(57)【要約】本発明は、細菌の染色体上の染色体分配蛋白質ｍｕｋＢ遺伝子が、ｍｕｋＢ遺伝子の下流に蛍光マーカー遺伝子を結合した融合遺伝子，薬剤耐性遺伝子および複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子が組み込まれたプラスミドで相同組換え遺伝子置換された宿主細胞に、被検物質を接触させ、蛍光焦点の形成の有無を観察することにより、染色体分配の主要な機能を担っているＭｕｋＦ，ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢ蛋白質からなるＭｕｋＦＥＢ複合体の形成を阻害する物質をスクリーニングする、新規で有用な抗菌剤の簡便かつ迅速な探索方法を提供を目的とし、本発明のスクリーニング方法によって得られる染色体分配蛋白質複合体の形成を阻害する物質は、新規な作用メカニズムに基づく抗菌剤として極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の染色体分配蛋白質ｍｕｋＢ遺伝子の下流に蛍光マーカー遺伝子を結合した融合遺伝子、薬剤耐性遺伝子および複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子が組み込まれたプラスミド。
【請求項２】
蛍光マーカー遺伝子として緑色蛍光蛋白遺伝子を用いることを特徴とする請求の範囲１記載のプラスミド。
【請求項３】
薬剤耐性遺伝子としてクロラムフェニコール耐性遺伝子を用いることを特徴とする請求の範囲１記載のプラスミド。
【請求項４】
蛍光マーカー遺伝子として緑色蛍光蛋白遺伝子、かつ薬剤耐性遺伝子としてクロラムフェニコール耐性遺伝子を用いることを特徴とする請求の範囲１記載のプラスミド。
【請求項５】
請求の範囲１〜４のいずれか一項に記載のプラスミドで遺伝子置換された宿主細胞。
【請求項６】
請求の範囲５記載の宿主細胞を用いて、細胞内で染色体分配に関与する蛋白質ＭｕｋＦ、ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢからなる染色体分配蛋白質複合体の形成を検出する方法。
【請求項７】
請求の範囲６記載の検出方法により、細胞内で染色体分配に関与する蛋白質ＭｕｋＦ、ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢからなる染色体分配蛋白質複合体の形成を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
細菌の染色体分配蛋白質ｍｕｋＢ遺伝子の下流に蛍光マーカー遺伝子を結合した融合遺伝子、薬剤耐性遺伝子および複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子が組み込まれたプラスミドで遺伝子置換された宿主細胞を被検物質で処理する工程、ＭｕｋＦ、ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢからなる染色体分配蛋白質複合体の形成状況を蛍光顕微鏡により観察する工程、および該複合体の形成を低下させるかまたは消失させる物質を選別する工程を含む、染色体分配蛋白質複合体の形成を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求の範囲７または８記載のスクリーニング方法により得られる染色体分配蛋白質複合体の形成を阻害する物質。
【請求項１０】
請求の範囲９記載の染色体分配蛋白質複合体の形成を阻害する物質を有効成分として含有する抗菌剤。
【請求項１１】
請求の範囲９記載の染色体分配蛋白質複合体の形成を阻害する物質の医薬上有効量を、患者に投与することを特徴とする、細菌感染症の予防、治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細菌の染色体分配に関与する蛋白質ＭｕｋＦ，ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢから構成される染色体分配蛋白質複合体（以下、「ＭｕｋＦＥＢ複合体」と略称することもある）の形成を検出する方法，該検出方法のための有用なプラスミド，該プラスミドで遺伝子置換した宿主細胞，該宿主細胞を用いてＭｕｋＦＥＢ複合体の形成を阻害する物質をスクリーニングする方法，および該スクリーニング方法によって得られる阻害物質に関するものである。
背景技術
衛生環境や栄養状態の改善および化学療法の著しい進歩により、一時細菌感染症は完全に征服されたかの如く見えた。ところが最近、抗菌剤の汎用により薬剤耐性菌が増加し大きな問題になっている。特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌，ペニシリン耐性肺炎球菌，バンコマイシン耐性腸球菌等の多剤耐性を示す細菌による感染症が社会的な問題となっている。これらの耐性菌対策として、種々のβ−ラクタム系抗生物質やキノロン系抗菌薬等の研究開発がなされてきたが、未だ満足すべき結果は得られていない。このような状況を克服するためには、従来とは全く異なる作用メカニズムに基づいた抗菌剤の開発が必要である。
生物が生存するための不可欠な仕組みとして細胞分裂があり、細胞は細胞分裂によって母細胞の遺伝情報を正確に娘細胞に伝える。このような基盤的な仕組みである細胞分裂では、染色体複製と染色体分配とそれに続く細胞質分裂が正しく起こらなければならない。染色体の複製が完了して娘細胞が伸長すると、複製された染色体は直ちに娘細胞へと移動し、分配される。現在、この様な染色体分配機構は二つの過程に分けて考えられている。一つ目は染色体複製完了時に、二つの染色体の絡みを分離するという脱連環作用の過程である。この過程はＤＮＡトポイソメラーゼＩＶ等のＩＩ型トポイソメラーゼにより行われている。二つ目は分離した染色体が娘細胞に分配される過程である。しかしながらこの過程は長い間不明のままであった。
本発明者らは染色体の分配が阻害されると染色体を持たない細胞、すなわち無核細胞が生じるので、この現象に着目し、無核細胞を高頻度に放出する大腸菌ｍｕｋ変異株（ｍｕｋａｋｕ：「無核」を表す）を検出する巧妙な遺伝学的スクリーニング法を考え出した（Ｈｉｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８９，１７１，１４９６−１５０５）。また、本発明者らは、染色体分配に関与する新規遺伝子を大腸菌から単離してその塩基配列を決定し、この遺伝子をｍｕｋＢ遺伝子と名付けた（Ｎｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１８３−１９３；Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９６，２５０，２４１−２５１）。この塩基配列は、日本データバンク（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ：ＤＤＢＪ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）より入手でき、ＤＤＢＪのアクセッション番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）がＤ９０７３０  ＡＢ００１３４０の塩基番号８６８０〜１３１４０に相当する。本発明者らは、このｍｕｋＢ遺伝子は染色体分配に関与する蛋白質（１７０ｋＤａ）をコードする遺伝子であること（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，１２３，２７−３１）、および該蛋白質（「ＭｕｋＢ蛋白質」という）のＮ末端側とＣ末端側は球状ドメインを形成し、その中央部はコイルドコイル構造を持つホモダイマーであることを明らかにした。また、本発明者らは、生化学的な解析により、ＭｕｋＢ蛋白質のＮ末端側の球状ドメインはＡＴＰ／ＧＴＰ結合能およびＡＴＰａｓｅ／ＧＴＰａｓｅ活性を有し、Ｃ末端側の球状ドメインはＤＮＡ結合能を持つことを明らかにした（Ｎｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１８３−１９３；Ｎｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９２，１１，５１０１−５１０９；Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９６，１４３，２１１−２１６；Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９８，４３０，２７８−２８２；Ｙａｍａｚｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９９，１８，５８７３−５８８４）。本発明者らは、ＭｕｋＢ蛋白質が染色体分配に必須であること、真核生物のキネシンやミオシン等のようなモーター蛋白様構造を持つこと、およびＡＴＰ／ＧＴＰ結合能を有することから、ＭｕｋＢ蛋白質が染色体分配の際に駆動力を与えると考えた（Ｈｉｒａｇａ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，６１，２８３−３０６）。
更に本発明者らは、ｍｕｋＢ遺伝子の染色体上流領域に２つの新規な遺伝子、すなわちｍｕｋＦおよびｍｕｋＥ遺伝子を見い出した。これらの遺伝子はｍｕｋＢ遺伝子と共にオペロンを形成し、ｍｕｋＦ−ｍｕｋＥ−ｍｕｋＢの順に配列していた。ｍｕｋＦ遺伝子はその中央部にロイシンジッパーモチーフを、Ｃ末端側近傍に酸性アミノ酸クラスタードメインを有する５１ｋＤａの蛋白質（「ＭｕｋＦ蛋白質」という）をコードしている。一方、ｍｕｋＥ遺伝子は２７ｋＤａの蛋白質（「ＭｕｋＥ蛋白質」という）をコードしている。ｍｕｋＦおよびｍｕｋＥ遺伝子のいずれかの遺伝子が破壊された変異株はｍｕｋＢ遺伝子が破壊された変異株と同様に、３０℃以上の高温では生育できず、無核細胞を放出し、染色体の分配異常を引き起こす（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９６，２５０，２４１−２５１）。
本発明者らは、ＭｕｋＦ，ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢ蛋白質が複合体を形成し、このときＭｕｋＢ蛋白質のＣ末端側の球状ドメインがこの複合体形成に重要であることを明らかにした（Ｙａｍａｚｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９９，１８，５８７３−５８８４）。最近、大腸菌のＭｕｋＢ蛋白質のＮ末端側の球状ドメインの三次元構造が報告され、更にＭｕｋＢ蛋白質は逆平行型のホモダイマーからなる対称的構造を示していることが報告された（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ，，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９９，７，１１８１−１１８７）。このことから本発明者らは、ＭｕｋＢ蛋白質はその両末端でＭｕｋＦ蛋白質やＭｕｋＥ蛋白質と複合体を形成すると共に、ＡＴＰの入り得るポケットやＤＮＡ結合部位も両末端に存在するというモデルを考えている。
本発明者らはまた、これらのｍｕｋＢ，ｍｕｋＥおよびｍｕｋＦ遺伝子は、大腸菌のみならず、コレラ菌，サルモネラ菌，ペスト菌，インフルエンザ菌，パステウラ菌，アクチノバチラス菌，クレブシラ菌等にも存在することを明らかにした（Ｈｉｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ，２０００，５，３２７−３４１）。
従って、細菌の染色体分配に関与するＭｕｋＢ，ＭｕｋＦおよびＭｕｋＥ蛋白質に関する上記の数多くの研究成果から、本発明者らは、これらの蛋白質が細胞分裂時に染色体分配の主要な機能を担っている因子であり、ＭｕｋＢ，ＭｕｋＦおよびＭｕｋＥ蛋白質のいずれの因子が欠損しても染色体分配を行うことができず、その結果として細菌は生存できないと考えている。
発明の開示
以上のことから、本発明者らは、既存の薬物とは異なる新規な作用メカニズムに基づく有用な抗菌剤として、ＭｕｋＦＥＢ複合体の形成を阻害する物質が極めて有望であると考えるに至った。本発明の目的は、細菌の生存に不可欠である染色体分配機能に関与する蛋白質複合体、すなわちＭｕｋＦＥＢ複合体をターゲットとする新規な作用メカニズムに基づく阻害物質を簡便かつ迅速に検出するスクリーニング方法、および該スクリーニング方法によって得られる阻害物質を提供することにある。
本発明者らは、ＭｕｋＦＥＢ複合体の形成を阻害する物質をスクリーニングする方法を開発するために、当初、ＭｕｋＦ，ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢの精製蛋白質よりｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭｕｋＦＥＢ複合体を再構築することを試みた。更に菌体より直接ＭｕｋＦＥＢ複合体を精製することも試みたが、何れもＭｕｋＦＥＢ複合体の収量が悪く、スクリーニング系の確立には至らなかった。更に研究を続けた結果、細胞生物学的な技術を利用し、細胞レベルでＭｕｋＦＥＢ複合体の形成を検出する方法を考えた。すなわち、細菌のｍｕｋＢ遺伝子の下流に蛍光マーカー遺伝子を結合した融合遺伝子を組み込んだプラスミドにより形質転換した宿主細胞をスクリーニングに用いる方法である。この方法は、細胞レベルでＭｕｋＦＥＢ複合体が形成されていれば、組み込まれた蛍光マーカー産物（蛍光蛋白質）の蛍光が蛍光顕微鏡下で蛍光焦点として観察（検出）されるという方法である。しかし、この方法ではプラスミドのコピー数増加に伴い、該融合遺伝子産物の細胞内での発現量が増加した場合、宿主細胞の増殖に悪影響を与える可能性および立体構造上、異常なＭｕｋＦＥＢ複合体が形成される可能性が危惧された。本発明者らは種々研究を重ねた結果、該プラスミド上の融合遺伝子を宿主染色体上のｍｕｋＢ遺伝子と置換させることにより、宿主細胞に悪影響を与えずにＭｕｋＦＥＢ複合体を形成させることに成功し、またかかる宿主細胞を用いてＭｕｋＦＥＢ複合体形成の有無を簡便かつ迅速に検出する方法を確立して本発明を完成した。
本発明は、第１に細菌の染色体分配蛋白質ｍｕｋＢ遺伝子の下流に蛍光マーカー遺伝子を結合した融合遺伝子、薬剤耐性遺伝子および複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子が組み込まれたプラスミド、第２に該プラスミドで遺伝子置換した宿主細胞、第３に該宿主細胞を用いて、細胞内で染色体分配に関与する蛋白質ＭｕｋＦ，ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢからなる染色体分配蛋白質複合体の形成を検出する方法、第４に該検出方法によって細胞内で染色体分配に関与する蛋白質ＭｕｋＦ，ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢからなる染色体分配蛋白質複合体の形成を阻害する物質をスクリーニングする方法、および第５に該スクリーニング方法によって得られる阻害物質ならびにその用途に関する。
発明の詳細な説明
以下に、本発明について説明する。細菌から抽出した染色体を用いて染色体分配蛋白質ｍｕｋＢ遺伝子の下流領域を増幅し、このＤＮＡ断片に薬剤耐性遺伝子を挿入させたプラスミドを先ず作製する。該プラスミドから薬剤耐性遺伝子を有するｍｕｋＢ遺伝子の下流領域と、別途細菌から抽出した染色体を用いて増幅したｍｕｋＢ遺伝子を、それぞれ蛍光マーカー遺伝子を有するプラスミドに組み込む、すなわちｍｕｋＢ遺伝子−蛍光マーカー遺伝子（本明細書では「融合遺伝子」ともいう）およびｍｕｋＢ遺伝子の下流に薬剤耐性遺伝子が組み込まれたプラスミドを作製する。次いで、該プラスミドから融合遺伝子および薬剤耐性遺伝子が配列した遺伝子領域を切り出し、このＤＮＡ断片を、高温（４２℃）で複製増殖できないプラスミド（該プラスミドを「複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子が組み込まれたプラスミド」ともいう）に組み込んだプラスミドを作製する。これら一連の作製技術は通常の遺伝子操作技術により行うことができる。このようにして作製した、融合遺伝子（ｍｕｋＢ遺伝子−蛍光マーカー遺伝子），薬剤耐性遺伝子および複製開示蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子が組み込まれたプラスミドを用いて形質転換された宿主細胞を、温度および抗生物質で選択培養すると、宿主細胞の染色体上のｍｕｋＢ遺伝子が、該プラスミド上のｍｕｋＢ遺伝子−蛍光マーカー遺伝子と相同組換えにより置換された宿主細胞（以下、「融合遺伝子置換細胞」と略称することもある）を作製することができる。本発明において、薬剤耐性遺伝子は、宿主細胞の染色体上のｍｕｋＢ遺伝子が、プラスミド上のｍｕｋＢ遺伝子と蛍光マーカー遺伝子との融合遺伝子と相同組換え遺伝子置換された宿主細胞を選択するために用いられ、また、複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子は、高温で複製増殖できないプラスミドを作製するために用いられる。薬剤耐性遺伝子および複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子の導入は、該融合遺伝子を宿主染色体上のｍｕｋＢ遺伝子と相同組換えさせて得られる相同組換え体を選別するために不可欠である。
この融合遺伝子置換細胞では、ＭｕｋＢ，ＭｕｋＦおよびＭｕｋＥ蛋白質が複合体を形成したときのみ、組み込まれた蛍光マーカー遺伝子産物（蛍光性蛋白質）の蛍光が蛍光顕微鏡下で蛍光焦点（以下、「Ｍｕｋクラスター」と称することもある、例えば図１２のＫＡＴ１で観察されるような蛍光スポット）として観察（検出）することができる。この（検出）方法によれば、該融合遺伝子置換細胞を検出細胞として用い、この検出細胞に被検験物質を接触させて蛍光焦点の有無を検出することにより、細胞内でＭｕｋＦＥＢ複合体の形成を阻害するかどうかを簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。
次に、本発明であるＭｕｋＦＥＢ複合体の形成を検出する方法に有用なプラスミド、すなわち、ｍｕｋＢ遺伝子と蛍光マーカー遺伝子との融合遺伝子，該融合遺伝子で置換された宿主細胞を選択するための薬剤耐性遺伝子および複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子を有するプラスミドの作製方法、および該プラスミドを組み込んだ宿主細胞の作製方法について、大腸菌を例に挙げて以下により詳しく説明する。
以下に示す具体的な配列や領域、制限部位等は、大腸菌の場合であって、且つ、その一例を示すものであり、目的とする細菌、即ち宿主細胞に応じて各条件を変更し得ることは当業者には明らかである。
まず、本発明における宿主細胞の作製方法について説明する。
大腸菌株ＹＫ１１００（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９６，２５０，２４１−２５１）から単離した染色体ＤＮＡ中のｍｕｋＢ遺伝子の下流側の約３．３Ｋｂの染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＥｃｏＲＩ認識部位を含む５’末端側プライマーとしてｄｍｕｋＢｕ２（配列番号１）を、ＥｃｏＲＩ認識部位を含む３’末端側プライマーとしてｄｍｕｋＢｒ（配列番号２）を用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）により目的ＤＮＡを増幅する。このＤＮＡの塩基配列は、日本データバンク（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ：ＤＤＢＪ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）のアクセッション番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）Ｄ９０７３０  ＡＢ００１３４０の塩基番号１３１３１〜１６４５４に相当する。そのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化してｄｍｕｋＢ断片を単離する。更に、ｄｍｕｋＢ断片の配列中の制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を切断し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を挿入し、プラスミドｐＫＯ２を作製する（図１参照）。次いで、該プラスミドｐＫＯ２をＥｃｏＲＩで切断し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む約４．４ＫｂのｄｍｕｋＢ断片を単離し、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光蛋白）の変異体遺伝子ｇｆｐＵＶ４を含むプラスミドｐＧＦＰｇｃｎ４のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することにより、プラスミドｐＫＯ３（図２参照）を作製する。
更に、大腸菌株ＹＫ１１００の染色体ＤＮＡを鋳型とし、５’末端側プライマーにｍｕｋＢｕ（配列番号３）を、３個のグリシンリンカーを含む３’末端側プライマーにｍｕｋＢｒ２（配列番号４）を用いたＰＣＲ法により調製した約４．５ＫｂのｍｕｋＢ遺伝子を、プラスミドｐＫＯ３のＳｍａＩ認識部位に挿入して、ｍｕｋＢ遺伝子とｇｆｐＵＶ４遺伝子を融合させた融合遺伝子が組み込まれたプラスミドｐＫＯ４（図３参照）を作製する。
次に、プラスミドｐＫＯ４を制限酵素ＰｓｔＩで消化して約６．７ＫｂのｍｕｋＢ−ｇｆｐＵＶ４−ｄｍｕｋＢを含むＤＮＡ断片を、複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子を有するプラスミドｐＨＳＧ４１５ｓに組み込むことにより、プラスミドｐＫＡＴ２（図４参照）を作製する。
次いで、プラスミドｐＫＡＴ２を大腸菌株ＹＫ１１００に導入し、クロラムフェニコール耐性を獲得した細胞を選択して当該プラスミドが染色体に組み込まれた宿主細胞を得、さらにクロラムフェニコール耐性で、かつアンピシリン感受性を示すコロニーをプラスミドが脱落したものとして選択することにより、染色体上のｍｕｋＢ遺伝子がｐＫＡＴ２上のｍｕｋＢ−ｇｆｐＵＶ４と相同組換えにより置換された宿主細胞（ＫＡＴ１）を得ることができる（図５参照）。当該融合遺伝子の置換は当該遺伝子領域の塩基配列を決定することにより確認することができる。
次に、本発明の染色体分配阻害物質の検出方法の原理およびスクリーニング方法について以下に説明する。
染色体分配蛋白質をコードするｍｕｋＢ遺伝子と蛍光マーカー遺伝子との融合遺伝子が細胞内で発現し、ＭｕｋＦ，ＭｕｋＥおよびＭｕｋＢ蛋白質の複合体が形成されていると（該複合体を「マーカーＭｕｋＦＥＢ複合体」ともいう）、蛍光顕微鏡下でそのマーカー遺伝子産物の蛍光性が蛍光焦点（Ｍｕｋクラスター）として観察でき、一方、ｍｕｋＥ破壊株やｍｕｋＦ破壊株のように、マーカーＭｕｋＦＥＢ複合体が形成されない場合では、蛍光が細胞内に分散し、Ｍｕｋクラスターは観察されない。従って、このようなスクリーニング系を用いると、被検物質がマーカーＭｕｋＦＥＢ複合体の形成を阻害する場合には、細胞内に蛍光焦点が観察できないが、逆に、マーカーＭｕｋＦＥＢ複合体の形成を阻害しない場合には、明確な蛍光焦点が観察できる。融合遺伝子、薬剤耐性遺伝子および複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子が組み込まれたプラスミドで遺伝子置換した宿主細胞（該細胞を「検定細胞」ともいう）を用いて、より具体的には、融合遺伝子で置換された大腸菌株ＫＡＴ１を検定細胞として、マーカーＭｕｋＦＥＢ複合体の形成に対する阻害の有無を蛍光顕微鏡を用いて検定することにより、新規作用メカニズムを有する抗菌性物質をスクリーニングすることができる。
検定細胞を被検物質で処理する工程は、ＭｕｋＦＥＢ複合体形成の有無を検出、判定できる条件下で行われれば特に限定されず、被検物質の該細胞への添加のタイミングや、処理方法ならびに複合体形成を検出するタイミング等は、使用する宿主細胞の種類や、その細胞周期等に応じて適宜設定される。被検物質の投与量（濃度）は、何段階かの濃度を有する希釈系列を作って適用することが好ましい。
本発明において、被検物質（被験化合物）とは、ＭｕｋＦＥＢ複合体形成の有無を観察（検出）することが所望される任意の物質を意図し、既に本作用ならびに他の作用を有する物質として公知な物質（化合物）であってもよいし、また新規に開発あるは発見された物質（化合物）であってもよい。
マーカーＭｕｋＦＥＢ複合体が形成され、蛍光焦点が観察された正常の細胞と比較して蛍光焦点の蛍光強度の減少および消失を生じる被検物質を染色体分配を阻害する物質として選別する。
本発明において用いられる蛍光マーカー遺伝子としては、例えば、発光クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）遺伝子や野生型ＧＦＰより強い蛍光を発するｇｆｐＵＶ遺伝子等が挙げられる。更に、強い青色や黄色の光を放出する改良型変異ｇｆｐ遺伝子も用いることができ、強化青色蛍光蛋白質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＢＦＰ）遺伝子や強化黄色蛍光蛋白質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＹＦＰ）遺伝子等が挙げられる。これらの遺伝子は商業的に入手可能であるか、又は刊行物等公知の技術を用いて調製することができる。該蛍光マーカー遺伝子を組み込んだプラスミドとして入手し、適宜切り出して、あるいは他の使用する遺伝子を組み込んで用いることができる。
本発明のスクリーニング方法はかかる蛍光マーカー遺伝子に基づく蛍光焦点の有無を蛍光顕微鏡下で検出する工程を含むが、その際の励起光の波長ならびに測定波長は使用する蛍光マーカー遺伝子の種類に応じて適宜設定される。例えばＧＦＰでは３９６ｎｍ（励起極大波長）の波長の励起光を用い５０７ｎｍ（蛍光極大波長）での蛍光を測定することができ、ｇｆｐＵＶでは４９４ｎｍ（励起極大波長）の波長の励起光を用い５１１ｎｍ（蛍光極大波長）での蛍光を測定することができる。これらの励起極大波長と蛍光極大波長の組み合わせは一実施態様を示すものであり、蛍光焦点を観察（検出）することができる組み合わせであれば適宜使用することができる。
本発明で用いられる薬剤耐性遺伝子は、宿主細胞の染色体上のｍｕｋＢ遺伝子が、プラスミド上のｍｕｋＢ遺伝子と蛍光マーカー遺伝子との融合遺伝子と相同組換え遺伝子置換された宿主細胞を選択するために用いられ、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子，テトラサイクリン耐性遺伝子，エリスロマイシン耐性遺伝子，カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。これらの薬剤耐性遺伝子も商業的に入手可能であり、又、これらの薬剤耐性遺伝子を組み込んだプラスミド（後述のクローニングプラスミド等）として入手して、適宜切り出すか、あるいは該プラスミドに他の使用する遺伝子を組み込んで用いることができる。
本発明で用いられる複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子とは、複製開始蛋白質をコードする遺伝子（ｒｅｐ）に変異を加えた遺伝子（ｒｅｐｔｓ）であって、該遺伝子は高温（４２℃）で複製開始蛋白質の高次構造を不安定化させ、すなわち失活させることにより複製増殖できず、その結果、プラスミドの宿主染色体への相同組換えを引き起こすことができる。このような遺伝子は後述の「宿主染色体への相同組換えのためのプラスミド」として提供され得る。
本発明に使用されるクローニング用プラスミドとしては少なくとも１つの制限酵素認識部位があればいずれでもよい。該プラスミドの塩基配列中に、その箇所でのみ切断するユニークな制限部位を含む場合はより好ましい。更に、形質転換された細胞の選択のための薬剤耐性遺伝子〔テトラサイクリン耐性遺伝子，アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ），カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）等〕を含有していることが好ましい。
本発明に使用される宿主染色体への相同組換えのためのプラスミドとしては、複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子が組み込まれており、原核細胞の各種宿主細胞内で高温、例えば４２℃で複製保持または自立増殖できないものであれば特に限定されるものでなく、このようなプラスミドとしては、例えば大腸菌由来のプラスミドｐＨＳＧ４１５ｓ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８１，１６，２２７−２３５）等が挙げられる。
本発明で用いられる宿主細胞は、原核細胞であって、前記のプラスミドに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される細菌であり、例えば大腸菌，サルモネラ菌，インフルエンザ菌，コレラ菌，ペスト菌，パステウラ菌，アクチノバチラス菌，クレブシラ菌等が挙げられる。
プラスミドの宿主細菌への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、本発明のように細菌の場合は、Ｃｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７２，６９，２１１０），プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８，１１１），コンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７１，５６，２０９）等によって形質転換することができる。
本発明において使用される培地は宿主細胞の増殖に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース，デキストリン，可溶性デンプン，ショ糖等が挙げられ、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液等が挙げられる。また、必要に応じ他の栄養素〔例えば、無機塩（塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム等），ビタミン類，抗生物質（テトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）等〕を含んでいてもよい。
培養は当該技術分野において知られている方法により行われる。下記に宿主が細菌である場合に用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されない。例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地であるが、宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．，１９７２，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），Ｌ培地（Ｈｉｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８９，１７１，１４９６−１５０５）等が挙げられる。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃、好ましくは２５〜３７℃、更に好ましくは３０℃付近で約３〜２４時間行うことができる。
本発明のスクリーニング方法によって得られた染色体分配蛋白質複合体の形成を阻害する物質は、該複合体の形成を阻害することにより、染色体分配を阻害する結果、正常な細胞分裂が行われず、細胞（細菌）は増殖することができない。このような新規な抗菌メカニズムを有する物質は、抗菌剤として使用することができる。
実施例
以下、本発明の一例として実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。
本発明のプラスミド作製のために、プラスミドｐＵＣ１８（Ｖｉｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８２，１９，２５９−２６８），ｐＵＣ４Ｋ（Ｖｉｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８２，１９，２５９−２６８），ｐＨＳＧ３９９（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８７，６１，６３−７４），ｐＧＦＰｇｃｎ４（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９，２６４，５５６−５６０）およびｐＨＳＧ４１５ｓ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８１，１６，２２７−２３５）を使用した。これらのうち、プラスミドｐＵＣ１８およびｐＨＳＧ３９９はＴａＫａＲａ（株）から購入することができる。宿主細胞としては、大腸菌株ＹＫ１１００（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９６，２５０，２４１−２５１）を使用した。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）に記載の方法により行った。例えば制限酵素を用いたＤＮＡ消化，アガロース電気泳動法，アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出法，プラスミド抽出のためのアルカリ−ＳＤＳ法等である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。例えばＰＣＲを用いたＤＮＡ増幅法，ＤＮＡ断片の結合やＤＮＡ末端平滑化は、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製），ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１  ｏｒ  ２（ＴａＫａＲａ社製）やＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。その他、遺伝子導入はＤｏｗｅｒ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８８，１６，６１２７−６１４５）の方法に従い、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いて実施した。
実施例１：ｍｕｋＢ−ｇｆｐ（緑色蛍光蛋白）融合遺伝子、薬剤耐性遺伝子および複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子が組み込まれたプラスミド（ｐＫＡＴ２）の作製
図１に示すように、ｍｕｋＢ遺伝子の下流側の領域約３．３Ｋｂを大腸菌株ＹＫ１１００より単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＥｃｏＲＩ認識部位を含む５’末端側のプライマーとしてｄｍｕｋＢｕ２（配列番号１）とＥｃｏＲＩ認識部位を含む３’末端側のプライマーとしてｄｍｕｋＢｒ（配列番号２）を用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）により目的のＤＮＡを増幅した。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して約３．３ＫｂのｄｍｕｋＢ断片を単離した。このｄｍｕｋＢ断片を大腸菌由来のプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に挿入して組換えプラスミドｐＫＯ１を作製した。このプラスミドｐＫＯ１で形質転換させた大腸菌より該組換えプラスミドを単離し、その組み込まれたｄｍｕｋＢ断片内の配列中制限酵素ＢａｍＨＩ部位を平滑末端に切断した後、相同組換えのための選択マーカーとしてプラスミドｐＨＳＧ３９９を制限酵素ＨｈａＩで処理して得られた約１．１Ｋｂのクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を挿入し、プラスミドｐＫＯ２を作製した。
次に、図２に示すように、上記で得られたプラスミドｐＫＯ２をＥｃｏＲＩで切断し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含んだ約４．４ＫｂのｄｍｕｋＢ断片を単離し、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）の変異体遺伝子ｇｆｐＵＶ４をコードするプラスミドｐＧＦＰｇｃｎ４のＥｃｏＲＩによる切断部位に挿入することによりプラスミドｐＫＯ３を作製した。
次に、図３に示すように、大腸菌株ＹＫ１１００の染色体ＤＮＡを鋳型とし、５’末端側のプライマーとしてｍｕｋＢｕ（配列番号３）と３個のグリシンリンカーを含む３’末端側のプライマーとしてｍｕｋＢｒ２（配列番号４）を用いたＰＣＲ法により調製した約４．５ＫｂのｍｕｋＢ遺伝子を、プラスミドｐＫＯ３の制限酵素ＳｍａＩ部位に挿入して、ｍｕｋＢ遺伝子とｇｆｐＵＶ４遺伝子を融合させた融合遺伝子を有するプラスミドｐＫＯ４を作製した。
最後に、図４に示すように、上記で得られたプラスミドｐＫＯ４を制限酵素ＰｓｔＩで消化して約６．７ＫｂのｍｕｋＢ−ｇｆｐＵＶ４−ｄｍｕｋＢを含むＤＮＡ断片を単離し、その両端を常法により平滑化した。このＤＮＡ断片を、複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子を有するプラスミドｐＨＳＧ４１５ｓをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで二重消化してその両端を平滑化したｍｕｋＢ−ｇｆｐＵＶ４−ｄｍｕｋＢを含むＤＮＡと結合させて、最終目的のプラスミドｐＫＡＴ２を作製した。
実施例２：大腸菌の染色体上のｍｕｋＢをプラスミド上のｍｕｋＢ−ｇｆｐ融合遺伝子で相同組換え遺伝子置換させた大腸菌株（ＫＡＴ１）の作製
遺伝子置換は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８９，１７１，４６１７−４６２２）に準じて行った。図５に示すように、プラスミドｐＫＡＴ２を３０℃で大腸菌株ＹＫ１１００に導入した後、１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地（Ｈｉｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８９，１７１，１４９６−１５０５）に播き、４２℃で一晩培養し、増殖したコロニーを採取することにより、当該プラスミド全体が染色体に組み込まれた細胞株を得ることができた。得られたコロニーを抗生物質を除いたＬ培地に接種して３０℃で一晩培養後、この培養液を新鮮なＬ培地で希釈して３０℃で更に一晩培養した。この培養液を１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地に播き、３０℃で一晩培養した。出現したコロニーについて２５μｇ／ｍｌのアンピシリン或いは１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含んだＬ寒天培地に画線し、３０℃でアンピシリンの感受性を調べることにより、プラスミドが脱落したものとしてクロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。このような表現型を示すコロニーを単離し、染色体上のｍｕｋＢ遺伝子とｐＫＡＴ２上のｍｕｋＢ−ｇｆｐＵＶ４とが相同組換えにより置換されていることをＰＣＲ法で確認することによって、ｍｕｋＢ−ｇｆｐ融合遺伝子により置換された大腸菌株ＫＡＴ１を得た。
実施例３：大腸菌株ＫＡＴ１の染色体分配蛋白質複合体の形成を検出する方法および該検出方法を用いて、該複合体の形成を阻害する物質をスクリーニングする方法
実施例１および２で作製した大腸菌株ＫＡＴ１を１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ培地を用いて３０℃、１６〜２４時間、振とう培養した。この培養液を１％の割合で新鮮な１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ培地に接種した後、対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．１〜０．５）まで振とう培養した。小試験管に対数増殖期に達した菌液９０μｌと１０００，１００および１０μｇ／ｍｌの濃度に調製した被験化合物１０μｌを加え、３０℃で振とう培養した。各濃度で作用させた培養液について１時間，２時間および３時間と経時的に１０μｌ程度サンプリングし、スライドガラス上に塗末標本を作製した。次にこの標本についてカラーチルド３ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製）および蛍光フィルター（Ｂ−２Ｅ／Ｃ：ニコン社製，励起波長４６５ｎｍ〜４９５ｎｍ；吸収波長５１５〜５５５ｎｍ）を装着した蛍光位相差顕微鏡（ニコン社製）を用いて倍率１０００倍、油浸で観察した。
被験化合物がマーカーＭｕｋＦＥＢ複合体の阻害剤である場合は、図１２のｍｕｋＥ破壊株（ＫＡＴ３７）やｍｕｋＦ破壊株（ＫＡＴ３８）のように、細胞内に蛍光焦点が観察できなかった。マーカーＭｕｋＦＥＢ複合体に対して阻害作用がない場合は、図１２の大腸菌株ＫＡＴ１のように明確な蛍光焦点を認めることができた。被験化合物の阻害作用の強さに応じ、＋＋，＋および−の三段階のスコアに判定した。「＋＋」は蛍光焦点がｍｕｋＥ破壊株（ＫＡＴ３７）やｍｕｋＦ破壊株（ＫＡＴ３８）（ポジティブコントロール）と同様に全く観察できない場合を、「＋」は蛍光焦点の蛍光強度がポジティブコントロールよりも弱い場合を、および「−」は蛍光焦点がＫＡＴ１株（ネガティブコントロール）と同様に明白に観察できた場合を表すことにした。
参考例１：大腸菌株ＫＡＴ１由来のｍｕｋＥおよびｍｕｋＦ遺伝子破壊株（ＫＡＴ３７およびＫＡＴ３８）の作製
（ａ）  ｍｕｋＥ遺伝子破壊株（ＫＡＴ３７）の作製
図６に示すように、ｍｕｋＦ−ｍｕｋＥ−ｍｕｋＢ遺伝子を含む８．５ＫｂのＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を持つプラスミドｐＡＸ８５０（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９６，２５０，２４１−２５１）を制限酵素ＳａｃＩ−ＡａｔＩＩで処理し、ｍｕｋＥ遺伝子を有する約３．５ＫｂのＤＮＡ断片を取り出し、末端平滑化の後ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＫＯ５を作製した。
得られたプラスミドｐＫＯ５のｍｕｋＥ遺伝子内の制限酵素ＡｇｅＩ部位にプラスミドｐＵＣ４ＫからＰｓｔＩ処理により得た約１．３Ｋｂのカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）をｍｕｋＥ遺伝子配列中に挿入することによってｍｕｋＥ遺伝子が破壊されたプラスミドｐＫＯ６を作製した。図７に示すように、このプラスミドｐＫＯ６を制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩで処理して約１．３Ｋｂのカナマイシンが挿入されたｍｕｋＥ遺伝子領域を切り出した後、末端平滑化し約４．８ＫｂのｍｕｋＥ：：ｋａｎ断片を得た。このｍｕｋＥ：：ｋａｎ断片とＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで処理して末端平滑化したプラスミドｐＨＳＧ４１５ｓとを結合させてプラスミドｐＫＡＴ４を作製した。
実施例１および２で作製した大腸菌株ＫＡＴ１の染色体上のｍｕｋＥ遺伝子をｐＫＡＴ４のｍｕｋＥ：：ｋａｎ遺伝子に置換する方法は、基本的に実施例２と同様である。図８に概略を示す。プラスミドｐＫＡＴ４をＫＡＴ１株に導入した後、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地に播き、４２℃で一晩培養し、増殖したコロニーを採取することにより、当該プラスミドが染色体に組み込まれたものを選択した。得られたコロニーをカナマイシンを除いたＬ培地に接種して、２２℃で一晩培養後、この培養液を新鮮なＬ培地で希釈して２２℃で更に一晩培養した。この培養液を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地に播き、２２℃で一晩培養した。出現したコロニーについて、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンあるいは２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んだＬ寒天培地に画線した。カナマイシン耐性かつアンピシリン感受性を示したコロニーをプラスミドが脱落したものとして選択した。更に２２℃で無核細胞を放出しながら増殖し、３０℃以上ではコロニー形成能がない株を選択し、ＰＣＲ法で染色体構造を確認した後、ｍｕｋＥ破壊株ＫＡＴ３７とした。
（ｂ）  ｍｕｋＦ遺伝子破壊株（ＫＡＴ３８）の作製
図９および図１０に示すように、ｍｕｋＥ遺伝子破壊株の場合と基本的に同様な方法で作製した。すなわちプラスミドｐＡＸ８５０をＡｇｅＩ処理してｍｕｋＦ遺伝子を有する約２．５ＫｂのＤＮＡ断片をｐＵＣ１８にクローニングした後（プラスミドｐＫＯ７）、ｍｕｋＦ遺伝子内の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位へ約１．３Ｋｂのカナマイシン耐性遺伝子を挿入することによってｍｕｋＦ遺伝子を破壊した（プラスミドｐＫＯ８）。この破壊されたｍｕｋＦ：：ｋａｎ  ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩで切り出した後末端平滑化し、約３．８ＫｂのｍｕｋＦ：：ｋａｎ  ＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで処理して末端平滑化したプラスミドｐＨＳＧ４１５ｓとを結合させてプラスミドｐＫＡＴ３を得た。図１１に示すように、プラスミドｐＫＡＴ３をＫＡＴ１株に導入して、ｍｕｋＥ破壊株と同様の選択法によりｍｕｋＦ破壊株ＫＡＴ３８を分離した。
産業上の利用分野
本発明のスクリーニング方法によれば、細菌の染色体分配蛋白質複合体の形成を阻害する物質を簡便かつ効率的にスクリーニングすることが可能であり、従来の抗菌剤にない新しい作用メカニズムによる抗菌剤を見出すことができ、また、従来の抗菌剤の耐性菌にも有効な抗菌剤の開発が可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２００１−３４４６４を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
配列表フリーテキスト
配列番号１：  人工配列についての記載：ＰＣＲのための合成プライマー。
配列番号２：  人工配列についての記載：ＰＣＲのための合成プライマー。
配列番号３：  人工配列についての記載：ＰＣＲのための合成プライマー。
配列番号４：  人工配列についての記載：ＰＣＲのための合成プライマー。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｍｕｋＢ−ｇｆｐ融合遺伝子で置換された宿主細胞を選択するための薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドｐＫＯ２の作製方法を示す模式図である。
図２は、プラスミドｐＫＯ２を用いＧＦＰの変異遺伝子ｇｆｐＵＶ４を有するプラスミドｐＫＯ３を作製する方法を示す模式図である。
図３は、プラスミドｐＫＯ３を用いｍｕｋＢ−ｇｆｐＵＶ４の融合遺伝子を有するプラスミドｐＫＯ４を作製する方法を示す模式図である。
図４は、プラスミドｐＫＯ４を用い複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子をもつプラスミドｐＫＡＴ２を作製する方法を示す模式図である。
図５は、プラスミドｐＫＡＴ２を用いｍｕｋＢ−ｇｆｐ融合遺伝子で遺伝子置換した大腸菌株ＫＡＴ１を作製する方法を示す模式図である。
図６は、ｍｕｋＥ遺伝子を破壊するための薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドｐＫＯ６の作製方法を示す模式図である。
図７は、プラスミドｐＫＯ６を用い複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子をもつプラスミドｐＫＡＴ４を作製する方法を示す模式図である。
図８は、プラスミドｐＫＡＴ４を用いＫＡＴ１株由来のｍｕｋＥ遺伝子を破壊した大腸菌株ＫＡＴ３７を作製する方法を示す模式図である。
図９は、ｍｕｋＦ遺伝子を破壊するための薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドｐＫＯ８の作製方法を示す模式図である。
図１０は、プラスミドｐＫＯ８を用い複製開始蛋白質をコードする温度感受性変異遺伝子をもつプラスミドｐＫＡＴ３を作製する方法を示す模式図である。
図１１は、プラスミドｐＫＡＴ３を用いＫＡＴ１株由来のｍｕｋＦ遺伝子を破壊した大腸菌株ＫＡＴ３８を作製する方法を示す模式図である。
図１２は、ＫＡＴ１，ＫＡＴ３７およびＫＡＴ３８株の蛍光顕微鏡による蛍光焦点の観察結果を示した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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