分散させる工程と、得られた小胞体を乾燥して乾燥小胞体とする工程と、該乾燥小胞体を前記水溶性物質の水性溶液に分散させる工程と、得られた小胞体分散液をフィルターに透過させる工程を順に行う小胞体分散液の製造方法を提供する。
この出願の発明は、第２には、前記第１の発明の小胞体分散液の製造方法において、一種以上の脂質を水性媒体に分散させる工程と、得られた小胞体を乾燥して乾燥小胞体とする工程との間に１回以上の凍結融解操作を行う小胞体分散液の製造方法を提供する。
第３には、この出願の発明は、前記第１および第２の発明において、脂質の一種がポリエチレングリコール型脂質である小胞体分散液の製造方法を提供する。
さらに、第４には、この出願の発明は、前記ポリエチレングリコール型脂質の濃度が０．０１〜１モル％である小胞体分散液の製造方法を提供する。
この出願の発明は、また、第５には、乾燥小胞体が、小胞体を凍結乾燥して得るものである小胞体分散液の製造方法、第６には、乾燥小胞体が、小胞体を噴霧乾燥して得られるものである小胞体分散液の製造方法を提供する。
第７には、この出願の発明は、前記第１〜６の発明において、水溶性物質が、ヘモグロビンおよびストローマフリーヘモグロビンからなる群より選択される小胞体分散液の製造方法を、そして、第８には、ヘモグロビンまたはストローマフリーヘモグロビンの水性溶液の濃度が１０〜５０ｇ／ｄＬである小胞体分散液の製造方法をも提供する。
この出願の発明の小胞体分散液の製造方法では、小胞体の膜構成脂質は、水性媒体中で二分子膜構造を形成しうる種々の両親媒性分子から選択される一種以上の脂質とする。好ましくは天然または合成の飽和リン脂質、不飽和リン脂質、およびこれらの組合せである。
飽和リン脂質としては、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチンなどの天然リン脂質やその誘導体、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンなどが例示される。また、不飽和リン脂質としては、卵黄レシチン、大豆レシチン、１，２−ビス（２，４−オクタデカジエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン、１，２−ビス−（８，１０，１２−オクタデカトリエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリンなどの重合性基を有する重合性リン脂質が例示される。このとき、重合性リン脂質は、非重合性の長鎖を有していてもよく、非重合性の長鎖としては、炭素数２〜２４の直鎖あるいは分岐鎖のアルキル基、アシル基、非重合性アルケニル基、非重合性アルケノイル基などが挙げられる。
小胞体の膜構成脂質として、とくに好ましくは、ポリエチレングリコール型脂質を含有する混合脂質である。ポリエチレングリコール鎖は、乾燥小胞体を水性溶液に分散させる後の工程において小胞体の粒子径変化を抑制する効果が高く、また、凝集を抑制するため、最終工程で押出し法を行う際に、小胞体の凝集によるフィルター透過性の低下や目詰まりを防止でき好ましい。ポリエチレングリコール型脂質の含有量としては、混合脂質の０．０１〜１モル％とすることが好ましいが、より好ましくは０．１〜０．３モル％である。０．１モル％より少ない場合は凝集抑制効果が弱くなり、また０．３モル％より多い場合は小胞体内相に伸びたポリエチレングリコール鎖の排除体積効果により水溶性物質の封入効率が低下する傾向があるためである。さらに、ポリエチレングリコールの分子量は２，０００〜１２，０００程度とすることが好ましい。
この出願の発明の小胞体分散液の製造方法では、小胞体の膜構成脂質として、負電荷脂質を有していてもよく、例えば、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、脂肪酸等が好ましく使用できる。このとき、負電荷脂質の含有量はとくに限定されないが、１〜５０モル％であることが好ましく、より好ましくは５〜２０モル％とする。負電荷脂質の含有量が１モル％未満である場合には封入効率が低下したり、小胞体の凝集が発生しやすくなり、５０モル％以上の場合には、小胞体膜が不安定となる場合があり好ましくない。
さらに、この出願の発明の小胞体分散液の製造方法では、小胞体の膜構成脂質として用いられる脂質成分として、安定化剤を添加していてもよい。このような安定化剤としてはステロール類が好ましく、具体的には、エルゴステロール、コレステロール等が挙げられるが、好ましくはコレステロールである。コレステロールの含有量はとくに限定されないが、小胞体膜を効果的に安定化するためには、２０〜６０モル％とすることが好ましい。
この出願の発明の小胞体分散液の製造方法では、「前調製」として、以上のとおりの一種以上の脂質を水性媒体に分散し、予め小胞体を形成する。このような前調製では、例えば、混合脂質粉末に水性媒体を加えて脂質粉末を水和、膨潤させた後、静置したり、ボルテックスミキサー、強制撹拌機、超音波照射機、ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、高圧押出し機（エクストルーダー）、凍結融解などにより脂質を分散させ小胞体を得ることができる。中でも凍結融解法は被覆層数を有効に減少でき、フィルターの透過性が著しく向上するため、好ましい。水性媒体中の脂質を分散させ、小胞体を前調製する方法は、これらの方法に限定されないが、有機溶媒注入法、界面活性剤除去法、逆送蒸発法、有機溶媒小球蒸発法などは残存物を完全に除去するのが困難であるため好ましくない。
前調製において得られる小胞体は、後の工程を経てその粒子径が１．３〜４倍縮小されることが発明者らの鋭意研究により明らかになっている。したがって、前調製においては、小胞体の粒子径は、最終的に目標とする小胞体の粒子径の１．３〜４倍とすることが好ましい。目標とする小胞体の粒子径は、小胞体分散液の用途に応じて変更でき、とくに限定されないが、例えば、ヘモグロビン含有小胞体分散液を静注製剤として用いる場合には、最終的な小胞体の粒子径は、７０ｎｍ〜３００ｎｍであることが好ましい。
このように前調製の段階で小胞体の粒子径をある程度制御する方法としては、種々のものが例示される。例えば、市販の脂質粉末を１〜５ｇ／ｄＬの濃度で水性媒体に添加し、室温で静置することによって０．５〜３００μｍの多重層小胞体が得られる。この小胞体分散液をボルテックスミキサーで５分程度処理すれば０．３〜３μｍの多重層小胞体が得られ、プローブ型超音波照射機により相転移温度以上で５分間処理すれば２０〜２００ｎｍの粒子径を有する小胞体が得られる。また、室温静置で得られた多重層小胞体を高圧押出し機に透過させれば、使用する分散液の濃度とフィルターの細孔の大きさに応じた粒子径分布の狭い任意の粒子径の小胞体を得ることができる。例えば、１〜１０ｇ／ｄＬ程度の脂質濃度で、０．０３〜３μｍの細孔径を有するフィルターを用いることにより最終的に透過させるフィルターの細孔径に応じた粒子径に調整できる。
以上のとおりの方法により前調製された小胞体分散液は、さらに粒子径分布を小さくするために、種々の方法により分画分取されてもよい。例えば超遠心分離、ゲル濾過などが考慮される。このようにして前調製された小胞体の粒子径は、様々な公知の方法によって測定できる。例えば動的光散乱法、電子顕微鏡法などが適用できる。
この出願の発明の小胞体分散液の製造方法では、水性媒体としては、純水、水溶液、緩衝溶液などが考慮される。小胞体分散液の用途に応じて適宜選択できるが、好ましくは生体において安全性の高い注射用水や生理食塩水である。
この出願の発明の小胞体分散液の製造方法では、前調製された小胞体を乾燥して乾燥小胞体とする。このとき、乾燥方法は、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥（スプレードライ）、クラックスなど、どのようなものであってもよく、とくに限定されないが、水性媒体を除去した後も小胞体構造を保持するためには、急冷凍結後に水分を除去する凍結乾燥法や小胞体分散液を噴霧して急激に乾燥する噴霧乾燥法が好ましい。もちろん、小胞体構造が保持されるものであれば、これらの方法に限定されない。
この出願の発明の小胞体分散液の製造方法では、次に、前調製された小胞体を乾燥して得られる乾燥小胞体を小胞体中に封入したい水溶性物質の水性溶液に添加する。前調製で得られた乾燥小胞体は、親水基を外側に向けた配向をとっているため、激しい撹拌や加熱などを行わなくても、水溶性物質の水溶液に短時間で完全に分散できる。
このとき、水溶性物質は、例えば種々の医薬品や医薬品の前駆体などの合成物質、ヘモグロビンや酵素などの天然物質、植物からの抽出物など様々なものが考慮される。例えば、ヘモグロビン溶液を用いれば、得られる小胞体分散液は人工酸素運搬体として好ましいものとなり得る。このようなヘモグロビン溶液としては、ヒト由来、ウシ由来の赤血球を常法によって溶血し、遠心分離や限外濾過によりストローマ成分のみを除去したストローマフリーヘモグロビン溶液、あるいはその溶液からヘモグロビンを単離した精製ヘモグロビン溶液、あるいはリコンビナントヘモグロビン溶液で、限外濾過により１０ｇ／ｄＬ以上に濃縮したものが使用される。酸素運搬体として充分量の酸素を生体組織に供給するためにはヘモグロビン濃度を２０〜５０ｇ／ｄＬとすることが好ましい。
さらに、小胞体に封入させる水溶性物質は、一種に限定されず、様々な物質の組み合せであってもよい。例えば、ヘモグロビン溶液を封入する場合には、イノシトールリン酸、ピリドキサール５’リン酸などの有機リン化合物を添加し、ヘモグロビンの酸素親和度を調節してもよい。また、ヘモグロビンの還元剤としてシステイン、ホモシステイン、グルタチオンなどのチオール類やアスコルビン酸など水溶性ビタミン類などを加えてもよい。さらには、活性酸素除去剤として、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼを加えることも考慮される。
この出願の発明の小胞体の製造方法では、前調製した乾燥小胞体を水溶性物質の水溶液に再分散させると、粒子径がやや増大する傾向が見られる。このような増大はもとの粒子径の３０％以内であり影響は大きくないが、前記のとおりに小胞体の膜構成脂質として、ポリエチレングリコール型脂質を含有する場合、ポリエチレングリコール鎖が保護剤として作用するため、このような粒子径の変化は殆ど起こらない。
この出願の発明の小胞体分散液の製造方法では、水溶性物質の水性溶液に前記の乾燥小胞体を分散させた後、得られる小胞体分散液を高圧下で均一孔径のフィルターに透過させる。このような押出し法を用いることにより、水溶性物質の小胞体への封入がより効率よく進行し、同時に、小胞体の粒子径を均一化できる。
このとき用いられるフィルターは、耐水性があり、目的とする小胞体の粒子径に対応する細孔径を有するものであれば単独あるいはそれよりも大きい細孔径を有するフィルターを組合わせて用いられる。例えば、膜面積３．１ｃｍ２のＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）を用いることができる。添加する試料の量は膜面積等に応じて適宜選択できる。また、圧力もとくに限定されず、膜が破砕しない限り、好ましい透過速度を維持できる圧力を選択すればよい。一般的には、２０ｋｇ／ｃｍ２以下の圧力が用いられる。
前記のとおり、フィルター透過により最終的に得られる小胞体の粒子径は、前調製された小胞体の粒子径の１．３〜４倍小さくなる。したがって、この点を考慮して前調製される小胞体の粒子径を設定する必要がある。１．３倍より小さい粒子を前調製した場合には、フィルター透過工程において、小胞体がフィルターを素通りするため、小胞体の再構成が行われず、封入効率が増大しない。また、４倍より大きな粒子を前調製した場合には、フィルター透過率が低下し、フィルターが詰まりやすくなるため、処理工程が増え、小胞体分散液の大量製造には適さない。
この出願の発明の小胞体分散液の製造方法は、以上のとおりのものであるが、前記のとおりの前調製工程と乾燥工程、乾燥小胞体を水溶性物質の水性溶液に添加する工程、得られた小胞体分散液をフィルターに透過させる工程以外に、凍結融解、攪拌、加熱などの操作を含んでいてもよい。また、小胞体に封入されずに残存した水溶性物質を超遠心分離、ゲルろ過担体を充填したカラム、限外濾過膜などにより除去してもよい。さらに、フィルター透過工程では、フィルターは１種に限定されず、同一細孔径のフィルターを繰り返し用いてもよいし、細孔径の異なる種々のものを用いて順次小胞体の粒子径を小さくしてもよい。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
実　施　例
以下の実施例および比較例において、ヘモグロビンの封入効率は未封入ヘモグロビンを除去して得られたヘモグロビン封入小胞体分散液中のヘモグロビン重量（Ａ）を総脂質重量（Ｂ）で除した数値（Ａ／Ｂ）として測定した。従ってＡ／Ｂの数値が大きい程ヘモグロビン封入効率は高いといえる。
ヘモグロビン重量はシアノメトヘモグロビン法、総脂質重量は過マンガン酸塩灰化法によるリン定量や酵素的測定法によるコレステロール定量から算出できるが、ここでは市販されている定量キットを用いた。
フィルター透過性は、膜面積３．１ｃｍ２のＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）に試料分散液を５ｍＬ導入し、一定圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）で加圧しながら透過液を目盛付きシリンダーに受け、液面の上昇速度をビデオ撮影して評価した。
＜実施例１＞
小胞体膜構成物質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン１４４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、コレステロール７６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール２９ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）からなる混合脂質を注射用水５ｍＬに分散させ、２５℃で攪拌して多重層小胞体分散液を得た。この分散液を液体窒素で凍結し２５℃で融解させる凍結融解サイクルを３回繰り返し、粒径５００ｎｍの小胞体分散液を得た。この小胞体分散液を噴霧乾燥し、乾燥小胞体を得た。得られた乾燥小胞体をヘモグロビン溶液５ｍＬ（３５ｇ／ｄＬ）に添加し、２５℃で２時間撹拌した。これをＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）しながら１４℃で孔径３．０μｍ、０．８μｍ、０．６５μｍ、０．４５μｍ、０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィルター（富士フィルム製）に順次透過させた。
いずれのフィルターにおいても目詰まりは起きず、透過性は良好であった。
作成した試料について超遠心分離（１００，０００ｇ、６０分）を３回繰り返し、残存ヘモグロビンを除去した。こうして得られたヘモグロビン小胞体の粒子径は、動的光散乱装置（ＣＯＵＬＴＥＲ　Ｎ４ＳＤ）により２５５±５２ｎｍと測定された。
市販のリン定量キットおよびヘモグロビン定量キットを用いて、リン定量、ヘモグロビン定量を行った。リン定量から総脂質重量を求め、ヘモグロビン重量を総脂質重量で除してヘモグロビン／総脂質比を算出したところ、１．７と算出された。
＜比較例１＞
実施例１と同様の方法で小胞体を前調製した後、噴霧乾燥を行わずに超遠心分離（３００，０００ｇ、６０分）にて小胞体を沈殿させ、上澄みを除去してヘモグロビン溶液５ｍＬ（３５ｇ／ｄＬ）に分散させた。
これをＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）しながら１４℃で孔径３．０μｍ、０．８μｍ、０．６５μｍ、０．４５μｍ、０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィルター（富士フイルム製）に順次透過させた。
いずれのフィルターにおいても透過性は良好であった。
作成した試料について超遠心分離（１００，０００ｇ、６０分）を３回繰り返し、残存ヘモグロビンを除去した。こうして得られたヘモグロビン小胞体の粒子径は、動的光散乱装置（ＣＯＵＬＴＥＲ　Ｎ４ＳＤ）により２５０±５０ｎｍと測定された。
市販のリン定量キットおよびヘモグロビン定量キットを用いて、リン定量、ヘモグロビン定量を行った。リン定量から総脂質重量を求め、ヘモグロビン重量を総脂質重量で除してヘモグロビン／総脂質比を算出したところ、０．８と算出された。
表１に実施例１および比較例１のヘモグロビン／総脂質比を示した。
2002038128.tif 000002
表１より、小胞体分散液の製造において、乾燥小胞体を得る工程を含まない場合（比較例１）、乾燥小胞体を得る工程を含んだ場合（実施例１）と同様にフィルター透過性は良好であることが分かった。しかし、乾燥小胞体を得る工程を含まないことにより、エクストルージョンによる封入効率は低下することが示された。これは、最初に小胞体を作製する際に使用した水性媒体が小胞体内相に残存するためと考えられる。
＜実施例２＞
小胞体膜構成物質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン４３２ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、コレステロール２２８ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール８７ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）からなる混合脂質を注射用水１５ｍＬに分散させ２５℃で攪拌し多重層小胞体分散液を得た。この溶液を５ｍＬずつ３つに分注し、（ａ）前処理による粒子径調製を行わない系、（ｂ）エクストルージョンにより粒子径を５００ｎｍに調製した系、（ｃ）エクストルージョンにより粒子径を２５０ｎｍに調製した系として、液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１２時間凍結乾燥して乾燥小胞体を得た。
各々の試料についてストローマフリーヘモグロビン溶液５ｍＬ（３５ｇ／ｄＬ）を添加し、１４℃で２時間撹拌してヘモグロビン小胞体分散液を得た。
これをＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）しながら１４℃で孔径３．０μｍ、０．８μｍ、０．６５μｍ、０．４５μｍ、０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィルター（富士フイルム製）に順次透過させた。
いずれのフィルターにおいても目詰まりは起きず、透過性は良好であった。
作成した試料について超遠心分離（１００，０００ｇ、６０分）を３回繰り返し、残存ヘモグロビンを除去した。こうして得られたヘモグロビン小胞体の粒子径は、動的光散乱装置（ＣＯＵＬＴＥＲ　Ｎ４ＳＤ）にて測定した。
市販のリン定量キットおよびヘモグロビン定量キットを用いて、リン定量、ヘモグロビン定量を行った。リン定量から総脂質重量を求め、ヘモグロビン重量を総脂質重量で除してヘモグロビン／総脂質比を算出した。
表２に得られた小胞体のフィルター透過性、粒子径、およびヘモグロビン封入効率（ヘモグロビン／脂質）を示した。
2002038128.tif 000003
前調製における粒子径（１，８００ｎｍ）が目的とする粒子径（２６５ｎｍ）の７倍のもの（試料（ａ））ではフィルター透過性が低いため、より大きな孔径のフィルターを用いて押出す必要があった。前調製における粒子径（２５８ｎｍ）が目的とする粒子径（２５０ｎｍ）の１倍のもの（試料（ｃ））ではフィルター透過性は高いものの、小胞体がフィルター細孔を素通りしたため、封入効率の低下が見られた。
一方、前調製における粒子径（５１５ｎｍ）が目的とする粒子径（２５６ｎｍ）の２倍のもの（試料（ｂ））では、良好なフィルター透過性と高い封入効率が得られた。
＜実施例３＞
小胞体膜構成脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン１４４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、コレステロール７６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール２９ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）、ジステアロイル−Ｎ−モノメトキシ−ポリエチレングリコール（分子量：５，０００）−サクシニルホスファチジルエタノールアミン７ｍｇ（１．３μｍｏｌ）を秤量し、１０ｍＬのナス型フラスコに加えた。ここにベンゼン５ｍＬを加え加温しながら完全溶解させた。これを液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１２時間凍結乾燥して白色粉末を得た。これを注射用水５ｍＬに添加して２５℃で攪拌し、粒子径１．８μｍの小胞体分散液を得た。この小胞体分散液を液体窒素で凍結して２５℃で融解させる凍結融解サイクルを４回繰返し、粒径５２０ｎｍの小胞体分散液を得た。この分散液を液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１５時間凍結乾燥して白色乾燥小胞体を得た。
乾燥小胞体にヘモグロビン溶液５ｍＬ（３５ｇ／ｄＬ）を添加し、２５℃で攪拌してヘモグロビン小胞体分散液を得た。この時小胞体の粒子径は５４０ｎｍであり、乾燥前の粒子径をほぼ保持していた。
これをＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）しながら１４℃で孔径３．０μｍ、０．８μｍ、０．６５μｍ、０．４５μｍ、０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィルター（富士フイルム製）に順次透過させた。透過挙動をビデオ撮影し、各フィルターにおける透過に要する時間と透過量を測定した。
図１に透過量と時間の関係を示した。
図１に示されるように、この出願の発明の小胞体分散液の製造方法により、良好なフィルター透過性を保ったまま目的粒子径２５０ｎｍが得られ、ヘモグロビン／総脂質比は１．７でヘモグロビンを封入させることができた。
＜比較例２＞
実施例３と同様の方法で小胞体を調製した後、凍結融解による粒径制御を行わずに、このものを液体窒素で凍結し、凍結乾燥機に装着し、１２時間凍結乾燥して白色粉末状の乾燥小胞体を得た。
乾燥小胞体にヘモグロビン溶液５ｍＬ（３５ｇ／ｄＬ）を添加し、２５℃で攪拌しながらヘモグロビン小胞体分散液を得た。
これをＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）しながら１４℃で孔径３．０μｍ、０．８μｍ、０．６５μｍ、０．４５μｍ、０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィルター（富士フイルム製）に順次透過させた。透過挙動をビデオ撮影し、各フィルターにおける透過に要する時間と透過量を測定した。
図２に透過量と時間の関係を示した。
図２より、前調製による粒子径の制御を行わない従来法では、各フィルターにおける透過速度が実施例３における場合と比較して低下することが示された。
＜実施例４＞
小胞体膜構成脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン８．６４ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）、コレステロール４．５６ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール１．７４ｇ（２．４ｍｍｏｌ）、ジステアロイル−Ｎ−モノメトキシ−ポリエチレングリコールサクシニルホスファチジルエタノールアミン０．４２ｇ（７８μｍｏｌ）からなる混合脂質を水酸化ナトリウム水溶液（［水酸化ナトリウム］＝８ｍＭ）３００ｍＬに分散させ、２５℃で攪拌して多重層小胞体分散液を得た。
この小胞体分散液を液体窒素で凍結して２５℃で融解させる凍結融解サイクルを４回繰返し、粒径５２０ｎｍの小胞体分散液を得た。これを液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１５時間凍結乾燥して白色乾燥小胞体を得た。
乾燥小胞体にヘモグロビン溶液３００ｍＬ（３５ｇ／ｄＬ）を添加し、１４℃で２時間撹拌して小胞体分散を得た。この分散液を１５０ｍＬずつ２つに分注し、（ｄ）膜面積４５．３ｃｍ２のレモリーノ（商品名、ミリポア製）に加え、加圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）しながら１４℃で孔径０．６５μｍ、０．４５μｍ、０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィルター（富士フイルム製）を順次透過させた系、（ｅ）マイクロフルイダイザーに加え、１０，０００ｐｓｉで１０サイクルの操作を行った系とした。
各試料について超遠心分離（１００，０００ｇ、６０分）を３回繰り返し、未内包ヘモグロビンを除去した。こうして得たヘモグロビン小胞体分散液の粒子径は、動的光散乱装置（ＣＯＵＬＴＥＲ　Ｎ４ＳＤ）により測定した。市販のリン定量キット及びヘモグロビン定量キットを用いて、リン定量、ヘモグロビン定量を行い、ヘモグロビン重量を総脂質重量で除してヘモグロビン／総脂質比を算出した。
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表３から、粒子径調整にマイクロフルイダイザーを用いることにより、比較的低い封入効率が得られ、粒子径分布が広く、サイズ分画工程が必要となるため、工程が煩雑になり、収率が低下することが示された。
一方、押出し法を用いた場合は、粒子径分布が狭い範囲に制御され、封入効率も高いことが確認された。
＜実施例５＞
小胞体膜構成物質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン１４４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、コレステロール７６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール２９ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）ジステアロイル−Ｎ−モノメトキシ−ポリエチレングリコール（分子量：５０００）−サクシニルホスファチジルエタノールアミン７ｍｇ（１．３μｍｏｌ）を秤量し、１０ミリリットルのナス型フラスコに加えた。ここにベンゼン５ｍＬを加え加温しながら完全溶解させた。これを液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１２時間凍結乾燥して白色粉末を得た。これを注射用水２５ｍＬに添加して２５℃で攪拌して多重層小胞体分散液を得た。この小胞体分散液を液体窒素で凍結して２５℃で融解させる凍結融解サイクルを４回繰返し、粒径５００ｎｍの小胞体分散液を得た。これを液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１５時間凍結乾燥して白色乾燥小胞体を得た。
乾燥小胞体にヘモグロビン溶液５ｍＬ（３５ｇ／ｄＬ）を添加し、２５℃で攪拌し小胞体分散ヘモグロビン溶液を得た。この時小胞体の粒子径は５２０ｎｍであり、乾燥前の粒子径をほぼ保持していた。これをＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）しながら１４℃で孔径３．０μｍ、０．４５μｍ、０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィルター（富士フイルム製）を順次透過させた。何れのフィルターにおいても透過性は極めて良好であった。
＜比較例３＞
小胞体膜構成物質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン１４４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、コレステロール７６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール２９ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）を秤量し、１０ミリリットルのナス型フラスコに加えた。ここにベンゼン５ｍＬを加え加温しながら完全溶解させた。これを液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１２時間凍結乾燥して白色粉末を得た。これを注射用水２５ｍＬに添加して２５℃で攪拌し多重層小胞体分散液を得た。この小胞体分散液を液体窒素で凍結して２５℃で融解させる凍結融解サイクルを４回繰返し、粒径５２０ｎｍの小胞体分散液を得た。これを液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１５時間凍結乾燥して白色乾燥小胞体を得た。
乾燥小胞体にヘモグロビン溶液５ｍＬ（３５ｇ／ｄＬ）を添加し、２５℃で攪拌し小胞体分散ヘモグロビン溶液を得た。この時小胞体の粒子径は６５０ｎｍであり、乾燥前の粒子径から僅かな増大が認められた。これをＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）しながら１４℃で孔径３．０μｍ、０．４５μｍ、０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィルター（富士フイルム製）を順次透過させた。何れのフィルターにおいても透過性は良好であったが、ポリエチレングリコール型脂質を導入した系と比較すると０．４５μｍ以下のフィルター透過速度の低下が認められた。
＜比較例４＞
小胞体膜構成物質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン１４４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、コレステロール７６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール２９ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）、ジステアロイル−Ｎ−モノメトキシ−ポリエチレングリコール（分子量：５，０００）−サクシニルホスファチジルエタノールアミン６１ｍｇ（１１．３μｍｏｌ）を秤量し、１０ミリリットルのナス型フラスコに加えた。ここにベンゼン５ｍＬを加え加温しながら完全溶解させた。これを液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１２時間凍結乾燥して白色粉末を得た。これを注射用水２５ｍＬに添加して２５℃で攪拌して多重層小胞体分散液を得た。この小胞体分散液を液体窒素で凍結して２５℃で融解させる凍結融解サイクルを４回繰返し、粒径５００ｎｍの小胞体分散液を得た。ここれを液体窒素で凍結後、凍結乾燥機に装着し、１５時間凍結乾燥して白色乾燥小胞体を得た。
乾燥小胞体にヘモグロビン溶液５ｍＬ（３５ｇ／ｄＬ）を添加し、２５℃で攪拌し小胞体分散ヘモグロビン溶液を得た。この時小胞体の粒子径は５００ｎｍであり、乾燥前の粒子径を保持していた。これをＥＸＴＲＵＤＥＲ（登録商標）（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ／ｃｍ２）しながら１４℃で孔径３．０μｍ、０．４５μｍ、０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィルター（富士フイルム製）を順次透過させた。何れのフィルターにおいても透過性は極めて良好であったが、ヘモグロビン内包効率の低下が認められた。
表４に実施例５および比較例３、４の前調製の粒子径、ヘモグロビン溶液に分散後の粒子径、フィルター透過性、ヘモグロビン／総脂質比（重量／重量）を示した。
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産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、高効率で高濃度の有用物質を封入でき、均一な粒子径を有する小胞体を高い収率で、安全に、かつ簡便に製造する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の実施例において、この発明の小胞体分散液の製造方法におけるヘモグロビン小胞体分散液のフィルター透過速度を示した図である。
図２は、この発明の実施例において、従来の小胞体分散液の製造方法におけるヘモグロビン溶液のフィルター透過速度を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年6月17日(2002.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性物質を小胞体に封入し、小胞体の粒子径を制御する小胞体分散液の製造方法であって、少なくとも、一種以上の脂質を水性媒体に分散させる工程と、１回以上の凍結融解工程と、得られた小胞体を乾燥して乾燥小胞体とする工程と、該乾燥小胞体を前記水溶性物質の水性溶液に分散させる工程と、得られた小胞体分散液をフィルターに透過させる工程を順に行うことを特徴とする小胞体分散液の製造方法。
【請求項２】
削除
【請求項３】
脂質の一種がポリエチレングリコール型脂質である請求項１の小胞体分散液の製造方法。
【請求項４】
ポリエチレングリコール型脂質の濃度が０．０１〜１モル％である請求項３の小胞体分散液の製造方法。
【請求項５】
乾燥小胞体は、小胞体を凍結乾燥して得る請求項１、３、または４のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項６】
乾燥小胞体は、小胞体を噴霧乾燥して得る請求項１、３、または４のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項７】
水溶性物質が、ヘモグロビンおよびストローマフリーヘモグロビンからなる群より選択される請求項１、３、４、５、または６のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項８】
ヘモグロビンまたはストローマフリーヘモグロビンの水性溶液の濃度が１０〜５０ｇ／ｄＬである請求項７の小胞体分散液の製造方法。
【請求項９】
水溶性物質を小胞体に封入し、小胞体の粒子径を制御する小胞体分散液の製造方法であって、少なくとも、一種以上の脂質を水性媒体に分散させる工程と、１回以上の凍結融解操作により最終的に調製される小胞体の粒子径の１．３〜４倍の粒子径に制御する工程と、この粒子径を保持したまま小胞体を乾燥して乾燥小胞体とする工程と、該乾燥小胞体を前記水溶性物質の水性溶液に分散させる工程と、得られた小胞体分散液をフィルターに透過させる工程を順に行うことを特徴とする小胞体分散液の製造方法。
【請求項１０】
脂質の一種がポリエチレングリコール型脂質である請求項９の小胞体分散液の製造方法。
【請求項１１】
ポリエチレングリコール型脂質の濃度が０．０１〜１モル％である請求項１０の小胞体分散液の製造方法。
【請求項１２】
乾燥小胞体は、小胞体を凍結乾燥して得る請求項９ないし１１のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項１３】
乾燥小胞体は、小胞体を噴霧乾燥して得る請求項９ないし１１のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項１４】
水溶性物質が、ヘモグロビンおよびストローマフリーヘモグロビンからなる群より選択される請求項９ないし１３のいずれかの小胞体分散液の製造方法。
【請求項１５】
ヘモグロビンまたはストローマフリーヘモグロビンの水性溶液の濃度が１０〜５０ｇ／ｄＬである請求項１４の小胞体分散液の製造方法。
【国際調査報告】
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