(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大動脈を、２カ所以上の場所で遮断することによって、その遮断場所の間に脊髄に通じる栄養血管が分枝している部分を含むように大動脈の分節を形成し、虚血自体では神経障害をきたさない時間、脊髄を虚血にし、かつその時間の間に、その分節にグルタミン酸またはアスパラギン酸を局所投与することによるグルタミン酸またはアスパラギン酸由来の脊髄障害をもった非ヒト動物の製造方法。
【請求項２】
前記動物がウサギ、ラット、ネコ、イヌ、ブタまたはサルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非ヒト動物の大動脈を、２カ所以上の場所で遮断することによって、その遮断場所の間に脊髄に通じる栄養血管が分枝している部分を含むように大動脈の分節を形成し、虚血自体では神経障害をきたさない時間、脊髄を虚血にし、かつその時間の間に、その分節にグルタミン酸またはアスパラギン酸と脊髄障害治療薬とを局所投与することによるグルタミン酸またはアスパラギン酸由来の脊髄障害治療薬の評価方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載された方法によりつくられた動物に、脊髄障害治療薬を投与することによるグルタミン酸またはアスパラギン酸由来の脊髄障害治療薬の評価方法。
【請求項５】
前記動物がウサギ、ラット、ネコ、イヌ、ブタまたはサルである、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタミン酸またはアスパラギン酸の神経毒性に由来する対麻痺等の脊髄障害をもった動物の製造方法及びグルタミン酸またはアスパラギン酸の神経毒性を減弱させることにより、神経を保護する脊髄障害治療薬の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
対麻痺等の脊髄障害は、胸腹部大動脈瘤手術の深刻な合併症であり、特に、対麻痺に関しては、発生率が、大動脈瘤の占拠部位と範囲、大動脈解離の有無によって異なるが、５から２０％と報告されており、これまで対麻痺の発生を防ぐためさまざまな外科的手術手技の改良や薬理学的な脊髄保護が提案されてきたが、未だ完全にこの悲惨な合併症を回避する手段は確立されていない。
従って、対麻痺等の脊髄障害の複雑な病態生理及び病因を解明し、それに応じた治療薬の開発等の研究が要望されており、特に、特定の病因に由来する対麻痺等の脊髄障害をもった実験動物の提供および特定の病因をターゲットとした薬の評価方法が要望されている。今までに、１５分から２０分の腎動脈下の大動脈遮断でウサギの脊髄において神経変性および対麻痺を生じるとの報告がある（MARTINEZ-ARIZALA, A., J, B. LONG, D. D. RIGGAMONTI, J. M. KRAIMER, et al. 1989. Deteriorating stroke model of spinal ischemia in the rabbit is associated with a marked hyperemia. Neurology 39(Suppl 1): 371-372)が、このウサギは対麻痺等が生じた要因が明らかでないため、上記目的の実験動物として必ずしも好ましくない。
一方、近年、脊髄を含む中枢神経系に広く分布する中心的な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸及びアスパラギン酸が、中枢神経細胞に対し、潜在的に神経毒性を持ち、様々な神経疾患の病態生理に関係していることが明らかになっており、また、グルタミン酸及びアスパラギン酸の神経毒性が対麻痺などの脊髄障害に寄与しているのではないかということが最近考えられている。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＲｅｇａｎとＣｈｏｉによって、ラットの脊髄培養細胞を、グルタミン酸溶液にさらすことで、神経変性がおこることが報告されている。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、グルタミン酸の神経毒性を直接示されておらず、ＭａｎｇａｎｏとＳｃｈｗａｒｃｚらによれば、３００ｍＭのグルタミン酸溶液を０．５μｌ／時の速度で２週間海馬に注入したにもかかわらず神経障害は認められなかった。従って、今までに外因性のグルタミン酸またはアスパラギン酸に由来する対麻痺等の脊髄障害をもった動物は得られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、対麻痺などの脊髄障害の要因の一つであるグルタミン酸またはアスパラギン酸に由来する対麻痺をもった動物を提供すること及びこの動物を用いたグルタミン酸またはアスパラギン酸由来の脊髄障害の治療薬の評価方法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、大動脈を、２カ所以上の場所で遮断することによって、その遮断場所の間に脊髄に通じる栄養血管が分枝する部分を含むように大動脈の分節を形成し、脊髄を虚血にし、なおかつ、その分節にグルタミン酸またはアスパラギン酸を局所投与することによる脊髄障害をもった非ヒト動物の製造方法に関する。また、本発明は、非ヒト動物の大動脈を、２カ所以上の場所で遮断することによって、その遮断場所の間に脊髄に通じる栄養血管が分枝する部分を含むように大動脈の分節を形成し、脊髄を虚血にし、なおかつその分節にグルタミン酸またはアスパラギン酸と脊髄障害治療薬とを局所投与することによる、または上記方法によりつくられた脊髄障害をもった非ヒト動物に、脊髄障害治療薬を投与することによる、グルタミン酸またはアスパラギン酸由来の脊髄障害治療薬の評価方法に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明において、「脊髄障害」とは、対麻痺、不全対麻痺または神経変性等をいう。本発明において、「大動脈」とは、脊髄に通じる栄養血管（脊髄根動脈）が分枝する部分の大動脈をいい、動物種によって異なり、ウサギでは腹部大動脈、イヌ、ブタでは胸部大動脈をいう。本発明において、「栄養血管」とは、臓器に血液を供給する動脈をいう。本発明において、「２カ所以上の場所」とは、それらの場所の間における遮断によって形成された分節が脊髄に通じる栄養血管が分枝している部分を含むような場所をいう。遮断によって形成された分節の中に、脊髄に通じる栄養血管以外の血管がある場合にはそれも遮断することが好ましい。本発明において用いられる、「グルタミン酸またはアスパラギン酸」は、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩も包含する。「グルタミン酸またはアスパラギン酸の投与」とは、グルタミン酸等の濃度と投与時間は任意に選択できるが、長時間大動脈を遮断するとグルタミン酸またはアスパラギン酸以外の要因例えば、低酸素、低潅流、血小板の凝集など複数の要因が作用してくるので、遮断による虚血だけでは、脊髄障害が起こらない程度の短時間、グルタミン酸溶液またはアスパラギン酸溶液を投与することが好ましい。本発明でいう「非ヒト動物」とはヒトを除く全ての動物をいい、好ましくはウサギ、ラット、ネコ、イヌ、ブタ及びサルである。本発明において、「脊髄障害治療薬」とは、グルタミン酸またはアスパラギン酸に由来する脊髄障害を治療することを目的とした薬物をいい、例えば、グルタミン酸受容体であるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体、非Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ｎｏｎ−ＮＭＤＡ）受容体等の拮抗薬及びグルタミン酸を細胞外から取り除き、細胞外濃度を低下させることを主な働きをしているグルタミン酸トランスポーターに関与する薬等があげられる。具体的には、ｎｏｎ  ＮＭＤＡ受容体の１つであるα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソアゾール−４−プロピオン酸／カイネート（ＡＭＰＡ／ｋａｉｎａｔｅ）受容体の選択的阻害薬であるＮＢＱＸ（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｎｉｔｏ−７−ｓｕｌｆａｍｏｙｌ−ｂｅｎｚｏ（ｆ）−ｇｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ）等があげられる。「局所投与」とは、遮断により形成した分節内に留置したカテーテルからグルタミン酸溶液および拮抗薬等を注入することをいう。この方法では、少量で高い組織濃度の薬液を脊髄に虚血を維持したままで投与が可能である。好ましくは、Seibel PS, Theodore P, Kron IL, Tribble CG. Regional adenosine attenuates postischemic spinal cord injury J Vasc Sung 1993; 18: 153-60に記載の投与をいう。
【０００６】
以下、本発明の実施の形態の一例として、ウサギを例にして図１に基づいて説明するが、本発明は何らこの例によって限定されるものではない。
【０００７】
（１）グルタミン酸またはアスパラギン酸由来の脊髄障害をもった動物の製造方法
（ｉ）    ウサギに、全身麻酔を施行したのち、仰臥位に固定し、正中切開で開腹し、腹部大動脈１を腎動脈２の直下及び二分岐部（bifurcation ）３直上で剥離する。ヘパリンを静注したのち、カテーテル６を大腿動脈４から腹部大動脈１にむけ挿入する。
（ｉｉ）  ２０ｍＭ以上のグルタミン酸溶液またはアスパラギン酸溶液９を生理的浸透圧になるように調節後上記カテーテル６から注入する。同時に腹部大動脈を血管鉗子５を用いて、腎動脈２下で遮断する。大腿動脈から挿入したカテーテル６を、二分岐部で腹部大動脈の周囲を回したテープ１０を図１のように外側から締め、血流を遮断する。このとき、テープ１０を強く締めすぎて、注入用カテーテルを閉塞させないように注意する。後腸間膜動脈１１も同時に血管鉗子５で遮断する。グルタミン酸溶液またはアスパラギン酸溶液をポンプ８を通した後加温器７で３９℃に加温し、３〜５分間、遮断した分節に注入する。対照群では、グルタミン酸溶液等のかわりに生理的食塩水９を同じ注入速度で、同様に注入する。注入後、血管鉗子５をはずし、二分岐部周囲のテープをゆるめ、血流を再開する。注入用のカテーテル６を抜去し、腹壁を２層に閉じる。
（ｉｉｉ）手術後、所定時間後に、下肢の神経学的所見をＴａｒｌｏｖのｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｃｏｒｅに従って、評価する。
ホルマリンで固定した後、ＨＥ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）染色、Ｌｕｘｏｌ−ｆａｓｔ−ｂｌｕｅ染色及びＮｉｓｓｌ染色で染色後、光学的顕微鏡で病理組織学的検索を行い、評価する。
【０００８】
（２）グルタミン酸またはアスパラギン酸由来の脊髄障害治療薬の評価方法
（ａ）  対照群は、上記方法（１）における実験群と同様に作成し、実験群は、上記方法における実験群において注入する２０ｍＭ以上のグルタミン酸溶液またはアスパラギン酸溶液の外に脊髄障害治療の薬効を検査するための薬も注入すること以外は上記方法（１）と同様な方法により作成し、上記方法（１）と同様な神経学的所見及び病理組織学的検索を行い、その結果を実験群のものと対照群のものと比較することによって、上記薬の脊髄障害治療効力を調べる。
そして、上記方法（１）に述べた脊髄障害の発症が有意に抑制された場合には、脊髄障害治療薬は治療効力を有すると評価される。
（ｂ）  対照群及び実験群ともに、上記方法（１）における実験群と同様に作成し、実験群には脊髄障害治療の薬効を検査するための薬を投与し、対照群は生理的食塩水を投与する。評価方法は（ａ）と同様に行う。（ｂ）における薬の投与経路は、静注、皮下注、筋注、腹腔内投与、脊髄腔内投与などとくに限定されない。
（ａ）の方法の方が薬の投与経路がグルタミン酸等を注入する経路と同じため少量の薬で脊髄組織での局所濃度を上昇させることができる点で有利である。
【０００９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
例１
３．５−４．０kgのニュージランド白ウサギ（New Zealand white rabbit) を使用した。前投薬は使用せず、１．５％ハロセンと９８．５％酸素の吸入による全身麻酔を施行した。兎は、仰臥位に固定し、自発呼吸下にて手術を行なった。気管内挿管や人工呼吸器による呼吸補助は行なわなかった。耳静脈に２４Ｇの静脈ラインを確保した。セファゾリン１０mg／kgを静注した。動脈圧は中心耳動脈で、体温は直腸温を持続的に測定した。加温用マットを用いて、動物の体温を維持した。滅菌下において正中切開で開腹した。腹部大動脈を腎静脈の直下および二分岐部（bifurcation ）直上で剥離した。抗凝固のため硫酸へパリンを６０Ｕ／kg静注したのち、２０Ｇのガイドワイヤーつきカテーテルを右大腿動脈から腹部大動脈にむけ挿入した。カテーテルの先端は大動脈を透して同定することができるため、二分岐部から５mm上の位置に固定した。
Ａ群では、５０ｍＭのグルタミン酸溶液を塩化ナトリウムと蒸留水で生理的浸透圧になるように調節し、大腿動脈から挿入したカテーテルから注入した。同時に腹部大動脈を血管鉗子を用いて、左腎静脈直下で遮断した。大腿動脈から挿入したカテーテルを、二分岐部で腹部大動脈の周囲を回したテープを図１のように外側から締め、血流を遮断した。後腸間膜動脈も同時に血管鉗子で遮断した。グルタミン酸溶液を加温器で３９℃に加温し、５分間、２ｍｌ／分の注入速度で、遮断した分節に注入した。Ｂ群（Ａ群の対照群）では、生理的食塩水をグルタミン酸溶液のかわりに同じ注入速度で、同様に注入した。５分後、血管鉗子をはずし、二分岐部周囲のテープをゆるめ、血流を再開した。同時に注入も停止した。注入用のカテーテルを抜去し、腹壁を２層に閉じた。ウサギは麻酔から覚醒させたのち、水および餌を自由に与えた。Ｃ群のウサギは４mg/kg のＮＢＱＸ（Tocris Cockson社から購入し、０．９％ＮａＣｌ溶液に溶解し４mg/ml の濃度に調整したもの）を２分間かけて大腿動脈から挿入したカテーテルから分節注入することにより前処置した。引き続き、３０ｍＭのグルタミン酸溶液を２ml/ 分の注入速度で、大腿動脈カテーテルから４分間注入した。Ｃ群のウサギは、このあと前述した方法と同様に実験を進め、腹壁を閉じたのち、０．１mg/kg/時のＮＢＱＸを手術後、６時間かけて持続静注し、漸減させた。この投与プロトコールは、ＮＢＱＸのグルタミン酸受容体をupregulateさせることによるパラドキシカルな神経障害効果を排除するために採用した。Ｄ群のウサギは、Ｃ群の対照群として、ＮＢＱＸの前処置の代わりに溶解液だけを２分間かけて大腿動脈から挿入したカテーテルから分節注入させた後、Ｃ群と同様に３０ｍＭのグルタミン酸溶液を２ml/ 分の注入速度で、大腿動脈カテーテルから４分間注入した。Ｄ群のウサギは、このあと前述した方法と同様に実験を進め、ＮＢＱＸを除いた溶解液だけを手術後、６時間かけて持続静注した。
神経学的および病理組織学的評価
下肢の神経学的所見をTarlovのmodifid score （０；対麻痺、１；不全対麻痺、２；補助により座れる、３；補助なしで座れる、４；弱いが跳ねる、５；完全に回復）に従い、手術後１２、２４、４８時間後の各時点において、評価した。手術後４８時間の時点において、再び麻酔をかけ、前回手術と同様に開腹、カテーテルを挿入した。ペントバルビタールの大量静注で安楽死せしめた後、１０％ホルマリン溶液を遮断した分節に注入して、脊髄を灌流固定した。脊柱ごと摘出した後、１０％ホルマリン溶液に２週間浸し、固定した。抽出した脊髄は、腰髄から仙髄まで横断切片とし、ＨＥ染色、Luxol-fast blue 染色、およびNissl 染色で染色後、光学顕微鏡で病理組織学的検索を行なった。組織学的所見は、神経学的所見の結果を知らない神経病理学者の判定に従った。すべての実験は、ＮＩＨの実験動物の動物愛護と使用についてのガイドラインに従い、施行した。実験群と対照群間の術後の神経学的所見の比較は、Mann-Whitney U test を用いて統計処理した。
【００１０】
Ａ群では７頭中、５頭が手術後、１２、２４、４８時間後の各時点において対麻痺（Tarlov 0) であった。２頭はすべての時点において不全対麻痺（Tarlov 1) であった。Ｂ群では７頭すべてが手術後、すべての時点において神経学的に正常（Tarlov 5) 回復した（表１）。Ａ群のウサギはＢ群と比較して、統計学的に有意に低い神経学的所見であった（p<0.001)。
Ｃ群では６頭中、３頭が４８時間後の時点において完全に回復した。３頭は軽度から中等度の運動機能の障害を４８時間後の時点において認めた。Ｄ群では、６頭中、３頭が麻痺（Tarlov 0) であった。１頭が不全対麻痺（Tarlov 1) であった（表１）。Ｃ群のウサギはＤ群と比較して、統計学的に有意に良好な神経学的所見であった（p<0.0039) 。
病理組織学的検索では、Ａ群から摘出したすべての腰髄から仙髄にかけて、前角、後角ともに血管壊死を伴う高度でかつ広範囲な灰白質の壊死が認められた。Ａ群では白質の変性を高度な灰白質の壊死の周囲に認めた（図２）。なお、予備試験において同様な方法で２０ｍＭのグルタミン酸溶液でも対麻痺が生じることが確認された。一方、Ｂ群ではすべての脊髄で正常の組織像が保たれていた（図３）。Ｃ群では空胞化、核の濃縮、好酸性変化などの軽度の変化が仙髄の前角に限局して認められた。白質の変化はＣ群には認めなかった（図４）。対して、Ｄ群では前角、後角に灰白質の壊死が認められた。白質は灰白質と比較して保たれており、高度な灰白質の壊死の周囲に限局性にあるだけだった（図５）。
大動脈遮断直前の直腸温は、Ａ群とＢ群間、Ｃ群とＤ群間にそれぞれ有意差を認めなかった。大動脈遮断中の体平均血圧と心拍数も各群間に有意差を認めなかった（表２）。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
【表２】
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【００１３】
【発明の効果】
本発明の方法により作成された実験動物及び本発明の評価方法は、グルタミン酸またはアスパラギン酸に由来する神経障害の阻害薬の薬効を評価するのに非常に優れたものである。特に、大動脈の遮断時間が非常に短時間であるので、グルタミン酸またはアスパラギン酸以外の要因が最小限におさえられている点で優れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】開腹したウサギに外科的手術を施した様子を示す、本発明の方法の一態様。
【図２】実施例１におけるＡ群の脊髄の組織切片を示す顕微鏡写真（（１）：×２５、（２）：×１２５）。
【図３】実施例１におけるＢ群の脊髄の組織切片を示す顕微鏡写真（（１）：×２５、（２）：×１２５）。
【図４】実施例１におけるＣ群の脊髄の組織切片を示す顕微鏡写真（（１）：×２５、（２）：×１２５）。
【図５】実施例１におけるＤ群の脊髄の組織切片を示す顕微鏡写真（（１）：×２５、（２）：×１２５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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