(57)【要約】ベイトと蛋白質であるプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法において、プレイを、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とし、ベイトは分離用修飾を有するようにし、無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳を行うことにより、翻訳と相互作用の工程をカップリングし、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は分離用修飾及び検出用標識を利用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）で、蛋白質間、核酸−蛋白質間などの相互作用の解析を高感度で行う。あるいは、ベイトが蛋白質である場合は、無細胞共翻訳系で、前記ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳、および前記プレイを含む蛋白質あるいは融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳により、翻訳と相互作用の工程をカップリングし、ベイトとプレイを生成させ相互作用せしめ、複合体の検出は分離用修飾および検出用標識を利用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）で、蛋白質間、核酸−蛋白質間などの相互作用の解析を高感度で行う。
2003014734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、
プレイは蛋白質であり、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳を行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は、分離用修飾及び検出用標識を利用して行われることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
ベイトが蛋白質であり、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳が行われることにより、ベイトが無細胞翻訳系に存在する請求項１記載の方法。
【請求項３】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は、分離用修飾及び翻訳されたプレイと会合したｍＲＮＡを利用して行われることを特徴とする前記方法。
【請求項４】
ｍＲＮＡが、その３’末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合する請求項３記載の方法。
【請求項５】
ペプチドアクセプター領域が、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなる請求項４記載の方法。
【請求項６】
スペーサー領域が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を主成分としたＰＥＧ領域である請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
ｍＲＮＡが、その３’末端領域に長さが２〜１０塩基のポリＡ配列を有する請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするＤＮＡの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は、分離用修飾及び翻訳されたプレイと会合したＤＮＡを利用して行われることを特徴とする前記方法。
【請求項９】
ＤＮＡが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、ＤＮＡがビオチンにより標識され、ＤＮＡ一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写及び翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で前記翻訳を行う請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ベイトが完全長蛋白質である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
プレイが、複数のプレイからなるプレイライブラリーとして提供される請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
プレイをコードするＤＮＡが、ランダムプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供される請求項８又は９記載の方法。
【請求項１４】
プレイをコードするＤＮＡが、ｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供される請求項８又は９記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項１６】
選択工程で選択されたプレイを調製する調製工程を含み、
調製されたプレイを、検出工程で使用されたベイトの代わりに又はそのベイトと共に用いて、検出工程、選択工程及び調製工程を繰り返す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイをコードするｍＲＮＡを選択することによりプレイを選択する選択工程を含み、選択工程で選択されたｍＲＮＡを検出工程のｍＲＮＡとして用いて検出工程及び選択工程を繰り返す、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項８又は９記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイをコードするＤＮＡを選択することによりプレイを選択する選択工程を含み、選択工程で選択されたＤＮＡを検出工程のＤＮＡとして用いて検出工程及び選択工程を繰り返す、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項１９】
ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で検出工程での翻訳を行う請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
ベイトが完全長蛋白質である請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
検出工程におけるプレイが、複数のプレイからなるプレイライブラリーとして提供される請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
検出工程における、プレイをコードするＤＮＡが、ランダムプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供される請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
検出工程における、プレイをコードするＤＮＡが、ｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供される請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
選択工程において複数のプレイが選択される請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の形成方法であって、
プレイは蛋白質であり、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳を行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させることを特徴とする前記方法。
【請求項２６】
ベイトが蛋白質であり、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳が行われることにより、ベイトが無細胞翻訳系に存在する請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の形成方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させることを特徴とする前記方法。
【請求項２８】
ｍＲＮＡが、その３’末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合する請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ペプチドアクセプター領域が、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなる請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
スペーサー領域が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を主成分としたＰＥＧ領域である請求項２８又は２９記載の方法。
【請求項３１】
ｍＲＮＡが、その３’末端領域に長さが２〜１０塩基のポリＡ配列を有する請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の形成方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするＤＮＡの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させることを特徴とする前記方法。
【請求項３３】
ＤＮＡが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、ＤＮＡがビオチンにより標識され、ＤＮＡ一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写及び翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合する請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で前記翻訳を行う請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ベイトが完全長蛋白質である請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ベイトと、複数のプレイからなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させる工程が行われる請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ベイトと、複数のプレイからなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させる工程が行われ、プレイをコードするＤＮＡが、ランダムプライミングｃＤＮＡライブラリーである請求項３２又は３３記載の方法。
【請求項３８】
ベイトと、複数のプレイからなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させる工程が行われ、プレイをコードするＤＮＡが、ｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーである請求項３２又は３３記載の方法。
【請求項３９】
複合体を形成するプレイが、複数のプレイからなる請求項２５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、物質と蛋白質との間の相互作用の検出方法、物質と相互作用する蛋白質のスクリーニング方法、及び、物質とその物質と相互作用する蛋白質との複合体の形成方法に関する。
背景技術
現在、ウイルスからヒトまで多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。ゲノムシーケンスの研究では、第２幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報からその意味を解析する研究、すなわち、遺伝子の機能解析の研究が期待されている（Ｓａｅｇｕｓａ  Ａ．Ｊａｐａｎ  ｂｏｏｓｔｓ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．．．Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，６７５１（１９９９），Ｄａｌｔｏｎ  Ｒ，Ａｂｂｏｔｔ  Ａ．Ｃａｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ  ｆｉｎｄ  ｒｅｃｉｐｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｐｓ？  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，６７６３（１９９９））。遺伝子機能の解析技術としては、コンピューターによる大量のゲノムシーケンスデータの中から、蛋白質の構造解析より得た機能モチーフパターンを見つけ出すアルゴリズムなどを駆使して遺伝子機能を解析するバイオインフォマティックス（Ｓａｌｉ  Ａ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，２３（１９９９））、ＤＮＡチップなどによりどの遺伝子がいつ働いているかという生物学的情報を得ることを目的とした遺伝子発現プロファイルを解析するトランスクリプトミクス（Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，４６７（１９９５））、そして、二次元ゲル電気泳動によるプロテオームの分離と質量分析計による同定（Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ  Ｗ．Ｐ．，Ｗｅｉｒ  Ｍ．Ｐ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３，１２１（１９９９））、蛋白質チップ（Ｄａｌｔｏｎ  Ｒ，Ａｂｂｏｔｔ  Ａ．Ｃａｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ  ｆｉｎｄ  ｒｅｃｉｐｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｐｓ？  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，６７６３（１９９９））による蛋白質発現プロファイルを解析するプロテオミクスなどがある。これらの研究の中でも、ゲノムに対するプロテオーム（蛋白質の総体）の研究であるプロテオミクスが特に注目されている。
蛋白質解析と遺伝子解析との間の大きな違いの１つは、蛋白質の多くが、生体内で複数で関わり合って相互作用しながら機能を果たしていると言う点である。たとえば細胞が外界からホルモンなどの刺激を受けて、レセプターに結合すると、様々な蛋白質が構造を変え、様々な蛋白質と相互作用することで、膜内と細胞質内の一連のシグナル伝達系が動き出し、最終的には核内の転写調節系に及び、特定の遺伝子の発現が制御される。このような様々な蛋白質−蛋白質間及び蛋白質−核酸間などの相互作用のネットワークである遺伝子ネットワークを解析することが、ポストゲノム機能解析の新しい大きな研究テーマとなっている（宮本悦子、柳川弘志（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１３６−１４５；宮本悦子、柳川弘志（２００１）蛋白質・核酸・酵素、４６（２），ｐｐ．１３８−１４７）。このようなポストゲノム機能解析によって、蛋白質間及び蛋白質−核酸間などの相互作用ネットワーク解析から重要な生体酵素の発見などによる医薬品の創製などが期待され、医療、食料、エネルギー、環境など多くの分野の産業で優れたネットワーク解析技術が所望されている。
蛋白質間の相互作用を解析する方法としては、免疫沈降（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，７０１−７０４）、ＧＳＴ融合蛋白質によるプルダウン・アッセイ（Ｋａｅｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｃｅｌｌ  ６４，５２１−５３２）、ＴＡＰ法（Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｒｉｇａｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７，１０３０（１９９９））、酵母ツーハイブリッド法（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｓ，Ｓｏｎｇ  Ｏ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，２４５（１９８９））などが知られている。一方、もともとは進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子（遺伝子型）と蛋白質（表現型）の対応付け」を特徴とする以下に示す方法も、ポストゲノム機能解析における蛋白質間などの相互作用を解析する方法として期待されている（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ａ．Ｒ，Ｂｒｅｎｔ  Ｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ−ｔｏｗａｒｄ  ａｎ  ｅｎｄｇａｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，１９４８（１９９９））。それらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｉｖａ  Ｏｒｉｇｉｎｏ  ２５，３５（１９９７）；Ｎｅｍｏｔｏ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ：Ｂｏｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）；ＷＯ  ９８／１６６３６「遺伝子型と表現型の対応付け分子及びその利用」柳川弘志ほか）、ＳＴＡＢＬＥ法（Ｄｏｉ  Ｎ，Ｙａｎａｇａｗａ  Ｈ．ＳＴＡＢＬＥ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５７，２２７（１９９９）；特開２００１−１２８６９０）、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｐ．Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８，１３１５（１９８５））、リボソーム・ディスプレイ法（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，９０２２−９０２６；Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．＆  Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９９５）ＷＯ  ９５／１１９２２）、ｍＲＮＡ−ペプチド対応付け分子（ｍＲＮＡディスプレイ）法（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２２９７）などである。
免疫沈降法では、基本的に目的蛋白質の抗体がないと検出できない。ライブラリーから網羅的に検出したものなど、目的蛋白質が未知であったり、抗体がない場合には利用は困難である。ＧＳＴ融合蛋白質によるプルダウン・アッセイでは、ベイトをＧＳＴ融合蛋白質として大腸菌などで大量発現させる手法がとられており、ベイトの準備に手間がかかる。ＴＡＰ法は、細胞で発現した蛋白質の複合体を網羅的に解析する方法であるが、「遺伝子（遺伝子型）と蛋白質（表現型）の対応付け」が採られていないため、スクリーニングされた蛋白質の複合体解析において、蛋白質そのものを解析する必要があり、また、細胞からの複合体の抽出操作も簡単なものではない。酵母ツーハイブリッド法では、酵母の細胞内で、あらゆる生物種からの２種類の蛋白質間の相互作用を調べることが出来るが、酵母細胞で発現するものに限られる。また、１組づつ解析していく必要があり、一度に網羅的な相互作用の解析を行うことは出来ない。そのために、大規模な総当たり解析が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（３），１１４３−７；Ｕｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｎａｔｕｒｅ  ４０３（６７７０），６２３−７），Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（Ｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，２１１−２１５）、そしてＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｗａｌｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７（５４５０），１１６−２２）で報告されている。一方、進化分子工学のｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法などの手法は「遺伝子（遺伝子型）と蛋白質（表現型）の対応付け」を実現しており、一挙に網羅的に蛋白質間相互作用解析に利用できる可能性がある（宮本悦子、柳川弘志（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１３６−１４５；宮本悦子、柳川弘志（２００１）蛋白質・核酸・酵素、４６（２），ｐｐ．１３８−１４７）。しかしながら、ファージディスプレー法、リボソーム・ディスプレイ法では、立体障害による蛋白質間の相互作用の妨げが予想される。すなわち、ファージディスプレー法では、細胞に提示された蛋白質間の相互作用の困難さ、リボソーム・ディスプレイ法では、リボソーム付きの蛋白質間の相互作用の困難さが予想される。一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法、ＳＴＡＢＬＥ法などでは、対応付け分子の蛋白質の自由度が大きいことが予想され、蛋白質間や核酸−蛋白質間などの相互作用を網羅的に解析できる可能性がある。
また、蛋白質間の相互作用の検出方法として、無細胞蛋白質合成法により合成した検出用標識を有する蛋白質と分離用修飾を有する蛋白質とを混合するか、無細胞蛋白質合成法により、検出用標識を有する蛋白質と分離用修飾を有する蛋白質とを同一の系内で合成し、蛋白質間の相互作用により形成された蛋白質対を、分離用修飾を利用して分離し、かつ検出用標識を利用して識別する方法が報告されている（特開２００１−２７６３３号公報）。
発明の開示
本発明の目的の一つは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）で、蛋白質間、核酸−蛋白質間などの相互作用の解析を、弱い相互作用も含めて高感度でかつ網羅的に行うことである。
本発明の別の目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、蛋白質間、核酸−蛋白質間などの相互作用の解析を一貫して行うことである。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法では、蛋白質の複合体を網羅的に解析出来る可能性を持っており、特に、蛋白質の直接解析の代わりに遺伝子を解析することができる利点を持つ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法では、ｃＤＮＡライブラリーの遺伝子群をｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳する際に、遺伝子情報を結合した蛋白質ライブラリー（対応付け分子ライブラリー）を構築し、そこからある蛋白質（ベイト）と相互作用のある蛋白質（プレイ）を網羅的にスクリーニングしようとするものである。プレイの蛋白質は対応付け分子であるため、自らのｍＲＮＡあるいはＤＮＡ情報をもち、その遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）あるいはＰＣＲで増幅し、遺伝子配列を解析できる（宮本悦子、柳川弘志（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１３６−１４５；宮本悦子、柳川弘志（２００１）蛋白質・核酸・酵素、４６（２），ｐｐ．１３８−１４７）。このシステムにおいて、もしｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ある蛋白質（ベイト）と相互作用のある蛋白質（プレイ）の翻訳・発現及び相互作用の複合体形成が可能であれば、ＧＳＴ融合蛋白によるプルダウン法を利用したｍＲＮＡディスプレイ法（Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１  Ｍａｒｃｈ  ３０−ｅｐｕｂ）のように、ベイトの用意を大腸菌などの細胞に依存した別途大量合成する手間がなくなり、一挙に、時間短縮及び応用範囲が広がることになる。また、細胞で発現した蛋白質の複合体を網羅的に解析する方法であるＴＡＰ法では、もしｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ある蛋白質（ベイト）と相互作用のある蛋白質（プレイ）の複合体が形成可能であれば、細胞の種類による蛋白質複合体の抽出法などに制限されることなく、市販のｃＤＮＡライブラリーなどを利用できる可能性など、一挙にその応用範囲が広がることになる。もちろん、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで相互作用の複合体が形成可能であれば、ＧＳＴ融合蛋白によるプルダウン法などにも直接利用できることになる。
ここで、一貫してｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質間あるいは核酸−蛋白質間などの相互作用を網羅的に検出するために解決しなければならない問題のひとつは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質間あるいは核酸−蛋白質間などの相互作用を実現することである。このためには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでネイティブなフォールディング状態で、蛋白質同士あるいは核酸−蛋白質などが出会うことが必要である。大腸菌で蛋白質ベイトを大量に発現させて精製するような方法では、大腸菌では発現しないベイトもあり、また発現しても精製時にベイトが変性して相互作用する際に効率が悪くなると言う問題がある。もう一つの解決しなければならない問題は、スクリーニングに際して、弱い相互作用も含めて網羅的に相互作用を検出したいが、一方非特異的結合による余計な解析は避けたいという相反する要求を両立する困難さである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法では、元々が進化分子工学でサイクルを回すことによって強い結合を濃縮するシステムであるため、数は少ないが強い相互作用の蛋白質の遺伝子解析が主な目的であったが、ここでは、サイクルはなるべく回さずに、弱い相互作用の蛋白質の解析の可能性も含めたシステムを構築する必要がある。
本発明者等は上記課題を達成すべく鋭意研究の結果、単一の無細胞翻訳系において、ベイトとして用いる蛋白質とプレイとして用いる蛋白質とを同時に翻訳した場合に、それらの複合体を検出できる系を確立するのに成功するとともに、無細胞翻訳系において、物質（ベイト）の存在下で、その物質と相互作用する蛋白質（プレイ）を、翻訳により生成させて、ベイトとプレイとを接触させると、ベイトとプレイとの間の相互作用が一層高感度で検出できることを見出し、本発明を完成した。
特開２００１−２７６３３号公報には、相互作用する蛋白質を検出するために、相互作用する蛋白質の両方を同一の系内で合成することが記載されているが、この場合に、一方の蛋白質のみを検出用標識を有する蛋白質として、他方の蛋白質のみを分離用修飾を有する蛋白質として合成する方法（このような方法がなければ、形成された複合体を検出できない）について具体的な記載はなく、また、翻訳後に混合した場合に比べて、同一の系で翻訳したときに相互作用がより高感度で検出できることについて記載も示唆もない。
従って、本発明は、蛋白質であってもよい物質であるベイトとプレイとの間の相互作用の検出、及び、ベイトとそれと相互作用する蛋白質であるプレイとの複合体の形成において、ベイト及びプレイに特定の様式で分離用修飾及び検出用標識を行い、そして、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを主な特徴とするものである。
すなわち、本発明は、ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、
プレイは蛋白質であり、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳を行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は、分離用修飾及び検出用標識を利用して行われることを特徴とする前記方法（以下、「本発明検出方法」ともいう）を提供する。
本発明検出方法では、ベイトが蛋白質であり、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳が行われることにより、ベイトが無細胞翻訳系に存在することが好ましい。
本発明検出方法では、プレイが蛋白質の場合には、プレイを融合蛋白質とする代わりに、プレイとプレイをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡとを会合させる、すなわち、対応付け分子を形成させることによって、検出用標識を有するプレイを得てもよい。従って、本発明は、以下の（１）又は（２）の態様の本発明検出方法を提供する。
（１）ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は、分離用修飾及び翻訳されたプレイと会合したｍＲＮＡを利用して行われることを特徴とする前記方法。
この態様では、ｍＲＮＡが、その３’末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合することが好ましい。ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなる。スペーサー領域は、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を主成分としたＰＥＧ領域である。ｍＲＮＡは、好ましくは、その３’末端領域に長さが２〜１０塩基のポリＡ配列を有する。
（２）ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするＤＮＡの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は、分離用修飾及び翻訳されたプレイと会合したＤＮＡを利用して行われることを特徴とする前記方法。
この態様では、ＤＮＡが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、ＤＮＡがビオチンにより標識され、ＤＮＡ一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写及び翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合することが好ましい。
本発明検出方法では、ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で前記翻訳を行うことが好ましい。
本発明検出方法では、また、ベイトが完全長蛋白質であることが好ましい。
プレイは、単一のプレイあるいは複数のプレイからなるプレイライブラリーとして提供されることがある。
プレイライブラリーが用いられる場合、プレイをコードするＤＮＡが用いられるときには、このＤＮＡをランダムプライミングｃＤＮＡライブラリー、又は、ｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供することができる。また、これらのライブラリーは、プレイが対応付け分子である場合は、スクリーニングの前に、対応付け分子のライブラリーとして（無細胞翻訳とＲＴ−ＰＣＲによって、対応付け分子を形成するテンプレートを濃縮したライブラリー）、対応付け分子のランダムプレイミングｃＤＮＡライブラリー、又は、対応付け分子のｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供することが好ましい。
本発明は、また、本発明検出方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法（以下、「本発明スクリーニング方法」ともいう）を提供する。
本発明スクリーニング方法は、選択工程で選択されたプレイを調製する調製工程を含み、調製されたプレイを、検出工程で使用されたベイトの代わりに又はそのベイトと共に用いて、検出工程、選択工程及び調製工程を繰り返すことが好ましい。
本発明スクリーニング方法において、検出工程が、プレイとプレイをコードするｍＲＮＡとを会合させる本発明検出方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程である場合には、選択工程のプレイの選択を、相互作用が検出されたプレイをコードするｍＲＮＡを選択することにより行うことができる。この場合、選択されたｍＲＮＡはそのまま検出工程のｍＲＮＡとして用いることができる。従って、本発明スクリーニング方法の一つの態様は、プレイとプレイをコードするｍＲＮＡとを会合させる本発明検出方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイをコードするｍＲＮＡを選択することによりプレイを選択する選択工程を含み、選択工程で選択されたｍＲＮＡを検出工程のｍＲＮＡとして用いて検出工程及び選択工程を繰り返す、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法である。
本発明スクリーニング方法において、検出工程が、プレイとプレイをコードするＤＮＡとを会合させる本発明検出方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程である場合には、選択工程のプレイの選択を、相互作用が検出されたプレイをコードするＤＮＡを選択することにより行うことができる。この場合、選択されたＤＮＡはそのまま検出工程のＤＮＡとして用いることができる。従って、本発明スクリーニング方法の別の一つの態様は、プレイとプレイをコードするＤＮＡとを会合させる本発明検出方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイをコードするＤＮＡを選択することによりプレイを選択する選択工程を含み、選択工程で選択されたＤＮＡを検出工程のＤＮＡとして用いて検出工程及び選択工程を繰り返す、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法である。
上記二つの様態においても、ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で検出工程での翻訳を行っても良い。また、ベイトが完全長蛋白質であっても良い。
本発明のスクリーニング方法では、検出工程におけるプレイが、単一のプレイあるいは複数のプレイからなるプレイライブラリーとして提供されることがある。
プレイライブラリーが用いられる場合、検出工程において、プレイをコードするＤＮＡが用いられるときには、このＤＮＡをランダムプライミングｃＤＮＡライブラリー、又は、ｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供することができる。また、これらのライブラリーは、プレイが対応付け分子である場合は、スクリーニングの前に、対応付け分子のライブラリーとして（無細胞翻訳とＲＴ−ＰＣＲによって、対応付け分子を形成するテンプレートを濃縮したライブラリー）、対応付け分子のランダムプレイミングｃＤＮＡライブラリー、又は、対応付け分子のｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法では、選択工程において、複数のプレイが選択されてもよく、これは、プレイライブラリーを用いた場合に特に好ましい。この場合、より網羅的な検出が可能であり、その効果をさらに高めるために、ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で検出工程での翻訳を行うこと、およびベイトが完全長であることがより好ましい。
本発明は、さらに、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の形成方法であって、
プレイは蛋白質であり、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳を行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させることを特徴とする前記方法（以下、「本発明形成方法」ともいう）を提供する。
本発明形成方法では、ベイトが蛋白質であり、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳が行われることにより、ベイトが無細胞翻訳系に存在することが好ましい。
本発明形成方法では、プレイが蛋白質の場合には、プレイを融合蛋白質とする代わりに、プレイとプレイをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡとを会合させる、すなわち、対応付け分子を形成させることによって、検出用標識を有するプレイを得てもよい。従って、本発明は、以下の（１）又は（２）の態様の本発明形成方法を提供する。
（１）ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の形成方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させることを特徴とする前記方法。
この態様では、ｍＲＮＡが、その３’末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合することが好ましい。ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなる。スペーサー領域は、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域である。
（２）ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の形成方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするＤＮＡの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させることを特徴とする前記方法。
この態様では、ＤＮＡが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、ＤＮＡがビオチンにより標識され、ＤＮＡ一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写及び翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合することが好ましい。
ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で検出工程での翻訳を行っても良い。また、ベイトが完全長蛋白質であっても良い。
ベイトと、複数のプレイからなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させる工程が行われることもある。
プレイライブラリーが用いられる場合、プレイをコードするＤＮＡが用いられるときには、このＤＮＡをランダムプライミングｃＤＮＡライブラリー、又は、ｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供することができる。また、これらのライブラリーは、プレイが対応付け分子である場合は、スクリーニングの前に、対応付け分子のライブラリーとして（無細胞翻訳とＲＴ−ＰＣＲによって、対応付け分子を形成するテンプレートを濃縮したライブラリー）、対応付け分子のランダムプレイミングｃＤＮＡライブラリー、又は、対応付け分子のｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーとして提供することが好ましい。
本発明形成方法では、複数のプレイを含む複合体が形成されてもよい。
発明を実施するための最良の形態
本発明検出方法は、ベイトと蛋白質であるプレイとの間の相互作用の検出において、ベイト及びプレイに特定の様式で分離用修飾及び検出用標職を行い、そして、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを主な特徴とするものである。本明細書においては、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを「無細胞共翻訳」ともいう。
本明細書において、ベイト及びプレイの用語は、物質間の相互作用の解析の技術分野で通常に用いられる意味を有する。すなわち、既知の物質である蛋白質や核酸などをベイト（おとり）と呼び、それと相互作用する物質である蛋白質や核酸などをプレイ（獲物）と呼ぶ。但し、本発明では、プレイは蛋白質である。
ここで、ベイトとしては、あらゆる蛋白質（ペプチドを含む）、核酸、抗体、ホルモンなどのリガンド、金属など、あるいは、これらの任意のものから構成される複合体が挙げられ、天然のものでも人工のもののいずれでも構わない。ベイトとしての分子量の制限などは特にない。たとえば蛋白質であれば、機能ドメインあるいは機能ドメインを含む完全長蛋白質などが挙げられる。プレイライブラリーを用いる場合は、完全長蛋白質とすることでより網羅的検出が可能となる。
また、プレイとしては、蛋白質が用いられる。プレイとしての分子量の制限などは特にない。
本発明検出方法は、上述のように、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明検出方法の構成は、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の通常の検出方法と同様でよい。
ベイト及びプレイの分離用修飾及び検出用標識は、複合体の検出に適合したものが適宜選択されるが、無細胞共翻訳において、ベイトとプレイとが共に検出用標識で標識されたり、分離用修飾を受けたりしないように行われる必要がある。そのため、プレイは、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされるか、又は、対応付け分子とされ、それに応じて、ベイトは分離用修飾を有するものとされる。
プレイが融合蛋白質とされる場合には、ベイトは分離用修飾を有するようにする。ベイトが蛋白質である場合には、ベイトは、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質として、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳が行われることにより無細胞翻訳系に存在させることが好ましい。
ベイトが蛋白質の場合の分離用修飾の例としては、蛋白質として、ＧＳＴ蛋白質やＴＡＰ法などに用いられているＣＢＰ（カルモジュリンビーズとの親和性により分離可能）やプロテインＡ（ＩｇＧ−プロテインＡ親和性により分離可能）、親和性タグとして、各種の抗体タグなどとの融合蛋白質とすることが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。プレイの検出用修飾としては、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光蛋白質との融合蛋白質とすることが挙げられる。
上記の融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの調製及びこのｍＲＮＡの無細胞翻訳系での翻訳は通常の方法に従って行うことができる。ｍＲＮＡは、無細胞転写翻訳系において、ＤＮＡの転写により生成するものであってもよい。
プレイが対応付け分子とされる場合には、ベイトには任意の分離用修飾を施すことができる。ベイトが蛋白質である場合には、上述の分離用修飾の例が挙げられる他、ベイトが核酸やドラッグなどの場合の分離用修飾の例としては、ストレプトアビジンやアビジンと相互作用のあるビオチンなどを利用することが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。
対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、通常には、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現形の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる分子である。この蛋白質としてプレイを用いることによりプレイを対応付け分子とすることができる。このような対応付け分子は、無細胞翻訳系において、プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うこと、又は、無細胞転写翻訳系において、プレイをコードするＤＮＡの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより形成することができる。従って、この製造の際に、ベイトを存在させることにより、無細胞共翻訳を行うことができる。すなわち、下記（１）又は（２）により無細胞共翻訳を行うことができる。
（１）無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
（２）無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするＤＮＡの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
以下、上記（１）及び（２）の態様について説明する。
（１）の態様では、ｍＲＮＡが、その３’末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス方法が挙げられる。
ｍＲＮＡは、好ましくは、転写プロモーター及び翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、プレイをコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含む核酸である。好ましくは、ポリＡ配列の５’側に、ＳＮＮＳ（ＳはＧまたはＣ）配列を含む発現増幅配列（例えば制限酵素ＸｈｏＩが認識する配列）が更に含まれる。５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。
ポリＡ配列は、少なくとも２残基以上のｄＡあるいは／又はｒＡの混合あるいは単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリＡ連続鎖である。
翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる５’ＵＴＲ、及び、ポリＡ配列を含む３’末端領域の組み合わせがある。３’末端領域のポリＡ配列の効果は通常には１０残基以下で発揮される。５’ＵＴＲの転写プロモーターはＴ７／Ｔ３あるいはＳＰ６などが利用でき、特に制限はない。好ましくはＳＰ６であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はＳＰ６を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、ＴＭＶのオメガ配列（Ｇａｌｌｉｅ  Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ  Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８）の一部（０２９）を含んだものが好ましい。
また、翻訳効率に関し、３’末端領域においては、ＸｈｏＩ配列とポリＡ配列の組み合わせが好ましい。さらに、ＯＲＦ領域の下流部分、すなわちＸｈｏＩ配列の上流に親和性タグがついたものとポリＡ配列の組み合わせが好ましい。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列又はＨｉｓ−ｔａｇ配列である。ポリＡ配列効果としては、Ｆｌａｇ−ｔａｇ等の親和性タグにＸｈｏＩ配列がついたものとそこへさらにポリＡ配列がついたものの翻訳効率が上昇する。ここで、Ｈｉｓ−ｔａｇについては、ＸｈｏＩ配列のない構成でも十分な翻訳効率を示し、有効である。
上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
５’ＵＴＲをＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）又はＨｉｓ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’ＵＴＲで約４９ｂｐ、３’末端領域で約３８ｂｐ又は約２６ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、５’ＵＴＲと３’末端領域をもったコード領域を簡単に作成できる。コード領域において、翻訳はＯＲＦ領域を超えてされてもよい。すなわち、ＯＲＦ領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、ＰＡＮＳ−アミノ酸、ＡＡＮＳ−アミノ酸などが挙げられる。
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、５’側に１残基以上のＤＮＡあるいは／又はＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ，Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２３，３７４−３７７）が適当である。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
スペーサー領域は、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域である。スペーサー領域は、通常には、ＰＥＧ領域の他に、核酸の３’末端に結合できるドナー領域を含む。
核酸の３’末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。ドナー領域は修飾物質を有していてもよい。
ドナー領域の５’末端の配列は、プレイをコードするコード領域とのライゲーション効率を左右する。コード領域とスペーサー領域をライゲーションさせるためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）あるいは２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
ＰＥＧ領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、ＰＥＧ領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が２０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が４００以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が１０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が１０００以上であることを意味する。
ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、４００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜８，０００である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約４００より低いと、このスペーサー領域を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｅ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３１８，２６８−２９３）、分子量１０００以上、より好ましくは２０００以上のＰＥＧを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量１０００以上で良好であり、分子量４００以下ではＤＮＡスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
ポリエチレングリコールを主成分とするスペーサー領域を有することによって、対応付け分子がウサギ網状赤血球のみならず小麦胚芽の無細胞翻訳系でも形成可能となり、両翻訳系での遺伝子型分子の安定性が飛躍的に向上し、翻訳後の処理を施すことが不要となる。
（２）の態様では、ＤＮＡが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、ＤＮＡがビオチンにより標識され、ＤＮＡ一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写及び翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、ＳＴＡＢＬＥ法が挙げられる。
エマルジョンは、通常には、２種の界面活性剤及びミネラルオイルと、無細胞転写翻訳系の反応液を混合して形成されるＷ／Ｏ型のエマルジョンである。Ｗ／Ｏ型のエマルジョンを形成するには、通常には、界面活性剤のＨＬＢ（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ）値が３．５〜６である必要がある。２種の界面活性剤を混合した場合のＨＬＢ値は、個々の界面活性剤のＨＬＢ値から簡単な計算式で求められる。例えば、Ｓｐａｎ８５（ＨＬＢ＝１．８及びＴｗｅｅｎ  ８０（ＨＬＢ＝１５．０）を、それぞれ４０．２μｌ及び９．８μｌの割合で混合することによりＨＬＢ＝４．４となる。界面活性剤とミネラルオイルの割合は、通常１：１８（容量比）である。また、反応液の割合はエマルジョン全体に対して１〜５０％（容量比）であり、通常は５％である。界面活性剤とミネラルオイルの混合物に、撹拌しながら、低温で、反応液をいくつかに分けて添加し、混合することによりエマルジョンを形成することができる。転写及び翻訳の反応は、エマルジョンの温度を上げることにより、開始させることができる。
プレイをコードするＤＮＡの調製及びこのＤＮＡの無細胞転写翻訳系での転写及び翻訳は通常の方法に従って行うことができる。
上述のように、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行うことにより、無細胞共翻訳により形成された複合体を特異的に検出することができる。
ベイトとプレイの無細胞共翻訳において、無細胞共翻訳を行う無細胞翻訳系（無細胞転写翻訳系を含む）については、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法では、対応付け分子の形成は、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉではかなり不安定であるが、ウサギ網状赤血球の系（Ｎｅｍｏｔｏ  Ｎ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ  Ｅ，Ｙａｎａｇａｗａ  Ｈ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５；Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２２９７）では安定であることが確認されており、さらに小麦胚芽の系（特願２０００−３８０５６２）ではより安定であることが確認されている。ＳＴＡＢＬＥ法では、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。
無細胞共翻訳における翻訳又は転写及び翻訳の条件は、用いる無細胞翻訳系に応じて適宜選択される。
無細胞翻訳系に添加するベイトとプレイのテンプレートは、無細胞翻訳系が転写も生じる無細胞転写翻訳系であれば、ＲＮＡあるいはＤＮＡのどちらでも構わない。
以下、ベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるベイトとして、図８に示すように、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなることを特徴とする翻訳テンプレートを利用する。コード部は、蛋白質に翻訳される情報であり、どのような配列でも良いが、好ましくは、コード部の３’末端領域にアクセプター（Ａ配列）を持つ、あるいは、コード部の３’末端領域にアクセプター（Ａ配列）を持ち、かつＡ配列の５’上流に翻訳増幅配列（Ｘ配列）を持つことを特徴とする。コード部のＡ配列として、短いポリＡ配列を含む。短いポリＡ配列とは、通常には２〜１０塩基のＡからなる配列である。Ｘ配列として、Ｃ（あるいはＧ）ＮＮＣ（あるいはＧ）配列を有する配列、たとえば、ＸｈｏＩ配列を有することを特徴とする。ＰＥＧスペーサ一部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、コード部と連結するためのドナー領域、および３’末端にＣＣＡ領域を持つ。ＰＥＧスペーサー部は、ドナー領域のみ、ＣＣＡ領域のみでもかまわないが、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域を含む構成をとる。ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量は、５００以上であることを特徴とする。また、ドナー領域あるいは／かつＣＣＡ領域において、少なくとも１つの機能付与ユニット（Ｆ）を含むことを特徴とする。機能付与ユニット（Ｆ１あるいは／かつＦ２）が、該翻訳テンプレートあるいは／かつ該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化あるいは蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｃｙ５，あるいはローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これらのコード部や翻訳テンプレート、およびそのライブラリー、さらに、リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリーに関するものである。
ベイトの翻訳テンプレート（図８のＡ）は、コード分子（図８のＢ）に由来するコード部とＰＥＧスペーサー分子（図８のＣ）に由来するＰＥＧスペーサー部からなる。本態様では、基本的にはコード部の配列によらず、コード部にＰＥＧスペーサー部を連結（ライゲーション）することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。しかしながら、さらにコード部の構成やＰＥＧスペーサー部の種類によって、その翻訳効率をより向上させることが可能である。以下にその詳細を記載する。
本態様のコード部（図８のＢ）は、５’末端領域、ＯＲＦ領域、３’末端領域からなり、５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。また、コード部の配列には特に制限はなく、あらゆるベクターやプラスミドに組み込まれたものとしての利用が考えられる。また、コード部の３’末端領域は、Ａ配列としてポリＡｘ８配列、あるいはＸ配列としてＸｈｏＩ配列や４塩基以上でＳＮＮＳ（ＳはＧまたはＣ）の配列を持つもの、およびＡ配列とＸ配列の組み合わせとしてのＸＡ配列がある。Ａ配列、Ｘ配列、あるいはＸＡ配列の上流に親和性タグ配列としてＦｌａｇ−ｔａｇ配列、からなる構成が考えられる。ここで、親和性タグ配列としてはＨＡ−ｔａｇやＩｇＧのプロテインＡ（ｚドメイン）などの抗原抗体反応を利用したものやＨｉｓ−ｔａｇなど、蛋白質を検出あるいは精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、ＸＡ配列の組み合わせが重要であり、Ｘ配列のなかで、最初の４塩基が重要であり、ＳＮＮＳの配列を持つものが好ましい。また、５’末端領域は、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはＴ７／Ｔ３あるいはＳＰ６などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、プロモーターとしては、ＳＰ６を用いることが好ましい。翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部（０２９）は、ＴＭＶのオメガ配列（Ｇａｌｌｉｅ  Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ  Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８）の一部を含んだものである。コード部のＯＲＦ領域については、ＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、あるいは、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。
本態様のＰＥＧスペーサー分子（図８のＣ）は、ＣＣＡ領域、ＰＥＧ領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずＰＥＧ領域を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、４００〜３０，０００で、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜６，０００である。また、ＣＣＡ領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。本翻訳テンプレートでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたＣＣＡ領域も考えられるが、リボソーム上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、より翻訳効率を高められる。その理由は定かではないが、蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボソームを刺激することでターンオーバーが促進される可能性がある。ＣＣＡ領域（ＣＣＡ）の５’側に１残基以上のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。配列としては、ｄＣ−Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，ｒＣ−Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎなど、より好ましくはｄＣｄＣ−Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，ｒＣｒＣ−Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，ｒＣｄＣ−Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，ｄＣｒＣ−Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ  Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２３，３７４−３７７）が適当である。本発明の一態様では、これらのピューロマイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。
本態様のＰＥＧスペーサー部は修飾物質（Ｆ１あるいは／かつＦ２）を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、あるいは固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、あるいはＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。また、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計可能な長さである。これによって新たな効果が生み出された。すなわち、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に、３’ＵＴＲの代わりとしてＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。
本態様のＰＥＧスペーサー分子とコード分子のライゲーションは、その方法については、一般的なＤＮＡリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。ＲＮＡリガーゼを用いるライゲーションでは、コード部でライゲーション効率に影響を与える範囲としては３’末端領域のＡ配列が重要であり、少なくとも２残基以上のｄＡあるいは／またはｒＡの混合あるいは単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６から８残基以上のポリＡ連続鎖である。ＰＥＧスペーサー部のドナー領域の５’末端のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡ配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とＰＥＧスペーサー部を、ＲＮＡリガーゼでライゲーションするためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）あるいは２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。さらに、ライゲーション反応時に、ＰＥＧ領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。
次に、プレイとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるプレイとして、図９に示すように、翻訳テンプレートによってＣ末端修飾された蛋白質（＝対応付け分子）を利用する。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなる。コード部の３’末端にＡ配列を有し、Ａ配列は、短いポリＡ配列を含む。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域において、ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする、また、ドナー領域あるいは／かつＣＣＡ領域において、少なくとも１つの修飾物質（Ｆ１あるいは／かつＦ２）を含むことを特徴とする。また、ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的にはＣＣＡ領域にピューロマイシンを有する。また、修飾物質（Ｆ１あるいは／かつＦ２）が、該翻訳テンプレートあるいは／かつ該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化あるいは蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｃｙ５，あるいはローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質（＝対応付け分子）および蛋白質（＝対応付け分子）のライブラリーに関するものである。
プレイは、翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質（図９のＡ；対応付け分子）であり、翻訳テンプレート（図９のＢ）と、ＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図９のＣ）の構成に特徴を持つ。以下詳細に記述する。
翻訳テンプレート（図９のＢ）のＰＥＧスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結できることを特徴とする以外は上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様である。また、コード部も上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、３’末端領域をＡ配列にすることが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減する。ここでも、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。これによって、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、ＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られる。
本態様のＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図９のＣ）は、蛋白質の相互作用検出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、ＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、ＲＮａｓｅ  Ａなどで意図的に切断してもよい。切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。また、単独の対応付け分子をプレートやビーズやスライドガラスに固定することも可能である。
無細胞共翻訳を、図１を参照して説明する。図１に示すように、ベイトの存在下でプレイがｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳される。図１のＡ及びＢに示されるように、ベイトが蛋白質であって、無細胞翻訳系でプレイと同時に翻訳される場合と、ベイトが、核酸やホルモンなどであって、無細胞翻訳系に添加される場合がある。図１に示すように、プレイは融合蛋白質又は対応付け分子とされる。
複合体は、ベイトと一つのプレイが結合して形成されること（Ｉ）の他に、ベイトに結合したプレイにさらに別のプレイが結合することにより形成されること（ＩＩ）もある。
本発明検出方法によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複合体の形成を行うことができるので、一貫してｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質間あるいは核酸−蛋白質間などの相互作用を検出できる。
ベイトが蛋白質である場合は、ベイトとしては、目的蛋白質との相互作用のための機能ドメインのみの蛋白質、機能ドメインを含む蛋白質、あるいは完全長蛋白質などが挙げられる。ここで、完全長蛋白質を用いることは、複数の機能ドメインを有することが一般に予測されるため、さらに網羅的にプレイを検出可能となることから、好ましい。完全長蛋白質は、単独で完全長の蛋白質でもよいし、完全長の蛋白質を再構成する複数のベイトの集まりでもよい。
ベイトは、図２に示したように、複合体であってもよく、これを「複合ベイト」と呼ぶ。複合体にすることによって、より非特異的な吸着を減らすことができ、かつ完全長蛋白質と同様の効果として、より網羅的にプレイを検出することが可能となる。
以上のように、無細胞共翻訳で考えられる複合体としては、単独のベイトと単独のプレイの複合体、複合ベイトとプレイの複合体、ベイトと複数のプレイの複合体、及び、複合ベイトと複数のプレイの複合体が可能である。従って、本発明検出法により検出可能な相互作用は、ベイトとプレイとの間の直接の相互作用だけでなく、複合体を形成するための間接的な相互作用をも包含するものである。
本発明における無細胞共翻訳で最も重要なことは、蛋白質がネイティブな状態でフォールディングしており、翻訳されたての変性していない状態であり、相互作用するべきベイトとプレイあるいはベイトとベイトやプレイとプレイが無細胞翻訳系に共存しており、速やかに相互作用できると言うことと考えられる。このことは、別々に翻訳して翻訳直後に混合して共存させるよりも、共に翻訳したものの方が優れた結果が得られたこと（図５のＣ参照）により支持される。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳された蛋白質がネイティブなフォールディング状態で、蛋白質あるいは核酸などと出会うことができるため、速やかに相互作用による複合体の形成が可能となったためと思われる。
従来の相互作用の検出法では、ベイトを大腸菌で大量に発現精製する必要があった。例えば、ＴＡＰ法などでベイトとプレイの相互作用を細胞で発現させる場合は、最低一ヶ月の準備が必要であった。また、ＧＳＴ融合蛋白によるプルダウン法を採用しているｍＲＮＡディスプレイ法では、ベイトを大腸菌などで大量に発現させて精製するため、最低２〜３週間かかり、大腸菌で発現しないものはベイトに出来ないなどの問題があり、さらに、プレイと相互作用させるにはプレイの５０〜１００倍の量のベイトを添加する必要があった。無細胞共翻訳では、無細胞翻訳系において、ほぼ同量のｍＲＮＡあるいはＤＮＡテンプレートを添加すればよいだけとなり、ベイトを細胞で発現させる必要は全くなくなり作業時間の大幅な短縮が行える。さらに、複合ベイトや完全長蛋白質によって、ベイトとプレイの相互作用をより強化し特異的なものとし、非特異的な結合の検出を回避することができる。また、複合ベイトによって、その第二のベイトと相互作用するより多くのプレイを網羅的に解析できる。
これまで、一貫してｉｎ  ｖｉｔｒｏで相互作用による複合体形成とスクリーニングを実現するシステムは存在しなかったが、以上の本発明検出法によって、ベイトも含めて完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳とスクリーニングを行って、蛋白質間あるいは蛋白質−核酸間の相互作用を非特異的な検出を回避しかつ網羅的に検出可能なシステムを構築できる。従って、本発明は、本発明検出方法を利用したスクリーニング方法も提供する。
本発明スクリーニング法は、ベイトとプレイが無細胞共翻訳を通して相互作用して複合体を形成し、複合体のスクリーニングによってベイトと相互作用するプレイを解析することを特長とする。従って、本発明スクリーニング方法は、本発明検出方法により、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程を含む他は、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイの通常のスクリーニング方法と同様でよい。
本発明スクリーニング方法は、選択工程で選択されたプレイを調製する調製工程をさらに含み、調製されたプレイを、検出工程で使用されたベイトの代わりに又はそのベイトと共に用いて、検出工程、選択工程及び調製工程を繰り返すことが好ましい。この態様は、例えば、図３に示すように、１）プレイ及びベイトが相互作用を形成する無細胞翻訳系における無細胞共翻訳の工程、２）ベイトと相互作用しているプレイを検出するスクリーニングの工程、３）プレイを分析及び解析する工程、及び４）３）で分析及び解析されたプレイを新たな次のベイトとし、１）から繰り返す工程から構成される。１）及び２）の工程が検出工程及び選択工程に相当し、３）の工程が調製工程に相当する。すなわち、検出工程のうちの、ベイトとプレイを接触させる工程が無細胞共翻訳の工程に相当し、検出工程のうちの複合体の検出及び選択工程がスクリーニングの工程に相当する。
本発明スクリーニング法では、選択工程で選択されたプレイを再度検出工程に付してもよい。
本発明スクリーニング法では、ベイトと複数のプレイの集団であるプレイ・ライブラリーとの無細胞共翻訳を行い、スクリーニングの工程において、２つ以上のプレイが検出されてもよい。
図２に示すように、複合ベイトとプレイが共存し、相互作用によって複合ベイトとプレイの複合体を形成する場合がある。この無細胞共翻訳で、プレイ・ライブラリーの複数のプレイがベイトと共存し、相互作用によってベイトと複数のプレイの複合体を形成することによって、スクリーニングにおいて、一挙に網羅的な相互作用する複数のプレイを検出できる。また、ベイトが完全長蛋白質であることによって、完全長蛋白質は一般に相互作用の機能ドメインを複数含むので、より多くのプレイを網羅的に検出可能となる。
さらに、図２に示すように、複合ベイトと相互作用する複数のプレイの複合体を形成することによって、複合ベイトと相互作用する複数のプレイを検出でき、また、第二のベイトがベイトとプレイの相互作用の補強剤となり、より特異的な相互作用が実現されることによって、網羅的検出における非特異的検出の回避が可能となる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法など進化分子工学的手法では、プレイは対応付け分子（ｆｕｓｉｏｎ）となる。プレイ・ライブラリーや複数のプレイを用いた場合の複合体の形成では、プレイは直接ベイトと相互作用する場合としない場合がある。
複合体のスクリーニングにより得られた複合体が対応付け分子である場合には、図３に示すように、複合体を形成するプレイをＲＴ−ＰＣＲあるいはＰＣＲにより検出し、さらに、ＰＣＲ産物をプレイとして再スクリーニングする（プレイの再構築）、あるいは、ＰＣＲ産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングしてもよい。ここで、ＰＣＲ産物から再スクリーニングする、あるいは、ＰＣＲ産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングする方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法など進化分子工学的手法においてのみ可能であり、プルダウン法、ＴＡＰ法など蛋白質を直接解析する方法ではできない。
対応付け分子を用いた場合には、スクリーニングの後、ＲＴ−ＰＣＲあるいはＰＣＲによって蛋白質プレイの遺伝子配列を知ることが出来る。図１及び２に示すように、ここでの蛋白質プレイとは、ベイトと相互作用しているプレイあるいはそのプレイと相互作用しているプレイなどであり、ベイトと相互作用しているすべての複数のプレイが網羅的に解析できる。さらにプレイの再スクリーニングが必要な場合は、ＲＴ−ＰＣＲあるいはＰＣＲの産物であるＤＮＡテンプレートを転写し、同じサイクルを繰り返す。また、ＲＴ−ＰＣＲあるいはＰＣＲとそれに続くシークエンスによってプレイが定まった場合は、その蛋白質プレイはベイトとして使えるようになる。はじめのベイトに対して相互作用するプレイが複数個見つかれば、複合ベイトを形成することが出来るようになり、さらにより多くのプレイを検出することが出来るようになる。
無細胞共翻訳を用いると、プルダウン法やＴＡＰ法においても一貫してｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質間相互作用を検出できることになるが、ＴＡＰ法では対応付け分子を形成していないので、プレイの解析において直接的に蛋白質を解析しなければならない。そこで、プルダウン法やＴＡＰ法をスクリーニングの方法としてｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法に応用すれば、対応付け分子を形成しているので、ＲＴ−ＰＣＲあるいはＰＣＲによって、相互作用するプレイの解析においてその遺伝子配列を簡単に検出することが出来る。さらに、無細胞共翻訳を用いると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法において、一貫してｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質間相互作用を検出できることになる。また、プレイの数が莫大な場合は、サイクルを回すことで再スクリーニングによりプレイを絞り込むことが可能である。また、解析されたプレイは、次の解析では、ベイトとして使うことができ、ベイトの数が増えれば、ベイトの複合化が進み、さらなるプレイが検出されることにつながる。このように、プレイをベイトとして次のサイクルで使用することは、対応付け分子を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法などでのみ簡単に実現できる。しかしながら、ｍＲＮＡディスプレイなどの方法では、新しいベイトのＧＳＴ融合蛋白を大腸菌で大量合成と精製が必要であり、ベイトの用意に時間がかかり困難である。無細胞共翻訳によれば、その必要もなく簡単にサイクルを回すことが出来る。
無細胞共翻訳後の複合体のスクリーニングにおいて、無細胞共翻訳によって出来た複合体を壊すことなくプレイを網羅的にスクリーニングできることが好ましい。このために、親和性タグなどによってベイトに固定化の仕組みを持たせ、ベイトと相互作用するプレイを検出してもよい。その固定化の仕組みは、いかなるものでも構わない。たとえば、既存のＴＡＰ法などのように、ＩｇＧ−プロテインＡ親和性やカルモジュリンビーズを用いた２段階のスクリーニングを行う方法、あるいはプルダウン法のように、ストレプトアビジンあるいはアビジン−ビオチン親和性、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ，Ｔ７−ｔａｇ，Ｈｉｓ−ｔａｇなどを利用した一段階あるいは二段階のスクリーニングを行う方法が挙げられる。
プレイ・ライブラリーとしては、ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライミング・ライブラリー、ｄＴプライミング・ライブラリー）、ランダム・ライブラリー、ペプチド・ライブラリー、ホルモン・ライブラリー、抗体・ライブラリー、リガンド・ライブラリー、医薬化合物ライブラリーなどが挙げられ、いかなるライブラリーでも構わない。たとえば、プレイ・ライブラリーとしてランダムプライミング・ｃＤＮＡライブラリーを用いた場合、このライブラリーには完全長プレイは望めないが、機能ドメインを含むプレイは期待できる。このようなライブラリーは、特に、複合ベイトや完全長蛋白質との組み合わせによるスクリーニングに用いると、プレイの網羅的検出に有効となる。
ランダムプライミングライブラリーの例としては、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の５’側に、転写プロモーターとしてＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（ＳＰ６）と、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルスのＴＭＶオメガ配列の一部（０２９）とを含んだ５’非翻訳（ＵＴＲ）領域を持ち、かつＭＣＳの３’側に親和タグ配列として、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列を、ＭＣＳに組み込まれた挿入配列から発現した蛋白質のＣ末端にＦｌａｇ−ｔａｇが付加されるように含む３’末端を持つベクターのＭＣＳに、ランダムプライミングで得られたｃＤＮＡが組み込まれたものが挙げられる。
上記の本発明検出方法は、ベイトとプレイとを接触させ複合体を形成させる工程を含んでいる。従って、この工程に準じて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとの複合体を形成させる方法が提供される。
本発明形成方法は、ベイトとベイトと相互作用する蛋白質であるプレイとの複合体の形成において、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明形成方法の構成は、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の通常の形成方法と同様でよい。ベイト及びプレイの特定の様式での検出用標識及び分離用修飾ならびに無細胞共翻訳については、本発明検出方法に関し説明した通りでよい。
本発明形成方法では、相互作用が既知のベイトとプレイとの間の複合体だけでなく、ベイトと、複数のプレイからなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させる工程を行うことによって、相互作用が未知の要素を含む複合体を形成することもできる。
実施例
以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
実施例１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法への応用１
本発明の無細胞共翻訳を、対応付け分子を用いる相互作用の検出方法であるｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法（Ｎｅｍｏｔｏ  Ｎ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ  Ｅ，Ｙａｎａｇａｗａ  Ｈ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５；Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２２９７）に応用すると次のようになる。▲１▼プレイ・ライブラリーとしてｃＤＮＡライブラリーの形成。▲２▼ｃＤＮＡライブラリーの対応付け分子の形成。▲３▼プレイとベイトの無細胞共翻訳による複合体の形成。▲４▼複合体のスクリーニング。▲５▼ベイトと相互作用のあるプレイのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅及びコードする蛋白質の配列の決定。
概略を図４を参照して説明する。図４のＡに示すように、相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ及びＪｕｎを用いて、Ｆｏｓをベイトとし、Ｊｕｎをプレイとし、さらに、第二のベイトとしてＦｏｓ／Ｊｕｎと相互作用するＤＮＡを、また、第二のプレイとしてＦｏｓ／Ｊｕｎと相互作用しないサイクリンＢを混在させた。全てが混在した系（Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、サイクリンＢ、ＤＮＡ；図４のＢ，Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／＋））、あるいはＤＮＡのない系（Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、サイクリンＢ；図４のＢ，Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／−））、あるいはプレイのみの系（Ｊｕｎ、サイクリンＢ；図４のＢ，Ｆｏｓ／ＤＮＡ（−／−））である無細胞翻訳系で共翻訳を行い、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ相互作用による複合体を形成せしめた。この実施例では、プレイは全て対応付け分子である。これをＩｇＧビーズで回収、ＴＥＶプロテアーゼでベイトを切断し、さらにカルモジュリンビーズで回収し、ＥＧＴＡで溶出する二段階スクリーニングによりベイトと特異的に結合するプレイであるＪｕｎをＲＴ−ＰＣＲで検出した（図４のＢ）。また、共翻訳（ベイトとプレイを共存させて翻訳）した系と別翻訳（ベイトとプレイを別々に翻訳後に混合）した系について比較した（図４のＣ）。以下、方法と結果を具体的に説明する。
方法：
ベイトとしてのＦｏｓについては、ｐＣＭＶ−ＦｏｓＣＢＰｚｚベクター（配列番号１）をテンプレートとし、ＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９）Ｔ７−ＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号２）と３’ＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号３）、ＰＣＲプログラムＣＹＣＢ１（表１参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ｐＣＭＶ−ＦｏｓＣＢＰｚｚベクターは、市販のベクターｐＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に、マウス精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｔａｋａｒａ）からクローニングしたｃ−Ｆｏｓ（１１８−２１１）を組み込み、さらにＴＡＰ法に従ってカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）及びプロテインＡのｚｚ領域を組み込んで作成した。プレイとしてのＪｕｎについては、ｐＵＣ−Ｊｕｎベクター（配列番号４）から二回のＰＣＲ（一回目は、ｐＵＣ−Ｊｕｎベクターをテンプレートとして、プライマー５’Ｔ７Ｊｕｎ（配列番号５）と３’ＪｕｎＦｌａｇ−Ａ（配列番号６）を用い、二回目は、一回目のＰＣＲプロダクトをテンプレートとして、プライマー５’ＳＰ６（０−２９）Ｔ７（配列番号７）と３’ＦｌａｇＡ（配列番号８）を用いた。ＰＣＲプログラムＶ−２あるいはＶ−ＴＤ（表１参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ｐＵＣ−Ｊｕｎベクターは、市販のベクターｐＵＣ（Ｔａｋａｒａ）に、マウス精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｔａｋａｒａ）からクローニングしたｃ−Ｊｕｎ（１７９−３３５）を組み込んで作成した。さらに、第二のプレイとしてのサイクリンＢについては、ｐＣＭＶｚｚＣＢＰｃＢ１ベクター（配列番号９）をテンプレートとし、ＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９）ｃＢ１（配列番号１０）と３’（６４６）ＦｌａｇＡ（配列番号１１）、ＰＣＲプログラムＣＹＣＢ１（表１参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ＰＣＭＶｚｚＣＢＰｃＢ１ベクターは、市販のベクターｐＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に、完全長サイクリンＢ遺伝子（東大、岡山博士より恵与）を組み込み、さらにＴＡＰ法に従ってカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）及びプロテインＡのｚｚ領域を組み込んで作成した。
それらのＤＮＡテンプレートについてＲｉｂｏＭＡＸＴＭ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写（３７℃，２ｈ）を行い、各ｍＲＮＡテンプレートを準備した。Ｊｕｎ及びサイクリンＢのｍＲＮＡの３’末端と、３’末端にピューロマイシンをもつスペーサー（ｐ（ｄＣ）２ｐＴ（フルオレセイン）−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ｐ（ｄＣ）２ピューロマイシン（ｎ＝３６〜５７））の５’末端とを連結し、ＪｕｎとサイクリンＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスのＲＮＡテンプレートをそれぞれ作成した。さらに、ＤＮＡベイトは、Ｆｏｓ／Ｊｕｎの結合配列を含むＤＮＡ−Ｆｏｓ／Ｊｕｎをテンプレートとし、ＰＣＲ（プライマー５’ＤＮＡ（配列番号１３）と３’ＤＮＡ（配列番号１５）、ＰＣＲプログラムＶ−２（表１参照））によって準備した。
ＦｏｓのｍＲＮＡテンプレート（１０ｐｍｏｌ）、ＪｕｎとサイクリンＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスのＲＮＡテンプレート（それぞれ２ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌ）、そしてＤＮＡベイト（１．５μｇ）を、５０μｌの小麦の無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））において共翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）した。５０μｌの翻訳反応液に対し、ＩｇＧ結合バッファー５０μｌを添加し計１００μｌ（無細胞共翻訳サンプル）とした。その後、ＴＡＰ法に従って以下のようにスクリーニングした。ＩｇＧアガロース（Ｓｉｇｍａ）をＩｇＧ結合バッファーで２回洗浄し、これに無細胞共翻訳サンプル（１００μｌ）を加え、４℃で２時間回転攪拌した。結合バッファーで３回、ＴＥＶ切断バッファーで１回洗浄し、ＩｇＧアガロースに結合したベイト／プレイ複合体をＴＥＶプロテアーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で切断した（１６℃、２時間）。切断後遠心し、上清１００μｌを回収し、うち１０μｌをＲＴ−ＰＣＲ用に採取した。さらに、残りの上清９０μｌに、３００μｌカルモジュリン結合バッファーと０．３μｌ  １Ｍ  ＣａＣｌ２、さらに、５００μｌカルモジュリン結合バッファーで２回洗浄した５０μｌカルモジュリンビーズを加えて４℃で１時間回転攪拌した。遠心後、１０００μｌカルモジュリン結合バッファーで３回洗浄した。５０μｌカルモジュリン溶出バッファーを加えて、氷上で１〜２分放置し、遠心後、上清（溶出液）５０μｌを回収した。うち２０μｌをＲＴ−ＰＣＲ用に採取した。また、ベイトの有無の条件を変えて同様の共翻訳及びスクリーニングを行った。
採取した一段目（ｓｔｅｐ  １）の溶出液と二段目（ｓｔｅｐ  ２）の溶出液及びその希釈液をテンプレートとして、プレイの共通配列に基づくプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ（プライマー５’０２９−Ｆ３と３’Ｆｌａｇ−Ｒ３、プログラムＲＴ−３０（表１参照））を行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について１％アガロースゲル電気泳動を行った。結果を図４のＢに示す。図中、レーン１は原液、レーン２は１／１００希釈、レーン３は１／１００００希釈である。また、Ｆｏｓ／ＤＮＡの欄は、−／−：両方なし、＋／−：ＦｏｓありＤＮＡなし、＋／＋：ＦｏｓもＤＮＡもあり、を示す。
また、以下の三つの翻訳反応液を調製した。
（Ｉ）ベイト無し
ＪｕｎとサイクリンＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスのＲＮＡテンプレート（それぞれ２ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌ）を、５０μｌの小麦の無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））において共翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）した。
（ＩＩ）別翻訳（ＦｏｓとＪｕｎを別の無細胞翻訳系で翻訳後に混合）
ベイトＦｏｓのｍＲＮＡテンプレート（１０ｐｍｏｌ）及びＤＮＡベイト（１．５μｇ）を、５０μｌの小麦の無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））において翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）した。同様に、ＪｕｎとサイクリンＢのＲＮＡテンプレート（それぞれ２ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌ）を、５０μｌの小麦の無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））において翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）した。これら二つの翻訳系を混合した（別翻訳）。
（ＩＩＩ）共翻訳（ＦｏｓとＪｕｎを一つの無細胞翻訳系で翻訳）
ＦｏｓのｍＲＮＡテンプレート（１０ｐｍｏｌ）、ＪｕｎとサイクリンＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスのＲＮＡテンプレート（それぞれ２ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌ）、そしてＤＮＡベイト（１．５μｇ）を、５０μｌの小麦の無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））において共翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）した（共翻訳）。
上記の三つの翻訳反応液を用いて、上記と同様にそれぞれスクリーニングし、ベイト無し、別翻訳及び共翻訳の各場合のスクリーニング後の溶出液及びその希釈液をテンプレートとして、プレイの共通配列に基づくプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ（プライマー５’０２９−Ｆ３と３’Ｆｌａｇ−Ｒ３、プログラムＲＴ−３０（表１参照））を行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について１％アガロースゲル電気泳動を行った。結果を図４のＣに示す。図中、レーン１は原液、レーン２は１／１００希釈、レーン３は１／１０００希釈、レーン４は１／１００００希釈である。また、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは、それぞれ、ベイト無し、別翻訳及び共翻訳を示す。
結果：
図４のＢに示すＲＴ−ＰＣＲの結果から、Ｆｏｓと相互作用しないサイクリンＢに比べてＪｕｎはスクリーニングの一段目で１０〜１００倍、二段目で１０００〜１００００倍濃縮されていることが分かる。また、スクリーニングにおいて、ＤＮＡベイトが存在すると、よりＪｕｎが選択的に回収されることがわかった（図４のＢ，Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／−），（＋／＋））。このことから、無細胞共翻訳によってＦｏｓ／ＪｕｎあるいはＦｏｓ／Ｊｕｎ／ＤＮＡの複合体が形成され、ＦｏｓをベイトとしたスクリーニングによりプレイであるＪｕｎが検出できることを確認できた。また、無細胞共翻訳の効果について調べた実験では、図４のＣに示すように、ベイトとプレイを共翻訳（ベイトとプレイを共存させて翻訳）した場合、別翻訳（ベイトとプレイを別々に翻訳した後混合）した場合に比較して、Ｊｕｎの選択的検出が顕著であることが分かった（図４のＣ，Ｉ−ベイトなし，ＩＩ−別翻訳，ＩＩＩ−共翻訳）。
ｍＲＮＡディスプレイ法（Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１  Ｍａｒｃｈ  ３０−ｅｐｕｂ）では、プルダウン法を採用しているため、大腸菌で発現精製が必要だが、本発明の無細胞共翻訳では、本実施例のように無細胞翻訳系で簡単にベイトを用意できる。
実施例２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法への応用２
ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法への応用において、プレイとしてプレイライブラリーを用いた例を示す。
プレイ・ライブラリーは、ランダムプライミング法によりマウス（Ｔｅｓｔｉｓ）のｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス用のベクターｐＥＴ−０２９／Ｔ７（ＥｃｏＲＩ）ＦＨ（配列番号１８）へ組み込んで、ランダムプライミングｃＤＮＡライブラリーを作成した。このライブラリーにはｃ−ｊｕｎが含まれていることを予め確認した。ｐＥＴ−０２９／Ｔ７（ＥｃｏＲＩ）ＦＨは、転写プロモーターにＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（ＳＰ６）を含み、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルスのＴＭＶオメガ配列の一部（０２９；配列番号２９）を含んだ５’ＵＴＲ領域を含み、かつ３’末端領域のポリＡ配列の上流にＸｈｏＩ配列、さらに親和タグ配列として抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列を含んだ配列をもち、市販のベクターｐＥＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にＳＰ６、０２９、Ｔ７タグ（Ｔ７−ｔａｇ）、ＥｃｏＲＩサイト、及び、Ｆｌａｇタグを含む配列を組み込んで作成したものである。
概略を図５を参照して説明する。Ｆｏｓをベイトとし、ランダムプライミングｃＤＮＡライブラリーをプレイとし、さらに、第二のベイトとしてＦｏｓ／Ｊｕｎと相互作用するＤＮＡを混在させた。全てが混在した系（Ｆｏｓ、ライブラリー、ＤＮＡ；図５のＢ，Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／＋））、あるいはＤＮＡが存在しない系（Ｆｏｓ、ライブラリー；図５のＢ，Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／−））、あるいはライブラリーのみの系（ライブラリーのみでＦｏｓなし；図５のＢ，Ｆｏｓ／ＤＮＡ（−／−））である無細胞翻訳系で共翻訳を行い、Ｆｏｓ／ライブラリー相互作用による複合体を形成せしめた。本実施例では、実施例１同様、プレイは全て対応付け分子である。これをＩｇＧビーズで回収し、ＴＥＶプロテアーゼでベイトを切断し、さらにカルモジュリンビーズで回収し、ＥＧＴＡで溶出する二段階スクリーニングによりベイトと特異的に結合するプレイを実施例１同様にＲＴ−ＰＣＲで検出し（図５のＢ）、さらに、ｃ−ｊｕｎ特異的な配列でＲＴ−ＰＣＲし、ライブラリーのＪｕｎが濃縮されていることを確認した（図５のＣ）。以下、方法と結果を具体的に説明する。
方法：
Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ法（Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ  １９８３  Ｇｅｎｅ  ２５，２６３）に基づいてｃＤＮＡを作成した。マウス（Ｔｅｓｔｉｓ）のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及び、ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、一本鎖ｃＤＮＡを合成する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨでＲＮＡにニックを入れて分解後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩとＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼによってＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置き換え、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにより、末端平滑化を行い、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（Ｔａｋａｒａ）を連結した。５’末端を燐酸化し、スピンカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓ−４００）で低分子量ＤＮＡを除去した。ベクターｐＥＴ−０２９／Ｔ７（ＥｃｏＲＩ）ＦＨ（ＥｃｏＲＩ切断、ＢＡＰ処理）と連結し、連結産物を精製し、エレクトロポーレーション法によりＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ（Ｔａｋａｒａ）に導入し形質転換して、インサート効率６０％、サイズ２ｘ１０６のインディペンデントクローンのライブラリーを得た。このライブラリーをプレイ・ライブラリーとして、ライブラリーのＤＮＡテンプレートをＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６−Ｌ（配列番号１９）と３’Ｆｌａｇ−Ｌ（配列番号２０）、プログラムＶ−２（表１参照））によって用意した。実施例２と同様に、転写し、３’末端にピューロマイシンをもつスペーサーと連結した。
上記のように作成したランダムプライミング法によるｃＤＮＡライブラリーに由来するｍＲＮＡ（１２μｇ）をＲＮＡテンプレートの代わりに用いた以外は、実施例１と同様に共翻訳及びスクリーニングを行った。また、ベイトの有無の条件を変えて同様の共翻訳及びスクリーニングを行った。
スクリーニング後の溶出液及びその希釈液をテンプレートとして、プレイの共通配列に基づくプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ（プライマー５’０２９−Ｆ３（配列番号１６）と３’Ｆｌａｇ−Ｒ３（配列番号１７）、プログラムＲＴ−３０（表１参照））を行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について１％アガロースゲル電気泳動を行った。結果を図５のＢに示す。図中、レーン１は原液、レーン２は１／１００希釈、レーン３は１／１００００希釈である。また、Ｆｏｓ／ＤＮＡの欄は、−／−：両方なし、＋／−：ＦｏｓありＤＮＡなし、＋／＋）：ＦｏｓもＤＮＡもあり、を示す。
さらに、スクリーニング後の溶出液及びその希釈液をテンプレートとして、ｊｕｎ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ（プライマー５’Ｊｕｎ（ＤＢ２）（配列番号２１）と３’Ｊｕｎ（Ｌｅｕ）（配列番号２２）、プログラムＲＴ−３０（表１参照））を行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について１％アガロースゲル電気泳動を行った。結果を図５のＣに示す。図中、レーン１は原液、レーン２は１／１００希釈、レーン３は１／１００００希釈である。また、Ｆｏｓ／ＤＮＡの欄は、−／−：両方なし、＋／＋：ＦｏｓもＤＮＡもあり、を示す。
結果：
図５のＢに示す結果から、ベイト無し（Ｆｏｓ／ＤＮＡ（−／−））、Ｆｏｓのみ（Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／−））、Ｆｏｓ／ＤＮＡ複合ベイト（Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／＋））を比較すると、ベイトがあるとライブラリーから、スミアながらより多くの遺伝子が検出されていることが確認できた。さらに、図５のＣに示す結果から、ｃ−ｊｕｎ特異的な配列でのＲＴ−ＰＣＲによってＪｕｎが濃縮されていることが確認できた（図５のＣ，Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／＋），レーン１）。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングによってＪｕｎの配列を確認した。以上から、ライブラリーからも同様にＪｕｎが濃縮されることが明らかとなった。
実施例３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法への応用３
現在、ＤＮＡ結合因子や転写制御因子の解析としては、ゲルシフト法、ＤＮａｓｅＩフットプリント法、サウスウエスタン法、表面プラズモン共鳴法などが行われているが、本発明の無細胞共翻訳とｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法を組み合わせ、スクリーニングの際に、ベイトをＤＮＡとすることによって、ライブラリーからＤＮＡ結合因子や転写制御因子を網羅的に検出可能である。本実施例では、ビオチンＤＮＡベイトによる蛋白質間相互作用の検出の例を示す。
概略を図６を参照して説明する。図６のＡに示すように、実施例１と基本的には同様であるが、ここでは、ベイトとしてビオチンＤＮＡ（Ｆｏｓ／Ｊｕｎと相互作用するＤＮＡ配列にビオチンをＰＣＲで導入したもの）を用いて、ＪｕｎとＦｏｓをプレイとした。ここでは、ＦｏｓとＪｕｎの対応付け分子、ビオチンＤＮＡを混在させた系において、ＤＮＡベイト量を０（Ｉ），５（ＩＩ），１００（ＩＩＩ），２０（ＩＶ），４０（Ｖ）ｐｍｏｌと変化させた無細胞翻訳系で共翻訳を行い、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ／ＤＮＡ相互作用による複合体を形成させた。ここで、実施例１同様、プレイは全て対応付け分子である。これをアビジンビーズで回収する１段階スクリーニングによりベイトと特異的に結合するプレイであるＦｏｓ、ＪｕｎをＲＴ−ＰＣＲで検出した（図６のＢ）。
方法：
ベイトとしてのビオチンＤＮＡは、５’プライマーにビオチンが結合しているものを用いた他は、実施例１のＤＮＡベイトと同様にＰＣＲ（テンプレートＤＮＡ−Ｆｏｓ／Ｊｕｎ、プライマー５’ＤＮＡ（ｂｉｏ）（配列番号１４）と３’ＤＮＡ（配列番号１５）、プログラムＶ−２（表１参照））によって準備した。プレイとしてのＪｕｎのｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスは、実施例１と同様に準備した。プレイとしてのＦｏｓのｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスは、ｐＣＭＶ−ＦｏｓＣＢＰｚｚベクター（配列番号１）からＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９）Ｆｏｓ（配列番号２３）と３’ＦｏｓＦｌａｇＡ（配列番号２４）、プログラムＶ−２（表１参照））によって得たＤＮＡテンプレートを用いて、さらにＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９／Ｆ．Ｈ）（配列番号２５）と３’ＦｏｓＦｌａｇ［Ｘ］Ａ（配列番号２６）、プログラムＶ−２（表１参照））によって準備し、転写し、３’末端にピューロマイシンをもつスペーサー（ｐ（ｄＣ）２ｐＴ（フルオレセイン）−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ｐ（ｄＣ）２ピューロマイシン（ｎ＝３６〜５７））と連結した。
ビオチンＤＮＡベイト（０〜４０ｐｍｏｌ（０〜３μｇ）の所定量）、Ｊｕｎ及びＦｏｓのｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスのＲＮＡテンプレート（それぞれ５ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌ）を、５０μｌの小麦の無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））において共翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）した。
５０μｌの翻訳反応液に対し、磁性アビジンビーズ（５００μｇ）を加え、室温で３０分インキュベートし、アビジン結合バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ＮＰ４０，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ）で３回洗浄し、５００μｇのアビジンビーズを得た。
洗浄したビーズ及びその希釈液をテンプレートとして、プレイの共通配列に基づくプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ（プライマー５’０２９−Ｆ３（配列番号１６）と３’Ｆｌａｇ−Ｒ３（配列番号１７）、プログラムＲＴ−３０（表１参照））を行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について２％アガロースゲル電気泳動を行った。結果を図６のＢに示す。図中、レーン１は洗浄ビーズ、レーン２は１／１００希釈、レーン３は１／１００００希釈を示す。また、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは、それぞれ、０，５，１０，２０，４０ｐｍｏｌのＤＮＡベイト量を示す。
結果：
図６のＢに示す結果から、ビオチンＤＮＡベイト量を増やしていくと、ＪｕｎとＦｏｓが検出されてくることがわかる。特に、２０ｐｍｏｌ（１．５μｇ）以上で効果が顕著である。
以上より、Ｊｕｎ／Ｆｏｓ／ＤＮＡの複合体が無細胞翻訳系で形成されたこと、及び一つのベイトに対して、複数のプレイが同時に検出できることが示された。ライブラリーから一挙に網羅的にプレイを検出するときなどは、この効果がより期待できるであろう。
実施例４  ＳＴＡＢＬＥ法への応用
ＳＴＡＢＬＥ法（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌｉｎｋａｇｅ  ｉｎ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ；Ｄｏｉ，Ｎ  ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５７，２２７−２３０）は次の５つのステップからなる。▲１▼ストレプトアビジンと融合した蛋白質を発現させるためのｃＤＮＡライブラリーの作成。これを鋳型としてＰＣＲを行い、ビオチンラベルしたｃＤＮＡの増幅。▲２▼ｃＤＮＡ１分子を一つのエマルジョン区画に閉じ込め、それがコードする蛋白質を合成。▲３▼ｃＤＮＡとそれに対応した蛋白質が結合（対応付け）。▲４▼エマルジョンを壊し、ベイトを固定した樹脂にｃＤＮＡ−蛋白質を吸着。▲５▼吸着したｃＤＮＡ−蛋白質をテンプレートにＰＣＲを行い、コードする蛋白質の配列を決定。以上のステップを繰り返すことにより、目的のｃＤＮＡを濃縮する。
概略を図７を参照して説明する。相互作用が既知の蛋白質の組合せとしてｃｄｃ２及びサイクリンＢを用いた。プレイ蛋白質はストレプトアビジン融合蛋白質として翻訳されるようにした。同一反応系で共翻訳することにより、対応付け分子とベイト蛋白質との複合体の形成が期待できる。複合体をＩｇＧビーズで回収、ＴＥＶプロテアーゼでベイト蛋白質を切断することにより、ベイト蛋白質と特異的に結合するストレプトアビジン融合蛋白質、及びこれをコードするＤＮＡが濃縮できているかどうかをＰＣＲで確認した（図７のＡ）。以下、方法と結果を具体的に説明する。
方法：
ベイト蛋白質に対する鋳型ＤＮＡはラベルされていないものを用いた。一方ストレプトアビジン融合蛋白質に対する鋳型ＤＮＡは、５’及び３’側にビオチン及びフルオレセインでラベルされたものを用いた。
ベイト蛋白質（ｃｄｃ２、サイクリンＢ、又はルシフェラーゼ）の鋳型ＤＮＡ（２２５ｎｇ）と、プレイ蛋白質（ｃｄｃ２、サイクリンＢ、又はルシフェラーゼ）を含むストレプトアビジン融合蛋白質の鋳型ＤＮＡ（２２５ｎｇ）とをウサギ網状赤血球の無細胞転写翻訳系（ＴＮＴ（商標）Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に添加して５０μｌとし転写翻訳反応液を作成した。本実施例は、相互作用が既知の蛋白質を用いたモデル実験であるため、転写翻訳反応液をエマルジョンとすることを省略して、３０℃で９０分間インキュベートした（共翻訳）。４５μｌの翻訳反応液に対し、結合バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ＮＰ４０）５４μｌ、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）１μｌを添加し計１００μｌ（無細胞共翻訳サンプル）とした。
ＩｇＧアガロース（Ｓｉｇｍａ）を結合バッファーで２回洗浄し、これに無細胞共翻訳サンプル（１００μｌ）を加え、４℃で２時間撹拌した。結合バッファーで３回、ＴＥＶ切断バッファーで１回洗浄、ＩｇＧアガロースに結合したベイト／プレイ複合体をＴＥＶプロテアーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で切断した（１６℃、２時間）。切断後遠心し、上清（溶出液）５０μｌを回収した。
溶出液を２×サンプルバッファーと混合し、４０μｌを１．３％アガロースゲルで電気泳動し、抗Ｔ７タグ及び抗ＳＴＡ抗体によるウエスタンブロットを行った。結果を、図７のＢに示す（上及び中）。また、スクリーニング後の溶出液をテンプレートとして、５’側及び３’側ともプレイの共通配列に基づくプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、１μｌを２００μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁、これをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとし、用いたプライマーの塩基配列は５’−ＡＡＧＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２７）及び５’−ＧＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡ−３’（配列番号２８）であり、９５℃で１ｍｉｎ加熱後、９８℃２０秒、５５℃１分、７２℃４分のサイクルを３０回の条件で行った。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲルで電気泳動した。結果を、図７のＢに示す（下）。
結果：
ストレプトアビジン融合蛋白質をベイト蛋白質と結合させ、ＴＥＶプロテアーゼにより切断、溶出画分を泳動した結果、ベイトをｃｄｃ２とした場合サイクリンＢが回収され、ベイトをサイクリンＢとした際にはｃｄｃ２が回収された。これにより対応付け分子が選択的に回収されることが示された（図７のＢ）。ベイトと相互作用した蛋白質をコードするＤＮＡが、ＰＣＲにより優位に増幅された（図７のＢ）。
2003014734.tif 000003
実施例５  ベイトの作成とその翻訳
コード分子は、マウス由来のｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓ（Ｇｅｎｔｚ  Ｒ，Ｒａｕｓｃｈｅｒ  ＦＪ  ３ｄ，Ａｂａｔｅ  Ｃ，Ｃｕｒｒａｎ  Ｔ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６９５−９；Ｎｅｕｂｅｒｇ  Ｍ，Ｓｃｈｕｅｒｍａｎｎ  Ｍ，Ｈｕｎｔｅｒ  ＪＢ，Ｍｕｌｌｅｒ  Ｒ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５８９−９０）の組み込まれているプラスミド（ｃ−ｊｕｎは、ｐＥＵ−Ｔ７ＪｕｎＦｌａｇ（配列番号３０）；ｃ−ｆｏｓは、ｐＣＭＶＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号３１））からＰＣＲで作成した。ＰＣＲのプライマーとしては、ｃ−ｊｕｎでは５’ＵＴＲ領域について１種類（プライマー；５’ＳＰ６−０２９（配列番号３２））と３’末端領域については１３種類（プライマー；３’Ａ８＝Ａ（配列番号３５）、３’Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）（配列番号３６）、３’Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）Ａ８＝ＸＡ（配列番号３７）、３’Ｘ（ＣＴＣＧＣＣ）Ａ８（配列番号３８）、３’Ｘ（ＣＴＣＧ）Ａ８（配列番号３９）、３’Ｘ（ＣＴＣ）Ａ８（配列番号４０）、３’Ｘ（ＣＴＣＴ）Ａ８（配列番号４１）、３’Ｘ（ＴＴＣＧ）Ａ８（配列番号４２）、３’Ｘ（ＧＴＣＣ）Ａ８（配列番号４３）、３’Ｘ（ＣＡＴＧ）Ａ８（配列番号４４）、３’Ｘ（ＣＴＣＣ）Ａ８（配列番号４５）、３’Ｘ（    ）Ａ８（配列番号４６）、３’ｎｏｎｅ（配列番号３４））、ｃ−ｆｏｓでは５’ＵＴＲ領域について１種類（プライマー；５’Ｔ７（０’）−ｂａｉｔ（配列番号３３））と３’末端領域については２種類（プライマー；３’ｂａｉｔＦｏｓＤ（配列番号３７），３’ｂａｉｔＦｏｓＤＡ（配列番号３８））を用い、計１５種類のＤＮＡテンプレートを調製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。これらのＤＮＡテンプレートを、ＲｉｂｏＭＡＸＴＭ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をもちいて転写（３７℃，２ｈ）し、合成したｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、ｍＲＮＡテンプレート（コード分子）を得た。
まず、得られたｍＲＮＡテンプレートを翻訳テンプレートとして用いて、翻訳を行った。翻訳テンプレート２ｐｍｏｌを用いて、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１０μｌの系で翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）を行い、翻訳と同時に、修飾剤として２４０ｐｍｏｌのＦｌｕｏｒ−ｄＣｐＰｕｒｏを用いて、蛋白質のラベル化（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６２：４３−４６）を行い、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、バンドの蛍光（フルオレセイン）をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。その結果をまとめたグラフを図１０に示す。
図１０から、ポリＡ配列（Ａ配列）よりＳＮＮＳ配列（Ｘ配列）を有する場合に、さらにＳＮＮＳ−ポリＡ配列（ＸＡ配列）を有する場合に、翻訳量が増加することが示された。このことから、ＸＡ配列を持つ翻訳テンプレートは、一般的な翻訳やＣ末端ラベル化により好ましいといえる。また、Ｘ配列を変えたときの翻訳結果から、Ｘ配列がＡ配列と組み合わさって効果を現すには、最低４塩基からなることが必要であり、第一番目と第四番目の塩基はＣかＧであることが要求され、ＳＮＮＳ（ＳはＣまたはＧ）の構成が必要であることが示された。
さらに、ｍＲＮＡテンプレートの３’側にＰＥＧスペーサー分子（下記製造例１〜４参照）をライゲーションした翻訳テンプレートを作成した。ここでは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（宝酒造）をもちいて、ＰＥＧスペーサー部（（ｄＣ）２（Ｔ）２，ＰＥＧ４０００，ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃ）と、コード分子（Ｊｕｎ−Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）Ａ８＝Ｊｕｎ−ＸＡ（プライマー３’Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）Ａ８＝ＸＡを用いて得られたもの））またはコード分子（Ｆｏｓ−Ｄ（−Ａ）または３’ｂａｉｔＦｏｓ−ＤＡ（＋Ａ）（プライマー３’ｂａｉｔＦｏｓＤまたは３’ｂａｉｔＦｏｓＤＡを用いて得られたもの））とのライゲーション（１５℃，２０ｈ）を行い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、８Ｍ尿素４％ＰＡＧＥで電気泳動し、エチレンブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、バンドの蛍光（ＥｔＢｒとフルオレセイン）をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出した。ライゲーションした２ｐｍｏｌの翻訳テンプレートを用いて、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）あるいは、ＰＲＯＴＥＩＯＳ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて、１０μｌの系で翻訳（２６℃；１，３，６，２０ｈｒ）を行い、翻訳と同時に、修飾剤として２４０ｐｍｏｌのＦｌｕｏｒ−ｄＣｐＰｕｒｏを用いて、蛋白質のラベル化（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６２：４３−４６）を行い、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、バンドの蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。ＲＮＡの安定性実験は、ＰＥＧスペーサー部の蛍光を用いて、ＲＮＡの残量をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。対照としてライゲーションしていない翻訳テンプレートを用いて同様の手順を行った。それらの結果をまとめたグラフを図１１および図１２に示す。
図１１から、コード部の配列は基本的にはどのような配列でもＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで翻訳量が増加することが示された（図１１のＡ）。また、ＸＡ配列を持つコード部をもつ翻訳テンプレート（ＸＡ）では、ＸＡ配列もＰＥＧスペーサー部も持たないコード分子（Ｎｏｎｅ）に比べて、翻訳量が約３〜４倍増加していることが示された。また、ＸＡ配列を持つコード部では、ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃの構成が最も翻訳量が増加することが示された（図１１のＢ）。よって、一般的な翻訳やＣ末端ラベル化を行う場合にはＰＥＧスペーサー部がライゲーションされたＸＡ配列を持つ翻訳テンプレートを用いることが適しているといえる。図１２から、ＸＡ配列を持つコード分子（●；ＸＡ）、ＸＡ配列を持たないコード分子（□；Ｎｏｎｅ）は３時間で翻訳量は飽和に達したが、ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃをもつ翻訳テンプレート（○；ＸＡ＋ＰＥＧ４００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃ）は、６時間でも翻訳の増加が見られた（図１２のＡ）。また、その翻訳量は、６時間で比較すると、ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃをもつ翻訳テンプレート（○）は、ＸＡ配列を持つコード分子（●；ＸＡ）の約２倍、ＸＡ配列を持たないコード分子（□；Ｎｏｎｅ）の約４倍であった（図１２のＡ）。コード分子と、ＰＥＧスペーサー部をもつ翻訳テンプレートとの安定性を比較すると、コード分子（●；ＸＡ）は、そのｍＲＮＡが１時間で５０％減るのに対して、ＰＥＧスペーサー部をもつ翻訳テンプレート（○）は、１３時間でようやく５０％減ることから、ＰＥＧスペーサー部をもつコード分子（○）の安定性が非常によいことがわかる（図１２のＢ）。以上から、翻訳テンプレート（○）の翻訳量が増加したのは、ライゲーションされたＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃによる安定性向上が原因と考えられる。
実施例６  プレイの作成
コード分子（ｍＲＮＡテンプレート）にＰＥＧスペーサー分子（下記製造例１〜４参照）をライゲーションしたものを翻訳テンプレートとして用いた。ここでは、実施例５で得たコード分子のｍＲＮＡテンプレート（Ｊｕｎ−ＸＡ，Ｊｕｎ−Ａ）とＰＥＧスペーサー部（ＰＥＧ２０００Ｐｕｒｏ）を実施例５と同様の方法でライゲーションした。ライゲーションしたｍＲＮＡテンプレートを小麦胚芽の無細胞翻訳系としてＷｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をもちいて、実施例１と同様の方法で翻訳し、対応付け分子を８Ｍ尿素１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、蛍光（フルオレセイン）によってマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出した。また、フリー蛋白質の量は、翻訳と同時に、修飾剤としてＦｌｕｏｒ−ｄＣｐＰｕｒｏを用いて、蛋白質のラベル化（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６２：４３−４６）を行い、８ＭＵｒｅａ１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、バンドの蛍光（フルオレセイン）をマルチ画像解析装置、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定し、あわせて、Ｔ７−ｔａｇによる抗体を用いたウエスタンブロットで総蛋白量を決定した。それらの結果をまとめたグラフを図１３に示す。
図１３から、対応付け分子は、ＸＡ配列を持つコード部とＡ配列を持つコード部について比較すると、添加するＲＮＡ量を変化させたときの対応付け効率は両方とも７０％でほとんど変わらないことが示された（図１３のＡ）。しかしながら、添加したＲＮＡテンプレートから合成された蛋白質総量（フリー蛋白質＋対応付け分子＝１００％）に対する対応付け効率については、添加するＲＮＡ量を変化させたとき、Ａ配列を持つコード部の場合は９０％（フリー蛋白質１０％）を超える高い効率を示すことが示された（図１３のＢ）。一方、ＸＡ配列を持つコード部の場合は、フリー蛋白質の生成割合が高い（図１３のＢ）。よって、プレイとして対応付け分子を用いる場合にはＸＡ配列よりもＡ配列を持つコード部が適しているといえる。
製造例１  ＰＥＧスペーサー分子（１１）の合成
ＰＥＧスペーサー分子（１１）は、図１４に示す試薬を用い、図１５に示す方法で合成した。図１４中アミダイト試薬（１〜５）はグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より購入した。平均分子量１０００、２０００、３０００のＰＥＧは日本油脂（東京都渋谷区）より購入した。平均分子量４０００のＰＥＧはフルカ社（スイス）より購入した。それらを原料にしてアミダイト試薬（６）を、Ｊａｓｃｈｋｅらが報告した方法（Ｊａｓｃｈｋｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：３０１−３０４）を用い合成した。図１４中１０はＩｋｅｄａらが報告した方法（Ｉｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：５９７５−５９７８）で合成した。なお、図１４中ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を、図１５中Ｆｍｏｃは９−フルオレンメトキシカルボニル基を示す。
１０（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）に対し、以下のＡ〜Ｄの処理を所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびＰＥＧが導入されるまで繰り返し行なった。
Ａ．３％トリクロロ酢酸−塩化メチレン溶液を１ｍＬ加え室温で３分間放置後、塩化メチレン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｂ．ヌクレオチドアミダイト３０μｍｏｌ、０．４５７Ｍテトラゾール−無水アセトニトリル溶液１００μＬ、および無水アセトニトリル１ｍＬを加え、室温で１５分間振盪する。アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｃ．５０ｍＭヨウ素溶液（テトラヒドロフラン−ピリジン−水＝７５：２０：５）１ｍＬを加え室温で３分間放置後、ピリジン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水ピリジン５ｍＬで５回洗浄する。
Ｄ．１０％無水酢酸−ピリジン溶液１ｍＬおよび触媒量の４，４−ジメチルアミノピリジンを加え室温で２０分間放置後、ピリジン５ｍＬで５回、塩化メチレン５ｍＬで５回洗浄する。
上記の処理をし所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された１０に濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製  ＹＭＣ  ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ＳＨ−３４３−５，溶離液  １０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ  酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、ＰＥＧスペーサー分子（１１）を得た。得られたＰＥＧスペーサー分子（１１）の構造及び収率を以下に示す。
2003014734.tif 000004
2003014734.tif 000005
製造例２  ＰＥＧスペーサー分子（１４）の合成
ＰＥＧスペーサー分子（１４）は、図１４に示す試薬を用い、図１５及び図１６に示す方法で合成した。図１４中、ローダミングリーン（ＲｈｏｄＧ）活性エステル（７）はモレキュラプローブ社（アメリカ合衆国、オレゴン州）より、Ｃｙ５活性エステル（８）およびＣｙ３活性エステル（９）はアマシャムファルマシアバイオテク社（イギリス、バッキンガムシャー）より、購入した。図１６中、１２はＩｋｅｄａらが報告した方法（Ｉｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：５９７５−５９７８）を応用し合成した。なお、図１４中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示す。
１２（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）に対し、ＰＥＧスペーサー分子（１１）の合成の場合と同様のＡ〜Ｄの処理を所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびＰＥＧが導入されるまで繰り返し行なった。
上記の処理を行ない、所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された１２に濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製  ＹＭＣ  ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％  アセトニトリル−０．１Ｍ  酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、１３を得た。１３を３０％アセトニトリル−水０．１ｍＬに溶かし、７，８または９を１０μｍｏｌ、および１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）を１０μＬ加え室温で２時間放置した。反応液を同上の条件のＨＰＬＣで精製後、産物を含む画分を濃縮した。残査を６０％トリフルオロ酢酸−水１ｍＬにて室温で３０分処理後、濃縮乾固した。残査を濃アンモニア水１ｍＬにて室温で１５分処理後、濃縮乾固した。残査を同上の条件のＨＰＬＣで精製後、産物を含む画分を濃縮し、ＰＥＧスペーサー分子（１４）を得た。なお、図１７中、ＲｈｏｄＧは図１４中７の、Ｃｙ５は図１４中８の、Ｃｙ３は図１４中９の、蛍光色素残基部をそれぞれ示す。得られたＰＥＧスペーサー分子（１４）の構造及び収率を以下に示す。
2003014734.tif 000006
製造例３  Ｂｏｃ保護ＰＥＧスペーサー分子（１５）の合成
図１８に示したように、１２（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）より、ＰＥＧスペーサー部（１１）と同じ方法を用いてＢｏｃ保護ＰＥＧスペーサー部（１５）を合成した。得られたＢｏｃ保護ＰＥＧスペーサー分子（１５）の構造と収率を以下に示す。
2003014734.tif 000007
製造例４  ピューロマイシン非含有ＰＥＧスペーサー分子（１６）の合成
Ｊａｓｃｈｋｅらが報告した方法（Ｊａｓｃｈｋｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：３０１−３０４）に従い合成した。得られたピューロマイシン非含有ＰＥＧスペーサー分子（１６）の構造と収率を以下に示す。
2003014734.tif 000008
実施例７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法によるＦＸＡライブラリーからの蛋白質間相互作用の検出
通常、ライブラリーからベイト蛋白質と相互作用する遺伝子群を濃縮する場合、所望の遺伝子の存在量が少ない場合は、無細胞共翻訳スクリーニングを何サイクルか繰り返す必要がある。また、このようにスクリーニングを何サイクルか繰り返して所望の遺伝子を濃縮出来ることが、対応付け分子を用いた場合の利点となる。本実施例は、ベイトとしてｃ−ｆｏｓを用いて、マウス精巣のＦＸＡライブラリー（ｍＲＮＡの３’末端領域のポリＡ配列とその上流にＸｈｏＩ配列、および親和タグ配列として抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列を含んだ配列をもつライブラリー）と共に無細胞共翻訳スクリーニングを行い、ＲＴ−ＰＣＲで増幅してライブラリーを作成し、それを再びベイトと共に無細胞共翻訳スクリーニングすることを複数回繰り返すことにより内在ｃ−ｊｕｎを濃縮する実施例である（図１９のＡ）。
方法：
各テンプレートの準備、マウス精巣のライブラリーの準備方法、無細胞共翻訳スクリーニング方法、スクリーニング後のＲＴ−ＰＣＲについては、全て実施例３に従った。無細胞共翻訳スクリーニングを４サイクル繰り返し、それらの各サイクルのＲＴ−ＰＣＲ結果を１％アガロースゲル電気泳動後にサザン・ブロットすることで、内在ｃ−ｊｕｎの濃縮を解析した。サザン・ブロットの方法は、ＤＩＧ  ＤＮＡ標識および検出キット（ロシュ・ダイアグノスティック）を用いて行った。具体的には以下の通りであった。ｃ−ｊｕｎ遺伝子のＤＮＡ結合領域とロイシンジッパー領域を含む３９０ｂｐフラグメント３μｇを１００℃、１０分加熱後、急冷し１本鎖ＤＮＡに変性させた。キット付属のＤＩＧラベルされたランダムプライマー（配列：ＮＮＮＮＮＮ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ））を添加した後、キット付属のクレノウフラグメントを添加して３７℃で一晩反応させた。エタノール沈殿させ、５０μｌ  ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。１％のアガロースゲル（ＳＩＧＭＡ；Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ａｇａｒｏｓｅ）を用意して、ＤＩＧラベルしてある分子量マーカー（ロシュ・ダイアグノスティック）と各サイクル毎のＲＴ−ＰＣＲ産物を泳動し、電気泳動終了後アガロースゲルを０．５Ｎ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌで２０分処理することで２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させた。さらに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０／１．５Ｍ  ＮａＣｌで５分処理することによりアガロースゲルのｐＨを調節した。次に、ワットマン３ＭＭろ紙、アガロースゲル、ナイロンメンブレン（ロシュ・ダイアグノスティック）、ワットマン３ＭＭろ紙、ペーパータオル、及び、厚さ１ｃｍのアクリル板を積み重ね、１〜２ｋｇの重しをのせ、一番下のろ紙を端部を２０Ｘ  ＳＳＣ溶液（３Ｍ  ＮａＣｌ，０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）に浸し、アガロースゲルのＤＮＡをナイロンメンブレンに一晩かけてトランスファーする。ナイロンメンブレンに移ったＤＮＡをＵＶで架橋することによりメンブレン上に固定し、風乾した。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュ・ダイアグノスティック）を用いて４２℃で１時間、プレハイブリダイゼーションを行った。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂに１で作成したプローブを最終濃度が１４〜１５ｎｇ／ｍｌになるように加えたハイブリダイゼーション溶液で一晩４２℃でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、室温で２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで２回洗浄、６０℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで２回洗浄した。室温でバッファー１（０．１Ｍ  マレイン酸／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．３％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１回、バッファー２（１％  ブロッキング剤／０．１Ｍ  マレイン酸／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で１回洗浄した。酵素標識抗体（抗ジゴシキゲニン、アルカリフォスファターゼ）を含むバッファー２で処理後、バッファー１で２回洗浄した。検出溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．５／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で処理後、発色溶液（検出溶液にＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えたもの）に交換し、冷暗所で静地して発色反応を行い、バンドを検出した（図１９のＢ）。
結果：
図１９のＢから、マウス精巣のＦＸＡライブラリーにおいて、無細胞共翻訳スクリーニングを繰り返すにつれて、内在ｃ−ｊｕｎの濃縮がより進んでいることが確認された。濃縮は３〜４回目でほぼ飽和している。このことから、ここでは、ライブラリーから所望の遺伝子（ここではｃ−ｊｕｎ）を３〜４回無細胞共翻訳スクリーニングを繰り返すことによって濃縮されることが確認できた。
実施例８  ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法によるＦＡテンプレートによる蛋白質間相互作用の検出
本実施例は、ベイトとしてｃ−ｆｏｓを用いて、ネガティブコントロールのサイクリンＢテンプレートとｃ−ｊｕｎテンプレートと共に無細胞共翻訳スクリーニングを行い、ＲＴ−ＰＣＲで増幅・転写してｃ−ｊｕｎのＦＡテンプレート（ｍＲＮＡの３’末端領域のポリＡ配列とその上流に、親和タグ配列として抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列を含んだ配列をもつテンプレート）を作成し、それを再びベイトと共に無細胞共翻訳スクリーニングすることを複数回繰り返すことによりｃ−ｊｕｎを濃縮する（図２０のＡ）。ここでは、サイクリンＢテンプレートに対してｃ−ｊｕｎテンプレートを１／１００００添加した系で無細胞共翻訳スクリーニングを３回繰り返し、ｃ−ｊｕｎが１サイクルでどの程度濃縮されるかを確認した。
方法：
各テンプレートの準備、無細胞共翻訳スクリーニング方法については、全て実施例３に従った。但し、スクリーニング後のＲＴ−ＰＣＲについては、ＦＡテンプレートとするために、プライマーとして、５’０２９−Ｆ３（配列番号１６）と３’Ｆｌａｇ１Ａ−Ｒ（配列番号４９）を用いた。無細胞共翻訳スクリーニングを３サイクル繰り返し、各サイクルのＲＴ−ＰＣＲ結果を１％アガロースゲル電気泳動し、ｃ−ｊｕｎの濃縮を確認した（図２０のＢ）。
結果：
図２０のＢから、ＦＡテンプレートｃ−ｊｕｎは、３サイクルで少なくとも１０９倍濃縮されていることがわかった。よって、１０３／サイクルの濃縮率が確認できた。一般的な濃縮率は最高でも１０２／サイクルであることから、このような高濃縮率は、濃縮を邪魔するであろう遊離の蛋白質が、ＦＡライブラリーではより少ない（実施例６および図１３参照）ことに起因すると考えられる。よって、ここでは、共翻訳スクリーニングにおける、ＦＡテンプレート効果が示された。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、ベイトの共存下でプレイを無細胞翻訳系での翻訳により生成させることで、翻訳と相互作用の工程をカップリングし、蛋白質とそれに相互作用する物質との間の相互作用による複合体を選択的に形成させることができる。この複合体の形成を検出することにより、相互作用を高感度でかつ網羅的に検出できる。また、弱い相互作用による複合体を得ることができる。
さらに、ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で翻訳を行うこと、あるいはベイトが完全長であることにより、より一層選択的で網羅的にプレイを解析できるシステムが実現する。また、ベイトが蛋白質である場合は、無細胞共翻訳となり、従来のようにベイトを別途、大腸菌などで大量発現・精製して準備する必要が無くなり、作業時間の大幅な短縮が行える。
【配列表】
2003014734.tif 000009
2003014734.tif 000010
2003014734.tif 000011
2003014734.tif 000012
2003014734.tif 000013
2003014734.tif 000014
2003014734.tif 000015
2003014734.tif 000016
2003014734.tif 000017
2003014734.tif 000018
2003014734.tif 000019
2003014734.tif 000020
2003014734.tif 000021
2003014734.tif 000022
2003014734.tif 000023
2003014734.tif 000024
2003014734.tif 000025
2003014734.tif 000026
2003014734.tif 000027
2003014734.tif 000028
2003014734.tif 000029
2003014734.tif 000030
2003014734.tif 000031
2003014734.tif 000032
2003014734.tif 000033
【図面の簡単な説明】
図１は、無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。
Ａ：  ベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。
Ｂ：  ベイトの共存下、プレイが無細胞翻訳系で翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。
図２は、複合ベイトを用いた場合の無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。
複合ベイトを構成する一部のベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは、単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。また、複合ベイトは、図に示した無細胞翻訳系で翻訳されたポリペプチドとＤＮＡベイトの組合せに限られず、無細胞翻訳系で翻訳された複数あるいは単独のポリペプチドと、無細胞翻訳系で共存する複数あるいは単独のベイト（たとえば、ＤＮＡベイトなど）の組み合わせが挙げられる。
図３は、無細胞共翻訳による複合体のスクリーニング方法の概略を示す。
図１及び２で示したような無細胞共翻訳による複合体形成の工程（１）、その複合体のプレイをスクリーニングする工程（２）、及び、プレイの解析の工程（３）により、無細胞共翻訳とスクリーニングをトータルにｉｎ  ｖｉｔｒｏで実現することができる。プレイが対応付け分子でかつ複数であれば、ＲＴ−ＰＣＲあるいはＰＣＲによってプレイをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡを再構成することにより再度（１）の工程からスクリーニングを繰り返すことができる。また、得られたプレイを解析後、ベイトとして（１）の工程からスクリーニングを新たに繰り返すことができる。
図４は、無細胞共翻訳をｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法へ応用した例の概略及び結果を示す。
Ａ：  相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ及びＪｕｎを用いて、Ｆｏｓをベイトとし、Ｊｕｎをプレイとし、さらに、第二のベイトとしてＦｏｓ／Ｊｕｎと相互作用するＤＮＡを、また、第二のプレイとしてＦｏｓ／Ｊｕｎと相互作用しないサイクリンＢを混在させた。ＤＮＡベイトの存在下、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、及び、サイクリンＢが無細胞共翻訳され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法に従ってＪｕｎとサイクリンＢは対応付け分子となり、相互作用による複合体Ｆｏｓ／Ｊｕｎ／ＤＮＡを形成する。ＴＡＰ法に従って二段階のスクリーニングを行い、ＲＴ−ＰＣＲでプレイを検出した。
Ｂ：  スクリーニングの一段目（ｓｔｅｐ  １）の溶出液と二段目（ｓｔｅｐ  ２）の溶出液について原液（レーン１）、１／１００希釈（レーン２）、１／１００００希釈（レーン３）をテンプレートとして、ベイトの条件の異なる３つの実験（Ｆｏｓ／ＤＮＡ（−／−）：両方なし、Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／−）：ＦｏｓありＤＮＡなし、Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／＋）：ＦｏｓもＤＮＡもあり）について、プレイの共通配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について１％アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
Ｃ：  プレイの共通配列をプライマーとして、スクリーニング後の溶出液について原液（レーン１）、１／１００希釈（レーン２）、１／１０００希釈（レーン３）、１／１００００希釈（レーン４）をテンプレートとして、ベイト無し（Ｉ）、別翻訳（ＦｏｓとＪｕｎを別の無細胞翻訳系で翻訳後に混合）（ＩＩ）、共翻訳（ＦｏｓとＪｕｎを一つの無細胞翻訳系で翻訳）（ＩＩＩ）についてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について１％アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
図５は、無細胞共翻訳をｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法へ応用した例の概略及び結果を示す。
Ａ：  相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ及びＪｕｎを用いて、Ｆｏｓをベイトとし、Ｊｕｎを含むライブラリーをプレイ・ライブラリーとした。第二のベイトとしてＦｏｓ／Ｊｕｎと相互作用するＤＮＡベイトの存在下、Ｆｏｓ及びライブラリーが無細胞共翻訳され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法によりライブラリーは対応付け分子のライブラリーとなり、相互作用の複合体Ｆｏｓ／ライブラリー／ＤＮＡを形成する。ＴＡＰ法に従って二段階のスクリーニングを行い、ＲＴ−ＰＣＲでプレイを検出した。
Ｂ：  スクリーニング後の溶出液について原液（レーン１）、１／１００希釈（レーン２）、１／１００００希釈（レーン３）をテンプレートとして、ベイトの条件の異なる３つの実験（Ｆｏｓ／ＤＮＡ（−／−）：両方なし、Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／−）：ＦｏｓありＤＮＡなし、Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／＋）：ＦｏｓもＤＮＡもあり）について、プレイの共通配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について１％アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
Ｃ：  スクリーニング後の溶出液について原液（レーン１）、１／１００希釈（レーン２）、１／１００００希釈（レーン３）をテンプレートとして、ベイトの条件の異なる２つの実験（Ｆｏｓ／ＤＮＡ（−／−）：両方なし、Ｆｏｓ／ＤＮＡ（＋／＋）：ＦｏｓもＤＮＡもあり）について、ｊｕｎ遺伝子に特異的なプライマーでＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について１％アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
図６は、無細胞共翻訳をｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法へ応用した例の概略及び結果を示す。
Ａ：  相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ及びＪｕｎを用いて、ベイトとしてビオチンＤＮＡ（Ｆｏｓ／Ｊｕｎと相互作用するＤＮＡ配列にビオチンをＰＣＲで導入したもの）を用いて、ＪｕｎとＦｏｓをプレイとした。ＪｕｎとＦｏｓは、蛋白質そのままでも対応付け分子でも構わない。ＦｏｓとＪｕｎの対応付け分子を、ビオチンＤＮＡベイト共存下で無細胞共翻訳した後、ビオチン−アビジンの親和性によりスクリーニングし、ＲＴ−ＰＣＲでＪｕｎとＦｏｓを検出した。
Ｂ：  スクリーニング後のアビジンビーズについて洗浄ビーズ（レーン１）、１／１００希釈（レーン２）、１／１００００希釈（レーン３）をテンプレートとして、ＤＮＡベイト量を０（Ｉ），５（ＩＩ），１０（ＩＩＩ），２０（ＩＶ），４０（Ｖ）ｐｍｏｌと変化させて、プレイの共通配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物について２％アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
図７は、無細胞共翻訳をＳＴＡＢＬＥ法へ応用した例の概略及び結果を示す。
Ａ：  相互作用が既知の蛋白質としてｃｄｃ２及びサイクリンＢを用いて、ストレプトアビジン融合蛋白質（プレイ）をベイト蛋白質と同一反応系で無細胞共翻訳し、対応付け分子をベイト蛋白質と結合させた。これをＩｇＧビーズで回収し、ＴＥＶプロテアーゼでベイト蛋白質を切断することにより、ベイト蛋白質と特異的に結合するストレプトアビジン融合蛋白質をコードするＤＮＡをＰＣＲで確認した。
Ｂ：  抗Ｔ７及び抗ＳＴＡ抗体によるウエスタンブロット及びＰＣＲ産物の２％アガロースゲル電気泳動の結果を示す（それぞれ、ａｎｔｉ−Ｔ７  ｔａｇ、ａｎｔｉ−ＳＴＡ及びＰＣＲ）。スクリーニング後の溶出液を用いて、ベイトなし、ベイトがｃｄｃ２、ベイトがサイクリンＢである場合について、抗Ｔ７及び抗ＳＴＡ抗体によるウエスタンプロットを行った。また、スクリーニング後の溶出液をテンプレートとして、ベイトなし、ベイトがｃｄｃ２、ベイトがサイクリンＢである場合について、ｃｄｃ２及びサイクリンＢの特異的プライマー、プレイの共通配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
図８は、本発明の翻訳テンプレート（Ａ）ならびにその構成要素であるコード分子（Ｂ）及びスペーサー分子（Ｃ）の構成を示す。翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスペーサー分子由来のスペーサー部からなる。Ｆ１及びＦ２は蛍光色素を示す。
図９は、Ｃ末端修飾された蛋白質（Ｃ末端ラベル化蛋白質）（Ａ）、本発明の翻訳テンプレート（Ｂ）、及び、修飾剤（Ｃ）の構成を示す。
図１０は、コード分子の３’末端配列の違いによる翻訳量の比較を示す。ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有する、異なる１２種類の３’末端配列を持つコード分子（Ａ８＝Ａ配列）の翻訳量の比較。Ｘ配列のバリエーションと必要な条件を示した。詳細は、実施例１参照。
図１１は、翻訳テンプレートがＰＥＧスペーサー部を持たない場合及び異なるＰＥＧスペーサー部を持つ場合の翻訳量の比較を示す。
Ａ：  ｃ−ｆｏｓの遺伝子配列を有するＡ配列もＸ配列も持たないコード分子（Ｎｏｎｅ（ｍＲＮＡ））と，Ａ配列を持つコード分子（Ａ（ｍＲＮＡ））、およびｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした翻訳テンプレート（＋ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃ，）の翻訳量の比較。詳細は、実施例５参照。
Ｂ：  ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するＡ配列もＸ配列も持たないコード分子（Ｎｏｎｅ（ｍＲＮＡ）），ＸＡ配列を持つコード分子（ＸＡ（ｍＲＮＡ））、およびコード分子（ＸＡ（ｍＲＮＡ））に（ｄＣ）２Ｔ（Ｆｌｕ）Ｔ（ＸＡ＋（ｄＣ）２Ｔ２），ｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＴＰＥＧ４０００（ＸＡ＋ＰＥＧ４０００），ｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃ（ＸＡ＋ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃ）をライゲーションした翻訳テンプレートの翻訳量の比較。詳細は、実施例５参照。
図１２は、翻訳テンプレートの翻訳量と安定性を示す。
Ａ：  ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するＸＡ配列を持つコード分子（●；ＸＡ配列）、Ａ配列もＸ配列も持たないコード分子（□；Ｎｏｎｅ配列）、およびコード分子（ＸＡ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした翻訳テンプレート（○）の翻訳量のタイムコース。詳細は、実施例５参照。
Ｂ：  ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するコード分子（●；ＸＡ配列）と、およびコード分子（ＸＡ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした翻訳テンプレート（○）の安定性のタイムコース。詳細は、実施例５参照。
図１３は、本発明の翻訳テンプレートが異なるＰＥＧスペーサー部を持つ場合の翻訳量の比較を示す。
Ａ：  ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するコード分子（ＸＡ配列，Ａ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによる対応付け分子の形成効率。ＩＶＶ；対応付け分子、Ｌｉｇａｔｅｄ  ｍＲＮＡ；コード部にＰＥＧスペーサー部がライゲーションされた翻訳テンプレート。レーン１〜６；ＲＮＡ添加量が１０，２５，５０，１００，２００，４００ｎＭ．詳細は、実施例６参照。
Ｂ：  ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するコード分子（ＸＡ配列，Ａ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによるフリー蛋白質（Ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の合成率（対応付け分子の形成量＋フリー蛋白質の合成量＝１００％）。レーン１〜６；ＲＮＡ添加量が１０，２５，５０，１００，２００，４００ｎＭ．詳細は、実施例６参照。
図１４〜１８は、本発明に使用されるＰＥＧスペーサー分子とその合成スキームを示す。
図１９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法によるＦＸＡライブラリーからの共翻訳スクリーニング（内在ｃ−ｊｕｎの濃縮）の概略及び結果を示す。
Ａ：  ベイトとしてｃ−ｆｏｓを用いて、プレイ・ライブラリーであるマウス精巣のＦＸＡライブラリー（ｍＲＮＡの３’末端領域にポリＡ配列とその上流にＸｈｏＩ配列、および親和タグ配列として抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列を含んだ配列をもつライブラリー）と共に無細胞共翻訳スクリーニングを行い、ＲＴ−ＰＣＲで増幅してライブラリーを作成し、それを再びベイトと共に無細胞共翻訳スクリーニングすることを複数回繰り返すことにより内在ｃ−ｊｕｎを濃縮する系。
Ｂ：  Ａの系を用いた内在ｃ−ｊｕｎの濃縮について、共翻訳スクリーニング後のＲＴ−ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ｃ−ｊｕｎのプローブを用いてサザン・ブロットした結果。Ｍ：ＤＩＧラベルしてある分子量マーカー（ロシュ・ダイアグノスティック）。
図２０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法によるＦＡテンプレートを用いた共翻訳スクリーニング（添加ｃ−ｊｕｎの濃縮）の概略及び結果を示す。
Ａ：  ベイトとしてｃ−ｆｏｓを用いて、ネガティブコントロールのサイクリンＢテンプレートとｃ−ｊｕｎテンプレートと共に無細胞共翻訳スクリーニングを行い、ＲＴ−ＰＣＲで増幅・転写してｃ−ｊｕｎのＦＡテンプレート（ｍＲＮＡの３’末端領域にポリＡ配列とその上流に、親和タグ配列として抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列を含んだ配列をもつテンプレート）を作成し、それを再びベイトと共に無細胞共翻訳スクリーニングすることを複数回繰り返すことによりｃ−ｊｕｎを濃縮する系。
Ｂ：  Ａの系を用いて、ネガティブコントロールのサイクリンＢテンプレートに対してｃ−ｊｕｎテンプレートを１／１００００添加した系で無細胞共翻訳スクリーニングを３回繰り返し、得られたＲＴ−ＰＣＲ産物について２％アガロースゲル電気泳動を行い、ｃ−ｊｕｎが１サイクルでどれだけ濃縮されるかを確認した。レーン１〜５：スクリーニングの溶出液を原液（レーン１）から順に１０倍づつ希釈したものをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲを行って得られたサンプルを電気泳動した。
【図１】
2003014734.tif 000034
【図２】
2003014734.tif 000035
【図３】
2003014734.tif 000036
【図４】
2003014734.tif 000037
【図５】
2003014734.tif 000038
【図６】
2003014734.tif 000039
【図７】
2003014734.tif 000040
【図８】
2003014734.tif 000041
【図９】
2003014734.tif 000042
【図１０】
2003014734.tif 000043
【図１１】
2003014734.tif 000044
【図１２】
2003014734.tif 000045
【図１３】
2003014734.tif 000046
【図１４】
2003014734.tif 000047
【図１５】
2003014734.tif 000048
【図１６】
2003014734.tif 000049
【図１７】
2003014734.tif 000050
【図１８】
2003014734.tif 000051
【図１９】
2003014734.tif 000052
【図２０】
2003014734.tif 000053
【国際調査報告】
2003014734.tif 000054
2003014734.tif 000055
2003014734.tif 000056
2003014734.tif 000057