(57)【要約】本発明は、Ｇ−ＣＳＦ誘導抗体の認識する抗原をコードする遺伝子として、（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ｂ）配列表の配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質：をコードする遺伝子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質：
をコードする遺伝子。
【請求項２】
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）配列表の配列番号１において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイズリダイズし、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
を有する遺伝子。
【請求項３】
（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号４において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または
（ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質：
をコードする遺伝子。
【請求項４】
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列；
（ｂ）配列表の配列番号３において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイズリダイズし、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
を有する遺伝子。
【請求項５】
顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体が寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−６１０３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項１から４の何れかに記載の遺伝子。
【請求項６】
マウスまたはヒト由来の遺伝子である、請求項１から５の何れかに記載の遺伝子。
【請求項７】
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において第５１９番目から第７３６番目の塩基配列、第６６６番目から第６８９番目の塩基配列、第３８１番目から第４０３番目の塩基配列または第７０９番目から第７２７番目の塩基配列；
（２）上記（１）に記載した塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列；あるいは
（３）上記（１）に記載した塩基配列の何れかと少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列：
の何れかを含むＤＮＡ断片。
【請求項８】
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において第５１９番目から第７３６番目の塩基配列、第６６６番目から第６８９番目の塩基配列、第３８１番目から第４０３番目の塩基配列または第７０９番目から第７２７番目の塩基配列；
（２）上記（１）に記載した塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列；あるいは
（３）上記（１）に記載した塩基配列の何れかと少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列：
の何れかを含み、顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
下記の何れかのタンパク質：
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質。
【請求項１０】
下記の何れかのタンパク質：
（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号４において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；
（ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または
（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質。
【請求項１１】
顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体が寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−６１０３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項９または１０記載のタンパク質。
【請求項１２】
マウスまたはヒトを含む哺乳動物由来のタンパク質である、請求項９から１１の何れかに記載のタンパク質。
【請求項１３】
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、第１番目から第９１番目のアミノ酸配列、第５０番目から第１４６番目のアミノ酸配列、第１番目から第７８番目のアミノ酸配列、第２００番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１７２番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１０３番目から第１５０番目のアミノ酸配列、第１６９番目から第２４１番目のアミノ酸配列；
（２）上記（１）に記載したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列；あるいは
（３）上記（１）に記載したアミノ酸配列の何れかと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列：
の何れかを含むタンパク質。
【請求項１４】
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、第１番目から第９１番目のアミノ酸配列、第５０番目から第１４６番目のアミノ酸配列、第１番目から第７８番目のアミノ酸配列、第２００番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１７２番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１０３番目から第１５０番目のアミノ酸配列、第１６９番目から第２４１番目のアミノ酸配列；
（２）上記（１）に記載したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列；あるいは
（３）上記（１）に記載したアミノ酸配列の何れかと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列：
の何れかを含み、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質。
【請求項１５】
請求項９から１４の何れかに記載のタンパク質に対する抗体またはそのフラグメント。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１７】
ヒト型モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体である、請求項１６記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１８】
請求項１から８の何れかに記載の遺伝子またはＤＮＡ断片を含有する組み換えベクター。
【請求項１９】
請求項１から８の何れかに記載の遺伝子またはＤＮＡ断片を含有する組み換えベクターを含む形質転換体。
【請求項２０】
寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む顆粒球コロニー刺激因子の産生を誘導することができる物質の受容体であって、請求項９から１２の何れかに記載のタンパク質を有し、かつマクロファージを含む顆粒球コロニー刺激因子を産生することのできる細胞に存在する前記受容体。
【請求項２１】
（ａ）物質を、請求項９から１２の何れかに記載のタンパク質または請求項２０記載の受容体を有する細胞に接触させる工程；および
（ｂ）前記物質の、前記タンパク質または受容体を介した効果を測定する工程
を含む、物質のスクリーニング方法。
【請求項２２】
（ａ）物質と請求項９から１２の何れかに記載のタンパク質若しくは請求項２０記載の受容体との結合性を測定すること；
（ｂ）物質の前記タンパク質若しくは受容体を介した効果を測定すること；
（ｃ）物質の構造とタンパク質若しくは受容体の構造とを比較すること；または
（ｄ）前記タンパク質若しくは受容体の構造情報をもとに化合物をデザインし、該化合物および／若しくはその類似体を１種以上合成し、そして該合成された化合物および／若しくはその類似体の中から物質を選択すること；
を含む、物質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
以下の何れかの物質を得るための、請求項２１または２２記載のスクリーニング方法：
（ａ）請求項２０記載の受容体と結合性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子の産生を誘導することができる物質；
（ｂ）請求項２０記載の受容体と結合性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子の産生を誘導しない物質；または
（ｃ）請求項２０記載の受容体と結合性を有し、かつ受容体自身がもつ顆粒球コロニー刺激因子の産生活性を阻害する物質。
【請求項２４】
請求項２１または２２記載のスクリーニング方法により得られた、顆粒球コロニー刺激因子の産生を変化させることができる物質。
【請求項２５】
以下の何れかである、請求項２４記載の物質：
（ａ）請求項２０記載の受容体と結合性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子の産生を誘導することができる物質；
（ｂ）請求項２０記載の受容体と結合性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子の産生を誘導しない物質；または
（ｃ）請求項２０記載の受容体と結合性を有し、かつ受容体自身がもつ顆粒球コロニー刺激因子の産生活性を阻害する物質。
【請求項２６】
請求項１から８の何れかに記載の遺伝子若しくはＤＮＡ断片、請求項９から１４の何れかに記載のタンパク質、請求項１５から１７の何れかに記載の抗体若しくはそのフラグメント、請求項２０に記載の受容体、または請求項２２若しくは２３記載の物質を含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項９から１２の何れかに記載のタンパク質または請求項２０記載の受容体との結合性を有する物質を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項２８】
感染症または好中球減少症を含む顆粒球コロニー刺激因子の関連する疾患または状態の、診断、予防または治療のための、請求項２６または２７記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体と反応性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、およびそれらの利用法に関する。
背景技術
顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）は、分子量は約１８０００から２２０００で、ヒトの場合１７４個（まれに１７８個）、マウスで１７８個のアミノ酸で構成されている、血液成分の白血球の一種である好中球の分化増殖を誘導する糖タンパク質である。
Ｇ−ＣＳＦは、成熟好中球の生存の延長や機能の亢進作用を有するが、エリスロポエチンによる赤芽球、インターロイキン３による芽球コロニーの形成も増強する。また、Ｇ−ＣＳＦは、白血球、赤血球、血小板等の血球増多（増強、増加）作用を示す。このようなＧ−ＣＳＦを産生する細胞としては、マクロファージ、ストローマ細胞、単球、Ｔリンパ球、繊維芽細胞、血管内皮細胞などが挙げられる。
Ｇ−ＣＳＦを薬剤として投与することは、抗ガン剤の副作用としての好中球減少症や骨髄移植後の好中球減少症の治療及び再生不良性貧血の治療に効果を示す。しかし、投与時においては、血中安定性が低いために頻回投与を必要とし、しかも投与は静脈投与あるいは皮下投与に限られているために患者、医師の双方に苦痛と負担を強いられてきた。さらに、Ｇ−ＣＳＦを薬剤として投与すると、副作用として骨痛を起こすことが報告されている。また、Ｇ−ＣＳＦを産生する細胞としてのマクロファージやストローマ細胞を直接投与することは、細胞であるために種々のタンパク質や様々な物質を含んでいるために思わぬ副作用を起こす可能性があるため、そのような治療は行われていない。
上記の如く、Ｇ−ＣＳＦ自体を投与することによって好中球を分化増殖させる方法では、副作用として骨痛を惹起することばかりでなく、頻回投与が必要であり、患者及び医師にも苦痛と負担を強いられてきたため、他の治療方法の開発が強く要望されているが、未だ確立されていない。
そこで、本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦ自体を投与するのではなく、Ｇ−ＣＳＦを産生させ、好中球を分化増殖させることを意図し、以前に、Ｇ−ＣＳＦ誘導抗体を提供することに成功している（出願番号特願平９−２６６５９１（平成９年（１９９７）９月３０日）、公開番号特開平１１−１０６４００（平成１１年（１９９９）４月２０日））。しかしながら、Ｇ−ＣＳＦ誘導抗体が認識する抗原については今だ解明されていなかった。
発明の概要
本発明は、Ｇ−ＣＳＦを誘導・分泌する抗体の認識する抗原をコードする遺伝子として、（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ｂ）配列表の配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質：をコードする遺伝子を提供する。
発明の開示
本発明が解決しようとする課題の一つは、Ｇ−ＣＳＦ誘導抗体の認識する抗原を特定することである。本発明が解決しようとする別の課題は、Ｇ−ＣＳＦ誘導抗体の認識する抗原をコードする遺伝子をクローニングし、同定することである。
また、本発明は、そのような抗原タンパク質を詳細に解析し、該タンパク質がＧ−ＣＳＦ遺伝子発現誘導ならびにＧ−ＣＳＦ分泌に関与してることを明確にすることも課題とする。さらに、Ｇ−ＣＳＦ産生を変化させる化合物をスクリーニングするための、該タンパク質を利用した一連の手順を提供することも課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、Ｇ−ＣＳＦ誘導能を持つモノクローナル抗体をプローブとして使用し、マクロファージ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをイムノスクリーニングした結果、陽性クローンの単離に成功し、さらにその塩基配列を決定することにより本発明を提供するに至った。さらに、本発明者らは、ヒト型の抗原遺伝子の塩基配列を決定した。
すなわち、本発明によれば、（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ｂ）配列表の配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質：をコードする遺伝子が提供される。
また、本発明によれば、（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ｂ）配列表の配列番号４において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または（ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質：をコードする遺伝子が提供される。
さらに、本発明によれば（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列；（ｂ）配列表の配列番号１において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイズリダイズし、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする塩基配列；を有する遺伝子が提供される。
また、本発明によれば（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列；（ｂ）配列表の配列番号３において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする塩基配列；または（ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイズリダイズし、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする塩基配列；を有する遺伝子が提供される。
上記において、顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体は、例えば、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である。
本発明の遺伝子は例えば、マウスまたはヒト由来の遺伝子である。
さらに本発明によれば、（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において第５１９番目から第７３６番目の塩基配列、第６６６番目から第６８９番目の塩基配列、第３８１番目から第４０３番目の塩基配列または第７０９番目から第７２７番目の塩基配列；（２）上記（１）に記載した塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列；あるいは（３）上記（１）に記載した塩基配列の何れかと少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列：の何れかを含むＤＮＡ断片が提供される。
さらに本発明によれば、（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において第５１９番目から第７３６番目の塩基配列、第６６６番目から第６８９番目の塩基配列、第３８１番目から第４０３番目の塩基配列または第７０９番目から第７２７番目の塩基配列；（２）上記（１）に記載した塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列；あるいは（３）上記（１）に記載した塩基配列の何れかと少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列：の何れかを含み、顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質をコードする遺伝子が提供される。
さらに本発明によれば、下記の何れかのタンパク質：（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ｂ）配列表の配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質：が提供される。
また、本発明によれば、下記の何れかのタンパク質：（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ｂ）配列表の配列番号４において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；（ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；または（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質：が提供される。
上記において、顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体は、例えば、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である。
本発明のタンパク質は好ましくは哺乳動物、特に好ましくは、マウスまたはヒト由来のタンパク質である。
さらに本発明によれば、（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、第１番目から第９１番目のアミノ酸配列、第５０番目から第１４６番目のアミノ酸配列、第１番目から第７８番目のアミノ酸配列、第２００番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１７２番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１０３番目から第１５０番目のアミノ酸配列、第１６９番目から第２４１番目のアミノ酸配列；（２）上記（１）に記載したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列；あるいは（３）上記（１）に記載したアミノ酸配列の何れかと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列：の何れかを含むタンパク質が提供される。
さらに本発明によれば、（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、第１番目から第９１番目のアミノ酸配列、第５０番目から第１４６番目のアミノ酸配列、第１番目から第７８番目のアミノ酸配列、第２００番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１７２番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１０３番目から第１５０番目のアミノ酸配列、第１６９番目から第２４１番目のアミノ酸配列；（２）上記（１）に記載したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列；あるいは（３）上記（１）に記載したアミノ酸配列の何れかと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列：の何れかを含み、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質が提供される。
さらに本発明によれば、上記した本発明のタンパク質に対する抗体またはそのフラグメントが提供される。抗体は好ましくはモノクローナル抗体であり、特に好ましくはヒト型モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体である。
さらに本発明によれば、本発明の遺伝子またはＤＮＡ断片を含有する組み換えベクターが提供される。
さらに本発明によれば、本発明の遺伝子またはＤＮＡ断片を含有する組み換えベクターを含む形質転換体が提供される。
さらに本発明により、顆粒球コロニー刺激因子を誘導・分泌させることができる新規の受容体またはその一部（本発明のタンパク質）が提供される。
さらに本発明によれば、本発明のタンパク質を利用した有用な物質（例えば、当該タンパク質に対するアゴニスト、アンタゴニスト）のスクリーニング方法およびそのスクリーニング方法により得られた物質、ならびに受容体に結合することのできる有用な物質（例えば、当該受容体に対するアゴニスト、アンタゴニスト）が提供される。
さらに本発明によれば、本発明の遺伝子、ＤＮＡ断片、タンパク質（タンパク質の断片を含む）、抗体（そのフラグメントを含む）、受容体、物質（低分子化合物を含む）を含む医薬組成物（特には、感染症、好中球減少症または赤血球、白血球若しくは血小板等の血球減少症の診断、予防または治療のための医薬組成物）、それらを用いた治療方法が提供される。
以下において、本発明の実施態様および実施方法について詳細に説明する。
本発明に先だち、本発明者らは、マクロファージ自体を免疫して抗体を取得し、得られた抗体の中からＧ−ＣＳＦを誘導する抗体の単離に成功している（特願平９−２６６５９１；この明細書に記載の内容は全て引用により本明細書中に取り込まれるものとする）。本発明の遺伝子は、この抗体をプローブとして用いてマウスマクロファージ由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離されたものであり、本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有することを特徴とする。
＜顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメント＞
先ず、本明細書で言う「顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメント」（本明細書中以下において、「本発明で用いる抗体」とも称する）について、その入手方法などについて説明する。
本発明者らは、まず、マウスマクロファージ細胞株を免疫原としてＭＲＬ／ｌｐｒマウス（自己免疫疾患マウス）に投与し、モノクローナル抗体の単離を行った。次いで、得られたモノクローナル抗体を、免疫原細胞であるマウスマクロファージ細胞株に作用させ、該抗体の免疫原細胞に与える影響を検討した結果、得られた抗体の一つが免疫原細胞株であるマウスマクロファージ細胞株から濃度依存的にＧ−ＣＳＦを誘導させる特性を有することを見い出した（この抗体を産生するハイブリドーマは国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０３として寄託されている）。
本明細書中で「モノクローナル抗体」とは、マクロファージ細胞株に反応性を有するモノクローナル抗体であり、具体的には、Ｇ−ＣＳＦを産生させる作用を有するモノクローナル抗体である。
本発明で用いる抗体は、マクロファージ細胞株に実質的に結合するという特性を有する。本発明で用いる抗体には、上記性質を有するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を共に包含する。また、「モノクローナル抗体」には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなるいずれのイムノグロブリンクラスに属するモノクローナル抗体をも包含し、好適には、ＩｇＧまたはＩｇＭイムノグロブリンクラスモノクローナル抗体である。
なお、マクロファージ細胞株は、例えば、自然発生の白血病細胞から調製したり、白血病ウイルスによる形質転換から調製することが可能である。
本発明で用いる抗体は常法（例えば、文献「続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、日本生化学会編：東京化学同人発行、等」に記載の方法）に従って取得することができる。
本発明で用いるモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリドーマ（融合細胞）から製造することができる。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハイブリドーマを形成し、当該ハイブリドーマをクローン化し、マクロファージ細胞株の全部または一部を抗原として、それに対して特異的親和性を示す抗体を生産するクローンを選択することによって製造される。その操作は免疫抗原としてマクロファージ細胞株の全部または一部を使用する以外は、従来既知の手段を用いることができる。
免疫抗原は、例えばマクロファージ細胞株そのものを用いるか、マクロファージ細胞株の膜画分若くは溶解抽出液の全部または一部を、必要に応じて、例えば完全フロインドアジュバンドなどと混和して調製される。免疫の対象として用いられる動物しては、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスが例示される。免疫は、これらの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フットパッド内、または腹腔内に１乃至数回注射することにより行われる。
通常、初回免疫から約１〜２週間毎に１〜４度免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行って、最終免疫より約３〜５日後に免疫感作された動物から抗体産生細胞が採取される。
本発明で用いるモノクローナル抗体には、「国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０３」のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（３−４Ｈ７抗体）若しくはそのフラグメントまたは該抗体と実質的に同一の性状を有する抗体が含まれる。「３−４Ｈ７抗体」は、細胞からのＧ−ＣＳＦ産生能を有する。
本発明で用いるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法で調製することが可能である。公知の方法としては、例えば、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製には、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２５６，ｐｐ．４９５−４９７，１９７５）及びそれに準じる修飾方法が挙げられる。すなわち、モノクローナル抗体は、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくは同種のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトの骨髄腫系細胞（ミエローマ）との融合により得られる融合細胞（ハイブリドーマ）を培養することにより調製される。培養は、インビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスター若しくはウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行うことができ、抗体はそれぞれ該培養上清、または哺乳動物の腹水から取得することができる。
細胞融合に用いられる骨髄腫系細胞としては、例えばマウス由来ミエローマ「Ｐ３／Ｘ６３−ＡＧ８」、「Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１」、「Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１」、「ＳＰ２／０−Ａｇ１４」、「ＰＡＩ」、「ＦＯ」または「ＢＷ５１４７」、ラット由来ミエローマ「２１０ＲＣＹ３−Ａｇ１．２．３」、ヒト由来ミエローマ「Ｕ−２６６ＡＲ１」、「ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２」、「ＵＣ７２９−６」、「ＣＥＭ−ＡＧＲ」、「Ｄ１Ｒ１１」又は「ＣＥＭ−Ｔ１５」などを挙げることができる。
本発明で用いるモノクローナル抗体を産生する融合細胞クローンのスクリーニングは、融合細胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の抗原に対する反応性を、例えば、フローサイトメトリー、ＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素抗体法によって測定することにより行うことができる。
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地などの低カルシウム培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地、ＲＤ培地などの高カルシウム培地などが挙げられる。該基本培地には、目的に応じて、例えば、血清、ホルモンサイトカインおよび／または各種の無機または有機物質などを含有させることができる。モノクローナル抗体の単離、精製は上述の培養上清または腹水を硫酸アンモニウム沈殿法、ユーグロブリン沈殿法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２など）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡ若くはプロテインＧカラム等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付すること、疎水クロマトグラフィーに付することなどにより行うことができる。
本発明で用いるモノクローナル抗体は、上述の製造方法に限定されることなく、いかなる方法で得られたものであってもよい。また、通常「モノクローナル抗体」は、免疫感作を施す哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる構造の糖鎖を有するが、本発明で用いる「モノクローナル抗体」は該糖鎖の構造差異により限定されるものではなく、あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル抗体をも包含するものである。ファージディスプレイでつくられるモノクローナル抗体、さらに、例えばヒトイムノグロブリン遺伝子を組み込むことにより、ヒト型抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたトランスジェニックマウスを用いて得られるヒト型モノクローナル抗体、あるいは、遺伝子組換え技術により、ある哺乳動物由来のモノクローナル抗体の定常領域（Ｆｃ領域）をヒトモノクローナル抗体のＦｃ領域と組み換えたキメラモノクローナル抗体、さらには抗原と相補的に直接結合し得る相補性決定部位（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｓｉｄｕｅ）以外、全領域をヒトモノクローナル抗体の対応領域と組換えたヒト化モノクローナル抗体も本発明で用いる「モノクローナル抗体」に包含される。
また、本発明においては「抗体のフラグメント」を使用してもよく、ここで言う、「抗体のフラグメント」とは、少なくとも一つの可変領域を含有する抗体フラグメントの意であり、特願平９−２６６５９１にいう「抗体の一部」と同義である。具体的にはＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’あるいはＦａｂを指す。ここで、「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）をタンパク質分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶＬ（Ｌ鎖可変領域）とＣＬ（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶＨ（Ｈ鎖可変領域）とＣＨγ１（Ｈ鎖定常領域中のγ１領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントをそれぞれＦａｂ’という。また、ＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）２という。
本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質は、上記詳述したような顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有することを特徴とする。本明細書中で言う「結合性」とは、タンパク質と抗体との間の通常の結合性を意味し、慣用的な免疫学的分析法（例えば、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法など）を用いて測定できる。
＜本発明の遺伝子＞
本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそれと相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。本発明はまた、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはそれと相同性を有する塩基配列を有する遺伝子を提供する。
本発明の遺伝子の種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、化学合成ＤＮＡの何れでもよく、またゲノミックＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの何れでもよい。
本発明の遺伝子は典型的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するが、これは本発明の一例を示すにすぎない下記の実施例で得られたクローン（ＭＭＲ１９）の塩基配列である。天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子のみに限定されるわけではなく、本明細書に記載した特徴を有するタンパク質をコードする全ての遺伝子を包含する。
本明細書で塩基配列について「１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入」というときは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に生じうる程度の数の塩基が置換等されていることを意味する。数個は、例えば１０個以下、好ましくは３〜５個以下である。
特に、本明細書により本発明のタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや、ＰＣＲという遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、そのような遺伝子も本発明の範囲に含まれる。
相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーションの条件は特に限定されず、目的の相同遺伝子とプローブとの相同性の度合いなどにより当業者ならば適宜選択することができるが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、６×ＳＳＣ［０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液［１０００ｍＬ中に１ｇフィコール、１ｇポリビニルピロリドン、１ｇＢＳＡ］、０．５％ＳＤＳ、２５℃〜６８℃（例えば３７℃、４２℃または６８℃）；あるいは０〜５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、２５〜６８℃（例えば３７℃、４２℃または６８℃）などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。ホルムアミド濃度、デンハルト溶液濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子は全て本発明の範囲の中に含まれる。
上記のようなハイブリダイゼーションを使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。
＜本発明のタンパク質＞
本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそれと相同性を有するタンパク質を提供する。
本発明の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、それをコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、それを適当な宿主に形質転換して組み換えタンパク質を発現させることによって得ることができる。しかしながら、本発明のタンパク質は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されず、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
本発明のタンパク質は典型的には、配列表の配列番号１に記載の２４１個のアミノ酸配列を有する。しかし、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、ここで言う「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。本発明のタンパク質は、クローニングされた遺伝子の塩基配列からの推測に基づいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、疎水性アミノ酸同士の置換、親水性アミノ酸同士の置換、酸性アミノ酸同士の置換または塩基性アミノ酸同士の置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
本明細書でアミノ酸配列について「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入」というときは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に生じうる程度の数のアミノ酸が置換等されていることを意味する。数個は、例えば１０個以下、好ましくは３〜５個以下である。また本明細書でアミノ酸配列について「相同」というときは、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いている。このとき、ギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：７２６−７３０（１９８３）等）。相同性の計算には、市販のソフトであるＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｓｒｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８３：６３−６９（１９９０））、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ（ソフトウエア開発社製）等を用いることができる。
本明細書の以下の実施例では本発明の一例を示すものとして、マウスマクロファージ由来のｃＤＮＡのクローニングが示されている。本明細書中に開示されたタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の配列（マウス由来）またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどの遺伝子工学的手法を用いて、他の起源などから同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離することは当業者の通常の知識の範囲内のことであり、そのようにして単離された遺伝子によりコードされるタンパク質も本発明の範囲に含まれる。
＜ヒト型の遺伝子およびタンパク質＞
例えば、本発明の遺伝子およびタンパク質に関してヒト由来のホモログを得るための方法の一例としては、以下の方法が挙げられる。
ヒトマクロファージ系細胞株（ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ＨＬ−６０）から、グアニジウムチオシアネート／フェノールクロロホルム・シングルステップ抽出法（ラボマニュアル遺伝子工学、第３版、第８３〜８４頁、１９９６）によって、全ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いて精製して、ポリＡ＋ＲＮＡを得る。逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴａｓｅ）とＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。この二本鎖ｃＤＮＡを用いて、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎｎの方法（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．及びＨｏｆｆｍａｎｎ，Ｂ．，Ｊ．：Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９，１９８３）によって、λＺＡＰＩＩファージベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築する。本明細書に開示したマウスｃＤＮＡ（ＭＭＲ１９クローン）の塩基配列（配列番号１）の中でヒトと高い相同性を有する領域（例えば、ヒトと９１％の相同性が認められた配列番号１中の１７２番目から２４１番目の領域）内の配列を増幅できるプライマーを用いてヒトマクロファージ細胞のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として増幅させたＤＮＡ配列をプローブとして、あるいはこの領域（例えば、配列番号１中の１７２番目から２４１番目の領域）を直接プローブとして用いて、ヒトマクロファージ細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって目的タンパク質の全長をコードするｃＤＮＡを単離する。Ｐｒｉｍｅｒ　Ｗａｌｋｉｎｇ法によって、ｃＤＮＡの塩基配列を解析する。目的タンパク質の全長をコードすることが確認されたｃＤＮＡをバキュロウイルスに導入し、タンパク質として発現させ、アフィニティカラムによりタンパク質を精製することによりヒト型ホモログタンパク質を得ることができる。
上記したように、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する遺伝子とタンパク質、ならびにこれらと相同性を有する遺伝子とタンパク質に関するものである。本発明により提供される配列番号１に記載の塩基配列および配列番号２に記載のアミノ酸配列と相同性を有する配列が、他の生物中にも存在するか否かを検索した結果、ヒトのＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）の中に本発明の遺伝子と相同性の高いものが存在することが確認された（以下の実施例３を参照）。従って、このような本発明の塩基配列と高い相同性を有するヒト由来のＥＳＴをプローブとして用いてヒト由来の遺伝子ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーなど）をスクリーニングすることによっても、ヒト由来のホモログ遺伝子を単離できることは明らかである。
上記した通り、本発明の配列番号１記載の塩基配列の一部分（即ち、ＤＮＡ断片）が、ヒトにおいても高い相同性を有して保存されていることがデータベース検索の結果、明らかとなった。このようなＤＮＡ断片は、上記したようにヒト由来のホモログ遺伝子をスクリーニングする際のプローブとして有用であり、本発明の一側面を形成する。そのようなＤＮＡ断片としては、配列表の配列番号１に記載の塩基配列において第５１９番目から第７３６番目の塩基配列、第６６６番目から第６８９番目の塩基配列、第３８１番目から第４０３番目の塩基配列または第７０９番目から第７２７番目の塩基配列の何れかを含むＤＮＡ断片が挙げられ、さらにこれらの何れかにおいて１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列；またはこれらの何れかと少なくとも８０％、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ断片も本発明の範囲内である。
また、本発明の配列番号２記載のアミノ酸配列の一部分が、ヒトにおいても高い相同性を有して保存されていることがデータベース検索の結果、明らかとなった。このような本発明のタンパク質の一部から成るタンパク質断片は、本発明のタンパク質と同様、Ｇ−ＣＳＦ誘導・分泌活性を有する抗体の分析または単離のための試薬として有用であり、また本発明のタンパク質と同様、医薬としても有用である可能性があり、本発明の一側面を形成する。
このようなタンパク質としては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、第１番目から第９１番目のアミノ酸配列、第５０番目から第１４６番目のアミノ酸配列、第１番目から第７８番目のアミノ酸配列、第２００番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１７２番目から第２４１番目のアミノ酸配列、第１０３番目から第１５０番目のアミノ酸配列、第１６９番目から第２４１番目のアミノ酸配列の何れかを含むタンパク質が挙げられ、さらにこれらの何れかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列；またはこれらの何れかと少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列の何れかを含むタンパク質も本発明の範囲内である。
本発明者らは、上述したものと類似の方法により、ヒト型の抗原遺伝子の塩基配列を決定した（以下の実施例５を参照）。従って、本発明は、配列表の配列番号３に記載の塩基配列またはそれと相同性を有する塩基配列を有する遺伝子を提供する。本発明はまた、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそれと相同性を有するタンパク質を提供する。ここで言う相同性の意味、即ち、本発明の範囲が、配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に限られないことは、本明細書「本発明の遺伝子」または「本発明のタンパク質」の項で説明したとおりである。
＜本発明の抗体＞
本発明は、上記した本発明のタンパク質に対する抗体（本明細書中以下において、「本発明のモノクローナル抗体」とも称される）を提供する。以下、本発明の抗体の実施態様および入手方法について詳細に説明する。
本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体の場合にはキメラ抗体でもよく、特にはマウス／ヒトキメラ抗体が好ましい。「モノクローナル抗体」には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなるいずれのイムノグロブリンクラスに属するモノクローナル抗体をも包含し、好適には、ＩｇＧまたはＩｇＭイムノグロブリンクラスモノクローナル抗体である。
抗原となる本発明のタンパク質は、それをコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、それを適当な宿主に形質転換して組み換えタンパク質を発現させることによって得ることができる。また、免疫抗原として、例えばマクロファージ細胞株そのもの、マクロファージ細胞株の膜画分を用いることができる。
本発明のポリクローナル抗体（抗血清）あるいはモノクローナル抗体などの抗体は常法（例えば、文献「続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、日本生化学会編：東京化学同人発行、等」に記載の方法）に従って取得することができる。
即ち、例えば、抗原を必要に応じてフロイントアジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｕｖａｎｄ）とともに、哺乳動物、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギに免疫する。ポリクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。また、モノクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することにより製造することができる。
モノクローナル抗体は、具体的には以下のようにして製造することができる。即ち、本発明のタンパク質あるいは本発明のタンパク質を発現している細胞等を免疫原として用い、必要に応じてフロイントアジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギ、好ましくはマウス、ラットまたはハムスター（これらの動物にはヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フットパッド内または腹腔内に１乃至数回注射するか、あるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１日乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリドーマ（融合細胞）から製造することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法で調製することが可能である。公知の方法としては、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２５６，ｐｐ．４９５−４９７，１９７５）及びそれに準じる修飾方法が挙げられる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくは同種のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の骨髄腫系細胞（ミエローマ）との融合により得られる融合細胞（ハイブリドーマ）を培養することにより調製される。
細胞融合に用いられる骨髄腫系（ミエローマ）細胞としては、例えばマウス由来ミエローマ「Ｐ３／Ｘ６３−ＡＧ８」、「Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１」、「Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１」、「ＳＰ２／０−Ａｇ１４」、「Ｘ６３，６５３」、「ＰＡＩ」、「ＦＯ」または「ＢＷ５１４７」、ラット由来ミエローマ「２１０ＲＣＹ３−Ａｇ１．２．３」、ヒト由来ミエローマ「Ｕ−２６６ＡＲ１」、「ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２」、「ＵＣ７２９−６」、「ＣＥＭ−ＡＧＲ」、「Ｄ１Ｒ１１」又は「ＣＥＭ−Ｔ１５」などを挙げることができる。
本発明のモノクローナル抗体を産生する融合細胞クローンのスクリーニングは、融合細胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の抗原に対する反応性を、例えば、フローサイトメトリー、ＲＩＡやＥＬＩＳＡ等によって測定することにより行うことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギなど、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中などでのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法などの種々の条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持および保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地などの低カルシウム培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地、ＲＤ培地などの高カルシウム培地などが挙げられる。該基本培地には、目的に応じて、例えば、血清、ホルモンサイトカインおよび／または各種の無機または有機物質などを含有させることができる。モノクローナル抗体の単離、精製は上述の培養上清または腹水を硫酸アンモニウム沈殿法、ユーグロブリン沈殿法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２など）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡ若くはプロテインＧカラム等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付すること、疎水クロマトグラフィーに付することなどにより行うことができる。
本発明における「キメラ抗体」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、例えば、その可変領域がマウスイムノグロブリン由来の可変領域であって、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体などのキメラモノクローナル抗体を意味する。ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥなどのアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明における組換えキメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグロブリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。本発明におけるキメラモノクローナル抗体は、例えば、以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものではないことは言うまでもない。
例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、実験医学（臨時増刊号）、第１．６巻、第１０号、１９８８年および特公平３−７３２８０号公報等を参照しながら作製することができる。即ち、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した該モノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性名ＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロブリンをコードするＤＮＡから取得したＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードする遺伝子）を、また該ハイブリドーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＬ遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロブリンをコードするＤＮＡから取得したＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードする遺伝子）を、各々発現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。
具体的には、まず、マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから常法によりＤＮＡを抽出後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等）を用いて消化し、電気泳動に付して（例えば０．７％アガロースゲル使用）サザンプロット法を行なう。泳動したゲルを例えばエチジウムブロマイド等で染色し、写真撮影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２回水洗し、０．２５ＭのＨＣｌ溶液に１５分浸す。次いで、０．４ＮのＮａＯＨ溶液に１０分間浸し、その間緩やかに振盪する。常法により、フィルターに移し、４時間後フィルターを回収して２×ＳＳＣで２回洗浄する。フィルターを十分乾燥した後、ベイキング（７５℃、３時間）を行なう。ベイキング終了後に、該フィルターを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に入れ、６５℃で３０分間処理する。次いで、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリダイゼーション液と共にビニール袋に入れる。６５℃で３〜４時間処理する。
次に、この中に３２Ｐ標識したプローブＤＮＡ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１２時間程反応させる。ハイブリダイゼーション終了後、適切な塩濃度、反応温度及び時間（例えば、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、室温、１０分間）のもとで、フィルターを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、２×ＳＳＣを少量加え、密封し、オートラジオグラフィーを行なう。上記サザンブロット法により、マウスモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列されたＶＤＪ遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。この方法を用いて同定したＤＮＡ断片を含む領域を塩化セシウム密度勾配遠心にて分画し、ファージベクター（例えば、ｃｈａｒｏｎ４Ａ、ｃｈａｒｏｎ２８、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４等）に組込み、該ファージベクターで大腸菌（例えば、ＬＥ３９２、ＮＭ５３９等）を形質転換し、ゲムノライブラリーを作製する。そのゲムノライブラリーを適当なプローブ（Ｈ鎖Ｊ遺伝子、Ｌ鎖（κ）Ｊ遺伝子等）を用いて、例えばベントンデイビス法（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１９６巻、第１８０〜第１８２頁（１９７７））に従って、プラークハイブリダイゼーションを行い、再配列されたＶＤＪ遺伝子或いはＶＪ遺伝子を各々含むポジティブクローンを得る。得られたクローンの制限酵素地図を作成し、塩基配列を決定し、目的とする再配列されたＶＨ（ＶＤＪ）遺伝子或いはＶＬ（ＶＪ）遺伝子を含む遺伝子が得られていることを確認する。
一方、キメラ化に用いるヒトＣＨ遺伝子及びヒトＣＬ遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトＩｇＧ１とのキメラ抗体を作製する場合には、ＣＨ遺伝子であるＣγ１遺伝子とＣＬ遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。これらの遺伝子はマウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用してヒトＣγ１遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウスＣγ１遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって得ることができる。
具体的には、例えば、クローンＩｇ１４６（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７５巻、第４７０９〜第４７１３頁（１９７８））からの３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とクローンＭＥＰ１０（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７８巻、第４７４〜第４７８頁（１９８１））からの６．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用い、ヒトのλＣｈａｒｏｎ４ＡのＨａｅＩＩＩ−ＡｌｕＩゲムノライブラリー（セル（Ｃｅｌｌ）、第１５巻、第１１５７〜１１７４頁（１９７８））中からヒトκ遺伝子を含み、エンハンサー領域を保持しているＤＮＡ断片を単離する。また、ヒトＣγ１遺伝子は、例えば、ヒト胎児肝細胞ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で分画した後、５．９ｋｂのバンドをλ７８８に挿入し、前記のプローブを用いて単離する。
このようにして得られたマウスＶＨ遺伝子とマウスＶＬ遺伝子、及びヒトＣＨ遺伝子とマウスＣＬ遺伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域などを考慮しながらマウスＶＨ遺伝子の下流にヒトＣＨ遺伝子を、またマウスＶＬ遺伝子の下流にヒトＣＨ遺伝子を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、例えば、ｐＳＶ２ｇｐｔ或いはｐＳＶ２ｎｅｏ等の発現ベクターに常法に従って組込む。この際、マウスＶＨ遺伝子／ヒトＣＨ遺伝子とマウスＶＬ遺伝子／ヒトＣＬ遺伝子のキメラ遺伝子は、一つの発現ベクターに同時に配置されてもよいし、各々別個の発現ベクターに配置することもできる。
このようにして作製したキメラ遺伝子挿入発現ベクターを、例えばＰ３Ｘ６３・Ａｇ８・６５３細胞或いはＳＰ２／０細胞といった、自らは抗体を産生していない骨髄腫細胞にスフェロプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法或いはエレクトロポレーション法等により導入する。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により選別し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞を取得する。このようにして選別された抗体産生細胞の培養上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得する。
本発明における「ヒト型抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には例えば、その超可変領域の相補性決定領域の一部又は全部がマウスモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン領域であることを特徴とするヒト型モノクローナル抗体を意味する。
ここで、超可変領域の相補性決定領域とは、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である３つの領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を指し、また可変領域の枠組領域とは、該３つの相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を指す。換言すれば、例えばマウスモノクローナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部又は全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き換わったモノクローナル抗体を意味する。ヒトイムノグロブリンの対応領域由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明におけるヒト型モノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグロブリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。また、ヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域についても限定されるものではない。
本発明におけるヒト型モノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものではないことは言うまでもない。例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する組換ヒト型モノクローナル抗体は、特表平４−５０６４５８号公報及び特開平６２−２９６８９０号公報等を参照して、遺伝子工学的に作製することができる。ヒト化抗体の作製は、まず目的とするモノクローナル抗体のＶ領域アミノ酸配列とホモロジーの高いヒトＶＨおよびＶＬを選び、コンピュータモデリングによりＣＤＲの高次構造に影響するＦＲ領域のアミノ酸残基を検索して選択し、マウス由来のＣＤＲ（ごく一部のＦＲ配列を含む）とヒト由来のＦＲ領域配列からなるＶＨおよびＶＬ領域の全アミノ酸配列をデザインする。Ｃ領域としては希望するヒト抗体のクラス・サブクラスを選ぶ。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、化学合成法やＰＣＲ法あるいはｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法などで作製する。このように設計したマウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域遺伝子を、プロモーター領域およびエンハンサー領域などを考慮して、それぞれヒトのＨ鎖およびＬ鎖のＣ領域遺伝子につなぎ、発現ベクターにそれぞれ組み込んで、細胞に導入して発現させる。発現ベクターとしてはｐＳＶ２ｇｐｔやｐＳＢ２ｎｅｏなどがよく用いられるが、１本の発現ベクターで発現させてもよい。つづいて免疫グロブリン非産生株であるマウスミエローマＳｐ２／０などへ導入して発現分泌させる。ミエローマ以外の動物細胞や昆虫細胞、あるいは酵母や大腸菌で産生させてもよい。
本発明における「ヒト抗体」とは、イムノグロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域ならびにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。ヒト抗体は、常法に従って、例えば少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原或いは免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、ネイチャージェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第７巻、第１３〜２１頁、１９９４年；特表平４−５０４３６５号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜５０頁、１９９５年；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３６８巻、第８５６〜８５９頁、１９９４年及び特表平６−５００２３３号公報に記載の方法に従って作製することができる。
本発明において「抗体の一部」または「抗体のフラグメント」とは、少なくとも一つの可変領域を含有する抗体フラグメントの意であり、前述の本発明における抗体、好ましくはモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’あるいはＦａｂを指す。ここで、「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）をタンパク質分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶＬ（Ｌ鎖可変領域）とＣＬ（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶＨ（Ｈ鎖可変領域）とＣＨγ１（Ｈ鎖定常領城中のγ１領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントをそれぞれＦａｂ’という。また、ＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）２という。
＜組換えベクターおよび形質転換体＞
本発明はさらに、本発明の遺伝子またはＤＮＡ断片を含有する組み換えベクターを提供する。
組み換えベクターは、簡便には当業界において入手可能な組み換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２などが例示されるがこれらに限定されない。
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現ベククーが有用である。発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現ベクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，（ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）」に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組み換えベクター（例えば、組み換えプラスミド）は、以下に記載するような方法で宿主細胞に導入することができる。
本発明の組み換えベクターを宿主細胞に導入（形質転換または形質移入）する方法としては、従来公知の方法を用いて行うことができ、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，（ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）」に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。あるいはまた、例えば、宿主細胞が細菌（Ｅ．ｃｏｉｌ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレーション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
形質転換体を作製する際に使用する宿主細胞としては、本発明の組み換えベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組み換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）などの原核細胞、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）などの単細胞性宿主を含む下等真核性細胞、カイコなどの高等真核性細胞などが挙げられる。宿主細胞は、大腸菌、酵母、昆虫細胞などが好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｉｌではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン若しくはネオマイシン、ハイグロマイシン、スペクチノマイシンまたはクロラムフェニコール等の抗生物質の耐性遺伝子などが例示される。
発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
＜受容体、スクリーニング方法＞
本発明の遺伝子がコードするタンパク質はＧ−ＣＳＦ誘導・分泌刺激の入口として働いていることが考えられる（即ち、本発明は以下の理論により拘束されることはないものの、一つの可能性としては、マクロファージ細胞の表層に存在する本発明のタンパク質に外部からのリガンドが結合して、それにより生じたシグナルが細胞内に伝達されることにより当該マクロファージがＧ−ＣＳＦを放出するようになるというモデルが考えられる）。従って、本発明のタンパク質は、Ｇ−ＣＳＦの誘導・分泌因子の受容体またはその一部でありうる。ここでいう「受容体の一部」とは、受容体を構成するサブユニットの一つである場合、糖鎖等で修飾されている場合を含む。この受容体は、例えば寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体またはそのフラグメントのような、Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質と結合性（親和性ということもある）を有し、また、マクロファージを含むＧ−ＣＳＦを産生することのできる細胞の細胞膜に存在すると考えられる。本発明はこのような受容体を提供する。
また、本発明はさらに、本発明のタンパク質または受容体を用いることを特徴とする、有用な物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、（ａ）物質を、請求項９から１２の何れかに記載のタンパク質または請求項２０記載の受容体を有する細胞に接触させる工程；および（ｂ）前記物質の、前記タンパク質または受容体を介した効果を測定する工程を含む。あるいは、問題の物質（単に「物質」、または「試験化合物」ということもある。）と本発明のタンパク質若しくは上記受容体、またはそれらを有する細胞との結合性を測定すること（例えば、本発明の受容体を細胞表面に有する細胞と問題の物質との結合をフローサイトメーターで解析すること）、問題の物質の上記受容体を介した効果（例えば、マクロファージからのＧ−ＣＳＦの産生、適当な形質転換細胞からのマーカーとなる物質の産生）を測定すること、または問題の物質の構造（例えば、問題の物質がタンパク質であるときは、そのアミノ酸配列）と本発明のタンパク質の構造（例えば、アミノ酸配列）とを比較することを含む。
さらに、本発明のタンパク質または受容体の構造情報をもとにコンピュータを用いて化合物をデザインし、そのような手法でデザインされた化合物および／またはその類似体をコンビナトリアルケミストリー等の技術を用いて多種類合成し、そしてそれらのなかから、適当な技術（例えば、ＨＴＳ（ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）等）を用いて有用な物質を選択する手法、ならびにそのような物質をリード化合物としてさらに改変体を合成・選択し、より効果の高い物質を得る手法等も、本発明のスクリーニング方法に含まれる。
スクリーニングに利用される本発明のタンパク質または受容体は、好ましくは、（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；（ｂ）配列表の配列番号４において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質；（ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９４％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有し、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質または；（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ顆粒球コロニー刺激因子誘導・分泌活性を有する抗体またはそのフラグメントと結合性を有するタンパク質、またはそのようなタンパク質を有する受容体である。
より具体的なスクリーニング方法の一例として、次のようなものが考えられる：Ｇ−ＣＳＦプロモーター遺伝子、その下流のルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）、β−ラクタマーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等のマーカータンパク質をコードする遺伝子、およびさらに下流のテトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の薬剤に対する薬剤抵抗性遺伝子を挿入したベクターを構築する。このベクターを、本発明のタンパク質を含む受容体をもつ細胞（例えばマクロファージ細胞株、好ましくはヒト由来マクロファージ細胞株）に導入する。得られた細胞を薬剤を含む培地で処理し、コロニーを形成した細胞群を選抜する。さらに、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）などのＧ−ＣＳＦ誘導薬によってマーカータンパク質を発現するクローンを選択する。なお、マーカータンパク質の発現が実際のＧ−ＣＳＦｍＲＮＡの発現を反映していることを確認しておく。このようにして得られた形質転換細胞株を種々の物質で処理する。そしてマーカータンパク質発現を誘導した物質をスクリーニングする。
本発明のスクリーニング方法においては、本発明のタンパク質のうちＧ−ＣＳＦ誘導・分泌活性を有する抗体（例えば、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体）またはそのフラグメントによって認識される部分が特に重要となる場合がある。例えば、このような部分の決定方法は当業者にはよく知られている。例えば、本発明のタンパク質の一つである配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質においては、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０３を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体によって認識される部分が本発明者らによって決定されている（実施例９参照）。
＜新規物質＞
スクリーニングにより得られる有用な物質は、Ｇ−ＣＳＦの産生を変化させることができる物質である。そのような物質は、（ａ）受容体と結合性を有し（結合の結果、受容体に変化をもたらし、受容体を介して細胞内に情報を伝達すると予想される。）、かつＧ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質（アゴニストまたは作用薬ともいう）；（ｂ）受容体と結合性を有し（結合の結果、Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質が受容体と結合することに拮抗し、かつその刺激を阻害すると予想される。）、かつＧ−ＣＳＦの産生を誘導しない物質（アンタゴニストまたは遮断薬ともいう）；および（ｃ）受容体と結合性を有し（結合の結果、Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質が受容体と結合するのを阻害すると予想される。）、かつ受容体自身がもつＧ−ＣＳＦの産生活性を阻害する物質（インバースアゴニストまたは反作用薬ともいう）を含む。
このような物質は新規である。従って、本発明は、本発明のスクリーニング方法により得られた、（ａ）受容体と結合性を有し（結合の結果、受容体に変化をもたらし、受容体を介して細胞内に情報を伝達すると予想される。）、かつＧ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質；（ｂ）受容体と結合性を有し（結合の結果、Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質が受容体と結合することに拮抗し、かつその刺激を阻害すると予想される。）、かつＧ−ＣＳＦの産生を誘導しない物質；または（ｃ）受容体と結合性を有し（結合の結果、Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質が受容体と結合するのを阻害すると予想される。）、かつ受容体自身がもつＧ−ＣＳＦの産生活性を阻害する物質をも提供する。また、本発明はさらに、本発明のタンパク質または受容体と結合性を有し：（ａ）Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質（結合の結果、受容体に変化をもたらし、受容体を介して細胞内に情報を伝達すると予想される。）；（ｂ）Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導しない物質（結合の結果、Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質が受容体と結合することに拮抗し、かつその刺激を阻害すると予想される。）；または（ｃ）受容体自身がもつＧ−ＣＳＦの産生誘導活性を阻害する物質（結合の結果、Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質が受容体と結合するのを阻害すると予想される。）をも提供する。以下、これらの物質を「本発明の物質」ということもある。なお、本発明の物質についての発明の技術的範囲には、公知の物質自体は含まれない。
本発明の物質の例としては、本発明の抗体、そのフラグメント、または他の低分子化合物であって：Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導する作用を有するもの；Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質が受容体と結合することに拮抗し、かつその刺激を阻害する作用を有するもの；または受容体自身がもつＧ−ＣＳＦの産生活性を誘導することができる物質が受容体と結合するのを阻害し、かつＧ−ＣＳＦの産生を阻害する作用を有するものがある。
上述の「他の低分子化合物」は、例えばコンビナトリアル合成等の当業者に周知の手段により、種々合成することができるし、入手可能な化学合成ライブラリーを利用することもできる（Ｍ．Ｊ．プランケットら：新薬開発とコンビナトリアル・ケミストリー：日経サイエンス７，６２−６９（１９９７）。コンビナトリアルケミストリー研究会編：コンビナトリアルケミストリー：化学同人（１９９８））。
上記受容体との結合性（または結合の阻害性）は、問題となる物質が抗体である場合は、例えば、抗体と結合したマクロファージ細胞株をフローサイトメトリーやＥＬＩＳＡ法などを用いて解析する等の方法により、測定することができる。
顆粒球コロニー刺激因子産生の誘導作用（または阻害作用）は、特開平１１−１０６４００に記載された方法により決定されうる。概略を以下に記載する。
ピッカジーン　エンハンサー　ベクター２（和光純薬工業（株）社製）のＸｈｏＩサイトからＮｃｏＩサイトにかけて、Ｇ−ＣＳＦプロモーター遺伝子を挿入し、その下流にＧ−ＣＳＦ遺伝子の代りにルシフェラーゼ遺伝子を結合させ、さらにＳＶ４０の下流のＳａｌＩサイトにｐＭＣ１Ｎｅｏ　Ｐｏｌｙ　Ａから切り出したネオマイシン抵抗性遺伝子を挿入したＰｉｃａＧＣＳＦｎｅｏベクターを構築する。このベクターをＲＡＷ２６４．７細胞にエレクトロポレーション法を用いて導入する。得られた細胞をジェネチシンを含む培地で処理し、コロニーを形成した細胞群を選抜する。ジェネチシン抵抗性クローンからさらに、ＬＳＰ等のＧ−ＣＳＦ誘導薬によってルシフェラーゼ活性を示すクローンを選択する。なお、ルシフェラーゼ活性が実際のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡの発現を反映していることを、３２ＰラベルマウスＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡをプローブとして、ノーザンブロット解析により確認しておく。このようにして得られた形質転換マクロファージ細胞株を、９６ウェルマイクロプレートにウェル当り５×１０４個ずつ播き、３７℃で２４時間培養し、必要に応じ予め得ておいたアゴニスト、アンタゴニストで処理した後、問題の物質を０、３．７５、７．５、１５、３０および／または６０μｇ／ｍｌ程度の濃度で添加する。さらに、３７℃で１８時間培養した後、ルシフェラーゼ活性を測定する。
また、Ｇ−ＣＳＦ産生の誘導作用（または阻害作用）は、以下の実施例１４に記載されているＧ−ＣＳＦバイオアッセイによっても決定されうる。
本発明の物質であるか否かは、種々の判断基準により決定することができる。例えば、（１）Ｇ−ＣＳＦを産生しうる系、またはＧ−ＣＳＦの産生を反映する測定可能な指標を有する系を構築し、試験化合物を添加する群と適切なコントロール群（例えば、試験化合物の代わりに既知の物質を用いる系、試験化合物およびその代わりの物質のいずれも用いない系）とを作製し、コントロール群で得られた値を基準として判断することができる。このとき、試験化合物と、予め得ておいたアゴニストまたはアンタゴニストを共存させる群を作製してもよい。また、（２）本発明の受容体またはタンパク質と試験化合物との結合力（例えば、適切な手段により測定された受容体若しくはタンパク質と試験化合物との結合定数（Ｋｍ、会合定数ということもある））を基に判断することができる。この場合も試験化合物の代わりに既知の物質を用いて得られた値を基準とすることができる。あるいは、（３）（１）および（２）を組み合わせて判断することができる。
より具体的には、細胞表面に本発明のタンパク質を有する細胞であって、ルシフェラーゼ活性が実際のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡの発現を反映するように形質転換された細胞を試験化合物で刺激した場合に、適当な条件において得られるルシフェラーゼ活性の最大値がコントロール群より高いとき、好ましくはコントロール群の約１．０１倍以上であるとき、より好ましくは約２倍以上であるとき、さらに好ましくは約２０倍以上であるとき、最も好ましくは約６０倍以上であるとき、その試験化合物を、本発明でいう「本発明のタンパク質または受容体と結合性を有し：（ａ）Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質」と判断することができる（実施例参照）。また、予め得ておいたアゴニストまたはアンタゴニストと試験化合物を共存させる群を含む系は、本発明でいう「本発明のタンパク質または受容体と結合性を有し：（ｂ）Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導しない物質；または（ｃ）Ｇ−ＣＳＦの産生を誘導することができる物質」であるか否かを判断する際に用いることができる。
本発明の物質は、Ｇ−ＣＳＦ以外のサイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロンＩＮＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、種々のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）等を誘導してもよい。他のサイトカインに比較して、Ｇ−ＣＳＦを選択的に誘導する物質は、本発明の物質の好ましい態様の一つである。そのような物質としては、例えば、適切な濃度で用いた場合に、他のサイトカインの誘導はコントロールと比較して約１０倍未満であるが、Ｇ−ＣＳＦサイトカインの誘導はコントロールの約１０倍以上、好ましくは約２０倍以上、より好ましくは約４０倍以上である物質である。他のサイトカインの誘導は、当業者に周知の方法で測定することができる。
＜医薬としての本発明の遺伝子等の利用＞
本発明の遺伝子は、例えば、血液成分の白血球の一種である好中球が関与する疾患（例えば、好中球減少症など）または赤血球、白血球若しくは血小板等の血球に関する疾患の診断、予防および治療（遺伝子治療など）などに利用することが可能である。また、本発明のタンパク質若しくはその部分ペプチド、抗体若しくはそのフラグメント、リガンド、受容体、または物質（以下、これらをまとめて「本発明のタンパク質等」ということもある）は、血液あるいは骨髄中の好中球の数または、広く赤血球、白血球若しくは血小板等の血球の数を調整する医薬となり得る。すなわち、本発明の遺伝子およびタンパク質等は、抗ガン剤の副作用としての好中球減少症や骨髄移植後の好中球減少症または赤血球、白血球若しくは血小板等等の血球減少症の治療及び再生不良性貧血の診断、予防および治療などのために用いることが可能である。
また、本発明者らにより、本発明のタンパク質または受容体がＧ−ＣＳＦの産生の誘導に関与することが見出された。したがって、本発明のタンパク質または受容体との結合性を有する物質は、医薬として、Ｇ−ＣＳＦの産生を促進する薬剤またはＧ−ＣＳＦに関する生物活性を調節する薬剤として用いることが可能である。特に抗ガン剤の副作用としての好中球減少症や骨髄移植後の好中球減少症、または赤血球、白血球若しくは血小板等等の血球減少症や骨髄移植後の好中球減少症の治療及び再生不良性貧血の診断、予防および治療などのために用いることが可能である。
本発明のタンパク質等は通常、全身または局所的に、一般的には非経口の形で投与することができる。非経口投与の内でも特に好ましくは静脈内投与である。
本発明の遺伝子は、生体内あるいは生体外で細胞に遺伝子を導入するいわゆる遺伝子治療の形で全身または局所的に投与することができる。遺伝子導入は、例えばバイオマニュアルＵＰシリーズ、遺伝子治療の基礎技術、島田隆、斎藤泉、小澤敬也編：羊土社発行、１９９６年に記載の方法に従って行うことができる。生体外で細胞に導入する場合には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、カチオニックリポソーム、ＨＶＪ−リポソームを用いる方法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法などを用いることができる。また、生体内で遺伝子を導入する場合には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、カチオニックリポソーム、ＨＶＪ−リポソームを用いる方法を挙げることができる。
投与量は、年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、投与するもの（タンパク質または遺伝子の種類）などにより異なるが、成人一人当たり、一回につき１μｇから１００ｇの範囲、好ましくは１０μｇから１０００ｍｇの範囲で、一日一回から複数回非経口投与することができるだろう。投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。本発明による非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤として混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水などが挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類などが挙げられる。
このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）のような補助剤を含んでいてもよい。
これらはバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を例えば凍結乾燥法などによって製造し、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためのその他の組成物としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例
実施例１：３−４Ｈ７抗体（寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１０３のハイブリドーマが産生するもの；特願平９−２６６５９１号明細書に記載）の作製および精製
情報伝達抗体（アゴニスト抗体）３−４Ｈ７（ＩｇＭ）の作製および精製は、微生物およびエンドトキシン（リポポリサッカライド、ＬＰＳ）の夾雑を防ぐためすべて無菌操作により行うとともに、用いた培養液および試薬のエンドトキシン濃度を常に測定（後述）し、許容範囲（０．１ＥＵ／ｍｌ以下）であることを確認しながら行った。すなわちインテグラＣＬ１０００培養フラスコ中、ハイブリドーマを１ｍｌあたり１×１０８個の密度でＡＳＦ１０４無血清培地に懸濁し５日間培養した上清を２００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で約３倍量に希釈し、これをやはり２００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＭＧＰＰカラムにロードした。そして２００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）でカラムを洗浄し夾雑物を除いた後、３００ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で抗体を溶出、これをリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）中で透析し抗体溶液を得た。精製した抗体の純度はＦＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、以下の実験に供した。
実施例２：ＬＰＳ濃度定量法
実験に用いた各種溶液に含まれるＬＰＳ濃度は、リムルス法によりエンドスペシー−トキシカラーシステム（生化学工業）を用いて定量した。すなわち、各種溶液５０μｌをエンドドキシンフリー９６ウエルマイクロプレートにとり、氷冷下ライセート−合成反応基質溶液５０μｌを加え、直ちに３７℃で３０分間反応した。この後すぐにそれぞれ５０μｌの亜硝酸ナトリウム溶液、スルファミン酸アンモニウム溶液、Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン二塩酸塩−Ｎ−メチル−２−ピロリドン−水溶液を順に加え、マイクロプレートリーダーＭ−Ｔｍａｘ（モレキュラーデバイス社）を用いて５５０ｎｍの吸収を測定、コントロールとして６５０ｎｍの吸収を引いた値を用いてＳｏｆｔＭａｘ１．５プログラムによりＬＰＳ濃度を計算した。標準ＬＰＳにはＵＳＰ標準品を用い、細胞を刺激する際も同じＬＰＳを用いた。
実施例３：マクロファージ系細胞株における３−４Ｈ７抗体の抗原遺伝子のクローニング
（１）マクロファージ系培養細胞株ＲＡＷ２６４．７からのポリＡ＋ＲＮＡの調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（２×１０８個）から、グアニジウムチオシアネート／フェノールクロロホルム・シングルステップ抽出法（ラボマニュアル遺伝子工学第３版，８３−８４，１９９６）によって、約０．３ｍｇの全ＲＮＡを調製した。これをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によりさらに精製し、約５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを得た。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡの合成は、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットを用い、リンカープライマー法（Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎｎ法：Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９，１９８３を改変したもの）によりおこなった。すなわち、上記（１）で得たポリＡ＋ＲＮＡ（５μｇ）に、オリゴ（ｄＴ）１８とＸｈｏＩ認識配列を含むリンカープライマー（２．８μｇ）および逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴａｓｅ；７０ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で６０分間反応させることにより相補性一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ｃＤＮＡ）を合成した。その際、後におこなう制限酵素処理からｃＤＮＡを保護するため、５−ｍｅｔｈｙｌ　ｄＣＴＰを取り込ませた。つづいて、ＲＮａｓｅ　Ｈ（２ｕｎｉｔ）を作用させ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド上に、切れ目（ニック）を導入し、生じたＲＮＡ鎖断片をプライマーとして、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ（１００ｕｎｉｔ）を加え１６℃で１５０分間反応させることによりｄｓ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）−ｃＤＮＡ（８μｇ）を合成した。フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱後、このようにして作製したｄｓ−ｃＤＮＡをＰｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔ）を加えた反応液中で７２℃，３０分間反応させることにより平滑末端化した。さらにフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱をおこない、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（４ｕｎｉｔ）を含むバッファー中で予めアニーリングさせたＥｃｏＲ　Ｉアダプター（０．３５μｇ）を８℃で一晩反応させることにより付加し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ｕｎｉｔ）で３７℃，３０分間反応させることによりｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ末端をリン酸化した。そして、リンカープライマー部分をＸｈｏＩ（１２０ｕｎｉｔ）により３７℃で９０分間反応させて切断し、得られたｃＤＮＡをスピンカラムによりサイズ分画し、１％アガロースゲル電気泳動によりｃＤＮＡの鎖長が０．５ｋｂｐ以上の長さであることを確認後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（４ｕｎｉｔ）を含むバッファー中１２℃で一晩反応させることにより、λＺＡＰ　ＩＩベクター（１μｇ）に挿入した。連結されたλＤＮＡはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＧｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　Ｇｏｌｄ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔを用いて室温で９０分間インキュベートすることによりｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇをおこない、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’に感染させ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；２．５ｍＭ），Ｘ−Ｇａｌ（４ｍｇ／ｍｌ）存在下、プレート上で３７℃，８時間プラークを形成させてタイトレーションをおこなった結果、このｃＤＮＡライブラリーは１．２×１０６のオリジナルクローンを含むことがわかった。このライブラリーを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’で３．４×１０９ｐｆｕまで増幅して以下のスクリーニングに用いた。
（３）３−４Ｈ７抗体と結合性を有するタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング
上記（２）で構築したｃＤＮＡライブラリーはｌａｃプロモーターで制御されているβガラクトシダーゼの構造遺伝子の３’側にｃＤＮＡが導入されているので、そのｃＤＮＡは、βガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現する。そこでこの融合タンパク質を膜上にブロッティングし、３−４Ｈ７抗体をプローブとしてイムノスクリーニングすることによって大腸菌による発現クローニングをおこなった。すなわち、各３．５×１０４ｐｆｕファージをトップアガロースと混合し、直径１５０ｍｍのプレート上に播種して計２０枚のプレートを作製した。これらのプレートを４２℃で４時間インキュベートして直径０．５ｍｍ程のプラークを形成させ、そこにあらかじめ滅菌したＩＰＴＧを浸み込ませたニトロセルロース膜をのせ、３７℃で３時間インキュベートして発現を誘導した。その後膜を剥がし、５％のスキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０，２０ｍＭトリス緩衝生理食塩水，ｐＨ７．６）溶液中で１時間ブロッキングをおこなった。その後、膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、１次抗体として３−４Ｈ７抗体（１．６μｇ／ｍｌ−１％ＢＳＡ−ＴＢＳ）を１時間反応させ、洗浄後、２次抗体としてアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＭウサギ抗体（Ｚｙｍｅｄ，０．６μｇ／ｍｌ）を１時間反応させた。再度よく洗浄後、基質液（５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む５００μｇ／ｍｌ　ＮＢＴ；ニトロブルーテトラゾリウム，５００μｇ／ｍｌ　ＢＣＩＰ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートＴＢＳ溶液，ｐＨ９．５）中、暗所で３０分間インキュベートし発色させた。フィルターをマスタープレートと突き合わせ、陽性クローンをトップアガロースから回収し増幅後、上記と同様の操作で２次、３次、４次スクリーニングをおこなった。その結果、７×１０５個のファージから１次スクリーニングでは２２個、最終的には３個の陽性クローン（ＭＭＲ１０，ＭＭＲ１７およびＭＭＲ１９）を得た。
（４）得られたポジティブクローンの遺伝子配列の解析
λＺＡＰ　ＩＩファージベクターは、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）全体がｆ１ファージのｉｎｉｔｉａｔｏｒ領域とｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ領域の間に挿入されているので、ヘルパーファージを感染させることにより、組換えＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔが自動的に切り出され、クローン化したＤＮＡ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングできる。そこで、上記（３）で得た３個のポジティブファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’に感染させ、これにヘルパーファージを感染させることにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−）にサブクローニングした。このプラスミドを大腸菌ＳＯＬＲに形質転換させることにより、約２０μｇのプラスミドＤＮＡを得た。プラスミドＤＮＡの配列解析はＰｒｉｍｅｒ　Ｗａｌｋｉｎｇ法によりおこなった。精製したプラスミドＤＮＡについてＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　ＢｉｇＤｙｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｏｒｅ　Ｋｉｔ（ＰＥ社）を用いてＭ１３Ｒｅｖプライマーと−２１Ｍ１３プライマーによりシークエンス反応をおこない、ロングレンジャーゲルを用いＡＢＩ　３７７型シークエンサーによりＤＮＡ配列を決定した。解析の結果、ＭＭＲ１９クローンはタンパク質のオープンリーディングフレームを含む８４０ｂｐからなる完全長のｃＤＮＡ塩基配列を有していた。一方、他のクローンではオープンリーディングフレームが確認されなかった。ＭＭＲ１９クローンの塩基配列を配列表の配列番号１に記載する。
（５）ｃＤＮＡクローンの塩基配列から推定されるタンパク質の一次構造
上記（４）で解析した遺伝子（ＭＭＲ１９）の塩基配列から推定されるタンパク質（以下「ＭＭＲＰ１９タンパク質」という）の一次構造（配列表の配列番号１および２に記載）は、２４１個のアミノ酸残基から構成され、推定される分子量は約２６．９ｋＤａであった。
実施例４：データベース検索によるマウス由来ＭＭＲ１９遺伝子と他の相同遺伝子の比較
実施例３で決定した配列番号１に記載の塩基配列およびアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴ，ＥＭＢＣおよびＰＲＯＳＩＴＥのプログラムによりデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＤＮＡ　ＤＡＴＡ　ＢＡＮＫ　ｏｆ　ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）；日本ＤＮＡデータバンク，文部省・国立遺伝学研究所・生命情報研究センター）を検索し、ヒトにおける相同遺伝子の有無をアミノ酸残基レベルおよびＤＮＡレベルの両方で解析した。得られた結果を以下の表１および表２に示す。この結果、本発明の遺伝子ＭＭＲ１９と相同性の高い遺伝子がヒトの９番染色体上に存在することが示された。
2002026978.tif 000002
2002026978.tif 000003
実施例５：ＭＭＲ１９ヒト型ホモローグのクローニング
ヒト正常脳組織由来全ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにかけ、ポリＡ＋ＲＮＡを精製した。次に実施例３（２）に示した方法により、ポリＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、マウス抗原遺伝子ＭＭＲ１９の配列から作製したプライマー（４位から２２位のセンスプライマー；５’−ＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＧＣ−３’；、７２１位から７０１位のアンチセンスプライマー；５’−ＣＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣ−３’）を用いてＰＣＲ反応をおこなった結果、ＭＭＲ１９ヒト型ホモローグの部分ｃＤＮＡが得られた。次に、得られたヒト型ホモローグの部分ｃＤＮＡの配列からレース法（ＣｌｏｎｔｅｃｈのＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用）を用いて全長ｃＤＮＡを得た。すなわち、ヒト正常脳組織由来ｃＤＮＡライブラリーを平滑末端化し、これにＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｄａｐｔｏｒ（ＡＰ１プライマー配列を含む）をライゲーションし、ＡＰ１とＧＳＰ（Ｇｅｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｒｉｍｅｒ）１（１８９位から１６７位のアンチセンスプライマー：５’−ＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＡ−３’）により５’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ反応を、ＧＳＰ２（６３０位から６５３位のセンスプライマー：５’−ＴＧＧＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＣ−３’）とＡＰ１により３’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ反応をおこない、それぞれ５’末端および３’末端側の配列を増幅した。これらＰＣＲ産物をアガロース電気泳動したところそれぞれ単一バンドが確認されたので、これをサブクローニング後、シークエンシングすることにより５’末端および３’末端側の配列を解読した。得られた５’−ＲＡＣＥ断片からセンスプライマー（５’−ＡＡＧＣＣＧＴＧＣＧＧＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧ−３’；１位から２１位）を、３’−ＲＡＣＥ断片からアンチセンスプライマー（５’−ＧＴＣＡＧＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣ−３’；９２４位から９０２位）を作製し、先に用いたヒト正常脳組織由来ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、これをＣｌｏｎｔｅｃｈのＡｄｖａｎＴＡｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてＴ／Ａ　ｃｌｏｎｉｎｇすることにより１１３６ｂｐからなるオープンリーディングフレームを含むヒト型ホモローグの全長ｃＤＮＡの塩基配列を明らかにした。得られた塩基配列を配列表の配列番号３に記載する。Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ（ソフトウェア開発社）を使用しヒト型ホモローグｃＤＮＡとマウスＭＭＲ１９　ｃＤＮＡ（８４０ｂｐ）の相同性を検討した結果、８５．０％相同であることが明らかとなった。
得られたＭＭＲ１９ヒトホモローグの塩基配列から推定されるタンパク質の一次構造は、２４２個のアミノ酸残基から構成される配列番号３および４に示すものである。推定されたアミノ酸配列は、マウスのそれと９３．８％相同であった。
実施例６：ＭＭＲＰ１９タンパク質の解析
ＭＭＲＰ１９タンパク質の部分アミノ酸配列からなる３種のペプチドに対するウサギポリクローナル抗体ＡＰＡ１、ＡＰＡ２、およびＡＰＡ３を以下のとおり調製した。すなわち、９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（ＦＭＯＣ）法によりＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３３型のペプチド合成機を用い、ＭＭＲ１９から推定したタンパク質の１２位から２５位まで、５８位から７１位まで、２２８位から２４１位までのアミノ酸配列に対するペプチドを合成し、逆相クロマトグラフィー（島津ＬＣ８Ａ型）で精製、最終的にそれぞれ約２５ｍｇのペプチドを得た。精製したペプチドをＮ−（６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ架橋剤を介してヘモシアニン（ＫＬＨ）キャリアタンパク質に結合させ、それぞれ１ｍｇをＦｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔと混合し、ウサギ（雌、２〜２．５ｋｇ）背部皮下に３回ほど免疫した。ＥＬＩＳＡ法により血液の抗体価をチェックしてから、それぞれのウサギより約１００ｍｌの血液を採取し、血清を調製した。さらにこの血清よりＩｇＧアフィニティカラムを用いることで、それぞれの抗ペプチド抗体（ＡＰＡ１、ＡＰＡ２およびＡＰＡ３）を得た。ＡＰＡ１はＭＭＲＰ１９タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号２）中における番号１２から２５まで、ＡＰＡ２は５８から７１まで、およびＡＰＡ３は２２８から２４１までの配列を有するポリペプチドに対する抗体である。
これらの抗ペプチド抗体と３−４Ｈ７抗体とを用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞溶解物についてウエスタン解析を行った。その結果図１に示すように、いずれの抗体によって識別されるバンドも分子量３０．４ｋＤａであったことから、これらの抗体が同一のタンパク質、すなわちＭＭＲＰ１９タンパク質と結合するものであることが確認された。なお、ここで得られた分子量（３０．４ｋＤａ）と、アミノ酸配列から計算される分子量（２６．９ｋＤａ）の差異は、糖鎖修飾に起因するものと考えられる。
次に、ＭＭＲＰ１９タンパク質について、Ｈｏｏｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｏｐ，Ｔ．Ｋ．ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ，Ｋ．Ｐ．：Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，４８３−４８９（１９８３））にしたがって、ハイドロパシー解析を行った。その結果を図２に示したようにＭＭＲＰ１９タンパク質には、２つの疎水性領域が存在する可能性が示された。
さらに、抗ペプチド抗体ＡＰＡ１、ＡＰＡ２、およびＡＰＡ３を用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞をフローサイトメーターＥＰＩＣＳ−ＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で解析した。その結果図３に示したとおり、ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＡＰＡ１およびＡＰＡ２によって識別されたが、ＭＭＲＰ１９タンパク質のＣ末端領域に対する抗体であるＡＰＡ３によっては認識されなかった。
これらの結果から、ＭＭＲＰ１９タンパク質は、Ｎ末端約９８個のアミノ酸残基からなる細胞外ドメイン、これに続く約３０個のアミノ酸残基からなる膜貫通（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ）ドメイン、さらにこれに続く約１１３個のアミノ酸残基からなる細胞内ドメインからなることが示唆された。
実施例７：Ｇ−ＣＳＦ遺伝子発現誘導へのＭＭＲＰ１９タンパク質の関与
（１）Ｐｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞の作製
レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いたピッカジーンシステム（Ｐｉｃａｇｅｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（和光純薬工業（株）社製））を使用した。ピッカジーンエンハンサー　ベクター２（和光純薬工業（株）社製）を用いてＸｈｏＩサイトからＮｃｏＩサイトにかけて、Ｇ−ＣＳＦプロモーター遺伝子を挿入し、その下流にＧ−ＣＳＦ遺伝子の代りにルシフェラーゼ遺伝子を結合させ、さらにＳＶ４０の下流のＳａｌＩサイトにｐＭＣ１Ｎｅｏ　Ｐｏｌｙ　Ａから切り出したネオマイシン抵抗性遺伝子を挿入したＰｉｃａＧＣＳＦｎｅｏベクターを構築した。
次に、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７に上記ベクターを以下の方法で導入した。対数増殖期のＲＡＷ２６４．７細胞株を収穫し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ社製）及び非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含むイーグル培地（ＥＭＥＭ）で一回洗浄し、同培地中に２×１０７個／ｍｌの濃度で再懸濁した。上記細胞懸濁液２５０μｌ（５×１０６個）を０．４ｃｍキュベットに入れ、塩化セシウム法で精製したＰｉｃａＧＣＳＦｎｅｏプラスミドＤＮＡ１０μｇと混合し、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）を用いて３００Ｖ、９６０μＦの高電圧パルスをかけることによりベクターを細胞に導入した。
形質転換して４８時間後、得られた細胞をｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ネオマイシンの一種）１ｇ／ｌを含む培地で処理し、コロニーを形成した細胞群を１０〜１５日後選抜した。５０個のｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性クローンのうち４３個のクローンにおいて、ＬＰＳで刺激した結果、優位なルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。そのなかでも一つのクローンが極めて高いルシフェラーゼ活性を示したことから、これをＲＡＷ２６４．７クローン２７−３（「Ｐｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞」ということもある。）と命名した。
なお、ルシフェラーゼ活性が実際のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡの発現を反映していることは以下の実験で確認した。すなわち、ＬＰＳ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）で１８時間刺激処理したＲＡＷ２６４．７クローン２７−３細胞（１．５×１０７個）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を溶解し全ＲＮＡを抽出後、全ＲＮＡを１％ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上で電気泳動させ、ナイロンフィルターに移し、３２ＰラベルマウスＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロット解析を行った。コントロールとしては、β−アクチンを用いた。その結果、Ｇ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡの誘導とルシフェラーゼ活性が相関することが示されたことから、ルシフェラーゼ活性が実際のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡの発現を反映していることが確認された。
（２）Ｇ−ＣＳＦ遺伝子誘導の検出
９６ウェルマイクロプレートに、１ウェルあたり５×１０４個／１００μｌとなるようにＰｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞を播種し、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。実施例６に記載の抗ペプチド抗体（ＡＰＡ１、ＡＰＡ２、ＡＰＡ３）と３−４Ｈ７抗体とを、種々の濃度でプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で細胞を一晩刺激した。これらのプレートをＰＢＳバッファーで３回洗浄した後、細胞をピッカジーン溶解剤により溶解し、遠心して得られた上清サンプルのルシフェラーゼ活性を、ルミノメーターＣＴ−９０００Ｄ化学発光測定用マイクロプレートリーダー（ダイアヤトロン）によって測定した。結果を図４に示した。
３−４Ｈ７抗体は、７７ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度で約６０倍のＧ−ＣＳＦ誘導活性を示した。また、細胞外領域を認識する抗ペプチド抗体（ＡＰＡ１、ＡＰＡ２）も、３−４Ｈ７抗体と同様にＰｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞に対して、Ｇ−ＣＳＦ誘導活性を示した（ＡＰＡ１：２４倍、ＡＰＡ２：２１倍）。これに対し、細胞内領域を認識するＡＰＡ３抗体にはＧ−ＣＳＦ誘導能は認められなかった。以上の結果より、ＡＰＡ１、ＡＰＡ２はＭＭＲＰ１９タンパク質の細胞外領域に結合し、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子発現誘導に関与することが示唆された。
実施例８：　マクロファージ系細胞における３−４Ｈ７抗体刺激によるＧ−ＣＳＦ遺伝子誘導と分泌の関係
ＲＡＷ２６４．７あるいはＰｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞を１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地に懸濁し（１．２×１０５個／ｍｌ）、これを９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり９０μｌ（１×１０４個／ウエル）播種し、まず３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩プレインキュベーションした。この後、各種濃度の３−４Ｈ７抗体、あるいはＬＰＳ溶液を各ウエルに１０μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間刺激した。この後培養上清をサンプルチューブにとり遠心し、この上清を以下のＮＦＳ−６０細胞を用いたＧ−ＣＳＦバイオアッセイ検出系に供した。Ｇ−ＣＳＦのバイオアッセイによる検出は以下のように行った。すなわち、まずＮＦＳ−６０細胞をＰＢＳで３回洗浄し、これを細胞密度が３×１０５細胞／ｍｌとなるように５％ＦＢＳおよび１００μＭのＮＥＡＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁した。このＮＦＳ−６０細胞懸濁液を９６ウエルマイクロプレートに５０μｌずつ播種し（１．５×１０４細胞／ｗｅｌｌ）、一晩３７℃、５％ＣＯ２存在下プレインキュベートした後、５０μｌのＲＡＷ２６４．７あるいはＰｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清またはＧ−ＣＳＦを含む培地を各ウエルに加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下２４時間インキュベートした。この後、各ウエルに１０μｌのＷＳＴ溶液（５ｍＭ　２−（４−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ９−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ・Ｎａ，０．２ｍＭ　１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｄｅ，２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４）を加え、３７℃で４時間反応させ、４５０ｎｍの吸光度を６５０ｎｍを参照波長として測定することでＮＦＳ−６０細胞の増殖を定量化し、Ｇ−ＣＳＦにより惹起される細胞増殖を指標に作製した検量線より培地中に含まれるＧ−ＣＳＦ量を定量した。またＰｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞については実施例７と同様にルシフェラーゼ活性についても検討した。その結果、図５から図８に示すように、３−４Ｈ７抗体はＬＰＳと同様にＲＡＷ２６４．７細胞およびＰｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞を刺激し、濃度依存的にＧ−ＣＳＦの分泌を促進することが示された。また３−４Ｈ７抗体によるＧ−ＣＳＦ分泌は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子誘導に比べて低濃度で認められることから、Ｇ−ＣＳＦ生合成および分泌には、わずかなＧ−ＣＳＦ遺伝子誘導で十分であることが示唆された。
実施例９：３−４Ｈ７抗体が認識する抗原分子ＭＭＲＰ１９のエピトープ領域
ＭＭＲＰ１９タンパク質の細胞外ドメインに対する部分ペプチド、ＭＭＲＰ１９（１２−２５，Ｐ１）、ＭＭＲＰ１９（１９−３６，Ｐ２）、ＭＭＲＰ１９（３２−４６，Ｐ３）、ＭＭＲＰ１９（４１−５５，Ｐ４）、ＭＭＲＰ１９（５０−６２，Ｐ５）、ＭＭＲＰ１９（５７−７１，Ｐ６）、ＭＭＲＰ１９（６４−８１，Ｐ７）、ＭＭＲＰ１９（７２−８７，Ｐ８）およびＭＭＲＰ１９（８１−９８，Ｐ９）の合成は９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ法により、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の４３３型自動ペプチド合成機を用いて行った。合成の結果得られたペプチド−樹脂をトリフルオロ酢酸により処理し、これを逆相クロマトグラフィー（島津ＬＣ８Ａ型）によって精製、各ペプチドともそれぞれ約２５ｍｇを得た。ＭＭＲＰ１９細胞外ドメインに対する９種の合成ペプチド（Ｐ１−Ｐ９）を、それぞれ０．５μｇずつ９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに固定した後、スキムミルクを用いてブロッキングし、ＰＢＳにより３回洗浄した。このマイクロプレートに３−４Ｈ７抗体溶液５０μｌを添加し（添加濃度１０μｇ／ｍｌ）、３７℃で１時間インキュベートした。これを０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにより３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭラット抗体溶液を加え３７℃で１時間反応させ、さらに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−を含むＰＢＳで５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質ＡＢＴＳと過酸化水素を加え３７℃で３０分間反応、マイクロプレートリーダーＭ−Ｔｍａｘ（モレキュラーデバイス社）により４０５ｎｍの吸収を測定した。その結果図９に示すように、ＭＭＲＰ１９の７２位から８７位（Ｐ８）および８１位から９８位（Ｐ９）のペプチドのみが３−４Ｈ７抗体に結合性を示し、残りのペプチドはほとんど結合活性を持たなかった。以上の結果より、ＭＭＲＰ１９の３−４Ｈ７抗体に対するエピトープはＭＭＲＰ１９の７２位から９８位の中に存在することが示された。
実施例１０：３−４Ｈ７抗体によるサイトカインの誘導パターン
９６ウェルマイクロプレートに、１ウェルあたり５×１０４個／１００μｌのＰｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞を藩種し、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下培養した。この後、３−４Ｈ７抗体（終濃度６０μｇ／ｍｌ）あるいはＬＰＳ（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）で細胞を一晩刺激した。刺激後、まず上清を回収し、ＥＬＩＳＡによる各種サイトカイン濃度測定に供するとともに、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子誘導活性を検討した。コントロールには、抗体、ＬＰＳのいずれも含まない培地のみを添加した系を用いた。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦの測定は市販のＥＬＩＳＡキット（エンドジェン）を用いて行なった。その結果、表３に示したように３−４Ｈ７抗体は、Ｇ−ＣＳＦに対して比較的高い誘導倍率を示した（約６０倍）。これに対し、他のサイトカイン誘導レベルは低いものであった（ＩＬ−６は約５．４倍、ＴＮＦ−αは約５．１倍、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦについては有意な変化が検出できなかった。）。一方、ＬＰＳは、Ｇ−ＣＳＦの他、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦも顕著に誘導した。
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実施例１１：サル由来細胞株ＣＯＳ７におけるヒト型ＭＭＲ１９ｃＤＮＡの発現
精製したヒト型ＭＭＲ１９ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクター（ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ）にライゲーションし、得られた組換えベクター（ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ　ＭＭＲ１９）をヒートショック法で大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄにトランスフェクトした。この大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄで生産した組換えベクターを精製し、約２０μｇを高電圧パルス法によって、ＭＭＲＰ１９のタンパク質非発現細胞であるサル由来細胞株ＣＯＳ７（１×１０７個）にトランスフェクトした。そして組換えベクターを導入した細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍで２日培養した後、４℃で１時間１次抗体（３−４Ｈ７）と反応した。さらに反応した細胞をＦＩＴＣ−標識二次抗体で染色し、フローサイトメーター　ＥＰＩＣＳ−ＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で解析した。
その結果、図１０に示したように３−４Ｈ７が組換えベクターを導入した細胞に結合したことから、ヒト型ＭＭＲＰ１９タンパク質は、マウスＭＭＲＰ１９タンパク質と同様、細胞表面に発現することが明らかになった。
実施例１２：　ＭＭＲＰ１９タンパク質のＲＡＷ２６４．７細胞膜上への大量発現
まず精製したＭＭＲ１９ｃＤＮＡをＤＮＡリガーゼによって発現ベクターｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の制限酵素Ｓｃａ　Ｉサイトに組みこみＭＭＲ１９発現ベクターを作製した。発現ベクターのＲＡＷ２６４．７細胞への導入は高電圧パルス法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により行った。すなわち２×１０７個のＲＡＷ２６４．７細胞を１０μｇのベクターを溶解した５００μｌのリン酸カリウム緩衝液中に懸濁しキュベットにいれ、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５００μＦ、３００Ｖの高電圧パルスをかけることで細胞膜に小孔を短期間生じさせてベクターを細胞に導入した。つづいてパルス後の細胞を２５０ｍｌのフラスコに播種し、１０％　ＦＢＳ−ＥＭＥＭ培地中、３７℃で７２時間培養した。この後、培養培地中にｇｅｎｅｔｉｃｉｎを終濃度１ｇ／ｌとなるように添加してさらに２週間培養し、形質転換細胞をｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性により選択した。さらにこれらの細胞の中から３−４Ｈ７抗体に反応性を示す細胞をフローサイトメトリーによって２回選択し、ＭＭＲＰ１９タンパク質過剰発現ＲＡＷ２６４．７（ＯＥ−ＲＡＷ２６４．７）細胞を得た。
ＲＡＷ２６４．７またはＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞膜に発現しているＭＭＲＰ１９タンパク質のフローサイトメトリーによる解析は以下のようにして行った。すなわち、ＲＡＷ２６４．７またはＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞を１００μｌ　ＰＢＳ中に細胞数が１．５×１０６個になるように調製し、それぞれに３−４Ｈ７抗体を加え（終濃度５μｇ／１００μｌ）、４℃で１時間反応させた。これを５％　ＦＢＳ、０．０５％　ＮａＮ３を含むＰＢＳで３回遠心洗浄した後、ＦＩＴＣ蛍光標識した抗マウスＩｇＭ抗体を終濃度３μｇ／１００μｌとなるように細胞懸濁液に加え、さらに４℃遮光下で１時間反応させた。この後細胞を５％　ＦＢＳ、０．０５％　ＮａＮ３を含むＰＢＳで５回遠心洗浄し、蛍光標識された細胞をフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ　ＡＬＴＲＡ、ベックマンコールター社）によって検出、解析した。その結果図１１に示したように、ＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞ではＲＡＷ２６４．７細胞に比較して過剰のＭＭＲＰ１９タンパク質を細胞膜に発現していることが示され、ＭＭＲＰ１９は細胞膜タンパク質として発現されていることが明らかになった。
実施例１３：　マクロファージ系細胞での３−４Ｈ７抗体刺激によるＧ−ＣＳＦ遺伝子誘導におけるＭＭＲＰ１９タンパク質過剰発現効果の検討
ＲＡＷ２６４．７あるいはＭＭＲＰ１９タンパク質過剰発現細胞であるＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞を６ウエルマイクロプレートの各ウエルに１．５×１０６個ずつ（５×１０５個／ｍｌ）播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養した。これに３−４Ｈ７抗体（終濃度５０μｇ／ｍｌ）あるいはＬＰＳ（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下、３、６、９あるいは１２時間刺激した。つづいてこれら３−４Ｈ７抗体あるいはＬＰＳにより刺激したＲＡＷ２６４．７およびＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞からＧｕａｎｉｄｉｕｍ　Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ／Ｐｈｅｎｏｌ　Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ法により全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴａｓｅ）とＤＮＡポリメラーゼを用いて全ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成した。そして、マウスＧ−ＣＳＦ遺伝子配列の中で１２１から１３８までに対するセンスプライマー（５’−ＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＡＣＴ−３’）、５３７から５２０までに対するアンチセンスプライマー（５’−ＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧ−３’）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。その結果図１２に示したように、ＲＡＷ２６４．７細胞では３−４Ｈ７抗体刺激６時間後はじめて有意なＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ誘導が認められたのに対し、ＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞では３時間後すでにＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡが誘導が確認された。またＬＰＳの刺激では、ＲＡＷ２６４．７細胞あるいはＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞とも、６時間後はじめてＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡが誘導された。このようにＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞においてはＲＡＷ２６４．７細胞に比較して、同濃度の３−４Ｈ７抗体の刺激でより迅速にＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡの誘導が起こることが示された。しかしＬＰＳによる刺激の場合、２つの細胞間でＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡの誘導に有意な差は認められなかった。以上の結果より、３−４Ｈ７抗体がＭＭＲＰ１９タンパク質に結合することによってＧ−ＣＳＦ遺伝子が誘導されることが示唆された。またＲＡＷ２６４．７細胞あるいはＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞において、３−４Ｈ７抗体の刺激によるＧ−ＣＳＦ誘導に関わるシグナル伝達経路がＬＰＳの刺激の場合と異なる可能性が示された。
実施例１４：　マクロファージ系細胞での３−４Ｈ７抗体刺激によるＧ−ＣＳＦ分泌の酵素免疫学的検出とＭＭＲＰ１９タンパク質過剰発現効果の検討
ＲＡＷ２６４．７あるいはＭＭＲＰ１９タンパク質過剰発現細胞であるＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞を５ｃｍシャーレに１．５×１０６個／５ｍｌずつ（３×１０５個／ｍｌ）播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養した。これに３−４Ｈ７抗体（終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下、９、１２、１８あるいは２４時間刺激し、それぞれの時間に培養上清を１００μｌずつ採取した。この培養上清を９６ウエルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社、ＭａｘｉＳｏｒｐ）に移し４℃で一晩固相化した後０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ　４００μｌで３回洗浄した。この後各ウエルに１００μｌずつウサギ血清を添加し室温で３０分間インキュベーションすることでウエルをブロッキングし、やはり０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ　４００μｌで３回洗浄した。そこに１０μｇ／ｍｌの濃度に調製した抗マウスＧ−ＣＳＦヤギ抗体（Ｒ＆Ｄ社製）１００μｌを添加した後４℃で一晩インキュベーションし、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ　４００μｌで５回洗浄した。このプレートの各ウエルにさらにビオチン化した抗ヤギＩｇウサギ抗体溶液を１００μｌずつ加えて室温で１時間インキュベーションした後０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ　４００μｌで３回洗浄、１００μｌのアビジン−パーオキシダーゼ溶液を加えてさらに室温で３０分間インキュベーションした後０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ　４００μｌで５回洗浄した。その後各ウエルに１００μｌのパーオキシダーゼ基質ＡＢＴＳ溶液を加えて室温で３０分反応、マイクロプレートリーダーＭ−Ｔｍａｘ（モレキュラーデバイス社）により４０５ｎｍの吸収を測定した。その結果図１３に示すように、３−４Ｈ７抗体はＲＡＷ２６４．７あるいはＭＭＲＰ１９過剰発現細胞であるＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞において時間依存的にＧ−ＣＳＦの分泌を促進すること、またその活性はＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞において有意に高いことが示された。これらの結果（実施例７・８・１３も含めて）より、３−４Ｈ７抗体はマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞において、その細胞表面に存在するＭＭＲＰ１９タンパク質に結合、活性化しＧ−ＣＳＦを誘導、分泌させることが示唆された。
実施例１５：ヒト細胞におけるＭＭＲＰ１９タンパク質ホモローグの機能解析
ヒト由来培養細胞であるＨＬ−６０細胞（理化学研究所）は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞密度が１．５×１０５〜１．５×１０６細胞／ｍｌとなるようにして、３７℃、５％ＣＯ２存在下培養した。ＨＬ−６０細胞の好中球様細胞への分化は５００μＭのｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）で３日間処理することにより行った。またマクロファージ様細胞への分化は１００μｇ／ｍｌのｐｈｏｒｂｏｌ　１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）でやはり３日間処理することにより行った。
まず３−４Ｈ７抗体の細胞膜表面抗原の存在を未分化、好中球様分化ならびにマクロファージ様分化ＨＬ−６０細胞についてフローサイトメトリーを用いて検討した。その結果、３−４Ｈ７　ｍＡｂ表面抗原はマクロファージ様分化ＨＬ−６０細胞にのみ存在するが、未分化および好中球様分化ＨＬ−６０細胞には存在しないことが示された。またヒト型ＭＭＲＰ１９タンパク質の合成を未分化、好中球様分化ならびにマクロファージ様分化ＨＬ−６０細胞のｌｙｓａｔｅを調製し、３−４Ｈ７抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ解析した場合、あるいはＲＴ−ＰＣＲ法によって検出した場合も同様であった。以上の結果より３−４Ｈ７抗体抗原であるヒト型ＭＭＲＰ１９タンパク質は、ヒト培養細胞であるＨＬ−６０細胞をＰＭＡを用いてマクロファージ様に分化したときに発現することが示された。
つづいて３−４Ｈ７抗体のＨＬ−６０細胞におけるＧ−ＣＳＦ誘導・分泌活性を検討した。すなわち未分化、好中球様分化ならびにマクロファージ様分化ＨＬ−６０細胞を終濃度６０μｇ／ｍｌの３−４Ｈ７抗体で１８時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下刺激し、その培養上清に分泌されたＧ−ＣＳＦをＧ−ＣＳＦバイオアッセイ法（実施例８）および酵素免疫法（実施例１４）によって検出した。またこの時の細胞に含まれるＧ−ＣＳＦをＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により検出するとともにＲＴ−ＰＣＲ法（実施例１３）によりＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡを検出した。その結果、やはりマクロファージ様分化ＨＬ−６０細胞の培養上清にのみＧ−ＣＳＦが分泌されていることが示された。以上の結果より３−４Ｈ７抗体はマクロファージ様に分化したＨＬ−６０細胞においても、ヒト型ＭＭＲＰ１９タンパク質に結合、活性化し、Ｇ−ＣＳＦを誘導、分泌することが示唆された。
実施例１６：３−４Ｈ７抗体（抗ＭＭＲＰ１９抗体）によるＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡの発現誘導
＜方法＞
（１）正常マウスの骨髄細胞および腹腔マクロファージ細胞に対する３−４Ｈ７抗体の作用
ＢＡＬＢ／ｃマウス（♂、７週齢）を用い、大腿骨および脛骨の骨髄細胞および腹腔マクロファージ細胞を採取した。２１Ｇの針を付けた１ｍｌのシリンジに冷ハンクス液を適当量含ませたものを用意し、摘出した大腿骨、頚骨に針先を骨腔の一端に刺し込み、骨髄細胞を２ｍＬのチューブ内に回収した。また、１ｍｌのシリンジに冷ハンクス液を適当量含ませたものを用意し、腹腔内を良く洗浄し、細胞懸濁ＰＢＳ液を回収した。同操作を２回繰り返し、腹腔マクロファージを回収した。採取した骨髄細胞（１．５×１０６個）および腹腔マクロファージ細胞（５×１０５個）を採取し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて１８時間静置した。静置した細胞に３−４Ｈ７抗体（１、２、５、１０、２０μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて６時間培養した。溶媒のみを加えた群をコントロール群とした。
結果、３−４Ｈ７抗体（１０μｇ／ｍｌ）存在下において腹腔マクロファージ細胞内のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ量が約６．５倍上昇した（図１４）。なお、同時にＬＰＳ２０ｎｇ／ｍｌで刺激したところ、腹腔マクロファージ細胞内のＧ−ＣＳＦｍＲＮＡは約３．６倍上昇した（図１４）。また、３−４Ｈ７抗体（１０μｇ／ｍｌ）存在下において骨髄細胞内のＧ−ＣＳＦｍＲＮＡ量が約３．２倍上昇した（図１４）。なお、同時にＬＰＳ２０ｎｇ／ｍｌで刺激したところ、骨髄細胞内のＧ−ＣＳＦｍＲＮＡは約２．２倍上昇した（図１４）。
（２）正常マウスの肝由来クッパー細胞に対する３−４Ｈ７抗体の作用
マウスをペントバルビタールにて麻酔後、肝臓を傷つけないように開腹し、腸を右に寄せ門脈と下大静脈を露出させ、門脈よりペリスタポンプを介して肝灌流液にて灌流し、肝臓を脱血した。コラゲナーゼ液にて肝臓内を処理した。肝臓を摘出し、１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０／ペニシリン−ストレプトマイシン培地にて緩やかに肝臓を解した後、メッシュにて濾過し、５０ｍｌ遠心チューブ内に回収した。５５０ｒｐｍ，２ｍｉｎ，４℃の条件にて遠心し、上清を回収した。この操作を２回繰り返した。１，５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃の条件にて遠心し、上清を除去し、残った細胞塊に、ＲＰＭＩ１６４０培地を１０ｍｌ加え、細胞浮遊溶液とした。細胞懸濁液を３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター内にて１時間静置させ、ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、クッパー細胞以外の非付着性の細胞を除去した。調製したクッパー細胞に３−４Ｈ７抗体（１０、３０μｇ／ｍｌ）またはリポポリサッカライド（ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて１、３、６時間培養した。溶媒のみを加えた群をコントロール群とした。
結果、３−４Ｈ７抗体（３０μｇ／ｍｌ）刺激１時間後において、肝由来クッパー細胞内のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ量が約５．２倍上昇した（図１５）。なお、同時にＬＰＳ１μｇ／ｍｌで１時間刺激したところ、肝由来クッパー細胞内のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡは約４．４倍上昇した（図１５）。
（３）正常マウス末梢血由来マクロファージ細胞に対する３−４Ｈ７抗体の作用　マウスの心臓より採血した血液に１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０／ペニシリン―ストレプトマイシン培地、を等量加え、細胞浮遊液を調製した。１５ｍｌの遠心チューブにＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ）を入れ、細胞浮遊液を静かに重層し、２，３００ｒｐｍ、２０分、４℃にて遠心した。中間層を静かに回収し、回収した細胞浮遊液に３倍量の培地を加えて良く混和し、２，５００ｒｐｍ、５分、４℃にて遠心した。上清を除き、細胞塊を解してからＲＰＭＩ１６４０培地を加え、１，５００ｒｐｍ、５分、４℃の条件にて遠心した。同操作を更に２回繰り返し、細胞をよく洗浄した。トリパンブルー溶液にて生細胞数を計数した。この細胞浮遊液（２ｘ１０６個）を２４穴プレートに播き、３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター内にて１時間静置させた。培地にて３回洗浄し、非付着性の細胞を除去した。Ｍ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）を各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養した。調製したマクロファージ細胞に３−４Ｈ７抗体（１０、３０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて１５分および１時間培養した。溶媒のみを加えた群をコントロール群とした。
結果、３−４Ｈ７抗体（１０μｇ／ｍｌ）はマクロファージ細胞内のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ量を約４．６倍上昇させた（図１６）。なお、同時にＬＰＳ　１μｇ／ｍｌで１時間刺激したところ、マクロファージ細胞内のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡは約５．４倍上昇した（図１６）。
（４）Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
回収した細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。以上の操作はすべて室温で行なった。２００μｌのｔｏｔａｌ　ＲＮＡを１０分間、６５℃でインキュベートした後、氷冷した。
（５）マウスＧ―ＣＳＦ　ｍＲＮＡ量の測定
上記で調製したｍＲＮＡ　１０μｌとＴａｑ　Ｍａｎ　ＥＺ　ＲＴ−ＰＣＲ　ＣＯＲＥ　ＲＥＡＧＥＮＴＳ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）の試薬を９６ｗｅｌｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）内で混和し、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７７００（アプライドバイオシステム）を用いてｍｏｕｓｅ　Ｇ―ＣＳＦ　ｍＲＮＡ定量を行った（サイクル数：４０）。内部標準としてＧＡＰＤＨを用いて、それぞれのｍＲＮＡ量の補正を行った。使用したｐｒｉｍｅｒは以下に記した。
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ＰｒｏｂｅとしてｍＧ−ＣＳＦ用にはＳＹＢＥＲ　ＧＲＥＥＮ登録商標を用い、ｍＧＡＰＤＨ用にはＶｉｃ−ＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＣ−Ｔａｍｕｒａを用いた。
結果、３−４Ｈ７抗体投与３時間後において腹腔マクロファージ細胞のＧ−ＣＳＦｍＲＮＡ量は未処置の細胞と比べ約９倍上昇した（図１７）。
（６）シクロフォスファミド誘発骨髄抑制マウスに対する３−４Ｈ７抗体の作用　ＢＡＬＢ／ｃマウス（♂、９週齢）２４匹にシクロフォスファミド（２５ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍｌ／ｋｇにて腹腔内投与した（２５０ｍｇ／ｋｇ）。シクロフォスファミド投与３日後より３日間、３−４Ｈ７の溶媒のＰＢＳ−、３−４Ｈ７抗体溶液（０．４２ｍｇ／ｍｌ）及びｒｈＧ−ＣＳＦ（１μｇ／ｍｌ）を１０ｍｌ／ｋｇで１日１回腹腔内投与した。また、ｒｈＧ−ＣＳＦ（１μｇ／ｍｌ）を１０ｍｌ／ｋｇで１日１回皮下投与した。７日後に各マウスの眼底静脈からヘパリン採血管を使用して採血し（約４０μｌ）、Ｓｙｓｍｅｘ　Ｆ−８００（シスメックス）にて血球数を測定した。また、同血液を用いて血液塗沫標本を作製し、メイ・グリュンワルド−ギムザ染色を行った。染色後顕微鏡下、白血球を５分類で２００個識別カウントした。有意差検定は１−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡにて分散分析の成立を確認後、ＬＳＤ　ｔｅｓｔを行った。
結果、シクロフォスファミド投与７日目の白血球数及び好中球数が有意に増加した（図１８）。また、陽性対照として用いたヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍｇ／ｋｇ）を同様に３日間腹腔内投与したところ、７日目の白血球数及び好中球数が有意に増加し、その増加量は３−４Ｈ７抗体投与による増加量とほぼ同程度であった（図１８）。
産業上の利用の可能性
本発明の遺伝子、それがコードするタンパク質（上記遺伝子の断片および上記タンパク質の断片を含む）、抗体（そのフラグメントを含む）、受容体、および物質（低分子を含む）は新規であり、医薬用途として有用である。
また、本発明の遺伝子、それがコードするタンパク質（上記遺伝子の断片および上記タンパク質の断片を含む）、抗体（そのフラグメントを含む）、受容体は、顆粒球コロニー刺激因子の誘導・分泌能を有する物質など（例えば、モノクローナル抗体、タンパク質、その他の低分子物質など）をスクリーニングする際の分析試薬としても有用である。また、顆粒球コロニー刺激因子はエリスロポエチンによる赤芽球、インターロイキン３による芽球コロニーの形成の増強作用や白血球、赤血球、血小板等の血球増多（増強、増加）作用を示すことから、顆粒球コロニー刺激因子を誘導させるこれらの上記物質を使用することにより、顆粒球コロニー刺激因子の産生を促進する薬剤または顆粒球コロニー刺激因子に関する生物的活性を調節する薬剤として用いることが可能である。具体的には、顆粒球コロニー刺激因子を薬剤として直接投与することによる副作用を回避しつつ、好中球減少症、再生不良性貧血および／または白血球、赤血球若しくは血小板等の減少症等の治療、診断等をすることが期待できる。
また、本発明の遺伝子の断片は、他の生物由来のホモログ遺伝子をスクリーニングする際のプローブとしても有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１：３−４Ｈ７抗体及び抗ＭＭＲＰ１９部分ペプチド抗体（ＡＰＡｓ）のウエスタンブロット解析。
図２：ＭＭＲＰ１９タンパク質のハイドロパシー図。横軸は、アミノ酸残基番号、縦軸は、ハイドロパシー・インデックス（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　Ｉｎｄｅｘ）である。アミノ酸配列の中心部分の番号９９から１２８は、ＭＭＲＰ１９タンパク質の唯一の膜貫通（ＴＭ）ドメインであると考えられる。
図３：ＭＭＲＰ１９の３種の部分ペプチドに対する各抗体のＲＡＷ２６４．７に対する反応性。ＲＡＷ２６４．７におけるＭＭＲＰ１９タンパク質の細胞膜における配向性をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示した。横軸は、蛍光強度、縦軸は、細胞数である。ＡＰＡ１、ＡＰＡ２及びＡＰＡ３は抗ペプチド抗体を表す。
図４：３−４Ｈ７及び抗ＭＭＲＰ１９部分ペプチド抗体（ＡＰＡｓ）のＧ−ＣＳＦ遺伝子誘導活性。ＭＭＲＰ１９タンパク質のＧ−ＣＳＦ遺伝子発現誘導への関与を示した。横軸は加えた抗ＭＭＲＰ１９タンパク質抗体の濃度、縦軸は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子発現誘導に対応するルシフェラーゼ活性である。●は３−４Ｈ７抗体、■は抗ペプチド抗体ＡＰＡ１、◆はＡＰＡ２、▲はＡＰＡ３を表す。ルシフェラーゼ活性は、コントロールを１としたときの値（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）で表した。
図５：ＲＡＷ２６４．７細胞における３−４Ｈ７抗体（Ａ）及びＬＰＳ（Ｂ）によるＧ−ＣＳＦ分泌刺激活性。横軸は、抗体濃度（μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ濃度（ＥＵ／ｍｌ）、縦軸は、Ｇ−ＣＳＦ分泌活性（％／最大分泌）である。
図６：Ｐｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞における３−４Ｈ７抗体（Ａ）及びＬＰＳ（Ｂ）によるＧ−ＣＳＦ遺伝子誘導または分泌活性。横軸は、抗体濃度（μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ濃度（ＥＵ／ｍｌ）、縦軸は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子誘導またはＧ−ＣＳＦ分泌活性（％／最大分泌）である。●はＧ−ＣＳＦ遺伝子誘導、○はＧ−ＣＳＦ分泌活性を表す。
図７：ＲＡＷ２６４．７細胞における３−４Ｈ７抗体によるＧ−ＣＳＦ分泌量（ｎ＝６）。横軸は、３−４Ｈ７抗体の濃度（０、１、１０μｇ／ｍｌ）を表す。縦軸は、Ｇ−ＣＳＦ分泌量（ｐｇ／１０４個細胞）を表す。
図８：Ｐｉｃａ−ＲＡＷ２６４．７細胞における３−４Ｈ７抗体によるＧ−ＣＳＦ分泌量（ｎ＝６）。横軸は、３−４Ｈ７抗体の濃度（０、１、１０μｇ／ｍｌ）を表す。縦軸は、Ｇ−ＣＳＦ分泌量（ｐｇ／１０４個細胞）を表す。
図９：ＭＭＲＰ１９部分ペプチドを用いた３−４Ｈ７抗体のエピトープマッピング。横軸は、ペプチド断片の種類を表す。縦軸は、４０５ｍｍにおける吸光度を表す。
図１０：３−４Ｈ７抗体のＣＯＳ７細胞に対する反応性。サル由来細胞株ＣＯＳ７におけるヒト型ＭＭＲ１９遺伝子発現のフローサイトメトリーを示した。横軸は、蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）、縦軸は、細胞数（Ｃｅｌｌ　Ｎｕｍｂｅｒｓ）である。Ｃは形質転換していないコントロールＣＯＳ７細胞、ＨＭはヒト型ＭＭＲＰ１９タンパク質を発現させたＣＯＳ７細胞をそれぞれ３−４Ｈ７抗体で染色したものを表す。
図１１：ＭＭＲＰ１９のＲＡＷ２６４．７細胞上への大量発現。ＲＡＷ２６４．７細胞（形質転換していない細胞株）またはＭＭＲＰ１９過剰発現ＲＡＷ２６４．７細胞（ＯＥ−ＲＡＷ２６４．７；形質転換細胞）におけるヒト型ＭＭＲ１９遺伝子発現のフローサイトメトリーを示した。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数である。
図１２：ＭＭＲＰ１９タンパク質を大量発現させたＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＧ−ＣＳＦ産生誘導。数字は、刺激後の時間を表し、上段はＧ−ＣＳＦ、下段はコントロールとしてのＧ３ＰＤＨのＰＣＲにより増幅されたバンドを表す。
図１３：ＭＭＲＰ１９過剰発現細胞における３−４Ｈ７抗体刺激時のＧ−ＣＳＦ分泌量の増加。ＲＡＷ２６４．７細胞またはＯＥ−ＲＡＷ２６４．７細胞における３−４Ｈ７抗体刺激時のＧ−ＣＳＦ分泌量を、ＥＬＩＳＡにより検出した。横軸は時間、縦軸は４０５ｍｍにおける吸光度（Ｇ−ＣＳＦの分泌量）を表す。
図１４：腹腔マクロファージ細胞および骨髄細胞に対する３−４Ｈ７抗体のマウスＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ誘導作用。腹腔マクロファージ細胞（０．５×１０６個）あるいは骨髄細胞（１．５×１０６個）を１８時間静置し、３−４Ｈ７抗体及びＬＰＳを加え６時間培養した。６時間後、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔにて抽出し、マウスＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＰＲＩＳＭ　７７００）にて測定した。また、内部標準としてＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ量を測定し、ＲＮＡ量を補正した。
図１５：肝由来クッパー細胞に対する３−４Ｈ７抗体のマウスＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ誘導作用。マウス肝臓よりクッパー細胞を調製し、３−４Ｈ７抗体（１０、３０μｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加え、１、３、６時間後にクッパー細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙキットにてＲＮＡを抽出した。マウスＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＰＲＩＳＭ　７７００）にて測定した。また、内部標準としてＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ量を測定し、ＲＮＡ量を補正した。
図１６：マクロファージ細胞における３−４Ｈ７抗体のマウスＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ誘導作用。マウス付着性末梢単核球をマクロファージコロニー刺激因子（３０ｎｇ／ｍｌ）にて４日間培養し、マクロファージ細胞へ分化させた。マクロファージ細胞に３−４Ｈ７抗体（１０、３０μｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加え、１５分、１時間後にマクロファージ細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙキットにてＲＮＡを抽出した。マウスＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＰＲＩＳＭ　７７００）にて測定した。また、内部標準としてＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ量を測定し、ＲＮＡ量を補正した。
図１７：３−４Ｈ７抗体投与による腹腔マクロファージ細胞のマウスＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ誘導作用。３−４Ｈ７抗体（４．２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、３、６、９時間後に腹腔マクロファージ細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙキットにてＲＮＡを抽出した。マウスＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＰＲＩＳＭ　７７００）にて測定した。また、内部標準としてＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ量を測定し、ＲＮＡ量を補正した。
図１８：シクロフォスファミド誘発骨髄抑制マウスに対する３−４Ｈ７抗体の効果。マウスにシクロフォスファミド（２５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。シクロフォスファミド投与開始３日後より３日間、溶媒、３−４Ｈ７抗体（４．２ｍｇ／ｋｇ）またはｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。陽性対照としてｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ）を皮下投与した（Ｎ＝６）。シクロフォスファミド投与開始７日後にマウスの眼窩静脈叢より採血し、末梢白血球数、赤血球数、血小板数をＳｙｓｍｅｘ　Ｆ−８００にて測定した。また、同血液サンプルの塗沫標本をメイギュルンワルド−ギムザ染色し、好中球率を計数した。統計計算は１元配置分散分析後、ＬＳＤテストを行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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