(57)【要約】生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質（干渉物質）を共存させることによって、当該発現産物の活性が制御される。干渉物質には、当該発現産物に対する受容体等が用いられる。遺伝子治療によって導入された遺伝子の過剰な発現産物の活性を制御することができる。干渉物質は、その遺伝子を生体内で発現させることによって投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を共存させることによって、当該発現産物の活性を制御する方法。
【請求項２】
発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子を同じ生体内で発現させることによって共存させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子が、ネーキッドＤＮＡからなる発現ベクターによって生体に導入される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
発現ベクターが、エレクトロポレーション法により生体に導入される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
発現産物の活性に干渉する蛋白質が、この発現産物の受容体、この発現産物の活性中和抗体、およびそれらの活性部位を含む蛋白質からなる群から選択される蛋白質である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子が、誘導型のプロモーターの制御下で発現するものである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法によって、遺伝子治療において導入された遺伝子発現産物の活性を制御する方法。
【請求項８】
導入された遺伝子が、血液蛋白質、サイトカイン、およびホルモンから選択されるいずれかの群に属する蛋白質の遺伝子である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
血液蛋白質、サイトカイン、およびホルモンから選択されるいずれかの群に属する蛋白質が、下記の群より選択されたいずれかの蛋白質である請求項８に記載の方法。
エリスロポエチン、　　　　　　　　　顆粒球−コロニー刺激因子、
顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、
ステムセルファクター、　　　　　　　スロンボポエチン、
腫瘍壊死因子α、
トランスフォーミング成長因子β、　　ＣＤ４、
ＣＤ４５、　　　　　　　　　　　　　骨形成因子、
インターフェロン−α、　　　　　　　インターフェロン−γ、
インターロイキン−１、　　　　　　　インターロイキン−２、
インターロイキン−６、　　　　　　　インターロイキン−１１、
インターロイキン−１２、　　　　　　表皮細胞成長因子、
酸性線維芽細胞成長因子、　　　　　　塩基性線維芽細胞成長因子、
線維芽細胞成長因子−Ｉ、　　　　　　血小板由来成長因子、
血管内皮成長因子、　　　　　　　　　神経成長因子、
脳由来神経栄養因子、　　　　　　　　インシュリン様成長因子−Ｉ、
インシュリン様成長因子−ＩＩ、　　　ヒト成長ホルモン、
パラサイロイドホルモン、　　　　　　血管新生阻害因子、
色素上皮由来因子、　　　　　および肝細胞成長因子
【請求項１０】
蛋白質が、エリスロポエチンである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
発現産物の活性に干渉する蛋白質が、可溶化したエリスロポエチン受容体である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
発現物質の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を同じ生体内において発現することができる、当該発現産物の活性を制御するための発現ベクター。
【請求項１４】
発現産物の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の発現ベクターを有効成分として含む、生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための組成物。
【請求項１６】
生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を同じ生体内において発現することができる発現ベクターの、生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための組成物の製造における使用。
【請求項１７】
発現産物の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である、請求項１６に記載の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体に人為的に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための方法に関する。
背景技術
１９９０年に米国で試みられたヒトを対象とする遺伝子治療は、その後、多くの国で幅広く行われるようになってきた。遺伝子レベルで疾患の背景が理解することができるようになると、遺伝子治療を利用して疾患の原因となる遺伝子の発現を制御することにより、多くの疾患の治療が可能となるのではないかと期待されている。現在最も広く行われている遺伝子治療は、遺伝子の異常によって不足している蛋白質の活性を、正常な遺伝子の導入によって補充するタイプのものである。このタイプの遺伝子治療の代表的なものが、ＡＤＡ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ）欠損症に対するＡＤＡ発現ベクターの導入による治療方法である。同様の遺伝子治療に、癌細胞における正常なｐ５３の導入が挙げられる。ｐ５３遺伝子に生じた変異のためにがん化の抑制が不能になった細胞を、正常なｐ５３の作用によって治療しようとする試みである。
初期の遺伝子治療において人為的に導入された遺伝子の発現レベルは、期待される水準よりも低いことが多かった。そのため、遺伝子の導入方法やベクターの改良によって、導入遺伝子をより強力に発現させることが遺伝子治療の新しい研究テーマとして注目されている。ところが、これらの研究の進展により、導入した遺伝子の発現が生理的濃度をはるかに越えて長期的な上昇がみられるといった新しい問題の発生が心配される。人為的に導入された遺伝子の発現機構には、過剰な発現を抑制するフィードバック機構が伴っていない。そのため、強力な発現システムには発現過剰の問題が常に存在する。人為的に導入した遺伝子の発現の持続は、治療に伴う副作用をもたらす恐れがある。
例えば、造血ホルモンの一種であるエリスロポエチン（以下、ＥＰＯと省略する）は、貧血の治療に有効である。しかしＥＰＯが過剰な場合には、逆に多血症を引き起こす原因となってしまう。その他、歩行時疼痛（間歇性破行）、下肢の組織障害を示す閉塞性動脈硬化症、慢性心不全を含む虚血性心疾患や再狭窄等に対して、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を用いた遺伝子治療が試みられている。ＶＥＧＦによる血管新生の遺伝子治療では、過剰のＶＥＧＦは目的部位以外にも多くの血管新生を引き起こしてしまう恐れがある。血管新生の亢進にともない、組織を異常に発達させてしまう可能性や、担癌患者における悪性腫瘍の増大の危険性等が考えられる。したがって、今後の遺伝子治療では、導入遺伝子の発現レベルや発現生成物の活性を制御可能であることが望まれる。
このような導入遺伝子の発現量を制御する方法として、導入するベクターに薬物に反応する制御領域を組み込み、薬物投与により発現を制御する方法が報告されている（Ｙｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８３，８８−９１）。しかしながら、この方法では投与する薬物による副作用等の問題も生じる。そのため、より安全で確実な発現遺伝子の制御方法が必要とされる。
一方、近年、様々なサイトカインが疾患に関与することが明らかとなり、これらサイトカインに対する可溶性キメラ受容体投与や、抗体投与等のａｎｔｉｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙの臨床応用が進み、成果を上げつつある（Ｆｅｌｄｍａｎ　ＡＭ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｆａｉｌｕｒｅ，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｌｏｙ，２０００，３５，５３７−５４４；Ｂｏｅｈｍｅ　ＭＷ　＆　Ｇａｏ　ＩＫ，Ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｄｉｒｅｃｔ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｂａｓｅｄ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｎｔｉｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｉｎ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆｕｒ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｉｅ，１９９９，５８，２５１−１６６；Ｃｈｏｙ　ＥＨ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９８，３７，４８４−４９０）。
例えば、心臓疾患（Ｆｅｌｄｍａｎ　ＡＭ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｆａｉｌｕｒｅ，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｌｏｙ，２０００，３５，５３７−５４４）やリウマチ（Ｏｈｓｈｉｍａ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ　ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｓｏｌｕｂｌｅ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ　ｓｕｂｓｅｔ　ｃｏｕｎｔｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＲＡ）ａｆｔｅｒ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−ＴＮＦ　ａｌｆａ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．，１９９９，１９，３０５−３１３；Ｃｈｏｙ　ＥＨ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９８，３７，４８４−４９０）、クローン病の関与が指摘されているＴＮＦに対して、ＴＮＦ−αのキメラ受容体投与やＴＮＦ−αに対する抗体投与がなされ、臨床においても有効な成績が得られている。また、Ｃｈｒｏｎｉｃ　ｉｎｊｕｒｙでのｆｉｂｒｏｓｉｓへの関与が指摘されているＴＧＦ−βのｔｙｐｅ　ＩＩ受容体の細胞外部分を含むキメラＩｇＧ可溶性受容体の投与では、動物モデルでｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓの抑制効果が得られている（Ｇｅｏｒｇｅ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：　ａ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｎｅｗ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９９，９６，１２７１９−１２７２４）。これらの報告では、疾患の原因であるサイトカインの活性を制御するために、サイトカインの活性に干渉する成分が投与されている。
またアデノウイルスｖｅｃｔｏｒを投与する遺伝子治療の際、ウイルスに対する免疫反応を抑える目的で、抗−ＣＤ４モノクローナル投与が動物で試みられた。その結果、導入遺伝子のｒｅｐｏｒｔｅｒ発現の持続や、ウイルスに対する抗体価の減少、ＩＦＮ−γの上昇の抑制等の効果が得られており（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｆｔｅｒ　ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ　ｈｅａｒｔ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｎｔｉ−ＣＤ−４　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０００，７０，１９１−１９８）、抗−ＣＤ４抗体療法は臓器移植等でも有効な手法であることを示唆している。
さらに、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅの活性化に関与するＣＤ４５に対する抗体投与は、実験的アレルギー脳炎であるＥＡＥの発症を抑制し、Ｔ−ｃｅｌｌの増殖を押さえ、ＴＮＦ−αのみならずＴｈ−１サイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２の産生を有意に抑制することが報告されている（Ｓｃｈｉｆｆｅｎｂａｕｅｒ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｌｌｅｇｉｃ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｂｙ　ａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　ＣＤ４５ＲＢ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１９０，１７３−１８２）。しかし、こういった、標的サイトカインの抗体や可溶性受容体の組み換え型蛋白を投与する方法は、それらに対する抗体が産生され、繰り返し投与では効果が減弱してくるといった問題や、組み換え型蛋白のコストの問題が依然として解決すべき課題として考えられる。
発明の開示
本発明は、生体に人為的に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御する方法の提供を課題とする。
生体に人為的に導入された遺伝子には、本来生体が備えているフィードバック機構が作用しない。そこで本発明者らは、人為的に導入された蛋白質の活性を制御することができる化合物を生体に投与することにより、ある種のフィードバック機構を実現できるのではないかと考えた。
そして本発明者らは、生体に人為的に導入した遺伝子に対して、その発現産物の活性に干渉する物質を生体中で共存させることによって、当該活性を制御することができることを明らかにし本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に述べる生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御する方法、並びにそのためのベクターに関する。
〔１〕生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を共存させることによって、当該発現産物の活性を制御する方法。
〔２〕発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子を同じ生体内で発現させることによって共存させる〔１〕に記載の方法。
〔３〕発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子が、ネーキッドＤＮＡからなる発現ベクターによって生体に導入される〔２〕に記載の方法。
〔４〕発現ベクターが、エレクトロポレーション法により生体に導入される〔３〕に記載の方法。
〔５〕発現産物の活性に干渉する蛋白質が、この発現産物の受容体、この発現産物の活性中和抗体、およびそれらの活性部位を含む蛋白質からなる群から選択される蛋白質である〔１〕に記載の方法。
〔６〕発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子が、誘導型のプロモーターの制御下で発現するものである〔２〕に記載の方法。
〔７〕〔１〕に記載の方法によって、遺伝子治療において導入された遺伝子発現産物の活性を制御する方法。
〔８〕導入された遺伝子が、血液蛋白質、サイトカイン、およびホルモンから選択されるいずれかの群に属する蛋白質の遺伝子である〔７〕に記載の方法。
〔９〕血液蛋白質、サイトカイン、およびホルモンから選択されるいずれかの群に属する蛋白質が、下記の群より選択されたいずれかの蛋白質である〔８〕に記載の方法。
エリスロポエチン　　　　　　　　　　　　顆粒球−コロニー刺激因子
顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子　ステムセルファクター
スロンボポエチン　　　　　　　　　　　　腫瘍壊死因子α
トランスフォーミング成長因子β　　　　　ＣＤ４
ＣＤ４５　　　　　　　　　　　　　　　　骨形成因子
インターフェロン−α　　　　　　　　　　インターフェロン−γ
インターロイキン−１　　　　　　　　　　インターロイキン−２
インターロイキン−６　　　　　　　　　　インターロイキン−１１
インターロイキン−１２　　　　　　　　　表皮細胞成長因子
酸性線維芽細胞成長因子　　　　　　　　　塩基性線維芽細胞成長因子
線維芽細胞成長因子−Ｉ　　　　　　　　　血小板由来成長因子
血管内皮成長因子　　　　　　　　　　　　神経成長因子
脳由来神経栄養因子　　　　　　　　　　　インシュリン様成長因子−Ｉ
インシュリン様成長因子−ＩＩ　　　　　　　　　ヒト成長ホルモン
パラサイロイドホルモン　　　　　　　　　血管新生阻害因子、
色素上皮由来因子、　　　　　　　　　　　および肝細胞成長因子
〔１０〕蛋白質が、エリスロポエチンである〔９〕に記載の方法。
〔１１〕発現産物の活性に干渉する蛋白質が、可溶化したエリスロポエチン受容体である〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕発現物質の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である〔１〕に記載の方法。
〔１３〕生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を同じ生体内において発現することができる、当該発現産物の活性を制御するための発現ベクター。
〔１４〕発現産物の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である〔１３〕に記載の発現ベクター。
〔１５〕〔１３〕に記載の発現ベクターを有効成分として含む、生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための組成物。
〔１６〕生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を同じ生体内において発現することができる発現ベクターの、生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための組成物の製造における使用。
〔１７〕発現産物の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である、〔１６〕に記載の発現ベクターの使用。
本発明において、生体に導入された遺伝子とは、その目的に関わらず、人為的に生体に導入されたあらゆる遺伝子を言う。たとえば、遺伝子治療を目的として人為的に導入された遺伝子は、その代表的なものである。治療以外の目的でも、その生物が本来備えていない形質を導入するために、しばしば外来遺伝子の導入が試みられる。たとえば、動物に有用蛋白質を生産させるために導入される遺伝子なども、本発明における人為的に生体に導入された遺伝子に含まれる。
本発明は、動物の血中に遺伝子産物を発現させることにより、導入した遺伝子の目的を達成するものにおいて、特に有用である。発現産物の過剰発現が局所に限定される場合に比べ、血中に存在する発現産物は全身的な影響を与える。したがって、人為的に生体に導入される遺伝子の中でも、動物において血中に遺伝子発現産物を産生させる場合に、特にその蛋白質の活性の制御が重要になる。本発明において、発現産物の血液への供給を目的として導入される遺伝子として、血液蛋白質、サイトカイン、およびホルモンのいずれかに属する蛋白質をコードする遺伝子を示すことができる。血液蛋白質とは、アルブミン、グロブリン、フェリチン、あるいは各種酵素などの、血液中に含まれる各種の蛋白質を含む用語である。一方、サイトカイン、およびホルモンとしては、より具体的には、たとえば以下の蛋白質の遺伝子を例示することができる。
エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＥＰＯ）
顆粒球−コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；Ｇ−ＣＳＦ）
顆粒球マクロファージーコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）
ステムセルファクター（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ）
スロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）
腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ−α）
トランスフォーミング成長因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＴＧＦ−β）
ＣＤ４
ＣＤ４５
骨形成因子（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）
インターフェロン−α（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α；ＩＦＮ−α）
インターフェロン−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ；ＩＦＮ−γ）
インターロイキン−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ；ＩＬ−１）
インターロイキン−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ；ＩＬ−２）
インターロイキン−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ；ＩＬ−６）
インターロイキン−１１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ；ＩＬ−１１）
インターロイキン−１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ；ＩＬ−１２）
表皮細胞成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）
酸性線維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ａＦＧＦ）
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ）
線維芽細胞成長因子−Ｉ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　Ｉ；ＦＧＦ−Ｉ）
血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）
血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）
脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ）
インシュリン様成長因子−Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ　ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−Ｉ；ＩＧＦ−Ｉ）
インシュリン様成長因子−ＩＩ（ｉｎｓｕｌｉｎ　ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−ＩＩ；ＩＧＦ−ＩＩ）
ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ；ｈＧＨ）
パラサイロイドホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ；ＰＴＨ）
血管新生阻害因子（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）
色素上皮由来因子（ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｃｔｏｒ；ＰＥＤＦ）
肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）
本発明において、前記遺伝子発現産物の活性に干渉する蛋白質とは、何らかの機序により、前記遺伝子発現産物の活性を修飾することができる蛋白質を言う。本発明において、前記活性に干渉する蛋白質を干渉物質と記載する。また本発明において、前記遺伝子発現産物の活性を干渉物質の量によって変化させ、目的とするレベルに近づけることを制御と言う。本発明において制御とは、前記活性を抑制する場合のみならず、上昇させる場合も含まれる。干渉物質には、具体的には、結合、分解、あるいは競合等によって、前記活性に干渉する蛋白質を示すことができる。具体的には、前記遺伝子発現産物の受容体、前記遺伝子発現産物の受容体結合部分をブロックして両者の結合を阻害しうる抗体、あるいは前記遺伝子発現産物のアンタゴニストとして作用する蛋白質などを示すことができる。
たとえばＥＰＯに対しては、ＥＰＯの受容体や、ＥＰＯの受容体結合部分をブロックして両者の結合を阻害しうる抗体、あるいはＥＰＯのアンタゴニストとして作用する蛋白質等を、本発明の干渉物質として示すことができる。またＶＥＧＦ等の他のサイトカインについても同様に、そのサイトカインをリガンドとする受容体や、抗体を干渉物質として利用することができる。
これらの蛋白質は、前記活性に干渉することができる限り、その活性断片や、活性断片と他の分子との融合体であることができる。たとえば受容体は、リガンド結合領域や、結合領域を含む融合蛋白質を干渉物質として用いることができる。また抗体であれば、その抗原結合領域を含む断片、あるいは１本鎖抗体であることができる。融合体としては、たとえば受容体と抗体のＦｃ部の融合体を示すことができる。抗体のＦｃ部との融合体とすることにより、次のような効果を期待できる。
１）分子量を大きくすることによって分解を防ぎ血中の滞留性が高まる
２）干渉物質の２量体化によって、標的分子への親和性が高まる
更に受容体が宿主にとって異種の蛋白質であるときには、宿主の蛋白質とのキメラ化によって、生体における安定性の向上が期待できる。融合体は、融合体をコードするキメラ遺伝子の発現によって生体内に導入することができる。
干渉物質は、投与の対象となる生体に由来するものであることが望ましい。したがって、たとえばヒトに対して本発明の方法を適用する場合には、ヒトに由来する蛋白質を利用するのが望ましい。同じ生体に由来する蛋白質を用いることにより、免疫機構の攻撃を誘導することのない、より安全な製剤とすることができる。また免疫機構によって干渉物質が排除されることがないので、効果的な投与が期待できる。
干渉物質として抗体やその断片を用いるときには、その一部をヒトのイムノグロブリンの構造に置換することにより、安全性を高めることができる。すなわち、キメラ抗体や、ＣＤＲグラフトなどの技術により、ヒト以外の種に由来するイムノグロブリンの一部をヒト化することができる。このようにして得ることができるヒト化蛋白質は、本発明をヒトに適用する場合の干渉物質として好ましい。
本発明の干渉物質は、前記遺伝子産物の過剰な発現が見られたときに、当該遺伝子産物が存在する場所に投与される。たとえば血中において前記遺伝子産物の過剰な発現が見られるときには、血中において干渉物質が活性の制御に有効な量で存在できるように、経口的に、あるいは非経口的に投与される。投与方法は特に限定されない。また本発明の干渉物質を、高分子化合物との結合物として投与することによって、血中滞留性の向上を期待することもできる。高分子化合物としては、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、あるいはアルブミンなどを示すことができる。
本発明において、蛋白質からなる干渉物質の投与の方法として遺伝子治療を応用することができる。すなわち、干渉物質をコードするＤＮＡを公知のベクターに組み込んで生体に投与することができる。遺伝子として投与し、当該生体の体内で発現される干渉物質は、その蛋白質が同じ生体に由来するものである場合には、免疫機構を刺激することが無いので安全である。また、生体内で産生が継続するうえに、免疫機構の攻撃を受けないことから、その効果を確実にかつ持続的に得ることができる。更に、蛋白質を工業的に生産し、精製するのに比べて、遺伝子治療用の製剤は、はるかに小規模な生産設備で安全な製剤を安価に製造することができる。
干渉物質をコードするＤＮＡの投与とその発現によって、生体中で干渉物質を共存させるとき、干渉物質は活性を制御すべき蛋白質が存在している場所に供給できるように発現させるのが望ましい。たとえば、血液中に存在する蛋白質の活性を制御するときには、干渉物質を分泌蛋白質として発現させることができる。本発明においては、このように分泌蛋白質として発現された干渉物質を、可溶性の蛋白質と言う。
たとえば受容体のような膜蛋白質を干渉物質として用いるときには、そのリガンド結合領域を分泌蛋白質として発現させることができる。更に具体的な例を示せば、ＥＰＯに対してＥＰＯ受容体を用いる場合には、ＥＰＯ受容体のＮ末端側１〜２２２位のアミノ酸残基を含み、かつ膜貫通領域を含まないアミノ酸配列をコードするＤＮＡを利用することができる。このようなアミノ酸配列からなる蛋白質を分泌蛋白として発現させるには、さらにそのＮ末端に分泌シグナルを付加する。たとえば、ヒトＥＰＯ受容体のｃＤＮＡによってコードされる前駆体蛋白質においては、その１〜２４６位が分泌シグナルとリガンド結合領域を含む。分泌シグナルは、ＥＰＯ受容体に由来するアミノ酸配列であることもできるし、生体の細胞で機能することができる他の種に由来する分泌シグナルであってもよい。本発明においては、このようにして分泌蛋白として発現されたＥＰＯ受容体を、可溶性のＥＰＯ受容体という。
干渉物質をコードするＤＮＡは、ウイルスベクターや、ＤＮＡの直接投与によって生体に導入することができる。ウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等を利用した多くのベクターが開発されている。またＤＮＡの直接投与とは、ウイルス構造を持たない真核細胞用の発現ベクターをｉｎ　ｖｉｖｏ、ｉｎ　ｓｉｔｕ、あるいはｅｘ　ｖｉｖｏで生体に投与する方法である。生体に外来遺伝子を人為的に導入する方法は、既に多くの方法が試みられている。本発明は、公知の遺伝子導入方法によって人的に導入されたあらゆる遺伝子の発現産物に適用することができる。
より具体的には、たとえば次に示すようなベクターが生体への遺伝子導入の目的で使用されている。これらのベクターは、いずれも本発明における干渉物質をコードするＤＮＡの導入のために用いうる。
プラスミド発現ベクター（ｐｌａｓｍｉｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｐ）
：ｐＶＲ、ｐＣＭＶ、ｐＣＡＧＧＳ、
複製能欠損アデノウイルスベクター（ｄｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）
：ＡｄＥＦ１、ＡｄＭＬＰ、
レトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ）：ＬｒＥＰＳＮ、
アデノ随伴ウイルスベクター（Ａｄｅｎｏ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｅｃｔｏｒ）
：ｒＡＡＶ−ＥＴ、ＡｄＣＭＶ
これらの各種のベクターの中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターでは、導入したベクターが他の細胞に感染していく現象が起きる可能性がある。この現象はバイスタンダー効果と呼ばれ、導入した遺伝子の持続的な発現をもたらすため、発現強度を期待するときには有効である。ところが本発明における干渉物質は、もともと治療のために導入された遺伝子の発現産物の活性を制御することが目的であるから、予想を越える持続的な発現は治療効果に対して競合的に作用する恐れがある。
ただし、ウイルスベクターを用いる方法であっても、干渉物質の発現を制御するプロモーターを誘導型のプロモーターとすることにより、本発明に利用することができる。具体的には、たとえば特定の薬剤によって発現を誘導できるプロモーターを利用すれば、薬剤の投与によって干渉物質の発現を制御することができる。このようなウイルスベクターでは、ベクターの持続感染が生じたとしても、干渉物質で制御すべき遺伝子発現産物の活性に対する必要以上の抑制を避けることができる。
したがって本発明においては、発現制御領域と、導入すべき遺伝子とを含む最低限の要素のみからなる発現ベクターを用いた遺伝子治療が、干渉物質をコードするＤＮＡの望ましい導入方法として挙げられる。
一般的な発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列等の発現制御領域、そして発現させるための外来遺伝子等から構成される。ウイルスベクターではなく、このような発現ベクターを利用する方法は、ネーキッドＤＮＡ法と呼ばれている。本発明において、ネーキッドＤＮＡとは、ＤＮＡのみからなる発現ベクターと定義される。
したがってネーキッドＤＮＡは、ウイルスベクターに見られるような蛋白質や糖等の生物学的な構造は持たない。ネーキッドＤＮＡ法では、遺伝子の発現が一過性で、かつ細胞から細胞へのベクターの自発的な感染（バイスタンダー効果）が起きず、ホストの染色体に組み込まれる危険性もないことから、本発明における望ましい遺伝子導入方法である。またウイルスベクターと比較して、安価に多量のベクターを調製できる点でも、ネーキッドＤＮＡは有利である。これらの遺伝子導入方法は、いずれも本発明の干渉物質をコードするＤＮＡの導入方法として応用することができる。
ネーキッドＤＮＡ法を本発明における干渉物質の発現に利用するには、たとえば以下のような発現ベクターを構築する。すなわち発現ベクターは、干渉物質をコードするＤＮＡ、プロモーター領域、転写終了シグナルを特定する３’に位置する領域、およびポリアデニル化部位等で構成される。このプロモーター領域は、干渉物質をコードするＤＮＡを発現するために当該細胞中または生体内で機能しうるものとする。
プロモーター領域は、干渉物質をコードするＤＮＡを発現させることができれば、たとえば他の生物や、他の遺伝子に由来するものであることもできる。たとえば、他の真核細胞遺伝子やウイルス遺伝子に由来するプロモーターを用いることもできる。プロモーターの特異性は、干渉物質をコードするＤＮＡを発現することができれば、必ずしも特異的である必要はない。プロモーターとして、誘導型のプロモーターを用いれば、その発現を誘導条件によって制御することもできる。
あるいはプロモーターとして組織特異性を有するものを用いれば、臓器特異的に干渉物質を発現させることもできる。したがって、遺伝子発現産物の過剰発現が実際に障害を与える組織において、干渉物質を発現させるといった応用も可能である。更に、例えばＥＰＯ過剰発現で組織の酸素供給が飽和している場合は、逆に高酸素に応答するプロモーター領域を、導入する干渉物質をコードする遺伝子の上流に組み込んでおくことによって人工的なフィードバックループを構成することができる。具体的には、たとえば以下のような遺伝子のプロモーターを用いることができる。
非特異的プロモーター
ニワトリのβアクチン、平滑筋のαアクチン、　チミジンキナーゼ、
メタロチオネイン、　　インターフェロン、　　免疫グロブリン
誘導型のプロモーター
ステロイドホルモンのレセプター
ウイルス由来のプロモーター
ＳＶ４０、　　　　　　Ｂ型肝炎ウイルス、
アデノウイルス主要後期遺伝子
プロモーターは、他の発現制御領域を構成する塩基配列の導入によって改変されたものであっても良い。たとえばニワトリβアクチンプロモーターでは、その一部をウサギのβ−グロビン遺伝子由来のスプラインシングアクセプターに改変することにより、遺伝子の転写効率が向上することが知られている（特許第２８２４４３４号，１９９８年）。
発現ベクターは、プロモーター以外にもターミネーターやエンハンサーを含むことができる。これらの発現制御領域についても、プロモーターと同様に、導入すべき遺伝子のもののみならず、他の遺伝子や、他の種に由来する発現制御領域を用いることもできる。
干渉物質をコードするＤＮＡを発現することができるネーキッドＤＮＡは、公知の方法により生体に導入することができる。たとえば、発現ベクターを導入した皮膚細胞や血液細胞を生体に移植することにより、ｅｘ　ｖｉｖｏでのＤＮＡの導入が行われる。皮膚細胞を利用した場合には、これを取り除くことで容易に干渉物質の発現レベルを調整することができる。細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法等を利用することができる。生体へのエレクトロポレーションによるネーキッドＤＮＡの導入は、例えば以下のようにして行われる。すなわち、ＤＮＡを脚部の筋肉に注射後、その注入部位を挟むように電極をセットし、エレクトロポレーション法でパルスで電圧を与える。また、移植臓器に導入する場合は、ＤＮＡ注入した臓器を生理食塩水等の溶液中で浸した状態で、電極を臓器に直接当てず溶液液全体をパルス刺激するエレクトロポレーション法を用いた組織の損傷を抑えた方法で、効率のよい導入が可能となる。あるいはハイドロゲル法によって、静脈内投与法により、肝臓・腎臓等の臓器で干渉物質をコードするＤＮＡを発現させることもできる。ＴｒａｎｓＩＴ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｒｕｓ社）等を用いた静脈内投与による遺伝子導入を応用することもできる。
更に、干渉物質をコードするＤＮＡの導入にあたり、取り扱いの容易なリポゾーム法と、効率の高いウイルスベクターの特徴をあわせもつＨＶＪ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　Ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ）−リポゾーム法を利用することもできる。この手法は、非分裂細胞にも効率よくＤＮＡを導入・発現可能であり、発現期間は一過性であるが、ホストのゲノムには挿入されない特徴を有する。したがって、本発明における干渉物質をコードするＤＮＡの発現系として、ネーキッドＤＮＡと同様に望ましい発現系であると言うことができる。
このようにして導入された干渉物質をコードするＤＮＡは、導入された細胞で発現し、生体内において干渉物質を産生する。産生された干渉物質は、人為的に導入された遺伝子の発現産物の活性を抑制する。干渉物質の発現は、形質転換された細胞の寿命とともに弱まり、やがて消失するので、人為的に導入された遺伝子の発現産物の活性を必要以上に弱める作用は無い。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。本実施例で用いた動物は、８週齢の雄性ラット（ＳＤ，Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｉｎｃ東京）を実験開始前にｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅの条件下１２時間の明暗サイクルで一週間以上飼育した。全ての動物は水と標準食（２３．８％　ｐｒｏｔｅｉｎ；０．２４％　ｓｏｄｉｕｍ；０．０１５４％　ｉｒｏｎ含有、ＭＦ，Ｏｒｉｅｎｔａｌ　Ｙｅａｓｔ，東京）を自由に摂取させた。
［実施例１］プラスミドベクターの調製
プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＥｐｏはラットＥＰＯ　ｃＤＮＡを発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９１，１０８，１９３−１９９）のＸｈｏＩ　ｓｉｔｅに挿入することで構築した。またプラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＥＰＯＲ２は、ヒト可溶性ＥＰＯ受容体（特許公開番号：ＷＯ　９９−５３３１３、ｈＳＥＰＯＲ２）のｃＤＮＡを、同じく発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳのＸｈｏＩ　ｓｉｔｅに挿入することで構築した。各プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ　ＥｎｄｏＦｒｅｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｇｉｇａ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した（Ｍａｒｕｙａｍａ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００，１１，４２９−４３７）。本実施例で構築した発現ベクターの構造を図１に示した。その塩基配列は、ヒト可溶性ＥＰＯ受容体をコードする場合の塩基配列は配列番号：１に示した。またラットＥＰＯをコードする場合の塩基配列は配列番号：２に示した。
対照としてｐＣＡＧＧＳ　ｐｌａｓｍｉｄを用いた。得られたＤＮＡは滅菌したｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で溶解し、注入時の濃度が２μｇ／μｌとなるように調製した。
［実施例２］ｐＣＡＧＧＳ−Ｅｐｏ及びｐＣＡＧＧＳの導入
エレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法による筋肉内へのｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡの注入は以前報告した方法（Ｍａｒｕｙａｍａ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｕｍａｎｅ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００，１１，４２９−４３７）に準じて行った。ｐＣＡＧＧＳ−Ｅｐｏ及びｐＣＡＧＧＳの、５０μｇ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを左右の下肢の内側（ｍｅｄｉａｌ）及び外側部分（ｌａｔｅｒａｌ　ｓｉｔｅ）に注入した（ｔｏｔａｌ　２００μｇ）。次にｐａｉｒになった幅１０ｍｍ、長さ５ｍｍの２本のｓｔａｉｎｌｅｓｓ　ｓｔｅｅｌ電極をＤＮＡ注入部位が中心となるよう設置し、ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｕｌｓｅ　ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｅｌｅｃｔｒｏ　Ｓｅｅｑｕｒｅ　Ｐｏｒａｔｏｒ　Ｔ８２０；ＢＴＸ）を用いて、電気ｐｕｌｓｅ（ｄｕｒａｔｉｏｎ　５０　ｍｓｅｃ，１００Ｖ，１ｐｕｌｓｅ／ｓで８ｐｕｌｓｅｓ）を与えた。
遺伝子導入後、動物をジエチルエーテルで軽く麻酔し、Ｏｈｗａｄａらの方法（Ｏｈｗａｄａ　Ｋ．，Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．，１９８６，３５，３５３−３５５）で心臓から２ｍｌ採血し、血清中のＥＰＯレベルをＲｅｃｏｍｂｉｇｅｎ　ＥＰＯ　ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ　ＤＰＣ，千葉）を用いて測定した。赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビン、白血球、血小板はＳｙｓｍｅｘ　ＳＥ−９００（Ｓｙｓｍｅｘ兵庫）で、網状赤血球（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ）はＳｙｓｍｅｘ　Ｒ−３５００で測定した。
結果を図２に示す。実験結果は平均値±標準誤差で表示し、統計的有意差は対応のないｔ検定で検定し、ｐ＜０．０５を有意とした。ＥＰＯを遺伝子導入すると、その後ヘマトクリット値が上昇し、３週間後でほぼピークとなった（図２）。一方、対照ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ導入群は導入前と比べ４週間後にヘマトクリット値の上昇が見られたが、ＥＰＯ遺伝子導入群と比べるとその程度は僅かなものであった。
［実施例３］ｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＥＰＯＲ２の導入
実施例２でヘマトクリットの上昇を確認できた個体に、４週間目にヒトＥＰＯ可溶性受容体発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＥＰＯＲ２）を遺伝子導入した。ｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＥＰＯＲ２は左右の大腿部筋肉内に、実施例２と同様に計８００μｇとなるよう注入した。エレクトロポレーションおよび血液採取も実施例２と同様にして行った。
ヒトＥＰＯ可溶性受容体発現ベクターを導入した群のヘマトクリット値は、非導入群と比べ減少傾向を示し、５週間目及び１３週目には有意なヘマトクリットの減少が確認された。対照群に４週間後ＥＰＯ可溶性受容体を導入した場合はその後ヘマトクリット値は変化せず、更に低下して貧血症状を呈することは無かった。
以上の結果から、可溶性受容体を生体内に導入することで、治療目的で導入した遺伝子による過剰な作用を確実に制御できることが明らかとなった。また、導入遺伝子の発現レベルが減少している時期（本実験では１５週以降）や、対照群のような外部由来の導入遺伝子の発現レベルがゼロである正常なｃｏｎｄｉｔｉｏｎに対して、さらにそのレベルを低下させるような強い副作用は確認されず、安全性の高い制御法と考えられる。
［実施例４］　ヒトＥＰＯ受容体−ＩｇＧ　Ｆｃキメラ遺伝子導入によるラットＥＰＯレベルの制御
先の実施例では、ラットＥＰＯの作用をヒト可溶性ＥＰＯ受容体で抑制した。本実施例においては、ヒト可溶性受容体を、ラットのＩｇＧＦｃとのキメラ蛋白質とすることによって、その作用がどのように変化するかを確かめた。
ＩｇＧ１ＦｃのｃＤＮＡを、市販のラット脾臓のライブラリー（Ｑｕｉｃｋ　Ｃｌｏｎｅ、クローンテック社）からＰＣＲ法によりクローニングした。ＩｇＧ１ＦｃのｃＤＮＡを実施例１と同様にして発現ベクターｐＣＡＧＧＳに挿入して、ラットＩｇＧＦｃ発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＩｇＧ１Ｆｃを構築した。更に、ＩｇＧ１ＦｃのｃＤＮＡとｈＥＰＯＲを連結したキメラのｃＤＮＡを実施例１記載の方法と同様の方法で発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＸｈｏＩ　ｓｉｔｅに挿入してキメラ蛋白質発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＥＰＯＲ２−ＩｇＧ１Ｆｃを構築した。キメラ蛋白質発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＥＰＯＲ２−ＩｇＧ１Ｆｃのインサートの塩基配列を配列番号：３に示す。各プラスミドは、実施例１と同様に精製し、以下の実験に用いた。
エレクトロポレーション法により動物（ラット）の筋肉内にｐＣＡＧＧＳ−Ｅｐｏ　１００μｇを左右下肢の内側、外側部に注入した（ｔｏｔａｌ　４００μｇ）。ｐＣＡＧＧＳ−Ｅｐｏは、ラットのＥｐｏを発現するプラスミドである。遺伝子導入１週間後、および２週間後に血中ＥＰＯレベルの上昇を確認後、３週間後にｐＣＡＧＧＳ−ＩｇＧ１Ｆｃ、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＥＰＯＲ２、及びｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＥＰＯＲ２−ＩｇＧ１Ｆｃプラスミドのそれぞれ８００μｇをＴｒａｎｓＩＴＲ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｒｕｓ，ＭＩＲ５１２５）を用いてラット尾静脈より導入した（Ｌｉｕ　Ｆ，Ｓｏｎｇ　ＹＫ，Ｌｉｕ　Ｄ，Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌｓ　ｂｙ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ，Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９，６，１２５８−１２６６）。
その後、経時的に採血を行い、血中ＥＰＯレベル、ヘマトクリット値、網状赤血球数（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ）を２４週間後まで計測した。統計的な有意差検定は対応の無いｔ検定を行い、５％以下の危険率を有意とみなした。
ｐＣＡＧＧＳ−ｈＥＰＯプラスミッドを導入後ＥＰＯの上昇した動物について、上昇の程度が各群同程度となるよう群分けし、尾静脈から各可溶性ヒトＥＰＯ受容体を導入した。その結果、導入ＥＰＯにより血清ＥＰＯレベルは１週間後にピークとなり、その後徐々に減少した（データ示さず）。一方、ヘマトクリット値は導入後より上昇し、４週間後にピークとなりその後ほぼ一定値を保った。その後は、初めのピーク値に対して有意ではないものの、１６週間後に再び上昇し２４週間後もこのレベルを維持した（図３）。
これに対して、ｈＳＥＰＯＲ２−ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質発現プラスミド導入群では、４週間後から２４週間後にわたって、ＥＰＯ導入群に比べ有意にヘマトクリット値を低下させた（図３）。ＩｇＧ１Ｆｃや可溶性ヒトＥＰＯ受容体を導入した群では、ＥＰＯ単独導入群と比べてヘマトクリット値を下げる傾向は見られるものの、両者の差は有意ではなかった。ｈＳＥＰＯＲ２−ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質の作用は、ＩｇＧ１Ｆｃ導入群と比較しても有意であり、可溶性ヒトＥＰＯ受容体導入群に比べても、４週〜１２週間後にわたって有意に強い効果を示した（図３）。
網状赤血球数は、ラットＥＰＯ導入１週間後にピークを示し、その後急速に低下する。ＩｇＧ１ＦｃやＥＰＯ受容体導入によって、ＥＰＯ遺伝子単独導入群と比べて網状赤血球数のレベルに変化は見られない。しかしｈＳＥＰＯＲ２−ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質の導入により、４週間後から２４週間後にわたって網状赤血球数は有意な減少を示す。その作用はＩｇＧ１Ｆｃ及びＥＰＯ受容体導入群と比べても有意に強かった（図４）。
以上の結果より、ＥＰＯ受容体を単独で発現するのに比べ、ラットＩｇＧ１Ｆｃとのキメラ受容体（ｈＳＥＰＯＲ２−ＩｇＧ１Ｆｃ）の形で導入した方が、上昇した血中のＥＰＯレベルをより強く低下させる作用があることが確認された。
なお実施例２（図２）ではＥＰＯ受容体の導入で、上昇したヘマトクリットを有意に低下したのに対して、実施例４（図３）では同じ傾向が見られたものの有意な差ではなかった。このＥＰＯ受容体の効果の違いは、導入したラットＥｐｏ（ｐＣＡＧＧＳ−ＥＰＯ）の量の違いに起因するものと思われた。ｐＣＡＧＧＳ−ＥＰＯの導入量が、実施例２（図２）の２００μｇに対して、実施例４（図３）では４００μｇとなっている。つまり実施例４におけるラットの方がより多くのＥＰＯを発現しているために、同量のＥＰＯ受容体では十分に中和できなかった可能性が考えられる。
産業上の利用の可能性
本発明は、従来の遺伝子治療法では考慮されていなかった導入遺伝子の発現産物の生体内での活性の制御方法を実現する。生体に人為的に導入した遺伝子の発現レベルが、生理的な濃度を越えて恒常的に発現されれば、生体に対して副作用を示す恐れがある。たとえばＥＰＯの場合には、多血症といった副作用を生じる。
本発明では、干渉物質の投与により、過剰発現に起因する副作用を軽減することができる。実施例では可溶性受容体の遺伝子の導入することによる干渉物質の投与例を示した。この他にも受容体のみならず、中和抗体や、それをコードする遺伝子の導入によっても受容体の同様の効果を得ることができる。
この目的のためにリコンビナントの可溶性受容体蛋白や、抗体蛋白を投与する方法では、抑制作用を得るのに大量の精製蛋白と繰り返し投与を必要とし、そのコストや、通院等の患者の物理的負担も大きくなる。発明者が示した遺伝子導入による方法は、患者自身の組織の細胞で蛋白が作られることから、糖鎖修飾等の点からも抗原性は少なく、効果の持続や、安全性にも優れていると考えられる。また、皮膚に遺伝子導入した場合は、皮膚移植により遺伝子導入のｓｗｉｔｃｈのｏｎ／ｏｆｆを簡便に行うことも可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、発現ベクターの構造を模式的に示した図である。
図２は、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＰＯ及びｐＣＡＧＧＳを導入したラットの血液におけるヘマトクリット値の変化を示したグラフである。縦軸はヘマトクリット値（％）を、横軸はｐＣＡＧＧＳ−ＥＰＯ後の経過時間（週）を示す。図中、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１
図３は、血中ヘマトクリットレベルの変化を示したグラフである。縦軸はヘマトクリット値（％）を、横軸は経過時間（週）を示す。各群ともにｎ＝９。図中、＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＃：ｐ＜０．０５、＃＃：ｐ＜０．０１、＃＃＃：ｐ＜０．０００１、＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１、＆：ｐ＜０．０５、＆＆：ｐ＜０．００１
図４は、血中網状赤血球数の変化を示したグラフである。縦軸は網状赤血球数（×１０４／μｌ）を、横軸は経過時間（週）を示す。各群ともにｎ＝９。図中、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＃：ｐ＜０．０５、＃＃＃：ｐ＜０．０００１、＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１、＆＆＆：ｐ＜０．００１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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