(57)【要約】本発明はＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原刺激により細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導されることを特徴とするＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物、当該トランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、あるいは前記スクリーニング方法により選択されたＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチド、当該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成に有用なキメラ遺伝子（ＤＮＡ構築物）、該キメラ遺伝子で形質転換された宿主細胞およびそれらの利用等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原刺激により、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導されることを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子をホモで有することを特徴とする、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子のα１及びα２領域とマウスＭＨＣクラスＩ遺伝子のα３領域を含有するキメラ遺伝子である、請求項１又は２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子がＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するものである、請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が配列番号：２に記載のヌクレオチド配列を含有するものである、請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含有するものである、請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が、請求項５〜７のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有するものである、請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１〜８のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
マウスがＣ５７ＢＬ／６系統のマウスである、請求項９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価するための標的細胞として、請求項１〜１０のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が保有しているＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が導入され、発現している形質転換細胞を用いることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項３〜１０のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が保有しているＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が導入され、発現している形質転換細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項１８】
配列番号：２に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれかに記載のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号：３に記載のアミノ酸配列の第２５位〜第１１４位をコードするヌクレオチド配列、第１１５位〜第２０６位をコードするヌクレオチド配列、及び第２０７位〜第２９８位をコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項２０に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項２２】
配列番号：２に記載のヌクレオチド配列の第７２位〜第３３９位、第３４２位〜第６１５位、及び第６１８位〜第８９１位で示される配列を有するポリヌクレオチドを含有する、請求項２０に載の単離されたＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項１７〜２２のいずれかに記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られる、ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体。
【請求項２８】
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列よりなる請求項２７に記載の腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体。
【請求項２９】
配列番号：１７に記載のアミノ酸配列よりなる、請求項２８に記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体。
【請求項３０】
請求項２７〜２９いずれかに記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を有効成分として含有する、ＣＴＬの誘導剤。
【請求項３１】
請求項２７〜２９いずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡ。
【請求項３２】
請求項３１に記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ。
【請求項３３】
請求項３２に記載の組換えＤＮＡを発現させて得られるポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３２に記載の組換えＤＮＡまたは請求項３３に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、ＣＴＬの誘導剤。
【請求項３５】
ＨＬＡ−Ａ２４抗原と請求項２７〜２９のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体が提示された抗原提示細胞。
【請求項３６】
請求項３５に記載の抗原提示細胞を有効成分として含有してなるＣＴＬの誘導剤。
【請求項３７】
ＨＬＡ−Ａ２４抗原と請求項２７〜２９のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を認識するＣＴＬ。
【請求項３８】
請求項２７〜２９のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体、請求項３２に記載の組換えＤＮＡ、請求項３３に記載のポリペプチド、請求項３５に記載の抗原提示細胞、あるいは請求項３７に記載のＣＴＬを有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤又は予防剤。
【請求項３９】
請求項２７〜２９のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を含有してなる腫瘍の診断薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニック動物及びその利用に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原刺激により細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬ）が誘導されることを特徴とするＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入トランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物を用いた腫瘍やウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により選択されたＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチド、あるいは、当該トランスジェニックマウスの製造に有用な組換えＤＮＡ構築物およびその利用などに関する。
背景技術
生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（以下ＣＴＬと呼ぶ）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌やウイルス等に由来する抗原タンパク質のペプチド断片と細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子（ヒトの場合はＨＬＡと呼ばれる）により形成された複合体をＴ細胞レセプターを介して認識して、癌細胞やウイルス感染細胞等を特異的に傷害したり、各種サイトカインを産生して免疫系を活性化する。ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成するペプチド断片は抗原ペプチドと呼ばれ、通常８から１１アミノ酸程度の長さである。ＭＨＣクラスＩ分子の細胞外ドメインは、α１、α２、およびα３領域より構成され、このうちα１およびα２領域は抗原ペプチドの収容溝の形成に関与し、α３領域はＣＴＬ表面に発現する補助レセプターＣＤ８分子との結合に関与する。
ＣＴＬが認識する腫瘍抗原タンパク質としては、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｖｏｌ．１０：２８１，１９９９のｔａｂｌｅ１に記載のものが代表例として挙げられる。具体的にはメラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５，１９９４）、ＭＡＲＴ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５，１９９４）、およびチロシナーゼ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９，１９９３）などのメラノソーム抗原が挙げられ、またメラノーマ以外の腫瘍抗原タンパク質としては、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２１０９，１９９５）、ＣＥＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８７：９８２，１９９５）、およびＰＳＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８９：２９３，１９９７）などの腫瘍マーカー、あるいは扁平上皮癌由来のＳＡＲＴ−１（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：２７７，１９９８）やサイクロフィリンＢ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１９０３，１９９１）などが挙げられる。
これらの腫瘍抗原タンパク質、腫瘍抗原ペプチド及びこれらをコードするＤＮＡ、さらにはウイルス由来の抗原タンパク質や抗原ペプチドを投与して、生体内の特異的なＴ細胞を増強させる、いわゆるワクチン療法は、癌やウイルス感染症等の治療や予防において有用であると考えられている。実際、メラノーマ、肺癌、頭頚部癌などで過剰に発現する腫瘍抗原タンパク質ＭＡＧＥ−３由来の抗原ペプチドを用いた臨床結果からも、腫瘍排除におけるワクチン療法の重要性が示唆されている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：２１９，１９９９）。
前記ワクチン療法剤の開発においてイン・ビボにおける有用性を評価するためには、実験動物として一般に使用される純系マウスは使用できず、ＨＬＡを発現するトランスジェニック動物（以下、ヒトモデル動物と称する場合もある）を用いる必要がある。すなわち、当該ワクチン療法剤に由来するヒト抗原ペプチドは、ＨＬＡに提示されることにより特異的免疫応答を誘導することが可能となるものであるが、当該ＨＬＡはヒトに特異的なＭＨＣクラスＩ分子であるため、ＨＬＡを有さない非ヒト実験動物をヒト治療用ワクチン療法剤のイン・ビボ評価に使用することは出来ない。従って、前記のようにワクチン療法剤の有用性の評価には、ＨＬＡを発現するトランスジェニック動物（ヒトモデル動物）が必須である。
ところでトランスジェニック動物の作製に関しては、種々の基本書により技術的には理解されているものの、所望の機能を有するトランスジェニック動物（ヒトモデル動物）を得ることは容易ではない。すなわち、導入遺伝子の発現が弱い、若しくは全く発現しない、あるいは発現していてもモデル動物としての所望の機能を有していない等、目的のモデル動物が得られないケースも多く、そのためヒトモデル動物の作製および／または樹立は未だ予測不能の技術であると考えられている。
ＨＬＡのヒトモデル動物に関しては、ＨＬＡと抗原ペプチドとの複合体をヒトモデル動物のＣＴＬが有効に認識できるように、モデル動物がマウスの場合には、ＨＬＡのα３領域をマウスＭＨＣクラスＩ分子の同領域に置換したキメラＨＬＡ分子の遺伝子を導入したヒトモデルマウスが好ましいとされている。しかしながら、当該キメラＨＬＡ遺伝子導入ヒトモデル動物の成功例は極めて少なく、ＨＬＡ−Ａ２．１に関するヒトモデル動物（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：９７，１９９６；ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスと呼ばれる，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５：２０３４，１９９７）、およびＨＬＡ−Ａ１１に関するヒトモデル動物（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：４７５３，１９９７；ＨＬＡ−Ａ１１／Ｋｂトランスジェニックマウスと呼ばれる）の２例が報告されているにすぎない。そこではトランスジェニックマウスのワクチン療法剤投与によるＣＴＬ誘導の有無が、ヒトの場合と高く相関していることが明らかにされており、トランスジェニックマウスのヒトモデル動物としての有用性が示されている。
前記ＨＬＡ−Ａ２．１及びＨＬＡ−Ａ１１は欧米人に多いＨＬＡハプロタイプであるが、これらのＨＬＡと異なりアジア人に多いＨＬＡハプロタイプ、すなわち約６０％の日本人を含む多数のアジア人に共通のＨＬＡハプロタイプとしては、ＨＬＡ−Ａ２４が良く知られている。当該ＨＬＡ−Ａ２４に関して、前述のようなキメラＨＬＡ遺伝子導入ヒトモデル動物が樹立されれば、アジア人に広く適用可能なＨＬＡ−Ａ２４拘束性ワクチン療法剤のイン・ビボ評価が可能となるため、当該領域の医薬品開発に多大な貢献をもたらすものと考えられる。しかしながら、当該ＨＬＡ−Ａ２４に関するヒトモデル動物は未だ報告されておらず、そのため当該モデル動物の樹立が望まれている状況にあった。そのようなモデル動物は、ワクチン療法剤の評価のみならず、スクリーニングにも有用である。
ところで腫瘍抗原タンパク質ＰＳＡは、正常な前立腺上皮細胞においても特異的に発現する糖タンパク質で、血中半減期は２〜３日である。癌化に伴い発現量が増強して腫瘍抗原タンパク質となることから、癌の診断マーカーとして利用されている（患者血清中のＰＳＡ値を測定）。前立腺癌は欧米諸国では発生率、死亡率ともに男性悪性腫瘍の第１〜３位を占め、また近年、我が国においても増加傾向が認められている。前立腺癌はアンドロゲン感受性癌であることより、アンドロゲン除去を目的とした治療法（内分泌療法）が施行されている。しかし、前立腺癌は治療開始時には内分泌療法に反応して制癌されていても、５年後には半数以上の症例が再燃癌、すなわちアンドロゲン不応性癌へと移行する。このアンドロゲン依存性喪失は前立腺癌の内分泌治療における大きな障害になっている。このため、ＰＳＡ由来の抗原ペプチドを用いたワクチン療法の開発が望まれている。
ＰＳＡに関して、最近、ＨＬＡ−Ａ２タイプの抗原ペプチド領域が同定された（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８９：２９３，１９９７）。しかしながらＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４０２）タイプに拘束性の抗原ペプチド領域の存在に関しては、これまで何ら報告されていない。ちなみにＭＨＣクラスＩ分子には多くのサブタイプが存在し、結合できるペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのサブタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。前記ＨＬＡ−Ａ２４タイプの結合モチーフは、２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである。しかしながら、当該結合モチーフより同定したペプチドが免疫原性を有するとは限らない。即ち、抗原ペプチドは腫瘍抗原タンパク質が細胞内でプロセシングされることにより生成されるため、ｉｎ　ｖｉｖｏでプロセシングにより生成されないペプチド領域は抗原ペプチドになり得ない。更に、結合モチーフに基づいて同定した腫瘍抗原タンパク質上のアミノ酸領域がペプチドとして細胞内で生成されても、そのような腫瘍抗原タンパク質は本来生体に存在する物質であるため、アナジーとなっている場合がある。以上のように、抗原ペプチドの同定は目的のＨＬＡタイプに対する結合モチーフによる予測のみでは不十分であり、この観点からも、前記ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチドを評価できるヒトモデル動物の樹立が望まれている状況にあった。
発明の開示
本発明は、抗原タンパク質や抗原ペプチドのイン・ビボ評価を可能とする、ＨＬＡ−Ａ２４のヒトモデル動物を初めて提供すること、及び当該ヒトモデル動物を用いて新規なＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを同定することなどを目的とする。具体的には、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原刺激によりＣＴＬが誘導されることを特徴とするＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入トランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物を用いた腫瘍やウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、あるいは当該スクリーニング方法により選択されたＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドなどを提供することなどを目的とする。
本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原タンパクや抗原ペプチドのイン・ビボ評価を可能とするために、ＨＬＡ−Ａ２４を発現するトランスジェニック動物（ヒトモデル動物）の作製につき鋭意検討した。
本発明者らの意図するトランスジェニックマウスの作製において参考となり得たのは、前述の２例の報告のうちＨＬＡ−Ａ２．１のケース（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：９７（１９９６））の１例のみであった。しかしながら、この文献に記載の方法は、本発明の目的を達成するには不適切であった。即ち、前述のごとく、ＨＬＡのヒトモデル動物の作製にあたり、ＨＬＡのα３領域をマウスＭＨＣクラスＩ分子（Ｈ−２Ｋｂなど）の同領域に置換したキメラＨＬＡ分子の遺伝子を導入する方法が知られているが、適切なキメラ遺伝子を得るには、ＨＬＡ分子上にＨ−２Ｋｂ分子との連結に適した制限酵素部位が必要である。しかし、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子の場合、ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子と異なり、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子のα１及びα２領域とマウスＭＨＣ（Ｈ−２Ｋｂ）のα３領域とをゲノム上で連結するための適当な制限酵素部位が存在しないので、人工的に適切な制限酵素部位を構築する必要があった。さらに、このような人工配列を含むキメラＨＬＡ−Ａ２４のゲノムＤＮＡを個体へ導入した際に、正常にスプライシングされて目的のキメラＨＬＡ−Ａ２４分子を発現するか否かは全く予測できない状況にあった。また、作製されたトランスジェニック動物が正常にキメラＨＬＡ−Ａ２４分子を発現し、所望のＣＴＬ誘導能を有するヒトモデル動物となり得るか否かについても不明であった。加えて、マウスＨ−２Ｋｂのイントロン３領域（ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子との連結領域）の大半は遺伝子配列が明らかにされておらず、入手が容易でないという状況にあった。
このような状況の中、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４０２）遺伝子およびマウスＨ−２Ｋｂ遺伝子の、キメラ分子作製に必要な領域をクローニングし、人工的に作製した制限酵素部位を介して両配列を連結し、キメラＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子）を作製することに成功した。そして、当該キメラ遺伝子をＣ５７ＢＬ／６マウス系統由来の受精卵へマイクロインジェクトすることにより、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスの作製を試みた。８００個以上の受精卵を対象にマイクロインジェクションを施行した結果、８ラインのトランスジェニックマウスが作出され、そのうち、わずかに１つのライン（０４−１ライン）のみが、ホモ型で本発明のＨＬＡ−Ａ２４遺伝子（キメラ遺伝子）を有するトランスジェニックマウスとして発生した。当該０４−１ライン系統のマウスに対して、既知のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドによる刺激を行った結果、良好なＣＴＬ誘導活性が認められ、本発明の目的にかなうＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックマウスであることが明らかとなった。
さらに本発明者は、この樹立されたトランスジェニックマウスを用いることにより、イン・ビボで抗原性を有するＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドを同定することにも成功した。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
即ち本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原刺激により、ＣＴＬが誘導されることを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（２）ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子をホモで有することを特徴とする、前記（１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（３）ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子のα１及びα２領域とマウスＭＨＣクラスＩ遺伝子のα３領域を含有するキメラ遺伝子である、前記（１）又は（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（４）ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子がＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子である、前記（１）〜
（３）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（５）ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するものである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（６）ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が配列番号：２に記載のヌクレオチド配列を含有するものである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（７）ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含有するものである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（８）ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が、前記（５）〜（７）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有するものである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（９）非ヒト哺乳動物がマウスである、前記（１）〜（８）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（１０）マウスがＣ５７ＢＬ／６系統のマウスである、前記（９）記載のトランスジェニツク非ヒト哺乳動物、
（１１）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法、
（１２）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、
（１３）被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価するための標的細胞として、前記（１）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が保有しているＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が導入され、発現している形質転換細胞を用いることを特徴とする、前記（１１）又は（１２）記載のスクリーニング方法、
（１４）前記（３）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が保有しているＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が導入され、発現している形質転換細胞、
（１５）前記（１４）記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法、
（１６）前記（１４）記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、
（１７）配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ、
（１８）配列番号：２に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ、
（１９）配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ、
（２０）前記（１７）〜（１９）のいずれかに記載のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、単離されたＤＮＡ、
（２１）配列番号：３に記載のアミノ酸配列の第２５位〜第１１４位をコードするヌクレオチド配列、第１１５位〜第２０６位をコードするヌクレオチド配列、及び第２０７位〜第２９８位をコードするヌクレオチド配列を含有する、前記（２０）に記載の単離されたＤＮＡ、
（２２）配列番号：２に記載のヌクレオチド配列の第７２位〜第３３９位、第３４２位〜第６１５位、及び第６１８位〜第８９１位で示される配列を有するポリヌクレオチドを含有する、前記（２０）に記載の単離されたＤＮＡ、
（２３）前記（１７）〜（２２）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する発現ベクター、
（２４）前記（２３）に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換細胞、
（２５）前記（２４）に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法、
（２６）前記（２４）に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、
（２７）前記（１１）〜（１３）のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られる、ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（２８）配列番号：１５に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（２７）に記載の腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（２９）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（２８）に記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（３０）前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を有効成分として含有する、ＣＴＬの誘導剤、
（３１）前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡ、
（３２）前記（３１）に記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
（３３）前記（３２）に記載の組換えＤＮＡを発現させて得られるポリペプチド、
（３４）前記（３２）に記載の組換えＤＮＡまたは前記（３３）記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、ＣＴＬの誘導剤、
（３５）ＨＬＡ−Ａ２４抗原と前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体が提示された抗原提示細胞、
（３６）前記（３５）に記載の抗原提示細胞を有効成分として含有してなるＣＴＬの誘導剤、
（３７）ＨＬＡ−Ａ２４抗原と前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を認識するＣＴＬ、
（３８）前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体、前記（３２）に記載の組換えＤＮＡ、前記（３３）に記載のポリペプチド、前記（３５）に記載の抗原提示細胞、あるいは前記（３７）に記載のＣＴＬを有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤又は予防剤、並びに
（３９）前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を含有してなる腫瘍の診断薬。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニック動物を初めて提供するものである。具体的には本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原刺激によりＣＴＬが誘導されることを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するものである。
本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の利用に関する。
さらに本発明は、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成に有用なＤＮＡ構築物（例、キメラ遺伝子）、該キメラ遺伝子で形質転換された宿主細胞およびそれらの利用等に関する。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するために導入されるＨＬＡ−Ａ２４遺伝子としては、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子やＨＬＡ−Ａ２４０３遺伝子などの亜種（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２３：２８２，２０００）を挙げることができる。しかし、ＨＬＡ−Ａ２４保有者の大半がＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を保有しているため、多くの患者に適応可能なワクチン療法剤をイン・ビボ評価できるトランスジェニック動物を作製するという観点から、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を用いることが好ましい。ここでＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６４７４０として登録されており、またＨＬＡ−Ａ２４０３遺伝子はＡｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６４７４１として登録されている。これらの配列に基き適当なＰＣＲプライマーを作製し、ヒト腫瘍細胞等の種々の細胞株由来のゲノムＤＮＡやｍＲＮＡを鋳型として前記プライマーを用いたＰＣＲ反応を行うことにより、所望のＨＬＡ−Ａ２４遺伝子をクローニングすることができる。
また導入するＨＬＡ−Ａ２４遺伝子としては、天然のＨＬＡ−Ａ２４遺伝子（ゲノム及びｃＤＮＡ）であってもよいが、当該ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子のα３領域が、導入対象動物の対応α３領域に置換されているキメラＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を用いることが好ましい。
ＨＬＡ分子の細胞外ドメインは、α１、α２、及びα３領域より構成されており、α１及びα２領域は抗原ペプチドの収容溝の形成に関与し、α３領域はＣＴＬ表面に発現する補助レセプター：ＣＤ８分子との結合に関与している。そして、ＨＬＡモデル動物のＣＴＬがＨＬＡと抗原ペプチドとの複合体を有効に認識するためには、該動物が、ＨＬＡのα３領域を導入対象動物のＭＨＣの同領域に置換したキメラＨＬＡ分子を発現していることが好ましいと考えられている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：９７，１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：４７５３，１９９７）。従って前述のように、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子のα３領域が導入対象動物の対応α３領域に置換されていることが好ましい。このようなキメラＨＬＡ−Ａ２４遺伝子も、発現してＨＬＡ−Ａ２４としての機能を保持する限り、本発明における「ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子」の範疇に含まれる。
なお、本発明の目的から、当該キメラＨＬＡ−Ａ２４遺伝子において、抗原ペプチドの収容溝の形成に関与しているα１及びα２領域は、少なくともＨＬＡ−Ａ２４遺伝子由来である必要がある。一方、α３領域は前述のように導入対象動物のＭＨＣの同領域に置換されていることが好ましく、さらにα３領域のみならず、α３領域以降の領域が導入対象動物のＭＨＣの同領域に置換されているキメラＨＬＡ−Ａ２４遺伝子が、より好ましい。
例えば、導入対象動物がマウスの場合、ヒトＨＬＡに対応するマウスＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩであるＨ−２（Ｈ−２Ｋｂなど）に相当する（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．，４１：１７８，１９９５）。従って、マウスに導入するＨＬＡ−Ａ２４遺伝子の好適な例として、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子のα１及びα２領域とマウスＨ−２Ｋｂ遺伝子のα３領域とを含有する、キメラＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子が挙げられる。
このように、本明細書中、本発明に関して「ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子」という語句は、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子に属する種々の亜種を包含し、さらに、そのようなＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を構成するα１、α２およびα３領域（ドメイン）の全てを含む天然のＨＬＡ−Ａ２４遺伝子のみならず、これら３つの領域のうち少なくともα１およびα２領域を含むＤＮＡ構築物をも包含する意味で用いる。ここに、ＤＮＡ構築物としては、ＨＬＡ−Ａ２４由来のα１、α２領域と、マウス等の任意の哺乳動物由来のα３領域からなるキメラ遺伝子が挙げられる。
本発明に有用なキメラＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子の具体例として、以下のものが列挙される。
（１）配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ。
（２）配列番号：２に記載のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ。
（３）配列番号：１に記載のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能（即ち、ＣＴＬ誘導活性）を有するようなＤＮＡ。
ここで（４）のＤＮＡは、前記（１）〜（３）のＤＮＡと類似の構造を有するＤＮＡ（例えば１〜数個のアミノ酸の改変等を含むＤＮＡ）を指すものである。具体的には、例えば、ホルムアミド濃度：４５％（ｖ／ｖ）、塩濃度：５×ＳＳＰＥ、温度：４２℃程度の条件下でハイブリダイズさせ、塩濃度：２×ＳＳＰＥ、温度：４２℃程度の条件下で洗浄するといったストリンジェントな条件下で、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズし、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる（活性測定法については後述する）。また、前記（１）〜（３）のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１〜複数個（好ましくは、１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる。さらには、前記（１）〜（３）のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列のいずれかと約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する配列をコードするＤＮＡであって、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる。
より具体的には、配列番号：３に記載のアミノ酸配列の第２５位〜第１１４位（α１領域）をコードするヌクレオチド配列、第１１５位〜第２０６位（α２領域）をコードするヌクレオチド配列、及び第２０７位〜第２９８位（α３領域）をコードするヌクレオチド配列を含有し、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる。さらに、配列番号：２に記載のヌクレオチド配列の第７２位〜第３３９位（α１領域）、第３４２位〜第６１５位（α２領域）、及び第６１８位〜第８９１位（α３領域）を含有し、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる。
以下、本発明のＨＬＡ−Ａ２４遺伝子作製法の具体例として、当該キメラＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子作製法の一例を記述するが、これらは本発明を制限するものではない。
まず、キメラＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を作製するために、ヒトＨＬＡ−Ａ２４０２のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｌ４７２０６）の配列情報を基に、α１及びα２領域を含む必要領域（プロモーター、エキソン１〜３、及びイントロン１〜３）をクローニングする。その際、マウスＨ−２Ｋｂ遺伝子との連結を可能とするために、イントロン３中に適当な制限酵素認識部位を構築することが望ましい。そのような制限部位としては制限酵素ＢｇｌＩＩ部位が好ましい。当該ＢｇｌＩＩ部位は、クローニングに用いる下流プライマー中にＢｇｌＩＩ部位が生じるような改変を施しておき、この下流プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、構築することができる。具体的には配列番号：５に記載のプライマーを用いることにより、当該改変を施すことができる。
なお前記クローニングは、例えばヒト腫瘍細胞株由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、前述のような適当なＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことなどにより実施することができる。当該ＰＣＲは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの基本書に従い容易に行うことができ、また現在ではＰＣＲキット等も多数市販されている。
他方、マウスＨ−２ＫｂのゲノムＤＮＡの配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ｖ００７４６，ｖ００７４７）を基に、例えばマウス腫瘍細胞株由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記と同じくＰＣＲ反応により、α３以降の領域（エキソン４〜８、及びイントロン３〜７）をクローニングする。なお、前記ＧｅｎＢａｎｋ登録配列は不完全であり、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子との連結に必要なイントロン３領域の大半が登録されていないので、まず当該未登録領域をクローニングして配列決定する必要がある。ここで、Ｈ−２Ｋｂ遺伝子には相同な偽遺伝子や相同性の高い遺伝子が存在しているため、正しいＨ−２Ｋｂ遺伝子をクローニングするには適切なプライマーを用いてクローニングする必要がある。好ましいプライマーとして、例えば、実施例２記載の各種プライマー（配列番号：６〜配列番号：９）を挙げることができる。
以上のようにして得られたＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノム断片及びマウスＨ−２Ｋｂゲノム断片を連結して、所望のキメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子）を構築する。その際、前記のようにＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子のイントロン３中にＢｇｌＩＩ部位を構築した場合は、当該ＢｇｌＩＩ部位とマウスＨ−２Ｋｂ遺伝子のイントロン３中のＢａｍＨＩ部位とで両遺伝子を連結することが好ましい。このようにして、本発明のキメラＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子）を作製することができる。
なお、作製されたキメラＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子に対して１〜複数個のアミノ酸の改変を施す手法も当業者に周知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い行うことができる。
次に、前記で作製されたＨＬＡ−Ａ２４遺伝子の受精卵への導入及びトランスジェニック動物の作製につき記述する。
まず、前記で作製されたＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を含有するプラスミドからＨＬＡ−Ａ２４遺伝子部分を切り出し、この断片を常法により受精卵に導入できる程度に精製する。なお、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子が前述のようにＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子の本来のプロモーター領域を保有している場合は、切り出したＨＬＡ−Ａ２４遺伝子断片をそのまま用いて受精卵に導入することが可能であるが、このような本来のプロモーターを有していない場合は、発現に必要な外来性プロモーターを付加する必要がある。当該プロモーターとしては、βアクチンプロモーター、メタロチオネインプロモーター等が挙げられる。さらに、より発現量を上げるためにエンハンサーを付加することも可能であり、当該エンハンサーとしてはＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、免疫グロブリンエンハンサー等が挙げられる。
次に、精製されたＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を対象動物の受精卵へ導入する。ここで対象動物としてはマウス、ラット、ウサギ等を具体的に例示することができるが、創製、育成、使用の簡便さなどからしてマウス、ラット等のげっ歯目動物が好ましく、特にマウスが好ましい。中でもＣ５７ＢＬ／６系統のマウスを用いることがより好ましい。すなわちＣ５７ＢＬ／６系統マウスはクラスＩ分子としてＨ−２Ｋｂを発現しており、ＨＬＡ−Ａ２４と同様な結合モチーフを有するＨ−２Ｋｄを発現していないため、当該トランスジェニックマウスにＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチドを投与しても、内因性のマウスクラスＩにより細胞表面に提示されることがなく、交差反応が起こらないという利点を有する。
以下、マウスを例にとりトランスジェニックマウスの作製につき説明する。
マウス受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなく、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等により導入することができる。導入後、得られた卵細胞を培養し、仮親マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから本発明のＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を含有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。当該トランスジェニックマウスの選択は、例えばマウスの尾ＤＮＡ調製物を鋳型として、導入したＨＬＡ−Ａ２４遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法等により、行うことができる。
作出されたトランスジェニックマウスのラインが、導入されたＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を細胞表面に発現しているか否かは、例えばトランスジェニックマウスより摘出した脾臓より脾細胞を回収し、当該脾細胞をフローサイトメトリー法により解析することにより、調べることができる。このようにして得られた本発明のトランスジェニックマウスは、導入ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子をホモで有していることが望ましい。
なお、以上のようなトランスジェニック動物は、例えば新遺伝子工学ハンドブック，２６９−２７６，羊土社（１９９６）や、マウス胚の操作マニュアル，近代出版（１９８９）などの基本書を参考にして創製することができる。例えば、マウスゲノムのＨ−２Ｋｂ遺伝子座にキメラＨＬＡ−Ａ２４遺伝子としてのＤＮＡ構築物を組み込むことを目的として、マウス胚性幹細胞中に導入し、そのようにして製造された組み換え幹細胞を選択し、次いで、マウス胚盤胞中に導入してキメラ胚を得る。これを偽妊娠マウス中に移植し子孫を得、その子孫をスクリーニングして、導入キメラ遺伝子の対立遺伝子を含むヘテロ接合マウスを同定する。次いで、これらのマウスを交雑させて、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原刺激により、ＣＴＬが誘導されることにより特徴付けられる表現型を有するホモ接合トランスジェニックマウスを得ることができる。
本発明のトランスジェニック動物がヒトモデル動物として使用できるか否か、すなわちＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原刺激により特異的ＣＴＬが誘導されるか否かは、当業者に周知のあらゆる手法を用いて調べることが可能であるが、以下に代表的な一例を記載する。
まず、既知のＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチドを、常法により不完全フロイントアジュバントと混合し、ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルションを作製する。当該エマルションでトランスジェニックマウスを免疫する。免疫部位としてはマウス尾部や背の皮下、腹腔内および足蹠などが好ましい。数日後に脾臓を摘出し、常法により脾細胞を回収・調製する。ここで脾細胞を用いる理由は、樹状細胞などの抗原提示細胞は脾細胞に含まれているためであるが、脾細胞に限定されるものではない。
次に当該脾細胞を溶血処理し、Ｘ線照射した後、前記抗原ペプチドをパルスする。その際、非照射・非ペプチドパルスの脾細胞を同時に加えて３７℃で再刺激を行う。数日間刺激し、これを評価用の被験試料とする。
他方、前記被験試料をアッセイするための標的細胞を作製する。当該標的細胞としては、細胞表面にＨＬＡ−Ａ２４が発現している細胞であれば、如何なる細胞であっても用いることが可能であり、天然にＨＬＡ−Ａ２４を発現している細胞、及びＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を導入して作製された形質転換細胞のいずれをも用いることができる。
ここで天然にＨＬＡ−Ａ２４を発現している細胞としては、本発明のトランスジェニック動物から単離・精製されたリンパ球や、天然にＨＬＡ−Ａ２４を発現しているＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ細胞（理研細胞バンク　ＲＣＢ０４４４）などが挙げられる。
また、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を導入して作製された形質転換細胞としては、以下のものが挙げられる。
まず、細胞へ導入するＨＬＡ−Ａ２４遺伝子としては、天然型のＨＬＡ−Ａ２４遺伝子であっても、また前述のようなキメラＨＬＡ−Ａ２４遺伝子であっても良いが、評価対象であるトランスジェニック動物のＣＴＬが認識し易いように、当該トランスジェニック動物が保有しているＨＬＡ−Ａ２４遺伝子と同じ遺伝子を細胞に導入することが好ましい。すなわち、トランスジェニック動物がキメラＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子）を保有している場合、当該トランスジェニック動物の評価に用いる標的細胞においても、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子を導入することが好ましい。
当該導入用のＨＬＡ−Ａ２４遺伝子は、ｃＤＮＡの形態であってもゲノムＤＮＡの形態であっても良い。またトランスジェニック動物自身から当該ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を単離しても、それ以外の細胞等から単離しても良い。
例えば導入用遺伝子としてＨＬＡ−Ａ２４のｃＤＮＡを用いる場合、トランスジェニック動物から単離されたｍＲＮＡを鋳型として、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲ反応を行うことにより、目的のｃＤＮＡを得ることができる。また、導入用遺伝子としてＨＬＡ−Ａ２４のゲノムＤＮＡを用いる場合は、天然にＨＬＡ−Ａ２４を発現しているＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ細胞（理研細胞バンク　ＲＣＢ０４４４）より単離されたゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲ反応を行うことにより、目的のゲノムＤＮＡを得ることができる。さらに、前記でトランスジェニック動物への導入用に作製されたＨＬＡ−Ａ２４遺伝子（キメラＨＬＡ−Ａ２４遺伝子等）も使用することができる。
当該導入されるｃＤＮＡやゲノムＤＮＡの具体例としては、前述の（１）〜（４）のＤＮＡ、すなわち、配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するｃＤＮＡや、配列番号：２に記載のヌクレオチド配列を含有するｃＤＮＡ、あるいは配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含有するゲノムＤＮＡなどが挙げられる。
得られたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１誘導体、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＥＦ誘導体、ｐＲＥＰ９誘導体（インビトロジェン）、ｐＩＲＥＳｎｅｏ（クロンテック）等の市販の発現ベクターに組み込むことにより、所望のＨＬＡ−Ａ２４を発現する組換え発現ベクターを作製することができる。
宿主細胞としては、ヒトリンパ球細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ　Ｔ１Ｂ−１５２）、Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１９９２）や、マウスリンパ球細胞であるＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ　Ｔ１Ｂ−３９）、ＲＭＡ−Ｓ細胞（Ｎａｔｕｒｅ．，３４６，４７６．８０（１９９０））、Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−２４３）、Ｃ１Ｒ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２３６９）などが挙げられる。当該宿主細胞へのＨＬＡ−Ａ２４遺伝子含有発現ベクターの導入法としては、例えば遺伝子導入装置を用いる方法、リン酸カルシウム法（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，５２，４５６−４６７（１９７３））、ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ社）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法等が挙げられる。その後、選択培地にて生存する細胞を培養することにより、導入遺伝子が安定に発現する宿主細胞を樹立することができる。
以上のようにして樹立された標的細胞は、当業者に周知の手法により前記トランスジェニック動物の評価（トランスジェニック動物由来の被験試料の評価）に用いられる。具体的には、例えば抗原刺激により誘導されたＣＴＬが標的細胞に反応して産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法などによって測定する手法や、標的細胞の傷害活性を測定する５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：３１７（１９９４））などが挙げられる。
ここで５１Ｃｒリリースアッセイとは、前記標的細胞を５１Ｃｒラベルし、対象となる抗原ペプチドをパルスして、前記トランスジェニック動物由来の被験試料（脾細胞）を添加し、標的細胞がＣＴＬにより傷害を受けて遊離された５１Ｃｒの量を測定する手法である。このようなアッセイによって抗原特異的なＣＴＬの誘導が認められれば、当該トランスジェニック動物はＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍抗原タンパクや腫瘍抗原ペプチドを評価することのできるヒトモデル動物であることが明らかとなる。
以上のようにして作製された本発明のトランスジェニック動物は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原刺激によりＣＴＬが誘導されるものである。従って、被験物質がイン・ビボで抗原特異的ＣＴＬ誘導能（誘導活性）を有するか否かの評価に使用することができる。すなわち、本発明は、本発明のトランスジェニック動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
当該スクリーニング方法に供される被験物質としては、イン・ビトロ試験で特異的ＣＴＬ誘導能を有することが明らかにされている抗原タンパクやそれに由来する抗原ペプチド、あるいはそれらをコードするプラスミドＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、活性未知のタンパク質やペプチドあるいはそれらをコードするプラスミドＤＮＡなども含まれる。
具体的には、例えばＭＡＧＥ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３，１９９１）、ｇｐ１００（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５，１９９４）、ＭＡＲＴ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５，１９９４）、チロシナーゼ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９，１９９３）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２１０９，１９９５）、ＣＥＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８７：９８２，１９９５）、ＰＳＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８９：２９３，１９９７）、ＳＡＲＴ−１（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１８７，ｐ２７７−２８８，１９９８、国際公開第９７／４６６７６号パンフレット）、サイクロフィリンＢ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１９０３，１９９１）、ＳＡＲＴ−３（国際公開第００／１２７０１号パンフレット）、ＡＲＴ−１（国際公開第００／３２７７０号パンフレット）等の腫瘍抗原タンパク質及びその部分ペプチド、あるいはそれらをコードするプラスミドＤＮＡが挙げられる。さらに、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、ＨＰＶ、ＨＴＬＶ、ＥＢＶ等のウイルス本体、ウイルス由来の抗原タンパク質及びその抗原ペプチドや、結核菌等の細菌由来の抗原タンパク質及びその抗原ペプチドが挙げられる。
このような被験物質のトランスジェニック動物への投与により、被験物質特異的なＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬが誘導されたか否かの測定・評価は、前記トランスジェニック動物の評価方法と同様にして行うことができる。
すなわち一例を以下に記載すると、まず、本発明のトランスジェニック動物を被験物質で免疫し、脾臓を摘出して脾細胞を回収する。当該脾細胞を溶血処理し、Ｘ線照射した後、被験物質をパルスする。その際、非照射・非パルスの脾細胞を同時に加えて３７℃で再刺激を行う。数日間刺激し、これを評価用の被験試料とする。
他方、前述のようなアッセイ用の標的細胞を５１Ｃｒでラベルし、被験物質の抗原ペプチドをパルスした後、前記被験試料（脾細胞）を添加する。被験試料の添加によって、抗原特異的なＣＴＬの誘導が認められた場合は、当該被験物質はイン・ビボで抗原特異的ＣＴＬ誘導能を有する物質であることが明らかとなる。このようにして選択されたＣＴＬの誘導剤は、腫瘍やウイルス感染症の治療剤及び／又は予防剤として用いることができる。
なお、前述の標的細胞は、トランスジェニック動物の評価や、トランスジェニック動物に投与した被験物質の評価に用いられるのみならず、ＨＬＡ−Ａ２４抗原特異的なＣＴＬが誘導されるか否かを評価する必要のある如何なる被験物質の評価においても、使用することができる。
本発明はまた、本発明のトランスジェニック動物を用いた前記スクリーニングにより得られた、ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチド、及び機能的に同等の特性を有するその誘導体を包含するものである。ここでＰＳＡとは、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０（２），９０３−９１０（１９８９）及びＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ　Ｎｏ．Ｍ２６６６３において開示されたアミノ酸配列を有する腫瘍抗原タンパク質である。
ＨＬＡ抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）があり、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の場合、８〜１１アミノ酸よりなるペプチドのうちのＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシシ、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：ｐ３９１３，１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４３０７，１９９４）。ＰＳＡのアミノ酸配列からこのような結合モチーフ構造を有するペプチド部分を選択し、選択されたペプチドを本発明のトランスジェニック動物に供することにより、イン・ビボで効果を有するＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドを同定し、得ることができる。
当該腫瘍抗原ペプチドとしては、具体的には配列番号：１５に記載のアミノ酸配列よりなる腫瘍抗原ペプチドが挙げられる。
本発明の腫瘍抗原ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ　２，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発　続　第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
前記において「腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有する誘導体」（以下、腫瘍抗原ペプチド誘導体と略す場合がある）とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸残基を改変した改変体であって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるという腫瘍抗原ペプチドとしての特性を有するものをいう。
ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り任意である。
前述の如く、ＨＬＡ抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）があり、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の場合、８〜１１アミノ酸よりなるペプチドのうちのＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：ｐ３９１３，１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４３０７，１９９４）。より好ましくは、当該モチーフは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはトリプトファンである。また、該モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸残基も許容される可能性がある。
従って、本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の具体例としては、第２位および／またはＣ末端のアミノ酸を前記モチーフ上置換が可能なアミノ酸に置換し、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。ペプチドの長さは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合して提示されるという観点から、８〜１１アミノ酸程度が好ましい。
具体的には、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンのいずれかに置換し、および／またはＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンのいずれかに置換したアミノ酸配列（配列番号：１７）からなり、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものが挙げられる。
本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体は、本発明の腫瘍抗原ペプチドと同様に、候補となるペプチドを前記ペプチド合成法に基づき合成し、これを本発明のトランスジェニック動物に供して前記のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ誘導活性に関して試験することにより、腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有するか否かを同定することができる。
本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、後述の実施例にも記載のようにＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を発揮することができる。従って本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。本発明は、腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分として含有する腫瘍の治療剤または予防剤を提供する。本発明の腫瘍の治療剤または予防剤をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＰＳＡ陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ２４抗原に腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体が効果的に提示され、提示されたＨＬＡ−Ａ２４抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、従って、腫瘍の治療または予防が可能となる。ＰＳＡは前立腺癌において高頻度に発現しているので、本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、特に前立腺癌に対して有効に使用される。
本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７：２７７−２８９，１９９４）に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが考えられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡをも提供するものである。本発明のＤＮＡは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列に基き、当業者であれば容易に合成することができる。本発明のＤＮＡの好適な例としては、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。
このような本発明のＤＮＡは、本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を製造する際に有効に用いられる。さらに以下に述べるように、本発明のＤＮＡはＣＴＬの誘導（腫瘍の治療又は予防）においても有効に用いることができる。
すなわち近年、複数のＣＴＬエピトープを連結させた、いわゆる″ポリトープ″をコードするＤＮＡを、ＤＮＡワクチンに利用する手法が用いられている（例えばＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６０，ｐ１７１７，１９９８などを参照のこと）。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡを少なくとも１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他の腫瘍抗原ペプチドをコードするＤＮＡも連結させることにより作製されたＤＮＡ（以下、当該連結されたＤＮＡを「組換えＤＮＡ」と称する）を、適当な発現ベクターに組み込むことにより、ＣＴＬの誘導剤（腫瘍の治療剤または予防剤）の有効成分とすることができる。また、前記の組換えＤＮＡを治療剤または予防剤として用いるのみならず、当該組換えＤＮＡを宿主細胞内で発現させて得られたポリペプチドも、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。
ここで「組換えＤＮＡ」は、ＤＮＡ合成および通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い容易に作製することができる。また、この組換えＤＮＡの発現ベクターへの組み込みも、前記基本書等に従い行うことができる。
作製された本発明の組換えＤＮＡが、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かも、本発明のトランスジェニック動物を用いて評価することができる。
本発明の組換えＤＮＡを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明の組換えＤＮＡを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明の組換えＤＮＡを実際に医薬として作用させるには、当該ＤＮＡを直接体内に導入するｉｎ　ｖｉｖｏ法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ　ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）。ｉｎ　ｖｉｖｏ法がより好ましい。
ｉｎ　ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。ｉｎ　ｖｉｖｏ法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明の組換えＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明の組換えＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明の組換えＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明の組換えＤＮＡを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
以上のような本発明の組換えＤＮＡの腫瘍患者への投与により、抗原提示細胞内で当該組換えＤＮＡに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明の組換えＤＮＡは、特に前立腺癌の治療又は予防に有効である。
また、前記組換えＤＮＡを発現させることにより得られる「ポリペプチド」は、前記組換えＤＮＡを適当な発現ベクター（例えばｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１など）に組み込みこんで作製された発現プラスミドを宿主細胞に導入して形質転換体を得、この形質転換体を適当な培地で培養することにより、発現・生産することができる。ここで宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。また、当該ポリペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かも、本発明のトランスジェニック動物を用いて評価することができる。
本発明のポリペプチドを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体と同様の投与形態、投与方法および投与量により、投与することができる。本発明のポリペプチドを腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明のポリペプチドは、特に前立腺癌の治療又は予防に有効である。
本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞をも提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激により強い細胞傷害活性が認められたが、これは、トランスジェニック動物のリンパ節に本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導された結果に他ならない。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞は、以下に述べるような細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
細胞療法において用いられる抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を体外でパルスして、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を提示可能なＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、前記のようなペプチドの形態のみならず、本発明の組換えＤＮＡまたはそのＲＮＡの形態であっても、本発明のポリペプチドの形態であっても良い。
本発明の抗原提示細胞は、例えば腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明のポリペプチドを体外でパルスしてＨＬＡ−Ａ２４抗原と前記ペプチドまたはその誘導体との複合体を作製することにより得られる（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはポリペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の組換えＤＮＡを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６やＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：ｐ５６０７，１９９８などを参考にして行うことができる。また、ＤＮＡのみならずＲＮＡの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができるが、この場合は、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：ｐ４６５，１９９６などを参考にして行うことができる。
本発明は、前記抗原提示細胞を有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤（腫瘍の治療剤）をも提供するものである。該治療剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＰＳＡ陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、腫瘍を治療することができる。本発明の抗原提示細胞は、特に前立腺癌の治療に有効である。
本発明はさらに、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体との複合体を認識するＣＴＬをも提供する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
すなわちメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８６：１１５９、１９９４）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５：４５３，１９９７）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明の組換えＤＮＡやポリペプチドを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
さらに本発明は、本発明のＣＴＬを有効成分として含有する腫瘍の治療剤も提供する。該治療剤は、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＰＳＡ陽性の患者の体内でＣＴＬによる腫瘍細胞の傷害作用が効率的に促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。本発明のＣＴＬは、特に前立腺癌の治療に有効である。
本発明の腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体はまた、腫瘍を診断するための診断薬の有効成分とすることができる。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体そのものを診断薬として用い、腫瘍が疑われる患者から得た試料（例えば血液、腫瘍組織など）中の抗体の存在を検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することが可能である。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択にも利用できる。具体的には、イムノブロット法、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、蛍光または発光測定法などを用いることにより、当該診断を行うことができる。本発明の診断薬は、特に前立腺癌の診断において有効に用いられる。
さらに近年、抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を用いて抗原特異的ＣＴＬを検出する新しい検出方法が確立された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：ｐ９４，１９９６）。本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体とＨＬＡ抗原との複合体を前記検出方法に供し、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することができる。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、当該医薬による治療効果の判定などにも利用できる。すなわち本発明においては、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分の一部として含有する、腫瘍の診断薬をも提供するものである。
具体的には、文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：ｐ９４，１９９６）に記載の方法に従って蛍光標識したＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体の４量体を作製し、これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより、前記診断を行うことができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
ＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ断片のクローニング
（１）ＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ断片のクローニング
ヒトＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡをＰＣＲクローニングするため、ヒト腫瘍細胞株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ細胞（理研細胞バンク　ＲＣＢ０４４４）を培養し、Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｐｒｅｐ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用い、添付のプロトコールに従い、ヒトゲノムＤＮＡを精製した。次に、キメラＨＬＡ遺伝子の構築に必要なＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ配列についてＧｅｎＢａｎｋデータベースにより調べたところ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．Ｚ７２４２２が該当するものであったが、プロモーター領域（２７０ｂｐ）が登録されていないことが判明した。当該トランスジェニックマウスの作製には、プロモーター、エキソン１〜３、およびイントロン１〜３を必要とする。そこで、プロモーターを含むＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡのＰＣＲクローニングにあたり、日本人に多いＨＬＡ−Ａ２６０１のプロモーターのヌクレオチド配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．ＡＢ００５０４８）を参考にＨＬＡ２６−１Ｆ（５’−ＣＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＣＴＣ　ＴＧＧ　ＣＡＣ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＧＡＴ−３’，３６ｍｅｒ、配列番号：４）を上流プライマーとし、またイントロン３に含まれるヌクレオチド配列の一部を改変したもの、すなわちＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．Ｚ７２４２２の５’末より１２８２番目をＧからＡに改変したＡ２４−ＢｇｌＩＩ３０（５’−ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＴＡＣ　ＡＧＧ　ＣＧＡ　ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＣＧＣ−３’，３０ｍｅｒ、配列番号：５）を下流プライマーとして用いた。
ここで、当該ヌクレオチド改変の理由は以下の通りである。すなわち、トランスジェニックマウスにおいて発現するキメラＨＬＡが、エキソン１から３までをＨＬＡ−Ａ２４０２、エキソン４から８までをＨ−２Ｋｂによって構成されることを目的としており、このようなキメラＨＬＡを作製するために、ＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ上流よりイントロン３にコードされる制限酵素ＢａｍＨＩ部位までとＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡのイントロン３より下流とを連結するため、ＨＬＡ−Ａ２４０２のイントロン３に人為的に制限酵素ＢｇｌＩＩ部位を構築する必要があったからである。
次に、３’→５’のエキソヌクレアーゼ活性の高いＮａｔｉｖｅ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、添付のプロトコールに従い、上記プライマーペアを用いてＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ断片のＰＣＲクローニングを行った。ＰＣＲは９５℃４５秒で熱処理した後、９５℃４５秒、６６℃１分、および７２℃４分を３５サイクル繰り返したのち、７２℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。増幅遺伝子断片をファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％ＮａＣｌ、２％寒天）で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。
（２）ＨＬＡ−Ａ２４０２プロモーター領域のヌクレオチド配列の決定
上記で得られた形質転換体の４個について、３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンをアルカリ溶解法（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．）により精製した。次に、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭ３７７ＤＮＡシークエンシングシステム（ＰＥバイオチステムズ社製）によりヌクレオチド配列を解析した。シーケンス解析用サンプルは、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて、添付プロトコールに従い、各クローンのシーケンスを解析した。その結果、すべてのクローンについてプロモーター領域を比較すると完全に一致していたことより、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されていないＨＬＡ−Ａ２４０２のプロモーター領域のヌクレオチド配列が決定された。また、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．Ｚ７２４２２のヌクレオチド配列と各クローンを比較したところ、ＰＣＲ変異はみられない正常な１個のクローンが存在していた。
実施例２
Ｈ−２ＫｂゲノムＤＮＡ断片のクローニング
（１）Ｈ−２ＫｂゲノムＤＮＡ断片のクローニング
マウス腫瘍細胞株ＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ　Ｔ１Ｂ−３９）を培養してマウスゲノムＤＮＡを精製し、ＰＣＲクローニングに用いた。ＤＮＡの精製方法は、長鎖ＤＮＡの増幅に適するＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＴａｑＴＭ（宝酒造社株式会社製）を用い、添付のプロトコールに従い実施した。次に、キメラＨＬＡ遺伝子の構築に必要なＨ−２Ｋｂ遺伝子配列についてＧｅｎＢａｎｋデータベースにより調べたところ、２つに分断されて登録されていた。すなわち、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号．ｖ００７４６およびｖ００７４７である。ｖ００７４６ではイントロン３の一部迄のＨ−２Ｋｂ上流をコードする１５９４ｂｐ領域が、一方、ｖ００７４７ではイントロン７の一部迄のＨ−２Ｋｂ下流をコードする１８３７ｂｐ領域が登録されていた。ｖ００７４６およびｖ００７４７により２つに分断されて登録されているイントロン３には制限酵素ＢａｍＨＩ部位が存在していなかったことにより、データベースに登録されているＨ−２Ｋｂ遺伝子は不完全長と推測された。
Ｈ−２Ｋｂ遺伝子には相同な偽遺伝子や相同性の高い遺伝子が存在している（Ｃｅｌｌ．，２５：６８３，１９８１）。そこで、当該相同遺伝子と相同性が低く且つｖ００７４６のエキソン３にコードされるＨ−２ＫＢ　Ｆ３（５’−ＣＧＣ　ＡＧＧ　ＣＴＣ　ＴＣＡ　ＣＡＣ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣ−３’，３０ｍｅｒ、配列番号：６）を上流プライマーとし、またｖ００７４７の末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を付加したＨ−２ＫＢ　３Ｒ（５’−ＣＧＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＡＴＣ　ＴＴＴ　ＡＧＣ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＧＧＣ　ＴＣ−３’，３８ｍｅｒ、配列番号：７）を下流プライマーとして、ＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＴａｑＴＭ（宝酒造社株式会社製）を用いて添付のプロトコールに従い、上記精製マウスゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を実施した。当該ＰＣＲは、９８℃１０秒および６６℃４分２５サイクル繰り返したのち、６８℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。
増幅遺伝子断片をファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。この形質転換体３個を３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含する組み換えプラスミドクローンを精製し、シーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。３つの当該クローンのヌクレオチド配列とｖ００７４７のヌクレオチド配列を比較したところ、２クローンでそれぞれ別々に１ヶ所のＰＣＲ変異が、他方１クローンで３ヶ所のＰＣＲ変異がみられた。また、３クローン間では共通しているがｖ００７４７と異なるヌクレオチドが５ヶ所みられた。これらヌクレオチドはイントロン６と３’非翻訳領域に相当する領域にあった。更に、未登録のイントロン３領域においては、３クローン間で異なるＰＣＲ変異したヌクレオチドが１ヶ所みられた。これより、未登録領域のヌクレオチド配列部分を決定することができなかったため、３’→５’のエキソヌクレアーゼ活性の高いポリメラーゼを用いて未登録のイントロン３領域について再度クローニングを行い、ヌクレオチド配列の決定を行った。
（２）Ｈ−２Ｋｂイントロン３のヌクレオチド配列の決定
未登録領域のヌクレオチド配列を決定するため、Ｎａｔｉｖｅ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、添付のプロトコールに従い、上記精製マウスゲノムＤＮＡを鋳型に未登録のイントロン３を含む領域についてＰＣＲクローニングした。ここでは、ｖ００７４６に登録されているＨ−２ｋｂ　Ｆ５（５’−ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＴＧＧ　ＡＣＴ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＧＣ　ＡＧＧ　ＧＴＣ　ＴＴ−３’，２９ｍｅｒ、配列番号：８）を上流プライマーとして用い、またｖ００７４７に登録されているＨ−２ｋｂ　５Ｒ（５’−ＣＡＴ　ＡＧＴ　ＣＣＣ　ＣＴＣ　ＣＴＴ　ＴＴＣ　ＣＡＣ　ＣＴＧ　ＴＧＡ　ＧＡＡ−３’，３０ｍｅｒ、配列番号：９）を下流プライマーとして用いた。ＰＣＲは９５℃４５秒で熱処理した後、９５℃４５秒、６８℃１分、および７２℃４分を２５サイクル繰り返したのち、７２℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。増幅遺伝子断片をファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。この形質転換体の５個について３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンを精製し、ヌクレオチド配列を解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、解析したクローン間のイントロン３領域について比較すると、すべてのクローンで完全に一致していた。これよりイントロン３領域のヌクレオチド配列を決定することができた。未登録領域の制限酵素ＢａｍＨＩ部位よりｖ００７４７までは、４６３ｂｐであることも判明した。
（３）Ｈ−２ＫｂゲノムＤＮＡの構築
前記（２）で未登録領域のヌクレオチド配列が決定されたことにより、目的とするキメラＨＬＡ遺伝子の構築に必要なＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡの全ヌクレオチド配列が決定された。その結果、前記（１）で得られた２種類のクローン、すなわち５’末端側にＰＣＲ変異の無い１つのクローン（Ｈ−２Ｋｂ＃２６）、及び３’末端側にＰＣＲ変異の無い１つクローン（Ｈ−２Ｋｂ＃２０）を組み合わせることにより、目的とするＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡが構築できることが明らかとなった。そこで、これらクローンを制限酵素消化で切断したのち、ＰＣＲ変異の無いそれぞれの領域を互いに組み合わせることにより、ＰＣＲ変異の無いＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡを構築した。構築方法の模式図を図１に示す。
両クローンを制限酵素ＢｇｌＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位で切断し、ライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。３個の形質転換体を３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンをアルカリ溶解法により精製し、シーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、すべての形質転換体がＰＣＲ変異の無いＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡをコードするプラスミドを含有することが明らかとなった。
なお、ここで得られたＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、後述する配列番号：１に記載のヌクレオチド配列の第１５５１位以降の配列に相当するものである。
実施例３
キメラゲノムＤＮＡ（ＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂＤＮＡ）の構築
上記実施例１で得られたＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（ＨＬＡ−Ａ２４０２＃１）を制限酵素ＢｇｌＩＩ部位で切断し、また上記実施例２で得られたＨ−２ＫｂのゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（Ｈ−２Ｋｂ＃２０／２６）を制限酵素ＢａｍＨＩ部位で切断し、ライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。構築方法の模式図を図２に示す。この組み換えプラスミドを４２℃のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に導入し、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。１０個の形質転換体を３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンを精製してシーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、３個の形質転換体が目的のキメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂＤＮＡ、単にＡ２４０２／ＫｂＤＮＡと略することもある）を有するプラスミドを含有することが明らかとなった。構築されたＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂのゲノム配列を配列番号：１に記載する。
実施例４
キメラゲノムＤＮＡのスプライシング解析
マウス腫瘍細胞株ＥＬ４細胞へ、遺伝子導入装置（島津製作所製）を用い、添付プロトコールに従い、構築したキメラＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子）をトランスフェクトした。２日後、トランスフェクトしたＥＬ４細胞およびコントロールとして遺伝子導入していないＥＬ４細胞より、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて添付のプロトコールに従って、トータルＲＮＡを精製した。次に、スーパースクリプトチョイスシステム（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を用いて、添付プロトコールに従い、当該ＲＮＡの一部を鋳型にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８により逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。更に、当該ｃＤＮＡの一部を鋳型にＮａｔｉｖｅ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、添付のプロトコールに従い、キメラ遺伝子を特異的にＰＣＲ増幅した。
このとき、上流プライマーとしてＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子のエキソン１にコードされ且つＨ−２Ｋｂ遺伝子と相同性の低いＣｈｉｍｅｒａ−Ｆ２（５’−ＣＧＡ　ＡＣＣ　ＣＴＣ　ＧＴＣ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＣＴＣ　ＴＣ−３’，２３ｍｅｒ、配列番号：１０）を、一方の下流プライマーとしてＨ−２Ｋｂ遺伝子のエキソン８にコードされ且つＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子と相同性が低いＣｈｉｍｅｒａ−Ｒ２（５’−ＡＧＣ　ＡＴＡ　ＧＴＣ　ＣＣＣ　ＴＣＣ　ＴＴＴ　ＴＣＣ　ＡＣ−３’，２３ｍｅｒ、配列番号：１１）を用い、ＰＣＲは９５℃４５秒を熱処理した後、９５℃４５秒、５３℃１分、および７２℃２分を４０サイクル繰り返したのち、７２℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。
その結果、トランスフェクトしたＥＬ４細胞においてのみ特異的に約１．１ｋｂｐ遺伝子断片が増幅したことより、導入したキメラゲノムＤＮＡはマウス細胞内で転写されたこと、すなわちＨＬＡプロモーターが機能し、予想した部位でスプライシングされたｍＲＮＡが発現していることが予想された。次に、前記ＰＣＲの増幅断片をシークエンス解析した結果、予想通りのＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列が決定された。当該ＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：２に、またそのアミノ酸配列を配列番号：３に記載する。さらに、配列番号：１に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂのゲノム配列と配列番号：２に記載のｃＤＮＡ配列とを並列に配して相互の位置関係を、図３（Ａ）〜図３（Ｐ）に示す。図中、上段は配列番号：１に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂゲノム配列、下段は配列番号：２に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂｃＤＮＡ配列を表している。
実施例５
マイクロインジェクション用ＤＮＡ溶液の製造
構築したキメラＨＬＡ遺伝子をコードするプラスミド１１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ、更にベクターのみを切断する制限酵素ＤｒａＩで消化した。１％ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ（ニッポンジーン社製）ゲルで電気泳動したのち、キメラゲノムＤＮＡを含有するゲル片を回収した。その後、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（バイオ・ラッド社製）を用い、添付プロトコールに従い、導入遺伝子を精製し、１／１０ＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８）に溶解することにより、マイクロインジェクション用ＤＮＡ溶液を製造した。
実施例６
マウス受精卵への導入とトランスジェニックマウスの同定
Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス由来の受精卵を対象に構築したキメラ遺伝子のインジェクションを施行した。
Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス由来の受精卵を用いた理由は、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスはクラスＩ分子としてＨ−２ｂ系統を発現しており、ＨＬＡ−Ａ２４０２と同様な結合モチーフを有するＨ−２Ｋｄを発現していないことによるものである。すなわち、当該Ｃ５７ＢＬ／６系統のトランスジェニックマウスにＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチドを投与しても、内因性のマウスクラスＩによって当該ペプチドが細胞表面に提示されず、交差反応が起こらないという利点を有する。
第１回目のインジェクションでは、８１個の受精卵を対象に施行し、４匹のレシピエントマウスに移植したが産出されなかった。第２回目のインジェクションでは、５０個の受精卵を対象に施行し、２匹のレシピエントマウスに移植することにより４匹が産出されたが離乳前にすべて死亡した。第３回目のインジェクションでは１０１個の受精卵を対象に施行し、４匹のレシピエントマウスに移植することにより１１匹が産出されたが離乳前にすべて死亡した。
第４回目のインジェクションでは、１６８個の受精卵を対象に施行し、６匹のレシピエントマウスに移植することにより２２匹が産出され、１９匹が離乳した。その中の４匹、すなわち０１−４、０４−２、０５−１、および０５−６がトランスジェニックマウスとして同定されたが、０１−４は奇形のため交配不可能で、０５−６は離乳後まもなく死亡した。第５回目のインジェクションでは、２２１個の受精卵を対象に施行し、８匹のレシピエントマウスに移植することにより１４匹が産出され、６匹が離乳した。その中の３匹、すなわち０４−１、０４−５、および０４−６がトランスジェニックマウスとして同定された。第６回目のインジェクションでは、２２５個の受精卵を対象に施行し、８匹のレシピエントマウスに移植することにより１３匹が産出され、９匹が離乳した。その中の３匹、すなわち１０−５、１４−１、および１５−２がトランスジェニックマウスとして同定された。
ここでトランスジェニックマウスの同定は、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子のクローニングで使用したプライマー、すなわちＨＬＡ２６−１Ｆ（配列番号：４）およびＡ２４−ＢｇｌＩＩ３０（配列番号：５）を用いて尾ＤＮＡ調整物を鋳型にＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＴａｑＴＭ（宝酒造社株式会社製）を用い、添付のプロトコールに従ってＰＣＲを行い、１％アガロースゲル電気泳動を行い、１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡバンドがみられるマウスを選別することにより行った。
実施例７
トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子産物の発現
実施例６で作出された８ライン、すなわち０４−２、０５−１、０４−１、０４−５、０４−６、１０−５、１４−１、および１５−２由来のトランスジェニックマウスより、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の記載に従い脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。トランスジェニックマウス脾細胞における導入遺伝子由来のタンパク質であるＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂの細胞表面発現は、フローサイトメトリー法により解析した。このとき、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスより調整した脾細胞をコントロールとして用いた。具体的には、５×１０６個の脾細胞をモノクローナルなＦＩＴＣ標識抗ＨＬＡ抗体Ｂ９．１２．１（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）で染色した。また、モノクローナルなＦＩＴＣ標識抗Ｈ−２Ｋｂ抗体ＡＦ６−８８．５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で内因性のマウスクラスＩを染色した。
その結果、５ライン、すなわち０４−１、０４−５、１０−５、１４−１、および１５−２でＨＬＡクラスＩ特異的な発現がみられ、このうち０４−１ラインのみが、繁殖能を有するラインであることが明らかとなった。一方、他の３ライン、すなわち０４−６、０４−２、および０５−１ラインではＨＬＡクラスＩ特異的な発現はみられなかった。以上により、８ラインのトランスジェニックマウスが作出されたが、クラスＩの発現様式であり且つホモ化を達成したのは０４−１ラインのみであった。
実施例８
ＨＬＡ−Ａ２４０２を発現する形質転換細胞の樹立
前記で作製されたトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ誘導能の評価のために、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂを安定に発現する形質転換細胞、Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞を樹立した。
（１）発現ベクターの構築
Ｔｇマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用い、添付のプロトコールに従って、トータルＲＮＡを精製した。次に、スーパースクリプトチョイスシステム（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を用いて、添付プロトコールに従い、当該ＲＮＡの一部を鋳型にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８により逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。更に、当該ｃＤＮＡの一部を鋳型にＬＡ−ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに従った。このとき、上流プライマーとしてｃｈｉ．ＰＦ１（５’−ＣＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＣＧＣ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＣＣＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＣＧＣ　ＣＣＣ　ＧＡＡ−３’、配列番号：１２）を、一方の下流プライマーとしてｃｈｉ．ＰＲ１（５’−ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＴＧＴ　ＣＴＴ　ＣＡＣ　ＧＣＴ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＴＣＡ　ＴＧＡ　ＡＣ−３’、配列番号：１３）を用いた。ＰＣＲは９５℃４５秒で熱処理した後、９５℃４５秒、６０℃１分、および６８℃２分を２５サイクル繰り返したのち、７２℃で１０分反応させ、その後４℃に冷却した。ＰＣＲ増幅遺伝子を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入することにより、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂをコードする発現ベクターを構築した。
（２）Ｊｕｒｋａｔ細胞への導入
１０ｕｇの上記ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで消化することにより、直線化した。次に、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ　Ｔ１Ｂ−１５２）５×１０６個について、遺伝子導入装置（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を用い、添付プロトコールに従い、構築したキメラＨＬＡ遺伝子をトランスフェクトした。９６穴プレートに０．５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、０．６ｍｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ含有培地で培養した。その結果、６穴中（６クローン）にて細胞の増殖が確認された（Ａ−２、Ａ−４、Ａ−６、Ａ−９、Ａ−１０、Ａ−１１）。これらの中で、Ａ−１０において導入遺伝子の発現が最も高かったことより、当クローンをＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞として樹立した。
実施例９
トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ誘導能試験
ヒト癌抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕは乳癌、卵巣癌、および肺癌で過剰発現していることで知られ、当該抗原由来ペプチドによってＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人末梢血から特異的ＣＴＬを誘導できることが、イン・ビトロ試験により明らかにされている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，８７：５５３，２０００）。
そこで、当該ヒト癌抗原由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチドＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８０−７８８（配列番号：１４）を、破傷風毒素由来のマウスＭＨＣクラスＩＩのＩ−Ａｂ拘束性ヘルパーペプチド（ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ）と共に当該トランスジェニックマウスに免疫し、ヒトの場合と同様に特異的ＣＴＬを誘導し得るか調べた。すなわち、ＤＭＳＯによりＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８０−７８８を４０ｍｇ／ｍｌに、またヘルパーペプチドを２０ｍｇ／ｍｌに調整し、生理食塩水で２ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌに希釈した。次に、ガラスシリンジを用いて、等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬株式会社製）と混合することによりｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルションを作製した。２００μｌの当該薬剤をトランスジェニックマウス（０４−１ライン）の尾の皮下に免疫した。実験開始７日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収・調製した。ＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ　ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ　ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２−７．４）にて溶血処理した脾細胞の一部をＸ線照射（２，０００ｒａｄ）した後、前記ペプチドを１００μｇ／ｍｌで１時間パルスして０．７×１０６個／ｗｅｌｌで２４穴プレートに播種した。このとき、非照射・非ペプチドパルスの７×１０６個／ｗｅｌｌの脾細胞を同時に加えて３７℃下で再刺激を施行した（ペプチド終濃度１μｇ／ｍｌ）。培養液には、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン、５５μＭ２−メルカプトエタノールを含む培養液（ＣＴＭ培養液）を１０ｍｌ用い、６日間イン・ビトロ刺激した。
他方、実施例８で作製したＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞を３．７ＭＢｑ／１０６個で５１Ｃｒラベル後、前記ペプチドを１００μｇ／ｍｌで１時間パルスした。（ラベル時間２時間、ラベル開始１時間後にペプチドを終濃度１００μｇ／ｍｌ添加）。また、ペプチド非パルスの細胞をコントロール標的細胞として調製した。
当該Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂを標的細胞とし、先に調製されたトランスジェニックマウス脾細胞調製物を添加して、ＣＴＬの誘導能を５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：４７５３，１９９７）により測定した。結果を図４に示す。結果として、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８０−７８８で刺激することにより、特異的なＣＴＬの誘導が認められた。
さらに、前記ＨＥＲ−２／ｎｅｕ７８０−７８８と同様にＨＬＡ−Ａ２４拘束性癌抗原ペプチドであることが知られているＭＡＧＥ−３１９５−２０３（配列番号：１８）、ＣＥＡ６５２−６６０（配列番号：１９）、及びＣＥＡ２６８−２７７（配列番号：２０）を用いて、前記と同様のＣＴＬ誘導能試験を行った。結果を図５〜図７に示す。結果として、これら既知のＨＬＡ−Ａ２４拘束性癌抗原ペプチドで刺激することにより、特異的なＣＴＬの誘導が認められた。
以上の結果から、本発明のＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックマウスは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍抗原タンパクや腫瘍抗原ペプチドを評価することのできるヒトモデル動物であることが明らかとなった。
実施例１０
癌抗原ＰＳＡ由来ペプチドによるＣＴＬ誘導
本発明のＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックマウスを用いてＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍抗原タンパクや腫瘍抗原ペプチドをｉｎ　ｖｉｖｏで評価できることが明らかとなったため、当該マウスを用いて、腫瘍抗原ペプチドとして未同定のペプチドの評価を行った。実験にはヒト癌抗原ＰＳＡ由来のペプチドを用いた。なおＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチド領域に関しては、これまで何ら報告されていない。
まず、ＰＳＡタンパク質のアミノ酸配列中のヒトＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ（第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニン）に一致する配列を検索し、９アミノ酸あるいは１０アミノ酸よりなる２種の配列（ＰＳＡ１５２−１６０：配列番号：１５、ＰＳＡ２４８−２５７：配列番号：１６）を同定した。なお、ＰＳＡ１５２−１６０はＰＳＡアミノ酸配列の上の第１５２−１６０位、ＰＳＡ２４８−２５７は第２４８−２５７位の部分に該当するものである。
ＰＳＡ１５２−１６０またはＰＳＡ２４８−２５７の腫瘍抗原性について、実施例７で作製した０４−１ライン由来ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスを利用することにより解析した。ＰＳＡ１５２−１６０またはＰＳＡ２４８−２５７を破傷風毒素由来のマウスＭＨＣクラスＩＩのＩ−Ａｂ拘束性ヘルパーペプチド（ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ）と共に当該トランスジェニックマウスに免疫し、実施例９と同様の手法によりＣＴＬの誘導能を測定した。図８にＰＳＡ１５２−１６０によるＣＴＬ誘導結果を、また図９にＰＳＡ２４８−２５７によるＣＴＬ誘導結果を示す。結果として、ＰＳＡ１５２−１６０において特異的なＣＴＬの誘導がみられたが、ＰＳＡ２４８−２５７では特異的なＣＴＬの誘導はみられなかった。これより、ＰＳＡ１５２−１６０はイン・ビボで腫瘍抗原性を有すること、すなわちＨＬＡ−Ａ２４拘束性の腫瘍抗原ペプチドであることが明らかになった。また、上記の結果は、ＨＬＡ−Ａ２４タイプの結合モチーフを有するペプチドが必ずしもｉｎ　ｖｉｖｏで免疫原性を有するとは限らず、本発明方法が、活性なペプチドの同定に有用であることを示している。
配列表フリーテキスト
配列番号：１に記載のヌクレオチド配列の第１位から第１５５０位までの領域はヒト由来であり、第１５５１位から第３５８７位までの領域はマウス由来である。
配列番号：２に記載のヌクレオチド配列の第１位から第６１８位までの領域はヒト由来であり、第６１９位から第１１１９位までの領域はマウス由来である。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列の第１位から第２０６位までの領域はヒト由来であり、第２０７位から第３７２位までの領域はマウス由来である。
配列番号：４に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：５に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：６に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：７に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：８に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：９に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：１０に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：１１に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：１２に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：１３に記載のヌクレオチド配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号：１７に記載のアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第９番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
産業上の利用可能性
本発明により、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原刺激によりＣＴＬが誘導されることを特徴とするＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入トランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物を用いた腫瘍やウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、及び当該スクリーニング方法により選択されたＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドが提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のキメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子）の作製に用いたＨ−２ＫｂゲノムＤＮＡの構築方法を示す模式図である。
図２は、本発明のキメラ遺伝子であるＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂ遺伝子の構築方法を示す模式図である。ＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（ＨＬＡ−Ａ２４０２＃１）を制限酵素ＢｇｌＩＩ部位で切断し、これにＨ−２ＫｂのゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（Ｈ−２Ｋｂ＃２０／２６）を制限酵素ＢａｍＨＩ部位で切断して切り出したＢａｍＨＩフラグメントをライゲーションにより連結して組み換えプラスミドＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂを構築した。なお、ｎｏｎ−Ａ２４０２／Ｋｂは、ＢｇｌＩＩ切断プラスミドプラスミド（ＨＬＡ−Ａ２４０２＃１）に、Ｈ−２Ｋｂ＃２０／２６のＢａｍＨＩフラグメントが逆向きに連結されて生じたプラスミドである。
図３（Ａ）〜（Ｐ）は、配列番号：１に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂゲノム配列と配列番号：２に記載のＨＬＡ−Ａ２４０２／ＫｂｃＤＮＡ配列の位置関係を示した図である。図３における配列相互の関係は以下の通りである。
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図４は、ＨＬＡ−２４拘束性のヒト癌抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕ由来の抗原ペプチド（ＨＥＲ２／ｎｅｕ７８０−７８８）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（％Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、ｐｅｐ＋はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、ｐｅｐ−はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。実験には、抗原ペプチドＨＥＲ２／ｎｅｕ７８０−７８８で免疫したＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスの脾細胞を該ペプチドでパルスして得たマウス脾細胞調製物を試料として用いた。標的細胞として、本発明のキメラ遺伝子ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂによる形質転換細胞Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞を５１Ｃｒで標識し、上記ペプチドでパルスしたもの（ｐｅｐ＋）を用いた。また、コントロールとしてペプチド非パルス標的細胞（ｐｅｐ−）を用いた。
図５は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の癌抗原ＭＡＧＥ−３由来の抗原ペプチド（ＭＡＧＥ−３１９５−２０３）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（％Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
図６は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の癌抗原ＣＥＡ由来の抗原ペプチド（ＣＥＡ６５２−６６０）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（％Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
図７は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の癌抗原ＣＥＡ由来の抗原ペプチド（ＣＥＡ２６８−２７７）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（％Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
図８は、ヒト癌抗原ＰＳＡタンパク質から、ヒトＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ情報に基づいて得たＰＳＡ由来の抗原ペプチド（ＰＳＡ１５２−１６０）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（％Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、ｐｅｐ＋はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、ｐｅｐ−はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
図９は、ヒト癌抗原ＰＳＡタンパク質から、ヒトＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ情報に基づいて得たＰＳＡ由来の抗原ペプチド（ＰＳＡ２４８−２５７）で本発明のＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫しても特異的ＣＴＬが誘導されなかったことを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（％Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、ｐｅｐ＋はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、ｐｅｐ−はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
【図１】
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【図２】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図３（Ｄ）】
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【図３（Ｅ）】
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【図３（Ｆ）】
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【図３（Ｇ）】
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【図３（Ｈ）】
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【図３（Ｉ）】
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【図３（Ｊ）】
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【図３（Ｋ）】
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【図３（Ｌ）】
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【図３（Ｍ）】
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【図３（Ｎ）】
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【図３（Ｏ）】
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【図３（Ｐ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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