(57)【要約】臨床学的または食品学的に重要なカフェイン、テオフィリン、テオブロミン、およびキサンチン等のキサンチン系化合物の濃度を特異的かつ短時間で容易に測定可能な方法の提供。下記の式（Ｉ）で表されるキサンチン系化合物が、ダイヤモンド電極において電気化学的に特異的に酸化される性質を利用する。すなわち、導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極と、対電極とを用意し、前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加し、該電圧下における電流値を測定し、予め用意した検量線を用いて、得られた電流値から前記被験試料中の前記式（Ｉ）で表される化合物の濃度を算出する。2001098766.tif 000012（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表す）
2001098766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中の下記の式（Ｉ）で表される化合物の濃度測定法であって：
2001098766.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表す）
導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極と、対電極とを用意し、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極とを被験試料に接触させ、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加し、該電圧下における電流値を測定し、
得られた電流値から前記被験試料中の前記式（Ｉ）で表される化合物の濃度を算出すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記ダイヤモンド電極が、３族または５族の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ダイヤモンド電極が、ホウ素、窒素、およびリンからなる群から選択される一以上の元素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で表される化合物が、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、およびキサンチンからなる群から選択される一種以上のものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
得られた電流値から前記被験試料中の前記式（Ｉ）で表される化合物の濃度を算出する工程が、予め作成された前記式（Ｉ）で表される化合物の濃度と電流値との検量線と、得られた電流値とを対比することにより行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
測定対象物がテオブロミンまたはキサンチンである場合、被験試料のｐＨを５．５以下として測定を行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧が、ピーク電流を与える電圧である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
参照電極を被験試料中に接触させ、前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧の絶対値を制御することをさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極からなる、請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物の濃度測定のためのセンサ。
【請求項１０】
前記ダイヤモンド電極が、ホウ素の混入により導電性とされたダイヤモンド薄膜を有するものである、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）で表される化合物が、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、およびキサンチンからなる群から選択される一種以上のものである、請求項９または１０に記載のセンサ。
【請求項１２】
被験試料中の請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物の濃度を測定する装置であって、
導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極と、
対電極と、
前記ダイヤモンド電極と、対電極とを被験試料に接触させる手段と、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加する手段と、
該印加電圧下における電流値を測定する手段と、
得られた電流値から前記被験試料中の前記式（Ｉ）で表される化合物の濃度を算出する手段と
を少なくとも備えてなる、装置。
【請求項１３】
参照電極を更に備えてなり、
該参照電極を被験試料中に接触させる手段と、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧の絶対値を制御する手段と
を備えてなる、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
被験試料中の下記の式（Ｉ）で表される化合物：
2001098766.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表す）
の濃度を測定するための、導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極の使用。
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、ダイヤモンド電極を用いた、臨床学的または食品学的に重要なカフェイン、テオフィリン、テオブロミン、およびキサンチン等のキサンチン系化合物の濃度測定法、およびそれに用いられるセンサ並びにそのための装置に関する。
背景技術
ダイヤモンドは本来抵抗率が１０１３Ωｃｍ程度の絶縁材料であるが、微量不純物のドープにより導電性を獲得する。この導電性ダイヤモンドには、種々の用途が期待されている。その一つに電気化学用の電極としての利用がある。導電性とされたダイヤモンドを電気化学用の電極として見ると、広い電位窓を有し、かつバックグラウンド電流が極めて小さいという優れた特長を有する。さらに、物理的、化学的に安定であり、耐久性に優れるとの特長もまた有する。導電性ダイヤモンド（好ましくはその薄膜）を有する電極は、ダイヤモンド電極と一般的に呼ばれるに至っている。
ダイヤモンド電極に関する先駆的研究はＩｗａｋｉらによって行われた（Ｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０９−２１０，１１２９（１９８３））。彼らは、アルゴンや窒素イオンを打ち込んで表面導電性を付与した単結晶ダイヤモンドの電気伝導材料としての性質を研究したものである。同時に、電解質溶液中におけるサイクリックボルタモグラムも示した。その後、ホットフィラメントを用いて気相合成した多結晶ダイヤモンドの特性が報告されている（Ｐｌｅｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２２８，１９（１９９３））。
本発明者らの一部は、気相合成したダイヤモンド電極を用いて、窒素酸化物の還元について先に報告した（Ｔｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３４７，４０９（１９９３））。この研究では、ドーパントとしてホウ素を導入したｐ型半導体ダイヤモンドを電極として使用した。その後、ダイヤモンド電極としては、ホウ素をドーパントとするｐ型半導体またはより導電性の高い金属様導電性ダイヤモンドの利用が主流となるに至る。１９９０年代に入って、ダイヤモンド電極の研究が複数のグループのより行われ、１９９５年以降は、気相合成よりも大面積のダイヤモンド薄膜が得られるプラズマＣＶＤ（ＰＣＶＤ）装置を用いて得られたダイヤモンド電極の研究が、電気化学分野にも散見されるに至っている。
一方、キサンチン構造を有する種々のキサンチン系化合物は、動植物体内で種々の生理学的な機能を担っている。
例えば、キサンチン（３，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）はプリン類に属し、アデニンおよびグアニンの尿酸への分解の中間体として重要な役割を果たしていることから、生物学的に極めて重要であると考えられている。更に、キサンチンは水に貧溶性であり、キサンチンは極めて稀ではあるが、代謝異常によってそれが凝集体として沈澱することがある。
テオフィリン（３，７−ジヒドロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）、テオブロミン（３，７−ジヒドロ−３，７−ジメチル−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）およびカフェイン（３，７−ジヒドロ−１，３，７−トリメチル−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）などのキサンチンのＮ−メチル誘導体は、植物生成物および飲料に広く分布しているアルカロイドであり、胃酸分泌、利尿、および中枢神経の刺激などの多くの生理学的効果を有することが知られている。とりわけテオフィリンは、気管支拡張剤として気管支喘息の治療薬として有用である。
よって、これらキサンチン系化合物の生体中または生体由来の試料中あるいは食品中の存在量を簡便に知ることが出来れば、医学薬学上または食品製造上極めて有意義なことである。
［発明の概要］
本発明者らは、今般、ダイヤモンド電極がキサンチン系化合物に特異的に感応し、その酸化電位における電流値から、その存在量を定量出来るとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
従って、本発明は、キサンチン系化合物の濃度を特異的かつ短時間で容易に測定可能な方法の提供をその目的としている。
また、本発明は、上記方法に用いられるセンサおよびそのための装置の提供をその目的としている。
そして、本発明の第一の態様によれば、被験試料中の下記の式（Ｉ）で表される化合物の濃度測定法が提供され、その方法は、
2001098766.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表す）
導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極と、対電極とを用意し、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極とを被験試料に接触させ、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加し、該電圧下における電流値を測定し、
得られた電流値から前記被験試料中の前記式（Ｉ）で表される化合物の濃度を算出すること
を含んでなるものである。
また本発明の別の態様によれば、上記測定法に用いられるセンサが提供され、そのセンサは、導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極からなるものである。
さらに、本発明の別の態様によれば、上記測定法を実施するための装置が提供され、その装置は、
導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極と、
対電極と、
前記ダイヤモンド電極と、対電極とを被験試料に接触させる手段と、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加する手段と、
該印加電圧下における電流値を測定する手段と、
得られた電流値から前記被験試料中の前記式（Ｉ）で表される化合物の濃度を算出する手段と
を少なくとも備えてなるものである。
また、本発明の別の態様によれば、被験試料中の下記の式（Ｉ）で表される化合物：
2001098766.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表す）
の濃度を測定するための、導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極の使用、が提供される。
［発明の具体的説明］
被検化合物
本発明による方法によれば、試料溶液中における式（Ｉ）の化合物の濃度を選択的に知ることが出来る。本発明者らは、前記したように、導電性ダイヤモンド電極上において、式（Ｉ）の化合物が電気化学的に特異的に酸化されること、さらには、導電性ダイヤモンドを作用電極とし、対電極との間に生じる電流値が系内の式（Ｉ）の化合物の濃度に正比例するとの関係も確認出来た。その結果、被験試料中の式（Ｉ）の化合物を定量的に検出することが可能となった。
被験試料は、式（Ｉ）の化合物が含まれていると考えられる生体由来の血液、体液等、または食品もしくは食品の希釈溶液または懸濁液であってよい。
式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が表す炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、また置換基を有していてもよい。
本発明において、特に生化学的に重要と思われる式（Ｉ）の化合物は以下の通りである。
2001098766.tif 000005
キサンチンは、例えばキサンチン尿症患者において大量に尿中に排出される。キサンチン結晶の析出は、いわゆる膀胱結石につながるおそれがある。従って、キサンチンの尿中濃度を短時間に、かつ簡便に測定可能とする本発明による測定法は、その診断および治療に有用である。また、テオフィリンは、気管支拡張剤、強心利尿剤等として臨床において利用されており、その血中中濃度等を知ることは有用である。さらに、テオブロミンは、テオフィリンと同様に強心作用および利用作用を有しており、その血中濃度等を知ることが出来ることは意義がある。さらにまた、カフェインは、医薬用途以外にも多くの食品に含まれ、食品の製造および栄養学上、その濃度を簡便に知ることが出来ることの意義は大きいと言える。
ダイヤモンド電極およびその製造
ダイヤモンドは本来優れた絶縁体である。しかしながら、３族や５族の不純物を添加することによって、半導体〜金属様の導電性を示すようになる。本発明にあっては、半導体〜金属様の導線性を示すダイヤモンドを電極として使用する。
このような導線性を付与するために添加される物質としては、上記の通り３族および５族の元素が挙げられ、さらに好ましくはホウ素、窒素、リンが挙げら、最も好ましくはホウ素または窒素であれる。この導電性を付与するために添加される物質の添加量は、ダイヤモンドに導電性を付与できる範囲で適宜決定されてよいが、例えば１×１０−２〜１０−６Ωｃｍ程度の導電性を与える量添加されることが好ましい。この導電性を付与するために添加される物質の添加量は、導電性ダイヤモンドの製造工程における添加量により制御されることが一般的である。
本発明によるダイヤモンド電極は、この導線性ダイヤモンドを電極として用いたものである。このダイヤモンド電極は、電気化学反応を水中で行うと、酸化反応として水の電気分解により酸素が発生せず、上記した式（Ｉ）の化合物の酸化反応を特異的に生じさせるとの極めて興味深い特性を有していた。この特性は、導電性ダイヤモンドの表面状態にかかわらず発揮されるものと考えられる。すなわち、後記するような化学気相成長法により、水素ガスをキャリアとして用いて製造された何の処理もされていない（ａｓ  ｇｒｏｗｎ）ダイヤモンド薄膜の表面には、末端炭素原子に水素原子が結合した状態に有ることが通常であるが、この終端水素原子を他の原子に置換した導電性ダイヤモンドによっても、上記式（Ｉ）の化合物の酸化反応を特異的に生じさせることが出来るものと考えられる。
導電性ダイヤモンドそれ自体を基材の支持によらず電極とすることも可能であるが、本発明の好ましい態様によれば、基材上に導線性ダイヤモンドの薄膜を形成し、この薄膜に導線を接続させ、電極とすることが好ましい。基材としては、Ｓｉ（例えば、単結晶シリコン）、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、Ｆｅ、Ａｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＣ、Ｓｉ３Ｎ４、ＺｒＯ２、ＭｇＯ、黒鉛、単結晶ダイヤモンド、ｃＢＮ、石英ガラス等が挙げられ、特に単結晶シリコン、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、ＳｉＣ、単結晶ダイヤモンドの利用が好ましい。
この態様の電極を図１を用いて更に説明する。図１（ａ）は、ダイヤモンド電極１の断面図であり、この電極は、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３とからなり、さらにこの導電性ダイヤモンド薄膜３には導線５が例えば金コーティング４を介して接続される。図１（ｂ）は、ダイヤモンド電極１の斜視図であり、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３とからなり、さらにこの導電性ダイヤモンド薄膜３を電極とするための金コーティング４を介して導線５が接続される。
導電性ダイヤモンド薄膜の厚さは、特に限定されないが、１〜１００μｍ程度の厚さが好ましく、より好ましくは５〜５０μｍ程度である。
さらに本発明の好ましい態様によれば、本発明によるダイヤモンド電極は、マイクロ電極の形態をとることが出来る。マイクロ電極の概念は既に公知であり、本発明においてマイクロ電極形態のダイヤモンド電極とは、Ｐｔ等の細線の末端を鋭利に切断し、電解研磨により末端をさらに鋭利にした後、その末端表面に導電性ダイヤモンドの薄膜を形成した構成のものを意味する。
本発明の好ましい態様によれば、導電性ダイヤモンド薄膜は、化学気相成長法により好ましく製造される。化学気相成長法とは、気相中で気体原料を化学反応させて物質を合成する方法であり、ＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法と一般に呼ばれる。この方法は、半導体製造プロセスにおいて広く利用されており、本発明における導電性ダイヤモンド薄膜の製造にも合目的的な改変のもと利用可能である。
ダイヤモンドの化学気相合成は、メタンなどの含炭素気体と水素を混合したものを原料気体として、それを励起源により励起させ、基板上に供給して堆積させることにより行われる。
励起源としては、熱フィラメント、マイクロ波、高周波、直流グロー放電、直流アーク放電、燃焼炎などが挙げられる。また、これらを複数組み合わせて核生成密度を調整したり、大面積化や均一化をはかることも可能である。
原料としては、炭素の含まれている多くの種類の、励起源により分解、励起されて、Ｃ、Ｃ２などの活性な炭素、およびＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ２などの炭化水素ラジカルを生じさせる化合物を利用可能である。好ましい具体例としては、気体としてＣＨ４、Ｃ２Ｈ２、Ｃ２Ｈ４、Ｃ１０Ｈ１６、ＣＯ、ＣＦ４、液体としてＣＨ３ＯＨ、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、（ＣＨ３）２ＣＯ、固体として黒鉛、フラーレンなどが挙げられる。
気相合成法にあって、ダイヤモンドに導電性を付与する物質の添加は、例えば添加物質のディスクを系内置き、炭素源原料と同様に励起させ、炭素気相に添加物質を導入する方法、炭素源に予め添加物質を添加し、系内に炭素源と共に導入し、励起源により励起し、炭素気相に添加物質を導入する方法等により行うことが出来る。本発明の好ましい態様によれば、後者の方法が好ましい。とりわけ、炭素源としてアセトン、メタノールなどの液体を用いる場合、これに酸化ボロン（Ｂ２Ｏ３）を溶解してボロン源とする方法が、ボロンの濃度の制御が容易で、かつ簡便であることから好ましい。例えば、気相合成法にあって、炭素源にホウ素を添加する場合、１０〜１２，０００ｐｐｍ程度が一般的にであり、また１，０００〜１０，０００ｐｐｍ程度が好ましい。
本発明の好ましい態様によれば、導電性ダイヤモンド薄膜の製造はプラズマ化学気相合成法により行われることが好ましい。このプラズマ化学気相合成法は、化学反応を引き起こす活性化エネルギーが大きく、反応が速いとの利点を有する。さらに、この方法によれば、熱力学的に高温でなければ存在しない化学種を生成して、低い温度での反応が可能となる。プラズマ化学気相合成法による導電性ダイヤモンド薄膜の製造は、本発明者らの一部を含めいくつかの報告が既にあり（例えば、Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１４５（１９９８）１８７０）、これら報告に記載の方法に従って行うことが好ましい。
測定法およびそのための装置
本発明にあっては、導電性ダイヤモンドが上記式（Ｉ）の化合物を電気化学的に特異的に酸化し、導電性ダイヤモンドを作用電極とし、対電極との間に生じる電流値が系内の式（Ｉ）の化合物の濃度に正比例するとの性質を利用して、被験試料中の式（Ｉ）の化合物を定量的に検出する。その測定は電流値を知ることにより行われるため、測定時間は短くかつ簡便であり、本発明による方法は短時間の内に容易に式（Ｉ）の化合物濃度を知ることが出来る点で極めて有利である。
また、ダイヤモンド電極は、式（Ｉ）の化合物以外の化合物を酸化する可能性を有するが、式（Ｉ）の化合物に極めて特異的に感応する。本発明者らの知る限り、上記したカフェイン、テオフィリン、テオブロミン、およびキサンチンの存在が予想される生体または食品由来の試料において、式（Ｉ）の化合物以外の物質が存在していても、それらには反応せず、式（Ｉ）の化合物のみをダイヤモンド電極は酸化する。従って、本発明による測定法は、式（Ｉ）の化合物のみを特異的に測定することを可能にする。式（Ｉ）の化合物の混合物、さらにはダイヤモンド電極に反応しうる物質が被験試料中に存在してるまたはその可能性がある場合には、液体クロマトグラフィーなどの前処理を行い、式（Ｉ）の化合物をダイヤモンド電極に応答性を有する他の物質と峻別して、本発明による測定法に付することが好ましいことは言うまでもない。
さらに、化合物ごとに酸化される電圧が異なる、すなわち後記するピーク電圧が異なることから、式（Ｉ）の化合物の複数を峻別が、印可電圧の制御により可能となる。
また、本発明による測定法によれば、式（Ｉ）の化合物を約１μｍｏｌ／ｌ〜飽和濃度まで広い濃度範囲で測定することが出来る。
本発明による式（Ｉ）の化合物の濃度測定法において、式（Ｉ）の化合物の定量のための電気化学的系は、導電性ダイヤモンドを作用電極とした以外は、一般的な電気化学的な系であることが出来る。
すなわち、本発明による式（Ｉ）の化合物の濃度測定法にあっては、導電性ダイヤモンドを作用電極とし、対電極とともに被験試料に接触させ、この二つの電極間に、ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加し、この電圧下における電流値を測定する。そして、この得られた電流値から被験試料中の式（Ｉ）で表される化合物の濃度を算出する。上記したように、式（Ｉ）の化合物の酸化により、導電性ダイヤモンドと対電極との間に生じる電流値は、系内の式（Ｉ）の化合物の濃度に正比例する。従って、一旦ある電圧値における電流値と式（Ｉ）の化合物の濃度との関係を求めておけば、その関係から、得られた電流値に対応する被験試料中の式（Ｉ）の化合物の濃度を容易に知ることが出来る。すなわち、本発明の好ましい態様にあっては、式（Ｉ）で表される化合物の濃度と電流値との検量線を予め作成しておき、この検量線と、得られた電流値とを対比することにより、式（Ｉ）の化合物の濃度を知ることが出来る。
本発明において対電極としては、白金、炭素、ステンレス、金、ダイヤモンド、ＳｎＯ２等の利用が好ましい。
本発明において、作用電極であるダイヤモンド電極と、対電極との間に印加される電圧は、ダイヤモンド電極上で式（Ｉ）の化合物の酸化反応が生じるものであれば限定されないが、測定効率および精度の観点から、この印加電圧は、式（Ｉ）の化合物の酸化のピーク電流を与える電圧であることが好ましい。ここで、ピーク電流とは、例えばサイクリックボルタンメトリーにより、最大電流値を与える電圧として求めることが出来る。さらに、本発明の別の好ましい態様によれば、最大電流値を与える電圧は、回転電極法またはマイクロ電極法により求めることが出来る。回転電極法またはマイクロ電極法によれば、測定条件等による測定誤差の可能性をより排除出来る点で有利である。
さらに、本発明の好ましい態様によれば、参照電極を被験試料中に接触させ、ダイヤモンド電極と、対電極との間に、ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧の絶対値を制御することが、測定精度の観点から好ましい。参照電極は公知のものを利用することが出来、標準水素電極、銀塩化銀電極、水銀塩化水銀電極、水素パラジウム電極等が利用可能である。
本発明による測定方法において、電気化学的系は、導電性ダイヤモンドを作用電極とした以外は、一般的な電気化学的な系であることが出来るが、本発明の好ましい態様によれば、所定の溶液を一定流速でキャリアとして系内を流し、そのキャリア溶液中に被験試料を注入して測定を行う、フローセルを用いたフローインジェクション法による測定が好ましい。
フローセルを用いたフローインジェクション法の概略は図２（ａ）に示される通りである。フローセル２１には、キャリア溶液溜６から、ポンプ７によりキャリア溶液が注入される。ポンプ７とフローセル２１との間には、被験試料注入口８が設けられ、キャリア溶液に被験試料が注入可能とされる。フローセル２１を通過したキャリア溶液は、廃液溜９に集められる。
フローセル２１の基本構造は図２（ｂ）に示されるとおりである。フローセル２１は、ダイヤモンド電極１、対電極２２、および参照電極２３が、キャリア溶液および被験試料が流れる流路２４内に露出され、被験試料と接触出来るよう構成されている。ダイヤモンド電極２１は、基本的に図１に示される構造を有し、図１におけるダイヤモンド薄膜３が、流路２４内に露出され、キャリア溶液および被験試料と接触する。キャリア溶液は、流路２４の流入口２５から入り、図中の矢印のように流れ、流出口２６に至る。ダイヤモンド電極１の導線Ａおよび対電極２２の導線Ｂの間に、式（Ｉ）の化合物をダイヤモンド電極１上で酸化を生じさせる電圧、好ましくはピーク電流を生じさせる電圧を印加する。
測定は以下のように行われる。まず、被験試料を注入しないキャリア溶液のみを流し、いわゆるバックグラウンド電流を出来るだけ小さくし、かつ安定させる。ダイヤモンド電極はバックグラウンド電流が小さいことを特長とする。次に、被験試料を被験試料注入口８より注入する。この注入は継続して行われてもよいが、ピーク電流を測定可能な程度の量を一時期に注入してもよい。式（Ｉ）の化合物が被験試料中に含まれている場合、式（Ｉ）の化合物がダイヤモンド電極１上で酸化され、酸化反応に伴う電流値が測定できる。この電流値より、式（Ｉ）の化合物の濃度を知る。
本発明による測定法にあっては、被験試料のｐＨは任意の特定の値に固定して測定に付されることが好ましい。式（Ｉ）の化合物の一部については、ピーク電流を与える電圧のｐＨ依存性は大きくないが、測定対象物と好ましい被験試料のｐＨの範囲は以下の通りである。
2001098766.tif 000006
本発明の別の好ましい態様によれば、フローセル２１におけるダイヤモンド電極１をマイクロ電極の形態とすることも好ましい。また、本発明の別の好ましい態様によれば、ダイヤモンド電極１を回転電極としてもよい。
以上の通り、本発明の別の態様によれば式（Ｉ）の化合物の濃度測定法が提供されるが、本発明の別の態様によれば、導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極からなる、式（Ｉ）の化合物の濃度測定のためのセンサが提供される。
さらに、本発明の別の態様によれば、被験試料中の式（Ｉ）の化合物の濃度を測定する装置が提供される。この装置の基本構成は図３に示される通りである。図３の装置において、電源・電流計３１には、図２に記載のフローセルより、ダイヤモンド電極１に接続される導線Ａ、対電極２２に接続される導線Ｂ、および参照電極２３に接続される導線Ｃが接続される。この電源・電流計３１は、ダイヤモンド電極と対電極との間にダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加する手段と、この印加電圧下における電流値を測定する手段とを兼ねるものである。すなわち、この電源・電流計３１によって、ダイヤモンド電極１および対電極２２の間に、式（Ｉ）の化合物をダイヤモンド電極１上で酸化を生じさせる電圧、好ましくはピーク電流を生じさせる電圧を印加し、さらに式（Ｉ）の化合物のダイヤモンド電極１上での酸化反応に伴う電流値を測定する。この電流値は、電柱値比較・濃度算出装置３２に送られる。この装置３２には、検量線データ３３が送られ、この装置内において、電源・電流計３１から送られた電流値と、検量線データを比較し、式（Ｉ）の化合物の濃度を算出する。すなわち、得られた電流値から被験試料中の前記式（Ｉ）で表される化合物の濃度を算出する手段を備える。得られた式（Ｉ）の化合物の濃度は、表示装置３４により表示される。
［実施例］
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
ダイヤモンド電極の調製
ダイヤモンド薄膜を、ＡＳＴｅＸ社製、マイクロ波ＣＶＤ成膜装置を用い、マイクロ波プラズマアシストＣＶＤ法により調製した。具体的には以下の通りである。
まず、シリコン基板（Ｓｉ（１００））の表面を、０．５μｍのダイヤモンド粉で研磨した後、ＣＶＤ成膜装置の基板ホルダにセットした。炭素源としてアセトンとメタノールとの混合物（混合比９：１（体積比））を用いた。さらに、この混合物に酸化ホウ素（Ｂ２Ｏ３）を、ホウ素／炭素比で１０４ｐｐｍとなる量溶解した。炭素源の混合物に純水素ガスを通し、溶存気体と置換した。一方、チャンバー内に純水素ガスを５３２ｃｃ／分の流速で流し、さらにその圧力を１１５×ｔｏｒｒ（１１５×１３３．３２２Ｐａ）とした。次に、２．４５ＧＨｚのマイクロ波をチャンバー内に注入し、放電させ、出力が５ＫＷとなるよう調製した。装置が安定したことを確認した後、炭素源混合物にキャリアガスとして純水素ガスを１５ｃｃ／分の流速で流し、チャンバー内に導入し、成膜を行った。成膜速度は１〜４μｍ／時であった。約３０μｍの厚さとなるまで成膜を行った。基板の加熱は行わなかったが、定常状態において約８５０〜９５０℃の温度となっていることが観察された。
得られたダイヤモンド薄膜のラマンスペクトルをとると、１３３３ｃｍ−１に単一ピークのみが観察された。また、電気伝導度は約１０−３Ωｃｍ程度であり、０．５Ｍ硫酸中においてサイクリックボルタモグラムを測定した結果、−１．２５〜＋２．３Ｖ（対ＳＨＥ）と、広い電位窓を有することが確認出来た。
ボルタンメトリー測定
ボルタンメトリー測定を、ガラスセル中において、Ｈｏｋｕｔｏ  Ｄｅｎｋｏ  ＨＡ−５０２ポテンショスタット、Ｈｏｋｕｔｏ  Ｄｅｎｋｏ  ＨＢ−１１ファンクションジェネレーター、およびＲｉｋｅｎ  Ｄｅｎｓｈｉ  ｘ−ｙレコーダーを用いて、室温にて行った。上記のようにして得られたダイアモンド薄膜を有するダイヤモンド電極を作用電極（露出面積０．０７ｃｍ２）として用い、また白金箔を対電極として用いた。参照電極として、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）を用いた。
実験例１：ピーク電流値と濃度との関係
（ａ）  キサンチン、テオフィリン（１級）、テオブロミン、およびカフェイン（特級）をＷａｋｏ社から求め、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１〜４００μｍｏｌ／ｌの濃度範囲で水溶液を調製した。なお、０．１ＭＮａＣｌＯ４を含む空気飽和Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（０．０４Ｍ）を電解質として用い、ｐＨは通常のガラス電極を用いて測定した。
（ｂ）  全ての水溶液のｐＨを１．８とし、電位掃引速度は２０ｍＶｓ−１のボルタンメトリー測定を行い、ピーク電流の値を求めた。さらに、得られたピーク電流値と、濃度との関係を調べると、原点を通る線形の関係が得られた。最小二乗法により得られた検量線：濃度Ｉ＝α×化合物濃度Ｍは、以下の通りである。
2001098766.tif 000007
なお、キサンチンについては、濃度約１５０μｍｏｌ／ｌを超えるとピーク電流値は濃度依存性を失った。これは、キサンチンの緩衝液への貧溶解性が原因と思われる。
（ｃ）  いくつかの濃度の溶液に対して、５回測定を行い、ピーク電流値の再現性を、ピーク電流値の偏差（％）として確認した。
その結果は、以下の通りであった。
2001098766.tif 000008
実験例２：ピーク電流値とｐＨのとの関係
（ａ）  ５０μＭテオフィリン溶液について、ｐＨ１、２、３、４、および５の条件の下、２０ｍＶｓ−１の掃引速度で陽極ボルタモグラフを記録した。その結果は、図４に示されるとおりであった。この結果から、ｐＨが増加すると、テオフィリンについてのピーク電圧が負のシフトを生じることが観察された。
（ｂ）  キサンチン、テオフィリン、テオブロミン、およびカフェインそれぞれについて、５０μＭの溶液を用意し、ピーク電圧と、ｐＨとの関係を調べた。その結果は、以下の通りであった。
2001098766.tif 000009
上記の通り、キサンチンおよびテオフィリンでは、広汎なｐＨ範囲（１．８〜１２．０）に亘って再現性あるピークが示されたが、テオブロミンおよびカフェインの場合には、ｐＨ値が約５．５では、酸化ピークは明確で無くなる傾向を示した。
実験例３：カフェインの定量
（ａ）検量線の作成
ｐＨ１の０．１ＭＨＣｌＯ４を溶媒とし、種々のカフェイン濃度の溶液を用意した。この溶液について、電位掃引速度を２０ｍＶｓ−１とするボルタンメトリー測定を行い、ピーク電流の値とカフェイン濃度との関係を得て、検量線を作成した。得られた検量線は、図５（ａ）および（ｂ）に示される通りであった。
（ｂ）カフェインの定量
市販のコーラ飲料をｐＨ１の０．１ＭＨＣｌＯ４を溶媒とし、１２５倍希釈した。この希釈溶液について、図３に示されるフローセルを用いた、フローインジェクション法により、ピーク電流値を求めた。印加電圧は、対塩化銀電極で１．５Ｖとした。得られたピーク電流値は、０．５１μＡであり、上記検量線から、１２５倍希釈溶液中のカフェイン濃度は８．１ｍｍｏｌ／ｌと算出された。市販のコーラ飲料中のカフェイン濃度は１９４．２１ｍｇ／ｌとされた。
実験例４：テオフィリンの定量
（ａ）検量線の作成
実施例３（ａ）と同様にして、テオフィリンにつき、ピーク電流の値とカフェイン濃度との関係を得て、検量線を作成した。得られた検量線は、図６に示される通りであった。
（ｂ）テオフィリンの定量
市販のテオフィリン１００ｍｇ錠をｐＨ１の０．１ＭＨＣｌＯ４を溶媒とし、まずその５０ｍｌに溶解し、更にその溶液０．０４ｍｌを前記溶媒２０ｍｌに溶解した。この溶液に付き、印加電圧を１．４Ｖとした以外は、実施例３（ｂ）と同様にしてピーク電流値を求めた。ピーク電流値は１７００ｎＡであり、上記検量線から、被測定溶液中のテオフィリン濃度は１９．９６ｍｍｏｌ／ｌと算出された。この濃度からテオフィリン１００ｍｇ錠中のテオフィリン量は９９．８ｍｇと算出された。
【図面の簡単な説明】
図１は、ダイヤモンド電極の構造を示す図であり、（ａ）はダイヤモンド電極１の断面図であり、この電極は、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３とからなる。（ｂ）は、ダイヤモンド電極１の斜視図であり、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３とからなる。
図２は、本発明による測定法に用いられるフローセルの基本構造を示す図である。
図３は、本発明による測定装置の基本構成を示す図である。
図４は、５０μＭテオフィリン溶液について、ｐＨ１、２、３、４、および５の条件の下、２０ｍＶｓ−１の掃引速度で陽極ポルタモグラフの結果を示す図である。
図５は、カフェイン濃度と、ピーク電流の値との検量線である。
図６は、テオフィリン濃度と、ピーク電流の値との検量線である。
【図１（ａ）】
2001098766.tif 000013
【図１（ｂ）】
2001098766.tif 000014
【図２（ａ）】
2001098766.tif 000015
【図２（ｂ）】
2001098766.tif 000016
【図３】
2001098766.tif 000017
【図４】
2001098766.tif 000018
【図５（ａ）】
2001098766.tif 000019
【図５（ｂ）】
2001098766.tif 000020
【図６】
2001098766.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成13年12月25日(2001.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
ーパントとするｐ型半導体またはより導電性の高い金属様導電性ダイヤモンドの利用が主流となるに至る。１９９０年代に入って、ダイヤモンド電極の研究が複数のグループにより行われ、１９９５年以降は、気相合成よりも大面積のダイヤモンド薄膜が得られるプラズマＣＶＤ（ＰＣＶＤ）装置を用いて得られたダイヤモンド電極の研究が、電気化学分野にも散見されるに至っている。
一方、キサンチン構造を有する種々のキサンチン系化合物は、動植物体内で種々の生理学的な機能を担っている。
例えば、キサンチン（３，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）はプリン類に属し、アデニンおよびグアニンの尿酸への分解の中間体として重要な役割を果たしていることから、生物学的に極めて重要であると考えられている。更に、キサンチンは水に貧溶性であり、キサンチンは極めて稀ではあるが、代謝異常によってそれが凝集体として沈澱することがある。
テオフィリン（３，７−ジヒドロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）、テオブロミン（３，７−ジヒドロ−３，７−ジメチル−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）およびカフェイン（３，７−ジヒドロ−１，３，７−トリメチル−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）などのキサンチンのＮ−メチル誘導体は、植物生成物および飲料に広く分布しているアルカロイドであり、胃酸分泌、利尿、および中枢神経の刺激などの多くの生理学的効果を有することが知られている。とりわけテオフィリンは、気管支拡張剤として気管支喘息の治療薬として有用である。
よって、これらキサンチン系化合物の生体中または生体由来の試料中あるいは食品中の存在量を簡便に知ることが出来れば、医学薬学上または食品製造上極めて有意義なことである。
［発明の概要］
本発明者らは、今般、ダイヤモンド電極がキサンチン系化合物に特異的に感応し、その酸化電位における電流値から、その存在量を定量出来るとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
従って、本発明は、キサンチン系化合物の濃度を特異的かつ短時間で容易に測定可能な方法の提供をその目的としている。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
図６は、テオフィリン濃度と、ピーク電流の値との検量線である。
［発明の具体的説明］
被検化合物
本発明による方法によれば、試料溶液中における式（Ｉ）の化合物の濃度を選択的に知ることが出来る。本発明者らは、前記したように、導電性ダイヤモンド電極上において、式（Ｉ）の化合物が電気化学的に特異的に酸化されること、さらには、導電性ダイヤモンドを作用電極とし、対電極との間に生じる電流値が系内の式（Ｉ）の化合物の濃度に正比例するとの関係も確認出来た。その結果、被験試料中の式（Ｉ）の化合物を定量的に検出することが可能となった。
被験試料は、式（Ｉ）の化合物が含まれていると考えられる生体由来の血液、体液等、または食品もしくは食品の希釈溶液または懸濁液であってよい。
式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が表す炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、また置換基を有していてもよい。
本発明において、特に生化学的に重要と思われる式（Ｉ）の化合物は以下の通りである。
2001098766.tif 000022
キサンチンは、例えばキサンチン尿症患者において大量に尿中に排出される。キサンチン結晶の析出は、いわゆる膀胱結石につながるおそれがある。従って、キサンチンの尿中濃度を短時間に、かつ簡便に測定可能とする本発明による測定法は、その診断および治療に有用である。また、テオフィリンは、気管支拡張剤、強心利尿剤等として臨床において利用されており、その血中濃度等を知ることは有用である。さらに、テオブロミンは、テオフィリンと同様に強心作用および利用作用を有しており、その血中濃度等を知ることが出来ることは意義がある。さらにまた、カフェインは、医薬用途以外にも多くの食品に含まれ、食品の製造


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
されるが、本発明の別の態様によれば、導電性ダイヤモンドを有するダイヤモンド電極からなる、式（Ｉ）の化合物の濃度測定のためのセンサが提供される。
さらに、本発明の別の態様によれば、被験試料中の式（Ｉ）の化合物の濃度を測定する装置が提供される。この装置の基本構成は図３に示される通りである。図３の装置において、電源・電流計３１には、図２に記載のフローセルより、ダイヤモンド電極１に接続される導線Ａ、対電極２２に接続される導線Ｂ、および参照電極２３に接続される導線Ｃが接続される。この電源・電流計３１は、ダイヤモンド電極と対電極との間にダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加する手段と、この印加電圧下における電流値を測定する手段とを兼ねるものである。すなわち、この電源・電流計３１によって、ダイヤモンド電極１および対電極２２の間に、式（Ｉ）の化合物をダイヤモンド電極１上で酸化を生じさせる電圧、好ましくはピーク電流を生じさせる電圧を印加し、さらに式（Ｉ）の化合物のダイヤモンド電極１上での酸化反応に伴う電流値を測定する。この電流値は、電流値比較・濃度算出装置３２に送られる。この装置３２には、検量線データ３３が送られ、この装置内において、電源・電流計３１から送られた電流値と、検量線データを比較し、式（Ｉ）の化合物の濃度を算出する。すなわち、得られた電流値から被験試料中の前記式（Ｉ）で表される化合物の濃度を算出する手段を備える。得られた式（Ｉ）の化合物の濃度は、表示装置３４により表示される。
［実施例］
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
ダイヤモンド電極の調製
ダイヤモンド薄膜を、ＡＳＴｅＸ社製、マイクロ波ＣＶＤ成膜装置を用い、マイクロ波プラズマアシストＣＶＤ法により調製した。具体的には以下の通りである。
まず、シリコン基板（Ｓｉ（１００））の表面を、０．５μｍのダイヤモンド粉で研磨した後、ＣＶＤ成膜装置の基板ホルダにセットした。炭素源としてアセトンとメタノールとの混合物（混合比９：１（体積比））を用いた。さらに、こ


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
条件の下、２０ｍＶｓ−１の掃引速度で陽極ボルタモグラフを記録した。その結果は、図４に示されるとおりであった。この結果から、ｐＨが増加すると、テオフィリンについてのピーク電圧が負のシフトを生じることが観察された。
（ｂ）  キサンチン、テオフィリン、テオブロミン、およびカフェインそれぞれについて、５０μＭの溶液を用意し、ピーク電圧と、ｐＨとの関係を調べた。その結果は、以下の通りであった。
2001098766.tif 000023
上記の通り、キサンチンおよびテオフィリンでは、広汎なｐＨ範囲（１．８〜１２．０）に亘って再現性あるピークが示されたが、テオブロミンおよびカフェインの場合には、ｐＨ値が約５．５では、酸化ピークは明確で無くなる傾向を示した。
実験例３：カフェインの定量
（ａ）検量線の作成
ｐＨ１の０．１ＭＨＣｌＯ４を溶媒とし、種々のカフェイン濃度の溶液を用意した。この溶液について、電位掃引速度を２０ｍＶｓ−１とするボルタンメトリー測定を行い、ピーク電流の値とカフェイン濃度との関係を得て、検量線を作成した。得られた検量線は、図５（ａ）および（ｂ）に示される通りであった。
（ｂ）カフェインの定量
市販のコーラ飲料をｐＨ１の０．１ＭＨＣｌＯ４を溶媒とし、１２５倍希釈した。この希釈溶液について、図３に示されるフローセルを用いた、フローインジェクション法により、ピーク電流値を求めた。印加電圧は、対銀塩化銀電極で１．５Ｖとした。得られたピーク電流値は、０．５１μＡであり、上記検量線から、




【国際調査報告】
2001098766.tif 000024
2001098766.tif 000025
2001098766.tif 000026