(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はフサリウム（Fusarium）の変異株から異種ポリペプチドを製造する方法において、
（１）アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oyzae）又はフサリウム（Fusarium）の親株を変異処理し；
（２）前記工程（１）において得られた変異処理した株から、親株に較べて低い放射状伸長率及び親株に較べて高い菌糸の枝分かれを有する変異株を選択し；
（３）前記工程（２）において選択された変異株から、前記異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む親株及び前記変異株を同一の条件下で培養された場合に、親株に較べて少なくとも10％高い異種ポリペプチド生産性を有する変異株を選択し；
（４）前記工程（３）において得られた変異株に、前記異種ポリペプチドをコードする核酸を導入し；そして
（５）前記工程（４）において得られた変異株を生産培地中で培養し、そして培養物から前記異種ポリペプチドを採取する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記異種ポリペプチドが酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異株がアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の変異株であり、そして前記酵素がリパーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異株がフサリウム（Fusarium）の変異株であり、そして前記酵素がセルラーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記放射状伸長率が親株に較べて少なくとも10％低い、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記放射状伸長率が親株に較べて少なくとも20％低い、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記放射状伸長率が親株に較べて少なくとも30％低い、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記菌糸の枝分かれが、親株に較べて少なくとも10％低い菌糸成長単位長さである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記菌糸の枝分かれが、親株に較べて少なくとも20％低い菌糸成長単位長さである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記菌糸の枝分かれが、親株に較べて少なくとも30％低い菌糸成長単位長さである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異株が、親株に較べて少なくとも20％多くの前記異種ポリペプチドを生産する、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記変異株が、親株に較べて少なくとも30％多くの前記異種ポリペプチドを生産する、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
親株に較べて少なくとも10％高い異種ポリペプチド生産性を有するアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はフサリウム（Fusarium）の変異株を製造する方法において、
（１）アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oyzae）又はフサリウム（Fusarium）の親株を変異処理し；
（２）前記工程（１）において得られた変異処理した株から、親株に較べて低い放射状伸長率及び親株に較べて高い菌糸の枝分かれを有する変異株を選択し；
（３）前記工程（２）において選択された変異株から、前記異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む親株及び前記変異株を同一の条件下で培養された場合に、親株に較べて少なくとも10％高い異種ポリペプチド生産性を有する変異株を選択し；そして
（４）前記工程（３）において得られた変異株に、前記異種ポリペプチドをコードする核酸を導入する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１４】
前記異種ポリペプチドが酵素である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記変異株がアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の変異株であり、そして前記酵素がリパーゼである、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異株がフサリウム（Fusarium）の変異株であり、そして前記酵素がセルラーゼである、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１７】
前記放射状伸長率が親株に較べて少なくとも10％低い、請求項13〜16のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記放射状伸長率が親株に較べて少なくとも20％低い、請求項13〜17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記放射状伸長率が親株に較べて少なくとも30％低い、請求項13〜18のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記菌糸の枝分かれが、親株に較べて少なくとも10％低い菌糸成長単位長さである、請求項13〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記菌糸の枝分かれが、親株に較べて少なくとも20％低い菌糸成長単位長さである、請求項13〜20のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記菌糸の枝分かれが、親株に較べて少なくとも30％低い菌糸成長単位長さである、請求項13〜21のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異株が、親株に較べて少なくとも20％多くの前記異種ポリペプチドを生産する、請求項13〜22のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異株が、親株に較べて少なくとも30％多くの前記異種ポリペプチドを生産する、請求項13〜23のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項13〜24のいずれか１項に記載の方法により得られる変異株。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、組換えポリペプチドの分泌のための改良された能力を有する新規真菌、及び該分泌を改良するための方法に関する。
関連技術の記載
糸状菌は組換えポリペプチドの生産のための広く用いられる宿主細胞システムとして確立されている。しかしながら多くの場合、形質転換能及び異種ポリペプチド発現の容易さの要求される特徴を有する真菌は、必ずしも、発酵の成功のための最も要求される特徴を有するわけではない。例えば、発酵の間の増殖形態は、多くの培養物はバイオマスの増加と共に極めて粘性になるので、最適ではあり得ない。粘度の増加は、発酵培養物を混合し通気する能力を制限し、菌糸体の酸素及び栄養素飢餓を導き、次に生存不能及び非生産的になり関心のポリペプチドの収率を制限する。他方、優れた発酵形態を示す糸状菌株は、生産される量に関して必ずしも最も優れた株でない。それゆえ、商業的目的のために、満足いく増殖特性、例えば迅速な増殖及び低粘度性を有し、それにより発酵中の生産性を増強する、商業的な量の組換えポリペプチドの発現のための能力を組み込む糸状菌宿主についての必要性がある。
発酵形態の改善のための多数の変異体のスクリーニングは極めて難しく、形態変異株は固体培地上の異常なコロニー形態に基づきしばしば単離されている。伝統的に、形態変異体は、異種遺伝子の多重コピーを含む形質転換株において単離されている。次にその変異体は、発酵増殖特性及び異種遺伝子発現について分析される。この方法は改良された発現株を同定することにおい役立ち得るが、いずれかの特定の真菌増殖形態と大量の分泌されるポリペプチドを生産する株の能力との間の関係はまだ確立されていない。形態変異体は形質転換株の変異誘発の後のポリペプチド発現改良スクリーンにおいても時折回収されるが、これらの株の研究も、形態の制御に対するいずれの重大な洞察も導いていない。更に、異種遺伝子発現カセットを含む親の株の形態学的に“改良された”株は、他の異種ポリペプチドの排他的発現のために用いることができないので、一般的な発現宿主としては適切でない。
本発明の目的は、異種ポリペプチド生産のための有用な形質変異体を生産し同定するための方法を提供することである。
発明の概要
本発明は、糸状菌の親細胞から変異体細胞を得る方法であって、
（ａ）前記親細胞の変異体細胞を得て；（ｂ）前記親細胞より制限されたコロニーの表現型及び／又はより広がった菌糸の枝分れを示す変異体細胞を同定し；そして前記変異体及び親細胞を同じ条件下で培養した時、前記親細胞より、異種ポリペプチドの生産について改良された特性を有する変異体細胞を同定することを含む方法に関する。
本発明は、本発明の方法により生産された変異体糸状菌細胞にも関する。
本発明は、異種ポリペプチドを生産するための方法であって、該異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む本発明の変異体細胞を培養し；そして（ｂ）前記異種ポリペプチドを回収することを含む方法にも関する。
図面の簡単な記載
図１は、pJeRS23の制限マップを示す。
図２は、PDA＋ウリジン固体培地上の対照株HowB425及びコロニーの変異体JeRS316のコロニー増殖を示す。
図３は、HowB425（対照）及びJeRS316（変異体）形質転換体におけるリパーゼ発現の分布のグラフ化した図を示す。
図４は、HowB425（対照）及びJeRS317（変異体）形質転換体におけるリパーゼ発現の分布のグラフ化した図を示す。
図５は、対照株対変異体株の発酵の異種リパーゼ生産相の比較を示す。
図６は、pCaHj418の制限マップを示す。
図７は、pDM148の制限マップを示す。
図８は、pDM149の制限マップを示す。
図９は、pJaL154の制限マップを示す。
図10は、pMT1612の制限マップを示す。
図11は、pJRoy30の制限マップを示す。
発明の詳細な記載
本発明は、糸状菌の親細胞から変異体細胞を得る方法であって、（ａ）前記親細胞の変異体細胞を得て；（ｂ）前記親細胞より制限されたコロニーの表現型及び／又はより広がった菌糸の枝分れを示す変異体細胞を同定し；そして前記変異体及び親細胞を同じ条件下で培養した時、前記親細胞より、異種ポリペプチドの生産について改良された特性を有する変異体細胞を同定することを含む方法に関する。
前記親細胞は、当該技術で周知である方法により変異誘発することができる。例えば、親細胞の変異誘発は、親細胞の照射、例えばUV、Ｘ線又はγ照射により達成することができる。更に、変異誘発は、化学的変異誘発物質、例えば亜硝酸、ニトロサミン、メチルニトロソグアニジン、及び５−ブロモウラシルのような塩基アナログでの処理により得ることができる。最も便利には、変異誘発物質は親株の胞子に適用され、その生き残った胞子が固体培地上での増殖のためにプレートされる。変異体は、選択、スクリーニング、又は選択及びスクリーニングの組合せのいずれかにより、特異的変異誘発手順なしでも集団内で自然に変異体となり得ることも理解されるであろう。例えば、フサリウム（Fusarium）株Ａ３／５の形態変異体を単離することについてWiebeら（1992, Mycological Research 96: 555〜562及びWiebeら，1991, Mycological Research 95: 1284〜1288）を参照のこと。それゆえ、本発明の目的のために、用語“変異体”は、変異誘発物質の意図的な適用のない天然の変異体又は突然変異体、即ち自発的変異体も包含する。
糸状菌親細胞は、いずれかの糸状菌細胞であり得る。糸状菌は、（Hawksworthら（In.Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK）により定義されるような）亜門ユーマイコタ（Eumycota）及びオオマイコタ（Oomycota）の全ての糸状菌形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合ポリサッカライドから構成される栄養型菌糸体を特徴とする。栄養型増殖は、菌糸の伸長及び炭素代謝が絶対好気性である。
本発明において、糸状菌の親細胞は、これらに限定されないが、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、マイセリオフトーラ（Myceliophthora）、ムコル（Mucor）、ニューロスポーラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、及びトリコデルマ（Trichoderma）の種の細胞又はそれらのテレオモルフもしくは異名であり得る。アルペルギルスのテレオモルフは、ユーロチウム（Eurotium）、ネオサルトリア（Neosartorya）、及びエメリセラ（Emericella）を含む。アスペルギルス及びそのテレオモルフの株は、いくつかの培養コレクションの機関、例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS)、及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)に直ちにアクセスできる。節ジスカラー（Discolor）のフサリウム（Fusarium）のテレオモルフは、ギブベレラ・ゴルドニイ（Gibberella gordonii）、ギブベレラ・シアネア（Gibberella cyanea）、ギブベレラ・ブリカリス（Gibberella pulicaris）、及びギブベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）を含む。
好ましい実施形態において、糸状菌親細胞はアスペルギルス細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、アクレモニウム細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、フサリウム細胞、例えば節エレガンス（Elegans）又は節ジスカラーのフサリウム細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、ヒュミコラ細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、マイセリオフトーラ細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、ムコル細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、ニューロスポーラ細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、ペニシリウム細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、チエラビア細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、トリポクラジウム細胞である。他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、トリコデルマ細胞である。より好ましい実施態様において、糸状菌親細胞は、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）、アスペルギルス・ニゲル（A. niger）、アスペルギルス・ホエチドウス（A. foetidus）、アスペルギルス・ニジュランス（A. nidulans）、又はアスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）細胞である。他のより好ましい実施形態において、糸状菌親細胞は、節ジスカラー（フサリウム節としても知られる）のフサリウム株である。例えば、糸状菌親細胞は、フサリウム・バクトリジオイデス（F. bactridioides）、フサリウム・セレアリス（F. cerealis）、フサリウム・クロオクウェルレンセ（F. crookwellense）、フサリウム・ケルモルム（F. culmorum）、フサリウム・グラミネアルム（F. graminearum）、フサリウム  グラミヌム（F. graminum）、フサリウム・ヘテロスポルス（F. heterosporum）、フサリウム・ネグンジ（F. negundi）、フサリウム・レチクラトウム（F. reticulatum）、フサリウム・ロセウム（F. roseum）、フサリウム・サムブシヌム（F. sambucinum）、フサリウム・サロキロウム（F. sarcochroum）、フサリウム・スルフレウム（F. sulphureum）、又はフサリウム・トリコテシオイデス（F. trichothecioides）細胞であり得る。他の好ましい実施形態において、糸状菌親細胞は節エレガンスのフサリウム株、例えばフサリウム・オキシスポルム（F. oxysporum）である。他のより好ましい実施形態において、糸状菌親細胞は、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）又はヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）細胞である。他のより好ましい実施形態において、糸状菌親細胞は、マイセリオフトーラ・サーモフィルム（Myceliophthora thermophilum）細胞である。他のより好ましい実施形態において、糸状菌親細胞はムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）細胞である。他のより好ましい実施形態において、糸状菌親細胞はニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）細胞である。他のより好ましい実施形態において、糸状菌親細胞はペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）細胞である。他のより好ましい実施形態において、糸状菌親細胞はチエラビア・テルレストリス（Thielavia terrestris）細胞である。他のより好ましい実施形態において、トリコデルマ（Trichoderma）細胞は、トリコデルマ・レエセイ（T. reesei）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）、トリコデルマ・ロンギブラキアトウム（T. longibrachiatum）、トリコデルマ・ハルジアヌム（T. harzianum）、又はトリコデルマ・コニンジイ（T. koningii）細胞である。
次に、最初のステップにおいて生産される変異体細胞は、変異体及び親細胞を同じ条件下で培養した場合、（ａ）親細胞より制限されたコロニーの表現型及び／又はより広がった菌糸の枝分れを示し；そして（ｂ）親細胞より異種ポリペプチドの生産について改良された特性を有する変異体細胞についてスクリーニングされる。好ましい実施形態において、変異体細胞は、最初に、より制限されたコロニーの表現型及び／又はより広がった菌糸の枝分れについて、より好ましくは、最初により制限されたコロニーの表現型、次により広がった菌糸の枝分れについて調べられる。
本発明の変異体細胞は、該変異体及び親細胞を同じ固体培地上で増殖させた時に、親細胞より制限されたコロニーの表現型を有し得る。“より制限されたコロニーの表現型”を有する変異体細胞は、本明細書において、変異体細胞及び親細胞が固体培地上で増殖する時に、親細胞より少い放射状の伸長比率を有する変異体細胞として定義される。好ましくは、変異体細胞のコロニーの表現型は、親細胞より、少くとも約10％、より好ましくは少くとも約20％、そして最も好ましくは少くとも約30％、制限される。
本発明の変異体細胞は、親細胞より広がった菌糸の枝分れも有し得る。“より広がった菌糸の枝分れ”を有する変異体細胞は、本明細書において、親細胞の菌糸の成長単位長さより少くとも10％小さい菌糸の成長単位長さを有する変異体細胞として定義される。好ましくは、変異体細胞の菌糸の枝分れは、親細胞より、少くとも約20％多く枝分れし、そしてより好ましくは少くとも約30％多く枝分れする。菌糸の成長単位長さの測定は、Trinciら
0003792725.tif 000002
の方法に従って行うことができる。この測定を行う１つの方法は、真菌の菌糸における枝の間の平均距離を測定することである（例えば、Withersら，1994, Mycological Research 98: 95〜100を参照のこと）。
本発明の変異体細胞は、変異体及び親細胞を同じ条件下で培養した場合、親細胞より異種ポリペプチドの生産について改良された特性も有する。本発明の方法により得られた変異体は、その形態が、親株に対して、発酵槽内により低い粘度を生じさせ、次により容易な混合、より優れたエレーション、より優れた増殖、及び最後に変異体株により生産された異種ポリペプチドの増強された収率を導く発酵の改良された増殖特性を有し得る。好ましい実施形態において、改良された特性は、（ａ）異種ポリペプチドの収率の増加、（ｂ）増殖の改良、（ｃ）粘度の低下、及び（ｄ）より優れた分泌からなる群から選択される。最も好ましい実施形態において、改良された特性は、異種ポリペプチドの収率の増加である。他の最も好ましい実施形態において、改良された特性は、増殖の改良である。他の最も好ましい実施形態において、改良された特性は、より低い粘度である。他の最も好ましい実施形態において、改良された特性はより優れた分泌である。
変異体細胞が親細胞より異種ポリペプチドの生産について改良された特性を有するか否かを決定するために、関心の異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構成物は、例えば形質転換により、親株及び形質変異体の両方に導入される。“核酸構成物”は、本明細書において、天然の遺伝子から単離され、又はさもなければ天然に存在しないであろう様式で組み込まれ並置された核酸のセグメントを含むように修飾された一本鎖又は２本鎖の核酸分子として定義される。変異体細胞は、核酸構成物を含むベクターで形質転換され、次にそのベクターは宿主染色体内に組み込まれる。“形質転換”は、核酸構成物が染色体の要素として維持されるように、該構成物を宿主細胞に導入することを意味する。組込みは、異種ポリペプチドをコードする核酸配列が細胞内により安定に維持されるので、有利であると一般に考えられる。ベクターの宿主染色体への組込みは、相同的又は非相同的組換えによりおこる。形質転換は、それらの多くは当該技術で公知である真菌宿主が用いられ得るのに適した技術を用いて行われる。アスペルギルス細胞の形質転換のための適切な手順は、EP 238023, Christensenら（1988, Bio/Technology 6: 1419〜1422）及びYeltonら（1984, Proceedings of the National Academy of Science USA 81: 1470〜1474）に記載される。フサリウム種を形質転換する適切な方法は、Malardierら（1989, Gene. 78: 147〜156）により、又は同時係属のUS通し番号08/269,449に記載される。
異種ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターでの変異体及び親細胞の形質転換の後、液体培地に接種するために変異体及び親から集めた胞子を用いる。適切な成長の期間の後、ポリペプチドの活性について上清をテストした。
改良された特性を得た場合、異種ポリペプチドの発現のレベルを、変異体株と親株との間で比較する。この場合、変異体の発酵の生産相は伸ばされるべきである。好ましい実施形態において、各々の株を同一条件下で培養した時、形質変異体は親株より少くとも約10％多い異種ポリペプチドを生産する。より好ましくは、変異体は少くとも20％、そして最も好ましくは少くとも30％、より多い異種ポリペプチドを生産する。特定の場合、変異体は、50％〜100％ものより多くのポリペプチド、又はそれ以上さえも生産することができる。全ての培養物において、特定範囲の発現レベルが観察され得ると予想されるので、この数字は、形質転換株の集団における発現の平均、中央又は最大レベルを表し得ると理解される。
改良された特性が粘度を減少させる場合、粘度は、当該技術で周知であるいずれかの手段、例えば、ブルックフィールド回転粘度計（規定された又は非限定のせん断距離及びスピンドル形状のいずれかの型）、動粘チューブ（フロースルーチューブ）、落球粘度計又はカップ型粘度計により決定することができる。本発明の好ましい宿主細胞は、同一の発酵条件下で親細胞により生産される粘度レベルの約90％又はそれ未満、好ましくは約80％又はそれ未満、そしてより好ましくは約50％又はそれ未満を示す。
その形態変異体は、関心のいずれかの原核又は真核生物異種ペプチド又はポリペプチドを発現するのに用いることができ、より好ましくは真核生物ペプチド又はポリペプチドを発現するのに用いることができる。これらの種について特に興味あるのは、異種ポリペプチド、特に真菌のポリペプチド、特に真菌の酵素の発現におけるそれらの使用である。形態変異体は、酵素、例えばヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、又はトランスフェラーゼを発現するのに用いることができる。より好ましくは、その酵素は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、グリコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グリコシダーゼ、β−グリコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、キシラナーゼ、又はキシロースイソメラーゼである。用語“真菌酵素”が、ネイティブの真菌酵素ばかりでなく、活性、熱安定性、pH許容性等を増強するために行われ得るアミノ酸置換、欠失、付加、又は他の修飾により修飾されている真菌酵素も含むことが当業者に理解されよう。発現することができる他のポリペプチドは、これらに限定されないが、哺乳動物ポリペプチド、例えばインスリン、シンスリン変異体、レセプタータンパク質、及びその一部、並びに抗体及びその一部を含む。
変異体は、宿主細胞に対してネイティブであるポリペプチドの組換え生産にも用いることができる。このような使用の例は、これらに限られないが、ポリペプチドをコードする遺伝子を異なるプロモーターの制御下においてポリペプチドの発現を増強すること、シグナル配列の使用により細胞外への関心のネイティブポリペプチドの運び出しを促進すること、又は宿主細胞により通常生産されるタンパク質をコードする遺伝子の複製数を増加させることを含む。これにより、本発明は、用語“異種ポリペプチド”の範囲内において、このような異種ポリペプチドの組換え生産を、このような発現が宿主に対してネイティブでない遺伝要素の使用を含む程度まで、又は宿主細胞において通常見られない様式で機能するよう操作されているネイティブ要素の使用も含む。
本発明において、核酸構成物は、調節配列と適合する条件下で変異体細胞内でのコード化配列の発現を推進することができる１又は複数の調節配列に作用的に結合される。本明細書に定義される用語“コード化配列”は、調節配列の制御下においた時に、mRNAに転写され、本発明のポリペプチドに翻訳される配列である。コード化配列の境界は、一般に、５′末端の翻訳開始コドン及び３′末端の翻訳停止コドンにより決定される。コード化配列は、これらに限られないが、DNA，cDNA、及び組換え核酸配列を含み得る。
用語“調節配列”は、核酸配列のコード化配列の発現に必要又は有利である全ての構成物を含むとして本明細書に定義される。各々の調節配列はポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブ又は外来性であり得る。このような調節配列は、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、ポリペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、及び転写ターミネーターを含む。最小限、調節配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含む。その調節配列には、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード化領域と共に、調節配列の連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的のためのリンカーが供される。
調節配列は、核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列である適切なプロモーター配列であり得る。そのプロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写及び翻訳調節配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。糸状菌細胞における本発明の核酸構成物の転写を推進するための適切なプロモーターの例は、（引用により本明細書にその内容が組み込まれる米国特許出願第08/208,092号に記載される）アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコム・ミエヘイアスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス・ニゲル中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル・酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニゲル又はアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイ・リパーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスアセトアミダーゼ、（引用により本明細書に組み込まれる米国特許第4,288,627号に記載される）フサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ、及びそれらのハイブリッドをコードする遺伝子から得られるプロモーターである。糸状菌細胞に用いるための特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi（アスペルギルス・ニゲル中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエトリオース・ホスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びglaAプロモーターである。
調節配列は、転写を停止するために宿主細胞により認識される配列である適切な転写ターミネーター配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３′末端に作用的に結合される。選択された宿主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターを、本発明に用いることができる。糸状菌細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスアントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニゲルα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
調節配列は、宿主細胞による転写に重要であるmRNAの非翻訳領域である適切なリーダー配列でもあり得る。そのリーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５′末端に作用的に結合される。選択された宿主細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列を本発明に用いることができる。糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。
調節配列は、核酸配列の３′末端に作用的に結合し、転写された時に、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を加えるためにシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列でもあり得る。選択された宿主細胞中で機能的であるポリアデニル化配列が本発明に用いることができる。糸状菌の宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスアントラニレートシンターゼ、及びアスペルギルス・ニゲルα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
調節配列は、細胞の分泌経路に発現されたペプチドを送ることができるポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード化領域でもあり得る。核酸配列のコード化配列の５′末端は、本来的に、分泌されるポリペプチドをコードするコード化領域のセグメントと共に、翻訳読み枠内の天然の連結したシグナルペプチドコード化領域を含み得る。あるいは、コード化配列の５′末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード化配列の部分に対して外来であるシグナルペプチドコード化領域を含み得る。外来シグナルペプチドコード化領域は、コード化配列がシグナルペプチドコード化領域を通常、含まない場合に要求され得る。あるいは、外来シグナルペプチドコード化領域は、そのコード化領域に通常関連する天然のシグナルペプチドコード化領域に対して、増強されたポリペプチドの分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード化領域と単純におきかわることができる。シグナルペプチドコード化領域は、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、リゾムコール種からのリパーゼもしくはプロティナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシアエからのα−因子のための遺伝子、バチルス種からのプロテアーゼ遺伝子、又はウシプレプロキモシン遺伝子から得ることができる。しかしながら、発現されたポリペプチドを、選択された宿主細胞の分泌経路に送ることができるいずれかのシグナルペプチドコード化領域を本発明に用いることができる。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード化領域は、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニゲル中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロティナーゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子、又はリゾムコル・ミエヘイリパーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード化領域である。
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置したアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード化領域でもあり得る。その結果生ずるポリペプチドはプロ酵素又はプロペプチド（又は特定の場合、チモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、そのプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒又は自己触媒による開裂により成熟活性ポリペプチドに転換することができる。プロペプチドコード化領域は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子（aprE）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）中性プロテアーゼ遺伝子（nprT）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子遺伝子、又はマイセリオフトーラ・サーモフィルムラッカーゼ遺伝子（WO 95／33836）から得ることができる。
ベクターは、組換えDNA手順に便利にはかけることができ、そのポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクターであり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞内でのベクターの適合性によるであろう。ベクターは、直鎖又は閉環状プラスミドであり得る。ベクターは、宿主細胞のゲノム内に導入される全てのDNAを一緒に含む単一のベクターもしくはプラスミド又は複数のベクターもしくはプラスミドであり得る。本発明のベクターは、好ましくは、そのベクターの宿主細胞ゲノムへの安定な組込みを許容する因子を含む。組込みのために、ベクターは、相同的又は非相同的組換えによるゲノム内へのベクターの安定な組込みのためのポリペプチドをコードする核酸配列又は他のベクターの因子に依存し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同的組換えにより組込みを促進するための付加的核酸配列を含み得る。その付加的核酸配列は、染色体内の正確な位置において、宿主細胞ゲノムへベクターを組込むことを可能にする。正確な位置での組込みの見込みを増加させるために、その組込み要素は、相同的組換えの確率を増加させるために、対応する標的配列と高い相同性である100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基対、そして最も好ましくは800〜1,500塩基対のような十分な数の核酸を好ましくは含むべきである。組込み要素は宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同であるいずれかの配列であり得る。更に、組込み要素は、非コード化又はコード化核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノム内に組込むことができる。
ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を許容する１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その産物が殺生物剤耐性、貴金属に対する耐性、及び栄養素要求体に対するプロトトロピー等を供する遺伝子である。糸状菌宿主細胞に用いるための選択マーカーは、これらに限られないが、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hygB（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（ニトレートレダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、sC（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、trpC（アントラニレートシンターゼ）、及びグルフシネート耐性マーカー、及び他の種からの等価物を含む群から選択することができる。アスペルギルス細胞に用いるために好ましいのは、アスペルギルス・ニジュランス又はアスペルギルス・オリザエのamdS及びpyrGマーカー並びにストレプトマイセス・ヒグロスコピクスのbarマーカーである。更に、選択は、選択マーカーが別個のベクター上にある場合、例えばWO 91／17243に記載されるような、同時形質転換により行うことができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、宿主は、選択マーカー、並びにプロモーター、要求されるポリペプチドのための遺伝子並びに転写ターミネーター及びポリアデニル化配列を含む導入された残りの異種DNAの両方を含む一本鎖DNAベクターで形質転換される。
核酸構成物及びベクターを作製するために上述の要素を連結するのに用いられる手順は当業者に公知である（例えば、Sambrookら，1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1984、前掲を参照のこと）。
本発明は、異種ポリペプチドを生産する方法であって、（ａ）該異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む本発明の変異体細胞を培養し；そして（ｂ）該異種ポリペプチドを回収することを含む方法にも関する。
細胞は、当該技術で周知である方法を用いて、ポリペプチドの生産に適した栄養培地内で培養される。例えば、細胞は、適切な培地内で行われる研究室又は工業用発酵槽内で、ポリペプチドが発現及び／又は単離されるのを許容する条件下で、振とうフラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フェドーバッチ、又は固相発酵を含む）により培養することができる。培養は、当該技術で周知である手順を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地内で行われる（例えば、バクテリア及びイーストについての文献：Bennett, J.W.及びLaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991を参照のこと）。適切な培地は市販の供給元から利用でき、又は公開された組成（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログ）に従って調製することができる。ポリペプチドが栄養培地に分泌されるなら、ポリペプチドは培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されないなら、それは細胞ライゼートから回収される。
ポリペプチドは、そのポリペプチドに特異的である当該技術で周知である方法を用いて検出することができる。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、又は酵素基質の消滅を含み得る。例えば、ポリペプチドの活性を決定するために酵素アッセイを用いることができる。酵素活性を決定するための手順は当該技術で公知である。
結果として生ずるポリペプチドは、当該技術で周知の方法により回収することができる。例えば、ポリペプチドは、これらに限られないが、遠心、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポーション、又は沈殿を含む慣用的な手順により栄養培地から回収することができる。次に回収されたポリペプチドは、種々のクロマトグラフィー手順、例えばイオン効果クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により更に精製することができる。
本発明のポリペプチドは、これらに限定されないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手順（例えば調製用等電点電気泳動）、溶解度の差（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出を含む当該技術で周知である種々の手順により精製することができる（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）。
実施例
株及び培地
出発株はアルファーアミラーゼ欠損pyrG陰性アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）HowB425及びフサリウム（Fusarium）Ａ３／５とする。フサリウムＡ３／５の形態学的突然変異体CC1-3，C2-3及びMC3-5（Wiebeら1992, Mycological Research 96: 555-562; Wiebeら1991, Mycological Research 95: 1284-1288; Wiebeら1991, Mycological Research 96: 555-562）は高度に枝のついたコロニー変異体である。
PDAプレートは39ｇ／ｌのポテトデキストロースアガー（Difco）を含み、そして何らかのことわりのない限りpyrG栄養要求株のために10mMのウリジンが添加されている。
MY50N培地は１リットル当り62.5ｇのNutriose、2.0ｇのMgSO4・7H2O、2.0ｇのKH2PO4、4.0ｇのクエン酸、8.0ｇの酵母抽出物、2.0ｇの尿素、0.1ｇのCaCl2及び0.5mlのpH 6.0の微量金属の溶液を含んで成る。MY50N振盪フラスコ培地をマイクロタイター増殖実験（MY50N／100）において使用するためにガラス蒸留水で１：100に希釈する。培養物は28〜37℃の温度で増殖させる。
最少培地プレートは１リットル当り6.0ｇのNaNO3、0.52ｇのKCl、1.52ｇのKH2PO4、1.0mlの微量金属溶液、20ｇのNober Agar（Difco）、20mlの50％のグルコース、20mlのメチオニン（50ｇ／ｌ）、20mlのビオチン（200mg／ｌ）、2.5mlの20％のMgSO4・7H2O及び1.0mlのmg／mlのストレプトマイシンを含んで成る。寒天培地をオートクレーブにおける前にpH 6.5に調整し、次いでグルコース、メチオニン、ビオチン、MgSO4・7H2O及びストレプトマイシンを滅菌溶液として冷却オートクレーブ済み培地に加え、そしてプレートの中に注ぎ入れる。
微量金属溶液（1000×）は１リットル当り22ｇのZnSO4・7H2O、11ｇのH3BO3、５ｇのMnCl2・4H2O、５ｇのFeSO4・7H2O、1.6ｇのCoCl2・5H2O、1.6ｇの(NH4)6Mo7O24及び50ｇのNa4EDTAを含んで成る。
COVEプレートは１リットル当り343.3ｇのスクロース、20mlのCOVE塩溶液、10mlの１Ｍのアセトアミド、10mlの３ＭのCsCl及び25ｇのNobel agarを含んで成る。COVE塩（50×）溶液は26ｇのKCl、26ｇのMgSO4・7H2O、76ｇのKH2PO4及び50mlのCOVE微量金属溶液を含んで成る。COVE微量金属溶液は１リットル当り0.04ｇのNaB4O7・H2O、0.040ｇのCuSO4・5H2O、0.70ｇのFeSO4・H2O、0.80ｇのNa2MoO2・2H2O及び10ｇのZnSO4を含んで成る。
M400Da培地は１リットル当り50ｇのマルトデキストリン、2.0ｇのMgSO4・7H2O、2.0ｇのKH2PO4、4.0ｇのクエン酸、8.0ｇの酵素抽出物、2.0ｇの尿素及び0.5mlの微量金属溶液を含んで成る。この培地を５ＮのNaOHでpH 6.0に調整する。微量金属溶液は１リットル当り14.3ｇのZnSO4・7H2O、2.5ｇのCuSO4・5H2O、0.5ｇのNiCl2・6H2O、13.8ｇのFeSO4・7H2O、8.5ｇのMnSO4・H2O及び3.0ｇのクエン酸を含んで成る。
実施例１：アスペルギルス・オリザ株HowB425の突然変異誘発
アスペルギルス・オリザ株HowB425の胞子を固形培地から回収し、そして0.01％のTween 80の中で2.2×107／mlの濃度へと懸濁する。５mlの胞子懸濁物を90mmのプラスチック製ペトリ皿に分注し、そしてその胞子に紫外線を１分間照射し、約５％の生存率とする。突然変異した胞子を暗所の中に１時間保存し、次いでPDA＋50mg／ｌのウリジンプレートにまく。
この突然変異誘発処理により得られる胞子の色突然変異体の頻度は白色胞子突然変異体が8.8×10-5、そして黄色胞子突然変異体が5.9×10-5である。制限コロニー表現型に関して全部で約34,000個の生存コロニー（プレート当り250〜800個）を目視スクリーニングする。80個の制限コロニーを選定する。プレート上で増殖している制限コロニーの縁を高度菌糸体枝つきコロニーについて顕微鏡（200×）で検査する。アスペルギルス・オリザHowB425コントロール株よりもはるかに多い菌糸枝パターンを有するものとして36個の選定コロニーが選定され、そしてPDA＋ウリジンプレート上で胞子を線引きすることにより精製する。増殖及び胞子形成後、株を似たようにして再精製する。36個の突然変異体をコロニー及び高度枝つき表現型について再検査する。双方のアッセイにおいて再検査した36個のうち12個が陽性であり、そして異種ポリペプチド発現分析について選定する。回収される突然変異体の頻度は12／34,000又は約3.5×10-4である。コロニー突然変異体をその菌糸枝表現型の検査により分類する（表１）。PDA＋ウリジン固形培地上でのコントロール株及び突然変異体の一つのコロニー形態を図２に示す。
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実施例２：リパーゼ発現プラスミド
リパーゼ発現プラスミドpJeRS23の地図を図１に示す。pJeRS23はアスペスギルス・ニドゥランス由来のamdS遺伝子塩基−118〜2191（ATG開始コドンに対応）、pMHan37由来のpTAKA-TPI／リポラーゼ／AMGtリパーゼ発現カセット、アスペルギルス・オリザpyrG遺伝子及びpUC19配列を含む。
実施例３：アスペルギルス・オリザ形質転換
形質転換すべき培養物を20mlの１％の酵母抽出物−２％のPeptone（Difco）−2.5％のグルコースの中で37℃で16〜20時間、撹拌しながら増殖させる。各培養物を10mlの1.2ＭのMgSO4と混合し、そして菌糸体をMiracloth（CalBiochem, La Jolla, CA）での濾過により、又は遠心分離により回収し、1.2ＭのMgSO4で洗い、次いで1.2ＭのMgSO4中の５mg／mlのNOVOZYM 234（Novo Nordisk A/S, Bagsvard, Demark）10mlの中に再懸濁する。この懸濁物を37℃で約１時間静かに撹拌しながらインキュベーションし、プロトプラストを構築する。未消化の菌糸体を滅菌Miracloth層を介する濾過により除去する。プロトプラストは3600ｇでの遠心分離により回収する。それらを10mlのST（１Ｍのソルビトール−10mlのトリスpH 7.5）で洗い、遠心分離し、10mlのSTC（１Ｍのソルビトール−10mMのトリスpH 7.5−10mMのCaCl2）で洗い、遠心分離し、次いで1.0mlのSTCに再懸濁する。プロトプラストの濃度を決定し、そして最終濃度をSTCにより２×106〜１×107／mlに調整する。0.1mlのプロトプラストのアリコートをFalcon 2059ポリプロピレンチューブ内の５μｌのpJeR23 DNA（約５μｇ）と混合し、そして室温で20分インキュベーションする。１mlのSPTC（0.8Ｍのソルビトール−40％のポリエチレングリコール4000−50mMのCaCl2−50mMのトリスpH ８）を加え、そしてこの懸濁物を静かに振盪しながら混合する。この懸濁物を室温で20分インキュベーションし、次いで７mlの溶融上層寒天（１×のCOVE塩、0.8Ｍのスクロース、１％の低融点アガロース）を加え、そしてこの懸濁物をCOVEプレート上に注ぐ。このプレートを37℃でインキュベーションする。
実施例４：リパーゼアッセイ
アッセイ基質は使用直前にストック基質（10μｌのｐ−ニトロフェニルブチレート／１mlのDMSO）をMCバッファー（３mMのCaCl2−0.1ＭのMOPS pH 7.5）に１：５で希釈することにより調製する。標準Lipolase（登録商標）は1000LU／mlの50％のグリセロール−0.66mMのCaCl2−33mMのトリスpH 7.5を含み、そして−20℃で保存する。標準Lipolase（登録商標）は使用直前にMCバッファーで１／100に希釈する。培養液サンプルをMCバッファーで希釈し、そしてこの希釈した培養液サンプルのアリコート100μｌを96穴マイクロタイター皿に分注し、次いで100μｌの希釈基質を分注する。nmでの吸収を時間の関数として記録する。培養液リパーゼ単位／ml（LU／ml）をLipolase（登録商標）標準品に対して計算する。
実施例５：Lipolase（登録商標）発現
12種の突然変異体それぞれを実施例２記載のLipolase（登録商標）発現プラスミドpJeRS23で形質転換し、そしてその形質転換体をウリジンについてのそれらの原栄養性及び唯一の窒素源としてのアセトアミドを利用して増殖する能力により選定する。親株アスペルギルス・オリザHowB425と共に平行形質転換を実施する。分生子形成した形質転換体をCOVEプレートに一回線引きし、そして個々のコロニー由来の胞子を90mmのCOVEプレートに接種するために用いる。胞子形成後、胞子を0.01％のTween 80の中に回収する。各胞子懸濁物のアリコート10μｌを１mlのMY50N／100液体培地を含む24穴マイクロタイタープレートのウェルの中に接種するために用いる。実験は異なる日に２回行い（実験Ａ及びＢ）、各日にアスペルギルス・オリザHowB425コントロール形質転換体の全セットを含ませる。マイクロタイタープレートを37℃で３〜５日間、100rpmの撹拌で増殖させ、そして培養上清液を実施例４に記載の通りにしてリパーゼ活性についてアッセイする。
その結果を表IIに示す。２種類の突然変異体のグラフ図を図３及び４に示す。任意の所定のアスペルギルス・オリザ宿主へのDNA発現プラスミドの導入を経て得られる個々の形質転換体が異種ポリペプチドを産生及び分泌するその能力において変動すること、及び各突然変異株内の形質転換体の数が非常に少ないことが典型的であるが、突然変異体JeRS316（図３）及びJeRS317（図４）についての発現プロフィールは、コントロールと比べ、より高いリパーゼ発現値へと更にシフトすることが明らかである。
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実施例６：アスペルギルス・オリザ突然変異体JeRS316の発酵
形態学的突然変異体が野生型形態株と比べて優れた発酵挙動を発揮するかを調べるため、親株アスペルギルス・オリザHowB425及びプラスミドpJeRS23で形質転換された突然変異株JeRS316それぞれの一の形質転換体をタンク発酵槽の中で発酵条件下で増殖させる。
発酵終了時でのコントロール培養物の形態はこれらの条件下で増殖するアスペルギルス・オリザにとって典型的なものである。この培養物は非常に粘性であり、粘性且つ粒状のゆっくりとした混合外観を有する。タンクの中に大きな気泡が見える。一方、JeRS316形質転換体は低粘性、繊維性、易混合形態を示し、発酵中のペレット形成の度合いは小さい。大きな気泡がタンク中で観察されることはあまりない。異種リパーゼの発現を調べ、そしてその結果を表５に示す。もし突然変異体が発酵においてその親株より優れているなら、突然変異体に関して発酵の生産期が延長されるであろうことが期待される。その結果を〔所定時（ｘ）での培養液中のリパーゼ力価〕／〔所定時（42時間）でのリパーゼ力価〕の比として報告する。この分析は、全ての形質転換体がその絶対発現レベルにおいて同等でないという事実に関し、発現データーを標準化させる。改善された形態学的突然変異体について予測の通り、発酵の異種ポリペプチド生産期はコントロールと比べ株JeRS316において著しく延期された。形態学的突然変異株の培養液中のリパーゼの最終発現は、コントロールと比べ、力価において約10倍高い。
実施例７：フサリウム発現ベクターpJRoy30の構築
pJRoy20のフサリウム・オキシスポルムトリプシン遺伝子プロモーターにおける−15においてのEcoRＶ部位（Royerら，1995, Bio/Technology 13: 1479-1483）及びCAREZYME（商標）（Novo Nordisk A/S, Bagsvard, Denmark）セルラーゼコード領域における＋243に存在するNcoＩ部位を、フサリウム・オキシスポルムトリプシン遺伝子プロモーター及びCAREZYME（商標）セルラーゼ遺伝子との間での正確な融合体を構築するために利用する。CAREZYME（商標）セルラーゼ遺伝子がすぐに後続するフサリウム・オキシスポルムトリプシン遺伝子プロモーターの−18〜−１を含むPCRフラグメントを下記のプライマー：
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を利用し、CAREZYME（商標）ベクターpCaHj418（図６参照）から構築する。フォワードプライマーにおける下の文字はフサリウム・オキシスポルムトリプシンのbp−24〜−１であり、上の文字はCAREZYME（商標）のbp１〜20である。
利用したPCR条件は95℃で５分、次いで95℃で30秒、50℃で１分及び72℃で１分づつのサイクル30回とする。得られる0.32kbのフラグメントをInvitrogenのTAクローニングキット（Invitrogen, La Jolla, CA）を用いてベクターpCRIIにクローニングし、pDM148を得る（図７参照）。0.26kbのEcoRＶ／NcoＩフラグメントをpDM148から単離し、そしてpCaHj418由来の0.69kbのNcoＩ／BglIIフラグメントとライゲーションさせ、そしてEcoRＶ／BamHＩ消化したpJRoy20にクローニングしてpDM149を構築する（図８参照）。
pMT1612はpBIT（Straubingerら，1992, Fungal Genetics Newsletter 39: 82-83）由来のbar遺伝子を含む575bpのBamHＩ−BamHＩフラグメントをBamHＩ／BglIIで切ったpIC19H（Marshら，1984, Gene 32: 481-485）に導入することより構築する。次いでbar遺伝子をBamHＩ−XhoＩフラグメントとして単離し、そしてBamHＩ−XhoＩ切断pIaL154（図９）に挿入し、pMT1612（図10）を作製する。3.2kbのEcoRＩ CAREZYME（商標）セルラーゼ発現カセットをpDM149からEcoRＩ切断したバスタ（basta）マーカーpMT1612へと移し、pJRoy30（図11）を作製する。
実施例８：フラリウムの形質転換
高度に枝つきした形態学的変異体CC1-3，CC1-8，CC2-3及びMC3-5（Wiebeら，1992, Mycological Research 96: 555-562）フサリウム株Ａ３／５（ATCC 20334）及びフサリウム株Ａ３／５をVogels培地（Vegel, 1964, Am.Nature 98: 435-446）と1.5％のグルコース及び寒天の10×15mmのペトリ皿上で25℃で３週間増殖させる。分生子及び／又は菌糸体断片（プレート当り約108個）をトランスファーループを用いて10mlの滅菌水に移し、そして４層のチーズクロスを介する濾過及び最後の一層のMiraclothを介する濾過により精製する。分生子及び／又は菌糸体懸濁物を遠心分離により濃縮する。１％の酵母抽出物、２％のバクトペプトン及び２％のグルコースを含んで成る50mlのYPG培地に108個の分生子及び／又は菌糸体断片を接種し、そして24℃、150rpmで14時間インキュベーションする。得られる菌糸を滅菌0.4μｍフィルター上で捕捉し、そして滅菌蒸留水、次いで1.0ＭのMgSO4で順々に洗う。菌糸を10mlのNOVOZYM 234（商標）溶液（1.0ＭのMgSO4中で２〜10mg／ml）に再懸濁し、そして34℃で15〜30分80rpmで撹拌しながら消化する。得られるプロトプラスト懸濁物から未消化の菌糸材料を４層のチーズクロス及びMiraclothを介する連続濾過により除去する。20mlの１Ｍのソルビトールをチーズクロス及びMiraclothに通し、そしてプロトプラスト溶液と合わせる。混合後、プロトプラスト（約５×108個）を遠心分離によりペレット化し、そして20mlの１Ｍのソルビトール及び20mlのSTCの中での連続再懸濁及び遠心分離により洗浄する。洗浄したプロトプラストを４部のSTC及び１部のSPTCの中に１〜２×108／mlの濃度で再懸濁する。100μｌのプロトプラスト懸濁物をポリプロピレンチューブ（17×100mm）内の５μｇのpJRoy30及び５μｌのヘパリン（STC中５mg／ml）に加え、そして30分氷上でインキュベーションする。１mlのSPTCをプロトプラスト懸濁物の中に静かに混合し、そしてインキュベーションを室温で20分続ける。COVE塩、25mMのNaNO3、0.8Ｍのスクロース及び１％の低融点アガロース（Sigma Chemical Company, St.Louis, MO）より成る25mlの溶融溶液（40℃に冷却）をプロトプラストと混合し、次いで空の150mmのペトリ皿上にまく。インキュベーションは室温で10〜14日間続ける。室温で24時間インキュベーション後、25mlの同じ培地とバスタ（５mg／ml）をペトリ皿の上にかぶせる。バスタはAgrEvo（Hoechst Schering, Rodovve, Denmark）より得たものであり、そしてフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１）で１回、及びクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）で１回使用前に抽出する。
実施例９：セルラーゼ活性の発現
フサリウムA3／5，CC1-3，CC2-3及びMC3-5の形質転換体をマイクロタイタープレート及び振盪フラスコ中のM400Da培地上で37℃で７日間培養する。フサリウムA3／5，CC1-3，CC2-3及びMC3-5それぞれの一の形質転換体を典型的な炭素及び窒素源並びに鉱物塩及び微量金属を含む培地の中で適当な発酵条件下で発酵槽内で培養する。
セルラーゼ活性は下記の手順を利用して測定する。セルラーゼ標準品の様々な希釈品５μｌ容量及び１〜５μｌのサンプルを96穴プレートの中に分注する。セルラーゼ標準品（CAREZYME（商標）Novo Nordisk A/S, Bagsvard Denmark）を100mMのMOPS pH 7.0の中に150，100，50，25，12.5及び6.25ECU／mlで希釈する。基質はアゾ−カルボキシメチルセルロース（アゾ−CMC）を100mMのMOPS pH 7.0の中に２％ｗ／ｖで溶解し、そして80℃で10分撹拌することにより調製する。65μｌのアゾ−CMC基質溶液をサンプルウェルそれぞれに分注し、そして混合する。96穴プレートを水浴の中で45℃で30分イキュベーションし、次いで氷の上に２分載せる。175μｌの容量の停止試薬を各ウェルに加え、そしてよく混合する。この停止試薬は0.2ｇのZnCl2を20mlの0.25ＭのMOPS pH 7.0の中に懸濁し、そしてこの懸濁物を１リットルのエタノール当り1.1mlの濃HClを含む酸性化エタノール80mlに加えることにより調製する。この96穴プレートをSorval RT 6000B遠心分離機の中で3000rpmで10分遠心分離する。遠心分離が完了したら、50μｌづつの上清液をウェル当り50μｌの水を含む新たな96穴プレートに移す。600nmでの吸収を測定する。
マイクロタイタープレート、振盪フラスコ及び発酵槽培養物についての結果を表IIIに示す。ここで最大セルラーゼ収率は、1.0に標準化してある。マイクロタイタープレート培養物中では、CC2-3及びMC3-5の形質転換体は親株と比較してそれぞれ22％及び46％高いレベルでセルラーゼを生産する。振盪フラスコ培養物中では、CC1-3，CC2-3 5及びMC3-5の形質転換体は親株と比較してそれぞれ85％、54％及び７％高いレベルでセルラーゼを生産する。発酵槽において、CC1-3，CC2-3 5及びMC3-5の形質転換体は親株と比較してそれぞれ136％、３％及び８％高いレベルでセルラーゼを生産する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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