(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤がオカダ酸とカリクリンＡの少なくとも１つである未成熟凝縮染色体生成剤であって、Ｇ１（ギャップ１期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２（ギャップ２期）、およびＭ期（分裂中期）のいずれの段階においても未成熟凝縮染色体を生成することのできる未成熟恐縮染色体生成剤。
【請求項２】
蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤がオカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸およびエンドタールから成る群から選ばれる少なくとも１種である未成熟凝縮染色体生成剤であって、Ｇ１（ギャップ１期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２（ギャップ２期）、およびＭ期（分裂中期）のいずれの段階においても未成熟凝縮染色体を生成することのできる未成熟凝縮染色体生成剤。
【請求項３】
オカダ酸とカリクリンＡの少なくとも１つを含む細胞培養液に浸漬処理することから成る未成熟凝縮染色体生成方法であって、Ｇ１（ギャップ１期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２（ギャップ２期）、およびＭ期（分裂中期）のいずれの段階においても未成熟凝縮染色体を生成することができる未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項４】
オカダ酸あるいはカリクリンＡの濃度が１−１００ｎＭである溶液を用いる請求項３の未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項５】
オカダ酸の濃度が１００ｎＭ以上の溶液でＧ１期、Ｓ期、あるいはＧ２期の未成熟凝縮染色体（ＰＣＣ）を生成し、あるいは１ｎＭ−１０ｎＭの溶液でＧ２期のＰＣＣを生成する請求項３または４の未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項６】
カリクリンＡの濃度が１０ｎＭ以上の溶液でＧ１期、Ｓ期、あるいはＧ２期のＰＣＣを生成し、あるいは１ｎＭの溶液でＧ２期のＰＣＣを生成する請求項３または４の未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項７】
生細胞を、オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸およびエンドタールから成る群から選ばれる少なくとも１種を含む細胞培養液に浸漬処理することから成る未成熟凝縮染色体生成方法であって、Ｇ１（ギャップ１期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２（ギャップ２期）、およびＭ期（分裂中期）のいずれの段階においても未成熟凝縮染色体を生成することができる未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項８】
オカダ酸アンモニウムあるいは３５−メチルオカダ酸の濃度が１−１００ｎＭである溶液を用いる請求項７の未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項９】
オカダ酸アンモニウムあるいは３５−メチルオカダ酸の濃度が１００ｎＭ以上の溶液でＧ１期、Ｓ期、あるいはＧ２期のＰＣＣを生成し、または１ｎＭ−１０ｎＭの溶液でＧ２期のＰＣＣを生成する請求項８の未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項１０】
タウトマイシンの濃度が１００ｎＭ−１０μＭである溶液を用いる請求項９の未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項１１】
タウトマシンの濃度が１μＭ以上の溶液でＧ１期、Ｓ期、あるいはＧ２期のＰＣＣを生成し、あるいは１００ｎＭの溶液でＧ２期のＰＣＣを生成する請求項１０の未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項１２】
カンタリジン、カンタリジン酸、あるいはエタンドールの濃度が５００ｎＭ−５０μＭである溶液を用いる請求項７の未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項１３】
カンタリジン、カンタリジン酸、あるいはエタンドールの濃度が５μＭ以上の溶液でＧ１期、Ｓ期、あるいはＧ２期のＰＣＣを生成し、または５００ｎＭの溶液でＧ２期のＰＣＣを生成する請求項７の未成熟凝縮染色体生成方法。
【請求項１４】
ヒトの生細胞の染色体の検査に使用される請求項１または２の未成熟凝縮染色体生成剤。
【請求項１５】
獣医学、動・植物学の分野で生細胞の染色体検査に使用される請求項１または２の未成熟凝縮染色体生成剤。
【請求項１６】
請求項１または２の未成熟凝縮染色体生成剤から成る細胞の未成熟凝縮染色体検査用の試薬キットならびに検査キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医学、獣医学、動・植物学などの分野において、種々の手段により得られた生細胞より、光学顕微鏡や電子顕微鏡で観察する際の染色体の生成方法に関し、より具体的には海綿から抽出あるいは合成された、オカダ酸などの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤を使用して、未成熟染色体凝縮法により未成熟凝縮染色体を作成する生成剤と生成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人間や生物の体の各部分は、それぞれの機能に応じて細胞が種々の状態に配列した組織から構成され、それらの細胞を光学顕微鏡や電子顕微鏡で観察すると、それぞれの細胞は、隣接する同種の細胞や間質腔が境界で区分されて独立した単位として存在し、各細胞の中央部に大きな球状の核があって、その内部には細胞内の塩基性の色素によく染められるクロマチン（染色質）と呼ばれる斑点状のものが散在している。
球状の核の周囲は細胞質と呼ばれ、その内部に多数の球形、楕円形、ヒゲ状などの構造体が存在し、細胞質の主成分は水で、その中にナトリウム、カリウムなどの無機イオンと、有機物としての蛋白質、炭水化物、脂質などを含んでいる。
前記の核も同様に境界で区分された内部にコロイド系があり、染色質や核小体がコロイド系内を浮遊している。
細胞の中には、前記のように核を有するもの（真核細胞）と、核として識別される構造体を有しないもの（前核細胞）とに大別される。
【０００３】
人体や生物体を構成する細胞は、例外として、一旦成熟すると二度と分裂しない神経や骨格筋と、通常は分裂しないが、肝臓や腎臓の細胞のように損傷がおきると損傷を埋めるように分裂を開始するものがあり、有糸分裂と呼ばれる方式で分裂し増殖を行う。
有糸分裂では図１に示すように、Ｇ１（ギャップ１）期→Ｓ期（ＤＮＡ合成期）→Ｇ２（ギャップ２）期→Ｍ期（分裂中期）→分裂後期→Ｇ１期の順に循環するサイクルを経ながら増殖し分裂を繰り返していく。
第１段階では核内の染色質から染色体ができて、分裂前期（Ｇ２期）では染色質のフィラメントが凝縮し、ヒトでは４６本の染色体に変わり、同時に核膜も消失する。
染色体は化学的には、ＤＮＡと呼ばれる核酸とヒストンと呼ばれる塩基性蛋白質などからなり、娘細胞に正確に分配されることにより、ＤＮＡに含まれる遺伝情報が次の世代に伝えられる。
前述した有糸分裂の中期（Ｍ期）では、個々の染色体が分割されて細胞の両極に集まり細胞質も中央部がくびれ、Ｍ期後期（分裂後期）になると、くびれた部分から分裂して染色体の周りに核膜が形成され、染色体は脱凝縮し静止核となりＧ１期にもどる。
真核生物においては、核内の遺伝子はＭ期において前述した染色体の形態をとり（遺伝子が凝縮したもの）、同時に紡垂糸が形成され２個の細胞に染色体が均等に分配され細胞が分裂し、分裂完了後染色体は脱凝縮し間期核となる。
細胞に紡垂糸形成の阻害剤であるコルヒチンあるいはその誘導体（コルセミドなど）を作用させて、Ｍ期に細胞を停止させることにより染色体を得ることが従来広く用いられている方法である。
しかしながら、この方法は細胞が上記のＭ期に達することが必須であり、細胞分裂が盛んな細胞では有効であるが、例えば神経細胞のように細胞分裂を起こしていない細胞、あるいは各種の固型腫瘍のように細胞分裂が盛んでない細胞では染色体を得るのが困難なことが多いことは、専門家の間では周知のことである。
このため、これら組織の染色体の解析には支障を来していた。
【０００４】
この点を改良するための方法として、Ｒaoらによって初めて報告された未成熟染色体凝縮法（Ｐremature Ｃhromosome Ｃondensation：ＰＣＣと称する）が知られている。
このＰＣＣの用語は上記のように未成熟染色体凝縮法（Premature ChromosomeCondensation）の略語として方法を示すために用いられる場合と、未成熟凝縮染色体（Premature Condensed Chromosome）を示すために用いられる場合とがあり、省略語ＰＣＣとしては同一であるが、文脈の前後関係から上記のいずれかを判断する必要がある。本発明では方法を示す場合はＰＣＣ法として示す。
図２は、前記のＲaoらによる古典的なＰＣＣ法を示す模式図であり、この方法は分裂中期（Ｍ期）に同調停止させた細胞（融合細胞）ａを、観察の対象とする細胞（被融合細胞）ｂと細胞融合させることにより、融合細胞中に存在する染色体凝縮促進因子（Ｍaturation Ｐromoting Ｆactor：以下ＭＰＦと称する）の働きで被融合細胞の間期核を凝縮させ、染色体の形態を誘発させるもので、被融合細胞の上記細胞周期の状態により生じる染色体構造物は、Ｇ１−ＰＣＣ、Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣ染色体と分類して呼ばれる。
図３は、これらの染色体の細胞周期を示す光学顕微鏡写真（x 1000）である。
図３において、符号ａ−ｆで示された組織の中、ａ−ｃはＧ１−ＰＣＣ染色体、ｄ−ｅはＳ−ＰＣＣ染色体、ｆはＧ２−ＰＣＣ染色体を示す。
図中に記入した太い矢印は融合細胞由来の染色体であり、細い矢印は被融合細胞由来の染色体である。
この方法は、Ｍ期に達しない細胞からでも染色体を得ることできるという利点を有している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記ＰＣＣ法は、
１）大量のＭ期同調細胞を用意する必要があること、
２）細胞融合を行う必要があること、
３）細胞融合の効率が高くないこと、
など技術的に困難（確立されていない）な点と、多大な労力が要求される点などの課題を有しているため、一般には普及されていない。
また、ＰＣＣ法で得られる染色体は、融合細胞と被融合細胞との染色体が混在するため染色体の解析も容易でなく、且つ明確でないという欠点を有している。
これらの課題を解消して効率的に且つ確実に染色体を作成することが本発明の目的である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明では、未成熟染色体凝縮による染色体の生成法として平成６年８月１２日に出願した際に使用した、オカダ酸、カリクリンＡなどの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤に加え、現在入手可能な蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤で細胞透過性を有するものとして、オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸（ジノフィジトキシン）、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールを試薬として使用し、細胞培養中に上記試薬を培養液中に加えることにより、上記の課題を解決した。
上記のオカダ酸、カリクリンＡは、いずれも海綿から得られる物質であり、その化学構造は次に示される。
オカダ酸は、クロイソカイメン（Ｈarichondria Ｏkadai）から抽出され、その化学構造はＣ44Ｈ68Ｏ13で、分子量は８０５.２である。オカダ酸アンモニウム（Ｏkadaic acid ammonium salt  Ｃ44Ｈ67Ｏ13−ＮＨ4分子量８２２.０５）、３５−メチルオカダ酸（35-methyl okadaic acid  Ｃ45Ｈ70Ｏ13  分子量８１９.０４）は、オカダ酸の誘導体である。
カリクリンＡは、チョコガタイシカイメン（Ｄiscodermia Ｃalyx）から抽出され、その化学構造はＣ50Ｈ81Ｎ4Ｏ15Ｐで、分子量は１００９.１８である。
タウトマイシン（Ｔautomycin  Ｃ41Ｈ66Ｏ13  分子量７６６.９７）は、土壌細菌ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces spiroverticillatus）より得られる抗生物質である。
カンタリジン（Ｃantharidine  Ｃ10Ｈ12Ｏ4  分子量１９６.２）は、ツチハンミョウ（Ｂlister Ｂeetle）の分泌液より得られる物質である。また、カンタリジン酸（Ｃanthardic Ａcid  Ｃ10Ｈ14Ｏ5  分子量２１４.２）、エンドタール（Ｅndothal  Ｃ8Ｈ10Ｏ5  分子量１８６.２）は、カンタリジンの誘導体である。
蛋白質脱リン酸化酵素とは、リン酸化された蛋白質のセリン／スレオニン残基の脱リン酸化反応を触媒する酵素である。
細胞培養は、５％ＣＯ2、９５％湿度、３７℃の条件で行った。
染色体の作成は、上記条件で培養の対数増殖期の細胞に、本発明に使用した薬剤を所定濃度添加し、２時間培養を続ける。細胞は回収後、７５ｍＭ塩化カリウム溶液で低張処理を行った後、３：１  メタノール：酢酸  液で固定し、スライドグラス上に展開した。
オカダ酸、３５−メチルオカダ酸、カリクリンＡ、タウトマイシンは、１００％エタノール、メタノール、あるいはＤＭＳＯ（Ｄimethyl sulfoxide）に１ｍＭの濃度に溶解して使用した。
オカダ酸アンモニウムは、水、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯに１ｍＭの濃度に溶解して使用した。
カンタリジン、エタノールは、１００％エタノール、メタノール、あるいはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度に溶解して使用した。
カンタリジン酸は、１００％エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、あるいは水に１００ｍＭの濃度に溶解して使用した。
上記のオカダ酸、カリクリンＡ、タウトマイシン、オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールなどを含む溶液中に細胞を所定の時間浸漬処理して、Ｍ期に達していない細胞からも染色体を生成することを可能にして課題を解決した。
また、これらの染色体生成剤と溶媒とをセットとして、ヒトの生細胞あるいは獣医学、動植物学などの分野での生細胞の未成熟凝縮染色体検査用の試薬キットならびに検査キットとして利用することを可能にした。
【０００７】
【発明の実施の形態】
実施の形態１：
実施の形態１として、被験細胞を、オカダ酸、カリクリンＡで３０分−２時間処理し、比較例として従来の方法であるコルセミド０．１μｇ／ｍｌで２時間処理した。薬剤の濃度は、特に明記しない限り細胞培養液中の濃度（最終濃度）で示す。
オカダ酸の濃度が１−１０ｎＭ（ナノモラー）の場合には、Ｇ２−ＰＣＣ染色体を、１００ｎＭの場合には、Ｇ１−ＰＣＣ、Ｓ−ＰＣＣおよびＧ２−ＰＣＣ染色体を、それぞれ容易に得ることが可能であった。
カリクリンＡ濃度が１ｎＭの場合には、Ｇ２−ＰＣＣ染色体を、１０−１００ｎＭの場合には、Ｇ１−ＰＣＣ、Ｓ−ＰＣＣおよびＧ２−ＰＣＣ染色体を、それぞれ容易に得ることが可能であった。
これらの染色体を得る効率は、従来の方法であるコルセミドを使用する方法より高く、また従来の方法によっては細胞分裂が盛んでないことから染色体がほとんど得られないような場合でも、上記のオカダ酸やカリクリンＡによる処理を行うことによって染色体を得ることが可能であった。
【０００８】
図４は、従来のコルセミド法により得られた染色体の光学顕微鏡写真（x 1000）である。
本発明によって得られた染色体のうち、図５のａは低濃度（１−１０ｎＭ）オカダ酸で誘発される未成熟凝縮染色体であるが、形態的な相違はなく各種の染料を使用しても従来法による染色体に対するのと同等に染色することが可能であり、染色体の解析に関し問題はなかった。
表１は、ヒトリンパ球（ＰＨＡ−Ｐ刺激）、ヒト樹立細胞株ＡＴ（Ｌ）５ＫＹ、ＡＴ（Ｌ）６ＫＹ、マウスリンパ球（コンカナバリンＡ、ＬＰＳ  刺激）およびマウス樹立細胞株Ｂａ／Ｆ３を試料とし、細胞培養中に、比較例として従来の分裂中期染色体を得る方法としてコルセミドを、本発明の未成熟凝縮染色体の生成剤である蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤としてのオカダ酸を、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭの３種の濃度で処理し染色体標本を作成し、間期核、生成されたＧ１−ＰＣＣ、Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣ、あるいはＭ期ＰＣＣ染色体（コルセミド処理例）のそれぞれの数とその割合（括弧内に表示）とを示したものである。
【０００９】
【表１】
0003834080.tif 000002
表１中の記号Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣは、Ｇ１／Ｓ期の細胞に誘導されるＰＣＣを、また、Ｇ２／Ｍ−ＰＣＣは、Ｇ２／Ｍ期の細胞に誘導されるＰＣＣを示す。
Ｇ１−ＰＣＣとＳ−ＰＣＣは、オカダ酸の濃度の相違で互いに分離できなかったため、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣとしてまとめて表記している。
Ｇ２／Ｍ−ＰＣＣも同様である。
また、本願明細書中で使用した下記の用語中で、
Ｇ１期はギャップ１（Ｇap １）期を、
Ｇ２期はギャップ２（Ｇap ２）期を、
Ｓ期はＤＮＡ合成期（Ｓynthesis）を、
Ｍ期は分裂中期（Ｍitosis）を示す。
ヒトリンパ球は２名の健常人の末梢血より分離し、幼若化刺激剤であるＰＨＡ−Ｐ（ファイトヘムアグルチニン）を用いて幼若化し、細胞増殖をさせた。
マウスリンパ球はマウスから脾臓リンパ球を採取し、幼若化刺激剤であるコンカナバリン（Ｃon Ａ）あるいはリポポリサッカロイド（ＬＰＳ）を用いて幼若化し、細胞増殖させた。
ヒト樹立細胞株ＡＴ（Ｌ）５ＫＹ、ＡＴ（Ｌ）６ＫＹ、あるいはマウス樹立細胞株Ｂａ／Ｆ３は対数増殖期の細胞に上記処理を行った。
【００１０】
ヒトリンパ球（ＰＨＡ−Ｐ刺激）、ヒト樹立細胞株ＡＴ（Ｌ）５ＫＹ、ＡＴ（Ｌ）６ＫＹ、マウスリンパ球（コンカナバリンＡ、ＬＰＳ  刺激）およびマウス樹立細胞株Ｂａ／Ｆ３を試料とし、細胞培養中に、比較例として従来の分裂中期染色体を得る方法としてのコルセミドと、本発明の未成熟凝縮染色体の生成剤である蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤の試料としてカリクリンＡを、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭの３種の濃度で処理し染色体標本を作成し、間期核、生成されたＧ１−ＰＣＣ、Ｓ−ＰＣＣおよびＧ２−ＰＣＣ染色体のそれぞれの数とその割合（括孤内）とを表２に示したものである。
【００１１】
【表２】
0003834080.tif 000003
【００１２】
追加の実施の形態：
現在入手可能な蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤で細胞透過性を有するものとして、平成６年８月１２日に出願した特願平６−２１０７１９号に記載したオカダ酸あるいはカリクリンＡに追加して、オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸（ジノフィジトキシン）、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールを用いた。これらの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤を用い、ヒト末梢血リンパ球（表３）およびヒト樹立細胞株ＡＴ（Ｌ）５ＫＹ（表４）への未成熟染色体凝縮の誘発を行った。
実施の形態２：
オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸（ジノフィジトキシン）の濃度が１００ｎＭ以上の場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であった。１ｎＭから１００ｎＭの濃度では、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。これは、オカダ酸の場合と同様であった。
実施の形態３：
カンタリジンおよびカンタリジン酸の濃度が５μＭ以上の場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であった。５００ｎＭから５μＭの濃度では、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。
実施の形態４：
エンドタールの濃度が５０μＭ以上の場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であったが、５μＭ以下の濃度では、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。また、出現したＰＣＣの頻度はカンタリジンおよびカンタリジン酸の場合に比較して低かった。
実施の形態５：
タウトマイシンの濃度が１０μＭの場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であった。１μＭの濃度では、若干のＧ１／Ｓ−ＰＣＣの出現が認められたが、１μＭより濃度が低いときは、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。
実施の形態２〜５に用いた、これらの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤を用い、ヒト末梢血リンパ球（表３）およびヒト樹立細胞株ＡＴ（Ｌ）５ＫＹ（表４）への未成熟染色体凝縮の誘発を行った。また、得られた未成熟染色体はオカダ酸で得られたものと同一であったので、顕微鏡写真は省略した。また、表３ならびに表４のデータのグラフ表示も省略し、データを表で表示するのに留めた。
【００１３】
表３、４は、上記の実施の形態２〜５で使用した処理剤の濃度と生成された間期核、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２／Ｍ−ＰＣＣのそれぞれの数とその割合および総数を表示したものである。
【００１４】
【表３】
0003834080.tif 000004
表３は、ヒトリンパ球に対して実施の形態２〜５を実施して得られたＰＣＣ出現頻度と薬剤濃度の関係を示したものである。
【表４】
0003834080.tif 000005
表４は、ヒト樹立細胞株ＡＴ（Ｌ）５ＫＹに対して実施の形態２〜５を実施して得られたＰＣＣの出現頻度と薬剤濃度の関係を示したものである。
【００１５】
結果の考察：
実施の形態１について：
表１に示した結果から、低濃度（１ｎＭ−１０ｎＭ）のオカダ酸では、出現する未成熟凝縮染色体はＧ２型である。
図４は、従来のコルセミド法により、ギムザ染色によって得られる染色体を矢印で示す顕微鏡写真である。
図５は、顕微鏡写真であって、ａは本発明の低濃度（１−１０ｎＭ）オカダ酸により誘発される未成熟凝縮染色体であり、出現する染色体の形態は２価染色体であり、図４に示したコルセミド法で得られるＧ２型未成熟染色体と同じで、その出現頻度もコルセミド法とほぼ同等であった。
ｂは高濃度（１００ｎＭ）オカダ酸で誘発される未成熟凝縮染色体であり、出現する染色体の形態は１価および２価染色体であり、Ｓ型未成熟凝縮染色体（矢印）がＧ２型未成熟染色体と共に出現する。
ｃは中倍率（４００倍）による観察で、高濃度（１００ｎＭ）オカダ酸で誘発される未成熟凝縮染色体を示し、矢印で示される部分は、染色体の複製が完了し染色体が２価となっている部分であり、他の薄く染色されている部分は複製が行われてなく染色体が１価であることを示す。
この染色体は複製完了部と未複製の部分が混在していることから、ＤＮＡ合成期にある細胞が未成熟染色体凝縮（Ｓ型未成凝縮熟染色体）を起こしたことを示している。
ｄは高倍率（１,０００倍）による観察で、矢印で示される複製完了部と未複製部分がより明確に観察される。
同様の現象は実施の形態２で、蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤の試料としてのカリクリンＡでも観察されたので顕微鏡写真は省略する。
【００１６】
図６は、表１に示した結果から、オカダ酸（ＯＡ）の濃度と出現するＰＣＣとの関係をグラフ化したもので、オカダ酸の濃度が１ｎＭ−１０ｎＭではＧ２型未成熟染色体が単独に、１００ｎＭ以上でＧ１／Ｓ型の未成熟凝縮染色体がＧ２型とともに出現することが明白に認められる。
図７は、表２に示した結果から、カリクリンＡ（Ｃalc Ａ）の濃度と出現するＰＣＣとの関係をグラフ化したもので、低濃度（１ｎＭ）では、出現する未成熟凝縮染色体はＧ２型であり、コルセミドにより得られる分裂中期染色体と形態的に同じであり、またその出現頻度もコルセミド法とほぼ同等であった。
カリクリンＡの濃度が１０ｎＭ以上に達すると、Ｇ２型未成熟凝縮染色体に加え、Ｇ１、Ｓ型未成熟凝縮染色体が出現する。
また、その出現頻度もコルセミド法に比べ数倍上昇した。この点からカリクリンＡはオカダ酸に比較して未成熟凝縮染色体を誘発する作用が強いことが確認できた。
以上の結果から、オカダ酸（ＯＡ）とカリクリンＡ（Ｃalc Ａ）とも濃度が１ｎＭを下回る場合は出現頻度が十分でなく、１００ｎＭで殆ど飽和し、それを超えても殆ど変化がなく、場合によっては染色体凝縮が過度になり、あるいは細胞毒性が強く、死滅細胞が増加するので濃度の上限を１００ｎＭとした。
【００１７】
実施の形態２〜５について：
表３は、ヒトリンパ球に対して実施の形態２〜５を実施して得られたＰＣＣの出現頻度と薬剤濃度の関係を示したものである。
オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸（ジノフィジトキシン）の濃度が１００ｎＭの場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であった。１ｎＭから１００ｎＭの濃度では、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。これはオカダ酸の場合と同様であった。
カンタリジンおよびカンタリジン酸の濃度が５μＭ以上の場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であった。５００ｎＭから５μＭの濃度では、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。
エンドタールの濃度が５０μＭ以上の場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であったが、５μ以下の濃度では、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。また、出現したＰＣＣの頻度は、カンタリジンおよびカンタリジン酸の場合に比較して低かった。
タウトマイシンの濃度が１０μＭの場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であった。１μＭでは若干のＧ１／Ｓ−ＰＣＣの出現が認められたが、１μＭより濃度が低いときは、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。
表４は、ヒト樹立細胞株ＡＴ（Ｌ）５ＫＹに対して表３と同様に、実施の形態２〜５を実施して得られたＰＣＣの出現頻度と薬剤濃度の関係を示したものである。得られたＰＣＣの頻度値の違いはあるものの、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣと各薬剤の濃度依存性は同等であった。
【００１８】
オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールは、すべて蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤である。未成熟染色体凝縮を誘発するために必要な濃度はそれぞれ異なるが、全て未成熟染色体凝縮を誘発することが可能であった。このことは、染色体の凝縮が蛋白質脱リン酸化酵素によって制御されていることを強く示唆している。このことは同時に、今後発見あるいは合成される新たなる蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤が強力な未成熟染色体凝縮の誘発作用を示すことが期待される。
【００１９】
先に行ったオカダ酸あるいはカリクリンＡに追加して、オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸（ジノフィジトキシン）、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールを用いた。
【００２０】
オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸（ジノフィジトキシン）の濃度が１００ｎＭ以上の場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であった。１ｎＭから１００ｎＭの濃度では、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。これはオカダ酸の場合と同様であった。
カンタリジンおよびカンタリジン酸の濃度が５μＭ以上の場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であった。５００ｎＭから５μＭの濃度では、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。
エンドタールの濃度が５０μＭ以上の場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ、Ｇ２−ＰＣＣを誘発することが可能であったが、５μＭ以下の濃度では、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。また、出現したＰＣＣの頻度は、カンタリジンおよびカンタリジン酸の場合に比較して低かった。
タウトマイシンの濃度が１０μＭの場合、Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣを誘発することが可能であった。１μＭでは、若干のＧ１／Ｓ−ＰＣＣの出現が認められたが、１μＭより濃度が低いときは、Ｇ２−ＰＣＣのみが誘発された。
【００２１】
以上の結果から、オカダ酸、オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸、カリクリンＡ、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールは、すべて本発明に適用できる蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤であると言い得る。
【００２２】
（作用）
現時点の技術では、本発明のオカダ酸、オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸などによる直接的なＰＣＣ誘導の機構は不明確な点が多いが、分子生物学的な知見により染色体の凝縮の機構にはヒストンその他多くの蛋白（タンパク）質のリン酸化が関わっているということが知られていて、その調節に蛋白質脱リン酸化酵素が関与しているという知見が得られている。
従って、上記の効果は、オカダ酸などによる蛋白質脱リン酸化酵素の阻害により、染色体の凝縮に関与している蛋白質のリン酸化が促進されて、染色体の凝縮が促進されることによるものと考えられる。
【００２３】
【発明の効果】
しかし、本発明の低濃度（１−１０ｎＭ）オカダ酸の場合、出現する染色体の形態や出現頻度も従来のコルセミド法とほぼ同等であったが、本発明による場合は、Ｍ期同調細胞を集めること、および細胞融合を行なう必要がなく極めて簡便で、しかも得られる染色体も解析の対象となる細胞自体のもつ染色体のみで構成されるので、その解析も容易である。従って低濃度（１−１０ｎＭ）で使用しても従来のコルセミド法に比較して優れている。
表２に示した結果から、１ｎＭのカリクリンＡでは出現する未成熟凝縮染色体はＧ２型であり、出現頻度も従来のコルセミド法とほぼ同等であったが、前記オカダ酸の場合と同様の理由により従来のコルセミド法に比較して優れている。
１０ｎＭのカリクリンＡと１０−１００ｎＭの場合にＧ１−ＰＣＣ、Ｓ−ＰＣＣおよびＧ２−ＰＣＣ染色体を、それぞれ容易に得ることが可能なので、従来のコルセミド法に比較して遥かに優れている。
オカダ酸などの蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤により、細胞に未成熟染色体凝縮を誘導させることにより、従来分裂中期細胞からのみ得られていた染色体を、分裂中期以外の細胞からも得られることが可能になった。
分裂中期細胞は、通常増殖の盛んな細胞では比較的良く得られることができるが、増殖が盛んでない細胞あるいは増殖をほとんど停止している細胞からは、得るのが極めて困難な場合が多い。
【００２４】
オカダ酸、オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸、カリクリンＡ、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールにより細胞を処理することにより、分裂中期だけでなくＧ１、Ｓ、Ｇ２期からも染色体形成を誘導することが可能となり、従来染色体を得るのが困難だったケースからも染色体サンプルを得るのが可能となった。
医学的な応用として、リンパ球、羊水細胞、絨毛細胞などで染色体解析を行う場合しばしば染色体を得られない場合があるが、本発明によれば今後より確実に染色体標本を得ることが期待できる。
また、オカダ酸、オカダ酸アンモニウム、３５−メチルオカダ酸、カリクリンＡ、タウトマイシン、カンタリジン、カンタリジン酸、エンドタールの濃度を増加させると、Ｇ２期ばかりでなく、Ｇ１、Ｓ期の細胞においても未成熟染色体凝縮を誘導させることが可能であった。
【００２５】
細胞に放射線、薬剤などを作用させるとき、染色体の切断組み替えが生じ最終的に染色体の異常が形成されるが、これは従来分裂中期染色体の解析をもって行われてきた。
しかしながら、染色体の切断組み替えは本来間期核で進行していく現象であって、一方分裂中期染色体はこれら現象の最終的な結果を反映しているに過ぎず、これら機構の解明には間期核での観察が不可欠である。
オカダ酸などにより、Ｍ期ばかりでなく、Ｇ２、Ｃ１、Ｓ期の細胞においても未成熟染色体凝縮を誘導させることが可能となったことは、これらのステージにおける染色体の状態を観察することが可能になったことを意味し、上記の現象の解明に大きく貢献することが期待される。
また、Ｒaoらが発表した従来のＰＣＣ法と比較すると、本発明による場合は、Ｍ期同調細胞を集めること、および細胞融合を行なう必要がなく、極めて簡便でしかも得られる染色体も解析の対象となる細胞自体のもつ染色体のみで構成されるので、その解析も容易である。
また、染色体を効率良く得ることができるため、用意する細胞の数も少なくてすむという利点を併せ持っている。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞周期と細胞分裂の関係を示す模式図である。
【図２】古典的なＰＣＣ法を示す模式図である。
【図３】図２の古典的なＰＣＣ法の細胞周期を示す光学顕微鏡写真（x 1000）である。
【図４】従来のコルセミド法により、ギムザ染色によって得られる染色体を示す顕微鏡写真である。
【図５】本発明の各濃度のオカダ酸により誘発される未成熟凝縮染色体を示す顕微鏡写真である。
【図６】表１に示した結果を集約して示すグラフである。
【図７】表２に示した結果を集約して示すグラフである。
【符号の説明】
ＰＣＣ：  未成熟凝縮染色体（Ｐremature Ｃondensed Ｃhromosome）
Ｇ１／Ｓ−ＰＣＣ：  Ｇ１、Ｓ期の細胞に誘導されるＰＣＣ
Ｇ２−ＰＣＣ：  Ｇ２期の細胞に誘導されるＰＣＣ
Ｇ１期：  ギャップ１（Ｇap １）期
Ｇ２期：  ギャップ２（Ｇap ２）期
Ｓ期：  ＤＮＡ合成期（Ｓynthesis）
ＯＡ：  オカダ酸（Ｏkadaic Ａcid）
ＣａｌｃＡ：  カリクリンＡ（Ｃalyculin Ａ）
【図１】
0003834080.tif 000006
【図２】
0003834080.tif 000007
【図３】
0003834080.tif 000008
【図４】
0003834080.tif 000009
【図５】
0003834080.tif 000010
【図６】
0003834080.tif 000011
【図７】
0003834080.tif 000012