(57)【要約】本発明は、変形性関節症及び慢性関節リウマチの疾患に対する有効な治療剤を提供することを目的とし、関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性及び軟骨基質分解亢進を抑制する活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分とする変形性関節症治療剤又は慢性関節リウマチ治療剤を提供する。
2002072134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する変形性関節症治療剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する変形性関節症治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項３】
さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む請求項１又は２に記載の変形性関節症治療剤。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む変形性関節症治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項５】
前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項４に記載の変形性関節症治療剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項６】
請求項４または５に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする請求項４又は５に記載の変形性関節症治療剤。
【請求項７】
下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する慢性関節リウマチ治療剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する慢性関節リウマチ治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項９】
さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む請求項７又は８に記載の慢性関節リウマチ治療剤。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む慢性関節リウマチ治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項１１】
前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項１０に記載の慢性関節リウマチ治療剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこれらの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の慢性関節リウマチ治療剤。
【請求項１３】
下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する関節軟骨細胞増殖剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項１４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する関節軟骨細胞増殖剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項１５】
さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む請求項１３又は１４に記載の関節軟骨細胞増殖剤。
【請求項１６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む関節軟骨細胞増殖剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項１７】
前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項１６に記載の関節軟骨細胞増殖剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の関節軟骨細胞増殖剤。
【請求項１９】
下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する軟骨基質分解亢進抑制剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項２０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する軟骨基質分解亢進抑制剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項２１】
さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む請求項１９又は２０に記載の軟骨基質分解亢進抑制剤。
【請求項２２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む軟骨基質分解亢進抑制剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項２３】
前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項２２に記載の軟骨基質分解亢進抑制剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこれらの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする請求項２２又は２３に記載の軟骨基質分解亢進抑制剤。
【請求項２５】
下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項２６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項２７】
さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む請求項２５又は２６に記載の関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
【請求項２８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項２９】
前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項２８に記載の関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする請求項２８又は２９に記載の関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
【請求項３１】
下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項３２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項３３】
さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む請求項３１又は３２に記載の軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
【請求項３４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項３５】
前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項３４に記載の軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこれらの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする請求項３４又は３５に記載の軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性及び軟骨基質分解亢進を抑制する活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質（以下、「ＣｈＭ−Ｉ」又は「コンドロモジュリン−Ｉ」タンパク質ともいう）を有効成分として含有する薬剤、特に変形性関節症治療及び慢性関節リウマチ治療に有効な薬剤に関する。
背景技術
関節構造・機能に破綻をきたす代表的な疾患として変形性関節症（以下、「ＯＡ」ともいう）や慢性関節リウマチ（以下、「ＲＡ」ともいう）が知られ、前者は老化や外的障害、後者は免疫制御の異常と密接な関連があるとされる。これら病態の根本的な発症要因はそれぞれ異なるものの、関節構造特に軟骨組織の崩壊過程には滑膜細胞あるいは軟骨細胞自身から産生されるマトリックス・メタロプロテアーゼなど各種プロテアーゼによる軟骨基質分解亢進が共通して関与しており、究極的には軟骨細胞の脱落や軟骨組織の欠損にまで至り得る。従来ＯＡに対しては、疼痛軽減を目的とした鎮痛消炎剤の投与や関節部の潤滑を目的としたヒアルロン酸製剤の関節内投与が対症療法として行われている。ＲＡに対しては、免疫調節薬を用いた免疫異常のコントロールが中心的な療法となっている。しかしながら現在、これら病態の本質とも言える骨・軟骨組織の崩壊に起因した関節破壊に対し、積極的にその進行をくい止める、あるいは再生させる目的で有効な薬剤は提供されていない。
また、ｈＣｈＭ（ヒトコンドロモジュリン）−Ｉタンパク質を含有した軟骨細胞増殖剤について特開平７−１３８２９５号公報に記載がある。同公報には、ｈＣｈＭ−Ｉタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、及び同ＤＮＡを用いてｈＣｈＭ−Ｉタンパク質を産生させる方法が開示されている。
しかし、該公報には、ヒトコンドロモジュリン−Ｉタンパク質が肋軟骨細胞を増殖させる活性及び血管内皮細胞の増殖を抑制する活性を有することの記載はあるものの、ヒトコンドロモジュリン−Ｉタンパク質が関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性及び軟骨基質分解亢進を抑制する活性を有することは知られておらず、またこれを利用して変形性関節症治療剤及び慢性関節リウマチ治療剤に用いるという試みは、いまだ報告されていない。
発明の開示
本発明は上記観点からなされたものであり、関節軟骨細胞を増殖させる活性及び軟骨基質分解亢進を抑制する活性を示す薬剤であって、関節軟骨細胞増殖剤や軟骨基質分解亢進抑制剤として、さらには関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患や軟骨基質分解の亢進に起因する疾患等各種の疾患、特に変形性関節症や慢性関節リウマチの疾患に対する治療剤として有効に使用できる薬剤を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、コンドロモジュリン−Ｉタンパク質が、関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性（以下、「軟骨細胞増殖促進活性」ともいう）及び軟骨基質分解亢進を抑制する活性（以下、「軟骨基質分解亢進抑制活性」ともいう）を有することを見出し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する変形性関節症治療剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する変形性関節症治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（３）さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む（１）又は（２）に記載の変形性関節症治療剤。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む変形性関節症治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（５）前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（４）に記載の変形性関節症治療剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（６）（４）または（５）に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする（４）又は（５）に記載の変形性関節症治療剤。
（７）下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する慢性関節リウマチ治療剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する慢性関節リウマチ治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（９）さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む（７）又は（８）に記載の慢性関節リウマチ治療剤。
（１０）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む慢性関節リウマチ治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（１１）前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（１０）に記載の慢性関節リウマチ治療剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこれらの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（１２）（１０）または（１１）に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする（１０）又は（１１）に記載の慢性関節リウマチ治療剤。
（１３）下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する関節軟骨細胞増殖剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（１４）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する関節軟骨細胞増殖剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（１５）さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む請求項（１３）又は（１４）に記載の関節軟骨細胞増殖剤。
（１６）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む関節軟骨細胞増殖剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（１７）前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（１６）に記載の関節軟骨細胞増殖剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（１８）（１６）または（１７）に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする（１６）又は（１７）に記載の関節軟骨細胞増殖剤。
（１９）下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する軟骨基質分解亢進抑制剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（２０）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する軟骨基質分解亢進抑制剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（２１）さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む（１９）又は（２０）に記載の軟骨基質分解亢進抑制剤。
（２２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む軟骨基質分解亢進抑制剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（２３）前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（２２）に記載の軟骨基質分解亢進抑制剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこれらの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（２４）（２２）または（２３）に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする（２２）又は（２３）に記載の軟骨基質分解亢進抑制剤。
（２５）下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（２６）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（２７）さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む（２５）又は（２６）に記載の関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
（２８）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（２９）前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（２８）に記載の関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（３０）（２８）または（２９）に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする（２８）又は（２９）に記載の関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤。
（３１）下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（３２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を有効成分として含有する軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（３３）さらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含む（３１）又は（３２）に記載の軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
（３４）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
（ａ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に記載されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（３５）前記ＤＮＡが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（３４）に記載の軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
（ｃ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３の塩基配列においては塩基番号２〜１００３、又は配列番号５の塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこれらの塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
（３６）（３４）または（３５）に記載のＤＮＡを含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬であることを特徴とする（３４）又は（３５）に記載の軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の関節軟骨細胞増殖剤や軟骨基質分解亢進抑制剤として、又は関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患や軟骨基質分解の亢進に起因する疾患等各種の疾患、特に変形性関節症や慢性関節リウマチの疾患に対する治療剤として使用する薬剤（以下、「本発明の薬剤」ともいう）は、コンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する。
本発明に用いるコンドロモジュリン−Ｉは、下記▲１▼及び▲２▼に記載の活性を有するタンパク質である。
▲１▼関節軟骨細胞を単独でまたは塩基性線維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性。
▲２▼軟骨基質分解亢進を抑制する活性。
上記活性を有するコンドロモジュリン−Ｉとしては、ヒトコンドロモジュリン−Ｉ（ｈＣｈＭ−Ｉ）が挙げられる。
ｈＣｈＭ−Ｉは、１つのポリペプチドから構成される水溶性タンパク質であって、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約２６Ｋダルトンであるタンパク質であり、肋軟骨細胞を単独でまたは繊維芽細胞増殖因子共存下において増殖させる活性、肋軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性、及び、血管内皮細胞の増殖を抑制する活性を有することが報告されている（特開平７−１３８２９５号公報）。本発明者により、ｈＣｈＭ−Ｉに関節軟骨細胞に対して増殖促進活性を有することが見い出された。またｈＣｈＭ−Ｉは軟骨細胞からのマトリックス・メタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３）を含む中性プロテアーゼ（ＮＰ）の産生を抑制したことから、ｈＣｈＭ−Ｉに軟骨基質分解亢進に対して抑制活性を有することが見い出された。
よって、軟骨細胞増殖促進活性と軟骨基質分解亢進抑制活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を有効成分として含有する薬剤は、関節軟骨細胞増殖剤や軟骨基質分解亢進抑制剤として、又はその他の関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患に対する治療剤あるいは軟骨基質分解の亢進に起因する疾患に対する治療剤として使用することができる。特に上記薬剤は、関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患や軟骨基質分解の亢進に起因する疾患の中でも、変形性関節症治療剤や慢性関節リウマチ治療剤として、好ましく使用することができる。また、本発明により、関節軟骨細胞を増殖させる活性と軟骨基質分解亢進を抑制する活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質の、変形性関節症治療剤や慢性関節リウマチ治療剤等の各種薬剤の製造における使用、及び、関節軟骨細胞を増殖させる活性と軟骨基質分解充進を抑制する活性を有するコンドロモジュリン−Ｉタンパク質の治療的に有効な量を、関節軟骨細胞の増殖や軟骨基質分解の亢進を抑制することが必要な患者に投与することを含む、変形性関節症や慢性関節リウマチ等の各種疾患の治療方法も提供される。
上記ｈＣｈＭ−Ｉ質の具体的態様としては、配列表の配列番号２、４又は６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
本発明で使用するＣｈＭ−Ｉは、ＣｈＭ−Ｉを含有する軟骨又は培養細胞から抽出、精製することによって取得することも可能であるが、大量生産の観点からは、ＣｈＭ−ＩをコードするＤＮＡを用いた組換えＤＮＡ技術によって製造することが好ましい。ｈＣｈＭ−Ｉタンパク質をコードするＤＮＡは、すでにクローニングされ、その塩基配列が明らかにされている。また、特開平７−１３８２９５号、特開平９−２９９０８８号などには、同ＤＮＡを用いたｈＣｈＭ−Ｉを産生させる方法が記載されており、これらの方法によって生産されるｈＣｈＭ−Ｉは、本発明に好適に用いることができる。
上記配列表の配列番号２、４又は６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１、３及び５に例示する。配列番号１に示す塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３に示す塩基配列においては塩基番号２〜１００３、及び配列番号５に示す塩基配列においては塩基番号２〜８８９がコード領域である。
上記のようなｈＣｈＭ−Ｉタンパク質をコードするＤＮＡは、すでにｈＣｈＭ−Ｉタンパク質のアミノ酸配列及びそれらをコードするＤＮＡの塩基配列が明らかとなっているため、それらの配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲによって、ヒト染色体ＤＮＡ又は染色ライブラリーから取得することができる。
本発明の薬剤に含有されるＣｈＭ−Ｉとしては、ｈＣｈＭ−Ｉ以外にも、ヒト以外の動物に由来するｈＣｈＭ−Ｉに相当するコンドロモジュリンタンパク質も、軟骨細胞増殖促進活性及び軟骨基質分解亢進抑制活性を有し、かつ、ヒトの治療に耐えうるものである限り使用することができる。
また、ｈＣｈＭ−Ｉ又はヒト以外の動物に由来するコンドロモジュリンタンパク質は、軟骨細胞増殖促進活性及び軟骨基質分解亢進抑制活性を有する限り、ＳＮＰ（シングル・ヌクレオチド・ポリモルフィズム）等に由来するアミノ酸変異を有するものであってもよい。さらに、前記ｈＣｈＭ−Ｉと同等の機能を有する限り、現在知られているｈＣｈＭ−Ｉ以外のｈＣｈＭ−Ｉ、又はヒト以外の動物のホモログであっても、本発明に使用することができる。あるいは、天然型のｈＣｈＭ−Ｉにアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加等を施した類似体であってもよい。
尚、抗原性等の点から、ｈＣｈＭ−Ｉ又はその類似体を用いることが好ましい。ｈＣｈＭ−Ｉの類似体としては、軟骨細胞増殖促進活性及び軟骨基質分解亢進抑制活性を有する限り、配列番号２、４又は６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられるもよい。本発明において「数個」とは、２〜３０個程度、好ましくは２〜２０個程度、特に好ましくは２〜１０個程度をいう。
また、上記のようなコンドロモジュリン−ＩをコードするＤＮＡは、変形関節症、慢性関節リウマチ、間接軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患、軟骨基質分解の亢進に起因する疾患等の遺伝子治療に用いることができる。このようなコンドロモジュリン−ＩをコードするＤＮＡとしては、
配列番号２、４、又は６に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又はこれらのいずれかのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ下記▲１▼及び▲２▼の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。具体的には、配列番号１に示す塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３に示す塩基配列においては塩基番号２〜１００３、及び配列番号５に示す塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また本発明のＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列においては塩基番号２〜１００３、配列番号３に示す塩基配列においては塩基番号２〜１００３、及び配列番号５に示す塩基配列においては塩基番号２〜８８９からなる塩基配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、軟骨細胞増殖促進活性と軟骨基質分解亢進抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。アミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加を有するコンドロモジュリン−ＩをコードするＤＮＡは、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得られる。部位特異的変異の手法には、様々な手法（Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰＣＲ  ｉｎ”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”ｐ．１７７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  ＤＮＡ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９等）があるが、部位特異的に変異を導入する手法であれば何れの手法を用いてもよい。
ｈＣｈＭ−ＩをコードするＤＮＡの調製、組換えＤＮＡ技術を用いたｈＣｈＭ−Ｉの製造において、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、特開平７−１３８２９５号に記載されているとおり、さらに特開平９−２９９０８８号にはｈＣｈＭ−Ｉをコードする塩基配列における翻訳開始メチオニンをコードする塩基配列のアデニンを基点とした上流３塩基を変換したＤＮＡ断片を用いたｈＣｈＭ−Ｉタンパク質の大量生産方法が記載されている。
本発明のＣｈＭ−Ｉタンパク質を含有する薬剤及び該タンパク質をコードするＤＮＡを含む薬剤は、関節軟骨細胞の増殖及び軟骨基質分解亢進抑制等の作用を示すため、関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患や軟骨基質分解の亢進に起因する疾患、特に変形性関節症及び慢性関節リウマチの疾患に対する予防薬または治療薬として有効である。
変形性関節症及び慢性関節リウマチでは、種々の要因からＩＩ型コラーゲンやプロテオグリカン等、軟骨細胞外基質の分解に伴う軟骨組織の脆弱化が生じ、終末病理像としては軟骨細胞の脱落を含むさらに高度な関節破壊が観察される。本発明においては、これら関節疾患の主要病変部となる関節軟骨組織を実験材料とすることにより、ｈＣｈＭ−Ｉが関節軟骨細胞の増殖を促進させることを示した。さらに、ｈＣｈＭ−Ｉは軟骨細胞外基質分解の病的亢進に関わる軟骨細胞からの中性プロテアーゼ活性誘導を抑制し、その中でも特に中心的な役割を持つとされるＭＭＰ−３の産生を抑制することが示された。従って、本発明のＣｈＭ−Ｉタンパク質を含有する薬剤及び該タンパク質をコードするＤＮＡを含む薬剤は軟骨細胞外基質の代謝異常並びに軟骨細胞自体の増殖制御に対して両側面的に改善することにより、ＯＡ及びＲＡ関節病態の臨床的進行をより強力に抑止し、構造的再生をもたらすことが期待される。
ＣｈＭ−Ｉを有効成分として含有する薬剤の場合、ＣｈＭ−Ｉを製剤化するに際し、ＣｈＭ−Ｉを単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。このときの有効成分ＣｈＭ−Ｉの担体成分に対する割合は、１重量％から９０重量％の間で変動され得る。例えば本発明のＣｈＭ−Ｉは、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、骨セメント、ハイドロキシアパタイト、セラミックス、炭素繊維、フィブリン糊等の生体適合性担体に混合、含浸、塗布することによって、骨折部位、軟骨疾患部位等に外用剤として投与することができる。
また、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、液剤等の剤形にして経口投与してもよいし、注射剤として静脈内投与、筋肉内投与、局所内投与、皮下投与してもよいし、坐剤として用いることもできる。経口、経腸、非経口の組成物を調製する場合は、有機または無機の、固体または液体の担体もしくは希釈剤が用いられる。
固形製剤を製造する際に用いられる賦形剤としては、例えば乳糖、ショ糖、デンプン、タルク、セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム等が用いられる。経口投与のための液体製剤、すなわち乳剤、シロップ剤、懸濁剤、液剤等は、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば水、植物油等を含む。この製剤は、不活性な希釈剤以外に補助剤、例えば湿潤剤、懸濁補助剤、甘味剤、芳香剤、着色剤、保存剤等を含むことができる。液体製剤にしてゼラチンのような吸収され得る物質のカプセル中に含ませてもよい。非経口投与の製剤、すなわち注射剤、坐剤等の製造に用いられる溶剤または懸濁化剤としては、例えば水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、オレイン酸エチル、レシチン等が挙げられる。坐剤に用いられる基剤としては、例えばカカオ脂、乳化カカオ脂、ラウリン脂、ウィテップゾール等が挙げられる。これらの調製方法は、適宜常法に従って行うことができる。
本発明の薬剤におけるＣｈＭ−Ｉの臨床投与量は、その投与形態、患者の年齢、体重、症状等によって適宜設定されるが、ＣｈＭ−Ｉの量として、一般に経口剤または外用剤として使用する場合、成人に対し１日量１ｎｇ〜５０ｍｇ（注射剤の場合は、その１０分の１以下）であることが望ましい。これは、１日に１回、または適当な間隔をおいて１日に２〜数回に分けて投与してもよいし、間欠投与してもよい。注射剤として用いる場合は、前記量を連続投与または間欠投与することが望ましい。なお、医薬用途を目的として使用されるＣｈＭ−Ｉは、精製されたＣｈＭ−Ｉ、組換えＣｈＭ−Ｉ、さらには形質転換体の培養液、分離形質転換体、形質転換体処理物、固定化形質転換体、粗酵素液、酵素処理物等のいずれであっても構わない。
本発明の薬剤は、ＣｈＭ−Ｉの効果が損なわれない限り、ＣｈＭ−Ｉ以外の関節軟骨細胞増殖効果や軟骨基質分解亢進抑制効果を示す、特に変形性関節症治療効果又は慢性関節リウマチ治療効果を示す他の成分をＣｈＭ−Ｉに併用させてもよい。
また、本発明の薬剤は、ＣｈＭ−Ｉとともに、塩基性線維芽細胞増殖因子を含んでいてもよい。
また、コンドロモジュリン−ＩをコードするＤＮＡを遺伝子治療に用いる場合は、通常、遺伝子治療に用いられる種々の技術を採用することができる。具体的には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベクターあるいは、膜融合リポソーム法などにより得られたコンドロモジュリン−ＩをコードするＤＮＡ発現ベクターを、特表平９−５０１０４６号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法などにより、変形性関節症や慢性関節リウマチ等関節軟骨細胞の増殖や軟骨基質分解の亢進を抑制することが必要な患者（以下、変形性関節症や慢性関節リウマチ等の患者ともいう）の骨髄細胞に移植することによる方法、特表平９−５０５０８４号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法などにより、変形性関節症や慢性関節リウマチ等の患者の筋肉組織、血管系、腸、皮膚、肺などに投与する方法、または、特表平９−５０５５６１号公報等に記載の方法またはそれに準じた方法などにより、変形性関節症や慢性関節リウマチ等の患者の脳脊髄液に投与する方法などにより、コンドロモジュリン−Ｉ遺伝子を患者の体内で発現させることを可能とする。また、変形性関節症や慢性関節リウマチ等の患者の卵細胞に上記の方法によりコンドロモジュリン−Ｉ遺伝子を導入することにより、患者の子孫における変形性関節症や慢性関節リウマチ等関節軟骨細胞の増殖の抑制や軟骨基質分解の亢進に起因する疾患を予防することが可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
尚、実施例で使用した器具と試薬、及び関節軟骨細胞は以下に示すとおりである。
＜使用器具及び試薬＞
培養用プラスティック器具は岩城硝子、Ｃａ２＋・Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））は大日本製薬、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲＤＦ−ＣＨＯ  Ｆｏｒｍｕｌａ培養液（以下、「ＴＳ−２」と記載）、ペニシリンＧ−ストレプトマイシン溶液およびトリプシン−ＥＤＴＡ溶液はライフテックオリエンタル、コラゲナーゼ（ＴｙｐｅＩＩ）、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＴＲＣＫ  Ｔｒｅａｔｅｄ）およびトリプシンインヒビター（Ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）はＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、アゾコール基質（Ａｚｏｃｏｌｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，＜５０ｍｅｓｈ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３（ＭＭＰ−３），ｒａｂｂｉｔ，ＥＬＩＳＡ  ｓｙｓｔｅｍはＡｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）はＰＥＰＲＯＴＥＣＨ、トリチウム標識チミジン（［３Ｈ］チミジン）はＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＭｅｌｔｉＬｅｘ  ＡはＷＡＬＬＡＣから、各々購入、入手した。
＜関節軟骨細胞の分離・調製＞
評価に用いた関節軟骨細胞は以下のごとく取得した。すなわち、１．５ｋｇ前後の雄性日本白色ウサギ（（株）日本医科学動物資材研究所より入手）の左右両膝及び肩関節より軟骨組織を採取し、０．０２５％トリプシン−０．２６５Ｍ  ＥＤＴＡ／ＴＳ−２中で３７℃で３０分間振盪後、上清を除去した。続いて、１０％ウサギ血清／ＴＳ−２により組織片を３回洗浄し、０．３％コラゲナーゼ／ＴＳ−２中で３７℃で６０分間振盪後、上清を除去した。組織片をメスで細断し、０．１５％コラゲナーゼ／１０％ウサギ血清／ＴＳ−２中で３７℃で３時間振盪によりさらに消化した。
以上の操作により得られた組織消化液をセルストレイナー（４０ｕｍ  ｍｅｓｈ）で濾過後、４℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、関節軟骨細胞を得た。細胞をＴＳ−２で洗浄後、１．５〜２×１０５個／ｍｌとなるように１０％ウサギ血清／ＴＳ−２に再懸濁した。この細胞懸濁液を９６穴プレートに１００μｌ／ウェルの割合で播種し、５％  ＣＯ２を含む空気存在下、３７℃にて培養した。なお、上記で用いたＴＳ−２は１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加して使用した。またウサギ血清は関節軟骨細胞の分離に用いたウサギと同一個体全血液から遠心分離にて調製し、５６℃で３０分間非働化した後に使用した。
実施例１
＜１＞関節軟骨細胞を増殖させる活性の確認
ｈＣｈＭ−Ｉの軟骨細胞増殖に対する作用は、関節軟骨細胞の［３Ｈ］チミジン取り込み能測定によるＤＮＡ合成活性と細胞数の変化で評価した。［３Ｈ］チミジン取り込み能は以下のことく測定した。上記方法で調製した関節軟骨細胞をセミコンフレントに達するまで培養した後、培養液を０．５％ウサギ血清／ＴＳ−２、１００μｌ／ウェルに置換した。２４時間培養を継続後、培養上清をｂＦＧＦ（終濃度０，１．６，８，４０，２００及び１０００ｎｇ／ｍｌ）、ｈＣｈＭ−Ｉ（終濃度０，１．２５，２．５，５及び１０μＭ）を含む各種ＴＳ−２、１００μｌ／ウェルに置換した。２４時間の培養継続後、ＰＢＳ（−）で５０μＣｉ／ｍｌに調製した［３Ｈ］チミジンを１０μｌ／ウェルずつ添加し、さらに５時間培養した。セルハーベスター（ＨＡＲＶＥＳＴＥＲ９６  ＭＡＣＨ  ＩＩＩＭ、ＴＯＭＴＥＣ社製）を用い各培養上清を吸引した後、０．０２５％トリプシン−０．２６５Ｍ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）を１００μｌ／ウェルずつ加え、５分間インキュベートした。浮遊した細胞をガラスフィルター（Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒ  ｍａｔ  Ａ，ＷＡＬＬＡＣ社製）に付着させ、フィルターを乾燥させた後、シンチレーターＭｅｌｔｉＬｅｘ  Ａを染み込ませ、βシンチレーションカウンター（ＴＲＩＬＵＸ  １４５  ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ，ＷＡＬＬＡＣ社製）にて放射活性を測定した。その結果、ｈＣｈＭ−Ｉは［３Ｈ］チミジン取り込み能に対しそれ単独ではほとんど影響しなかったが、ｂＦＧＦによる［３Ｈ］チミジン取り込み促進を濃度依存的に増強した（図１、２）。
細胞数の変化は以下のごとく測定した。セミコンフレントに達した関節軟骨細胞の培養上清をウサギ血清（終濃度０，０．５％及び１０％）、ｂＦＧＦ（終濃度０及び２００ｎｇ／ｍｌ）、ｈＣｈＭ−Ｉ（終濃度０及び１０μＭ）を含む各種ＴＳ−２、１００μｌ／ウェルに置換し、さらに３日間培養を継続した。各培養上清を除去後、細胞を０．０２５％トリプシン−０．２６５Ｍ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）５０μｌ／ウェル中で剥離し、血球計算板（改良ノイバイエル盤）を用いて顕微鏡下細胞数を計測した。その結果、ｈＣｈＭ−Ｉは関節軟骨細胞数に対しそれ単独ではほとんど影響せず、また血清濃度上昇に伴う細胞数増加に対してもほとんど影響しなかった（図３）。しかし、ｈＣｈＭ−ＩはｂＦＧＦ添加による細胞数増加をさらに促進した（図４）。これらの結果、ｈＣｈＭ−ＩはＤＮＡ合成に対するｂＦＧＦ協調的かつ促進的な調節作用を介し、関節軟骨細胞の増殖を促すことが示された。
＜２＞軟骨基質分解亢進抑制活性の確認（インターロイキン−１β刺激関節軟骨細胞における細胞外基質分解酵素産生亢進に及ぼす影響）
ｈＣｈＭ−Ｉの軟骨細胞外基質分解酵素産生に対する作用は、培養上清の中性プロテアーゼ（ＮＰ）活性とＭＭＰ−３濃度により評価した。すなわち、上記方法で調製した関節軟骨細胞をコンフレントに達するまで培養後、培養上清をＩＬ−１β（終濃度０及び１ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（終濃度０及び２００ｎｇ／ｍｌ）、ｈＣｈＭ−Ｉ（終濃度０，２．５，５，１０，２０μＭ）を含む各種ＴＳ−２、１００μｌ／ウェルに置換した。引き続き５％  ＣＯ２を含む空気存在下、３７℃で２４時間培養した後に培養上清を回収し、後述の測定実施時まで−８０℃で凍結保存した。また予め別途、１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１βで２４時間処理したウサギ関節軟骨細胞の培養上清をスタンダードとして調製、保存した。
ＮＰ活性の測定は、以下のごとく行った。室温にて融解したサンプルおよび段階希釈したスタンダード７５μｌに１ｍｇ／ｍｌトリプシン溶液５μｌを添加後、３７℃で１５分インキュベートすることによりサンプル中の不活性型プロテアーゼ前駆体を活性型へ変換した。さらに５ｍｇ／ｍｌトリプシンインヒビター溶液５μｌを加え、変換反応を停止した。続いて、予めマイクロチューブに分注したアゾコール基質懸濁液（６０μｇ／ｍｌ  ｉｎ  １ｍＭ塩化カルシウム含有０．０５Ｍトリスハイドロキシメチルアミノメタン（ｔｒｉｓ（Ｈｙｄｒｏｘｍｅｔｈｙｌ）Ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、１２５μｌ／チューブ）中に、活性型へ変換処理したサンプル７５μｌを添加し、良く攪拌した後、３７℃で２４時間インキュベートした。未分解基質と基質分解に伴い溶出した色素を含んだ上清を３０００ｐｐｍ、１０分間遠心分離後、直ちに各サンプル上清８０μｌをマイクロプレートに回収し、色素の特異吸収波長５２０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ２５０，Ｍｏｌｗｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて測定した。各サンプルのＮＰ活性は、スタンダードの吸光度より得られた回帰直線から相対活性として算出した。その結果、ｈＣｈＭ−Ｉは、ＩＬ−１β刺激により亢進した関節軟骨細胞培養上清のＮＰ活性を、ｂＦＧＦの存在・非存在下に関わらず、用量依存的に抑制した（図５）。
ＭＭＰ−３濃度の測定は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３（ＭＭＰ−３），ｒａｂｂｉｔ，ＥＬＩＳＡ  ｓｙｓｔｅｍ）を用い、添付の操作法に従い以下のごとく行った。抗ウサギＭＭＰ−３モノクローナル抗体（ウサギ不活性型ＭＭＰ−３前駆体を特異認識）が固相化された９６穴プレートに各サンプルおよび濃度既知ウサギＭＭＰ−３スタンダード溶液を１００μｌ／ウェル添加し、４℃で２時間インキュベートした。サンプルを洗浄除去後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＭＭＰ−３モノクローナル抗体溶液を１００μｌ／ウェルずつ添加し、４℃で１時間インキュベートした。未反応の抗体を洗浄除去後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）／過酸化水素溶液を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間インキュベートした。直ちに、ペルオキシダーゼにより発色した反応液の特異吸収波長４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。各サンプル中のＭＭＰ−３濃度はスタンダードの吸光度より得られた回帰直線から算出した。その結果、ｈＣｈＭ−Ｉは、ＩＬ−１β刺激により亢進した関節軟骨細胞上清中のＭＭＰ−３濃度を、ｂＦＧＦの存在・非存在下に関わらず、用量依存的に抑制した（図６）。図５で示したｈＣｈＭ−ＩによるＮＰ活性亢進抑制は、関節軟骨細胞におけるＭＭＰ−３酵素タンパク質の合成抑制作用で少なくとも一部説明し得る。
産業上の利用の可能性
本発明により、関節軟骨細胞増殖剤及び軟骨基質分解亢進抑制剤、さらには、関節軟骨細胞の増殖の抑制に起因する疾患や軟骨基質分解の亢進に起因する疾患等各種の疾患、特に変形性関節症及び慢性関節リウマチに有効に作用する治療剤を提供することができる。具体的には、関節軟骨細胞を増殖させる活性及び軟骨基質分解亢進を抑制する活性を有するタンパク質を有効成分として含有する変形性関節症治療剤及び慢性関節リウマチ治療剤等各種薬剤を提供することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｈＣｈＭ−Ｉ存在下及び非存在下、ｂＦＧＦで刺激した関節軟骨細胞における［３Ｈ］チミジン取り込み能を示す。
図２は、ｂＦＧＦ存在下及び非存在下、ｈＣｈＭ−Ｉで刺激した関節軟骨細胞における［３Ｈ］チミジン取り込み能の測定結果を示す。
図３は、ｈＣｈＭ−Ｉ存在下で培養した関節軟骨細胞の細胞数の変化を示す。
図４は、ｂＦＧＦ及びｈＣｈＭ−Ｉ存在下で培養した関節軟骨細胞細胞数の変化を示す。
図５は、ＩＬ−１β刺激により亢進した関節軟骨細胞の培養上清におけるＮＰ活性及びそれに対するｈＣｈＭ−ＩとｂＦＧＦの影響を示す。
図６は、ＩＬ−１β刺激により亢進した関節軟骨細胞の培養上清におけるＭＭＰ−３濃度及びそれに対するｈＣｈＭ−ＩとｂＦＧＦの影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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