(57)【要約】再生医学において有用である、白血球を含まないことを特徴とする、脂肪組織に由来する多能性幹細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球を含まないことを特徴とする、脂肪組織に由来する多能性幹細胞。
【請求項２】
インビトロにおいて神経細胞に分化することができる、脂肪組織に由来する多能性幹細胞。
【請求項３】
請求の範囲第１項又は第２項記載の多能性幹細胞と足場材料とからなる細胞の分化及び／又は生体の再生のための材料。
【請求項４】
足場材料がＰＧＡ不織布である、請求の範囲第３項記載の材料。
【請求項５】
骨組織又は神経組織再生のための、請求の範囲第３項又は第４項記載の材料。
【請求項６】
骨分化培地又は神経分化培地を更に含む、請求の範囲第５項記載の材料。
【請求項７】
細胞増殖因子を更に含む、請求の範囲第６項記載の材料。
【請求項８】
細胞増殖因子が徐放性担体によって徐放化されている、請求の範囲第７項記載の材料。
【請求項９】
インビトロにおいて培養された、請求の範囲第３項〜第８項いずれか１項記載の材料。
【請求項１０】
生体内における、細胞の分化及び／又は生体の再生のための、請求の範囲第３項〜第９項いずれか１項記載の材料。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な脂肪組織に由来する多能性幹細胞、特に脂肪組織に由来する多能性（多分化能）を有する脂肪組織由来成体幹細胞に関する。
さらに、本発明は、該多能性幹細胞の生体組織の再生のための材料としての使用にも関する。
背景技術
近年、再生医学の観点から、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が注目を集めている。しかし、ＥＳ細胞は受精卵のクローニングによって得られるため、これを使用するにあたっては材料である受精卵の入手の困難性が問題となる。さらに、ＥＳ細胞の使用は、生命の芽生えである胎盤胞を壊すことになるので、特にヒトでは、倫理上の問題も引き起こす。また、たとえＥＳ細胞から組織が得られたとしても、その組織は他人由来であることから、免疫拒絶反応は必発である。これは、これまでの臓器移植と何ら変わるところはない。これを解決するためには、患者本人から、特に、胚性ではなく成体から幹細胞を採取する必要がある。
ＥＳ細胞に代わる成体幹細胞としては、骨髄にある未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）がある。ＭＳＣは、骨、軟骨、筋肉、脂肪、血管、更に最近では神経などにも分化することがわかっており、また患者（成人）からの採取が可能であることから、ＭＳＣの臨床的、実用的な価値は、ＥＳ細胞よりも高いといわれている。しかし、ＭＳＣには、成体内に微量しか存在しないこと、特に、加齢に伴いこの傾向が激しくなることなどの問題点がある。
脂肪前駆細胞は、脂肪組織から得られるため、骨髄穿刺に比べて細胞採取の点で容易であり、また、ＭＳＣに比べて、増殖速度が速い点が優れている。もちろん、患者本人の脂肪組織から得られるため、免疫拒絶の問題もない。脂肪前駆細胞の分化能については、読んで字のごとく脂肪の前駆細胞であることから脂肪細胞への分化が調べられ、これがインビトロ及びインビボにおいて確認されているのみであった。
したがって、再生医学を現実のものとするためには、生体組織及び臓器の再生を誘導するような増殖、分化ポテンシャルの高い細胞、幹細胞が必要である。ところが、現在知られているＥＳ細胞やＭＳＣには、上記の問題点があった。そこで、上記の問題点を解消した、多能性を有する幹細胞が求められている。
本発明者は、脂肪組織からの脂肪前駆細胞を研究中に、驚くべきことに、脂肪組織への分化能はもちろんのこと、骨、軟骨、筋肉、神経、血液系、肝、膵などの内胚葉系等の各種組織に分化し得る多能性をも有する多能性幹細胞を発見し、本発明を完成した。
発明の開示
本発明は、白血球を含まないことを特徴とする、脂肪組織に由来する多能性幹細胞である。
また、本発明は、インビトロにおいて神経細胞に分化することができる、脂肪組織に由来する多能性幹細胞である。
すなわち、本発明は、骨、軟骨、筋肉、神経等の各種組織に分化し得る多能性を有する多能性幹細胞に関する。特に好ましい組織は、骨組織及び神経組織である。本発明の脂肪組織由来多能性幹細胞は、インビトロでもインビボでも多能性を発揮することができ、各種組織に分化することができる。
発明を実施するための最良の形態
本発明の脂肪組織由来多能性幹細胞は、ヒトを含む動物の脂肪組織を、酵素、例えば、コラゲナーゼで処理することによって得ることができる。脂肪組織を採取する動物は、その種類や性別・年齢を問わない。また、脂肪組織を採取する動物の部位は、脂肪組織が存在する部位であれば特に問わないが、特に臨床上の容易さ、患者の負担などの観点から、皮下脂肪組織から採取するのが望ましい。免疫拒絶を回避する観点からは、自己の脂肪組織を使用して脂肪組織由来多能性幹細胞を得るのが、特に好ましい。
本発明の脂肪組織由来多能性幹細胞は、脂肪組織を、例えばコラゲナーゼ処理して得た細胞を、例えば１９９培地で培養することによって単離することができる。
本発明の脂肪組織由来多能性幹細胞は、各種培地中においてインビトロで、または、生体内でのインビボで増殖・分化させることができるが、三次元的、立体的に増殖・分化させるためには、足場材料を使用することが望ましい。
したがって、本発明は、上記した脂肪組織由来多能性幹細胞と足場材料からなる組織再生用の材料にも関する。
本発明における足場材料は人工の細胞外マトリックスを意味し、足場材料を足場として脂肪組織由来多能性幹細胞が増殖・分化する。インビトロにおける増殖・分化、あるいは、欠損及び荒廃した組織臓器などの細胞外マトリックスが不足した部位でのインビボにおける再生医学では、足場材料の使用が必須となる場合が多い。
足場材料としては、生体内で分解吸収されていく性質を持つものが好ましい。このような材料として、例えば、コラーゲン、アルブミン、フィブリンなどのタンパク質、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、ε−カプロラクトンと乳酸又はグリコール酸との共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリプロピレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニンなどの合成項分子、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びそれらの誘導体などの多糖が挙げられる。また、これらの材料の混合物及び共重合体なども挙げられる。
足場材料の形態は特に限定されないが、例えば、スポンジ状、メッシュ状、不織布状であってもよいし、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、ペースト状であってもよい。
本発明の脂肪組織由来多能性幹細胞は、再生の速度を増加するために、好ましくは、細胞増殖因子の存在下で増殖・分化させる。
したがって、本発明は、多能性幹細胞、足場材料及び細胞増殖因子からなる組織再生用材料にも関する。
細胞増殖因子は、脂肪組織由来多能性幹細胞の数を増加させるか又はその分化を促進させる作用を有するものが好ましく、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板分化増殖因子（ＰＤＧＦ），インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ），肝細胞増殖因子（ＨＧＦ），グリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ），神経栄養因子（ＮＦ）、ホルモン、サイトカイン、骨形成因子（ＢＭＰ），トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などが挙げられる。その濃度は、細胞１０５個〜１０８個当たり０．０００１〜１０μｇ、好ましくは０．００１〜１μｇである。
本発明の脂肪組織由来多能性幹細胞の増殖・分化に用いる細胞増殖因子は、分化させるべき組織によって変化し得る。例えば、脂肪組織由来多能性幹細胞を用いてインビボにおいて骨組織を形成させる場合にはｂＦＧＦ、ＢＭＰ−２が好ましい。また、脂肪組織由来多能性幹細胞をインビトロにおいて神経細胞に分化させる場合にはＮＧＦ、ＧＤＮＦが好ましく、筋肉細胞へ分化させる場合にはＨＧＦが好ましい。また、脂肪組織由来多能性幹細胞の数を増やす作用をもったｂＦＧＦと組み合わせることで、それらを埋入した周辺環境に応じた組織に分化させることも可能である。例えば、幹細胞とｂＧＦＧとの組合わせを骨組織欠損にいれると骨を、軟骨組織欠損に入れると軟骨を、そして筋組織欠損に入れると筋を、神経欠損に入れると神経を再生することができる。
本発明において、細胞増殖因子は、例えば、徐放性担体により徐放性化されていることが望ましい。徐放期間は好ましくは約１〜３週間である。
徐放性担体は、生体内で分解吸収される性質を持つものが好ましく、例えば、足場材料として例示した上記材料が好ましく用いられる。これらの材料から細胞増殖因子の徐放性担体を作製することができるが、細胞膜成分との均一な混合ができることからミクロ粒子の形態の担体が好ましい。ミクロ粒子の直径は１０〜５００μｍ、好ましくは２０〜１００μｍである。
徐放性の調節は、徐放性担体の分解性を選択又は調節することによって行い得る。分解性の調節は、例えば、担体調製時における架橋度を変えることによって行い得る。徐放期間を１〜３週間とするには、例えば、担体作製時における架橋剤濃度あるいは反応時間を調節し、含水率を９４〜９８％とする。
本発明の脂肪組織由来多能性幹細胞をインビトロで増殖・分化するための培地としては、従来の多能性幹細胞の培養に用いられる培地であれば特に限定されないが、増殖・分化の効率や速度の点からは、α−ＭＥＭ培地（α−ＭＥＭ、炭酸水素ナトリウム、ペニシリン、及びＦＣＳを含む培地）が挙げられる。骨分化誘導の場合には、骨分化培地（β−グリセロホスフェート、Ｌ−アスコルビン酸及びデキサメタゾンを含有するα−ＭＥＭ培地）等が特に好ましい。
実施例
以下、実施例をあげて本発明について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１  脂肪組織由来多能性幹細胞の単離
乳癌切除時に患者（６０歳）の同意を得た上で、周囲正常部位の脂肪組織（約５ｇ）を摘出し、カルシウム・マグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ）で洗浄し、余分な血球成分を洗い流した。次に、脂肪組織のみを目視で選別し、黄色部分を中心に米粒大の大きさに、はさみを用いて細断した。この脂肪組織に、コラゲナーゼ溶液〔コラゲナーゼＳ−１（新田ゼラチン製、最終濃度２ｍｇ／ｍｌ）及びウシ血清アルブミン（Ｎａｃａｌａｉ社製、最終濃度２０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ：Ｆ−１２の１：１混合物（Ｓｉｇｍａ社製）に溶かし、０．２２μｍフィルターでろ過したもの〕５ｍｌを加えて、ウォーターバス付きシェーカーを用いて１時間振盪しながらインキュベートし（３７℃、１００回／分）、脂肪組織を分散させた。この処理溶液を孔径が２００μｍのナイロンメッシュによってろ過し、コラゲナーゼ消化されていない組織片などを取り除いた。ろ液に、増殖用培地〔１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＩＣＮ社製）、１００単位／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１μｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有する１９９培地（（Ｓｉｇｍａ社製））〕１０ｍｌ及び０．２ＭのＥＤＴＡ〔二ナトリウム二水素エチレンジアミン四酢酸二水和物（Ｎａｃａｌａｉ社製）〕／ＣＭＦ−ＰＢＳ１ｍｌを加え、混合し、次いで遠心分離（１２００ｇ、５分間）した。成熟脂肪細胞を含有する上清を除去し、増殖用培地１０ｍｌを用いて、もう一度同様の操作を行った。デカンテーションにより上清を捨て、１９９培地溶液１５ｍｌを加え、ピペッティングによって細胞を良く分散させた後、この細胞懸濁液（血球成分及び脂肪前駆細胞などを含む）を７５ｃｍ２の培養フラスコ（コーニング社製、Ｔ−７５）に播種した（約１．５×１０４個）。
不要な血球、特に、白血球を除去し、かつ、より高い生存度及び生理活性を有する細胞を取得するために、以下の操作を行った。３７℃、５％二酸化炭素の条件下で２４時間培養した。その後、フラスコを静かに揺らすことによって脂肪前駆細胞を剥離することなく血球細胞のみを剥離して培地中に浮遊させ、浮遊した細胞を培地とともにデカンテーションにより捨てた。新しい増殖用培地１５ｍｌをフラスコに加え、コンフルエント状態になるまで更に１０日間培養を続けた。ただし、培地は２〜３日毎に一度新しいものと交換した。白血球等を培養操作により除去することによって得られた脂肪組織由来多能性幹細胞の生存度は、従来の単離方法によって得られた細胞に比べて高まった。また、白血球等を除去することによって、白血球等に由来する負の免疫生体反応の寄与を除くことができた。
実施例２  ポリグリコール酸（ＰＧＡ）不織布上での培養
２−１  脂肪組織由来多能性幹細胞の初代培養
実施例１で得たコンフルエント状態の脂肪組織由来多能性幹細胞を、４枚の直径１５０ｍｍの培養ディッシュ（コーニング社製）に再播種した。培地は、上記増殖用培地を用いた。２日間の培養で５０〜８０％の集密度になり、培養ディッシュ４枚の全細胞数は３．９×１０６個であった。
２−２  ＰＧＡ不織布の調製
ＰＧＡ不織布（グンゼ社製、８プライ）を９６ウェルサイズにくりぬき、７０％エタノール（Ｎａｃａｌａｉ社製）に４日間浸漬した。播種する直前にαＭＥＭ培地で２回洗浄し、アスピレーターで余分な培地を吸い取った。
２−３  骨分化培地成分の調製
（１）β−グリセロ（１００×）：β−グリセロホスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）５．４ｇをαＭＥＭ溶液２５ｍｌに溶かし、０．２２μｍフィルターでろ過し、１ｍｌずつ分注し、−２０℃で保存した。
（２）Ｖｃ（１００×）：Ｌ−アスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）３２ｍｇをαＭＥＭ溶液２５ｍｌに溶かし、０．２２μｍフィルターでろ過し、１ｍｌずつ分注し、−２０℃で保存した。
（３）Ｄｅｘ（１００×）：デキサメタゾン（Ｎａｃａｌａｉ社製）１ｍｇを７０％エタノール２５．５ｍｌに溶かした溶液０．２５ｍｌをαＭＥＭ溶液２４．７５ｍｌに溶かし、０．２２μｍフィルターでろ過し、１ｍｌずつ分注し、−２０℃で保存した。
２−４  不織布上への脂肪組織由来多能性幹細胞の播種と培養
実施例２−１で得られた脂肪組織由来多能性幹細胞の懸濁液を２．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に調整し、９６ウェルプレート〔（コーニング社製）各ウェル内に上記不織布を１枚置いたもの〕の各ウェル当たり１００μｌずつ細胞懸濁液を分注した（実質的に不織布１枚当たり２．５×１０５細胞）。これを、３７℃、５％二酸化炭素の条件下で２時間培養した。培養後、プレートを１０００ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離した。上清を捨て、不織布を６ウェルプレート（コーニング社製）に移し（１ウェル当たり不織布２枚）、培地を１ウェル当たり６ｍｌ加えた。このとき用いた培地は、αＭＥＭ溶液（普通培地）、又はαＭＥＭ溶液に骨分化培地成分（１）〜（３）を各０．５ｍｌずつを加えた培地（骨分化培地）であった。培地を２〜３日毎に新しい培地と交換しながら、２週間インビトロで培養した。多能性幹細胞を普通培地又は骨分化培地で培養した群につき６枚ずつの不織布を上記の通りに培養し、ヌードマウスの背部皮下への埋め込み実験に供した。
実施例３．電子顕微鏡による観察
２％グルタルアルデヒド〔グルタルアルデヒド（Ｎａｃａｌａｉ社製、電子顕微鏡用）にＣＭＦ−ＰＢＳを加えたもの〕に実施例２−４に記載の通りに培養した不織布を浸漬し、４℃で１時間固定した。ＣＭＦ−ＰＢＳで３回洗った後、１％オスミウムに不織布を浸漬し、４℃で１時間固定した。ＣＭＦ−ＰＢＳで３回洗った後、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％及び１００％エタノール（Ｎａｃａｌａｉ社製）で逐次的にそれぞれ１０分間ずつ浸漬し、脱水を行った。トリブチルアルコール（和光純薬社製）１０分間浸漬による脱水を２回行った。凍結乾燥機（日立社製、ＥＳ−２０３０）で凍結乾燥した後、走査型電子顕微鏡（日立社製、Ｓ−２３８０Ｎ）で不織布への付着細胞を観察するとともに不織布のＥＤＸ（Ｅｎｅｒｇｙ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ  Ｘ−ｒａｙ）分析を行い、リン酸カルシウムの検出を行った。図１に、脂肪組織由来多能性幹細胞を骨分化培地（Ａ）及び普通培地（Ｂ）で培養した後の不織布の走査型電子顕微鏡写真を示す。また、図２には、その不織布のＥＤＸ分析結果を示す。（Ａ）及び（Ｂ）は図１と同義である。
電子顕微鏡観察によって、脂肪組織由来多能性幹細胞が不織布のＰＧＡ繊維表面に付着していることがわかる。また、骨分化培地を用いて培養した場合には、細胞そのものは認められず、組織が何かの物質で覆われているように見える。この物質をＥＤＸで測定したところ、リン酸カルシウム又はハイドロキシアパタイトであることが確認された。このことは、脂肪組織由来多能性幹細胞を不織布に播種した後、骨分化培地で培養することによって、インビトロにおいて細胞が骨芽細胞へと分化し、骨形成を起こしたと考えられる。
実施例４．ヌードマウスへの埋め込み
４−１．徐放性ゼラチン粒子の作製
１０００ｍｌ容の丸底フラスコにオリーブ油３７５ｍｌを加え、固定した撹拌用モーター（新東科学社製、スリーワンモーター）にテフロン製撹拌用プロペラを取り付け、フラスコに固定した。オリーブ油を３０℃、４２０ｒｐｍにて撹拌しながら等電点４．９のアルカリ処理ゼラチン（新田ゼラチン社製）の水溶液（１０ｗｔ％、１０ｍｌ）を滴下し、Ｗ／Ｏ型エマルションを調製した。１０分間の撹拌後、フラスコを１０〜２０℃に冷却し、さらに、３０分間撹拌した。このエマルションにアセトン１００ｍｌを加え、さらに１時間撹拌した後、遠心分離（５０００ｒｐｍ，４℃、５分間）によりゼラチン粒子を回収した。アセトンさらに２−プロパノールを用いて粒子を遠心洗浄することによって、未架橋のゼラチン粒子を得た。得られた未架橋ゼラチン粒子（５００ｍｇ）を０．０１ｗｔ％濃度のグルタルアルデヒドを含む、０．１ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ  ８０の水溶液（１００ｍｌ）に懸濁させ、４℃で１５時間緩やかに撹拌することによってゼラチンの架橋反応を行った。その後、粒子を０．１ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ  ８０の水溶液、２−プロパノール、蒸留水で２回ずつ洗浄した後、凍結乾燥した。２−プロパノールからの風乾時あるいはＰＢＳ中、３７℃での平衡膨潤時における粒子の直径を、それぞれ１００個粒子について顕微鏡にて測定した。膨潤状態の粒子の体積に対する粒子に含まれる水の体積の比として含水率を算出したところ、その含水率は約９５ｖｏｌ％であった。また、膨潤時における粒子の平均粒径は４０μｍであった。
なお、この含水率９５％の粒子を１２５Ｉにより標識した後、マウス皮下に投与したところ、投与部位での放射活性は時間とともに減少した。その放射活性は１４日後にゼロとなった。次に、ｂＦＧＦを１２５Ｉにより標識し、ゼラチン粒子に含浸した後、上記と同様にマウス背部皮下に投与して、放射活性の時間的変化を調べたところ、その放射活性の残存の時間依存性は粒子の場合とほぼ同じであった。このように、この粒子の分解とともにｂＦＧＦはインビボで徐放化された。このゼラチン粒子からのｂＦＧＦの徐放化期間は１４日であることが判った。
実施例４−２．ゼラチン粒子へのｂＦＧＦの含浸
実施例４−１で得た凍結乾燥ゼラチン粒子（不織布１枚当たり２ｍｇ）をＥＯＧ滅菌にかけた。ｂＦＧＦが不織布１枚当たり１００μｇとなるように、ｂＦＧＦ水溶液を凍結乾燥ゼラチン粒子（２ｍｇ）に２０μｌ添加し、室温で１２時間放置することによって、ｂＦＧＦ含浸ゼラチン粒子を得た。
実施例４−３．ヌードマウスへの埋め込み
実施例４−２で得られたｂＦＧＦ含浸ゼラチン粒子にＣＭＦ−ＰＢＳ５０μｌを加え、ゼラチン粒子を分散させた。この分散液を、実施例２−４の培養後に培地から取り出した不織布の上に滴下した。この不織布をすぐにヌードマウス（系統名：ＢＡＬＢ／ｃ、週齢：６週齢、性別：雌、供給元：清水実験動物）の背部皮下の脂肪組織のない部位に埋め込んだ（ｎ＝３）。３週間後皮膚を剥離し、埋入した不織布の写真を撮るとともに、不織布内に新生した組織をｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色し、観察した。２０％中性緩衝化ホルマリンにて不織布に付着している細胞及びその産生物を固定し、切片を作製し、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色した。ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色で黒く染まるのはリン酸カルシウムであり、これが認められることは骨が形成されたことを意味する。その光学写真を図３に、またその組織切片を図４に示す。
ｂＦＧＦ含浸粒子との混合によらず、骨分化培地で培養した場合には、不織布の色は白味を帯び、硬くなっていた。これらの観察結果は、骨分化培地で培養した場合には、ｂＦＧＦ含浸ゼラチン粒子の有無に関係なく、埋入することによってインビボで骨形成が誘導されたことを示している。図４からわかるように、骨分化培地で培養した群においては、ｂＦＧＦ含浸ゼラチン粒子の混合の有無によらず、組織切片中に黒く染色された部分が点在している。これは、リン酸カルシウムの沈着を示している。一方、普通培地培養群では、このような染色像は認められなかった。つまり、脂肪組織由来多能性幹細胞を骨分化培地で培養後、マウス背部皮下に埋入することによって、骨組織が再生されたことがわかった。増殖用培地での培養、埋入群では、そのような変化は、この３週間埋入時では見られなかった。
実施例５．脂肪組織由来多能性幹細胞の神経細胞への分化誘導
脂肪組織由来多能性幹細胞の神経細胞への分化誘導は、Ｗｏｏｄｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌの方法に準じて行った（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６１，３６４−３７９（２０００）Ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎｓ．）。
実施例２−１で増殖させた脂肪組織由来多能性幹細胞を、１×１０５細胞／ｍｌの細胞密度に希釈し、チャンバースライド付シランコーティングスライドグラス（Ｄａｋｏ社製）に播種した。２４時間静置培養し（３７℃、５％ＣＯ２）、細胞をスライドグラス上に接着させた後、細胞表面をＣＭＦ−ＰＢＳで洗浄し、次いで血清含有神経分化培地〔ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）／２０％ＦＳＣ（ＩＣＮ社製）／１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）〕を加え、更に２４時間培養した。そして、細胞表面をＣＭＦ−ＰＢＳで洗浄し、次いで血清不含神経分化培地〔ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）／１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）〕を加え、更に２４時間静置培養した。この細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定（室温、１時間）し、位相差顕微鏡を用いて細胞形態を撮影した（図５）。
図５には、神経分化培地で培養した前後の脂肪組織由来多能性幹細胞の位相差顕微鏡写真を示している。明らかに両者の間に細胞形態に違いが認められている。つまり、分化培地で培養することによって、細胞からの突起が出現している。この突起は、神経突起であり、このことは、上記培地で培養することによって、脂肪組織由来多能性幹細胞が神経細胞に分化したことを示している。
産業上の利用可能性
本発明によれば、脂肪組織から採取された脂肪組織由来多能性幹細胞を用いることによってインビトロ及びインビボにおいて、例えば、骨組織を形成させることができる。この効果は、従来のＭＳＣと同様の増殖分化のポテンシャルを脂肪組織由来多能性幹細胞が有していることを示している。
また、本発明では、この脂肪組織由来多能性幹細胞と足場材料とを組み合わせることによって、組織再生用の材料を供給することもできる。細胞増殖因子との組合わせは、再生する組織により、場合により必要となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、骨分化培地（Ａ）又は普通培地（Ｂ）中で培養された脂肪組織由来多能性幹細胞を含む不織布である。
図２は、骨分化培地（Ａ）又は普通培地（Ｂ）中で培養された脂肪組織由来多能性幹細胞を含む不織布のＥＤＸ分析である。
図３は、埋入３週間後の不織布である。（Ａ）：骨分化培地で培養した脂肪組織由来多能性幹細胞、（Ｂ）：普通培地で培養した脂肪組織由来多能性幹細胞、（Ｃ）：骨分化培地で培養し、ｂＦＧＦ含浸粒子と混合して埋入した脂肪組織由来多能性幹細胞、（Ｄ）：普通培地で培養し、ｂＦＧＦ含浸粒子と混合して埋入した脂肪組織由来多能性幹細胞。
図４は、埋入３週間後の不織布のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色組織切片である。（Ａ）〜（Ｄ）は図３と同義である。
図５は、神経分化培地中で培養する前（Ａ）又は後（Ｂ）の脂肪組織由来多能性幹細胞である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2003008592.tif 000008