(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物細胞へエレクトロポレーションにより外来遺伝子を導入するにあたり、電気パルスとしてＤＣパルスを用い、ＤＣパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、１秒間に複数回連続して前記周期によるＤＣパルスを発生させることにより、外来遺伝子を導入することを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項２】
前記ＤＣパルスのオン時間の電場強度は、１〜５００ｖ／ｃｍであることを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入方法。
【請求項３】
前記オン時間及び前記オフ時間は、１〜９９９ｍｓｅｃであることを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入方法。
【請求項４】
前記周期は、１秒間に２〜９９回連続することを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入方法。
【請求項５】
非ヒト生物細胞へエレクトロポレーションにより薬剤を導入するにあたり、電気パルスとしてＤＣパルスを用い、ＤＣパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、１秒間に複数回連続して前記周期によるＤＣパルスを発生させることにより、薬剤を導入することを特徴とする薬剤導入方法。
【請求項６】
前記ＤＣパルスのオン時間の電場強度は、１〜５００ｖ／ｃｍであることを特徴とする請求項５記載の薬剤導入方法。
【請求項７】
前記オン時間及び前記オフ時間は、１〜９９９ｍｓｅｃであることを特徴とする請求項５記載の薬剤導入方法。
【請求項８】
前記周期は、１秒間に２〜９９回連続することを特徴とする請求項５記載の薬剤導入方法。
【請求項９】
前記薬剤は、抗癌剤であることを特徴とする請求項５記載の薬剤導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物細胞に外来遺伝子を導入する遺伝子導入方法と生物細胞に薬剤を導入する薬剤導入方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞に外来遺伝子を導入する手法は、種々あるが、広範な生物種に適用できるエレクトロポレーションによる方法が注目を集めている。エレクトロポレーション法は、導入したい外来遺伝子の存在下において、電気パルスを印加し、細胞内に外来遺伝子を導入するものである。ここで、この電気パルスとしては、ＡＣ（交流）パルス、エクスポネンシャルパルスなどがある。
【０００３】
そして、近年、ＤＣ（直流）パルスを印加できる遺伝子導入装置が実用化され、ＤＣパルスによる遺伝子導入が試みられ始めている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、従来のＤＣパルスによる遺伝子導入方法（以下単に「従来方法」という）では、ＤＣパルスのオン時間の長さ、電圧を、遺伝子導入の効率を確かめながら、導入対象にあわせて設定していた。このような設定を工夫すると、遺伝子導入の効率をある程度高くすることができる。
【０００５】
しかしながら、細胞に遺伝子を導入できても、導入後まもなく、細胞が壊死してしまうことが多く、バイアビリティ（遺伝子導入後に細胞が生きている率）が低く、また、著しい奇型が生じやすいという問題点があった。
【０００６】
ところで、従来方法では、ＤＣパルスのオン時間とオフ時間の和（周期）は、約１秒に固定されていた。これは、この種の遺伝子導入装置として、米国ＢＴＸ社Ｔ８２０（商標）なる製品が、デファクトスタンダードとなっており、右製品では、一周期を約１秒に固定した設定しか行えないようになっているためと思われる。
【０００７】
したがって、１秒間に何周期も連続してＤＣパルスを印加する手法は試みられていない。一方で、本出願人らは、１秒間に何周期も連続してＤＣパルスを印加できる遺伝子導入装置を開発した。そして、右装置を用いて、本発明者らが、鋭意実験研究を行った結果、バイアビリティを大幅に向上でき、奇型が全く生じないとの知見を得た。即ち、本発明は、ＤＣパルスによるエレクトロポレーションを用い、バイアビリティを大幅に向上でき、奇型の発生を抑制できる遺伝子導入方法を提供することを第１の目的とする。
【０００８】
また、同様に、エレクトロポレーションは、抗癌剤等の薬剤を生物細胞に導入する用途にも用いられる。しかしながら、従来の遺伝子導入装置では、高電場強度である１０００〜３０００ｖ／ｃｍの高電圧を１秒に１回印加するものとなっており、組織細胞に対する電気的損傷があり、細胞への薬剤導入効率が低いので、実際の臨床応用には不適であった。
【０００９】
そこで本発明は、従来法に比べて、電場強度を大幅に低下でき、臨床応用に適した薬剤導入方法を提供することを第２の目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
第１の目的のため、本発明の遺伝子導入方法は、非ヒト動物細胞へエレクトロポレーションにより外来遺伝子を導入するにあたり、電気パルスとしてＤＣパルスを用い、ＤＣパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、１秒間に複数回連続して周期によるＤＣパルスを発生させることにより、外来遺伝子を導入する。
【００１１】
この構成により、ＤＣパルスによるエレクトロポレーションを用い、バイアビリティを大幅に向上でき、奇型の発生を抑制できる。
【００１２】
また、第２の目的のため、本発明の薬剤導入方法は、非ヒト生物細胞へエレクトロポレーションにより薬剤を導入するにあたり、電気パルスとしてＤＣパルスを用い、ＤＣパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、１秒間に複数回連続して周期によるＤＣパルスを発生させることにより、薬剤を導入する。
【００１３】
この構成により、従来法に比べて印加電場強度を約１０分の１程度に下げることができ、組織（細胞）は電気的損傷を被ることなく、細胞への薬剤導入効率が著しく高くなるので、臨床応用への道を開くことができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
請求項１記載の遺伝子導入方法では、非ヒト動物細胞へエレクトロポレーションにより外来遺伝子を導入するにあたり、電気パルスとしてＤＣパルスを用い、ＤＣパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、１秒間に複数回連続して周期によるＤＣパルスを発生させることにより、外来遺伝子を導入する。
【００１５】
請求項２記載の遺伝子導入方法では、ＤＣパルスのオン時間の電場強度は、１〜５００ｖ／ｃｍである。この電場強度の中から、対象となる動物細胞や緩衝液などの条件に合う電場強度を選択できる。
【００１６】
請求項３記載の遺伝子導入方法では、オン時間及びオフ時間は、１〜９９９ｍｓｅｃである。このオン時間及びオフ時間の中から、対象となる動物細胞や緩衝液などの条件に合うオン時間及びオフ時間を選択できる。
【００１７】
請求項４記載の遺伝子導入方法では、周期は、１秒間に２〜９９回連続する。この周期の連続回数の中から、対象となる動物細胞や緩衝液などの条件に合う周期の連続回数を選択できる。
【００１８】
以上の構成は、薬剤の導入にも応用できる。
【００１９】
（第１の実施の形態）
次に図面を参照しながら、本発明の第１の実施の形態について説明する。図１は、本発明の第１の実施の形態における遺伝子導入装置の概念図である。ここでは、後述するように、動物細胞として角膜内皮細胞を選ぶ。
【００２０】
図１において、１は、ステンレス鋼、金、白金などの導電性材料から構成される電極部であり、そのうち、２は、細長い円柱状の第１電極であり、その外周を円環状をなす第２電極３が同心円状かつ一体的に取り囲んでいる。即ち、第１電極２と第２電極３との間には、リング状の空間４が開けてあり、第１電極２と第２電極３とは、電気的に絶縁されている。
【００２１】
第１電極２の下面は、緩衝液の注入口に接触させる第１接触面５であり、第２電極３の下面は、この注入口の外周側で眼球の角膜に接触する第２接触面６であり、第１接触面５と第２接触面６とは、ほぼ面一になっている。
【００２２】
７は、例えばベークライトやテフロン等で円筒状に形成される握り部であって、作業者が片手でつかみやすい形状にする。８、９は、握り部７内を貫通し、第１電極２と第２電極３にそれぞれ電気的に接続される配線である。配線８、９の外周は、例えば絶縁体からなるパイプで包囲されており、配線８、９によって、電極部１は握り部７に剛結された状態にあり、電極部１は、握り部７に対して、ペン状に支持されている。したがって、作業者が握り部７を把持し、握り部７を移動させると、電極部１を容易に任意の位置へ移動させることができる。配線８、９の後端部は、端子１０、１１となっており、次に述べるパルス印加手段１２に電気的に接続される。
【００２３】
パルス印加手段１２のうち、１３は、矩形波印加手段である。矩形波印加手段１３は、上述のように、第１電極２及び第２電極３に接続され、これらの電極２、３にＤＣパルスを印加するものであって、オン時間及びオフ時間を１００μｓ〜１０００ｍｓｅｃの範囲で設定でき、オン時の電場強度を１〜５００ｖ／ｃｍの範囲で設定可能なものを用いる。
【００２４】
また、パルス印加手段１２のうち、１４は、インピーダンス測定手段であり、ＤＣパルス印加前後において、これらの電極２、３間のインピーダンスを測り、細胞の損傷程度を知るためのものである。このインピーダンスを適切にすると、矩形波印加手段１３の印加条件を最適化できる。
【００２５】
さて、以上の装置を用いるに先立ち、外来遺伝子を緩衝液に含有させ、この緩衝液を、対象となる動物細胞に注入する。そして、第１接触面５を注入口に接触させ、その外周に第２接触面６を接触させ、矩形波印加手段１３を用いて、これらの電極２、３巻にＤＣパルスを印加する。このＤＣパルスの印加によって、外来遺伝子は、電極部１が接触している箇所において、対象となる動物細胞へ導入される。なお、本出願人が開発したＣＵＹ２１（商標）又はその後続の製品には、以上のパルス印加手段１２が搭載されている。
【００２６】
（実験例１）
本発明者は、次の実験を行った。まず、遺伝子の導入対象として、ウィスター系成熟ラットの角膜内皮を選び、ＢＳＳ（ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓａｌｉｎｅ）からなる緩衝液に、ｌａｃＺ遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡを０．５μｇ／ｌ入れた。そして、この緩衝液を、３０Ｇの針を付けたマイクロシリンジに入れ、上記ラットの眼球の前房内に注入した。
【００２７】
さて、遺伝子の導入が成功したかどうかを直接測ることは、容易でない。このため、本実験では、遺伝子の導入ができたかどうかを確認できるマーカーとなりうるｌａｃＺ遺伝子を用いた。勿論、これは、実験結果を確認するための選択であって、実際に治療などに応用する際には、マーカーとなり得ない他の遺伝子を用いることができる。
【００２８】
さて、ｌａｃＺ遺伝子の導入が成功しｌａｃＺ遺伝子が角膜内皮中に存在したとすると、Ｘ−ｇａｌ（本実験では、１ｍｇ／ｍｌ）と反応させることにより、緑様の呈色があらわれる。つまり、この呈色の有無及びその広さを調べることにより、遺伝子導入の成否及びその効果を知ることができる。そして、この効果を示す指標として、本実験では、呈色が確認された面積を、電極部１の外周で囲まれる円の面積で除した面積比（％）を用いている。
【００２９】
次に、図１に示した電極部１の第１接触面５の中心をハミルトンシリンジの針による注入口に合わせて接触させ、その外周に第２接触面６を接触させる。そして、矩形波印加手段１３により、次の周期を連続８回行った。
オン時の電場強度  ２００ｖ／ｃｍ（電極間のギャップは１ｍｍ）
オン時間          ５０ｍｓｅｃ、
オフ時間          ８０ｍｓｅｃ、
周期            １３０ｍｓｅｃ。
そして、ラットから眼球を摘出し、面積比を求めたところ、面積比は１００％であった。
【００３０】
一方、比較例１として、上記の条件に対し、以下の点のみを変更した実験を行った。
オフ時間      １０００ｍｓｅｃ、
周期          １０５０ｍｓｅｃ。これによる面積比は、２０％弱であった。
【００３１】
結果を比べると、比較例１に対し、実験例１では、導入効率が面積で５倍以上高まり、しかも、壊死による障害は軽減した。つまり、実験例１のバイアビリティは、比較例１の５倍以上に向上したものである。勿論、本発明は、本形態や実験例１のみに限定されるものではない。
【００３２】
（第２の実施の形態）
次に、図２〜図６を参照しながら、本発明の第２の実施の形態を説明する。ここで、パルス印加手段１２は、第１の実施の形態と同様のものを用いる。
【００３３】
第２の実施の形態では、遺伝子導入対象となる動物細胞として、ニワトリ初期胚（以下単に「胚」という）を選ぶ。そして、次のような導入装置を用意する。
【００３４】
図２、図３に示すように、ガラス製のシャーレ１５の底面に、円板状の液担体１６を載置する。この液担体１６は、硬いシリコンゴムや合成樹脂などから構成され、上面が平坦になるように仕上げられている。そして、液担体１６の上部中央には、凹部１７が形成され、凹部１７に緩衝液を溜めうるようになっている。
【００３５】
さらに、図３矢印で拡大して示しているように、凹部１７の底面には、矩形板状の導電体からなる第１電極１８が装着され、第１電極１８の周縁には、絶縁体１９が装填されている。そして、第１電極１８は、配線２０によってパルス印加手段１２の−極側に電気的に接続され、この例では、上方に２ｍｍ角だけ露出している。また、第１電極１８と同外形を持つ、第２電極２１を、図４に示すように形成し、パルス印加手段１２の＋極側へ接続する。なお、後述するように、凹部１７に緩衝液２３を溜めるので、胚は第１電極１８に直接接触しないようになっている。
【００３６】
次に、図５、図６を用いて、以上の装置による遺伝子導入過程を説明する。まず、卵から、卵黄膜２５、外胚葉２８及び内胚葉２９を含む、胚を取り出す。また、導入する遺伝子２７として、チキン胚導入遺伝子ＧＦＰ（Plasmid name:pCAGGS-AFP）を用意する。
【００３７】
そして、図５（ａ）に示すように、液担体１６の凹部１７に、緩衝液２３を溜める。次に、図５（ｂ）に示すように、胚を、その導入箇所が緩衝液２３上に位置するように、液担体１６の上に敷く。さらに、図５（ｃ）及び図６に示すように、ガラス製円環状のリング２６を胚の上に載せる。
【００３８】
そして、図５（ｄ）に示すように、胚の周囲を折り畳み、図６（ｂ）に示すように、リング２６にならわせて整形する。本来、図６に示すように、胚は、不定形で変形しやすいが、以上の整形によって、胚はリング２６に拘束された一定の姿勢を保持し、テンションを有する状態となる。次いで、胚の卵黄膜２５と外胚葉２８との間に遺伝２７を注入する。
【００３９】
次に、図５（ｅ）に示すように、内胚葉２９に第２電極２１を接近させ、凹部１７内の第１電極１８と第２電極２１との間（電極間のギャップは１ｍｍ）に、パルス印加手段１２からＤＣパルスを印加して、エレクトロポレーションを行う。
【００４０】
（実験２）
以上の要領で、本発明者は、次の実験を行った。ここでの導入対象は、上述のようにニワトリ初期胚であり、より詳しくは、同初期胚の予定神経板である。また、緩衝液２３として、次のものを使用した。
ＰＢＳ（＋）
１リットル中、8.0g NaCl,0.2g KCl,2.9g Na2HPO4・12H2O,0.2g KH2PO4に、
0.1g MgCl2・6H2O,0.1g CaCl2を加えて、緩衝液２３とする。
【００４１】
そして、矩形波印加手段１３により、次の周期を連続８回行った。
オン時の電場強度  １００ｖ／ｃｍ（電極間のギャップは１ｍｍ）、
オン時間          ５０ｍｓｅｃ、
オフ時間        １００ｍｓｅｃ、
周期            １５０ｍｓｅｃ。
これによるバイアビリティは、１００％であり、奇型は全く生じなかった。そして、導入済みの胚をインキュベターにより１〜２日培養し、脳に該当する部分を切り出して、別の新しい卵の脳に関与する部位へ移植すると、継続して長期間内用できる。
【００４２】
一方、比較例２として、上記の条件に対し、以下の点のみを変更した実験を行った。
オン時の電場強度  ２００ｖ／ｃｍ（電極間のギャップは１ｍｍ）、
オン時間          ５０ｍｓｅｃ、
オフ時間      １０００ｍｓｅｃ、
周期          １０５０ｍｓｅｃ。ここで、周期１０００ｍｓｅｃ程度では、この条件が最良の結果となり、バイアビリティは１００％であったが、全てに著しい奇型が生じて、導入後の追跡が不可能となった。
【００４３】
結果を比べると、比較例２に対し、実験例２では、奇型発生率は０％であった。勿論、本発明は、本形態や実験例２のみに限定されるものではない。
【００４４】
以上をまとめると、本発明では、図７に示すタイムチャートのようなＤＣパルスの印加を行っていることが理解されよう。そして、ここでは、動物細胞へエレクトロポレーションにより外来遺伝子を導入するにあたり、電気パルスとしてＤＣパルスを用いている。そして、ＤＣパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、１秒間に複数回連続して周期によるＤＣパルスを発生させている。
【００４５】
また、ＤＣパルスのオン時間の電場強度は、１〜５００ｖ／ｃｍであり、オン時間及びオフ時間は、１〜９９９ｍｓｅｃであり、周期は、１秒間に２〜９９回連続する。ものである。勿論、細かな条件は、対象となる動物細胞や緩衝液などに合うように定める。
【００４６】
（第３の実施の形態）
本形態では、以上の２つの実施の形態と異なり、薬剤の導入に関する。但し、導入装置としては、第１，第２の実施の形態と同様のものを用い、電極の形態を若干変更すればよい。そして、この例では、生物組織として、ヒト子宮平滑筋肉腫を選ぶ。
【００４７】
（実験３）
まず、上記肉腫をヌードマウス皮下に移植した。そして、抗癌剤であるプレオマイシンを生理食塩水で２０μｇ／０．１ｍｌの濃度に調整し、ヌードマウスで生育した移植片へ注入した。
【００４８】
さて、プレオマイシンの導入が成功し、プレオマイシンがヌードマウス皮下のヒト子宮平滑筋肉腫組織中に存在すると、ＤＮＡに亀裂を生じさせ、細胞死を誘導することとなる。つまり、ヌードマウス皮下の上記肉腫組織が、増殖を停止するか、または縮小する。そして、この肉腫組織の大きさを計測することによって、薬剤導入の成否及びその効果を知ることができる。
【００４９】
ここでは、プレオマイシンを添加し、次の周期で連続８回ＤＣパルスを印加した（本群）。
オン時の電場強度    １００ｖ／ｃｍ、
オン時間          ５０ｍｓｅｃ、
オフ時間          ７５ｍｓｅｃ、
周期            １２５ｍｓｅｃ。
なお、これは一例であって、細かな条件は、対象となる組織やその形状、大きさなどに合うように定める。
【００５０】
また、比較のため、プレオマイシン添加を行いパルスを印加しない群（比較第１群）、プレオマイシンを添加せずパルスを印加する群（比較第２群）及びプレオマイシンを添加せずパルスも印加しない群（比較第３群）についても、調べた。その結果を、図８に示す。図８の縦軸は、ヒト子宮筋平滑筋肉腫組織の体積を％表示したもので、横軸は、経過日である。上記組織が増殖を停止すれば、平坦な線となり、縮小すれば右下がりの線となる。特に、０％付近で停滞すれば、上記細胞はほとんど死滅したということができる。
【００５１】
その結果、比較第１，第２及び第３群では、概ね右上がりの線となり、腫瘍の増大に有意な差は認められなかった。しかし、本群では、０％付近で停滞する線となり、印加後に腫瘍の増大が有意に抑制されている。さらに、ヌードマウス５匹で８日後に腫瘍の消失が確認された。
【００５２】
つまり、１００ｖ／ｃｍ程度の（臨床応用に好適な）低電場強度でも、上記条件による印加を行うエレクトロポレーションによって、腫瘍に対して抗腫瘍効果があることが明らかとなった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明の遺伝子導入方法は、以上のように構成したので、ＤＣパルスのエレクトロポレーションを用いながら、バイアビリティを大幅に向上でき、奇形の発生を抑制できる。したがって、導入遺伝子の発現及びその利用に資することができる。
【００５４】
また、本発明の薬剤導入方法によれば、従来法に比べて印加電場強度を大幅に低下でき、導入効果を向上できるだけでなく、また、組織（細胞）に対する電気的損傷を抑制し、特的部位の組織（例えば腫瘍など）への薬剤導入効率を向上させることができ、臨床応用への適性を高め得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の第１の実施の形態における遺伝子導入装置の概念図
【図２】  本発明の第２の実施の形態における陽極の平面図
【図３】  同陽極の側面図
【図４】  同陰極の斜視図
【図５】  （ａ）同遺伝子導入過程の説明図
（ｂ）同遺伝子導入過程の説明図
（ｃ）同遺伝子導入過程の説明図
（ｄ）同遺伝子導入過程の説明図
（ｅ）同遺伝子導入過程の説明図
（ｆ）同遺伝子導入過程の説明図
【図６】  （ａ）同遺伝子導入過程の説明図
（ｂ）同遺伝子導入過程の説明図
（ｃ）同遺伝子導入過程の説明図
【図７】  本発明におけるＤＣパルスの印加要領を示すタイムチャート
【図８】  本発明の第３の実施の形態における組織増殖経過を示すグラフ
【符号の説明】
２、１７  第１電極
３、２１  第２電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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