(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物タンパク質原料からアグルコンイソフラボン濃縮抽出物を製造する方法であって、
（ａ）グルコンイソフラボンを含有する植物タンパク質原料を、６．０〜１０．０のｐＨを有する水性抽出剤で抽出して、タンパク質及びグルコンイソフラボンを含む水性抽出物を製造し、
（ｂ）ベータ−グルコシダーゼ酵素を前記抽出物に添加し、そして、
（ｃ）前記グルコンイソフラボンを、前記酵素と、２〜２４時間、４０℃〜６０℃の温度で且つ４．０〜８．０のｐＨで接触させ、該抽出物中の前記グルコンイソフラボンの少なくとも８０％をアグルコンイソフラボンへ転換してアグルコンイソフラボン濃縮抽出物を製造する事を特徴とする方法。
【請求項２】
イソフラボン濃縮植物タンパク質原料を回収する方法であって、
（ａ）イソフラボンを含む植物タンパク質原料を、６．０〜１０．０のｐＨを有する水性抽出剤で抽出してタンパク質及びイソフラボンを含む水性抽出物を製造し、
（ｂ）ベータ−グルコシダーゼ酵素を前記抽出物に添加し、
（ｃ）前記抽出物中の前記イソフラボンを、前記酵素と、２〜２４時間、４０℃〜６０℃の温度で且つ４．０〜８．０のｐＨで接触させ、前記抽出物中の前記イソフラボンの少なくとも８０％を溶解性のより低いイソフラボンへ転換し、
（ｄ）前記抽出物のｐＨを４．０〜５．０に調整して前記タンパク質を前記抽出物から沈殿させ、
（ｅ）前記沈殿したタンパク質を前記抽出物から分離して、少なくとも８０％の前記イソフラボンを含むタンパク質原料を回収する事を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、植物タンパク質原料から可溶性物質を抽出し、大部分のグルコンイソフラボンが、タンパク質単離物中に保留されるアグルコンイソフラボンに転換される様な条件下で、１種以上のベータ−グルコシダーゼ酵素で処理する事による、アグルコンイソフラボンの濃縮された抽出物及び単離物の製造に関する。本願は、米国特許出願番号第08/135,196（１９９３年１０月１２日出願）の一部継続出願である。
発明の背景
イソフラボンは、大豆の様な植物タンパク質原料を含む種々のマメ科植物中に存在する。これらの化合物としては、ダイジン(daidzin)、６″-OAcダイジン、６″-OMalダイジン、ダイザイン(daidzein)、ゲニスチン(genistin)、６″-OAcゲニスチン、６″-OMalゲニスチン、ゲニステイン(genistein)、グリシチン(glycitin)、６″-OAcグリシチン、６″-OMalグリシチン、グリシテイン(glycitein)、ビオカニンＡ(biochanin A)、ホルムオノネチン(formononetin)及びクメストロール(coumestrol)が挙げられる。一般に、これらの化合物は、大豆独特の苦味と関係があり、工業製品、例えば単離物及び濃縮物の製造においては、これらの物質を除去する事が肝要であった。例えば、大豆フレークを水性アルカリ媒体で抽出する大豆タンパク質単離物の従来の製造方法では、多くのイソフラボンが抽出物中に溶解し、単離物を形成する為のタンパク質の酸沈殿の後に捨てられるホエー中に溶解されて残る。酸沈殿されたタンパク質単離物中に残る残留イソフラボンは、単離物を徹底的に洗浄する事によって除去される。
大豆のような植物タンパク質中に含まれるイソフラボンは、人間の癌細胞、例えば次の文献に開示されている様な乳癌細胞及び前立腺癌細胞の増殖を抑制する可能性のある事が、最近確認された(“Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells, Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene”by Peterson and Barnes, Biochemical and Biop hysical Research, Communications, Vol. 179, No. 1, pp. 661-667, Aug 30, 1991;“Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostate Cancer Cell but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosph orylation”by Peterson and Barnes, The Prostate, Vol. 22, pp. 335-345 (1993); “Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models in Breast Cancer”by Barnes et al., Mutagens and Carcinogens in the Diet, pp. 239-253 (1990)。
前述のイソフラボンの内の幾つかは、グルコース分子の結合したグルコシド又はグルコンとして存在する。６″-OAcゲニスチンの様なグルコンの幾つかは、グクコン分子それ自身の６つの位置に結合したアセテート基を含む。グルコシドを含む全てのイソフラボンは、医学的評価の対象であるが、最も興味ある特定のイソフラボンは、グルコース分子が結合していないアグルコンである。これらのイソフラボンは、グルコン或いはイソフラボングルコシドの様な水溶性ではない。この範疇に入る特定のイソフラボンは、ダイザイン、ゲニステイン及びグリシテインである。これらのアグルコンは、次の一般式を有する。
0003777390.tif 000002
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、Ｈ、ＯＨ及びＯＣＨ3から成る群から選ばれてもよい。それ故、本発明は、アグルコン及びそれらの物質を含む植物タンパク質単離物の濃縮物に関する。
グルコンイソフラボンをアグルコンイソフラボンへ転換する方法は、日本特許出願第258,669号(Obata et al)に記載されている様に公知である。この方法は、穏やかな範囲の転換のみを達成し、それ故望ましくなく、特に大規模工業生産には望ましくない。更に、日本特許出願第258,669号(Obata et al)に記載されている方法は、タンパク質原料からのイソフラボンの除去を教示するが、アグルコンイソフラボン濃縮タンパク質抽出物又は単離物を如何に調製するかについては開示していない。従って、少なくとも大部分の、そして好ましくは殆ど全てのグルコンイソフラボンをアグルコンイソフラボンへ転換し、アグルコンイソフラボン濃縮タンパク質抽出物及び単離物を製造する方法の必要性が存在する。
それ故、本発明の目的は、アグルコンイソフラボン濃縮抽出物及びタンパク質単離物並びにその製造方法を提供する事である。この目的及びその他の目的は、以下に示す本発明の詳細な説明で明らかとなる。
発明の要約
本発明は、アグルコンイソフラボン濃縮植物タンパク質抽出物及び単離物並びにその製造方法を提供する。この抽出物の製造方法は、植物タンパク質原料の等電点付近以上のpHを有する水性抽出剤で、グルコンイソフラボンから成る植物タンパク質を抽出し、グルコンイソフラボンを、十分な量の１種以上のベータ−グルコシダーゼ酵素と、抽出物中の少なくとも大部分のグルコンイソフラボンがアグルコンイソフラボンへ転換するのに十分な時間、温度及びｐＨで反応させ、それによってアグルコンイソフラボン濃縮抽出物を製造する事を含む。又本発明は、補足的なベータ−グルコシダーゼが、アグルコンイソフラボン濃縮抽出物を製造する為に、抽出物に添加される様な抽出物製造方法を提供する。更に、本発明は、前述の抽出物のｐＨを、タンパク質原料を沈殿させる為にタンパク質原料の等電点付近に調整する事によって、アグルコンイソフラボンを濃縮したタンパク質単離物を製造する、アグルコン濃縮タンパク質単離物を得る方法を提供する。次いで、得られるアグルコンイソフラボン濃縮単離物は分離されて、乾燥濃縮単離物を形成する為に脱水される。更に、本発明は、イソフラボンを、高い割合で、植物タンパク質原料から回収する方法を提供する。
好適な実施態様の詳細な説明
本発明は、大豆製品に関して開示し、そしてその方法は、大豆原料からのアグルコンイソフラボン濃縮抽出物及び単離物の製造に適うものであるが、本発明は、イソフラボンを含む種々の植物タンパク質源からのタンパク質抽出物及び単離物の製造に、一般的に適用できる。その様な植物タンパク質源の例としては、大豆原料を含む植物タンパク質原料がある。ここで使用される「大豆原料」なる言葉は、大豆又はあらゆる大豆誘導体を指すものである。
好適な実施態様の抽出物又は単離物に関する出発原料は、大豆フレークであり、その油は、溶剤抽出で除去されている。フレークは、タンパク質原料の等電点付近以上のｐＨ、好ましくは約6.0〜約10.0、最も好ましくは約6.7〜約9.7のpHを有する水性抽出剤で抽出される。若し、水性抽出剤のpHを上げようとする場合は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化カルシウムの様な一般的なアルカリ試薬を使用してもよい。望ましいイソフラボン化合物は、一般に、水性抽出物に可溶である。又、タンパク質原料中の固有のイソフラボンを出来るだけ多く溶解させる為に、抽出物に対する大豆フレークの重量比を特定の水準に調節する事は、水性抽出物中のそれらの化合物の回収を最大限にする為に望ましい。
タンパク質及びイソフラボンの抽出は、フレークに対する水性抽出剤の重量比が、約8:1〜約16:1で、フレークの向流抽出を含む種々の方法で行う事が出来、初期抽出物は、フレークの抽出に使用され、タンパク質及びイソフラボンの水性抽出物を用意する。別に、二段階抽出方法も使用出来、その場合、第一段階でのフレークに対する抽出剤の重量比は、約10:1から成り、次いで新鮮な抽出剤でのフレークの第二抽出は、フレークに対する抽出剤の重量比が、約６:1以下で行い、両段階でのフレークに対する抽出剤の合わせた重量比が、フレークに対する抽出剤の全重量比の約１６：１を越えない様にする。
不溶性物質を除去後、溶解したイソフラボンを含む、得られた水性タンパク質抽出物を、大部分の、そして好ましくは殆ど全ての、グルコース分子の結合したグルコン形イソフラボンを、アグルコンイソフラボンへ転換する為に、１種以上のベータ−グルコシダーゼ酵素と反応させる。ベータ−グルコシダーゼ酵素の好適なｐＨ範囲は、使用される特定のベータ−グルコシダーゼ酵素によって変わる。抽出物のｐＨは、一般に、特定の酵素が、酵素と反応する前に、最も活性であるｐＨ範囲の辺りに調整される。ｐＨは、一般に、食用の酸、例えば酢酸、硫酸、燐酸、塩酸又はその他適当な試薬を添加して調整する。
ベータ−グルコシダーゼ酵素は、大豆原料中に当然に存在するもの又は、ここでは「残留」酵素と称する微生物の増殖からのものであってもよく、又はタンパク質抽出物に添加されたものであってもよい。添加される酵素は、ここでは、「補足的酵素」と称する。一般に、大豆原料又は抽出物中の残留酵素の濃度が、大部分の、そして好ましくは殆ど全ての、グルコン形イソフラボンを、アグルコン形へ転換するのに不十分な時は、補足的酵素を添加しなければならない。イソフラボンの転換を行うのに十分な酵素の量は、存在する酵素の型、酵素濃度の分布、系のｐＨ、及び存在する系の活性によって変化する。残留酵素、補足的酵素又はその両方で、酵素の濃度を十分なものとしたならば、溶解したイソフラボンを伴うタンパク質抽出物を、抽出物中に含まれる少なくとも大部分の、そして好ましくは殆ど全てのグルコンイソフラボンをアグルコン形へ転換するのに十分な時間、温度及びｐＨで、ベータ−グルコシダーゼ酵素と反応させる。
好ましいベータ−グルコシダーゼ酵素としては、ビオペクチナーゼ１００Ｌ及び３００Ｌ、ビオペクチナーゼＯＫ７０Ｌ、ラクターゼＦ及びラクトザイムが挙げられる。ラクターゼＦは、アマノ国際酵素会社(Amano International Enzyme Co., P.P. Box 1000, Troy, VA 22974)で市販するもので、約４〜約６の好適なｐＨ範囲を有し、ラクトザイムは、ノボ社(Novo Industries, Enzyme Division, Novo Alle, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark)の市販品で、約７の好適なｐＨ範囲を有する。ビオペクチナーゼ１００Ｌ、３００Ｌ及び、ビオペクチナーゼＯＫ７０Ｌは、クエストインターナショナル(Quest International, Sarasoda, Florida)から手に入れる事が出来る。補足的酵素は、少なくとも大部分の、そして好ましくは殆ど全てのグルコンイソフラボンをアグルコンへ転換するのに十分な量を添加する。補足的酵素の添加が必要な場合には、添加される酵素の量は、乾燥基準でタンパク質沈殿物の約0.5％〜５％である。
他の種類の適当な酵素には、エステラーゼ酵素がある。これらの酵素は、イソフラボン複合体からアセテート及びマロネート基を除去する事によって、アセテート及びマロネート化合物を、グルコンイソフラボンへ転換するので、ここに開示される好適な実施態様方法には十分適合するものと考える。最も好適な実施態様では、両方の型の酵素、即ちベータ−グルコシダーゼとエステラーゼ酵素が利用される。
好適な実施態様の方法としては、１段階方法が好ましく、短時間で、容易且つ経済的に、イソフラボンの非常に高い程度の転換を達成する。ここで使用される「１段階」反応方法なる言葉は、或る種の反応パラメーター値が、一般に、その反応の工程にわたって維持される反応方法を意味するものである。
非常に高い程度の転換とは、大豆原料抽出物中に存在するグルコン形の少なくとも大部分の、そして好ましくは殆ど全てのグルコンイソフラボンが、アグルコン形へ転換される事である。「大部分」なる言葉は、グルコンイソフラボンが、少なくとも約５０％のアグルコンイソフラボンへ転換する範囲を意味するものである。「殆ど全て」なる言葉は、グルコンイソフラボンが、少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％のアグルコンイソフラボンへ転換する範囲を意味するものである。
特定の理論に拘泥する積りはないが、ここに述べられる方法の驚くべき、そして予期せぬ高い程度の転換は、１段階反応方法中で利用されるプロセスパラメーターの組み合わせの結果であると考える。反応系のｐＨは、約４〜約８、そして最も好ましくは、１段階反応方法中でのイソフラボン複合体との反応前で酵素が最も活性である値に維持されるか、それに近い値である事が好ましい。反応系の温度は、約４０℃〜約６０℃、そして最も好ましくは、１段階反応方法中で、約６０℃の温度に維持されるか、それに近い値である事が好ましい。一般に、ここで開示される１段階方法を介しての、アグルコンへの殆ど全てのグルコンイソフラボンの転換を達成する為に必要な時間は、約２時間〜約２４時間である。
１種以上のベータグルコシド酵素との反応後、ｐＨは、大豆タンパク質の等電点、一般には約4.0〜約5.0の間、好ましくは約4.4〜約4.6の間に、酸の添加によって調整される。等電点へのｐＨの調整は、難溶性アグルコンが濃縮した凝乳(curd)の形でタンパク質を沈殿させる。沈殿に次いで、凝乳又は沈殿したタンパク質は、アグルコンイソフラボン濃縮タンパク質単離物を形成する為に、ホエーから、例えば遠心分離機で分離される。
好適な実施態様では、たとえアグルコンが、他のイソフラボンより水に溶解しにくいとはゆうものの、アグルコンイソフラボン濃縮単離物を用意する為に、アグルコンイソフラボンの除去を実質的に減少させる為に、沈殿タンパク質の洗浄は、全体に避けるか、最小限とする。それ故、酸沈殿タンパク質を水で洗浄する事は、完全に避けるか、或いは水での一度の洗浄に制限するのがよく、その間の沈殿タンパク質に対する水の重量比は、約２：１〜約６：１の間である。酸沈殿凝乳の洗浄の省略は、多量の洗浄がイソフラボンの少ない回収で行う事が出来るとしても、イソフラボンの望ましい水準で濃縮単離物を用意する。中間的な量での洗浄は、乾燥基準含有量で約1.5〜約3.5ｍｇ／ｇのゲニステインと、約1.0〜約3.0ｍｇ／ｇのダイザイン含有量を有するタンパク質単離物を与える。
又、本発明は、大豆原料の様な植物タンパク質原料から、非常に高い割合でイソフラボンを回収する方法を提供する。ここに開示する方法により得ることのできる回収水準は、一般に、出発植物タンパク質中の特定のイソフラボンの全形態の合計を基準として少なくとも５０％、好ましくは６５％、最も好ましくは８０％である。特定の理論に拘泥する積りはないが、ここに開示する転換反応からの高い回収系統は、開示された種々のプロセスオペレイションと結び付いているものと考える。処理の特定の段階で、比較的可溶性で、アグルコン形を殆ど溶解しないグルコンイソフラボン複合体を転換する事によって、供給物質から、高収率でイソフラボンを最終生成物として回収する事が可能である。
以下の実施例は、特定のものではあるが、本発明の実施態様を限定するものではない。
実施例
抽出され、脱脂された大豆フレーク（細粉）5gを、水５ｇに添加してサンプルを調製し、ｐＨを７及び８に調整した。酵素濃度が、各サンプル中の固形分の約５％重量であるそれぞれの上澄み液に、０．２５ｇのラクターゼＦ又はラクトザイムと添加した。サンプルを、４０℃及び６０℃で培養した。補助サンプルは、酵素が添加される前(t=0)で、目標温度での24時間培養後に取り下げた。ラクターゼＦ又はラクトザイムでの24時間培養後の大豆フレーク（細粉）の変化とその割合の分布が表１に示される。このサンプルは、補足的酵素と微生物を添加する前に滅菌されていず、汚染物の増殖は抑制されなかった。
0003777390.tif 000003
0003777390.tif 000004
0003777390.tif 000005
これらのデータは、残留酵素及び補足的酵素の組み合わせによって達成され得る転換の程度を示す。残留酵素源は、微生物増殖或いは体内に由来の大豆酵素であってもよい。イソフラボン複合体のアグルコンへの顕著な転換は、ｐＨ８、６０℃で２４時間培養した大豆フレーク（細粉）で起こった。ここに開示するイソフラボンの各タイプの濃度は、イソフラボンタイプの全ての形の合計を基準とする。脱脂大豆フレークの１６％水性懸濁液を作って、別のサンプルを調製した。このサンプルを、ｐＨ4.5と７に調整し、４５℃で２４時間培養した。補助サンプルは、０及び２４時間で採取した。全てのサンプルについて、イソフラボン含有量を分析した。表２は、ｐＨ4.5と７で、４５℃で２４時間培養後の脱脂フレーク中の計算されたイソフラボンの割合分布の変化を示す。
0003777390.tif 000006
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これらのデータは、タンパク質原料中の残留酵素により達成され得る転換の程度を示す。イソフラボン複合体のアグルコンへの顕著な転換は、ｐＨ７で、４５℃で２４時間培養後に起こった。
その他の実施例では、大豆から誘導されたタンパク質単離物中のゲニステイン及びダイザインの回収割合が検討された。回収割合は、単離物中のゲニステイン（又はダイザイン）の量を決定し、大豆出発原料中のゲニステイン（又はダイザイン）の全形態の合計量を基準とした割合としての量を表示する事によって明らかとなった。１００ｇの脱脂大豆細粉を、１，０００ｇの水で抽出し、３２℃の温度の水酸化ナトリウムの添加でｐＨ９．７に調整し、細粉に対する水の重量割合を１０：１とした。細粉を抽出物から分離し、ｐＨ9.7、温度３２℃の水性抽出物６００ｇで再抽出した。第二抽出段階で、細粉に対する水の重量割合は６：１となった。細粉を、遠心分離機で分離し、第一、第二抽出物を組み合わせ、大豆ホエーのスラリーを形成する為に、ｐＨを4.5に調整した。スラリーを５０℃に加熱し、酵素ラクターゼＦの凝乳の２％乾燥重量を添加した。グルコンイソフラボンのアグルコン形への完全な転換を確実にする為に、スラリーを５０℃で１６時間反応させた。アグルコン濃縮単離物を形成する為、遠心分離機で、ホエーから酸沈殿凝乳を分離した。水での沈殿凝乳の更なる洗浄は避けた。単離物中に回収されたゲニステインの量は、出発原料（脱脂大豆細粉）中のゲニスチン及びゲニステインの全形態の合計の８６％であった。同様に、単離物中に回収されたダイアジンの量は７５％であった。
以下は、大豆製品中のイソフラボンを定量化する為の方法についての記述である。イソフラボンは、０．７５ｇのサンプル（噴霧乾燥又は細かに粉砕した粉）を８０／２０のメタノール／水溶媒の５０ｍｌと混合する事によって、大豆製品から抽出した。混合物を、オービタルシェイカーで、室温で２時間振盪した。２時間後、残った不溶解物質を、ワットマン４２番濾紙でろ過して除去した。ろ液の５ｍｌを水４ｍｌ及びメタノール１ｍｌで希釈した。
抽出イソフラボンを、ベックマンＣ１８逆転相カラムを使用して、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分離した。イソフラボンをカラム上に噴射し、８８％のメタノール、１０％の水及び２％の氷酢酸での開始、及び９８％のメタノール及び２％の氷酢酸での終点溶媒勾配で溶出した。流速０．４ｍｌ／分で、全てのイソフラボン、即ちゲニスチン、６″-0-アセチルゲニスチン、６″-0-マロニルゲニスチン、ゲニステイン、ダイジン、６″-0-アセチルダイジン、６″-0-マロニルダイジン、ダイジン、グリシチン及びその誘導体及びグリシテインが、明らかに再溶解された。ピーク検出は、262mmでの紫外線吸光度による。ピークの同定は、質量分析計で行った。
定量化は、インドフィンク化学会社(Indofinc Chemical Company)から購入した純粋標準試薬（ゲニスチン、ゲニステイン、ダイジン及びダイザイン）を使用して達成した。応答因子（集積領域／濃度）は、上記化合物のそれぞれについて計算し、未知のサンプルの定量化の為に使用した。純粋の標準試薬を利用しない複合体形に対しては、応答因子は、親分子のものとし推定し、分子量の違いを補正した。グリシチンに対する応答因子は、分子量の違いを補正したゲニスチンのそれと推定した。
この方法は、それぞれ個々のイソフラボンの性質を用意する。全ての複合体形がそれらの個々の非複合体形へ転換されるならば、便宜的に、全ゲニステイン、全ダイザイン及び全グリシテインが計算出来、それら化合物の凝集体重量を表示出来る。又、これらの合計は、複合体形を転換する為の酸加水分解を使用する方法で、直接に測定出来る。
勿論、前述の記載は、本発明の単に好ましい実施態様であって、均等論を含む特許法の原理に関して解釈される添付のクレームに示される精神とその広範な観点から離れる事なしに、様々な変化或いは変更が成される事が理解される。
専用権或いは特許権がクレームされる本発明の実施態様は次の通り定義される。