(57)【要約】ヒト脳由来の新規なタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離し、公知配列との相同性分析からＡＤＡＭＴＳファミリーに属し、レプロリシン（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）型亜鉛メタロプロテアーゼドメイン（Ｚｎ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ディスインテグリン様（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ）ドメイン及びＴＳＰ１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｔｙｐｅ　１）ドメインを保存している新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質を得た。特性は、卵巣での高発現及び性周期における発現量の変動、腫瘍細胞における存在の低下及び当該遺伝子の染色体上の位置が５Ｐ−症候群の欠失部位に位置することを特徴とする。この特性を利用して、該ｃＤＮＡ、該タンパク質及びその由来物であるポリペプチドもしくはペプチド、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニング方法、スクリーニングされた化合物等を提供し、これらを利用した医薬組成物、診断・治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選ばれるＡＤＡＭＴＳファミリーに属するポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質；
▲１▼配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲２▼前記▲１▼のポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲３▼前記▲１▼のポリペプチドと少なくとも約５０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
及び
▲４▼前記▲１▼〜▲３▼のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列の一部を有する部分ペプチドであって、少なくとも約８個の連続するアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項３】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖。
【請求項４】
配列表の配列番号２又は配列番号３又は配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖。
【請求項５】
請求の範囲第３項又は第４項に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求の範囲第２項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖。
【請求項７】
配列表の配列番号２又は配列番号３又は配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補的塩基配列の少なくとも約１５個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求の範囲第６項又は第７項に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求の範囲第３項ないし第８項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求の範囲第９項に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求の範囲第１０項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求の範囲第１項又は第２項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドの製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項又は第２項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１３】
少なくともＡＤＡＭＴＳファミリーポリペプチドを認識する、請求の範囲第１２項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは促進する作用を有する化合物、及び／又は請求の範囲第３項ないし第５項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、請求の範囲第１項又は第２項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、請求の範囲第３項ないし第８項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、請求の範囲第９項に記載のベクター、請求の範囲第１０項に記載の形質転換体、請求の範囲第１２項若しくは第１３項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは活性化する化合物、又は請求の範囲第３項ないし第５項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、化合物とポリペプチド又はタンパク質との間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチド又はタンパク質とスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作用はポリペプチド又はタンパク質と化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し得る第２の成分に関連したものである）、次いで、化合物とポリペプチド又はタンパク質との相互作用により生じるシグナルの存在又は不存在又は変化を検出することにより、化合物がポリペプチド又はタンパク質と相互作用して、その活性を活性化又は阻害するかどうかを決定することを含む方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の方法でスクリーニングされる化合物であって、請求の範囲第１項に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害又は促進する化合物又はその塩。
【請求項１７】
請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の方法でスクリーニングされる化合物であって、請求の範囲第３項ないし第５項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物又はその塩。
【請求項１８】
請求の範囲第１項又は第２項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、請求の範囲第３項ないし請求の範囲第８項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、請求の範囲第９項に記載のベクター、請求の範囲第１０項に記載の形質転換体、請求の範囲第１２項若しくは第１３項に記載の抗体、又は請求の範囲第１６項若しくは第１７項に記載の化合物のうちの少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質の発現又は活性に関連した疾病の診断方法であって、（ａ）該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び／又は（ｂ）試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１項又は第２項に記載のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、請求の範囲第３項ないし第８項に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、又は請求の範囲第１２項若しくは第１３項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる、（ａ）該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び／又は（ｂ）試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法に使用する試薬キット。
【請求項２１】
請求の範囲第３項ないし第８項に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖をエクソンとして含有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求の範囲第２１項に記載のヒトゲノム遺伝子断片の塩基配列又はその相補配列の少なくとも１５個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求の範囲第２１項又は第２２項に記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求の範囲第２２項又は第２３項記載のポリヌクレオチド又はその相補鎖をマーカー又はプライマーとして用いることを特徴とする疾病の診断方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なＡＤＡＭＴＳファミリーポリペプチド又はタンパク質、及び該ポリペプチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものである。さらに詳しくは、該ポリペプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部を有するペプチド、該ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該ペプチド又はポリペプチドに対する抗体、これらを利用した化合物のスクリーニング方法でスクリーニングされた化合物、該ポリペプチド若しくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害化合物又は活性賦活化合物、これらに関係する医薬組成物、及びこれらに関係する疾病診断方法、当該形質転換体を使ったペプチド又はポリペプチドの製造方法、当該スクリーニング方法に関する。
背景技術
近年、レプロリシン型（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ　ｔｙｐｅ）亜鉛メタロプロテアーゼドメイン（Ｚｎ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）（Ｈｏｏｐｅｒ　Ｎ．Ｍ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．（１９９４）３５４：１−６）、ディスインテグリン様（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ）ドメイン及びＴＳＰ１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｔｙｐｅ　１　ｒｅｐｅａｔｓ）ドメインを有するユニークなタンパク質が見い出されており（Ｋｕｎｏ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：５５６−５６２；Ｖａｚｑｕｅｓ．Ｆ．，ｅｔ　ａｌ，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：２３３４９−２３３５７等）、これらの特徴的なドメインを有するタンパク質はＡＤＡＭＴＳ（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｍｏｔｉｆｓ）ファミリーと総称されている（Ｔａｎｇ　Ｂ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．（１９９９）４４５：２２３−２２５）。
レプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼドメインは、ＡＤＡＭＴＳ及びＡＤＡＭ（ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）ファミリー等に含まれ、活性中心は一般にＨＥＸ１Ｘ２ＨＸＸ１ＧＸ１ＸＨＤ（通常、Ｘ１；疎水性アミノ酸、Ｘ２；グリシンあるいは疎水性アミノ酸）であり、３つのヒスチジン残基が１つの亜鉛分子に配位していると考えられている（Ｈｏｏｐｅｒ　Ｎ．Ｍ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．（１９９４）３５４：１−６）。
ＴＳＰ１ドメインは、トロンボスポンジン１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）が有する繰り返し配列として見い出され、そのＣＳＶＴＣＧモチーフはＣＤ３６／ＬＩＭＰＩＩ受容体に結合し、ＷＳＸＷモチーフは細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）に結合することが知られている。
ディスインテグリン様ドメインは、システインに富み抗血液凝固作用を有するヘビ毒のディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）に４０％程度の相同性を有している。機能的にヘビ毒のディスインテグリンと同等あるいは同様の作用を有するかは未解明である。
現在、ＡＤＡＭＴＳファミリーとしてＡＤＡＭＴＳ−１〜１０、１２〜１３の１２種類（ＡＤＡＭＴＳ１１も報告されているが、ＡＤＡＭＴＳ５と同一分子であった）が報告されている。その中には、細胞外マトリックスのアグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）切断活性を持つＡＤＡＭＴＳ−４（Ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１）、ＡＤＡＭＴＳ−５（Ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−２）やプロコラーゲン切断活性をもつＡＤＡＭＴＳ−２（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｉ／ＩＩ　ａｍｉｎｏｐｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）のように従来のマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）とよく似た酵素活性をもつものが認められている反面、ＡＤＡＭＴＳ−１（ＭＥＴＨ１）やＡＤＡＭＴＳ−８（ＭＥＴＨ２）のようにエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）やＴＳＰという従来知られていた血管新生阻害因子よりも強い血管新生阻害作用を持つものも発見されている（Ｖａｚｑｕｅｓ．Ｆ．，ｅｔ　ａｌ，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：２３３４９−２３３５７）。
ＡＤＡＭＴＳ−１については、血管新生阻害作用の他、炎症組織での発現上昇（Ｋｕｎｏ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：５５６−５６２）、性周期による発現変動と排卵への関与（Ｒｏｂｋｅｒ　Ｒ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（２０００）９７：４６８９−４６９４；Ｒｏｂｋｅｒ　Ｒ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｔｅｒｏｉｄｓ（２０００）６５：５５９−５７０）等が報告されている。基質としては、アグリカン（Ｋｕｎｏ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．（２０００）４７８：２４１−２４５）及びバージカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）（Ｓａｎｄｙ　Ｊ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：１３３７２−１３３７８）が報告されている。
ＡＤＡＭＴＳ−２は、その欠損が、プロコラーゲンＩの蓄積による皮膚の形成異常を特徴とするＥｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｔｙｐｅ　ＶＩＩＣの原因であることが報告されている（Ｃｏｌｉｇｅ　Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９９）６５：３０８−３１７；Ｌｉ　Ｓ．Ｗ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００１）３５５：２７１−２７８）。ＡＤＡＭＴＳ−３は、ドメイン構造及び活性中心の配列がＡＤＡＭＴＳ−２と非常に似ており、ＡＤＡＭＴＳ−２とともにプロコラーゲンＩＩを基質とすることが報告されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ　Ｒ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：３１５０２−３１５０９）。
ＡＤＡＭＴＳ−４及びＡＤＡＭＴＳ−５は、基質としてアグリカンの３７３番目のグルタミン酸残基と３７４番目のアラニン残基間（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４　ｂｏｎｄ）を切断することが報告されている（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ　Ｍ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：１６６４−１６６６；Ａｂｂａｓｚａｄｅ　Ｉ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：２３４４３−２３４５０）。同部位の切断は慢性関節リウマチや変形性関節症のような関節軟骨破壊を伴う関節疾患の初期徴候の一つであり（Ｓａｎｄｙ　Ｊ．Ｄ．，　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９２）８９：１５１２−１５１６）、ＡＤＡＭＴＳ−４及びＡＤＡＭＴＳ−５の阻害剤がその治療薬として着目されている。また、生体内におけるＡＤＡＭＴＳ−４及びＡＤＡＭＴＳ−５の強力な阻害剤としてＴＩＭＰ−３が報告されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．（２００１）４９４：１９２−１９５；Ｋａｓｈｉｗａｇｉ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：１２５０１−１２５０４）。ＡＤＡＭＴＳ−４については、アグリカン以外の基質として、ブレビカン（ｂｒｅｖｉｃａｎ）（Ｍａｔｔｈｅｗｓ　Ｒ．Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５：２２６９５−２２７０３）、バージカン（Ｓａｎｄｙ　Ｊ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：１３３７２−１３３７８）が報告されている。
最近同定されたＡＤＡＭＴＳ−１３については、血液凝固に関与するフォンビルブランドファクター（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ）の切断活性が認められている（Ｆｕｊｉｋａｗａ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｌｏｏｄ（２００１）９８：１６６２−１６６６；Ｚｈｅｎｇ　Ｘ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）Ｓｅｐ１３［ｅｐｕｂ　ａｈｅａｄ　ｏｆ　ｐｒｉｎｔ］；Ｓｏｅｊｉｍａ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）（２００１）１３０：４７５−４８０）。同酵素活性の欠損は、血栓性血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ　ｐｕｒｐｕｒａ）の原因とされており、ＡＤＡＭＴＳ−１３が着目されている。
発明の開示
本発明が解決しようとする課題のひとつは、上記のように多様な作用の原因物質となり得るＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質に関する新規な物質を見い出し、生体内におけるＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質の制御を可能にすることである。より具体的には、本発明の課題は新規な特性をもつ新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質を提供することであり、それに伴い有用性ある新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質由来のペプチド又はポリペプチドを提供することである。また本発明の別の課題は、新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質由来のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することであり、さらにこれを利用して遺伝子工学手法による新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質の製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質、ペプチド又はポリペプチドに対する抗体を提供することである。その他の本発明の課題は、上記のものを利用して新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニングを行なうことであり、スクリーニングされた化合物を提供することであり、またこれらを利用した医薬組成物及び診断方法を提供することである。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト脳細胞中のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードするｃＤＮＡを単離し、全塩基配列を解析することに成功した。そして、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、当該タンパク質はＮ末端側にレプロリシン（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）様の亜鉛メタロプロテアーゼドメイン（Ｚｎ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）を１個、Ｃ末端側にＴＳＰ１ドメインを５回繰り返して保持し、その中間にディスインテグリン様ドメインを１個有することを確認し、これらのｃＤＮＡにコードされるタンパク質が新規なＡＤＡＭＴＳタンパク質であることを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の１態様は、下記の群より選ばれるＡＤＡＭＴＳファミリーに属するポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質である；
▲１▼配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲２▼前記▲１▼のポリペプチドを含有するポリペプチド、
▲３▼前記▲１▼のポリペプチドと少なくとも約５０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
及び
▲４▼前記▲１▼〜▲３▼のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチド。
本発明の１態様は、配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列の一部を有する部分ペプチドであって、少なくとも約８個の連続するアミノ酸配列を有するペプチドである。
本発明の１態様は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の１態様は、配列表の配列番号２又は配列番号３又は配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の１態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の１態様は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖である。
本発明の１態様は、配列表の配列番号２又は配列番号３又は配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補的塩基配列の少なくとも約１５個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の１態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の１態様は、上記いずれか１つのポリヌクレオチド又はその相補鎖を含有する組換えベクターである。
本発明の１態様は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体である。
本発明の１態様は、上記形質転換体を培養する工程を含む、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドの製造方法である。
本発明の１態様は、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチドを免疫学的に認識する抗体である。
本発明の１態様は、少なくともＡＤＡＭＴＳファミリーポリペプチドを認識する、上記抗体である。
本発明の１態様は、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは促進する作用を有する化合物、及び／又は上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、上記いずれかのポリヌクレオチド、上記ベクター、上記形質転換体、上記抗体のうちの少なくともいずれか一つを用いることを特徴とするスクリーニング方法である。
本発明の１態様は、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害若しくは活性化する化合物、又は上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、化合物とポリペプチド又はタンパク質との間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチド又はタンパク質とスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作用はポリペプチド又はタンパク質と化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し得る第２の成分に関連したものである）、次いで、化合物とポリペプチド又はタンパク質との相互作用により生じるシグナルの存在又は不存在又は変化を検出することにより、化合物がポリペプチド又はタンパク質と相互作用して、その活性を活性化又は阻害するかどうかを決定することを含む方法である。
本発明の１態様は、上記方法でスクリーニングされる化合物であって、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質と相互作用してその活性を阻害又は促進する化合物又はその塩である。
本発明の１態様は、上記方法でスクリーニングされる化合物であって、上記いずれかのポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害若しくは促進する化合物又はその塩である。
本発明の１態様は、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、上記いずれかのポリヌクレオチド、上記ベクター、上記形質転換体、上記抗体、又は上記化合物のうちの少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする医薬組成物である。
本発明の１態様は、上記ポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質の発現又は活性に関連した疾病の診断方法であって、（ａ）該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び／又は（ｂ）個体由来の試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法である。
本発明の１態様は、上記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを有するタンパク質又はペプチド、上記いずれか１つのポリヌクレオチド、又は上記抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる、（ａ）該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸、及び／又は（ｂ）試料中の該ポリペプチド又はタンパク質をマーカーとして分析することを含む方法に使用する試薬キットである。
本発明の１態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をエクソンとして含有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリヌクレオチドである。
本発明の１態様は、上記ヒトゲノム遺伝子断片の塩基配列又はその相補配列の少なくとも１５個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明の１態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の１態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をマーカー又はプライマーとして用いることを特徴とする疾病の診断方法である。
発明を実施するための最良の形態
（新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質）
本発明において提供される新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質は、ヒト脳細胞中のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから発現配列タグ（ＥＳＴ）分析（Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：１６５１−１６５６；Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５５：６３２−６３４；Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７７　Ｓｕｐｐ：３−１７４）を用いてＴＳＰ１ドメインをマーカーとして釣上げられたｃＤＮＡクローン（配列表の配列番号２）の塩基配列から特異的に作成したプライマーを使用して、さらに５′ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄ）法で取得された全長ｃＤＮＡ（配列番号３）がコードする新規なアミノ酸配列を有するものである。当該ｃＤＮＡクローンにコードされるアミノ酸配列は配列表の配列番号１に、該全長ｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列は配列表の配列番号４に記載した。この新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のｍＲＮＡは、ヒトの卵巣で発現が高く、ついで腎臓、肺、胃、精巣、副腎、膵臓で発現量が高かった。また、脳、小腸、骨格筋、皮膚において中程度に発現していた。卵巣での発現が特に高かったことから、同タンパク質は卵の分化・成熟あるいは排卵ひいては受精等に関与することが考えられる。また、卵巣・心臓及び腎臓の腫瘍組織ではｍＲＮＡの発現量が正常組織に比べ著しく低下していたことから腫瘍に関連する遺伝子であることが推定された。さらに、この新規遺伝子が、第５染色体短腕１５．２−１５．３（５ｐ１５．２−１５．３）に存在することを見い出した。５ｐ１５．２−１５．３は５Ｐ−症候群（Ｃｒｉ−ｄｕ−ｃｈａｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の欠失部位であることが報告されていることから（Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）２：２４７−２５２）、該遺伝子と同症候群との関連が示唆された。また、本発明においては、上記新規なヒトＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のマウスのカウンターパートをも見い出し、これを提供する。このマウスＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のｃＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番号７に、該ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列は配列番号８に記載した。
本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質は、公知データベース登録配列との相同性分析からＡＤＡＭＴＳファミリーに属し、ＴＳＰ１ドメイン及びレプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼ（Ｚｎ−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）ドメインを有し、システイン−リッチ　リージョン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ　ｒｅｇｉｏｎ）を有することが判明した。
本タンパク質がＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質であること、またＴＳＰ１ドメインを有することから、ＡＤＡＭＴＳ１及びＡＤＡＭＴＳ８で報告されているのと同様に血管新生阻害作用を有することが示唆される。また、レプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼを有し、かつ卵巣で性周期に応じて発現が変動することから、卵巣の細胞外マトリックスを基質として、その分解及び再構築に関与していると考えられる。
（タンパク質、ポリペプチド又はペプチド）
本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質は、配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列と同一、又は実質的に同一なアミノ酸配列を含有するタンパク質である。当該新規なＡＤＡＭＴＳファミリー含有タンパク質は、ヒトや哺乳動物のあらゆる細胞、又はそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、実施例６及び７にみられる発現特性を保持する限りは特に限定されず、例えば、配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
また、配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、さらに配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質等が例示される。実質的に同質の活性として、例えば同一ファミリーに属するＡＤＡＭＴＳ１及びＡＤＡＭＴＳ８で報告されているように、本発明に係る新規なタンパク質が血管新生阻害活性を有することも考えられるが、その活性測定方法としては、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）法として、ニワトリ胚の漿尿膜（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いるＣＡＭ法（Ｍｏｓｅｓ　Ｍ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：２６４５−２６５０）、ウサギやラットの目の角膜に少し切り目をつけて試料を入れ、そこに向かって近くの細静脈から伸びてくる新生血管を観察する角膜法（Ｇａｕｄｒｉｃ　Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ　Ｒｅｓ．（１９９２）２４：１８１−１８８）等を、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）法として、培養血管内皮細胞を用いてボイデンチャンバーで遊走を、単層培養で細胞の増殖を観察し、管腔形成は三次元のコラーゲンゲルやマトリゲル（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン／エンタクチン及びヘパラン硫酸よりなる再構成基底膜ゲル）で培養して観察する方法（Ｈａａｓ　Ｔ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３：３６０４−３６１０）等をそれぞれ挙げることができる。
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、ｃＤＮＡの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。
本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリーポリペプチドを含むタンパク質は「成熟」タンパク質の形態であってもよく、あるいは融合タンパク質のごとき大型のタンパク質の一部であってもよい。分泌又はリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基のごとき精製を促進する配列、又は組換え生産を行っている間の安定性のためのさらなる配列を含むものであってもよい。
本発明に係るポリペプチド又はペプチドは、配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分配列を有するポリペプチド又はペプチドを包含し、これらは例えば試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位としては８個以上のアミノ酸、好ましくは１０個以上のアミノ酸、より好ましくは１２個以上、さらに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、好ましくは免疫学的に同定し得るポリペプチド又はペプチドを本発明の対象とする。これらのペプチドは、試薬若しくは標準物質、又は後述するように本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質に特異的な抗体を作製するための抗原として単独又はキャリア（例えば、キーホールリンペイトヘモシアニン又は卵白アルブミン）と結合して使用できるが、これらのように別種のタンパク質又は物質を結合したものも本発明の範囲に包含される。部分配列は、「独立して存在するもの（ｆｒｅｅ　ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であるか、あるいはより大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、その中で部分配列は一部分若しくはある領域を形成していてもよい。最も好ましくは、単一の連続した領域としてより大きなポリペプチドに含まれる。
さらに、このように特定されたポリペプチド又はペプチドを基にして、その生理活性（例えば血管新生抑制能）を指標とすることにより、１以上、例えば１ないし１００個、好ましくは１ないし３０個、より好ましくは１ないし２０個、さらに好ましくは１ないし１０個で、特に好ましくは１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はペプチドも提供される。欠失、置換、付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独又は適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテク１９８９年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用できる。例えば、Ｎ末端を含む一連の残基が欠失、又はＣ末端を含む一連の残基が欠失、あるいは一方がＮ末端でもう一方がＣ末端を含む２種の一連の残基が欠失していること以外は上記新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のアミノ酸配列を有する末端切断ポリペプチドを包含する。
また、構造的又は機能的属性により特徴づけられる部分配列、例えばアルファーヘリックス及びアルファーヘリックス形成領域、ベータシート及びベータシート形成領域、ターン及びターン形成領域、コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、及び高抗原性指標領域を含む部分配列等も好ましい。また、生物学的に活性な領域も好ましく、類似の活性若しくは改善された活性のある、又は望ましくない活性を減じた部分配列等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的又は免疫原的な部分配列もまた含まれる。
本発明に係るタンパク質、ポリペプチド及びそれらの部分配列ペプチドのアミノ酸配列は保存的アミノ酸置換により変化したものも含まれている。かかる典型的な置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ間；Ｓｅｒ及びＴｈｒ間；Ａｓｐ及びＧｌｕ間；Ａｓｎ及びＧｌｎ間；並びに塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇ間；あるいは芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ間におけるものである。数個、５ないし１０個、１ないし５個、又は１ないし２個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失又は付加されているものが特に好ましい。
上記のような変異の導入において、当該タンパク質の基本的な性質（物性、活性、又は免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。
なお、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質はペプチド結合又は修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個又はそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドを意味する。また、本明細書において、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称する短鎖をポリペプチド、また、長鎖のものをタンパク質ということもある。
本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質は、２０種の遺伝子によりコードされたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することもできる。「タンパク質」には、プロセッシング及びその他の翻訳後修飾のような天然のプロセッシングにより修飾されたものが含まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。このような修飾は基礎的な参考書及びさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びＮ末端側又はＣ末端側等のポリペプチドの任意の部位で行われ得る。同一の型の修飾は該ポリペプチドの幾つかの部位で、同一又は異なる程度で存在し得る。また、タンパク質は多くの型の修飾をも含み得る。タンパク質は、ユビキチネーションの結果として分枝状であってもよく、分枝を伴う又は伴わない環状のものであってもよい。環状、分枝状及び分枝状かつ環状のタンパク質は翻訳後の天然プロセッシングにより生じるものであってもよく、あるいは合成法により製造されるものであってもよい。
修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、及びセレノイル化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ酸の添加、並びにユビキチネーション等がある。
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９９３年及びＰｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９８３年のＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１−１２頁；Ｓｅｉｆｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）１８２：６２６−６４６及びＲａｔｔａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ａｇｉｎｇ，　Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）６６３：４８−６２参照。
さらに、本発明に係るポリペプチド等の検出若しくは精製を容易にするために、又は別の機能を付加するために、Ｎ末端側やＣ末端側に別のタンパク質、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｍｙｃ−ｔａｇ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、又はＦＬＡＧ−ｔａｇ等のペプチドを直接又はリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することは当業者には容易であり、これらの別の物質を結合したポリペプチド等も本発明の範囲に包含される。なお、ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。
（ポリヌクレオチド）
一つの態様において、本発明に係るポリヌクレオチド及びその相補鎖は、本発明に係るポリペプチド等、例えば配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドに対する相補鎖を意味する。好ましいポリヌクレオチドの塩基配列は、配列表の配列番号２又は配列番号３又は配列番号７に記載した。
別の態様において本発明は、本発明に係るポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号２又は配列番号３又は配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖の対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものであるが、その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭ　クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ　リン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ・精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件であってもよい。
これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、特に配列表の配列番号２又は配列番号３又は配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖にハイブリダイズするものであれば必ずしも相補的配列でなくとも良い。例えば、配列表の配列番号２又は配列番号３又は配列番号７の塩基配列又はその相補的配列に対する相同性において、少なくとも約４０％、例えば、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上である。また本発明に係るポリヌクレオチドは、指定された塩基配列の領域に対応する連続する１０個以上の、好ましくは１５個以上の、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド及びこれらの相補鎖を包含する。ここで、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質又はこれと同様の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現タンパク質の確認を行い、その生理活性を指標にして選別することにより行なうことができる。無細胞タンパク質発現系を利用する場合は、例えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒｅ（１９５７）１７９：１６０−１６１）。
上記本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチド等の製造において、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードする核酸、例えばその遺伝子若しくはｍＲＮＡの検出用プローブ若しくはプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として、又は遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として有用である。その意味で、本発明に係るポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。例えば、アンチセンスによって本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリー含有タンパク質の発現を特異的に阻害するためには、当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質に固有な領域の塩基配列を用いることが想定される。一方、保存配列を用いることにより当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質を含む複数のＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質又はＴＳＰ１含有タンパク質の発現を同時に抑制することも可能と考えられる。
本発明に係るポリヌクレオチドは、一般的には、修飾されていないＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又は修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい。「修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡ」は、安定性又はその他の理由により、修飾された塩基を有するＤＮＡ又はＲＮＡ、並びに修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡを包含する。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及びイノシンのごとき通常的でない塩基を包含する。また、「修飾された」骨格は、フォスフォジエステル骨格が、例えばフォスフォロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）骨格及びモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）骨格のごとき通常でない骨格を包含する。種々の修飾がＤＮＡ及びＲＮＡについて行われており、典型的に天然において見いだされるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ＲＮＡ若しくはＤＮＡ」は、しばしば「オリゴヌクレオチド」と称する短いポリヌクレオチドを包含する。
本発明に係るポリヌクレオチドは、対象のＲＮＡ、ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を変化させるものであってもよく、対象配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠損、融合及び末端切断を招く場合があるが、本発明はこれらのものも包含する。これらの変化は１又はそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配列が変化し得るものであり、これらの変化は、突然変異技術、直接的合成、及び当業者に既知のその他の組換え技術により製造できる。
本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列及びポリペプチドのアミノ酸配列の同一性は、本発明に係るＲＮＡ、ＤＮＡ又は本発明に係るタンパク質の同一性の尺度である。一般的には、最高の合致が得られるように配列を並置する。同一性はそれ自体当該分野において認識された意味を有し、公表された方法を用いて算出できる。
例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，　Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ，パートＩ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．、アカデミック・プレス、１９８７年；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ，　Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、エム・ストックトン・プレス、ニューヨーク、１９９４年に記載の方法が利用できる。二つの配列の同一性を測定する方法は多くあるが、用語「同一性」は当業者によく知られている（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．、アカデミック・プレス、１９８７年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ，　Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、１９９１年；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．（１９８８）４８：１０７３）。
配列間の同一性又は類似性を測定するために通常用いられる方法はＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．　ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，　ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．（１９９８）４８：１０７３等に開示されているが、これらに限定するものではない。同一性及び類似性を決定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに集成されている。二つの配列間の同一性及び類似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３）等があるが、これらに限定するものではない。
さらにまた、本発明におけるポリヌクレオチドの別の態様は、上記ポリヌクレオチド又はその相補鎖をエクソンとして含有するヒトゲノム遺伝子断片たるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド又はその相補鎖をなす塩基配列の少なくとも約１５個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを包含する。
上記本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば上記新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬・標準品としても利用できる。例えば、上記ポリヌクレオチドをマーカー又はプライマーとして、後述するように、上記ポリヌクレオチドの変異や発現に関連する疾病の診断方法に使用できる。また、後述するように、当該疾病の防止及び／又は治療に用いる医薬組成物の成分の一つとして用いることができる。
（形質転換体）
本発明は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、並びにカイコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ等の実験動物等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によっても、又は本発明に係るＤＮＡ由来のＲＮＡを用いた無細胞タンパク質合成法により、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドは提供可能である。後述する実施例では、哺乳動物由来のＣＯＳ７細胞及び昆虫細胞系を宿主として利用し、上記ポリペプチドを遺伝子工学的に発現した。
形質転換は、自体公知の手段が応用され、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。組合せは原核細胞、真核細胞によって分別され、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー、マーカー配列、転写配列、非翻訳配列、スプライシング及びポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡを安定化する配列のごとき非コーディング５′及び３′配列等を自体公知の方法によって組合せ利用できる。なお、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社製）中に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド（Ｇｅｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９８９）８６：８２１−８２４に記載される）又はＨＡタグ（Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ（１９８４）３７：７６７）が好適に例示される。
ＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８６年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年の如き多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行なうことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｉｎ　ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）及び感染等がある。
適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えば連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｓ２）及びスポドプテラＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｓｆ９）細胞；動物細胞例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３及びボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞；並びに植物細胞等がある。
ベクターには、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミド及びファージミド等がある。
発現系の構築物には発現を制御及び引き起こす調節領域を含有させることができる。通常、宿主中にＤＮＡを保持、伸長又は発現するためには、タンパク質を発現するのに適した任意の系又はベクターを選択することが必要となる。これらは周知の技術により適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入することができ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年に記載されている。また、翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラスミックスペース又は細胞外環境へ分泌させるために、適当な分泌シグナルを発現するタンパク質に組み込むことができる。これらのシグナルはタンパク質に本来的なものであってもよく、あるいは異種性のシグナルであってもよい。
形質転換体は、各宿主の培養に最適な自体公知の条件を選択して培養される。培養は、発現産生される本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドの生物活性をマーカーにして行なってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養又はバッチ培養によって行ってもよい。
目的とするタンパク質、ポリペプチド又はペプチドが上記形質転換体の培養培地中に分泌される場合は、該培地を回収し、該培地から精製することによりそれらを得ることができる。さらに、それらが上記形質転換体の細胞内に生成される場合は、まず細胞を溶解し、次いで、タンパク質を回収することによって目的のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを得ることができる。また、目的とするタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをスクリーニングアッセイのために発現させる場合、一般的には、細胞表面にタンパク質を生産させるのが好ましい。この場合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集めてもよい。
また、カイコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ等の実験動物等に本発明に係る遺伝子を導入して組換え動物を作製し、目的とするタンパク質を当該動物の生体内で発現させることも可能である。このような技術は、当該分野においては公知である。
（新規なＡＤＡＭＴＳファミリードメイン含有タンパク質及びその由来物の精製・回収）
本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドは、ヒトやその他哺乳動物の細胞、組織、培養された該細胞若しくはその培養培地（細胞培養物）、上記遺伝子組換え技術により作製した細胞又はその培養物、又は上記遺伝子組み換え技術により作製した組換え動物由来の試料、例えば細胞、組織、乳汁、血液、尿等から周知の精製方法により得ることができる。その方法には例えば硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー等がある。これらの方法は適宜組み合わせて行ってもよい。好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列を認識する抗体を作成し、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。また、高速液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。簡便には、ヘパリンを利用した親和性クロマトグラフィーが利用できる。さらに、精製過程において、生理活性（例えば血管新生抑制能）を指標にして、精製の確認を行うこともできる。タンパク質が単離及び／又は精製中に変性した場合、再び活性な立体配座にするために、タンパク再生のための周知の技法を用いることができる。
（抗体）
抗体は、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、あるいはそれらの抗原決定基を含むペプチドから選択したものを抗原として用いて作製する。抗原は当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質自体又はその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質に免疫特異的な抗体を作製するためには、新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質に固有な配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号１又は配列番号４又は配列番号８と相同である必要はなく、タンパク質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位がアミノ酸の一次配列上で不連続部位であったとしても当該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に結合又は認識する限り特に限定されない。この結合又は認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。「免疫特異的」とは、先行技術の他の関連タンパク質に対する親和性よりも、当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質に対する親和性が実質的に大きいことを意味する。
抗体の生産は、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質、その由来物からなるペプチド又はポリペプチドを、アジュバントの存在又は非存在下で、単独又は担体に結合して、動物に対して体液性応答及び／又は細胞性応答等の免疫誘導を行なうことによって行われる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。
モノクローナル抗体の生産は、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓又はリンパ節由来）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、上記抗体産生細胞と永久増殖性細胞とから作成されたハイブリドーマをクローン化し、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質を特異的に認識する抗体を産生しているハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。実例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，　Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）；トリオーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ　Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８５）：７７−９６）に記載されるような種々の技法がある。
一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）は、本発明に係るタンパク質に対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を包含する他の生物を用いて、哺乳動物における免疫学的反応を誘起する方法によりヒト化抗体を発現させてもよい。
上記抗体は、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質を発現するクローンの単離又は同定、あるいは親和性クロマトグラフィーによる該タンパク質の精製に使用できる。
また、上記抗体を用いて、当該新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質が関与する疾患の診断及び治療に使用できる。
（スクリーニング及びスクリーニングされた化合物）
かくして調製された新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド及びその相補鎖、これらのアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、又はこれらを用いるタンパク質合成系並びに当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独又は複数手段を組合せることによって、当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドに対する活性阻害剤又は活性賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提供する。例えば、ペプチド又はポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、タンパク質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等を、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質は哺乳動物宿主に広く存在し、多くの生物学的機能に関与しており、多くの疾患にも関わっている。したがって、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質を、その活性を阻害又は促進する作用を有する化合物を見い出すためのスクリーニングに用いることは有用である。
具体的には、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを用いて、スクリーニングの対象とされる化合物とこれらペプチド又はポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選別し、この相互作用の有無を検出することのできるシグナル及び／又はマーカー（第２の成分）を使用する系を導入し、次いで、このシグナル及び／又はマーカーの存在又は不存在又はその変化（量的変化及び／又は質的変化を含む）を検出することにより、当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドの活性を賦活又は阻害する化合物をスクリーニング可能である。例えば、当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質を用いて、スクリーニングの対象とされる化合物中で小型分子基質及びリガンドの結合を評価してもよい。これらの基質及びリガンドは天然の基質及びリガンドであってもよく、あるいは構造又は機能を模倣したものであってもよい（Ｃｏｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）１（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ５参照）。
さらにまた、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のｃＤＮＡ、タンパク質及び該タンパク質に対する抗体を用いて、細胞における当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のｍＲＮＡ及びタンパク質の産生に対する添加化合物の影響を調べるためのスクリーニングアッセイを行ってもよい。例えば、当該分野で知られた一般的方法により、モノクローナル及びポリクローナル抗体を用いて、当該ＡＤＡＭＴＳファミリー含有タンパク質の分泌又は細胞結合レベルを測定するための酵素免疫固相法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｖｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）を構築してもよく、また、これを用いて当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質の産生を阻害又は促進し得る因子を適当に処理された細胞又は組織から見い出すこともできる。スクリーニングアッセイを行なうための一般的方法は当該分野においてよく知られたものである。
スクリーニングの対象とされる化合物としては、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー及び天然産物混合物等が挙げられる。
このようにしてスクリーニングされた化合物は、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド及びポリペプチドについての活性阻害剤、活性拮抗剤、活性賦活剤の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物に対する発現阻害剤、発現拮抗剤、発現賦活剤の候補化合物としても利用可能である。それらは、ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質に由来する各種症状の予防・治療効果を期待できる。上記スクリーニング方法により選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性とのバランスを考慮してさらに選別することによって、医薬組成物として調製可能である。
（医薬組成物）
本発明において提供される新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド及びその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター、当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に認識する抗体、並びに上記スクリーニング方法により選別された化合物は、当該ＡＤＡＭＴＳファミリー含有タンパク質の活性阻害・拮抗・賦活等の機能を利用した治療薬等の医薬手段として使用可能である。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチド又はポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、又は抗体等それぞれに応じた製剤化方法を導入すればよい。
例えば、本発明は、抗体及び／又はＴ細胞を産生させるに十分な上記新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質又はその断片を哺乳動物に接種して、哺乳動物における免疫学的反応を誘起する方法による治療にも使用できる。
本発明はさらに、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をインビボで発現させるための核酸ベクターを送達して、かかる免疫学的応答を誘導し、該動物を疾患から保護する抗体を生じさせることに使用できる。
さらに、本発明は、哺乳動物宿主中に導入された場合、上記新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質に対する哺乳動物の免疫学的応答を誘導させる免疫学的ワクチン処方（組成物）に使用できる。該組成物は当該新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる。ワクチン処方は、さらに適当な担体を含んでいてもよい。当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質は胃で分解される可能性があるので、好ましくは非経口投与する。非経口投与としては、例えば皮下筋肉内、静脈、皮内等への注射による投与が挙げられる。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、バッファー、制細菌剤及び処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい水性又は非水性滅菌注射用溶液；並びに懸濁剤又は増粘剤を含んでいてもよい水性又は非水性滅菌懸濁液を包含する。処方を１回量又は複数回量として容器に入れて提供してもよく、例えば、密封アンプル及びバイアルに入れて提供してもよく、また使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として保存してもよい。またワクチン処方は、水中油系及び当該分野で知られた他の系のごとき処方の免疫原性を高めるためのアジュバント系を含んでいてもよい。用量は、個々のワクチンの活性に左右され、通常の実験により容易に決定できる。
本発明は、ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質の関与する生体機能の解明、例えば、卵の成熟及び排卵・受精のプロセスの解明、癌化のプロセスの解明、血管新生のプロセス解明や血管新生に関連する疾患（血管新生病又は血管新生不全症等）の解明、予防、治療及び診断を可能とする上で非常に有用なものになると期待される。また、本発明は、血管新生が原因となる疾患（いわゆる血管新生病）、例えば固形悪性新生物、眼科的疾患（増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患）、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、尋常性乾癬、粥状動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、また逆に血管新生が不十分である血管新生不全症、例えば虚血性心疾患、下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、難治性胃潰瘍、手術後の癒合不全等の治療方法を提供する。さらに、本発明遺伝子の発現が性周期と関連しており、排卵に伴う卵巣の細胞外マトリックスの分解及び再構築に関与することが示唆されたことから、該細胞外マトリックスの分解及び再構築に関連する疾患の解明、防止及び／又は診断・治療にも有用である。すなわち、排卵障害による不妊症の解明、防止及び／又は診断・治療に有用であり、また逆に避妊にも有用である。また、本発明遺伝子が第５染色体短腕１５．２−１５．３（５ｐ１５．２−１５．３）に存在することを確認したこと、５ｐ１５．２−１５．３は５Ｐ−症候群（Ｃｒｉ−ｄｕ−ｃｈａｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の欠失部位であることが報告されていることから、本発明遺伝子は５Ｐ−症候群の解明、防止及び／又は診断・治療にも有用である。
本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその活性が過剰な場合、有効量の上記阻害剤化合物を医薬上許容される担体とともに対象に投与して、当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質の活性を阻害し、そのことにより異常な症状を改善することもできる。
さらに、発現ブロック法を用いて内在性の上記ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードしている遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成した、あるいは別個に投与されたアンチセンス配列を、かかる知られた方法に使用する（例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）中、Ｏ’Ｃｏｃｃｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０参照）。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを用いてもよい（例えば、Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；Ｃｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０参照）。これらのオリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現させることもできる。
本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその活性の発現不足に関連する異常な症状の治療には、１つの方法として当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質自体あるいはこのタンパク質をコードする遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物（促進剤）を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。別法として、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞による当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質の細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌクレオチドを処理加工して複製欠損レトロウイルスベクターに入れて発現するようにしてもよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードしているＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導入して、今度はパッケージング細胞が目的遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成するようにしてもよい。インビボでの細胞の処理加工及びインビボでのタンパク質の発現のために、これらのプロデューサー細胞を対象に投与してもよい。遺伝子治療の概説としては、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ．　Ｓｔｒａｃｈａｎ　ａｎｄ　Ａ．Ｐ．Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｔｄ（１９８６）中、第２０章、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（及びその中の引用文献）参照。もう１つの方法は、適当な医薬担体と混合して治療量の上記新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質を投与することである。
本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドあるいは化合物の処方及び投与形態は、適当な医薬担体と組み合わせて処方することが好ましい。かかる処方は、治療上有効量のタンパク質又は化合物、及び医薬上許容される担体又は賦形剤を含む。かかる担体としては、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。処方は投与経路に適したものとすべきであり、当業者によく知られている。さらに本発明は、上記本発明成分の１種又はそれ以上を充填した、１個又はそれ以上の容器を含んでなる医薬パック及びキットにも関する。
本発明に係るタンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド及び化合物は単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、注射であり、とりわけ静脈注射である。皮下、筋肉内又は腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。全身投与の別の手段としては、胆汁酸塩又はフシジン酸又は他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜又は経皮投与が挙げられる。さらに、腸溶処方又はカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。これらのタンパク質又は化合物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。
必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、及び担当医師の判断による。しかしながら、適当な用量は対象の体重１ｋｇあたり０．１ないし１００μｇの範囲である。しかしながら、種々の使用タンパク質及び化合物、種々の投与経路のさまざまな有効性を考慮すれば、必要な用量はさらに広範囲なものである。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量が必要である。当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行なうことができる。
遺伝子治療において、治療に使用するタンパク質を対象中において生成させることもできる。例えば、タンパク質をコードしているＤＮＡ又はＲＮＡを用いて、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いることによりエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）において対象由来の細胞を処理加工し、次いで、細胞を対象に導入することもできる。
（診断薬及び診断方法）
また本発明からなる新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド及びその相補鎖、並びに当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。また、これらのうちの１種又はそれ以上を充填した、１個又はそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチド又はポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、又は抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
診断方法としては、例えば本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドをコードしている核酸との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸の存在量、及び／又は当該タンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドについて個体中の生体内分布、及び／又は個体由来の試料中の存在、及び／又は個体由来の試料中の存在量を、自体公知の方法を利用して測定し、それらの存在の有無及び／又は存在量の変化（増加又は減少）により、本発明に係る当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びその由来物からなるペプチド又はポリペプチドの発現又は活性に関連する疾患の有無及び／又はその変化（増悪又は軽減）を判定できる。すなわち、当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及び／又は核酸をマーカーとして検査するのである。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、又はＰＣＲ反応系等を利用すればよい。
診断用の核酸は、個体由来の試料、例えば細胞、血液、尿、唾液、組織生検又は剖検材料等から得られる。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲ若しくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡ又はｃＤＮＡを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失及び挿入を検出できる。増幅ＤＮＡを標識した上記ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。ＲＮアーゼ消化により、又は融解温度の差により、完全に対合した配列を誤対合二重らせんから区別できる。ＤＮＡ配列の相違はまた、変性物質を含有する又は含有しないゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動における移動度の変化を検出することにより、又は直接的なＤＮＡ配列決定により検出できる（例えば、Ｍｅｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｈｃｅ（１９８５）２３０：１２４２参照）。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼ及びＳ１保護又は化学的切断法によっても明らかにすることができる（例えば、Ｃｏｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１参照）。また、上記ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードするＤＮＡ又はその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイ（ａｒｒａｙ）を構築して、例えば遺伝学的変異の効果的なスクリーニングを行なうことができる。アレイ法はよく知られており、広い適用範囲を有し、遺伝子発現、遺伝学的連関、及び遺伝学的変異可能性を包含する分子遺伝学における種々の問題を調べるために用いられ得る（例えば、Ｍ．Ｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７４：６１０参照）。
また、本明細書記載の方法によって上記ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードするＤＮＡの変異・減少・増加を検出することにより、細胞・組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。また、本発明遺伝子が５ｐ１５．２−１５．３に存在することを確認したこと、５ｐ１５．２−１５．３は５Ｐ−症候群（Ｃｒｉ−ｄｕ−ｃｈａｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の欠失部位であることが報告されていることから、本発明に係るＤＮＡの変異・減少・増加を検出することで、５Ｐ−症候群の診断方法も提供する。さらに、本発明に係るＤＮＡの変異・減少・増加を検出することで、血管新生が原因となる疾患（いわゆる血管新生病）として固形悪性新生物、眼科的疾患（増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患）、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、尋常性乾癬、粥状動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、また、逆に血管新生が不十分である血管新生不全症として虚血性心疾患、下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、難治性胃潰瘍、手術後の癒合不全等の診断方法又はかかる疾病に対する感受性の診断方法を提供する。
さらに、対象由来の試料について上記ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質又は当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のｍＲＮＡレベルを調べることを特徴とする方法によって、細胞・組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。また、本発明遺伝子が５ｐ１５．２−１５．３に存在することを確認したこと、５ｐ１５．２−１５．３は５Ｐ−症候群（Ｃｒｉ−ｄｕ−ｃｈａｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の欠失部位であることが報告されていることから、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のｍＲＮＡレベルを検出することで、５Ｐ−症候群の診断方法を提供する。さらに本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のｍＲＮＡレベルを検出することで、血管新生が原因となる疾患（いわゆる血管新生病）として固形悪性新生物、眼科的疾患（増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、老人性円板状黄斑変性症、その他虚血をきたす眼科疾患）、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、尋常性乾癬、粥状動脈硬化巣外膜の異常毛細血管網等、また、逆に血管新生が不十分である血管新生不全症として虚血性心疾患、下肢の閉塞性動脈硬化症での側副血行路形成不全や、創傷治癒過程での血管新生が不十分なことによる難治性皮膚潰瘍、難治性胃潰瘍、手術後の癒合不全等を診断することができる。また、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質のｍＲＮＡのレベルを検出することで、細胞・組織の癌化のレベルを診断する方法を提供する。
本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードするＤＮＡの発現の増加又は低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野では周知方法の任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティング及びその他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルで測定できる。また、試料中の当該ＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質レベルを決定するために用いることができるアッセイ法は当業者に周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡアッセイ等がある。
本発明に係るポリヌクレオチドの染色体の同定（染色体アッセイ）にも価値がある。該ポリヌクレオチドの配列は、個々のヒト・染色体上の特定の位置を標的とし、これにハイブリダイゼーションし得る。本発明による重要な配列の染色体へのマッピングは、それらの配列を遺伝子関連疾病と関連づける重要な第１工程である。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと関連づけることができる。かかるデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用できる）に見いだされる。次いで、連関（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）の分析により、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定する。罹病個体と未罹病個体との間のｃＤＮＡ又はゲノム配列の相違も調べることができる。罹病個体のいくつか又は全部において変異が観察されるが正常個体においては観察されない場合、その変異は疾病の原因である可能性がある。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
実施例１
（ヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築と遺伝子の分取）
市販ヒト脳、胎児脳、及び脳海馬由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社製：カタログＮｏ．６５１６−１、６５２５−１、及び６５７８−１）を出発原料として常法によりｃＤＮＡライブラリーを構築し、ｄｂＥＳＴ（ｄａｔａｂａｓｅ　ｏｆ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇｓ）分析によりｃＤＮＡ断片を単離して塩基配列を決定し、本発明に係る新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードする塩基配列を担持するＤＮＡを得た。
具体的には、小原らの方法（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７）４：５３）に従って調製した上記ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、約５０，０００個の組換え体をランダムに選択し、このうち約３０，０００個のクローンのｃＤＮＡについて、その５′末端及び３′末端の塩基配列を決定した。さらに約１，１００個を主にインビトロの転写翻訳実験によって選択し、それらのｃＤＮＡの塩基配列を小原らの方法（同上）に従って決定した。全塩基配列の決定を行ったｃＤＮＡクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法によってタンパク質コード領域（ＯＲＦ）を予想し、この領域についてＰｆａｍ　ＨＭＭ　Ｓｅａｒｃｈ（ＨＭＭＰＦＡＭ）によりドメイン検索を行い、ＴＳＰ１ドメイン（ＴＳＰ１）を有するｃＤＮＡを同定した。
この様にして本発明者は、ＴＳＰ１を担持する配列表の配列番号１に記載した推定アミノ酸配列（全アミノ酸数１０２１個）からなる新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列表の配列番号２）を有するクローンＰＪ０１２５６（ヒト脳由来ｃＤＮＡクローンＰＪ０１２５６）を得た。なお、配列は、ＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号或いは当該技術分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体が有り得る場合は、特に明示しない限りＬ体を示すものとする。
実施例２
（ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ取得）
ヒトＰＪ０１２５６の全長アミノ酸コード領域を有するｃＤＮＡ（以下、ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ）は、配列番号２に記載したヒト脳由来ｃＤＮＡクローンＰＪ０１２５６の塩基配列から特異的に作製したプライマーあるいはプローブを用いて、５′ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄ）法あるいはライブラリスクリーニング法等を行なうことで取得できる。ここでは、５′ＲＡＣＥ法によるヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡの取得を記述する。
（１）まず、ヒト脳由来ｃＤＮＡクローンＰＪ０１２５６特異的に合成したｍＲＮＡに対しアンチセンス方向の２本のプライマー（例えば以下のＰＪ−Ａ０１・ＰＪ−Ａ０３等）と、鋳型ｃＤＮＡに連結させたアダプター配列特異的な２本のプライマー（例えば以下のＡＰ１・ＡＰ２等）を組み合わせて用い、一般的に行われているように２回のＰＣＲを行なう。
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鋳型ｃＤＮＡには、例えば市販の「Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ　Ｈｕｍａｎ　Ｏｖａｒｙ；既知配列のアダプターが連結されたヒト卵巣由来二本鎖ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製」等を用いることが可能である。あるいはｍＲＮＡから、二本鎖ｃＤＮＡを合成し、任意の配列からなるアダプターを連結したものも、鋳型ｃＤＮＡとして使用できる。
５′ＲＡＣＥ法で用いる耐熱性酵素は、例えば「ＫＯＤ　ＰＬＵＳ、東洋紡製」等を利用できる。「ＫＯＤ　ＰＬＵＳ」及び「Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ　Ｈｕｍａｎ　Ｏｖａｒｙ」を用いた場合の第一次及び第二次ＰＣＲの条件を以下に記述する。
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５′ＲＡＣＥ産物は、例えば「Ｚｅｒｏ　ＢｌｕｎｔＴＭ　ＴＯＰＯＴＭ　ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製」等を用いて、プラスミドベクター（「Ｚｅｒｏ　ＢｌｕｎｔＴＭ　ＴＯＰＯＴＭ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ」の場合にはｐＣＲＴＭ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ）に連結し、大腸菌コンピテントセルに形質導入することで、５′ＲＡＣＥ産物を含むプラスミドベクターを有する大腸菌形質転換体としてクローン化できる。５′ＲＡＣＥ産物を分子量で分画する場合には、アガロース電気泳動後、ＤＮＡのバンドをゲルから切り出し、例えば「ＱＩＡ　Ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製」等を用いて回収することで分画し、上記の方法で同様にクローン化できる。
クローン化した５′ＲＡＣＥ産物は、使用したプラスミドベクターに適応した抗生物質（ｐＣＲＴＭ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯの場合には、「硫酸カナマイシン、ナカライテスク社製等」）を含む大腸菌生育培地（例えばＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ等）で大腸菌形質転換体を培養し、プラスミドを、例えば「ＱＩＡｐｒｅｐＴＭ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製」等で抽出することで得られる。
５′ＲＡＣＥ産物の塩基配列データは、鋳型として抽出したプラスミド、使用したプラスミドベクターに適応したプライマー（ｐＣＲＴＭ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯの場合には、ＳＰ６プライマー、Ｔ７プライマー等）、必要に応じてＰＪ０１２５６特異的プライマー（ＰＪ−Ａ０１等）を用い、「ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製」等にて調製したサンプルを、電気泳動式塩基配列解析装置（サンプル調製に「ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」を用いた場合には「ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭ　３１０　ジェネティックアナライザ、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製」等）で解析することにより得られる。得られた塩基配列データを、シーケンスアセンブリングソフト（例えば「Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ３．１、Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ社製」）等を用いて連結することで、クローンごとの塩基配列が得られる。
ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡの塩基配列は、上記５′ＲＡＣＥ産物のクローンごとの塩基配列と実施例１に記載したヒト脳由来ｃＤＮＡクローンＰＪ０１２５６の塩基配列（配列番号２）を、互いのオーバーラップを５′ＲＡＣＥに使用したプライマー以外の部分で確認した後、連結することで得られる。
（２）ヒトＰＪ０１２５６全アミノ酸コード領域の塩基配列を明らかにするため、ヒト脳由来ｃＤＮＡクローンＰＪ０１２５６塩基配列（配列番号２）特異的に合成した上記プライマー（ＡＰ１、ＡＰ２、ＰＪ−Ａ０１、及びＰＪ−Ａ０３）を用いて５′ＲＡＣＥ法を行なった。
５′ＲＡＣＥの鋳型ｃＤＮＡには、市販の「Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ　Ｈｕｍａｎ　Ｏｖａｒｙ；既知配列のアダプターが連結されたヒト卵巣由来二本鎖ｃＤＮＡ、クロンテック社製、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．７４１７−１」を用いた。ＰＣＲ用耐熱性酵素には「ＫＯＤ　ＰＬＵＳ、東洋紡製」を用い、以下の条件で第一次ＰＣＲを行なった。
第一次ＰＣＲ反応液組成は、上記のものと同一である。
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第一次ＰＣＲ反応終了後、脱塩及び脱プライマーするため、反応液を「Ｓｕｐｒｅｃ−０２、宝酒造製」を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物は１００μｌ（５０μｌ×２回）のＴＥ緩衝液で回収し、以下の第二次ＰＣＲの鋳型として用いた。
第二次ＰＣＲ反応液組成は、上記のものと同一である。
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５′ＲＡＣＥ産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。得られた５′ＲＡＣＥ産物の塩基配列から、上記と同様に、特異的プライマーを作製して５′ＲＡＣＥ法を繰り返すことにより、ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ塩基配列（配列番号３）を得た。
ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ塩基配列（配列番号３）は、総塩基数がポリＡ（ｐｏｌｙＡ）配列を除いて５，６１０であり、３，６７２塩基からなるアミノ酸コード領域（配列番号３の７７０−４，４４１番目）を有していた。該領域にコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、５′非翻訳領域上にアミノ酸コード領域と同一フレーム上の終止コドンが２箇所（配列番号３の２０６−２０８番目；ＴＡＧ、２７５−２７７番目；ＴＧＡ）、３′非翻訳領域上にポリＡ付加シグナルが１箇所（配列番号３の５，５８６−５，５９１番目；ＡＡＴＡＡＡ）存在した。
Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ　Ｈｕｍａｎ　Ｏｖａｒｙを鋳型として、アミノ酸コード領域を再度クローニングしたところ、２つの対立遺伝子がそれぞれ得られ、両者の比較で３箇所のＳＮＰｓが確認された（表１のＳＮＰｓ　１〜３）。そのうち２つのＳＮＰｓはアミノ酸置換を伴っていた（表１のＳＮＰｓ　２及び３）。また、ヒト脳由来ＰＪ０１２５６ｃＤＮＡクローン（配列番号２）との比較では２箇所のＳＮＰｓが確認され（表１のＳＮＰｓ　４及び５）、うち１つのＳＮＰｓはアミノ酸置換を伴っていた（表１のＳＮＰｓ　４）。
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実施例３
（ヒトＰＪ０１２５６遺伝子発現ベクター作製）
ヒトＰＪ０１２５６のＣ末端にＭｙｃＨｉｓタグ配列が融合されたものを発現する哺乳動物細胞用発現ベクターの作製は、以下のような操作で行なうことができる。
まず、ヒトＰＪ０１２５６の終始コドンを除く全アミノ酸コード領域の両端にアニーリングするＰＣＲプライマーペアを設計する。上流側プライマーには、ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡの開始コドン（ＡＴＧ）の５′上流側に発現用ベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓＡ）のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素部位（例えば、ＮｈｅＩあるいはＮｏｔＩ等）を付加して設計し、下流側プライマーにはヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡがコードするＣ末端アミノ酸（ロイシン）コドンの下流に、同じく発現ベクターのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素部位（例えばＨｉｎｄＩＩＩあるいはＫｐｎＩ等）を付加して設計する。なお、選択する制限酵素は可能なかぎりヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡの全アミノ酸コード領域に認識部位が存在しない制限酵素を用いる。また制限酵素を用いたＤＮＡ断片の挿入により生じるアミノ酸フレームのずれを考慮してプライマーを設計する。例えばｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓＡの場合には、下流側に設定する制限酵素は、発現ベクターと連結した際にＭｙｃＨｉｓ領域とフレームが合うよう塩基の数を調整して設計する。以上のように設計したプライマーを用い、ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを鋳型として、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ　ＰＬＵＳ（東洋紡）等でＰＣＲ反応を行ない、発現ベクターに挿入可能な制限酵素部位を有する全長ｃＤＮＡ断片を取得できる。
適当な哺乳動物細胞発現用ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及び増幅した全長ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡを、プライマーに付加した制限酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動し、それぞれ目的のＤＮＡ断片を、例えばＱＩＡ　Ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等を用いてアガロースゲル中から回収する。ゲル中から回収した全長ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡ及びｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓＡ断片は、例えばＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ　Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて連結できる。連結したプラスミドを大腸菌コンピテントセル（例えば、ＤＨ５αコンピテント細胞、東洋紡製）に導入し、形質転換体を得る。得られた大腸菌形質転換体は、用いた発現ベクターの選択マーカー（例えばアンピシリン等）を含むＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地等で培養し、当該ＤＮＡを含むプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐＴＭ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販のＤＮＡ抽出キットで精製できる。
作製したプラスミドのＤＮＡ塩基配列は以下のようにして確認できる。発現ベクター由来の配列から設計したプライマー（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓＡを用いた場合には、ｐｃＤＮＡ−Ｓ１：ＣＡＣＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧ及びｐｃＤＮＡ−Ａ１：ＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧ等のプライマー）と、ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡ配列上で約３００ｂｐ程度ごとに適当なプライマーを設計し、例えば、「ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列決定用サンプル調製試薬を用いて、抽出したプラスミドの塩基配列決定用サンプルを調製する。サンプル調製に「ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」を用いた場合には、キャピラリー電気泳動式塩基配列解析装置ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭ　３１０ジェネティックアナライザ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等で解析する。得られた塩基配列データは、例えばＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ３．１（Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ社製）等のシーケンスアセンブリングソフトを用いて１本に連結し、作製したプラスミドのＤＮＡ塩基配列を得る。
このようにして得られたプラスミドのＤＮＡ塩基配列から目的の塩基配列を有するプラスミドを選択して、ヒトＰＪ０１２５６発現ベクターを作製できる。
実施例４
（ヒトＰＪ０１２５６遺伝子発現ベクター作製）
ヒト全長ＰＪ０１２５６のＣ末端にＨｉｓタグ配列を融合発現する哺乳動物細胞用発現ベクターを作製するため、以下のプライマーを合成した（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社に発注）。
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なお、ＢＨＰＪ−Ｓ０１は、制限酵素消化のためのスペーサー（４塩基；ＧＡＡＡ）、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列（６塩基；ＧＧＡＴＣＣ）、ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡへのアニーリング配列（２０塩基；ＣＧＧＡＧＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧ：配列番号３の７５６−７７５番目に完全一致）から成る。また、ＨＤＰＪ−Ａ０１は、制限酵素消化のためのスペーサー（４塩基；ＧＡＡＡ）、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列６塩基ＡＡＧＣＴＴ）、ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡへのアニーリング配列（２０塩基；ＣＡＡＧＴＴＧＧＡＣＴＴＡＧＡＧＣＡＡＧ：配列番号３の４，４２２−４，４４１番目の相補鎖に完全一致）から成る。
ＢＨＰＪ−Ｓ０１及びＨＤＰＪ−Ａ０１をプライマーとして用い、ＰＣＲ法によってヒトＰＪ０１２５６全アミノ酸コード領域の増幅を試みた。鋳型ｃＤＮＡは、市販の「Ｍａｒａｔｈｏｎ　−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ　Ｈｕｍａｎ　Ｏｖａｒｙ；既知配列のアダプターが連結されたヒト卵巣由来二本鎖ｃＤＮＡ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、ＣｏｄｅＮｏ．７４１７−１」を用いた。ＰＣＲ用耐熱性酵素には「ＫＯＤ　ＰＬＵＳ、東洋紡製」を用い、以下の条件でＰＣＲを行なった。
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得られた約３．７ＫｂｐのＰＣＲ産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結して大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し、塩基配列を決定した。その結果、約３．７ＫｂｐのＰＣＲ産物は目的のＰＣＲ産物（スペーサー−ＢａｍＨＩ認識配列−配列番号３の７５６〜４，４４１−ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列−スペーサー）であった。
哺乳動物細胞発現用ベクターはｐＣＭＨ０１（図１のＡ；市販の「ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製」のＢＧＨポリＡ配列をチミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリＡ配列に置換したもの）を用いた。すなわち、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓＡの、ＢＧＨポリＡ配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｃｏｍ／ｖｅｃｓｅｑ　ｇｃｇ／ｐｃｄｎａ３．１ｍｙｃｈｉｓａ−．ｓｅｑに提示されている塩基配列の１，１１６〜１，３４３番目）は、その両側に認識サイトを有する制限酵素ＡｆｌＩＩ（認識サイト；ＣＴＴＡＡＧ、同配列の１，０９０〜１，０９５番目）及びＰｖｕＩＩ（認識サイト；ＣＡＧＣＴＧ；同配列の１，３６３〜１，３６８番目）で消化することで除いた。ＴＫポリＡ配列は「ｐＲＥＰ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製」を鋳型として、プライマーペア（ＧＡＡＡＣＴＴＡＡＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＡＣ及びＧＧＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣ）でＰＣＲ法により増幅したものをＡｆｌＩＩで消化することで調製した。ＢＧＨポリＡ配列を除いたｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓＡ及びＴＫポリＡ配列は、常法に従い連結した後、大腸菌形質転換体としてクローン化し、プラスミドを抽出して塩基配列を確認した。
得られたヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡクローン及び哺乳動物細胞発現用ベクターｐＣＭＨ０１は、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、常法に従い連結した。作製したプラスミドｐＣＭＨ０１−ＰＪ０１２５６は大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出して塩基配列を決定し、ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡ下流にＭｙｃＨｉｓタグ配列が同一フレームで連結されたことを確認した（図１のＢ）。
実施例５
（ヒトＰＪ０１２５６の哺乳動物細胞での発現）
ヒトＰＪ０１２５６の哺乳動物細胞での発現を確認するため、実施例４で作製した哺乳動物細胞用発現ベクターｐＣＭＨ０１−ＰＪ０１２５６を用いて、以下の検討を行った。
φ１０ｃｍ組織培養用ディッシュ「Ｆａｌｃｏｎ　３００１、ベクトン・ディッキンソン社製」上に約５０％コンフレント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）に付着生育させたＣＯＳ７細胞に対し、１ディッシュあたり１０μｇのｐＣＭＨ０１−ＰＪ０１２５６を遺伝子導入した。対照としては１ディッシュあたり１０μｇのｐＣＭＨ０１を用いた。遺伝子導入は市販の「ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ　ＰＬＵＳ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製」を用い、添付プロトコルに従って行った。
遺伝子導入４８時間後、細胞を回収し、１００μｌの細胞溶解液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．４、１０％　グリセロール、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、０．１％　ＳＤＳ）で溶解させた。１００μｌのＳＤＳ電気泳動用緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ６．８、２０％　グリセロール、１２％　２−メルカプトエタノール、４％　ＳＤＳ、ブロモフェノールブルーで着色）を加えた後、１００℃で２分間加熱したものをサンプルとして、ウェスタンブロッティング解析を行った。各サンプル０．２ｍｌのうち３０μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動は、市販の「マルチゲル４／２０、第一化学薬品社製」を「カセット電気泳動槽「第一」ＤＰＥ−１２０」にセットし、４０ｍＡ定電流で１時間行った。泳動用緩衝液は、「Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＳＤＳ・Ｐｏｗｄｅｒ、宝酒造製」を用い、分子量マーカーは、「６×Ｈｉｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｄｄｅｒ、ＱＩＡＧＥＮ社製」を用いた。泳動終了後、「ミニトランスブロット、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製」を用いて、エレクトロトランスファー（Ｅｌｅｃｔｒｏ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ）によりＰＶＤＦメンブレン「ＴＥＦＣＯ社製、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．０３−０５６」にブロッティングした。エレクトロトランスファーは、「Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ　Ｐｏｗｄｅｒ、宝酒造製」にメタノールを２０％添加した緩衝液中で、１５０ｍＡ定電流で１．５時間行った。ブロッティングしたＰＶＤＦメンブレンは、「Ｐｅｎｔａ　Ｈｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ＨＲＰ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製」を用い、添付されていたプロトコルに従って抗体反応を行った。抗体にラベルされたホースラディシュ・パーオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の検出には「ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製」を用い、添付されていた標準プロトコルに従って行った。結果を図２に示した。
図２に示したように、ｐＣＭＨ０１−ＰＪ０１２５６を導入したＣＯＳ７細胞では分子量１００ｋＤａ以上のタンパク質のシグナル（図２の矢印）が確認された。対照としたｐＣＭＨ０１では該当するシグナルは検出されなかった。以上の検討より、ヒトＰＪ０１２５６タンパク質の発現が哺乳動物細胞系で確認された。
実施例６
（ヒトＰＪ０１２５６の発現組織解析）
（１）ヒトＰＪ０１２５６遺伝子の発現組織を解析するため、下記のＰＣＲプライマーを合成した。下記プライマーの組み合わせを用いてＰＣＲにより、５０５ｂｐのヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡ断片が増幅された。
2002031163.tif 000011
次に２４種のヒト臓器のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを４種の濃度で９６ウェルプレート中に調製した「ヒトＲＡＰＩＤ−ＳＣＡＮＴＭ　ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＰＡＮＥＬ」（ＯｒｉＧｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を鋳型として、下記の酵素溶液（２５μｌ／ウエル）を添加し、ミネラルオイルを適量（約２５μＬ）重層した。
2002031163.tif 000012
ミネラルオイルを重層後、プレートをプラスティックカバーシートで被い、１５分間静置後、サーマルサイクラー（ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＭＰ：宝酒造）にセットし、以下のＰＣＲ運転プログラムで反応させた。
2002031163.tif 000013
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ産物５μＬを１μＬの１０×泳動用緩衝液（宝酒造の制限酵素に添付）と混合し、Ｍｕｐｉｄ電気泳動槽（コスモバイオ）にセットした２％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）に供し、トリス−ホウ酸緩衝液（宝酒造製）下、１００Ｖの定電圧で約４５分間泳動した。泳動後、５００ｎｇ／ｍＬの臭化エチジウム溶液で染色し、紫外線照射下で泳動像を観察した。その結果を図３に示す。
図３に示した結果から、ヒトＰＪ０１２５６遺伝子は、特に卵巣で発現が高く、ついで腎臓、肺、胃、精巣、副腎、膵臓で、発現量が高かった。脳、小腸、骨格筋、皮膚で中程度に発現しており、心臓、大腸、胎盤、前立腺では弱い発現が観察された。脾臓、肝臓、唾液腺、甲状腺、子宮、白血球、骨髄では、ほとんど発現が観察されなかった。また、胎児組織については、脳で中程度に発現しており、肝臓では弱い発現が観察された。
（２）さらに、ノーザンハイブリダイゼーションにより、ヒトＰＪ０１２５６遺伝子の発現組織分布及びｍＲＮＡの解析を行った。プローブは、ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡのＫｐｎＩ／ＳｔｕＩ消化断片（６６３ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動法により分離・精製したものを用いた。プローブＤＮＡのラベリングは、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製の「ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｂｅａｄｓ（−ｄＣＴＰ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．２７−９２４０−０１」と、「３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＢ１０２０５」を用いて行った。ＤＮＡに取り込まれなかった３２Ｐ−ｄＣＴＰの除去は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製の「Ｐｒｏｂｅ　ＱｕａｎｔＴＭ　Ｇ−５０　Ｍｉｃｒｏ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２７−５３３５−０１」により行った。各種組織由来ｍＲＮＡをブロットしたフィルターは、クロンテック社より購入したＨｕｍａｎ　ＭＴＮ　Ｂｌｏｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．７７６０−１）、Ｈｕｍａｎ　ＭＴＮ　ＢｌｏｔＩＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．７７５９−１）、Ｈｕｍａｎ　ＭＴＮ　ＢｌｏｔＩＩＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．７７６７−１）を用い、ハイブリダイゼーションの条件はクロンテック社のプロトコールに従って行った（図４）。
図４のＡ．に示した結果から、ヒトＰＪ０１２５６遺伝子は卵巣において特異的に発現しており、次いで腎臓及び膵臓で弱く発現していることが示された。またｍＲＮＡの大きさは約５．５Ｋｂで、全長ｃＤＮＡの大きさと一致しており、明瞭なスプライシングバリアントは検出されなかった。また、５′末端側のＤＮＡ断片（ＳａｃＩＩ／ＳａｌＩ断片、７４６ｂｐ）をプローブとして用いた場合も上記と同様の結果が得られた。さらに長期間の露光により得られた結果（図４のＢ．）から、脳、肝臓、精巣、小腸、胃、副腎の各組織においてもわずかに発現していることが示された。また、図４のＣ．には、ノーザン解析の内部コントロールであるアクチン遺伝子のブロットの結果を示した。
実施例７
（ヒトＰＪ０１２５６遺伝子のがん組織における発現解析）
ＰＪ０１２５６遺伝子と病態との関与を解析することを目的として、ヒトの腫瘍組織における発現量と正常組織における発現量とを比較検討した。ＰＣＲ増幅用のプライマーとしては、実施例６で用いたＰＪ−Ｓ０９（センスプライマー）及びＰＪ−Ａ１２（アンチセンスプライマー）を使用した。このプライマーセットによりＰＣＲで５０５ｂｐのヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡ断片が増幅された。コントロール遺伝子としてはグリセルアルデヒド　３−リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（Ｇ３ＰＤＨ）を用い、ＰＣＲ増幅用のプライマーとしては、市販のプライマーセット（クロンテック社製，Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．５４０５−１）を用いた。このプライマーセットによりＰＣＲで４５２ｂｐのＧ３ＰＤＨ　ｃＤＮＡ断片が増幅された。
ヒト腫瘍組織及び正常組織（卵巣、脳、及び副腎）由来ｃＤＮＡは、ＢｉｏＣｈａｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した、「Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｔｕｍｏｒ　Ｏｖａｒｙ　ｃＤＮＡ（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．０５４００１６、Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ａ３０１０１７」及び「Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｏｖａｒｙ　ｃＤＮＡ、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．０５１００３７、Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ａ３０３２１２」、「Ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ　Ｔｕｍｏｒ　ｃＤＮＡ（Ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ）、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．０５４０００４、Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ａ３０４００７」及び「Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｂｒａｉｎ　ｃＤＮＡ、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．０５１０００５、Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ａ３０１０８９」、「Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｔｕｍｏｒ　Ａｄｒｅｎａｌ　ｃＤＮＡ（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．０５４０００１、Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ａ２１２０３０」及び「Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ａｄｒｅｎａｌ　ｃＤＮＡ、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．０５１０００１、Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ａ２０６０９５」を用いた。それぞれのｃＤＮＡ原液をＴＥ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で１０倍希釈した後に、さらに１／２倍希釈操作を順次７回繰り返して、濃度が１倍、１／２倍、（１／２）２倍、（１／２）３倍、（１／２）４倍、（１／２）５倍、（１／２）６倍、（１／２）７倍の希釈系列を作製し、各溶液５μｌを鋳型ｃＤＮＡとした。ＰＣＲ反応は、宝酒造の「ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭ、ＣｏｄｅＮｏ．ＲＲ００１Ａ」を用いて下記の条件で行った。
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ＰＣＲチューブに各ｃＤＮＡ溶液を分注し、上記の酵素／プライマー溶液を添加後、サーマルサイクラー（ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＭＰ：宝酒造製）にセットし、以下のＰＣＲ運転プログラムで反応させた。
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ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ産物１０μＬを１μＬの１０×泳動用緩衝液（宝酒造の制限酵素に添付）と混合し、Ｍｕｐｉｄ電気泳動槽（コスモバイオ：東京）にセットした２％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，　Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ，ＵＳＡ）に供し、トリス−ホウ酸緩衝液（宝酒造製）下、１００Ｖの定電圧で約４５分間泳動した。泳動後、アガロースゲルを５００ｎｇ／ｍＬの臭化エチジウム溶液で染色し、紫外線照射下で泳動像を観察してＰＪ０１２５６遺伝子及びＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量をＰＣＲ産物の濃度として可視的に判定した。その結果を図５（卵巣）、図６（脳）及び図７（副腎）に示す。
その結果、図５、６、及び７に示したように、いずれの組織においてもＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量は、正常組織と腫瘍組織においてほぼ同じ発現量であるのに対し、腫瘍組織ではＰＪ０１２５６遺伝子の発現量が著しく低下（約１／３２〜１／６４）していることが示された。この結果から、ヒトＰＪ０１２５６遺伝子が卵巣、脳、副腎における腫瘍に関連する遺伝子であることが示唆された。
実施例８
（ＰＪ０１２５６マウスカウンターパートの取得）
ＰＪ０１２５６のマウスカウンターパートを取得するため、ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡのアミノ酸コード領域をクエリーとして公共データベースを検索したところ、２つのマウスゲノムＤＮＡ配列〔ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のＩＤ　ＡＺ０９３０８０及びＡＺ１１９８００〕がヒットした。ＡＺ０９３０８０の塩基配列の１４６〜２４２番目及びＡＺ１１９８００の塩基配列の４１８〜４７８番目が、それぞれヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３）の２，３７３〜２，４７０番目及び２，６２１〜２，６８０番目に高い相同性を示した。両マウス配列の相同性の高かった部分から下記のプライマーを作製し、以下の検討に使用した。
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マウスｃＤＮＡ断片取得のため、市販の「Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ　Ｍｏｕｓｅ　Ｔｅｓｔｉｓ；既知配列のアダプターが連結されたマウス精巣由来二本鎖ｃＤＮＡ、クロンテック社製、ＣｏｄｅＮｏ．７４５５−１」を鋳型として、以下の条件でＰＣＲを行なった。ＰＣＲ用耐熱性酵素には「ＫＯＤ　Ｄａｓｈ、東洋紡製」を用いた。
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その結果、約２３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
塩基配列決定の結果、得られたＰＣＲ産物は２３３ｂｐであり、ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３）の２，４０９〜２，６４１番目に対してＤＮＡレベルで８３．７％（１９５／２３３）、同部分の推定アミノ酸配列で９３．５％（７２／７７）の相同性を有していた。
引き続き同一鋳型ｃＤＮＡを用いて５′ＲＡＣＥ法を行った。ＰＣＲ用耐熱性酵素には「ＫＯＤ　ＰＬＵＳ、東洋紡製」を用い、以下の条件で第一次ＰＣＲを行なった。
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第一次ＰＣＲ反応終了後、脱塩及び脱プライマーするため、反応液を「Ｓｕｐｒｅｃ−０２、宝酒造製」を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物は１００μｌ（５０μｌ×２回）のＴＥ緩衝液で回収し、以下の第二次ＰＣＲの鋳型として用いた。
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５′ＲＡＣＥ増幅産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
５′ＲＡＣＥ産物の塩基配列は、先のマウスＰＪ０１２５６部分ｃＤＮＡ塩基配列とのオーバーラップを確認した後、連結した。その結果、得られたマウスＰＪ０１２５６部分ｃＤＮＡ塩基配列（配列番号５）は４２２ｂｐであり、ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３）の２，２２０〜２，６４１番目に対してＤＮＡレベルで８５．３％（３６０／４２２）の相同性を有していた。また、マウスＰＪ０１２５６部分ｃＤＮＡ推定アミノ酸配列（配列番号６）は１４０残基であり、ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ推定アミノ酸配列（配列番号４）の４８５〜６２４番目に９５．０％（１３３／１４０）の相同性を有していた（図８）。
実施例９
（ヒトＰＪ０１２５６のホモロジー検索）
ヒト脳由来ＰＪ０１２５６ｃＤＮＡクローンのアミノ酸配列（配列番号１）を既知配列に対して解析プログラム（ＢＬＡＳＴ２．０）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ　Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ　Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），”Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ”，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．）を用いて検索したところ、表２（ヒトＰＪ０１２５６のアミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラムＢＬＡＳＴ２．０を用いて検索した結果で、Ｅ−ｖａｌｕｅがｅ−４０以下のもの）に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。さらに、ヒトＰＪ０１２５６全長アミノ酸配列（配列番号４）を既知配列に対して解析プログラム（ＢＬＡＳＴ２．１）（同上）を用いて検索したところ、表３（ヒトＰＪ０１２５６の全長アミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラムＢＬＡＳＴ２．１を用いて検索した結果で、Ｅ−ｖａｌｕｅがｅ−１４０以下のもの）に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。ヒトＰＪ０１２５６はＡＤＡＭＴＳファミリーと相同性を有するクローンであることが判明した。
2002031163.tif 000021
2002031163.tif 000022
実施例１０
（ヒトＰＪ０１２５６の解析）
ヒトＰＪ０１２５６全長アミノ酸配列（配列番号４）をクエリーとし、検索ツールＰｆａｍ　ＨＭＭ　Ｓｅａｒｃｈ（ＨＭＭＰＦＡＭ）（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ　ＥＬ，Ｅｄｄｙ　ＳＲ，Ｂｉｒｎｅｙ　Ｅ，Ｂａｔｅｍａｎ　Ａ，Ｄｕｒｂｉｎ　Ｐｆａｍ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ＨＭＭ−ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｏｍａｉｎｓ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）Ｊａｎ１；２６（１）：３２０−３２２）を用いて検索した。ＨＭＭＰＦＡＭのアルゴリズムにはＨＭＭＥＲ２．１（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）を、データベースにはＰＦＡＭ６．０（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）を用いた。その結果、ヒトＰＪ０１２５６はＴＳＰ１ドメイン（ｔｓｐ　１）、及びレプロリシン型亜鉛メタロプロテアーゼドメイン及びレプロリシンファミリーペプチド（Ｐｅｐ　Ｍ１２Ｂｐｒｏｐｅｐ）を有することが判明した（表４）。
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実施例１１
（マウスＰＪ０１２５６カウンターパートのホモロジー検索）
マウスＰＪ０１２５６のアミノ酸配列を既知配列に対して解析プログラム（ＢＬＡＳＴ２．１）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ　Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ　Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），”Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９−３４０２．）（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ｎｒ　２００１年２月２３日更新分）を用いて検索したところ、表５に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。マウスＰＪ０１２５６はＡＤＡＭＴＳファミリーと相同性を有するクローンであることが判明した。
2002031163.tif 000024
実施例１２
（マウスＰＪ０１２５６カウンターパートの解析）
マウスＰＪ０１２５６のアミノ酸配列をクエリーとし、ＨＭＭＰＦＡＭ（ＨＭＭＥＲ２．１、ＰＦＡＭ６．０）（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／を用いて実施例１０と同様に検索した。その結果、マウスＰＪ０１２５６はＴＳＰ１ドメイン（ｔｓｐ　１）を有することが判明した（表６）。
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実施例１３
（ヒト及びマウスＰＪ０１２５６とＡＤＡＭＴＳファミリーのアライメント）
Ｃｌｕｓｔａｌｗ１．８１（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ　Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇａｐ　ｐｅｎａｌｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｔｒｉｘ　ｃｈｏｉｃｅ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０．）を用いてヒト及びマウスＰＪ０１２５６と既知のＡＤＡＭＴＳファミリーとのアミノ酸配列のアライメントを行なった（表７〜表３１）。表７〜表３１は、ヒト及びマウスＰＪ０１２５６と既知のＡＤＡＭＴＳファミリー遺伝子のアミノ酸配列を、Ｎ末端側からＣ末端側までアライメントした一連の表である。表中、「＊」はその位置で全ての配列で完全に保存されていることを意味する。また、「：」はその位置で、｛ＳＴＡ｝、｛ＮＥＱＫ｝、｛ＮＨＱＫ｝、｛ＮＤＢＱ｝、｛ＱＨＲＫ｝、｛ＭＩＬＶ｝、｛ＭＩＬＦ｝、｛ＨＹ｝、｛ＦＹＷ｝のようなグループのうちのいずれかが保存されている事を意味する。さらに、「．」はその位置で｛ＣＳＡ｝、｛ＡＴＶ｝、｛ＳＡＧ｝、｛ＳＴＮＫ｝、｛ＳＴＰＡ｝、｛ＳＧＮＤ｝、｛ＳＮＤＥＱＫ｝｛ＮＤＥＱＨＫ｝、｛ＮＥＱＨＲＫ｝のようなグループのうちのいずれかが保存されている事を意味する。ＡＤＡＭＴＳファミリーは、ＴＳＰ１ドメイン、ｚｉｎｃ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅドメイン及びＣｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈｒｅｇｉｏｎ（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ）からなることが知られており（Ｍ．Ｄ．Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：１６６４−１６６６；Ｆ．Ｖａｚｑｕｅｚ　ｅｔ　ａｌ，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：２３３４９−２３３５７）、アライメントの結果から、３０３から３７６番目のアミノ酸（太字、＃で印をつけた部分）はディスインテグリン様領域（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ　ｒｅｇｉｏｎ）であることが判明した。この結果得られたドメインと実施例１０又は実施例１２にて同定したドメインを、ヒトＰＪ０１２５６については表３２に、マウスＰＪ０１２５６については表３３にまとめた。
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実施例１４
（解析プログラムによる解析）
実施例１０及び実施例１３でヒトＰＪ０１２５６について同定したドメインのアミノ酸配列（表３４：検索したドメインとクエリーに用いた配列）を既知配列に対して解析プログラム（ＢＬＡＳＴ２．１）を用いて検索したところ、表３５（検索したクエリーに対してヒットした既知配列：最も相同性の高いもの）に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。また、実施例１２及び実施例１３でマウスＰＪ０１２５６について同定したドメインのアミノ酸配列（表３６）について同様に検索を行ったところ、表３７に示す配列とホモロジーを有することが明らかになった。
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実施例１５
（ＰＪ０１２５６マウスカウンターパートの取得）
実施例８で得たＰＪ０１２５６マウスカウンターパートは部分ｃＤＮＡであったため、引き続きＰＪ０１２５６のマウスカウンターパート取得を試みた。その際、後述する実施例１７に示したようにマウスＰＪ０１２５６の発現量が高かった発情期マウス卵巣より「ＴＲＩＺＯＬ登録商標　Ｒｅｇｅｎｔ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製」を用いて抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行なった。
ＲＴ反応は、「ＴａＫａＲａ　ＲＮＡ　ＬＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ１．１；宝酒造製」を用い下記の条件で行なった。
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ＰＣＲ反応は、ヒトＰＪ０１２５６特異的プライマーＰＪ−Ｓ０２（下記参照）と前述のマウスＰＪ０１２５６特異的プライマーｍＰＪ−Ａ０３を用い、「ＫＯＤ　Ｄａｓｈ、東洋紡製」にて下記の条件で行なった。
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その結果、約５５０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物は、常法に従いプラスミドベクターに連結し、大腸菌形質転換体としてクローン化した後、プラスミドを抽出し塩基配列を決定した。
塩基配列決定の結果、得られたＰＣＲ産物はヒト特異的プライマーであるＰＪ−Ｓ０２の２０ｂｐを除いて５２５ｂｐであった。マウスＰＪ０１２５６部分ｃＤＮＡ塩基配列（配列番号７）は、ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３）の２，１１７−２，６４１番目に対してＤＮＡレベルで８４．７％（４４５／５２５）一致していた。また、コードされる推定アミノ酸配列（配列番号８）は１７５残基であり、ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ推定アミノ酸配列（配列番号４）の４５０−６２４番目に９４．８％（１６６／１７５）一致していた（図９）。
実施例１６
（マウスＰＪ０１２５６遺伝子の発現組織解析）
（１）マウスＰＪ０１２５６遺伝子の発現組織を解析するため、下記のＰＣＲプライマーを合成した。下記プライマーの組み合わせで、４１２ｂｐのマウスＰＪ０１２５６ｃＤＮＡ断片が増幅される。
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２４種のマウス臓器由来ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを調製した「マウスＲＡＰＩＤ−ＳＣＡＮＴＭ　ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＰＡＮＥＬ、ＯｒｉＧｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製」を鋳型として、下記の条件でＰＣＲを行なった。
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ＰＣＲ産物を電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、紫外光照射下で画像を取り込み、各バンド濃度を比較した（図１０）。
図１０に示した結果から、マウスＰＪ０１２５６遺伝子は、腎臓、精巣、卵巣、子宮で発現が高く、脳、脾臓、胃、皮膚で弱い発現が観察された。脳では、サイズの異なるバンドが観察され、スプライシングバリアントの存在が示唆される。また、９．５日、１２．５日、１９日の胎児で発現が観察され、発生にしたがって発現量が増加していた。このことより、ＰＪ０１２５６は発生に関与していることが示唆された。
（２）さらに、ノーザンハイブリダイゼーションにより、マウスＰＪ０１２５６遺伝子のｍＲＮＡ解析を行った。プローブは、アガロースゲル電気泳動法により分離・精製したマウスＰＪ０１２５６ｃＤＮＡの部分断片（４２２ｂｐ、配列番号５）を用いた。プローブＤＮＡのラベリングは、アマシャム　ファルマシア　バイオテク社の「ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｂｅａｄｓ（−ｄＣＴＰ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．２７−９２４０−０１」と、「３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＢ１０２０５」を用いて行った。ＤＮＡに取り込まれなかった３２Ｐ−ｄＣＴＰの除去は、アマシャム　ファルマシア　バイオテク社の「Ｐｒｏｂｅ　ＱｕａｎｔＴＭ　Ｇ−５０　Ｍｉｃｒｏ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２７−５３３５−０１」により行った。マウス胎児由来ｍＲＮＡをブロットしたフィルターは、クローンテック社より購入したＭｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　ＭＴＮ　Ｂｌｏｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．７７６３−１，Ｌｏｔ．０１２０８０５）を用い、ハイブリダイゼーションの条件はクローンテック社のプロトコールに従って行った（図１１）。
図１１で示した結果から、マウスＰＪ０１２５６遺伝子は７日、１１日、１５日、１７日めの胎児いずれの時期にも発現していることが示され、その発現量は発生にしたがって発現量が増加していた。このことより、ＰＪ０１２５６は発生に関与していることが示唆された。またｍＲＮＡの大きさは約５．５Ｋｂで、明瞭なスプライシングバリアントは検出されなかった。
実施例１７
（ＰＪ０１２５６の性周期による発現変動）
ＰＪ０１２５６の主な発現部位は実施例６に示したノーザンハイブリダイゼーション及びＲＴ−ＰＣＲの結果から卵巣であった。卵巣は、性周期に従って排卵を繰り返すことで、組織形態が変化している。その過程では、細胞外マトリックスの分解及び再構築が繰り返されており、分解系及び合成系の種々の酵素が性周期に従って変動していると考えられる。ＰＪ０１２５６と同じＡＤＡＭＴＳファミリーであるＡＤＡＭＴＳ１は、プロゲステロンの制御下で性周期に従って発現が変動することが報告されている（Ｒ．Ｌ．Ｒｏｂｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ，　Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．（２０００）６５（１０−１１）：５５９−５７０；Ｒ．Ｌ．Ｒｏｂｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（２０００）９７（９）：４６８９−４６９４．）。
以下、マウスＰＪ０１２５６の卵巣での性周期による発現変動を検討した。対照組織として、腎臓での検討も同様に行なった。
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＰＣＲによる検討を行なうために、以下のプライマー及び定量的ＰＣＲ用プローブを作製した。ｍＰＪ−がマウスＰＪ０１２５６用、Ｇ３ＰＤＨ−及びｍＧＤＨ−が内部標準遺伝子として用いたマウスグリセルアルデヒド　３−燐酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）用であり、Ｓはセンスプライマー、Ａはアンチセンスプライマーを示す。
ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー
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定量的ＰＣＲ用プライマー
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定量的ＰＣＲ用プローブ（ＴａｑＭａｎ　プローブ）
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マウスはＳｌｃＩＣＲ系メス９週齢を５個体使用した。性周期は、採取当日及び前日にスメアーテストを行ない判定した（表３８）。卵巣及び腎臓を採取後、「ＴＲＩＺＯＬ登録商標　Ｒｅｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製」を用いて、添付プロトコルに従いＲＮＡを抽出した。
ＲＴ−ＰＣＲの第一次反応である逆転写反応（ＲＴ反応）は、上記で抽出したＲＮＡを鋳型として、「ＴａＫａＲａ　ＲＮＡ　ＬＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ１．１；宝酒造製」を用い、下記の条件で行なった。
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ＲＴ−ＰＣＲの第二次反応であるＰＣＲは、上記のＲＴ反応で調製したｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件で行なった。
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ＰＣＲ産物を電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、紫外光照射下で画像を取り込み、各バンド濃度を比較した（図１２、表３８）。Ｇ３ＰＤＨのバンドが各個体及び卵巣、腎臓でほとんど同じだったのに対し、ＰＪ０１２５６のバンド濃度は発情期である個体１の卵巣で特に強く、個体１及び個体３の腎臓、個体４の卵巣で若干強かった。
性周期による発現変動の更なる検討のため、定量的ＰＣＲによる解析を行なった。定量的ＰＣＲ反応溶液は、「ＴａｑＭａｎ登録商標Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製」を用い、前記のＲＴ反応で調製したｃＤＮＡを鋳型として、以下の通り調製した。
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反応は、定量的ＰＣＲ装置「ＧｅｎｎｅＡｍｐ５７００登録商標　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製」に上記の反応溶液を入れたチューブを１サンプル当たり２本ずつセットし、以下の運転プログラムにて行なった。
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定量的ＰＣＲ装置で得られた増幅曲線より、Ｇ３ＰＤＨ及びＰＪ０１２５６の相対濃度を得た。続いて、ＰＪ０１２５６の相対濃度を内部標準遺伝子であるＧ３ＰＤＨの相対濃度で除算し、補正した。補正値を組織及び遺伝子ごとの最低値で除算し、相対濃度比を算出した（表３８）。その結果、発情期である個体１の卵巣でのみ、ＰＪ０１２５６の発現が高くなっていることが確認された。
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ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＰＣＲの結果から、共に発情期卵巣ではＰＪ０１２５６の発現が亢進していることが示された。このことより、ＰＪ０１２５６は性周期に従って卵巣での発現が変動しており、排卵に伴う卵巣の細胞外マトリックスの分解及び再構築に関与していることが示唆された。
実施例１８
（組換えヒトＰＪ０１２５６タンパク質の細胞外マトリックス局在化の検討）
実施例５においてＣＯＳ７細胞で発現させたヒトＰＪ０１２５６タンパク質が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に局在していることを確認するため、論文（Ｋｕｎｏ，Ｋ．ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｋ．　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３，１３９１２−１３９１７）の方法に準じて以下の検討を行った。
７５ｃｍ２組織培養用フラスコに約５０％コンフレントに付着生育させたＣＯＳ７細胞に対し、１０μｇのｐＣＭＨ０１−ＰＪ０１２５６を遺伝子導入した。対照には１０μｇのｐＣＭＨ０１を用いた。遺伝子導入は市販の「ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ　ＰＬＵＳ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製」を用い、添付プロトコルに従って行った。遺伝子導入３日後、培養上清液（１２ｍｌ）を回収し、等量の２×ＳＤＳ電気泳動用緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ６．８、２０％　グリセロール、１２％　２−メルカプトエタノール、４％　ＳＤＳ、ブロモフェノールブルーにより染色）を添加後、１００℃で５分間加熱して培地画分（Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ）とした。フラスコに付着した細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄した後、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を添加したＰＢＳで細胞を遊離させた。懸濁した細胞液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分、室温）して細胞を沈殿させ、氷冷したＰＢＳで洗浄後、０．０５ｍｌのＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．０％　ＮＰ４０、０．５％　デオキシコーレート、０．１％　ＳＤＳ、１ｍＭ　フェニルメチルスルフォニルフルオリド）に懸濁して細胞を破砕した。細胞破砕液に等量の２×ＳＤＳ電気泳動用緩衝液を添加後、１００℃で５分間加熱して細胞画分（Ｃｅｌｌ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ）とした。細胞を遊離させた後にフラスコに付着したＥＣＭ画分を、１．０ｍｌの１×ＳＤＳ電気泳動用緩衝液に懸濁し、１００℃で５分間加熱して細胞外マトリックス画分（ＥＣＭ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ）とした。
各画分サンプル５μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動は、市販の「マルチゲル４／２０、第一化学薬品社製」を「カセット電気泳動槽「第一」ＤＰＥ−１２０」にセットし、４０ｍＡ定電流で１時間行った。泳動用緩衝液は、「Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＳＤＳ　Ｐｏｗｄｅｒ、宝酒造製」を用い、分子量マーカーは、「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．１６１−０３７２」を用いた。泳動終了後、「ミニトランスブロット、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製」を用いてエレクトロトランスファーによりＰＶＤＦ膜「ＴＥＦＣＯ社製、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．０３−０５６」にブロッティングした。エレクトロトランスファーは、「Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ　Ｐｏｗｄｅｒ、宝酒造製」にメタノールを２０％添加した緩衝液中で、１５０ｍＡ定電流で１．５時間行った。ブロッティングしたＰＶＤＦ膜は、「抗Ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）抗体、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．ＳＣ−４０」を１次抗体として反応させ、「Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ−ＰＯＸ、Ｓｉｇｍａ社製」を２次抗体として反応させた。抗体にラベルされたホースラディシュパーオキシダーゼの検出には「ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製」を用い、添付されていた標準プロトコルに従って行った。結果を図１３に示した。
図１３に示したように、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティング解析の結果、ｐＣＭＨ０１−ＰＪ０１２５６をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞では、発現したＰＪ０１２５６タンパク質のシグナルは主にＥＣＭ画分に検出された。対照としたｐＣＭＨ０１では該当するシグナルは検出されなかった。以上の結果より、ＣＯＳ７細胞で発現したヒトＰＪ０１２５６タンパク質は主にＥＣＭに局在していることが示された。
実施例１９
（ＰＪ０１２５６のエクソン部位決定と染色体マッピング）
ＰＪ０１２５６のゲノム配列及び疾患との関わりを調べるため、ゲノム配列を検索し、染色体マッピングを行なった。
ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ（配列番号３）で公共データベースであるＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、染色体クローンＡＣ０１０２６９．５がヒットした。同配列に対しヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡをＧＴ−ＡＧルールにあてはめ、エクソン部位を決定した。その結果、ヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ　５６１０ｂｐ中１−３５５８ｂｐが、エクソン１〜１８としてＡＣ０１０２６９．５上に存在した。エクソン１９以降はＡＣ０１０２６９．５上には存在しなかった（表３９、図１４）。
ＮＣＢＩのＨｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｍａｐ　Ｖｉｅｗｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｈｕｍ　ｓｒｃｈ？ｃｈｒ＝ｈｕｍ　ｃｈｒ．ｉｎｆ＆ｑｕｅｒｙ）を用いて、ヒトＰＪ０１２５６のゲノム配列であるＡＣ０１０２９６．５の染色体上の位置をデータベース上で調べ、染色体マッピングを行なった。その結果、２００１年９月１９日現在ＡＣ０１０２６９．５は、５番染色体短腕１５．３１（５ｐ１５．３１）に存在していた（図１５）。なお、同ゲノム配列は２００１年５月８日には５ｐ１５．３３、同年５月１０日には５ｐ１５．２に存在していた。
染色体マッピングの結果から、ＰＪ０１２５６は５ｐ１５．２−１５．３に存在することが示された。５ｐ１５．２−１５．３は、５Ｐ−症候群（Ｃｒｉ−ｄｕ−ｃｈａｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の欠失部位であり（Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）３（２）：２４７−２５２）、同症候群との関連が示唆される。
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実施例２０
（ヒトＰＪ０１２５６の昆虫細胞系での大量発現）
ヒトＰＪ０１２５６の大量発現を行なうため、昆虫細胞／バキュロウィルスでの発現系を構築した。発現系構築には「Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ登録商標　Ｂａｃｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ社（現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）製」を使用した。
発現させたヒトＰＪ０１２５６のＣ末端にＭｙｃＨｉｓタグ配列を付加するため、組換えバキュロウィルスＤＮＡプラスミド（Ｂａｃｍｉｄ）調製用ベクター「ｐＦａｓｔＢａｃ１、Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ社（現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）製」を改変した。すなわち、下記の合成ＤＮＡ（ＭＥＨＴ−１、ＭＥＨＴ−２、ＭＥＨＴ−３、及びＭＥＨＴ−４）をアニーリングさせ連結したものを、ｐＦａｓｔＢａｃ１のＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイト間に挿入した。作製したｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＴのクローニング部位を図１６に示す。
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ヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡは実施例４で作成したｐＣＭＨ０１−ＰＪ０１２５６から制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＴの同サイトに挿入した。作製したプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＴ−ＰＪ０１２５６は、塩基配列を決定しＰＪ０１２５６ｃＤＮＡ下流にＭｙｃＨｉｓタグ配列が同一フレームで連結されたことを確認した（図１７、配列番号９）。
昆虫細胞／バキュロウィルス発現系において効率良くＰＪ０１２５６を分泌させるため、ミツバチ　メリチン（Ｈｏｎｅｙｂｅｅ　Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）由来シグナル配列（以下、メリチンシグナル、Ｔｅｓｓｉｅｒ　Ｄ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ，　Ｇｅｎｅ（１９９１）９８（２）：１７７−１８３）を付加した。すなわち、下記の合成ＤＮＡをアニーリングさせたものを、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＴ−ＰＪ０１２５６のＢａｍＨＩサイトに挿入した。
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作製したプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６‐２は、塩基配列を決定しＰＪ０１２５６ｃＤＮＡ上流にメリチンシグナル配列が同一フレームで連結されたことを確認した（図１８、配列番号１０）。
また、活性型ＰＪ０１２５６を高効率で得る目的で、ＰＪ０１２５６自体のシグナル配列及びメタロプロテアーゼ活性を抑制すると考えられるプロ領域を除いたものも作製した。すなわち、下記のプライマーで増幅される２５７ｂｐのヒトＰＪ０１２５６断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６‐２の両サイト間に連結した。なお、ＢＨＰＪ−Ｓ０５は、５’側９ｍｅｒがＢａｍＨＩの認識配列と同酵素での消化を可能とするスペーサー配列であり、３’側２１ｍｅｒはヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３）の１５９３〜１６１３番目に完全一致する配列よりなるプライマーである。ＰＪ−Ａ２５はヒトＰＪ０１２５６全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３）の１８１１〜１８４０番目の相補鎖に完全一致する配列よりなるプライマーである。
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作製したプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６‐１は、塩基配列を決定しメリチンシグナル配列下流にヒトＰＪ０１２５６ｃＤＮＡのメタロプロテアーゼドメインが同一フレームで連結されたことを確認した（図１９、配列番号１１）。
作製した組換えＢａｃｍｉｄ調製用ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＴ−ＰＪ０１２５６、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６‐１及びｐＦａｓｔＢａｃ１−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６‐２で、組換えＢａｃｍｉｄ調製用大腸菌；「Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ１０　Ｂａｃコンピテントセル、菌体内にＢａｃｍｉｄを有する、Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ社（現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）製」をそれぞれ形質転換した。その結果、Ｔｎ７部位特異的トランスポジションによって、それぞれのＰＪ０１２５６の発現ユニットが組換えられたＢａｃｍｉｄ（Ｂａｃｍｉｄ−ＨＴ−ＰＪ０１２５６、Ｂａｃｍｉｄ−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６‐１及びＢａｃｍｉｄ−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６‐２）を得た。
Ｂａｃｍｉｄ−ＨＴ−ＰＪ０１２５６、Ｂａｃｍｉｄ−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６‐１及びＢａｃｍｉｄ−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６‐２をそれぞれ２クローンずつＳｆ９細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入はリポソーム法にて行なった。４日後、培養上清を０．２μｍのフィルターでろ過し、それぞれのＰＪ０１２５６組換えバキュロウィルス液（ＢＶ　ｓｏｌ．ＰＪ０１２５６−ＨＴ　Ｎｏ．１、ＢＶ　ｓｏｌ．ＰＪ０１２５６−ＨＴ　Ｎｏ．２、ＢＶ　ｓｏｌ．ＰＪ０１２５６−ＭＳＨＴ１　Ｎｏ．１、ＢＶ　ｓｏｌ．ＰＪ０１２５６−ＭＳＨＴ１　Ｎｏ．２、ＢＶ　ｓｏｌ．ＰＪ０１２５６−ＭＳＨＴ２　Ｎｏ．１及びＢＶ　ｓｏｌ．ＰＪ０１２５６−ＭＳＨＴ２　Ｎｏ．２）として回収した。
回収したそれぞれのＰＪ０１２５６組換えバキュロウィルス液を３×１０６個のＳｆ９細胞に約ｍｏｉ１０で感染させた。３日後、細胞を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ　ＥＤＴＡで懸濁し、等量の２×サンプルバッファーを加え、約５分間煮沸させた後、１／１００量をウェスタンブロッティングに供した。ウェスタンブロッティングは、「Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ　ＨＲＰ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製」と「ＥＣＬ　ＰＬＵＳ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製」を用いて、それぞれの添付プロトコルに従って行なった。
ウェスタンブロッティングの結果を図２０に示した。昆虫細胞／バキュロウィルス系での発現の結果、それぞれの分子量に応じたＰＪ０１２５６の発現産物が得られた。本発現系の構築により、ＰＪ０１２５６の大量調製が可能となった。
産業上の利用可能性
以上説明したように本発明は、新規なＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質及びそれをコードする新規遺伝子を提供するものであり、卵巣での高発現及び性周期における発現量の変動、腫瘍細胞における存在の低下、及び当該遺伝子の染色体上の位置が５Ｐ−症候群の欠失部位に位置することを特徴とする。この特性を利用した新規医薬組成物、診断・治療手段の提供はＡＤＡＭＴＳファミリータンパク質関連の臨床・基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１はヒトＰＪ０１２５６を有するベクターｐＣＭＨ０１−ＰＪ０１２５６を示す模式図である。
図２はヒトＰＪ０１２５６を有するベクターを形質導入した哺乳動物細胞でのヒトＰＪ０１２５６タンパク質の発現を示す。
図３はヒトＰＪ０１２５６遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図４はヒトＰＪ０１２５６遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図５は正常卵巣及び腫瘍卵巣でのヒトＰＪ０１２５６発現量を示す。
図６は正常脳及び脳腫瘍でのヒトＰＪ０１２５６発現量を示す。
図７は正常副腎及び腫瘍副腎でのヒトＰＪ０１２５６発現量を示す。
図８はヒトＰＪ０１２５６とマウスＰＪ０１２５６のアミノ酸配列を比較して示す。
図９はヒトＰＪ０１２５６とマウスＰＪ０１２５６のアミノ酸配列を比較して示す。
図１０はマウスＰＪ０１２５６遺伝子の発現組織解析の結果を示す。
図１１はマウスＰＪ０１２５６遺伝子のマウス胎児における発現を示す。
図１２はマウスＰＪ０１２５６ｍＲＮＡの性周期変動を示す。グリセルアルデヒド　３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）ｍＲＮＡの性周期変動を対照として示す。図中、各数字はマウスの個体番号であり、それぞれのマウスの性周期は次のように判定された；１＝発情期；２＝発情後期〜休止期；３＝発情後期；４＝発情前期〜発情期；５＝発情後期。
図１３はＣＯＳ７細胞で発現させたヒトＰＪ０１２５６タンパク質の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への局在を示す。図中、ＣはｐＣＭＨ０１をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞、ＰＪはｐＣＭＨ０１−ＰＪ０１２５６をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞についての結果である。
図１４はヒト染色体クローンＡＣ０１０２６９．５上のヒトＰＪ０１２５６エクソンの位置を示す。
図１５はヒト染色体クローンＡＣ０１０２６９．５が５番染色体短腕１５．３１（５ｐ１５．３１）に存在することを示す。
図１６はヒトＰＪ０１２５６遺伝子を挿入した組換えバキュロウイルスＤＮＡ調製用プラスミドベクターｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＴのクローニング部位を示す。図中、イタリック文字は合成ＤＮＡ挿入部分を示す。
図１７はプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＴ−ＰＪ０１２５６の構造を示す模式図である。
図１８はプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６−２の構造を示す模式図である。
図１９はプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６−１の構造を示す模式図である。
図２０はヒトＰＪ０１２５６の昆虫細胞／バキュロウイルス系での発現結果を示す。図中、ＨＴはＢａｃｍｉｄ−ＨＴ−ＰＪ０１２５６、ＭＳＨＴ１はＢａｃｍｉｄ−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６−１、及びＭＳＨＴ２はＢａｃｍｉｄ−ＭＳ／ＨＴ−ＰＪ０１２５６−２を遺伝子導入したＳｆ９細胞の培養上清を示す。それぞれ２クローンずつ遺伝子導入し、Ｎｏ．１及びＮｏ．２として表示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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