(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
0003792898.tif 000011
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基であり、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子であり、Ｘは硝酸イオン又はハロゲン化物イオンであり、ｎは１である。）
で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を
下記一般式（２）
【化２】
0003792898.tif 000012
（一般式（２）において、Ｒ1 は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アクリル基又はフェニル基であり、Ｒ2 は、メチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は、メチル基、エチル基又はプロピル基であり、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているアミド基の炭素原子及び窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において波長４００〜８００ｎｍの可視光照射下で反応させて得られる化学発光性物質を含有する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
下記一般式（１）
【化３】
0003792898.tif 000013
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基であり、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子であり、Ｘは硝酸イオン又はハロゲン化物イオンであり、ｎは１である。）
で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を
下記一般式（２）
【化４】
0003792898.tif 000014
（一般式（２）において、Ｒ1 は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アクリル基又はフェニル基であり、Ｒ2 は、メチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は、メチル基、エチル基又はプロピル基であり、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているアミド基の炭素原子及び窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において波長４００〜８００ｎｍの可視光照射下で反応させて得られる化学発光性物質を含有する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩からなる群より選択される少なくとも一種である請求項１又は２に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項４】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）である請求項１又は２のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項５】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘンズアミドおよびＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種である請求項１〜４のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項６】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドである請求項１〜４のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項７】
前記水素受容体が過酸化水素または過酸化水素源である請求項１〜６のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項８】
前記発光増強剤フェノール性化合物が、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール及び６−ヒドロキシベンゾチアゾールからなる群より選ばれる少なくとも１種のフェノール性化合物である請求項２〜７のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光法を利用するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであり、更に、詳しくは、特定の新規化学発光試薬を用いる化学発光法を利用する、水素受容体の存在下における高感度なペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは、水素受容体の存在下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このような触媒活性は、例えば、ヘモグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度で検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬として幅広い分野で利用されている。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる分析方法は、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他アビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異的な親和性を利用する分析系に用いられる。
【０００３】
また、このようなペルオキシダーゼ活性の測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で測定する比色法または蛍光物質を生成させてその蛍光を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行なわれている。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性の測定に比色法を用いる場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に欠けると云う問題点があり、これを解決する目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発されている。化学発光法は、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量する方法であり、化学発光性物質にルミノールを、水素受容体として過酸化水素を、そして発光増強剤としてｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペルオキシダーゼ活性を高感度で定量することが可能になっている。
【０００４】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定の更なる高感度化が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、前記事情に鑑み、更に高感度で測定可能な化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の新規な測定方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光試薬として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下に反応させることにより調製した化学発光試薬を用い、水素受容体として過酸化水素を用い、そして、発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる発光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる発光系に比較して、更に高感度でペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて、本発明に到達したものである。
【０００７】
従って、本発明の第一は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより調製した化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下でペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより調製した化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下でペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光性物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより得られる化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において、更に、好ましくは発光増強剤の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定するものである。その測定方法は任意であるが、化学発光性物質、発光増強剤及びペルオキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体溶液を添加して化学発光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する方法を採用することができる。
【００１０】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより得られる化学発光性を有する反応生成物を含有するものであり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、下記の一般式（１）
【００１１】
【化３】
0003792898.tif 000002
で表すことができる。
【００１２】
前記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜１４を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は、炭素数６〜１４のものが好ましく、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、更に、アルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１３】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、各々、互いに同一でも又は異なるものでもよい。これらの炭化水素基としては、炭素数が、例えば、１〜２０、特に、１〜１０のものが好ましい。
【００１４】
また、一般式（Ｉ）において、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、特に限定されるものではなく、硝酸イオン（ＮＯ3-）、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン等）、（メタ）リン酸イオン（ＰＯ3-）等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【００１５】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’ブスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’ビスアクリジニウム塩などが挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が好ましい。
また、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は次の下記一般式（２）
【００１６】
【化４】
0003792898.tif 000003
で表すことができる。
【００１７】
前記一般式（２）において、Ｒ1 は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。Ｒ2 は、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。又、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１８】
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等を非限定的に挙げることができる。
【００１９】
前記化学発光試薬の製造に用いる光照射用の光線としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。この光照射により得られる化学発光試薬は、光源を用いずに自然光の下で製造した化学発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃度で製造し同量で使用した場合に短時間で非常に高い発光強度を示すことと、この反応を光遮蔽下に実施した場合にはペルオキシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試薬が得られないことから、化学発光性化合物の生成には光照射が重要な役割を担っていることが認められる。Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペルオキシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応は起こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオンと安定な塩を形成しているためと考えられる。しかし、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の高い化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの対アニオンからの電化移動が促進され、イオン性の高い塩類からラジカル性を有する電化移動錯体に変化し、この錯体がＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の配位もしくは溶媒和によって安定化され、この安定化されたラジカル性化合物が過酸化水素の酵素分解により生成する活性酸素と反応して、励起状態のジオキセタン構造を経て発光するのでペルオキシダーゼ濃度に依存した発光強度が得られるものと考えられる。
【００２０】
前記の光照射を行なう際に必要なＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対するＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物のモル比としては、過剰量が望ましいが、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モルの量で用いることができ、更に、同種及び／又は異種のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び／又はその他の溶媒を反応溶媒として用いることもできる。
【００２１】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いる化学発光試薬の製造時の反応温度は溶媒の有無及び種類によって異なるが、一般的に、−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１５時間、特に好ましくは３０分〜１０時間の範囲の時間で行なうことができる。
【００２２】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いる化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光は、フェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等を非限定的に挙げることができる。
【００２３】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いる化学発光試薬は、１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０〜５００μｌ、特に５０〜３００μｌの範囲で用いることが好ましい。また、発光増強剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲で用い、その濃度は１０-6〜１Ｍ、特に１０-4〜１０-2Ｍの範囲で用いるのが好ましい。また、化学発光反応に用いられる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではなく、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素が好ましく用いられる。水素受容体の使用量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、特に１０〜１０００倍モルの範囲で用いるのが好ましい。
【００２４】
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２５】
化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に選択することができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが好ましい。また、反応時には界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【００２６】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下に反応させることにより得られる化学発光性物質を用い、この化学発光試薬を過酸化水素の存在下において塩基性条件下で、試料中のペルオキシダーゼの作用により発光反応させ、その発光量を測定することにより、ペルオキシダーゼ活性を定量するものであるが、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、更に、種々の物質の定量に利用することが可能になる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を８×１０-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈して化学発光試薬溶液を調製する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH8.0)溶液１００μｌを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液５０μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示す発光強度が得られ、ＨＲＰを５×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定可能なことが認められ、光照射せずに反応を行なった比較例１に較べて感度及び発光強度において改善が見られた。
【００２９】
【表１】
0003792898.tif 000004
【００３０】
［比較例１］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することにより化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
次に、この化学発光試薬を４．０×１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表２に示す如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３１】
【表２】
0003792898.tif 000005
【００３２】
［実施例２］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを５時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を８×１０-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈して化学発光試薬溶液を調製する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH8.0)溶液１００μｌを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液５０μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間の発光量を積算した結果、表３に示す発光強度が得られ、ＨＲＰを５×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定可能なことが認められ、光照射せずに反応を行なった比較例１に較べて感度及び発光強度において改善が見られた。
【００３３】
【表３】
0003792898.tif 000006
【００３４】
［比較例２］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することにより化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
次に、この化学発光試薬を４．０×１０-5Ｍ及びｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表４に示す如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３５】
【表４】
0003792898.tif 000007
【００３６】
［実施例３］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ−メチル−２−ピロリドン１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを３時間照射することにより化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を８×１０-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈して化学発光試薬溶液を調製する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH8.0)溶液１００μｌを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液５０μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表５に示す発光強度が得られ、ＨＲＰを５×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定可能なことが認められ、光照射せずに反応を行なった比較例３に較べて感度及び発光強度において改善が見られた。
【００３７】
【表５】
0003792898.tif 000008
【００３８】
［比較例３］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することにより化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
次に、この化学発光試薬を４．０×１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表６に示す如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３９】
【表６】
0003792898.tif 000009
【００４０】
［比較例４］
複数の化学発光測定用ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２０μｌを加えた後、これにルミノール５．６×１０-5Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌ及び０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを順次加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表７に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-17 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００４１】
【表７】
0003792898.tif 000010
【００４２】
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を従来から広く使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で測定することが可能になり、ペルオキシダーゼを標識物質に用いる酵素免疫測定法により抗原、抗体類を、ハイブリダイゼーションアッセイ法により核酸類を各々より高感度で検出もしくは定量することができる。