(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝血物質に対する解毒剤として用いられる組成物であって、プロトロンビン複合体濃縮物および少なくとも一つの凝血を促進する付加的成分を含む、前記組成物。
【請求項２】
プロトロンビン複合体濃縮物が非活性化プロトロンビン複合体濃縮物である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
凝血を促進する付加的成分がファクターVIIIである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
凝血を促進する付加的成分がファクターVIIIおよびvon Willebrandファクター（ｖＷＦ）である請求項１記載の組成物。
【請求項５】
凝血を促進する付加的成分がファクターＶである請求項１記載の組成物。
【請求項６】
凝血を促進する付加的成分がファクターＶａである請求項１記載の組成物。
【請求項７】
凝血を促進する付加的成分がvon Willebrandファクターである請求項１記載の組成物。
【請求項８】
凝血を促進する付加的成分がファクターXIである請求項１記載の組成物。
【請求項９】
凝血を促進する付加的成分がファクターXIIである請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
凝血を促進する付加的成分がファクターXIIIである請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
凝血を促進する付加的成分が少なくとも一つの脂質または脂質混合物である請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記成分が負に荷電した脂質または脂質混合物である請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
凝血を促進する付加的成分が少なくとも一つの利尿剤である請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
プロトロンビン複合体濃縮物と請求項３〜１３のいずれかに記載の凝血を促進する少なくとも二つの付加的成分とを含む請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
プロトロンビン複合体濃縮物が治療対象患者体重１kgあたり１〜２０００国際単位（IU）の濃度で存在する請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
プロトロンビン複合体濃縮物が１０〜１０００IU／kgの量で存在する請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
凝血を促進する付加的成分が１〜２０００IU／kgの濃度で存在する請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
凝血を促進する付加的成分が１０〜１０００IU／kgの量で存在する請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記脂質または脂質混合物が治療対象患者体重１kgあたり０.０１〜１００mg／kgの濃度で存在する請求項１１記載の組成物。
【請求項２０】
前記利尿剤が治療対象患者体重１kgあたり０.０１〜１００mg／kgの量で存在する請求項１３記載の組成物。
【請求項２１】
前記脂質または脂質混合物が治療対象患者体重１kgあたり０.１〜１０mg／kgの量で存在する請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
前記利尿剤が治療対象患者体重１kgあたり０.１〜１０mg／kgの量で存在する請求項２０記載の組成物。
【請求項２３】
抗凝血物質に対する解毒剤として用いられる組成物であって、一方において、脂質、脂質混合物および利尿剤より成る群より選択される少なくとも一つの成分を、そして他方においてプロトロンビン複合体濃縮物、ファクターII、 Ｖ、Ｖａ、VIII、 IX、 Ｘ、XI、 XIIまたはXIIIのうちの一つ、およびvon Willebrandファクターより成る群より選択された少なくとも一つの成分を単一ファクターとしてまたはこれらのファクターの混合物として含んで成る、前記組成物。
【請求項２４】
抗凝血物質に対する解毒剤として用いられる組成物であって、ＡおよびＢの二群の一方から選択される少なくとも一つの成分を、それぞれの場合、含んで成り、ここでＡ群はファクターII、 Ｖ、Ｖａ、VIIIおよびIXより成り、またＢ群はファクターII、Ｖ、Ｖａ、VII、 VIIａおよびVIII、von Willebrandファクター、およびファクターIX、Ｘ、XI、XIIおよびXIIIより成るが、ただしＡ群からの成分はＢ群からの成分と一致しない、前記組成物。
【請求項２５】
請求項１記載の組成物の、抗凝血物質に対する解毒剤としての医薬の調製のための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、抗凝血物質に対する解毒剤に関する。
凝血は血漿タンパク質および細胞が関与する複雑なプロセスである。創傷閉鎖の形成は損傷表面への血小板の迅速な付着およびカスケード様反応シーケンスで順次活性化される接触因子およびプロテアーゼによって開始される。この事象の進行により、就中フィブリンを形成するフィブリノーゲンの活性化を触媒するトロンビンが生産される。
【０００２】
ファクターVIIIおよびＶなどのタンパク質は促進物質としてこの系の効率に貢献している。プロティンＣ系に加えて、関与するプロテアーゼの阻害物質が、創傷閉鎖が生起している間過剰反応が避けられるように、凝血プロセスを本質的に調節している。この精緻に調節された平衡が乱れるとフィブリン沈着や血栓形成を招き得る。知られるように、この結果生じる血管閉塞は多くの病理生理学的プロセス、例えばとりわけ心筋梗塞の原因となる。この問題は、しばしば術後合併症となる血栓症のリスク増大を受けやすい患者にあっては特に重要である。
【０００３】
これらの病理生理学的プロセスを防止するために様々なアプローチがとられている。すなわち、臨床実務では血栓の形成を防止するため、あるいはその溶解（血栓溶解）を支援するために、凝血事象に様々な仕方で介入する抗凝血物質がしばしば用いられている。血小板機能（凝集、付着および活性化および活性化生成物の合成および分泌）を低下させたり防止したりすることのほかに、参画凝血プロテアーゼの、特にトロンボプラスチン／ファクターVIIａ複合体の、ファクターＸａの、そして特にトロンビン（ファクターIIａ）の阻害剤が研究されそして適用されている。
【０００４】
ヒルジンはもともと水蛭（Hirudo medicinalis）の唾液腺から単離されたが、これはトロンビンのとりわけ特異的かつ強力な阻害剤である。この間に、ヒルジンのバラエティーに富む様々な変種、類縁物質、断片および変異物質が知られるようになり、またそれらの適切さについて研究されている。ヒルジンは天然型では硫酸化されているが、非硫酸化型でも有益な生物学的活性が保持されていることがわかっている。その結果、ヒルジンまたはその誘導体は都合よくも遺伝子操作により調製することができる。
【０００５】
抗凝血物質はまた、ヘパリン、およびその断片および変種のほかトロンビンおよび他の凝血プロテアーゼ、例えばファクターＸａ、の触媒活性を阻害する合成阻害剤を包含する。これらの成分はまた、血栓症性または前血栓症性合併症の予防および／または治療に用いることもできる。ヘパリンまたはビタミンＫアンタゴニストなどの臨床的に確立された物質は効果が不十分であったり、あるいは望ましくないまた症例によっては深刻な副作用を示すという不十分な状況を反映して、一段と特異的かつ強力な抗凝血物質および抗血栓剤が探究されている。現在、ヒルジンは凝血カスケードの他の酵素には干渉しない最も強力な既知のトロンビン阻害剤である。今日までヒルジンについては、脈拍、呼吸、血圧、血小板数またはフィブリノーゲンまたはヘモグロビン含量に対する認め得べき副作用が全く観察されていない。このため、ヒルジンは好ましい抗凝血物質である。
【０００６】
抗凝血物質または抗血栓剤の患者への使用は出血傾向を高めるというリスクを伴うが、これは極端な状況にあっては、例えば使用または用量が不適正であったりした場合に、コントロールされない出血につながり得る。このような場合の望ましくない傾向に対抗し得るために、患者の血漿から、透析によって、その構成（分子量および構造）がそれを可能とする一部の物質を迅速に除去することができる。しかしながら適切な装置が無かったりあるいは他の理由でこれを為し得ない場合には解毒剤が利用可能とならなければならない。
【０００７】
一部の物質または調製物は既に解毒剤として提案されている。すなわち、トロンビン類およびそれらのブロックされた変種は一定のヒルジン−中和効果を示す。しかしながら、一方において、抗凝血物質で治療されている患者への活性トロンビンの使用は一般に禁忌であり、また他方において、共有結合を結ぶ低分子量阻害剤を用いて不活性トロンビンを調製することはこれらの物質の毒性故に問題がある。加えて、これらの複合体がひょっとして抗原作用を有するかどうかについて経験を欠いている。これらの複合体は、それらの性質故に、低分子量(合成)抗トロンビン物質または抗血栓剤の中和に適していない。プロトロンビンが活性化されてトロンビンを形成する際に短時間生成する中間体であるメイゾトロンビンは一定のアンタゴニスト能を有しているが、それは速やかに生体内でトロンビンに変化することができ、そのままでは一般に禁忌である。
【０００８】
適切なモデルを用いたヒルジン解毒剤としてのファクターVIIの研究は満足のいく結果を与えなかった。欧州特許出願ＥＰＡ ８９.８１０７３３.９はファクターVIIIまたはファクターVIIIの断片の、抗凝血物質に対する解毒剤としての使用を記載している。血中ファクターVIII濃度を高める物質、例えばデスモプレッシン（Mannucci, P.M., Progress in Haemostasis and Thrombosis, 8 (1986), pp. 19-45）を使用できることも知られている。
しかしながら、これらの解毒剤はすべての適用分野に十分というわけではないことから、より効果的であってしかも副作用の少ない、抗凝血物質、抗血栓剤および血小板アンタゴニストに対する解毒剤を利用可能にする必要が依然として存在している。
【０００９】
本出願の範囲内において、抗凝血または抗血栓物質とは、グリコサミノグリカンおよび硫酸化ポリサッカライド、例えばヘパリン類、特に未分画の低分子量（ＬＭＷ）ペントサンポリサルフェート、ヘパランサルフェート、デルマタンサルフェートまたはコンドロイチンサルフェート、そして更にはヒルジン類およびそれらの断片、例えばヒルゲン（J. Biol. Chem. 265 (1990), 13484-13487; EP-A-0 333 356）、類縁物質（アナローグ）または変異物質（ミュータント）、例えばHirulogR (WO 92/13952）、結合（coupled）ヒルジン類、例えばＰＥＧ−ヒルジンまたはヒルトニン類、トロンボプラスチン／ファクターVIIａ複合体の、ファクターＸａのまたはトロンビンの天然または合成阻害剤、プロティンＣ系の成分、すなわち活性化プロティンＣ、ファクターＳおよびトロンボモジュリン、フィブリン凝集または架橋の阻害剤、ビタミンＫアンタゴニスト群からの物質、血小板活性化および／または血小板凝集または血小板付着に対し作用する物質、例えば特にフィブリノーゲン受容体アンタゴニスト、または線維素溶解の内生能力を高めることができる物質、例えば特にＰＡＩ−１阻害剤、またはプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の合成および分泌の刺激剤を意味し、従って間接的な抗血栓作用を有する。
前記の結合ヒルジン類、例えば、ＰＥＧ−ヒルジン、に対する適切な解毒剤を提供することが極めて重要である。何故ならばこれらの結合ヒルジンは生物体からの除去に困難を伴うからである。
【００１０】
従って、本発明は、抗凝血物質に対する解毒剤として用いられる組成物であって、これら抗凝血物質はグリコサミノグリカンおよび硫酸化ポリサッカライド、ヒルジン類、およびそれらの断片、類縁物質または変異物質、トロンボプラスチン／ファクターVIIａ複合体の、ファクターＸａのまたはトロンビンの天然または合成阻害剤、プロティンＣ系の成分、すなわち活性化プロティンＣ、プロティンＳおよびトロンボモジュリン、フィブリン凝集または架橋の阻害剤、ビタミンＫアンタゴニスト群からの物質、血小板活性化および／または血小板凝集または血小板付着に対し作用する物質、例えば特にフィブリノーゲン受容体アンタゴニスト、または線維素溶解の内生能力を高めることができる物質、例えば特にＰＡＩ−１阻害剤、またはプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の合成および分泌の刺激剤より成る群より選択することができ、そしてプロトロンビン複合体濃縮物および少なくとも一つの凝血促進成分を含む組成物に関する。
【００１１】
本発明により用いられるプロトロンビン複合体濃縮物は、相当の血液調製物から濃縮により単離される。プロトロンビン複合体濃縮物は特にファクターII、 VII、 IXおよびＸを含む。プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＰＳＢ）は非活性化型または活性化型のいずれでも存在でき、そして活性化は、通常プロトロンビン複合体濃縮物を例えばトロンビンまたは接触アクタベーターと反応させることによって行われる。従って、活性化プロトロンビン複合体濃縮物は相当に速く反応し、また相対応してコントロールが一段と難しくなる。しかしながら、非活性化プロトロンビン複合体濃縮物が本発明の範囲内において好ましい。
【００１２】
好ましい一態様において、凝血を促進する付加的成分はファクターVIIIであるが、凝血を促進する付加的成分は特に好ましくはファクターVIIIとvon Willebrandファクター（ｖＷＦ）との組み合わせである。
他の、同じく好ましい、態様においては、凝血を促進する付加的成分はファクターＶ、ファクターＶａ、von Willebrandファクター、ファクターXI、 ファクターXIIまたはファクターXIII、特にファクターＶおよびVIIIである。適切な場合には、これらの成分の混合物を用いることもできる。
これらの成分はまた、特に遺伝子操作により調製することができる活性断片または変種の形で存在することもできる。本発明のもう一つの好ましい態様においては、凝血を促進する付加的成分は少なくとも一つの脂質または脂質の混合物であり、負に荷電した脂質または脂質混合物が好ましい。
【００１３】
本発明のもう一つの好ましい態様においては、凝血を促進する付加的成分は少なくとも一つの利尿剤である。
プロトロンビン複合体濃縮物と、凝血を促進する少なくとも二つの（前述のとおりの）付加的成分を含んで成る組成物が特に好ましい。
本発明による組成物においては、プロトロンビン複合体濃縮物は、治療対象患者体重１kgあたり１〜２０００国際単位（IU）の濃度で用いられ、１０〜１０００IU／kg量のプロトロンビン複合体濃度が特に好ましい。
凝血を促進する付加的成分は、通常、各場合につき１〜２０００IU／kgの濃度で存在するが、この場合にも１０〜１０００IU／kg濃度が特に好ましい。
利尿剤および／または脂質または脂質混合物は、通常、患者体重１kgあたり０.０１〜１００mgの濃度で存在するが、０.１〜１０mg／kg量の利尿剤および／または脂質または脂質混合物が特に好ましい。
【００１４】
もう一つの態様において、本発明は、抗凝血物質に対する解毒剤として用いられる組成物であって、該抗凝血物質はグリコサミノグリカンおよび硫酸化ポリサッカライド、ヒルジン類、およびそれらの断片、類縁物質または変異物質、トロンボプラスチン／ファクターVIIａ複合体の、ファクターＸａのまたはトロンビンの天然または合成阻害剤、プロティンＣ系の成分、すなわち活性化プロティンＣ、プロティンＳおよびトロンボモジュリン、フィブリン凝集または架橋の阻害剤、ビタミンＫアンタゴニスト群からの物質、血小板活性化および／または血小板凝集または血小板付着に作用する物質、例えば特にフィブリノーゲン受容体アンタゴニスト、または線維素溶解の内生能力を高めることができる物質、例えば特にＰＡＩ−１阻害剤またはプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の合成および分泌の刺激剤より成る群より選択することができ、そして、一方において、脂質、脂質混合物および利尿剤より成る群より選択される少なくとも一つの成分を、そして他方においてプロトロンビン複合体濃縮物、ファクターII、 Ｖ、Ｖａ、VIII、 IX、 Ｘ、XI、XIIまたはXIIIのうちの一つ、およびvon Willebrandファクターより成る群より選択された少なくとも一つの成分を単一ファクターとしてあるいはこれらのファクターの混合物として含んで成る組成物に関する。
【００１５】
もう一つの態様において、本発明は、抗凝血物質に対する解毒剤として用いられる組成物であって、該抗凝血物質はグリコサミノグリカンおよび硫酸化ポリサッカライド、ヒルジン類、およびそれらの断片、類縁物質または変異物質、トロンボプラスチン／ファクターVIIａ複合体の、ファクターＸａのまたはトロンビンの天然および合成阻害剤、プロティンＣ系の成分、すなわち活性化プロティンＣ、プロティンＳおよびトロンボモジュリン、フィブリン凝集または架橋の阻害剤、ビタミンＫアンタゴニスト群からの物質、血小板活性化および／または血小板凝集または血小板付着に対し作用する物質、例えば特にフィブリノーゲン受容体アンタゴニスト、またはＰＡＩ−１阻害剤またはプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の合成および分泌の刺激剤より成る群より選択することができ、そして、各組成物はＡおよびＢの二群の一方から選択される少なくとも一つの成分を含んで成り、Ａ群はファクターII、 Ｖ、Ｖａ、VIIIおよびIXより成りまたＢ群はファクターII、 Ｖ、Ｖａ、VII、 VIIａおよびVIII、von Willebrandファクター、およびファクターIX、Ｘ、XI、XIIおよびXIIIより成るが、ただしＡ群からの成分はＢ群からの成分と一致しない、前記組成物に関する。本発明はまた、前記組成物の抗凝血物質に対する解毒剤としての使用にも関する。
本発明を次の実施例により更に説明する。
【００１６】
実施例１
この試験管内実験では、Ｆ VIII（BeriateR）、非活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＰＳＢ／ヘパリン不含BeriplexR）およびそれら二者の組み合わせの、ヒルジンの凝血阻害作用に拮抗する能力を標準人血漿(ＳＨＰ)で試験した。
このために、１００μｌずつのクエン酸塩−ＳＨＰを、各々に２μｌの適切に濃縮された原液を添加した後、それぞれ３および２０μｇ／mlヒルジンの最終濃度となるようにした。５０μｌのＦ VIIIおよび／またはＰＰＳＢ含有濃縮溶液と混合し、そして１００μｌのPathromtinR／カオリン懸濁液を添加後、全体を３７℃で２分間インキュベートした。反応は５０μｌの５０mM ＣａＣｌ2溶液を混合することにより開始させた。（修飾された）活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）はSchnitgerおよびGrossに従って測定した。
【００１７】
表１に記載の凝血時間から、３μｇ／mlのヒルジンによって生じた（コントロールと対比された）ａＰＴＴの延長が２IUのＦ VIIIにより短縮されたことが明らかである。ＰＰＳＢそれ自体により生じる延長は、おそらく、これまでに完全には解明されていない試験管内効果によるものである可能性がある。それら２化合物の組み合わせは特に有効であることがわかった。この効果はアンタゴニスト投与されていない血漿を２０００秒後でさえも血餅形成しないようにする極めて高いヒルジン濃度（２０μｇ／ml）を用いた場合に一段と明らかとなった。ここで、１IUのＰＰＳＢ自体で一定の短縮効果が示されたのに対し、２IUのＦ VIII自体では何らの血餅形成も誘導されなかった。これに対し、Ｆ VIII／ＰＰＳＢの組み合わせは、再び、個々の成分よりも著しく良い効果を有していることが認められた。
【表１】
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【００１８】
表２は、前述の実験系列を補いかつその結果を確認するＦ VIII／ＰＰＳＢ濃度の様々な組み合わせを示す（１０μｇ／mlのヒルジンを使用し、またコントロールと対比）。
【表２】
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【００１９】
実施例２
ａ）  実施例１に用いたものに対応する方法により、１０μｇ／mlのヒルジンを添加したラットクエン酸加血漿をａＰＴＴ試験に用いてＦ VIII、ＰＰＳＢおよびそれら二者の組み合わせの拮抗作用を調べた。表３に示された凝血時間は、再び、その組み合わせにより個々の成分よりも効果的な正常化が生じることを実証している。
【表３】
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【００２０】
ｂ）  生体内状態により近づけるべくトロンボエラストグラフ（ＴＥＧ）で検討されたラット全血を用いた実験は、ａＰＴＴ試験で得られた結果を確認している（表４）。ｒ値（反応時間）は、血餅形成が始まるまでの時間、すなわち、反応開始（採血またはリカルシフィケーション（recalcification)）からＴＥＧ曲線の１mm拡幅までの時間、を本質的に示す。ｋ値（血餅形成時間）は、ｒ値の終点から前記曲線が２０mmに拡幅するまでの経過時間に相当する。
このために、２００μｌのラットクエン酸加全血を５０μｌの（ジエチルバルビツレート緩衝液、pH７.６；１％ヒト血清アルブミン中の）ヒルジンの適切に濃縮された原液と、そして５０μｌの解毒剤（Ｆ VIII, ＰＰＳＢまたはＦ VIII＋ＰＰＳＢ）と混合し、そして３７℃で３分間プレインキュベーションに付した。反応は５０μｌの１００mM ＣａＣｌ2溶液を添加することにより開始した。
【表４】
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【００２１】
実施例３
ファクターＶとＰＰＳＢの組み合わせの拮抗作用を実施例１で用いたものに対応する方法により試験した。この場合にも、その組み合わせの使用の方が個々の成分の使用よりも優れていることが認められた。結果を表５に示す。
【表５】
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【００２２】
実施例４
原則として、低分子量トロンビン阻害剤、例えばアルガトロバン（ＭＤ８０５、(２Ｒ,４Ｒ)−４−メチル−１−｛Ｎ−｛３−メチル−１,２,３,４−テトラヒドロ−８−キノリニル）スルホニル｝−Ｌ−アルギニニル｝−２−ピペリジンカルボン酸）、を用いて得られる望ましくない過剰の抗凝血反応にも前述の成分を用いて対抗できるが、それら二者の組み合わせが極めて効果的である。ＳＨＰのａＰＴＴに対する典型的な効果（実施例１の記載と同様に実施）を表６に示す。
【表６】
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【００２３】
表７に例示されるように、HirulogeR 型の二価トロンビン阻害剤、例えばD-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu（類縁物質）、を用いても同様な効果を得ることができる。
【表７】
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【００２４】
実施例５
実施例１で用いたものに対応する方法により、１０μｇ／mlのヒルジンを添加したＳＨＰを、Ｆ VIII、 Ｆ IXおよびそれら二者の組み合わせの拮抗作用についてａＰＴＴ試験で調べた。この場合にも表８に示された凝血時間は、Ｆ IXもある程度の拮抗作用を有しているが、個々の成分の組み合わせの方が優れていることを実証している。
【表８】
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【００２５】
実施例６
実施例１で用いたものと対応する方法により、２０μｇ／mlのヒルジンを添加したＳＨＰを、Ｆ II、 Ｆ Ｖ、Ｆ VII、 Ｆ VIII、 Ｆ IXおよびＦ Ｘおよびこれらの成分の組み合わせの拮抗作用についてａＰＴＴ試験で調べた。この場合にも、表９に示された凝血時間は、それら化合物の組み合わせの方が個々の成分より優れていることを実証している。すべての６成分の組み合わせが最も効果的であった。
【００２６】
【表９】
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【００２７】
【表１０】
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【００２８】
【表１１】
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