(57)【要約】レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体。
【請求項２】
レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡが組換えレトロウイルスに由来する請求項１記載の複合体。
【請求項３】
組換えレトロウイルスが当該組換えレトロウイルスに対する感受性を有する細胞に当該組換えレトロウイルスを感染させて得られる請求項２記載の複合体。
【請求項４】
組換えレトロウイルスに対する感受性を有する細胞が細胞周期を停止している請求項３記載の複合体。
【請求項５】
単離された、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡ、および単離された、レトロウイルス由来タンパク質成分を混合して得られる請求項１記載の複合体。
【請求項６】
レトロウイルス由来タンパク質成分がパッケージング細胞の培養上清由来及び／又はパッケージング細胞の抽出物由来であることを特徴とする請求項１記載の複合体。
【請求項７】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するＤＮＡを染色体ＤＮＡに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項１記載の複合体。
【請求項８】
下記工程を包含することを特徴とする複合体の製造方法：
（ａ）レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列とを含有する組換えレトロウイルスを当該組換えレトロウイルスに対する感受性を有する細胞に感染させる工程；
（ｂ）（ａ）工程で得られる感染細胞を培養する工程；及び
（ｃ）（ｂ）工程で得られる培養細胞より、組換えレトロウイルス由来の２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を採取する工程。
【請求項９】
組換えレトロウイルスに対する感受性を有する細胞が細胞周期を停止していることを特徴とする請求項８記載の複合体の製造方法。
【請求項１０】
下記工程を包含することを特徴とする複合体の製造方法：
（ａ）レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列とを含有する組換えレトロウイルス粒子を破壊し、ウイルスの構成成分を含有する混合液を調製する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られる混合液にデオキシリボヌクレオチドを添加し、組換えレトロウイルス由来の２本鎖ＤＮＡを調製し、当該２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を形成させる工程；及び、
（ｃ）（ｂ）工程で得られる当該複合体を採取する工程。
【請求項１１】
下記工程を包含することを特徴とする複合体の製造方法：
（ａ）レトロウイルス由来の末端反復配列及び当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡを含有する２本鎖ＤＮＡを単離する工程；
（ｂ）レトロウイルス由来タンパク質成分を単離する工程；
（ｃ）前記工程で得られる２本鎖ＤＮＡ及びレトロウイルス由来タンパク質成分を混合し、複合体を形成させる工程；及び、
（ｄ）前記工程で形成される複合体を採取する工程。
【請求項１２】
レトロウイルス由来タンパク質がパッケージング細胞の培養上清及び／又パッケージング細胞の抽出物であることを特徴とする請求項１１の製造方法。
【請求項１３】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するＤＮＡを染色体ＤＮＡに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項８、１０および１１のいずれか１項記載の複合体の製造方法。
【請求項１４】
レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする細胞への遺伝子導入方法。
【請求項１５】
複合体が請求項８、１０および１１のいずれか１項に記載の製造方法により得られる請求項１４記載の細胞への遺伝子導入方法。
【請求項１６】
レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡを細胞に導入することを特徴とする、細胞への遺伝子導入方法。
【請求項１７】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、パッケージング細胞培養上清由来であることを特徴とする請求項１６記載の細胞への遺伝子導入方法。
【請求項１８】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するＤＮＡを染色体ＤＮＡに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項１６記載の遺伝子導入方法。
【請求項１９】
レトロウイルス由来タンパク質成分を含有することを特徴とする細胞への遺伝子導入用組成物。
【請求項２０】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡと複合体を形成していることを特徴とする請求項１９記載の細胞への遺伝子導入用組成物。
【請求項２１】
複合体が請求項８、１０および１１のいずれか１項に記載の製造方法により得られることを特徴とする請求項２０記載の細胞への遺伝子導入用組成物。
【請求項２２】
さらに、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するベクターを含有することを特徴とする請求項１９の遺伝子導入用組成物。
【請求項２３】
ベクターが、組換えレトロウイルスを作製するためのベクターであることを特徴とする請求項２２記載の遺伝子導入用組成物。
【請求項２４】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項２２記載の遺伝子導入用組成物。
【請求項２５】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、パッケージング細胞の培養上清由来及び／又はパッケージング細胞の抽出物由来であることを特徴とする請求項１９記載の遺伝子導入用組成物。
【請求項２６】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するＤＮＡを染色体ＤＮＡに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項１９記載の遺伝子導入用組成物。
【請求項２７】
レトロウイルス由来タンパク質成分を含有する細胞への遺伝子導入用組成物を包含する細胞への遺伝子導入用キット。
【請求項２８】
細胞への遺伝子導入方法に使用されるキットであって、パッケージされた形態において、レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする細胞への遺伝子導入用キット。
【請求項２９】
細胞への導入方法に使用されるキットであって、パッケージされた形態において、レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとを細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする細胞への遺伝子導入用キット。
【請求項３０】
包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬を含む製造品であって、該遺伝子導入用試薬がレトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体及び／又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない遺伝子導入に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への遺伝子導入用試薬の製造品。
【請求項３１】
包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬を含む製造品であって、該遺伝子導入試薬がレトロウイルス由来タンパク質成分を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない遺伝子導入に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への遺伝子導入用試薬の製造品。
【請求項３２】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するＤＮＡを染色体ＤＮＡに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項３０又は３１記載の製造品。
【請求項３３】
レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする細胞の形質転換方法。
【請求項３４】
複合体が請求項８、１０および１１のいずれか１項に記載の製造方法により得られることを特徴とする請求項３３記載の細胞の形質転換方法。
【請求項３５】
レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとを細胞に導入することを特徴とする、細胞の形質転換方法。
【請求項３６】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、パッケージング細胞の培養上清由来及び／又はパッケージング細胞の抽出物由来であることを特徴とする請求項３５記載の細胞の形質転換方法。
【請求項３７】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するＤＮＡを染色体ＤＮＡに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項３５記載の細胞の形質転換方法。
【請求項３８】
レトロウイルス由来タンパク質成分を含有することを特徴とする細胞の形質転換用組成物。
【請求項３９】
レトロウイルス由来タンパク質成分がレトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡと複合体を形成していることを特徴とする請求項３８記載の細胞の形質転換用組成物。
【請求項４０】
複合体が請求項８、１０および１１のいずれか１項記載の製造方法により得られることを特徴とする請求項３８記載の細胞の形質転換用組成物。
【請求項４１】
さらに、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡを作製するためのベクターを含有することを特徴とする請求項３８記載の細胞の形質転換用組成物。
【請求項４２】
ベクターが、組換えレトロウイルス作製用であることを特徴とする請求項４１記載の細胞の形質転換組成物。
【請求項４３】
ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項４１記載の細胞の形質転換用組成物。
【請求項４４】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、パッケージング細胞の培養上清由来及び／又はパッケージング細胞の抽出物由来であることを特徴とする請求項３８記載の細胞の形質転換用組成物。
【請求項４５】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するＤＮＡを染色体ＤＮＡに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項３８記載の細胞の形質転換用組成物。
【請求項４６】
レトロウイルス由来タンパク質成分を含有する細胞の形質転換用組成物を包含する細胞の形質転換用キット。
【請求項４７】
細胞の形質転換方法にレトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする細胞の形質転換用キット。
【請求項４８】
細胞の形質転換方法に使用されるキットであって、パッケージされた形態において、レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとを細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする細胞の形質転換用キット
【請求項４９】
包装材と該包装材に封入された形質転換用試薬を含む製造品であって、該形質転換用試薬が組換えレトロウイルス由来の２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体及び／又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記形質転換用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への形質転換用試薬の製造品。
【請求項５０】
包装材と該包装材に封入された形質転換用試薬を含む製造品であって、該形質転換用試薬がレトロウイルス由来タンパク質成分を含有し、前記形質転換用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞の形質転換用試薬の製造品。
【請求項５１】
レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するＤＮＡを染色体ＤＮＡに組込む活性を有する酵素であることを特徴とする請求項４９又は５０記載の製造品。
【請求項５２】
遺伝子を導入する対象が真核細胞である請求項１４又は１６記載の遺伝子導入方法。
【請求項５３】
遺伝子を導入する対象が真核細胞由来の培養細胞である請求項請求項１４又は１６記載の遺伝子導入方法。
【請求項５４】
遺伝子を導入する対象が真核生物個体である請求項請求項１４又は１６記載の遺伝子導入方法。
【請求項５５】
遺伝子を導入する対象が脊椎動物受精卵である請求項請求項１４又は１６記載の遺伝子導入方法。
【請求項５６】
遺伝子を導入する対象が脊椎動物生殖細胞系列である請求項請求項１４又は１６記載の遺伝子導入方法。
【請求項５７】
形質転換する対象が真核細胞である請求項３３又は３５記載の形質転換方法。
【請求項５８】
形質転換する対象が真核細胞由来の培養細胞である請求項請求項３３又は３５記載の形質転換方法。
【請求項５９】
形質転換する対象が真核生物個体である請求項請求項３３又は３５記載の形質転換方法。
【請求項６０】
形質転換する対象が脊椎動物受精卵である請求項請求項３３又は３５記載の形質転換方法。
【請求項６１】
形質転換する対象が脊椎動物生殖細胞系列である請求項請求項３３又は３５記載の形質転換方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は医学、薬学、農林水産学、食品学の分野において有用な真核生物に外来遺伝子を導入して形質転換する方法およびそれに関連する一連の技術に関する。
背景技術
真核生物への遺伝子導入法としては、ウイルスベクターを用いる方法、裸のＤＮＡをエンドサイトーシスや電気穿孔法、遺伝子銃によって導入する方法等が知られている。ウイルスベクターは、遺伝子治療の分野で基礎から臨床まで幅広く利用されている技術であり、例えばアデノウイルスベクターは標的細胞で目的遺伝子を一過性に大量発現させるのに適している。一方、レトロウイルスベクターは、宿主染色体への安定な組み込み機能により長期安定発現が可能であり、遺伝病の遺伝子治療の分野で期待されているベクターであり、また、トランスジェニック動物作製の分野でも期待されているベクターである。
しかし、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法では、ウイルス感染を介して遺伝子導入されることからウイルスの指向性が問題となり、該ウイルスに対するレセプターを細胞表面に発現していない細胞には遺伝子導入することができない。この欠点を克服するため、水疱性口内炎ウイルスの外皮糖蛋白質ＶＳＶ−Ｇを利用した広範な宿主域に感染可能なシュードタイプレトロウイルスベクターが開発されている。該ベクターは哺乳類のみならず、魚類、鳥類、昆虫、両生類等に遺伝子導入可能で、トランスジェニック動物作製への応用が試みられているが、レトロウイルスの特性上、標的細胞に１コピーしか入らないこと、及び感染から染色体への組み込みまでに少なくとも７時間を要すること等の問題点を有している。
裸のＤＮＡを用いた遺伝子導入の場合、ＤＮＡは大腸菌等で容易に大量に調製することが可能であり、また、遺伝子導入は例えばリン酸カルシウムやカチオニックリポソームを介したエンドサイトーシスや、電気穿孔法、遺伝子銃、あるいはマイクロインジェクション技術によって可能である。この場合、一部のＤＮＡが組換えにより染色体に取り込まれるが、その効率はきわめて悪く、ほとんどの場合一過性の遺伝子発現を期待した場合にのみ用いられている技術であり、長期安定発現には不適である。しかしながら、トランスジェニック生物作製においては、現時点では専ら裸のＤＮＡをマイクロインジェクション等によって導入する技術が採用されてきており、上記したように染色体への遺伝子の組み込みは偶然の組換えによってしか成立せず、トランスジェニック生物の作製効率はきわめて悪く、そのため多大なコストと時間がかかっているのが現状である。
発明の目的
本発明の目的は、レトロウイルスベクターの持っている特性である染色体への安定な遺伝子の組み込み機能を生かしつつ、宿主域を選ばずに遺伝子を導入し、幅広い範囲の細胞を形質転換する方法、及び該方法に使用される遺伝子導入用組成物、形質転換用組成物を提供することにある。これにより、幅広くトランスジェニック生物作製が可能な技術を確立し、また、遺伝子治療の分野での新規ベクターを開発することが出来る。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、組換えレトロウイルスベクターが宿主染色体に組込まれる直前に形成される組換えプレインテグレーション複合体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ：ｒＰＩＣ）を調製して標的細胞に導入した場合、このｒＰＩＣに含まれる遺伝子が驚くべきことに元のウイルスの指向性に関係なく標的細胞の染色体上に組込まれることを見出した。
更に本発明者らは、この知見に基づき、幅広い範囲の標的細胞に遺伝子導入可能な複合体、及びその製造方法を開発し、該複合体を用いた細胞への遺伝子導入方法、細胞の形質転換法を開発し、本発明を完成した。
即ち、本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体に関する。
本発明の第２の発明は、第１の発明の複合体の製造方法に関する。
本発明の第３の発明は、第１の発明の複合体を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする遺伝子導入方法に関する。
本発明の第４の発明は、レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡを細胞に導入することを特徴とする遺伝子導入方法に関する。
本発明の第５の発明は、第１の発明の複合体を含有することを特徴とする遺伝子導入用組成物に関する。
本発明の第６の発明は、第３または第４の発明の遺伝子導入方法を行なうための遺伝子導入用キットに関する。
本発明の第７の発明は、包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬からなる製造品に関し、該遺伝子導入用試薬が第１の発明の複合体及び／又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない遺伝子導入に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への遺伝子導入用試薬の製造品に関する。
本発明の第８の発明は、包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬からなる製造品に関し、該遺伝子導入用試薬が第４の発明の遺伝子導入を行うための試薬を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない遺伝子導入に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への遺伝子導入用試薬の製造品に関する。
本発明の第９の発明は、第１の発明の複合体を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする細胞の形質転換方法に関する。
本発明の第１０の発明は、第４の発明の方法によって遺伝子を導入する工程を包含することを特徴とする細胞の形質転換方法に関する。
本発明の第１１の発明は、第１の発明の複合体を含有することを特徴とする細胞の形質転換用組成物に関する。
本発明の第１２の発明は、第３または第４の発明の遺伝子導入方法を包含することを特徴とする細胞の形質転換に使用されるキットに関する。
本発明の第１３の発明は、包装材と該包装材に封入された形質転換用試薬からなる製造品に関し、該形質転換用試薬が第１の発明の複合体及び／又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記形質転換用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞の形質転換用試薬の製造品に関する。
本発明の第１４の発明は、包装材と該包装材に封入された形質転換用試薬からなる製造品に関し、該形質転換用試薬が第１０の発明の形質転換を行うための試薬を含有し、前記形質転換用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞の形質転換用試薬の製造品に関する。
発明の詳細な説明
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
本発明の複合体は、標的細胞に遺伝子を導入するための複合体であって、具体的には少なくともレトロウイルス由来の末端反復配列（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ：ＬＴＲ）と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡ（すなわち、当該レトロウイルスとは異なる起源のＤＮＡ）とを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含有する複合体であり、レトロウイルスとしての構造を持たない複合体である。即ち、本発明の複合体は、レトロウイルスのＲＮＡゲノムやエンベロープを持たず、あるいはレトロウイルスのＲＮＡゲノムやエンベロープが感染能を失っており、感染性をもたない複合体である。１つの実施態様において、上記レトロウイルス由来の末端反復配列および当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡは組換えレトロウイルスに由来する。該複合体を使用することによって該複合体中の組換えレトロウイルス由来２本鎖ＤＮＡに含まれる遺伝子、或いは当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡを標的細胞に導入することが出来る。ここで、組換えレトロウイルスとは、天然のレトロウイルスのゲノムの塩基配列の一部が改変されたものを言い、例えば、外来遺伝子が挿入されたレトロウイルスや、ウイルスゲノム上に存在する遺伝子、またはその一部に欠損、置換、挿入、付加を有するレトロウイルス等があげられる。該組換えレトロウイルスに特に限定はなく、エコトロピックであってもアンフォトロピックであってもシュードタイプであっても良く、例えば、市販の組換えレトロウイルスベクターを使用することが出来る。
ここで、レトロウイルス由来の末端反復配列（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ：ＬＴＲ）と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとしては、特に限定はないが、好適にはレトロウイルス由来の２つのＬＴＲの間に当該ウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡが挿入されたものが挙げられる。
当該ウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡには特に限定はなく、細胞中に導入することが望まれる任意のＤＮＡを使用することができる。例えば、酵素、増殖因子やその他のタンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡの他、アンチセンス核酸、リボザイム、等をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを使用することができる。
また、上記のＤＮＡは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を含有していてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子や、酵素活性によって遺伝子導入された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子等が利用できる。
本発明において、細胞に導入しようとする遺伝子は適当なプロモーター、例えば、レトロウイルスベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターの制御下に、本発明の複合体の２本鎖ＤＮＡに含有させて使用することができる。また、効率よい外来遺伝子の転写を達成するためにプロモーターや転写開始部位と共同する他の調節要素、例えばエンハンサー配列やターミネーター配列等を２本鎖ＤＮＡ内に含有させてもよい。また、染色体へのポジションエフェクトを回避するために、インスレーター配列等を２本鎖ＤＮＡ内に含有させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子が、ライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。
本発明において、レトロウイルス由来タンパク質成分とは、宿主ＤＮＡにウイルスＤＮＡを組込む活性を有するものを言い、特に限定はないが、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するＤＮＡを染色体に組込む活性を有する酵素、例えばレトロウイルス由来のインテグラーゼを含有するものが挙げられる。さらに、レトロウイルス由来タンパク質成分には、レトロウイルスによる染色体への遺伝子の組込みに際して形成されるプレインテグレーション複合体（ＰＩＣ）に含まれることが知られている他のタンパク質が含まれていてもよい。そのようなタンパク質としては逆転写酵素、核酸結合蛋白質、カプシド蛋白、マトリックス蛋白が挙げられる。その他、細胞内に存在する因子、例えば非ヒストン蛋白であるＨＭＧＩ、ＢＡＦ−１やＤＮＡ依存性蛋白リン酸化酵素（ＤＮＡ−ＰＫ）等が含まれていても良い。また、本発明に使用されるレトロウイルス由来タンパク質成分には、宿主染色体へのウイルスのＤＮＡの組込む活性を有する範囲で天然のレトロウイルス由来タンパク質成分に欠損、置換、挿入、付加を有するものも含まれる。
レトロウイルスは分裂増殖している細胞に感染し、そのウイルス遺伝子は宿主細胞の染色体に組込まれる。レトロウイルスによる染色体への遺伝子の組込みは、（１）レセプターを介したウイルス粒子の標的細胞表面への吸着、（２）コアの放出による細胞質内への侵入、（３）コア内に存在する逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成、（４）同酵素のＲＮａｓｅＨ活性とＤＮＡ依存ＤＮＡ合成活性による２本鎖ＤＮＡの合成、（５）プレインテグレーション複合体（ｐｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ：ＰＩＣ）の形成、（６）ＰＩＣの核への移行、（７）組込み活性を有する酵素の作用による宿主染色体への安定な組み込み、の一連の過程により成立する。
遺伝子の染色体への組み込みのためには、宿主細胞の核膜の崩壊によってＰＩＣが宿主の核内へ移行することが必要であり、この移行は宿主細胞がＧ２／Ｍ期を通過することによって成立する。即ち、分裂していない細胞ではＰＩＣは核内に移行できず、遺伝子は染色体に組込まれない。従って、レトロウイルスが感染した細胞をＧ１期で停止しておくと、核内に移行できないＰＩＣが細胞質に蓄積する。蓄積したＰＩＣは細胞質より調製することが出来る。
本発明の複合体は、好適には上記したメカニズムを利用して、例えば以下のようにして調製することが出来る。
組換えレトロウイルスをアフィディコリン等の細胞周期調節剤で処理してＧ１期で停止した細胞に感染させ、感染細胞を培養する。本明細書において培養とは、細胞数の増加を目的として細胞のインキュベートを行なうことのみに限定されず、細胞を細胞周期を停止した状態で維持する行為をも包含する。感染から７〜１１時間程の間に、細胞質内では逆転写、２本鎖ＤＮＡ合成、組換えプレインテグレーション複合体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ：ｒＰＩＣ）形成が進行するが、細胞周期がＧ１期で停止されているため、生成したｒＰＩＣは染色体内に組込まれることはなく、細胞質に蓄積する。細胞質に蓄積したｒＰＩＣは、界面活性剤で細胞膜を分解することによって容易に抽出でき、抽出したｒＰＩＣは本発明の方法に使用することが出来る。また、抽出されたｒＰＩＣは遠心分離やクロマトグラフィー等の公知の方法によって精製することが出来、このようにして得られた精製ｒＰＩＣも本発明の方法に使用することが出来る。
本発明の複合体を調製するための培養細胞は、用いるレトロウイルスが感染しうる細胞であれば何でもよく、例えばＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５８）、ＨＴ−１０８０細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−１２１）、２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１５７３）等を使用することが出来る。
組換えレトロウイルスをＧ１期で停止した細胞に感染させる際には、ポリブレン等、適当な補助剤や、国際公開ＷＯ９５／２６２００号公報やＷＯ９７／１８３１８号公報に記載の機能性物質を使用することによって、効率よく感染させることが出来る。上記機能性物質としては、フィブロネクチンのフラグメントを使用することが出来、特にレトロネクチン（宝酒造社製）を好適に使用することが出来る。
組換えレトロウイルスの粒子内には２本鎖ＤＮＡの合成に必要な逆転写酵素活性とＤＮＡ合成酵素活性が存在し、また、染色体への組み込みに必要なインテグラーゼ等のタンパク質成分が存在する。従って本発明の複合体は、組換えレトロウイルス粒子を試験管内で崩壊したものに、デオキシリボヌクレオチドを添加してインキュベートすることによっても、調製することが出来る。
即ち、組換えレトロウイルス粒子を試験管内で適当な条件で崩壊し、ここにデオキシリボヌクレオチドを添加することによって試験管内でｃＤＮＡの合成及び２本鎖ＤＮＡの合成反応が進行し、合成された２本鎖ＤＮＡはインテグラーゼ等のタンパク質成分と会合し、ｒＰＩＣが形成される。このようにして形成されたｒＰＩＣは本発明の方法に使用することが出来る。また、形成されたｒＰＩＣは遠心分離やクロマトグラフィー等の公知の方法によって精製することが出来、このようにして得られた精製ｒＰＩＣも本発明の方法に使用することが出来る。
また、本発明の複合体はレトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列とを有する２本鎖ＤＮＡと、レトロウイルス由来タンパク質成分を別々に調製し、両者を試験管内で混合することによって、ウイルス粒子を使用することなく調製することもできる。
ここで使用されるレトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡを有する２本鎖ＤＮＡには特に限定はないが、例えば、レトロウイルス由来の２つのＬＴＲの間に当該ウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡが挿入されたものが挙げられる。ここで、当該ウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡのサイズに限定はなく、目的に応じて任意のサイズのものを使用することが出来る。
レトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡを有する２本鎖ＤＮＡの調製法に特に限定はなく、例えば、レトロウイルス由来のＬＴＲと当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡのカセットを有するプラスミドを構築し、該プラスミドで形質転換した大腸菌等の宿主細胞を培養し、該培養物から単離されたプラスミドより大量に調製することが出来る。該プラスミドにおいて、レトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡを有する２本鎖ＤＮＡの両側に制限酵素切断部位を配しておけば、該制限酵素を作用させることによって目的の２本鎖ＤＮＡを容易に調製することが出来る。また、レトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡを有する２本鎖ＤＮＡは、上記したカセットを有するプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法にて増幅することによっても調製することも出来る。
一方、本発明に使用されるレトロウイルス由来タンパク質成分の調製法に特に限定はないが、例えばウイルス粒子より調製したもの、遺伝子工学的に調製したもの、或いはパッケージング細胞より調製したもの等が挙げられる。本発明に使用されるレトロウイルス由来タンパク質成分、例えばインテグラーゼをコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングし、該発現ベクターを用いて大腸菌等を宿主として遺伝子工学的に発現することによって容易に該成分を調製することが可能である。
パッケージング細胞を培養して得られる培養上清にＤＮＡの組込み活性を有する成分が含まれており、該培養上清より本発明に使用されるレトロウイルス由来タンパク質成分を調製することが出来る。例えば、パッケージング細胞を培養して得られた培養上清を超遠心にかけることにより、該成分を含む蛋白質複合体を調製することが出来る。また、該成分を含む蛋白質複合体は、パッケージング細胞抽出液より得ることができる。該蛋白質複合体は、本発明に使用できる。また、該蛋白質複合体より、公知の方法でＤＮＡの組込み活性を有する成分を精製することができ、このようにして精製されたものも本発明に使用できる。
ここで、用いられるパッケージング細胞に特に限定はなく、例えばＢＯＳＣ２３細胞等が好適に使用される（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８３９２−８３９６（１９９３））。
以上のようにしてインビトロで別々に調製したレトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分をインビトロで混合することによって、ウイルス粒子を用いることなくインビトロで本発明の複合体を調製することが出来る。このようにして調製された複合体は、本発明の方法に使用できる。また、該複合体は必要に応じて遠心分離やクロマトグラフィー等の公知の方法によって精製することが出来、精製された複合体も本発明の方法に使用することが出来る。
また、このようにインビトロで本発明の複合体を調製する場合、上記したように複合体中の２本鎖ＤＮＡの大きさに限定はなく、該複合体を用いれば、従来のレトロウイルスベクターによる遺伝子導入法では導入が不可能であった８ｋｂ以上の遺伝子の導入が可能である。
さらに、上記の複合体は、当該複合体の細胞への導入、ＤＮＡの染色体への組込みを妨げない範囲で他の要素を含むことが出来る。
また、本発明の複合体はレトロウイルス粒子にパッケージングされている必要はない。
本発明の複合体は、調製後、直ちに遺伝子導入に使用することが出来る。また、凍結保存しておき、必要な時に融解して使用することも出来る。凍結保存の方法に特に限定はないが、例えば、ドライアイスで急凍したのち−８０℃で保存することが出来る。
上記の方法によって調製した複合体を標的細胞に導入することにより、標的細胞の染色体へ遺伝子を導入することが出来、また標的細胞を形質転換することが出来る。
複合体の標的細胞への導入方法に特に限定はなく、例えば、カチオニックリポソーム法やリン酸カルシウム法等のエンドサイトーシスを利用した方法、電気穿孔法や遺伝子銃法やマイクロインジェクション法等の公知の方法で導入することが出来る。穿孔法を用いて導入を行なう場合には、国際公開ＷＯ９６／１７０７３号公報に記載のように、導入後の標的細胞を細胞接着活性を有する物質の存在下にて培養することで効率良く形質転換された細胞を得ることが出来る。
また、レトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡと、レトロウイルス由来タンパク質成分を、それぞれ標的細胞に導入することにより、標的細胞の染色体へ遺伝子を導入することが出来、また標的細胞を形質転換することができる。
レトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡと、レトロウイルス由来タンパク質成分の導入の順序に限定はなく、レトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡを先に導入しても良いし、レトロウイルス由来タンパク質成分を先に導入しても良く、また、両者を同時に導入しても良い。レトロウイルス由来のＬＴＲと当該ウイルスに存在しない塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡと、レトロウイルス由来タンパク質成分の標的細胞への導入方法に特に限定はなく、例えば、カチオニックリポソーム法やリン酸カルシウム法等のエンドサイトーシスを利用した方法、電気穿孔法や遺伝子銃法やマイクロインジェクション法等の穿孔法等の公知の方法で導入することが出来る。穿孔法を用いて導入を行なう場合には、国際公開ＷＯ９６／１７０７３号公報に記載のように、導入後の標的細胞を細胞接着活性を有する物質の存在下にて培養することで効率良く形質転換された細胞を得ることが出来る。
本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法の標的細胞の由来に特に限定はなく、本発明の複合体の由来する組換えレトロウイルスの指向性に限定されることなく、幅広く任意の真核細胞を標的とすることが出来、例えば、哺乳類、鳥類、魚類、昆虫、植物等の真核生物の細胞を標的とすることが出来る。
また、標的細胞の種類にも特に限定はなく、例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞等の幹細胞の他、卵、精子等の生殖細胞、各種体細胞等あらゆる種類の細胞を標的とすることが出来る。
また、標的細胞は、培養細胞であっても生物個体であっても良く、脊椎動物の受精卵、生殖細胞系列を標的とすることでトランスジェニック動物の作製も可能である。
従来のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入ではウイルスの感染から遺伝子の染色体への組込みまでに少なくとも７時間を有していたが、これは細胞質内でプレインテグレーション複合体が形成されるのに時間を要していたためであり、この間に標的細胞の細胞分裂が起こり、その結果として遺伝子が導入される細胞と遺伝子が導入されない細胞が生じるモザイク化がおこり、トランスジェニック動物の作製において、大きな問題点となっていた。
一方、本発明の遺伝子導入法においては、導入後直ちに遺伝子は染色体に導入され、モザイク化を引き起こすことはない。即ち、本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法はトランスジェニック生物の効率の良い作製をも可能とするものである。
また、従来のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入では標的細胞１個あたり１コピーの遺伝子しか導入できなかったが、本発明の導入方法では、導入する複合体の量を調節することによって、標的細胞１個あたり複数コピーの遺伝子を導入することが可能である。
本発明の遺伝子導入用組成物、形質転換用組成物とは、本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法に使用される遺伝子導入用組成物、形質転換用組成物を指し、本発明の複合体、またはレトロウイルス由来タンパク質成分を含有することを特徴とする。該組成物には、適当な緩衝液、塩類等を含有させることが出来、更に遺伝子導入を促進させる任意の物質を含有させることも出来る。
本発明の遺伝子導入用キット、形質転換用キットとは、本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法に使用されるキットを指し、パッケージされた形態において、該方法に使用される試薬類に加え、本発明の複合体を細胞に導入することを指示した指示書、もしくはレトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとを細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする。ここで指示書とは、本発明の実施方法を指示する書面を指す。例えば本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法、該方法における本発明の複合体、レトロウイルス由来タンパク質成分の使用方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
本発明のキットは、本発明の複合体調製のための細胞、細胞培養のための培地、試薬、培養器、複合体やレトロウイルス由来タンパク質成分やレトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡの標的細胞への導入に使用される試薬類等を含めることが出来る。
該キットを用いることで、本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法を簡便に行なうことが出来る。
本発明の遺伝子導入用試薬の製造品又は形質転換用試薬の製造品とは、包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬又は細胞の形質転換用試薬からなる製造品であって、該遺伝子導入用試薬又は形質転換用試薬がレトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列のＤＮＡとを含有する２本鎖ＤＮＡとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体及び／又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記遺伝子導入用試薬又は形質転換用試薬が、目的とする細胞へのレトロウイルスの感染の工程を含まない遺伝子導入又は形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなることを特徴とする。
また、本発明の遺伝子導入用試薬の製造品又は形質転換用試薬の製造品とは、包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬又は形質転換用試薬からなる製造品であって、該遺伝子導入試薬又は形質転換用試薬がレトロウイルス由来タンパク質成分を含有する組成物を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない遺伝子導入又は形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなることを特徴とする。
本発明によれば、従来のレトロウイルスベクターによる遺伝子導入方法の欠点であった宿主域の限定は克服され、あらゆる真核細胞への遺伝子導入が可能である。即ち、従来のレトロウイルスベクターによる遺伝子導入は、該ウイルスに対するレセプターを介した感染によるものであり、該レセプターの有無により宿主域は限定される。一方、本発明の複合体は、エンドサイトーシスを利用した方法、即ち、電気穿孔法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法等の公知の方法によってレセプターの有無に関わりなく導入することが出来、その結果、宿主域の限定なく広く任意の細胞に遺伝子を導入することが出来る。また、本発明の方法によれば、目的の標的細胞に導入すると直ちに遺伝子が染色体に組込まれるため、従来のトランスジェニック生物の作製法において問題となっていたモザイク化は起こらず、効率の良いトランスジェニック生物の作製も可能である。
また、従来のウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法では、使用されるウイルス粒子の作製に煩瑣な操作を必要し、また力価の高いウイルスベクターを作製することは難しいとの欠点があった。しかしながら、本発明の複合体は、ウイルス粒子を用いることなくインビトロで調製することも可能であり、この場合、煩瑣な操作を行なうことなく、短時間で大量の複合体を調製することが出来、従来に比べ、はるかに簡便に効率の良い遺伝子導入が可能となった。
このように、本発明は従来の技術の欠点を克服した優れた技術であり、例えば、従来の方法の限界により効果が限定されていたあらゆる遺伝子治療に応用することで、顕著な治療効果を期待できる等、優れた有用性を示す。
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
組換えプレインテグレーション複合体（ｒＰＩＣ）の調製
１．ｅｃｏＧＦＰウイルス液の調製
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドをパッケージング細胞ＧＰ＋Ｅ−８６［ジャーナル　オブ　ウイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁（１９８８年）］に導入したｅｃｏＧＦＰウイルス産生細胞は１０％ウシ胎児血清（バイオウィターカー社製）ならびに５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。なお、以降の操作に使用したＤＭＥＭはすべて５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含んだものである。ｅｃｏＧＦＰウイルス液は上記産生細胞をセミコンフルエントに生育させた１０ｃｍ径のプレートに１０％ウシ胎児血清を含有する７ｍｌのＤＭＥＭを添加し、３２℃、５％ＣＯ２にて２４時間培養した後に培養上清を０．４５ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過してウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−８０℃で保存した。
２．ウイルス上清液の力価の測定
ウイルス上清液の力価の測定はＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５８）を使用して標準的な方法［ジャーナル　オブ　ウイロロジー、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁（１９８８年）］に従って測定した。すなわち、６ウェルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）の１ウェルあたり５×１０４個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む１０％ウシ血清（ギブコ社）を含有するＤＭＥＭ　２ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩培養した後、培地を吸引除去し、各ウェルに系列希釈したウイルス上清液１ｍｌを加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）を終濃度８μｇ／ｍｌとなるよう加えた。これを３７℃で４時間培養し、さらに１０％ウシ血清を含有するＤＥＭＥＭを１ｍｌ添加して２０時間培養した後、培地を終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）と１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ　２ｍｌと交換しさらに培養を続けた。３〜４日毎にＧ４１８含有培地を交換し１０〜１２日後に生育したＧ４１８耐性コロニーを０．２％メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色しその数を計測した。ウェルあたりのコロニー数にウイルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清１ｍｌあたりの感染性粒子数（ｃｆｕ／ｍｌ）を算出し、ウイルス力価とした。調製したｅｃｏＧＦＰウイルス液の力価は１×１０７ｃｆｕ／ｍｌであった。
３．ｒＰＩＣの調製
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞２×１０６個を１０ｃｍ径のプレートで１０％ウシ血清を含有する１０ｍｌのＤＭＥＭで２４時間、３７℃、５％ＣＯ２で培養し、培地を２μｇ／ｍｌのアフィディコリン（和光純薬社製）と１０％ウシ血清を含有する７ｍｌのＤＭＥＭに交換しさらに１４時間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。アフィディコリンを添加してから１４時間後に、培地を吸引除去し、ｅｃｏＧＦＰウイルス液２ｍｌと１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ　３ｍｌを混和し、更にアフィディコリンを終濃度２μｇ／ｍｌとなるよう、およびポリブレンを終濃度８μｇ／ｍｌとなるよう加えた液をＮＩＨ／３Ｔ３細胞に添加して３２℃、５％ＣＯ２でウイルス感染を開始した。感染開始から３時間後にウイルス液を除去し、培地を２μｇ／ｍｌのアフィディコリンと１０％ウシ血清を含有する７ｍｌのＤＭＥＭに交換しさらに７時間（ウイルス感染開始から１０時間）、３２℃、５％ＣＯ２で培養した。この間に、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に感染したウイルスは逆転写、ＤＮＡ合成反応が進行し、ｒＰＩＣを形成するが、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞はアフィディコリンでＧ１期に細胞周期が停止しているためレトロウイルス遺伝子が染色体に組込まれることはなく細胞質に蓄積する。
細胞質に蓄積したｒＰＩＣは以下の方法によって抽出した。すなわち、感染から１０時間後の細胞を５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ液（バイオウィターカー社製）で細胞を分散し、１０％ウシ血清を含有する５ｍｌのＤＭＥＭを添加して細胞を遠心分離（２００×ｇ、５分）し、沈殿した細胞を９ｍｌのバッファーＡ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２２５ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、ｐＨ７．４）で洗浄して遠心分離（２００×ｇ、５分）し、沈殿を２５０μｌのバッファーＡに懸濁した。細胞懸濁液に１．２５μｌの５％ジギトニン／ＤＭＳＯ溶液を添加し、２５℃にて５分間静置して細胞質画分を抽出した。抽出液を１０００×ｇで３分間遠心分離し、上清をさらに５０００×ｇで３分間遠心した。得られた上清はｒＰＩＣ液として５０μｌずつ分注し、−８０℃にて保存した。
４．２本鎖ＤＮＡの検出
上記３にて、抽出し、凍結保存したｒＰＩＣ液を希釈したものを鋳型とし、ＧＦＰ遺伝子特異的プライマーを使用したＰＣＲ反応により組換えレトロウイルス由来のＧＦＰ遺伝子の検出を行った。タカラ　タック（ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ、５ｕｎｉｔｓ／μｌ、宝酒造社製）０．５μｌ、１０×ＰＣＲバッファー（宝酒造社製）５μｌ、１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ　混合液　８μｌ、鋳型１μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ１（配列番号１）２０ｐｍｏｌ、Ｐｒｉｍｅｒ　２（配列番号２）２０ｐｍｏｌを混合し、蒸留水で５０μｌにメスアップして調製したＰＣＲ反応液にミネラルオイルを重層して９４℃、１分間加熱の後、９４℃で３０秒、５９℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとする反応を３０回繰り返した。反応後、ＰＣＲ反応液１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅断片を確認した。鋳型には、ｒＰＩＣを希釈したもの、およびｒＰＩＣよりフェノール−クロロフォルム抽出で精製したＤＮＡを用い、対照としてウイルス感染していないＮＩＨ／３Ｔ３細胞から同様の操作で抽出した画分を用いＰＣＲ反応に供した。陽性コントロールとしてＧＦＰ発現プラスミドベクターを用いた。その結果、ｒＰＩＣを希釈したもの、ｒＰＩＣよりフェノール−クロロフォルム抽出で精製したＤＮＡを鋳型とした場合、ＧＦＰ遺伝子由来の３１６ｂｐの断片の増幅が確認され、上記３で調製されたｒＰＩＣに組換えウイルス由来のＧＦＰ遺伝子が含まれていることが示された。
実施例２
ｒＰＩＣの培養細胞への導入
マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞は１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を増殖培地とし、ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１５７３）は１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を増殖培地とし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。１０ｃｍ径プレートでコンフルエントに増殖したマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ヒト２９３細胞はトリプシン処理でプレートから剥がした後、血清を含まないＤＭＥＭで洗浄し、７００μｌのＤＭＥＭに懸濁した。７００μｌの細胞懸濁液と実施例１で調製したｒＰＩＣ　１００μｌを０．４ｃｍ幅のエレクトロポレーションキュベット（バイオラッド社製）に入れ、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド社製）で２５０Ｖ、９７５μＦ、室温の条件でエレクトロポレーションを行い、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞は１／１０量を、ヒト２９３細胞は１／４量を１０ｃｍ径のゼラチンコート（岩城硝子社製）に播き、エレクトロポレーションの翌日からＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ含有する増殖培地で培養した。
エレクトロポレーションから７日目に蛍光顕微鏡にて観察したところ、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ヒト２９３細胞の何れにおいても緑色の蛍光を発する細胞が観察され、マウス由来細胞、ヒト由来細胞を問わず導入したＧＦＰ遺伝子が発現していることが示された。
また、更に培養を続け、エレクトロポレーションから２週間、Ｇ４１８選択培地で培養した後、出現したネオマイシン（Ｇ４１８）耐性コロニーをメチレンブルーで染色したところ、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞からは４６個の耐性コロニーが得られ、ヒト２９３細胞からは１９６個の耐性コロニーが得られ、導入した遺伝子が安定的に発現していることが示された。
以上の結果は、マウス由来の細胞にしか感染することが出来ないエコトロピックウイルスから調製したｒＰＩＣが、従来の方法では遺伝子導入できなかったヒト由来の細胞へ遺伝子を安定的に導入できたことを示し、ｒＰＩＣが宿主域を選ばず安定的に遺伝子導入可能なベクターであることを示すものである。
実施例３
高力価ｒＰＩＣの調製とｒＰＩＣのインテグレーション効率の評価
１．高力価ｒＰＩＣの調製
ｅｃｏＧＦＰウイルス液２５０ｍｌを、４℃、２９００　ｘ　ｇ、１６時間低速遠心し、沈殿を１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ５ｍｌで懸濁することにより、高力価ｅｃｏＧＦＰウイルス液を調製した。このウイルス液の力価は４　ｘ　１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。このウイルス液を使用し、Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝２００の条件でＮＩＨ／３Ｔ３細胞に感染し、実施例２の方法でｒＰＩＣを調製した。
２．ｒＰＩＣのインテグレーション効率の評価
高力価ｒＰＩＣを用いて、２９３細胞にエレクトロポレーション法で遺伝子導入した。対照として、ＧＦＰ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドベクターをエレクトロポレーション法、およびトランスフェクション法で２９３細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入から３日後の２９３細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に供し、ＧＦＰ発現２９３細胞を選択的に回収した。回収後の２９３細胞のＧＦＰ発現率は、ｒＰＩＣ導入実験区が９４．３％、プラスミドベクターエレクトロポレーション実験区が９４．３％、プラスミドベクタートランスフェクション実験区が９８．８％、であり、一過性に遺伝子導入された細胞が選択的に回収された。この一過性ＧＦＰ発現２９３細胞をＧ４１８＋およびＧ４１８−培地中で２週間培養し、［Ｇ４１８含有プレートのコロニー数］÷［Ｇ４１８不含プレートのコロニー数］から長期安定遺伝子発現効率を算出し、インテグレーション効率とした。ｒＰＩＣのインテグレーション効率は９８．７％、プラスミドベクターエレクトロポレーション実験区のインテグレーション効率は７．５％、プラスミドベクタートランスフェクション実験区のインテグレーション効率は１．４％であった。ｒＰＩＣはインテグレーション効率に優れたベクターであることが示された。
実施例４
ｒＰＩＣのメダカ受精卵への導入
成熟したヒメダカ　オス、メス各１尾を一組として、３Ｌの水道水で水温２５℃、１４時間照明、１０時間暗条件にて飼育し、一日３〜５回、テトラフィン（テトラベルケ社）を３〜５分で食べ切る量を与え、産卵させた。産卵直後の卵を採取し、８ｐｐｍのメチレンブルー水溶液中で、ピンセットでほぐし、同水溶液で洗浄した。実施例３で調製した高力価ｒＰＩＣ　をゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｏｓｅ６（アマシャムファルマシア社）で精製し、ｒＰＩＣ含有画分５μｌをマイクロインジェクションピペット（ナリシゲ社製芯入硝子管　モデルＧＤ−１より作製）に入れ、顕微鏡下で観察しながら１細胞期のメダカ受精卵の細胞１個あたりに約５０ｐｌのｒＰＩＣ液を注入した。６９個の卵にマイクロインジェクションを行い、９６ウェルプレートの各ウェルに卵を１個づつ入れ、８ｐｐｍのメチレンブルー水溶液中で２５℃で培養した。産卵後８日目以降、ふ化してきた稚魚を順次水槽に移し最終的に合計４７匹の稚魚がふ化した。孵化直後の稚魚１６匹をサンプリングし、１．５ｍｌ容マイクロチューブに入れ、−２０℃で保存した。ふ化した稚魚からは以下の方法でゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法でネオマイシン耐性遺伝子の検出を行った。すなわち、稚魚１匹が入っているマイクロチューブに１００μｌの抽出バッファー（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、３９　ｍＭ　ＤＴＴ、２％　ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ、ｐＨ　８）を添加し、６０℃にて４時間インキュベートした。なお、インキュベート開始の３０分後、６０分後に攪拌を行った。次にチューブあたり５μｇのＲＮａｓｅＡを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、さらに、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を施し、得られたゲノムＤＮＡをそれぞれ５０μｌの蒸留水に溶解した。
得られたゲノムＤＮＡ溶液の内、１μｌを鋳型とし、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲ反応により導入遺伝子の検出を行った。反応はＴａＫａＲａ　Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて、ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ　０．５μｌ、１０　ｘ　ＰＣＲバッファー　５μｌ、ｄＮＴＰ　混合液　８μｌ、希釈した鋳型１μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ３（配列番号３）２０　ｐｍｏｌ、Ｐｒｉｍｅｒ４（配列番号４）２０　ｐｍｏｌ、蒸留水で５０μｌにメスアップし、ミネラルオイルを重層して９４℃１分間加熱の後、９４℃　３０秒、５６℃　３０秒、７２℃　３０秒の反応を３０回繰り返した。ＰＣＲ反応液１０μｌを２％　アガロースゲルで電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果、マイクロインジェクションによりｒＰＩＣを導入したメダカ１６匹中１６匹から導入遺伝子が検出され、遺伝子導入効率は１００％であった。メダカ受精卵は受精後１時間は１細胞期であるが、以後は３５分に一度分裂していく。このように非常に早い速度で分裂する細胞においては、ＶＳＶ−Ｇレトロウイルスベクターを用いた場合は逆転写のプロセスが律速となり、発生がかなり進んだ段階でしか遺伝子が組込まれない。また、プラスミドベクターは偶然の組換えによってのみ、宿主染色体に組込まれる。一方、ｒＰＩＣはＮＩＨ／３Ｔ３細胞のゲノムに組込まれる直前に抽出しているため、インテグレーション効率の高い状態で調製されており、細胞分裂の初期段階でゲノムに組込まれることが期待でき、トランスジェニック動物作製用ベクターなど多方面で応用可能なベクターであることを示すものである。
実施例５
ＢＯＳＣ２３細胞上清を利用した培養細胞への遺伝子導入
レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子とエコトロピックｅｎｖ遺伝子が導入されたパッケージング細胞ＢＯＳＣ２３を１０％ウシ胎児血清ならびに５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で培養した。
１０ｃｍ径プレートでＢＯＳＣ２３細胞を培養し、セミコンフルエントに生育したところで新しい１０％ウシ胎児血清を含有する５　ｍｌのＤＭＥＭ培地と交換し、３７℃、５％　ＣＯ２にて２４時間培養した。
その培養上清を０．４５ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過したものを、超遠心機により、３００００ｒｐｍ、４℃、２時間遠心した。
得られた沈殿物をＤＭＥＭにて洗浄後、再度、超遠心機により、３００００ｒｐｍ、４℃、２時間遠心し、得られた沈殿物を５０μｌのＤＭＥＭに懸濁し、ＳＤＳ含有試薬を加え、９９℃、５分間、加熱処理後、蛋白質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行なった。
その結果、沈殿物中にｇａｇ蛋白（ｐ３０、ｐ１５）が含まれていることが確認できた。
このことから、ＢＯＳＣ２３細胞の培養上清には、ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ蛋白を含む蛋白複合体の存在が示唆された。この蛋白複合体はｅｎｖ蛋白の機能により、細胞への感染能も有すると予想される。この、ＢＯＳＣ２３細胞の培養上清に存在する蛋白複合体を利用した培養細胞ゲノムへのプラスミドＤＮＡ組込み能について実験を行なった。
１．　ＢＯＳＣ２３細胞上清サンプルの調製
ＢＯＳＣ２３細胞上清サンプルとは、１０ｃｍ径プレートでセミコンフルエントに生育したＢＯＳＣ２３細胞を、新しい１０％ウシ胎児血清を含有する１０ｍｌのＤＭＥＭ培地と交換し、３２℃、５％ＣＯ２にて２４時間培養し、得られた培養上清を０．４５ミクロンのフイルター（ミリポア社製）でろ過したものである。
２．　ＢＯＳＣ２３細胞上清サンプルを利用した遺伝子の導入
マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞は１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を増殖培地とし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１０ｃｍ径プレートでセミコンフルエントに生育させたものに対し、レトロウイルスＬＴＲ遺伝子に挟まれたＧＦＰ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子を含有するレトロウイルス産生用プラスミドベクター　ｐＤＯＮ−ＡＩ−ｒｓＧＦＰをリポフェクトアミン２０００（ギブコ社製）にて遺伝子導入し、１０ｍｌの１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５時間培養したものを試験サンプルとした。尚、ｐＤＯＮ−ＡＩ−ｒｓＧＦＰは、ｒｓＧＦＰをコードするプラスミドｐＱＢＩ２５（宝酒造社製）より調製したｒｓＧＦＰをオードする遺伝子をレトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ＡＩに組み込んだものである。試験サンプルは、５時間培養後、培地を吸引除去し、１．で調製したＢＯＳＣ２３細胞上清サンプル４ｍｌを加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）を終濃度８μｇ／ｍｌになるように加え、３２℃で１６時間培養した。１６時間培養後、ＢＯＳＣ２３細胞上清サンプルを吸引除去し、１０ｍｌの１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。２４時間培養後、細胞を回収し、内２００００個の細胞を６ｃｍ径のゼラチンプレートに播き、終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるようにＧ４１８（ギブコ社製）を加えた１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地にて培養を行なった。１４日後に生育したＧ４１８耐性コロニーを０．２％メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色し、その数を計測した。加えて、コントロールとして５００個の細胞を６ｃｍ径のゼラチンプレートに播いたものも用意し、Ｇ４１８を含まない通常の培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１４日間培養後、生育したコロニーを０．２％メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色し、その数を計測した。
対照として、トランスフェクションによる遺伝子導入後、５時間後に、培地を吸引除去し、通常の培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行なった。
４０時間後に細胞を回収し、内２００００個の細胞を６ｃｍ径のゼラチンプレートに播き、終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるようにＧ４１８（ギブコ社製）を加えた１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地にて培養を行なった。１４日後に生育したＧ４１８耐性コロニーを０．２％メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色しその数を計測した。加えて、コントロールとして５００個の細胞を６ｃｍ径のゼラチンプレートに播いたものを用意し、通常の培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１４日間培養後、生育したコロニーを０．２％メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色し、その数を計測した。
長期遺伝子発現効率（インテグレーション効率）は、［Ｇ４１８含有プレートのコロニー数］÷［Ｇ４１８不含プレートのコロニー数］にて算出した。試験サンプルにて得られたインテグレーション効率は、５．００％であった。これに対し、対照実験区より得たインテグレーション効率は、０．７６％であった。このことから、プラスミドベクターを細胞に導入後、ＢＯＳＣ２３細胞上清サンプルをその導入細胞に感染させることで、ＢＯＳＣ２３細胞上清サンプル中のｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ蛋白を含む蛋白複合体の働きにより、プラスミドベクターを宿主細胞ゲノムに約７倍の高い効率で組込ませることができることが示された。これは、ＬＴＲを有するプラスミドベクターと、レトロウイルス構造タンパク質が標的細胞内で複合体を形成していることを示すものである。
産業上の利用の可能性
本発明によって、幅広く宿主域を選ばずに遺伝子を効率よく導入する方法が提供された。また、本発明の遺伝子導入法によれば、導入された遺伝子は速やかに宿主の染色体に組込まれるため、効率良いトランスジェニック生物の作製を可能にするものである。
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【配列表】
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【国際調査報告】
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