(57)【要約】本発明の目的は、骨量減少症を治療するうえで、ＰＴＨ投与により誘導される皮質骨の喪失を伴わずに海綿骨骨量を増加させる治療剤を提供することである。生体内でのオステオポンチンの作用を阻害しながらＰＴＨを投与することにより、海綿骨骨量だけでなく、皮質骨骨量も増加させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を含有する骨量減少症治療剤。
【請求項２】
該生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質が、オステオポンチン遺伝子の発現を抑制する物質である請求項１に記載の骨量減少症治療剤。
【請求項３】
該生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質が、オステオポンチンとその受容体との結合を阻害する物質である請求項１に記載の骨量減少症治療剤。
【請求項４】
オステオポンチンの該受容体がαｖβ３インテグリンである請求項３に記載の骨量減少症治療剤。
【請求項５】
骨量減少症が、骨粗鬆症によって引き起こされる疾患である請求項１から４のいずれか１項に記載の骨量減少症治療剤。
【請求項６】
生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を含有する骨形成促進剤。
【請求項７】
生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を含有する皮質骨骨量増加剤。
【請求項８】
（ａ）生体内でのオステオポンチンの作用を阻害するのに有効な量のオステオポンチン阻害物質、（ｂ）骨量の増加に有効な量の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質、並びに（ｃ）使用説明書、を含む骨量減少症治療用キット。
【請求項９】
ａ）生体内でのオステオポンチンの作用を阻害するのに有効な量のオステオポンチン阻害物質、（ｂ）骨量の増加に有効な量の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質、並びに（ｃ）使用説明書、を含む骨形成促進用キット。
【請求項１０】
ａ）生体内でのオステオポンチンの作用を阻害するのに有効な量のオステオポンチン阻害物質、（ｂ）骨量の増加に有効な量の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質、並びに（ｃ）使用説明書、を含む皮質骨骨量増加用キット。
【請求項１１】
生体内でのオステオポンチンの作用を阻害するのに有効な量のオステオポンチン阻害物質、並びに骨量の増加に有効な量の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を、それを必要とする患者に投与することを含む骨量減少症の治療方法。
【請求項１２】
生体内でのオステオポンチンの作用を阻害するのに有効な量のオステオポンチン阻害物質、並びに骨量の増加に有効な量の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を、それを必要とする患者に投与することを含む骨形成の促進方法。
【請求項１３】
生体内でのオステオポンチンの作用を阻害するのに有効な量のオステオポンチン阻害物質、並びに骨量の増加に有効な量の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を、それを必要とする患者に投与することを含む皮質骨骨量の増加方法。
【請求項１４】
骨量減少症治療剤を製造するための、生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を含有する、骨量減少症治療剤、骨形成促進剤及び皮質骨骨量増加剤に関する。
背景技術
オステオポンチン（ＯＰＮ）はシアル酸を多く含有し、ＲＧＤ配列を有する糖タンパク質である。破骨細胞のｃｌｅａｒ  ｚｏｎｅに接する部位に局在し、インテグリン、特にαｖβ３インテグリンとの結合を介して骨基質への接着に関与する。また、骨芽細胞にも存在する。Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：８１５６−８１６０（１９９９）には、ＯＰＮノックアウトマウスにおいて、卵巣切除により誘導される骨吸収が軽減されたことが記載されている。
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は副甲状腺より分泌されるアミノ酸８４個から成る直鎖のポリペプチドで、骨と腎臓に作用し、血中のカルシウム濃度を調節している。ＰＴＨは骨芽細胞系細胞に作用してＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなどのサイトカイン産生を促進し、破骨細胞の形成を促進することによって、骨吸収を亢進するが、骨形成も促進することが知られている。例えば、Ｒｅｅｖｅらは閉経後骨粗鬆症患者に６ヶ月間、１００μｇ／ｄａｙのＰＴＨ（１−３４）を連日皮下投与した結果、カルシウムバランスが正常化し、海綿骨骨量が増加したことを報告している。さらに高用量（２００μｇ）投与では骨形成も骨吸収も刺激されるのに対し、低用量（１００μｇ）ではカルシウムバランスを是正し、骨形成を増加させたとしている。さらに彼らは７施設、計２１人の骨粗鬆症患者に対し、６〜２４ヶ月間のＰＴＨ連日皮下投与を実施した。患者背景が均一でないため結果は多様であったが、カルシウムバランスは改善せず、海綿骨骨量は増加し、皮質骨骨量は低下していた（Ｒｅｅｖｅら、Ｂｒ  Ｍｅｄ  Ｊ  ２８０：１３４０−１３４４（１９８０））。このように、ＰＴＨは海綿骨の骨量は増加させるが、皮質骨については骨量を減少させる作用があることが知られている。一方で、骨量減少症治療の臨床結果を判断する上で重要な骨折頻度抑制には、海綿骨のみならず皮質骨の骨量を増加させることが重要であると考えられている。
発明の開示
骨量減少症の治療は骨折頻度抑制を目的としている。骨強度を増加させ、骨折頻度を軽減させるためには海綿骨のみならず皮質骨の骨量を増加させることが重要である。しかしながら、ＰＴＨ投与による海綿骨骨量の増加には皮質骨骨量の喪失が伴うという問題があった。
そこで、本発明者は、上記問題を解決するため、ＰＴＨ投与による骨量の増加方法について種々の検討を行った。その結果、生体内でのＯＰＮの作用を阻害した動物モデルにＰＴＨを投与することによって、海綿骨骨量を増加させるとともに、皮質骨骨量も増加させることができることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成したものである。
したがって、本発明は、海綿骨だけでなく皮質骨の骨量も増加させる理想的な骨量減少症治療剤を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を含有する骨量減少症治療剤を提供する。
また、本発明は、生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を含有する骨形成促進剤を提供する。
更に、本発明は、生体内でのオステオポンチンの作用を阻害する物質、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を含有する皮質骨骨量増加剤を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の骨量減少症治療剤は、生体内でのオステオポンチン（ＯＰＮ）の作用を阻害する物質、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質を含有する。ＰＴＨによる骨折頻度抑制作用を高めるためには、海綿骨骨量を増加させるとともに、皮質骨骨量も増加させることが必要であり、このためには、実施例で後述するとおり、生体内でのＯＰＮの作用を阻害することが必要である。
実施例から明らかなように、ＯＰＮを欠損させても破骨細胞数や全身の骨代謝に変化はみられない。一方、データは示していないが、ＯＰＮ欠損型マウスでは、野生型マウスと比較して、骨芽細胞の分化が促進される。すなわち、ＯＰＮは破骨細胞ではなく、骨芽細胞系列の細胞に影響を与えているものと思われる。さらに、ＯＰＮは、ＰＴＨ投与による骨代謝回転において負のフィードバック制御を行っていると考えられる。
したがって、本発明の骨量減少症治療剤にはＰＴＨ、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質に加えて、生体内でのＯＰＮの作用を阻害する物質を含有する。
生体内でのＯＰＮの作用を阻害する物質としては、ＯＰＮの潜在的なアンタゴニストが挙げられる。潜在的なアンタゴニストは、ＯＰＮ及び／又はその受容体であるインテグリン、好ましくはαｖβ３インテグリンのポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドと結合し、それによりその活性又は発現を阻害又は消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体及び低分子化合物を包含する。
例えば、潜在的なアンタゴニストは、ＯＰＮ及び／又はその受容体であるインテグリン、好ましくはαｖβ３インテグリンのポリペプチドの結合部位に結合してその部位を占領し、それによりＯＰＮと受容体との結合を妨害して、正常な生物学的活性を防御する小型分子を包含する。小型分子の例は、小型有機分子、ペプチド、ペプチド様分子、低分子化合物を包含するが、これらに限定するものではない。αｖβ３インテグリンに結合するアンタゴニストの具体例としては、ＲＧＤペプチド様化合物であるＳＣ６５８１１（ＷＯ９７／０８１４５号）などが挙げられる。
その他の潜在的なアンタゴニストはアンチセンス分子を包含する（これらの分子についての記載に関しては、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＳ  ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＩＮＨＩＢＴＯＲＳ  ＯＦ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照。）。
潜在的アンタゴニストは、ＯＰＮに関連する化合物及びその変種を包含する。
ＯＰＮの潜在的アンタゴニストとして抗オステオポンチン抗体を用いる場合は、ＯＰＮのＲＧＤ配列を認識する抗体が好ましい。本発明の方法に使用される抗体は、所望の抗原と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１９８１））等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させて免疫を行えばよい。
また、発現ブロッキング法を用いてＯＰＮ及び／又はその受容体をコードしている遺伝子の発現を阻害することができる。このブロッキングは遺伝子発現のいずれの工程を標的としてもよいが、好ましくは、転写及び／又は翻訳を標的とする。この種の既知方法の例は、体内で生じるか又は別個に投与されるアンチセンス配列の使用を包含する（例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＳ  ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＩＮＨＩＢＴＯＲＳ  ＯＦ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。別法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供してもよい（例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１））。これらのオリゴマーはそれ自体投与することができ、あるいは重要部分のオリゴマーをインビボで発現させることもできる。
本発明の骨量減少症治療剤には、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質が含まれる。
「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）」には、天然型のＰＴＨ、遺伝子工学的手法で製造された組換えＰＴＨ、化学的に合成されたＰＴＨが包含され、好ましい例としては、８４アミノ酸残基より成るヒトＰＴＨ（ヒトＰＴＨ（１−８４））、特に遺伝子工学的手法で製造された組換えヒトＰＴＨ（１−８４）が挙げられる。
「ＰＴＨ誘導体」には、骨形成を刺激し、そして骨量を増加させることのできるＰＴＨフラグメント又は代謝産物、及びそれらの構造類似物が包含される。また、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、副甲状腺ホルモン関連ペプチドの活性フラグメント及び副甲状腺ホルモン関連ペプチドの類似物（ＷＯ９４／０１４６０号）も含まれる。骨形成刺激活性及び骨量増加活性は、標準的アッセイに従って、当業者により容易に決定することができる（Ｅｒｉｋｓｅｎ  Ｅ．Ｆ．ら、Ｂｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．１−７４；Ｇｒｉｅｒ  Ｓ．Ｊ．ら、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｕａｌ−Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｖ．Ｒａｄｉｏｌ．，１９９６，３１（１），ｐｐ．５０−６２；Ｗａｈｎｅｒ  Ｈ．Ｗ．及びＦｏｇｅｌｍａｎ  Ｉ．，Ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．，Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐｐ．１−２９６）。多様なＰＴＨ誘導体が文献に記載されており、当業者に利用可能である。また、当業者には、その他のＰＴＨ誘導体も公知になるであろう。典型的なＰＴＨ誘導体が、以下の参考文献中に開示されている（”Ｈｕｍａｎ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ”，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｉｎｔ．３（Ｓｕｐｐ−１），１９９−２０３；”ＰＴＨ  １−３４  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｄｅｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｉｎｔ．１，１６２−１７０）。また、ＰＴＨ誘導体には、ＰＴＨフラグメントや、ＰＴＨそのものあるいはそのフラグメントの構成アミノ酸を一部他のアミノ酸に置換したペプチド、ＰＴＨそのものあるいはその部分ペプチドの構成アミノ酸の一部を欠失したペプチド、及びＰＴＨそのものあるいはその部分ペプチドに１種以上のアミノ酸を付加したペプチドなどで同様の活性を有するすべてのペプチドが含まれる。ここで、アミノ酸の置換、欠失又は付加とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により置換、欠失又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されることを意味する。好ましいＰＴＨフラグメントとしては、ヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−６４）、ヒトＰＴＨ（３５−８４）、ウシＰＴＨ（１−３４）などが挙げられるがこれらには限定されない。「ＰＴＨ（１−３４）」とは、ＰＴＨのＮ末端から３４番目までの３４個のアミノ酸から成るＰＴＨの部分ペプチドを示す。更に好ましいＰＴＨフラグメントとしては、アミノ酸３４残基より成るヒトＰＴＨ（ヒトＰＴＨ（１−３４））、特に遺伝子工学的手法で製造された組換えヒトＰＴＨ（１−３４）が挙げられる。また、アミノ酸置換の好ましい例としては、８番目の構成アミノ酸のロイシンやノルロイシンへの置換、１８番目の構成アミノ酸のロイシンやノルロイシンへの置換、３４番目の構成アミノ酸のチロシンへの置換などが挙げられる。
本発明の骨量減少症治療剤を用いることにより、海綿骨骨量だけでなく、皮質骨骨量も増加させることができる。また、海綿骨や皮質骨（特に骨膜領域）において、骨形成率や石灰化速度を上昇させることが可能である。
本発明の治療剤を用いることができる骨量減少症は、例えば、骨粗鬆症等の疾患によって引き起こされる。
本発明の治療剤は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む薬学的組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
本発明の治療剤の有効成分の投与量は、患者の体型、年齢、体重、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができるが、例えば、経口投与及びその他の非侵襲経路による投与の場合には、一般に０．０１〜１，０００ｍｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎの用量で使用され、筋注及び皮下注による非経口投与の場合には０．００１〜１，０００ｍｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎの用量で使用され、静注による非経口投与の場合には０．０００１〜１，０００ｍｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎの用量で使用される。有効成分としてＰＴＨ（１−３４）を使用する場合は、筋注及び皮下注による非経口投与の場合には０．０１〜１００ｍｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎ、好ましくは２０〜４０μｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎの用量が好ましい。静注による非経口投与の場合には０．００１〜１００ｍｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎ、好ましくは２μｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎの用量が好ましい。経口投与及びその他の非侵襲経路による投与の場合には０．１〜１００ｍｇ／ｄａｙ／ｐｅｒｓｏｎの用量が好ましい。
上記記載は本発明の骨形成促進剤及び皮質骨骨量増加剤についても同様にあてはまる。
本発明の骨量減少症治療用キットは、（ａ）生体内でのオステオポンチンの作用を阻害するのに有効な量のオステオポンチン阻害物質、（ｂ）骨量の増加に有効な量の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ誘導体及びＰＴＨ受容体アゴニストから選ばれる少なくとも１つの物質、並びに（ｃ）使用説明書、を含む。
実施例
以下の実験例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例及び比較例において行った解析方法を以下に示す。
海綿骨骨量の測定
大腿骨骨幹端領域について矢状断面の切片を作製し、Ｘ線マイクロ断層撮影装置Ｍｕｓａｓｈｉ（Ｎｉｔｔｅｔｓｕ−ＥＬＥＸ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて断層像を得た。次に、Ｌｕｚｅｘ−Ｆ自動画像解析システム（Ｎｉｒｅｃｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、骨遠位端の成長板から０．２ｍｍ離れたところに位置する、１．４７ｍｍ２（０．７×２．１ｍｍ）の四角面積内の画像データを解析してＢＶ／ＴＶ値を得た。
ＢＶ／ＴＶ（ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ／ｔｏｔａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｖｏｌｕｍｅ）は、単位骨量（％）、すなわち、組織全体の体積に占める骨梁全体の体積を表す。したがって、ＢＶ／ＴＶの増加は石灰化した骨が増加したことを意味する。
皮質骨の厚さ及び面積の測定
大腿骨骨幹中央について水平断面の切片を作製し、Ｘ線マイクロ断層撮影装置Ｍｕｓａｓｈｉ（Ｎｉｔｔｅｔｓｕ−ＥＬＥＸ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて断層像を得た。次に、Ｌｕｚｅｘ−Ｆ自動画像解析システム（Ｎｉｒｅｃｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、画像データを解析し、皮質骨の厚さ及び面積を測定した。厚さは、４５°ごとに８点で測定した値の平均値により評価した。
骨形成率（ＢＦＲ）及び石灰化速度（ＭＡＲ）の測定
皮質骨については、大腿骨骨幹中央について水平断面の脱灰切片（厚さ３μｍの連続切片）を調製し、骨膜及び骨内膜領域におけるＢＦＲ及びＭＡＲを調べた。具体的には、検体採取前９日及び２日に、カルシウムキレート作用を有するカルセイン（４ｍｇ／ｋｇ体重）を皮下投与し、標識された２本のバンドの間隔を蛍光顕微鏡で測定することによりＢＦＲ及びＭＡＲを算出した。
ＢＦＲは、単位骨梁面当たりの骨形成速度（μｍ３／μｍ２／ｄａｙ）を表す。
ＭＡＲは、標識された石灰化面間の距離の増加率（μｍ／ｄａｙ）を表す。
海綿骨については、骨幹端領域の脱灰矢状切片を調製し、骨遠位端の成長板から０．２ｍｍ離れた１．４ｍｍ２の四角面積内のＢＦＲ及びＭＡＲを調べた。標識は、検体採取前４日にキシレノールオレンジ（１００ｍｇ／ｋｇ体重）を、２日前にカルセインを皮下投与することにより行った。
ＴＲＡＰ陽性細胞（破骨細胞）の測定
ＰＴＨ投与後、前肢の骨を切り出した。骨をＰＢＳでリンスし、４％パラホルムアルデヒド酸で７日間固定後、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で３日間カルシウム除去を行った。次に、脱水してパラフィンに包埋した。パラフィンブロックから厚さ７μｍの連続切片を調製し、染色してＴＲＡＰ（ｔａｒｔｒａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性を測定した。対比染色はアルシアンブルーを用いて行った。各骨から得た厚さ７μｍの連続切片１５枚を用いて、海綿骨に付着した３つ以上の核を有するＴＲＡＰ陽性細胞を数えた。各１５切片は、１本の骨当たり合計７５切片を切り出し、５切片毎にとったものである。１５切片すべてのＴＲＡＰ陽性細胞数を合計し、そして単位骨梁周囲長当たりの破骨細胞数を得た。
尿中デオキシピリジノリン解析
ＰＴＨ投与２６日後に、各マウスから２４時間以内の尿サンプル（各群１０サンプル）を回収した。骨代謝マーカーとして、尿中デオキシピリジノリン（Ｄｐｙｒ）レベルをＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｔｒａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて製造者のプロトコルにしたがい測定した。
統計解析
データは全て平均±標準誤差として示し、統計的有意差はＦｉｓｈｅｒ検定を用いて評価した。
実施例１
生体内でのＯＰＮの作用を阻害した動物モデルとして、７週齢の１２９系雌マウスについてＯＰＮ遺伝子を欠損させたノックアウトマウス（ＯＰＮ−ＫＯマウス）をＲｉｔｔｌｉｎｇら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１３：１１０１−１１１１，１９９８に記載のごとく作製し、これを用いてＰＴＨ投与試験を１回行った。各群６匹のマウスを用いた。
組換えヒトＰＴＨ（１−３４）（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む酸性化生理食塩水に溶解した。ＯＰＮ−ＫＯマウスに、８０μｇ／ｋｇ体重のヒトＰＴＨ（１−３４）を、１週間に５日間、４週間にわたって皮下投与した。対照群には生理食塩水のみを投与した。
ＯＰＮ作用を欠損させたマウスにおける骨代謝に対するＰＴＨの効果について以下のように試験した。
（１）海綿骨骨量
図１は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける海綿骨骨量（％）の変化を表したグラフである。図１に示すように、ＯＰＮ−ＫＯマウスにおける生理食塩水投与群（ＰＴＨ（−）群）のＢＶ／ＴＶは１３．４５±２．８８％であったのに対し、ＰＴＨ投与群（ＰＴＨ（＋）群）のＢＶ／ＴＶは２４．４１±２．８５％であった。ＰＴＨ投与によりＯＰＮ−ＫＯマウスの海綿骨骨量は有意（ｐ＜０．０５）に増加した。
（２）皮質骨の厚さ及び面積
図２Ａは、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける皮質骨の厚さ（ｍｍ）の変化を表したグラフである。ＯＰＮ−ＫＯマウスでは、ＰＴＨ（−）群の皮質骨の厚さは０．２０±０．０２ｍｍであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群の厚さは０．２６±０．０４ｍｍに増加し、その差は有意であった（ｐ＜０．０５）。
図２Ｂは、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける皮質骨の面積（ｍｍ２）の変化を表したグラフである。ＯＰＮ−ＫＯマウスでは、ＰＴＨ（−）群の皮質骨の面積は０．６９±０．０９ｍｍ２であったのに対し、ＰＴＨ（＋）群の面積は０．８８±０．１３ｍｍ２であり、ＰＴＨ投与により皮質骨の面積は有意（ｐ＜０．０５）に増加した。
（３）皮質骨のＢＦＲ及びＭＡＲ
骨形成の機構について調べるため、大腿骨骨幹中央の皮質骨の骨膜及び骨内膜におけるＢＦＲ及びＭＡＲを測定した。図３は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける大腿骨骨幹中央の皮質骨形成の変化を表したグラフである。
骨膜においては、ＰＴＨ（−）群のＢＦＲ（図３Ａ）は１．２９±０．１０μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲ（図３Ｂ）は２．４４±０．１８μｍ／ｄａｙであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群のＢＦＲは２．３８±０．１８μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲは２．９７±０．２５μｍ／ｄａｙであった。ＰＴＨ投与によりＢＦＲは約１．８倍、ＭＡＲは約１．２倍に増加し、その差はいずれも有意（ｐ＜０．０５）であった。
一方、骨内膜においては、ＰＴＨ（−）群のＢＦＲ（図３Ｃ）は０．６６±０．１０μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲ（図３Ｄ）は１．２５±０．２０μｍ／ｄａｙであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群のＢＦＲは０．６２±０．０９μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲは１．３３±０．２８μｍ／ｄａｙであった。ＰＴＨ投与による影響はほとんど認められなかった。
（４）海綿骨のＢＦＲ及びＭＡＲ
海綿骨においても同様にＢＦＲ及びＭＡＲを測定した。図４は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける大腿骨遠位端の海綿骨形成の変化を表したグラフである。
ＰＴＨ（−）群のＢＦＲ（図４Ａ）は１．２７±０．０８μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲ（図４Ｂ）は３．７５±０．２３μｍ／ｄａｙであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群のＢＦＲは２．６８±０．３４μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲは６．２１±１．１１μｍ／ｄａｙであった。ＰＴＨ投与によりＢＦＲは約２．１倍、ＭＡＲは約１．７倍に増加し、その差はいずれも有意（ｐ＜０．０５）であった。
（５）破骨細胞数
図５は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける単位骨梁周囲長当たりの破骨細胞数の変化を表したグラフである。ＯＰＮ−ＫＯマウスの海綿骨の骨梁における単位領域当たりの破骨細胞数は、ＰＴＨ（−）群は６．３±０．９個／ｍｍであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群は７．６±１．０個／ｍｍに増加した。
（６）Ｄｐｙｒ尿中排泄
ＰＴＨ投与による全身骨再吸収の変化を評価するために、マウス尿中のＤｐｙｒレベルを測定した。図６は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける尿中Ｄｐｙｒレベルの変化を表したグラフである。ＰＴＨ（−）群では２８．９３±８．５４ｎＭ／ｍＭ  Ｃｒであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群では３４．６７±４．５２ｎＭ／ｍＭ  Ｃｒであった。ＰＴＨ投与により全身の骨再吸収は約１．２倍に増加し、その差は有意（ｐ＜０．０５）であった。
比較例１
野生型の１２９系雌マウス（７週齢）を用いて、骨代謝に対するＰＴＨの効果について実施例１と同様の方法で調べた。各群６匹のマウスを用いた。
（１）海綿骨骨量
図１に示すようにＰＴＨ（−）群のＢＶ／ＴＶは１３．１４±２．２７％であったのに対し、ＰＴＨ（＋）群のＢＶ／ＴＶは２１．１７±２．６８％であった。
すでに報告されているとおり（Ｊｉｌｋａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１０４巻：４３９〜４４６頁、１９９９年）、４週間のＰＴＨ投与によりＷＴマウスの海綿骨骨量は有意（ｐ＜０．０５）に増加した。しかし、ＯＰＮ−ＫＯマウスとの間で増加率に大差はなかった。
（２）皮質骨の厚さ及び面積
ＰＴＨ（−）群の皮質骨の厚さは０．１８±０．０２ｍｍであり、ＰＴＨ（＋）群の厚さは０．２０±０．０１ｍｍであった（図２Ａ）。ＰＴＨの投与により、皮質骨の厚さはわずかに増加したものの大きな変化は認められなかった。
図２Ａに示すように、ＰＴＨ（−）群の皮質骨の厚さは、ＷＴマウスとＯＰＮ−ＫＯマウスとのあいだで大きな差が認められなかったのに対し、ＰＴＨ（＋）群では、ＷＴマウスとＯＰＮ−ＫＯマウスのあいだで比較するとその差は有意であった（ｐ＜０．０５）。
ＰＴＨ（−）群の皮質骨の面積は０．６５±０．０７ｍｍ２であり、ＰＴＨ（＋）群の面積は０．６９±０．０３ｍｍ２であった（図２Ｂ）。ＰＴＨの投与により、皮質骨の面積はやや増加したものの大きな変化は認められなかった。
図２Ｂから明らかなように、ＰＴＨ（−）群の皮質骨の面積にはＷＴマウスとＯＰＮ−ＫＯマウスとのあいだで大きな差は認められなかった。一方、ＰＴＨを投与してもＷＴマウスでは皮質骨の面積がわずかしか増加しなかったのに対し、ＯＰＮ−ＫＯマウスではＰＴＨ投与により皮質骨の面積が有意（ｐ＜０．０５）に増加していた。ＰＴＨ（＋）群のＷＴマウスとＯＰＮ−ＫＯマウスとのあいだで皮質骨の面積を比較してもその差は有意（ｐ＜０．０５）であった。
（３）皮質骨のＢＦＲ及びＭＡＲ
骨膜においては、ＰＴＨ（−）群のＢＦＲ（図３Ａ）は１．６７±０．０８μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲ（図３Ｂ）は２．７９±０．１５μｍ／ｄａｙであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群のＢＦＲは１．０７±０．０８μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲは２．０５±０．２１μｍ／ｄａｙであった。ＰＴＨ投与により、骨膜のＢＦＲは約０．６倍、ＭＡＲは約０．７倍になり、骨形成を有意（ｐ＜０．０５）に抑制した。
骨内膜においては、ＰＴＨ（−）群のＢＦＲ（図３Ｃ）は０．７６±０．１１μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲ（図３Ｄ）は１．６８±０．１８μｍ／ｄａｙであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群のＢＦＲは１．３７±０．１８μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲは２．４４±０．２９μｍ／ｄａｙであった。骨膜とは逆に、ＰＴＨ投与により骨内膜のＢＦＲ及びＭＡＲが有意（ｐ＜０．０５）に増加した（それぞれ約１．８倍及び約１．５倍）。
したがって、ＯＰＮの欠損により、ＰＴＨによる皮質骨の骨形成抑制効果がブロックされ、ＰＴＨによる皮質骨形成の促進を、特に骨膜領域を介する作用により誘導することが示された。
（４）海綿骨のＢＦＲ及びＭＡＲ
海綿骨においては、ＰＴＨ（−）群のＢＦＲ（図４Ａ）は１．２９±０．０８μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲ（図４Ｂ）は３．６１±０．１９μｍ／ｄａｙであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群のＢＦＲは１．８５±０．０８μｍ３／μｍ２／ｄａｙ、ＭＡＲは４．８４±０．２１μｍ／ｄａｙであった。ＰＴＨ投与により、骨幹端海綿骨領域のＢＦＲ及びＭＡＲを有意（ｐ＜０．０５）に増加させた（それぞれ約１．４倍及び約１．３倍）。
ＰＴＨ（−）群のＢＦＲ及びＭＡＲは、ＷＴマウスとＯＰＮ−ＫＯマウスとのあいだで差はなかった。しかしながら、ＰＴＨ投与によるＭＡＲ及びＢＦＲの増加率は、ＯＰＮの欠損により有意（ｐ＜０．０５）に高まった（それぞれ約１．４倍及び約１．３倍）。
（５）破骨細胞数
海綿骨の骨梁における単位骨梁周囲長当たりの破骨細胞数はＰＴＨ（−）群は５．４±１．１個／ｍｍであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群は９．２±１．８個／ｍｍに増加し、その差は有意であった（ｐ＜０．０５）（図５）。
図５に示すように、ＷＴマウスとＯＰＮ−ＫＯマウスとのあいだで破骨細胞数に有意な差はなく、したがって両者のあいだで骨吸収が同程度に行われていることが示唆された。
（６）Ｄｐｙｒ尿中排泄
ＰＴＨ（−）群では２８．７２±５．３６ｎＭ／ｍＭ  Ｃｒであったのに対し、ＰＴＨ（＋）群では３４．８６±６．９０ｎＭ／ｍＭ  Ｃｒであった。ＰＴＨ投与により全身の骨再吸収は約１．２倍に増加し、その差は有意（ｐ＜０．０５）であった（図６）。
ＰＴＨ投与による尿中Ｄｐｙｒレベルの変化は、ＷＯマウスとＯＰＮ−ＫＯマウスとのあいだで差がなかった（図６）。これは、ＯＰＮを欠損させてもＰＴＨ投与により単位面積当たりの破骨細胞数に変化はないという上記知見を支持するものである。
産業上の利用の可能性
ＯＰＮ作用の非存在下でＰＴＨを投与すると、海綿骨骨量が増加するだけでなく、皮質骨の厚さや面積も有意に増加し、ＰＴＨによる骨形成の活性化を強化したことを示した。したがって、本発明の治療剤は、骨減少症の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、野生型（ＷＴ）マウス及びＯＰＮノックアウト（ＯＰＮ−ＫＯ）マウスにおける海綿骨骨量（ＢＶ／ＴＶ）の変化を表したグラフである。
図２は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける皮質骨の変化を表したグラフである。Ａは皮質骨の厚さを、Ｂは皮質骨の面積を示す。
図３は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける大腿骨骨幹中央の皮質骨形成の変化を表したグラフである。Ａは骨膜の骨形成率（ＢＦＲ）、Ｂは骨膜の石灰化速度（ＭＡＲ）、Ｃは骨内膜のＢＦＲ、Ｄは骨内膜のＭＡＲを示す。
図４は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける大腿骨遠位端の海綿骨形成の変化を表したグラフである。ＡはＢＦＲ、ＢはＭＡＲを示す。
図５は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける海綿骨の単位骨梁周囲長当たりの破骨細胞数の変化を表したグラフである。
図６は、ヒトＰＴＨ（１−３４）の投与による、ＷＴマウス及びＯＰＮ−ＫＯマウスにおける尿中デオキシピリジノリン（Ｄｐｙｒ）レベルの変化を表したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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