(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルファチドを有効成分とするインフルエンザウイルス吸着阻止剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インフルエンザウイルス吸着阻止剤に関する。
本発明のインフルエンザウイルス吸着阻止剤によるとインフルエンザウイルスの細胞への吸着を阻止し、感染を防御することができる。
【０００２】
【従来の技術】
インフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科に属するウイルスで、その粒子は直径80〜100nm の球形状であり、宿主由来の脂質二重膜を有するいわゆるエンベロープウイルスの一種である。そして、インフルエンザウイルスのエンベロープ外側は、三量体を形成したヘマグルチニン (赤血球凝集素) と四量体を形成したノイラミニダーゼの二種類の糖タンパク質がスパイク状に突き出した形状を呈している。また、インフルエンザウイルスの粒子内部は、 (−) 鎖ＲＮＡ、核タンパク質及び３種のＲＮＡポリメラーゼからなる８本の分節を形成したリボヌクレオプロテインとマトリクスプロテインとが存在しており、主に、このリボヌクレオプロテインとマトリクスプロテインの抗原性の差により、インフルエンザウイルスはＡ型、Ｂ型及びＣ型に分類されている。さらに、Ａ型は、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼの抗原性の差により、多くの亜型(subtype) に分類されている。現在、ヘマグルチニンは14種 (Ｈ１〜Ｈ14) 、ノイラミニダーゼは９種 (Ｎ１〜Ｎ９) が知られている。なお、インフルエンザウイルスの細胞への感染は、インフルエンザウイルスが宿主細胞の表面に存在するレセプター糖鎖 (シアロ複合糖鎖) にヘマグルチニンを介して吸着した後、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれてエンドソームやライソゾームに運搬され、顆粒内の弱酸性条件下でウイルス膜とオルガネラ膜が融合してウイルス粒子内容物を細胞外へ放出するという機構が考えられている。
【０００３】
このインフルエンザウイルスは、未だ有効な治療法や感染防御法が見出されていない病原体の一つである。インフルエンザウイルスは、極めて感染性が強く、抗原変異を繰り返し、それまでの抗原性とは大きく異なる新種が出現するため、効果的な防御対策が立て難く、10数年に一度の割合で世界的規模の流行を繰り返している。今世紀に入ってもスペイン風邪をはじめとして、アジア風邪、ホンコン風邪、ソ連風邪等が出現し、多数の人命を脅かしてきている。このような背景から、インフルエンザウイルス感染の予防や治療効果を有する医薬の開発が待たれている現状にある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、インフルエンザウイルス感染の予防や治療効果を有する物質を求めて鋭意研究を進めていたところ、インフルエンザウイルスの受容体機能を有することが知られているガングリオシド (ＧＤｌａ等) とは異なるシアロ糖鎖を含まない硫酸化糖脂質のスルファチドが、インフルエンザウイルスとの強い結合活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、新規なインフルエンザウイルス吸着阻止剤を提供することを課題とする。さらに詳細には、スルファチドを有効成分とする新規なインフルエンザウイルス吸着阻止剤を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、スルファチドを有効成分とするインフルエンザウイルス吸着阻止剤に関する。
本発明のインフルエンザウイルス吸着阻止剤の有効成分として使用するスルファチドは、下記の一般式（Ｉ）で示される既知の糖脂質であり、脳灰白質に比較的多量に存在することが知られている物質である。
【０００６】
【化１】
0003834362.tif 000002
【０００７】
なお、スルファチドの製造方法としては、例えば、牛脳から抽出精製する方法(Lipids, vol.20, pp.588-598,1985; 生化学実験講座「脂質の科学」, vol.3, pp.368-388,東京化学同人発行) や化学合成する方法(Carbohydrate Res., vol.2, pp.371-379, 1966)等が知られている。また、スルファチドは、試薬として市販もされている。
【０００８】
以下に、参考例として、スルファチドの調製方法を示す。
【参考例１】
新鮮なウシ脳灰白質１kgに５倍量のアセトンを加えてホモジナイズした後、濾過して抽出液を得た。この抽出液を凍結乾燥した後、５倍量のクロロホルム：メタノール＝２：１(v/v) 溶媒で抽出し、さらに、クロロホルム：メタノール＝１：１(v/v) 溶媒で抽出して濃縮して濃縮液を得た。次に、この濃縮液を３倍量のアセトンで抽出した後、３倍量のジエチルエーテルで処理してグリセロホスホリピドを除去した。そして、0.5N水酸化ナトリウム／メタノール溶液で37℃、３時間処理し、蒸留水に透析した後、凍結乾燥してスルファチドの粗画分を得た。
このスルファチドの粗画分をフォルチ分配法(Folchs partition)に供して下層を集めた後、クロロホルム：メタノール：水＝30：60：８(v/v/v) 溶媒で平衡化したＱ−セファロースカラムに供し、酢酸ナトリウム０〜4Mの直線グラジエントで溶出した。そして、各溶出画分を薄層クロマトグラフに供してスルファチド標準物質と比較確認した。その結果、スルファチドは、酢酸ナトリウム１〜1.5Mの溶出画分に溶出されていることが判った。この溶出画分をエバポレートして溶媒を除去した後、残渣に蒸留水を加えて溶解し、蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥して純度99％以上のスルファチドの白色粉末を得た。
【０００９】
本発明は、このようなスルファチドを有効成分とするインフルエンザウイルス吸着阻止剤を投与することによって組織へのインフルエンザウイルスの吸着を阻止し、インフルエンザウイルスの感染を防御しようとするものである。
【００１０】
次に、スルファチドのインフルエンザウイルスに対する効果を確認した試験例を示す。
【試験例１】
参考例１で得られたスルファチドと、インフルエンザウイルスに強く結合することが知られているシアリルパラグロボシドとを使用し、TLC/Virus Binding Assay によりインフルエンザウイルスに対する反応性を調べた。すなわち、シリカゲル薄層板(Polygram Sil G Nagel)上に、0.25〜1.50nmolのスルファチド又はシアリルパラグロボシドをスポットし、クロロホルム：メタノール：水＝５：４：１(v/v/v) 溶媒で展開した後、風乾し、１％ウシ血清アルブミン- リン酸緩衝液 (ＢＳＡ−ＰＢＳ) 溶液で４℃、一晩処理した。このシリカゲル薄層板をＰＢＳ溶液で５回洗浄した後、インフルエンザウイルスA/Aichi/2/68(H3N2)−ＰＢＳ懸濁液を加えて、４℃、一晩振盪した。その後、ＰＢＳ溶液で５回洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で 250倍に希釈した抗インフルエンザウイルス抗体と、４℃、３時間反応させた。なお、抗インフルエンザウイルス抗体は、インフルエンザウイルスA/Aichi/2/68(H3N2)をウサギに免疫することにより得られたポリクローナル抗体を使用した。このシリカゲル薄層板をＰＢＳ溶液で５回洗浄した後、 250倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識プロテインＡを含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中で、４℃、３時間反応させた。このシリカゲル薄層板をＰＢＳ溶液で５回洗浄した後、0.1M酢酸緩衝液(pH 6.0) 10ml に、110mM 4-クロロ-1- ナフトールを含むアセトニトリル溶液 200μl 、 60mM N,N-ジエチル -p-フェニルエジアミン- ジヒドロキシクロライドを含むアセトニトリル溶液 200μl 及び30％過酸化水素水１μl を混和した発色液を加えて、室温で15分間振盪反応させた。このシリカゲル薄層板を精製水で洗浄した後、風乾し、発色をデンシトメーター(CS-9000、島津製作所) により、測定波長 600nm、対照波長 425nmにて定量した。その結果を図１に示す。図１に示すようにスルファチド（○）はシアリルパラグロボシド（●）にくらべてインフルエンザウイルスに対して高い反応性を示している。すなわち、スルファチドは、インフルエンザウイルスに強く結合することが知られているシアリルパラグロボシドよりもさらに強くインフルエンザウイルスと濃度依存的に結合することが判った。
【００１１】
【試験例２】
参考例１で得られたスルファチドとガングリオシドＧＭ３を使用し、 ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)によりインフルエンザウイルスに対する反応性を調べた。すなわち、マイクロプレート(96flat-bottom wells, Polysorp Nunc.) の各ウエルに、エタノールに溶解した４〜500pmol 濃度のスルファチド又はガングリオシドＧＭ３を50μl ずつ加え、37℃でエタノールを完全に蒸発させた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを 200μl ずつ加え、一晩ブロッキングした。各ウエルをＰＢＳ溶液で５回洗浄した後、インフルエンザウイルスA/Aichi/2/68を含む 0.5％ＢＳＡ−ＰＢＳ懸濁液(32HAU) を各ウエルに50μl ずつ加え、４℃、一晩振盪した。各ウエルをＰＢＳ溶液で５回洗浄し、 1,000倍希釈した抗インフルエンザウイルス抗体を含む 0.5％ＢＳＡ−ＰＢＳを各ウエルに50μl ずつ加え、４℃、２時間反応させた。各ウエルをＰＢＳ溶液で５回洗浄した後、 0.5％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で 1,000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識Protein A を50μl ずつ加え、４℃、２時間反応させた。各ウエルをＰＢＳ溶液で４回洗浄した後、発色基質溶液（オルトフェニレンジアミン４mgをクエン酸−リン酸緩衝液(pH5.6) 10mlに溶解し、30％過酸化水素 3.3μl を加えた溶液)100μl を加えて暗所発色させた後、1N塩酸 100μl を加えて反応を停止させて、マイクロプレートリーダー (CORONA、MTP-32) により、測定波長 496nm、対照波長 630nmにて比色定量した。その結果を図２に示す。
図２にみられるようにスルファチド（○）は、ガングリオシドＧＭ３（●）よりも強くインフルエンザウイルスと結合することが判った。
【００１２】
【試験例３】
参考例１で得られたスルファチドとガングリオシドＧＭ３を使用し、溶血活性阻害実験によりインフルエンザウイルスに対する反応性を調べた。すなわち、スルファチド又はガングリオシドＧＭ３をＰＢＳに溶解した後、512HAUのインフルエンザウイルスA/Aichi/2/68を加えて、４℃、３時間反応させた溶液50μl を２％ニワトリ赤血球１mlに加え、４℃、30分反応させた。そして、生理的食塩水で３回遠心洗浄(1,200×g)した後、50mM酢酸等張緩衝液(pH5) １mlを加えて、37℃、30分間反応させた。氷冷して反応を停止し、遠心(1,200×g)した後、波長 540nmにて上清中のヘモグロビン量を測定した。その結果を図３に示す。
図３にみられるようにガングリオシドＧＭ３（●）は、インフルエンザウイルスによる赤血球の溶血作用を阻害する活性を殆ど有さなかったが、スルファチド（○）は、インフルエンザウイルスによる赤血球の溶血作用を阻害する活性を有していることが判った。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のインフルエンザウイルス吸着阻止剤は、スルファチドを有効成分とするものであり、インフルエンザウイルスの細胞への吸着を阻止する目的で使用される。
スルファチドは、脳のミエリン構成物質であって毒性が殆どないので、投与方法に特に制限はなく、軟カプセル剤、硬カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、懸濁剤、散剤、液剤、シロップ剤、乳濁剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、ペッサリー、坐剤、軟膏、塗布剤等の非経口剤として投与することができる。なお、一日当たり成人の投与量は、経口投与で約 0.1〜1g、静脈内投与で約10〜100mg 、筋肉内投与で約50〜300mg 、皮下及び皮内投与で約30〜150mg が好ましく、一日一回又は数回に分けて投与すれば良い。
【００１４】
本発明の製剤例を実施例として示す。本発明は、これらの実施例にのみ限定して解釈されるべきものではない。
【実施例１】
参考例１で得られたスルファチド10g を精製蒸留水1Lに懸濁し、これを10mLのアンプルに充填し、殺菌を行なって静注用注射剤を得た。
【００１５】
【実施例２】
参考例１で得られたスルファチド200gを乳糖15g 、トウモロコシ澱粉15g 、カルボキシメチルセルロースカルシウム10g 及びステアリン酸マグネシウム1 g を混合し、打錠して錠剤1000錠を製造した。
【００１６】
【発明の効果】
スルファチドは、インフルエンザウイルスと強く結合するので、インフルエンザウイルスの吸着を阻止することができる。したがって、本発明のスルファチドを有効成分とするインフルエンザウイルス吸着阻止剤を使用することにより、インフルエンザウイルスの感染を予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１におけるスルファチドとシアリルパラグロボシドのインフルエンザウイルスに対する反応性を示す。
【符号の説明】
○：スルファチド
●：シアリルパラグロボシド
【図２】試験例２におけるスルファチドとガングリオシドＧＭ３のインフルエンザウイルスに対する反応性を示す。
【符号の説明】
○：スルファチド
●：ガングリオシドＧＭ３
【図３】試験例３におけるスルファチドとガングリオシドＧＭ３のインフルエンザウイルスによる溶血阻止活性を示す。
【符号の説明】
○：スルファチド
●：ガングリオシドＧＭ３
【図１】
0003834362.tif 000003
【図２】
0003834362.tif 000004
【図３】
0003834362.tif 000005