(57)【要約】新規ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターでトランスフェクションされた細胞、前記ポリペプチドに結合する抗体又はその断片、及び前記ポリペプチドの製造方法を開示する。前記ポリペプチドは、新規プロテアーゼである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列、あるいは、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項３】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項４】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列との相同性が、９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項５】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列との相同性が、９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項６】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる、あるいは、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなるポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞を培養し、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを回収することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
（１）請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドと、（２）α２−マクログロブリンと、（３）試験化合物とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドとα２−マクログロブリンとが、ＳＤＳ及び／又は還元剤では解離しない複合体を形成するか否かを分析する工程
を含む、試験化合物が前記ポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害するか否かを検出する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法による検出工程、及び
プロテアーゼ活性を阻害する物質を選択する工程
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により、慢性腎不全治療用物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法による検出工程、及び
製剤化工程
を含む、慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なプロテアーゼに関する。
背景技術
ＡＤＡＭＴＳ（Ａ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｍｏｔｉｆ）は、ディスインテグリン様ドメイン、金属プロテアーゼ様ドメイン、及びトロンボスポンジンＩ型繰り返し配列（以下、ＴＳＰ−１繰り返し配列と称する）を含む分子群であり、現在までに９種のヒトＡＤＡＭＴＳ分子が報告されている。
前記ヒトＡＤＡＭＴＳ分子の中で、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）及びＡＤＡＭＴＳ１１（アグリカナーゼ−２）では、細胞外基質アグリカンを第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の間）で選択的に切断する活性が示され、関節炎や変形性関節症における軟骨細胞外基質アグリカンの分解の本体の酵素である可能性が示唆されていた（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ　Ｍ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１６６４−１６６６，１９９９；及びＡｂｂａｓｚａｄｅ　Ｉ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２３４４３−２３４５０，１９９９）。また、ＡＤＡＭＴＳ２（プロコラーゲンＩ　Ｎ−プロテイナーゼ）は、Ｉ型コラーゲンプロ体のＮ末部の切断除去酵素として、Ｉ型コラーゲンのプロ体から成熟型への転換に関与し、コラーゲン線維の形成に重要な役割を果たしており、その遺伝子の異常とＶＩＩＣ型エーラース・ダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ）症候群との関連性が示されている（Ｃｏｌｉｇｅ　Ａ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６５，３０８−３１７，１９９９）。
すなわち、ＡＤＡＭＴＳ分子は、アグリカンやコラーゲン等の細胞外マトリクスの分解及び成熟といった代謝に関与することが示されている。
一方、慢性腎不全は、糸球体硬化及び腎間質線維化を特徴とする疾患であり、細胞外マトリクス成分の質的変化及び／又は量的増加が主要な発病及び進行機序とされている。腎不全疾患モデルを用いた実験において、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の特異的な作用抑制タンパク質であるデコリンの遺伝子導入（Ｉｓａｋａ　Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．，２，４１８−４２３，１９９６）や抗ＴＧＦ−β投与（Ｚｉｙａｄｅｈ　Ｆ．Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，８０１５−８０２０，２０００；Ｓｈａｒｍａ　Ｋ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，５２２−５３０，１９９６；及びＢｏｒｄｅｒ　Ｗ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６，３７１−３７４，１９９０）が有効性を示したことより、ＴＧＦ−βの生理機能を抑制又は阻害することが慢性腎不全の治療に繋がると考えられている。
しかし、満足のいく慢性腎不全治療薬がない現状のもと、期待されているにも係わらず、現在までにＴＧＦ−β阻害剤は上市されていない。
発明の開示
ＴＧＦ−βは、多種多様の生理機能を示す分化及び成長因子であるため、ＴＧＦ−βの生理機能全てを阻害することは、長期投与が想定される慢性腎不全の治療においては副作用の観点から危険である。ＴＧＦ−βの生理作用のうち、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害することが望ましい。
本発明の課題は、ＴＧＦ−βにより誘導され、細胞外マトリクスの代謝に関与する、慢性腎不全治療剤のスクリーニングツールとして有用な新規のプロテアーゼ、及びそれをコードする新規のポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡより、配列番号２で表される配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列からなり、１２２４個のアミノ酸残基からなる新規プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを見出した。更に、本発明者は、この新規プロテアーゼの７５０アミノ酸残基からなるＮ末端側部分断片も、充分なプロテアーゼ活性を有することを見出した。また、前記プロテアーゼは、（１）ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼに分類されることより、細胞外マトリックスの代謝に関与するプロテアーゼであると考えられること、（２）実際に、ヒトの腎臓での発現が認められること、（３）腎臓の初代培養細胞において、ＴＧＦ−βにより発現誘導されること、及び（４）腎不全モデル動物において、その遺伝子発現量が増加していることを見出した。これらにより、本発明のプロテアーゼは、腎不全の原因となるポリペプチドであり、本発明のポリペプチドを用いて、そのプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングすることにより、ＴＧＦ−βの生理作用のうち、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害する慢性腎不全治療剤として有用な物質をスクリーニングすることができることを明らかにし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列、あるいは、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；
［３］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；
［４］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列との相同性が、９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；
［５］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列との相同性が、９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；
［６］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる、あるいは、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなるポリペプチド；
［７］［１］〜［６］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［８］［７］記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
［９］［８］記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞；
［１０］［１］〜［６］記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片；
［１１］［９］記載の細胞を培養し、［１］〜［６］記載のポリペプチドを回収することを含む、［１］〜［６］記載のポリペプチドの製造方法；
［１２］（１）［１］〜［６］記載のポリペプチドと、（２）α２−マクログロブリンと、（３）試験化合物とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドとα２−マクログロブリンとが、ＳＤＳ及び／又は還元剤では解離しない複合体を形成するか否かを分析する工程
を含む、試験化合物が前記ポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害するか否かを検出する方法；
［１３］［１２］記載の方法による検出工程、及び
プロテアーゼ活性を阻害する物質を選択する工程
を含む、［１］〜［６］記載のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法；
［１４］［１３］記載の方法により、慢性腎不全治療用物質をスクリーニングする方法；並びに
［１５］［１２］記載の方法による検出工程、及び
製剤化工程
を含む、慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法
に関する。
本明細書において「プロテアーゼ活性」とは、血清中に存在するプロテアーゼ阻害タンパク質であるα２−マクログロブリンと、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び／又は還元剤では解離しない複合体を形成することのできる性質を意味する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；並びに
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
が含まれる。
本発明のポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド」は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、
（１ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなるポリペプチド；
（１ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、プロテアーゼ活性を示す融合ポリペプチド；
（１ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列のＣ末端に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第７５１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列又はそのＣ末端から１〜４７３個のアミノ酸が欠失した配列が付加されたアミノ酸配列［すなわち、Ｃ末端が第７５１番〜第１２２４番のアミノ酸のいずれかである；以下、「配列番号２で表されるアミノ酸配列又はそのＣ末端欠失配列」と称する］を有するポリペプチド；並びに
（１ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又はそのＣ末端欠失配列において、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が更に付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、プロテアーゼ活性を示す融合ポリペプチド
などが含まれる。
本明細書において、或るポリペプチド（以下、試験ポリペプチドと称する）が「プロテアーゼ活性を示す」か否かを判定する方法（以下、「プロテアーゼ活性の判定方法」と称することがある）は、「血清中に存在するプロテアーゼ阻害タンパク質であるα２−マクログロブリンと、ＳＤＳ及び／又は還元剤では解離しない複合体を形成することのできる性質」を示すか否かを判定することができる限り、特に限定されるものではないが、例えば、前記の試験ポリペプチドと、血清中に存在するプロテアーゼ阻害タンパク質であるα２−マクログロブリンとを接触させ、ＳＤＳ及び／又は還元剤［例えば、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）］では解離しない複合体を形成するか否かを分析することにより、確認することができ、具体的には、例えば、実施例４に記載の方法で確認することができる。
α２−マクログロブリンは、血清中に存在するプロテアーゼ阻害タンパク質であり、多くのプロテアーゼと複合体を形成することが知られている。この複合体の形成はプロテアーゼ活性に依存しており、また、形成された複合体は、プロテアーゼとα２−マクログロブリンとがアミド結合したものであるため、ＳＤＳ又は還元剤（例えば、２−ＭＥ）では解離しないことが知られている（Ｆｅｉｎｍａｎ　Ｒ．Ｄ．ら，Ａｎｎ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７３７，２４５−２６６，１９９４；及びＫｕｎｏ　Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１８８２１−１８８２６，１９９９）。
前記ポリペプチド（１ａ）、すなわち、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなるポリペプチド」は、プロテアーゼ活性を示す、７５０個のアミノ酸残基からなる新規プロテアーゼである。前記ポリペプチド（１ａ）は、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなるポリペプチド」の部分ポリペプチドに相当する。
本発明のポリペプチドにおける前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明の機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個（例えば、１〜数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなるポリペプチドのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体）をコードするポリヌクレオチドを元にして、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを元にして、遺伝子工学的に人為的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなるポリペプチドのヒトにおける変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することが可能である。
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例４に記載の方法により、プロテアーゼ活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例４に記載の方法により、プロテアーゼ活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
本発明の機能的等価改変体には、例えば、
（２ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；
（２ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更に、そのＮ末端及び／又はＣ末端に適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、プロテアーゼ活性を示す融合ポリペプチド；
（２ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更に、そのＣ末端に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第７５１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列又はそのＣ末端から１〜４７３個のアミノ酸が欠失した配列が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；並びに
（２ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更に、そのＣ末端に、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第７５１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列又はそのＣ末端から１〜４７３個のアミノ酸が欠失した配列が付加されたアミノ酸配列であって、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が更に付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、プロテアーゼ活性を示す融合ポリペプチド
などが含まれる。
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列に関して、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の相同ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列との相同性、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列との相同性が９０％以上（より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチドがより好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｎｇｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）により得られた値を意味し、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥＧ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
以上、本発明のポリペプチドについて説明したが、本発明のポリペプチドとしては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなるポリペプチド」、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなるポリペプチド」、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド」、あるいは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、プロテアーゼ活性を示すポリペプチド」が好ましく、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなるポリペプチド」、あるいは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなるポリペプチド」がより好ましい。
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列における第１番〜第２２５０番の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができ、配列番号１で表される塩基配列における第１番〜第２２５０番の塩基からなるポリヌクレオチドが特に好ましい。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
前記（１）のＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。抽出した前記ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
前記（２）の常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ　Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、又はＪＭ１０９株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシン等に対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（ｉ）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（ｉｉ）ＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法、又は（ｉｖ）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング法を採用することができる。
前記（ｉ）の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルター又はポリアミドフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
前記（ｉｉ）のＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
前記（ｉｉｉ）の本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、予め、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株の培養上清、細胞内、又は細胞表面にポリペプチドを産生させ、本発明のポリペプチドに対する抗体及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポリペプチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
前記（ｉｖ）のセレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルター等にブロットし、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを適当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞へ注入したり、あるいは、ウサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、ポリペプチドに翻訳させる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて検出して、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
前記（３）の化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ　１０００Ｍ　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
［３］本発明の発現ベクター及び細胞
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞をトランスフェクションすることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
また、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｄ．Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
更に、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生するトランスフェクションされた細胞を得ることができる。
本発明の細胞は、常法（例えば、日本生化学会編，「新生化学実験講座１８　細胞培養技術」，東京化学同人，１９９０）に従って培養することができ、前記培養により細胞外に本発明のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
本発明の細胞を培養することにより、前記細胞の細胞外に生産きれる本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法（例えば、岡田雅人及び宮崎香編，「改訂タンパク質実験ノート上・下」，羊土社，１９９９）により、分離精製することができる。具体的には、本発明のポリペプチドを含む培養液を、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のポリペプチドを精製することができる。
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のポリペプチドの発現の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。
［４］本発明の検出方法及びスクリーニング方法
本発明のポリペプチドを用いると、試験化合物が、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害するか否かを検出することができる。また、この本発明の検出方法を用いると、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物賀をスクリーニングすることができる。本発明のポリペプチドであるＭＤＴＳ９（Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｗｉｔｈ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｔｙｐｅ−１　ｒｅｐｅａｔｓ　９）は、その配列よりＡＤＡＭＴＳプロテアーゼであると考えられることから、細胞外マトリクスの代謝に関与するプロテアーゼであると考えられ、後述の実施例５及び実施例８に示すように、腎臓で発現しているタンパク質であり、しかも、後述の実施例６に示すように、ＴＧＦ−βにより誘導されるＡＤＡＭＴＳプロテアーゼである。従って、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質は、ＴＧＦ−βの生理作用のうち、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害する可能性が高く、長期投与が想定される慢性腎不全治療剤の有効成分として有用であり、本発明のポリペプチドそれ自体を、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質、あるいは、慢性腎不全治療用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。
本発明の検出方法又はスクリーニング方法にかけることのできる試験化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。前記公知化合物には、例えば、プロテアーゼ阻害活性を有することが知られているが、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性に対して阻害するか否かが不明な化合物（ペプチドを含む）が含まれる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明の検出方法は、
（１）本発明のポリペプチドと、（２）α２−マクログロブリンと、（３）試験化合物とを接触させる工程、及び
本発明のポリペプチドとα２−マクログロブリンとが、ＳＤＳ及び／又は還元剤（例えば、２−ＭＥ）では解離しない複合体を形成するか否かを分析する工程
を含む。
本発明の検出方法においては、試験ポリペプチドとα２−マクログロブリンとを接触させる代わりに、本発明のポリペプチドとα２−マクログロブリンと試験化合物とを接触させること以外は、先述のプロテアーゼ活性の判定方法と同様にして実施することができる。すなわち、本発明の検出方法では、本発明のポリペプチドと基質用ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、前記試験化合物の存在下において、本発明のポリペプチドとα２−マクログロブリンとがＳＤＳ及び／又は還元剤（例えば、２−ＭＥ）では解離しない複合体を形成するか否かを分析することにより、前記試験化合物が、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害するか否かを検出する。試験化合物の存在下において、本発明のポリペプチドとα２−マクログロブリンとがＳＤＳ及び／又は還元剤（例えば、２−ＭＥ）では解離しない複合体を形成しないか、あるいは、前記形成の程度が減少する場合には、前記試験化合物が、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害すると判断することができる。
本発明のスクリーニング方法では、本発明の検出方法により、試験化合物が、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害するか否かを検出し、その結果に基づいて、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質、あるいは、慢性腎不全治療用物質を選択する。より具体的には、例えば、本発明のポリペプチドとα２−マクログロブリンと試験化合物とを接触させ、前記試験化合物の存在下における本発明のポリペプチドとα２−マクログロブリンとの複合体の形成の有無又は程度を指標として、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質、あるいは、慢性腎不全治療用物質を選択することができる。試験化合物の存在下において、本発明のポリペプチドとα２−マクログロブリンとがＳＤＳ及び／又は還元剤（例えば、２−ＭＥ）では解離しない複合体を形成しないか、あるいは、前記形成の程度が減少する場合には、前記試験化合物が、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質、あるいは、慢性腎不全治療用物質であると判定することができる。
［５］本発明の慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法
本発明には、本発明のスクリーニング方法により選択される、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質を有効成分とする慢性腎不全治療用医薬組成物が包含される。
慢性腎不全治療用医薬組成物の品質規格の確認試験において、本発明の検出方法により、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害するか否かを検出する工程、及び製剤化工程を含む、慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
また、前記検出工程を含む本発明のスクリーニング方法で得られた物質を製剤化することからなる、慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与又は消化を受けない製剤化手段、例えば、ＷＯ９５／２８９６３号パンフレットに記載の製剤化手段が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。また、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。
［６］本発明の抗体又はその断片
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリーコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施した。
実施例１：Ｃ末ＦＬＡＧ付加型発現ベクターの作製
プラスミドｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）を、制限酵素ＣｌａＩ及びＮｓｉＩで切断し、平滑末端化した後、自己連結反応を行なうことにより、エプスタイン・バーウイルス由来のＥＢＮＡ１発現ユニットを除去した発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを作製した。得られた発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを、制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、アガロースゲル抽出することにより得られた約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせて得られた二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入することにより、発現ベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧを作成した。なお、得られた発現ベクターが目的の配列を有することは、塩基配列により確認した。
得られた発現ベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧを鋳型とし、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとして、パイロベスト（ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７２℃（３０秒間）とからなるサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃（７分間）の伸長反応を行なった。前記ＰＣＲにより生じた約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで切断した後、このＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧ（約７．７Ｋｂｐ）に挿入することにより、発現ベクターｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧを作成した。得られた発現ベクターｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧにおいては、プロモーターから下流に向かって、クローニングサイトであるＸｂａＩ認識配列、ＮｈｅＩ認識配列、ＮｏｔＩ認識配列、及びＢａｍＨＩ認識配列、並びにＦＬＡＧタグがこの順に配列されている。
実施例２：新規プロテアーゼ遺伝子ＭＤＴＳ９の全長ＯＲＦ遺伝子のクローニング
配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’側にＳｐｅＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列が付加してある）と配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’側にＮｏｔＩ認識配列が付加してある）との組み合わせをプライマーとし、ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ；クロンテック社製）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６８℃（２分３０秒間）とからなるサイクルを４０回繰り返し、最後に６８℃（７分間）の伸長反応を行なった。前記ＰＣＲにより生成した約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片（５’側にＳｐｅＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列が付加され、３’側にＮｏｔＩ認識配列が付加されている）を、プラスミドＰＣＲ２．１（インビトロジェン社製）にサブクローンすることにより、クローンｐＭＤＴＳ９Ｃｙｓ１を得た。
得られたプラスミドｐＭＤＴＳ９Ｃｙｓ１を制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで切断して生成した約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、前記実施例１で構築したｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧのＸｂａＩ部位及びＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ１−ＦＬＡＧを構築した。
配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’側にＳｐｅＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列が付加してある）と配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとし、ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ；クロンテック社製）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６８℃（３０秒間）とからなるサイクルを４５回繰り返し、最後に６８℃（７分間）の伸長反応を行なった。前記ＰＣＲにより生成した約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片（５’側にＳｐｅＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列が付加されている）を、プラスミドＰＣＲ２．１（インビトロジェン社製）にサブクローンすることにより、クローンｐＭＤＴＳ９（５Ｓ２−１２）を得た。
得られたプラスミドｐＭＤＴＳ９（５Ｓ２−１２）を制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｃｏＩで切断して生成した約０．２ｋｂｐのＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ　ＤＮＡ断片Ａと、先に得られたプラスミドｐＭＤＴＳ９Ｃｙｓ１を制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで切断して生成した約２．０ｋｂｐのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ　ＤＮＡ断片Ｂとを、前記実施例１で構築したｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧのＸｂａＩ部位及びＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧを構築した。同様に、前記ＤＮＡ断片Ａと前記ＤＮＡ断片Ｂとを、プラスミドｐＺＥｒＯ−２（インビトロジェン社製）のＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＺＥｒＯ−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２を構築した。
配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとし、ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ；クロンテック社製）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６８℃（２分３０秒間）とからなるサイクルを４０回繰り返し、最後に６８℃（７分間）の伸長反応を行なった。前記ＰＣＲにより生成した約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、プラスミドＰＣＲ２．１（インビトロジェン社製）にサブクローンすることにより、クローンｐＭＤＴＳ９−３Ｈを得た。
得られたプラスミドｐＭＤＴＳ９−３Ｈを制限酵素ＳｐｈＩ及びＮｏｔＩで切断して生成した約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片と、先に得られたプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧを制限酵素ＳｐｈＩ及びＮｏｔＩで切断して生成した約９．３ｋｂｐのＤＮＡ断片とを連結することにより、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｆｕｌｌ−ＦＬＡＧを構築した。
このプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｆｕｌｌ−ＦＬＡＧは、新規プロテアーゼ遺伝子ＭＤＴＳ９の配列番号１で表される塩基配列における第１番〜第３６７２番の塩基からなる遺伝子を含有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２４番のアミノ酸からなる配列のＣ末端に、配列番号２１で表されるアミノ酸配列が付加したポリペプチドを、動物細胞を宿主として、発現することができる。
また、先に得られたプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧは、新規プロテアーゼ遺伝子ＭＤＴＳ９の配列番号１で表される塩基配列における第１番〜第２２５０番の塩基からなる遺伝子を含有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第７５０番のアミノ酸からなる配列のＣ末端に、配列番号２１で表されるアミノ酸配列が付加したポリペプチドを、動物細胞を宿主として、発現することができる。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼであると考えられる。
実施例３：ＭＤＴＳ９短長タンパク質（ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２）及びＭＤＴＳ９全長タンパク質（ＭＤＴＳ９Ｆｕｌｌ）の発現
前記実施例２で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧ又はプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｆｕｌｌ−ＦＬＡＧ（あるいは、対照として、前記実施例１で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧ）を、市販のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ；ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて、添付指示書に従い、血清培地［ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、１０％牛胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２５０μｇ／ｍＬ−Ｇ４１８（ナカライテスク社製）］で培養していたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社製）に導入した。
プラスミド導入後、そのまま４８時間培養する（以下、血清培養と称する）か、あるいは、前記プラスミド導入後、そのまま１６時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄した後に、無血清培地［ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、１００μｇ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍＬ−Ｇ４１８（ナカライテスク社製）］にて３２時間培養した（以下、無血清培養と称する）。
前記血清培養又は無血清培養で得られた各培養液を、遠心分離器（８８００型；久保田製作所社製）により遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０分間）することにより、培養上清を得た。また、前記培養液を除去した後に残った各細胞を、抽出液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１％トリトンＸ−１００、１％グリセロール、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］にて１５分間処理した後、ピペッティングにより細胞を培養プレートより剥離し、得られた細胞懸濁液を遠心分離器（８８００型；久保田製作所社製）により遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０分間）することにより、細胞膜結合画分（上清）と細胞画分（沈澱）とに分画した。
得られた各画分（すなわち、培養上清、細胞膜結合画分、及び細胞画分）における目的タンパク質の発現は、Ｃ末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２；シグマ社製）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、前記の各画分を、２−ＭＥを用いた還元条件下、ＳＤＳ／１０％〜２０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社製）を用いて電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、前記マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ザイメッド社製又はタゴ社製）とを、順次反応させた。あるいは、前記ブロッキングに続いて、ビオチン化Ｍ２抗体（シグマ社製）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）とを、順次反応させた。反応後、市販のウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、目的タンパク質の発現を確認した。
プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧを導入した細胞を無血清培養することにより得られた各画分において検出されたタンパク質（すなわち、ＭＤＴＳ９短長タンパク質）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における見かけ上の分子質量は、培養上清において約５５〜６５ＫＤａであり、細胞膜結合画分において約５５〜６５ＫＤａであり、細胞画分において８０〜９５ＫＤａであった。一方、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｆｕｌｌ−ＦＬＡＧを導入した細胞を無血清培養することにより得られた各画分において検出されたタンパク質（すなわち、ＭＤＴＳ９全長タンパク質）は、主として細胞膜結合画分及び細胞画分に検出され、そのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける見かけ上の分子質量は、いずれも約１３０〜１４０ＫＤａであった。
実施例４：ＭＤＴＳ９短長タンパク質のプロテアーゼ活性の確認
（１）プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑ−ＦＬＡＧの構築
クィックチェンジ・サイトダイレクテド・ミュータジェネシス・キット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；ストラタジーン社製）を用い、添付の指示書に従って、活性中心と考えられるＨｉｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（配列番号２２）のＧｌｕ（グルタミン酸）をＧｌｎ（グルタミン）に置換した遺伝子ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑを含有するプラスミドｐＺＥｒＯ−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑを作製した。なお、鋳型としては、前記実施例２で作製したプラスミドｐＺＥｒＯ−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２を用い、プライマーセットとしては、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
得られたプラスミドｐＺＥｒＯ−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑを制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで切断して生成した約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、前記実施例１で構築したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧのＸｂａＩ及びＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑ−ＦＬＡＧを得た。
（２）α２−マクログロブリンとの複合体形成を指標としたプロテアーゼ活性の確認
前記実施例２で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧ、又は前記実施例４（１）で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑ−ＦＬＡＧ（あるいは、対照として、前記実施例１で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧ）でトランスフェクションした各細胞の血清培養の培養上清を、前記実施例３で示した手順と同様にして、２−ＭＥを用いた還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、ヤギ抗α２−マクログロブリン抗体［セダーレーン（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ）社製］と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧポリクローナル抗体［ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製］とを、順次反応させた。反応後、市販のウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、目的タンパク質の発現を確認した。
プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２−ＦＬＡＧでトランスフェクションした細胞由来の血清培養の培養上清では、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２Ｅ／Ｑ−ＦＬＡＧ又はプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧでトランスフェクションした細胞由来の各血清培養の培養上清で検出されない約２５０ＫＤａのバンドが検出された。この結果は、ＭＤＴＳ９短長タンパク質（ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２）がα２−マクログロブリンと複合体を形成したことを示しており、従って、ＭＤＴＳ９短長タンパク質（ＭＤＴＳ９Ｃｙｓ２）にプロテアーゼ活性があることが確認された。
実施例５：ＭＤＴＳ９遺伝子の組織発現分布の確認
市販のｃＤＮＡパネル［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃＤＮＡ（ＭＴＣＴＭ）Ｐａｎｅｌの内、Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ　Ｉ（カタログ番号：Ｋ１４２０−１）、Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ　ＩＩ（カタログ番号：Ｋ１４２１−１）、Ｈｕｍａｎ　Ｆｅｔａｌ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ（カタログ番号：Ｋ１４２５−１）、及びＨｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ（カタログ番号：Ｋ１４２２−１）］を用いて、ＭＤＴＳ９遺伝子の組織発現分布を以下の手順で解析した。
すなわち、配列番号１５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとし、前記ｃＤＮＡパネルを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６８℃（１分３０秒間）とからなるサイクルを４４回繰り返した。続いて、反応液のアガロースゲル電気泳動を行ない、ＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡに由来する約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を検出した。その結果、ＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡは、腎臓に発現していることが判明した。
実施例６：ＴＧＦ−βによるＭＤＴＳ９遺伝子の発現誘導
（１）鋳型ｃＤＮＡの調製
６穴プレート（旭テクノグラス社製）に正常ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞［クロネテクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）社製］を５×１０５個となるように撒き、腎上皮細胞培地キット（クロネテクス社製）で１日間培養した。無血清の腎上皮細胞培地に変換し、更に１日間培養した後、ＴＧＦ−β１（シグマ社製）を終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した無血清の腎上皮細胞培地に交換し、２４時間培養した。なお、対照群は、ＴＧＦ−β１を添加していない無血清の腎上皮細胞培地に交換し、２４時間培養した。
各処理群から、それぞれ、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ＩＳＯＧＥＮ；日本ジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られた総ＲＮＡをＤＮアーゼ（日本ジーン社製）を用いて、３７℃で９０分間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇをスーパースクリプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡに変換した。
（２）定量ＰＣＲによるＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡの定量
正常ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞での発現変動解析は、前記実施例６（１）で調製したｃＤＮＡを鋳型として、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行なった。なお、プライマーセットとしては、配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを使用した。また、ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　ｃｏｒｅ　ｒｅａｇｅｎｔ；アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６０秒間）とからなるサイクル反応を４０回繰り返すことにより実施した。
なお、内部標準としてヒトβアクチンの遺伝子発現量を算出するために、前記ｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーセットとし、同条件のＰＣＲを行なった。また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るために、前記実施例６（１）で調製したＴＧＦ−β１無刺激のヒト腎臓近位尿細管上皮細胞ｃＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーセット（すなわち、配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ）を用いて同条件のＰＣＲを行なった。一定量の総ＲＮＡ当たりのＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡの発現量を得るため、各条件でのＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、各条件でのβアクチン遺伝子発現量に対する割合で示した。その結果、ＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡは、ＴＧＦ−β１により、約８倍に遺伝子発現誘導されることが判明した。
実施例７：ラット腎不全モデルにおけるＭＤＴＳ９遺伝子の発現変動
（１）鋳型ｃＤＮＡの調製
ｃＤＮＡの調製は、ラット５／６腎摘モデル（木村健二郎，「腎と透析」１９９１臨時増刊号，４３１−４３９）の腎臓より調製した。５／６腎摘終了後、１週、２週、３週、４週、６週、８週、及び１０週に、５／６腎摘ラット及び偽手術ラットを各々５匹ずつ解剖し、腎臓を摘出し、その後直ちに−８０℃にて凍結保存した。これら各群の腎臓を液体窒素凍結下、細胞破砕機（クライオプレスＣＰ−１００；マイクロテック・ニチオン社製）を用いて破砕後、総ＲＮＡ精製試薬（ＩＳＯＧＥＮ；日本ジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。抽出した総ＲＮＡをＤＮアーゼ（ニッポンジーン社製）を用い、３７℃で９０分間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．２５μｇをスーパースクリプトＩＩファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）にてｃＤＮＡに変換した。
（２）定量ＰＣＲによるラットＭＤＴＳ９カウンターパートのｍＲＮＡの定量
ラット腎不全モデルにおける腎臓での発現変動解析は、実施例７（１）で調製したｃＤＮＡを鋳型にして、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行なった。配列番号２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマーセットとして用いた。ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬［サイバーグリーンＰＣＲコアリエージェント（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　ｃｏｒｅ　ｒｅａｇｅｎｔ）；アプライドバイオシステムズ社製）］を用い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６０秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。
また、内部標準としてヒトグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）の遺伝子発現量を算出するため、前記ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマーセットとして同条件のＰＣＲを行なった。更に、ｍＲＮＡ発現量算出に用いる標準曲線を得るために、ラットゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件のＰＣＲを行なった。各群における一定量の総ＲＮＡ当たりのラットＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡの発現量を比較するため、各条件でのラットＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、各条件でのＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量に対する割合で示した。その結果、ラットＭＤＴＳ９遺伝子のｍＲＮＡは、５／６腎摘モデルにおいて、偽手術ラットに比べ、術後１週で約５倍の遺伝子が発現しており、尿タンパク質量が顕著に増加する術後３週、正常腎重量と比べ著明に腎重量が増加し始める術後６週、更に病態が悪化する術後８週で、それぞれ、約２倍の遺伝子が発現していることが判明した。
本実施例により、腎不全モデルでは、ＭＤＴＳ９の遺伝子が発現誘導されることが明らかとなった。
実施例８：ヒト腎臓組織切片の免疫組織染色
（１）抗ヒトＭＤＴＳ９抗体の作製
まず、実験解説書（岡田雅人及び宮崎香編，「改訂タンパク質実験ノート」上，羊土社，ｐ．１６２−１７９）］に準じて、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を発現ベクターとして用い、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２８０番〜第４１０番のアミノ酸からなるペプチドと、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＤＴＳ９Ａ）を、大腸菌を用いて封入体画分に生産した。続いて、封入体画分について、調製用ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実施し、ゲルから拡散法によって目的のＧＳＴ−ＭＤＴＳ９Ａタンパク質を抽出した（岡田雅人及び宮崎香編，「改訂タンパク質実験ノート」下，羊土社，ｐ．４８−５１）。
得られたＧＳＴ−ＭＤＴＳ９Ａタンパク質を、ウサギ（日本白色種）に１０〜１４日間隔で計５回免疫した後、抗血清を調製した。この抗血清より、まずＩｇＧ画分をプロテインＧセファロースＦＦカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）でアフィニティー精製し、続いて、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第２８０番〜第４１０番のアミノ酸からなるペプチドと、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質（ＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａ）を固定したカラム（ＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａカラム）でアフィニティー精製を行ない、抗ヒトＭＤＴＳ９抗体とした。プロテインＧセファロースＦＦカラムでのアフィニティー精製、並びにＣＮＢｒ活性化セファロースＦＦカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）へのＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａの固定及びＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａカラムでのアフィニティー精製は、添付説明書に従った。また、ＭＢＰ−ＭＤＴＳ９Ａの大腸菌での生産及び精製は、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を発現ベクターとして用い、同社の「ｐＭＡＬ蛋白融合及び精製システム」の指示書に従った。
（２）ヒト腎臓でのＭＤＴＳ９タンパク質の検出
スライドガラス上にホルマリン固定及びパラフィン包埋した組織切片に、実施例８（１）で調製した抗ヒトＭＤＴＳ９抗体を反応させた後、市販の染色キット（ベクタステインＡＢＣ−ＡＰキット，カタログ番号ＡＫ−５０００；ベクター社製）を用いて、添付説明書に従い、染色した。その際、二次抗体としてビオチン標識抗ウサギ抗体（カタログ番号ＢＡ−１０００；ベクター社製）、発色基質としてアルカリフォスファターゼ基質キットＩ（カタログ番号ＳＫ−５１００；ベクター社製）を用いた。その結果、健常人及び糖尿病性腎症（初期又は後期）患者の腎臓において、上皮細胞、中でも特に糸球体上皮細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅｓ）での染色が認められた。
本実施例から、ＭＤＴＳ９タンパク質がヒト腎臓で発現していることが明らかである。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドは、ＴＧＦ−βにより誘導され、細胞外マトリクスの代謝に関与する、腎臓に発現している新規プロテアーゼであるので、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質は、ＴＧＦ−βの生理作用のうち、細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害する可能性が高く、長期投与が想定される慢性腎不全治療剤として有用である。すなわち、本発明のポリペプチドによれば、慢性腎不全治療剤の簡便なスクリーニング系を提供することができる。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、及び抗体は、本発明のポリペプチドを製造するのに有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３及び４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したリンカー配列である。また、配列表の配列番号５〜９及び１２〜１４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。更に、配列表の配列番号２１の配列で表されるアミノ酸配列は、制限酵素ＮｏｔＩ認識ヌクレオチド配列及びＦＬＡＧタグアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡの発現により得られるアミノ酸配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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