(57)【要約】質量分析器を利用した遺伝多型の検出において、目的の多型を含むゲノムＤＮＡとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを基板結合させ、この基板にゲノムＤＮＡ試料を適用することにより、基板上で該ＤＮＡ試料から目的の多型を含むゲノムＤＮＡを選別すると共に基板に結合させることができ、これにより効率的に標的多型を検出し得ることを見出した。本発明の方法によれば、多くの検体の多型の検出を迅速かつ網羅的に行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡの多型を検出する方法であって、
（ａ）被験者から多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料を調製する工程、
（ｂ）基板に固定したオリゴヌクレオチドフラグメントであって標的多型を含むＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドフラグメントに対し、上記ＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる工程、および
（ｃ）基板に固定したオリゴヌクレオチドフラグメントにハイブリダイズされたＤＮＡを質量分析により検出する工程、を含む方法。
【請求項２】
基板に固定したオリゴヌクレオチドフラグメントが、検出する多型の近傍領域の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）におけるＤＮＡ試料が、（ｉ）多型部位を挟みこむように設計されたプライマー対であって、少なくともその一方が特異的に切断することが可能な部位を含むプライマー対を利用して、被験者由来のゲノムＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行ない、（ｉｉ）これにより得られる増幅産物を、該特異的に切断することが可能な部位で切断し、（ｉｉｉ）切断後の該増幅産物に対し、任意のＤＮＡを付加する、ことにより得られるものであり、工程（ｂ）におけるオリゴヌクレオチドが、該任意のＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
特異的に切断することが可能な部位が制限酵素部位である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
多型がマイクロサテライトである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料が、同一人の複数の異なる遺伝子座の多型部位を標的として調製されており、該ＤＮＡ試料を、同一の基板上に固定されたオリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズさせる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料が、複数人の同一の遺伝子座の多型部位を標的として調製されており、該ＤＮＡ試料を、同一の基板上に固定されたオリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズさせる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法に用いるための基板であって、該任意のＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドが固定された基板。
【請求項９】
請求項６に記載の方法に用いるための基板であって、同一人の複数の異なる遺伝子座の多型部位を標的として調製された、多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料に対し、ハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドフラグメントが固定された基板。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法に用いるための基板であって、複数人の同一の遺伝子座の多型部位を標的として調製された、多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料に対し、ハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドフラグメントが固定された基板。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドフラグメントが、多型の近傍領域の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有している、請求項９または１０に記載の基板。
【請求項１２】
多型がマイクロサテライトである、請求項８から１１のいずれかに記載の基板。
【請求項１３】
基板がガラス板である、請求項８から１２のいずれかに記載の基板。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、質量分析を利用してゲノム上の多型を効率的に同定するためのシステムに関する。
背景技術
ゲノム解析技術の発展に伴い、現在では、ヒト全ゲノム塩基配列が決定されつつある。さらに、決定されたゲノム塩基配列情報を利用して、個々人のゲノム塩基配列の差異、即ち、遺伝多型の決定も盛んに行なわれるようになってきた。遺伝多型の決定は、疾患関連遺伝子、疾患原因遺伝子、ひいては創薬標的遺伝子の特定を可能とするため、近年、医療・診断分野における最も重要な課題の一つとなっている。
これまで遺伝多型を決定する手法としては、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法が用いられてきた。この方法は、ＰＣＲにて増幅した産物に塩基配列特異的な制限酵素を反応させた後、電気泳動にて塩基配列の違いによる切断の有無を分子量の違いとして検出することを原理とする。しかしながら、この方法においては、多型部位を特異的に認識する制限酵素が必ずしも存在するとは限らず、また、対象とするＳＮＰｓにより用いる制限酵素が異なるため、大量のサンプルを扱うにはあまり適していないという問題点が存在する。
また、ＰＣＲ−ＳＳＰＣ（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法も遺伝多型の検出に利用されてきた。１本鎖に変性させたＤＮＡを非変性条件に戻すと、ヘアピンループなどの分子高次構造を形成し、この分子内構造は１塩基の変異によっても大きく影響を受け大きく変化する。この方法は、この構造の違いを非変性条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動で移動度の違いとして検出することを原理とする。しかしながら、この方法においては、その変異のすべてを検出することは困難であり、多型の取りこぼしは避けられず、また、電気泳動時の条件により移動度が変化し、再現性のあるデータを得ることは容易ではないなどの問題点が存在する。
また、自動蛍光シークエンサーを用いた遺伝多型の解析も行なわれてきた。この方法においては、まず、多型マイクロサテライト繰り返し配列を挟んでプライマーを設定し、さらにそのプライマーに蛍光修飾を行なう。次いで、このプライマーを用いてＰＣＲを行ない、得られた産物を自動蛍光シークエンサーにて泳動し、その鎖長を標準ＤＮＡを指標として計測することにより、繰り返し配列の多型を検出する。この方法は、近年、大量のサンプルを処理可能なシークエンサーが開発されて汎用されるに至り、マイクロサテライト多型を検出する有効な手段となっている。しかしながら、この方法では、サンプルの正確な鎖長を特定することは不可能であり、マイクロサテライト繰り返し単位が１塩基、２塩基のものでは多型判定が困難である場合があるなどの問題点が存在する。
一方、質量分析を利用した多型の検出も行なわれるようになった。これまで質量分析は、多数のサンプルが迅速に解析できない、検出されるＤＮＡの分子量の大きさに検出限界があると考えられていたなどの理由により、多型の検出に利用されておらず、主として合成オリゴヌクレオチドの純度検定のために利用されてきた。質量分析を利用した純度検定においては、検体である合成オリゴヌクレオチドをステンレス基板または同等の伝導性を保持する基板に直接マトリックス溶液と共に塗布し乾燥させた上で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ）によりピークを検出していた。
最近になり、ようやく質量分析器を利用した、一塩基置換多型（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）の検出も行なわれるようになった。この方法は、検出したいゲノムフラグメントをｓｉｌｉｃｏｎｅ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｄｅｒｉｖｅｒｔｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎにより基板に固定化した上で、Ｐｒｉｍｅｒ−Ｏｌｉｇｏ　Ｂａｓｅｄ　Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎプライマーによりポリメラーゼ連鎖反応を行い、反応物を質量分析器を用いて検出し、一塩基置換多型を決定するものである（Ｋａｉ　Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．１００１６−１００２０，（１９９９））。
しかしながら、質量分析器を利用した従来の遺伝多型の検出法では、検出したい多型を有するＤＮＡ試料を調製した上で、これを直接基板に塗布させ、分子量の測定を行なうため、これら手法を利用して多くの検体の測定を行なう場合には、多大の時間と労力を必要となるという問題が存在した。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は質量分析器を利用して遺伝多型を効率的に検出し得る方法を提供することにある。本発明は、また、多量の検体の遺伝多型を迅速かつ網羅的に検出しうる方法を提供することをも目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、質量分析器を利用した遺伝多型の検出において、目的の多型を含むゲノムＤＮＡとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを基板に結合させ、この基板にゲノムＤＮＡ試料を適用することにより、基板上で該ＤＮＡ試料から目的の多型を含むゲノムＤＮＡを選別すると共に基板に補足することができ、これにより効率的に標的多型を検出し得ることを見出した。
即ち、従来法においては、予め目的の多型を含むゲノムＤＮＡを選別した上で、これを直接基板に塗布してその多型を検出していたため、多型の検出に多大な時間と労力を必要とした。一方、本発明の方法によれば、基板に目的の多型を含むゲノムＤＮＡとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを結合させているため、ＤＮＡ試料中に目的の多型を含むゲノムＤＮＡ以外のＤＮＡが含まれていても、ハイブリダイゼーション反応により、基板上で目的のＤＮＡを選別でき、それと同時に基板に該ＤＮＡを補足することができる。このため、本発明の方法においては、予め多型を含むゲノムＤＮＡを選別して基盤に塗布する必要がなく、多型の検出を効率的に行うことが可能である。このことは特に多くの検体の多型の検出を行う場合、例えば、数１００人−数１，０００人のサンプル集団について遺伝多型のバリエーションを網羅的に決める場合やある疾患群の疾患相関解析に必要な遺伝マーカー（例えば多型マイクロサテライト）を同定する場合などにおいて有効である。
本発明は、上記知見を基に完成されたものであり、質量分析を利用したＤＮＡの多型の検出において、基板上でのハイブリダイゼーション反応を利用して目的の多型を含むＤＮＡの選別および補足を行なう方法を提供する。
より詳しくは、本発明は、
（１）　ＤＮＡの多型を検出する方法であって、
（ａ）被験者から多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料を調製する工程、
（ｂ）基板に固定したオリゴヌクレオチドフラグメントであって標的多型を含むＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドフラグメントに対し、上記ＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる工程、および
（ｃ）基板に固定したオリゴヌクレオチドフラグメントにハイブリダイズされたＤＮＡを質量分析により検出する工程、を含む方法、
（２）　基板に固定したオリゴヌクレオチドフラグメントが、検出する多型の近傍領域の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有している、（１）に記載の方法、
（３）　工程（ａ）におけるＤＮＡ試料が、（ｉ）多型部位を挟みこむように設計されたプライマー対であって、少なくともその一方が特異的に切断することが可能な部位を含むプライマー対を利用して、被験者由来のゲノムＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行ない、（ｉｉ）これにより得られる増幅産物を、該特異的に切断することが可能な部位で切断し、（ｉｉｉ）切断後の該増幅産物に対し、任意のＤＮＡを付加する、ことにより得られるものであり、工程（ｂ）におけるオリゴヌクレオチドが、該任意のＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドである、（１）に記載の方法、
（４）　特異的に切断することが可能な部位が制限酵素部位である、（３）に記載の方法、
（５）　多型がマイクロサテライトである、（１）から（４）のいずれかに記載の方法、
（６）　多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料が、同一人の複数の異なる遺伝子座の多型部位を標的として調製されており、該ＤＮＡ試料を、同一の基板上に固定されたオリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズさせる、（１）から（５）のいずれかに記載の方法、
（７）　多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料が、複数人の同一の遺伝子座の多型部位を標的として調製されており、該ＤＮＡ試料を、同一の基板上に固定されたオリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズさせる、（１）から（５）のいずれかに記載の方法、
（８）　（３）に記載の方法に用いるための基板であって、該任意のＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドが固定された基板、
（９）　（６）に記載の方法に用いるための基板であって、同一人の複数の異なる遺伝子座の多型部位を標的として調製された、多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料に対し、ハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドフラグメントが固定された基板、
（１０）　（７）に記載の方法に用いるための基板であって、複数人の同一の遺伝子座の多型部位を標的として調製された、多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料に対し、ハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドフラグメントが固定された基板、
（１１）　オリゴヌクレオチドフラグメントが、多型の近傍領域の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能な配列を有している、（９）または（１０）に記載の基板、
（１２）　多型がマイクロサテライトである、（８）から（１１）のいずれかに記載の基板、および
（１３）　基板がガラス板である、（８）から（１２）のいずれかに記載の基板、を提供するものである。
本発明は、質量分析器を利用してＤＮＡの多型を効率的に検出する方法を提供する。本発明の方法においては、まず、被験者から多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料を調製する（工程（ａ））。
本発明の方法において検出し得る多型としては特に制限はない。多型としては、例えば、一塩基置換多型（ＳＮＰ）やマイクロサテライトなどが挙げられるが、広大なゲノム領域を標的とした相関解析においては、特にマイクロサテライトが好適である。マイクロサテライトを利用してヒトの全ゲノム領域をカバーする相関解析を行なう場合には、約３万箇所のマイクロサテライトを利用することができれば目的を達成し得るが、一塩基置換多型の場合には、約数１０万箇所が必要であると考えられる。従って、本発明の方法を利用して広大なゲノム領域を標的とした相関解析を行なう場合には、マイクロサテライトを標的とする方が、検出対象として必要となる多型の数の減少を図ることができるため好適である。
多型部位とその近傍領域を含むＤＮＡ試料は、例えば、以下のようにして被験者から調製することができる。即ち、まず、ヒトゲノム配列からマイクロサテライト繰り返し配列をコンピューターにより検出し、その繰り返し配列を挟んで単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の鎖長が２００ｂｐから３００ｂｐとなるようにプライマーを設定する。次いで、このように設定したプライマーを用いて被験者のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行なうことにより、目的サイズのＤＮＡ試料を得る。
本発明において多型部位の「近傍領域」とは、ゲノムＤＮＡ上で多型部位と隣接する該多型の５’側および３’側のＤＮＡ領域を指す。質量分析器を利用して分析可能なＤＮＡ断片のサイズは、一般に２００ｂｐから３００ｂｐである。従って、本発明においてプライマーを設定して遺伝子増幅を行なう対象とする「多型部位の近傍領域」は、通常、多型部位から３００ｂｐ以内であり、好ましくは２００ｂｐ以内である。
本発明の方法においては、次いで、基板に固定したオリゴヌクレオチドフラグメントであって、標的多型を含むＤＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドフラグメントに対し、上記ＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる（工程（ｂ））。
この工程においては、目的の多型を含むＤＮＡが、ＤＮＡ試料から選別されると同時に基板に補足される。このため目的の多型を含むＤＮＡを予め調製して塗布していた従来法と比較して、格段に労力と時間が削減される。このことは特に多量の検体の多型を検出する場合に顕著である。例えば、複数の多型を標的とする複数のオリゴヌクレオチドがそれぞれ異なるドットとして結合された基板に対し、それぞれの多型を含むＤＮＡの混合物からなるＤＮＡ試料を適用した場合においても、本発明によれば、基板上でそれぞれのオリゴヌクレオチドに対応するＤＮＡが振り分けられる。従って、ハイブリダイズする位置により、該ＤＮＡがどの多型に対応するかを区別することができる。これにより多量の検体の多型を迅速かつ網羅的に検出することが可能となる。
本発明の方法において「基板」とは、オリゴヌクレオチドを固定することが可能な材料であれば特に制限されないが、好ましくは板状の材料である。オリゴヌクレオチドを結合させる基板としては、検出対象となるＤＮＡをイオン化させるため電導性を有するものを用いる。基板としては電導性を有するものであれば特に制限はないが、例えば、電導性の板に固定したガラス板を本発明において好適に用いることができる。好ましい伝導性の板としては、例えば、ステンレス板を例示することができる。ガラス板はポリカルボジイミド等によりコートされているガラス板であることが好ましい。
基板に固定するオリゴヌクレオチドは、標的多型を含むＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドフラグメントであれば特に制限はない。ここで「特異的にハイブリダイズ」とは、ＤＮＡ試料中の標的多型を含むＤＮＡと実質的にハイブリダイズし、他のＤＮＡとは実質的にハイブリダイズしないことを意味する。オリゴヌクレオチドは、好ましくは検出する多型の近傍領域の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、検出する多型の近傍領域の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
基板に固定するオリゴヌクレオチドは１種類に限定する必要はなく、同定したいゲノムフラグメントの領域で相補性を有する複数種のオリゴヌクレオチドの混合物でもよい。本発明の好ましい態様において、基板に固定するオリゴヌクレオチドは、同一人からの遺伝情報を得るように設計することができる。例えば、同一人のマイクロサテライトの多型を同定できるように、多くの多型部位（例えば、１０，０００−３０，０００部位）を標的としたオリゴヌクレオチドを１枚もしくは複数枚の基板上に固定して１セットとして用いることができる。このような同一基板上の複数種のオリゴヌクレオチドに対し、被験者から調製したＤＮＡ試料を同時に適用し、ハイブリダイズさせることにより、同一人の複数の多型を迅速かつ網羅的に検出することが可能となる。従って、基板上に、例えば、複数の疾患に関係する複数の多型を標的としたオリゴヌクレオチドを結合しておけば、被験者が発病するおそれのある、あるいは発病している疾患を簡便に同定することができるため、このような基板は遺伝子診断において特に有用である。
また、本発明の他の好ましい態様において、基板に同一のオリゴヌクレオチドを複数のドットとして結合させることにより、特定の多型に関する複数人のサンプル集団の遺伝情報を迅速かつ網羅的に得ることができる。このような態様は、特に、遺伝多型（例えば、マイクロサテライトやＳＮＰ）を利用して疾患相関解析を行なう上で有効である。
被験者からＤＮＡ試料を調製する際に、多型およびその近傍領域を含むＤＮＡの末端に任意のＤＮＡを付加した場合には、該任意のＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドが固定された基板を利用して目的のＤＮＡの多型を検出することも可能である。この場合、ＤＮＡ試料は、（Ｉ）多型部位を挟みこむように設計されたプライマー対であって、少なくともその一方が特異的に切断することが可能な部位を含むプライマー対を利用して、被験者由来のゲノムＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行ない、（ｉｉ）これにより得られる増幅産物を、該特異的に切断することが可能な部位で切断し、（ｉｉｉ）切断後の該増幅産物に対し、任意のＤＮＡを付加する、ことにより得ることができる。ＤＮＡ試料における特異的に切断することが可能な部位は、好ましくは制限酵素部位である。制限酵素部位としては、ゲノム上で頻度の低いもの、例えば、ＮｏｔＩ部位などが好ましい。切断処理後の増幅産物に付加する任意のＤＮＡとしては、特に制限はないが、例えば、ｐｏｌｙＡ配列を好適に用いることができる。
基板に結合するオリゴヌクレオチドの長さは、一般的には、５塩基から２００塩基であり、好ましくは１０塩基から１３０塩基であり、さらに好ましくは１５塩基から１００塩基である。オリゴヌクレオチドの基板への固定は、化学的または非化学的に行なうことができる。化学的な固定の手法としてはカルボジイミド法（特開２０００−１４６９７８号）を例示することができ、非科学的な固定の手法としてはポリリジン法（Ｐ．Ｏ．Ｂｒｏｗｎ’ｓ　Ｌａｂ．：ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／）を例示することができる。
基板上のオリゴヌクレオチドとＤＮＡ試料とのハイブリダイゼーション反応は、例えば、実施例記載の条件により行なうことができる。但し、ハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドの長さなどの諸要因により変動し得ることは当業者に周知であることを理解されたい。
本発明の方法においては、次いで、基板に固定したオリゴヌクレオチドフラグメントにハイブリダイズされたＤＮＡを質量分析により検出する（工程（ｃ））。
質量分析の方法としては、絶対分子量が得られる方法であれば特に制限はないが、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳが好ましい。ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法））における試料は、多量のマトリックスと均一に混合された状態におかれる。マトリックスは、紫外光である窒素レーザー光（波長＝３３７ｎｍ）を吸収し、熱エネルギーに変換する。この時、マトリックスのごく一部が急速に加熱され、試料と共に気化される。また、ＴＯＦ　ＭＳ（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（飛行時間型質量分析法））は、イオンの電荷量をｚ、イオンの質量をｍとした時に質量電荷比ｍ／ｚ値の違いでイオンの飛行時間が異なることを利用して質量分析を行う。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳは、ＧＰＣやＬＡＬＬＳなどの相対分子量を求める他の質量分析法と異なり、絶対分子量が得られるという特徴を持つ。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳで検出するためのＤＮＡ試料は、事前処理として、非化学的結合による二重鎖を高温（例えば、９０℃）処理および急冷処理を必ずしもする必要性はない。しかしながら、これらの事前処理は検体感度を高め得るために好ましい。質量分析を行なう際には、ＤＮＡがハイブリダイズした基板に対し適当なマトリックス溶液を加え、基板上のＤＮＡを乾固する。
質量分析においては、イオン化された検体（基板上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたＤＮＡ）の分子量に応じて、その飛行時間が異なり、この異なる飛行時間が異なるピーク位置として検出される。分子量が大きいほど飛行時間は短くなり、逆に分子量が小さいほど飛行時間は長くなる。従って、検出されたピーク位置により、検体の分子量を判定することができ、これにより検体の多型（マイクロサテライトの繰り返し数や一塩基置換多型における塩基の種類）を特定することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ガラス板を用いた２００ｂｐ　ｄｓＤＮＡ（ＰＣＲ産物）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定
（１）ＰＣＲ反応
ＰＣＲに用いた反応混合液（ｘ１）は以下の通りである（（）内はｘ１００の場合）。
2002050307.tif 000002
ＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　ＰＥ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、「９５℃で９分」の後、「９６℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で１分」を４０サイクル、その後「７２℃で５分、４℃での終結」で実施した。
（２）ＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔによる精製
得られたＰＣＲ産物を、ＱＩＡＧＥＮ　ＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔプロトコールに従って精製を行った。１本のカラムに対し３００μｌのＰＣＲ産物を通し、ｄＨ２Ｏ　１０μｌを溶出した。
（３）エタノール沈殿
上記ＱＩＡＧＥＮ精製物（６セット分（６０μｌ）＋ｄＨ２Ｏ　２４０μｌ）３００．０μｌに、１０Ｍ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　４６．９μｌ、１００％エタノール７５０．０μｌ、グリコーゲン０．５μｌを添加し、エタノール沈殿を行った。−２０℃で２０分静置し、１２，０００ｒｐｍで１５分遠心し、得られた沈殿を７０％エタノールでリンスし、さらに１２，０００ｒｐｍで１５分遠心し、１０分乾燥を行い、最終的にｄＨ２Ｏ　１５μｌにて溶出した。
（４）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｋｉｔによる定量
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）プロトコールに従って定量を行った。
（５）マトリックスと混合
ステンレス板（サンプルスライド）にスライドガラス（Ｃｏｄｅ．＃０００：厚さ０．０４ｍｍ）を両面テープで固定した。
また、５０％アセトニトリル１ｍｌ中に、３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｉｃｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）：Ｍｗ．１３９．１１　０．７Ｍを０．０９７４ｇ、Ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｃｉｔｒａｔｅ：Ｍｗ．２２６．２　０．０７Ｍを０．０１０５８３ｇを溶かし、マトリックスを調製した。
マトリックスとサンプルを１：１で混合し、ガラス上へ０．５μｌスポットした。サンプルスライドは、自然乾燥後（結晶化）、質量分析器に導入し測定した。
（６）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
測定は、ＫＲＡＴＯＳ　ＫＯＭＰＡＣＴ　ＭＡＬＤＩ　４（島津）を用いて行った。ＫＯＭＰＡＣＴ　ＭＡＬＤＩ　４の測定条件を以下に示す。
2002050307.tif 000003
測定の結果、２００ｂｐという高分子量のＤＮＡ分子について、顕著な高分解能を示すピークが得られた（図１）。このことは、一般的に不適と考えられていた、絶縁体であるガラス板を用いた質量分析が十分に適用可能であることを示している。それと同時に、ガラス板上でハイブリダイズさせたＤＮＡサンプルについて、その状態のままで直接質量分析を行うことが可能であることを示唆するものである。
［実施例２］ステンレス板上でハイブリダイゼーションしたＤＮＡ分子の質量分析
（１）核酸の固定
ステンレス板（ステンレス板；ＫＲＡＴＯＳ　ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ（株）社製）を、特開２０００−１４６９７８の方法に準じてカルボジイミド化した。
配列番号：１（計算値；分子量７５８３）及び配列番号：２（計算値；分子量７６３８）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、１００ｐｍｏｌ／μｌになるようにバッファーに溶解しＤＮＡ溶液とした。ピペットマンを用いて、カルボジイミド化ステンレス板の所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液を１μｌスポットした。
次いで、３７℃にて３０分間乾燥を行なった後、３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む緩衝液Ａ（０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．０５％トライトンＸ−１００）に浸し、３７℃にて１５分間乾燥した。次に、このカルボジイミド化ステンレス板をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．２）／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で洗浄後、３７℃にて１５分間乾燥した。
（２）ハイブリダイゼーション
上記カルボジイミド化ステンレス板のＤＮＡを固定した部分に、ハイブリダイゼーション溶液［５×ＳＳＣ（ＳＳＣ：１．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）、１０％デキストラン、配列番号：３（計算値；分子量６１９０）のプローブ］２５μｌをのせ、４０℃のウォーターバスで１晩加熱した。
（３）ポストハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションの後、カルボジイミド化ステンレス板からハイブリダイゼーション溶液を軽く吸い取り、ポストハイブリダイゼーション洗浄を行ない、非特異的に吸着したプローブを除去した。
ポストハイブリダイゼーション洗浄条件は、（Ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；室温５分間、２回、（ｉｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；４０℃、５分間、２回、（ｉｉｉ）２×ＳＳＣ；室温、５分間、（ｉｖ）０．３Ｍクエン酸アンモニウム水溶液；室温、１５秒を採用した。
（４）ハイブリダイゼーションの検出
得られたカルボジイミド化ステンレス板をＫＯＭＰＡＣＴ　ＭＡＬＤＩ２（（株）島津製作所社製）を用いて測定した。その結果を図２及び図３に示す。
図２及び図３の結果から、本発明の核酸の検出方法によれば、プローブ核酸を（実測値；分子量６１８５の位置に）非常に明瞭なシグナルとして特異的に得ることができる。一方、配列番号：２のスポットからは、シグナルを検出できなかった。
［実施例３］カバーガラス上でハイブリダイゼージョンしたＤＮＡ分子の質量分析
（１）核酸の固定（図４）
カバーガラス＃０００（松浪ガラス（株）社製）を、特開２０００−１４６９７８の方法に準じてカルボジイミド化した。
配列番号：４（Ｃａｐｔｕｒｅオリゴマー）及び配列番号：５（陰性対照）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、１２０ｐｍｏｌ／μｌになるようにバッファーに溶解しＤＮＡ溶液とした。ピペットマンを用いて、カルボジイミド化カバーガラスの所定の位置に、前記ＤＮＡ溶液及びバッファーを０．５μｌスポットした。
次いで、固定操作を行なった後、３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む緩衝液Ａ（０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍとリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．０５％トライトンＸ−１００）に浸し、３７℃にて１５分間乾燥した。次に、このカルボジイミド化カバーガラスをＴＥ緩衝液（１０ｍＭとリス塩酸（ｐＨ７．２）／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で洗浄後、３７℃にて１５分聞乾燥した。オリゴヌクレオチド無添加（ＤＮＡ（−））も対照として用いた。
（２）ハイブリダイゼーション
上記カルボジイミド化カバーガラスのＤＮＡを固定した部分に、ハイブリダイゼーション溶液［５×ＳＳＣ（ＳＳＣ：１．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）、１０％デキストラン、配列番号：６または配列番号：７のプローブ］１０μｌをのせ、３０℃の乾燥機で１晩加熱した。
（３）ポストハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションの後、カルボジイミド化カバーガラスからハイブリダイゼーション溶液を軽く吸い取り、以下の条件でポストハイブリダイゼーション洗浄を行なった。
ポストハイブリダイゼーション洗浄条件は、（Ｉ）２×ＳＳＣ；室温５分間、（ｉｉ）０．３Ｍクエン酸アンモニウム水溶液；室温、１５秒を採用した。
（４）ハイブリダイゼーションの検出
得られたカルボジイミド化ガラス板を「ＫＯＭＰＡＣＴ　ＭＡＬＤＩ４（（株）島津製作所社製）」を用いて測定した。質量分析の結果を図５に示す。相補的配列をもつ試料ではピークが観察された。このことからガラス板上でハイブリダイズさせた試料でもＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳで測定可能であることが判明した。
なお、測定におけるマトリックスは、５０％アセトニトリル１ｍｌ中に、３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｉｃｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）：Ｍｗ．１３９．１１　０．７Ｍを０．０９７４ｇ、Ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｃｉｔｒａｔｅ：Ｍｗ．２２６．２　０．０７Ｍを０．０１０５８３ｇを溶かし、調製した。
また、ＫＯＭＰＡＣＴ　ＭＡＬＤＩ　４の測定条件を以下に示す。
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産業上の利用の可能性
本発明により質量分析器を利用して遺伝多型を効率的検出し得る方法が提供され、これにより多検体の遺伝多型を迅速かつ網羅的に検出することが可能となった。本発明の方法は、特定の病気の原因となる多型を決定するための疾患相関解析や遺伝子診断に大きく貢献しうるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ガラス板を用いた２００ｂｐ　ｄｓＤＮＡ（ＰＣＲ産物）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定の結果を示す図である。
図２は、ステンレス板を基板として配列番号：１のオリゴヌクレオチドを固定したときのハイブリダイゼーションシグナルを示す図である。
図３は、ステンレス板を基板として配列番号：２のオリゴヌクレオチドを固定したときのハイブリダイゼーションシグナルを示す図である。
図４は、ステンレス版であるサンプルスライドへのカバーガラスの固定を示す図である。
図５は、ガラス板を基板として配列番号：４または５（陰性対照）のオリゴヌクレオチドを固定したときのハイブリダイゼーションシグナルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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