(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Iで表され、質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である、マイコプラズマ・ファーメンタンスから抽出され得るグリセロ糖リン脂質。
【化１】
0003735388.tif 000005
（式中、アシルは、独立して、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイル又はエイコサノイルを示す。）
【請求項２】
アシルがパルミトイルである請求項１記載のグリセロ糖リン脂質。
【請求項３】
請求項１または２記載のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗グリセロ糖リン脂質抗体。
【請求項４】
６’−Ｏ−ホスホコリン−α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールと、請求項１または２記載のグリセロ糖リン脂質との両方と反応する請求項３に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。
【請求項５】
ポリクローナル抗体である請求項３〜４のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。
【請求項６】
請求項１または２記載のグリセロ糖リン脂質のみに対して反応特異性を有する請求項３に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体、または、請求項１または２記載のグリセロリン脂質に対して反応特異性を有するそのフラグメントである請求項３〜６のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。
【請求項８】
マイコプラズマ・ファーメンタンスを特異的に認識し、他種のマイコプラズマを認識しない請求項３記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。
【請求項９】
前記他種のマイコプラズマが、マイコプラズマ・アルソリティディス及びマイコプラズマ・ホミニスである請求項８記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。
【請求項１０】
シアル酸含有糖脂質（ガングリオシド）、血小板活性化因子（１−アルキル−２−アセチルグリセロ−３−ホスホコリン）もしくはその部分脱アシル化物、ホスファチジルコリンもしくはその部分脱アシル化物、またはスフィンゴミエリンに交差反応を示さない請求項３記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体。
【請求項１１】
検体中の以下の性質を有するグリセロ糖リン脂質を、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグリセロ糖リン脂質の測定法；少なくともホスホコリン、グルコース、脂肪酸及びグリセロールを含み、ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体に対して非吸着性の脂質であり、アルカリに不安定であるグリセロ糖リン脂質。
【請求項１２】
検体中に含まれる請求項１又は２記載のグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質を、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質の測定法。
【請求項１３】
検体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂質を、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグリセロ糖リン脂質の測定法。
【請求項１４】
請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含まれるグリセロ糖リン脂質を前記抗体に結合させ、非吸着成分を固相から分離除去し、次いで、標識物質で標識化したマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を前記固相に接触させ、前記検体液中に含まれるグリセロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質とを競合反応させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出することを特徴とする検体中のグリセロ糖リン脂質の測定法。
【請求項１５】
請求項１または２記載のグリセロ糖リン脂質が結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含まれる抗グリセロ糖リン脂質抗体を前記グリセロ糖リン脂質に結合させ、非吸着成分を固相から分離除去し、次いで、抗ヒトイムノグロブリン抗体を標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、標識物質を検出することを特徴とする検体中の抗グリセロ糖リン脂質抗体の測定法。
【請求項１６】
検体中のグリセロ糖リン脂質を、請求項１３または１４記載の測定法によって測定し、このグリセロ糖リン脂質の存否またはその存在量と検体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスの存否またはその存在量とを関連づけることを特徴とするマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法。
【請求項１７】
前記検体中のグリセロ糖リン脂質が、生体由来の検体から抽出した脂質画分である請求項１６記載のマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法。
【請求項１８】
生体由来の検体が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、関節液または細胞培養液である請求項１７記載のマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法。
【請求項１９】
検体から脂質画分を抽出し、該脂質抽出物を固相と接触させて脂質を吸着させ、脂質が吸着した固相と請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体を反応させ、同時またはその後に、前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、標識物質を検出することを特徴とする検体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法。
【請求項２０】
生体組織または細胞を、そのまま又はグリセロ糖リン脂質の固定処理を施した後、標識物質で標識化した請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体と反応させ、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染した生体組織または細胞に標識化抗体を結合させ、標識物質を測定することを特徴とするマイコプラズマ・ファ
ーメンタンスの検出法。
【請求項２１】
生体組織または細胞を、そのまま又はグリセロ糖リン脂質の固定処理を施した後、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体を反応させ、同時またはその後に、前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染した生体組織または細胞に標識化二次抗体を結合させ、標識物質を測定することを特徴とするマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法。
【請求項２２】
免疫学的方法により検体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出するための試薬キットであって、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体と、標識物質で標識化したマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質とを含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項２３】
免疫学的方法により検体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出するための試薬キットであって、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抗グリセロ糖リン脂質抗体と、前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した二次抗体とを含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項２４】
生体から採取された血清中に含まれる、請求項１または２記載のグリセロ糖リン脂質もしくはこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質、またはこれらのグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗体を検出することを特徴とする、エイズ、腎炎及びＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチーから選ばれる疾病の検出法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、マイコプラズマ・ファーメンタンス由来の新規グリセロ糖リン脂質、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂質に対する抗体、この抗体を用いるグリセロ糖リン脂質の測定法及びマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは、先にＭＴ−４細胞（ＨＴＬＶ−Ｉ（ヒトＴリンパ球向性レトロウイルス−タイプＩ）が感染したヒトヘルパーＴ細胞(Miyoshi et al. Gann, 71, 155-156 (1980))）から５種のグリセロ糖リン脂質（ホスホコリン含有グリセロ糖脂質）を見出し、このうちの１種が６’−Ｏ−ホスホコリン−α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールであることを見出している（脂質生化学研究、第３５巻、第１１１〜１１４頁、１９９３年）。
【０００３】
一方、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Mycoplasma fermentans）は、ヒト免疫不全症候群（エイズ；ＡＩＤＳ）の増悪因子である（Lo. S., -C. et al. 1991, Science 251: 1074-1076；米国特許第５，２４２，８２０号）、あるいはリウマチの原因である（Williams, M. H. et al. 1970, Lancet ii: 277-280）という報告がある。
【０００４】
従来、種々のマイコプラズマに対する抗体が知られており、臨床検査等にも使用されているが、多くはマイコプラズマ・ニューモニエ（M. pneumoniae）またはマイコプラズマ・ジェニタリウム（M. genitalium）に対する抗体である。また、これらのマイコプラズマに対するモノクローナル抗体も作成されているが、これらの抗体は、マイコプラズマの蛋白質または蛋白質と脂質を同時に認識する抗体であると考えられ、いずれもマイコプラズマ・ファーメンタンスに特異性を示さない（特開昭６３−２９８、特開昭６３−１８４０６４、特開昭６３−３２４９６、特開平５−３０４９９０、米国特許第５，１５８，８７０号、米国特許第４，９４５，０４１号、米国特許第５，２４２，８２０号）。また、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異性を示す抗体が米国特許第５，２４２，８２０号に開示されているが、菌体の全抽出物を免疫原として得られた抗体であり、蛋白質を認識する抗体であると考えられる。よって、この抗体を用いて、種々の蛋白質を含む血清などの体液中のマイコプラズマを検出する場合、この抗体が非特異的な結合をする可能性が高く、高い感度は期待できないと考えられる。また、抗原が蛋白質の場合、蛋白質のアミノ酸配列の変異により抗原性が消失する場合も十分に考えられる。
【０００５】
本発明者らが知る限り、マイコプラズマがホスホコリンを含有したグリセロ糖リン脂質を持つという報告はない。さらに、マイコプラズマ由来のグリセロ糖リン脂質を免疫原とし、このグリセロ糖リン脂質に特異性を示す抗体を得た例は知られていない。またさらに、このグリセロ糖リン脂質に特異性を示す抗体が、マイコプラズマ・ファーメンタンスに高い特異性を示すことも全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
マイコプラズマの感染が、ヒト免疫不全ウイルス感染者のエイズへの病態の進行を加速しているという報告があり（1991, Science 251: 4991）、前記の通り、マイコプラズマ・ファーメンタンスがエイズの増悪因子であるという報告もあるが、生体内においてこのようなマイコプラズマ・ファーメンタンスの動態を正確に検出できる手段がなく、生体内のマイコプラズマ・ファーメンタンスを免疫学的に検出可能な抗体の提供が望まれていた。
【０００７】
本発明は、上記観点からなされたものであり、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂質の解明、このグリセロ糖リン脂質に対する抗体、この抗体を用いたグリセロ糖リン脂質の測定法及びマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、レトロウイルス感染による細胞の異常増殖、細胞破壊及び免疫異常を解明するために、これらの感染細胞の脂質解析を行う過程でヒトヘルパーＴ細胞株から抽出されたグリセロ糖リン脂質（ホスホコリン含有グリセロ糖脂質）が、意外なことにマイコプラズマ・ファーメンタンス由来のグリセロ糖リン脂質（ホスホコリン含有グリセロ糖脂質：以下、単に「グリセロ糖リン脂質」という）であることを確認し、この脂質の構造を解明した。さらに、この脂質に対する抗体を作成し、種々のマイコプラズマに対する特異性を確認したところ、この抗体がマイコプラズマ・ファーメンタンスを特異的に認識することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本願発明は、以下の性質を有する、マイコプラズマ・ファーメンタンスから抽出され得るグリセロ糖リン脂質である。
（Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲンドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。
（Ｂ）アルカリで分解される。
（Ｃ）ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体による分画において非吸着画分として得られる。
（Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
【００１０】
上記グリセロ糖リン脂質は、α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール、ホスホコリン及びアミノプロパンジオールのリン酸エステルを構成成分とする可能性が高い。
【００１１】
また、本願発明は、少なくともホスホコリン、グルコース、脂肪酸及びグリセロールを含み、ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体に対して非吸着性の脂質であり、アルカリに不安定であるグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗グリセロ糖リン脂質抗体である。このグリセロ糖リン脂質としては、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂質が挙げられる。
【００１２】
上記抗グリセロ糖リン脂質抗体の具体的態様として本願発明は、６’−Ｏ−ホスホコリン−α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールと、以下の性質を有する、マイコプラズマ・ファーメンタンスから抽出され得るグリセロ糖リン糖脂質との両方と反応する抗グリセロ糖リン脂質ポリクローナル抗体、及び以下の性質を有するグリセロ糖リン脂質に対する反応特異性を有する抗グリセロ糖リン脂質モノクローナル抗体を提供する。
（Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲンドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。
（Ｂ）アルカリで分解される。
（Ｃ）ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体による分画において非吸着画分として得られる。
（Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
【００１３】
また本願発明は、検体中の上記の性質を有するグリセロ糖リン脂質を、上記の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグリセロ糖リン脂質の測定法、及びこの方法により検体中のグリセロ糖リン脂質を測定し、このグリセロ糖リン脂質の存否またはその存在量と検体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスの存否またはその存在量とを関連づけることを特徴とするマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、検体中に含まれる上記（Ａ）〜（Ｄ）の性質を有するグリセロ糖リン脂質及び／又はこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質を、上記の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とするグリセロ糖リン脂質及び／又はこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質の測定法を提供する。
【００１５】
また本願発明は、免疫学的方法により検体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスまたはマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を検出するための試薬キットであって、前記抗グリセロ糖リン脂質抗体と、標識物質で標識化したマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質、または前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した二次抗体とを含むことを特徴とする試薬キットを提供する。
【００１６】
さらに本願発明は、血液中に含まれる、上記（Ａ）〜（Ｄ）の性質を有するグリセロ糖リン脂質もしくはこのグリセロ糖リン脂質に抗原性が類似した物質、またはこれらのグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗体を検出することを特徴とする、エイズ、腎炎及びＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチーから選ばれる疾病の検出法を提供する。
【００１７】
尚、本明細書において、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特異的に存在するグリセロ糖リン脂質を、単に「グリセロ糖リン脂質」ということがある。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
＜１＞本発明のグリセロ糖リン脂質
本発明の抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Mycoplasma fermentans）のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有するものであり、このグリセロ糖リン脂質を抗原として調製される。はじめに、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質について説明する。
【００１９】
従来、レトロウイルス感染細胞に特有な脂質が存在することが知られており、ＨＴＬＶ−Ｉ感染ヒトヘルパーＴ細胞から５種のグリセロ糖リン脂質（ＧＧＰＬｓ：ＧＧＰＬ−Ｉ、ＧＧＰＬ−II、ＧＧＰＬ−III、ＧＧＰＬ−IV、ＧＧＰＬ−Ｖ）が見い出されている。そのうちＧＧＰＬ−Ｉの構造が本発明者らによって決定されている（西田ら、日本農芸化学会誌 第６８巻第３号（１９９４）「１９９４年度大会講演要旨集」第３９頁）。ＧＧＰＬ−Ｉ以外のＧＧＰＬｓは存在が認められているのみであり、その物性、構造などは知られていなかった。
【００２０】
本発明者らは、ＧＧＰＬｓが認められたＨＴＬＶ−Ｉ感染ヒトヘルパーＴ細胞（ＭＴ−４（ＧＧＰＬ＋））と、これを抗マイコプラズマ剤（ＭＣ２０１（大日本製薬（株）製））で処理したＭＴ−４（ＧＧＰＬ−）から調製した脂質画分をＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィー）で分離し、オルシノール（orcinol）試薬で糖脂質を、ディットマー（Dittmer）試薬でリン脂質を染色したところ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ＋）にみられ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ−）ではみられない２本のバンドが検出された（図４）。この２本のバンドは、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターを通過させたＭＴ−４（ＧＧＰＬ＋）細胞の培養上清を加えて培養したＭＴ−４（ＧＧＰＬ−）細胞からも検出された。後記実施例に示すように、これらのうち一方はＧＧＰＬ−Ｉであり、他方はＧＧＰＬ−IIIであることがわかった。
【００２１】
マイコプラズマ属微生物がホスホコリンを含有したグリセロ糖リン脂質を細胞の構成成分として有するという報告はなく、ＧＧＰＬｓはヒト細胞由来であると考えられていたが、上記結果から、マイコプラズマ・ファーメンタンスに由来することが明らかとなった。したがって、上記グリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗体が得られれば、マイコプラズマ・ファーメンタンスを検出することが可能となると考えた。
【００２２】
マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンスの培養物から調製することができる。マイコプラズマ・ファーメンタンスは、例えば以下のようにして得られる。ＧＧＰＬｓの存在が認められる（「ＧＧＰＬ陽性」）培養細胞、例えばＭＴ−４細胞（ＨＴＬＶ−Ｉ（ヒトＴリンパ球向性レトロウイルス−タイプＩ）が感染したヒトヘルパーＴ細胞）の培養上清を、ポアサイズ0.22μｍのフィルターで濾過することによって、濾液中にマイコプラズマ・ファーメンタンスが得られる。また、マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株等のタイプストレイン等を用いてもよい。
【００２３】
得られたマイコプラズマ・ファーメンタンスを、PPLO broth（デイフコ・ラボラトリーズ製）寒天培地等を用いて培養し、コロニーを単離した後、10％(v/v)ウシ胎仔血清(FBS)、５％(w/v)酵母抽出物（フロー・ラボラトリーズ製）、1000単位／ｍｌペニシリン、１％(w/v)デキストロース、０．００２％(w/v)フェノールレッドを含むPPLO broth（ディフコ・ラボラトリーズ製）等の液体培地中で培養すれば、マイコプラズマ・ファーメンタンスの培養菌体が得られる。次に、マイコプラズマ・ファーメンタンスの菌体にメタノールを加え数時間放置した後、クロロホルムを加えて超音波処理し、さらに数時間放置した後に、菌体をポーター型テフロンホモジナイザー等を用いてホモジナイズして上清を回収し、この上清を蒸発させることにより、脂質抽出物が得られる。こうして得られる脂質抽出物はグリセロ糖リン脂質を含有する。
【００２４】
実施例に示すように、この脂質画分をＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィー）プレートにアプライし、クロロホルム：メタノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開し、リン脂質の分析を行ったところ、６本のバンド（Lipid i、Lipid ii、Lipid iii、Lipid iv、Lipid v、及びLipid vi）が検出された（図３）。ＴＬＣ上の挙動から、これらのうち、Lipid v及びLipid viは、各々ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIに相当することがわかった。また、ＦＡＢマススペクトルの結果から、ＧＧＰＬ−ＩはLipid vと同一であり、ＧＧＰＬ−IIIはLipid viと同一であることが確認された。
【００２５】
マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染したＭＴ−４細胞からも得られる。例えば、ＭＴ−４細胞を１０％(v/v)ＦＣＳ（仔ウシ胎仔血清）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した細胞に対し、クロロホルム：メタノール（＝２：１、１：１、あるいは１：２）の混合液４００ｍｌを用いて脂質を抽出する。
【００２６】
上記のようにして得られたマイコプラズマ・ファーメンタンスまたはＭＴ−４細胞の脂質抽出物を、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有する陰イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ−セファデックス Ａ２５（ファルマシア社製）等を用いて非吸着画分（中性画分）と吸着画分（酸性画分）に分け、非吸着画分を得る。この非吸着画分をシリカビーズカラムにかけ、クロロホルム／メタノール／水（８３：１６：０．５〜２０：８０：８ (v/v)）による濃度勾配で分画することにより、ＧＧＰＬ−IIIを他のリン脂質から分離することができる。さらに、１−プロパノール／アンモニア水／水（８０：５：１５〜７５：５：２０）の濃度勾配で溶出することにより、ＧＧＰＬ−Ｉが単離される。
【００２７】
ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIは、いずれもオルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲンドルフ（Dragendorff）試薬（コリンを染色する）に陽性を示し、また、緩和なアルカリ処理で分解した。さらに、ＧＧＰＬ−Ｉはニンヒドリン反応（アミノ基を染色する）に陰性を示したが、ＧＧＰＬ−IIIは陽性であった。
【００２８】
精製したＧＧＰＬ−IIIを用いて行った物理化学的分析の結果を以下に示す。▲１▼赤外線吸収スペクトル
-CH2および-CH3基、水酸基、エステルカルボニル基、リン酸基、コリン基及び一級アミン基にそれぞれ対応する吸収が検出された。
【００２９】
▲２▼液体２次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）
分子中に少なくとも３種類の脂肪酸の存在が示唆された。また、ＧＧＰＬ−IIIには少なくとも４種類の分子が存在し、そのうち主要成分の分子量については１０４８であると結論された。さらに、分子量１０２０、１０７６及び１１０４のＧＧＰＬ−IIIも存在することが示された。
【００３０】
▲３▼タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ）
分子中にホスホコリンの存在が示唆された。また、ＧＧＰＬ−IIIの分子量は、主要成分については１０４８であると結論された。
【００３１】
▲４▼一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル
グリセロールのシグナル、コリンのシグナル及びグルコースのシグナルが検出された。さらに、アミノプロパンジオールの存在が予測されたので、３−アミノプロパン−１，２−ジオール（１−アミノプロパン−２，３−ジオール）および２−アミノプロパン−１，３−ジオールの標準標品を用いて得られた一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトルとＧＧＰＬ−IIIのスペクトルとを比較した結果、ＧＧＰＬ−IIIは２−アミノプロパン−１，３−ジオールを構成成分として含有している可能性が示唆された。
【００３２】
▲５▼二次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＰＨ−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ法）
ジアシルグリセロールに由来するプロトンのシグナルが認められた。またコリンのプロトンのシグナルが認められた。
【００３３】
▲６▼二次元1Ｈ−31Ｐ ＮＭＲスペクトル
１分子のＧＧＰＬ−III中に２個のＰ（リン）が含まれていることが示された。また、リンを含有する化合物はグルコース残基の１位または６位に結合していると推定された。この位置は６位である可能性がより高い。
【００３４】
さらに、コリンにリン酸基が結合したホスホコリンの構造が示唆され、グルコース残基の６位にはまずアミノプロパンジオールのリン酸エステルが結合しており、さらにこのアミノプロパンジオールのリン酸エステルにホスホコリンが結合した構造が推定された。
【００３５】
以上の結果から、ＧＧＰＬ−IIIは、下記性質を有する新規グリセロ糖リン脂質であることがわかった。
（Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲンドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。
（Ｂ）アルカリで分解される。
（Ｃ）ＤＥＡＥ基を有する陰イオン交換体による分画において非吸着画分として得られる。
（Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
【００３６】
さらに、上記結果からＧＧＰＬ−IIIは、α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール、ホスホコリン及びアミノプロパンジオールのリン酸エステルを構成成分とすることが示された。このアミノプロパンジオールのリン酸エステルは、２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリン酸エステルであり、その結合部位は、α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールのグルコース残基の６’位であると推定された。さらに、この２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリン酸エステルにホスホコリンが結合していることが示唆された。また、ＧＧＰＬ−IIIの主要成分は、アシル基として２個のパルミトイル基を有し、その推定構造は下記式の通りであり、ＧＧＰＬ−Ｉ（６’−Ｏ−ホスホコリン−α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール）のグルコース残基とホスホコリンとの間に２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリン酸エステルが挿入された構造を有していると推定される。
【００３７】
【化２】
0003735388.tif 000002
また、分子量が異なる他のＧＧＰＬ−III分子は、α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール中のアシル基の種類が異なるものであり、分子量１０２０のものではミリストイル基とパルミトイル基、１０７６のものではパルミトイル基とステアロイル基、１１０４のものでは２つのステアロイル基、またはパルミトイル基とエイコサノイル基を有していると推定されるが、詳細は明らかではない。
【００３８】
＜２＞本発明の抗体の調製
本発明の抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンス由来のグリセロ糖リン脂質を抗原として動物を免疫し、その動物から血清を分離するか、あるいはその動物の抗体産生細胞を採取し、永続的に培養可能とし、その培養物から回収することによって得られる。以下に、本発明の抗体の調製法を例示するが、これに限定されるものではなく、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を抗原に用いるならば、その他の方法によって調製してもよい。
【００３９】
（１）ポリクローナル抗体の調製
前記のようにして得られたマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質抽出物に、モノフォスフェートリピド、フロイント完全アジュバント、及びミネラルオイルを加えて混合し、さらに０．１％(v/v)Tween 80を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を加えて乳化する。
【００４０】
次に、得られた乳化物をマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ等の動物の皮下または腹腔内に投与する。初回免疫後、２〜３週間目に常法によって追加免疫を行うと、力価の高い抗血清が得られる。最終免疫から１週間後に血液を採取し、血清を分離する。この血清を熱処理して補体を失活させた後、硫酸アンモニウムによる塩析、イオン交換クロマトグラフィー等の通常の抗体の精製と同様の方法によってイムノグロブリン画分を取得する。尚、最終免疫の後に、酵素免疫測定法等により血中抗体価の上昇を確認しておくことが望ましい。
【００４１】
上記のようにして得られる抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有し、マイコプラズマ・アルソリティディス及びマイコプラズマ・ホミニスなど他のマイコプラズマのグリセロ糖リン脂質には反応しない。
【００４２】
マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質抽出物の代わりに、精製したＧＧＰＬ−IIIを用いれば、ＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するポリクローナル抗体が得られる。
【００４３】
（２）モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、ケーラーとミルステインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，４９５〜４９２頁、１９７５年）によって得られる。すなわち、グリセロ糖リン脂質に対する抗体を産生する哺乳動物の抗体産生細胞と骨髄腫（ミエローマ）細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、目的の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、このハイブリドーマを培養することによって培養液中にモノクローナル抗体が得られる。以下、工程ごとに分説する。
【００４４】
(i)動物の免疫及び抗体産生細胞の調製
グリセロ糖リン脂質に対する抗体を産生する細胞は、グリセロ糖リン脂質でマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどの動物を免疫し、その動物から脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血液等を調製することにより得られる。上記動物をグリセロ糖リン脂質で免疫するには、（１）と同様に行えばよい。
【００４５】
ＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を得るには、精製したＧＧＰＬ−IIIで動物を免疫してもよいが、グリセロ糖リン脂質混合物で免疫した動物の抗体産生細胞を用いてハイブリドーマを調製し、得られたハイブリドーマからＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生する株を選択してもよい。この方法によれば、動物の免疫に必要な量のＧＧＰＬ−IIIを得る必要がなく、酵素免疫法による検出が可能な程度の微量のＧＧＰＬ−IIIがあればよい。
【００４６】
(ii)ハイブリドーマの作製
グリセロ糖リン脂質で免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、骨髄腫細胞との細胞融合を行う。細胞融合に使用する骨髄腫細胞には種々の哺乳動物の細胞株を利用することができるが、抗体産生細胞の調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するのが好ましい。また、骨髄腫細胞株は、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにするために、未融合の骨髄腫細胞が生存できずハイブリドーマだけが増殖できるように、マーカーを有するものを用いることが好ましい。例えば、８−アザグアニン耐性株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損しており、核酸合成はｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路に依存している。このような骨髄腫細胞と正常抗体産生細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）では、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）中で、アミノプテリンによりｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路が阻害されても、チミジン、ヒポキサンチンが存在しているので、リンパ球由来のサルベージ回路により核酸合成できるので、増殖が可能である。これに対し、８−アザグアニン耐性の骨髄腫細胞は、アミノプテリンによりｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路も阻害されるため、核酸合成できずに死滅し、また正常細胞である抗体産生細胞も長期培養はできない。したがって、抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によって生成したハイブリドーマのみがＨＡＴ培地で増殖できるので、非融合細胞から融合細胞を選択することができる（サイエンス 第１４５巻７０９頁、１９６４年）。また、骨髄腫細胞として、固有のイムノグロブリンを分泌しない株を使用することが、ハイブリドーマの培養上清から目的の抗体を取得することが容易となる点で好ましい。
【００４７】
ハイブリドーマを得るための細胞融合は、例えば以下のようにして行う。免疫動物から脾臓を摘出し、RPMI1640培地に懸濁して細胞浮遊液を調製する。この脾細胞と、対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞、例えばSP2/O細胞（アザグアニン耐性、ＩｇＧ非分泌：ATCC CRL-1581）とを、脾細胞とミエローマ細胞が１０：１〜１：１程度となるように混合し、遠沈後、沈渣に平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコールを、最終濃度が３０〜５０％となるように加えて細胞を融合させる。ポリエチレングリコールを加える代わりに、細胞混合液に電気パルスを印加することによって融合させてもよい。
【００４８】
融合処理を行った細胞は、例えば１０％(v/v)仔ウシ胎仔血清(FCS)を含むRPMI1640培地などで培養後、ＨＡＴ培地などの選択培地に浮遊させ、９６ウェルのマイクロタイタープレートなどに分注して培養を行いハイブリドーマのみを生育させる。
【００４９】
(iii)グリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマの検索
上記のようにして得られたハイブリドーマは、複数の抗原あるいは抗原決定部位に対する各々のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの混合物であるので、これらの中からグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有するモノクローナル抗体、特にＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生する株を選択する。また、ＧＧＰＬ−IIIに結合するモノクローナル抗体のうち、抗原性の強い抗原決定部位に対するモノクローナル抗体を産生する株を選択することが好ましい。
【００５０】
グリセロ糖リン脂質に対するモノクローナル抗体を産生する株は、これらを抗原として用いる酵素免疫法によって選択できる。このような方法としてＥＬＩＳＡ法、すなわち、抗原をマイクロタイタープレート等に固相化しておき、これにハイブリドーマ培養液を加え、さらに酵素、ケイ光物質、発光物質などで標識した第２抗体を加えてインキュベートし、結合した標識物質によって抗体を検出する方法が挙げられる。その際、抗体を固相化し、これに抗原、標識第２抗体を順次加えてインキュベートしてもよい。尚、ＥＬＩＳＡ法については後に詳述する。
【００５１】
精製されたＧＧＰＬ−IIIが得られていない場合には、マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分を高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレートを用いて分離し、このプレートにハイブリドーマの培養液、標識２次抗体を順次加えてインキュベートし、標識物質が結合する位置を検出する。この位置がＧＧＰＬ−IIIがＨＰＴＬＣによって展開される位置と同じであれば、そのハイブリドーマはＧＧＰＬ−IIIに対するモノクローナル抗体を産生すると認められる。ＧＧＰＬ−IIIに対するモノクローナル抗体が得られれば、これを用いたアフィニティークロマトグラフィー等によって、脂質画分からＧＧＰＬ−IIIを精製することもできる。
【００５２】
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを含むことが確認されたら、そのハイブリドーマが含まれていたウェルの細胞から限界希釈法などによりクローニングを行う。
【００５３】
後記実施例に示すように、このようにして得られたＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−５１１５の受託番号で寄託されている。
【００５４】
(iv)モノクローナル抗体の調製
上記のようにして得られたハイブリドーマを適当な培地中で培養すれば、その培養上清中に本発明のモノクローナル抗体が得られる。さらに常法により、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティクロマトグラフィー、あるいは抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィーなどによってモノクローナル抗体を精製することができる。
【００５５】
こうして得られるモノクローナル抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに感染していない健常人の血清中に存在するシアル酸含有糖脂質（ガングリオシド）、血小板活性化因子（１−アルキル−２−アセチルグリセロ−３−ホスホコリン）もしくはその部分脱アシル化物、ホスファチジルコリンもしくはその部分脱アシル化物、またはスフィンゴミエリン等の糖脂質及びリン脂質とは交差反応を示さない。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体は、そのまま使用することもできるが、フラグメント化したものを使用することもできる。抗体のフラグメント化の際、抗体の抗原結合部位（Ｆａｂ）が保存されていることが抗原と抗体との結合に必須であるので、抗原結合部位を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン）で抗体を処理して得られる抗原結合部位（Ｆａｂ）を含むフラグメントは使用することができる。
【００５７】
また、本発明のモノクローナル抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に抗原結合部位（Ｆａｂ）を含むフラグメントを作製することが可能である。
【００５８】
＜３＞本発明のグリセロ糖リン脂質及びそれに対する抗体の利用法
本発明の抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンス固有のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有するので、これを用いて検体中のグリセロ糖リン脂質を免疫学的に測定することができる。この際、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIの両方に対して反応特異性を有する抗体を用いれば、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIを測定することができ、ＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有する抗体を用いれば、ＧＧＰＬ−IIIを選択的に測定することができる。ＧＧＰＬ−IIIの測定に際しては、前記のようにして得られるＧＧＰＬ−IIIを標準物質として使用することができる。また、前記検体中のグリセロ糖リン脂質としては、生体由来の検体から抽出した脂質画分が挙げられる。
【００５９】
免疫学的な測定法としては、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法等、抗体を用いる通常の免疫学的方法を適用することができる。例えば、抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含まれるグリセロ糖リン脂質を前記抗体に結合させ、非吸着成分を固相から分離除去し、次いで、標識物質で標識化したマイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質を前記固相に接触させ、前記検体液中に含まれるグリセロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質とを競合反応させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出することにより、検体液中のグリセロ糖リン脂質を測定することができる。
【００６０】
また、抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合した固相に、検体液と、標識物質で標識化したグリセロ糖リン脂質とを接触させ、前記検体液中に含まれるグリセロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質とを前記抗体に対して競合反応させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出することにより検体中のグリセロ糖リン脂質を測定することができる。この際、標識化したグリセロ糖リン脂質の代わりに無標識の標準グリセロ糖リン脂質を用い、検体中のグリセロ糖リン脂質と標準グリセロ糖リン脂質との競合反応を行った後、さらに標識物質で標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体を固相に接触させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。この場合も、さらに標識化した二次抗体を用いてもよい。
【００６１】
さらに、検体液中のグリセロ糖リン脂質を固相に結合し、これに標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体を接触させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。
【００６２】
また、標準グリセロ糖リン脂質を固相に結合させ、これに検体液及び標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体を接触させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。この場合においても、標識二次抗体を使用することもできる。標準グリセロ糖リン脂質として精製したＧＧＰＬ−IIIを用いれば、検体中のＧＧＰＬ−IIIを測定することができる。
【００６３】
さらには、グリセロ糖リン脂質が結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含まれる抗グリセロ糖リン脂質抗体を前記固相に結合させ、非吸着成分を固相から分離除去し、次いで、抗ヒトイムノグロブリン抗体を標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、標識物質を検出することにより、検体中の抗グリセロ糖リン脂質抗体を測定することができる。本発明のグリセロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに固有であるので、検体中の抗グリセロ糖リン脂質抗体の有無を調べることによって、マイコプラズマ・ファーメンタンスの感染の有無を知ることができる。
【００６４】
その他、免疫学的測定法には種々の態様が知られているが、いずれの方法も本発明に適用することができる。
また、上記のような固相を用いる方法以外に、ハプテン、抗原の免疫測定に使用される方法、例えば、前記抗体に対して検体中のグリセロ糖リン脂質と標識化したグリセロ糖リン脂質を競合反応させ、抗体と結合した抗原と遊離の抗原を、例えばポリエチレングリコール、デキストラン、二次抗体等を用いて分離し、遊離の標識抗原の標識物質を検出する液相法を採用してもよい。
【００６５】
上記固相としては、アガロースビーズ、ラテックス粒子、ポリスチレン、ナイロン等のマイクロタイタープレートのウェル等の通常の材料及び形態（粒子、微粒子、試験管、マイクロタイタープレート、ストリップ等）のものが挙げられる。固相に抗体またはグリセロ糖リン脂質を結合させた後に、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やゼラチンなどを用いてブロッキングを行うことが好ましい。また、標識物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等、酵素反応により色素の発色が可能な酵素；放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート等の蛍光色素などが挙げられる。
【００６６】
色素は、ペルオキシダーゼに対しては４−クロロ−１−ナフトール、Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）もしくは３，３’−ジアミノベンチジン等、アルカリフォスファターゼに対してはｐ−ニトロフェニルフォスフェート等を使用する。
【００６７】
マイコプラズマ・ファーメンタンスは本発明に係るグリセロ糖リン脂質を有しているので、本発明の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出することができる。例えば、検体から脂質画分を抽出し、該脂質抽出物を固相と接触させて脂質を吸着させ、脂質が吸着した固相と本発明の抗体を反応させ、同時またはその後に、標識物質で標識化された該抗体と反応する抗免疫グロブリン抗体を反応させ、標識物質を検出することにより、検体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出することができる。
【００６８】
また、本発明に係るグリセロ糖リン脂質は、マイコプラズマ・ファーメンタンスに固有であるので、前記の方法により検体中のグリセロ糖リン脂質を測定し、グリセロ糖リン脂質の存否またはその存在量と検体中のマイコプラズマ・ファーメンタンスの存否またはその存在量とを関連づけることによって、マイコプラズマ・ファーメンタンスを検出することもできる。
【００６９】
上記グリセロ糖リン脂質の測定法またはマイコプラズマ・ファーメンタンスの検出法において、検体としては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、関節液または細胞培養液（上清）等が挙げられる。
【００７０】
上記方法の他に、生体組織または細胞を、そのまま又はグリセロ糖リン脂質の固定処理を施した後、標識物質で標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体と反応させ、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染した生体組織または細胞に標識化抗体を結合させ、標識物質を測定することにより、マイコプラズマ・ファーメンタンスを検出することもできる。固定処理の方法としては、例えばホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド等を用いる方法が挙げられる。また、標識物質で標識化した抗グリセロ糖リン脂質抗体の代わりに、無標識の抗グリセロ糖リン脂質抗体を固定処理した生体組織または細胞と反応させ、同時またはその後に、前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染した生体組織または細胞に標識化二次抗体を結合させ、標識物質を測定してもよい。
【００７１】
免疫学的方法により被検体中のグリセロ糖リン脂質またはマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出する際に、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗体と、この抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した二次抗体とを含む試薬キットを予め用意しておくと、検出を簡便に行うことができる。
【００７２】
具体的なキットの一例として、マイクロタイタープレート、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のブロッキング試薬、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質（標準物質）、本発明の抗体、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体、過酸化水素水、ＯＰＤ、洗浄用緩衝液からなるキットが挙げられる。抗体類、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質等は、凍結乾燥品として、またはこれらを安定して保存できる溶媒に溶解しておくことが好ましい。
【００７３】
マイコプラズマ・ファーメンタンスの検出は、以下に示すような診断法に利用することができる。
【００７４】
▲１▼レトロウイルス感染症の発症予測
マイコプラズマ・ファーメンタンスは、エイズ（後天性免疫不全症候群）の増悪因子であるという報告がある（Lo, S.-C. et al. 1993. Res.Microbiol. 144, 489-493）。エイズは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）が感染していても必ずしも発症するものではなく、通常潜伏期間が長く、発症にはマイコプラズマ・ファーメンタンスの複合感染が関与している。同様に、他のレトロウイルス感染症の発症にもマイコプラズマ・ファーメンタンスが関与しているものがあると考えられる。
【００７５】
ＨＩＶが潜伏感染した細胞の培養液に、各種マイコプラズマから抽出した脂質を表１に示した脂質濃度（終濃度）で加えて培養し、光学顕微鏡を用いて破壊された細胞数を調べることにより、ＨＩＶの発現誘導頻度の指標とした。結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
0003735388.tif 000003
【００７７】
この結果及び従来の報告から、マイコプラズマ・ファーメンタンスはレトロウイルスの増殖を誘導する活性を有することがわかる。したがって、レトロウイルス感染者の血液等でマイコプラズマ・ファーメンタンスの複合感染の有無を調べることによって、発症の予測が可能となり、適切な処置を行うことができる。
【００７８】
▲２▼リウマチの診断
マイコプラズマ・ファーメンタンスはリウマチの原因であるという報告がある（Williams, M. H. et al. Lancet ii: 277-280(1970)）。したがって、本発明の抗体を用いてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出することにより、リウマチ罹患の診断が可能となることが期待される。
【００７９】
▲３▼ターゲティング療法への応用
アジドチミジン、ジデオキシイノシン等の抗ＨＩＶ剤または／及び抗マイコプラズマ剤を結合させた本発明の抗体をレトロウイルス感染者やリウマチ患者に投与し、レトロウイルス発症の予防あるいはリウマチの治療に利用する等の応用が期待される。
【００８０】
▲４▼中和抗体として治療への利用
本発明の抗体はマイコプラズマ・ファーメンタンスに結合してそれによる感染を阻止するための中和抗体としての活性が期待され、この抗体を生体に投与してマイコプラズマ・ファーメンタンスが複合感染する可能性の高いウイルスによる感染症の治療または予防に使用することができる。
【００８１】
▲５▼腎炎の診断
後記実施例に示すように、腎炎患者の血液中に、本発明の抗グリセロ糖リン脂質抗体が結合する脂質が高率で認められ、この脂質を検出することによって腎炎の診断を行うことができることが示唆された。この脂質は、ＨＰＴＬＣ上の位置からはＧＧＰＬ−IIIとは区別されるが、ＧＧＰＬ−IIIを認識するモノクローナル抗体が結合したことから、ＧＧＰＬ−IIIと抗原性が類似した脂質であると考えられる。このＧＧＰＬ−IIIに抗原性が類似した物質は、本発明の抗グリセロ糖リン脂質抗体を用いて免疫学的に測定することができる。
【００８２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００８３】
【実施例１】
新規グリセロ糖リン脂質の単離及びその構造解析
＜１＞マイコプラズマ・ファーメンタンスの培養及び脂質の調製
ＧＧＰＬｓを含むＭＴ−４細胞（ヒトＴリンパ球向性レトロウィルス−タイプＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）が感染したヒトヘルパーＴ細胞株）の培養上清を、ポアサイズ0.22μｍのフィルターで濾過して、その濾液をPPLO broth（ディフコ・ラボラトリーズ製）寒天培地に接種して培養し、コロニーを単離した後、10％(v/v)ウシ胎仔血清(FBS)、５％(w/v)酵母抽出物（フロー・ラボラトリーズ製）、1000単位／ｍｌペニシリン、１％(w/v)デキストロース、０．００２％(w/v)フェノールレッドを含むPPLO broth（ディフコ・ラボラトリーズ製）の液体培地中で培養した。形成されたコロニーはフライドエッグ状を呈し、マイコプラズマであることが確認された。
【００８４】
また、本微生物からＤＮＡを調製し、マイコプラズマの種によって異なる１６Ｓ−２３ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子間スペーサ領域の二段階ＰＣＲ（Harasawa, R. et al. 1993. Res. Microbiol. 144: 489-493）による解析を、ＭＴ−４細胞から分離したマイコプラズマ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・ファーメンタンス タイプストレインＰＧ１８、マイコプラズマ・ヒオリニス（M. hyorhinis）ＤＢＳ１０５０(ATCC 17981)、マイコプラズマ・アルギニニ（M. arginini）Ｇ２３０(ATCC 23838)、マイコプラズマ・オラレ（M. orale）ＣＨ１９２９９、マイコプラズマ・サリバリウム（M. salivarium）ＰＧ２０(ATCC 23064)、マイコプラズマ・ペネトランス（M. penetrans）ＧＴＵ−５４−６Ａ１の各菌種について行った。その結果、一段階ＰＣＲ産物は、マイコプラズマ・ファーメンタンスのタイプストレインであるＰＧ１８株と一致した（図１）。さらに、このＰＣＲ産物を用いて第２段階のＰＣＲを行って得られた増幅産物は、VspI及びHindIIIで切断され、ClaI、HincII及びHaeIIIでは切断されなかった（図２）ことから、本微生物はマイコプラズマ・ファーメンタンスと同定され、ＧＧＰＬ株（M. fermentans GGPL strain）と命名された。
【００８５】
上記の方法で培養したマイコプラズマ・ファーメンタンスの菌体１ｇにメタノールを１００ｍｌ加え数時間放置した後、クロロホルムを２００ｍｌ加えて超音波処理し、さらに数時間放置した。これを、ポーター型テフロンホモジナイザーでホモジナイズして得られたホモジネートを１０，０００ｒｐｍで遠心し、その上清を回収した。この上清を蒸発させることにより、脂質抽出物５０ｍｇを得た。
【００８６】
＜２＞マイコプラズマ・ファーメンタンス脂質画分の分析
上記で得られたマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分をＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィー）プレート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：メタノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開し、ディットマー試薬を用いてリン脂質を染色した。リン脂質のパターンを、ＴＬＣデンシトメータ（島津製作所製ＣＳ９１０）を用いて５８０ｎｍでの吸収により測定した。その結果、６本のバンド（Lipid i、Lipid ii、Lipid iii、Lipid iv、Lipid v、及びLipid vi）が検出された（図３）
一方、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染したＭＴ−４細胞及びこの細胞を抗マイコプラズマ剤（ＭＣ２０１（大日本製薬（株）製））で処理して得られたＭＴ−４細胞から脂質画分を既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(1959))により抽出した。各々の脂質画分抽出物を、ＨＰＴＬＣ（高速薄層クロマトグラフィー）プレート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：メタノール：0.2％(v/v)塩化カルシウム水溶液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開し、オルシノール（orcinol）試薬を用いて糖脂質を染色し、ディットマー（Dittmer）試薬を用いてリン脂質を染色したところ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ＋）にみられ、ＭＴ−４（ＧＧＰＬ−）ではみられない２本のバンドが検出された（図４）。これらのバンドのうち一方は、すでに構造が知られているＧＧＰＬ−Ｉであり、他方はＧＧＰＬ−IIIであると同定された。尚、その他のディットマー試薬陽性のバンドはＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＤ１ａ、オルシノール試薬陽性のバンドはホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンと同定されている（Matsuda , K. et al. Biochem. Biophys. Acta, 1168, 123-129 (1993)）。
【００８７】
また、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターを通過させたＭＴ−４細胞（マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染したもの）の培養上清を加えて培養したＭＴ−４（抗マイコプラズマ剤ＰＣ２０１で処理したもの）細胞から抽出した脂質画分を上記と同様にしてＨＰＴＬＣにより分析したところ、上記の２本のバンドが検出された。したがって、これらのバンド、すなわちＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIは、マイコプラズマ・ファーメンタンスに由来することが明らかである。
【００８８】
これらＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIは、ＴＬＣ上の挙動から、前記マイコプラズマ・ファーメンタンス由来のLipid v及びLipid viに各々相当することがわかった。また、ＦＡＢマススペクトルの結果から、ＧＧＰＬ−ＩはLipid vと同一であり、ＧＧＰＬ−IIIはLipid viと同一であることが確認された。
【００８９】
マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染したＭＴ−４細胞６０ml（湿体積）に対し４００mlのクロロホルム：メタノール＝２：１,１：１および１：２を用いて抽出し９９３ｍｇの総脂質を得た。総脂質は、ＤＥＡＥ  Ｓephadex Ａ-２５カラムにより非吸着画分（中性画分）と吸着画分（酸性画分）に分け、非吸着画分７７５mgが得られた。この非吸着画分をイアトロビーズカラム（イアトロン社製）にかけ、クロロホルム／メタノール／水（８３：１６：０．５〜２０：８０：８, v/v/v）の濃度勾配で３回分画し、最後に１-プロパノール／アンモニア水／水（８０：５：１５〜７５：５：２０, v/v/v）による濃度勾配で溶出してＧＧＰＬ−III ３ｍｇを単離した。
【００９０】
＜３＞ＧＧＰＬ−IIIの構造解析
ＧＧＰＬ−IIIは、オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲンドルフ試薬に陽性を示し、また、緩和なアルカリ処理で分解した。さらに、ＧＧＰＬ−Ｉはニンヒドリン反応に陰性を示したが、ＧＧＰＬ−IIIは陽性を示した。これらの結果から、ＧＧＰＬ−IIIはコリンを含む糖リン脂質であることがわかった。
【００９１】
さらに、以下に示すようにして、ＧＧＰＬ−IIIの構造解析を行った。
【００９２】
（１）赤外線吸収スペクトル測定
ＧＧＰＬ−IIIの赤外線吸収スペクトルを、赤外線顕微鏡（ＩＭＳ−８０００、島津製作所製）を装着した赤外分光光度計（ＦＴＩＲ−８１００Ｍ：島津製作所製）を用いて測定した。結果を図５に示す。
【００９３】
その結果、-CH2および-CH3基（２９５７，２９２０，２８５２，１４６７，１４１９，１３７８ｃｍ-1）、水酸基（３２７１ｃｍ-1）、エステルカルボニル基（１７４０，１１６５ｃｍ-1）、リン酸基（１０９１ｃｍ-1）、コリン基（９７０ｃｍ-1）、及び一級アミン基（１５６０−１６７０ｃｍ-1）にそれぞれ対応する吸収が検出された。
【００９４】
（２）液体２次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）
前記のようにして精製したＧＧＰＬ−III 約１μｇをクロロホルム：メタノール（１体積：１体積）の混合溶液１μＬに溶解し、この溶液に、（＋）法の場合は３−ニトロベンジルアルコールを、（−）法の場合はトリエタノールアミンをマトリクスとして０．５ｍＬ加えて混合した。これらの混合溶液を試料とし、ＴＳＱ７０三連四重極型質量分析計（Finnegan MAT製）を使用して液体２次イオン質量分析を行った。、一次イオン流として、２０ｋｅＶに加速したセシウムイオン（Ｃｓ+）を用いた。スペクトルは、250原子質量単位(amu)/secの速度で得た。（＋）法によるスペクトルを図６に、（−）法によるスペクトルを図７に示す。
【００９５】
その結果、（＋）法でｍ／ｚ１０２１、ｍ／ｚ１０４９およびｍ／ｚ１０７７イオンが認められた。このことから、脂肪酸組成が異なるＧＧＰＬ−III分子が少なくとも３種類存在することが示唆された。また、ＧＧＰＬ−IIIの主要成分はｍ／ｚ１０４９のピークであり、その分子量は、１０４９からプロトンの質量１を差し引いた１０４８であると結論された。他の成分の分子量も同様に、１０２０及び１０７６であると結論された。
【００９６】
また、（−）法では、ｍ／ｚ１０４７、ｍ／ｚ１０７６およびｍ／ｚ１１０３イオンが認められた。（＋）法によるスペクトル解析と併せると、ＧＧＰＬ−III分子は、脂肪酸組成が異なる分子が少なくとも４種類存在することが示唆された。（−）法におけるＧＧＰＬ−IIIの主要成分はｍ／ｚ１０４７のピークであり、その分子量は、１０４７にプロトンの質量１を加えた１０４８であると結論された。他の成分の分子量も、同様に１１０４であると結論された。ｍ／ｚ１０７６イオンから推定される分子量は１０７７であるが、（＋）法の結果から推定される分子量は１０７６であり、他の成分の分子量との差がメチレン基２個分に相当することから、１０７６であると結論された。
【００９７】
（３）タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ）
ＬＳＩＭＳに用いた試料と同様に調製した試料（（＋）法用の試料および（−）法の試料）を用い、ＴＳＱ７０三連四重極型質量分析計（Finnegan MAT製）を使用してタンデムマススペクトルの測定を行った。一次イオン流として、２０ｋｅＶに加速したセシウムイオン（Ｃｓ+）を用い、ＣＡＤ（低エネルギー衝突活性化開裂）気体として、０．２６パスカル（２．０ｍＴｏｒｒ）に維持したアルゴンを用いた。スペクトルは、250原子質量単位(amu)/secの速度で得た。（＋）法によるスペクトルを図８に、（−）法によるスペクトルを図９に示す。
【００９８】
その結果、（＋）法ではｍ／ｚ１８４イオンおよびｍ／ｚ１０４９イオンが認められた。ｍ／ｚ１８４イオンから、ＧＧＰＬ−IIIの分子中にホスホコリンの存在が示唆された。また、ＧＧＰＬ−IIIの分子量は、１０４９からプロトンの質量１を差し引いた１０４８であると結論された。（−）法では、ｍ／ｚ１０４７イオンが認められた。このことから、ＧＧＰＬ−IIIの分子量は１０４７にプロトンの質量１を加えた１０４８であると結論された。また、ＬＳＩＭＳにより示唆された複数種類のＧＧＰＬ−IIIのうち、分子量１０４８の分子が主要成分であることが支持された。
【００９９】
（４）一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル
重水素（2H）で置換したＧＧＰＬ−III（５００μｇ）、ホスファチジルコリン（２ｍｇ）、Ｄ−グルコース ６−リン酸・２ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）（約２００μｇ）を、各々０．５ｍＬの［2H］ジメチルスルホキシド（(C2H3)2SO)：2H2O（９８体積：２体積）に溶解し、ＧＸ−４００スペクトロメーター（日本電子製）を使用して、６０℃下、４００ＭＨｚにおける1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを得た。スタンダードとしてはテトラメチルシランを用いた。
【０１００】
グルコース(GlcH1)のシグナルの積分値を1.00として標準化し、他のシグナルの強度を定量化した。結果を図１０に示す。
その結果、グリセロール（Gro）のシグナルが４．３１９ｐｐｍ（GroH1b）、４．１４５ｐｐｍ（GroH1a）、５．１１８ｐｐｍ（GroH2）、３．６７７ｐｐｍ（GroH3b）、３．５６２ｐｐｍ（GroH3a）に検出された。また、コリンのシグナルが４．０７４ｐｐｍ（-POCH2-）、３．５２９ｐｐｍ（-CH2N≡）、３．１３９ｐｐｍ（-N(CH3)3）に検出された。また、３−アミノプロパン−１，２−ジオール（１−アミノプロパン−２，３−ジオール）および２−アミノプロパン−１，３−ジオールの標準標品を用いて、それぞれ上述の方法により得られた一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル（それぞれ図１１Ａ，図１１Ｂ）とＧＧＰＬ−IIIのスペクトルとを比較した結果、ＧＧＰＬ−IIIには２−アミノプロパン−１，３−ジオールが含有されている可能性が高い。さらに、グルコース（Glc）のシグナルとして４．６４７ｐｐｍ（GlcH1）が顕著に検出された。
【０１０１】
（５）二次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル
一次元1Ｈ ＮＭＲと同様に調製した試料を用い、ＦＸ−４００スペクトロメーター（日本電子製）を使用して、６０℃下、４００ＭＨｚで、各次元２０００Ｈｚ幅でＰＨ−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ法による二次元の1Ｈ−ＮＭＲ分析を行った。結果を図１２に示す。
【０１０２】
その結果、ジアシルグリセロールに由来するプロトンのシグナル（図１２中、GroH2/H1b，GroH2/H1a，GroH2/H3b，GroH2/H3a）が認められた。またコリン（図中、-CH2-N-/-CH2OP-）のプロトンのシグナルが認められた。
【０１０３】
（６）二次元1Ｈ−31Ｐ ＮＭＲスペクトル
一次元1Ｈ ＮＭＲと同様に調製した試料をＦＸ−４００スペクトロメーター（日本電子製）を使用して、６０℃下４００ＭＨｚで二次元の1Ｈ−31Ｐ ＨＭＱＣスペクトルを得た。結果を図１３に示す。
【０１０４】
その結果一次元目（1Ｈ ＮＭＲ）は、前述の1Ｈ ＮＭＲと同様のスペクトルが得られ、二次元目（31Ｐ ＮＭＲ）からは、２本のシグナルが得られた。これは、１分子のＧＧＰＬ−III中に２個のＰ（リン）が含まれていることを示している。
【０１０５】
また一次元目で、グルコース残基の２位，３位，４位，５位のプロトンのシグナルが出ている位置（２．９〜３．０ｐｐｍ付近）と、二次元目のリンのシグナルが出ている位置（−０．９ｐｐｍおよび１．１ｐｐｍ）にクロスするピークが検出されなかったことから、リンを含有する化合物はグルコース残基の１位または６位に結合していると推定された。さらに、グルコース残基の６ａ位のプロトンのシグナル（一次元目の４．０ｐｐｍ付近）と二次元目のリンのシグナル（−０．９ｐｐｍ）およびグルコース残基の６ｂ位のプロトンのシグナル（一次元目の３．６ｐｐｍ付近）と二次元目のリンのシグナル（−０．９ｐｐｍおよび１．１ｐｐｍ）のシグナルとクロスするピークがそれぞれ検出された。
【０１０６】
また、一次元目のコリンのシグナル（約４．０５〜約４．１ｐｐｍ）と二次元目のリンのシグナル（−０．９ｐｐｍ）とのクロスピークが検出されたことから、コリンにリン酸基が結合したホスホコリンの構造をたどることができる。さらに、このホスホコリンのクロスピークは、グルコース残基の６ａ位のプロトンシグナル（一次元目の４．０ｐｐｍ付近）とずれていることから、グルコース残基の６位にはまずアミノプロパンジオールのリン酸エステルが結合しており、さらにこのアミノプロパンジオールのリン酸エステルにホスホコリンが結合する構造が推定された。
【０１０７】
以上の結果をまとめると、ＧＧＰＬ−IIIは、下記性質を有する新規グリセロ糖リン脂質である。
（Ａ）オルシノール試薬、ディットマー試薬、ドラゲンドルフ試薬及びニンヒドリン試薬に反応する。
（Ｂ）アルカリで分解される。
（Ｃ）ＤＥＡＥ基を有する陰イオン交換体による分画において非吸着画分として得られる。
（Ｄ）質量分析計によって測定した分子量が１０４８＋２８ｎ（nは、−１、０、１又は２）である。
【０１０８】
さらに、上記結果からＧＧＰＬ−IIIは、α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール、ホスホコリン及びアミノプロパンジオールのリン酸エステルを構成成分とすることが示された。このアミノプロパンジオールのリン酸エステルは、２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリン酸エステルであり、その結合部位は、α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールのグルコース残基の６’位であると推定された。さらに、この２−アミノプロパン−１，３−ジオールのリン酸エステルにホスホコリンが結合していることが示唆された。
【０１０９】
分子量が異なるそれぞれのＧＧＰＬ−III分子は、α−グルコピラノシル−（１’−３）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール中のアシル基の種類が異なるものであり、主要成分（分子量１０４８）におけるアシル基はいずれもパルミトイル基であると推定され、全体の推定構造は、前記化２式に示した通りである。尚、他の分子量を有するＧＧＰＬ−III分子はアシル基の長さが異なり、分子量１０２０のものではミリストイル基とパルミトイル基、１０７６のものではパルミトイル基とステアロイル基、１１０４のものでは２つのステアロイル基、またはパルミトイル基とエイコサノイル基を有していると推定されるが、詳細は明らかではない。
【０１１０】
＜４＞各種マイコプラズマの脂質成分の解析
各種マイコプラズマ（マイコプラズマ・ファーメンタンス  ＧＧＰＬ株、マイコプラズマ・ファーメンタンス  インコグニタス(incognitus)（ATCC 53949）、マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株、マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１７株、マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１株、マイコプラズマ・ファーメンタンスＦ７株、マイコプラズマ・アルスリティディス(M. arthritidis)、マイコプラズマ・ホミニス(M. hominis)(ATCC 15488)）を、１０％(v/v)ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、５％(w/v)酵母抽出物（フロー・ラボラトリーズ製）、1000単位／ｍｌペニシリン、１％(w/v)デキストロース、０．００２％(w/v)フェノールレッドを含むPPLO broth（ディフコ・ラボラトリーズ製）の液体培地中で培養した。これらの培養液から既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(1959))により脂質を抽出し、この脂質抽出物をＨＰＴＬＣプレート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：メタノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開した。このプレートをヘキサンに溶解した0.4％ポリイソブチルメタクリル酸塩に３０秒間浸した。このプレートを常法に従い、ディットマー試薬による染色を行った。結果を図１４に示す。この結果より、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIに相当するバンドは、各種マイコプラズマ・ファーメンタンスにのみ見られ、他のマイコプラズマ菌種には見られなかった。このことから、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIは、マイコプラズマ・ファーメンタンスに特徴的なグリセロ糖リン脂質であると結論された。
【０１１１】
【実施例２】
抗マイコプラズマ糖脂質ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして得たマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質抽出物５０ｍｇに、モノフォスフェートリピドＡ（リビ・イムノケム・リサーチ社）５０μｇと、完全アジュバント（ナカライテスク（株））５０μｇとを加え、さらにミネラルオイル２５０μｌ加えて４００ｒｐｍで２分間グラインドした。さらに０．１％(v/v)Tween 80を含むＰＢＳを２５０μｌ加えて４００ｒｐｍで２分間グラインドして、脂質抽出物を含むエマルジョン０．５ｍｌを得た。
【０１１２】
上記の方法で調製したエマルジョンを、７週齢のメスBALB/cマウスの皮下に１匹あたり０．５ｍｌ注射した。初回免疫後２週間目と３週間目に、上記の方法で調製した脂質抽出物を含むエマルジョンを１匹あたり０．５ｍｌ腹腔内に注射した。
【０１１３】
上記のようにして免疫したマウスの血液から、常法によって血清を分離した。この血清を用いて以下のように免疫染色を行った。ＧＧＰＬ陽性のＭＴ−４細胞から、脂質画分を既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(1959))で抽出し、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレート（メルク社製）に脂質画分抽出物をアプライし、クロロホルム：メタノール：0.2％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝50：45：10(v/v/v)の混合溶媒で展開した。このプレートを、ヘキサンに溶解した0.4％ポリイソブチルメタクリル酸塩に３０秒間浸した後、風乾した。
【０１１４】
１次抗体として、上記の血清または免疫してないマウスの血清をＨＰＴＬＣプレートに添加して、４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳでＨＰＴＬＣプレートを洗った後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（カペル社製）をＨＰＴＬＣプレートに添加して、室温で４時間インキュベートした。ＨＰＴＬＣプレートを純水で洗った後、抗原のバンドをペルオキシダーゼ発色キット（KONICA Immunostaining HRPKit：コニカ社製）を用いて検出した。結果を図１５に示す。この結果から上記の血清はＧＧＰＬ−ＩおよびＧＧＰＬ−IIIに対するポリクローナル抗体を含むことが確認された。
【０１１５】
【実施例３】
抗ＧＧＰＬ−IIIモノクローナル抗体の作製
（１）ハイブリドーマの調製
実施例２と同様に、マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質抽出物を含むエマルジョンを、７週齢のメスBALB/cマウスの皮下に１匹あたり０．５ｍｌ注射した。初回免疫後２週間目と３週間目に、上記の方法で調製した脂質抽出物を含むエマルジョンを１匹あたり０．５ｍｌ腹腔内に注射した。
【０１１６】
最終免疫の４日後にマウスから脾臓を摘出し、RPMI1640培地を用いて細胞浮遊液を調製した。この２×108個の脾細胞と、対数増殖期にあるマウスミエローマSP2/O細胞〔アザグアニン耐性、ＩｇＧ非分泌；ATCC CRL-1581〕（２×107 個）とを混合し、遠沈後、沈渣に45％ポリエチレングリコール（PEG4000（和光純薬（株）製）１ｍｌを１分間かけてゆるやかに振盪しながら加え、その後３７℃下でゆるやかに振盪しながら２分間インキュベーションした。これに、RPMI1640培地１ｍｌを１分間かけて加えてゆるやかに振盪し、同じく１ｍｌを１分間かけて加えてゆるやかに振盪した後、更に８ｍｌを３分間かけて加えた。
【０１１７】
上記細胞混合液を遠沈後、細胞を１０％仔牛胎仔血清(FCS)を含むRPMI1640培地５０ｍｌに浮遊させ、９６穴マイクロプレート４枚に、１ウェルあたり１００μｌずつ分注し、炭酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス、３７℃）中で培養した。２４時間後、培地をＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有、１０％(v/v)FCS培地）に交換し、ひきつづき炭酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス、３７℃）で培養した。ＨＡＴ培地での培養開始後４日目に、新しいＨＡＴ培地を１ウェルあたり１００μl追加した。ＨＡＴ培地での培養開始後７日目にＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）に交換し、その翌日に１０％(v/v)ＦＣＳを含むRPMI1640培地に交換した後、コロニー形成の有無をチェックした。
【０１１８】
（２）抗体産生ハイブリドーマの選択
マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分２０μｇを１０ｍｌのエタノールに溶解した溶液を、９６穴マイクロプレートの１ウェルあたり５０μｌ加えた後、ドライヤーで３０分間乾燥させた。１％(w/v)ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μｌ加え、室温で１時間静置した。１ウェルあたり１００μｌの０．３Ｍショ糖溶液で５回洗った後、前記の培養上清を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で６０分間振盪した。０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗った後、ＰＢＳで５００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製製）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で６０分間振盪した。
【０１１９】
０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗った後、１０ｍｇオルトフェニレンジアミンおよび５０μｌの３０％(v/v)過酸化水素水を含む１０ｍｌのクエン酸緩衝液を１ウェルあたり１００μｌ加えて室温で１５分間インキュベートした。１ウェルあたり１００μｌの０．５Ｍ硫酸を加えてペルオキシダーゼの酵素反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。抗体を産生するハイブリドーマについて限界希釈法によってクローニングを繰り返し、マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分を抗原に用いたＥＬＩＳＡにより第一次スクリーニングを行い、ＥＬＩＳＡ陽性のコロニーについては、さらにマイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分のＨＰＴＬＣの免疫染色により二次スクリーニングを行い、ＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株ＭＦ−III−１株を得た。この株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−５１１５の受託番号で寄託されている。
【０１２０】
（３）モノクローナル抗体の獲得
つづいてＭＦ−III−１株を、１０％(v/v)FCSを含むRPMI1640培地中で培養し、その培養上清を回収することにより、ＧＧＰＬ−IIIに対するモノクローナル抗体を得た。
【０１２１】
【実施例４】
モノクローナル抗体の免疫染色による評価
得られた抗ＧＧＰＬ−IIIモノクローナル抗体を用いて、以下のように免疫染色を行った。各種マイコプラズマ（マイコプラズマ・ファーメンタンス  ＧＧＰＬ株、マイコプラズマ・ファーメンタンス  インコグニタス(incognitus)（ATCC 53949）、マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株、マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１７株、マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１株、マイコプラズマ・ファーメンタンスＦ７株、マイコプラズマ・アルスリティディス(M. arthritidis)、マイコプラズマ・ホミニス(M. hominis)(ATCC 15488)）の脂質画分を、既知の方法(Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37,911-917(1959))で抽出し、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレート（メルク社製）に脂質画分抽出物をアプライし、クロロホルム：メタノール：０．２％(w/v)塩化カルシウム水溶液＝５０：４５：１０(v/v/v)の混合溶媒で展開した。
【０１２２】
上記プレートを、ヘキサンに溶解した０．４％(w/v)ポリイソブチルメタクリル酸塩に３０秒間浸した後、風乾した。１次抗体として、上記の抗ＧＧＰＬ−IIIモノクローナル抗体をＨＰＴＬＣプレートに添加して、４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳでＨＰＴＬＣプレートを洗った後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）をＨＰＴＬＣプレートに添加して、室温で４時間インキュベートした。ＨＰＴＬＣプレートを純水で洗った後、抗原のバンドをペルオキシダーゼ発色キット（KONICA Immunostaining HRPKit：コニカ社製）で検出した。結果を図１６に示す。
【０１２３】
この結果から、本発明のモノクローナル抗体は、マイコプラズマ・ファーメンタンスのグリセロ糖リン脂質に特異的に結合し、マイコプラズマ・アルソリティディス及びマイコプラズマ・ホミニスのリン脂質及び糖脂質には結合しないことが明らかである。さらに、ＨＰＴＬＣ上でディットマー試薬及びオルシノール試薬で染色されたバンドのうち、ＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＤ１ａ、ホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンと同定されているバンド及びＧＧＰＬ−Ｉのバンドは、免疫染色においては認められず、本発明のモノクローナル抗体はＧＧＰＬ−IIIのみに特異的に結合した。
【０１２４】
次に、マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染したＭＴ−４細胞を、１次抗体として抗ＧＧＰＬ−IIIモノクローナル抗体、２次抗体としてフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を図１７に示す。
【０１２５】
この結果から、本発明のモノクローナル抗体を用いてマイコプラズマ・ファーメンタンスを検出することができることが明らかである。
【０１２６】
【実施例５】
腎炎患者の血液中のＧＧＰＬ−IIIまたはＧＧＰＬ−IIIに抗原性が類似した物質の検出
腎炎患者の血液および正常人の血液から、常法により調製した血清それぞれ１００μｌに対し、既知の方法（Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-917 (1959)）に従い、それぞれ１００μｌのクロロホルム：メタノール（２：１、１：１及び１：２(V/V)）の混合溶媒を用いて血清中の総脂質を抽出した。抽出溶媒は３層に分かれ、そのうちの最下層を回収し、これを水に対して透析し、凍結乾燥させた。このようにして得られた試料を高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレート（メルク社製）にアプライし、クロロホルム：メタノール：０．２％（W/V）塩化カルシウム水溶液の混合溶媒（５０：４５：１０(V/V/V)）で展開した。また、標準物質として、精製したＧＧＰＬ−IIIを用いて同様にＨＰＴＬＣプレートにアプライして展開した。
【０１２７】
上記プレートを、ヘキサンに溶解した０．４％(w/v)ポリイソブチルメタクリル酸塩に３０秒間浸した後、風乾した。１次抗体として、上記の抗ＧＧＰＬ−IIIモノクローナル抗体をＨＰＴＬＣプレートに添加して、４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳでＨＰＴＬＣプレートを洗った後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）をＨＰＴＬＣプレートに添加して、室温で４時間インキュベートした。ＨＰＴＬＣプレートを純水で洗った後、抗原のバンドをペルオキシダーゼ発色キット（KONICA Immunostaining HRPKit：コニカ社製）で検出した。
【０１２８】
上記の方法で、腎炎患者の血清９検体および正常人の血清９検体について行ったところ、腎炎患者９検体のうち６検体についてはＧＧＰＬ−IIIの付近にシグナルが認められた（図１８）。このシグナルは、正常人の検体には検出されなかった（図１８）。腎炎患者に高率に見られるこのシグナルは、ＨＰＴＬＣ上の位置からはＧＧＰＬ−IIIとは異なっているが、抗原性が類似した脂質であると考えられる。
【０１２９】
尚、上記のようにして脂質を抽出した後、それぞれの凍結乾燥試料を、クロロホルム：メタノール：水（８３：１６：０．５(V/V/V)）の混合溶媒に溶解し、イアトロビーズ ６ＲＳ−８０６０（イアトロン社製）をつめたイアトロビーズカラム（クロロホルム：メタノール：水（８３：１６：０．５(V/V/V)）の混合溶媒で平衡化したもの）にアプライし、クロロホルム：メタノール：水の組成を変えて段階的に溶出させたものをＨＰＴＬＣにかけてもよい。
【０１３０】
【実施例６】
精製ＧＧＰＬ−IIIを抗原としたＥＬＩＳＡ法による、血清中の抗ＧＧＰＬ−III抗体の検出
実施例１で精製されたＧＧＰＬ−III ４０μｇを１０ｍｌのエタノールに溶解した溶液を、９６穴マイクロプレートの１ウェルあたり５０μｌ加えた後、ドライヤーで３０分間乾燥させた。１％(w/v)ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを１ウェルあたり１００μｌ加え、室温で１時間静置した。１ウェルあたり１００μｌの０．３Ｍショ糖溶液で５回洗った後、正常人、エイズ（ＡＩＤＳ）患者、腎炎（nephritis）患者、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチー（ＨＡＭ；HTLV-1 associated myelopathy）患者それぞれの血液から常法によって調製した血清を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で６０分間振盪した。０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗った後、ＰＢＳで２０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（カペル社製）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で６０分間振盪した。
【０１３１】
０．０５％Tween 20溶液で各ウェルを洗った後、１０ｍｇオルトフェニレンジアミンおよび５０μｌの３０％(v/v)過酸化水素水を含む１０ｍｌのクエン酸緩衝液を１ウェルあたり１００μｌ加えて室温で１５分間インキュベートした。１ウェルあたり１００μｌの０．５Ｍ硫酸を加えてペルオキシダーゼの酵素反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１３２】
正常人血清４６検体、エイズ（ＡＩＤＳ）患者血清１０検体、腎炎（nephritis）患者血清２２検体、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチー（ＨＡＭ；HTLV-1 associated myelopathy）患者血清９検体について上述の方法で４５０ｎｍの吸光度を測定し、正常人をコントロールとして、正常人よりも４５０ｎｍの吸光度が大きい血清検体を、抗ＧＧＰＬ−III抗体陽性とした。結果を表２に示す。
【０１３３】
【表２】
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【０１３４】
表２から分かるように、正常人では４６検体中１検体（２．２％）、エイズ患者では１０検体中８検体（８０．０％）、腎炎患者では２２検体中３検体（１３．８％）、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパチー患者では９検体中２検体（２２．２％）が、それぞれ血清中の抗ＧＧＰＬ−III抗体陽性であった。また、前述の２次抗体（ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体）のかわりにペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体（カペル社製）を用いて同様に調べた場合、腎炎患者の血清中の抗ＧＧＰＬ−III抗体陽性率はさらに増加した。
【０１３５】
【発明の効果】
本発明により、マイコプラズマ・ファーメンタンス由来の新規グリセロ糖リン脂質、ＧＧＰＬ−IIIが得られた。また、マイコプラズマ・ファーメンタンス由来のグリセロ糖リン脂質に対して反応特異性を有する抗体、特に、ＧＧＰＬ−Ｉ及びＧＧＰＬ−IIIに対して反応特異性を有するポリクローナル抗体、及びＧＧＰＬ−IIIのみに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体が得られた。
【０１３６】
本発明の抗体を用いることにより、マイコプラズマ・ファーメンタンスの特異的な検出が可能となり、エイズ等のレトロウイルス感染症の発症の予測、及びリウマチの診断、腎炎の診断等への応用が期待される。
【０１３７】
さらに、マイコプラズマ・ファーメンタンスが複合感染する可能性の高いウイルスによる感染症の治療または予防に使用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  各種マイコプラズマの１６Ｓ−２３ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子間スペーサ領域の第一段階ＰＣＲによる増幅産物の電気泳動の結果を示す図。
１：ＭＴ−４細胞から分離したマイコプラズマ・ファーメンタンス ＧＧＰＬ株２：マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８
３：マイコプラズマ・ヒオリニス ＤＢＳ１０５０
４：マイコプラズマ・アルギニニ Ｇ２３０
５：マイコプラズマ・オラレ ＣＨ１９２９９
６：マイコプラズマ・サリバリウム ＰＧ２０
７：マイコプラズマ・ペネトランス ＧＴＵ−５４−６Ａ１
８：ネガティブコントロール
【図２】  マイコプラズマ・ファーメンタンスの１６Ｓ−２３ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子間スペーサ領域の第二段階ＰＣＲによる増幅産物を各種制限酵素で消化した断片の電気泳動の結果を示す図。
１．VspI，２．HindIII，３．ClaI，４．HincII，５．HaeIII，６．無処理
【図３】  マイコプラズマ・ファーメンタンスの脂質画分に含まれるリン脂質のＴＬＣパターン（デンシトメトリー）を示す図。
【図４】  マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染した又は非感染のＭＴ−４細胞の脂質画分に含まれるリン脂質及び糖脂質のＴＬＣパターンを示す図。ＰＣはホスファチジルコリンを、ＳＰＭはスフィンゴミエリンを各々表す。
【図５】  ＧＧＰＬ−IIIの赤外線吸収スペクトルを示す図。
【図６】  ＧＧＰＬ−IIIの（＋）法による液体２次イオン質量スペクトルを示す図。
【図７】  ＧＧＰＬ−IIIの（−）法による液体２次イオン質量スペクトルを示す図。
【図８】  ＧＧＰＬ−IIIの（＋）法によるタンデムマススペクトルを示す図。
【図９】  ＧＧＰＬ−IIIの（−）法によるタンデムマススペクトルを示す図。
【図１０】  一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図１１】  ３−アミノプロパン−１，２−ジオール（１−アミノプロパン−２，３−ジオール）（Ａ）および２−アミノプロパン−１，３−ジオールの一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトル（Ｂ）を示す図。
【図１２】  ＧＧＰＬ−IIIのＰＨ−ＤＱＦ−ＣＯＳＹ法による二次元の1ＨＮＭＲスペクトルを示す図。
【図１３】  ＧＧＰＬ−IIIの二次元1Ｈ−31Ｐ ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図１４】  各種マイコプラズマの脂質画分に含まれるリン脂質のＴＬＣの結果（ディットマー試薬で染色）を示す図。
１．マイコプラズマ・ファーメンタンス  ＧＧＰＬ株
２．マイコプラズマ・ファーメンタンス  インコグニタス
３．マイコプラズマ・ファーメンタンス ＰＧ１８株
４．マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１７株
５．マイコプラズマ・ファーメンタンス Ｆ１株
６．マイコプラズマ・ファーメンタンスＦ７株
７．マイコプラズマ・アルスリティディス
８．マイコプラズマ・ホミニス
【図１５】  ＨＰＴＬＣで分離したＭＴ−４細胞の脂質画分を実施例２のポリクローナル抗体を用いて免疫染色した結果を示す図。
【図１６】  ＨＰＴＬＣで分離した各種マイコプラズマの脂質画分を実施例３のモノクローナル抗体を用いて免疫染色した結果を示す図。（数字は図１４と同じ。）
【図１７】  マイコプラズマ・ファーメンタンスが感染したＭＴ−４細胞を本発明のモノクローナル抗体を用いて免疫染色した結果を示す写真（生物の形態）。
【図１８】  ＨＰＴＬＣで分離した腎炎患者および正常人の血液から抽出した脂質を実施例３のモノクローナル抗体を用いて免疫染色した結果を示す図（クロマトグラフ）。nephritis patientsは腎炎患者の血液から抽出した脂質、normal individualsは正常人の血液から抽出した脂質についての結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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