(57)【要約】新規ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターでトランスフェクションされた細胞、並びに前記ポリペプチドを有効成分とするＩＩ型コラーゲン産生促進用医薬組成物、アグリカン産生促進用医薬組成物、及び変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物を開示する。前記ポリペプチドは、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチドである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチド、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチド。
【請求項４】
ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及びアグリカン産生促進活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第３８８番又は第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７に記載の発現ベクターと、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、ＩＩ型コラーゲン産生促進用医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７に記載の発現ベクターと、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、アグリカン産生促進用医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７に記載の発現ベクターと、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７に記載の発現ベクターを、ＩＩ型コラーゲン産生促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ＩＩ型コラーゲン産生を促進する方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７に記載の発現ベクターを、アグリカン産生促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、アグリカン産生を促進する方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７に記載の発現ベクターを、変形性関節症の治療及び／又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、変形性関節症を治療及び／又は予防する方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７に記載の発現ベクターの、ＩＩ型コラーゲン産生促進用医薬組成物、アグリカン産生促進用医薬組成物、あるいは、変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物を製造するための使用。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規ポリペプチドに関する。
背景技術
変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；以下、ＯＡと略称することがある）は、関節軟骨の損傷及び／又は変性を主病変とする関節疾患の中でも、最も患者数の多い疾患である。ＯＡ疾患に対する現行の薬物治療法では、痛みを軽減する目的で対症療法的に鎮痛消炎剤やヒアルロン酸製剤が用いられていて、充分な治療効果を上げているとは言えない状況にあり、最終的には外科的治療が必要な状態に至る。
関節軟骨は自己修復能に乏しい組織と考えられており、ＯＡ病態における関節軟骨の修復を目的とした治療法の開発の一例としては、関節軟骨細胞を生体から取り出して、イン・ビトロ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ）で培養して増殖させ、欠損した関節部位に埋め戻すという方法がある。しかし、この方法は、外科手術を必要とする上に多くの問題点を抱えていて、治療法としては確立していない（Ｏｎｓｔｏｔｔ　Ａ．Ｔ．ら，ＡＯＲＮ　Ｊ．，７１，８４３−８４５，８４８−８５１，２０００）。また、軟骨細胞の分化誘導活性を示す各種生理活性物質を治療剤として用いる試みがされているが、軟骨を欠損させた関節を作成した動物モデルで効果を検証している段階に留まっていて、臨床応用まで至っていない（Ｓｅｌｌｅｒｓ　Ｒ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒｇ．Ａｍ．，７９Ａ，１４５２−１４６３，１９９７；及びＴｒｉｐｐｅｌ　Ｓ．Ｂ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，４３，１２９−１３２，１９９５）。
軟骨組織の内部には、血管、神経、及びリンパ管が存在しない。関節軟骨は、軟骨細胞と、軟骨細胞が産生する細胞外基質とで構成されており、関節軟骨細胞が産生するＩＩ型コラーゲンやプロテオグリカンなどの細胞外基質は、軟骨組織に特有の弾性と硬度、圧力に対する抵抗性を持たせて、関節軟骨として機能するために重要な役割を担っている［Ｈｕｂｅｒ　Ｍ．ら，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，３５（１０），５７３−５８０，２０００］。しかし、ＯＡ疾患では、関節軟骨組織の変性破壊やコラーゲンの繊維化が引き起こされており、特に、ＩＩ型コラーゲンが分解されて、正常に機能するＩＩ型コラーゲンの減少が顕著である［Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ　Ａ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３（４），１７２２−１７３２，１９９４］。
アグリカンは、ＩＩ型コラーゲン同様、関節軟骨細胞より産生されていて、軟骨組織を構成する主要なプロテオグリカンである。アグリカンは、関節軟骨として機能するために重要な役割を担っているが、ＯＡ疾患では、アグリカンの分解及び変性が観察されている［Ｎｅａｍｅ　Ｐ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｆｌａ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，８１（３），１９１−１９３，１９９４］。
発明の開示
本発明は、ＯＡ治療に有用な、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を有する物質の提供、並びに、新規なＯＡ治療及び／又は予防用医薬組成物の提供を課題としている。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性を示す新規ポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチドを見出した。次いで、前記ポリヌクレオチドのｍＲＮＡの発現分布を解析し、関節軟骨組織に特異的に発現していることを確認した。また、前記ポリヌクレオチドは、ＯＡの遺伝的要因となる感受性遺伝子が存在するとして知られている、ヒト染色体の１１ｑ２２に存在することを確認した。そして、前記ポリペプチドをヒト関節軟骨細胞中で過剰発現させることにより、ＩＩ型コラーゲン産生及びアグリカン産生を促進することを確認し、前記ポリペプチドが、ＯＡ治療及び／又は予防用に有用であることを明らかにし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチド、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチド；
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチド；
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチド；
［４］ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及びアグリカン産生促進活性を有する、［１］〜［３］記載のポリペプチド；
［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第３８８番又は第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチド；
［６］［１］〜［５］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［７］［６］記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
［８］［７］記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞；
［９］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクターと、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、ＩＩ型コラーゲン産生促進用医薬組成物；
［１０］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクターと、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、アグリカン産生促進用医薬組成物；
［１１］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクターと、薬剤学的に許容することのできる担体とを含む、変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物；
［１２］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクターを、ＩＩ型コラーゲン産生促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ＩＩ型コラーゲン産生を促進する方法；
［１３］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクターを、アグリカン産生促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、アグリカン産生を促進する方法；
［１４］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクターを、変形性関節症の治療及び／又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、変形性関節症を治療及び／又は予防する方法；
［１５］［１］〜［５］記載のポリペプチド、［６］記載のポリヌクレオチド、又は［７］記載の発現ベクターの、ＩＩ型コラーゲン産生促進用医薬組成物、アグリカン産生促進用医薬組成物、あるいは、変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物を製造するための使用；並びに
［１６］［１］〜［５］記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列を有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド２３／３８８」と称することがある）；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列（すなわち、「ポリペプチド２３／３８８」のアミノ酸配列）の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（３）「ポリペプチド２３／３８８」のアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）が含まれる。
本発明のポリペプチドである前記ポリペプチド（１）〜（３）の内、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）及びアグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を併せ持つポリペプチドがより好ましい。
本発明のポリペプチドの１つである、分泌シグナル配列が切断されたポリペプチド（Ｎ末端が、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番目のアミノ酸、すなわち、ポリペプチド２３／３８８であると推定される）は、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）を示し、しかも、アグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）も併せ持つ。
本明細書において、或るポリペプチドが「ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後述の実施例１２に記載の方法、又は後述の実施例１６に記載の方法）により確認することができる。すなわち、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、前記ポリヌクレオチドを含まないコントロール用発現ベクターとで、それぞれ、所望の細胞（特には、ヒト関節軟骨細胞）をトランスフェクションし、所定日数（例えば、３日間）が経過した後、それぞれの細胞におけるＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡの発現量を測定する。コントロール用発現ベクターでトランスフェクションした細胞に比べて、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクションした細胞におけるＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡの発現量が上昇していれば、前記ポリペプチドが「ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）」を示すと判定することができる。
あるいは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして得られるウイルスと、前記ポリヌクレオチドを含まないコントロール用ウイルスベクターをトランスフェクトして得られるコントロール用ウイルスとを、それぞれ、所望の細胞（特には、ヒト関節軟骨細胞）に感染させ、所定日数（例えば、４日間又は７日間）が経過した後、それぞれの細胞におけるＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡの発現量を測定する。コントロール用ウイルスを感染させた細胞に比べて、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして得られるウイルスを感染させた細胞におけるＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡの発現量が上昇していれば、前記ポリペプチドが「ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）」を示すと判定することができる。
本明細書において、或るポリペプチドが「アグリカン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後述の実施例１６に記載の方法）により確認することができる。すなわち、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして得られるウイルスと、前記ポリヌクレオチドを含まないコントロール用ウイルスベクターをトランスフェクトして得られるコントロール用ウイルスとを、それぞれ、所望の細胞（特には、ヒト関節軟骨細胞）に感染させ、所定日数（例えば、４日間又は７日間）が経過した後、それぞれの細胞におけるアグリカンｍＲＮＡの発現量を測定する。コントロール用ウイルスを感染させた細胞に比べて、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターをトランスフェクトして得られるウイルスを感染させた細胞におけるアグリカンｍＲＮＡの発現量が上昇していれば、前記ポリペプチドが「アグリカン産生促進活性（特には、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）」を示すと判定することができる。
本発明の機能的等価改変体は、ポリペプチド２３／３８８のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個（好ましくは１〜２２個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示すことができるポリペプチド（例えば、ポリペプチド２３／３８８のアミノ酸配列を含み、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性及び／又はアグリカン産生促進活性を示すポリペプチド）である限り、特に限定されるものではないが、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）及びアグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を併せ持つポリペプチドであることがより好ましい。
本発明の機能的等価改変体の起源はヒトに限定されない。例えば、ポリペプチド２３／３８８のヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、又はヒト以外の生物由来の機能的等価改変体）又はポリペプチド２３／３８８を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
ポリペプチド２３／３８８のヒトにおける変異体、又はヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、ポリペプチド２３／３８８の遺伝子の塩基配列（例えば、配列表の配列番号１で表される塩基配列における第１０３番〜第１２０３番の塩基からなる配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュアル）に従って実施することが可能である。
例えば、ポリペプチド２３／３８８の遺伝子の塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドの遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例１２に記載の方法により、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性を示すことを確認することにより、あるいは、実施例１６に記載の方法により、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、ポリペプチドの遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例１２に記載の方法により、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性を示すことを確認することにより、あるいは、実施例１６に記載の方法により、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、本発明の機能的等価改変体には、ポリペプチド２３／３８８［あるいは、ポリペプチド２３／３８８のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個（好ましくは１〜２２個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド］を含むポリペプチド、例えば、Ｎ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）も、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示す限り、含まれる。
前記マーカー配列としては、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
更に、本発明の機能的等価改変体には、配列番号２で表されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列）からなるポリペプチドそれ自体、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個（好ましくは１〜２２個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは、これらのポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）も、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示す限り、含まれる。
本発明の相同ポリペプチドは、ポリペプチド２３／３８８のアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列）との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）及び／又はアグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、ポリペプチド２３／３８８のアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。また、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進活性）及びアグリカン産生促進活性（好ましくは、関節軟骨細胞のアグリカン産生促進活性）を併せ持つポリペプチドであることがより好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｎｇｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索により得られた値を意味し、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥＧ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列表の配列番号１で表される塩基配列における第１０３番〜第１２０３番の塩基からなる配列、あるいは、配列表の配列番号１で表される塩基配列における第３７番〜第１２０３番の塩基からなる配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。配列表の配列番号１で表される塩基配列における第１０３番〜第１２０３番の塩基からなる配列を有する前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチド２３／３８８をコードする。また、配列表の配列番号１で表される塩基配列における第３７番〜第１２０３番の塩基からなる配列を有する前記ポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の組換えポリペプチドを製造するために用いることができるばかりでなく、遺伝子治療により体内で本発明のポリペプチドを産生させるために用いることもできる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。変性温度又は変性剤添加条件などを適宜選択し、作成した各々のプライマーセットに適した逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
あるいは、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織から調製したｍＲＮＡから逆転写酵素により作製したｃＤＮＡ、あるいは、市販のヒト細胞又は組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、先述の方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ　Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、又はＪＭ１０９株等）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシン等に対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。もちろん、市販のコンピテント細胞を使用することもできる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法、（２）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法、（３）他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法、（４）本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて選択する方法、又は（５）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる方法を採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルター又はポリアミドフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株を培養し、ポリヌクレオチドを増幅させ、そのポリヌクレオチドを動物細胞にトランスフェクトし、ポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドを細胞外に産生させる。なお、この場合、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラスミド、あるいは、動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれを用いることもできる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出することにより、元の形質転換株の中から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて選択する方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、予め、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株の培養上清、細胞内、又は細胞表面にポリペプチドを産生させ、本発明のポリペプチドに対する抗体及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポリペプチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルター等にブロットし、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを適当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞への注入したり、あるいは、ウサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、ポリペプチドに翻訳させる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて検出して、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュアル）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ　１０００Ｍ　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵単細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
本発明の発現ベクターには、本発明の組換えポリペプチドを製造するための発現ベクターと、遺伝子治療により体内で本発明のポリペプチドを産生させるための発現ベクターとが含まれる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｏｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
遺伝子治療のベクターとしては、例えば、（１）ウイルスベクター、又は（２）非ウイルスベクターがあり、一般的に使用されているベクター（ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はセンダイウイルス等）を用いることができる［高久史麿監修，実験医学（増刊号）「遺伝子治療の最前線」，第１２巻，第１５号，１９９４年］。
本発明の細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞外に本発明のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
本発明の細胞を培養することにより、前記細胞の細胞外に生産される本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、例えば、本発明のポリペプチドを含む培養液を、通常のポリペプチド沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等を用いて処理することにより、本発明のポリペプチドを精製することができる。
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のポリペプチドの発現の確認及び精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサ−ヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８（１９９６）。
本発明のポリペプチドの内、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲンの発現量を上昇させるポリペプチドは、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進用医薬組成物の有効成分として有用である。また、ＩＩ型コラーゲンは、関節軟骨として機能するために重要な役割をもつことが知られているので、前記ポリペプチドは、変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物の有効成分としても有用である。
本発明のポリペプチドの内、アグリカンの産生を促進する活性を有するポリペプチドは、アグリカン産生促進用医薬組成物の有効成分として有用である。また、アグリカンは軟骨組織を構成する主要なプロテオグリカンであるので、変形性関節症の治療及び／又は予防用医薬組成物の有効成分としてより有用である。
本発明においては、本発明のポリペプチドを、それ単独で、あるいは、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
また、本発明のポリペプチドは、ＩＩ型コラーゲン産生促進用医薬組成物、アグリカン産生促進用医薬組成物、あるいは、変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物を製造するために使用することができる。
本発明による関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進用医薬組成物、アグリカン産生促進用医薬組成物、又は変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物は、有効成分に応じて、それらの製剤化に通常用いられる添加剤を用いて調製することができる。
投与方法としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に酵素の影響を受けるポリペプチドにあっては、静注等の非経口投与とするか、あるいは、消化酵素の影響の少ない消化管の下部（例えば、空腸、回腸、結腸、又は大腸）に前記ポリペプチドが分解されずに送達される製剤技術を用いることが好ましい。このような製剤技術としては、例えば、徐放性製剤（例えば、国際公開パンフレットＷＯ９４／０６４１４号）、結腸放出製剤（例えば、国際公開パンフレットＷＯ９５／２８９６３号）、又は時間放出型若しくはパルス放出型製剤（国際公開パンフレットＷＯ９３／０５７７１号）を挙げることができる。
非経口のための注射剤には、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤が含まれる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤における希釈剤としては、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを挙げることができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を挙げることができる。
前記注射剤は、更に、溶解補助剤、保存剤、安定剤、乳化剤、無痛化剤、等張化剤、緩衝剤、賦形剤、着色剤、又は増粘剤などの添加剤を配合することができる。前記溶解補助剤としては、例えば、シクロデキストリン類等を挙げることができる。前記保存剤としては、例えば、パラ安息香酸メチル等を挙げることができる。前記乳化剤としては、例えば、レシチン等を挙げることができる。前記無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール等を挙げることができる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム等を挙げることができる。前記賦形剤としては、例えば、マルトース等を挙げることができる。前記増粘剤としては、例えば、ヒアルロン酸等を挙げることができる。
前記注射剤は、例えば、バクテリア保留フィルターを通過させる濾過、殺菌剤の配合、あるいは、照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物として製造し、使用に際して、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、例えば、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。また、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。
遺伝子治療のための、遺伝子伝達方法としては、例えば、（１）ウイルスベクター、（２）非ウイルスベクター、又は（３）むきだしのＤＮＡを用いることができる。また、遺伝子治療の方法としては、遺伝子導入細胞を患者に移植する方法（ｅｘ　ｖｉｖｏ法）、あるいは、細胞を介さずに直接個体にこれらの遺伝子自体を注入する方法（ｉｎ　ｖｉｖｏ法）を用いることができる［新津洋司郎ら編集，蛋白質核酸酵素（増刊号）「遺伝子治療」，第４０巻，第１７号，１９９５年］。
投与方法は、その有効量が患部に到達するような方法で投与される限り、特に限定されるものではない。例えば、全身的投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、又は経口投与など）、局所投与（例えば、関節腔内投与又は髄腔内投与など）、経粘膜投与（例えば、鼻腔内投与、気管内投与、又は口腔内投与など）、又は腸管内投与（例えば、座剤投与など）などによる治療方法が含まれるが、関節腔内投与が好ましい［Ｂａｒａｇｉ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（２），２１６−２２０，２０００］。
また、本発明のポリヌクレオチド又は本発明の発現ベクターと、薬学的に許容することのできる担体又は溶媒（例えば、生理食塩水、ｐＨ緩衝液、安定剤、保存剤、又は懸濁剤など）とを混合して、ＩＩ型コラーゲン産生促進、アグリカン産生促進、及び／又は治療及び／又は予防のための組成物とすることができる。また、遺伝子治療の効果をあげるために、例えば、ベクター自身を生分解性のゲルに包埋する技術を用いることができる。具体的には、アテロコラーゲン（ＫＯＫＥＮ　Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＤＮＡの放出を持続させる方法（Ｔ．ＯＣＨＩＹＡら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，７０７−７１０，１９９９）を用いることができる。あるいは、遺伝子の細胞導入効率を向上させる目的で、リン脂質及び／又はコレステロールを配合することができる。
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。
以上のように分離精製された抗体について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュアル）に従って実施した。
実施例１：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全長ＯＲＦ遺伝子配列の決定
市販のｃＤＮＡライブラリーと本発明者が設計したプライマーを使用し、５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）及び３’−ＲＡＣＥを行なった。
まず、５’−ＲＡＣＥの初段ＰＣＲでは、市販のヒト卵巣及びヒト子宮のｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、配列番号３で表される塩基配列からなるＧＳＰ２プライマーと、ＡＰ１プライマー［Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に添付］とをプライマーとし、Ｔａｑポリメラーゼ（ＬＡ−ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）をＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９８℃（５秒間）と７２℃（９０秒間）とからなるサイクル反応を５回、９８℃（５秒間）と７０℃（９０秒間）とからなるサイクル反応を５回、及び９８℃（５秒間）と６８℃（９０秒間）とからなるサイクル反応を２５回、それぞれ繰り返し、最後に、６８℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。
続いて、前記の初段ＰＣＲで得られた反応液を鋳型として、第２段のネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを実施した。第２段ＰＣＲでは、初段ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号４で表される塩基配列からなるＧＳＰ１プライマーと、ＡＰ２プライマー［Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に添付］とをプライマーとし、前記ＴａｑポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９８℃（５秒間）と７２℃（９０秒間）とからなるサイクル反応を５回、９８℃（５秒間）と７０℃（９０秒間）とからなるサイクル反応を５回、及び９８℃（５秒間）と６８℃（９０秒間）とからなるサイクル反応を２０回、それぞれ繰り返し、最後に、６８℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。
得られた第２段ＰＣＲ産物を電気泳動し、切り出したバンドをＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、前記ＧＳＰ１プライマーと、シークエンス用キット（Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，パーキンエルマー社）とを用いてＤＮＡ伸長反応を行なった後、蛍光式自動シークエンサー（ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　Ｐｒｉｓｍ　３７７；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，パーキンエルマー社）を用いて塩基配列を解読し、配列番号１で表される塩基配列における第１番〜第５８４番の塩基配列を決定した。
一方、３’−ＲＡＣＥでは、初段ＰＣＲのプライマーとして、配列番号５で表される塩基配列からなるＦ２プライマーと、前記ＡＰ１プライマーとを使用し、第２段ＰＣＲのプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列からなるＦ１プライマーと、前記ＡＰ２プライマーとを使用したこと以外は、前記５’−ＲＡＣＥと同様の操作を繰り返すことにより、ＤＮＡ断片を得た。
３’−ＲＡＣＥで得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、前記Ｆ１プライマーを用いること以外は、前記５’−ＲＡＣＥの場合と同様にして塩基配列を解読し、配列番号１で表される塩基配列における第１０３３番〜第１７０２番の塩基配列を決定した。
次に、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＯＲＦの配列決定を行なった。すなわち、市販のヒト卵巣のｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、配列番号７で表される塩基配列からなるＮＣ５Ａプライマーと、前記ＧＳＰ１プライマーとをプライマーとし、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎａｔｉｖｅ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＴＭ；ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。得られたＰＣＲ産物を、ライゲーションキット（ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２；宝酒造社製）を用いて、クローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯＴＭ−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へサブクローンし、前記蛍光式自動シークエンサーを用いて塩基配列を解読した。
更に、前記ＮＣ５Ａプライマーと前記ＧＳＰ１プライマーとの組み合わせの代わりに、配列番号８で表される塩基配列からなるＦ３プライマーと、配列番号９で表される塩基配列からなる１５５Ｎ３プライマーとの組み合わせを用いること以外は、前記ＰＣＲ操作と、それに続く、ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の塩基配列解読の操作とを繰り返した。
以上の結果から、本発明による配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全長ＯＲＦは、配列番号１で表される塩基配列における第３７番〜第１２０３番の塩基からなる配列から構成されており、配列番号２で表されるアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝３８８）からなる新規ポリペプチドであることが判明した。そのドメイン構造は、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、分泌シグナル配列、コイルドコイルドメイン、及びフィブリノーゲン様ドメインから構成される分子であることが判った。この新規分子は、アンギオポイエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）ファミリー（Ｄａｖｉｓ　Ｓ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３７，１７３−１８５，１９９９）及びフィブリノーゲン様因子のｐＴ４９（Ｒｕｅｇｇ　Ｃ．ら，Ｇｅｎｅ，１６０，２５７−２６２，１９９５）と同様のドメイン構造をしていた。市販の配列相同性解析プログラム（ＭｅｇＡｌｉｇｎ；ＤＮＡＳＴＡＲ社製）でアミノ酸配列の相同性を調べた結果、最もホモロジーが高いものでも、アンギオポイエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）と約２１％であり、ｐＴ４９と約２２％であり、いずれも低かった。
なお、本願の優先日後に公開されたＷＯ０１／０５８２５号公報には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と１アミノ酸のみ異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列（ＣＧ１４４）、及びその推定アミノ酸配列の記載がある。ＷＯ０１／０５８２５号公報には、ＣＧ１４４がコードするポリペプチドが、アンギオポイエチンであると記載されているが、実験的裏付けはなく、また、本発明のポリペプチドが有するＩＩ型コラーゲン産生促進活性及びアグリカン産生促進活性については何ら記載されていない。
実施例２：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型発現ベクターの作製
ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素ＣｌａＩ及びＮｓｉＩで切断し、平滑末端化処理を行なった後、自己連結反応を行ない、ＥＢＮＡ１発現ユニットを除去した発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを作製した。このベクターを制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、アガロースゲル抽出した約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせた二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入した。得られたプラスミドの塩基配列を解析することにより、目的の配列を有することを確認し、プラスミドｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧと命名した。
このベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧを鋳型とし、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとし、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ；宝酒造社）を用いて、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（１分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。生じた約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで切断した後、ＸｂａＩで切断したベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧ（約７．７Ｋｂｐ）に挿入した。得られたクローンの中から、目的どおりに、プロモーターから下流に向かって、クローニングサイトであるＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、及びＢａｍＨＩの各認識配列、並びにＦＬＡＧタグがこの順に並んでいるクローンを選択し、ベクターｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧと命名した。
実施例３：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現プラスミドの構築
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎ末端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発現される。この分泌発現されたポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するためのプラスミドは、以下の手順で構築した。
まず、配列番号１で表される塩基配列における第３７番〜第１２００番の塩基からなる配列を有するポリヌクレオチドを、ＰＣＲにより取得した。すなわち、配列番号７で表される塩基配列からなるＮＣ５Ａプライマーと配列番号４で表される塩基配列からなるＧＳＰ１プライマーとをプライマーとし、市販のヒト卵巣のｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎａｔｉｖｅ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＴＭ；ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。得られたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
更に、前記ＮＣ５Ａプライマーと前記ＧＳＰ１プライマーとの組み合わせの代わりに、配列番号８で表される塩基配列からなるＦ３プライマーと、配列番号９で表される塩基配列からなる１５５Ｎ３プライマーとの組み合わせを用いること以外は、前記ＰＣＲ操作と、それに続く、ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の精製操作とを繰り返した。
これらの２種類の精製したＰＣＲ産物（すなわち、ＮＣ５ＡプライマーとＧＳＰ１プライマーとの組み合わせを用いて得られたＰＣＲ産物、及びＦ３プライマーと１５５Ｎ３プライマーとの組み合わせを用いて得られたＰＣＲ産物）を鋳型とし、前記ＮＣ５Ａプライマーと前記１５５Ｎ３プライマーとをプライマーとし、前記Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。得られたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
続いて、この精製したＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１４で表される塩基配列からなるＫ５Ａプライマーと、前記１５５Ｎ３プライマーとをプライマーとし、前記Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側にＫｐｎＩ認識配列及びコザック（Ｋｏｚａｋ）配列が付加され、３’側にＮｏｔＩ認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯＴＭ−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、前記実施例２で先に作製したｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧのＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＣＥＰ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
更に、配列番号１５で表される塩基配列からなる１５５ＸＢ５プライマーと、配列番号１６で表される塩基配列からなる１５５Ｘ３プライマーとをプライマーとし、プラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを鋳型とし、前記Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側にＸｂａＩ認識配列及びコザック配列が付加され、３’側にＸｂａＩ認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯＴＭ−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵素ＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９９）のＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＢＯＳ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
実施例４：シグナル配列及びＮ末端ＦＬＡＧ付加型発現ベクターの作製
ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素ＣｌａＩ及びＮｓｉＩで切断し、平滑末端化処理を行なった後、自己連結反応を行ない、ＥＢＮＡ１発現ユニットを除去した発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを作製した。このベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで切断した後、アガロースゲル抽出した約７．７ＫｂｐのＤＮＡ断片に、配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせた二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入した。目的の配列を有するクローンを選択し、プラスミドｐＣＥＰ４ｄ−ＳｉｇｎａｌＦＬＡＧと命名した。
実施例５：Ｎ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現プラスミドの構築
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列（すなわち、ポリペプチド２３／３８８のアミノ酸配列）を有する、シグナル配列を欠失したポリペプチドのＮ末端に、外来のシグナルペプチド及びＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するためのプラスミドは、以下の手順で構築した。前記の本発明のポリペプチドは、Ｎ末端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発現される。
まず、配列番号１で表される塩基配列における第１０３番〜第１２０３番の塩基からなる配列を有するポリヌクレオチドを、ＰＣＲにより取得した。すなわち、配列番号１９で表される塩基配列からなる１５５ＳＦＢプライマーと、配列番号２０で表される塩基配列からなる１５５ＴＸプライマーとをプライマーとし、前記実施例３で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを鋳型とし、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎａｔｉｖｅ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＴＭ；ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側にＢｃｌＩ認識配列が付加され、３’側にＸｈｏＩ認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯＴＭ−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵素ＢｃｌＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＣＥＰ４ｄ−ＳｉｇｎａｌＦＬＡＧのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＣＥＰ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
更に、配列番号２１で表される塩基配列からなるＸｂａＳＦプライマーと、配列番号２２で表される塩基配列からなる１５５ＴｅｒＸプライマーとをプライマーとし、プラスミドｐＣＥＰ−ＳＦ−ＣＤＦを鋳型とし、前記Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側及び３’側にＸｂａＩ認識配列がそれぞれ付加される。このＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯＴＭ−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵素ＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９９）のＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＢＯＳ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
実施例６：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現プラスミド及びバクミドの構築
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎ末端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発現される。この分泌発現されたポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するためのプラスミド及びバクミドは、以下の手順で構築した。
まず、配列番号１５で表される塩基配列からなる１５５ＸＢ５プライマーと、配列番号１６で表される塩基配列からなる１５５Ｘ３プライマーとをプライマーとし、前記実施例３で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを鋳型とし、前記Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側にＢｃｌＩ認識配列及びコザック配列が付加され、３’側にＸｂａＩ認識配列が付加される。このＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯＴＭ−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵素ＢｃｌＩ及びＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ１（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＦＢ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
更に、得られたプラスミドｐＦＢ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧと、市販のコンピテント細胞（ＤＨ１０　ＢＡＣ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ；ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）とを用いて、製品添付文書に従ってリコンビナントバクミドＤＮＡを調製した。得られたバクミドＤＮＡをＢＡＣ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧと命名した。
実施例７：Ｎ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現プラスミド及びバクミドの構築
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２３番〜第３８８番のアミノ酸からなる配列（すなわち、ポリペプチド２３／３８８のアミノ酸配列）を有する、シグナル配列を欠失したポリペプチドのＮ末端に、外来のシグナル配列及びＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するためのプラスミド及びバクミドは、以下の手順で構築した。前記の本発明のポリペプチドは、Ｎ末端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発現される。
まず、配列番号２１で表される塩基配列からなるＸｂａＳＦプライマーと、配列番号２２で表される塩基配列からなる１５５ＴｅｒＸプライマーとをプライマーとし、前記実施例５で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＳＦ−ＣＤＦを鋳型とし、前記Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返し、最後に、７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した目的ＤＮＡ断片には、５’側及び３’側にＸｂａＩ認識配列がそれぞれ付加される。このＤＮＡ断片をクローニング用ベクター（ｐＺｅｒＯＴＭ−２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵素ＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ１（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）のＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＦＢ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
更に、得られたプラスミドｐＦＢ−ＳＦ−ＣＤＦと、市販のコンピテント細胞（ＤＨ１０　ＢＡＣ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ；ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）とを用いて、製品添付文書に従ってリコンビナントバクミドＤＮＡを調製した。得られたバクミドＤＮＡをＢＡＣ−ＳＦ−ＣＤＦと命名した。
実施例８：Ｎ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチドの動物細胞株での発現
前記実施例５で先に作製した発現プラスミドｐＣＥＰ−ＳＦ−ＣＤＦを、市販のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、添付指示書に従って、２９３−ＥＢＮＡ細胞（ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社製）に導入した。プラスミド導入後、２〜３日間培養して得た培養上清中に目的ポリペプチドが存在することを、Ｎ末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２；Ｓｉｇｍａ社製）を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。
すなわち、前記培養上清を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２モノクローナル抗体アガロースアフィニティーゲル（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｇａｒｏｓｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌ；Ｓｉｇｍａ社製）にアプライし、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出された精製ポリペプチドをＳＤＳ含有アクリルアミドゲル（ＳＤＳ／４％〜２０％アクリルアミドゲル；第一化学薬品社製）を用いて電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロックエース（大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ社製又はＴＡＧＯ社製）とを、順次反応させた。あるいは、ブロッキング後、ビオチン化したマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社製）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシア社製）とを、順次反応させた。反応後、ウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬ　Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシア社製）を用いて、ポリペプチドの発現を確認した。
発現したポリペプチドの分子量は、還元条件のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）では５５ｋＤａであるのに対して、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは１３０ｋＤａ以上の異なる分子量であり、マルチマー構造をしていることが判明した。
実施例９：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチドの昆虫細胞株での発現
前記実施例６で先に作製した発現用バクミドＢＡＣ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを、市販のトランスフェクション試薬（ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎＴＭ　Ｒｅａｇｅｎｔ；ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いて、添付指示書に従って、Ｓｆ９細胞（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）に導入した。バクミド導入後、２〜３日間培養して得た培養上清中に目的ポリペプチドが存在することを、Ｃ末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体を用いて確認した。
すなわち、前記培養上清を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２モノクローナル抗体アガロースアフィニティーゲル（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｇａｒｏｓｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌ；Ｓｉｇｍａ社製）にアプライし、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出された精製ポリペプチドをＳＤＳ含有アクリルアミドゲル（ＳＤＳ／４％〜２０％アクリルアミドゲル；第一化学薬品社製）を用いて電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロックエース（大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社製）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ社製又はＴＡＧＯ社製）とを、順次反応させた。あるいは、ブロッキング後、ビオチン化したマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社製）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシア社製）とを、順次反応させた。反応後、ウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬ　Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシア社製）を用いて、ポリペプチドの発現を確認した。
発現したポリペプチドの分子量は、還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは５０ｋＤａであるのに対して、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは１００ｋＤａ以上の異なる分子量であり、マルチマー構造をしていることが判明した。
実施例１０：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの発現分布解析
（１）鋳型ｃＤＮＡの調製
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの発現分布解析は、定量ＰＣＲ法で実施した。ヒト組織での発現分布解析は、市販のｃＤＮＡパネル［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃＤＮＡ（ＭＴＣＴＭ）Ｐａｎｅｌの内、Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ　Ｉ、Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ　ＩＩ、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ、Ｈｕｍａｎ　Ｆｅｔａｌ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ、Ｈｕｍａｎ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ、及びＨｕｍａｎ　Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ］を用いて実施した。
また、ヒト膝関節軟骨組織及びヒト培養細胞での発現分布解析では、ヒト膝関節軟骨組織及びヒト培養細胞から、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ＩＳＯＧＥＮ；Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られた総ＲＮＡをＤＮアーゼ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ社製）を用いて、３７℃で１５分間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇを、スーパースクリプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いてｃＤＮＡに変換した。
（２）定量ＰＣＲによる配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの定量
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡのヒト組織及びヒト培養細胞での発現分布解析は、前記実施例１０（１）で調製したｃＤＮＡ、あるいは、前記実施例１０（１）で説明した市販のｃＤＮＡパネルを鋳型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行なった。なお、配列番号６で表される塩基配列からなるＦ１プライマーと、配列番号２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマーセットとして用いた。ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　ｃｏｒｅ　ｒｅａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６０秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。
また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件のＰＣＲを行なった。更に、内部標準としてヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇ３ｐｄｈ）の発現量を算出するために、前記ｃＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとして、同条件のＰＣＲを行なった。一定量のｍＲＮＡ当たりの、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの発現量を得るために、各組織及び細胞における配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの発現量は、各組織及び細胞でのｇ３ｐｄｈのｍＲＮＡの発現量に対する割合で示した。
本発明による配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡは、ヒト組織の内、関節軟骨及び卵巣に特異的に発現していた。関節軟骨及び卵巣以外のヒト組織については、市販のｃＤＮＡパネルを用いて４７種類の異なるヒト組織を用いて発現を調べたが、いずれの組織でもほとんど発現していなかった。また、ヒト培養癌細胞株では、軟骨肉腫細胞株であるＨＣＳ−２／８でのみ発現が確認され、その他の９６種類のヒト癌細胞ではほとんど発現していなかった。更に、ヒト初代培養正常細胞では、ヒト関節軟骨細胞でのみ発現が確認され、４種類のヒト血管内皮細胞及び間葉系幹細胞ではほとんど発現していなかった。
実施例１１：軟骨細胞分化に伴う配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの発現誘導
（１）間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導
ヒト間葉系幹細胞は、ＴＧＦ−β３等の刺激下でスフェロイド培養することにより、軟骨細胞に分化することが知られている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ　Ｍ．Ｆ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７，１９９９）。
正常ヒト間葉系幹細胞（Ｂｉｏ　Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を、ヒト間葉系幹細胞増殖培地キット（Ｂｉｏ　Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で培養して５×１０５個の細胞を得た。続いて、２．５×１０５個の細胞を、不完全軟骨分化誘導培地［ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌプロリン（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、０．１μｍｏｌ／Ｌデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１７ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２−リン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、及びＩＴＳ＋１　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ社製）］で洗浄した後、完全軟骨分化誘導培地［０．０１μｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３（Ｓｉｇｍａ社製）を含む不完全軟骨分化誘導培地］５００μｌに細胞を懸濁し、ポリプロピレンチューブを用いて１５０×ｇで５分間遠心分離することにより細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを、そのまま細胞培養装置中で培養して、３〜４日に一度、完全軟骨分化誘導培地に培地交換しながら、２週間培養を継続して、軟骨細胞に分化させた。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの発現誘導
未分化ヒト間葉系幹細胞及び分化した軟骨細胞から、それぞれ、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ＩＳＯＧＥＮ；Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られた総ＲＮＡをＤＮアーゼ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ社製）を用いて、３７℃で１５分間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇをスーパースクリプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いてｃＤＮＡに変換した。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの未分化ヒト間葉系幹細胞及び分化した軟骨細胞での発現分布解析は、前記実施例１０（２）と同様にして行なった。また、間葉系幹細胞が軟骨細胞に分化したことを確認するために、軟骨細胞に特異的に発現しているＩＩ型コラーゲン及びＩＸ型コラーゲンの各ｍＲＮＡ発現を確認した。ＩＩ型コラーゲンの発現は、配列番号２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとして、そして、ＩＸ型コラーゲンは、配列番号２８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとして、前記実施例１０（２）に記載した方法により遺伝子発現量を測定した。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の、ヒト間葉系幹細胞の軟骨分化前後での発現を測定した結果を、図１に示す。軟骨への分化前の間葉系幹細胞では、ＩＩ型コラーゲン及びＩＸ型コラーゲンは共にほとんど発現していないが、軟骨細胞へ分化することで、ＩＩ型コラーゲン及びＩＸ型コラーゲンの各遺伝子発現が誘導された。このことより、間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化したことが確認された。また、図１に示すように、本発明による配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡは、分化前の間葉系幹細胞では殆ど発現していなかったが、軟骨細胞に分化することにより、４０倍と顕著に発現が誘導された。
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｍＲＮＡの発現誘導の経時的分析
次いで、ヒト間葉系幹細胞の軟骨細胞分化の過程での、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現誘導を詳細に調べた。実施例１１（１）に記載の方法で、ヒト間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させた。未分化ヒト間葉系幹細胞並びに分化誘導後、２、４、８、１４、１７、２２、及び２８日間培養した細胞を用い、実施例１１（２）に記載の方法で総ＲＮＡ及びｃＤＮＡを調製した。各細胞での、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの遺伝子発現量は、実施例１０（２）に記載の方法で調べた。その結果、未分化ヒト間葉系幹細胞に比べて、分化誘導後２、４、８、１４、１７、２２、及び２８日間の培養により、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの遺伝子発現量は、それぞれ１、２、５、４、６、１２、及び１６倍増加した。本結果より、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの遺伝子は、軟骨分化に伴い、発現が誘導されることがより明確になった。
実施例１２：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチドによる軟骨細胞の分化誘導活性
ヒト関節軟骨細胞（ＢＩＯ　ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）を、軟骨細胞増殖培地（ＢＩＯ　ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）を用いて６ウエルプレートで約７０％コンフルエントまで培養した。前記実施例３で先に作製した発現プラスミドｐＢＯＳ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧ（２μｇ）又はコントロール用プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（２μｇ）を、それぞれ、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、添付指示書に従って、前記ヒト関節軟骨細胞に導入した。軟骨細胞分化培地（ＢＩＯ　ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）で３日間培養した細胞から、前記実施例１０（１）に記載の方法と同様にして、総ＲＮＡの調製及びｃＤＮＡへの変換を実施した。
ＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量は、得られた前記ｃＤＮＡを鋳型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行なった。なお、配列番号２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマーセットとして用いた。ＰＣＲは、ＰＣＲ試薬（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　ｃｏｒｅ　ｒｅａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６０秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。
また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るために、ヒト軟骨肉腫細胞株であるＨＣＳ−２／８細胞から調製したｃＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件のＰＣＲを行なった。更に、内部標準としてヒトｇ３ｐｄｈの発現量を算出するために、前記ｃＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとして、同条件のＰＣＲを行なった。一定量のｍＲＮＡ当たりのＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡの発現量を得るために、各細胞でのＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡの発現量は、各細胞でのｇ３ｐｄｈのｍＲＮＡの発現量に対する割合で示した。
Ｃ末端にＦＬＡＧ配列を付加した本発明のポリペプチドの発現プラスミドｐＢＯＳ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを、関節軟骨細胞にトランスフェクションすることにより、コントロール用プラスミドであるｐＥＦ−ＢＯＳをトランスフェクションした場合に比べて、ＩＩ型コラーゲンの発現量が約２倍上昇した。
以上より、本発明のポリペプチドをヒト関節軟骨細胞で発現させることにより、ＩＩ型コラーゲンの発現を促進することが明らかである。
実施例１３：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのゲノム構造と染色体マッピング
配列番号１で表される塩基配列と、アクセッションＮｏ．ＡＣ０１５５００のヒトゲノムドラフト配列とについて、配列相同性解析プログラム（ＭｅｇＡｌｉｇｎ；ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を用いてアライメントを行ない、前記ゲノムドラフト配列から、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮＡのエクソン及びイントロンを明らかにした。その結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮＡは、配列番号１で表される塩基配列における１番〜１３２番の塩基からなる配列を有するエクソン１、配列番号１で表される塩基配列における１３３番〜２７７番の塩基からなる配列を有するエクソン２、配列番号１で表される塩基配列における２７８番〜３８１番の塩基からなる配列を有するエクソン３、配列番号１で表される塩基配列における３８２番〜４７５番の塩基からなる配列を有するエクソン４、配列番号１で表される塩基配列における４７６番〜５７６番の塩基からなる配列を有するエクソン５、配列番号１で表される塩基配列における５７７番〜６９７番の塩基からなる配列を有するエクソン６、配列番号１で表される塩基配列における６９８番〜８８３番の塩基からなる配列を有するエクソン７、及び配列番号１で表される塩基配列における８８４番〜１７０２番の塩基からなる配列を有するエクソン８の合計８個のエクソンから構成されていることが判った。
前記実施例１で得られた配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮＡに関して、ＧｅｎＢａｎｋに対するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）（Ｓ．Ｆ．ＡＬｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５．４０３−４１０，１９９０）検索を行なった。その結果、アクセッションＮｏ．ＡＰ００２３７２及びアクセッションＮｏ．ＡＰ０００６３４の各ＢＡＣクローンに、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｃＤＮＡが含まれることが判った。これらのＢＡＣクローンはそれぞれ、約１５万及び約４万塩基対から構成されていて、いずれもヒト染色体の１１ｑ２２にマッピングされている。従って、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの遺伝子は、ヒト染色体の１１ｑ２２にマッピングされることが判った。ヒト染色体の１１ｑ２２には、ＯＡになりやすい家系やＯＡ患者の遺伝学的調査により、ＯＡ疾患に関連する感受性遺伝子が連鎖することが報告されている（Ｃｈａｐｍａｎ　Ｋ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６５，１６７−１７４，１９９９）。従って、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの遺伝子の変異が、ＯＡの感受性を規定している変異である可能性が考えられる。
実施例１４：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチド発現アデノウイルスベクターの構築
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎ末端の分泌シグナル配列が切断されて分泌発現される。この分泌発現されたポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧを付加した本発明のポリペプチドを発現するためのウイルスベクターは、以下の手順で構築した。
まず、配列番号３０で表される塩基配列からなる１５５ＫＢ５プライマーと配列番号３１で表される塩基配列からなる１５５Ｘｈ３プライマーとをプライマーとし、実施例３で先に作製したプラスミドｐＣＥＰ−ＣＤＦ−ＦＬＡＧを鋳型とし、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎａｔｉｖｅ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＴＭ；ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＤＮＡポリメラーゼとして、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、９４℃（２分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７４℃（２分間）とからなるサイクルを４０回繰り返し、最後に７４℃（５分間）の最終伸長反応を行なった。こうして生成した５’側にＫｐｎＩ認識配列及びコザック配列を、３’側にＸｈｏＩ認識配列が付加された目的ＤＮＡ断片を、クローニング用ベクター（ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローンして配列を確認した後、制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切断し、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（Ｈｅ　Ｔ．−Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，２５０９−２５１４，１９９８）のＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇと命名した。
大腸菌ＢＪ５１８３（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１（Ｈｅ　Ｔ．−Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，２５０９−２５１４，１９９８）でトランスフォームして、プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１を含む大腸菌ＢＪ５１８３［以下、大腸菌ＢＪ５１８３（ｐＡｄＥａｓｙ−１）と称する］を作製した。先に調製したプラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇを制限酵素ＰｍｅＩで切断し、これを用いて大腸菌ＢＪ５１８３（ｐＡｄＥａｓｙ−１）をトランスフォームした。プラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１とプラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇとがリコンビネーションしたクローンを選択するために、得られたトランスフォーマントのクローンからプラスミドを調製して、制限酵素ＸｈｏＩによる切断パターンを調べた。プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇの場合、４．５ｋｂのエキストラバンド（ｅｘｔｒａ　ｂａｎｄ）が出現するクローンを選択した。その結果、プラスミドのアーム部位で、デザインどおりにリコンビネーションを起こしたクローンを得ることができ、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇと命名した。
また、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇの代わりに、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（すなわち、空ベクター）を用いること以外は、前記手順を繰り返すことにより、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＭＶを作製した。なお、プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶの場合には、３ｋｂのエキストラバンドの出現を指標にクローンを選択した。
実施例１５：ウイルスの産生及び精製
実施例１４で作製したウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇを制限酵素ＰａｃＩで切断し、市販のトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００；ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製］を用いて、添付指示書に従って、ＨＥＫ２９３細胞（大日本製薬社製）に導入した。トランスフェクションした後、８日間培養し、ウイルスの産生が確認できた時点で細胞を回収した。ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ユニットを有しているため、このプラスミドを導入した細胞は蛍光顕微鏡を用いて容易に判別することができる。回収した細胞をＰＢＳに縣濁して、数回の凍結融解後、遠心分離した上精を回収して、一次ウイルス溶液ｖＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇを得た。得られたウイルスを、ＨＥＫ２９３細胞に添加後、３日間培養を行ない、約５０％の細胞が剥がれた時点で細胞を回収して、凍結融解によりウイルス画分を調製して、二次ウイルス溶液を得た。前記のウイルス感染、細胞回収、及びウイルス画分調製を、更に２回繰り返すことにより、最終的に、フラスコ（底面積＝１５０ｃｍ２）１０枚で培養したウイルス感染ＨＥＫ２９３細胞よりウイルス溶液を得た。塩化セシウム密度勾配法によりウイルス溶液を更に精製した。精製したウイルス溶液を緩衝液［１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２，１３５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ］に透析した後、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）を測定して、ウイルスのパーティクル濃度（単位＝パーティクル／ｍｌ）を、式：
Ａ２６０×１．１×１０１２
により求めた。その結果、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇをトランスフェクトして得られたウイルスｖＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇについては、１．２×１０１１パーティクル／ｍＬのウイルスパーティクルが得られた。
また、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇの代わりに、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＭＶを用いること以外は、前記手順を繰り返すことにより、ウイルスベクターｐＡｄ−ＣＭＶをトランスフェクトして得られたウイルスｖＡｄ−ＣＭＶについては、５．９×１０１０パーティクル／ｍＬのウイルスパーティクルが得られた。
実施例１６：Ｃ末端ＦＬＡＧ付加型ポリペプチドによる軟骨細胞の分化誘導活性
ヒト関節軟骨細胞（ＢＩＯ　ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）を軟骨細胞増殖培地（ＢＩＯ　ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）を用いて６ウエルプレートで約７０％コンフルエントまで培養した。前記実施例１５で先に作製した各ウイルス（ウイルスｖＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇ、又はネガティブコントロール用ウイルスｖＡｄ−ＣＭＶ）を、各ウイルスについて、３×１０７パーティクル／ｗｅｌｌ又は１×１０８パーティクル／ｗｅｌｌの２段階のパーティクル濃度で添加した。軟骨細胞分化培地（ＢＩＯ　ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）で４日間又は７日間培養した後、細胞を回収して、ＲＮＡ調製キット（ＲＮｅａｓｙ；ＱＩＡＧＥＮ社製）及びＤＮアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付文書に従ってＤＮａｓｅ処理を行なった総ＲＮＡを調製した。更に、ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇを、スーパースクリプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いてｃＤＮＡに変換した。
ＩＩ型コラーゲンの遺伝子発現量は、作製したｃＤＮＡを鋳型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、リアルタイムの蛍光量を計測することで測定した。配列番号３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号３３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマーセットとして用いた。ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　ｃｏｒｅ　ｒｅａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６０秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るため、３週間の軟骨分化刺激を行ったヒト間葉系幹細胞から調製したｃＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件のＰＣＲを行なった。
アグリカンの遺伝子発現量は、作製したｃＤＮＡを鋳型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、リアルタイムの蛍光を計測することで測定した。配列番号３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号３５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマー、そして、配列番号３６で表される塩基配列からなる蛍光標識オリゴヌクレオチド（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をタックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブとして用いた。ＰＣＲは、タックマンバッファー（ＴａｑＭａｎ　Ｂｕｆｆｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９５℃（１５秒間）と６０℃（６０秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るため、未刺激のヒト関節軟骨細胞、あるいは、３週間の軟骨分化刺激を行なったヒト間葉系幹細胞から調製したｃＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件のＰＣＲを行なった。
更に、内部標準としてヒトｇ３ｐｄｈの発現量を算出するため、前記ｃＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとして、同条件のＰＣＲを行なった。
一定量のｍＲＮＡ当たりの本発明のポリペプチドの発現量を得るため、各細胞でのＩＩ型コラーゲン遺伝子及びアグリカン遺伝子の発現量は、各細胞でのｇ３ｐｄｈ発現量に対する割合で示した。
各培養日数及び各感染ウイルス濃度におけるＩＩ型コラーゲン遺伝子及びアグリカン遺伝子の各発現量を、コントロール用ウイルスｖＡｄ−ＣＭＶを感染させた場合の発現量に対する相対値として、表１に示す。その内、感染後７日目のＩＩ型コラーゲン遺伝子の発現量を図２に示し、感染後４日目のアグリカン遺伝子の発現量を図３に示す。
ヒト関節軟骨細胞は、もともとＩＩ型コラーゲン及びアグリカン遺伝子を産生しているが、本発明のポリペプチドをアデノウイルスベクターを用いて細胞に強制発現させることにより、表１に示すように、両遺伝子の発現量を上昇させた。ネガティブコントロールとしては、本発明のポリペプチドのｃＤＮＡを含まないウイルス（ｖＡｄ−ＣＭＶ）を用いた。
ウイルスｖＡｄ−ＣＤＦ−Ｆｌａｇを感染させて本発明のポリペプチドを発現する関節軟骨細胞は、コントロールのウイルスｖＡｄ−ＣＭＶを感染させた場合に比べて、ＩＩ型コラーゲンの発現量については、３×１０７パーティクル／ｗｅｌｌ又は１×１０８パーティクル／ｗｅｌｌの濃度でウイルスを添加した場合、４日間の培養でいずれも約２倍上昇し、７日間の培養でそれぞれ約６倍又は約９倍上昇した。また、アグリカンの発現量については、３×１０７パーティクル／ｗｅｌｌ又は１×１０８パーティクル／ｗｅｌｌの濃度でウイルスを添加した場合、４日間の培養でそれぞれ約２倍又は約７倍上昇し、７日間の培養で約２倍又は約３倍上昇した。
以上より、本発明のポリペプチドをヒト関節軟骨細胞で発現させることにより、ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンの発現を促進することが明らかである。
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産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドの内、ＩＩ型コラーゲン産生促進活性を有するポリペプチドは、ＩＩ型コラーゲンが関節軟骨として機能するために重要な役割を担っているので、関節軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン産生促進用医薬組成物の有効成分として有用である。また、ＯＡ疾患ではＩＩ型コラーゲンが減少しているため、変形性関節症治療及び／又は予防用医薬組成物の有効成分としても有用である。
本発明のポリペプチドの内、アグリカン産生促進活性を有するポリペプチドは、アグリカンが関節軟骨として機能するために重要な役割を担っているので、アグリカン産生促進用医薬組成物の有効成分として有用である。また、アグリカンは軟骨組織を構成する主要なプロテオグリカンであり、ＯＡ疾患ではアグリカンが分解及び変性されるので、変形性関節症の治療及び／又は予防用医薬組成物の有効成分としても有用である。
本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、及び抗体は、本発明のポリペプチドを製造するのに有用である。
また、本発明のポリヌクレオチド及び発現ベクターは、ＩＩ型コラーゲン産生促進、アグリカン産生促進、及び／又は変形性関節症治療及び／又は予防のための遺伝子治療に用いることができる。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号９、１２〜１６、１９〜２２、３０、及び３１の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、また、配列表の配列番号１０、１１、１７、及び１８の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したリンカー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト間葉系幹細胞の軟骨分化前後での、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を示すグラフである。
図２は、感染後７日目のＩＩ型コラーゲン遺伝子の発現量を示すグラフである。
図３は、感染後４日目のアグリカン遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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