(57)【要約】本発明の蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質を認識する抗体を用いることにより、本発明の蛋白質に関与する疾患の判定法、および本発明の蛋白質に関与する疾患の診断薬、予防薬および治療薬を提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求項１に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ請求項１に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号６２〜６９番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、かつ請求項１に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
【請求項５】
請求項４に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求項１に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
【請求項６】
請求項４に記載の蛋白質のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ請求項１に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号２で表される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ請求項１に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１２】
宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞からなる群から選ばれる細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質を認識する抗体。
【請求項１５】
寄託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７７であるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７７。
【請求項１７】
請求項１４または請求項１５に記載の抗体を用いる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質を免疫学的に検出または定量する方法。
【請求項１８】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、またはそれらオリゴヌクレオチドの誘導体。
【請求項１９】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行うことを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出または定量する方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体をプライマーとして用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクションを行うことを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出または定量する方法。
【請求項２１】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体を用いてハイブリダイゼーションを行うことを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体を用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクションを行うことを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する方法。
【請求項２３】
以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の疾患の判定方法。
（Ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡの変異の検出または発現量の測定を行ない、健常人と比較することを特徴とする、疾患の判定方法。
（Ｂ）請求項１４または請求項１５に記載の抗体を用いて、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質の変異の検出または発現量の測定を行ない、健常人と比較することを特徴とする、疾患の判定方法。
【請求項２４】
疾患が、異常な細胞増殖を伴う疾患、血管障害を伴う疾患、骨代謝の異常を伴う疾患、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃酸分泌の異常を伴う疾患、または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患である、請求項２３に記載の判定方法。
【請求項２５】
異常な細胞増殖を伴う疾患が、急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、脳腫瘍、悪性腫瘍または固形腫瘍であり、血管障害を伴う疾患が心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血または脈絡膜循環障害であり、骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であり、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、末端肥大症または小児慢性腎不全であり、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患が動脈硬化、気管支疾患または再狭窄であり、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患が重症筋無力症であり、胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏または自己免疫疾患である、請求項２４に記載の判定方法。
【請求項２６】
判定方法が、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の方法によるものである、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の判定方法。
（Ａ）  請求項２１または２２に記載の検出方法。
（Ｂ）  請求項１７、１９または２０に記載の検出方法、または定量方法。
【請求項２７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質を含有する医薬。
【請求項２８】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡ、または請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド誘導体を含有する医薬。
【請求項２９】
医薬が、遺伝子予防用ベクターまたは遺伝子治療用ベクターである、請求項２８に記載の医薬。
【請求項３０】
請求項１４または請求項１５に記載の抗体を含有する医薬。
【請求項３１】
医薬が、異常な細胞増殖を伴う疾患、血管障害を伴う疾患、骨代謝の異常を伴う疾患、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、請求項２７〜３０に記載の医薬。
【請求項３２】
異常な細胞増殖を伴う疾患が急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、脳腫瘍、悪性腫瘍または固形腫瘍であり、血管障害を伴う疾患が心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血または脈絡膜循環障害であり、骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であり、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、末端肥大症または小児慢性腎不全であり、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患が動脈硬化、気管支疾患または再狭窄であり、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患が重症筋無力症であり、胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏または自己免疫疾患である、請求項３１に記載の医薬。
【請求項３３】
（ｉ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質を発現する細胞での該蛋白質の発現量と、（ｉｉ）該蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触させた場合の該蛋白質の発現量とを比較し、被験試料より請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量を制御する化合物を選択することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量を制御する化合物のスクリーニング方法。
【請求項３４】
（ｉ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質を発現する細胞の機能と（ｉｉ）該蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触させた場合の細胞の機能とを比較し、被験試料より請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質の機能を制御する化合物を選択することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質の機能を制御する化合物のスクリーニング方法。
【請求項３５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写を制御する領域の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させ、被験試料より請求項１〜６に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御する化合物を選択することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニング方法。
【請求項３６】
請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のスクリーニング法によって得られる化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項３７】
請求項３６に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有する医薬。
【請求項３８】
異常な細胞増殖を伴う疾患、血管障害を伴う疾患、骨代謝の異常を伴う疾患、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患に対する予防薬または治療薬である、請求項３７に記載の医薬。
【請求項３９】
異常な細胞増殖を伴う疾患が急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、脳腫瘍、悪性腫瘍または固形腫瘍であり、血管障害を伴う疾患が心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血または脈絡膜循環障害であり、骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であり、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、末端肥大症または小児慢性腎不全であり、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患が動脈硬化、気管支疾患または再狭窄であり、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患が重症筋無力症であり、胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏または自己免疫疾患である、請求項３８に記載の医薬。
【請求項４０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質と被験試料を接触させ、被験試料より該蛋白質と特異的に結合する蛋白質を選択することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質と特異的に結合する蛋白質のスクリーニング法。
【請求項４１】
請求項４０に記載のスクリーニング法により取得される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質と特異的に結合する蛋白質。
【請求項４２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現が低下または完全に抑制されたノックアウト非ヒト動物。
【請求項４３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質の有する機能が低下または完全に抑制されたノックアウト非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なインスリン様増殖因子結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡおよび該蛋白質を認識する抗体、および該蛋白質が関与する疾患の判定法、診断薬、予防薬または治療薬に関する。
背景技術
インスリン様増殖因子結合蛋白質（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、「ＩＧＦＢＰ」という）は、体液中のインスリン様増殖因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、以下、「ＩＧＦ」という）が高分子複合体として存在することから発見された分子群で、現在までに、ＩＧＦＢＰ−１〜１０までの１０種類の分子の存在が報告されており、スーパーファミリーを形成していることが知られている〔Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１８，８０１（１９９７）、Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．，３，２４３（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３５，３６８（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１２９８１（１９９７）〕。
ＩＧＦＢＰの機能としては、インテグリンへの結合などによる直接作用の存在も示唆されているが、主な作用は、ＩＧＦやインスリンに結合してその活性や分布、代謝などを調節することによって発揮されると考えられ〔Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１８，８０１（１９９７）、Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ用語ライブラリー  サイトカイン・増殖因子  改訂版ｐ１４−１７（１９８８）〕、具体的にはＩＧＦＢＰは、血中および血管外へのＩＧＦの運搬と分解の抑制、受容体への結合調節などによりその機能を発揮していると考えられている。
ＩＧＦＢＰスーパーファミリーのうち、ＩＧＦＢＰ−１〜６までの６種類の分子は構造的にも類似しており、インスリンよりもＩＧＦに高い親和性をもって結合することから、ＩＧＦ高親和性ＩＧＦＢＰとしてサブファミリーに分類されている〔Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２，４０４（１９８８）、ＥＭＢＯ  Ｊ．，８，２４９７（１９８９）、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２，１１７６（１９８９）、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，４，１８０６（１９９０）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７６，２１９（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，９０４３（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１０６４６（１９９１）〕。
ＩＧＦ高親和性ＩＧＦＢＰのサブファミリー分子間のアミノ酸配列の相同性はヒトで４９％〜６０％である。また、ＩＧＦＢＰ−６を除く５種類のＩＧＦＢＰでは１８個のシステイン残基が保存されており、このうちＮ末端の３個がＧｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓで代表される相同配列〔Ｘは任意のアミノ酸を表しており、該相同配列はインスリン様増殖因子結合モチーフと呼ばれ（以下、「ＩＧＦＢＰモチーフ」ともいう）〕を形成し、ＩＧＦの結合に関与することが示されている〔Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．，３，２４３（１９９１）〕。
ＩＧＦＢＰ−１と３は、ＩＧＦの作用を抑制する場合と促進する場合の両方があることが知られている。また、ＩＧＦＢＰ−２、４、６は抑制性の、ＩＧＦＢＰ−５は促進性のＩＧＦ結合蛋白質である。ＩＧＦには、成長ホルモン依存的に肝、骨組織などで産生され、身体的成長を促進させる増殖因子として機能しているＩＧＦ−Ｉと中枢神経系、骨組織などに多量に発現し、主として胎生期の成長に重要な役割を果たしていると推定されるＩＧＦ−ＩＩとが存在するが、ＩＧＦＢＰ−１、３、４はＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩに同等の結合活性を示し、ＩＧＦＢＰ−２、５、６は主としてＩＧＦ−ＩＩに強い結合活性を示すことが知られている。
また、ＩＧＦ高親和性ＩＧＦＢＰのサブファミリー分子の組織分布は、各分子によって異なっており、ＩＧＦＢＰ−１は主に羊水や胎児血清中に、ＩＧＦＢＰ−２は主に胎児肝臓や成人脳に、ＩＧＦＢＰ−３は主に肝臓や血清中に、ＩＧＦＢＰ−４は主に腎糸球体、皮膚および腸上皮に、ＩＧＦＢＰ−５は主に腸上皮や骨に、ＩＧＦＢＰ−６は主に皮膚や心臓に存在していることが知られている。
ＩＧＦＢＰと病態との関わりに関しては、以下にあげるような知見が報告されている。
小人症や末端肥大症患者ではＩＧＦやＩＧＦＢＰの発現変動が病態生理に直接関与していることが知られている。また、小児慢性腎不全においてもしばしば成長障害が起こるが、成長ホルモンやＩＧＦの発現レベルは正常であり、多くはＩＧＦＢＰ−２や３の増加によるＩＧＦの機能障害が原因であることが知られている〔Ｍｉｎｅｒ．Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｒｔａｂ．，１８，３２０（１９９２）〕。ＩＧＦＢＰ−４および５は骨代謝に重要な機能を有しており、骨粗鬆症ではＩＧＦＢＰ−５の発現量が減少し、副甲状腺ホルモンの上昇を伴う老人女性の骨折患者ではＩＧＦＢＰ−４の発現が上昇することが報告されている。また、腎摘出後や小腸切除後の代償性肥大においてＩＧＦ−Ｉの傍分泌作用の亢進が観察されているが、ＩＧＦ−ＩのｍＲＮＡ量は変化せず、ＩＧＦＢＰ−３の発現低下によって遊離のＩＧＦ−Ｉが増加することが報告されている〔Ｊ．Ｆｕｌｌｅｒ；Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８，１６５（１９９４）〕。さらに、子宮内膜の悪性腫瘍では、良性腫瘍に比べてＩＧＦＢＰ−１の発現が低下していることが報告されている〔Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．，３，７４，（１９９３）〕。
一方、ＧＦＢＰスーパーファミリーのうち、ＩＧＦＢＰ−７〜１０までの４種類の分子は構造的に類似し、かつ、ＩＧＦに低い親和性を有するという共通の性質を持つと考えられることから、ＩＧＦ低親和性ＩＧＦＢＰとして別のサブファミリーに分類されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１２９８１（１９９７）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９，２７８７（１９９９）〕。
ＩＧＦＢＰ−７については様々な生理活性についての報告がなされ、特に癌およびその病態との関係について多くの報告がなされている。
ＩＧＦＢＰ−７は、老化したヒト上皮細胞で発現が上昇している〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，４，７１５（１９９３）〕一方で、カルシノーマ細胞株などでは発現が低下していることから、癌抑制活性遺伝子としての機能を有するのではないかと考えられている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，４４７２（１９９５）〕。
ＩＧＦＢＰ−７のヒト染色体上の遺伝子座は４ｑ１２で、ヒト上皮細胞をレチノイン酸で処理することでその発現が上昇することも知られている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，４４７２（１９９５）〕。
乳癌組織では、染色体４ｑ１２〜１３の位置にＬＯＨ（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）が約５０％の頻度で観察され、かつ、ＩＧＦＢＰ−７の発現が減少していることが確認されている〔Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１６，２４５９（１９９８）〕。前立腺癌組織でもＩＧＦＢＰ−７の発現がｍＲＮＡレベルで減少しており、特に悪性の前立腺癌由来の細胞株では検出されないことが報告されている〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８３，４３５５（１９９８）〕。
さらに、ＩＧＦＢＰ−７の発現が減少した前立腺癌細胞株にＩＧＦＢＰ−７を強制発現させると、細胞分裂時間の延長、軟寒天培地中でのコロニー形成能の低下、ヌードマウス移植時の腫瘍形成能の低下、薬剤処理によるアポトーシス誘導率の上昇が観察されており、ＩＧＦＢＰ−７の発現と前立腺癌の悪性度との関係が示唆されている〔Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９，２３７０（１９９９）〕。
白血病患者では、脳脊髄液中のＩＧＦＢＰ−７およびＩＧＦＢＰ−３の濃度が上昇することが報告されており、白血病の病態との関係が注目されている〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８４，１２８３（１９９９）〕。
大腸癌では、大腸癌組織および大腸癌細胞株においてＩＧＦＢＰ−７の発現が上昇していることから、病態との関係が注目されている〔Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，３３，２１３（１９９８）〕。
大型の子宮平滑筋腫部位では、ＩＧＦＢＰ−７の発現が低下しており、ゴナドトロピン分泌促進ホルモン（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）治療をうけた患者ではＩＧＦＢＰ−７の発現が上昇することが報告されている〔Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４３，５３（２０００）〕。
ＳＶ４０Ｔ抗原で誘導されたマウス肝臓癌細胞では、ＩＧＦＢＰ−７遺伝子の５’上流域がメチル化され発現量が減少していることから、癌化にともなうＩＧＦＢＰ−７の発現調節に遺伝子のメチル化による機構が提唱されている〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６７，１０９（２０００）〕。
ＩＧＦＢＰ−７と糖尿病との関連についても報告されている。
血管内皮細胞に作用しプロスタサイクリンＰＧＩ２の産生を促進する因子（ＰＧＩ２−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、以下「ＰＳＦ」と略す）が、ＩＧＦＢＰ−７と同一であることが示され〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０３，５９１，（１９９４）〕、血管内皮細胞及び平滑筋細胞において発現している該因子は〔Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，７４，１４０７（１９９５）〕、ストレプトゾトシン投与によるＩ型糖尿病モデルでは腎臓および血管障害部位で発現が低下していることが報告されている〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，Ｓ１１１（１９９６）、Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ＆  ｉｔｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１２，２５２（１９９８）〕。またＩＩ型糖尿病患者の冠状動脈平滑筋細胞においてもＩＧＦＢＰ−７の発現低下が蛋白質レベルで観察されている〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４６，１６２７（１９９７）〕。さらに、牛の動脈由来平滑筋細胞を高グルコース培地で培養するとＩＧＦＢＰ−７の発現量が低下することがｍＲＮＡおよび蛋白レベルで確認されている〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４６，１６２７（１９９７）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，４１，１３４（１９９８）〕。
ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）によってＩＧＦＢＰ−７の発現が骨芽細胞において上昇することから、ＩＧＦＢＰ−７が骨芽細胞に生理的作用を及ぼすことが示唆されている〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，１９９８（１９９９）〕。また、骨芽細胞をグルココルチコイドで処理するとＩＧＦ−Ｉの発現を抑制する一方でＩＧＦＢＰ−７の発現を上昇させることも報告されている〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，２２８（１９９９）〕。
また、ＩＧＦＢＰ−７は骨格筋への分化にもＩＧＦの分化促進作用を抑制することで影響していることが示唆されている〔Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３７，１９２（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１，１００（２０００）〕。
ＩＧＦＢＰ−７がプロスタサイクリンＰＧＩ２の産生を促進する因子ＰＳＦと同一分子であったことから、ＩＧＦＢＰ−７の生理機能の一部はＰＧＩ２をエフェクター分子として発揮されていると考えられている。
プロスタグランジンの一種であるＰＧＩ２は強力な血小板凝集抑制作用と血管弛緩作用を有し、逆の作用を有するＴＸＡ２と拮抗的に作用し生体内の恒常性の維持に関与していることが知られており〔Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．，７６，３（１９８２）〕、血栓症や動脈硬化症などではＴＸＡ２およびＰＧＩ２の産生の不均衡、とりわけＰＧＩ２の産生が低下し血管障害が発症することが知られている〔Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．，７６，３（１９８２）〕。糖尿病性血管障害の発症や進展においても、血小板由来のＴＸＡ２の産生亢進に加え〔Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１９，２１１（１９８０）、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，９７，８７（１９８１）〕、血管由来のＰＧＩ２の産生低下が血小板凝集の亢進を引き起こすことが糖尿病患者や実験糖尿病動物で確認されている〔Ｌａｎｃｅｔ，１，３２５（１９７９）、Ｌａｎｃｅｔ，２，１３６５（１９７９）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３００，３６６（１９７９）、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，２３，３５１（１９７８）〕。
また、ＰＳＦは血流中に存在する因子であり、血管壁でのＰＧＩ２産生を刺激すること〔Ｎａｔｕｒｅ，２７１，５４９（１９７８）〕、および該因子は、溶血性尿毒症症候群〔Ｌａｎｃｅｔ，２，８７１（１９７８）〕、血栓性血小板減少性紫斑病〔Ｌａｎｃｅｔ，２，７４８（１９７９）〕、鎌形赤血球性貧血症〔Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，４８，５４５（１９８１）〕、急性心筋梗塞〔Ｃｏｒｏｎａｒｙ，２，４９（１９８５）〕、糖尿病性血管障害〔Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，３８，８３７（１９８９）、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１６，４４７（１９８６）、Ｄｉａｂ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．，３，２４３（１９８７）〕、動脈硬化性疾患において血中レベルが低下していることが報告されている。
すなわち、ＩＧＦＢＰ−７は血管内皮細胞のＰＧＩ２産生を促し血中のＰＧＩ２濃度を高めることにより血小板凝集抑制作用、平滑筋弛緩作用、胃酸分泌抑制作用を発揮することが明らかになっている。
以上のように、ＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する因子は、ＩＧＦやインスリンの機能の調節、妊娠、消耗性疾患における代償作用、骨代謝、骨格筋細胞の分化、血管内皮細胞に対するＰＧＩ２産生促進、ＰＧＩ２を介した血小板擬集抑制、血管平滑筋弛緩、気管支平滑筋弛緩、胃酸分泌抑制など様々な生理現象に関与していることが示されている。また、小人症、末端肥大症、小児慢性腎不全、骨粗鬆症、乳癌、前立腺癌、急性白血病、大腸癌、子宮平滑筋腫、肝臓癌、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、血栓症、動脈硬化症、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、鎌形赤血球性貧血症、急性心筋梗塞、糖尿病性血管障害等の疾患に関与していることも示されている。
したがって、ＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属するＩＧＦＢＰとしての活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、アンチセンスＤＮＡ、蛋白質を認識する抗体は、異常な細胞増殖を伴う疾患、血管障害を伴う疾患、骨代謝の異常を伴う疾患、ＩＧＦや成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患の判定、治療または予防のための医薬になりうると考えられており、ＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する因子は有用な新薬開発のターゲットとして非常に注目されている。
また、ＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する新規な因子が存在する可能性も想起され、新規ＩＧＦＢＰ遺伝子を取得できれば、該ＩＧＦＢＰのアミノ酸配列と既知ＩＧＦＢＰのアミノ酸配列とを比較したり、該ＩＧＦＢＰ遺伝子の転写物の発現分布を調べることにより、該ＩＧＦＢＰの機能を推定し、医薬品開発に有用な情報を得ることができる。また、新規ＩＧＦＢＰ遺伝子が取得できれば、該ＩＧＦＢＰの発現または機能を抑制する物質をスクリーニングすることが可能になる。該スクリーニングにより得られる化合物は有用な医薬品として期待される。
発明の開示
本発明は、新規インスリン様増殖因子結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質を認識する抗体、該蛋白質が関与する疾患の判定方法、診断薬、予防薬および治療薬を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＩＧＦＢＰファミリーに属する新規インスリン様増殖因子結合蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡを取得することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４３）を提供するものである。
（１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
（２）  配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（１）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
（３）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（１）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
（４）  配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号６２〜６９番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、かつ（１）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
（５）  （４）に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（１）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
（６）  （４）に記載の蛋白質のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（１）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質。
（７）  （１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（８）  配列番号２で表される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（９）  （１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ（１）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１０）  （７）〜（９）のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１１）  （１０）に記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（１２）  宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞からなる群から選ばれる細胞であることを特徴とする、（１１）に記載の形質転換体。
（１３）  （１１）または（１２）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質の製造方法。
（１４）  （１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質を認識する抗体。
（１５）  寄託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７７であるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
（１６）  ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７７。
（１７）  （１４）または（１５）に記載の抗体を用いる、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質を免疫学的に検出または定量する方法。
（１８）  （７）〜（９）のいずれか１項に記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、またはそれらオリゴヌクレオチドの誘導体。
（１９）  （７）〜（９）のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは（１８）に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行うことを含む、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出または定量する方法。
（２０）  （１８）に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体をプライマーとして用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクションを行うことを含む、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現の検出方法、または発現量の定量方法。
（２１）  （７）〜（９）のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは（１８）に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体を用いてハイブリダイゼーションを行うことを含む、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する方法。
（２２）  （１８）に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体を用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクションを行うことを含む、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する方法。
（２３）  以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の疾患の判定方法。
（Ａ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡの変異の検出または発現量の測定を行ない、健常人と比較することを特徴とする、疾患の判定方法。
（Ｂ）（１４）または（１５）に記載の抗体を用いて、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質の変異の検出または発現量の測定を行ない、健常人と比較することを特徴とする、疾患の判定方法。
（２４）  疾患が、異常な細胞増殖を伴う疾患、血管障害を伴う疾患、骨代謝の異常を伴う疾患、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患である、（２３）に記載の判定方法。
（２５）  異常な細胞増殖を伴う疾患が、急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、脳腫瘍、悪性腫瘍または固形腫瘍であり、血管障害を伴う疾患が心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血または脈絡膜循環障害であり、骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であり、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、末端肥大症または小児慢性腎不全であり、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患が動脈硬化、気管支疾患または再狭窄であり、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患が重症筋無力症であり、胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏または自己免疫疾患である、（２４）に記載の判定方法。
（２６）  判定方法が、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の方法によるものである、（２３）〜（２５）のいずれか１項に記載の判定方法。
（Ａ）  （２１）または（２２）に記載の検出方法。
（Ｂ）  （１７）、（１９）または（２０）に記載の検出方法、または定量方法。
（２７）  （１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質を含有する医薬。
（２８）  （７）〜（９）のいずれか１項に記載のＤＮＡ、または（１８）に記載のオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド誘導体を含有する医薬。
（２９）  医薬が、遺伝子予防用ベクターまたは遺伝子治療用ベクターである、（２８）に記載の医薬。
（３０）  （１４）または（１５）に記載の抗体を含有する医薬。
（３１）  医薬が、異常な細胞増殖を伴う疾患、血管障害を伴う疾患、骨代謝の異常を伴う疾患、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、（２７）〜（３０）に記載の医薬。
（３２）  異常な細胞増殖を伴う疾患が急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、脳腫瘍、悪性腫瘍または固形腫瘍であり、血管障害を伴う疾患が心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血または脈絡膜循環障害であり、骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であり、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、末端肥大症または小児慢性腎不全であり、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患が動脈硬化、気管支疾患または再狭窄であり、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患が重症筋無力症であり、胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏または自己免疫疾患である、（３１）に記載の医薬。
（３３）  （ｉ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質を発現する細胞での該蛋白質の発現量と、（ｉｉ）該蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触させた場合の該蛋白質の発現量とを比較し、被験試料より（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量を制御する化合物を選択することを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質の発現量を制御する化合物のスクリーニング方法。
（３４）  （ｉ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質を発現する細胞の機能と（ｉｉ）該蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触させた場合の細胞の機能とを比較し、被験試料より（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質の機能を制御する化合物を選択することを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質の機能を制御する化合物のスクリーニング方法。
（３５）  （１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写を制御する領域の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させ、被験試料より（１）〜（６）に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御する化合物を選択することを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニング方法。
（３６）  （３３）〜（３５）のいずれか１項に記載のスクリーニング法によって得られる化合物またはその薬理学的に許容される塩。
（３７）  （３６）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有する医薬。
（３８）  異常な細胞増殖を伴う疾患、血管障害を伴う疾患、骨代謝の異常を伴う疾患、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患に対する予防薬または治療薬である、（３７）に記載の医薬。
（３９）  異常な細胞増殖を伴う疾患が急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、脳腫瘍、悪性腫瘍または固形腫瘍であり、血管障害を伴う疾患が心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血または脈絡膜循環障害であり、骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であり、インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、末端肥大症または小児慢性腎不全であり、異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患が動脈硬化、気管支疾患または再狭窄であり、異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患が重症筋無力症であり、胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏または自己免疫疾患である、（３８）に記載の医薬。
（４０）  （１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質と被験試料を接触させ、被験試料より該蛋白質と特異的に結合する蛋白質を選択することを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質と特異的に結合する蛋白質のスクリーニング法。
（４１）  （４０）に記載のスクリーニング法により取得される、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質と特異的に結合する蛋白質。
（４２）  （１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現が低下または完全に抑制されたノックアウト非ヒト動物。
（４３）  （１）〜（６）のいずれか１項に記載の蛋白質の有する機能が低下または完全に抑制されたノックアウト非ヒト動物。
本発明の蛋白質としては、
（ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
（ｃ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
（ｄ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号６２〜６９番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、かつ上記（ａ）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
（ｅ）  上記（ｄ）に記載の蛋白質を表すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記（ａ）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
（ｆ）  上記（ｄ）に記載の蛋白質を表すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ上記（ａ）に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をあげることができる。
インスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーに属する因子は、ＩＧＦあるいはインスリンと親和性を有する蛋白性の因子であり、インスリン様増殖因子結合モチーフ（ＩＧＦＢＰモチーフ）を有している。該モチーフはインスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーに属する蛋白質のＮ末端部分で保存されており、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓで代表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の部分（Ｘは任意のアミノ酸を表す）をさす。インスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーに属する蛋白質では、ＩＧＦＢＰモチーフを中心に少なくとも１０個のシステイン残基が保存されており、ＩＧＦＢＰモチーフ部分を介してＩＧＦあるいはインスリンに親和性を示す。配列番号１で表されるアミノ酸配列においては、アミノ酸番号６２〜６９番で表されるアミノ酸配列がＩＧＦＢＰモチーフである。
上述した配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一な活性を有する蛋白質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と、結合するインテグリン、ＩＧＦ、インスリンまたは受容体等の蛋白質が同一である蛋白質があげられる。実質的に同一とは、活性が性質的に同一であることを示す。したがって、結合活性の程度、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
本発明の蛋白質である配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換、挿入および／もしくは付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換、挿入および／もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。また、本発明には、このような人為的に作成した変異体のみならず、自然界において生じた変異体も含まれる。
本発明の蛋白質である配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質としては、例えば、シグナルペプチドが除去された蛋白質が挙げられる。
また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有するためには、配列番号１に記載のアミノ酸配列との相同性が、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上であることが好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３−５８７７（１９９３）〕によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている〔Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）〕。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
本発明の蛋白質は、上記本発明の蛋白質のアミノ酸配列中の部分アミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質も含む。
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有するには、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号６２〜６９番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなる蛋白質であることが好ましい。
また該蛋白質に１以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質もまた本発明の蛋白質である。該蛋白質としては、上述した周知の部位特異的変異導入法により導入可能な数のアミノ酸が欠失、置換または付加した蛋白質であり、かつ配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をあげることができる。
また、上記（ｄ）に記載の蛋白質と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有するには、（ｄ）に記載の蛋白質のアミノ酸配列との相同性が、上記ＢＬＡＳＴのプログラムを利用して計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である。
本発明のＤＮＡとしては、
（１）配列番号２の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（２）上記定義した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）（２）に記載のＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一な活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡなどの本発明のＤＮＡまたはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、ヒト組織由来のｍＲＮＡ、例えばヒト脳由来のｍＲＮＡを単離し、そのｃＤＮＡライブラリーを作製し、次いで該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして目的のクローンを得ることにより調製することができる。
ヒト脳ｍＲＮＡは、市販のもの（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、以下のごとくヒト脳組織から調製してもよい。後者の場合には、まず、脳組織から全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離することができる。
脳組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）〕、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）、実験医学，９，１９３７（１９９１）〕などがあげられる。全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。あるいは、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製したヒト脳組織ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕およびｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕等をあげることができる。
宿主微生物としては、エシュリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に属する微生物、特にエシュリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下、「大腸菌」ともいう）に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以下の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、完全長ｃＤＮＡをできるだけ効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法〔Ｇｅｎｅ，１３８，１７１（１９９４）、Ｇｅｎｅ，２００，１４９（１９９７）、蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）、実験医学，１１，２４９１（１９９３）、ｃＤＮＡクローニング，羊土社（１９９６）、遺伝子ライブラリーの作製法，羊土社（１９９４）〕を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
作製したｃＤＮＡライブラリーから各クローンを単離し、それぞれのクローンについてｃＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
それぞれのｃＤＮＡの塩基配列が新規な配列を有しているかどうかは、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の既存の遺伝子の塩基配列と完全に一致すると考えられるような明らかな相同性を示す塩基配列がないことにより確認できる。
上記の方法で得られる新規な配列を含むｃＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号２で表される塩基配列があげられる。
配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを翻訳して得られる蛋白質（配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質）は、ＢＬＡＳＴ２〔Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）〕を用いた相同性解析において、ＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する蛋白質ヒトＩＧＦＢＰ−７と３９％の相同性を有する。
ＩＧＦＢＰスーパーファミリーにおいては、ＩＧＦあるいはインスリンとの結合に重要なインスリン様増殖因子結合モチーフ部分およびＩＧＦＢＰモチーフを中心とした少なくとも１０個のシステイン残基の位置が保存されていることが知られている。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質においても、インスリン様増殖因子結合モチーフに相当する部分に、代表的なインスリン様増殖因子結合モチーフであるＧｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）からなるアミノ酸配列と非常に類似したＧｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓからなるアミノ酸配列が存在し、このモチーフ部分を中心に１０個のシステイン残基がＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する因子間で保存されている位置に存在する。従って、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質がＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する蛋白質としての活性を有することがわかる。
ＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する蛋白質と疾患の関係については、急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、悪性腫瘍、固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血、脈絡膜循環障害等の血管障害を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、小人症、末端肥大症、小児慢性腎不全等のインスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、動脈硬化、気管支疾患、再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃潰瘍等の胃酸分泌の異常を伴う疾患、微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏、自己免疫疾患等の異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等について報告があることから、本発明の蛋白質もまた、上記疾患と関連がある蛋白質であることが予想される。これら疾患は、例えば、本発明の蛋白質の機能や発現の異状に起因している可能性がある。本実施例において、本発明の蛋白質を発現させた細胞の培養上清が癌細胞株の増殖を抑制する活性を示したことから、本発明の蛋白質は、大腸癌などの異常な細胞増殖を伴う疾患に関係していると考えられる。
配列番号２で表される塩基配列を含む分子がｃＤＮＡライブラリー作製の際に人工的に生じたものではないことを確認するためには、ヒトゲノムライブラリーを、配列番号２で表される塩基配列に特異的な配列を用いてスクリーニングし、得られたゲノムクローンの塩基配列を決定することで判断することができる。
ヒトゲノムライブラリーは市販のもの（例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製ＢＡＣライブラリー）を用いてもよいし、ヒトの細胞や組織から自体公知の方法〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９，４１３（１９９５）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２４，５２７（１９９４）等に記載の方法〕を用いて調製してもよい。
ヒトゲノムライブラリーを、配列番号２で表される塩基配列に特異的な配列を用いてスクリーニングする方法としては、配列番号２で表される塩基配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕や、配列番号２で表される塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）などがあげられる。
上記の方法で配列番号２で表される塩基配列の両方を含むゲノムＤＮＡクローン（例えば、ヒトゲノムＢＡＣクローン）が得られる。このゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し配列番号２で表される塩基配列と比較すると、配列番号２で表される塩基配列は６つの部分に別れて同一ヒトゲノム上に約１８ｋｂにわたって存在していることが分かる。すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は６つのエクソンからから構成されており、ｃＤＮＡライブラリー作製の際に人工的に生じたものではないことが分かる。
配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡが一旦取得され、その塩基配列が決定された後は、該塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ヒトまたは非ヒト動物の脳等の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。
また、配列番号２で表されるＤＮＡの全長あるいは一部をプローブとして、ヒトまたは非ヒト動物の脳等の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、本発明のＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡについて、該ＤＮＡを含む組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を用いて蛋白質を発現させることにより、または該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列とヒトＩＧＦＢＰ−１、ヒトＩＧＦＢＰ−２、ヒトＩＧＦＢＰ−３、ヒトＩＧＦＢＰ−４、ヒトＩＧＦＢＰ−５、ヒトＩＧＦＢＰ−６、ヒトＩＧＦＢＰ−７、ヒトＩＧＦＢＰ−８、ヒトＩＧＦＢＰ−９若しくはヒトＩＧＦＢＰ−１０のアミノ酸配列との相同性およびシステイン残基の位置を比較することにより、該ＤＮＡがＩＧＦＢＰスーパーファミリーとしての活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認することができる。
配列番号２で表される塩基配列またはその断片の塩基配列に関する情報に基づき、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより、本発明のＤＮＡの塩基配列、例えば配列番号２で表される塩基配列のうち、連続した５〜６０塩基、好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（以下、アンチセンス・オリゴヌクレオチドという）を調製することがきる。
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ等のオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
該オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドとして、例えば、検出したいｍＲＮＡの一部の塩基配列において、５’末端側の塩基配列に相当するセンスプライマー、３’末端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライマー等をあげることができる。ただし、ｍＲＮＡにおいてウラシルに相当する塩基は、オリゴヌクレオチドプライマーにおいてはチミジンとなる。
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしては、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドで、５〜６０塩基、好ましくは１０〜５０塩基数のものがあげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
２．本発明の蛋白質の製造
本発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の蛋白質をコードする遺伝子、及び転写終結配列より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＳｕｐｅｘ等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、目的とする蛋白質の生産率を向上させることができる。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明の蛋白質を製造することができる。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造された蛋白質は、例えば本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該蛋白質を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
３．本発明の蛋白質を認識する抗体の調製
本発明の蛋白質、またそれら蛋白質の部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは本発明の蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用いることにより、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、本発明の蛋白質を認識する抗体を作製することができる。
（１）ポリクローナル抗体の作製
本発明の蛋白質、またそれら蛋白質の部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは本発明の蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
免疫に用いた本発明の蛋白質の部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００〜２００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明の蛋白質の部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明の蛋白質の部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明の蛋白質に特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株の１例としては、ハイブリドーマ株ＫＭ３１０３が挙げられる。ハイブリドーマ株ＫＭ３１０３は、平成１４年３月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６：郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７７として寄託されている。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明の蛋白質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
４．本発明のＤＮＡ、蛋白質または抗体の利用
（１）本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出・定量することによる疾患の判定方法
本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）、ＰＣＲ法およびＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）−ＰＣＲ法〔ともにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕（以上、併せてＰＣＲ法ともいう）等を行い、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出することで、急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、脳腫瘍、悪性腫瘍、固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血、脈絡膜循環障害等の血管障害を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、小人症、末端肥大症、小児慢性腎不全等のインスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、動脈硬化、気管支疾患、再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃潰瘍等の胃酸分泌の異常を伴う疾患、微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏、自己免疫疾患等の異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等のＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する蛋白質の関与の報告がある疾患の判定を行うことができる。
ＲＴ−ＰＣＲ法は簡便な方法であるため、遺伝子の発現の検出法として特に有用である。
例えば、配列番号２で表される塩基配列中の連続した１００〜２８８１塩基と同じ配列を有するＤＮＡ、または該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行い、配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現量を定量し、健常者と比較することにより上記疾患を判定することができる。
該判定の具体的方法として、例えば、以下の方法をあげることができる。
被験者および健常者の白血球細胞または組織由来全ＲＮＡ（１０〜２０μｇ）、またはそれらのｍＲＮＡ（１〜５μｇ）を、変性溶液〔５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、２．２ｍｏｌ／Ｌホルムアルデヒド、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸］（ＰＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ〕中、６５℃で５分間加熱し、変性させ、２．２ｍｏｌ／Ｌ  ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで電気泳動する。
電気泳動後、ゲル中のＲＮＡをニトロセルロースフィルター（Ｏｐｔｉｍａｌ  ＢＡ−Ｓ８５；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）上にブロッティングし、減圧下８０℃で１時間加熱し固定化する。
該フィルターをハイブリダイゼーション溶液〔５×ＳＳＰＥ（７５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）〕中に浸漬しプレハイブリダイゼーションを行う。
プレハイブリダイゼーション後、該溶液にプローブを添加し、６５℃でハイブリダイゼーションを行う。
プローブとしては、例えば配列番号２に記載のＤＮＡ断片をマルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社製）を用いて３２Ｐで標識したものを使用できる。
ハイブリダイゼーション後のフィルターを、以下の順で洗浄する。
（ａ）０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、３０ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸ナトリウム）溶液中、室温で１５分間洗浄する。これを数回繰り返す。
（ｂ）０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸ナトリウム）溶液中、５０〜７０℃で１５分間洗浄する。これを数回繰り返す。
（ｃ）５０〜７０℃の０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ（１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸ナトリウム）溶液中、５０〜７０℃で１５分間洗浄する。これを数回繰り返す。
フィルター洗浄後、イメージングプレートを用いてオートラジオグラフィーを行い、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム）で配列番号２に記載のＤＮＡの発現を検出し定量することができる。
また、例えば、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡに特異的な１組のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、被験者および健常者の白血球細胞または組織由来全ＲＮＡ、それらのｍＲＮＡまたはこれらＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅断片を検出・定量し、被験者と健常者の本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を比較することにより上記疾患を判定することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
ＰＣＲの鋳型となるｍＲＮＡまたは全ＲＮＡは、血液より分離・取得した各種白血球細胞、または疾患の疑いがある組織等から抽出することができる。
白血球細胞としては、多形核白血球、単球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞等をあげることができる。
多形核白血球および単核球は、被験者の末梢血より、ナイコメッド・ファーマ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）社製のキットであるＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭを用いることにより、分離・取得することができる。
取得した単核球より、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３０，７０６（１９８３）等に記載の方法により、単球およびリンパ球を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ，９，１５３（１９７７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，２７３（１９７６）、Ｎｙｃｏｍｅｄ社の血球細胞の単離法に関するマニュアル等に記載の方法により、Ｔ細胞やＢ細胞を分離・取得することができる。
Ｔ細胞はナイロンウール法〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３，６４５（１９７３）〕を用いて取得することもできる。また、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージにそれぞれ特異的な抗体を結合した磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｌ社製のＤｙｎａｂｅａｄｓ）を用いて、各細胞を分離・取得することができる。
白血球細胞または組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）〕等をあげることができる。
全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等をあげることができる。
また、ファースト・トラック・ｍＲＮＡ・アイソレーション・キット〔Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製〕、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ・ピュリフィケーション・キット（Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ファルマシア社製）等のキットを用いてｍＲＮＡを調製することもできる。
一本鎖ｃＤＮＡは、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡから、一本鎖ｃＤＮＡ合成キットＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＲＬ社製）を用いて、合成することができる。合成は、キットに添付のマニュアルに従って行うことができる。
上記のように調製できる全ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕により、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を定量することができる。
（２）本発明の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出することによる疾患の判定方法
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして、ゲノムＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）、ＰＣＲ法等を行うことにより、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出することができる。該検出方法は、ＩＧＦＢＰファミリーに属する蛋白質が関与しているとの報告がある急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、脳腫瘍、悪性腫瘍、固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血、脈絡膜循環障害等の血管障害を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、小人症、末端肥大症、小児慢性腎不全等のインスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、動脈硬化、気管支疾患、再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃潰瘍等の胃酸分泌の異常を伴う疾患、微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏、自己免疫疾患等の異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の判定に利用することができる。
具体的には、例えば、患者が保有する本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの翻訳領域をＰＣＲ法で増幅させ、塩基配列を決定し、健常者が有する該ＤＮＡの塩基配列と比較することにより、翻訳領域における変異の有無を調べることができる。
ＰＣＲ法に供する鋳型となるｃＤＮＡは（１）に記載した方法により取得できる。取得されたｃＤＮＡの塩基配列は、パーキンエルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ  ＰｒｉｓｍＴＭ  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定できる。
（３）免疫学的検出法・定量法による疾患の判定法
本発明の抗体を用いて、被験者および健常者の血液中または組織における本発明の蛋白質の発現を免疫学的に検出または定量し、健常者と比較することで下記疾患を判定することができる。
免疫学的に検出する方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等をあげることができる。
免疫学的に定量する方法としては、例えば液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２５Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明の蛋白質と該蛋白質を認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ法等があげられる。
該免疫学的方法は、本発明の蛋白質の関与が報告されている急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、悪性腫瘍、固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血、脈絡膜循環障害等の血管障害を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、小人症、末端肥大症、小児慢性腎不全等のインスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、動脈硬化、気管支疾患、再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃潰瘍等の胃酸分泌の異常を伴う疾患、微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏、自己免疫疾患等の異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の疾患の判定に利用することができる。
（４）本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写または翻訳を抑制することによる疾患の予防および治療
ＩＧＦＢＰの発現量の上昇と疾患の関係については、小児慢性腎不全はＩＧＦＢＰ−２や３の増加が原因であること〔Ｅｌｅｃｔｒｏｉｙｔｅ  Ｍｒｔａｂ．，１８，３２０（１９９２）〕、副甲状腺ホルモンの上昇を伴う老人女性の骨折患者ではＩＧＦＢＰ−４の発現が上昇すること、白血病患者では脳脊髄液中のＩＧＦＢＰ−７およびＩＧＦＢＰ−３の濃度が上昇すること〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８４，１３６１（１９９６）〕、大腸癌では、大腸癌組織および大腸癌細胞株においてＩＧＦＢＰ−７の発現が上昇していること〔Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，３３，２１３（１９９８）〕等が報告されている。
また、ＴＧＦ−β、ＰＴＨＰＧＥ２によってＩＧＦＢＰ−７の発現が上昇すること〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，１９９８（１９９９）〕、骨芽細胞をグルココルチコイドで処理するとＩＧＦ−Ｉの発現を抑制する一方でＩＧＦＢＰ−７の発現を上昇させること〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，２２８（１９９９）〕、ＩＧＦＢＰ−７は骨格筋への分化にもＩＧＦの分化促進作用を抑制することで影響していること〔Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３７，１９２（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１，１００（２０００）〕から、ＩＧＦＢＰ−７は骨代謝および骨格筋分化に関わる疾患にも関与すると考えられている。
従って、ＩＧＦＢＰ遺伝子の発現量の増大、あるいはＩＧＦＢＰの機能亢進が一因となっている疾患については、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの転写量若しくは翻訳量を減少させることが疾患の予防および治療に有効である。またＩＧＦＢＰに直接起因しない疾患であっても、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写量若しくは翻訳量を低下させる、または本発明の蛋白質の機能を抑制することにより対症療法的に上記疾患の予防または治療を行うこともできる。
また、ＩＧＦＢＰの発現増加が原因で受容体を介した生理作用が亢進している患者がいる場合、本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を患者に投与することにより、該生理作用を抑制することができ、またＩＧＦＢＰの発現増加が疾患の直接の原因でなくても本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体の投与により対症療法が可能な疾患に対して、本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、有効な予防薬および治療薬となり得る。
該予防薬または治療薬を使用する方法としては、例えばアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕、トリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）〕、リボザイム技術〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２７４（１９９９）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２３，２５７（１９９９）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４，Ｄ４９７（１９９９）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，Ｒ３３（１９９９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，５２３７（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，４３８（１９９８）〕、あるいはデコイＤＮＡ法〔Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５６，５６３（１９９８）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８２，１０２３（１９９８）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，５，４２９（１９９７）、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５４，２５８３（１９９６）〕をあげることができ、該方法を用いることにより任意の遺伝子の発現を抑制することができる。
本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を上記予防薬および治療薬として使用する場合は、本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、下記に記載した常法に従って製剤化、処方および投与することができる。
レトロウィルス、アデノウィルス等のウィルスベクターやその他遺伝子治療用のベクターに組み込んだ遺伝子治療用ベクターを遺伝子治療薬または予防薬として用いるには、該遺伝子治療用ベクターと遺伝子治療剤に用いる基剤を調合することにより製造することができる〔Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，８，４２（１９９４）〕。
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の遺伝子治療剤は、液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に遺伝子治療の直前に溶解して治療に使用することができる。本発明の遺伝子治療剤の投与方法としては、患者の治療部位に吸収されるように、局所的に投与する方法をあげることができる。
また、非ウイルス遺伝子移入法によっても目的とする治療部位にＤＮＡを輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７（１９７３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２（１９８０）〕、マイクロインジェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８４（１９８０）；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１（１９８１）；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２−９４（１９８１）〕、リポソームを介した膜融合−介在移入法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７）；
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４（１９８９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９（１９８９）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，２６７−２７５，（１９９２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８（１９９０）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７−２０１１（１９９２）〕あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体−媒介ＤＮＡ移入法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９（１９９１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６９８７（１９８９）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４（１９９１）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４（１９９１）〕等をあげることができる。
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能であることが腫瘍に関する研究において報告されている〔Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，３９９（１９９２）〕。
（５）本発明の蛋白質の発現量または機能が低下している疾患の予防および治療
ＩＧＦＢＰの発現減少と疾患の関係については、骨粗鬆症ではＩＧＦＢＰ−５の発現が減少していること、腎摘出後や小腸切除後の代償性肥大ではＩＧＦＢＰ−３の発現低下に伴う遊離ＩＧＦ−Ｉの増加がみられること〔Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８，１６５（１９９４）〕、子宮内膜の悪性腫瘍ではＩＧＦＢＰ−１の発現が低下していること〔Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．，３，７４（１９９３）〕、乳癌組織においてはヒト染色体上のＩＧＦＢＰ−７の遺伝子座に５０％以上の頻度でＬＯＨが観察され、ＩＧＦＢＰ−７の発現の減少が見られること〔Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１６，２４５９（１９９６）〕、前立腺癌組織におけるＩＧＦＢＰ−７の発現のｍＲＮＡレベルでの減少、および悪性の前立腺癌由来細胞株においてＩＧＦＢＰ−７の発現が検出されないこと〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８３，４３５５（１９９８）〕、大型の子宮平滑筋腫部位では、隣接する子宮平滑筋細胞や腫瘍容積が１２０ｃｍ３以下の小さな子宮平滑筋に比べＩＧＦＢＰ−７のｍＲＮＡの発現が低下していること〔Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４３，５３（２０００）〕、ＳＶ４０Ｔ抗原で誘導されたマウス肝臓癌細胞では、ＩＧＦＢＰ−７遺伝子の５’上流領域がメチルかされ発現量が減少していること〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６７，１０９（２０００）〕、ストレプトゾトシン投与によるＩ型糖尿病モデルでは腎臓および血管障害部位でＩＧＦＢＰ−７の発現が低下していること〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，Ｓ１１１（１９９６）、Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ＆  ｉｔｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１２，２５２（１９９８）〕、ＩＩ型糖尿病患者の冠状動脈平滑筋細胞においてもＩＧＦＢＰ−７の発現低下が蛋白質レベルで観察されていること〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４６，１６２７（１９９７）〕、牛の動脈由来平滑筋細胞を高グルコース培地で培養するとＩＧＦＢＰ−７の発現量がｍＲＮＡおよび蛋白レベルで低下すること〔Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４６，１６２７（１９９７）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，４１，１３４（１９９８）〕、またＩＧＦＢＰ−７は血管壁でのＰＧＩ２産生を刺激すること〔Ｎａｔｕｒｅ，２７１，５４９（１９７８）〕、および溶血性尿毒症症候群〔Ｌａｎｃｅｔ，２，８７１（１９７８）〕、血栓性血小板減少性紫斑病〔Ｌａｎｃｅｔ，２，７４８（１９７９）〕、鎌形赤血球性貧血症〔Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，４８，５４５（１９８１）〕、急性心筋梗塞〔Ｃｏｒｏｎａｒｙ，２，４９（１９８５）〕、糖尿病性血管障害〔Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，３８，８３７（１９８９）、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１６，４４７（１９８６）、Ｄｉａｂ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．，３，２４３（１９８７）〕、動脈硬化性疾患において血中レベルが低下していること等が報告されている。
また、ＴＧＦ−β、ＰＴＨＰＧＥ２によってＩＧＦＢＰ−７の発現が上昇すること〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，１９９８（１９９９）〕、骨芽細胞をグルココルチコイドで処理するとＩＧＦ−Ｉの発現を抑制する一方でＩＧＦＢＰ−７の発現を上昇させること〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，２２８（１９９９）〕、ＩＧＦＢＰ−７は骨格筋への分化にもＩＧＦの分化促進作用を抑制することで影響していること〔Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３７，１９２（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１，１００（２０００）〕から、ＩＧＦＢＰ−７が骨代謝および骨格筋分化に関わる疾患にも関与すると考えられている。
ＩＧＦＢＰ−７の発現が減少した前立腺癌細胞株にＩＧＦＢＰ−７を強制発現させると、細胞分裂時間の延長、軟寒天培地中でのコロニー形成能の低下、ヌードマウス移植時の腫瘍形成能の低下、薬剤処理によるアポトーシス誘導率の上昇すること〔Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９，２３７０（１９９９）〕、ｐ５３の機能が失われているオステオザルコーマ細胞株にＩＧＦＢＰ−７を強制発現させると、ｐ５３遺伝子を導入したときと同様に細胞株の増殖を抑制することができることから〔Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２，１３６１（１９９６）〕、本発明のＤＮＡおよび蛋白質の発現を増大させることで、ＩＧＦＢＰの発現減少が関与する上記疾患を予防または治療できる。またＩＧＦＢＰに直接起因しない疾患であっても、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写量若しくは翻訳量を増大させる、または本発明の蛋白質量を増大させることにより対症療法が可能な上記疾患の予防または治療を行うことも可能である。
従って、ＩＧＦＢＰの発現減少または機能低下により該蛋白質の生理作用が減退している患者がいる場合、本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体、あるいは本発明の蛋白質を患者に投与することにより、該生理作用を促進することができ、またＩＧＦＢＰの発現減少、または機能低下が疾患の直接の原因でなくても対症療法が可能な疾患に対しては、本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体、あるいは本発明の蛋白質は、上記疾患の予防薬および治療薬として有用である。
該予防薬および治療薬の投与方法としては、例えば、本発明の蛋白質の発現低下や変異のために正常な生理作用が期待できない患者がいる場合に、（ｉ）本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させること（ｉｉ）対象となる細胞に本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植すること、あるいは（ｉｉｉ）本発明の蛋白質を該患者に投与することなどによって、患者の体内における本発明の蛋白質の量を増加させ、該蛋白質の生理作用を充分に発揮させることができる。したがって、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡまたは本発明の蛋白質は、本発明の蛋白質の発現量または機能が低下した疾患、または該蛋白質の変異による機能異常に起因する疾患、あるいは本発明の蛋白質に直接起因しなくとも、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、あるいは本発明の蛋白質の投与により対症療法的な治療が可能な疾患に対して安全で低毒性な予防薬および治療薬として有用である。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを上記予防薬および治療薬として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記（４）に記載した常法に従って製剤化、処方および投与することができる。
また、本発明の蛋白質を有効成分として含有する医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該蛋白質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該蛋白質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該蛋白質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
（６）本発明の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を取得する方法
本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することができる。
プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域があげられる。例えば、ヒトの脳組織において本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写に関与するプロモーター領域をあげることができる。該プロモーターは後述（７）に記載した本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写または翻訳を制御する物質のスクリーニング法に利用することができる。
（７）本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写または翻訳を制御する物質のスクリーニング法
急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、悪性腫瘍、固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血、脈絡膜循環障害等の血管障害を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、小人症、末端肥大症、小児慢性腎不全等のインスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、動脈硬化、気管支疾患、再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃潰瘍等の胃酸分泌の異常を伴う疾患、微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏、自己免疫疾患等の異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の疾患は、ＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する蛋白質が関与していると報告されている。
上記疾患の一因として、ＩＧＦＢＰをコードするＤＮＡの転写量の変動、または本発明の蛋白質の機能変化が考えられ、この場合、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの転写量若しくは翻訳量を制御することが疾患の予防および治療に有効である。またＩＧＦＢＰに直接起因しない疾患であっても、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写量若しくは翻訳量を制御することにより対症療法的に上記疾患の予防または治療を行うことが可能である。
従って、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写過程、あるいは転写産物から蛋白質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、該蛋白質の発現を制御することにより、該蛋白質を介して発揮される細胞機能を制御することが可能であり、安全で低毒性な医薬組成物として有用である。
該化合物は、以下（ａ）〜（ｃ）に示す方法により取得できる。
（ａ）［ｉ］本発明の蛋白質を発現する細胞と、［ｉｉ］試験物質の存在下、本発明の蛋白質を発現する細胞を、上記２に記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該蛋白質量を、上記（３）で記載した本発明の抗体を用いて測定、比較し、該蛋白質量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し取得する方法。
本発明の抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。
（ｂ）［ｉ］本発明の蛋白質を発現する細胞と、［ｉｉ］被験物質の存在下、本発明の蛋白質を発現する細胞を、上記２に記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該蛋白質をコードするＤＮＡの転写産物量を、上記（１）で記載したノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法等の方法を用いて測定、比較し、該転写産物量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し取得する方法。
（ｃ）上記（６）で取得したプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだプラスミドを公知の方法により作製し、上記２に記載の方法に準じて動物細胞に導入し、形質転換体を取得する。［ｉ］該形質転換体と、［ｉｉ］被験物質の存在下、該形質転換体を、上記２に記載の培養法で２時間から１週間培養し、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を公知の方法〔東京大学医科学研究所  制癌研究部編，新細胞工学実験プロトコール，秀潤社（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，９１４（１９９６）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９，４５３（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，４４８（１９９５）、細胞工学，１６，５８１（１９９７）〕を用いて測定、比較し、該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し取得する方法。
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等をあげることができる。
（８）本発明の蛋白質の機能を制御する物質のスクリーニング方法
急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、骨髄腫、子宮平滑筋腫、悪性腫瘍、固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、心筋梗塞、脳梗塞、末梢血管閉鎖症、狭心症、高血圧、高脂血症、糖尿病、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、動脈硬化、血栓、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、うっ血、脈絡膜循環障害等の血管障害を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、小人症、末端肥大症、小児慢性腎不全等のインスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、動脈硬化、気管支疾患、再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、胃潰瘍等の胃酸分泌の異常を伴う疾患、微生物感染、慢性Ｂ型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、移植片−対−宿主疾患、インスリン依存性糖尿病、腎炎、外傷性悩損傷、炎症性腸疾患、アレルギー、アトピー、喘息、花粉症、気道過敏、自己免疫疾患等の異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の疾患は、ＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する蛋白質が関与していると報告されている。
上記疾患の一因として、ＩＧＦＢＰの機能変化が考えられ、この場合、本発明の蛋白質の機能を阻害または亢進させることが該疾患の予防および治療に有効である。またＩＧＦＢＰに直接起因しない疾患であっても、本発明の蛋白質の機能を阻害または亢進させることにより対症療法的に上記疾患の予防または治療を行うことができる。
よって、本発明の蛋白質の機能変化が原因で、細胞の生理作用が減退または亢進している患者がいる場合、本発明の機能を制御する化合物を投与することにより該生理作用を制御することができ、また本発明の蛋白質の機能変化が疾患の直接の原因でなくても本発明の蛋白質の機能を制御することで対症療法が可能な疾患もまた、該化合物の投与により予防および治療できる。
該化合物は、例えば以下に示す方法により取得できる。
［ｉ］本発明の蛋白質を発現する細胞と、［ｉｉ］被験物質の存在下、本発明の蛋白質を発現する細胞を、上記２に記載の培養法で２時間から１週間培養後、該蛋白質が機能することにより生じる細胞応答を検出、比較し、該蛋白質の機能を阻害または亢進させる活性を有する化合物を選択し取得する方法。
本発明の蛋白質が機能することにより生じる細胞応答を検出する方法としては、例えば、培地中に含まれるインスリンあるいはインスリン様増殖因子に依存的な細胞内情報伝達、遺伝子の転写、糖の取り込み、増殖などの変化を検出する公知の方法が挙げられる。また、プロスタグランジン産生の変化を測定する公知の方法も挙げられる〔Ｎａｔｕｒｅ，２６３，６６３（１９７６）、臨床科学，１７，９５８（１９８１）〕。
（９）本発明の蛋白質と特異的に結合する蛋白質をスクリーニングする方法
本発明の蛋白質と特異的に結合する蛋白質は、本発明の蛋白質に起因する疾患の予防薬または治療薬の開発に利用することができる。例えば、本発明の蛋白質の受容体は、本発明の蛋白質と結合して、細胞内に情報を伝達し、生理作用を発現する機能を有しているので、該受容体の活性、または該受容体をコードする遺伝子の転写若しくは翻訳を制御する物質は、本発明の蛋白質、または本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写若しくは翻訳を制御する物質と同様、本発明の蛋白質の機能異常に起因する疾患の予防薬および治療薬として有用である。
本発明の蛋白質と特異的に結合する蛋白質をスクリーニングする方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，９８９（１９９２）等に記載の発現クローニングの方法を挙げることができ、本発明の蛋白質と被験試料を接触させたとき、本発明の蛋白質に特異的に結合する蛋白質を被験試料より選択することで取得できる。
具体的には、以下の方法があげられる。
組織よりｃＤＮＡを調製する。該ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製しｃＤＮＡライブラリーを作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、組織で発現している遺伝子を発現する形質転換体を得る。標識した本発明の蛋白質が特異的に結合する蛋白質を産生する形質転換体を選択する。
選択した該形質転換体に導入したｃＤＮＡにコードされている遺伝子配列を決定することにより、本発明の蛋白質と特異的に結合する蛋白質を取得することができる。
ｃＤＮＡライブラリーを調製する方法としては、上記１に記載した方法が挙げられる。
組換えベクターの導入方法、形質転換体を得る方法、および得られた形質転換体を培地に培養する方法としては、上記２に記載した方法が挙げられる。
放射性同位元素やビオチン化等公知の蛋白質を標識する方法で標識した本発明の蛋白質と形質転換体とを共培養することで、標識された本発明の蛋白質と特異的に結合する遺伝子産物を産生する形質転換体を選択することができる。
選択した形質転換体に導入したｃＤＮＡを単離する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，２８３７（１９８８）等に記載のファージベクターやプラスミドベクターを回収する方法あるいはＨｉｒｔ法を挙げることができる。
単離したｃＤＮＡの遺伝子配列を決定する方法としては、上記１に記載した方法が挙げられる。
（１０）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、本発明の蛋白質に関与する疾患の予防薬および治療薬として有用である。
ＩＧＦＢＰの発現量の上昇と疾患の関係については、小児慢性腎不全はＩＧＦＢＰ−２や３の増加が原因であること〔Ｅｌｅｃｔｒｏｉｙｔｅ  Ｍｒｔａｂ．，１８，３２０（１９９２）〕、副甲状腺ホルモンの上昇を伴う老人女性の骨折患者ではＩＧＦＢＰ−４の発現の上昇すること、白血病患者では脳脊髄液中のＩＧＦＢＰ−７およびＩＧＦＢＰ−３の濃度が上昇すること〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８４，１３６１（１９９６）〕、大腸癌では、大腸癌組織および大腸癌細胞株においてＩＧＦＢＰ−７の発現が上昇していること〔Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，３３，２１３（１９９８）〕等が報告されている。
また、ＴＧＦ−β、ＰＴＨおよびＰＧＥ２によってＩＧＦＢＰ−７の発現が上昇すること〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，１９９８（１９９９）〕、骨芽細胞をグルココルチコイドで処理するとＩＧＦ−Ｉの発現を抑制する一方でＩＧＦＢＰ−７の発現を上昇させること〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，２２８（１９９９）〕、ＩＧＦＢＰ−７は骨格筋への分化にもＩＧＦの分化促進作用を抑制することで影響していること〔Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３７，１９２（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１，１００（２０００）〕から、ＩＧＦＢＰ−７が骨代謝および骨格筋分化に関わる疾患にも関与すると考えられている。
よって、ＩＧＦＢＰの発現量の増大、あるいは機能の亢進が一因である疾患に対しては、本発明の蛋白質の発現量を抑制する、あるいは機能を阻害することが疾患の予防および治療に有効である。またＩＧＦＢＰに直接起因しない疾患であっても、本発明の蛋白質の発現量を抑制、あるいは機能を阻害することにより対症療法が可能な上記疾患の予防または治療を行うこともできる。
従って、ＩＧＦＢＰの発現量の増大、あるいは機能亢進が原因で、細胞の生理作用が亢進している患者がいる場合、本発明の蛋白質と結合する抗体を投与することにより該生理作用を抑制することができ、また本発明の蛋白質が疾患の直接の原因でなくても本発明の蛋白質の機能を抑制することで対症療法が可能な疾患もまた、本発明の抗体の投与により予防および治療できる。
該抗体を有効成分として含有する医薬は、上記（５）に記載した本発明の蛋白質を含有する医薬の製造に準じ、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供することができる。
（１１）（７）の探索法で得られた化合物を含有する医薬
本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写過程、あるいは転写産物から蛋白質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、安全で低毒性な医薬組成物として有用である。
（７）で得られた化合物は（５）に記載した本発明の蛋白質を含有する医薬の製造法に準じ、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供することができる。
（１２）本発明のＤＮＡを用いたノックアウト非ヒト動物の作製
本発明のＤＮＡを含有してなる組換えベクターを用い、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ニワトリ等の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）において、染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等〕により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作製する〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，６３１５，２４３（１９９１）〕。胚性幹細胞の変異クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子に任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入ったホモ個体の中から、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現が一部または完全に抑制された個体としてノックアウト非ヒト動物を得ることができる。
また、染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子の任意の位置へ変異を導入することにより、ノックアウト非ヒト動物を作製することも可能である。例えば染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子の翻訳領域中へ塩基を置換、欠失、挿入等させて変異を導入することにより、その産物の活性を改変させることも可能である。また、その発現制御領域への同様な変異を導入することにより、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させることも可能である。さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例〔Ｃｅｌｌ，８７，７，１３１７（１９９６）〕やＣｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５，（１９９７）〕が知られている。
従って、染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子についても、このように任意の時期や組織で発現を制御できる、または任意の挿入、欠失、置換をその翻訳領域や発現制御領域に有する、ノックアウト非ヒト動物を作製することができる。
ノックアウト非ヒト動物は、任意の時期、任意の程度または任意の部位で、本発明の蛋白質に起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。
このように、本発明のノックアウト非ヒト動物は、本発明の蛋白質に起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬、また機能性食品、健康食品等の評価用モデルとして非常に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］  ヒト神経前駆細胞ＮＴ−２由来ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト胎児精巣由来のテラトカルシノーマ細胞であって、レチノイン酸処理により神経細胞に分化可能なＮＴ−２神経前駆細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入）を用いて以下の方法によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。添付マニュアルに従って、ＮＴ−２細胞を培養後、レチノイン酸を添加して、さらに２週間培養した。その培養細胞を集めて、モレキュラー・クローニング第２版に記載の方法によりｍＲＮＡを抽出した。さらに、オリゴｄＴセルロースでｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを精製した。それぞれのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡよりオリゴキャプ法〔Ｇｅｎｅ，１３８，１７１（１９９４）〕によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ  ｌｉｎｋｅｒ（配列番号３で表される塩基配列を有するＲＮＡ）及びＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ）を用いて文献〔蛋白質核酸酵素，４１，１９７（１９９６）、Ｇｅｎｅ，２００，１４９（１９９７）〕に記載の方法に従ってＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。
次いで、５’末端側のセンスプライマー（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）と３’末端側のアンチセンスプライマー（配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ）の２種のＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により二本鎖ｃＤＮＡに変換し、ＳｆｉＩで切断した。なお、このＰＣＲは市販のキットであるＧｅｎｅａｍｐ  ＸＬ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で１分間、５８℃で１分間及び７２℃で１０分間の反応サイクルを１２回繰り返し、その後４℃で保持することにより行った。次いで、ＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４、発現ベクター、３３９２ｂｐ）にｃＤＮＡを一定方向で連結して組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換することによりｃＤＮＡライブラリーを作製した。得られた形質転換体が保持する各々のプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’端と３’端の塩基配列を、ＤＮＡシークエンシング試薬（Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ又はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシークエンシング反応を行った後、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。
［実施例２］  ＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する新規因子の同定
作製したｃＤＮＡライブラリーの各クローンの塩基配列について、蛋白アミノ酸データベースＳＷＩＳＳＰＲＯＴあるいは塩基配列データベースＧｅｎＢａｎｋに登録されているＩＧＦＢＰスーパーファミリーに属する既知蛋白質としてヒトＩＧＦＢＰ−１、ヒトＩＧＦＢＰ−２、ヒトＩＧＦＢＰ−３、ヒトＩＧＦＢＰ−４、ヒトＩＧＦＢＰ−５、ヒトＩＧＦＢＰ−６、ヒトＩＧＦＢＰ−７、ヒトＩＧＦＢＰ−８、ヒトＩＧＦＢＰ−９若しくはヒトＩＧＦＢＰ−１０の１０分子を用い、これら分子をコードする塩基配列と相同性を有するクローンＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２を選択した。Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の塩基配列は配列番号２の塩基番号４５１〜２８８１の塩基配列に相当し、塩基番号４５１〜８６３の塩基配列部分はＢＬＡＳＴ２を用いた相同性解析においてヒトＩＧＦＢＰ−７（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．１１９２０６）とＰ値６．０×１０−１４で５９％の有意な相同性を示した。
Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２は５’部分が欠出した不完全長ｃＤＮＡであったことから、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の塩基配列をもとに、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭｋｉｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用い添付のプロトコールに従い、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の塩基配列を含むヒトゲノムＤＮＡ領域の塩基配列情報を取得した。取得した、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の５’末端から３６塩基部分の塩基配列（配列番号２の塩基番号４５１〜４８６の塩基配列の部分）を含むクローンの塩基配列を配列番号７に示した。Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の５’末端から３６塩基部分の塩基配列を含むゲノム領域の４５０塩基上流に開始コドンＡＴＧが、さらに２８塩基上流付近にスプライシングのアクセプター配列であるＡＧが存在した。また、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の５’末端から３６塩基部分の塩基配列を含むゲノム領域直後にはスプライシングのドナー配列であるＧＴが存在することから、配列番号７の塩基番号９〜４９４の塩基配列の部分は一つのエクソンを構成しており、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡの塩基配列は配列番号２に示す塩基配列であることが分かった。配列番号１にＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列を示した。
Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴ２を用いた相同性解析において、インスリン様増殖因子結合蛋白質ファミリーに属する蛋白質であるヒトＩＧＦＢＰ−７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｉ５２８２５）とＰ値１．０×１０−３９で３９％の有意な相同性を示した。インスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーにおいては、ＩＧＦ−１やＩＧＦ−２、インスリンとの結合に重要な１０個のシステイン残基が存在し、そのうち４個のシステイン残基を含むインスリン様増殖因子結合モチーフ〔ＧＣＧＣＣＸＸＣ（Ｇ：グリシン残基、Ｃ：システイン残基、Ｘ：任意のアミノ酸残基）〕を中心に、このファミリーに属する因子間で高く保存されている。Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列をインスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーの各因子と比較してみると、配列番号１で表されるアミノ酸配列においても、システイン残基の位置と数が保存されており、インスリン様増殖因子結合モチーフ部分も高く保存されていることが分かった（図１）。また、Ｎ末端側のシグナル配列も、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質とインスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーに属する因子間で高く保存されていた（図１）。
以上の結果より、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質がインスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーに属するヒト新規蛋白質であり、インスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーに属する蛋白質としての活性を有することが明らかとなった。
配列番号２に示した塩基配列をもとに、塩基配列データベースＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪを、ＢＬＡＳＴ２を用いて検索したところ、機能が未知な遺伝子として登録されているＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．２１４００と相同性が高いことが分かった。このＨｓ．２１４００は他の遺伝子と有為な相同性を示さない３２個のＥＳＴから構成されており、ＢＬＡＳＴ２を用いた相同性解析で配列番号２に示した塩基配列の３’部分とＰ値８．５×１０−１０３、相同性９３％であった。また、配列番号２に示した塩基配列と同一遺伝子由来と考えられるヒトＥＳＴが一つ存在したが、このＥＳＴ塩基配列はＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡをカバーしていなかった。このＥＳＴのＧｅｎｅＢａｎｋアクセッションナンバーはＡＷ１２９０７６である。
プラスミドＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２を含む大腸菌：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ／ｐＭＥ１８ＳＦＬ３−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４７３として、平成１３年３月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６  郵便番号３０５−８５６６）（旧称経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所、旧住所  日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６））に寄託されている。
［実施例３］  Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡの塩基配列の解析
配列番号２に示したＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、蛋白質の開始コドン予測プログラムＡＴＧＰｒ〔Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１４，３８４（１９９８）〕を用いて開始コドン周辺配列を解析した。配列番号２に示した塩基配列では、２７〜２９番目に位置するＡＴＧが開始コドン、８６１〜８６３番目に位置するＴＡＧが終始コドンと特定され、ＯＲＦにコードされる蛋白質は２７８アミノ酸から構成されると推定された。配列番号１に示したＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡのコードするアミノ酸配列をもとに、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  ７．３（ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  ＣＯ．，ＬＴＤ製）を用いて疎水性プロットを作製した結果、Ｎ末端部分には分泌蛋白質に特徴的な疎水性の高い領域が存在した。
［実施例４］  Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする遺伝子のゲノム解析
配列番号２に示したＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、塩基配列データベースＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪをＢＬＡＳＴ２を用いて検索し、配列番号２で表される塩基配列を含むゲノムクローン（ＧｅｎＢａｎｋアクションナンバー：ＡＬ１３５７８５）の塩基配列情報を取得した。
取得したヒトゲノム遺伝子配列と配列番号２で表される塩基配列の比較から、配列番号２で表される塩基配列は６つの部分に別れて同一ヒト第９染色体ｐ１１−１３．３のゲノム上に約１８ｋｂにわたって存在していることが分かった。
［実施例５］  Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡを発現している臓器
ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．２１４００のＮＣＢＩに登録されているＳＡＧＥデータ（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／からのリンクデータ）を表１に示した。配列番号２に示したＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡは、脳組織由来のｃＤＮＡライブラリーＳＡＧＥ  Ｄｕｋｅ  １２７３で高頻度存在し、脳組織に比較的選択的に発現していることが分かった。また、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２自身もレチノイン酸処理したＮＴ−２神経前駆細胞より調製されたことから、脳組織における細胞増殖、細胞分化、組織再生に関わりの深い分子で有ることが推定された。
2002081515.tif 000002
［実施例６］  ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の由来遺伝子の発現解析
クロンテック社より購入したヒト臓器ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ  ４μｇを鋳型とし、市販のＳＵＰＥＲ  ＳＣＲＩＰＴ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ギブコ社製）を用い、添付マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。
ヒト臓器ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡとしては、脳、下垂体、精巣、甲状腺、子宮、副腎、小脳、腎臓、膵臓、小腸、骨髄、心臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、脊髄、脾臓、胃、胸腺、気管由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを用いた。
次いで、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号８および９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１０および１１で表される塩基配列を有するＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、合成したｃＤＮＡを滅菌水を用いて５０倍に希釈した溶液およびＡｄｖａｎｔａｇｅＲ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて常法により反応液を調製後、９４℃で７分間反応させ、次いで９４℃で１分間、６８℃で３分間のサイクルを３２サイクル反復し、最後に６８℃で７分間反応させる条件で行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動し、それぞれのプライマーセットに特異的なＤＮＡ断片の濃さを比較することで発現量の比較を行った結果、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２は脳、下垂体、精巣、甲状腺、子宮で有意に高い発現が確認された。
なお、配列番号８および配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡをＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２に特異的なプライマーセットとして、配列番号１０および配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡをヒトβアクチンに特異的なプライマーセットとして用いた。
［実施例７］  Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡの取得
（１）  ヒト脳由来全一本鎖ｃＤＮＡの調製
ヒト脳由来全ＲＮＡ（クロンテック社製）を４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
得られた各々の全ＲＮＡ  ３μｌに対しＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＮ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲクローニングには該反応液の５０倍希釈水溶液を使用した。使用するまで−８０℃で保管した。
（２）  Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡの取得
（ａ）  ５’末端側のｃＤＮＡ断片の取得
上記（１）で作製したヒト脳由来一本鎖ｃＤＮＡに対し、配列番号１６および配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ反応は、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてヒト脳由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌ含む２５μｌの反応液（ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／ｌ上記プライマーセット）を調製し、９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクル繰り返した後、さらに７２℃で５分間加熱する条件で行った。ＰＣＲ終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、約１１００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いて精製（以下、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製にはこの方法を用いた。）し、滅菌水２０μｌで溶出した。該ＤＮＡ断片９μｌをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いた２０μｌの反応系でｐＧＥＭ  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）５０ｎｇとの連結反応を行い、該反応液２μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αをコーエンらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，６９，２１１０（１９７２）〕（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた）により形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーから、公知の方法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７，１５１３（１９７９）〕（以下、プラスミドの単離方法にはこの方法を用いた）に従って、プラスミドＤＮＡ（以下、ｐＧＥＭ−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｎと称す）を単離した。
（ｂ）  ３’末端側のｃＤＮＡ断片の取得
上記（１）で作製したヒト脳由来一本鎖ｃＤＮＡに対し、配列番号１８および配列番号１９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、上記（２）（ａ）と同様にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。得られた増幅ＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−のＡｐａＩ−ＳａｃＩ断片と連結し、上記（２）（ａ）と同様の方法でプラスミドＤＮＡ（以下、ｐＳＫ−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｃと称す）を単離した。
（ｃ）  完全長ｃＤＮＡの取得
上記（２）（ａ）で作製したｐＧＥＭ−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｎのＳａｃＩＩ−ＡｐａＩ断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈを用いて本項（２）（ｂ）で作製したｐＳＫ−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｃのＳａｃＩＩ−ＡｐａＩ断片と連結し、上記（２）（ａ）と同様の方法でプラスミドＤＮＡ（以下、ｐＳＫ−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｔと称す）を単離した。
インサートの有無は、アガロースゲル電気泳動によるサイズ比較により確認し、塩基配列はＤＮＡシーケンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒａｅｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を使用して添付のマニュアルに従い決定した。ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを除いた後、決定された塩基配列と配列番号２で表される塩基配列を比較し、該プラスミドに挿入されたＤＮＡは、配列番号２で表されるＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡと同じであることを確認した。
［実施例８］  動物細胞を宿主としたＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質の発現
（１）組換えベクターの作製
実施例７で取得されたクローンＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｔを鋳型とし、配列番号１２および配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、または配列番号１２および配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて常法により反応液を調製後、９８℃で１５秒間、６５℃で２秒間、７４℃で３０秒間のサイクルを２５サイクル繰り返す条件でＰＣＲを行い、各々の反応にて約８４０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片としてＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２を得た。
次に該Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の５’側がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の３’側が、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−のＸｈｏＩ部位側になるように挿入することにより、配列番号１２および配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を有するプラスミドであるｐＳＫ−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２、配列番号１２および配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を有するプラスミドであるｐＳＫ−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈを作製した。
次に、ｐＳＫ−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２およびｐＳＫ−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片（約８３０ｂｐ）を動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ部位に挿入し、ｐｃＤＮＡ３−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２およびｐｃＤＮＡ３−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈを作製した。
なお、配列番号１２および配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡのプライマーセットは、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２のＣ末端にＨｉｓマーカーペプチドが付加されるように設計した。
（２）細胞へのベクターの導入
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ギブコ社製）１００μｌにＦｕＧＥＮＥＴＭ６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）２μｌを加え、室温で５分間放置した。次いでコントロールプラスミドｐｃＤＮＡ３、上記（１）で作製したＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２またはｐｃＤＮＡ３−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈを１μｇ添加し、さらに室温で１５分間放置した。この間に６ウェルプレートに１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（ギブコ社製）を２ｍｌ／ウェルとなるように分注し、さらにＣＯＳ−１細胞（Ｒｉｋｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ；ＲＣＢ０１４３）を３×１０５個／ウェルで播種した。１５分間放置後、該プラスミドとＦｕＧＥＮＥＴＭ６トランスフェクション試薬の混合液を２５μｌ／ウェルずつ６ウェルプレートへ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で７２時間培養し、一過性形質転換株を取得した。以下、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２、およびｐｃＤＮＡ３−Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈを各々導入して作製した形質転換株を、それぞれＣＯＳ−１／ｍｏｃｋ株、ＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２株、およびＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈ株と称する。
（３）発現の確認
（ａ）  培養上清の調製
上記（２）で作製したＣＯＳ−１／ｍｏｃｋ株、ＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２株、およびＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈ株の培養上清を４ｍｌ回収し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形物を除去し、培養上清を取得した。なお、取得した培養上清は−２０℃で保存し、必要に応じて解凍後、以下の実験に用いた。
（ｂ）  細胞破砕液の取得
上記（２）で作製したＣＯＳ−１／ｍｏｃｋ株、ＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２株、およびＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈ株の細胞をセルスクレイパー（住友ベークライト社製）で６ウェルプレートから剥離後、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．２）〔以下、「ＰＢＳ」と称す（ギブコ社製）〕２ｍｌに懸濁し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した。次いで、動物細胞用プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）１００μｌを含むＰＢＳ１ｍｌに懸濁した後、超音波破砕することにより、細胞破砕液を取得した。なお、取得した細胞破砕液は−２０℃で保存し、必要に応じて解凍後、以下の実験に用いた。
（ｃ）  ウエスタンブロッティングによる検出
上記（３）（ａ）で調製したＣＯＳ−１／ｍｏｃｋ株、ＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈ株の培養上清１０μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）にて分画後、常法に従いＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティングした。該膜を５％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ−ＰＢＳ（以下、「ブロッキング液」と称す）でブロッキング後、該膜に抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を１μｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、室温で１時間放置した。該膜を０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〔商品名：スパン２０（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ２０相当品：和光純薬社製）〕／ＰＢＳ（以下、「Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ」と略す）でよく洗浄した後、二次抗体として２，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯ社製）を用いて検出した。
ＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈ株の培養上清では、ＣＯＳ−１／ｍｏｃｋ株には観察されないバンドが検出された。従って、ＣＯＳ−１細胞において、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２がコードする蛋白質の発現が確認された（図２）。
［実施例９］  Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質を認識するモノクローナル抗体の作製
（１）抗原ペプチドの選択
Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列を解析し、親水性の高い部分、Ｎ末端、Ｃ末端、二次構造上ターン構造、ランダムコイル構造を有する部分の中から、抗原として適当と考えられる部分配列として、化合物１（配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）を選択した。
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１３８巻，９頁（１９８４年）〕に従った。
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸
Ａｓｘ：Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−アスパラギン
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン
Ｇｌｙ：グリシン
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン
Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｔＢｕ：ｔ−ブチル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｇ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル−Ｌ−アルギニン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｉｍ−トリチル−Ｌ−システイン
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
以下の実施例において、化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。
質量分析は、日本電子ＪＭＳ−ＨＸ１１０Ａを用いＦＡＢ−ＭＳ法により行った。アミノ酸分析は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ａ．）らの方法〔アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２２２，１９（１９９４）〕により行った。加水分解は塩酸蒸気中１１０℃で２０時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ・アキュ・タグ（Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ−Ｔａｇ）アミノ酸分析計（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い分析した。
（２）化合物１（配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドＡｃ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＯＨ）の合成
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、２２．８μｍｏｌが結合した担体樹脂〔Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−ＣｌＴｒｔ  ｒｅｓｉｎ樹脂、ノバビオケム社製〕４０ｍｇを自動合成機（島津製作所）の反応容器に入れ、６００μｌのＤＭＦを加えて３分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
（ａ）３０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液５００μｌを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｂ）担体樹脂を６００μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
（ｃ）Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（２２８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２２８μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ  １水和物（２２８μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（６８４μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．１２ｍｌ）中で３分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を３０分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｄ）担体樹脂を６００μｌのＤＭＦで１分間洗浄後溶液を排出し、これを５回繰り返した。
上記の工程により、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を担体上に合成した。
次に、（ａ）（ｂ）の工程の後、（ｃ）の工程でＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｄ）の洗浄工程を経て、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を担体上に合成した。
以下、工程（ｃ）において、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した後、（ａ）（ｂ）の脱保護、洗浄工程を経て、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。次に得られた担体樹脂に対し次の（ｅ）〜（ｇ）の操作を行った。
（ｅ）担体樹脂を８００μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を３回繰り返した。
（ｆ）無水酢酸（４５６μｍｏｌ）及びＤＭＦ（５００μｌ）を樹脂に加えて混合物を２時間攪拌し、溶液を排出した。
（ｇ）担体樹脂を８００μｌのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を３回繰り返した。
この後、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、Ｎ末端がアセチル化された側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、ＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、エチルメチルスルフィド（３％）、１，２−エタンジチオール（２．５％）およびチオフェノール（２％）からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で８時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約１０ｍｌを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして６６．６ｍｇを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ３０ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ  ２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。０．１％  ＴＦＡ水溶液に、ＴＦＡ  ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を２３．０ｍｇ得た。
質量分析［ＦＡＢＭＳ］；ｍ／ｚ＝２４１３．０（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ  １．０（１），Ｇｌｙ  ２．０（２），Ｈｉｓ  ４．３（４），Ａｒｇ  ３．８（４），Ｔｈｒ  １．０（１），Ａｌａ  ２．９（３），Ｐｒｏ  ２．９（３），Ｌｅｕ  １．０（１），Ｌｙｓ  １．０（１），Ｃｙｓ  １．３（１）
（３）免疫原の調製
実施例９（２）で得られた化合物１は、免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（カルビオケム社）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌに調整し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＳ〔Ｎ−（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ；ナカライテスク社〕を滴下して３０分撹拌反応させた。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢＳ  ２．５ｍｇを０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、攪拌反応した。反応後、ＰＢＳで透析したペプチドを免疫原として用いた。
（４）動物の免疫と抗体産生細胞の調整
実施例９（３）で調製した化合物１のＫＬＨコンジュゲート１００μｇを水酸化アルミニウムアジュバント〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ９９、１９８８〕２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに６週令雌Ｂａｌｂ／ｃマウス３匹に投与した。投与２週間後より、ＫＬＨコンジュゲート１００μｇを１週間に１回、計４回投与した。該マウスの眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスにＫＬＨコンジュゲート１００μｇを最終免疫し、その３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（５）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイ用の抗原には実施例９（２）で得られた化合物１をサイログロブリン（以下、ＴＨＹと略す。）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は実施例９（３）に記した通りであるが、架橋剤にはＭＢＳの代わりにＳＭＣＣ〔４−（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ；シグマ社〕を用いた。９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上記のように調製したコンジュゲートを５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／穴で分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、１％  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／ダルベッコリン酸バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）を１００μｌ／穴加え、室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。
放置後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌ／穴で分注し、２時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社）を５０μｌ／穴で加えて室温、１時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム、１ｍｍｏＬ／Ｌ  ＡＢＴＳ／０．１ｍｏＬ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４．２）〕を添加し、発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。
（６）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１：ＡＴＣＣより購入）を正常培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（７）ハイブリドーマの作製
実施例９（４）で得られたマウス脾細胞と実施例９（６）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）１ｇ、ＭＥＭ培地１ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．３５ｍｌの混液を１０８個のマウス脾細胞あたり０．５ｍｌ加え、該懸濁液に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。
該懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地にＨＡＴ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁した。該懸濁液を９６穴培養用プレートに２００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。
培養後、培養上清を実施例９（５）に記載した酵素免疫測定法で調べ、化合物１に反応して陰性対照化合物に反応しない穴を選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、抗Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株ＫＭ３１０３を確立した。
抗Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２モノクローナル抗体ＫＭ３１０３を産生するハイブリドーマ細胞株は、平成１４年３月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６：郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７７として寄託されている。
（８）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に実施例９（７）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）した。
該腹水を遠心分離（１２００×ｇ、５分間）し固形分を除去した。精製ＩｇＧモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法により決定した。図３に示すようにＫＭ３１０３のサブクラスはＩｇＧ１であった。
（９）モノクローナル抗体の反応性の検討（バインディングＥＬＩＳＡ）
実施例９（５）に示した方法に従って行なった。ただし、１次抗体には実施例９（８）で得られたＫＭ３１０３を１０μｇ／ｍｌから１０倍希釈で５段階に希釈したものを用いた。結果を図４に示す。ＫＭ３１０３は濃度依存的に化合物１に特異的な反応性を示した。
［実施例１０］  モノクローナル抗体ＫＭ３１０３を用いたＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質のウエスタンブロッティングによる検出
実施例８で調製したＣＯＳ−１／ｍｏｃｋ株、ＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２株、およびＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈ株の培養上清１０μｌ、または細胞破砕液２．５μｌを、実施例８（３）（ｃ）の記載に従い、検出抗体として実施例９で取得したモノクローナル抗体ＫＭ３１０３を用いてウエスタンブロッティングを行った。
抗Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２モノクローナル抗体ＫＭ３１０３は、実施例８に記載したＣＯＳ−１細胞で発現させたＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質を特異的に認識することが分かった（図５）。
［実施例１１］  Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質の癌細胞増殖に及ぼす効果
Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質の癌細胞増殖への作用を調べるため、実施例８（３）（ａ）で取得したＣＯＳ−１／ｍｏｃｋ株、ＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２株、およびＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈ株の培養上清を用い、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）のＩＧＦ依存的な増殖に与える影響を以下のように検討した。
ウシ血清アルブミン（ギブコ社製）２００μｇ／ｍｌ、ヒトトランスフェリン（ギブコ社製）１０μｇ／ｍｌを添加したＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ギブコ社製）中に１×１０５個／ｍｌに調製したＨＴ−２９細胞を、９６ウェルプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で３時間培養した。次いで、ヒトＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、またはヒトＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。続いてＣＯＳ−１／ｍｏｃｋ株、ＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２株、またはＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈ株の培養上清を５μｌ／ｗｅｌｌずつ添加して、さらに３７℃のＣＯ２インキュベーター中で５日間培養した後、生細胞数をＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＷＳＴ−１（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により測定した。
ＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２株およびＣＯＳ−１／Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２ｈ株の培養上清を加えた試験区では、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９細胞のＩＧＦ依存的な増殖を有意に阻害することが示された（図６）。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、新規インスリン様増殖因子結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質を認識する抗体、および該蛋白質が関与する疾患の判定法、診断薬、予防薬および治療薬が提供できる。
配列表フリーテキスト
配列番号３−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質とＩＧＦＢＰファミリー因子とのアミノ酸配列の比較を示す図である。なお、図中のＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＧＦＢＰ−７は、それぞれヒトＩＧＦＢＰ−１、ヒトＩＧＦＢＰ−２、ヒトＩＧＦＢＰ−３、ヒトＩＧＦＢＰ−４、ヒトＩＧＦＢＰ−５、ヒトＩＧＦＢＰ−６、ヒトＩＧＦＢＰ−７を指す。また、Ｃ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２の完全長ｃＤＮＡがコードする蛋白質とインスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリー間で保存されているアミノ酸配列を白抜きで示し、ファミリー間で高く保存されているシステイン残基に＊印を記した。
図２は、ＣＯＳ−１細胞を宿主としたＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２がコードする蛋白質の発現を示す写真である。ｍｏｃｋは対照を表す。
図３は、サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体ＫＭ３１０３のサブクラスを示す図である。左カラムがＰ３−Ｕ１、右カラムがモノクローナル抗体ＫＭ３１０３の結果を示す。各カラムは左から、全サブクラス、Ｇ１、Ｇ２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ３、Ｍを認識する抗体を用いた試験区を示す。
図４は、バインディングＥＬＩＳＡによりモノクローナル抗体ＫＭ３１０３とモノクローナル抗体ＫＭ３１０３の抗原ペプチドとの反応性を示す図である。図中、●は化合物１を加えた試験区を、○はコントロール化合物を加えた試験区を示す。
図５は、ＫＭ３１０３を用いたウエスタンブロッティングによるＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２がコードする蛋白質の検出を示す写真である。ｍｏｃｋは対照を表す。
図６は、ＨＴ−２９細胞のＩＧＦ依存的な増殖に及ぼすＣ−ＮＴ２ＲＩ２００４３１２がコードするタンパク質の影響を示す図である。ｍｏｃｋは対照を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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