(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチトロンビンIII（ＡＴIII）と組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰＩ）を有効成分として含有する汎発性血管内凝固症候群治療剤。
【請求項２】
ＡＴIIIがヒト血液由来のＡＴIIIである請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
ＡＴIIIが遺伝子組換え技術によって製造されるＡＴIIIである請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
ＴＦＰＩがヒト血液由来のＴＦＰＩである請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
ＴＦＰＩが遺伝子組換え技術によって製造されるＴＦＰＩである請求項１に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アンチトロンビンIII（ＡＴIII）と組織因子凝固系インヒビター（Tissue Factor Pathway Inhibitor，ＴＦＰＩ）を有効成分として含有する血栓症の治療剤に関するものである。さらに詳細には、本発明はＡＴIIIとＴＦＰＩを有効成分として含有する汎発性血管内凝固症候群（Disseminated Intravascular Coagulation，ＤＩＣ）の治療剤である。
【０００２】
【発明の背景及び従来技術】
血液凝固は損傷した血管での止血や、細菌並びにウイルス等の感染進展の防御等の様々な役割を果たす重要な生体防御機構の一つである。そのため、血液凝固反応に関する研究は古くから活発に行なわれ、それに伴い血液凝固反応の詳細な機序も明らかにされてきた。その結果、血液凝固反応は内因系凝固系と外因系凝固系の２経路の開始反応を中心としたカスケード反応により構成され、最終的にフィブリンネットワークを形成する事によって終了することが明らかになった。さらに、近年の血液凝固開始機構に関する研究から、組織因子（Tissue  Factor：ＴＦ)と活性型第VII因子複合体（ＴＦ−Ｆ.VIIa)により第Ｘ因子及び第IX因子が活性化される反応、いわゆる外因系凝固反応が血液凝固の開始反応として非常に重要である事が明らかにされている［Davie, E.V. et al, Biochem., 30, p10363(1991)］。
【０００３】
しかし、一度この血液凝固反応に異常が生じると、血友病に見られる出血症や心筋梗塞等の血栓症が発症する事も良く知られている。特に、血栓症は心筋梗塞や脳梗塞等に代表されるように、致死率も非常に高く、現在最も重篤な疾患の一つに数えられている。
このような重篤な血栓症を防止するための療法としては、血液凝固の亢進状態を適切に防御する抗凝固療法及び抗血小板療法と、形成される血栓を効率良く溶解させる線溶療法がある。現在、抗凝固療法としては、生体に存在する凝固阻害因子や制御因子を中心として、合成された凝固因子活性阻害剤や凝固因子産生阻害剤（ワーファリン）等が臨床応用されている。線溶療法としては、ウロキナーゼやｔＰＡ等のプラスミノゲンアクチベーターが臨床応用されている。
【０００４】
また、血栓症の中でも、特に汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）は癌や白血病、感染症等の多彩な基礎疾患に伴って発症し、診断や治療法が多様であるために、臨床各領域で注目されている疾患の１つである。そして、その併発によって基礎疾患の病態は大きく修飾され、生命の予後をも左右する可能性があるので、迅速かつ的確な診断と治療が必要とされている。一般的にＤＩＣでは、何らかの機序により血管内で血液凝固が亢進し、その結果生じた大量のトロンビンにより多数の微小血栓が複数の臓器に形成され、循環障害に基づく多様な臓器症状と、血小板や凝固因子の消費による消費性凝固障害及び二次性に亢進した線溶に基づく著明な出血症状とが同時に見られる。
【０００５】
ＤＩＣ治療の原則は、基礎疾患の治療とともに、血液凝固亢進状態を是正することにある。しかし、その治療が必ずしも容易でない場合、出血や臓器不全による合併症を防止するために、ヘパリンまたは合成プロテアーゼ阻害剤等による抗血栓療法が用いられる。また、必要に応じてＡＴIII製剤等による補充療法が行なわれる。さらに、近年トロンボモジュリン（ＴＭ）や活性型プロテインＣ（ＡＰＣ）［Okajima, K. et al., Am.J.Haematol., 33, p277(1990)］による療法も臨床検討されはじめている。
【０００６】
ＡＴIIIは分子量59,000の糖蛋白質で、トロンビンをはじめとする血液凝固反応に関与するセリンプロテアーゼに対する阻害因子で、その活性はヘパリンにより著しく促進される［Rosenberg, R.D. et al., J.Biol.Chem., 248, p6490 (1973)］。ＤＩＣでは、ＡＴIIIの血管外への露出や消費性等の理由により血液中のＡＴIIIレベルが低下するが、ヘパリン療法を行なう際には、ヘパリンの効果を発揮するために、ＡＴIIIの血中レベルを70％以上に保つ事が必要とされている。よって、ＡＴIII低下に伴うＤＩＣにおいて、ＡＴIIIの補充療法が行なわれている［Schipper, H.G. et al., Lancet II, p754(1978)、小林紀夫他、臨床医薬、1, p773(1985)］。
【０００７】
さらに、最近の外因系凝固反応に関する一連の研究を通じて、ＴＦがさまざまな病態の凝固亢進状態に関与している事が推定されている。それは、血管損傷やサイトカイン等の刺激により、血管内皮細胞、平滑筋細胞や単球／マクロファージ等で過剰に発現されると、容易に凝固亢進状態になることが明らかにされているからである。よって、このＴＦ活性を阻害する事はＤＩＣ等の血栓症の早期治療を可能にすると考えられている。
【０００８】
ＴＦＰＩは分子量42,000の糖蛋白質で、アプロチニン等と同じクニッツ型プロテアーゼインヒビターに属し、活性型Ｘ因子を介してＴＦ−Ｆ.VIIaに結合して、その活性を抑制すると考えられている。ＴＦＰＩは、蛋白構造的には主にクニッツ１、クニッツ２、クニッツ３の３つの領域から構成されており、クニッツ１が活性型第VII因子との結合部位、クニッツ２が活性型第Ｘ因子との結合部位である事が明らかとなっている［Girard,T.J. et al., Nature, 338, p518(1989)］。生体中のＴＦＰＩは主に生体中で血管内皮細胞で合成された後、内皮細胞のヘパリン様物質に結合して、内皮細胞の抗血栓作用に重要な機能を果たしている事が推定されている［Novotny, W.F. et al., Blood, 78, p394(1991)；Sandset, P.M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 88, p708(1991)］。
【０００９】
実際に、動物モデルを用いた解析結果からＴＦＰＩは、抗敗血症作用［Creasey, A.A. et al., J. Clin.Invest., 91, p2850(1993)］、抗ＤＩＣ作用［Kathleen, C. et al., Blood, 76, p1538(1990)］等を有することが報告されている。さらに、ＴＦＰＩはＡＴIIIと同様にヘパリンにより活性が増強される事から、ヘパリンとの併用による相乗作用も期待されている［Wun,T.C., Blood, 79, p430(1992)］。このように、ＴＦＰＩは血液凝固の開始因子であるＴＦ−Ｆ.VIIa活性を直接阻害する事から、ＤＩＣ等の凝固亢進状態を早期にかつ効率的に抑制する新規治療薬として非常に期待されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
現在、ＤＩＣの治療に当たっては上述したように、ヘパリンやＡＴIII、合成プロテアーゼインヒビター等の薬剤が臨床応用されている。しかし、現状の薬剤だけではその有効率も約60〜70％と十分な治療が行なえているとは言い難い状況にある。その原因としては、▲１▼ＤＩＣを惹起する基礎疾患が多種多様である事から、従来の薬剤による画一的治療法では十分な治療が行なえない、▲２▼従来の薬剤は凝固反応の結果生じたプロテアーゼを阻害するために、凝固反応が起こる前の早期段階での治療が行なえない等が考えられる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
このような状況において、本発明者らはＤＩＣ等の血栓症に対して十分な治療効果をもつ早期治療薬剤を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＴIII及びＴＦＰＩを有効成分とする製剤が、それぞれの単独製剤よりもはるかに有効であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、有効成分として実質的にＡＴIIIとＴＦＰＩを含有する血栓症、好ましくはＤＩＣの治療剤である。
【００１２】
本発明におけるＡＴIII及びＴＦＰＩは、ヒト、その他の哺乳動物の血液から得られるＡＴIII及びＴＦＰＩ、または遺伝子組換え技術によって製造されるヒト、その他の哺乳動物由来のＡＴIII及びＴＦＰＩを含むものをいう。さらに、本発明のＡＴIII及びＴＦＰＩとしては、これらの中でもヒト血液由来又は遺伝子組換え技術によって製造されるヒトＡＴIIIとヒトＴＦＰＩをあげる事ができる。なお、本発明の目的とするＤＩＣ等の血栓症の治療剤としての効果が得られる限り、血液由来及び遺伝子組換え技術によって製造されるＡＴIIIやＴＦＰＩと生理学的に同等の活性を有するＡＴIIIやＴＦＰＩの全アミノ酸配列の一部が欠損、置換、挿入、追加等のなされた誘導体も本発明に含まれる。
【００１３】
本発明におけるＡＴIII及びＴＦＰＩの製造方法は特に限定されないが、ヒト血液より分離されるもの、あるいは遺伝子組換え技術によって製造されるものが含まれる。
特に、血液由来のＴＦＰＩについては血液中の含量が非常に少なく（約100ng/ml)、殆どのＴＦＰＩがリポ蛋白質と結合している事から、比活性の高い遊離型のＴＦＰＩを大量に製造する事は非常に困難である。よって、遺伝子組換え技術によって組換え型ＴＦＰＩ（ｒＴＦＰＩ）を調製する事が好ましいと考えられる。そのｒＴＦＰＩの製法としては、特願平5-188746号（亀井ら）や特願平6-239532号（神窪ら）に記載された以下の方法がある。
【００１４】
例えば、ヒトＴＦＰＩのｃＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞の培養上清から、
(１)Pedersen等の方法［J.Biol.Chem.,265,p16786(1990)］に従って、ヘパリンゲルによるアフィニティークロマトグラフィーを行った後、MonoQ HR5/5カラム(Pharmacia-LKB)とMonoS HR5/5カラム(Pharmacia-LKB)によるイオン交換クロマトグラフィーで精製する方法、または、
(２)抗ＴＦＰＩ抗体（好ましくはモノクローナル抗体)を結合させたゲルによるアフィニティークロマトグラフィーを行なった後、ヘパリンゲル(Pharmacia-LKB)によるアフィニティークロマトグラフィーで精製する方法である。
なお、上記の方法で得られるｒＴＦＰＩは、アミノ酸配列分析やSDS-PAGE等の分析より、殆どが分解を受けていない比活性の高いFull-length型のＴＦＰＩである。
【００１５】
また、血液から調製する方法としては、
(１)Novotnyらの報告［J.Biol.Chem.,264,p18832(1989)］に従って、Phenyl-Sepharose(Pharmacia-LKB)、Q-Sepharose(Pharmacia-LKB)と活性型第Ｘ因子によるアフィニティークロマトグラフィーを併用して調製する方法、
(２)抗ＴＦＰＩ抗体ゲルによるアフィニティークロマトグラフィーとヘパリンゲルによるアフィニティークロマトグラフィーを併用する方法がある。
【００１６】
一方、ＡＴIIIを調製する方法としては、血液及び組換え細胞の培養上清からヘパリンゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィー等の公知の確立された方法［Miller-Anderson et al., Thromb. Res., 5, p439(1974)］に従って調製する事が可能である。
【００１７】
上述の方法で調製されたＡＴIIIとＴＦＰＩの活性を最大限に維持するためには、本発明のＡＴIIIとＴＦＰＩが新鮮であるか、凍結保存しておく方が好ましい。あるいは、好適な安定化剤と共に凍結乾燥して保存する事も可能である。
本発明では、有効成分としてのＡＴIIIとＴＦＰＩとを公知の適当な賦形剤（人血清アルブミン、マンニトール等）を組み合わせ、公知の方法で非経口投与剤、好ましくは静脈投与用製剤とする事により本発明の血栓症の治療剤とする事ができる。
【００１８】
本発明により得られるＡＴIII及びＴＦＰＩ含有製剤は、ＤＩＣの動物モデルを用いた実験により、各々単独で使用した場合と比較して、極めて有効な治療効果を有することが確認された。このことから、ＤＩＣ等の血栓症の治療において、従来のＡＴIII補充療法に加えて、ＴＦＰＩを同時に併用することが有効であることが明らかとなった。また、本発明のＡＴIII及びＴＦＰＩ含有製剤は、従来抗血栓療法として使用されている製剤、例えばヘパリンや合成プロテアーゼ等との併用投与によりさらに大きな血栓治療効果が期待される。
【００１９】
以下、本発明の理解を深めるために実施例に添って説明するが、本発明はこれらの実施例に必ずしも限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
ラットで作製したＤＩＣモデルにＡＴIIIとｒＴＦＰＩを投与して、凝血学的パラメーターと臓器障害を指標にして、その治療効果を確認した。
【００２１】
《参考例１》  ＡＴIII及びＴＦＰＩの調製
ＡＴIIIは、ヘパリンゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いてヒト血漿から精製して得たものを使用した［Miller-Anderson et al., Thromb. Res., 5, p439(1974)］。
ヒト組換えＴＦＰＩ（ｒＴＦＰＩ）は、ヒトＴＦＰＩのｃＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞の培養上清から、Pedersenらの方法［J.Biol.Chem., 265, p16786(1990)］に従い、ヘパリンゲル（Pharmacia-LKB）によるアフィニティークロマトグラフィーを行った後、MonoQ HR5/5カラム（Pharmacia-LKB）とMonoS HR5/5カラム（Pharmacia-LKB）によるイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することにより得られた。
【００２２】
《実施例１》  ＤＩＣモデル動物の作製
ＤＩＣモデル動物は、山崎らの方法［日本血栓止血学会誌、4、p325(1993)］に従い、200〜250gのWistar系ラットにリポポリサッカライド（ＬＰＳ；Escherichia coli serotype 0111:B4 由来 シグマ社）を50mg/kgのドーズで大腿静脈からボーラス投与して作製した。ＡＴIIIとｒＴＦＰＩの薬剤はＬＰＳを投与した直後に大腿静脈からボーラス投与した。
【００２３】
《実施例２》  ＡＴIII及びｒＴＦＰＩの治療効果
上記のモデル動物を以下の５群に分類し、ＡＴIII及びｒＴＦＰＩの治療効果を検討した。なお、各群ラット５匹を用いた。
第Ｉ群 ；ＬＰＳ非投与群．
第II群 ；ＬＰＳ（50mg/kg）投与群．
第III群；ＬＰＳ（50mg/kg）投与直後、ＡＴIII(250U/kg)を投与．
第IV群 ；ＬＰＳ（50mg/kg）投与直後、ｒＴＦＰＩ(１mg/kg)を投与．
第Ｖ群 ；ＬＰＳ（50mg/kg）投与直後、ＡＴIII( 250U/kg)及びｒＴＦＰＩ(１mg/kg)を投与．
【００２４】
ＬＰＳ投与後、腹部大静脈から採血して、凝血パラメーターや臓器障害の酵素マーカーを測定した。ＤＩＣの診断基準の項目のうち、凝血パラメーターとして、フィブリノゲン量、第VIII因子活性量を測定した。また、臓器障害のマーカーとして、ＧＰＴを測定した。なお、いずれの測定項目も、ヒト由来の標準品もしくは正常ヒト血漿をもとにしてその濃度を算出した。
【００２５】
ＬＰＳと薬剤投与後４時間の凝血学的パラメーターを表１に示した。第II群において、ＬＰＳ投与後、ＤＩＣの特異的症状であるフィブリノゲン量及び第VIII因子活性量の減少が観察されたことより、ＬＰＳ投与によりＤＩＣ症状を示す動物モデルが作製できることがわかる。
【００２６】
ＬＰＳ投与直後、ＡＴIII（第III群）もしくはｒＴＦＰＩ（第IV群）を単独で投与した群において、ＤＩＣにおける凝血パラメーターの改善効果が確認されたが、その効果は十分とは言い難いものであった。これに対して、両者を併用投与した群（第Ｖ群）においては、さらにＤＩＣによるフィブリノゲンと第VIII因子の消費が抑制され、その改善効果は単独投与と比較して非常に顕著であることが確認された。また、スチューデントｔ検定による統計解析を行なった結果、本試験結果は、危険率が0.1％以下で有意差が確認された。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
また、ＤＩＣにおいては、臓器障害、特に肝臓障害が高頻度で起こることが知られている。そこで、ＬＰＳと薬剤投与後４時間の血液中の臓器障害のマーカーとしてＧＰＴ値を測定し、その結果を表２に示した。表２から明らかなように、ＡＴIIIとＴＦＰＩの併用群（第Ｖ群）は、単独投与群（第III群及び第IV群）と比較して、ＧＰＴ値が低く、肝臓障害の程度が軽度であることから、併用投与がＤＩＣにより惹起される臓器障害の軽減に有効であることが確認された。また、スチューデントｔ検定による統計解析を行なった結果、本試験結果は、危険率が２％以下で有意差が確認された。
【００２９】
【表２】
0003761914.tif 000003
【００３０】
今回、本実施例において、実際に臨床で使用される量に対して過剰のＡＴIIIを投与しており、さらに過剰に投与しても効果は期待できないと考えられる。このように、過剰な濃度のＡＴIIIによる補充療法で十分な効果が果たせないＤＩＣ治療において、ＴＦＰＩを併用することで、より十分な治療効果が得られることが明らかとなった。