(57)【要約】複数の健常者とアレルギー性疾患の患者の血液を採取し、ディファレンシャルディスプレイ法により発現に差の見られる遺伝子を探索した結果、患者群で発現レベルが有意に高い遺伝子Ｂ１１５３を単離することに成功した。本発明者らは、この遺伝子をアレルギー性疾患の検査、および治療薬候補化合物のスクリーニングに使用できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法。
ａ）被検者のＴ細胞における、配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）健常者のＴ細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
【請求項２】
アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項５】
配列番号：１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
【請求項６】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
【請求項７】
次の工程を含む、候補化合物が下記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法。
（１）下記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（２）前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
【請求項８】
細胞が株化Ｔ細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
次の工程を含む、候補化合物が下記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、および
（２）被験動物のＴ細胞における前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程。
【請求項１０】
請求項７、または請求項９に記載の方法によって、前記発現レベルに与える影響を検出し、対照と比較して前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程を含む、前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを低下させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
次の工程を含む、候補化合物が配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域の活性に与える影響を検出する方法。
（１）配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、および
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法によって、候補化合物の前記活性に与える影響を検出し、対照と比較して前記活性を低下させる化合物を選択する工程を含む、配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域の活性を低下させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
次の工程を含む、被検化合物が（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の活性に与える影響を検出する方法。
（１）下記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に候補化合物を接触させる工程、および
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程
【請求項１４】
蛋白質の活性が、ミオシン結合サブユニット８５、または骨格筋α２アクチニンとの結合活性である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法によって、候補化合物の前記活性に与える影響を検出し、対照と比較して前記活性を低下させる化合物を選択する工程を含む、（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の活性を低下させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを導入した細胞。
【請求項１８】
請求項１０、請求項１２、および請求項１５のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
【請求項１９】
配列番号：１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬。
【請求項２０】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬。
【請求項２１】
下記の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
【請求項２３】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを発現可能に保持するベクター。
【請求項２４】
請求項２１に記載のポリヌクレオチド、または請求項２３に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載の形質転換細胞を培養し、その発現産物を回収する工程を含む、請求項２２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載の蛋白質に対する抗体。
【請求項２７】
請求項２６に記載の抗体と、請求項２２に記載の蛋白質の免疫学的な反応を観察する工程を含む、請求項２２に記載の蛋白質の免疫学的測定方法。
【請求項２８】
配列番号：１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１５塩基の長さを持つオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のオリゴヌクレオチドと、請求項２１に記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイズを観察する工程を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチドの測定方法。
【請求項３０】
下記の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドのＴ細胞における発現レベルを上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患モデル動物。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号：１に記載の塩基配列、またはその相補配列にハイブリダイズする少なくとも１５塩基の長さを有するポリヌクレオチドと、配列番号：１に記載の塩基配列からなる遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキット。
【請求項３２】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体と、配列番号：１に記載の塩基配列からなる遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキット。
【請求項３３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の蛋白質、およびこの蛋白質に対して相互作用する蛋白質を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキット。
【請求項３４】
相互作用する蛋白質が、ミオシン結合サブユニット８５、骨格筋α２アクチニン、およびそれらの相互作用ドメインを含む断片からなる群から選択されるいずれかの蛋白質である請求項３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アレルギー性疾患に関連する遺伝子、並びに該遺伝子の発現を指標としたアレルギー性疾患の検査方法およびアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難である。
またアレルギー性疾患には、変異や欠陥を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
近年の遺伝子発現の解析技術の発達により、多くの臨床試料で、遺伝子の発現を解析・比較することが可能となった。このような方法としては、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）法が有用である。ディファレンシャルディスプレイ法は、ライアンおよびパディー（Ｌｉａｎｇ　ａｎｄ　Ｐａｒｄｅｅ）によって１９９２年に最初に開発された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５７：９６７−９７１）。この方法を用いることによって、１回に数十種類以上のサンプルをスクリーニングすることができ、それらのサンプル中で発現が変化した遺伝子を検出することが可能である。このような方法を用いて、変異が生じた遺伝子や、時間や環境とともに発現が変わるような遺伝子を調べることによって、病因遺伝子の解明のために重要な情報がもたらされることが期待される。これらの遺伝子には、環境要因によって発現に影響を受けるような遺伝子も含まれる。
さて、現在アレルギー疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ　ｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。ブリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であると言うことができる。
この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
好酸球数とＥＣＰ値は、Ｉ型アレルギーに引き続いて起きる遅延型反応や、アレルギー性炎症反応に関連する診断項目である。好酸球の数は、アレルギー症状の進展を反映するとされている。また、好酸球の顆粒に含まれる蛋白質であるＥＣＰ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）も、喘息患者の発作に伴って強く活性化される。これらの診断項目は、確かにアレルギー症状を反映するものではある。しかし、実際に診断の指標とできる範囲は限られている。
したがって、アレルゲンに関わらず、アレルギー患者の病態の把握や治療方針の決定に役立てることができる診断指標が求められていた。加えて、患者に対する危険が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー疾患のマーカーが提供されれば有用である。
発明の開示
本発明は、アレルギー性疾患に関連する遺伝子を提供することを課題とする。さらに、本発明は該遺伝子の発現を指標とした、アレルギー性疾患の検査方法およびアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、既に確立された「蛍光ＤＤ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ＤＤ）法」（Ｔ．Ｉｔｏら，１９９４，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３５１：２３１−２３６）の手順に基づき、複数のヒトの血液から調製したＴ細胞ＲＮＡサンプルを解析できるＤＤシステムを開発した（ＷＯ　００／６５０４６）。そして該システムを、アレルギー性疾患特異的に発現量が異なる遺伝子の単離に応用した。
すなわち、まず本発明者らは、健常者およびアレルギー性疾患（気管支喘息およびアトピー性皮膚炎）の患者を含む複数の被検者について、ダニに対するＩｇＥ値を測定した。その結果、アレルギー性疾患の患者群（以下、単に「患者群」と呼ぶ場合あり）においてスコアが有意に高いことを示し、患者群はダニ抗原に対してアレルギーを有することを確認した。
次に、複数の被検者を健常群、およびアレルギー性疾患の患者群とに分け、被検者の血液からＴ細胞を採取して、前記システムを利用し、健常者群と患者群で発現量が変化する遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、患者群において有意に高い発現量を示す遺伝子「Ｂ１１５３」の単離に成功した。この遺伝子は、公知の遺伝子データベースに同一の塩基配列を見出すことができず、新規な遺伝子であると考えられた。さらに本発明者らは、この遺伝子の発現量を指標として、アレルギー性疾患の検査、およびアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、アレルギー素因を有する者に高い発現を示す遺伝子、該遺伝子によってコードされる蛋白質、並びにそれらの応用に関する。より具体的には、該遺伝子の発現を指標としたアレルギー性疾患の検査方法、および候補化合物の該遺伝子の発現に与える影響を検出する方法、更にこの検出方法に基づくアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法。
ａ）被検者のＴ細胞における、配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）健常者のＴ細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程
〔２〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕配列番号：１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔６〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。
〔７〕次の工程を含む、候補化合物が下記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法。
（１）下記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（２）前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
〔８〕細胞が株化Ｔ細胞である〔７〕に記載の方法。
〔９〕次の工程を含む、候補化合物が上記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、および
（２）被験動物のＴ細胞における前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程。
〔１０〕〔７〕、または〔９〕に記載の方法によって、前記発現レベルに与える影響を検出し、対照と比較して前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程を含む、前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを低下させる化合物のスクリーニング方法。
〔１１〕次の工程を含む、候補化合物が配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域の活性に与える影響を検出する方法。
（１）配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、および
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、
〔１２〕〔１１〕に記載の方法によって、候補化合物の前記活性に与える影響を検出し、対照と比較して前記活性を低下させる化合物を選択する工程を含む、配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域の活性を低下させる化合物のスクリーニング方法。
〔１３〕次の工程を含む、被検化合物が上記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の活性に与える影響を検出する方法。
（１）上記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に候補化合物を接触させる工程、および
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程
〔１４〕蛋白質の活性が、ミオシン結合サブユニット８５、または骨格筋α２アクチニンとの結合活性である〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕〔１３〕に記載の方法によって、候補化合物の前記活性に与える影響を検出し、対照と比較して前記活性を低下させる化合物を選択する工程を含む、上記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の活性を低下させる化合物のスクリーニング方法。
〔１６〕配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクター。
〔１７〕〔１６〕に記載のベクターを導入した細胞。
〔１８〕〔１０〕、〔１２〕、および〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１９〕配列番号：１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬。
〔２０〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬。
〔２１〕上記の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
〔２２〕〔２１〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔２３〕〔２１〕に記載のポリヌクレオチドを発現可能に保持するベクター。
〔２４〕〔２１〕に記載のポリヌクレオチド、または〔２３〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔２５〕〔２４〕に記載の形質転換細胞を培養し、その発現産物を回収する工程を含む、〔２２〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔２６〕〔２２〕に記載の蛋白質に対する抗体。
〔２７〕〔２６〕に記載の抗体と、〔２２〕に記載の蛋白質の免疫学的な反応を観察する工程を含む、〔２２〕に記載の蛋白質の免疫学的測定方法。
〔２８〕配列番号：１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１５塩基の長さを持つオリゴヌクレオチド。
〔２９〕〔２８〕に記載のオリゴヌクレオチドと、〔２１〕に記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイズを観察する工程を含む、〔２１〕に記載のポリヌクレオチドの測定方法。
〔３０〕上記の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドのＴ細胞における発現レベルを上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患モデル動物。
〔３１〕配列番号：１に記載の塩基配列、またはその相補配列にハイブリダイズする少なくとも１５塩基の長さを有するポリヌクレオチドと、配列番号：１に記載の塩基配列からなる遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキット。
〔３２〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドを認識する抗体と、配列番号：１に記載の塩基配列からなる遺伝子を発現する細胞を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキット。
〔３３〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列の蛋白質、およびこの蛋白質に対して相互作用する蛋白質を含む、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキット。
〔３４〕相互作用する蛋白質が、ミオシン結合サブユニット８５、骨格筋α２アクチニン、およびそれらの相互作用ドメインを含む断片からなる群から選択されるいずれかの蛋白質である〔３３〕に記載のキット。
あるいは本発明は、〔１０〕、〔１２〕、および〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法に関する。さらに本発明は、〔１０〕、〔１２〕、および〔１５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物の、アレルギー性疾患の治療のための医薬組成物の製造における使用に関する。加えて本発明は、「Ｂ１１５３」遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、または「Ｂ１１５３」蛋白質に結合する抗体を投与する工程を含むアレルギー性疾患の治療方法に関する。また本発明は、「Ｂ１１５３」遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、または「Ｂ１１５３」蛋白質に結合する抗体の、アレルギー性疾患の治療のための医薬組成物の製造における使用に関する。
本発明は、新規な遺伝子「Ｂ１１５３」、並びにＴ細胞における「Ｂ１１５３」の発現レベルを指標とする、アレルギー疾患の検査方法に関する。「Ｂ１１５３」は、配列番号：１に示す塩基配列を有する。また「Ｂ１１５３」は、健常者群とアレルギー性疾患の患者群とで発現量が変化する遺伝子である。本発明の遺伝子「Ｂ１１５３」は、公共データベースからは、特に構造的に同一性の高い既知遺伝子を見出すことができなかった。
「Ｂ１１５３」は、その配列の５’側約１９３ｂｐにおいて、既に報告されている、ヒト分泌蛋白質の５’ＥＳＴ（ヨーロッパ特許第１，０３３，４０１号のＳＥＱ　ＩＤ　２０８１１）と９６％の相同性を示したが、完全には一致しなかった。したがって、「Ｂ１１５３」は新規な遺伝子であると考えられた。また言うまでも無く、このＥＳＴがアレルギー性疾患に関与することを示す報告もない。配列番号：１に示す塩基配列を有する「Ｂ１１５３」がアレルギー性疾患に関与していることは、本発明者らによって今回初めて見出された知見である。
「Ｂ１１５３」は、ＯＲＦを含む３５９６ｂｐの完全長ｃＤＮＡクローンとして単離された。決定された「Ｂ１１５３」ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、またこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に示した。
これらの配列情報についてホモロジー検索したところ、配列番号：１に示した「Ｂ１１５３」遺伝子塩基配列中の５０５ｂｐから２１４８ｂｐまでの塩基配列は、ＫＩＡＡ１８６１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０５８７６４）と、また１４２０ｂｐから３５９６ｂｐまでの配列はＦＬＪ２３５８１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＫ０２７２３４）と相同性が高かった。しかし、１ｂｐから５０４ｂｐまでの配列は新規配列であった。これらの塩基配列の関係を、図５にまとめた。これらの塩基配列の他には、このアミノ酸配列と相同性を示す既知アミノ酸配列は見出されず、「Ｂ１１５３」は新規な蛋白質をコードしていると考えられた。
配列番号：１に示す塩基配列は、全長ｃＤＮＡである。このｃＤＮＡは、Ｔ細胞のｃＤＮＡライブラリーを、配列番号：１に示した塩基配列から選択された塩基配列からなるプローブでスクリーニングすることによって取得することができる。
本発明は、配列番号：１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、このポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、このポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明において、ポリヌクレオチドとは、ＤＮＡやＲＮＡのような天然の核酸分子の他、標識を付した分子や、各種のヌクレオチド誘導体によって構成された人工的な分子をも含む。人工的なポリヌクレオチドには、ホスホロチオエート結合やペプチド結合をバックボーンとするポリヌクレオチドが含まれる。
これら本発明のポリヌクレオチドは、化学的に合成することもできるし、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、あるいはゲノムライブラリー等の天然の核酸から単離することもできる。本発明のポリヌクレオチド分子は、それによってコードされる蛋白質の生産、「Ｂ１１５３」の発現を阻害するためのアンチセンス核酸、あるいはその存在をハイブリダイゼーションによって検出するためのプローブ等として有用である。
また本発明において、ある蛋白質がアレルギー性疾患患者、あるいはアレルギー疾患動物のＴ細胞において発現が増加するとき、本発明の蛋白質と機能的に同等と言う。ある蛋白質が、Ｔ細胞において発現が増加することは、採取されたＴ細胞における当該蛋白質をコードする遺伝子の発現レベルを比較することによって確認することができる。
このポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１に記載の塩基配列に基づいて、ハイブリダイズやＰＣＲなどの公知の手法によって取得することができる。たとえば、配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ストリンジェントな条件下で、Ｔ細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、配列番号：１に記載の塩基配列と同一性の高い塩基配列からなるｃＤＮＡを取得することができる。
あるポリヌクレオチドがストリンジェントな条件下で配列番号：１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、このポリヌクレオチドがコードする蛋白質は本発明の蛋白質と類似した活性を持つものが多いと考えられる。ストリンジェントな条件とは、一般的には以下のような条件を示すことができる。すなわち、４×ＳＳＣ、６５℃でハイブリダイゼーションさせ、０．１×ＳＳＣを用いて６５℃で１時間洗浄する。
ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーションや洗浄の温度条件は、融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、ハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度、ホルムアミドやドデシル硫酸ナトリウム濃度）によって変動する。したがって、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を経験的に設定することができる。
同一性の高い塩基配列からなるｃＤＮＡによってコードされる蛋白質は、本発明における機能的に同等な蛋白質である可能性が高い。本発明において、同一性が高い塩基配列とは、一般的に７０％以上、通常は８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を示す塩基配列を言う。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴＮ等の公知のアルゴリズムによって計算することができる。
あるいは、配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列なるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、やはりＴ細胞のｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、同一性の高いｃＤＮＡを取得することもできる。ｃＤＮＡのソースとしてヒトの細胞を用いれば、ヒトのｃＤＮＡを取得することができる。またヒト以外の、脊椎動物細胞を利用すれば、異種動物におけるカウンターパートを取得することができる。このような非ヒト脊椎動物としては、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギなどの多くの実験動物を例示することができる。実験動物における「Ｂ１１５３」のカウンターパートは、各動物種におけるアレルギーモデル動物の作成や、アレルギーの治療薬の開発におけるマーカーとして有用である。
あるいは「Ｂ１１５３」タンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、「Ｂ１１５３」遺伝子と機能的な遺伝子として示すことができる。また、実施例において用いた配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅することができる遺伝子であって、アレルギー素因を有する者に高い発現を示す蛋白質をコードする遺伝子も、機能的に同等な遺伝子である。本発明において、配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子、あるいはこの遺伝子と機能的に同等な遺伝子を指標遺伝子という。そして指標遺伝子によってコードされる蛋白質を指標蛋白質という。
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。たとえば真核生物の遺伝子には、しばしば多型が見出される。多型によって１個あるいはそれ以上のアミノ酸が置換される場合もあるが、通常蛋白質の活性は維持される。また、一般に、１個または数個のアミノ酸配列の改変によって、蛋白質の活性が維持される場合が多いことが知られている。したがって、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの人為的な改変によってアミノ酸配列に変異を与えた蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、該蛋白質が本発明の遺伝子の特徴的な機能を有する限り、すべて本発明に含まれる。このようなアミノ酸配列は、好ましくは配列番号：２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上のホモロジーを持つ配列を含む。アミノ酸配列のホモロジーは、ＦＡＳＴＡによって決定することができる。
なお、アミノ酸に対するコドンは公知であり、その選択も任意でよい。例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる［Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．９，ｒ４３（１９８１）］。したがって、コドンの縮重を考慮して、ＤＮＡを適宜改変したものもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的変位導入法（ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，５６６２（１９８４）］等にしたがって、これら塩基配列のコドンを一部改変することができる。
本発明はまた、配列番号：１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１５塩基の長さを持つオリゴヌクレオチドに関する。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡにおいてはＴをＵに読みかえる）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、本明細書に記載したアルゴリズムにより決定することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの検出や合成に有用である。オリゴヌクレオチドをプローブやプライマーとして、標的ポリヌクレオチドを検出、あるいは合成する手法は公知である。たとえば、ｍＲＮＡを標的ポリヌクレオチドとするノーザンブロット法は、ＲＮＡの代表的な検出方法である。ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行えば、本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。また、その合成産物の有無や量を指標としてｍＲＮＡの有無やその発現レベルを知ることができる。あるいは、Ｔ細胞中に発現している本発明のポリヌクレオチドを、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出することもできる。
更に本発明のポリヌクレオチドを利用して、それがコードする蛋白質を組み換え体として製造することができる。より具体的には、配列番号：１の塩基配列を有するポリヌクレオチドのコード領域を公知の発現ベクターに組み込み、適切な宿主に形質転換することによって形質転換体を得る。あるいは、前記コード領域を含むポリヌクレオチドを適切な宿主のゲノムにインテグレートすることにより、形質転換体とすることもできる。
得られた形質転換体を、導入された本発明のポリヌクレオチドが発現可能な条件下で培養し、発現生成物を回収することにより、本発明の蛋白質を得ることができる。発現生成物は、公知の方法によって精製蛋白質とすることができる。
加えて本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に関する。本発明の蛋白質は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の診断のための指標として有用である。
あるいは本発明の蛋白質やその断片は、本発明の蛋白質に対する抗体を作成するための免疫原として有用である。与えられた免疫原を利用して抗体を得る手法は、公知である。すなわち、蛋白質、あるいはその断片を、適切なアジュバントと混合して免疫原とし、免疫動物に接種する。免疫動物は限定されない。代表的な免疫動物としては、マウス、ラット、ウサギ、あるいはヤギ等の動物が挙げられる。抗体価の上昇を確認した後に採血し、血清を分取すれば抗血清とすることができる。あるいは、更にＩｇＧ分画を精製することにより、精製抗体を取得することもできる。抗体の精製には、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ結合セファロースや本発明の蛋白質をリガンドとするイムノアフィニティクロマトグラフィー等の手法を利用することができる。
更に、抗体産生細胞を細胞融合などの手法によって形質転換し、クローン化することによって、モノクローナル抗体を得ることもできる。あるいは、抗体産生細胞の遺伝子を取得し、ヒト化抗体やキメラ抗体を構築する方法も公知である。このようにして得ることができる抗体は、本発明の蛋白質を免疫学的に測定するためのツールとして有用である。本発明の蛋白質をその抗体と接触させ、両者の免疫学的な反応を観察することにより、本発明の蛋白質を免疫学的に測定することができる。本発明の免疫学的な測定には、公知の多くのアッセイフォーマットを応用することができる。たとえば、血清等に含まれる蛋白質であれば、ＥＬＩＳＡ等の手法によって測定することができる。あるいはＴ細胞に発現する蛋白質を抗体によって検出するには、免疫組織学的な手法や、あるいは蛍光標識抗体を用いたＦＡＣＳ等を利用することができる。
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によってＴ細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のうち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本発明における遺伝子「Ｂ１１５３」は、健常者群とアレルギー性疾患の患者群との比較において、患者群で統計学的に有意に高い発現を示した。従って、「Ｂ１１５３」の遺伝子の発現レベルを指標として、アレルギー性疾患の検査を行うことができる。
本発明におけるアレルギー疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。まず、アレルギー疾患様の症状がアレルギー反応に起因するものであるかどうかを判断するための検査が挙げられる。アレルギー疾患様の症状としては、具体的には、皮膚炎（かゆみ、発赤）、鼻炎（はなづまり、鼻水、くしゃみ）、喘息（喘鳴、呼吸困難）等を示すことができる。これらの症状は、それぞれ皮膚乾燥症、かぜ症候群（鼻風邪）、気管支炎などでも認められるが、本発明の検査方法により、その症状がアレルギー反応に起因しているのかどうかを判別可能である。また本発明のアレルギーの検査方法には、アレルギー素因を有するか否かを判断するための検査が含まれる。
本発明において、「Ｂ１１５３」の遺伝子の発現レベルとは、これらの遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。したがって本発明によるアレルギー疾患の検査方法は、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベル、あるいは前記遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査における「Ｂ１１５３」遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、たとえばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーとしては、配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮ等のアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ　ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ　ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ　ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ　ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ　Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ　ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ　ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ，Ｚｉｎｎ　Ｋ，Ｇｒｅｅｎ　ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ　ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、前記遺伝子「Ｂ１１５３」によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。このような検査方法としては、例えば、この遺伝子でコードされる蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いる「Ｂ１１５３」蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ　３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
「Ｂ１１５３」蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、この遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは配列番号：１に記載の全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
本発明においては、被検者のＴ細胞を試料とする。Ｔ細胞は、末梢血から公知の方法によって調製することができる。すなわち、たとえばヘパリン採血した血液を遠心分離によって分画し、リンパ球を分離する。分離されたリンパ球は、そのまま本発明によるアレルギー性疾患の検査のための試料として用いることもできる。純粋なＴ細胞集団ではなく、リンパ球分画を試料として直接分析することにより、ベッドサイドにおける簡便な検査が可能となる。あるいは分離したリンパ球から、ＣＤ３マイクロビーズ標識によってＣＤ３陽性細胞を分取し、更にセルソーターなどによってＴ細胞を分離することができる。分離されたＴ細胞を破壊してライセートとすれば、前記蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。Ｔ細胞のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。
あるいは、Ｔ細胞の分離を行わず、全血や、末梢血リンパ球集団を対象として、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルを測定しても良い。この場合には、測定値の補正を行うことによって、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を求めることができる。たとえばＴ細胞に特異的に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することができる。
また検出すべき蛋白質が分泌型の蛋白質である場合には、被検者の血液や血清などの体液試料に含まれる目的とする蛋白質の量を測定することによって、それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。
本発明によるアレルギー性疾患の検査の結果、本発明の遺伝子の発現レベルが健常者に比べて高ければ、アレルギー性疾患を罹患していると判定することができる。あるいはアレルギー素因の検査においては、その被検者はアレルギー素因を有するものと判定することができる。
また本発明は、下記の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドのＴ細胞における発現レベルを上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアレルギー疾患モデル動物に関する。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アレルギー性疾患患者のＴ細胞において発現が増加する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
本発明によって、アレルギー疾患患者においては、前記遺伝子「Ｂ１１５３」のＴ細胞における発現レベルが高いことが明らかとなった。したがって、Ｔ細胞においてこの遺伝子、またはこの遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アレルギー疾患のモデル動物として利用することができる。なおＴ細胞における発現レベルの上昇とは、血液細胞における標的遺伝子の発現レベルの上昇を含む。すなわち、前記遺伝子の発現レベルを上昇させるのはＴ細胞のみである場合のみならず、血液細胞全体において、あるいは全身性に前記遺伝子の発現レベルが上昇している場合を含む。本発明において機能的に同等な遺伝子とは、前記（ａ）−（ｄ）に記載したポリヌクレオチドのいずれかを意味する。
たとえば本発明によるアレルギー疾患モデル動物がアレルギー性の皮膚炎を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは宿主が備える遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すような定量的なＰＣＲにより確認することができる。また翻訳産物であるタンパク質の活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、目的とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この他のトランスジェニック動物には、たとえば遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域に変異を導入することにより、本発明の遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．ＬａｖｉｔｒａｎｏｅｔらＣｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
本発明のトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
本発明によるトランスジェニック動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。
更に本発明は、候補化合物が本発明のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法に関する。本発明において、「Ｂ１１５３」遺伝子は、アレルギー疾患を持つヒトにおいて有意に発現レベルが高い。したがって、この遺伝子の発現レベルに与える影響を検出する方法に基づいて、対照と比較してその発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アレルギー疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、蛋白質の活性発現のいずれかのステップに対して阻害的に作用する作用を持つ化合物である。
候補化合物が本発明のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響の検出方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏで行なうこともｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うこともできる。ｉｎ　ｖｉｖｏでの影響を検出するには、適当な被験動物を利用する。被験動物には、たとえばアレルギー疾患モデル動物や、前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドのＴ細胞における発現が増強されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。本発明に基づくｉｎ　ｖｉｖｏでの発現レベルに与える影響の検出は、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物のＴ細胞における前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいては、例えば、前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載したポリヌクレオチドを発現する細胞に候補化合物を接触させ、これらポリヌクレオチドの発現レベルを検出する方法を利用することができる。具体的には、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載したポリヌクレオチドを発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載したポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
本発明において、工程（１）に用いるための細胞は、株化Ｔ細胞、あるいはこれらポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ　ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
本発明の検出方法においては、前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現する細胞として、株化Ｔ細胞を用いることもできる。株化Ｔ細胞としてＭｏｌｔ４細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞を例示できる。スクリーニングの方法は、まず前記株化Ｔ細胞に候補化合物を添加する。その後、該株化Ｔ細胞における前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、対照と比較して該ポリヌクレオチドの発現レベルを低下させる化合物を選択する。
なお本発明の方法において、前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルは、これらのポリヌクレオチドがコードする蛋白質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルの比較を行うには、蛋白質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡや蛋白質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに本発明の開示に基づいて本発明の遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流にこの転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の工程を含む、候補化合物が配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域の活性に与える影響を検出する方法に関する。
（１）配列番号：１に記載の塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、および
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
本発明の遺伝子の転写調節領域は、次のようにして取得することができる。すなわち、まず本発明で開示したｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を検出することによって、転写調節領域に対する候補化合物の作用を評価することができる。
本発明の前記ポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法に基づいて、前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物のスクリーニングを行うことができる。本発明は、次の工程を含む前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物のスクリーニング方法に関する。
すなわち本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、候補化合物による前記ポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出し、対照と比較して前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程を含む、前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを低下させる化合物のスクリーニング方法に関する。
あるいは本発明は、配列番号：１に示す塩基配列を有する遺伝子の転写調節領域を利用するレポーターアッセイによる、転写調節領域に作用する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明によるレポーターアッセイの結果に基づいて、対照と比較してレポーター遺伝子の発現を低下させる化合物を選択することにより、配列番号：１に示す塩基配列を有する遺伝子の発現を誘導する化合物を取得することができる。
また本発明の蛋白質「Ｂ１１５３」の活性を指標として、被検化合物の本発明の蛋白質「Ｂ１１５３」の活性に与える影響を評価することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、被検化合物が、「Ｂ１１５３」蛋白質の活性に与える影響を測定する方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と被検化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、
本発明における指標蛋白質である「Ｂ１１５３」は、実施例に記載したようにミオシン結合サブユニット８５、および骨格筋α２アクチニンとの相互作用が観察された。したがって、「Ｂ１１５３」蛋白質と、これらの分子との相互作用を指標として、被検化合物が「Ｂ１１５３」蛋白質の活性に与える影響を評価することができる。分子間の相互作用の測定には、公知の方法を利用することができる。このような解析手法の一つとして、プルダウンアッセイを示すことができる。
プルダウンアッセイは、たとえば次のようにして行われる。まず、指標蛋白質である「Ｂ１１５３」蛋白質と、結合パートナーであるミオシン結合サブユニット８５（または骨格筋α２アクチニン）のいずれかを標識する。標識には、３５Ｓ−メチオニンなどが利用される。プルダウンアッセイに用いる指標蛋白質および結合パートナーは、完全な分子構造を維持していなくてもよい。たとえば、相互の結合に必要なドメインを含む部分ペプチドを用いることもできる。実施例において確認されたように、ミオシン結合サブユニット８５はそのＣ末端領域において、Ｂ１１５３蛋白質との結合活性を示す。また、骨格筋α２アクチニンは、その中央部分である３０９ａａ−５２８ａａに相当する領域において、Ｂ１１５３蛋白質との結合活性が確認された。
次いで指標蛋白質と結合パートナーとを、被検化合物とともにインキュベートし、結合分画を回収する。結合分画を容易に分離するために、指標蛋白質に予めタグを結合させておくと便利である。タグには、ヒスチジンタグやＨＡタグなどが用いられる。結合分画に含まれる標識の量を対照と比較することにより、被検化合物の影響が評価される。
本発明による、被検化合物が、「Ｂ１１５３」蛋白質の活性に与える影響を測定する方法を利用して、「Ｂ１１５３」蛋白質の活性を調節する機能を有する化合物をスクリーニングすることができる。すなわち本発明は、以下の工程を含む、「Ｂ１１５３」蛋白質の活性を抑制する機能を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
（１）被検化合物が、「Ｂ１１５３」蛋白質の活性に与える影響を測定する工程、および
（２）対照と比較して「Ｂ１１５３」蛋白質の活性を抑制する化合物を選択する工程
このようにして得ることができる化合物は、「Ｂ１１５３」の働きを抑制する。したがって当該化合物の投与によって、Ｔ細胞において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、アレルギー性疾患を制御することができる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、モデル動物、「Ｂ１１５３」蛋白質、あるいは「Ｂ１１５３」蛋白質の結合パートナー等は、予め組み合わせてキットとすることができる。「Ｂ１１５３」蛋白質の結合パートナーとは、Ｂ１１５３蛋白質と相互作用する成分を言う。たとえばミオシン結合サブユニット８５、および骨格筋α２アクチニンは、Ｂ１１５３蛋白質と相互作用することが確認された。これらの成分、並びにＢ１１５３との相互作用に必要なこれらの成分の部分構造を有する化合物は、本発明における「Ｂ１１５３」蛋白質の結合パートナーとして用いることができる。
より具体的には、たとえば指標遺伝子を発現する細胞と、これらの指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬とで構成される。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも１つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。あるいは、少なくとも１つの指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。
あるいは、「Ｂ１１５３」蛋白質および、結合パートナーであるミオシン結合サブユニット８５（または骨格筋α２アクチニン）を組み合せたキットとすることもできる。キットを構成する、結合パートナーであるミオシン結合サブユニット８５または骨格筋α２アクチニンは、先に述べたような、Ｂ１１５３蛋白質との相互作用に必要な領域を含む断片であってもよい。同様にＢ１１５３蛋白質は、キットを構成する結合パートナーとの相互作用に必要な領域を含む断片を用いることもできる。このようなキットは、被検化合物Ｂ１１５３蛋白質の活性に与える影響を評価するためのキットとして用いることができる。更に、Ｂ１１５３蛋白質、またはその結合パートナーをビーズや反応容器に固定した状態で、供給することもできる。反応に必要な成分を固相化したキットは、ハイスループットスクリーニングに有用である。
これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。本発明に基づく候補化合物の「Ｂ１１５３」遺伝子の発現レベルに与える影響を検出するためのキットは、「Ｂ１１５３」遺伝子の発現レベルを修飾する化合物のスクリーニング用キットとして利用することができる。
これらの方法に用いる被験候補化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。あるいは、指標遺伝子の発現を抑制することができる、アンチセンスＤＮＡも、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。更に、指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体が、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
あるいはアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー疾患患者のＴ細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。Ｔ細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎ　ｖｉｖｏ、あるいはｅｘ　ｖｉｖｏで行う方法が公知である。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕患者および健常者からの血液採取
アレルギー性疾患特異的に発現が異なる遺伝子を単離する目的で、症例を解析し、選出された患者および健常者から血液を採取した。健常者および極軽症者群として１２名、気管支喘息患者群として２３名、アトピー性皮膚炎患者群として２４名から血液を採取した。これらの血液試料の一部を用いて、ダニ抗原特異的ＩｇＥの量を測定した。
特異的ＩｇＥの測定はペーパーディスクを固相とするＲＡＳＴ法を改良したＣＡＰ　ＲＡＳＴ法により行った。Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製の標準の抗体価を含む血清を基準とし、それぞれの検体のＩｇＥ抗体価を決定した。得られた値をスコアで示した。
被検者のダニ特異的ＩｇＥ抗体価のスコアを表１の「ＩｇＥスコア」のカラムに示す。表１に示されるように、健常者および極軽症者群では、極軽症者の一人を除いてスコアが０であった。一方、患者群では高いスコアが示され、ダニ抗原に対するアレルギーを持つことが示された。
2002050269.tif 000002
〔実施例２〕血液試料からのリンパ球画分の調製
血液１０ｍｌから、以下のようにしてＴ細胞を調製した。まずノボ社製等のヘパリン１ｍｌで注射筒壁を万遍なく処理し、最終濃度５０ｕｎｉｔ／ｍｌのヘパリンを含む１０ｍｌ注射筒に採血した。このとき一人の採血に２２Ｇ針を２本準備した。注射針をはずし、５０ｍｌの遠心チューブ（ポリプロピレン製）に移した。１５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心し、できるだけ表面近くから１．１ｍｌを採取し、１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心して上清１ｍｌを血漿（ｐｌａｓｍａ）として回収した。血漿を回収した残りに３％のデキストラン（ナカライ社製）を含む０．９％　ＮａＣｌを等量（９ｍｌ）加え、静かに数回転倒させて混和した。その後３０分間室温で静置した。ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｒｉｃｈ　ｐｌａｓｍａ，血小板に富む血漿）を別の１５ｍｌ遠心チューブに移し、１２００ｒｐｍ（トミー社製の遠心機で１５０×ｇに相当する）で５分間、室温で遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細胞をギブコ社等から入手したＣａ、Ｍｇ不含のＨＢＳＳ　５ｍｌに懸濁した。これを、パスツールピペットを用いてＦｉｃｏｌ　Ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）が５ｍｌが入ったチューブ（ファルコンチューブ：２００６または２０５９；ポリプロピレン製）１本に上層した。１２００ｒｐｍで５分間遠心後、１５００ｒｐｍ（Ｔｏｍｙ社製の遠心機で４００×ｇに相当する）で３０分間室温で遠心した。その結果、顆粒細胞（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）が沈殿し、フィコール層を挟んで中間層にリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）が含まれた。
パスツールピペットで中間層を回収し、２〜３倍の容量のＢＳＡ／ＰＢＳ（０．５％　ＢＳＡ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｉｎ　ＰＢＳ，ｐＨ７．２；使用直前に脱気した）を添加し、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。沈殿を回収し、ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄後、細胞を５ｍｌに懸濁し、その一部をトリパンブルーで２倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約１×１０７であった。これをリンパ球画分とした。
〔実施例３〕リンパ球画分からのＴ細胞の分離
実施例２で得たリンパ球画分を１２００ｒｐｍで４℃、５分間遠心し、１００μｌあたり１０８になるようにＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。容量は約２０μｌになった。これをエッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）に移し、ＣＤ３マイクロビーズ液を添加した。その後、３０分間４〜１０℃に放置した（このとき氷上には置かなかった）。この試料をマグネチックセルソーター（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．製）で以下のように処理した。
ＭＳ＋／ＲＳ＋カラムをＭｉｎｉ　ＭＡＣＳまたはＶａｒｉｏ　ＭＡＣＳセパレーションユニットに装着した（針は付けなかった）。５００μｌのＢＳＡ／ＰＢＳをカラムに静かにアプライし、バッファーは流し出した。次にＣＤ３マイクロビーズ標識した細胞をカラムにアプライした。カラムを５００μｌで３回洗浄した（Ｂ細胞画分）。カラムをセパレーションユニットからはずし、溶出液を集めるチューブ上に置いた。１ｍｌのＢＳＡ／ＰＢＳをカラムにアプライし、カラム添付のプランジャーを用いポジティブ細胞を急速に流し出した。これをＴ細胞画分とした。
得られたＴ細胞画分について、１２００ｒｐｍ、５分間４℃で遠心した。沈殿をＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄後、細胞を１ｍｌに懸濁し、その一部をトリパンブルーで２倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約４×１０６であった。
〔実施例４〕Ｔ細胞からの全ＲＮＡの調製
Ｔ細胞からの全ＲＮＡの調製はＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用い、原則として添付のマニュアルに従い行った。操作はすべて手袋を着用して、室温で行った。またウォッシュバッファーＲＰＥに４倍量のエタノールを加えた。リシスバッファーＲＬＴには１０μｌ／ｍｌの２−メルカプトエタノールを加えた。
細胞浮遊液を１０００〜１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をアスピレーションで除いた。沈殿に３５０μｌのリシスバッファーＲＬＴ（２−メルカプトエタノールを含む）溶液を加えた。この段階で、ＲＬＴバッファー中の細胞のライセートは、−７０℃で保存可能であった。細胞のライセートを冷凍保存していた場合は、３７℃で１０〜１５分間インキュベートして、不溶物が見えるようなら最大速度で３分間遠心し、上清のみを回収した。このライセートを２０Ｇのカテラン針を付けた注射筒でホモゲナイズ後、キアシュレッダー（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ）で処理した。すなわち、ピペットマンを用いて３５０μｌの細胞のライセートをキアシュレッダーユニットにアプライした。これを１５００ｒｐｍで２分間遠心し、流出液を回収した。３５０μｌの７０％エタノールを加え、ピペッティングしてよく混ぜた。
ＲＮｅａｓｙスピンカラムを添付の２ｍｌチューブに装着し、細胞のライセート混合物をアプライし、８０００×ｇ（１１５００ｒｐｍ）で１分間遠心し、流出液は捨てた。ウォッシュバッファーＲＷ１　７００μｌをカラムにアプライし、５分間フタをした形で立てた。１１５００ｒｐｍで１５秒間遠心し、流出液は捨てた。カラムを新しい２ｍｌチューブに装着し、ウォッシュバッファーＲＰＥ（エタノールを含む）５００μｌをカラムにアプライした後、１１５００ｒｐｍで１５秒間遠心し、流出液は捨てた。ウォッシュバッファーＲＰＥ　５００μｌをカラムにアプライし、最大速度で２分間遠心した。カラムを新しい１．５ｍｌチューブに装着し、ＤＥＰＣ処理した水３０μｌをアプライし、フタをして１０分間立てた。１１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、全ＲＮＡを得た。濃度を測定し、量が少ないようなら、再度カラムを新しい１．５ｍｌチューブに装着し、ＤＥＰＣ処理した水３０μｌをアプライし、フタをして１０分間立て、１１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。
〔実施例５〕全ＲＮＡのＤＮａｓｅ処理
Ｔ細胞から調製した全ＲＮＡからＤＮＡを除くため、ＤＮａｓｅ処理を行った。反応は２ユニットのＤＮａｓｅ（ニッポンジーン社）および５０ユニットのＲＮａｓｅインヒビター（ファルマシア社）を含む１００μｌの１×ＤＮａｓｅバッファー（ニッポンジーン社）中で行った。これを３７℃１５分間インキュベートした後、等量のＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加え、ボルテックスした。１２０００ｒｐｍで室温、１０分間遠心し、上層（水層）を新しい１．５ｍｌチューブに移した。１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加え、２．５倍量の１００％エタノールおよびエタ沈メイト１μｌを加えて、転倒混和させた。−２０℃で１５分間静置させた後、１２０００ｒｐｍで４℃、１５分間遠心し、上清を除去し、７０％エタノールを加えた。沈殿がはがれる程度にタッピングした後、上清をきれいに除去した。３分間乾燥させ、１０〜２０μｌのＤＤＷ（ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不含）に溶解させた。濃度を測定し、使用まで−８０℃に保存した。
〔実施例６〕Ｔ細胞から調製した全ＲＮＡを用いたディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）解析
Ｔ細胞から調製した全ＲＮＡを用いた蛍光ディファレンシャルディスプレイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ，「ＤＤ」と略記する）解析は文献（Ｔ．Ｉｔｏら，１９９４，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３５１：２３１−２３６）に記載の方法に準じて行った。Ｔ細胞から調製した全ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得た。第一次ＤＤ−ＰＣＲ反応用には３種のアンカープライマーの各々について全ＲＮＡの各０．２μｇを用いてｃＤＮＡを調製した。第二次ＤＤ−ＰＣＲ反応用には、３種のアンカープライマーの各々についてＲＮＡ　０．４μｇを用いてｃＤＮＡを調製した。いずれのｃＤＮＡも、０．４ｎｇ／μｌ　ＲＮＡ相当の最終濃度に希釈し、実験に用いた。１反応あたり１ｎｇ　ＲＮＡ相当のｃＤＮＡを用いてＤＤ−ＰＣＲ反応を行った。反応液の組成は表２の通りである。
2002050269.tif 000003
ＰＣＲの反応条件は、「９５℃３分、４０℃５分、７２℃５分」を１サイクル、続いて、「９４℃１５秒、４０℃２分、７２℃１分」を３０サイクルの後、７２℃５分、その後連続的に４℃にした。
使用したプライマー対はアンカープライマーであるＧＴ１５Ａ（配列番号：３）、ＧＴ１５Ｃ（配列番号：４）、およびＧＴ１５Ｇ（配列番号：５）に対して任意プライマーをそれぞれＡＧ　１〜１１０、ＡＧ　１１１〜１９９、およびＡＧ　２００〜２８７を組み合わせ、計２８７組の反応をおこなった。なお、任意プライマーとしてはＧＣ含量５０％の１０ヌクレオチドからなるオリゴマーを設計し、合成して用いた。
ゲル電気泳動は、６％変性ポリアクリルアミドゲルを作製し、２．５μｌの試料をアプライし、４０Ｗで２１０分間泳動した。その後、日立製蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯ　ＩＩを用いてゲル板をスキャンし、蛍光検出によって泳動画像を得た。
２回のＤＤ解析を行い、患者群と健常群間で再現性よく発現に差を示すバンドをゲルから切り出し、配列決定を行った。その結果、健常群と患者群の間で発現レベルに差が見られた遺伝子（ＤＤ解析のバンドＩＤ　Ｂ１１５３−０３；以後、この遺伝子を「Ｂ１１５３」と称する）を同定した。バンドＩＤ　Ｂ１１５３−０３の増幅に用いたプライマーセットを以下に示す。また、Ｂ１１５３−０３のＤＤバンドの塩基配列を配列番号：６に示す。
2002050269.tif 000004
〔実施例７〕塩基配列の伸長
（１）５’ＲＡＣＥ法による塩基配列解析
実施例６で決定した塩基配列に基づいて、５’ＲＡＣＥ法により本発明の遺伝子の塩基配列解析を進めた。Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のプロトコールに従いＨｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｍａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型としてキット付属のＡＰ１プライマーと「Ｂ１１５３」特異的なプライマー１１５３−２ＲでＰＣＲを行った。さらに、この増幅断片を鋳型にアダプター内の配列［ＡＰ２］とプライマー１１５３−２Ｒを用いてＰＣＲを行った。増幅した断片をサブクローニングし配列決定をしたところ「Ｂ１１５３」の配列を含む約２．０ｋｂの配列（配列番号：８）が得られた。
プライマー配列
2002050269.tif 000005
（２）ゲノム配列解析
（１）で得られた２．０ｋｂ配列に対し、複数のゲノム配列がホモロジーを示した。そのうち、最も高いホモロジーを示したゲノム配列（ＡＣ００２４５３）に対して、エキソン検索ソフト（ＧＥＮＳＣＡＮ，ＧＲＡＩＬ，Ｇｅｎｅ　ＦｉｎｄｅｒまたはＥＲ）を用いてエキソン予測を行った。その結果、予測遺伝子を見出した。２．０ｋｂ配列はその予測遺伝子のイントロン領域であった。２．０ｋｂ配列近傍の仮想エキソン配列を基に、複数のＰＣＲプライマーを設計した。ＧＥＮＳＣＡＮおよびＧｅｎｅ　Ｆｉｎｄｅｒによって予測されたエキソンと、これらの予測に基づいて設定したプライマーの位置関係を図１に示した。
ヒト末梢血由来Ｔ細胞およびＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ、末梢血単核球細胞）から調製した全ＲＮＡならびにヒト末梢血白血球由来ｐｏｌｙＡ　ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲの鋳型とした。この鋳型に対して、２組以上の上記ＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅断片は、クローニングした後、配列決定を行い、仮想エキソン配列か否かを確認した。その結果、フォーワードプライマーとして１１５３−１４３Ｕ１７、リバースプライマーとして１１５３−３５９Ｌ２１を用いたＰＣＲにより、予測された遺伝子配列１９９ｂｐ（配列Ａ、配列番号：１０）が実際に存在することを確認できた。
プライマー配列
2002050269.tif 000006
（３）ＥＳＴクラスタリングによる塩基配列解析
公共データベースから、配列Ａと一致するＥＳＴ配列（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：ＡＩ７９３０６２、５２４ｂｐ）や、配列Ａと相同性が認められたＥＳＴ配列を見出した。これらのＥＳＴをクラスタリングし、６８１ｂｐの塩基配列を得た。この配列中にプライマー１１５３ＥＳＴ−Ｆ（５’−ＧＧＧＴＣＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＣＧＧ−３’；配列番号：１３）および１１５３ＥＳＴ−Ｒ（５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＣＣＧ−３’；配列番号：１４）を設計し、（２）と同じライブラリーを鋳型としてＰＣＲしたところ、６４９ｂｐのＰＣＲ増幅断片が得られた。このＰＣＲ増幅断片の配列を決定した結果、ＥＳＴクラスタリング配列と一致していた。
（４）クラスタリングによる塩基配列解析
このようにして決定された６４９ｂｐの塩基配列のうち、プライマーに由来する塩基配列を除く６０１ｂｐの塩基配列をもとに、ゲノム配列（ＡＣ００２４５３）上のエキソン解析をさらに進めた。３’下流に予測された仮想エキソン配列を基にして以下のＰＣＲプライマーを設計し、（２）と同様の操作によって、クローニングとＰＣＲ産物の配列決定を行った。
プライマー
2002050269.tif 000007
ＰＣＲ増幅の結果、６３６ｂｐの遺伝子断片が増幅され、その配列には予測されたエキソン配列が含まれていた。前記プライマーによって増幅された６３６ｂｐの塩基配列を配列番号：１７に示す。ここで得られた６３６ｂｐと先に得られた６０１ｂｐの配列をあわせて、全体で８２４ｂｐ（配列番号：２５）の塩基配列を得ることができた。配列番号：２５は、３’側にＯＲＦの一部と見られる領域（５０−８２０）を含み、２５７アミノ酸（配列番号：２６）をコードしていた。このアミノ酸配列と相同性を示す既知アミノ酸配列は見出されず、「Ｂ１１５３」は新規な蛋白質をコードしていると考えられた。
〔実施例８〕ＡＢＩ７７００による発現量の定量
実施例１とは異なる健常者、アトピー性皮膚炎軽症患者、アトピー性皮膚炎中等症患者およびアトピー性皮膚炎重症患者各１０名のＴ細胞より調製した全ＲＮＡ試料の一部を、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ７７００を用いるＴａｑＨａｎ法による遺伝子発現定量に使用した。このＴａｑＭａｎ法は、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ鎖を蛍光色素を用いてリアルタイムに定量検出するシステムである。
ＤＤバンドの塩基配列を基に実施例７において決定した「Ｂ１１５３」の塩基配列を基にして作製したプライマーセットを使用した。また、ＴａｑＭａｎプローブは５’端をＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、３’端をＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で蛍光標識して用いた。使用したプライマーセット、およびＴａｑＭａｎプローブの塩基配列を以下に示す。
2002050269.tif 000008
鋳型には全ＲＮＡからポリＴ（１２〜１８ｍｅｒ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを用いた。コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成は表３に示した。
2002050269.tif 000009
また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子の定量には、ヒトｃＤＮＡを鋳型として用いた。
βアクチン測定用のプライマーとプローブは、ＴａｑＭａｎ　β−ａｃｔｉｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥバイオシステムズ）に添付のものを用いて行った。塩基配列は以下の通りである。βアクチンにより補正した「Ｂ１１５３」遺伝子発現量（ｃｏｐｙ／ｎｇ　ＲＮＡ）を表４および図２に示す。
2002050269.tif 000010
表４の値を用いて各群間で遺伝子発現に有意な差があるかをパラメトリックな手法で統計解析した。健常群と患者群（アトピー性皮膚炎の軽症患者、中等症患者および重症患者を含む）の２群間の検定としてはｔ検定を行った。健常群ならびにアトピー性皮膚炎の軽症患者群、中等症患者群および重症患者群の４群に分け、その中の２群間での検定にＴｕｋｅｙ型多重比較検定を行った。検定は、Ｔｈｅ　ＳＡＳ　ＳＹＳＴＥＭのＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｓｉｏｎ　４．０（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．）を用いて行った。ｔ検定、およびＴｕｋｅｙ型多重比較の結果を表５に示す。
2002050269.tif 000011
2002050269.tif 000012
2002050269.tif 000013
統計解析の結果、ｔ検定により、健常群に比べアトピー性皮膚炎患者群で、有意に発現が高いことが確認された（ｐ＝０．０２８）。Ｔｕｋｅｙ型多重比較検定からは、健常群または軽症患者群に比べ、中等症患者群または重症患者群では、有意に発現が高いことが確認された。ｐ値は、健常群・中等症患者群間ではｐ＝０．０１３５、健常群・重症患者群間ではｐ＝０．００７２、軽症患者群・中等症患者群間ではｐ＝０．００９５、軽症患者群・重症患者群間ではｐ＝０．００５である。以上の知見は、「Ｂ１１５３」遺伝子の発現がアトピー性皮膚炎患者において高いことを示している。これらの結果は、この遺伝子の発現を測定することが、アトピー性皮膚炎において診断的価値をもつことを示している。このＴ細胞由来遺伝子は、アトピー性皮膚炎の治療標的あるいは診断マーカーとして医療上有用である。
〔実施例９〕様々な組織や細胞における「Ｂ１１５３」の発現レベルの測定
ヒト各種組織および癌細胞株から調製したｍＲＮＡを転写したフィルターを用いて「Ｂ１１５３」の発現を調べた。用いたフィルターは次の６種（いずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）である。
2002050269.tif 000014
実施例〔７〕−（３）で用いた「Ｂ１１５３」プライマー１１５３ＥＳＴ−Ｆと１１５３ＥＳＴ−Ｒを用いてＰＣＲ増幅した６４９ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて３２Ｐにより標識してプローブとした。Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、添付使用書通りにノーザンハイブリダイゼーションおよび膜洗浄を行った。洗浄後の膜をイメージングプレートに曝露し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって画像を取得した。
結果は図３に示した。免疫組織を含むほとんどの組織および癌細胞株で、約４ｋｂのｍ−ＲＮＡを検出した。本発明による遺伝子「Ｂ１１５３」は、特に脳で強い発現が認められた。
〔実施例１０〕各種免疫細胞での「Ｂ１１５３」遺伝子の発現
５人の健常人の末梢血から分離した細胞での「Ｂ１１５３」遺伝子の発現を調べた。Ｔ細胞（Ｔ）の分離は下記の通り行った。採取した全血に３％デキストラン溶液を加えて３０分室温放置し、赤血球を沈降させた。上層の白血球画分を回収し、フィコール溶液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ；アマシャムファルマシアバイオテク）の上に載せて１５００ｒｐｍ、３０分室温で遠心した。下層に回収された顆粒球画分をＣＤ１６抗体磁気ビーズと４℃で３０分反応させ、ＭＡＣＳを用いた分離でトラップされずに溶出する細胞を好酸球として実験に用いた。好中球（Ｎ）は好酸球を溶出させた後、ＣＤ１６抗体磁気ビーズでトラップされた細胞を磁界から外して溶出、回収して調製した。一方、フィコール遠心分離で中間層に回収される単球画分を、ＭＡＣＳ　ＣＤ３抗体磁気ビーズにより溶出画分（Ｍ：ｍｏｎｏｃｙｔｅとＢ　ｃｅｌｌの混合物）とトラップされる画分（Ｔ　ｃｅｌｌ画分）に分離した。次に、溶出画分をＭＡＣＳ　ＣＤ１４抗体磁気ビーズにより、溶出画分（Ｂ　ｃｅｌｌ画分）とトラップされる画分（ｍｏｏｃｙｔｅ画分）に分け、それぞれを精製Ｔ細胞、精製Ｂ細胞、そして精製単球とした。
好酸球はＩｓｏｇｅｎ、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、そして単球はＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて可溶化し、全ＲＮＡ抽出、ＤＮａｓｅ処理後（方法は前述の通り）遺伝子発現解析に供した。用いたプライマー、プローブ等は上記と同一である。これらの血球細胞での平均発現量（ＡＶＥＲＡＧＥ：ｃｏｐｙ／ｎｇ（補正値））をＳＤとともに以下に示した。また測定結果を図４にまとめた。この結果から、Ｔ細胞での発現がもっとも高いことが確認された。
2002050269.tif 000015
〔実施例１１〕ｃＤＮＡクローンの単離
ＧＥＮＥ　ＴＲＰＰＥＲ　ＩＩシステム（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を用いて、Ｂ１１５３遺伝子のｃＤＮＡクローンを単離した。配列番号：２５における６４ｂｐ〜３４７ｂｐに相当する２８４ｂｐ（配列番号：２４）のＢ１１５３プローブを用いてＧＴ　ＩＩ　Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ　Ｔｅｓｔｉｓ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に対してスクリーニングしたところ、ＯＲＦを含む３５９６ｂｐの完全長ｃＤＮＡクローンが得られた。決定されたｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、またこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に示した。
これらの配列情報についてホモロジー検索したところ、配列番号：１に示したＢ１１５３遺伝子塩基配列中の５０５ｂｐから２１４８ｂｐまでの塩基配列は、ＫＩＡＡ１８６１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０５８７６４）と、また１４２０ｂｐから３５９６ｂｐまでの配列はＦＬＪ２３５８１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＫ０２７２３４）と相同性が高かった。しかし、１ｂｐから５０４ｂｐまでの配列は新規配列であった。これらの塩基配列の関係を、図５にまとめた。
〔実施例１２〕Ｙｅａｓｔ　Ｔｗｏ　Ｈｙｂｒｉｄシステムによる相互作用タンパク質のスクリーニング
ＧＡＬ４系酵母のｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子発現型を利用した、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰＲＯＱＵＥＳＴＴＭ　ＴＷＯ−Ｈｙｂｒｉｄシステムによって、本発明の蛋白質と相互作用する蛋白質を探索した。Ｂ１１５３のＯＲＦ領域全長（８６ｂｐ〜２９７７ｂｐ）をｂａｉｔとして、Ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ　ｃＤＮＡライブラリに対して、Ｂ１１５３と相互作用するタンパク質をスクリーニングした。プロトコルは、システムの指示書にしたがった。
その結果、Ｂ１１５３タンパク質と相互作用する５個のポジティブクローンが得られた。５個のうち、４個は、ミオシン結合サブユニット８５（ｍｙｏｓｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｕｂｕｎｉｔ　８５；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ３１２０２８）（図６）の部分配列であり、１個は、骨格筋α２アクチニン（ｓｋｅｌｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｌｐｈａ　２　ａｃｔｉｎｉｎ；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ８６４０６）の部分配列であった。得られたｐｒｅｙクローンが保持している配列範囲を以下に示す。なお（）内の情報はＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏである。この結果に基づいて、ミオシン結合サブユニット８５、または骨格筋α２アクチニンを構成するアミノ酸配列中、Ｂ１１５３との相互作用に必要な領域を特定することができる。
たとえばミオシン結合サブユニット８５は、以下に示す４つのｐｒｅｙベクターのうちの３つまでは５９０ａａ以降のＣ末端領域を含んでいるので、ミオシン結合サブユニット８５のＣ末端領域はＢ１１５３と相互作用すると考えられる。同様にして、骨格筋α２アクチニンは、中央領域である３０９ａａ−５２８ａａに相当する領域を含むｐｒｅｙベクターがポジティブだったので、３０９ａａ−５２８ａａに相当する骨格筋α２アクチニンの中央部分がＢ１１５３と相互作用すると考えられた。
2002050269.tif 000016
ミオシン結合サブユニット８５は、ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　１，ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｓｕｂｕｎｉｔ　１２Ｃの別名を持ち、２００１年６月のＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．２４，２１２０９−２１２１６）に、新規遺伝子として掲載された。Ｎ末端の１００アミノ酸残基−２８７アミノ酸残基のアンキリンリピート（ａｎｋｙｒｉｎ　ｒｅｐｅａｔ）は、ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　１δ（ＰＰ１δ）と結合し、アクチン脱重合に必須な領域である。中央部分にはＭＥＲＣ−αキナーゼによってリン酸化を受ける領域（ＭＥＲＣ−ａｌｐｈａ　ｋｉｎａｓｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｙｌａｔｅｄ　ｄｏｍａｉｎ）が見出された。ミオシン結合サブユニット８５は、この領域のリン酸化によって構造変化をひきおこすことが知られている。ミオシン結合サブユニット８５は、この他のモチーフとして、Ｃ末端にαヘリカルロイシンリピート（ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｒｅｐｅａｔ）、およびリン酸化阻害モチーフ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｍｏｔｉｆ）が見出されている。リン酸化阻害モチーフは、アンキリンリピートに対する拮抗作用を有する領域である。
骨格筋α２アクチニンは、アクチン結合調節タンパク質として既によく知られている分子である。これら２つの遺伝子は、いずれもアクチン脱重合に関与していることから、Ｂ１１５３遺伝子のアクチン脱重合への関与が示唆された。Ｔ細胞において、Ｂ１１５３遺伝子は細胞骨格の再構築に作用し、Ｔ細胞の活性化、分裂、遊走に関与する可能性が示唆された。
したがって、Ｂ１１５３蛋白質と、ミオシン結合サブユニット８５あるいは骨格筋α２アクチニンとの相互作用を妨げる化合物は、Ｂ１１５３蛋白質の活性の阻害に基づくアレルギー性疾患の治療効果が期待される。被検化合物の相互作用に与える活性は、蛋白質間の結合反応を指標として容易に評価することができる。たとえば、固定化したＢ１１５３蛋白質と、標識したミオシン結合サブユニット８５あるいは骨格筋α２アクチニンを用いて、被検化合物の干渉を評価するためのハイスループットスクリーニングを行うことも可能である。すなわち本発明のＢ１１５３蛋白質は、アレルギー性疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングするための、ハイスループットスクリーニングを可能とする。
産業上の利用の可能性
本発明により、健常者とアレルギー性疾患の患者とで発現に差の見られる遺伝子が提供された。本発明の遺伝子の発現を指標にすることにより、アレルギー性疾患の検査、および治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能となった。特に、本発明において明らかにされたＢ１１５３蛋白質の活性を指標にすれば、ハイスループトスクリーニングを容易に構築することができる。
本発明によって提供されたアレルギー疾患関連遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。したがって、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明によるアレルギーの検査方法は、末梢血白血球を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、たとえばＥＣＰなどの蛋白質測定と異なって、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。したがって本発明によるアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味でこれらの病態関連遺伝子の診断的価値は高い。
更に、本発明のスクリーニング方法は、アレルギー患者に共通して発現が見られた遺伝子を指標として実施される。したがって、このスクリーニング方法によって見出すことができる化合物は、幅広いアレルギーの病態制御に有用であると期待できる。
【配列表】
2002050269.tif 000017
2002050269.tif 000018
2002050269.tif 000019
2002050269.tif 000020
2002050269.tif 000021
2002050269.tif 000022
2002050269.tif 000023
2002050269.tif 000024
2002050269.tif 000025
2002050269.tif 000026
2002050269.tif 000027
2002050269.tif 000028
2002050269.tif 000029
2002050269.tif 000030
2002050269.tif 000031
2002050269.tif 000032
2002050269.tif 000033
2002050269.tif 000034
2002050269.tif 000035
2002050269.tif 000036
2002050269.tif 000037
2002050269.tif 000038
2002050269.tif 000039
2002050269.tif 000040
2002050269.tif 000041
2002050269.tif 000042
2002050269.tif 000043
2002050269.tif 000044
2002050269.tif 000045
2002050269.tif 000046
2002050269.tif 000047
2002050269.tif 000048
2002050269.tif 000049
2002050269.tif 000050
2002050269.tif 000051
【図面の簡単な説明】
図１は、ゲノム配列（ＡＣ００２４５３）上の５’ＲＡＣＥ法により得られた約２．０ｋｂの配列（配列番号：８）、ＧＥＮＳＣＡＮおよびＧｅｎｅ　Ｆｉｎｄｅｒによって予測されたエキソン、並びにこれらの予測に基づいて設定したプライマーの位置関係を示す図。１０．７ｋｂ−１２．７ｋｂ付近に示したボックスが、ＤＤ断片と５’−ＲＡＣＥによって塩基配列を決定した部分である。それぞれを「５’−ＲＡＣＥ」および「ＤＤ」で示した。黒のボックスがＧＥＮＥＳＣＡＮで予測されたエキソン、白抜きのボックスはＧｅｎｅ　Ｆｉｎｄｅｒで予測されたエキソンを示す。矢印はプライマーとそのプライマーの３’側の向きを示す。
図２は、健常群と患者群（アトピー性皮膚炎患者）に分けた場合の「Ｂ１１５３」発現量の分布を示すグラフである。
図３は、様々な組織、または細胞における「Ｂ１１５３」の発現レベルを測定したノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。図中の番号と組織は、以下のように対応している。
2002050269.tif 000052
図４は、各種免疫細胞での「Ｂ１１５３」遺伝子の発現を測定した定量的ＰＣＲの結果を示すグラフである。縦軸がβアクチン補正した「Ｂ１１５３」遺伝子の発現レベル（ｃｏｐｙ／ｎｇ）、横軸が細胞の種類を示す。
図５は、本発明の遺伝子「Ｂ１１５３」と、既知塩基配列ＫＩＡＡ１８６１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０５８７６４）、ＦＬＪ２３５８１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＫ０２７２３４）、およびＦＬＪ２００９７との関係をまとめた図である。
図６は、実施例１２において「Ｂ１１５３」蛋白質との相互作用が検出された、ミオシン結合サブユニット８５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ３１２０２８）の構造を示す図である。
【図１】
2002050269.tif 000053
【図２】
2002050269.tif 000054
【図３】
2002050269.tif 000055
【図４】
2002050269.tif 000056
【図５】
2002050269.tif 000057
【図６】
2002050269.tif 000058
【国際調査報告】
2002050269.tif 000059
2002050269.tif 000060
2002050269.tif 000061