(57)【要約】スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体調節剤からなる気道抵抗制御剤。Ｓ１Ｐの吸入により気道閉塞が亢進されることから、Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストは気道抵抗を低下させ、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患の治療、予防に有用である。またＳ１Ｐ受容体アゴニストを用いた系はＳ１Ｐ受容体アンタゴニストのスクリーニングに有用である。
2003020313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体調節剤からなる呼吸器疾患の治療および／または予防剤。
【請求項２】
請求の範囲１記載のスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体調節剤を有効成分として含有する、気道収縮、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管狭窄症、びまん性汎細気管支炎、または感染、結合組織病もしくは移植に伴なう気管支炎、びまん性過誤腫性肺脈管筋腫症（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｏｓｉｓ）、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、間質性肺炎、肺癌、過敏性肺臓炎、または特発性間質性肺炎の治療および／または予防剤。
【請求項３】
気道抵抗を制御するＳ１Ｐ受容体調節剤からなる請求の範囲１記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤。
【請求項４】
気道平滑筋細胞増殖を制御するＳ１Ｐ受容体調節剤からなる請求の範囲１記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤。
【請求項５】
Ｓ１Ｐ受容体調節剤が、気道抵抗低下作用を有するＳ１Ｐ受容体アンタゴニストである請求の範囲３記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤。
【請求項６】
Ｓ１Ｐ受容体調節剤が、気道抵抗上昇作用を有するＳ１Ｐ受容体アゴニストである請求の範囲３記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤。
【請求項７】
請求の範囲５記載の気道抵抗低下作用を有するＳ１Ｐ受容体アンタゴニストを有効成分として含有する、気道収縮、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管狭窄症、びまん性汎細気管支炎、または感染、結合組織病もしくは移植に伴なう気管支炎の治療および／または予防剤。
【請求項８】
Ｓ１Ｐ受容体がＥＤＧ−１、ＥＤＧ−３またはＥＤＧ−５である請求の範囲７記載の治療剤および／または予防剤。
【請求項９】
Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストが、ＥＤＧ−１、ＥＤＧ−３またはＥＤＧ−５のアンタゴニストである請求の範囲５記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤。
【請求項１０】
Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストが、ＥＤＧ−５アンタゴニストである請求の範囲９記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤。
【請求項１１】
ＥＤＧ−５アンタゴニストが、式（ＩＩ）
2003020313.tif 000008
（式中、Ｒ１ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキルまたは−ＣＯＲ７ａ（基中、Ｒ７ａはＣ１〜８アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアラルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、置換されていてもよいアリールオキシまたは置換されていてもよいアラルキルオキシを表わす。）を表わし、
Ｒ２ａはＣ１〜８アルキルまたは置換されていてもよいアリールを表わし、
Ｒ３ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、ハロアルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルまたは置換されていてもよいアリールを表わし、
Ｒ４ａは水素原子またはＣ１〜８アルキルを表わし、
Ｒ５ａおよびＲ６ａは、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、ハロアルキル、Ｃ１〜８アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜８アルキル）アミノ、アシル、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ、置換されていてもよいアラルキルオキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアラルキル、アルコキシアルキルまたは−ＣＯＮＨＲ８ａ（基中、Ｒ８ａは置換されていてもよりアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを表わす。）を表わし、
Ｘａは−Ｎ（Ｒ９ａ）−（基中、Ｒ９ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキルまたは−ＮＨＲ１０ａ（基中、Ｒ１０ａはカルボキシルまたはＣ２〜６アルコキシカルボニルを表わす。）を表わす。）、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝または−ＣＨ（Ｒ１１ａ）−（基中、Ｒ１１ａは水素原子またはＣ１〜８アルキルを表わす。）を表わし、
Ｙａは−Ｎ（Ｒ１２ａ）−（基中、Ｒ１２ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキル、置換されていてもよいアラルキル、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニルまたは−ＣＯＮＨＲ１３ａ（基中、Ｒ１３ａは、置換されていてもよいアリールまたは、置換されていてもよいアラルキルを表わす。）を表わす。）、＝Ｎ−、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−Ｏ−、−ＣＯ−または単結合を表わし、
Ｚａは−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−または単結合を表わし、
Ｗａは−Ｎ（Ｒ１４ａ）−（基中、Ｒ１４ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキル、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル、置換されていてもよいアリールオキシカルボニルまたはヘテロアリールＣ１〜８アルキルを表わす。）、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−（ただし、窒素原子は環Ａａと結合する。）、−ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−（ただし、炭素原子は環Ａａと結合する。）または単結合を表わし、−−−−−は、二重結合または単結合を表わし、
環Ａａは置換されていてもよいアリール、ヘテロアリールまたはＣ３〜７シクロアルキルを表わす。）で示されるピラゾロピリジン化合物またはそれらの非毒性塩である請求の範囲１０に記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤。
【請求項１２】
気道平滑筋細胞増殖を制御するＳ１Ｐ受容体調節剤がＥＤＧ−５アンタゴニストである請求の範囲４記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤。
【請求項１３】
請求の範囲１２記載の気道平滑筋細胞増殖を制御するＥＤＧ−５アンタゴニストを有効成分として含有する、慢性気管支喘息、びまん性過誤腫性肺脈管筋腫症、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺炎、肺癌、過敏性肺臓炎、びまん性汎細気管支炎または特発性間質性肺炎の治療および／または予防剤。
【請求項１４】
ＥＤＧ−５アンタゴニストが、請求の範囲１１に記載の式（ＩＩ）で示されるピラゾロピリジン化合物またはそれらの非毒性塩である請求の範囲１３に記載の治療および／または予防剤。
【請求項１５】
請求の範囲６記載の気道抵抗上昇作用を有するＳ１Ｐ受容体アゴニストを用いることを特徴とする哺乳動物の気道抵抗の測定方法。
【請求項１６】
Ｓ１Ｐを吸入させる請求の範囲１５記載の哺乳動物の気道抵抗の測定方法。
【請求項１７】
請求の範囲１６記載の方法を用いることを特徴とする気道抵抗を低下させることのできる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求の範囲１７記載の方法によって得られる気道抵抗を低下させることのできる化合物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１ＰまたはＳＰＰとも呼ばれる。以下本明細書中、Ｓ１Ｐと略記することがある。）受容体調節剤からなる呼吸器疾患治療剤に関する。
さらに詳しく言えば、本発明は、
（１）Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストからなる気道抵抗低下剤または気道平滑筋細胞の増殖抑制剤、および
（２）Ｓ１Ｐ受容体アゴニストを用いることを特徴とする気道抵抗低下作用を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
式（Ｉ）
2003020313.tif 000003
で示されるスフィンゴシン−１−リン酸（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４−エニル−１−リン酸；Ｓ１Ｐ）は細胞内でのスフィンゴ脂質の代謝回転や、細胞外での分泌性スフィンゴシンキナーゼの作用で合成される脂質であり、細胞間および細胞内のメッセンジャーとして働くことが提唱されている（Ｈｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．５８，２０１（１９９９））。Ｓ１Ｐの細胞内セカンドメッセンジャーとしての作用を示唆する実験結果が当初報告されたが（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１６５３（１９９０））、Ｓ１Ｐが直接作用する細胞内分子は未だ見出されていない。一方、Ｓ１Ｐの細胞外からの作用には、Ｇタンパク質共役型受容体のＥＤＧ−１（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅ−１）とその類縁分子であるＥＤＧ−３、ＥＤＧ−５、ＥＤＧ−６およびＥＤＧ−８が関与することが相次いで示され、細胞外からＳ１Ｐを加えたときに生じる様々な薬理作用が、細胞膜に存在するこれらＳ１Ｐ受容体を介して起こることが分かってきた。ＥＤＧ−１がＳ１Ｐ受容体であることは１９９８年に報告され（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，１５５２（１９９８））、その後他の受容体もＳ１Ｐと反応することが示されたが、これらの受容体はリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体であるＥＤＧ−２，４，７とも高い相同性を有していることが明らかになり、ＥＤＧ−１〜８はＳ１Ｐ／ＬＰＡ受容体ファミリーを形成するとされている。
なお、ＥＤＧ−１，３，５，６，８はそれぞれＳ１Ｐ１，Ｓ１Ｐ３．Ｓ１Ｐ２，Ｓ１Ｐ４，Ｓ１Ｐ５とも呼ばれている。
Ｓ１Ｐの作用として、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）では平滑筋細胞や癌細胞の運動抑制、血小板の凝集などが、またインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）では血管新生作用、腎血流の減少作用、肺線維化の抑制作用などが知られている。Ｓ１Ｐの血管新生作用に関して、Ｍｅｎｑ−Ｊｅｒ  Ｌｅｅらはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて、Ｓ１ＰがＥＤＧ−１およびＥＤＧ−３受容体を介するＨＵＶＥＣのサーバイバル延長、接着点形成、および微小血管形成を促すことを報告している（Ｃｅｌｌ  ９９，３０１（１９９９））。また、彼らはＳ１Ｐはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）においても血管新生に対してＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；線維芽細胞増殖因子）やＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；血管内皮増殖因子）と相乗的に作用し、効果を示すことを報告している。ＯＫ−Ｈｅｅ  Ｌｅｅらも同様にＨＵＶＥＣを用いてＳ１ＰのＨＵＶＥＣに対するＤＮＡ合成促進作用、および遊走作用を明らかにし、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）においても血管新生に対して、Ｓ１Ｐが単独で血管新生を促進することを報告している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６４，７４３（１９９９））。これらのことより、Ｓ１Ｐの生体内での生理作用の一つとして血管新生促進作用があることが考えられる。
Ｓ１Ｐの腎血流に対する作用に関しては、Ａｎｇｅｌａ  Ｂｉｓｃｈｏｆｆらは最近、Ｓ１Ｐがラット腎血流を一過性に強力に減少させることを見出した（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３０，１８７８（２０００））。この作用はＧｉαシグナルを抑制する百日咳毒素により阻害されることから、Ｇｉαと結合したＳ１Ｐ受容体を介していると考えられている。
一方、Ｓ１Ｐの肺への作用として、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ではＳ１Ｐが気道平滑筋細胞（Ａｉｒｗａｙ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ，ＡＳＭ）の増殖を亢進する作用が知られている（Ａｍｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．Ｍａｒｃｈ  ２０，２００１）。さらにＳ１Ｐが肺線維化を抑制することが、ブレオマイシン惹起の肺線維症モデルを用いて明らかになっている（ＷＯ０１／０３７３９号）。
しかし、Ｓ１Ｐの気道抵抗上昇作用についてはこれまで全く知られていないし、さらにはＳ１Ｐの気道平滑筋増殖作用がどの受容体を介しているかについても全く知られていない。
なお、Ｓ１Ｐ受容体に対するリガンドとしては、ＷＯ０１／９８３０１号明細書には、ピラゾロピリジン化合物がＳ１Ｐ受容体拮抗作用を有し、肝線維症、肺線維症、腎線維症および動脈硬化症の治療に有効である旨の記載がある。
発明の開示
本発明者らは、Ｓ１Ｐの受容体の役割を解明すべくＳ１Ｐが有する生理作用について種々検討を行なった結果、意外にもＳ１Ｐが気道抵抗の上昇に関わっていることを見出した。またそのサブタイプとしてＥＤＧ−３および／またはＥＤＧ−５が関与していることが明らかになった。また、ＥＤＧ−５アンタゴニストが気管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有することも明らかになった。これらのことは従来技術から見て全く予期できないことであり、今回、本発明者らが実験により初めて確認したことである。
すなわち、本発明はＳ１Ｐ受容体調節剤からなる呼吸器疾患治療剤に関する。
さらに詳しくは、
１．スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体調節剤からなる呼吸器疾患の治療および／または予防剤、
２．前項１記載のスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体調節剤を有効成分として含有する、気道収縮、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管狭窄症、びまん性汎細気管支炎、または感染、結合組織病もしくは移植に伴なう気管支炎、びまん性過誤腫性肺脈管筋腫症（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｏｓｉｓ）、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、間質性肺炎、肺癌、過敏性肺臓炎、または特発性間質性肺炎の治療および／または予防剤、
３．気道抵抗を制御するＳ１Ｐ受容体調節剤からなる前項１記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤、
４．気道平滑筋細胞増殖を制御するＳ１Ｐ受容体調節剤からなる前項１記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤、
５．Ｓ１Ｐ受容体調節剤が、気道抵抗低下作用を有するＳ１Ｐ受容体アンタゴニストである前項３記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤、
６．Ｓ１Ｐ受容体調節剤が、気道抵抗上昇作用を有するＳ１Ｐ受容体アゴニストである前項３記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤、
７．前項５記載の気道抵抗低下作用を有するＳ１Ｐ受容体アンタゴニストを有効成分として含有する、気道収縮、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管狭窄症、びまん性汎細気管支炎、または感染、結合組織病もしくは移植に伴なう気管支炎の治療および／または予防剤、
８．Ｓ１Ｐ受容体がＥＤＧ−１、ＥＤＧ−３またはＥＤＧ−５である前項７記載の治療剤および／または予防剤、
９．Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストが、ＥＤＧ−１、ＥＤＧ−３またはＥＤＧ−５のアンタゴニストである前項５記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤、
１０．Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストが、ＥＤＧ−５アンタゴニストである前項９記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤、
１１．ＥＤＧ−５アンタゴニストが、式（ＩＩ）
2003020313.tif 000004
（式中の記号は後記と同じ意味を表わす。）
で示されるピラゾロピリジン化合物またはそれらの非毒性塩である前項１０に記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤、
１２．気道平滑筋細胞増殖を制御するＳ１Ｐ受容体調節剤がＥＤＧ−５アンタゴニストである前項４記載の呼吸器疾患の治療および／または予防剤、
１３．前項１２記載の気道平滑筋細胞増殖を制御するＥＤＧ−５アンタゴニストを有効成分として含有する、慢性気管支喘息、びまん性過誤腫性肺脈管筋腫症、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺炎、肺癌、過敏性肺臓炎、びまん性汎細気管支炎または特発性間質性肺炎の治療および／または予防剤、
１４．ＥＤＧ−５アンタゴニストが、前項１１に記載の式（ＩＩ）で示されるピラゾロピリジン化合物またはそれらの非毒性塩である前項１３に記載の治療および／または予防剤、
１５．前項６記載の気道抵抗上昇作用を有するＳ１Ｐ受容体アゴニストを用いることを特徴とする哺乳動物の気道抵抗の測定方法、
１６．Ｓ１Ｐを吸入させる前項１５記載の哺乳動物の気道抵抗の測定方法、
１７．前項１６記載の方法を用いることを特徴とする気道抵抗を低下させることのできる化合物のスクリーニング方法、および
１８．前項１７記載の方法によって得られる気道抵抗を低下させることのできる化合物に関する。
本発明において、Ｓ１Ｐとは式（Ｉ）で示されるスフィンゴシン−１−リン酸を意味する。
2003020313.tif 000005
Ｓ１Ｐ受容体アゴニストとしては、Ｓ１Ｐ受容体に作用し、Ｓ１Ｐ受容体を活性化するものなら何でもよく、天然および非天然の化合物を含む。Ｓ１Ｐ受容体アゴニストのうちＥＤＧ−１、３、５、６および８アゴニストが好ましく、特に好ましいのは、Ｓ１Ｐ自身、ＥＤＧ−３アゴニストおよび５アゴニストである。
Ｓ１Ｐ受容体アゴニストは、吸入により気道閉塞作用を有することから、哺乳動物を用いた気道抵抗の測定に有用である。
Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストとしては、Ｓ１Ｐ受容体に作用し、Ｓ１Ｐ受容体を不活性化するものなら何でもよく、天然および非天然の化合物を含む。Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストのうち、ＥＤＧ−１、３、５、６、８アンタゴニストが好ましく、特に好ましいのは、ＥＤＧ−３および５アンタゴニストである。
Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストは気道抵抗低下作用を有することから、気道収縮、気道閉塞が関与するとされる気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管狭窄症、びまん性汎細気管支炎、および感染、結合組織病または移植に伴なう気管支炎の治療および／または予防に有効であると考えられる。
また、ＥＤＧ−５アンタゴニストは気管支平滑筋増殖抑制作用を有することから、気道平滑筋細胞増殖に伴う疾患、すなわち慢性気管支喘息、びまん性過誤腫性肺脈管筋腫症（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｏｓｉｓ）、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺炎、肺癌、過敏性肺臓炎、びまん性汎細気管支炎、特発性間質性肺炎などの疾患の治療および／または予防に有効であると考えられる。
本発明で使用するＥＤＧ−５アンタゴニストは、ＥＤＧ−５に作用し、ＥＤＧ−５を不活性化するものであれば何でも構わない。例えば、以下の式（ＩＩ）で示される化合物またはそれらの非毒性塩が好適に用いられる。
2003020313.tif 000006
（式中、Ｒ１ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキルまたは−ＣＯＲ７ａ（基中、Ｒ７ａはＣ１〜８アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアラルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、置換されていてもよいアリールオキシまたは置換されていてもよいアラルキルオキシを表わす。）を表わし、
Ｒ２ａはＣ１〜８アルキルまたは置換されていてもよいアリールを表わし、
Ｒ３ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、ハロアルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルまたは置換されていてもよいアリールを表わし、
Ｒ４ａは水素原子またはＣ１〜８アルキルを表わし、
Ｒ５ａおよびＲ６ａは、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、ハロアルキル、Ｃ１〜８アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜８アルキル）アミノ、アシル、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ、置換されていてもよいアラルキルオキシ、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアラルキル、アルコキシアルキルまたは−ＣＯＮＨＲ８ａ（基中、Ｒ８ａは置換されていてもよりアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを表わす。）を表わし、
Ｘａは−Ｎ（Ｒ９ａ）−（基中、Ｒ９ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキルまたは−ＮＨＲ１０ａ（基中、Ｒ１０ａはカルボキシルまたはＣ２〜６アルコキシカルボニルを表わす。）を表わす。）、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝または−ＣＨ（Ｒ１１ａ）−（基中、Ｒ１１ａは水素原子またはＣ１〜８アルキルを表わす。）を表わし、
Ｙａは−Ｎ（Ｒ１２ａ）−（基中、Ｒ１２ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキル、置換されていてもよいアラルキル、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニルまたは−ＣＯＮＨＲ１３ａ（基中、Ｒ１３ａは、置換されていてもよいアリールまたは、置換されていてもよいアラルキルを表わす。）を表わす。）、＝Ｎ−、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−Ｏ−、−ＣＯ−または単結合を表わし、
Ｚａは−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−または単結合を表わし、
Ｗａは−Ｎ（Ｒ１４ａ）−（基中、Ｒ１４ａは水素原子、Ｃ１〜８アルキル、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル、置換されていてもよいアリールオキシカルボニルまたはヘテロアリールＣ１〜８アルキルを表わす。）、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−（ただし、窒素原子は環Ａａと結合する。）、−ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−（ただし、炭素原子は環Ａａと結合する。）または単結合を表わし、−−−−−は、二重結合または単結合を表わし、
環Ａａは置換されていてもよいアリール、ヘテロアリールまたはＣ３〜７シクロアルキルを表わす。）
本発明者らは、Ｓ１Ｐがインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でモルモット気道抵抗を上昇させることを初めて確認した（実施例１）。Ｓ１Ｐと気道との関連性を示唆する既報としては、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）実験での上記ＡＳＭ細胞を用いた報告があるのみであり（Ａｍｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．Ｍａｒｃｈ  ２０，２００１）、この報告から今回発見したＳ１Ｐの気道抵抗上昇作用を推測することはできない。
Ｓ１Ｐを気道に吸入した時に低濃度から気道抵抗の上昇が惹起されるという今回の発見により初めて、直接的にＳ１Ｐの気道抵抗に及ぼす効果が明確になった。
この作用はＳ１Ｐの麻酔下モルモットへの吸入（１０〜１００μｇ／ｍＬ）で有意に認められ（実施例１）、静脈内投与では僅かに認められた（実施例２）。一般に気道抵抗の上昇は気道収縮、気道閉塞から起こり、呼吸器疾患と密接に関連しているとされている。また気道抵抗を上昇させる生理活性因子は受容体を介して呼吸器疾患の増悪因子として作用することが知られている（以上、最新内科学体系、第６０巻「肺気腫，閉塞性肺疾患」、同第６２巻「気管支喘息，アレルギー性肺疾患」，中山書店）。Ｓ１Ｐの本作用は、Ｓ１Ｐのビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）である１０％メイロンやＳ１Ｐの陰性対照薬であるスフィンゴシンでは作用は認められなかったこと（参考例１）、体外からＳ１Ｐを処置したときに生じる反応であることより、Ｓ１Ｐ受容体を介した作用であることが示唆される。Ｓ１Ｐ受容体サブタイプとして、ＥＤＧ−１、３、５、６、８の可能性が考えられる。また気管支拡張薬サルブタモールの前処置によって気道閉塞は部分的にしか抑制されなかったことから（実施例３）、Ｓ１Ｐの作用点として気管支平滑筋収縮およびこれ以外の気道閉塞作用があることが示唆される。
なお、ＥＤＧ−３およびＥＤＧ−５アンタゴニストを用いた実験により、Ｓ１Ｐによって惹起される気道収縮作用を抑制する作用はＥＤＧ−３およびＥＤＧ−５を介することが示唆される（実施例４、５および６）。
また、気道平滑筋における細胞増殖がＥＤＧ−５を介して起こること（実施例７）から、ＥＤＧ−５アンタゴニストは気道リモデリングを伴う慢性喘息などの疾患に有効と考えられる。
さらに、気道抵抗の上昇はＳ１Ｐの投与によって起こることから、Ｓ１Ｐの吸入または静脈内投与で気道抵抗が上昇することを測定する本実験系は、（１）Ｓ１Ｐの生理作用評価系として高感度である、（２）短期系である、（３）化合物の作用評価法として汎用性がある、などの理由からＳ１Ｐ受容体アンタゴニストのスクリーニング系として有用である。
これらのことから、本発明者らはＳ１Ｐが気道抵抗を強力に上昇させる作用を有することを初めて明らかにした。またその作用は気道平滑筋の収縮および／または物理的な気道閉塞である可能性が示唆され、Ｓ１Ｐと病態との関連性が予測される。
［毒性］
本発明に用いられる化合物の毒性は低いものであり、医薬として使用するために十分に安全であると判断できる。
産業上の利用可能性
［医薬品への適用］
本発明で使用されるＳ１Ｐ受容体アンタゴニストは、Ｓ１Ｐ受容体に結合するため、気道閉塞に起因する疾患、すなわち気道収縮、気管支喘息、慢性喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管狭窄症、びまん性汎細気管支炎または感染、結合組織病もしくは移植に伴なう気管支炎の予防および／または治療に有用であると考えられる。またこのＳ１Ｐ受容体のうち、ＥＤＧ−３またはＥＤＧ−５がこれらの作用に関係するため、ＥＤＧ−３および／またはＥＤＧ−５アンタゴニストがこれらの疾患の予防および／または治療に有用であると考えられる。
また、Ｓ１Ｐ受容体アゴニストを用いた本方法は、Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストを見出すスクリーニング方法として有用である。
なお、ＥＤＧ−５が気道平滑筋細胞増殖作用に関連していることから、ＥＤＧ−５アンタゴニストは、気道平滑筋細胞増殖に伴う疾患、すなわち慢性気管支喘息、びまん性過誤腫性肺脈管筋腫症（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｏｓｉｓ）、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺炎、肺癌、過敏性肺臓炎、びまん性汎細気管支炎、特発性間質性肺炎などの予防および／または治療に有用である。
本発明のＳ１Ｐ受容体調節剤を上記の目的で用いるには、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間などにより異なるが、通常、成人一人あたり、１回につき、１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口投与されるか、または成人一人あたり、１回につき、０．１ｍｇから１００ｍｇの範囲で、１日１回から数回非経口投与（好ましくは、静脈内投与）されるか、または１日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与される。
もちろん前記したように、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
ＥＤＧ−５アンタゴニストの慢性喘息に対する予防および／または治療効果の補完および／または増強のために他の薬剤を併用することができる。
他の薬剤としては、ステロイド剤、β２アドレナリン受容体刺激薬、ロイコトリエン受容体拮抗剤、トロンボキサン合成酵素阻害剤、トロンボキサンＡ２受容体拮抗剤、メディエーター遊離抑制薬、抗ヒスタミン剤、キサンチン誘導体、抗コリン薬、サイトカイン阻害薬、プロスタグランジン類、フォルスコリン製剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、去痰薬、抗生物質等が用いられる。
ステロイド剤としては、例えば、外用薬として、プロピオン酸クロベタゾール、酢酸ジフロラゾン、フルオシノニド、フランカルボン酸モメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ジフルプレドナート、プデソニド、吉草酸ジフルコルトロン、アムシノニド、ハルシノニド、デキサメタゾン、プロピオン酸デキサメタゾン、吉草酸デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、プロピオン酸デプロドン、吉草酸酢酸プレドニゾロン、フルオシノロンアセトニド、プロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、ピバル酸フルメタゾン、プロピオン酸アルクロメタゾン、酪酸クロベタゾン、プレドニゾロン、プロピオン酸ペクロメタゾン、フルドロキシコルチド等が挙げられ、
内服薬、注射剤として、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、ブチル酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酢酸ハロプレドン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメサゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメタゾン、酢酸パラメサゾン、ベタメタゾン等が挙げられ、
吸入剤として、プロピオン酸ベクロメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、ブデソニド、フルニソリド、トリアムシノロン、ＳＴ−１２６Ｐ、シクレソニド、デキサメタゾンパロミチオネート、モメタゾンフランカルボネート、プラステロンスルホネート、デフラザコート、メチルプレドニゾロンスレプタネート、メチルプレドニゾロンナトリウムスクシネート等が挙げられる。
β２アドレナリン受容体刺激薬としては、例えば、臭化水素酸フェノテロール、硫酸サルブタモール、硫酸テルブタリン、フマル酸フォルモテロール、キシナホ酸サルメテロール、硫酸イソプロテレノール、硫酸オルシプレナリン、硫酸クロルプレナリン、エピネフリン、塩酸トリメトキノール、硫酸ヘキソプレナリンメシル、塩酸プロカテロール、塩酸ツロブテロール、ツロブテロール、塩酸ピルブテロール、塩酸クレンブテロール、塩酸マブテロール、塩酸リトドリン、バンブテロール、塩酸ドペキサミン、酒石酸メルアドリン、ＡＲ−Ｃ６８３９７、レボサルブタモール、Ｒ、Ｒ−フォルモテロール、ＫＵＲ−１２４６、ＫＵＬ−７２１１、ＡＲ−Ｃ８９８５５、Ｓ−１３１９等が挙げられる。
ロイコトリエン受容体拮抗剤としては、例えば、プランルカスト水和物、モンテルカスト、ザフィルルカスト、セラトロダスト、ＭＣＣ−８４７、ＫＣＡ−７５７、ＣＳ−６１５、ＹＭ−１５８、Ｌ−７４０５１５、ＣＰ−１９５４９４、ＬＭ−１４８４、ＲＳ−６３５、Ａ−９３１７８、Ｓ−３６４９６、ＢＩＩＬ−２８４、ＯＮＯ−４０５７等が挙げられる。
トロンボキサン合成酵素阻害剤としては、例えば、塩酸オザグレル、イミトロダストナトリウム等が挙げられる。
トロンボキサンＡ２受容体拮抗剤としては、例えば、セラトロダスト、ラマトロバン、ドミトロバンカルシウム水和物、ＫＴ−２−９６２等が挙げられる。
メディエーター遊離抑制薬としては、例えば、トラニラスト、クロモグリク酸ナトリウム、アンレキサノクス、レピリナスト、イブジラスト、ダザノラスト、ペミロラストカリウム等が挙げられる。
抗ヒスタミン剤としては、例えば、フマル酸ケトチフェン、メキタジン、塩酸アゼラスチン、オキサトミド、テルフェナジン、フマル酸エメダスチン、塩酸エピナスチン、アステミゾール、エバスチン、塩酸セチリジン、ベポタスチン、フェキソフェナジン、ロラタジン、デスロラタジン、塩酸オロパタジン、ＴＡＫ−４２７、ＺＣＲ−２０６０、ＮＩＰ−５３０、モメタゾンフロエート、ミゾラスチン、ＢＰ−２９４、アンドラスト、オーラノフィン、アクリバスチン等が挙げられる。
キサンチン誘導体としては、例えば、アミノフィリン、テオフィリン、ドキソフィリン、シパムフィリン、ジプロフィリン等が挙げられる。
抗コリン剤としては、例えば、臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、臭化フルトロピウム、臭化シメトロピウム、テミベリン、臭化チオトロピウム、レバトロペート（ＵＫ−１１２１６６）等が挙げられる。
サイトカイン阻害薬としては、例えばトシル酸スプラタスト（商品名アイピーディ）等が挙げられる。
プロスタグランジン類（以下、ＰＧと略記する。）としては、ＰＧ受容体アゴニスト、ＰＧ受容体アンタゴニスト等が挙げられる。
ＰＧ受容体としては、ＰＧＥ受容体（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４）、ＰＧＤ受容体（ＤＰ、ＣＲＴＨ２）、ＰＧＦ受容体（ＦＰ）、ＰＧＩ受容体（ＩＰ）、ＴＸ受容体（ＴＰ）等が挙げられる。
ホスホジェステラーゼ阻害剤としては、例えば、ＰＤＥ４阻害剤であるロリプラム、シロミラスト（商品名アリフロ）、Ｂａｙ１９−８００４、ＮＩＫ−６１６、ロフルミラスト（ＢＹ−２１７）、シパムフィリン（ＢＲＬ−６１０６３）、アチゾラム（ＣＰ−８０６３３）、ＳＣＨ−３５１５９１、ＹＭ−９７６、Ｖ−１１２９４Ａ、ＰＤ−１６８７８７、Ｄ−４３９６、ＩＣ−４８５等が挙げられる。
エラスターゼ阻害剤としては、ＯＮＯ−５０４６、ＯＮＯ−６８１８、ＭＲ−８８９、ＰＢＩ−１１０１、ＥＰＩ−ＨＮＥ−４、Ｒ−６６５、ＺＤ−０８９２、ＺＤ−８３２１、ＧＷ−３１１６１６、ＡＥ−３７６３等が挙げられる。
去痰薬としては、例えば、アンモニアウイキョウ精、炭酸水素ナトリウム、塩酸ブロムヘキシン、カルボシステイン、塩酸アンブロキソール、塩酸アンブロキゾール徐放剤、メチルシステイン塩酸塩、アセチルシステイン、塩酸Ｌ−エチルシステイン、チロキサポール等が挙げられる。
本発明化合物を投与する際には、経口投与のための内服用固形剤、内服用液剤および、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤などとして用いられる。
経口投与のための内服用固形剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。
このような内服用固形剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質はそのままか、または賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプンなど）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウムなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムなど）、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸など）などと混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなど）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための内服用液剤は、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含む。このような液剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる希釈剤（精製水、エタノールまたはそれらの混液など）に溶解、懸濁または乳化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤などを含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類など、およびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）など）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤などを含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって調製される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためのその他の製剤としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟膏剤、塗布剤、吸入剤、スプレー剤、坐剤および膣内投与のためのペッサリーなどが含まれる。
スプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤となど張性を与えるような緩衝剤、例えば塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第２，８６８，６９１号および同第３，０９５，３５５号に詳しく記載されている。
発明を実施するための最良の形態
以下、参考例および実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：麻酔下モルモットを用いた気道抵抗の測定
モルモット気道抵抗の測定はコンゼット−ロスラー法（Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄ．Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍａｋ．１９５，７１〜）を改変して行なった。雄性ハートレイ系モルモット（５〜７週齢，使用時体重３００〜５００ｇ）をペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）により麻酔、仰臥固定し、気管および頸静脈にカニューレを施した。人工呼吸器により気道を確保し（５ｍＬ／ｓｔｒｏｋｅ，６０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ）、送気路をＴ字管で分岐させブロンコスパスムトランスデューサーに接続させ気道抵抗を測定した。モルモットにガラミン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）を投与し、不動化した。また、化合物の吸入前にアセチルコリン（３０μｇ／ｋｇ静脈内投与）を投与することにより各個体の一過性の気道収縮の感受性をチェックし、感受性が同等の個体を用いた。
超音波式ネブライザー（オムロンＮＥ  Ｕ−０７）でＳ１Ｐ（Ａｌｅｘｉｓ社製）を気化させて、５分間吸引させた（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．５０，４４５−４６６（１９８９））。気管カニューレ側のチューブをクランプした場合の気道抵抗値からＳ１Ｐ吸入開始時の気道抵抗値を差し引き、これに１０分（吸入５分＋吸入終了後５分）を乗した面積を完全閉塞（ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ）とした。化合物投与による気道閉塞率の計算はＳ１Ｐ吸入開始後、１０分間（吸入５分＋吸入終了後５分）のＡＵＣを完全閉塞（ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ）で除し、気道閉塞率（ＡＵＣ／ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ）％とした。Ｓ１Ｐ（０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ）を麻酔下モルモットに吸入し気道抵抗を測定した。
その結果、０．１〜１ｍｇ／ｍＬ投与時に強い気道抵抗の上昇が認められた。０．１ｍｇ／ｍＬ投与時の結果を図１に示す。また、気道抵抗の上昇はＳ１Ｐ吸入を中止しても持続的にかつ不可逆的に認められた。Ｓ１Ｐの吸入による気道抵抗上昇作用はヒスタミンの吸入と同レベル（Ｓ１Ｐとヒスタミンの分子量からモル数に換算）で、用量依存型であった（図２（Ａ），（Ｂ）、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ）。
参考例１：１０％メイロンおよびスフィンゴシンの吸入投与による気道抵抗の測定
１０％メイロンおよびスフィンゴシン（Ｍａｔｒｅｙａ社製，０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ）を用いて実施例１で示される方法と同様に行なった。その結果、１０％メイロンおよびスフィンゴシンいずれの投与群でも気道抵抗の上昇は認められなかった（図３）。
実施例２：Ｓ１Ｐの静脈内投与による気道抵抗の測定
雄性モルモット（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｈａｒｔｌｅｙ，５〜７週齢，使用時体重３００〜５００ｇ）をペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）により麻酔、仰臥固定し、気管および頸静脈にカニューレを施した。Ｓ１Ｐを静脈内投与し、実施例１と同様に気道抵抗の測定を行なった。Ｓ１Ｐ投与群に気道抵抗の上昇が認められたが（図４（Ａ））、ヒスタミンと比較すると軽微であった（図４（Ｂ））。
実施例３：サルブタモール前処置による気道抵抗への影響
気管支拡張薬であるサルブタモール（１００μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を前処置したあと、実施例１で示される方法と同様に操作して、気道抵抗への影響を調べた。
その結果、サルブタモールの前処置（１００μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）によってＳ１Ｐの気道抵抗上昇は部分的にしか抑制されなかった。そのため、Ｓ１Ｐの作用点として気管支平滑筋収縮およびこれ以外の気道閉塞作用があることが示唆された（図５）。
実施例４：ＥＤＧ−１，３および５拮抗活性の評価
ヒトＥＤＧ−５遺伝子を過剰発現させたチャイニーズハムスターオーバリー（ＣＨＯ）細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびブラスチサイジン（５μｇ／ｍｌ）含有のＨａｍ’ｓＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）で培養した。培養した細胞をＦｕｒａ２（５μＭ）−ＡＭ溶液［ＦＢＳ（１０％）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．４）、およびプロベネシド（２．５ｍＭ）含有のＨａｍ’ｓＦ１２培地）］中で、３７℃、６０分間インキュベートした。２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．４）、プロベネシドを含むＨａｎｋｓ液（２．５ｍＭ）で１回洗浄し、同液に浸した。蛍光ドラッグスクリーニングシステムにプレートをセットし、３０秒間無刺激で細胞内カルシウムイオン濃度を測定した。被験薬（終濃度は１ｎＭ〜１０μＭのジメチルスルホキシド溶液）の溶液を添加した後、その５分後にＳ１Ｐ（終濃度：１００ｎＭ）を加え、Ｓ１Ｐ添加前後の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を３秒間隔で測定した（励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍ、蛍光波長５００ｎｍ）。ＥＤＧ−５拮抗活性は、各種化合物の代わりにＤＭＳＯを添加したウェルでのＳ１Ｐ（終濃度：１００ｎＭ）によるピーク値をコントロール値（Ａ）とし、化合物を処置した細胞でのＳ１Ｐ添加前の値から添加後の上昇値（Ｂ）とを比較し、抑制率（％）として以下のように算出した。
抑制率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／Ａ｝×１００
ＩＣ５０値は、抑制率５０％を示す本発明化合物の濃度として算出した。なお、ＥＤＧ−１，３アンタゴニストの評価に関してもヒトＥＤＧ−１またはＥＤＧ−３を過剰発現させた細胞を作製し、ＥＤＧ−５と同様の方法で行なった。代表例として、ＥＤＧ−５アンタゴニストである化合物１（Ｎ−（１Ｈ−１，３−ジメチル−４−イソプロピルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素）の活性を表１に示す。
2003020313.tif 000007
実施例５：モルモット摘出気管のＳ１Ｐによる収縮作用に対するＥＤＧ−５およびＥＤＧ−３アンタゴニストの阻害活性
安楽死させた雄性ハートレイ系モルモットの気管を摘出し、速やかにクレブス−ヘンゼライト液（１１２ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５．９ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１．２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、２５．０ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウムＮａＨＣＯ３、１１．５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース、４℃）に浸した。摘出組織はらせん状標本としてクレブス−ヘンゼライト液（３７±１℃、［９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２］を通気）を充たしたマグヌス管内（容量：１０ｍＬ）に懸垂した。１ｇの張力負荷を与え６０分間安定させた後、フォース・ディスプレースメント・トランスデューサー（Ｆｏｒｃｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）からひずみ圧アンプを介してレコーダー上に収縮運動を記録した。コントロールの収縮反応は、高濃度塩化カリウム液（クレブス−ヘンゼライトの塩化ナトリウムをすべて塩化カリウムに置換したもの）、ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）あるいはヒスタミン刺激により得た。ＥＤＧアンタゴニストは、Ｓ１Ｐによる収縮を起こした後に加えた。マグヌス管内に懸垂した後は、適時、標本の洗浄を繰り返した。
Ｓ１Ｐ（１０μｍｏｌ／Ｌ）のモルモット気管に対する作用を観察した結果、Ｓ１Ｐは非常にゆっくりとした収縮作用を示し、この収縮の速度は他の収縮薬（ＬＴＤ４、ヒスタミンなど）と比べて３〜５倍長く、プラトーに到達するまで３０〜６０分程度を要した（図６）。
次に各種Ｓ１Ｐ受容体作用薬の作用を検討した。化合物１（Ｎ−（１Ｈ−１，３−ジメチル−４−イソプロピルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素）；ＥＤＧ−５特異的アンタゴニスト）はＳ１Ｐによる収縮を抑制した（図６）。これらのことから、Ｓ１Ｐの気管収縮に関する受容体はＥＤＧ−５であることが示唆された。
ただし、ラットを用いた同様の検討ではＥＤＧ−５以外にＥＤＧ−３の作用の関与も認められている。
実施例６：麻酔下モルモットのＳ１Ｐによるインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における気道抵抗の上昇に対するＥＤＧ−５アンタゴニストの阻害活性
モルモット気道抵抗の測定はコンゼット−ロスラー法（Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄ．Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍａｋ．１９５，７１〜）を改変して行なった。雄性ハートレイ系モルモット（５〜７週齢，使用時体重３００〜５００ｇ）をペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）により麻酔、仰臥固定し、気管および頸静脈にカニューレを施した。人工呼吸器により気道を確保し（５ｍＬ／ｓｔｒｏｋｅ，６０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ）、送気路をＴ字管で分岐させブロンコスパスムトランスデューサーに接続させ気道抵抗を測定した。モルモットにガラミン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）を投与し、不動化した。超音波式ネブライザーでＳ１Ｐを気化させて、５分間吸引させた（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．５０，４４５−４６６（１９８９）を参照）。Ｓ１Ｐ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を麻酔下モルモットに吸入し気道抵抗を測定した。強い気道抵抗の上昇が認められた後、化合物１を静脈内投与した。その結果、Ｓ１Ｐによって惹起された気道抵抗の上昇が抑制された（図７）ことから、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるＳ１Ｐの気道抵抗の上昇はＥＤＧ−５を介していることが示された。
実施例７：ヒト気道平滑筋細胞のＳ１ＰによるＤＮＡ合成促進作用のＥＤＧ−５アンタゴニストによる阻害活性
正常ヒト気道平滑筋細胞（ＢＳＭＣ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）に１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、アムフォテルシンＢ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびヒトｂＦＧＦ、ヒトインスリン含有ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ社）を加えて培養し、２４時間後にデオキシブロモウリジン（ＢｒｄＵ）を加えた。
ヒトインスリン含有ＭＥＭ−α培地に１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で正常ヒト気道平滑筋細胞（ＢＳＭＣ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）を９６ウエルプレートに播き２４時間培養した後、ハンクス液で２回洗浄し、無血清培地（ＭＥＭ−α／ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、アムフォテルシンＢ（５０ｎｇ／ｍＬ）に交換してさらに２４時間培養した。その後Ｓ１Ｐを終濃度０．０３μＭ〜１０μＭの濃度で添加し、それと同時にデオキシブロモウリジン（ＢｒｄＵ）を加えさらに６時間培養してＢｒｄＵ取りこみ活性を測定した。また、コントロールとしてＳ１Ｐのビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）である生理食塩水を同量加えた。
細胞をＢｒｄＵで処理後、培養上清を捨て、各ウェルに細胞固定・ＤＮＡ変性溶液を１５０μＬ加えて３０分間放置した。細胞固定・ＤＮＡ変性溶液を取り除き、ブロッキングバッファー（１５０μＬ）を加えさらに３０分間放置した。次にブロッキングバッファーを取り除き、ペルオキシダーゼでラベルした抗ＢｒｄＵ抗体溶液（１００μＬ）を加え３０分間放置した。次に抗体溶液を取り除き、洗浄バッファー（ＰＢＳ（−））（１５０μＬ）で３回洗浄し、水分を取り除いた後、反応基質溶液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの１５％ＤＭＳＯ溶液；１００μＬ）を加えた。１５分後、２Ｎ硫酸溶液を２５μＬ加え、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
上記で示した方法でＢＳＭＣを培養し、Ｓ１Ｐを加える直前に化合物１（終濃度：０．０１μＭ〜１０μＭ）を加えた。Ｓ１Ｐ（３μＭ）を加えた後にＢｒｄＵを加えさらに６時間培養してＢｒｄＵ取りこみ活性を測定した。その結果、ＥＤＧ−５アンタゴニストがＳ１Ｐに拮抗して阻害作用を示した。
遊離ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）を指標とした細胞毒性評価を行なったところ、化合物１は培地中でのＬＤＨの活性に増強は認められなかった。
これらのことから、Ｓ１Ｐ刺激がヒト気道平滑筋細胞のＤＮＡ合成を促進することおよびその担当受容体がＥＤＧ−５であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｓ１Ｐ吸入によるモルモット気道抵抗の上昇を示すグラフである。
図２は、（Ａ）Ｓ１Ｐ吸入によるモルモット気道抵抗の上昇を示すグラフおよび（Ｂ）ヒスタミン吸入によるモルモット気道抵抗の上昇を示すグラフである。
図３は、スフィンゴシン吸入によるモルモットの気道への影響を示すグラフである。
図４は、（Ａ）Ｓ１Ｐの静脈投与によるモルモット気道抵抗の上昇を示すグラフおよび（Ｂ）ヒスタミンの静脈投与によるモルモット気道抵抗の上昇を示すグラフである。
図５は、Ｓ１Ｐ投与前にサルブタモール投与を行なった影響を示すグラフである。
図６は、Ｓ１Ｐ惹起モルモット摘出気管収縮におけるＥＤＧ−５アンタゴニストの抑制作用を示すグラフである。
図７は、Ｓ１Ｐ吸入によるモルモット気道抵抗の上昇に対するＥＤＧ−５アンタゴニストの効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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