(57)【要約】ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰなどのＭＭＰｓの活性調節に関与する遺伝子を解明し、ＭＭＰｓの関与する様々な生物活性・生理現象の研究開発を行う。Ｎ−Ｔｅｓは、ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠くなどの特徴ある配列を有し、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰなどの活性を抑制する機能を有し、有用な医薬の開発研究に役立つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ヒト由来のＮ−Ｔｅｓポリペプチド若しくは
（Ｂ）（ｉ）該Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有し且つ
（ｉｉ）（ａ）Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠いている、
（ｂ）ＴＹ　ｄｏｍａｉｎやＣＷＣＶ　ｄｏｍａｉｎを欠いている、
（ｃ）Ｃ末端が特徴的な配列Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを有している、及び
（ｄ）Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列のうちの少なくとも５〜３１３個の連続したアミノ酸残基を有する
から成る群から選ばれた特徴を有しているもの
であることを特徴とするポリペプチド又はその塩。
【請求項２】
配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、
（ｉ）少なくとも連続した５〜７０個のアミノ酸残基を有するもの、
（ｉｉ）少なくとも連続した７１〜１５０個のアミノ酸残基を有するもの、
（ｉｉｉ）少なくとも連続した１５１〜３１３個のアミノ酸残基を有するもの、
（ｉｖ）少なくとも第２２番目〜第１２２番目のアミノ酸配列を有するもの、
（ｖ）第２２番目〜第３１３番目のアミノ酸配列を有するもの、
（ｖｉ）第１番目〜第３１３番目のアミノ酸配列を有するもの、及び
（ｖｉｉ）それらのいずれか一つと実質的に同等のアミノ酸配列を有するもの
からなる群から選ばれたポリペプチドであることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド又はその塩。
【請求項３】
請求項１または２記載のポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩。
【請求項４】
下記の性質：
１）ＭＴ−ＭＭＰ類のＭＭＰ類活性化能を抑制する機能を有し、且つ
２）（ｉ）配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、Ａｌａ２２〜Ｇｌｙ１２２のアミノ酸配列のうち、少なくとも５〜１０１個の連続したアミノ酸残基を有するもの、及び
（ｉｉ）Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列のうちの少なくとも５〜３１３個の連続したアミノ酸残基を有するもの
から成る群から選ばれたものである
ことを特徴とするポリペプチド又はその塩。
【請求項５】
（ｉ）ＭＴ−ＭＭＰ類がＭＴ１−ＭＭＰ又はＭＴ３−ＭＭＰである及び／又は（ｉｉ）ＭＭＰ類がＭＭＰ−２であることを特徴とする請求項４記載のポリペプチド又はその塩。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とする核酸。
【請求項７】
配列表の配列番号：１で表される塩基配列のうち、オープンリーディングフレーム部分またはそれと実質的に同等な塩基配列を有することを特徴とする請求項６記載の核酸。
【請求項８】
請求項６または７記載の核酸を含有することを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項６又は７記載の核酸あるいは請求項８記載のベクターを含有することを特徴とする形質転換体。
【請求項１０】
宿主細胞が大腸菌、酵母、２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞からなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体によって発現させて得たものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列表の配列番号：１で表される塩基配列のうち、オープンリーディングフレーム部分又はその一部あるいはそれと実質的に同等な塩基配列をＰＣＲ増幅するに有効なプライマー。
【請求項１３】
次のものに対する抗体：
（ｉ）請求項１記載のポリペプチドまたはその塩、
（ｉｉ）請求項２記載のポリペプチドまたはその塩、
（ｉｉｉ）請求項３記載の部分ペプチドまたはその塩、
（ｉｖ）請求項４記載のポリペプチドまたはその塩、あるいは
（ｖ）請求項５記載のポリペプチドまたはその塩。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一記載のポリペプチドまたはその塩と特異的に免疫反応する抗体を測定試薬として用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一記載のポリペプチドまたはその塩の免疫学的測定方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一記載のポリペプチドまたはその塩と特異的に免疫反応する抗体を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一記載のポリペプチドまたはその塩の免疫学的測定試薬。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか一記載のポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩；あるいは請求項６または７記載の核酸；あるいは請求項１３記載の抗体を含有していることを特徴とする医薬。
【請求項１７】
（ｉ）ＭＴ１−ＭＭＰ又はＭＴ３−ＭＭＰ活性阻害剤、
（ｉｉ）癌の浸潤、転移抑制及び／又は阻害剤、
（ｉｉｉ）血管新生阻害剤、
（ｉｖ）アルツハイマー治療剤、及び
（ｖ）関節破壊治療剤
から成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項１６記載の医薬。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか一記載のポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有していることを特徴とする医薬。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか一記載のポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法およびスクリーニングキット。
【請求項２０】
ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現プラスミドと検体遺伝子を宿主細胞に導入し、発現するＭＭＰについての検出を指標とすることを特徴とするＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの活性調節に関与する遺伝子のスクリーニング方法およびスクリーニングキット。
【請求項２１】
ＭＭＰ−２、ＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミドと検体プラスミドを２９３Ｔ細胞などの宿主細胞に導入し、例えば潜在型、中間体、活性化型ＭＭＰ−２を検出にかけることを特徴とする請求項２０記載のスクリーニング方法およびスクリーニングキット。
【請求項２２】
下記の指標：
（ａ）Ｎ−Ｔｅｓの発現量が正常部位に比べ低いこと、
（ｂ）Ｎ−Ｔｅｓポリペプチド又はそれから誘導されたペプチド断片、
（ｃ）Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子又はそれから誘導されたｍＲＮＡなどの核酸、及び
（ｄ）抗Ｎ−Ｔｅｓ抗体
から成る群から選ばれたものを指標として使用することを特徴とするグリオーマの検出方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド（あるいは核酸）及びポリペプチド（あるいはタンパク質）（又はその一部）あるいはその塩；該ポリヌクレオチド（あるいは核酸）及びポリペプチド（あるいはタンパク質）の変異体及び誘導体；該ポリヌクレオチド（あるいは核酸）及びポリペプチド（あるいはタンパク質）、並びにそれらの変異体及び誘導体の製造法；該ポリペプチド（あるいはタンパク質）（又はその一部）に対する抗体、該抗体を用いた免疫学的測定法及びそれに使用する試薬；該ポリペプチド（あるいはタンパク質）のアゴニスト及びアンタゴニスト、それらに関連したスクリーニング法及びスクリーニングキット；並びに該ポリヌクレオチド（あるいは核酸）、ポリペプチド（あるいはタンパク質）、変異体、誘導体、アゴニスト及びアンタゴニストの用途に関するものである。
背景技術
マトリックスメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）は、細胞外マトリックスと基底膜成分のさまざまな構成タンパク質を分解する亜鉛依存性のエンドペプチダーゼのファミリーである。これらの酵素群は、正常な胚の発生、骨の成長あるいは創傷の治癒など、結合組織の再構成に関連している（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊ．，５，２１４５−２１５４（１９９１）；Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，Ｌ．Ｍ．，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１４，４５５−４６３（１９９２）；Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｍｏｏｒｅ　Ｗ．Ｇ．Ｉ．，Ｂｏｄｄｅｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｗｉｎｄｓｏｒ，Ｌ．Ｊ．，Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｂ．，ＤｅＣａｒｌｏ，Ａ．，ａｎｄ　Ｅｎｇｌｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ　Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４，１９７−２５０（１９９３））。また、アテローム性動脈硬化症（Ｈｅｎｎｅｙ，Ａ．Ｍ．，Ｗａｋｅｌｅｙ，Ｐ．Ｒ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｋ．，Ｈｅｍｂｒｙ，Ｒ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．，ａｎｄ　Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８１５４−８１５８（１９９１））、肺気腫（Ｈａｕｔａｍａｋｉ，Ｒ．Ｄ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｄ．Ｋ．，Ｓｅｎｉｏｒ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ　Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｓ．Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，２００２−２００４（１９９７））、リウマチ性関節炎（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．，ａｎｄ　Ｈｅｍｂｒｙ，Ｒ．Ｍ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，１９，６１−６４（１９９２））および癌の浸潤・転移（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．，Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎ，Ｓ．，ａｎｄ　Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，９，５４１−５７３（１９９３））などさまざまな病的な過程における関与が知られるようになってきた。
今日までに、アミノ酸レベルまで解析されたＭＭＰｓ（ＭＭＰ−１（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）；ＭＭＰ−２（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ　Ａ）；ＭＭＰ−３（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１）；ＭＭＰ−７（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）；ＭＭＰ−８（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）；ＭＭＰ−９（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ　Ｂ）；ＭＭＰ−１０（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−２）；ＭＭＰ−１１（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−３）；ＭＭＰ−１２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｅｌａｓｔａｓｅ）；ＭＭＰ−１３（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−３）；ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１６（ＭＴ３−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１７（ＭＴ４−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１８（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−４）；ＭＭＰ−１９；ＭＭＰ−２０（ｅｎａｍｅｌｙｓｉｎ）；ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−２５（ＭＴ６−ＭＭＰ）など）が知られている（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊ．，５，２１４５−２１５４（１９９１）；Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，Ｌ．Ｍ．，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１４，４５５−４６３（１９９２）；Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｍｏｏｒｅ　Ｗ．Ｇ．Ｉ．，Ｂｏｄｄｅｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｗｉｎｄｓｏｒ，Ｌ．Ｊ．，Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｂ．，ＤｅＣａｒｌｏ，Ａ．，ａｎｄ　Ｅｎｇｌｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ　Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４，１９７−２５０（１９９３）；Ｇｕｒｕｒａｊａｎ，Ｒ．，Ｇｒｅｎｅｔ，Ｊ．，Ｌａｈｔｉ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ　Ｋｉｄｄ，Ｖ．Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５２，１０１−１０６（１９９８）；Ｖｅｌａｓｃｏ，Ｇ．，Ｐｅｎｄａｓ，Ａ．Ｍ．，Ｆｕｅｙｏ，Ａ．，Ｋｎａｕｐｅｒ，Ｖ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．，ａｎｄ　Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ，Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，４５７０−４５７６（１９９９）；Ｐｅｉ　Ｄ．，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．，９，２９１−３０３（１９９９））。１次構造、基質特異性および細胞分布により、これらのＭＭＰｓは少なくとも４種のサブファミリー：コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシンおよび膜型ＭＭＰｓ（ＭＴ−ＭＭＰｓ）に分類されている。
ＭＴ−ＭＭＰｓサブファミリーは、最も新しくＭＭＰｓのサブクラスとして報告されたもので、ＭＭＰｓに保存された領域に対するディジェネレートプライマーとＲＴ−ＰＣＲによってこれまで５種を超えるメンバー（ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰなど）が単離同定されている（Ｓａｔｏ，Ｈ，Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｅ．，ａｎｄ　Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４）；Ｗｉｌｌ，Ｈ．，ａｎｄ　Ｈｉｎｚｍａｎｎ，Ｂ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１，６０２−６０８（１９９５）；Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ａ．，ａｎｄ　Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２３０１３−２３０２０（１９９５）；Ｐｕｅｎｔｅ　Ｘ．Ｓ．，Ｐｅｎｄａｓ，Ａ．Ｍ．，Ｌｌａｎｏ，Ｅ．，Ｖｅｌａｓｃｏ　Ｇ．，ａｎｄ　Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ，Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，５６，９４４−９４９（１９９６）；特開２０００−２７０８７４号；Ｐｅｉ，Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，８９２５−８９３２，１９９９；Ｋａｊｉｔａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，４５７，３５３−３５６，１９９９）。
ＭＴ−ＭＭＰｓは、多くのＭＭＰｓに特徴的なホモペキシンドメインの後方に、単一の膜貫通領域と短い細胞内テールを持つＩ型の膜タンパク質である。さらに、これらはプロペプチドと活性ドメインの間に塩基性アミノ酸の挿入が共通して存在し、フューリン（ｆｕｒｉｎ）あるいはフューリン様酵素による切断で、これらの膜タンパク質の活性化がおきる（Ｐｅｉ，Ｄ．，ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，９１３５−９１４０（１９９６）；Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．，ａｎｄ　Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，３９３，１０１−１０４（１９９６）；Ｃａｏ，Ｊ．，Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ，Ａ：，Ｂａｈｏｕ，Ｗ．，ａｎｄ　Ｚｕｃｋｅｒ，Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３０１７４−３０１８０（１９９６））。
Ｔｅｓｔｉｃａｎは、精巣で最初に発見されたプロテオグリカンで、ヒト精巣プラズマよりコンドロイチン硫酸／ヘパラン硫酸プロテオグリカンとして単離された（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８８，５６５−５６９（１９９２））。そのアミノ酸配列は、ヒト精巣ｃＤＮＡより推論され（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１４：３４７−３５０（１９９３））、ＢＭ−４０／ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｃｉｄｉｃ　ａｎｄ　ｒｉｃｈ　ｉｎ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＳＰＡＲＣ）／ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８８，５６５−５６９（１９９２），ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，４１４，５５７−５６１（１９９７））と類似のドメイン構造を持っていることが示されている。Ｔｅｓｔｉｃａｎは、マルチドメイン構造を持っている。Ｔｅｓｔｉｃａｎの局在は、脳の限定された領域であり、シナプス後部に存在する。このことは、Ｔｅｓｔｉｃａｎが、レセプター活性、神経調節、シナプスの形成性、あるいは神経伝達などに関与することが考えられる。
Ｔｅｓｔｉｃａｎ及びその関連物質としては、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１４：３４７−３５０（１９９３））、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−２（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７３：１２−２０（１９９９））、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３などのＴｅｓｔｉｃａｎ類のほか、ＢＭ−４０／ＳＰＡＲＣ／ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ，ＱＲ１，ＳＣ１／ｈｅｖｉｎ，ｔｓｃ３６／Ｆｌｉｋなどが知られ、それらのタンパク質のうちには、特徴的なドメイン構造、例えばｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃａ２＋−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ（ＥＣ　ｄｏｍａｉｎ），ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ　ｄｏｍａｉｎ（ＦＳ　ｄｏｍａｉｎ）の存在が認められ、あるものには、ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ　ｄｏｍａｉｎ（ＴＹ　ｄｏｍａｉｎ）やＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅが存在している。特に、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３は、４３６個のアミノ酸をコードしている遺伝子に由来し、マルチドメイン構造をもっている。その特徴的なドメインとしては、Ｋａｚａｌ−ｔｙｐｅ　ｄｏｍａｉｎ（アミノ酸配列の第１４８−１８３位）で、セリンプロテアーゼインヒビターとして働くｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ様ドメイン、そしてＴＹ　ｄｏｍａｉｎ（Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｒｅｐｅａｔｓ，アミノ酸配列の第３１７−３８０位，特には第３３８−３８０位）で、システインプロテアーゼインヒビター、ヘパリンの結合パートナーとして働くドメインが挙げられる。Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３は、Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを持っていることが認められる。
これと類似したアミノ酸配列を持つものに、ＨＰＴＬＧ（ＷＯ９９／２３１１０　Ａ１）がある。このＨＰＴＬＧは、ヒト視床下部からのＨＰＴＬＧ遺伝子に由来するもので、細胞の粘着、移動、増殖等に関与すると考えられている。Ｔｅｓｔｉｃａｎ様タンパク質であることから、脳において成長因子のレセプターとして働くことが推測される。ＨＰＴＬＧはマルチドメイン構造をもっており、その特徴的なドメインとしては、Ｋａｚａｌ−ｔｙｐｅ　ｄｏｍａｉｎ（アミノ酸配列の第１３６−１８２位）で、ＱＲ１、ＳＣ１やｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎのようなタンパク分解阻害活性が知られ、そして、ＣＷＣＶ　ｄｏｍａｉｎ（アミノ酸配列の第３３２−３８１位）で、これは、例えば、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓを結合することが知られている。ＨＰＴＬＧもＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを持っていることが認められる。
これまでのＭＭＰ類及び／又は膜型ＭＭＰ類と癌との関係については、例えば、プロゼラチナーぜＡの活性化（Ｏｋａｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９４，ｐｐ７２１−７３０，１９９０）、ＭＴ１−ＭＭＰによるＭＭＰ−２の活性化（Ｓａｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，ｐｐ６１−６５，１９９４）などによる関係が示唆されているが、具体的な関与については未だ不明である。
こうした細胞外マトリックスや基底膜成分のさまざまな構成タンパク質に対して活性を有するＭＭＰｓは、その活性の亢進などにより様々な病的な症状や発症に影響を及ぼしているだけでなく、癌などの転移・浸潤、さらには癌組織周辺での血管新生などに関与していることが示唆されている。従って、ＭＭＰｓの活性調節に関与している遺伝子やタンパク質として如何なるものが存在し、どのような機構でそれらがＭＭＰｓの活性の制御に関与しているなどを解明することが求められている。
発明の開示
発明者等は、ＭＭＰｓの活性調節に関与している遺伝子のスクリーニング系を構築し、ヒト由来遺伝子につき、ＭＭＰｓの活性調節に関与している遺伝子の探索をおこなった結果、Ｔｅｓｔｉｃａｎと呼ばれる一群の遺伝子群と極めて類似してはいるが、ＭＴ１−ＭＭＰやＭＴ３−ＭＭＰに対して阻害活性を有し、特徴ある構造を有する新規な遺伝子及びそれがコードする新規なポリペプチドを見出した。
すなわち、本発明は、
〔１〕　（Ａ）ヒト由来のＮ−Ｔｅｓポリペプチド若しくは
（Ｂ）（ｉ）該Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有し且つ
（ｉｉ）（ａ）Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠いている、
（ｂ）ＴＹ　ｄｏｍａｉｎやＣＷＣＶ　ｄｏｍａｉｎを欠いている、
（ｃ）Ｃ末端が特徴的な配列Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを有している、及び
（ｄ）Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列のうちの少なくとも５〜３１３個の連続したアミノ酸残基を有する
から成る群から選ばれた特徴を有しているもの
であることを特徴とするポリペプチド又はその塩；
〔２〕　配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、
（ｉ）少なくとも連続した５〜７０個のアミノ酸残基を有するもの、
（ｉｉ）少なくとも連続した７１〜１５０個のアミノ酸残基を有するもの、
（ｉｉｉ）少なくとも連続した１５１〜３１３個のアミノ酸残基を有するもの、
（ｉｖ）少なくとも第２２番目〜第１２２番目のアミノ酸配列を有するもの、
（ｖ）第２２番目〜第８１３番目のアミノ酸配列を有するもの、
（ｖｉ）第１番目〜第３１３番目のアミノ酸配列を有するもの、及び
（ｖｉｉ）それらのいずれか一つと実質的に同等のアミノ酸配列を有するもの
からなる群から選ばれたポリペプチドであることを特徴とする上記〔１〕記載のポリペプチド又はその塩；
〔３〕　上記〔１〕または〔２〕記載のポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩；
〔４〕　下記の性質：
１）ＭＴ−ＭＭＰ類のＭＭＰ類活性化能を抑制する機能を有し、且つ
２）（ｉ）配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、Ａｌａ２２〜Ｇｌｙ１２２のアミノ酸配列のうち、少なくとも５〜１０１個の連続したアミノ酸残基を有するもの、及び
（ｉｉ）Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列のうちの少なくとも５〜３１３個の連続したアミノ酸残基を有するもの
から成る群から選ばれたものである
ことを特徴とするポリペプチド又はその塩。
〔５〕　（ｉ）ＭＴ−ＭＭＰ類がＭＴ１−ＭＭＰ又はＭＴ３−ＭＭＰである及び／又は（ｉｉ）ＭＭＰ類がＭＭＰ−２であることを特徴とする上記〔４〕のポリペプチド又はその塩；
〔６〕　上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とする核酸；
〔７〕　配列表の配列番号：１で表される塩基配列のうち、オープンリーディングフレーム部分またはそれと実質的に同等な塩基配列を有することを特徴とする上記〔６〕記載の核酸；
〔８〕　上記〔６〕または〔７〕記載の核酸を含有することを特徴とするベクター；
〔９〕　上記〔６〕または〔７〕記載の核酸あるいは上記〔８〕記載のベクターを含有することを特徴とする形質転換体；
〔１０〕　宿主細胞が大腸菌、酵母、２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞からなる群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔９〕記載の形質転換体；
〔１１〕　上記〔１０〕記載の形質転換体によって発現させて得たものであることを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチド；
〔１２〕　配列表の配列番号：１で表される塩基配列のうち、オープンリーディングフレーム部分又はその一部あるいはそれと実質的に同等な塩基配列をＰＣＲ増幅するに有効なプライマー；
〔１３〕　次のものに対する抗体：
（ｉ）上記〔１〕記載のポリペプチドまたはその塩、
（ｉｉ）上記〔２〕記載のポリペプチドまたはその塩、
（ｉｉｉ）上記〔３〕記載の部分ペプチドまたはその塩、
（ｉｖ）上記〔４〕記載のポリペプチドまたはその塩、あるいは
（ｖ）上記〔５〕記載のポリペプチドまたはその塩；
〔１４〕　上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチドまたはその塩と特異的に免疫反応する抗体を測定試薬として用いることを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチドまたはその塩の免疫学的測定方法；
〔１５〕　上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチドまたはその塩と特異的に免疫反応する抗体を含むことを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチドまたはその塩の免疫学的測定試薬；
〔１６〕　上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩；あるいは上記〔６〕または〔７〕記載の核酸；あるいは上記〔１３〕記載の抗体を含有していることを特徴とする医薬；
〔１７〕　（ｉ）ＭＴ１−ＭＭＰ又はＭＴ３−ＭＭＰ活性阻害剤、
（ｉｉ）癌の浸潤、転移抑制及び／又は阻害剤、
（ｉｉｉ）血管新生阻害剤、
（ｉｖ）アルツハイマー治療剤、及び
（ｖ）関節破壊治療剤
から成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔１６〕記載の医薬；
〔１８〕　上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有していることを特徴とする医薬；
〔１９〕　上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩の生物学的活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法およびスクリーニングキット；
〔２０〕　ＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの発現プラスミドと検体遺伝子を宿主細胞に導入し、発現するＭＭＰについての検出を指標とすることを特徴とするＭＭＰｓから成る群から選ばれたものの活性調節に関与する遺伝子のスクリーニング方法およびスクリーニングキット；
〔２１〕　ＭＭＰ−２、ＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミドと検体プラスミドを２９３Ｔ細胞などの宿主細胞に導入し、例えば潜在型、中間体、活性化型ＭＭＰ−２を検出にかけることを特徴とする上記〔２０〕記載のスクリーニング方法およびスクリーニングキット；１及び
〔２２〕　下記の指標：
（ａ）Ｎ−Ｔｅｓの発現量が正常部位に比べ低いこと、
（ｂ）Ｎ−Ｔｅｓポリペプチド又はそれから誘導されたペプチド断片、
（ｃ）Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子又はそれから誘導されたｍＲＮＡなどの核酸、及び
（ｄ）抗Ｎ−Ｔｅｓ抗体
から成る群から選ばれたものを指標として使用することを特徴とするグリオーマの検出方法を提供する。
別の態様では、本発明は
〔２３〕　ＭＴ１−ＭＭＰ及び／又はＭＴ３−ＭＭＰに対して阻害活性を有することを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のポリペプチド又はその塩；
〔２４〕　ＭＴ１−ＭＭＰ及び／又はＭＴ３−ＭＭＰに対して阻害活性を有するポリペプチド又はタンパク質を産生する機能を有する上記〔６〕又は〔７〕記載の核酸；
〔２５〕　ＭＴ１−ＭＭＰ及び／又はＭＴ３−ＭＭＰに対して阻害活性を有するポリペプチド又はタンパク質を産生する機能を有する上記〔８〕記載のベクター；
〔２６〕　ＭＴ１−ＭＭＰ及び／又はＭＴ３−ＭＭＰに対して阻害活性を有するポリペプチド又はタンパク質を産生する機能を有する上記〔９〕記載の形質転換体；
〔２７〕　抗体が、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３及びＨＰＴＬＧと実質的に交差反応はしないものであることを特徴とする上記〔１３〕記載の抗体；
〔２８〕　モノクローナル抗体であることを特徴とする上記〔１３〕記載の抗体；
〔２９〕　少なくとも二種の抗Ｎ−Ｔｅｓモノクローナル抗体を使用することを特徴とする上記〔１４〕記載の測定方法；
〔３０〕　少なくとも二種の抗Ｎ−Ｔｅｓモノクローナル抗体を含有することを特徴とする上記〔１５〕記載の測定試薬；及び
〔３１〕　本発明の活性成分を使用することを特徴とするグリオーマの検出用試薬及びその測定方法を提供する。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
本明細書において、用語「及び／又は」とは、（１）併合的接続関係と（２）選択的接続関係の両方が存在することを意味しており、例えば「治療及び／又は予防」の場合では（１）治療及び予防並びに（２）治療又は予防の両方を包含する意味で使用されている。その他においても用語「及び／又は」は同様に（１）併合的接続関係と（２）選択的接続関係の両方を包含する意味で使用されている。
発明を実施するための最良の形態
本発明に従い、Ｔｅｓｔｉｃａｎファミリーの一種で、ＭＭＰ阻害活性を有するヒト由来のＮ−Ｔｅｓポリペプチド若しくは該Ｎ−Ｔｅｓポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有し且つＭＭＰ阻害活性あるいは同等の抗原性を有するものであるペプチドまたはその塩、そのポリペプチドの特徴的な部分ペプチドまたはその塩、それらをコードする遺伝子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど、その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可能なように含有しているベクターあるいはプラスミド、こうしたベクターなどで形質転換された宿主細胞、さらにはその遺伝子を発現するトランスジェニックマウス等のトランスジェニック動物、その遺伝子を特異的に不活性化したノックアウトマウス等のノックアウト動物、その形質転換細胞を、培養して該ポリペプチドまたはその塩を製造する方法、こうして得られた該ポリペプチドまたはその塩やそのポリペプチドの特徴的な部分ペプチドまたはその塩を用いて得られた抗体、特にはモノクローナル抗体、その抗体を産生するハイブリドーマ細胞、該単離された遺伝子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどをプローブとして用いたり、あるいは該抗体を用いた測定・診断手段並びに試薬が提供される。さらには、本明細書で開示され説明されている活性成分の利用を提供し、例えば、該活性成分を含有する医薬あるいは試薬などが提供され、そうした活性成分を用いた疾患、疾病あるいは異常な状態の治療及び／又は予防方法、さらにはスクリーニング方法などが提供される。
本明細書において「Ｎ−Ｔｅｓ」とは、プロテオグリカンであるＴｅｓｔｉｃａｎ類に関連したペプチドであって、本発明で開示されている新規なペプチドを指している。該Ｎ−Ｔｅｓは、３１３個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、そのＣ末端側には特徴的な配列Ｇｌｙ３１１−Ｌｙｓ３１２−Ａｒｇ３１３を有しており、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３やＨＰＴＬＧに存在するＴＹ　ｄｏｍａｉｎやＣＷＣＶ　ｄｏｍａｉｎを欠いたもので、さらにＴｅｓｔｉｃａｎ−３やＨＰＴＬＧに存在しているＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠いていることを特徴としている。該Ｎ−Ｔｅｓは、ＭＴ−ＭＭＰｓ阻害活性を有し、特に、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰに対して強い阻害活性を有し、さらにＭＴ３−ＭＭＰに対してより強い阻害活性を有する。この阻害活性としては、例えば、ＭＴ−ＭＭＰｓがＭＭＰ−２を活性化することを阻害することが挙げられる。このＭＴ−ＭＭＰｓに対する阻害活性は、配列表の配列番号：１の第２２番目〜第１２２番目のアミノ酸配列部分内にあると予測され、これらアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＭＴ−ＭＭＰｓに対する阻害活性を有することを意味する。これは、また、例えば、ＨＰＴＬＧはＭＴ−ＭＭＰｓに対する阻害活性を有することを意味する。さらに、ｔｅｓｔｉｃａｎ−３は、これら配列に３アミノ酸残基の挿入があるが、ｔｅｓｔｉｃａｎ−３も同様にＭＴ−ＭＭＰｓに対する阻害活性を有するものと考えられる。
本明細書で用いる用語「ポリペプチド」としては、以下に記載するような如何なるポリペプチドを指すものであってもよい。ポリペプチドの基本的な構造は周知であり、当該技術分野において非常に数多くの参考書及びその他の刊行物に記載がある。こうしたことに鑑み、本明細書で用いる用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾したペプチド結合により互いに結合しているような２個又はそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又は任意のタンパク質を意味する。本明細書で用いる用語「ポリペプチド」としては、当該分野において通常、例えばペプチド、オリゴペプチドあるいはペプチドオリゴマーとも称せられる短い鎖のもの、及びタンパク質と一般的に言われ、多くの形態のものが知られている長い鎖のものの両方を意味してよい。ポリペプチドは、しばしば、通常、２０種の天然型アミノ酸（天然に存在しているアミノ酸：あるいは遺伝子でコードされるアミノ酸）と称されるアミノ酸（２０個存在している）以外のアミノ酸を含有していてもよい。ポリペプチドは、また末端アミノ酸残基を含めて、その多くのアミノ酸残基が翻訳された後にプロセッシング及びその他の改変（あるいは修飾）されるといった天然の工程によるのみならず、当業者に周知の化学的改変技術によっても、上記のポリペプチドはそれが改変（修飾）できることは理解されよう。該ポリペプチドに加えられる改変（修飾）については、多くの形態のものが知られており、それらは当該分野の基礎的な参考書及びさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。幾つかのとりわけ常套的な改変・修飾としては、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、水酸化及びＡＤＰ−リボシル化等が挙げられ、例えばＴ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９３）；Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｅｄ．），Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８３）（Ｗｏｌｄ，Ｆ．，“Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”，ｐｐ．１−１２）；Ｓｅｉｆｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，“Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｇｉｎｇ”，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６３：ｐ，４８−６２（１９９２）等の記載を参照できる。
本発明の「ポリペプチド」としては、特にはＮ−Ｔｅｓ及びその関連ポリペプチドを包含する。該Ｎ−Ｔｅｓ及びその関連ポリペプチドとしては、ヒト由来のものが挙げられ、ＭＭＰｓ阻害活性、例えばＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰなどに対して阻害活性を有するものが挙げられ、代表的にはＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠いている及び／又はＴＹ　ｄｏｍａｉｎやＣＷＣＶ　ｄｏｍａｉｎを欠いたものが挙げられ、より具体的には、配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、少なくとも第３１１位〜第３１３位のアミノ酸配列を有するもの、第２２位〜第１２２位のアミノ酸配列を有するもの、同第２２位〜第３１３位のアミノ酸配列を有するもの、同第１位〜第３１３位のアミノ酸配列を有するもの、及びそれらのいずれか一つと少なくとも６０％より高い相同性、好ましくは７０％以上の相同性、さらに好ましくは８０％以上の相同性、また好ましくは８５％以上の相同性、もっと好ましくは９０％以上の相同性、より好ましくは９５％以上の相同性、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し且つＭＭＰ阻害活性あるいは同等の抗原性などといった実質的に同等の生物学的活性を有するアミノ酸配列を有するものがすべて挙げられる。
本発明のヒトＮ−Ｔｅｓとしては、ＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰなどの阻害活性を有し、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３などのＴｅｓｔｉｃａｎファミリーのバリアントの一種であり、Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠いたもので且つ新規なアミノ酸配列を有するものであればよい。より好ましくは、本発明のペプチドとしては、Ｔｅｓｔｉｃａｎファミリーと少なくとも６０％より高い相同性を持つアミノ酸配列を有するもののうち、ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠いたものが挙げられ、特には配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、少なくとも第３１１位〜第３１３位のアミノ酸配列部位、第２２位〜第１２２位のアミノ酸配列部位あるいはそれの主要部位（例えば、該第３１１位〜第３１３位を含む連続したアミノ酸残基、あるいは該第２２位〜第１２２位のうちの連続したアミノ酸残基５個以上、好ましくは１０個以上、また好ましくは２０個以上、さらに好ましくは３０個以上、より好ましくは４０個以上、また好ましくは５０個以上、さらに好ましくは６０個以上、もっと好ましくは７０個以上、また好ましくは８０個以上、さらに好ましくは９０個以上、もっとも好ましくは１００個以上、また好ましくは１１０個以上）を有するものが挙げられる。代表的には、本発明のペプチドは、配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、少なくとも第２２位〜第３１３位のアミノ酸配列を有するもの、及びそれらのいずれか一つと実質的に同等のアミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたものである。さらに本発明のペプチドとしては、配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列の一部または全部を有していてもよい。こうした配列を有するものはすべて包含されてよい。
本明細書中、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である（例えば、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．（Ｅｄ．），Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９３）；Ｇｒｉｆｉｎ，Ａ．Ｍ．＆　Ｇｒｉｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ：Ｐａｒｔ　Ｉ，Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８７）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．＆　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．（Ｅｄ．），Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ−Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９１）等）。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ（Ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｈｕｇｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，（１９９４）；Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ，＆　Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３（１９９０））等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。
本発明のＮ−Ｔｅｓをコードする遺伝子は、代表的には配列表の配列番号：２で表されるペプチド及びその一部の連続したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するもの、例えば、配列表の配列番号：１で表される塩基配列の少なくとも１０３８−１０４６位により構成される塩基配列を含有するもの、配列表の配列番号：１で表される塩基配列の少なくとも１７１−４７３位により構成される塩基配列を含有するもの、及び配列表の配列番号：１で表される塩基配列の１０８−１１０位のＡＴＧから１０４７−１０４９位のＴＧＡより構成される塩基配列を含有するもの（１０４７−１０４９の終止コドンＴＧＡは、ＴＡＡまたはＴＡＧであってもよい）であることができるし、配列表の配列番号：１で表される塩基配列の１７１位から１０４９位の塩基配列を含有するもの、塩基配列に開始コドン、例えば、Ｍｅｔをコードするコドン（及び終止コドン）を付加したもの、また、該塩基配列がコードするタンパク質と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を持ち且つＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰなどのＭＭＰｓの少なくとも一つに対し阻害活性を有するかあるいは同等の抗原性などのそれと実質的に同等の生物学的活性を有するペプチドをコードするといったそれと同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。該Ｎ−Ｔｅｓをコードする遺伝子は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、合成ＤＮＡなどの核酸であり、またヒトゲノムＤＮＡ、ヒトジェノミックＤＮＡライブラリー、ヒト組織・細胞由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれであってもよい。該Ｎ−Ｔｅｓをコードする遺伝子の塩基配列は、修飾（例えば、付加、除去、置換など）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。さらには、以下説明するように、本発明の核酸は、本発明のペプチドあるいはその一部をコードするものであってよく、好ましいものとしてはＤＮＡが挙げられる。また上記「同効の塩基配列」とは、例えばストリンジェントな条件で配列表の配列番号：１の塩基配列うちの連続した５個以上の塩基配列、好ましくは１０個以上の塩基配列、より好ましくは１５個以上の塩基配列、さらに好ましくは２０個以上の塩基配列とハイブリダイズし、Ｎ−Ｔｅｓと実質的に同等のアミノ酸配列をコードするものなどが挙げられる。
配列表の配列番号：１で表される塩基配列またはそれと同効の塩基配列を含有する本発明のＤＮＡは、例えば以下に示す方法によって取得できる。
なお、遺伝子組換え技術は、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ　ｅｄ．，Ｖｏｌ．１　ｔｏ　４，（Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；日本生化学会編、「続生化学実験講座Ｉ、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ　ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｂ）＆　１０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ，１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｅ）＆　１５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐａｒｔ　Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｒ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２１８，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
クローニングされているヒト由来のｃＤＮＡライブラリー、例えば種々のヒト由来の組織あるいは培養細胞（特には、ヒトの腎臓、脳、松果体、下垂体後葉、網膜、胸腺、精巣、卵巣、子宮、腸、心臓、肝臓、膵臓、小腸、大腸などの組織・細胞等）ｃＤＮＡライブラリーから得られたｃＤＮＡ挿入配列を持つプラスミドを、適当な検知系によって、ＭＭＰｓのうちの少なくとも一つの活性を抑制していることを指標にして選別を行う。具体的には、例えばＭＭＰ−９，ＭＭＰ−２及びＭＴ１−ＭＭＰの全長のｃＤＮＡを発現するベクターと共に、試験されるべき該ｃＤＮＡライブラリーから得られたｃＤＮＡ挿入配列を持つプラスミドを、適当な宿主細胞にトランスフェクトし、例えば潜在型、中間体、活性化型ＭＭＰ−９，ＭＭＰ−２を検出にかけ、活性化型ＭＭＰ−９あるいは活性化型ＭＭＰ−２の産生を抑制する遺伝子プラスミド集団を検索する。
この検索手法は、繰り返し行なうことができる。こうして同定された遺伝子につき、その配列決定する。こうして同定された配列に基づいて適切なプライマーを設計・合成し、場合によっては、同定された配列のオリジンである動物由来のｃＤＮＡライブラリーを用いるなどし、目的の配列をポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）増幅する。得られたＤＮＡ断片はそれをプローブに種々のヒト組織あるいは培養細胞等から構築されたヒトジェノミックＤＮＡライブラリーあるいはヒト由来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、プローブにハイブリダイズするクローンを選択し、該クローン中のＤＮＡの挿入配列の塩基配列を決定し、新規なＮ−Ｔｅｓ及びそれに関連する遺伝子配列を有するＤＮＡ断片を決定・取得することもできる。必要に応じて該クローン中のＤＮＡの挿入配列はサブクローニングすることができる。こうして解析された新規な遺伝子を有していると考えられるＤＮＡ配列を基に、該Ｎ−Ｔｅｓ及びそれに関連する遺伝子配列をコードする遺伝子を取得することも可能である。また、解析された該新規なＮ−Ｔｅｓ及びそれに関連する遺伝子配列（ＤＮＡ配列）を基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーをデザインし、合成することができる。センスプライマーは、好ましくは解析された該所望のペプチドと推定される遺伝子の５’端側のエクソン部位から選んで合成することができ、アンチセンスプライマーは、好ましくは解析された該所望のペプチドと推定される遺伝子の３’端側のエクソン部位から選んで合成することができ、より好ましくは該センスプライマー合成に利用したエクソン部位以外から選ぶことができる。
遺伝子のｃＤＮＡは、その全長を一度に入手することを目指してもよいが、解析されたエクソン部位（複数のエクソン部位）を利用して、複数のプライマーをデザインして合成し、複数のＰＣＲをデザインして行い（必要に応じて塩基配列決定されたＤＮＡ断片を解析して、当該遺伝子のｃＤＮＡの全塩基配列を決定し、それに基づいてクローニングし）、得られたＤＮＡ断片から当該遺伝子のｃＤＮＡを得ることができる。プライマーは、好ましくは５個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは１８〜２５個の塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。プライマーの作製は、当該分野で知られた方法で行うことができ、代表的にはフォスフォジエステル法、フォスフォトリエステル法、フォスフォアミダイト法などにより合成でき、例えば自動ＤＮＡ合成装置、例えば、ｍｏｄｅｌ　３８１Ａ　ＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などを用いて合成できる。ｃＤＮＡライブラリーと前記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを増幅することもできる。また、当該遺伝子の取得には、上記のようにして同定されたクローンから特異的なハイブリダイゼーションプローブを調製し、ヒト由来ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、プローブにハイブリダイズするクローンを選択することにより行うことができる。プローブなどを放射性同位体などによって標識するには、市販の標識キット、例えばランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）などを使用して行うことができる。例えば、ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｉｎｇキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ，Ｕｐｐｓａｌａ）などを使用して、プローブ用ＤＮＡを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などで標識し、放射活性を持つプローブを得ることができる。
さらに鋳型として用いるｃＤＮＡライブラリーは、市販の種々の組織由来ｃＤＮＡライブラリーを直接使用することもでき、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈなどから市販されたｃＤＮＡライブラリーを用いることができる。典型的な例では、該標識ＤＮＡ断片とヒト組織・細胞から調製した遺伝子ライブラリー、例えばヒトＰ１　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅジェノミックライブラリー（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｍａｐｐｉｎｇ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈなどから入手可能）を用い、ハイブリダイゼーションを行う。ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、λｇｔ１０などのファージ中に構築することができ、それを大腸菌Ｃ６００ｈｆｌ株などの宿主大腸菌に感染させ、プラークを形成させて得ることができる。必要に応じて該クローン中のｃＤＮＡの挿入配列はサブクローニングすることができる。決定された塩基配列を基にして、目的とするＤＮＡを単離することもできる。
塩基配列の決定は、ダイデオキシ法、例えばＭ１３ダイデオキシ法など、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法などを用いて行うことができるが、市販のシークエンシングキット、例えばＴａｑダイプライマーサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ｖ　２．０　ｋｉｔなどを用いたり、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光ＤＮＡシーケンサー装置（例えば、Ｍｏｄｅｌ　３７３Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などを用いて行うことが出来る。ダイデオキシ法に用いられるポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー・フラグメント、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ、修飾Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
本明細書中、「ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」又は「ＰＣＲ」とは、一般的に、米国特許第４６８３１９５号明細書などに記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。一般に、ＰＣＲ法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行うようなサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、ＰＣＲ法で用いられるプライマーは、鋳型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用され得る。
ＰＣＲ反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えばＲ．Ｓａｉｋｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０，１９８５；Ｒ．Ｓａｉｋｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７，１９８８；Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ　ｅｄ．，ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ　ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，（Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９０））；Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｑｕｉｒｋｅ　ａｎｄ　Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ（Ｅｄ．），ＰＣＲ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２（１９８８）などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、ＰＣＲ法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
代表的な場合には、例えば鋳型となる１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡとプライマーとを、１０×反応緩衝液（Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼなどＤＮＡポリメラーゼに添付されている）、ｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの混合物）、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ　２４００　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓなどの自動サーマルサイクラーを用いて一般的なＰＣＲサイクル条件下にそのサイクルを２５〜６０回繰り返すが、増幅のためのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とすることができる。ＰＣＲサイクル条件としては、例えば、変性９０〜９５℃５〜１００秒、アニーリング４０〜６０℃５〜１５０秒、伸長６５〜７５℃３０〜３００秒のサイクル、好ましくは変性９４℃１５秒、アニーリング５８℃１５秒、伸長７２℃４５秒のサイクルが挙げられるが、アニーリングの反応温度及び時間は適宜実験によって適当な値を選択できるし、変性反応及び伸長反応の時間も、予想されるＰＣＲ産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニーリングの反応温度は、通常プライマーと鋳型ＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値に応じて変えることが好ましい。伸長反応の時間は、通常１０００ｂｐの鎖長当たり１分程度がおおよその目安であるが、より短い時間を選択することも場合により可能である。
得られたＰＣＲ産物は、通常１〜２％アガロースゲル電気泳動にかけて、特異なバンドとしてゲルから切り出し、例えば、ｇｅｎｅ　ｃｌｅａｎ　ｋｉｔ（Ｂｉｏ　１０１）などの市販の抽出キットを用いてＤＮＡを抽出する。抽出されたＤＮＡは適当な制限酵素で切断し、必要に応じ精製処理したり、さらには必要に応じ５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどによりリン酸化した後、ｐＵＣ１８などのｐＵＣ系ベクターといった適当なプラスミドベクターにライゲーションし、適当なコンピータント細胞を形質転換する。クローニングされたＰＣＲ産物はその塩基配列を解析される。
また、当該遺伝子のエクソン部位のうち解析した５’端側のエクソン部位の塩基配列に基づいてデザインされたプライマーを利用して、当該遺伝子のｃＤＮＡの５’端側のｃＤＮＡを取得し、一方当該遺伝子のエクソン部位のうち解析した３’端側のエクソン部位の塩基配列に基づいてデザインされたプライマーを利用して、当該遺伝子のｃＤＮＡの３’端側のｃＤＮＡを取得し、次に必要に応じてこれらプライマーや得られた当該遺伝子のｃＤＮＡの５’端側のｃＤＮＡ並びに３’端側のｃＤＮＡの塩基配列の情報を利用してデザインしたプライマーを用い、ヒトの組織、特には、ヒト脳組織などから単離したｍＲＮＡから逆転写酵素により作製された１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅して、当該遺伝子のｃＤＮＡを得ることもできる。
５’端側のプライマーとしては、少なくとも開始コドンを含有するか、あるいは該開始コドンを含めて増幅できるように選択し、また３’端側のプライマーとしては、少なくともストップコドンを含有するか、あるいは該ストップコドンを含めて増幅できるように選択することが好ましい。当該遺伝子の全長のｃＤＮＡを得るにあたり、ＰＣＲは上記したようにして行なうことができ、また好ましいＰＣＲサイクル条件としては、例えば、変性９２〜９５℃１０〜２０秒、アニーリング５５〜６０℃１０〜３０秒、伸長６５〜７５℃１５０〜３００秒のサイクル、より好ましくは変性９４℃１５秒、アニーリング５８℃１５秒、伸長６８℃４分のサイクルが挙げられる。
得られたＰＣＲ産物は、上記と同様にしてクローニングしてその塩基配列を解析され決定される。
また決定されたＤＮＡの塩基配列を基にプライマーをデザインし、これらプライマーと各種の動物細胞由来のｃＤＮＡライブラリー（例えば、各種のヒト、細胞由来のｃＤＮＡライブラリー）を用いて、スクリーニングを行うことにより、同様に目的とするクローンを得ることができる。またこれらプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、目的とする遺伝子や、新規な遺伝子、それらの断片などを得ることができる。こうしてＮ−Ｔｅｓと相同性を有するが、配列が新規なＰＣＲ産物を検索することもできる。
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドで、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，Ｖｏｌ．２８，ｐ．７１６−７３４（１９８９）に記載されているような既知の方法、例えば、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホスホネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られており、例えば、自動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてよい。
得られたＰＣＲ産物をクローニングし、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、新規なＮ−Ｔｅｓ及びそれに関連した遺伝子配列を有するＤＮＡ断片を取得することもできる。また、このＤＮＡ断片をプローブに同様にして種々のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、目的とするＤＮＡを単離することもできる。ＰＣＲ産物のクローニングには、例えば、ｐ−Ｄｉｒｅｃｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ），ｐＡｍｐＴＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）などの市販のプラスミドベクターを用いることが出来る。
ｃＤＮＡライブラリーを構築するためには、ｃＤＮＡを入手する必要があるが、これは、例えば次のようにして得られる。種々のヒトの組織あるいは培養細胞からｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ　７，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ　ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，（Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２，Ｐａｒｔ　Ａ　＆　Ｂ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６８）；Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５２，ｐ．３３　＆　ｐ．２１５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−５２９９，１９７９などに記載の方法、例えばグアニジン−塩化セシウム法、チオシアン酸グアニジン法、フェノール法などの方法で行うことが出来る。ｍＲＮＡの単離に用いられるキットとしては、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬなどから市販されているものが挙げられる。必要に応じ、得られた全ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム、スピンカラム、オリゴ（ｄＴ）結合磁性ビーズなどを使用して精製してポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを得ることが出来る。
このｍＲＮＡ及び逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて、ｃＤＮＡを作製する。逆転写反応では、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いることができる。オリゴ（ｄＴ）プライマーは、好適には１２〜１８個のＴ残基を持つものが使用できる。指向性クローニングを行う場合には、１２〜１８個のＴ残基の５’側に制限酵素部位を連結した合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いることも好ましい。こうしたプライマーの例としては、Ｘｂａ　Ｉオリゴ（ｄＴ）プライマーアダプターなどが挙げられる。またランダムヘキサマープライマーを用いると、ｍＲＮＡの５’末端側が得られる可能性が増大し、このランダムヘキサマープライマーは単独で、あるいはオリゴ（ｄＴ）プライマーと混合して使用できる。逆転写反応では、必要に応じてＲＮａｓｅ阻害剤、例えば、ＲＮａｓｉｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えることができる。ｍＲＮＡ及び逆転写酵素を用いてのｃＤＮＡ合成は当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、Ｈ．Ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，９：２２５１，１９８１；Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９，１９８３；Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５２，ｐ．３０７，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）などに記載の方法が挙げられる。
得られたｃＤＮＡはそれを基にして、ファージベクター、プラスミドベクターを使用するなどしてｃＤＮＡライブラリーを構築できる。またファージベクターを使用する以外で、大腸菌などの宿主細胞の形質転換をするには、例えばカルシウム法、ルビジウム／カルシウム法、カルシウム／マンガン法、ＴＦＢ高効率法、ＦＳＢ凍結コンピテント細胞法、迅速コロニー法、エレクトロポレーションなど当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができる（Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７，１９８３など）。
目的とするＤＮＡを単離するためには、逆転写ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）を適用することが出来る。ＲＡＣＥは、例えば、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ，“ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”），ｐｐ．２８−３８，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９０）などに記載された方法に従って行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲ産物はプラスミドベクターにクローニングすることができ、それを高効率のコンピータント細胞に導入できる。
更に、微量の細胞あるいは組織からｍＲＮＡを単離精製できる方法、例えば、ＲＥＸ　ｋｉｔ，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｇｌａｓｓ　ＭＡＸＴＭ　ＲＮＡ　ｓｐｉｎ　ｃａｒｔｒｉｄｇｅ　ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬなどの市販のキットを利用し、得られたｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写して、１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡを合成し、ついで１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡの３’末端にホモポリマーテール（例えば、Ｇ残基）を付けた後、あるいは該ＤＮＡにアダプターを付けた後、オリゴ（ｄＴ）プライマーとオリゴ（ｄＣ）プライマーあるいはアダプタープライマーを用いてｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することもできる。これに適した市販のキットとしては、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）；ｃＤＮＡ　ＣｙｃｌｅＴＭ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、所定の挿入ＤＮＡを保持するなどしている微生物により形成されたプラーク（核酸自体でもよい）をナイロンフィルターなどの膜に転写せしめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理などを施した後、その膜に転写せしめられたものを、必要に応じ変成させた標識プローブＤＮＡ断片と、ハイブリダイゼーション用バッファ中で反応させて行われる。ハイブリダイゼーション処理は、普通約３５℃〜約８０℃、より好適には約５０℃〜約６５℃で、約１５分〜約３６時間、より好適には約１時間〜約２４時間行われるが、適宜最適な条件を選択して行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーション処理は、約５５℃で約１８時間行われる。ハイブリダイゼーション用バッファとしては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、例えば、Ｒａｐｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などを用いることができる。転写した膜の変成処理としては、アルカリ変性液を使用する方法が挙げられ、その処理後中和液や緩衝液で処理するのが好ましい。また膜の固定化処理としては、普通約４０℃〜約１００℃、より好適には約７０℃〜約９０℃で、約１５分〜約２４時間、より好適には約１時間〜約４時間ベーキングすることにより行われるが、適宜好ましい条件を選択して行うことができる。例えば、フィルターを約８０℃で約２時間ベーキングすることにより固定化が行われる。転写した膜の洗浄処理としては、当該分野で普通に使用される洗浄液、例えば１Ｍ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．０などで洗うことにより行うことができる。ナイロンフィルターなどの膜としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、例えば、ナイロンフィルター［ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ］などを挙げることができる。
上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、０．５Ｍ　ＮａＯＨおよび１．５Ｍ　ＮａＣｌを含有する液などを挙げることができ、中和液としては、例えば、１．５Ｍ　ＮａＣｌ含有０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．０などを挙げることができ、緩衝液としては、例えば、２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４および２ｍＭ　ＥＤＴＡ）などを挙げることができる。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に応じて転写した膜はプレハイブリダイゼーション処理することが好ましい。このプレハイブリダイゼーション処理は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液［５０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（０．２％ウシ血清アルブミン、０．２％ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ　ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ），５×ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ］などに浸し、約３５℃〜約５０℃、好ましくは約４２℃で、約４〜約２４時間、好ましくは約６〜約８時間反応させることにより行うことができるが、こうした条件は当業者であれば適宜実験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができる。ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブＤＮＡ断片の変成は、例えば、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約１００℃で、約１分間〜約６０分間、好ましくは約５分間加熱するなどして行うことができる。なお、ハイブリダイゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で行うことができるが、本明細書でストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度に関し、約１５〜約５０ｍＭ、好ましくは約１９〜約４０ｍＭ、より好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度については約３５〜約８５℃、好ましくは約５０〜約７０℃、より好ましくは約６０〜約６５℃の条件を示す。
ハイブリダイゼーション完了後、フィルターを十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダイゼーション反応をした標識プローブＤＮＡ断片以外の標識プローブを取り除く。フィルターの洗浄処理は、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いて行うことができ、例えば、０．１％ＳＤＳ含有０．５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸）溶液などで洗うことにより実施できる。
ハイブリダイズしたプラーク（核酸）は、代表的にはオートラジオグラフィーにより検出することができるが、当該分野で用いられる方法の中から適宜選択してプラーク（核酸）検出に用いることもできる。検出したシグナルに相当するプラーク（核酸）を、適切な緩衝液、例えば、ＳＭ溶液（１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）などに懸濁し、ついでこのファージ（核酸自体を含めてよい）懸濁液を適度に希釈して、大腸菌に感染させ、得られた大腸菌を培養して、その培養された大腸菌から目的組換え体ファージ（核酸）を得る。なお、必要に応じて上記プローブＤＮＡを使用して、ハイブリダイゼーション処理により遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから目的組換え体ファージ（核酸）をスクリーニングする処理は、繰り返して行うことができる。また目的組換え体ファージ（核酸）は、培養された大腸菌から抽出処理、遠心分離処理などを施して得ることができる。
得られたファージ粒子は、当該分野で普通に使用される方法で精製分離することができ、例えば、グリセロールグラジエント超遠心分離法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２ｎｄ　ｅｄ．７８，１９８９）などにより精製することができる。ファージ粒子からは、当該分野で普通に使用される方法でＤＮＡを精製分離することができ、例えば、得られたファージをＴＭ溶液（１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．８）などに懸濁し、ＤＮａｓｅ　ＩおよびＲＮａｓｅ　Ａなどで処理後、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｅ　Ｋ及び０．５％ＳＤＳ混合液などを加え、約６５℃、約１時間保温した後、これをフェノール抽出ジエチルエーテル抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させ、次に得られたＤＮＡを７０％エタノールで洗浄後乾燥し、ＴＥ溶液（１０ｍＭ　ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）に溶解するなどして得られる。また、目的としているＤＮＡは、サブクローニングなどにより大量に得ることも可能であり、例えばサブクローニングは、宿主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて行うことができる。こうしたサブクローニングにより得られたＤＮＡも、上記と同様にして遠心分離、フェノール抽出、エタノール沈殿などの方法により精製分離できる。
こうして本発明に従って、目的とするＤＮＡを含有するクローン（例えば、組換え体ファージなどとして）を得ることができる。例えば、このクローン化した組換え体ファージより単離されたＤＮＡインサートの配列決定された塩基配列の全長は１５１０ｂｐであり、その配列は配列表の配列番号：１で示されたものが得られていることが認められる。同定されたＤＮＡ配列中には、推定３１３個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームの存在が認められ、その推定されるアミノ酸配列は、配列表の配列番号：２で示されるようなものと認められる。ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＭＢＬ　ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｓｅなどを使用したホモロジー検索の結果、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２３１１２４）、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−２（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＪ００１４５３）、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＡＪ００１４５４）およびＨＰＴＬＧ（ＷＯ９９／２３１１０）のアミノ酸配列と高い相同性が認められたが、そのＣ末端側には特徴的な配列Ｇｌｙ３１１−Ｌｙｓ３１２−Ａｒｇ３１３を有しており、さらにＴｅｓｔｉｃａｎ−３やＨＰＴＬＧに存在するＴＹ　ｄｏｍａｉｎやＣＷＣＶ　ｄｏｍａｉｎを欠いたものであって、またＴｅｓｔｉｃａｎ−３やＨＰＴＬＧに存在しているＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠いているとの特徴が認められた。この推定されるタンパク質は、新規なヒトＴｅｓｔｉｃａｎ類の一つであり、それを「Ｎ−Ｔｅｓ」と名付けた。そして、Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子は、新規なＴｅｓｔｉｃａｎファミリーに属するポリペプチドをコードしていることは明白であり、Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子を用いて作製した組換え体プラスミドは全て新規な組換え体であり、そのプラスミドで形質転換あるいはトランスフェクトされ得られた形質転換体あるいはトランスフェクタントも新規なものである。
配列表の配列番号：１で示される塩基配列の全部あるいは一部を有する核酸は、化学合成によって得ることも可能である。その場合断片を化学合成し、それらを酵素により結合することによってもよい。また、化学合成断片を上記したようにして、プライマーあるいはプローブとして用いて目的とする配列を得ることも可能である。ＰＣＲ法で用いるプライマーとしては、上記の部位を含むＤＮＡ断片を増幅できるものであれば、特に限定されない。代表的には、プライマーは（ａ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（ｂ）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、より好ましくは（１）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５’端側の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（２）配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの３’端側の任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、例えば、３〜１００個、好ましくは１０〜５０個、さらに好ましくは１５〜３５個のヌクレオチドを含有するものが挙げられる。また、ＰＣＲ条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件でよく、例えば、上記した文献の記載を参考に選択することができる。ＰＣＲにおいては、ＤＮＡ鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例えば、１０〜５０回、好ましくは２０〜３５回、より好ましくは２５〜３０回繰り返して行われる。
本発明で得られたＤＮＡ断片を、下記で詳しく説明するような適当なベクター、例えば、プラスミドｐＥＸ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＫＧ５などのベクターに組込み、下記で詳しく説明するような適当な宿主細胞、例えば、大腸菌、酵母、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞などで発現させることができる。また、該ＤＮＡ断片は、そのままあるいは適当な制御配列を付加したＤＮＡ断片として、または適当なベクターに組込み、そして動物に導入して、Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子、例えば、Ｎ−Ｔｅｓを発現するトランスジェニック動物を作成することができる。動物としては、哺乳動物が挙げられ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシなどが挙げられる。好ましくは、マウスなどの動物の受精卵に該ＤＮＡ断片を導入して、トランスジェニック動物を作成することができる。
Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子産物の確認を、Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子をトランスフェクションした、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ−１細胞などのそれに適した動物細胞などを用いて行うことができる。この外来遺伝子を哺乳動物などの動物細胞に導入する方法としては当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができ、例えばリン酸カルシウム法（例えば、Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，１９７３など）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（例えば、Ｄ．Ｗａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３：３７１，１９６８など）、エレクトロポレーション法（例えば、Ｅ．Ｎｅｕｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ，１：８４１，１９８２など）、マイクロインジェクション法、リボソーム法、ウイルス感染法、ファージ粒子法などが挙げられる。こうしてＮ−Ｔｅｓ遺伝子をトランスフェクションされた動物細胞の産生する遺伝子産物は、それを解析することもできる。
Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子など（本発明で得られたＤＮＡなど）を組込むプラスミドとしては遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞等の真核細胞宿主、Ｓｆ２１等の昆虫細胞宿主）中で該ＤＮＡが発現できるプラスミドであればどのようなプラスミドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適に修飾されたコドンが含まれていることができるし、制限酵素部位が設けられていることもできるし、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御配列、促進配列など、目的とする遺伝子を結合するのに役立つリンカー、アダプターなど、さらには抗生物質耐性などを制御したり、代謝を制御したりし、選別などに有用な配列（ハイブリドタンパク質や融合タンパク質をコードするものも含む）等を含んでいることができる。
好ましくは、適当なプロモーター、例えば大腸菌を宿主とするプラスミドでは、トリプトファンプロモーター（ｔｒｐ）、ラクトースプロモーター（ｌａｃ）、トリプトファン・ラクトースプロモーター（ｔａｃ）、リポプロテインプロモーター（ｌｐｐ）、λファージＰＬプロモーター等を、動物細胞を宿主とするプラスミドでは、ＳＶ４０レートプロモーター、ＭＭＴＶ　ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ　ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等を、酵母を宿主とするプラスミドでは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０プロモーター等を使用し得る。
大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＴＺ−１８Ｒ／−１８Ｕ、ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ、ｐＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳＴＭ、（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。大腸菌での発現に適したプラスミドベクターとしては、ｐＡＳ、ｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＭＣ１４０３、ｐＭＣ９３１、ｐＫＣ３０、ｐＲＳＥＴ−Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）なども挙げられる。動物細胞を宿主とするプラスミドとしては、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマ・ウイルスベクター、ワクシニア・ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられ、例えばｐｃＤ、ｐｃＤ−ＳＲα、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＢＣ１２ＢＩ、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。酵母を宿主とするプラスミドとしては、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベクター、ＹＣｐ型ベクターなどが挙げられ、例えばｐＧＰＤ−２などが挙げられる。宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば大腸菌Ｋ１２株に由来するものが挙げられ、例えばＷ５３３、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｃ６００、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ１１Ｓ、ＤＨ１２Ｓ、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＪＭ１０９、ＳＴＢＬ２、Ｂ８３４株由来としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどが挙げられる。宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリカミドリザル線維芽細胞由来のＣＯＳ−７細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＶ−１細胞、マウス線維芽細胞由来のＣＯＰ細胞、ＭＯＰ細胞、ＷＯＰ細胞、チャイニーズ・ハムスター細胞由来のＣＨＯ細胞、ＣＨＯ　ＤＨＦＲ−細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、マウス細胞由来Ｃ１２７細胞、マウス細胞由来ＮＩＨ　３Ｔ３細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては、カイコ核多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）あるいはそれに由来するものをベクターとし、カイコ幼虫あるいはカイコ培養細胞、例えばＢＭ−Ｎ細胞などを用いることが挙げられる。植物細胞を宿主細胞として使用することも可能であり、それに適するベクターと共に、それらは当該分野で広く知られている。
本発明の遺伝子工学的手法においては、当該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆転写酵素、ＤＮＡ断片をクローン化するのに適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素であるＤＮＡ修飾・分解酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどを用いることが出来る。制限酵素としては、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３：ｒ１６５，１９８５；Ｓ．Ｌｉｎｎ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ｐ．１０９，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８２；Ｒ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｍａｃｅｌｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１９：Ｓｕｐｐｌ．２０７７，１９９１などに記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、例えばマウスモロネイ白血病ウイルス（ｍｏｕｓｅ　Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ；ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ　ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ；ＡＭＶ）由来の逆転写酵素などが挙げられる。逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ　Ｈ欠損体などは好ましく用いることができ、特にはＲＮａｓｅ　Ｈ活性を欠いた修飾ＭＭＬＶ　ＲＴが好ましく使用でき、さらには熱安定性の高いものが好ましい。適した逆転写酵素としては、ＭＭＬＶ　ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、その誘導体であるクレノウ・フラグメント、大腸菌ファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ファージＴ７　ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱菌ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼとしては、例えばＲ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００，ｐ．９６，Ａｃａｄｅｍｌｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）に記載の３’−ＯＨ末端にデオキシヌクレオチド（ｄＮＭＰ）を付加するＴｄＴａｓｅなどが挙げられる。ＤＮＡ修飾・分解酵素としては、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなどが挙げられ、例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＩ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＶＩＩ、λエキソヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ　Ｉ、ヌクレアーゼＳ１、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）ヌクレアーゼなどが挙げられる。ＤＮＡリガーゼとしては、例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどが挙げられる。
ＤＮＡ遺伝子をクローニングしてＤＮＡライブラリーを構築するのに適したベクターとしては、プラスミド、λファージ、コスミド、Ｐ１ファージ、Ｆ因子、ＹＡＣなどが挙げられ、好ましくはλファージ由来のベクターが挙げられ、例えばＣｈａｒｏｎ　４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ　２１Ａ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＤＡＳＨＩＩ、λＦＩＸＩＩ、λＥＭＢＬ３、λＺＡＰＩＩＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。
本発明のタンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、必要に応じて適当な選択マーカーを用い、繰り返しクローニングを行うことにより、高い発現能を安定して有する細胞株を得ることができる。例えば、宿主細胞として動物細胞を用いた形質転換体において、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして利用した場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを増幅させ、より高い発現を得られる細胞株を得ることができる。本発明の形質転換体は、本発明のタンパク質をコードする核酸が発現可能な条件下で培養し、目的物を生成、蓄積せしめることができる。該形質転換体は、当該分野で汎用されている培地中で培養することができる。例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母などを宿主としている形質転換体は、液体培地を好適に使用することができる。培地中には、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、麦芽エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては，例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、カザミノ酸、生長促進因子などを添加してもよい。また、必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル　アクリル酸のような薬剤を加えることができる。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
培養は、例えば大腸菌では通常約１５〜約４５℃で約３〜約７５時間行い、必要により、通気や攪拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜約２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＰＲＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地などが用いられる。ｐＨは約６〜約８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜約４０℃で約１５〜約７２時間行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。上記培養細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中には尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤や、トリトンＸ−１００（商品名）、ツウィーン−８０（商品名）などの界面活性剤を加えてあってもよい。培養液中に目的生成物が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる目的生成物は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせてその精製を行なうことができ、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ることができる。好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、リガンドなどを固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。例えば、ゼラチン−アガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
さらに、本発明に係わるＮ−Ｔｅｓの遺伝子塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いることにより、Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列中に適宜、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当するタンパク質を製造することができる。こうした変異・変換・修飾法としては、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０　＆　ｐ．３６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００，ｐ．４５７　＆　ｐ．４６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ａ．Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５，１９８５；Ｔ．Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３：３３０５，１９８５；Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３：８７６５，１９８５；Ｒ．Ｗｕ　ｅｄ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５５，ｐ．５６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ａ．Ｒ．Ｏｌｉｐｈａｎｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４４：１７７，１９８６などに記載の方法が挙げられる。例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）（Ｚｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１０：６４８７，１９８７；Ｃａｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３：４３３１，１９８６），カセット変異導入法（ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５，１９８５），制限部位選択変異導入法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ　Ｓｅｒ　Ａ，３１７：４１５，１９８６），アラニン・スキャンニング法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　＆　Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５，１９８９），ＰＣＲ変異導入法，ＰＣＲメガプライマー法，Ｋｕｎｋｅｌ法，ｄＮＴＰ［αＳ］法（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ），亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
さらに得られた本発明のタンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体などにすることができる。本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ１−５アルキル−カルボニル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。また遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然のＮ−Ｔｅｓと実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してアフィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可能である。こうした融合タンパク質としては、ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、あるいは、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ），グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）又はＣｒｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅのアミノ酸配列に融合せしめられたものなどが挙げられる。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニアスなエピトープのタグを付加され、該エピトープに特異的に結合する抗体を用いてのイムノアフィニティ・クロマトグラフィーによる精製をなし得るようにすることもできる。より適した実施態様においては、該エピトープタグとしては、例えばＡＵ５，ｃ−Ｍｙｃ，ＣｒｕｚＴａｇ　０９，ＣｒｕｚＴａｇ　２２，ＣｒｕｚＴａｇ　４１，Ｇｌｕ−Ｇｌｕ，ＨＡ，Ｈａ．１１，ＫＴ３，ＦＬＡＧ（ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ　ｔｒａｄｅｍａｒｋ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），Ｏｍｎｉ−ｐｒｏｂｅ，Ｓ−ｐｒｏｂｅ，Ｔ７，Ｌｅｘ　Ａ，Ｖ５，ＶＰ１６，ＧＡＬ４，ＶＳＶ−Ｇなどが挙げられる。（Ｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：ｐｐ．２１５９−２１６５（１９８８）；Ｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：ｐｐ．３６１０−３６１６（１９８５）；Ｐａｂｏｒｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：ｐｐ．５４７−５５３（１９９０）；Ｈｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：ｐｐ．１２０４−１２１０（１９８８）；Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：ｐｐ．１９２−１９４（１９９２）；Ｓｋｉｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：ｐｐ．１５１６３−１５１６６（１９９１）；Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：ｐｐ．６３９３−６３９７（１９９０））など。酵母を利用したｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法も利用できる。さらに融合タンパク質としては、検出可能なタンパク質となるようなマーカーを付��れたものであることもできる。より好適な実施態様においては、該検出可能なマーカーは、ビオチン／ストレプトアビジン系のＢｉｏｔｉｎ　Ａｖｉ　Ｔａｇ、螢光を発する物質などであってよい。該螢光を発する物質としては、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｅａ）などの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパク質（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）、それを改変した変異体（ＧＦＰバリアント）、例えば、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　ＧＦＰ），ｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ　ＧＦＰ），黄色螢光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＹＦＰ），緑色螢光タンパク質（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ），藍色螢光タンパク質（ｃｙａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＦＰ），青色螢光タンパク質（ｂｌｕｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ），ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ　ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＧＦＰなどが挙げられる（宮脇敦史編、実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座３−ＧＦＰとバイオイージング、羊土社（２０００年））。また、上記融合タグを特異的に認識する抗体（モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む）を使用して検出を行うこともできる。
本発明の好ましい態様において、精製を好適に実施するのに役立つマーカー配列、例えばヘキサ−ヒスチジンペプチドを融合したものなどが使用できる。こうした融合タンパク質の発現及び精製は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。タンパク質の構造の修飾・改変などは、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質ＶＩＩ、タンパク質工学」、東京化学同人（１９９３）を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。また下記するようにその生物学的活性のうちには、免疫的に活性、例えば抗原性を有するということも含まれてよい。該修飾・改変のうちには、脱アミノ化、ヒドロキシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化、開環、閉環、含有糖鎖の種類を違うものに変えること、含有糖鎖の数を増減すること、Ｄ−体アミノ酸残基への置換などであってもよい。それらの方法は、当該分野で知られている（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｐ．７９−８６　Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ（１９８３），等）。
かくして本発明のヒト由来のタンパク質は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明のヒト由来のタンパク質は、Ｎ−Ｔｅｓに特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。天然のＮ−Ｔｅｓの特徴であるドメイン構造あるいは活性中心構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含される。また本発明のＮ−Ｔｅｓは天然のＮ−Ｔｅｓと実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のＮ−Ｔｅｓと実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。本発明のヒト由来のタンパク質は、例えば、配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、第２２位〜第１２２位のアミノ酸配列を有するもの、同第２２位〜第３１３位のアミノ酸配列を有するもの、及び同第１位〜第３１３位のアミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれたアミノ酸配列に対し、６０％、場合によっては７０％より高い相同性を有しているものが挙げられ、より好ましくはそれに対し、８０％あるいは９０％以上の相同アミノ酸配列を有するものが挙げられ、特にはＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠くものが挙げられる。本発明のヒト由来のタンパク質の一部のものとは、該ヒト由来のタンパク質の一部のペプチド（すなわち、該タンパク質の部分ペプチド）であって、本発明のＮ−Ｔｅｓと実質的に同等な活性を有するものであればいずれのものであってもよい。例えば、該本発明のタンパク質の部分ペプチドは、本発明のＮ−Ｔｅｓの構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは２０個以上、さらに好ましくは５０個以上、より好ましくは７０個以上、もっと好ましくは１００個以上、ある場合には２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられ、好ましくはそれらは連続したアミノ酸残基に対応するものであるか、あるいは、例えば、配列表の配列番号：２で示されるアミノ酸配列のうち対応する領域に対する相同性に関して、上記と同様の相同性を有するものが挙げられる。
本明細書において、「実質的に同等」とは蛋白質の活性、例えば、阻害活性、生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、例えば、ＭＭＰｓのいずれか一つに対する阻害活性、ＭＭＰｓいずれか一つ用の合成基質に対する分解活性を抑制あるいは阻害する活性などを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、薬理学的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例えば、ＭＭＰｓのいずれか一つに対する阻害活性などの活性が、同等（例えば、約０．００１〜約１０００倍、好ましくは約０．０１〜約１００倍、より好ましくは約０．１〜約２０倍、さらに好ましくは約０．５〜約２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよい。次に、アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、しばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめないし、こうした場合、その置換、欠失、あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされるであろう。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられ、極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドの合成には、当該ペプチド合成分野で知られた方法、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。こうした方法では、例えばタンパク質あるいはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、それ自体公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくはそれ自体公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドは、それが遊離型のものとして得られた場合には、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で塩に変換することができ、またそれらは塩として得られた場合には、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で遊離型のものあるいは他の塩に変換することができる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドの塩としては、生理的に許容されるものあるいは医薬として許容されるものが好ましいが、これらに限定されない。こうした塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。さらに該塩としては、アンモニウム塩、例えばエチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ヒドロキシエチルアミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。
こうした本発明のＮ−Ｔｅｓ及びその変異体、修飾体、誘導体などは、上記で説明したような分離・精製処理を施すことができる。本発明では、「断片」、「誘導体」及び「類縁体」なる用語は、配列番号：２のポリペプチド、配列番号：１の配列から転写され且つスプライシングされていないか又は特異的にスプライシングされたｈｎＲＮＡ又はｍＲＮＡによりコードされるポリペプチド、又はジェノミックＤＮＡによりコードされるポリペプチドに関連して、その「断片」、「誘導体」又は「類縁体」と称した場合、このようなポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能又は活性を有しているポリペプチドを意味する。従って、類似体にはプロタンパク質部分が切断されて活性成熟ポリペプチドを産生するような、活性化できるプロタンパク質等が包含される。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドでよい。特定の好ましい態様では、これは組換えポリペプチドである。
一方では、こうして本発明は上記したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そして天然の特性の全部あるいは一部を有するＮ−Ｔｅｓのポリペプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコードするＤＮＡ配列も包含する。本発明のポリヌクレオチドは、アミノ末端に付加アミノ酸又はカルボキシル末端に付加アミノ酸を加えた成熟タンパク質、又は成熟タンパク質に内在するポリペプチド（例えば、成熟形態で一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）のアミノ酸をコードしているものであることができる。このような配列は、前駆体から成熟形態のタンパク質へのプロセッシングにおいても何らかの働きをなすものであってよく、例えば、タンパク質の移動や輸送を促進したり、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮したり、又はタンパク質を操作してその検出もしくは産生を容易にすることができるものであってよい。一般的には、例えば、付加アミノ酸は、細胞酵素によりプロセッシングされ、成熟タンパク質から取り除かれる。１又はそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態ポリペプチドを有する前駆タンパク質は、不活性形態ポリペプチドであることができる。プロ配列が除去されると、このような不活性前駆体は、通常活性化される。プロ配列のいくつか又は全ては、活性化の前に除去できる。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称される。本発明のポリペプチドは、成熟タンパク質、リーダー配列を付加してある成熟タンパク質（プレタンパク質と称することができる）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１又はそれ以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、又はリーダー配列及び１又はそれ以上のプロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタンパク質であってよい。また、該プロ配列は通常活性形態ポリペプチド及び成熟形態ポリペプチドを産み出すようなプロセッシングの段階で除去され得る。
本発明のＤＮＡ配列は、これまで知られていなかった哺乳動物のタンパク質のアミノ酸配列に関する情報を提供しているから、こうした情報を利用することも本発明に包含される。こうした利用としては、例えばＮ−Ｔｅｓ及び関連タンパク質をコードする哺乳動物、特に好ましくはヒトの、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの単離及び検知のためのプローブの設計などが挙げられる。
本発明のＤＮＡ配列は、例えばＮ−Ｔｅｓ及び関連タンパク質をコードする哺乳動物、特に好ましくはマウスやヒトの、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの単離及び検知のためのプローブとして有用である。プローブは、必要に応じて、抗体に関連して挙げられている標識を付与しておくことができる。遺伝子の単離にあたっては、ＰＣＲ法、さらには逆転写酵素（ＲＴ）を用いたＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用することが出来る。Ｎ−Ｔｅｓ　ｃＤＮＡ及びその関連ＤＮＡは、クローニングされ、配列決定されたＮ−Ｔｅｓ　ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ＤＮＡプライマーをデザインして化学合成し、得られたＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ、その他の方法を用いてＮ−Ｔｅｓ関連遺伝子の単離、検出などに利用することが出来る。例えば、Ｎ−Ｔｅｓ　ｍＲＮＡのヒト組織中での発現を各種の組織由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋　ＲＮＡに対するノーザンブロット分析により検討することができる。本発明のｃＤＮＡをプローブとして用いれば、例えばノーザン・ブロティング、サザン・ブロティング、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどによりヒト組織中でのＮ−Ｔｅｓ　ｍＲＮＡの発現やＮ−Ｔｅｓ遺伝子自体などを検出・測定でき、ヒト組織における細胞内タンパク質代謝、ホルモン前駆体の活性化、および骨の改変を含む、多くの正常な細胞のプロセスに関与するＭＭＰ阻害の役割、アルツハイマー病、肺気腫、リウマチ性関節炎、筋ジストロフィー、骨粗鬆症、神経変性疾患および癌の浸潤・転移の様な多くの疾患等の研究の発展に貢献できる。Ｎ−Ｔｅｓに関連した疾患の遺伝子診断にも利用できる。そうした診断は、当該Ｎ−Ｔｅｓ及び関連タンパク質をコードする核酸の異常、例えば損傷、突然変異、発現低下、発現過多などを診断するものであることができる。
本明細書中で開示したＮ−Ｔｅｓ及びそれに関連したタンパク質、そのフラグメント、さらにはＤＮＡを含めた核酸（ｍＲＮＡやオリゴヌクレオチドを含む）は、それらを単独あるいは有機的に使用し、更には以下で説明する技術（アンチセンス法、モノクローナル抗体を含めた抗体、トランスジェニク動物など）とも適宜組合わせて、ゲノミックス及びプロテオミックス技術に応用できる。例えば、Ｎ−Ｔｅｓ変異体は、ドミナントネガティブ効果を利用した機能解析にも利用可能である。また、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用してのＲＮＡｉ（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）技術への応用の途もある。かくして、一塩基多型（ＳＮＰ；ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を中心とした遺伝子多型解析、核酸アレイ、タンパク質アレイを使用した遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、タンパク質間相互作用解析、関連疾患解析、疾患治療薬解析をすることが可能となる。例えば、核酸アレイ技術では、ｃＤＮＡライブラリーを使用したり、ＰＣＲ技術で得たＤＮＡを基板上にスポッティング装置で高密度に配置して、ハイブリダイゼーションを利用して試料の解析が行われる。該アレイ化は、針あるいはピンを使用して、あるいはインクジェトプリンティング技術などでもって、スライドガラス、シリコン板、プラスチックプレートなどの基板のそれぞれ固有の位置にＤＮＡが付着せしめられることによりそれを実施することができる。該核酸アレイ上でのハイブリダイゼーションの結果得られるシグナルを観察してデータを取得する。該シグナルは、螢光色素などの標識（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５，ＢＯＤＩＰＹ，ＦＩＴＣ，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　ｄｙｅｓ（商品名），Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ（商品名）など）より得られるものであってよい。検知にはレーザースキャナーなどを利用することもでき、得られたデータは適当なアルゴリズムに従ったプログラムを備えたコンピューターシステムで処理されてよい。また、タンパク質アレイ技術では、タグを付された組換え発現タンパク質産物を利用してよく、二次元電気泳動（２−ＤＥ）、酵素消化フラグメントを含めての質量分析（ＭＳ）（これにはエレクトロスプレーイオン化法（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ），マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）などの技術が含まれ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析計、ＥＳＩ−３連四重極分析計、ＥＳＩ−イオントラップ分析計などを使用してよい）、染色技術、同位体標識及び解析、画像処理技術などが利用されることができる。したがって、本発明には上記で得られるあるいは利用できるＮ−Ｔｅｓに関連したソフトウエア、データベースなども含まれてよい。
本発明で得られたＤＮＡ（例えば、Ｎ−ＴｅｓをコードするＤＮＡ）を対象動物に転移させるにあたっては、それをＤＮＡ断片としてあるいは該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合して用いるのが一般に有利である。たとえば、マウスにＮ−Ｔｅｓ　ＤＮＡを導入する場合、これと相同性が高い動物由来のＮ−Ｔｅｓ　ＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、対象動物の受精卵、たとえばマウス受精卵へマイクロインジェクションすることによってＮ−Ｔｅｓを高産生する遺伝子導入（トランスジェニック）マウスを作出できる。マウスとしては、特に純系のマウスに限定されないが、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６，Ｂａｌｂ／Ｃ，Ｃ３Ｈ，（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１（ＢＤＦ１）などが挙げられる。このプロモーターとしては、例えばウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン等のユビキタスな発現プロモーターなどが好ましく使用しうる。また該Ｎ−Ｔｅｓ　ＤＮＡを導入する場合、組換えレトロウイルスに組み換えて、それを用いて行うこともできる。好適には対象ＤＮＡを導入されたマウス受精卵は、例えば、ＩＣＲのような仮親のマウスを使用して生育せしめることができる。
受精卵細胞段階における本発明で得られたＤＮＡ（例えば、Ｎ−ＴｅｓをコードするＤＮＡ）の転移は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞においてＮ−ＴｅｓをコードするＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに該Ｎ−ＴｅｓをコードするＤＮＡを有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てにおいて、該Ｎ−Ｔｅｓを発現できる可能性を有している。
該Ｎ−Ｔｅｓ　ＤＮＡ導入動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。該Ｎ−Ｔｅｓ　ＤＮＡが導入された動物は、該Ｎ−Ｔｅｓタンパク質が高発現させられているので、該Ｎ−Ｔｅｓタンパク質に対する阻害剤（インヒビター）のスクリーニング用の動物などとして有用である。またＮ−Ｔｅｓ遺伝子の発現を阻害することのできるアンチセンス　オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスＤＮＡなどのスクリーニング用の動物などとして有用である。
この遺伝子導入動物を、組織培養のための細胞源として使用することもできる。例えば、遺伝子導入マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するかあるいは遺伝子により発現されたタンパク質組織を分析することにより、ＭＴ１−ＭＭＰやＭＴ３−ＭＭＰ活性阻害に関連したタンパク質について分析することができる。該Ｎ−Ｔｅｓを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、たとえば脳、胸腺、精巣、脳、腸、腎臓やその他の組織由来の細胞についてその機能を研究することができる。また、その細胞を用いることにより、たとえば各種組織の機能を高めるような医薬開発に資することも可能である。また、高発現細胞株があれば、そこから、Ｎ−Ｔｅｓを単離精製することも可能である。トランスジェニック　マウスなどに関連した技術は、例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４４３８，１９８５；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．＆　Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（ｅｄｓ）：Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５などの文献に記載の方法あるいはそこに引用された文献に記載の方法、さらにはそれらの改変法により行うことができる。
本発明で得られた遺伝子（例えば、Ｎ−Ｔｅｓに相当するマウスＮ−ＴｅｓをコードするＤＮＡ）に変異をもち、マウスＮ−Ｔｅｓを全く発現しない変異マウス（ノックアウトマウス）を作出することができる。たとえば、該遺伝子の翻訳開始コドンの前後４ｋｂを含むおよそ８ｋｂのゲノムＤＮＡの中央近傍に位置し翻訳開始コドンに近いエクソンにｎｅｏ耐性遺伝子−ｐｏｌｙＡ付加シグナルからなる遺伝子カセットを挿入した変異遺伝子を持つターゲティングベクターを構築することができる。挿入する遺伝子カセットはｎｅｏ耐性遺伝子カセット以外にＤＴ−Ａカセット、ｔｋカセット、ｌａｃＺカセットなどが挙げられる。ターゲティングベクターを直鎖状に開き、樹立したマウス胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）にエレクトロポレーションで導入、さらに培養してｎｅｏ耐性を獲得したＥＳ細胞を選別する。ＥＳ細胞は１２９、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６×ＣＢＡ）マウスなどのマウス系統から選択して調製することができる。ｎｅｏ耐性を獲得したＥＳ細胞は、マウスＮ−Ｔｅｓ遺伝子領域において遺伝子カセットを挿入したターゲティングベクターと相同組換えを起こしていると想定され、少なくともマウスＮ−Ｔｅｓ遺伝子アレルのうち一つは破壊され、マウスＮ−Ｔｅｓを正常に発現できなくなる。選別には挿入した遺伝子カセットによりそれぞれ適当な方法が選択され、また、変異の導入はＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーションあるいはノーザンハイブリダイゼーションなどの方法を用いて確認することができる。
変異を導入したＥＳ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、ＩＣＲマウスなどから取り出した８細胞期胚に注入、１日培養し胚盤胞に発生したものをＩＣＲのような仮親に移植することで個体まで生育させることができる。生まれる子マウスは変異をもつＥＳ細胞と正常な宿主胚に由来するキメラマウスで、ＥＳ細胞に由来する細胞がどの程度含まれるかは個体の毛色で判断する。従って、ＥＳ細胞と宿主胚は毛色の異なった系統の組合わせが望ましい。得られたキメラマウスの変異はヘテロであり、これらを適宜交配することでホモ変異マウスを得ることができる。このようにして得られたホモ変異マウスは生殖細胞および体細胞の全てにおいて、マウスＮ−Ｔｅｓ遺伝子のみが破壊され、マウスＮ−Ｔｅｓを全く発現せず、繁殖継代される子孫もまた同様の表現系をもつ。
このノックアウトマウスは正常マウスとの比較において、発生、成長、生殖、老化および死など個体のライフサイクルにおけるＮ−Ｔｅｓの役割や各臓器、組織におけるＮ−Ｔｅｓの機能を解析するのに有用である。また、ＭＭＰ阻害に関連した医薬品開発にも応用できる。ノックアウトマウスはこれらモデル動物としてだけではなく、組織培養のための細胞源として使用することもでき、細胞レベルでのＮ−Ｔｅｓの機能解析などに供することができる。ノックアウトマウス等に関連した技術は、例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，；Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２，１９８８；Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．，ｅｄ．；Ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，１９９３；相沢慎一，ジーンターゲティングＥＳ細胞を用いた変異マウスの作成，羊土社，１９９５などの文献に記載の方法あるいはそこに引用された文献に記載の方法、さらにはそれらの改変法により行うことができる。
本発明に従えば、Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子の発現を阻害することのできるアンチセンス・オリゴヌクレオチド（核酸）を、クローン化したあるいは決定されたＮ−ＴｅｓをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたオリゴヌクレオチド（核酸）は、Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ｍＲＮＡの機能を阻害することができるか、あるいはＮ−Ｔｅｓ関連ｍＲＮＡとの相互作用などを介してＮ−Ｔｅｓ遺伝子の発現を調節・制御することができる。Ｎ−Ｔｅｓ関連遺伝子の選択された配列に相補的なオリゴヌクレオチド、及びＮ−Ｔｅｓ関連遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドは、生体内及び生体外でＮ−Ｔｅｓ遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、またそれに関連した病気などの治療又は診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列又は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列又は核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。当該遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、及び３’端ヘアピンループは、好ましい対象領域として選択しうるが、当該遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとの関係を意味し、それは、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ，１本鎖ＤＮＡ，２本鎖ＲＮＡ，１本鎖ＲＮＡ，さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴヌクレオチド、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」とは、公知のプリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもっようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ　Ｔｅｃｈ　Ｊａｐａｎ，８：２４７，１９９２；８：３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，１９９３などに開示がある。本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうした付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピッド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＮ−Ｔｅｓの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸はそれ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以上述べた、本発明者らの研究成果によりＮ−Ｔｅｓの遺伝子及び組換えＤＮＡ分子を宿主に移入し、Ｎ−Ｔｅｓを発現させ、目的とするＮ−Ｔｅｓを得る方法が提供される。こうして本発明によれば、Ｎ−Ｔｅｓの遺伝子を実質的に発現する組換え体あるいはトランスフェクタント及びその製造法、さらにはその用途も提供される。
別の面では、本発明はＴｅｓｔｉｃａｎファミリーに属するＭＭＰ阻害活性を有し且つＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅを欠いている及び／又はＴＹ　ｄｏｍａｉｎやＣＷＣＶ　ｄｏｍａｉｎを欠いているポリペプチドの一種であり且つ　天然のヒトＮ−Ｔｅｓと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタンパク質またはその塩、より好ましくはＮ−Ｔｅｓまたはその塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一次構造コンフォメーションを持つ該タンパク質の少なくとも一部あるいは全部を有するポリペプチドを、大腸菌などの原核生物あるいは哺乳動物細胞などの真核生物で発現させることを可能にするＤＮＡやＲＮＡなどの核酸に関するとすることができる。またこうした核酸、特にはＤＮＡは、（ａ）配列表の配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードできる配列あるいはそれと相補的な配列、（ｂ）該（ａ）のＤＮＡ配列またはその断片とハイブリダイズすることのできる配列、及び（ｃ）該（ａ）又は（ｂ）の配列にハイブリダイズすることのできる縮重コードを持った配列であることができる。ここでハイブリダイズの条件としては、ストリンジェントな条件であることができる。こうした核酸で形質転換され、本発明の該ポリペプチドを発現できる大腸菌などの原核生物あるいは哺乳動物細胞などの真核生物も本発明の特徴をなす。
こうして典型的には本発明の目的は、Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子、それから誘導されたプローブを用い、あるいはさらに必要に応じ、Ｎ−Ｔｅｓに対する阻害物質を用い、被検試料中のＮ−Ｔｅｓあるいはその遺伝子、さらには産生細胞を検知・分別定量する優れた方法及びその為の試薬キットを提供することにある。本発明はこうしたＮ−Ｔｅｓあるいはその遺伝子、さらには産生細胞を検知・分別定量することのできる試薬キットのうちの各試薬をすべてその実施態様のうちに含むと理解される。さらに本発明の目的は、上記方法を用いてＮ−Ｔｅｓあるいはその遺伝子、さらには産生細胞を検知・分別定量することにより、細胞内タンパク質代謝、ホルモン前駆体の活性化、および骨の改変など、多くの正常な細胞のプロセスに関与するＭＭＰｓの役割、アルツハイマー病、肺気腫、リウマチ性関節炎、筋ジストロフィー、骨粗鬆症、神経変性疾患および癌の浸潤・転移の様な多くの疾患などをモニターし得る方法並びに試薬あるいは診断剤を提供することにある。したがって、医学的・生理学的分野における上記試薬の各種利用、腫瘍・癌といったヒトなどの動物の細胞・組織の研究・解析・測定などの目的で上記試薬を使用することはすべて本発明のその実施態様のうちに含まれると理解される。
本発明のＮ−Ｔｅｓあるいはその塩は、ＭＭＰｓ阻害活性を有し、例えば生体内でタンパク質代謝、抗原提示、骨の改変、ホルモン前駆体の活性化などにおいて不可欠な因子であると考えられる。そして、該タンパク質はＮ−Ｔｅｓ無形成症、Ｎ−Ｔｅｓ発現不全症、Ｎ−Ｔｅｓ遺伝子欠損症など病状を呈するＮ−Ｔｅｓ関連機能不全疾患の治療に有用であると考えられる。すなわち、Ｎ−Ｔｅｓ、変異体、修飾体、誘導体を含有する医薬を用いれば、Ｎ−Ｔｅｓによる活性が不充分であることに起因する疾患患者を健常な状態にすることが可能である。本発明のポリペプチドは、プロテアーゼ阻害剤の一つであり、該タンパク質の発現量やプロテアーゼ阻害活性が減少している場合に生ずる種々の疾患の治療及び／又は予防剤などの医薬として有用である。また本発明のポリペプチドは、組織やタンパク質に対するＭＭＰ分解活性が亢進している場合に生ずる種々の疾患の治療及び／又は予防剤などの医薬として有用である。例えば、生体内においてＮ−Ｔｅｓが減少あるいは欠損しているために、細胞における当該生物学的活性が十分に得られていないか、あるいは正常でない症状の患者の場合には、（Ａ）本発明のタンパク質等を該患者に投与することによるか、（Ｂ）本発明のＤＮＡなどの核酸を該患者に投与して、生体内で本発明のタンパク質等を発現させることによるか、（Ｃ）本発明のＤＮＡなどの核酸を発現可能に導入した細胞を該患者に移植することによって、生体内に本発明のタンパク質等を補充する等して、該患者における当該症状を改善したりする。
本発明のＮ−Ｔｅｓの生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ阻害活性など）を促進する化合物（アゴニスト、あるいは促進剤）又はその塩は、Ｎ−Ｔｅｓ機能不全症状、肺気腫、筋ジストロフィー、骨粗鬆症、アルツハイマー病、神経変性疾患、リウマチ性関節炎および癌の浸潤・転移などの各種の疾病の治療及び／又は予防剤として有用な医薬として使用できる。一方、本発明のＮ−Ｔｅｓの生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ阻害活性など）を阻害する化合物（アンタゴニスト、あるいは阻害剤）又はその塩は、過Ｎ−Ｔｅｓ機能症、肺気腫、筋ジストロフィー、骨粗鬆症、アルツハイマー病、神経変性疾患、リウマチ性関節炎および癌の浸潤・転移などの各種の疾病の治療及び／又は予防剤などの医薬として使用できる。例えばＮ−Ｔｅｓは、ＭＴ１−ＭＭＰやＭＴ３−ＭＭＰなどのＭＭＰｓの活性発現に関与し、それらに対して阻害活性を有する。したがって、該Ｎ−Ｔｅｓは、ＭＴ１−ＭＭＰやＭＴ３−ＭＭＰなどのＭＭＰｓによる過剰分解に起因する疾患の治療用医薬として有用である。
かくして、本発明のＮ−Ｔｅｓなどのポリペプチド等は、本発明のＮ−Ｔｅｓなどのポリペプチド等の、生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ阻害活性など）を促進する化合物（アゴニスト）や阻害する化合物（アンタゴニスト）又はそれらの塩をスクリーニングするための試薬として有用である。かくして、本発明のＮ−Ｔｅｓなどのポリペプチド、その一部のペプチド又はそれらの塩を用いた、本発明のＮ−Ｔｅｓといったタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩などの生物学的活性などの機能（例えば、プロテアーゼ阻害活性など）を促進する化合物（アゴニスト）や阻害する化合物（アンタゴニスト）又はそれらの塩のスクリーニング方法も提供される。
該スクリーニングでは、例えば（ｉ）本発明のタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩（該タンパク質を発現する形質転換体を含んでいもよい、以下同様）などに基質を接触させた場合と、（ｉｉ）本発明のタンパク質、その一部のペプチド又はそれらの塩などに基質及び試験試料を接触させた場合との比較を行う。具体的には、上記スクリーニングでは、当該生物学的活性（例えば、プロテアーゼ活性など）を測定して、比較する。
基質としては、ＭＭＰｓ等の基質となることのできるものであれば何れのものであってよい。例えば、カゼイン、コラーゲン、合成オリゴペプチド類などのプロテアーゼ活性を測定する目的で使用されるもの中から選んで用いることができるが、好ましくはＭＭＰｓ用の蛍光標識合成ペプチド基質などを使用できる。基質は、そのまま使用できるが、好ましくはフルオレッセインなどの蛍光、酵素や放射性物質で標識したものを使用できる。
試験試料としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、植物抽出物、動物などの組織抽出物、細胞抽出物などが挙げられる。試験試料に使用される試験化合物の例には、好ましくはＭＭＰ阻害剤、ＭＭＰファミリーに対するインヒビター活性を有する化合物、特には合成化合物を含んでいてよい。これら化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。該スクリーニングは、通常のプロテアーゼ活性の測定法に準じて実施することができ、例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，ｐｐ．４３３０−４３３７（１９９３）に示されている方法などを参考にして行うことができる。また、各種標識、緩衝液系その他適当な試薬等を使用したり、そこで説明した操作等に準じて行うことができる。スクリーニングにあたっては、ＭＭＰｓ等をアミノフェニル酢酸水銀などの活性化剤で処理したり、その前駆体あるいは潜在型のものを活性型のものに予め変換しておくこともできる。測定は通常トリス塩酸緩衝液、リン酸塩緩衝液などの反応に悪影響を与えないような緩衝液等の中で、例えば、ｐＨ約４〜約１０（好ましくは、ｐＨ約６〜約８）において行うことができる。
これら個々のスクリーニングにあたっては、それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明のＮ−Ｔｅｓあるいはそれと実質的に同等な活性を有するポリペプチドあるいはペプチドに関連した測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，２，５　＆　６（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）；同書，Ｖｏｌ．３（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）；同書，Ｖｏｌ．４（Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｓｔ）；同書，Ｖｏｌ．１９（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）；同書，Ｖｏｌ．４５（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｂ）；同書，Ｖｏｌ．８０（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｃ）（以上、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社（ＵＳＡ）発行）など参照〕。
本発明のスクリーニング方法又はスクリーニングキットを用いて得られる化合物又はその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の機能を促進あるいは阻害する化合物である。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容される塩などが挙げられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本明細書中、「抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のＮ−Ｔｅｓポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’及びＦａｂといったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原又はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、クワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ），トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、ＤＮＡ組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含していてよい。本明細書中「抗体」との用語は、所望のＮ−Ｔｅｓポリペプチド及び関連ペプチド断片に対する抗体と同様、抗ＭＭＰ抗体についても同様な意味で解釈される。
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（エピトープ）に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来やイムノグロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり（例えば、ヒト化抗体）、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７など）。
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，ｐｐ．４９５−４９７（１９７５））；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ，４，ｐｐ．７２−７９（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，ｐｐ．３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）；トリオーマ法；ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５））（ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法）；米国特許第４９４６７７８号（単鎖抗体の産生のための技術）が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙げられる：Ｓ．Ｂｉｏｃｃａ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ，９，ｐｐ．１０１−１０８（１９９０）；Ｒ．Ｅ．Ｂｉｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，ｐｐ．４２３−４２６（１９８８）；Ｍ．Ａ．Ｂｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，ｐｐ．３７９１−３８０６（１９８４）；Ｊ．Ｂｕｋｏｖｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，ｐｐ．２１９−２２８（１９８７）；Ｍ．ＤＡＩＮＯ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，ｐｐ．２２３−２２９（１９８７）；Ｊ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，ｐｐ．５８７９−５８８３（１９８８）；Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｓ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４）；Ｖ．Ｔ．Ｏｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，ｐｐ．２１４−２２１（１９８６）；Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．８２３−３２７（１９８８）；Ａ．Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，ｐｐ．６７３６−６７４０（１９８６）；Ｃ．Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，ｐｐ．４４６−４４９（１９８５）；Ｎａｔｕｒｅ，３１４，ｐｐ．４５２−４５４（１９８５）あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
本発明に係るモノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモローガスである、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に包含する（米国特許第４８１６５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．６８５１−６８５５（１９８４））。
以下、モノクローナル抗体を例に挙げて、抗体の作製につき詳しく説明する。
本発明のモノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，ｐｐ．４９５−４９７（１９７５）など）を利用して得られたモノクローナル抗体であってよく、例えば次のような工程で作製できる。
１．免疫原性抗原の調製
２．免疫原性抗原による動物の免疫
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
６．モノクローナル抗体の製造
１．免疫原性抗原の調製
抗原としては、上記で記載してあるように、Ｎ−Ｔｅｓポリペプチド又はそれから誘導された断片を単離したものを用いることもできるが、決定されたＮ−Ｔｅｓのアミノ酸配列情報を基に、適当なオリゴペプチドを化学合成しそれを抗原として利用することができる。代表的には配列表の配列番号：２の
（１）少なくとも第３１１位〜第３１３位のアミノ酸配列；
（２）第２２位〜第１２２位のアミノ酸配列；
（３）第２２位〜第３１３位のアミノ酸配列；及び
（４）第１位〜第３１３位のアミノ酸配列
から成る群から選ばれた領域に存在するアミノ酸残基のうちの連続した少なくとも５個のアミノ酸を有するペプチドが挙げられる。
抗原は、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できるが、免疫原性コンジュゲートなどにしてもよい。例えば、免疫原として用いる抗原は、Ｎ−Ｔｅｓを断片化したもの、あるいはそのアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成して得られた合成ポリペプチド断片であってもよい。また、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみと反応できる（あるいは特定の配列のみを認識できる）モノクローナル抗体をデザインするのに用いることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにしておくことができる。担体タンパク質類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず活性化されることができる。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入することが挙げられる。
活性化結合基としては、（１）活性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシンイミドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば２−ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク質類としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。
２．免疫原性抗原による動物の免疫
免疫は、当業者に知られた方法により行うことができ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体・補体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じて行うことができる。免疫化剤を（必要に応じアジバントと共に）一回又はそれ以上の回数哺乳動物などに注射することにより免疫化される。代表的には、該免疫化剤及び／又はアジバントを哺乳動物に複数回皮下注射あるいは腹腔内注射することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原ペプチドあるいはその関連ペプチド断片を含むものが挙げられる。免疫化剤は、免疫処理される哺乳動物において免疫原性であることの知られているタンパク質（例えば上記担体タンパク質類など）とコンジュゲートを形成せしめて使用してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどのマウス、ハムスター、その他の適当な動物を使用して行われる。抗原の投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウスとのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫の程度を確認できる。本発明の抗体は、こうして得られ免疫された動物から得られたものであってよく、例えば、抗血清、ポリクローナル抗体等を包含する。
３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製
細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）としては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶことができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ−２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２，Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９〜２７０，１９７８）、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Ｃｕｒｒ．ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１−７，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Ｎａｔｕｒｅ，２５６；４９５−４９７，１９７５）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３（６５３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８−１５５０，１９７９）などを用いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例えばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例えば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよい。
４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それから脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該分野で知られたものを用いることができ、この様なものとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　Ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ）なども挙げられる。好ましくは、例えば３０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００のポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコールがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるようにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもできる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが挙げられるが、より好ましくは４：１〜７：１とすることができる。
融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培地に移す。
５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化
選択用培地としては、例えばヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）及びチミジン（Ｔ）を含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレートに分注した容量と等容量を翌日加え、その後１〜３日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというように処理することができるが、適宜これに変更を加えて行うこともできる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリンを除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をすることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺細胞を使用することもでき、それが好ましい場合がある。
ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）などで、所定の断片ペプチドを抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりする。
目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされうる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。クローニングは複数回行うことが好ましい。
６．モノクローナル抗体の製造
得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいは例えばヌード・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収して得ることが出来る。動物はハイブリドーマの移植に先立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与しておくことができ、その処理後、ハイブリドーマを増殖させ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製してモノクローナル抗体として用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ・カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など）を固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーなどが挙げられる。
また、トランスジェニックマウス又はその他の生物、例えば、その他の哺乳動物は、本発明の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化抗体等の抗体を発現するのに用いることができる。
またこうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。当該モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの慣用の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたＤＮＡは、上記したようにして発現ベクターに入れ、ＣＨＯ，ＣＯＳなどの宿主細胞に入れることができる。該ＤＮＡは、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ヒトの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６５８１，１９８４）。かくして所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。また、抗体は、下記するような縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。
ヒト化抗体は、当該分野で知られた技術により行うことが可能である（例えば、Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：ｐｐ．５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：ｐｐ．３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：ｐｐ．１５３４−１５３６（１９８８））。ヒトモノクローナル抗体も、当該分野で知られた技術により行うことが可能で、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒトミエローマ細胞やヒト・マウスヘテロミエローマ細胞は当該分野で知られている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，ｐｐ．３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｕｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７））。バイスペシフィックな抗体を製造する方法も当該分野で知られている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：ｐｐ．５３７−５３９（１９８３）；ＷＯ９３／０８８２９；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１０：ｐｐ．３６５５−３６５９（１９９１）；Ｓｕｒｅｓｈ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１，ｐｐ．２１０（１９８６））。
さらにこれら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２といった抗体フラグメントにして使用してもよい。
抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、及び免疫沈降検定に使用することができる（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、当分野で知られる任意の方法を使用することができ、例えば、Ｄａｖｉｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３巻，１０１４−１０２１頁（１９７４）；Ｐａｉｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：ｐｐ．２１９−２３１（１９８１）；及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４，ｐｐ．１３８−１６３（１９９０）により記載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆａｂ’を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがある。
本発明での検知・測定は、イムノ染色、例えば組織あるいは細胞染色、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ，ＦＩＡなどを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくは放射免疫測定法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法であり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明のＮ−Ｔｅｓ及びその関連ペプチド断片に対する抗体とし、他方をＮ−ＴｅｓのＣ末端側残基に対する抗体とし、そして一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、ここで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわちＮ−Ｔｅｓポリペプチド断片抗原の量と比例する。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変えることができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行うことが出来る。
抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々知られており、本発明においても勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例えば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたもの、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。
さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられる。
これら担体へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明で得られる抗原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。
標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。
代表的な放射性物質の標識用同位体元素としては、［３２Ｐ］，［１２５Ｉ］，［１３１Ｉ］，［３Ｈ］，［１４Ｃ］，［３５Ｓ］などが挙げられる。
代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエート・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼなどのアルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
アルカリホスファターゼを用いた場合、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウンベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その酸素を電極などで検知することもできる。電極としてはガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分子膜電極などであることもできる。
酵素標識は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。標識及び検知可能な信号を得るには、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
本発明においては、信号の形成に４−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニルガラクトシドなどとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働きで形成しうるものが使用できる。
蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。
標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。また上記免疫原性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用されることのできる縮合剤などを用いることができる。
縮合剤としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることができるし、同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用することができる。
測定にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ約４〜約９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０℃〜約６０℃の間の温度で行うことが好ましい。
酵素などで標識されたモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。
抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。キレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（ＢＤＴＡ）がより好ましい。
当該分野で普通に採用されていたりあるいは当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定されず用いることが出来る。
本発明の測定方法で測定される試料としては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、例えば胸腺、睾丸、腸、腎臓、脳、乳癌、卵巣癌、結腸・直腸癌、血液、血清、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析・定量法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の当該対象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測定系を構築すればよい。
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江　寛編，「ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和４９年発行；入江　寛編，「続ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和５４年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」，医学書院，昭和５３年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第２版），医学書院，昭和５７年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第３版），医学書院，昭和６２年発行；Ｈ．Ｖ．Ｖｕｎａｋｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ａ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｂ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ，），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１７８（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｍｉｃｒｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｔ　Ｂ：Ａｎｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ａｎｄ　Ｄｒｕｇｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９１）などあるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）〕。
本発明の抗Ｎ−Ｔｅｓ抗体、特にモノクローナル抗体を用いて、エピトープマッピングを行うこともでき、各エピトープを認識する抗体を用いればＮ−Ｔｅｓ及びその関連ペプチド断片などの検知・測定を行うことができる。
Ｎ−Ｔｅｓ及びその関連ペプチド断片に対する抗体は、Ｎ−ＴｅｓによるＭＴ−ＭＭＰ類の活性阻害などの現象の検出及び／又は測定、さらにはＭＭＰｓ活性の過剰により生ずる各種の生理活性物質の検出及び／又は測定に有用である。該抗体、特にモノクローナル抗体は、（ｉ）ＭＭＰｓによる組織あるいはタンパク質の分解が関連する障害、異常及び／又は疾患を検出したり、（ｉｉ）ＭＭＰｓによる組織あるいはタンパク質の分解が引き起こす細胞の腫瘍化、細胞の移動、浸潤、遊走及び／又は転移あるいはその可能性を検出したり、及び／又は（ｉｉｉ）細胞の腫瘍化、腫瘍細胞、血液系細胞などの細胞の移動、浸潤、遊走及び／又は転移あるいはその可能性を検出するのに有用である。癌の移動性、浸潤性、走化性及び／又は転移性の程度を知るのに使用できると期待される。
本発明にしたがえば、Ｎ−ＴｅｓによるＭＴ−ＭＭＰ類の活性阻害を検出及び／又は測定し、抗癌剤、癌転移阻害剤、血管新生阻害剤、アルツハイマー治療剤、関節破壊治療剤、消炎剤及び／又は免疫抑制剤の効果判定モニターとして使用することが可能となる。
また、本発明では、ＭＴ１−ＭＭＰ及び／又はＭＴ３−ＭＭＰによる組織あるいはタンパク質の分解現象の検出及び／又は測定方法やそのための試薬が提供できる。
本発明で使用する抗体（モノクローナル抗体を含む）としては、公知のものあるいは公知の各種の該抗体の製造法を適用して得られるものを含む他、上記で説明した抗体の調製法に準じて得られるものも包含される。
本発明の活性成分〔例えば、（ａ）Ｎ−Ｔｅｓポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩、それに関連するペプチド等、（ｂ）該Ｎ−ＴｅｓあるいはＮ−ＴｅｓポリペプチドをコードするＤＮＡなどの核酸等、（ｃ）本発明の抗体、その一部断片（モノクローナル抗体を包含する）またはその誘導体、（ｄ）Ｎ−ＴｅｓによるＭＴ−ＭＭＰ類の活性阻害などの現象あるいは組織あるいはタンパク質の分解現象といった生物学的活性を抑制及び／又は阻害する化合物またはその塩、（ｅ）本発明のＤＮＡなどの核酸に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドなど〕を医薬として用いる場合、例えばＭＭＰ阻害剤またはそれらの塩等は、通常単独或いは薬理的に許容される各種製剤補助剤と混合して、医薬組成物又は医薬調製物などとして投与することができる。好ましくは、経口投与、局所投与、または非経口投与等の使用に適した製剤調製物の形態で投与され、目的に応じていずれの投与形態（吸入法、あるいは直腸投与も包含される）によってもよい。
また、本発明の活性成分は、抗腫瘍剤（抗癌剤）、腫瘍移転阻害剤、血管新生阻害剤、アルツハイマー治療剤、関節破壊治療剤、消炎剤及び／又は免疫抑制剤と配合して使用することもできる。抗腫瘍剤（抗癌剤）、腫瘍移転阻害剤、血管新生阻害剤、アルツハイマー治療剤、関節破壊治療剤、消炎剤や免疫抑制剤としては、有利な働きを持つものであれば制限なく使用でき、例えば当該分野で知られたものの中から選択することができる。
そして、非経口的な投与形態としては、局所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内投与を包含し得るが、患部への直接投与も可能であり、またある場合には好適でもある。好ましくはヒトを含む哺乳動物に経口的に、あるいは非経口的（例、細胞内、組織内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内、点滴法、注腸、経直腸、点耳、点眼や点鼻、歯、皮膚や粘膜への塗布など）に投与することができる。具体的な製剤調製物の形態としては、溶液製剤、分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、成型製剤、浸出製剤などが挙げられ、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣を施した剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョン剤、灌注剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤、クリーム剤、油剤、坐剤（例えば、直腸坐剤）、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、塗布剤、輸液剤、注射用液剤などのための粉末剤、凍結乾燥製剤、ゲル調製品等が挙げられる。
医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。例えば、適宜必要に応じて、生理学的に認められる担体、医薬として許容される担体、アジュバント剤、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香料、甘味剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩和剤、帯電防止剤、無痛化剤などを単独もしくは組合わせて用い、それとともに本発明のタンパク質等を混和することによって、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態にして製造することができる。
非経口的使用に適した製剤としては、活性成分と、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る媒体との無菌性溶液、または懸濁液剤など、例えば注射剤等が挙げられる。一般的には、水、食塩水、デキストロース水溶液、その他関連した糖の溶液、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類が好ましい注射剤用液体担体として挙げられる。注射剤を調製する際は、蒸留水、リンゲル液、生理食塩液のような担体、適当な分散化剤または湿化剤及び懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方法で、溶液、懸濁液、エマルジョンのごとき注射しうる形に調製する。
注射用の水性液としては、例えば生理食塩液、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液などが挙げられ、薬理的に許容される適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノールなど）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０ＴＭ，ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）又は浸透圧調節のための試薬、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、アスコルビン酸などの酸化防止剤、吸収促進剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
非経口投与には、界面活性剤及びその他の薬学的に許容される助剤を加えるか、あるいは加えずに、水、エタノール又は油のような無菌の薬学的に許容される液体中の溶液あるいは懸濁液の形態に製剤化される。製剤に使用される油性ベヒクルあるいは溶剤としては、天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジあるいはトリグリセリド類、天然、半合成あるいは合成の油脂類あるいは脂肪酸類が挙げられ、例えばピーナッツ油、トウモロコシ油、大豆油、ゴマ油などの植物油が挙げられる。例えば、この注射剤は、通常本発明化合物を０．１〜１０重量％程度含有するように調製されることができる。
局所的、例えば口腔、又は直腸的使用に適した製剤としては、例えば洗口剤、歯磨き剤、口腔噴霧剤、吸入剤、軟膏剤、歯科充填剤、歯科コーティング剤、歯科ペースト剤、坐剤等が挙げられる。洗口剤、その他歯科用剤としては、薬理的に許容される担体を用いて慣用の方法により調製される。口腔噴霧剤、吸入剤としては、本発明化合物自体又は薬理的に許容される不活性担体とともにエアゾール又はネブライザー用の溶液に溶解させるかあるいは、吸入用微粉末として歯などへ投与できる。軟膏剤は、通常使用される基剤、例えば、軟膏基剤（白色ワセリン、パラフィン、オリーブ油、マクロゴール４００、マクロゴール軟膏など）等を添加し、慣用の方法により調製される。
歯、皮膚への局所塗布用の薬品は、適切に殺菌した水または非水賦形剤の溶液または懸濁液に調剤することができる。添加剤としては、例えば亜硫酸水素ナトリウムまたはエデト酸二ナトリウムのような緩衝剤；酢酸または硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウムまたはクロロヘキシジンのような殺菌および抗真菌剤を含む防腐剤およびヒプロメルローズのような濃厚剤が挙げられる。
坐剤は、当該分野において周知の担体、好ましくは非刺激性の適当な補形剤、例えばポリエチレングリコール類、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等の、好ましくは常温では固体であるが腸管の温度では液体で直腸内で融解し薬物を放出するものなどを使用して、慣用の方法により調製されるが、通常本発明化合物を０．１〜９５重量％程度含有するように調製される。使用する賦形剤および濃度によって薬品は、賦形剤に懸濁させるかまたは溶解させることができる。局部麻酔剤、防腐剤および緩衝剤のような補助薬は、賦形剤に溶解可能である。
経口的使用に適した製剤としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、トローチのような固形組成物や、液剤、シロップ剤、懸濁剤のような液状組成物等が挙げられる。製剤調製する際は、当該分野で知られた製剤補助剤などを用いる。錠剤及び丸剤はさらにエンテリックコーティングされて製造されることもできる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
さらに、本発明のＤＮＡなどの核酸を上記したような治療及び／又は予防剤として用いる場合、該核酸はそれを単独で用いることもできるし、あるいは上記したような遺伝子組換え技術で使用される適当なベクター、例えばレトロウイルス由来ベクターなどウイルス由来のベクターなどに結合させるなどして用いることができる。本発明のＤＮＡなどの核酸は通常の知られた方法で投与でき、そのままで、あるいは、例えば細胞内への摂取が促進されるように、適当な補助剤あるいは生理的に許容される担体などと共に、製剤化されて用いることができ、上記したような、医薬組成物又は医薬調製物などとして投与することができる。また遺伝子治療として知られた方法を適用することもできる。
本発明の活性成分は、その投与量を広範囲にわたって選択して投与できるが、その投与量及び投与回数などは、処置患者の性別、年齢、体重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
医薬品製造にあたっては、その添加剤等や調製法などは、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十四改正　日本薬局方解説書、平成１３年６月２７日発行、株式会社廣川書店；一番ヶ瀬　尚　他編　医薬品の開発１２巻（製剤素剤〔Ｉ〕）、平成２年１０月１５日発行、株式会社廣川書店；同、医薬品の開発１２巻（製剤素材〔ＩＩ〕）平成２年１０月２８日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して適用することができる。
本発明の活性成分は、ＭＭＰｓ、特にはＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰの活性阻害あるいはＭＭＰｓの活性化阻害といった生物学的活性を抑制及び／又は阻害する作用をもつものであれば特に限定されないが、好ましくは有利な作用を持つものが挙げられる。本発明の活性成分は、例えば、（ａ）Ｎ−Ｔｅｓ、その変異体ポリペプチド、その一部のペプチドまたはそれらの塩等、（ｂ）該Ｎ−ＴｅｓをコードするＤＮＡ、Ｎ−Ｔｅｓ変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡなどの核酸等、（ｃ）本発明の抗体、その一部断片（モノクローナル抗体を包含する）またはその誘導体、（ｄ）Ｎ−ＴｅｓによるＭＴ−ＭＭＰ類の活性阻害といった生物学的活性を抑制及び／又は阻害する化合物またはその塩などが包含される。本発明の活性成分には、抗ＭＭＰ抗体、例えばモノクローナル抗ＭＭＰ抗体も包含される。
本発明の活性成分は、ＭＭＰｓによる各種組織あるいはタンパク質のプロセッシング、例えば少なくともＭＴ１−ＭＭＰあるいはＭＴ３−ＭＭＰによるタンパク質のプロセッシングを抑制あるいは阻害するのに有用と期待される。また、該活性成分は、ＭＭＰｓ、例えばＭＭＰ−９，ＭＭＰ−２活性発現の抑制に有用であり、ＭＴ１−ＭＭＰあるいはＭＴ３−ＭＭＰ遺伝子発現細胞におけるＭＭＰｓによるタンパク質のプロセッシングが関連する障害、異常及び／又は疾患の予防あるいは治療に有用である。また、ＭＭＰｓが関与する腫瘍細胞などの移動、浸潤、遊走及び／又は転移の制御、例えば抑制に有用であと期待される。
Ｎ−Ｔｅｓ及びその関連ペプチドは、悪性腫瘍、すなわち癌の移動、浸潤及び／又は転移の阻止及び／又は抑制するのに有用で、血管新生阻害剤、抗腫瘍剤及び／又は癌転移抑制剤として期待できる。また、血液系細胞の、ＭＭＰｓによるプロセッシングに関連する障害、異常及び／又は疾患の予防あるいは治療にも有用で、消炎剤及び／又は免疫抑制剤としても期待できる。さらに、アルツハイマー治療剤、関節破壊治療剤などとしても期待できる。
さらに、本発明では、（ａ）Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列中、第２２番目のアミノ酸残基〜第３１２番目のアミノ酸残基の範囲の配列：
（ｂ）Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列中、第１番目のアミノ酸残基〜第３１２番目のアミノ酸残基の範囲の配列：及び
（ｃ）Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列中、第２２番目のアミノ酸残基〜第１２２番目のアミノ酸残基の範囲の配列
から成る群から選ばれたものに基づいて分子設計を施して、ＭＭＰｓによる各種タンパク質のプロセッシングを抑制あるいは阻害する活性を有する物質を得るのに使用できる。こうして得られる物質も本発明の思想の範囲内のものであるし、本発明の活性成分として扱うことができる。該配列から特定の特徴部分を選択し、（ｉ）そのうちの薬理作用団をイソスターで置き換えることによりなされるか、（ｉｉ）構成アミノ酸残基の少なくとも１個をＤ体のアミノ酸残基に置き換えるか、（ｉｉｉ）アミノ酸残基の側鎖を修飾するか、（ｉｖ）該配列に存在するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を配置して連結するか、（ｖ）立体構造を解析してｍｉｍｉｃ体をデザインすることなど、当該分野で採用される技術を駆使して行うことができる（例えば、首藤　紘一　編　医薬品の開発７巻（分子設計）、平成２年６月２５日発行、株式会社廣川書店及びそこで引用している文献や論文など）。そうした技術の一部は、上記で説明したものを含んでいる。
明細書及び図面において、用語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
実施例
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されず、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
なお、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、ＤＮＡクローニングではＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ　ｅｄ．，Ｖｏｌ．１　ｔｏ　４，（Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；特にＰＣＲ法ではＨ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ　ｅｄ．，ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ　ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，（Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）及びＭ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄ．，“ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９０）に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）や添付の薬品等を使用している。
実施例１：Ｎ−Ｔｅｓのクローニング
１）一次スクリーニング
ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ＥｄｇＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社のＵｎａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ヒト胎児腎臓由来）を使用した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社のｃＤＮＡ合成キット、発現プラスミド、コンピータントセルを使用しても可能である。
ヒト胎児腎臓由来ｃＤＮＡ発現ライブラリーの３０クローンの大腸菌を１プールとしてＴＢ培地にて３７℃で１６時間培養し、培養大腸菌１．５ｍｌよりアルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミドを精製した。
９６穴マイクロプレートに１穴あたりおよそ２０，０００個の２９３Ｔ細胞を５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭで播き、２４時間培養した。ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、ＭＴ１−ＭＭＰの全長ｃＤＮＡをｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のクローニングサイトに挿入した発現ベクターを作成し、１穴あたりＭＭＰ−９発現プラスミド３ｎｇ、ＭＭＰ−２発現プラスミド２２ｎｇ、ＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミド３３ｎｇを上記ライブラリーＤＮＡ　２００ｎｇとともにリン酸カルシウム法にてトランスフェクションした。３７℃で４８時間培養後、培地を除き、細胞を１穴あたり５０マイクロリットルのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ６．８，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２４ｍｇ／ｍｌ　ＢＰＢ，１％ＳＤＳ）で可溶化した。３７℃で３０分加温後、５マイクロリットルをゼラチンザイモグラフィーに供し、潜在型、中間体、活性化型ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２を検出にかけた。一次スクリーニングにより、ライブラリーより活性化型ＭＭＰ−２の産生を抑制する遺伝子プラスミドの集団を特定した。
２）二次スクリーニング
一次スクリーニングで得られた候補遺伝子プラスミドの集団を大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入し、アンピシリン含有ＬＢプレート上で２４時間培養した。大腸菌コロニー５０個を１個づつ分離し、ＴＢ培地にて３７℃で１６時間培養し、培養大腸菌１．５ｍｌよりアルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミドを精製した。前項記載の一次スクリーニングと同様にＭＭＰ−９，ＭＭＰ−２，ＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミドと精製プラスミドを２９３Ｔ細胞に導入し、ゼラチンザイモグラフィーにて潜在型、中間体、活性化型ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２を検出にかけた。活性化型ＭＭＰ−２の産生を抑制した単一プラスミドを同定した。
図１にマイクロプレート８穴のデーターを示す。レーン４では中間体及び活性化型ＭＭＰ−２の産生が抑制されている。この活性化型ＭＭＰ−２の産生が抑制されたウエルに添加された単一プラスミドについて、ＬＩ−ＣＯＲ　ＤＮＡシークエンサーＭｏｄｅｌ４２００を使用して挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定した。決定したＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号：１に記載した。
この遺伝子は、１５１０ベースペアの長さを有し、３１３アミノ酸残基からなるオープンリーディングフレームをコード（ＯＲＦ）していた。該ＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号：２に記載した。ホモロジー検索の結果、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２３１１２４），Ｔｅｓｔｉｃａｎ−２（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＪ００１４５３），Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＡＪ００１４５４）およびＨＰＴＬＧ（ＷＯ９９／２３１１０）のアミノ酸配列のＮ末端側およそ３１０残基と相同性が認められた（図２）。この遺伝子をＮ−Ｔｅｓと命名した。
実施例２：Ｎ−ＴｅｓのＮ末端１２２アミノ酸残基からなる組換えタンパク質発現プラスミドの構築
１）Ｎ−Ｔｅｓ　ｃＤＮＡフラグメント（１−４７３）のＰＣＲ増幅
Ｎ−Ｔｅｓ　ｃＤＮＡの４５１−４７３位に対応する相補鎖に制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列およびＢｇｌＩ切断効率向上のため２塩基を付加したＰＣＲプライマー
2002057448.tif 000002
を設計した。ｃＤＮＡ発現ライブラリーｐＥＡＫ８プラスミド（ＥｄｇＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）内のＴ７プロモーターに対応するＴ７プライマー
2002057448.tif 000003
と本プライマーを用い、Ｎ−Ｔｅｓ　ｃＤＮＡ含むｐＥＡＫ８を鋳型としてＰＣＲ増幅を行った。その結果、約５００塩基の断片を得た。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化後、ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化したｐＳＧ−ＦＬＡＧベクターとＤＮＡリガーゼを用いて連結した。ｐＳＧ−ＦＬＡＧは、ｐＳＧ５のクローニングサイトの３’末端側にＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＫ）をコードする塩基配列と終止コドンを挿入したもので、リーディングフレームを合わせることにより、発現タンパク質のＮ末端側にＦＬＡＧペプチドを付加することができる。これを大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅに導入、増幅した後アルカリ−ＳＤＳ法、ＣｓＣｌ超遠心精製法により、発現ベクターｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧを得た。ｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧで発現するタンパク質は、Ｎ−ＴｅｓのＭｅｔ１からＧｌｙ１２２に由来する１２２アミノ酸残基とＢｇｌＩＩ認識配列およびＦＬＡＧ配列に由来する１２アミノ酸残基をあわせた１３４アミノ酸残基からなるタンパク質（配列表の配列番号：５）をコードする。うち、Ｍｅｔ１からＡｌａ２１の２１アミノ酸残基は、リーダー配列であり、細胞より分泌される際に切断除去され、１１３アミノ酸残基の組換えタンパク質が産生される。この発現プラスミドにより産生されるタンパク質をＮ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧとする。Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧは、Ｎ−Ｔｅｓ（１０１アミノ酸残基、Ａｌａ２２からＧｌｙ１２２）のＣ末端にＦＬＡＧペプチドタグを有する。
２）Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧによるＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰを介したＭＭＰ−２活性化抑制
２４穴プラスチックプレート（Ｎｕｎｃ）に５０，０００個の２９３Ｔ細胞を５％牛胎児血清加ＤＭＥＭ　０．５ｍｌで播き、２４時間後にＭＭＰ−２（２５ｎｇ）、ＭＴ１−ＭＭＰ（５０ｎｇ）あるいはＭＴ３−ＭＭＰ（５０ｎｇ）発現ベクターと前項記載の２５０ｎｇのｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧを導入した。３６時間後に牛胎児血清を含まないＤＭＥＭ　１００マイクロリットルと交換し、１２時間後に１０マイクロリットルを採取し、５マイクロリットルのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加、３７℃で３０分加温後、ゼラチンザイモグラフィーゲルで分析した（図３）。図３中、レーン１：ＭＭＰ−２：２５ｎｇ；ｐＳＧ５：４７５ｎｇ、レーン２：ＭＭＰ−２：２５ｎｇ；ＭＴ１−ＭＭＰ：５０ｎｇ；ｐＳＧ５：４２５ｎｇ、レーン３：ＭＭＰ−２：２５ｎｇ；ＭＴ１−ＭＭＰ：５０ｎｇ；ｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧ：４２５ｎｇ、レーン４：ＭＭＰ−２：２５ｎｇ；ｐＳＧ５：４７５ｎｇ、レーン５：ＭＭＰ−２：２５ｎｇ；ＭＴ３−ＭＭＰ：５０ｎｇ；ｐＳＧ５：４２５ｎｇ、レーン６：ＭＭＰ−２：２５ｎｇ；ＭＴ３−ＭＭＰ：５０ｎｇ；ｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧ；４２５ｎｇをそれぞれ示している。
図３中、レーン３および６ではそれぞれＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ３−ＭＭＰを介したＭＭＰ−２の活性化が抑制された。このことは、Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧがＭＴ−ＭＭＰｓの活性を阻害することを示している。さらに、Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧと同じ塩基配列を含むＮ−Ｔｅｓ、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３およびＨＰＴＬＧもＭＴ−ＭＭＰｓの活性を阻害し、ＭＭＰ−２の活性化を抑制することが容易に類推できる。
実施例３：グリオーマにおけるＮ−Ｔｅｓ発現
グリオーマ患者の腫瘍部位（レーンＴ）と腫瘍を含まない部位（レーンＮ）から抽出した全ＲＮＡから逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）とランダムプライマー（宝酒造）を用いてｃＤＮＡを合成し、このものを鋳型としてＮ−Ｔｅｓに特異的なプライマー
2002057448.tif 000004
を用いてＰＣＲを行った。配列番号：６は、配列表の配列番号：１の１００８−１０２７位に対応するもので、配列番号：７は、配列表の配列番号：１の１３０８−１２８９位に相補的な配列に対応するものである。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅＡｍｐ　２４００　ＰＣＲシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）などを使用し、変性（９４℃，１５秒）、アニーリング（６０℃，１５秒）および伸長（７２℃，１５秒）の４０サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、２．５％アガロースゲルで分析した。
結果を、図４に示す。６名のグリオーマ患者すべてで、Ｎ−Ｔｅｓ発現は、腫瘍を含まない部位（レーンＮ）に比べ腫瘍部位（レーンＴ）で有意に低かった（図４）。このことより、グリオーマ悪性度とＮ−Ｔｅｓ発現低下が関連するものと考えられる。
実施例４：ＭＴ−ＭＭＰとＮ−Ｔｅｓの結合
直径６０ｍｍの培養プレートに２９３Ｔ細胞をおよそ５０万個をまき、２４時間後にｐＳＧ５、ＭＴ１−ＭＭＰを発現するｐＳＧＭＴ１−ＭＭＰおよびＮ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧを発現するｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧのそれぞれを、（１）４μｇ　ｐＳＧ５（ｌａｎｅ　１），（２）２μｇ　ｐＳＧＭＴ１−ＭＭＰ＋２μｇ　ｐＳＧ５（ｌａｎｅ　２），（３）２μｇ　ｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧ＋２μｇ　ｐＳＧ５（ｌａｎｅ　３），（４）２μｇ　ｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧ＋２μｇ　ｐＳＧＭＴ１−ＭＭＰ　ｐｌａｓｍｉｄ（ｌａｎｅ　４），（５）４μｇ　ｐＳＧ５（ｌａｎｅ　５），（６）２μｇ　ｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧ＋２μｇ　ｐＳＧ５（ｌａｎｅ　６），（７）２μｇ　ｐＳＧＭＴ１−ＭＭＰ＋２μｇ　ｐＳＧ５（ｌａｎｅ　７）及び（８）２μｇ　ｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧ＋２μｇ　ｐＳＧＭＴ１−ＭＭＰ　ｐｌａｓｍｉｄ（ｌａｎｅ　８）となるようにトランスフェクションし、２４時間後に１００マイクロキューリー／ｍｌのＳ−３５ラベルのｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ＋ｃｙｓｔｅｉｎｅを添加し４時間培養した。細胞は、１ｍｌの細胞溶解バッファー（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ｖ／ｖ）、１％ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ＳＤＳおよびｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）を含有した５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で可溶化し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収した。この上清をａｎｔｉ−ＭＴ１−ＭＭＰ抗体（１１３−５Ｂ７（第一ファインケミカル）、レーン１−４）およびａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、レーン５−８）のそれぞれ１マイクログラムと共に１２時間インキュベートした後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲル（２０マイクロリットル）と１時間混合した。ゲルを細胞溶解バッファーで３回洗った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを１０マイクロリットル加えて、１００℃で２分煮沸した後、上清を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで展開し、Ｓ−３５のシグナルをＦｕｊｉ　ＢＡＳ　１０００で検出した（図５）。
レーン４では、免疫沈降したＭＴ１−ＭＭＰと結合したＮ−Ｔｅｓが共沈すること、レーン８では、免疫沈降したＮ−Ｔｅｓと結合したＭＴ１−ＭＭＰが共沈することが観察された（図５）。このことより、Ｎ−Ｔｅｓは、ＭＴ１−ＭＭＰと結合することにより、ＭＴ１−ＭＭＰのＭＭＰ−２活性化能を抑制していると思われる。
実施例５：モノクローナル抗体の作成
（ａ）免疫源
免疫に用いる抗原は、実施例２などで得られる融合組換えＮ−Ｔｅｓをはじめ、配列表の配列番号：２のアミノ酸配列を基にデザインされた合成ペプチドを使用することができる。さらに、免疫に用いる抗原は、実施例１で得られたｃＤＮＡを動物細胞発現ベクターに連結し、これをＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞などで発現させて得られる組換えＮ−Ｔｅｓを使用することも可能である。これらの抗原タンパク質は、イオン交換、ゲル濾過またはそれ以外の各種クロマトグラフィーによって精製できる。
精製した免疫用抗原を一般的な方法で免疫し、抗体産生細胞を誘導、細胞融合によりハイブリドーマとして抗体産生細胞を得ることができる。さらに精製した免疫用抗原に対する反応性に基づいてクローニング、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして株化できる。
また、Ｎ−Ｔｅｓ特異的モノクローナル抗体を得るための免疫源としては、Ｎ−Ｔｅｓに特徴的なアミノ酸配列を持つハプテン化合成ペプチドが使用できる。
例えば、Ｃ末端にはＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ〔配列番号：１０〕を含むことが特に好ましく、具体的にはＣｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ〔配列番号：１１〕などが免疫源として好適である。
（ｂ）抗原ポリペプチドの調製
配列番号：２に記載したヒトＮ−Ｔｅｓのアミノ酸配列中より特徴的な配列を選択し、合成する。ペプチドはペプチド合成機（ペプチドシンセサイザー９６００、ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）を使用して、Ｆｍｏｃ−ｂｏｐ法で合成する。ポリペプチドのＮ末端にはシステインを導入する。合成したペプチドはμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ，Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた高速液体クロマトグラフィーなどにより精製する。
（ｃ）ポリペプチドとＢＳＡの複合体の調製
システイン残基を介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させ、抗原コンジュゲートとした。１０．１ｍｇのＢＳＡを１ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に溶解したものと１．１４ｍｇのＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｅｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を２４．９μＬのジメチルホルムアミドに溶解したものと混合し、３０℃、３０分間反応させ、ついで、上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲルカラム（直径１３ｍｍ、長さ１２０ｍｍ）でゲルろ過する。前記（ｂ）で合成したポリペプチドを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に溶解し、マレイミド結合ＢＳＡに対しおおよそ５０倍モル量を混合する。すなわち、ポリペプチドに対しマレイミド結合ＢＳＡを混合し、４℃、２０時間インキュベートし、ＢＳＡ−ポリペプチド複合体を調製する。得られるＢＳＡ−ポリペプチド複合体を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で希釈した後、１５０μＬずつに分注して−３０℃で凍結保存する。
（ｄ）抗体産生細胞の調製
前記（ｃ）で調製したＢＳＡ−ポリペプチド複合体を完全フロインドアジュバントと共に６週令Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫した。おおよそ１８日目に０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解したＢＳＡ−ポリペプチド複合体を初回免疫したマウスに腹腔内投与し、追加免疫する。さらにおおよそ５２日目に０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解したＢＳＡ−ポリペプチド複合体を静脈内投与し、最終免疫とする。その４日後に脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を調製する。
（ｅ）細胞融合
細胞融合には、以下の材料および方法を用いる。ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＲＰＭＩ−１６４０（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌ろ過する。ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過したウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加える。ＰＥＧ−４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエチレングリコール−４０００（ＰＥＧ−４０００，Ｍｅｒｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／ｗ）になるように加えた無血清培地を調製する。
８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｐ３５１〜３７２（ｅｄ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓ．Ｎ．Ｓｈｉｉｇｉ），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）に記載のＯｉらの方法を若干改変して行う。
前記（ｄ）で調製した有核脾細胞（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とをおおよそ５：１〜１０：１の比率で以下の手順で融合する。ポリペプチド免疫脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄する。次に同じ培地に懸濁し、融合させるために有核脾細胞とミエローマ細胞を混合する。すなわち、おおよそ４．０×１０８個の有核脾細胞に対しおおよそ８．０×１０７個のミエローマ細胞を混合する。
次に、それぞれの細胞混合液を遠心分離により細胞を沈殿させ、上清を完全に吸引除去する。沈殿した細胞に３７℃に加温した５０％ＰＥＧ−４０００含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ミエローマ細胞がおおよそ３×１０７個／ｍＬとなるよう体積を決定する）を滴下し、撹拌し、細胞を再懸濁、分散させる。次に添加した５０％ＰＥＧ−４０００含有ＲＰＭＩ−１６４０培地の２倍体積の３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地を滴下する。さらに添加した５０％ＰＥＧ−４０００含有ＲＰＭＩ−１６４０培地の７倍体積のＲＰＭＩ−１６４０培地を常に撹拌しながら滴下し、細胞を分散させる。これを遠心分離し、上清を完全に吸引除去する。次に、ミエローマ細胞がおおよそ３×１０６個／ｍＬとなるように３７℃に加温したＮＳ−１培地を沈殿した細胞に速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピペッティングで分散する。さらに同培地を加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウエルにウエル当りミエローマ細胞がおおよそ６．０×１０５個となるように接種する。それぞれの細胞を加えた上記マイクロウエルを７％炭酸ガス／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％で培養する。
（ｆ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖
（１）使用した培地は以下の通りである。
ＨＡＴ培地：前記（ｅ）項で述べたＮＳ−１培地に更にヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加える。ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ培地と同一組成のものである。
（２）前記（ｅ）項の培養開始後翌日（１日目）、細胞にパスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍｌ）を加える。２、３、５、８日目に培地の半分（約０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１０日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。ハイブリドーマの生育が肉眼にて認められた全ウエルについて固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウエルを調べる。まず、２０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した抗原ポリペプチドでポリスチレン製９６穴プレートをコート（１００ｎｇ／ウエル）し、次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳを用いて洗浄して未吸着のペプチドを除く。各ウエルにハイブリドーマの生育が確認されたウエルの培養上清０．１ｍｌを添加し、室温で約１時間静置する。洗浄後、２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ）を加え、さらに室温で約１時間静置する。洗浄後、基質である過酸化水素と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加え発色させる。各ウエルに２Ｎ硫酸を加え発色反応を停止し、発色の程度をマイクロプレート用吸光度測定機（ＭＲＰ−Ａ４、東ソー）を用いて４９２ｎｍの吸光度で測定する。
（ｇ）ハイブリドーマのクローニング
上記（ｆ）項で得られた抗原ペプチドに対する陽性ウエル中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクローン化する。すなわち、ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフィーダーとしておおよそ１０７個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルにハイブリドーマをウエル当り５個、１個、０．５個になるように希釈し、それぞれ３６穴、３６穴、２４穴に加える。５日目、１２日目に全ウエルに約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加する。クローニング開始後肉眼的に十分なハイブリドーマの生育を認めたもの、コロニー形成陰性ウエルが５０％以上である群について（ｆ）項に記載したＥＬＩＳＡを行う。調べた全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が１個のウエルを４〜６個選択し、再クローニングを行う。最終的にそれぞれのポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。
（ｈ）モノクローナル抗体のクラス、サブクラスの決定
前述したＥＬＩＳＡに従い、それぞれのポリペプチドをコートしたポリスチレン製９６穴プレートに、前記（ｇ）項で得られたハイブリドーマの上清を加える。次にＰＢＳで洗浄後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂ．）を加える。ＰＢＳにより洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加え、基質として過酸化水素および２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン酸）を用いてクラス、サブクラスを決定する。
（ｉ）ハイブリドーマの培養とモノクローナル抗体の精製
得られたハイブリドーマ細胞をＮＳ−１培地で培養し、その上清からモノクローナル抗体を得ることができる。また、得られたハイブリドーマ１０７個を予め１週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ系、雌、６週齢）に同じく腹腔内投与し、１〜２週間後、腹水中からも４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得ることができる。得られた腹水を４０％飽和硫酸アンモニウムで塩析後、ＩｇＧクラスの抗体をプロテインＡアフィゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に吸着させ、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で溶出することにより精製する。
実施例６：サンドイッチＥＩＡ
下記の方法に従えば、実施例５で調製した抗Ｎ−Ｔｅｓ抗体から適当な２種の抗体の組み合わせによってヒトＮ−Ｔｅｓを特異的に検出・測定するサンドイッチＥＩＡ系が構成できる。ＥＩＡ系は１ステップ法、２ステップ法のいずれも可能であり、標識抗体はＦａｂ’−ＨＲＰに限定されない。各反応緩衝液の組成や反応条件は測定の目的に応じて、短縮、延長など調整できる。また、標準品となるヒトＮ−Ｔｅｓは、組織培養上清、細胞培養上清または実施例２記載あるいはそれ以外の方法で発現した組換え体から精製することができる。精製にはイオン交換、ゲルろ過、抗ヒトＮ−Ｔｅｓモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーまたそれ以外の各種アフィニティークロマトグラフィーの組み合わせによって達成される。
（ａ）標識抗体の調製
抗ヒトＮ−Ｔｅｓモノクローナル抗体を０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．２に抗体量の２％（Ｗ／Ｗ）のペプシンを加え、３７℃、２４時間消化する。消化物に３Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を添加し、反応を停止する。０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムによるゲルろ過でＦ（ａｂ’）２画分を分取する。このＦ（ａｂ’）２画分に最終濃度０．０１Ｍとなるようにシステアミン塩酸塩を添加し、３７℃、１．５時間還元し、５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムによるゲルろ過でＦａｂ’画分を分取する。
上記の操作とは別にＨＲＰを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に溶解、ＨＲＰの２５倍モル量のＥＭＣＳをＤＭＦ溶液として加え、３０℃、３０分間反応させる。これを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で平衡化したＮＩＣＫ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過しマレイミド標識ＨＲＰ画分を分取する。
Ｆａｂ’画分とマレイミド標識ＨＲＰを等モルとなるように両画分を混合し４℃、２０時間反応させた後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレイミドで未反応のチオール基をブロックする。これを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４カラムでゲルろ過し、Ｆａｂ’−ＨＲＰ標識抗体を分取する。これに０．１％ＢＳＡおよび０．００１％クロルヘキシジンを添加して４℃で保存する。
（ｂ）モノクローナル抗体結合担体の調製
抗ヒトＮ−Ｔｅｓモノクローナル抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解し、５０μｇ／ｍＬの濃度に調製する。このモノクローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエルあたり１００μＬずつ加え、４℃、１８時間静置する。モノクローナル抗体溶液を除去し、生理食塩液で１回、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄後、１％ＢＳＡ，０．１Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０を加えブロッキングする。
（ｃ）１ステップサンドイッチＥＩＡ法
精製したヒトＮ−Ｔｅｓ画分を標準抗原としてヒトＮ−Ｔｅｓ定量用標準曲線を作成する。１％ＢＳＡ，０．０５％Ｂｒｉｊ３５，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で段階希釈した標準ヒトＮ−Ｔｅｓを６０μＬずつ分注、それぞれに１％ＢＳＡ，０．０５％Ｂｒｉｊ３５，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で１００ｎｇ／５０μＬに調製した標識抗体Ｆａｂ’−ＨＲＰを６０μＬずつ添加し十分混和する。調製した抗体結合マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄し、標準抗原と標識抗体混合液を１００μＬ／ウエルずつ添加する。室温で１時間反応した後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄する。次に、６％ジメチルホルムアミド、０．００５％過酸化水素含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解した０．０１％３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンをウエルあたり１００μＬ添加し、室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸を１００μＬ添加し反応を停止する。この反応混液の４５０ｎｍをマイクロプレートリーダーを用いて測定し、標準曲線を求める。
測定検体は、ヒト血清、脊髄液、血漿、関節液、尿および唾液などヒトに由来する体液成分、各種ヒト組織の抽出液、ヒト由来あるいは組換え体など各種培養細胞の細胞抽出液、培養上清などから調製される。それぞれの測定検体は、標準ヒトＮ−Ｔｅｓにかえて上記の１ステップサンドイッチＥＩＡに供し、標準ヒトＮ−Ｔｅｓと同時に反応を進行させる。測定検体から得られた標準曲線にあてはめ、測定検体に含まれるヒトＮ−Ｔｅｓの量を算出する。
実施例７：Ｎ−Ｔｅｓのクローニング
（１）一次スクリーニング
発現ベクターｐＥＫＡ８で構築されたヒト胎児腎臓由来ｃＤＮＡ発現ライブラリーの３０クローンの大腸菌を１プールとしてＭＭＩ培地（１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１．２５％ｔｒｙｐｔｏｎｅ，２．５％ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，１２５ｍＭ　ＮａＣｌ，０．４％ｇｌｙｃｅｒｏｌ；ｐＨ７．２）にて３７℃で１６時間培養し、培養大腸菌２ｍｌよりポリエチレングリコールを用いたアルカリ法（変法）にてプラスミドを精製した。
９６穴マイクロプレートに１穴あたりおよそ５０，０００個の２９３Ｔ細胞を５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭで播き（０．１ｍＬ／穴）、２４時間培養した。ＭＭＰ−９，ＭＭＰ−２，ＭＴ１−ＭＭＰの全長ｃＤＮＡをｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のクローニングサイトに挿入した発現ベクターを作成し、１穴あたりプロＭＭＰ−９発現プラスミド３ｎｇ，プロＭＭＰ−２発現プラスミド２０ｎｇ，ＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミド３０ｎｇを上記ライブラリーＤＮＡ　１００ｎｇとともにＴｒａｎｓＩＴ　ＬＴ１遺伝子導入試薬（Ｍｉｒｕｓ）にてトランスフェクションした。３７℃で４８時間培養後、培地を除き、細胞を１穴あたり５０マイクロリットルのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ６．８，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．１％ＢＰＢ，２％ＳＤＳ）で懸濁し穏やかな超音波破砕にて可溶化した。３７℃で３０分加温後、５マイクロリットルをゼラチンザイモグラフィーに供し、潜在型、中間体、活性化型ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２を検出した。一次スクリーニングによりライブラリーより活性化型ＭＭＰ−２の産生を抑制する遺伝子プラスミドの集団を特定した。
任意の１２検体について、ゼラチンザイモグラフィーで解析したところ、すべてから９２ｋＤａのプロＭＭＰ−９，６８ｋＤａのプロＭＭＰ−２および６４ｋＤａの活性型中間体ＭＭＰ−２が認められた。しかしながら、検体９において、プロＭＭＰ−２の切断が抑制され、活性型中間体ＭＭＰ−２が比較的少ないことが観察された。
（２）二次スクリーニング
一次スクリーニングの検体９で用いた候補遺伝子プラスミドの集団を大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入しアンピシリン含有ＬＢプレート上で２４時間培養した。大腸菌コロニー５０個を１個づつ分離し、ＭＭＩ培地にて３７℃で１６時間培養し、培養大腸菌２ｍｌよりプラスミドを精製した。前項記載の一次スクリーニングと同様にプロＭＭＰ−９，プロＭＭＰ−２，ＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミドと精製プラスミドを２９３Ｔ細胞に導入し、ゼラチンザイモグラフィーにて潜在型、中間体、活性化型ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２を検出した。活性化型ＭＭＰ−２の産生を抑制した単一プラスミドを同定した。
任意の１２検体について、ゼラチンザイモグラフィーで解析したところ、検体３、５および６で６４ｋＤａの活性型中間体ＭＭＰ−２が全く見られなかった。これらのレーンに用いたプラスミドは１．４ｋｂの挿入配列を有しており、ＬＩ−ＣＯＲ　ＤＮＡシークエンサーＭｏｄｅｌ　４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用して挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定した（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０５６８６６）。この配列において、最初の５’側の１０３８残基は、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１６９５０）の３１１−３１９が欠損している以外ではＴｅｓｔｉｃａｎ　３と同一であった。１０３９残基以降の配列はユニークであった。オープンリーディングフレームは１０８から１０４６残基で見出され、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３のＮ−末端断片に相当する３１３アミノ酸残基をコードしていた。ただし、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３の６４から６６残基部分を欠き、またＣ−末端に変化が見られた。この遺伝子が、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３のＮ−末端側をコードするものであったことから、Ｎ−Ｔｅｓと命名した。Ｎ−Ｔｅｓの３’部分とＴｅｓｔｉｃａｎ　３のｃＤＮＡ塩基配列が、第４染色体ゲノムデータベース（ＢＡＣ　ｃｌｏｎｅ　ＲＰ１１−４４０Ｌ３０，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＣ０２０５９９）上に見出されたことからＮ−ＴｅｓはＴｅｓｔｉｃａｎ　３のスプライシングバリアントと考えられる。
Ｎ−ＴｅｓのＮ−末端側２１アミノ酸残基は、疎水性のシグナルペプチド、２２−８５アミノ酸残基は、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　１、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２およびＴｅｓｔｉｃａｎ　３以外では見られないユニークな配列であった。また、８６−１９１アミノ酸残基は、システインリッチなｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ（ＦＳ）ドメイン、８７−３１１アミノ酸残基は、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃａ２＋結合（ＥＣ）ドメインであった。Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３は、Ｃ−末端側にｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＴＹ）様ドメインと２ヶ所の糖鎖修飾部位を持つ。
実施例８：組換えＴｅｓｔｉｃａｎ　１，Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２，Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３およびＢＭ−４０のクローニング
Ｃ−末端側にＦＬＡＧエピトープを付加したＴｅｓｔｉｃａｎ　１，Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２，Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３およびＢＭ−４０を発現するプラスミドを以下の様にして作製した。マルチクローニングサイトとＦＬＡＧエピトープ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ〔配列番号：１２〕）をコードしたＤＮＡ断片をｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ　ｐｌａｓｍｉｄ（ＩＢＩ　ＦＬＡＧ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＹ）からプライマーＮ２６とＣ２４（ＩＢＩ　ＦＬＡＧ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＹ）によるＰＣＲで調製した。この断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩで切断したｐＳＧ５（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）クローニングサイトに挿入しｐＳＧ−ＦＬＡＧと称するプラスミドを作製した。ｃＤＮＡは、ヒトあるいはマウス胎盤由来のｔｏｔａｌ　ＲＮＡより８ｍｅｒランダムプライマーとＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）で合成した。ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ　１、ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ　２、ヒトＴｅｓｔｉｃａｎ　３およびマウスＢＭ−４０に対するプライマーをＧｅｎｅＢａｎｋＴＭ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ：ＣＡＡ５１９９９、ＣＡＡ０４７７４、ＮＭ＿０１６９５０およびＮＭ＿００９２４２に記載の配列に基
づいて作製した。
2002057448.tif 000005
ＰＣＲにて増幅した各ｃＤＮＡ断片は、プライマー中のＢａｍＨＩあるいはＢｇｌＩＩサイトで切断し、ｐＳＧ−ＦＬＡＧのＢｇｌＩＩサイトに挿入した。Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３　ｃＤＮＡは、ｐＳＧ−ＦＬＡＧのＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩサイトに挿入した。各ｃＤＮＡ断片は、ＬＩ−ＣＯＲ　ＤＮＡシークエンサーでその塩基配列を確認した。それぞれの発現ベクターをｐＳＧ−Ｔｅｓｔｉｃａｎ　１−ＦＬＡＧ，ｐＳＧ−Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２−ＦＬＡＧ，ｐＳＧ−Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧおよびｐＳＧ−ＢＭ−４０−ＦＬＡＧと称した。
ＰＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧとｐＳＧ−Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧを２９３Ｔ細胞に導入し、Ｎ−ＴｅｓとＴｅｓｔｉｃａｎ　３の分布を調べた。Ｎ−ＴｅｓとＴｅｓｔｉｃａｎ　３に付加したＦＬＡＧエピトープは、遺伝子導入した細胞のライゼートおよび培養上清に見出された。分子量はそれぞれ３７ｋＤａ、６０ｋＤａを示した。一方、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧは、遺伝子導入した細胞のＥＣＭから見出されたが、Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧは検出されなかったことから、Ｎ−Ｔｅｓは可溶性のタンパク質であると判断された。
実施例９：免疫沈降によるＮ−ＴｅｓとＭＴ１−ＭＭＰの結合
径６０ｍｍの培養ディッシュに２９３Ｔ細胞を播き込み、１μｇのｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよび３μｇのｐＳＧ−ＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミドを導入し、４８時間後に１００μＣｉ／ｍｌのＰｒｏ−ｍｉｘ　Ｌ−（３５Ｓ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｅｌｌ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｍｉｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で４時間、標識した。細胞は、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＥＤＴＡ，１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，０．１％ＳＤＳ含有１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４）で溶解し、１５，０００ｒｐｍ　１０分間遠心して上清を得た。４００ｎｇ抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体１１４−１Ｆ２（第一ファインケミカル）あるいは抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）をこの上清に加え４℃で１６時間インキュベートした。抗原−抗体の複合体は、２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で回収し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを乾燥し放射活性をＢｉｏ−ｉｍａｇｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　ＢＡＳ１０００（Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ）で検出した。
抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体は、ＭＴ１−ＭＭＰ遺伝子のみを導入した細胞から５０ｋＤａおよび４７ｋＤａのＭＴ１−ＭＭＰを沈殿させた。Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧとＭＴ１−ＭＭＰ遺伝子を共導入した細胞から３７ｋＤａのＮ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧが抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体によってＭＴ１−ＭＭＰと共に沈殿したが、Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧ遺伝子のみを導入した細胞から、この抗体によってＮ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧは沈殿しなかった。
抗ＦＬＡＧ抗体は、Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧ遺伝子を導入した細胞から３５ｋＤａのＮ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧを沈殿させた。抗ＦＬＡＧ抗体は、ＭＴ１−ＭＭＰ遺伝子を導入した細胞からＭＴ１−ＭＭＰを沈殿させなかったが、Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧとＭＴ１−ＭＭＰ遺伝子を共導入した細胞からＭＴ１−ＭＭＰが共沈した。同様に、ＭＴ３−ＭＭＰもまた、Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧと共沈が確認された。これらの結果から、ＭＴ１−ＭＭＰとＭＴ３−ＭＭＰは、Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧと安定な複合体を形成することが示された。
実施例１０：ＭＴ−ＭＭＰｓの阻害活性を有するＮ−Ｔｅｓドメインの決定
（１）Ｎ−Ｔｅｓ変異体の発現ベクターの作製
Ｎ−Ｔｅｓの欠損変異体８５、９７および１２２のｃＤＮＡ断片をｐＥＡＫ８の５’プライマーと以下に記載したプライマーによるＰＣＲで増幅した。
2002057448.tif 000006
得られたＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩで切断し、ｐＳＧ−ＦＬＡＧに挿入した。
１２２Ｃ／Ｓ変異体ｃＤＮＡは、以下のプライマーによる連続的なＰＣＲにて４ヶ所のシステイン残基をセリン残基に置換して作製した。下線は、変異を導入した塩基である。
2002057448.tif 000007
（２）Ｎ−Ｔｅｓ／Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２キメラの作製
Ｎ−Ｔｅｓ／Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２キメラｃＤＮＡ断片を作製した。５５０番から始まるＴｅｓｔｉｃａｎ　２のＣ−末端側ｃＤＮＡ断片をＴｅｓｔｉｃａｎ　２−３’プライマーおよび
2002057448.tif 000008
を用いて増幅した。Ｎ−Ｔｅｓ　ｃＤＮＡのＣ−末端側断片（３５９番−１０４６番）をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断除去し、増幅した断片を挿入した。
（３）Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２／Ｎ−Ｔｅｓキメラの作製
Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２／Ｎ−ＴｅｓキメラｃＤＮＡ断片を作製した。Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２のＮ−末端側ｃＤＮＡ（２７９番−５５０番）のｃＤＮＡ断片をＴｅｓｔｉｃａｎ　２−５’プライマーおよび５５０番から始まる
2002057448.tif 000009
を用いて増幅した。増幅した断片は、Ｎ−Ｔｅｓ　ｃＤＮＡのＮ−末端側（１番−５５０番）と置換した。
（４）結果
Ｔｅｓｔｉｃａｎ　１およびＴｅｓｔｉｃａｎ　３の発現は、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ３−ＭＭＰによるプロＭＭＰ−２活性化を阻害したが、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２およびＢＭ−４０の発現では、阻害活性は認められなかった。Ｎ−ＴｅｓのＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ３−ＭＭＰ阻害活性ドメインを決定するために欠損変異株を作製した。Ｎ−ＴｅｓのＮ−末端側の１２２アミノ酸残基（Δ１２２）は、野生型Ｎ−Ｔｅｓと同等のプロＭＭＰ−２活性化阻害能を有していた。Ｎ−末端側の９７、８５残基からなる欠損変異株（Δ９７、Δ８５）は、野生型より低いレベルでＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ３−ＭＭＰを阻害した。Δ１２２の４つのシステイン残基をセリン残基に置換した変異体（Δ１２２Ｃ／Ｓ）は、阻害活性を維持していた。しかしながら、Ｎ−Ｔｅｓの３３−８４残基を欠損したものは、阻害活性を失った。
Ｎ−ＴｅｓのシグナルとユニークドメインをＴｅｓｔｉｃａｎ　２のＦＳ、ＥＣ、ＴＹおよびＣ−末端ドメインから成るキメラ（Ｎ−Ｔｅｓ／Ｔｅｓ−２）は、充分な阻害活性を示したが、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　２のシグナルとユニークドメインで置き替えられたＮ−Ｔｅｓ（Ｔｅｓ−２／Ｎ−Ｔｅｓ）は、阻害活性を失った。これらのことから、Ｎ−ＴｅｓのＮ−末端のユニークドメインが、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ３−ＭＭＰの阻害に必須であることが確認された。
実施例１１：半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＮ−ＴｅｓおよびＴｅｓｔｉｃａｎ　３　ｍＲＮＡの解析
（１）臨床検体
ヒトグリオーマ組織は、１０人の患者より脳腫瘍除去手術に伴う正常脳組織と共に調製した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ調製のため、検体は摘出後、液体窒素で急速冷凍し−８０℃で保存した。また、組織検査のため４％パラホルムアルデヒド固定液で１８から２４時間（４℃）で固定した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、検鏡した。脳腫瘍の分類は、Ｋｌｅｉｈｕｅｓ，Ｐ．，Ｂｕｒｇｅｒ，ＰＣ．，Ｓｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ，ＢＷ．，“Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｕｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｎｅｒｖｏｕｓ　Ｓｙｓｔｅｍ”，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３，ｐｐ１１−２０．記載の判定基準で行った。すべての腫瘍組織に対して、切除前に化学療法、放射線治療は行われていない。
（２）半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＮ−ＴｅｓおよびＴｅｓｔｉｃａｎ　３　ｍＲＮＡの解析
Ｎａｋａｄａ，Ｍ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｉｋｅｄａ，Ｅ．，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｊ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，ａｎｄ　Ｏｋａｄａ，Ｙ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ　１，２，ａｎｄ　３　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ　ｔｕｍｏｒｓ．”，Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ．１５４：４１７−２８，１９９９．記載の方法に従って、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＮ−Ｔｅｓ，Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの解析を行った。プライマーは下記のものを用いた。
2002057448.tif 000010
（３）結果
半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより正常脳およびグリオーマ組織のＮ−ＴｅｓおよびＴｅｓｔｉｃａｎ　３のｍＲＮＡ発現レベルを調べた。正常脳において、Ｎ−ＴｅｓおよびＴｅｓｔｉｃａｎ　３のいずれもが検出されたが、グリオーマ組織において低下が認められた。
グリオーマ細胞株Ｔ９８およびＵ８７におけるＮ−Ｔｅｓ　ｍＲＮＡ発現は正常脳と同等であったが、Ｕ２５１細胞では有為に低かった。一方、検出可能なレベルのＴｅｓｔｉｃａｎ　３を発現するグリオーマ細胞株は存在しなかった。
図６に、ＮＢ（ｎｏｒｍａｌ　ｂｒａｉｎ；正常脳組織，ｎ＝１８）；ＬＧＡ（Ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ　ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ；低度星細胞腫，ｎ＝９）；ＡＡ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ；未分化星細胞腫，ｎ＝８）；ＧＢ（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ；グリア芽細胞腫，ｎ＝３４）；Ｍｅｔａ（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒ；脳へ転移した他臓器癌，ｎ＝９）及びＧＣＬ（ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ；グリオーマ細胞株，ｎ＝４）のＴｅｓｔｉｃａｎ　３とＮ−Ｔｅｓの発現レベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示した。悪性度が高くなるにつれて、Ｎ−Ｔｅｓの発現レベルの低下が認められた。
実施例１２：Ｎ−ＴｅｓあるいはＴｅｓｔｉｃａｎ　３による癌の浸潤阻害
（１）組換えＴｅｓｔｉｃａｎ　３、Ｎ−ＴｅｓおよびＮ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ発現細胞株の樹立
ｐＳＧ−Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ，ｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよびｐＳＧ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧのそれぞれをＸｂａＩで切断し、ｐＳＧ５のｅａｒｌｙ　ＳＶ４０プロモーター、ラビットβ−グロビンのイントロンＩＩ、Ｔ７バクテリオファージプロモーター、それぞれのｃＤＮＡおよびポリアデニレーションシグナルを含む断片を切り出し、予めＸｂａＩで切断したｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｌｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られた発現ベクターをｐＣＥＰ−Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ、ｐＣＥＰ−Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよびｐＣＥＰ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧと称した。
ｐＣＥＰ−Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧおよびｐＣＥＰ−Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧをｅｒｂＢ２で癌化したＭＤＣＫ細胞あるいはＵ２５１グリオーマ細胞に導入し、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ存在下で選択した。
（２）コラーゲンゲルにおける培養
Ｉ型コラーゲンゲル（Ｎｉｔｔａ　Ｇｅｌａｔｉｎ）を調製した。１ｍＬのコラーゲンをゲル化した径３５ｍｍの培養ディッシュに３，０００個のＵ２５１細胞を含む６μＬのコラーゲンゲルを置き、さらに１ｍＬのコラーゲンゲルでサンドイッチした。ゲルに２ｍＬの培地を添加し、５日間培養した。ＭＤＣＫ−ｅｒｂ２細胞の浸潤アッセイには、径３５ｍｍの培養ディッシュにおよそ３，０００個の細胞を含むコラーゲンをゲル化し２ｍＬの培地を添加し、７日間培養した。
（３）結果
安定的にＮ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧあるいはＴｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ遺伝子を導入したＵ２５１で両遺伝子の発現を抗ＦＬＡＧ抗体によるウエスタンブロッティングで確認した。Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよびＴｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ融合タンパク質は、それぞれ３７ｋＤａおよび５５ｋＤａのバンドを示した。野生型Ｕ２５１，ｐＣＥＰ４，Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよびＴｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧを導入したＵ２５１のコラーゲンゲルに対する浸潤を比較した。Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧあるいはＴｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧの導入は、Ｕ２５１の浸潤能を明らかに低下させた。
ＭＴ１−ＭＭＰを発現し、コラーゲンゲル中で浸潤生育するｅｒｂＢ２で癌化したＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ−ｅｒｂＢ２）にＮ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧあるいはＴｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ発現プラスミドを導入し、導入後の性質を比較した。Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧあるいはＴｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ遺伝子の導入によって、形態学的変化は全く誘導されなかった。親細胞株あるいは空ベクター導入ＭＤＣＫ−ｅｒｂＢ２細胞株は、コラーゲンゲル中で浸潤生育を示したが、注目すべきことに、Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧあるいはＴｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ遺伝子の導入後、浸潤生育能が低下した。
実施例１３：組換えＴｅｓｔｉｃａｎ　３、Ｎ−ＴｅｓおよびＮ−Ｔｅｓ−ｄｅ
ｌの精製
（１）組換えＴｅｓｔｉｃａｎ　３、Ｎ−ＴｅｓおよびＮ−Ｔｅｓ−ｄｅｌの発現系
ｐＣＥＰ−Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ、ｐＣＥＰ−Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよびｐＣＥＰ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧを２９３ＥＢＮＡ細胞に導入し、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ存在下で選択してＴｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ、Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよびＮ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧを産生する細胞株を得た。
（２）組換えＴｅｓｔｉｃａｎ　３、Ｎ−ＴｅｓおよびＮ−Ｔｅｓ−ｄｅｌの発現
それぞれの発現株をローラーボトルに播き込み、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭでコンフルエントまで培養した。培養液をＦＣＳ不含のＤＭＥＭに交換し２日間培養を継続した後、培養上清を回収した。培養上清０．５ｍＬを濃縮し、抗ＦＬＡＧ抗体によるウエスタンブロッティングで発現を確認した。
（３）組換えＴｅｓｔｉｃａｎ　３、Ｎ−ＴｅｓおよびＮ−Ｔｅｓ−ｄｅｌの精製
培養上清を遠心し細胞残渣を除去した後、抗ＦＬＡＧ抗体アフィニティーゲルに供し、精製した。抗ＦＬＡＧ抗体によるウエスタンブロッティングおよびＣＢＢ染色で発現と純度を検討した。
実施例１４：ポリクローナル抗体の作製
（１）抗原ポリペプチドの調製
Ｎ−Ｔｅｓのアミノ酸配列中より、Ｎ−Ｔｅｓに特徴的な配列として次の配列を選択した。
2002057448.tif 000011
このポリペプチドをＦｍｏｃ−ｂｏｐ法で合成した。合成したペプチドは、逆相ＨＰＬＣにより８０〜９０％純度以上に精製した。
（２）ポリペプチドとＢＳＡの複合体の調製
各ポリペプチドをペプチドＮ末端に付加したシステイン残基を介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させ、抗原コンジュゲートを調製した。
（３）ウサギ抗血清の調製
前項（２）で調製したＢＳＡ−ポリペプチドを完全フロイントアジュバントと共に日本白色種メス家兎２羽に皮下投与（０．１５ｍｇ／羽）し、初回免疫した。これらのウサギに２週、４週、６週、８週、１０週後に０．３ｍｇ／羽のＢＳＡ−ポリペプチド複合体を不完全フロイントアジュバントと共に内皮に追加免疫し、１１週後に全採血を行なった。得られた血液を遠心分離し、抗ＢＳＡ−ポリペプチド複合体ポリクローナル抗体を含むウサギ抗血清を得た。
免疫したＢＳＡ−ポリペプチド複合体を固相化した９６穴プレートにてＥＬＩＳＡを行い、全採血して得た抗血清の力価を測定して抗体の存在を確認した。
2002057448.tif 000012
（４）ポリクローナル抗体の精製
前項（３）で得られたウサギ抗血清をそれぞれ４０％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、得られた沈殿を６０ｍＭ　ＮａＣｌ含有４０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ８）で溶解後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）ゲルカラム（直径３２ｍｍ、長さ３５ｃｍ）に供した。素通り画分を５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、得られた沈殿を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解、同緩衝液で透析しウサギポリクローナル抗体を得た。
実施例１５：抗Ｎ−Ｔｅｓモノクローナル抗体の作製
（１）免疫抗原の調製
Ｎ−ＴｅｓのＣ−末端側にＨｉｓタグを付加した融合タンパク質を発現する発現ベクターｐＣＴＣＮ−ＴｅｓＨｉｓを導入した大腸菌ＪＭ１０９を４ｍＬの５０μｇ／ｍＬ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培地に接種、３７℃で１６時間培養し、１次カルチャーを調製した。これを４００ｍＬの５０μｇ／ｍＬ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培地に再接種、３７℃でおよそ３時間、対数増殖期中期まで培養した。ＩＰＴＧ（最終濃度０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間培養を継続し、組換え融合タンパク質の発現を誘導した。
培養液を直ちに氷冷し、遠心（５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で菌体を回収２０ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ含有２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し１５分間、氷中に置いて細胞壁を破壊した。菌体懸濁液を氷冷下で超音波破砕（３０秒、１０回）、遠心（１８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）してｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙを回収した。Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙを１ｍＬの０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁し洗浄、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して沈殿を回収、これを１ｍＬの８Ｍ　ｕｒｅａ，０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。
上記の組換え大腸菌（４００ｍＬ培養）より調製した不溶性封入体を８Ｍ　ｕｒｅａ，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で可溶化し、Ｎｉ＋＋Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルカラムに供した。洗浄後、８Ｍ　ｕｒｅａ，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，０．５Ｍ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出、得られた精製画分に１％ＳＤＳ，０．５％２−メルカプトエタノールを添加した。室温で３０分間置いた後、２％ＤＯＣを添加してＰＢＳで透析した。２日間、計７回の外液交換を行った。さらに組換えタンパク質画分をＰＢＳで２．５ｍＬに調製し、ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０にてバッファー交換した。精製画分より５μＬとり還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色し、タンパク質１．４ｍｇ、純度９５％と見積もった。
（２）抗体の作製と選択
▲１▼免疫は以下のスケジュール
免疫動物：６週齢　Ｂａｌｂ／Ｃ雌、２匹
精製抗原：１ｍｇ／ｍｌ　Ｎ−Ｔｅｓ　０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
初回免疫：４５．５μｇ／３００μｌ／マウス（完全フロイントアジュバント）腹腔内投与
追加免疫：２０日後４１．１μｇ／１８５μｌ／マウス　腹腔内投与
最終免疫：５５日後３６．７μｇ／２２０μｌ／マウス　静脈内投与
最終免疫の３日後（５８日後）に細胞融合を行った。
▲２▼スクリーニング（ＥＬＩＳＡ法によるハイブリドーマの検索）
ＥＬＩＳＡ：固相１００ｎｇ／ウエルで免疫抗原をコート。
細胞融合の１１日後にスクリーニングを実施。３５株を選択。
▲３▼クローニング（限界希釈）
限界希釈でクローニング、ＥＬＩＳＡで抗体産生ハイブリドーマを選択。９クローンを選抜。
▲４▼サブクラスアッセイ
９クローンについてサブクラスを決定した。
2002057448.tif 000013
▲５▼イムノブロッティングによる選択
免疫抗原を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開、ニトロセルロースメンブレンに転写、各ハイブリドーマ培養上清を１次抗体として添加、抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）−ＨＲＰを２次抗体として使用、染色した。いずれの培養上清も免疫抗原と強く反応した。
実施例１３に記載のｐＣＥＰ−Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧ、ｐＣＥＰ−Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよびｐＣＥＰ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧを導入した２９３ＥＢＮＡ細胞より調製した細胞抽出画分を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開、ニトロセルロースメンブレンに転写、サブクラス毎に任意に選択した２８８−９Ｈ３（γ２ｂ／κ）、２８８−１２Ｈ５（γ２ａ／κ）および２８８−２９Ｂ６（γ１／κ）の各ハイブリドーマ培養上清を１次抗体として添加、抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）−ＨＲＰを２次抗体として使用、染色した。いずれのクローンも組換えＴｅｓｔｉｃａｎ　３−ＦＬＡＧおよびＮ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧと良く反応したが、検討した３種のクローンにはＮ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧと反応するものは含まれなかった。
実施例１３に記載のｐＣＥＰ−Ｎ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよびｐＣＥＰ−Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧを導入した２９３ＥＢＮＡ細胞培養上清より精製したＮ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧおよびＮ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開、ニトロセルロースメンブレンに転写した。前項記載の各ハイブリドーマ培養上清を１次抗体として添加、抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）−ＨＲＰを２次抗体として使用し染色した。いずれのクローンも組換えＮ−Ｔｅｓ−ＦＬＡＧと反応することを確認した。また、検討した９種のクローンのうち２８８−２１Ｄ１１は、Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧと反応した。
産業上の利用可能性
ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＴ３−ＭＭＰなどのＭＭＰｓに対して阻害作用を有するＮ−Ｔｅｓは、癌の浸潤・転移、血管新生などを抑制に有効であると期待されるし、アミロイド前駆体分解抑制によるアルツハイマー病の進行抑制にも有効であると期待される。またそのＮ−Ｔｅｓに対する抗体は、診断薬としても期待される。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【配列表】
2002057448.tif 000014
2002057448.tif 000015
2002057448.tif 000016
2002057448.tif 000017
2002057448.tif 000018
2002057448.tif 000019
2002057448.tif 000020
2002057448.tif 000021
2002057448.tif 000022
2002057448.tif 000023
2002057448.tif 000024
2002057448.tif 000025
【図面の簡単な説明】
図１は、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、ＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミドと試験検体プラスミドを２９３Ｔ細胞に導入し、ゼラチンザイモグラフィーにて潜在型、中間体、活性化型ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２を検出にかけた結果を示す。
図２は、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−１、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−２、Ｔｅｓｔｉｃａｎ−３およびＨＰＴＬＧと、Ｎ−Ｔｅｓとのアミノ酸配列に関するホモロジーを示す。
図３は、ゼラチンザイモグラフィー分析した、Ｎ−Ｔｅｓ−ｄｅｌ−ＦＬＡＧによるＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰを介したＭＭＰ−２活性化抑制の結果を示す。
図４は、グリオーマにおけるＮ−Ｔｅｓ発現検索の結果を示す。
図５は、ＭＴ−ＭＭＰとＮ−Ｔｅｓの結合性の調査結果を示す。
図６は、Ｔｅｓｔｉｃａｎ　３とＮ−Ｔｅｓの発現レベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す。ＮＢ：正常脳組織；ＬＧＡ：低度星細胞腫；ＡＡ：未分化星細胞腫；ＧＢ：グリア芽細胞腫；Ｍｅｔａ：脳へ転移した他臓器癌及びＧＣＬ：グリオーマ細胞株
【図１】
2002057448.tif 000026
【図２Ａ】
2002057448.tif 000027
【図２Ｂ】
2002057448.tif 000028
【図２Ｃ】
2002057448.tif 000029
【図３】
2002057448.tif 000030
【図４】
2002057448.tif 000031
【図５】
2002057448.tif 000032
【図６】
2002057448.tif 000033
【国際調査報告】
2002057448.tif 000034
2002057448.tif 000035
2002057448.tif 000036
2002057448.tif 000037