(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンにヘパリン-フォスファチジルエタノールアミンをコートした担体に、肝実質細胞増殖因子を固相化させた、固相化肝実質細胞増殖因子から成る肝細胞増殖剤。
【請求項２】
肝細胞の増殖誘導能を有する請求項１記載の肝細胞増殖剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は肝実質細胞増殖剤に関するものであり、詳しくは、グリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体と肝実質細胞増殖因子を結合することにより、該増殖因子が固相化された肝実質細胞増殖剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
近年、種々の細胞増殖因子がクロ−ニングされているが、それらの中で、ヘパリンに強い親和性を有する一群の増殖因子が見出されている。これをヘパリン結合性増殖因子と総称するが、この中には線維芽細胞増殖因子（以下ＦＧＦと略す）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、プレイオトロフィン、顆粒球／マクロファ−ジ・コロニ−形成刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インタ−ロイキン３及び７、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等、種々の既知または未同定の増殖因子が含まれる（実験医学、９（１４）、１７７２−１７７６（１９９１））。  これらの因子は、ヘパリンやヘパラン硫酸に代表されるグリコサミノグリカンと結合することが知られており、中でもＦＧＦは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合により細胞表面や細胞外基質に貯蔵されること、及びＦＧＦの有する生物学的活性がヘパリンによって調節され得ることが確認された（Ｃｅｌｌ、６４、８４１−８４８（１９９１））。
【０００３】
大工原らは、肝実質細胞を生体内より取り出して生体外においてその増殖を促進させうるヒト由来の蛋白性因子、即ちヒト肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）を劇症肝炎患者血漿より見いだし（特開昭６３−２２５２６号公報）、さらに喜多村らはｈＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）配列（特開平３−７２８８３号公報）、さらにこのｃＤＮＡを用いたｈＨＧＦ蛋白質の生産方法および形質転換体を発明するに至った（特開平３−２８５６９３号公報）。かかる発明により生産されるｈＨＧＦ蛋白質は、生体外において肝実質細胞の増殖を促進する働きが認められている。また、ｈＨＧＦに限らずＨＧＦ蛋白質は、ヘパリンに強い親和性を有する上記ヘパリン結合性増殖因子の一種であることが判明している。
【０００４】
一方、一般に細胞の増殖や運動性の調節には、液性因子のみならず、細胞に隣接する細胞外基質（ＥＣＭ）が重要な役割を果たすと考えられている。ＥＣＭを構成する主成分は、コラ−ゲン、エラスチンなどの繊維状蛋白質、フィブロネクチオン、ラミニンなどの接着性蛋白質、そしてグリコサミノグリカン糖鎖をもつプロテオグリカンなどの複合糖質である。このうち、生体材料からプロテオグリカンを調製するのは容易でなく、ＥＣＭ中のグリコサミノグリカンの生理的意義や増殖因子との相互作用について解析が遅れていた。
【０００５】
プロテオグリカンはグリコサミノグリカンと蛋白質との共有結合化合物の総称であるが、近年、各種グリコサミノグリカンを、天然コア蛋白質の代わりに他の蛋白質やリン脂質に共有結合させたプロテオグリカンのモデル化合物が作成されている（ネオプロテオグリカン；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４（１４）、８０１２−８０１８（１９８９），特開平４−８０２０１号および同４−８０２０２号各公報）。このネオプロテオグリカンは、効率よくグリコサミノグリカン糖鎖を培養皿に固相化する方法を初めて可能にした。
【０００６】
従来の技術では、ｈＨＧＦ等のヘパリン結合性増殖因子も含め、種々の増殖因子を溶液中に添加してその作用を見ることは可能であったが、該増殖因子を活性を保持した状態で固相化できなかったために、固相化した増殖因子の作用については解析されていない。また、増殖因子を生体内に投与した場合、該増殖因子を作用局所にとどめておくことは、技術的に困難であった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＨＧＦのグリコサミノグリカンへの結合性を利用して、該増殖因子を固相化し、その作用を検討することを試みた。その結果、興味深いことに、ＨＧＦはグリコサミノグリカンを介して固相化され、肝実質細胞に対して増殖刺激と成り得ることが判明し本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明の要旨は、グリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体に肝実質細胞増殖因子を結合してなることを特徴とする固相化された肝実質細胞増殖剤に存する。
以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明で使用する肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、生体材料から精製して得られたもの及び組換え法によりそのｃＤＮＡを発現させて得られたもののいずれのものも使用できる。ヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）の具体例としては、特開昭６３−２２５２６号公報に記載された方法に従い劇症肝炎患者血漿から蛋白化学的に分離精製することによって、或は、特開平３−２８５６９３号公報に記載された方法に従いｈＨＧＦをコ−ドするｃＤＮＡを含む発現ベクタ−を構築し、ＣＨＯ細胞等の宿主中で発現させることによって得られるものが挙げられる。かかるｈＨＧＦは、約０．５〜２ｎｇ／ｍｌの濃度で肝実質細胞の増殖活性を示しはじめ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で最高の増殖誘導活性に到達する。
【０００９】
本発明において、上記ＨＧＦを固相化する担体として、グリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体が使用される。グリコサミノグリカンとは、ヘキソサミンを構成糖として含む多糖の総称であり、具体的にはヒアルロン酸、コンドロイチン、テイクロン酸、コロミン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸ＤおよびＥ（コンドロイチンポリ硫酸）、ヘパリン、ケラト硫酸（ケラタン硫酸）、ヘパリチン硫酸（ヘパラン硫酸）、ポリアセチルガラクトサミンリン酸等の酸性グリコサミノグリカンや、キチン、ガラクトサミノグリカン等が挙げられる。一方、グルカンとはグルコースを構成糖として含む多糖の総称であり、具体的にはデキストラン、デキストラン硫酸、ラミナラン、リヘナン、セルロース、アミロース、アミロペクチン等が挙げられ、本発明においてはデキストランまたはデキストラン硫酸が好ましい。これらは既知の方法を用いて適宜調製することができる。
【００１０】
また、かかるグリコサミノグリカンまたはグルカンの誘導体としては特に制限はされないが、本発明においてはグリコサミノグリカンまたはグルカンと共有結合しうる蛋白質、またはリン脂質との誘導体であることが好ましい。蛋白質としては、アルブミン等の生体内蛋白質が、リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール等のグリセロリン脂質や、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質等が挙げられる。これらの蛋白誘導体は、いわゆるネオプロテオグリカンの製法として既知の方法（例えば，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（１４），８０１２−８０１８（１９８９）に記載の方法）により調製することができ、またリン脂質誘導体は特開平４−８０２０１号、同４−８０２０２号公報等に記載の方法に準じて調製することができる。
【００１１】
本発明において、ＨＧＦはグリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体に結合される。このとき、ＨＧＦはもともとヘパリン結合性であることから両者を混合することにより容易に結合されるが、その性質を損なわない範囲においてリン酸緩衝−生理食塩水等を共存させても差し支えない。またＨＧＦとグリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体とは、モル比で１：１〜１：１０００の割合で結合させることが好ましい。さらに本発明においては、グリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体を予めコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カドヘリン等の細胞接着性蛋白質（以下、「培養基質」と略す）上に結合させておくと、より安定に固相化することができるので好ましい。その際、グリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体を直接、或は間接的に培養基質にコ−トし、その上にＨＧＦを溶液の状態で添加して固相化してもよいし、培養基質の代わりに例えばシ−ト状の高分子基材を用いてもよい。かかる高分子基材としては、生体に適合する材料であれば特に制限はされない。培養基質を用いる場合は、これを更に高分子基材上に結合させて使用してもよい。かくして固相化されたＨＧＦは、細胞或は組織にさらすことによって、局所にて該増殖因子本来の生理活性を誘導することができる。
【００１２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するがその要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：ネオプロテオグリカンで固相化したｈＨＧＦの肝実質細胞増殖誘導能
担体の調製：直径２．３ｃｍのウェルを有するマルチウェル  プラスチック  ディッシュ（コ−ニング社）に、まずウシ由来Ｉ型コラ−ゲン溶液（１０μｇ／ｍｌ、コ−ケン社）をコ−トして培養基質とし、次いで合成グリコサミノグリカン脂質誘導体（ＧＡＧ−ＰＥ）としてヘパリン−フォスファチジルエタノ−ルアミン（Ｈｅｐ−ＰＥ）を１０μｇ／ｍｌの濃度でコ−トして固相化の担体とした（Ｈｅｐ−ＰＥは、特開平４−８０２０１号公報の実施例１に記載の方法に準じて調製した）。対照実験として合成グリコサミノグリカン脂質誘導体をコ−トしないウェルも用意した。
【００１３】
ｈＨＧＦの固相化：リコンビナントｈＨＧＦ（特開平３−２８５６９３号公報に記載の方法に準じて調製）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるよう１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有の１０ｍＭリン酸緩衝−生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ（−））にて調製し、上記担体中に添加した。４℃にて６時間反応後、溶液を除き、担体をＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。比較実験として担体をさらに１ＭＮａＣｌで２回洗浄したウェルも用意した。
【００１４】
細胞の調製：セグレン（Ｓｅｇｌｅｎ）の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ１３，ｐ２９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７６））に従い、ウィスタ−系雄ラット（体重２００ｇ）より、０．０５％コラゲナ−ゼ（タイプＩ，シグマ社）を用いて肝実質細胞を単離した。この肝実質細胞を、上記担体及びｈＨＧＦをコ−トしたマルチウェル  プラスチック  ディッシュ（コ−ニング社）に２．５×１０4個／０．２５ｍｌ／ｃｍ2の濃度でまき込み、５％炭酸ガス含有空気気相下、３７℃で単層培養した（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４，９３７−９４６（１９７８））。培養培地としては５％牛胎児血清（ＦＣＳ，フィルトロン社）、１０-8Ｍインスリン、１０-8Ｍデキサメサゾン及び６０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したウィリアムスＥ（ＷＥ）培地（フロ−ラボラトリ−ズ社、以下「基本培地」と略す）を使用した。
【００１５】
細胞増殖誘導活性の測定：培養開始２時間後に新たな基本培地に交換し、さらに１８時間後に牛胎児血清を含まないＷＥ培地（１０-7Ｍインスリン及び６０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有）に交換した。培養開始２８時間後にウェル当り１．２５μＣｉの［メチル3Ｈ］チミジン（アマシャム社）を添加し、必要に応じて１０μｇ／ｍｌのアフィジコリン（シグマ社）を加えた。２４時間後、細胞を１ｍｌの冷１０％トリクロロ酢酸で１−２時間固定し、９５％エタノ−ルで３回洗浄後、１ＭＮａＯＨで溶解した。中和後の細胞溶解液にシンチレ−タ−を加え、よく混合後、液体シンチレ−ションカウンタ−にて細胞中に取り込まれた放射活性を測定した。複製ＤＮＡ合成値は、各放射活性カウントからアフィジコリン存在下のカウントを差し引いて算出した。コントロ−ル群として、各試料にＧＡＧ−ＰＥを添加しなかった場合の放射活性を求め、その値に対する比で結果を示した（図１）。また、比較実験として、ｈＨＧＦの代わりにグリコサミノグリカンに親和性を持たない上皮成長因子（ＥＧＦ）を用いて、同様の実験を行った。  図１に結果を示す。縦軸は各試料のＤＮＡ合成誘導活性を、ＧＡＧ−ＰＥを使用しなかったコントロ−ル群のＤＮＡ合成誘導活性に対する比（％）で示してある。培養基質にＨｅｐ−ＰＥを用いた場合、細胞まき込み以前に添加されたｈＨＧＦが効果的に固相化され、培地交換後も肝実質細胞のＤＮＡ合成を刺激し得ることがわかる。すなわち、コントロ−ルに比べて６６％の増強を認めた（ａ）。
また、Ｈｅｐ−ＰＥ上の肝実質細胞に、従来のようにｈＨＧＦを溶液として後添加してもコントロ−ルに比べ約２０％のＤＮＡ合成増強が見られた（ｂ）。固相化したｈＨＧＦを１ＭＮａＣｌで洗浄した場合、ＤＮＡ合成増強は、６６％から３３％へと減少した（ｃ）。これは、１ＭＮａＣｌの洗浄によって、固相化していたｈＨＧＦの一部が外れたためと解釈される。ヘパリン結合能を持たないＥＧＦでは、ＧＡＧ−ＰＥの有無によって、全く差が認められなかった（ｄおよびｅ）。このことは、ｈＨＧＦが予想通りグリコサミノグリカンとの結合性によってＧＡＧ−ＰＥ上に結合し、培養基質上に固相化されることを示唆する。
【００１６】
以上の結果から、肝実質細胞増殖因子とグリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体とを組み合わせることにより、効果的に該増殖因子が固相化され、固相化増殖因子は生理作用を発揮し得ることがわかる。
【００１７】
【発明の効果】
従来、肝実質細胞増殖因子を利用する上で、かかる蛋白の活性を保持した状態での固相化方法もしくは固相化該増殖因子の利用については知られていなかった。本発明が示すように、肝実質細胞増殖因子を、適当なグリコサミノグリカン、グルカンまたはその誘導体を用いることによって活性を保持したまま固相化することが可能であり、その結果、この固相化増殖因子をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで利用できるようになった。本発明を基に肝実質細胞増殖因子の固相化担体を工夫することにより、医療分野での広範な利用が期待でき、さらに生体への投与における際に徐放効果・集積効果も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】合成グリコサミノグリカン脂質誘導体（Ｈｅｐ−ＰＥ）によるｈＨＧＦの固相化を表す図面である。
【図１】
0003859732.tif 000002