(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物学的反応により得られたＬ−リボース含有液をアルカリ金属形カチオン交換樹脂またはアルカリ土類金属形カチオン交換樹脂に接触させることを特徴とするＬ−リボースの精製方法。
【請求項２】
アルカリ金属形カチオン交換樹脂またはアルカリ土類金属形カチオン交換樹脂との接触によりＬ−リボースをクロマト分離することを特徴とする請求項１記載の精製方法。
【請求項３】
Ｌ−リボース含有液がＬ−リブロースの生物学的異性化反応により得られることを特徴とする請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
Ｌ−リブロースがリビトールの生物学的酸化反応により得られることを特徴とする請求項３記載の精製方法。
【請求項５】
リビトールがグルコースを原料とした発酵により得られることを特徴とする請求項４記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−リボースの精製方法に関し、さらに詳しくは生物学的反応により得られたＬ−リボース含有液をゲル型濾過材に接触させることを特徴とするＬ−リボースの単離精製法に関する。
【従来の技術】
近年、非天然型の糖類は医薬及び農薬の中間原料として注目されている。リボースに関しては天然型のＤ体はＤＮＡの構成糖としては勿論、種々のビタミンや補酵素の構成糖として全生物界に豊富に分布しているにもかかわらず、非天然型のＬ体はほとんど供給の目処が立っていないのが現状である。現在知られているＬ−リボースの主な生産方法としては、Ｌ−アラビノースを原料としたコバルト触媒による合成法が挙げられる。一方、微生物を用いてＬ−リボースを生産する方法としてはアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）ＤＬ−２８株の産出する酵素がＬ−リブロースを異性化し、Ｌ−リボースを生産することが唯一報告されている（Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.81,No.6,493-497.1996）。しかし、この酵素反応の原料であるＬ−リブロースは天然にはほとんど存在せず、合成による供給も不可能であるが、リビトールを原料とした微生物反応により容易に得ることができる。またさらに、Ｌ−リブロースの原料たるリビトールは市販されているものは合成品あるいは天然界からの抽出品で、決して安価ではないが、本発明者らは既に極めて安価なグルコースを原料とした発酵法により容易に生産できることを見いだしている。
【０００２】
しかし、微生物反応を用いたＬ−リブロースの異性化によりＬ−リボースを生産した場合、反応終了液中には基質のＬ−リブロースが残存し、特にグルコースからの発酵液を用いて多段階に微生物を接触させた場合、最終産物であるＬ−リボース液には複製生物や着色成分を含め、多くの有機、無機の夾雑物が共存する。この一連の多段階生物反応においてＬ−リボースとＬ−リブロースを分離する方法としては、従来より知られている晶析法を応用して、Ｌ−リボースのみを析出させる方法が考えられるが、晶析法は一般に溶液中の夾雑物の影響を受けやすい。また、晶析には顕著な影響を与えないが、微量の着色成分の混入も、その後の精製工程には大きな負荷を与える。高純度のＬ−リボースを高収率で得るためには反応終了後のＬ−リボース液から上記のような不純物を出来る限り除いておくことが望ましく、その方法が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
実際に従来の方法を用いて工業的規模でＬ−リボースを生物学的に生産しようとした場合、種々の問題点が生じる。つまり微生物の多段階反応でＬ−リボース液を得、低温晶析やアルコール晶析によりＬ−リボースを単離しようとした場合、その夾雑物質の多さからＬ−リボースが全く析出しなかったり、晶析に要する時間が極端に長く、また晶析率も極めて低くなる傾向が表れる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の問題を解決すべく鋭意検討した結果、微生物反応により得られたＬ−リボース液をゲル型濾過材に接触させることで着色成分や塩類、Ｌ−リブロースも含めた夾雑物を有効に除去し、以後低温晶析やアルコール晶析を含む簡単な操作でＬ−リボースを単離出来ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の要旨は、微生物学的反応により得られたＬ−リボース含有液をゲル型濾過材に接触させることを特徴とするＬ−リボースの精製方法に存する。本発明の好ましい態様としては、ゲル型濾過材との接触によりＬ−リボースをクロマト分離すること、ゲル型濾過材がカチオン系イオン交換体であること、及び、カチオン系イオン交換体がアルカリ金属形カチオン交換樹脂またはアルカリ土類金属形カチオン交換樹脂であることが挙げられる。
更に本発明の好ましい態様としては、Ｌ−リボース含有液が、Ｌ−リブロースの生物学的異性化反応により得られること、Ｌ−リブロースがリビトールの生物学的酸化反応により得られること、及び、リビトールがグルコースを原料とした発酵により得られることが挙げられる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明により精製することが出来るＬ−リボース含有液としては、微生物学的反応により得られたものであれば、いかなる手段で得られたものでも構わないが、本発明の特徴が顕著に表れるのは、Ｌ−リブロースの生物学的異性化により得られた場合であり、さらにはＬ−リブロースがリビトールの生物学的酸化により得られた場合、さらにはリビトールがグルコースを原料とした発酵により得られた場合である。
例えば、Ｌ−リボースはＬ−リブロース含有液にセルロモナス属等に属する微生物を作用させることにより得られる。セルロモナス属に属する微生物としては、セルロモナス・ゲリダ（Cellulomonas gerida）に属する微生物としてＪＣＭ１４９０が、セルロモナス・ビアゾテア（Cellulomonas biazotea）に属する微生物としてＡＴＣＣ４８６が、セルロモナス・フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）に属する微生物としてＡＴＣＣ４８２等が挙げられる。また上記微生物は、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。これらの微生物は１種あるいは２種以上を用いられる。具体的には、培養して得られた菌体をそのまま、あるいは公知の手法で処理したものを作用させてもよいし、これらの菌体および／または菌体処理物からＬ−リブロースに作用しＬ−リボースを生産する能力を有する酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。このほかにも公知の方法であるアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）ＤＬ−２８株の産出する酵素、また欧州公開第８０７６８２号公報に記載のような酵素をＬ−リブロースに作用させてもよい。これらの微生物を用いて反応を行った場合、反応が平衡反応であるため、得られた反応液はＬ−リボースとＬ−リブロースの混合液となり、これをＬ−リボース含有液と呼ぶ。
【０００６】
上述のＬ−リブロースもまた生物学的に得ることができる。つまり、使用する微生物としては好気的反応条件下、リビトールをＬーリブロースに変換する能力を有する微生物であれば特に限定はされないが、リビトールからＬーリブロースを製造し、かつリビトール以外の副生産されたポリアルコールを資化する能力を有する微生物が好ましく、より好ましくは、アセトバクター(Acetobacter)属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アシネトバクター(Acinetobacter )属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、アエロモナス(Aeromonas)属、オーレオバクテリウム(Aureobacterium)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属,クレブシエラ(Klebsiella)属、オクロバクトラム(Ochrobactrum)属、リゾビウム(Rhizobium)属、セラチア(Serratia)属, ロドバクター(Rhodobacter)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、パラコッカス(Paracoccus)属、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物である。特にグルコノバクター属に属する微生物がポリアルコールの資化性の点からも好ましく、具体的には、グルコノバクター・フラテウリ(Gluconobacter frateurii) としてIFO 2508が、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans) としてIFO 3292が挙げられる。
【０００７】
これらの属に属する微生物とを好気的条件下で接触させる。なお、これらについても上記で述べたような組換え株、菌体そのもの、及び、菌体処理物いずれも使用可能であるし、以下で述べるリビトール生産菌についても同様である。
さらに上述のリビトールも生物学的に得ることができる。即ち糖の好気的発酵によりリビトールを効率よく生産することが可能である。つまり、トリコスポロノイデス属に属する微生物、例えばトリコスポロノイデス・マディダ（Trichosporonoides madida）に属する微生物としてＣＢＳ２４０．７９、トリコスポロノイデス・ニグレセンス（Trichosporonoides nigrescens）に属する微生物としてＣＢＳ２６８．８１、２６９．８１が、トリコスポロノイデス・エドセファリス（Trichosporonoides oedocephalis）に属する微生物としてＣＢＳ５６８．８５が、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis）に属する微生物としてＣＢＳ５６７．８５が、トリコスポロノイデス・スパチュラータ（Trichosporonoides spathulata）に属する微生物としてＣＢＳ２４１．７９、ＣＢＳ２４２．７９Ａ、ＣＢＳ２４２．７９Ｂあるいはこれらの変異株例えばＭＣＩ３４４２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１７６として通商産業省工業技術院生命工学工業研究所に寄託されている）等を１種あるいは２種以上、グルコースを炭素源として定法通り好気的に培養する。このようにして得られた培養液はリビトールを含んでおり、これをそのまま前述のＬ−リブロース化の基質として用いることが出来る。もちろんリビトールの段階である程度の精製を行ってもよい。
【０００８】
以上のようにＬ−リボースは例えば、グルコースを出発原料として３段階の生物反応により得られるが、この様に多段階の生物反応を行った場合、得られたＬ−リボース含有液は、平衡反応物質であるＬ−リブロース以外にも微生物由来のタンパク質等の高分子物質、塩類、副反応で生成したと思われる有機酸類や、ジヒドロキシアセトン、その他少量の糖類、着色成分等の夾雑物を含む。これらの夾雑物は精製の早い時期に出来るだけ取り除いておくことが、その後の精製にとって望ましい。
本発明で用いるゲル型濾過材としては、Ｌ−リボースと他の成分とを効率よく分離することが出来るものであれば特に限定されないが、好ましくはカチオン系ゲル型イオン交換体が挙げられ、更に好ましくは架橋度４〜８％のアルカリ金属またはアルカリ土類金属型のカチオン系イオン交換体が挙げられる。アルカリ金属形カチオン交換樹脂では、主として灰分及び多糖類を除去し、アルカリ土類金属型カチオン交換樹脂では、主としてＬ−リブロースを除去する。かかるイオン交換体の具体例としては、ＵＢＫ−５３０、ＵＢＫ−５３５、ＵＢＫ−５５０、ＵＢＫ−５５５（いずれも三菱化学製）等が挙げられる。これらを用いてクロマト分離を行うことが好ましい。
【０００９】
具体的な精製手段としては、例えば上述したゲル型濾過材を脱塩水にてスラリー化し、十分に気泡を除去した後分離カラムに充填する。該カラムに、充填した濾過材容量の１／２〜１／１００、好ましくは１／５〜１／２０量の粗Ｌ−リボース含有液を送入し、次いで水で溶出させてＬ−リボース画分とその他の画分とに分画する。このＬ−リボース画分を、一般に糖の精製に用いられる通常知られた方法により脱塩脱色後、晶析を行うことにより高純度のＬ−リボースを得ることができる。
また分離効率を上げ、溶離水の使用量を減らす目的で、公知の種々のクロマト分離手法や疑似移動床法を用いることにより、さらに効果的な分画を行うこともできる。
【００１０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
実施例１
１）リビトール発酵上清の製造
１Ｌ容量のマイクロジャーにグルコース３０％、ポリペプトン２％からなる培地６００ｍＬを入れ、トリコスポロノイデス  メガチリエンシス（ＭＣＩ３４４２）の種培養液５ｍＬを接種した。種培養液は、予めバッフル付きフラスコを用いてグルコース３０％、酵母エキス１％からなる培地中で３０℃、２日間、１６０ｒｐｍの振とう培養により得られた。マイクロジャーは８００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、３０℃の条件で制御され、６日間培養を行った。得られた培養液から遠心分離により清澄な培養上清４５０ｍＬを得た。
【００１１】
２）粗Ｌ−リブロース液の製造
グルコノバクター・フラテウリ（ＩＦＯ２５０８）種培養液を２％グリセロール、０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトンよりなる培地４００ｍＬを入れた１Ｌマイクロジャーに１％接種した。種培養液は予め同一培地４０ｍＬを入れた２００ｍＬバッフル付きフラスコで１６０ｒｐｍ、３０℃で１日振とう培養して得られた。マイクロジャーは５００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、３０℃の条件で制御され、１日間培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して培養上清を除き、菌体を１００ｍＭのリン酸緩衝液バッファー（ｐＨ７．０）４０ｍＬに懸濁した。
１Ｌマイクロジャーに１）で得られたリビトール発酵上清４５０ｍＬを入れ、グルコノバクター懸濁液を４０ｍＬを加えて、３０℃にて５００ｒｐｍで攪拌しながら１日間反応を行った。反応終了液を遠心分離して菌体を除き清澄な粗Ｌ−リブロース液４３０ｍＬを得た。
【００１２】
３）粗Ｌ−リボース液の製造
セルロモナス・ゲリダ（ＪＣＭ１４９０）をスクロース  ２．０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５．０ｇ／Ｌ、大豆ペプチド  ５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／Ｌ、Ｌ−リボース１５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）よりなる培地４５０ｍＬを入れた１Ｌマイクロジャーに１％接種した。種培養は予め同一培地２０ｍＬを入れた２００ｍＬバッフル付きフラスコで１６０ｒｐｍ、３０℃で１８時間振とう培養して得られた。マイクロジャーは５００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、３０℃の条件で制御され、１８時間培養を行った。得られた培養終了液を遠心分離し、集菌した。菌体ペレットにグリシン−塩酸緩衝液（５０ｍＭ・ｐＨ８．５）を４０ｍＬを加え均一に懸濁した後、トルエンを１．３ｍＬ加え、１５分間激しく混合した。このように調整したトルエン処理菌体を２）で得られた粗Ｌ−リブロース液４３０ｍＬに加え、均一になるよう緩やかに攪拌しつつ３０℃で２４時間反応を行った。途中、１Ｎ  ＮａＯＨによってｐＨ８．５に制御した。得られた反応終了液を遠心分離して菌体を除き、さらに０．２２μｍ孔径の精密濾過膜を通して清澄な粗Ｌ−リボース液４００ｍＬを得た。
【００１３】
４）粗Ｌ−リボース液の精製
３）で得られた粗リボース液をエバポレーターにて濃縮し、９０ｍＬの粗リボースシロップを得た。このシロップの濃度はブリックス６３、Ｌ−リボースの対固形分比率はＨＰＬＣのピーク面積換算で約４２％、Ｌ−リブロースの比率は１８％であった。このシロップをカラムクロマトグラフィーの原料に供した。即ちイオン交換樹脂ＵＢＫ−５３０（三菱化学社製）３２０ｍＬを充填したカラム４本を直列に接続し、カラム温度を６５℃に保った状態でその一方の端から流速６００ｍＬ／ｈｒで粗リボースシロップ１００ｍＬを供給した。次いで水を流速６００ｍＬ／ｈｒで送入し、シロップをカラム内で展開、分離させながらカラム末端に移動させた。原料を送入して７７分後から目的とするＬ−リボースが流出し始めた。さらに１８分してから流出液をＬ−リボース含有画分として採取を開始した。原料の送入開始から１１７分後Ｌ−リボースの流出がほぼ終わったので、サンプル回収を停止した。このＬ−リボース含有画分中のＬ−リボースの対固形分比率はＨＰＬＣのピーク面積換算で８０％、Ｌ−リブロースの比率は１８％であり、Ｌ−リボースの回収率は５５．１％であった。このＬ−リボース画分をさらに脱塩脱色した後、ブリックス９０まで濃縮し４℃で１ヶ月静置したところ、Ｌ−リボース結晶が析出した。この結晶を冷アルコール等で洗浄し、乾固したところ純度９９％のＬ−リボース結晶が得られた。
【００１４】
実施例２
実施例１の１）〜３）と同様の培養条件で３０Ｌ容量の発酵槽を用いて粗Ｌ−リボース液を製造し、ブリックス５０まで濃縮したのち、カラムクロマトグラフィーの原料に供した。
特公平７−４６０９７号公報に記載された疑似移動床型クロマト分離系（充填材が充填された充填床の前端と後端とが流体通路で連結され、流体の循環を可能にしたもの）において、充填材としてＮａ型の強カチオン交換樹脂（ダイヤイオンＵＢＫ−５３０，三菱化学社製）を使用し、脱着剤として水を使用した。内径２７ｍｍ、充填層高５５０ｍｍの直列に連結した４本のカラムに前記充填材を合計で１２４０ｍＬ充填した充填床を６５℃に保ち、下記表１に示すタイムスケジュールで定常となるまで分離操作を行った。定常状態に達した後の各画分の組成を、下記表２に示す。Ｌ−リボースの回収率は８１．８％であった。
【００１５】
【表１】
0003835000.tif 000002
【００１６】
【表２】
0003835000.tif 000003
【００１７】
得られたＬ−リボース含有画分を実施例１と同様に脱塩脱色、濃縮後、シロップの２倍容量のエタノールを添加し、微量のＬ−リボース結晶を種晶として加え、４℃で２４時間静置したところ、Ｌ−リボース結晶が析出した。この結晶を冷エタノールで数回洗浄した後乾固し、純度９９．９％の結晶を得た。晶析率は７０％であった。
【００１８】
実施例３
実施例２の疑似移動床法にて得られたＬ−リボース含有画分をさらにカラムクロマトグラフィーの原料に供した。
実施例２と同様のクロマト分離系を用い、充填材としてＣａ型の強カチオン交換樹脂（ダイヤイオンＵＢＫ−５５５，三菱化学社製）を使用した。下記表３に示すタイムスケジュールで定常となるまで分離操作を行った。定常状態に達した後の各画分の組成を、下記表４に示す。Ｌ−リボースの回収率は７２．４％であった。
【００１９】
【表３】
0003835000.tif 000004
【００２０】
【表４】
0003835000.tif 000005
【００２１】
得られたＬ−リボース画分を脱塩脱色後、乾固したところ純度９９％のＬ−リボース結晶が得られた。
なお、各実施例においてＬ−リボース含量は高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で測定した。Ｌ−リボースの保持時間は下記分析条件において、２４．０分である。
【００２２】
【表５】
0003835000.tif 000006
【００２３】
【発明の効果】
本発明の精製方法によれば、多段階の微生物学的反応により得られた不純物の多いＬ−リボース含有液から高純度のＬ−リボースを得ることが可能である。