(57)【要約】配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質を特異的に認識し、かつ該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体を提供する。本発明によれば、ヒトＶＰＬＦに特異的に反応し、かつその活性を阻害するモノクローナル抗体を作製し、ＶＰＬＦの関与する疾患、すなわち、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨芽細胞の異常に基づく疾患、膵臓β細胞の異常に基づく疾患、虚血性疾患及び創傷治癒の遅延を伴う疾患の治療薬又は診断薬として利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白買を特異的に認識し、かつ該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
【請求項２】
配列番号１における第２２７アミノ酸〜第３４５アミノ酸に存在するエピトープを認識する請求項１記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
【請求項７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＮ末から少なくとも２２６番目までのアミノ酸が欠失されたアミノ酸配例を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白買を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
【請求項８】
配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
【請求項９】
配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
【請求項１０】
蛋白質の有する増殖因子としての活性が平滑筋細胞に対する増殖促進活性である請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
平滑筋細胞が、ラット由来である請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項１２記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体がＩｇＧ１サブクラスである請求項１２記載の抗体。
【請求項１５】
マウスモノクローナル抗体がＩｇＧ１サブクラスである請求項１３記載の抗体。
【請求項１６】
ハイブリドーマ細胞株ＫＭ２７６４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９３）により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項１７】
ハイブリドーマ細胞株ＫＭ２７６７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９４）により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項１２記載のモノクローナル抗体の部分断片からなる抗体断片。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１８記載の抗体断片と、放射性同位元素、蛋白質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２１】
ハイブリドーマ細胞株ＫＭ２７６４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９３）である請求項２０記載のハイブリドーマ。
【請求項２２】
ハイブリドーマ細胞株ＫＭ２７６７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９４）である請求項２０記載のハイブリドーマ。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８記載の抗体断片又は請求項１９記載の抗体の誘導体をコードするＤＮＡ。
【請求項２４】
請求項２３記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項２５】
請求項２４記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項２６】
請求項２５記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８記載の抗体断片又は請求項１９記載の誘導体を生成蓄積させ、該培養物から該抗体、該抗体断片又は該誘導体を採取することを特徴とする、抗体、抗体断片又は誘導体の製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８記載の抗体断片又は請求項１９記載の抗体の誘導体を含有する医薬。
【請求項２８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８記載の抗体断片又は請求項１９記載の抗体の誘導体を含有する、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患及び腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の治療薬。
【請求項２９】
異常な血管新生の亢進を伴う疾患が固形腫瘍及び腫瘍転移からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく眼の疾患が糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症及び血管新生緑内障からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく関節炎が慢性関節リュウマチであり、異常な血管新生を伴う皮膚疾患が乾せんであり、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患が腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群及び卵巣過剰刺激症候群からなる群より選択され、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患が動脈硬化であり、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患が糸球体腎炎である請求項２８記載の治療薬。
【請求項３０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８記載の抗体断片又は請求項１９記載の抗体の誘導体を含有する、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨芽細胞の異常に基づく疾患、膵臓β細胞の異常に基づく疾患、虚血性疾患及び創傷治癒の遅延を伴う疾患からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の診断薬。
【請求項３１】
異常な血管新生の亢進を伴う疾患が固形腫瘍及び腫瘍転移からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく眼の疾患が糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症及び血管新生緑内障からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく関節炎が慢性関節リュウマチであり、異常な血管新生を伴う皮膚疾患が乾せんであり、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患が腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群及び卵巣過剰刺激症候群からなる群より選択され、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患が動脈硬化であり、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患が糸球体腎炎であり、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患が貧血であり、骨芽細胞の異常に基づく疾患が骨粗鬆症であり、膵臓β細胞の異常に基づく疾患が糖尿病であり、虚血性疾患が脳梗塞、急性心筋梗塞及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択され、創傷治癒の遅延を伴う疾患が神経性下肢潰瘍及び糖尿病性下肢潰瘍からなる群より選択される請求項３０記載の診断薬。
【請求項３２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８記載の抗体断片又は請求項１９記載の抗体の誘導体を用いて以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質を免疫学的に定量する方法：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＮ末から少なくとも２２６番目までのアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｈ）配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｉ）蛋白質の有する増殖因子としての活性が平滑筋細胞に対する増殖促進活性である上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の蛋白質；及び
（ｊ）平滑筋細胞が、ラット由来である上記（ｉ）に記載の蛋白質。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８記載の抗体断片又は請求項１９記載の抗体の誘導体を用いて以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質を免疫学的に検出する方法：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＮ末から少なくとも２２６番目までのアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｈ）配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｉ）蛋白質の有する増殖因子としての活性が平滑筋細胞に対する増殖促進活性である上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の蛋白質；及び
（ｊ）平滑筋細胞が、ラット由来である上記（ｉ）に記載の蛋白質。
【請求項３４】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８記載の抗体断片又は請求項１９記載の抗体の誘導体を用いて、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨芽細胞の異常に基づく疾患、膵臓β細胞の異常に基づく疾患、虚血性疾患及び創傷治癒の遅延を伴う疾患からなる群より選択される少なくとも１種の疾患を検出する方法。
【請求項３５】
異常な血管新生の亢進を伴う疾患が固形腫瘍及び腫瘍転移からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく眼の疾患が糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症及び血管新生緑内障からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく関節炎が慢性関節リュウマチであり、異常な血管新生を伴う皮膚疾患が乾せんであり、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患が腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群及び卵巣過剰刺激症候群からなる群より選択され、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患が動脈硬化であり、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患が糸球体腎炎であり、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患が貧血であり、骨芽細胞の異常に基づく疾患が骨粗鬆症であり、膵臓β細胞の異常に基づく疾患が糖尿病であり、虚血性疾患が脳梗塞、急性心筋梗塞及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択され、創傷治癒の遅延を伴う疾患が神経性下肢潰瘍及び
糖尿病性下肢潰瘍からなる群より選択される請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な抗体、並びに該抗体を用いた診断薬、医薬及び治療薬に関する。
背景技術
血管形成、血管新生活性を有する血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、以下「ＶＥＧＦ」という）及び平滑筋細胞の分化、増殖活性を有する血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、以下「ＰＤＧＦ」という）は構造が類似しており、類縁因子であるＰｌＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＶＥＧＦ−Ｅを含めてＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーの増殖因子と分類されている。
血管新生は、脊椎動物の胎生期における循環器系の形成や多くの組織の構築に重要な役割を果たすとともに、成熟個体（雌）においても性周期における黄体形成、子宮内膜の一過性の増殖、胎盤形成などに密接に関与する。さらに、病的状態としては、固形腫瘍の増殖、転移形成、糖尿病性網膜症、慢性関節リュウマチの病態形成、促進に血管新生が深く関与している（Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１０９３１，１９９２）。
血管新生は、血管新生因子が分泌される過程、これが引き金となって近傍にある既存の血管の内皮細胞からプロテアーゼが分泌される過程、該プロテアーゼにより基底膜及び間質が破壊される過程、続いて血管内皮細胞の遊走及び増殖がはじまる過程、並びに、管腔が形成されることにより血管が新生される過程よりなる（Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１０９３１，１９９２）。血管新生を誘導する因子としては多くの因子の関与が報告されているが、中でも血管透過性因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ、以下「ＶＰＦ」という）／ＶＥＧＦが上記発生段階における血管新生及び病的な状態における血管新生において最も重要な因子として知られている（Ｍ．Ｓｈｉｂｕｙａ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６７，２８１，１９９５）。ＶＰＦ／ＶＥＧＦはホモダイマーよりなる分子量約４万の蛋白質であり、１９８３年にＶＰＦとして（Ｄ．Ｒ．Ｓｅｎｇｅｒら；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，９８３，１９８３）、１９８９年にＶＥＧＦとして独立した分子として報告されたが（Ｎ，Ｆｅｒｒａｒａら；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１，１９８９）、ｃＤＮＡクローニングの結果、両者は同一の物質であることが明らかとなった（Ｄ．Ｗ．Ｌｅｕｎｇら；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０６，１９８９；Ｐ．Ｊ．Ｋｅｃｋら；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０９，１９８９）（以下、「ＶＥＧＦ」と記載する）。ＶＥＧＦの活性としてはこれまでに、血管内皮細胞に対しては増殖促進活性（ＥＤ５０＝２−３ｐＭ）（Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａら；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１，１９８９）、遊走促進活性（Ａ．Ｅ．Ｋｏｃｈら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，４１４９，１９９４）、メタロプロテアーゼ分泌促進活性（Ｅ．Ｎ．Ｕｎｅｍｏｒｉら；Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５３，５５７，１９９２）、ウロキナーゼ、ｔＰＡ分泌促進活性（Ｍ．Ｓ．Ｐｅｐｐｅｒら；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８１，９０２，１９９１）、転写因子ＥＴＳ−１の発現促進（Ｃ．Ｉｗａｓａｋａら；Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６９，５２２，１９９６）、インテグリンαｖβ３の発現上昇（Ｄ．Ｒ．Ｓｅｎｇｅｒら；Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４９，２９３，１９９６）等が報告され、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては血管新生促進活性（Ｔ．Ａｓａｈａｒａら；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９２  ｓｕｐｐｌ  ＩＩ，３６５，１９９５）、血管透過性促進活性（Ｄ．Ｒ．Ｓｅｎｇｅｒら；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９，９８３，１９８３）等が報告されている。ＶＥＧＦは血管内皮細胞に極めて特異性の高い増殖因子であることが報告されている（Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａら；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１，１９８９）。
ヒトＶＥＧＦには、選択的スプライシングにより長さの異なる４種類の蛋白質（それぞれ１２１、１６５、１８９、２０６アミノ酸残基よりなるＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６）が存在することが報告されている（Ｋ．Ａ．Ｈｏｕｃｋら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２６０３１，１９９１）。最も短い長さのＶＥＧＦ１２１についても血管新生促進活性、血管透過性亢進活性が報告されている（Ｓ．Ｋｏｎｄｏら；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１２４３，１９５−２０２，１９９５）。ＶＥＧＦ１６５をプラスミンで分解して得られるＮ末アミノ酸１番目から１１０番目よりなるＶＥＧＦ部分フラグメントはＶＥＧＦ１６５と同等の受容体結合活性を有するが、血管内皮細胞の増殖促進活性が１／１００に低下することが報告されている（Ｂ．Ａ．Ｋｅｙｔら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，７７８８−７７９５，１９９６）。これらの結果は、受容体結合活性には、１番目から１１０番目のアミノ酸が関与するが、内皮細胞の充分な活性化にはさらに１１１番目から１６５番目のアミノ酸が必要であることを示している。
ＶＥＧＦには、ダイマー間のジスルフイド結合形成、蛋白質分子内のジスルフィド結合形成、及び、活性発現に重要な８個のシステイン残基の存在が報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３２８７９−３２８８５，１９９４）。これら８個のシステイン残基は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている（Ｃ．Ｂｅｔｓｈｏｌｄｓら；Ｎａｔｕｒｅ，３２０，６９５−６９９，１９８６）。ＶＥＧＦのアミノ酸残基の改変によりＶＥＧＦ結合阻害剤を作製することが試みられ、ＶＥＧＦのループＩＩの変異体とループＩＩＩの変異体のヘテロダイマーはＶＥＧＦ結合阻害、血管内皮細胞増殖促進阻害活性を示すことが報告されている（Ｇ．Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，４６２５−４６２９，１９９８）。
ヒトのＶＥＧＦ受容体としてはこれまでに受容体型チロシンキナーゼファミリーに属する第１の受容体であるＦｌｔ−１（ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）（Ｍ．Ｓｈｉｂｕｙａら；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５，５１９，１９９０；Ｃ．Ｖｒｉｅｓら；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，９８９，１９９２）及び第２の受容体であるＫＤＲ（ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（Ｂ．Ｉ．Ｔｅｒｍａｎら；ＷＯ９２／１４７４８，Ｂ．Ｉ．Ｔｅｒｍａｎら；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｍｍｕｎ．，１８７，１５７９，１９９２）の２種が報告されている。ヒト型ＶＥＧＦ受容体ＫＤＲのマウス型ホモログはＦｌｋ−１（Ｗ．Ｍａｔｔｈｅｗｓら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９０２６，１９９１；Ａ．Ｕｌｌｉｃｈら；ＷＯ９４／１１４９９；Ｂ．Ｍｉｌｌａｕｅｒら；Ｃｅｌｌ，７２，８３５，１９９３）と命名されている。Ｆｌｔ−１遺伝子はもともと癌遺伝子ｆｍｓと相同性を示す機能未知な新規遺伝子として発見されたが（Ｍ．Ｓｈｉｂｕｙａら；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５，５１９，１９９０）、ＶＥＧＦ蛋白質を用いた発現クローニングによりＶＥＧＦ受容体遺伝子のクローン化が試みられた結果取得された遺伝子と一致し、Ｆｌｔ−１はＶＥＧＦ受容体であることが示された（Ｃ．Ｖｒｉｅｓら；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，９８９，１９９２）。
Ｆｌｔ−１及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の細胞外ドメインは７個のイムノグロブリン様ドメインよりなり、細胞内ドメインはチロシンキナーゼドメインを有する分子量１８０〜２００キロダルトンの膜蛋白質である。ＶＥＧＦは、Ｆｌｔ−１及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１にそれぞれ２０ｐｍｏｌ／ｌ及び７５ｐｍｏｌ／ｌのＫｄ値で特異的に結合する。また、Ｆｌｔ−１及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は血管内皮細胞に特異的に発現していると報告されている（Ｔ．Ｐ．Ｑｕｉｎｎら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７５３３，１９９３；Ｒ．Ｌ．Ｋｅｎｄａｌｌら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８９１５，１９９３）。
血管新生を伴う疾患の中で、固形腫瘍の増殖、転移形成、糖尿病性網膜症及び慢性関節リュウマチの病態形成にＶＥＧＦが深く関与していることが報告されている。固形腫瘍については、これまでに、腎癌（Ａ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，４２３３，１９９４）、乳癌（Ｌ．Ｆ．Ｂｒｏｗｎら；Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２６，８６，１９９５）、脳腫瘍（Ｒ．Ａ．Ｂｅｒｋｍａｎら；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１，１５３，１９９３）、消化器癌（Ｌ．Ｆ．Ｂｒｏｗｎら；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３，４７２７，１９９３）、卵巣癌（Ｔ．Ａ．Ｏｌｓｏｎら；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，２７６，１９９４）などの多くのヒト腫瘍組織においてＶＥＧＦが産生されていることが報告されている。乳癌についてＶＥＧＦと患者の予後との関係が検討された結果、ＶＥＧＦ高発現腫瘍は、低発現腫瘍に比べて腫瘍血管新生が盛んであり、生存率が低いことが明らかとなっている（Ｍ．Ｔｏｉら；Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８５，１０４５，１９９４）。
ＶＥＧＦを認識する抗体は、該抗体を用いた、免疫組織染色による腫瘍組織で発現されるＶＥＧＦの解析（Ｔ．Ｓｈｉｂｕｙａら；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４，１４８３−１４８７，１９９８；Ｙ．Ｋｉｔａｄａｉら；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４，２１９５−２２００，１９９８）、免疫学的検出法であるＥＬＩＳＡ法による腫瘍組織又は血清中のＶＥＧＦ測定（Ｇ．Ｇａｓｐａｒｉｎｉら；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，８９，１３９−１４７，１９９７；Ｓ．Ｋｏｎｄｏら；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１２２１，２１１−２１４，１９９４）等に用いることができるため、組織診断等の診断に重要であると考えられている。
ヌードマウスにヒト腫瘍を皮下移植したゼノグラフトモデル実験系において、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は腫瘍増殖抑制効果を示すことが報告されている（Ｊ．Ｋ．Ｋｉｍら；Ｎａｔｕｒｅ，３６２，８４１，１９９３）。また、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍の転移癌モデルにおいて、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は癌転移を抑制できることが報告されている（Ｏ．Ｍｅｌｎｙｋら；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，９２１，１９９６）。
さらに、ＶＥＧＦをコードするＤＮＡのアンチセンスＤＮＡを用い、ヌードマウス移植腫瘍モデルの腫瘍増殖が抑制できることが報告されている（Ｍ，Ｓａｌｅｈら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，３９３−４０１，１９９６）。従って、ＶＥＧＦ活性を抑制することができれば、癌患者における腫瘍の増殖又は転移形成を抑制できるものと期待される。
ＶＥＧＦは、ヒトの癌性胸水、腹水中に高濃度のＶＥＧＦが検出されることから、胸水、腹水貯留の主要な因子である可能性も示されている（Ｓ．Ｋｏｎｄｏら；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１２２１，２１１，１９９４）。マウスモデルにおいて、抗ＶＥＧＦ抗体によりＶＥＧＦをブロックすることで癌性腹水の貯留を防止できることが示されている（Ｊ，Ｃ，Ｌｕｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８，２５９４−２６００，１９９８．）。
糖尿病性網膜症においては、異常な血管新生により網膜剥離や硝子体出血をおこして失明にいたるが、糖尿病性網膜症における血管新生と患者眼球内のＶＥＧＦレベルが正相関することが報告されている（Ｌ．Ｐ．Ａｉｅｌｌｏら；Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３１，１４８０，１９９４）。また、サルの網膜症モデルにおいて、抗ＶＥＧＦ中和モノクローナル抗体Ａ４．６．１の眼内投与によりＶＥＧＦ活性を抑制すると、血管新生が抑制されることが報告されている（Ａ．Ｐ．Ａｄａｍｉｓら；Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１１４，６６，１９９６）。従って、過剰に産生されるＶＥＧＦ活性を抑制することで糖尿病性網膜症における血管新生を抑制できることが期待される。
慢性関節リュウマチの関節炎の病態の進展（骨、軟骨の破壊）は血管新生を伴うが、慢性関節リュウマチ患者の関節液中にはＶＥＧＦが高濃度で含まれていること、関節中のマクロファージがＶＥＧＦを産生することが報告されている（Ａ．Ｅ．Ｋｏｃｈら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，４１４９，１９９４；Ｒ．Ａ．Ｆａｖａら；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０，３４１，１９９４）。過剰に産生されるＶＥＧＦ活性を抑制することで関節炎における血管新生を抑制できることが期待される。
また、糖尿病性網膜症と同様に異常な血管新生を伴う眼疾患である未熟児網膜症（Ｋ．Ｌａｓｈｋａｒｉら；Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５６，１３３７−１３４４）、加齢黄斑変性症（浅山展也ら；日本眼科学会雑誌，１０４，３９０−３９５，２０００）、血管新生緑内障（Ｒ．Ｃ．Ｔｒｉｐａｔｈｉら；Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１０５，２３２−２３７，１９９８）において患者の眼のＶＥＧＦレベルの増加が報告されており、ＶＥＧＦ活性を抗体により抑制することで血管新生を抑制できることが期待される。
また、ＶＥＧＦはＣｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群（Ｏ，Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｌａｎｃｅｔ，３４７，７０２，１９９６．）、卵巣過剰刺激症候群（Ｅ，Ｒ，Ｌｅｖｉｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２，１９７８−１９８５，１９９８）、乾せん等の皮下疾患（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０，１１４１−１１４６，１９９４；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，２８０１−２８０７，１９９５）、動脈硬化（Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８，２１０８−２１１６，１９９８）等の疾患の発症、進展に関与することが報告されている。
脳梗塞、急性心筋梗塞、末梢動脈閉塞症などの虚血性疾患においては、側副血行路の発達を促進させることにより、虚血を解除して疾患を治療する血管新生療法が試みられている。ウサギ大腿動脈慢性虚血肢モデルにおいてＶＥＧＦ蛋白質を投与すると、虚血部位に側副血行路が形成され、下肢血圧の上昇や血流量の増加などの治療効果が認められたと報告されている（Ｓ，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３，６６２−６７０，１９９４）。下肢が動脈閉塞した患者に対し、カテーテルを用いたＶＥＧＦのｃＤＮＡの動脈内投与、又は下肢の筋注を行うことにより側副血行路の再建が確認されたと報告されている（Ｉ，Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９７，１１１４，１９９８）。
血管内皮細胞及び血液細胞は、共通の前駆細胞である血管血液幹細胞より別れて分化することが示されている。血管血液幹細胞にはＶＥＧＦ受容体であるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が発現することから、ＶＥＧＦは、血管血液幹細胞から血管内皮前駆細胞及び血液前駆細胞への分化に必須な因子である可能性が指摘されている（Ｓ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２５，１７４７−１７５７，１９９８）。血管血液幹細胞を虚血モデル動物に投与すると、該細胞が虚血部位の血管新生に利用されることが報告されている（Ｔ．Ａｓａｈａｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，９６４−９６７，１９９７）。
ＶＥＧＦは血管内皮細胞に極めて高い特異性を示すが、一部の血球細胞、骨芽細胞、膵臓β細胞に対する作用も報告されている。ヒト単球細胞にはＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ−１が発現しており、ＶＥＧＦは単球の遊走促進活性を有することが報告されている（Ｂ，Ｂａｒｌｅｏｎら、Ｂｌｏｏｄ，８７，３３３６−３３４３，１９９６）。抗原提示細胞として重要なヒト樹状細胞にはＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ−１が発現しており、ＶＥＧＦは樹状細胞の成熟化を阻害する活性を有することが報告されている。樹状細胞の活性化は免疫による腫瘍破壊において重要なステップであるので、腫瘍細胞より産生されるＶＥＧＦは、腫瘍免疫抑制により腫瘍増殖を促進していると推測されている（Ｄ，Ｍ，Ｇａｒｂｉｌｏｖｉｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２，１０９６−１１０３，１９９６）。ＶＥＧＦは骨芽細胞に作用し、遊走及び分化を促進することが報告されている（Ｖ，Ｍｉｄｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９，３８０−３８６，１９９４）。また、膵臓のβ細胞にＶＥＧＦ受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が発現しており、ＶＥＧＦがβ細胞の分化に関わっている可能性が示されている（Ｃ．Ｏｂｅｒｇら，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１０，１１５−１２６，１９９４）。
ＶＥＧＦの類縁因子としては、これまでにＰｌＧＦ（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（Ｄ，Ｍａｇｌｉｏｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９２６７−９２７１，１９９１），ＶＥＧＦ−Ｂ（Ｂ，Ｏｌｏｆｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，２５７６−２５８１，１９９６），ＶＥＧＦ−Ｃ（Ｊ．Ｌｅｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，１９８８−１９９２，１９９６），ＶＥＧＦ−Ｄ（Ｍ，Ｇ，Ａｃｈｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５，５４８−５５３，１９９８），ｏｒｆウイルスＮＺ２株およびＮＺ７株のＶＥＧＦホモログ（以下それぞれＮＺ２−ＶＥＧＦおよびＮＺ７−ＶＥＧＦという。Ｄ，Ｊ，Ｌｙｔｔｌｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６８，８４−９２，１９９４），ＰＤＧＦ−Ａ（Ｃ，Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ，３２０，６９５−６９９，１９８６）、ＰＤＧＦ−Ｂ（Ｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３１６，７４８−７５０，１９８５．）が単離されている。
ＰＤＧＦは血小板中に存在し、主として間葉系細胞に対する遊走・増殖刺激活性を有する因子として１９７９年に精製された（Ｈｅｌｄｉｎ．Ｃ．Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７６，３７２２−３７２６，１９７９）。ＰＤＧＦは、Ａ鎖（以下ＰＤＧＦ−Ａという）及びＢ鎖（以下ＰＤＧＦ−Ｂという）と呼ばれる２種類のポリペプチド鎖（各々の分子量は約３万）がジスルフィド結合により二量体化した構造をとり、３種のアイソフォームＰＤＧＦ−ＡＡ，ＡＢ，ＢＢの存在が報告されている。Ａ鎖（Ｂｅｔｓｈｏｔｚｓ，Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３２０，６９５−６９９，１９８６）及びＢ鎖（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３１６，７４８−７５０，１９８５）のｃＤＮＡが単離され、これらの成熟型蛋白質では６０％のアミノ酸相同性があり、構造及び活性の保持に必要な８個のシステイン残基の位置は保存されている（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３２０２３−３２０２６，１９９４）。ＰＤＧＦは、生合成の際、前駆体蛋白質よりＡ鎖はＮ末端部分、Ｂ鎖はＮ末端及びＣ末端部分の切断を受け、成熟型蛋白質となる（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３２０２３−３２０２６，１９９４）。ＰＤＧＦの断片化、アミノ酸残基の改変等によりＰＤＧＦ阻害剤を作製することが試みられ、ＰＤＧＦ−Ｂについては、１１６〜１２１及び１５７〜１６３に対応する１３残基よりなるペプチドが、ＰＤＧＦ−ＢのＰＤＧＦ受容体への結合を阻害する活性を有することが報告されている（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，Ｕ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１６５８１−１６５８７，１９９２）。
ＰＤＧＦは創傷治癒に関係する細胞群、すなわち、血小板のみならず、マクロファージ、平滑筋細胞、内皮細胞、繊維芽細胞などからも分泌されること、また細胞遊走・増殖刺激活性に加え、コラーゲンなどの細胞外マトリクスの産生、リモデリングに働く酵素の産生を促進することから、創傷治癒過程において重要な働きをしていると考えられている（Ｒｏｓｓ，Ｒ．ら，Ｃｅｌｌ，４６，１５５−１６９，１９８６）。ウサギモデルにおいては、ＰＤＧＦ投与により、皮膚の損傷の修復が促進されることが報告されている（Ｐｉｅｒｃｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，３１９−３２６，１９９１）。現在、ＰＤＧＦは、神経性下肢潰瘍、糖尿病性下肢潰瘍等の、創傷治癒が遅延することにより生じる病態の治療薬として注目されている。
動脈硬化病変形成初期では、損傷を受けた動脈の内膜に集まった血小板及びマクロファージなどから分泌されたＰＤＧＦが、中膜平滑筋細胞の内膜側への遊走及び内膜での増殖を惹起し、病変を進展させると考えられている（Ｒｏｓｓ，Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１００９−１０１２，１９９０）。さらに、ＰＤＧＦ抗体投与により、ラット動脈硬化モデルで病態を抑制できたことが報告されている（Ｆｅｒｎｓ  Ｇ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９−１１３２，１９９１）。
糸球体腎炎の発症・進展において、メサンギウム細胞は中心的役割を担っている。ヒトの糸球体腎炎においてＰＤＧＦの発現が上昇していること（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．ら，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１７，２５−３１，１９９７）、ラット腎炎モデルにＰＤＧＦ中和抗体を投与すると治療効果が認められること（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５，１４１３−１４１６，１９９２）が報告されている。
ＰＤＧＦ−Ｂ鎖はサル肉腫ウイルスの癌遺伝子であるｖ−ｓｉｓプロトオンコジーンであることが判明し（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３０４，３５−３９，１９８３）、発ガン研究の面からも注目されている。ＰＤＧＦは２６種の異なるヒト腫瘍由来の１６８種の細胞株がＰＤＧＦを発現していること、及びこれら癌細胞のオートクライン、パラクライン増殖因子である可能性があることが報告されている（Ｐｏｔａｐｏｖａ，Ｏ．ら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，６６，６６９−６７７，１９９６）。
以上のように、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する増殖因子は、固形腫瘍、腫瘍転移等の異常な血管新生の亢進を伴う疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、血管新生緑内障等の異常な血管新生に基づく眼の疾患、慢性関節リュウマチ等の異常な血管新生に基づく関節炎、乾せん等の異常な血管新生を伴う皮膚疾患、腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、卵巣過剰刺激症候群等の異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、動脈硬化等の平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、糸球体腎炎等の腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、貧血等の血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨芽細胞の異常に基づく疾患、糖尿病等の膵臓β細胞の異常に基づく疾患、脳梗塞、急性心筋梗塞、末梢動脈閉塞症等の虚血性疾患、神経性下肢潰瘍、糖尿病性下肢潰瘍等の創傷治癒の遅延を伴う疾患に関与することが示されている。また、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する増殖因子の活性を阻害できる抗体、アンチセンスＤＮＡ等の阻害剤は、固形腫瘍や腫瘍転移等の異常な血管新生の亢進を伴う疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、血管新生緑内障等の異常な血管新生に基づく眼の疾患、慢性関節リュウマチ等の異常な血管新生に基づく関節炎、乾せん等の異常な血管新生を伴う皮膚疾患、腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、卵巣過剰刺激症候群等の異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、動脈硬化等の平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、糸球体腎炎等の腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患を治療する活性が示されている。さらに、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する増殖因子は、蛋白質又はそれをコードする遺伝子投与により、脳梗塞、急性心筋梗塞、末梢動脈閉塞症等の虚血性疾患に対する血管新生療法、神経性下肢潰瘍、糖尿病性下肢潰瘍等の疾患に対する創傷治癒促進療法に有効であることが示されている。また、ＶＥＧＦ受容体は、血液幹細胞、骨芽細胞、膵臓β細胞に発現し、それら細胞の増殖分化に関与する可能性が報告されており、貧血等の血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨芽細胞の異常に基づく疾患、糖尿病等の膵臓β細胞の異常に基づく疾患に対する治療薬になる可能性が示唆されている。従って、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子は有用な新薬開発のターゲットとして非常に注目されている。ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する新規な因子が存在する可能性も想起され、これまでにＶＥＧＦ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＧＥＮＥ（ＷＯ９９／３７６７１）及びＶＥＧＦ−Ｅ（ＷＯ９９／４７６７７）が報告されている。このような新規な因子も新薬開発のターゲットとなるであろうが、特に、新規な因子の有する活性を阻害する抗体は、該因子の関与する疾患の診断薬、治療薬等として有用であろう。
発明の開示
本発明の目的は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ様因子（ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ−Ｌｉｋｅ  Ｆａｃｔｏｒ、以下「ＶＰＬＦ」という。）に特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害する抗体を提供し、また、ＶＰＬＦの関与する疾患、例えば、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨芽細胞の異常に基づく疾患、膵臓β細胞の異常に基づく疾患、虚血性疾患及び創傷治癒の遅延を伴う疾患等の、本発明の抗体を用いた治療法又は診断法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害するモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質を特異的に認識し、かつ該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
（２）配列番号１における第２２７アミノ酸〜第３４５アミノ酸に存在するエピトープを認識する（１）記載の抗体。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＮ末から少なくとも２２６番目までのアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
（８）配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
（９）配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質を特異的に認識し、かつ、該蛋白質の有する増殖因子としての活性を阻害する抗体。
（１０）蛋白質の有する増殖因子としての活性が平滑筋細胞に対する増殖促進活性である（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体。
（１１）平滑筋細胞が、ラット由来である（１０）記載の抗体。
（１２）抗体がモノクローナル抗体である、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体。
（１３）モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である（１２）記載のモノクローナル抗体。
（１４）モノクローナル抗体がＩｇＧ１サブクラスである（１２）記載の抗体。
（１５）マウスモノクローナル抗体がＩｇＧ１サブクラスである（１３）記載の抗体。
（１６）ハイブリドーマ細胞株ＫＭ２７６４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９３）により産生されるモノクローナル抗体。
（１７）ハイブリドーマ細胞株ＫＭ２７６７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９４）により産生されるモノクローナル抗体。
（１８）（１２）記載のモノクローナル抗体の部分断片からなる抗体断片。
（１９）（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体又は（１８）記載の抗体断片と、放射性同位元素、蛋白質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。
（２０）（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（２１）ハイブリドーマ細胞株ＫＭ２７６４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９３）である（２０）記載のハイブリドーマ。
（２２）ハイブリドーマ細胞株ＫＭ２７６７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９４）である（２０）記載のハイブリドーマ。
（２３）（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体、（１８）記載の抗体断片又は（１９）記載の抗体の誘導体をコードするＤＮＡ。
（２４）（２３）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（２５）（２４）記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（２６）（２５）記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体、（１８）記載の抗体断片又は（１９）記載の誘導体を生成蓄積させ、該培養物から該抗体、該抗体断片又は該誘導体を採取することを特徴とする、抗体、抗体断片又は誘導体の製造方法。
（２７）（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体、（１８）記載の抗体断片又は（１９）記載の抗体の誘導体を含有する医薬。
（２８）（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体、（１８）記載の抗体断片又は（１９）記載の抗体の誘導体を含有する、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患及び腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の治療薬。
（２９）異常な血管新生の亢進を伴う疾患が固形腫瘍及び腫瘍転移からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく眼の疾患が糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症及び血管新生緑内障からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく関節炎が慢性関節リュウマチであり、異常な血管新生を伴う皮膚疾患が乾せんであり、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患が腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群及び卵巣過剰刺激症候群からなる群より選択され、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患が動脈硬化であり、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患が糸球体腎炎である（２８）記載の治療薬。
（３０）（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体、（１８）記載の抗体断片又は（１９）記載の抗体の誘導体を含有する、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨芽細胞の異常に基づく疾患、膵臓β細胞の異常に基づく疾患、虚血性疾患及び創傷治癒の遅延を伴う疾患からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の診断薬。
（３１）異常な血管新生の亢進を伴う疾患が固形腫瘍及び腫瘍転移からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく眼の疾患が糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症及び血管新生緑内障からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく関節炎が慢性関節リュウマチであり、異常な血管新生を伴う皮膚疾患が乾せんであり、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患が腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群及び卵巣過剰刺激症候群からなる群より選択され、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患が動脈硬化であり、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患が糸球体腎炎であり、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患が貧血であり、骨芽細胞の異常に基づく疾患が骨粗鬆症であり、膵臓β細胞の異常に基づく疾患が糖尿病であり、虚血性疾患が脳梗塞、急性心筋梗塞及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択され、創傷治癒の遅延を伴う疾患が神経性下肢潰瘍及び糖尿病性下肢潰瘍からなる群より選択される（３０）記載の診断薬。
（３２）（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体、（１８）記載の抗体断片又は（１９）記載の抗体の誘導体を用いて以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質を免疫学的に定量する方法：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＮ末から少なくとも２２６番目までのアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｈ）配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｉ）蛋白質の有する増殖因子としての活性が平滑筋細胞に対する増殖促進活性である上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の蛋白質；及び
（ｊ）平滑筋細胞が、ラット由来である上記（ｉ）に記載の蛋白質。
（３３）（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体、（１８）記載の抗体断片又は（１９）記載の抗体の誘導体を用いて以下の（ａ）〜（ｊ）からなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質を免疫学的に検出する方法：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＮ末から少なくとも２２６番目までのアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｈ）配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｉ）蛋白質の有する増殖因子としての活性が平滑筋細胞に対する増殖促進活性である上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載の蛋白質；及び
（ｊ）平滑筋細胞が、ラット由来である上記（ｉ）に記載の蛋白質。
（３４）（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の抗体、（１８）記載の抗体断片又は（１９）記載の抗体の誘導体を用いて、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨芽細胞の異常に基づく疾患、膵臓β細胞の異常に基づく疾患、虚血性疾患及び創傷治癒の遅延を伴う疾患からなる群より選択される少なくとも１種の疾患を検出する方法。
（３５）異常な血管新生の亢進を伴う疾患が固形腫瘍及び腫瘍転移からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく眼の疾患が糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症及び血管新生緑内障からなる群より選択され、異常な血管新生に基づく関節炎が慢性関節リュウマチであり、異常な血管新生を伴う皮膚疾患が乾せんであり、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患が腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群及び卵巣過剰刺激症候群からなる群より選択され、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患が動脈硬化であり、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患が糸球体腎炎であり、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患が貧血であり、骨芽細胞の異常に基づく疾患が骨粗鬆症であり、膵臓β細胞の異常に基づく疾患が糖尿病であり、虚血性疾患が脳梗塞、急性心筋梗塞及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択され、創傷治癒の遅延を伴う疾患が神経性下肢潰瘍及び糖尿病性下肢潰瘍からなる群より選択される（３４）記載の方法。
本発明は、ＶＰＬＦを特異的に認識し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害する抗体に関する。
ＶＰＬＦは、ヒト神経前駆細胞ＮＴ−２及びヒト卵巣癌組織由来ｃＤＮＡライブラリーよりクローニングされたＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する新規増殖因子である。
本発明におけるＶＰＬＦとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ該蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質、並びに配列番号１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を挙げることができる。
本発明におけるＶＰＬＦとしては、さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ上記ＶＰＬＦの有する増殖因子としての活性を有する蛋白質、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含み、かつ上記ＶＰＬＦの有する増殖因子としての活性を有する蛋白質を挙げることができる。上記部分配列としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＮ末端配列が欠失したアミノ酸配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列において２２７番目のフェニルアラニンから３４５番目のグリシンまでのアミノ酸配列を挙げることができる。また、このような蛋白質としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列において２２７番目のフェニルアラニンから３４５番目のグリシンまでのアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に４アミノ酸（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ：配列番号３４）が付加されたアミノ酸配列（配列番号３２）を有する蛋白質、または、２アミノ酸（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）が付加されたアミノ酸配列（配列番号３３）を有する蛋白質を挙げることができる。
本発明におけるＶＰＬＦは、増殖因子としての活性を有することを特徴とする蛋白質である。本発明におけるＶＰＬＦは、血管内皮細胞の増殖促進活性、遊走促進活性、チューブ形成促進活性、プロテアーゼ産生促進活性、血管新生促進活性、血管透過性亢進活性、血管血液幹細胞の分化・増殖促進活性、単球の遊走促進活性、樹状細胞の成熟阻害活性、平滑筋細胞を含む間葉系細胞に対する遊走・増殖促進活性等の増殖因子としての活性を有し、特に好ましくは、平滑筋細胞に対する増殖促進活性を有する。これまでに昆虫細胞発現ＶＰＬＦΔＮ（配列番号１の１〜２２６番目のアミノ酸が欠失したＮ末欠失体）を用いてヒト未分化造血細胞（ＣＤ３４陽性ヒト骨髄細胞；ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）、ヒト皮膚由来微小血管内皮細胞ＨＭＶＥＣ（クラボウ社製）、及びラット由来平滑筋細胞ＲＳＭＣ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２５，１２３，１９９８）に対する増殖促進活性を検討した結果、ＲＳＭＣにおいて濃度依存的な増殖活性を示した。
配列番号１で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ該蛋白質の有する増殖因子としての活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、「モレキュラー・クローニング第２版」という）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」という）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質（以下「配列番号１のＶＰＬＦ」という）をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。また、本発明におけるＶＰＬＦが増殖因子としての機能を有するためには、配列番号１記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する。さらに、このようなアミノ酸の欠失、置換又は付加を導入した場合においても、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されている８個のシステイン残基を含んでいることが好ましい。
配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列を含む蛋白質は、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、こうして作製される蛋白質又はＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質を得ることができる。
本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡは、例えば配列番号１のＶＰＬＦをコードするＤＮＡとして、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられるが、これに限定されない。一般に１つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、配列番号２とは異なる塩基配列を有するＤＮＡであっても、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするものであれば本発明に用いることができる。さらに、本発明におけるＶＰＬＦのアミノ酸配列は、上述のような配列番号１以外のものであってもよいため、それらの蛋白質をコードするＤＮＡも本発明に用いることができる。本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、及び該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを挙げることができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。より具体的には、ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
本明細書において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３８，ｐ．９，１９８４］に従った。
次に示す略号は、特に断わらない限り対応する次のアミノ酸を表す；Ａｌａ：Ｌ−アラニン；Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン；Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン；Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸；Ａｓｘ：Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−アスパラギン；Ｃｙｓ：Ｌ−システイン；Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン；Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸；Ｇｌｘ：Ｌ−グルタミン酸又はＬ−グルタミン；Ｇｌｙ：グリシン；Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン；Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン；Ｌｙｓ：Ｌ−リジン；Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン；Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン；Ｓｅｒ：Ｌ−セリン；Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン；Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン。
また、次に示す略号は、対応する次のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す；Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；ｔＢｕ：ｔ−ブチル；Ｔｒｔ：トリチル；Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル；Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｇ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル−Ｌ−アルギニン；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニルＮγ−トリチル−Ｌ−アスパラギン；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−トリチル−Ｌ−グルタミン；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−０−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−０−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｉｎｄ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−トリプトファン。
さらに、次に示す略号は、対応する次の反応溶媒、反応試薬等を表す；ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート；ＤＩＰＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン。
本明細書に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、好ましくはＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値、アミノ酸配列については、好ましくはＢＬＡＳＴ２〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，７，６４９（１９９７）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。
本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が挙げられ、好ましくはモノクローナル抗体、例えば、ハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体等が挙げられる。
本明細書において「ハイブリドーマ」とは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有するモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下「ＣＤＲ」という。）移植抗体等が挙げられる。
本明細書において「ヒト型キメラ抗体」とは、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（重鎖は「Ｈ鎖」と称し、可変領域は「Ｖ領域」と称するため、以下「ＨＶ」又は「ＶＨ」という。）及び抗体軽鎖可変領域（軽鎖は「Ｌ鎖」と称し、可変領域は「Ｖ領域」と称するため、以下「ＬＶ」又は「ＶＬ」という。）、並びにヒト抗体の重鎖定常領域（重鎖は「Ｈ鎖」と称し、定常領域は「Ｃ領域」と称するため、以下「ＣＨ」という。）及びヒト抗体の軽鎖定常領域（軽鎖は「Ｌ鎖」と称し、定常領域は「Ｃ領域」と称するため、以下「ＣＬ」という。）からなる抗体を意味する。前記ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることにより、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下「ｈＩｇ」という。）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
本明細書において「ヒト型ＣＤＲ移植抗体」とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害するヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を、任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、これらをヒト抗体のＣＨ及びヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入して発現させることにより、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体を取得するためには、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させて不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養することができ、その培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより、Ｆａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として、所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へ変換することもできる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法としては、例えば、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法により、該トランスジェニック動物からヒト抗体産生ハイブリドーマを得、このハイブリドーマを培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させる方法が挙げられる。
抗体断片としては、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ、以下「ｓｃＦｖ」という。）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ、以下「ｄｓＦｖ」という。）、ＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分のアミノ酸とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理することにより得ることができる。あるいは、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。あるいは、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合させることにより、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。あるいは、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することができる。
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下「Ｐ」という。）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬ又はＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明のｓｃＦｖに含まれるＶＨ及びＶＬとしては、本発明のハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
本発明のｓｃＦｖは、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることにより、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものである。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖに含まれるＶＨ及びＶＬとしては、本発明のハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
本発明のｄｓＦｖは、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることにより、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖又はＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることにより、製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体の誘導体は、本発明のハイブリドーマが産生する抗体、ヒト化抗体、若しくはヒト抗体又はそれらの抗体断片に放射性同位元素、蛋白質若しくは低分子の化合物などを結合させた抗体である。
本発明の抗体の誘導体は、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害する抗体又は抗体断片のＨ鎖又はＬ鎖のＮ末端側又はＣ末端側、抗体又は抗体断片中の適当な置換基又は側鎖、さらには抗体又は抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、蛋白質又は低分子の化合物などを化学的手法［抗体工学入門（金光修著  １９９４年  （株）地人書館）］により結合させることにより製造することができる。
あるいは、本発明の抗体の誘導体は、ＶＰＬＦに特異的に反応し、かつＶＰＬＦの有する活性を阻害する抗体又は抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入するという遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
上記放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉ等が挙げられ、例えば、クロラミンＴ法等により、抗体に結合させることができる。
上記低分子の化合物（薬剤）としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミド等のアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセート等の代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ，ダウノルビシン、ドキソルビシン等の抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン等の植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソン等のホルモン剤等の抗癌剤［臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編  １９９６年  癌と化学療法社）］、又はハイドロコーチゾン、プレドニゾン等のステロイド剤、アスピリン、インドメタシン等の非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミン等の免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリン等の免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチン等の抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤［炎症と抗炎症療法  昭和５７年  医歯薬出版株式会社］などが挙げられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等が挙げられる。
上記蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン−２（以下「ｈＩＬ−２」という。）、ヒト顆粒球−マクロファージーコロニー刺激因子（以下「ｈＧＭ−ＣＳＦ」という。）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下「ｈＭ−ＣＳＦ」という。）、ヒトインターロイキン１２（以下「ｈＩＬ−１２」という。）等が挙げられる。また、癌細胞を直接障害するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体は、抗体又は抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させることにより製造することができる。
以下に、本発明を詳細に説明する。
１．本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡの調製
本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡは、ヒト卵巣又は精巣由来のｍＲＮＡを単離し、そのｃＤＮＡライブラリーを作製し、次いで該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして目的のクローンを得ることにより調製することができる。
ヒト卵巣又は精巣ｍＲＮＡは、市販のもの（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、以下のごとくヒト卵巣若しくは卵巣癌組織（以下、「卵巣由来組織」という）又はヒト精巣若しくはヒト胎児精巣由来テラトカルシノーマ（以下、「精巣由来組織」という）から調製してもよい。後者の場合には、まず卵巣由来組織又は精巣由来組織から全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離することができる。
卵巣由来組織又は精巣由来組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）、実験医学、９，１９３７（１９９１）］等が挙げられる。全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを単離する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等が挙げられる。あるいは、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製したヒト卵巣由来組織又は精巣由来組織ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法、又は市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等を用いる方法などが挙げられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等、いずれのものでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等を挙げることができる。
宿主微生物としては、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に属する微生物、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、以下「大腸菌」という。）に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、大腸菌Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、大腸菌Ｙ１０８８［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、大腸菌Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、大腸菌ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、大腸菌Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］及び大腸菌ＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降のスクリーニングに用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、完全長ｃＤＮＡをできるだけ効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［Ｇｅｎｅ，１３８，１７１（１９９４）；Ｇｅｎｅ，２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング、羊土社（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法、羊土社（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下のスクリーニングに用いてもよい。
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、まず該ライブラリーに含まれる全クローンの塩基配列決定を行い、次いでそれぞれの塩基配列を既知の配列と比較することにより行う。上記全クローンの塩基配列決定は、上述のようにして作製したｃＤＮＡライブラリーから各クローンを単離し、それぞれのクローンについてｃＤＮＡの塩基配列を末端から決定することにより行うことができる。ｃＤＮＡライブラリーからの各クローンの単離は、当業者に公知の方法、例えば、単一コロニー単離法（モレキュラー・クローニング第２版）等により行うことができる。また、各クローンの塩基配列決定は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばＳａｎｇｅｒらのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］により、又はＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより行うことができる。
次いで、各クローンの塩基配列を既知の配列と比較する。それぞれのｃＤＮＡの塩基配列が新規な配列かどうかは、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の既存の遺伝子の塩基配列と一致すると考えられるような明らかな相同性を示す塩基配列がないことにより確認できる。このような方法で得られる新規なＤＮＡの塩基配列として、例えば、配列番号２で示される塩基配列が挙げられる。
配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを翻訳して得られるＶＰＬＦのアミノ酸配列（配列番号１）は、ＢＬＡＳＴ２を用いた相同性解析において、ＶＥＧＦファミリーに属するヒトＶＥＧＦ、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ及びヒトＰｌＧＦのアミノ酸配列、並びにＰＤＧＦファミリーに属するヒトＰＤＧＦ−Ａ及びヒトＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸配列と、それぞれ２９％、２９％、２５％、２９％、２６％、３６％及び２８％の相同性を有する。また、同じＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属するＮＺ２−ＶＥＧＦ及びＮＺ７−ＶＥＧＦのアミノ酸配列とも、それぞれ２９％及び３０％の相同性を有する。
ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーにおいては、ダイマー間のジスルフィド結合形成、蛋白質分子内のジスルフィド結合形成、及び活性発現に重要な８個のシステイン残基が存在し（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３２８７９−３２８８５，１９９４）、これら８個のシステイン残基は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されていることが知られている。配列番号１で示されるアミノ酸配列においても、該モチーフを形成するために必須なシステイン残基の位置と数が完全に保存されている。従って、配列番号１のＶＰＬＦがＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する増殖因子としての活性を有することは明白である。
ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する増殖因子は、固形腫瘍、腫瘍転移等の異常な血管新生の亢進を伴う疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、血管新生緑内障等の異常な血管新生に基づく眼の疾患、慢性関節リュウマチ等の異常な血管新生に基づく関節炎、乾せん等の異常な血管新生を伴う皮膚疾患、腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、卵巣過剰刺激症候群等の異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、動脈硬化等の平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、糸球体腎炎等の腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、貧血等の血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨芽細胞の異常に基づく疾患、糖尿病等の膵臓β細胞の異常に基づく疾患、脳梗塞、急性心筋梗塞、末梢動脈閉塞症等の虚血性疾患、神経性下肢潰瘍、糖尿病性下肢潰瘍等の創傷治癒の遅延を伴う疾患に関与することが示されている。ＶＰＬＦの増殖因子の活性を阻害できる抗体は、ＶＰＬＦを検出および定量できるので、固形腫瘍、腫瘍転移等の異常な血管新生の亢進を伴う疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、血管新生緑内障等の異常な血管新生に基づく眼の疾患、慢性関節リュウマチ等の異常な血管新生に基づく関節炎、乾せん等の異常な血管新生を伴う皮膚疾患、腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、卵巣過剰刺激症候群等の異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、動脈硬化等の平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、糸球体腎炎等の腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、貧血等の血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨芽細胞の異常に基づく疾患、糖尿病等の膵臓β細胞の異常に基づく疾患、脳梗塞、急性心筋梗塞、末梢動脈閉塞症等の虚血性疾患、神経性下肢潰瘍、糖尿病性下肢潰瘍等の創傷治癒の遅延を伴う疾患の診断薬となりうる。また、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する増殖因子の活性を阻害できる抗体は、固形腫瘍や腫瘍転移等の異常な血管新生の亢進を伴う疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、血管新生緑内障等の異常な血管新生に基づく眼の疾患、慢性関節リュウマチ等の異常な血管新生に基づく関節炎、乾せん等の異常な血管新生を伴う皮膚疾患、腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、卵巣過剰刺激症候群等の異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、動脈硬化等の平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、糸球体腎炎等の腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患を治療する活性が示されている。従って、ＶＰＬＦの増殖因子の活性を阻害できる抗体は、固形腫瘍や腫瘍転移等の異常な血管新生の亢進を伴う疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、血管新生緑内障等の異常な血管新生に基づく眼の疾患、慢性関節リュウマチ等の異常な血管新生に基づく関節炎、乾せん等の異常な血管新生を伴う皮膚疾患、腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、卵巣過剰刺激症候群等の異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、動脈硬化等の平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、糸球体腎炎等の腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患の治療薬となりうる。
配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡが一旦取得され、その塩基配列が決定された後は、該塩基配列の５’端及び３’端の塩基配列に基づいて設計したプライマーを調製し、ヒト又は非ヒト動物の卵巣、精巣等の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡを取得することができる。
また、配列番号２で示されるＤＮＡの全長又は一部をプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の卵巣、精巣等の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）等を行うことにより、本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡを取得することができる。
あるいは、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ホスホアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡについて、該ＤＮＡを含む組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を用いて蛋白質を発現させることにより、又は該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列とＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰｌＧＦ、ＮＺ２−ＶＥＧＦ若しくはＮＺ７−ＶＥＧＦのアミノ酸配列との相同性を比較することにより、該ＤＮＡが増殖因子としての活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認することができる。
２．本発明におけるＶＰＬＦの製造
本発明におけるＶＰＬＦは、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、これをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
まず、全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際、もし必要であれば、全長ｃＤＮＡをもとにして本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、上記全長ｃＤＮＡの代わりに該ＤＮＡ断片を使用してもよい。次いで、該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明におけるＶＰＬＦを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれをも用いることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自立複製可能又は染色体中への組込が可能で、本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合には、本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。該組換えベクターは、さらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＮ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｐＳｕｐｅｘ等を挙げることができる。
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、目的とする蛋白質の生産率を向上させることができる。さらに、上記組換えベクターにおいては、本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リクエファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・インマリオフィルムＡＴＣＣ１４０６８（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカムＡＴＣＣ１４０６６（Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６）、ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７（Ｂ．ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９（Ｂ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９）、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１３８７０（Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルムＡＴＣＣ１５３５４（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４）、シュードモナスｓｐ．Ｄ−０１１０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０）等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等を挙げることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能を発揮できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等を挙げることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ）等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等を挙げることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等を挙げることができる。    組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等を挙げることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、トリチョプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）の卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等を挙げることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙げることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。
宿主細胞としては、例えば、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等を挙げることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明におけるＶＰＬＦを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明におけるＶＰＬＦを製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン、デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類などを用いることができる。
窒素源としては、該生物が資化し得るものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、該生物が資化し得るものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養又は深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として又は植物の細胞若しくは器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれらの培地にオーキシン、サイトカイニンその他の植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞又は植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ＶＰＬＦを生成蓄積させ、該培養物より該ＶＰＬＦを採取することにより、該ＶＰＬＦを製造することができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
本発明におけるＶＰＬＦの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
本発明におけるＶＰＬＦが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、又は特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ＶＰＬＦを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明におけるＶＰＬＦの活性部位を含む蛋白質のＮ末端側にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明におけるＶＰＬＦを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物又は植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）又は植物個体（トランスジェニック植物）を作製し、これらの個体を用いて本発明におけるＶＰＬＦを製造することもできる。
形質転換体が動物個体又は植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育又は栽培し、該ＶＰＬＦを生成蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該ＶＰＬＦを採取することにより、該ＶＰＬＦを製造することができる。
動物個体を用いて本発明におけるＶＰＬＦを製造する方法としては、例えば、公知の方法［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して作製した動物中に本発明におけるＶＰＬＦを生産する方法が挙げられる。
動物個体を用いる場合には、例えば、本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ＶＰＬＦを採取することにより、該ＶＰＬＦを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等を挙げることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明におけるＶＰＬＦを製造する方法としては、例えば、本発明におけるＶＰＬＦをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該ＶＰＬＦを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ＶＰＬＦを採取することにより、該ＶＰＬＦを生産する方法が挙げられる。
本発明における形質転換体により製造されたＶＰＬＦは、例えば、以下のようにして単離・精製することができる。本発明におけるＶＰＬＦが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ＶＰＬＦが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該蛋白質を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該ＶＰＬＦの精製標品を得ることができる。
本発明におけるＶＰＬＦ又はその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＶＰＬＦ又はその糖修飾体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるＶＰＬＦとして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＶＰＬＦを挙げることができる。
また、本発明におけるＶＰＬＦは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
３．抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
１．に記載した方法でＶＰＬＦをコードするＤＮＡを調製し、２．に記載した方法で該ＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入してリコンビナントＶＰＬＦ蛋白質を得る。あるいはＶＰＬＦを発現しているヒト株化細胞等からＶＰＬＦを精製する。あるいは、ＶＰＬＦ部分配列を有する合成ペプチドを抗原に用いることもできる。
これら抗原は、そのまま投与するか、又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、メチル化牛血清アルブミン（メチル化ＢＳＡ）、牛サイログロブリン（ＴＨＹ）等の分子量の大きいキャリアタンパク質と結合させて投与する。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものを用いてもよい。以下に、マウス及びラットを用いる例を説明する。
３〜２０週令のマウス又はラットに、上記（１）で調製した抗原を免疫し、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内又は腹腔内に、適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバンドとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等が挙げられる。各投与後３〜７日目に、免疫動物の眼底静脈叢又は尾静脈より採血し、抗原として用いたＶＰＬＦに対する反応性を酵素免疫測定法等により確認し［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）］、その血清が十分な抗体価を示したマウス又はラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス又はラットより公知の方法［アンティボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリングハーバー・ラボラトリー（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、以下「アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル」という。］に準じて脾臓を摘出し、後に行う脾細胞と骨髄腫細胞との融合に用いる。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］など、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養及び継代については公知の方法（アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
上記（２）及び（３）で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄した後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁させる。細胞の洗浄にはＭＥＭ培地、ＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）等を用いる。また、融合細胞を懸濁させる培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地｛正常培地［ＲＰＭＩ１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）及び牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地］にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）及びアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／ｌ）を加えた培地｝を用いる。
培養後、培養上清の一部をとり、酵素免疫測定法により、抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。次いで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（５）ハイブリドーマ産生抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体の選択
抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアルに述べられている方法などに従い、以下に述べる測定法により行う。
バインディングＥＬＩＳＡ
抗原又は抗原を発現した細胞などを９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清又は上述の方法（具体的手順については以下の（６）を参照されたい。）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。
第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、第一抗体のイムノグロブリンを認識できる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質、放射性化合物等で標識した抗体である。具体的には、上記（２）の抗体産生細胞作製においてマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスイムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。
反応後、第二抗体の標識の種類に応じた検出反応を行い、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウス又はヌードマウスに、上記（４）で得られた抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０７〜５×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウス又はヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラム、セルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラム等を用いて、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキット又はラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法により、又は２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が挙げられる。
（７）抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体の反応特異性
上記（５）で選択された抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体の反応特異性は、上記（５）に示したバインディングＥＬＩＳＡにより確認する。その際、９６ウェルプレートにコートする抗原として、ＶＰＬＦの他にＶＥＧＦやＰＤＧＦを用いることにより、抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体がＶＰＬＦに特異的な反応性を有するか否かを検討することができる。
（８）抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体のＶＰＬＦ生物活性に対する阻害活性の測定
ＶＰＬＦのラット由来平滑筋細胞ＲＳＭＣに及ぼす増殖促進活性を用いて、抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体がＶＰＬＦ阻害活性を有するか否かを調べることができる。
すなわち、９６ウェル培養プレートにＲＳＭＣを一定の細胞濃度でまき、抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体を加え、さらにＶＰＬＦを添加して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２日間培養する。培養終了後、ＷＳＴ−１反応試薬（ベーリンガーマンハイム社製）等の生細胞数に応じて呈色する試薬を添加し、吸光値を測定することにより生細胞数を定量する。ＶＰＬＦ添加により誘導されたＲＳＭＣの増殖（生細胞数の増加）が抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体により抑制されるか否かを検討することにより、抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体の阻害活性の有無を判断することができる。
４．本発明の抗体を用いてＶＰＬＦを免疫学的に検出する方法
本発明の抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体を用い、抗原抗体反応を行わせることにより、ＶＰＬＦ又はＶＰＬＦを含む組織を免疫学的に検出することができる。該検出法は、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨芽細胞の異常に基づく疾患、膵臓β細胞の異常に基づく疾患、虚血性疾患、創傷治癒の遅延を伴う疾患等、ＶＰＬＦが関与する疾患、例えば、ＶＰＬＦをコードする遺伝子の変異が原因となっている疾患の診断に利用することができる。また、該検出方法は、ＶＰＬＦの定量にも用いられる。
免疫学的に検出する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、酵素免疫測定法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法［単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７年）、続生化学実験講座５  免疫生化学研究法（東京化学同人、１９８６年）］などを用いることができる。
蛍光抗体法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）；単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７）］等に記載された方法を用いて行うことができる。具体的には、分離した細胞又は組織などに、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリンなどの蛍光物質で標識した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）は、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ等の酵素標識、ビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）は、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
免疫細胞染色法及び免疫組織染色法は、抗原又は抗原を発現した細胞などに本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ等の酵素標識、ビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法であり、文献「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）；単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック，１９８７）］等に記載された方法を用いて行うことができる。
ウェスタンブロッティング法は、抗原又は抗原を発現した細胞などをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８］で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜又はニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣ等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ等の酵素標識、ビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体又は結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって確認する方法である。
免疫沈降法とは、抗原又は抗原を発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等のイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、抗原に対する２種類の抗体を用いて抗原濃度を定量するＥＬＩＳＡ法である。該ＥＬＩＳＡ法では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類のモノクローナル抗体を準備し、そのうち、一方のモノクローナル抗体又は抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、他方のモノクローナル抗体又は抗体断片をＦＩＴＣ等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ等の酵素、ビオチンなどで標識しておく。上記の抗体吸着プレートに、生体内から分離された、細胞又はその破砕液、組織又はその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液等を反応させた後、標識したモノクローナル抗体又はその抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知のＶＰＬＦ蛋白賀を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプルの濃度を算出することができる。
診断は以下のようにして行うことができる。複数の健常者の生体から採取した組織、血液、血清、胸水、腹水、眼液等の生体試料について、本発明の抗体若しくはその抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、上記の免疫学的検出方法を用いて、ＶＰＬＦの定量を行い、健常者の生体試料中のＶＰＬＦの発現レベルを調べておく。被験者の生体試料中についても同様にＶＰＬＦの定量を行い、その発現レベルを健常者の発現レベルと比較する。異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患等のＶＰＬＦの発現の増加が見られる疾患では、被験者の発現レベルが健常者と比較して増加している場合に陽性と診断できる。血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨芽細胞の異常に基づく疾患、膵臓β細胞の異常に基づく疾患、虚血性疾患、創傷治療の遅延を伴う疾患等のＶＰＬＦの減少が見られる疾患では、被験者の丸現レベルが健常者と比較して減少している場合に陽性と診断できる。診断に用いる生体試料は、それぞれの疾患について、その疾患に関係する組織又は組織由来の体液等が好ましい。
本発明の抗体若しくはその抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行うための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行うための試薬としては、緩衝剤、塩等が挙げられる。検出用試薬としては、本発明の抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体、または本発明の抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、標識に対応した基質等の通常の免疫学的検出法に用いられる試薬が挙げられる。
５．本発明の抗体を含有する医薬
ＶＰＬＦ、例えば配列番号１のＶＰＬＦはＶＥＧＦと高い相同性を示すが、ＶＥＧＦは固形腫瘍や腫瘍転移等の異常な血管新生の亢進を伴う疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、血管新生緑内障等の異常な血管新生に基づく眼の疾患、慢性関節リュウマチ等の異常な血管新生に基づく関節炎、乾せん等の異常な血管新生を伴う皮膚疾患、腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、卵巣過剰刺激症候群等の異常な血管透過性の亢進を伴う疾患を進展・増悪させることが報告され、ＶＥＧＦ抗体はこれら疾患の治療に有用であることが報告されていることから、本発明の抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体、特に配列番号１のＶＰＬＦに対する抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体は、固形腫瘍や腫瘍転移等の異常な血管新生の亢進を伴う疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、血管新生緑内障等の異常な血管新生に基づく眼の疾患、慢性関節リュウマチ等の異常な血管新生に基づく関節炎、乾せん等の異常な血管新生を伴う皮膚疾患、腹水癌、胸水癌、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、卵巣過剰刺激症候群等の異常な血管透過性の亢進を伴う疾患の治療薬になり得る。
また、ＶＰＬＦ、例えば配列番号１のＶＰＬＦはＰＤＧＦと高い相同性を示すが、ＰＤＧＦは、動脈硬化等の平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、糸球体腎炎等の腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患を進展・増悪させることが報告され、ＰＤＧＦ抗体はこれら疾患の治療に有用であることが報告されていることから、本発明の抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体、特に配列番号１のＶＰＬＦに対する抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体は、動脈硬化等の平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、糸球体腎炎等の腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患の治療薬になり得る。
本発明の抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療薬は、有効成分としての該抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体又はペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体又はペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例及び参考例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例及び参考例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
〔参考例１〕ヒト神経前駆細胞ＮＴ−２及びヒト卵巣癌組織由来ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト胎児精巣由来のテラトカルシノーマ細胞であって、レチノイン酸処理により神経細胞に分化可能なＮＴ−２神経前駆細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入）を用いた。添付マニュアルに従って、ＮＴ−２細胞を培養後、レチノイン酸を添加して、さらに２週間培養した。その培養細胞を集めて、文献モレキュラー・クローニング第２版記載の方法によりｍＲＮＡを抽出した。さらに、オリゴｄＴセルロースでｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを精製した。
同様に、ヒト卵巣癌組織より、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）記載の方法によりｍＲＮＡを抽出した。さらに、オリゴｄＴセルロースでｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを精製した。
それぞれのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡよりオリゴキャップ法［Ｍ．Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１−１７４（１９９４）］によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ  ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：３）及びＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：４）を用いて文献［鈴木・菅野，蛋白質核酸酵素，４１：１９７−２０１（１９９６）、Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉら，Ｇｅｎｅ，２００：１４９−１５６（１９９７）］に記載の方法に従ってＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次いで、５’末端側のセンスプライマー（配列番号：５）と３’末端側のアンチセンスプライマー（配列番号：６）の２種のＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により二本鎖ｃＤＮＡに変換し、ＳｆｉＩで切断した。なお、このＰＣＲは市販のキット：ＧｅｎｅＡｍｐ  ＸＬ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で１分間、５８℃で１分間及び７２℃で１０分間の反応サイクルを１２回繰り返し、その後４℃で保持することにより行った。次いで、ＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４、発現ベクター，３３９２ｂｐ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。これらより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’端と３’端の塩基配列を、ＤＮＡシークエンシング試薬（Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ又はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシークエンシング反応を行った後、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。
〔参考例２〕ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する新規増殖因子の同定
作製したｃＤＮＡライブラリーの各クローンの塩基配列がコードし得る各フレームのアミノ酸配列について、蛋白質アミノ酸配列データベースＳＷＩＳＳＰＲＯＴあるいは塩基配列データーベースＧｅｎＢａｎｋに登録されているＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する既知蛋白質であるヒトＶＥＧＦ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッションナンバー：Ｐ１５６９２）、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッションナンバー：Ｐ４９７６５）、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッションナンバー：Ｐ４９７６７）、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＪ０００１８５）、ヒトＰｌＧＦ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッションナンバー：Ｐ４９７６３）、ヒトＰＤＧＦ−Ａ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッションナンバー：Ｐ０４０８５）及びヒトＰＤＧＦ−Ｂ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッションナンバー：Ｐ０１１２７）の７分子のアミノ酸配列に対する相同性解析を行い、これら分子のアミノ酸配列と相同性をもつアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡクローンを選択し、そのクローンにコードされる蛋白質をＶＰＬＦとした。配列番号１にＶＰＬＦのアミノ酸配列を、配列番号２にその塩基配列をそれぞれ示す。
ＶＰＬＦは、ＢＬＡＳＴ２を用いた相同性解析において、血管内皮増殖因子ファミリーに属する蛋白質ヒトＶＥＧＦ、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ及び血小板由来増殖因子ファミリーに属する蛋白質ヒトＰＤＧＦ−Ａ、ヒトＰＤＧＦ−Ｂと、それぞれＰ値０．００２２で２９％、Ｐ値０．００１４で２９％、Ｐ値０．０００２２で２５％、Ｐ値１．８ｘ１０−７で２９％、Ｐ値０．００１６で３６％、Ｐ値０．０００５９で２８％の有意な相同性を示した。また、同じＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属するＮＺ２−ＶＥＧＦ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッションナンバー：Ｐ５２５８４）及びＮＺ７−ＶＥＧＦ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッションナンバー：Ｐ５２５８５）とも、それぞれＰ値４．７ｘ１０−５で２９％、Ｐ値７．７ｘ１０−７で３０％と有意な相同性を示した。血管内皮増殖因子ファミリーに属する蛋白質ヒトＰｌＧＦとは、Ｐ値０．９４で２６％の相同性を示した。ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーにおいては、ダイマー間のジスルフィド結合形成、蛋白質分子内のジスルフィド結合形成、及び、活性発現に重要な８個のシステイン残基が存在し（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３２８７９−３２８８５，１９９４）、これら８個のシステイン残基は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する因子間で保存されていることが知られている。ＶＰＬＦのアミノ酸配列をアライメントプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０，１９９４）を用いて既知ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリー分子と比較してみると、配列番号１で示されるアミノ酸配列においても該モチーフを形成するために必須なシステイン残基の位置と数が完全に保存されていることが分かった（図１）。従って、ＶＰＬＦがＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属する増殖因子としての活性を有することは明白である。なお、図１中のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰｌＧＦ、ＮＺ２およびＮＺ７は、それぞれヒトＶＥＧＦ、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ、ヒトＰＤＧＦ−Ａ、ヒトＰＤＧＦ−Ｂ、ヒトＰｌＧＦ、ＮＺ２−ＶＥＧＦおよびＮＺ７−ＶＥＧＦを指す。また、ＶＰＬＦとファミリー分子間で保存されている配列を白抜きで示し、すべてのファミリー分子で保存されているシステイン残基に＊印を、その他のアミノ酸残基に＃印を記した。
配列番号２に示した塩基配列をもとに、塩基配列データーベースＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪを、ＢＬＡＳＴ２を用いて検索したところ、同一遺伝子由来のＥＳＴと考えられる塩基配列３個と一致していることが分かった（１９９９年２月５日現在）。これらＥＳＴのＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーは、Ｗ２１４３６、ＡＩ０２４６１７、ＡＡ７５９１３８であり、ＶＰＬＦ塩基配列との関係を図２に示す。これらＥＳＴ塩基配列はＶＰＬＦの完全長をカバーしていない。それぞれのＥＳＴの塩基配列と相同性を示す遺伝子をＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＤＤＢＪの各データーベースよりＢＬＡＳＴ２を用いて検索したが、有意な相同性を示す遺伝子はどのＥＳＴにおいても選択されなかった。従って、ＶＰＬＦは本発明により初めて取得された新規な遺伝子であることが分かった。
ＶＰＬＦをコードするｃＤＮＡ（配列番号２の全塩基配列）を含有するプラスミドＮＴ２ＲＰ４０００３２８を含む大腸菌：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ／ＮＴ２ＲＰ４０００３２８及びその部分配列ｃＤＮＡ（配列番号２のうち、塩基第５７６番〜第１３２８番）を含有するプラスミドＯＶＡＲＣ１００１４０１を含む大腸菌：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ／ＯＶＡＲＣ１００１４０１は、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−６６８６及びＦＥＲＭ  ＢＰ−６６８７として、平成１１年４月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６：郵便番号３０５−８５６６）に寄託されている。
〔参考例３〕ＶＰＬＦの塩基配列の解析
配列番号２に示したＶＰＬＦの塩基配列をもとに、蛋白質の開始コドン予測プログラムＡＴＧＰｒ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１４、３８４−３９０，１９９８）を用いて開始コドン周辺配列を解析した。５’末端側から９４〜９６番目に位置するＡＴＧが開始コドン、１１２９〜１１３１番目に位置するＴＡＧが終止コドンと特定され、ＯＲＦにコードされる蛋白質は３４５アミノ酸から構成されると推定された。さらに、配列番号１に示したＶＰＬＦのアミノ酸配列をもとに、蛋白質の細胞内局在性部位予測プログラムＰＳＯＲＴ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１４，８９７−９１１，１９９２）を用い、分泌蛋白質としての特徴を有するかどうかについて解析を行った。ＶＰＬＦのＮ末端１４残基のアミノ酸配列部分は、分泌蛋白質に見られるシグナルペプチド配列の特徴を有しており、ＶＰＬＦは分泌蛋白質に分類された。また、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ７．３（ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  ＣＯ．，ＬＴＤ製）を用いて疎水性プロットを作製した結果を図３に示す。ＶＰＬＦのＮ末端部分には分泌蛋白質に特徴的な疎水性の高い領域が存在する。
〔参考例４〕ＶＰＬＦを発現している臓器
ＶＰＬＦの塩基配列の一部と一致した３個のＥＳＴ、Ｗ２１４３６、ＡＩ０２４６１７、ＡＡ７５９１３８は、それぞれ肺、精巣、精巣から単離された。また、ＶＰＬＦをコードするｃＤＮＡクローンの３’末端非翻訳領域の塩基配列をもとに、塩基配列データーベースＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪをＢＬＡＳＴ２を用いて検索したところ、同一遺伝子由来のＥＳＴと考えられる塩基配列１６個と一致していることが分かった（１９９９年２月５日現在）。これらＥＳＴのＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーは、ＡＡ６３１１４９、ＡＡ０３９９６５、ＡＡ０３９８８０、ＡＩ１２８９３７、Ｎ８９８０７、ＡＡ６１３０５９、ＡＡ８６８２５２、Ｃ０２０６６、ＡＩ０５１８２４、ＡＡ５９４８８８、Ｎ６６７５３、ＡＩ１９３３３２、ＡＩ２４３１６５、ＡＩ２６２９０８、ＡＩ２８４７９５及びＮ２２０７６であり、ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．４３０８０として登録されている。これら１６個のＥＳＴは、大腸、耳、肺、腎臓、卵巣、甲状腺上皮、前立腺、子宮から単離された。従って、ＶＰＬＦが大腸、耳、肺、腎臓、卵巣、甲状腺上皮、前立腺、精巣、子宮で発現していることが示された。
〔参考例５〕Ｔ−ＰＣＲ法を用いたＶＰＬＦをコードするＤＮＡの発現解析
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入したヒト臓器ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ４μｇ、および癌細胞株からＡＧＰＣ法［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）、実験医学、９，１９３７（１９９１）］にて調製した全ＲＮＡ４μｇを鋳型とし、市販のＳＵＰＥＲ  ＳＣＲＩＰＴ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用い、添付マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。
ヒト臓器ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡとしては、副腎、脳、小脳、脳下垂体、腎臓、膵臓、小腸、骨髄、心臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、子宮由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを用いた（図４において、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５と略した）。
癌細胞株としては、Ｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ−３、Ｍｏｌｔ−４、ＨＵＴ７８；図５において、それぞれ１、２、３、４と略した）、Ｂ細胞株（Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ；図５において、それぞれ５、６、７と略した）、顆粒球／単球系細胞株（ＨＬ−６０、Ｕ−９３７、ＴＨＰ−１；図５において、それぞれ８、９、１０と略した）、血管内皮細胞株（ＩＶＥＣ、ＨＵＶＥＣ；図５において、それぞれ１１、１２と略した）、メラノーマ細胞株（ＷＭ２６６−４、ＷＭ１１５；図５において、それぞれ１３、１４と略した）、神経芽細胞腫細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ；図５において１５と略した）、肺癌細胞株（ＰＣ−９、ＨＬＣ−１、ＱＧ９０；図５において、それぞれ１６、１７、１８と略した）、前立腺癌細胞株（ＰＣ−３；図５において１９と略した）、胃癌細胞株（ＫＡＴＯＩＩＩ；図５において２０と略した）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２；図５において、それぞれ２１、２２と略した）、大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０；図５において、それぞれ２３、２４、２５と略した）を用いた。Ｊｕｒｋａｔ、ＱＧ９０およびＳＷ１１１６は愛知癌センターより入手した。ＨＬＣ−１は大阪大学癌研究所より入手した。ＫＡＴＯ  ＩＩＩおよびＰＣ−９は免疫生物研究所より入手した。ＨＵＶＥＣ（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｅｌｉｃａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）はクラボウ社より入手した。ＩＶＥＣ〔Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５７，４１（１９９３）〕はＮ．Ｔ．Ｌ．ＦＲＡＮＣＥ社より入手した。Ｍｏｌｔ−４、ＤａｕｄｉはＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ〔インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｈｓ．ｇｏ．ｊｐ／〕より入手した。それ以外の細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手した。
次いで、合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。すなわち、下記に示すヒトＶＰＬＦ、ヒトＶＥＧＦ、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ、ヒトＰＤＧＦ−Ａ、ヒトＰＤＧＦ−Ｂ、ヒトＰｌＧＦ、あるいはヒトβアクチンに特異的な塩基配列を含むプライマーを用い、合成したｃＤＮＡを滅菌水を用いて５０倍に希釈した溶液を材料にして常法により反応液［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２，０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰ，０．００１％（ｗ／ｖ）ｇｅｌａｔｉｎ，０．２μｍｏｌ／ｌ遺伝子特異的プライマー，１  ｕｎｉｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）］を調製後、９４℃で３分間反応させ、次いで９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３０あるいは３５サイクル反復し、最後に７２℃で７分間反応させ、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行った。
該ＰＣＲでは、配列番号７及び配列番号８に示したオリゴヌクレオチドをヒトＶＰＬＦに特異的なプライマーとして、配列番号９及び配列番号１０に示したオリゴヌクレオチドをヒトＶＥＧＦに特異的なプライマーとして、配列番号１１及び配列番号１２に示したオリゴヌクレオチドをヒトＶＥＧＦ−Ｂに特異的なプライマーとして、配列番号１３及び配列番号１４に示したオリゴヌクレオチドをヒトＶＥＧＦ−Ｃに特異的なプライマーとして、配列番号１５及び配列番号１６に示したオリゴヌクレオチドをヒトＶＥＧＦ−Ｄに特異的なプライマーとして、配列番号１７及び配列番号１８に示したオリゴヌクレオチドをヒトＰｌＧＦに特異的なプライマーとして、配列番号１９及び配列番号２０に示したオリゴヌクレオチドをヒトＰＤＧＦ−Ａに特異的なプライマーとして、配列番号２１及び配列番号２２に示したオリゴヌクレオチドをヒトＰＤＧＦ−Ｂに特異的なプライマーとして、配列番号２３及び配列番号２４に示したオリゴヌクレオチドをヒトβアクチンに特異的なプライマーとして用いた。
該ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動により分析したところ、それぞれのプライマーに特異的なＤＮＡのバンドが観察され、その大きさは、ヒトＶＰＬＦ、ヒトＶＥＧＦ、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ、ヒトＰＤＧＦ−Ａ、ヒトＰＤＧＦ−Ｂ、ヒトＰｌＧＦ、ヒトβアクチンでそれぞれ、約１，０００ｂｐ、３５０ｂｐ、３００ｂｐ、５２０ｂｐ、５００ｂｐ、４２０ｂｐ、４３０ｂｐ、３６０ｂｐ、８００ｂｐであった。
これらのバンドの濃さを比較することで、各種因子の発現量の半定量的な比較を行った。ヒト臓器より調製したｃＤＮＡを材料にした場合の結果を図４に、癌細胞株から調製したｃＤＮＡを材料にした場合の結果を図５に示した。図４及び図５により、ＶＰＬＦは、正常組織よりも癌化した細胞での発現が高いこと、癌細胞株の中でも上皮系の細胞で強く発現し、血球系での発現は低いことが分かった。
〔参考例６〕昆虫細胞を宿主とした、全長型ＶＰＬＦ及びＶＰＬＦΔＮ（配列番号１の１〜２２６番目のアミノ酸が欠失したＮ末欠失体）の発現
昆虫細胞による組換え蛋白質の生産には目的ＤＮＡを組み込んだ組換えウイルスの作製が必要であるが、その作製には、（１）目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを含む特殊なベクター（トランスファーベクター）を作製する過程、（２）バキュロウイルスＤＮＡとトランスファーベクターとを昆虫細胞にコトランスフェクションし、相同組換えにより組換えウイルスを作製し、さらに増殖させる過程、及び（３）組換えウイルスを細胞に感染させ、目的の蛋白質を発現させる過程が含まれる。具体的には、以下のようにして組換えウイルスを作製し、目的蛋白質を生産した。
（１）トランスファーベクターの作製
（ｉ）  ｐＶＬ−ＶＰＬＦ：ＶＰＬＦの全長（配列番号１の１〜３４５番目のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡを運ぶベクター、ｐＶＬ−ＶＰＬＦを以下のように作製した（図６）。
参考例２に記載のプラスミドＮＴ２ＲＰ４０００３２８（以下「ｐＭＥ−ＶＰＬＦ」という）のＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ断片（０．６６ｋｂ）をベクターｐＥＴ２１ａ（＋）（ノバジェン社製）のＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ部位へ挿入することにより、プラスミドｐＥＴ２１−ＶＰＬＦ（５’）を作製した。本プラスミドをＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩで切断し、０．６８ｋｂの断片（断片Ａ）を調製した。
ｐＭＥ−ＶＰＬＦを鋳型とし、配列番号２５及び配列番号２６に示したＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、０．４ｋｂの断片（断片Ｂ）を調製した。
断片Ａ及び断片Ｂを、昆虫細胞トランスファーベクターｐＶＬ１３９２（ファーミンジェン社製）のＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＶＬ−ＶＰＬＦを作製した。本プラスミドには、ＶＰＬＦの第１番目のＭｅｔから第３４５番目のＧｌｙまでをコードするＤＮＡが含まれていた。
（ｉｉ）  ｐＶＬ−ＶＰＬＦΔＮ：ＶＰＬＦの、Ｃ末端側の部分ペプチド（配列番号１の２２７〜３４５番目のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡを含むベクター、ｐＶＬ−ＶＰＬＦΔＮを以下のように作製した（図７）。
昆虫由来の分泌蛋白質メリチンのシグナルペプチドＤＮＡを運ぶプラスミドｐＭｂａｃ（ストラタジーン社製）をＮｈｅＩで切断した後、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ）で処理し、ＮｏｔＩリンカー（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）を連結させてプラスミドｐＭｂａｃ（ＮｏｔＩ）を作製した。本プラスミドをＮｏｔＩ及びＳｍａＩで切断し、８５ｂｐの断片を調製した（断片Ｃ）。
ｐＭＥ−ＶＰＬＦを鋳型とし、配列番号２６及び配列番号２７に示したＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。増幅した断片をＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、０．３６ｋｂの断片を調製した（断片Ｄ）。
断片Ｃ及び断片Ｄを、ベクターｐＶＬ１３９２のＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＶＬ−ＶＰＬＦΔＮを作製した。本プラスミドには、メリチン由来のシグナルペプチド、メリチン由来のペプチド（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ：配列番号３４）、及びＶＰＬＦの２２７番目のＰｈｅから３４５番目のＧｌｙまでをコードするＤＮＡが含まれていた。
（２）組換えウイルスの作製
ＥＳＦ９２１培地（プロテインエクスプレッション社製）にて培養した昆虫細胞Ｓｆ９（岩城硝子社製）に、線状バキュロウイルスＤＮＡ［バキュロゴールド・バキュロウイルスＤＮＡ；ファーミンジェン社製］及び上記（１）で作製したトランスファーベクターをリポフェクチン法［蛋白質核酸酵素、３７、２７０１（１９９２）］にて導入することによって、組換えバキュロウイルスを作製した。これは、具体的には以下のようにして行った。
４μｇのＰＶＬ−ＶＰＬＦ又はｐＶＬ−ＶＰＬＦΔＮと、１５ｎｇの線状バキュロウイルスＤＮＡとを１２ｍｌの滅菌蒸留水に溶解し、さらに、リポフェクチン６ｍｌと滅菌蒸留水６ｍｌとを混和したものを添加し、室温で１５分間放置した。一方、Ｓｆ９細胞１×１０６個を２ｍｌのＥＳＦ９２１培地に懸濁し、直径５０ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れた。ここに、上記のプラスミドＤＮＡ、線状バキュロウイルスＤＮＡ、及びリポフェクチン混和溶液全量を加え、２７℃で３日間培養後、組換えウイルスを含む培養上清１ｍｌを採取した。シャーレには新たにＥＳＦ９２１倍地１ｍｌを添加し、さらに２７℃で３日間培養して、組換えウイルスを含む培養上清をさらに１．５ｍｌ取得した。
次に、ＶＰＬＦをコードするＤＮＡまたはＶＰＬＦΔＮをコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをそれぞれ、以下の手順で増殖させた。
Ｓｆ９細胞を５×１０５／ｍｌとなるように５０ｍｌのＥＳＦ９２１培地中で、１２５ｍｌ容三角フラスコを用い、２７℃にて１２５ｒｐｍで振とう培養した。細胞が２×１０６／ｍｌにまで増殖した時点で、組換えウイルスをＭＯＩ（感染多重度）＝１０となるように感染させ、さらに３日間培養した。培養液を１１７６０ｍ／ｓ２で１０分間遠心分離して細胞を除去し、蛋白質発現に使用する組換えウイルス溶液を得た。
なお、組換えウイルス溶液の力価は以下に示す方法で測定した。
Ｓｆ９細胞６×１０５個を４ｍｌのＥＳＦ９２１培地に懸濁し、直径５０ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れ、室温で１時間放置して細胞をシャーレに付着させた。上清を除き、ＥＳＦ９２１培地４００ｍｌとＥＳＦ９２１培地で希釈した上記組換えウイルス溶液１００ｍｌを加え、室温で１時間放置した後、培地を除き、５ｍｌの１％低融点アガロース［アガープラーク・アガロース；ファーミンジェン社製］を含む培地［滅菌した、１ｍｌの５％アガープラークプラス・アガロース水溶液と４ｍｌのＴＭＮ−ＦＨインセクトメディウム（ファーミンジェン社製）を混和し、４２℃に保温したもの］を該シャーレに流し込んだ。室温で１５分間放置した後、乾燥を防ぐためにビニルテープをシャーレに巻き、密閉可能なプラスチック製容器に該シャーレを入れ、２７℃で５日間培養した。該シャーレに０．０１％のニュートラルレッドを含むＰＢＳを１ｍｌ加え、さらに１日間培養した後、出現したプラーク数を数えた。その結果、０．５〜２×１０８／ｍｌの組換えウイルス溶液を調製することができた。
（３）蛋白質の発現
Ｈｉｇｈ５細胞（インビトロージェン社製）を５×１０５／ｍｌとなるように１００ｍｌのＥＳＦ９２１培地中で、２５０ｍｌ容三角フラスコを用い、２７℃にて１２５ｒｐｍで振とう培養した。細胞が３〜４×１０６／ｍｌにまで増殖した時点で、３×１０７個になるように、２５ｍｌのＥＳＦ９２１倍地をあらかじめ添加してある底面積１８２ｃｍ２のフラスコに継代した。室温で１時間放置して細胞を付着させた後、培地を除去し、ＶＰＬＦをコードするＤＮＡ又はＶＰＬＦΔＮをコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをＭＯＩ＝５になるように添加し、さらにＥＳＦ９２１培地を添加して１０ｍｌとし、室温で１時間感染させた。ＥＳＦ９２１培地を２０ｍｌ添加し、２７℃で３日間培養し、目的の組換え蛋白質を発現させた。
ＶＰＬＦをコードするＤＮＡまたはＶＰＬＦΔＮをコードするＤＮＡを含む組換えウイルスを感染させた細胞の培養上清それぞれに、ヘパリンセルロファイン樹脂を添加して４℃にて一晩反応させた後、樹脂を回収して２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出させた。培養上清１ｍｌ相当分の溶出液を試料として、参考例１３で得られた抗ＶＰＬＦペプチド抗体（ＫＭ２６７６）を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果、ＶＰＬＦをコードするＤＮＡを感染させた場合には分子量約４０ｋＤａ付近のバンドが、ＶＰＬＦΔＮをコードするＤＮＡを含む組換えウイルスを感染させた場合には分子量約２０ｋＤａ付近のバンドが検出された。
〔参考例７〕ＶＰＬＦΔＮの精製
ＶＰＬＦΔＮを発現させたＨｉｇｈ５細胞の培養上清４００ｍｌに、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で平衡化したヘパリンセルロファイン樹脂（チッソ社製）を４ｍｌ添加し、４℃で１２時間静かに攪拌することによって、蛋白質を樹脂に吸着させた。樹脂をカラムに詰め、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）１０ｍｌで洗浄した後、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）／０．７５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ溶液１０ｍｌで溶出した。２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）／０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ溶液に対して透析した後、７８４００ｍ／ｓ２で５分間遠心分離し、上清を、２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）／０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ溶液で平衡化した、１０ｍｌのＳＰセファロース（ファルマシアバイオテク社製）カラムに通塔した。２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）／０．２ｍｏｌ／ｌＮａＣｌ溶液４０ｍｌで洗浄した後、０．２〜１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌのリニアグラジエント４０ｍｌで溶出させた。さらに、２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）／１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ溶液１０ｍｌで溶出させた。溶出条件は、１ｍｌ／分、２ｍｌ／画分で行った。ＶＰＬＦΔＮが多く含まれる画分を回収し、３ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌになるように２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）／４ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ溶液を添加した。次に、２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）／３ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ溶液で平衡化したブチルセファロース（ファルマシアバイオテク社製）カラム１．５７ｍｌに通塔し、２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）／３ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ溶液１０ｍｌで洗浄した後、３〜０ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌのリニアグラジエント２０ｍｌで溶出させた。溶出条件は、０．２ｍｌ／分、１ｍｌ／画分で行った。ＶＰＬＦΔＮを含む画分を回収し、セントリコン−１０（アミコン社製）を用いて濃縮した。
得られた濃縮液を試料として、５〜２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０を用いたゲル染色によって解析した結果、精製純度は約８５％であった。精製蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を解析した結果、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号３５）及びＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（配列番号３６）であったので、本精製蛋白質は、ＶＰＬＦの２２７番目のＰｈｅから３４５番目のＧｌｙのＮ末端に、メリチン成熟体由来の４アミノ酸（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ：配列番号３４）が付加した蛋白質（配列番号３２）と２アミノ酸（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）が付加した蛋白質（配列番号３３）の混合物であることが明らかとなった。
次に、精製したＶＰＬＦΔＮ２μｇを試料とし、還元条件下及び非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ＶＰＬＦΔＮの移動度の変化を調べた。検出は、クマシーブリリアントブルーＲ２５０での染色によって行った。その結果、還元条件下では分子量約２０ｋＤａに相当する移動度を示していたバンドが、非還元条件下では、移動度が低下し、分子量約３０ｋＤａに相当する位置にバンドが検出された（図８）。したがって、ＶＰＬＦΔＮはＳ−Ｓ結合を介した二量体を形成していることが示唆された。
次にＮ型糖鎖の有無を調べた。０．５％ＳＤＳ及び５０ｍｍｏｌ／ｌ  β−メルカプトエタノールの存在下で、２μｇのＶＰＬＦΔＮを１００℃で５分間処理した後、２．５％になるようにＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（ナカライテスク社製）を添加し、０．３ＵのＮ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（宝酒造社製）を添加して反応させた。３７℃で２０時間反応させた後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色でＶＰＬＦΔＮを検出した。その結果、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆによる処理で分子量が低下したことから、ＶＰＬＦΔＮにはＮ型糖鎖が付加されていることが示された。
〔参考例８〕動物細胞を宿主としたＶＰＬＦの発現
（１）組換えベクターの作製：
（ｉ）  ｐＩＲＥＳ−ＶＰＬＦ：ｐＩＲＥＳｎｅｏ（クロンテック社製）のＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、ｐＶＬ−ＶＰＬＦのＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ（１ｋｂ）断片を挿入し、ｐＩＲＥＳ−ＶＰＬＦを作製した（図９）。
（ｉｉ）  ｐＡＧＥ２４８−ＶＰＬＦ及びｐＡＧＥ２１０−ＶＰＬＦ：ｐＶＬ−ＶＰＬＦのＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ（１ｋｂ）断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩに挿入し、ｐＢＳ−ＶＰＬＦを作製した。ｐＢＳ−ＶＰＬＦをＮｏｔＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗで処理した後、ＢａｍＨＩリンカー（５’−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’）を挿入し、ｐＢＳ−ＶＰＬＦ（Ｂ）を作製した。ｐＢＳ−ＶＰＬＦ（Ｂ）のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ（１ｋｂ）をｐＡＧＥ２１０又はｐＡＧＥ２４８［Ｓａｓａｋｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９．１４７３０−１４７３７（１９９４））のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ部位に挿入し、ｐＡＧＥ２１０−ＶＰＬＦ及びｐＡＧＥ２４８−ＶＰＬＦを作製した（図１０）。
（２）細胞への組換えベクターの導入
（ｉ）ＰＣ−９細胞への導入：
プラスミドｐＩＲＥＳ−ＶＰＬＦ  １μｇを含むＲＰＭＩ１６４０培地（０．２％炭酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−グルタミンを含む）５０ｍｌと、２ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ２０００（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地５０ｍｌとを混合し、室温で２０分間放置した。ＰＣ−９細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２４ウェルプレートに添加した０．５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中へ、３×１０５個の細胞を播種した。本細胞培養液へ上記の混合液を添加し、３７℃で一日培養した。０．３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８及び５％ｄＦＣＳ（ギブコ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、耐性株（以下「ＰＣ−９／ＶＰＬＦ株」という）を取得した。
（ｉｉ）ＣＨＯ（ＤＧ４４株）細胞への導入：
８×１０６細胞／ｍｌになるようにＫ−ＰＢＳ溶液（１０．２ｇ  ＫＣｌ，０．１６ｇ  ＮａＣｌ，１．１５ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，０．８１ｇ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）に懸濁した細胞懸濁液２００ｍｌに、ｐＡＧＥ２４８−ＶＰＬＦ又はｐＡＧＥ２１０−ＶＰＬＦを４μｇ添加し、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ２（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、エレクトロポレーション法（０．３５ｋＶ，２５０ｍＦ）にて組換えベクターを細胞に導入した。組換えベクターを導入した細胞を５％のｄＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＥＸＣＥＬＬ３０２培地（ニチレイ社製）で１日間培養後、０．３ｍｇ／ｍｌになるようにハイグロマイシンを添加し耐性株を選択した。さらに、１００ｎｍｏｌ／ｌ或いは５００ｎｍｏｌ／ｌになるようにメトトレキセート（ＭＴＸ）を添加し耐性株を選択した（以下、ｐＡＧＥ２４８−ＶＰＬＦ、ｐＡＧＥ２１０−ＶＰＬＦを導入して作製した耐性株を、それぞれ「ＤＧ４４／ｐＡＧＥ２４８−ＶＰＬＦ株」、「ＤＧ４４／ｐＡＧＥ２１０−ＶＰＬＦ株」といい、２種類の株を「ＤＧ４４／ＶＰＬＦ株」と総称する）。
（３）発現の確認
上記（２）（ｉ）で作製したＰＣ−９／ＶＰＬＦ株、及び（ｉｉ）で作製したＤＧ４４／ＶＰＬＦ株を、それぞれＲＰＭＩ１６４０培地（０．２％炭酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ及び０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む）及び、ＥＸＣＥＬＬ３０２（５％ＦＣＳ、０．３ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン、及び１００ｎｍｏｌ／ｌ若しくは５００ｎｍｏｌ／ｌ  ＭＴＸを含む）中で、コンフルエントになるまで培養し、培養上清を得た。この培養上清に、それぞれ、ヘパリンセルロファイン樹脂（チッソ社製）を添加して４℃にて一晩反応させた後、樹脂を回収して２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出させた。培養上清１ｍｌ相当分の溶出液を試料として、下記の参考例１３で取得される抗ＶＰＬＦペプチド抗体（ＫＭ２６７６）を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果を図１１に示した。図１１において、ＰＣ−９／ＶＰＬＦ株の培養上清から調製した溶出液を泳動したレーンをＣＭＶ−ＶＰＬＦ、ＤＧ４４／ｐＡＧＥ２４８−ＶＰＬＦ株の培養上清から調製した溶出液を泳動したレーンをＳＶ４０−ＶＰＬＦ、ＤＧ４４／ｐＡＧＥ２１０−ＶＰＬＦ株の培養上清から調製した溶出液を泳動したレーンをＭｏ−ＶＰＬＦとして示した。
ウェスタンブロッティングによる解析の結果、動物細胞で発現させた培養上清中から、分子量約４５ｋＤａ及び約２０ｋＤａの２本のバンドが検出された。約２０ｋＤａのバンドは、昆虫細胞を宿主として発現させたＶＰＬＦΔＮとほぼ同じ移動度を示した。したがって、ＶＰＬＦは動物細胞においてプロセッシングを受けたフォームで発現することが分かった。
〔参考例９〕ＶＰＬＦのヒト未分化造血細胞に及ぼす効果
参考例７で得られたＶＰＬＦΔＮのヒト未分化造血細胞に及ぼす効果を以下のようにして調べた。ヒト未分化造血細胞として、ＣＤ３４陽性ヒト骨髄細胞（ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）を用いた。ＩＭＤＭ倍地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）中に１×１０５個／ｍｌの細胞密度で懸濁したＣＤ３４陽性ヒト骨髄細胞を１００μｌ／ウェルで細胞培養用９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播種し、終濃度５００ｎｇ／ｍｌになるようにＶＰＬＦΔＮ又は幹細胞因子ＳＣＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を加え、５％ＣＯ２条件下、３７℃で４８時間培養した。４８時間後、９．２５ｋＢｑ［６−３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（以下「３Ｈ−ＴｄＲ」と略す）（ＮＥＮ社製）を加え更に１２時間培養し、セルハーベスターを用いてガラスフィルター上に細胞を回収した。回収した細胞内に取り込まれた放射活性を放射線カウンターマトリックス９６（パッカード社製）を用いて測定した。ボランティア二人のＣＤ３４陽性ヒト骨髄細胞ロット番号９Ｆ０３２９（１９歳、アジア人、男性、ＣＤ３４陽性率９６．４％）とロット番号９Ｆ１８０９（２９歳、白人、男性、ＣＤ３４陽性率９６．１％）を用い、独立に上述の実験を繰り返したが、いずれの場合も同じ結果が得られた。ロット番号９Ｆ０３２９を用いた実験の結果を図１２に示した。ＳＣＦのヒトＣＤ３４陽性骨髄細胞に対する増殖促進活性は観察されたが、ＶＰＬＦΔＮの効果としては当該増殖促進活性は観察されなかった。
〔参考例１０〕ＶＰＬＦの平滑筋細胞に及ぼす効果
参考例７で得られたＶＰＬＦΔＮの平滑筋細胞に対する生物活性を、以下のようにして確認した。
９６ウェルコラーゲンコートプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１００μｇ／ｍｌを添加したＭ−１９９培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）に浮遊させたラット由来平滑筋細胞（ＲＳＭＣ）［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２５，１２３，（１９９８）］を３０００個／２００μｌ／ウェルとなるように加え、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１日間培養した。培養後、培養上清を除去し、各ウェルに１００μｌずつＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で３時間培養した。培養後、各ウェルにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈したヒトＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ社製）、ヒトＩＬ−５（Ｒ＆Ｄ社製）、ヒトＰＤＧＦ  ＢＢ（Ｒ＆Ｄ社製）又はＶＰＬＦΔＮをそれぞれ１００μｌ／ウェル（終濃度１６０ｐｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ）添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。培養終了後、各ウェルに１０μｌずつＭＴＴ反応試薬［Ｃｅｌｌ  Ｐｅｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ；ベーリンガーマンハイム社製］を添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で４時間培養した。培養終了後、各ウェルに１００μｌずつ溶解試薬を加えた後、３７℃でインキュベーター中で一晩溶解した。溶解終了後、ＯＤ６５０ｎｍを対象波長としてＯＤ５９０ｎｍにおける各ウェルの吸光値を測定した。
結果を図１３に示す。ヒトＶＰＬＦΔＮは濃度依存的に、ＲＳＭＣに対する増殖促進活性を示した。腸性コントロールのヒトＰＤＧＦ  ＢＢの増殖活性は５０〜１００倍低い濃度でＲＳＭＣに対する増殖促進活性を示した。これに対してヒトＶＥＧＦ１６５およびコントロールとして用いたヒトＩＬ−５はＲＳＭＣに対する増殖活性を示さなかった。
〔参考例１１〕ＶＰＬＦの内皮細胞に及ぼす効果
参考例７で得られたＶＰＬＦΔＮの内皮細胞に対する生物活性を、以下のようにして確認した。
９６ウェルコラーゲンコートマイクロタイタープレート（ＩＷＡＫＩ社製）に、Ｅ−ＢＭ培地に２％牛胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト組換え型上皮成長因子（ｒＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍｌ、ハイドロコーチゾン１μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ、アンファテリシンＢ  ５０ｎｇ／ｍｌを添加した培地（クラボウ社製）に浮遊させたヒト皮膚由来微小血管内皮細胞ＨＭＶＥＣ（クラボウ社製）を３０００個／１００μｌ／ウェルになるように加えた。次に、上記培地で希釈したヒトＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ社製）、ヒトＩＬ−５（Ｒ＆Ｄ社製）、ヒトＰＤＧＦ  ＢＢ（Ｒ＆Ｄ社製）又はＶＰＬＦΔＮをそれぞれ１００μｌ／ウェル（終濃度１０ｐｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ）添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で５日間培養した。培養終了後、各ウェルに２０μｌの細胞発色用試薬［Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ；同仁化学社製］を加え、３７℃で１〜２時間培養した。培養終了後、ＯＤ４５０ｎｍを対象波長としてＯＤ６５０ｎｍにおける各ウェルの吸光値を測定した。
結果を図１４に示す。ヒトＶＥＧＦ１６５は濃度依存的にＨＭＶＥＣに対する増殖活性を示したが、ヒトＶＰＬＦΔＮ、ヒトＰＤＧＦ  ＢＢは増殖活性を示さなかった。また、コントロールとして使用したヒトＩＬ−５は増殖活性を示さなかった。
〔参考例１２〕ＶＰＬＦ抗体作製用の抗原の調製
ＶＰＬＦの蛋白配列を解析し、親水性の高い部分、Ｎ末端、Ｃ末端、二次構造上ターン構造、ランダムコイル構造を有する部分の中から、抗原として適当と考えられる部分配列として、化合物１〜４（配列番号２８〜３１）を選択した。
以下の参考例において、化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。質量分析は、日本電子ＪＭＳ−ＨＸ１１０Ａを用いるＦＡＢ−ＭＳ法により行った。アミノ酸分析は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ａ．）らの方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｌｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２２２，１９（１９９４）］により行った。加水分解は塩酸蒸気中１１０℃で２０時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ・アキュ・タグ（Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ−Ｔａｇ）アミノ酸分析計（ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて分析した。
（１）化合物１（配列番号２８）（Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）の合成
１６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−ＮＨが結合した担体樹脂［Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ｒｅｓｉｎ樹脂；ノバビオケム社製］３０ｍｇを自動合成機（島津製作所製）の反応容器に入れ、８５８μｌのＤＭＦを加えて１分間攪拌して溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従って次の操作を行った。
（ａ）３０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液７３４μｌを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｂ）担体樹脂を５００μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
（ｃ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１６５μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１６５μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ１水和物（１６５μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３３０μｍｏｌ）をＤＭＦ（８５８μｌ）中で３分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を３０分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｄ）担体樹脂を８５８μｌのＤＭＦで１分間洗浄後、溶液を排出し、これを５回繰り返した。
こうして、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮＨが担体上に合成された。
次に、（ａ）及び（ｂ）の工程の後、（ｃ）の工程でＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｄ）の洗浄工程を経て、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＮＨが担体上に合成された。
以下、工程（ｃ）において、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）の工程を繰り返した。その後、（ａ）及び（ｂ）の脱保護、洗浄工程を経て、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下で１２時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨの縮合時には、８５８μＬのＤＭＦの代わりに１９８ｕＬのＮＭＰと６６０μＬのＤＭＦの混合溶媒を用いた。これに、ＴＦＡ（９０％）、チオアニソール（５％）、および１，２−エタンジチオール（５％）からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で２時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約１０ｍｌを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして３７．９ｍｇを取得した。この粗生成物を、１ｍｌの９０％酢酸、４ｍｌのＤＭＦ、１ｍｌのトリフルオロエタノールに溶解した上清を逆相カラム（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ３０ｍｍｌ．Ｄ．Ｘ  ２５ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。０．１％ＴＦＡ水溶液に、ＴＦＡ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、化合物１を含む画分を得た。さらに粗ペプチド溶解時の沈殿に３０ｍｇのジチオスレイトールと１ｍｌの８ｍｏｌ／ｌ尿素を加えて溶解し、３ｍｌの２ｍｏｌ／ｌ酢酸で希釈して、上記と同様に逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物１を含む画分を得た。これらの画分を凍結乾燥して、化合物１を８．６ｍｇ得た。
質量分析［ＦＡＢＭＳ］：ｍ／ｚ＝２４３４．０（Ｍ＋Ｈ＋）；
アミノ酸分析：Ａｓｘ３．１（３），Ｓｅｒ４．６（５），Ｇｌｘ５．１（５），Ｇｌｙ１．１（１），Ｔｈｒ０．９（１），Ａｌａ１．０（１），Ｃｙｓ１．３（１），Ｌｙｓ２．０（２），Ｌｅｕ１．０（１），Ｐｈｅ２．０（２）
（２）化合物２（配列番号２９）（Ｈ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）の合成
１６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−ＮＨが結合した担体樹脂［Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂、ノバビオケム社製］３０ｍｇを出発物質として、上記（１）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ））−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに５ｍｇ／ｍＬの濃度で２−メチルインドールを含むＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、エチルメチルスルフィド（３％）、１，２−エタンジチオール（２．５％）およびチオフェノール（２％）からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で６時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。上記（１）と同様にして、粗ペプチド４１．４ｍｇを取得し、酢酸水溶液に溶解後、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物２を７．１ｍｇ得た。質量分析［ＦＡＢＭＳ］：ｍ／ｚ＝２０５１．２（Ｍ＋Ｈ＋）；
アミノ酸分析：Ａｓｘ１．１（１），Ｓｅｒ１．０（１），Ｇｌｘ２．１（２），Ｇｌｙ１．３（１），Ａｒｇ１．５（２），Ｔｈｒ１．９（２），Ｐｒｏ１．１（１），Ｃｙｓ１．２（１），Ｌｙｓ１．０（１），Ｉｌｅ１．８（２），Ｌｅｕ１．１（１），Ｐｈｅ０．９（１）（Ｔｒｐは分析せず）
（３）化合物３（配列番号３０）（Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）の合成
１６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−ＮＨが結合した担体樹脂［Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂、ノバビオケム社製］３０ｍｇを出発物質として、上記（１）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去し、３１μｌの無水酢酸を含む５００μｌのＤＭＦを加えて３０分間攪拌した。溶液を排出後、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これにＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、エチルメチルスルフィド（３％）、１，２−エタンジチオール（２．５％）およびチオフェノール（２％）からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で８時間放置し、側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行った。上記（１）と同様にして粗ペプチド４０．７ｍｇを取得し、酢酸水溶液に溶解後、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物３を１８．３ｍｇ得た。
質量分析［ＦＡＢＭＳ］：ｍ／ｚ＝２０７１．６（Ｍ＋Ｈ＋）；
アミノ酸分析：Ａｓｘ４．０（４），Ｇｌｘ３．１（３），Ｇｌｙ１．０（１），Ａｒｇ０．９（１），Ｔｈｒ１．０（１），Ｐｒｏ１．０（１），Ｃｙｓ１．３（１），Ｌｙｓ１．０（１），Ｉｌｅ０．９（１），Ｌｅｕ１．０（１），Ｐｈｅ２．０（２）
（４）化合物４（配列番号３１）（Ｈ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ）の合成
２４．０μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｇｌｙが結合した担体樹脂［Ｗａｎｇ樹脂、ノバビオケム社製］３０ｍｇを出発物質として、上記（１）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去し、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これにＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、エチルメチルスルフィド（３％）、１，２−エタンジチオール（２．５％）およびチオフェノール（２％）からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で８時間放置し、側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行った。上記（１）と同様にして粗ペプチド２１．１ｍｇを取得し、０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解後、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物４を３．６ｍｇ得た。
質量分析［ＦＡＢＭＳ］：ｍ／ｚ＝６３７．２（Ｍ＋Ｈ＋）；
アミノ酸分析：Ｓｅｒ０．９（１），Ｇｌｙ３．１（３），Ａｒｇ０．９（１），Ｔｈｒ０．９（１），Ｃｙｓ１．１（１）
〔参考例１３〕ＶＰＬＦを認識するモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
参考例１２で得られた化合物１〜４は、免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（カルビオケム社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌに調整し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＳ［Ｎ−（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ；ナカライテスク社製］を滴下して３０分撹拌反応させた。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢ２．５ｍｇを０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７．０）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、ＰＢＳで透析したものを免疫原として用いた。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（１）で調製した化合物１〜４のＫＬＨコンジュゲート１００μｇをそれぞれ水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ９９、１９８８）２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに５週令雌ＳＤラット各３匹に投与した。投与２週間後より、各ＫＬＨコンジュゲート１００μｇを１週間に１回、計４回投与した。該ラットの心臓より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（２４５０ｍ／ｓ２、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（３）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイ用の抗原には参考例１２で得られた各化合物をサイログロブリン（以下「ＴＨＹ」という）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は、架橋剤にＭＢＳの代わりにＳＭＣＣ［４−（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ  ｅｓｔｅｒ；シグマ社］を用いる以外は上記（１）と同様に行った。９６ウェルのＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上記のように調製したコンジュゲート（１０μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳを１００ｍｌ／ウェル加え、室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。
放置後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを捨て、該プレートに被免疫ラット抗血清、モノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体を５０ｍｌ／ウェル分注し、２時間放置した。該プレートを０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：スパン２０（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ  ２０相当品：和光純薬社製）］／ＰＢＳ（以下［Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ」という）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリンを５０ｍｌ／ウェル加え、室温で１時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液（２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム、１ｍｍｏｌ／ｌＡＢＴＳ／０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４．２））を添加し、発色させてＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー［Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社］を用いて測定した。
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１［Ｐ３−Ｕ１：ＡＴＣＣより購入］を正常培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（５）ハイブリドーマの作製
上記（２）で得られたラット脾細胞と上記（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（２４５０ｍ／ｓ２、５分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液を１０８個のマウス脾細胞あたり０．５ｍｌ加え、該懸濁液に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。
該懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地にＨＡＴ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ベーリンガーマンハイム社製）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁した。該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００ｍｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。
培養後、培養上清を上記（３）に記載した酵素免疫測定法で調べ、抗原ペプチドに反応してコントロールペプチドに反応しないウェルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。その結果、化合物２を抗原に用いて抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体ＫＭ２６７６を取得した。
図１５に示すように、ＫＭ２６７６は化合物２に特異的な反応性を示した（図１５において、化合物２をコートしたウェルをＶＰＬＦ２ペプチドとして示した）。
なお、抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体ＫＭ２６７６を産生するハイブリドーマＫＭ２６７６は、平成１２年４月１８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６：郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７１３７として寄託されている。
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に上記（５）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）した。
該腹水を遠心分離（１１７６０ｍ／ｓ２、５分間）し、固形分を除去した。精製ＩｇＧモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ２ｂと決定された。
〔参考例１４〕抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体を用いたヒトＶＰＬＦの検出（ウェスタンブロッティング）
参考例７で得られたＶＰＬＦΔＮを１００ｎｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％グラジエントゲル、アトー社製）（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）にて分画した後、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティングした。
該膜を１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング後、該膜に抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体ＫＭ２６７６の培養上清を原液で添加し、室温で２時間放置した。該膜をＴｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体として１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を添加し、室温で１時間放置した。
該膜をＴｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、ＥＣＬｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて検出した（図１６）。
図１６に示すように、抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体ＫＭ２６７６は、ヒトＶＰＬＦ（Ｎ末欠失体）の分子量に相当する２０ｋＤａ付近のバンドに特異的に反応した。
〔実施例１〕ヒトＶＰＬＦを認識し、その生物活性を阻害するモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
参考例７で得られた昆虫細胞発現ＶＰＬＦΔＮ蛋白質（以下「ＶＰＬＦΔＮ」という。）は、免疫原性を高める目的で以下の方法でキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；カルビオケム社）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。０．１ｍｏｌ／ｌ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ＰＨ７）−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ溶液８００μｌにＶＰＬＦΔＮ  １２０μｇを溶解した。該ＮＰＬＦ溶液にＫＬＨを３０μｇ加え、さらに１％グルタールアルデヒドを５μｌ加えて室温で５時間攪拌した。得られた溶液をＰＢＳで透析したものを免疫原として用いた。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（１）で調製したＶＰＬＦΔＮのＫＬＨコンジュゲート３０μｇを水酸化アルミニウムアジュバント〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ９９、１９８８〕２ｍｇ及び百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに６週令雌Ｂａｌｂ／ｃマウス各３匹に投与した。投与２週間後より、ＫＬＨコンジュゲート３０μｇを１週間に１回、計３回投与した。該マウスの眼底静脈より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（２４５０ｍ／ｓ２、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（３）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイ用の抗原には参考例２で得られたＶＰＬＦΔＮを用いた。コントロール抗原蛋白質としてはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞の培養上清のヘパリンカラム結合蛋白質を用いた。９６ウェルのＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上記の抗原蛋白質を２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを１００ｍｌ／ウェル加え、室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。
放置後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを捨て、該プレートに被免疫マウス抗血清、モノクローナル抗体の培養上清若しくは精製モノクローナル抗体を５０ｍｌ／ウェル分注し、２時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリンを５０ｍｌ／ウェル加えて、室温で１時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＡＢＴＳ／０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４．２）〕を添加し、発色させてＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１：ＡＴＣＣより購入）を正常培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（５）ハイブリドーマの作製
上記（２）で得られたマウス脾細胞と上記（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（２４５０ｍ／ｓ２、５分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌ及びジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液を１０８個のマウス脾細胞あたり０．５ｍｌ加え、該懸濁液に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。
該懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＴＩ１６４０培地にＨＡＴ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ベーリンガーマンハイム社製）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁した。該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００ｍｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。
培養後、培養上清を上記（３）に記載した酵素免疫測定法で調べ、ＶＰＬＦ△Ｎに反応してコントロール抗原蛋白質に反応しないウェルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。その結果、ハイブリドーマＫＭ２７６４〜２７７２を取得した。
図１７に示すように、これらはＶＰＬＦΔＮに特異的な反応性を示した。
なお、抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体ＫＭ２７６４及びＫＭ２７６７を産生するハイブリドーマ細胞株ＫＭ２７６４及びＫＭ２７６７は、平成１２年９月７日付で、ブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９３及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７２９４として寄託されている。
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に上記（５）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）した。
該腹水を遠心分離（１１７６０ｍ／ｓ２、５分間）し、固形分を除去した。精製ＩｇＧモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕により精製することによって取得した。モノクローナル抗体のサブクラスは、サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法により、表１のように決定された。
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〔実施例２〕抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体の反応特異性の検討
抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体の反応特異性を実施例１（３）に示したバインディングＥＬＩＳＡ法により検討した。抗原には実施例１（３）で用いたΔＮ−ＶＰＬＦの他、昆虫細胞発現ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ  ＡＡ（Ｒ＆Ｄ社製）、ＰＤＧＦＢＢ（Ｒ＆Ｄ社製）、ＰＤＧＦ  ＡＢ（Ｒ＆Ｄ社製）を用いた。結果を図１８に示す。
図１８によれば、ＫＭ２７６４〜２７７０はいずれもＶＥＧＦには交叉反応を示さなかったが、ＫＭ２７６５、ＫＭ２７６８及びＫＭ２７７０はＰＤＧＦに交叉反応を示した。ＫＭ２７６４、ＫＭ２７６６、ＫＭ２７６７及びＫＭ２７６９はＶＰＬＦに特異的な反応性を示した。また、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体はＶＥＧＦに反応した他、ＶＰＬＦとＰＤＧＦに交叉反応を示し、ウサギ抗ＰＤＧＦポリクローナル抗体（ジェンザイム社製）はＰＤＧＦに反応した他、わずかにＶＥＧＦにも交叉反応を示した。
〔実施例３〕抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体を用いたヒトＶＰＬＦの生物活性の阻害
参考例１０に記したＶＰＬＦのラット由来平滑筋細胞ＲＳＭＣに及ぼす増殖促進活性に対して抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体が阻害活性を有するか否かを調べた。
９６ウェルコラーゲンコートプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１００μｇ／ｍｌを添加したＭ−１９９培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）に浮遊させたＲＳＭＣを３０００個／２００μｌ／ウェルとなるように加え、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１日間培養した。培養後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて２回培地交換し、さらに１日間培養した。培地除去後、各ウェルにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈した抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体ＫＭ２７６４〜２７７０（終濃度０．０４μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）、又は可溶性ＰＤＧＦレセプターα若しくはβ（Ｒ＆Ｄ社製；終濃度０．０４μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌ）をそれぞれ５０μｌ／ウェル添加し、３７℃で３０〜６０分間反応させた。コントロール抗体としてＫＭ５１１（抗ＮＤ２８モノクローナル抗体）を同様に反応させた。さらにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈したＶＰＬＦΔＮ（終濃度３００ｎｇ／ｍｌ）又はヒトＰＤＧＦ  ＢＢ（Ｒ＆Ｄ社製；終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェル添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。培養終了後、各ウェルに１０μｌずつＷＳＴ−１反応試薬（ベーリンガーマンハイム社製）を添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で３時間培養した。培養終了後、ＯＤ４５０ｎｍの吸光値を測定した。
図１９に示すように、ＶＰＬＦΔＮのＲＳＭＣに対する増殖促進活性は、コントロール抗体では全く阻害されないのに対し、ＫＭ２７６４とＫＭ２７６７により抗体濃度依存的に阻害された。また、ＫＭ２７６４とＫＭ２７６７はＰＤＧＦＢＢのＲＳＭＣに対する増殖促進活性は全く阻害しないことから、これらの抗体はＶＰＬＦ特異的な阻害活性を有することが示された。
〔実施例４〕抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体を用いたヒトＶＰＬＦの定量
サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＶＰＬＦの定量を検討した。
まず抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体ＫＭ２７６４のビオチン標識体を作製した。ＫＭ２７６４はＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、４分の１容量の０．５ｍｏｌ／ｌ炭酸バッファー（ＰＨ９．２）を加え、さらに１ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルホルムアミドに溶解したＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎ（ピアス社製）を抗体溶液の４分の１容量、攪拌下で添加した。室温で３時間、攪拌下で反応させた後、ＰＢＳで一晩透析してビオチン標識ＫＭ２７６４を得た。
抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体ＫＭ２７６７は９６ウェルのＥＩＡ用プレートに、１０μｇ／ｍｌの濃度で、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００ｍｌ／ウェル加え、室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。
放置後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを捨て、該プレートに１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したＶＰＬＦ△Ｎ及び昆虫細胞発現ＶＥＧＦ１６５（０．４９ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）を５０ｍｌ／ウェル分注し、４℃で一晩放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、上記のように調製したビオチン標識ＫＭ２７６４を１０μｇ／ｍｌの濃度で、５０ｍｌ／ウェル加えて、室温で２時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ−Ａｖｉｄｉｎ（ベクター社製）を５０ｍｌ／ウェル加えて、室温で１時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を添加して発色させ、ＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。    図２０に示すように、ＫＭ２７６７とビオチン標識ＫＭ２７６４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによりＶＰＬＦを特異的に定量することが可能であった。検出限界はおよそ１０ｎｇ／ｍｌであった。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ヒトＶＰＬＦに特異的に反応し、かつその活性を阻害するモノクローナル抗体を作製し、ＶＰＬＦの関与する疾患、すなわち、異常な血管新生の亢進を伴う疾患、異常な血管新生に基づく眼の疾患、異常な血管新生に基づく関節炎、異常な血管新生を伴う皮膚疾患、異常な血管透過性の亢進を伴う疾患、平滑筋細胞の分化増殖異常を伴う疾患、腎メサンギウム細胞の分化増殖異常を伴う疾患、血液幹細胞の分化増殖異常を伴う疾患、骨芽細胞の異常に基づく疾患、膵臓β細胞の異常に基づく疾患、虚血性疾患及び創傷治癒の遅延を伴う疾患の治療薬又は診断薬として利用することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号３：人工的に合成したオリゴキャップリンカー配列
配列番号４：人工的に合成したオリゴ（ｄＴ）プライマー配列
配列番号５〜２７：人工的に合成したプライマー配列
配列番号２８〜３１：人工的に合成したペプチド配列
配列番号３２及び３３：人工的な融合ポリペプチド配列
配列番号３４：市販のプラスミドｐＭｂａｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に含まれる部分配列
配列番号３５：配列番号３２の合成ペプチドのＮ末端配列
配列番号３６：配列番号３３の合成ペプチドのＮ末端配列
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図  ＶＰＬＦとＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーとのアミノ酸配列の比較を示す図である。
第２図  ＶＰＬＦとＥＳＴクローンの関係を示す図である。
第３図  ＶＰＬＦの疎水性プロットを示す図である。
第４図  ＲＴ−ＰＣＲ法による、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属す因子のヒト組織における発現を解析した結果を示す。
第５図  ＲＴ−ＰＣＲ法による、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーに属す因子の癌細胞における発現を解析した結果を示す。
第６図  プラスミドｐＶＬ−ＶＰＬＦの構築の手順を示す。
第７図  プラスミドｐＶＬ−ＶＰＬＦΔＮの構築の手順を示す。
第８図  精製したＶＰＬＦΔＮの還元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す。
第９図  プラスミドｐＩＲＥＳ−ＶＰＬＦの構築の手順を示す。
第１０図  プラスミドｐＡＧＥ２４８−ＶＰＬＦ及びｐＡＧＥ２１０−ＶＰＬＦの構築の手順を示す。
第１１図  動物細胞（ＰＣ−９、ＣＨＯ）を宿主としてＶＰＬＦを発現させた結果を示す。
第１２図  ヒトＣＤ３４陽性細胞に対するＶＰＬＦΔＮの作用を検討した結果を示す。
第１３図  ラット平滑筋細胞ＲＳＭＣに対するＶＰＬＦΔＮ、ＶＥＧＦ１６５、ＰＤＧＦ  ＢＢ、及びＩＬ−５の増殖促進活性を検討した結果を示す。
第１４図  ヒト皮膚由来微小血管内皮細胞ＨＭＶＥＣに対するＶＰＬＦΔＮ、ＶＥＧＦ１６５、ＰＤＧＦ  ＢＢ、及びＩＬ−５の増殖促進活性を検討した結果を示す。
第１５図  抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体ＫＭ２６７６の反応特異性を解析した結果を示す。
第１６図  ウェスタンブロッティングによるヒトＶＰＬＦの検出結果を示す。
第１７図  抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体の反応特異性を示す図である。
第１８図  抗ＶＰＬＦモノクローナル抗体のＶＥＧＦ及びＰＤＧＦに対する交叉反応性を示す図である。
第１９図  抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体によるＶＰＬＦのラット由来平滑筋細胞（ＲＳＭＣ）に対する増殖促進活性の阻害を示す図である。
第２０図  抗ヒトＶＰＬＦモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系によるヒトＶＰＬＦの定量性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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