(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子を有効成分とする、血流の再灌流障害、腎移植時の虚血再灌流障害及び臓器移植時の臓器障害から選ばれる疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
肝実質細胞増殖因子の虚血再酸素化時の細胞傷害抑制作用に基づく予防及び／または治療であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項３】
肝実質細胞増殖因子を虚血再酸素化時に細胞傷害を抑制するために投与することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項４】
肝実質細胞増殖因子がｃＤＮＡを用いた組換え肝実質細胞増殖因子である請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項５】
組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号１に示されるアミノ酸配列で表される肝実質細胞増殖因子である請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項６】
組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミン酸から７２８番目のセリンまでの配列で表される肝実質細胞増殖因子である請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の予防及び／又は治療剤。
【請求項７】
組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表される肝実質細胞増殖因子である請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は虚血性疾患の予防・治療剤に関し、更に詳しくは肝実質細胞増殖因子（以下、「ＨＧＦ」と略すことがある）を有効成分とする虚血性疾患の予防及び／又は治療剤に関する。
背景技術
急性腎不全とは、腎機能が突然低下し、血中尿素窒素（ＢＵＮ）及び血清クレアチニンが著しく上昇するような状態を指す。この急性腎不全は、しばしば虚血により引き起こされることが知られている。このような急性腎不全の治療においては、原因を除去して腎虚血を回復させるとともに、虚血後の再灌流に伴う組織障害を防止することが、その後の腎機能の回復を左右するものと考えられる。その他、虚血性心疾患や虚血性脳血管障害等の、腎臓以外の虚血性疾患の治療においても、血流の再開とともに、再灌流障害を防止することの重要性が指摘されている。また、停止又は低下した臓器機能を回復させる手段として、臓器移植が施行されているが、その際、移植臓器をいかにして虚血障害から保護するかという問題が、重要な課題とされている。
一方ＨＧＦは、初代培養肝実質細胞の増殖を促進させうるヒト由来の蛋白性因子として、劇症肝炎患者血漿より見い出された（特開昭63-22526号公報。以下、ヒト肝実質細胞増殖因子を「ｈＨＧＦ」と略すことがある）。その後、ｈＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）（特開平3-72883号公報）、さらにこのｃＤＮＡを用いた組換えｈＨＧＦ蛋白質（以下、「ｒｈＨＧＦ」と略すことがある）の生産方法および形質転換体（特開平3-285693号公報）が報告されている。ｒｈＨＧＦ蛋白質は、生体外（J. Clin. Invest., 87, 1853-1857(1991)）、及び生体内（Jpn. J. Pharmacol., 59(suppl.1), 137(1992)）において肝実質細胞の増殖及び機能を促進する働きが認められている。さらに、ＨＧＦの標的細胞、組織が広く検索され、肝細胞以外の種々の上皮細胞（尿細管上皮、肺上皮、胆管上皮、胃上皮）や線維芽細胞、リンパ球系細胞がＨＧＦに反応してその増殖や運動性を変化させることが判明している（Mitsubishi Kasei R&D Review, 7, 16-24(1993)）。また、これらＨＧＦ標的細胞上のレセプター分子として、癌原遺伝子ｃ−ｍｅｔ産物が機能していることが明らかとなっている（Science, 251, 802-804(1991)）。
ところで特開平4-49246号公報には、ＨＧＦがヒトを含むほ乳動物の腎疾患に対して有用であることが報告されている。同公報の目的は、「腎臓細胞の増殖を亢進し慢性腎炎における腎再生を促進し、さらに腎不全を改善し得る治療剤、および腎臓の代謝性肥大を促進する治療剤、薬物による腎障害を予防する予防剤、培養腎細胞増殖を促進する薬剤、および腎臓機能を診断する診断薬を提供すること」（同公報、第３頁左下欄、第１行〜第６行）にあるが、具体的に開示されているのはＨＧＦの近位尿細管細胞に対する増殖促進活性のみである。すなわち同公報においては、腎の細胞増殖作用に基づく薬効を推定して示しているに過ぎず、虚血性の腎疾患に対するＨＧＦの効果については一切触れられていない。
本発明者らは、ＨＧＦの腎細胞障害に対するＨＧＦの直接の作用につき探索、検討を進めてきた結果、ＨＧＦは虚血障害モデルで細胞の障害を抑制する作用を有することを初めて見い出し、本発明を完成するに至った。
発明の開示
すなわち本発明の要旨は、ＨＧＦを有効成分とする虚血性疾患の予防及び／又は治療剤に存する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明の虚血性疾患の予防及び／又は治療剤は、ＨＧＦを有効成分とする。かかるＨＧＦとしては、ＨＧＦを含有することが知られているヒトやラット等のほ乳動物由来の体液や組織、または自発的にＨＧＦを産生する細胞から単離・生成された天然のＨＧＦを用いてもよいし、遺伝子組換え法により該ＨＧＦのｃＤＮＡを細胞に導入して得られる組換えＨＧＦを用いてもよい。本発明の虚血性疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分としては、ｈＨＧＦを用いることが好ましい。
組換えＨＧＦを産生させる宿主としては、特に限定はされないが、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。具体例としては、上記ほ乳動物由来の胎盤、肝障害患者肝組織及び血液、MRC-5細胞、IMR-9細胞などの線維芽細胞株、あるいは特開平3-285693号公報に記載された方法に従いｈＨＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをＣＨＯ細胞等の宿主に導入した産生株などから得られるものが挙げられる。また、上記の天然又は組換えＨＧＦ自体の他、その前駆体蛋白質や、肝実質細胞を増殖させる活性を損なわない範囲において天然ＨＧＦの一部のアミノ酸を置換、欠失、挿入、修飾するなどの改変を行った非天然型ＨＧＦを用いてもよい。かかる非天然型ＨＧＦとしては、特開平2-288899号公報、WO90/10651号公報、特開平3-130091号公報、同3-255096号公報、同4-30000号公報、Nature, 342, 440-443(1989)等に記載のものが挙げられる。
本発明においては、ＨＧＦが、特開昭63-22526号公報及び米国特許第5,004,805号公報に記載されている以下の理化学的性質を有する蛋白性因子であることが好ましい。
１）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；非還元条件下）による推定分子量が約７６，０００〜９２，０００ダルトンである
２）肝実質細胞を増殖させる活性を有する
３）８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活する
４）トリプシンによる消化処理又はキモトリプシンによる消化処理により上記活性が失活する
５）ヘパリンに対して強い親和性を有する
かかるＨＧＦはヒト由来のものであることが好ましく、特に好ましいものは特開平3-72883号公報、特開平4-89499号公報及びヨーロッパ公開特許第0412557号公報に記載されている、後記配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列で表わされるもの、配列番号１のアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミン酸から７２８番目のセリンまでの配列で表されるもの、配列番号１のアミノ酸配列のうち３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表されるものを挙げることができる。
本発明の虚血性疾患の予防及び／又は治療剤は、前記ＨＧＦの１種または２種以上を単独もしくは適当な希釈剤や他の添加剤と共に製剤形態（剤型）に調合され、使用される。剤型としては、一般に非経口的投与に適する剤型であれば特に限定はされないが、好ましくは、注射用アンプル剤や注射用凍結乾燥粉末剤（バイアル）が使用される。各種剤型への調製は、本技術分野で慣用される通常の手法を用いて行われる。製剤化に使用される製剤担体としては、各種剤型への調製に慣用される希釈剤や添加剤などが用いられる。例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、精製された前記ＨＧＦの有効量を、例えば、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてカルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなどの賦形剤、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミンなどの安定化剤、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノールなどの保存剤、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、塩酸、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムなどのｐＨ調節剤などを加え、常法に従い凍結乾燥することにより調製される。また、注射用アンプル剤は、前記ＨＧＦの有効量を、例えば、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウム、マンニトールなどの溶解補助剤、クエン酸ナトリウム、グリセリンなどの緩衝剤、ブドウ糖、添加糖などの等張化剤、上記安定化剤、上記保存剤、上記無痛化剤、上記ｐＨ調節剤などの添加剤を加え、これを通常の加熱滅菌、無菌濾過などにより無菌化して調製される。なお、有効成分の種類によっては、加熱滅菌、無菌濾過などにより失活する場合があるので、滅菌方法は適宜選択するのが良い。また、上記安定化剤、保存剤、無痛剤及びｐＨ調節剤等の配合量は、各種剤型に応じて適宜決定される。
本発明の虚血性疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分であるＨＧＦは、虚血障害モデルで細胞の障害を抑制する作用を有するので、本発明の虚血性疾患の予防及び／又は治療剤は、血流の再灌流障害、腎移植時の虚血再灌流障害、急性腎不全、虚血性心疾患、虚血性脳血管障害等の虚血性疾患に対する予防及び／又は治療に有効である。また、腎臓、肝臓、心臓、血管等の臓器移植手術における移植臓器の保護剤、即ち、臓器移植時の臓器障害等の虚血性疾患に対する予防及び／又は治療に有効である。
本発明の虚血性疾患の予防及び／又は治療剤には、本発明と同様な薬理作用あるいは他の薬理作用を有する他の医薬の有効成分を配合してもよい。
また本発明の虚血性疾患の予防及び／又は治療剤は、特開平5-301824号公報およびヨーロッパ特許第0517182号公報に記載のように、ＨＧＦをヘパリン、デキストラン硫酸等の硫酸化多糖類もしくはその誘導体と併用することにより、その活性を増強することができ、また安定化することができる。
本発明の虚血性疾患の予防及び／又は治療剤は、これを必要とする患者に対して非経口的に、一般には皮下、筋肉または静脈内注射により、その所定量を単回、もしくは複数回に分けて投与するか、または点滴などにより連続的に投与する。かかる投与量は、患者の年齢、性別、症状、体重等により適宜調整されるが、有効ＨＧＦ量として成人１日当たり１μg/kg〜10mg/kg、より好ましくは10〜1000μg/kgの範囲で投与される。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なおＨＧＦは、特開平3-285693号公報に記載されているBD-24株等を用いて製造されたｒｈＨＧＦを使用した。
実施例１
虚血性急性腎不全で強く障害を受けることが知られており、近位尿細管様の性質を有するブタ腎由来培養上皮細胞株ＬＬＣ−ＰＫ1（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）に牛胎児血清およびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）をそれぞれ５％、１０ｍＭになるように添加した培地で、ＣＯ2インキュベーターを用いて、細胞がコンフルエンスに達するまで培養した。
培地をグルコースおよび血清を含まないＤＭＥＭに交換した後、Ｇａｓ  Ｐａｋ  ＰｏｕｃｈTM（ＢＢＬ社製）を用い、酸素濃度を実験開始後２時間以内に２％未満に低下させた。コンフルエンス後の細胞を、この低酸素下で６時間培養した後、通常の酸素を含有する条件下（９５％  ａｉｒ，５％  ＣＯ2）（再酸素化）で１時間培養した。
細胞障害は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の培地中への漏出量を指標とした（腎とフリーラジカル、第２集、１３９〜１４１頁、東京医学社、１９９４年１２月）。
ＨＧＦは、５０または１００ｎｇ／ｍｌを低酸素化処理の直前、あるいは再酸素化する直前に培地中へ添加した。ＨＧＦ無添加時においては、低酸素化または再酸素化により、培地中へのＬＤＨ遊離量の増大が認められた。ＨＧＦを添加した場合のＬＤＨ遊離量に及ぼす作用について上記条件により測定した。その測定結果を表１に示す。結果はＨＧＦ無添加時の遊離ＬＤＨ量を１００％としたときの相対量として示した。
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上記の通り、低酸素化する直前または再酸素化する直前にＨＧＦを培地中に添加することにより、ＬＤＨ遊離量は顕著に抑制された。
上記のように、コンフルエンスに達した細胞において、ＨＧＦ添加後少なくとも１時間で効果を発現したことから、ＨＧＦはＬＬＣ−ＰＫ1細胞に対して、細胞増殖促進作用以外の細胞障害抑制作用を有することが明らかである。
産業上の利用可能性
本発明の予防及び／又は治療剤は、虚血障害モデルで細胞の障害を抑制する作用を有するので、虚血性疾患の予防及び／又は治療剤として有効である。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：７２８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名：ヒト
配列
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