(57)【要約】本発明は、試料中のアディポネクチン（ＧＢＰ２８）を測定し得るモノクローナル抗体を用いてＧＢＰ２８を定量的に測定することにより、２型糖尿病等インスリン抵抗性の関連する成人病を早期発見する方法及び２型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のアディポネクチン（ＧＢＰ２８）を測定することにより糖代謝異常を診断又はモニタリングする方法。
【請求項２】
糖代謝異常が２型糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＢＰ２８が天然型である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試料中のＧＢＰ２８を測定することにより２型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする方法。
【請求項５】
ＧＢＰ２８が天然型である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
２型糖尿病治療剤がチアゾリジン誘導体である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
抗原−抗体反応を用いて測定することを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
試料中の天然型ＧＢＰ２８を測定することを特徴とする、ＧＢＰ２８の測定方法。
【請求項９】
ＧＢＰ２８の測定を、天然型ＧＢＰ２８に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用して行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６０またはＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６１が産生するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＢＰ２８の測定を、固相法、競合法、凝集法、比濁法、サンドウィッチ酵素抗体法のいずれかによって行うことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
試料が、血清、血漿、関節液、胸水、組織抽出液、組織、培養上清又は尿であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＢＰ２８の３量体構造及び／又はＧＢＰ２８の３量体が凝集した構造を有する天然型ＧＢＰ２８に対して特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項１４】
ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６０またはＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６１が産生するものである、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
天然型ＧＢＰ２８に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を含む、試料中の天然型ＧＢＰ２８を測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、試料中のアディポネクチン（ＧＢＰ２８）を測定することにより糖代謝異常を診断又はモニタリングする方法、試料中のＧＢＰ２８を測定することにより２型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする方法、試料中の天然型ＧＢＰ２８を測定することを特徴とするＧＢＰ２８の測定方法、及び、天然型ＧＢＰ２８に対して特異的に反応するモノクローナル抗体に関する。
背景技術
糖尿病に罹患している患者は世界中で１億人以上に達しており、その９０％以上が２型糖尿病である（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，Ｋ．及びＡｕｗｅｒｘ，Ｊ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５５：１００８−１０１０，２０００）。２型糖尿病は、インスリン分泌障害及び／又はインスリン抵抗性を特徴とする（ＤｅＦｒｏｎｚｏ，Ｒ．Ａ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １５：３１８−３６８，１９９２）。チアゾリジンジオンは、動物実験及び臨床研究の双方においてインスリン抵抗性を改善することが示された。２型糖尿病患者にこれらの薬剤を投与すると、インスリンの作用が上昇する結果として、血糖値、糖ヘモグロビン、及び血清インスリンレベルが低下する（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｓ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：８６１−８６６，１９９８）。
一方、脂肪細胞由来の血漿タンパク質であるアディポネクチン（Ｍａｅｄａ，Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１：２８６−２８９，１９９６；Ａｒｉｔａ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５７：７９−８３，１９９９）［別名ゼラチン結合タンパク質２８（ＧＢＰ２８）（Ｎａｋａｎｏ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：８０３−８１２，１９９６；Ｓａｉｔｏ，Ｋ．ら，Ｇｅｎｅ  ２２９：６７−７３，１９９９；Ｓａｉｔｏ，Ｋ．ら，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２２：１１５８−１１６２，１９９９）］は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて損傷した血管壁に接着し、内皮性ＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害し（Ｏｕｃｈｉ，Ｎ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２：１２９６−１３０１，２０００）、ＨＢ−ＥＧＦ及びＰＤＧＦによって誘導される平滑筋の細胞増殖を抑制する（Ｍａｔｓｕｚａｗａ，Ｙ．ら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９２：１４６−１５４，１９９９）。さらに、肥満患者においてはこのタンパク質の血清レベルは低いことが報告されており（Ａｒｉｔａ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５７：７９−８３，１９９９）、また、２型糖尿病患者及び冠状動脈疾患患者においても前記血清レベルが低下していることが報告されている（Ｈｏｔｔａ，Ｋ．ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０：１５９５−１５９９，２０００）。
従来、２型糖尿病と関連する因子として、血中グルコース、ＨｂＡ１Ｃ、血清インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ等が知られている。しかしながら、これらを２型糖尿病の診断又は治療効果のモニタリングの指標として使用するには、操作性及び／又は感度の点で不十分であった。また、上述のように、ＧＢＰ２８についても２型糖尿病との関連についての示唆がなされていたが、実際に臨床の場において、ＧＢＰ２８が２型糖尿病の診断及び治療効果モニタリングに利用可能であるか否かについては十分な知見が得られていなかった。
一方、ＧＢＰ２８の測定方法としては、大本らによるＥＬＩＳＡ法が知られている（Ｏｈｍｏｔｏら，ＢＩＯ  Ｃｌｉｎｉｃａ  １５（１０）７５８−７６１，２０００；特開２０００−３０４７４８）。しかしながら、血液中の天然型ＧＢＰ２８は単量体３個から構成され、更にこの３量体が４〜６個ずつ凝集した存在形態をとっている（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，８０３−８１２，１９９６）のに対し、かかる従来法は単量体構造のＧＢＰ２８に対するモノクローナル抗体を用いていることから試料中の天然型ＧＢＰ２８を変性させなければならず、測定にあたって検体をＳＤＳ溶液と混合し、１００℃で熱処理を行うことが必要であり、操作が煩雑であった。また、かかる従来法は天然型ＧＢＰ２８を変性させた形態で測定するものであり、天然の状態のＧＢＰ２８を直接測定することができなかった。
発明の概要
本発明者等は、上記課題を解決するために、臨床において２型糖尿病等の糖代謝異常の診断及び治療効果モニタリングの指標となり得る因子を探索すべく、２型糖尿病関連の種々のパラメーターにつき２型糖尿病患者における血中濃度を測定し、鋭意検討を重ねた結果、後述の実施例に示すように、ＧＢＰ２８の測定が糖代謝異常の診断及びその治療剤の治療効果モニタリングに非常に有効であることを見出した。また、ＧＢＰ２８を凝集した形態のままで測定することにより、試料中のＧＢＰ２８を天然の状態で簡便そして迅速に測定できることを見出し、本発明を完成させるに到った。
すなわち本発明は、以下の（１）〜（１３）を提供する。
（１）  試料中のアディポネクチン（ＧＢＰ２８）を測定することにより糖代謝異常を診断又はモニタリングする方法。
（２）  糖代謝異常が２型糖尿病である、上記（１）に記載の方法。
（３）  ＧＢＰ２８が天然型である、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  試料中のＧＢＰ２８を測定することにより２型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする方法。
（５）  ＧＢＰ２８が天然型である、上記（４）に記載の方法。
（６）  ２型糖尿病治療剤がチアゾリジン誘導体である、上記（４）又は（５）に記載の方法。
（７）  抗原−抗体反応を用いて測定することを特徴とする、上記（５）又は（６）に記載の方法。
（８）  試料中の天然型ＧＢＰ２８を測定することを特徴とする、ＧＢＰ２８の測定方法。
（９）  ＧＢＰ２８の測定を、天然型ＧＢＰ２８に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用して行うことを特徴とする、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）  ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６０またはＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６１が産生するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、上記（９）に記載の方法。
（１１）  ＧＢＰ２８の測定を、固相法、競合法、凝集法、比濁法、サンドウィッチ酵素抗体法のいずれかによって行うことを特徴とする、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）  試料が、血清、血漿、関節液、胸水、組織抽出液、組織、培養上清又は尿であることを特徴とする、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）  ＧＢＰ２８の３量体構造及び／又はＧＢＰ２８の３量体が凝集した構造を有する天然型ＧＢＰ２８に対して特異的に反応するモノクローナル抗体。
（１４）  ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６０またはＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６１が産生するものである、上記（１３）に記載のモノクローナル抗体。
（１５）  天然型ＧＢＰ２８に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を含む、試料中の天然型ＧＢＰ２８を測定するためのキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００１−２４８０４７号の明細書及び／または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
ＧＢＰ２８は、ヒトにおいては配列番号１に示すアミノ酸配列及び配列番号２に示すヌクレオチド配列を有することが知られている。また、ＧＢＰ２８は、血液中においては単量体３個から構成される３量体が更に４〜６個ずつ凝集した存在形態をとっていることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，８０３−８１２，１９９６）。
本発明者等は、健常人由来の血液等の試料中のＧＢＰ２８濃度が２型糖尿病の特徴であるインスリン抵抗性の指標に関わるインスリン、インスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ−ＩＲ）、中性脂肪、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロールと相関関係を示したこと、及び、２型糖尿病患者由来の血液等の試料中のＧＢＰ２８濃度が、２型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする上で、従来２型糖尿病の指標とされていた血漿グルコース、ＨｂＡ１Ｃ、血清インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲと比較して大きな変化率を示す事を確認したことから、血液等の試料中のＧＢＰ２８濃度が２型糖尿病等の糖代謝異常の診断及び２型糖尿病等の治療剤の治療効果のモニタリングにおける新たな指標として非常に有効であることを見出した。
従って、本発明者等は、試料中のＧＢＰ２８、好ましくは天然型ＧＢＰ２８を測定することにより２型糖尿病等の糖代謝異常を診断する方法及び２型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする方法を提供する。
本発明において、試料とは、血清、血漿、関節液、胸水、組織抽出液、組織、培養上清又は尿を挙げることができるが、本発明はこれらに特に限定されるものではない。
糖代謝異常としては、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）や糖尿病合併症（高血圧、高脂血症、動脈硬化、緑内障）等が挙げられ、特に本発明は２型糖尿病の診断又は治療剤による治療効果のモニタリングのために好適である。
糖代謝異常の治療剤としては、公知の種々のものが使用できる。例えば、２型糖尿病の治療剤としては、一般にグリベンクラミド、グリクラジド、トルブタミド、グリメピリド等のスルホニルウレア剤、ナテグリニド等の即効型インスリン分泌促進剤、ボグリボース、アカルボース等のαグルコシダーゼ阻害剤、ピオグリタゾン等のインスリン抵抗性改善剤、メトホルミン等のビグアナイド剤が挙げられ、本発明の方法を好適に適用することができる。特に好適な２型糖尿病治療剤としては、ピオグリタゾン、トログリタゾン等のチアゾリジン誘導体が挙げられる。
ＧＢＰ２８の測定は、特に限定されるものではないが、ＧＢＰ２８、好ましくは、ＧＢＰ２８の３量体構造及び／又はＧＢＰ２８の３量体が凝集した構造を有する天然型ＧＢＰ２８に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用し、固相法、競合法、凝集法、比濁法、サンドウィッチ酵素抗体法等の当分野において通常行われるいずれかの方法によって行うことができる。特に固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定するのが好ましい。酵素免疫検定法は、当分野において通常行われる方法であり、当業者であれば、上記のＧＢＰ２８に特異的に反応する抗体を用いて行うことができる。
上記測定方法において天然型ＧＢＰ２８に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用する場合には、天然の状態では存在しない、変性した構造やＧＢＰ２８単量体を測定しないようにすることができる。具体的には、ＧＢＰ２８がコラーゲン様の立体構造を組んでいるときの３量体において初めて出現する部位を認識するモノクローナル抗体を作製し使用することが特に好ましい。
図１に、ＧＢＰ２８を測定するための本発明の方法及び従来法の原理を模式的に示す。従来法では、ＧＢＰ２８に対するモノクローナル抗体を取得するために、遺伝子組換大腸菌によって発現されたＧＢＰ２８を免疫原として用いている。しかし、組換えＧＢＰ２８は封入体として菌中に存在するため、該蛋白の精製時には塩酸グアニジン、尿素、還元剤などによる処理が必要である。そのため、免疫原として用いるＧＢＰ２８には変性型かつ単量体構造のＧＢＰ２８しか用いることができない。その結果、得られるモノクローナル抗体は変性した単量体ＧＢＰ２８にのみ反応するものであり、試料中の天然型ＧＢＰ２８を測定するにあたっては、試料中の該ＧＢＰ２８を単量体ＧＢＰ２８に変性させるための処理が予め必要である。これに対して、本発明の方法は、天然型ＧＢＰ２８に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用するので、血液中に存在する天然型ＧＢＰ２８を処理することなくそのまま測定することができるものである。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、天然型ＧＢＰ２８を抗原として当分野において一般的な方法によって得ることができる。天然型ＧＢＰ２８は、そのゼラチン結合性を利用して、例えば大量のヒト血漿をＧｅｌａｔｉｎ−ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅカラム（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，８０３−８１２，１９９６）に通すことによって精製することができる。この天然型ＧＢＰ２８を使用し、例えば、動物に免疫し、この免疫動物から脾臓又はリンパ節を採取する。この脾臓又はリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。培養は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行っても良いが、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともでき、例えばマウス等の腹腔内にハイブリドーマを投与した後、腹水から目的の抗体を得ることができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。これにより調製された抗体は、ＧＢＰ２８の測定のために用いられる他、ＧＢＰ２８の発現異常に起因する疾患の抗体治療等に利用することも可能である。
本発明において特に好適に使用できる抗ＧＢＰ２８モノクローナル抗体の特徴は以下の通りである。
使用したミエローマ細胞株：Ｐ３Ｕ１
抗原：ヒト血清より単離精製したＧＢＰ２８（約５０μｇ）溶液を完全アジュバントとミセル化してマウス腹腔内に投与。２週間後にブーストしてから３日目に脾臓を摘出してＢ細胞を採取。
モノクローナル抗体を調整したクローン数：３個（ＩＨ５、６、７）
Ｉｇ型：全てＩｇＧκ型
エピトープ：ＧＢＰ２８の３量体で熱変性されていないもののみ認識する。従って、コラーゲン様の立体構造を組んでいるときの３量体において初めて出現する部位と考えられる。
尚、本発明において好適に使用できる抗ＧＢＰ２８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＩＨ−６及びＩＨ−７は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００１年７月１２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６０及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６１という受託番号で寄託されている。
試料中のＧＢＰ２８を測定することにより糖代謝異常を診断する方法及び治療剤による治療効果をモニタリングする方法は、具体的には、例えば、次の様にして行うことができる。
１）ＧＢＰ２８濃度の測定
患者等から採取した血清等を希釈し、マウス抗ＧＢＰ２８モノクローナル抗体で被覆した９６ウェルのマイクロタイタープレートに添加し、血清中のＧＢＰ２８をウェル上のマウス抗ＧＢＰ２８モノクローナル抗体に結合させる。ウェルを洗浄後、酵素標識マウス抗ＧＢＰ２８モノクローナル抗体を添加し、ウェル上に存在するマウス抗ＧＢＰ２８モノクローナル抗体に結合させる。さらにウェルを洗浄後、酵素に対する基質溶液を加えることにより発色反応を起こさせ、発色反応停止後、吸光度を測定する。予め、同様の方法で既知濃度のＧＢＰ２８標準溶液について吸光度を測定し、ＧＢＰ２８の濃度に対する吸光度の標準曲線を作成しておき、測定した吸光度の値を該標準曲線から、ＧＢＰ２８の濃度に換算することによって、患者等から採取した血清等中のＧＢＰ２８の濃度を測定することができる。
２）糖代謝異常を診断又はモニタリングする方法
ＧＢＰ２８を２型糖尿病等の糖代謝異常の診断における指標として使用する場合は、例えば、上述した測定法により測定したＧＢＰ２８の濃度値を、予め求めておいた正常値若しくは境界値と比較する。
３）治療剤の治療効果をモニタリングする方法
また、ＧＢＰ２８を２型糖尿病治療剤の治療効果のモニタリングにおける指標として使用する場合は、例えば、２型糖尿病患者から治療開始前と治療開始後の血液を採取し、上述した測定法によりＧＢＰ２８を測定し、治療開始前後の血液中のＧＢＰ２８含量からの変化率を計算し、治療効果の判定を行う方法が挙げられる。治療開始後の血中ＧＢＰ２８濃度が治療開始前に比べ増加した場合、治療剤による治療効果が認められたとの判定ができる。前後の血液採取の間隔は１ヶ月から３ヶ月が好ましい。
本発明はまた、天然型ＧＢＰ２８に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を含む、試料中の天然型ＧＢＰ２８を測定するためのキットである。本発明のキットは、上記本発明の抗体の他、緩衝剤、ペルオキシダーゼ等の標識体で標識した二次抗体、標準液、ブロッキング液、ペルオキシダーゼ等の酵素基質液、洗浄液等を適宜含んでいても良い。本発明のモノクローナル抗体は、ＧＢＰ２８の３量体構造を認識するものであるため、非標識のモノクローナル抗体をプレート上に固定してＧＢＰ２８含有試料を添加した後、標識した同じ種類のモノクローナル抗体を使用してサンドイッチアッセイを行うことができる。
実施例
以下、本発明を実施例を挙げて更に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
尚、各実施例において、統計的解析は全てＭａｃｉｎｔｏｓｈのためのＳｔａｔＶｉｅｗ（登録商標）プログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．５−Ｊ，Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行った。ベースライン及び３ヶ月間の追跡データの比較のためにＷｉｌｃｏｘｏｎ  ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋテスト（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）を行い、ＧＢＰ２８及び他のパラメーターの変化率の比較のために、有意性はＰｅａｒｓｏｎの相関係数と偏相関係数を用いて評価した。血清インスリン、ＴＧ及びＧＢＰ２８レベル、並びにＨＯＭＡ−ＩＲは、大規模の研究においてｌｏｇ変換すると正規分布するため、これらのパラメーターについては対数を解析に使用した。全てのデータは平均±Ｓ．Ｄ．で表わし、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であるとした。
［実施例１］  各パラメーターの測定
食事療法のみを受けている（ｎ＝７）か、又は食事療法と共にスルホニルウレア剤の投与を受けている（ｎ＝３）、４０〜６６歳（５７．７±７．４）の１０名の２型糖尿病男性患者に対して、チアゾリジン系薬ピオグリタゾンの３ヶ月投与の前後に以下のパラメーターについて調べた。各患者の体重、血糖及び血圧、及び各患者に対する治療は検討開始前少なくとも３ヶ月間は一定していた。３名の患者に対するスルホニルウレア剤の投与量は期間中一定とした。１０名の患者全員に毎日朝食後にピオグリタゾンを投与した（経口、３０ｍｇ／日）。開始時点における患者の年齢、体格指数（ＢＭＩ）、及び臨床プロファイルを表１に示す。
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尚、表中、データはｎ又は平均（±Ｓ．Ｄ．）を示す。
最大血圧（ＳＢＰ）及び最小血圧（ＤＢＰ）は少なくとも５分間休憩した後に座った状態で２回測定した。身長、体重、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、ＨｂＡ１ｃ、血清インスリン、アディポネクチン、総コレステロール（ＴＣ）、中性脂肪（ＴＧ）、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、及び尿酸レベルは、一晩絶食後の朝に測定した。血漿グルコース、脂質及び尿酸は一般的な自動化測定方法によって測定した。血清インスリン濃度は、以前記載されているように（Ｋａｗａｉ，Ｔ．ら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ４８：１１０２−１１０７，１９９９；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｈ．ら，Ｃｌｉｎ，Ｓｃｉ．（Ｃｏｌｃｈ）９４：６３３−６３６，１９９８；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１６：２００７−２０１２，１９９８；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｈ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｃｏｌｃｈ）１００：１４５−１５０，２００１）、市販のキット（Ｔｏｓｏｈ、Ｔｏｋｙｏ）ＥＩＡによって測定した。インスリン抵抗性指数は、ホメオスタシスモデルアセスメント（ＨＯＭＡ−ＩＲ）によって評価した（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｒ．ら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２８：４１２−４１９，１９８５；Ｒｕｄｅｎｓｋｉ，Ａ．Ｓ．ら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ４０：９０８−９１７，１９９１）。
結果を表２に示す。
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尚、表中、データはｎ又は平均（±Ｓ．Ｄ．）を示す。
表２に示すように、ピオグリタゾンの３ヶ月投与により、最大血圧、最小血圧、空腹時血漿グルコース、ＨｂＡ１Ｃ、血清インスリン及びＨＯＭＡ−ＩＲは顕著に低下した。体格指数（ＢＭＩ）及びＬＤＬ−コレステロールは上昇したが、中性脂肪、ＨＤＬ−コレステロール及び尿酸は有意な変化がなかった。
血糖及び血圧コントロールに対する効果は、対照食事療法群とは違い、トログリタゾン（Ｋａｗａｉ，Ｔ．ら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４８：１１０２−１１０７，１９９９）と同様に認められた。血圧に対するチアゾリジンジオンの効果に関しては、トログリタゾンはインスリン抵抗性動物（Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１８：１８５７−１８６４，２０００）及び臨床研究（Ｏｇｉｈａｒａ，Ｔ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．８：３１６−３２０，１９９５）において血圧を低下させることが報告されている。ＬＤＬ−コレステロールに対する効果については、トログリタゾン（ＳｃｈｗａｒｔｚＳ．ら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：８６１−８６６，１９９８）又はロジグリタゾン（Ｂａｌｆｏｕｒ，Ｊ．Ａ．およびＰｌｏｓｋｅｒ，Ｇ．Ｌ．，Ｄｒｕｇｓ  ５７：９２１−９３０，１９９９）の投与がＬＤＬ−コレステロールの上昇に関与することが報告されている。ピオグリタゾンの投与によってもＬＤＬ−コレステロールがわずかに増加したが、３ヵ月後に顕著であった。
［実施例２］  脂肪分布の測定
実施例１と同じ患者に対して、ピオグリタゾン３ヶ月投与前後の脂肪分布を測定した。皮下脂肪及び内臓脂肪分布は、Ｔｏｋｕｎａｇａらの臍高レベルにおけるコンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）スキャニング方法（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｋ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．７：４３７−４４５，１９８３）を改変して−１５０〜−５０  Ｈｏｕｎｓｆｉｅｌｄユニット領域を測定することによって決定した。ＣＴ画像は本発明者等が先に報告したもの（Ｋａｗａｉ，Ｔ．ら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４８：１１０２−１１０７，１９９９）と同じプロトコルでベースライン及び３ヶ月治療後で撮影した。Ｖ／Ｓ比率は臓器内脂肪領域（ＶＦＡ）を皮下脂肪領域（ＳＦＡ）で割った値として計算した。結果を表３に示す。
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尚、表中、データはｎ又は平均（±Ｓ．Ｄ．）を示す。
表３に示すように、ピオグリタゾン３ヶ月投与の後、ＢＭＩ及び皮下脂肪領域（ＳＦＡ）が顕著に増加した。これはトログリタゾンの結果（Ｋａｗａｉ，Ｔ．ら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４８：１１０２−１１０７，１９９９；Ｋｅｌｌｙ，Ｉ．Ｅ．ら，Ｄａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２：２８８−２９３，１９９９；Ｍｏｒｉ，Ｙ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２：９０８−９１２，１９９９）と本質的に同じであった。対照的に、臓器内脂肪領域（ＶＦＡ）は減少せず、むしろわずかに増加し、トログリタゾンで得られた知見と異なっていた。この違いの理由は明らかでないが、トログリタゾンのビタミンＥ構造、及び／又はＰＰＡＲαの機能のような構造的差異による可能性がある。尚、ＶＦＡは増加傾向にあり、Ｖ／Ｓ比率は減少傾向にあったが、これらの差異において統計学的有意性は得られなかった。
［実施例３］  ＧＢＰ２８の測定
実施例１と同じ患者に対して、ピオグリタゾン３ヶ月投与前後のＧＢＰ２８の血中濃度を測定した。
抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体は以下のようにして作製した。まず、ヒト血清より単離精製したＧＢＰ２８（約５０μｇ）溶液を完全アジュバントとミセル化してマウス腹腔に投与し、２週間後にブーストしてから３日目に脾臓を摘出してＢ細胞を採取した。このＢ細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを調製し、目的のハイブリドーマをマウスに腹腔内投与した後、（２０日後に）腹水をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗで処理することにより目的のモノクローナル抗体を得た。
ＥＬＩＳＡによるＧＢＰ２８の測定は以下のようにして行った。ＧＢＰ２８の標準サンプル、４４１倍希釈の未知サンプル及び対照サンプル各１００μｌを、マウス抗ＧＢＰ２８モノクローナル抗体で被覆した９６ウェルのマイクロタイタープレートに添加した。プレートを６０分間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識マウス抗ＧＢＰ２８モノクローナル抗体と共に更に３０分間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、テトラメチルベンジジン試薬と共に３０分間インキュベートした。次いで、各ウェルに０．３６Ｎの硫酸水溶液１００μｌを添加して反応を止め、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。アッセイ内及びアッセイ間係数はそれぞれ４．８−４．９％及び３．３−６．８％であった。
３ヶ月間のピオグリタゾン投与の結果、１０名の患者全てにおいて血清アディポネクチンレベルは上昇した（ベースラインの値の１．５〜６．８倍、平均して３倍）（表２及び図２）。更に、ＧＢＰ２８及び表２及び３に示す他のパラメーター間の３ヶ月間の変動について検討した。各パラメータの測定値（一部は対数値）の変化率を比較した結果、従来から知られている２型糖尿病関連因子である血中グルコース（１８．２％）、ＨｂＡ１ｃ（９．０％）、血清インスリン（２３．７％）、ＨＯＭＡ−ＩＲ（６２．６％）等よりも、試料中のＧＢＰ２８濃度は大きな変化率（８０．９％）を示した。
［実施例４］  健常人での測定結果
実施例３では、ＧＢＰ２８は２型糖尿病患者において、２型糖尿病治療剤であるチアゾリジン誘導体の治療効果のモニタリングに用いることができることが明らかとなり、ＧＢＰ２８濃度はインスリン抵抗性の指標になる可能性が予測できた。そこで、健常人を対象とし、血中のＧＢＰ２８濃度とインスリン抵抗性との関わりが報告されているパラメーターとの関係について調べた。
毎年来院して健康診断を受けている３０歳から６５歳の９８０名を対象にインスリン抵抗性との関わりが報告されているパラメーターについて調べた。対象者の内訳としては、男性７１４名、女性２６６名であり、内分泌疾患患者及び腎臓ないし肝臓に重篤な疾患をもつ患者は測定対象から除いた。また、インスリンや抗糖尿病薬、抗高脂血症薬の治療を受けている患者も測定対象から除いた。
測定したパラメーターとしては、最大血圧（ＳＢＰ）及び最小血圧（ＤＢＰ）は少なくとも５分間休憩した後に座った状態で２回測定した。年齢、ＢＭＩ、心拍数、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、血清インスリン、アディポネクチン、総コレステロール（ＴＣ）、中性脂肪（ＴＧ）、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、及び尿酸レベルは、一晩絶食後の朝に測定した。血漿グルコース、尿酸は一般的な自動化測定方法によって測定した。血清インスリン濃度は、先に記載されているように、市販のキット（Ｔｏｓｏｈ、Ｔｏｋｙｏ）ＥＩＡによって測定した。インスリン抵抗性指数は、ホメオスタシスモデルアセスメント（ＨＯＭＡ−ＩＲ）によって評価した。
本検討で測定した各パラメーターとＧＢＰ２８との比較結果を男性については表４に、女性については表５に示す。
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尚、表中、データは平均±ＳＤ及び相関係数そしてｐ値を示す。血中のＧＢＰ２８は０．４μｇ／ｍＬから６１．２μｇ／ｍＬと幅広い濃度分布を示した。男性の血中ＧＢＰ２８濃度は７．２±４．６μｇ／ｍＬ、女性の血中ＧＢＰ２８濃度は１３．３±７．３μｇ／ｍＬ、で、男性よりも女性のほうが高い濃度を示した。
表４及び表５に示すように、血中のＧＢＰ２８の濃度はＢＭＩ、最大血圧、最小血圧、空腹時血漿グルコース、インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、中性脂肪、ＬＤＬ−コレステロールそして尿酸と負の相関関係を示した。またＨＤＬ−コレステロールとは正の相関関係を示した。また、年齢とＢＭＩでの補正を加えてＧＢＰ２８と各パラメーターとの比較を行った場合にはインスリン（男性ｒ＝−０．２２９、女性ｒ＝−０．１３７）、ＨＯＭＡ−ＩＲ（男性ｒ＝−０．２３７、女性ｒ＝−０．１３４）、中性脂肪（男性ｒ＝−０．１９７、女性ｒ＝−０．２７５）、ＨＤＬ−コレステロール（男性ｒ＝−０．３３０、女性ｒ＝０．３４５）、ＬＤＬ−コレステロール（男性ｒ＝−０．０８３、女性ｒ＝−０．１９９）とｐ＜０．０５の信頼性で統計学的に有意な相関関係を示した。その結果、ＨＯＭＡ−ＩＲや、インスリン、中性脂肪、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロールと相関関係を示した。
以上から、健常人においても、ＧＢＰ２８濃度がインスリン抵抗性の指標になりうることが確認された。
［実施例５］試料中の天然型ＧＢＰ２８を測定するためのキットの製造
Ａ．本発明のキットに使用する材料
（１）抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体コート・プレート
・抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体溶液
マウス腹水をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗで処理することにより得られた抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１０μｇ／ｍＬとした。
・プレート調製用洗浄液組成
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・ブロッキング溶液組成
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１．Ｎｕｎｃ製ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｆ８プレートに抗体溶液を１２０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、４℃で一晩静置。
２．抗体溶液を除いた後、洗浄液で２回洗浄。
３．ブロッキング溶液を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、３７℃で一晩静置。
４．ブロッキング溶液を除去。
５．減圧下で一晩置き十分に乾燥させた後、密封し４℃に保存。
（２）標準液
・ＧＢＰ２８抗原溶液
抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラムにより健常人プール血清からＧＢＰ２８を精製した後、更にゲル濾過を行った。ＧＢＰ２８濃度は２８０ｎｍの吸光度より求めた。（Ａｂｓ．２８０ｎｍ＝１．０００の時の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。）
・希釈用緩衝液
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ＧＢＰ２８抗原溶液を上記組成の希釈用緩衝液にて希釈することにより、ＧＢＰ２８濃度を０、２、５、１０、２５、５０ｎｇ／ｍＬとした。
（３）ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体溶液
・ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体原液
抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体をペプシン処理及び還元処理することによりＦａｂ’フラグメントとし、これにマレイミド化ペルオキシダーゼを結合させた。濃度は２８０、４０３ｎｍの吸収より抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体のＦａｂ’部分とペルオキシダーゼ部分の各々の濃度を求め、合計することにより算出した。
・標識抗体希釈溶液
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ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体溶液を上記組成の標識抗体希釈溶液にて希釈し標識抗体濃度を３５０ｎｇ／ｍＬとし、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＧＢＰ２８モノクローナル抗体溶液とした。
（４）濃縮洗浄液（用時精製水にて２０倍希釈する）
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（５）基質液
市販のＥＬＩＳＡ用ＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）溶液を用いた。
（６）反応停止液
０．３６Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いた。
Ｂ．アッセイ・プロトコル
被検検体は標準液の調製に用いた希釈用緩衝液で、適切な濃度（〜５０ｎｇ／ｍＬ）になるまで希釈する。通常の検体は約４００〜５００倍が適切と思われる。（例：２１倍希釈を２回繰り返し、４４１倍希釈とする。）
１．標準液及び被検試料を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れる。
２．プレート攪拌機で５〜１０秒程度攪拌した後、遮光、室温で６０分間静置。
３．標準液及び被検試料を除き、洗浄液にて４回洗浄。
４．ペルオキシダーゼ標識抗体溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れる。
５．プレート攪拌機で５〜１０秒程度攪拌した後、遮光、室温で３０分間静置。
６．ペルオキシダーゼ標識抗体溶液を除き、洗浄液にて４回洗浄。
７．基質液を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れる。
８．プレート攪拌機で５〜１０秒程度攪拌した後、遮光、室温で３０分間静置。
９．反応停止液を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れる。
１０．プレート攪拌機で５〜１０秒程度攪拌した後、各ｗｅｌｌの吸光度を測定。
（測定波長：４５０／６５０ｎｍ（主／副）、検量線近似式：二次式）
［実施例６］  検量線の作成
調製した０、２、５、１０、２５、５０ｎｇ／ｍＬのＧＢＰ２８標準液をサンプルとして測定し、検量線を確認したところ、図３に示すように、ほぼ直線の検量線が得られた。血液中のＧＢＰ２８の平均濃度は１０μｇ／ｍＬであるため、検体は２１倍希釈を２回行った４４１倍希釈で測定することとした（測定範囲：０〜２２μｇ／ｍＬ）。
［実施例７］  同時再現性試験
キット測定値の変動を評価するために、３種類の血清サンプルを用いて、各々２４回ずつ測定した。その結果、表１１に示すように、ＣＶ値はいずれも５％以下と満足できる結果であった。このことから、当キットの測定値に対する信頼性を得ることができた。
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［実施例８］  日差再現性試験
キット測定値の日差変動を評価するために、５種類の血清サンプルを用いて、各々５回ずつ５日に分けて測定を行った。その結果、表１２に示すように、５日間の測定値のバラツキはＣＶ３．３〜６．８％と満足できる結果であった。このことから、当キットの測定値に対する信頼性を得ることができた。
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［実施例９］  希釈試験
診断薬キットでは、血清成分の反応系への影響をさける目的で、血清サンプルを通常希釈してアッセイに用いる。そのため、至適な希釈倍率であるかどうかを確認するために、所定濃度のサンプルを適宜希釈して測定し、得られた値がグラフ上で直線を描くかどうかを確認する。直線が描ければ、標準液と同等の性能を得たことになり測定値に血清成分の影響がないと判断する。
そこで、３種類の血清サンプルをアッセイプロトコルに従って４４１倍に希釈し、さらにそのサンプルを１／５〜５／５まで希釈して各々２回ずつ測定した。その結果、表１３及び図４に示すように、いずれの検体においても良好な直線性が得られたことから、当キットの希釈倍率に支障がないことが確認された。
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［実施例１０］  添加回収試験
血中に存在するタンパク質は単離されたタンパク質と異なり、さまざまな血中に存在する他のタンパク質や物質と複合体を構成する場合や立体構造に変化をきたす場合がある。そのため、単離されたタンパク質を濃度調製した標準品では良好な評価結果が得られていても、血清などをサンプルとした場合に、正確な濃度が測定されていない場合がある（例えば、複合体が形成されることにより、抗体に対するエピトープが失われるなど）。
そこで、サンプル血清に適当な濃度に調製されたＧＢＰ２８標準液を添加したものをサンプルとして測定した。続いて、得られた値から標準品添加前のサンプル濃度を差し引いた値を、添加した量で割ることにより回収率として求めた。その結果、表１４に示すように、平均９５％程度の良好な回収率が得られたことから、当キットでは、添加した標準品が血中成分の影響を受けることなく測定されていることが証明され、血中ＧＢＰ２８を正確に測定できていることが確認された。
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産業上の利用可能性
本発明により、試料中のＧＢＰ２８の濃度を測定することから、臨床の場において２型糖尿病等の糖代謝異常を簡便に診断することが可能になると共に、２型糖尿病治療剤、特にチアゾリジン誘導体の治療効果をモニタリングすることが可能となった。また、本発明の抗体を用いれば、ＧＢＰ２８好ましくは天然型のＧＢＰ２８の血中濃度を測定することが可能であり、試料中のＧＢＰ２８に対して熱処理等の前処理を行わずに、ＧＢＰ２８を定量的に測定することができる。このことにより、測定の簡便化及び検体処理能力の改善が期待できる。
更に、本発明の方法は、大量の検体を簡便に処理できるため、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化等インスリン抵抗性の関連する成人病に対する臨床的検査において、非常に有効な測定系を提供するものである。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の方法及び従来法の原理を模式的に示す。
図２は、１０名の２型糖尿病患者（日本人男性）に対するピオグリタゾンの３ヶ月投与（３０ｍｇ／日）による血清アディポネクチンレベルの変化を示す。
○−○：食事療法及びピオグリタゾン（ｎ＝７）
■−■：食事療法、スルホニルウレア剤及びピオグリタゾン（ｎ＝３）
図３は、ＧＢＰ２８の検量線を示す。
図４は、ＧＢＰアッセイの希釈直線性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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