(57)【要約】本発明は、ＴＲ４３０タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）またはその類似体に対して特異的に結合する抗体を提供する。本発明はさらに、ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞内部でのＮＦ−κＢ転写活性を調節する被検化合物のスクリーニング方法、もしくはこの方法により得られた化合物を提供する。本発明はまた、前記抗体または前記スクリーニング方法により得られた化合物を含む、細胞内部でのＮＦ−κＢ活性の増大または低下と関連する疾患を治療するための医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のタンパク質またはその類似体に対して特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ウサギ抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
Ｂ細胞もしくは腫瘍化した細胞表面上のＴＲ４３０タンパク質に結合して、前記Ｂ細胞もしくは前記腫瘍化した細胞の機能を調節することができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
細胞内部のＮＦ−κＢ活性を増大することにより前記Ｂ細胞もしくは前記腫瘍化した細胞の機能を調節する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
細胞内部のＮＦ−κＢ活性を低下することにより前記Ｂ細胞もしくは前記腫瘍化した細胞の機能を調節する、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
（ｉ）被検体から採取した被検細胞に対してＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を適用すること；および；
（ｉｉ）Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体に対しては陰性であるが、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗原に対しては陽性である細胞を検出すること；
により、被検細胞中に腫瘍化した細胞が存在することを検出する方法。
【請求項８】
（ｉ）ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞に候補化合物を接触させ；
（ｉｉ）候補化合物を接触させたＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞、および候補化合物を接触させていないＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞との間で、両細胞内部でのＮＦ−κＢ転写活性を比較し；
（ｉｉｉ）候補化合物の接触によりＮＦ−κＢ転写活性化を調節する程度を検出し；そして
（ｉｖ）ＮＦ−κＢ転写活性化を調節する化合物を選択する；
ことを含む、ＴＲ４３０タンパク質の機能を調節する被検化合物のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞が、Ｂ細胞、腫瘍化した細胞もしくはＴＲ４３０遺伝子を導入した形質転換細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞が請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体と接触させた細胞であることを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＦ−κＢ転写活性化を、Ｉ−κＢのリン酸化もしくは分解を検出することにより検出する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＦ−κＢ転写活性化を、ＮＦ−κＢ結合部位を有するＤＮＡに結合する核タンパク質量を検出することにより検出する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法により得られた、ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞内部でのＮＦ−κＢ転写活性化を調節することができる化合物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または請求項１３の化合物、および医薬的に許容可能な担体とを含む、細胞内部でのＮＦ−κＢ活性の増大と関連する疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または請求項１３の化合物、および医薬的に許容可能な担体とを含む、細胞内部でのＮＦ−κＢ活性の低下と関連する疾患を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のタンパク質（本明細書の以下において、ＴＲ４３０タンパク質と総称する）に特異的に結合することができる抗体に関する。本発明はさらに、当該タンパク質に結合し、かつ当該タンパク質の機能を調節することができる抗体に関する。本発明はまた、このようにして得られた抗体を使用する腫瘍化した細胞の検出方法にも関する。本発明はまた、当該タンパク質の機能を調節することができる化合物のスクリーニング方法、およびそのスクリーニング方法により選択された当該タンパク質の機能を調節することができる化合物に関する。本発明はさらに、当該タンパク質を介する細胞シグナルを調節することにより細胞機能を調節することを目的とする、当該タンパク質の機能を調節することができる抗体または化合物を含む組成物に関する。
背景技術
本発明者らは以前に、ヒトレチノブラストーマ細胞（理研細胞銀行より入手）由来のｃＤＮＡライブラリから、ＴＲ４３０ａ遺伝子およびＴＲ４３０ｇ遺伝子と命名した２種類の遺伝子を採取した。この遺伝子のヌクレオチド配列を詳細に解析した結果、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属するサイトカイン受容体分子をコードする遺伝子の一種であることがわかり、また２種類のヌクレオチド配列はアリルの違いに由来すると考えられることがわかった。これら２種類の遺伝子、ＴＲ４３０ａ遺伝子およびＴＲ４３０ｇ遺伝子のヌクレオチド配列を、本発明においてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として記載する。
これら２種類のヌクレオチド配列、ＴＲ４３０ａ遺伝子およびＴＲ４３０ｇ遺伝子（すなわちＴＲ４３０遺伝子）を特許遺伝子データベース、ＧＥＮＥＳＥＱを使用して検索したところ、ＴＲ４３０ａ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のヌクレオチド配列は、国際特許出願ＷＯ９９／５２９２４においてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１としてすでに記載される分子と同一であることがわかった。国際特許出願ＷＯ９９／５２９２４明細書には、ＴＲ４３０ａ遺伝子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列およびその発現分布が開示されている。この分子は、１２９０ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有し、それにより４３０アミノ酸残基のタンパク質をコードすることが推測されている。このヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列については、前記国際特許出願ＷＯ９９／５２９２４明細書中でも示されているが、本願明細書中においてもＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載する。
国際特許出願ＷＯ９９／５２９２４明細書によれば、この推定タンパク質のＮ−末端には、２２アミノ酸残基からなる推定シグナル配列が含まれており、したがってこのタンパク質は４０８アミノ酸残基からなる推定成熟タンパク質からなることが推定される。この推定成熟タンパク質は、１回膜貫通ドメイン、そして腫瘍壊死因子／神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）（ＴＮＦＲ／ＮＧＦＲ）システインリッチ領域ドメインを有していると考えられている。
しかしながら、国際特許出願ＷＯ９９／５２９２４明細書においては、当該ヌクレオチド配列をクローニングし、配列決定したことまでしか記載されていない。したがって、具体的にそのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質がどのような機能を有するかについては、全くわかっていなかった。また、その他のグループからも、ＴＲ４３０遺伝子に関しては、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列以外の研究成果については何ら報告されていない。
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を有するＴＲ４３０タンパク質の具体的な機能を解析することを課題とする。本発明は、当該課題を解決するために、まず、ＴＲ４３０タンパク質に特異的に結合することができる抗体を産生することを課題とする。本発明はまた、上記のように作製した抗体を使用して、ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞を同定し、その細胞における機能を解析することを課題とする。さらに、そのような抗体を使用することにより、細胞活性を調節することも本発明の課題である。
本発明はまた、ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞におけるＴＲ４３０タンパク質を介する細胞シグナル伝達を調節することができる化合物を選択することを課題とする。さらに、そのような化合物を使用することにより、細胞活性を調節することも本発明の課題である。
本発明はさらに、ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞活性を調節することにより、ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞の異常な機能に関連する疾患を治療することを課題とする。本発明はまた、そのような疾患を治療するための医薬組成物を提供することも課題とする。
発明の開示
本発明は、ＴＲ４３０タンパク質またはその類似体に対して特異的に結合する抗体を提供する。
本発明はさらに、被検化合物を接触させたＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞、および被検化合物を接触させていないＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞との間で、両細胞内部でのＮＦ−κＢ転写活性を比較して、被検化合物の接触によりＮＦ−κＢ転写活性化を調節する程度を検出することを含む、ＴＲ４３０タンパク質の機能を調節する被検化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明は、さらにＴＲ４３０タンパク質の刺激から生じる細胞内シグナル伝達を媒介するシグナル伝達分子の機能を調節する被検化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明はさらに、ＴＲ４３０タンパク質の機能を調節する被検化合物の前記スクリーニング方法により得られた、ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞内部でのＮＦ−κＢ転写活性化を調節することができる化合物を提供する。
本発明はまた、ＴＲ４３０タンパク質またはその類似体に対して特異的に結合する抗体または前記スクリーニング方法により得られた化合物、および医薬的に許容可能な担体とを含む、細胞内部でのＮＦ−κＢ活性の増大または低下と関連する疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の実施にあたっては、明細書中に特に示されない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡに関する従来から存在する技術を使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８９）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））参照）。
１．ヌクレオチド配列のクローニングと解析
本発明者らは、ヒトレチノブラストーマ細胞から、ＴＲ４３０ａ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＴＲ４３０ｇ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）という２種類のヌクレオチド配列をクローニングした。これら２種類の遺伝子は、アリルに由来すると見られる多型を有しており、推定ＴＲ４３０ｇタンパク質は推定ＴＲ４３０ａタンパク質と比較して、１８７番アミノ酸残基がＬｙｓ（ＴＲ４３０ａ）からＧｌｕ（ＴＲ４３０ｇ）へ、そして２７３番アミノ酸残基がＨｉｓ（ＴＲ４３０ａ）からＡｒｇ（ＴＲ４３０ｇ）へとそれぞれ置換したものであった。本明細書においては特に言及しない限り、ＴＲ４３０ａ遺伝子およびＴＲ４３０ｇ遺伝子をあわせてＴＲ４３０遺伝子と、ＴＲ４３０ａタンパク質およびＴＲ４３０ｇタンパク質をあわせてＴＲ４３０タンパク質という。
これらの配列を特許遺伝子データベース、ＧＥＮＥＳＥＱを用いて相同性検索したところ、ＴＲ４３０ａ遺伝子のヌクレオチド配列は、すでにＷＯ９９／５２９２４中に開示されているヌクレオチド配列と同一であった。ＴＲ４３０ａ遺伝子のヌクレオチド配列から推定されたＴＲ４３０ａタンパク質のアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示した。
一方、ＴＲ４３０ｇ遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびＴＲ４３０ｇタンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は、ともにこれまでに報告されたことがない新規な配列であった。
ＴＲ４３０ａタンパク質は、第１〜２２番アミノ酸からなるシグナルペプチド配列、およびその後に続く４０８アミノ酸からなる成熟タンパク質部分を有することを特徴とする（例えば、ＷＯ９９／５２９２４を参照）。このタンパク質はさらに、第５１〜９０番アミノ酸からなる腫瘍壊死因子受容体／神経成長因子受容体（ＴＮＦＲ／ＮＧＦＲ）のシステインリッチドメイン、第１６３（細胞外末端）〜１８６（細胞質末端）番アミノ酸からなる膜貫通ドメイン（ＴＭドメイン）を有していることが知られている。このことから、本発明のＴＲ４３０タンパク質は、細胞膜を貫通し、細胞外からの刺激を受容する細胞外ドメインとその刺激を細胞内部のシグナル伝達系に伝達する細胞内ドメインとを有する、ＴＮＦＲ／ＮＧＦＲ様のタンパク質であることがわかった。
２．ＴＲ４３０  ｍＲＮＡの発現解析
ＴＲ４３０遺伝子発現の組織分布については、ｍＲＮＡを定量することができる当該技術分野において既知の方法で調べることができる。ＴＲ４３０  ｍＲＮＡの組織分布を調べるには、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザンハイブリダイゼーション法などの方法を使用することができる。このような方法でＴＲ４３０遺伝子の発現分布を調べた結果、本発明のＴＲ４３０遺伝子の発現は末梢血白血球、脾臓に限局していることがわかった。この結果は、末梢リンパ球、脾臓および骨格筋で発現されており、心臓、脳および胎盤で弱く発現していると報告している以前の知見（ＷＯ９９／５２９２４）と一致している。
本発明で使用することができるＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ、すなわち逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いて、ｍＲＮＡを鋳型としたＤＮＡの合成反応をあらかじめ行い、次いでそのＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲを行う方法である。ＲＴ−ＰＣＲ法は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）中に記載される手順に従って、行うことができる。本発明のＲＴ−ＰＣＲ法においてファーストストランドｃＤＮＡを作成するために使用することができる逆転写反応のためのプライマーは、オリゴｄＴプライマーまたはランダムヘキサマープライマーである。
上述の逆転写反応により作成されたファーストストランドｃＤＮＡを用いたＰＣＲ反応において使用するプライマーは、ＴＲ４３０遺伝子ｃＤＮＡの配列にアニールすることができる、１５〜１００塩基対の長さ、好ましくは１５〜３５塩基対の長さの配列からなる１組のプライマー対である。本発明においては、例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ：
2002062852.tif 000002
を好ましいＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして使用することができ、これによりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の６２０番〜１２５５番ヌクレオチド部分を増幅することができる。
本発明で使用することができるノザンハイブリダイゼーション法は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）中に記載される手順に従って行うことができる。概略すると、細胞から抽出したＴＲ４３０ｍＲＮＡを変性ゲル上で電気泳動した後、その核酸をニトロセルロース膜などに転写して、その膜上の標的配列を、当該配列にハイブリダイズできるプローブを使用して検出する。ノザンハイブリダイゼーション法において使用することができるプローブは、ＴＲ４３０ｍＲＮＡの配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列を有するものである。
本発明において使用するプローブは、少なくとも２２塩基対、好ましくは２００〜１０００塩基対、最も好ましくは２００〜６００塩基対の配列からなるプローブである。本発明において使用するプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１５０〜３５０番ヌクレオチド、４００〜７００番ヌクレオチド、等にハイブリダイズできるようなプローブであることが望ましい。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、例えば、約２５℃から約３７℃のインキュベーション温度、約６×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸塩バッファー）から約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度、約０％から２５％のホルムアミド濃度、および約６×ＳＳＣの洗浄溶液、のような場合があるが、これには限定されない。高度にストリンジェントな条件の例としては、例えば、約５５℃から約６８℃のインキュベーション温度、約１×ＳＳＣから約０．１×ＳＳＣのバッファー濃度、約５５％から約７５％のホルムアミド濃度、および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、もしくは脱イオン水からなる洗浄溶液、のような場合があるが、これらには限定されない。一般的に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は５分〜２４時間であり、１もしくはそれ以上の洗浄工程を含み、および洗浄インキュベーション時間は約１〜１５分である。
３．免疫原の調製
本発明においては、免疫原として、ＴＲ４３０タンパク質に対して実質的に特異的に反応する抗体を産生するための免疫原性を有するタンパク質を調製する。例えば、このような免疫原として、ＴＲ４３０ａタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）そのもの、ＴＲ４３０ｇタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）そのもの、またはそれらの類似体を使用することができる。
ここで、ＴＲ４３０ａタンパク質もしくはＴＲ４３０ｇタンパク質の類似体とは、欠失、置換、付加により、これらのタンパク質のアミノ酸配列とは少なくとも１つのアミノ酸が異なっているタンパク質であって、同様の免疫原性を有しているものをいう。当該類似体は、同様の活性もしくは同様の免疫原性を有しているものであればその配列同一性（例えばアミノ酸配列にして６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性など）は問題とされない。さらに、この類似体は、アミノ酸残基数を特に限定するものではなく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のタンパク質（４３０アミノ酸残基）と同じ程度の長さを有するタンパク質、ＧＳＴなどの他のタンパク質と融合されてアミノ酸残基数が増加したキメラタンパク質、あるいはアミノ酸残基数が少なくとも４残基、好ましくは少なくとも８残基、より好ましくは少なくとも１０残基程度の短いものであってもよい。したがって、本発明の類似体には、例えばＴＲ４３０タンパク質のフラグメント、ＴＲ４３０の細胞外ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２６〜１６２番）のようなものが含まれるが、これには限定されるものではない。
本発明で使用することができるＴＲ４３０タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は、ＴＲ４３０遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を遺伝子工学的に発現して得たものであっても、またはヒト組織サンプル、例えば末梢血リンパ球から単離・精製したものであってもよい。さらに本発明で使用することができるＴＲ４３０タンパク質の類似体は、上述したように遺伝子工学的に発現させたＴＲ４３０タンパク質もしくは組織サンプルから単離・精製したものを、好ましいタンパク質分解酵素で分断することにより生じたフラグメントであっても、あるいは目的の配列を有するポリペプチドを人工的に合成すること、例えば目的の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させること、もしくは固相ペプチド合成法などの化学的合成により調製してもよいが、これらには限定されない。
ＴＲ４３０タンパク質をＴＲ４３０遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）に基づいて調製する場合、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）などに記載されているような、当該技術分野において周知の遺伝子工学的方法を使用することができる。具体的には、本発明においては、ＴＲ４３０タンパク質を、大腸菌発現系、昆虫細胞発現系、もしくは哺乳動物細胞発現系などを使用して発現させることができる。
例えば以下に記載する方法により、ＴＲ４３０タンパク質の細胞外ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸２６〜１６２番）を大腸菌発現系を用いて発現させることができる。ＴＲ４３０タンパク質の細胞外ドメイン（アミノ酸番号２６〜１６２）をコードする塩基配列を、プライマー：
2002062852.tif 000003
を用いたＰＣＲにより増幅し、増幅されたＰＣＲ産物をいったんｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ社）にクローニングした。挿入された配列の確認後、このベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断し、得られた制限酵素断片を、同様に制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断したｐＥＴ−３２ａ（ノバジェン社）中にサブクローニングし、大腸菌チオレドキシン融合発現ベクターｐＥＴ３２ａ／ＴＲｅｘを構築した。
発現ベクターｐＥＴ３２ａ／ＴＲｅｘを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換し、終濃度１ｍＭ  ＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導し、当該大腸菌を３７℃で培養することにより、目的とするチオレドキシン−ＴＲ４３０細胞外ドメイン融合タンパク質を発現させる。この発現タンパク質は不溶性であるため、発現誘導後の菌体からタンパク質を抽出した後、６Ｍ尿素溶液で溶解した。溶解液中の目的とする発現タンパク質をＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて製造者の指示に従い、吸着・溶出し、当該タンパク質の精製を行った。さらに溶出画分を１００倍強の体積の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールに対して室温にて終夜透析し、続いて１００倍強の体積の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１Ｍ  ＮａＣｌに対して室温にて終夜透析した。透析画分を遠心分離して、目的とする発現タンパク質がほぼ単一バンドとして検出されるにまで精製された。
４．抗体の産生
本発明においては、上述したように調製した免疫原を使用して、ＴＲ４３０タンパク質またはその類似体に対して特異的に結合する抗体を産生することができる。本発明において、抗体という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれをも含む。このような抗体は、当該技術分野において周知の方法に従って調製することができる。
ここで、ＴＲ４３０タンパク質またはその類似体に特異的に結合する抗体とは、前記タンパク質またはその類似体上に存在するいずれかのペプチド部分に対しては結合するが、それ以外の配列を有するペプチド部分に対しては実質的に結合することができない抗体のことをいう。このような特徴を有する抗体は、例えば細胞膜表面のＴＲ４３０タンパク質またはその類似体を特異的に検出するため、もしくは当該タンパク質またはその類似体に結合してその機能を調節するため、に使用することができる。ここで当該タンパク質またはその類似体の機能の調節とは、当該タンパク質またはその類似体自体を活性化または不活性化することのみならず、当該タンパク質またはその類似体自体の活性化または非活性化した結果として細胞内部で生じるシグナル伝達物質を活性化または非活性化することをも含む概念をいう。
この抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の動物を、上述したように調製した免疫原を用いて免疫化することにより作成する。免疫化する際には、抗体を産生させる動物の免疫活性を増強するために、アジュバントとともに投与することができる。アジュバントの例としては、Ｍａｒｔｉｎ，ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照することができる。アジュバントとして、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、もしくはアルミニウムアジュバントなどのいずれをも使用することができる。油中水型エマルジョンの例としては、フロイント（Ｆｌｅｕｎｄ）の完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバントなど、水中油型エマルジョンの例としてはＲＩＢＩアジュバントシステム（ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．）など、そしてアルミニウムアジュバントの例としては硫酸アルミニウムカリウム、などを使用することができるが、これらのものに限定されるものではない。
ポリクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法により作製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲））。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の動物を、上述したように調製した免疫源と上述したアジュバントとを混合して投与、免疫化することにより、ポリクローナル抗体を作成する。前記動物を数回にわたり免疫化した後、動物の血液を微量採取し、ＴＲ４３０タンパク質と実質的に特異的に結合するという特徴を有する抗体が実際に産生されていることを確認する。動物血液中に目的とする抗体が産生されている場合には、その動物から得た血清を、プロテインＡカラム、抗原吸着カラム、ゲル濾過カラム、イオン交換カラム、逆相カラムなどを用いて精製することにより、目的とするポリクローナル抗体を得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）などの酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ウェスタンブロット法、およびフローサイトメトリーに使用することができ、あるいは細胞培養上清中に添加して培養細胞の活性を調節すること、そして生体内に投与して標的となる細胞の活性を調節すること、当該技術分野で周知の方法に従った免疫組織化学、などにも使用することができるが、これら以外の用途に使用することもできる。
モノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法により作製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲））。免疫化した動物がマウスの場合、まず、上述したように調製した免疫原をアジュバントとともにマウスに数回にわたり投与し、免疫化を行う。数回の免疫化の後、前記マウスの血液を微量採取し、ＴＲ４３０タンパク質と実質的に特異的に結合するという特徴を有する抗体が実際に産生されていることを確認する。マウス血液中に目的とする抗体が産生されている場合には、マウスを犠死させて脾細胞を単離し、マウス由来のミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を得る。このようにして得られたハイブリドーマ細胞のうち、標的タンパク質であるＴＲ４３０タンパク質もしくはその類似体に特異的に結合する抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞をクローン化する。
次いで、このようにして得られたハイブリドーマ細胞を培養条件下で培養してその培養上清を採取するか、もしくはハイブリドーマ細胞をマウス腹腔に投与して当該マウス腹腔内に貯留する腹水を採取する。得られた培養上清もしくはマウス腹水を、プロテインＡカラム、抗原吸着カラム、ゲル濾過カラム、イオン交換カラム、逆相カラムなどを使用して精製することにより、マウスモノクローナル抗体を得ることができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡなどのＥＩＡ、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、およびフローサイトメトリーに使用することができ、あるいは細胞培養上清中に添加して培養細胞の活性を調節すること、そして生体内に投与して標的となる細胞の活性を調節すること、当該技術分野で周知の方法に従った免疫組織化学、などにも使用することができるが、これら以外の用途に使用することもできる。
５．抗体を用いたＴＲ４３０ａの発現解析
本発明者は、上述した方法により調製した抗体を用いて、ＴＲ４３０タンパク質の発現解析を試みた。目的の抗体を使用してＴＲ４３０タンパク質の発現解析を行うためには、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法などの方法を使用することができる。
固型組織におけるＴＲ４３０タンパク質の発現解析を行う場合、この抗体を用いて免疫組織化学を行うことが好ましい。免疫組織化学の手法は、当該技術分野において周知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲）などに記載される方法に従って、例えば、パラフィン固定組織切片、細胞塗沫もしくは凍結組織切片を使用して行うことができる。パラフィン固定切片を使用する場合には脱パラフィンした後、細胞塗沫は細胞をメタノール、パラホルムアルデヒドなどで固定化した後、凍結組織切片を使用する場合にはコンパウンドを除去した後、ＴＲ４３０タンパク質またはその類似体に特異的に結合する抗体を組織切片に接触させて、続いてこの抗体を二次抗体もしくはアビジン−ビオチンシステムなどを使用して検出することにより、ＴＲ４３０タンパク質が当該組織で発現しているかどうかを確認することができる。
血球系細胞や培養細胞などの浮遊系細胞におけるＴＲ４３０タンパク質の発現解析を行う場合、例えば、この抗体を用いてフローサイトメトリー、免疫沈降法などを行うことが好ましい。例えばフローサイトメトリーを行う場合、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）／２％牛胎児血清（ＦＢＳ）中に懸濁した細胞（例えば、１０６／１００μＬ）に対して目的とする抗体を添加し、細胞に抗体を結合させる。遠心分離後、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで再懸濁した後、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ３、ＦＩＴＣなどの蛍光色素でラベルされた適量の二次抗体を添加して、細胞に結合した目的の抗体と結合させる。このように処理した細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディキンソン社）を用いて解析することにより、細胞表面にＴＲ４３０タンパク質が発現しているかどうかについてを解析した。
本発明のＴＲ４３０遺伝子は、多種類のヒト組織の中でも、主として末梢血リンパ球で発現されていることが確認された（図１）。この結果は、以前にＷＯ９９／５２９２４においても明らかにされている知見と一致する。
本発明においてはさらに末梢血リンパ球に含まれる多種類の細胞のうちどの細胞で発現されているかを明らかにするため、ＦＩＴＣラベルされた抗ヒトＣＤ３もしくは抗ヒトＣＤ１９抗体などの抗体も用いて、ヒト末梢血リンパ球についてのフローサイトメトリーを行った。その結果、ＴＲ４３０タンパク質は、Ｂ細胞上に発現していることが初めて明らかになった（図２）。
さらに本発明においてヒト白血病細胞株におけるＴＲ４３０タンパク質の発現を上述したフローサイトメトリーにより調べたところ、Ｂ細胞系列以外の細胞株６例中、５例においてＴＲ４３０タンパク質の発現が同定された（図３）。この知見および本願発明のＴＲ４３０遺伝子がヒトの眼由来のレチノブラストーマ細胞のｃＤＮＡから単離されたことから判断して、本発明のＴＲ４３０タンパク質は、広く腫瘍化した細胞に発現していることが示唆される。
本発明の一態様において、本発明のタンパク質の上述する性質を利用することにより、上述した方法により得られた抗体を、腫瘍化した細胞の検査、診断、抗腫瘍治療中の予後観察に利用することができる。すなわち、本発明の抗体を用いて、被検体体内における腫瘍化した細胞の存在を検出することができる。具体的には、
（ｉ）被検体から採取した被検細胞に対してＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を適用すること；および；
（ｉｉ）Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体に対しては陰性であるが、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗原に対しては陽性である細胞を検出すること；
により、被検細胞中に腫瘍化した細胞が存在することを検出することができる。
本発明の一態様において、被検細胞が浮遊細胞である血液細胞の場合、
（ｉ）被検体から採取した被検血液細胞に対して、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を使用してフローサイトメトリーを行うこと；および；
（ｉｉ）Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体に対しては陰性であるが、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗原に対しては陽性である細胞を検出すること；
により、被検血液細胞中に腫瘍化した細胞が存在することを検出することができる。
本発明の別の態様において、浮遊細胞もしくは固型組織からのバイオプシーなどを塗沫の状態で使用する場合、
（ｉ）被検体から採取した被検細胞をスライドグラス上に固定し、この被検細胞に対してＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を適用すること；および；
（ｉｉ）Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体に対しては陰性であるが、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗原に対しては陽性である細胞を検出すること；
により、被検細胞中に腫瘍化した細胞が存在することを検出することができる。
本発明のさらに別の態様において、切除されたヒト固型組織を用いる場合、
（ｉ）被検体から採取した被検組織切片に対して、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を適用すること；および；
（ｉｉ）Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体に対しては陰性であるが、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗原に対しては陽性である細胞を検出すること；
により、被検組織切片中に腫瘍化した細胞が存在することを検出することができる。
本発明において腫瘍化した細胞は特定のものには限定されず、例えば血液細胞の腫瘍化した細胞としては白血病細胞、骨髄性白血病細胞、リンパ球系系白血病細胞、などが存在し、腫瘍化した固型組織由来細胞としてはレチノブラストーマ細胞、小細胞肺癌細胞、大細胞肺癌細胞、肝癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、黒色腫細胞、大腸癌細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞、などが存在するが、これらには限定されない。Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、などが知られているが、これらには限定されない。
本発明のさらに別の態様においては、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識することができる抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を含む、腫瘍化した細胞の検出キットを提供することもできる。このキットは、フローサイトメトリー、免疫組織化学、などに使用することができる。したがって、フローサイトメトリーに使用することができるように、キットに含まれるこれらの抗体に対して蛍光色素を直接結合させてもよく、あるいはこれらの抗体を特異的に認識することができる蛍光色素結合二次抗体をキット中に含むこともできる。あるいは、免疫組織化学において使用することができるように、キットに含まれる抗体に対してホースラディッシュペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン、アルカリホスファターゼを直接結合させてもよく、あるいはホースラディッシュペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン、アルカリホスファターゼを結合させた、これらの抗体を特異的に認識することができる二次抗体をキット中に含むこともできる。
６．Ｂ細胞におけるシグナル伝達経路の解析
上述したように、ＴＲ４３０タンパク質は、末梢血Ｂ細胞およびヒト白血病細胞などの腫瘍化した血液細胞の細胞表面に発現する、１回膜貫通型のＴＮＦＲ／ＮＧＦＲファミリーに属するタンパク質であることが明らかになった。本発明では次いで、このＴＲ４３０タンパク質を、上述した方法により得られた抗体で刺激することにより、ＴＲ４３０発現細胞中においてどのような細胞内シグナル伝達反応が生じるかについて調べることができる。
Ｂ細胞は、骨髄に由来する抗体産生細胞の前駆細胞であり、細胞膜表面上に抗原特異的受容体でもある免疫グロブリン（Ｂ細胞抗原受容体、以下ＢＣＲという）を保有している。Ｂ細胞はＢＣＲに特異的なリガンドによる刺激を受けると、Ｂ細胞の膜上に発現する共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と会合または協同し、それにより初めてＢＣＲを介する外部からのシグナルを細胞内部に伝達する。このように共受容体がＢＣＲシグナルを制御することにより、Ｂ細胞は強力に反応すべき抗原に対しては強力に反応し、一方で反応すべきでない抗原に対しては反応しなくなる。
Ｂ細胞上に発現するＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する分子ＣＤ４０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡからのシグナルは、ＢＣＲからのシグナルを修飾し、Ｂ細胞の運命を決定することも知られている（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，９９５；Ｂｕｌｏｗ  ａｎｄ  Ｂｒａｍ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，１３８；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，２６０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１２９；Ｂａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，３２６１）。ＴＮＦＲからの刺激が細胞内部でどのようなシグナル伝達を経由するかについては従来報告されており、ＴＲＡＤＤおよび／またはＲＩＰを介したＴＲＡＦ２の活性化（ＴＮＦＲＩ）もしくはＴＲＡＦ２の直接的な活性化（ＴＮＦＲＩＩ）に引き続いて、ＮＩＫ、ＩκＢなどを介して、その一つの結果としてＮＦ−κＢの活性化が生じることがわかっている。
本発明において、上述した方法により産生される抗体を使用して、細胞表面に発現するＴＲ４３０タンパク質を刺激することにより、末梢血Ｂ細胞あるいは腫瘍化した細胞などにどのような刺激が伝達されるかを調べることができる。上述した従来の知見から、ＴＲ４３０タンパク質の刺激とＮＦ−κＢの活性との間に何らかの関係があると推測される。
ＴＲ４３０タンパク質とＮＦ−κＢ活性との間にどのような関係があるかを調べるため、本発明の一態様において、ＴＲ４３０遺伝子を一過性に導入し過剰発現させた細胞において、ＮＦ−κＢレポーターアッセイを行うことができる。例えば、上述した方法により産生されたポリクローナル抗体が、ＮＦ−κＢ結合部位を有するプロモーターを活性化できるかどうかを、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現増強をレポーターとして、調べることができる。ＴＲ４３０遺伝子を一過性に導入し過剰発現させるために使用することができる細胞としては、例えばヒト胎児腎細胞株２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、などを使用することができる。
ＴＲ４３０タンパク質を一過性に導入し過剰発現させた細胞を本発明の抗体で刺激したところ、細胞内部で、最終的にＮＦ−κＢの活性が著しく上昇することがわかった（図５）。このことから、当該細胞表面に存在するＴＲ４３０タンパク質の細胞外ドメインを、本発明の抗体により刺激すると、その刺激が細胞内部に伝達され、最終的にＮＦ−κＢ活性が著しく増大することが示唆される。このことからまた、ＴＲ４３０タンパク質は、細胞外からの何らかの未知のシグナルに対する受容体として機能していることが示唆される。このＢ細胞内部で活性化されるＮＦ−κＢ（核因子κＢ）は、Ｂ細胞の生存、増殖に中心的な転写因子として機能していることが知られている（Ｇｒｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３，４００；Ｆｒａｎｚｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１，３４８２；Ｇｒｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，６６３；Ｋｏｎｔｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９，１９６５）。
本発明の一態様において、上述した抗体によるＴＲ４３０タンパク質への刺激が、細胞内部においてどのようなシグナルカスケードの活性化を引き起こすのかを調べるために、本発明において、酵母２ハイブリッド（Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ）スクリーニングを行うことができる。この方法を用いることにより、例えば、ＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメイン（１８７〜４３０番アミノ酸部分）に対して選択的に結合することができるタンパク質を選択することができる。
本発明の酵母２ハイブリッドスクリーニングは、例えば、ＴＲ４３０細胞内ドメインをコードする塩基配列をＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインプラスミド（ｐＢＴＭ１１８）にクローニングして囮タンパク質発現ベクターを構築し、ｐＡＣＴ２にクローニングされたヒト末梢血白血球ライブラリ（クローンテック社）ともにレポーター酵母株Ｌ４０に導入することにより行うことができる。実際的には、例えばＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（クローンテック社）などの商業的に入手可能なキットを、製造者の指示書に基づいて使用して行うことができる。
上述したような酵母２ハイブリッドスクリーニングを行ったところ、２種類のキナーゼ、ＴＲＡＫ１（ＴＲ４３０−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ  １）およびＴＲＡＫ２が、ＴＲ４３０タンパク質に選択的に結合することができるタンパク質として見出された。これらのタンパク質をコードする遺伝子を配列決定し、配列相同性に関して検索したところ、ＴＲＡＫ１はＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＦ０９９９８９として登録されているヒトＳｔｅ−２０関連キナーゼ、ＳＰＡＫのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）と同一の配列を有していることがわかった。ＴＲＡＫ２は、同様に、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＢ０１７６４２として登録されているヒト酸化ストレス応答性分子１（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ−ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  １）のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）と同一の配列を有していることがわかった。
さらに、上述したように同定されたキナーゼ、ＴＲＡＫ１およびＴＲＡＫ２から、さらにその下流においてどのようなシグナルカスケードを形成しているのかについて、例えば免疫沈降法、リン酸化タンパク質の定量など、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲）に記載された方法などを使用して調べることができる。
サイトカイン受容体を介したＮＦ−κＢの活性化において、ＴＲＡＦファミリータンパク質もしくはＮＩＫの変異体がドミナントネガティブ分子として阻害的に働くことが示されている（Ｍａｌｉｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，５４０）。このような研究結果から、本明細書の先に述べた様に、サイトカイン受容体シグナルによるＮＦ−κＢ活性化に際してはＴＲＡＦファミリータンパク質およびＮＩＫが重要な働きをしていることが知られている。
本発明の一態様においては、上述のＮＦ−κＢレポーターアッセイ、および免疫沈降法、リン酸化タンパク質の定量など、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲）に記載された方法などを使用して、ＴＲＡＦ２および／またはＮＩＫの活性化または不活性化を介してＮＦ−κＢ活性の調節に関与しているかどうかについて検討することができる。ＴＲＡＦ２のドミナントネガティブ体、ＮＩＫのドミナントネガティブ体は、ＴＲ４３０タンパク質によるＮＦ−κＢ活性化を阻害した。したがって、細胞表面ＴＲ４３０からのシグナルは、ＴＲＡＦ２、そしてＮＩＫが関与するカスケードにより、最終的にＮＦ−κＢに刺激を伝達することが示唆される。
７．ＴＲ４３０タンパク質のリガンドの同定
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する分子ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩに対するリガンドとして、ＴＮＦファミリーに属する分子であるＡＰＲＩＬ（ａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）やＢＬｙＳが知られている。このうち、ＡＰＲＩＬは血清非存在下での癌細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進し、ＡＰＲＩＬを過剰発現させたＮＩＨ−３Ｔ３株は、ヌードマウスにおいて高率で腫瘍形成を引き起こすことが知られている。また、ＢＣＭＡ可溶型受容体は、ＡＰＲＩＬによる細胞増殖を抑制し、ヌードマウスにおける癌増殖を抑制する。これらのことより、ＡＰＲＩＬとその受容体は癌増殖に関わる重要な因子である、と考えられている（Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８，１１８５；Ｒｅｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１６７７；Ｗａｒｅ（２００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，Ｆ３５）。一方で、ＡＰＲＩＬはＢＣＭＡ、ＴＡＣＩともに発現していない癌細胞の増殖を促進することから、ＡＰＲＩＬをリガンドとする別の受容体の存在が示唆されている（Ｗａｒｅ（２００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，Ｆ３５）。
ＴＲ４３０タンパク質は白血病細胞株で高確率でその発現が検出されたこと（図３参照）、および、ＴＲ４３０タンパク質の刺激によりＮＦ−κＢの活性化が起こることから（図５参照）、本発明者は、ＴＲ４３０がＡＰＲＩＬ受容体の候補である可能性があると考え、その検討を行った。
本発明においては、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する分子のリガンドであるＡＰＲＩＬ、ＢＬｙＳを用いて、ＴＲ４３０に対する刺激活性を有しているか否かについて、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＰＲＩＬまたはＢＬｙＳとＴＲ４３０との一過的共発現系で、これらのリガンドによる刺激の結果、ＮＦ−κＢの活性化が生じるかどうかを指標にして、評価した。
ＨＥＫ２９３細胞を使用するＡＰＲＩＬまたはＢＬｙＳとＴＲ４３０との一過的共発現系は、ＡＰＲＩＬまたはＢＬｙＳ発現プラスミドをそれぞれＴＲ４３０発現プラスミドと同時にＨＥＫ２９３細胞に導入することにより作成した。
ＢＬｙＳとＴＲ４３０とをＨＥＫ２９３細胞に共発現した場合には、ＴＲ４３０の活性化によるＮＦ−κＢ活性化レベルを刺激しなかった。その一方で、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０とをＨＥＫ２９３細胞に同時に発現させると、ＮＦ−κＢレポーター活性は増強した（図８）。ＢＬｙＳがＴＲ４３０を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＮＦ−κＢ活性を増大することができなかった、という事実は、ＢＬｙＳがＴＲ４３０を刺激しないことと共に、この細胞がＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ分子を発現していないことを示す。その一方で、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０とを共発現させた場合には、当該ＨＥＫ２９３細胞におけるＮＦ−κＢが活性化されるという事実は、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩを発現していない細胞においても、ＡＰＲＩＬによりＴＲ４３０が刺激され、その後の細胞内シグナル伝達が機能し、結果的にＮＦ−κＢが活性化される、という経路を示唆する。したがって、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０とがこれまで知られていなかったリガンド−受容体関係を有していることが推測される。すなわち、ＴＲ４３０に対する未知リガンドがＡＰＲＩＬであると推測される。
本発明者はさらにＡＰＲＩＬが血清非存在下で増殖を支持するＪｕｒｋａｔ細胞において、ＴＲ４３０が発現されており、その一方でＢＣＭＡ、ＴＡＣＩは発現していないことをノーザンブロット法で確認した（図９）。この知見もまた、ＴＲ４３０に対する未知リガンドがＡＰＲＩＬであるという推測を支持するものである。
さらに、本発明者は、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０が結合することを一過的共発現系での免疫沈降法により確認した（図１０）。これらの結果は、ＴＲ４３０がＡＰＲＩＬの受容体であることを示しており、このことから、可溶性ＴＲ４３０受容体や中和抗体、もしくは低分子化合物などによりＴＲ４３０機能を阻害できれば、ＡＰＲＩＬ刺激によっておこる癌細胞の増殖促進、Ｂ細胞の異常増殖に基づく疾病を抑制する効果があることが示唆される。
８．ＴＲ４３０タンパク質の機能を調節する化合物の単離スクリーニング方法
本発明はまた、ＴＲ４３０タンパク質の機能を調節する候補化合物をスクリーニングする方法を提供することができる。本発明で提供することができるスクリーニング方法は、
（ｉ）ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞に候補化合物を接触させ；
（ｉｉ）候補化合物を接触させたＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞、および候補化合物を接触させていないＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞との間で、両細胞内部でのＮＦ−κＢ転写活性を比較し；
（ｉｉｉ）候補化合物の接触によりＮＦ−κＢ転写活性化を調節する程度を検出し；そして
（ｉｖ）ＮＦ−κＢ転写活性化を調節する化合物を選択する；
ことを含む。工程（ｉ）を行う前に、ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞を、あらかじめＴＲ４３０アゴニストを添加することにより活性化させてもよい。ＴＲ４３０アゴニストによる活性化により、候補化合物によるＴＲ４３０タンパク質の機能の調節の程度をより明瞭に検出することができる。
上記工程（ｉ）において使用するＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞は、例えばＹ７９などのヒト培養細胞株や末梢血Ｂ細胞、前述した腫瘍化した細胞などのＴＲ４３０タンパク質をもともと発現する細胞であってもよく、もしくはもともとはＴＲ４３０タンパク質を発現していないがＴＲ４３０遺伝子を導入して形質転換した細胞であってもよい。
候補化合物がＮＦ−κＢ活性を調節する程度は、ＮＦ−κＢの活性化に直接的に機能するＩκＢのリン酸化および分解、ＮＦ−κＢ結合部位を有するＤＮＡに結合する核タンパク質の量を検出することにより、測定することができる。もしくは、ＮＦ−κＢ転写活性化により発現を誘導されるレポーターをＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞に導入し、候補化合物により活性化されたＮＦ−κＢがレポーターの発現を誘導する程度を検出することもでき、また同様にして候補化合物によるＮＦ−κＢ活性化抑制をレポーターの発現を抑制する程度として検出することもできる。現在使用することができるレポーターとして、例えばＮＦ−κＢ活性化をルシフェラーゼ活性として検出可能なｐＮＦｋＢ−Ｌｕｃ（ストラタジーン社）などを使用することができるが、これらには限定されない。
ＴＲ４３０タンパク質を介したシグナル伝達を調節する候補化合物は、ＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメインとＴＲＡＫ１を候補化合物の存在下で接触させるか、または、ＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメインとＴＲＡＫ１を接触させた後にさらに候補化合物と接触させることにより、ＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメインとＴＲＡＫ１の結合を調節するかどうかに基づいて選択することができる。
タンパク質相互作用の調節を検出するためには、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法、ＢＩＡＣＯＲＥ（アマシャムファルマシア社）等の生体分子間相互作用を用いた方法、などを用いることができる。タンパク質は天然の発現細胞から精製でき、また大腸菌、動物細胞や昆虫細胞を宿主とした組み換えタンパク質として発現させ、精製して用いることもできる。公知の方法によりタンパク質を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、各種酵素、免疫的なタグを用いて標識しておくことにより、タンパク質間相互作用の検出を容易にすることができる。また、酵母または動物細胞を宿主とした２ハイブリット法（クローンテック社）などを用いてタンパク質相互作用の調節を検出することもできる。
動物細胞においてＴＲ４３０タンパク質とＴＲＡＫ１組み換えタンパク質を同時に発現させ、その相互作用を免疫沈降法により検出できる（図６）。一方の組み換えタンパク質を固相化し、これに結合するタンパク質量を酵素免疫学的に検出することもできる。たとえば、ＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメインをＧＳＴ融合タンパク質として発現精製し、直接もしくは抗ＧＳＴ抗体などをもちいて間接的に固相化する。これにＦＬＡＧタグをつけたＴＲＡＫ１を加え、候補化合物とともにインキュベーションする。洗浄後、固相化したＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメインに結合するＴＲＡＫ１の量をＦＬＡＧタグを認識する抗体を用いて検出する。固相化する分子を入れ替えても同様にタンパク質相互作用に対する作用を評価でき、タグの種類、融合タンパク質の種類をかえて実施することもできる。
ＴＲＡＫ１とＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメインの相互作用を酵母２ハイブリット法を用いて検出できる。たとえば、ＴＲ４３０細胞内ドメイン／ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質を発現させるプラスミドと、ＴＲＡＫ１／ＧＡＬ４転写活性化ドメイン融合タンパク質を発現させるプラスミドをレポーター株に導入し、相互作用をβガラクトシダーゼ活性として検出できる（図７）。
本発明の別の態様においては、上述したスクリーニング方法により得られた化合物を提供することもできる。このような化合物は、ＴＲ４３０タンパク質を介して当該ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞の機能を調節することができる。ここでＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞の機能とは、ＴＲ４３０タンパク質を刺激することにより細胞内部でＮＦ−κＢ活性の増大または減少が関連する機能をいう。より具体的には、ＮＦ−κＢ活性の増大または減少が関連する機能とは、Ｂ細胞の増殖・分化・生存、抗体産生、抗体のサブクラススイッチング、腫瘍化した血液細胞の増殖・生存、などのことをいうが、これらには限定されない。
あるいは、候補化合物の存在下でＴＲＡＫ１のキナーゼ活性を検出し、タンパク質リン酸化を調節するかどうかに基づいてＮＦ−κＢ活性を調節する候補化合物を選択することができる。
キナーゼ活性を検出するためには、反応系において［γ３２Ｐ／３３Ｐ］ＡＴＰを用いることにより、放射活性的に検出することができる。リン酸基の転移を受けるタンパク質としては、ＴＲＡＫ１を使用することができ、あるいはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、Ｍｙｅｌｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＨＡＳ−Ｉ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｈｅａｔ  ａｎｄ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｉｎｓｕｌｉｎ）などの外来性タンパク質を基質として使用することもできるが、これらに限定されない。
これらの場合においては、反応後の酸不溶画分に取り込まれたラジオアイソトープ量を定量することにより、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後にオートラジオグラフィーを行うことにより、タンパク質のリン酸化を評価することもできる。あるいは、シンチレーションプロキシミティアッセイ（ＳＰＡ、Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、アマシャムファルマシア社）や、マルチスクリーンアッセイシステム（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ミリポア社）を使用して、スクリーニングをハイスループット化することもできる。
９．ＴＲ４３０タンパク質の機能に基づく医療用途
本発明の一態様においては、ＴＲ４３０タンパク質に結合する抗体もしくは本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を使用して細胞表面に発現するＴＲ４３０タンパク質を刺激し、細胞内部のＮＦ−κＢの転写活性化を調節することができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を使用して、ＴＲ４３０タンパク質を刺激して生じるシグナルを媒介するタンパク質の機能を調節し、ＮＦ−κＢの転写活性化を調節することができる。その結果、これらの抗体もしくは化合物によりＢ細胞あるいは腫瘍化した細胞の発現する機能を調節することができ、ＮＦ−κＢ活性の増大もしくは減少と関連する疾患の治療などを目的として利用することもできる。
本発明において、Ｂ細胞の発現する機能という用語は、Ｂ細胞自身の増殖機能、抗体産生機能、生存機能などについて言及するが、これらには限定されない。本発明において、腫瘍化した細胞の発現する機能という用語は、その細胞自身の増殖機能、生存機能などについて言及するが、これらには限定されない。またこれらの細胞の機能の調節という用語は、上述した細胞の機能を増強する場合、抑制する場合の両方の概念に言及する。したがって、これらの細胞の機能を調節することは、具体的には、例えば、これらのＢ細胞もしくは腫瘍化した細胞自身の増殖機能の増強もしくは抑制、Ｂ細胞の抗体産生機能の増強もしくは抑制、生存機能の増強もしくは抑制などが含まれる。
ＮＦ−κＢからＩκＢが遊離してＮＦ−κＢが核内に移行すると、主に炎症・免疫応答に関わる遺伝子、例えば免疫グロブリン遺伝子の他、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−２受容体α遺伝子などの様々な遺伝子、の発現を制御することが知られている（Ｊａｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，３３３−３４２）。この他にも、ＮＦ−κＢはアポトーシスの制御だけでなく、ボディープラン（Ｍｅｒｃｕｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１，２２６−２３２；Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．１５，２２９−２３５）にも関与していることが知られている。
マウスでは、ＴＮＦ受容体様分子からの過剰な刺激が与えられた場合、リンパ節症、プラズマ細胞増加症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患様の症状を引き起こすことがわかっている（Ｋｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，３３７０−３３７５；Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，９９５−９９９）。これらの疾患は、本来アポトーシスにより除去されるべき細胞群の細胞死プログラムがＴＮＦ受容体様分子からの生存シグナルにより阻害されるためであると考えられており、同様の機構が腫瘍細胞の生存にも関与しているのではないかと示唆されている（Ｌａａｂｉ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｓｓｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，８８３；Ｒｏｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ３６，２５５；Ｆｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，２２００；Ｒｏｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２，９９０）。
上述したように、本発明の一態様においては、ＴＲ４３０タンパク質に結合する抗体もしくは本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を使用して、細胞内部のＮＦ−κＢの転写活性化を調節し、その結果これらの抗体もしくは化合物をＮＦ−κＢ活性の増大もしくは減少と関連する疾患の治療などを目的として利用することもできる。
抗体を患者の治療目的で用いる場合には、抗体自体の免疫原性が少ないことから、ヒト抗体またはヒト化抗体を使用することが好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス（例えば、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｏｆ  ｍｅｇａｂａｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｏｃｉ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６，１９９７参照）に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３，９９−１２１，１９９１）。
本明細書中で細胞内部のＮＦ−κＢ活性を増大するとは、外部からＴＲ４３０タンパク質を刺激することにより細胞内部にシグナルが形成され、ＩκＢのリン酸化を介して、標的遺伝子の活性化を引き起こす程度に、ＮＦ−κＢの転写因子としての活性が高まった状態をいう。Ｂ細胞中においてＮＦ−κＢ活性が増大した場合、Ｂ細胞分化、抗体のサブクラススイッチング、生存能の増強、などの機能を発揮することが知られている。
一方、本明細書中で細胞内部のＮＦ−κＢ活性を低下するとは、ＩκＢのリン酸化が生じることなく、標的遺伝子の活性化を引き起こす程度にまでＮＦ−κＢの転写因子としての活性が亢進していない状態、もしくはそれ以下の活性を示す状態をいう。例えば、Ｂ細胞中においてＮＦ−κＢ活性が低下した場合、アポトーシスなどの現象が生じることが知られている。
したがって、ＴＲ４３０タンパク質刺激によってもたらされるＮＦ−κＢ活性化を中和できるＴＲ４３０タンパク質に特異的に結合することができる抗体は、本来はアポトーシスにより除去されるべき細胞が細胞内部でのＮＦ−κＢ活性が増大するために生存することにより生じる疾患を治療するために用いることができる。細胞内部のＮＦ−κＢ活性の増大と関連する疾患としては、リンパ節症、プラズマ細胞増加症、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、癌、などが知られているが、これらには限定されない。
本発明の一態様において、本発明のＴＲ４３０タンパク質に対して特異的に結合することができる抗体を治療的有効量で含む医薬組成物を提供することができる。このような医薬組成物は、細胞内部でのＮＦ−κＢ活性の増大もしくは減少と関連する疾患を治療するために用いることができる。
上述した抗体を含む医薬組成物は、皮下投与及び非経口投与を含むいずれかの適当な投与経路から投与することができる。好ましくは非経口投与により被検体に投与する。非経口投与の例には静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与および腹腔内投与などが含まれる。本発明においては、静脈内投与および腹腔内投与が好ましい。医薬組成物中で投与する１回当たりの抗体の治療的有効量は、典型的には患者の体重１ｋｇ当り約０．２〜２０ｍｇの範囲であってよい。しかしながら、投与量および投与方法は主として抗体を含む医薬組成物の用途、治療すべき患者の年齢、体重、および患者の症状等を含む状況を考慮して医師により決定されるものであり、上述した投与量および投与方法には限定されない。
非経口投与のためには、抗体は一般に医薬的に許容可能なビヒクルと共に単位投与剤形として、例えば溶液剤、懸濁剤、乳剤などに製剤化される。この様なビヒクルは本質的に非毒性である。この様なビヒクルの例には水、塩溶液、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれる。非水ビヒクル、例えば硬化油及びオレイン酸エチルを使用することもできる。キャリヤーとしてリポゾームを使用することができる。例えば、抗体は典型的にはこの様なビヒクル中に約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。
本発明の別の一態様において、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を治療的有効量で含む医薬組成物を提供することができる。このような医薬組成物は、細胞内部でのＮＦ−κＢ活性の増大もしくは減少と関連する疾患を治療するために用いることができる。
上述した化合物を含む医薬組成物は、皮下投与及び非経口投与を含むいずれかの適当な投与経路から投与することができる。経口投与には舌下投与、胃内投与、小腸内投与などが含まれる。非経口投与の例には静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与および腹腔内投与などが含まれる。本発明においては、静脈内投与および腹腔内投与が好ましい。医薬組成物中で投与する１回当たりの化合物量は、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇであり、１日当たり１回〜３回投与することが好ましい。しかしながら投与量および投与方法は、投与すべき化合物の種類、化合物を含む医薬組成物の用途、治療すべき患者の年齢、体重、および患者の症状等を含む状況を考慮して医師により決定されるものであり、これらには限定されない。
実施例
以下に実施例を提供する。これらの実施例は本発明を具体的に説明するために記載するものであり、本発明の技術的範囲を限定するために記載するものではない。
実施例１：遺伝子・タンパク質構造の解析
シグナル配列、Ｐｆａｍ  ＴＮＦＲ／ＮＧＦＲ  Ｃｙｓリッチモチーフ、一回膜貫通ドメインを有するＴＮＲ受容体スーパーファミリーに属するサイトカイン受容体分子を、Ｙ７９細胞株（理研細胞銀行より入手）由来のｃＤＮＡライブラリより、クローニングした。配列解析の結果、アリルの違いに由来すると考えられる二種類の転写産物を同定した。これらの遺伝子の一つがコードするＴＲ４３０ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は、ＷＯ９９／５２９２４に記載されているＴ１２９と同一分子であった。ＴＲ４３０ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）はＴ１２９タンパク質のアミノ酸配列、すなわちＴＲ４３０ａタンパク質のアミノ酸配列の、アミノ酸残基１８７番目のＬｙｓがＧｌｕに、２７３番目のＨｉｓ残基がＡｒｇへ置換したアミノ酸配列をコードするクローンであった。
実施例２：ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析
Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ（クローンテック、カタログ番号Ｋ１４２０−１、Ｋ１４２１−１、Ｋ１４２５−１）を用い、ＴＲ４３０遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ法による組織発現解析を行った。増幅の際に用いたプライマーは以下の通りである：
2002062852.tif 000004
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を用い、製造者の指示に従い、反応液を調製した。プライマーの終濃度は４００ｎＭ、鋳型ｃＤＮＡの容量は１２．５μｌあたり０．５μｌであった。ＰＣＲ反応サイクルは、９４℃  １ｍｉｎの後、９４℃  ３０秒間、６０℃  ３０秒間、７２℃  １分間を１サイクルとして３２サイクル行った。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を図１に示す。遺伝子発現は、末梢血白血球、脾臓に限局していたことから、ＴＲ４３０遺伝子は血球系細胞で優勢に発現していることが示唆された。
実施例３：受容体細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体の作製
抗原として用いる受容体細胞外ドメインタンパク質を、大腸菌発現系により、以下の様に調製した。ＴＲ４３０タンパク質の細胞外ドメイン（アミノ酸番号２６−１６２）をコードする塩基配列を、プライマーＷＡＬＴ−ＮｆとＷＡＬＴ−Ｎｒを用いたＰＣＲにより増幅し、いったんｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ社）にクローニングし配列確認を行った。配列の確認後、このベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断し、得られた制限酵素断片を、ｐＥＴ−３２ａ（ノバジェン社）中にサブクローニングし、大腸菌チオレドキシン融合発現ベクターｐＥＴ３２ａ／ＴＲｅｘを構築した。ＰＣＲに用いたプライマー配列は以下の通りである：
2002062852.tif 000005
発現ベクターｐＥＴ３２ａ／ＴＲｅｘを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換し、終濃度１ｍＭ  ＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導し、当該大腸菌を３７℃で培養した。目的とする発現タンパク質は封入体として不溶性画分に存在した。発現誘導後の菌体を遠心分離し、Ｂ−ＰＥＲ（ピアース社）を用いてタンパク質を抽出した後、さらに遠心分離し、沈殿画分を６Ｍ尿素溶液で溶解した。溶解液中の目的とする発現タンパク質をＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて製造者の指示に従い、吸着・溶出し、当該タンパク質の精製を行った。溶出画分を１００倍強の体積の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールに対して室温にて終夜透析し、続いて１００倍強の体積の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１Ｍ  ＮａＣｌに対して室温にて終夜透析した。透析画分を遠心分離して、可溶性画分を得た。その可溶性画分には、ＴＲ４３０タンパク質細胞外ドメイン融合タンパク質が存在し、この融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色でほぼ単一バンドとして検出されるにまで精製された。
精製されたＴＲ４３０タンパク質細胞外ドメイン融合タンパク質を免疫原として、ウサギを免疫化し、ウサギポリクローナル抗体を作製した。フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ；Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）をアジュバントとした抗原タンパク質を、日本白色種家兎（雌）に対し、初回のみ０．１５ｍｇ、その後は二週間毎に０．３ｍｇを計５回皮内にブーストして免疫し、抗血清を得た。
免疫前血清および抗血清に対して、プロテインＡに対するアフィニティ精製もしくは抗原タンパク質に対するアフィニティ精製を行い、抗体を精製した。ＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡおよびＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−活性化カラムを用い（どちらもアマシャムファルマシアバイオテク社）を用い、製造者の指示に従い、抗体の精製を行った。
実施例４：Ｙ７９細胞株およヒト末梢血における受容体タンパク質発現解析
終夜培養したＹ７９細胞を遠心分離して回収し、１０６／１００μＬの細胞数になるようリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）／２％牛胎児血清（ＦＢＳ）中に懸濁した。この細胞調製液に対して２μｌの免疫前の血清、もしくは免疫後抗血清のいずれかを添加し、氷上で３０分間インキュベーションした。遠心分離後、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで再懸濁したものに対して、０．５μｌの抗ウサギＣｙ３抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社）を添加し、氷上で３０分間インキュベーションした。遠心分離と再懸濁を繰り返して細胞を二回洗浄した後に、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディキンソン社）を用いて、抗体が細胞表面のＴＲ４３０タンパク質に結合するかどうかについて解析した。
図２Ａにおいて、太線が抗血清と抗ウサギＣｙ３抗体を用いた場合、実線が免疫前血清と抗ウサギＣｙ３抗体を用いた場合、点線が抗ウサギＣｙ３抗体のみを用いた場合による染色結果を示す。免疫前の血清ではＴＲ４３０タンパク質発現細胞であるＹ７９細胞は弱くしか染色されない一方で、免疫後の抗血清ではＹ７９細胞が強く染色された。これは、得られた抗血清中に、細胞膜上に発現するＴＲ４３０タンパク質を認識する抗体が含まれていることを示す。
正常健常人男子の血液よりモノ・ポリ分離溶液（大日本製薬）を用い、末梢血単核球細胞を調製した。細胞懸濁液に抗血清もしくは免疫前血清を添加し氷上で３０分間放置した後、遠心分離を行い細胞を洗浄した。懸濁後ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）ラベルされた抗ウサギ抗体を添加し、氷上で３０分間放置した。遠心分離後、再懸濁し、ＦＩＴＣラベルされた抗ヒトＣＤ３もしくは抗ヒトＣＤ１９抗体（ベックマンコールター社）を添加し、さらに氷上で３０分間放置した。遠心後、再懸濁したのちＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで細胞の二重染色パターンを解析した。図２Ｂに示すように、ＣＤ１９陽性細胞が抗血清で選択的に染色されたことから、Ｂリンパ球上にＴＲ４３０タンパク質が発現していることが明らかとなった。対照となる免疫前の血清では顕著な細胞染色は見られなかった。
実施例５：培養細胞株におけるＴＲ４３０タンパク質発現解析
ヒト血球系腫瘍細胞株におけるＴＲ４３０タンパク質発現をアフィニティ精製したウサギ抗ＴＲ４３０ポリクローナル抗体を用いて解析した。フローサイトメトリーによる解析結果を図３に示した。図中において実線が抗ＴＲ４３０抗体、点線が対照ＩｇＧ抗体による染色を示す。急性リンパ芽球白血病細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、急性Ｔ細胞白血病細胞Ｊｕｒｋａｔ、慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２およびＫＵ８１２、骨髄性白血病細胞Ｕ９３７、およびＢリンパ芽球細胞Ｕ２６６に対し抗ＴＲ４３０抗体による染色が観察され、受容体ＴＲ４３０タンパク質の発現が示された。前骨髄性白血病細胞ＨＬ６０には受容体タンパク質の発現は検出されなかった。
実施例６：受容体刺激によるＮＦ−κＢ活性化
ＴＲ４３０刺激によるＮＦ−κＢ活性化能を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＮＦ−κＢの複数の結合部位をもつ合成プロモーターをもつレポータープラスミドｐＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ（ストラタジーン社）を用いて評価した。ＣＭＶプロモーターにより発現調節をうける受容体遺伝子発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＴＲ４３０ａおよびｐｃＤＮＡ−ＴＲ４３０ｇ）とｐＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃをヒト胎児腎細胞株２９３細胞に一過的に導入し、過剰発現によるＮＦ−κＢレポーター活性化能を調べた。陽性対照としてｐＦＣ−ＭＥＫＫ（ストラタジーン社）、陰性対照として空の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（−）ＭｙｃＨｉｓ（インビトロジェン社）を用いた。２×１０４細胞を４８ウェルプレート１ウェルあたりに捲き込み、２００μｌ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳの培地で３７℃、５％ＣＯ２下で終夜培養した。培地交換後、１ウェルあたり１００ｎｇの発現プラスミドおよび２００ｎｇのレポータープラスミドをＦｕＧＥＮＥ−６（ロッシュダイアグノスティックス社）を用い、細胞へ導入した。２４時間培養後のルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）を用い定量した。図４Ａに示すように、陰性対照ｍｏｃｋに比べ、ＴＲ４３０ａ遺伝子、ＴＲ４３０ｇ遺伝子を過剰発現させることにより、約７から１０倍のＮＦ−ＫＢ活性化が起こった。
ＴＲ４３０タンパク質細胞外ドメインに対する抗血清よる受容体刺激能を、上述の方法に評価した（図４Ｂ）。ＴＲ４３０を過剰発現させた場合、ＮＦ−κＢ活性化能はＦＢＳの濃度に非依存である一方で、終濃度１％のウサギ抗血清を添加することにより、単に過剰発現させた場合に対して更に約１０倍の活性化の増強が見られた。免疫前の血清である対照血清に増強能は認められなかった。また、受容体を発現しない対照空ベクターｍｏｃｋの場合には、抗血清による活性化の増強は認められなかった。抗原タンパク質に対しアフィニティー精製を行ったポリクローナル抗体による受容体刺激によるＮＦ−κＢ活性化を図４Ｃに示した。精製された抗体の添加により活性化シグナルの増強が起こることが示された。
実施例７：酵母２ハイブリッド（Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ）スクリーニングによるＴＲ４３０−細胞内ドメインに結合するキナーゼＴＲＡＫ１、ＴＲＡＫ２の同定
ＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメインに結合するタンパク質の選択をＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（クローンテック社）を用いて行った。ＴＲ４３０ａタンパク質の細胞内ドメイン（アミノ酸残基番号１８７−４３０）をコードする塩基配列をＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインプラスミド（ｐＢＴＭ１１８）にクローニングし、囮タンパク質発現ベクターを構築した。ｐＡＣＴ２にクローニングされたヒト末梢血白血球ライブラリ（クローンテック社）ともにレポーター酵母株Ｌ４０に導入し、ＨＩＳ３遺伝子発現に対する選択を行った。選択されたクローン配列を解析し、その後、相互作用の選択性の確認をｌａｃＺ遺伝子発現による青白で判定した。結果を図６に示した。ＴＲ４３０の細胞内ドメインに選択的に結合する遺伝子として、二種の互いによく似たＳｔｅ−２０関連キナーゼＳＰＡＫ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０９９９８９）およびＯＳＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１７６４２）が同定された。相互作用が同定されたキナーゼＳＰＡＫとＯＳＲ１をそれぞれ、ＴＲ４３０と結合することに基づき、以下ではＴＲＡＫ１（ＴＲ４３０−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ１）およびＴＲＡＫ２と呼称する。図６のクローン＃２６は全長配列を含むＴＲＡＫ２遺伝子であり、クローン＃４９、＃６２はそれぞれアミノ酸３４および３６７残基以降の配列をコードするＴＲＡＫ１遺伝子配列であった。ＴＲＡＫ１とＴＲＡＫ２のアミノ酸配列相同性はキナーゼドメインを含むＮ末端側でより高いが、ＴＲＡＫ１の３６７残基以降の配列がＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメインに選択的に結合したことから、ＴＲ４３０タンパク質との結合ドメインはアミノ酸３６７残基以降のＣ末端側配列上に存在すると推測された。
実施例８：免疫沈降によるＴＲ４３０タンパク質とＴＲＡＫ相互作用
酵母２ハイブリッドスクリーニングにより同定されたＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメイン結合タンパク質の哺乳動物細胞内での相互作用を一過的共発現系での免疫沈降により確認した。シグナル配列が切断された成熟型ＴＲ４３０（２６−４３０残基）のＮ末端にＩｇκのシグナル配列およびＨＡタグを付加した発現ベクターおよびＴＲＡＫ１、ＴＲＡＫ２のＮ末端にＦＬＡＧタグを付加した発現ベクターをそれぞれ単独もしくは同時に２９３細胞へ導入した。３５ｍｍディシュあたり２×１０５の細胞を巻き込み、終夜培養した。培地交換後、１ディシュあたりそれぞれ５００ｎｇの発現ベクターをＦｕＧＥＮＥ−６を使い細胞に導入した。２日間培養後、ＰＢＳで一度細胞を洗浄し、細胞抽出液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ＣＨＡＰＳ、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ  ｐ−ＡＢＳＦ）でタンパク質を可溶化した。このうちの一部を用いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロティングを行い、導入プラスミド由来のタンパク質発現をマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマ社）、ウサギ抗ＨＡ抗体（サンタクルーズ社）を用いて確認した。残り抽出画分について抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（シグマ社）を用い免疫沈降を行い、共沈するＴＲ４３０タンパク質をウサギ抗ＨＡ抗体で検出した。図５に示すように、ＴＲＡＫ１、もしくはＴＲＡＫ２の存在に依存したＴＲ４３０タンパク質の共沈が確認された。
実施例９：ＴＲ４３０タンパク質細胞内シグナルカスケードの同定
ＴＲ４３０タンパク質刺激を介したＮＦ−κＢ活性化細胞内シグナルカスケードにおける他ＴＮＦ受容体スーパーファミリーにおいてシグナルを介在するＴＲＡＦ２、ＮＩＫの関与を、２９３細胞における共発現系でのＮＦ−κＢレポーターアッセイにより調べた（図７）。ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２はそれ単独でＮＦ−κＢの活性化することが知られている。キナーゼ活性を消失するようアミノ酸置換を施したＮＩＫ変異体ＮＩＫ（ＫＫ４２９−４３０ＡＡ）は、過剰発現させることにより、上流からのシグナルに応じた内在性のＮＩＫの活性化を競合的ブロックし、ドミナントネガティブとしてＮＦ−κＢ活性化に阻害的にはたらく（Ｍａｌｉｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，５４０）。Ｎ末端を欠失させたＴＲＡＦ２変異体ＴＲＡＦ２（２２５−５０１）もＴＲＡＦ２を介した活性化シグナルに対しドミナントネガティブとして働く。ＮＩＫ（ＫＫ４２９−４３０ＡＡ）およびＴＲＡＦ２（２２５−５０１）は、ＴＲ４３０タンパク質からの活性化シグナルに対し阻害的に働いた。これらの結果は、ＴＲ４３０タンパク質の下流のＮＦ−κＢ活性化経路にＴＲＡＦ２、ＮＩＫが関与していることを表している。シグナルカスケードを形成する下流因子を阻害することによりＴＲ４３０タンパク質を介したＮＦ−κＢの活性化シグナルを遮断可能なことを示す。
実施例１０：ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０タンパク質の共発現によるＴＲ４３０タンパク質の活性化
本実施例においては、ＡＰＲＩＬ、ＢＬｙＳによるＴＲ４３０タンパク質活性化の効果の有無をＨＥＫ２９３細胞におけるＮＦ−κＢレポーターアッセイにより調べた。ＡＰＲＩＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４６８８８）およびＢＬｙＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１３２６００）をヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲ法によりクローニングした。この際使用したプライマーの配列は、以下の通りであった：
2002062852.tif 000006
であった。
得られた遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）に組み込み、ＣＭＶプロモーターの調節下で遺伝子発現が制御されるように、発現プラスミドの構築をおこなった。発現プラスミドの構築は、ＰＣＲ増幅産物をいったんｐＧＥＭＴ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ）に組み込んだ後、ＥｃｏＲＩで切断した目的遺伝子を含むフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、遺伝子の挿入方向がプロモーターに対し、順方向にクローニングされたクローンを選択することにより行った。
１００ｎｇのＴＲ４３０タンパク質発現プラスミド、７５ｎｇ  ＮＦ−κＢレポータープラスミド、１００ｎｇのＡＰＲＩＬ発現プラスミドもしくはＢＬｙＳ発現プラスミド、２５ｎｇの形質転換効率校正用のβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドを混和し、５０μｌのＤＭＥＭと２μｌ  ＦｕＧＥＮＥ混和液に加え、１５分間放置した。その後、継代後終夜培養したＨＥＫ２９３細胞に対して、４８ウエルプレート１ウエルあたり、１０μｌの溶液を培養液２００μｌに対して添加、混合した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で終夜培養をおこなった。ＨＥＫ２９３細胞の培養後のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を用いて定量した。
結果を図８に示す。ＴＲ４３０を過剰発現させていない形質転換細胞においては、ＢＬｙＳ、ＡＰＲＩＬ発現を発現させても、レポーター活性の上昇は観測されなかったが、ＴＲ４３０を過剰発現させて同時にＡＰＲＩＬを過剰発現させると約３倍のレポーター活性の上昇がみられた。ＢＬｙＳをＴＲ４３０と共発現しても、レポーター活性の上昇は観測されなかった。
実施例１１：白血病細胞株におけるＴＲ４３０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ遺伝子のノーザンブロット解析
Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｕ９３７細胞株より、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、製造者の指示通りにトータルＲＮＡを調製した。それぞれ１レーンあたり１５μｇの得られたトータルＲＮＡをホルムアルデヒド変性アガロースゲルで電気泳動し、泳動後のサンプルをナイロン膜（ＨｙＢｏｎｄＸＬ、アマシャムファルマシアバイオテク）にキャピラリー法により転写した。
ＴＲ４３０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡの３２Ｐ  ｃＤＮＡプローブをＲＴＧ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｂｅａｄｓ（−ｄＣＴＰ）（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて作製した。ハイブリダイゼーションプローブは、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡについては全翻訳領域をコードする塩基配列（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２３６１４およびＺ２９５７５）、ＴＲ４３０については細胞内ドメインをコードする塩基配列領域を鋳型に用い作製した。具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２アミノ酸配列番号１８７から４３０をコードする塩基配列を有する核酸をＴＲ４３０プローブとして使用した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）。
プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションはＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（クローンテック）を用いて、製造者の指示にしたがって行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、製造者の指示書に記載された方法に従って、ストリンジェントな条件、すなわち２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳを用いて室温にて１時間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて６５℃にて１時間で行った。その後、ラジオオートグラフィをＢＡＳ５０００（富士フィルム）を用いて行った。
結果を図９に示す。ＴＲ４３０遺伝子の発現が３つの細胞株すべてに検出されたのに対し、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ遺伝子の発現はＲａｊｉのみで認められた。Ｊｕｒｋａｔ、およびＵ９３７細胞にＴＡＣＩ、ＢＣＭＡが発現していないことは、以前別グループにより発表された内容と一致する結果である（Ｒｅｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１６７７）。
実施例１２：ＴＲ４３０−ＡＰＲＩＬ複合体の検出
シグナル配列が切断された成熟型ＴＲ４３０（２６−４３０残基）のＮ末にＩｇκのシグナル配列およびＨＡタグを付加したＴＲ４３０発現プラスミド、およびＮ末端にＦＬＡＧタグを付加したＡＰＲＩＬ発現プラスミドまたはＢＬｙＳ発現プラスミドを単独もしくは同時に、ＨＥＫ２９３細胞へ導入した。
６ウェルディシュあたり２×１０５のＨＥＫ細胞を巻き込み、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを使用して、終夜培養した。培地交換後、１ディシュあたりそれぞれ５００ｎｇの発現ベクター、すなわち５００ｎｇの上記ＴＲ４３０発現プラスミドと５００ｎｇのＡＰＲＩＬ発現プラスミド、または５００ｎｇの上記ＴＲ４３０発現プラスミドと５００ｎｇのＢＬｙＳ発現プラスミドをＦｕＧＥＮＥ−６を使い細胞に導入した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養した後、ＰＢＳで一度細胞を洗浄し、細胞抽出液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ＣＨＡＰＳ、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ  ｐ−ＡＢＳＦ）でタンパク質を可溶化した。このようにして得られた可溶化タンパク質の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ウエスタンブロティングに供し、導入プラスミド由来のタンパク質発現をマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマ）、ウサギ抗ＨＡ抗体（サンタクルーズ）により確認した。残りの抽出画分について抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（シグマ）を用いて免疫沈降を行い、共沈するＴＲ４３０の有無をラビット抗ＨＡ抗体で検出した。
結果を図１０に示す。ＡＰＲＩＬの存在に依存したＴＲ４３０の共沈が確認され、ＴＲ４３０とＡＰＲＩＬが複合体を形成することが示された（図１０）。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＴＲ４３０遺伝子のヒト組織発現解析結果を示す。
図２は、Ｙ７９細胞株及びヒト末梢血リンパ球の細胞膜上に発現するＴＲ４３０タンパク質の抗血清による検出を示す。
図３は、ヒト白血病細胞株に発現するＴＲ４３０タンパク質の抗ＴＲ４３０抗体による検出を示す。
図４は、ＴＲ４３０遺伝子過剰発現によるＮＦ−κＢの活性化（Ａ）、抗血清添加による受容体からのＮＦ−κＢ活性化シグナルの増強（Ｂ）、および、抗原タンパク質に対しアフィニティ精製されたポリクローナル抗体によるＴＲ４３０受容体を介したＮＦ−κＢの活性化（Ｃ）を示す。
図５は、動物細胞で共発現させたＴＲＡＫ１、ＴＲＡＫ２とＴＲ４３０タンパク質が相互作用する様子を示す。
図６は、酵母２ハイブリッドスクリーニングでＴＲ４３０細胞内ドメインに選択的に結合するクローンを示す。
図７は、ＴＲ４３０のＮＦ−κＢ活性化シグナルを媒介する分子群の効果を示す。
図８は、ＡＰＲＩＬがＴＲ４３０を刺激し、結果的にＮＦ−κＢの活性化をもたらすが、ＢＬｙＳはＮＦ−κＢの活性化を引き起こさないことを示す。
図９は、ＡＰＲＩＬの受容体として知られているＴＡＣＩ、ＢＣＭＡとともに、ＴＲ４３０のｍＲＮＡ発現について、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＵ９３７細胞に由来するｍＲＮＡを用いたノザンブロット解析の図である。
図１０は、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０の結合を示す、免疫沈降の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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