(57)【要約】本発明は、フコイダン、その分解物又はそれらの塩を利用した、生体の恒常性維持作用を有する生体の恒常性維持剤、食品、飲料又は飼料を提供する。また、本発明は、着色が少なく、苦味やヨード含量が軽減され、フレッシュ感のある、風味が改善されたフコイダン及び海藻類抽出物、当該フコイダン及び／又は海藻類抽出物を含有する食品、飲料、調味料、飼料、化粧品又は医薬、及びそれらの効率的な製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダン、その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される１つ以上を有効成分として含有することを特徴とする生体の恒常性維持剤。
【請求項２】
肝機能障害の治療剤又は予防剤である請求項１記載の生体の恒常性維持剤。
【請求項３】
肝機能障害が肝線維化を伴う疾患である請求項２記載の生体の恒常性維持剤。
【請求項４】
血液の恒常性維持剤である請求項１記載の生体の恒常性維持剤。
【請求項５】
血糖値上昇抑制作用を有する請求項４記載の生体の恒常性維持剤。
【請求項６】
血中の中性脂肪値上昇抑制作用を有する請求項４記載の生体の恒常性維持剤。
【請求項７】
飲食後における血液の恒常性維持作用を有する請求項４〜６いずれか１項に記載の生体の恒常性維持剤。
【請求項８】
フコイダン、その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される１つ以上を含有することを特徴とする生体の恒常性維持用の食品、飲料又は飼料。
【請求項９】
肝機能障害の改善又は予防用である請求項８記載の食品、飲料又は飼料。
【請求項１０】
肝機能障害が肝線維化を伴う疾患である請求項９記載の食品、飲料又は飼料。
【請求項１１】
血液の恒常性維持用の食品、飲料又は飼料である請求項８記載の食品、飲料又は飼料。
【請求項１２】
血糖値上昇抑制作用を有する請求項１１記載の食品、飲料又は飼料。
【請求項１３】
血中の中性脂肪値上昇抑制作用を有する請求項１１記載の食品、飲料又は飼料。
【請求項１４】
飲食後における血液の恒常性維持作用を有する請求項１１〜１３いずれか１項に記載の食品、飲料又は飼料。
【請求項１５】
海藻類を還元性物質の存在下で抽出して得られるフコイダン。
【請求項１６】
還元性物質がアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、エリソルビン酸、エリソルビン酸塩、システイン及びグルタチオンからなる群より選択される１つ以上の還元性物質である請求項１５記載のフコイダン。
【請求項１７】
抽出が温水又は溶剤を用いて行われるものである請求項１５又は１６記載のフコイダン。
【請求項１８】
抽出が３０℃〜１３０℃において５分間〜３２時間行われるものである請求項１５〜１７いずれか１項に記載のフコイダン。
【請求項１９】
海藻類が予めプロテアーゼ処理されたものである、及び／又は抽出工程においてプロテアーゼ処理されるものである請求項１５〜１８いずれか１項に記載のフコイダン。
【請求項２０】
フコイダンが請求項１５〜１９いずれか１項に記載のフコイダンである請求項１〜７いずれか１項に記載の生体の恒常性維持剤。
【請求項２１】
フコイダンが請求項１５〜１９いずれか１項に記載のフコイダンである請求項８〜１４いずれか１項に記載の食品、飲料又は飼料。
【請求項２２】
海藻類を還元性物質の存在下で抽出して得られる海藻類抽出物。
【請求項２３】
フコイダンを含有してなる請求項２２記載の海藻類抽出物。
【請求項２４】
還元性物質がアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、エリソルビン酸、エリソルビン酸塩、システイン及びグルタチオンからなる群より選択される１つ以上の還元性物質である請求項２２又は２３記載の海藻類抽出物。
【請求項２５】
抽出が温水又は溶剤を用いて行われるものである請求項２２〜２４いずれか１項に記載の海藻類抽出物。
【請求項２６】
抽出が３０℃〜１３０℃において５分間〜３２時間行われるものである請求項２２〜２５いずれか１項に記載の海藻類抽出物。
【請求項２７】
海藻類が予めプロテアーゼ処理されたものである、及び／又は抽出工程においてプロテアーゼ処理されるものである請求項２２〜２６いずれか１項に記載の海藻類抽出物。
【請求項２８】
請求項１５〜１９いずれか１項に記載のフコイダン及び／又は請求項２２〜２７いずれか１項に記載の海藻類抽出物を含有してなることを特徴とする食品、飲料、調味料又は飼料。
【請求項２９】
請求項１５〜１９いずれか１項に記載のフコイダン及び／又は請求項２２〜２７いずれか１項に記載の海藻類抽出物を含有してなることを特徴とする化粧料。
【請求項３０】
請求項１５〜１９いずれか１項に記載のフコイダン及び／又は請求項２２〜２７いずれか１項に記載の海藻類抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とする医薬。
【請求項３１】
コレステロール低下用医薬、血液清澄用医薬、抗血液凝固用医薬、抗がん用医薬、抗エイズウイルス用医薬、又は抗潰瘍用医薬である請求項３０記載の医薬。
【請求項３２】
海藻類を還元性物質の存在下で抽出する工程を包含することを特徴とするフコイダンの製造方法。
【請求項３３】
還元性物質がアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、エリソルビン酸、エリソルビン酸塩、システイン及びグルタチオンからなる群より選択される１つ以上の還元性物質である請求項３２記載のフコイダンの製造方法。
【請求項３４】
抽出を温水又は溶剤を用いて行う請求項３２又は３３記載のフコイダンの製造方法。
【請求項３５】
抽出を３０℃〜１３０℃において５分間〜３２時間行う請求項３２〜３４いずれか１項に記載のフコイダンの製造方法。
【請求項３６】
海藻類を予めプロテアーゼ処理する、及び／又は抽出工程においてプロテアーゼ処理する請求項３２〜３５いずれか１項にフコイダンの製造方法。
【請求項３７】
海藻類を還元性物質の存在下で抽出する工程を包含することを特徴とする海藻類抽出物の製造方法。
【請求項３８】
海藻類抽出物がフコイダンを含有してなるものである請求項３７記載の海藻類抽出物の製造方法。
【請求項３９】
還元性物質がアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、エリソルビン酸、エリソルビン酸塩、システイン及びグルタチオンからなる群より選択される１つ以上の還元性物質である請求項３７又は３８記載の海藻類抽出物の製造方法。
【請求項４０】
抽出を温水又は溶剤を用いて行う請求項３７〜３９いずれか１項に記載の海藻類抽出物の製造方法。
【請求項４１】
抽出を３０℃〜１３０℃において５分間〜３２時間行う請求項３７〜４０いずれか１項に記載の海藻類抽出物の製造方法。
【請求項４２】
海藻類を予めプロテアーゼ処理する、及び／又は抽出工程においてプロテアーゼ処理する請求項３７〜４１いずれか１項に記載の海藻類抽出物の製造方法。
【請求項４３】
請求項３２〜３６いずれか１項において記載の工程及び／又は請求項３７〜４２いずれか１項において記載の工程を包含することを特徴とする食品、飲料、調味料又は飼料の製造方法。
【請求項４４】
請求項３２〜３６いずれか１項において記載の工程及び／又は請求項３７〜４２いずれか１項において記載の工程を包含することを特徴とする化粧料の製造方法。
【請求項４５】
請求項３２〜３６いずれか１項において記載の工程及び／又は請求項３７〜４２いずれか１項において記載の工程を包含することを特徴とする医薬の製造方法。
【請求項４６】
医薬がコレステロール低下用医薬、血液清澄用医薬、抗血液凝固用医薬、抗がん用医薬、抗エイズウイルス用医薬、又は抗潰瘍用医薬である請求項４５記載の医薬の製造方法。
【請求項４７】
無臭性又は海藻臭の低減された請求項１５〜１９いずれか１項に記載のフコイダン。
【請求項４８】
無色性又は海藻由来の緑褐色の低減された請求項１５〜１９いずれか１項に記載のフコイダン。
【請求項４９】
無臭性又は海藻臭の低減された請求項２２〜２７いずれか１項に記載の海藻類抽出物。
【請求項５０】
無色性又は海藻由来の緑褐色の低減された請求項２２〜２７いずれか１項に記載の海藻類抽出物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体の恒常性維持作用を有する医薬、食品、飲料または飼料に関する。
また、本発明は、風味が改善されたフコイダン及び海藻類抽出物、当該フコイダン及び／又は海藻類抽出物を含有する食品、飲料、調味料、飼料、化粧料又は医薬、及びそれらの製造方法に関する。
背景技術
海藻類には褐藻類、緑藻類、紅藻類などがある。このうち褐藻類には、コンブ、ワカメ、モズク、ヒジキ等、味も良く健康にも良いとされる海藻が多く、古くから人類の食物として大量に利用されてきた。これらの褐藻類は毎日かなりの量を摂取しても、みるべき障害がでないことから、食品としての安全性は極めて高い。また褐藻類は中国においてがんの治療薬として使われ、多くの研究者が褐藻類から抗がん作用を示す物質を同定しようと試みてきた。褐藻類からの熱水抽出物中に存在するフコイダンは硫酸化フコースを含有する硫酸化多糖の一種である。天然のフコイダンは分子量が数十万あるいはそれ以上あり、親水性の高い硫酸基と、疎水性の高いメチル基など相反する性質の化学構造を併せ持つため、海藻に含まれる様々な成分を吸着し易く、精製が非常に困難な物質である。近年、フコイダンの生理機能として、抗がん作用、アポトーシス誘発作用、血圧低下作用、抗アレルギー作用等が明らかになってきていることから、その有用性は高まってきており、医薬品および健康食品としての用途開発が期待されている。また、フコイダンは、食品、飲料、飼料、化粧料又は医薬の有効成分としてこれらの生理機能を十分に発揮することから、簡便で高効率な高純度フコイダンの調製方法の開発が望まれている。
また、海藻類は、食材や調味料のだしとして一般に多用されている。例えば、食用として根コンブを軽く水洗いし、水中に入れ１２時間程抽出して、コンブのエキスが出たコンブ水として用いたり、またコンブだしを取るため、温水で煮て、旨味であるグルタミン酸に富むだしを調製したりする。海藻類はアミノ酸、ミネラル類や粘質多糖を含み、これらの成分を抽出して食品や調味料へ利用している。しかし、海藻類には苦味成分が含まれており、水や温水抽出で液部へ溶出される。また、これ以外にも海藻類に特有な香り成分や味成分があり、また煮出し時に着色成分がさらに増加する。海藻類の抽出は冷水及び温水においても、粘質多糖、ミネラル類やヨード分、及び海藻臭が抽出液へ移行するので、苦味や過度にヨードが抽出され、食材としての使用においても、海藻臭が好まれない食品や調味料としては使用しづらい。現代人の健康には、粘質多糖やミネラル類を摂取することは重要であり、海水飲料が好まれて飲用されているが、嗜好の面からは苦味を軽減させる事が重要で、特に海藻臭を防止した食品、飲料及び調味料の開発が望まれている。
苦味、渋味及び過度の着色成分の除去は、一般に用いられている化学反応によるイオン交換樹脂や物理的吸着による活性炭処理等が汎用され効果を示すが、これらの方法は、海藻類の本来の香味成分も過度に除去され、着色の色彩も変化する。従って、手作りの海藻類の水抽出物や煮出し汁の香味からかけ離れた品質、風味となる。その結果、素朴な手作り感を残した、本格的な海藻類抽出液が得られず、それを生かした食品、飲料、調味料又は飼料も知られていない。
発明の開示
本発明はフコイダンの新たな生理作用を見出すことにあり、その目的はフコイダン、その分解物又はそれらの塩を利用した、生体の恒常性維持作用を有する生体の恒常性維持剤、食品、飲料または飼料を提供することにある。
また、本発明の目的は、着色が少なく、苦味やヨード含量が軽減され、フレッシュ感のある、風味が改善されたフコイダン及び海藻類抽出物、当該フコイダン及び／又は海藻類抽出物を含有する食品、飲料、調味料、飼料、化粧料又は医薬、及びそれらの効率的な製造方法を提供することにある。
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕　フコイダン、その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される１つ以上を有効成分として含有することを特徴とする生体の恒常性維持剤、
〔２〕　フコイダン、その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される１つ以上を含有することを特徴とする生体の恒常性維持用の食品、飲料又は飼料、
〔３〕　海藻類を還元性物質の存在下で抽出して得られるフコイダン、
〔４〕　海藻類を還元性物質の存在下で抽出して得られる海藻類抽出物、
〔５〕　前記〔３〕記載のフコイダン及び／又は前記〔４〕記載の海藻類抽出物を含有してなることを特徴とする食品、飲料、調味料又は飼料、
〔６〕　前記〔３〕記載のフコイダン及び／又は前記〔４〕記載の海藻類抽出物を含有してなることを特徴とする化粧料、
〔７〕　前記〔３〕記載のフコイダン及び／又は前記〔４〕記載の海藻類抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とする医薬、
〔８〕　海藻類を還元性物質の存在下で抽出する工程を包含することを特徴とするフコイダンの製造方法、
〔９〕　海藻類を還元性物質の存在下で抽出する工程を包含することを特徴とする海藻類抽出物の製造方法、
〔１０〕　前記〔８〕において記載の工程及び／又は前記〔９〕において記載の工程を包含することを特徴とする食品、飲料、調味料又は飼料の製造方法、
〔１１〕　前記〔８〕において記載の工程及び／又は前記〔９〕において記載の工程を包含することを特徴とする化粧料の製造方法、ならびに
〔１２〕　前記〔８〕において記載の工程及び／又は前記〔９〕において記載の工程を包含することを特徴とする医薬の製造方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の第１の態様は、フコイダン、その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される１つ以上を有効成分として含むことを１つの大きな特徴とする、生体の恒常性維持剤、生体の恒常性維持用の食品、飲料ならびに飼料を提供するものである。本発明の所望の効果の発現は、本発明者らが見出した当該有効成分により発揮される生体の恒常性維持作用に基づくものである。
本明細書において、かかる生体の恒常性維持作用とは、すなわち、生体を維持するために、生命維持の機能を一定の状態に維持する作用をいうものであり、特に肝機能の恒常性維持作用および血液の恒常性維持作用をいう。それらの作用の詳細については後述する。なお、維持には、一定の状態を保つ、という意の他、一定の状態を保つように調節する、という意を含む。
本発明において有効成分として使用するフコイダンとは硫酸化フコースを構成成分として含む硫酸化フコース含有多糖であり、生体の恒常性維持作用を有していればよく、特に限定はない。例えば、藻類、例えば、ガゴメコンブ、トロロコンブ、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、ジャイアントケルプ、レッソニア　ニグレセンス、モズク、オキナワモズク、ヒバマタ、アスコフィラム　ノドッサム等のコンブ目、ナガマツモ目、ヒバマタ目等の褐藻類に属する海藻は特に生体の恒常性維持作用を有するフコイダンを多く含んでおり、原料として好適である。また、原料としては棘皮動物、例えばナマコ、ウニ、ヒトデ等を用いてもよく、それらに由来するフコイダンも好適に使用することができる。中でも、コンブ目の海藻は優れた生体の恒常性維持作用を有するフコイダンを多く含んでおり、原料としてより好適である。従って、本発明の有効成分として使用されるフコイダンとしては藻類由来または棘皮動物由来のものが好ましく、褐藻類由来のものがより好ましい。
これらのフコイダンの調製はそれぞれ公知の方法で行えば良く、粗調製物、精製物又はいくつかの分子種に分けたフコイダン等を本発明に使用することができる。
例えばガゴメコンブからフコイダンを調製し、該フコイダンからグルクロン酸含有フコイダン（以下、Ｕ−フコイダンと称す）とグルクロン酸非含有フコイダン（以下、Ｆ−フコイダンと称す）を分離することができ、本発明の有効成分としてそれぞれのフコイダンを使用することが出来る。また、ガゴメコンブから硫酸化フコガラクタン（以下、Ｇ−フコイダンと称す）を調製し、使用することができる。
Ｕ−フコイダン及びＦ−フコイダンは、例えばガゴメコンブからフコイダンを調製後、陰イオン交換樹脂、界面活性剤等を用いて分離される。ガゴメコンブ由来のＵ−フコイダン及びＦ−フコイダンの存在比は約１：２であり、Ｕ−フコイダンはフコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸等を含み、硫酸含量は約２０％、Ｆ−フコイダンはフコースとガラクトースを含み、硫酸含量は約５０％、分子量は両物質共に約２０万を中心に分布している（第１８回糖質シンポジウム要旨集、第１５９頁、１９９６年）。
例えばガゴメコンブから調製したフコイダン溶液をＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにアプライ後、塩化ナトリウム含有緩衝液にて濃度勾配法により溶出させることにより、Ｕ−フコイダンとＦ−フコイダンに分離することができる。第１図にその１例を示す。すなわち第１図はＵ−フコイダンとＦ−フコイダンの分離を示す図であり、図中前ピークがＵ−フコイダン、後ピークがＦ−フコイダンである。
また例えばモズク由来フコイダン、オキナワモズク由来フコイダン、ワカメ由来フコイダン、ワカメ　メカブ由来フコイダン、ヒバマタ由来フコイダンもそれぞれ公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。
フコイダンを含有するナマコとしては、例えば特開平４−９１０２７号公報に記載のナマコがあり、当該公報記載の方法にてナマコよりフコイダンを調製することができる。また、市販のフコイダンを使用することもできる。また、上記フコイダンは所望により適宜硫酸化して使用することもでき、硫酸化の方法は公知の方法に従えばよい。
本発明において有効成分として使用するフコイダンの分解物（以下、本発明の分解物と称することがある）は、酵素学的方法、化学的方法、物理学的方法等の公知の方法にてフコイダンを分解し、生体の恒常性維持作用を指標として所望の分解物を選択することにより得られる。また、本発明で使用するフコイダンの分解物は所望により適宜硫酸化して使用することもでき、硫酸化の方法は公知の方法に従えばよい。
本発明で使用するフコイダンの分解物の調製方法としては、例えば酸分解法があり、当該フコイダンを酸分解することにより、生体の恒常性維持作用を有する分解物を調製することができる。
本発明で使用するフコイダンの酸分解条件は、生体の恒常性維持作用を有する分解物が生成する条件であれば、特に限定はない。例えばフコイダンを酸水溶液等に溶解または懸濁し、酸分解反応を行うことにより、本発明の分解物が生成する。また、反応時に加熱することにより、本発明の分解物の生成に必要な時間が短縮される。フコイダンの酸分解に使用できる酸としては、特に限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が挙げられる。
酸の濃度も特に限定はないが、好ましくは０．０００１〜５規定、より好ましくは０．０１〜１規定程度の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定は無いが、好ましくは０〜２００℃、より好ましくは２０〜１３０℃に設定すれば良い。
また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒〜数日間に設定すれば良い。酸の種類と濃度、反応温度及び反応時間は、本発明の分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。例えば、本発明の分解物の製造に際しては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸を使用し、酸の濃度は数１０ｍＭ〜数Ｍ、加熱温度は５０〜１１０℃、好適には７０〜９５℃、加熱時間は数分〜２４時間の範囲から適宜選択することにより、本発明の分解物を調製することができる。フコイダンの酸分解物としてはガゴメコンブ由来フコイダンの酸分解物が例示され、当該分解物は生体の恒常性維持作用を有する食物繊維としても使用することができる。
本発明の分解物は、生体の恒常性維持作用を指標として分画することができ、例えば酸分解物をゲルろ過法、分子量分画膜による分画法等により分子量分画することができる。
ゲルろ過法の例としては、セルロファインＧＣＬ−３００（生化学工業社製）を使用し、例えば分子量２５０００超、分子量２５０００〜１００００超、分子量１００００〜５０００超、分子量５０００以下等の任意の分子量画分を調製でき、セルロファインＧＣＬ−２５（生化学工業社製）を用い、例えば分子量５０００以下の画分を分子量５０００〜３０００超、分子量３０００〜２０００超、分子量２０００〜１０００超、分子量１０００〜５００超、分子量５００以下等の任意の分子量画分に調製することができる。
また、本発明の分解物は、限外ろ過膜を用いて工業的に分子量分画を行うことができ、例えばダイセル社製ＦＥ１０−ＦＵＳＯ３８２を用いることにより分子量３００００以下の画分を、同ＦＥ−ＦＵＳ−Ｔ６５３を使用することによって分子量６０００以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を用いることにより分子量５００以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合せることにより、任意の分子量画分を調製することができる。
本発明に使用できる生体の恒常性維持作用を有するフコイダンの分解物としては、下記式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される化合物が例示され、これらの化合物は国際公開第９７／２６８９６号パンフレット、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット、国際公開第００／５０４６４号パンフレットに記載の方法で調製することができる。また、本発明の分解物としては、国際公開第９７／２６８９６号パンフレット、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット、国際公開第００／５０４６４号パンフレットに記載のフコイダンの分解物も例示される。
2002022140.tif 000002
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３である。）
2002022140.tif 000003
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
2002022140.tif 000004
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
2002022140.tif 000005
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
なお、式（Ｉ）で表される化合物の例としては後述の式（Ｖ）で表される化合物が、式（ＩＩ）で表される化合物の例としては後述の式（ＶＩ）および式（ＶＩＩ）で表される化合物が、式（ＩＩＩ）で表される化合物の例としては後述の式（ＶＩＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
式（Ｉ）で表される化合物は、例えば前出Ｆ−フコイダンを、アルテロモナス　ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７４７）が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン特異的分解酵素）で分解し、得られた分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（Ｉ）で表される化合物の多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、例えば前出Ｕ−フコイダンを、フラボバクテリウム　ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０２）が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン特異的分解酵素）を用いて分解し、得られた分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には各々式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
ガゴメコンブ由来フコイダンをアルテロモナス　ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７４７）が産生するＦ−フコイダン特異的分解酵素、及びフラボバクテリウム　ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０２）が産生するＵ−フコイダン特異的分解酵素で分解し、得られた分解物を精製して、前出Ｇ−フコイダンを調製することができる。
前記フラボバクテリウム　ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０２）はこのＧ−フコイダンを特異的に分解するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｇ−フコイダン特異的分解酵素）をも産生する。当該Ｇ−フコイダン特異的分解酵素をＧ−フコイダンに作用させることにより、当該Ｇ−フコイダンの分解物を調製し、目的に応じて分解物を精製し、当該分解物中より本発明において有効成分として使用しうる分解物を調製することもできる。式（ＩＶ）で表される化合物はその例である。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ＩＶ）で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
なお、上記各酵素については、国際公開第９７／２６８９６号パンフレット又は国際公開第００／５０４６４号パンフレットに記載されている。また、上記のＦ−フコイダン特異的分解酵素、Ｕ−フコイダン特異的分解酵素、Ｇ−フコイダン特異的分解酵素はそれぞれ公知の方法でこれらの遺伝子を単離し、組み換え体を作製して酵素を調製し、使用することもできる。例えば、Ｆ−フコイダン特異的分解酵素及びＵ−フコイダン特異的分解酵素については国際公開第９９／１１７９７号パンフレット記載の方法で組み換え体より調製し、使用することもできる。
前記フコイダンの特定の分画物、特にＦ−フコイダン、Ｕ−フコイダン、Ｇ−フコイダンはその基本構造が初めて明確となったフコイダン分画物であり、各分画物に特異的に作用する酵素を用いて調製される各分解物、特にその分解物の分画物、例えば上記式（Ｉ）〜式（ＩＶ）等の化合物は、フコイダンと比較して分子量が小さく、かつフコイダンと同等の生理活性を有するという点において、構造、組成、物性が不明確な単に分離されたフコイダンもしくはフコイダン含有物に比べて顕著に優れる。
本発明において有効成分として使用されるフコイダンまたはその分解物の塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基等との塩が例示される。例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、またはジエタノールアミン、エチレンジアミン等との塩が挙げられる。これらの塩は、例えば、フコイダン等に存在する硫酸基やカルボキシル基を公知の方法により塩に変換することで得られる。かかる塩としては薬理学的に許容されうる塩が好ましい。
さらに、本発明の第１の態様においては、後述する本発明の第２の態様の説明において詳細に記載する、本発明の海藻類抽出物の製造方法に従って得られうるものであって、生体の恒常性維持作用を有するフコイダン、ならびにその分解物及びそれらの塩を有効成分として好適に使用することができる。当該フコイダンは、所望の原料より還元性物質の存在下に抽出することによる、高純度かつ高収率なフコイダンの製造方法により得られるもので、従来のフコイダンの製造方法により得られるフコイダンと比較して外観の色が薄く、海藻臭も低減されているという性質を有しており、本発明の態様における有効成分としてより好ましいものである。当該フコイダンの製造方法は、原料として前記したような、フコイダンを含有することが知られる、またはフコイダンを含有すると考えられる海藻類（好適には褐藻類）を用いることを除いて、原料の処理条件や原料からの目的物質の抽出条件等は、後述の海藻類抽出物の製造方法と同様である。当該フコイダン（以下、還元抽出フコイダンという場合がある）及びその製造方法は本発明に包含される。
なお、本発明の有効成分の生体の恒常性維持作用の発現は後述の実施例に記載の方法により評価することができる。例えば、肝機能の恒常性維持作用については実施例１〜４に記載の方法により評価することができる。また、血液の恒常性維持作用については実施例５〜６に記載の方法により評価することができる。
本発明の第１の態様における、医薬としての生体の恒常性維持剤は、生体の恒常性の変調によって生ずる疾患や病態（あるいは生体の恒常性維持を要する疾患や病態）を、前記有効成分の生体の恒常性維持作用により予防又は治療する医薬など、当該作用に基づいて薬理効果を発揮する全ての医薬を包含するものである。中でも、当該有効成分は、肝機能の恒常性維持作用及び血液の恒常性維持作用に優れており、本発明の態様において好適には、肝機能障害の治療剤又は予防剤としての、あるいは血液の恒常性維持剤としての、生体の恒常性維持剤が提供される。
本発明の有効成分が有する肝機能の恒常性維持作用とは、具体的には肝機能障害の治療又は予防作用をいうものであり、従って、本発明の恒常性維持剤は肝機能の恒常性の変調によって生ずる疾患や病態、特に肝機能障害の治療又は予防に有効である。
肝機能障害の治療剤又は予防剤としての、本発明の恒常性維持剤（以下、本発明の肝機能障害の治療剤または予防剤と称することがある）の治療又は予防の対象となる肝機能障害としては、特に限定はないが、例えば急性肝炎、劇症肝炎、アルコール性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝がん等が例示され、好適には肝線維化を伴う疾患である慢性肝炎、アルコール性肝炎または肝硬変が例示される。さらに、これらの障害を経て発症する肝がんも肝線維化を伴う疾患として包含される。
肝線維化は慢性肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変において見られる肝臓にコラーゲンなどの結合組織の増生及び蓄積をきたした病態である。従って、肝線維化を抑制することで前記疾患の治療または予防を行うことができる。一方、慢性肝炎、肝硬変が悪化すると肝がんへと進行する危険率が高くなる。このことから肝線維化を抑制することは肝がんの治療又は予防においても極めて有用である。
また、これらの肝機能障害の原因因子としては、特に限定はなく、ウィルス、自己免疫、薬物、アルコール、栄養障害、先天性代謝異常、循環障害等の原因因子があり、これらのいずれの原因による肝機能障害についても、本発明の恒常性維持剤を使用することができる。また、本発明の有効成分は後述の実施例３及び４に示すように、アルコール性の肝機能障害に対しても特に有用である。
一方、本発明の有効成分が有する血液の恒常性維持作用とは、例えば生活習慣病（特に糖尿病、肥満症、高脂血症）の原因となる血糖値や血中の中性脂肪値の上昇を抑制する、あるいは上昇した血糖値や血中の中性脂肪値を低下させる、等の作用、すなわち、血糖値上昇抑制作用や血中の中性脂肪値上昇抑制作用等をいうものである。なお、抑制には調節の意を含む。本発明の有効成分は、特に血液の恒常性維持作用として具体的に記載した前記作用に優れ、従って、本発明により、それらの作用を有する生体の恒常性維持剤が提供される。当該恒常性維持剤によれば、血糖値や血中の中性脂肪値の上昇を抑制し、もしくは上昇した血糖値や血中の中性脂肪値を低下させ、生活習慣病、特に糖尿病、肥満症、高脂血症の予防又は治療を行うことができる。また、本発明の有効成分は飲食後における血糖値および血中の中性脂肪値の上昇を抑制する作用をも有しており、それゆえ、本発明により、飲食後の血液の恒常性維持剤としての生体の恒常性維持剤が提供される。かかる恒常性維持剤は、食事制限される糖尿病患者、肥満症患者、高脂血症患者の治療又は予防にとって非常に有用である。なお、本明細書において中性脂肪としてはモノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリド等が例示される。
次に、本発明の恒常性維持剤の製造方法について説明する。本発明の生体の恒常性維持剤は、フコイダン、その分解物、及びそれらの塩からなる群より選択される一つ以上を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せて製剤化すれば良い。当該製剤の製造は一般的には、本発明の有効成分を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、これを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、外用剤とすることもできる。
医薬用担体は、本発明の恒常性維持剤の投与形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、所望により殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製することができる。
外用剤としては、経皮投与用の固体、半固体又は液状の製剤が含まれる。また、座剤等も含まれる。例えば、乳剤、ローション剤等の乳濁剤、外用チンキ剤等の液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏等の軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤等の経皮投与用の貼付剤等とすることもできる。
本発明の恒常性維持剤は、適宜、製薬分野における公知の方法により製造することができる。該恒常性維持剤における有効成分の含有量は、投与形態、投与方法等を考慮し、当該製剤を用いて好ましくは後述の投与量範囲で当該有効成分を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。
本発明の生体の恒常性維持剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与することができる。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
本発明の生体の恒常性維持剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではないが、一般には製剤中に含有される有効成分の量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の恒常性維持剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。また、フコイダン、その分解物、及び／又はそれらの塩を生体の恒常性維持用飲食品の原料として用いても良い。
また、本発明の有効成分として使用する、フコイダン、その分解物及び／又はそれらの塩は、その生体の恒常性維持作用により、生体の恒常性維持に関する、例えば肝機能障害の発生、血糖値上昇もしくは血中の中性脂肪値上昇抑制のメカニズムの研究や、肝機能改善剤、血糖値上昇抑制剤、血中の中性脂肪値上昇抑制剤のスクリーニングにも有用である。
また、本発明の別の態様として、本発明の前記有効成分を個体に投与する、生体の恒常性維持方法を提供する。かかる方法は、肝機能障害の治療又は予防、あるいは血液の恒常性維持にとって特に有用である。個体に投与するフコイダンとしては藻類由来又は棘皮動物由来であるものが好ましく、藻類としては褐藻類であるのが好ましい。また、特に前記還元抽出フコイダンを投与するのが好適である。なお、個体とは哺乳動物、中でもヒトである。
かかる方法は、例えば、生体の恒常性維持が必要であると予想される、またはその必要のあるヒトに対し、前記有効成分を、好ましくは本発明の恒常性維持剤として投与することにより行うことができる。有効成分の投与方法、投与量等は、当該有効成分の投与に使用する本発明の恒常性維持剤の投与方法、投与量などに従えばよい。なお、本態様においては、後述する食品、飲料または飼料を用いることもできる。
続いて、本発明の有効成分を含有してなる本発明の食品、飲料または飼料（以下、本発明の生体の恒常性維持用食品、飲料または飼料と称することがある）を説明する。本発明の食品、飲料または飼料は、有効成分の有する生体の恒常性維持作用により、当該有効成分に感受性を示す生体の恒常性維持に有効であり、従って、恒常性維持を要する疾患の改善、予防に極めて有用である。本発明により、前記恒常性維持剤と同様の作用及び効果を有する、食品、飲料又は飼料が提供される。好適な態様についても前記恒常性維持剤と同様である。
なお、本発明の食品、飲料または飼料にいう「含有」の語は、含有、添加、希釈の意を含むものであり、含有とは食品、飲料または飼料中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、添加とは食品、飲料または飼料の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、希釈とは本発明で使用される有効成分に、食品、飲料または飼料の原料を添加するという態様をいうものである。
本発明の生体の恒常性維持用の食品または飲料の製造法は、特に限定はないが、調理、加工及び一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品または飲料に生体の恒常性維持作用を有するフコイダン、その分解物、及び／又はそれらの塩が有効成分として含有、添加及び／又は希釈されていれば良い。
本発明の生体の恒常性維持用食品又は飲料とは、特に限定はないが、例えば穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥又は濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
本発明の食品又は飲料における本発明の有効成分の含有量は特に限定されず、その官能と作用発現の観点から適宜選択できるが、例えば、食品１００重量部当たり好ましくは０．０００１重量部以上、より好ましくは０．００１〜１０重量部であり、たとえば、飲料１００重量部当たり好ましくは０．０００１重量部以上、より好ましくは０．００１〜１０重量部である。
また、本発明により、本発明の有効成分を含有、添加及び／又は希釈してなる生物用の飼料が提供される。また、本発明の別の一態様として、前記有効成分を生物に投与することを特徴とする生物の飼育方法が提供される。さらに本発明の別の一態様として、前記有効成分を含有することを特徴とする生物飼育用剤が提供される。
これらの発明において、生物とは例えば養殖動物、ペット動物等であり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類又は貝類が例示される。飼料としては体調の維持及び／又は改善用飼料が例示される。生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。
これらの発明によれば、それらを適用する前記例示するような生物において、本発明の有効成分が有する生体の恒常性維持作用に基づき、本発明の前記恒常性維持剤と同様の効果が期待できる。
本発明の飼料において、本発明で使用される前記有効成分は通常、対象生物の体重１ｋｇ、１日当たり０．０１〜２０００ｍｇ投与される。投与は、例えば、当該有効成分を、人工配合飼料の原料中に添加混合して調製した飼料を用いて行う、または人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料とさらに添加混合して調製した飼料を用いて行うことができる。生物用の飼料中の本発明の有効成分の含有量は特に限定はなく、目的に応じて設定すれば良いが、好ましくは０．００１〜１５重量％の割合が適当である。
人工配合飼料としては、魚粉、カゼイン、イカミールなどの動物性原料、大豆粕、小麦粉、デンプン等の植物性原料、飼料用酵母等の微生物原料、タラ肝油、イカ肝油等の動物性油脂、大豆油、菜種油等の植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、抗酸化剤等を原料とする人工配合飼料が挙げられる。また魚肉ミンチ等の魚類用飼料が挙げられる。
本発明の飼料の製造方法に特に限定はなく、一般の飼料の製法に準じて製造することができ、製造された飼料中に本発明の有効成分の有効量が含有、添加及び／又は希釈されていればよい。
また、本発明の有効成分をプール、水槽、保持タンク又は飼育領域の水、海水等に直接、添加し、対象生物を浸漬することにより、投与することもできる。この浸漬方法は対象生物の飼料摂取量が低下したときに特に有効である。本発明の有効成分の水又は海水中の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、好ましくは０．００００１〜１重量％の割合が適当である。
また、本発明の有効成分を含有する飲料を飼育用飲料として対象生物に摂取させても良い。飲料中の本発明の有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて適宜設定すれば良いが、好ましくは０．０００１〜１重量％の割合が適当である。本発明の有効成分を含んでなる生物飼育用剤、例えば浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤はそれ自体公知の方法で調製すれば良い。該生物飼育用剤における有効成分の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
本発明の前記飼料等が適用できる生物としては限定はないが、前記養殖動物としては、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマ等の家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物、鶏、アヒル、七面鳥、ダチョウ等の家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミ等の甲殻類等、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキ等の貝類が、ペット動物としてはイヌ、ネコ等が挙げられ、陸上・水中動物に広く適用できる。
本発明により提供される、本発明の有効成分を生物に投与する生物の飼育方法は、例えば、前記飼料及び／又は生物用飼育用剤を、それらにより本発明の所望の効果が得られうるように投与対象の生物に対し投与することにより行うことができる。
本発明の飼料を摂取させること、又は本発明の有効成分の含有液に対象生物を浸漬することにより、家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類、貝類、ペット動物等の体調を良好に維持したり改善させたりすることができる。
本発明の生体の恒常性維持用食品、飲料または飼料としては、有効成分としての生体の恒常性維持作用を有するフコイダン、その分解物及び／又はそれらの塩が含有、添加及び／又は希釈されており、その作用を発現させるための必要量が含有されていれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の経口的に摂取可能な形状物も包含する。なお、本発明の有効成分は、生体の恒常性維持作用と食物繊維機能とを合わせ持つ健康食品素材として、食品、飲料または飼料の製造素材として極めて有用である。
さらに、本発明の一態様として、生体の恒常性維持のための薬剤を製造するための、フコイダン、その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される一つ以上の使用を提供する。
本発明の第２の態様は、着色が少なく、苦味やヨード含量が軽減され、フレッシュ感のある、風味が改善されたフコイダン及び海藻類抽出物、当該フコイダン及び／又は海藻類抽出物を含有する食品、飲料、調味料、飼料、化粧料又は医薬、及びそれらの効率的な製造方法を提供するものである。本発明の態様において、食品、飲料、調味料、飼料、化粧料又は医薬に使用されるフコイダン及び海藻類抽出物は、本発明により提供される、フコイダン又は海藻類抽出物の製造方法により得られうるものである。当該フコイダン及び海藻類抽出物は海藻臭の原因となる成分、色素、タンパク質等が低減又は除去されたものであり、それぞれ好適には無臭性もしくは海藻臭の低減されたフコイダン及び海藻類抽出物、又は無色性もしくは海藻由来の緑褐色の低減されたフコイダン及び海藻類抽出物として提供され、原料素材として他の成分と混合して使用する場合に高濃度で使用しても風味などに影響がなく、他の成分の特徴を生かすことができる。また、後述するように、本発明のフコイダン又は海藻類抽出物の製造方法においてプロテアーゼを使用する場合、得られる本発明のフコイダン又は海藻類抽出物はアレルゲンとなり得るタンパク質が顕著に低減あるいは除去されており、アレルギー反応を回避させた食品、飲料、調味料、飼料、化粧料又は医薬の素材としても特に有用である。さらに、本発明のフコイダン及び海藻類抽出物はヨード（ヨウ素）含量が低減されており、ヨードの過剰摂取は体によくないと言われていることから、食品、飲料、調味料、飼料、化粧料又は医薬の素材として有用である。また、当該フコイダンを本発明の第１の態様に記載のフコイダンと同様に分解し、フコイダンの分解物として当該フコイダンと同様に使用することができる。
また、本発明のフコイダン及び海藻類抽出物は不純物が少ないので、再加工や、他の成分との酵素及び／又は化学反応を行う場合にも、その精製工程でタンパク質除去や不純物による副生成物の除去を軽減又は省略できるので、先駆物質としても使用に優れる。例えば、酵素や酸による水解によるオリゴ糖生成並びに化学合成への使用に好適である。さらに、原料素材としての不純物が少ないので、保存中に成分間の化学変化が生じにくく、成分品質の安定化が図れる。
本発明のフコイダン又は海藻類抽出物の色、タンパク質含量及びヨード含量は具体的には後述の実施例７又は１４に記載されるようにして測定することができる。色としては波長６６０ｎｍにおける吸光度が０．００１〜０．０３が好ましく、０．０１〜０．０２がより好ましい。タンパク質含量としては０．０１〜８ｇ／１００ｇが好ましく、０．１〜７ｇ／１００ｇがより好ましい。ヨード含量としては０．１〜５．５ｍｇ％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．２〜５ｍｇ％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
なお、本発明の態様において提供されるフコイダンは、化合物そのものとして、又はフコイダン画分、すなわちフコイダンと他成分を一部含む組成物として提供される。また、フコイダン、海藻類抽出物、およびその原料の量をいう場合、特段の事情がない限り乾燥重量をいう。
さらに、本発明のフコイダン及び海藻類抽出物は、それらについて知られる種々の生理作用を有するものであり、例えば、アポトーシス誘発作用、肝細胞増殖因子産生増強作用、サイトカイン産生調節作用、育毛作用、コレステロール低下作用、血液清澄作用、抗血液凝固作用、抗がん作用、抗エイズウイルス作用、ならびに抗腫瘍作用等を発現しうる。特に当該フコイダン及び海藻類抽出物は、そのコレステロール低下作用、血液清澄作用、抗血液凝固作用、抗がん作用、抗エイズウイルス作用、ならびに抗腫瘍作用に優れる。
従って、このような本発明のフコイダン及び／又は海藻類抽出物を含有してなる、本発明により提供される食品、飲料、調味料、飼料、化粧料又は医薬（以下、本発明の食品等という場合がある）は種々の点でヒトへの適用性に優れたものであり、フコイダン及び／又は海藻類抽出物の各種作用、特にコレステロール低下作用、血液清澄作用、抗血液凝固作用、抗がん作用、抗エイズウイルス作用、ならびに抗腫瘍作用に基づき、例えば、本発明の医薬によれば、上記作用に感受性を示す疾患の症状の改善もしくは緩和効果や、当該疾患の治療もしくは予防効果を期待できる。従って、本発明の医薬としては、好適にはコレステロール低下用医薬、血液清澄用医薬、抗血液凝固用医薬、抗がん用医薬、抗エイズウイルス用医薬、又は抗潰瘍用医薬が提供される。
本発明の食品等には前述の還元抽出フコイダンが使用される。また、本発明により提供される海藻類抽出物から得られるフコイダンを使用することもできる。一方、本発明の食品等に使用される当該海藻類抽出物は、具体的には以下に示す方法により得られうるものであり、当該海藻類抽出物及びその製造方法は本発明に包含される。
本発明の海藻類抽出物の製造方法は海藻類を還元性物質の存在下で抽出する工程を含むことを１つの大きな特徴とするものである。
原料としての海藻類は、藻類であればどのようなものでもよく、例えばヒバマタ目、アミジグサ目、コンブ目、ケヤリモ目、クロガシラ目、ムチモ目、ウイキョウモ目、カヤモノリ目、ナガマツモ目、イソガワラ目、シオミドロ目等の褐藻類（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）、イギス目、マサゴシバリ目、ウミゾウメン目、スギノリ目、カクレイト目、ダルス目、テングサ目等の紅藻類（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、ミル目、カサノリ目、アオサ目、イワズタ目等の緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）等が挙げられる。特に褐藻類が好ましく、褐藻類を本発明に使用した場合、機能性成分であるフコイダンを含む海藻類抽出物が得られ、さらに当該海藻類抽出物より還元抽出フコイダンを高純度、高収率で得ることもできる。このうちコンブ目のコンブ科及びチガイソ科が特に好ましい。コンブ科としては、例えばマコンブ、リシリコンブ、ホソメコンブ、ミツイシコンブ、ガゴメコンブなどを用いることができる。また、チガイソ科としては、例えばワカメ、ヒロメ、アオワカメなどを用いることができる。さらに、ワカメは葉状体とメカブ（胞子葉）のいずれか、もしくはいずれをも用いることができる。
本発明の海藻類抽出物の製造方法において、抽出前における原料の前処理の方法は特に限定はないが、単なる水洗、焙炒、焙煎、蒸しを通常の方法に従って行ってもよく、後述のようにプロテアーゼ処理を行ってもよく、又これらを組み合わせてもよい。前処理後の海藻類の形状は特に限定はないが、粉状、フレーク状、細片、角切りまたは薄片、そのままで使用すればよい。
本発明に用いる還元性物質は特に限定はないが、食用に供されるものが好ましく、還元の効果や味に及ぼす影響からアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、エリソルビン酸、エリソルビン酸塩、システイン及びグルタチオンからなる群より選ばれる１つ以上を使用することが好適である。ここで、アスコルビン酸塩及びエリソルビン酸塩はナトリウム、カリウム、カルシウム等の塩が好適である。使用する還元性物質の量は特に限定はないが、抽出に用いる溶媒１００重量部に対して好ましくは０．００５〜１．０重量部、より好ましくは０．０１〜０．１重量部である。
また、生産効率の観点から、海藻類からの海藻類抽出物の抽出は還元性物質存在下で温水又は溶剤を用いて行うのが好ましく、さらに海藻類をあらかじめプロテアーゼ処理した後に還元性物質存在下で温水又は溶剤抽出する、又は、海藻類を還元性物質存在下でプロテアーゼ処理しながら温水又は溶剤抽出するのがより好ましい。なお、温水の温度としては、後述する抽出温度内であるのが好ましい。
抽出方法には特に限定はなく、操作性の観点から、公知の温水浸漬法、温水散水法、または温水循環法が好ましいが、その他、超臨界抽出法により抽出を行うこともできる。
本発明における抽出条件は特に限定するものではなく、例えば、前記抽出方法において公知の条件に準じて抽出を行うことができる。
好適な態様では、原料として使用する海藻類（乾物）の重量は、抽出に用いる溶媒及び当該海藻類乾物の合計１００重量部に対し、生産効率の観点から、好ましくは０．５以上２５重量部未満であり、香味の点から、より好ましくは１〜１０重量部である。尚、０．５〜２５重量部の範囲で抽出後、得られた海藻類抽出物を濃縮して含有物の濃度を上昇させて使用することもでき、又は粉末化してもよい。更に、希釈して用いてもよい。抽出に用いる溶媒は特に限定はなく、無毒であれば可飲のものでもよい。例えば、水又は溶剤が適宜使用できる。溶剤としては有機及び無機のものが使用でき、例えばエチルアルコールやエチルアルコール水溶液等が挙げられる。また、例えば、超臨界抽出を行う場合には炭酸ガス等が挙げられる。取り扱いの容易性からは水を溶媒として好適に使用できる。抽出に用いる水は特に限定はなく、飲用に供されるものが好ましいが、中でも脱塩水、蒸留水が好ましく、水道水も使用できる。
抽出温度は、抽出効率の観点から、好ましくは３０〜１３０℃であり、より好ましくは７５〜１３０℃であり、特に好ましくは５０〜１００℃である。また、海藻類抽出物の官能的品質の観点から、さらに８０〜１００℃が好ましい。抽出時間は、生産効率の観点から、好ましくは５分間〜３２時間、より好ましくは０．２〜２４時間、さらに好ましくは０．５〜５時間である。このときの抽出液のｐＨは３〜７が好適である。また、抽出後のｐＨは３〜６前後が保存と香味保持の上から好ましい。海藻類からの抽出物を含む抽出液と抽出残渣との固液分離の方法は特に限定しないが、通常の濾別、遠心分離、または籠状の金網中に原料を入れ、抽出後、抽出残渣を回収することもできる。固液分離後の精製は、抽出液に可溶化している高分子成分を低温下（好ましくは１０℃以下０℃以上）で冷却し、これらの成分を常法の柿渋及び滓下げ剤を用いて凝集、沈澱させ、濾過することにより、清澄な液を得ることができる。濾過は好ましくは１μｍφ又は０．４５μｍφポアサイズメンブレンフィルターを用いて濾過すると良い。
プロテアーゼ処理、すなわち、原料である海藻類のプロテアーゼによる分解を行う場合に用いるプロテアーゼは特に限定はなく、動物、植物及び微生物起源のものが使用でき、例えば、動物起源のものとして、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン及びキモシンが挙げられ、植物起源のものとして、パパイン及びブロメラインが挙げられ、微生物起源のものとして、細菌、放線菌、麹菌、カビ及び担子菌由来の酸性、中性及びアルカリ性プロテアーゼが挙げられる。また、コラゲナーゼ、エステラーゼ及びケラチナーゼもここでいうプロテアーゼに包含される。また、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの少なくとも一つ以上とプロテアーゼを併用してもよい。
海藻類を前処理としてプロテアーゼ処理する場合、プロテアーゼの使用量は特に限定はないが、使用海藻類乾物１００重量部あたり、好ましくは０．０１〜１０重量部、より好ましくは０．０５〜５重量部である。溶媒は、所望の酵素反応を行いうるものであれば特に限定はないが、水又はエチルアルコール水溶液（エチルアルコール濃度、０〜５０容量％）が好適に使用できる。また、反応温度は、使用酵素によって特に限定はなく、好ましくは３０〜１２０℃であるが、作業上５０〜１００℃がより好ましい。反応時間は、反応温度によって適宜設定できるが、好ましくは０．１〜３２時間、より好ましくは０．２〜２４時間である。
一方、抽出過程においてプロテアーゼを添加し、プロテアーゼ処理をしながら抽出を行う場合、プロテアーゼの使用量は特に限定はないが、使用海藻類乾物１００重量部あたり、好ましくは０．０１〜１０重量部、より好ましくは０．０５〜５重量部である。
得られた海藻類抽出物は、例えば、１２０℃、２０秒間殺菌加熱後、濃縮、そのまま又は水で希釈してさらに無菌濾過して容器へ充填する。この時窒素ガス充填を行ってもよく、その後９０℃、１分間加熱殺菌して製品とすることができる。
本発明の抽出物の形状としては、特に限定はないが、液状、乾燥物等の固形状、粉末状でも良い。
さらに本発明の海藻類抽出物から公知の方法で還元抽出フコイダンを高収率に分離することができる。海藻類抽出物からの当該フコイダンの分離方法は、特に限定はなく、公知の高分子成分の分離方法であればよい。例えば、海藻類を還元性物質存在下でプロテアーゼ処理後、熱水又は溶剤抽出し、フィルタープレスで固液分離する。液部を限外フィルターで濃縮・脱塩後、ケイソウ土により濾過する。次いで、濾過液を濃縮機で濃縮し、殺菌をオートクレーブを用いて１２１℃、１５分間で行う。この濃縮液を凍結乾燥して本発明の還元抽出フコイダンを得ることができる。
さらに、得られたフコイダンを公知の方法により分解し、当該フコイダンの分解物を得ることができる。例えば、国際公開第９７／２６８９６号パンフレット、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット、国際公開第００／５０４６４号パンフレット記載の方法によりフコイダンの分解物を調製し、本発明の海藻類抽出物又はフコイダンと同様に使用することができる。これらのフコイダン分解物も本発明に包含される。
本発明の第２の態様において提供される食品、飲料、調味料、飼料、ならびに医薬の製造方法及びその使用態様は特に限定されるものではなく、それぞれ、例えば前記本発明の第１の態様において記載した食品、飲料、飼料、ならびに恒常性維持剤に準じればよい。一方、同様に提供される化粧料は、有効成分として含有するフコイダン及び／又は海藻類抽出物の公知の生理作用、例えば、皮膚の保湿性や弾力性の向上作用、皮膚の老化防止作用、抗アレルギー作用等を有しており、当該化粧料によれば、しわの改善・予防、皮膚の弾力性向上・維持、皮膚肥厚改善・予防等の効果が期待できる。その製造方法及び使用態様は特に限定するものではないが、例えば、以下の態様を挙げることができる。
当該化粧料における、本発明のフコイダン及び／又は海藻類抽出物の含有量は、通常、好ましくは０．０００１〜２０重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％、更に好ましくは０．０３〜３重量％である。
また、その他の成分として、化粧料分野において公知の各種成分を所望により含有せしめることができる。かかる成分としては、例えば、ピロリドンカルボン酸塩等の保湿剤、流動パラフィン、ワセリン等の皮膚柔軟剤、ビタミンＥ等のビタミン類、プロピレングリコールモノステアレート等の界面活性剤、ステアリルアルコール等の乳化安定剤、防腐剤、顔料、抗酸化剤、紫外線吸収剤等を挙げることができる。これらの成分は、本発明の所望の効果の発現を阻害しない範囲で、所望により当該成分の効果が期待されうる量で含有させればよい。
本発明の化粧料の形状としては、特に限定するものではなく、たとえば、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石ケン、浴用洗剤又は軟膏が好適である。
当該化粧料は、本発明のフコイダン及び／又は海藻類抽出物ならびに所望により前記その他の成分を原料として用い、化粧品分野における公知の方法に従って適宜製造することができる。また、化粧料の形状に応じ、適宜、所望の効果が得られるように使用すればよい。例えば、ローション類であれば、例えば、ヒトの顔面全体に適用するような場合、１回の使用当たり前記有効成分の量として、好ましくは０．０１〜５ｇ程度用いれば、肌に張りや艶を与え、美肌効果が得られうる。
さらに、本発明は、本発明の食品等の好適な製造方法を提供する。すなわち、本発明のフコイダンの製造方法における、海藻類を還元性物質の存在下で抽出する工程及び／又は本発明の海藻類抽出物の製造方法における、海藻類を還元性物質の存在下で抽出する工程を包含することを特徴とする、食品、飲料、調味料又は飼料の製造方法、化粧料の製造方法、ならびに医薬（好適には、コレステロール低下用医薬、血液清澄用医薬、抗血液凝固用医薬、抗がん用医薬、抗エイズウイルス用医薬、又は抗潰瘍用医薬）の製造方法を提供する。かかる方法は、食品、化粧料、医薬品等の公知の製造工程におけるいずれかの段階において、本発明のフコイダン及び／又は海藻類抽出物の製造工程を含むものである。前記食品等の原料であって、有効成分として働くフコイダン及び／又は海藻類抽出物の製造から最終の製品形態である食品等の製造を連続的に行うことで、本発明の食品等のより効率的な製造が可能となる。
なお、本発明に使用する、特に生体の恒常性維持作用を有するフコイダン、その分解物及び／又はそれらの塩、ならびに海藻類抽出物はラットへの経口投与において２ｇ／ｋｇを経口単回投与しても死亡例は認められない。
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、特段の事情がない限り実施例における％は重量％を意味する。
製造例１
（１）ガゴメコンブを充分乾燥後、乾燥物　２０ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕した。
水道水　９００リットルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製）７．３ｋｇを溶解し、次にガゴメコンブ粉砕物　２０ｋｇを混合した。液温１２℃から液温９０℃となるまで水蒸気吹込みにより４０分間昇温させ、次いで攪拌下９０〜９５℃に１時間保温し、次いで冷却し、冷却物　１１００リットルを得た。
次いで固液分離装置（ウエストファリアセパレーター社製ＣＮＡ型）を用い、冷却物の固液分離を行い、約９００リットルの固液分離上清液を調製した。
固液分離上清液　３６０リットルをダイセル社製ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２（分画分子量３万）を用い、２０リットルまで濃縮した。次いで水道水を２０リットル加え、また２０リットルまで濃縮するという操作を５回行い、脱塩処理を行い、ガゴメコンブ由来の抽出液　２５リットルを調製した。
該溶液１リットルを凍結乾燥し、ガゴメコンブ由来フコイダン乾燥物　１３ｇを得た。
（２）製造例１−（１）記載のフコイダン乾燥物　７ｇを、５０ｍＭ　塩化ナトリウムおよび１０％エタノールを含む２０ｍＭ　イミダゾール緩衝液（ｐＨ８．０）７００ｍｌに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム（φ１１．４ｃｍ×４８ｃｍ）を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩化ナトリウムの５０ｍＭから１．９５Ｍの濃度勾配により溶出させた（１フラクション：２５０ｍｌ）。フェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法にて、総糖量及びウロン酸含量を求め、溶出順にフラクション４３〜４９、フラクション５０〜５５、フラクション５６〜６７の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後、凍結乾燥し、フラクション４３〜４９よりＩ画分（３４０ｍｇ）、フラクション５０〜５５よりＩＩ画分（８７０ｍｇ）、フラクション５６〜６７よりＩＩＩ画分（２．６４ｇ）をそれぞれ調製した。
第１図にガゴメコンブ由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す。第１図において縦軸はカルバゾール硫酸法での５３０ｎｍの吸光度（図中黒丸）、フェノール硫酸法での４８０ｎｍの吸光度（図中白丸）、及び電導度（ｍＳ／ｃｍ：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す。図中前ピークがＵ−フコイダン、後ピークがＦ−フコイダンである。
（３）ガゴメコンブから硫酸化フコース含有多糖画分を調製した。すなわち、市販の乾燥ガゴメコンブ　２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）で破砕し、２０リットルの８０％エタノール中に懸濁後、２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残渣を４０リットルの１００ｍＭ　塩化ナトリウムを含む３０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、穴径１０６μｍのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に２００ｇの活性炭、４．５リットルのエタノール、１２，０００Ｕのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業社製）を添加し、２５℃で２０時間攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で４リットルに濃縮後、遠心分離により不溶物を除去し、５℃で２４時間放置した。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外ろ過機により溶媒交換して１００ｍＭ　塩化ナトリウム溶液とした。この溶液を４℃以下に冷却後、塩酸によりｐＨを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清のｐＨを水酸化ナトリウムにより８．０とし、４リットルに濃縮後、限外ろ過機により２０ｍＭ　塩化ナトリウムに溶媒交換した。この溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、ガゴメコンブ由来フコイダンの乾燥物７６ｇを得た。
製造例２
（１）アルテロモナス　ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７４７）を、グルコース　０．２５％、ペプトン　１．０％、酵母エキス　０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分間）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン　１．０％、酵母エキス　０．０２％、下記製造例２−（２）に記載のフコイダン　０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水（ｐＨ８．０）からなる培地　２０リットルを３０リットル容のジャーファメンターに入れて１２０℃、２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後、８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、硫酸化多糖に選択的に作用するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン特異的分解酵素）液６００ｍｌを調製した。
（２）乾燥したガゴメコンブ２ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られたコンブのチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、９５℃に加温した４０リットルの５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５に懸濁し、時々攪拌しながら９５℃で２時間維持し、硫酸化多糖を抽出した。
抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を３．５リットルの１００ｍＭ　塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。
両ろ液を合わせた後、３０℃まで温度を下げ、３０００Ｕのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを４リットル加え２５℃で２４時間攪拌した。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを備えた限外ろ過機により４リットルに濃縮し、更に、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。
非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を５℃まで温度を下げ、０．５Ｎ　塩酸によりｐＨを２．０とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに１Ｎ　水酸化ナトリウムによりｐＨを８．０とした。
次に、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過を行い、２０ｍＭ　塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）により完全に溶媒置換後、再度ｐＨを８．０として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約９５ｇの硫酸化多糖を調製した。
（３）乾燥したガゴメコンブ　２ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより粉砕し、得られたコンブのチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、３０ｍｌの上記製造例２−（１）で調製したＦ−フコイダン特異的分解酵素液、１０％のエタノール、１００ｍＭ　塩化ナトリウム、５０ｍＭ　塩化カルシウムを含む２０リットルの５０ｍＭ　イミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で４８時間攪拌した。この懸濁液を網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過し、残渣を５０ｍＭ　塩化カルシウムを含む１０％のエタノールで洗浄した。更にその残渣を１０リットルの５０ｍＭ　塩化カルシウムを含む１０％のエタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ステンレス金網でろ過し、同様に洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、１６時間攪拌し、直径３２μｍのステンレス金網でろ過し、同様に洗浄した。
こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量３０００のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。このろ過液をロータリーエバポレーターで約３リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に０．１Ｍとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ５０ｍＭ　酢酸カルシウムにより平衡化させたＤＥＡＥ−セルロファインカラム（樹脂量４リットル）にかけ、５０ｍＭ　酢酸カルシウム及び５０ｍＭ　塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０ｍＭ〜８００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。この時の分取量は１本当り５００ｍｌで行った。分取した画分をセルロースアセテート膜電気泳動法〔アナリティカル　バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７巻、第１９７〜２０２頁（１９７０）〕により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約０．４Ｍで溶出される硫酸化糖（フラクションナンバー６３付近）が均一であった。そこで、まずフラクションナンバー６３の液を１５０ｍｌに濃縮後、濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ４Ｍ　塩化ナトリウムにより平衡化したフェニルセルロファインカラム（樹脂量２００ｍｌ）にかけ、４Ｍ　塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液　５０５ｍｌを得た。得られた脱塩液のうち４０ｍｌを、１０％のエタノールを含む０．２Ｍ　塩化ナトリウムによって平衡化したセルロファインＧＣＬ−９０のカラム（４．１ｃｍ×８７ｃｍ）にかけて、ゲルろ過を行った。分取は１フラクション当り９．２ｍｌで行った。全フラクションに対して総糖量の分析をフェノール硫酸法〔アナリティカル　ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕により行った。
この結果、硫酸化糖は１つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー６３〜７０を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、１１２ｍｇの下記式（Ｖ）で表される化合物の乾燥品を得た。該化合物を７−１２ＳＦｄ−Ｆと称す。
2002022140.tif 000006
（４）十分に乾燥させたガゴメコンブを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕した。粉砕したガゴメコンブを９５℃、２時間熱水抽出後、デカンターにて固液分離し、次いで排除限界分子量３万の限外濾過膜により濃縮し、フコイダン抽出液を得た。
（５）国際公開第９９／１１７９７号パンフレット記載のエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン特異的分解酵素）を含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩＩ１０３の培養液を、分画分子量１万の限外ろ過膜にて濃縮し、得られた濃縮液をＦ−フコイダン特異的分解酵素液とした。５０ｍＭ　塩化カルシウムおよび３００ｍＭ　塩化ナトリウムを含む２５ｍＭ　ホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に、製造例２−（４）記載のフコイダン抽出液、およびＦ−フコイダン特異的分解酵素液を加え、３７℃で１９時間反応させた。
反応液を排除限界分子量１万の限外濾過膜により濃縮し、次いで濾液を逆浸透濃縮装置（東レ製）によりさらに濃縮した。得られた濃縮液を電気透析器（旭化成製）にて脱塩した。
得られた脱塩液をＤＥ５２（ワットマン製）、ＤＥＡＥ−セファロースカラム（アマシャム　ファルマシア　バイオテク製）、ポリエチレンイミンゲルカラム（山善製）に負荷し、順次クロマトグラフィーを行った。
得られた硫酸化糖画分を電気透析器にて脱塩し、次いで滅菌濾過、凍結乾燥を行い、上記の式（Ｖ）で表される化合物　７−１２ＳＦｄ−Ｆ乾燥標品を得た。
（６）製造例１−（２）記載の方法で調製したＦ−フコイダン　９８ｍｇを５ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、室温にてピペリジン硫酸　９８０ｍｇを添加した後、８０℃にて２時間攪拌した。反応液を冷却後、分子量１０００カットの透析膜にて２日間透析した。得られた透析内液を陽イオン交換カラム〔アンバーライトＩＲＡ−１２０（Ｎａ＋）〕に供じた後、減圧乾固することによりＦ−フコイダンの高硫酸化体　９８ｍｇを調製した。
（７）製造例２−（３）記載の方法で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆ　３４ｍｇを４ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、その後、製造例２−（６）と同様の操作で、７−１２ＳＦｄ−Ｆの高硫酸化体　３４ｍｇを調製した。
製造例３
（１）乾燥ガゴメコンブ　２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残渣を５０ｍＭ　塩化カルシウム、１００ｍＭ　塩化ナトリウム、１０％エタノール、及びＩＵの製造例２−（１）で調製したアルテロモナス　ｓｐ．ＳＮ−１００９由来Ｆ−フコイダン特異的分解酵素を含む２０リットルの３０ｍＭ　イミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で２日間攪拌し、次いで穴径３２μｍのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残渣を１００ｍＭ　塩化ナトリウム、１０％エタノール、及び４ｇのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）を含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に懸濁し、２５℃で４日間攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量１０万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％エタノールを含む１００ｍＭ　塩化ナトリウムで溶媒交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ　酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、１Ｎ　塩酸でｐＨ２．０とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を１Ｎ　水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０とした。この溶液を限外ろ過により１リットルに濃縮後、１００ｍＭ　塩化ナトリウムで溶媒交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍ　塩化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭ　塩化ナトリウムで溶媒交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は２９．３ｇであった。
（２）上記の凍結乾燥物　１５ｇを４００ｍＭ　塩化ナトリウム及び国際公開第９７／２６８９６号パンフレット記載のフラボバクテリウム　ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０２）を培養し、該培養物から得られたエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン特異的分解酵素）を９Ｕ含む１．５リットルの５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液に溶解し、２５℃で６日間反応後、エバポレーターで約３００ｍｌに濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チューブに入れて徹底的に透析し、透析チューブ内に残った液を、５０ｍＭ　塩化ナトリウムで平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ、５０ｍＭ　塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０〜６５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出を行った。更に同カラムを６５０ｍＭ　塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭ　塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量１０万の限外ろ過機により濃縮後、１０ｍＭ　塩化ナトリウムで溶媒を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタンの凍結乾燥物を０．８５ｇ得た。得られた硫酸化フコガラクタン（Ｇ−フコイダン）は、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約２：１であった。
製造例４
製造例１−（３）で得られたガゴメコンブ由来のフコイダンに製造例３−（２）記載のＵ−フコイダン特異的分解酵素を作用させ分解物の調製を行った。
すなわち、２．５％のフコイダン水溶液　１６ｍｌと、５０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１２ｍｌと４Ｍ　塩化ナトリウム　４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌの前記Ｕ−フコイダン特異的分解酵素の水溶液　８ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。
反応液をセルロファインＧＣＬ−３００（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子量２０００以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーＧ３（旭化成社製）により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムにより３つの画分に分離し、脱塩後、凍結乾燥し、それぞれ４１ｍｇ、６９ｍｇ、及び９．６ｍｇの精製物を得た。質量分析により、これらはそれぞれ分子量が５６４、７２４、１１２８でありＮＭＲ分析により下記式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）で表される化合物であることを確認した。これらをそれぞれ３−１Ｓ、３−３Ｓ、６−２ＳＦｄ−Ｕと称す。
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製造例５
市販のワカメ　メカブの乾燥物　１ｋｇを穴の径が１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより破砕後、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を５０ｍＭ　塩化ナトリウムを含む４０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２０リットルに懸濁し、９５℃で２時間処理した。処理液を３７℃まで冷却後、１０％となるようにエタノールを添加し、市販のアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業社製）を１２０００Ｕ添加後、室温で２４時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を５℃に冷却後、０．５Ｎ　塩酸を添加してｐＨを２．０とした後、３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のｐＨを０．５Ｎ　水酸化ナトリウムにより８．０とし、限外ろ過により溶媒を２０ｍＭ　塩化ナトリウムに置換した。溶液のｐＨを８．０に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、９０．５ｇのワカメ　メカブ由来フコイダンを得た。
製造例６
製造例１−（１）記載の方法で調製したガゴメコンブ由来フコイダン　２ｇを１００ｍｌの水に溶解し、そのｐＨをクエン酸にてｐＨ３に調整後、１００℃で３時間処理し、当該フコイダンの酸分解物を調製した。この酸分解物をセルロファインＧＣＬ−３００、又はセルロファインＧＣＬ−２５によるゲルろ過で分子量分画し、分子量２５０００超（Ａ画分）、２５０００〜１００００超（Ｂ画分）、１００００〜５０００超（Ｃ画分）、５０００〜２０００超（Ｄ画分）、２０００〜５００超（Ｅ画分）、５００以下（Ｆ画分）に分画した。更にこれらの画分及び酸分解物をそれぞれ脱塩後、凍結乾燥を行い、酸分解物の各分画物及び酸分解物を調製した。
製造例７
市販の塩蔵モズク　５ｋｇを２０リットルのエタノールと混合し、はさみで細断した。１晩放置後、ろ紙でろ過し、得られた残渣を１２．５リットルの水に懸濁し、９５℃で２時間維持した。懸濁液をろ紙によりろ過後、３５０ｍＭ　塩化ナトリウムを含む２．５％塩化セチルピリジニウム溶液を２６００ｍｌ添加し、３日間放置した。上清部分を廃棄し、沈殿部分を遠心分離して、その上清も廃棄した。得られた沈殿に２．５リットルの３５０ｍＭ　塩化ナトリウムを添加後ホモジナイザーで均一にし遠心分離した。この洗浄操作を３回繰り返した。得られた沈殿に４００ｍｌの４００ｍＭ　塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし、８０％となるようにエタノールを添加して３０分間攪拌後、ろ紙でろ過した。得られた残渣に５００ｍｌの塩化ナトリウム飽和８０％エタノールを添加後、ホモジナイザーで均一にし、１リットルとなるように塩化ナトリウム飽和エタノールを添加して３０分間攪拌後ろ紙でろ過した。この洗浄操作をろ液の２６０ｎｍの吸光度が実質的に０になるまで繰り返した（通常５回）。得られた残渣を１．５リットルの２Ｍ　塩化ナトリウムに溶解後、不溶物を遠心分離により除去し、あらかじめ２Ｍ　塩化ナトリウムにより平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥセルロファインＡ−８００のカラムを素通しさせた。素通り画分を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、限外ろ過により溶媒を２ｍＭ　塩化ナトリウムに置換した。この溶液を遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、２２．９ｇのモズク由来フコイダンを得た。
製造例８
マナマコ　５ｋｇを解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量　２００ｇ当り５００ｍｌのアセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がでなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾燥し、１４０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物に２．８リットルの０．４Ｍ　食塩水を加え、１００℃で１時間維持後、ろ過し、残渣を０．４Ｍ　食塩水で充分洗浄し、抽出液３．７リットルを得た。この抽出液に５％セチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を０．４Ｍ　食塩水に懸濁後、再度遠心分離し、得られた沈殿に１リットルの４Ｍ　食塩水を添加し、ホモジナイザーで処理後、攪拌しながら４リットルのエタノールを添加し、１時間攪拌後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、８０％エタノールに懸濁後ろ過という工程を上清の２６０ｎｍの吸光度が実質的に０になるまで繰り返した。得られた沈殿を２リットルの２Ｍ食塩水に懸濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量３万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し、３．７ｇのナマコ由来フコイダンを得た。
製造例９
市販の塩蔵オキナワモズク　６２５ｇを４３７５ｍｌの３０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、ホモジナイザーにより８０００回転／分で５分間処理後、９５℃で１時間維持し、遠心分離により上清を得た。得られた上清に１０ｇの活性炭を添加後３０分間攪拌し、遠心分離により上清を得た。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、２０ｍＭ　塩化ナトリウムで溶媒置換し、凍結乾燥して１０．９ｇのオキナワモズク由来のフコイダン画分の乾燥物を得た。
製造例１０
粉砕したヒバマタ（Ｆｕｃｕｓ　ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）の乾燥物　１ｋｇを、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を１００ｍＭ　塩化ナトリウムを含む３０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０リットルに懸濁し、９５℃で２時間維持した。懸濁液を３７℃まで冷却後、１００ｇの活性炭を添加し、３０分間攪拌した。市販のアルギン酸リアーゼＫを３０００Ｕ添加後、１０％となるようにエタノールを添加し、室温で２４時間攪拌した。得られた反応液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に１００ｍＭ　塩化ナトリウムを含む３０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えながら限外ろ過し、色素を除去した。得られた非ろ過液を５℃に冷却後、０．５Ｎ　塩酸を添加してｐＨを２．０とした後３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のｐＨを０．５Ｎ　水酸化ナトリウムにより８．０とし、限外ろ過により溶媒を２０ｍＭ　塩化ナトリウムに置換した。得られた溶液のｐＨを８．０に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、７１ｇのヒバマタ由来フコイダンを得た。
実施例１　フコイダンの肝線維化抑制効果
７週齢の雄性ＳＤ系ラットに豚血清（ギブコ社）を週２回、０．５ｍｌ／ラットの用量で１０週間腹腔内投与することにより肝線維モデルを作製した。製造例１−（１）記載のガゴメコンブ由来フコイダンの溶液は水道水にて０．５％に調整し、実験開始５週後より、飲水として与えた。コントロール群には水道水を与えた。正常対照群には、豚血清のかわりに生理的食塩水を同様に投与した。
肝線維化の評価は、コラーゲンの主要な構成アミノ酸であるハイドロキシプロリン量の増加を指標として行った。すなわち、摘出した肝組織のハイドロキシプロリン量を測定し、肝組織中ハイドロキシプロリン量を肝重量１ｇ当りの濃度（μｇ／ｇ肝）および肝臓全体のハイドロキシプロリン量（ｍｇ／肝全体）で示した。その結果、コントロール群と比較してガゴメコンブ由来フコイダン投与群では肝組織中のハイドロキシプロリン量は有意に減少していた。さらに、コントロール群におけるコラーゲンの蓄積による肝重量の増加および肝／体重比の上昇についても、ガゴメコンブ由来フコイダン投与群では有意に抑制した。これらの結果を表１および表２に示す。また、摘出した肝組織を観察したところ、コントロール群では線維化により肝表面の光沢が失われ、凹凸が明瞭であるのに対し、フコイダン投与群では正常対照群と同様に線維化は見られなかった。
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実施例２　７−１２ＳＦｄ−Ｆの肝線維化抑制効果
７週齢の雄性ＳＤ系ラットに豚血清（ギブコ社）を週２回、０．５ｍｌ／ラットの用量で、８週間腹腔内投与することにより線維肝モデルを作製した。製造例２−（４）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆ乾燥標品を蒸留水で希釈し、１００または３０ｍｇ／５ｍｌ／ｋｇの用量で実験開始４週後より、連日強制経口投与した。コントロール群には蒸留水を同様に投与した。正常対照群には、豚血清の代りに生理的食塩水を同様に投与した。
肝線維化の評価は、摘出した肝臓のハイドロキシプロリン量を測定することにより行った。これらの結果を表３に示す。
その結果、豚血清の８週間投与により、肝線維化（肝臓へのコラーゲンの蓄積）が進行し、肝組織中ハイドロキシプロリン量および単位肝重量当りの濃度は、正常肝の約４倍にまで上昇した。一方、７−１２ＳＦｄ−Ｆを豚血清投与の４週目より１００または３０ｍｇ／ｋｇの用量で連日経口投与することにより、肝組織中のハイドロキシプロリン量および単位肝重量当りのハイドロキシプロリンの濃度は、ほぼ４週目の時点の値に維持された。
以上の結果より、７−１２ＳＦｄ−Ｆが肝線維化の進行を抑制することが分かった。
また、摘出した肝組織を観察したところ、コントロール群では線維化により肝表面の光沢が失われ、凹凸が明瞭であるのに対し、７−１２ＳＦｄ−Ｆ投与群では明らかに線維化が抑制されていた。
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実施例３　フコイダンのアルコール摂取肝障害抑制効果
５週齢の雄性Ｃｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）系ラット（日本チャールズ・リバー社）を購入し、飼料は液体飼料（日本クレア社製）を使用した。製造例１−（１）記載のガゴメコンブ由来フコイダンを水道水に溶解し、経口投与した（投与量は表４に示す）。コントロール群には水道水を与えた。ガゴメコンブ由来フコイダン供与開始日を第０日目とし、第７日目からＣＥ−２飼料にエタノールを終濃度５％となるように添加し、アルコール食として摂取させた。
肝障害抑制化の評価は、血清生化学検査によって行った。すなわち、第３５日目に採血を行い、ヘパリン処理後、遠心分離にて血漿を得、血清生化学検査により血中マーカー（ＧＯＴ、ＧＰＴ、γＧＴＰ）を測定した。また、肝臓を摘出し、１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、パラフィン包埋してヘマトキシリン・エオシン染色し、病理学的観察を行った。ＧＯＴ、ＧＰＴ、およびγＧＴＰの測定試薬はそれぞれＳ．ＴＡ−ＨＲＩＩ　ＧＯＴ　７０７０、Ｓ．ＴＡ−ＨＲＩＩ　ＧＰＴ　７０７０、およびＬタイプワコー　γＧＴＰ（すべて和光純薬工業社）測定キットを用いた。また、第３５日目に採血後絶食にし、第３６日目にエーテル麻酔下腹部大動脈から採血を行い、ヘパリン処理をした。遠心分離後、血清を得、血清生化学検査により血中マーカー（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）を測定した。ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬの測定は電気泳動法により行った。尚、試験期間中、飼料摂取量ならびに飲水量の各群間の差はなかった。
その結果、ガゴメコンブ由来フコイダンの経口投与によってアルコールによるＧＯＴ、ＧＰＴ、およびγＧＴＰの上昇が抑制され、かつ血中コレステロールの中でいわゆる悪玉コレステロールとされるＶＬＤＬの割合の増加が抑制され、善玉コレステロールとされるＨＤＬの割合の減少が抑制された。さらに肝臓の病理所見から、肝細胞の損傷・壊死・び慢性増殖が明らかに抑制されることも分かった。これらの結果を表４に示す。
以上の結果より、ガゴメコンブ由来フコイダンがアルコールによる肝障害を抑制することが分かった。
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実施例４　フコイダンのアルコール摂取肝障害抑制効果
第３５日目まで実施例３と同様の方法で飼育し、その後絶食して、第３６日目にエーテル麻酔下腹部大動脈から採血を行い、ヘパリン処理をした。遠心分離後、血清を得、血清生化学検査によりトリグリセリド値を測定した。トリグリセリド値の測定はトリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定した。尚、試験期間中、飼料摂取量ならびに飲水量の各群間の差はなかった。
その結果、トリグリセリド値はコントロール群と比較して、強い低下傾向を示した。この結果を表５に示す。
以上の結果より、ガゴメコンブ由来フコイダンがアルコールによる肝障害を抑制することが分かった。
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実施例５　フコイダンの血糖値上昇抑制効果
日本チャールズ・リバー株式会社より５週齢の雄性Ｃｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）系ラット（ＳＰＦ動物）を購入した。製造例１−（１）記載のフコイダンを水道水に溶かしてフコイダン溶液を調製し、ラットに自由摂取させた。このときフコイダン溶液の濃度は０．００５％、０．０５％、０．５％を設定した。また、対照には水道水を与えた。飼育後１０日目に、前日から１８〜２０時間絶食した動物を用い、液体飼料（グルコース２ｇ／ｋｇ）のみを経口投与した。採血は飼料投与前、投与０．５、１、２および３時間後に尾静脈より行い、ヘパリン処理した。その後、遠心分離により血漿を得、血糖量を測定した。その結果を第２図に示す。なお、血糖量はグルコース投与前の対象のラットの血糖量を１００％として算出した。第２図はフコイダンによる食後のラットの血糖値上昇抑制作用を示す図であり、縦軸は血糖量（％）、横軸は経過時間（時間）を示す。これにより、フコイダン経口投与による血糖値上昇抑制作用が認められた。
また、同様にして６時間までの総血糖量について比較したところ、フコイダン投与群の方がコントロールに比べて、明らかに血糖値の上昇が抑制されていた。
実施例６　フコイダンの血中の中性脂肪値上昇抑制効果
実施例５と同様の方法で、飼育１９日目にオリーブオイル添加液体飼料をオリーブオイルが５ｍｌ／ｋｇとなるように経口投与し、飼料投与前、１、２時間後に採血し、トリグリセリド量を測定した。その結果を第３図に示す。なお、トリグリセリド量はオリーブオイル添加液体飼料前の対照ラットのトリグリセリド量を１００％として算出した。第３図はフコイダンによる食後のラットの血中の中性脂肪値上昇抑制作用を示す図であり、縦軸はトリグリセリド量（％）、横軸は経過時間（時間）を示す。これにより、フコイダン経口投与による血中の中性脂肪値上昇抑制作用が認められた。
また、同様にして６時間までの血中の総トリグリセリド量について比較したところ、フコイダン投与群の方がコントロールに比べて、明らかに血中の総トリグリセリド量の上昇が抑制されていた。
実施例７
ワカメメカブ（乾燥品、５ｍｍφパスまで破砕）３０ｇを脱塩水９７０ｇへ入れ、還元剤としてアスコルビン酸Ｎａを０．００５％ｗ／ｗ、０．０１％ｗ／ｗ、０．０２％ｗ／ｗ、０．０５％ｗ／ｗ、０．０８％ｗ／ｗ、０．１％ｗ／ｗ、０．５％ｗ／ｗ、１．０％ｗ／ｗになるように添加した。対照は、アスコルビン酸Ｎａ無添加とした。抽出は９５℃で１時間、時々ゆるく攪拌して行なった。固液分離は、濾過助剤（セライト）を２％添加後、フィルターペーパーＮｏ．２（東洋濾紙）さらに０．４５μｍφポアサイズメンブレンフィルターを用いる濾過により行い、ワカメメカブ抽出液を得た。
得られた抽出液について、ヨード含量測定及び官能評価を行った。
その結果を表６に示す。官能評価は１０名のパネルメンバーで、５段階（１良〜５悪）で行い、その平均値で表示した。
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表６より、還元剤を添加して抽出したワカメメカブ抽出液は、還元剤を添加しない対照と比較して、添加量０．０２％ｗ／ｗから１．０％ｗ／ｗでは特に海藻臭が軽減され、苦味が著しく軽減されて、スッキリして後味が改善された。
官能評価の比較から香り、味、色、の総合ではアスコルビン酸Ｎａ　０．００５％ｗ／ｗから１．０％ｗ／ｗ添加で対照３．３に対し２．８から２．２であった。また総合評価値が２．５以下を示す還元剤アスコルビン酸Ｎａ濃度は０．０１％ｗ／ｗから１．０％ｗ／ｗであった。これらの結果より、好ましい還元剤添加量は０．００５％ｗ／ｗから１．０％ｗ／ｗであり、さらに官能的に好適には０．０１％ｗ／ｗから０．１％ｗ／ｗであることがわかった。色については、いずれも対照の緑褐色に比べ薄いか、または無色であった。またヨード含量は、還元剤を入れることにより抽出液への移行が少なくなり、還元剤無添加を１００％とすると還元剤０．００５％添加で５％のヨードの移行が、還元剤０．０１％以上では、７％以上のヨードの移行が軽減できた（表中、移行率参照）。この結果は苦味の軽減と相関していると推測される。
実施例８
ワカメメカブ（乾燥品、５ｍｍφパスまで破砕）９ｇを脱塩水２０１ｇへ入れ、還元剤としてアスコルビン酸Ｎａを０．０２％ｗ／ｗ添加し、抽出時間を１時間に設定し、種々の温度７５、８０、９０、９５、１００、１２０及び１３０℃で抽出した。得られた濾液については、実施例７と同様に処理し、官能評価を行った。その結果を表７に示す。
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表７より、ワカメメカブ抽出の温度は７５から１００℃までは、官能評価による高い総合の評価値が得られた。また、１００℃超ではかえって官能評価による総合評価値は低下し、１３０℃抽出では総合評価値は７５℃と同水準となった。したがって、抽出温度の範囲は７５℃から１３０℃が好ましく、官能的品質からは８０℃から１００℃がさらに好ましいことがわかった。
実施例９
ワカメメカブ（乾燥品、５ｍｍφパスまで破砕）９ｇを脱塩水２０１ｇへ入れ、還元剤としてアスコルビン酸Ｎａを０．０２％ｗ／ｗ添加し、抽出温度を９５℃に設定し、抽出時間を０．５、１、３、５時間とした。得られた濾液については、実施例７と同様に処理し、官能評価を行った。その結果を表８に示す。
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表８より、ワカメメカブ抽出時間において、海藻臭が少なく、旨味良好、苦味がわずかに残る効果を示すのは、０．５時間抽出であった。また１時間抽出で官能評価の総合の値は最も優れており、さらに抽出するとこの値が高くなったが、５時間抽出でも海藻臭の低減効果が認められた。したがって、抽出時間は０．５時間から５時間が好適であることがわかった。
実施例１０
ｐＨの影響について調べた。実施例９に準じて、抽出溶媒のｐＨを３．０、４．０、５．０、６．０、及び７．０にクエン酸または重曹で調整して、９５℃で、１時間抽出を行った。その結果、得られた抽出液の海藻臭は、すべてにおいて減少することを確認した。味については、添加クエン酸や重曹の影響が出ることから比較しなかった。したがって、抽出時のｐＨは、海藻臭の低減からはｐＨ３．０から７．０が好適であることがわかった。
実施例１１
ワカメメカブ（乾燥品、５ｍｍφパスまで破砕）０．６ｋｇを脱塩水２０リットルに入れ、還元剤アスコルビン酸Ｎａは脱塩水に対して０．０２％ｗ／ｗになるように添加した。対照は、還元剤無添加とした。攪拌しつつ加温し、９５℃で保持して１時間後、室温まで冷却した。濾過は濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ＃３２７）を使用し、プレコートとして濾過助剤（Ｓｉｌｉｋａ＃６００Ｓ，２０ｇ）を用い、ボディフィードとして濾過助剤（Ｃｅｌｉｔｅ＃５４５，４５ｇ）を用いて常法に従って行った後、１μｍφポアサイズメンブレンフィルターで濾過した。濾過液は１９．４リットルを得た。殺菌は１２０℃で６０秒間行い、得られた殺菌液を減圧濃縮（４０℃、７５０ｍｍＨｇ）して、２．６リットル（７．５８倍）（２２．７％）の濃縮液を得た。濃縮液の一部（１リットル）を凍結乾燥して９ｇの粉末を得た。この操作を５回行った。得られた濃縮液の分析値を表９に示す。
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表９より、本発明のワカメメカブからの抽出液の濃縮液は、対照に比べると一般的な分析値はほぼ同水準の値を示したが、ヨウ素に関しては、含量が対照の８４％となり１５％以上の減少効果が得られた。蒸留水で７．７倍に希釈した液の官能評価では、本発明品が対照品に比べて、海藻臭が少なく、フレッシュ感があり、苦味が感じられなくなるという香味の点で著しい効果が得られた。
実施例１２
ガゴメコンブ、マコンブ及びワカメ葉状体（それぞれ乾燥品、５ｍｍφパスまで破砕）９ｇをそれぞれ脱塩水２０１ｇへ入れ、還元剤としてアスコルビン酸Ｎａを０．０２％ｗ／ｗ添加し、抽出温度を９５℃に設定し、抽出時間１時間で抽出した。対照は、アスコルビン酸Ｎａ無添加のものを同様に処理した。得られた濾液については、実施例７と同様に処理し、官能評価を行った。その結果を表１０に示す。
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表１０より、ガゴメコンブ、マコンブ及びワカメ葉状体においてもワカメメカブと同様に、還元物質の存在下での抽出では、海藻臭が軽減され、苦味も除去できるので香味とも改善され、フレッシュ感があった。本発明品は、海藻の種類によらず、食材として嗜好にかなう好適な抽出物であった。
実施例１３
褐藻類のガゴメコンブ４ｇ（乾燥品、５ｍｍφパスまで破砕）に塩化カルシウム　１００ｍｍｏｌ／リットルを含む脱塩水を入れ、還元剤としてアスコルビン酸Ｎａを０．０１％ｗ／ｗ、０．０５％ｗ／ｗ、０．１０％ｗ／ｗ、０．２０％ｗ／ｗ又は０．５０％ｗ／ｗ添加して、９５℃で２時間抽出後、フィルターペーパーＮｏ．２（東洋濾紙）で濾過した。濾液中のフコイダン含量を、システイン−硫酸法によりＬ−フコースを測定する方法を用いて測定した。対照は、アスコルビン酸Ｎａ無添加のものを用いた。その結果を表１１に示す。
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表１１より、アスコルビン酸０．０１〜０．５０％ｗ／ｗまでは、フコイダンの抽出率が向上しており、対照の１．６倍まで上昇し、還元剤のアスコルビン酸存在下で、フコイダン抽出効率が向上していた。
次に、プロテアーゼ処理との組合せを検討した。すなわち、褐藻類のガゴメコンブ４ｇ（乾燥品、５ｍｍφパスまで破砕）及びプロテアーゼとして植物起源のパパイン（ナガセ生化学工業）、又は枯草菌起源ＳＰ−１５ＦＧ（ナガセ生化学工業）を各４０ｍｇ、１００ｍｍｏｌ／リットルの塩化カルシウムを含む脱塩水１００ｍｌとを混合し、１２℃から９５℃まで２時間で徐々に昇温し、酵素処理し、その後還元剤のアスコルビン酸Ｎａを０．１０％ｗ／ｗになるように各々添加した。対照は、酵素のみ無添加のものを用いた。抽出は９５℃で２時間行い、抽出後、フィルターペーパーＮｏ．２（東洋濾紙）を用いて濾過した。この濾過液のうち４ｍｌを限外濾過膜（分子量１０，０００カット）で０．１ｍｌまで脱塩濃縮した。この脱塩濃縮液へ脱塩水４ｍｌを各々添加し、再び０．１ｍｌまでに濃縮し、濃縮液へ脱塩水を加えて１ｍｌとした。この液についてフコイダン含量及びケルダール窒素含量を測定した。また、この測定結果から原料のガゴメコンブ重量あたりのフコイダン収率（％）（フコイダン収率（％）＝（濃縮液１ｍｌ中のフコイダン重量（ｇ）×２５）／原料ガゴメコンブ重量（ｇ））×１００）を求めた。その結果を表１２に示した。
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表１２より、酵素プロテアーゼ処理とアスコルビン酸Ｎａの抽出を組合せると、フコイダンの抽出効率はさらに向上することが確認でき、また、ガゴメコンブ由来のタンパク質も低分子化（分子量１０，０００以下）されて限外濾過で除去して低減でき、パパインの場合で対照の１／２以下となった。さらに、対照の抽出液の濁度は酵素プロテアーゼ処理により清澄化していた。これらの結果から、酵素プロテアーゼ処理とアスコルビン酸Ｎａ抽出によるフコイダン抽出により、収率の向上及びタンパク質の低減が可能となり、高純度なフコイダンを得ることができた。
実施例１４
（１）褐藻類のガゴメコンブ４０ｋｇ（乾燥品、５ｍｍφパスまで破砕）、塩化カルシウム　１５ｋｇ、酵素パパイン　４００ｇ（ナガセ生化学工業）、アスコルビン酸Ｎａ　１ｋｇを脱塩水に混合し、１０００リットルとした。酵素処理及び抽出は、８０分間かけて１５℃から６０℃まで昇温し、６０℃で６０分間反応及び抽出を行なった。さらに、抽出は８０分間かけて６０℃から９５℃まで昇温し、９５℃で１２０分間抽出を行なった。その後２４時間かけて９℃に冷却し本発明抽出処理物とした。この抽出処理物のフコイダン含量を測定し、原料のガゴメコンブあたりのフコイダン収率（％）（フコイダン収率（％）＝（抽出処理物中のフコイダン重量（ｋｇ）／原料ガゴメコンブ重量（ｋｇ））×１００）を求めた。また対照は還元剤アスコルビン酸Ｎａ及び酵素パパインを添加せず同様に処理して得た。測定結果を表１３に示す。
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（２）引き続き実施例１４−（１）で得られた本発明抽出処理物の固液分離をフィルタープレスを用いて行い、８００リットルの圧搾濾過液を得た。次に限外濾過処理及び脱塩処理を行い８０リットルにまで濃縮した。この濃縮液を濾紙及びケイソウ土を用いる濾過機で濾過を行い、濾液７７リットルを得た。さらに濾液を濃縮機（エバポール、ＣＥＰ−３０Ｓ、加熱温度９０℃、品温４０〜４５℃）を用いて濃縮して６．８リットルの濃縮液を得、１２１℃１５分間オートクレーブで殺菌した。その殺菌液を凍結乾燥し、フコイダン　７８０ｇを得た。対照は還元剤アスコルビン酸Ｎａ及び酵素パパインを添加せず同様に処理して得た。本発明品及び対照の凍結乾燥品およびこれらの１％ｗ／ｖ水溶液（フコイダン溶液）の分析値をそれぞれ表１４、表１５に示す。
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表１４より、酵素プロテアーゼ処理とアスコルビン酸Ｎａ抽出の組合せによってフコイダンの抽出効率が向上したことが確認できた。さらに表１４から明らかなように、本発明品のタンパク質含量は顕著に減少した。また、表１５から本発明の方法により高純度のフコイダンを得ることができた。
また、本発明品の外観の色について調べたところ、本発明品は対照の緑褐色に比べて色が薄く、白っぽい緑褐色になった。すなわち、本発明品及び対照品を蒸留水でフコイダン含量２ｇ／Ｌになるように調製し、その６６０ｎｍの吸光度を測定したところ、本発明品と対照はそれぞれ０．０１７と０．０３６であり、本発明品は緑の着色成分が低減されていることが分かった。
また、本発明品の海藻臭の程度についても調べたところ、本発明品は対照に比べて、海藻臭が低減されていた。すなわち、得られた対照を２０℃蒸留水を用いて０．５％ｗ／ｖ溶液を調製し、それと同等の臭い強度を示す本発明品の溶液濃度を５名のパネルメンバーで求めたところ、本発明品では２．６％であり、本発明品は対照に比べて、海藻臭が低減されていることが分かった。
実施例１５
実施例１１の本発明及び対照のワカメメカブ抽出液の濃縮液を用いて、表１６に示す配合表のワカメメカブ抽出飲料を調製した。
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表１６の配合により得られた、それぞれの飲料は２００ｍｌ容缶に充填し、１１５℃で１５分間加熱殺菌し、缶詰品を調製した。官能評価は実施例７と同様にして実施した。パネルメンバーは１０名で、５段階評価（１良〜５悪）を用い、平均値を求めた。その結果を表１７に示す。
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表１７より、本発明品のワカメメカブ抽出物の濃縮物を用いた飲料は、対照品に比べ、海藻臭がなく、苦味がないので甘味、酸味及び旨味のバランスがよく、後味がすっきりして新規な香味の海藻飲料となった。対照品は、ワカメメカブ由来の海藻臭がきつく、また苦味が舌に残り、香味バランスがくずれ、後味も悪かった。また、本発明品は対照品に比べて色調も良好であった。
実施例１６
ワカメメカブの抽出液を用いたスープを調製した。ワカメメカブ抽出液（濃縮）は実施例１１の３％ワカメメカブの抽出液を７．５８倍に濃縮したもの（２２．７％ワカメメカブ抽出液に相当）を用い、本発明品は還元処理したもの、対照には無処理のものを用いた。表１８にワカメメカブ抽出液（濃縮）入りスープの配合を示す。この配合に従って、スープを調製し、２００ｍｌ缶に充填して１２０℃、１５分間加熱殺菌を行い、缶詰品とした。官能評価は実施例７と同様にして実施した。パネルメンバーは１０名で、５段階評価（１良〜５悪）を用い、平均値を求めた。その結果を表１９に示す。
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表１９より、本発明品は対照に比べて後味がよく、スッキリした味に仕上がり、ワカメメカブ抽出液の香味がポークエキスと良く馴染み、ポークエキス単独では味わえない、新規な味となり、全体の香味バランスを整えた。対照は海藻臭が残り、ポークエキスと調和がくずれ、また苦味がわずかに残り、香味全体のバランスをくずす傾向にあった。このように、調理の面から見て、本発明品のワカメメカブ抽出物は、その香味の特性から調味料として優れていることが明らかとなった。また、色調も、本発明品は対照品に比べて良好であった。
実施例１７
ふりかけとして魚粉２．４ｋｇ、食塩０．５ｋｇ、グルタミン酸ソーダ０．３ｋｇを混合（計３．２ｋｇ）し、本発明品及び対照として実施例１１で得られたワカメメカブの抽出物の凍結乾燥品を上記ふりかけ１ｋｇ当たり５ｇをそれぞれ添加し、及び無添加で常法に従って造粒した。これらそれぞれの造粒品約３．２ｋｇに対してごま１．２ｋｇをよく混合して調製した。これらのふりかけを米飯にふりかけ、官能評価を実施例７と同様にして行った。その結果、本発明品は対照に比べ、魚粉やゴマの香味と旨味が調和し、隠し味として機能を有することがわかった。対照は海藻臭がわずかに残り、魚粉及びゴマの香りのバランスをくずし、また、苦味が口にわずかに残った。本発明品は総合して、ふりかけの品質を向上させることが分かった。
実施例１８
ふりかけとして魚粉２．４ｋｇ、食塩０．５ｋｇ、グルタミン酸ソーダ０．３ｋｇを混合（計３．２ｋｇ）し、本発明品及び対照としての実施例１１で得られたワカメメカブの抽出物の上記ふりかけ１ｋｇあたり５ｇをそれぞれ添加し、及び実施例１４で得られたガゴメコンブ由来のフコイダン１ｇを本発明品のみに添加した。これらのふりかけを米飯にふりかけ、官能評価を実施例７と同様にして行った。その結果、本発明品は対照に比べ魚粉やゴマの香味と旨味が調和し、対照に比べバランスのとれた風味で、ワカメ風味が引き立っていた。両者を組合せるとふりかけの品質がさらに向上した。
実施例１９
表２０の配合で、打錠機を用い、打錠時の圧力３０００ｋｇ／ｃｍ２で常法に従い錠菓を作製した。本発明品には、実施例１４で得られたプロテアーゼ処理還元抽出フコイダンを用い、対照は実施例１４で得られた対照のフコイダンを用いた。その結果、本発明品は、口に含んだときコンブ臭が無く、全体の味のバランスが向上し、舌触りが滑らかであった。
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寄託された生物材料
（１）寄託機関の名称・あて名
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（２）寄託された微生物
（ｉ）アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＳＮ−１００９
原寄託日　　　　　　　　　　：１９９６年２月１３日
国際寄託への移管請求日　　　：１９９６年１１月１５日
受託番号：　ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７４７
（ｉｉ）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＳＡ−００８２
原寄託日　　　　　　　　　　：１９９５年３月２９日
国際寄託への移管請求日　　　：１９９６年２月１５日
受託番号：　ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０２
産業上の利用可能性
本発明により、フコイダン、その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される１つ以上を有効成分として含有する生体の恒常性維持剤が提供される。該医薬は、前記有効成分により生体の恒常性維持作用を発揮し、肝機能障害の治療剤又は予防剤、血液の恒常性維持剤として有用である。また、本発明により、前記有効成分の有する生体の恒常性維持作用を利用した食品、飲料又は飼料が提供される。
更に本発明は、海藻臭の低減された、食品等の原料として有用なフコイダン及び海藻類抽出物、高純度で高収率のフコイダンの製造方法及び海藻類抽出物の製造方法、ならびにそれらのフコイダン及び／又は海藻類抽出物を含有してなる、食品、飲料、調味料、飼料、化粧料及び医薬を提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ガゴメコンブ由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す図である。
第２図は、フコイダンによる食後のラットの血糖値上昇抑制作用を示す図である。
第３図は、フコイダンによる食後のラットの血中中性脂肪値上昇抑制作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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