(57)【要約】本発明者らは虚血性心不全、特に心筋梗塞後心不全において生存率を改善する薬剤を鋭意探索する過程において、βＡＲＫ１阻害剤であるβＡＲＫｃｔが、心筋梗塞後心不全に対して心機能改善作用だけでなく生存率改善作用を有することを見出した。従って、βＡＲＫ１阻害剤は、心機能改善作用だけでなく生存率改善作用を有する有効な虚血性心不全治療剤として使用され、虚血性心不全患者の予後の改善につながることが大いに期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性心不全に対して生存率改善作用を有するβアドレナリン受容体キナーゼ１阻害剤。
【請求項２】
βアドレナリン受容体キナーゼ１阻害剤を有効成分として含有する、虚血性心不全に対して生存率改善作用を有する虚血性心不全治療剤。
【請求項３】
虚血性心不全が心筋梗塞後心不全である、請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
虚血性心不全患者の生存率を改善する方法であって、該患者に請求項１に記載の阻害剤、または請求項２もしくは３に記載の治療剤を、該患者の心機能を改善するのに十分量を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、虚血性心不全に対して生存率改善作用を有するβアドレナリン受容体キナーゼ１阻害剤および該βアドレナリン受容体キナーゼ１阻害剤を有効成分として含有する虚血性心不全治療剤に関する。
背景技術
慢性心不全は循環器系疾患の中でも極めて予後の悪い疾患のひとつであり、５年生存率は５０％以下と言われている。慢性心不全は多くの疾患が最終的に呈する症候であり、その基礎疾患から、虚血性心不全と非虚血性心不全（主に拡張型心筋症）に分類される。これまでに、虚血性心不全と非虚血性心不全では、病態が両者で異なることが示唆されている。例えばＣＩＢＩＳ試験においてビソプロロール（ｂｉｓｏｐｒｏｌｏｌ）は、非虚血性心不全患者の死亡率を３７％低下させたが、虚血性心不全患者の死亡率は改善しないことが報告されている（ＣＩＢＩＳ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０：１７６５−１７７３，１９９４）。また、ＰＲＡＩＳＥ試験においてアムロジピン（ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ）は、非虚血性心不全患者の死亡率を４６％低下させたが、虚血性心不全患者の死亡率を改善しなかった（Ｐａｃｋｅｒ  Ｍ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３５：１１０７−１１１４，１９９６）。これらの結果は、虚血性心不全と非虚血性心不全の病態が両者で異なることを示唆するものである。
虚血性心不全、特に心筋梗塞後心不全は、心筋梗塞治療の進歩に伴う死亡率の著しい減少により、欧米を中心に、近年急激に増加している（Ｃｈｉｅｎ  ＫＲ．Ｃｅｌｌ  ９８：５５５−５５８，１９９９）。最近の大規模臨床研究結果から、ＡＣＥ阻害薬が虚血性心不全の第一選択薬になっているものの、虚血性心不全は依然として予後不良の疾患である。現在、種々の薬剤の可能性が検討されているが、生存率を改善するβ遮断薬では、投与開始時における心不全の悪化が少なからず出現することが指摘されている。また、短期ＱＯＬを改善する強心薬は、かえって長期生存率を悪化させることが指摘されている（Ｐａｃｋｅｒ  Ｍ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２５：１４６８−１４７５，１９９１）。
βアドレナリン受容体キナーゼ１（β  Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｋｉｎａｓｅ  １：βＡＲＫ  １）は、心筋細胞に発現するβアドレナリン受容体（β  Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：βＡＲ）のシグナル伝達経路を調節する主要分子のひとつであり、βＡＲＫ１がβＡＲをリン酸化することにより、βＡＲの脱感作（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）が誘導されることが示唆されている。βＡＲＫ１はウシ（Ｂｅｎｏｖｉｃ  Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：２３５−２４０，１９８９）、ハムスター（Ｕｒａｓａｗａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２１９：２６−３０，１９９６）、ラット（Ａｒｒｉｚａ  Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １２：４０４５−４０５５，１９９２）、ヒト（Ｂｅｎｏｖｉｃ  Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２８３：１２２−１２６，１９９１）等で既にアミノ酸配列、ＤＮＡ配列が明らかになっており、遺伝子工学的に製造することができる。また、天然に存在するβＡＲＫ１タンパク質の分離、精製方法も確立されている。さらに、βＡＲＫ１の基質も明らかになっており、βＡＲＫ１活性測定方法も確立されている（Ｂｅｎｏｖｉｃ  Ｊ．Ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２００：３５１−３６２，１９９１；Ｐｉｔｃｈｅｒ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７：６５３−６９２，１９９８）。
また現在のところ慢性心不全モデルとしては、原因疾患別に、高血圧性心不全モデル（ラットおよびマウスａｏｒｔｉｃ  ｂａｎｄｉｎｇモデル、Ｄａｈ１食塩感受性（ＤＳ）ラットモデル、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  Ｒａｔ  ｗｉｔｈ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ（ＳＨＨＦ）等）、虚血性心不全モデル（ラットおよびマウス心筋梗塞後心不全モデル等）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）モデル（心筋症ハムスター、ウサギおよびイヌｐａｃｉｎｇ負荷モデル、遺伝子改変動物モデル（ｍｕｓｃｌｅ  ＬＩＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ（ＭＬＰ  ＫＯ）マウス、ｃａｌｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ（ＣＳＱ  ＴＧ）マウス等）等）が知られている。
最近、拡張型心筋症（ＤＣＭ）モデル（ＣＳＱ  ＴＧマウス）において、心不全の進展に伴い、βＡＲＫ１発現量・活性の上昇に伴うβＡＲ反応性の減弱が認められることが報告された（Ｃｈｏ  ＭＣ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：２２２５１−２２２５６，１９９９）。さらに、拡張型心筋症（ＤＣＭ）モデル（ＣＳＱ  ＴＧマウス）において、βＡＲＫ１の阻害剤であるβＡＲＫｃｔ（４９５番目のアミノ酸から６８９番目のアミノ酸からなるペプチド）は、心機能の改善を示し、生存率を向上することが示された（Ｈａｒｄｉｎｇ  ＶＢ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５８０９−５８１４，２００１）。また、心筋梗塞後心不全モデルのウサギの心筋にβＡＲＫｃｔを導入することで心機能が改善することが示された（Ｗｈｉｔｅ  ＤＣ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５４２８−５４３３，２０００、Ｓｈａｈ  ＡＳ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１３１１−１３１６，２００１）。しかし、βＡＲＫ１阻害剤が生存率を改善するか否かについては明らかにされていない。
以上の結果は、βＡＲＫ１阻害剤が、非虚血性心不全に対して心機能改善作用および生存率改善作用を有すること、並びに虚血性心不全に対して心機能改善作用を有することを示している。しかしながら、これまでに、βＡＲＫ１阻害剤が虚血性心不全に対して生存率改善作用を有することを示す報告は皆無であった。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、βＡＲＫ１阻害剤が虚血性心不全に対して生存率改善作用を有することを明らかにし、虚血性心不全に対して生存率改善作用を有するβＡＲＫ１阻害剤および該βＡＲＫ１阻害剤を有効成分として含有する虚血性心不全治療剤を提供することにある。
本発明者らは虚血性心不全、特に心筋梗塞後心不全において生存率を改善する薬剤を鋭意探索する過程において、βＡＲＫ１阻害剤であるβＡＲＫｃｔ（Ｋｏｃｈ  ＷＪ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１３５０−１３５３，１９９５）が、心筋梗塞後心不全に対して心機能改善作用だけでなく生存率改善作用を有することを見出した。すなわち、βＡＲＫｃｔを有するトランスジェニックマウスおよび対照マウスに、心筋梗塞作製手術を施した結果、βＡＲＫｃｔを有するトランスジェニックマウスでは、対照マウスに比べ、心機能の著明な改善が観察された。さらに、βＡＲＫｃｔを有するトランスジェニックマウスでは、対照マウスに比べ、術後の生存率が著しく改善された。従って、βＡＲＫ１阻害剤は、心機能改善作用だけでなく生存率改善作用を有する有効な虚血性心不全治療剤になり得るものと大いに期待される。
即ち、本発明は、虚血性心不全に対して生存率改善作用を有するβＡＲＫ１阻害剤および該βＡＲＫ１阻害剤を有効成分として含有する虚血性心不全治療剤に関し、より具体的には、
〔１〕  虚血性心不全に対して生存率改善作用を有するβアドレナリン受容体キナーゼ１阻害剤、
〔２〕  βアドレナリン受容体キナーゼ１阻害剤を有効成分として含有する、虚血性心不全に対して生存率改善作用を有する虚血性心不全治療剤、
〔３〕  虚血性心不全が心筋梗塞後心不全である、〔２〕に記載の治療剤、
〔４〕  虚血性心不全患者の生存率を改善する方法であって、該患者に〔１〕に記載の阻害剤、または〔２〕もしくは〔３〕に記載の治療剤を、該患者の心機能を改善するのに十分量を投与することを含む方法、を提供するものである。
本発明者らは、βＡＲＫ１阻害剤が虚血性心不全に対して生存率改善作用を有することを初めて見出した。従って、βＡＲＫ１阻害剤は生存率改善作用を有する虚血性心不全治療剤となるものと期待される。本発明は、虚血性心不全に対して生存率改善作用を有するβＡＲＫ１阻害剤、および該βＡＲＫ１阻害剤を有効成分として含有する、虚血性心不全治療剤を提供する。
本発明において心不全とは、心機能低下により、全身の組織代謝に必要な血液量を駆出できない状態、あるいは、それが心室充満圧の上昇によってのみ可能な状態と定義される。また、虚血性心不全とは、心筋梗塞による広範の心筋壊死、または高度な慢性心筋虚血を伴う心筋障害が原因となり、左心室の拡大と収縮力の低下により慢性心不全を呈する病態を言う。本発明おいて治療の対象となる虚血性心不全としては、具体的には心筋梗塞後心不全を挙げることができるが、特にこの疾患に制限されない。また心筋梗塞とは、冠動脈の閉塞または狭窄により血行障害をきたし、心筋虚血が一定時間持続した結果、心筋細胞が壊死に陥り、肉眼的に認められる程度の大きさになったものを指す。通常、心筋梗塞は不整脈、心不全等を合併する。心不全は心筋梗塞によって引き起こされる二次性の疾患として頻繁に認められるものであり、特に、うっ血性心不全は２０％〜５０％の患者で認められる。心筋梗塞を原因疾患として、二次性に誘発される心不全を心筋梗塞後心不全と呼ぶ。また、うっ血性心不全は心不全の代表的疾患であり、心筋梗塞後心不全には心筋梗塞後うっ血性心不全が含まれる。
また、うっ血性心不全を含む心不全に対する薬物療法はいくつか知られている。例えば利尿剤は前負荷軽減作用を有し、肺うっ血、全身の浮腫がある場合に効果が期待される。ＡＣＥ阻害剤（アンジオテンシン変換酵素阻害剤：レニン−アンジオテンシン−アルドステロン系を抑制する）は、前および後負荷軽減作用とアンジオテンシンＩＩによる刺激の抑制作用を有する。すなわち、血管拡張薬として静脈系、動脈系の両者に作用して血管拡張をもたらし、心不全により活性化されたアンジオテンシンＩＩ、アルドステロン、ノルエピネフリン、バソプレッシン等の神経体液性因子の作用を抑制する。また、ＡＣＥ阻害剤は心筋リモデリング機構を抑制し、心筋梗塞後心不全発症に予防的に作用するとされている。β遮断薬は収縮力減少作用、交感神経刺激抑制作用を有し、拡張型心筋症に対する有効性が報告されており、ＱＯＬの改善や予後延長効果が期待されている。各種の血管拡張薬も後負荷軽減作用を有し、心不全治療剤として使用されている。静脈系に作用する薬物としては、亜硝酸薬、モルシドミン、動脈系に作用する薬物としてはヒドララジン、ミノキシジル、カルシウム拮抗薬等が知られている。また、静脈、動脈の両方に作用するものとしてフロセキナン、ニトロプロジッドが知られている。強心薬であるジギタリスは、収縮力増強作用（陽性変力作用）、心拍出数減少作用（陰性変時作用）、交感神経遠心路の抑制、圧受容体反射の改善を介して効果を示すことが報告されている。
また、本発明における「生存率改善作用」とは、薬剤を投与された患者の生存率が、薬剤を投与されていない患者の生存率よりも有意に高くなる作用、あるいは、薬剤を投与された患者が、薬剤を投与されない患者に比べて長期間生存するようになる作用を言う。本発明において、生存率改善作用の測定は、当業者においては周知の方法により実施することができる。例えば、臨床的に生存率改善作用を測定する方法を挙げることができる。この方法においては、治療剤（本明細書において薬剤と記載する場合あり）投与時の生存曲線を観察することで、生存率改善作用を測定することが可能である。すなわち、薬剤を投与される患者群（薬剤投与群）と薬剤を投与されない患者群（対照群）を作製し、ついで、各患者の生存と死亡を時間の経過を追って追跡すればよい。具体的には、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により累積生存率から生存曲線を作製し、ｌｏｇ−ｒａｎｋ法検定により有意差を検定すればよい。これらの解析は、ＳｔａｔＶｉｅｗ  ｖｅｒ．５  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ等の市販の解析ソフトを用いて行うことができる。例えば、一定期間経過後の各患者の生存と死亡を確認し、生存患者の割合を算出する。薬剤投与開始時の生存率を１００％、あるいは１とし、横軸に時間、縦軸に累積生存率をプロットすれば、薬剤投与群と対照群の生存曲線をそれぞれ得ることができる。両者の生存率を比較するには、薬剤投与群の生存曲線が、対照群の生存曲線に比べて上方にシフトしていれば、生存率改善作用を有すると判断できる。あるいは、一定期間後の両者の生存率を比較し、薬剤投与群が対照群に比べて有意に生存率が高ければ、生存率改善作用を有すると判断することができる。一定期間とは、少なくとも半年、好ましくは１年、さらに好ましくは２年、最も好ましくは３年である。対照群は、薬剤投与群と同時進行で追跡する必要はなく、既に調査された患者の生前率や生存曲線を使用することができる。具体的には、被検薬剤投与により、生存曲線が統計学的に有意に上方にあった時に、被検薬剤は生存率改善作用を有すると判定する。
また、実験動物を使用することにより生存率改善作用を測定することも可能である。この場合、疾患モデル動物において、被検薬物を投与した動物と投与しない動物の生存曲線を観察することで、生存率改善作用を測定することができる。具体的には、被検薬剤投与により、生存曲線が統計学的に有意に上方にあった場合に、被検薬剤は生存率改善作用を有すると判定する。上記疾患モデル動物としては、特に制限はないが、虚血性心不全モデル（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、およびブタ心筋梗塞後心不全モデル等）等を例示することができる（Ｈｏｎｇｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ７：１６１−１６７，１９９７；Ｐａｔｔｅｎ  Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７４：Ｈ１８１２−Ｈ１８２０，１９９８）。
本発明の虚血性心不全に対して生存率改善作用を有するβＡＲＫ１阻害剤は、該阻害剤が生存率改善作用以外の作用を併せて有していてもよい。生存率改善作用以外の作用としては、例えば、心機能改善作用を挙げることができる。よって、生存率改善作用と心機能改善作用とを共に有するβＡＲＫ１阻害剤もまた、本発明の虚血性心不全に対して生存率改善作用を有するβＡＲＫ１阻害剤に含まれる。
上記心機能改善作用の測定は、当業者においては一般的に行われる方法、例えば、ＮＹＨＡ心機能分類、および心エコー図等を用いて行うことができる。ＮＹＨＡ心機能分類は、心不全患者の心機能評価のために、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）によって提唱された下記の４つのｃｌａｓｓ機能分類が存在する
（１）ｃｌａｓｓＩ：  心疾患はあるが、身体活動には特に制限がなく、日常労作により、特に呼吸困難、狭心痛、疲労、動悸などの愁訴が生じないもの。
（２）ｃｌａｓｓＩＩ：  心疾患があり、身体活動が軽度に障害されるもの。安静時または軽労作時には障害が無いが、日常労作のうち、比較的強い労作によって、上記の愁訴が発現するもの。
（３）ｃｌａｓｓＩＩＩ：  心疾患があり、身体活動が著しく制限されるもの。安静時は愁訴が無いが、比較的軽い日常労作でも、上記の愁訴が出現するもの。
（４）ｃｌａｓｓＩＶ：  心疾患があり、いかなる程度の身体労作の際にも、上記愁訴が出現し、また、心不全症状、または狭心症症候群が、安静時においてもみられ、労作によりそれが増進するもの。
このうち、ｃｌａｓｓＩは基本的に薬物療法の対象でなく、正常レベルと考えることができる。従って、ｃｌａｓｓＩＩ、ｃｌａｓｓＩＩＩ、ｃｌａｓｓＩＶの患者が、ｃｌａｓｓＩに分類された場合に当該患者の心機能は改善されたと判定する。また、心エコー図を用いて得られる心機能の測定値には、左室駆出率（ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＥＦ）、または左室内径短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ：ＦＳ）がある。ＥＦの正常値は６０−８０％であり、ＦＳの正常値は３０−５０％である。心不全患者では、ＥＦもしくはＦＳが正常値よりも明らかに低下する。
このように心機能改善作用とは、ＮＹＨＡ心機能分類のｃｌａｓｓの低下、および／または心不全患者で低下しているＥＦもしくはＦＳの上昇作用を指す。好ましくはＥＦ、ＦＳの両方が正常値になることであるが、いずれか一方が正常値となる場合でもよい。従って、本発明においては、ＮＹＨＡ心機能分類のｃｌａｓｓ低下、および／または心不全患者で低下しているＥＦもしくはＦＳの上昇作用を示す薬剤を心機能改善作用を有する薬剤であると判定する。
薬剤の心機能改善作用を動物実験において確認することも可能である。この場合には、心エコーを用いて、心駆出性収縮機能（ＦＳまたはＥＦ）を測定すればよい。ＤＳラットモデル、ラットおよびマウス心筋梗塞後心不全モデル、ＤＣＭモデル（心筋症ハムスター、ウサギおよびイヌｐａｃｉｎｇ負荷モデル、遺伝子改変動物モデル（ＭＬＰ  ＫＯマウス、ＣＳＱ  ＴＧマウス等）等）の種々の心不全動物モデルでは、ＦＳまたはＥＦが、正常動物と比較して明らかに低下している。本発明においては、この低下したＦＳまたはＥＦを統計学的に有意に増加させる薬剤を、心機能改善作用を有する薬剤であると判定する。
本発明のβＡＲＫ１阻害剤としては、βＡＲＫ１の機能を阻害あるいは抑制する作用を有するものであれば特に制限はなく、核酸、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。タンパク質およびペプチドとしては、例えば、βＡＲＫ１のドミナントネガティブ、βＡＲの部分ペプチド等を挙げることができる。また、核酸としては、上記ドミナントネガティブ等のアミノ酸から構成されたペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだベクター等を例示することができる。
上記βＡＲＫ１のドミナントネガティブとは、βＡＲＫ１の作用発現に必須の機能を欠損したタンパク質またはペプチドを意味する。このようなβＡＲＫ１のドミナントネガティブとしては、通常βＡＲＫ１の部分ペプチドを使用することができる。欠損する機能としては、特に制限はなく、キナーゼ活性でもよいし、基質結合作用であってもよいし、細胞内局在化作用であってもよい。これらのドミナントネガティブはβＡＲＫ１の作用発現に必要な機能を欠如しているために、βＡＲＫ１のシグナル伝達経路に干渉し、結果としてβＡＲＫ１の阻害剤として作用する。βＡＲＫ１のドミナントネガティブの具体的な例としては、本実施例に記載された、βＡＲＫｃｔを挙げることができる（Ｋｏｃｈ  ＷＪ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１３５０−１３５３，１９９５）。
また、本発明のβＡＲＫ１阻害剤としては、βＡＲＫ１の基質であるβＡＲの部分ペプチドを使用することも可能である。例えば本発明のβＡＲＫ１阻害剤として、βＡＲのアミノ酸配列の５６番目のアミノ酸から７４番目の部分ペプチド、同じく２１９番目のアミノ酸から２４３番目の部分ペプチドを使用することができる（米国特許ＵＳ  ６０９６７０５）。さらに、同米国特許には、ポリアニオン構造を有する高分子化合物、例えばヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、硫酸デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）を使用することができることが記載されている。
本発明においては、βＡＲＫ１の阻害剤として、上記ドミナントネガティブやβＡＲの部分ペプチド等のアミノ酸から構成されたペプチドあるいはタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを使用することも可能である。βＡＲＫ１阻害剤をコードするＤＮＡは、効率的な発現のために機能的にプロモーターとリンクしていることが好ましい。このためのプロモーターとしては、例えばＣＭＶプロモーターを使用することができる。また、組織特異的に発現させるために、心筋細胞特異的プロモーターを使用することができる。例えば心室筋細胞特異的プロモーター（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）として、心室ミオシン軽鎖２プロモーター（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、心室ミオシン重鎖プロモーター（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を使用することができる。
上記ベクターは、遺伝子治療用に使用することも可能である（Ａｋｈｔｅｒ  ＳＡ  ｅｔ．ａｌ．，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｃａｒｄｉａｃ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｖｉａ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１２１００−１２１０５，１９９７、Ａｓｈｉｓｈ  ＳＳ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  β−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｅａｒｔ  ｒｅｓｅｒｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１３１１−１３１６，２００１）。遺伝子治療とは、薬効を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを患者に投与し、治療または予防することをいう。遺伝子治療に使用することができるベクターには、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）等が挙げられるが、これに制限されない。ベクターへのβＡＲＫｃｔをコードするＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことができる。生体内への投与はｅｘ  ｖｉｖｏ法でもよいが、ｉｎ  ｖｉｖｏ法が好ましい。
また、本発明のβＡＲＫ１阻害剤としては、被験試料のスクリーニングによって得られる物質を用いることも可能である。ここで、上記被験試料としては、例えば天然試料、有機試料、無機試料、タンパク質、ペプチドなどの単一試料、並びに、試料ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、それらに限定されない。
βＡＲＫ１阻害剤のスクリーニングは、当業者においては周知の方法、例えば、βＡＲＫ１のリン酸化活性を指標としてスクリーニングする方法（Ｂｅｎｏｖｉｃ  Ｊ．Ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２００：３５１−３６２，１９９１）等により実施することができる。βＡＲＫ１のリン酸化活性を指標としたスクリーニング方法で単離されるβＡＲＫ１阻害剤は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｉｒｏにおいてＩＣ５０≦１０ｎｍｏｌ／Ｌ、細胞系においてＩＣ５０≦１μｍｏｌ／ＬのβＡＲリン酸化阻害活性を有する阻害剤である。また、βＡＲＫ１阻害活性の特異性を測定するためには、市販のキナーゼを用いて阻害活性を測定し、βＡＲＫ１に対する阻害活性と比較すればよい。酵素阻害活性の比較にはＩＣ５０値を使用することができる。例えばＰＫＡ、ＰＫＣ、ｃｄｃ２、ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、ＰＴＫ等はＰｒｏｍｅｇａ社のＳｉｇｎａＴＥＣＴＴＭＰｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用することができる。βＡＲＫ１阻害剤としては、上記５種類のキナーゼに対する阻害活性に比較し、好ましくは１０倍以上強く、さらに好ましくは１００倍以上強い。
また、βＡＲＫ１はβＡＲを基質とするキナーゼであるが、同時にロドプシンを基質とする事が明らかになっている（Ｂｅｎｏｖｉｃ  Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：２３５−２４０，１９８９）。従って、βＡＲの代わりにロドプシンを基質として用いて活性を確認することができる。ロドプシンの由来はヒトであることが好ましいが、特に制限されず、例えば、ウシ由来のロドプシンであってもよい。ロドプシンの調製は常法により行うことができる。例えば、暗所下、好ましくは低温・遮光（赤外ランプ下）において、眼球網膜にバッファーＡ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、６５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）中の４４ｗ／ｖ％ショ糖を加え懸濁後、２５，０００ｘｇで１５分間遠心して上清を回収する。一方、沈殿をバッファーＡ中の４４ｗ／ｖ％ショ糖に再懸濁させ遠心後、上清を回収する。それぞれの上清をろ過し、等容量のバッファーＡで希釈後、２５，０００ｘｇで４０分遠心し、沈殿を回収する。沈殿をバッファーＡ中の３６ｗ／ｖ％ショ糖に懸濁させ、２５，０００ｘｇで３０分遠心後の上清を回収する。一方、沈殿をバッファーＡ中の３６ｗ／ｖ％ショ糖に再懸濁させ、遠心した上清を回収する。１／２量のバッファーＡで希釈後２５，０００ｘｇで２５分遠心し、沈殿を回収する。バッファーＢ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、５ｍｏｌ／Ｌ  Ｕｒｅａ）に懸濁し、ホモジナイザーですりつぶす。５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５に懸濁後１００，０００ｘｇで４５分遠心して沈殿を回収する。
ロドプシンを用いた場合の被験試料のβＡＲＫ１阻害活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に測定することができる。例えば９６−ｗｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌに被験試料のＤＭＳＯ溶液（終濃度４ｖｏｌ％ＤＭＳＯ程度が好ましい）を加え、低温、赤外ランプ下に、酵素と基質液（ｆｉｎａｌ  ３．１μｍｏｌ／Ｌのロドプシン、終濃度２６．９ｎｍｏｌ／Ｌの精製したβＡＲＫ１、終濃度２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）を一定量加えて５分間振とう後、［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ液（終濃度４０μｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ（１６ｋＢｑ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＡＴ＃  ＡＨ９９６８））を加え５分間振とうする。反応開始は室内灯等の光をあてればよい。３０分後、２５ｖｏｌ％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）／ＰＢＳを加え、低温室内で１０分間振とうすることにより反応を停止させる。吸引ろ過によりロドプシン画分をフィルタープレート上にトラップし、次いで、放射活性をＭｉｃｒｏＢｅｔａ  １４５０  ＰＬＵＳ（Ｗａｌｌａｃ）等の測定機器を用いて測定すればよい。
ロドプシンの他に、βＡＲＫ１の基質としては文献に記載されたペプチドＲＲＲＥＥＥＥＥＳＡＡＡ（但しアミノ酸の一文字表記）を使用することができる（Ｃｈｅｎ  ＣＹ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９３；２６８：７８２５−７８３１）。具体的な実験方法も文献記載の方法を参考にすることができる（Ｐｉｔｔ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １９９６；１：４７−５１）。
スクリーニングに使用するβＡＲＫ１は、特に制限はなく、例えば、ヒト、ウシ、ハムスター、ウサギ等由来のものが挙げられるが、好ましくはヒト由来である。ヒト由来のβＡＲＫ１は遺伝子工学的に作製することができる。例えばＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトβＡＲＫ１  ｍＲＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ８０７７６）の塩基配列を基にプライマーを設計し、ヒト白血球由来ｃＤＮＡライブラリー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １０４２１−０２２）を鋳型としてＰＣＲにて増幅し、プラスミドを構築することができる。増幅したヒトβＡＲＫ１  ｃＤＮＡを用いて組み換えヒトβＡＲＫ１タンパク質を発現するには、発現ベクター及び宿主を適宜組み合わせればよい。多くの発現ベクター、宿主が市販されており、容易に入手可能である。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＢａｃＰＡＫ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ＃  Ｋ１６０１−１）を用いることができる。この昆虫細胞を用いた発現系ではｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎにより相同組換えが起こり、Ｓｆ−９にβＡＲＫ１を発現させる組み換えウィルスが構築される。また、ウシ由来のβＡＲＫ１を用いる場合は、公知の方法を用いて精製することができる（例えば米国特許６０９６７０５）。
細胞系によるスクリーニングにおいては、一過性にβ２アドレナリン受容体を発現させた細胞を用いればよい。β２アドレナリン受容体は、精製してもよいし、遺伝子工学的に製造してもよいが、大量に入手可能な点で遺伝子工学的に製造することが好ましい。β２アドレナリン受容体のｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０２９６０）に登録されている。
β２アドレナリン受容体の一過性の発現を行うには、市販のキットを使用すればよい。例えばＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  ＣＡＴ＃  １  ８１４  ４４３）を用いてＨＥＫ２９３細胞に発現させることができる。より具体的には、β２アドレナリン受容体ｃＤＮＡを上記キットを用いてトランスフェクションし、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ−３２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＡＴ＃  ＰＢＳ１３）を加え２時間３７℃で培養することにより細胞をアイソトープラベルする。細胞を回収した後、培養上清２ｍｌに懸濁し０．２ｍｍｏｌ／Ｌオカダ酸ＤＭＳＯ溶液を加え（ｆｉｎａｌ  １００ｎｍｏｌ／Ｌ）、被験試料のＤＭＳＯ溶液を加え（ｆｉｎａｌ  ＤＭＳＯ濃度＝０．１ｖｏｌ％）、３７℃で２０分間培養する。ついで、（−）−イソプロテレノール（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ：ＩＳＯ）（ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴ＃  Ｉ６５０４、ｆｉｎａｌ  １０μｍｏｌ／Ｌ）を添加し３７℃で１５分間培養する。ＰＢＳで２回遠心した後、ＲＩＰＡ（＋）バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｖｏｌ％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．１ｗ／ｖ％  ＳＤＳ、０．５ｗ／ｖ％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＰＭＳＦ、１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍＬ  ｃｏｍｐｌｅｔｅＴＭ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＣＡＴ＃  １  ８７３  ５８０））に懸濁した後、２６Ｇの注射針を５回通し細胞を破砕し、膜タンパク質を可溶化する。１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心した後上清を回収し、Ａｎｔｉ−ＨＡ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ  ＣＡＴ＃  １  ８１５  ０１６）を６０μＬ加え、免疫沈降を行う。２４時間後、ＲＩＰＡ（＋）バッファー１ｍＬで洗浄し、ＲＩＰＡ（＋）１０μＬ，５０μｇ／ｍＬ  ＨＡペプチド１０μＬを加え室温で２０分間溶出させ、４ｘＳａｍｐｌｅバッファー（８ｗ／ｖ％  ＳＤＳ、４００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、２４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、４０ｖｏｌ％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．４ｍｇ／ｍＬ  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）５μＬ加え１０分間室温で放置する。遠心後の上清を回収し、１０％Ｔ  ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに２０μＬアプライし、電気泳動を行い、泳動終了後３ＭＭ  Ｐａｐｅｒにゲルを固定し、ＢＡＳ  ２０００  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（富士フィルム）等の測定装置によりリン酸化量を定量すればよい。
また、本発明は、上記βＡＲＫ１阻害剤を有効成分として含有する虚血性心不全に対して生存率改善作用を有する虚血性心不全治療剤が提供される。該虚血性心不全治療剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
上記虚血性心不全治療剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。
本発明の虚血性心不全治療剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状、虚血性心不全の種類や進行の程度等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定されるものであるが、一般に大人では、１日当たり、０．１〜２０００ｍｇを１〜数回に分けて経口投与することができる。より好ましくは１〜１０００ｍｇ／日、更により好ましくは５０〜５００ｍｇ／日、最も好ましくは１００〜３００ｍｇ／日である。これらの投与量は患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与期間も、患者の治癒経過等に応じて適宜決定することが好ましい。
さらに、本発明は、虚血性心不全患者の生存率を改善する方法であって、本発明のβＡＲＫ１阻害剤、または虚血性心不全治療剤を、該患者の心機能を改善するのに十分量を投与することを含む方法を提供する。上記投与の形態としては、例えば、上記の製剤化した本発明の薬剤の経口投与または非経口投与の形態を挙げることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  心筋梗塞後心不全マウスの生存率、心機能に対するβＡＲＫ１阻害剤の効果
実験に使用した材料および方法は下記（１）および（２）の通りである。
（１）実験動物
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂより購入し、自家繁殖した雄のβＡＲＫｃｔ  ＴＧ（＋／＋）マウス（Ｂ６、ＳＪＬ−ＴｇＮ（ｍｉｎｉＢＡＲＫｃｔ）２７Ｗｊｋ、ホモ接合体）と、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア）を交配して得られた雄のβＡＲＫｃｔ  ＴＧ（＋／−）マウスと、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを交配して得られたβＡＲＫｃｔ  ＴＧおよび同腹対照（ＷＴ）マウスを、１１−１３週齢で使用した。
マウスの尾から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、αＭＨＣプロモーターからβＡＲＫｃｔ  ｃＤＮＡの後に挿入したβ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子間に設定した一対のプライマー（センス鎖５’−ＣＴＣＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＣＧ−３’／配列番号：１、アンチセンス鎖５’−ＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＴＡＡＴＡＧ−３’／配列番号：２）を用い、ＰＣＲ増幅（〜８００ｂｐ）の認められた個体をＴＧ、ＰＣＲ増幅の認められなかった個体をＷＴと判定した。ＷＴは雌２６匹、雄２５匹、ＴＧは雌３０匹、雄１８匹であった。
（２）統計解析
結果は、全て平均値±標準誤差で示した。生存率の比較には、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法とｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いた（ＳｔａｔＶｉｅｗ  ｖｅｒ．５  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ）。同腹対照の心筋梗塞偽処置群（ＷＴ−ｓｈａｍ群）、同腹対照の心筋梗塞処置群（ＷＴ−ＭＩ群）、βＡＲＫｃｔ  ＴＧの心筋梗塞偽処置群（βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ｓｈａｍ群）、βＡＲＫｃｔ  ＴＧの心筋梗塞処置群（βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群）の心エコーデータ等の比較には、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重比較法を用いた（ＳｔａｔＶｉｅｗ  ｖｅｒ．５  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ）。有意水準はＰ＜０．０５（両側）とした。
（３）実験方法及び結果
ＷＴおよびβＡＲＫｃｔ  ＴＧを用いて心筋梗塞（ＭＩ）作製を行った。ＭＩ作製は、基本的にＰａｔｔｅｎらの方法（Ｐａｔｔｅｎ  ＲＤ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７４：Ｈ１８１２−Ｈ１８２０，１９９８）に準じた。マウスを２．５％  Ａｖｅｒｔｉｎ（２，２，２−ｔｒｉｂｒｏｍｏｅｔｈａｎｏｌ［Ｃａｔ．Ｔ４８４０−２，Ａｌｄｒｉｃｈ］をｔｅｒｔ−ａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ［Ｃａｔ．２４０４８−６，Ａｌｄｒｉｃｈ］に１００ｗ／ｖ％で溶解後、ｓａｌｉｎｅで２．５ｖｏｌ％に希釈した）で麻酔（１４μＬ／ｇ，ｉ．ｐ．）し、仰臥位に固定した。口蓋より２２Ｇ留置針外筒を挿入（気道確保）し、人工呼吸（１ｍＬ／ｓｔｒｏｋｅ、１２０  ｃｙｃｌｅ／ｍｉｎ；ｍｏｄｅｌ  ＳＮ−４８０−７、シナノ製作所）を行った。左第３肋間を開胸した後、左心耳先端付近の左冠動脈を６ｍｍ丸針付７−０絹糸（松田医科）を用いて結紮した。Ｓｈａｍ群では、空中で絹糸を結んだ以外ＭＩ群と同様の外科的処置を行った。閉胸し覚醒させた後、マウスをケージに戻した。ＷＴのＭＩ群（ｎ＝３１）は術後１週間以内に１７匹死亡し、βＡＲＫｃｔ  ＴＧのＭＩ群（ｎ＝２５、剖検後ＭＩが認められなかった１匹を除外）は１４匹死亡した（生存率：ＷＴ−ＭＩ群，４５％；βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群，４４％；ＮＳ）。なお、マウスはＭＩ後２４時間までは急性心筋梗塞で死亡し、さらに雄は１週間までは心臓破裂により死亡することが知られているので、本実験の慢性心不全死に対する生存分析は、術後１週以降生存していた個体を用いた（本実験においても１週間以内の死亡例は心臓破裂によるものであることを確認した）。Ｓｈａｍ群では、ＷＴ（ｎ＝１５）、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ（ｎ＝１３）ともに全実験期間を通して死亡例は認められなかった。以上から、ＷＴ−ｓｈａｍ  １５匹、ＷＴ−ＭＩ  １４匹、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ｓｈａｍ  １３匹、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ  １１匹を実験に使用した。
術後８週目に２．５％  Ａｖｅｒｔｉｎでマウスを麻酔（１４μＬ／ｇ，ｉ．ｐ．）し、仰臥位に固定した。生存全例（ＷＴ−ｓｈａｍ群ｎ＝１５、ＷＴ−ＭＩ群ｎ＝７、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ｓｈａｍ群ｎ＝１３、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群ｎ＝１０）の心エコーを測定した（１３ＭＨｚプローブ［ＥＵＰ−Ｃ１３Ｈ］使用；ＥＵＢ８０００、日立メディコ）（図１）。βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群、ＷＴ−ＭＩ群ともに、ｓｈａｍ群と比較して、左心室内腔の拡大による遠心性左心肥大が認められ、心機能が大きく低下していた。βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群の心機能は、ＷＴ−ＭＩ群と比較して、著明な改善が認められた。
各測定パラメータ（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄ−ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ［ＬＶＥＤＤ］、ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ［ＬＶＥＳＤ］、ｓｅｐｔａｌ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ［ＳＥＰｔｈ］、ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ［ＰＷｔｈ］、ｈｅａｒｔ  ｒａｔｅ［ＨＲ］およびｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ［ＦＳ］）の３回の測定値を平均し、これをデータとして採用した。術後２６週目まで生存率を測定した。ＷＴ−ＭＩ群と比較して、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群の生存率は著明に改善した（図２、ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定、Ｐ＝０．０１０１）。なお、同条件において、ＷＴ−ｓｈａｍ群およびβＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ｓｈａｍ群のマウスについては全て生存していた。
生存率測定後、安楽死させて心臓を摘出し、ｓａｌｉｎｅで心臓をよく洗浄した後、心室長軸方向中心部を横断方向にスライスし、それぞれの横断面を撮影した（ＣＯＯＬＰＬＸ  ９５０、ＮＩＫＯＮ）。その後、各スライスを左心室と右心室に分離して湿重量を測定した後、液体窒素で凍結し−８０℃で保存した。撮影した心筋スライスの左心室全外周長に対する瘢痕（ｓｃａｒ）部分の外周長の％比率として梗塞のサイズ（ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ）を求めた（Ｓｉｇｍａ  Ｓｃａｎ  Ｐｒｏ  ｖｅｒ．４．０１、ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）。なお、生存率測定中の死亡例について全例ＭＩが作製されていることを目視で確認した。βＡＲＫｃｔ  ＴＧおよびＷＴマウスのＭＩ後７−８週における心重量、梗塞のサイズ、心エコーデータを表１に示す。
2003020312.tif 000002
2003020312.tif 000003
2003020312.tif 000004
［実施例２］  心筋梗塞後心不全モデルマウスの心臓βＡＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇに対するβＡＲＫ１阻害剤の効果
（１）方法
凍結保存（−８０℃）したマウス心臓を、氷冷ｌｙｓｉｓバッファー（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡ，１０μｇ／ｍＬ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，２０μｇ／ｍＬ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ）中（１ｍＬ／１００ｇ心臓）でホモジナイズ（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）後、５００×ｇ，１０分遠心した。その上清を１５０００×ｇ，１５分で遠心し、膜画分（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）とサイトゾル画分（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）に分離した。膜画分は、β−Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（βＡＲ）ｄｅｎｓｉｔｙ、およびａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ（ＡＣ）活性の測定に用い、サイトゾル画分は、β−Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｋｉｎａｓｅ  １（βＡＲＫ１）タンパク質量の測定に供した。
膜画分（２５μｇ）と種々の濃度の［１２５Ｉ］ｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ（ＮＥＸ１８９，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をｂｉｎｄｉｎｇバッファー（７５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）中（２００μＬ）で、３７℃，１時間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。その後、ＧＦ／Ｂグラスフィルターで吸引ろ過、洗浄、固形シンチレーター（Ｍｅｌｔｉｌｅｘ  Ａ，Ｗａｌｌａｃ）を重積し、ＭｉｃｏＢｅｔａ（Ｗａｌｌａｃ）で放射活性を測定した。全結合量から非特異的結合量（１０μｍｏｌ／Ｌ  ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ存在下での結合量）を差し引き、特異的結合量とした。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（ｖｅｒ．３．０）を用いて算出された飽和結合量（Ｂｍａｘ．）を、βＡＲ  ｄｅｎｓｉｔｙとした。
膜画分（２０μｇ）と、１００μｍｏｌ／Ｌ  ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（ＩＳＯ）／５０μｍｏｌ／Ｌ  ＧＴＰ、３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ／６０μｍｏｌ／Ｌ  ＡｌＣｌ３、もしくは１００μｍｏｌ／Ｌ  ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ）をｃｙｃｌａｓｅバッファー（４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，５０μｇ／ｍＬ  ｐｈｏｓｐｈｏｃｒｅａｔｉｎｅ，５ＩＵ／ｍＬ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ）中（１００μＬ）で、３７℃，１０分インキュベートした。その後、９５℃で１．５分煮沸し反応を停止させ、１５０００×ｇ，１５分遠心して得た上清中のｃＡＭＰ量をｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（ＲＰＮ２２５，Ａｍｅｒｓｈａｍ）で測定し、得られたｃＡＭＰ産生量から基礎（ｂａｓａｌ）のｃＡＭＰ産生量を差し引き、ＩＳＯ，ＡｌＦ４−，ＦＳＫ依存ＡＣ活性とした。
ＲＩＰＡバッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％  ＳＤＳ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ，５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｏｐｈａｔｅ，１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ）中サイトゾル画分（３ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬに、ａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＧＲＫ２（βＡＲＫ１）ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓｃ−５６２ＡＣ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）３５μＬ添加し、４℃，ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで免疫沈降した後、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦ膜に転写した。βＡＲＫ１（〜８０ｋＤａ）タンパク質量は、ａｎｔｉ−ＧＲＫ２  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓｃ−５６２，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ、およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ＭＳ１００Ｒ，ＴＲＯＰＩＸ）による化学発光をＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ  Ｆ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で測定、Ｌｕｍｉ−Ａｎａｌｙｓｔ（ｖｅｒ．３．０）を用いて定量することにより求めた。
（２）統計解析
結果は、平均値±標準誤差で示した。
データの比較には、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重比較法を用いた（ＳｔａｔＶｉｅｗ  ｖｅｒ．５  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ）。有意水準はＰ＜０．０５（両側）とした。
（３）実験結果
心筋梗塞（ＭＩ）後心不全を呈したｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ（ＷＴ）マウスの心臓では、約４４％のβＡＲ量減少が認められたが、ＭＩ後のβＡＲＫｃｔトランスジェニック（ＴＧ）マウスの心臓では、βＡＲ量の減少は認められなかった（図３Ａ）。また、ＭＩ後のＷＴマウスの心臓では、ＩＳＯ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性が、約７１％（ＡｌＦ４−−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性で補正）および約６７％（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性で補正）減少していたが、ＭＩ後のβＡＲＫｃｔ  ＴＧマウスの心臓では、ＩＳＯ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性の減少が認められなかった（図３Ｂ，Ｃ）。なお、ＡｌＦ４−−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性およびｆｏｒｓｋｏｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性は、群間で差がなかった。さらに、ＭＩ後心不全を呈したＷＴマウスの心臓では、βＡＲＫ１発現レベルが上昇していたが、ＭＩ後のβＡＲＫｃｔ  ＴＧマウスの心臓では不変であった（図４）。
これらの結果から、ＭＩ後心不全を呈した心臓では、ＧＴＰ−結合タンパク質およびＡＣ活性のレベルの障害は無いものの、βＡＲＫ１発現レベルが上昇し、βＡＲレベルの脱感作が生じていることが明らかとなった。さらに、βＡＲＫ１を阻害（βＡＲＫｃｔのｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）することにより、βＡＲＫ１発現レベルおよびβＡＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇが正常に復することが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
本発明において、虚血性心不全に対して生存率改善作用を有するβＡＲＫ１阻害剤および該βＡＲＫ１阻害剤を有効成分として含有する虚血性心不全治療剤が提供された。本発明によって、βＡＲＫ１阻害剤が、心機能改善作用だけでなく生存率改善作用を有する有効な虚血性心不全治療剤として使用され、虚血性心不全患者の予後不良の改善につながることが大いに期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＷＴ−ｓｈａｍ群、ＷＴ−ＭＩ群、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ｓｈａｍ群、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群の典型的な左心室Ｍモード心エコーを示す写真である。
図２は、ＷＴ−ＭＩ群（ｎ＝１４）およびβＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群（ｎ＝１１）の生存曲線を示す図である。縦軸は累積生存率、横軸はＭＩ作製手術後の時間（週）を示す。
図３は、ＷＴ−ｓｈａｍ群、ＷＴ−ＭＩ群、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ｓｈａｍ群、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群におけるβＡＲシグナリングの特徴を示す図である。（Ａ）ＷＴおよびβＡＲＫｃｔ  ＴＧマウスの心臓におけるβＡＲ量を示す。（Ｂ）ＡｌＦ４−−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性で補正した場合のＩＳＯ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性を示す。（Ｃ）ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性で補正場合のＩＳＯ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＣ活性を示す。ヒストグラムは、平均値±標準誤差を表す。各群ｎ＝６。＊＊，Ｐ＜０．０１；＊，Ｐ＜０．０５  ＷＴ−ＭＩ  ｖｓ．ＷＴ−Ｓｈａｍ；＃＃，Ｐ＜０．０１；＃，Ｐ＜０．０５  ＷＴ−ＭＩ  ｖｓ．βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍａｅｒ  ｔｅｓｔ）
図４は、ＷＴ−ｓｈａｍ群、ＷＴ−ＭＩ群、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ｓｈａｍ群、βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ群におけるβＡＲＫ１タンパク質の発現レベルを示す写真および図である。（Ａ）免疫沈降法による解析結果を示す。ｈβＡＲＫ１は、精製ヒトＡＲＫ１を表す。（Ｂ）βＡＲＫ１の免疫ブロッティングによって決定された心臓におけるβＡＲＫ１タンパク質の発現レベルを示す。ヒストグラムは、平均値±標準誤差を表す。各群ｎ＝６。＊＊，Ｐ＜０．０１  ＷＴ−ＭＩ  ｖｓ．ＷＴ−Ｓｈａｍ、＃＃，Ｐ＜０．０１  ＷＴ−ＭＩ  ｖｓ．βＡＲＫｃｔ  ＴＧ−ＭＩ（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍａｅｒ  ｔｅｓｔ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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