(57)【要約】ピリオド２遺伝子プロモーター、前記プロモーター及びレポーター遺伝子を含むコンストラクト、前記コンストラクトを含む細胞、並びに前記コンストラクトを組み込んだトランスジェニック動物、体内時計遺伝子の発現又は発現振動を制御する物質のスクリーニング方法を開示する。前記スクリーニング方法は、前記細胞、前記トランスジェニック動物の視交叉上核切片若しくは末梢組織、又は前記トランスジェニック動物を使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベーサルのプロモーター活性を保持し、かつＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーにより転写活性化されるプロモーター活性を示す、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列における第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列における第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列における第５２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列。
【請求項２】
請求の範囲１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
請求の範囲１または２に記載のＤＮＡとレポーター遺伝子とを含むコンストラクト。
【請求項４】
請求の範囲３に記載のコンストラクトを含む細胞。
【請求項５】
請求の範囲４に記載の細胞と被検物質とを接触させる工程、及び
レポーター活性を測定する工程
を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング法。
【請求項６】
請求の範囲３に記載のコンストラクトを導入したトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記動物がラットである請求の範囲６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
請求の範囲４に記載の細胞、あるいは請求の範囲６又は請求の範囲７に記載のトランスジェニック動物の視交叉上核切片若しくは末梢組織に被検物質を作用させる工程、及び
発現振動を測定する工程
を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法。
【請求項９】
請求の範囲６又は請求の範囲７に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与し、前記動物の視交叉上核の発現振動を測定する工程
を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法。
【請求項１０】
ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質が、リズム障害改善用である、請求の範囲５、請求の範囲８、又は請求の範囲９のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、体内時計遺伝子のプロモーター、前記プロモーター及びレポーター遺伝子を含むコンストラクト、前記コンストラクトを含む細胞、前記コンストラクトを組み込んだトランスジェニック動物、並びに体内時計遺伝子の発現及び／または発現振動を制御する物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
多くの生物が約２４時間の概日リズムを生みだす機構を体内に有することが知られている（文献１）。哺乳類において、概日リズム発振機構は、睡眠覚醒リズム、血圧、体温、及び一部のホルモン分泌リズムを制御している（文献２，文献３）。概日リズムに起因する疾患として、睡眠覚醒リズム障害（ＤＳＰＳ、非２４時間行動）、季節性うつ病、時差症候群（ＪＥＴ−ＬＡＧ）、昼夜交代勤務労働者における睡眠障害、痴呆老人にみられる夜間徘徊、及びせん妄などが報告されている（文献４〜文献７）。更に、社会問題となっている不登校又は不出社の一部は、概日リズム障害に起因するとの報告がある（文献８）。高齢化と社会構造のグローバル化が進むことにより、今後リズム障害患者の増加が予想されるが、確実なリズム障害改善薬が存在しないのが実状である。一方、早朝に５０００ルクス程度の光を数時間見続けることを含む高照度光療法は、痴呆老人の夜間徘徊、せん妄、あるいはＤＳＰＳなどのリズム障害の症状に対し、良好な治療効果を示すとの報告がある（文献６，文献７，文献９〜文献１２）。しかしながら、高ルクスの光源の前に長時間にわたって拘束される高照度光療法は、患者とその介護者にとって苦痛あるいは負担であることから、この光療法を代替する薬剤への期待は高い。
組織破壊及び組織移植実験から、哺乳類のリズムセンターは視交叉上核（ＳＣＮ）に存在することが１９７２年に明らかにされた（文献１３，文献１４）。しかし、リズム発振の分子メカニズムについては近年まで不明であった（文献１５）。一方、遺伝学的手法からショウジョウバエのリズム変異体［ピリオド（Ｐｅｒｉｏｄ）変異体］が作出され、続いて、ショウジョウバエのピリオド遺伝子がクローニングされた（文献１６，文献１７）。ショウジョウバエにおいて、翻訳されたピリオドタンパク質（ＰＥＲＩＯＤ）は核内へ移行し、自身の発現転写を抑制すること（ネガティブフィードバック機構）によって、約２４時間の発現振動が達成されており、これによって最終的に概日リズム表現型（行動、羽化）が現われると考えられている（文献１８，文献１９）。一方、哺乳類においては、１９９７年に、ショウジョウバエピリオド遺伝子のホモログとして、ヒト及びマウスのピリオド１遺伝子（Ｐｅｒｉｏｄ１；Ｐｅｒ１）がそれぞれクローニングされた（文献２０，文献２１）。その後、マウスのピリオド２遺伝子（Ｐｅｒｉｏｄ２；Ｐｅｒ２）（文献２２，文献２３）及びマウスのピリオド３遺伝子（Ｐｅｒｉｏｄ３；Ｐｅｒ３）（文献２４，文献２５）がクローニングされた。この他、哺乳類時計遺伝子として、マウスのクロック遺伝子（Ｃｌｏｃｋ）（文献２６）及びマウスのビーマル１遺伝子（Ｂｍａｌ１）（文献２７）が報告されている。このようにリズム発振機構について、現在は分子レベルでの理解が可能である。実際に、クロック遺伝子、ビーマル１遺伝子が時計遺伝子の概日振動に重要であること（文献４４、文献４５）、クロック遺伝子でコードされるタンパク質、ビーマル１遺伝子でコードされるタンパク質は時計遺伝子のＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘに結合し、該時計遺伝子の転写を活性化すること、即ち、クロック、ビーマル１による転写活性化にはＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘ配列が必須であること（文献２７）が明らかにされている。
２０００年に、マウスの時計遺伝子であるピリオド１遺伝子（ｍＰｅｒ１）の上流配列をルシフェラーゼ遺伝子につないだＤＮＡをラットに導入したトランスジェニックラット（ｍＰｅｒ１：ｌｕｃトランスジェニックラット）が報告された（文献２８）。極微弱発光計数装置（フォトマル）を用いてルシフェラーゼ活性をリアルタイムに測定することで、視交叉上核のみならず、体の末梢組織でもまたピリオド１が発現振動していることが報告されている（文献２８）。また、ピリオド１遺伝子の上流配列をルシフェラーゼ遺伝子につないだＤＮＡをラットに導入したトランスジェニックマウス（ｍＰｅｒ１：ｌｕｃトランスジェニックマウス）についても同様の結果が報告されている（文献４３）。
ピリオド遺伝子の３つのホモログのうち、ピリオド２遺伝子は人為的遺伝子変異マウスにおいて概日リズムが消失することから、リズム発振に重要な役割を持つことが示唆されている（文献２９）。また、体内リズム疾患の一つである睡眠相前進症候群（ＡＳＰＳ）を示す１家系の原因はピリオド２遺伝子の点突然変異であることが報告された（文献３０）。このようにピリオド２遺伝子は遺伝子変異マウスがリズム異常を示すだけでなく、ヒトのリズム疾患にも関与することまで証明された遺伝子である。
ピリオド２遺伝子の上流領域に関する唯一の報告は、マウス配列についてのＷＯ０１／０７６５４であり、当該特許には、マウスのピリオド２転写制御配列と定義してＤＮＡ配列が記載され、Ｐｅｒ２制御配列−レポーター遺伝子を含む細胞を供給、試験化合物を導入、レポーター遺伝子の転写をアッセイすることからなるピリオド２転写阻害化合物を同定する方法について述べられている。しかしながら、マウスピリオド２転写制御配列と記載されている前記ＤＮＡ配列を現実に取得したという具体的な実施例はなく、取得できるように記載されてもいない。また、転写開始点を決定した、あるいは転写活性を測定したという具体的な実施例もない。更に、開示されたＤＮＡ配列には塩基が特定できていない箇所があり、ピリオド２遺伝子の上流配列に関する配列情報は具体的に開示されていなかった。
なお、ピリオド１遺伝子上流配列の解析については数々の報告があるが、ピリオド１とピリオド２は染色体上の位置も異なり、共通する特徴的な配列もないので、ピリオド２プロモーター配列を推定する情報とはならなかった。
体内時計遺伝子の発現を制御することを作用機序とする、リズム障害改善薬として有用な物質を得るためのスクリーニングに用いるツール、及び、体内時計遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法が待望されている。
発明の開示
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ヒトピリオド２遺伝子の転写活性を制御する領域であり、発現振動に寄与する領域であるヒトピリオド２遺伝子プロモーター配列を初めて決定し、前記プロモーター及びレポーター遺伝子を含むコンストラクト、並びに前記コンストラクトを含む細胞を取得した。また、マウスピリオド２遺伝子プロモーター配列を決定し、前記プロモーター及びレポーター遺伝子を含むコンストラクト、並びに前記コンストラクトを含む細胞を取得した。更に、前記コンストラクトを組み込んだトランスジェニック動物を作製した。次いで、マウスに由来する本発明のピリオド２プロモーターにはＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘ配列が含まれていないにも関わらず、意外にも、マウスビーマル１遺伝子でコードされるタンパク質とマウスクロック遺伝子でコードされるタンパク質とからなるヘテロダイマー（ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマー）によりピリオド２遺伝子が転写活性化および発現振動することを見出した。また、本遺伝子プロモーター活性を簡便に検出することができる系を構築した。この結果、ピリオド２遺伝子プロモーター、該プロモーター及びレポーター遺伝子を含むコンストラクト、前記コンストラクトを含む細胞、並びに前記コンストラクトを組み込んだトランスジェニック動物を、体内時計遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質であるリズム障害改善薬をスクリーニングするために有用なツールとして提供し、また、簡便なリズム障害改善薬スクリーニング方法を提供し、本発明を完成した。なお、本明細書中、コンストラクトとは、目的となる機能を有するようにＤＮＡを組み合わせて構築したＤＮＡからなる構築物をいう。
ピリオド遺伝子のホモログの一つであるマウスピリオド１遺伝子の第一エクソンの上流には５箇所のＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘが存在しており、基本転写活性領域は、これら５箇所のＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘを含まない第一エクソン周辺配列と第一イントロン中のヒト・マウス間で保存されている領域にある。ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーはＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘに結合してマウスピリオド１遺伝子の転写を活性化するが、ＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘを含まない基本転写活性領域は、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーによる転写活性を殆んど増強しない（文献２７）。また、マウスピリオド１遺伝子の５箇所のＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘに変異を入れると、基本転写活性と同程度の転写活性になる（文献３４）。これらのことから、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーはＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘを介してマウスピリオド１遺伝子の転写活性化を引き起こすと考えられている。一方、ビーマル１ノックアウトマウスでは、恒暗条件下でピリオド１及びピリオド２遺伝子の概日振動が消失することが報告され（文献４４）、クロック遺伝子のミュータントマウスは、恒暗条件下でピリオド１及びピリオド２遺伝子の概日振動が極度に減弱することが報告されている（文献４５）。即ち、ビーマル１及びクロックが振動に重要であることが明らかとなっている。これらのことからすると、前記ＷＯ０１／０７６５４でマウスのピリオド２転写制御配列と定義されたＤＮＡ配列（即ち、本発明のＤＮＡ塩基配列である配列番号１で表される塩基配列の第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列の一部（第６０５０番目〜７７６１番目）に相当するが、数箇所において配列が不一致である配列）はＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘを含んでいないため、単なる基本転写活性領域を示しているにすぎない。また同様にＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘを含まない本発明のピリオド２遺伝子のＤＮＡが、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーによる転写活性増強を示すとは考えられず、更には、発現振動に寄与するとは予想もされなかった。しかしながら、意外にも、ＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘを含まない本発明のＤＮＡがＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーによる転写活性増強を示し、更には発現振動に寄与すること、すなわち発現振動に必須な領域であることを見出し、発現振動を測定する簡便な系を構築した。即ち、ＣＡＣＧＴＧ型Ｅ−ｂｏｘを含むマウスピリオド２遺伝子配列（即ち本明細書のｐＣＨ１）よりも、本発明のピリオド２プロモーターの方が高い活性を示したことから、本発明のＤＮＡを用いることにより、より検出の容易な系が構築でき、より有用なリズム改善薬を得る方法を提供し、本発明を完成した。
即ち本発明は、
［１］ベーサルのプロモーター活性を保持し、かつＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーにより転写活性化されるプロモーター活性を示す、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）に記載の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列における第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列における第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列における第５２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列。
［２］［１］の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
［３］［１］または［２］に記載のＤＮＡとレポーター遺伝子とを含むコンストラクト、
［４］［３］に記載のコンストラクトを含む細胞、
［５］［４］に記載の細胞と被検物質とを接触させる工程、及び
レポーター活性を測定する工程
を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング法、
［６］［３］に記載のコンストラクトを導入したトランスジェニック動物、
［７］前記動物がラットである［６］に記載のトランスジェニック動物、
［８］［４］に記載の細胞、あるいは［６］または［７］に記載のトランスジェニック動物の視交叉上核切片若しくは末梢組織に被検物質を作用させる工程、及び
発現振動を測定する工程
を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法、
［９］［６］又は［７］に記載のトランスジェニック動物に被検物質を投与し、前記動物の視交叉上核の発現振動を測定する工程
を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法、
［１０］ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質が、リズム障害改善用である、［５］、［８］、又は［９］のいずれか一項に記載のスクリーニング法
に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
［本発明のＤＮＡ］
本発明のＤＮＡは、（ａ）配列番号１で表される塩基配列における第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列における第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列における第５２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、又は、（ｅ）配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列を含み、ピリオド２遺伝子プロモーター活性を示す。
本明細書において「ピリオド２遺伝子プロモーター活性」とは、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列からなるＤＮＡとしてのベーサルのプロモーター活性が少なくとも保持されており（すなわち、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列からなるＤＮＡのベーサルなプロモータ活性の少なくとも５０％の活性を有しており、好ましくはＤＮＡのベーサルなプロモータ活性と実質的に同じであるか、あるいは、優れており）、しかも、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーにより、転写活性化される（即ち発現振動に寄与する）プロモーター活性を意味する。
ここで、「ベーサルのプロモーター活性」とは、何も刺激しない状態で所定時間（例えば、４８時間）経過したときのプロモーター活性を意味し、「何も刺激しない状態」とは、具体的には、実施例３に示すように、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマー不在下の状態を意味する。また、前記「ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマー」は、ピリオド１遺伝子、ピリオド２遺伝子、及びピリオド３遺伝子の各転写を制御する転写因子である。
あるＤＮＡが「ピリオド２遺伝子プロモーター活性」を示すか否かの判定方法は、特に限定されるものではないが、例えば、実施例３に示すように、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマー不在下の状態でベーサルのプロモーター活性を測定することにより、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列からなるＤＮＡのプロモータ活性と実質的に同じであるか、あるいは、優れていることを確認し、更に、実施例３に記載の条件下で、用量依存的なＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーによる転写活性化を示すか否かを確認することにより、判定することができる。
本発明の好ましいＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列における第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第５２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列からなるＤＮＡ、又は配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列からなるＤＮＡなどを挙げることができるが、配列番号１で表される塩基配列における第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第５２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列からなるＤＮＡ、又は配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列を含み、ピリオド２遺伝子プロモーター活性を示すＤＮＡであれば本発明のＤＮＡに含まれる。
配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列は、後述の実施例１に示すように、マウスピリオド２の上流領域であり、また、後述の実施例３に示すように、ピリオド２遺伝子プロモーター活性を示す。
配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列からなるＤＮＡは、後述の実施例１に示すように、ヒトピリオド２の上流領域である。マウス遺伝子の実験結果（後述の実施例１及び実施例３）から、マウスのプロモーター活性を示したＤＮＡ（すなわち、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列からなるＤＮＡ）は、ヒト／マウス間の７つの保存領域の内、第一イントロン側の保存領域（ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩ）を除いたＤＮＡであることが判明した。従って、ヒト／マウス間の７つの保存領域の内、第一イントロン側の保存領域（ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩ）を除いたＤＮＡに対応するヒトのＤＮＡ、すなわち、配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列からなるＤＮＡも、ピリオド２遺伝子プロモーター活性を有すると考えられる。
本発明のＤＮＡは、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することにより、あるいは、（２）ファージライブラリーをスクリーニングすることにより、調製することができる。
（１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法
ＰＣＲ法を利用して本発明のＤＮＡを調製する場合には、まず、配列番号１又は２で表される各塩基配列の情報に基づいて、本発明のＤＮＡを増幅することのできるプライマーセットを設計する。
マウスピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列を含む本発明のＤＮＡの場合には、配列番号１で表される塩基配列の情報に基づいて、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列を含むが、保存領域ＩＶ（第８５３４番目）以降を含まないように、増幅するプライマーセットを設計する。また、ヒトピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列を含む本発明のＤＮＡの場合には、配列番号２で表される塩基配列の情報に基づいて、配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列を含むが、保存領域ＩＶ（第６５３１番目）以降を含まないように、増幅するプライマーセットを設計する。
設計した前記プライマーセットと、鋳型であるゲノムＤＮＡとを用いてＰＣＲを実施することにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
（２）ファージライブラリースクリーニング法
ファージライブラリー（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）をスクリーニングすることにより本発明のＤＮＡを調製する場合には、まず、配列番号１又は２で表される各塩基配列の情報に基づいて、本発明のＤＮＡを含むファージクローンをスクリーニングすることのできるプローブを設計する。
マウスピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列を含む本発明のＤＮＡの場合には、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列の情報に基づいて、プローブを設計する。また、ヒトピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列を含む本発明のＤＮＡの場合には、配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列の情報に基づいて、プローブを設計する。
設計した前記プローブを使用して、ファージライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のＤＮＡを含むファージクローンを得ることができる。得られたファージクローンを、適当な制限酵素で処理した後、適当な精製手段（例えば、アガロースゲル電気泳動法）を用いて所望のＤＮＡ断片を精製することにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
［本発明のコンストラクト及び細胞］
本発明のコンストラクトは、本発明のＤＮＡとレポーター遺伝子とを含む。前記レポーター遺伝子としては、細胞内において遺伝子発現の指標として使用することのできる公知のレポータータンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。前記レポータータンパク質としては、例えば、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はエクオリンなどを挙げることができる。本発明のコンストラクトにおいては、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子を用いることが好ましい。
本発明のコンストラクトでは、本発明のＤＮＡの下流であって、しかも、本発明のＤＮＡのプロモーター活性の調節下にあるように、レポーター遺伝子を配置する限り、本発明のＤＮＡ及びレポーター遺伝子の配置位置は限定されるものではない。また、本発明のコンストラクトは、本発明のＤＮＡとレポーター遺伝子とを少なくとも含む限り、特に限定されるものではないが、ベクター領域を更に含むことが好ましい。
本発明のコンストラクトは、特に限定されるものではないが、本発明のＤＮＡ及びレポーター遺伝子に加え、ベクター領域を更に含む本発明のコンストラクトは、例えば、本発明のＤＮＡを適当なレポーターベクター（すなわち、レポーター遺伝子を含むベクター）のマルチクローニングサイトに導入することにより調製することができる。前記レポーターベクターとしては、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（プロメガ社）、ＳＥＡＰをコードする遺伝子を含むベクターｐＳＥＡＰ２−ｂａｓｉｃベクター（クロンテック社）、あるいは、ＧＦＰの不安定型をコードする遺伝子を含むベクターｐｄ１ＥＧＦＰ（クロンテック社）を挙げることができる。
より具体的には、ＰＣＲ法を利用して得られた本発明のＤＮＡを、レポーターベクターのマルチクローニングサイトに導入することにより、本発明のコンストラクトを調製することができる。
あるいは、ファージライブラリーをスクリーニングすることにより得られたファージクローンを、適当な制限酵素で処理した後、適当な精製手段（例えば、アガロースゲル電気泳動法）を用いて精製した本発明のＤＮＡを、所望に応じて平滑末端化した後、レポーターベクターのマルチクローニングサイトに導入することにより、本発明のコンストラクトを調製することができる。例えば、ヒトピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列を含むファージクローンの場合には、そのファージクローンを適当な制限酵素（例えば、第３５１３番目の位置で切断する制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩと、第６４４７番目の位置で切断する制限酵素ＰｓｈＢＩとの組み合わせ）で処理した後、適当な精製手段（例えば、アガロースゲル電気泳動法）を用いて精製することにより、２９３５ｂｐのＤＮＡ断片を取得し、このＤＮＡ断片を平滑末端化した後、レポーターベクターのマルチクローニングサイトに導入することにより、ヒトピリオド２遺伝子プロモーターを含む本発明のコンストラクトを調製することができる。本発明のＤＮＡを含むデリーションコンストラクトは、例えば、上記手段で得た本発明のＤＮＡのうち、より長いＤＮＡを適当な制限酵素で処理した後、適当な精製手段を用いて精製することにより、所望のＤＮＡ断片を取得し、セルフライゲーションすることにより得ることができる。より具体的には実施例１０に記載の方法により得ることができる。
本発明の細胞は、本発明のコンストラクトを含む。本発明の細胞は、特に限定されるものではないが、適当な宿主細胞（好ましくは真核生物）を、本発明のコンストラクト（好ましくは、本発明のＤＮＡ及びレポーター遺伝子に加え、ベクター領域を更に含む本発明のコンストラクト）で形質転換することにより、調製することができる。
真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、サルＣＯＳ細胞（文献３７）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（文献３８）、マウスＬ細胞、マウスＡ９細胞、又はサルＢＳ−Ｃ−１細胞などを挙げることができ、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いることが好ましい。
本発明のコンストラクトは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（文献３９）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（文献４０）、市販のトランスフェクション試薬［例えば、リポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）］を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（文献４１）等により、宿主細胞に取り込ませることができる。
本発明の細胞は、常法に従って培養することができる。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の場合には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｅｄｉｕｍ）に、グルコース（最終濃度＝４．５ｇ／Ｌ）と子ウシ血清（最終濃度＝１０％）とを加えた培地を使用することができる。
［本発明のトランスジェニック動物］
本発明のトランスジェニック動物は、本発明のコンストラクトが導入されている限り、特に限定されるものではないが、例えば、導入するＤＮＡとして、本発明のコンストラクトを使用すること以外は、従来公知の方法（例えば、文献３５）に基づいて作製することができる。具体的には、例えば、後述の実施例４に記載の手順に基づいて作製することができる。
なお、本明細書において「動物」とは、ヒトを除く動物（すなわち、非ヒト動物）を意味し、例えば、ヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、イルカ、又はウマ）、鳥類（例えば、ニワトリ又はウズラ）、両生類（例えば、カエル）、爬虫類、又は昆虫（例えば、ショウジョウバエ）などを挙げることができるが、ラット又はマウスが好ましく、特にはラットが好ましい。
［本発明のスクリーニング方法］
本発明のスクリーニング法では、本発明の細胞、本発明のトランスジェニック動物の視交叉上核切片又は末梢組織、あるいは、本発明のトランスジェニック動物それ自体を用いて実施することができる。スクリーニングに使用する被検物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（文献３１）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
本発明の細胞を用いる本発明のスクリーニング法では、本発明の細胞と被検物質とを接触させ、レポーター活性を測定（すなわち、レポーターアッセイ）することにより、ピリオド２遺伝子の発現を制御する物質、すなわち、転写活性を修飾する物質を選択することができる。
本発明の細胞と被検物質とを接触させる場合には、コンストラクトを一時的あるいは安定的に導入された細胞を調製し、薬物（即ち被検物質）刺激を行なう。薬物（即ち被検物質）刺激から一定時間後にレポーターアッセイを行なうことでピリオド２遺伝子の発現制御を可能とする物質をスクリーニングすることができる。
レポーターアッセイは、使用するレポータータンパク質の種類に応じて、公知のアッセイ方法により実施することができる。例えば、レポータータンパク質としてホタルルシフェラーゼを使用する場合には、その基質として、化学発光基質ルシフェリンを用いることができ、シーパンジー（ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）ルシフェラーゼを使用する場合には、その基質として、化学発光基質セランテラジンを用いることができる。また、ＳＥＡＰを使用する場合には、その基質として、化学発光基質ＣＳＰＤ［ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ（１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２‘−（５’−ｃｈｏｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３．７］ｄｅｃａｎ）−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］又は蛍光基質ＭＵＰ（４−ｍｅｔｈｙｌｕｎｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いることができる。レポーターアッセイとしては、ルシフェラーゼアッセイが好ましく、ルシフェラーゼアッセイは、好ましくは、後述の実施例３に記載の条件で実施することができる。
ピリオド２遺伝子の発現を促進する物質及び抑制する物質のいずれもが、リズム障害改善薬として有用であり、ピリオド２遺伝子の発現を抑制する物質をスクリーニングするためには、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーのような公知のピリオド２遺伝子の転写活性化因子共存下でアッセイを行なうことにより、スクリーニングが可能である。昼の同調因子は、ピリオド２遺伝子の転写を促進する又は転写阻害を解除する（結果的に転写促進）ような性質を持ち、昼に作用させるとリズムを同調させることができ、夜に作用させると位相変位をおこす。また、夜の同調因子は、ピリオド遺伝子の転写を抑制する、又は、転写促進を解除する（結果的に転写を抑制）ような性質を持ち、夜に作用させるとリズムを同調させることができ、昼に作用させると、位相変位を起こすことを確認している。従って、ピリオド２遺伝子の転写を促進する薬物であれば昼に飲めば、リズムを同調させることができ、逆に、ピリオド２の転写を抑制する薬物であれば夜に飲めば、リズムを同調させることができる。
本発明の細胞、又はトランスジェニック動物の視交叉上核切片若しくは末梢組織を用いる本発明のスクリーニング法では、本発明の細胞、又はトランスジェニック動物の視交叉上核切片若しくは末梢組織に被検物質を作用させ、発現振動を測定することにより、ピリオド２遺伝子の発現を制御する物質を選択することができる。
ｍＰｅｒ１：ｌｕｃトランスジェニックラットにおいて、培養下の視交叉上核切片あるいは末梢組織からの発光量を極微弱発光計数装置（フォトマル）を用いて自動計測することで２４時間ごとの発光振動曲線が得られるとの報告がある（文献２８）。この方法を用いて、ピリオド２遺伝子プロモーター活性を示すＤＮＡとレポーター遺伝子を含むコンストラクトを導入したトランスジェニック動物の視交叉上核切片又は末梢組織における発光の振動を自動計測し、発光振動が安定した頃、一方では、被検物質（例えば、本発明の細胞を用いる本発明のスクリーニング法でスクリーニングされてきた体内リズム改善薬候補等の被検物質）を、前記トランスジェニック動物の視交叉上核切片又は末梢組織に作用させ、他方では、コントロールとして、被検物質の溶媒［例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など］だけを視交叉上核切片又は末梢組織に作用させ、自動計測を継続する。トランスジェニック動物としては、トランスジェニックラットが好ましい。被検物質（例えば、体内リズム障害を改善する候補の被検物質）処理群から得られた発光振動曲線と、コントロールの未処理群から得られた発光振動曲線とを比較することで、位相変位（振動ピーク又はボトムの位置変化）即ち発現振動を評価することができる。このようにして、理想の位相変位を示す物質をスクリーニングすることにより、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質を選択することができる。また、視交叉上核切片や末梢組織の替わりに、本発明の細胞、即ちマウスピリオド２遺伝子の上流配列をレポーター遺伝子につないだＤＮＡを導入した細胞を用い、細胞群を同調させることにより上記スクリーニングを行うことができる。細胞群は、高濃度の血清あるいはデキサメサゾン（ＤＥＸ）で刺激することによって同調させることができるが、好ましくは実施例６に記載の方法で同調させることができる。
例えば、後述の実施例５に記載した方法で、マウスピリオド２遺伝子の上流配列をルシフェラーゼ遺伝子につないだＤＮＡをラットに導入したトランスジェニックラット（ｍＰｅｒ２：ｌｕｃトランスジェニックラット）の視交叉上核切片又は末梢組織（例えば、肝臓、腎臓、肺、又は眼球）に対する自動発光測定を行ない、被検物質処理群から得られた発光振動曲線と、未処理群（コントロール）から得られた発光振動曲線とを比較することで、位相変位を評価し、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質を選択することができる。実施例５に記載の方法で行なう場合は、視交叉上核切片について、発現振動が認められる測定開始３〜９日目のいずれかの時において、一方はコントロールとして溶媒（例えば、ＤＭＳＯ等）のみを添加した新しい培地に交換し、他方は溶媒（ＤＭＳＯ等）に溶解した被検物質を添加した新しい培地に交換し、被検物質添加後の振動をコントロールと比較することにより、被検物質のリズムに対する作用を評価することが可能である。また、末梢組織についても、例えば、肝臓、肺、及び眼球は、それぞれ、振動が認められる測定開始４〜５日目の間、測定開始１〜５日目の間、及び測定開始１〜３日目の間に、同様に被検物質を含む培地に交換すること（コントロールは溶媒のみ）によって、被検物質のスクリーニングが可能である。
また、後述の実施例５に示すように、末梢組織では、数回の振動リズムを示した後、細胞間脱同調により減衰した（図７〜図９参照）が、この減衰を抑制する薬剤をスクリーニングすることにより、高齢者の減弱した活動リズム及び／又は睡眠リズムを改善する作用を示す薬物を得ることが可能となる。
なお、大きな末梢組織（例えば、肝臓又は肺等）をスクリーニングに用いる場合は、末梢組織片を用いることが好ましい。
本発明のトランスジェニック動物を用いる本発明のスクリーニング法では、本発明のトランスジェニック動物に被検物質を投与し、前記動物の視交叉上核の発現振動を測定することにより、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質を選択することができる。
具体的には、被検物質（例えば、本発明の細胞を用いる本発明のスクリーニング法でスクリーニングされてきた体内リズム改善薬候補等の被検物質）を、ピリオド２プロモーター活性を示すＤＮＡとレポーター遺伝子を含むコンストラクトを導入したトランスジェニック動物に投与する。レポータータンパク質としてルシフェラーゼを使用する場合には、頭頂部から視交叉上核近傍へ細管を通してルシフェリンを供給し、同時に視交叉上核直上に挿入した微小光ファイバーで個体を生かしたまま、連続的に発光を測定する方法（文献４２）を用いることで、リズムセンター視交叉上核の振動への作用を評価して化合物のスクリーニングをすることが可能である。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２；及びＨｉｌｌｅ，Ｂ．，ｌｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９２）に従って実施した。
（実施例１）
《マウス及びヒトピリオド２上流のＤＮＡ配列取得と比較解析》
マウスピリオド２の上流配列取得は、マウスゲノムＤＮＡファージライブラリーを用いたスクリーニングと、ゲノムウォーカーキット（クロンテック社）とを用いて行なった。
はじめに、マウスピリオド２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０３６８９３）の既報の配列から、マウスピリオド２遺伝子のｃＤＮＡにおける第２１８番目〜第７２３番目の間を増幅することのできるプライマーセット、すなわち、配列番号３で表される塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０３６８９３）の第２１８番目〜第２３９番目の配列］からなるフォワードプライマーと、配列番号４で表される塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０３６８９３）の第７０２番目〜７２３番目の配列に対して相補的な配列］からなるリバースプライマーとを作成し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。なお、前記ＰＣＲは、酵素としてＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ；アプライドバイオシステムズ社）を用い、９５℃（１０分間）の保温の後、９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（１分間）とからなるサイクルを４０回繰り返すことにより実施した。
得られた増幅断片（５０５ｂｐ）をプローブとして、マウスゲノムＤＮＡのファージライブラリー（クロンテック社）からスクリーニングを行なった。その結果、第二エクソンから上流６．０ｋｂのマウスピリオド２遺伝子の第一イントロンを含むクローンを得た。取得したファージＤＮＡに対して、ＤＮＡシーケンス試薬（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用い、マニュアルに従ってシーケンス反応を実施した後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７；アプライドバイオシステムズ社）でＤＮＡ塩基配列を解析したところ、配列番号１で表される塩基配列の第１０１０４番目〜第１７００４番目の塩基からなる配列が得られた。
続いて、ファージのＤＮＡ配列から更に上流の配列を取得するため、ゲノムウォーカーキット（クロンテック社）を用いて、上流配列の取得を進めた。ゲノムウォーカーキットの鋳型としては、キット付属のライブラリーＭＤＬ１〜ＭＤＬ５を使用し、ＰＣＲの酵素としては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ；クロンテック社）を使用した。
最初に、プライマーセットとして、キット付属のＡＰ１と、配列番号５で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第１３００５番目〜第１３０３４番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるファーストプライマーとを使用し、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で、９４℃（２秒間）と７２℃（３分間）とからなるサイクルを７回、続いて、９４℃（２秒間）と６７℃（３分間）とからなるサイクルを３６回繰り返し、最後に６７℃で４分間保温することにより、ＰＣＲを実施した。続いて、得られた反応生成物の５０倍希釈液１μＬを鋳型として使用し、キット付属のＡＰ２と、配列番号６で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第１２４２９番目〜第１２４５８番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプライマーとをプライマーセットとして使用し、９４℃（２秒間）と７２℃（３分間）とからなるサイクルを５回、続いて、９４℃（２秒間）と６７℃（３分間）とからなるサイクルを２４回繰り返し、最後に６７℃で４分間保温することにより、ＰＣＲを実施した。
前記の２段階ＰＣＲにより得られた増幅バンドのシークエンシング解析を行なうことにより、配列番号１で表される塩基配列の第９８７４番目〜第１２４５８番目の塩基からなる配列が得られた。この配列に基づいて、更に上流の配列を得るためのプライマーセット、すなわち、配列番号７で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第１０１０３番目〜第１０１３２番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるファーストプライマーと、配列番号８で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第１００２１番目〜第１００５０番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプライマーとを作製した。
配列番号５で表される塩基配列からなるファーストプライマー及び配列番号６で表される塩基配列からなるセカンドプライマーの代わりに、配列番号７で表される塩基配列からなるファーストプライマー及び配列番号８で表される塩基配列からなるセカンドプライマーを用いること以外は、前記の２段階ＰＣＲを繰り返し、得られた増幅バンドのシークエンシング解析を行なうことにより、配列番号１で表される塩基配列の第９１４６番目〜第１００５０番目の塩基からなる配列が得られた。
以下、順次、更なる上流の配列を得るために、前記の操作、すなわち、ファーストプライマー及びセカンドプライマーの作製、２段階ＰＣＲ、並びに得られた増幅バンドのシークエンシング解析を繰り返した。各２段階ＰＣＲに使用したファーストプライマーとセカンドプライマーとの組み合わせは、
配列番号９で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第９３５５番目〜第９３８４番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるファーストプライマーと
配列番号１０で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第９３０７番目〜第９３３６番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプライマーとの組み合わせ；
配列番号１１で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第７８３８番目〜第７８５７番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるファーストプライマーと
配列番号１２で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第７８１８番目〜第７８３７番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプライマーとの組み合わせ；及び
配列番号１３で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第２２３４番目〜第２２６３番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるファーストプライマーと
配列番号１４で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第２１３４番目〜第２１６３番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプライマーとの組み合わせ
であり、この順に使用した。
なお、配列番号９で表される塩基配列からなるファーストプライマーと配列番号１０で表される塩基配列からなるセカンドプライマーとの組み合わせを用いた２段階ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡバンドのシークエンシング解析の結果得られた、配列番号１で表される塩基配列の第８９１８番目〜第９３３６番目の塩基からなる配列に基づいて設計したプライマーを用いた２段階ＰＣＲでは、更なる上流の配列が取得できなかった。そこで、更に上流配列を取得するために、第一エクソンの配列に基づいて設計した配列番号１１で表される塩基配列からなるファーストプライマーと配列番号１２で表される塩基配列からなるセカンドプライマーとの組み合わせを用いて、２段階ＰＣＲを実施した。
これまでの解析の結果、配列番号１で表される塩基配列の第１番目〜第１７００４番目の塩基からなる配列（但し、第７８５８番目〜第９１４５番目の塩基からなる配列を除く）が得られた。前記の第７８５８番目〜第９１４５番目の塩基からなる未決定配列に相当する第一エクソンと第一イントロンとの間のギャップを埋めるために、鋳型としてマウスゲノムＤＮＡを使用し、酵素としてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ；クロンテック社）を使用し、２段階のＰＣＲ［ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ］を実施した。第１回目のＰＣＲは、プライマーセットとして、配列番号１５で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第７５１６番目〜７５４５番目の塩基からなる配列）からなるフォワードプライマーと、配列番号１６で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第９０６３番目〜９０９２番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるリバースプライマーとを使用し、５％ＤＭＳＯ存在下で、９５℃で１分間保温した後、９５℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と６８℃（５分間）とからなるサイクルを３５回繰り返し、最後に６８℃で１０分間保温することにより、実施した。第２回目のＰＣＲは、プライマーセットとして、配列番号１７で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第７５５６番目〜７５８５番目の塩基からなる配列）からなるフォワードプライマーと、配列番号１８で表される塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第８９７７番目〜９００６番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるリバースプライマーとを使用すること以外は、第１回目のＰＣＲと同じ条件で実施した。
前記の２段階ＰＣＲの結果、１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られ、その配列解析により、第一エクソンと第一イントロンとの間のギャップを埋めることができた。
以上の解析の結果を全てまとめると、配列番号１で表される塩基配列が得られた。配列番号１で表される塩基配列には、第一エクソン（第７７３６番目〜第７８５７番目）及び第二エクソン（第１６１５８番目〜第１６３９６番目）と、第一イントロン（第７８５８番目〜第１６１５７番目）とが含まれており、マウスピリオド２の翻訳開始点は、第二エクソン（第１６１７６番目）に存在することが明らかとなった。また、転写開始点は、第７７３６番目に存在する（後述の実施例２参照）。
マウスとヒトとの遺伝子上流の配列比較を行なった場合、遺伝子発現制御に重要な領域は種間で保存されていることが予想されることから、ヒトピリオド２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００３８９４）の上流配列の取得を試みた。ドラフトシーケンスをネット［ＢＬＡＳＴ２；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］上で検索した結果、ヒトピリオド２遺伝子の上流領域を含むクローン（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ０１３４００．５；１８８．２ｋｂｐ；フェーズ１）を見出した。
このドラフトシーケンスクローンＡＣ０１３４００．５は、第一イントロンと第二エクソンとの間にギャップがあったため、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型として、ＰＣＲを実施した。前記ＰＣＲは、プライマーセットとして、配列番号１９で表される塩基配列（配列番号２で表される塩基配列の第１４５７７番目〜第１４６０６番目の塩基からなる配列）からなるフォワードプライマーと、配列番号２０で表される塩基配列［配列番号２で表される塩基配列の第１５８５５番目〜第１５８８４番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列］からなるリバースプライマーとを使用し、酵素として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ；アプライドバイオシステムズ社）を使用し、９５℃で１０分間保温した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（２分間）とからなるサイクルを４０回繰り返すことにより実施し、ギャップを含むＤＮＡ断片（約１．２ｋｂｐ）のＤＮＡ配列を解析した。
一方、その後、新しいクローン（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ０１２４８５．１３；１６８．７ｋｂｐ；フェーズ３完全配列）がネット上に登録されたことを見出したので、前述のマウスのゲノム配列１７００４ｂｐに相当する領域を、クローンＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ０１２４８５．１３から１７１１２ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ０１２４８５．１３の３５３５４番目から５２４６５番目に対して相補的な配列）抽出し配列番号２として示した。得られたヒトピリオド２遺伝子の上流配列の解析から、マウスと同様にヒトの翻訳開始点も第二エクソンに存在することが明らかとなった。以上、マウスピリオド２遺伝子及びヒトピリオド２遺伝子の約１７ｋｂｐにおよぶ第二エクソンから上流約１７ｋｂｐの配列情報を取得した。
取得したマウスピリオド２遺伝子及びヒトピリオド２遺伝子の約１７ｋｂｐにおよぶ上流領域付近の配列情報に対し、相同性比較（解析条件はデフォルト値）を、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）ＶＥＲＳＩＯＮ  ＢＬＡＳＴＮ２．２．１  ＡＵＧ−１−２００１プログラムにて解析した。Ｅｘｐｅｃｔがｅ−３以下の確度の高い領域を保存性があるとした。その解析結果を図１に示す。図１に示すように、ヒトとマウスとの間には、第一エクソンの前後に断片的に保存された領域（Ｉ〜ＶＩＩ）が７つ存在することが明らかとなった。
図２に、保存された領域内のそれぞれの配列を示す。図２において、記号「Ｈ」はヒトの配列を示し、記号「Ｍ」はマウスの配列を示し、ヒト配列とマウス配列との間の「縦棒」は、ヒト及びマウスの両方で塩基の種類が一致した箇所を表す。
以上の解析の結果を全てまとめると、配列番号２で表される塩基配列には、第一イントロン（第６０６９番目〜第１６４６１番目）と第二エクソン（第１６４６２番目〜第１６７１０番目）とが含まれており、ヒトピリオド２の翻訳開始点は、第１６４８１番目に存在することが明らかとなった。
ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、上流領域ＤＮＡ断片を取得した場合には、遺伝子変異が生じる可能性がある。マウスゲノムのファージライブラリー（クロンテック社）のマニュアルに従って、１×１０６のファージから、変異のない上流領域ＤＮＡ断片を含むファージのクローニングを試みた。
プローブ調製のために、先に得られたマウスピリオド２遺伝子の上流の配列情報を基に、配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーとを設計した。ＰＣＲは、鋳型としてマウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を使用し、酵素としてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ；クロンテック社）を使用し、９５℃で１分間保温した後、９５℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と６８℃（２分間）とからなるサイクルを３５回繰り返すことにより実施し、１．４ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
得られたＤＮＡ断片をプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ；ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、増幅した。このプラスミドに制限酵素ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ処理を行ない、アガロールゲル電気泳動によりプローブ用ＤＮＡ断片を取得した。次いで、プローブ用ＤＮＡ断片を、ラベリングキット（ＢｃａＢＥＳＴラベリングキット；宝酒造株式会社）のマニュアルに従って、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて標識した。このプローブを用いたマウスゲノムファージライブラリーのスクリーニグの結果、ヒトとマウスとの間の６つの保存領域を含むクローンを取得した。マニュアルに従って、このファージクローンを大量調製し、上流領域を含むファージＤＮＡを、ファージＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて調製した。
７つの保存領域を含むＤＮＡ断片を取得するため、得られたファージゲノムを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＮｈｅＩで切り出し、アガロースゲル電気泳動を行うことにより、６．４ｋｂのＤＮＡ断片のバンドを抽出精製した。前記ＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の第４４１５番目〜第１０８７７番目の塩基からなる配列である。精製したＤＮＡ断片をＤＮＡブランティングキット（宝酒造株式会社）にて平滑末端化を行なった。
ルシフェラーゼベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（プロメガ社；以下、ｐＧＬ３−ｂと略称する）は、プロモータ配列を持たないレポーターベクターであり、上流断片のプロモータ活性を評価することができる。このベクターｐＧＬ３−ｂを制限酵素ＳｍａＩで切断した後に、先に平滑末端化したマウス上流断片を組み込むことにより、ベクターｐＣＨ１を作製した。次いで、前記ベクターｐＣＨ１に対して制限酵素ＸｈｏＩ／ＳｎａＢＩ処理を行なった後、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片を除き、セルフライゲーションを行なうことにより、ベクターｐＣＨ１から第一イントロン側の保存領域（ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ）を除いたベクターｐＣＨ３を作製した。前記ベクターｐＣＨ３の内、マウスピリオド２遺伝子の上流域部分の配列は、配列番号１で表される塩基配列の第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列に該当する。
（実施例２）
《マウスピリオド２の転写開始点の同定》
前記実施例１で取得したマウスピリオド２遺伝子上流領域断片を含むベクターｐＣＨ１及びベクターｐＣＨ３が、プロモーター領域を含むか否かは、転写開始点を含んでいるかを調べることで確かめることができる。転写開始点同定のため、オリゴキャップ法により作製されたマウス全脳のｃＤＮＡライブラリー（文献３２，文献３３）を用いて、キャップ部位の同定を試みた。
【００５１】
キャップ部位には配列番号２１で表される塩基配列からなるアダプターがついているので、前記アダプターに対しては、配列番号２２で表される塩基配列（配列番号２１で表される塩基配列の第１番目〜第２１番目の塩基からなる配列）からなるプライマー及び配列番号２３で表される塩基配列（配列番号２１で表される塩基配列の第１１番目〜第３０番目の塩基からなる配列）からなるプライマーを作製した。一方、マウスピリオド２遺伝子に対しては、配列番号２４で表される塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０３６８９３）の第４３９番目〜第４５９番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマー、配列番号２５で表される塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０３６８９３）の第３７７番目〜第３９８番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマー、及び配列番号２６で表される塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０３６８９３）の第３００番目〜第３１９番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマーを作製した。
配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用いる第１回目のＰＣＲと、配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２５で表される塩基配列からなるプライマーを用いる第２回目のＰＣＲとからなるネスティドＰＣＲを実施したところ、キャップ部位を含む４１４ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。また、配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用いる第１回目のＰＣＲと、配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマーを用いる第２回目のＰＣＲとからなるネスティドＰＣＲを実施したところ、キャップ部位を含む３３５ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
これらのＤＮＡ断片に対するシークエンス解析の結果、転写開始点は、翻訳開始点（配列番号１で表される塩基配列の第１６１７６番目の塩基）から８４４０ｂｐ上流（配列番号１で表される塩基配列の第７７３６番目の塩基）に存在することが明らかとなった。このことから、構築したベクターｐＣＨ１及びベクターｐＣＨ３に転写開始点が含まれ、ベクターｐＣＨ１は、マウスピリオド２遺伝子の−３３２１〜＋３１４２（転写開始点を「＋１」とする）の塩基を有し、ベクターｐＣＨ３は、マウスピリオド２遺伝子の−３３２１〜＋１９６の塩基を有することを確認した。
（実施例３）
《マウスピリオド２上流領域のプロモータ活性とエンハンサー活性の解析》
マウス培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、ルシフェラーゼアッセイの前日に、６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５ずつ撒いた。トランスフェクション試薬としてリポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用い、各種レポーターベクター１μｇとインターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０；プロメガ社）２０ｎｇとを用いて、マニュアルに従ってトランスフェクションを行なった。前記レポーターベクターとしては、前記実施例１で取得したベクターｐＣＨ１及びベクターｐＣＨ３、ネガティブコントロールとしてプロモーター活性を有しないベクターｐＧＬ３−ｂ（プロメガ社）、そして、ポジティブコントロールとして、ルシフェラーゼの上流にＳＶ４０プロモーターが連結されているベクターｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（プロメガ社；以下、ｐＧＬ３−ｐと略称する）を使用した。
なお、インターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）以外のベクター（すなわち、ベクターｐＧＬ３−ｂ、ベクターｐＣＨ１、ベクターｐＣＨ３、及びベクターｐＧＬ３−ｐ）に含まれるルシフェラーゼ遺伝子が、ホタル由来であるのに対して、インターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）に含まれるルシフェラーゼ遺伝子は、シーパンジー（ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）由来である。
トランスフェクションから４８時間経過後に、細胞をリン酸緩衝用液（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、アッセイキット（ピッカジーンデュアルレポーターアッセイキット；ニッポンジーン社）を用いて、マニュアルに従ってアッセイを行なった。発光測定は、マイクロタイタールミノメーターＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて行なった。
結果を図３に示す。図３において「ＢＬＫ」は、トランスフェクションを実施していない宿主細胞における発光量を意味する。また、図３に示す「ルシフェラーゼ相対活性（標準化）」は、インターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）に由来するルシフェラーゼ発現量に基づいて、標準化した値を意味する。図３に示すように、ベクターｐＣＨ１のベーサルのプロモーター活性は、低い活性（ベクターｐＧＬ３−ｐの７％）であったのに対し、ベクターｐＣＨ３は、ベクターｐＧＬ３−ｐの５５％のプロモーター活性を示した。
保存された７つの領域（Ｉ〜ＶＩＩ）の内、第一エクソン上流の３つの保存領域（Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）を含むベクターｐＣＨ３が機能的であるかどうかを評価するため、ピリオドの転写活性化因子であるＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーにより転写活性化されるか否かを検討した。
すなわち、ベクターｐＣＨ３（１０ｎｇ）と一緒に、ｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｂｍａｌ１及びｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｃｌｏｃｋを、それぞれ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、又は２５０ｎｇずつ加えて、リポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いてトランスフェクションを行なった。なお、前記ベクターｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｂｍａｌ１及びベクターｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｃｌｏｃｋは、ｐＣｌ−ｎｅｏベクター（プロメガ社）に、それぞれ、マウスビーマル１又はマウスクロックを導入したもの（文献３４）であり、マウスビーマル１及びマウスクロックは、培養細胞内で構成的に発現される。また、前記トランスフェクションの際には、インターナルコントロールとしてｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社）０．５ｎｇを加え、更に、トランスフェクションするＤＮＡが全量で１μｇになるように、ｐＣｌ−ｎｅｏベクター（プロメガ社）で調整した。
トランスフェクションから４８時間経過後に、前記操作と同様に、アッセイキット（ピッカジーンデュアルレポーターアッセイキット；ニッポンジーン社）を用いて発光測定を行なった。
結果を図４に示す。図４における「ＢＬＫ」は、図３に示す「ＢＬＫ」と同じ意味である。図４に示すように、用量依存的なＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーによる転写活性化を確認した。この結果から、構築したマウスピリオド２遺伝子上流を含むルシフェラーゼベクターが機能的であることが判明した。
（実施例４）
《ｍＰｅｒ２：ｌｕｃトランスジェニックラットの作製》
前記実施例３で実施したイン・ビトロの実験結果から、ベクターｐＣＨ３がピリオド２遺伝子本来の発現を示すのに充分な要素を含むことが考えられることから、これを用いてｍＰｅｒ２：Ｌｕｃトランスジェニックラットの作製を試みた。
まず、遺伝子導入ラットを作製するにあたり、ベクター自身に由来する配列（例えば、複製開始Ｏｒｉ及びアンピシリン耐性遺伝子など）を制限酵素Ｓａｌｌ／Ｍｌｕｌ処理に続くアガロースゲル電気泳動により除いた。目的の断片の精製は、ゲルバンド精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ；ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行ない、フェノール／クロロホルム処理を実施した後、滅菌ＴＥバッファー［１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］１００μＬに溶解することによりＤＮＡ溶液（濃度＝７５ｎｇ／μＬ）を調製した。前記ＤＮＡ断片には、配列番号１で表される塩基配列の第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列と、ルシフェラーゼをコードする遺伝子とが含まれる。
トランスジェニックラットを作製するため、日本チャールスリバーからＷｉｓｔａｒラットを購入した。トランスジェニックラットの作製操作は、基本的には公知方法（文献３５）に基づいて実施し、ラット前核期受精卵への注入用ＤＮＡ溶液のマイクロインジェクションは、以下の要領で行なった。
すなわち、性成熟した８週齢のＷｉｓｔａｒラットを、明暗サイクル１２時間（４：００〜１６：００を明時間とした）、温度２３±２℃、及び湿度５５±５％の条件下で飼育し、膣スメアにより雌の性周期を観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌ラットに妊馬血清性性腺刺激ホルモン［ＰＭＳ全薬（ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｍａｒｅｓｅｒｕｍ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ；ＰＭＳＧ）；日本ゼンヤク社］１５０ＩＵ／ｋｇを腹腔内投与して過剰排卵処理を行ない、その４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン［プベローゲン（ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ；ｈＣＧ）；三共臓器社］７５ＩＵ／ｋｇを投与した後、雄との同居により交配を行なった。ｈＣＧ投与から３２時間経過後に、卵管灌流により前核期受精卵を採取した。卵管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（文献３６）を使用した。採取した受精卵を、０．１％ヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  Ｔｙｐｅｌ−Ｓ；シグマ社）を含むｍＫＲＢ液中で、３７℃にて５分間の酵素処理を行ない、卵丘細胞を除去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、ＤＮＡ注入操作までＣＯ２−インキュベーター内（５％ＣＯ２，３７℃，飽和湿度）に保存した。このようにして準備したラット受精卵の雄性前核に、先に調製したＤＮＡ溶液を注入した。５２５個の胚に注入操作を実施し、生き残った４３１個の胚の内、形態的正常胚４２０個を偽妊娠誘起した仮親雌の卵管内に移植した。
ラットに外来ＤＮＡ（ルシフェラーゼ遺伝子を含む）が導入されたか否かを調べるために、ルシフェラーゼ遺伝子に対するＰＣＲプライマーとして、配列番号２７で表される塩基配列［クローニングベクターｐＧＬ３−ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４７２９５）の第４１０番目〜第４３２番目の塩基からなる配列］からなるプライマー及び配列番号２８で表される塩基配列［クローニングベクターｐＧＬ３−ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４７２９５）の第９８０番目〜第１０００番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマーを設計した。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ産物（５９１ｂｐ）の有無により、外来ＤＮＡ（ルシフェラーゼ遺伝子を含む）の導入を確認することができる。
４２０個の胚移植により６５匹のラットが生まれた。３週齢時に、産子の尾の先１ｃｍ程度を小直剪刀にて切断し、リシス溶液８００μＬを加えて５５℃恒温槽内で一晩振とうすることによって尾を溶解した。なお、前記リシス溶液は、リシスバッファー［最終濃度として、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）が５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）が１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＮａＣｌが１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、ＳＤＳが１％である溶液］の中に、アクチナーゼＥとプロテアーゼＫとを、最終濃度がともに１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解して調製した。
続いて、フェノール処理を２度行ない、遠心後の上部水層を採取し、イソプロパノールの入ったチューブに移した。混和後、現れた糸状ゲノムＤＮＡを、加工したガラス製のマイクロピペットの先で巻き取り、それを７０％エタノールで５分間、続いて１００％エタノールに５分間つけ、最後にＴＥにつけて溶解し、各個体のゲノムＤＮＡの調製を行なった。
各個体ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュダイアグノスティック社）を用い、９４℃で１分間保温した後、９４℃（３０秒）と５７℃（３０秒）と７２℃（６０秒）とからなるサイクルを４０回繰り返すことにより実施した。その結果、生まれた６５匹のラットの内、８匹がｍＰｅｒ２：Ｌｕｃトランスジェニックラットであることが明らかとなった。
更に、７週齢時に、８匹のｍＰｅｒ２：Ｌｕｃトランスジェニックラットの尾の先５ｍｍ程度を小直剪刀により切断した。切断面にルシフェリン溶液を塗り、切断面を上にして極微弱発計数装置［フォトマル（型名ＬＭ−３００Ｙ２）；浜松フォトニクス社］で発光量を測定した。なお、前記ルシフェリン溶液は、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地（ｃａｔ．１３０００−０５４；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）に、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２；最終濃度＝１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ペニシリン抗生物質（最終濃度＝２５Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン抗生物質（最終濃度＝２５μｇ／ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３；最終濃度＝０．３ｇ／Ｌ）、及びルシフェリン［Ｃａｔ．Ｅ１６０１（プロメガ社）；最終濃度＝０．１ｍｍｏｌ／Ｌ］を加えて調製した。
その結果、８匹中、４匹のラットの尾が、それぞれ９２３ｃｐｓ、４３９２ｃｐｓ、１１２２ｃｐｓ、及び８６５ｃｐｓを示した。これらの発光量は、コントロール（野生型ラットの尾）の１００ｃｐｓ前後に比べて、有意な発光量であり、ルシフェラーゼが生体内で機能するｍＰｅｒ２：Ｌｕｃトランスジェニックラット４匹を取得したことを確認した。
これらの４匹のメスのトランスジェニックラット（Ｆ０）の内、尻尾の発光量が最も高かったライン（４３９２ｃｐｓ）と野生型のオスとを交配させ、Ｆ１ラット１１匹を取得した（オス５匹及びメス６匹）。
（実施例５）
《ｍＰｅｒ２：ｌｕｃトランスジェニックラットの視交叉上核切片及び末梢組織（肝臓片、肺片、及び眼球）に対する自動発光測定の実施》
実施例４で取得したＦ１ラットは、野生型とヘテロ・トランスジェニックラットとの交配であるため、その嫡出子Ｆ１には、野生型と、ヘテロのトランスジェニックラットとが含まれる。本実施例で実験に供するトランスジェニックラットを、前記Ｆ１ラットの中から選択するために、前記Ｆ１ラット（すなわち、実施例４で取得した尻尾の発光量が最も高かったラインと野生型との交配から得たＦ１ラット）の尻尾を６週齢時に切断し、実施例４と同様にして発光を示すかどうかを検討した。その結果、有意な発光を示すＦ１のトランスジェニックラットは８匹であることが明らかとなった（オス４匹及びメス４匹）。この８匹のトランスジェニックラットの内、１匹のメス（７週齢）から、以下に示す手順に従って、リズムセンターである視交叉上核切片と、末梢組織（肝臓片、肺片、及び眼球）とをそれぞれ調製し、リアルタイム振動測定を実施した。
まず、視交叉上核切片の調製については、以下のようにして実施した。すなわち、ジエチルエーテルによりトランスジェニックラットを麻酔し、頸椎脱臼による屠殺の後、光による入力を遮断するため、両眼を切除し、全脳の摘出を行なった。全脳の内、余分な側頭部、前頭葉部、及び小脳をメス刃で切除し、氷冷したスライサー台に接着剤（アロンアルファ２０１；東亞合成株式会社）にて固定した。スライサー台に固定した脳に、ハンクスバッファー［最終濃度として、１×Ｈａｎｋｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社；ｃａｔ．１４０６０−０５７）及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社；ｃａｔ．１５６３０−０８０）］を加えて満たし、氷冷しながらスライサー（Ｍｉｃｒｏｓｌｉｃｅｒ  ＤＴＫ−１０００；堂阪イーエム株式会社）にて、切片（４００μｍ厚）調製を行なった。視交叉上核を含む切片を実体顕微鏡（ＳＭＺ６４５；ニコン社）観察にて選択した。更に、実体顕微鏡下で、この切片から第三脳室下の視交叉上核だけを、メス刃を用いて切り取ることにより、視交叉上核切片の調製を行なった。
一方、ルシフェリンを含む測定用培地［フェノールレッド不含のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社；ｃａｔ．１３０００−０５４）の中に、最終濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社；ｃａｔ．１５６３０−０８０）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌルシフェリン・カリウム塩（プロメガ社）、抗生物質（２５Ｕ／ｍＬペニシリン及び２５μｇ／ｍＬストレプトマイシン；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、及び０．３ｇ／Ｌ−ＮａＨＣＯ３（和光純薬株式会社）となるように調製した］１．２ｍＬを３５ｍｍディッシュの中に加え、その培地中にメンブレンフィルター（ＭｉｌｉＣｅｌｌＣＭ；ミリポア社；ｃａｔ．ＰＩＣＭＯＲＧ５０）を浮かべた。下から培地が供給される、このメンブレンフィルターの上に、先に調製した視交叉上核切片を乗せ、培養中に培地が乾燥しないように、３５ｍｍディッシュの上にスライドガラスカバー（４０ｍｍ×５０ｍｍ；松浪硝子工業株式会社）を乗せ、その間をシリコングリースコンパウンド（東レ・ダウコーニングシリコーン株式会社）を塗ることによって密封した。このようにして準備した視交叉上核切片入り３５ｍｍディッシュを、コンピューターに接続した極微弱発計数装置（ＬＭ−３００Ｙ２；浜松フォトニクス社）内にセットし、自動発光測定（リアルタイムモニター）を実施した。自動発光測定は２０日間にわたって継続し、その間に１回だけ（測定開始から１０日目）測定用培地を交換した。
末梢組織については、トランスジェニックラットから肝臓、肺、及び眼球をそれぞれ摘出した。その後、肝臓及び肺については、メス刃により約１ｍｍ角の組織片を調製し、以下の測定を行なった。一方、眼球については、摘出したそのままの組織を用いて以下の測定を行なった。視交叉上核切片の培養に使用したのと同じ前記ルシフェリン含有測定用培地の中へ、成長促進剤Ｂ−２７添加物（５０×）［Ｂ−２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社］を最終濃度が２％（１×）になるように加えた培地を調製し、この中に直接、末梢組織（肝臓片、肺片、又は眼球）を入れ、カバーガラスで密封し、視交叉上核切片と同様に極微弱発計数装置により自動発光測定を実施した。自動発光測定は２０日間にわたって継続し、その間に１回だけ（測定開始から１０日目）測定用培地を交換した。
視交叉上核切片における最初の１０日間（すなわち、測定開始から１０日間経過後まで）の自動発光測定の結果を図５及び図６に示し、末梢組織（肝臓片、肺片、及び眼球）における最初の１０日間の自動発光測定の結果をそれぞれ、図７、図８、及び図９に示す。図５〜図９において、横軸は、測定開始からの日数（測定開始日を０日とした）を表わし、縦軸は発光量（ｃｐｍ）を表わす。なお、図６は、図５に示すグラフを、縦軸方向にのみ拡大し、その一部を示すグラフである。
図５及び図６に示すように、視交叉上核切片の発光量は、測定開始から３日目の約９時間後には振動ピークを示し、その後、約２４時間ごとの振動リズムが認められた。なお、この振動は、測定開始から２０日目まで継続した。
肝臓片の発光量は、図７に示すように、測定開始３日目の約１８時間後と、４日目の約１８時間後に振動のピークを示したが、その後の振動は減衰により認められなかった。また、測定開始１０日目の培地交換によって、４回まで振動リズムが回復したことから、振動リズムの減衰は細胞の死滅によるものではなく、細胞間の脱同調によるものであると考えられる。
肺片の発光量は、図８に示すように、急激な変化を伴いながらも測定開始日から計５回の振動リズムが認められた。
眼球の発光量は、図９に示すように、測定開始１日目の約１４時間後をピークとする振動リズムがみられ、その後、振幅は小さいものの３回の振動リズムが認められた。
以上、視交叉上核及び末梢組織（肝臓、肺、及び眼球）は、各組織ごとに振動位相や振動の継続回数に差異はあるものの、全ての組織において約２４時間の振動リズムが認められた。本発明のトランスジェニックラット、又はその視交叉上核切片若しくは末梢組織を用いたピリオド２遺伝子発現自動モニター系により、ピリオド２遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニングが可能となると考えられる。
（実施例６）
《培養細胞系におけるマウスピリオド２プロモーターの振動誘導能確認》
ラット培養細胞Ｒａｔ−１を高濃度のウマ血清あるいはＤＥＸで刺激すると、細胞群が同調し、時計遺伝子および時計遺伝子に制御される遺伝子群がいっせいに２４時間間隔の発現振動を開始し数日に渡って継続し、その後減衰することが報告されている（文献２）。
マウスピリオド２遺伝子上流領域をルシフェラーゼベクターに連結した、前述のｐＣＨ３コンストラクトを、Ｒａｔ−１細胞にトランジェントに導入し、その後ＤＥＸ刺激を行い、ルシフェラーゼを含む培地に交換して、そこからの発光を、前述の極微弱発光計測装置にてリアルタイムに計測することを試みた。具体的な方法を以下に記述する。まず、Ｒａｔ−１細胞（ＡＴＣＣより購入：Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ＝Ｒａｔ１−Ｒ１２；ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ＝ＣＲＬ−２２１０）を、２２５ｃｍ２フラスコ（イワキ社）の中で１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＪＲＨバイオサイエンス社）を含む培地［フェノールレッドを含むＤＭＥＭ（ｃａｔ．１１９６５−０９２）の中に、最終濃度が抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）となるように調製した］２ｍＬ存在下、５％ＣＯ２、３７度環境下で培養維持した。トランスフェクション前日に、３５ｍｍディッシュ（ファルコン社）に、１ウェルあたり、１．２×１０６の細胞数になるようにＲａｔ−１細胞を撒き、５％ＦＢＳを含む前記培地２ｍＬにて培養を継続した。翌日、１マイクログラムのｐＣＨ３コンストラクトをトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従ってトランスフェクションした。トランスフェクションの３時間後に、新鮮な１０％ＦＢＳを含む前記培地２ｍＬに交換し培養を継続した。トランスフェクション１６時間後に、最終濃度０．１マイクロｍｏｌ／ＬのＤＥＸ（ＳＩＧＭＡ社；ｃａｔ．Ｄ−８８９３）を含む前記培地（１０％ＦＢＳ含む）に交換して刺激を開始した。ＤＥＸ刺激２時間後にルシフェリンを含む測定用培地（最終濃度０．１ミリｍｏｌ／Ｌのルシフェリン・カリウム塩（プロメガ社）を含む前記培地（１０％ＦＢＳを含む））２ｍＬに交換した。ルシフェリンを含む測定用培地添加後、スライドガラスカバーをのせ、シリコングリースコンパウンドにて密封し、コンピューターに接続した極微弱発計数装置内にセットして、自動発光測定（リアルタイムモニター）を実施した。
結果を図１０に示す。図１０の横軸は、測定開始からの日数（測定開始日を０日とした）を表わし、縦軸は発光量（ｃｐｍ）を表わす。図１０のように、２４時間ごとの発光の振動が観察された。このことから、我々がクレームするマウスピリオド２遺伝子上流領域（配列番号１で表される塩基配列の第４４１５番目〜７９３１番目）は、培養細胞においても振動能を有することが確認された。したがって、この領域を用いることで、培養細胞において振動を変化させる物質のスクリーニングが可能であると考えられる。
（実施例７）
《ルシフェラーゼベクターにヒトピリオド２上流配列を連結したコンストラクトｐＴＭ１５の構築》
実施例３および、実施例５のマウスプロモーター活性の解析結果から、７つの保存領域のうち、振動に十分であると考えられるのは、Ｉ〜ＩＩＩの領域であると示唆された。そこでヒトのＩ〜ＩＩＩの領域（配列番号２で表される塩基配列の第３８２０番目〜６０６８番目）を含むＤＮＡ断片を取得するために、鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を使用し、酵素としてＴａｑポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ；クロンテック社）を使用し、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、配列番号２９で表される塩基配列（配列番号２で表される塩基配列の第３６４４番目〜３６７１番目の塩基からなる配列）からなるフォワードプライマーと、配列番号３０で表される塩基配列（配列番号２で表される塩基配列の第６４０２番目〜６４２９番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるリバースプライマーとを使用し、９４℃で１分間保温した後、９４℃（１５秒間）と５８℃（３０秒間）と６８℃（４分間）とからなるサイクルを３５回繰り返し、最後に６８℃で１０分間保温することにより、実施した。ＰＣＲの結果、２．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られた。一般的に、Ｔａｑポリメラーゼにより増幅されたＰＣＲ断片は３’末端にヌクレオチドＡが付加されることから、Ａが付加されたＤＮＡ断片を効率よくクローニングするために、ルシフェラーゼベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃのＳｍａＩサイトにヌクレオチドＴを付加したクローニングベクターの作製を試みた。すなわちｐＧＬ３−ｂａｓｉｃを制限酵素ＳｍａＩで処理して切断した後、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、ゲルから切断されたベクターを抽出し、Ｔａｑポリメラーゼ（ロッシュダイアグノスティック社）を含むＰＣＲ反応液に加えて７０度で２時間保温し、ＳｍａＩ切断部位へのオリゴヌクレオチドＴ付加を行った。このようにして作製したＰＧＬ３−ｂａｓｉｃ  ＴＡベクターは、ＰＣＲ断片を効率的よくＳｍａＩ部位にクローニングできる。ＰＧＬ３−ｂａｓｉｃ  ＴＡベクターに先述のＰＣＲにより取得した２．８ｋｂｐのＰＣＲ断片を組み込むことによって、レポーターベクターｐＴＭ１５を作製した。ベクターｐＴＭ１５の内、ヒトピリオド２遺伝子の上流域部分の配列は、配列番号２で表される塩基配列の第３６４４番目〜６４２９番目の塩基からなる配列に該当し、保存領域Ｉ〜ＩＩＩ（配列番号２で表される第３８２０番目〜第６０６８番目）を含む。
（実施例８）
《ヒトピリオド２の転写開始点の同定》
実施例２において、マウスピリオド２の転写開始点がＩ〜ＩＩＩ保存領域内に存在すること明らかにしたが、ヒトピリオド２の転写開始点に関する情報はない。そこで、ヒトピリオド２の転写開始点同定のため、オリゴキャップ法により作製されたヒト小脳のｃＤＮＡライブラリー（ソースとなるＴｏｔａｌ  ＲＮＡはクロンテック社（ｃａｔ．６４０３５−１）から入手；文献３２，文献３３）を用いて、キャップ部位の同定を試みた。すなわち、配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマー及び、配列番号３１で表される塩基配列［ヒトピリオド２遺伝子のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００３８９４．１）の第４８０番目〜５０１番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマーを用いる第１回目のＰＣＲと、配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３２で表される塩基配列［ヒトピリオド２遺伝子のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００３８９４．１）の第１２２番目〜第１４３番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマーを用いる第２回目のＰＣＲとからなるネスティドＰＣＲを実施したところ、キャップ部位を含む２０９ｂｐと３２３ｂｐの二つのＤＮＡ断片が得られた。これら２つのＤＮＡ断片に対するシークエンス解析の結果、ヒトピリオド２遺伝子の第一エクソンは二種類（便宜的にエクタン１Ａ、エクソン１Ｂとする）存在し、これが第二エクソン（配列番号２で表される塩基配列の第１６４６２番目〜１６７１０番目）にそれぞれ独立して連結することが明らかとなった。エクソン１Ａは配列番号２で表される塩基配列の第５６２５番目〜５７７３番目であり、エクソン１Ｂは配列番号２で表される塩基配列の第５８０６番目〜６０６８番目である。このように、ヒトピリオド２遺伝子の転写開始点は二つ存在し、配列番号２で表される塩基配列の第５６２５番目（エクソン１Ａ）と第５８０６番目（エクソン１Ｂ）に存在することを明らかにした。このことから、構築したベクターベクターｐＴＭ１５に転写開始点が含まれることを確認した。
（実施例９）
《培養細胞系における、ヒトピリオド２プロモーターの振動誘導能確認》
実施例６と同様の方法により、培養細胞におけるヒトピリオド２プロモーターベクターｐＴＭ１５の振動誘導能を調べた結果、図１１に示す有意な振動を確認した。図１１の横軸は、測定開始からの日数（測定開始日を０日とした）を、縦軸は発光量（ｃｐｍ）を表わす。我々がクレームするヒトピリオド２遺伝子上流領域（配列番号２で表される第３８２０番目〜６０６８番目）含むＤＮＡ断片が培養細胞においても振動能を示したことから、この領域を用いることで、培養細胞において振動を変化させる物質のスクリーニングが可能であると考えられる。
（実施例１０）
《ルシフェラーゼベクターにマウスピリオド２上流配列を連結したデリーションコンストラクトの作製》
実施例１で取得したマウスピリオド２遺伝子上流領域断片で第一エクソン上流の３つの保存領域（Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）を含むベクターｐＣＨ３（配列番号１で表される塩基配列の第４４１５番目から第７９３１番目の塩基からなる配列を含む）が、実施例３の図３に示すように強いプロモーター活性を有し、且つ、図４に示すようにピリオドの転写活性化因子であるＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーにより転写活性化されることが明らかとなっている。マウスピリオド２遺伝子のベーサルプロモーター活性に重要な領域及びＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーによる転写活性化に重要な領域が、３つの保存領域のどこに存在するのかを明らかにするために保存領域デリーションコンストラクトを作製して検討した。まず、保存領域Ｉ，ＩＩ，及びＩＩＩ（それぞれ、配列番号１で表される塩基配列の第５９３２番目から第６０４３番目の、第６０８７番目から第６１７９番目の、及び第７５１８番目から第７７３５番目の塩基からなる配列に該当する）を全て含むより短い塩基配列からなるデリーションコンストラクトを作製した。前記ベクターｐＣＨ３に対して制限酵素ＭｌｕＩ／ＢａｌＩ処理を行ない、切断したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により除去した。このようにしてデリーションＤＮＡ断片を欠失させたものについてセルフライゲーションを行なうことにより、ベクターｐＣＨ３からベクターｐＣＨ３−Ｄ１を作製した。ベクターｐＣＨ３−Ｄ１の内、マウスピリオド２遺伝子の上流領域部分の配列は、配列番号１で表される塩基配列の第５２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列（転写開始点を「＋１」とすると−２４８７〜＋１９６の塩基配列）に該当する。次いで、保存配列Ｉ及びＩＩを欠失させたデリーションコンストラクトを作製した。ベクターｐＣＨ３に対して制限酵素ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ処理処理を行ない、切断したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により除去した。このようにしてデリーションＤＮＡ断片を欠失させたものについてセルフライゲーションを行なうことにより、ベクターｐＣＨ３からベクターｐＣＨ３−Ｄ２を作製した。ベクターｐＣＨ３−Ｄ２の内、マウスピリオド２遺伝子の上流領域部分の配列は、配列番号１で表される塩基配列の第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列（転写開始点を「＋１」とすると−１３１９〜＋１９６の塩基配列）に該当する。更に、主に保存領域ＩＩＩのみを含むベクターを構築するために、ベクターｐＣＨ３に対して制限酵素ＭｌｕＩ／ＢｓｔＸＩ処理を行ない、切断したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により除去した。このようにしてデリーションＤＮＡ断片を欠失させたものについてセルフライゲーションを行なうことにより、ベクターｐＣＨ３からベクターｐＣＨ３−Ｄ３を作製した。ベクターｐＣＨ３−Ｄ３の内、マウスピリオド２遺伝子の上流領域部分の配列は、配列番号１で表される塩基配列の第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列（転写開始点を「＋１」とすると−２７３〜＋１９６の塩基配列）に該当する。
（実施例１１）
《マウスピリオド２上流領域デリーションコンストラクトのプロモータ活性とエンハンサー活性の解析》
マウス培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、ルシフェラーゼアッセイの前日に、６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５ずつ撒いた。トランスフェクション試薬としてリポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用い、各種レポーターベクター１μｇとインターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０；プロメガ社）２０ｎｇとを用いて、マニュアルに従ってトランスフェクションを行なった。前記レポーターベクターとしては、前記実施例１０で取得したベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−Ｄ２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３、ネガティブコントロールとしてプロモーター活性を有しないベクターｐＧＬ３−ｂ（プロメガ社）、そして、ポジティブコントロールとして、ベクターｐＣＨ３を使用した。
なお、インターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）以外のベクター（すなわち、ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−Ｄ２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３及びベクターｐＣＨ３）に含まれるルシフェラーゼ遺伝子が、ホタル由来であるのに対して、インターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）に含まれるルシフェラーゼ遺伝子は、シーパンジー（ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）由来である。
トランスフェクションから４８時間経過後に、細胞をリン酸緩衝用液（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、アッセイキット（ピッカジーンデュアルレポーターアッセイキット；ニッポンジーン社）を用いて、マニュアルに従ってアッセイを行なった。発光測定は、マイクロタイタールミノメーターＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて行なった。
結果を図１２に示す。図１２において「ＢＬＫ」は、トランスフェクションを実施していない宿主細胞における発光量を意味する。また、図１２に示す「ルシフェラーゼ相対活性（標準化）」は、インターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）に由来するルシフェラーゼ発現量に基づいて、標準化した値を意味する。図１２に示すように、ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−Ｄ２のベーサルのプロモーター活性は、ベクターｐＣＨ３の約６０％のプロモーター活性を示した。ベクターｐＣＨ３−Ｄ３のベーサルのプロモーター活性は、ベクターｐＣＨ３の約８０％のプロモーター活性を示した。以上のことからマウスピリオド２のベーサルプロモーター活性を担う領域は、配列番号１で表される塩基配列の第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列の中に存在することが示唆された。この領域中に転写開始点及び保存領域ＩＩＩが含まれることを考慮すると、保存領域ＩＩＩがベーサルプロモーター活性の発現に重要であると考えられる。
次に、ピリオド２が転写活性化因子ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーによって転写活性化を受けるために必要な領域について検討した。
前記ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−Ｄ２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３或いはベクターｐＣＨ３の１０ｎｇと一緒にｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｂｍａｌ１及びｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｃｌｏｃｋを、それぞれ２５０ｎｇずつ加えて、リポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いてトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの際には、インターナルコントロールとしてｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社）０．５ｎｇを加え、更に、トランスフェクションするＤＮＡが全量で１μｇになるように、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（プロメガ社）で調整した。
トランスフェクションから４８時間経過後に、前記操作と同様に、アッセイキット（ピッカジーンデュアルレポーターアッセイキット；ニッポンジーン社）を用いて発光測定を行なった。
結果を図１２に示す。図１２における「ＢＬＫ」は、図４に示す「ＢＬＫ」と同じ意味である。図１２に示すように、ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−Ｄ２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３及びベクターｐＣＨ３は、全てビーマル１遺伝子及びクロック遺伝子のコトランスフェクションにより転写がそれぞれおよそ５．０倍、５．６倍、７．１倍及び５．６倍活性化されたことから、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーにより転写活性化を受けたものと考えられた。この結果から、マウスピリオド２が転写活性化因子ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーによって転写活性化を受けるのに重要な配列は、配列番号１で表される塩基配列の第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列の中に存在することが示唆された。この領域中に保存領域ＩＩＩが含まれることから保存領域ＩＩＩの中に、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーが機能するための応答配列が存在するものと考えられる。
（実施例１２）
《マウスピリオド２上流領域デリーションコンストラクトの振動誘導能の解析》
実施例６と同様の方法により、実施例１０で作成したベクターｐＣＨ３−Ｄ３を用いて培養細胞における振動誘導能を調べた結果、図１３に示す有意な振動を確認した。図１３の横軸は、測定開始からの日数（測定開始日を０日とした）を、縦軸は発光量（ｃｐｍ）を表わす。マウスピリオド２遺伝子上流領域のうち保存領域ＩＩＩのみを含むＤＮＡ断片（配列番号１で表される塩基配列の第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列に該当する）が、培養細胞において振動能を示したことから、マウスピリオド２の保存領域ＩＩＩの中に発現振動に重要な配列が存在すると考えられ、この領域を用いることで、培養細胞において振動を変化させる物質のスクリーニングが可能であると考えられる。
産業上の利用可能性
本発明のピリオド２遺伝子プロモーター、前記プロモーター及びレポーター遺伝子を含む本発明のコンストラクト、本発明の細胞、本発明のトランスジェニック動物、又はその視交叉上核切片若しくは末梢組織を用いて、体内時計遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング系を構築することができる。前記スクリーニング系により選択された物質は、概日リズム疾患（例えば、概日リズム異常に起因する、睡眠傷害、うつ病、又は老年性痴呆患者の行動異常）を改善する薬剤の候補物質として有用である。
＜文献リスト＞
１．Ｊ．Ｃ．Ｄｕｎｌａｐ，Ｃｅｌｌ，９６，２７１−９０（１９９９）．
２．Ａ．Ｂａｌｓａｌｏｂｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，２３４４−７（２０００）．
３．Ｓ．Ｓ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，３９６−９（１９９８）．
４．Ｐ．Ｍ．Ｓｅｄｇｗｉｃｋ，Ｐｏｓｔｇｒａｄ  Ｍｅｄ．Ｊ．，７４，１３４−８．（１９９８）．
５．Ｎ．Ｋａｊｉｍｕｒａ，Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ，５６，４０４−９．（１９９８）．
６．Ｋ．Ｍｉｓｈｉｍａら，Ａｃｔａ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｓｃａｎｄ，８９，１−７（１９９４）．
７．Ａ．Ｓａｔｌｉｎ，Ｌ．Ｖｏｌｉｃｅｒ，Ｖ．Ｒｏｓｓ，Ｌ．Ｈｅｒｚ，Ｓ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１４９，１０２８−３２（１９９２）．
８．Ａ．Ｔｏｍｏｄａ，Ｔ．Ｍｉｉｋｅ，Ｋ．Ｙｏｎａｍｉｎｅ，Ｋ．Ａｄａｃｈｉ，Ｓ．Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，４１，８１０−３．（１９９７）．
９．Ｃ．Ａ．Ｃｚｅｉｓｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３，６６７−７１（１９８６）．
１０．Ｎ．Ｅ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら，Ｓｌｅｅｐ，１３，３５４−６１．（１９９０）．
１１．Ｌ．Ｗｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２３５，５−１９．（１９９４）．
１２．Ｔ．Ｐａｒｔｏｎｅｎ，Ｍ．Ｐａｒｔｉｎｅｎ，Ａｃｔａ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ．，３７７，４１−５（１９９４）．
１３．Ｆ．Ｋ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｉ．Ｚｕｃｋｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６９，１５８３−６．（１９７２）．
１４．Ｒ．Ｙ．Ｍｏｏｒｅ，Ｖ．Ｂ．Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，４２，２０１−６（１９７２）．
１５．Ｄ．Ｒ．Ｗｅａｖｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｈｙｔｈｍｓ，１３，１００−１２（１９９８）．
１６．Ｒ．Ｊ．Ｋｏｎｏｐｋａ，Ｓ．Ｂｅｎｚｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６８，２１１２−６．（１９７１）．
１７．Ｐ．Ｒｅｄｄｙら，Ｃｅｌｌ，３８，７０１−１０．（１９８４）．
１８．Ｐ．Ｅ．Ｈａｒｄｉｎ，Ｊ．Ｃ．Ｈａｌｌ，Ｍ．Ｒｏｓｂａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，３４３，５３６−４０（１９９０）．
１９．Ｐ．Ｅ．Ｈａｒｄｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，８，６４２−７（１９９８）．
２０．Ｚ．Ｓ．Ｓｕｎら，Ｃｅｌｌ，９０，１００３−１１（１９９７）．
２１．Ｈ．Ｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３８９，５１２−６（１９９７）．
２２．Ｔ．Ｔａｋｕｍｉら，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，３，１６７−７６（１９９８）．
２３．Ｕ．Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｚ．Ｓ．Ｓｕｎ，Ｇ．Ｅｉｃｈｅｌｅ，Ｃ．Ｃ．Ｌｅｅ，Ｃｅｌｌ，９１，１０５５−６４（１９９７）．
２４．Ｔ．Ｔａｋｕｍｉら，Ｅｍｂｏ  Ｊ．，１７，４７５３−９（１９９８）．
２５．Ｍ．Ｊ．Ｚｙｌｋａ，Ｌ．Ｐ．Ｓｈｅａｒｍａｎ，Ｄ．Ｒ．Ｗｅａｖｅｒ，Ｓ．Ｍ．Ｒｅｐｐｅｒｔ，Ｎｅｕｒｏｎ，２０，１１０３−１０（１９９８）．
２６．Ｄ．Ｐ．Ｋｉｎｇら，Ｃｅｌｌ，８９，６４１−５３（１９９７）．
２７．Ｎ．Ｇｅｋａｋｉｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１５６４−９（１９９８）．
２８．Ｓ．Ｙａｍａｚａｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，６８２−５（２０００）．
２９．Ｂ．Ｚｈｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，４００，１６９−７３（１９９９）．
３０．Ｋ．Ｌ．Ｔｏｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１，１０４０−３（２００１）．
３１．Ｎ．Ｋ．Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｍ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｋｏｂｙｌｅｃｋｉ，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−７３（１９９５）．
３２．Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ，１３８，１７１−４．（１９９４）．
３３．Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｔｏｍｏ−Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ａ．Ｓｕｙａｍａ，Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ，２００，１４９−５６．（１９９７）．
３４．Ａ．Ｈｉｄａら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６５，２２４−３３（２０００）．
３５．Ｓ．Ｈｏｃｈｉ，Ｔ．Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ｈ．Ｍ，Ａ．Ｙｕｋｉ，Ａｎｉｍａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｉｏｇｙ，１，１７５−８４（１９９０）．
３６．Ｙ．Ｔｏｙｏｄａ，Ｍ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．，３６，９−２２（１９７４）．
３７．Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２（１９８１）．
３８．Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．，Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１９８０）．
３９．Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．，Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８（１９８３）．
４０．Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７（１９７３）．
４１．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５（１９８２）．
４２．岡村均ら，２０００年度時間生物学会会誌，第４２頁．
４３．Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，６８４（２００１）
４４．Ｃｅｌｌ，１０３，１００９−１０１７（２０００）
４５．Ｃｅｌｌ，９６，５７−６８（１９９９）
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号２１の配列で表される塩基配列は、オリゴキャップのアダプター配列である。配列表の配列番号２２の配列で表される塩基配列は、配列表の配列番号２１の配列で表される塩基配列における第１番目〜第２１番目の塩基からなる配列である。配列表の配列番号２３の配列で表される塩基配列は、配列表の配列番号２１の配列で表される塩基配列における第１１番目〜第３０番目の塩基からなる配列である。配列表の配列番号２７の配列で表される塩基配列は、クローニングベクターｐＧＬ３−ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４７２９５）の第４１０番目〜第４３２番目の塩基からなる配列である。配列表の配列番号２８の配列で表される塩基配列は、クローニングベクターｐＧＬ３−ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４７２９５）の第９８０番目〜第１０００番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
2002081682.tif 000002
2002081682.tif 000003
2002081682.tif 000004
2002081682.tif 000005
2002081682.tif 000006
2002081682.tif 000007
2002081682.tif 000008
2002081682.tif 000009
2002081682.tif 000010
2002081682.tif 000011
2002081682.tif 000012
2002081682.tif 000013
2002081682.tif 000014
2002081682.tif 000015
2002081682.tif 000016
2002081682.tif 000017
2002081682.tif 000018
2002081682.tif 000019
2002081682.tif 000020
2002081682.tif 000021
2002081682.tif 000022
【図面の簡単な説明】
図１は、マウスピリオド２遺伝子及びヒトピリオド２遺伝子（ｈＰｅｒ２）上流を比較した結果を示すグラフである。
図２は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている６つの領域の塩基配列を示す説明図である。
図３は、マウスピリオド２遺伝子上流領域のベーサルのプロモーター活性を示すグラフである。
図４は、マウスピリオド２遺伝子上流領域を含むベクターｐＣＨ３に対する、転写因子ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーの作用を示すグラフである。
図５は、測定開始から１０日間にわたる視交叉上核切片における自動発光測定の結果を示すグラフである。
図６は、図５に示すグラフを、縦軸方向にのみ拡大し、その一部を示すグラフである。
図７は、測定開始から１０日間にわたる肝臓片における自動発光測定の結果を示すグラフである。
図８は、測定開始から１０日間にわたる肺片における自動発光測定の結果を示すグラフである。
図９は、測定開始から１０日間にわたる眼球における自動発光測定の結果を示すグラフである。
図１０は、測定開始から４日間にわたるｐＣＨ３導入培養細胞における自動発光測定の結果を示すグラフである。
図１１は、測定開始から５日間にわたるｐＴＭ１５導入培養細胞における自動発光測定の結果を示すグラフである。
図１２は、マウスピリオド２遺伝子上流領域のベーサル活性、及び同領域を含むベクターに対する転写因子ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫヘテロダイマーの作用を示すグラフである。
図１３は、測定開始から６日間にわたるｐＣＨ３−Ｄ３導入培養細胞における自動発光測定の結果を示すグラフである。
【図１】
2002081682.tif 000023
【図２】
2002081682.tif 000024
【図３】
2002081682.tif 000025
【図４】
2002081682.tif 000026
【図５】
2002081682.tif 000027
【図６】
2002081682.tif 000028
【図７】
2002081682.tif 000029
【図８】
2002081682.tif 000030
【図９】
2002081682.tif 000031
【図１０】
2002081682.tif 000032
【図１１】
2002081682.tif 000033
【図１２】
2002081682.tif 000034
【図１３】
2002081682.tif 000035
【国際調査報告】
2002081682.tif 000036
2002081682.tif 000037
2002081682.tif 000038