(57)【要約】新規ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターでトランスフェクションされた細胞、前記ポリペプチドに結合する抗体、前記ポリペプチドの抑制化剤のスクリーニング方法、抗肥満治療剤のスクリーニング方法、及び前記ポリペプチドの製造方法を開示する。前記ポリペプチドは、視床下部に発現している新規のカリウムチャネルである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、カリウムチャネル活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを発現させた細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する工程
を含む、前記ポリペプチドの抑制化剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを発現させた細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する工程
を含む、抗肥満治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項５に記載の細胞を培養する工程、及び
請求項１又は２に記載のポリペプチドを回収する工程
を含む、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規カリウムチャネルに関する。
背景技術
肥満遺伝子（ｏｂ　ｇｅｎｅ）は脂肪組織で特異的に発現し、レプチンをコードしている。レプチンは、脂肪蓄積を調節する末梢組織由来の情報として中枢神経系へ、中でも視床下部に送られ、視床下部の諸核に存在するレプチン受容体（Ｏｂ−Ｒ）に結合することで、食行動を抑制する。一方で、レプチンは、自律神経系を介して末梢でもエネルギー消費を亢進させる。視床下部におけるレプチン受容体の発現は、室傍核、弓状核、腹内側核、及び腹側前乳頭核に認められる。また、レプチンの作用部位や作用機序についても解明が進み、レプチンが弓状核の神経細胞体においてニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）の摂食促進及びエネルギー消費抑制作用を阻害し、メラノサイト刺激ホルモン（ａｌｐｈａ−ＭＳＨ）の受容体であるメラノコルチン−４受容体（ＭＣ−４Ｒ）を介して摂食抑制作用及びエネルギー消費亢進作用を増強することが明らかになっている（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ，３８７，ｐ．１１３，１９９６；Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，ｐ．５３１，１９９６；及びＮａｔｕｒｅ，３８５，ｐ．１６５，１９９７）。
また、視床下部は、血液中の化学情報や、末梢消化器官の化学受容器及び機械受容器から送られる神経性情報により、摂食調節を行なう。視床下部腹内側核、室傍核、及び視交差上核などからなる内側視床下部は、その破壊により過食及び／又は肥満を引き起こすこと、あるいは、刺激により摂食抑制が見られることなど、古くから摂食抑制機構の中枢として働くことが知られている（Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｎ．ら，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，４１６，１５３−１５６，１９８７；及びＴａｋａｋｉ　Ａ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６２，Ｒ５８６−Ｒ５９４，１９８７）。そのため、内側視床下部の神経興奮性の上昇は、摂食抑制効果を引き起こすと考えられる。
神経細胞の興奮性は、膜電位によって変化する。膜電位が脱分極することによって神経細胞は興奮し、逆に膜電位が過分極すると興奮性は低下する。すなわち、神経細胞の膜電位を制御することにより、その興奮性をコントロールすることが可能である。膜電位は、細胞の内外のＮａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ−、又はＣａ２＋などの無機イオンが担う電荷の分布によって決定されており、この電荷分布は、膜タンパク質によって構成される種々のイオンチャネルの開閉によって変化する。そのため、イオンチャネルの開閉は、膜電位の変化において重要な役割を担っている。特に、カリウムイオンを選択的に透過する膜タンパク質であるカリウムチャネルは、静止膜電位の維持や脱分極後の膜電位の再分極などに関与していると考えられており、神経細胞の興奮性を制御するための良いターゲットの１つであり、その抑制化剤は、細胞の膜電位を上昇させ、神経細胞の興奮性を上昇させる（Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｏｆ　Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９２；Ｅｄｗａｒｄら，ＴＨＥ　ＩＯＮ　ＣＨＡＮＮＥＬ　Ｆａｃｔ　Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９９９）。
発明の開示
本発明の課題は、新規のカリウムチャネルタンパク質、及びそれをコードする新規のポリヌクレオチドを提供し、視床下部神経細胞の興奮性を上昇させることを作用機序とする抗肥満治療剤として有用な物質を得るための簡便なスクリーニング系を提供することにある。
本発明者は、鋭意研究を行なった結果、摂食調節を行う視床下部に集中して発現している配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチドを取得し、本チャネルを製造し、抗肥満治療剤のスクリーニングツールを提供した。本チャネルが、視床下部のうち、摂食抑制及びエネルギー消費亢進作用を有するレプチン受容体と同じ室傍核、弓状核、及び腹内側核に発現していることを確認し、本チャネルが抗肥満治療剤のスクリーニングツールとして有用であることをより明確とした。また、本カリウムチャネルを発現させ、チャネル活性の検出系を構築し、本発明のポリペプチドの抑制化剤スクリーニング法及び抗肥満治療剤スクリーニング法を提供し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、カリウムチャネル活性を示すポリペプチド；
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
［３］［１］又は［２］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［４］［３］記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
［５］［４］記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞；
［６］［１］又は［２］記載のポリペプチドを発現させた細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する工程
を含む、前記ポリペプチドの抑制化剤のスクリーニング方法；
［７］［１］又は［２］記載のポリペプチドを発現させた細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する工程
を含む、抗肥満治療剤のスクリーニング方法；
［８］［５］記載の細胞を培養する工程、及び
［１］又は［２］記載のポリペプチドを回収する工程
を含む、前記ポリペプチドの製造方法；並びに
［９］［１］又は［２］記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片
に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；並びに
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は数箇所において、全体として１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、カリウムチャネル活性を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）
が含まれる。
本発明のポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
本明細書において、「カリウムチャネル活性を示す」とは、
（ａ）電圧刺激により電流が生じること；及び
（ｂ）カリウムイオン選択性が高いこと
の２つの特徴を全て満たすことを意味する（Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｏｆ　Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９２；又はＥｄｗａｒｄら，ＴＨＥ　ＩＯＮ　ＣＨＡＮＮＥＬ　Ｆａｃｔ　Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９９９）。
本明細書において、或るポリペプチド（以下、試験ポリペプチドと称する）が「電圧刺激により電流が生じる」か否かは、当業者に公知の方法（Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｏｆ　Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９２）で確認することができ、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後述の実施例４に記載の方法）を用いることができる。すなわち、前記試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞をトランスフェクションし、得られた細胞をホールセル膜電位固定（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ　ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ）法により膜電位固定した状態で、保持電位−８０ｍＶから４００ミリ秒間、０ｍＶの脱分極パルスを与える。前記脱分極パルスにより外向き電流が生じれば、前記試験ポリペプチドが「電圧刺激により電流が生じる」と判定することができる。
また、本明細書において、試験ポリペプチドの「カリウムイオン選択性が高い」か否かは、当業者に公知の方法（Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｏｆ　Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９２）で確認することができ、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後述の実施例５に記載の方法）により確認することができる。すなわち、前記試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞をトランスフェクションし、得られた細胞をホールセル膜電位固定法により膜電位固定した状態で、細胞外液のカリウムイオン濃度を変えながら、各カリウムイオン濃度における反転電位をランプ波を用いて測定する。各カリウムイオン濃度に対する反転電位をプロットし、得られた直線の傾きが、ネルンスト（Ｎｅｒｎｓｔ）の式：
Ｅ＝（２．３０３ＲＴ／Ｆ）ｌｏｇ（［Ｋ］ｏｕｔ／［Ｋ］ｉｎ）
（式中、Ｅは膜電位であり、［Ｋ］ｏｕｔは細胞外カリウムイオン濃度であり、［Ｋ］ｉｎは細胞内カリウムイオン濃度であり、Ｒはガス定数であり、Ｆはファラデー定数であり、Ｔは絶対温度である）
から求められる傾きの理論値とほぼ同様の数値（好ましくは４７〜５８ｍＶ／ｄｅｃａｄｅ）が得られれば、前記試験ポリペプチドの「カリウムイオン選択性が高い」と判定することができる。
本発明のポリペプチドの１つである、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、５４３個のアミノ酸残基からなるヒト由来の新規のカリウムチャネルタンパク質である。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、後述の実施例２に示すように、摂食調節を行なう視床下部に集中して発現しており、視床下部の内、実施例８又は９に示すように、摂食を抑制するレプチン受容体が発現している室傍核、弓状核、及び腹内側核に発現しているタンパク質である。
なお、Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２７５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１５，２８３９８−２８４０５，２０００には、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１８番〜第５４３番のアミノ酸からなる配列を、第１３番〜第５３８番のアミノ酸配列として含むカリウムチャネルであるヒトＴＲＥＫ−２（全長５３８ａａ）が記載されている。しかし、ヒトＴＲＥＫ−２は、腎臓及び膵臓で強く発現し、精巣、脳、大腸、及び小腸でも発現があることが確認されている。また、Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２７５，Ｊｕｎｅ　９，１７４１２−１７４１９，２０００）には、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｎｇｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索の結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第２５番及び第４４番〜第５４３番のアミノ酸からなる各配列とそれぞれ１００％及び９７％一致するアミノ酸配列を、第１番〜第２５番及び第３９番〜第５３８番のアミノ酸配列として有するカリウムチャネルであるラットＴＲＥＫ−２（全長５３８ａａ）が記載されている。しかし、ラットＴＲＥＫ−２は、ノーザンブロットの結果、小脳で強い発現が、脾臓と精巣で弱い発現があることが確認されている。摂食に関与する視床下部での発現が無く、特に摂食に関与するとの記載もないことより、ヒトＴＲＥＫ−２及びラットＴＲＥＫ−２は、摂食調節機能には関与していないと考えられ、摂食調節機能を有する本発明のポリペプチドとは、生体内での役割が異なると考えられる。従って、本発明のポリペプチドは、ＴＲＥＫ−２を用いて容易に得られるものではなく、また、予測することができない有利な効果を有する。
本発明の機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は数箇所（例えば、１〜３箇所）において、全体として１又は数個（例えば、１〜３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、カリウムチャネル活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体）をコードするポリヌクレオチドを元にして、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを元にして、遺伝子工学的に、コードするアミノ酸配列を人為的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列における第１３番〜第１６４４番の塩基からなる配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施することが可能である。
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例４に記載の方法により、脱分極パルスにより外向き電流が生じることを確認し、更に、実施例５に記載の方法により、カリウムイオン選択性が高いことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例４に記載の方法により、脱分極パルスにより外向き電流が生じることを確認し、更に、実施例５に記載の方法により、カリウムイオン選択性が高いことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列における第１３番〜第１６４４番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
前記（１）のＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。抽出した前記ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
前記（２）の常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ　Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（ｉ）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（ｉｉ）ＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法、又は（ｉｖ）カリウムチャネル活性を指標とする形質転換株スクリーニング法を採用することができる。
前記（ｉ）の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。
前記（ｉｉ）のＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
前記（ｉｉｉ）の本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、予め、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株の細胞表面でポリペプチドを産生させ、本発明のポリペプチドに対する抗体及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポリペプチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
前記（ｉｖ）のカリウムチャネル活性を指標とする形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、予め、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株の細胞表面でポリペプチドを産生させ、カリウムチャネル活性を指標として、所望のポリペプチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
前記（３）の化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ　１０００Ｍ　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスフェイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
［３］本発明の発現ベクター及び細胞
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞をトランスフェクションすることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）又は後述の実施例６で使用したＣＨＯ−Ｋ１細胞、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、及び後述の実施例３で使用したＬ９２９細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２１４８）等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、サイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、又はｐＩＲＥＳｎｅｏ２（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）等を挙げることができる。
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生するトランスフェクションされた細胞を得ることができる。
更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
本発明の細胞は、常法（例えば、日本生化学会編，「新生化学実験講座１８細胞培養技術」，東京化学同人，１９９０）に従って培養することができ、前記培養により細胞内又は細胞表面に本発明のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
本発明の細胞を培養することにより、前記細胞の細胞内又は細胞表面に生産される本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法（例えば、岡田雅人及び宮崎香編，「改訂タンパク質実験ノート上・下」，羊土社，１９９９）により、分離精製することができる。具体的には、例えば、本発明のポリペプチドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより、本発明のポリペプチドを含む細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶化した後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のポリペプチドを精製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、又はジキトニン等）を用いることにより、可溶化後もカリウムチャネルの特性を保持することができる。
［４］本発明のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドを発現させた本発明の細胞を用いると、本発明のポリペプチドを抑制化する物質をスクリーニングすることができる。
先に述べたように、本発明のポリペプチドは、視床下部に集中して発現しているカリウムチャネルである。背景技術欄で述べたように、カリウムチャネルは、静止膜電位の維持や脱分極後の膜電位の再分極などに関与していると考えられており、この事実は、神経細胞のカリウムチャネルに対する抑制化剤が、膜電位の脱分極側へのシフトを引き起こし、神経細胞の興奮性を上昇させる作用を有することを示している。
また、背景技術欄で最初に述べたように、内側視床下部神経細胞の興奮性を上昇させる薬剤は、摂食抑制作用を引き起こすと考えられる。従って、視床下部神経細胞に発現するカリウムチャネルに対する抑制化剤は、視床下部神経細胞の興奮性を上昇させることを作用機序とする摂食抑制による抗肥満治療剤として有用であると考えられる。
従って、本発明のポリペプチドを発現させた本発明の細胞それ自体を、抗肥満治療剤（特には、本発明のポリペプチドの抑制化剤）のスクリーニングツールとして使用することができる。
なお、本明細書において、本発明のポリペプチドを「抑制化」するとは、チャネル機能を抑制化することを意味し、ポリペプチドの発現を抑制することにより、チャネル機能を抑制化することも含む。
本発明の抗肥満治療剤（特には、本発明のポリペプチドの抑制化剤）スクリーニング方法は、本発明のポリペプチドを発現させた本発明の細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する工程を含む。
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は、カリウムチャネルとして機能するように本発明のポリペプチドを発現させた本発明の細胞（すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクションされ、前記ポリペプチドがカリウムチャネルとして機能するように発現された細胞）と試験化合物とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する工程を含む限り、特に限定されるものではないが、本発明のポリペプチドの抑制化を分析するのに用いる方法の違いに基づいて、例えば、
［１］電位固定（ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ）法、特にはホールセル膜電位固定法を利用するスクリーニング方法、
［２］放射性同位元素ルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンの放出を利用するスクリーニング方法、あるいは、
［３］膜電位感受性色素を利用するスクリーニング方法
を挙げることができ、これらの方法の中でも、放射性同位元素ルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンの放出を利用するスクリーニング方法が好ましい。
前記［１］の電位固定法、特にはホールセル膜電位固定法を利用して、抗肥満治療剤として有用な、本発明のポリペプチドを抑制化する物質をスクリーニングする場合には、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞を、電位固定法、特にはホールセル膜電位固定法により膜電位固定し、試験化合物の存在下における前記細胞の全細胞電流を分析（すなわち、測定又は検出）することにより、本発明のポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する。すなわち、電位固定法、特にはホールセル膜電位固定法を利用する本発明のスクリーニング方法では、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞を、電位固定法、特にはホールセル膜電位固定法により膜電位固定した状態で、前記細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び前記細胞における全細胞電流の変化を分析する工程を含む。
より具体的には、後述の実施例４に記載の方法により実施することが好ましい。例えば、細胞外液としては、１４９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．３）を含む溶液を使用し、細胞内液としては、１４９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、４．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ、及び９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｋ（ｐＨ＝７．３）を含む溶液を用いることができる。例えば、保持電位−４０ｍＶに膜電位固定された細胞の細胞外液に、試験化合物を添加した場合に、外向き電流が抑制されれば、前記試験化合物は、本発明のポリペプチドを抑制化する物質であると判定することができる。
前記［２］の放射性同位元素ルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンの放出を利用して、抗肥満治療剤として有用な、本発明のポリペプチドを抑制化する物質をスクリーニングする場合には、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞に、放射性同位元素ルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンを取り込ませた後、試験化合物を添加した際の細胞外へ放出される放射活性の量を分析（すなわち、測定又は検出）することにより、本発明のポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する（Ｍａｉｎｇｒｅｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１３８１，１９９９）。すなわち、放射性同位元素ルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンの放出を利用する本発明のスクリーニング方法では、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞に、放射性同位元素ルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンを取り込ませた後、前記細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び前記細胞の細胞外へ放出される放射活性の量を分析する工程を含む。このスクリーニングは、カリウムチャネルが、一般にカリウムイオンと同様にルビジウムイオンを通すことができる性質を利用するものである。
より具体的には、後述の実施例７に記載の方法により実施することが好ましい。例えば、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞を、８６ＲｂＣｌとインキュベートすることにより、ルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンを前記細胞内に取り込ませることができる。前記細胞を、通常濃度（例えば、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）のカリウムイオンを含む溶液で洗浄し、取り込まれなかったルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンを取り除く。次に、前記細胞を高カリウム濃度（例えば、１００ｍｍｏｌ／Ｌ）のカリウムイオンで刺激すると、前記細胞よりルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンが放出される。カリウムチャネルが抑制化すると、前記細胞からのルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオン放出量が減少するので、細胞外液の放射活性をチャネル活性の指標とし、本発明のポリペプチドが抑制化されるか否かを分析することができる。試験化合物を添加した際の細胞外へ放出された放射活性を分析（すなわち、測定又は検出）することにより、本発明のポリペプチドを抑制化する物質をスクリーニングすることができる。
前記［３］の膜電位感受性色素を利用して、抗肥満治療剤として有用な、本発明のポリペプチドを抑制化する物質をスクリーニングする場合には、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞に、膜電位感受性色素を取り込ませた後、試験化合物を添加した際の、細胞内の前記色素の蛍光強度変化を分析（すなわち、測定又は検出）することにより、本発明のポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する。すなわち、膜電位感受性色素を利用する本発明のスクリーニング方法では、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞に、膜電位感受性色素を取り込ませた後、前記細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び前記細胞内の前記色素の蛍光強度変化を分析する工程を含む。このスクリーニングは、膜電位感受性色素が、カリウムチャネルの開口に伴う膜電位の変化を光学的に検出することできるという性質を利用するものである。
より具体的には、前記膜電位感受性色素として、ＤｉＢＡＣ［ｂｉｓ−（１，３−ｄｉｂｕｔｙｌｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄ）ｔｒｉｍｅｔｈｉｎｅ　ｏｘｏｎｏｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製］又はその誘導体などを用いることができる。これらの色素を用いると、本発明のポリペプチドの活性を分析（すなわち、測定又は検出）することができ、試験化合物存在下と非存在下とで前記色素の蛍光強度変化を比較することにより、本発明のポリペプチドを抑制化する物質をスクリーニングすることができる。具体的には、カリウムチャネルが抑制化すると、蛍光強度が上昇する。
また、前記［１］〜［３］記載の方法で本発明のポリペプチドを抑制化する物質を選択することにより、抗肥満治療剤をスクリーニングすることができる。
［５］本発明の抗体又はその断片
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリーコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２；及びＨｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｏｆ　Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９２）に従って実施した。
実施例１：新規カリウムチャネルをコードする遺伝子の単離及び発現ベクターの構築
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規カリウムチャネルをコードする全長ｃＤＮＡは、ヒト脳由来のポリＡ＋　ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型とし、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、以下の手順で取得した。
まず、ヒト脳ポリＡ＋　ＲＮＡ（１０ｎｇ）を鋳型として、市販のＲＴ−ＰＣＲキットキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ　Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ−ＰＣＲ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いて逆転写させ、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。
得られた第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端にＥｃｏＲＩ認識配列が付加してある）をフォワードプライマーとして、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端にＢａｍＨＩ認識配列が付加してある）をリバースプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＬＡＴＩＮＵＭ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いて、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、最初に９５℃（５分間）で熱変性を行なった後、９５℃（１５秒間）と６８℃（２分３０秒間）とからなるサイクルを３５回繰り返した。その結果、約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化した後、プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ２（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いてクローニングした。得られたクローンをｐＩＲＥＳｎｅｏ２−５４３と命名した。なお、前記プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ２は、サイトメガロウイルス由来のプロモーター配列を持っており、動物細胞に新規カリウムチャネルを発現させるために使用することができる。
得られたクローンｐＩＲＥＳｎｅｏ２−５４３の塩基配列を、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析し、配列番号１で表される塩基配列が得られた。
配列番号１で表される塩基配列は、１６３２塩基対からなるオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列における第１３番〜第１６４４番の塩基からなる配列）を有する。前記オープンリーディングフレームから予測される５４３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列であった。
実施例２：新規カリウムチャネル遺伝子の発現分布の解析
ヒト組織における、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる新規カリウムチャネルをコードする遺伝子の発現分布を、ＲＴ−ＰＣＲ法により以下の手順で解析した。
ヒトの各組織由来のポリＡ＋　ＲＮＡ（各５ｎｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＤＮアーゼ処理した後、ＲＴ−ＰＣＲキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ　Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ−ＰＣＲ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いて逆転写させ、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。
得られた第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＬＡＴＩＮＵＭ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いて、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、最初に９５℃（５分間）で熱変性を行なった後、９５℃（３０秒間）と６８℃（２分３０秒間）とからなるサイクルを３０回繰り返した。なお、前記各プライマーの塩基配列は、本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子に特異的な配列である。
ヒトの各組織（扁桃体、尾状核、海馬、脳梁、黒質、視床、小脳、前頭葉、視床下部、脊髄、下垂体、全脳、心臓、胎盤、肺、気管、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、甲状腺、唾液腺、副腎、乳腺、及び前立腺）についてＲＴ−ＰＣＲ解析を行なったところ、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が、視床下部において顕著に増幅され、また、前頭葉において少量増幅された。この結果から、本発明の新規カリウムチャネルのｍＲＮＡの発現は、視床下部に集中していることが明らかになった。
実施例３：新規カリウムチャネルの動物細胞Ｌ９２９細胞における発現
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規カリウムチャネルのチャネル活性を検出するために、動物細胞に前記タンパク質を発現させた。前記動物細胞としては、膜電位の変化によって内在性のチャネルによる電流を発生しないＬ９２９細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２１４８）を用いた。前記実施例１で得られた発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ２−５４３と、市販のトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）とを用いて、Ｌ９２９細胞のトランスフェクションを行ない、前記細胞にてカリウムチャネルを発現させた。なお、具体的な手順は、前記トランスフェクション試薬に添付のマニュアルに従って実施した。また、コントロール細胞として、プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ２でトランスフェクションした細胞も同様にして作成した。
得られたこれらのトランスフェクションされた細胞を、以下の実施例４及び実施例５で使用した。
実施例４：新規カリウムチャネルのチャネル活性の検出
前記実施例３で得られた各細胞を、ホールセル膜電位固定法により膜電位固定し、全細胞電流を測定した。細胞外液として、１４９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．３）を含む溶液を使用し、細胞内液として、１４９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、４．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ、及び９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｋ（ｐＨ＝７．３）を含む溶液を用いた。
プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ２−５４３でトランスフェクションされた細胞では、保持電位−８０ｍＶから４００ミリ秒間、脱分極パルスを与えると、外向き電流が惹起された。この電流は、瞬時に立ち上がる成分と、それに引き続いて流れる成分とが存在し、電圧刺激中に不活性化はみられなかった。一方、コントロール細胞に、同様の脱分極パルスを与えてみたが、この様な電流は観測されなかった。
この結果を図１に示す。図１において、グラフ（Ａ）は、プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ２−５４３でトランスフェクションされたＬ９２９細胞を用いた場合の結果であり、グラフ（Ｂ）は、コントロールベクター（プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ２）でトランスフェクションされたＬ９２９細胞を用いた場合の結果である。
実施例５：新規カリウムチャネルのカリウムイオン選択性の確認
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規カリウムチャネルのカリウムイオンの選択性を検証するために、細胞外液のカリウムイオン濃度を５ｍｍｏｌ／Ｌから種々濃度（１５ｍｍｏｌ／Ｌ、３０ｍｍｏｌ／Ｌ、７５ｍｍｏｌ／Ｌ、及び１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に変え、そのときの反転電位をランプ波を用いて測定した。その結果、カリウムイオン濃度を高くするに従って、反転電位は脱分極側に移動した。各カリウムイオン濃度に対する反転電位をプロットし、直線回帰したところ、その傾きは４９ｍＶ／ｄｅｃａｄｅであり、ネルンスト（Ｎｅｒｎｓｔ）の式から求められる傾きの理論値に近い値であった。この結果から、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規カリウムチャネルは、カリウムイオンの選択性が高いと考えられる。
実施例６：新規カリウムチャネルの動物細胞ＣＨＯ−Ｋ１における発現
動物細胞としてＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いたこと以外は、前記実施例３に記載の手順を繰り返すことにより、前記細胞にカリウムチャネルを発現させた。得られたこれらのトランスフェクションされた細胞を、以下の実施例７で使用した。
実施例７：ルビジウム（８６Ｒｂ）イオン放出を利用した新規カリウムチャネルのチャネル活性の検出
カリウムチャネル活性を簡便に測定するため、カリウムチャネルが、一般にカリウムイオンと同様にルビジウムイオンを通すことができる性質に基づき、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規カリウムチャネルにおけるルビジウムイオンの放射活性を測定することにより、イオン透過性を検討した。
前記実施例６で得られた各細胞を、塩化ルビジウム（８６Ｒｂ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ；２ｍＣｉ／ｍＬ）を含む培養液にて培養し、ルビジウムイオンを細胞に取り込ませた。前記細胞を、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．４）を含む洗浄用溶液にて洗浄し、取り込まれなかったルビジウムイオンを取り除いた。続いて、高濃度のカリウムイオンを含む測定用溶液［５２．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．４）を含む溶液］に置換した後、前記測定用溶液に含まれるルビジウムイオンの放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定することで分析したところ、放射活性が測定された。
この結果、本発明の新規カリウムチャネルを発現させた細胞は、高カリウムイオン濃度刺激（Ｈｉｇｈ　Ｋ刺激）によりルビジウムイオンを透過させると考えられる。この系でも、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規カリウムチャネルがカリウムチャネル活性を示すことが確認できた。
実施例８：新規カリウムチャネルのヒト視床下部及び前頭葉における発現分布の解析
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる新規カリウムチャネルのヒト脳視床下部における発現分布の解析を行なった。
抗体作製に用いるポリペプチドとして、配列番号２で表されるアミノ酸配列をホップ及びウッズ（Ｈｏｐｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ）のアルゴリズムで解析することにより決定した、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１０５番〜第１２２番のアミノ酸からなる配列であって、そのＮ末端に更にシステインを付加した配列からなるポリペプチドを合成した。作製したポリペプチドをアジュバントに乳濁した後、ウサギに免疫し、感作した。ウサギより血清を採取し、ペプチドアフィニティーにより、新規の抗カリウムチャネル抗体を精製した。
５００倍又は１０００倍に希釈した抗カリウムチャネル抗体を用い、ホルマリン固定パラフィン包埋したヒト視床下部組織切片にて免疫組織染色を行なった。なお、抗原抗体反応の検出には、ＡＢＣ法（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社キット）にて行なった。
抗カリウムチャネル抗体による免疫組織染色の結果、５００倍又は１０００倍希釈のいずれの場合についても、視床下部の内、室傍核及び視索上核が強く染色され、また、弓状核及び腹内側核の神経細胞体も染色された。視床は陰性であった。
本実施例により、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる新規カリウムチャネルタンパク質は、レプチン受容体が発現している室傍核、弓状核、及び腹内側核に発現していることが明らかになった。
実施例９：新規カリウムチャネルのマウス視床下部における発現分布の解析
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトカリウムチャネルに対応するマウスカリウムチャネル（オルトログ）のマウス脳視床下部における発現分布の解析を行なった。
雄ｄｄＹマウス（日本ＳＬＣより購入）をペントバルビタールナトリウム深麻酔下にて開胸し、右心耳切開後、左心室より氷冷したリン酸緩衝液２０ｍＬにて還流脱血した。更に、左心室より氷冷した４％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）２０ｍＬで還流固定した。その後速やかに脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒドを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液を用いて、４℃で２日間の浸潤固定を行なった。更に、１６％ショ糖を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）に２日おきに４回浸し、これをマウス脳ショ糖置換試料とした。視床下部を含む脳組織を試料ステージ上に乗せ、コンパウンド（ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＣ；ＭＩＬＥＳ社）で包埋した後、ドライアイスにより急速凍結した。ミクロトーム（ＨＭ５００−ＯＭ；カールツァイス株式会社）にて厚さ１６μｍの凍結切片を作製した。
１６０μｍおきに調製した一連のマウス視床下部切片を、２％過酸化水素及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）で室温にて３０分間処理し、１０％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社キット）でブロッキングした後、１％正常ヤギ血清及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）で３００００倍希釈した実施例８で作製した抗カリウムチャネル抗体と４℃で３日間反応させた。抗原抗体反応の検出には、ＡＢＣ法（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社キット）にて行なった。また、マウス視床下部諸核の同定は、連続切片をニッスル染色し、Ｋｅｉｔｈ　Ｂ．Ｊ．Ｆ．ら，“Ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｂｒａｉｎ　ｉｎ　Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ　Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９６を参考に行なった。実施例８で作製したポリペプチドを用いた吸収実験を行なったところ、抗体反応時における０．１μｍｏｌ／Ｌのポリペプチドの添加により染色が阻害された。
実施例８で作製した新規の抗カリウムチャネル抗体による発現解析の結果、マウス視床下部では、視床下部周辺の神経細胞体が染色された。染色されたニューロンには小型のものが多かった。また、細胞体の周りにイバラ様の突起を持つオリゴデンドロサイトの前駆細胞も染色されていた。
視床下部における新規カリウムチャネル発現は、腹内側核に強く見られた。腹内側核の中でも、特に外側にあたる範囲は強く発現していた。また、弓状核、隆起核、視索上核、及び室傍核にも比較的強い発現が見られた。一方、前視床下野、外側野、前外側核、背内側核、及び視交叉上核は、一部分を除き陰性であった。
本実施例により、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトカリウムチャネルに対応するマウスカリウムチャネルも、レプチン受容体が発現している室傍核、弓状核、及び腹内側核に発現していることが明らかになった。
実施例１０：新規カリウムチャネルの動物細胞ＣＨＯｄｈｆｒ−における発現
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規カリウムチャネルを発現させるため、動物細胞に前記ポリペプチドを発現させた。前記細胞としては、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞）を用いた。前記実施例１で得られた発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ２−５４３と、市販のトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを用いて、ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞のトランスフェクションを行ない、前記細胞にてカリウムチャネルを発現させた。細胞培養用プレートとしては、９６ウェルプレート［Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ　Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ（ＲＰＮＱ０１６３），アマシャムファルマシアバイオテク株式会社；９６Ｆ　Ｎｕｎｃｌｏｎ　Ｄｅｌｔａ　Ｗｈｉｔｅ　ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（１３６１０２），Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ社；又はカルチャープレート（白色）（６００５１８０），パッカードジャパン株式会社］、あるいは、細胞培養用２４ウェルプレート［マイクロプレート（３８２０−０２４Ｎ），旭テクノグラス株式会社；又はカルチャープレート（白色）（６００５１８０），パッカードジャパン株式会社］を用いた。なお、具体的な手順は、前記トランスフェクション試薬に添付のマニュアルに従って実施した。得られたこれらのトランスフェクションされた細胞を、以下の実施例１１で使用した。
実施例１１：放射性同位元素ルビジウム（８６Ｒｂ＋）イオンの放出を利用した新規カリウムチャネルのチャネル活性を阻害する物質のスクリーニング
カリウムチャネルが、一般にカリウムイオンと同様にルビジウムイオンを通すことができる性質に基づき、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規カリウムチャネルの活性を阻害する物質を、ルビジウムイオンの放射活性を測定することにより、スクリーニングした。
前記実施例１０で得られた各細胞を、塩化ルビジウム（８６Ｒｂ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ；２ｍＣｉ／ｍＬ）を含む培養液にて培養し、ルビジウムイオンを細胞に取り込ませた。前記細胞を、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．４）を含む洗浄用溶液、あるいは、市販の培地［Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ａｌｐｈａ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ．１２５７１−０４１）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社］にて洗浄し、取り込まれなかったルビジウムイオンを取り除いた。続いて、高濃度のカリウムイオンを含む測定用溶液Ａ［５２．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．４）］、高濃度のカリウムイオン及びアラキドン酸を含む測定用溶液Ｂ［５２．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．４）、及び１００μｍｏｌ／Ｌアラキドン酸］、あるいは、これらの測定用溶液（すなわち、測定用溶液Ａ又は測定用溶液Ｂ）に試験化合物溶液［すなわち、試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した溶液］を添加した溶液に置換し、各々１５分間刺激を行なった。また、ネガティブコントロールとして、洗浄用溶液に再度置換し、１５分間刺激を行なった。刺激後、各溶液を測定用９６ウェル［オプティプレート（６００５１９０）；パッカードジャパン株式会社］又は２４ウェルプレート［オプティプレート（６００５１８６）；パッカードジャパン株式会社］に移し、また、プレートに残った細胞は、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＯＨにて溶解した後、適宜、測定用プレートに移した。マルチウェルシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ　ＮＸＴ　ＨＴＳ；Ｐａｃｋａｒｄ社）にて、前記プレートの各ウェルに含まれるルビジウムイオンの放射活性を測定した。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドは、視床下部に集中して発現しており、視床下部の内、摂食抑制及びエネルギー消費亢進作用を有するレプチン受容体と同じ組織に発現しているカリウムチャネルであるので、本発明のポリペプチドを抑制化する物質をスクリーニングすることにより、抗肥満治療剤を得ることができる。
また、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現する本発明の細胞によれば、抗肥満治療剤の簡便なスクリーニング系を提供することができる。更に、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、及び抗体は、本発明のポリペプチドを製造するのに有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３及び４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
2002052000.tif 000002
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2002052000.tif 000004
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2002052000.tif 000007
2002052000.tif 000008
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ２−５４３（Ａ）又はコントロールベクター（Ｂ）でトランスフェクションされたＬ９２９細胞を、ホールセル膜電位固定法により膜電位固定した状態で、脱分極パルスを与えた場合に励起される外向き電流の観察結果を示すグラフである。
【図１】
2002052000.tif 000009
【国際調査報告】
2002052000.tif 000010
2002052000.tif 000011
2002052000.tif 000012