(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料を、上部に解放された開口を有する試料液溜め(101)、前記血液試料が流れるとともに前記試料液溜め(101)に一端が接続された血球が粘着する素材から成るフローセル(102)および前記フローセル(102)の他端に接続された吸引口(103)を含むチャンバー(1)の前記試料液溜めに導入し、吸引手段(2)によって前記吸引口(103)から吸引して前記血液試料を前記フローセル(102)に流すことにより前記血液試料中の血球を前記フローセル(102)内で粘着凝集させ、前記血球の粘着および凝集を光学的に測定することを特徴とする血球粘着凝集能の測定方法。
【請求項２】
前記チャンバー(1)が、試料液溜め(101)と吸引口(103)を有する透明部材を、フローチャネルの形状に開口(22)を有するスペーサー(24)を介して、透明平板(25)に密着させて構成され、前記スペーサー(24)は、前記フローセル(102)の光学測定に適するように光吸収性の素材から成る請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記チャンバー(1)に、前記の試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)が複数設けられている請求項１または２記載の測定方法。
【請求項４】
血球が粘着する透明の素材から成る１枚の透明平板(25)により前記複数のフローセル(102)の底面が構成される請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
前記チャンバー(1)が使い捨て部材で構成される請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項６】
前記チャンバーを自動交換することを含む請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
前記血液試料を前記フローセル(102)に流す前に、前記血液試料中において進行する反応に影響を与える物質を含む試薬液を前記血液試料に加えることを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項８】
前記フローセル(102)内で血球を粘着凝集させた後に、血球の固定染色のための試薬を、定められた時間間隔と順番で前記試料液溜め(101)に導入し、前記フローセル(102)に流すことを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項９】
上部に解放された開口を有する試料液溜め(101)、前記血液試料が流れるとともに前記試料液溜め(101)に一端が接続された血球が粘着する素材から成るフローセル(102)および前記フローセル(102)の他端に接続された吸引口(103)を含むチャンバー(1)と、
前記試料液溜め(101)に導入された血液試料を前記フローセル(102)に流すために前記吸引口(103)に接続された吸引手段(2)と、
前記フローセル(102)内で粘着凝集した血球の粘着および凝集を光学的に測定する光学的測定手段(3)と
を備える血球の粘着凝集能の測定装置。
【請求項１０】
前記チャンバー(1)が、試料液溜め(101)と吸引口(103)を有する透明部材を、フローチャネルの形状に開口(22)を有するスペーサー(24)を介して、透明平板(25)に密着させて構成され、前記スペーサー(24)は、前記フローセルの光学測定に適するように光吸収性の素材から成る請求項９に記載の測定装置。
【請求項１１】
前記チャンバー(1)に、前記の試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)が複数設けられている請求項９または１０記載の測定装置。
【請求項１２】
血球が粘着する透明の素材から成る１枚の透明平板(25)により前記複数のフローセル(102)の底面が構成される請求項１１記載の測定装置。
【請求項１３】
前記チャンバー(1)が使い捨て部材で構成される請求項９〜１２のいずれか１項に記載の測定装置。
【請求項１４】
前記チャンバーを自動交換する手段を含む請求項１３に記載の測定装置。
【請求項１５】
一種以上の試薬を前記試料液溜め(101)に導入する導入手段(21)を含む請求項９〜１４のいずれか１項に記載の測定装置。
【請求項１６】
前記導入手段(21)が、前記試薬の導入の時間間隔と順番とをプログラムできるものである請求項１５に記載の測定装置。
【請求項１７】
前記試薬が、血球の固定染色のための試薬、および、前記血液試料中において進行する反応に影響を与える物質から成る群から選ばれる１種以上である請求項１５または１６に記載の測定装置。
【請求項１８】
使用時に上部に解放される開口を有する試料液溜め(101)、前記血液試料が流れるとともに前記試料液溜め(101)に一端が接続された血球が粘着する素材から成るフローセル(102)および前記フローセル(102)の他端に接続された吸引口(103)を含み、前記の試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)が複数設けられているチャンバー(1)。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血球が粘着する素材から成る管状のフローセル中に血液を流し、素材に粘着した血球と凝集した血球を独立して測定することにより、血球の粘着凝集能を測定する方法と、この方法を実施するための測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血球の粘着の測定方法については、血小板が粘着する素材から成るビーズを詰めた管（ビーズカラム）中に血液試料を流し、ビーズカラムの前後で血小板数を計測し、その数の差から粘着した血小板数を求める方法が、ビーズカラム法として知られている。また、平行板フローチャンバー(parallel-plate flow chamber)内に血液試料を流し、血小板や白血球などの粘着と凝集を測定する平行板フローチャンバー法が、1987年、Sakariassen K.S.らによって報告されている（J. Lab. Clin. Med., 102, 522-535）。
【０００３】
ビーズカラム法には、ビーズカラム内で血球の粘着と凝集が同時に生じるため、ビーズカラムの前後の血小板数の差からは、凝集と粘着を独立して測定できないという問題がある。平行板フローチャンバー法は、この問題点を解決する手段の一つであり、粘着と凝集とを独立して測定できる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の平行板フローチャンバー法には以下のような改良すべき問題がある。
１）血液を注射筒やペリスタティックポンプなどによりフローチャンバー内に注入するため、チューブ連結が必要であり、測定実施者が血液に接触する機会が多く、バイオハザードを避けるのに十分でないことがある。
２）血球が注射筒やチューブ内で変化を受け、より生理学的状態に近い血球粘着凝集能を測定できない。そのため、特別な処理が必要とされることがある。例えば、血小板は注射筒やチューブの壁面で活性化されやすいため、注射筒やチューブの壁面をシリコーンなどで処理する必要がある。
３）血球の粘着凝集過程に影響を及ぼす物質を血液に加え、それらの物質の作用を調べる際に、予めそれらの物質を添加した血液を注射筒に入れておく必要がある。従って、種々の物質を逐次加えて測定する操作が極めて煩雑である。
４）平板に粘着凝集した血球を顕微鏡で観察するが、その際、洗浄、固定、染色などの血球の固定染色に必要な複雑な操作を測定施行者が行わなくてはならない。
【０００５】
従って、本発明の目的は、好適なバイオハザードの防止環境下に血球の粘着と凝集とを独立して測定する方法と、この測定方法を実施するための、取り扱い及び自動化が容易な測定装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究した結果、特定の形状のチャンバーと吸引手段を組み合わせることにより、上記課題を解決できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の第１の要旨は、血液試料を、上部に解放された開口を有する試料液溜め、前記血液試料が流れるとともに前記試料液溜めに一端が接続された血球が粘着する素材から成るフローセルおよび前記フローセルの他端に接続された吸引口を含むチャンバーの前記試料液溜めに導入し、吸引手段によって前記吸引口から吸引して前記血液試料を前記フローセルに流すことにより前記血液試料中の血球を前記フローセル内で粘着凝集させ、前記血球の粘着および凝集を光学的に測定することを特徴とする血球粘着凝集能の測定方法（以下、本発明方法ともいう）に存する。
【０００８】
前記チャンバーは、試料液溜めと吸引口を有する透明部材を、フローチャネルの形状に開口を有するスペーサーを介して、透明平板に密着させて構成され、前記スペーサーは、前記フローセルの光学測定に適するように光吸収性の素材から成っていてもよい。
【０００９】
前記チャンバーには、前記の試料液溜め、フローセルおよび吸引口が複数設けられていることが好ましい。複数のフローセルの底面を血球が粘着する透明の素材から成る１枚の透明平板により構成してもよい。
【００１０】
前記チャンバーは使い捨て部材で構成されていることが好ましい。本発明方法は、好ましくは、このチャンバーを自動交換する工程を含む。
本発明方法は、好ましくは、前記血液試料を前記フローセルに流す前に、前記血液試料中において進行する反応に影響を与える物質を前記血液試料に加える工程を含む。
【００１１】
また、本発明方法は、好ましくは、前記フローセル内で血球を粘着凝集させた後に、血球の固定染色のための試薬を、定められた時間間隔と順番で前記試料液溜めに導入し、前記フローセルに流す工程を含む。
【００１２】
本発明の第２の要旨は、上部に解放された開口を有する試料液溜め、前記血液試料が流れるとともに前記試料液溜めに一端が接続された血球が粘着する素材から成るフローセルおよび前記フローセルの他端に接続された吸引口を含むチャンバーと、
前記試料液溜めに導入された血液試料を前記フローセルに流すために前記吸引口に接続された吸引手段と、
前記フローセル内で粘着凝集した血球の粘着および凝集を光学的に測定する光学的測定手段と
を備える血球の粘着凝集能の測定装置（以下、本発明装置ともいう）に存する。
【００１３】
前記チャンバーは、試料液溜めと吸引口を有する透明部材を、フローチャネルの形状に開口を有するスペーサーを介して、透明平板に密着させて構成され、前記スペーサーは、前記フローセルの光学測定に適するように光吸収性の素材から成っていてもよい。
【００１４】
前記チャンバーには、前記の試料液溜め、フローセルおよび吸引口が複数設けられていることが好ましい。複数のフローセルの底面を血球が粘着する透明の素材から成る１枚の透明平板により構成してもよい。
【００１５】
前記チャンバーは使い捨て部材で構成されていることが好ましい。本発明装置は、好ましくは、このチャンバーを自動交換する手段を含む。
本発明装置は、一種以上の試薬を前記試料液溜めに導入する導入手段を含むことが好ましい。この導入手段は、前記試薬の導入の時間間隔と順番とをプログラムできるものであることが好ましい。前記試薬は、血球の固定染色のための試薬、および、前記血液試料中において進行する反応に影響を与える物質から成る群から好ましくは選ばれる。
【００１６】
本発明の第３の要旨は、上記測定方法および測定装置において使用されるチャンバーであって、使用時に上部に解放される開口を有する試料液溜め、前記血液試料が流れるとともに前記試料液溜めに一端が接続された血球が粘着する素材から成るフローセルおよび前記フローセルの他端に接続された吸引口を含み、前記の試料液溜め、フローセルおよび吸引口が複数設けられているチャンバー（以下、本発明チャンバーともいう）に存する。
【００１７】
本発明の本質的な利点は、特定の形状のチャンバーと吸引手段を組み合わせたことにより、注射筒やペリスタティックポンプ用チューブを用いずに血液試料を扱うことができるとともに測定の自動化が容易になるので、測定実施者が血液試料に直接触れる可能性が極めて低くなり、好適なバイオハザード防止環境が保たれることである。すなわち、測定実施者は、採血した血液試料に触れることなく、自動化された装置により測定を行うことができ、さらには、チャンバーを使い捨て部材にすることにより、血液感染の危険を無くし、好適なバイオハザード防止環境を保つことが可能である。
【００１８】
本発明の別の利点は、生理学的に生体内の環境に近い状態での血球粘着測定能を測定できることである。すなわち、血液試料が入る試料液溜めがフローセルの近傍に配置されることにより、血球が注射筒やチューブの壁面で活性化されることが無く、より生体内の環境に近い状態での血球の粘着凝集能を測定できる。
【００１９】
本発明のさらに別の利点は、血球の粘着凝集過程に影響を及ぼす物質の作用を容易に調べることができることである。すなわち、試料液溜めは上部に解放された開口を有するので、種々の物質またはその溶液を自動ピペッティング操作などにより任意に試料液溜めに添加することでき、従って、物質の作用を容易に調べることができる。
【００２０】
本発明のさらに別の利点は、フローセル内に粘着凝集した血球を観察するための、洗浄、固定、染色などの複雑な操作が容易にできることである。すなわち、試料液溜めは上部に解放された開口を有し、且つ、吸引手段によって試薬液等をフローセルに流すので、自動ピペッティング操作などにより試料液溜めに洗浄液、固定液、染色液などの血球の固定染色のための試薬を含む試薬液を順次導入し、フローセル中を灌流させることにより、一連の操作を自動化することが容易である。
【００２１】
本発明の測定方法および測定装置は、例えば、血栓症患者の血小板機能検査や手術時における血液凝固能の検査に有利に適用される。例えば、コンピュータの制御の下に、一定の間隔例えば10分間隔で自動的に測定を行い、血小板などの血球の粘着凝集能の低下や亢進の程度を調べることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明方法、本発明装置、本発明チャンバーの順に説明する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、血液試料を、上部に解放された開口を有する試料液溜め、血液試料が流れるとともに試料液溜めに一端が接続された血球が粘着する素材から成るフローセルおよびフローセルの他端に接続された吸引口を含むチャンバーの試料液溜めに導入する第１工程、吸引手段によって吸引口から吸引して血液試料をフローセルに流すことにより血液試料中の血球をフローセル内で粘着凝集させる第２工程、および、血球の粘着および凝集を光学的に測定する第３工程を含む血球の粘着凝集能を測定する方法である。
【００２３】
第１工程において使用されるチャンバーは、試料液溜め、フローセルおよび吸引口を含む。試料液溜めは、上部に解放された開口を有する。フローセルは、血球が粘着する素材、例えば無色透明の基材の血液試料に接触する表面の全部または一部にコラーゲン、フィブロネクチンなどの血球粘着物質を均一にコーティングした物から成る。この素材では少なくとも血球の粘着凝集を測定する面が血球粘着物質によってコーティングされている。また、フローセルは、管状の空間を有し、その一端が試料液溜めに接続され、血液試料がその内部を流れる。フローセルの管状の空間は、例えばその幅を連続的に変化させることによって断面積を連続的に変化させてもよい。このようにすることによって、連続的に変化するずり応力を負荷することができる。すなわち、ずりの大きさによって血小板などの血球の粘着・凝集は増大するため、一つのフローセルで測定するだけで、低いずり応力（フローセルの幅が広い）から高いずり応力（フローセルの幅が狭い）までの連続した条件下での粘着・凝集を同時に測定できる。
【００２４】
吸引口はフローセルの他端に接続され、この吸引口に吸引手段が接続される。
チャンバーは、３部材の組立物であってもよい。すなわち、試料液溜めと吸引口を有する透明部材を、フローチャネルの形状に開口を有するスペーサーを介して、透明平板に密着させて構成してもよい。スペーサーは、フローセルの光学測定に適するように光吸収性の素材から成っていてもよい。
【００２５】
チャンバーには、試料液溜め、フローセルおよび吸引口が複数設けられていることが好ましい。複数のフローセルの底面を血球が粘着する透明の素材から成る１枚の透明平板により構成してもよい。
【００２６】
チャンバーは使い捨て部材で構成されていることが好ましい。
第１工程では、血液試料を試料液溜めの開口から試料液溜めに導入する。導入手段としては、自動ピペットが挙げられる。自動ピペットの先端チップは使い捨て部材とすることが好ましい。複数の試料溜めを設けたチャンバーを使用するときには、複数の自動ピペットを用いることが好ましい。
【００２７】
血液試料は、被験者から採取した試料をそのまま用いてもよいし、必要により前処理をおこなってもよい。粘着凝集能を測定する血球は、通常、血小板である。
【００２８】
第２工程では、吸引口に接続された吸引手段によって血液試料がフローセルに流される。血液試料がフローセル内を流れることによって、血液試料中の血球がフローセル内で粘着凝集する。
【００２９】
吸引手段は、例えば、吸引口に適合した吸引ノズルとピストンシリンダーを備えており、ピストンシリンダーの動作により吸引を行う。好ましくは吸引ノズルとピストンシリンダーの間に廃液溜めを設け、吸引した試料等を廃液溜めに貯留する。
【００３０】
血液試料をフローセル内に流す時の流速は、フローセルのサイズ、測定対象の血球の種類などにより、適宜選択される。血液試料およびフローセルの温度は適宜選択されるが、通常には３７℃である。
【００３１】
第３工程では、粘着凝集した血球の粘着と凝集を独立して測定する。この測定は、公知の方法によって行うことができる。この方法としては、顕微鏡などの光学装置を介して粘着凝集した血球の画像をカメラなどの撮影手段により撮影し、撮影された画像から、画像解析ソフトにより粘着した血球数と血球の凝集塊数を算出する方法が挙げられる。
【００３２】
また、フローセルの表面（フローセルが水平に配置される場合、通常には底面）にコヒーレント光を照射し、その散乱光を解析する方法が挙げられる。具体的には、フローセルにレーザ光を照射し、フローセルの表面に粘着凝集した血球からの散乱光の強度分布（回折パターン）をＣＣＤカメラまたはフォトダイオードアレイなどの散乱光測定装置により測定することにより、血球の粘着凝集能を測定する。この場合、粘着している血球数は散乱光の強度分布のピーク値と正の相関にあり、凝集塊数と粘着数との比は強度分布の半値幅と負の相関にあるため、両者の関数から血球の粘着と凝集を独立して求めることができる。
【００３３】
本発明方法は、好ましくは、チャンバーを自動交換する工程を含む。チャンバーの自動交換は、チャンバー搬送駆動装置によって行うことができる。
本発明方法は、好ましくは、血液試料をフローセルに流す前に、血液試料中において進行する反応に影響を与える物質を血液試料に加える工程を含む。この物質は、必要により溶液の形態にして加えられる。溶媒は、物質の種類により適宜選択される。反応に影響を与える物質の例としては、血小板の場合には、RGDSなどの血小板の凝集を抑制する物質、プロスタグランジンなどの血小板の粘着と凝集を抑制する物質などが挙げられる。この物質の血液試料への添加は自動ピペットなどの導入手段によって行うことができる。
【００３４】
また、本発明方法は、好ましくは、フローセル内で血球を粘着凝集させた後に、血球の固定染色のための試薬を、定められた時間間隔と順番で試料液溜めに導入し、フローセルに流す工程を含む。血球の固定染色のための試薬とは、固定化剤、色素、標識抗体などの通常に血球の固定染色に使用される試薬である。これらの試薬は、必要により溶液の形態にして導入される。血球の固定染色に有効な試薬の組み合わせ、使用量などの条件は、適宜決定される。これらの試薬の導入は、自動ピペットなどの導入手段により行うことができる。
【００３５】
上記の導入手段、吸引手段、光学的測定手段などの操作は、パーソナルコンピュータなどにより連係させて制御することが好ましい。
【００３６】
＜２＞本発明装置
図１の本発明装置の概略図および図２の本発明装置の実施態様を示す図を参照して説明する。
【００３７】
本発明装置は、チャンバー(1)と、吸引手段(2)と、光学的測定手段とを備える。また、必要により導入手段(21)も備える。
チャンバー(1)は、試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)を含む（図３）。試料液溜め(101)は、上部に解放された開口を有する。フローセル(102)は、血球が粘着する素材、例えば無色透明の基材の血液試料に接触する表面の全部または一部にコラーゲン、フィブロネクチンなどの血球粘着物質を均一にコーティングした物から成る。この素材では少なくとも血球の粘着凝集を測定する面が血球粘着物質によってコーティングされている。また、フローセル(102)は、管状の空間を有し、その一端が試料液溜め(101)に接続され、血液試料がその内部を流れる。フローセル(102)の管状の空間は、例えばその幅を連続的に変化させることによって断面積を連続的に変化させてもよい。フローセル(102)の粘着凝集した血球を測定する表面は血球粘着物質を均一にコーティングした面であり、平面であることが好ましい。吸引口(103)はフローセル(102)の他端に接続され、この吸引口(103)に吸引手段(2)が接続される。
【００３８】
チャンバー(1)は、図４に示されるように、３部材の組立物であってもよい。すなわち、試料液溜め(101)と吸引口(103)を有する透明部材を、フローチャネルの形状に開口(22)を有するスペーサー(24)を介して、透明平板(25)に密着させて構成してもよい。スペーサー(24)は、フローセル(102)の光学測定に適するように光吸収性の素材から成っていてもよい。
【００３９】
チャンバー(1)には、試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)が複数設けられていることが好ましい。また、血球が粘着する透明の素材から成る１枚の透明平板(25)により複数のフローセルの底面を構成してもよい。
【００４０】
チャンバー(1)は使い捨て部材で構成されていることが好ましい。
チャンバー(1)における、試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)の配置は、試料液溜めの開口が上部に解放されている限り任意である。例えば、フローセル(102)を垂直に配置してもよい（図５）。
【００４１】
チャンバーの各部のサイズは、測定すべき血液試料の容量および種類などや、光学的測定手段(3)および吸引手段(2)などに適合するように適宜設定される。
吸引手段(2)は、試料液溜め(101)に導入された血液試料をフローセル(102)に流すために吸引口(103)に接続される。
【００４２】
吸引手段(2)は、吸引口(103)に接続され、試料液溜め(101)中の血液試料等をフローセル(102)を通して吸引する。血液試料等とは、血液試料、血液試料中において進行する反応に影響を与える物質を含む試薬液、および、洗浄液、固定液、染色液などの、固定染色用試薬を含む試薬液などである。吸引手段(2)は、例えば、吸引口(103)に適合した吸引ノズル(7)とピストンシリンダー(4)を備えており、ピストン駆動装置(19)によりピストンシリンダー(4)を動作させ吸引を行う。好ましくは、吸引ノズル(7)とピストンシリンダー(4)の間に廃液溜め(11)を設け、吸引した試料等を廃液溜め(11)に貯留する。廃液溜め(11)には、廃液バルブ(13)を介し、廃液タンク(12)を接続してもよい。廃液溜め(11)に一定量を超えて貯留された、吸引された血液試料等は、廃液バルブ(13)を介して廃液タンク(12)に移され貯蔵される。この廃液タンク(12)は使い捨て部材にすることが好ましい。また、吸引ノズル駆動装置(8)を設け、吸引ノズル(7)を可動にし、吸引口(103)と吸引ノズル(7)の接続を自動的に行えるようにすることによってチャンバー(1)の交換操作を容易にすることが好ましい。試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)を複数設けたチャンバー(1)を使用する場合には、吸引ノズル(7)、ピストンシリンダー(4)などを複数設けることが好ましい。
【００４３】
光学的測定手段(3)は、フローセル(102)内で粘着凝集した血球の粘着および凝集を光学的に測定する。血球の粘着および凝集を独立して光学的に測定する手段は、公知のものを使用できる。この手段は、例えば、顕微鏡などの光学装置(14)と、該光学装置(14)を介して粘着凝集した血球の画像を撮影する、カメラなどの撮影装置(15)、撮影装置(15)によって撮影された画像を格納する画像メモリー(16)、および、画像メモリー(16)に格納された画像から、画像解析ソフトにより粘着した血球数と血球の凝集塊数とを独立して算出するコンピュータ(20)を含む。また、フローセル(102)の表面（フローセルが水平に配置される場合、通常には底面）にコヒーレント光を照射し、その散乱光を解析する手段も挙げられる。この手段は、具体的には、コヒーレント光を照射するレーザ光源(41)、ＣＣＤカメラやフォトダイオードアレイなどの散乱光測定装置(44)、および、コヒーレント光をフローセル(102)に、散乱光を散乱光測定装置(44)に導くレンズ(43a,43b,43c)を含む。
【００４４】
導入手段(21)としては、公知の手段が使用できる。通常には、自動ピペット(5)および自動ピペット(5)を駆動する自動ピペット駆動装置(17)が使用される。試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)を複数設けたチャンバー(1)を使用する場合には、自動ピペット(5)を複数設けることが好ましい。自動ピペットの先端チップは使い捨て部材にすることが好ましい。
【００４５】
本発明装置は、さらにチャンバー搬送駆動装置(18)を含むことが好ましい。チャンバー搬送駆動装置(18)は、チャンバー(1)の自動交換および／または移動を行う。特に、試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)を複数設けたチャンバー(1)を使用する場合には、チャンバー(1)を一定位置に逐次移動させ、導入手段(21)による血液試料などの導入および吸引手段(2)による吸引、ならびに、光学的測定手段(3)による測定を順次行えるようにする。
【００４６】
また、本発明装置は、さらにコンピュータ(20)を含むことが好ましい。コンピュータ(20)は、自動ピペット駆動装置(17)、チャンバー搬送駆動装置(18)、ピストン駆動装置(19)のいずれかまたは全てに接続され、これらの装置を制御する。このコンピュータ(20)は、画像メモリー(16)に格納された画像から、画像解析ソフトにより粘着した血球数と血球の凝集塊数とを独立して算出するコンピュータ(20)と同一であることがハード資源の効率の観点から好ましいが、別のコンピュータとしてもよい。
【００４７】
また、本発明装置は、血液試料等および／またはチャンバー(1)を所定温度に保つ保温装置を備えていてもよい。
次に、本発明装置の一例の動作について説明する。
【００４８】
採血された血液試料(6)から、自動ピペット駆動装置(17)により駆動される自動ピペット(5)により一定量が採取され、チャンバー(1)の試料液溜め(101)に注入される。続いて、血球の粘着凝集過程に影響を及ぼす物質を含む試薬液(9)から自動ピペット(5)により一定量が採取され、血液試料が入れられた試料液溜め(101)に添加される。吸引ノズル駆動装置(8)により吸引ノズル(7)が吸引口(103)に装着され、続いて、ピストン駆動装置(19)によりピストンシリンダー(4)が一定速度で作動して試料液溜め(101)の血液試料を吸引し、フローセル(102)内に血液試料を一定速度で灌流させる。これによって、フローセル(102)内に血球を粘着凝集させる。血液試料の灌流が終了した後、フローセル(102)内に粘着凝集した血球を、固定、染色するために、洗浄液、固定液、染色液などの固定染色用試薬液(10)が逐次、自動ピペット(5)により採取され、試料液溜め(101)に注入され、ピストンシリンダー(4)により吸引されてフローセル(102)内に灌流される。吸引後の血液試料等は、廃液溜め(11)に貯留され、一定量を超えると廃液バルブ(13)が開き廃液タンク(12)に移され貯蔵される。フローセル(102)の底面に粘着凝集した血球の画像を光学装置(14)を介して撮影装置(15)で撮影する。撮影された画像から、画像メモリー(16)に格納され、その格納された画像からコンピュータ(20)にインストールされた画像解析ソフトにより粘着した血球数と、血球の凝集塊の数が各々算出される。
【００４９】
光学的測定手段に散乱光を解析する手段を用いた場合には、フローセルにレーザ光を照射し、フローセルの表面に粘着凝集した血球からの散乱光の強度分布をＣＣＤカメラまたはフォトダイオードアレイにより測定することにより、血球の粘着凝集能を測定する。この場合、粘着している血球数は散乱光の強度分布のピーク値と正の相関にあり、凝集塊数と粘着数との比は強度分布の半値幅と負の相関にあるため、両者の関数から血球の粘着と凝集を独立して求めることができる。
【００５０】
チャンバー搬送駆動装置(18)は、チャンバー(1)の交換を行う。また、チャンバー(1)が複数のフローセル(102)を有する場合には、チャンバー搬送駆動装置(18)によりチャンバー(1)が一定位置に逐次移動し、上記一連の操作が自動的に実施される。コンピュータ(20)は、血液試料等の導入、吸引、光学的測定、チャンバーの搬送および交換などの一連の操作を制御する。保温装置は、血液試料(6)およびチャンバー(1)の温度を所定温度（例えば３７℃）に保つ。
【００５１】
＜３＞本発明チャンバー
本発明チャンバーは、上記測定方法および測定装置において使用されるチャンバーであって、使用時に上部に解放される開口を有する試料液溜め(101)、血液試料が流れるとともに試料液溜め(101)に一端が接続された血球が粘着する素材から成るフローセル(102)およびフローセル(102)の他端に接続された吸引口(103)を含み、試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)が複数設けられているチャンバー(1)である。
【００５２】
フローセル(102)は、血球が粘着する素材、例えば無色透明の基材の血液試料に接触する表面の全部または一部にコラーゲン、フィブロネクチンなどの血球粘着物質を均一にコーティングした物から成る。この素材では少なくとも血球の粘着凝集を測定する面が血球粘着物質によってコーティングされている。また、フローセル(102)は、管状の空間を有し、その一端が試料液溜め(101)に接続され、血液試料がその内部を流れる。フローセル(102)の管状の空間は、例えばその幅を連続的に変化させることによって断面積を連続的に変化させてもよい。フローセル(102)の粘着凝集した血球を測定する表面は血球粘着物質を均一にコーティングした面であり、平面であることが好ましい。吸引口(103)はフローセル(102)の他端に接続され、この吸引口(103)は吸引手段(2)に接続するのに適合している。
【００５３】
チャンバー(1)は、３部材の組立物であってもよい。すなわち、複数の試料液溜め(101)と吸引口(103)を有する透明部材を、フローチャネルの形状に複数の開口(22)を有するスペーサー(24)を介して、透明平板(25)に密着させて構成してもよい。スペーサー(24)は、フローセル(102)の光学測定に適するように光吸収性の素材から成っていてもよい。
【００５４】
チャンバー(1)は使い捨て部材で構成されていることが好ましい。
チャンバー(1)における、試料液溜め(101)、フローセル(102)および吸引口(103)の配置は、試料液溜めの開口が使用時に上部に解放される限り任意である。
【００５５】
チャンバーの各部のサイズは、測定すべき血液試料の容量および種類などや、光学的測定手段(3)および吸引手段(2)などに適合するように適宜設定される。
【００５６】
【実施例】
本実施例で使用した測定装置は以下の構成を有していた。
チャンバーはＰＭＭＡで作製し、フローセルの大きさは2.5×0.12×28.0mm（W×H×L）とし、その底面にはコラーゲンを均一にコーティングした。吸引手段としては、シリンジポンプ（テルフュージョン STC-525、テルモ製）を、吸引できるように改造したものを用いた。光学的測定手段としては、顕微鏡(BH2、オリンパス製）およびＣＣＤカメラと、画像解析ソフト(Adobe Photoshop 3.0J, アドビ社）をインストールしたパーソナルコンピュータとを用いた。これらを用いて上記実施の形態の欄で説明したように構成した。
【００５７】
上記の装置を用いて以下の操作を行った。
試料液溜めに血液を２．０ｍｌ入れ、シリンジポンプにより毎分０．４ｍｌの流速で吸引した。５分後にポンプを停止し、フローセル底面に粘着・凝集した血小板をメイグリュンドワルド＝ギムザ法により染色した。血小板の粘着・凝集画像を顕微鏡およびＣＣＤカメラを用いて取得した。得られた画像をパーソナルコンピュータにビデオ入力し、画像解析ソフトにより解析した。
【００５８】
図７に、血小板の粘着凝集過程に影響を及ぼす種々の物質を血液試料に添加し、上記の操作により得られたフローセルの底面に粘着凝集した血小板の画像を示す。画像Ａは、血液試料中において進行する反応に影響を与える物質を添加せず、血液試料のみをフローセルに流したときの結果で、粘着した単一血小板と凝集した血小板の塊、すなわち凝集塊が見られる。画像Ｂは、血小板の凝集を抑制する物質のＲＧＤＳを添加した血液試料をフローセルに流したときの結果で、血小板の凝集塊は見られないが、粘着した血小板が多く見られる。画像は、血小板の粘着と凝集を抑制する薬物のプラスタグランディンE1を添加した血液試料をフローセルに流したときの結果で、粘着した血小板も凝集塊も見られない。グラフＤは、得られた画像Ａ、ＢおよびＣから画像解析ソフトにより粘着した血球数と血球の凝集塊数の各々を算出した結果を示す。
【００５９】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明によれば、測定実施者が血液試料に触れる可能性が極めて低く、且つ、自動化が容易な操作により、血球の粘着と凝集が独立して測定されるので、血液感染の危険をなくし、好適なバイオハザード環境を保つことができる。例えば、血栓症患者の血小板機能検査や手術時における血液凝固の検査に有用な測定方法および測定装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明装置の概略図である。
【図２】本発明装置の実施態様を示す図である。
【図３】本発明で使用されるチャンバーの構成の一例を示す図（断面図、上面図および側面図）である。
【図４】チャンバーの別の構成例を示す組立図である。
【図５】チャンバーのさらに別の構成例を示す断面図である。
【図６】光学的測定装置の構成例を示す図である。
【図７】血球の粘着と凝集の測定結果を示す。Ａ〜Ｃは顕微鏡およびＣＣＤカメラを用いて取得した画像である（Ａ：対照（ＣＯＮＴ）、Ｂ：ＲＧＤＳ、Ｃ：プロスタグランジン（ＰＧＥ1））。
【符号の説明】
１      チャンバー
１０１  試料液溜め
１０２  フローセル
１０３  吸引口
２      吸引手段
３      光学的測定手段
２１    導入手段
２２    開口
２４    スペーサー
２５    透明平板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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