(57)【要約】配列番号１のゲノムＤＮＡにおいて、下記の１つ以上の変異を有するゲノムＤＮＡ、その変異を利用したヒト慢性関節リウマチの診断方法、その発症可能性の判定方法およびそれらの検出用の診断キットに関する。（１）位置１９８７の塩基がシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）へ置換。（２）位置３６６４の塩基がチミン（ｔ）からグアニン（ｇ）への置換。（３）位置３７６９の塩基がアデニン（ａ）からシトシン（ｃ）への置換。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなるゲノムＤＮＡにおいて、下記の変異：
（１）位置１９８７の塩基がシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）へ置換；
（２）位置３６６４の塩基がチミン（ｔ）からグアニン（ｇ）への置換；および
（３）位置３７６９の塩基がアデニン（ａ）からシトシン（ｃ）への置換
の１以上を有することを特徴とする慢性関節リウマチに関与するゲノムＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のゲノムＤＮＡを検出することを特徴とする慢性関節リウマチの診断方法またはその発症可能性の判定方法。
【請求項３】
請求項１に記載のゲノムＤＮＡの変異を検出する方法を利用した慢性関節リウマチの診断またはその発症可能性の判定キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本出願の発明は、変異を有するゲノムＤＮＡ、その変異を利用したヒト慢性関節リウマチの診断方法、その発症可能性の判定方法およびそれらの検出用の診断キットに関する。
背景技術
慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＲＡ）は多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは、寛解と増悪を繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊と変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。ときには生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
ＲＡは、その発症の仕方も多種多様であり、その診断には、アメリカリウマチ学会の診断基準が広く使用されている。しかしながら、ＲＡの発症は、通常、緩徐で数週間から数ヶ月にわたり、アメリカリウマチ学会の診断基準における客観的な指標としてのリウマトイド因子の存在は、その陽性率が３ヶ月以内で３３％、１２ヶ月以上においても８８％程度（治療、第７３巻、第３号、第２３〜２７頁、１９９１年）であり、ＲＡと確実に診断するには至っていない。そこで、組換え抗原と反応する患者血清中のリウマチ性関節炎関連抗体ＩｇＭ抗体を検出し、リウマチ性関節炎を診断しようとする試みなどがなされている（特開平１０−５１３２５７号）。
また、ＲＡの治療は、ＲＡ病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段は異なるのが通常である。一般的に確定診断が下せない初期では、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、確定診断が下せた場合は、ＮＳＡＩＤに加えて疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を投与する。特にＲＡ発症の初期には、確定診断を下すことは、困難であり、現状では、ＮＳＡＩＤを投与し、経過を慎重に観察しながら膠原病を含む他のリウマチ疾患との鑑別を同時に行っている。さらに症状が進行した場合は、ステロイド薬の投与を行う場合もあり、疼痛のための薬物療法と共に関節機能の維持・回復に対して理学療法・装具療法を行なう。また、関節破壊により日常生活が不自由になった場合には、手術療法を行う場合もある。
ＲＡの原因である関節炎と関節破壊の様相、特にそれらの病理過程は、種々の研究を通じて次第に明らかになりつつあるが、ＲＡは、生活環境を含めた多数の原因因子が重なり合ってはじめて疾患へと発展・増悪する疾患である。そのため、疾患の正しい解明と適切な治療を行うには、多因子相互作用の本体そのものが明らかにされなければならない。ＲＡは、世界的には罹患率１％以下の疾患であるが（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２：１２７７−１２８９，１９９０）、患者の同胞では約８％以上が発症する（Ｃｅ１１  ８５：３１１−３１８，１９９６）ことから、その原因因子として何らかの遺伝的要因が想定されている。また、環境が原因因子の１つと考えられていることから、あらかじめ発症可能性を知ることにより、日常生活において、例えば、食餌、ウイルス感染およびストレス等に注意することにより発症を遅らせたり防ぐことが可能である。さらに、診断を早め、早期に適切な治療を行うことによってＲＡの進行を遅らせることが可能であり、予後の改善が期待される。
国際公開ＷＯ９８／５１７９１号には、本出願の発明者らが、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析をＲＡ患者およびその血縁者に対して実施することにより、慢性関節リウマチの疾患遺伝子が位置する３カ所の遺伝子座を特定し、以下の疾患遺伝子を同定している。
（１）ヒト第１染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ１Ｓ２１４および／またはＤＩＳ２５３がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
（２）ヒト第８染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ８Ｓ５５６がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
（３）ヒトＸ染色体の、マイクロサテライトマーカーＤＸＳＩ００１、ＤＸＳ１０４７、ＤＸＳ１２０５、ＤＸＳ１２２７および／またはＤＸＳ１２３２がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する慢性関節リウマチの疾患遺伝子。
また、本願発明者らは、前記（３）の疾患遺伝子についてさらに研究を進め、Ｘ染色体のＤｂｌプロトオンコジーン（ＥＭＢＯ  Ｊ、７（８）：２４６５−２４７３，１９８８；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ１２５５６）の変異（２エクソン欠失型変異）がＲＡの発症に関係していることを見出し、特許出願している（ＰＣＴ／ＪＰＯ０／０１６９７）。
本発明は、ヒトＤｂｌ遺伝子のさらなる変異とＲＡの発症またはその発症可能性を解明し、その変異を利用してＲＡの発症またはその発症可能性を高精度に診断することのできる方法を提供することを課題としている。さらに本発明は、ＲＡに関するＤｂｌの変異したゲノムＤＮＡを検出するための有用な診断キットを提供するものである。
発明の開示
このような状況下において、本発明者らは鋭意研究を行った結果、被験者から得られた細胞においてＤｂｌ遺伝子のイントロン２４−エクソン２４−イントロン２３の塩基配列を示した配列番号１のゲノムＤＮＡにおいて下記の変異を見出した。
（１）位置１９８７の塩基がシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）へ置換。
（２）位置３６６４の塩基がチミン（ｔ）からグアニン（ｇ）への置換。
（３）位置３７６９の塩基がアデニン（ａ）からシトシン（ｃ）への置換。
すなわち、位置１９８７の塩基（ｃ）はイントロン２４に存在し、位置３６６４および３７６９の塩基（ｔ）および（ａ）はイントロン２３に存在する。ＲＡの発症に関与するゲノム遺伝子は従来から複数存在することが知られているが、本発明の変異したゲノムＤＮＡは、これらのＲＡ発症原因の一部を構成するものである。なお、イントロン領域における１塩基置換と疾患との関係については、例えば２型糖尿病の疾患遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６：１６３−１７５，２０００）等が知られている。
これらの知見より、被験者から得られた細胞におけるＤｂｌ遺伝子の変異を指標とし、ＲＡの診断方法またはその発症可能性の判定方法およびこれらの変異を検出する診断キットが有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明は、慢性関節リウマチの新たな予防・治療法および治療薬剤の開発にも有用である。
本明細書において、特にことわらない限り、ａ、ｃ、ｇおよびｔは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。
また、配列番号１は、Ｄｂｌ遺伝子のゲノムＤＮＡを含むＸ染色体ｑ２５−２６．３領域のヒトゲノムとしてジーンバンクに登録されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ０３３４０３）の位置５５，８２３〜５９，６９６の配列に相当する。なお、このジーンバンクに登録されている配列は、その相補鎖が＋ストランドであり、位置１１５，８３７から５’方向に翻訳され、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ１２５５６のｍＲＮＡを転写する。
本発明のＲＡの診断方法、その発症可能性の判定方法およびそれらの検出用の診断キットにおいては、ゲノムＤＮＡの前記変異の少なくとも一つを検出する。
発明を実施するための最良の形態
変異ゲノムＤＮＡの同定およびＲＡの診断またはその発症可能性の判定は、例えば、以下のようにして実施できる。
被験者のゲノムＤＮＡは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、たとえば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、得られたゲノムＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して使用することができる。
ゲノムの変異の検出方法としては、たとえば、特に限定されないが、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法などが挙げられる。
ＰＣＲ法を用いて変異を検出する場合には、配列番号１の変異位置を含む領域をＰＣＲ増幅することのできるＰＣＲプライマーを合成し、被験者のゲノムＤＮＡから増幅されるＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスにより決定できる。配列番号１のゲノムの１つ以上の上記変異を検出することにより、被験者のＲＡの診断またはその発症可能性の判定を高精度に行うことができる。
本発明で使用されるプライマーは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
また、以上の変異は、例えば変異部位周辺の正常配列および変異配列からなるオリゴヌクレオチドを備えたマイクロアレー装置等によっても検出することができる。
さらにまた、位置３６６４の変異（ｔ→ｇ）は、実施例で示したように、その変異部位を含む合成オリゴヌクレオチド（配列番号２、３）をプライマーとしてゲノムＤＮＡの＋ストランドをＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を制限酵素Ｈｉｎｆ−Ｉで切断し、２断片化されるか否かを調べることによっても検出することができる（ＲＦＬＰ分析）。すなわち、配列番号１の相補鎖における位置３６６４周辺の正常配列は５’−ｇａａｔｃ−３’でありＨｉｎｆ−Ｉ（認識配列５’−ｇ↓ａｎｔｃ−３’）によって切断される。一方、配列番号１の相補鎖における位置３６６４周辺の変異配列は５’−ｇｃａｔｃ−３’となるため、Ｈｉｎ−Ｉによっても切断されることはない。
本明細書における診断キットは、上記のゲノムＤＮＡの１以上の変異を検出できる試薬、たとえば、プライマー、プローブなどを含むものであれば特に限定されず、さらにその他の試薬を組み合わせることにより得ることができる。
たとえば、上記の変異を１つ以上含むゲノム領域を増幅できるように設計されたプライマーを含み、さらに、上記の変異を１つ以上含むゲノム領域を検出できるように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびチェーンターミネーター法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、変異を検出するために必要な試薬を１つ以上、組み合わせたキットが挙げられる。また、好ましくは、蛍光標識されたダイデオキシヌクレオチドを含むキットが挙げられる。
これらの診断キットを使用することにより、ＲＡの診断またはその発症可能性を判定を高精度に行うことができる。
本発明の診断キットは、たとえば位置３６６４の変異に対するＲＦＬＰ分析のためのキットの場合には、配列番号２および３の塩基配列からなるプライマーセット、制限酵素Ｈｉｎｆ−Ｉ、ＤＮＡ合成酵素等によって構成することができる。また、変異の検出の妨げとならない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
実施例
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１
遺伝子変異の特定
ＲＡ患者２名、健常者１名を１家系とした３０家系９０名を対象とした。末梢血からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｄｂｌ遺伝子ｃＤＮＡの２２３ｂｐ欠損領域に対応するエクソン２３、２４の近傍約５．３ｋｂｐの領域をＰＣＲ法により増幅後、既報ゲノム配列（Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ０３３４０３．１）に基づき設計したシークエンスプライマー（図１）を用いたＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ法により塩基配列を決定した。統計処理として百分率によるχ２検定により有意差検定を行った。ＰＣＲに用いた各プライマーセットの塩基配列は次のとおりである。
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その結果、イントロン領域に１５個所のＳＮＰｓを確認した。それぞれの頻度を表１に示す。χ２検定を行ったところ、ｎｔ２６３２＋１０６（ｔ→ｇ）、ｎｔ２６３２＋２１１（ａ→ｃ）、およびｎｔ２７４５＋５７６（ｇ→ａ）の３ヶ所についてＲＡ患者と健常者との間で頻度に有意差を認めた（ｐ＜０．０５）。なお、例えばｎｔ２６３２＋１０６（ｔ→ｇ）という標記は、ｃＤＮＡセンス鎖の２６３２番目の塩基に対応するゲノム塩基（エクソンの最終塩基）から１０６番目のイントロン塩基ｔがｇに変異していることを示し、配列番号１では位置３７６９のａ→ｃ変異に相当する。同様に、ｎｔ２６３２＋２１１（ａ→ｃ）は配列番号１の位置３６６４のｔ→ｇ変異、ｎｔ２７４５＋５７６（ｇ→ａ）は配列番号１の位置１９８７のｃ→ｔ変異にそれぞれ相当する。
2002079466.tif 000003
実施例２
配列番号１における位置３６６４のｔ→ｇ変異のＲＦＬＰ分析
既報配列に従って合成したＤＮＡプライマー：
2002079466.tif 000004
によって以下のような反応組成および条件でＰＣＲ法により３７１ｂｐのゲノムＤＮＡを単離した。
ゲノムＤＮＡ                                  １μｌ
ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒｌｌ（アプライドバイオシステムズ社）  ２．５
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                          １．５
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                              ２．５
１０ｐｍｏｌ／μｌセンスプライマー            ０．５
１０ｐｍｏｌ／μｌアンチセンスプライマー      ０．５
Ｇｏｌｄ  Ｔａｑポリメラーゼ                  ０．２５
滅菌水                                        １６．２５
反応条件：（９５℃／１２分）×１
（９４℃／３０秒、５０℃／３０秒、７２℃／１分）×３０
得られたＤＮＡ増幅反応液を以下の反応組成により制限酵素Ｈｉｎｆ−Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｂｉｏｌａｂｓ社、認識配列５’−Ｇ↓ＡＮＴＣ−３’）によって３７℃１時間反応させ完全消化し、常法により２．０％アガロース電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により分析した。
ＰＣＲ反応液                                  １０μｌ
Ｈｉｎｆ  Ｉ                                  ２μｌ
反応緩衝液（ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒｌｌ）          １．５μｌ
滅菌水                                        １．５μｌ
結果は図２に示したとおりである。第２レーンは正常Ｄｂｌ遺伝子を鋳型として得られたＰＣＲ産物のＨｉｎｆ−Ｉ処理後の電気泳動像であり、位置３６６４（ｎｔ２６３２＋２１１）周辺のＨｉｎｆ−Ｉ認識配列（５’−ｇａａｔｃ−３’）によって切断されて２２７ｂｐと１４４ｂｐに分割される。第１レーンは変異型Ｄｂｌ遺伝子由来のＰＣＲ産物の電気泳動像であり、位置３６６４のｔ→ｇ変異（ｎｔ２６３２＋２１１のａ→ｃ変異）によってＨｉｎｆ−Ｉ認識配列が消失するため、分割されることはない。さらに第３レーンはヘテロ変異型Ｄｂｌ遺伝子由来のＰＣＲ産物の電気泳動像である。Ｈｉｎｆ−Ｉ認識配列を有する断片と認識配列を持たない断片が増幅されるため、分割されない３７７ｂｐ断片と、それが２２７ｂｐおよび１４４ｂｐに分割された２断片の計３断片が同時に検出された。
産業上の利用可能性
本出願の発明は、ヒト慢性関節リウマチに関連した変異を有するゲノムＤＮＡと、この変異を利用したヒト慢性関節リウマチの診断方法、その発症可能性の判定方法およびそれらの検出用の診断キットに関する。これらの発明は、慢性関節リウマチの発病またはその発症可能性を高精度に簡便かつ確実に行うことができ、有用である。さらに、本発明は、慢性関節リウマチの新たな予防・治療法および治療薬剤の開発にも有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＡ疾患遺伝子の配列決定に用いたプライマーとゲノムＤＮＡとの関係を示した模式図である。
図２は、配列番号２および３の塩基配列からなるプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物のＨｉｎｆ−Ｉ処理後の電気泳動像である。レーン１はホモ変異型Ｄｂｌ遺伝子由来のＰＣＲ産物、レーン２は正常（野生型）Ｄｂｌ由来のＰＣＲ産物、レーン３はヘテロ変異型Ｄｂｌ由来のＰＣＲ産物の結果である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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