(57)【要約】ヒトに病原性のないウイルスを利用したウイルスベクターを主成分とする、病原性の再獲得の可能性のないウイルスベクターワクチン製剤を提供することを課題とし、本発明は、抗原をコードする遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを主成分とするワクチン製剤を提供する。
2002062381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原をコードする遺伝子を組み込んだヒト非宿主ウイルスを主成分とするワクチン製剤。
【請求項２】
ヒト非宿主ウイルスがバキュロウイルスである、請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項３】
抗原が、ウイルスの膜タンパク質抗原である、請求項１または２に記載のワクチン製剤。
【請求項４】
ウイルスの膜タンパク質抗原が、インフルエンザＨＡ抗原である、請求項３に記載のワクチン製剤。
【請求項５】
さらにアジュバントおよび／または薬学的に許容し得る担体を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン製剤。
【請求項６】
鼻腔投与されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、病原性がなく、病原性の再獲得の可能性もない、抗原を持続的に生体に作用させることができるワクチン製剤を提供することに関する。
背景技術
従来、ヒトの遺伝子治療などに用いられてきたウイルスベクターのほとんどは、アデノウイルスなどのヒトに病原性を示すウイルス由来であり、病原性を抑制した弱毒株などが利用されている。しかしながら、その病原性をコードしている遺伝子は完全には除去されていないため、宿主の細胞性免疫反応により感染細胞ごと宿主から排除されてしまい、結果として遺伝子の発現が一過性に留まることとなる。また、アデノウイルスやワクシニアウイルスなどの、すでにヒトに対して免疫をもつウイルスでは、中和抗体の存在により早期にウイルスが中和されてしまっていた。すなわち、アデノウイルスやワクシニアウイルスなどを利用したウイルスベクターを連続投与すると、中和抗体の存在により治療効果が低下してしまっていた。さらに、レトロウイルスなどでは、宿主遺伝子への挿入変異によるプロトオンコジーンの活性化や細胞障害性等の問題があり、増殖性ウイルスとの交雑における病原性の再獲得も懸念される。
生体に対し感染性を有する組み換えウイルスベクターワクチンは、感染細胞内で外来性抗原を産出するため、本来の病原性抗原と同等の抗原分子形態、すなわち、オーセンティックなプロセッシング、糖鎖付加、リン酸化等の修飾をもたらす。このことは、よりネイティブな抗原性を有するとともに強い免疫原性を引き起こす。さらに、液性免疫に加え、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を介した細胞性免疫の誘導も期待される。現在、開発の進んでいる既存ウイルスベクターには、アデノウイルス（Ｌｅｅ  Ｈ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．，（１９９１））、ワクシニアウイルス（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．，７，（１９８９））等がある。遺伝子組み換えワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスの複製非必須領域に外来抗原遺伝子を挿入したものであり、複製はしないが感染性は有するもので、大腸菌におけるプラスミドのように遺伝子発現ベクターとして応用したものである。しかしながら、種痘に用いられたワクシニアウイルスでは、わずかながら一過性脳炎等の発症が認められたため（Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．（１９８８））、インフルエンザに対する生ワクチンと同様に温度感受性弱毒株が開発されている。また、ワクシニアウイルスも含め、既存ウイルスベクターワクチンに応用されているウイルスはヒトに病原性を示すものが多く、弱毒株の選出においても完全には毒性復帰の不安定要素は拭きれないことが示唆されている。
また、大部分の病原体の付着・侵入が、皮膚や粘膜を介し、その感染は、主に、鼻粘膜、喉頭・咽頭粘膜や消化管粘膜などの経粘膜感染であることから、感染を防御するために、分泌型ＩｇＡ抗体を粘膜表面上に誘導することが考えられている。このようなＩｇＡ抗体の粘膜表面上への誘導は、皮下接種では困難で、経口免疫や経鼻免疫などの経粘膜ワクチンにより行なわれている（武川寛樹ら、「経口ワクチン」、医学のあゆみ、１８１巻９号７３４頁、１９９７年）。しかしながら、従来の粘膜系に分布するリンパ組織を利用したワクチン開発は、ポリオウイルス、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ラビエスウイルス、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）などのヒト病原性ウイルスなどを利用することで行なわれており、毒性復帰などの不安定要素を含んでいた。
従来、昆虫を始めとする多くの前足動物をその感染宿主域としたバキュロウイルスを用いたタンパク質の産生は知られている。特開平７−２２８５９５号には、バキュロウイルスを用いてオーエスキー病ウイルスｇＩＩタンパク質を産生し、この産生したタンパク質をバキュロウイルスから精製し、ワクチンとして用いることが開示されている。
近年、臨床効果ならびに安全性の点で問題のある不活化ワクチンや生ワクチンとは異なり、抗原情報をコードしている遺伝子（ＤＮＡ，ＲＮＡ）を直接生体に投与することで免疫応答を誘導する遺伝子ワクチン（ＤＮＡ，ＲＮＡワクチン）が注目されている（Ｕｌｍｅｒ  Ｊ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２５９，（１９９３））。ＤＮＡワクチンは効果的なアジュバントと併用することにより、より高い免疫増強作用が得られる。しかしながら、現在のＤＮＡワクチンの問題点は投与量と発現量の低さであることが指摘されており、筋肉、皮肉内にて充分な免疫応答を得るには最低数百マイクログラムのＤＮＡが必要とされ、遺伝子銃等の物理的な手法を用いても主として誘導されるのは液性免疫であり、細胞性免疫の誘導は低い。
一方で、バキュロウイルスが、ヒト肝細胞を含むさまざまな動物細胞に感染可能であることが示されている（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｃ．，Ｓａｎｄｉｇ，Ｖ．，Ｊｅｎｎｉｎｇ，Ｇ．，Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｍ．，Ｓｃｈｌａｇ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍ．（１９９５）．”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ｓｃｉ  ＵＳＡ．９２，１００９９−１０１０３、Ｓｈｏｊｉ  Ｉ．，Ａｉｚａｋｉ  Ｈ．，Ｔａｎｉ  Ｈ．，Ｉｓｈｉｉ  Ｋ．，Ｃｈｉｂａ  Ｔ．，Ｓａｉｔｏ  Ｉ．，Ｍｉｙａｍｕｒａ  Ｔ．，ａｎｄ  Ｍａｓｙｕｕｒａ  Ｙ．（１９９７）．”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｎｏｎ−ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｂｙ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８，２６５７−２６６４、および  Ｂｏｙｃｅ，Ｆ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂｕｃｈｅｒ，Ｎ．Ｌ．Ｒ．（１９９６）．”Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ｓｃｉ  ＵＳＡ．９３，２３４８−２３５２）。
また、バルソウムら（Ｂａｒｓｏｕｍ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８，２０１１−２０１８（１９９７））により、エンベロープにおいて、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のＧ糖タンパク質が発現しているバキュロウイルスを用いて、ほ乳類の細胞に形質導入することが開示されている。
しかしながら、これまで、バキュロウイルスを用いて発現、精製したタンパク質をワクチンに用いることは知られていたが、バキュロウイルスベクター自体（ウイルス粒子やウイルス核酸）をワクチン製剤として用いることについては、これまで示されていなかった。
従来のアデノウイルスやワクシニアウイルスなどを利用したウイルスベクターを遺伝子ワクチンとして利用する場合、ウイルスの病原性再獲得の虞がある。また、通常これらのヒトが感染する可能性の高いウイルスについては、多くのヒトは感染の経験があり、中和抗体をもつこととなり、免疫反応によってウイルスワクチンを導入できないなどの問題があった。
これらの問題を解決するために、遺伝子ワクチンとして利用可能であって、ヒトに病原性のないウイルスを利用したウイルスベクターが望まれていた。
発明の開示
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、バキュロウイルスのような、自然状態でヒトを宿主とせず、ヒトに病原性がない昆虫病原ウイルスなどを利用したウイルスベクターを、ウイルスベクターワクチン製剤として用いることで、持続的に抗原を発現し、病原性を再獲得しないワクチン製剤を提供できることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、抗原をコードする遺伝子を組み込んだヒト非宿主ウイルスを主成分とするワクチン製剤に関する。
また、本発明は、ヒト非宿主ウイルスがバキュロウイルスである、前記のワクチン製剤に関する。
さらに、本発明は、抗原が、ウイルスの膜タンパク質抗原である、前記のワクチン製剤に関する。
また、本発明は、ウイルスの膜タンパク質抗原が、インフルエンザＨＡ抗原である、前記のワクチン製剤に関する。
さらに、本発明は、さらにアジュバントおよび／または薬学的に許容し得る担体を含む、前記のワクチン製剤に関する。
また、本発明は、鼻腔投与されることを特徴とする、前記のワクチン製剤に関する。
ヒトが、インフルエンザウイルスなどのような、自然状態でヒトを感染宿主域とし、ヒトに感染性のあるウイルスの感染を受けると、感染ウイルスに対する中和抗体を産生する。したがって、ワクチン製剤に用いるウイルスベクターとして、インフルエンザウイルスなどのヒト病原性ウイルスを用いると、すでにヒトの体内に存在する中和抗体のため、ワクチン製剤の効果が充分に高められない可能性がある。
これに対し、本発明において用いられるヒト非宿主ウイルスは、通常、ヒトが感染を受けることがない。すなわち、ワクチン製剤として、ヒト非宿主ウイルスを用いた場合、ヒトには、その中和抗体がないために、高いワクチン製剤の効果が得られる。なお、本明細書におけるヒト非宿主ウイルスとは、自然状態でヒトを感染宿主としないウイルスを意味し、自然状態でヒトに感染しない昆虫ウイルスや植物ウイルスなどを意味する。
とくに本発明において好適に用いられる、昆虫病原ウイルスであるバキュロウイルスは、自然状態ではヒトを感染宿主とはしない。しかしながら、昆虫細胞だけでなく、ヒト肝細胞をはじめとする多くの哺乳動物細胞においても遺伝子発現が可能であり、さらに、適当なプロモーターの選択により、高い遺伝子の発現が可能である。また、バキュロウイルスはヒトに対する中和抗体をもたず、哺乳動物細胞内においては非増殖型ウイルスであり、そのため細胞に与える障害度は低く、これを用いることにより極めて有用なワクチン製剤とすることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に、ヒト非宿主ウイルスであるバキュロウイルスを応用したウイルスベクターワクチンを例に、本発明の実施の形態を説明する。
本発明のワクチン製剤は、所望の抗原となるポリペプチドを発現する遺伝子を組み込んだバキュロウイルス粒子またはバキュロウイルス核酸を主成分としたワクチン製剤であって、アジュバントおよび／または薬学的に許容し得る担体を含んでいてもよい。
本発明において、バキュロウイルスに組み込む遺伝子は、生体が免疫を獲得するための抗原をコードしていればよい。このような抗原としては、特に限定されないが、例えば、病原性のあるウイルスのエンベロープを形成する膜タンパク質などであれば、生体が病原性のあるウイルスに対する抗体を獲得することから好ましい。このようなウイルスの膜タンパク質抗原としては、ＨＡ抗原、ＮＰ抗原、Ｍ抗原、ＮＳ１抗原およびＮＡ抗原などのインフルエンザ由来の抗原などがあげられる。
本発明のワクチン製剤を投与する場合、ウイルスのエンベロープを破壊し、細胞内に取り込まれる効率を低下させる虞があることから、通常はアジュバントを用いないで投与する。また、本発明のワクチン製剤に用い得るアジュバントは、ウイルスのエンベロープを破壊しない限り、特に限定されない。
本発明のワクチン製剤に用い得る薬学的に許容し得る担体は、ウイルスのエンベロープを破壊しない限り、特に限定されず、例えば、アミノ酸、アルブミン、ポリエチレングリコールなどがあげられる。
本発明のワクチン製剤の投与方法は、特に限定されないが、鼻腔、筋肉、皮下、腹腔などへ投与することができる。本発明のバキュロウイルスベクターワクチン製剤を投与する場合、血流中の補体の作用を回避するように投与されるのが望ましく、鼻腔投与および腹腔投与などが好ましい。
また、本発明のワクチン製剤において、インフルエンザに由来する抗原を用いる場合、ワクチン製剤の投与方法は、鼻腔投与が特に好ましい。
本来、インフルエンザウイルスは空気伝染し、鼻腔など気道の粘膜にウイルス粒子が付着し感染する。インフルエンザウイルスが鼻腔の粘膜において感染すると、インフルエンザＨＡ抗原に効果的に応答する抗体、特にＩｇＡが産生され、免疫応答することとなる。このようなことを考え合わせると、病原性ウイルスの感染経路に即した投与が好ましいと考えられる。例えば、鼻腔粘膜から感染するインフルエンザに対するワクチン製剤の投与は、噴霧製剤などにより鼻腔から行なわれることが好ましい。
以下、本発明を、実施例を示しながら、さらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
［実施例］
実施例１  ＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスの作製及び各種哺乳動物細胞株における遺伝子発現の評価
Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４：Ｈ１Ｎ１）ＨＡ（血球凝集素；ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）遺伝子（山之内製薬探索研究所スクリーニング研究室  中田進博士よりｐＪＺ１０２（ＨＡ遺伝子挿入ベクター）を入手）をＣＡＧプロモーター（Ｃｈｉｃｋｅｎ  β−ａｃｔｉｎ由来のプロモーター）を有するバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＣＡＧ（国立感染症研究所  松浦善治博士より入手）に組み込み（図１Ａ）、ｓｆ−９細胞内における相同組み換え法によりＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスを作製した（図１Ｂ）。なお、ｓｆ−９細胞は、夜蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞）で、バキュロウイルスの増殖に汎用されている。ｓｆ−９細胞は、ファーミンゲン社製ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｐａｃｋａｇｅに含まれている細胞を使用した。ｓｆ−９細胞の培養は、昆虫細胞培養液（ＴＭＮ−ＦＨ；ファーミンゲン社製）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；三光純薬社）を１０％になるよう調製したものを用い、２７℃恒温インキュベーター内で培養をおこなった。
また、図中のＡｍｐｒは、アンピシリン耐性遺伝子を示す。ＣＡＧプロモーターは、Ｃｈｉｃｋｅｎ  β−ａｃｔｉｎ由来のプロモーターを示す。ウサギβグロビンポリＡシグナルは、ウサギβグロビン由来の翻訳終止シグナルを示す。ポリヘドリン遺伝子は、バキュロウイルスＤＮＡとの相同組み換え配列を含んだバキュロウイルスの遺伝子を示す。
構築した組み換えウイルスを５回経代増幅し、ウイルス力価を十分に高めた後、２５，０００ｒｐｍ、４℃、９０分間にて、１０％／６０％ショ糖密度勾配遠心法により組み換えウイルスの精製を行なった。
精製した組み換えバキュロウイルスの力価をプラークアッセイ（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）にて決定した後、各種哺乳動物細胞株における、（１）ＨＡ遺伝子の発現レベル、（２）細胞障害性（毒性）、および（３）ウイルス力価の評価を経時的に行なった。
（１）ＨＡ遺伝子の発現レベルについて
構築した精製組み換えウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡのさまざまな哺乳動物細胞株におけるＨＡ遺伝子の発現レベルを、ＦＩＴＣ標識抗ＨＡＭＡｂ（デンカ生研社製）を用いた蛍光抗体法において確認した。すなわち、精製組み換えバキュロウイルスをｍ．ｏ．ｉ  ５０において３７℃、２時間吸着感染させ、２４時間後にＦＩＴＣ標識抗ＨＡＭＡｂを反応させてから共焦点レーザー顕微鏡で観察した。なお、ｍ．ｏ．ｉは、ウイルス感染価ともいい、感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を示し、ウイルスを細胞に感染させる場合の１細胞あたりの平均感染性ウイルス数をいう。
観察の結果、ヒト肝細胞株（Ｈｕｈ−７）などで特に強い蛍光強度が観察された（図２（Ａ））。なお、図２（Ｂ）は、対照として、ヒト肝細胞株（Ｈｕｈ−７）を明視野で観察した結果を示す。
（２）細胞障害性（毒性）について
細胞障害性の評価は、各種哺乳動物細胞株を９６ウェル細胞培養プレートに２×１０４細胞／ウェルで培養した後、ｍ．ｏ．ｉ  １００から段階希釈した組み換えウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡを接種し、１、３、５日後にＭＴＴ試薬を加え、吸光マイクロプレートリーダーにて５４０／６９０ｎｍの吸光度を測定して生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を算出した。
試験した哺乳動物細胞株は、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌由来；理研遺伝子ＢＡＮＫより入手）、ＭＤＣＫ（イヌ腎皮質由来；理研遺伝子ＢＡＮＫより入手）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌由来；理研遺伝子ＢＡＮＫより入手）、Ｈｕｈ−７（ヒト肝細胞癌由来；理研遺伝子ＢＡＮＫより入手）、ＣＰＫ（ブタ腎臓細胞由来；理研遺伝子ＢＡＮＫより入手）、Ｃ１２７（マウス胸腺上皮癌細胞由来；山之内製薬探索研究所スクリーニング研究室  中田進博士より入手）、Ｃｏｓ−７（サル腎臓細胞由来；理研遺伝子ＢＡＮＫより入手）、ＷＩ−３８（ヒト正常肺組織由来；理研遺伝子ＢＡＮＫより入手）、および２９３細胞（ヒト腎臓細胞由来；理研遺伝子ＢＡＮＫより入手）である。
構築した精製組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡのさまざまな哺乳動物細胞株における細胞障害度をｍ．ｏ．ｉ依存的に検証した。
表１は、ヒト肝細胞株（Ｈｕｈ−７）及び昆虫細胞（ｓｆ−９）におけるＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルス感染時の細胞障害性の評価結果を示している。
2002062381.tif 000003
バキュロウイルスの宿主細胞であるｓｆ−９の細胞生存率は、ｍ．ｏ．ｉ  １００において、５日後で１１．６％であったのに対し、ヒト肝細胞株（Ｈｕｈ−７）には、ｍ．ｏ．ｉ  １００においても、細胞生存率は、５日後で１００％であり、顕著な細胞毒性は認められなかった（表１）。
表２は、各種哺乳動物細胞株におけるＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルス感染時の細胞障害性の評価の結果を示している。
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Ｈｕｈ−７以外のヒト由来細胞株（ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ−３８、２９３）及び他の動物細胞株（Ｃｏｓ−７、ＭＤＣＫ、Ｃ１２７、ＣＰＫ）においても、顕著な細胞変性効果は観察されなかった（表２）。また、対照実験として本来の宿主細胞であるｓｆ−９細胞に対して同様の細胞障害試験を行なったところ、ウイルスの感染価が高くなるにつれて細胞障害度の上昇が認められた。ｍ．ｏ．ｉ  １００における５日後の細胞生存率は、約１２％であった（表１）。
実施例２  ＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡ接種免疫マウスにおける抗ＨＡ抗体価の測定
６週齢の雌、ＢＡＬＢ／ｃマウスに無麻酔下の状態でＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡを、１×１０５、１０６、１０７、１０８ｐｆｕ／マウスの投与量で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）を行なった。その２週間後に同量を用いて追加免疫（ｂｏｏｓｔ）を行った。２次免疫後、１、３週間後に採血を行い、回収した血清サンプルをＰＢＳ（−）にて１００倍希釈しＥＬＩＳＡ法において抗ＨＡ抗体価を測定した。
具体的には、ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートにＡ型インフルエンザウイルスＨＡ抗原を７．５μｇ／ｍｌの濃度で１８時間、４℃で固相化した後、標準コントロールＨＡ抗体（１０、２０、４０、８０、１６０、３２０ｎｇ／ｍｌ）と免疫血清サンプルを加えて、２時間、３７℃でインキュベートした。その後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（１μｇ／ｍｌ）、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（０．２μｇ／ｍｌ）を反応させ、最後にｐＮＰＰを加えた後、吸光マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定して抗ＨＡ抗体価を算出した。
その結果を表３に示す。
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表３の結果から、３、５週間後の血清サンプルについて組み換えウイルス接種量依存的に抗ＨＡ抗体価の上昇が認められた。それぞれの投与量に対する抗ＨＡ抗体価は、３週目；１×１０５ｐｆｕ／マウスでは２．６±０．２、１×１０６ｐｆｕ／マウスでは３．３±０．６、１×１０７ｐｆｕ／マウスでは４．２±０．２、１×１０８ｐｆｕ／マウスでは６．１±０．７μｇ／ｍｌ、５週目；１×１０５ｐｆｕ／マウスでは２．８±０．４、１×１０６ｐｆｕ／マウスでは４．７±０．４、１×１０７ｐｆｕ／マウスでは９．７±７．６、１×１０８ｐｆｕ／マウスでは１０．１±２．６μｇ／ｍｌであった。
さらに、同様の実験スケジュール下において他の投与経路、具体的には、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、鼻腔内（ｉ．ｎ．）におけるＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡの免疫感作を行い、初回免疫から３週間後（２次免疫後から１週間後）の抗ＨＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法において算出した。結果を表４に示す。なお、表４の生存率については、実施例３において説明する。
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その結果、各投与経路における抗ＨＡ抗体価は、皮内（ｉ．ｄ．）では４．１±０．４、筋肉内（ｉ．ｍ．）では７．０±０．６、鼻腔内（ｉ．ｎ．）では７．３±２．３μｇ／ｍｌであった（表４）。
実施例３  ＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡ接種免疫マウスにおけるインフルエンザウイルス感染防御効果
６週齢、雌、ＢＡＬＢ／ｃマウスに無麻酔下の状態でＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡを、１×１０７、１０８ｐｆｕ／マウスの投与量で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）を試み、その２週間後に同量を用いて追加免疫（ｂｏｏｓｔ）をおこなった。２次免疫後、３週間後に１００ＬＤ５０のインフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４：Ｈ１Ｎ１）をネンブタール麻酔下の状態で鼻腔内に接種した。インフルエンザウイルスを感染させてから、日々、マウスの形態観察ならびに体重変化量を記録し、１４日後までの生存率を評価した。
初回免疫からインフルエンザウイルス感染防御試験まで日々マウスの形態観察及び体重変化量を測定し、ＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡのマウス個体に及ぼす影響を観察した（図３）。
この高い抗体価が誘導された免疫マウスに対して、致死量のインフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４：Ｈ１Ｎ１）を鼻腔内感染させたときのウイルス感染防御試験を行なったところ、ウイルス感染後５日目頃から全群に対するマウスの死亡例が増加し、７日目には非免疫群では９割が死亡した。それに対して、ＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルス免疫マウスでは１０８ｐｆｕ投与群で５０％の生存率が観察された（図４）。
さらに、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、鼻腔内（ｉ．ｎ．）におけるＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡの免疫感作を行い、そのインフルエンザウイルス感染防御効果を評価した。その結果、各投与経路における免疫感作時の１４日後のマウス生存率は、皮内（ｉ．ｄ．）では０％、筋肉内（ｉ．ｍ．）では３８％、鼻腔内（ｉ．ｎ．）では１００％であった（図５及び表４）。また、非免疫群ならびにコントロールウイルス接種免疫群ではその生存率は低く（ＰＢＳ（−）投与群では１３％、コントロールウイルス接種群では０％であった）、ＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡの鼻腔内免疫感作の有意性が示された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ヒトに病原性のないウイルスを利用したウイルスベクターを主成分とする、病原性の再獲得の可能性のないウイルスベクターワクチン製剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、ＨＡ遺伝子発現バキュロウイルストランスファーベクターの概略図を示す。
図１Ｂは、ＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスベクターの構造を示す概略図である。
図２はＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルスｒＢａｃＣＡＧ／ＨＡ感染ヒト肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７）におけるＨＡタンパク質の発現を示す図（写真）である。（Ａ）は、蛍光像を示し、（Ｂ）は明視野での像を示す。
図３はＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルス腹腔内接種免疫マウスの免疫期間中の体重変化量を表したグラフである。
図４はＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルス腹腔内接種免疫マウスにおけるインフルエンザウイルス感染防御試験の結果を示すグラフである。
図５はＨＡ抗原発現組み換えバキュロウイルス各投与経路接種免疫マウスにおけるインフルエンザウイルス感染防御試験の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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