(57)【要約】下記に示す、第１の酵素の情報に基づき、別のターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法。（１）第１の酵素のポケットアミノ酸群を決定し、（２）前記（１）のアミノ酸群の幾何学的配置を決定し、（３）前記（２）と同様の幾何学的配置を有するアミノ酸群を前記ターゲット酵素に見出し、（４）前記（３）で見出したアミノ酸群を構成する各アミノ酸が、（ｉ）ターゲット酵素の表面に存在する、（ｉｉ）前記ターゲット酵素とは異なる種類の生物由来の酵素を比較して、生物間で保存されているかを検索し、これらの条件を満足する場合、第１の酵素のポケットがターゲット酵素にも存在すると推定し、ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
2002044112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の酵素に対して生化学的な阻害活性を有する第１の阻害物質が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析し、アミノ酸配列の二次及び三次構造が既知であるターゲット酵素において、前記幾何学的配置と同様の配置を検索することにより、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）前記第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の阻害物質が結合するアミノ酸複数個からなる第１のポケットアミノ酸群を決定する工程であって、
前記第１の阻害物質非存在下における前記第１の酵素の１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、前記第１の阻害物質存在下における前記第１の酵素の１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフト及び１５Ｎケミカルシフトの各々の絶対値の少なくとも一方の値が特定の値以上を満足するアミノ酸であることを条件として前記第１のポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記第１のポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、前記第１の酵素の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸のＣα原子間距離を求める工程、
（３）前記ターゲット酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するターゲットポケットアミノ酸群候補を検出する工程であって、
前記ターゲット酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する複数個のアミノ酸とそれぞれ同種類のアミノ酸であって、各々のアミノ酸のＣα原子間距離が、前記工程（２）で求めた第１のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸のＣα原子間距離と比較したとき、対応するアミノ酸のＣα原子間距離の差の絶対値が特定の値以下であるアミノ酸であることを条件として、前記第１のポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するターゲットポケットアミノ酸群候補がターゲット酵素に存在すると推定する工程、
（４）前記工程（３）で検出したターゲットポケットアミノ酸群候補が、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する工程であって、前記ターゲットポケットアミノ酸群候補のアミノ酸が、次の要件：
（要件ｉ）前記ターゲット酵素の三次構造において表面に存在するアミノ酸である、及び
（要件ｉｉ）前記ターゲット酵素のアミノ酸の一次配列と、前記ターゲット酵素が由来する生物の生物学的分類とは異なる種類の生物由来の酵素であって、前記ターゲット酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する酵素のアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である
を満足することを条件として、ターゲット酵素の阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程
を具備し、
前記第１の阻害物質における前記第１の酵素との結合部位にあるアミノ酸残基とそれらの幾何学的配置に基づき、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
【請求項２】
ラットＤＮＡポリメラーゼβのアミノ酸の三次構造において、ネルボン酸が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析し、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素において、前記幾何学的配置を検索することにより、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）ラットＤＮＡポリメラーゼβの三次構造において、ネルボン酸が結合するアミノ酸複数個からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程であって、ネルボン酸非存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、ネルボン酸存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフトの絶対値が０．０６ｐｐｍ以上、又は１５Ｎケミカルシフトの絶対値が０．４ｐｐｍ以上を満足するアミノ酸を選択し、Ｌｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９の各々のＣα原子間距離を求め、これらのアミノ酸により形成される三角錐の幾何学的配置を決定する工程、
（３）ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸の三次構造において、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するターゲットポケットアミノ酸群候補を検出する工程であって、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸の三次構造において、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒとそれぞれ同種のアミノ酸であって、各々のＣα原子間距離が、前記工程（２）で求めたＣα原子間距離と比較したとき、対応するＣα原子間距離の差が、±２×１０−１ｎｍの範囲内にあるＬｙｓ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｒをターゲットポケットアミノ酸群候補とする工程
（４）前記ターゲットポケットアミノ酸群候補が、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るものであるか否かを検索する工程であって、前記Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｒからなるターゲットポケットアミノ酸群候補のうち、次の２つの要件：
（要件ｉ）ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素の三次構造において表面に存在するアミノ酸である、及び
（要件ｉｉ）ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸の一次配列と、ヒトの生物学的分類とは異なる種類の生物由来の免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸の一次配列とを比較したとき、各々の生物間で保存されているアミノ酸であるを満足するＬｙｓ−６５、Ｌｅｕ−１００、Ｈｉｓ−２３５及びＴｈｒ−３８６からなるアミノ酸群を前記分子構造設計に利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程
を具備し、
ネルボン酸におけるラットＤＮＡポリメラーゼβとの結合部位にあるアミノ酸残基とそれらの幾何学的配置に基づいて分子構造を設計することにより、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
【請求項３】
アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の酵素に対して生化学的な阻害活性を有する第１の阻害物質が結合するアミノ酸が形成する幾何学的配置を解析し、アミノ酸の一次、二次及び三次構造が既知である第２の酵素において、前記幾何学的配置と同様の幾何学的配置を検索することにより、アミノ酸の三次構造が未知であるターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）前記第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の阻害物質が結合するアミノ酸複数個からなる第１のポケットアミノ酸群を決定する工程であって、
前記第１の阻害物質非存在下における前記第１の酵素の１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、前記第１の阻害物質存在下における前記第１の酵素の１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフト値及び１５Ｎケミカルシフトの各々の絶対値の少なくとも一方の値が特定の値以上を満足するアミノ酸であることを条件として前記第１のポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記第１のポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、前記第１の酵素の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸のＣα原子間距離を求める工程、
（３）前記第２の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有する第２のポケットアミノ酸群を検出する工程であって、
前記第２の酵素が次の要件：
（要件ｉ）前記ターゲット酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する、
（要件ｉｉ）酵素が由来する生物の生物学的分類がターゲット酵素とは異なる、
（要件ｉｉｉ）酵素のアミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である、並びに
（要件ｉｖ）前記第１の阻害物質により生化学的に阻害される
を満足し、かつ
前記第２の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する複数個のアミノ酸とそれぞれ同種類のアミノ酸であって、各々のアミノ酸のＣα原子間距離を、前記工程（２）で求めた第１のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸のＣα原子間距離と比較したとき、対応するアミノ酸のＣα原子間距離の差の絶対値が特定の値以下であることを条件として、第１のポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有する第２のポケットアミノ酸群であるとする工程、
（４）前記第２のポケットアミノ酸群が、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する工程であって、前記第２のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸が、次の要件：
（要件ｉ）前記第２の酵素の三次構造において表面に存在するアミノ酸である、並びに
（要件ｉｉ）前記第２の酵素のアミノ酸の一次配列と、前記ターゲット酵素のアミノ酸の一次配列と、前記第２の酵素が由来する生物の生物学的分類及び前記ターゲット酵素が由来する生物の生物学的分類のいずれとも異なる種類の生物由来の酵素であって、前記第２の酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する酵素のアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である
を満足することを条件として、前記阻害物質を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程
を具備し、
前記第１の阻害物質における第１の酵素との結合部位にあるアミノ酸残基とそれらの幾何学的配置に基づいて、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
【請求項４】
ラットＤＮＡポリメラーゼβのアミノ酸の三次構造において、ネルボン酸が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析し、酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩにおいて、前記幾何学的配置と同様の幾何学的配置を検索することにより、アミノ酸の三次構造が未知のヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）ラットＤＮＡポリメラーゼβの三次構造において、ネルボン酸が結合するアミノ酸複数個からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程であって、ネルボン酸非存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、ネルボン酸存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフトの絶対値が０．０６ｐｐｍ以上、又は１５Ｎケミカルシフトの絶対値が０．４ｐｐｍ以上を満足するアミノ酸を選択し、Ｌｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９の各々のＣα原子間距離を求め、これらのアミノ酸により形成される三角錐の幾何学配置を決定する工程、
（３）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の三次構造において、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒからなる酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を選択する工程であって、前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒの各々のＣα原子間距離と、前記工程２で求めたラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成する各アミノ酸のＣα原子間距離とを比較したとき、対応するＣα原子間距離の差が、±２×１０−１ｎｍの範囲内にあるＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒを酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群とする工程、
（４）前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群が、前記ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する工程であって、前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒのうち、次の要件：
（要件ｉ）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩの三次構造において表面に存在するアミノ酸である、並びに
（要件ｉｉ）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列と、ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列と、酵母の生物学的分類及びヒトの生物学的分類のいずれとも異なる種類の生物由来のＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である
を満足するＴｈｒ−５９６、Ｈｉｓ−７３５、Ｌｅｕ−７４１及びＬｙｓ−９８３を前記分子構造の設計に利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程を具備し、
ネルボン酸における酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩとの結合部位にある基とそれらの幾何学的配置に基づき、前記ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
【請求項５】
ラットＤＮＡポリメラーゼβのアミノ酸の三次構造において、リトコール酸が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析し、酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩにおいて、前記幾何学的配置と同様の幾何学的配置を検索することにより、アミノ酸の三次構造が未知のヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）ラットＤＮＡポリメラーゼβの三次構造において、リトコール酸が結合するアミノ酸複数個からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程であって、リトコール酸非存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、リトコール酸存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフトの絶対値が０．０６ｐｐｍ以上、又は１５Ｎケミカルシフトの絶対値が０．４ｐｐｍ以上を満足するアミノ酸を選択し、Ｌｙｓ−６０、Ｌｅｕ−７７及びＴｈｒ−７９からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成するＬｙｓ−６０、Ｌｅｕ−７７及びＴｈｒ−７９の各々のＣα原子間距離を求め、これらのアミノ酸により形成される三角形の幾何学配置を決定する工程、
（３）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の三次構造において、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するＬｙｓ、Ｌｅｕ及びＴｈｒからなる酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を選択する工程であって、前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を構成するＬｙｓ、Ｌｅｕ及びＴｈｒの各々のＣα原子間距離と、前記工程２で求めたラットＤＮＡポリメラーゼβのポケットアミノ酸群を構成する各アミノ酸のＣα原子間距離とを比較したとき、対応するＣα原子間距離の差が、±２×１０−１ｎｍの範囲内にあるＬｙｓ、Ｌｅｕ及びＴｈｒを酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群とする工程、
（４）前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群が、前記ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する工程であって、前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を構成するＬｙｓ、Ｌｅｕ及びＴｈｒのうち、次の要件：
（要件ｉ）前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩの三次構造において表面に存在するアミノ酸である、並びに
（要件ｉｉ）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列と、ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列と、酵母の生物学的分類及びヒトの生物学的分類のいずれとも異なる種類の生物由来のＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である
を満足するＬｙｓ−７２０、Ｌｅｕ−７６０及びＴｈｒ−７９１を前記分子構造設計に利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程を具備し、
ネルボン酸における酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩとの結合部位にある基とそれらの幾何学的配置に基づき、前記ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酵素阻害物質の設計方法に関する。
より詳細には、本発明は、アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の酵素に対して生化学的な阻害活性を有する第１の阻害物質が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析することにより、アミノ酸配列の二次及び三次構造が既知であるターゲット酵素において、前記幾何学的配置と同様の配置を検索することにより、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法に関する。
また、アミノ酸配列の二次、二次及び三次構造が既知である第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の酵素に対して生化学的な阻害活性を有する第１の阻害物質が結合するアミノ酸が形成する幾何学的配置を解析し、アミノ酸の一次、二次及び三次構造が既知である第２の酵素において、前記幾何学的配置と同様の幾何学的配置を検索することにより、アミノ酸の三次構造が未知であるターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法にも関する。
背景技術
ＤＮＡは遺伝子情報を担う物質であり、それが倍加する反応である「ＤＮＡ複製」や、その構造上の誤り、損傷を直す反応である「ＤＮＡ修復」、遺伝情報の交換反応である「ＤＮＡ組換え」は、あらゆる生命現象の基礎であることはよく知られている。これら一連のＤＮＡ合成反応は、ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる酵素を中心に行われている。
真核生物（主として哺乳動物）のＤＮＡポリメラーゼ（以下、「ｐｏｌ．」ともいう）は、分子量や蛋白質化学的な特徴、及びＤＮＡ合成の機能の違いからｐｏｌ．α、β、γ、δ、ε、ζ、η及びθの８種類の存在が現在のところ知られている（１−４）（カッコ内の数字は、後掲の参考文献欄に挙げた文献の番号である）。これらの酵素は、色々な役割に応じて分業した形で存在していると考えられている。即ち、ｐｏｌ．α、δ及びεは、核のＤＮＡ複製用で（１）、ｐｏｌ．γはミトコンドリアのＤＮＡ複製用（１）、そしてｐｏｌ．β、ζ、η及びθは、核ＤＮＡの修復に関与していると考えられており（１−４）、また、ｐｏｌ．βは、ＤＮＡ組換えにも関与していることが示唆されている（１）。しかし、ＤＮＡ合成反応におけるＤＮＡポリメラーゼの占める生化学的な役割は未だ不明な点が多い。
一般に、酵素の役割の研究によく用いられる分子生物学的手法として、その酵素の欠損突然変異株を作成するか、又は、その遺伝子をノックアウトした固体を作成して、その表現型を調査する方法がよく知られている。しかし、ＤＮＡポリメラーゼに関しては、これらの手法を用いると生物は死に至る場合が多いため、この手法を用いて酵素の役割を解明することが困難である。
一方、ＤＮＡ合成酵素の機能を、その酵素に対する阻害物質の面から研究する手法も知られている。従来、阻害物質の検索は、天然物やケミカルファイルなどを用いた検索が行われている。しかし、このような検索法は、膨大な試行数により偶然的に阻害物質を探り当てる方法であるため、必ずしも効率のよい方法とはいえない。
また、酵素のアミノ酸残基の三次構造まで解明できればその酵素に対する阻害物質の分子構造を予測し易くなる。しかしながら、通常、酵素は分子量が大きい上に複雑な立体構造を有しているので、三次構造まで解明することは困難なことが多い。
そこで、本発明は、酵素の阻害剤を、多数の試行を重ねることなく効率よく見出すための方法を提供することを目的とする。特に、本発明は、ＮＭＲで三次構造を特定できない分子量約３０，０００以上の酵素に対する阻害物質を、多数の試行を重ねることなく効率よく見出すための方法を提供することも目的とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、鋭意研究した結果、特定の酵素とこれに対する阻害物質との反応において、阻害物質が結合する酵素のアミノ酸残基とそれらのアミノ酸残基のＣα原子が形成する幾何学的配置を特定し、これらのアミノ酸が（１）酵素蛋白質の表面に存在するアミノ酸残基であるか及び（２）進化的に保存されたアミノ酸残基であるかを検索することにより、酵素に対する阻害物質の分子構造の設計を、通常の検索法で阻害物質を検索するよりも顕著に試行数を減らし、効率よく阻害物質を見出し得ることを認め、本発明を完成した。
即ち、本発明は、下記の、アミノ酸配列の二次及び三次構造が既知である酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法（以下、「本発明の第１の方法」ともいう。）を提供する。
アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の酵素に対して生化学的な阻害活性を有する第１の阻害物質が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析し、アミノ酸配列の二次及び三次構造が既知であるターゲット酵素において、前記幾何学的配置と同様の配置を検索することにより、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）前記第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の阻害物質が結合するアミノ酸複数個からなる第１のポケットアミノ酸群を決定する工程であって、
前記第１の阻害物質非存在下における前記第１の酵素の１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、前記第１の阻害物質存在下における前記第１の酵素の１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフト及び１５Ｎケミカルシフトの各々の絶対値の少なくとも一方の値が特定の値以上を満足するアミノ酸であることを条件として前記第１のポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記第１のポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、前記第１の酵素の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸のＣα原子間距離を求める工程、
（３）前記ターゲット酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するターゲットポケットアミノ酸群候補を検出する工程であって、
前記ターゲット酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する複数個のアミノ酸とそれぞれ同種類のアミノ酸であって、各々のアミノ酸のＣα原子間距離が、前記工程（２）で求めた第１のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸のＣα原子間距離と比較したとき、対応するアミノ酸のＣα原子間距離の差の絶対値が特定の値以下であるアミノ酸であることを条件として、前記第１のポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するターゲットポケットアミノ酸群候補がターゲット酵素に存在すると推定する工程、
（４）前記工程（３）で検出したターゲットポケットアミノ酸群候補が、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する工程であって、前記ターゲットポケットアミノ酸群候補のアミノ酸が、次の要件：
（要件ｉ）前記ターゲット酵素の三次構造において表面に存在するアミノ酸である、及び
（要件ｉｉ）前記ターゲット酵素のアミノ酸の一次配列と、前記ターゲット酵素が由来する生物の生物学的分類とは異なる種類の生物由来の酵素であって、前記ターゲット酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する酵素のアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である
を満足することを条件として、ターゲット酵素の阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程
を具備し、
前記第１の阻害物質における前記第１の酵素との結合部位にあるアミノ酸残基とそれらの幾何学的配置に基づき、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
本発明の第１の方法の１つの態様は、次のような方法である。
ラットＤＮＡポリメラーゼβのアミノ酸の三次構造において、ネルボン酸が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析し、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素において、前記幾何学的配置を検索することにより、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）ラットＤＮＡポリメラーゼβの三次構造において、ネルボン酸が結合するアミノ酸複数個からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程であって、ネルボン酸非存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、ネルボン酸存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフトの絶対値が０．０６ｐｐｍ以上、又は１５Ｎケミカルシフトの絶対値が０．４ｐｐｍ以上を満足するアミノ酸を選択し、Ｌｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９の各々のＣα原子間距離を求め、これらのアミノ酸により形成される三角錐の幾何学的配置を決定する工程、
（３）ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸の三次構造において、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するターゲットポケットアミノ酸群候補を検出する工程であって、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸の三次構造において、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒとそれぞれ同種のアミノ酸であって、各々のＣα原子間距離が、前記工程（２）で求めたＣα原子間距離と比較したとき、対応するＣα原子間距離の差が、±２×１０−１ｎｍの範囲内にあるＬｙｓ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｒをターゲットポケットアミノ酸群候補とする工程
（４）前記ターゲットポケットアミノ酸群候補が、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るものであるか否かを検索する工程であって、前記Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｒからなるターゲットポケットアミノ酸群候補のうち、次の２つの要件：
（要件ｉ）ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素の三次構造において表面に存在するアミノ酸である、及び
（要件ｉｉ）ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸の一次配列と、ヒトの生物学的分類とは異なる種類の生物由来の免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸の一次配列とを比較したとき、各々の生物間で保存されているアミノ酸であるを満足するＬｙｓ−６５、Ｌｅｕ−１００、Ｈｉｓ−２３５及びＴｈｒ−３８６からなるアミノ酸群を前記分子構造設計に利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程
を具備し、
ネルボン酸におけるラットＤＮＡポリメラーゼβとの結合部位にあるアミノ酸残基とそれらの幾何学的配置に基づいて分子構造を設計することにより、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
また、本発明は、以下のアミノ酸の三次構造が未知である酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法（以下、「本発明の第２の方法」ともいう。）を提供する。
アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の酵素に対して生化学的な阻害活性を有する第１の阻害物質が結合するアミノ酸が形成する幾何学的配置を解析し、アミノ酸の一次、二次及び三次構造が既知である第２の酵素において、前記幾何学的配置と同様の幾何学的配置を検索することにより、アミノ酸の三次構造が未知であるターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）前記第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の阻害物質が結合するアミノ酸複数個からなる第１のポケットアミノ酸群を決定する工程であって、
前記第１の阻害物質非存在下における前記第１の酵素の１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、前記第１の阻害物質存在下における前記第１の酵素の１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフト値及び１５Ｎケミカルシフトの各々の絶対値の少なくとも一方の値が特定の値以上を満足するアミノ酸であることを条件として前記第１のポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記第１のポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、前記第１の酵素の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸のＣα原子間距離を求める工程、
（３）前記第２の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有する第２のポケットアミノ酸群を検出する工程であって、
前記第２の酵素が次の要件：
（要件ｉ）前記ターゲット酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する、
（要件ｉｉ）酵素が由来する生物の生物学的分類がターゲット酵素とは異なる、
（要件ｉｉｉ）酵素のアミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である、並びに
（要件ｉｖ）前記第１の阻害物質により生化学的に阻害される
を満足し、かつ
前記第２の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する複数個のアミノ酸とそれぞれ同種類のアミノ酸であって、各々のアミノ酸のＣα原子間距離を、前記工程（２）で求めた第１のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸のＣα原子間距離と比較したとき、対応するアミノ酸のＣα原子間距離の差の絶対値が特定の値以下であることを条件として、第１のポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有する第２のポケットアミノ酸群であるとする工程、
（４）前記第２のポケットアミノ酸群が、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する工程であって、前記第２のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸が、次の要件：
（要件ｉ）前記第２の酵素の三次構造において表面に存在するアミノ酸である、並びに
（要件ｉｉ）前記第２の酵素のアミノ酸の一次配列と、前記ターゲット酵素のアミノ酸の一次配列と、前記第２の酵素が由来する生物の生物学的分類及び前記ターゲット酵素が由来する生物の生物学的分類のいずれとも異なる種類の生物由来の酵素であって、前記第２の酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する酵素のアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である
を満足することを条件として、前記阻害物質を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程
を具備し、
前記第１の阻害物質における第１の酵素との結合部位にあるアミノ酸残基とそれらの幾何学的配置に基づいて、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
本発明の第２の方法の１つの態様は、次のような方法である。
ラットＤＮＡポリメラーゼβのアミノ酸の三次構造において、ネルボン酸が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析し、酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩにおいて、前記幾何学的配置と同様の幾何学的配置を検索することにより、アミノ酸の三次構造が未知のヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）ラットＤＮＡポリメラーゼβの三次構造において、ネルボン酸が結合するアミノ酸複数個からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程であって、ネルボン酸非存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、ネルボン酸存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフトの絶対値が０．０６ｐｐｍ以上、又は１５Ｎケミカルシフトの絶対値が０．４ｐｐｍ以上を満足するアミノ酸を選択し、Ｌｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９の各々のＣα原子間距離を求め、これらのアミノ酸により形成される三角錐の幾何学配置を決定する工程、
（３）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の三次構造において、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒからなる酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を選択する工程であって、前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒの各々のＣα原子間距離と、前記工程２で求めたラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成する各アミノ酸のＣα原子間距離とを比較したとき、対応するＣα原子間距離の差が、±２×１０−１ｎｍの範囲内にあるＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒを酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群とする工程、
（４）前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群が、前記ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する工程であって、前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を構成するＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｈｒのうち、次の要件：
（要件ｉ）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩの三次構造において表面に存在するアミノ酸である、並びに
（要件ｉｉ）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列と、ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列と、酵母の生物学的分類及びヒトの生物学的分類のいずれとも異なる種類の生物由来のＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である
を満足するＴｈｒ−５９６、Ｈｉｓ−７３５、Ｌｅｕ−７４１及びＬｙｓ−９８３を前記分子構造の設計に利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程を具備し、
ネルボン酸における酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩとの結合部位にある基とそれらの幾何学的配置に基づき、前記ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
また、本発明の第２の方法の別の態様は、次のような方法である。
ラットＤＮＡポリメラーゼβのアミノ酸の三次構造において、リトコール酸が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析し、酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩにおいて、前記幾何学的配置と同様の幾何学的配置を検索することにより、アミノ酸の三次構造が未知のヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計する方法において、
前記方法が、次の工程：
（１）ラットＤＮＡポリメラーゼβの三次構造において、リトコール酸が結合するアミノ酸複数個からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程であって、リトコール酸非存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルと、リトコール酸存在下におけるラットＤＮＡポリメラーゼβの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルとを比較したとき、１Ｈケミカルシフトの絶対値が０．０６ｐｐｍ以上、又は１５Ｎケミカルシフトの絶対値が０．４ｐｐｍ以上を満足するアミノ酸を選択し、Ｌｙｓ−６０、Ｌｅｕ−７７及びＴｈｒ−７９からなるラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を決定する工程、
（２）前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する工程であって、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群を構成するＬｙｓ−６０、Ｌｅｕ−７７及びＴｈｒ−７９の各々のＣα原子間距離を求め、これらのアミノ酸により形成される三角形の幾何学配置を決定する工程、
（３）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の三次構造において、前記ラットＤＮＡポリメラーゼβポケットアミノ酸群と同様の幾何学的配置を有するＬｙｓ、Ｌｅｕ及びＴｈｒからなる酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を選択する工程であって、前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を構成するＬｙｓ、Ｌｅｕ及びＴｈｒの各々のＣα原子間距離と、前記工程２で求めたラットＤＮＡポリメラーゼβのポケットアミノ酸群を構成する各アミノ酸のＣα原子間距離とを比較したとき、対応するＣα原子間距離の差が、±２×１０−１ｎｍの範囲内にあるＬｙｓ、Ｌｅｕ及びＴｈｒを酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群とする工程、
（４）前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群が、前記ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する工程であって、前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩポケットアミノ酸群を構成するＬｙｓ、Ｌｅｕ及びＴｈｒのうち、次の要件：
（要件ｉ）前記酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩの三次構造において表面に存在するアミノ酸である、並びに
（要件ｉｉ）酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列と、ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列と、酵母の生物学的分類及びヒトの生物学的分類のいずれとも異なる種類の生物由来のＤＮＡトポイソメラーゼＩＩのアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である
を満足するＬｙｓ−７２０、Ｌｅｕ−７６０及びＴｈｒ−７９１を前記分子構造設計に利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する工程を具備し、
ネルボン酸における酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩとの結合部位にある基とそれらの幾何学的配置に基づき、前記ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計する方法。
以下、本発明の第１の方法である、アミノ酸配列の二次及び三次構造が既知である酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法を詳細に説明する。
図１に本発明の第１の方法の各工程を簡略化したブロック図を示す。
本発明の第１の方法は、アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の酵素に対して生化学的な阻害活性を有する第１の阻害物質が結合するアミノ酸により形成される幾何学的配置を解析することにより、アミノ酸配列の二次及び三次構造が既知であるターゲット酵素において、前記幾何学的配置と同様の配置を検索することにより、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法である。
本発明の第１の方法において、工程（１）において用いる第１の酵素は、アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である。ここで、一次、二次及び三次構造が既知であるとは、例えば、アミノ酸の一次構造において、ＮＭＲによるクロスピークの帰属がなされていないアミノ酸が全くないことを意味するものではなく、酵素全体として三次構造までが解明されていることをいう。本発明においては、既に三次構造までが解明されている酵素を用いることが簡便であるが、別途、酵素の一次から三次構造を解析した上で本発明の第１の方法を適用することもできる。酵素の一次から三次構造は、当技術分野に既知の生化学的手法、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析法を組み合わせることにより解析することができる。
アミノ酸の三次構造までが解明されている酵素の一例として、ラットＤＮＡポリメラーゼβ（以下、「ラットｐｏｌ．β」ともいう。）を挙げることができる。ラットｐｏｌ．βは、遺伝子の本体であるＤＮＡの合成反応を触媒する、生物に必須な酵素であるＤＮＡポリメラーゼ群のなかで、唯一三次構造まで解明されている酵素である。
ラットｐｏｌ．βのアミノ酸配列は文献５に、二次構造を含めた三次構造は文献６及び７に掲載されている。図２Ａにラットｐｏｌ．βのアミノ酸残基一次配列を示す（後掲の配列表の配列番号１）。アミノ酸配列は、ＳＷＩＳＳ−Ｐｌｏｔ　Ｄａｔａ　Ｂａｓｅより入手した。図３にラットｐｏｌ．βのアミノ酸残基三次構造において、アミノ酸の主鎖をリボンにより示した模式図を示す。
図３に示すように、ラットｐｏｌ．βは、Ｎ末端側の８ｋＤａドメイン（１〜８７アミノ酸残基）と、それに続くＣ末端側の３１ｋＤａドメイン（８８〜３３５アミノ酸残基）から構成される単一ペプチドである。８ｋＤａと３１ｋＤａの２つのドメインは、トリプシンによる穏やかな加水分解により切断され得る。また、８ｋＤａドメインの全８７アミノ酸残基のうち、７５残基はＮＭＲによるクロスピークの帰属がなされている（文献９）。
本発明の第１の方法で用いる、第１の酵素に対する第１の阻害剤は、特に制限はないが、阻害活性（ＩＣ５０など）がμＭのオーダー又はそれ以下のものが好ましい。また、阻害様式は、拮抗型であっても非拮抗型であってもよい。本発明の第１の方法において用いる酵素がラットｐｏｌ．βである場合、基質となるＤＮＡ鎖の結合に対し拮抗的な阻害剤であることが好ましい。
ラットｐｏｌ．βに対する生化学的な阻害活性を有する阻害物質の一例として、ネルボン酸（ｃｉｓ−１５−テトラコセン酸）及びリトコール酸（３−α−ヒドロキシ−５β−コラン酸）を挙げることができる。
ネルボン酸及びリトコール酸の化学式を以下に示す。
2002044112.tif 000003
ネルボン酸は、最も強くラットｐｏｌ．βを阻害する脂肪酸の一つである。リトコール酸は、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する物質として知られているステロイド類の代表として、例えば、小川らがＪｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．８９，１１５４−１１５９（１９９８）に報告している。ネルボン酸もリトコール酸も共に市販されており、容易に大量に入手することができる。
本発明の第１の方法の工程（１）において、第１の酵素のアミノ酸の三次構造において第１の阻害物質が結合するアミノ酸複数個からなる第１のポケットアミノ酸群を決定する。
第１の酵素のアミノ酸の三次構造において阻害物質が結合するアミノ酸複数個からなる第１のポケットアミノ酸群の決定は、阻害物質存在下及び非存在下における１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトル（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｑｕａｎｔｕｍ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）をそれぞれ測定し、クロス・ピークを重ね、１Ｈケミカルシフト及び１５Ｎケミカルシフトの絶対値の少なくとも一方の値が各々特定の値以上であることを指標としてアミノ酸を複数個選択する。ここで、シフト値は、本発明の第１の方法で用いる酵素と阻害物質の種類等に応じて決定することができるものである。通常、１Ｈケミカルシフト及び１５Ｎケミカルシフトの値は、選択されるアミノ酸残基の数が３〜４個になるように決定することができるが、これらの数に限定されるものではない。選択されるアミノ酸の数を３〜４個としたのは、アミノ酸残基により構成される幾何学的配置を特定するための最低の個数が３個であり、また、いたずらにアミノ酸残基の個数を増やすと幾何学的配置の特定が複雑になるからである。
１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルは、バリアン社から市販されているＶａｒｉａｎ　Ｕｎｉｔｙ−Ｐｌｕｓ　７５０スペクトロメータを用いて測定することができる。１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルの測定条件は、後掲の文献４を参照して設定することができる。
阻害剤存在下における１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルを測定する際の阻害剤の量は、酵素活性を阻害するために必要な量を予め別途求めることにより設定することができる。
本発明の第１の方法において、第１の酵素及び第１の阻害剤の組み合わせとして、それぞれラットｐｏｌ．β及びネルボン酸を用いた場合、ネルボン酸の添加量は、ラットｐｏｌ．βと等モルに設定することができる。また、指標とすべき１Ｈケミカルシフトの絶対値は０．０６ｐｐｍ以上に、１５Ｎケミカルシフトの絶対値は、０．４ｐｐｍ以上に設定することができる。ラットｐｏｌ．βのアミノ酸配列において、このような１Ｈケミカルシフト又は１５Ｎケミカルシフトを満足するアミノ酸残基は、Ｌｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９の４個のアミノ酸残基であった。
一方、本発明の第１の方法において、第１の酵素及び第１の阻害剤の組み合わせとして、それぞれラットｐｏｌ．β及びリトコール酸を用いた場合、リトコール酸の添加量も、ラットｐｏｌ．βと等モルに設定することができる。また、指標とすべき１Ｈケミカルシフトの値は０．０６ｐｐｍ以上に、１５Ｎケミカルシフトの値は、０．６ｐｐｍ以上に設定することができる。ラットｐｏｌ．βのアミノ酸配列において、このような１Ｈケミカルシフト又は１５Ｎケミカルシフトを満足するアミノ酸残基は、Ｌｙｓ−６０、Ｌｅｕ−７７及びＴｈｒ−７９の３個のアミノ酸残基であった。
本発明の第１の方法の工程（２）では、上記工程（１）で決定した第１のポケットアミノ酸の幾何学的配置を決定する。幾何学的配置の決定は、具体的には、前記第１の酵素の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸のＣα原子間距離を求めることにより行う。
工程（２）におけるＣα原子間距離は、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ラットｐｏｌ．βの場合は、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ：１ＢＮＯ、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩの場合は、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ：１ＢＪＴ）を利用して算出することができ、第１のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸のＣα原子により形成される幾何学的配置を解析することができる。この解析手法は、後掲の文献４に詳細に説明されている。
本発明の第１の方法の工程（３）において、前記工程（２）で求めた第１のポケットアミノ酸群の幾何学的配置を有するターゲットポケットアミノ酸群候補をターゲット酵素において検出する。この検出は、目的（ターゲット）とする酵素の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する複数個のアミノ酸とそれぞれ同種類のアミノ酸であって、各々のアミノ酸のＣα原子間距離が、前記工程（２）で求めた第１のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸のＣα原子間距離と比較したとき、対応するアミノ酸のＣα原子間距離の差の絶対値が特定の値以下であるアミノ酸を選択し、これをターゲットポケットアミノ酸群候補とする。
ここで、「対応するアミノ酸のＣα原子間距離」とは、具体的には、第１のポケットアミノ酸群を形成するアミノ酸をＡ、Ｂ及びＣとし、ターゲットアミノ酸群を構成するアミノ酸をａ、ｂ及びｃとしたとき、ＡのＣα原子とＢのＣα原子との間の距離が、ａのＣα原子とｂのＣα原子との間の距離に対応し、ＢのＣα原子とＣのＣα原子との間の距離が、ｂのＣα原子とｃのＣα原子との間の距離に対応し、ＡのＣα原子とＣのＣα原子との間の距離が、ａのＣα原子とｃのＣα原子との間の距離に対応することをいう。
対応するアミノ酸のＣα原子間距離の差は、通常、±２×１０−１ｎｍの範囲に設定することができるが、用いる第１の酵素及びターゲット酵素、並びに第１の阻害物質の種類等に応じて設定することができる。しかしながら、この差が大きいと第１のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸残基により形成される幾何学的配置と、ターゲットポケットアミノ酸群が構成するアミノ酸残基により形成される幾何学的配置の差違が大きくなるため、ターゲット酵素に対する阻害物質が満足すべき幾何学的配置の精度が落ちることになり好ましくない。
本発明の第１の方法において、第１の酵素及び第１の阻害剤として、ラットｐｏｌ．β及びネルボン酸を用い、ターゲット酵素としてヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素を用いた場合、ラットｐｏｌ．βにおけるＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９と同様の幾何学的配置を有するＬｅｕ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ及びＬｙｓは、Ｌｙｓ−６５、Ｌｅｕ−１００、Ｈｉｓ−２３５及びＴｈｒ−３８６であった。
本発明の第１の方法の工程（４）では、前記ターゲットポケットアミノ酸群候補が、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する。
本発明の第１の方法の特徴の一つは、この検索方法にある。具体的には、検索は、上記工程（３）で決定したポケットアミノ酸群候補を構成する各アミノ酸が、次の２つの要件を満足するか否かにより行われる。
（要件ｉ）前記ターゲット酵素の三次構造において表面に存在するアミノ酸である、及び
（要件ｉｉ）前記ターゲット酵素のアミノ酸の一次配列と、前記ターゲット酵素が由来する生物の生物学的分類とは異なる種類の生物由来の酵素であって、前記ターゲット酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する酵素のアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である。
上記２つの要件を満足する場合、工程（３）で決定したポケットアミノ酸群候補は、ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であると決定する。
工程（４）において、ポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸が三次構造において表面に存在することを要件の１つとした理由は、特定の物質が酵素活性を阻害するためには、その物質が酵素の表面に存在するアミノ酸と結合することによりその酵素活性を阻害することが考えられるからである。
また、工程（４）において、前記ターゲット酵素のアミノ酸の一次配列と、前記ターゲット酵素が由来する生物の生物学的分類とは異なる種類の生物由来の酵素であって、前記ターゲット酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する酵素のアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸であることをもう一つの要件とした。これは、生物において、酵素の活性保持に重要なアミノ酸（酵素の活性に直接的に関わるアミノ酸）が変化すると酵素は失活し、その結果、その生物は死んでしまう。従って、酵素活性に重要な役割を果たすアミノ酸は、生物の進化を経ても保持されているであろうという考え方に基づいている。
ここで、生物学的分類とは、ウイルスを含む生物の進化論的、遺伝学的な分類をいう。従って、生物学的分類が異なる種類の生物由来の酵素とは、ヒトとエンドウ豆のように動物界と植物界との間や、ヒトと酵母のように動物界と菌類界との間のように異なる界に属する種に属する生物由来の酵素である場合、さらに、ラットとマウスのように同じ動物界の中での異なる種に属する生物由来の酵素である場合などが含まれる。また、ウイルスの場合には、ヒト免疫不全ウイルスとサル免疫不全ウイルスのようにウイルスが宿主とする生物が生物学的分類に異なる種に属する場合や、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のように、宿主は同じ種であるが、遺伝学的タイプの異なるウイルス由来の酵素の場合などが含まれる。
本発明の第１の方法においては、進化論的、遺伝学的に互いにより離れた種について検索することが好ましい。
このような多種の生物間で、アミノ酸配列に相同性があるか否かを検索する手法は、分子生物学、情報生物学の分野等で行われる手法であるが、この手法を分子設計に適用した例は本発明が初めてである。
工程（４）の要件ｉｉ）で用いるターゲット酵素が由来する生物の生物学的分類とは異なる種類の生物由来の酵素は、複数種であることが好ましく、更に好ましくは、１０種以上の酵素について検索する。酵素の数は、多いほうが検索の精度を高めることができるので好ましい。
また、生物間で保存されているか否かの判断は、試験した試料のうち、通常、８０％以上、好ましくは１００％一致するものを保存されているとする。生物間で１００％一致するアミノ酸は、ポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸のうちできるだけ多くのアミノ酸が満足していることが好ましいが、全てのアミノ酸が満足していなくても、ポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸の少なくとも１つが満足していればよい。
工程（４）に規定する２つの要件を満足するか否かは、市販のコンピューターソフト（ＩＮＳＩＧＨＴ　ＩＩ／ＢＩＮＤＩＮＧ　ＳＩＴＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ（ＭＳＩ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓＩＮｃ．）、米国））を用いて判定することができる。
本発明の第１の方法では、第１の阻害物質における第１の酵素と結合する部位にある基とそれらの立体配置に基づいて、前記酵素に対する新たな阻害物質の分子構造を設計する。
具体的には、第１のポケットアミノ酸群のアミノ酸と結合する第１の阻害物質の置換基を特定し、これらの置換基が、第１のポケットアミノ酸群が形成する幾何学的配置に、よりよく適合するように、これらの置換基間の距離と立体配置を設計する等の手法を用いて行うことができる。第１のポケットアミノ酸群のアミノ酸残基と結合する置換基の特定は、当業者に既知の生化学的方法等を用いることにより行うことができる。
以上説明したように、本発明の第１の方法では、アミノ酸配列の三次構造まで解明されたものであって、第１の酵素とはその酵素活性の種類が異なる酵素の阻害物質の分子構造を設計することができる。しかしながら、本発明の第１の方法の変形例として、第１の酵素に対する新たな阻害物質の分子構造を設計することもできる。
具体的には、本発明の第１の方法の工程（１）及び（２）により求めた幾何学的配置を有するアミノ酸に、より強く結合し得る置換基とそれらの幾何学的配置になるように分子構造を設計することにより、第１の酵素の新たな阻害物質の分子構造を設計することができる。
より具体的には、ラットｐｏｌ．βのＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９とネルボン酸との結合は、図１４に示すように、ネルボン酸鎖の一方の末端にあるカルボキシル基が、Ｌｙｓ−３５の親水性サイトに結合し、他方の末端にあるメチル基がＬｅｕ−１１、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９に結合している。ネルボン酸鎖の二重結合の折れ曲がりによりラットｐｏｌ．βのＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９が形成する立体形状の疎水性ポケットに収まることができる。
従って、ラットｐｏｌ．βのＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９が形成する立体形状のポケットに、より適合するような脂肪酸鎖の長さや二重結合の位置を検討することにより、ラットｐｏｌ．βに対するネルボン酸以外の新たな阻害物質の分子構造を設計することができる。
次に、本発明の第２の方法を詳細に説明する。
本発明の第２の方法は、アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である第１の酵素のアミノ酸の三次構造において、前記第１の酵素に対して生化学的な阻害活性を有する第１の阻害物質が結合するアミノ酸が形成する幾何学的配置を解析し、アミノ酸の一次、二次及び三次構造が既知である第２の酵素において、前記幾何学的配置と同様の幾何学的配置を検索することにより、アミノ酸の三次構造が未知であるターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する方法である。
図４に本発明の第１の方法の各工程を簡略化したブロック図を示す。
本発明の第２の方法は、上述した本発明の第１の方法の工程（１）〜（４）において利用した手法と基本的には同じ手法を用いる点で第１の方法と共通している。
しかしながら、本発明の第１の方法が第１の酵素の幾何学的配置を利用して、三次構造までが解明された第２の酵素（ターゲット酵素）の阻害物質の分子構造を設計するのに対して、本発明の第２の方法は、２種類の酵素について、上記手法を用い、アミノ酸の三次構造が未解明である第３の酵素（ターゲット酵素）の阻害物質の分子構造を設計することができる点で第１の発明とは異なっている。
ここで、ターゲット酵素とは、上述したように、本発明の方法を実施することにより、その酵素に対する阻害物質の分子構造を設計しようとする対象（ターゲット）とする酵素である。
一般に、酵素は分子量が大きく、複雑な立体構造を有するので、その酵素を構成するアミノ酸の一次及び二次構造までは解明できたとしても、三次構造まで決定することが技術的に極めて困難であることが多い。従って、複数の生物学的分類の生物に存在する同じ生化学的活性を有する酵素群のなかには、ある生物学的分類に属する生物の酵素についてはアミノ酸の三次構造までが明らかになっても、その他の生物学的分類に属する生物の対応する酵素については、三次構造までは解明されていない場合がある。例えば、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（以下、「ｔｏｐｏ　ＩＩ」ともいう。）は、ＤＮＡの二本鎖を切断・再結合させることによりねじれを解消させる、ＤＮＡのトポロジーを変化させる機能を有する真核生物が共通して有する酵素であるが、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｔｏｐｏ　ＩＩのアミノ酸配列はその三次構造まで解明されているが（後掲の文献１４、１５）、ヒトのｔｏｐｏ　ＩＩのアミノ酸配列は一次構造しか解明されていない。本発明の第２の方法は、このような三次構造が不明の酵素に対する阻害物質の分子構造を、効率よく設計するために利用できる方法である。
ｔｏｐｏ　ＩＩは、上述したように、ＤＮＡの二本鎖を切断・再結合させることによりねじれを解消させる、ＤＮＡのトポロジーを変化させる酵素である。細胞分裂の進行においてこのトポロジー変化は必須であることから、ヒトｔｏｐｏ　ＩＩに対する阻害物質は、制癌剤としての応用が期待できる。
本発明の第２の方法において用いる３種類の酵素（第１の酵素、第２の酵素及びターゲット酵素）について説明する。
第１の酵素及び第２の酵素は、そのアミノ酸配列の三次構造までが明らかな酵素である。これに対して、ターゲット酵素は、そのアミノ酸配列の少なくとも一次構造は明らかであるが、三次構造は未解明の酵素である。第１の酵素は、第２の酵素及びターゲット酵素とは異なる種類の生化学的活性を有している。第２の酵素及びターゲット酵素は、生化学的活性は同種であるが、生物学的に異なる種類の生物に由来する酵素である。本発明の第１の方法は、分子量が大きいためにＮＭＲによる構造解析が不可能な酵素（ターゲット酵素）に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用できる方法である。
また、本発明の第２の方法で用いる酵素に対する阻害物質は一種類である。この阻害物質は、第１の酵素活性を阻害することのできる物質である。この阻害物質を第１の阻害剤と呼ぶ。
第１、第２及びターゲット酵素、並びに第１の阻害物質の組み合わせの具体例としては、ラットｐｏｌ．β、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩ及びヒトｔｏｐｏ　ＩＩ、並びにネルボン酸の組み合わせ、さらには、ラットｐｏｌ．β、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩ及びヒトｔｏｐｏ　ＩＩ、並びにリトコール酸の組み合わせを挙げることができる。
また、本発明の第２の方法では、上記第１の酵素、第２の酵素及びターゲット酵素について、それぞれ「ポケットアミノ酸群」との用語を用いる。これらポケットアミノ酸群とは、後述するように、ある酵素において、特定の要件を満足するアミノ酸複数個からなる群を呼ぶものである。
本発明の第２の方法の工程（１）において用いる第１の酵素は、アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である。ここで、一次、二次及び三次構造が既知であるとは、例えば、アミノ酸の一次構造において、ＮＭＲによるクロスピークの帰属がなされていないアミノ酸が全くないことを意味するものではなく、酵素全体として三次構造までが解明されていることをいう。
本発明においては、既に三次構造までが解明されている酵素を用いることが簡便であるが、別途、酵素の一次から三次構造を解析した上で本発明の第１の方法を適用することもできる。酵素の一次から三次構造は、当技術分野に既知の生化学的手法、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析法を組み合わせることにより解析することができる。
アミノ酸の三次構造までが解明されている酵素の一例として、ラットｐｏｌ．βを挙げることができる。ラットｐｏｌ．βは、遺伝子の本体であるＤＮＡの合成反応を触媒する、生物に必須な酵素であるＤＮＡポリメラーゼ群のなかで唯一三次構造まで解明されている酵素である。
本発明の第２の方法で用いる、アミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である第１の酵素に対する第１の阻害剤は、特に制限はないが、阻害活性（ＩＣ５０など）がμＭのオーダー又はそれ以下のものが好ましい。また、阻害様式は、拮抗型であっても非拮抗型であってもよい。本発明の第２の方法において用いる酵素がラットｐｏｌ．βである場合、基質となるＤＮＡ鎖の結合に対し拮抗的な阻害剤であることが好ましい。
ラットｐｏｌ．βに対する生化学的な阻害活性を有する阻害物質の一例として、ネルボン酸及びリトコール酸を挙げることができる。
本発明の第２の方法の工程（１）において、第１の酵素のアミノ酸の三次構造において第１の阻害物質が結合するアミノ酸複数個からなる第１のポケットアミノ酸群を決定する。
酵素のアミノ酸の三次構造において阻害物質が結合するアミノ酸複数個からなる第１のポケットアミノ酸群の決定は、阻害物質存在下及び非存在下における１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルをそれぞれ測定し、クロス・ピークを重ね、１Ｈケミカルシフト及び１５Ｎケミカルシフトの絶対値の少なくとも一方の値が各々特定の値以上であることを指標としてアミノ酸を複数個選択する。ここで、シフト値は、本発明の第２の方法で用いる酵素と、阻害物質の種類等に応じて決定することができるものである。通常、１Ｈケミカルシフト及び１５Ｎケミカルシフトの値は、選択されるアミノ酸残基の数が３〜４個になるように決定することができるが、これらの数に限定されるものではない。選択されるアミノ酸の数を３〜４個としたのは、アミノ酸残基により構成される幾何学的配置を特定するための最低の個数が３個であり、またいたずらにアミノ酸残基の個数を増やすと幾何学的配置の特定が複雑になるからである。
１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルは、バリアン社から市販されているＶａｒｉａｎ　Ｕｎｉｔｙ−Ｐｌｕｓ　７５０スペクトロメータを用いて測定することができる。１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルの測定条件は、後掲の文献４を参照して設定することができる。
阻害剤存在下における１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルを測定する際の阻害剤の量は、酵素活性を阻害するために必要な量を予め別途求めることにより設定することができる。
本発明の第２の方法において、第１の酵素及び第１の阻害剤の組み合わせとして、それぞれラットｐｏｌ．β及びネルボン酸を用いた場合、ネルボン酸の添加量は、ラットｐｏｌ．βと等モルに設定することができる。また、指標とすべき１Ｈケミカルシフトの絶対値は０．０６ｐｐｍ以上に、１５Ｎケミカルシフトの絶対値は、０．４ｐｐｍ以上に設定することができる。ラットｐｏｌ．βのアミノ酸配列において、このような１Ｈケミカルシフト又は１５Ｎケミカルシフトを満足するアミノ酸残基は、Ｌｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９の４個のアミノ酸残基であった。
一方、本発明の第２の方法において、第１の酵素及び第１の阻害剤の組み合わせとして、それぞれラットｐｏｌ．β及びリトコール酸を用いた場合、リトコール酸の添加量も、ラットｐｏｌ．βと等モルに設定することができる。また、指標とすべき１Ｈケミカルシフトの値は０．０６ｐｐｍ以上に、１５Ｎケミカルシフトの値は、０．６ｐｐｍ以上に設定することができる。ラットｐｏｌ．βのアミノ酸配列において、このような１Ｈケミカルシフト又は１５Ｎケミカルシフトを満足するアミノ酸残基は、Ｌｙｓ−６０、Ｌｅｕ−７７及びＴｈｒ−７９の３個のアミノ酸残基であった。
本発明の第２の方法の工程（２）では、上記工程（１）で決定した第１のポケットアミノ酸群の幾何学的配置を決定する。幾何学的配置の決定は、具体的には、前記第１の酵素の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸のＣα原子間距離を求めることにより行う。
工程（２）におけるＣα原子間距離は、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋを利用して算出することができ、第１のポケットアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸のＣα原子により形成される幾何学的配置を解析することができる。この解析手法は、後掲の文献４に詳細に説明されている。
本発明の第２の方法の工程（３）において、前記工程（２）で求めた第１のポケットアミノ酸群と同じ幾何学的構造を有する第２のポケットアミノ酸群を第２の酵素において検出する。工程（３）で用いる第２の酵素は、次の要件を満足する：
（ｉ）ターゲット酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する、
（ｉｉ）酵素が由来する生物の生物学的分類がターゲット酵素とは異なる、
（ｉｉｉ）酵素のアミノ酸配列の一次、二次及び三次構造が既知である、並びに
（ｉｖ）第１の阻害物質により生化学的に阻害される。
工程（３）の要件（ｉ）に規定する「ターゲット酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する」とは、酵素反応において、同様の基質から生成物への生化学反応を触媒することをいう。
要件（ｉｉ）に規定する「酵素が由来する生物の生物学的分類がターゲット酵素とは異なる」とは、第１の方法において述べた通りである。また、第２の酵素が由来する生物の生物学的分類と、ターゲット酵素が由来する生物学的分類の関係が、より離れていることが好ましいことも同じである。
要件（ｉｉｉ）に規定する「酵素のアミノ酸配列の一次、二次及び三次構造」は、上述したように、既に三次構造までが解明された酵素を用いることが簡便であるが、別途、酵素の一次から三次構造を解析した上で本発明の第２の方法を適用することもできる。酵素の一次から三次構造は、当技術分野に既知の生化学的手法、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析法を組み合わせることにより解析することができる。
要件（ｉｖ）に規定する「前記第１の阻害物質により生化学的に阻害される」とは、第２の酵素に対する阻害活性ＩＣ５０の値が、第１の酵素に対する阻害活性ＩＣ５０の値と比較して、好ましくは１０倍〜１／１０の範囲、より好ましくは同等程度であることをいう。
本発明の第２の方法の工程（３）において、第１のポケットアミノ酸群の幾何学的配置を有する第２のポケットアミノ酸群を第２の酵素において検出する。この検出は、第２の酵素の三次構造において、前記第１のポケットアミノ酸群を構成する複数個のアミノ酸とそれぞれ同種類のアミノ酸であって、各々のアミノ酸のＣα原子間距離が、前記工程（２）で求めた第１のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸のＣα原子間距離と比較したとき、対応するアミノ酸のＣα原子間距離の差の絶対値が特定の値以下であるアミノ酸を選択し、これを第２のポケットアミノ酸群候補とする。
ここで、「対応するアミノ酸のＣα原子間距離」とは、前述の第１の方法で説明した通りである。
対応するアミノ酸のＣα原子間距離の差は、通常、±２×１０−１ｎｍの範囲に設定することができるが、用いる第１の酵素及びターゲット酵素、並びに第１の阻害物質の種類等に応じて設定することができる。しかしながら、この差が大きいと第１のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸残基により形成される幾何学的配置と、第２のポケットアミノ酸群が構成するアミノ酸残基により形成される幾何学的配置の差違が大きくなるため、ターゲット酵素に対する阻害物質が満足すべき幾何学的配置の精度が落ちることになり好ましくない。
第１の酵素、第２の酵素及びターゲット酵素として、それぞれラットｐｏｌ．β、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩ及びヒトｔｏｐｏ　ＩＩを、並びに第１の阻害物質としてネルボン酸を用いる場合、この特定の値は、±２×１０−１ｎｍの範囲内にすることができる。第１の阻害物質としてリトコール酸を用いる場合も同様である。
本発明の第２の方法の工程（４）では、上記工程（３）で決定した第２のポケットアミノ酸群が、ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用し得るターゲットポケットアミノ酸群であるか否かを検索する。
本発明の第２の方法の特徴の一つは、この検索方法にある。具体的には、検索は、第２のポケットアミノ酸群が、次の２つの要件を満足するか否かにより行われる。
（要件ｉ）前記第２の酵素の三次構造において表面に存在するアミノ酸である、並びに
（要件ｉｉ）前記第２の酵素のアミノ酸の一次配列と、前記ターゲット酵素のアミノ酸の一次配列と、前記第２の酵素が由来する生物の生物学的分類及び前記ターゲット酵素が由来する生物の生物学的分類のいずれとも異なる種類の生物由来の酵素であって、前記第２の酵素と生化学的に同じ酵素活性を有する酵素のアミノ酸の一次配列とを比較して、生物間で保存されているアミノ酸である。
上記２つの要件を満足する場合、この第２のポケットアミノ酸群は、ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計するために利用できるアミノ酸群であると決定する。
工程（４）において、上記２つの要件を用いた理由は、第１の方法で述べた通りである。
工程（４）の（要件ｉｉ）で用いる生物学的に異なる分類の生物に由来する酵素の数は、少なくとも２種の酵素について、好ましくは、１０種以上の酵素について検索する。酵素の数は、多いほうが検索の精度を高めることができるので好ましい。
また、生物間で保存されているか否かの判断は、試験した試料のうち、通常、８０％以上、好ましくは１００％一致するものを保存されているとする。生物間で１００％一致するアミノ酸は、ポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸のうちできるだけ多くのアミノ酸が満足していることが好ましいが、全てのアミノ酸が満足していなくても、ポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸の少なくとも１つが満足していればよい。
工程（３）で決定した第２のポケットアミノ酸群を構成する各アミノ酸残基が、第１のポケットアミノ酸群を構成する各対応するアミノ酸が形成する幾何学的配置と同様の立体配置にあるか否か、さらに、第２のポケットアミノ酸群を構成する各アミノ酸残基が、工程（４）に規定する要件を満足するか否かは、市販のコンピューターソフト（ＩＮＳＩＧＨＴ　ＩＩ／ＢＩＮＤＩＮＧ　ＳＩＴＥ　ＡＮＡＬＹＳＩ（ＭＳＩ社、米国））を用いて検索することができる。
第１の酵素、第２の酵素及びターゲット酵素として、それぞれラットｐｏｌ．β、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩ及びヒトｔｏｐｏ　ＩＩを用い、並びに第１の阻害物質としてネルボン酸を用いる場合、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩにおける第２のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸残基のうち、Ｔｈｒ−５９６、Ｈｉｓ−７３５、Ｌｅｕ−７４１及びＬｙｓ−９８３が上記工程（３）及び（４）の各要件を満足した。一方、第１の阻害物質としてリトコール酸を用いた場合はＬｙｓ−７２０、Ｌｅｕ−７６０およびＴｈｒ−７９１が満足した。
本発明の第２の方法では、第２の酵素が有する第２のポケットアミノ酸群が上記工程（４）に規定する２つの要件を満足する場合、ターゲット酵素においてもターゲットポケットアミノ酸群が存在すると推定する。すなわち、第２のポケットアミノ酸群を構成するアミノ酸残基とそれぞれ同種類のアミノ酸残基が存在し、かつ、これらのアミノ酸残基が第２のアミノ酸群を構成する各々のアミノ酸により構成される立体配置と同じ位置に配置されていると推定する。
本発明の第２の方法では、このような推定を行った後に、第１の阻害物質が第２の酵素と結合する基、それらの幾何学的配置に基づいて、前記ターゲット酵素に対する阻害物質の分子構造を設計する。
具体的な設計方法は、上記第１の方法において述べたものを用いることができる。
本発明の実施例を以下に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
本実施例では、第１の酵素としてラットｐｏｌ．β、第１の阻害剤としてネルボン酸及びターゲット酵素としてヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素を用いて、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の分子構造を設計した。
＜１−１＞ラットｐｏｌ．βのアミノ酸残基の一次配列は図２Ａに、三次構造モデルは、図３に示した通りである。
＜１−２＞ネルボン酸によるラットｐｏｌ．βの阻害活性の測定
ラットｐｏｌ．βの活性は、後掲の文献３に記載の方法に従い、基質としてｐｏｌｙ（ｄＡ）／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（鋳型ＤＮＡ）及び［３Ｈ］−ｄＴＴＰ（ヌクレオチド）を用い、異なるネルボン酸濃度存在下に取り込まれた［３Ｈ］−ｄＴＴＰの放射能を測定することにより測定した。
図５に阻害曲線を示す。図５において、縦軸は、ラットｐｏｌ．βの活性を示し、横軸は、ネルボン酸の濃度を示す。
＜１−３＞ネルボン酸存在下及び非存在下における１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルの測定
後掲の文献４に記載の方法に従い、ラットｐｏｌ．βの８ｋＤａドメインの組換え体大腸菌を構築し、ネルボン酸存在下（１．２５ｍＭ、ラットｐｏｌ．βの８ｋＤａドメインと等モル）及び非存在下において、培地に窒素源として１５ＮＨ４Ｃｌを加えてラベルし、１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトル（７５０Ｍｚ　Ｖａｒｉａｎ　Ｕｎｉｔｙ−Ｐｌｕｓ　７５０スペクトロメータ（バリアン社））を測定した。ここで、ラットｐｏｌ．βの８ｋＤａのみについて試験を行った理由は、ネルボン酸が結合するアミノ酸残基は、８ｋＤａにのみ存在することが確認されているからである（後掲の文献３、４）。
図６に１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルのクロスピークを示す。図６において、縦軸は、１５Ｎのシフト値を表し、横軸は、１Ｈのシフト値を表す。図６は、１Ｈケミカルシフトが０．０１５ｐｐｍ以上、かつ１５Ｎケミカルシフトが０．１ｐｐｍ以上であったアミノ酸残基のクロスピークであって、ネルボン酸存在下のクロスピークとネルボン酸非存在下のクロスピークを重ね合わせている。図６では、これらのアミノ酸残基のうち、１Ｈケミカルシフトの絶対値が０．０６ｐｐｍ以上、又は１５Ｎケミカルシフトの絶対値が０．４ｐｐｍ以上であったアミノ酸残基（Ｌｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９の４個のアミノ酸残基）にアミノ酸１文字コードと配列番号を付している。以下、これら４個のアミノ酸残基からなる群を「ラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−１」という。
図７及び図８は、図６に示した１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルのクロスピークを、それぞれ１Ｈのシフト値及び１５Ｎケミカルシフトに分けて棒グラフで表したものである。縦軸は、ケミカルシフト値を表し、横軸は、アミノ酸の配列番号を表している。
＜１−４＞ラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−１の各Ｃα原子間距離の測定
上記＜１−３＞で得られたラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−１を構成するＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９のＣα原子間距離をＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ；１ＢＮＯを利用し、後掲の文献１４、１５及び１６を参照して求めた。得られた各Ｃα原子間の距離を表１に示す。
2002044112.tif 000004
図９Ａは、上記表１に示した距離にある各アミノ酸残基のＣα原子の幾何学的配置を立体的に示した図である（コンピュータソフト（ＩＮＳＩＧＨＴ　ＩＩ／ＢＩＮＤＩＮＧ　ＳＩＴＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．，米国）を用いた）。また、図１０Ａは、ネルボン酸が結合した状態にあるこれらのラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−１を構成する４つのアミノ酸残基を、リボンで表したラットｐｏｌ．β中に示したモデルである。
＜１−５＞ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素におけるターゲットポケットアミノ酸群の検索
▲１▼ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸配列中に、ラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−１に対応するターゲットポケットアミノ酸群（ＨＩＶポケットアミノ酸群−１）が存在するか否かの検索、
▲２▼上記▲１▼で得られたＨＩＶポケットアミノ酸群−１を構成する各アミノ酸が、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素の三次構造において、表面に存在するか否かの検索、及び
▲３▼ＨＩＶポケットアミノ酸群−１を構成する各アミノ酸が、異なる生物学的分類に属する生物の免疫不全ウイルス逆転写酵素間で保存されているアミノ酸であるか否かの検索を、コンピューターソフト（ＩＮＳＩＧＨＴ　ＩＩ／ＢＩＮＤＩＮＧ　ＳＩＴＥ　ＡＮＡＬＹＳＩ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．，米国）を用いて検索した。
得られたＣα原子間の距離を表２に示す。
2002044112.tif 000005
なお、上記▲１▼の条件として、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素における各Ｃα原子間距離は、表１に示したラットｐｏｌ．βにおける対応するＣα原子間距離の±２×１０−１ｎｍの範囲内にあるものを対象とした。また、上記▲２▼及び▲３▼の検索には、図１１Ａ〜Ｆに示す次の３１種の生物由来の免疫不全ウイルス逆転写酵素を用いた。
図１１Ａ〜図１１Ｆに上記３１種類の免疫不全ウイルス逆転写酵素のアミノ酸配列（後掲の配列表の配列番号３〜３３、配列表には、アミノ酸番号１００までのもののみを示した。）も合わせて示す。各アミノ酸配列は、ＳＷＩＳＳ−Ｐｌｏｔ　Ｄａｔａ　Ｂａｓｅより入手した。図１１の配列では、逆転写酵素間で保存されているアミノ酸を検出し易いように特定のアミノ酸間にスペース（−）を入れている（上記ＩＮＳＩＧＨＴ　ＩＩ／ＢＩＮＤＩＮＧ　ＳＩＴＥ　ＡＮＡＬＹＳＩを用いた。）。
図１１Ｂに示すように、アミノ酸番号６５のＬｙｓ（Ｋ）は、検索した３１種類全てのアミノ酸が一致している。他のアミノ酸（例えば、図１１Ｃに示すアミノ酸番号１００）については必ずしも完全に一致していない。しかしながら、このような場合でも、上記▲１▼及び▲２▼の要件を満たすアミノ酸は、ターゲットアミノ酸群を構成するアミノ酸と決定することができる。この際、ラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−１を構成するアミノ酸の種類と、ＨＩＶポケットアミノ酸群−１を構成するアミノ酸の種類が一致していることは必須の要件であるが、その他の要件（各アミノ酸のＣα原子間距離、表面に存在するアミノ酸であること、生物間で保存されているアミノ酸であること）については、この順に優先順位が低くなるようにしてターゲットアミノ酸群を決定することができる。
検索した結果、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素において、Ｌｙｓ−６５、Ｌｅｕ−１００、Ｈｉｓ−２３５及びＴｈｒ−３８６は、（ＨＩＶポケットアミノ酸群−１）が上記要件▲１▼〜▲３▼を満足することが分かった。
図１２ＢにこれらのＬｙｓ−６５、Ｌｅｕ−１００、Ｈｉｓ−２３５及びＴｈｒ−３８６のＣα原子の幾何学的配置を立体的に示す。また、図１３Ｂにネルボン酸が結合した状態にあるヒト免疫不全ウイルスの立体モデルを示す。図１２Ａ及び図１３Ａには、参考のため、ネルボン酸が結合した状態にあるラットｐｏｌ．βの幾何学的配置及び立体モデルをそれぞれ示した。
＜１−６＞ラットｐｏｌ．βとネルボン酸との結合様式についての考察
図１４にラットｐｏｌ．βの８ｋＤａドメインにネルボン酸（ＮＡ）が結合した状態の立体的分子模型を示す（ダイキン工業（株）製、Ｍｏｌ　Ｇｒａｐｈにより作成）。図１４Ａと図１４Ｂとは、観察角度が縦軸に沿って９０度異なっている。
＜１−７＞
ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対するネルボン酸の阻害活性の確認を行った。
後掲の文献８（水品ら、ＢＢＡ，１３３６，５０９−５２１（１９９７））に記載される方法に従い、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害活性を測定した。
結果を図１５に示す。
図１５の阻害曲線から明らかなように、ネルボン酸のヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害活性は、ラットｐｏｌ．βに対するネルボン酸の阻害活性とほぼ同等である。
＜１−８＞ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の設計
上記１−７）の図１３の分子モデルに示したように、ラットｐｏｌ．βとネルボン酸の結合様式がヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の結合様式と同様であると推定できる。そこで、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害物質の構造として、脂肪酸の炭素鎖の炭素数が１６〜２４の範囲であり、シス型の、二重結合１つを炭素鎖の中央よりもメチル基末端側に有するものを好ましい阻害剤の分子構造の１として挙げることができる。
さらに、次のような分子構造の設計も可能である。
ネルボン酸のような脂肪酸は、生体内では代謝されてしまい、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるラットｐｏｌ．βの役割を研究することが困難である。そこで、上述したヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素に対する阻害活性を有すると推測される分子構造を維持しつつ、生体内で代謝されないように分子構造を変更することにより、生体内でも活性を維持した化合物を提供することができる。
（実施例２）
本実施例では、第１の酵素及び第２の酵素としてそれぞれラットｐｏｌ．β及び酵母ｔｏｐｏ　ＩＩを、並びに第１の阻害物質としてネルボン酸を用いて、第３の酵素（ターゲット酵素）としてヒトｔｏｐｏ　ＩＩに対する阻害物質の分子構造を設計した。
＜２−１＞ラットｐｏｌ．βにおけるネルボン酸との結合部位の幾何学的配置は、上記実施例１の＜１−４＞と同様にして決定した。
＜２−２＞ネルボン酸による酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ＩＩの阻害活性
文献１０及び１１に記載の方法に従い、ネルボン酸による酵母ｔｏｐｏ　ＩＩの阻害活性を測定した。
図１６に結果を示す。図１６は、ネルボン酸非存在下（レーン１）並びにネルボン酸濃度１００、５０及び２５μＭ存在下における電気泳動図である。
図１６において、ニック（Ｆｏｒｍ　ＩＩ）は、反応生成物のバンドであり、スーパーコイル（Ｆｏｒｍ　Ｉ）は、未反応基質のバンドである。
＜２−３＞酵母ｔｏｐｏ　ＩＩにおけるターゲットアミノ酸群の検索
▲１▼酵母ｔｏｐｏ　ＩＩのアミノ酸配列中に、ラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−１に対応するポケットアミノ酸群（酵母ｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−１）が存在するか否かの検索、
▲２▼酵母ｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−１を構成する各アミノ酸が酵母ｔｏｐｏ　ＩＩの表面に存在するか否かの検索、及び
▲３▼酵母ｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−１を構成する各アミノ酸が生物学的由来が異なる種類の生物間で保存されているアミノ酸であるか否かの検索。
コンピューターソフト（ＩＮＳＩＧＨＴ　ＩＩ／ＢＩＮＤＩＮＧ　ＳＩＴＥ　ＡＮＡＬＹＳＩ，ＭＳＩ社）を用いて、上記▲１▼〜▲３▼の要件を満足するアミノ酸が存在するか否かを検索した。
なお、上記▲１▼の条件として、ｔｏｐｏ　ＩＩにおける各Ｃα原子間距離は、表１に示したラットｐｏｌ．βにおける対応するＣα原子間距離の±２×１０−１ｎｍの範囲内にあるものを対象とした。また、上記▲３▼の検索には、図１７に示した１３種の生物由来のｔｏｐｏ　ＩＩを用いた。
図１７には、用いた１３種類のｔｏｐｏ　ＩＩのアミノ酸残基の一部（アミノ酸残基７００〜７８０番（後掲の配列表の配列番号３４〜４６）を示している。
図１７に示すように、アミノ酸番号７３５のＨｉｓ（Ｈ）と７４１番のＬｅｕ（Ｌ）は、生物間で進化論的に保存されていることが分かる。
検索した結果、ｔｏｐｏ　ＩＩにおいて、Ｔｈｒ−５９６、Ｈｉｓ−７３５、Ｌｅｕ−７４１及びＬｙｓ−９８３（ｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−１）が要件を満足することが分かった。
図９ＢにこれらのＴｈｒ−５９６、Ｈｉｓ−７３５、Ｌｅｕ−７４１及びＬｙｓ−９８３のＣα原子の幾何学的配置を立体的に示す。また、図１０Ｂにこれらのｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−１を構成する４つのアミノ酸残基を、ｔｏｐｏ　ＩＩのアミノ酸残基をリボンにより表わしたモデル中に示す。
図２Ｂに酵母ｔｏｐｏ　ＩＩのアミノ酸配列を示す（後掲の配列表、配列番号２）。アミノ酸配列は、ＳＷＩＳＳ−Ｐｌｏｔ　Ｄａｔａ　Ｂａｓｅ：１ＢＪＴより入手した。
図２Ｂに示す酵母ｔｏｐｏ　ＩＩの配列と図２Ｂに示すラットｐｏｌ．βの配列とを比較すると、ラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−１を構成するＬｅｕ−１１、Ｌｙｓ−３５、Ｈｉｓ−５１及びＴｈｒ−７９と酵母ｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−１を構成するＴｈｒ−５９６、Ｈｉｓ−７３５、Ｌｅｕ−７４１及びＬｙｓ−９８３は、アミノ酸残基の一次配列で見るとその出現順はＬｅｕが先頭である点で一致するのみでその後の順番は異なっていることが分かる。しかも各アミノ酸残基の間に存在するアミノ酸残基の数も異なっている。このように両酵素のアミノ酸残基の一次配列からネルボン酸の結合部位を予測するのは非常に困難である。
（実施例３）
第１の阻害物質としてネルボン酸の代わりにリトコール酸を用いたこと以外は実施例２と同様の試験を行った。
＜３−１＞リトコール酸存在下及び非存在下における１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルの測定
図１８に１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルを示す。
図１９及び図２０は、図１８に示した１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルのクロスピークを、それぞれ１Ｈのシフト値及び１５Ｎケミカルシフトに分けて棒グラフで表したものである。縦軸は、ケミカルシフト値を表し、横軸は、アミノ酸の配列番号を表している。
１Ｈケミカルシフトが０．０６ｐｐｍ以上、かつ１５Ｎケミカルシフトが０．６ｐｐｍ以上であったものは、Ｌｙｓ−６０、Ｌｅｕ−７７及びＴｈｒ−７９の３個のアミノ酸残基であった。以下、これら４個のアミノ酸残基からなる群を「ラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−２」という。
＜３−２＞ラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−２の各Ｃα原子間距離の測定
表３にラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−２の各々のＣα原子間の距離を示す。
2002044112.tif 000006
図２１Ａは、上記表３に示した距離にある各アミノ酸残基のＣα原子の幾何学的配置を立体的に示した図である。また、図２２Ａラットｐｏｌ．βにおけるリトコール酸との結合アミノ酸残基と、各アミノ酸残基のＣα原子間の距離を立体的に示した図を示す。また、図２２Ａは、リトコール酸が結合した状態にあるこれらのラットｐｏｌ．βのポケットアミノ酸群−２を構成する４つのアミノ酸残基を、ラットｐｏｌ．βのアミノ酸残基をリボンにより表したモデル中に示す。
＜３−３＞酵母ｔｏｐｏ　ＩＩにおけるターゲットアミノ酸群の検索
▲１▼酵母ｔｏｐｏ　ＩＩのアミノ酸配列中に、ラットｐｏｌ．βポケットアミノ酸群−２に対応するポケットアミノ酸群（酵母ｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−２）が存在するか否かの検索、
▲２▼酵母ｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−２を構成する各アミノ酸が酵母ｔｏｐｏ　ＩＩ表面に存在するか否かの検索、及び
▲３▼酵母ｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−２を構成する各アミノ酸が生物間で保存されているアミノ酸であるか否かの検索
なお、▲１▼の検索に当たり、ｔｏｐｏ　ＩＩにおける各Ｃα原子間距離は、表３に示した対応するＣα原子間距離の±２×１０−１ｎｍの範囲内にあるものを対象とした。
図２３に１３種類のｔｏｐｏ　ＩＩのアミノ酸残基の一部（７００〜７８０番）（後掲の配列番号３４〜４６）を示す。
図２３に示すように、アミノ酸番号７２０のＬｙｓ（Ｋ）と７６０番のＬｅｕ（Ｌ）は、生物間にわたり進化論的に保存されていることが分かる。
検索した結果、Ｌｙｓ７２０、Ｌｅｕ７６０及びＴｈｒ７９１（ｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−２）が要件を満足することが分かった。
図２１ＢにこれらのＬｙｓ７２０、Ｌｅｕ７６０及びＴｈｒ７９１のＣα原子の幾何学的配置を立体的に示す。また、図２２Ｂは、リトコール酸が結合した状態にあるこれらのｔｏｐｏ　ＩＩポケットアミノ酸群−２を構成する３つのアミノ酸残基を、ｔｏｐｏ　ＩＩのアミノ酸残基をリボンにより表したモデル中に示す。
＜３−４＞ヒトｔｏｐｏ　ＩＩに対する新たな阻害物質の設計
上記２−６）に記載したラットｐｏｌ．βとリトコール酸との結合様式を考慮することにより、ヒトｔｏｐｏ　ＩＩに対する阻害物質の構造として、少なくともカルボキシル基を分子構造の末端付近に有するステロイド骨格が有利なことが予測される。さらに、Ｌｙｓ７２０、Ｌｅｕ７６０及びＴｈｒ７９１により構成される三角形によりよく適合するように、アルキル鎖のような側鎖を付加することも有利であろう。
（参考文献）
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（３）水品ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１３３６，５０９−５２１（１９９７）
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（１３）Ｒ．Ｐｒａｓａｄら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１１１１２１−１１１２６（１９９８）
（１４）小林ら：Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４，６７７（１９９７）
（１５）Ｗａｌｌａｃｅら：Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．６，２３０８−２３２３（１９９７）
（１６）Ｒｕｓｓｅｌｌら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９，１２１１−１２２７（１９９８）
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の第１の方法の各工程の概略を示すブロック図である。
図２Ａは、ラットｐｏｌｙ．βのアミノ酸配列である。図２Ｂは、酵母ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（以下、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩをｔｏｐｏ　ＩＩともいう。）のアミノ酸配列である。
図３は、ラットｐｏｌｙ．βのアミノ酸鎖を立体的に示したモデルである。
図４は、本発明の第２の方法の各工程の概略を示すブロック図である。
図５は、ネルボン酸のラットｐｏｌｙ．βの阻害活性を示すグラフである。
図６は、ラットｐｏｌｙ．βの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルである。
図７は、ラットｐｏｌｙ．βの１Ｈ　ＨＭＱＣスペクトルのシフト値を示す棒グラフである。
図８は、ラットｐｏｌｙ．βの１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルのシフト値を示す棒グラフである。
図９Ａは、ラットｐｏｌｙ．βのネルボン酸と結合するアミノ酸残基の幾何学的配置を示す図である。図９Ｂは、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩのネルボン酸と結合するアミノ酸残基の幾何学的配置を示す図である。
図１０Ａは、ラットｐｏｌｙ．βの立体的モデルにおいて、ネルボン酸と結合するアミノ酸残基の位置を明示した図である。図１０Ｂは、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩの立体的モデルにおいて、ネルボン酸と結合するアミノ酸残基の位置を明示したモデルである。
図１１Ａ〜図１１Ｆは、実施例１の検索で用いた３１種類の酵素のアミノ酸一次配列である。
図１２Ａは、ラットｐｏｌｙ．βのネルボン酸と結合するアミノ酸残基の幾何学的配置を示す図である。図１２Ｂは、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素のネルボン酸と結合するアミノ酸残基の幾何学的配置を示す図である。
図１３Ａは、ラットｐｏｌｙ．βの立体的モデルにおいて、ネルボン酸と結合するアミノ酸残基の位置を示した図である。図１３Ｂは、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素の立体的モデルにおいて、ネルボン酸と結合するアミノ酸残基の位置を示した図である。
図１４Ａは、ラットｐｏｌｙ．βの８ｋＤａドメインにおいて、ネルボン酸が結合した状態のモデルである。図１４Ｂは、図１４Ａを縦軸方向に９０度回転した図である。
図１５は、ラットＤＮＡポリメラーゼ、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素などに対するネルボン酸の阻害活性を示すグラフである。
図１６は、ネルボン酸の酵母ｔｏｐｏ　ＩＩ阻害活性を表わす電気泳動図である。
図１７は、進化論的に保存されているアミノ酸残基を明示した酵母ｔｏｐｏ　ＩＩ等のアミノ酸一次配列である。
図１８は、ラットｐｏｌｙ．βの１Ｈ−１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルである。
図１９は、ラットｐｏｌｙ．βの１Ｈ　ＨＭＱＣスペクトルのシフト値を示す棒グラフである。
図２０は、ラットｐｏｌｙ．βの１５Ｎ　ＨＭＱＣスペクトルのシフト値を示す棒グラフである。
図２１Ａは、ラットｐｏｌｙ．βのリトコール酸との結合アミノ酸残基の幾何学的配置を示す図である。図２１Ｂは、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩのリトコール酸と結合するアミノ酸残基の幾何学的配置を示す図である。
図２２Ａは、ラットｐｏｌｙ．βの立体モデルにおいて、リトコール酸と結合するアミノ酸残基の位置を明示した図である。図２２Ｂは、酵母ｔｏｐｏ　ＩＩの立体モデルにおいて、リトコール酸と結合するアミノ酸残基の位置を明示したモデルである。
図２３は、進化論的に保存されているアミノ酸残基を明示した酵母ｔｏｐｏ　ＩＩ等の一次配列である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
2002044112.tif 000053
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2002044112.tif 000060
【図１１Ｅ】
2002044112.tif 000061
【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2002044112.tif 000064
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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2002044112.tif 000081
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