(57)【要約】ＩＬ−１８阻害剤を有効成分とする新規な代謝性骨疾患治療剤を提供する。本願発明の治療剤は、骨粗鬆症の発症に深く関与する、過剰に発現したＩＬ−１８の作用を抑制することにより治療効果を発揮する。更に、その他の代謝性骨疾患の治療剤としても有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン１８阻害剤を有効成分とする代謝性骨疾患治療剤。
【請求項２】
代謝性骨疾患が骨粗鬆症である請求項１の治療剤。
【請求項３】
インターロイキン１８阻害剤が、インターロイキン１８の前駆体から活性型への変換を阻害する物質である請求項１または請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
インターロイキン１８阻害剤がインターロイキン１β変換酵素阻害剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項５】
インターロイキン１８阻害剤が、インターロイキン１８結合蛋白質である請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【請求項６】
インターロイキン１８阻害剤が、インターロイキン１８に特異的なモノクローナル抗体である請求項１または請求項２に記載の治療剤。
【請求項７】
インターロイキン１８阻害剤が、インターロイキン１８の受容体に特異的なモノクローナル抗体である請求項１または請求項２に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
代謝性骨疾患とは、骨代謝異常に起因する、骨粗鬆症、腎性骨疾患、慢性関節リウマチ等の疾患を意味する。本発明は、インターロイキン１８阻害剤を有効成分とする代謝性骨疾患治療剤に関する。
背景技術
代謝性骨疾患の中でも特に骨粗鬆症は患者数も多く社会的に問題となっている。
骨粗鬆症は骨量（骨に含まれるカルシウムを中心としたミネラルの量）が減少し、かつ骨組織の微細構造が変化し、そのために骨が脆くなり骨折しやすくなった病態と定義される。骨粗鬆症は原発性と続発性に分類される。前者は老化以外に原因が明確でないもので、老人性骨粗鬆症を示す。後者は原因が明確で、その原因を取り除くと改善するものを示す。しかしながら、いずれの骨粗鬆症においてもその発症への分子機序および遺伝的素因は必ずしも明らかになっていない。
骨粗鬆症の治療には、エストロゲン類、活性型ビタミンＤ３誘導体、カルシトニン、ビスホスホネート類、ビタミンＫ、カルシウム類などが用いられるが、その効果は必ずしも満足されるものではなく、新たな治療剤が求められている。
インターロイキン１８（ＩＬ−１８）は、マクロファージの産性するインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）誘導因子として１９９５年に発見された新しいサイトカインである［Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，８８−９１（１９９５）］。ＩＬ−１８は、前駆体（ｐｒｏ  ＩＬ  −１８）として合成された後、インターロイキン１β変換酵素［カスパーゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）］等により切断されて活性型（ｍａｔｕｒｅ  ＩＬ−１８）となる。
マウスＩＬ−１８の前駆体は１９２個のアミノ酸よりなり、その活性型は１５７個のアミノ酸よりなる。また、ヒトＩＬ−１８の前駆体は１９３個のアミノ酸よりなり、その活性型は１５７個のアミノ酸よりなる。本願明細書では、特に明記しない限りＩＬ−１８は活性型を意味する。
ＩＬ−１８の受容体は、ＩＬ−１受容体ファミリーに属し、ＩＬ−１８ＲαとＩＬ−１８Ｒβとが知られている。
ＩＬ−１８は、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）やナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）に作用してＩＦＮ−γの産性を誘導するほか、細胞傷害性Ｔ細胞活性を増強させることにより細胞傷害活性を増強することが知られており、Ｔｈ１応答をもたらす炎症性サイトカインと考えられている。
骨代謝に関連して、骨芽細胞はＩＬ−１８を産生し、破骨細胞の形成を抑制することが報告されて（Ｕｄａｇａｗａら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９７  １８５：１００５−１０１２）おり、ＩＬ−１８そのものを用いる骨粗鬆症治療の可能性が示唆されている。
発明の開示
本発明の目的は、代謝性骨疾患、特に骨粗鬆症の治療に用いられる新規な治療剤を提供することである。
本発明者は、ＩＬ−１８の生体内での役割を明らかにするために、ＩＬ−１８を過剰に産生するトランスジェニックマウス（ＩＬ−１８ＴＧマウス）を作製し、骨に及ぼす影響を検討した。
その結果、遺伝子を導入していないマウスに比較して、ＩＬ−１８ＴＧマウスでは骨粗鬆症の病態が観察され、骨粗鬆症の病態形成にＩＬ−１８が深く係っていることを見い出した。
本発明は、ＩＬ−１８阻害剤を有効成分とする代謝性骨疾患、特に骨粗鬆症治療剤に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられるＩＬ−１８阻害剤としては、過剰に発現したＩＬ−１８の働きを抑える物質であれば特に限定されない。
本発明に用いられるＩＬ−１８阻害剤としては、例えば、ＩＬ−１８前駆体から活性型ＩＬ−１８への変換を阻害する物質が挙げられる。当該物質の具体例としては、システインプロテアーゼの阻害剤を挙げることができる。システインプロテアーゼの阻害剤としてはインターロイキン１β変換酵素阻害剤（カスパーゼ１の阻害剤）が好適に使用できる。
また、本発明に用いられるＩＬ−１８阻害剤としては、ＩＬ−１８結合蛋白質（ＩＬ−１８  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、抗ＩＬ−１８抗体等のＩＬ−１８の活性を中和する物質およびＩＬ−１８受容体へのＩＬ−１８の結合を阻害する物質等が挙げられる。更に、ＩＬ−１８受容体結合後のシグナル伝達の阻害剤等が挙げられる。
本発明に用いられるＩＬ−１８阻害剤としては、特に、ＩＬ−１８受容体へのＩＬ−１８の結合を阻害する物質が好適に使用される。
本発明に用いられるインターロイキン１β変換酵素阻害剤としては、種々の化合物が知られており、具体例として、例えば、公開特許公報平５−２５５２１８号公報に記載のペプチド誘導体、公開特許公報平１１−１４７８７３号公報に記載のスルホンアミド誘導体、公表特許公報平１０−５０４２８５号公報に記載のペプチド誘導体、公開特許公報平１１−１４７８９５号公報に記載のグリシン誘導体および国際出願ＷＯ９７／２４３３９号公報に記載のテトラゾール誘導体等が挙げられる。
ＩＬ−１８結合蛋白質は、文献［Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１０，１２７−１３６（１９９９）］に記載の方法に準じて調製することができる。
ＩＬ−１８に特異的なモノクローナル抗体は、文献［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１７，９７−１０２（１９９８）］に記載の方法に準じて調製することができる。
ＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒα）へのＩＬ−１８の結合を阻害する物質の具体例としては、例えば、ＩＬ−１８受容体蛋白質およびＩＬ−１８の受容体に特異的なモノクローナル抗体等を挙げることができる。
上記ＩＬ−１８の受容体に特異的なモノクローナル抗体は、哺乳動物由来の抗体、キメラ抗体または擬人化抗体のいずれであっても良い。
本発明に用いられるＩＬ−１８受容体蛋白質およびＩＬ−１８の受容体に特異的なモノクローナル抗体は、例えば、特開平１１−１００４００号公報に記載の方法に準じて調製することができる。
本発明の代謝性骨疾患治療剤は、適宜、経口投与用製剤、注射剤または吸入剤等種々の製剤形態で患者に投与することができる。
また、本発明の代謝性骨疾患治療剤は、適宜、エストロゲン類等、骨粗鬆症の治療に用いられる他の薬剤と組み合わせて使用することもできる。更に、本発明に使用されるインターロイキン１β変換酵素阻害剤、ＩＬ−１８結合蛋白質、抗ＩＬ−１８抗体、ＩＬ−１８の受容体に特異的なモノクローナル抗体等を適宜２種以上組み合わせて使用することもできる。
本発明の代謝性骨疾患治療剤の各種製剤は、常法により製造することができる。
例えば、経口投与のための剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤および散剤等があり、これらの製剤は、本発明に用いられるＩＬ−１８阻害剤と、乳糖、コーンスターチ、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、タルク等の通常の医薬品添加物とを適宜混合し、常法により製造される。
注射剤は、常法によって製造することができ、適宜、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビット、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース等の等張化剤、亜硫酸ナトリウム、アルブミン等の安定化剤、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸メチル等の保存剤等を製剤中に添加することができる。
注射剤は、用時溶解用の凍結乾燥製剤とすることもできる。凍結乾燥製剤は、常法によって製造することができ、適宜、上記、等張化剤、安定化剤、保存剤等を製剤中に添加することができる。
吸入剤は、常法によって製造することができ、本発明に用いられるＩＬ−１８阻害剤を生理食塩液に溶解または懸濁させ、適宜、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビット、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース等の等張化剤、亜硫酸ナトリウム、アルブミン等の安定化剤、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸メチル等の保存剤等を添加して調製される。
本発明に用いられるＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８受容体に特異的なモノクローナル抗体である場合には、本発明の代謝性骨疾患治療剤は、通常注射剤もしくは経口剤として用いられる。当該注射剤もしくは吸入剤の製造も常法によって行うことができる。
本発明の代謝性骨疾患治療剤の投与量は、本発明に用いられる阻害剤の種類、投与経路、患者の病態、年齢、体重などによってもそれぞれ異なるが、通常、１日当たり０．１ｍｇから１０００ｍｇであり、これを１度にまたは２〜３回に分けて適宜投与する。
本発明の効果は、次の試験例から明らかである。即ち、ＩＬ−１８ＴＧマウスは野生型マウスに比較して血漿中ＩＬ−１８濃度が有意に高値を示し（試験例１参照）、その大腿骨皮質骨の面積および厚さは低値を示した（試験例２参照）がマウスの体重は両群の間で差がなかった。従って、ＩＬ−１８が直接または間接的に骨量を低下させる作用を有することが示唆され、ＩＬ〜１８阻害剤は代謝性骨疾患、特に骨粗鬆症の治療剤として有用である。
試験例１
ＩＬ−１８遺伝子導入マウスにおける骨粗鬆症の病態形成の確認
（１）試験方法
ＩＬ−１８を過剰に産生するトランスジェニックマウス（ＩＬ−１８ＴＧマウス）を作製し、その骨標本を、遺伝子を導入していないマウスのそれと比較した。
マウスイムノグロブリンκ鎖のＶ−Ｊ２−Ｃ領域のシグナルペプチドおよびマウスのＩＬ−１８を連結させた相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をＩＬ−１８の前駆体のｃＤＮＡを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）で増幅し、作製した。このＤＮＡをｐＣＲ２．１ベクターに組み込み、ＥｃｏＲＩで消化した。このＩＬ−１８およびシグナルペプチドをコードしたＤＮＡ断片をヒトＥμエンハンサーおよびマウスＩｇＶＨプロモーターをコードしたｐＥμＩｇＨベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入し遺伝子導入用プラスミドを完成した。
受精卵に注入する前にプラスミドをＸｂａＩとＳａＩＩで消化し、４．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＣ５７ＢＬ／６マウスの受精卵に注入した。誕生したマウスは４週齢で尾を切断し、ゲノムＤＮＡを抽出した。これを以下に示す３種類のＰＣＲプライマー
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を用いてＰＣＲ法により増幅し、ＩＬ−１８遺伝子導入マウスを確認した。
次いで、当該ＩＬ−１８遺伝子導入マウスと野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配させることにより、ヘミ接合体ＩＬ−１８ＴＧマウスを作製した。その結果、表１に示すように、雄性のヘミ接合体ＩＬ−１８ＴＧマウスでは同腹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに比較して血漿中ＩＬ−１８濃度が有意に高値を示した。
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雄性のヘミ接合体ＩＬ−１８ＴＧマウスおよび同腹の雄性の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１０週齢で犠牲死させ、大腿骨を摘出した。骨は常法に従ってホルマリン固定した後脱灰し、薄切標本を作製した。標本はヘマトキシリンエオジン染色を行ない、骨の形態を観察した。
（２）試験結果
図１及び図２に示すように、野生型マウスと比較して、ヘミ接合体ＩＬ−１８ＴＧマウス骨標本には骨量の減少が観察された。
試験例２
ＩＬ−１８遺伝子導入マウスにおける大腿骨皮質骨の形態計測
（１）試験方法
試験例１の方法に従って作製した雄性のヘミ接合体ＩＬ−１８ＴＧマウスおよび雄性の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜９週齢）より左大腿骨を摘出した。同様の方法にて薄切標本（大腿骨骨幹中央部の垂直輪切り切片；厚さ３μｍ）を作製し，画像解析ソフト（Ｍａｃ  ＳＣＯＰＥ，Ｍｉｔａｎｉ  Ｃｏｒｐ．）を用いて皮質骨の外側周囲長，面積および厚さを計測した。
（２）試験結果
試験結果を表２に示した。
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野生型マウスに対するＩＬ−１８ＴＧマウスのデータについて有意差検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔ）を実施し、結果を＊印又は＊＊印で表した。
＊印  ｐ＜０．０５，      ＊＊印  ｐ＜０．０１，
ＩＬ−１８ＴＧマウスの大腿骨骨幹中央部の皮質骨面積および厚さは野生型マウスに比較して低値を示した。
以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
注射剤：
ヒトＩＬ−１８の受容体に特異的なモノクローナル抗体が溶解しているＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌ）を濾過滅菌した後、１アンプルに５ｍｌずつ分注することにより、ヒトＩＬ−１８の受容体に特異的なモノクローナル抗体を含有する注射剤（５ｍｇ／アンプル）が調製される。
産業上の利用可能性
本発明に係る代謝性骨疾患のうち、骨粗鬆症治療剤は、骨粗鬆症の病態形成に深く関与するＩＬ−１８の過剰な作用発現を抑えることによって治療効果をもたらす。
【図面の簡単な説明】
図１はヘミ接合体ＩＬ−１８ＴＧマウスの大腿骨骨幹中央部皮質骨の写真である。図中の黒線の長さは１００μｍを示す。
図２は上記ＩＬ−１８ＴＧマウスと同腹の野生型マウスの大腿骨骨幹中央部皮質骨の写真である。図中の黒線の長さは１００μｍを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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