(57)【要約】本発明は、麹菌遺伝子発現の検出方法、及び麹菌発酵条件の特異的測定用ＤＮＡを提供する。具体的には、本発明の麹菌発酵条件の特異的測定用ＤＮＡは、富栄養培養、貧栄養培養、固体培養、発芽初期培養、アルカリ培養、高温培養及び低温培養からなる群から選択される少なくとも１つの培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜６００６のいずれかに示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜６００６のいずれかに示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、富栄養培養、貧栄養培養、固体培養、発芽初期培養、アルカリ培養、高温培養、低温培養及びマルトース培養からなる群から選択される少なくとも１つの培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡ
【請求項２】
富栄養培養、貧栄養培養、固体培養、発芽初期培養、アルカリ培養、高温培養、低温培養及びマルトース培養からなる群から選択される少なくとも１つの培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡ。
【請求項３】
富栄養培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡが、表１の第１列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
貧栄養培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡが、表１の第２列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項５】
固体培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡが、表１の第３列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項６】
発芽初期培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡが、表１の第４列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項７】
アルカリ培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡが、表１の第５列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項８】
高温培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡが、表１の第６列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項９】
低温培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡが、表１の第７列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
マルトース培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡが、表１の第８列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものである請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
糸状菌がアスペルギルス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、ムコール属又はフザリウム属に属する微生物である請求項１〜１０のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
アスペルギルス属に属する微生物が麹菌である請求項１１記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
麹菌がアスペルギルス・オリゼである請求項１２記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１〜１０に記載のＤＮＡから選ばれる複数のＤＮＡのうち全部又は一部の領域から調製されるヌクレオチド配列からなる群から選択される、少なくとも２個の糸状菌遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１５】
請求項１〜１０に記載のＤＮＡから選ばれる複数のＤＮＡのうち全部又は一部の領域から調製されるヌクレオチド配列を含む、糸状菌遺伝子検出用プローブ。
【請求項１６】
糸状菌から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、請求項１４記載のプライマーセットを用いて該ｃＤＮＡを増幅し、得られる増幅産物から糸状菌遺伝子を検出することを特徴とする糸状菌の検出方法。
【請求項１７】
糸状菌から抽出されたＲＮＡに請求項１５記載のプローブをハイブリダイズさせ、得られる産物から糸状菌遺伝子を検出することを特徴とする糸状菌の検出方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７記載の検出方法により得られた検出結果を指標として、糸状菌の生育状態又は発酵機能を推定する方法。
【請求項１９】
糸状菌がアスペルギルス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、ムコール属又はフザリウム属に属する微生物である請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
アスペルギルス属に属する微生物が麹菌である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
麹菌がアスペルギルス・オリゼである請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、糸状菌遺伝子発現の検出方法、及び糸状菌発酵条件の特異的測定用ＤＮＡに関する。
背景技術
麹菌を用いた発酵生産では、麹菌の生育の状態、麹菌の様々な発酵機能（遺伝子）の発現などを詳細にモニターすることが重要である。また、発酵生産工程は必ずしも単一の微生物の働きだけによるものではなく、進化的に近縁の異なる複数の微生物を使用することもあり、かつ、それらは人為的に接種されたものではなく、発酵生産の過程において自然環境中から受動的に混入される場合がある。しかも、これらの混入した微生物は、発酵生産に必須な場合が多く、本来その混入が期待されていることから、混入そのものを防ぐことができない場合が多数存在する。一方、自然環境中には、発酵生産に好ましくない微生物も多数存在し、これらの中には進化的に麹菌と極めて近縁の生物種も存在する。従って、発酵生産では、多数の識別が困難な微生物種の中から、麹菌だけについて、上記の項目を正確に測定する必要がある。
従来は、これらを直接的にモニターする方法は存在せず、目視や芳香などを用いた技術者（職人）による観測、あるいは生産物中の有機酸やエステルなどの成分の分析などに基づいた観測が行われ、これまでの経験に基づいて生育の状態や発酵機能の発現を推定してきた。しかし、これらの観測は非客観的・非直接的で数値化が難しく、従って自動化や省力化が困難な場合が多々存在した。
発明の開示
本発明は、麹菌遺伝子発現の検出方法、及び麹菌発酵条件の特異的測定用ＤＮＡを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、麹菌の多数の遺伝子を利用して麹菌の生育状態や発酵の程度を検出し得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである。
（ａ）配列番号１〜６００６のいずれかに示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜６００６のいずれかに示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、富栄養培養、貧栄養培養、固体培養、発芽初期培養、アルカリ培養、高温培養、低温培養及びマルトース培養からなる群から選択される少なくとも１つの培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡ
さらに、本発明は、富栄養培養、貧栄養培養、固体培養、発芽初期培養、アルカリ培養、高温培養、低温培養及びマルトース培養からなる群から選択される少なくとも１つの培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡである。
上記ＤＮＡは、富栄養培養、貧栄養培養、固体培養、発芽初期培養、アルカリ培養、高温培養、低温培養及びマルトース培養からなる群から選択される少なくとも１つの培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるものである。
ここで、（ａ）富栄養培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡとしては表１の第１列目に、（ｂ）貧栄養培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡとしては表１の第２列目に、（ｃ）固体培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡとしては表１の第３列目に、（ｄ）発芽初期培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡとしては表１の第４列目に、（ｅ）アルカリ培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡとしては表１の第５列目に、（ｆ）高温培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡとしては表１の第６列目に、（ｇ）低温培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡとしては表１の第７列目に、（ｈ）マルトース培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるＤＮＡとしては表１の第８列目に、それぞれ記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記ＤＮＡから選ばれる複数のＤＮＡのうち全部又は一部の領域から調製されるヌクレオチド配列からなる群から選択される、少なくとも２個の麹菌遺伝子増幅用プライマーセットである。
さらに、本発明は、前記ＤＮＡから選ばれる複数のＤＮＡのうち全部又は一部の領域から調製されるヌクレオチド配列を含む、糸状菌遺伝子検出用プローブである。
さらに、本発明は、糸状菌から抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、前記プライマーセットを用いて該ｃＤＮＡを増幅し、得られる増幅産物から糸状菌遺伝子を検出することを特徴とする糸状菌の検出方法である。
さらに、本発明は、糸状菌から抽出されたＲＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせ、得られる産物から糸状菌遺伝子を検出することを特徴とする糸状菌の検出方法である。
さらに、本発明は、前記検出方法により得られた検出結果を指標として、糸状菌の生育状態又は発酵機能を推定する方法である。
糸状菌としては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、ムコール属又はフザリウム属に属する微生物が挙げられる。また、アスペルギルス属に属する微生物としては麹菌（例えばアスペルギルス・オリゼ）が挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．はじめに
本発明は、麹菌の多数の遺伝子の塩基配列を利用して、上記の問題を解決しようとするものである。即ち、本発明による塩基配列を有する多数のハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーを用いて、麹菌のＤＮＡ量および麹菌遺伝子の発現量を正確に測定することにより、発酵生産工程に存在する多数の微生物種から麹菌の生育状態又は麹菌の発酵機能の発現を直接的かつ正確に測定することが可能となる。本発明は、種々の代表的な発酵生産条件において発現する遺伝子の塩基配列のほとんど全てを網羅しており、発酵生産過程における麹菌の発酵機能の発現などを詳細にモニターすることが可能である。また、進化的に近縁な麹菌と異なる微生物が存在していても、多数の遺伝子の塩基配列を用いて解析することによって、小数の遺伝子を用いて測定する場合よりも正確に測定することが可能である。これにより、従来は極めて困難であった自動化および省力化が達成されるばかりでなく、発酵生産の信頼性の向上および標準化が達成される。これにより、大幅な生産コストの削減が可能となる。
麹菌は発酵工業で広範に用いられているが、本発明において生産効率を向上させるために、詳細な培養条件を設定する。麹菌由来のＤＮＡをクローニングし、その塩基配列は、麹菌の発酵状態を詳細にモニターするための、ハイブリダイゼーション用プローブあるいはＰＣＲ用プライマーの設計および製造に用いる。
２．麹菌由来ＤＮＡのクローニング
麹菌由来ｍＲＮＡの調製は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、麹菌の発酵処理物を、グアニジウムチオシアネート、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロース若しくはセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法又はバッチ法によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。得られる組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。
ここで、大腸菌の形質転換は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うことができる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有することが必要である。また、プラスミド以外のクローニングベクター、例えばλファージ等を用いることもできる。
得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のオートシークエンサー（モデルＡＢＩ  ３７７）等）を用いて配列決定が行われる。
全塩基配列は配列番号１〜６００６に示す。但し、本発明のＤＮＡは、配列番号１〜６００６に示す塩基配列を有するもののほか、配列番号１〜６００６に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、（ａ）富栄養培養、貧栄養培養、固体培養、発芽初期培養、アルカリ培養、高温培養、低温培養及びマルトース培養からなる群から選択される少なくとも１つの培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができるＤＮＡ、あるいは（ｂ）当該ＤＮＡの発現産物と同一機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃での条件をいう。
また、本発明ＤＮＡは、培養条件によって発現の態様が異なるものである。培養条件と発現するＤＮＡとの関係、すなわちどの培養条件のときにどのＤＮＡが発現するか、培養条件と配列番号を表１にまとめた。
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３．糸状菌の培養条件
上記ＤＮＡの塩基配列は、糸状菌の各培養条件のうち単独又はこれらの種々の組合わせの条件により発現が調節（促進又は抑制）される遺伝子の塩基配列からなるものである。これらの遺伝子をプライマー又はプローブとして使用すると、様々な条件の組合わせの状況を詳細かつ正確に測定することが可能となる。本発明において、各種培養条件としては富栄養、貧栄養、固体培養、発芽初期、アルカリ培養、高温培養及び低温培養の各条件が挙げられる。
培養の対象となる糸状菌としては、アスペルギルス属（エマリセラ属を含む）、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、ムコール属又はフザリウム属に属する微生物が挙げられる（下記参照）。
ペニシリウム属：既知のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に分類される全ての種。
フミコーラ属：既知のＨｕｍｉｃｏｌａ属に分類される全ての種。
トリコデルマ属：既知のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に分類される全ての種。
ムコール属：既知のＭｕｃｏｒ属に分類される全ての種。
フザリウム属：既知のＦｕｓａｒｉｕｍ属に分類される全ての種。
麹菌：アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・パラシティカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ又はＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）
なお、本発明においては、アスペルギルス・オリゼを使用することが好ましい。本発明の塩基配列の決定に用いたアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９３５として平成１４年３月４日付で寄託されている。
（１）富栄養培養条件
富栄養培養条件とは、ポリペプトンあるいは酵母エクストラクトなどを含む完全培地であり、０．１％〜５％のグルコース、好ましくは２％のグルコースを含み、ｐＨ５〜７、好ましくはｐＨ６．３の培地を用い、培養温度２５℃〜３３℃、好ましくは３０℃で、麹菌が旺盛な生育をする培養条件を意味する。典型的な培養条件は、以下のＹＰＤ培地中、３０℃で２２時間培養する。
ＹＰＤ培地
酵母エキス：１％
バクトペプトン：２％
アデニン硫酸：０．０４％
グルコース：２％
この条件で培養することにより発現するＤＮＡは、表１の第１列目に記載した配列番号に示すものである。
（２）貧栄養培養条件
貧栄養培養条件とは、タンパク質、炭水化物などの炭素源を全く含まず、麹菌が増殖しない培養条件を意味する。麹菌はあらかじめ生育が可能な培養条件、好ましくは上記ＹＰＤ液体培地で培養し、菌体を集菌・洗浄後、さらにグルコースなどの炭素源を含まない、ｐＨ５〜７、好ましくはｐＨ５．５の培地を用い、２５℃〜３３℃、好ましくは３０℃で、４〜１０時間、好ましくは８時間培養する。典型的な培養条件は、以下のＹＰＤ液体培地中、３０℃で２２時間培養し、菌体を濾過によって回収し、滅菌水で洗浄後、以下のＣＤ（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）液体培地で３０℃、８時間培養する。
ＹＰＤ液体培地
酵母エキス：１％
バクトペプトン：２％
アデニン硫酸：０．０４％
グルコース：２％
この条件で、３０℃、２２時間培養し、集菌・洗浄後、以下の貧栄養培地に移す。
ＣＤ液体培地
ＮａＮＯ３：０．３％
ＫＣｌ：０．２％
ＫＨ２ＰＯ４：０．１％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５％
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．００１％
ｐＨ５．５
この条件で培養することにより発現するＤＮＡは、表１の第２列目に記載した配列番号に示すものである。
（３）固体培養条件
固体培養条件とは、蒸した米、小麦、大豆などの固形炭水化物あるいはタンパク質からなる穀物などを培地として麹菌を増殖させる培養状態を意味する。同様の培養条件は、寒天培地上にメンブレンフィルターを密着して置き、その上で菌体を生育させることによっても実現される。典型的な培養条件としては、小麦ふすまに分生子を着生させ、３０℃、２７時間培養する。
この条件で培養することにより発現するＤＮＡは、表１の第３列目に記載した配列番号に示すものである。
（４）発芽初期培養条件
発芽初期培養条件とは、麹菌が生育可能な液体あるいは寒天培地に分生子を接種し、２５℃〜３３℃、好ましくは３０℃で、８〜１５時間、好ましくは１２時間培養し、分生子が発芽した直後の培養条件を意味する。典型的な培養条件は、以下のＳＰ液体培地で３０℃、１２時間培養する。
ＳＰ液体培地  可溶性デンプン：３．５％
ポリペプトン：２％
ＫＨ２ＰＯ４：０．５％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５％
この条件で培養することにより発現するＤＮＡは、表１の第４列目に記載した配列番号に示すものである。
（５）アルカリ培養条件
アルカリ培養条件とは、麹菌の生育に必要な炭素源および窒素源などを含み、ｐＨが８〜１０、好ましくはｐＨ１０に調整された液体あるいは寒天培地に麹菌分生子を接種し、２５℃〜３３℃、好ましくは３０℃で１日〜１週間、好ましくは３日間培養し、麹菌菌体がアルカリ性環境化で生育する培養条件を意味する。典型的な培養条件は、以下のｐＨ１０に調製されたＣＤ液体培地で、３０℃、３日間培養する。
ＣＤ液体培地（ｐＨ１０）
グルコース：２％
ＮａＮＯ３：０．３％
ＫＣｌ：０．２％
ＫＨ２ＰＯ４：０．１％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５％
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．００１％
ｐＨ１０
この条件で培養することにより発現するＤＮＡは、表１の第５列目に記載した配列番号に示すものである。
（６）高温培養条件
高温培養条件とは、ポリペプトンあるいは酵母エクストラクトなどを含む完全培地であり、０．１％〜５％のグルコース、好ましくは２％のグルコースを含み、ｐＨ５〜７、好ましくはｐＨ６．３の培地を用い、培養温度３５℃〜４２℃、好ましくは３７℃で、麹菌が生育可能であり、麹菌が高温に対する応答あるいは適応を必要とする培養条件を意味する。典型的な培養条件は、以下のＹＰＤ培地中、３７℃で２４時間培養する。
ＹＰＤ培地
酵母エキス：１％
バクトペプトン：２％
アデニン硫酸：０．０４％
グルコース：２％
この条件で培養することにより発現するＤＮＡは、表１の第６列目に記載した配列番号に示すものである。
（７）低温培養条件
低温培養条件とは、蒸した米、小麦、大豆などの固形炭水化物あるいはタンパク質からなる穀物などを培地として、培養温度２８℃〜３３℃、好ましくは３０℃で、１日〜３日、好ましくは３４時間培養した後、培養温度を２０℃〜２５℃、好ましくは２５℃に降下させ、さらに２時間〜５時間、好ましくは３時間培養する生育条件を意味する。典型的な培養条件としては、脱脂加工大豆と焙炒割砕小麦を吸水後加熱滅菌する。麹菌分生子を接種後、３０℃で３４時間培養して菌糸を生育させ、２５℃に冷却してさらに３時間培養する。
この条件で培養することにより発現するＤＮＡは、表１の第７列目に記載した配列番号に示すものである。
（８）マルトース培養条件
マルトース培養条件とは、ポリペプトンなどを含む完全培地であり、０．１％〜５％のマルトース、好ましくは２％のマルトースを含み、ｐＨ５〜７、好ましくはｐＨ６．３の培地を用い、培養温度２５℃〜３３℃、好ましくは３０℃で、麹菌が生育をする培養条件を意味する。典型的な培養条件は、以下のＡＣＭ液体培地で、３０℃、２４時間培養し、菌体を濾過により集菌し滅菌水で洗浄した後、以下の２％マルトースを含む天然培地で、３０℃、４時間、麹菌を培養する条件をいう。
ＡＣＭ液体培地
Ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ：２％
Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎ：０．１％
グルコース：２％
２％マルトースを含む液体培地
Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎ：１％
ＫＨ２ＰＯ４：０．５％
ＮＡＮＯ３：０．１％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５％
マルトース：２％
この条件で培養することにより発現するＤＮＡは、表１の第８列目に記載した配列番号に示すものである。
（９）培養条件の組合せ
上記各培養条件は、単独で使用することができるが、麹菌の検出目的、各種培養条件のモニターの目的等に応じて適宜組合せることも可能である。例えば、富栄養培養条件と低温培養条件との組合せ、固体培養条件と高温培養条件との組合せ、固体培養条件と高温培養条件とマルトース培養条件との組合せ、富栄養培養条件と発芽初期培養条件と高温培養条件とアルカリ培養条件との組合せ、上記（１）〜（８）の矛盾しない条件のすべての組合せ等が挙げられる。
４．プローブ又はプライマーの設計
麹菌の検出用プライマー、すなわちＰＣＲのフォワードプライマー（センスプライマーともいう）及びリバースプライマー（アンチセンスプライマーともいう）は、配列番号１〜６００６に示される配列から設計及び合成することができる。前記培養条件のうち１つの条件又はこれらの条件の組合せにより培養された結果得られるＤＮＡの種類は、各培養条件により変動する（表１参照）。各培養条件により得られる麹菌ＤＮＡは複数個含まれているので、そのようなＤＮＡから選ばれる多種類かつ複数のＤＮＡを、本発明のプライマーを設計するための基礎とする。例えば、富栄養条件で培養されたときの麹菌ＤＮＡ（表１、第１列目に記載の配列番号）から複数のＤＮＡを任意に選択して当該選択されたＤＮＡの一部の領域からプライマーを設計する。また、複数条件の組合せで培養されたときの麹菌は、表１中、その条件に対応する列に記載のＤＮＡを発現する。
これらのＤＮＡから複数のＤＮＡを任意に選択して当該選択されたＤＮＡの一部の領域からプライマーを設計する。プライマーの数は、麹菌近縁種の近縁度および混在度を勘案して必要な最小限の数を決定するが、少なくとも１組（２本）、好ましくは２組〜４組である。プライマーは、麹菌に特徴的な領域から設計することもでき、それ以外の領域から設計することもできる。プライマーの長さは１５〜５０塩基、好ましくは２４〜３０塩基の長さであり、プライマー設計のためのＤＮＡの位置は、増幅したときの断片が５０〜４０，０００ｂｐ、好ましくは３００〜１，０００ｂｐとなるように適宜選択する。
本発明のプライマーは、通常の化学合成、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ自動合成装置を用いた化学合成により得ることができる。
一方、麹菌の検出用プローブも、麹菌検出用プライマーを設計したときと同様の要領で、上記ＤＮＡの全部又は一部の領域から設計することができる。あるいは、上記プライマーを用いて、ゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅させることにより、プローブを調製することも可能である。一部の領域から設計する場合は、長さが１４〜３，０００塩基、好ましくは２０〜１，０００塩基となるようにする。
５．プライマーセット及び／又はプローブを含むキット
上記プライマーセット及び／又はプローブは、麹菌由来ＤＮＡを増幅又は検出するためのキットとして使用される。プライマーセットは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ等）とともに、麹菌由来のＤＮＡ増幅用キットとして使用される。
６．ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション及び検出
上記のようにして調製されたプライマーセット及びＤＮＡポリメラーゼを用いて麹菌のＤＮＡを増幅する。鋳型となるＤＮＡの調製は、公知の手法、例えばヤタラーゼ（Ｔａｋａｒａ）などの細胞壁溶菌酵素を用いた方法、あるいはグアニジウムイソチオシアネートを用いてＲＮＡを調製した後、市販のｃＤＮＡ合成キット（ＧｉｂｃｏＢＲＬなど）を用いた法方等により行うことができる。
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行う。ＤＮＡポリメラーゼとしてはＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等が挙げられる。
増幅の条件は、９０℃〜９８℃で５秒〜１分、好ましくは９４℃で１０秒〜１分の変性工程、３７℃〜６８℃で５秒〜３分、好ましくは５５℃で３０秒〜１分のアニーリング工程、及び６５℃〜７５℃で２秒〜３０分、好ましくは７２℃で３０秒〜１分の伸長工程を１サイクルとしてこれを１４〜４０サイクル、好ましくは３０サイクル行う。但し、鋳型ＤＮＡ及びプライマーを十分変性させるために、上記増幅サイクルの前に９４℃で１〜３分の変性工程を加えてもよく、また、増幅されたＤＮＡを完全に伸長するために、増幅サイクルの後に７２℃で２〜１０分の伸長工程を加えてもよい。さらに、増幅産物の検出を直ちに行わない場合は、非特異的な増幅が起こらないようにするために、増幅産物を４℃で保存する工程を加えることが好ましい。また、アニーリング行程と伸長工程を同一の温度で行うことにより、反応時間を簡略かつ迅速化する事もできる。
その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、各麹菌の存在を判断することができる。アガロースゲル電気泳動の代わりにポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいはキャピラリー電気泳動を実施してもよい。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。また、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により検出する等、電気泳動を必要としない検出方法も採用することができる。
ハイブリダイゼーションを行った場合は、３２Ｐあるいは３５Ｓ等の放射性同位体、あるいはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等により標識されたプローブとサンプルＤＮＡとをハイブリダイズさせ、オートラジオグラフィー、イメージアナライザー等により検出することができる。
ところで、麹菌は、生産目的に応じて様々な突然変異体（置換、欠失、挿入）が存在するが、通常その変異の詳細は解明されていない。従って、ある種のプローブでは、対応する遺伝子が欠失していることなどにより、本来検出されるべき信号が検出できないことが多々存在する。そこで、多数のプローブを用いて（冗長性を上げて）検出することにより、突然変異による例外的な検出結果を除去し、正確な検出を可能にする。この場合に使用するプローブの数は、１〜１００個、好ましくは２〜５個である。
従って、本発明の検出方法により得られた検出結果を指標として、麹菌の生育状態又は発酵状態の推定が可能となる。例えば、胞子発芽初期という検出結果が得られた場合は、麹菌の生育状態は発酵生産に不十分であると推定することができ、貧栄養条件であるという検出結果が得られた場合は、麹菌の生育状態は既に最良の状態を過ぎていると推定することができる。また、富栄養条件という検出結果が得られた場合は、麹菌の発酵状態は良好であり、効率的な発酵生産が持続可能であると推定することがでる。さらに、固体培養条件にあるという検出結果が得られた場合は、固形物の発酵は十分ではなく、麹菌の発酵状態を持続させることによって、発酵を進める必要があると推定することができる。
また、突然変異体に対する測定の場合、多数のプローブを用いた検出により、特定の遺伝子の発現だけが異常になっているものが発見されることが多い。この結果に基づいて、該突然変異体の変異に直接的に関与する遺伝子を同定することが可能であり、同定された突然変異に基づいて効率的に種を改良する（育種する）ことが可能となる。この場合に使用するプローブの数は、１〜１００個、好ましくは５〜２０個である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕培養条件の設定
（１）富栄養ライブラリー
麹菌アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０株をＹＰＤ培地（１％酵母エキス，２％バクト−ペプトン，０．０４％アデニン硫酸，２％グルコース）で２２時間培養し、得られた菌体からグアニジウムチオシアネートを用いた方法でｍＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡ合成はクロンテック社のＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ合成キットの逆転写用プライマーを用い、アダプターはＰｈａｒｍａｃｉａのＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌ  ＢｏｘのＥｃｏＲＩアダプターを用いた。ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ＋を用い、上記ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩとＮｏｔＩサイトに５’→３’の向きに挿入した。これを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換し、アルカリ法でプラスミドを調製し、Ｍ１３ユニバーサルプライマーを用いてシークエンスした。
逆転写用プライマー
2002079476.tif 000017
ＥｃｏＲＩアダプター
2002079476.tif 000018
その結果、表１の第１列目に記載の配列番号に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。
（２）固体培養ライブラリー
小麦ふすまに、分生子水に麹菌を懸濁して添加し、３０℃、２７時間培養して菌体を回収した。このときの肉眼観察によって状貌をみたところでは、気中菌糸がはっきりと認められるが、分生子形成は始まっていなかった。菌体を液体窒素中で粉砕後、Ｃａｔｈａｌａ法によってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを分離した。ｍＲＮＡ分離はＯｌｉｇｏｔｅｘ法によった。ｃＤＮＡ合成は、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬのｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。ベクターはキットに付属のｐＳＰＯＲＴ１を使用し、ｃＤＮＡをＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入した。形質転換、プラスミドの調製方法、シークエンス方法などは富栄養ライブラリーと同じである。
逆転写用プライマー
2002079476.tif 000019
ＳａｌＩアダプター
2002079476.tif 000020
その結果、表１の第３列に記載の配列番号に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。
（３）高温培養ライブラリー
ＹＰＤ培地で，３７℃，２４時間振とう培養し，菌体から日本ジーン社のＩＳＯＧＥＮによって全ＲＮＡを抽出したのち，ファルマシア社のｍＲＮＡ精製キットを用いてｍＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡ合成は，ファルマシアのｃＤＮＡ合成キットとｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｏｏｌｂｏｘのＮｏｔＩ／Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ１８プライマーを用い、得られたｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ＋のＥｃｏＲＩ→ＮｏｔＩサイトに組み込んだ。形質転換、プラスミドの調製方法、シークエンス方法などは富栄養ライブラリーと同じである。
その結果、表１の第６列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。
（４）発芽初期ライブラリー
分生子は、ＰＤ（ポテトデキストロース寒天）平板で２８℃８日間培養し、取得した。発芽菌体は、分生子をＳＰ液体培地（３．５％可溶性デンプン、２％ポリペプトン、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）で３０℃、１２時間培養して得た。分生子、発芽菌体を液体窒素と海砂で破砕し、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてｍＲＮＡの精製を行った。次いで、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成した。ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ＋を用い、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩサイトに挿入した。形質転換、プラスミドの調製方法、シークエンス方法などは富栄養ライブラリーと同じである。
その結果、表１の第４列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。
（５）アルカリ培養ライブラリー
ｐＨ１０に調製したＣＤ（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）寒天培地上に滅菌したセロファンを置き、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株の分生子を植菌し、３０℃で３日間培養した。セロファンに生育した菌体を回収し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）にてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製後、ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア）にてｍＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成はＢＲＬのキットを用い、ベクターはｐＳＰＯＲＴ１でＳａｌＩとＮｏｔＩサイトに挿入した。形質転換、プラスミドの調製方法、シークエンス方法などは富栄養ライブラリーと同じである。
その結果、表１の第５列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。
（６）マルトース培養ライブラリー
麹菌をＡＣＭ培地（２％麦芽エキス，０．１％バクト−ペプトン，２％グルコース）で３７℃、２４時間振とう培養し、菌体を濾過集菌して天然培地（１％バクト−ペプトン，０．５％ＫＨ２ＰＯ４，０．１％ＮＡＮＯ３，０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）で洗浄した。この菌体を２％マルトースを含む天然培地で３７℃、４時間更に振とう培養し、得られた菌体よりＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法に基づきＲＮＡを調製した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｍＲＮＡをｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｄＴ３０（Ｓｕｐｅｒ）（日本ロシュ）を用いて精製し、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に準じてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）ＥｃｏＲ  Ｉ→Ｘｈｏ  Ｉサイトに組み込んだ。形質転換、プラスミドの調製方法、シークエンス方法などは富栄養ライブラリーと同じである。
その結果、表１の第８列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。
（７）貧栄養ライブラリー
ＹＰＤ培地（１％酵母エキス，２％バクト−ペプトン，０．０４％アデニン硫酸，２％グルコース）で２２時間培養し、菌体をろ過によって集菌し蒸留水で洗浄した。この菌体を、グルコースなどの炭素源を含まない（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）ＣＤ培地に移してさらに８時間培養し、得られた菌体からｍＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡ合成は富栄養ライブラリーの場合と同様である。ライブラリーのｃＤＮＡの平均長は、約１．５ｋｂｐ弱であった。
その結果、表１の第２列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。
（８）低温培養ライブラリー
脱脂加工大豆１０ｇに１５ｍｌの水を加えて吸水させ、焙炒割砕小麦１０ｇを加えて攪拌した。これを５００ｍｌ容三角フラスコに入れてバイオシリコ栓をして３０分間オートクレーブ処理し、冷却後Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０を１×１０５個胞子／ｇになるように接種した。接種後３０℃（気相式）で３４時間、その後２５℃で３時間製麹した。従って製麹開始から３７時間目の麹のＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。なお、製麹途中１８時間目と３４時間目に三角フラスコを振って撹拌した。ｃＤＮＡ合成は、ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）でＬＤ  ＰＣＲを用いて作製した。ベクターはλＴｒｉｐＥｘ２でＳｆｉＩサイトに挿入した。形質転換、プラスミドの調製方法、シークエンス方法などは富栄養ライブラリーと同じである。
その結果、表１の第７列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。
〔実施例２〕麹菌の生育状態の測定
蒸米に麹菌の分生子を付着させ、水分含量２５％、室温３日間菌糸を生育させた。この発酵生産過程の１５時間後および２日後の発酵産物より、細胞壁溶解酵素とフェノール抽出を組合わせた方法でＲＮＡを抽出し、ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、泳動分離されたＲＮＡを毛細管現象を利用してニトロセルロース膜上に転写した。この膜をカゼインを含む緩衝液でブロッキングした後、本発明による固体培養条件および発芽初期培養条件において検出されたそれぞれのＥＳＴ配列、３９９０（配列番号３９９０）および３８４７（配列番号３８４７）の配列を有するＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを加えてハイブリダイゼーションを行った。クエン酸を含む洗浄液で数回洗浄し、最終的に０．２ｘＳＳＣで４２℃１５分洗浄した膜を、抗−ＤＩＧ抗体とアルカリフォスファターゼ複合体を含む緩衝液で処理し、化学発光試薬ＣＤＰ−Ｓｔａｒで発光させ、光増感装置を備えたＣＣＤカメラで映像化した。これにより、３９９０由来のプローブを用いた場合には、対照実験である富栄養液体培養条件ではシグナルが検出されず、蒸米を用いた場合の１５時間後および２日後では、いずれもシグナルが検出された。一方、３８４７由来のプローブを用いた場合には、１５時間後は強いシグナルが検出されたが、２日後にはほぼ完全に消失した。（図１）。
発酵開始後１５時間後は、分生子からの発芽が旺盛に進んでいる時期であり、２日後は、発芽が終了して菌糸が活発に成長し、固体状態での発酵が進む時期である。本発明により、遺伝子レベルで麹菌の正確な増殖状態を決定することが可能であった。
〔実施例３〕麹菌の生育状態の測定
蒸した大豆に麹菌の菌糸を着生させた後、水分含量約３０％とし、室温で発酵させた。発酵開始から１日後、３日後および５日後に発酵混合物を一部回収し、濾過残さから細胞壁溶解酵素とフェノール抽出を組合わせた方法でＲＮＡを抽出した。このＲＮＡをホルムアルデヒドを含むアガロースゲル電気泳動を行い、ニトロセルロース膜上に転写した。この膜を定法通りブロッキングした後、本発明による貧栄養培養条件から得られたＥＳＴ塩基配列９８８（配列番号９８８）を有するＤＩＧ標識プローブをハイブリダイズさせた。
この結果、培養開始から１日後、３日後および５日後にかけてシグナル強度が増大し、特に５日後にシグナル強度が大きく増大した（図２）。一方、対照としてのヒストン遺伝子のシグナル強度はほぼ一定であった。今回の発行条件では、３日〜４日後にかけて炭水化物由来の炭素源が消費されて減少し、これにともなってプロテアーゼが活発に生産されることが経験的に知られている。従って、本発明を用いることによって、これまで経験的に求められてきたプロテアーゼの発現状態を、遺伝子的に求めることが可能である。
本明細書は、本願優先権の基礎となる特願２００１−９８３７１の出願内容を包含するものである。また、本明細書に引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参照により本明細書に組み入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明により、麹菌遺伝子発現の検出方法、及び麹菌発酵条件の特異的測定用ＤＮＡが提供される。従来の方法では発酵産物の色、香り、ｐＨ、水分含量などの２次的な要素で測定していたが、本発明の方法により、麹菌の実際の生育状態（発酵状態）を直接的かつ定量的に測定することができる点で有用である。また、本発明は、麹菌での発酵生産において発現するほぼ全ての遺伝子を網羅しており、標的とする遺伝子と似た配列を有する他の遺伝子の存在があらかじめ予測できるばかりでなく、標的以外の遺伝子には存在しない塩基配列を有するプローブあるいはプライマーを用いることによって、標的遺伝子と似た配列を有する他の遺伝子が大量に発現していた場合であっても、標的遺伝子の発現量を正確に測定することができる点で有用である。
配列表フリーテキスト
配列番号６００７：合成ＤＮＡ
配列番号６００８：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
図１は蒸米の発酵における麹菌の生育状態のモニターを示す写真である。
図２は大豆の固体発酵における麹菌体栄養状態のモニターを示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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