(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラキドン酸代謝産物、飽和アシル鎖脂質及びｐＨ４．５のクエン酸緩衝液含有区画を含む嵌合−融合リポソーム。
【請求項２】
前記飽和アシル鎖脂質が脂質二分子膜に含まれ、該脂質二分子膜が、ヘッドグループ修飾脂質を含む請求項１の嵌合−融合リポソーム。
【請求項３】
前記アラキドン酸代謝物が、プロスタグランジンである請求項１または２に記載の嵌合−融合リポソーム。
【請求項４】
前記プロスタグランジンが、Ｅ系のプロスタグランジン又はＩ系のプロスタグランジンである請求項３の嵌合−融合リポソーム。
【請求項５】
前記プロスタグランジンが、プロスタグランジンＥ1である請求項４の嵌合−融合リポソーム。
【請求項６】
前記飽和アシル鎖脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンである請求項１ないし５のいずれかに記載の嵌合−融合リポソーム。
【請求項７】
乾燥防護剤を含有する請求項１ないし６のいずれかに記載の嵌合−融合リポソーム。
【請求項８】
前記乾燥防護剤が、糖である請求項７の嵌合−融合リポソーム。
【請求項９】
前記糖が、マルトース、デキストロース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース又はトレハロースである請求項８の嵌合−融合リポソーム。
【請求項１０】
前記アラキドン酸代謝物が、プロスタグランジンＥ1であり、飽和アシル鎖脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン又はジステアロイルホスファチジルコリンである請求項１ないし９のいずれかに記載の嵌合−融合リポソーム。
【請求項１１】
更に乾燥防護剤を含有する請求項１０の嵌合−融合リポソーム。
【請求項１２】
更に他の生理活性剤を含む請求項１ないし１１のいずれかに記載の嵌合−融合リポソーム。
【請求項１３】
薬理学的に許容され得る担体及び請求項１ないし１２のいずれかに記載の嵌合−融合リポソームを含む医薬組成物。
【請求項１４】
前記リポソームが、脱水されている請求項１ないし１２のいずれかに記載の嵌合−融合リポソーム。
【請求項１５】
更に乾燥防護剤を含有する請求項１４に記載の脱水嵌合−融合リポソーム。
【請求項１６】
（ａ）アラキドン酸代謝産物と飽和アシル鎖脂質含有脂質二分子膜を含有する脱水嵌合−融合リポソームと、（ｂ）クエン酸緩衝液とからなり、前記脱水嵌合−融合リポソームと前記クエン酸緩衝液とが、脱水リポソームの再水和時に混合されるようになっている二成分系。
【請求項１７】
前記脂質二分子膜が、ヘッドグループ修飾脂質を含む請求項１６に記載の二成分系。
【請求項１８】
アラキドン酸代謝産物、飽和アシル鎖脂質含有脂質二分子膜及びｐＨ４．５のクエン酸緩衝液含有区画を含む嵌合−融合リポソームからなる、動物に適用するための該代謝産物含有医薬組成物。
【請求項１９】
前記脂質二分子膜が、ヘッドグループ修飾脂質を含む請求項１３または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記アラキドン酸代謝産物が、プロスタグランジンＥ1である請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記動物が、ヒトである請求項１８ないし２０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２２】
静脈用である請求項１８ないし２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
脈管炎、再灌流傷害、外傷後ショック、心筋梗塞、リュウマチ性関節炎、痛風、全身性エリテマトーデス、若年性糖尿病、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群、成人呼吸障害症候群、術後合併症、重症筋無力症、火傷又は血管形成後の再狭乍がある動物のための、アラキドン酸代謝産物の抗障害有効量を含有する請求項１８ないし２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
代謝産物の前記有効量が、動物の体重１ｋｇ当たり代謝産物１０-12ｇ以上である請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
更に他の生理活性剤を含有する請求項１８ないし２４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２６】
アラキドン酸代謝産物、飽和アシル鎖脂質及びｐＨ４．５のクエン酸緩衝液含有区画を含む嵌合−融合リポソームと、薬理学的に許容し得る担体とを混合することを包含するものであり、脈管炎、再灌流傷害、外傷後ショック、心筋梗塞、リュウマチ性関節炎、痛風、全身性エリテマトーデス、若年性糖尿病、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群、成人呼吸障害症候群、術後合併症、重症筋無力症、火傷又は血管形成後の再狭乍がある動物の治療のための、上記嵌合−融合リポソームと薬理学的に許容し得る担体とを含有することを特徴とする薬剤の調製方法。
【請求項２７】
前記飽和アシル鎖脂質が脂質二分子膜に含まれ、該脂質二分子膜が、ヘッドグループ修飾脂質を含む請求項２６の薬剤の調製方法。
【請求項２８】
前記アラキドン酸代謝産物が、プロスタグランジンＥ1である請求項２６または請求項２７に記載の薬剤の調製方法。
【請求項２９】
前記動物が、ヒトである請求項２６ないし２８のいずれかに記載の薬剤の調製方法。
【請求項３０】
更に他の生理活性剤を含有する請求項２６ないし２９のいずれかに記載の薬剤の調製方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、アラキドン酸代謝産物のリポソーム製剤に関する。本発明のリポソーム製剤は、プロスタグランジンにより改善されることのできる病気、障害、症状の治療に用いられる。
プロスタグランジンを作るには、アラキドン酸及びその他の炭素数２０で少なくとも３個の二重結合を有する“必須”脂肪酸を用いることができる［例えば、「グッドマン及びギルマンの治療のための薬理学的基礎」（A．Goodman、Gilman等編）、６００〜６１１頁、Pergamon press、New York（１９９０）；L．Stryer「生化学」（第２版）、８５３〜８５４頁、W.H.Freeman and Co.、New York（１９８１）参照］。種々のプロスタグランジンは、いくつかのカテゴリー（Ａ〜Ｉ）にグループ分けされ、プロスタグランジン合成中に、炭素数２０の脂肪酸前駆体に導入される５炭素環の置換基を変えることによって区分される。これらのグループは、プロスタグランジン中の炭素鎖における二重結合の数及び位置に基づいて、更に細分することができる。
プロスタグランジンは、細胞表面のレセプタを経て目的とする細胞に作用すると考えられる。つまり、これらのレセプタは、プロスタグランジンの作用を媒介する第２の伝達系と結合すると考えられる。プロスタグランジンは、広範囲にわたる生物活性を有することができる。プロスタグランジンは、血管の平滑筋に作用し、それによって、有効な血管拡張薬となり得る。また、プロスタグランジンは、血液細胞、特に白血球及び血小板の機能化にも影響を及ぼすことができる。子宮収縮は、プロスタグランジン作用の影響を受け、このプロスタグランジン作用は、腎臓、中枢神経系及び求心神経の機能にも影響を及ぼすことができる。種々の内分泌組織は、プロスタグランジンに反応することができる。更に、プロスタグランジンは、動物の炎症性の症状を和らげることができる。
体内の酵素は、プロスタグランジンを急速に不活性化することがある。このために、代表的には、大量の化合物を頻繁に投与して、治療上有効な血清中の濃度を維持することが必要となり、それによって、プロスタグランジン治療の費用がかさみ、不必要な副作用の可能性をもたらすことになる。更に、プロスタグランジンの不活性化は、主として、血液が肺を通過する際に起こるので、一般には、化合物を動脈内に投与する。
リポソーム製剤は、アラキドン酸代謝産物、例えばプロスタグランジンの循環半減期を延長することができ、また、肺の中でのそれらの不活性化を避けることができる。従って、このようなリポソーム製剤は、プロスタグランジン治療のための医療上有用な別の手段を提供することができる。Mizishima等［J．Rheumatol．、１４巻、９７頁（１９８７）］及びHoshi等「Drugs．Exptl．Clin．Res．、１２巻（８）、６８１頁（１９８６）］は、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ1）を含有する脂質マイクロスフェアについて述べている。しかしながら、Mizishima等（米国特許第４，４９３，８４７号）及びImagawa等（米国特許第４，６８４，６３３号）に開示されているように、これらの“マイクロスフェア”は、実際にはプロスタグランジン含有脂肪のエマルジョンであって、リポソームではなく、ここに提供されるリポソームプロスタグラジンと同じ性質を有するものでも、同じ利点を有するものでもない。Shell及びSee（米国特許第４，８２０，７３２号及び４，９５５，８７８号）は、プロスタグランジン含有組成物を患者に投与することを含む、血管形成中の機能障害を減らすための治療について開示している。これらの組成物は、担体をも含有している。しかしながら、開示されている液体担体、例えば、無水アルコール及び食塩水は、一般には、プロスタグランジンを持続して放出することができない。開示されている脂肪に装填されたマイクロスフェア担体は、少なくとも赤血球と同程度の大きさ、即ち、直径が少なくとも７ミクロンであると教示されており、それよりも、もっと大きいこともあり得る。このような大きいサイズの粒子を動物に投与すると、肺の毛細血管などの小さい血管内でマイクロスフェアが固着するようになり、詰まるため、障害が生じることになる。
リポソームは、両親媒性脂質分子の一つ又はそれ以上のバイレイヤー〔二分子膜（bilayer）〕からなる自己集合構造体であり、そのそれぞれが、内部水性容積（internal aqueous volume）を取り囲んでいる。ユニラメラ（unilamellar）リポソームは、単一の脂質二分子膜を有している。マルチラメラ（multilamellar）リポソームは、２つ又はそれ以上の脂質二分子膜を有している。嵌合−融合小胞（interdigitation-fusion vesicle）（ＩＦＶ）は、ユニラメラでもマルチラメラでもよいが、代表的には、主にユニラメラである。個々のＩＦＶは、ユニラメラ及びマルチラメラの両方であってもよい。
ＩＦＶの脂質二分子膜は、嵌合された（interdigitated）脂質を含有している。即ち、二分子膜の個々の一分子膜における脂質のアシル鎖が、二分子膜の中央面を横切って、反対側の一分子膜に浸透しており、ここで、それらは、アシル基と相互に作用することができる。ＩＦＶは、他のリポソームを融合することによって製造することができる（Boni等、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４２２（０７／２５／９１）及びBoni等、米国特許出願番号第０７／９６１，２７７、０８／０６６，５３９、０８／１３６，４７０、それぞれ、１９９２年１０月１４日、１９９３年５月２４日、１９９３年１０月１３日出願、を参照のこと）。
リポソームには、受動的に、即ち、水溶性生理活性剤の場合は、リポソームを形成する媒体内にその分子を可溶化することにより、あるいはリポソームを作るリポソーム溶液に脂質溶解性生理活性剤を添加することにより、生理活性剤を装填することができる。イオン化し得る生理活性剤は、積極的に、例えば、リポソーム膜を横切る方向に電気化学ポテンシャル勾配を形成し、その後、リポソームの外側の媒体にその生理活性剤を添加することにより、リポソームに装填することもできる（Bally等、米国特許第５，０７７，０５６号参照）。
薬剤のリポソーム製剤は、薬剤の毒性を低くするか、効能を高めるか、あるいはその両方によって、治療指数を高めることができる。更に、リポソームは、循環における他の微粒子物質と同様に、代表的には、洞様毛細血管を有する組織内の細網内皮系の食細胞によって取り込まれ、それにより、細胞内感染の部位に導かれることが多い。
薬剤をリポソームに取り込む効率を最大にすることにより、被治療者に与えられる脂質の量を最少にすることができ、また貴重な薬剤製品の浪費を最少にすることができる。リポソームから漏出する傾向のある化合物の放出は、そのカプセル化から最大の利益を得るために、抑制されるべきである。更に、安定に貯蔵できるリポソーム製剤を供給すれば、それから得られる治療上の利益が増大するであろう。
本発明は、これらのことに関するリポソーム製剤を提供する。これらの製剤は、遊離（取り込まれていない）型製剤の投与と比較して、アラキドン酸代謝産物の治療指数を高めることができる。
本発明のリポソームアラキドン酸代謝産物製剤は、プロスタグランジンにより治療することのできる病気、障害あるいは症状を改善又は予防するのに有用である。これらの製剤で治療することのできる障害としては、細胞活性化／接着障害及び炎症性障害を挙げることができる。細胞活性化／接着障害は、血液中の細胞の異常な活性化を特徴とするものであり、活性化した細胞は、互いに接着するか、あるいは周囲の血管内皮内の活性化細胞に接着することがある。このような接着は、肺の毛細血管などの小さい血管の閉塞をもたらし、その結果、血流が止まり、次いで、周辺組織が損傷することになる。本発明で言う細胞活性化／接着障害のなかには、再灌流傷害、敗血症性ショック、心筋梗塞、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）、リウマチ性及び全身性脈管炎、狼瘡、外傷後ショック、火傷及び血管形成後の再狭乍がある。
プロスタグランジン治療は、このような障害に苦しむ動物に現れるダメージを減少させることができる。活性化された同一細胞は、引き続いて細胞間接着を受け、表面プロスタグランジンレセプタを有することもできる。いずれにしても、理論により限定されることを意図するものではないが、プロスタグランジンがこれらの細胞プロスタグランジンレセプタと結合する場合は、活性化されているときに高水準の細胞間接着の原因となっていると考えられる表面レセプタを不活性化することができるものと考えられる。
炎症は、冒された血管及び周辺組織内で、損傷に応じて発生する細胞学的及び組織学的反応の過程である［例えば、ステッドマン医学辞典（図解）（２４版、編者J．V．Basmajian等編）、７０７〜７０８頁、Williams and Wilkins, Baltimore, MD（１９８２）］。損傷に対する炎症反応としては、局部的な反応及びその結果生ずる形態学的な変化、有害物質の破壊又は除去、及び修復機構の活性化が挙げられる。このように、炎症は、動物が自己治癒する過程の一部であることができる。しかしながら、炎症は、異常な生理学的刺激に応じて起こった場合などには、それ自身、体内で問題を引き起こすことがある。例えば、関節は、炎症を起こして、通風、リウマチ性関節炎及びライム病などの関節炎状態となる（例えば、ステッドマン医学辞典（図解）、上記、１２３〜１２４頁参照）。このような状態は、細胞の浸出、即ち、循環系から炎症領域へ細胞が出ることを特徴とする。アラキドン酸代謝産物、例えばプロスタグランジンのような薬剤は、このような浸出を抑制することができ、あるいは異常な生理学的刺激に対する炎症反応を抑制することができ、炎症障害を治療するのに使用することができる。
１９９２年１月１６日出願の米国特許出願第０７／８２１，６４８は、リポソームアラキドン酸代謝産物組成物に関するものであり、その内容は、ここに参照のために記載した。１９９３年１１月４日出願の米国特許出願第            は、１９９２年４月３０日出願の米国特許出願第０７／８７６，２００の継続出願であり、細胞活性化／接着障害の治療方法に関するものであって、その内容は、ここに参照のために記載した。
発明の要旨
本発明は、アラキドン酸代謝産物、飽和アシル鎖脂質及び放出抑制水性緩衝液含有区画（compartment）を含む嵌合−融合リポソームを提供する。好ましくは、アラキドン酸がプロスタグランジンである。更に好ましくは、プロスタグランジンがＥ系のプロスタグランジン又はＩ系のプロスタグランジンである。最も好ましくは、プロスタグランジンがプロスタグランジンＥ1である。放出抑制水性緩衝液は、クエン酸緩衝液であることが好ましく、ｐＨが約４．５のクエン酸緩衝液であることが最も好ましい。飽和アシル鎖脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンであることが好ましい。
望ましくは、嵌合−融合リポソームが乾燥防護剤を含有する。好ましくは、乾燥防護剤が糖である。糖は、マルトース、デキストロース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース又はトレハロースであることがより好ましく、マルトースであることが最も好ましい。
従って、本発明の好ましい態様は、飽和アシル鎖脂質、ｐＨが約４．５のクエン酸緩衝液を含有する水性区画、及びプロスタグランジンＥ1を含み、その飽和アシル鎖脂質がジパルミトイルホスファチジルコリン又はジステアロイルホスファチジルコリンである嵌合−融合リポソームである。更に好ましくは、このＩＦリポソームが乾燥防護剤を含有する。
本発明のＩＦリポソームは、ヘッドグループ修飾脂質を含む脂質二分子膜を有していてもよい。リポソームは、更に他の生理活性剤を含んでもよく、脱水されていてもよい。脱水リポソームは、乾燥防護剤を含むことができる。
薬理学的に許容され得る担体と嵌合−融合リポソームを含む組成物も、ここに提供される。
更に、（ａ）アラキドン酸代謝産物と飽和アシル鎖脂質含有脂質二分子膜を含有する脱水嵌合−融合リポソームと、水溶液とからなり、脱水嵌合−融合リポソームと水溶液とが、脱水リポソームを再水和するように混合されている二成分系が、ここに提供される。
更に、また、アラキドン酸代謝産物、飽和アシル鎖脂質含有脂質二分子膜及び放出抑制水性緩衝液含有区画を含む嵌合−融合リポソームを動物に投与することからなる該代謝産物を動物に投与する方法が提供される。この代謝産物は、プロスタグランジンＥ1であることが好ましい。動物は、ヒトであることが好ましく、投与は、静脈内投与を含むことが好ましい。
本発明の方法は、抗障害有効量のアラキドン酸代謝産物を含む組成物を動物に投与して、細胞活性化及び接着、炎症又は毒血症を特徴とする障害に苦しむ動物を治療するのに使用することができる。治療される障害は、アラキドン酸代謝産物による治療を受けることができるものであれば任意であり、代表的には、血管閉塞性障害、関節性障害又は自己免疫障害である。一般に、治療される障害としては、脈管炎、再灌流傷害、外傷後ショック、心筋梗塞、リュウマチ性関節炎、痛風、全身性エリテマトーデス、若年性糖尿病、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群、成人呼吸障害症候群、術後合併症、重症筋無力症、火傷又は血管形成後の再狭乍が挙げられ、好ましくは、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である。
代表的には、代謝産物の有効量は、動物の体重１ｋｇ当たり代謝産物約１０-12ｇ以上である。一般には、代謝産物の有効量は、動物の体重１ｋｇ当たり代謝産物約１０-12ｇから、体重１ｋｇ当たり約１０-3ｇまでである。好ましくは、代謝産物の有効量は、動物の体重１ｋｇ当たり代謝産物約１０-8ｇから、体重１ｋｇ当たり約１０-4ｇまでである。更に好ましくは、アラキドン酸代謝産物の抗細胞活性化／接着有効量は、動物の体重１ｋｇ当たり代謝産物約１０-6ｇである。
更に、本発明の方法は、他の生理活性剤を動物に投与することを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
図１  嵌合−融合リポソーム（ＩＦＶ）からのＰＧＥ1の放出、下記の方法に従って調製されたＩＦＶを、ｐＨが約７の緩衝液中で、表示時間（ｘ軸、分）だけ培養し、その後、ペレット内に保持されたプロスタグランジンのパーセント（ｙ軸）を求めた。黒丸：ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ；５０ｍＭクエン酸緩衝液）を含むＩＦＶ；黒菱形：ジパルミトイルホスファチジルコリン含有ＩＦＶ（ＤＰＰＣ；５０ｍＭクエン酸緩衝液）；黒三角：ＤＳＰＣ−ＩＦＶ（５０ｍＭ酢酸緩衝液）；黒四角：ＤＰＰＣ−ＩＦＶ（５０ｍＭ酢酸緩衝液）；黒逆三角：Ｃ−５３
詳細な説明
本発明は、アラキドン酸代謝産物、飽和アシル鎖脂質含有脂質二分子膜及び放出抑制水性緩衝液含有区画を含む嵌合−融合リポソームを提供する。リポソームは、両親媒性脂質分子の一つ又はそれ以上の二分子膜からなる自己集合構造体であり、そのそれぞれが、内部水性容積を取り囲んでいる。脂質二分子膜を構成する両親媒性脂質分子は、一つ又は二つの非極性（疎水性）アシル鎖に共有結合で結合されている極性（親水性）ヘッドグループ領域を含んでいる。疎水性アシル鎖と水性媒体との間のエネルギー的に好ましくない接触によって、極性ヘッドグループが水性媒体に向かって配向し、一方、アシル鎖が二分子膜の内部に向かって再配向するように、脂質分子が再配列される。最終結果は、アシル鎖が、水性媒体と接触するのを有効に遮蔽するエネルギー的に安定な構造となる。
嵌合−融合小胞（ＩＦＶ）は、ユニラメラでもマルチラメラでもよいが、一般には、主にユニラメラである。個々のＩＦＶは、ユニラメラ及びマルチラメラの両方であってもよい。ＩＦＶの脂質二分子膜は、嵌合された脂質を含有しており、他のリポソームを融合することによって製造される（Boni等、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４２２（０７／２５／９１）及びBoni等、米国特許出願番号第０７／９６１，２７７、０８／０６６，５３９、０８／１３６，４７０、それぞれ、１９９２年１０月１４日、１９９３年５月２４日、１９９３年１０月１３日出願、を参照のこと）。
“嵌合”及び“嵌合された”は、ここでは、各一分子膜における脂質のアシル鎖が、二分子膜の中央面を横切って、反対側の一分子膜に浸透している脂質二分子層を述べるのに用いられる。リポソームは、完全に嵌合されていてもよい。“完全嵌合”とは、二分子膜の各一分子膜におけるアシル鎖が、二分子膜の幅全体にわたっている、即ち、ヘッドグループ表面積当たり４つのアシル鎖がある脂質二分子膜を意味するものである。不整アシル鎖を有する脂質、即ちアシル鎖の長さが不均一な脂質は、混合又は部分嵌合を受けることもできる。
嵌合−融合リポソームの製造は、リポソームを融合するのに有効な量の誘発因子（inducer）の存在下で、サイズを揃えた（sized）リポソームを培養することを包含する。小さい曲率半径によって加えられた二分子膜の歪みを除去するために、サイズを揃えたリポソームは、誘発因子の或る濃度において融合して、脂質シート（ゲル）となることができる。他のリポソームからサイズを揃えたリポソーム個体群（population）を製造するには、当該技術分野で使用できる任意の方法、例えば音波破砕、押し出し、均質化などを利用することができる。サイズを揃えたリポソームを形成した後、一般に、カプセル化しようとする溶質、好ましくは生理活性剤を水性溶剤に混合する。使用される誘発因子、例えばエタノールなどの短鎖有機化合物、静水圧、自己誘発リポソームの量等は、例えば、使用される誘発因子の種類及び利用されるサイズを揃えたリポソームの性質によって変ってくる。
リポソームには、受動的に、即ち、水溶性生理活性剤の場合は、リポソームを形成する媒体内にその分子を可溶化することにより、あるいはリポソームを作るリポソーム溶液に脂質溶解性生理活性剤を添加することにより、生理活性剤を装填することができる。イオン化し得る生理活性剤は、積極的に、例えば、リポソーム膜を横切る方向に電気化学ポテンシャル勾配を形成し、その後、リポソームの外側の媒体にイオン化し得る生理活性剤を添加することにより、リポソームに装填することもできる（Bally等、米国特許第５，０７７，０５６号参照）。
“アラキドン酸代謝産物”は、プロスタグランジン又は人工的若しくは動物の体内でプロスタグランジンに変換できる化合物である。プロスタグランジンは、５炭素環に加えて、７炭素鎖と８炭素鎖を含む炭素数２０の脂肪酸群であり、炭素数が２０で、少なくとも３個の二重結合を有する他の脂肪酸、即ち、“必須”脂肪酸から製造される（例えば、８，１１，１４−エイコサトリエン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタン酸、例えば、上記の「グッドマン及びギルマンの治療のための薬理学的基礎」参照）。アラキドン酸は、これらの炭素数２０のプロスタグランジン前駆体のうち、ヒトに最も豊富に存在するものである。
炭素数２０の必須脂肪酸プロスタグランジン前駆体、プロスタグランジン合成中に形成される中間体、例えばプロスタン酸、及びこれらの化合物に変換できる構造類似体は、“アラキドン酸代謝産物”である。ロイコトリエン、トロンボキサン、リポキシン、プロスタサイクリンなどの“プロスタグランジン関連化合物”としては、プロスタグランジンと機能的に関連し、炭素数２０の必須脂肪酸プロスタグランジン前駆体から誘導することもできる化合物を挙げることができる。プロスタグランジン及びプロスタグランジン関連化合物は、エイコサノイドと呼ぶことができる。プロスタグランジン、プロスタグランジン関連化合物及びこのような化合物に変換できる構造類似体も、“アラキドン酸代謝産物”である。
プロスタグランジンは、好ましいアラキドン酸代謝産物である。種々のプロスタグランジンは、５炭素環における置換基の配置によって、いくつかの大きいグループ（Ａ〜Ｉ）に分類される。これらのグループは、プロスタグランジンの炭素鎖における二重結合の数及び位置に基づいて、更に細分することができる。好ましいプロスタグランジンは、Ｅ系又はＩ系プロスタグランジンであり、最も好ましくは、ＰＧＥ1である。
プロスタグランジンは、体内で、急速かつ効率よく異化され、不活性化される。化合物は、一連のプロスタグランジン特異性酵素を触媒とする反応の結果として、その生物活性の大部分を失う。不活性化工程の次の段階が、脂肪酸酸化経路の酵素によって行われる。プロスタグランジンは、広範囲にわたる生物活性を有することができる。例えば、Ｅ系プロスタグランジンは、血管の平滑筋、例えば、細動脈、前毛細血管、括約筋及び後毛細管小静脈に作用し、有効な血管拡張薬となりうる。ＰＧＤ2、ＰＧＦアルファ及びＰＧＩ2も、血管拡張作用を有することができる。プロスタグランジン及び関連誘導体は、血液細胞、特に白血球及び血小板の機能化にも影響を及ぼすことができる。例えば、ＰＧＩ2は、１ｎＭといった低濃度で、血小板の凝集を抑制することができる（上記の「グッドマン及びギルマンの治療のための薬理学的基礎」参照）。子宮収縮は、ＰＧＥ、ＰＧＦ及びＰＧＩの作用の影響を受けることがある。プロスタグランジンは、腎臓、中枢神経系及び求心神経の機能にも影響を及ぼすことができる。種々の内分泌組織は、通常、プロスタグランジンに反応する。更に、プロスタグランジンは、炎症反応を和らげることができる。
プロスタグランジンは、それらの目的とする細胞の表面レセプタと結合することにより、作用すると考えられる。これらのレセプタは、目的とする細胞におけるプロスタグランジンの作用を媒介する第２の伝達系と結合すると考えられる。
プロスタグランジンが体内で受ける急速な酵素的不活性化には、血清中の治療有効濃度を維持するために、プロスタグランジンを多量に繰り返して投与することがしばしば必要になる。このような治療法では、プロスタグランジン治療の費用がかさみ、不必要な副作用が生ずることになる。例えば、ＰＧＥ1の濃度を高くすると、低血圧、頻脈、下痢を引き起こす。更に、プロスタグランジン不活性化は主に肺で起こるので、一般に動脈内投与が必要である。
本発明の嵌合−融合リポソームは、飽和アシル鎖脂質、即ち、炭素原子間に二重結合がないアシル鎖を有する脂質を含む脂質二分子膜からなる。飽和アシル鎖脂質は、プロスタグランジン−脂質相互作用の強度を高め、それにより、リポソームからのプロスタグランジンの放出を抑制する。このような脂質は、“放出抑制脂質”とも呼ばれる。放出抑制脂質は、例えば、脂質二分子膜を水及び他の小さい分子が透過し難くすることにより、例えば、アシル鎖間のファンデルワールス、双極子−双極子及びその他の相互作用を高めることにより、従って、アシル鎖が、脂質二分子膜内に、より緊密に詰まった状態にすることにより、プロスタグランジン−脂質相互作用の強度を高める傾向がある。二分子膜アシル鎖の二重結合の数は、二分子膜における鎖の相互配置に影響を及ぼすことができる。二重結合の数が少ないほど、アシル鎖が緊密に詰まった状態になる可能性があり、従って、二分子膜を通過する分子に対して、障壁を与える可能性が大きくなる。現在、好ましい飽和アシル鎖放出抑制脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。しかし、他の飽和アシル鎖脂質を用いることもできる。
プロスタグランジン−脂質結合（association）を高める傾向のある因子は、リポソーム形成中にも脂質とプロスタグランジンの結合を高める傾向があり、従って、リポソームと結合するプロスタグランジンのパーセントを高めることができる。ここで用いられるプロスタグランジン−リポソーム“結合”とは、物理的又は化学的なプロスタグランジン−脂質二分子膜相互作用、あるいはリポソームの水性区画内へのプロスタグランジンの取り込みを意味する。好ましい結合としては、プロスタグランジン−脂質二分子膜結合を挙げることができる。
リポソームにおける水性緩衝液も、リポソームと結合したプロスタグランジンの放出を抑制又は防止することができる。このような水性緩衝液は、“放出抑制緩衝液”と呼ぶことができる。成分の一つ又はそれ以上が、プロスタグランジン−脂質結合の強度を高める傾向がある水性緩衝液が、ここでは、好ましい放出抑制緩衝液である。好ましい放出抑制緩衝液の特性としては、プロスタグランジンとの静電反発を設定する能力及びそれによりプロスタグランジン−脂質相互作用を高める能力が挙げられるが、それらに限定されるものではない。更に、緩衝能の高い緩衝液、従って、所望のｐＨに保持する能力が大きい緩衝液は、良好な放出抑制緩衝液となるであろう。好ましい放出抑制緩衝液は、クエン酸緩衝液であり、例えば、ｐＨが約４．５のこれらのクエン酸緩衝液である。
本発明の嵌合−融合リポソームは、乾燥防護剤を含むことができ、好ましくは、糖であって、例えば、マルトース、デキストロース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース又はトレハロースである。糖は、マルトースであることが好ましい。乾燥防護剤は、リポソームを脱水する際に使用することができる。理論により制限されることを意図するものではないが、乾燥防護剤は、脱水／再水和工程を通じて、リポソームのサイズ及び完全性を保持するものと考えられる。
従って、本発明の嵌合−融合リポソームは、ＰＧＥ1、ｐＨが約４．５のクエン酸緩衝液を含有する水性区画、及びＤＰＰＣ又はＤＳＰＣを含有する脂質二分子膜を含むことが好ましい。好ましい嵌合−融合リポソームは、乾燥防護剤、例えばマルトースを含むことができる。
本発明の嵌合−融合リポソームは、別のアラキドン酸代謝産物、例えばプロスタグランジンなどの、他の生理活性剤を含むことができる。ここで用いる“生理活性剤”とは、動物、例えばヒトにおいて、生理活性を有する任意の化合物又は組成物を示す。生理活性剤としては、抗ウイルス性化合物、抗菌性化合物、抗真菌性化合物、抗寄生菌性化合物、代謝拮抗性化合物、抗緑内症性化合物、抗炎症性化合物、抗腫瘍性化合物、ステロール、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、免疫グロブリン、免疫調節剤、染料、トキシン、酵素、ホルモン、神経伝達物質、糖ペプチド、放射性標識剤、放射線不透性化合物、蛍光化合物、細胞受容体蛋白質、細胞受容体リガンド、散瞳性化合物、気管支拡張剤、局所麻酔薬、成長促進剤、再生剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。第二の生理活性剤としては、他のプロスタグランジンなどの、追加又は第二のアラキドン酸代謝産物を挙げることができる。
本発明の嵌合−融合リポソームは、更にヘッドグループ修飾脂質を含むことができる。リポソームは、固定及び循環マクロファージからなる細網内皮系（ＲＥＳ）によって、動物の体から排除される。ＲＥＳ排除を回避することによって、より長時間、リポソームを循環させたままにしておくことができ、このことは、目的とする血清濃度を達成するのに、より少ない薬剤を投与すればよいことを意味する。循環時間が長くなれば、リポソームが、ＲＥＳを含まない組織を標的にすることもできる。動物に投与した場合、リポソームの表面は、血清蛋白質で被覆されるようになる。ＲＥＳによる排除速度は、このような蛋白質被覆の速度及びレベルに関係することができる。従って、血清蛋白質の結合が一般に抑制されるように、リポソームの外表面を修飾することによって、排除を抑制することができる。これは、蛋白質結合を促進することができる負の表面電荷を最少にするが、遮蔽することにより、あるいは、そうでなければ、血清蛋白質の結合に対して立体障害を与えることにより、達成することができる。
有効な表面修飾、即ち、ＲＥＳ取り込みを抑制することになるリポソーム外表面に対する変更は、ヘッドグループ修飾脂質をリポソーム二分子膜へ入れることにより、達成することができる。ここで用いられる“ヘッドグループ修飾脂質”とは、動物の循環系における小胞の薬物動力学的挙動を変えるように、リポソームへの血清蛋白質の結合を抑制することができる化学官能基、例えばポリエチレングリコール、ポリアルキルエーテル、ガングリオシド、有機ジカルボン酸（例えば、グルタル酸）などをヘッドグループへ結合することにより、その極性ヘッドグループを誘導体化した（derivatize）両親媒性脂質のことである［例えば、Blume等、Biochim. Biophys. Acta.、１１４９巻、１８０頁（１９９３）；Gabizon等、Pharm. Res.、１０（５）巻、７０３頁（１９９３）；Park等、Biochim. Biophys. Acta.、１１０８巻、２５７頁（１９９２）；Woodle等、米国特許第５，０１３，５５６号；Allen等、米国特許第４，８３７，０２８号及び米国特許第４，９２０，０１６号参照］。本発明によって提供されるリポソームは、更にこのようなヘッドグループ修飾脂質を含むことができる。リポソームに取り込まれるヘッドグループ修飾脂質の量は、当業者によく知られているか、あるいは必要以上の実験を行わなくても当業者が決めることのできる範囲内の多数の要因によって決まる。これらの要因としては、脂質の種類及びヘッドグループ修飾の種類、リポソームの種類及びサイズ並びにリポソーム製剤の目的とする治療用途などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。代表的には、リポソーム内のヘッドグループ修飾脂質の濃度は、少なくとも約５モルパーセントであり、約１０モルパーセントが望ましい。
アラキドン酸代謝産物と飽和アシル鎖脂質含有脂質二分子膜とを含む脱水嵌合−融合リポソームも、ここに提供される。リポソームを脱水すると、長期間にわたってリポソームを貯蔵することが可能となる。これらは、被験者への投与が必要となった際に、再構成することができる。標準的な凍結乾燥装置又はその同等装置を用いて、凍結することにより、リポソームを脱水することができる。凍結乾燥は、それらの内容を、ここに参照のために記載したSchneider等（米国特許第４，２２９，３６０号）及びJanoff等［米国特許第４，８８０，６３５号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０１１０３（０２／２７／８６））］の方法に従って、一つ又はそれ以上の乾燥防護剤、好ましくは保護糖をリポソーム生成物に混合した後、行うのが好ましい。凍結せずに脱水を行い、十分な水がリポソーム生成物に残されたままにして、脱水−再水和工程を通じてリポソーム二分子膜の実質的な部分の完全性を維持するのであれば、保護糖、例えば、マルトース、スクロース、デキストロース、ラフィノース、トレハロース、ラクトース又はガラクトース、好ましくはマルトースを省略することができる。本発明の脱水嵌合−融合リポソームは、乾燥防護剤、例えばマルトースを含むことができる。
本発明は、アラキドン酸代謝産物を含有する脱水嵌合−融合リポソーム、飽和アシル鎖脂質を含有する脂質二分子膜及び水溶液を含む二成分系を提供する。脱水嵌合−融合リポソームと水溶液は、脱水リポソームを再水和又は再構成するように混合されている。
水溶液は、ここに記載されている緩衝水溶液などの、薬理学的に許容され得る担体を含む多数の溶液であることができる。これらの成分は、貯蔵及び混合するのに便利なバイアル瓶又はその他のパッケージングに入れて提供することができる。
更に、薬理学的に許容され得る担体と本発明の嵌合−融合リポソームを含む医薬組成物、即ち、アラキドン酸代謝産物、飽和アシル鎖脂質含有脂質二分子膜及び放出抑制緩衝液含有水性区画を含む嵌合−融合リポソームが提供される。
アラキドン酸代謝産物はＰＧＥ1、放出抑制緩衝液はｐＨが約４．５のクエン酸緩衝液、飽和アシル鎖脂質はＤＰＰＣ又はＤＳＰＣであることが好ましい。ここで用いられる“薬理学的に許容され得る担体”とは、動物、特にヒトへの生理活性剤の投与に関連しての使用を一般に意図する標準的な担体、希釈剤、賦形剤などのどれでもを意味する。このような担体は、当該技術分野ではよく知られており、一般に、用いられる特定の薬剤、目的とする投与経路などの多数の要因に関連して選択され、それらは当業者によりよく理解されているものであり、必要以上の実験を行わなくても当業者が決めることのできる範囲内のものである。適当な担体としては、生理食塩水などの塩溶液、Ｄ５Ｗなどのデキストロース水溶液などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。この医薬組成物は、当業者によく知られている理由及び量で、更に、防腐剤、酸化防止剤などの補助剤を含むことができる。
本発明は、アラキドン酸代謝産物を動物、好ましくはヒトに投与する方法を提供する。この方法は、薬理学的に許容され得る担体と本発明のリポソーム製剤を含む組成物を、動物に投与することからなる。投与方法は、好ましくは静脈内投与を含む。
本発明のリポソーム製剤は、ＩＦリポソームに結合した抗障害有効量のアラキドン酸代謝産物を動物に投与することにより、脂肪活性化及び接着、炎症又は毒血症という特徴がある障害などの、プロスタグランジンにより治療することのできる病気、障害あるいは症状を予防又は改善するのに使用することができる。一般に、障害としては、脈管炎、外傷後ショック、心筋梗塞、リュウマチ性関節炎、痛風、全身性エリテマトーデス、若年性糖尿病、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群、成人呼吸障害症候群、術後合併症、重症筋無力症、火傷又は血管形成後の再狭乍などの血管閉塞性、関節性又は自己免疫性障害が挙げられる。治療される障害は、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が好ましい。
“細胞活性化／接着障害”とは、血液中の細胞、例えば、血小板や好中球の異常な活性化及びそれに続くこれらの細胞同士の接着又は周囲の血管内皮内の活性化細胞への接着を特徴とする障害である。細胞活性化／接着障害は、広範囲にわたる内科病理学において、重大な問題である。血管、複数の囲心又は腹内皮細胞などの内皮細胞は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、細菌内毒素などのサイトカインによって活性化されることがある。同様に、血液細胞、特に好中球及び血小板は、ＧＭ−ＣＳＦ、細菌内毒素、細菌性化学誘引物質（bacterial chemoattractant）、ＴＮＦ−アルファ、補体のＣ５ａ成分などの剤によって活性化されることがある。活性化細胞は、それらの表面に、互いに接着することのできる接着部位を持っている。活性化し、接着した細胞は、凝集塊を形成することがあり、肺や心臓に見られるような小さい血管を詰まらせ、それにより、周辺組織への血液の流れを減少させる。活性化細胞は、活性化血管内皮細胞とも接着することがある。このような接着が生ずると、その後、血管内皮の脱顆粒が起こり、あるいはスーパーオキサイドアニオン（Ｏ2-）や蛋白分解酵素などの細胞損傷媒介物質を放出ことになる。本発明で言う活性化／接着障害の中には、閉塞した血管の再灌流に関する傷害、あるいは血流が一時的に停止する手術に付随して起こる傷害などの再灌流傷害がある［例えば、白血球接着分子、１３８〜１４８頁、Springer-Verlag、New York（１９９０）のSeewaldt-Becker等、「再灌流傷害に及ぼす抗接着抗体の影響」（Springer等編）及び白血球接着分子、８５〜１５６頁、Springer-Verlag、New York（１９９０）の「病気及び治療における接着」（Springer等編）参照］。血管に閉塞がある場合、下流の虚血性組織の他に、周囲の内皮細胞が損傷を受ける。閉塞が取り除かれた場合、すぐ近くの内皮細胞も更に損傷を受けることがある。このように損傷を受けた細胞は、患部への血流の再灌流後に、好中球及び血小板を順次活性化させるができる。
プロスタグランジン治療は、細胞活性化／接着障害に苦しむこれらの動物に現れるダメージを減少させることができる。活性化剤のレセプタを有する同一細胞は、表面プロスタグランジンレセプタを有することもできる。いずれにしても、理論により限定されることを意図するものではないが、プロスタグランジンがこれらのプロスタグランジンレセプタと結合する場合は、活性化されているときに、高水準の細胞間接着の原因となっている表面レセプタを不活性化することができるものと考えられる。この不活性化の機構は、蛋白質キナーゼで媒介される細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇によるものと考えられる。
リポソームプロスタグランジンの“抗細胞活性化／接着有効量”とは、血液内又は周辺血管組織内の細胞の接着部位の活性化、及び／又はこのように活性化された細胞の血液内又は周辺血管組織内の他の細胞への接着を改善、抑制又は予防するのに有効なリポソームプロスタグランジンの量である。抗細胞活性化／接着量は、一般に、このような活性化及び細胞間接着に起因する血管閉塞を抑制又は少なくするのに有効であろう。
炎症は、冒された血管及び周辺組織内で、損傷に応じて発生する細胞学的及び組織学的反応の過程である［例えば、ステッドマン医学辞典（図解）（２４版、編者J．V．Basmajian等編）、７０７〜７０８頁、Williams and Wilkins, Baltimore, MD（１９８２）］。このような刺激に対する炎症反応としては、局部的な反応及びその結果生ずる形態学的な変化、有害物質の破壊又は除去、及び修復機構の活性化が挙げられる。このように、炎症は、動物が自己治癒する過程の一部であることができる。しかしながら、炎症は、異常な生理学的刺激に応じて起こった場合のように、体内で問題を引き起こすことがある。例えば、関節は、炎症を起こして、通風、リウマチ性関節炎及びライム病などの関節炎状態となる（例えば、ステッドマン医学辞典（図解）、上記、１２３〜１２４頁参照）。このような状態は、細胞の浸出、即ち、循環系から炎症領域へ細胞が出ることを特徴とする。プロスタグランジンなどの薬剤は、このような浸出を抑制することができ、あるいは異常な生理学的刺激に対する炎症反応を抑制することができ、炎症障害を改善するのに使用することができる。
嵌合−融合リポソームアラキドン酸代謝産物の“抗炎症障害有効量”とは、炎症反応、即ち、異常炎症、換言すれば、異常な生理学的刺激に応ずるもので、損傷に応ずる体の正常修復過程の一部ではない炎症を特徴とする症状に苦しむ動物における反応を改善、抑制又は予防するのに有効なリポソーム代謝産物の量である。
代表的には、細胞活性化及び接着、炎症又は毒血症障害に苦しむ動物へ投与されるアラキドン酸代謝産物の量、従って、代謝産物の“抗障害有効”量は、動物の体重１ｋｇ当たり代謝産物約１０-12ｇ以上である。一般には、代謝産物の有効量は、動物の体重１ｋｇ当たり代謝産物約１０-12ｇから、体重１ｋｇ当たり約１０-3ｇまでである。好ましくは、代謝産物の有効量は、動物の体重１ｋｇ当たり代謝産物約１０-8ｇから、体重１ｋｇ当たり約１０-4ｇまでである。更に好ましくは、アラキドン酸代謝産物の抗細胞活性化／接着有効量は、動物の体重１ｋｇ当たり代謝産物約-6ｇである。
以下、実施例で本発明を更に説明するが、これらの実施例が、その後に続く請求範囲で規定された本発明を、単に説明するだけのものであることは、当業者が容易にわかるところであろう。
実施例
実施例１
嵌合−融合リポソーム（ＩＦＶ）の調製
次のようにして、ＰＧＥ1原液（エタノールに１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。２０ｍｇの乾燥ＰＧＥ1を２０ｍｌのバイアル瓶に移し、それに、２０ｍｌの無水エタノールを加えた。静かにかきまぜながら、ＰＥＧ1をそのエタノール中に溶解し、得られた溶液を−２０℃で貯蔵した。ＰＧＥ1を、脂質に対するＰＧＥ1の重量比（ｇ／ｇ）を１：２０にして、飽和アシル鎖脂質（ＤＰＰＣ又はＤＳＰＣ）の有機溶剤溶液と混合した。ＰＧＥ1／脂質溶液を用いて、米国特許出願番号第０７／９６１，２７７、０８／０６６，５３９、０８／１３６，４７０（それぞれ、１９９２年１０月１４日、１９９３年５月２４日、１９９３年１０月１３日に出願。）に記載された方法により、ＩＦＶを調製した。簡単に、有機溶剤を蒸発させることにより、ＰＧＥ1／飽和アシル鎖脂質の有機溶剤溶液を乾燥させた。多重ラメラリポソームの懸濁液を形成するように、乾燥ＰＧＥ1／脂質混合物を水溶液（５０ｍＭクエン酸緩衝液又は５０ｍＭ酢酸緩衝液）で再水和した。次いで、これらのリポソームのサイズを揃え、誘発因子、例えばエタノールを、サイズを揃えたリポソームへ加えた。次いで、リポソーム−誘発因子混合物を、飽和アシル鎖脂質の転移温度（Ｔｍ）よりも低い温度で培養した。
ｐＨ７の緩衝液での培養後に、ＤＳＰＣ ＩＦＶ及びＤＰＰＣ ＩＦＶに残っているＰＧＥ1のパーセントを測定し、第１図に示した（下記参照）。
【図１】
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