(57)【要約】本発明の光増感剤を含有する超音波治療用活性酸素発生剤は、身体の深部においてもフラーレンなどの光増感剤に活性酸素を発生させることができるため、光照射が不可能な身体深部のがん、ウィルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変の治療にも用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光増感剤を含有する超音波治療用活性酸素発生剤。
【請求項２】
光増感剤が、水溶性高分子と複合化したフラーレンである、請求項１記載の超音波治療用活性酸素発生剤。
【請求項３】
フラーレンが、Ｃ６０フラーレン又はナノチューブフラーレンである、請求項２記載の超音波治療用活性酸素発生剤。
【請求項４】
水溶性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンのような非イオン性水溶性合成高分子；デキストラン；プルラン；デンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びヒドロキシプロピルデンプンのようなデンプン誘導体を含む非イオン性水溶性高分子；アルギン酸；ヒアルロン酸；キトサン；キチン誘導体；並びにこれらの高分子のアニオン性又はカチオン性誘導体及びこれらの高分子の２成分又は３成分の共重合体から選択される、請求項２又は３記載の超音波治療用活性酸素発生剤。
【請求項５】
水溶性高分子が、官能基を介してフラーレンと複合化している、請求項２〜４のいずれか１項記載の超音波治療用活性酸素発生剤。
【請求項６】
官能基が、アミノ基である、請求項５記載の超音波治療用活性酸素発生剤。
【請求項７】
光増感剤が、ポルフィリン誘導体である、請求項１記載の超音波治療用活性酸素発生剤。
【請求項８】
ポルフィリン誘導体が、水溶性高分子と結合している、請求項７記載の超音波治療用活性酸素発生剤。
【請求項９】
水溶性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンのような非イオン性水溶性合成高分子；デキストラン；プルラン；デンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びヒドロキシプロピルデンプンのようなデンプン誘導体を含む非イオン性水溶性高分子；アルギン酸；ヒアルロン酸；キトサン；キチン誘導体；並びにこれらの高分子のアニオン性又はカチオン性誘導体及びこれらの高分子の２成分又は３成分の共重合体から選択される、請求項８記載の超音波治療用活性酸素発生剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の超音波治療用活性酸素発生剤を含有する、がん、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変の治療剤。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項記載の超音波治療用活性酸素発生剤及び薬学的に許容しうる担体を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、超音波を照射することによってフラーレン及びポルフィリン誘導体などの光増感剤に活性酸素を発生させる、光増感剤を含有する超音波治療用活性酸素発生剤に関する。
背景技術
一重項酸素などの活性酸素は、反応性に富み、細胞のＤＮＡを切断し、細胞増殖を抑制し、タンパク質分解酵素の活性を阻害するなどの細胞毒性を示すことから、がん、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変などの各種疾患における効果が期待されている。このような活性酸素は、各種光増感剤に可視光を照射することにより発生することが知られており、このような光増感剤としては、フラーレン、ポルフィリン誘導体などがある。しかしこれらの光増感剤に活性酸素を発生させるには、光照射が必須であるため、上記のような疾患においても、光照射が可能な部位における疾患（例えば、皮膚がん、気管がん、食道上皮がんのような体及び粘膜表面のがん）にその適用が限られていた。例えば上述の他の疾病に対しても、その病巣が臓器組織の内部に位置していることから光照射が有効ではなかった。そのため、光照射が不可能な身体深部の疾患においても光増感剤に活性酸素を発生させることができる光増感剤含有活性酸素発生剤の開発が求められていた。
また光増感剤の一つであるフラーレンに関しては、Ｃｎ（炭素）クラスターの総称であり、ｎの数に応じてＣ６０、Ｃ７０などの純炭素物質、又は金属（もしくは金属酸化物）を内包した炭素クラスターなどの化合物があることが知られている（化学、５０（６），１９９５を参照）。フラーレン自体は、水不溶性であるため、生体内への投与が困難である。一方、がん組織には、正常組織と比べてその組織構造の違いから、高分子物質が移行しやすく、またがん組織に長く滞留する傾向がある。このため生体内への投与を可能とするように水溶性を付与するとともに、がん組織に特異的に移行し、滞留する特性を付与することによって、正常組織が活性酸素の細胞毒性を被ることによる副作用を軽減するために、各種水溶性高分子をフラーレンと結合させることが検討されている。このような水溶性高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、プルラン、デンプン誘導体、及びこれらの高分子の誘導体を用いることが提案されている（ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７，ｐａｇｅｓ  ３０−３７，１９９７、特開平９−２３５２３５号を参照）。
一方、超音波照射に関しては、液体に超音波を照射すると、液体内部に泡が生成（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）し、この生成した泡が壊れる際に、局所的に熱、圧力などが発生する。これによりラジカル（・ＯＨなど）が発生し、このラジカルが、励起状態から基底状態に遷移したり、再結合する際に、主として３００〜６００ｎｍの波長範囲を有する光が出る（この現象は、ソノルミネッセンスと称される）ことが知られている（”Ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｋ．Ｓ．Ｓｕｓｌｉｃｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４７，ｐａｇｅｓ  １４３９−１４４５，１９９０を参照）。
上述したように、光照射が不可能な身体深部の疾患においてもフラーレンなどの各種光増感剤に活性酸素を発生させることができる光増感剤含有活性酸素発生剤のシステムの開発が求められていた。本発明者らは、このようなシステムを開発するために鋭意研究を行った結果、生体に光増感剤を投与後、生体に超音波照射を行なうと、ソノルミネッセンスにより生じた主として３００〜６００ｎｍの波長範囲を有する光によって光増感剤が活性酸素を発生することを発見し、本発明を完成させるに至った。
発明の開示
本発明は、水溶性高分子と複合化したフラーレンなどの光増感剤を含有する、超音波治療用活性酸素発生剤に関する。
上述したように、本発明の超音波治療用活性酸素発生剤は、超音波を照射した際に生じるソノルミネッセンス（光生成現象）を利用して、生体内において光増感剤に活性酸素を発生させ、それによってがん、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変などの病巣の細胞を破壊させるというものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含有される光増感剤としては、ソノルミネッセンスにより活性酸素を発生することができる光増感剤であればいかなる光増感剤をも使用することができ、具体的には、水溶性高分子と複合化したフラーレン及び各種ポルフィリン誘導体のほか、従来光増感剤として使用されている、アクリジン、ローズベンガル、アクリジンオレンジ、硫酸ベルベリン、フルオレセイン、テトラサイクリン、エオシンＹ、ＮＴＳ、プソラレン、ボネリン、フェオフォルミド、クロリンｅ６、メソテトラ（ヒドロキシフェニル）クロリン、フタロシアニン、プルプリン、５−アミノラエブリン酸（ＡＬＡ）、ＨＡＴ−ＤＯ１（マグネシウム  塩素−塩素二量体）など各種の光増感剤を挙げることができる。ポルフィリン誘導体としては、ポルフィマーナトリウム（フォトフリン（登録商標））、ヘマトポルフィリン、メタロポルフィリン、硫酸テトラフェニルポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、ジヘマトポルフィリンエーテル（ＤＨＥ）、ベンゾポルフィリン（ＢＰＳ）、ＡＴＸ−７０（ガリウム−プロフィリン錯体）、ＡＴＸ−Ｓ１０（ｆｏｕｒ−ｆｏｒｍｙｌｏｘｉｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｖｉｎｙｌ−ｄｅｕｔｅｒｉｏ  ｐｏｒｐｈｙｎｙｌ（ＩＸ）−６−７−ｂｉｓａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）などを挙げることができる。各種ポルフィリン誘導体のなかでも、特にポルフィマーナトリウムを好ましく使用することができる。
本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含有される光増感剤の一つである水溶性高分子と複合化したフラーレンとは、本来水に不溶性であるフラーレンを、水溶性高分子と化学結合、又は分子間力による物理的結合により複合化したものであり、水溶性高分子と複合化させることによって水溶性を付与されている。このフラーレンとしては、その種類で特に限定されるものではなく、活性酸素を発生するものであればいかなる種類のものも使用しうるが、ｎ＝６０の純炭素物質Ｃ６０フラーレン、Ｃ７０フラーレン、やはり純炭素物質であるナノチューブフラーレン、そして各種高次フラーレンなどを用いることができる。なかでも供給及び取り扱いの容易さの点から、ナノチューブ及びＣ６０フラーレンを用いるのが好ましい。特に、従来の炭素線維よりも細く、ほぼ完全にグラファイト化し（グラファイトの各層が入れ子構造的に積層している）、先端部は五員環が入ることにより閉じており、それぞれの層は、螺旋構造を有しているナノチューブ（フラーレンの化学と物理、篠原他著、名古屋大学出版界）を好ましく使用することができる。これらの各種フラーレンは、市販されており、例えば本荘ケミカル、三菱商事、東京化成工業などから入手可能である（商品名：Ｃ６０フラーレン、Ｃ７０フラーレン、マルチウオールナノチューブ、シングルウオールナノチューブなど）。
また、上記のフラーレンに水溶性を付与するためにフラーレンと複合化している水溶性高分子としては特に限定されるものではなく、市販されている各種水溶性高分子を使用することができる。なかでも、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンのような非イオン性水溶性合成高分子；デキストラン；プルラン；デンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びヒドロキシプロピルデンプンのようなデンプン誘導体を含む非イオン性水溶性高分子；アルギン酸；ヒアルロン酸；キトサン；キチン誘導体；並びにこれらの高分子のアニオン性又はカチオン性誘導体、及びこれらの高分子の２成分又は３成分の共重合体を用いることができる。なかでもフラーレンと共通溶媒を持ち、フラーレンとの複合化反応に関与する官能基が分子末端のみにあり、化学結合様式が単純であるなどの理由から、ポリエチレングリコールを好ましく用いることができる。
これらの水溶性高分子の分子量は、特に限定されるものではないが、１，０００〜１，０００，０００のもの、好ましくは５，０００〜５０，０００のものを用いることができる。
水溶性高分子としては、分子量１，０００〜１，０００，０００、特に５，０００〜１５，０００のポリエチレングリコールを用いるのが特に好ましい。
本発明の超音波治療用活性酸素発生剤においてフラーレンと複合化させるために使用しうる水溶性高分子は、フラーレンと複合化させるための官能基を有しており、水溶性高分子は、官能基を介してフラーレンと複合化している。このような官能基としては、フラーレンとの複合化を可能とするようないかなる官能基も用いることができ、アミノ基、水酸基、シアノ基、カルボキシル基などの求核置換反応性を有する官能基を挙げることができる。なかでもアミノ基を好ましく使用することができる。例えばアミノ基を用いてフラーレンを化学結合により水溶性高分子と結合させる場合は、フラーレンの二重結合へのアミノ基の付加反応により、フラーレンが水溶性高分子と結合する。このような官能基は、フラーレンとの複合化に適した箇所であれば水溶性高分子の分子内のいかなる箇所に存在してもよいが、複合化のしやすさを考慮して、水溶性高分子の末端に位置するのが好ましい。このような官能基を有しない水溶性高分子を用いる場合には、フラーレンとの複合化の前にまず官能基を導入しておくことが必要である。また、フラーレンと複合化させるために使用しうる水溶性高分子は、アミノ基などの官能基に加えて、フラーレンと反応しない官能基、なかでもメトキシのようなＣ１−６アルコキシ基を更に有しているのが望ましい。水溶性高分子の片端にアミノ基のような官能基がある場合、もう一方の末端にもフラーレンと結合する官能基が存在すると、水溶性高分子の両端がフラーレンと複合化することにより、フラーレンと水溶性高分子の集合体が生成してしまうが、このような集合体は、分子量が大きくなるために十分な水溶性を有しなくなる。したがって、フラーレンと複合化させるために使用しうる水溶性高分子は、アミノ基などの官能基に加えて、メトキシのようなフラーレンと反応しない官能基を更に有しているのが望ましい。ただし、両端にアミノ基などの官能基を有するポリエチレングリコールであっても、生成されるフラーレンと水溶性高分子の集合体が、十分な水溶性を有する場合であれば、使用することができる。
本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含まれる増感剤の一つである水溶性高分子と結合したフラーレンの構造の一例を図１に示す。例示したのは、Ｃ６０フラーレンに、片端にアミノ基を有し、もう一方の端にメトキシ基を有するポリエチレングリコールを結合させたものである。
上述したように本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に増感剤として含まれる水溶性高分子と複合化したフラーレンは、生体への投与が可能な程度の水溶性を有していればよい。水溶性が低い場合、水溶性高分子と複合化したフラーレンは、凝集塊を形成するが、その塊の粒径は、がんなどの組織への移行と集積のし易さを考慮すると、４００ｎｍ以下である必要があるため、これ以上の凝集塊を形成しない程度の水溶性を有する必要がある。このような溶解度を達成するために必要なフラーレン：水溶性高分子の配合モル比は、用いる水溶性高分子の種類、水溶性高分子中のアミノ基などの官能基の含有率によっても異なる。例えば１分子当たり１個のアミノ基を有する分子量５，０００〜１５，０００のポリエチレングリコールを用いる場合には１：０．１〜１：１５０の範囲であるのが好ましい。なかでも良好な水溶性を得るためには、１：５０〜１：１５０のモル比が特に好ましい。
光増感剤として水溶性高分子と化学的に結合したフラーレンを含有する本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を製造するには、遮光条件下にて、所望の溶解度を達成するのに必要なモル比のフラーレン及び官能基を有する水溶性高分子を、有機溶媒に溶解し、撹拌し、フラーレンと水溶性高分子を官能基を介して結合させることによって得ることができる。有機溶媒としては、ベンゼン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなど、なかでもベンゼンを好ましく用いることができる。反応温度は、約４〜４０℃、好ましくは約２５℃であり、反応時間は、約６〜４８時間、好ましくは約２４時間である。得られた反応生成物は、疎水性又はアフィニティクロマトグラフィーなどによる精製後、凍結乾燥することにより回収することができる。また水溶性高分子と分子間力により物理的に結合したフラーレンを含有する超音波治療用活性酸素発生剤を製造するには、所望の溶解度を達成するのに必要なモル比のフラーレン及び官能基を有する水溶性高分子を混合すればよい。この場合も混合することにより得られた凝集塊は、組織への移行のし易さなどの点から、４００ｎｍ以下の粒径を有しているのが望ましい。
なお上述したように、光増感剤として水溶性高分子と複合化したフラーレンを含有する本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を製造するために使用する水溶性高分子は、フラーレンとの複合化を可能とするように、アミノ基などの官能基を有している必要がある。官能基を有しない水溶性高分子を用いる場合には、フラーレンとの複合化の前にまず官能基を導入することが必要である。例えば水酸基のみを有する水溶性高分子にアミノ基を導入するには、過ヨウ素酸酸化法、塩化シアヌル法、臭化シアン法、又はエピクロロヒドリン法などにより水溶性高分子の水酸基と、アルキルジアミン、リシン、リシンのエステル化合物のような一分子中にアミノ基を２個以上有するアミノ化合物との間に化学結合を形成させ、高分子側鎖にアミノ基を導入する。またカルボキシル基を有する水溶性高分子においては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・カルボジイミド、カルボジイミド、クロロ炭酸エチルなどを用いたカルボキシル基とアミノ化合物との間の結合反応によりアミノ基を高分子側鎖に導入する。例えばポリエチレングリコールにアミノ基を導入するには、両末端ＣＯＯＨを有するポリエチレングリコールをｐＨ５．０のリン酸緩衝液（１０重量％）に溶解させ、そこへ水溶性カルボジイミドをＣＯＯＨに対して３倍モル量投入し、室温で１時間撹拌することにより、カルボキシル基を活性化する。その後、エチレンジアミンをＣＯＯＨに対して１０倍モル量加え、更に室温で６時間反応させる。得られた反応液を水に対して透析することにより両末端にアミノ基が導入されたポリエチレングリコールを得ることができる。また、片端にアミノ基が、もう一方の片端にメトキシ基が導入されたポリエチレングリコールは、日本油脂株式会社から入手可能である。
上記のようにして得られた光増感剤として水溶性高分子と複合化したフラーレンを含有する本発明の超音波治療用活性酸素発生剤は、フラーレンが水溶性高分子と複合化しているため、生体に投与するのに十分な水溶性を有すると共に、がん組織や炎症組織への高い移行性、滞留性を有する。
本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含まれる光増感剤は、生体への投与を可能とする程度の水溶性を有しているが、水溶性高分子と複合化したフラーレン以外の光増感剤も、必要に応じて水溶性高分子と結合させることによって、がん組織や炎症組織への移行性、滞留性を高めることができる。この場合は、フラーレンと複合化させた水溶性高分子について例示したのと同じ各種水溶性高分子を使用することができる。これらの光増感剤は、有機化学の分野において従来使用されている方法で水溶性高分子と結合させることができる。
本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含まれるフラーレンなどの光増感剤は、超音波照射により惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光により水性媒体中で一重項酸素などの活性酸素を発生させることにより細胞毒性を示すため、がんを含む各種疾患の治療に使用することができる。照射する超音波は、周波数約１００ＫＨｚ〜２０ＭＨｚ、特に約１〜３ＭＨｚのものを好ましく使用することができる。照射は、約０．１〜５Ｗａｔｔ／ｃｍ２、なかでも約２Ｗａｔｔ／ｃｍ２の出力で行うのが好ましい。Ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅは、約１〜１００％、好ましくは約１０％である。照射時間は、用いる周波数、照射出力によっても異なるが、約５〜３００秒、好ましくは約３０〜１２０秒である。
本発明の超音波治療用活性酸素発生剤は、活性酸素が細胞毒性を示すあらゆる種類のがん、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、漫性腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変などの治療に有効である。例えばがんとしては、肺がん、肝がん、膵がん、胃腸がん、膀胱がん、腎がん、脳腫瘍のような臓器の表層及びその内部に発生するあらゆる固形がんを挙げることができる。なかでも光照射が不可能であり従来は光線力学的治療が不可能であった身体深部のがんの治療に有効に用いることができる。その他の疾病については、その病巣又は感染細胞（罹患細胞）が臓器内部に位置しているので、光増感剤をその部位に適当な方法によって集積させた後、そこに外部より超音波照射することによって治療を行うことができる。
本発明の超音波治療用活性酸素発生剤は、注射剤（静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内など）、分散剤、流動性剤、固形粉末剤などのあらゆる剤型とすることができる。例えば注射剤とする場合には、本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を、注射剤に一般に用いられる緩衝剤、生理食塩水、保存剤、注射用蒸留水などの各種添加剤を配合して注射剤とすることができる。本発明の超音波治療用活性酸素発生剤の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、疾患の種類及び状態によっても異なるが、成人１日当たり約１〜１０ｍｇ／ｋｇを１〜数回に分けて投与することができる。
上述したように、がん組織や炎症組織には、正常組織と比較して高分子物質が移行しやすく、かつ蓄積しやすい。したがって、水溶性高分子と複合化又は結合した光増感剤を含有する本発明の超音波治療用活性酸素発生剤は、生体に投与されると、正常組織に比べてがん組織や炎症組織に集積され、正常組織におけるよりも高濃度で長くがん組織や炎症組織に滞留する。一方、正常組織においてはがん組織や炎症組織におけるよりも速やかに本超音波治療用活性酸素発生剤が排泄されるため、本超音波治療用活性酸素発生剤を生体に投与後、ある程度の時間をおけば、がん組織や炎症組織における本超音波治療用活性酸素発生剤の濃度は、正常組織における濃度よりも有意に高いものとなり、本超音波治療用活性酸素発生剤ががん組織や炎症組織に特異的に高濃度で分布することになる。したがって、本超音波治療用活性酸素発生剤を生体に投与後、ある程度の時間をおいた後に生体に超音波を照射すれば、超音波照射により惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光により光増感剤が一重項酸素などの活性酸素を発生させることによりがん組織や炎症組織において特異的に抗がん活性や抗炎症活性が示される。一方、正常組織においては、本超音波治療用活性酸素発生剤の濃度は低くなっているため、正常組織に対する細胞毒性はがん組織や炎症組織におけるほどは高くなく、正常組織における副作用が軽減されることが期待される。
ヒトにおいて本発明の超音波治療用活性酸素発生剤の投与後、がん組織や炎症組織での光増感剤の濃度が正常組織での濃度よりも有意に高くなり、超音波照射が可能になるまでの時間は、個々の患者の治療部位における代謝の状態、光増感剤の分布の時間変化などによって異なるが、一般的には投与の約０．１〜４８時間後、特に約２４時間後に超音波照射を行うのが好ましい。ヒトに照射するには、前述したような周波数の超音波を、前述したような出力、時間で照射する。したがって、本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を用いて治療を行なうには、本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を、例えば注射剤の剤型で患者に投与し、約０．１〜４８時間後に、超音波発生装置を用いて超音波照射を行なう。投与量、及び投与／照射の頻度、回数などは、患者の年齢、体重、性別、疾患の種類及び状態などに応じて決定することができる。
また、水溶性高分子と複合化又は結合していない光増感剤を含有する本発明の超音波治療用活性酸素発生剤は、がん組織や炎症組織に特異的に移行、蓄積されるわけではないが、目標とする組織や細胞へ本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を送達する任意の方法、例えばドラッグデリバリーシステムにより特異的に送達する方法を用いることにより、目標とする組織や細胞でその細胞毒性作用を示させることが可能である。このような方法としては、目標とする組織や細胞に本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を直接注入する方法（例えば内視鏡を用いることで体内のほとんどの部位への送達が可能である）、目標とする組織や細胞に対する抗体、レクチン、細胞接着因子、糖鎖などの細胞認識因子を光増感剤に結合させた本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を投与する方法などを挙げることができる。また、本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を生体に投与後、光増感剤に活性酸素を発生させたい箇所のみに超音波照射をすることにより、所望の箇所でのみ活性酸素を発生させて細胞毒性を示させることもできる。また、超音波をフォーカシングすることによって、細胞毒性発現部位の選択性を向上させることも可能である。
実施例
以下に本発明の超音波治療用活性酸素発生剤の製造方法、及びその抗がん活性について具体的に説明するが、これによって本発明の超音波治療用活性酸素発生剤が限定されるものではなく、これらの説明は、記載した光増感剤以外の光増感剤や、記載した疾患以外の疾患についても同様に適用される。
製造例１：本発明の超音波治療用活性酸素発生剤の製造
水溶性高分子として、一端にアミノ基、他端にメトキシ基を有するポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ−ＮＨ２と記載する）（分子量約５，０００、日本油脂製）及びＣ６０フラーレン（東京化成工業製）を用いた。０．５４ｍＭＣ６０フラーレンのベンゼン溶液１０ｍｌに、０〜１０８ｍＭのＰＥＧ−ＮＨ２を含むベンゼン溶液１０ｍｌを加え、遮光条件下、２５℃で２４時間撹拌することによってフラーレンをＰＥＧ−ＮＨ２と結合させて、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体を得た。反応終了後、反応溶液を凍結乾燥し、フラーレン濃度が０．２７ｍＭとなるようにフラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体をベンゼンに溶解し、等量の蒸留水と混合し、２５℃で４８時間放置することにより、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体を水で抽出し、水への移行を調べた。水への移行は、抽出前後のベンゼン溶液の５００ｎｍにおけるフラーレンの吸光度の変化を測定することにより評価した。その結果、フラーレンに対するＰＥＧ−ＮＨ２の比率が大きいほど、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の水への移行が大きくなることが認められた。このことより、本来水に不溶性であったフラーレンが、ＰＥＧ−ＮＨ２と結合することにより、水への溶解度が増大し、フラーレンが水可溶性となることが示された。フラーレンに対するＰＥＧ−ＮＨ２の添加モル比が５０以上の場合では、ほぼ１００％のフラーレンが水相に移行しており、フラーレンの完全に近い水可溶化が達成されていた。
試験例１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗がん活性
がん細胞としてＲＬ♂１細胞（京都パスツール研究所より供与）を用い、この細胞を１００ｍｍディッシュにてＲＰＭＩ１６４０培地（コスモ・バイオ社製、３０５−０２−０１、血清１０％含有）中、５％ＣＯ２、９５％大気、３７℃の培養条件下で、コンフルエントになるまで培養した。
製造例１と同様の方法で製造したフラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体を遮光下で、がん細胞の培養に用いたのと同じ組成の培地に溶解し、１０μｇ／ｍｌの濃度に調整後、滅菌濾過した。６ウエルプレートの各ウエルに調整後のフラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体含有培地を１ｍｌづつ分注した。コントロールのウエルには、結合体を含まない培地のみを分注した。上記のコンフルエントになった細胞を２×１０５細胞／ｍｌに調整して細胞懸濁液を得、上記の各ウエルに細胞懸濁液１ｍｌづつを分注した（この時点で各ウエルには、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体が１０μｇ、ＲＬ♂細胞２×１０５個、培地が２ｍｌ含まれている）。ウエル中の細胞をピペットで軽く撹拌した後、伝導ジェルを介して６ウエルプレートの底部より超音波照射装置（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：ＭＯＤＥＬ  ＃６１００）を用いて超音波を照射した（周波数：１ＭＨｚ、出力：２ｗａｔｔ／ｃｍ２、照射時間６０秒、Ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ：１０％）。超音波照射後、プレートをアルミホイルで遮光し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３日間培養した。その後細胞係数装置（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ：同仁化学、３４５−０６４６３）を用いて生存細胞数を測定し、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体を添加せず、超音波照射もしなかったコントロールに対する生存細胞数の割合を％で算出した。その結果、図５に示すように、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体１０μｇ／ウエルの存在下では、生存細胞数はコントロールに比べて２０％以下であった。更にウエルに加えるフラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の量を１．２５、２．５、５又は１０μｇ／ｍｌ、超音波の周波数を１又は３ＭＨｚ、照射時間を０〜１２０秒で変化させて、生存細胞数を計数した。出力及びＤｕｔｙ  ｃｙｃｌｅは変化させなかった。結果を図２〜５に示す。
図２は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体をウエルに添加しない場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す（周波数１又は３ＭＨｚ、照射時間は、白いバーで３０秒、黒いバーで６０秒）。１ＭＨｚ、６０秒の照射で、細胞生存数は、変化していなかった。
図３は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体５μｇ／ウエルを添加した場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す（周波数１又は３ＭＨｚ、照射時間は、白いバーで３０秒、黒いバーで６０秒）。１ＭＨｚ、６０秒の照射で、細胞生存数は、有意に低下した（３０秒に対してｐ＜０．０５）のが認められる。
図４は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体５μｇ／ウエルを添加し、１ＭＨｚの超音波照射時間を０〜１２０秒の間で変化させた場合の細胞生存率を示す。照射時間を長くするにつれて細胞生存率が低下するのが認められた。また照射１５分から有意に細胞生存率が低下した。
図５は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の添加量を０〜１０μｇ／ウエルで変化させた場合の細胞生存率を示す（周波数１ＭＨｚ、照射時間６０秒）。フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の添加量が増大するにつれて細胞生存率が低下したのが認められる。ラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の濃度１．２５μｇ／ウエルから有意差が認められた。
試験例２：ｉｎ  ｖｉｖｏ抗がん活性
担がんマウスを作成するために、マウスリンパ腫細胞（ＲＬ♂１）５×１０６個をＲＰＭＩ−１６４０培地１００μｌに懸濁し、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスに尾静脈から投与した。このマウスリンパ腫細胞は、投与後約１０日でマウスの肝臓に腫瘤を形成し、マウスをがん死させるモデル系である。製造例１に記載の方法でフラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体を製造し、リンパ腫細胞の投与の２４時間（日）後に、フラーレン含有量４００μｇの結合体を含む水溶液をマウスの尾静脈から投与した。投与の２４時間後、皮膚に照射プローベをあてて肝臓部位に体外から６０秒間超音波を照射し（周波数：１ＭＨｚ、出力：２Ｗａｔｔ／ｃｍ２、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ：１０％）、照射後にマウスの死亡日を記録して生存率を求めた。
その結果、超音波の照射によりマウスの生存率の増加が認められた。フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の投与後超音波照射を行わなかったマウス群、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体を投与せずに超音波照射のみを行ったマウス群、及び投与も照射も行わなかったマウス群では、リンパ腫細胞の投与約１４日ですべてのマウスが死亡した。フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の投与後、超音波照射を行ったマウス群では、リンパ腫細胞の投与１４日後でも、照射時間に関係なくいずれの群においてもマウスは生存しており、超音波照射時間が長くなるにつれてその効果は大きくなっていると考えられた。
試験例３：活性酸素発生試験
チトクローム法により、活性酸素（スーパーオキシドアニオン，Ｏ２−）発生量を測定した。チトクロームＣ３０μＭを含有するハンクス液（ＨＢＳＳ、ｐＨ＝７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｏｒｉｅｎｔａｌ，Ｉｎｃ．，東京）８００μｌを、製造例１で得たＣ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体のＨＢＳＳ溶液２００μｌと混合して、結合体の最終濃度を２．５μｇ／ｍｌとした。この溶液に６０秒間超音波照射した（出力：２Ｗ／ｃｍ２、周波数：１ＭＨｚ、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ：１０％）。２５℃で５分間放置した後、溶液の吸光度を５５０ｎｍで測定した。各操作は、暗所で行ない、各群毎に３回実験を行なった。Ｃ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の存在下及び非存在下で超音波照射を行なった後のＯ２−発生量を、以下の表に示す。Ｃ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体と超音波照射を行なった場合のみ、有意なＯ２−発生が観察された。Ｃ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体のみで超音波照射を行なわなかった場合、及びＣ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の非存在下で超音波照射を行なった場合はいずれも、Ｏ２−はほとんど発生しなかった。
2002066061.tif 000002
試験例４：腫瘍に対するＣ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の音波動力学的効果
ＲＬ♂１細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ条件に慣らすために、細胞を、６週齢のＢＡＬＢ／ｃ系雌性マウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ、静岡）に、５×１０６細胞／０．２ｍｌ培地／マウスの濃度で静脈内接種した。２週間後にマウスの肝臓を採取し、肝臓に形成された節から腫瘍細胞を単離した。単離した細胞を再び同様に接種した。次に得られたＲＬ♂１細胞を、マウスに、０．２ｍｌの量（５×１０６細胞／マウス）を静脈内接種して、肝腫瘍を有するマウスを得た。
腫瘍の接種の１日後、製造例１で得たＣ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体を含有するＰＢＳを、４００μｇ／０．２ｍｌ／マウスの量で、腫瘍を有するマウスに静脈内投与した。３０分後、肝臓に超音波を１又は５分間照射した（出力：２Ｗ／ｃｍ２、周波数：１ＭＨｚ、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ：２０％、）。超音波トランスデューサーチップを腹部の皮膚に取り付けて、超音波伝導ゲルを介して経皮的肝臓超音波照射を行なった。マウスは毎日観察して、その生存期間を記録した。対照群には、Ｃ６０フラーレンを含有しないポリエチレングリコールを静脈内注射した後、超音波を照射し、又は照射しなかった。また、Ｃ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体のみを投与し、超音波照射しない実験と、まったく注射せずに超音波照射のみを行なった実験も行なった。各実験群は、６匹のマウスからなり、すべてのマウスは、通常の飼料と水を自由に摂取させたが、実験の間は暗所で飼育した。
この結果を図６に示す。図６には、腫瘍を有するマウスに対するＣ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の投与とその後の超音波照射による治療効果を示す。Ｃ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体のみを投与した場合と、超音波照射のみをおこなった場合とでは、マウスの生存期間は延長されなかった。反対に、Ｃ６０フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体を投与し、超音波照射を行なった場合では、超音波照射を肝臓に対して１分間行なった場合で、マウスの生存期間は有意に延長された。
産業上の利用可能性
本発明の超音波治療用活性酸素発生剤は、生体に投与された後、超音波照射されることにより一重項酸素などの活性酸素を発生するため、肺がん、肝がん、膵がん、胃腸がん、膀胱がん、腎がん、脳腫瘍などの、光照射が不可能な身体深部のがん並びにウィルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺繊維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変などの治療に有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に増感剤として含まれる水溶性高分子と結合したフラーレンの構造の一例を示す。
図２は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体をウエルに添加しない場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す。
図３は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体５μｇ／ウエルを添加した場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す。
図４は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体５μｇ／ウエルを添加した場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す。
図５は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体０〜１０μｇ／ウエルを添加した場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す。
図６は、腫瘍を有するマウスに対するフラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ２結合体の投与とその後の超音波照射の治療効果を示す。
【図１】
2002066061.tif 000003
【図２】
2002066061.tif 000004
【図３】
2002066061.tif 000005
【図４】
2002066061.tif 000006
【図５】
2002066061.tif 000007
【図６】
2002066061.tif 000008
【国際調査報告】
2002066061.tif 000009
2002066061.tif 000010
2002066061.tif 000011
2002066061.tif 000012