(57)【要約】ＤＮＡの末端部分を破損させることなく、ＤＮＡの解明を効率的に行うことができ、分子生物学分野、生化学分野等において有用なハイブリット形成用担体を提供することを目的とする。オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが固定化された担体であって、担体を化学修飾し、これにハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡを固定し、更に、デハイブリタイズしてオリゴヌクレオチドを結合したヌクレオチド固定用担体を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが固定化されていることを特徴とするハイブリッド形成用担体。
【請求項２】
ハイブリタイズしたオリゴヌクレチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが２個以上連続して第１級アミンを有するヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載のハイブリッド形成用担体。
【請求項３】
第１級アミンを有するヌクレオチドがデオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸あるいはデオキシグアニル酸であることを特徴とする請求項１又は２記載のハイブリッド形成用担体。
【請求項４】
第１級アミンを有するヌクレオチドが５’末端側に存在することを特徴とする請求項１〜３記載のハイブリッド形成用担体。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが５’突出末端であることを特徴とする請求項１乃至４記載のハイブリッド形成用担体。
【請求項６】
ｃＤＮＡが５’末端側に２個以上連続して第１級アミンを有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成されることを特徴とする請求項１又は２記載のハイブリッド形成用担体。
【請求項７】
ｇＤＮＡが５’末端側に２個以上連続して第１級アミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制限酵素により切断されることを特徴とする請求項１又は２記載のハイブリッド形成用担体。
【請求項８】
ｇＤＮＡが５’突出末端側に２個以上連続して第１級アミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制限酵素により切断されることを特徴する請求項１、２又は７記載のハイブリッド形成用担体。
【請求項９】
デオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸あるいはデオキシグアニル酸がハイブリッド形成用担体側に固定化されていることを特徴とする請求項１乃至８記載のハイブリッド形成用担体。
【請求項１０】
ハイブリッド形成用担体に固定するハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが、固定側の末端に第１級アミンを有するヌクレオチドを１〜１０個有することを特徴とする請求項９記載のハイブリッド形成用担体。
【請求項１１】
ハイブリッド形成用担体を化学修飾し、これにハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡを固定した後、担体に固定化されていない相補的なオリゴヌクレチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡをデハイブリタイズすることを特徴とするハイブリットの固定化方法。
【請求項１２】
ハイブリッド形成用担体の化学修飾が、ハイブリッド形成用担体の表面の塩素化、アミノ化およびカルボキシル化からなる請求項１１記載のハイブリットの固定化方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、分子生物学分野、遺伝子工学関連分野において有用な、核酸を固定化可能なハイブリット形成用担体、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡからなるハイブリットの固定化方法に関するものである。
背景技術
遺伝子解析は分子生物学、遺伝子工学分野で有用であり、近年では病気の発見等医療分野でも利用されている。
遺伝子解析において、近年ＤＮＡチップが開発され解析速度が著しく速くなった。しかし従来のＤＮＡチップはスライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にＤＮＡを固定する方法である。また、フォトリソグラフ等の半導体技術を用いてガラス基板上にオリゴヌクレオチドを合成する方法が用いられている。
しかし、スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布してＤＮＡを固定する方法では、ＤＮＡの固定化状態が不安定であり、ハイブリッド形成工程や洗浄工程において、ＤＮＡが剥離するといった問題が生じる。また、半導体技術を用いたＤＮＡチップは、製造工程の煩雑さから非常に高価であるという問題がある。
このような問題点を解決するためには、固体支持体表面にＤＮＡを高密度で且つ強固に固定化する必要がある。
また、従来、固体支持体の表面を化学修飾した基体が知られている。しかし、化学修飾部分にアミド結合で直接所望のＤＮＡを結合させると、化学結合の際の処理等によりＤＮＡの末端部分が破損するおそれがあるため、改良が望まれていた。
本発明は、上記のようにＤＮＡの末端部分を破損させることなく、ＤＮＡの解明を効率的に行うことができ、分子生物学分野、遺伝子工学分野等において有用なヌクレオチド固定化用担体を提供しようとすることを目的とするものである。
発明の開示
本発明者らは、固体化用担体を化学修飾したものに、ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチドを固定することにより、オリゴヌクレオチドが固定化用担体の表面に対して垂直方向に固体化し、一塩基多型のＤＮＡ情報を容易に読みとることができる。
すなわち、請求項１記載の本発明は、ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが固定化されていることを特徴とするハイブリッド形成用担体を提供するものである。ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが２個以上連続して第１級アミンを有するヌクレオチド含むことが望ましい。第１級アミンを有するヌクレオチドは、デオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸あるいはデオキシグアニル酸であることが望ましい。また、第１級アミンを有するヌクレオチドは、５’末端側に存在することが好ましい。オリゴヌクレオチドは、５’突出末端であることが好ましい。ｃＤＮＡが５’末端側に２個以上連続して第１級アミンを有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成されても良い。ｇＤＮＡが５’末端側に２個以上連続して第１級アミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制限要素により切断されることを特徴とする。ｇＤＮＡが５’突出末端側に２個以上連続して第１級アミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制限要素により切断されることを特徴とする。更に、デオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸あるいはデオキシグアニル酸がハイブリット形成用担体側に固定化されていることが望ましい。ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが固定側の末端に第１級アミンを有するヌクレオチドを１〜１０個有することが望ましい。
請求項１１記載の発明は、ハイブリッド形成用担体を化学修飾し、これにハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡを固定した後、担体に固定されてない相補的オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡをデハイブリタイズすることを特徴とするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡからなるハイブリットの固定化方法。また、ハイブリッド形成用担体の化学修飾が、担体の表面を塩素化、アミノ化及びカルボキシル化の順に行った方法が望ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明のハイブリッド形成用担体は、化学修飾によってハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが固定化されたされた担体であって、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが担体に対して垂直に固定化していることを特徴とするものである。このため、容易に、一塩基多型のｃＤＮＡの情報を読みとることができる。
このハイブリタイズしたオリゴヌクレチドは、相補的なオリゴヌクレチドをデハイブリタイズして、担体に残ったオリゴヌクレチドの情報を読みとる。
このように、オリゴヌクレオチドは、必然的にＤＮＡなど二本鎖の核酸である。オリゴヌクレオチドは、高等動物、カビ類、バクテリア、ウイルス等の天然のもののほか、人為的にこれらの構造改変を加えたもの、合成したものが挙げられるが、後述の方法により簡便に合成することができるので、好ましい。
なお、オリゴヌクレオチドの塩基数は１０〜５０個とすることが好ましい。
本発明のハイブリッド形成用担体は、以下の方法により簡便に作成することができる。
（１）ハイブリッド形成用担体の化学修飾
本発明においては、このようなオリゴヌクレオチドが化学修飾されたハイブリッド形成用用担体に固定化されている。
ハイブリッド形成用担体としては、ガラス、ダイヤモンド、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；上記ガラス、ダイヤモンド、金属とセラミックスとの積層体；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック等が挙げられる。
その他の材料でも、化学的に安定な材料であれば使用でき、例えば、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボンが挙げられる。また、上記材料の混合体又は積層体でもよい。例えば、ダイヤモンドライクカーボンを表面にコーティングしたスライドガラス等が挙げられる。。
これらのうち、ＤＮＡの固定化密度が極めて高い点からダイヤモンド或いはダイヤモンドライカーボンが好ましい。
ダイヤモンドとしては、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、或いは天然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。また、それらの構造が単結晶体或いは多結晶体のいずれでも差し支えない。生産性の観点よりマイクロ波プラズマＣＶＤ法などの気相合成法を用いて製造されたダイヤモンドを用いることが好ましい。
ダイヤモンド或いはダイヤモンドライクカーボンの形成方法は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ法、ＥＣＲＣＶＤ法、ＩＰＣ法、直流スパッタリング法、ＥＣＲスパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。また、金属粉末やセラミック粉末等に関しては、原料をプレス成形機を用いて圧粉したものを高温で焼結したものもあげられる。
担体の表面は意図的に粗面化されていることが望ましい。このような粗面化表面は基体の表面積が増えて多量のＤＮＡ等を固定させることに好都合であるからである。基体の形状は平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。
さらに、このダイヤモンド或いはダイヤモンドライクカーボンからなるハイブリッド形成用担体は、ダイヤモンド或いはダイヤモンドライクカーボンと他の物質との複合体（例えば、２相体）であってもよい。
化学修飾は、ポリヌクレオチドを結合可能とすべく、末端に極性基、例えば、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基等を有する炭化水素基で固体支持体表面を置換することによる。このような炭化水素基の炭化水素部分は、炭素数０〜１２、中でも０〜６であることが好ましい。このようなものとして、蟻酸、酢酸、プロピオン酸等のモノカルボン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などのジカルボン酸、トリメリット酸等の多価カルボン酸等が挙げられるが、中でもシュウ酸、コハク酸が望ましい。
そして、この炭化水素基は固体支持体表面に対しアミド結合されていることが望ましい。アミド結合させることにより、化学修飾を容易かつ強固なものとできるからである。
このような化学修飾は、ハイブリッド形成用担体の表面に紫外線照射してを塩素化、アンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化、次いで適当な酸クロリドあるいは無水多価カルボン酸を用いてカルボキシル化することにより達成できる。
（２）ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチドの固定
次に、化学修飾部分にハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド（以下、オリゴヌクレオチドＨという。）をアミド結合により固定する。このオリゴヌクレオチドＨ（配列表の配列番号５参照）を含んだ液をハイブリダイズ形成用担体にスポットして、オリゴヌクレオチドの５’末端側に含まれる第１級アミンを結合させる。固定前に、化学修飾の炭化水素基末端を脱水縮合剤で活性化しておくと、固定が容易となるので望ましい。特に、脱水縮合剤としては、カルボジイミドを用いることが好ましい。
なお、このような方法のほか、オリゴヌクレオチド固定化担体の表面を塩素化、アミノ化した状態（カルボキシル化しない）とし、形成された第１級アミノ基に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによりジカルボン酸を予め活性化した活性化ジエステルの一方のエステル基を脱水縮合させることにより形成することもできる。
また、化学修飾したハイブリダイズ形成用担体とのアミド結合の容易性を考慮して、固定側にデオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸、デオキシグアニル酸等の第１級アミンを１〜１０塩基有することが望ましい。オリゴヌクレオチドＨはハイブリダイズ形成用担体の表面に対して垂直方向に固定化されるので、ＤＮＡの情報を読みとりやすい。
特に望ましくは、固定側（５’末端）の１〜２０塩基がデオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸又はデオキシシチジル酸であることが望ましい。
（３）オリゴヌクレオチドＨをデハイブリダイズさせる。
９６℃位の温水中にオリゴヌクレオチドを固定したハイブリダイズ形成用担体を浸漬し、更に水洗することによりデハイブリタイズする。
実施例
実施例１（ＥｃｏＲＩで切断したｇＤＮＡを固定化したハイブリッド形成用担体）
（１）ハイブリッド形成用担体の化学修飾
塩素ガス中でダイヤモンドチップに紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、酸クロリドを１０重量％含む１，４−ジオキサン中に浸漬してカルボキシル化し、化学修飾されたチップを得た。
（２）ＥｃｏＲＩによるλファージＤＮＡの切断
λファージＤＮＡをＥｃｏＲＩにより切断し２１ｋｂｐのフラグメントを回収した。
（１）で得られた化学修飾されたチップを、ハイドロゲンシアナミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化エステルとし、先に得られたλファージ２１ｋｂｐフラグメントの１μｇ／μｌ濃度の水溶液に浸漬けてｇＤＮＡを固定化した。
該フラグメントの５００ｂｐのセグメントをＰＣＲによる増幅を確認することにより、ｇＤＮＡがチップに対して垂直方向に固定化していることを確認した。
（３）ハイブリタイズしたｇＤＮＡのデハイブリタイズ
（２）で得られたチップを９６℃の温水中に浸漬後、水洗してデハイブリタイズした。
（４）λファージ２１ｋｂｐフラグメントのＣｙ３標識
（２）で得られたλファージ２１ｋｂｐをＬａｂｅｌ　ＩＴＴＭ（ＰａｎＶｅｒａ社）を用いてＣｙ３標識し、１μｇ／μｌの水溶液とした。この溶液を９６℃で５分間加熱して２本鎖を１本鎖にして、（３）でデハイブリダイズしたチップを浸漬しでハイブリダイズさせた後、蛍光スキャナーで蛍光強度を測定した結果、λファージ２１ｋｂｐは３０ｆｍｏｌ／ｍｍ２固定化されていた。
実施例２（オリゴヌクレオチドを固定したハイブリダイズ形成用担体による一塩基変異の検出）
（１）ハイブリッド形成用担体の化学修飾
塩素ガス中で軟ダイヤモンドをコーティングしたスライドグラスに紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、酸クロリドを１０重量％含む１，４−ジオキサン中に浸漬してカルボキシル化し、化学修飾されたチップを得た。
（２）オリゴヌクレオチドの固定
（１）で得られたハイブリッド形成用担体に、スポッターを用いて、１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調製したオリゴヌクレオチド溶液ＡおよびＢを固定化した。なお、オリゴヌクレオチドＡ（配列表の配列番号１参照）はオリゴヌクレオチドＡ’（配列表の配列番号２参照）と、オリゴヌクレオチドＢ（配列表の配列番号３参照）はオリゴヌクレオチドＢ’（配列表の配列番号４参照）と、４℃で５時間ハイブリダイズさせた後にサンプルとして用いた。
（３）ハイブリダイゼーション
（２）で得られたオリゴヌクレオチドを固定化したハイブリッド形成用担体を９６℃の熱湯中に入れ、１ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調製したオリゴヌクレオチド溶液Ａ（ハイブリダイスさせていない）をのせ、カバーグラスで覆った後に、５℃で１２時間ハイブリダイズした。
（４）蛍光観察
（３）で得られた基板を洗浄・乾燥し、蛍光スキャナーで観察した結果、オリゴヌクレオチドＡを固定したスポットでは蛍光が観察され、オリゴヌクレオチドＢを固定したスポットからは蛍光が観察されなかった。
産業上の利用可能性
本発明のハイブリッド形成用担体は、ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチドを垂直方向に固定しているので、ＤＮＡ等の情報が容易に、正確に読みとれる。また、読みとる前にデハイブリタイズしているので、情報がより正確になる。
【配列表】
2002039111.tif 000002
2002039111.tif 000003
【国際調査報告】
2002039111.tif 000004
2002039111.tif 000005
2002039111.tif 000006