(57)【要約】トキソプラズマ・ゴンディの抗原タンパク質ＳＲＳ１，Ｐ２２、又はＰ５４を含んで成るトキソプラズマ・ゴンディに対するワクチン。このワクチンは、トキソプラズマ・ゴンディの感染に対して動物を保護し、シストの形成を抑制する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）由来の抗原ＳＲＳ１，Ｐ２２又はＰ５４を含んで成る、トキソプラズマ・ゴンディに対するワクチン。
【請求項２】
抗原ＳＲＳ１を含んで成り、該抗原ＳＲＳ１が配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号：２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つＳＲＳ１抗原が有する免疫原性を維持している蛋白質である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
抗原Ｐ２２を含んで成り、該抗原Ｐ２２が配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号：４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つＰ２２抗原が有する免疫原性を維持している蛋白質である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
抗原Ｐ５４を含んで成り、該抗原Ｐ５４が配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号：６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つＰ５４抗原が有する免疫原性を維持している、蛋白質である、請求１に記載のワクチン。
【請求項５】
配列番号：１に記載の塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、ＳＲＳ１抗原と同等の免疫原性を有するタンパク質を含んで成る、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
配列番号：３に記載の塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、Ｐ２２抗原と同等の免疫原性を有するタンパク質を含んで成る請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
配列番号：５に記載の塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、Ｐ５４抗原と同等の免疫原性を有するタンパク質を含んで成る、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
請求項１〜７に記載のワクチンの製造方法において、前記抗原タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物から前記抗原タンパク質を採取する工程を含んで成る方法。
【請求項９】
ヒト以外の哺乳動物をトキソプラズマ・ゴンディに対して免疫する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチンをヒト以外の哺乳類に投与することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、トキソプラズマ・ゴンディ由来の抗原を用いたワクチン並びにその製造方法及びその使用に関する。
背景技術
トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）はヒト及び多くの温血動物に対して感染性を有する寄生虫である。健康人へのトキソプラズマ感染（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）が死に至ることはまれであるが、感染が生涯にわたってつづくとともに、宿主の種々の器官でシスト（嚢胞）の形成がみられる。ヒトにおけるトキソプラズマ感染の症状としては、堕胎、胎児における重度の脳炎及び視覚障害がみられ、特に免疫障害がある人では種々の臨床症状が現れる。エイズ患者での中枢神経系へのトキソプラズマの日和見感染は死に至ることが多い。エイズ感染の拡大や臓器移植等における免疫抑制により、Ｔゴンディ感染の危険性が増大している。一方、家畜へのＴゴンディ感染は堕胎を引き起こすため、重大な経済的損失をもたらす。
これまでは、家畜への感染を防止するためのワクチンの開発に多くの努力が注がれてきており、Ｔゴンディの変種を用いた生ワクチンはいくらかの成果をあげている。しかし、これまでの生ワクチンは、その副作用、シェルフライフ（ｓｈｅｌｆ  ｌｉｆｅ）の短さ及び高価であるために、市場に広く受け入れられてはいない。また、生ワクチンは、危険な復帰突然変異（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）、予期できない大量感染及びヒトへの不慮の感染を引き起こす危険がある。
そのため、最近ではこのような危険を避けるために、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）に対するサブユニットワクチンやＤＮＡワクチンの開発に興味が集まっている。Ｔゴンディからは多くの抗原が単離され、それをコードする遺伝子の配列が決定されてクローン化されている。表面抗原の一つであるＳＡＧ１（Ｐ３０）は、表面抗原の中で最も支配的な抗原である。このため、トキソプラズマ・ゴンディに対するサブユニットワクチンの研究は、主として抗原ＳＡＧ１（Ｐ３０）について行われてきた。
しかしながら、抗原Ｐ３０は、トキソプラズマ・ゴンディに対するワクチン用免疫原としては、必ずしも有効なものではなかった。
発明の開示
従って本発明は、トキソプラズマ・ゴンディ由来のサブユニット抗原タンパク質を用いた、トキソプラズマ・ゴンディに対する新規なワクチンを提供しようとするものである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、トキソプラズマ・ゴンディ由来のタンパク質サブユニットの内、ＳＲＳ１，Ｐ２２及びＰ５４が、他のタンパク質サブユニットＰ３０及びＰ４３に比べて非常に高い免疫原性を有することを見出し、本発明を完成した。
従って、本発明は、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）由来の抗原ＳＲＳ１，Ｐ２２又はＰ５４を含んで成る、トキソプラズマ・ゴンディに対するワクチンを提供する。
本発明はまた、抗原ＳＲＳ１を含んで成り、該抗原ＳＲＳ１が配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号：２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つＳＲＳ１抗原が有する免疫原性を維持している蛋白質である、ワクチンを提供する。
本発明はまた、抗原Ｐ２２を含んで成り、該抗原Ｐ２２が配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号：４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つＰ２２抗原が有する免疫原性を維持している蛋白質である、ワクチンを提供する。
本発明はまた、抗原Ｐ５４を含んで成り、該抗原Ｐ５４が配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号：６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つＰ５４抗原が有する免疫原性を維持している蛋白質である、ワクチンを提供する。
本発明はまた、配列番号：１に記載の塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、ＳＲＳ１抗原と同等の免疫原性を有するタンパク質を含んで成るワクチンを提供する。
本発明はまた、配列番号：３に記載の塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされおり、Ｐ２２抗原と同等の免疫原性を有するタンパク質を含んで成るワクチン提供する。
本発明はまた、配列番号：５に記載の塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、Ｐ５４抗原と同等の免疫原性を有するタンパク質を含んで成るワクチンを提供する。
本発明はさらに、前記のワクチンの製造方法において、前記抗原タンパク質をコードるＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物から前記抗原タンパク質を採取する工程を含んで成る方法を提供する。
本発明はさらに、ヒト以外の哺乳動物をトキソプラズマ・ゴンディに対して免疫する方法であって、前記のワクチンをヒト以外の哺乳類に投与することを特徴とする方法を提供する。
発明の実施の形態
本発明の抗原タンパク質は、遺伝子組換え方法により、これをコードする遺伝子の発現により得るのが便利である。本発明に使用する抗原の遺伝子はイントロンを含まないので、抗原をコードするＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡを用いることができ、例えばトキソプラズマ・ゴンディのゲノムＤＮＡを用い、既知の配列に基いて設計したプライマー対を用いて、上記ゲノムＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ法などによりクローニングすることができる。また常法に従い、ｃＤＮＡライブラリーを用いて抗原をコードするｃＤＮＡをクローニングすることもできる。クローニングの具体例は実施例１に記載する。
典型的な配列の例として、ＳＲＳ１抗原タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に記載し、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に記載する。また、Ｐ２２抗原蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に記載し、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：４に記載する。さらに、Ｐ５４抗原タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：５に記載し、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：６に記載する。
従って、典型的な例として、本発明のＳＲＳ１抗原タンパク質は配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、Ｐ２２抗原タンパク質は配列番号：４に示すアミノ酸配列を有し、そしてＰ５４抗原タンパク質は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する。しかしながら、ある生物活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸の欠失、付加、他のアミノ酸による置換等により修飾されても生来の生物活性を維持することがよく知られている。
従って、本発明の抗原タンパク質には、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の免疫原性を維持しているタンパク質も含まれる。このような修飾された抗原タンパク質も含めて、本発明においてはＳＲＳ１抗原タンパク質と称する。
同様に、本発明の抗原タンパク質には、配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、配列番号：４に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の免疫原性を維持しているタンパク質も含まれる。このような修飾された抗原タンパク質も含めて、本発明においてはＰ２２抗原タンパク質と称する。
同様にして、本発明の抗原タンパク質には、配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、配列番号：６に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の免疫原性を維持しているタンパク質も含まれる。このような修飾された抗原タンパク質も含めて、本発明においてはＰ５４抗原タンパク質と称する。
上記の修飾において、修飾されるアミノ酸の数は、部位特定変異誘発法、ＰＣＲ法等常用のアミノ酸配列修飾手段により修飾可能な範囲であり、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、例えば１〜数個のアミノ酸の範囲である。
このような修飾された抗原タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば配列番号：１，３又は５に示す塩基配列を有するＤＮＡを、部位特定変異誘発法、ＰＣＲ法等の常用手段により修飾することにより得られる。さらに、Ｃ−末端が短縮された抗原タンパク質をコードするＤＮＡは、前記の塩基配列の所定の位置に終止コドンを導入することによっても得られる。
ある生物活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがクローニングされれば、そのＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、上記の生物活性を有するタンパク質をコードしていることがしばしばである。
あるＤＮＡの塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、その塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを得るためには、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
従って本発明の抗原タンパク質には、配列番号：１に示される塩基配列によりコードされる蛋白質のみならず、配列番号：１に示す塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、且つ配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の免疫原性を有するタンパク質も本発明に含まれ、このようなタンパク質を含めてＳＲＳ１抗原タンパク質と称する。
本発明抗原タンパク質にはまた、配列番号：３に示される塩基配列によりコードされる蛋白質のみならず、配列番号：３に示す塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、且つ配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の免疫原性を有するタンパク質も本発明に含まれ、このようなタンパク質を含めてＰ２２抗原タンパク質と称する。
本発明抗原タンパク質にはさらに、配列番号：５に示される塩基配列によりコードされる蛋白質のみならず、配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、且つ配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の免疫原性を有するタンパク質も本発明に含まれ、このようなタンパク質を含めてＰ５４抗原タンパク質と称する。
なお、参考のため、トキソプラズマ・ゴンディのＰ３０抗原タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：７及び８に示し、そしてＰ４３抗原タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：９及び１０に示す。
本発明の抗原タンパク質は、それをコードするＤＮＡを常法に従って発現せしめることにより製造することができる。一旦、所定のタンパク質をコードするＤＮＡがクローニングされれば、それを発現させて所定のタンパク質を製造するのは常用技術に過ぎない。すなわち、本発明の抗原タンパク質は、それをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って培養し、その培養物から前記抗原タンパク質を採取すればよい。その具体例を実施例１に示す。
実施例
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．抗原タンパク質の製造
トキソプラズマ・ゴンディＲＨ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、次の表１に示すプライマーを用いて、５種類の抗原タンパク質をコードするＤＮＡを増幅した。
2002017960.tif 000002
次に、上記のクローニングしたＤＮＡの各々を、大腸菌発現ベクターｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ニューヨーク、米国、から入手）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、このベクターにより大腸菌を形質転換し、この大腸菌を常法に従って培養して、前記抗原タンパク質を、遺伝子１０リーダーペプチドとの融合タンパク質として発現せしめた。培養した大腸菌細胞を遠心分離により集め、超音波処理（Ｕｌｔｒａ  Ｓｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ  ＵＰ−１５８，Ｔａｉｔｅｃｈ）により細胞破砕物を調製し、１８，０００×Ｇにおいて遠心分離することにより融合タンパク質を沈澱せしめた。
生成したペレットを洗浄し、リン酸緩衝液に再懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）により分離し、クマッシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ；ＣＢＢ）により染色した。融合タンパク質の含量を、抗原に対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ−ＣＢＢバンドの濃度により決定した。同様にして、前記融合タンパク質の一部分を構成する遺伝子１０ペプチドを調製した。
前記大腸菌からのコード遺伝子のそれぞれをｐＵＣ１９（東洋紡）にサブクローニングし、そしてＰＲＩＳＭ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＥ  Ａｐｐｌｒｉｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、日本）を用いて、標準的方法により配列決定した。得られたＤＮＡのコード領域の塩基配列を配列番号：１（ＳＲＳ１）、配列番号：３（Ｐ２２）、配列番号：５（Ｐ５４）、配列番号：７（Ｐ３０）、及び配列番号：９（Ｐ４３）に示し、そしてこれらによりコードされているアミノ酸配列を配列番号：２（ＳＲＳ１）、配列番号：４（Ｐ２２）、配列番号：６（Ｐ５４）、配列番号：８（Ｐ３０）、及び配列番号：１０（Ｐ４３）に示す。
実施例２．免疫感作実験
この実験のため、上記５種類の抗原タンパク質ＳＲＳ１，Ｐ２２，Ｐ５４，Ｐ３０及びＰ４３、並びに比較のために上記５種類の抗原タンパク質を混合したもの（混合抗原と称する）、融合タンパク質の一部分を構成する遺伝子１０ペプチド（Ｇｅｎｅ１０と称する）、及びトキソプラズマ・ゴンディの細胞溶解物（ＴＬと称する）を用いた。この細胞溶解物ＴＬの全タンパク質量は、ＴＬをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）と共に３７℃にて１時間インキュベートした後の５６２ｎｍにおける吸光度により測定した。
実験用Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、Ｃｌｅａ  Ｊａｐａｎ（静岡）から購入した。このマウスは８週令で実験に供した。マウスは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅにより認可された動物実験ガイドラインに従って扱った。
前記すべての抗原は使用前にリン酸緩衝液により１μｇ／μＬの濃度に調製し、０．１ｍｇのタンパク質をマウスの腹腔内に２週間間隔で２回投与した。初回は、フロインド完全アジュバントと共に投与し、２回目はフロインド不完全アジュバントと共に投与した。
前記第２回目の抗原投与から２週間後に、トキソプラズマのチャレンジを行った。すなわち、トキソプラズマ・ゴンディＢｅｖｅｒｌｙ株のブラデイゾイト（ｂｒａｄｙ  ｚｏｉｔｅ）の新鮮な細胞３００個を０．５ｍＬのリン酸緩衝液に懸濁し、マウスの腹腔内に接種した。チャレンジ後４ヶ月間、生存及び臨床的所見について観察を行った。この間生存したマウスについては４ヶ月後に殺した後、脳内の組織シストを観察した。無菌リン酸緩衝液を、摘出した脳に加えて３ｍＬとし、ガラスホモジナイザーによりホモジナイズし、氷上に保持した。脳懸濁液の１０μＬのスポット１０個を顕微鏡により観察した。
さらに、全ホモジネートをおよそ３等分し、３匹のＳＰＦマウスの腹腔に注射した。これらのマウスを、臨床所見によるトキソプラズマ感染、ＥＬＩＳＡによる血清分析、及び顕微鏡による脳シストの観察により試験した。
すべてのマウスにおいて、見かけ上の実験的トキソプラズマ感染が認められた。チャレンジの約１週間後、数日間にわたり、マウスの活動が低下し、毛が立った。その後、Ｐ２２，ＳＲＳ１，Ｐ５４又は混合抗原を投与されたマウスの内の幾匹かは前記の症状が消滅し、生存し、他のマウスは死亡した。トキソプラズマの細胞溶解物（ＴＬ）により免疫されたマウスは他の群に比べて症状が穏和であったが、実験期間中に生存率は徐々に低下した。Ｐ２２，ＳＲＳ１，Ｐ５４又は混合抗原を投与された群の累積死亡率は、バックグラウンドに比べて有意に低かった。結果を表２に示す。
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チャレンジから４ヵ月後に生存していたマウスの脳における組織シストを測定したところ、Ｐ２２，ＳＲＳ１又はＰ５４抗原を投与されたマウスでは検出されなかったが、トキソプラズマ細胞溶解物（ＴＬ）を投与されたマウスにおいては２０００個以上のシストが観察された。各マウスの結果を次の表３に示す。
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シストの形成を他の方法により試験するため、Ｐ２２又はＳＲＳ１を投与され、チャレンジ後４ヵ月後生存したマウスの脳のホモジネートを他のマウスに注射したところ、すべてのマウスにおいて注射後２ヵ月目に有意な臨床所見は見られず、ＥＬＩＳＡにおいて血清陽性応答は生じず、そして脳中に組織シストは存在しなかった。
以上の通り、本発明のトキソプラズマ・ゴンディに対するワクチンは、トキソプラズマ感染から動物を保護し、シストの生成を防止した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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