(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７に示されたヌクレオチド配列からなる単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１７に示された核酸分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、単離核酸分子。
【請求項３】
請求項１の核酸分子に相補的な単離分子であって、前記単離分子は
ｍＲＮＡ又はＤＮＡである単離分子。
【請求項４】
請求項１の核酸分子でトランスフェクション又はトランスフォーメーションされた宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞がＨＬＡ−Ａ２を発現する真核細胞である請求項４の宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞がＨＬＡ−Ａ２を発現する原核細胞である請求項４の宿主細胞。
【請求項７】
請求項２の核酸分子でトランスフェクション又はトランスフォーメーションされた宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞がＨＬＡ−Ａ２を発現する真核細胞である請求項７の宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞がＨＬＡ−Ａ２を発現する原核細胞である請求項７の宿主細胞。
【請求項１０】
プロモーターに操作可能にリンクした請求項１の単離核酸分子を有する発現ベクター。
【請求項１１】
プロモーターに操作可能にリンクした請求項２の単離核酸分子を有する発現ベクター。
【請求項１２】
さらにＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を有する請求項１０の発現ベクター。
【請求項１３】
さらにＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を有する請求項１１の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１の核酸分子によってコードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体。
【請求項１５】
配列番号６又は配列番号８に示されたアミノ酸配列を有する単離ペプチド。
【請求項１６】
ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原へとプロセッシングされるＮＡＧ腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる疾患の治療用医薬組成物であって、前記疾患を軽減するのに十分な量の、ＮＡＧ腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との複合体に対して特異的であり、前記複合体を提示する細胞を溶解する細胞溶解性Ｔ細胞を含有する、医薬組成物。
【請求項１７】
配列番号１７のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる疾患の治療用医薬組成物であって、前記疾患を軽減するのに十分な量の、ＨＬＡ分子と、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原との複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
【請求項１８】
ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原へとプロセッシングされるＮＡＧ腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる疾患の治療用医薬組成物であって、前記ＮＡＧ由来の腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との複合体に対する免疫応答を誘発する物質を、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量を含有する医薬組成物。
【請求項１９】
配列番号１７のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされるＮＡＧ腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる疾患の治療用医薬組成物であって、ＨＬＡ−Ａ２分子と配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチドとの複合体に対する免疫応答を誘発する物質を、前記複合体を提示する細胞に対する前記免疫応答を誘発するのに十分な量を含有する医薬組成物。
【請求項２０】
配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列からなり、ＨＬＡ−Ａ２分子と複合体を形成するＮＡＧ由来の腫瘍拒絶抗原へとプロセッシングされるＮＡＧ腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる疾患を検出する方法であって、被験体から採取したサンプルと、前記複合体に対して特異的な薬剤とを生体外で接触させ、前記疾患の検出として、前記複合体と前記物質との間の相互作用を検出することからなる方法。
【請求項２１】
配列番号１７に示された配列を有する核酸分子によってコードされるＮＡＧ腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる疾患を検出する方法であって、被験体から採取したサンプルと、前記前駆体に由来し、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原前駆体に対して特異的な物質とを生体外で接触させ、前記疾患の検出として、前記物質と、前記配列又は発現産物との間の相互作用を検出することからなる方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、病的状態の診断及び治療に関して、有効な、単離核酸分子とペプチドに関する。より詳しくは、本発明はＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ａ２によって提示されるペプチドへとプロセッシングされるタンパク質及び提示されるペプチド自体に関する。これらのペプチドは診断及び治療において有用である。
背景及び先行技術
哺乳類の免疫系が、外来又は異質の物質を認識し、それらに反応するプロセスは複雑なものである。このシステム（免疫系）の重要な側面はＴ細胞応答である。この応答は、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（“ＨＬＡ”）又は主要組織適合遺伝子複合体（“ＭＨＣ”）と呼ばれる細胞表面分子と、ペプチドとからなる複合体を認識し、この複合体と相互作用することを必要とする。このペプチドはＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によって、プロセッシングされるより大きな分子に由来する。メール（Ｍａｌｅ）他，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｐ．Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８７）、特に６〜１０章を参照のこと。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチドの複合体との相互作用は制限されたものであり、あるＨＬＡ分子とあるペプチドとの特定の組み合わせに対して特異的なＴ細胞を必要とする。もし、特異的なＴ細胞が存在しなければ、たとえそのパートナー複合体が存在していてもＴ細胞応答は起こらない。同様に、もし特異的な複合体が存在していなければ（特異的な）Ｔ細胞が存在していても応答は起こらない。このメカニズムは、外来物質に対する免疫系の応答、自己免疫疾患、及び、細胞異常に対する応答において関与している。タンパク質がＨＬＡに結合するペプチドへとプロセッシングされるメカニズムに関して、多くの研究が行われてきた。バリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：８８０（１９９２）；フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：９１９（１９９２）；マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：９２７（１９９２）；及びラトロン（Ｌａｔｒｏｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：９６４（１９９２）を参照のこと。
Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは、ガンについても関係している。例えば、参考文献として本出願にその内容が合体される、１９９２年３月２２日に出願され、１９９２年１１月２６日に公表されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、ペプチドへとプロセッシングされ、その後細胞表面に表出され、特異的なＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を誘導することができる、遺伝子のファミリーが開示されている。これらの遺伝子は“腫瘍拒絶抗原前駆体”又は、“ＴＲＡＰ”分子をコードするといわれており、これらに由来するペプチドは、“腫瘍拒絶抗原”又は“ＴＲＡ”と呼ばれている。この遺伝子ファミリーについてのさらなる情報については、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３５：１４５（１９９２）；ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３（１９９１）を参照のこと。また、米国特許第５，３４２，７７４号も参照のこと。
参照文献として、本出願にその開示内容が合体される米国特許出願第９３８，３３４号には、ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるノナペプチドが教示されている。この参考文献は特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が知られているとすれば、特定のペプチドは１つのＨＬＡ分子に対して結合し、他のＨＬＡ分子には結合しないと予想されると教示している。これは重要なことである。というのは、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するからである。その結果、特定のペプチドが特定のＨＬＡ分子に対するパートナーであるとして同定されたことが診断上及び治療上の効果を有するとしても、それらの効果は、その特定のＨＬＡ表現型を有する個体に対してのみ適切であることになる。この分野におけるさらなる研究が必要である。というのは、細胞異常は、１つの特定のＨＬＡ表現型に制限されるものではないからである。そして標的化療法（targeted therapy）は、問題となる異常細胞の表現型に関する相当の知識を必要とするのである。
以下に記載するように、本出願はＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ａ２によって提示される、新規な、イントロン−発現（inntron-expressed）腫瘍拒絶抗原、及び、その抗原をコードする核酸分子に関する。本出願は、さらにこの新規な腫瘍拒絶抗原を利用する治療及び診断方法に関する。本発明は以下の開示においてさらに詳しく述べられている。
【図面の簡単な説明】
前述の簡単な説明、及び本発明のさらなる目的と特徴は、後述の、本発明の、例示的ではあるが、現在好適であるとされる実施例の詳細な説明と添付の図面とをともに参照することによって、より完全に理解されるであろう。添付の図面において；
図１は、ＣＴＬ２１３とともにインキュベートした際の、ＮＡ１７−ＭＥＬ、ＮＡ１７−ＥＢＶ及びＫ５６２細胞による51Ｃｒ放出を示している。
図２は、細胞溶解性Ｔ細胞ラインＣＴＬ２１３を細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ４３．ＨＬＡ−Ａ２、ＳＫ２９−ＭＥＬ、ＬＢ３７３−ＭＥＬ、ＳＫ２３−ＭＥＬ、ＮＡ７４−ＭＥＬ、及びＮＡ１７−ＭＥＬと接触させた際のＴＮＦ放出を示している。
図３は、ＣＴＬ２１３を、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされたＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞、ＨＬＡ−Ａ２と５６０Ｅ１ｃＤＮＡとで共トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞、またはＨＬＡ−Ａ２単独か、５６０Ｅ１ｃＤＮＡ単独からのどちらかでトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞と接触させた際のＴＮＦ放出を示している。
図４Ａは、ｃＤＮＡ５６０Ｅ１の中における、ＣＴＬ２１３によって認識されるＮＡＧ抗原性ペプチドをコードする領域の位置を示している。
図４Ｂは、ＣＴＬ２１３と、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐにクローニングされたｃＤＮＡ５６０Ｅ１フラグメントとＨＬＡ−Ａ２のＣＯＳ細胞共トランスフェクタント（cotransfectant）とをともにインキュベートした後のＴＮＦ放出を示している。
図５は、様々なペプチドとともにインキュベートされた、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＴ２細胞の、ＣＴＬ２１３による溶解を示している。
図６は、λファージ中の、ＭＺ２−ＭＥＬ２．２．５由来のゲノムＤＮＡの１４ｋｂインサートの５’末端と３’末端のヌクレオチド配列を表している。この１４ｋｂインサートは、ｃＤＮＡ５６０Ｅ１のヌクレオチド４８−１８５に対応するプローブによるスクリーニングにおいて陽性であったものである。
図７は、ｃＤＮＡ５６０Ｅ１、３’ＲＡＬＥクローンｃＤＮＡ、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ、及びλファージ１４ｋｂゲノムインサートの概略図である。
図８は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の一部の概略図である。そして、
図９は、最長の５’ＲＡＣＥクローンと３’ＲＡＣＥクローンの核酸配列を編集したものを表している。
例  １
ここにおいて利用した腫瘍細胞ラインは、以下のようにして得られた：細胞ラインＮＡ８−ＭＥＬ、ＮＡ１７−ＭＥＬ、及びＮＡ７４−ＭＥＬは、患者ＮＡ８，ＮＡ１７、及びＮＡ７４の転移メラノーマ由来であった。メラノーマ細胞ＮＡ１７−ＭＥＬとＮＡ７４−ＭＥＬは患者ＮＡ１７とＮＡ７４から得られ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１％Ｌ−グルタミンを追加した、ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３はメラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ由来であり、ヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９：３９０−３９６（１９８７）及びファン・デア・エインデ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４４：６３４−６４０（１９８９）によって以前に記載されているように培養した。メラノーマ細胞ラインＳＫ２９−ＭＥＬとＳＫ２３−ＭＥＬとは、ロイド・オールド（Ｌｌｏｙｄ Ｏｌｄ）博士によって提供されたものであり、これらはよく知られている。ＳＫ２９−ＭＥＬ、ＳＫ２３−ＭＥＬ及びＮＡ８−ＭＥＬの培養培地は以前に記載されている（クーリ（Ｃｏｕｌｉｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８：３５−４２（１９９４））。腫瘍細胞ラインＬＢ３７３−ＭＥＬは、メラノーマ患者ＬＢ３７３由来であり、１０％ＦＣＳを追加したＩｓｃｏｖｅ培地で培養した。リンパ芽球細胞ＮＡ１７−ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたＢ細胞）、標準的技術によって患者ＮＡ１７から得られ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１％Ｌ−グルタミンを追加したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。
細胞溶解性Ｔ細胞ラインＣＴＬ２１３、参考文献として本出願にその内容が合体される、パンドルフィーノ（Ｐａｎｄｏｌｆｉｎｏ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１７９５−１８０２（１９９２）に記載されているように、ＩＬ２追加培地中で、患者ＮＡ１７の皮膚の転移メラノーマのフラグメントを培養することによって得られた。具体的には、皮膚の転移メラノーマＭ１７のフラグメントは、ＲＰＭＩ１６４０、８％ヒトＡＢ血清、１５０Ｕ／ｍｌの組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ２）及び抗生物質からなるＩＬ−２追加培地で培養した。このタイプの培養の結果、混合リンパ球−腫瘍細胞培養物（mixed lymphocyte-tumor cell culture）（ＭＬＴＣ）が得られた。ＣＴＬをクローニングに先立って１６日間培養した。
次に、ＣＴＬの限界希釈培養を、９６穴マイクロプレート中、０．３、０．６、３、６及び３０ＣＴＬ／ウェルで照射を受けた支持細胞と刺激細胞（２ｘ１０4ＬＡＺ細胞と１．５ｘ１０3メラノーマ細胞）とともに、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）（１／１０００）を含有する２００μｌのｒＩＬ−２培地中で行った。４８時間後、そしてその後は週に２回、各ウェルの半量を新鮮なＩＬ−２培地で置換した。１５から２０日の培養の後、各ウェルを顕微鏡観察によって、増殖について評価した。８０％を超えるクローンとなる可能性を示すミクロ培養（microcultures）を、新たに照射した支持細胞と刺激細胞とともに新しいプレートへ移した。同様に、ウェル当たり２ｘ１０3又は５ｘ１０3のリンパ球を２又は３週間おきに移すことによって長期クローン増殖（long-term clone growth）が得られた。ＣＴＬクローンのうち１つがＣＴＬ２１３と表示された。ヴィレット（Ｖｉｒｅｔ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１４３−１４６（１９９３）は、ＣＴＬ２１３は細胞溶解アッセイによってテストされた１５のメラノーマ細胞ラインのうち１２を溶解したと教示している。このＣＴＬを以下の実験において用いた。
例  ２
細胞ラインＮＡ１７−ＭＥＬの自己細胞（autologous cell）とＣＴＬ２１３とを混合した。これは、ＣＴＬ２１３がこのメラノーマ細胞ラインに提示される抗原を認識するか否かを確かめる目的で行った。用いたアッセイは、参考文献として本出願にその内容が合体される、ヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９：３９０−３９６（１９８７）に記載されている、周知の51Ｃｒ放出試験であった。しかし、ここでこのアッセイについて記載する。標的メラノーマ細胞をイン・ヴィトロで増殖させ、その後、１０％ＦＣＳを追加したＲＰＭＩ１６４０中に１０7細胞／ｍｌとなるように再懸濁し、３７℃で４５分間２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（51Ｃｒ）Ｏ4とともにインキュベートした。標識化された細胞を１０％ＦＣＳを追加したＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄した。次にこれらの細胞を１０％ＦＣＳを追加したＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁し、その後１０3の細胞を含む１００μｌのアリクオットを９６穴マイクロプレートに分配した。ＣＴＬ２１３のサンプルを１００μｌの同じ培地中で添加し、アッセイを二連で行った。プレートを８％ＣＯ2環境中で、３７℃で４時間インキュベートした。
プレートを遠心分離にかけ、上清のうち１００μｌのアリクオットを収集しカウントした。51Ｃｒ放出のパーセンテージは以下の様に計算した。
％51Ｃｒ放出＝（（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ））ｘ１００
ここで、ＥＲは実験に基づき観察された51ＣＲ放出であり、ＳＲは１０3の標識化細胞を２００μｌの培地のみの中でインキュベートすることにより測定される自然放出であり、そしてＭＲは標的細胞に１００μｌの０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加することにより得られる最大放出である。
ＮＡ１７−ＭＥＬ細胞（標的細胞、即ち“Ｔ”）とＣＴＬ２１３細胞（エフェクター細胞、即ち“Ｅ”）をＥ／Ｔ比が１０：１となるように混合した。ナチュラルキラー細胞（細胞ラインＫ５６２）及び自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）ＥＢＶ−形質転換−β細胞（“ＮＡ１７−ＥＢＶ”）についてもテストした。51Ｃｒ放出は４時間後に測定した。結果を図１に示す。これらの結果は、ＣＴＬ２１３がＮＡ１７−ＭＥＬ細胞表面上のペプチド／ＭＨＣ複合体を認識したということを示している。ＣＴＬ２１３はＫ５６２と自己（autologous）ＥＢＶ−Ｂ細胞のどちらも溶解しなかった。従って、関係のある抗原をコードする遺伝子はＮＡ１７細胞のみにおいて発現していたことが示された。
例  ３
ＣＴＬ２１３に特異的である抗原を提示するＭＨＣ分子を、ヴィレット（Ｖｉｒｅｔ）他，（前述）に記載されている、２種の抗−ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた溶解阻害によって決定した。使用した抗体は、ハイブリドーマＰＡ２．１（抗−Ａ２／Ａ２８）及びＭＡ２．１（抗−Ａ２／Ｂ１７）から得た。これらのｍＡｂは、当業者に周知の多数のＨＬＡ−Ａ２特異的ｍＡｂを代表するものである。
ＣＴＬ２１３による細胞溶解反応のｍＡｂによる阻害は、２００Ｕ／ｍｌの組換えインターフェロンα（γＩＦＮ−α）で４８時間処理したＮＡ１７腫瘍細胞（ヴィレット（Ｖｉｒｅｔ）他，（前述）においてはＭ１７と呼ばれている）についてアッセイした。溶解は抗−Ａ２／Ａ２８及び抗−Ａ２／Ｂ１７抗体によって用量依存的に阻害された。これは当該抗原を提示する分子はＨＬＡ−Ａ２であることを示している。
例  ４
以前に、その細胞表面にＨＬＡ−Ａ２を提示することが同定されている、同種の（allogeneic）メラノーマ細胞ラインを用いて、ＣＴＬ２１３に関するさらなる実験を行った。用いられたアッセイは、参考文献として、本出願にその内容が合体される、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３５：１３５−１４２（１９９２）に記載されている、ＴＮＦ放出アッセイであった。簡単に言えば、ＴＮＦ放出を測定するために、１０％ヒト血清及び２５ユニット／ｍｌのｒ−ｈｕ−ＩＬ２を含有する、１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地中で、２５００細胞のＣＴＬ２１３を、標的細胞を含むマイクロウェルに添加した。４８時間後上清を回収し、そのＴＮＦ含有量を、ＷＥＨＩ−１６４クローン１３細胞に対するその細胞障害効果をテストすることによって測定した。標的同種細胞ライン（target allogeneic cell lines）は、ＳＫ２９−ＭＥＬ、ＬＢ３７３−ＭＥＬ、ＳＫ２３−ＭＥＬ、ＮＡ７４−ＭＥＬ及びＭＺ２−ＭＥＬ４３．ＨＬＡ−Ａ２であった。図２に示すように、５つのラインのうち４つが陽性であり、そして同（allogeneic）ラインＭＺ２−ＭＥＬ４３．ＨＬＡ−Ａ２（以後“ＭＥＬ．４３と称する）はＮＡ１７−ＭＥＬよりも良好な結果を提供した。この理由のため、以下の実験ではＭＥＬ．４３を用いた。ＭＥＬ．４３は本来はＨＬＡ−Ａ２を提示しないものであり、ＨＬＡ−Ａ２をコードする遺伝子を含むベクターで、トランスフェクションされたものであるということが注目される。
例  ５
提示ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ａ２であると同定されたので、このペプチド／ＭＨＣ複合体をさらにキャラクタライズするための研究を行った。第１段階は、当該ペプチドへとプロセッシングされる分子を同定することに関するものであった。
これを行うため、ｍＲＮＡ抽出キットを用いてＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞からポリ−Ａ＋ＲＮＡを抽出した。このｍＲＮＡをオリゴｄＴ（ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ）プライマーを用いて、ｃＤＮＡに変換し、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔプラスミドシステムキット（Ｂｉｂｃｏ ＢＲＬ）に記載されているように、ＢｓｔＸＩアダプターに連結し、ＮｏｔＩで切断し、そして製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）の使用説明書に従って発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡＭＰのＢｓｔＸＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入した。組換えプラスミドをＤＨ５の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂａｃｔｅｒｉａ）にエレクトロポーレーションし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で選抜した。
形質転換されたバクテリアをそれぞれ１００のバクテリアからなる６４７のプールに分けた。各プールは約９０の異なるｃＤＮＡに相当していた。というのは、分析によって約９０％のプラスミドがインサートを含んでいることが示されたからである。各プールを、飽和するまで増幅（増殖）させ、そしてプラスミドＤＮＡをアルカリ溶菌、酢酸カリウム沈殿、及びフェノール抽出によって単離した。上記のプロトコールは、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８２）に従った。セシウム勾配遠心分離法は用いなかった。
増幅させたプラスミドを、次に、ＨＬＡ−Ａ２をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐｃＤＮＡＩ−Ａｍｐ−Ａ２とともに、真核細胞に共トランスフェクションした。ＣＯＳ−７細胞のサンプルを、１０％胎児ウシ血清を追加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ（“ＤＭＥＭ”）中で組織培養平板マイクロウェルに１５，０００細胞／ウェルとなるように播種した。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、培地を除去し、そして１０％ヌー(Nu)血清、４００μｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン、１００μＭクロロキン、１００ｎｇのプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２及び１００ｎｇの前述したｃＤＮＡライブラリーのプールのＤＮＡを含有する、ＤＭＥＭ培地で３０μｌ／ウエルとなるように置換した。３７℃での４時間のインキュベーションの後、培地を除去し、１０％ＤＭＳＯを含有する５０μｌのＰＢＳで置換した。この培地を２分後に除去し、１０％ＦＣＳを追加した２００μｌのＤＭＥＭで置換した。
この培地交換の後、ＣＯＳ細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。次に、培地を捨て、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を追加した、１０％プールヒト血清（pooled human serum）を含有する、ＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌ中にて、２５００細胞のＣＴＬ２１３を添加した。上清を２４時間後に除去し、前述したようにＷＥＨＩ−１６４クローン１３細胞を用いた、ＴＮＦアッセイによってＴＮＦ含有量を測定した。
二連でテストして６４７ウェルのうち、ほとんどのものはｍｌ当たり１ｐｇから４ｐｇの間のＴＮＦを産生した。しかしながら、２つのプールは二連でｍｌ当たり４及び８及び５及び６ｐｇのＴＮＦを上清中に産生した。これらの結果を考慮して、これらのプールを次のトランスフェクションにおいて用いた。
例  ６
これらの２つの陽性と推定されたプールについて確かめるため、これらのプールと他のいくつかのプールとを用いて次のトランスフェクションを行った。２つの陽性と推定されたプールのうち１つは前と変わらず明らかに陽性であった（二連で１０及び９ｐｇ／ｍｌ、一方他のミクロ培養（microcultures）では３ｐｇ／ｍｌ以下であった）。
この陽性プールのバクテリアをクローニングし、そして１１５０のバクテリアについてテストした。これらのプラスミドＤＮＡを抽出し、前述のＨＬＡ−Ａ２コンストラクト（ｐｃＤＮＡ−Ａｍｐ−Ａ２）とともに共トランスフェクションし、そしてそのＣＯＳ−７共トランスフェクタント（cotransfectant）について、前述の方法で、それらがＣＴＬ２１３を刺激する能力をテストした。この陽性プールの中から、２つの陽性クローンが見つかった。これらのｃＤＮＡクローンのうち１つ（５６０Ｅ１）を用いて得られた結果を図３に示す。図３は、ＣＴＬ２１３がＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションされたＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞と接触すると、ＴＮＦが放出されることを示している。ＣＴＬ２１３が、ＨＬＡ−Ａ２と５６０Ｅ１ｃＤＮＡとで共トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞と接触した場合においてもＴＮＦが放出される。ＣＴＬ２１３が、ＨＬＡ−Ａ２単独でトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞、又は５６０Ｅ１ｃＤＮＡ単独でトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞と接触した場合では、どちらにおいてもＴＮＦは放出されない。
例  ７
ｃＤＮＡ５６０Ｅ１の配列決定を行った。ＤＮＡ配列決定分析は、合成オリゴ又クレオチドを用いた特異的プライミングによって行った。シークエンシング反応はジデオキシ−チェインターミネーション法を用いて行った。配列が推定されたので、シークエンスホモロジーについてのコンピュータサーチをプログラムＦＡＳＴＡ＠ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ及びｂｌａｓｔ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを用いて行った。
ｃＤＮＡ５６０Ｅ１（配列番号１）は、２２３７塩基対長である。５６０Ｅ１の配列とｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ｌｉｂｒａｒｙ中の配列との比較により、５６０Ｅ１のヌクレオチド８４−２３０は、サイトウ（Ｓａｉｔｏ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８：３１８（１９９４）に記載されている、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（N-acetylgucosaminyltransferaseV（“ＧｎＴ−Ｖ”））をコードするｃＤＮＡの一部と同一であることが明らかになった。５６０Ｅ１の上流塩基対１−８３はｃＤＮＡライブラリー中の他のどの配列とも重要なホモロジーを示さなかったが、以下に述べるように領域１−８３はＧｎＴ−Ｖのイントロンに対してもホモロガスである。
例  ８
５６０Ｅ１由来であってＨＬＡ−Ａ２によって提示される抗原（ここで“ＮＡＧ抗原”と称する）を決定するために、標準的技術を用いてｃＤＮＡ５６０Ｅ１について、エキソヌクレアーゼ切断を行い、ｃＤＮＡフラグメントを調製した。エキソヌクレアーゼ切断を行うために、ｃＤＮＡ５６０Ｅ１を含むプラスミドを、エキソヌクレアーゼIIIによる切断に先立って、ＮｏｔＩ及びＳｐｈＩを用いて開裂させた。この処理はＥｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅ（登録商標）システム（ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行った。ライゲーションの後、プラスミドをＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂａｃｔｅｒｉａ）にエレクトロポーレーションし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で選抜した。クローンを単離し、プラスミドＤＮＡを各クローンから抽出し、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子とともにＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。ＮＡＧ抗原を発現する領域が同定された。この領域は配列番号１のヌクレオチド１−２９１にわたっていた（図４）。
この領域（即ちヌクレオチド１−２９１）の様々な部分を、ポリメラーゼ連鎖反応及び標準的技術を用いて増幅させた。ＰＣＲ増幅によって、ＣＤＮＡクローン５６０Ｅ１から（複数の）フラグメントを生成させた。末端を平滑化、及びリン酸化し、フラグメントをＥｃｏＲＶで切断したベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにサブクローニングした。ＰＣＲフラグメント１−１８５を生成させるために、ＶＢ１（５’−ＡＣＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣ−３’）（配列番号２）をセンスプラマー（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐの位置２９１５から２９３２に相補的である）として使用し、そしてＶＢ５６（５’−ＴＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧ−３’）（配列番号３）をアンチセンスプライマーとして使用した（ＰＣＲフラグメントの境界は、ｃＤＮＡ５６０Ｅ１の第１ヌクレオチドに対して相対的なヌクレオチド位置として示されている）。ＰＣＲフラグメント３５−８２を生成させるために、ＶＢ７２（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＴＧ−３’）（配列番号４）をセンスプライマー（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列をｃＤＮＡ５６０Ｅ１の位置３５におけるＡＴＧ開始部位の上流に追加したことに注目のこと）として使用し、そしてＹＧ１５（５’−ＣＴＡＧＴＧＴＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＣＡＣＡＧＣＧＴＡＴＧＡＡ−３’）（配列番号５）をアンチセンスプライマーとして使用した。
この手法により、当該抗原の発現を移入する（transfer）ことができる、４８塩基対の領域（ヌクレオチド３５から８２）を同定した。そしてこの領域は、前述のようにＨＬＡ−Ａ２遺伝子を含むベクターとの共トランスフェクション実験において、ＣＴＬ２１３による溶解を引き起こした。次に、この４８塩基対配列によってコードされるアミノ酸配列を既知のＨＬＡ−Ａ２結合コンセンサス配列を比較した。このコンセンサス配列はＸａａ（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｍｅｔ）Ｘａａ3ＺＸａａ2（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）であり、ここにおいてＺ＝Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒである（フォーク（Ｆａｌｋ）他，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：２９０−２９６（１９９１）及びルッパート（Ｒｕｐｐｅｒｔ）他，Ｃｅｌｌ，７４：９２９−９３７（１９９３））。ＨＬＡ−Ａ２コンセンサス配列と非常によく似た２つの配列が、この４８塩基対領域の中において見つかった。
例  ９
これらの２つの配列によってコードされるペプチドＶａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ（配列番号６）及びＰｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｉｌｅ（配列番号７）を合成し、テストした。これらのペプチドを、アサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）他，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，１：５３８（１９８１）に記載されているようにＦ−ｍｏｃを一過性のＮＨ２−末端保護用に使用して、固相上で合成し、そして質量分析法によりキャラクタライズした。全てのペプチドは、＞９０％の純度であることが分析用ＨＰＬＣにより示された。凍結乾燥したペプチドをＤＭＳＯ中に溶解させ、−８０℃で保存した。これらをブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｄ．，１５２：１１８４−１１９３（１９８８）に記載されているようにクロム放出試験によりテストした。このペプチド感作アッセイにおいて標的細胞を３７℃で１時間かけて51Ｃｒ−標識化し、そして広範に（extensively）洗浄した。次に、１００００のＣＴＬ２１３細胞を添加するのに先立って、１０００の標的細胞を３７℃で３０分間、様々な濃度のペプチドの存在下で９６穴マイクロプレート中でインキュベートした。クロム放出を３７℃で、４時間後に測定した。５６０Ｅ１のヌクレオチド３８−６７に対応する１０マーのＮＡＧ抗原ペプチド、Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ（配列番号６）（アミノ酸１−１０）のみが標的Ｔ２細胞ラインをＣＴＬ２１３に対して感作した。
２種のノナマーペプチド（アミノ酸１−９及びアミノ酸２−１０）を合成し、テストした。ヌクレオチド３８−６４に対応するＮＡＧ抗原ノナペプチドＶａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｃｙｓ（配列番号８）（アミノ酸１−９）は、標的Ｔ２細胞ラインをＣＴＬ２１３に対して感作した。オクタペプチドＶａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ（配列番号９）（アミノ酸１−８）は、全く認識を引き起こすことができなかった（図５）。配列番号８を、前述のサイトウ（Ｓａｉｔｏ）他，により示されたＧｎｔ−Ｖのエキソンと比較して際、このペプチドは見られないということが判った。また、配列番号１のリーディングフレームはＧｎｔ−Ｖのものと異なっているということが確認された。
例  １０
前に言及したように、５６０Ｅ１、ｃＤＮＡとＧｎｔ−ＶｃＤＮＡの間の類似性が示されているので、たとえあるとしたら、５６０Ｅ１ｃＤＮＡとＧｎｔ−Ｖ−ｃＤＮＡの間にどのような関係があるのか調査するために、さらに研究を行った。
まず最初に、λファージ中にＭＺ２−ＭＥＬ．２．２．５ＤＮＡのゲノムライブラリーを標準的技術を用いて調製した。このライブラリーを５６０Ｅ１ｃＤＮＡのヌクレオチド４８−１８５からなる32Ｐ−標識化プローブ（プローブ“Ｂ”）でプロービングした。
プロービングの結果、１４キロベースのインサートを有するファージが同定された。このインサートを切り出し、ＳａｃＩで切断したところ５．５ｋｂのフラグメントと８．５ｋｂのフラグメントが生じた。次に、これらのフラグメントを、１４ｋｂインサートについて使用したプローブ“Ｂ”と、配列ＧＧＴＴＴＣＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣ（配列番号１０）を有する32Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドである、プローブ“Ａ”とを用いてプロービングした。８．５ｋｂのフラグメントはプローブＢとハイブリダイズし、そして５．５ｋｂのフラグメントはプローブＡとハイブリダイズした。この２つのフラグメントをプラスミドｐＴＺ１９Ｒにサブクローニングし、周知の技術によって部分的に配列決定した。
８．５ｋｂフラグメントは５６０Ｅ１ｃＤＮＡの最初の８３ヌクレオチドを含んでおり、それはスプライス受容部位で終端しており、その後にＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの一部分に対してホモロガスであるヌクレオチド８４−２３０が続くということが判明した。このフラグメントの後にはスプライス供与部位が隣接している。５６０Ｅ１ｃＤＮＡの最初の８３ヌクレオチドは、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ中には見られないということに注目するべきである。
５．５ｋｂフラグメントを配列決定したところ、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡと比較した際に、前述の塩基８４−２３０の配列の上流にみられる、１５０塩基対の配列を含むことが判明した。図７はこれをいくらか詳しく示している。
１５０塩基対と１４７塩基対の配列はＧｎＴ−ＶｃＤＮＡにおける２つの隣接したエキソンを表している：５．５ｋｂフラグメント中にみられるエキソンＡはＧｎＴ−ＶｃＤＮＡのヌクレオチド１５２６−１６７５からなる。８．５ｋｂフラグメント中にみられるエキソンＢはＧｎＴ−ＶｃＤＮＡのヌクレオチド１６７６−１８２２からなる。前記ペプチドをコードする配列は、ＧｎＴ−ＶエキソンＡとＢとの間からなるイントロン（図７中にイントロンＩ）の最後の部分に位置している。この配列はＧｎＴ−Ｖをコードするものとは異なるオープンリーディングフレームに属する。
例  １１
抗原性ペプチドをコードするイントロン領域は、サイトゾル内に部分的にスプライシングされていないＧｎＴ−Ｖメッセンジャーが存在する結果、それが翻訳のために用いられる可能性がある。他の可能性として、いくらかのメラノーマ細胞中では、イントロン中に位置するプロモーター領域が活性化されて、その結果、イントロンＩの最後の部分から開始するメッセンジャーが生じるのかもしれない。本発明者らは、メッセンジャーの５’末端を同定するためにＲＡＣＥプロトコールを用いることによってこれらの可能性を見分けることを試みた。
５’末端の増幅は５’−Ａｍｐｌｉｆｉｎｄｅｒ（商標）ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて行った。ｃＤＮＡ合成のために用いたプライマーはＹＧ１０４（５’−ＣＡＧＣＧＴＡＴＧＡＡＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣ−３’）（配列番号１１）であった（これはｃＤＮＡ５６０Ｅ１のヌクレオチド位置４３からヌクレオチド位置６３に対応）。ｃＤＮＡをキットに記載されているように、Ａｍｐｌｉｆｉｎｄｅｒ（商標）アンカーに連結した。ファーストラウンドＰＣＲ増幅は、アンチセンスプライマーＹＧ１０４と、５’−Ａｍｐｌｉｆｉｎｄｅｒ（商標）ＲＡＣＥキットに記載されているセンスＡｍｐｌｉｆｉｎｄｅｒアンカープライマーとを用いて行い、そしてセカンドランド増幅はＹＧ２０（５’−ＡＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＡＣ−３’）（配列番号１２）（これはｃＤＮＡ５６０Ｅ１のヌクレオチド位置２５からヌクレオチド位置４２に対応）と、同じＡｍｐｌｉｆｉｎｄｅｒアンカープライマーとを用いて行った。増幅産物をＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）クローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のベクターにクローニングし配列決定した。３つのクローニングしたＰＣＲ産物のシークエンシングにより、それらの配列がイントロンＩの最後の部分と同一であることが明らかになったが、それらは、長さにおいてそれぞれ互いに異なっていた：１つのクローンはエキソンＢの９１塩基対上流から、もう１つのクローンは（エキソンＢの）１９９塩基対上流から、そして最長のクローンは（エキソンＢの）２４７塩基対上流から開始している。第１回目の実験で得られたクローンは比較的短く、そして全てが異なるサイズであったので、５’末端増幅について、第２回目の実験を行った。第２回目の実験では、ＹＧ１０４をｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして用い、アンチセンスプライマーＹＧ２０（配列番号１２）と、Ａｍｐｌｉｆｉｎｄｅｒ ＲＡＣＥキットに記載されているセンスＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲアンカープライマーとを、ファーストラウンドＰＣＲ増幅に用い、そしてアンチセンスプライマーＹＧ３１（５’−ＣＡＣＴＡＴＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧ−３’）（配列番号１３）（これは、第１回目の実験で得られたクローン内において、ＹＧ２０よりも１６１ｎｔ５’側に位置する）と、センスＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲアンカープライマーとを、セカンドラウンドＰＣＲ増幅に用いた。産物を上記のようにクローニングした。８つのクローニングされたＰＣＲ産物はすべて同じ配列を共有しており、それはイントロンＩの最後の部分と同一であり、そしてエキソンＢの２７０塩基対上流から開始していた。第３回目のＲＡＣＥ実験ではエキソンＢ内に位置するアンチセンスプライマー（ＶＢ５６）（配列番号３）を逆転写のために用い、増幅のラウンドはアンチセンスプライマーＹＧ１０４とＹＧ２０を連続して用いて行った。４つのクローニングされたＰＣＲ産物を配列決定した。すべてがイントロンＩの最後の部分と同一であり、エキソンＢの９６、２２１、２３４、及び２８７塩基対上流から開始していた。
ｃＤＮＡライブラリーの中から、ＮＡＧ腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするより長いｃＤＮＡをサーチすることにより、ｃＤＮＡ５６０Ｅ１はおそらく関係のないｃＤＮＡとの間の組換え産物であろうということが示された。すなわち、ｃＤＮＡ５６０Ｅ１の９７３塩基対のＸｂａＩ制限断片（図７）に対応するプローブを用いてコロニーハイブリタイゼーション研究を行ったところ、ヌクレオチド２３１まではｃＤＮＡ５６０Ｅ１と異なる５’末端を有し、一方３’末端部はｃＤＮＡ５６０Ｅ１の３’末端とホモロガスであるいくらかのクローンが得られたのである。その結果、周知のＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）技術を使用してｃＤＮＡの３’末端をサーチすることにした。
３’末端を増幅する際に、ｃＤＮＡ合成のために用いたプライマーは、フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５１：８９９８−９００２（１９８８）に記載されている、ＥＤＰ１２６０（５’−ＧＡＣＦＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）（配列番号１４）であった。ファーストＰＣＲ増幅はセンスプライマーＶＢ７２（５’−ＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＴＧ−３’）（配列番号１５）（これはｃＤＮＡ５６０Ｅ１のヌクレオチド位置３５からヌクレオチド位置５２に対応）とアンチセンスプライマーＥＤＰ１２６０とを用いて行った。セカンドＰＣＲ増幅は、センスプライマーＶＢ４５（５’−ＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＡＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＴ−３’）（配列番号１６）（これはｃＤＮＡ５６０Ｅ１のヌクレオチド位置４７からヌクレオチド位置６９に対応）とアンチセンスプライマーＥＤＰ１２６０とを用いて行った。増幅産物は上記のようにクローニングした。ｃＤＮＡ５６０Ｅ１の最初の８３ｎｔ中に位置するセンスプライマーを用いて行った、３’末端のｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎと、増幅産物のクローニングによりＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの３’末端（ヌクレオチド１６７５からヌクレオチド２４２１まで）とホモロガスな配列のｃＤＮＡクローンが得られた。このクローンを３’ＲＡＣＥクローンと称する。前述のアンチセンスプライマーＥＤＰ１２６０の配列をｃＤＮＡ合成とＰＣＲ増幅に用いた。この配列はこのクローン（３’ＲＡＣＥクローン）の３’末端には見られなかった。その代わりに、前述のファーストラウンド増幅において、センスプライマーとして用いたプライマーとである、ＶＢ７２の配列が見られ、アンチセンスプライマーとして利用されていた。
５’ＲＡＣＥの結果がＲＮＡ分子における推定局在（putative localized）二次構造によるアーティファクトではないということを確かめるために、イントロン配列＋／−上流９００塩基対と下流３００塩基対に囲まれたエキソンＢを含む、８．５ｋｂゲノムサブクローン由来の１．３ｋｂＨｉｎｄIII−ＳａｃＩ制限断片を転写ベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）にクローニングした。ＳａｃＩで切断したプラスミドに対して、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて対応するセンスＲＮＡを合成し、ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅＤＮＡｓｅＩで処理し、そして無関係な酵母ｔＲＮＡ中に希釈した。１／１０2、１／１０4及び１／１０6の問題のＲＮＡを含む２μｇの全ＲＮＡをアンチセンスプライマーＶＢ５６又はＹＧ１０４を用いて逆転写した。プラスミドＤＮＡのコンタミネーションを評価するために、同一のＲＮＡ希釈物についてＭ−ＭＬＶ−逆転写酵素を用いない、コントロール反応を行った。ＹＧ２０をアンチセンスプライマーとし、そしてＹＧ１１８をセンスプライマーとして用いて、ｃＤＮＡに対してＰＣＲを行った。ＹＧ１１８はイントロンＩ内に位置し、エキソンＢの５８５塩基対上流にある。もし、ＲＮＡ希釈物においてコンタミネーションプラスミドＤＮＡが残存していなければ、ｃＤＮＡ合成が推定局在二次構造により妨害されない場合に限り、特異的ＰＣＲ産物が選られる可能性ある。特異的バンドは実際に、１／１０2及び１／１０4ＲＮＡ希釈物から合成されたｃＤＮＡについて観察され、対応するＤＮＡコンタミネーションコントロールでは増幅は検出できなかった。
例  １２
ＧｎＴ−ＶｍＲＮＡとＮＡＧ抗原の、組織及び腫瘍における発現をＰＣＲを利用して判定した（図８参照）。ＰＣＲを行うために、デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＰＰ．１３０−１３５（１９８６）に記載されているように、トータルＲＮＡをグアニジン−イソチオシアネート法によって抽出した。逆転写を、反応容量２０μｌで、２μｇのトータルＲＮＡについて行った。この２０μｌの反応容量の中には、４μｌの５ｘ逆転写酵素バッファー、２μｌの２０ｍＭオリゴ（ｄＴ−１５）プライマー溶液、２０ＵのＭｏＭＬＶ逆転写酵素が含まれる。この反応物を４２℃で６０分間インキュベートした。
ＰＣＲを行うために、このｃＤＮＡ反応産物の１／２００に、２．５μｌの１０ｘ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼバッファー、０．５μｌのｄＮＴＰ各１０ｍＭ溶液、０．６２５μｌのプライマー各２０μＭ溶液、０．５ＵのＤｙｎａＺｙｍｅ（商標）及び水を最終容量が２５μｌとなるように追加した。ＮＡ１７−ＡｃＤＮＡの増幅（ＰＣＲ“Ｉ−Ｃ”）のために、前述のＶＢ４５（配列番号１６）をセンスプライマーとして用い、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡのヌクレオチド１８９０からヌクレオチド１９１３までからなる、ＹＧ２８をアンチセンスプライマーとして用いた。ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの増幅（ＰＣＲ“Ａ−Ｂ”）のために、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡのヌクレオチド１５３８からヌクレオチド１５６１までからなる、ＹＧ２６をセンスプライマーとして用い、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡのヌクレオチド１７２２からヌクレオチド１７４４までからなる、ＹＧ２９をアンチセンスプライマーとして用いた。ＰＣＲは３０サイクル（９４℃で１分、６２℃で２分、そして７２℃で２分）で行った。ＰＣＲ産物のうち１０μｌを、１．５％アガロースゲルでサイズ分別した。ＲＮＡ調製物の質はヒトβ−アクチンｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によってチェックした。このＰＣＲは、プライマー５’−ＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧ−３’）（配列番号１８）（エキソン３センス）及び５’−ＧＴＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡ−３’）（配列番号１９）（エキソン６アンチセンス）を用いて、９４℃で１分、６５℃で２分、そして７２℃で２分を２１サイクルで行った。
定量的発現測定のために、ｃＤＮＡを前述のように合成した。クローンＭ２２−ＭＥＬ．４３から得た純粋なＲＮＡが含められ、そして定量的ＰＣＲの各シリーズにおいて連続的に希釈された。スタンダードの直線的な曲線図表（linear curve）を得るために、サイクル数をＰＣＲＩ−Ｃについては２４にＰＣＲＡ−Ｂについては２５に、そしてβ−アクチンＰＣＲについては１８に減らした。微量の標識化ｄＣＴＰ（０．２μＣｉ）を追加し、そしてホスホーイメージャー技術（phosphor-imager technology）を使用して正確な定量を得た。
ＰＣＲ“Ａ−Ｂ”は、既知のＧｎＴ−ＶｍＲＮＡ由来の２０６塩基対−フラグメントを増幅させた。ＲＴ−ＰＣＲＡ−Ｂでテストした、２２の正常組織サンプルのすべて及び２９のメラノーマサンプルのすべてが陽性であった。ＲＴ−ＰＣＲ“Ｉ−Ｃ”は、イントロンＩの最後の部分を含み、従ってＮＡＧ抗原をコードするＧｎＴ−Ｖ転写産物からのみ、２７１塩基対−フラグメントを増幅させた。
様々な正常組織を、ＲＴ−ＰＣＲＩ−Ｃでテストした（表１）。メラノサイト細胞ライン（ＭＺ２−ＭＥＬ．４３ラインにおいて観察された発現レベルの６０％の発現レベル）と、１つの脳サンプル（テストした５つのうち１つ）及び１つの胸部サンプル（６つのうち１つ）（これらは非常にかすかなバンドを示した）を除くと、テストした４７サンプルはすべて陰性であった。最も強いバンドを示した脳サンプルは黒質サンプルに対応し、定量ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイを行ったところ４％の発現レベルを示した。１３のＨＬＡ−Ａ２腫瘍細胞ラインについて、定量ＲＴ−ＰＣＲＩ−Ｃ及びＣＴＬ２１３を用いたＴＮＦ放出アッセイを並行して行ってテストした。ＣＴＬ２１３によるＴＮＦ放出を刺激する、８つのＨＬＡ−Ａ２腫瘍細胞ラインは、ＭＺ−２ＭＥＬ．４３細胞ラインについて観察された発現レベル（ＮＡＧ抗原ｍＲＮＡ発現レベル）の８％と２９８％の間のＮＡＧ抗原ｍＲＮＡ発現レベルを示した。ＴＮＦアッセイにおいて陰性であった５つのＨＬＡ−Ａ２腫瘍細胞ラインは、ＭＺ−２ＭＥＬ．４３細胞ラインについて観察された発現レベルの３％以下の発現レベルを示した。
0003849102.tif 000002
４２のメラノーマ組織サンプルと１９８のメラノーマ以外の腫瘍サンプルについてＲ−ＰＣＲＩ−Ｃによるテストを行った。リファレンスであるＭＺ２−ＭＥＬ．４３ＲＮＡの８倍希釈物（１２．５％）について得られたバンドと同等か、あるいはそれより強いＰＣＲバンドを示したサンプルを、ＮＡＧ抗原発現が陽性であるものとみなした。検出可能なＰＣＲバンドを示さなかったサンプルを陰性であるものとみなした。定量ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイし、きわどい結果の場合には、２％と１２．５％の間のＰＣＲバンドを示したすべてのサンプルを中間であるものとみなした。結果を以下の表２において詳細に示す。メラノーマサンプルの半分はかなりのレベルのＮＡＧ抗原を発現していたが、一方ほとんどの他のタイプの腫瘍はそうではなかった（１つの肉腫と１つの脳腫瘍ではかなりのレベルのＮＡＧ抗原を発現している）。
0003849102.tif 000003
前述の諸例は、イントロン−発現（intron-expressed）ＮＡＧ腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子の単離を示す。本発明の一面はいくつかの核酸分子を編集したものからなる配列である。この配列を配列番号１７に示す。そこに記載したヌクレオチド配列を含む核酸分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子もまた本発明の一部をなす。ここで用いられる“ストリンジェントな条件”という用語は、当業者によく知られているパラメーターのことを指す。より具体的には、ここで用いられるストリンジェントな条件とは、３．５ｘＳＳＣ、１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、２５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ及び２ｍＭＥＤＴＡ中における６５℃で１８時間のハイブリダイゼーションのことを指す。このハイブリダイゼーションの後、２ｘＳＳＣ、０．１％、ＳＤＳ中において６５℃で２０分間にフィルターの洗浄を４回、そして０．３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において２０分間にわたる洗浄を１回行う。同じ程度のストリンジェンシーを生じるような、使用可能な他の、条件、試薬、その他もある。熟練した当業者はそのような条件について精通しているであろうから、それらはここでは提供しないことにする。
ＮＡＧコード配列を、発現ベクターにおいて、また、原核細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）及び真核細胞（例えばＣＨＯ又はＣＯＳ細胞）を含む宿主細胞、細胞ライン、そして細胞株のトランスフォーメーション（形質転換）又はトランスフェクションにおいて利用することが本発明に含まれるということも前記諸例から理解されるであろう。発現ベクターでは、前記配列がプロモーターに操作可能にリンクしていることが必要である。発現ベクター、ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸配列も含んでいてもよい。ベクターが両方（ＮＡＧ及びＨＬＡ−Ａ２）のコード配列を含んでいる場合では、通常はそれらのどちらも発現しない細胞をトランスフェクションするのに使用できる。例えば宿主細胞がすでにＨＬＡ−Ａ２を発現している場合には、腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列を単独で使用できる。前記コード配列を単独で使用できる。前記コード配列を含むベクターは所望であればＨＬＡ−Ａ２提示細胞において使用可能であり、そしてＮＡＧ腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子はＨＬＡ−Ａ２を発現しない宿主細胞においても使用可能である。従ってもちろん使用可能な特定の宿主細胞の制限はない。
本発明は、また、当業者に所望の発現ベクター又は複数のベクターを用意することを可能にする、発現キット（expression kit）も含む。そのような発現キットは、少なくとも先に記載したコード配列のそれぞれの分離した部分（separate portious）を含む。先に言及した、必要とされる配列が含まれる限り所望であれば他の構成要素を加えてもよい。
本発明の核酸分子とイントロン−発現ＴＲＡＰを区別するため、本発明をＮＡＧ核酸分子及びＴＲＡＰと呼ぶことにする。配列番号６及び配列番号８のＮＡＧ抗原性ペプチドも本発明の一部である。これらのＮＡＧ抗原性ペプチドは、例えばＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ａ２を提示する細胞を同定するために利用することができる。これを達成するための１つの方法として、例えば検出可能なシグナルを担持した、前記ペプチドを投与し、次いで前記ペプチドと結合した細胞を同定するというものが挙げられる。これを達成するための他の方法として、固相結合ペプチドの利用が挙げられる。固相結合ペプチドに、ＨＬＡ−Ａ２提示細胞が結合し、従ってアッセイされるサンプルからそれらを取り出すことになる。
それに加えて本発明は、特に脳、及びメラノサイトにおける、ＮＡＧＴＲＡＰの発現によって特徴づけられる疾患を、当業者が診断することを可能にする。これらの方法は、ＮＡＧＴＲＡＰ遺伝子の発現、及び／又は、ＨＬＡ−Ａ２によって提示されるＮＡＧＴＲＡのようなＮＡＧＴＲＡＰ遺伝子に由来するＮＡＧＴＲＡを判定することを含む。前者の場合、そのような判定は、ポリメラーゼ連鎖反応又は標識化ハイブリダイゼーションプローブを用いたアッセイを含む、いずれかの標準的核酸判定アッセイによっても行うことが可能である。後者の場合、ＮＡＧＴＲＡとＨＬＡとの複合体に対する、抗体のような結合パートナーを用いてアッセイするのが特に好適である。代わりの判定方法としては前述のタイプのＴＮＦ放出アッセイが挙げられる。
ＮＡＧＴＲＡＰをコードする核酸分子の単離によりＮＡＧＴＲＡＰ分子そのもの特に配列番号１７コードされるアミノ酸配列を含むＮＡＧＴＲＡＰ分子を単離することも可能になる。これらの単離分子にＮＡＧＴＲＡとして、又はＨＬＡ−Ａ２のようなＨＬＡとＴＲＡとの複合体をして提示された場合、アジュバントのような物質を組み合わせて、ＮＡＧＴＲＡＰ分子の発現によって特徴づけられる疾患の治療において有効なワクチンを作成することができる。それに加えて、非増殖性のガン細胞及び非増殖性のトランスフェクタント（transfectant）のような細胞であって、ＮＡＧＴＲＡ／ＨＬＡ複合体をその表面に提示する細胞からワクチンを調製することができる。細胞がワクチンとして使用されるすべての場合において、それらはＣＴＬ応答を引き起こすのに必要な一方の又は両方の成分をコードする配列でトランスフェクションされた細胞であってもよくもしくは、トランスフェクションされないで、両方の分子を発現する細胞であってもよい。さらに、ＮＧＡＴＲＡＰ分子、それと関連するＮＡＧＴＲＡ、及びＮＡＧＴＲＡとＨＬＡとの複合体は、当業者（当業分野に熟練したもの）によく知られている標準的技術を用いて抗体を作成するのに利用できる。
ここで“疾患”という用語が用いられた場合、それはＮＡＧ腫瘍拒絶抗原前駆体が発現する、すべての病的（異常）な状態を指す。そのような疾患の一例は、特にメラノーマである。
本開示に基づく治療上のアプローチは、ＨＬＡ−Ａ２のようなＮＡＧＴＲＡ提示細胞の溶解を導く、患者の免疫系による応答を前提としている。そのようなアプローチの１つは、問題の表現型の異常細胞を有する患者に、前記複合体に特異的なＣＴＬを投与することである。そのようなＣＴＬをインヴィトロで開発することは当業者の技術範囲内に含まれる。すなわち、血液細胞のような細胞のサンプルを前記複合体を提示する細胞に接触させると特異的なＣＴＬの増殖を誘発することができる。標的細胞は前述のタイプのＣＯＳ細胞のようなトランスフェクタントとすることができる。その表面に所望の複合体を提示するトランスフェクタントとすることができる。その表面に所望の複合体を提示するトランスフェクタントは問題のＣＴＬと結合すると、その（ＣＴＬの）増殖を刺激する。ここで用いたようなＣＯＳ細胞は他の適当な宿主細胞と同様に広く入手可能である。
養子移入（養子免疫細胞移入）と呼ばれる治療上の方法論を詳述すると、（グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６（５）：１９１７（１９８６）；レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２３８（７−１０−９２）；リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：１４０３−１４１０（１９９１）；カスト（Ｋａｓｔ）他，Ｃｅｌｌ，５９：６０３−６１４（１１−１７−８９））所望の複合体を提示する細胞をＣＴＬと結合させると、その結果それに特異的なＣＴＬが増殖する。増殖したＣＴＬは、次に特定の複合体を提示するいくらかの異常細胞によって特徴づけられる細胞異常を有する患者に投与される。すると、前記ＣＴＬが異常細胞と溶解し、それによって所望の治療目的が達成される。
前述の療法は少なくともいくらかの患者の異常細胞が問題に関連したＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示するということを仮定している。このことは非常に簡単に判定できる。というのは、特定のＨＬＡ分子を提示する細胞と同定する方法、及びこの場合はＮＡＧ配列であるが、適切な配列のＤＮＡを発現する細胞をどのように同定するかということについて、当業者は非常によく精通しているからである。上記のスクリーニング方法によって、問題に関連した複合体を提示する細胞が同定されれば、それらを患者からのサンプルと接触させることができる。ここにおけるサンプルはＣＴＬを含有するものである。もし、複合体提示細胞が（患者からの）混合ＣＴＬサンプルによって溶解されたならば、ＮＡＧ由来の腫瘍拒絶抗原が提示されており、その患者は前述の治療上のアプローチにふさわしい候補者であると考えることができる。
養子移入（養子免疫細胞移入）のみが本発明に従って利用できる両方の唯一の形態であるわけではない。ＣＴＬを数々のアプローチを利用して、インヴィヴォで刺激することも可能である。１つのアプローチ、すなわち前記複合体を発現する非増殖性の細胞の利用については、先に詳述した。このアプローチにおいて用いられる細胞は、照射をうけたメラノーマ細胞又は前記複合体（ＨＬＡ／ＴＲＡ複合体）を提示するのに必要な一方又は両方の遺伝子でトランスフェクションされた細胞のような、通常前記複合体を発現する細胞であってよい。チェン（Ｃｈｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１０−１１４（１９９１）は、治療法（therapeutic regime）における、ＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクション細胞の利用を示しており、このアプローチを例証している。様々な細胞タイプが利用可能である。同様に問題の遺伝子の一方又は両方を担持するベクターが利用可能である。ウイルスの又はバクテリアのベクターが特に好ましい。これらのシステムにおいて、問題の遺伝子は、例えばワクシニアウイルス又はバクテリアＢＣＧによって伝えられ、この物質は、事実上、宿主細胞に“感染”する。その結果得られた細胞は問題の複合体を提示し、自己のＣＴＬによって認識され、そしてそのＣＴＬは増殖する。問題のＨＬＡ分子を提示する、ＨＬＡ−Ａ２提示細胞への組み込みを容易にするためにＮＡＧ腫瘍拒絶抗原又はその前駆体自体とアジュバントとを組み合わせることによって、同様の効果が達成できる。ＴＲＡＰは、ＨＬＡ分子はペプチドパートナーを生じるためにプロセッシングされるが、一方ＴＲＡはさらなるプロセッシングをされる必要なく、提示される。
本発明は、ここにおいて、特定の実施例に言及して記載されているが、これらの実施例は単に本発明の様々な側面を提示しているにすぎないということが理解されるべきである。従って、これらの例示的な実施例の枠内で、多くの改変を行うことが可能であり、本発明の精神と範囲から逸脱することなく他の組み合わせを考慮することが可能であることが理解されるべきである。
配列リスト
(1)一般情報：
(i)出願人：ヤニック・ギユー；フランシーヌ・ジョトロー；ティエリー・ブーン−ファラー；ソフィー・ルーカス；ヴィンセント・ブリチャード
(ii)発明の名称：単離核酸分子、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ａ２と複合体を形成するペプチド及びその利用
(iii)配列の数：19
(iv)連絡先：
(A)宛名    ：フェルフェ・アンド・リンチ
(B)通り名  ：サード・アベニュー805
(C)都市名  ：ニューヨーク
(D)州名    ：ニューヨーク
(E)国名    ：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：10022
(v)コンピュータ読み取り可能フォーム
(A)媒体型式：3.5インチ フロッピーディスク，1.44Mbメモリ
(B)コンピュータ：IBM PS/2
(C)オペレーティング・システム：PC-DOS
(D)ソフトウェア：ワードパーフェクト(Wordperfect)
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：未定
(B)出願日  ：ここに同封
(C)分類    ：435
(vii)先の出願データ：
(A)出願番号：08/487,135
(B)出願日  ：1995年6月7日
(viii)弁理士／代理人情報：
(A)氏名    ：パスカリーニ，パトリシア，エイ
(B)登録番号：34,894
(C)参照／書類番号：LUD 5388-PCT
(ix)通信情報：
(A)電話  ：    (212)688-9200
(B)ファックス：(212)838-3884
(2)配列番号1の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：2237
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号1:
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(3)配列番号2の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：18
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号2:
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(4)配列番号3の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：26
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号3:
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(5)配列番号4の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：24
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号4:
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(6)配列番号5の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：34
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号5:
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(7)配列番号6の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：10
(B)タイプ：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号6:
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(8)配列番号7の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：9
(B)タイプ：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号7:
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(9)配列番号8の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：9
(B)タイプ：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号8:
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(10)配列番号9の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：8
(B)タイプ：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号9:
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(11)配列番号10の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：22
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号10:
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(12)配列番号11の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：21
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号11:
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(13)配列番号12の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：18
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号12:
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(14)配列番号13の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：22
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号13:
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(15)配列番号14の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：35
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号14:
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(16)配列番号15の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：18
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号15:
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(17)配列番号16の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：23
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号16:
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(18)配列番号17の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：1054
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号17:
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(19)配列番号18の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：19
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号18:
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(20)配列番号19の情報：
(i)配列特徴：
(A)長さ：19
(B)タイプ：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記述：配列番号19:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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