(57)【要約】乳癌に対し治療効果のある癌組織特異的な癌治療薬を提供する。重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含むヒトモノクローナル抗体と抗腫瘍性物質とを、当該抗腫瘍性物質を封入したリポソームに当該抗体を結合させる等により会合させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含むヒトモノクローナル抗体と、この抗体に会合した抗腫瘍性物質とを含む乳癌治療薬。
【請求項２】
モノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むものである請求項１記載の乳癌治療薬。
【請求項３】
抗腫瘍性物質を内包するリポソームの表面に抗体を結合させることにより、抗体に抗腫瘍性物質が会合している請求項１または２記載の乳癌治療薬。
【請求項４】
脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームに、抗体をチオエーテル基を介して結合させることにより、リポソームの表面に抗体が結合している請求項３記載の乳癌治療薬。
【請求項５】
抗体の結合量がマレイミド化脂質１モルに対して０．１〜２モル％である請求項４記載の乳癌治療薬。
【請求項６】
マレイミド基を有するリポソームと抗体由来のイオウ含有基とを反応させてチオエーテル結合を形成することにより、リポソームの表面に抗体が結合している請求項４又は５に記載の乳癌治療薬。
【請求項７】
リポソームの表面にさらにポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合した請求項３〜６のいずれかに記載の乳癌治療薬。
【請求項８】
ポリアルキレングリコール部分を含む化合物の結合量がリポソームに含まれるマレイミド化脂質１モルに対して１５〜５０モル％である請求項７記載の乳癌治療薬。
【請求項９】
マレイミド化脂質のマレイミド基と、チオール基を付加したポリアルキレングリコール部分を含む化合物とを反応させることにより、リポソームの表面にポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合している請求項７または８記載の乳癌治療薬。
【請求項１０】
ポリアルキレングリコール部分がポリエチレングリコール部分である請求項７〜９のいずれかに記載の乳癌治療薬。
【請求項１１】
ポリアルキレングリコール部分を含む化合物が２つのポリエチレングリコール部分を有する化合物である請求項１０に記載の乳癌治療薬。
【請求項１２】
ポリエチレングリコール部分の分子量が２，０００〜７，０００ダルトンである請求項１０または１１に記載の乳癌治療薬。
【請求項１３】
抗体がＦ（ａｂ´）２フラグメントである請求項１〜１２のいずれかに記載の乳癌治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、乳癌治療薬に関するものである。
背景技術
抗体の特異的な反応性を利用して、抗腫瘍性物質等の薬剤を抗体との複合体として投与し、抗腫瘍性物質を癌組織に集積させる方法が開発されている。例えば、薬剤を修飾することなく大量に運ぶ手段として、リポソームに薬剤を封入しその表面に抗体を結合したもの、すなわち抗体結合リポソームが提案されており、その優れた抗腫瘍効果が多数報告されている（今野ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７，４４７１（１９８７）、橋本ら、特開昭５８−１３４０３号公報）。
癌組織に対する抗体として、胃癌及び大腸癌との反応性からスクリーニングされたヒトモノクローナル抗体であるＧＡＨ抗体が知られている（特開平４−３４６９１８号及び特開平５−３０４９８７号各号公報）。しかしながら、一般に抗体とは抗原に対する特異性が極めて高いものであり、胃癌及び大腸癌との反応性からスクリーニングされたＧＡＨ抗体の、他の癌との反応性を予測することは当業者でも困難である。
また、乳癌をターゲットとした抗体医薬としては、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）に対する抗体（国際公開ＷＯ８９／６６９２号公報参照）が現在開発されているが、この抗体は、もともとマウス由来のモノクローナル抗体として取得されたものを、さらに遺伝子組換法によりヒト化したものであり、超可変領域はマウス由来である。このように、既知抗原をマウスに免役して得られた抗体であれば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などを用いて抗原そのものの分布を確認し癌種を特定することも容易であるが、純粋なヒト由来のモノクローナル抗体の場合、マウス由来の抗体とは異なり、抗原そのものの分布を確認することや癌種を特定することが困難である。
発明の開示
本発明の課題は、乳癌に対しても効果のある癌組織特異的な癌治療薬を提供することである。
本発明者らは、ＧＡＨ抗体が、胃癌、大腸癌などの消化器系の癌種以外に、乳癌にも反応性がある、幅広い特異性をもつ抗体であること、及び、この抗体に抗腫瘍性物質を会合させたものにより乳癌の増殖が有効に抑制されることを見い出し、本発明を完成した。
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
（１）重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含むヒトモノクローナル抗体と、この抗体に会合した抗腫瘍性物質とを含む乳癌治療薬。
（２）モノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むものである前記に記載の乳癌治療薬。
（３）抗腫瘍性物質を内包するリポソームの表面に抗体を結合させることにより、抗体に抗腫瘍性物質が会合している前記に記載の乳癌治療薬。
（４）脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームに、抗体をチオエーテル基を介して結合させることにより、リポソームの表面に抗体が結合している前記に記載の乳癌治療薬。
（５）抗体の結合量がマレイミド化脂質１モルに対して０．１〜２モル％である前記に記載の乳癌治療薬。
（６）マレイミド基を有するリポソームと抗体由来のイオウ含有基とを反応させてチオエーテル結合を形成することにより、リポソームの表面に抗体が結合している前記に記載の乳癌治療薬。
（７）リポソームの表面にさらにポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合した前記に記載の乳癌治療薬。
（８）ポリアルキレングリコール部分を含む化合物の結合量がリポソームに含まれるマレイミド化脂質１モルに対して１５〜５０モル％である前記に記載の乳癌治療薬。
（９）マレイミド化脂質のマレイミド基と、チオール基を付加したポリアルキレングリコール部分を含む化合物とを反応させることにより、リポソームの表面にポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合している前記に記載の乳癌治療薬。
（１０）ポリアルキレングリコール部分がポリエチレングリコール部分である前記に記載の乳癌治療薬。
（１１）ポリアルキレングリコール部分を含む化合物が２つのポリエチレングリコール部分を有する化合物である前記に記載の乳癌治療薬。
（１２）ポリエチレングリコール部分の分子量が２，０００〜７，０００ダルトンである前記に記載の乳癌治療薬。
（１３）抗体がＦ（ａｂ´）２フラグメントである前記に記載の乳癌治療薬。
発明を実施するための最良の形態
本発明の乳癌治療薬は、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含むヒトモノクローナル抗体と、この抗体に会合した抗腫瘍性物質とを含む。
本発明において、乳癌治療薬とは、用いる抗体が反応性を示す細胞または組織を含む乳癌に対する抗腫瘍剤を意味する。
本発明は、ＧＡＨ抗体が乳癌組織に対する反応性を有するという知見、及び、この抗体に抗腫瘍性物質を会合させたものにより乳癌の増殖が有効に抑制されるという知見に基づいてなされたものである。ＧＡＨ抗体において、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列は、重鎖可変領域の中でも超可変領域と呼ばれ、同様に配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列は、軽鎖可変領域の中でも超可変領域と呼ばれる。かかる領域は、免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定するものであり、相補性決定部とも呼ばれる。従って、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。すなわち、ＧＡＨ抗体と同様の超可変領域を有する抗体はＧＡＨ抗体と同様に本発明において使用できると考えられる。
従って、本発明に使用されるヒトモノクローナル抗体は、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含むものである。これらのアミノ酸配列は、通常、重鎖及び軽鎖の各鎖の３つの超可変領域に、Ｎ末端側から、配列表の配列番号１、２及び３並びに配列表の配列番号４、５及び６の順でそれぞれ含まれる。本発明においては、乳癌組織との反応性を損なわない範囲で一部のアミノ酸を置換、挿入、削除あるいは追加する等の改変を行ったものも、本発明において使用できるモノクローナル抗体に含まれる。
本発明において使用されるヒトモノクローナル抗体は、癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、上記の特定のアミノ酸配列を有するものを選択することによって得ることができる。
ハイブリドーマは、Ａ．Ｉｍａｍらの方法〔Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓａｒｃｈ４５，２６３（１９８５）〕に準じて、まず、癌患者から摘出された癌所属のリンパ節から、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞と融合して得られる。得られたハイブリドーマの上清を用いて、パラフォルムアルデヒド固定した各種癌細胞株に対し、エンザイムイムノアッセイにより陽性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングを行う。
さらに、ハイブリドーマの上清から、常法〔Ｒ．Ｃ．Ｄｕｈａｍｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１，２１１（１９７９）〕によりモノクローナル抗体を精製し、蛍光物質でラベルし、生癌細胞株、各種の赤血球、白血球等に対する反応性をフローサイトメトリーで検出することにより、生癌細胞株に対しては反応性を示す抗体を、赤血球、白血球に対しては、反応性を示さない抗体を選別する。また、癌患者から摘出される癌組織から単離される癌細胞、および同一患者の同一組織の非癌部から単離される正常細胞に対する反応性を比較して、癌細胞に、より多量の抗体が結合し、正常細胞には反応がないか、もしくは健常人由来の抗体と同程度の反応性しかない抗体を選別する。
かくして選別されたハイブリドーマが産生する抗体をコードするＤＮＡの塩基配列は、たとえば、以下の方法によって得られる。抗体産生ハイブリドーマから、チオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法〔Ｃａｓａｒａら，ＤＮＡ，２，３２９（１９８３）〕でｍＲＮＡを調製して、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてそのｃＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、ｃＤＮＡに（ｄＧ）テーリングを行い、このｄＧテールにハイブリダイズするポリＣと、既に遺伝子が取得されているヒト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の各々共通な配列部分をプローブとしてＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。その後、ＤＮＡの末端平滑化を行い、電気泳動法によってゲルから切りだしたＤＮＡをｐＵＣ１１９等のクローニングベクターに挿入し、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）〕によってその塩基配列が決定される。この塩基配列に基づいて、上記特定のアミノ酸配列を有するものを選別できる。
また、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、遺伝子工学的な手法により作製することもできる。
本発明において特に好適なモノクローナル抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が夫々配列表の配列番号７および８のアミノ酸配列で表されるものである。重鎖および軽鎖の定常領域の塩基配列は、例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４，１７７９（１９８６）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５７，１５１６（１９８２）およびＣｅｌｌ  ２２，１９７（１９８０）に記載のものと同じ配列を有するものでよい。
本抗体は、本抗体を産生するハイブリドーマを牛胎児血清含有ｅＲＤＦ、ＲＰＭＩ  １６４０培養液等を用いて培養するか、または、上記の特定の超可変領域を含む可変領域をコードするＤＮＡにさらに重鎖および軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡが夫々連結された遺伝子を化学合成し、その遺伝子の発現を可能とする公知の種々の発現ベクター、例えば、動物細胞における発現ベクターとして、ｐＫＣＲＨ２〔三品ら、Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６０５（１９８４）〕から特開平５−３０４９８７号公報の図１または図２に示した手順で構築することができるｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨとｐＫＣＲＤに挿入し、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハイスター卵巣細胞）等の宿主中で発現させることにより得ることができる。例えば、重鎖遺伝子の両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加したものをｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、またこのプラスミドのＳａｌＩ部位にＤＨＦＲ遺伝子等の選択マーカー遺伝子を挿入する。一方、軽鎖遺伝子の両端にはＥｃｏＲＩ部位を付加したものをｐＫＣＲＤのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、さらにこのプラスミドのＳａｌＩ部位にもＤＨＦＲ遺伝子を挿入する。両プラスミドをＣＨＯｄｈｆｒ−〔Ｕｒｌａｕｂ  Ｇ．＆  Ｃｈａｓｉｎ  Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６（１９８０）〕等の細胞にリン酸カルシウム法で導入し、ヌクレオチドを含まないαＭＥＭ培養液等で増殖する細胞から、さらに抗体を産生する細胞を選別することによって得ることができる。抗体は、これらの細胞を培養した培養液から、プロテインＡをセルロファイン、アガロース等の支持体に結合させたカラム等に吸着し、溶出させること等によって精製される。
抗体としては、全長抗体（抗体全体）又は抗体断片（抗体フラグメント）、又は抗体誘導体などを用いることができる。
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗体全体及び抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ＳＣＦｖ（一本鎖抗体）など）のほか、誘導体化又は修飾した抗体などを包含しており、最も広義に解釈しなければならない。
ヒトモノクローナル抗体は、本発明の乳癌治療薬をヒトに投与する場合、異種動物の蛋白質ではない点で有利である。
本発明に使用される抗腫瘍性物質の種類は特に限定されないが、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の抗腫瘍剤（抗癌剤）；リシンＡ、ジフテリアトキシン等の毒素；アンチセンスＲＮＡ；並びにそれらの薬学的に許容し得る塩及び誘導体などを用いることができる。これらの物質は、市販品を購入するか、または、それぞれ公知の方法により適宜製造することにより得ることができる。
上記の薬学的に許容し得る塩としては、薬学的に許容し得る多価陰イオン性物質との塩、例えば、クエン酸塩、酒石酸塩、グルタミン酸塩、及びそれらの誘導体との塩が好ましい。
抗体と抗腫瘍性物質との会合は、抗体と抗腫瘍性物質を化学的に結合する方法、リポソームに抗腫瘍性物質を封入し、そのリポソームの表面に抗体を結合する方法等、当業者に利用可能な方法によって行うことができる。
本発明の乳癌治療薬においては、抗腫瘍性物質を内包するリポソームの表面に抗体を結合させることにより、抗体に抗腫瘍性物質が会合していることが好ましい。
リポソームを構成する脂質としては、例えば、天然レシチン（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン）やジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルフォファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルフォスファチジン酸（ＤＭＰＡ）等のリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質等の糖脂質、脂肪酸、両親媒性ジアルキルジメチルアンモニウム（ｄｉａｌｋｙｌ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｎｏｎｉｕｍ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ）、ポリグリセロールアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，１４１，１９９３）、アルキルグリコシド、アルキルメチルグルカミド、アルキルシュークロースエステル、ジアルキルポリオキシエチレンエーテル、ジアルキルポリグリセロールエーテル等（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，１４１，１９９３）、ポリオキシエチレン−ポリ乳酸等の両親媒性ブロック共重合体等（特表平６−５０８８３１号公報）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの脂質は単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができ、さらにコレステロール等の非極性物質、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ１，Ｎ１−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）等のコレステロール誘導体と組み合わせ用いてもよい。
リポソームにおいては、ポリアルキレングリコールを含む化合物及び必要に応じて抗体などの蛋白質の結合のために、脂質成分の一部として、例えばマレイミド化フォスファチジルエタノールアミンなどのマレイミド化された脂質（本明細書において「マレイミド化脂質」と呼ぶ。）を用いることが好ましい。全脂質に対するマレイミド化脂質の割合は、通常、約０．５〜１０モル％である。
マレイミド化フォスファチジルエタノールアミンの例で説明すると、この化合物はアミノ基に反応性を有するマレイミド含有化合物とフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のアミノ基との反応により得られる。該マレイミド含有化合物はカプロイル基、ベンゾイル基、フェニルブチリル基等の残基を含んでいてもよく、例えば、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド等を挙げることができる。ＰＥとしてはジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等のフォスファチジルエタノールアミン類が使用できるが、好ましくはＤＰＰＥである。脂質成分として、さらにステアリルアミン、ジセチルフォスフェートなどの荷電性物質を含んでいてもよい。また、リポソームは、ウイルスの一部または全部を組み込んだ融合リポソーム、例えばセンダイウイルスとリポソームを融合したリポソームであってもよい。
典型的なリポソームとしては、例えば、フォスファチジルコリン１モルに対して、コレステロールを０．３〜１モル、好ましくは０．４〜０．６モル、マレイミド化フォスファチジルエタノールアミンを０．０１〜０．２モル、好ましくは０．０２〜０．１モル、さらに好ましくは０．０２〜０．０５モルを含む脂質組成物を用いることができ、フォスファチジン酸を加える場合には０．４モル以下、好ましくは０．１５モル以下の脂質組成物を用いることができる。
リポソームの製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な方法はいずれも適用可能である。また、リポソームの形態も特に限定されず、いかなる形態であってもよい。例えば、ガラス壁に付着させた脂質薄膜に水溶液を加え、機械的振盪を加えて形成するマルチラメラリポソーム（ＭＬＶ）；超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法により得られるスモールユニラメラリポソーム（ＳＵＶ）；界面活性剤除去法、逆相蒸発法（リポソーム、砂本順三ら、南江堂、１９９８）、ＭＬＶを均一孔径を有するメンブランから加圧により押し出すイクストゥルージョン法等によって得られるラージユニラメラリポソーム（ＬＵＶ）のいずれであってもよい（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，１４１，１９９３）。リポソームの粒径は、例えば、３００ｎｍ以下、好ましくは３０から２００ｎｍ程度である。
リポソームには抗腫瘍性物質が封入される。抗腫瘍性物質をリポソームに導入する方法は特に限定されず、当業者に利用可能は方法はいずれも適用可能である。例えば、リポソーム形成時に水溶液として添加してリポソーム内部に封入してもよい。また、リポソーム形成後、ベジクル内外にｐＨ勾配などの濃度勾配を形成し、このポテンシャルを駆動力としてイオン化可能な抗腫瘍性物質をリポソーム内部に取り込ませる方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９，５９２２，１９８９；ＢＢＡ，４５５，２６９，１９７６）などを用いることができる。
リポソームの表面に抗体を結合させる方法としては、精製抗体に疎水性の物質を結合させ、リポソームに挿入する方法、ホスファチジルエタノールアミンと抗体とをグルタールで架橋させる方法等があるが、好適には、抗体にチオール基を付与した後、リポソームのマレイミド基と該チオール化抗体とを反応させることによって、リポソームを抗体で修飾する方法が挙げられる。抗体へのチオール基の付与は、抗体のアミノ基に対して、蛋白質のチオール化に通常用いるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３，１９７８）やイミノチオラン、メルカプトアルキルイミデート（Ｔｒａｕｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，３２６６，１９７３）等の化合物を反応させる方法により行なうことができる。
また、抗体由来のイオウ含有基、すなわち、抗体の内在性ジオール基を反応させることもでき、抗体活性の維持の点から内在性ジチオール基を用いる方法は好適である。抗体の内在性ジチオール基は、それを還元してチオール基とすることによりマレイミド基と反応させることができる。例えば、ＩｇＧを用いる場合はペプシン等の酵素でＦ（ａｂ´）２化し、さらにジチオスレイトール等で還元して得られるＦａｂ´に生じるチオール基をリポソームとの結合反応に利用することができる（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，４２２９，１９８１）。ＩｇＭの場合には、ミラーらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，２８６，１９６５）に準じ、緩和な条件でＪ鎖を還元して得られるＩｇＭｓのＦｃ部分のチオール基をリポソームとの結合に利用すればよい。特開平５−３０４９８７号公報に記載されたＧＡＨ抗体を用いる場合には、Ｆ（ａｂ´）２を用いることが好適である。
チオール基が付与された抗体などの蛋白質とマレイミド基を含むリポソームとの結合は、通常には、中性の緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）中で２〜１６時間反応させることにより達成される。
リポソームは、その表面に、ポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合していることが好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールなどを用いることができるが、ポリエチレングリコールを用いることが好ましい。
ポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量が２，０００〜７，０００ダルトン程度のもの、好ましくは約５，０００ダルトン程度のものを用いることができる。
リポソームは、上記ポリアルキレングリコール部分を含む化合物がリポソーム表面のマレイミド化脂質にチオエーテル結合を介して結合した形態を有していることが好ましい。この場合には、通常、ポリアルキレングリコール部分を含む化合物にチオール基を導入した後、この化合物をリポソームのマレイミド基と反応させることにより、ポリアルキレングリコールを結合させたリポソームを製造することができる。ポリアルキレングリコール部分を含む化合物としては、通常、ポリエチレングリコール基を有し、かつ末端にチオール化可能な化合物又は末端にメルカプト基を有する化合物を挙げることができる。具体的には、例えば、ポリアルキレングリコール基をトリアジンに結合した化合物、さらに該トリアジンがアミノ酸などにより置換された化合物を挙げることができる。この際、ポリアルキレングリコール基を２つ有する化合物（２本鎖）であってもよい。
チオール基が導入されたポリアルキレングリコール部分を含む化合物の製造には、ポリアルキレングリコールとしてポリエチレングリコールを用いる場合には、例えば、モノメトキシポリオキシエチレンアミンと各種チオールカルボン酸とを脱水縮合する方法；モノメトキシポリオキシエチレンアミンにＳＰＤＰでピリジルジチオプロピオニル基を導入し、さらに還元する方法；モノメトキシポリオキシエチレンアミンにイミノチオランによりチオール基を導入する方法；モノメトキシポリオキシエチレンカルボン酸の活性エステルと各種チオールアミンを結合させる方法；ポリエチレングリコールトリアジン誘導体をチオールアミンと縮合する方法などを利用することができる。さらに具体的には、２，４−ビス（ポチエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジン（活性化ＰＥＧ２（生化学工業株式会社製））をシスチンと反応させ、さらに還元してシステイン結合活性化ＰＥＧ２を得ることができる。
リポソームにおけるポリアルキレングリコール部分を含む化合物の結合量は特に限定されず、残存マレイミド化脂質に対して過剰に反応させてもよいが、ポリアルキレングリコールの好ましい結合量としては、全脂質に対して０．２８〜０．９０モル％程度、より好ましくは０．２８〜０．５６モル％程度、マレイミド化脂質に対しては１５〜５０モル％程度、より好ましくは１５〜３０モル％程度であり、ＤＰＰＣに対して０．４４〜１．４５モル％程度、より好ましくは０．４４〜０．８９モル％程度である。
本発明の好ましい実施態様では、抗体及びポリアルキレングリコール部分を含む化合物とが結合されたリポソームが使用され、これを製造するためには、まず、マレイミド基を有するリポソームに対して中性の緩衝液中でチオール化抗体を反応させる。例えば、リポソームを構成する全脂質１００ｍｇあたり０．５〜５．３ｍｇ、好ましくは０．５〜４．５ｍｇ、より好ましくは１．２〜２ｍｇの抗体が結合するように、すなわちチオール化抗体をマレイミド基（マレイミド化脂質）１モルに対して、０．１モル％から約２モル％程度、好ましくは０．１〜１．６モル％、より好ましくは０．４〜０．７モル％反応させればよい。ついで、残存しているマレイミド基に対してチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を反応させ、抗体とポリアルキレングリコール部分を含む化合物とが結合したリポソームを製造することができ、具体的には、マレイミド化脂質基１モルに対して、１５モル％から５０モル％、好ましくは１５〜３０モル％（全脂質に対して０．２８〜０．９０モル％、好ましくは０．２８〜０．５６モル％、ＤＰＰＣを用いる場合には、ＤＰＰＣに対して０．４４〜１．４５モル％、好ましくは０．４４〜０．８９モル％）のチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を加え、抗体とポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合したリポソームを製造することができる。
抗体が結合した腫瘍性物質含有リポソームは、公知の方法、例えば、脱水法（特表平２−５０２３４８号公報）、安定化剤を加え液剤として用いる方法（特開昭６４−９３３１号公報）、凍結乾燥法（特開昭６４−９９３１号公報）等により製剤化することができ、乳癌の治療のために、血管内投与、局所投与などの方法で患者に投与することができる。投与量は有効成分の抗腫瘍性物質の種類に応じて適宜選択することができるが、例えばドキソルビシンを封入したリポソームを投与する場合には、有効成分量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。
実施例
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１  乳癌組織に対するＧＡＨ抗体の反応性
特開平５−３０４９８７号公報（実施例１、２、３）に記載のＧＡＨ抗体にビオチン化試薬（アマシャム社製）を用いてビオチン化標識を行った。ヒト乳癌組織のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、５％−ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に室温で１時間浸してブロッキングを行った後、１００μｇ／ｍｌのビオチン化ＧＡＨ抗体溶液と３７℃で２時間反応させた。切片をＰＢＳで洗浄し、４μｇ／ｍｌのＰｅｒＣＰ（ペリジニン  クロロフィル  プロテイン）標識ストレプトアビジン溶液（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｉｎ社製）と遮光下、氷冷中で３０分間反応させた。ＧＡＨ抗体の乳癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長４９０ｎｍにおける６８０ｎｍのＰｅｒＣＰの赤色蛍光として検出した。ＧＡＨ抗体の反応性をその特異的赤色蛍光の強度、ならびに分布から判断した結果、乳癌組織１１例に対し、５例の陽性反応が確認された。
乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ４６８（大日本製薬）を培養し、それぞれの細胞をヌードマウス（５週令オス、日本クレア）の皮下に移植した。腫瘍が約１ｃｍ３程度の大きさに増殖した時点で腫瘍を摘出し、パラフィン包埋を行い組織切片を作製した。これらの乳癌組織切片に対するＧＡＨ抗体の反応性を、上記ヒト乳癌組織切片に対する反応性検討と同様の方法を用いて行った結果、乳癌株３株の内、ＭＤＡ−ＭＢ２３１に陽性反応が認められた。
実施例２  ＧＡＨ抗体結合リポソームの乳癌細胞株に対する増殖抑制効果
ＷＯ００／６４４１３号公報（実施例１）に記載の方法に準じて、ドキソルビシン（ＤＸＲ）（協和発酵社）を封入したリポソームを作成し、チオール化したＧＡＨ抗体を結合させ、さらにチオール化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させ、抗体結合リポソームを作成した。また、これらの手順から抗体結合の操作を省くことによって抗体非結合リポソームを作成した。
ＧＡＨ抗体の反応性が確認された乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１を９６−ウェルプレートに５×１０３個／ウェルの密度に播種し、１０％ＦＢＳ添加したｅ−ＲＤＦ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で２日培養を行った後、培養上清を除去してＤＸＲ量換算として５μｇ／ｍｌの濃度のＧＡＨ抗体結合リポソームまたは抗体非結合リポソームを１００μｌ／ウェル、各９ウェルに添加した。３７℃で１時間反応を行った後、各リポソーム溶液を除去し、１０％ＦＢＳ添加したｅ−ＲＤＦ培地を添加して培養を継続した。５日目に細胞の生存率を比較するため、ＭＴＴ（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔ，３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｉａｚｏｙｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）アッセイ（Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７０：２５７−２６８，１９８４）を行った。生細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素によって形成されたフォルマザンを０．０４Ｎ−ＨＣｌ添加イソプロピルアルコールで溶解し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。コントロールとしてリポソーム添加濃度が０のウェルの値を１００％とし、抗体結合リポソームおよび抗体非結合リポソームを添加したウェルの細胞生存率を算定した。その結果を第１図に示す。抗体非結合リポソームに比較して、ＧＡＨ抗体結合リポソームでは、さらに強力な乳癌細胞の増殖抑制効果が認められた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、抗体の特異的反応性により、胃癌、大腸癌に加え、乳癌に対しても優れた治療効果が得られる乳癌治療薬が提供可能である。
なお、本出願は、日本特許出願  特願２００１−２２４５９６号を優先権主張して出願されたものである。
【配列表】
2003009870.tif 000002
2003009870.tif 000003
2003009870.tif 000004
2003009870.tif 000005
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＧＡＨ抗体の乳癌細胞株に対する増殖抑制効果を検討した結果を示す図である。
【図１】
2003009870.tif 000006
【国際調査報告】
2003009870.tif 000007
2003009870.tif 000008
2003009870.tif 000009
2003009870.tif 000010