(57)【要約】本発明は酵素反応を模倣した新しい触媒機能を有する合成ポリマーを提供する。さらに、本発明は、そのようなポリマーを用いた糖化蛋白質の測定方法、特に糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、糖化アルブミンやその分解産物であるフルクトシルバリンをはじめとするフルクトシルアミンの測定方法ならびにその方法に基づき構築される測定用試薬ならびにセンサーを提供する。
2002022698.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクトシルアミン化合物と結合し、該物質の酸化を電子受容体の存在下で触媒する合成ポリマー。
【請求項２】
請求項１記載のポリマーにおいてボロン酸基を有するポリマー。
【請求項３】
請求項１記載のポリマーにおいてイミダゾール基を有するポリマー。
【請求項４】
請求項１記載のポリマーにおいてイミダゾール基とボロン酸基との両方を有するポリマー。
【請求項５】
請求項１記載のポリマーにおいてビニルボロン酸を重合して得られるポリマー。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のポリマーにおいてビニルイミダゾールを含む化合物を用いて合成して得られるポリマー。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のポリマーにおいてビニルイミダゾールとビニルボロン酸の共重合体であることを特徴とするポリマー。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のポリマーにおいて１−ビニルイミダゾールを用いて合成して得られるポリマー。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のポリマーにおいて４−ビニルフェニルボロン酸を用いて合成して得られるポリマー。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のポリマーにおいて、さらに架橋試薬を添加して合成して得られることを特徴とするポリマー。
【請求項１１】
請求項１０記載のポリマーにおいて架橋試薬がエチレングリコールジメタクリレートであることを特徴とするポリマー。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載のポリマーにおいて、さらに鋳型分子を添加して合成して得られることを特徴するポリマー。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリマーにおいて、重合後、鋳型分子が取り除かれて得られることを特徴とするポリマー。
【請求項１４】
請求項１２または１３記載のポリマーにおいて鋳型分子がフルクトシルアミンであることを特徴とするポリマー。
【請求項１５】
請求項１４記載のポリマーにおいてフルクトシルアミンがフルクトシルバリンであることを特徴とするポリマー。
【請求項１６】
請求項１２または１３記載のポリマーにおいて鋳型分子がメチルバリンであることを特徴とするポリマー。
【請求項１７】
請求項１から１１のいずれかに記載のポリマーにおいて、さらに塩基性モノマーを添加して合成して得られることを特徴するポリマー。
【請求項１８】
請求項Ａ２記載のポリマーにおいて、塩基性モノマーが、アリルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリレートおよびジエチルアミノエチルメタクリレートからなる群より選択されることを特徴とするポリマー。
【請求項１９】
フルクトシルアミンの測定方法であって、試料を請求項１〜Ａ３のいずれかに記載のポリマーと接触させ、酸化されたフルクトシルアミンの量を測定することを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法において、前記接触がメディエータの存在下で行われ、フルクトシルアミンの酸化により生成される還元型のメディエータの量を電気化学的手法により計測することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の方法において、前記接触がｐＨ６〜１０の反応溶液中で行われることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１−１８のいずれかに記載のポリマーを含むフルクトシルアミン測定キット。
【請求項２３】
請求項１−１８のいずれかに記載のポリマーを含むことを特徴とするフルクトシルアミンセンサー。
【請求項２４】
請求項２３記載のフルクトシルアミンセンサーにおいて電極がカーボンペースト電極であることを特徴とするフルクトシルアミンセンサー。
【請求項２５】
糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の測定方法であって、試料中のＨｂＡ１ｃあるいはＨｂＡ１ｃを分解して生成させたフルクトシルバリンを請求項１９記載の方法により定量することを含む方法。
【請求項２６】
請求項１−１８のいずれかに記載のポリマーを含む糖化ヘモグロビン測定キット。
【請求項２７】
請求項１−１８のいずれかに記載のポリマーを含む糖化ヘモグロビンセンサー。
【請求項２８】
糖化アルブミンの測定方法であって、試料中の糖化アルブミンあるいは糖化アルブミンを分解して生成させたフルクトシルアミンを請求項１９記載の方法により定量することを含む方法。
【請求項２９】
請求項１−１８のいずれかに記載のポリマーを含む糖化アルブミン測定キット。
【請求項３０】
請求項１−１８のいずれかに記載のポリマーを含む糖化アルブミンセンサー。
【請求項３１】
フルクトシルアミン化合物と結合し、該物質の酸化を電子受容体の存在下で触媒する合成ポリマーを製造する方法であって、ビニルボロン酸を重合させることを特徴とする方法。
【請求項３２】
フルクトシルアミン化合物と結合し、該物質の酸化を電子受容体の存在下で触媒する合成ポリマーを製造する方法であって、ビニルイミダゾールとビニルボロン酸とを共重合させることを特徴とする方法。
【請求項３３】
フルクトシルアミン化合物と結合し、該物質の酸化を電子受容体の存在下で触媒する合成ポリマーを製造する方法であって、ビニルイミダゾールと４−ビニルフェニルボロン酸とを共重合させることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３２または３３記載の方法において、ビニルイミダゾールが１−ビニルイミダゾールであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３１−３４のいずれかに記載の方法において、さらに架橋試薬を添加して重合させることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５記載の方法において、架橋試薬がエチレングリコールジメタクリレートであることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３１−３６のいずれかに記載の方法において、さらに鋳型分子を添加して重合させることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の方法において、重合後に鋳型分子を取り除く工程をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３７または３８記載の方法において、鋳型分子がフルクトシルアミンであることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９記載の方法において、フルクトシルアミンがフルクトシルバリンであることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３７または３８記載の方法において、鋳型分子がメチルアミンであることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４１記載の方法において、メチルアミンがメチルバリンであることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項３１−３６のいずれかに記載の方法において、さらに塩基性モノマーを添加して重合させることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４３記載の方法において、塩基性モノマーが、アリルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリレートおよびジエチルアミノエチルメタクリレートからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は酵素反応を模倣した新しい触媒機能を有する合成ポリマーとそれを用いた新規な糖化蛋白質の測定方法に関する。より詳細には本発明は触媒機能を有するモノマーおよび分子認識機能を有するモノマーを分析対象としている分子を鋳型として存在させた状態で重合して得られるポリマーに関する。さらに臨床検査などの分野で糖尿診断のマーカなどで利用されている糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、糖化アルブミンやその分解産物であるフルクトシルバリンをはじめとするフルクトシルアミンの測定方法ならびにその方法に基づき構築される測定用試薬ならびにセンサーに関する。
背景技術
蛋白質主鎖および側鎖のアミノ基はグルコースなどの還元糖の還元末端と非酵素的に結合して、アマドリ化合物すなわち糖化蛋白質を生ずる。血中においては、ヘモグロビンが糖化されて糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン；ＨｂＡ１ｃ）を生ずることが知られている。糖尿病患者では健常人に比べてヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの存在比率が高いこと、およびＨｂＡ１ｃの血中濃度は過去数週間の血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃ血中濃度は糖尿病の診断および糖尿病患者の血糖コントロールの指標として、臨床試験において極めて重要である。
これまでに、種々の菌株からアマドリ化合物に対して作用する酵素、フルクトシルアミン酸化酵素が単離されており、これらの酵素を用いて糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃおよびフルクトシルアミン等の糖化蛋白質を分析しうることが示唆されている（特開昭６１−２６８１７８、特開昭６１−２８０２９７、特開平３−１５５７８０、特開平５−１９２１９３、特開平７−２８９２５３、特開平８−１５４６７２、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１），１０３−１１０，１９８９、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（２），３３３−３３８，１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（４４），２７２９７−２７３０２，１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１２），４４８７−４４８９，１９９５、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９（３），４８７−４９１，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１），２１８−２２４，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（５１），３２８０３−３２８０９，１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（６），３４３７−３４４３，１９９７、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８（１１），８６９−８７１，２０００、Ｍａｒｉｎｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１２６−１３２，２００１／０９／０５）。
しかし、これまでに報告されているフルクトシルアミン酸化酵素は蛋白質であることから安定性の改良が望まれていた。
本発明はアマドリ化合物を認識し、これを酸化するための触媒機能を有するポリマーならびに新規な糖化蛋白質の測定方法を提供することを目的とする。より詳細には本発明は臨床検査などの分野で利用され、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、糖化アルブミンやその分解産物であるフルクトシルバリンをはじめとするフルクトシルアミンの測定方法ならびにその方法に基づき構築される測定用試薬ならびにセンサーを提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は糖化蛋白質およびその分解産物を基質として酸化する合成高分子触媒を鋭意検討した結果、フルクトシルアミン化合物と結合し、さらに該物質の酸化を電子受容体の存在下で触媒するポリマーを開発することに成功した。すなわち、イミダゾールおよびボロン酸を含むポリマーを合成したところ該触媒活性を有することを見い出し、さらに同ポリマーを用いてフルクトシルアミンを反応させる方法を見出した。
すなわち、本発明はフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒するポリマーならびにこれを用いるフルクトシルアミンならびにその関連化合物の測定方法を提供する。別の観点からは、フルクトシルアミンをイミダゾールとボロン酸を含むポリマーと作用させた結果還元される電子受容体（メディエータ）を測定することを特徴とするフルクシルミンの測定方法を提供する。特に、本測定をメディエータの存在下で反応を行い、かつ反応溶液のｐＨが６〜１０であることを特徴とするフルクトシルアミンの測定方法を提供する。
すなわち本発明はフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒するポリマーを提供する。またそのようなポリマーにおいて、イミダゾール基あるいはボロン酸基、あるいはイミダゾール基およびボロン酸基を同時に有するポリマーを提供する。
本発明はフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒する、ビニルボロン酸を重合して得られるポリマーを提供する。
さらに本発明はフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒するビニルイミダゾールを含む化合物を用いて合成して得られるポリマーを提供する。
また本発明はフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒するビニルイミダゾールとビニルボロン酸の共重合体であることを特徴とするポリマーを提供する。
本発明はまたフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒する１−ビニルイミダゾールを用いて合成したポリマーを提供する。
本発明はまたフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒する４−ビニルフェニルボロン酸を用いて合成したポリマーを提供する。
さらに本発明はフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒する架橋試薬を用いて合成されたポリマーを提供する。
また本発明はフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒する架橋試薬がエチレングリコールジメタクリレート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ；ＥＧＤＭＡ）であることを特徴とするポリマーを提供する。
本発明はフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒する鋳型分子を重合時に添加し合成されることを特徴するポリマーを提供する。
本発明はまた、フルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒する、重合後、鋳型分子が取り除かれて調製されることを特徴とするポリマーを提供する。
本発明はまた上記のポリマーにおいて鋳型分子がフルクトシルアミンであることを特徴とするポリマーを提供する。
さらに本発明では上記のポリマーにおいてフルクトシルアミンがフルクトシルバリンであることを特徴とするポリマーを提供する。
本発明はまた上記ポリマーにおいて鋳型分子がメチルアミン化合物であることを特徴とするポリマーを提供する。
さらに本発明では上記ポリマーにおいてメチルアミン化合物がメチルバリンであることを特徴とするポリマーを提供する。
本発明はフルクトシルアミンと結合しその酸化を触媒するポリマーを含むフルクトシルアミン測定キットを提供する。また本発明は上記記載の方法においてフルクトシルアミンが反応した結果生成される還元型のメディエータを電気化学的手法により計測することを特徴とするフルクトシルアミンの測定方法を提供する。
さらに本発明は上記記載の方法を実施するためのフルクトシルアミンセンサーを提供する。
本発明はまた、フルクトシルアミンセンサーにおいて電極としてカーボンペーストを用いることを特色としたフルクトシルアミンセンサーを提供する。
さらに本発明は上記記載の方法を実施するための糖化ヘモグロビン測定キットを提供する。また本発明は上記記載の方法を実施するための糖化ヘモグロビンセンサーを提供する。さらに本発明は糖化アルブミンの測定方法を提供する。すなわち、試料中の糖化アルブミンあるいは糖化アルブミンを分解して生成させたフルクトシルアミンを上記記載の方法で定量することを含む方法を提供する。
さらに本発明は上記記載の方法を実施するための糖化アルブミン測定キットを提供する。また、本発明は上記記載の方法を実施するための糖化アルブミンセンサーを提供する。
さらに本発明は、フルクトシルアミン化合物と結合し、該物質の酸化を電子受容体の存在下で触媒する合成ポリマーを製造する方法を提供する。該方法は、ビニルボロン酸を重合させることを特徴とする。好ましくは、ビニルイミダゾールとビニルボロン酸とを共重合させ、より好ましくは、ビニルイミダゾールと４−ビニルフェニルボロン酸とを共重合させる。重合すべきモノマー混合物は、さらに架橋試薬、鋳型分子または塩基性モノマーを含んでいてもよい。
発明を実施するための最良の形態
本発明のフルクトシルアミンと結合し、その酸化反応を触媒する能力を有するポリマーはイミダゾール基あるいはボロン酸基、あるいはイミダゾール基およびボロン酸基を同時に有するポリマーとして合成される。イミダゾール基およびボロン酸基を有するポリマーは、イミダゾール基およびボロン酸基を有するモノマーを重合することによって合成できる。このようなポリマーを合成するためにはモノマーとして例えば１−ビニルイミダゾールあるいは４−ビニルフェニルボロン酸などがあるが、イミダゾール基およびボロン酸基を有するモノマーであれば限定されるものではない。また、フルクトシルアミン類を認識し、さらに該物質の酸化を電子受容体の存在下で進行する触媒機能を有するのであれば、イミダゾール基およびボロン酸基を有するモノマーに限定されるものではない。たとえば、イミダゾールに限らず、一般塩基触媒の機能を果たす官能基、たとえばピリジンを含むビピリジルを含むモノマーを用いて重合してよい。このようなモノマーの例としては、４（５）−ビニルイミダゾール、４−ビニルピリジン、２−ビニルピラジン、２−ビニルピリジン、２−ビニル−２，６−ジアミノ−ｓ−トリアジンが挙げられる。
さらに、このようにして作成されるポリマーの組成にアクリル酸、アクリルアミドなどのほかの重合可能な機能性モノマーを混在させ、同時に重合してコポリマーを形成してもよい。特に、アリルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート等の塩基性ポリマーを加えてコポリマーを作成すると、鋳型としてフルクトシルバリンを用いない場合であっても、フルクトシルリシンと比較してフルクトシルバリンに対する選択性を有するポリマーを得ることができる。また、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等を加えて重合することにより、ポリマーの親水性を高めることができる。
さらに、本発明のポリマーを架橋することにより安定なポリマーが合成される。例えばポリマー重合時にＥＧＤＭＡ等の架橋剤を添加することにより、ポリマーの構造がより安定化され、分子の認識機能が向上する。
さらに上記架橋時に分子認識の対象となる鋳型分子を混合させておくことにより、合成されたポリマーに高い分子認識機能を付与することが可能となる。例えば、１−ビニルイミダゾールと４−フェニルビニルボロン酸とを混合し、架橋剤としてＥＧＤＭＡを加えラジカル重合を開始する際に、フルクトシルアミン化合物の１つであるフルクトシルバリンを添加して重合することにより、得られるポリマーのフルクトシルバリン認識機能は鋳型分子を混合せずに合成したポリマー（コントロールポリマー）に比べ１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上となる。また単位ポリマーあたりに結合できるようになるフルクトシルバリン量も同コントロールポリマーに比べ１．５倍以上となる。その結果、電子受容体の存在下でのフルクトシルバリンの酸化速度も同コントロールポリマーに比べ１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上となる。
さらに本発明に従えば、フルクトシルバリンを鋳型として重合することにより、他のフルクトシルアミンと比較してフルクトシルバリンに対する選択性を有するポリマーを得ることができる。血中に含まれる糖化タンパク質はヘモグロビン以外にも糖化アルブミンがある。糖化アルブミンとはアルブミンのアミノ酸配列中のリジンのε位アミンが糖化を受けたものである。これまでの糖化タンパク質の測定法では糖化ヘモグロビンと糖化アルブミンを明確に区別して測定することはできなかった。フルクトシルバリンを鋳型として合成したポリマーは、糖化アルブミンのモデル化合物であるε−フルクトシルリジンと比較してフルクトシルバリンに対する反応性の向上を示すため、血中の糖化アルブミンに対して糖化ヘモグロビンを特異的に認識するセンサーへの応用が可能である。
また、鋳型分子としてメチルアミンを用いることもできる。例えば、鋳型としてメチルバリンを用いてポリマーを作成することによって、フルクトシルバリンに対する選択性を得ることができる。
本発明における糖化蛋白質、たとえば糖化アルブミンあるいはＨｂＡ１ｃ、あるいは糖化アルブミンやＨｂＡ１ｃを酵素的あるいは化学的に分解し生成したフルクトシルバリン等のフルクトシルアミンを測定する方法は、フルクトシルアミン等をまたこのようにして合成されたポリマーと作用させることにより達成される。特に、本測定をメディエータの存在下で反応を行い、かつ反応溶液のｐＨが６〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７近辺で測定することが望ましい。
ビニルイミダゾールとビニルボロン酸とをＥＧＤＭＡを架橋剤としてフルクトシルバリン存在下で合成されたポリマーを触媒とし、メディエータとしてフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）とジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いて基質としてフルクトシルバリンを用いたとき、時間とともにフルクトシルバリンが酸化され、ＰＭＳを介してＤＣＩＰが還元され退色していくことが観測される。このＤＣＩＰの退色の速度を指標にフルクトシルバリンの濃度を測定できる。すなわち、本発明のポリマーを触媒とし、メディエータとしてフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）とジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）の存在下で未知濃度のフルクトシルバリンを１ｍＭ以下の感度で定量できる。
さらに種々の人工電子メディエーターを利用することができる。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体などを用いることができる。
アッセイキット
別の観点においては、本発明は、本発明のポリマーを用いた測定方法を含むＨｂＡ１ｃあるいは糖化アルブミンといった糖化蛋白質およびフルクトシルアミンの測定キットを特徴とする。本発明の糖化蛋白質測定キットは、本発明に従うビニルイミダゾールとビニルボロン酸とをＥＧＤＭＡを架橋剤としてフルクトシルバリン存在下で合成されたポリマーを触媒として備えた反応液を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、該ポリマーとｐＨ６．０〜１０に調整された緩衝液、適当なメディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのフルクトシルバリンもしくはその誘導体の標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う糖化蛋白質分析キットは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
さらに別の観点においては、本発明はＨｂＡ１ｃアッセイキットを特徴とする。ＨｂＡ１ｃを酵素的または化学的に分解することによりフルクトシルバリンが生成し、これを本発明のフルクトシルバリン分析キットを用いて定量することによりＨｂＡ１ｃをアッセイすることができる。したがって、本発明のＨｂＡ１ｃアッセイキットは、上述のフルクトシルバリンアッセイキットにさらに加水分解試薬または蛋白質分解酵素を含む。
センサー
別の観点においては、本発明は、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃおよびフルクトシルアミン計測用センサーを特徴とする。本発明のポリマーのひとつであるビニルイミダゾールとビニルボロン酸とをＥＧＤＭＡを架橋剤としてフルクトシルバリン存在下で合成されたポリマーが基質の酸化反応を触媒し、このときにメディエータが還元され、還元されたメディエータを電極上で電気化学的に酸化し、得られた電流値を指標に基質の濃度を決定することができる。
本発明の測定原理に従い、以下のようにフルクトシルアミン計測用センサーが構築できる。本発明のセンサーシステムの一例を図３に示す。アンペロメトリック系で測定する場合、センサーシステムは、セル１０、ポテンシオスタット１２およびレコーダー１４を備え、セル１０の中には適当な緩衝液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）が入れられている。セル１０は、バッチ式でもフロー式でもよい。セル１０には、作用電極２０、対極２２および参照電極２４が緩衝液中に浸るように備えられており、ポテンシオスタット１２により作用電極２０に一定（例えば１００ｍＶ）の電圧を印加する。作用電極２０としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のポリマーを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーを用いる方法などがあり、これらを組み合わせて用いてもよい。
カーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電極２０としてフルクトシルアミン化合物と結合し、該物質の酸化を電子受容体の存在下で触媒するポリマーを固定化した電極を用い、対極２２（例えば白金電極）および参照電極２４（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、メディエーターを含む緩衝液を入れたセル１０の中に挿入して一定温度に保持する。ポテンシオスタット１２により作用電極２０に一定の電圧を印加し、試料を加えて電流の増加値を測定し、レコーダー１４で記録する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。
さらにカーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエータを用いる系がある。すなわち、フルクトシルアミン化合物と結合し、該物質の酸化を電子受容体の存在下で触媒する本発明のポリマーとともに、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどの電子メディエータを吸着あるいは共有結合法により高分子マトリックスに固定化した電極を作用電極２０として用い、対極２２（例えば白金電極）および参照電極２４（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、緩衝液を入れたセル１０の中に挿入して一定温度に保持する。ポテンシオスタット１２により作用電極２０に一定の電圧を印加し、試料を加えて電流の増加値を測定し、レコーダー１４で記録する。
いずれの電極を用いる場合にも、標準濃度のフルクトシルバリン溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のフルクトシルバリン濃度を求めることができる。
ＨｂＡ１ｃ計測用センサーとして用いる場合は、上述のフルクトシルバリン計測用センサーに、さらに蛋白質分解酵素（例えばプロテアーゼ）を固定化した膜などを組み合わせて、複合センサーを構築する。このような、複数の酵素等の触媒の組み合わせによる連続的反応を用いる複合センサーの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎｔｈｏｎｙ　Ｐ．Ｆ．Ｔｕｎｅｒ，Ｉｓａｏ　Ｋａｒｕｂｅ　ａｎｄ　Ｇｅｒｏｇｅ　Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７に記載されている。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２０００−３１８６１８号の明細書に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例１
４−ビニルフェニルボロン酸０．２ｍｍｏｌ、架橋試薬としてエチレングリコールジメタクリレート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ；ＥＧＤＭＡ）２ｍｍｏｌ、重合開始剤として２，２’−Ａｚｏｂｉｓｉｓｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅを０．０６ｍｍｏｌ加え、鋳型分子としてフルクトシルバリン０．２ｍｍｏｌを加え、溶媒として５２２μｌのメタノールと１７４μｌの水を用い、アルゴン置換した後、４５℃で１２時間重合反応を行った。ここで得られたポリマーＢ−ＭＩＰとよぶ。このポリマーを乳鉢にてすりつぶし、ふるいによって粒子径４０μｍのポリマーを調製した。また鋳型分子であるフルクトシルバリンを添加しないで、上記と全く同じ操作を行うことによりコントロールポリマー，Ｂ−ＣＰを合成した。これらのポリマーをメタノール：酢酸（７：２）で２回、アセトニトリル：酢酸（９：１）で２回、アセトニトリルで１回、メタノールで１回、それぞれ洗浄した。
実施例２
実施例１で得られたポリマーをそれぞれ５ｍｇ／ｍｌとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に懸濁し、そこへ適当量のフルクトシルバリンを添加し、ポリマーのフルクトシルバリン結合能力を評価した。その結果を図１に示す。鋳型分子であるフルクトシルバリンの存在下で重合したＢ−ＭＩＰのフルクトシルバリンに対する結合定数ならびに単位ポリマーあたりの最大結合能力はコントロールとして用いたＢ−ＣＰのそれぞれ１．２倍、および２．１倍であった。
実施例３
１−ビニルイミダゾール１．６ｍｍｏｌ、４−ビニルフェニルボロン酸０．８ｍｍｏｌ、架橋試薬としてエチレングリコールジメタクリレート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ；ＥＧＤＭＡ）２ｍｍｏｌ、重合開始剤として２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを０．０６ｍｍｏｌ加え、鋳型分子としてフルクトシルバリン０．２ｍｍｏｌを加え、溶媒として５２２μｌのメタノールと１７４μｌの水を用い、アルゴン置換した後、４５℃で１２時間重合反応を行った。ここで得られたポリマーＢＩ−ＭＩＰとよぶ。このポリマーを乳鉢にてすりつぶし、ふるいによって粒子径４０μｍのポリマーを調製した。また鋳型分子であるフルクトシルバリンを添加しないで、上記と全く同じ操作を行うことによりコントロールポリマー，ＢＩ−ＣＰを合成した。これらのポリマーをメタノール：酢酸（７：２）で２回、アセトニトリル：酢酸（９：１）で２回、アセトニトリルで１回、メタノールで１回、それぞれ洗浄した。
実施例４
実施例３で得られたポリマーをそれぞれ５ｍｇ／ｍｌとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に懸濁し、そこへ適当量のフルクトシルバリンを添加し、ポリマーのフルクトシルバリン結合能力を評価した。その結果を図２に示す。鋳型分子であるフルクトシルバリンの存在下で重合したＢＩ−ＭＩＰのフルクトシルバリンに対する結合定数ならびに単位ポリマーあたりの最大結合能力はコントロールとして用いたＢＩ−ＣＰのそれぞれ１．５倍、および１．６倍であった。
実施例５
カーボンペースト５０ｍｇに対して実施例１および３で作成したポリマーを２０ｍｇ混合し、カーボンペースト電極に充填した。この電極を１ｍＭ　１−メトキシフェナジンメトスルフェート（ｍＰＭＳ）を含む１０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓａｌｉｎｅ　ｐＨ７．４の溶液に浸漬し、印加電圧を１００ｍＶ（ｖｓ　Ａｇ／ＡｇＣｌ）とし、基質にフルクトシルバリンを添加したときの応答を観測した。本センサーを図３に示す。また、本センサーを用いて、フルクトシルバリンの測定を行った結果を図４に示す。何もポリマーをつけていないカーボンペースト電極単独では応答はきわめて低い。これに対してＢ−ＭＩＰ，Ｂ−ＣＰを固定した電極の応答は２．５倍に向上する。さらにＢＩ−ＣＰを固定した電極では３倍、さらにＢＩ−ＭＩＰを固定した電極では５倍の応答が得られた。
実施例６
フルクトシルバリンを鋳型として作成したポリマーのフルクトシルバリンに対する選択性を調べた。恒温セルに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を入れ、電子受容体として、終濃度１ｍＭメトキシ−ＰＭＳ（ｍ−ＰＭＳ）を加え、総量を１０ｍｌとした。作用電極としては実施例５で作製したカーボンペースト電極を用い、対極として白金電極、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。
応答電流値は＋１００ｍＶの電位を印加し、電流が定常になったところで、適当な濃度のフルクトシルバリンを加えて増加した電流値を測定した。同様の操作をフルクトシルグリシン、フルクトシルアラニン、フルクトシルフェニルアラニン、ε−フルクトシルリジンについて行った。フルクトシルバリンを加えていないときの電流値をＯＡとした。測定温度は４０℃で行った。結果を図５および６に示す。調べたすべてのフルクトシルアミン化合物に対して、電極の反応性が向上していた。インプリントしたポリマーとコントロールポリマーとの反応性の差はフルクトシルグリシンがもっとも大きく、次いでフルクトシルバリン、フルクトシルアラニン、フルクトシルフェニルアラニン、フルクトシルリジンの順であった。
実施例７
種々の塩基性モノマーの添加の効果を調べた。１−ビニルイミダゾール、４−ビニルフェニルボロン酸、塩基性モノマーとして、アリルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリレートまたはジエチルアミノエチルメタクリレート、架橋剤としてエチレングリコールジメタクリレート（８：４：８：１０）に重合開始剤ＡＢＤＶを加え、メタノール：水（４：１）の溶媒に溶解し、Ａｒで置換し、４５℃で１２時間、重合反応を行った。得られたポリマーを破砕して粒子径を３２μｍ以下に制限した後、洗浄し、乾燥した。
カーボンペースト５０ｍｇに得られたポリマー各２０ｍｇおよびミネラルオイル２０μｌを加え、よく混合した。これをカーボンペースト電極に充填し、作用極とした。参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極、対極として白金電極を用い、反応溶液１ｍＭ　ｍ−ＰＭＳを含む１０ｍＭｐｐｂ（ｐＨ７．５）、反応温度４０℃、印加電位＋１００ｍＶ／ＡｇＣｌとして、フルクトシルバリンまたはフルクトシルリシンを添加したときの増加電流値を測定した。
アリルアミンを固定した電極はカーボンペーストのみの電極と比較すると、フルクトシルバリンはより高い応答を示し、フルクトシルリシンはより低い応答を示した（図７）。Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノエチルメタクリレートまたはジメチルアミノプロピルメタクリレートを固定した電極はカーボンペーストのみの電極と比較すると、フルクトシルバリンは同程度の応答を示し、フルクトシルリシンはより低い応答を示した。ジエチルアミノエチルメタクリレートを固定した電極はカーボンペーストのみの電極と比較すると、フルクトシルバリン、フルクトシルリシンともにより低い応答を示したが、フルクトシルバリンの応答はフルクトシルリシンより高かった。
すなわち、塩基性モノマーを加えることにより、鋳型としてフルクトシルバリンを用いない場合であっても、フルクトシルリシンと比較してフルクトシルバリンに対する選択性が向上した。
実施例８
フルクトシルバリンの代わりにメチルバリンを鋳型として実施例３と同様にポリマーを合成し、これをカーボンペースト電極に固定して作成したセンサーについて、実施例５と同様にして種々のフルクトシルアミン化合物に対する応答を調べた。対照としては鋳型を用いずに合成したポリマーを用いた。結果を図８に示す。メチルバリンを鋳型としたポリマーは、フルクトシルバリンを鋳型としたポリマーを用いた場合と同様に、α位が糖化されたフルクトシルアミン化合物に対する応答性が向上し、特にεフルクトシルリシンと比較してフルクトシルバリンに対する選択制が向上した。
実施例９
１−ビニルイミダゾールの代わりに４（５）−ビニルイミダゾールまたは４−ビニルイミダゾールを用いて、実施例３と同様にポリマーを作成し、これらのポリマーを固定した電極を用いてフルクトシルバリンおよびフルクトシルリシンに対する応答を調べた。いずれのポリマーもフルクトシルバリンに対して酸化触媒能を有していた。しかし、フルクトシルバリンとフルクトシルリシンに対する応答は同程度であり、１−ビニルイミダゾールを用いたポリマーとは異なりフルクトシルバリンに対する選択性は示さなかった。
産業上の利用性
本発明のポリマーは酵素反応を模倣した触媒機能を有する合成ポリマーとして、糖化蛋白質の測定、特に糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、糖化アルブミンやその分解産物であるフルクトシルバリンをはじめとするフルクトシルアミンの測定において用いるのに有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１で合成されたポリマーのフルクトシルバリンに対する結合能力を評価した図である。Ｂ−ＭＩＰは鋳型分子の存在下で作成したボロン酸重合体を、Ｂ−ＣＰは鋳型分子の非存在下で作成したボロン酸重合体をそれぞれ示す。
図２は、実施例１および実施例３で合成されたポリマーのフルクトシルバリンに対する結合能力を評価した図である。ＢＩ−ＭＩＰは鋳型分子の存在下で作成したビニルイミダゾール−ボロン酸共重合体を、ＢＩ−ＣＰは鋳型分子の非存在下で作成したビニルイミダゾール−ボロン酸共重合体を、Ｂ−ＭＩＰは鋳型分子の存在下で作成したボロン酸重合体を、Ｂ−ＣＰは鋳型分子の非存在下で作成したボロン酸重合体を、それぞれ示す。
図３は、本発明のセンサーシステムの図である。
図４は、実施例５で作成したセンサーを用いてフルクトシルバリンの濃度を電気化学的に測定した結果である。ＢＩ−ＭＩＰは鋳型分子の存在下で作成したビニルイミダゾール−ボロン酸共重合体を用いた電極、ＢＩ−ＣＰは鋳型分子の非存在下で作成したビニルイミダゾール−ボロン酸共重合体を用いた電極、Ｂ−ＭＩＰは鋳型分子の存在下で作成したボロン酸重合体を用いた電極、ＣＰは対照であるカーボンペースト電極の応答をそれぞれ示す。
図５は、フルクトシルバリンを鋳型として作成したポリマーの、ε−フルクトシルリジンと比較したフルクトシルバリンに対する選択性を示す図である。Ｆｒｕ−Ｌｙｓはε−フルクトシルリジンを、Ｆｒｕ−Ｖａｌはフルクトシルバリンを、ＭＩＰはフルクトシルバリンを鋳型として作成したポリマーを、ＣＰは鋳型を用いずに作成した対照ポリマーをそれぞれ示す。
図６は、フルクトシルバリンを鋳型として作成したポリマーの、種々のフルクトシルアミンと比較したフルクトシルバリンに対する選択性を示す表である。ＭＩＰはフルクトシルバリンを鋳型として作成したポリマー用いたときの電極の応答を、ＣＰは鋳型を用いずに作成した対照ポリマーを用いたときの電極の応答をそれぞれ示す。
図７は、塩基性モノマーとしてアリルアミンを加えて得られたコポリマーを用いた電極の、フルクトシルバリンおよびフルクトシルリシンに対する応答を示す図である。ＣＰ−１はアリルアミンを加えて得られたコポリマーを用いた電極の応答を、ＣＰは対照であるカーボンペースト電極の応答をそれぞれ示す。
図８は、メチルバリンを鋳型として合成したポリマーを用いた電極の、種々のフルクトシルアミン化合物に対する応答を示す図である。ｍ−Ｖａｌはメチルバリンを鋳型として合成したポリマーを、対照は鋳型を用いずに合成したポリマーを示す。各化合物の下に示される数字は、ｍ−Ｖａｌと対照の電流値増加の比率を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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