(57)【要約】ＨＬＡ−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識されるおよび／またはＣＴＬを誘導しうる腫瘍抗原をコードする遺伝子をヒト大腸癌細胞株及びヒト食道癌細胞株から同定し、さらに上記腫瘍抗原のエピトープを有するペプチドを見出した。さらに、上記遺伝子によりコードされるポリペプチドまたは上記ペプチド、これらの１つをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、組み換えベクター、形質転換体等を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号２１５から配列番号２８８（配列番号２２８、配列番号２３６、配列番号２６１、および配列番号２６９を除く）、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３８５、および配列番号３８６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチド。
【請求項４】
前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである請求の範囲第３項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するポリペプチド。
【請求項６】
前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである請求の範囲第５項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のポリペプチドからなる医薬。
【請求項８】
配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する癌ワクチン。
【請求項９】
大腸癌、食道癌、口腔扁平上皮癌、腎癌、肺癌、婦人科癌、および前立腺癌の少なくともいずれか１の治療に用いる請求の範囲第８項に記載の癌ワクチン。
【請求項１０】
配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項１１】
配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のポリペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１２】
配列表の配列番号１から配列番号２８８、配列番号３５６から配列番号３８１、および配列番号３８５から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項１３】
配列表の配列番号２９０から配列番号３５５（配列番号２９９および配列番号３３２を除く）および配列番号３８２から配列番号３８４のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項１４】
配列表の配列番号２８９から配列番号３５５および配列番号３８２から配列番号３８４のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるものであるポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項１５】
前記細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されることが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導すること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識されることである請求の範囲第１４項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項１６】
請求の範囲第１２項から第１５項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求の範囲第１２項から１６項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター。
【請求項１８】
組換えベクターが発現組換えベクターである請求の範囲第１７項に記載の組換えベクター。
【請求項１９】
請求の範囲第１７項または第１８項に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項２０】
請求の範囲第１８項に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、請求の範囲第１項、第３項、若しくは第４項に記載のペプチドまたは請求の範囲第２項、第５項、若しくは第６項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２１】
請求の範囲第１項、第３項、若しくは第４項に記載のペプチドまたは請求の範囲第２項、第５項、若しくは第６項に記載のポリペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項２２】
請求の範囲第４項に記載のペプチド若しくは請求の範囲第６項に記載のポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２分子若しくはＨＬＡ−Ａ２６分子と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドまたは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および／または請求の範囲第１２項から第１５項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物の、スクリーニング方法であって、請求の範囲第４項に記載のペプチド、請求の範囲第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１２項から第１５項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖、請求の範囲第１７項または第１８項に記載の組換えベクター、請求の範囲第１９項に記載の形質転換体、または請求の範囲第２１項に記載の抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求の範囲第２２項に記載のスクリーニング方法で得られた化合物。
【請求項２４】
請求の範囲第４項に記載のペプチド若しくは請求の範囲第６項に記載のポリペプチドの少なくとも１つに対するＨＬＡ−Ａ２拘束性若しくはＨＬＡ−Ａ２６拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、または請求の範囲第１２項から第１５項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物。
【請求項２５】
請求の範囲第１項、第３項、若しくは第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項、若しくは第６項に記載のポリペプチド、請求の範囲第１２項から第１５項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、請求の範囲第１７項若しくは第１８項に記載の組換えベクター、請求の範囲第１９項に記載の形質転換体、請求の範囲第２１項に記載の抗体、または請求の範囲第２３項若しくは第２４項に記載の化合物のうちの少なくとも１つを含有してなる癌治療に用いる医薬組成物。
【請求項２６】
請求の範囲第１項、第３項、若しくは第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項、若しくは第６項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第１２項から第１５項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの定量的あるいは定性的な測定方法。
【請求項２７】
癌疾患検査に用いる請求の範囲第２６項に記載の測定方法。
【請求項２８】
請求の範囲第２２項に記載のスクリーニング方法または請求の範囲第２６項に記載の測定方法に使用する試薬キットであって、第１項、第３項、若しくは第４項に記載のペプチド、請求の範囲第２項、第５項、若しくは第６項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第１２項から第１５項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または請求の範囲第２１項に記載の抗体のうちの少なくとも１つを含んでなる試薬キット。
【請求項２９】
癌疾患検査に用いる請求の範囲第２８項に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、腫瘍抗原に関し、さらに詳しくは腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチド若しくは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ポリペプチドまたは該ペプチドに対する抗体、該ポリペプチド若しくは該ペプチドおよび／またはＨＬＡあるいは該ポリヌクレオチドと相互作用を有する化合物、該ペプチドおよび／または該ポリペプチドからなる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤、およびこれらの１種以上を含む医薬組成物、並びに該ポリペプチドまたは該ペプチドの製造方法、該化合物のスクリーニング方法、該ポリペプチドおよび／または該ペプチドを用いる細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドまたはこれらのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの測定方法、および該スクリーニング方法または該測定方法に使用する試薬キットに関する。
背景技術
生体における癌の排除には免疫系、特に細胞性免疫に係る細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）が重要な役割を果たしている。癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤が認められている〔Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．（１９９０）１２６：２００−２０５〕。この腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子（腫瘍抗原）は、メラノーマにおいて初めて発見された。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて８乃至１１個のアミノ酸からなるペプチド（腫瘍抗原ペプチド）になり、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ分子と腫瘍抗原ペプチドからなる複合体を認識し、腫瘍細胞を傷害する。すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡ拘束性に腫瘍細胞を認識する。
ＨＬＡは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別されるが、細胞傷害性Ｔ細胞により抗原ペプチドと共に認識されるＨＬＡはクラスＩ抗原である。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃなどに分類され、ヒトでは有核細胞がそれぞれ異なった量のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを有する。また、その遺伝子は多型に富むことが報告されている。例えば、ＨＬＡ−ＡにはＡ１、Ａ２、Ａ２４、Ａ２６、およびＡ３１などの、ＨＬＡ−ＢにはＢ８、Ｂ２７、およびＢ４６などの、ＨＬＡ−ＣにはＣｗ３やＣｗ６などの多型が存在する。そのため、それぞれの個体が有するＨＬＡの型は必ずしも同一ではない。その中で、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカコーカサス人の約４９％、南アメリカコーカサス人の約３８％、アフリカ黒人の約２３％にみられる。また、ＨＬＡ−Ａ２６対立遺伝子は、日本人の約２２％、韓国人の約１６％、北アメリカコーカサス人の約８％で認められている〔Ｉｍａｎｉｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＨＬＡ  １９９１（１９９２）１：１０６５−１２２０，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ〕。
細胞傷害性Ｔ細胞はＨＬＡクラスＩ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識するとき、ＨＬＡの型をも認識する。また、ＨＬＡ分子と結合する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列には、ＨＬＡの型により異なるモチーフ（規則的配列）が存在することが知られている。
近年、腫瘍拒絶抗原遺伝子およびＴ細胞抗原受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＣＲ）などの特異免疫に関与する分子が、メラノーマ、食道癌、およびその他の癌で同定されてきており、進行癌または転移性癌においてペプチドによる特異的免疫療法が検討されている〔Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１６４３−１６４７〕〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３：１１８５−１１９２〕〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：４９９４−５００４〕〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：４３２−４３６〕〔Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６９：１２８１−１２８４〕〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８６：７８５−７９３〕。
現在欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法が開発されつつあり、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原ｇｐ１００ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、インターロイキン−２を静脈内投与することにより、４２％の患者で腫瘍の縮小が認められている〔Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９８）４：３２１〕。このように腫瘍抗原は、癌ワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。
しかしながら、同定されている腫瘍抗原はメラノーマ由来のものが多く、発病頻度の高い上皮性の癌や腺癌由来の腫瘍抗原についての報告は少ない。また、癌の多様性を考えると、全ての癌細胞において同一の腫瘍抗原が同程度発現されているとは考えられない。癌細胞の種類や組織の違いにより、発現している腫瘍抗原の種類や発現量が異なる。さらに、上記のようにＨＬＡ遺伝子に多型が存在するためにＨＬＡの型が各個体で異なり、そのために各個体において機能し得る腫瘍抗原ペプチドの種類が異なると考えられる。勿論、単一の腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を活性化せしめる癌ワクチン療法によっても、該腫瘍抗原を有する癌の治療効果は得られる。しかし、癌の治療において特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し、かつ癌の多様性に対応して高い治療効果を得るためには、数多くの新たな腫瘍抗原を発見し利用することが重要である。
発明の開示
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号２１５から配列番号２８８（配列番号２２８、配列番号２３６、配列番号２６１、および配列番号２６９を除く）、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３８５、および配列番号３８６のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドである。
本発明の一態様は、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである前記ペプチドである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞傷害性Ｔ細胞に認識される、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するポリペプチドである。
本発明の一態様は、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞に認識されること、および／または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することである前記ポリペプチドである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のポリペプチドからなる医薬である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する癌ワクチンである。
本発明の一態様は、大腸癌、食道癌、口腔扁平上皮癌、腎癌、肺癌、婦人科癌、および前立腺癌の少なくともいずれか１の治療に用いる前記癌ワクチンである。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のポリペプチドを含有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号２１３、配列番号３５８から配列番号３８１、および配列番号３８８から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のペプチド、および／または、配列表の配列番号２１４から配列番号２８８、配列番号３５６、配列番号３５７、および配列番号３８５から配列番号３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列から選ばれる１種以上のポリペプチドを使用することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号１から配列番号２８８、配列番号３５６から配列番号３８１、および配列番号３８５から配列番号４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号２９０から配列番号３５５（配列番号２９９および配列番号３３２を除く）および配列番号３８２から配列番号３８４のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、配列表の配列番号２８９から配列番号３５５および配列番号３８２から配列番号３８４のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞により認識されるものであるポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、前記細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞により認識されることが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導すること、および／またはＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞により認識されることである前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドである。
本発明の一態様は、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクターである。
本発明の一態様は、組換えベクターが発現組換えベクターである前記組換えベクターである。
本発明の一態様は、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
本発明の一態様は、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、前記ペプチドまたは前記ポリペプチドの製造方法である。
本発明の一態様は、前記ペプチドまたは前記ポリペプチドを免疫学的に認識する抗体である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２分子若しくはＨＬＡ−Ａ２６分子と相互作用して少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による該ペプチドまたは該ポリペプチドの認識を増強する化合物、および／または前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物の、スクリーニング方法であって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖、前記組換えベクター、前記形質転換体、または前記抗体のうちの少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法である。
本発明の一態様は、前記スクリーニング方法で得られた化合物である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドの少なくとも１つに対するＨＬＡ−Ａ２拘束性若しくはＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識を増強する化合物、または前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖と相互作用してその発現を増強する化合物である。
本発明の一態様は、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、前記組換えベクター、前記形質転換体、前記抗体、または前記化合物のうちの少なくとも１つを含んでなる癌治療に用いる医薬組成物である。
本発明の一態様は、前記ペプチド若しくは前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドの定量的あるいは定性的な測定方法である。
本発明の一態様は、癌疾患検査に用いる前記測定方法である。
本発明の一態様は、前記スクリーニング方法または前記測定方法に使用する試薬キットであって、前記ペプチド、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド若しくはその相補鎖、または前記抗体のうちの少なくとも１つを含んでなる試薬キットである。
本発明の一態様は、癌疾患検査に用いる前記試薬キットである。
発明を実施するための最良の形態
（腫瘍抗原遺伝子の単離・同定）
本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ分子のうち日本人の多数においてみられる型であるＨＬＡ−Ａ２と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞、ＯＫ−ＣＴＬを、既報〔Ｇｏｍｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：４９９４−５００４〕に記載の方法にしたがって、大腸癌患者の腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）（以下、ＴＩＬと略称することもある）から樹立した。得られたＯＫ−ＣＴＬはその８０％がＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋の表現型（残りの細胞はＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−であった）を有するＴリンパ球であった。ＯＫ−ＣＴＬは、試験した全てのＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞を認識してインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を産生し、十分な細胞傷害活性を示した。一方、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞、エプスタインバーウイルス形質転換自己Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ）、およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球化自己Ｔ細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＰＨＡ−ｂｌａｓｔｏｉｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）は溶解（ｌｙｓｉｓ）しなかった。ＯＫ−ＣＴＬの細胞傷害活性は、ＨＬＡクラスＩ、ＣＤ８またはＨＬＡ−Ａ２に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって阻害された。これらから、ＯＫ−ＣＴＬがＨＬＡクラスＩ抗原であるＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍細胞を認識することにより活性化し、細胞傷害活性を示すことが判明した。本発明においては、ＯＫ−ＣＴＬのサブラインの１つであるＯＫ−ＣＴＬｄを用いた。凍結保存しておいたＯＫ−ＣＴＬｄを１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（以下、ＩＬ−２と略称する）と２週間以上培養して実験に供した。
ＯＫ−ＣＴＬｄにより認識され、該ＯＫ−ＣＴＬｄを活性化し得る腫瘍抗原を、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ６２０（ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ａ２４０２）のｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子発現クローニング法〔Ｓｈｉｃｈｉｊｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：２７７−２８８〕を用いて単離・同定した。まず、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ６２０のｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ０２０７のｃＤＮＡとをＣＯＳ−７細胞に共遺伝子導入し、該導入遺伝子が発現された細胞のうち、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進するものを選択することにより、腫瘍抗原をコードする遺伝子を同定した。具体的な方法は、後述する実施例に示す。その結果、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＯＫ−ＣＴＬｄにより認識される遺伝子産物をコードする６７個のｃＤＮＡクローンが得られた。以下、遺伝子産物というときは、各遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列はダイデオキシヌクレオチドシークエンシング法で決定した。これらの塩基配列を配列表の配列番号２８９〜３５５に示す。このなかで、クローン７６（配列番号３４６）とクローン７８（配列番号２９５）は同一であることが判明した。上記遺伝子は、国立遺伝子研究所・日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に登録した（表１〜７）。
これらについて、既存のデータベースに対して相同性検索を行った結果、上記得られた６７個の遺伝子のうち、５７個のクローンには相同性の高いヒト由来の遺伝子が見い出された（下記の表１〜７を参照）。しかし、クローン４、クローン３７、クローン５８、クローン７１、クローン７９、クローン８７、クローン８９、クローン９２、およびクローン９７の合計９個の遺伝子については相同性の高いものはなかった。クローン３０については、マウス由来の遺伝子で相同性の高いものがあったが、ヒト由来の遺伝子で相同性の高いものは見い出されなかった。本発明に係る遺伝子と相同性の高い遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列は開示されているが、これらが腫瘍抗原をコードしていることは報告されておらず、２００１年１１月２日、６日、および７日に閲覧したＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）公開データベースにおいても開示されていなかった。
これまでにクローニングされたことが報告されているメラノーマなどの癌拒絶抗原遺伝子では、突然変異抗原を含む非定常型蛋白質をコードする遺伝子の割合が比較的高い。しかし、本発明で得られた遺伝子には、各種酵素、並びに転写、翻訳、およびその他に関係する分子と高い相同性を有するものが多い。当該相同性を有する蛋白質の種類は、ＳＥＲＥＸ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｂｒａｌｉｅｓ）で検出された抗原の種類と類似していた。ＳＥＲＥＸ法〔Ｓａｈｉｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１１８１０−１１８１３〕では、患者血清中に出現する抗体を用いて抗原を検出する。かかる方法では、液性免疫を誘導する抗原が検出されることが多い。当該方法により、既に１，５００種余りの腫瘍抗原が同定されている。
本発明で得られた遺伝子のうち５遺伝子（クローン１２、クローン６５、クローン８１、クローン８６、およびクローン１００）にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１４、２２８、２６９、２６１、および２３６）は、ＳＥＲＥＸ法により同定されてＳＥＲＥＸデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｌｕｄｗｉｇ．ｕｎｉｌ．ｃｈ／ＳＥＲＥＸ．ｈｔｍｌ）で公開された公知の遺伝子ＩＤ４５６、ＩＤ６２９、ＩＤ１２２６、ＩＤ１６３、およびＩＤ１１６のコードするものとそれぞれ同一であった。また、クローン１２、クローン８２、およびクローン８６の塩基配列（配列番号２８９、２９９、および３３２）は、ＩＤ４５６、ＩＤ１１９７、およびＩＤ１６３とそれぞれ同一であった。また、クローン３２、クローン４１、クローン７４、およびクローン８７がそれぞれＩＤ１０７２、ＩＤ１２３３、ＩＤ９７９、およびＩＤ５６７と部分的相同性を有することが判明した。
ＳＥＲＥＸ法は腫瘍抗原の検出に使用できる方法であるが、同方法で検出された１，５００種余りの腫瘍抗原のうち細胞性および液性免疫の両方を惹起し得る腫瘍抗原として今までに同定されたものはＭＡＧＥ−１、チロシナーゼ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１のみである。ＳＥＲＥＸ法により腫瘍抗原として同定されたものであっても細胞性免疫に関わる細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬと略称することもある）を誘導および／または活性化するとは限らない。ＳＥＲＥＸデータベースでその塩基配列およびアミノ酸配列が公開された上記遺伝子の遺伝子産物が、ＣＴＬにより認識されること、またＣＴＬを誘導および／または活性化することは２００２年６月１０日に閲覧した当該データベースには開示されていなかった。
上記遺伝子（クローン１２、クローン６５、クローン８１、クローン８２、クローン８６、およびクローン１００）を含めて表１から表７に示した遺伝子の遺伝子産物がＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬに認識されること、並びにＣＴＬを誘導および／または活性化し得ることは、本発明において初めて見い出された。
本発明において得られた上記遺伝子は腫瘍特異的なＣＴＬによりＨＬＡ−Ａ２拘束性に認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子であり、細胞で発現させると、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識され、ＣＴＬを誘導および／または活性化し得る。これらの遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列表の配列番号２１４〜２８８、３５６、および３５７に記載した（表１〜７参照）。ただし、クローン７６とクローン７８が同一であったため、両遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号２７７および配列番号２２０）も同一であることが判明した。
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さらに、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２６と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化されるＨＬＡ−Ａ２６拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞ＫＥ４−ＣＴＬを、食道癌患者（ＨＬＡ−Ａ２６０１／２４０２）から樹立した〔Ｎａｋａｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９５）５５：４２４８−４２５２〕。そして、ＫＥ４−ＣＴＬに認識される腫瘍抗原を、ヒト食道癌細胞株ＫＥ４（ＨＬＡ−Ａ２６０１／２４０２）のｃＤＮＡライブラリーから、上記同様に単離・同定した。すなわち、ヒト食道癌細胞株ＫＥ４のｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ２６０１のｃＤＮＡとをＶＡ１３細胞に共遺伝子導入し、該導入遺伝子が発現された細胞のうちＫＥ４−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進するものを選択することにより、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＫＥ４−ＣＴＬに認識される腫瘍抗原をコードする３個のｃＤＮＡクローンを得た。これらの塩基配列および推定アミノ酸配列を上記同様に決定し、それぞれ配列表の配列番号３８２〜３８４および配列番号３８５〜３８７に記載した。これらの遺伝子は、国立遺伝子研究所・日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に登録した（表８）。また、表８に記載したように、これら遺伝子と相同性の高い遺伝子が相同性検索により見い出された。これらのうち、ＫＥ４−ｃｌ．２１の塩基配列はリボソーム蛋白質Ｌ１０ａのものと第６４０番目に位置する１つのヌクレオチドが異なる他は同一であり、推定アミノ酸配列は同一であった。これら相同性の高い遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列は開示されているが、これらが腫瘍抗原をコードしているという報告はなく、２００１年１１月７日に閲覧したＮＣＢＩ公開データベースにおいても開示されていなかった。かくして得られた遺伝子は腫瘍特異的なＣＴＬによりＨＬＡ−Ａ２６拘束性に認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子であり、細胞で発現させると、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識され、ＣＴＬを誘導および／または活性化し得る。
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本明細書において、腫瘍抗原とは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであり、腫瘍細胞が有する蛋白質またはペプチドを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるおよび／または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを意味する。さらに、腫瘍抗原が有する腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および／または活性化し得るアミノ酸配列の部位を腫瘍抗原エピトープ（腫瘍抗原決定基）という。
ここで、「認識する（ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ）」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞あるいは腫瘍抗原ペプチドを認識するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された腫瘍抗原ペプチドにＴ細胞抗原受容体（以下、ＴＣＲと略称することもある）を介して結合することを意味する。「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するものまたは状態を、さらに増強するまたは作動させることを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性Ｔ細胞が活性化するとは、細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ分子により提示された抗原を認識することにより、例えばＩＦＮ−γを産生すること、あるいは細胞傷害性Ｔ細胞が認識した標的細胞に対し細胞傷害活性を示すことを意味する。「誘導する」とは、ある活性若しくは作用をほとんど持たないものまたは状態から、該活性若しくは該作用を発生させることを意味する。特に、本明細書において、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するとは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を分化および／または増殖させることを意味する。また、本明細書において細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤とは、ある抗原を特異的に認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在しないあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、該抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用を示す薬剤を意味する。
（腫瘍抗原ペプチＣＴＬドの同定）
上記遺伝子がコードするアミノ酸配列から腫瘍抗原ペプチドを得るために、まずＨＬＡ−Ａ２に結合し得るモチーフ（規則的配列）をバイオインフォーマティクス  アンド  モレキュラー  アナリシス  セクション（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ）（ＢＩＭＡＳ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）を用いて検索し、上記遺伝子がコードするアミノ酸配列並びに上記遺伝子と高い相同性を有する遺伝子の遺伝子産物のアミノ酸配列について該モチーフに適合するアミノ酸配列を特定した。そして、その結果に基づいて、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを持ったそれぞれ異なる複数個の９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを設計して合成した。
ＨＬＡ−Ａ２を発現しているＴ２細胞に合成した各ペプチドをそれぞれパルスした後、ＯＫ−ＣＴＬｄと共に培養し、該ＯＫ−ＣＴＬｄから産生されるＩＦＮ−γを測定した。ＩＦＮ−γ産生量を指標にしてＯＫ−ＣＴＬｄにより認識されるペプチドの選択を行った。合成した６２８個のペプチドのうち、２３７個のペプチド（配列番号１〜２１３および３５８〜３８１）が、ＯＫ−ＣＴＬｄにより認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生をペプチドの用量依存的に促進した。これらのペプチドのうち、クローン７８由来のＰ７７（配列番号２０）およびＰ７９（配列番号２１）は、クローン７６由来のＰ６５６（配列番号２１１）およびＰ６５８（配列番号２１２）とそれぞれ同一であった。かくして、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬにより認識され、当該ＣＴＬを活性化し得る２３５種類の腫瘍抗原ペプチドを得た。
次いで、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識される上記腫瘍抗原（配列番号３８５〜３８７）のアミノ酸配列に基づいて、既報〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８４：７３５〜７４０〕に記載の方法により、ＨＬＡ−Ａ２６に結合し得るそれぞれ異なる複数個の９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを設計し合成した。遺伝子ＫＥ４−ｃｌ．１７については、該遺伝子と相同性の高い遺伝子がコードするアミノ酸配列に基づいたペプチドも設計し合成した。ＨＬＡ−Ａ２６０１を発現させたＶＡ１３細胞に、上記合成したペプチドをパルスした後、ＫＥ４−ＣＴＬと共に培養し、ＫＥ４−ＣＴＬから産生されるＩＦＮ−γを測定し、これを指標としてＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＫＥ４−ＣＴＬにより認識されるペプチドを選択した。合成したペプチドのうち２１個のペプチド（配列番号３８８〜４０８）が、ＫＥ４−ＣＴＬにより認識され、ＫＥ４−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生をペプチドの用量依存的に促進した。かくして、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識され、該ＣＴＬを活性化し得る２１種類の腫瘍抗原ペプチドを得た。
（ペプチドを認識するＴＣＲの特異性）
ＣＴＬはその細胞表面上に発現しているＴＣＲにより、腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を認識する。ＴＣＲの多様性は１０１７を超えると報告されており、ＯＫ−ＣＴＬｄを親株として樹立した４８０種類のＯＫ−ＣＴＬｄサブラインを用いて検討したところ、サブラインの種類により認識するペプチドが異なることが判明した（表９参照）。また、各ペプチドを認識するこれらＯＫ−ＣＴＬｄサブラインのＴＣＲ  Ｖβが、それぞれのサブラインで異なっていた（図７ｂ参照）。これらから、異なったＴＣＲ  Ｖβを持つＣＴＬが各ペプチドに対して異なった特異性を示すことが判明した。これらから、１患者の腫瘍浸潤リンパ球から樹立されたＣＴＬであっても、異なったＴＣＲを有する細胞の集団であること、そのため多種の抗原およびペプチドを認識し得ることが判明した。
（癌患者由来の末梢血単核細胞におけるＣＴＬの誘導および／または活性化）
ＯＫ−ＣＴＬｄによりＨＬＡ−Ａ２拘束性に認識される上記遺伝子産物のうち４５種について、ＨＬＡ−Ａ２＋大腸癌患者由来の末梢血単核細胞（以下、ＰＢＭＣと略称することもある）により認識されるか検討した。その結果、１人の大腸癌患者（ＯＫ−ＣＴＬの樹立に用いたＴＩＬを提供した大腸癌患者）由来のＰＢＭＣは、６つの遺伝子産物（クローン２０、クローン４３、クローン５６、クローン８４、クローン８６、およびクローン１０８）を認識し、別の大腸癌患者由来のものは４つの遺伝子産物（クローン２０、クローン８４、クローン８６、およびクローン１０８）を認識した。一方、転移性メラノーマ患者由来のＰＢＭＣ、健常人由来のＰＢＭＣ、または肺癌組織浸潤リンパ球から樹立した細胞傷害性Ｔ細胞ＧＫ−ＣＴＬによっては認識されなかった。
さらに、これら遺伝子産物由来のペプチド、クローン２０由来のＰ４３０、Ｐ４３１、Ｐ４３４、およびＰ４４０（配列番号３６０、３６１、１４４、および１４６）、クローン４３由来のＰ４５（配列番号１０）、クローン５６由来のＰ２８８（配列番号３５８）およびＰ２８９（配列番号３５９）、クローン８４由来のＰ１８４（配列番号６５）、クローン８６由来のＰ４８５（配列番号１６６）およびＰ４８６（配列番号３６３）、クローン１０８由来のＰ４４９（配列番号１５３）およびＰ４６３（配列番号３６２）が、上記両方または一方の大腸癌患者由来のＰＢＭＣに認識されて、当該ＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生を促進した。ＰＢＭＣのなかで、上記遺伝子産物あるいは上記ペプチドを認識してＩＦＮ−γを産生する細胞は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞であった。
以上、上記腫瘍抗原およびそれに由来するペプチドをＨＬＡ−Ａ２拘束性に認識するＣＴＬ前駆体が、大腸癌患者のＰＢＭＣに存在することが判明した。これら腫瘍抗原およびそれに由来するペプチドはこの患者においてＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍特異的なＣＴＬを誘導および／または活性化できると考えられる。さらに、これらから、表１から表７に示した腫瘍抗原およびそれに由来するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２＋大腸癌患者の特異的免疫療法への使用に適すると考えられる。
また、ＫＥ４−ＣＴＬによりＨＬＡ−Ａ２６拘束性に認識される上記ペプチドのうち、ＫＥ４−ＣＴＬを強く活性化した６つのペプチド、ＫＥ４−ｃｌ．１８由来のペプチドＫＥ４−１８・Ｐ５（配列番号３９５）、ＫＥ４−１８・Ｐ２２（配列番号３９９）、およびＫＥ４−１８・Ｐ２５（配列番号４００）、並びにＫＥ４−ｃｌ．２１由来のペプチドＫＥ４−２１・Ｐ２８（配列番号４０３）、ＫＥ４−２１・Ｐ２９（配列番号４０４）およびＫＥ４−２１・Ｐ４０（配列番号４０７）について、ＨＬＡ−Ａ２６＋癌患者（口腔扁平上皮癌４例、腎癌１例、および肺癌１例）由来のＰＢＭＣにおけるＣＴＬ誘導能を検討した。その結果、上記６種のペプチドは、癌患者由来のＰＢＭＣに認識され、当該ＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生を有意に促進したが、健常人由来のＰＢＭＣにおいてはＩＦＮ−γ産生を促進しなかった。さらにＫＥ４−１８・Ｐ２２、ＫＥ４−２１・Ｐ２８、またはＫＥ４−２１・Ｐ２９で刺激したＰＢＭＣはＨＬＡ−Ａ２６＋癌細胞（ＫＥ４）に対して強い細胞傷害活性を示したが、ＨＬＡ−Ａ２６−癌細胞（ＫＥ３）に対する細胞傷害活性は弱く、さらにＨＬＡ−Ａ２６＋ＰＨＡ芽球化細胞には反応しなかった。
これらから、表８に示した腫瘍抗原およびそれに由来するペプチドは、癌患者のＰＢＭＣにおいて、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性に腫瘍特異的なＣＴＬを誘導および／または活性化することができるため、ＨＬＡ−Ａ２６＋癌患者の特異的免疫療法に使用するのに適すると考えられる。
（ポリペプチドおよびペプチド）
本明細書において、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドのうち長鎖ペプチドをポリペプチドという。例えばタンパク質も本明細書においてはポリペプチドに含まれる。また、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを、単にペプチドという。以降、アミノ酸配列を表記する場合、１文字にて表記する場合と３文字にて表記する場合がある。
本発明に係るポリペプチドは、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ６２０またはヒト食道癌細胞株ＫＥ４から得られた上記遺伝子がコードするポリペプチドである。好ましくは配列表の配列番号２１４〜２８８、３５６、３５７、および３８５〜３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。これらポリペプチドのうち、配列番号２１４、２２８、２３６、２６１、および２６９のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、既にＳＥＲＥＸデータベースに公開されているポリペプチドと同一であった。また、配列番号３８７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋで公開されているポリペプチドと同一であった。
これらのポリペプチドは、ＣＴＬを誘導および／または活性化する腫瘍抗原として使用できる。例えば、配列表の配列番号２１４〜２８８、３５６、および３５７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原特異的なＣＴＬにより認識されるため、当該ＣＴＬを誘導するおよび／または活性化する腫瘍抗原として使用できる。また、配列表の配列番号３８５〜３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性の抗原特異的なＣＴＬにより認識されるため、当該ＣＴＬを誘導するおよび／または活性化する腫瘍抗原として使用できる。さらに、これらのポリペプチドは、腫瘍抗原エピトープを特定して腫瘍抗原ペプチドを得るための材料として使用できる。
本発明に係る腫瘍抗原ペプチドは、上記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計されたペプチドからＣＴＬに認識されるおよび／または誘導するものを選択することにより取得できる。当該選択の方法としては、後述する実施例のように、例えば、ペプチドをパルスした抗原提示細胞とＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性のＣＴＬ、例えばＯＫ−ＣＴＬｄまたはＫＥ４−ＣＴＬなど、とを共に培養して、活性化された当該ＣＴＬから産生されるＩＦＮ−γを測定し、これを指標として選択する方法などを例示できる。当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２６と結合して細胞表面上に提示され、かつＣＴＬにより認識される腫瘍抗原エピトープとしての性質を有するものであればよく、少なくとも約５個以上、好ましくは約７個以上、より好ましくは９乃至１０個のアミノ酸残基からなるペプチドである。さらに好ましくは、配列表の配列番号１〜２１３、３５８〜３８１、および３８８〜４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。これらのペプチドは、ＣＴＬを誘導するおよび／または活性化する腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。例えば、配列表の配列番号１〜２１３および３５８〜３８１のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原特異的なＣＴＬに認識されるため、当該ＣＴＬを誘導および／または活性化する腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。また配列表の配列番号３８８〜４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性の抗原特異的なＣＴＬに認識されるため、当該ＣＴＬを誘導および／または活性化する腫瘍抗原ペプチドとして使用できる。
上記ポリペプチドまたはペプチドは、ＣＴＬを誘導および／または活性化するために、単独で使用してもよいし、２つ以上を組み合せて使用してもよい。ＣＴＬはペプチド特異的なＣＴＬの複数種類からなる細胞集団であることから、好ましくは、これらを２つ以上組み合わせて用いることが推奨される。
また、このように特定されたポリペプチドまたはペプチドに基づいて、少なくともＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性のＣＴＬによる認識および／またはＣＴＬの誘導を指標にして、１乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、および／または挿入などの変異を有するポリペプチドまたはペプチドも提供される。変異を有するペプチドまたはポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加、および／または挿入などの変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術〔ｃＳｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６〕を利用できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドまたはペプチドの基本的な性質（物性、活性、または免疫学的活性など）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、または芳香族アミノ酸など）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これらポリペプチドまたはペプチドは、その構成アミノ基若しくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
（ポリヌクレオチド）
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性若しくはＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識されるおよび／またはＣＴＬを誘導する上記ポリペプチド若しくはペプチドをコードするものまたはその相補鎖である。好ましくは、配列表の配列番号１〜２１３、３５８〜３８１、および３８８〜４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくは配列番号２１４〜２８８、３５６、３５７、および３８５〜３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするものまたはその相補鎖である。例えば、配列表の配列番号２８９〜３５５および３８２〜３８４のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖である。これらポリヌクレオチドのうち、配列番号２８９、２９９、および３３２のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、既にＳＥＲＥＸデータベースに公開されているポリヌクレオチドと同一であった。
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドのアミノ酸配列中で腫瘍抗原エピトープをコードする領域に対応する少なくとも約１５個以上、好ましくは約２１乃至３０個以上の連続するヌクレオチドからなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖であってもよい。この有用なポリヌクレオチドの選択および塩基配列の決定は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現させたペプチドまたはポリペプチドのＣＴＬの誘導能および／または活性化能の確認を行うことにより可能である。
上記ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２６を有する細胞で発現させたときに、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識されるため、ＣＴＬを誘導および／または活性化できる。例えば、配列表の配列番号２８９〜３５５のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ａ２を有する細胞で発現させたときに、ＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原特異的なＣＴＬに認識されることおよび／または当該ＣＴＬを誘導することができる。また、配列表の配列番号３８２〜３８４のいずれか１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ａ２６を有する細胞で発現させたときに、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性の抗原特異的なＣＴＬに認識されることおよび／または当該ＣＴＬを誘導することができる。
さらに、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。好ましくは、コードするポリペプチドまたはペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識されるおよび／またはＣＴＬを誘導するものであるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド分子としてＤＮＡ分子を代表例にとると、「ＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子」は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）などに記載の方法によって取得できる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが観察されることを表す。上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＨＬＡ−Ａ２拘束性若しくはＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識されるおよび／またはＣＴＬを誘導するポリペプチド若しくはペプチドをコードするポリヌクレオチドの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現させた該ポリペプチドまたはペプチドのＣＴＬによる認識および／またはＣＴＬの誘導能の確認を行うことにより可能である。後述する実施例のように、例えば、ペプチドをパルスした抗原提示細胞とＨＬＡ−Ａ２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２６拘束性のＣＴＬ、例えばＯＫ−ＣＴＬｄまたはＫＥ４−ＣＴＬなど、とを共に培養して、活性化された当該ＣＴＬから産生されるＩＦＮ−γを測定し、これを指標として選択する方法などを例示できる。
上記ポリヌクレオチドには、その３′末端にポリ（Ａ）構造が存在するが、ポリ（Ａ）の数は腫瘍抗原として作用するアミノ酸のコード部位に影響するものではないため、その数は特に限定されない。
上記ポリヌクレオチドは、いずれも本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸としての試薬・標準品としても利用できる。
（組換えベクター）
上記ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、組換えベクターが得られる。用いるベクターＤＮＡは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合せたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドなどがあげられる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクターなどを用いることができる。
組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサーなど、とを構成要素とし、これらを自体公知の方法で組み合せて作製される。前記ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組み込む方法は、自体公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選択し、ＤＮＡを処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的ポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
（形質転換体）
上記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクターＤＮＡにより、自体公知の宿主、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、または動物細胞などを自体公知の方法を用いて形質転換することで形質転換体が得られる。形質転換を行う場合、より好ましい系としては遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法があげられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を用いることができる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）などに記載されている標準的な方法で実施できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染などを例示できる。
また、形質転換体に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを提供可能である。上記ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターＤＮＡを導入した形質転換体は、各宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、形質転換体により発現される本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの作用、特に少なくともＣＴＬを誘導および／または活性化する作用あるいは宿主中または宿主外に産生された該ポリペプチドまたは該ペプチド量を指標にして行ってもよいし、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。
（ポリペプチドまたはペプチドの製造）
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、上記ベクターまたは形質転換体を利用して、上記のように遺伝子工学的技術で製造可能である。また、通常のペプチド化学において知られる方法でも製造できる。例えば、ペプチド合成（丸善）１９７５年やＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６が例示されるが、無論公知の方法が広く利用可能である。
本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの精製および回収は、該ポリペプチドまたは該ペプチドのＣＴＬ誘導能および／または活性化能を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどを組み合せるか、溶解度差に基づく硫安、アルコールなどの分画手段によって実施できる。より好ましくは、これらのアミノ酸配列の情報に基づき、ポリペプチドまたはペプチドに対する抗体を作製し、得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。
（抗体）
本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドまたはペプチドを抗原として用いて作製する。抗原は上記ポリペプチド若しくはペプチド自体でもまたはその断片でもよく、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８乃至１０個のアミノ酸で構成される。上記ポリペプチドまたはペプチドに特異的な抗体を作製するためには、該ポリペプチドまたはペプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも該ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列と相同である必要はなく、該ポリペプチドまたはペプチドの立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、免疫学的に該ポリペプチドまたはペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。
抗体を産生するためには、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを、アジュバントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答などの免疫誘導を行うことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害な作用を及ぼさずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などが例示される。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせが例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマなどが好適に用いられる。
ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得される。好ましい手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法で得られる。
モノクローナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株などのミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、上記ポリペプチドまたはペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
かくして得られた、上記ポリペプチドまたはペプチドを認識し結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該ポリペプチドまたはペプチドの精製用抗体、試薬、または標識マーカーなどとして利用できる。
（化合物のスクリーニング方法）
上記ポリペプチド若しくはペプチド、該ポリペプチド若しくはペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、またはこれらを免疫学的に認識する抗体は、単独でまたは複数を組み合せて用いることにより、ＣＴＬによる該ポリペプチド若しくは該ペプチドの認識を増強し得る物質のスクリーニングに有効な手段を提供する。スクリーニング方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。例えば、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ（ＯＫ−ＣＴＬｄなど）と、腫瘍抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞とを共に培養し、ＣＴＬから産生されるＩＦＮ−γ量を指標にして該ＣＴＬによるペプチドの認識を測定する実験系を用いて、ここに被検物質を加えることで、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによる上記ポリペプチド若しくはペプチドの認識を増強する物質を選別できる。ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの代わりにＨＬＡ−Ａ２６拘束性ＣＴＬ（ＫＥ４−ＣＴＬなど）を用いて同様にＨＬＡ−Ａ２６拘束性ＣＴＬによる上記ポリペプチドまたはペプチドの認識を増強する物質を選別できる。この実験系はスクリーニング方法の１つを説明するものであり、本発明に係るスクリーニング方法はこれに限定されるものではない。
上記スクリーニング方法によって得られた化合物は、本発明の範囲に包含される。該化合物は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬにより認識される上記ポリペプチドまたはペプチド、例えば配列表の配列番号１〜２１３および３５８〜３８１のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド若しくは配列番号２１４〜２８８、３５６、および３５７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２分子と相互作用して、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによる当該ポリペプチドまたはペプチドの認識を増強する化合物であり得る。または、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＴＬにより認識される上記ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物などであり得る。
また、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識される上記ポリペプチドまたはペプチド、例えば配列表の配列番号３８５〜３８７のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド若しくは配列番号３８８〜４０８のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／またはＨＬＡ−Ａ２６と相互作用してＨＬＡ−Ａ２６拘束性ＣＴＬによる当該ポリペプチドまたはペプチドの認識を増強する化合物を提供できる。さらにＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬにより認識される上記ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を増強する化合物を提供できる。
かくして選別された化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮してさらに選別することによって、医薬組成物として調製可能である。
（医薬組成物）
本発明において提供されるポリペプチドまたはペプチドは、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドとして、腫瘍特異的なＣＴＬを誘導および／または活性化するために使用できる。すなわち、上記ポリペプチドおよびペプチドから選ばれた１種以上からなる医薬、上記ポリペプチドおよびペプチドから選ばれた１種以上を使用することを特徴とするＣＴＬの誘導方法、並びに上記ポリペプチドおよびペプチドから選ばれた１種以上を含有するＣＴＬの誘導剤も、本発明の範囲に包含される。
また、上記ポリペプチド若しくはペプチド、該ポリペプチド若しくはペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき作製した組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換させた細胞、該ポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体、該ポリペプチドまたはペプチドと相互作用してＣＴＬによる認識を増強する化合物、または該ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物を、単独でまたは複数を組み合せて利用することによって、これらのうちの少なくとも１つを含んでなる医薬組成物を提供できる。該医薬組成物は癌の治療において有用である。ＳＷ６２０大腸癌細胞株から得られた上記ポリペプチドまたはペプチドは、例えば大腸癌の治療において有用である。また、ＫＥ４食道癌細胞株から得られた上記ポリペプチドまたはペプチドは、例えば食道癌、口腔扁平上皮癌、および腎癌などの治療において有用である。これらの癌以外にも、婦人科癌（乳癌、子宮体癌、子宮頚癌、卵巣癌など）や前立腺癌など、各種の癌に適用が可能である。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカコーカサス人の約４９％、南アメリカコーカサス人の約３８％、アフリカ黒人の約２３％においてみられ、またＨＬＡ−Ａ２６対立遺伝子は、日本人の約２２％、韓国人の約１６％、北アメリカコーカサス人の約８％で認められている〔Ｉｍａｎｉｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＨＬＡ  １９９１（１９９２）１：１０６５−１２２０，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ〕。したがって、上記医薬および医薬組成物は多数の患者においてその効果を期待できる。
具体的には、例えば上記ポリペプチドおよびペプチドから選ばれた１種以上からなる医薬、さらに上記ポリペプチドおよびペプチドから選ばれた１種以上を含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用できる。ここでいう癌ワクチンとは、癌細胞に対する特異的免疫応答を誘導および／または増強することにより、癌細胞を選択的に傷害し得る薬物を意味する。その投与量は、ＣＴＬによる該ポリペプチドまたは該ペプチドの認識の程度により適宜変更を加えて決定できるが、一般的には活性本体として０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／日／成人ヒトである。投与方法は、公知の医療用ペプチドの投与方法に準じて行えばよく、好適には皮下、静脈内、あるいは筋肉内投与にて行われる。投与に際して、免疫応答を誘導および／または増強するために、本発明に係るポリペプチドおよび／またはペプチドは適当なアジュバントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して用いてもよい。担体は、それ自体が人体に対して有害な作用を及ぼさずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンなどが例示される。アジュバントは、通常のペプチドワクチン接種に用いられるものであればよく、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、鉱物油などが例示される。また、剤形は自体公知のペプチドを製剤化する手段を応用して適宜選択できる。
または、上記ポリペプチド若しくはペプチドを用いて、患者の末梢血から採取した単核細胞画分においてＣＴＬを誘導および／または活性化した後、当該画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。培養の条件、例えば単核細胞濃度、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの濃度、培養時間などは、簡単な実験により決定できる。培養時にＩＬ−２などのリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。
癌ワクチンとして上記ポリペプチドまたはペプチドを使用する場合、１種類のポリペプチドまたはペプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、複数種類の上記ポリペプチドまたはペプチドを組み合せて使用することもできる。最近、複数ペプチドに基づく免疫治療（ｍｕｌｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）が有効であることが報告されている〔Ｍｉｙａｇｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００１）７：３９５０−３９６２〕〔Ｌｅｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００１）１９：３８３６−３８４７〕〔Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９８）４：３２８−３３２〕。癌患者のＣＴＬはペプチド特異的なＣＴＬの複数種類からなる細胞集団であるため、１種類のポリペプチドまたはペプチドを癌ワクチンとして使用するより複数を組み合せて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られるときがある。特に、ＨＬＡ−Ａ２６とＨＬＡ−Ａ２とを両方有する癌患者においては、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性ＣＴＬに認識されるポリペプチドまたはペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬに認識されるポリペプチドまたはペプチドとを組み合わせて癌ワクチンとして使用すると、高い効果が得られるときがある。
上記ポリペプチド若しくはペプチド、好ましくはペプチド、をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖は、癌の遺伝子治療に利用可能である。これらポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入して発現させる方法またはヒトから細胞を採取した後に体外で細胞内に導入して発現させる方法があるが、いずれも利用できる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなどが知られているが、レトロウイルス系が推奨される。これらウイルスは複製欠陥性のものを用いる。投与量は、ＣＴＬによる該ポリペプチドまたはペプチドの認識の程度により変化するが、一般的には本発明に係るポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ含量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日乃至数月に１回投与する。
（測定方法および試薬）
上記ポリペプチドまたはペプチド、該ポリペプチド若しくはペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、並びに該ポリペプチドまたは該ペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬などとして使用可能である。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤などの物質を含んであってもよい。また本発明は、これらのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたはポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体などそれぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
これら試薬および試薬キットは、上記本発明に係るスクリーニング方法に使用できる。または本発明に係るポリペプチド若しくはペプチド、これらのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの定量的若しくは定性的測定に使用できる。当該測定をするための方法は、当業者に周知の方法を利用して構築できる。利用できる方法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡなどが例示できる。また、核酸は、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルでの検出および定量が可能である。
測定される試料としては、個体由来の細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料などがあげられる。また、測定される核酸は、上記各試料から自体公知の核酸調製法で得られる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲ若しくはその他の増幅法を用いて酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。
上記増幅生成物のサイズ変化を測定することにより、正常遺伝子型との比較において、遺伝子の欠失および挿入を検出できる。また、標識した上記ポリペプチドをコードするＤＮＡに、増幅生成物をハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。
大腸癌細胞株ＳＷ６２０から得られた上記遺伝子の約８７％は、正常大腸組織と比べて大腸癌において高発現しており、その差は約２倍である。例えば、クローン１０、クローン３０、およびクローン１０８は大腸癌細胞において選択的に発現していることが判明した（実施例６参照）。
食道癌細胞株ＫＥ４から得られたＫＥ４−ｃｌ．１８のｍＲＮＡは、試験した全ての癌細胞および非悪性腫瘍細胞株（ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞およびＶＡ１３）で発現していたが、精巣、筋肉、および末梢血単核細胞以外の正常組織では発現していなかった。また、ＫＥ４−ｃｌ．２１のｍＲＮＡは、試験した全ての癌細胞および非悪性腫瘍細胞株並びに正常組織で発現していたが、正常組織での発現レベルは低かった。これらのｍＲＮＡは、特に頭部および頚部の癌細胞並びに非悪性増殖細胞で過剰発現していることが判明した。
したがって、上記測定方法で本発明に係るポリペプチド若しくはペプチドまたはこれらのいずれか１つをコードするＤＮＡの変異、減少、増加を検出することにより、当該ポリペプチド若しくはペプチドまたはＤＮＡが関連する疾患、例えば上皮性の癌や腺癌などの診断が可能になる。
実施例
以下に実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの樹立）
ＨＬＡ−Ａ２拘束性の腫瘍特異的なＣＴＬは、大腸癌患者（ＨＬＡ−Ａ０２０７／３１０１、−Ｂ４６／５１、−Ｃｗ１）のＴＩＬから、文献に記載の方法に準じて樹立した〔Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）８１：４５９−４６６〕〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：４９９７−５００４〕。まず、大腸癌患者から得たＴＩＬを１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を添加して５０日以上長期培養した。培養７日毎にこれらＩＬ−２活性化ＴＩＬの一部を採取し、種々の腫瘍細胞または正常細胞と共に培養して、ＩＦＮ−γ産生の測定および腫瘍細胞からの５１Ｃｒ遊離実験を行い、それによりＣＴＬ活性を検定した〔Ｇｏｍｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：４９９７−５００４〕。ＩＦＮ−γの測定は、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ）で行った。培養５８日目に、ＨＬＡ−Ａ２拘束性かつ腫瘍特異的な細胞傷害活性を示すＣＴＬ（ＯＫ−ＣＴＬと呼ぶ）が得られた。ＯＫ−ＣＴＬは、その８０％がＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋の表現型をもつことが判明した（残り２０％はＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−）。樹立した上記ＣＴＬは、それぞれ少量ずつ分別して凍結し、使用直前まで保存した。
ＯＫ−ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋Ｐａｎｃ−１膵臓腺癌、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋ＳＷ６２０大腸腺癌細胞、ＨＬＡ−Ａ０２０６＋ＫＥ３扁平上皮癌（ＳＣＣ）細胞、およびＨＬＡ−Ａ０２０７＋ＣＡ９−２２口部ＳＣＣ細胞を認識してＩＦＮ−γを産生し、かつ十分な細胞傷害活性を示した。しかし、ＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞、エプスタインバーウイルス形質転換自己Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球化自己Ｔ細胞に対しては細胞傷害活性を示さなかった。また、ＯＫ−ＣＴＬは試験した全てのＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞（ＨＬＡ−Ａ０２０１＋Ｒ２７乳腺癌、ＨＡＫ−２原発性肝細胞癌、ＳＫ−ＭＥＬ−５メラノーマ、ＳＦ１２６星状細胞腫、ＨＬＡ−Ａ０２０６＋ＰＣ９肺腺癌、ＨＬＡ−Ａ０２０７＋１−８７肺腺癌、およびＯＭＣ−４頚部ＳＣＣ細胞）を溶解した。その活性は、抗ＨＬＡクラスＩ、抗ＣＤ８または抗ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体（以下、モノクローナル抗体をｍＡｂと略称することもある）によって阻害されたが、他のｍＡｂでは阻害されなかった。このことから、ＯＫ−ＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬであることが確認された。
なお、上記腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の遺伝子型は既に報告されている〔Ｇｏｍｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：４９９７−５００４〕。また上記患者のＨＬＡクラスＩの抗原型は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて従来の方法で決定した。さらに、ＨＬＡ−Ａ２サブタイプは、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ法と直接ＤＮＡ配列決定法（ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって決定した。ＯＫ−ＣＴＬの表面表現型は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、若しくは抗ＣＤ８ｍＡｂ（ニチレイ）、または抗ＴＣＲαβｍＡｂ（ＷＴ３１、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による直接免疫蛍光法によって分析した。また、ＯＫ−ＣＴＬのＨＬＡ拘束性および特異性を検定するために用いた抗体は、抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡ−Ａ２（ＢＢ７．２、ＩｇＧ２ｂ）、抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡクラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ−１、ＩｇＧ２ａ）、および抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ、ＩｇＧ１）ｍＡｂである。抗ＣＤ１３（ＭＣＳ−２、ＩｇＧ１）および抗ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂは、アイソタイプ適合コントロールｍＡｂとして使用した。
実施例２
（ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡクローンの同定）
ＯＫ−ＣＴＬのサブラインの１つであるＯＫ−ＣＴＬｄによって認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子は、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ６２０のｃＤＮＡライブラリーから、既知の方法〔Ｓｈｉｃｈｉｊｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：２７７−２８８〕に準拠して単離・同定した。凍結保存されたＯＫ−ＣＴＬｄを１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に２週間以上培養して実験に用いた。
まず、ＳＷ６２０細胞のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに転換してＳａｌＩアダプターにライゲーションし、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。また、ＨＬＡ−Ａ０２０７のｃＤＮＡを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって得、真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローン化した。
ＳＷ６２０細胞ｃＤＮＡライブラリーは１００クローンずつプールし、各ウエルにプールしたｃＤＮＡ２００ｎｇと、ＨＬＡ−Ａ０２０７ｃＤＮＡ２００ｎｇとを、１００μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１：２００混液中で３０分間混合した。この混合物の５０μｌをサル腎細胞株ＣＯＳ−７（１×１０４）に加え、６時間インキュベーションして共遺伝子導入した。次いで１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて２日間培養した後、ＯＫ−ＣＴＬｄ（２×１０５）を各ウエルに添加した。さらに１８時間インキュベーション後、上清の１００μｌを採り、産生されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した。このとき、ネガティブコントロールとして遺伝子を導入していないＣＯＳ−７細胞を標的細胞としてＯＫ−ＣＴＬｄによるＩＦＮ−γ産生を検討し、産生されたＩＦＮ−γの値をバックグランドとして各測定値から減算した。
ＯＫ−ＣＴＬｄからのＩＦＮ−γ産生を促進するｃＤＮＡをＣＴＬ活性化能が陽性であると判定し、この判定基準によりｃＤＮＡライブラリーのプールをスクリーニングした。ＣＴＬ活性化能が認められたプールについて再現性を確認後、ＣＴＬ活性化能が陽性のプールから個別にクローンを取り出してさらにスクリーニングし、独立プール由来のＣＴＬ活性化能陽性クローンを選別した。得られたクローンのＯＫ−ＣＴＬｄ活性化における用量依存性を確認し、最終的に６５個のクローンを得た。一方、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−２のみをＨＬＡ−Ａ０２０７と共に共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞では、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生は促進されなかった。代表例としてクローン２、クローン２９、およびクローン４０についての結果をそれぞれ図１、図２、および図３に示した。他のクローンについても同様の結果が得られた。
得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列の決定は、ＤＮＡシークエンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３７７ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、ダイデオキシヌクレオチドシークエンシング法で行った。さらに、ｃＤＮＡクローンがコードするアミノ酸配列を塩基配列から推定した（上記表１〜６を参照）。得られた遺伝子のうち、クローン７６（配列番号３４６）とクローン７８（配列番号２９５）は同一であることが判明した。
得られた各遺伝子について、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪに対して相同性検索を行い、その結果を上記表１〜６に記載した。また、ＳＥＲＥＸデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｌｕｄｗｉｇ．ｕｎｉｌ．ｃｈ／ＳＥＲＥＸ．ｈｔｍｌ）に対する相同性検索により、クローン１２、クローン６５、クローン８１、クローン８６、およびクローン１００がコードするアミノ酸配列は、ＳＥＲＥＸデータベースで公開された公知の遺伝子ＩＤ４５６、ＩＤ６２９、ＩＤ１２２６、ＩＤ１６３、およびＩＤ１１６のコードするものとそれぞれ同一であることが判明した。また、クローン１２、クローン８２、およびクローン８６の塩基配列は、ＩＤ４５６、ＩＤ１１９７、およびＩＤ１６３と同一であった。さらに、クローン３２、クローン４１、クローン７４、およびクローン８７が、それぞれＩＤ１０７２、ＩＤ１２３３、ＩＤ９７９、およびＩＤ５６７と部分的相同性を有することが明らかになった。
実施例３
（ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍抗原ペプチドの同定）
実施例２で得た遺伝子がコードする腫瘍抗原から腫瘍抗原ペプチドを得るために、ＨＬＡ−Ａ２に結合し得るモチーフ（規則的配列）をバイオインフォーマティクス  アンド  モレキュラー  アナリシス  セクション（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ）（ＢＩＭＡＳ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）を用いて、該遺伝子がコードするアミノ酸配列について検索した。ＯＫ−ＣＴＬｄのＨＬＡの型がＨＬＡ−Ａ０２０７であるため、ＨＬＡ−Ａ０２０７分子に結合し得るペプチドのモチーフ検索を行った。ＨＬＡ−Ａ０２０７分子はＨＬＡ−Ａ０２０１分子とそのアミノ酸配列において第１２３番目のアミノ酸残基のみが相違し、それぞれＹおよびＣである。このアミノ酸残基は、ペプチド結合に関与するα−ヘリックスまたはβ−シートではなく、第２構造のコイル領域に配置しているため、この相違はペプチド結合に影響しない。このことから、ＨＬＡ−Ａ０２０１結合モチーフ〔Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．−Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９５）４１：１７８−２２８〕に適合するペプチドはＨＬＡ−Ａ０２０７と結合すると考えられる。そこで、ＨＬＡ−Ａ０２０１結合モチーフの検索を行って得られた結果に基づいて、ＨＬＡ−Ａ０２０７分子に結合し得るペプチドを設計し、それぞれ異なる複数個の９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチド（７０％以上の純度）を自体公知の方法で合成した。さらにクローン５、クローン２３、クローン２６、クローン３５、クローン６５、クローン８１、およびクローン１００については、それぞれの遺伝子と相同性の高い遺伝子がコードするアミノ酸配列に基づいてペプチドを設計して合成した。
ＣＴＬによる上記ペプチドの認識を試験するために抗原提示細胞としてＴ２細胞を用いた。Ｔ２細胞は、ＴＡＰ（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）欠損のため、ＨＬＡ−Ａ２分子がペプチドと結合しない形で細胞表面に発現している〔Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９４）５４：１０７１−１０７６〕。まず、Ｔ２細胞を上記合成された各ペプチド（１０μＭ）と共に、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒの下で３７℃にて３時間インキュベーションし、細胞表面上に発現しているＨＬＡ−Ａ２にペプチドを結合させた。このようにペプチドをパルスしたＴ２細胞を標的細胞（Ｔ）として用いた。また、実施例１で得たＯＫ−ＣＴＬｄをエフェクター細胞（Ｅ）として用いた。標的細胞１×１０４とエフェクター細胞２×１０４とを混合し（Ｅ／Ｔ比＝２）、１８時間インキュベーション後、上清１００μｌを回収してＥＬＩＳＡでＩＦＮ−γを測定した。このとき、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞に対するＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生量をバックグランドとして各測定値から減算した。その結果、配列表の配列番号１〜２１３のいずれか１に記載したアミノ酸配列からなる２１３個のペプチドがＯＫ−ＣＴＬｄにより認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生をペプチドの用量依存的に促進した。得られた２１３個ペプチドは、クローン１２由来のＰ１〜Ｐ４（配列番号１〜４）、クローン４０由来のＰ２６、Ｐ２８、Ｐ３４、Ｐ３８、Ｐ３９（配列番号５〜９）、クローン４３由来のＰ４５（配列番号１０）、クローン２由来のＰ４６、Ｐ４８、Ｐ５３、Ｐ５４（配列番号１１〜１４）、クローン１１由来のＰ５７、Ｐ６４（配列番号１５、１６）、クローン８由来のＰ７１、Ｐ７３、Ｐ７５（配列番号１７〜１９）、クローン７８由来のＰ７７、Ｐ７９、Ｐ８０、Ｐ８１（配列番号２０〜２３）、クローン６７由来のＰ８５、Ｐ８６、Ｐ８８（配列番号２４〜２６）、クローン９由来のＰ９０〜Ｐ９３、Ｐ９５（配列番号２７〜３１）、クローン９５由来のＰ９８、Ｐ１００、Ｐ１０２、Ｐ１０３、Ｐ１０４（配列番号３２〜３６）、クローン８２由来のＰ１１０〜Ｐ１１２（配列番号３７〜３９）、クローン１０３由来のＰ１１８、Ｐ１２０、Ｐ１２１（配列番号４０〜４２）、クローン４由来のＰ１２２、Ｐ１３１（配列番号４３、４４）、クローン１４由来のＰ１３２、Ｐ１３３（配列番号４５、４６）、クローン６５由来のＰ１３８〜Ｐ１４１、Ｐ１４４、Ｐ１４６、Ｐ１４９、Ｐ１５０、Ｐ１５２（配列番号４７〜５５）、クローン６９由来のＰ１５３（配列番号５６）、クローン８３由来のＰ１７５〜Ｐ１７７、Ｐ１７９、Ｐ１８０（配列番号５７〜６１）、クローン８４由来のＰ１８１〜Ｐ１８４（配列番号６２〜６５）、クローン３２由来のＰ１９３〜Ｐ１９５、Ｐ１９７（配列番号６６〜６９）、クローン２１由来のＰ２０１、Ｐ２１４、Ｐ２１７、Ｐ２２６（配列番号７０〜７３）、クローン３３由来のＰ２２９、Ｐ２３０、Ｐ２３６（配列番号７４〜７６）、クローン６８由来のＰ２４２、Ｐ２４３（配列番号７７、７８）、クローン１００由来のＰ２４７、Ｐ２４９、Ｐ２５１、Ｐ２５５、Ｐ２５９（配列番号７９〜８３）、クローン７３由来のＰ２６０、Ｐ２６２〜Ｐ２６５（配列番号８４〜８８）、クローン２７由来のＰ２６８、Ｐ２７２、Ｐ２７３（配列番号８９〜９１）、クローン２６由来のＰ２７７〜Ｐ２８０、Ｐ２８２（配列番号９２〜９６）、クローン５６由来のＰ２９４、Ｐ２９５、Ｐ２９７（配列番号９７〜９９）、クローン５由来のＰ３００、Ｐ３０２、Ｐ３０３（配列番号１００〜１０２）、クローン１０由来のＰ３１２、Ｐ３１７、Ｐ３１９（配列番号１０３〜１０５）、クローン２２由来のＰ３２１〜Ｐ３２３、Ｐ３３０（配列番号１０６〜１０９）、クローン３０由来のＰ３３３、Ｐ３４０、Ｐ３４２、Ｐ３４４、Ｐ３４７、Ｐ３４８（配列番号１１０〜１１５）、クローン８８由来のＰ３５４、Ｐ３５８、Ｐ３６０（配列番号１１６〜１１８）、クローン４５由来のＰ３６２、Ｐ３６３、Ｐ３６７、Ｐ３６９、Ｐ３７９、Ｐ３８０（配列番号１１９〜１２４）、クローン５８由来のＰ３８４、Ｐ３８５（配列番号１２５、１２６）、クローン１８由来のＰ３８８、Ｐ３８９（配列番号１２７、１２８）、クローン８７由来のＰ３９０、Ｐ３９１（配列番号１２９、１３０）、クローン２４由来のＰ３９３、Ｐ３９４（配列番号１３１、１３２）、クローン４６由来のＰ４００、４０１（配列番号１３３、１３４）、クローン１１０由来のＰ４０６、Ｐ４０９、Ｐ４１０、Ｐ４１２、Ｐ４１８、Ｐ４２１、Ｐ４２４（配列番号１３５〜１４１）、クローン２０由来のＰ４２６、Ｐ４２９、Ｐ４３４、Ｐ４３６、Ｐ４４０、Ｐ４４１（配列番号１４２〜１４７）、クローン６由来のＰ４４３、Ｐ４４５〜Ｐ４４７（配列番号１４８〜１５１）、クローン１０８由来のＰ４４８〜Ｐ４５０、Ｐ４５３、Ｐ４５５〜Ｐ４５７、Ｐ４６１（配列番号１５２〜１５９）、クローン２３由来のＰ４７０（配列番号１６０）、クローン８６由来のＰ４７９、Ｐ４８０、Ｐ４８２〜Ｐ４８５、Ｐ４８９、Ｐ４９２、Ｐ４９５（配列番号１６１〜１６９）、クローン８９由来のＰ４９７（配列番号１７０）、クローン９２由来のＰ５１１（配列番号１７１）、クローン８５由来のＰ５１５、Ｐ５２２〜Ｐ５２４、Ｐ５２８、Ｐ５２９、Ｐ５３２、Ｐ５３３、Ｐ５３６、Ｐ５２５、Ｐ５２６（配列番号１７２〜１８２）、クローン３由来のＰ５３８、Ｐ５３９（配列番号１８３、１８４）、クローン２９由来のＰ５４２、Ｐ５４３、Ｐ５４６、Ｐ５４８（配列番号１８５〜１８８）、クローン３５由来のＰ５５０、Ｐ５５５、Ｐ５５６（配列番号１８９〜１９１）、クローン８１由来のＰ５７０、Ｐ５７９（配列番号１９２、１９３）、クローン１１４由来のＰ５８３、Ｐ５８７、Ｐ５８９、Ｐ５９０、Ｐ５９６、Ｐ５９７（配列番号１９４〜１９９）、クローン１９由来のＰ６０３（配列番号２００）、クローン７４由来のＰ６１４、Ｐ６１６、Ｐ６１７、Ｐ６２３（配列番号２０１〜２０４）、クローン４１由来のＰ６３４、Ｐ６３６（配列番号２０５、２０６）、クローン７９由来のＰ６４２、Ｐ６４４（配列番号２０７、２０８）、クローン３６由来のＰ６４９、Ｐ６５４（配列番号２０９、２１０）、クローン７６由来のＰ６５６、Ｐ６５８、Ｐ６６１（配列番号２１１〜２１３）である。これらのうち、クローン７８由来のＰ７７（配列番号２０）およびＰ７９（配列番号２１）は、クローン７６由来のＰ６５６（配列番号２１１）およびＰ６５８（配列番号２１２）とそれぞれ同一であった。
代表例としてクローン２、クローン２９、およびクローン４０由来のペプチドについての結果をそれぞれ図４、図５、および図６に示した。図中、ＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄを活性化し得るペプチドと判定されたものは太線で示した。また、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフに適合するＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）由来のペプチド（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）（ネガティブコントロール）は、ＯＫ−ＣＴＬｄにより認識されなかった。
実施例４
（ペプチドを認識するＴＣＲの特異性）
実施例３で得た腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２によって細胞表面に提示されており、ペプチド特異的ＯＫ−ＣＴＬｄクローン上に発現されているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によりＨＬＡ分子と共に認識される。ＴＣＲの多様性は１０１７を超えると報告されており、認識されるＨＬＡ分子の型およびペプチドの種類はＴＣＲの種類により異なる。
そこで、ＯＫ−ＣＴＬｄを親株として樹立した４８０種類のサブライン（以下、ＯＫ−ＣＴＬｄサブラインとよぶ）を用いて、腫瘍細胞および上記ペプチドの認識における各サブラインの特異性を検討した。ＯＫ−ＣＴＬｄサブラインは、親株であるＯＫ−ＣＴＬｄから、これを１，０００細胞／ウエルの濃度で既報〔Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００１）６１：２０３８−２０４６〕に記載の方法でインキュベーションすることにより樹立した。ＯＫ−ＣＴＬｄサブラインによる腫瘍細胞（ＳＷ６２０およびネガティブコントロールであるＣＯＳ−７）および上記ペプチドをパルスしたＴ２細胞の認識は、当該サブラインによるＩＦＮ−γ産生を指標にして、実施例３と同様に行った。
その結果、１０１種類のＯＫ−ＣＴＬｄサブライン（２１％）がＳＷ６２０に反応して、ＣＯＳ−７に対する反応で生産される量より、有意に高いレベルのＩＦＮ−γを産生した。これらのうち、良好な生育を示した２７種類のサブラインについての結果を表９に示す。表９において“−”は、ＩＦＮ−γ産生量が２０ｐｇ／ｍｌ以下であることを意味する。これらのサブラインは少なくとも１つのペプチドと（８種類のサブライン）、最多で８種類のペプチドと（サブライン＃７０）反応し、反応するペプチドの平均数は２．６種類であった。表９に示す１５種類のペプチドは少なくとも１種類のサブラインにより（３種類のペプチド）、最多で（クローン２０由来Ｐ４４０）（配列番号１４６）２１種類のサブラインにより認識され、応答するサブラインの平均数は４．７種類であった。また、これらのサブラインは、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞（表９中、ＮＣと表示）あるいはＨＬＡ−Ａ２結合モチーフに適合するＨＩＶ由来のペプチドをパルスしたＴ２細胞（表９中、ＨＩＶと表示）を認識しなかった。
2003008450.tif 000010
ＯＫ−ＣＴＬｄサブラインをプールしてエフェクター細胞として用い、標的細胞に対する細胞傷害活性を５１Ｃｒ遊離試験で検討した。標的細胞として、クローン１２由来のＰ１（配列番号１）、クローン１１０由来のＰ４２４（配列番号１４１）、クローン２０由来のＰ４４０（配列番号１４６）、クローン１０８由来のＰ４４９（配列番号１５３）、またはクローン１１４由来のＰ５９０（配列番号１９７）をパルスして５１Ｃｒ標識したＴ２細胞を用いた。エフェクター細胞と標的細胞とを１０、２０、および４０の比率（Ｅ／Ｔ比）で混合して６時間培養し、培養上清中に遊離される５１Ｃｒの放射活性を測定した。その結果、図７ａに示すように、ＯＫ−ＣＴＬｄサブラインはペプチドをパルスした標的細胞に対して有意なレベルの細胞傷害活性を示した。しかし、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフに適合するＨＩＶ由来のペプチド（ネガティブコントロール）をパルスした標的細胞に対しては細胞傷害活性を示さなかった。
また、各ペプチドを認識するこれらＯＫ−ＣＴＬｄサブラインのＴＣＲ  Ｖβを分析したところ、その型がそれぞれのサブラインで異なっていることが判明した（図７ｂ）。ＴＣＲ  Ｖβ使用（ＴＣＲ  Ｖβ  ｕｓａｇｅｓ）の分析方法は、既報〔Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００１）６１：２０３８−２０４６〕に準じて行った。
これらの結果から、異なったＴＣＲ  Ｖβを持つＣＴＬが各ペプチドに対して異なった特異性を示すことが判明した。一方、試験した全てのＴＣＲ  Ｖβは、ＯＫ−ＰＢＭＣ（ＯＫ−ＣＴＬの樹立に用いたＴＩＬを提供した大腸癌患者のＰＢＭＣ）または健常人のＰＢＭＣで同等に発現していた。
このように１患者の腫瘍浸潤リンパ球から樹立されたＣＴＬであっても均一ではなく、ペプチド特異的なＣＴＬの複数種類からなる細胞集団であり、上記のように多種の抗原およびペプチドを認識することが判明した。
実施例５
（癌患者のＰＢＭＣにおけるＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの解析）
３人のＨＬＡ−Ａ２＋癌患者（ＯＫ−ＣＴＬの樹立に用いたＴＩＬを提供した大腸癌患者＜ＯＫ＞、別の大腸癌患者＜ＴＴ＞、および転移性メラノーマ患者）の末梢血から単核細胞画分を調製し、ＩＬ−２存在下で３０日間培養した。その後、実施例２で得た腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡクローンに対する反応性を、実施例２と同様の方法で検討した。さらに当該ｃＤＮＡクローンがコードするペプチドに対する反応性を、実施例３と同様の方法で検討した。このとき、肺癌組織の腫瘍浸潤リンパ球から樹立したＧＫ−ＣＴＬ〔Ｇｏｍｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：４９９４−５００４〕についても同様の方法で解析を行った。
大腸癌患者ＯＫ由来のＰＢＭＣ（以下、ＯＫ−ＰＢＭＣと呼ぶ）により６つの遺伝子（クローン２０、クローン４３、クローン５６、クローン８４、クローン８６、およびクローン１０８）産物が認識され（図８ａ）、大腸癌患者ＴＴ由来の活性化せしめたＰＢＭＣ（以下、ＴＴ−ＰＢＭＣと呼ぶ）により４つの遺伝子（クローン２０、クローン８４、クローン８６、およびクローン１０８）産物が認識され、その結果それぞれのＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生が促進された。
また、これら６つの遺伝子産物由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド、すなわちクローン２０、クローン４３、クローン５６、クローン８４、クローン８６、およびクローン１０８にコードされるそれぞれ３、１、２、１、１、および１つのペプチドが、ＯＫ−ＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生をペプチドの用量依存的に促進した（図８ｂ）。これらのペプチドは、クローン２０由来のＰ４３０、Ｐ４３４、およびＰ４４０（配列番号３６０、１４４、および１４６）、クローン４３由来のＰ４５（配列番号１０）、クローン５６由来のＰ２８８（配列番号３５８）およびＰ２８９（配列番号３５９）、クローン８４由来のＰ１８４（配列番号６５）、クローン８６由来のＰ４８５（配列番号１６６）、並びにクローン１０８由来のＰ４４９（配列番号１５３）である。ＯＫ−ＰＢＭＣは、クローン５６由来のＰ２８９（配列番号３５９）、クローン１０８由来のＰ４４９（配列番号１５３）、およびクローン８６由来のＰ４８５（配列番号１６６）に対して強く反応し、他の６つのペプチドに対する反応と比較して多くのＩＦＮ−γを産生した。
さらに、当該ＩＦＮ−γ産生がＨＬＡクラスＩ抗原、ＣＤ８、またはＨＬＡ−Ａ２に対するモノクローナル抗体により阻害され、抗ＨＬＡクラスＩＩ抗原ｍＡｂ、抗ＣＤ４ｍＡｂ、またはアイソタイプが合致したコントロール抗体として用いた抗ＣＤ１４ｍＡｂでは阻害されなかった。このことから、上記活性化されたＰＢＭＣによるこれらのペプチドの認識は、ＨＬＡ−クラスＩ抗原であるＨＬＡ−Ａ２拘束性であること、また当該ペプチドを認識して活性化されたＰＢＭＣはＣＤ８陽性のＣＴＬであることが判明した。
ＴＴ−ＰＢＭＣは、クローン２０由来のＰ４３１（配列番号３６１）、クローン８４由来のＰ１８４（配列番号６５）、クローン８６由来のＰ４８６（配列番号３６３）、およびクローン１０８由来のＰ４６３（配列番号３６２）を認識した。
上記ペプチドのうち、クローン５６由来のＰ２８８（配列番号３５８）およびＰ２８９（配列番号３５９）、クローン２０由来のＰ４３０（配列番号３６０）およびＰ４３１（配列番号３６１）、クローン１０８由来のＰ４６３（配列番号３６２）、並びにクローン８６由来のＰ４８６（配列番号３６３）は、実施例３の検討において、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を強く促進しなかった。しかし、上記のように、大腸癌患者のＰＢＭＣによりＨＬＡ−２拘束性に認識され、それらのＩＦＮ−γ産生を強く促進した。
このように、少なくとも上記の遺伝子（クローン２０、クローン４３、クローン５６、クローン８４、クローン８６、およびクローン１０８）産物および該遺伝子産物由来のペプチド、具体的には上記１２種のペプチド、が大腸癌患者のＰＢＭＣにより認識され、ＨＬＡ−２拘束性にＣＴＬを活性化し得ることが判明した。一方、上記遺伝子産物は、転移性メラノーマ患者由来の活性化せしめたＰＢＭＣまたはＧＫ−ＣＴＬにより認識されなかった。また、健常人由来のＰＢＭＣによっても認識されなかった。
これらから、上記腫瘍抗原およびそれに由来するペプチドをＨＬＡ−Ａ２拘束性に認識するＣＴＬ前駆体が、大腸癌患者のＰＢＭＣに存在することが判明した。したがって、これら腫瘍抗原およびそれに由来するペプチドはこの患者においてＨＬＡ−Ａ２拘束性に腫瘍特異的なＣＴＬを誘導および／または活性化できると考えられる。
実施例６
（遺伝子の発現レベル）
実施例２で得られた遺伝子について、大腸癌（４つの大腸癌細胞株および２つの原発腫瘍）および正常な大腸組織（２つの大腸上皮組織）における発現レベルを、ＳＡＧＥ分析〔Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｖ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２７０：４８４−４８７〕で検討した。ｃＤＮＡの発現レベルを大腸癌と正常大腸組織とで比較すると、上記遺伝子はその約８７％が正常大腸組織と比べて大腸癌において高発現しており、その差は約２倍であることが判明した。一方、クローン１１、クローン３５、クローン８４、クローン９５、およびクローン１１０の発現は、反対に正常大腸組織における発現が高かった。
さらに、ノザンブロット分析により、各種細胞におけるクローン１０、クローン３０、クローン４１、およびクローン１０８の発現を確認した。ノザンブロット分析は、健常人由来のＰＢＭＣ若しくはＰＨＡ芽球化細胞、ＳＷ６２０（大腸癌細胞株）、またはＰａｎｃ−１（膵臓癌細胞株）から抽出した総ＲＮＡ（１０μｇ／レーン）を用いて、既報〔Ｎｉｓｈｉｚａｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０００）６０：４８３０−４８３７〕に記載の方法に準じて行った。プローブｃＤＮＡは、３２Ｐ標識した以下のものを用いた；ＡｃｃＩで消化したクローン１０の第２，０２８〜２，６２０番目の５９３ｂｐ断片ｃＤＮＡ；ＤｒａＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化したクローン３０の第８８５〜１，９０４番目の１，０２０ｂｐ断片ｃＤＮＡ；ＡｃｃＩで消化したクローン４１の第２，７０９〜３，５２０番目の８１２ｂｐ断片ｃＤＮＡ；ＡｖａＩＩで消化したクローン１０８の第２，１４６〜３，２５４番目の１，１０９ｂｐ断片ｃＤＮＡ。また、β−アクチンｍＲＮＡを発現程度のコントロールとして同様に検出した。その結果、クローン１０、クローン３０、およびクローン１０８が大腸癌細胞において選択的に発現していることが判明した（図９）。
実施例７
（ＨＬＡ−Ａ２腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡクローンの単離・同定）
実施例２と同様に、ＳＷ６２０のｃＤＮＡライブラリーのプールをスクリーニングして、ＯＫ−ＣＴＬｄにより認識される新たな２個のｃＤＮＡクローン、ＳＷ６２０−ｃｌ．４８（配列番号３５４）およびＳＷ６２０−ｃｌ．１２１（配列番号３５５）を得た。図１０のａおよびｂに示すように、これらのｃＤＮＡクローンは、それぞれＨＬＡ−Ａ２拘束性かつプラスミドの用量依存的にＯＫ−ＣＴＬｄにより認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進した。一方、発現ベクターｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−２のみをＨＬＡ−Ａ０２０７と共に共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞を用いたときには、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生は促進されなかった。かくして、ＣＴＬによりＨＬＡ−Ａ２拘束性に認識され、ＣＴＬを活性化し得る腫瘍抗原をコードする２つのｃＤＮＡクローンを得た。
得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列の決定は実施例２と同様の方法で行い、各ｃＤＮＡクローンがコードするアミノ酸配列をそれぞれの塩基配列から推定した。また、得られた各クローンの塩基配列について、ＧｅｎＢａｎｋに対して相同性検索を行った。その結果を上記表７に示した。
実施例８
（ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍抗原ペプチドの同定）
実施例７で得た遺伝子ＳＷ６２０−ｃｌ．４８および遺伝子ＳＷ６２０−ｃｌ．１２１がコードするアミノ酸配列に基づいて、実施例３と同様に、ＨＬＡ−Ａ０２０７に結合し得るモチーフ（規則的配列）に適合するそれぞれ異なる複数個の９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを設計して自体公知の方法で合成し、７０％以上の純度を有するペプチドを得た。
上記合成した各ペプチド（１．２２ｎｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）のうち、ＯＫ−ＣＴＬｄによりＨＬＡ−Ａ２拘束性に認識されるペプチドを、実施例３と同様の方法で選択した。その結果、配列表の配列番号３６４〜３８１に記載した１８個のペプチドが用量依存的にＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進した。一方、ネガティブコントロールとして該ペプチドの代わりにＨＩＶ由来のペプチド（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）を用いたときは、ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生は促進されなかった。得られた１８個のペプチドは、ＳＷ６２０−ｃｌ．４８由来のＳＷ６２０−４８・Ｐ１６２、ＳＷ６２０−４８・Ｐ１６３、ＳＷ６２０−４８・Ｐ１６５、ＳＷ６２０−４８・Ｐ１６６、ＳＷ６２０−４８・Ｐ１７３、およびＳＷ６２０−４８・Ｐ１７４（配列番号３６４〜３６９）、並びにＳＷ６２０−ｃｌ．１２１由来のＳＷ６２０−１２１・Ｐ６６５、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６６６、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６６７、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６６８、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６６９、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６７６、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６７７、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６７８、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６７９、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６８５、ＳＷ６２０−１２１・Ｐ６８６、およびＳＷ６２０−１２１・Ｐ６８８（配列番号３７０〜３８１）である。代表例として、ＳＷ６２０−ｃｌ．４８由来の６個のペプチドが用量依存的にＯＫ−ＣＴＬｄに認識されて、該ＯＫ−ＣＴＬｄによるＩＦＮ−γ産生を促進した結果を図１１に示した。
実施例９
（ＨＬＡ−Ａ２６拘束性ＣＴＬの樹立）
ＨＬＡ−Ａ２６拘束性の腫瘍特異的なＣＴＬを、食道癌患者（ＨＬＡ−Ａ２６０１／２４０２）から、文献に記載の方法に準じて樹立した〔Ｎａｋａｏ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９５）５５：４２４８−４２５２〕。その結果、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性に腫瘍特異的細胞傷害活性を示す細胞株が得られた（ＫＥ４−ＣＴＬと呼ぶ）。樹立したＣＴＬは、それぞれ少量ずつ分別して凍結し、使用直前まで保存した。
実施例１０
（ＨＬＡ−Ａ２６拘束性腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡクローンの単離・同定）
ＫＥ４−ＣＴＬによって認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子を、ヒト食道癌細胞株ＫＥ４から、既知の方法〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：２７７−２８８〕に準拠して単離・同定した。まず、ＫＥ４細胞のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに転換してＳａｌＩアダプターにライゲーションし、発現ベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。また、ＨＬＡ−Ａ２６０１のｃＤＮＡを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって得、真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローン化した。
ＫＥ４細胞ｃＤＮＡライブラリーは１００クローンずつプールし、各ウエルにプールしたｃＤＮＡ２００ｎｇとＨＬＡ−Ａ２６０１ｃＤＮＡ２００ｎｇとを、１００μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１：２００混液中で３０分間混合した。この混合物の５０μｌをＶＡ１３細胞（１×１０４）に加え、６時間インキュベーションして共遺伝子導入した。次いで１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて２日間培養し、ＫＥ４−ＣＴＬ（２×１０５）を各ウエルに添加した。１８時間インキュベーションした後、上清の１００μｌを採り、産生されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより測定した。
ＫＥ４−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生を促進するｃＤＮＡをＣＴＬ活性化能が陽性であると判定し、この判定基準によりｃＤＮＡライブラリーのプールをスクリーニングした。ＣＴＬ活性化能が認められたプールについて再現性を確認後、ＣＴＬ活性化能が陽性のプールから個別にクローンを取り出してさらにスクリーニングし、独立プール由来のＣＴＬ活性化能陽性クローンを選別した。得られたクローンの用量依存性を同様に確認し、最終的に、ＫＥ４−ｃｌ．１７、ＫＥ４−ｃｌ．１８、およびＫＥ４−ｃｌ．２１の３個のｃＤＮＡクローンを得た。これらのｃＤＮＡクローンは、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性かつプラスミドの用量依存的にＫＥ４−ＣＴＬにより認識され、ＫＥ４−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進した（図１２）。一方、発現ベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１のみをＨＬＡ−Ａ２６０１と共に共遺伝子導入したＶＡ１３細胞を用いたときには、ＫＥ４−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生の促進は観察されなかった。
得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列の決定は実施例２と同様の方法で行い、各ｃＤＮＡクローンがコードするアミノ酸配列をそれぞれの塩基配列から推定した。また、得られた各クローンの塩基配列について、ＧｅｎＢａｎｋに対して相同性検索を行った。その結果を上記表８に示した。
実施例１１
（ＨＬＡ−Ａ２６拘束性腫瘍抗原ペプチドの同定）
腫瘍抗原をコードする遺伝子ＫＥ４−１７、遺伝子ＫＥ４−１８、および遺伝子ＫＥ４−２１から腫瘍抗原ペプチドを得るために、当該各遺伝子がコードするアミノ酸配列に基づき、既報（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：７３５〜７４０，１９９６）に記載の方法で、それぞれ異なる複数個の９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを設計して合成し、７０％以上の純度を有するペプチドを得た。遺伝子ＫＥ４−１７については、該遺伝子と相同性の高い遺伝子がコードするアミノ酸配列に基づいたペプチドも設計し合成した。
ＨＬＡ−Ａ２６０１を発現させたＶＡ１３細胞に上記合成したペプチドをパルスした後、ＫＥ４−ＣＴＬと共に培養し、ＫＥ４−ＣＴＬから産生されるＩＦＮ−γを測定し、これを指標としてＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬに認識されるペプチドを選択した。まず、ＶＡ１３細胞に、ＨＬＡ−Ａ２６０１プラスミドを１００ｎｇ／ウエル加え、２日間培養して遺伝子導入した後に、上記合成された各ペプチド（１．２２ｎｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）と共に、５％ＣＯ２−９５％Ａｉｒの下で３７℃にて４時間インキュベーションし、細胞表面上に発現しているＨＬＡ−Ａ２６にペプチドを結合させた。該ペプチドをパルスしたＶＡ１３細胞を標的細胞（Ｔ）として用い、ＫＥ４−ＣＴＬをエフェクター細胞（Ｅ）として用いた。標的細胞１×１０４とエフェクター細胞２×１０４とを混合し（Ｅ／Ｔ比＝２）、１８時間インキュベーションした。インキュベーション後の上清１００μｌを回収してＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γを測定した。この時、ペプチドをパルスしていないＶＡ１３細胞に対するＣＴＬのＩＦＮ−γ産生をバックグランドとして、各測定値から減算した。この検討は各ペプチドについて２回ずつ行った。２回の実験それぞれにおいて、ＫＥ４−ＣＴＬは凍結保存しておいたものを融解後にフィーダー細胞を用いて培養してから使用した。すなわち、２回の実験で使用したＫＥ４−ＣＴＬのロットは異なる。
その結果、配列表の配列番号３８８〜４０８に記載した２１個のペプチドがＫＥ４−ＣＴＬにより認識され、該ＫＥ４−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進した。得られた２１個のペプチドは、ＫＥ４−１７由来のＫＥ４−１７・Ｐ１２およびＫＥ４−１７・Ｐ１９（配列番号３９３および３９４）、ＫＥ４−１７と相同性の高い遺伝子由来のＫＥ４−１７・Ｐ１、ＫＥ４−１７・Ｐ３、ＫＥ４−１７・Ｐ５、ＫＥ４−１７・Ｐ７、およびＫＥ４−１７・Ｐ１１（配列番号３８８〜３９２）、ＫＥ４−１８由来のＫＥ４−１８・Ｐ５、ＫＥ４−１８・Ｐ９、ＫＥ４−１８・Ｐ１５、ＫＥ４−１８・Ｐ１６、ＫＥ４−１８・Ｐ２２、ＫＥ４−１８・Ｐ２５、ＫＥ４−１８・Ｐ２６、およびＫＥ４−１８・Ｐ２７（配列番号３９５〜４０２）、並びにＫＥ４−２１由来のＫＥ４−２１・Ｐ２８、ＫＥ４−２１・Ｐ２９、ＫＥ４−２１・Ｐ３８、ＫＥ４−２１・Ｐ３９、ＫＥ４−２１・Ｐ４０、およびＫＥ４−２１・Ｐ４７（配列表の配列番号４０３〜４０８）である。このうち、ＫＥ４−１７・Ｐ３（配列番号３８９）、ＫＥ４−１７・Ｐ１２（配列番号３９３）、ＫＥ４−１８・Ｐ１５（配列番号３９７）、ＫＥ４−１８・Ｐ２７（配列番号４０２）、ＫＥ４−２１・Ｐ２８（配列番号４０３）、およびＫＥ４−２１・Ｐ４０（配列番号４０７）は、２回行った両方の実験においてＫＥ４−ＣＴＬにより認識され、該ＫＥ４−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進した。残り１５個のペプチドは、２回行った実験のうち一方でのみＫＥ４−ＣＴＬにより認識されて該ＫＥ４−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進した。２回の実験において結果が異なるのは、ＣＴＬがペプチド特異的なＣＴＬの複数種類からなる細胞集団であることから、例えば上記のように凍結状態から融解した後の培養時に使用するフィーダー細胞が異なった場合、ペプチドに対する反応性が異なるＣＴＬが得られることが十分有り得るためであると推察される。
代表例としてＫＥ４−２１由来のペプチドによりＫＥ４−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生がペプチド用量依存的に促進されたことを図１３に示した。図１３のａおよびｂは、２回行った実験の各結果を示す。
実施例１２
（ＰＢＭＣにおけるＨＬＡ−Ａ２６拘束性ＣＴＬ誘導）
ＨＬＡ−Ａ２６＋癌患者（口腔扁平上皮癌４例、腎癌１例、および肺癌１例）または健常人５例から得たＰＢＭＣ（１×１０５）を１０μＭのペプチド（純度＞９０％）と共に、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２存在下でインキュベーションした。培養３、６、および９日目に、培地の半分を対応するペプチド（２０μＭ）を含む新鮮培地と交換した。３回刺激した後に、ＨＬＡ−Ａ２６０１を導入して対応するペプチドをパルスしたＶＡ１３細胞を添加して１８時間インキュベーションし、培養上清中のＩＦＮ−γ濃度を測定した。両側スチューデントＴ検定（Ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｓｔｕｄｅｎｔ’Ｓ  Ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて統計分析を行った。
検討には、ＫＥ４−ｃｌ．１８由来のペプチド、ＫＥ４−１８・Ｐ５（配列番号３９５）、ＫＥ４−１８・Ｐ２２（配列番号３９９）、およびＫＥ４−１８・Ｐ２５（配列番号４００）、並びにＫＥ４−ｃｌ．２１由来のペプチド、ＫＥ４−２１・Ｐ２８（配列番号４０３）、ＫＥ４−２１・Ｐ２９（配列番号４０４）およびＫＥ４−２１・Ｐ４０（配列番号４０７）を用いた。その結果、３例の癌患者（Ｐｔ．１、Ｐｔ．２、およびＰｔ．４）のＰＢＭＣにより上記６種のペプチドのうちそれぞれ４種、１種および４種が認識され、当該ＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生を有意に促進した（図１４ａ）。ＫＥ４−１８・Ｐ２２およびＫＥ４−２１・Ｐ２８は、それぞれ癌患者５例のうち３例および患者６例のうち２例のＰＢＭＣにより認識され、当該ＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生を促進した。一方、これらのペプチドは残りの癌患者３例または健常人５例のＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生を促進しなかった。これらの細胞応答は、抗ＨＬＡクラスＩおよび抗ＣＤ８ｍＡｂにより阻害されたが、試験に用いた他の抗体によっては阻害されなかった。このことから、ＰＢＭＣのなかで、上記ペプチドを認識してＩＦＮ−γを産生する細胞は、ＨＬＡクラスＩ拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞であることが判明した。
これらペプチドで刺激されたＰＢＭＣを用い、ＨＬＡ−Ａ２６＋またはＡ２６−癌細胞に対する細胞傷害活性を、３つの異なったＥ／Ｔ比で６時間の５１Ｃｒ遊離試験を行うことにより測定した。ＫＥ４−１８・Ｐ２２、ＫＥ４−２１・Ｐ２８、またはＫＥ４−２１・Ｐ２９で刺激したＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２６＋癌細胞（ＫＥ４）に対して強い細胞傷害活性を示したが、ＨＬＡ−Ａ２６−癌細胞（ＫＥ３）の対する細胞傷害活性は弱く、さらにＨＬＡ−Ａ２６＋ＰＨＡ芽球化細胞には反応しなかった（図１４ｂ）。ＫＥ４細胞に対する細胞傷害活性とＫＥ３細胞に対する細胞傷害活性には有意差が認められた。
これらから、本発明に係るＨＬＡ−Ａ２６拘束性腫瘍抗原およびそれに由来するペプチドは、癌患者のＰＢＭＣにおいて、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性に腫瘍特異的なＣＴＬを誘導および／または活性化し得ることが判明した。
実施例１３
実施例１０で得られた遺伝子ＫＥ４−ｃｌ．１８およびＫＥ４−ｃｌ．２１について、そのｍＲＮＡの組織および各種癌細胞における発現をノザンブロッティング分析により検討した。ノザンブロッティング分析は実施例６に記載した方法と同様の方法で行った。プローブｃＤＮＡとして、ＫＥ４−ｃｌ．１８およびＫＥ４−ｃｌ．２１と相同性の高いリボソーム蛋白質Ｓ２およびＬ１０ａ  ｃＤＮＡを３２Ｐ標識したものを用いた。同様に、β−アクチンｍＲＮＡを発現程度のコントロールとして測定した〔Ｓｈｉｃｈｉｊｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：２７７−２８８〕。
得られた結果を基に、下記式１〔Ｓｈｉｃｈｉｊｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：２７７−２８８〕により相対的発現レベルを算出し、表１０に示した。
式１
インデックス＝（試料のＳ２またはＬ１０ａ濃度／試料のβ−アクチン濃度）×（ＫＥ４細胞のβ−アクチン濃度／ＫＥ４細胞のＳ２またはＬ１０ａ濃度）
ＫＥ４−ｃｌ．１８は試験した全ての癌細胞（ＫＥ４、ＫＥ３、Ｋｕｍａ−１、Ｋｕｍａ−３，ＨＳＣ−２、ＨＳＣ−３、ＨＳＣ−４、ＯＳＣ−２０、Ｃａ９−２２、ＱＧ５６、Ｓｑ−１．ＬＣ９９Ａ、ＬＫ７９、１１−１８、ＬＫ８７、およびＰＣ−９）並びに非悪性腫瘍細胞株（ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞およびＶＡ１３）で発現していた。しかし、精巣、筋肉、並びに末梢血単核細胞以外の正常組織、脳、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、胎盤、小腸、脾臓、および胃では発現していなかった。
ＫＥ４−ｃｌ．２１は試験した全ての癌細胞および非悪性腫瘍細胞株並びに正常組織で発現していたが、正常組織での発現レベルは低かった。
特に、ＫＥ４−ｃｌ．１８およびＫＥ４−ｃｌ．２１のｍＲＮＡは、頭部および頚部の癌細胞並びに非悪性増殖細胞で過剰発現していることが認められた。
【表１０】
2003008450.tif 000011
産業上の利用可能性
本発明により、ＨＬＡ−Ａ２拘束性若しくはＨＬＡ−Ａ２６拘束性にＣＴＬを誘導および／または活性化せしめることができ、上皮性癌および腺癌などの、例えば大腸癌、食道癌、口腔癌、腎癌、肺癌、婦人科癌、および前立腺癌などの特異的免疫療法が可能となる。現在、アメリカ合衆国では年間１６０，０００人の患者が新たに大腸癌と診断されている。また、大腸癌により年間およそ５８，０００人が死亡しており（癌による死亡の約１８％）、大腸癌は癌による死因の第３位を占める。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、日本人の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカコーカサス人約４９％、南アメリカコーカサス人の約３８％、アフリカ黒人の約２３％においてみられる。また、ＨＬＡ−Ａ２６対立遺伝子は、日本人の約２２％、韓国人の約１６％、北アメリカコーカサス人の約８％で認められている。したがって、本発明は、癌治療において多大な貢献を期待し得る。また、本発明は、上皮性癌および腺癌などの、Ｔ細胞による認識に関する分子の基礎的研究にも多大に寄与するものである。
配列表フリーテキスト
配列表の配列番号１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号５９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号６９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号７９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号８９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号９９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１００：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１０９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１１９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１２９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１３９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１４９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１５９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１６９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１７９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１８９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号１９９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２００：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２０９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２１０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２１１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２１２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２１３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号２８４：″Ｘａａ″は、″Ａｓｐ″または″Ｇｌｕ″でありうる。
配列表の配列番号３５２：″ｎ″は、″ａ″、″ｃ″、″ｇ″または″ｔ″でありうる。
配列表の配列番号３５８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３５９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３６９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７２：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７３：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７４：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７５：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７６：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７７：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７８：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３７９：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３８０：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３８１：ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３８８：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３８９：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９０：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９１：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９２：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９３：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９４：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９５：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９６：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９７：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９８：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号３９９：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４００：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４０１：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４０２：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４０３：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４０４：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４０５：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４０６：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４０７：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
配列表の配列番号４０８：ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞により認識される設計されたペプチド
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｃＤＮＡクローン２がＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのインターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γと略称する）産生を促進したことを示す。
図２は、ｃＤＮＡクローン２９がＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す。
図３は、ｃＤＮＡクローン４０がＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す。
図４は、ｃＤＮＡクローン２由来のペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す。
図５は、ｃＤＮＡクローン２９由来のペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す。
図６は、ｃＤＮＡクローン４０由来のペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す。
図７は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＯＫ−ＣＴＬｄのサブライン（ｓｕｂｌｉｎｅ）の細胞傷害活性およびＴ細胞抗原受容体Ｖβの使用（ＴＣＲ  Ｖβ  ｕｓａｇｅｓ）を示す図である。図７ａは、５種類の各ペプチドまたはネガティブコントロール（ｎ．ｃ．）であるＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）由来のペプチドをパルスしたＴ２細胞に対するプールしたＯＫ−ＣＴＬｄサブラインの細胞傷害活性を示す。図中、縦軸はＴ２細胞から遊離された５１Ｃｒの割合（％  ｏｆ  ５１Ｃｒ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）、すなわち特異的溶解率を示す。横軸は標的細胞に対するエフェクター細胞の割合（Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏ）を示す。図７ｂは、癌患者ＯＫ由来の末梢血単核細胞（ＯＫ−ＰＢＭＣ）、ＯＫ−ＣＴＬｄ−６、ＯＫ−ＣＴＬｄ−９、またはＯＫ−ＣＴＬｄ−９から樹立した各サブラインを図中に示したようにプールしたもののＴＣＲ  Ｖβ使用を示す図である。図中、ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｌｉｎｅｓとはペプチドに反応性を示さないサブラインを指す。上部に示した数字は、ＴＣＲ  Ｖβの各型を示す。
図８は、癌患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に各ｃＤＮＡクローンまたは各ペプチドを認識したことを示す。図８ａは、癌患者由来のＰＢＭＣ（ＯＫ−ＰＢＭＣ）が、各ｃＤＮＡクローンを担持したプラスミドとＨＬＡ−Ａ０２０７とを共遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞を認識し、その結果当該ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生が促進されたことを示す。図８ｂは、癌患者由来のＰＢＭＣが、ＨＬＡ−Ａ０２０７を遺伝子導入してペプチドをパルスしたＣＯＳ−７細胞を認識し、その結果当該ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生が促進されたことを示す。
図９は、クローン１０、クローン３０、クローン４１、およびクローン１０８の、各種細胞〔Ｐａｎｃ−１細胞、ＳＷ６２０細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＰＨＡ芽球化細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）〕におけるｍＲＮＡレベルでの発現を示す。
図１０は、ヒト大腸癌由来のｃＤＮＡクローンであるＳＷ６２０−ｃｌ．４８（図１０ａ）およびＳＷ６２０−ｃｌ．１２１（図１０ｂ）が、それぞれＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。
図１１は、ヒト大腸癌由来のｃＤＮＡクローンであるＳＷ６２０−ｃｌ．４８由来のペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＯＫ−ＣＴＬｄに認識され、ＯＫ−ＣＴＬｄのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。
図１２は、ヒト食道癌由来のｃＤＮＡクローンであるＫＥ４−ｃｌ．１７、ＫＥ４−ｃｌ．１８、およびＫＥ４−ｃｌ．２１が、それぞれＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＫＥ４−ＣＴＬに認識され、ＫＥ４−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。
図１３は、ヒト食道癌由来のｃＤＮＡクローンであるＫＥ４−ｃｌ．２１由来のペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性細胞傷害性Ｔ細胞ＫＥ４−ＣＴＬに認識され、ＫＥ４−ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を促進したことを示す図である。図１３ａおよびｂは２回行った実験のそれぞれの結果を示す。図１３ａにおいて、−●−はＫＥ４−２１・Ｐ２８を、−▲−はＫＥ４−２１・Ｐ２９を、−■−はＫＥ４−２１・Ｐ３９を、および−〇−はＫＥ４−２１・Ｐ４０を示す。図１３ｂにおいて、−●−はＫＥ４−２１・Ｐ２８を、−▲−はＫＥ４−２１・Ｐ３８を、−〇−はＫＥ４−２１・Ｐ４０を、および−■−はＫＥ４−２１・Ｐ４７を示す。
図１４は、ヒト食道癌由来のｃＤＮＡクローンであるＫＥ４−ｃｌ．１８およびＫＥ４−ｃｌ．２１由来のペプチドにより、癌患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ＨＬＡ−Ａ２６拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞が誘導および／または活性化されたことを示す。図中、Ｐｔ．は患者例を意味する。図１４ａは、ペプチドで予め刺激されたＰＢＭＣが対応するペプチドを認識し、その結果当該ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生が促進されたことを示す。図１４ａ中、＊は両側スチューデントＴ検定により有意差（Ｐ＜０．０５）があると認められたものを示す。図１４ｂは、癌患者由来のＰＢＭＣをペプチドと共に２１日間培養後、ＨＬＡ−Ａ２６＋食道癌（ＫＥ４）、ＨＬＡ−Ａ２６−食道癌細胞（ＫＥ３）、およびＰＨＡ芽球化細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）に対する細胞傷害活性を、６時間の５１Ｃｒ遊離試験により試験した結果を示す。縦軸は特異的溶解率（％）を示し、横軸は標的細胞に対するエフェクター細胞の比（Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏ）を示す。図１４ｂ中、＊は両側スチューデントＴ検定によりＫＥ４腫瘍細胞に対する溶解率とＫＥ３腫瘍細胞に対する溶解率の間に有意差（Ｐ＜０．０５）があると認められたものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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