(57)【要約】医療器具（主として血液接触を伴う材料）の生体適合性評価方法。採血した血液等の有核細胞を含む水溶液を、材料表面とインビトロで一定時間接触せしめ、該細胞含有液を回収し、しかる後に該細胞内よりＲＮＡ画分を抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製し、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法またはＤＮＡ  ａｒｒａｙ法を用いて特定の遺伝子の発現量を定量する。一方、材料と接触させずに同様の操作をした該細胞の特定の遺伝子の発現量を定量し、両者を対比する。前者の定量値が後者の定量値に近いほど材料は生体適合性がある。従来の方法にくらべてインビトロの条件下で簡便に感度良く、定量的に細胞の機能変化を評価できる。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子、またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の発現変化を対比することにより、従来の方法には無い観点での細胞の機能変化を評価可能とする。さらにエンドトキシンのコンタミネーションを抑えることによつて、材料自身による真の細胞の機能変化を評価できる。このような評価方法で評価した体液処理用材料、生体適合性評価用物質及び評価マーカーの選定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
材料表面と白血球を含む水溶液とをインビトロで一定時間接触せしめ、白血球を含む水溶液を回収し、しかる後に白血球細胞内よりＲＮＡ画分を抽出し、逆転写酵素を用いて、この抽出液からｃＤＮＡを作製したのち、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法またはＤＮＡ  ａｒｒａｙ法を用いて特定の遺伝子の発現量を定量し、材料と接触させずに同様の操作をした白血球の特定の遺伝子の発現量と比較することを特徴とする材料の生体適合性評価法。
【請求項２】
材料表面とヒトを含む動物由来の有核細胞含有液とを一定時間接触せしめ、該細胞含有液を回収し、しかる後に該細胞内よりＲＮＡ画分を抽出し、逆転写酵素を用いて、この抽出液からｃＤＮＡを作製し、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子の発現量を定量し、材料と接触させずに同様の操作をしたヒトを含む動物由来の有核細胞からのウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子の発現量とを比較することを特徴とする生体適合性評価法。
【請求項３】
ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法またはＤＮＡ  ａｒｒａｙ法を用いてウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子の発現量を定量する請求の範囲２に記載の生体適合性評価法。
【請求項４】
材料表面とヒトを含む動物由来の有核細胞含有液とを一定時間接触せしめ、該細胞含有液を回収し、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量または細胞内ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度あるいは細胞外の可溶性ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度を定量し、材料と接触させずに同様の操作をしたヒトを含む動物由来の有核細胞のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の発現量または濃度とを比較することを特徴とする生体適合性評価法。
【請求項５】
白血球を含む水溶液またはヒトを含む動物由来の有核細胞含有液を回収し、更に３７℃で１０分〜２４時間有核細胞を培養し、しかる後に該細胞内よりＲＮＡ画分を抽出する工程を含む請求の範囲１〜３のいずれかに記載の生体適合性評価法。
【請求項６】
実験に用いる器具及び材料が、実質的に特定の遺伝子の発現量および、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子発現量、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量、細胞内ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度または細胞外の可溶性ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度に影響を与えない量のエンドトキシンレベルである請求の範囲１〜５のいずれかに記載の生体適合性評価法。
【請求項７】
材料表面と接触させる白血球を含む水溶液または、材料表面と接触させるヒトを含む動物由来の有核細胞含有液が、ヒトを含む動物の血液またはヒトを含む動物の血液から分離した白血球を含む水溶液であり、全ての工程をインビトロで行う、請求の範囲１〜６のいずれかに記載の生体適合性評価法。
【請求項８】
白血球を含む水溶液または、ヒトを含む動物由来の有核細胞含有液が、ヒト健常人末梢血由来である請求の範囲１〜７のいずれかに記載の生体適合性評価法。
【請求項９】
材料表面と白血球を含む水溶液とを接触させる時間または、材料表面とヒトを含む動物由来の有核細胞含有液とを接触させる時間が、２時間未満である、請求の範囲１〜８のいずれかに記載の生体適合性評価法。
【請求項１０】
材料の形態が中空糸状、糸状、不織布状、フィルター状、平膜状、粒子状のいずれかである、請求の範囲１〜９のいずれかに記載の生体適合性評価法。
【請求項１１】
特定の遺伝子が、サイトカイン及びケモカイン遺伝子のうち、少なくとも一種類であること、またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子であることを特徴とする請求の範囲１〜１０のいずれかに記載の生体適合性評価法。
【請求項１２】
請求の範囲１〜１１のいずれかに記載の生体適合性評価法を用いて評価した場合、特定の遺伝子の発現量が、材料と接触させずに同様の操作をした細胞の遺伝子発現量に比べて実質的な差異を生じないことを特徴とする、体液処理用材料。
【請求項１３】
請求の範囲２〜１０のいずれかに記載の生体適合性評価法を用いて評価した場合、材料と接触させずに同様の操作をした有核細胞のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター分子の遺伝子発現量、またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量、または細胞内ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度あるいは有核細胞含有液中の有核細胞外の可溶性ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度と比べて実質的な差異を生じないことを特徴とする、体液処理用材料。
【請求項１４】
人末梢血と材料表面とを３７℃、３０ｍｉｎ、血液と材料の接触表面積比２５０ｃｍ２／ｍｌ〜１６０ｃｍ２／ｍｌの条件で接触させた場合、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量が、材料と接触させずに同様の操作をした人末梢血のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量と比較して１．８０倍未満である事を特徴とする体液処理用材料。
【請求項１５】
人末梢血と材料表面とを３７℃、３０分、血液と材料の接触表面積比２５０ｃｍ２／ｍｌ〜１６０ｃｍ２／ｍｌの条件で接触させた場合、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量が、材料と接触させずに同様の操作をした人末梢血のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量と比較して１．７６倍未満である事を特徴とする体液処理用材料。
【請求項１６】
人末梢血と材料表面とを３７℃、３０分、血液と材料の接触表面積比２５０ｃｍ２／ｍｌ〜１６０ｃｍ２／ｍｌの条件で接触させた場合、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量が、材料と接触させずに同様の操作をした人末梢血のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量と比較して１．７２倍以下である事を特徴とする体液処理用材料。
【請求項１７】
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量を、該人末梢血中の白血球表面で測定することにより比較する操作を含む請求の範囲１４〜１６のいずれかに記載の体液処理用材料。
【請求項１８】
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量を、該人末梢血中の単球表面で測定することにより比較する操作を含む請求の範囲１４〜１６のいずれかに記載の体液処理用材料。
【請求項１９】
疎水性高分子並びに親水性高分子を主成分としてなる材料であって、疎水性高分子含有率が全体の５０重量％以上である、請求の範囲１２〜１８のいずれかに記載の体液処理用材料。
【請求項２０】
疎水性高分子がポリスルホン系樹脂である請求の範囲１９に記載の体液処理用材料。
【請求項２１】
親水性高分子がポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）又は、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）又は、ＰＶＰあるいはＰＥＯと疎水性高分子との共重合体又は、これら親水性高分子を２種類以上含む請求の範囲１９に記載の体液処理用材料。
【請求項２２】
材料が中空糸膜形態をしている請求の範囲１２〜２１のいずれかに記載の体液処理用材料。
【請求項２３】
中空糸膜の内径が１００〜３００μｍである請求の範囲２２に記載の体液処理用材料。
【請求項２４】
中空糸膜の内径が１６０〜２５０μｍである請求の範囲２２に記載の体液処理用材料。
【請求項２５】
純水の透水量が５ｍｌ／ｍ２・ｍｍＨｇ・ｈｒ以上、１０００ｍｌ／ｍ２・ｍｍＨｇ・ｈｒ以下である請求の範囲２２に記載の体液処理用材料。
【請求項２６】
β２−ミクログロブリンのふるい係数が０．４以上、１以下である請求の範囲２２に記載の体液処理用材料。
【請求項２７】
血液処理用途に使用される材料である請求の範囲１２〜２６のいずれかに記載の体液処理用材料。
【請求項２８】
血液の体外循環用途に使用される材料である請求の範囲１２〜２７のいずれかに記載の体液処理用材料。
【請求項２９】
血液の体外循環による血液浄化用途に使用される材料である請求の範囲１２〜２８のいずれかに記載の体液処理用材料。
【請求項３０】
血液透析、血液濾過、血液濾過透析のいずれかの用途に使用される材料である請求の範囲１２〜２９のいずれかに記載の体液処理用材料。
【請求項３１】
材料が滅菌処理されている請求の範囲１２〜３０のいずれかに記載の体液処理用材料
【請求項３２】
滅菌処理が、高圧蒸気滅菌、放射線滅菌、ガス滅菌のいずれかである請求の範囲３１に記載の体液処理用材料。
【請求項３３】
滅菌処理が、乾燥状態または湿潤状態にて実施される請求の範囲３２に記載の体液処理用材料。
【請求項３４】
滅菌処理に使用する放射線が電子線またはγ線である請求の範囲３２または請求の範囲３３に記載の体液処理用材料。
【請求項３５】
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡと同一あるいは相補的な配列を１０残基以上含む核酸であることを特徴とする生体適合性評価用物質。
【請求項３６】
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプターのタンパク質分子に親和性を有する物質であることを特徴とする生体適合性評価用物質。
【請求項３７】
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプターのタンパク質分子に親和性を有する物質が抗体である請求の範囲３６に記載の生体適合性評価用物質。
【請求項３８】
材料表面とヒトを含む動物由来の有核細胞含有液とを一定時間接触せしめ、該細胞含有液を回収し、しかる後に該細胞内よりＲＮＡ画分を抽出し、逆転写酵素を用いて、この抽出液からｃＤＮＡを作製したのち、ＤＮＡ  ａｒｒａｙ法を用いて特定の遺伝子の発現量を定量し、材料と接触させずに同様の操作をした細胞の特定の遺伝子の発現量と比較した場合、両者の発現量に相違があるものを候補とする材料の細胞刺激性に関する評価マーカーの選定方法。
【請求項３９】
ＤＮＡ  ａｒｒａｙ法以外の遺伝子発現定量法を用いて、材料接触の有無で該候補遺伝子の発現量に相違があることを確認する操作を含む請求の範囲３８に記載の材料の細胞刺激性に関する評価マーカーの選定方法。
【請求項４０】
候補遺伝子がコードするタンパク質を、細胞内、細胞表面または細胞外のタンパク質濃度として定量する事により、材料接触の有無で該候補遺伝子の発現量に相違があることを確認する操作を含む請求の範囲３８または３９に記載の材料の細胞刺激性に関する評価マーカーの選定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、主に血液接触を伴う医療器具、特に体外循環型医療器具において、白血球の機能変化、例えば白血球の活性化・免疫機能の低下などの有害な生理反応を最小にするかまたは無くすための生体適合性の評価法に関する。より詳しくは、材料表面と接触した白血球のサイトカイン・ケモカイン遺伝子、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質などの発現変化を、簡便、高感度、定量的に測定することによる、医療材料の細胞刺激性の評価方法に関する。さらに、本発明は、このような評価方法で評価した体液処理用材料、生体適合性評価用物質及び評価マーカーの選定方法に関する。
従来の技術
近年、血液接触を伴う医療器具、特に体外循環型医療器具の進歩はめざましく、体外循環施行中に血液凝固などを起こして、体外循環が続行できなくなるなどのトラブルは少なくなった。血液透析に代表される体外循環治療時の主なトラブルは、異物である材料表面と血液が接触することにより、生体反応が惹起されることに始まる。主な臨床症状としては血液凝固、アナフィラキシーショック、白血球の一過性減少（ロイコペニア）、発熱、血圧の低下または上昇など多岐にわたる。これら急性の臨床症状を伴う体外循環時の問題発生のメカニズムは古くから研究されており、材料表面と血液が接触することによって、血小板が活性化されることや、セルロースなどの水酸基を多く持つ表面との接触による血液中の補体成分の活性化、陰性荷電表面と血液の接触によるブラジキニンの産生、透析液から血液側にエンドトキシンが逆流入することなどが原因と考えられている。従来の医療機器はこれらのメカニズムを考慮し、材料の生体適合性または血液適合性を良くすることによって問題を改善してきた。
しかし、透析の分野では近年透析期間の長期化、患者の高齢化などにより、透析アミロイドーシス、易感染化、動脈硬化などの長期に頻回の透析治療を続けることによって発症する症状が問題視されており、更なる改善が望まれている。これらの症状は、医療機器材料の生体適合性と密接に関わっていると考えられている。しかしながら、従来の評価法では、長期間での臨床症状を予測できるような優れた生体適合性の評価は出来ておらず、また実際に透析中の患者より血液を採取して評価しなければならず、安全性や性能を満足してからでないと評価が出来なかった。これらの理由により、生体外で少量のサンプルを多数評価可能で、且つ材料との接触による微妙な生体側の変化をとらえる評価法の開発が産業上必要である。
特開平７−１７８１６６号公報にウサギ体外循環による中空糸の残血評価、及び人血液より分離した白血球食細胞懸濁液と平膜状の材料を接触させ、さらに０．１ｍＭの２−メチル６（−ｐ−メトキシフェノール）−３，７−ジヒドロイミダゾ（−１，２−ａ）−ピラジン−３−オン（以下、ＭＣＬＡ）を添加することによって、白血球から放出される活性酸素種を発光に変換して測定する方法が開示されている。しかし、この方法は、白血球から多量に活性酸素が放出されるような状況での評価であり、活性酸素産生量が低い材料間の比較は困難である。またＭＣＬＡは一部の化学物質や材料表面と反応することや自己酸化により、擬陽性を生じやすいなどの問題点を持っている。特表平９−５１０９０３号公報に材料と接触した血液のトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ（ＴＡＴ）、カリクレイン様活性、凝固時間、末端補体複合体（ＴＣＣ活性）、ＩＬ−１βタンパク質産生量、血小板からの微粒子放出、Ｐ−セレクチンの発現量、血小板−白血球会合体量、白血球表面のＬ−セレクチン・ＣＤ１１ｂの発現量など多様な指標を測定した実施例が記載されている。このなかで、本発明における白血球機能の指標として使用できるものは、ＩＬ−１βタンパク質分泌量、血小板−白血球会合体量、白血球表面のＬ−セレクチン・ＣＤ１１ｂの発現量である。材料表面に単核球細胞（単球、リンパ球）が接触するとＩＬ−１βタンパク質分泌することが報告されている（エム・エー・カルドナ（Ｃａｒｄｏｎａ，Ｍ．Ａ．）らＢｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２６：８５１−８５９（１９９２））。しかし、ＩＬ−１βタンパク質分泌量は非常に微量であり、材料表面による白血球の活性化を評価する場合、ＬＰＳなどの細胞活性化剤を使用しないと効率的に検出できない。（１例挙げるならばＴＮＦαにおいては材料＋ＬＰＳの１８ｈｒの複合刺激で最大２３０．４ｐｇ／ｍｌ程度）加えて材料表面へのＩＬ−１βタンパク質の吸着量を把握することが難しいため、接触させる材料によっては測定値を低く算出してしまうという問題点が存在する。血小板−白血球会合体量、白血球表面のＬ−セレクチン・ＣＤ１１ｂの発現量では、材料間の相違を必ずしも明確に見積もることが難しい。
佐々木らは、膜（ＭＥＭＢＲＡＮＥ）１９（６）：４００−４１０（１９９４）および「血液透析スタッフのための新しいハイパフォーマンスダイアライザー」（東京医学社）：１３−２７（１９９８）において白血球適合性の指標として、材料との接触による、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、顆粒球エラスターゼの各タンパク質の分泌量および、ＭＣＬＡを用いた発光による活性酸素産生量を測定しているが、この方法によるとタンパク質の分泌量（特にＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαのようなサイトカインなどの極微量のタンパク質）を定量する場合、前述のように材料表面へのタンパク質の吸着により、正確な定量が困難なことに加え、測定法の検出限界を下回るような白血球の微妙な活性化を検出することはできないおそれがある、。また、血液と材料との接触時間を長時間にしないと検出が困難である。（例を挙げるならばＩＬ−１βにおいては材料の６ｈｒ刺激で最大８００ｐｇ／ｍｌ未満、ＴＮＦαにおいては材料の１ｈｒ刺激で最大２００ｐｇ／ｍｌ未満であり、材料の種類によっては全くの未刺激と同様に検出限界以下となっている）
Ｓ．ｋｕｓｈｉｈａｔａらＩｎｔ．Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ  ２１（７）：３８４−３９０（１９９８）には中空糸材料とインビトロで接触したヒト単核球のＴＮＦαのｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により定量化する方法が記載されている。しかし実際の透析患者の血液を使用しており、透析患者は腎機能の低下によって、赤血球産生を司るエリスロポエチンが不足しているため、貧血を呈する場合が多く、白血球適合性評価のために多量の採血をすることは難しいことが問題となり、産業上の利用は著しく制限される。さらにＲＴ−ＰＣＲ後のＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動・ＥｔＢｒ染色後、ＰＣＲ産物のバンドをイメージとして定量しているため、操作が煩雑で熟練を要し、ＰＣＲ反応に由来する誤差が大きく定量的には解析できない問題がある。Ｎ．Ｗｅｂｅｒら２００１  ＳＯＣＩＥＴＹ  ＦＯＲ  ＢＩＯＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ２７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  １８５ページには、ヒト血液とチューブ状材料とを、インビトロで接触させ、該血液から単球を分離し、材料接触後単球のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により定量化する方法が記載されている。しかし抗ＣＤ１４抗体が固定されたマグネチックビーズを使用して、単球を分離する操作は煩雑であり、単球以外の白血球画分の生体適合性評価をすることが出来ない。また、上記と同様にＲＴ−ＰＣＲ後のＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動・ＥｔＢｒ染色後、ＰＣＲ産物のバンドをイメージとして定量しているため、操作が煩雑で熟練を要し、ＰＣＲ反応に由来する誤差が大きく定量的には解析できない。また、ＰＣＲ産物をサザンブロット法で検出する方法も記載されているが、これによってもＰＣＲ反応に由来する誤差は解消できない。以上のような問題点により、産業上簡便で感度が高く、定量的な生体適合性評価法が望まれていた。
最近の研究では材料との接触による微妙な生体側の変化をとらえることが可能になってきた。しかし材料表面と接触した生体側の変化はこれらの指標のみでは全てを説明することが出来ず、より多くの指標を元に生体適合性の評価をしていくことが必要である。
上記以外の生体適合性の指標を見つけるためには、例えば透析患者と健常人で量や質が異なる特定のタンパク質を見いだし、材料表面との接触の有無によってそのタンパク質量の変化をＥＬＩＳＡで定量することや、フローサイトメーターなどにより細胞表面量の変化を定量すること、またはその遺伝子の発現量変化を定量すること等が行われてきたが、多大な労力と時間を要するため、新規な指標を見いだすことは非常に困難を極めている。
さらに、一般に血液細胞はエンドトキシン（パイロジェン及びＬＰＳも同様の意味として用いる）に対して感受性が高く、本発明におけるような遺伝子発現量評価においては、エンドトキシンが極めて少ない状況で行わないと、試料や器具にコンタミネーションしているエンドトキシンの影響が測定値に大きな影響を及ぼす。この点については、先に例示した先行文献中には、エンドトキシンに関する記載が殆ど見られず、エンドトキシンの記載がある場合でも、材料接触後に細胞活性化剤として添加しているのみであり、エンドトキシンのコンタミネーションによる遺伝子発現への影響が考慮されておらず、材料自身による真の生体適合性を評価できていないという問題があった。
発明の開示
本発明は、従来の方法では検出が困難な材料表面に接触した細胞の活性化を検出し得る、新規な生体適合性の指標を提供することを目的とする。さらに本発明の目的は、臨床の患者の血液を使用することなどに限定されず、汎用性があり且つ簡便で感度が高く、定量的な材料の生体適合性評価法を提供することにある。また、エンドトキシンのコンタミネーションを抑えることによって、材料自身の真の生体適合性評価法を提供することにある。さらに本発明による生体適合性評価法によって評価する事によって従来よりも優れた生体適合性材料、または、体液処理用材料を提供することにある。
本発明者らは、前記問題点を解決すべく鋭意検討を進めた結果、採血した血液由来の有核細胞含有液または白血球を含む水溶液を、材料表面とインビトロで一定時間接触せしめ、該細胞含有液または白血球を回収し、しかる後に細胞内よりＲＮＡ画分を抽出し、逆転写酵素を用いてこの抽出液からｃＤＮＡを作製し、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法またはＤＮＡ  ａｒｒａｙ法を用いて特定の遺伝子の発現量を定量し、材料と接触させずに同様の操作をした白血球の特定の遺伝子の発現量とを比較することにより、従来の方法より簡便に感度良く、定量的に白血球の機能変化、白血球の活性化を検出できることを見いだした。さらに、生体適合性の指標として従来全く知られていなかった、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子が、材料接触によって発現が上昇するという驚くべき知見を見いだした。さらに詳細に検討したところ、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプターの細胞表面濃度も、材料表面との接触によって上昇することを見いだした。その上、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプターの細胞表面濃度を指標とする場合は、ある測定条件では材料非接触に比べて材料接触後の表面濃度が１．８０倍未満の増加範囲である材料が優れているという驚くべき知見を見いだした。
また、エンドトキシンのコンタミネーションを抑えることによって、材料自身による真の白血球の機能変化、特に白血球の活性化を検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、次のような材料表面の生体適合性評価方法、体液処理用材料、生体適合性評価用物質及び評価マーカーの選定方法に関する。
（１）材料表面と白血球を含む水溶液とをインビトロで一定時間接触せしめ、白血球を含む水溶液を回収し、しかる後に白血球細胞内よりＲＮＡ画分を抽出し、逆転写酵素を用いてこの抽出液からｃＤＮＡを作製し、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法またはＤＮＡ  ａｒｒａｙ法を用いて特定の遺伝子の発現量を定量し、材料と接触させずに同様の操作をした白血球の特定の遺伝子の発現量と比較して材料の生体適合性を評価することよりなる生体適合性評価法。
この発明においては、前者の遺伝子の発現量と後者のそれとを比較して実質的に差異のない材料が生体に適合していると判断され、医療器具材料、例えば人工腎臓用材料として用いられる。
（２）材料表面とヒトを含む動物由来の有核細胞含有液とを一定時間接触せしめ、該細胞含有液を回収し、しかる後に該細胞内よりＲＮＡ画分を抽出し、逆転写酵素を用いてこの抽出液からｃＤＮＡを作製し、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子の発現量を定量し、材料と接触させずに同様の操作をしたヒトを含む動物由来の有核細胞からのウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子の発現量とを比較することよりなる生体適合性評価法。
この発明では、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子の発現量の定量をｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法またはＤＮＡ  ａｒｒａｙ法を用いて行うことが望ましい。
（３）材料表面とヒトを含む動物由来の有核細胞含有液とを一定時間接触せしめ、該細胞含有液を回収し、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量または細胞内ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度あるいは細胞外の可溶性ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度を定量し、材料と接触させずに同様の操作をしたヒトを含む動物由来の有核細胞のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の発現量または濃度とを比較することよりなる生体適合性評価法。
この発明においては、前者のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子の発現量またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量あるいは該タンパク質の細胞内濃度、または細胞外の可溶性ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度の定量値が後者の定量値と比べて実質的な差異を生じないほど生体に適合した材料であると評価する。
この発明において、人末梢血と材料表面とを３７℃、３０ｍｉｎ、血液と材料の接触表面積比２５０ｃｍ２／ｍｌ〜１６０ｃｍ２／ｍｌの条件で接触させた場合、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量が、材料と接触させずに同様の操作をした人末梢血のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量と比較して１．８０倍未満である事を特徴とする体液処理用材料。
さらに本発明は、このような生体適合性評価用物質及び材料の細胞刺激性に関する評価マーカーの選定方法に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書中に記載されているインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏも同様の意味として用いる）とは、試験管や培養器内のような人工環境内で生じる過程または反応を指し、透析や体外循環治療のように血液を一度体外に取り出してから、再び生体内に戻す場合は含まれない。
本明細書中に記載されている白血球を含む水溶液とは、ヒト及びほ乳類の末梢血に抗凝固剤（ヘパリン、クエン酸、ＥＤＴＡ（説明のために例示するが、これらに限定されない））を添加した血液、並びに前記の血液から比重の違いなどを利用して、白血球を分離し、生理的塩濃度とｐＨを持つ緩衝水溶液（ＰＢＳ（−）、ＨＢＳＳ、生理食塩水、血清、血漿（説明のために例示するが、これらに限定されない））に懸濁したものをいう。
本明細書中に記載されている有核細胞含有液とは、生体外で増殖させることが可能な、ヒトを含む動物由来の培養細胞を、生理的塩濃度とｐＨを持つ緩衝水溶液（ＰＢＳ（−）、ＨＢＳＳ、生理食塩水、血清、血漿、培地（説明のために例示するが、これらに限定されない））に懸濁したもの。或いは、ヒト及びほ乳類の末梢血に抗凝固剤（ヘパリン、クエン酸、ＥＤＴＡ（説明のために例示するが、これらに限定されない））を添加した血液、並びに前記の血液から比重の違いなどを利用して、白血球を分離し、生理的塩濃度とｐＨを持つ緩衝水溶液に懸濁したものをいう。前述の白血球を含む水溶液も有核細胞含有液の範疇に含まれる。
本明細書中に記載されている白血球とは、顆粒球、単核球、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球などの白血球の分類の内、全ての分類を含むか、あるいは好中球などの特定の細胞集団に純化しても良い。
材料表面と有核細胞含有液との接触時間は、特に制限されないが、材料との接触効率の点で１０秒以上が望ましい。また、細胞の生存率の低下を防ぐ為に、６時間以下が望ましく、さらに材料表面への付着による細胞の回収率の低下を防ぐ為に２時間未満がより望ましい。
材料表面と有核細胞含有液との接触表面積比は、特に制限されないが、材料との接触効率の点で１ｃｍ２／ｍｌ以上が望ましく、材料表面への付着による細胞の回収率の低下を防ぐ為に５００ｃｍ２／ｍｌ以下が望ましい。また、材料表面と白血球を含む水溶液との接触法は、静置・撹拌下・細胞含有液が流動している状態のいずれも可能である。さらに好適な条件を敢えて例示するならば、２５０ｃｍ２／ｍｌ〜１６０ｃｍ２／ｍｌの範囲が望ましい。
材料表面と有核細胞含有液との接触時の温度は、細胞の生存率の低下を防ぐため４５℃以下で、且つ緩衝水溶液が液体である０℃以上であれば、いずれの温度も本発明に好適であるが、細胞の生理活動が活発な１５℃から３７℃がより望ましい。
本明細書中に記載されている材料の例としては、水に不溶な固体状表面及び水を含んだハイドロゲル表面など、水溶液と界面を形成するものであれば、何れも使用することが出来るが、敢えて例示するならば、中空糸状、糸状、不織布状、フィルター状、平膜状、粒子状のものが本発明に好適に使用される。また、前述の材料表面に高分子材料を溶媒と共に塗布して、溶媒のみを揮発させ該高分子材料を表面にコーティングしたものや、固体表面の改質のために物理的及び化学的方法によって表面修飾を施したもの、固体表面に高分子材料をグラフト重合したものなども本発明に好適である。
本明細書中に記載されているＲＮＡ画分とは、有核細胞内に存在するリボゾームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（以下「ｍＲＮＡ」という）の全てを含むトータルＲＮＡ（以下「ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ」という）や、オリゴｄＴカラムなどにより精製したｍＲＮＡをいう。ＲＮＡ画分の抽出法は特に限定されないが、望ましくはＡｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法（以下「ＡＧＰＣ法」という）が簡便で且つ少量のサンプルで抽出できる点で、本発明に好適に使用できる。
本明細書中に記載されている、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製する際のｐｒｉｍｅｒは特に限定されないが、リボゾームＲＮＡの影響を少なくする点で、オリゴｄＴプライマーや、遺伝子特異的なアンチセンスプライマーを使用することが望ましい。
本明細書中に記載されているｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法は、ＰＣＲ産物の量を蛍光強度などに変換し、ＰＣＲの温度サイクル１サイクル毎に記録することによって、ＰＣＲの対数直線増幅期のサイクルを精密に同定し、蛍光強度などのシグナルが、バックグランドから区別出来るようになるサイクル数を算出することによって、ＰＣＲ反応前のｃＤＮＡ（ｍＲＮＡの量を反映している）を定量するものである。この蛍光検出のための方法は、特に限定されないが、インターカレーション法、ＴａｑＭａｎプローブ法、ユニプライマー法、ハイブリプローブ法などいずれも本発明に好適に使用できる（参考文献として川口ら臨床検査４４（６）２０００がある）。
本明細書中に記載されているＤＮＡ  ａｒｒａｙ法は、ガラスやナイロン膜などの基材上に複数のＤＮＡ配列を、整列して固定化したもので、その作製や検出法にはＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社法や、Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学法などがあるが、特に限定されず、いずれも本発明には好適に使用することが出来る（実験医学  ｖｏｌ．１９（２００１）Ｎｏ．１〜８（羊土社）中の「クローズアップ実験法」参照）。これらの定量化のための検出法は、ＲＮＡ画分を逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ画分を調整する際、ラジオアイソトープや蛍光物質により標識するか、またはＲＮＡ画分を逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製後に、ラジオアイソトープや蛍光物質により標識しておき、整列状に固定化されたＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションさせる。これらを洗浄した後、各ＤＮＡ配列のスポットの放射能や蛍光強度を測定することによって行われる。２種類以上のＲＮＡ画分サンプルから、別々に２種類以上の標識をしたｃＤＮＡを作製し、競合させながらハイブリダイゼーションさせる方法なども本発明には好適である。これらの方法では、ＰＣＲのステップを必要としないので、定量性が期待できる。
本明細書中に記載されているサイトカインは、極微量で細胞表面の特異的レセプターを介して生理活性を示すタンパク質因子の総称である。そのいずれもが本発明に好適に使用できるが、敢えて例示するならば、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ類（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８など）や、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、Ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１２ｋＤ（ＢＣＧＦ−１２ｋＤ）、ＣＤ４０  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ）、Ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦα、ＴＮＦβ）、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ類（ＩＮＦα、ＩＮＦβ、ＩＮＦγ）、Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ（ＯＳＭ）、Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）、Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ類（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５）、Ｎｅｕ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ（ＮＤＦ）、Ｎｅｕｒｅｇｕｒｉｎ（ＮＲＧ）、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（Ｇ−ＣＳＦ）、Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１（ＣＳＦ−１）、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ）、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦβ）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ、およびそれらのレセプターなどがある。また、動物血などを対象とする場合はこれらのホモローグも本発明に好適である。より望ましくは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦαが本発明に好適である。
本明細書中に記載されているケモカインとは内在性の白血球走化因子の総称である。そのいずれも本発明に好適に使用できるが、敢えて例示するならば、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＰＦ４、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２、ＩＬ−８、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ、ＢＲＡＫ、Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ、ＳＣＭ−１β、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、Ｉ−３０９、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−４、ＴＡＲＣ、ＤＣ−ＣＫ−１、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、６Ｃｋｉｎｅ、ＭＤＣ、ＭＰＩＦ−１、ＭＰＩＦ−２、ＴＥＣＫ、Ｅｏｔａｘｉｎ−３、ＣＴＡＣＫ（以上の別名としてＣＸＣＬ１からＣＸＣＬ１５、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ１からＣＣＬ２７（参考文献としてＡｌｂｅｒｔ  ＺｌｏｔｎｉｋらＩｍｍｕｎｉｔｙ  １２（Ｆｅｂｒｕａｒｙ）１２１−１２７  ２０００がある）、さらにそれらのレセプターであるＣＸＣＲ１からＣＸＣＲ５、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ１からＣＣＲ１０などがある。また、動物血などを対象とする場合はこれらのホモローグも本発明に好適である。より望ましくは、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８が本発明に好適である。
本明細書に記載されているウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター；ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（以下「ｕＰＡ−Ｒ」という）は、別名ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ３（以下「Ｍｏ３」という）またはＣＤ８７である（以下、「ｕＰＡ−Ｒ」、「Ｍｏ３」、「ＣＤ８７」は同様の分子を指す）。機能としては、ｕＰＡ−Ｒに結合したプラスミノーゲン活性化因子の働きにより、プラスミノーゲンをプラスミンに変換してセリンプロテアーゼ活性を発現させる。腫瘍細胞や炎症に関わる細胞の細胞表面の近傍にプラスミン活性を局在化させる。この分子の局在は、単核食細胞・好中球・Ｔ細胞などの白血球、内皮細胞、肝細胞、そして造血系および非造血系のある種の腫瘍細胞で発現している。ヒトＣＤ８７分子は分子量約５０〜６０ｋＤの糖蛋白質であり、ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧＰＩ）アンカーが２８３番目のグリシンに結合した形で細胞膜表面に発現されている表面抗原である。また、可溶性のＣＤ８７分子種は、炎症メディエーターで刺激した骨髄芽細胞株Ｕ−９３７や単球の培養液および炎症又は腫瘍を持つ患者の血液や体液中で見いだされている（参考文献として右田ら別冊・医学の歩み  ＣＤ抗原ハンドブック  医歯薬出版株式会社１９９９年、４３９−４４２頁がある）。
Ｕ−９３７細胞株ではｕＰＡ−ＲのｍＲＮＡが、ＴＮＦαやＩＦＮγの８時間の刺激によって上昇すること、またＵ−９３７細胞表面のｕＰＡ−Ｒタンパク質発現量はＩＦＮγの２４時間の刺激によって上昇し、ＴＮＦαの２４時間刺激では上昇しないと報告されている（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｇ  ＳｉｔｒｉｎらＢｌｏｏｄ  ｖｏｌ．８４  Ｎｏ．４  １９９４年、１２６８−１２７５頁）。
ヒト健常人末梢血では、単球表面のｕＰＡ−Ｒタンパク質発現量は、ＬＰＳ（１−１０００ｎｇ／ｍｌ）の４−２４時間の刺激によって上昇し、比較的高い濃度のＴＮＦα（１−１００ｎｇ／ｍｌ）の４時間刺激で上昇すると報告されている（Ｐａｓｃａｌｅ  Ｅ  Ｐ  ＤｅｋｋｅｒｓらＩｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ａｐｒ．２０００年、２１５６−２１６０頁）
ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（角質細胞）の細胞株では、細胞表面のｕＰＡ−Ｒタンパク質発現量は比較的高い濃度のＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）の２４時間の刺激および、ＩＬ−１β（５００Ｕ／ｍｌ）の２４時間刺激で上昇すること、またｕＰＡ−ＲのｍＲＮＡが、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）やＩＬ−１β（５００Ｕ／ｍｌ）の刺激によって１−２ｈｒ後以降に上昇することと報告されている（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ  ＢｅｃｈｔｅｌらＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ．２２３  １９９６年、３９５−４０４頁）。
本発明の生体適合性評価法には、細胞表面および細胞内のＣＤ８７分子または有核細胞含有液中に存在する可溶性のＣＤ８７分子を検出・定量する方法は何れも好適に用いられるが、蛍光標識抗体を用いたフローサイトメーター法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法などが定量性の面で望ましい。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプターのタンパク質分子（ＣＤ８７分子）に親和性を有する物質を利用する方法として、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子の量または活性、さらにウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子により活性化されて産生されるプラスミンの量または活性によっても、細胞表面のＣＤ８７分子を検出・定量することが出来る。さらにはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子に対する細胞の遊走能を測定することによっても、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプターの細胞表面量を見積もることが可能である。また本発明の生体適合性評価法には、有核細胞内よりＲＮＡ画分を単離した後、ＣＤ８７分子の遺伝子発現量を検出・定量する方法は何れも好適に用いられるが、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡ  ａｒｒａｙ法などが定量性の面で望ましい。動物血などを対象とする場合はヒトｕＰＡ−Ｒ分子のホモローグ（タンパク質、遺伝子ともに）も本発明に好適である。
本発明のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子を検出するための生体適合性評価用物質には、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子と特異的にハイブリダイゼーションあるいはアニールする事が出来る核酸が挙げられる。検出の特異性の観点よりウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡと同一あるいは相補的な配列を１０残基以上含む核酸が望ましい。本明細書中の配列表配列番号１および２はこの一例（説明のために記載するが、これに限定されない）である。前記核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび検出のための標識を含む核酸や、核酸の誘導体などでも本発明には好適である。
本発明のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質分子を検出するための生体適合性評価用物質には、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプターのタンパク質分子（ＣＤ８７分子）に親和性を有する物質が挙げられる。この場合の親和性は、水溶液中でウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質分子との解離定数がＫｄ＝１０−７Ｍ以下が定量性や特異性の面で望ましい。敢えて例示するならば、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプターのタンパク質分子に対する抗体などが挙げられ、これらに酵素や蛍光、ラジオアイソトープ標識する事も可能である。本明細書中のＣＤ８７  Ｒ−ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：米国  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ社製はこの一例（説明のために記載するが、これに限定されない）である。
本明細書中に記載されている医療材料の細胞刺激性とは、材料表面に直接または血漿成分などを介して細胞が接触した場合、材料非接触時に比べて、何らかの遺伝子またはタンパク質の発現が亢進または減弱することをいう。
本明細書中に記載されている実質的に差異を生じないとは、統計学的に解析した場合に有意差を認めないことをいう。
本明細書に記載されている生体適合性とは、材料表面に直接または血漿成分などを介して生体が接した場合、生体側に何らかの有害な作用を及ぼさない性質をいう。敢えて具体例を例示するならば、体内に移植された人工物が免疫反応などで拒絶されにくい性質などが挙げらる。この場合、生体適合性が良いとは、例えば白血球の活性化などの有害な生理反応が他の材科と比較して最小または無いことである。
本明細書に記載きれている体液とは生体に存在し、水を主成分とし細胞成分、固形成分や油分を含んだ液体のことをいう。敢えて説明の為に例示するならば、血液・骨髄液・腹水・胸水・リンパ液・尿・胆汁・消化液・組織液・粘液・汗・間質液などを挙げることが出来るがこれらに限定されない。
本明細書に記載されている体液処理とは、生体内や生体外（ｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏやｅｘ  ｖｉｖｏ）において、材料表面との接触や、温度変化、圧力変化など、何らかの作用を体液に対して人為的に及ぼすことをいう。敢えて説明の為に例示するならば、血液の体外循環・採血・輸血・骨髄採取・骨髄穿刺・腹水採取などを挙げることが出来るがこれらに限定されない。また、水に不溶な材料、または水と界面を形成する材料を体内の任意の場所に埋込み或いは移植した場合においても、組織液・リンパ液・血液・間質液などを介して生体組織と材料は接触することとなるため、この場合も体液処理に該当する。
本明細書中に記載されている体液処理用材料とは、本発明の生体適合性評価方法を用いて評価した場合に、特定の遺伝子の発現量が、材料と接触させずに同様の操作をした細胞の遺伝子発現量に比べて実質的な差異を生じない材料のことである。
すなわち、材料と接触させずに同様の操作をした有核細胞のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター分子の遺伝子発現量、またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量、または細胞内ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度あるいは有核細胞含有液中の有核細胞外の可溶性ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質濃度と比べで実質的な差異を生じない体液処理用材料のことをいう。
なかでも、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質にあっては、人末梢血と材料表面とを３７℃、３０ｍｉｎ、血液と材料の接触表面積比２５０ｃｍ２／ｍｌ〜１６０ｃｍ２／ｍｌの条件で接触させた場合、前記レセプタータンパク質の細胞表面発現量が、材料と接触させずに同様の操作をした人末梢血のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量と比較して１．８０倍未満である事が必要である。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量が比較対照の１．８０倍以上になると、細胞として高い活性化状態となっており、炎症反応を惹起し易くなるため好ましくない。前述の炎症反応を惹起する一つのメカニズムとしては、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量が高くなる程、そのリガンドであるウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（以下ｕＰＡという）を細胞表面に多く結合できるため、結果として、血中に存在するプラスミノーゲンが蛋白分解酵素であるプラスミンに細胞表面の近傍において変換され、より多くのプラスミン活性が細胞表面近傍に局在化されることとなり、最終的には、該活性化細胞の組織への浸潤能力が顕著に高くなるためと考えられる。発現量のより好ましい範囲は１．７６倍未満であり、特に好ましくは１．７２倍以下である。なお、体液処理用材料として好ましい数値の下限は比較対照と同等である１．００である。前述の数値は１．００未満の値を示す場合も理論上あり得るが、この場合は、材料と接触しない状態で、既に有核細胞が活性化状態にあったと考えられ、体液処理用材料としての評価が妥当でない。ただし、統計学的に有意差が認められない程度の低下である場合は、本明細書では比較対照と同等と見なす。
本明細書中に記載されている体液処理用材料は、上記の生体適合性を示すものであれば、その素材や形態は特に限定するものではなく、水に不溶な固体状表面及び水を含んだハイドロゲル表面など、水溶液と界面を形成するものであれば何れも使用することができる。
好ましくは、体液を処理する際に、体液流によって機械的に破損しないもの、材料の機能が損なわれるほどに変形しないもの等であり、例えば、疎水性高分子を成型した構造体、あるいは、親水性高分子が３次元的に架橋し、構造体となったハイドロゲル等が挙げられる。
材料の素材が疎水性高分子のみの場合は、細胞粘着等、一般的に細胞を活性化する傾向があり、一方、親水性高分子のみの場合は材料としての強度や取り扱い性に不十分な点が残ることから、これらを混合した疎水性高分子並びに親水性高分子を主成分としてなる材料がより好ましい。体液処理用材料としての強度を考慮すると、疎水性高分子含有率を全体の５０重量％以上とし、親水性高分子の含有率を必要以上に高くしない方がよい。
なお、体液が接触するのは材料表面のみであることを考慮すると、任意の材料に特定の高分子材料をコーティングしたものや、固体表面の改質のために物理的及び化学的方法によって表面修飾を施したもの、固体表面に高分子材料をグラフト重合したものなども本発明の範疇となる。
本明細書に記載されている疎水性高分子の例としては、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリイミド、ポリフェニルエーテル、ポリフェニレンスルフィドなどほとんどのエンジニアリングプラスチックを用いることができるが、下記基本骨格を有するポリスルホンが特に好ましい。下記基本骨格中、ベンゼン環部分を修飾したものも好ましく用いることができるが、これに限定されない。
2003014394.tif 000002
式中、ｎは１以上の整数を示す。
本明細書に記載されているポリスルホン系樹脂とは、上記式（Ｉ）に示すポリスルホン骨格の誘導体や、ジフェニルスルホンがエーテル結合した式（ＩＩ）の基本構造を持つポリエーテルスルホンなどを示す。
2003014394.tif 000003
式中、ｎは１以上の整数を示す。
本明細書に記載されている親水性高分子の例としては、特に限定されるものではないが説明のために例示するならば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどがあるが、これらを単独で用いてもよいし、混合して用いてもよい。また、１分子中に親水性の高分子部と疎水性の高分子部の両方を併せ持つ、ランダム共重合体やブロック共重合体やグラフト共重合体なども好適に使用できる。
本明細書中ではポリエチレンオキサイド（以下ＰＥＯという）とポリエチレングリコール（以下ＰＥＧという）は同じ分子構造を意味するものとする。
体液処理用材料の形態は特に限定するものではないが、敢えて例示するならば、中空糸状・糸状・不織布状・平膜状・粒子状のものが本発明において好適に使用される。中空糸・糸・平膜の揚合は、ポリマー粒子が密にパッキングしたいわゆる均一構造、スポンジ様の多孔質構造、あるいは、これらにマクロボイドが存在する構造の何れでもよい。粒子状の場合は、多孔質構造であってもよい。
また、体液処理用材料の機能は特に限定するものではないが、敢えて例示するならば、物質の選択透過性を示す透析や濾過機能、および／または、選択吸着性を示す吸着機能を有していると体液処理用として好ましい。
これらの形態と機能を様々に組合せることにより、中空糸膜・不織布フィルター・不織布吸着材・粒状吸着材等として用いることが出来る。
本明細書に記載されている体液処理用途とは、具体的には、血液の体外循環・採血・輸血・血液製剤作成等の血液処理用途、骨髄採取・骨髄穿刺・腹水採取等の処理である。さらに、血液の体外循環は、血液透析・血液濾過・血液濾過透析のほか、血漿交換や吸着療法等の血液浄化用途に分けることができる。
本明細書に記載されている体液処理用材料は、これらの体液処理の何れにおいても好適なものではあるが、慢性腎不全の治療方法である血液透析・血液濾過・血液濾過透析において最も好ましく使用できる。その理由は、血液透析療法は高頻度かつ長期にわたって継続的に繰り返される治療方法であり、このように体液が材料から刺激を受ける頻度が極めて高い用途においては、格段に優れた生体適合性が要求されるからである。
血液透析をはじめ、血液浄化用途の体液処理用材料としては、コンパクト・高強度・血液容量の少なさ等の利点から、中空糸膜が好ましく用いられる。中空糸膜の内径は１００μｍ〜３００μｍあればよく、使用中の血栓形成や物質交換効率を考慮すると、１６０μｍ〜２５０μｍであることが好ましい。また、強度や取り扱い性の点から、中空糸膜の膜厚は１５〜１００μｍが好ましく、それ以上に厚いと物質透過性が低下する。
本明細書中に記載されている透水量は、体液処理用材料が膜である時の透過性の一指標であり、膜の一方から他方に一定の圧力を掛けながら純水を濾過させた場合に、他方に流出してくる単位時間・単位面積当たりの純水の濾過量を示す。例えば、中空糸膜の場合は、中空糸膜の一端を封止したモジュールを準備し、中空糸膜の内側から外側、または外側から内側に濾過する量を測定すれば、次式により算出される。
透水量（ｍｌ／ｍ２・ｍｍＨｇ・ｈｒ）＝Ｑｗ／（Ｐ×Ｔ×Ａ）
ここで、Ｑｗは濾過量（ｍｌ）、Ｔは流出時間（ｈｒ）、Ｐは圧力（ｍｎＨｇ）、Ａは膜面積（ｍ２：中空糸内表面換算）をそれぞれ示す。
純水の透水量は、低すぎると実質的に水が透過せず、また細孔も小さくなる傾向なので溶質の透過性が悪くなり、透析や濾過に不向きとなる。反対に、高すぎると、例えば、体液中の有用物質の一つであるアルブミンが抜ける傾向にある。従って、透水量は５ｍｌ／ｍ２・ｍｍＨｇ・ｈｒ以上、１０００ｍｌ／ｍ２・ｍｍＨｇ・ｈｒ以下の範囲が好ましい。
また、本明細書中に記載きれているβ２−ミクログロプリン（以下、β２ＭＧと言う）とは、細胞表面に存在する主要組織適合性抗原ＭＨＣクラスＩ分子と非共有桔合的に会合している分子量１１，８００のタンパク質であり、血液や血清中にも遊離の状態で存在している。腎不全の状態においては、β２ＭＧの血中濃度が健常人に比べて高く、治療が長期化するにつれて蓄積する傾向が認められている。
β２ＭＧのふるい係数は、体液処理用材料が特に血液透析膜・血液濾過膜・血液濾過透析膜である時に、長期透析患者における症状改善を見る一指標として用いられ、その測定方法・計算方法については、「血液透析スタッフのための新しいハイパフォーマンスダイアライザー（竹沢真吾編集、東京医学社  １９９８年、１１１−１１３頁）」に詳しく記載されている。
β２ＭＧのふるい係数は、低すぎると透析治療において血中β２ＭＧを低下させることができないので、０．４以上１以下の範囲が好ましい。
体液処理用材料は、その用途を考慮すると、滅菌によって菌体を死滅させておくことが好ましい。一般に、材料の滅菌方法としては、乾熱滅菌・高圧蒸気滅菌・ホルマリンガスやエチレンオキサイドガスによるガス滅菌、電子線やγ線等の放射線滅菌が挙げられるが、材料へのダメージや残留ガスの問題、あるいは生産性を考慮すると、放射線滅菌が好ましく、材料内部までの浸透性に優れるγ線滅菌が最も好ましい。
また、このような滅菌処理は、材料が実質的に水分を含まない乾燥状態、または、材料が垂れない程度に水分を含むか水中に完全に浸漬されている湿潤状態において行われる。その際、材料の酸化劣化を軽減する点から、湿潤状態で滅菌処理されていることが好ましい。
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量を定量する細胞は特に限定されないが、該タンパク質を予め検出感度以上に細胞表面に発現している細胞を定量する事が必要となり、材料表面と接触させる有核細胞含有液が人末梢血である場合には、白血球の表面で定量する事が望ましい。また、材料との接触刺激の程度を鋭敏に、該タンパク質の表面発現量の変化として反映する点で、リンパ球以外の白血球である顆粒球や単球が好ましく、中でも単球が最も本発明に好適に使用できる。
本明細書中に記載されている、材料の細胞刺激性に関する評価マーカーの選定方法では、細胞が材料表面と接触した際に、該細胞内に起こる様々な変化の内、遺伝子発現変化を伴う場合を対象とし、材料非接触の細胞との対比を行い、両者に相違があるものを候補とする。対比を行う方法としては複数種類の遺伝子を同時に比較できることが望ましい。また、生体適合性の既知のマーカー以外を選定するためには、非常に多種類の遺伝子について調べることが必要となる。このため、本発明に好適に使用できる方法は、該細胞からＲＮＡ画分を抽出し、逆転写酵素を用いてこの抽出液からｃＤＮＡを作製した後、ＤＮＡ  ａｒｒａｙ法を用いて特定の遺伝子の発現量を定量的に測定する方法である。また、将来的にはＲＮＡ画分を直接あるいは定量的に増幅して用いて、ＤＮＡ  ａｒｒａｙ法の様な網羅的な発現解析が可能になると考えられるが、これらも本明細書中の材料の細胞刺激性に関する評価マーカーの選定方法に応用可能である。
ＤＮＡ  ａｒｒａｙ法を使って、日常的に材料の生体適合性を評価するのでは、特殊な設備を持った一部の施設に限られ、更にコストがかかる。このため、ＤＮＡ  ａｒｒａｙ法以外の遺伝子発現定量法によって、材料接触の有無で該候補遺伝子の発現量に相違が有ることを確認する操作を行えば、材料の細胞刺激性に関する評価マーカーの利用価値が広がる。この場合の遺伝子発現定量法は、特に限定されないが、定量性と簡便性の点でｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法が最も望ましい。
また，候補遺伝子の発現量の相違は最終的には、候補遺伝子がコードするタンパク質の発現量や濃度の相違となる。このため、候補遺伝子がコードするタンパク質の発現量や濃度を定量する事によって、材料接触の有無で該候補遺伝子の発現量に相達が有ることを確認する操作を行えば、材料の細胞刺激性に関する評価マーカーが汎用的に使用できるものとなる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、何らこれに限定されるものではない。
（実施例１）
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて１００ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）５００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５  米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）、緩やかに混合した。この血液に、滅菌したデキストランＴ−７０の生理食塩水溶液を９：１の割合で静かに混合し、室温で４０分静置した。上部の多白血球血小板血漿（以下「ＬＰＲＰ」という）を回収し、同じ供血人由来の乏血小板血漿（以下「ＰＰＰ」という）を用いて、白血球数を１×１０７個／ｍｌに調整した。
中空糸材料として、ＡＭ−ＳＤ−１５０Ｕ（日本国  旭メディカル社製）を用いた。ＡＭ−ＳＤ−１５０Ｕ（再生セルロース膜製、以下「ＡＭ−ＳＤ」という）は、クリーンベンチ内において生理食塩水（日本国  大塚製薬）５００ｍｌで中空糸内・外表面を洗浄した後に、無菌的にダイアライザーを分解し中空糸を取り出した後に供試材料とした。
前記中空糸材料を、外表面積で８０ｃｍ２クリーンベンチ内で無菌的に切り出し、容量５０ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２０７０  米国  ＦＡＬＣＯＮ社）に入れ生理食塩水２０ｍｌで３回洗浄した。上記のＬＰＲＰを９ｍｌずつを添加し（材料：ＬＰＲＰ接触表面積比８．９ｃｍ２／ｍｌ）、３７℃ウオーターバス内（ＴＨＥＲＭＯ  ＭＩＮＤＥＲ  ＤＸ−１０  日本国ＴＡＩＴＥＣ社製）で１５分間、時々転倒混和しながら接触させた。比較対照は中空糸材料を入れずに同様の操作を行った。材料接触後のＬＰＲＰを容量５０ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２０７０  米国  ＦＡＬＣＯＮ社）に移し替え、更に３７℃恒温培養器内（日本国  ＩＷＡＫＩ社製  ＮＩＢ−９０）で６０分間インキュベーションした。細胞を４℃、４００ｇ、１０ｍｉｎで遠心分離、生理的リン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ（−）」という）１０ｍｌに再懸濁する洗浄操作を２回繰り返した。
前記細胞を遠心分離後ＰＢＳ（−）を除いた細胞ペレットを１．５ｍｌ  ＰＰチューブ（ポリプロピレン、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ社、ＳａｆｅＳｅａｌ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅｓ）に移し、Ｔｒｉｚｏｌ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１ｍｌで細胞を溶解後、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。各サンプルのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２０μｇをＡｔｌａｓＴＭ  Ｇｌａｓｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（米国  ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、説明書に従ってＣｙ５またはＣｙ３（アマシャムファルマシア社製）標識したｃＤＮＡを作製した。
この際、材料未接触の細胞由来のｃＤＮＡと材料接触後の細胞由来のｃＤＮＡの標識は異なるものになるようにした。材料未接触のものと特定の材料に接触した、それぞれ別の標識されたｃＤＮＡを等量混合してＡｔｌａｓＴＭ  Ｇｌａｓｓ  Ｈｕｍａｎ  １．０  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（米国  ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）の説明書に従って、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。Ｓｃａｎｉｎｇデータの取得はＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅ（米国  ＧＳＩ  ＬＵＭＯＮＩＣＳ社製）とＱｕａｎｔＡｒｒａｙ  ｖｅｒ２．０（米国  ＧＳＩ  ＬＵＭＯＮＩＣＳ社製）を用いて、Ｌａｓｅｒ  Ｐｏｗｅｒ  ８０Ｖで、複数のｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅの蛍光強度がＣｙ５とＣｙ３の場合で同じになるように条件を決めた。さらにデータの解析はＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＴＭ  ３．０（米国  ＳｉｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて数値化した。
ＡＭ−ＳＤに接触したサンプルをＣｙ５標識し、材料未接触のサンプルをＣｙ３標識した場合の、蛍光強度の比Ｃｙ５／Ｃｙ３は、ＩＬ−１β遺伝子で２．３９、ＩＬ−８遺伝子で４．１４であり、ＡＭ−ＳＤに接触することによって、ＩＬ−１βは２．３９倍、ＩＬ−８は４．１４倍遺伝子発現が増加することが判り、遺伝子発現を指標とした材料の生体適合性を定量的に測定することが出来た。
さらに確認のため、蛍光標識を入れ替え、ＡＭ−ＳＤに接触したサンプルをＣｙ３標識し、材料未接触のサンプルをＣｙ５標識した場合の、蛍光強度の比Ｃｙ３／Ｃｙ５は、ＩＬ−１β遺伝子で３．１３、ＩＬ−８遺伝子で４．３５であり、同様のデータが得られた。また、その他の遺伝子では０．５＜Ｃｙ５／Ｃｙ３＜２、および蛍光色素を入れ替えて標識した場合０．５＜Ｃｙ３／Ｃｙ５＜２の条件を満たしており、有意に発現が変化する遺伝子は見られなかった。
（実施例２）
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。また定量性を確認するため、実験はｎ＝３で行った。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて６０ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）３００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５  米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、緩やかに混合し、実験開始まで室温で保存した（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）。
中空糸材料として、ＡＰＳ−１５０Ｓ（日本国  旭メディカル社製）、ＢＫ−１．６Ｐ（日本国  東レ社製）を用いた。ＡＰＳ−１５０Ｓ（ポリスルホンとポリビニルピロリドンのブレンド製、以下「ＡＰＳ」という）、ＢＫ−１．６Ｐ（アイソタクチックポリメチルメタクリレートとシンジオタクチックポリメチルメタクリレートのブレンド、以下「ＢＫ」という）はクリーンベンチ内において生理食塩水（日本国  大塚製薬）５００ｍｌで中空糸内・外表面を洗浄した後に、無菌的にダイアライザーを分解し中空糸を取り出した後に供試材料とした。また、ＢＫについては、中空糸間に挿入されている細い糸状のスペーサーフィラメントを無菌的に分離し、中空糸のみにしたものを供試材料とした。
前記中空糸材料を、外表面積で４０ｃｍ２クリーンベンチ内で無菌的に切り出し、容量１５ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２３２７−０１５  日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に入れ生理食塩水５ｍｌで３回洗浄した。先に採血した血液５ｍｌを添加し（材料：血液接触表面積比８ｃｍ２／ｍｌ）、ローテーター「ＲＯＴＡＴＯＲ  ＲＴ−５」（日本国  ＴＡＩＴＥＣ社製）にセットし、３７℃恒温培養器内（日本国  ＩＷＡＫＩ社製  ＮＩＢ−９０）で６０分間、２ｒｐｍで撹拌接触させた。比較対照は中空糸材料を入れずに同様の操作を行った。
材料接触後の血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ液（米国  アマシャムファルマシア社製）３ｍｌが入った容量１５ｍｌのＰＳチューブ（ポリスチレン、２３２１−０１５  日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に界面を形成するように静かに重層し、４００ｇ、室温、３０ｍｉｎ遠心分離後、単核球層を回収し、生理食塩水１０ｍｌを加え４００ｇ、室温、１０ｍｉｎ遠心分離して、洗浄された単核球ペレットを得た。細胞ペレットを１．５ｍｌ  ＰＰチューブ（ポリプロピレン、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ社、ＳａｆｅＳｅａｌ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅｓ）に移し、ＩＳＯＧＥＮ（日本国  ニッポンジーン社製）１ｍｌで細胞を溶解後、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ）（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）処理した後、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、説明書に従ってｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡは仕込みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算の濃度で５ｎｇ／μｌの濃度に希釈して、ＰＣＲ反応のテンプレートとした。
（実施例３）
実施例２のＰＣＲテンプレートをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ＩＬ−６遺伝子のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の定量も同時に行った。検出法はＴａｑＭａｎプローブ法を使用し、Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ  ＲｅａｇｅｎｔｓのＨｕｍａｎ  ＩＬ−６及びＨｕｍａｎ  Ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ（米国  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（米国  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃａｐｓ（米国  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。ＰＣＲの温度サイクルは、５０℃  ２ｍｉｎ後、９５℃  １０ｍｉｎした後、（９５℃  １５ｓｅｃ−６０℃  １ｍｉｎ）の２温度サイクルを４０サイクル繰り返した。解析は各サンプルのＩＬ−６遺伝子発現量をβ−ａｃｔｉｎ遺伝子発現量で規格化してＩＬ−６／β−ａｃｔｉｎを算出し、さらに材料未刺激のサンプルのＩＬ−６／β−ａｃｔｉｎ値を１とした相対値で算出した。結果を表１に示した。
（実施例４）
実施例２のＰＣＲテンプレートをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒクイックシステム３３０（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、ＩＬ−６遺伝子のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子及びＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の定量も行った。検出法はＩＬ−６及びβ−ａｃｔｉｎはＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎプローブ法を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用した。Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）の検出法はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ法を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用した。プライマーとプローブはＩＬ−６用（配列表配列番号１：５’−ＡＡＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣ−３’、配列表配列番号２：５’−ＧＴＣＡＧＧＧＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴ−３’、配列表配列番号３：５’−ＣＡＧＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＧＣＣ−ＦＩＴＣ−３’、配列表配列番号４：５’−ＬＣＲｅｄ−ＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＡＡＧＴＣＣＴ−リン酸化−３’）、β−ａｃｔｉｎ用（配列表配列番号５：５’−ＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’、配列表配列番号６：５’−ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴ−３’、配列表配列番号７：５’−ＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴＣ−ＦＩＴＣ−３’、配列表配列番号８：５’−ＬＣＲｅｄ−ＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡ−リン酸化−３’）、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）用（配列表配列番号９：５’−ＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧ−３’、配列表配列番号１０：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’）を用いた。
ＰＣＲ反応用のキャピラリーはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用し、ＰＣＲ反応溶液中のＭｇ２＋濃度は３ｍＭにした。ＰＣＲの温度サイクルは、ＩＬ−６用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １５ｓｅｃ−５５℃  １５ｓｅｃ−７２℃  １１ｓｅｃの３温度サイクルを４０サイクル繰り返した）、β−ａｃｔｉｎ用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １５ｓｅｃ−５９℃  １５ｓｅｃ−７２℃  １９ｓｅｃの３温度サイクルを４０サイクル繰り返した）、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １０ｓｅｃ−５５℃  ５ｓｅｃ−７２℃  １３ｓｅｃ−８５℃  ３ｓｅｃの４温度サイクルを４０サイクル繰り返した）で行った。解析は各サンプルのＩＬ−６遺伝子発現量をβ−ａｃｔｉｎ遺伝子発現量又はＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で規格化してＩＬ−６／β−ａｃｔｉｎ又はＩＬ−６／Ｇ３ＰＤＨを算出し、さらに材料未刺激のサンプルのＩＬ−６／β−ａｃｔｉｎ値又はＩＬ−６／Ｇ３ＰＤＨ値を１とした相対値で算出した。結果を表１に示した。
（比較例１）
実施例２のＰＣＲテンプレートを従来のＰＣＲ法により定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の定量も行った。ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼ（日本国  宝酒造社製）を使用し、プライマーはＩＬ−６用（配列表配列番号１１：５’−ＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣ−３’、配列表配列番号１２：５’−ＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＡＣＴ−３’）Ｇ３ＰＤＨ用（配列表配列番号１３：５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ−３’、配列表配列番号１４：５’−ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’）を用いた。ＰＣＲの温度サイクルは、両遺伝子共に９５℃  ４５ｓｅｃ−６０℃  ４５ｓｅｃ−７２℃  ２ｍｉｎの３温度サイクルを３０サイクル繰り返した。上記ＰＣＲ終了後のサンプル１０μｌを１．５％Ａｇａｒｏｓｅゲルで電気泳動し、ＥｔＢｒ染色後、Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡ（米国  Ｂｉｏ  Ｉｍａｇｅ社製）により蛍光イメージを取得した。この蛍光イメージ画像をＢａｓｉｃ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ（米国  Ｂｉｏ  Ｉｍａｇｅ社製）ソフトを用いてＰＣＲ産物バンドを定量化した。解析は各サンプルのＩＬ−６遺伝子発現量をＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で規格化してＩＬ−６／Ｇ３ＰＤＨを算出し、さらに材料未刺激のサンプルのＩＬ−６／Ｇ３ＰＤＨ値を１とした相対値で算出した。結果を表１に示した。
2003014394.tif 000004
実施例３及び実施例４のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物の検出法や、内部標準として用いたｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅの違いにも関わらず同様の結果を示したのに対し、従来一般的に用いられているＰＣＲ法による比較例１の定量値は、測定値の標準偏差が大きく、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法で検出可能であった、ＢＫ接触サンプルの約２倍のＩＬ−６遺伝子発現量の差異を検出することは出来なかった。従って、本発明の方法は、従来の方法より簡便に感度良く、定量的に白血球の微妙な活性化を検出できることが示された。
（比較例２）
Ｓｈｉｎｙａ  ＫａｔｏらＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９：８２１−８２７（１９９８）には、材料表面と接触した細胞のヒート・ショック・プロテイン遺伝子の発現量が、生体適合性の指標になることが報告されている。
実施例２のＰＣＲテンプレートをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒクイックシステム３３０（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、ＨＳＰ７０Ｂ遺伝子のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子及びＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の定量も行った。検出法はβ−ａｃｔｉｎはＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎプローブ法を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用した。ＨＳＰ７０Ｂ及びＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）の検出法はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ法を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用した。
プライマーとプローブはβ−ａｃｔｉｎ用（配列表配列番号５：５’−ＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’、配列表配列番号６：５’−ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴ−３’、配列表配列番号７：５’−ＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴＣ−ＦＩＴＣ−３’、配列表配列番号８：５’−ＬＣＲｅｄ−ＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡ−リン酸化−３’）、ＨＳＰ７０Ｂ用（配列表配列番号１５：５’−ＣＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＴ−３’、配列表配列番号１６：５’−ＧＧＡＣＴＴＣＣＣＧＡＣＡＣＴＴＧＴＣＴ−３’）、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）用（配列表配列番号９：５’−ＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧ−３’、配列表配列番号１０：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’）を用いた。
ＰＣＲ反応用のキャピラリーはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用し、ＰＣＲ反応溶液中のＭｇ２＋濃度はＨＳＰ７０Ｂの場合は２ｍＭ、他の場合は３ｍＭにした。ＰＣＲの温度サイクルは、ＨＳＰ７０Ｂ用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １０ｓｅｃ−５６℃  ８ｓｅｃ−７２℃  １３ｓｅｃの３温度サイクルを４０サイクル繰り返した）、β−ａｃｔｉｎ用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １５ｓｅｃ−５９℃  １５ｓｅｃ−７２℃  １９ｓｅｃの３温度サイクルを４０サイクル繰り返した）、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １０ｓｅｃ−５５℃  ５ｓｅｃ−７２℃  １３ｓｅｃ−８５℃  ３ｓｅｃの４温度サイクルを４０サイクル繰り返した）で行った。解析は各サンプルのＨＳＰ７０Ｂ遺伝子発現量をβ−ａｃｔｉｎ遺伝子発現量又はＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で規格化してＨＳＰ７０Ｂ／β−ａｃｔｉｎ又はＨＳＰ７０Ｂ／Ｇ３ＰＤＨを算出し、さらに材料未刺激のサンプルのＨＳＰ７０Ｂ／β−ａｃｔｉｎ値又はＨＳＰ７０Ｂ／Ｇ３ＰＤＨ値を１とした相対値で算出した。結果を表２に示した。
2003014394.tif 000005
表１に示した、ＩＬ−６遺伝子発現量を指標とする場合に比べ、表２のＨＳＰ７０Ｂ遺伝子を指標とした場合ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を使用しても、ＡＰＳとＢＫ各材料間の相違を認めることが出来なかった。
（実施例５）
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて６０ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）３００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、緩やかに混合し、実験開始まで室温で保存した（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）。
中空糸材料として、再生セルロース膜を以下の方法で作成した。紡糸液として公知の方法にて作成したセルロース濃度８％のキュプラアンモニウムセルロース液、中空部形成剤としてテトラフルオロエタンガスを準備し、二重紡糸口金より各々、１２．９ｍｌ／分、３．３４ｍｌ／分で空気中に吐出させ、空気中を約５５ｃｍ落下させた後１１％ＮａＯＨ水溶液で凝固させる。その後約２％の硫酸水溶液で精錬、水洗を行いグリセリン処理を行った後、乾燥する。得られた中空糸膜は内径１８０μｍ、膜厚は１０μｍであった（以下「セルロース中空糸」という）。
フィラメント数２００本、長さ１８０ｍｍのミニモジュールを作成し、使用直前に生理食塩水１０ｍｌを通液し、さらに脱液した。またタイゴンチューブＲ−３６０３（内径３．１５φ）（ＮＯＲＴＯＮ  ＫＫ社製）で循環通血用のラインを作り、ＮａＯＨ処理後生理食塩水で洗浄してエンドトキシンを不活化した。３７℃恒温培養器内（日本国  ＩＷＡＫＩ社製  ＮＩＢ−９０）で、容量１５ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２３２７−０１５  日本国  ＩＷＡＫＩ社製）、カセットチューブポンプＳＭＰ−２３Ｓ（日本国  ＥＹＥＬＡ社製）及びタイゴンチューブを用いて、上記ミニモジュールに上記ヘパリン添加ヒト新鮮血液５ｍｌを３ｍｌ／ｍｉｎの流速で６０分間循環通血した（材料：血液接触表面積比４０．８ｃｍ２／ｍｌ）。更に容量１５ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２３２７−０１５  日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に血液を移し、３７℃で１ｈｒインキュベーションした。比較対照はミニモジュールを繋がずに、回路のみで循環通血を行ったものと、材料接触及び循環通血していないもの（未処理）で行った。
材料接触後の血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ液（米国  アマシャムファルマシア社製）３ｍｌが入った容量１５ｍｌのＰＳチューブ（ポリスチレプロピレン、２３２１−０１５  日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に界面を形成するように静かに重層し、４００ｇ、室温、３０ｍｉｎ遠心分離後、単核球層を回収し、生理食塩水１０ｍｌを加え４００ｇ、室温、１０ｍｉｎ遠心分離して、洗浄された単核球ペレットを得た。細胞ペレットを１．５ｍｌ  ＰＰチューブ（ポリプロピレン、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ社、ＳａｆｅＳｅａｌ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅｓ）に移し、ＩＳＯＧＥＮ（日本国  ニッポンジーン社製）１ｍｌで細胞を溶解後、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ）（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）処理した後、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、説明書に従ってｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡは仕込みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算の濃度で５ｎｇ／μｌの濃度に希釈して、ＰＣＲ反応のテンプレートとした。
上記ＰＣＲテンプレートをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒクイックシステム３３０（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１遺伝子のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の定量も行った。検出法はＩＬ−６及びβ−ａｃｔｉｎは実施例４と同様、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦαはＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎプローブ法を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用した。ＭＣＰ−１の検出法はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ法を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用した。プライマーとプローブはＩＬ−６及びβ−ａｃｔｉｎは実施例４と同様、ＩＬ−１β用（配列表配列番号１７：５’−ＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴ−３’、配列表配列番号１８：５’−ＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡＡＴＴＧＣＡＴＧＧ−３’、配列表配列番号１９：５’−ＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＣＣ−ＦＩＴＣ−３’、配列表配列番号２０：５’−ＬＣＲｅｄ−ＡＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡ−リン酸化−３’）、ＩＬ−８用（配列表配列番号２１：５’−ＴＡＡＡＣＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧ−３’、配列表配列番号２２：５’−ＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡ−３’、配列表配列番号２３：５’−ＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＣＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣ−ＦＩＴＣ−３’、配列表配列番号２４：５’−ＬＣＲｅｄ−ＴＣＴＡＡＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＡ−リン酸化−３’）、ＴＮＦα用（配列表配列番号２５：５’−ＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴ−３’、配列表配列番号２６：５’−ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧＡＣ−３’、配列表配列番号２７：５’−ＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡ−ＦＩＴＣ−３’、配列表配列番号２８：５’−ＬＣＲｅｄ−ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴ−リン酸化−３’）、ＭＣＰ−１用（配列表配列番号２９：５’−ＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＴＧＣＣＣＣＡＧ−３’、配列表配列番号３０：５’−ＡＧＴＣＴＴＣＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧ−３’）を用いた。ＰＣＲ反応用のキャピラリーはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用し、ＰＣＲ反応溶液中のＭｇ２＋濃度はＩＬ−１β及びＭＣＰ−１は２ｍＭ、それ以外は３ｍＭにした。ＰＣＲの温度サイクルは、ＩＬ−６、β−ａｃｔｉｎは実施例４と同様、ＩＬ−１β及びＩＬ−８用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １５ｓｅｃ−５６℃  １０ｓｅｃ−７２℃  １３ｓｅｃの３温度サイクルを４０サイクル繰り返した）、ＴＮＦα用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １５ｓｅｃ−５９℃  １５ｓｅｃ−７２℃  １１ｓｅｃの３温度サイクルを４０サイクル繰り返した）、ＭＣＰ−１用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １０ｓｅｃ−５６℃  ８ｓｅｃ−７２℃  １３ｓｅｃの３温度サイクルを４０サイクル繰り返した）で行った。解析は各サンプルの各遺伝子発現量をβ−ａｃｔｉｎ遺伝子発現量で規格化して各遺伝子／β−ａｃｔｉｎを算出し、さらに材料未刺激のサンプルの各遺伝子／β−ａｃｔｉｎ値１とした相対値で算出した。結果を表３に示した。
2003014394.tif 000006
評価したいずれの遺伝子も、材料未接触（未処理）及び回路のみに比べ、セルロース中空糸モジュールへの血液の循環接触によって、発現が誘導されているのが定量的に測定出来た。
（実施例６）
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて６０ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）３００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、緩やかに混合し、実験開始まで室温で保存した（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）。
中空糸材料として、実施例５に記載したセルロース中空糸を使用した。
フィラメント数３００本、長さ１１０ｍｍのミニモジュールを作成し、使用直前に生理食塩水５ｍｌを通液し、さらに脱液した。ミニモジュール上端より上記ヘパリン添加ヒト新鮮血液３ｍｌを静かに流し、そのまま中空糸モジュール内に血液をｈｏｌｄした（材料：血液接触表面積比２２２ｃｍ２／ｍｌ）。これを速やかに３７℃恒温培養器内（日本国  ＩＷＡＫＩ社製  ＮＩＢ−９０）で３０分間インキュベーションした。遠心分離によりｈｏｌｄされた血液を、容量１５ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２３２７−０１５日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に回収し、更に３７℃で１ｈｒインキュベーションした。比較対照はミニモジュール接触していないもの（未処理）で行った。
材料接触後の血液をＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ０．５μｇを説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ）（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）処理した後、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、説明書に従ってｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡは仕込みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算の濃度で５ｎｇ／μｌの濃度に希釈して、ＰＣＲ反応のテンプレートとした。
上記ＰＣＲテンプレートをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒクイックシステム３３０（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１α、ＭＣＰ−１遺伝子のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の定量も行った。検出法はＩＬ−６、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）は実施例４と同様、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１は実施例５と同様、ＩＬ−１αの検出法はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ法を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用した。プライマーとプローブはＩＬ−６、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）は実施例４と同様、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１は実施例５と同様、ＩＬ−１αは（配列表配列番号３１：５’−ＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＣＣＡＧＴ−３’、配列表配列番号３２：５’−ＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＧＧＴＧＧ−３’）を用いた。ＰＣＲ反応用のキャピラリーはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用し、ＰＣＲ反応溶液中のＭｇ２＋濃度はＩＬ−６、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）は実施例４と同様、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１は実施例５と同様、ＩＬ−１αは３ｍＭにした。ＰＣＲの温度サイクルは、ＩＬ−６、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）は実施例４と同様、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１は実施例５と同様、ＩＬ−１α用（９５℃  １０ｍｉｎした後、９５℃  １０ｓｅｃ−５５℃  ５ｓｅｃ−７２℃  １３ｓｅ−８１℃  ３ｓｅｃの４温度サイクルを４０サイクル繰り返した）、で行った。解析は各サンプルの各遺伝子発現量をＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で規格化して各遺伝子／Ｇ３ＰＤＨを算出し、さらに材料未刺激のサンプルの各遺伝子／Ｇ３ＰＤＨ値１とした相対値で算出した。結果を表４に示した。
2003014394.tif 000007
評価したいずれの遺伝子も、材料未接触（未処理）に比べ、セルロース中空糸モジュールへの血液の静止（ｈｏｌｄ）接触によって、発現が誘導されているのが定量的に測定出来た。また、白血球の全ての画分を含む全血よりＲＮＡ画分を抽出することによっても簡便に評価することが出来た。
（実施例７）
実施例５及び実施例６で使用したセルロース中空糸のエンドトキシンコンタミネーションによる遺伝子発現への影響を検討した。
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて６０ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）３００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、緩やかに混合し、実験開始まで室温で保存した（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）。
中空糸材料として、実施例５に記載したセルロース中空糸を使用した。フィラメント数３００本、長さ１１０ｍｍのミニモジュール（以下「セルロースモジュール」という）を作成した。このセルロースモジュールにＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｏ２６：Ｂ６米国  ＳＩＧＭＡ社製）の１μｇ／ｍｌ溶液３ｍｌを静かに流し、そのまま中空糸モジュール内にＬＰＳ溶液をｈｏｌｄした。これを室温で６０分間インキュベーションし、脱液し生理食塩水１０ｍｌを通液する洗浄をし、人為的にエンドトキシンをコンタミネーションさせたもの（以下「ＬＰＳコンタミモジュール」という）を用意した。また、ＬＰＳコンタミモジュールに、０．５Ｎ  ＮａＯＨ溶液３ｍｌを静かに流し、そのまま中空糸モジュール内にｈｏｌｄし、５０℃で２時間放置後、脱液し生理食塩水１０ｍｌを通液する洗浄をし、洗浄に用いた生理食塩水のｐＨが中性であるのを確認してエンドトキシンを不活化したもの（以下「ＬＰＳ不活化モジュール」という）を用意した。さらに、未処理モジュールに上記ＮａＯＨ処理をのみをしたもの（以下「ＮａＯＨ処理モジュール」という）を用意した。
上記ミニモジュール数種を使用直前に生理食塩水５ｍｌを通液し、さらに脱液した。ミニモジュール上端より上記ヘパリン添加ヒト新鮮血液３ｍｌを静かに流し、そのまま中空糸モジュール内にｈｏｌｄした（材料：血液接触表面積比２２２ｃｍ２／ｍｌ）。これを速やかに３７℃恒温培養器内（日本国  ＩＷＡＫＩ社製  ＮＩＢ−９０）で３０分間インキュベーションした。遠心分離によりｈｏｌｄされた血液を、容量１５ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２３２７−０１５日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に回収し、更に３７℃で１ｈｒインキュベーションした。比較対照はミニモジュール接触していないもの（未処理）で行った。
材料接触後の血液をＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ０．５μｇを説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ）（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）処理した後、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、説明書に従ってｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡは仕込みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算の濃度で５ｎｇ／μｌの濃度に希釈して、ＰＣＲ反応のテンプレートとした。
上記ＰＣＲテンプレートをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒクイックシステム３３０（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて実施例４と同様にして、ＩＬ−６遺伝子のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の定量も行った。解析は各サンプルの各遺伝子発現量をＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で規格化して各遺伝子／Ｇ３ＰＤＨを算出し、さらに材料未刺激のサンプルの各遺伝子／Ｇ３ＰＤＨ値１とした相対値で算出した。結果を表５に示した。
2003014394.tif 000008
人為的なエンドトキシン（ＬＰＳ）のコンタミネーションにより、ＩＬ−６遺伝子発現に多大な影響が出ることが判る。
また、「セルロースモジュール」「ＬＰＳ不活化モジュール」「ＮａＯＨ処理モジュール」がいずれも同様な値となっているため、セルロースモジュールは遺伝子発現に影響しない程度のエンドトキシンレベルであり、ＮａＯＨ処理で遺伝子発現量に影響が無く、またＮａＯＨ処理でＬＰＳを不活化可能であることが判る。さらに材料と接触していない状態よりもＩＬ−６遺伝子発現が誘導されていることから、本発明の方法によって、材料自身の真の生体適合性評価が可能なことが判る。
（実施例８）
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて１００ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）１０００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）緩やかに混合した。
中空糸材料として、ＡＭ−ＳＤ−１５０Ｕ（日本国  旭メディカル社製を用いた。ＡＭ−ＳＤ−１５０Ｕ（再生セルロース膜製、以下「ＡＭ−ＳＤ」という）、はクリーンベンチ内において生理食塩水（日本国  大塚製薬）５００ｍｌで中空糸内・外表面を洗浄した後に、無菌的にダイアライザーを分解し中空糸を取り出した後に供試材料とした。
前記中空糸材料を、外表面積で８０ｃｍ２クリーンベンチ内で無菌的に切り出し、容量５０ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２０７０米国  ＦＡＬＣＯＮ社）に入れ生理食塩水２０ｍｌで３回洗浄した。上記の血液を１５ｍｌずつを添加し、３７℃ウオーターバス内（ＴＨＥＲＭＯ  ＭＩＮＤＥＲ  ＤＸ−１０日本国  ＴＡＩＴＥＣ社製）で６０分間、１０分間隔で転倒混和しながら接触させた（材料：血液接触表面積比５．３ｃｍ２／ｍｌ）。比較対照は中空糸材料を入れずに同様の操作を行った。材料接触後の血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ液（米国  アマシャムファルマシア社製）３ｍｌが入った容量１５ｍｌのＰＳチューブ（ポリプロピレン、２３２１−０１５日本国  ＩＷＡＫＩ社製）数本に分けて界面を形成するように静かに重層し、４００ｇ、室温、３０ｍｉｎ遠心分離後、単核球層を回収し、生理食塩水１０ｍｌを加え４００ｇ、室温、１０ｍｉｎ遠心分離して、洗浄された単核球ペレットを得た。
この単核球ペレットを１．５ｍｌ  ＰＰチューブ（ポリプロピレン、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ社、ＳａｆｅＳｅａｌ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅｓ）に移し、Ｔｒｉｚｏｌ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１ｍｌで細胞を溶解後、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。各サンプルのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２０μｇをＡｔｌａｓＴＭ  Ｇｌａｓｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（米国  ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、説明書に従ってＣｙ５またはＣｙ３（アマシャムファルマシア社製）標識したｃＤＮＡを作製した（この際、材料未接触の細胞由来のｃＤＮＡと材料接触後の細胞由来のｃＤＮＡの標識は異なるものになるようにした）。材料未接触のものと特定の材料に接触した、それぞれ別の標識されたｃＤＮＡを等量混合してＡｔｌａｓＴＭ  Ｇｌａｓｓ  Ｈｕｍａｎ  １．０  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（米国  ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に説明書に従って、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。Ｓｃａｎｉｎｇデータの取得はＳｃａｎ  Ａｒｒａｙ  Ｌｉｔｅ（米国  ＧＳＩ  ＬＵＭＯＮＩＣＳ社製）とＱｕａｎｔＡｒｒａｙ  ｖｅｒ２．０（米国  ＧＳＩ  ＬＵＭＯＮＩＣＳ社製）を用いて、Ｌａｓｅｒ  Ｐｏｗｅｒ  ８０Ｖで、複数のｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅの蛍光強度がＣｙ５とＣｙ３の場合で同じになるように条件を決めた。さらにデータの解析はＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＴＭ  ３．０（米国  ＳｉｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて数値化した。
ＡＭ−ＳＤに接触したサンプルをＣｙ５標識し、材料未接触のサンプルをＣｙ３標識した場合の、蛍光強度の比Ｃｙ５／Ｃｙ３は、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子で２．００であり、ＡＭ−ＳＤに接触することによって、ｕＰＡ−Ｒは２．００倍遺伝子発現が増加することが判り、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子発現を指標とした材料の生体適合性を定量的に測定することが出来た。さらに確認のため、蛍光標識を入れ替え、ＡＭ−ＳＤに接触したサンプルをＣｙ３標識し、材料未接触のサンプルをＣｙ５標識した場合の、蛍光強度の比Ｃｙ３／Ｃｙ５は、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子で１．８２であり、同様のデータが得られた。また、その他の遺伝子では、材料接触によって遺伝子発現が上がることが知られているＩＬ−１β遺伝子、ＩＬ−８遺伝子がそれぞれ２０倍強、１５倍弱遺伝子発現が増加するのが認められ、実験法に問題が無くｕＰＡ−Ｒ遺伝子が材料表面接触によって発現誘導されることが示された。これにより、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子が材料の細胞刺激性に関する評価マーカーの候補として見出された。
（実施例９）
実施例８とは異なる供血者からの血液を用いて、実施例８と全く同様の実験を行った結果、ＡＭ−ＳＤに接触したサンプルをＣｙ５標識し、材料未接触のサンプルをＣｙ３標識した場合の、蛍光強度の比Ｃｙ５／Ｃｙ３は、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子で２．２３であった。これにより、実施例８は供血人特異的な現象ではなく、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子が材料表面接触によって発現誘導されることが示された。また、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子が材料の細胞刺激性に関する評価マーカーの候補として示された。
（実施例１０）
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。また市販品中空糸に僅かにコンタミネーションしている可能性があるエンドトキシンの影響も除外するため、ＬＰＳ結合性抗生物質である硫酸ポリミキシンＢを添加して実験を行った。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて１００ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）１０００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）、緩やかに混合した。
中空糸材料として、ＡＭ−ＳＤ−１５０Ｕ（日本国  旭メディカル社製）、ＡＰＳ−１５０Ｓ（日本国  旭メディカル社製）、ＢＫ−１．６Ｐ（日本国  東レ社製）を用いた。ＡＭ−ＳＤ−１５０Ｕ（以下「ＡＭ−ＳＤ」という）、ＡＰＳ−１５０Ｓ（ポリスルホンとポリビニルピロリドンのブレンド製、以下「ＡＰＳ」という）、ＢＫ−１．６Ｐ（アイソタクチックポリメチルメタクリレートとシンジオタクチックポリメチルメタクリレートのブレンド、以下「ＢＫ」という）は、実験前日にクリーンベンチ内において生理食塩水（日本国  大塚製薬）５００ｍｌで中空糸内・外表面を洗浄した後に、無菌的にダイアライザーを分解し中空糸を取り出した後に供試材料とした。また、ＢＫについては、中空糸間に挿入されている細い糸状のスペーサーフィラメントを無菌的に分離し、中空糸のみにしたものを供試材料とした。これらの中空糸を外表面積で８０ｃｍ２クリーンベンチ内で無菌的に切り出し、容量５０ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２０７０米国  ＦＡＬＣＯＮ社）に入れ、１μｇ／ｍｌの硫酸ポリミキシンＢ（米国  ＳＩＧＭＡ社製）を添加した注射用水（日本国  大塚製薬社製）中、４℃で実験当日まで保存した。
前記中空糸材料を、実験直前に生理食塩水（日本国  大塚製薬社製）３０ｍｌで３回洗浄した。先に採血した血液に最終濃度で１０μｇ／ｍｌの硫酸ポリミキシンＢ（米国  ＳＩＧＭＡ社製）を添加したもの１５ｍｌずつを添加し、３７℃ウオーターバス内（ＴＨＥＲＭＯ  ＭＩＮＤＥＲ  ＤＸ−１０日本国  ＴＡＩＴＥＣ社製）で６０分間、１０分間隔で転倒混和しながら接触させた（材料：血液接触表面積比５．３ｃｍ２／ｍｌ）。比較対照は中空糸材料を入れずに同様の操作を行った。材料接触後の血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ液（米国  アマシャムファルマシア社製）３ｍｌが入った容量１５ｍｌのＰＳチューブ（ポリスチレン、２３２１−０１５日本国  ＩＷＡＫＩ社製）数本に分けて界面を形成するように静かに重層し、４００ｇ、室温、３０ｍｉｎ遠心分離後、単核球層を回収し、生理食塩水１０ｍｌを加え４００ｇ、室温、１０ｍｉｎ遠心分離して、洗浄された単核球ペレットを得た。
細胞ペレットを１．５ｍｌ  ＰＰチューブ（ポリプロピレン、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ社、ＳａｆｅＳｅａｌ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅｓ）に移し、Ｔｒｉｚｏｌ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１ｍｌで細胞を溶解後、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。各サンプルのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ）（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）処理した後、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、説明書に従ってｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡは仕込みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算の濃度で５０ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈して、ＰＣＲ反応のテンプレートとした。
上記ＰＣＲテンプレートをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒクイックシステム３３０（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、ＩＬ−６遺伝子のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の定量も行った。ｕＰＡ−Ｒ遺伝子、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）の検出法はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ法を使用し、−ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用した。プライマーは、ｕＰＡ−Ｒ用（配列表配列番号３３：５’−ＡＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣ−３’、配列表配列番号３４：５’−ＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＧＴＣＡＴＴＡ−３’）、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）用（配列表配列番号３５：５’−ＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧ−３’、配列表配列番号３６：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’）を用いた。ＰＣＲ反応用のキャピラリーはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用し、ＰＣＲ反応溶液中のＭｇ２＋濃度は３ｍＭにした。ＰＣＲの温度サイクルは、ｕＰＡ−Ｒ、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）ともに、９５℃  １０ｍｉｎとした後、９５℃  ０ｓｅｃ−５５℃  ５ｓｅｃ−７２℃  １３ｓｅｃ−８５℃  １ｓｅｃの４温度サイクルを４０サイクル繰り返し行った。解析は各サンプルのｕＰＡ−Ｒ遺伝子発現量をＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で規格化してｕＰＡ−Ｒ／Ｇ３ＰＤＨを算出し、さらに材料未刺激のサンプルのｕＰＡ−Ｒ／Ｇ３ＰＤＨ値を１とした相対値で算出し、ＰＣＲテンプレートの各希釈倍率毎に得られた値を平均した。結果を表６に示した。
2003014394.tif 000009
市販品中空糸に僅かにコンタミネーションしている可能性があるエンドトキシンの影響も除外するため、ＬＰＳ結合性抗生物質である硫酸ポリミキシンＢを添加して実験を行っても、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子は材料表面との接触によって発現誘導されることが判り、材料自身の真の生体適合性評価の指標となることが示された。またｕＰＡ−Ｒ遺伝子発現を指標にすることによって、汎用性且つ簡便で感度が高く、定量的に材料間の相違を評価できることが示された。また、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子が材料の細胞刺激性に関する評価マーカーとして妥当であることを確認した。
（実施例１１）
エンドトキシンコンタミネーションによるｕＰＡ−Ｒ遺伝子発現への影響を検討した。実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて６０ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）３００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、緩やかに混合し、実験開始まで室温で保存した（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）。
中空糸材料として、ＡＭ−ＳＤ−１５０Ｕ（日本国  旭メディカル社製）を用いた。ＡＭ−ＳＤ−１５０Ｕ（以下「ＡＭ−ＳＤ」という）はクリーンベンチ内において生理食塩水（日本国  大塚製薬）５００ｍｌで中空糸内・外表面を洗浄した後に、無菌的にダイアライザーを分解し中空糸を取り出した後に供試材料とした。前記中空糸材料を、外表面積で４０ｃｍ２クリーンベンチ内で無菌的に切り出し、容量１５ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２３２７−０１５日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に入れ生理食塩水５ｍｌで３回洗浄（以下「未処理ＳＤ」という）した。
この未処理ＳＤをＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ０２６：Ｂ６米国  ＳＩＧＭＡ社製）の１μｇ／ｍｌ溶液または１００ｎｇ／ｍｌ溶液６ｍｌに浸漬し、室温で９０分間インキュベーションした後、生理食塩水１０ｍｌで２回洗浄をし、人為的にエンドトキシンをコンタミネーションさせたもの（以下それぞれ「ＳＤ−ＬＰＳ  １μｇ／ｍｌ  中空糸」および「ＳＤ−ＬＰＳ  １００ｎｇ／ｍｌ  中空糸」という）を用意した。また、未処理ＳＤおよびＳＤ−ＬＰＳ  １００ｎｇ／ｍｌ中空糸に、ＬＰＳ結合性抗生物質である硫酸ポリミキシンＢ（米国  ファイザー製薬社製）の５０００ｕｎｉｔ／ｍｌ入り生理食塩水１０ｍｌに浸漬し、室温で９０分間インキュベーションした後、生理食塩水１０ｍｌで３回洗浄をして、エンドトキシンを極力不活化したもの（以下それぞれ「ＳＤ−ポリミキシン処理中空糸」および「ＳＤ−ＬＰＳ  １００ｎｇ−ポリミキシン処理中空糸」という）を用意した。
上記の各種処理を施した中空糸数種を使用直前に生理食塩水５ｍｌで洗浄し、さらに生理食塩水を取り除いた。上記ヘパリン添加ヒト新鮮血液５ｍｌを添加し、ローテーター「ＲＯＴＡＴＯＲ  ＲＴ−５」（日本国  ＴＡＩＴＥＣ社製）にセットし、３７℃恒温培養器内（日本国  ＩＷＡＫＩ社製  ＮＩＢ−９０）で６０分間、２ｒｐｍで撹拌接触させた（材料：血液接触表面積比８ｃｍ２／ｍｌ）。容量１５ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２３２７−０１５日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に血液のみを移し、更に３７℃で１ｈｒインキュベーションした。比較対照は中空糸材料を入れずに同様の操作を行った。
材料接触後の血液をＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ０．５μｇを説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ）（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）処理した後、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、説明書に従ってｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡは仕込みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算の濃度で５ｎｇ／μｌの濃度に希釈して、ＰＣＲ反応のテンプレートとした（このテンプレートでのデータを表７では「ＷＢＣ画分」と表記）。
また、未処理ＳＤに接触した血液はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ液（米国  アマシャムファルマシア社製）３ｍｌが入った容量１５ｍｌのＰＳチューブ（ポリプロピレン、２３２１−０１５日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に界面を形成するように静かに重層し、４００ｇ、室温、３０ｍｉｎ遠心分離後、単核球層を回収し、生理食塩水１０ｍｌを加え４００ｇ、室温、１０ｍｉｎ遠心分離して、洗浄された単核球ペレットを得た。細胞ペレットを１．５ｍｌ  ＰＰチューブ（ポリプロピレン、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ社、ＳａｆｅＳｅａｌ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅｓ）に移し、ＩＳＯＧＥＮ（日本国  ニッポンジーン社製）１ｍｌで細胞を溶解後、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ）（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）処理した後、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、説明書に従ってｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡは仕込みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算の濃度で５ｎｇ／μｌの濃度に希釈して、ＰＣＲ反応のテンプレートとした（このテンプレートでのデータを表７では「ＰＢＭＣ画分」と表記）。
上記ＰＣＲテンプレートをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒクイックシステム３３０（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、実施例１０のＰＣＲの温度サイクルを９５℃  １０ｍｉｎとした後、９５℃  ０ｓｅｃ−５５℃  ５ｓｅｃ−７２℃  １３ｓｅｃ−８５℃  ３ｓｅｃの４温度サイクルを４０サイクル繰り返す以外、実施例１０と同様にして、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の定量も行った。解析は各サンプルのｕＰＡ−Ｒ発現量をＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で規格化してｕＰＡ−Ｒ／Ｇ３ＰＤＨを算出し、さらに材料未刺激のサンプルのｕＰＡ−Ｒ／Ｇ３ＰＤＨ値１とした相対値で算出した。結果を表７に示した。
2003014394.tif 000010
ｕＰＡ−Ｒ遺伝子発現には、少量のエンドトキシンコンタミネーションでは殆ど影響が無く、「未処理ＳＤ」と「ＳＤ−ＬＰＳ  １００ｎｇ／ｍｌ  中空糸」では大きな相違は無かった。またこれらと「ＳＤ−ＬＰＳ  １００ｎｇ−ポリミキシン処理中空糸」および「ＳＤ−ポリミキシン処理中空糸」がいずれも同様な値となっており、且つ、多量のエンドトキシンコンタミネーション「ＳＤ−ＬＰＳ  １μｇ／ｍｌ  中空糸」ではｕＰＡ−Ｒ遺伝子発現が上昇することより、「未処理ＳＤ」は遺伝子発現に影響しない程度のエンドトキシンレベルであることが判る。さらに材料と接触していない状態よりも「未処理ＳＤ」ではｕＰＡ−Ｒ遺伝子発現が誘導されていることから、本発明の方法によって、材料自身の真の生体適合性評価が可能なことが判る。
また、「未処理ＳＤ」ではＷＢＣ画分とＰＢＭＣ画分でｕＰＡ−Ｒ遺伝子発現量に相違が認められないため、何れのＲＮＡ画分の抽出法（白血球の全ての画分を含む全血よりＲＮＡ画分を抽出する方法および単核球画分を分離後にＲＮＡ画分を抽出する方法）も本発明に好適であることが示された。さらに、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子が材料の細胞刺激性に関する評価マーカーとして妥当であることを確認した。
（実施例１２）
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて６０ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）３００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、緩やかに混合し、実験開始まで室温で保存した（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）。
中空糸材料として、再生セルロース膜を以下の方法で作成した。紡糸液として公知の方法にて作成したセルロース濃度８％のキュプラアンモニウムセルロース液、中空部形成剤としてテトラフルオロエタンガスを準備し、二重紡糸口金より各々、１２．９ｍｌ／分、３．３４ｍｌ／分で空気中に吐出させ、空気中を約５５ｃｍ落下させた後１１％ＮａＯＨ水溶液で凝固させる。その後約２％の硫酸水溶液で精錬、水洗を行いグリセリン処理を行った後、乾燥する。得られた中空糸膜は内径１８０μｍ、膜厚は１０μｍであった（以下「セルロース中空糸」という）。
上記セルロース中空糸を用いてフィラメント数３００本、長さ１１０ｍｍのミニモジュールを作成し、使用直前に生理食塩水５ｍｌを通液し、さらに脱液した。ミニモジュール上端より上記ヘパリン添加ヒト新鮮血液３ｍｌを静かに流し、そのまま中空糸モジュール内に血液をｈｏｌｄした（材料：血液接触表面積比２２２ｃｍ２／ｍｌ）。これを速やかに３７℃恒温培養器内（日本国  ＩＷＡＫＩ社製  ＮＩＢ−９０）で３０分間インキュベーションした。遠心分離によりｈｏｌｄされた血液を、容量１５ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２３２７−０１５日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に回収し、更に３７℃で１ｈｒインキュベーションした。比較対照はミニモジュール接触していないもの（未処理）で行った。
材料接触後の血液をＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し、説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ０．５μｇを説明書に従ってＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ）（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）処理した後、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（米国  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて、説明書に従ってｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡは仕込みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算の濃度で５ｎｇ／μｌの濃度に希釈して、ＰＣＲ反応のテンプレートとした。
上記ＰＣＲテンプレートをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒクイックシステム３３０（独国  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、実施例１１と同様にして、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子のｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ定量を行った。また、内部標準としてｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅのＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の定量も行った。解析は各サンプルのｕＰＡ−Ｒ発現量をＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で規格化してｕＰＡ−Ｒ／Ｇ３ＰＤＨを算出し、さらに材料未刺激のサンプルのｕＰＡ−Ｒ／Ｇ３ＰＤＨ値１とした相対値で算出した。結果はｕＰＡ−Ｒ遺伝子発現量（材料未接触を１としたときの相対値）で２．４であり、材料未接触（未処理）に比べ、セルロース中空糸モジュールへの血液の静止（ｈｏｌｄ）接触によって、発現が誘導されているのが定量的に測定出来た。また、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子が材料の細胞刺激性に関する評価マーカーとして妥当であることを確認した。
（実施例１３）
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて２０ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）１００μｌが入った５０ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７０米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、緩やかに混合し、実験開始まで室温で保存した（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）。
中空糸材料として、ＡＭ−ＳＤ−１５０Ｕ（日本国  旭メディカル社製；以下「ＡＭ−ＳＤ」という）を用い、クリーンベンチ内において生理食塩水（日本国  大塚製薬）５００ｍｌで中空糸内・外表面を洗浄した後に、無菌的にダイアライザーを分解し中空糸を取り出した後に供試材料とした。
前記中空糸材料を、外表面積で８ｃｍ２クリーンベンチ内で無菌的に切り出し、容量２ｍｌのシリコナイズ（表面がシリコン処理された）されたＰＰチューブ（ポリプロピレン、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ社、ＳａｆｅＳｅａｌ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅｓ）に入れ生理食塩水１ｍｌで３回洗浄した。先に採血した血液１ｍｌを添加し、ローテーター「ＲＯＴＡＴＯＲ  ＲＴ−５」（日本国  ＴＡＩＴＥＣ社製）にセットし、３７℃恒温培養器内（日本国  ＩＷＡＫＩ社製  ＮＩＢ−９０）で２０分間、２ｒｐｍで撹拌接触させた（材料：血液接触表面積比８ｃｍ２／ｍｌ）。比較対照は中空糸材料を入れずに同様の操作を行った。１．５ｍｌ  ＰＰチューブ（ポリプロピレン、米国  トレフ社製）に材料接触後の血液１００μｌをサンプリングし、ここに１０μｌのｕＰＡ−Ｒタンパク質に対する抗体（ＣＤ８７  Ｒ−ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：米国  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ社製）を添加し、室温で３０分間放置した。ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を水で１０倍希釈した溶液（以下、「溶血ｂｕｆｆｅｒ」と言う）を１ｍｌ添加して細胞ペレットを懸濁後、室温、暗所で２０分間溶血した。１０，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、上澄み液を取り除いた後に、再度溶血Ｂｕｆｆｅｒ１００μｌを入れて撹拌後、更にＢＳＡ（ｓｉｇｍａ社）を１％（ｗ／ｖ）で生理的リン酸緩衝液、ｐＨ＝７．４に溶解したｂｕｆｆｅｒ（以下、「洗浄ｂｕｆｆｅｒ」と言う）を１ｍｌを添加して１０，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、上澄み液を取り除いた後に、細胞ペレットを１％ｐａｒａｆｏｒｍａｒｄｅｈｙｄｅ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製「ＣｅｌｌＦＩＸ」を蒸留水で１０倍に希釈したもの）３００μｌに懸濁し、蛍光強度の測定サンプルとした。
細胞の蛍光測定はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）フローサイトメーターを用いて行った。測定条件自動設定ソフトウェアであるＦＡＣＳＣｏｍｐ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）のＬｙｓｅ／ｗａｓｈモードにてＣａｌｉＢＲＩＴＥ  Ｂｅａｄｓ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた自動調整後、４８８ｎｍアルゴンレーザーを励起光とし、蛍光波長５７５±１５ｎｍで測定を行った。測定データはデータ収集解析ソフトウェアのＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて、前方散乱と側方散乱の範囲が、顆粒球に相当する部分、または単球に相当する部分にゲートをかけて行った。顆粒球に相当する部分、または単球に相当する部分の細胞の蛍光強度の平均値±標準偏差（ｎ＝３）を算出した結果を表８に示した。またその際の代表的なヒストグラムを図１及び図２にに示した。
2003014394.tif 000011
表８、図１及び図２の結果より、中空糸材料（ＡＭ−ＳＤ）を接触していない血液に比べ、中空系材料（ＡＭ−ＳＤ）と接触した白血球（顆粒球および単球）の蛍光強度が上昇しており、これらの細胞表面へのｕＰＡ−Ｒタンパク質分子の発現が上昇していることが判る。よって、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子の発現変動のみならず、ｕＰＡ−Ｒタンパク質分子の発現変動を指標にしても、簡便に生体適合性評価が可能である。また、この蛍光強度の上昇の割合が低いほど良好な生体適合性を有していると判断できる。さらに、ｕＰＡ−Ｒ遺伝子及びｕＰＡ−Ｒタンパク質が材料の細胞刺激性に関する評価マーカーとして妥当であることを確認した。
（実施例１４）
中空糸材料を以下の方法で作成した（以下「Ｆ−ＰＥＯ  ５％中空糸」という）。
１０００ｍｌ三つ口セパラブルフラスコに、ビスフェノールＡ（東京化成工業製、Ｂ０４９４）４０．６３ｇ、４，４’−ジクロロジフェニルスルホン（東京化成工業製、Ｂ０８１０）７１．５７ｇ、炭酸カリウム（和光純薬工業製、１６２−０３４９５）７０．０ｇ、トルエン（和光純薬工業製、２０４−０１８６６）７０ｍｌ、Ｎ−メチルピロリドン（以下、ＮＭＰ、東京化成工業製、Ｍ０４１８）１８２ｍｌを入れ、攪拌下、窒素置換した。反応混合液を１５５℃に保持し、トルエンを３時間還流させ、その間、共沸してくる水をディーンスタックトラップで反応混合液から除去した。続いて、反応混合液を１９０℃に昇温し、トルエンを留去、さらに１９０℃で４時間保持して、ポリエーテルスルホンプレポリマーを合成した。得られたポリマーの重量平均分子量は４．２×１０３であった。
１０００ｍｌ三つ口セパラブルフラスコに、ポリエチレングリコール＃１０００（三洋化成工業、水酸基価１１３ｍｇＫＯＨ／ｇ）７０．２４ｇ、エチレンジアミンに酸化プロピレンと酸化エチレンを逐次付加したものから派生した４官能ブロック・コポリマー（ＢＡＳＦ社、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ３０４  水酸基価１３９ｍｇＫＯＨ／ｇ）５０．９９ｇ、炭酸カリウム（和光純薬工業、１６２−０３４９５）２１５．０ｇ、トルエン（和光純薬工業、２０４−０１８６６）１２０ｍｌ、ＮＭＰ（東京化成工業製、Ｍ０４１８）２９０ｍｌを入れ、攪拌下、窒素置換した。反応混合液を１５５℃保持しトルエン（和光純薬工業、２０４−０１８６６）を３．５時間還流させ、その間、共沸してくる水をディーンスタックトラップで反応混合液から除去した。１７５℃に昇温し、トルエンを留去した後、４，４’−ジフルオロジフェニルスルホン（東京化成工業、Ｄ０５３７）８．６５ｇを加えた。さらに１７５℃で３．５時間保持して、分岐ＰＥＯプレポリマーを合成した。得られたポリマーの重量平均分子量は８．０×１０３であった。
分子量測定に使用した以外は共重合体調製に使用して、両末端クロロ型のポリスルホンプレポリマー反応混合液（１９０℃）に、分岐ＰＥＯプレポリマー反応混合液（１５５℃）を加え、そのまま１９０℃で８時間保持して、分岐ＰＥＯ−ＰＳｆブロック共重合体を合成した。
反応混合液を、攪拌下の水８０００ｍｌへ滴下し、繊維状ポリマーを得た。濾物を水４０００ｍｌへ入れた後、濃塩酸でｐＨ２とし、濾過した。濾液がｐＨ７になるまで水洗し、水膨潤した分岐ＰＥＯ−ＰＳｆブロック共重合体とした。この水膨潤した分岐ＰＥＯ−ＰＳｆブロック共重合体をさらに９５℃熱水６０００ｍｌで３時間洗浄した後、濾別、５０℃で真空乾燥した。得られたポリマーの重量平均分子量は７．４×１０４であった。
芳香族ポリスルホン（アモコ・エンジアリング・ポリマーズ社製：ユーデルＰ−１７００）１８重量部、上記で得た分岐ポリエチレンオキサイドと芳香族ポリスルホンのブロック共重合体５重量部、ポリエチレングリコール６００を２５重量部、Ｎ−メチル−２ピロリドン５２重量部からなる紡糸原液を作製した。この紡糸原液を５０℃に保持し、水９０重量部、Ｎ−メチル−２−ピロリドン１０重量部からなる混合溶液を内筒液として、２重紡口から押し出し、６００ｍｍ下方に設けた７５℃の水中に浸漬させ５０ｍ／ｍｉｎの速度で巻取った。エアギャップ間はフード状になっており、その中は水蒸気で満たされ温度４０℃、湿度９０％の状態にしている。その後、９０℃の熱水にて９０ｍｉｎ間洗浄し、７０℃にて乾燥させ評価用中空糸を得た。
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて６０ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）３００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、緩やかに混合し、実験開始まで室温で保存した（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）。異なる健常人供血者３人の血液をそれぞれ用いた。
上記Ｆ−ＰＥＯ  ５％中空糸を用いてフイラメント数３００本、長さ１００ｍｍのミニモジュールを作成し、使用前に中空糸内表面と外表面にそれぞれ生理食塩水２０ｍｌを通液し、さらに脱液した。ミニモジュール上端より上記ヘパリン添加ヒト新鮮血液３ｍｌを静かに流し、そのまま中空糸モジュール内に血液をｈｏｌｄした（材料：血液接触表面積比２００ｃｍ２／ｍｌ）。これを速やかに３７℃恒温培養器内（日本国  ＩＷＡＫＩ社製  ＮＩＢ−９０）で３０分間インキュベーションした。遠心分離によりｈｏｌｄされた血液を、容量１５ｍｌのＰＰチューブ（ポリプロピレン、２３２７−０１５日本国  ＩＷＡＫＩ社製）に回収し、比較対照はミニモジュール接触していないもの（未処理）で行った。
１．５ｍｌ  ＰＰチューブ（ポリプロピレン、米国  トレフ社製）に材料接触後の血液１００μｌをサンプリングし、ここに１０μｌのｕＰＡ−Ｒタンパク質に対する抗体（ＣＤ８７  Ｒ−ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：米国  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ社製）を添加し、室温で３０分間放置した。ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を水で１０倍希釈した溶液（以下、「溶血ｂｕｆｆｅｒ」と言う）を１ｍｌ添加して細胞ペレットを懸濁後、室温、暗所で３０分間溶血した。１０，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、上澄み液を取り除いた後に、更にＢＳＡ（ｓｉｇｍａ社）を１％（ｗ／ｖ）で生理的リン酸緩衝液、ｐＨ＝７．４に溶解したｂｕｆｆｅｒ（以下、「洗浄ｂｕｆｆｅｒ」と言う）を１ｍｌを添加して１０，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、上澄み液を取り除いた後に、細胞ペレットを１％ｐａｒａｆｏｒｍａｒｄｅｈｙｄｅ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製「ＣｅｌｌＦＩＸ」を蒸留水で１０倍に希釈したもの）３００μｌに懸濁し、蛍光強度の測定サンプルとした。
細胞の蛍光測定はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）フローサイトメーターを用いて行った。測定条件自動設定ソフトウェアであるＦＡＣＳＣｏｍｐ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）のＬｙｓｅ／ｗａｓｈモードにてＣａｌｉＢＲＩＴＥ  Ｂｅａｄｓ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた自動調整後、４８８ｎｍアルゴンレーザーを励起光とし、蛍光波長５７５±１５ｎｍで測定を行った。測定データはデータ収集解析ソフトウェアのＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（米国  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて、前方散乱と側方散乱の範囲が、単球に相当する部分にゲートをかけて行った。異なる健常人供血者３人の血液を用いて、単球に相当する部分の細胞の蛍光強度の平均値±標準偏差（ｎ＝３）を算出し、更に材料と接触させずに同様の操作をした未処理のサンプルの蛍光強度に対する倍率を表９に示した。
（比較例３）
中空糸材料としてＡＰＳ−１５０Ｅ（日本国  旭メディカル社製）を以下のように処理して使用した。ＡＰＳ−１５０Ｅ（ポリスルホンとポリビニルピロリドンのブレンド製、以下「ＡＰＳ−Ｅ」という）は、クリーンベンチ内において注射用水（日本国  大塚製薬）５００ｍｌで中空糸内・外表面を洗浄した後に、無菌的にダイアライザーを分解し中空糸を取り出し、クリーンベンチ内で風乾した。
上述のＡＰＳ−Ｅを使用し実施例１４と同様にして測定した結果を表９に示した。この際、ＡＰＳ−Ｅの中空糸内径は２００μｍであった為、材料：血液接触表面積比２００ｃｍ２／ｍｌとなっている。
2003014394.tif 000012
表９の結果より、本明細書中に記載されているＦ−ＰＥＯ  ５％中空糸材料は、従来の材料に比べて材料接触後の単球表面のｕＰＡ−Ｒタンパク質分子の細胞表面への発現の増加が抑えられていることが判る。
請求の範囲１４に記載の条件で測定した場合には、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量が、材料と接触させずに同様の操作をした人末梢血のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質の細胞表面発現量と比較して１．８０倍未満である材料が、従来のものよりも良好な生体適合性を有していると判断できる。
（比較例４）
中空糸材料としてＡＰＳ−１５０Ｓ（日本国  旭メディカル社製）を以下のように処理して使用した。ＡＰＳ−１５０Ｓ（ポリスルホンとポリビニルピロリドンのブレンド製、以下「ＡＰＳ」という）は、クリーンベンチ内において注射用水（日本国  大塚製薬）５００ｍｌで中空糸内・外表面を洗浄した後に、無菌的にダイアライザーを分解し中空糸を取り出し、クリーンベンチ内で風乾した。
また、実施例５に記載した「セルロース中空糸」（実施例７に記載の通りエンドトキシン汚染が無いことが判っている）も使用した。
実験に用いた器具はエンドトキシンの混入を避けるため、細胞の溶解までは全てパイロジェンフリーのものを使用した。
健常人肘静脈から、ディスポーザブルシリンジと１９Ｇの翼状針にて６０ｍｌの採血を行い、直ちにヘパリンナトリウム液（日本国  清水製薬社製）３００μｌが入った２００ｍｌのＰＰ容器（ポリプロピレン、２０７５米国  ＦＡＬＣＯＮ社製）に静かに移し、緩やかに混合し、実験開始まで室温で保存した（ヘパリン最終濃度５Ｕ／ｍｌ）。健常人供血者１人の血液を用いた。
上記ＡＰＳとセルロース中空糸を用いてフィラメント数３００本、長さ１００ｍｍのミニモジュールを作成し、使用前に中空糸内表面と外表面にそれぞれ生理食塩水２０ｍｌを通液し、さらに脱液した。ミニモジュール上端より上記ヘパリン添加ヒト新鮮血液３ｍｌを静かに流し、そのまま中空糸モジュール内に血液をｈｏｌｄした。この際、ＡＰＳの中空糸内径は２００μｍであった為、材料：血液接触表面積比２００ｃｍ２／ｍｌとなっており、セルロース中空糸では内径は１８０μｍであった為、材料：血液接触表面積比２２２ｃｍ２／ｍｌとなっている。
健常人供血者１人の血液を用いてｎ＝３で測定した点を除き、実施例１４及び比較例３と同様にして測定した結果を表１０に示した。
2003014394.tif 000013
表１０の結果より、人工腎臓になどに一般的に用いられている材料では材料接触後の単球表面のｕＰＡ−Ｒタンパク質分子の細胞表面への発現の増加が高いことが判る。
産業上の利用可能性
本発明の生体適合性評価法を用いることにより、大量入手可能な細胞を用い、体外循環回路等を使用せず、完全にインビトロの条件で、材料表面に接触した血液細胞の活性化を測定することが出来る。より詳しくは、材料表面と接触した白血球のサイトカイン・ケモカイン遺伝子などの発現変化を、簡便、高感度、定量的に測定すること、およびエンドトキシンコンタミネーションを抑えることにより、材料の真の生体適合性を評価することが出来る。本発明のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター遺伝子またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタータンパク質分子の発現変化を指標に用いることにより、従来の方法では検出が困難な材料表面に接触した有核細胞の活性化を検出し得る、新規な生体適合性評価法を提供できる。これにより、材料の生体適合性に起因する、有害な生体反応を起こさない体液処理用材料の開発に有効な指標となる。また、本発明は、血液細胞の活性化を起こすことが必要な材料の開発にも有効な指標となる。また、本発明の体液処理用材料は、従来の方法では検出し得なかった観点において良好な生体適合性を有している。
【配列表】
2003014394.tif 000014
2003014394.tif 000015
2003014394.tif 000016
2003014394.tif 000017
2003014394.tif 000018
2003014394.tif 000019
2003014394.tif 000020
2003014394.tif 000021
2003014394.tif 000022
2003014394.tif 000023
2003014394.tif 000024
2003014394.tif 000025
2003014394.tif 000026
2003014394.tif 000027
【図面の簡単な説明】
図１は、材料表面に接触した顆粒球表面の、ｕＰＡ−Ｒタンパク質分子の発現量を材料表面に未接触の顆粒球表面のｕＰＡ−Ｒタンパク質分子の発現量と比較した図である。
図２は、材料表面に接触した単球表面の、ｕＰＡ−Ｒタンパク質分子の発現量を材料表面に未接触の単球表面の、ｕＰＡ−Ｒタンパク質分子の発現と比較した図である。
【図１】
2003014394.tif 000028
【図２】
2003014394.tif 000029
【国際調査報告】
2003014394.tif 000030
2003014394.tif 000031
2003014394.tif 000032
2003014394.tif 000033
2003014394.tif 000034
2003014394.tif 000035