(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離した白血球細胞表面上のSF-25抗原を測定することを含む、くすぶり型成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病の検出方法。
【請求項２】
くすぶり型成人Ｔ細胞白血病を検出する請求項１記載の方法。
【請求項３】
白血球細胞のうち、その表面上にSF-25抗原を発現する細胞の割合を測定することを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
白血球細胞が単核球である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
SF-25抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片と、白血球細胞上のSF-25抗原との抗原抗体反応を利用して行う請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体又はその抗原結合性断片が蛍光標識されており、フローサイトメトリーにより行う請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
SF-25抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む、くすぶり型成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病診断用試薬。
【請求項９】
くすぶり型成人Ｔ細胞白血病診断薬である請求項８記載の試薬。
【請求項１０】
前記抗体が蛍光標識されている請求項８又は９記載の試薬。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、くすぶり型成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病の検出方法及びそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
成人Ｔ細胞白血病（adult T-cell luekemia, 以下、「ATL」ということがある）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス-I(human T-cell leukemia virus-I, HTLV-I)により、Ｔ細胞が癌化する白血病であり、皮膚病変、肝脾腫大、リンパ節腫脹が高率で起きる。HTLV-Iに感染しても、発病する者は約２０００人に１人と少なく、ほとんど全ての感染者（キャリア）は、ATLを発病することなく生涯を終える。しかし、一旦発病すれば、治療法はなく、ほとんどの患者は発病から１年以内に死亡する。従来、ATLの診断は、臨床症状並びに白血球の検鏡及び抗体検査等の結果を総合的に考慮して行われている。
【０００３】
キャリアが発症する場合、「くすぶり型」(smoldering type)を経由して完全な発症に至る。くすぶり型では、癌化したＴ細胞は極僅かであり、Ｔ細胞のほとんどは正常であるため、この段階で治療を行えば、発症を防ぐことが可能である。したがって、くすぶり型を検出することができれば、ATLの発症を防止することができ、医療上、極めて有利である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、くすぶり型では、未だ臨床的には発症していないので、臨床症状に基づく診断はもちろんできない。また、抗体検査では、キャリアか否かは区別できるが、キャリアとくすぶり型の区別はできない。さらに、くすぶり型では、ほとんどのＴ細胞は正常細胞であり、癌化しているのは極少数であるから、検鏡によって癌化した極少数のＴ細胞を見つけ出すことはなかなか困難である。このように、くすぶり型を容易に検出できる診断方法は現在までに知られていない。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、くすぶり型のATLを容易に検出することができるくすぶり型ATLの検出方法及びそのための試薬を提供することである。さらにまた、本発明の目的は、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病をも容易に検出することができる、白血病の検出方法及びそのための試薬を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、白血球細胞上のSF-25抗原を癌マーカーとして用いることにより、くすぶり型のATLを検出することができることを見出し、本発明を完成した。また、本願発明者らは、白血球細胞上のSF-25抗原を癌マーカーとして用いることにより、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病をも検出することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、生体から分離した白血球細胞表面上のSF-25抗原を測定することを含む、くすぶり型成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病の検出方法を提供する。また、本発明は、SF-25抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む、くすぶり型成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病診断用試薬を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明のくすぶり型成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病の検出方法は、生体から分離した白血球細胞表面上のSF-25抗原を測定することを含む。SF-25抗原は、1987年に発見された分子量約125 kDaの公知の糖タンパク抗原である(WO89/05307, 欧州特許第0 397 700号、米国特許第5,212,085号、Takahashi H, Wilson B, Ozturk M, Motte P, Strauss W, Isselbacher KJ and Wands JR. In vivo localization of colon adenocarcinoma by monoclonal antibody binding to a highly expressed cell surface antigen. Cancer Research 1988; 48: 6573-6579. 、Wilson B, Ozturk M, Takahashi H, Motte P, Kew M, Isselbacher KJ and Wands JR.  Cell surface changes associated with transformation of human hepatocytes to the malignant phenotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 3140-3144.、Takahashi H, Carlson R, Ozturk M, Sun S, Motte P, Strauss W, Isselbacher KJ and Wands JR, Shouval D. Radioimmunolocalization of hepatic and pulmonary metastasis of human colon adenocarcinoma. Gastroenterology 1989; 96: 1317-1329.、Hurwitz E, Stancovski I, Wilcheck M, Shouval D, Takahashi H, Wands JR, Sela M. A conjugate of 5-Fluorourodine-poly(L-lysine) and an antibody reactive with human colon carcinoma. Bioconjugate Chemistry 1990; 1: 285-290.、Wands JR, Takahashi H. Studies on cell surface changes associated with transformation of human hepatocytes to the malignant phenotype and their role as potential immunotargeting sites. In Frontiers of Mucosal Immunology. Volume 2. Eds by Tsuchiya M. 1991 pp. 295-298. Hurwitz E, Adler R, Shouval D, Takahashi H, Wands JR, Sela M. Immunotargeting of daunomycin to localized and metastatic human colon adenocarcinoma in athymic mice. Cancer Immunology Immunotherapy 1992; 35: 186-192.、Takahashi H, Nakada T, Puisieux I. Inhibition of human colon cancer growth by antibody-directed human LAK cells in SCID mice. Science 1993; 259: 1460-1463.、Takahashi H, Nakada T, Nakaki M, Wands JR.  Inhibition of hepatic metastases of human colon cancer in nude mice by a chimeric SF-25 monoclonal antibody.  Gastroenterology 1995; 108: 172-182.)。SF-25抗原は、ヒト結腸腺腫細胞株(例えば、LS 180 (ATCC No. CL0187), COLO 320 (ATCC No. CCL-220.1), WiDr (ATCC No. CCL-218), Caco-2 (HTB-37)や、ヒト肝臓癌細胞株(例えばFOCUS (Lun H. et al., in Vitro 20; 493-504(1984))の表面上に発現していることが知られている。また、抗SF-25モノクローナル抗体も公知であり(WO89/05307, 欧州特許第0 397 700号、米国特許第5,212,085号)、抗SF-25モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマがATCCに寄託されている(ATCC No. HB9599)。
【０００９】
下記実施例に具体的に記載するように、本願発明者らは、くすぶり型のATL患者の単核球表面上にSF-25抗原が発現され、健常者及びHTLV-1の健常キャリアの単球上にはSF-25抗原がほとんど全く発現されていないことを見出し、これを利用してくすぶり型のATLを検出できることを見出した。さらに、下記実施例に具体的に記載するように、インバースＰＣＲにより、HTLV-1がプロウイルス化（ヒトの染色体ＤＮＡ中に、ウイルスＤＮＡが組み込まれること）することによりSF-25抗原が単核球表面上に出現することを確認し、これにより、本発明の方法で、くすぶり型ATLが検出できることが確認された。
【００１０】
本発明の方法では、生体から分離された白血球細胞表面上のSF-25抗原を検出する。白血球細胞としては、特に限定されず、単核球や多核球を挙げることができる。血液から白血球細胞を分離する方法は周知であり、下記実施例にも単核球の分離方法が記載されている。
【００１１】
白血球細胞表面上のSF-25抗原の検出は、白血球細胞と抗SF-25抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して、周知の免疫学的方法により行うことができる。抗SF-25抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。上記の通り、抗SF-25モノクローナル抗体は公知であり、寄託もされている。寄託されている、ハイブリドーマATCC No. HB9599により産生されるモノクローナル抗体は、上記したヒト肝臓癌細胞株FOCUSを免疫原としてマウスに免疫し、常法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、得られたモノクローナル抗体のうち、上記した各種ヒト結腸腺腫細胞株と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択することにより得られた。本発明の方法には、この寄託された抗SF-25モノクローナル抗体を用いることもできるし、同様な方法で作製される他のモノクローナル抗体を用いることもできる。なお、ATCC No. HB9599を記載しているWO89/05307, 欧州特許第0 397 700号及び米国特許第5,212,085号の実施例に具体的に記載されているように、上記の方法により、抗SF-25モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ATCC No. HB9599以外にも１回の作製操作で多数得られているから、抗SF-25モノクローナル抗体は、公知の方法により容易に作製可能なものであり、したがって、本発明の方法に用いられるモノクローナル抗体は、寄託されたハイブリドーマが産生するものに限定されるものでは全くない。また、上記したSF-25抗原を発現していることが知られているヒト結腸腺腫細胞株やヒト肝臓癌細胞株を免疫原として動物を免疫し、常法によりモノクローナル抗体を作製し、正常ヒト白血球細胞と抗原抗体反応しないモノクローナル抗体を選択することによっても容易に得ることができる。また、抗体自体のみならず、FabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗原との結合性を有する断片も用いることができる。
【００１２】
抗SF-25抗体を用いて、SF-25抗原を発現している白血球細胞を検出すること、さらには、白血球細胞のうち、その表面上にSF-25抗原を発現する細胞の割合を測定することは、周知のフローサイトメトリーにより容易に行うことができる。フローサイトメトリーでは、蛍光標識した抗体を細胞と接触させ、抗原抗体反応により細胞に蛍光標識抗体が結合した細胞数を計数することができ、ひいては、抗体と結合した細胞の割合を算出することができる。フローサイトメトリーの装置及び必要な試薬類は市販されており、当業者が容易に実施することが可能である。
【００１３】
下記実施例に具体的に記載するように、SF-25抗原を発現している単核球の割合は、平均して、急性ATL患者で約43%、慢性ATL患者で約28%、くすぶり型ATL患者で約15%であったが、健常人では約0.4%、健常キャリアで約0.6%であり、健常人＋健常キャリアの群と、急性＋慢性＋くすぶり型の群とは明瞭に区別することができる。すなわち、健常人の値と比較して、有意に高ければATL（くすぶり型を含む）であると診断できる。また、下記実施例に具体的に記載するように、インバースＰＣＲにより、HTLV-1がプロウイルス化することによりSF-25抗原が単核球表面上に出現することを確認し、これにより、本発明の方法で、ATL及びくすぶり型ATLが検出できることが確認された。
【００１４】
本発明の方法は、くすぶり型ATLを検出することができるという、医療上、非常に重要な特徴を有する。
【００１５】
さらに、下記実施例に具体的に記載するように、SF-25抗原は、ATL以外の他の白血病であるＢ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の患者の単核球上にも存在することが明らかになった。したがって、上記した白血球細胞上のSF-25抗原の検出は、ATLのみならず、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の検出にも適用することができることが明らかになった。
【００１６】
なお、白血球細胞上のSF-25抗原の検出のみでは、白血病がATL、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病のいずれであるのかを識別することはできない。これらの識別は、公知の血液学的検査や、遺伝子検査（例えばATLの場合には、下記実施例に具体的に記載するインバースＰＣＲ等）により行うことができる。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１    ATLの検出
１．  試料の調製
急性ATL患者７名、慢性ATL患者５名、くすぶり型ATL患者９名、健常ATLキャリア４２名及び健常人（HTLV-1非感染者）８名の末梢血から単核球を分離した。単核球の分離は、具体的に次のようにして行った。Lymphaprep(商品名） (Axis-Sheld PoC AS, Oslo, Norway)5ｍｌを遠心管にとり、前記対象からえられたヘパリン加静脈血5mlを静かに重層する。その後400g、30分遠心し血漿と分離液の中間に帯上に浮遊する単核球を毛細管ピペットで回収した。回収した単核球をリン酸バッファー生理食塩水(PBS)を用いて３回遠心洗浄し、以下の実験に用いた。
【００１９】
２．  フローサイトメトリー
マウス抗SF-25モノクローナル抗体(ATCC No. HB9599により産生)を常法により、周知の蛍光標識であるフルオレッセインイソチオシアネート(FITC)で標識し、得られた蛍光標識抗SF-25モノクローナル抗体を用い、上記１で分離した単核球についてフローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリーは、具体的に次のようにして行った。PBS中に5x106/mlとなるよう調整した単核球浮遊液から、0.1mlずつ２本の小試験管に分注し、１本には希釈した蛍光標識抗SF-25モノクローナル抗体を10μl加え、他の１本には同様にFITC標識マウスIgG1を10μl加えた。１０分ごとに静かに混和させながら、４℃３０分間反応させた。反応終了後PBSを加え、２回遠心洗浄後フローサイトメーター(EPICS XL(商品名）、Coulter, Miami, Florida, U.S.A.)にアプライし、FITC標識マウスIgG1をコントロールとして約1万個の細胞をカウントし陽性細胞の比率を求めた。
【００２０】
上記フローサイトメトリーにより、全単核球中の、SF-25抗原を発現している単核球の割合を計測した。結果を下記表１及び図１に示す。
【００２１】
【表１】
表１
0003761861.tif 000002
【００２２】
表１及び図１から明らかなように、本発明の方法により、健常人＋健常キャリアの群と、急性＋慢性＋くすぶり型の群とは明瞭に区別することが可能である。とりわけ、くすぶり型であっても、健常HTLV-Iキャリアとは明瞭に区別できることがわかる。
【００２３】
３．  インバースＰＣＲ及びサザンブロット
次に、SF-25抗原を発現している単核球の染色体ＤＮＡに、HTLV-I遺伝子がプロウイルス化して挿入されているか否かをインバースＰＣＲ及びサザンブロットにより調べた。これらは、具体的に次のようにして行った。
【００２４】
インバースＰＣＲの方法：
くすぶり型ATL患者の末梢血から上記のようにして分離した単核球107をリン酸緩衝生食水（pH 7.2、0.5％牛血清アルブミンおよび2mM EDTAを含むー以下バッファー）60μlに浮遊させた。次に、FITC標識したマウス抗SF-25モノクローナル抗体(ATCC No. HB9599により産生)溶液（濃度0.1％）10μｌを加え4oC5分間反応させ、2回洗浄し未吸着の抗体を除去した。この細胞に90μｌのバッファ-を加え再浮遊させ、10μｌの Anti-FITC マイクロ磁性ビ-ズ(Miltenyi Biotec GmbH, Bergish Gladbach, Germany  粒子直径50nｍ)を加え、6oC15分間標識し、SF-25抗原を表面に有する単核球を磁性ビーズと結合させた。未吸着の磁性ビーズを除去するため細胞を2回洗浄後、500μｌのバッファーに再浮遊させた。マックスミディセット(Miltenyi Biotec GmbH, Bergish Gladbach, Germany)  を用いて、この細胞をMACS分離ポジティブセレクションMSカラム(Miltenyi Biotec GmbH, Bergish Gladbach, Germany)  （一度バッファー500μｌで洗浄したもの）にアプライし、磁力により磁性ビーズで標識された細胞（SF-25抗原陽性細胞）と磁性ビーズで標識されなかった細胞（SF-25抗原陰性細胞）を分画し、以下の実験で検体として用いた。
【００２５】
Takemoto Sらによる報告（Blood  Vol 84  No9 3080-3085, 1994）に基づき以下のように行った。DNAzol(Molecular Research Center, Inc., Montgomery Rd., Cincinnati, Ohio.)を用いて各検体より染色体ＤＮＡを抽出し、このDNAをSau3AIを用いて切断し、T4 DNA ligaseをもちいてセルフライゲーションを行った。この方法により、HTLV-1 5'LTR及びgag sequnceからなるものと、HTLV-1 3'-LTRと染色体DNAからなるものとができる。HTLV-1の5' proviral DNAからなるものを除く目的で、Sac IIで加熱処理した。このDNAをテンプレートとしてprimer 1 ; primer 1: 5'-aagccggcagtcagtcgtga-3'（HTLV-I  塩基配列の8946-8927)、 primer 2: 5'-aagtaccggcaactctgctg-3'  (HTLV-I  塩基配列の8958-8977)で第一段階のPCRを行い、次いでnested primerとして 3:  5'-gaaagggaaaggggtggaac-3' (HTLV-I 塩基配列の8924-8905)  primer 4: 5'-ccagcgacagcccattctat-3'.（HTLV-I  塩基配列の8986-9005） で第二段階のnested PCRを行った。各PCRはThermal Cycler を用いて94℃20秒、55℃20秒、72℃30秒のサイクルを第一段階は50回、第二段階は35回行った。このPCR産物 5mlをとり2% アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色後、バンドを確認しHTLV-Iのクローナルな組み込みの有無をみた。
【００２６】
サザンブロット：
上記の泳動産物を、ナイロンメンブランフィルタ-にトランスファーし、オリゴヌクレチド(5'-ctccaggagagaaatttagtacac-3'  HTLV-I塩基配列の9012-9035)をプローブとしてHTLV-Iの組み込みを確認した。Takemotoらによる報告によると、この方法により染色体遺伝子を含むHTLV-1の3'LTRのU5領域が増幅されると考えられる。ATL患者におけるHTLV-1遺伝子の組み込みは各症例間でランダムであるが、1人の患者ATL細胞におけるHTLV-1遺伝子の組み込みはモノクローナルであり、染色体DNAを含むHTLV-1の3'LTRのU5領域を増幅することで、モノクローナルな増殖であるか否かを決定できる。事実彼らは染色体DNAを含むHTLV-1の3'LTRのU5領域のDNA sequence行うことによりそのことを確認している。
【００２７】
その結果、SF-25抗原陽性単核球では、HTLV-Iプロウイルス化ＤＮＡが、モノクローナルに組み込まれており、SF-25抗原陰性細胞では、HTLV-Iのプロウイルス化は検出されなかった。このことから、本発明の方法により、急性、慢性及びくすぶり型ATLが検出できることが確認された。
【００２８】
実施例２    Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の検出
実施例１と同様な方法により、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病患者１２名、急性リンパ性白血病患者１０名及び急性骨髄性白血病患者１２名の末梢血中の単核球について、SF-25抗原を発現している単核球の割合を測定した。結果を下記表２に示す。
【００２９】
【表２】
表２
0003761861.tif 000003
【００３０】
上記のとおり、健常人中のSF-25抗原発現単核球の割合(%)は0.4%であるから、SF-25抗原をマーカーとしてＢ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の検出も可能であることが明らかになった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、くすぶり型ATLを、容易に高感度に検出することができる方法が初めて提供された。本発明によれば、末梢血中の単核球を用いて、容易にくすぶり型ATLを検出することができる。くすぶり型ATLは治療可能であるので、くすぶり型ATLを容易に高感度に検出できることは、医療上、非常に有利である。
【００３２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  SRL, INC.
<120>  Method for Detecting Leukemia and Reagent therefor
<130>  02807
<160>
【００３３】
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide forward primer used in inverse PCR for amplifying a region of HTLV-1 gene
<400>  1
aagccggcag tcagtcgtga                                                20
【００３４】
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide reverse primer used in inverse PCR for amplifying a region of HTLV-1 gene
<400>  2
aagtaccggc aactctgctg                                                20
【００３５】
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide forward primer used in inverse PCR for amplifying a region of HTLV-1 gene
<400>  3
gaaagggaaa ggggtggaac                                                20
【００３６】
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide reverse primer used in inverse PCR for amplifying a region of HTLV-1 gene
<400>  4
ccagcgacag cccattctat                                                20
【００３７】
<210>  5
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Oligonucleotide probe used for detecting a region of HTLV-1 gene<400>  5
ctccaggaga gaaatttagt acac                                           24
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において、急性ATL患者、慢性ATL患者、くすぶり型ATL患者、健常ATLキャリア及び健常人（HTLV-1非感染者）の末梢血中の単核球を被検試料とし、抗SF-25モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより測定した、全単核球中のSF-25抗原陽性単核球の割合を示す図である。
【図１】
0003761861.tif 000004