(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも試料中のエピネフリン（Ｅ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）及びドーパミン（ＤＡ）を分離カラムで分離して分析するカテコールアミン分析装置において、少なくとも蛍光検出器を含む検出装置と制御装置を含み、該検出装置は蛍光検出器の検出感度切り替え手段を有し、該制御装置は試料の種別を識別するための識別信号を記憶する記憶手段、ＤＡが分離カラムから溶出する時間を記憶する手段及び計時手段とを有すると共に、試料の種別によって前記蛍光検出器でＤＡが検出される間、蛍光検出器の検出感度を低下させる機能を有することを特徴とするカテコールアミン分析装置。
【請求項２】
前記分離カラムの上流側に、試料を蛍光標識するための蛍光試薬導入路及び試料と蛍光試薬の反応器を有することを特徴とする請求項１の分析装置。
【請求項３】
前記カラムから検出器に至るまでの流路中に、試料を蛍光標識するための蛍光試薬導入路及び試料と蛍光試薬の反応器を有することを特徴とする請求項１の分析装置。
【請求項４】
検出装置が有する蛍光検出器の感度切り替え手段が、蛍光検出器の光源の強度を変更する手段である請求項１の分析装置。
【請求項５】
検出装置が有する蛍光検出器の感度切り替え手段が、蛍光検出器の光源からの励起光強度を変更する手段である請求項１の分析装置。
【請求項６】
検出装置が有する蛍光検出器の感度切り替え手段が、試料からの蛍光強度を変更する手段である請求項１の分析装置。
【請求項７】
検出装置が有する蛍光検出器の感度切り替え手段が、蛍光検出器中の蛍光検出素子の感度を変更する手段である請求項１の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーの原理を利用してエピネフリン（Ｅ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）又はドーパミン（ＤＡ）の定量等を行なう、カテコールアミン分析装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
通常、カテコールアミンは、試料（血液、血漿又は尿等）について除蛋白質等の前処理を行った後に液体クロマトグラフィーを用いて分離し、電気化学的検出法や蛍光検出法で分析される。
【０００３】
電気化学的検出法は、高感度の分析が可能であるが、電気化学的に活性な成分の全てを検出してしまう、言い換えればカテコールアミンを特異的に検出できないため、生体試料についての分析には不適当である。
【０００４】
蛍光検出法には、自然蛍光を利用する方法の他、蛍光強度を増強し、かつ、選択性を増すため、カテコール骨格やアミンに特異的な蛍光試薬を用いる方法がある。即ち、特異的蛍光試薬として例えばＴＨＩ（Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｉｎｄｏｌ）、エチレンジアミン、ＯＰＡ（ＯｒｔｏＰｔｈａｌＡｌｄｅｈｙｄｅ）、フルオレスカミン、ダンシルクロライド、ＤＰＥ（ＤｉＰｈｅｎｙｌＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）等を使用し、カラムによる分離前にカテコールアミンを蛍光誘導体化する方法（プレカラム法）や、カラムによる分離後にカテコールアミンを蛍光誘導体化する方法（ポストカラム法）が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
血液や尿には、Ｅ、ＮＥ、ＤＡ等のカテコールアミンが含まれており、液体クロマトグラフィーとプレカラム（誘導体化）法又はポストカラム（誘導体化）法を利用することにより、一度の操作でこれら全てについて分析を行うことができるが、尿では、ＥとＮＥに比較してＤＡの濃度が高いという特徴がある。また多くの試料の中には、Ｅの濃度下限値とＤＡの濃度上限の間に約１０００倍もの差が生じることも珍しいことではない。
【０００６】
このように、液体クロマトグラフィーを利用して一度の操作でＥ、ＮＥ及びＤＡを分析しようとする場合、ＥやＮＥの濃度下限を考慮して検出器のゲインを設定すると、ＤＡの濃度が高い尿由来の試料等ではＤＡに由来する信号が測定限界を超えてしまい、試料を希釈して再度分析操作を行う等の操作が必要になる。とはいえ、検出器のゲインを高濃度のＤＡに適するように設定すると、低濃度のＮやＮＥに対しては感度が不足してしまうという課題が生じる。
【０００７】
そこで本発明は、ＥやＮＥとＤＡの濃度差が生じる場合、例えば血液由来の試料（以下、血液試料という）と尿由来の試料（以下、尿試料という）について検出器の設定を変更したり、試料を希釈して分析操作を行なう必要のない、カテコールアミン分析装置を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的に鑑みてなされた本発明は、少なくとも試料中のエピネフリン（Ｅ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）及びドーパミン（ＤＡ）を分離カラムで分離して分析するカテコールアミン分析装置において、少なくとも蛍光検出器を含む検出装置と制御装置を含み、該蛍光検出装置は蛍光検出器の検出感度切り替え手段を有し、該制御装置は試料を識別するための識別信号を記憶する記憶手段、ＤＡが分離カラムから溶出する時間を記憶する手段及び計時手段とを有すると共に、前記蛍光検出器でＤＡが検出される間、蛍光検出器の検出感度を低下させる機能を有することを特徴とするカテコールアミン分析装置である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明は、カテコールアミンをその自然蛍光から、また例えばＴＨＩ、エチレンジアミン、ＯＰＡ、フルオレスカミン、ダンシルクロライド、ＤＰＥ等で蛍光誘導体化し、蛍光検出器で検出するための装置である。カテコールアミンを蛍光誘導体化する場合、いわゆるプレカラム法又はポストカラム法のいずれの方法を採用しても良い。
【００１０】
本発明の装置は、蛍光検出器を含む検出装置と制御装置を含むことを特徴とするが、その他、後述するような装置を含んでいても良い。蛍光検出装置は、蛍光検出器の検出感度切り替え手段を有する。通常、蛍光検出器は、光源、励起光集光系、測定用セル、蛍光集光系そして検出素子とから構成される。これら各構成要素は、通常の蛍光検出器と同様のものを使用することができる。
【００１１】
光源は、例えばＸｅランプ、Ｘｅフラッシュランプ、水銀ランプ、白熱ランプ、レーザー等、カテコールアミン成分又はその蛍光誘導体を蛍光励起するのに必要な波長と強度が得られるものであれば良い。
【００１２】
励起光集光系及び蛍光集光系は、例えばレンズやミラー等の集光素子と、フィルターや回折光子等の分光素子から構成すれば良い。必要に応じてこれら集光系には、開口率を制限するためのアパーチャを配置することもできる。
【００１３】
測定セルは、例えば光学ガラスや石英ガラス等で構成された中空直方体や中空円筒体で、中空部が分析されるべき試料の流路となるものを例示できる。励起光集光系と蛍光集光系は、同一軸又は測定セルで交差する軸上に配置されるが、特に直交するように照射或いは取り出されることが好ましい。両者が同一軸の場合、即ち光源と検出素子を同一方向に配置する場合、ダイクロックミラー等を使用して励起光光路と蛍光光路を分離すれば良い。
【００１４】
検出素子は、例えばフォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電管、光電子増倍管等を用いればよいが、高感度の分析を行うためにはアバランシェフォトダイオードや光電子増倍管が好ましい。アバランシェフォトダイオードや光電子増倍管では、印加する電圧に依存した増幅率を得られるからである。光源の光強度変動を補正するため、蛍光強度を測定する検出素子に加えて、励起光集光系から光の一部を取り出したり、測定セルを透過した励起光を検出する励起光検出素子を配置することができる。これらの素子は、一つの素子を両目的に使用することもできるが、別個に設けても良い。
【００１５】
蛍光検出装置が有する蛍光検出器の検出感度切り替え手段としては、例えば蛍光検出器の光源の強度を変更し、或いは蛍光検出器の光源からの励起光強度を変更し、また或いは試料からの蛍光強度を変更し、又は蛍光検出器の蛍光検出素子の感度を変更するものを例示できる。ここで、変更とは、光源強度等を増減することを包含するが、具体的には、ＥやＮＥの分析に十分な光源強度等が与えられ、かつ、これらと比較して高濃度であるＤＡの分析の際には必要に応じて光源光強度が相対的に減衰され、これによって試料の希釈等を行う必要がないように構成されることを意味する。
【００１６】
光源の強度を変更するには、例えばＸｅフラッシュランプの場合は容量の異なるコンデンサを切り替えたり、コンデンサの充電電圧を変化させてランプに流す電流を変化させれば良い。例えばＸｅフラッシュランプ又は水銀ランプの場合、ランプに流す電流を変化させれば良い。例えば白熱ランプの場合は、ランプに印加する電圧又はランプに流す電流を変化させれば良い。
【００１７】
光源からの励起光強度を変更し又は試料からの蛍光強度を変更するには、例えば励起光集光系又は蛍光集光系にフィルタ、半透過性板、アパーチャ、スリット、メッシュ等、光の一部のみを透過する遮光板を機械的に出し入れするなどすれば良い。例えばフィルタは、励起光又は蛍光を減光することができる特性を有するものであれば、分光特性等に制限はない。電気的に透過率を変更することができる液晶フィルタは、機械的に集光系に出し入れする必要がなく、特に好ましい。この他にも、励起光集光系又は蛍光集光系の集光特性を変更して測定セルや検出素子を照射する励起光又は蛍光の強度を変更することもできる。即ち、集光特性を悪化させれば照射範囲が広がり、測定セル又は検出素子の有効体積（有効面積）に到達する光量を低下させることができる。アパーチャ、スリット、メッシュについては、これらを出し入れするのみではなく、その開口径を変化させたり、スリット幅を変化させることもできる。
【００１８】
蛍光検出素子の感度を変更するには、例えば光電子増倍管の場合は印加電圧を変更して増幅率を変更すれば良い。光電子増倍管の１段当たりの増幅率は、電圧の０．７乗〜０．８乗に比例するから、１０段では電圧の７〜８乗に比例するので、印加電圧を０．７５倍に減らすと増幅率は１／１０倍に低下する。
【００１９】
本発明の装置のもう一方の特徴である制御装置は、試料を識別するための識別信号を記憶する記憶手段、ＤＡが分離カラムから溶出する時間を記憶する手段及び計時手段とを有し、前記蛍光検出器でＤＡが検出される間、蛍光検出器の検出感度を低下させる機能を有するが、コンピュータやマイクロチップ等を用いて構成すれば良い。
【００２０】
試料を識別するための識別記号を記憶する記憶手段は、試料の種別、即ち分析に供された試料が尿試料であるか、又は血漿試料であるか等を識別するための情報を記憶するものである。この情報は、例えば試料貼付したバーコード等から自動的に入力するようにしても良いし、キーボード等から入力するようにしても良い。なお記憶手段は、例えば分析結果や前記したような光源等の強度変更操作が行われたか否かに関する情報が自動的に保存されるように構成しても良い。
【００２１】
計時手段は、分析装置への試料の注入からの経過時間を計算するための手段であり、前記したようにコンピュータ内部の計時手段等をそのまま利用できる。
【００２２】
制御装置は、分析に供せられた試料が尿試料であった場合に、該試料の装置への注入からの経過時間を計時手段により計算し、ＤＡ分画が検出器に到達したタイミングを図って光源の強度等を変更する。試料注入後、ＤＡ分画が検出器に到達するまでの時間は、使用する分離カラム、送液速度、配管の長さ等により変化するが、同一の分析装置においては尿試料、血漿試料等で同一であるから、制御装置に外部から入力するように構成しておき、該入力値と計時手段による計時結果を比較するようにすることが例示できる。また制御装置は、一つの試料に対する分析が終了した後に、蛍光検出装置に対して検出器の光源の強度等を初期状態に復帰する指令を出すように構成する。
【００２３】
本発明の装置は、以上に説明した特徴的な装置以外に、通常の液体クロマトグラフィー装置が有する各種要素を有する。例えば、移動相を保持するための移動相容器、試料を注入するための試料注入装置、送液のための液体ポンプ、分離カラム、分析後の試料等を廃棄するための廃液溜等と、これらを連通する配管を例示できる。これら各要素は、例えば前記した制御装置の制御を受けるように構成しても良い。例えば、試料注入装置を制御装置の制御下におき、制御装置の計時手段の始動と同期して試料の注入を行なうようにすることも可能である。分離カラムは、逆相カラムやイオン交換カラム、或いはアフィニティカラム等、従来からカテコールアミン分析に利用されている分離カラムを用いることができる。また、分離カラムに加え、試料中のカテコールアミン成分を濃縮或いは精製するための前処理カラムをその上流に配置することもできる。また更に、前記各要素に加え、プレカラム法やポストカラム法を利用する場合、カテコールアミンの蛍光誘導体化反応を生じさせるため、反応器を使用することもできる。プレカラム法用の反応器としては、例えば従来から使用されているような、試料注入装置と一体に構成されたものを例示できる。該一体化した装置は、試料を保持する容器及び６方バルブ等の試料注入手段から構成される本体と、反応器（反応容器）、蛍光試薬を保持する容器及び反応器の温度調節手段等で構成することができる。これにより、試料と蛍光試薬を混合し、一定時間一定温度下で蛍光誘導体化反応を行った後、試料を注入することが可能になる。ポストラベル法用の反応器としては、中空細管や、ガラス等の不活性粒子を充填した細管又はカラムを使用することができる。この反応器を分離カラムの下流に接続しておき、蛍光試薬を混入して分離されたカテコールアミンと反応させれば良い。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例等を記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
図１は、本発明の装置の概要を示すものである。図中、１は光源、２は励起光集光系、３は測定セル、４は蛍光集光系、５は蛍光検出素子、６は光源からの励起光強度を変更するフィルタ、７は前記フィルタを励起光集光系の光路上に出し入れするための駆動源、８は光源駆動用の電源、９は蛍光検出素子に印加する電圧を発生する高圧電源、１０は蛍光検出器（蛍光検出装置）、１１は制御装置である。
【００２６】
光源は、具体的には市販のキセノンフラッシュランプ（浜松ホトニクス製）であり、輝線の上下方向の長さは３ｍｍ、幅１ｍｍである。なお光源は、移動機構を用いて水平方向に動かし、信号が最も大きくなる位置に固定してある。
【００２７】
励起光集光系は、具体的には２枚の平凸レンズ、干渉フィルタ、アパーチャで構成した。平凸レンズは２５ｍｍ径であり、アパーチャは２４ｍｍ×１６ｍｍの楕円形である。また干渉フィルタは、３３０〜３５０ｎｍの波長の光を選択的に透過するものである。
【００２８】
蛍光集光系は、具体的には２枚の平凸レンズ、干渉フィルタ、アパーチャで構成した。平凸レンズは２０ｍｍ径であり、アパーチャは１８ｍｍ×１４ｍｍの楕円形である。また干渉フィルタは、４６０〜５００ｎｍの波長の光を選択的に透過するもので、測定セルの壁等で反射された励起光が蛍光検出素子に到達するのを防止できる。
【００２９】
蛍光検出素子は、具体的には市販のフォトマルチプライヤ（浜松ホトニクス製）であり、その前面に幅１ｍｍのスリットを配置することで、測定セル壁からの散乱光が入射しないようにした。なお蛍光検出素子は、移動機構を用いて水平方向に動かし、蛍光信号が最も大きくなる位置に固定してある。
【００３０】
フィルタは、具体的には市販のＮＤフィルタを使用した。該フィルタは、約１０％の透過特性を有するものである。フィルタを励起光集光系の光路上に出し入れするための駆動源は、具体的にはロータリーソレノイドであり、電圧を印加することによりフィルタを出し入れすることが可能である。
【００３１】
図２は、ポストカラム法によるカテコールアミン分析装置の概略を示す図である。図中、１２は試料容器、１３は６方弁を利用した試料注入装置、１４は試料中の不純物を除去するための前処理カラム、１５はカテコールアミンを濃縮するための前処理カラム、１６はイオン交換ゲルを充填した分離カラム、１７は蛍光試薬との反応器、１８は図１にて示した各装置である。また、１９は試料容器に収納された試料をループまで吸引するための定量ポンプ装置（ピストン）であり、２０は前記６方弁に配置された、一定量の試料を注入するためのループである。なお、本図においては、送液のための送液ポンプ、移動相容器、蛍光試薬容器等は示していない。
【００３２】
図２に示した装置及び市販の分析装置（ＨＬＣ−７２５ＣＡ、東ソー（株）製）を用いて、カテコールアミンの分析を行った。試料中のカテコールアミン画分を、１ｍｌ／分の流速で分離カラム１６から溶出させた。この後、反応器１７において、前記流速で通液しつつ、予め９０℃に予熱したジフェニルエチレンジアミン（東ソー（株）製）と混合し、同温度にて９０℃約３分間、蛍光誘導体化反応を行った。なお、使用した試薬は全て前記市販装置の専用試薬であり、その使用条件も指定された条件に従った。
【００３３】
通液しつつ蛍光誘導体化されたカテコールアミン分画を、続いて図１の測定セル３中を通過させ、蛍光励起するとともにカテコールアミン分画からの蛍光を検出した。なお、本発明の装置においては、尿試料が測定に供された場合、ＤＡ画分が検出器に到達するタイミングにおいて図１に示したフィルタを励起光光路に入れるように制御装置を構成した。具体的には、尿試料が注入されてから１９分後に前記ロータリーソレノイドを駆動するようにした。
【００３４】
血漿について分析を行った場合、市販の装置及び本発明の分析装置とも、Ｅは５〜２００ｐｇ／ｍｌ、ＮＥは４０〜２０００ｐｇ／ｍｌそしてＤＡは１００ｐｇ／ｍｌ以下で、蛍光信号の比は１：２：１であった。両装置とも検出器のダイナミックレンジは１０００であるため、試料を希釈することなしに、一度の操作で分析することが可能であった。
【００３５】
これに対して尿試料について分析を行った場合、Ｅは１〜２００ｎｇ／ｍｌ、ＮＥは１０〜６００ｎｇ／ｍｌそしてＤＡは９０〜５０００ｎｇ／ｍｌで、蛍光信号の比は、最大１：５０００と、検出器のダイナミックレンジを超えていた。このため、市販の装置においては、試料を希釈する前は図３のような結果となり、ＤＡについて分析することはできなかった。一方、本発明の装置では、ＤＡの分析に先立ち、ＮＤフィルタを励起光集光系に入れることにより、検出器の検出感度を１／１０に低下させることにより、試料を希釈することなく、全カテコールアミンの分析を一度に行うことが可能であった。この結果を図４に示す。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、試料の種類によって蛍光検出器の感度を変更することにより、検出器のダイナミックレンジを超える信号比を示す試料についても、一度の操作で全カテコールアミンを分析することが可能である。例えば尿試料は、ＥやＮＥの濃度に比較して高濃度のＤＡを含むため、従来はＥ及びＮＥの分析の後、試料を希釈して再度ＤＡを分析する必要が生じることがあったが、本発明によればこのような試料希釈に要する操作や時間はもとより、再分析に要する時間を節約することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカテコールアミン分析装置の概要を示すための図である。
【図２】本発明のカテコールアミン分析装置の概要を示すための図である。
【図３】市販のカテコールアミン分析装置により、尿試料を希釈することなく分析した結果を示す図である。図中、ＮＥはノルエピネフリン、ＥはエピネフリンそしてＤＡはドーパミンをそれぞれ示す。
【図４】本発明のカテコールアミン分析装置により、尿試料を希釈することなく分析した結果を示す図である。図中、ＮＥはノルエピネフリン、ＥはエピネフリンそしてＤＡはドーパミンをそれぞれ示し、ＤＡのピーク前後の矢印は、蛍光検出器の検出感度を１／１０に低下し（矢印ａ）、ＤＡ検出後に検出感度を復帰したタイミングを示す（矢印ｂ）。
【符号の説明】
１  光源
２  励起光集光系
３  測定セル
４  蛍光集光系
５  蛍光検出素子
６  ＮＤフィルタ
７  ロータリソレノイド
８  電源
９  高圧電源
１０  増幅回路
１１  制御装置
１２  試料容器
１３  試料注入装置
１４  前処理カラム（不純物除去用）
１５  前処理カラム（濃縮用）
１６  分離カラム（イオン交換カラム）
１７  反応器
１８  蛍光検出部
１９  洗浄液注入装置
２０  ループ
【図１】
0003823473.tif 000002
【図２】
0003823473.tif 000003
【図３】
0003823473.tif 000004
【図４】
0003823473.tif 000005