(57)【要約】セレノプロテインＰおよび／または当該蛋白質のペプチドもしくは当該ペプチド群を主要構成成分とする新規な神経変性疾患治療剤、とりわけ運動障害改善剤が提供される。本発明による神経変性疾患治療剤、とりわけ運動障害改善剤は、とりわけ運動機能の低下している疾患に対して好適に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレノプロテインＰおよび／または当該蛋白質のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群を主要構成成分とする運動障害改善剤。
【請求項２】
前記蛋白質のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群が、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位アミノ酸から３６２位アミノ酸までのアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有する細胞障害抑制活性を示すペプチドまたは当該ペプチド群である、請求項１記載の運動障害改善剤。
【請求項３】
前記蛋白質のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群が、次式：
2002076492.tif 000011
および／または
2002076492.tif 000012
（式中、Ｘａａはセレノシステインを表す）
で表されるアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記いずれかのアミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチド群である請求項１または請求項２記載の運動障害改善剤。
【請求項４】
運動障害が、神経変性疾患に付随して生じる症候である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の運動障害改善剤。
【請求項５】
運動障害が、老化、外傷性神経障害疾患、脳血管障害性疾患または免疫異常性疾患に付随して生じる症候である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の運動障害改善剤。
【請求項６】
セレノプロテインＰおよび／または当該蛋白質のペプチドもしくは当該ペプチド群を主要構成成分とする神経変性疾患治療剤。
【請求項７】
神経変性疾患が、運動失調症、てんかん、運動ニューロン疾患、老化、外傷性神経障害、脳血管障害、免疫異常性疾患より選択される、請求項６に記載の神経変性疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は医療用医薬品の分野に属する血漿蛋白質の新たな用途に関する。さらに詳細には、老化や外傷性、脳血管障害、免疫異常性疾患、運動失調症、てんかん、運動ニューロン疾患など神経系を構成する細胞の細胞死や細胞変性に起因する神経変性に対する医薬品に関する。より詳しくは、血漿蛋白質の一種であるセレノプロテインＰを、好適には当該セレノプロテインＰのＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群を主たる有効成分として含有する神経変性疾患治療剤とりわけ運動障害改善剤に関する。
背景技術
神経系を構成する細胞（神経細胞やグリア細胞など）の細胞死や細胞変性が認められる神経性疾患として、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、多発性脳梗塞性痴呆、ビンスワンガー型白質脳症、慢性硬膜下血腫などの脳血管障害性疾患、多発性硬化症、ギランバレー症候群、膠原病などの自己免疫性疾患、脊髄小脳変性症、シャイドレーガー症候群、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー症、ピック病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、進行性核上麻痺、てんかん、プリオン病などの神経変性疾患、さらには老化に付随する痴呆症、歩行障害や、交通事故などによる外傷性の脊髄損傷、脳障害なども知られている。これらのほとんどの疾患では、主症状として運動機能の低下（運動障害）が認められている。
運動障害には、筋の障害、神経の障害、骨や関節の障害などがあるが、そのうち、運動障害をきたす神経中枢性障害について、部位別に分類列挙すると、大脳（前頭葉）性、小脳性、前庭（迷路）性及び脊髄性の運動障害症がある。
大脳性運動障害症では大脳皮質、殊に前頭葉性の障害が考えられ、脳血管障害性病変、脳萎縮、外傷、腫瘍、ピック病をはじめ慢性硬膜下血腫などでしばしば問題となる。また、失調性歩行のほか精神機能の低下を示す。
小脳性運動障害症は、小脳障害すなわち小脳腫瘍、血管性障害、変性性疾患、小脳萎縮、奇形などに伴う重要な症状で、小脳虫部の損傷では主として体幹性失調をきたし、起立歩行の障害・蹣跚歩行、大歩行を示し、一般に姿勢、体位保持が困難で平衡バランス障害をきたす。それに反し、小脳半球性障害では四肢筋トーヌスの異常、筋緊張の低下を示し、患側方向への偏位歩行、協調運動不能、誤示（指−指、指−鼻試験）、運動測定障害、ホームズ・スチュアート現象のほか、企図振戦や小脳性言語（断続性・爆発性）を伴う。
前庭（迷路）性失調症では、前庭機能障害に由来し、原因としてその多くは耳科的、内耳性障害性疾患の存在あるいは後遺症としてみられる。例えば、メニエール病、突発性難聴、ストレプトマイシンやカナマイシンなどの薬物中毒による平衡神経の障害、外傷、梅毒、音響外傷、耳硬化症、内耳炎（及びその続発症）が挙げられる。
脊髄性運動障害症は、別名後索性運動失調症と呼称するごとく、脊髄後索障害により深部感覚の障害すなわち、位置覚、関節覚、握覚の障害により失調をきたすものである。フリードライヒ運動失調症、亜急性脊髄連合変性症、脊髄癆などで特徴的にみられる。
これらの運動障害を呈する神経変性疾患は神経細胞死や細胞変性と病態が深く関係している。例えば、ハンチントン病、脊髄小脳変性症（マシャド・ジョセフ病、フリードライヒ失調症など）、筋緊張性ジストロフィーなどに見られるポリグルタミン病やアルツハイマー病などでは、異常蛋白の細胞内蓄積による神経細胞死や変性が認められている。運動ニューロン疾患でも、その代表例である筋萎縮性側索硬化症において、フリーラジカルの発生、グルタミン酸の過剰蓄積による神経細胞死、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇、ＮＯ発生などが、病因と考えられている。さらに、パーキンソン病では黒質緻密層ドーパミン性神経細胞の変性が主病変と考えられている。
人は老化が進むにしたがって進行的な身体機能の低下が観られる。これら変化の基礎を成す形態の老化として臓器は萎縮（重量の減少）する。例えば、老化が進行すると脳萎縮がみられ、顕著な場合には、歩行障害や痴呆症になる。組織病理学的には、神経細胞の変性あるいは脱落、老人斑、アルツハイマー原線維変化などがみられる。これらの神経系の細胞死や変性はフリーラジカルなどの酸化ストレスやグリケーションによって生じているといわれている。また、剖検脳の生化学的知見として神経伝達物質の減少、ことにコリン作動系ニューロンの障害が報告されているが、なお病因は不明である。
さらに、健常人でも、交通事故などによって脊髄や脳を損傷して、歩行障害になることがある。事故などで強力な外力が加わり、脊椎の脱臼骨折がみられると脊髄に圧迫や挫創が起こり、脊髄が損傷される。原因にはその他放射創、切創、刺創がある。骨傷の明白でない場合もあり、頚椎の過伸展損傷でよくみられる。病態は、脊髄実質に出血、浮腫を基盤とした脊髄の挫滅と圧迫病変である。臨床症状として不全あるいは完全横断麻痺が出現する。
自己免疫疾患によって運動障害が生じる場合がある。免疫系は本来外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかし時にはこの免疫系の働きが、結果的に生体に有害であることがある。これをもとにある病態が生じた時には、自己免疫疾患と呼ぶ。この自己免疫反応が原因で、運動障害を呈する疾患として、重症筋無力症、多発性硬化症、慢性関節リウマチなどが知られている。
例示される多発性硬化症は、脱髄疾患の一種で、中枢神経系の白質に大小さまざまの脱髄巣が散在し、その病巣もまた新旧様々なものが存在することを特徴とする。病巣は側脳室周囲、視神経、脳幹、脊髄などの白質に好発する。組織学的には髄鞘を形成するオリゴデンドロサイトが傷害される疾患であり、病巣にアポトーシスを起こした細胞が多数認められる。脱髄巣は早期には炎症性細胞浸潤があるが、慢性期になるとグリア線維で置き換えられて硬化する。臨床症状は視神経炎、複視、眼振などの眼球運動障害、痙性麻痺、有痛性強直性痙攣発作、レルミット症候群、失調症、言語障害、膀胱直腸障害などの症状がいろいろな組み合わせで出現し、しかも寛解を示すことに特徴がある。
脳血管障害性疾患においては、脳梗塞や脳内出血など様々な要因によって生じた脳の虚血状態が、一般的に虚血領域の細胞や組織に酸素欠乏と栄養障害をもたらし、酸素欠乏はＡＴＰ産生の途絶を介して、まず機能が障害され、ついには変性、壊死、あるいは萎縮をきたす。具体的には、虚血に伴う酸素とグルコースの供給低下が引き金となり、フリーラジカルの発生、グルタミン酸の過剰蓄積、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇、ＮＯ産生の増大などが見られ、神経細胞死を引き起こしている。この障害は虚血時間に依存し、虚血時間が長いほど再灌流時の障害も悪化する傾向にある。これらのことから、神経細胞死や細胞変性により運動機能にも障害を呈することになる。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
以上述べてきたように、疾患の種類こそ異なるものの、運動障害を呈する神経変性疾患には、共通する病因として神経細胞死や細胞変性が考えられている。従って、この神経細胞死や変性を抑制あるいは改善するような効果を持つ物質は、前述のような神経変性疾患、とりわけ運動障害の治療薬になると考えられる。現在、これらの症状を改善するために、種々の薬剤が試みられている。例えば、スーパーオキシドジスムターゼやカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼほか多数の生体の酸化障害に対する予防、制御物質のほか、実際に治療に用いられている虚血性心疾患治療剤である塩酸トリメタジジン、トロンボキサン合成酵素阻害剤であるオザグレルナトリウム、脳循環代謝改善剤である酒石酸イフェンプロジル、虚血性脳障害改善剤であるフマル酸ニゾフェノンなどもあるが、これらにより障害が完全に抑制できるわけではない。
このように神経細胞死や神経変性を伴う運動障害について、症状を改善する有効な治療薬はほとんど知られておらず、そのため対処療法が主体となっている。例えば、手の震えなどのパーキンソニズムにはパーキンソン病治療薬、起立性低血圧などの自律神経症状には自律神経調整薬が使われている。従って、神経細胞死や細胞変性によって生じる運動障害を改善するためには、前述のように、神経細胞にとって悪条件下で生じる細胞死や細胞変性を抑制する物質、中でも細胞内抗酸化能を上昇させる物質が切望されている。
なお、上記の記述（背景技術及び発明が解決しようとする技術的課題）は、「虚血によりなぜ細胞は死ぬのか」田川邦夫著、共立出版；「脳卒中ハンドブック」佐野圭司、アイ・ピー・シー；「今日の診療」ＣＤ−ＲＯＭ版、医学書院；「医学大辞典」ＣＤ−ＲＯＭ版、南山堂；「最新医学大辞典」ＣＤ−ＲＯＭ第２版、医歯薬出版、「アポトーシスと疾患」水野美邦編、医薬ジャーナル社の記述を参考にした。
（その解決方法）
上述の状況の下、本願発明者らは先に、血液成分由来の蛋白質であるセレノプロテインＰに、そしてより好適な態様として当該セレノプロテインＰのＣ末端側ペプチドに、従来報告されていなかった細胞死抑制活性が認められることを見出し、この知見を基に特許出願した（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０６３２２）。さらに、本願発明者らは、新たな神経変性疾患改善剤、とりわけ運動障害改善剤を供するべく鋭意研究した結果、驚くべきことに従来試みられることのなかった前記セレノプロテインＰまたはそのＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群が、モデル動物での実際の生体内投与によって、運動障害改善剤として人間その他の動物に充分に適応できる事実を見出し、この知見に基づいて本願発明を完成するに至った。
すなわち、本願発明は、セレノプロテインＰおよび／または当該蛋白質のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群を主要構成成分とする運動障害改善剤に関する。
本願発明の好ましい態様において、前記蛋白質のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群は、セレノプロテインＰのＣ末端側１０３アミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチド群である。
本願発明のさらに好ましい態様において、前記蛋白質のＣ末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群は、次式、
2002076492.tif 000002
および／または
2002076492.tif 000003
（式中、Ｘａａはセレノシステインを表す）
で表されるアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記いずれかのアミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチド群である。
発明を実施するための最良の形態
セレノプロテインＰは１９７７年にグルタチオンペロキシダーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）とは異なるセレン含有蛋白質として確認され、１９８２年にセレンがセレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）の形態で取り込まれていることが明らかにされた。さらに、１９９１年にセレノプロテインＰのｃＤＮＡのクローニングにより全長のアミノ酸配列が明らかにされ、その結果、当該蛋白質は最大１０個のセレノシステインを含む可能性等が示された（Ｈｉｌｌ  Ｋ．Ｅ．及びＢｕｒｋ  Ｒ．Ｆ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．，１０，ｐ．１９８−２０８（１９９７））。セレノプロテインＰの機能はほとんど不明であったが、最近、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系でｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅやｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅの還元活性、神経細胞のｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒとしての作用が見出された。
具体的な事例として、老化のモデルマウスであるクロトーマウスにおいて、顕著な運動性の回復が認められ、さらに、多発性硬化症のモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：ＥＡＥ）でも発症抑制効果と症状低減効果が認められ、運動障害症の改善作用があることが判明した。また、脳血管障害性疾患のモデルである、スナネズミの両頸動脈遮断実験において、虚血・再灌流後の神経症状、とりわけ運動障害改善に有効であることも示された。さらに、セレノプロテインＰに培養神経細胞に突起を形成させる作用があることが分かり、細胞ダメージから機能回復させる作用もあることが示された。これらのことから、神経系においては、虚血・再灌流障害だけでなく、病因には依存せずに、神経障害、とりわけ運動障害症状を改善する作用をセレノプロテインＰが有していることが示された。
本願発明は、セレノプロテインＰの前記知見に基づく新たな薬効に関するものであり、本願発明の神経障害改善剤の本態はセレノプロテインＰである。さらに詳細には、セレノプロテインＰの中のセレンを含むセレノシステインに特徴があり、このアミノ酸が神経障害とりわけ運動障害の改善作用の中心アミノ酸であると思われる。本願発明者らは、先の特許出願において、血液成分由来の蛋白質であるセレノプロテインＰのＣ末端側ペプチド断片に従来報告されていなかった細胞死抑制活性が認められることを開示した。この活性にも、含有されるセレノシステインが関与していることが明らかである。従って、セレノシステインを含み細胞死抑制活性を持つ蛋白質及び／またはペプチド群は、運動障害改善剤の候補となりうる。
そもそも、本願発明に関係するセレンは、微量必須元素の一つであり、それが欠乏した場合には心筋症などを伴う重篤な欠乏症が知られている。また、無血清培養の培地に亜セレン酸ナトリウムの添加が必須であることから、セレンが細胞レベルでの生存維持・増殖に必須であることが示されている。しかし、セレン化合物が毒物指定されていることから理解されるように、有効量と危険量の幅、つまり安全域の濃度幅が狭く、適量以上のセレン化合物は一般的には細胞にとって毒性を示し、逆に細胞死を誘導する。例えば、セレンの急性中毒症状として、顔面蒼白、神経症状、神経障害、皮膚炎、胃腸障害などが知られている。また、細胞培養にセレノシステインの２量体であるセレノシスチンを添加すると、単独ではかなり強い毒性を示す。これに対して、本願発明の好適な態様であるセレノプロテインＰ、セレノプロテインＰのＣ末端側断片は、その構造中に９〜１０個のセレノシステインを含むにも拘わらず、強い毒性は観察されなかった。このことから、本発明の薬効作用を示すセレノプロテインＰの特徴として、セレノシステインを含み、なおかつ毒性が減弱していることが重要と思われる。本願発明のペプチドまたは当該ペプチド群は、毒性の低減というセレン化合物に対する命題を克服するのみならず、予期し得ない運動障害改善作用をもたらすことを可能とするものである。
ここで用いられるセレノプロテインＰに特段の制約はなく、所望の運動障害改善活性を有するものであれば如何なる分子形態のものをも包含する。すなわち、完全分子型セレノプロテインＰをはじめ種々の分子形態のものが対象となり得る。この中で、好適な態様はセレノプロテインＰのＣ末端側ペプチドもしくは当該ペ
2002076492.tif 000004
ステインを表す）（配列番号３）のアミノ酸配列または当該アミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列を含有するアミノ酸配列を有するペプチドまたは当該ペプチド群は、とりわけ好適な態様として推奨され得る。
なお、本願明細書で用いる「当該ペプチド群」とはセレノプロテインＰのアミノ酸配列に由来し、少なくとも１個のセレノシステインを含むペプチドで、当該アミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、糖鎖の有無、荷電の相違、断片化の多様性等に起因する微細構造の異なるペプチドの集合体を意味する。すなわち、本願発明のセレノプロテインＰ及びペプチド群は、セレノプロテインＰのアミノ酸配列に由来し、細胞障害抑制活性を有するものであればその分子形態に特段の制約はなく、これらには完全分子型のセレノプロテインＰをはじめこれに起因するＣ末端側ペプチド等が含まれる。このような本願発明のペプチドは、ペプチド合成機を用いて常法に従って調製することもできるし、また、本願発明のペプチドをリード物質として、化学合成物をデザインすることも可能である。
本願発明に使用されるセレノプロテインＰまたは当該蛋白質に由来するペプチドもしくはペプチド群を製造する方法は特に限定されるものではないが、例えばヒト血液より分離する方法、または遺伝子組換え技術により製造することができる。本願発明に使用される運動障害改善剤の主要構成成分となるセレノプロテインＰまたは当該蛋白質に由来するペプチドもしくはペプチド群は、一般的な酵素類よりも熱、変性剤、幅広いｐＨ、血中のプロテアーゼに対して安定であるため、これを精製同定するに際しては、一つの態様として、血漿を出発原料とし種々のクロマトグラフィー工程、例えば、ヘパリンクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗体カラムの様な各種アフィニティークロマトグラフィー等、適用可能な種々の担体を用いた分画方法の他、硫酸アンモニウム沈殿分画、分子量膜分画、等電点分画、電気泳動分画等、種々の分画法が利用可能である。これらの分画法を組み合わせることにより、所望のセレノプロテインＰまたはペプチドもしくはペプチド群を分画することが可能である。その望ましい組み合わせの一例を調製例１に示す。
本願発明では、有効成分としての当該蛋白質またはペプチドもしくはペプチド群と公知の適当な賦形剤を組み合わせ、公知の方法で本願発明の運動障害改善剤とすることができる。本願発明の運動障害改善剤の有効投与量は、投与対象者の年齢、症状及び重症度などにより変動し、最終的には医師の意図により変動する。薬効は投与方法には依存しないが、皮下、皮内、腹腔への投与、血管内への単回（ボーラス）投与あるいは点滴投与などが最適である。また、分子量の小さなペプチド群の場合は、経口投与や経皮投与なども可能である。
本願発明の神経障害改善剤の投与対象は、神経細胞死あるいはその細胞変性に起因し、神経症状を呈する疾患、とりわけ運動機能の低下している疾患であれば特に限定されることはない。例えば、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、多発性脳梗塞性痴呆、ビンスワンガー型白質脳症、慢性硬膜下血腫などの脳血管障害性疾患、虚血性臓器障害、臓器移植等再灌流障害、血管性障害、神経障害、動脈硬化及び心筋梗塞等、神経変性疾患では、多発性硬化症、ギランバレー症候群、膠原病などの自己免疫性疾患、脊髄小脳変性症、シャイドレーガー症候群、マチャド・ジョセフ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ失調症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー症、ピック病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、進行性核上麻痺、てんかんなどの神経変性疾患、さらには老化に付随する痴呆症、歩行障害や、交通事故などによる外傷性の脊髄損傷、脳障害などがその対象として考慮され得る。中でも、運動失調症、てんかん、運動ニューロン疾患、老化や外傷性の疾患、脳血管障害性疾患、免疫異常性疾患に分類されるものが最適対象と考えられる。運動障害のような神経障害改善剤として本願発明のセレノプロテインＰまたはこれに由来するペプチドもしくはペプチド群を主要構成成分として含有する薬剤を使用する場合、本薬剤を単独で投与することもできるし、他の治療薬剤との併用投与も効果を増大させるための有効な手段として期待できる。また、予防的または治療的投与のいずれにおいても効果が期待できる。
本願発明により、種々の病因に起因する神経変性疾患、とりわけ運動機能の低下している疾患に対する好適な神経障害改善剤が提供される。
以下、調製例及び実施例に沿って本願発明をさらに詳細に説明するが、これらは本願発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、以下に示す調製例及び実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡、及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社、ファルマシヤ社、バイオラド社、シグマ社、ギブコＢＲＬ社製の試薬を使用した。
調製例１
（セレノプロテインＰ断片に対する抗体結合担体（抗ＳｅＰ抗体カラム）を用いたセレノプロテインＰ断片の精製）
血漿中のヘパリンセファロース結合画分を２Ｍ硫酸アンモニウムにより沈殿させ、その沈殿画分に対して５倍以上の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）により沈殿を溶解させた。この溶液に存在するセレノプロテインＰを抗ＳｅＰ抗体カラムに結合させ、ＰＢＳで洗浄した。その後４Ｍ尿素を含有する２０ｍＭクエン酸バッファーによりセレノプロテインＰを溶出し、２０ｍＭクエン酸バッファーで平衡化した陽イオン交換体（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ：ＢｉｏＲａｄ）に結合させた。これを塩化ナトリウムによる塩濃度勾配溶出を行ない、細胞死抑制活性を示す画分を回収した。この時、全長のセレノプロテインＰを得ることが可能であるが、蛋白あたりの細胞死抑制活性は明らかに弱い値を示した。本方法では、短時間の精製が可能であるため、蛋白あたりの細胞死抑制活性の強いセレノプロテインＰ断片を得ることができた。ここで得られた断片もまた、糖鎖の有無、分子間結合の有無、内部切断の有無などにより種々のサイズの分子種を含む混合画分であり、非還元電気泳動で１０〜３０ｋＤａのサイズを示すセレノプロテインＰ断片群であった。
実施例１
（細胞障害抑制活性）
細胞障害抑制活性のアッセイ系に使用するＤａｍｉ細胞（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌ．７２，ｐ．１９６８−１９７７（１９８８）に記載）を用いて、アッセイ培地（５０％ＰＢＳ／ＳＡ／０．０３％ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製））またはＳＡ／０．０５％脱脂肪酸ＢＳＡ（ＷＡＫＯ社）／４μＭの長鎖多価脂肪酸（アラキドン酸、リノール酸またはリノレン酸等）により２回洗浄しで３×１０４細胞／ｍｌになるように懸濁後、得られた細胞懸濁液をサンプル添加ウェルのみ２００μｌ、段階希釈のためのウェルには１００μｌずつを９６ｗｅｌｌプレートに分注した。サンプル添加ウェルにアッセイ試料として調製例１で得られたセレノプロテインＰ断片及び、セレノシスチン、セレノメチオニン、エブセレン、亜セレン酸ナトリウムについて同一濃度の溶液を調製し、それらを２μｌ添加し撹拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウェルに対して段階希釈した。そして、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間培養し細胞の生死を判定した。
その結果、調製例１で精製したセレノプロテインＰ断片以外に、その断片より
2002076492.tif 000005
性にとってセレノシステインが重要であることが示された。
実施例２
（脳虚血再潅流障害モデルにおけるセレノプロテインＰ断片の虚血・再灌流障害抑制効果）
セレノプロテインＰの脳虚血再灌流障害による運動障害に及ぼす影響を麻痺の度合いで確認するために、１２週齢のスナネズミを用いて評価した。塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射にて全身麻酔をかけ、正中切開にて頚静脈を露出させ、本願発明のセレノプロテインＰ断片を１ｍｇ／匹の量で静脈内投与した。３０分虚血、４５分間虚血を行なった後、血流を再灌流させ、６時間後及び２４時間後の麻痺の度合いにより評価した。
６時間後及び２４時間後の麻痺の状態を表１に示すスコアで判定し評価した。
2002076492.tif 000006
図１に示すように、３０分虚血モデルにおける６時間後の麻痺の状態及び２４時間後の麻痺の状態を評価すると、セレノプロテインＰ断片投与群の方が明らかに症状が良好である結果が得られた。また、４５分虚血モデルでは６時間後の麻痺の度合いは大差ないが、２４時間後の麻痺の度合いに大きな差が観られた。
実施例３
（クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）マウスへのセレノプロテインＰの投与による運動失調の改善効果）
老化に付随する運動機能低下の改善を目的として、クロトーマウス（Ｎａｔｕｒｅ，３９０：４５−５１，１９９７）を用いて本願発明のセレノプロテインＰ断片の効果を確認した。クロトーマウスは、１９９７年に京都大学大学院医学研究科の鍋島陽一先生らが作出した老化モデルマウスで、平均寿命は６０日、生後２０日頃から発育が遅延し、生後１００日以内にほぼ全例が死亡する。Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子変異のため、動脈硬化症、肺気腫、皮膚萎縮、性腺萎縮（卵子や精子が減数分裂しない）、神経変性（小脳Ｐｕｒｋｉｎｊｅ細胞の脱落、運動失調症）、脳下垂体の機能異常（成長ホルモンの生産低下、成長障害）、骨粗鬆症（軟部組織や軟骨の異所性石灰化）など、老化に関連した異常が認められるマウスである。Ｎａｔｕｒｅ，３９０：４５−５１，１９９７に記載され、クロトーマウスは京都大学大学院医学研究科の鍋島陽一先生の許可を得て日本クレアより入手した。
１群４匹の４週齢のクロトーマウスに対して８週齢まで、生理食塩水に溶解した調製例１で得られたセレノプロテインＰ断片（１．５ｍｇ／ｍｌ）及び生理食塩水を毎週３００μｌずつ腹腔に投与し、その状態変化を観察した。その結果、生理食塩水投与群、セレノプロテインＰ断片投与群ともに、４週齢からの体重の増加は観察されず、根本原因を解決する事は無かった。しかし、その行動を比較するとセレノプロテインＰ断片投与群が手のひらに乗せた際、自発的に逃げるために飛び降りることが可能であるのに対し、生食投与群は自発的な逃避行動をとることが出来なかった。これはセレノプロテインＰ断片による運動能低下の改善効果を示すものと考えられた。
実施例４
（マウス実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ））
セレノプロテインＰの免疫異常性疾患による運動障害に及ぼす影響を麻痺の度合いで確認するために、マウスＥＡＥでのセレノプロテインＰ投与実験をを行った。動物として、ＳＪＬ／ＪＯｒＩＩＣｒｊ、メス、１４週令（日本チャールズリバー）を用い、免疫原としてｍｙｅｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＬＰ）ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １３９−１５１（アミノ酸配列：Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ）（配列番号６）を２５ｍｇ／マウスで、フロイント完全アジュバントＨ３７Ｒａ（４００ｍｇ／マウス）と百日咳菌毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製；２００ｎｇ／マウス）とともに尾根部２箇所に皮内投与した。
１群１３匹で、セレノプロテインＰを発症前日（８日目）から１３日目まで毎日、０．５ｍｇ／ｈｅａｄで腹腔内投与した。対象として同様にＳａｌｉｎｅを腹腔投与した。発症後、その麻痺の程度を表２に示すスコアで毎日判定し、評価した。
2002076492.tif 000007
その結果、図２に示すように、セレノプロテインＰ投与群に、発症の抑制と重症度の軽減効果が認められた。さらに、１０日目の発症率を比較すると、Ｓａｌｉｎｅ投与群は１３匹中１２匹が発症しているにもかかわらず、セレノプロテインＰ投与群では１３匹中４匹しか発症していない。このことから、セレノプロテインＰには免疫異常性疾患における発症の抑制効果と運動障害の軽減効果があることが示された。
実施例５
（培養ヒト神経細胞の突起形成に対するセレノプロテインＰの効果）
ＮＴ２（Ｎｔｅｒａ２／Ｄ１）（Ｐｌｅａｓｕｒｅ，Ｓ．Ｊ．及びＬｅｅ，Ｖ．Ｍ．１９９３  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ，３５：５８５−６０２）はヒト奇形癌由来の神経前駆細胞であり、レチノイン酸により中枢神経系の神経の性状を示すｈＮＴ神経細胞へと分化させることが可能である（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．ら、１９９３  Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２２：２８３−２９４）。このｈＮＴ細胞の突起形成に対するセレノプロテインＰの効果を検討した。
ＮＴ２、ｈＮＴ細胞ともに３７℃、ＣＯ２インキュベーターで培養可能であり、ｈＮＴ細胞は以下の操作により得た。まず、１０％ＦＣＳ／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地で継代培養可能であるＮＴ２細胞を２．５×１０５細胞／ｍｌでプレーティングしておき、２４時間後に１０μＭ  ａｌｌｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄを含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２に培地を交換して誘導を開始した。その後３日毎に同培地を交換し、６週間培養することによりＮＴ２細胞をｈＮＴ細胞へ分化させた。分化した細胞を全て回収後、１０％ＦＣＳ／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地により３倍に拡張継代培養した。更に４８時間後に３−４×１０６細胞／ｍｌになるようにプレーティングした。４８時間培養後に５％ＦＣＳ／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２プラスｍｉｔｏｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０μＭ  Ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ，Ｕｒｉｄｉｎｅ，１μＭ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）に培地を交換、３日毎に同培地を交換しながら１０日間培養した。その後、短時間のトリプシン処理後、軽いタッピングで遊離してくるｈＮＴ神経細胞を回収した。回収した細胞はＮＴ２培養上清（１０％ＦＣＳ／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）と新しい１０％ＦＣＳ／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２を等量混合した培地に懸濁後、Ｌａｍｉｎｉｎコートプレートにプレーティング後、細胞を維持した。このようにして得られたｈＮＴ細胞を実験に用いた。
得られたｈＮＴ細胞はトリプシン処理により細胞回収後、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｄ−ＭＥＭ、Ｆ−１２を１：２：２で混合した基礎培地により洗浄後、同培地懸濁後９６穴プレートに３０００細胞／ｗｅｌｌで培養を行うと、５〜７日目に完全に死滅した。それに対して、セレノプロテインＰを１００ｎｇ／ｍｌ添加すると完全に細胞死が抑制され、その状態で、２週間以上維持可能であった。また、培養４日目に細胞形態を観察すると、図３に示すように、セレノプロテインＰ添加では、突起形成が認められた。このことより、セレノプロテインＰに神経細胞の樹状突起や軸索などの突起形成に効果があることが示された。
【配列表】
2002076492.tif 000008
2002076492.tif 000009
2002076492.tif 000010
【図面の簡単な説明】
図１はスナネズミの両頸動脈遮断誘導運動障害に対するセレノプロテインＰの改善効果を示す図である。
図２はマウスＥＡＥにおける運動障害に対するセレノプロテインＰの改善効果を示す図である。
図３はセレノプロテインＰを添加した場合（ＳｅＰ（＋））と添加しない場合（ＳｅＰ（−））に観察される培養ヒト神経細胞の顕微鏡写真である。セレノプロテインＰを添加した場合には培養ヒト神経細胞に突起形成が認められる。
【図１】
2002076492.tif 000013
【図２】
2002076492.tif 000014
【図３】
2002076492.tif 000015
【国際調査報告】
2002076492.tif 000016
2002076492.tif 000017
2002076492.tif 000018