(57)【要約】本発明は、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖の製造方法に用いることのできるポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡとその用途を提供することを課題とし、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列若しくは、そのアミノ配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡとその用途を確立することにより前記課題を解決するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列若しくは、それらのアミノ配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記の理化学的性質を有する請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
（１）　分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、約８２，０００乃至１３２，０００ダルトン
（２）　至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、約５０℃
（３）　至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応で、ｐＨ約５．５乃至６．０
（４）　温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持で、約４５℃以下に温度安定域を有する。
（５）　ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ約４．５乃至１０．０の範囲内にｐＨ安定域を有する。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列若しくは、それらの塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列、または、それらに相補的な塩基配列若しくはそれらの塩基配列における１若しくは複数個を、遺伝子の縮重に基づき、それがコードするアミノ酸配列を変えることなく他の塩基で置換した塩基配列を含有する、請求の範囲第３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
遺伝子コードの縮重に基づき、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列における塩基の１若しくは複数個を他の塩基で置換した請求の範囲第３項または第４項記載のＤＮＡ。
【請求項６】
バチルス属の微生物に由来する請求の範囲第３項、第４項または第５項記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求の範囲第３項乃至第６項のいずれかに記載のＤＮＡと、自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項８】
自律複製可能なベクターが、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）である請求の範囲第７項記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項９】
請求の範囲第７項または第８項記載の組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項１０】
宿主が大腸菌である請求の範囲第９項記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求の範囲第９項または第１０項記載の形質転換体を培養し、培養物から請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
培養物中の請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドを、遠心分離、濾過、濃縮、塩析、透析、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動および等電点電気泳動から選ばれる一種または二種以上の方法により採取する請求項１１記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１３】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質に、請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドを作用させてサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質を生成させる工程を含んでなる、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質の製造方法。
【請求項１４】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質が、澱粉、澱粉質またはそれらを酸および／またはアミラーゼで部分加水分解したものを、α−グルコシダーゼ、デキストリンデキストラナーゼ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて糖転移させたものである請求の範囲第１３項記載のサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質の製造方法。
【請求項１５】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質が、プルランをβ−アミラーゼとプルラナーゼ共存下で加水分解して得られたものである、請求の範囲第１３項または第１４項記載のサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質の製造方法。
【請求項１６】
非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質が、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオースおよび／または６５−Ｏ−α−グルコシルマパノースである、請求の範囲第１３項、第１４項または第１５項記載のサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列若しくは、それらのアミノ配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドとその用途に関する。より詳細には、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列若しくは、それらのアミノ配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体、当該ポリペプチドの製造方法、および前記特定の構造を有する糖質とその用途に関するものである。
背景技術
グルコースを構成糖とする糖質、例えば、澱粉を原料として製造される部分分解物としては、アミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端が非還元末端と還元末端とからなり、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物の場合、固形物当たりの還元力の大きいものは、通常、低分子、低粘度、高甘味である。また、高反応性が高いことからアミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起し易く、褐変して悪臭を発生し、品質が劣化し易い欠点のあることが知られている。従って、還元性糖質の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、『ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ）』、第７１巻、３５３乃至３５８頁（１９４９年）に開示されているように、澱粉にマセランス・アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ　ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６、７または８個のグルコース分子がα−１，４グルコシル結合したα−、β−またはγ−環状デキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれら環状デキストリンが工業的規模で生産され、これら環状デキストリンがそれぞれ有する、非還元性、無味、包接能などの特性を生かして種々の用途に用いられている。また、先に、本出願人が、特開平７−１４３８７６号公報、特開平７−２１３２８３号公報などで開示したように、マルトオリゴ糖など澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素およびトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２個のグルコース分子がα，α−結合したトレハロースを生成させる方法も知られている。現在では、トレハロースは澱粉から工業的規模で生産され、その非還元性と温和で高品質な甘味特性を生かして種々の用途に用いられている。このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度２のトレハロース、グルコース重合度６、７および８のα−、β−およびγ−環状デキストリンは、それぞれの特性を生かして工業的規模で生産され利用されているものの、これら糖質とは性質性状の異なる更なる非還元性糖質乃至低還元性糖質の提供が望まれる。
一方、近年、グルコースを構成糖とする新たな環状構造の四糖類が開示された。例えば、『ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８頁（１９９４年）には、主として、グルコース残基がα−１，３結合とα−１，６結合とが交互に連なるアルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）に、加水分解酵素アルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることによりサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（以下、特にことわらない限り、本願明細書では本糖質を「環状四糖」と呼ぶ。）を生成させ、これをメタノール共存下で晶出させることが開示されている。環状四糖は、環状構造を有し、非還元性の糖質ゆえに、包接能を示し揮発性有機物を安定化する作用を有し、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工できることが期待される。しかしながら、環状四糖の製造に必要な原料のアルテルナンや酵素のアルテルナナーゼの入手が困難であり、加えて、その酵素を産生する微生物も入手困難であった。
斯かる状況に鑑み、本発明者等は、工業的実施が容易な環状四糖の新規製造方法につき鋭意研究したところ、バチルス属又はアルスロバクター属に属するある種の微生物が、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から環状四糖を生成するという、従来未知の全く新規な酵素、α−イソマルトシル転移酵素を産生することを見出し、ＰＣＴ／ＪＰ０１／０４２７６号明細書に開示した。更に、これら微生物が、グルコース重合度２以上の澱粉糖から、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度３以上の糖質を生成する新規酵素、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をも産生することを見出し、ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６４１２号明細書に開示した。そして、これらα−イソマルトシル転移酵素とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とを用いることにより、グルコース重合度２以上の澱粉糖から環状四糖を生成し得ることを見出した。しかしながら、これら微生物はいずれもα−イソマルトシル転移酵素の産生量が充分でなく、環状四糖を大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題があった。
一方、今日では分子生物学が発展し、酵素の本質がポリペプチドであり、それを構成するアミノ酸配列がその酵素活性を左右するものであり、そのアミノ酸配列は遺伝子ＤＮＡによりコードされていることが明らかにされている。即ち、ポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、そのポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して、得られる形質転換体を培養することにより、比較的容易に所望量のポリペプチドが取得できるようになった。
斯かる状況に鑑み、上記α−イソマルトシル転移酵素の本質であるポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明し、斯かる構造の解明されたポリペプチドを遺伝子組換え技術により、大量、安価、安定に供給するのが急務となっている。
発明の開示
本発明の第一の課題は、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から環状四糖を生成するα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」と略記することもある。）を創製することである。
本発明の第二の課題は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
本発明の第三の課題は、斯かるＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
本発明の第四の課題は、斯かる組換えＤＮＡを導入した形質転換体を提供することにある。
本発明の第五の課題は、斯かる形質転換体を利用する、本発明のポリペプチドの製造方法を提供することにある。
本発明の第六の課題は、本発明のポリペプチドを利用する、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有しているグルコース重合度が３以上の糖質から環状四糖を生成する方法を提供することにある。
本発明の第七の課題は、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖とその用途を提供することにある。
本発明は、前記第一の課題を、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列若しくは、それらのアミノ配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドにより解決するものである。
本発明は、前記第二の課題を、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。
本発明は、前記第三の課題を、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能なＤＮＡにより解決するものである。
本発明は、前記第四の課題を、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
本発明は、前記第五の課題を、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を培養し、その培養物から前記ポリペプチドを採取してなる当該ポリペプチドの製造方法により解決するものである。
本発明は、前記第六の課題を、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質に本発明のポリペプチドを作用させて環状四糖を生成させる工程を含んでなる環状四糖の製造方法により解決するものである。
更に、本発明の第七の課題を、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖を製造し、斯かる環状四糖又はこれを含む混合糖質を含有せしめた飲食物、消し用品、医薬品などの組成物を提供することにより解決するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から環状四糖を生成する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。斯かる酵素は、本発明者等が土壌から単離した新規微生物Ｃ１１株及びＮ７５株の培養物からポリペプチドとして得ることができる。Ｃ１１株は、下記の性質を有しており、本発明者等は本菌を新規微生物バチルス　グロビスポルスＣ１１と命名し、平成１２年４月２５日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４として受託された。又、Ｎ７５株は、下記の性質を有しており、本発明者等は本菌を新規微生物バチルス　グロビスポルスＮ７５と命名し、平成１３年５月１６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１として受託された。なお、Ｃ１１株及びＮ７５株は、本発明者等がＰＣＴ／ＪＰ０１／０６４１２号明細書で開示した如く、グルコース重合度２以上の澱粉糖から、非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元性末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度３以上の糖質を生成する酵素、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をも産生する。
＜バチルス　グロビスポルスＣ１１株＞
Ａ　細胞形態
肉汁寒天培養（２７℃）
通常０．５乃至１．０×１．５乃至５μｍの桿菌。多形性なし。運動性あり。球形の胞子を細胞内の端に形成。膨潤した胞子嚢を形成。グラム陽性。
Ｂ　培養性質
（１）肉汁寒天平板培養（２７℃）
形状：円形　大きさは２日間で１乃至２ｍｍ。
周縁：全縁
隆起：半レンズ状
光沢：鈍光
表面：平滑
色調：不透明、淡い黄色
（２）肉汁寒天斜面培養（２７℃）
生育：中程度
形状：放散状
（３）肉汁ゼラチン穿刺培養（２７℃）
液化する。
Ｃ　生理学的性質
（１）ＶＰ試験：陰性
（２）インドールの生成：陰性
（３）硝酸からのガス生成：陽性
（４）澱粉の加水分解：陽性
（５）色素の生成：可溶性色素の生成はない
（６）ウレアーゼ：陽性
（７）オキシダーゼ：陽性
（８）カタラーゼ：陽性
2002040659.tif 000002
（１０）酸素に対する態度：好気性
（１１）炭素源の利用性と酸生成の有無
2002040659.tif 000003
（１４）ＤＮＡのＧＣ含量：３９％
＜バチルス　グロビスポルスＮ７５株＞
Ａ　細胞形態
（１）肉汁寒天培養、２７℃
通常０．５乃至１．０μｍ×１．５乃至５μｍの桿菌。多形性なし。運動性あり。球形の胞子を細胞内の端に形成。膨潤した胞子嚢を形成。グラム陽性。
Ｂ　培養性質
（１）肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：円形、大きさは２日間で１乃至２ｍｍ
周縁：全縁
隆起：半レンズ状
光沢：鈍光
表面：平滑
色調：不透明、淡い黄色
（２）肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育：中程度
形状：放散状
（３）肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化する。
Ｃ　生理学的性質
（１）ＶＰ試験：陰性
（２）インドールの生成：陰性
（３）硝酸からのガス生成：陽性
（４）澱粉の加水分解：陽性
（５）色素の生成：可溶性色素の生成はない
（６）ウレアーゼ：陽性
（７）オキシダーゼ：陽性
（８）カタラーゼ：陽性
（９）生育の範囲：ｐＨ５．７乃至９．０、温度１０乃至３５℃
（１０）酸素に対する態度：好気性
（１１）炭素源の利用性と酸生成の有無
2002040659.tif 000004
（１２）ＤＮＡのＧＣ含量：４０％
バチルス　グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４）又はバチルス　グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１）の培養物から得ることができるα−イソマルトシル転移酵素を、本発明者等がカラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組み合せて単離し、その性質・性状を調べたところ、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から、α−イソマルトシル転移することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する糖質を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが判明した。更に、当該ポリペプチドの理化学的性質は次のとおりであった。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、約８２，０００乃至１３２，０００ダルトン
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、約５０℃
（３）至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応で、ｐＨ約５．５乃至６．０
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持で、約４５℃以下に温度安定域を有する。
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ約４．５乃至１０．０の範囲内にｐＨ安定域を有する。
次に、本発明に係るα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質を解明すべく行った実験について説明する。
実験１　バチルス　グロビスポルスＣ１１由来のポリペプチドの調製
実験１−１　粗ポリペプチドの調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス　グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。これとは別に、容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、前記種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．８単位／ｍｌで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．５５単位／ｍｌであった。この培養物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシル転移酵素活性は約１．７単位／ｍｌ（総活性約３０，４００単位）で、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約０．５１単位／ｍｌ（総活性約９，１８０単位）であり、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型ポリペプチドであることが判明した。
なお、α−イソマルトシル転移酵素活性の測定は、パノースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、この基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量し、α−イソマルトシル転移酵素の活性１単位を上記条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量と定義した。
また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性の測定は、マルトトリオースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、３５℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中のマルトース量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位を上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量とした。なお、ＨＰＬＣは、『ショーデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製）を用い、カラム温度６０℃、溶離液として水を用い、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製）を用いて行なった。
上記した培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して、４℃で２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４１６ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシル転移酵素活性を約２８，０００単位、６−グルコシル酵素活性を約８，４４０単位を含むことが判明した。この粗酵素液を、三菱化学製『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシル転移酵素活性、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、いずれも、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に検出された。この非吸着画分を回収し、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安濃度が１Ｍから０Ｍに減少するリニアグラジエント、更に続いて、マルトテトラオース濃度が０ｍＭから１００ｍＭに上昇するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシル転移酵素活性とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は分離してカラムから溶出し、α−イソマルトシル転移酵素活性は、硫安のリニアグラジエントでその濃度が約０Ｍ付近の画分に検出され、一方、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マルトテトラオースのリニアグラジエントでその濃度が約３０ｍＭ付近の画分に検出された。次いで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分とα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め、それぞれ、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する粗ポリペプチド、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する粗ポリペプチドとして回収した。
更に、以下の手法により、α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドと、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドとを別々に精製し、分取した。
実験１−２　α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの精製
実験１−１で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する粗ポリペプチドを、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水性カラムクロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素活性は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度が１Ｍから０Ｍに減少するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素活性が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００ゲル』を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。この各精製ステップにおけるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
2002040659.tif 000005
2002040659.tif 000006
α−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを、７．５％（ｗ／ｖ）濃度のポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動にかけてその純度を検定したところ、単一の蛋白質バンドを示す純度の高い標品であった。
実験１−３　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製
実験１−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する粗ポリペプチドを、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水性カラムクロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素活性は、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度が１Ｍから０Ｍに減少するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した酵素活性成分が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００ゲル』を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。この各精製ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
2002040659.tif 000007
精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を、７．５％（ｗ／ｖ）濃度のポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動にかけてその純度を検定したところ、単一の蛋白質バンドを示す純度の高い標品であった。
実験２　α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質
実験２−１　作用
基質として、グルコース、６−Ｏ−α−グルコシルグルコース（別名、イソマルトース）、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース（別名、パノース）、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース（別名、イソマルトシルマルトース）、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、または６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオースを１０ｍＭ含む水溶液を調製し、これに実験１−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを基質１ｍＭ当り２単位加え、３０℃、ｐＨ６．０で１２時間反応させた。反応物を常法により脱塩後、三菱化学製ＨＰＬＣ用カラム『ＭＣＩ　ＧＥＬ　ＣＫ０４ＳＳ』を用いるＨＰＬＣにより糖組成を分析した。ＨＰＬＣは温度８０℃で実施し、溶出液を東ソー製示差屈折計『ＲＩ−８０１２型』でモニターしながら、溶離液として水を０．４ｍｌ／分の流速でカラムに通液した。結果を表３に示す。
2002040659.tif 000008
表３中、イソマルトシルパノースは、構造式１又は２の構造を有する糖質（２種類の糖質）、およびイソマルトシルパノシドは、構造式３の構構造を有する糖質である。
構造式１：
2002040659.tif 000009
構造式２：
2002040659.tif 000010
構造式３：
2002040659.tif 000011
表３の結果は、バチルス　グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドが、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度３以上の糖質である６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオースに作用して、主に環状四糖と、基質よりもグルコース重合度が２低下したマルトオリゴ糖を生成したことを示している。反応物からはこれら環状四糖と、基質よりもグルコース重合度が２低下したマルトオリゴ糖と未反応の基質に加えて、加水分解作用に由来すると考えられる微量のイソマルトースと、転移作用に由来すると考えられる環状四糖以外のその他の糖質が検出された。個々の基質からの環状四糖の収量は、固形物当り、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトースからは４３．５％、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオースからは３０．８％、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオースからは２５．６％、６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオースからは１８．２％であった。なお、グルコースおよび６−Ｏ−α−グルコシルグルコースからは新たな糖質の生成を見なかった。
実験２−２　Ｎ末端側アミノ酸配列
常法により、パーキン・エルマー製気相プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』を使用して分析したところ、α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドは、Ｎ末端側に配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列を有していた。
実験２−３　部分アミノ酸配列
実験１−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を１０μｇ加え、３０℃、２２時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物を、予め８％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいた液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８カラム』（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）に負荷し、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−８％アセトニトリル溶液から０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−４０％アセトニトリル溶液に１２０分間かけて変化するリニアグラジエントを通液し、カラムから溶出したペプチド断片を波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。通液開始から約２２分後、約３８分後、約４０分後、約６３分後および約７１分後に溶出したペプチド断片を含む画分をそれぞれ採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸にそれぞれ溶解した。以降、実験２−２と同様に分析したところ、５種類のペプチド断片が得られ、それらペプチド断片は、配列表における配列番号６乃至１０に示すアミノ酸配列を有していた。
実験２−４　分子量
ユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて、実験１−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量約８２，０００乃至１２２，０００ダルトンに相当する位置に、当該酵素活性を有する単一の蛋白質バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカーは、ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）およびオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。
実験２−５　至適温度
実験１−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを、常法により、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、異なる温度で３０分間反応させたところ、第１図に示すように、当該ポリペプチドは、約５０℃に至適温度を示した。
実験２−６　至適ｐＨ
実験１−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを、常法により、ｐＨの相違するマッキルヴェイン氏緩衝液中、３５℃で３０分間反応させたところ、第２図に示すように、当該ポリペプチドは、ｐＨ約５．５乃至６．０に至適ｐＨを示した。
実験２−７　熱安定性
実験１−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを、常法により、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、異なる温度で６０分間インキュベートしたところ、当該ポリペプチドは、第３図に示すように、約４０℃以下に温度安定域を有していた。
実験２−８　ｐＨ安定性
実験１−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを、常法により、ｐＨの異なるマッキルヴェイン氏緩衝液または５０ｍＭ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、４℃で２４時間インキュベートしたところ、当該ポリペプチドは、第４図に示すように、ｐＨ約４．５乃至９．０の範囲にｐＨ安定域を有していた。
実験３　バチルス　グロビスポルスＮ７５由来のポリペプチド
実験３−１　粗ポリペプチドの調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス　グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養液とした。
容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後の培養液中の本酵素活性は約１．１単位／ｍｌであり、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの本酵素活性は１．１単位／ｍｌ（総酵素活性約１９，８００単位）で、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は約０．３３単位／ｍｌの活性（総活性約５，４９０単位）であり、両酵素活性共に培養上清中に検出される分泌型ポリペプチドであることが判明した。
上記した培養上清約１８Ｌを６０％飽和硫安液で塩析して４℃で２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約４５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシル転移酵素活性を約１５，７００単位、α−イソマルトシルクルコ糖質生成酵素活性を約４，７１０単位有していた。この粗酵素液を、実験１−１に記載の『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル（三菱化学株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。α−イソマルトシル転移酵素活性画分は、セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３ゲルに吸着した。続いて、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍに上昇するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分は、ＮａＣｌのリニアグラジエント濃度が約０．２５Ｍ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシル転移酵素活性画分と、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分とを別々に集め、それぞれ、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する粗ポリペプチド、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する粗ポリペプチドを得た。
更に、以下の精製方法により、α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドと、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドとを別々に精製し、分取した。
実験３−２　α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの精製
実験３−１で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する粗ポリペプチドを、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除去し、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製）を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本ポリペプチドは、セファクリルＨＲ　Ｓ−２００ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍに減少するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。更に、本酵素活性画分を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本ポリペプチドは、ブチル−トヨパール６５０Ｍゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍに減少するのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。この回収液を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『スーパーＱ−トヨパール（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｃ）』ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。本ポリペプチドは、スーパーＱ−トヨパール（ＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｃ）ゲルに吸着せずに非吸着画分に溶出した。この溶出画分を回収し、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを得た。これら各精製ステップに於けるα−イソマルトシル転移酵素活性量、比活性、収率を表４に示す。
2002040659.tif 000012
７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、本実験で最終的に得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で、純度の高い標品であった。
実験３−３　α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製
実験３−１で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する粗ポリペプチドを１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。本酵素活性成分は、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍに減少するリニアグラジエント、続いて、マルトテトラオース濃度０ｍＭから１００ｍＭに上昇するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、リニアグラジエントのマルトテトラオース濃度が約３０ｍＭ付近で吸着していたゲルから溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）に供した。本酵素は、ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍに減少するリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近でゲルに吸着した本酵素活性成分が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。この回収液を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００ゲルを用いるアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。これら各精製ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
2002040659.tif 000013
2002040659.tif 000014
得られた精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により本酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
実験４　α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質
実験４−１　作用
基質として、グルコース、６−Ｏ−α−グルコシルグルコース（別名、イソマルトース）、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース（別名、パノース）、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース（別名、イソマルトシルマルトース）、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、又は６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオースを１０ｍＭ含む水溶液を調製し、これに実験３−２で調製したα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを基質１ｍＭ当たり２単位加え、３０℃、ｐＨ６．０で１２時間反応させた。反応物を常法により脱塩した後、実験２−１に記載したＨＰＬＣ法により糖組成を分析した。その結果を表６に示す。
2002040659.tif 000015
表６の結果は、バチルス　グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドが、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度３以上の糖質である６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、及び６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオースに作用して、主として、環状四糖と、用いた基質よりもグルコース重合度が２低下したマルトオリゴ糖を生成したことを示している。反応物からは、これら環状四糖と、基質よりもグルコース重合度が２低下したマルトオリゴ糖未反応の基質に代えて、加水分解作用に由来すると考えられる微量のイソマルトースと、転移作用に由来すると考えられる環状四糖以外のその他の糖質が検出された。基質としての６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、及び６５−Ｏ−α−グルコシルマルトペンタオースを用いたときの環状四糖の生成収率は、固形物当たり、それぞれ４３．２％、３０．９、２５．８％及び１８．７％であった。６−Ｏ−α−グルコシルグルコースからは、新たな糖質の生成を認めなかった。
実験４−２　Ｎ末端側アミノ酸配列
常法により、実験３−２で調製したα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドのＮ末端側アミノ酸配列を『プロテインシーケンサー　モデル４７３Ａ』（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列を有していた。
実験４−３　部分アミノ酸配列
実験３−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で透析した後、同緩衝液を用いて約１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。この希釈液約１ｍｌにリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）１０μｇを加え、３０℃で２２時間反応させて精製ポリペプチドを部分加水分解した。得られた部分加水分解物を、予め４％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいた液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム』（直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウオーターズ社製）に負荷し、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１％トリフルオロ酢酸−４％アセトニトリル溶液から０．１％トリフルオロ酢酸−４２．４％アセトニトリル溶液に９０分間かけて変化するリニアグラジエントを通液し、カラムから溶出したペプチド断片を波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。通液開始から、約２１分後、約３８分後、約５６分後及び約６９分後に溶出したペプチド断片を含む画分をそれぞれ採取し、各々真空乾燥した後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸にそれぞれ溶解した。以降、実験２−２と同様に分析したところ、配列表における配列番号８及び１１乃至１４に示すアミノ酸配列を有する５種類のペプチド断片が得られた。
実験４−４　分子量
実験３−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを、実験２−４と同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して当該ポリペプチドの分子量を測定したところ、分子量約９２，０００乃至１３２０，０００ダルトンに相当する位置に、当該酵素活性を有する単一の蛋白質バンドが検出された。
実験４−５　至適温度
実験１−１に示すα−イソマルトシル転移酵素の活性測定方法に準じて、実験３−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、各種温度で３０分間反応させたところ、第５図に示すように、当該ポリペプチドの至適温度は約５０℃であった。
実験４−６　至適ｐＨ
実験１−１に示すα−イソマルトシル転移酵素の活性測定方法に準じて、実験３−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを各種ｐＨのマッキルヴェイン氏緩衝液中で、３５℃で３０分間反応させたところ、第６図に示すように、当該ポリペプチドの至適ｐＨはｐＨ約６．０であった。
実験４−７　熱安定性
実験１−１に示すα−イソマルトシル転移酵素の活性測定方法に準じて、実験３−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、各種温度で６０分間反応させたところ、当該ポリペプチドは、第７図に示すように、約４５℃以下に温度安定域を有していた。
実験４−８　ｐＨ安定性
実験１−１に示すα−イソマルトシル転移酵素の活性測定方法に準じて、実験３−２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する精製ポリペプチドを各種ｐＨのマッキルヴェイン氏緩衝液又は５０ｍＭ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中で、４℃で２４時間反応させたところ、第８図に示すように、α−イソマルトシル転移酵素を有する精製ポリペプチドのｐＨ安定域は、ｐＨ約４．５乃至１０．０の範囲であった。
実験５　バチルス　グロビスポルスＣ１１由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体
実験５−１　染色体ＤＮＡの調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』２．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物『アサヒミースト』１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％および水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・グロビスポルス　Ｃ１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇおよび１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌとなるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、得られた溶液を−８０℃で凍結した。
実験５−２　組換えＤＮＡ　ｐＢＧＣ１と形質転換体ＢＧＣ１の調製
実験５−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ　３ＡＩを約３５単位加え、３７℃で２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、ストラタジーン・クローニング・システム製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）』を常法により制限酵素Ｂａｍ　ＨＩを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを宝酒造製『ＤＮＡライゲーション・キット』を用いて、添付の説明書にしたがって操作して連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりストラタジーン・クローニング・システム製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。このようにして得た遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム塩１００ｍｇ／Ｌおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０ｍｇ／Ｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約５，０００個をアマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に固定した。別途、実験２−３の方法で明らかにした、配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列における第１番目より第６番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＡＡＹＴＧＧＴＧＧＡＴＧＷＳＮＡＡ−３′で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識して、合成ＤＮＡ（プローブ１）を得た。次いで、先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーを、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適用して４種類の形質転換体を選択した。常法により、これら４種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列における第９番目より第１４番目までのアミノ酸配列に基づき、５′−ＧＴＮＴＴＹＡＡＹＣＡＲＴＡＹＡＡ−３′で表わされる塩基配列のプローブ２を化学合成し、同様に同位体標識した後、通常のサザーン・ハイブリダイズ法を適応して、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、選択した形質転換体を『ＢＧＣ１』と命名した。この形質転換体ＢＧＣ１を常法にしたがい、アンピシリンナトリウム塩１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養し、培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、バチルス　グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４）に由来する、鎖長３８６９塩基対の、配列表における配列番号１５に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。当該組換えＤＮＡにおいて、前記配列表における配列番号１５に示す塩基配列からなるＤＮＡは、第９図中、黒い太線で示す部分で表され、制限酵素Ｘｂａ　Ｉによる認識部位の下流に連結されていた。
一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号１５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験２−２の方法で確認されたα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドのＮ末端側のアミノ酸配列および実験２−３の方法で明らかにされた中間部部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号５および配列番号６乃至１０に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列は、配列番号１５に併記したアミノ酸配列における第３０番目から第４８番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号６、７、８、９および１０に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号１５に併記したアミノ酸配列における第５８４乃至５９７番目、第２９２乃至３０５番目、第５４５乃至５５０番目、第６６乃至７７番目および第３９０乃至４００番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドが配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含むものであり、当該ポリペプチドはバチルス　グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４）においては、配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。また、配列表における配列番号１５に併記したアミノ酸配列における第１乃至２９番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表における配列番号１５に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号１５に示す塩基配列にコードされていることが判明した。以上のようにして調製し、塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＢＧＣ１』と命名した。
実験６　バチルス　グロビスポルスＮ７５由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製
実験６−１　染色体ＤＮＡの調製
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．０％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃で２０分間滅菌し、冷却して、バチルス　グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１）を接種し、２７℃で２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、逮心分離して上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
実験６−２　組換えＤＮＡ　ｐＢＧＮ１と形質転換体ＢＧＮ１の調製
実験６−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を０．１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｃ　Ｉを約１００単位加え、３７℃で６時間反応させて染色体ＤＮＡを分解した後、アガロース電気泳動法により分離し、クオンタム・バイオテクノロジー社製のＤＮＡ精製用キット『ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＩＩ　ＫＩＴ）』を用いて、本キットに添付された説明書に従って操作して、約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を回収した。別途、ストラタジーン・クローニング・システム製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）』を常法により制限酵素Ｓａｃ　Ｉ作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを宝酒造製『ＤＮＡライゲーション・キット』を用いて、本キットに添付された説明書にしたがって操作して連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりストラタジーン・クローニング・システム製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。このようにして得た遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム塩１００ｍｇ／Ｌ、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０ｍｇ／Ｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約４，０００個をアマシャム製ナイロン膜『ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ＋』上に固定した。別途、実験２−３の方法で明らかにした、配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列における第１番目より第６番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＡＡＹＴＧＧＴＧＧＡＴＧＷＳＮＡＡ−３′で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識して合成ＤＮＡ（プローブ１）を得た。次いで、先に得たナイロン膜上に固定したコロニーの内、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーを、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適応して２種類の形質転換体を選択した。常法により、これら２種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表における配列番号１４に示すアミノ酸配列における第８番目から第１５番目までのアミノ酸配列に基づき、５′−ＧＡＹＴＧＧＡＴＨＧＡＹＴＴＹＴＧＧＴＴＹＧＧ−３′で表わされる塩基配列のプローブ２を化学合成し、同様に同位体標識後、通常のサザン・ブロット・ハイブリダイゼーション法を適応して、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、当該形質転換体を『ＢＧＮ１』と命名した。この形質転換体ＢＧＮ１を常法にしたがい、アンピシリンナトリウム塩を１００μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養し、培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、バチルス　グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１）に由来する、鎖長４９８６塩基対の、配列表における配列番号１６に示す塩基配列からなるＤＮＡを含んでいた。当該組換えＤＮＡに於いて、前記配列表における配列番号１６に示される塩基配列からなるＤＮＡは、第１０図中、黒い太線で表され、制限酵素Ｓａｃ　Ｉによる認識部位の下流に連結していた。
一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号１６に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験４−２の方法で確認されたα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドのＮ末端側のアミノ酸配列及び実験４−３の方法で明らかにされた中間部部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号５、８、及び１１乃至１４に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列は、配列番号１６に併記したアミノ酸配列における第３０乃至４８番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号８、１１、１２、１３及び１４に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号１６に併記したアミノ酸配列における第５４５乃至５５０番目、第５６５乃至５８２番目、第６６乃至８３番目、第３９０乃至４０６番目及び第７９０乃至８０９番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、α−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドが配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を含むものであり、当該ポリペプチドは、バチルス　グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１）においては、配列表における配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。また、配列表における配列番号１６に併記したアミノ酸配列における第１乃至２９番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表における配列番号１６に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号１６に示す塩基配列にコードされていることが判明した。以上のようにして調製し、塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＢＧＮ１』と命名した。
実験７−１　形質転換体によるα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの産生
実験７−２　形質転換体ＢＧＣ１
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌおよびリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験３−２の方法で得た形質転換体ＢＧＣ１を接種し、２７℃で約４８時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリペプチドの所在を調べるために、常法にしたがい、遠心分離して培養上清と菌体とを分離して回収し、更に、菌体については、超音波破砕法による細胞からの全抽出物と、浸透圧ショック法による細胞ペリプラズムからの抽出物とを別々に調製した。超音波破砕法は、菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモゲナイザー『モデルＵＨ−６００』（株式会社エスエムテー製）で細胞破砕することによって行い、その破砕物を細胞全抽出物とした。浸透圧ショック法は、菌体を３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄した後、洗浄菌体をスクロース２００ｇ／Ｌおよび１ｍＭＥＤＴＡを含む３３ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）に懸濁し２７℃で２０分間振盪し、続いて、遠心分離して菌体を回収し、その菌体を、予め約４℃に冷却しておいた０．５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液に懸濁し、氷水中で２０分間振盪して細胞ペリプラズムから抽出した。その後、遠心分離して、上清を回収し、その上清を細胞ペリプラズム抽出物とした。このようにして調製した培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリプラズム抽出物について、それぞれのα−イソマルトシル転移酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。結果を表７に示す。
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表７の結果から明らかなように、大腸菌形質転換体ＢＧＣ１は、本発明のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドを細胞内に産生し、その大部分は細胞ペリプラズムに分泌されることが判明した。
なお、第一の対照として、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外はすべて上述の形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、バチルス　グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４）を、アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物とも当該酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清および菌体破砕物には当該酵素活性がそれぞれ約１．２単位および約０．１単位含まれ、培養物当たりの全酵素活性は約１．３単位であった。この酵素活性は、形質転換体ＢＧＣ１の培養物当たりの全酵素活性３．４単位と比較すると明らかに低レベルであった。
本実験で得た細胞ペリプラズム抽出物を、更に実験１に示した方法に準じて、塩析、透析し、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３ゲル』、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００ゲル』、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍゲル』を用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、更にこの精製酵素ポリペプチドを実験２に示した方法に準じて分析した。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は約８２，０００乃至１２２，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点は約５．１乃至６．１、α−イソマルトシル転移酵素活性の至適温度は約５０℃、至適ｐＨは約５．５乃至６．０、温度安定性は約４５℃まで、ｐＨ安定性は約４．５乃至９．０であり、実験１に示した方法で調製されたα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドが、組換えＤＮＡ技術によって大量、安価かつ安定に製造できることを示している。
実験７−２　形質転換体ＢＧＮ１
澱粉部分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ及びリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験６−２の方法で得た形質転換体ＢＧＮ１を接種し、２７℃で約４８時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリペプチドの所在を調べるために、常法にしたがい、遠心分離して培養上清と菌体とを分離して回収し、更に、実験７−１と同様に、超音波破砕法による細胞からの全抽出物と、浸透圧ショック法による細胞ペリプラズムからの抽出物とを別々に調製した。培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリプラズム抽出物それぞれにつき、α−イソマルトシル転移酵素活性を測定し、それらの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。結果を表８に示す。
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表８の結果から明らかなように、大腸菌形質転換体ＢＧＮ１は、本発明のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドを細胞内に産生し、その大部分は細胞ペリプラズムに分泌されることが判明した。また、当該酵素活性は、培養上清にも認められた。
なお、第一の対照として、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外はすべて上述の形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、バチルス・グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１）を、アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物とも当該酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清および菌体破砕物には当該酵素活性がそれぞれ約０．７単位および約０．１単位含まれ、培養物当たりの全酵素活性は約０．８単位であった。この酵素活性は、形質転換体ＢＧＮ１の培養物当たりの全酵素活性３．３単位と比較すると明らかに低レベルであった。
本実験で得た細胞ペリプラズム抽出物を、更に実験３に示した方法に準じて、塩析、透析し、『セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３ゲル』、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ＨＲ　Ｓ−２００ゲル』、『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍゲル』を用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、更にこの精製ポリペプチドを実験４の方法に準じて分析した。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は約９２，０００乃至１３２，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点は約７．３乃至８．３、α−イソマルトシル転移酵素活性の至適温度は約５０℃、至適ｐＨは約６．０、温度安定域は約４５℃以下で、ｐＨ安定域は約４．５乃至１０．０の範囲であり、実験３の方法で調製されたα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のポリペプチドが、組換えＤＮＡ技術によって大量、安価かつ安定に製造できることを示している。
以上説明したように、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から環状四糖を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列、若しくは、そのアミノ配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明者の長年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知の酵素には見られない独特の理化学的性質を具備している。本発明は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、斯るポリペプチドを創製しようとするものである。以下、実施例等を参照しながら、本発明のポリペプチド並びに製造方法および用途につき具体的に説明する。
本発明で言うポリペプチドとは、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から環状四糖を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列、若しくは、そのアミノ配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチド全般を意味する。本発明のポリペプチドは、通常、解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号１又は２に示すＮ末端からのアミノ酸配列またはそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体は、所期の理化学的性質を実質的に変えることなく、配列番号１又は２のアミノ酸配列における構成アミノ酸の１若しくは複数個、即ち、１個または２個以上、場合によっては、１乃至５０個、或いは、１乃至３０個、若しくは、１乃至１０個を欠損させたり、他のアミノ酸で置換したり、更には付加することにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地成分、組成や培養温度、ｐＨなどによっては、宿主内外酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の理化学的性質は保持しているものの、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１若しくは複数個、即ち、１個または２個以上、場合によっては、１乃至３０個、或いは、１乃至２０個、若しくは、１乃至１０個欠失させたり、他のアミノ酸と置換したり、更にはＮ末端に１個または２個以上、場合によって、１乃至３０個、或いは、１乃至２０個、若しくは、１乃至１０個のアミノ酸が新たに付加した変異体が生成することがある。斯かる変異体であっても、それが所望の理化学的性質を具備している限り、当然、本発明のポリペプチドに包含されることは言うまでもない。
本発明のポリペプチドは、本発明のＤＮＡを適宜宿主に導入し、得られる形質転換体の培養物から採取することができる。本発明で使用する形質転換体としては、例えば、配列表における配列番号３又は４に示す５’末端からの塩基配列若しくは、その塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列、または、それらに相補的な塩基配列若しくはそれらの塩基配列における１若しくは複数個を、遺伝子の縮重に基づき、それがコードするアミノ酸配列を変えることなく他の塩基で置換した塩基配列からなるＤＮＡを含む形質転換体を例示できる。また、上記塩基配列として、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１若しくは複数個、即ち、１個または２個以上、場合によっては、１乃至１９０個、或いは、１乃至６０個、若しくは、１乃至３０個を他の塩基に置き換えたものを例示できる。
本発明に係るＤＮＡは、それが前述のような塩基配列を有する限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、バチルス　グロビスポルスＣ１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７１４４）及びバチルス　グロビスポルスＮ７５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５９１）を含むバチルス属の微生物が挙げられる。これら微生物の菌体から本発明のＤＮＡを含む遺伝子を得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１乃至約３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られる。一方、ＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含む遺伝子を鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ合成することも有利に実施できる。このようにして化学合成した配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含む組換えＤＮＡを採取すればよい。
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。このうち、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣおよびλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１およびφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７およびｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素および／または超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子およびベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ　３ＡＩ、Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、Ｂａｍ　ＨＩ、Ｓａｌ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｓａｃ　Ｉ、Ｐｓｔ　Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内または生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を含む栄養培地で培養し、該糖質より環状四糖を生成するものを選択すればよい。
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に本発明のポリペプチドを産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、更には、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用される。個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース、β，β−トレハロースなどの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニアおよびその塩類、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機／有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に接種し、栄養培地を温度２０乃至４０℃、ｐＨ２乃至１０に保ちつつ、通気攪拌などによる好気的条件下で約１乃至約６日間培養すれば、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。この培養物は酵素剤としてそのまま使用可能であるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出したり、超音波や細胞溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより本発明のポリペプチドを菌体または菌体破砕物から分離し、精製する。その精製方法としては、通常、ポリペプチドを精製するための通常の方法が採用でき、例えば、菌体または菌体破砕物を除去した培養物に、濃縮、塩析、透析、分別沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの一種または二種以上を適宜組合わせて適用すればよい。
本発明のポリペプチドは、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質から環状四糖を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列若しくは、そのアミノ配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するという従来の酵素には見られない独特の性質を有する。生成した環状四糖は、非還元性であるが故に、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変や劣化が少ないと共に、環状糖質の故にエチルアルコールや酢酸など揮発成分との包接能を有しており、更には、過度の甘味によって食品本来の風味を損なうことの少ない温和で低甘味な糖質であり、難発酵性、難消化性で食物繊維として好適であるなど有用な特性を有している。
環状四糖の生成方法につき説明する。当該環状四糖は、本発明のポリペプチドをその基質、即ち、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質に作用させることにより得ることができる。斯かる糖質としては、澱粉、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲンなどの澱粉または澱粉質やそれらを酸および／またはアミラーゼで部分加水分解したものを、α−グルコシダーゼ、デキストリンデキストラナーゼ、先に本発明者等がＰＣＴ／ＪＰ０１／０６４１２号明細書で開示した、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素などによって糖転移させて得られる糖質、或いは、プルランをβ−アミラーゼとプルラナーゼ共存下で加水分解することにより得られる糖質を例示することができる。これら糖質としては、通常、６２−Ｏ−α−グルコシルマルトース、６３−Ｏ−α−グルコシルマルトトリオース、６４−Ｏ−α−グルコシルマルトテトラオース、６５−Ｏ−α−グルコシルマパノースなどの非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質の一種または二種以上の糖質を例示することができる。
本発明のポリペプチドを用いての環状四糖の生成方法に於いては、上記した非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質が生成する前後に本発明のポリペプチドを共存させて、糖質が生成した後に作用させることも、当該糖質の生成開始時または生成途中で、本発明のポリペプチドを共存させて作用させることも随意である。通常、基質として上記したような糖質の一種または二種以上を含む水溶液などの適宜溶液中に本発明のポリペプチドを共存せしめ、水溶液を所定の温度、ｐＨに保ちつつ、所望量の環状四糖が生成するまで反応させる。反応は０．１％程度の基質濃度下でも進行するが、環状四糖の生成方法を大規模に実施するには、より高濃度の１％（ｗ／ｗ）（以下、本明細書では、特にことわらない限り、「％（ｗ／ｗ）」を「％」と略称する。）以上、望ましくは、５乃至５０％とするのがよい。反応温度は反応が進行する温度、すなわち６０℃付近までで行なえばよいが、好ましくは３０乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４．５乃至８の範囲でに調整すればよいが、好ましくはｐＨ約５．５乃至約７の範囲に調整する。本発明のポリペプチドの使用量と反応時間は密接に関係しており、目的とする反応の程度により適宜選択すればよい。反応に際しては、当該ポリペプチドを公知の手法で適宜担体に固定化して、固定化ポリペプチドとして用いることも随意である。
上記の反応によって得られた反応液は、通常、環状四糖と共にグルコース、マルトースなどマルトデキストリン、更には、非還元末端の結合様式としてα−１，６グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシル結合を有するグルコース重合度３以上のオリゴ糖などを含有しており、そのまま環状四糖含有糖液として用いることができる。必要に応じて、本発明のポリペプチドを作用させた後に、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびα−グルコシダーゼから選ばれる一種または二種以上を作用させて、夾雑するオリゴ糖を加水分解した環状四糖含有液として用いることもできる。一般的には、更に、精製して用いられる。精製方法としては、公知の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭での脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂での脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、環状四糖を利用せず夾雑糖質を資化または分解する微生物、例えば、乳酸菌、酢酸菌、酵母などによる発酵処理、アルカリ処理などによる残存している還元性糖質の分解除去などの方法から選ばれる一種または二種以上の精製方法が有利に採用できる。とりわけ、工業的大量製造方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより環状四糖以外の夾雑糖類を除去し、目的物の含量を向上させた環状四糖またはこれを含む糖質水溶液を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式、バッチ方式、半連続方式、連続方式のいずれの方式をも採用することができる。
このようにして得られた環状四糖、またはその含量を向上させ環状四糖高含有物は、通常、環状四糖を、固形物当り、１０％以上、望ましくは４０％以上含有する水溶液で、通常、これを濃縮し、シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。更には、本発明における環状四糖の結晶を製造するには、通常、前記の精製方法を用いた、望ましくは環状四糖を、固形物当り約４０％以上含有する糖質水溶液が用いられる。結晶の形態として、５乃至６含水結晶を製造する場合には、通常、この糖質水溶液を環状四糖の過飽和水溶液、例えば、濃度約４０％乃至約９０％水溶液とし、これを助晶缶にとり、約０．１乃至約２０％の種結晶共存下で、過飽和を保つ温度、望ましくは、１０乃至９０℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、結晶を含有するマスキットを製造する。環状四糖１含水結晶や無水結晶を晶出させる場合には、一般的には、更に高濃度、高温度での過飽和条件が採用される。マスキットから結晶またはこれを含有する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。環状四糖１含水結晶や無水結晶は環状四糖５乃至６含水結晶を脱水または乾燥させて製造することもできる。このようにして製造される環状四糖結晶またはこれの高含有粉末は、上品で温和な低甘味を有する非還元性乃至低還元性の白色粉末で、耐酸性、耐熱性に優れた安定な糖質であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することも少なく、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、吸湿性も低く、粉末状物の付着、固結を防止できる。
また、環状四糖自体は、包接能を有していることから、香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化が防止されることから、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れており、保香剤、安定剤などとして好適である。この際、必要ならば、他の環状糖質、例えば、環状デキストリン類、分岐環状デキストリン類、環状デキストラン類、環状フラクタン類などを併用して、安定化を強化することも有利に実施できる。
更に、環状四糖自体は、アミラーゼやα−グルコシダーゼによって分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、また、腸内細菌によって醗酵されにくく、極めて低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。換言すれば、環状四糖を摂取すれば、糖質としての重量、容量があるので、満腹感が得られものの実質的に消化されず、低カロリー食品素材、ダイエット食品素材として好適である。また、虫歯誘発菌などによっても、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。
更に、環状四糖自体は、耐酸性、耐アルカリ性、耐熱性に優れた無毒、無害の天然甘味料である。また安定な甘味料であることにより、結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターち、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤と糖衣錠として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、離水防止性、固結防止性、保香性、安定性、他の糖類の晶出防止性、難醗酵性、澱粉老化防止性、蛋白質変性防止性、脂質劣化防止性などの性質を具備している。
従って、環状四糖またはこれを含む糖質は、甘味料、難醗酵性食品素材、難消化性食品素材、低う蝕性食品素材、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、固結防止剤、保香剤、澱粉老化防止剤、蛋白質変性防止剤、脂質劣化防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、そのままで、または必要に応じて、当該糖質と公知材料とを適宜併用してして、各種組成物、例えば、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などのに有利に利用できる。公知の材料としては、例えば、呈味料、着色料、着香料、強化剤、乳化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、薬効成分などが適宜利用できる。
環状四糖またはこれを含む糖質は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース、β，β−トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロース、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料と併用して使用することも、また、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。とりわけ、エリスリトール、キシリトール、マルチトールなどの低カロリー甘味料や、α−グリコシルステビオシド、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファムＫ、スクラロースなどの高甘味度甘味料などと併用して、低カロリー甘味料またはダイエット甘味料などとして利用することも好適である。
また、環状四糖またはこれを含む糖質の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である。
更に、環状四糖またはこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、風味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のたれ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりン、新みりン、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料へ甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステら、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム（ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウに、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タら、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、果実酒、酒などの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、アミノ酸含有飲料、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、風味改良に、品質改良などに有利に実施できる。
また、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上またはカロリーを低減させるなどの目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローち、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などの嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、更に品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、化粧品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのサイトカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、クマザサエキス、モモの葉エキス、ビワの葉エキス、ユズの皮エキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品、化粧品、医薬品などを容易に製造できることとなる。
以上述べたような各種組成物に環状四糖またはこれを含む糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その配合量は、環状四糖の種々の特性、とりわけ包接作用、呈味改良、風味改良などを発揮させるためには、環状四糖として、固形物当たり０．１％未満では不充分で、通常０．１％以上、望ましくは１％以上含有せしめるのが好適である。
以下、実施例により、本発明のポリペプチドの製造方法、それを用いる環状四糖、またはそれを含む糖質の製造方法について具体的に説明する。
実施例１　ポリペプチドの製造
澱粉部分分物『パインデックス＃４』５ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌおよびリン酸一水素ナトリウム１ｇ／Ｌを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩を１００μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実験５−２の方法で得た形質転換体ＢＧＣ１を接種し、３７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。次に、３０Ｌ容ファーメンターに上記と同じ組成の液体培地を約１８Ｌとり、同様に滅菌し、２７℃まで冷却後、アンピシリンナトリウム塩を５０μｇ／ｍｌ加え、種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、２７℃で４８時間通気培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の本発明のポリペプチドのα−イソマルトシル転移酵素活性を測定したところ、培養物１Ｌ当り、約３，１００単位の酵素活性が検出された。この上清を用いて実験１の方法により精製したところ、比活性約３０単位／ｍｇ蛋白質のα−イソマルトシル転移酵素活性を有する本発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約１３５単位含む水溶液が約７４ｍｌ得られた。
実施例２　ポリペプチドの製造
実施例１に記載した方法に準じて、実験６−２で得た形質転換体ＢＧＮ１を種培養した後、３０Ｌ容ファーメンターを用いて主培養した。得られた培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の本発明のポリペプチドのα−イソマルトシル転移酵素活性を測定したところ、培養物１Ｌ当り、約３，０００単位の酵素活性が検出された。この上清を用いて実験３の方法により精製したところ、比活性約３０単位／ｍｇ蛋白質のα−イソマルトシル転移酵素合戦を有する本発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約７２単位含む水溶液が約１５０ｍｌ得られた。
実施例３　環状四糖を含む粉状物の製造
パノース（株式会社林原生物化学研究所製）を１０％濃度になるように水に溶解させた後、ｐＨ６．０、温度３５℃に調製し、これに実施例１の方法で得た酵素ポリペプチドをパノース１グラム当たり２単位の割合になるように加え、３６時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に、濃縮し、乾燥し、粉砕して、環状四糖含有粉末を固形物当たり収率約９１％で得た。
本品は、固形物当たり、グルコース３４％、イソマルトース２．１％、パノース２．３％、環状四糖４５．０％、イソマルトシルパノース４．８％、イソマルトシルパノシド１．８％、およびその他の糖質を１０．０％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など組成物に有利に利用できる。
実施例４　環状四糖を含むシロップ状組成物の製造
粉末マルトース（登録商標『サンマルト』、株式会社林原製）を３０％水溶液とし、これにα−グルコシダーゼを含有する酵素剤（天野製薬株式会社、商品名『トランスグルコシダーゼ　Ｌ「アマノ」』）をマルトース固形物当たり０．０８％加え、ｐＨ５．５に調整し、５５℃で１８時間反応させ、次いで加熱失活させた後、ｐＨ６．０、温度３５℃に調製し、これに実施例１の方法で得た酵素ポリペプチドを固形物１グラム当たり２単位の割合になるように加え、３６時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度７０％のシラップを固形物当たり収率約９２％で得た。
本品は、固形物当たり、グルコース３２．５％、マルトース１５．７％、イソマルトース９．８％、マルトトリオース４．０％、パノース０．３％、イソマルトトリオース１．６％、環状四糖１７．５％、イソマルトシルパノース１．２％、イソマルトシルパノシド０．７％、およびその他の糖質を１６．７％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
実施例５　環状四糖結晶粉末の製造
１５％馬鈴薯澱粉乳に最終濃度０．１％となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製、商品名『ターマミール６０Ｌ』を澱粉１グラム当り０．２％になるように加え、９５℃で１５分間反応させた。その反応液を２ｋｇ／ｃｍ２の圧力下、３０分間オートクレーブを行った後、３５℃に冷却し、これに実施例１の方法で得た本発明のポリペプチドを澱粉１グラム当り７．５単位と実験１−３の方法で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉１グラム当り２単位の割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉１グラム当り１０単位になるように加え、４８時間反応させた。その反応液を９５℃で３０分間保った後、濃度５％、ｐＨ５．０、温度４５℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（『トランスグルコシダーゼ　Ｌ「アマノ」』）、グルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たりそれぞれ１，５００単位および７５単位添加し、２４時間反応させて、その反応液を９５℃に加熱して３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％のシラップを得た。本シラップは、固形物当り、グルコース２７．４％、環状四糖６５．１％、その他の糖質を７．５％含有していた。得られた糖液を、強酸性カチオン交換樹脂（『アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型』、オルガノ株式会社製）を用いてカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、これらカラムを直列につないで樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度を６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣでモニターし、環状四糖高含有画分を採取し、環状四糖高含有液を固形物当たり収率約２１％で得た。本溶液は、固形物当たり約９８％の環状四糖を含有していた。
本溶液を濃度約７０％に濃縮した後、助晶缶にとり、種晶として環状四糖５乃至６含水結晶を約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマスキットを得た。本マスキットを乾燥搭上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ２の高圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥搭の上部より送風し、底部に設けた移送用金網コンベア上に結晶粉末を捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥搭外に徐々に移動させながら取り出した。この結晶粉末を熟成搭に充填して温風を送りつつ、１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、環状四糖５乃至６含水結晶粉末を得た。
本品は、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性、を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
実施例６　環状四糖結晶粉末の製造
とうもろこし澱粉を濃度約２８％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、その反応液を２ｋｇ／ｃｍ２の圧力下、３０分間オートクレーブした。その後、５０℃に冷却し、これに実施例２で得たα−イソマルトシル転移酵素活性を有する本発明のポリペプチドを澱粉グラム当たり６単位と、実験３−３で得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉グラム当たり１．８単位添加し、更にシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり１単位添加し、７２時間反応させた。得られた反応液を９５℃で３０分間保った後、ｐＨ５．０に調整した後、温度５０℃に調整した後、α−グルコシダーゼ剤（商品名『トランスグルコシダーゼ　Ｌ「アマノ』、天野製薬株式会社製）を固形物グラム当たり３００単位加え（２４時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）及びα−アミラーゼ剤（商品名『ネオスピターゼ　ＰＫ２』）を固形物グラム当たりそれぞれ１０単位及び２０単位添加し、１７時間反応させて、その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過し、得られる濾液を常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％シラップを得た。
本シラップは、固形物当り、グルコース３５．１％、環状四糖５１．１％、その他の糖質を１３．８％含有していた。本糖液を用いて、実施例５に記載の強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラム分画を行って環状四糖高含有画分を採取し、環状四糖高含有画分を固形物当たり収率約３９％で得た。本溶液は、固形物当たり約８０％の環状四糖を含有していた。
本溶液を濃縮しながら連続晶析させ、得られるマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少量の水で噴霧洗浄して、高純度の環状四糖５乃至６含水結晶を固形物当たり約２３％の収率で得た。
本品は、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易で、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明は、α−イソマルトシル転移酵素活性を有する新規なポリペプチド、その製造方法および用途を提供する発明である。本発明のポリペプチドは、遺伝子組換え技術により大量かつ安価に安定して供給できることから、当該ポリペプチドを用いて、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖、これを含む混合糖質及び各種組成物を、工業的に大量かつ安価に安定に製造することが可能となった。当該ポリペプチドを用いて得られる環状四糖は、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性、を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの組成物に有利に利用できる。
本発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義ある発明と言える。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、バチルス　グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの至適温度を示す図である。
第２図は、バチルス　グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの至適ｐＨを示す図である。
第３図は、バチルス　グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの熱安定性を示す。
第４図は、バチルス　グロビスポルスＣ１１由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドのｐＨ安定性を示す図である。
第５図は、バチルス　グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの至適温度を示す図である。
第６図は、バチルス　グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの至適ｐＨを示す図である。
第７図は、バチルス　グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの熱安定性を示す。
第８図は、バチルス　グロビスポルスＮ７５由来のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドのｐＨ安定性を示す図である。
第９図は、本発明による組換えＤＮＡ『ｐＢＧＣ１』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルス　グロビスポルスＣ１１由来の本発明のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
第１０図は、本発明による組換えＤＮＡの『ｐＢＧＮ１』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルス　グロビスポルスＮ７５由来の本発明のα−イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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