(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖類及び少糖類を含む糖類混合物を、２種類以上の異なる移動相を用いた液体クロマトグラフィー法により各成分に分離したのち、分離された各成分ごとに反応試薬を反応させてその誘導体を形成させ、この誘導体をセルに収容して検出する糖類混合物の同時分析方法において、分析カラムと検出用セルを連絡する流路を遮断し、洗浄溶媒を用いた検出用セル洗浄処理と、分析カラム平衡化移動相を用いた再平衡化処理を行い、検出用セル洗浄処理終了後から次に分析すべき糖類混合物の導入までの間に分析カラム溶出液流路を復元することにより、分析カラムへの送液を中断することなく、検出処理ごとに検出用セルを洗浄処理することを特徴とする分析方法。
【請求項２】
糖類混合物を各成分に分離するための液体クロマトグラフィー用分析カラム、分離された各成分をそれぞれ誘導体化するための反応器、各成分の誘導体を収容する検出器セル、検出器セルを装着して検出処理するための検出器、検出終了後に検出用セルに洗浄溶媒を供給するための溶媒供給機構、分析カラムを再平衡化するための再生機構、及び分析カラム溶出液の流路切り替え機構を包含してなる糖類混合物の同時分析装置。
【請求項３】
分析カラム溶出液の流路切り替え機構が、分析カラムと検出器セルを連絡する流路を遮断し、洗浄溶媒を用いた検出器セル洗浄処理と、分析カラム平衡化移動相を用いた再平衡化処理を行い、検出器セル洗浄処理終了後から次に分析すべき糖類混合物の導入までの間に分析カラム溶出液流路を復元する機能を有する請求項２記載の糖類混合物の同時分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高速液体クロマトグラフィー法により、単糖類及び少糖類を含む糖類混合物から各成分を分離して同時に分析する方法及び装置の改良に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
単糖類や少糖類などの糖質を分析する方法として、ゲルろ過クロマトグラフィー法や順相クロマトグラフィー法が知られている。これらの方法においては、蛍光や紫外部吸収、可視部吸収がない試料の検出には示差屈折計を用いるのが常套手段であり、単糖類や少糖類の検出も示差屈折計によっている。
【０００３】
しかしながら、ゲルろ過クロマトグラフィー法では単糖類と少糖類との分離は可能であっても、単糖類相互の分離や同じ分子量を有する少糖類相互の分離を行うことは困難である。また順相クロマトグラフィー法の場合も、示差屈折計によって検出を行う場合には移動相が均一組成に制限されるため、少糖類の完全溶出か、単糖類相互の分離のいずれかを犠牲にしなければならないという欠点がある。
【０００４】
また、試料を前処理して各成分の誘導体を形成させることにより各成分に蛍光特性や紫外部吸収特性を付与した後、高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、蛍光検出器や紫外部吸収検出器により検出する方法が知られている。この方法によれば移動相の組成を変化させて溶離を行うことができ、均一組成の移動相を用いる場合に比べて単糖類や少糖類の各成分相互を分離することも可能となるが、還元糖の誘導体化反応収率に影響を及ぼす物質が分析試料中に混入していると正確な分析値が得られなくなるため、この方法を食品等多成分混合試料中の還元糖の高感度同時分析に応用する際には定量的な面では必ずしも満足できるものではない。
【０００５】
そのほか、２種類以上の異なる移動相を用いて糖質の分離を行った後に、各成分の誘導体化を行い、この誘導体を検出器で検出する方法（特開平５−１１３４３９号公報）、［「食品衛生学雑誌」，第３９巻，第５号，第３３３〜３４０ページ（１９９８年）］が知られている。
【０００６】
しかしながら、これらの方法においては、分析カラムで糖質を分離した後にオンラインで糖質と反応試薬を混合し、誘導体に変換し検出器で検出するという分析方法を採用しているために分析操作中に反応混合物や反応試薬液が検出器セルを通過することにより検出器セルが汚染され、この結果として分析回数の増加と共に誘導体化物の検出感度（検出される蛍光強度）が低下するという欠点がある。
【０００７】
この欠点を克服するには、検出器セルをその都度洗浄することが考えられるが、検出器セルを洗浄するには、分析カラムを取り外して検出器とポンプを直結して洗浄溶媒を送液するか、分析カラムを連結したままで移動相送液ポンプから洗浄溶媒を送液するか、分析カラム溶出液出口以降で接続した別のポンプから洗浄溶媒を送液することが必要である。しかしながら、分析カラムを取り外す方法では移動相送液ポンプが一旦停止することになり、ポンプの停止は流量精度低下、それによる分析値の精度低下などの欠点があり、分析カラムを連結したままで移動相送液ポンプから洗浄溶媒を送液する方法では、分析カラムに充填された分離剤により洗浄溶媒が限定されるという欠点があり、分析カラム溶出液出口以降で接続したポンプから洗浄溶媒を送液する方法では、移動相送液ポンプを止めない限り洗浄溶媒に移動相溶媒が混入するという欠点がある。
【０００８】
また、使用する溶媒由来の気体（例えば空気）が発生し、ポンプ内に留まり、ポンプの流量精度を低下させ、分析再現性を低下させる原因になったり、あるいは発生した空気が検出器セル内に入り検出を妨害したりする問題が知られている。これは、特に有機溶媒含有溶媒を使用して連続して分析を行う場合に多い。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、連続的に分析を行っても、分析回数の増加と共に各成分の誘導体の検出感度（検出される蛍光強度）や、ポンプの送液流量精度が低下せず、再現性のよい分析結果を得ることが可能な糖類混合物の同時分析方法及び同時分析装置を提供することを目的としてなされたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糖類混合物の同時分析方法について種々研究を重ねた結果、２種類以上の異なる移動相を用いて液体クロマトグラフィー用分析カラムによって各成分に分離を行った後で、分離した各成分の誘導体化を行い、この誘導体を検出器で検出して、糖類中の各成分を同時に分析する際に、１つの検体の分析が終了するごとに分析カラム溶出液流路と検出器セルを結んだ流路を切り離し、洗浄溶媒を用いた検出器セル洗浄と分析カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）を用いた分析カラムの再平衡化を行い、検出器セル洗浄処理の終了後から次の分析試料添加までの間に分析カラム溶出液流路を元に戻す処理を挿入することにより、前記した欠点を克服しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、単糖類及び少糖類を含む糖類混合物を、２種類以上の異なる移動相を用いた液体クロマトグラフィー法により各成分に分離したのち、分離された各成分ごとに反応試薬を反応させてその誘導体を形成させ、この誘導体をセルに収容して検出する糖類混合物の同時分析方法において、分析カラムと検出用セルを連絡する流路を遮断し、洗浄溶媒を用いた検出用セル洗浄処理と、分析カラム平衡化移動相を用いた再平衡化処理を行い、検出用セル洗浄処理終了後から次に分析すべき糖類混合物の導入までの間に分析カラム溶出液流路を復元することにより、分析カラムへの送液を中断することなく、検出処理ごとに検出用セルを洗浄処理することを特徴とする分析方法、及び糖類混合物を各成分に分離するための液体クロマトグラフィー用分析カラム、分離された各成分をそれぞれ誘導体化するための反応器、各成分の誘導体を収容する検出器セル、検出器セルを装着して検出処理するための検出器、検出終了後に検出用セルに洗浄溶媒を供給するための溶媒供給機構、分析カラムを再平衡化するための再生機構、及び分析カラム溶出液の流路切り替え機構を包含してなる糖類混合物の同時分析装置を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明方法は、リボース、フルクトース、グルコースなどの単糖類と、ラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオース、ラミナリヘキサオース、ラミナリヘプタオースなどの少糖類とを含む糖類混合物から、これらの各成分を相互に分離して分析する方法であるが、このような単糖類と少糖類とを含む糖類混合物としては、例えば、麦芽飲料、ジュースなどの飲料類、水飴、ゼリーなどの菓子類、ハチミツ、しょうゆなどの食品類、ガラクトース転化糖を含んだオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖を含んだオリゴ糖などのオリゴ糖製品類などを挙げることができる。ここで少糖類とは分子量５０００以下のものをいう。
【００１３】
次に、本発明方法において、糖類混合物を２種類以上の異なる移動相を用いた液体クロマトグラフィー法により各成分に分離したのち、分離された各成分ごとに反応試薬を反応させて、その誘導体を形成させ、この誘導体をセルに収容して検出するまでの方法は、これまで知られている方法、例えば特開平５−１１３４３９号公報に記載された方法によって行うことができる。
【００１４】
図１は、上記の方法を実施するのに好適な装置を示す工程図の１例であって、糖類混合物を各成分に分離するための高速液体クロマトグラフィー法は、吸着材料を充填した液体クロマトグラフィー用分析カラム及び２種以上の異なる移動相を用いて行われる。
【００１５】
この図１において、１、２は移動相液溜、５，６は定流速送液ポンプ、７はミキサーで、グラジエント溶離法の場合には該ミキサー７において移動相液溜１からポンプ５によって送液される溶離液１ａと、移動相液溜２からポンプ６によって送液される溶離液２ａが混合される。試料注入バルブ８より注入された試料は溶離液によって保護用のプレカラム９´を経て分析カラム９に導入され各成分に分離される。プレカラム９´、分析カラム９は恒温槽１０内で一定温度に保持されている。１４、１５は分離した各成分を誘導体化するための反応試薬液溜、１８、１９は各反応試薬液溜１４、１５内の反応試薬１４ａ、１５ａを送液するための定流速送液ポンプである。反応試薬液溜は反応試薬を誘導体化すべき成分の違いに応じて適宜交換しうるように通常複数設けられる。分析カラム９において分離された各成分は反応試薬と混合され、反応槽１２の反応コイル２０内を通過する間に誘導体化され、冷却コイル２２内で冷却された後、検出器２３において検出されるように構成されている。なお、上記の例では移動相液溜、反応試薬液溜をそれぞれ２つ設けた場合について示したが、３つ以上の移動相液溜、反応試薬液溜を設け３種以上の溶離液や反応試薬を用いうるように構成することもできる。
【００１６】
上記の液体クロマトグラフィー用分析カラムとして、イオン交換クロマトグラフィー用分析カラム、逆相クロマトグラフィー用分析カラム、順相クロマトグラフィー用分析カラムなどを用いることができるが、糖の保持力が分子量に比例している傾向がある点や、分子量の大きな糖（分子量５０００〜１００００程度）まで分析できる点で特に順相クロマトグラフィー用分析カラムが好ましい。例えば順相クロマトグラフィー用分析カラム用吸着材料としては、市販ゲル吸着剤「ティー・エス・ケイ・ジェルアミド−８０（ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０、東ソー社製、商品名）」が好ましい。
【００１７】
本発明方法において、移動相として使用する溶媒は流速０．２〜１．６ｍｌ／分で送液するのが好ましい。移動相として使用する溶媒は分析カラムによっても異なるが、順相クロマトグラフィー用分析カラムを用いる場合は、アセトニトリル／水（アセトニトリルと水の混合溶媒を意味する。以下同じ）、アセトン／水、１，４‐ジオキサン／水、メチルアルコール／水、エチルアルコール／水などの２成分系の混合溶媒、アセトニトリル／メチルアルコール／水、アセトニトリル／エチルアルコール／水などの３成分系の混合溶媒などを用いることができる。
【００１８】
さらに、これらにギ酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、酢酸−トリエチルアミンなどの塩類やトリヒドロキシメチルアミノメタン、エタノールアミン、トリエチルアミンなどの塩基を含むものなども用いることができる。好ましいのは、アセトニトリル／水の２成分系の混合溶媒である。これらは、よりシャープなピークを得る目的で移動相としての溶媒に１００ｍｍｏｌ程度添加される。
【００１９】
本発明方法においては、移動相として異なる２種類以上の溶媒を用いるが、特に好ましい溶媒の例としては、アセトニトリル／蒸留水（体積比７９：２１）混合溶媒とアセトニトリル／蒸留水（体積比５８：４２）混合溶媒を挙げることができる。本発明方法においては、移動相として使用する溶媒成分の濃度を段階的に切り替える段階溶離法、移動相として使用する溶媒成分の濃度を勾配を持たせて変化させるグラジエント溶離法などの方法も採用することができる。
【００２０】
このようにして、液体クロマトグラフィー用分析カラムで分離された各成分は、検出器に送るまでの間にオンラインで誘導体化される。各成分の誘導体化に用いる反応試薬としては例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、２−シアノアセトアミド、タウリン、ベンズアミジン、４−メトキシベンズアミジン、フェノール／硫酸、アミノ安息香酸などを用いることができる。
【００２１】
上記反応試薬による誘導体化反応は、反応試薬として４‐アミノ安息香酸を用いる場合には強アルカリ性で、エチレンジアミン、エタノールアミン、２‐シアノアセトアミド、ベンズアミジン、４‐メトキシベンズアミジンを用いる場合には弱アルカリ性で、タウリンを用いる場合には中性で、フェノール／硫酸を用いる場合には強酸性で行う。反応試薬は試薬の種類別に最適な割合を検討し添加することが好ましい。
【００２２】
液体クロマトグラフィー用分析カラムとして順相クロマトグラフィー用分析カラムを用いる場合は、順相クロマトグラフィー用の移動相への溶解度が高く、かつホウ酸緩衝液の添加なしでも反応生成物である蛍光誘導体が十分な蛍光強度を示すという点で、上記反応試薬のうちベンズアミジン、４‐メトキシベンズアミジンなどの芳香族アミジン類が好ましい。
【００２３】
本発明方法における検出器としては、蛍光検出器、紫外部吸収検出器、可視吸収検出器などを用いることができるが、使用し得る検出器及び測定波長は用いる反応試薬や移動相の種類などによって選択する必要がある。
【００２４】
すなわち、反応試薬がエチレンジアミンの場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー：励起波長３６０ｎｍ、測定波長３８３ｎｍ、４５５ｎｍ）、エタノールアミンの場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー：励起波長３５７ｎｍ、測定波長４３６ｎｍ）、２‐シアノアセトアミドの場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー：励起波長３３１ｎｍ、測定波長３８３ｎｍ）及び紫外部吸収検出器（イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、配位子交換クロマトグラフィー等：測定波長２７５〜２８０ｎｍ）、タウリンの場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー等：励起波長３５７ｎｍ、測定波長４４０ｎｍ）、ベンズアミジンの場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー等：励起波長２８８ｎｍ、測定波長３６０ｎｍ、４７０ｎｍ）、４‐メトキシベンズアミジンの場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー等：励起波長３１０ｎｍ、測定波長４７０ｎｍ）、フェノール／硫酸の場合には可視吸収検出器（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等：測定波長４８０〜４９０ｎｍ）、４‐アミノ安息香酸の場合には可視吸収検出器（逆相クロマトグラフィー：測定波長４１０ｎｍ）が用いられる。なお、かっこ内は使用するクロマトグラフィーの種類及び検出波長を示したものである。
【００２５】
本発明方法においては、上記の公知の操作に加えて、１つの検体の検出操作が終了するごとに検出器２３に装着する検体収容用セル（以下検出器セルという）を洗浄溶媒を用いて洗浄することが必要である。
【００２６】
この際の検出器セル洗浄溶媒としては、アセトン、アセトニトリル、エチルアルコール、メチルアルコール、イソプロパノールなどの有機溶媒、硝酸などの酸、蒸留水などが挙げられる。本発明方法における検出器セル洗浄溶媒としては、移動相として使用する溶媒と組成が異なるものが用いられる。移動相として使用する溶媒、用いる反応試薬、分析する試料の種類によって最適な洗浄溶媒を検討し使用することが好ましい。
【００２７】
洗浄溶媒として使用する有機溶媒濃度は、８５〜１００質量％が好ましく、９８質量％以上が特に好ましい。洗浄溶媒として使用する硝酸濃度は、２〜６モルが好ましい。検出器セル洗浄溶媒と検出器セル内溶液が混和しない場合は、検出器セル内溶液及び洗浄溶媒の両方とも混和する溶媒で検出器セル内を置換する操作を追加することが好ましい。例えば２〜６モルの硝酸で検出器セルを洗浄する場合は、硝酸洗浄の前後に蒸留水での洗浄操作を追加する。
【００２８】
そして、本発明方法における検出器セルの洗浄では、洗浄溶媒による洗浄操作と、必要時に追加する混和性溶媒によるセル内溶媒置換の操作を行わなければならない。
この際の検出器セル洗浄溶媒の流速は、０．２〜２．０ｍｌ／分の範囲内で選ばれるが、洗浄溶媒の粘性、検出器セルの耐圧力を考慮して最適の流速を設定することが好ましい。
【００２９】
また、本発明方法においては、移動相として使用する溶媒の種類、反応試薬の種類、反応試薬濃度、流速、反応条件（反応時間や反応温度など）などを考慮して検出器セル洗浄処理の挿入回数を任意の分析回数ごとに設定することができるが、特に１つの検体の分析が終了するたびに検出器セル洗浄処理を挿入するのが好ましい。
【００３０】
本発明方法において、検出器セル洗浄時間は、移動相として使用する溶媒の種類、反応試薬の種類、反応試薬濃度、流速、反応条件（反応時間や反応温度など）などを考慮して任意に設定することができるが、液体クロマトグラフィー用分析カラムとして順相クロマトグラフィー用分析カラムを使用し、反応試薬として芳香族アミジンを使用した分析の場合は、アセトニトリル（９８質量％以上）、アセトン（９９質量％以上）、エチルアルコール（９９．５質量％以上）などを洗浄溶媒として流速０．６〜２．０ｍｌ／分で１５〜６０分間洗浄するのが好ましい。
【００３１】
本発明方法における検出器セル洗浄処理は、分析カラム溶出液流路切り替えにより分析カラム溶出液が検出器セルを通過しない状態になってから開始するのが好ましい。検出器セル洗浄処理が終了した後から次回の試料注入までの間に、分析カラム溶出液流路切り替えにより分析カラム溶出液は検出器セルを通過する状態に復元される。
【００３２】
２種類以上の異なる移動相を用いた糖質分析を連続で行う場合は、分析終了後に分析カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）で分析カラムを再平衡化する処理が必要である。本発明方法において、検出器セル洗浄処理が行われている間でも分析カラムへ移動相として使用する溶媒の送液を中断する必要がないため、流量変動の少ない条件での連続分析が可能となる。また、検出器セル洗浄処理が行われている間に、分析カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）で分析カラムを再平衡化する処理が開始できることにより、連続分析における分析間の時間の短縮ができる。
【００３３】
本発明方法において移動相として使用する溶媒、反応試薬液、セル洗浄溶媒がそれぞれの送液ポンプに入る前に、溶媒中の溶存気体を脱気する処理が挿入されている。ただし、溶媒の溶存気体を脱気する処理で使用する脱気装置（デガッサ）の接液部材料、接ガス部材料を侵す可能性がある溶媒、例えば２モル硝酸などは脱気装置を通さないで使用することが好ましい。溶媒中の溶存気体を脱気する処理の挿入目的は、溶媒由来の気体（例えば空気）の発生によるポンプ流量精度の低下や検出器セルに入った気体による検出妨害などを防止するためである。
【００３４】
次に、図１の公知方法に検出器カラムの洗浄処理を付加した本発明方法について添付図面に従って説明する。
図２は本発明方法の全体的構成を示す工程図であって、この図において、１、２は移動相溶媒溜、３、４は脱気装置、５、６は送液ポンプ、７はミキサーで、グラジエント溶離法の場合には当該ミキサー７において移動相溶媒溜１からポンプ５によって送液される溶媒１ａと、移動相溶媒溜２からポンプ６によって送液される溶媒２ａが混合される。試料注入装置の試料注入バルブ８より注入された試料、すなわち糖類混合物は移動相によって分析カラム９に導入され各成分に分離される。分析カラムは恒温槽１０内で一定温度に保持されている。分析カラム溶出液は、試料分析時には分析カラム溶出液流路切り替え装置１１を通り、反応槽１２へ送られる。
【００３５】
分析カラム溶出液流路切り替え装置１１は、図３に示すように、試料分析時には分析カラム溶出液が反応槽１２へ流れる流路が連結されている状態（ａ）に保たれている。試料１回分の分析終了後から検出器セル洗浄処理開始までの間に、分析カラム溶出液切り替え装置１１の流路切り替えが行われ、分析カラム溶出液が反応槽１２へ流れる流路が遮断され、分析カラム溶出液の流路は廃液溜１３へ流れる状態（ｂ）に変更される。検出器セル洗浄処理終了後から次回の試料注入までの間に、分析カラム溶出液切り替え装置１１の流路切り替えが再度行われ、分析カラム溶出液の流路は反応槽１２へ流れる状態（ａ）に戻される。
【００３６】
１４、１５は分離した各成分を誘導体化するための反応試薬液溜、１６、１７は各反応試薬液溜１４、１５内の反応試薬液１４ａ、１５ａを脱気するための脱気装置、１８、１９は各反応試薬液溜１４、１５内の反応試薬液１４ａ、１５ａを送液するための送液ポンプである。
【００３７】
反応試薬液溜は、誘導体化すべき成分の違いによって反応試薬を適宜交換しうるように通常複数設けられる。分析カラム９によって分離された各成分は反応試薬液と混合され反応槽１２内の反応コイル２０を通過する間に誘導体化され、冷却槽２１内で一定温度で保たれた冷却コイル２２で冷却された後、検出器２３において検出される。検出信号はデーター処理装置２４で処理される。検出器２３より溶出した廃液は、廃液溜２５に集められる。
【００３８】
２６、２７は検出器セルを洗浄するための洗浄溶媒溜、２６ａ、２７ａは各洗浄溶媒溜内の洗浄溶媒である。２８、２９は各洗浄溶媒溜２６、２７内の洗浄溶媒２６ａ、２７ａを脱気するための脱気装置である。
【００３９】
３０は反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置で、反応試薬液溜１５が脱気装置１７を介して送液ポンプ１９に連結する流路位置（図２ではＳＰ１と記載）、洗浄溶媒溜２６が脱気装置２８を介して送液ポンプ１９に連結する流路位置（図２ではＳＰ２と記載）、洗浄溶媒溜２７が脱気装置２９を介して送液ポンプ１９に連結する流路位置（図２ではＳＰ３と記載）の合計３種の流路位置からいずれか１つの流路を選択し連結する装置である。
【００４０】
反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０は、試料分析時には反応試薬液溜１５が脱気装置１７を介して送液ポンプ１９と連結されている流路位置（図２ではＳＰ１と記載）にあり、ポンプ１９より反応試薬液１５ａが送液されている。１つの検体の分析終了後から検出器セル洗浄処理開始までの間に、流路切り替え装置３０の流路切り替えが行われ、反応試薬液溜１５が脱気装置１７を介して送液ポンプ１９に連結する流路が遮断され、洗浄溶媒溜２６が脱気装置２８を介して送液ポンプ１９に連結する流路又は洗浄溶媒溜２７が脱気装置２９を介して送液ポンプ１９に連結する流路のどちらか一方の流路が開かれ、ポンプ１９より洗浄溶媒２６ａ又は２７ａが送液される。
【００４１】
検出器セル洗浄処理において２種類以上の洗浄溶媒を使用して検出器セル洗浄を行う場合に、ポンプ１９によって送液される洗浄溶媒の変更は流路切り替え装置３０の流路切り替えによって行われる。検出器セル洗浄処理終了後から次回の試料注入までの間に、流路切り替え装置３０の流路切り替えが行われ、反応試薬液溜１５が脱気装置１７を介して送液ポンプ１９に連結する流路（図２ではＳＰ１と記載）が再度開かれ、ポンプ１９によって反応試薬液１５ａが送液される。図２には２種類の洗浄溶媒２６ａ、２７ａで検出器セル洗浄を行うように示されているが、洗浄溶媒は１種類でも可能な場合がある。
【００４２】
また、１つの検体分の分析終了時の検出器セル内溶液又は反応試薬液１５ａが検出器セル洗浄溶媒と混和しない性質を有するときは、分析終了時の検出器セル内溶液あるいは反応試薬液１５ａに対して混和する性質を有し、かつ検出器セル洗浄溶媒とも混和する性質を有する溶媒で検出器セル内及び流路を変換してから検出器セル洗浄溶媒での検出器セル洗浄を行う必要があるが、この場合、図２に示した洗浄溶媒溜２６，２７のいずれか一方を検出器セル内及び流路置換に用いる溶媒を入れた置換溶媒溜として使用する。脱気装置１６と送液ポンプ１８との間に流路切り替え装置３０と同等の流路切り替え装置１基を挿入し、洗浄液２６ａ、２７ａと同じ洗浄溶媒の入った洗浄溶媒溜を装着することにより２つの送液ポンプ１８、１９を使用して検出器セル洗浄を行うこともできる。
【００４３】
なお、上記の例では移動相として使用する溶媒溜、反応試薬液溜、検出器セル洗浄溶媒溜をそれぞれ２つ設けた場合について示したが、３つ以上の移動相として使用する溶媒溜、反応試薬溶液溜、検出器セル洗浄溶媒溜を設け３つ以上の移動相として使用する溶媒、反応試薬液、検出器セル洗浄溶媒を用いうるように構成することもできる。
【００４４】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００４５】
実施例
図２において溶媒１ａとしてアセトニトリル／蒸留水（体積比７９：２１）混合溶媒を、溶媒２ａとしてアセトニトリル／蒸留水（体積比５８：４２）混合溶媒を、反応試薬液１４ａとして１．０Ｍ水酸化カリウム溶液を、反応試薬液１５ａとしてアセトニトリル／蒸留水（体積比４０：６０）混合溶媒に１００ｍＭベンズアミジン塩酸塩一水和物を溶解した溶液を、検出器セル洗浄溶媒２６ａとして蒸留水を、検出器セル洗浄溶媒２７ａとしてアセトニトリル（９８質量％以上）をそれぞれ用いた。
【００４６】
各溶媒中の溶存気体の脱気装置３，４，１６，１７，２８，２９としてオンライン式脱気装置（東ソー社製）を用いた。移動相送液用送液ポンプ５，６として東ソー社製のＣＣＰＭ−ＩＩ型送液ポンプを使用して、ＰＸ−８０２０型ポンプコントローラーで制御して溶媒１ａと溶媒２ａの高圧グラジエントを行った。
【００４７】
反応試薬液及び洗浄溶媒送液用送液ポンプ１８，１９として東ソー社製のＣＣＰＭ−ＩＩ型送液ポンプ樹脂仕様を使用して、ＰＸ−８０２０型ポンプコントローラーで制御した。ミキサー７として東ソー社製のＭＸ−８０１０型ダイナミックミキサーを使用した。試料としてリボース（２．０μｇ／ｍｌ）、フルクトース（２．０μｇ／ｍｌ）、グルコース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリビオース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリトリオース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリテトラオース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリペンタオース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリヘキサオース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリヘプタオース（２．０μｇ／ｍｌ）を含む溶液を用い、この溶液１０μｌを試料注入装置の試料注入バルブ８より注入した。試料注入装置として東ソー社製のＡＳ−８０２０型オートサンプラーを使用した。分析カラム９としては東ソー社製のＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍ）を、８０℃に温度制御した恒温槽１０内に設置して使用した。恒温槽１０として東ソー社製のＣＯ−８０２０型カラム恒温槽を用いた。
【００４８】
溶離法としては予め溶媒１ａが移動相中に占める割合が１００％となるように送液してカラムを試料注入前に平衡化しておき、試料注入直後に溶媒２ａの混合を開始し、時間経過と比例して移動相中の溶媒２ａ濃度を直線的に上昇させ、試料注入後３５．０分に移動相中に占める溶媒２ａの割合が１００％となるように組成変化させる溶媒２ａの直線勾配濃度上昇溶離法（グラジエント溶離法）を採用した。
【００４９】
試料注入後、３５．０分経過した後は移動相中に占める溶媒２ａの割合が１００％の状態で送液を継続した。移動相の送液速度は０．８ｍｌ／分、反応試薬液１４ａの送液速度は流速０．６ｍｌ／分、反応試薬液１５ａの送液速度は０．６ｍｌ／分にそれぞれ設定した。カラム９で分離された成分の誘導体化反応は反応槽１２内に設置した反応コイル２０（内径０．４ｍｍ、長さ２０ｍ、ステンレス鋼製）内で行った。反応槽２０として東ソー社製のＲＥ−８０２０型反応槽を９５℃に温度制御して使用した。
【００５０】
反応コイル２０から溶出した反応混合物を恒温槽２１内に設置した冷却コイル２２（内径０．２５ｍｍ、長さ４ｍ、テフロン製）内で冷却した後、蛍光検出器２３において検出した。恒温槽２１としてアドバンテック東洋社製のＬＣＨ−２０００型冷却槽を９℃に温度制御して使用した。分析カラム９と反応槽１２との間に装着する分析カラム溶出液流路切り替え装置１１として東ソー社製のスイッチングバルブユニットを装備したＶＣ−８０２０型バルブコントローラーを使用した。
【００５１】
分析カラム溶出液流路切り替え装置１１を用いて、試料分析時には分析カラム溶出液が反応コイル１２へ送液され［図３で状態（ａ）と記載］、検出器セル洗浄処理には分析カラム溶出液が廃液溜１３へ送液されるように［図３で状態（ｂ）と記載］分析カラム溶出液流路切り替えを行った。データ収集時間を５０分、分析終了から次回試料注入までの間隔を４０分に設定し、９０分毎に試料注入を行った。１回の試料分析終了ごとに検出器セルの洗浄を行った。
【００５２】
送液ポンプ１９と脱気装置１７との間に装着する反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０として東ソー社製のソレノイドバルブユニットを装備したＶＣ−８０２０型バルブコントローラーを使用した。反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０を用いて、試料分析時には反応試薬液１５ａが送液ポンプ１９によって送液され（図２で流路位置ＳＰ１と記載）、検出器セル洗浄工程などでは洗浄溶媒２６ａ（図２で流路位置ＳＰ２と記載）又は２７ａ（図２で流路位置ＳＰ３と記載）が送液される流路位置になるように流路切り替えを行った。
【００５３】
検出器セル洗浄処理は、最初に検出器セル洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ／分で２．８分間送液、２番目に検出器セル洗浄溶媒２７ａを流速２．０ｍｌ／分で１５分間送液、３番目にセル洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ／分で３分間送液することにより行った。検出器セル洗浄処理開始後すぐに、移動相組成を溶媒１ａ１００％に切り替えて送液することにより、分析カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）で分析カラムを再平衡化する処理を開始した。次回の試料注入まで移動相組成を溶媒１ａ１００％で送液する状態を保持した。
【００５４】
また、検出器２３として東ソー社製のＦＳ−８０２０型蛍光検出器を、データ処理装置２４として東ソー社製のＬＣ−８０２０型データプロセッサをそれぞれ用いた。各溶媒送液ポンプ５，６，１８，１９の流速などの送液制御、分析カラム溶出液流路切り替え装置１１及び反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０の分析開始から９０分までの制御プログラムを表１に示す。
【００５５】
この表において、［  ］内は送液している溶媒を、（  ）内はその流速を意味する。移動相溶媒送液ポンプの流速は０．８ｍｌ／分に固定し、データ収集時間は試料注入後５０分間であり、分析終了から次の試料注入までの間隔を４０分間とし、９０分ごとに試料注入した。また、検出器セルの洗浄は分析終了ごとに行った。
【００５６】
当該分析プログラムを用いて同一試料について１２回の連続分析を行った。得られたクロマトグラムの一部を図４に示す。図４において、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ単糖類のリボース、フルクトース、グルコースを、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉはそれぞれ少糖類のラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオース、ラミナリヘキサオース、ラミナリヘプタオースを示す。
【００５７】
図４に示されるように各単糖相互及び各少糖類相互が完全に分離され、これらの完全溶出までに要した時間は４５分以内であった。分析した還元糖のうちグルコースとラミナリビオースについて行った１２回の分析の糖ピークの保持時間（分）とピークの高さ（蛍光強度：ｍＶ）についての測定値を表２に示す。
【００５８】
グルコース及びラミナリビオースの各還元糖に基づく保持時間の変動係数ＣＶ（相対標準偏差）はそれぞれ０．１１６％、０．１４３％、蛍光ピーク高さの変動係数ＣＶ（相対標準偏差）はそれぞれ０．８６０％、１．１４％であった。なお、変動係数ＣＶ（相対標準偏差）は、試料の標準偏差Ｓ（Ｓ＝σn-1）を試料の平均ｘで割った値に１００を乗じて算出した。以上の結果から、本発明方法によると、単糖類及び少糖類を含む試料を高感度で検出可能であり、単糖類間の高度分離が達成でき、かつ少糖類の短時間での完全溶出ができることが分る。さらに、変動係数ＣＶの結果から連続分析において得られた分析値の再現性も高いことが分る。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
【表２】
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【００６１】
比較例１
検出器セル洗浄処理を行わずに、実施例１と同様の試料を実施例１と同様の装置（図２）を用いて１２回連続して分析した。分析カラム溶出液流路切り替え装置１１は状態（ａ）の状態に、反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０は流路位置ＳＰ１の状態に固定した。移動相溶媒１ａ、移動相溶媒２ａ、反応試薬液１４ａ，反応試薬液１５ａは実施例１と同様の溶媒を使用した。移動相溶媒送液ポンプ５、６の制御は実施例１と同様のプログラムを使用し、移動相は流速０．８ｍｌ／分で送液した（表１参照）。連続分析の間、反応試薬液１４ａを流速０．６ｍｌ／分で、反応試薬液１５ａを流速０．６ｍｌ／分で送液した。その他の分析条件は実施例１と同様であった。分析した還元糖のうちグルコースとラミナリビオースについて、ピークの高さ（蛍光強度：ｍＶ）について表３に示す。
【００６２】
グルコース及びラミナリビオースの各還元糖に基づく蛍光ピーク高さの変動係数ＣＶ（相対標準偏差）は、それぞれ３．６５％、４．５８％であった。検出器セル洗浄処理が含まれていない比較例１によって得られたグルコースとラミナリビオースの変動係数ＣＶ値は、実施例１の変動係数ＣＶ値のそれぞれ４．２倍と４．０倍に相当した。なお、変動係数ＣＶ値は、小さいほど分析の再現性がよい。
以上の結果から、検出器セル洗浄処理を行わない比較例１では、分析値の再現性が実施例１よりも低いことが分る。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
比較例２
実施例１で検出器セル洗浄処理において流路切り替え装置による分析カラム溶出液流路切り替えを採用した代わりに、１回の試料分析ごとに検出器セル洗浄を行う際に分析カラムを取り外して検出器セルを洗浄して、実施例１と同様の試料を実施例１と同様の装置（図２）を用いて１２回連続して分析した。分析カラム溶出液流路切り替え装置１１は状態（ａ）の状態に、反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０は流路位置ＳＰ１の状態に固定した。
【００６５】
移動相溶媒１ａ、移動相溶媒２ａ、反応試薬液１４ａ，反応試薬液１５ａは実施例１と同様の溶媒を使用した。移動相溶媒送液ポンプ５、６の制御は実施例１と同様のプログラムを使用し、移動相は流速０．８ｍｌ／分で送液した（表１参照）。連続分析の間、反応試薬液１４ａを流速０．６ｍｌ／分で、反応試薬液１５ａを流速０．６ｍｌ／分で送液した。
【００６６】
検出器セル洗浄は次のように行った。試料注入後５０．０分経過しデータ収集が終了した後に、すべての送液ポンプを停止し、分析カラムを取り外し、分析カラムの代わりにステンレス鋼製チューブを取り付け、検出器セル洗浄処理を行った。検出器セル洗浄処理は、最初に検出器セル洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ／分で２．８分間送液、２番目に検出器セル洗浄溶媒２７ａを流速２．０ｍｌ／分で１５分間送液、３番目にセル洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ／分で３分間送液することにより行った。
【００６７】
検出器セル洗浄処理後、ステンレス鋼製チューブの代わりに分析カラムを取り付け、移動相組成を溶媒１ａのみに切り替えて送液ポンプ５，６から送液すると共に、反応試薬液１４ａを送液ポンプ１８で、反応試薬液１５ａを送液ポンプ１９で送液を再開した。分析カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）での分析カラム再平衡化を３０分間行った後に、次回の試料注入を行った。その他の分析条件は実施例１と同様の条件で行った。分析した還元糖のうちグルコースとラミナリビオースについての、保持時間（分）を表４に示した。
【００６８】
グルコース及びラミナリビオースの各還元糖の保持時間（分）に関する変動係数ＣＶ（相対標準偏差）は、それぞれ０．１５７％、０．２４４％であった。検出器セル洗浄工程の際に分析カラムを取り外す操作を含んでいる（すなわち移動相送液ポンプが連続分析中に停止、再始動を繰り返す）比較例２によって得られたグルコースとラミナリビオースの変動係数ＣＶ値は、実施例１の変動係数ＣＶ値のそれぞれ１．４倍と１．７倍に相当した。なお、変動係数ＣＶ値は、小さいほど分析の再現性がよいことを示している。
【００６９】
以上の結果から、検出器セル洗浄工程の際に分析カラムを取り外す操作を含んでいる（すなわち移動相送液ポンプが連続分析中に停止、再始動を繰り返す）比較例２では、分析値の再現性が実施例１よりも低下することが分る。また、比較例２では分析カラムの取り外しや取り付け作業（約５分）、検出器セル洗浄作業（約２０．８分）、分析カラム平衡化移動相での分析カラム再平衡化作業（約３０分）などに約５５分ほどの時間を必要とするため試料注入間隔は約１０５分であった。この結果から、比較例２では一定時間での連続分析における分析可能な試料数が実施例１に比べて少なくなることが分る。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
比較例３
実施例１の溶離法を２種類以上の溶離液を使用せずに単一組成の移動相を用いて行う以外は、実施例１と同様にして分析を行った。単一組成の移動相としてアセトニトリル／蒸留水（体積比７９：２１）を用いた。得られたクロマトグラムを図５に示す。単糖間の分離は可能であったが、分析時間１５０分までにラミナリペンタオースまでしか溶出せずに少糖類の完全溶出ができなかった。１種類の移動相を用いた比較例３では、単糖類間の高度分離と少糖類の短時間での完全溶出の両立は困難であることが分る。
【００７２】
比較例４
実施例１の溶離法を２種類以上の溶離液を使用せずに単一組成の移動相を用いて行う以外は、実施例１と同様にして分析を行った。単一組成の移動相としてアセトニトリル／蒸留水（体積比５８：４２）を用いた。このようにして得たクロマトグラムを図６に示す。これより、ラミナリヘプタオースまでが１５分間で溶出したが、単糖間の分離が達成できなかった。１種類の移動相を用いた比較例４では、単糖類間の高度分離と少糖類の短時間での完全溶出の両立は困難であることが分る。
【００７３】
【発明の効果】
本発明によると、高速液体クロマトグラフィー法を用い、分析回数の増加による検出感度やポンプの送液流量精度の低下なしに、糖類混合物の各成分ごとの同時分析を、再現性よく、連続して行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明方法で用いる公知部分の工程図。
【図２】  本発明方法全体の工程図。
【図３】  図２における流路切り替え機構の説明図。
【図４】  本発明方法により分析した１例の結果を示すクロマトグラム。
【図５】  比較例３における分析した結果を示すクロマトグラム。
【図６】  比較例４における分析した結果を示すクロマトグラム。
【符号の説明】
１、２  移動相溶媒溜
３、４、１６、１７，２８、２９  脱気装置
５、６、１８、１９  送液ポンプ
７  ミキサー
８  試料注入バルブ
９  分析カラム
１０  恒温槽
１１、３０  流路切り替え装置
１２  反応槽
１３、２５  廃液溜
１４、１５  反応試薬液溜
２０  反応コイル
２１  冷却槽
２２  冷却コイル
２３  検出器
２４  データ処理装置
２６、２７  洗浄溶媒溜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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