(57)【要約】基板上にアレー状に配列されたプローブ分子群すなわちバイオチップを、簡便に、かつ、未結合分子の洗浄が可能なように、また、作製過程においてプローブ分子を乾燥させて変性させてしまうことなく作る方法を提供する。本発明に係る方法は、基板上に分子認識のパターンを有するバイオチップの作製方法であって、以下のステップ：（１）一つ一つ取り扱える程度の大きさの粒子を用意し；（２）試験管内で上記粒子に分子認識を行うプローブを固定し；（３）上記粒子を、機械的な手段により、上記プローブの種類ごとに、搬送して、上記基板上の特定の位置に配置し；そして（４）上記配置された粒子を上記位置に固定する、を含む前記方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に分子認識のパターンを有するバイオチップの作製方法であって、以下のステップ：
（１）一つ一つ取り扱える程度の大きさの粒子を用意し；
（２）試験管内で上記粒子に分子認識を行うプローブを固定し；
（３）上記粒子を、上記プローブの種類ごとに、搬送して、上記基板上の特定の位置に配置し；そして
（４）上記配置された粒子を上記位置に固定する、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記プローブが、オリゴヌクレオチド、糖鎖、及び抗体を含むタンパク質から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子の直径が、５０μｍ〜５ｍｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子が、磁性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基板が、前記粒子を配置又は配列するための、凹凸パターン又は磁気パターン又はその両者を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記基板上への前記粒子の固定が、前記基板上の磁気パターンによる前記磁気粒子の吸着による、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子の固定が、前記基板上の凹凸パターンの凹部への前記粒子の嵌合又は入り込みによる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記パターンが、２次元状に周期的に配置又は配列されたパターンである、請求項１又は５に記載の方法。
【請求項９】
前記基板の凹部に前記粒子が導入された後に、前記基板を上から半透膜又は多孔質膜で覆い蓋をする、請求項１又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規バイオチップ作製方法に関する。
背景技術
ＤＮＡ上の特定の塩基配列を検出する手法として、いわゆるＤＮＡチップがある。その原理は次のようである。１）基板上にさまざまな配列を持つオリゴヌクレオチド（塩基を数個〜２０個程度持つＤＮＡ）を２次元アレー状にパターニング・固定しておき、２）蛍光プローブをつけたＤＮＡ試料をこのチップ上に撒き、３）蛍光顕微鏡下で、どの位置に結合するかを見る。ＤＮＡの結合は相補性により生ずるので、もし、試料ＤＮＡがある位置に結合したとすると、結合した位置に固定されていた配列と相補的な配列が試料ＤＮＡ上に存在するはずである。すなわち、パターン上の結合位置から、試料ＤＮＡの持つ配列が検出できることになる。このＤＮＡチップと同様に、基板上に抗体等の分子認識性のタンパクをパターニング・固定しておけば、抗原等の検出が行えるプロテインチップ、糖鎖をパターニング・固定しておけば、糖鎖に結合する分子を検出するチップとなる。
これらはすべて、多数の「プローブ」を基板上のあらかじめ定まった位置に整然と固定しておき、外来分子との結合が生じた位置を検出することにより、分子の同定を行うことを原理としている。
基板上にプローブを配列する手法としては、金属ピン等を用いてプローブ溶液をガラス基板に１つずつ丹念に塗布していく方法、インクジェットを用いて塗布する方法、光パターニングにより部位選択的に化学合成を行う方法などが開発されている。
溶液を塗布する方法やインクジェットを用いて塗布する方法は、塗布した溶液が乾燥する際にプローブ分子が基板に吸着されることを固定の原理としている。たとえばタンパクは一旦乾燥してしまうと、その生理活性そのものが変化してしまう可能性があり、この点からは、塗布による方法はあまり好ましいとは言えない。また、光パターニングにも、光照射による分子の損傷といった問題点もある。
一方、通常の生化学においては、表面にプローブを固定した直径数ミクロン〜数十ミクロンの微粒子懸濁液を７２ウェル（穴）のペトリディッシュに入れておき、これとの反応を見ることがしばしば行われる。この方法の問題点としては、１枚のペトリディッシュを用いて行うことができる検査の数が７２個に限定されること、微粒子がディッシュに固定されていないため結合しない分子を洗浄しようとすると微粒子自体が洗い流されてしまうこと、各々のウェルにピペットで分注する手間が大変なこと、などが挙げられる。１つのウェルの中に、何種類かの蛍光色・蛍光強度でタグをつけた微粒子を入れることにより、等価的に１枚のペトリディッシュあたりの検査数を増やす試みもあるが、蛍光色・蛍光強度の計測は複雑なシステムを要求する。
発明の開示
本発明においては、１個１個取り扱える程度の大きさの粒子を用意し、試験管内でこの粒子の表面に分子認識を行うプローブを固定し、機械的な手段により個々の粒子を搬送し、表面に固定されたプローブの種類ごとに基板上の定まった位置に配置・固定することにより、基板上に分子認識プローブのパターンを作製する。
本発明の１の態様においては、基板上に分子認識のパターンを有するバイオチップの作製方法であって、以下のステップ：
（１）一つ一つ取り扱える程度の大きさの粒子を用意し；
（２）試験管内で上記粒子に分子認識を行うプローブを固定し；
（３）上記粒子を、上記プローブの種類ごとに搬送して、上記基板上の特定の位置に配置し；そして
（４）上記配置された粒子を上記位置に固定する、
を含む、前記方法が提供される。
前記プローブは、オリゴヌクレオチド、糖鎖、及び抗体を含むタンパク質から成る群から選ばれることができる。
前記粒子の直径は、５０μｍ〜５ｍｍであることができる。
前記粒子は、磁性を有することができる。
前記基板は、前記粒子を配置又は配列するための、凹凸パターン又は磁気パターン又はその両者を有することができる。
前記粒子の、前記基板上への固定は、前記基板上の磁気パターンによる前記磁性粒子の吸着によることができる。
前記粒子の固定は、前記基板上の凹凸パターンの凹部に前記粒子が嵌合し又は入り込むことにより行われることができる。
前記パターンは、２次元状に周期的に配置又は配列されたパターンであることができる。
本発明の他の態様においては、前記基板の凹部に前記粒子が導入された後に、前記基板を上から半透膜又は多孔質膜で覆い蓋をすることができる。このように蓋をすることは、例えば、乾燥を防止するために有効であり、ここで、半透膜又は多孔質膜は、これに限定されないが、例えば、メンブレンフィルターや不織布を含む。
発明を実施するための最良の形態
図１は、本発明の実施例を、１−１，１−２…４−４の１６種類のプローブのパターンを作製する場合を例として図示したものである。
参照番号１は、プローブ固定粒子２の入った試験管である。試験管の形状は、図１で示される形状の他、粒子を搬送しやすい形状を有する場合、プローブを固定しやすい構成を有する場合、或いは、プローブを粒子に固定する空間とプローブを固定した粒子を収容する空間の２つに分かれている場合等が例示されうるが、この様な例示構成にも限られない。
参照番号２は、プローブを表面に固定した粒子である。図１で示すような球状に限らず他の形状であってもよい。
参照番号３は、整然とした一定の配列をもつ凹凸構造を持つ基板であり、シリコンやプラスチック等で形成され、透光性部材で構成される場合もあるが、これらに限定はされない。
参照番号４は、基板上のアドレスを示すマーカーである。図１で示される記号の他、粒子が目視又は機械的、電気的、磁気的、光学的、その他様々な手段で識別、認識できればよい。
参照番号５は、粒子を固定する窪み（凹部）であり、窪み５は、深さが少なくともプローブを固定した粒子が固定できる程度の凹凸である場合や粒子の直径以上の深さである場合であってもよく、又は１つ（場合によっては複数）の粒子が固定できる程度の広さ、形状、深さがあればよい場合もあり、図１に示すものに限られるものではない。
参照番号６は、粒子を固定するための磁石であり、磁石６と窪み５は、図１で示すように両方ある場合の他、一方のみの場合もある。
参照番号７は、搬送手段による粒子の搬送経路である。
参照番号８は、粒子搬送手段として用いるロボットアームである。搬送手段８による粒子の搬送は凡そ一つ一つ（一つ以上、好ましくは一つ一つ）行われればよく、搬送の状況に応じ適宜調整される。搬送経路７も一例であり、試験管１より、基板３に粒子が搬送され、窪み又は磁力発生部位又はこれらの組み合わせた所定部位に固定されればよく、その搬送経路も適宜調整される。
まず、粒子として磁性粒子を用い、１６種類のプローブすべてに対し、各々のプローブを表面に固定した粒子を、試験管１内に用意する。磁性粒子としては、金属粒子、金属粒子の表面をプラスチックコーティングしたもの、磁性体粉を含むプラスチック粒子などが含まれ、プローブの粒子表面への固定には、プローブ分子を分子リンカーを用いて粒子表面に固定する手法、粒子表面上で直接合成する手法などがある。これと並行して、基板上に、窪み（凹部）５を２次元アレー状に配列する。各々の窪み５の下には磁石６を配置する。磁石６は、永久磁石であっても磁性体を外部磁化により一時的に磁化したものであってもよい。次に、基板３上を水溶液で満たしておいて、ロボットアーム等の搬送手段８により、１６種類の試験管１からプローブ固定粒子２を一つ一つ取り出し、２次元アレー状窪み５の相当する位置に一つづつ置く（搬送経路７）。置かれた粒子は窪み５下の磁石６により固定される。
以上のプロセスや、水溶液中または粒子表面が乾燥しない条件下で容易に行うことができるので、乾燥によるプローブの活性低下は生じない。また、本発明で用いる粒子は個々の扱いが可能な直径５０μｍ以上の粒子であり、生化学的アッセイで一般に用いられるラテックス粒子より粒径が大きいため、働く磁力が大きく、相対的に流れの影響を受けにくいので、基板上に固定した後のサンプルの導入や洗浄等の過程においても流れにより洗い出されてしまうことはない。
本発明によるバイオチップ作製方法によれば、プローブの乾燥をともなわず、高い集積度のバイオチップを簡便に作製できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明によるバイオチップの作製を示す概略図である。
参照番号の一覧表
１…プローブ固定粒子の入った試験管
２…プローブを表面に固定した粒子
３…整然とした凹凸構造を持つ基板
４…基板上のアドレスを示すマーカー
５…粒子を固定する窪み（凹部）
６…粒子を固定するための磁石
７…搬送手段による粒子の搬送経路
８…粒子搬送手段として用いるロボットアーム
【図１】
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【国際調査報告】
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