(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度不飽和脂肪酸の本質的酵素分画方法であって、脂肪酸混合物の酵素触媒作用によるエステル化をメタノールを用いて行い、形成されたメチルエステルを未反応の脂肪酸からこの脂肪酸を水性媒体中の弱塩基を用いて鹸化することによって分離し、形成された石鹸を水により抽出し、その水性相を酸性化し、形成された脂肪酸をヘキサンを用いて抽出して、目的の高度不飽和脂肪酸を豊富化した画分を得る方法。
【請求項２】
出発脂肪酸混合物は高度不飽和酸の豊富な油のトリグリセリドの全酵素加水分解由来のものを使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
使用油はｎ−３およびｎ−６系脂肪酸、特にガンマリノレン酸が豊富で、特に黒スグリ種子油、ルリヂサ油および月見草油から選択した油である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
弱塩基はナトリウム、カリウムまたはアンモニウムの炭酸塩、リン酸塩、クエン酸塩またはその混合物であり、反応媒体を水性相および有機相に分離する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
鹸化は炭酸ナトリウム水溶液と反応させて行う、請求項４記載の方法。
【請求項６】
反応は２０°〜８０℃の温度で撹拌しながら行う、請求項４記載の方法。
【請求項７】
反応は撹拌速度を高め、温度を徐々に約４５°〜約７５℃に上げて行う、請求項４記載の方法。
【請求項８】
相の分離は塩化ナトリウム飽和溶液を添加して強化する、請求項４記載の方法。
【請求項９】
水溶性脂肪酸含有水性相は脂溶性エステル含有有機相から遠心分離により分離する、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
遊離脂肪酸は水性相を酸、特に濃塩酸により酸性化後、ヘキサンにより抽出し、次いでヘキサンを特に蒸発により除去して回収する、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は本質的に酵素による高度不飽和脂肪酸の分画方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｎ−６およびｎ−３系脂肪酸は、特にプロスタグランジンの生合成における前駆体として栄養価を有する。各種栄養品および化粧品適用に対しこれらの脂肪酸の豊富化画分を利用しうることは有利である。これらの脂肪酸は主としてトリグリセリドとして天然に見出される。遊離脂肪酸は高温および高圧下でトリグリセリドを加水分解して工業的に得られる。次いでこれらの脂肪酸を分画するために、いくつかの方法、例えば結晶化、蒸留、含有複合体の形成またはクロマトグラフ技術が開発された。これらの方法の適用では高度不飽和脂肪酸の場合分解を生じ、または工業的に適用するには費用がかかり過ぎることが分かった。
【０００３】
酵素方法は先行方法に対する別法を表わし、ほとんどエネルギーを使用せず、応力の少ない設備を使用して温和な條件下で反応を行うことができる。
【０００４】
例えば、魚油および月見草油脂肪酸を分画する酵素方法は、Ｍａｔｔｈｅｗ
Ｊ．ＨｉｌｌｓらのＪＡＯＣＳ，６７巻、９号、５６１〜５６３頁から既知であり、これは菜種リパーゼおよびＭｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉにより触媒され、ブタノールによるエステル化はエステル化される酸の飽和度の関数であることに基づく。高飽和度を有する脂肪酸のエステル化後、エステルは薄層クロマトグラフィにより未反応脂肪酸から分離する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は酵素によエステル化により高度不飽和脂肪酸の豊富な油から脂肪酸を分画する方法を供することで、これはクロマトグラフ分離を避け、工業的に適用できる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は高度不飽和脂肪酸を本質的に酵素により分画する方法に関し、この方法は酵素触媒作用により脂肪酸混合物のエステル化を行ない、形成エステルは未反応脂肪酸から分離し、所望の高度不飽和脂肪酸が豊富化した画分を得るもので、脂肪酸エステルは脂肪酸を調整鹸化し、形成石鹸を水で抽出し、水性相を酸性化し、形成酸を非極性溶媒で抽出することにより分離することを特徴とする。
【０００７】
本発明方法を実施するために、好ましくは、高度不飽和脂肪酸の豊富な油のトリグリセリドの全酵素加水分解由来の出発脂肪酸混合物を使用する。この加水分解は好ましくは、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａの非領域−特異性リパーゼにより好ましくは、室温で、中性ｐＨまたは中性に近いｐＨで、および大気圧で乳化媒体で行う。
【０００８】
出発油として、任意の天然油は高度不飽和脂肪酸、特に３以上の不飽和度を有する動物または植物または合成起源のもの、例えばガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ）の豊富な黒スグリ種子油、ルリヂサ油、月見草油またはアラキドン酸の豊富な「ＴＧＡ」油を挙げることができる。
【０００９】
エステル化はメタノールおよび溶媒、例えばヘキサンまたは少量の水の存在で行う。反応は５〜７０時間、好ましくは１０〜４０時間、好ましくは室温で継続する。使用酵素は固定化しても、またはしなくてもよい。再使用できるように固定化することが好ましい。領域−特異性でも、またはなくてもよい。
【００１０】
反応後、遊離脂肪酸および脂肪酸メチルエステルの混合物を得る。エステル化画分は高不飽和度を有する脂肪酸、例えば黒スグリ種子油の場合特にＧＬＡおよびステアリドン酸（ＳＡ）が少なくなる。これはこれらの酸がほとんどエステル化されず、従って遊離脂肪酸画分に豊富化されることを示す。
【００１１】
本発明によれば、エステルから遊離脂肪酸の分離は温和な條件下で脂肪酸の鹸化により行う。これらの條件は水性媒体中で弱塩基、例えばナトリウム、カリウムまたはアンモニウムの炭酸塩、リン酸塩、クエン酸塩またはその混合物、好ましくは炭酸ナトリウムと、室温からの出発温度、例えば２０℃〜約８０℃までの温度で撹拌、好ましくは次第に強く撹拌しながら、徐々に温度を４５℃から約７５℃まで上げて反応させることを特徴とする。次に水性相と有機相間に分離が認められ、この分離は例えば飽和食塩溶液の添加により強化できる。
【００１２】
この方法により石鹸形で水溶性になる脂肪酸のみを反応させることができる。得た水性相は、例えば遠心分離によりデカンテーション後脂溶性エステルを含有する有機相から容易に分離できる。遊離脂肪酸は酸、例えば濃塩酸により水性相を酸性化して回収し、溶媒、例えばヘキサンにより抽出することができ、次に溶媒は例えば蒸発により除去できる。
【００１３】
次例は本発明を説明する。例中、％および部は特記しない限り重量による。遊離脂肪酸の定量分析は塩化アセチルによるメチレーション後気相クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により行ない、従ってメチルエステル基準である。
【００１４】
【実施例】
例１
１．１  脂肪酸出発混合物の製造
Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａの非特異性リパーゼにより黒スグリ種子油の酵素加水分解由来の脂肪酸混合物を出発材料として使用した。脂肪酸混合物は次の方法で得た。
２０％の黒スグリ種子油を含有し、１．２％の大豆レシチン（Ａｓｏｌ  １００（商標）ルーカスマイヤー）を７８．８％の０．０２５Ｍリン酸塩緩衝水溶液（ｐＨ６．８８）に溶解し、ミクロ流動化装置（１１０Ｔ，ミクロフルイディスク社，ニュートン）を５回通して油滴の平均直径を約４５０ｎｍにした油／水エマルジョンを製造した。
Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａタイプＢのリパーゼ（バイオカタリスツ社，カーディフ，英国）をリン酸塩緩衝液に溶解し、次に４０００ｇで２０分遠心分離して不溶性残留物を除去した。上澄を試験に使用した。１０mlの上記エマルジョン（２ｇの黒スグリ種子油含有）は２５mlの栓付エルレンマイヤーフラスコに入れ、３７℃の温度にサーモスタット制御された浴で２５０ｒｐｍで電磁撹拌しながら、そこに０．２ｇのリパーゼに相当する酵素溶液を添加した。
４時間反応後、媒体は４０００ｇで遠心分離してエマルジョンを破壊し、油相はエーテルで抽出して回収した。抽出物は水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、次いで溶媒を蒸発除去した。得た脂肪酸は光から保護し、窒素下で−２５℃で貯蔵した。
水性相のリパーゼ溶液および形成グリセロールは限外濾過（モジュール  ＹＭ１０、カットオフ限界１０，０００、アミコン，デンバー，米国）により回収し、再使用できるリパーゼ濃溶液を得た。
反応中遊離した脂肪酸％に相当する加水分解度はＭｅｔｒｏｈｍ  ｔｉｔｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ６９２により酸−塩基滴定により測定して９９．９％に相当した。エタノールおよびエチルエーテルの２５mlの等量混合物に溶解した分析試料は、０．１Ｎ濃度のＫＯＨアルコール溶液により滴定した。
脂肪酸混合物はメチルエステル形でＧＰＣにより測定して次の組成を有した。
脂肪酸                                  ％
Ｃ  １６：０                          ７．１
Ｃ  １８：０                          １．７
Ｃ  １８：１                        １３．３
Ｃ  １８：２                        ４５．６
Ｃ  １８：３  ガンマ                １５．５
Ｃ  １８：３  アルファ              １２．２
Ｃ  １８：４                          ２．９
Ｃ  ２０：１                          ０．８
Ｃ  ２０：２                          ０．２
その他                                ０．８
１．２  エステル化
脂肪酸は１１mlのヘキサンおよび１mlのメタノール混液中の９００mgの脂肪酸混合物および１２００mgの固定化リパーゼ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのＬｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＭ２０，ノボノルディスク社，デンマーク）を使用してメタノールによりエステル化した。この酵素は位置２と比較してトリグリセリドのグリセロール骨格の位置１および３で強い特異性を有する。反応は電磁バーを供したガラスフラスコで、機械撹拌機上に置いて２０時間室温で行った。反応後、酵素は濾別し、すすぎ、１０容量％の水で再水和後再使用できる。遊離脂肪酸および脂肪酸メチルエステルの混合物を得た。
１．３  脂肪酸およびメチルエステルの分離
２０ｇの脂肪酸および脂肪酸メチルエステルの上記混合物を４０℃に加熱し、次に水に溶解した１．１ｇの炭酸ナトリウムを撹拌しながら添加した。次いで撹拌速度を上げ、温度を７５℃に高めた。この温度に達すると、加熱を中止し、２０mlの飽和塩溶液を添加した。それにより有機相および水性相の形成が認められた。次に全体を３０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、２相を分離し、次いで石鹸を含有する水性相は塩酸溶液により固化した。次に形成脂肪酸はヘキサンにより抽出し、次いでヘキサンは蒸発除去した。こうしてＧＬＡおよびＳＡが豊富化した、次の組成（メチルエステルのＧＰＣ）を有する１．５ｇの脂肪酸を回収した。
脂肪酸                                ％
Ｃ  １６：０                          １．３
Ｃ  １８：１                          ２
Ｃ  １８：２                          ６．５
Ｃ  １８：３  ガンマ                ７３．４
Ｃ  １８：３  アルファ                ２．４
Ｃ  １８：４                        １３．６
その他                                ０．８
【００１５】
例２
エステル化工程（例１の１．２に相当）において、９mlのメタノールおよび１mlの水から成る溶媒混合物を使用したことを除いて、手順は例１に従った。
こうして６４．６％のＧＬＡおよび１１．８％のＳＡの豊富化相（石鹸から得た非エステル化部分から成る）を得た。
【００１６】
例３〜７
エステル化工程（例１の１．２に相当）において、酵素反応時間は表示のように変え、豊富化相のＧＬＡ％およびＳＡ％の結果は表示のように得たこと以外、手順は例１と同じであった（ＧＰＣによりメチルエステルを測定）。
【表１】
0003798467.tif 000002
【００１７】
例８〜１５
黒スグリ種子油脂肪酸混合物のエステル化を各種起源および区域−特異性の酵素により室温で２０時間反応させて例１（１．２の項）のように行った。得た結果はエステル化画分の脂肪酸組成を測定して評価した（ＧＰＣによりメチルエステルで）。
【表２】
0003798467.tif 000003
上記結果は、すべての場合エステル化画分はＧＬＡおよびＳＡが減少したことを示す。これはこれら２つの酸がほとんどエステル化されず、従って遊離脂肪酸画分にこれらの酸が豊富化することを示す。
【００１８】
例１６
原料として、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｆｕｎｇｕｓから抽出し、アラキドン酸が非常に豊富な、サントリー会社、東京、日本からの合成ＴＧＡ油の全加水分解物を使用した。トリグリセリドの加水分解後、遊離脂肪酸混合物はＬｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＭ２０により室温で２０時間例１（１．２の項）のようにエステル化した。次に遊離脂肪酸メチルエステルは薄層クロマトグラフィにより分離し、遊離脂肪酸混合物の組成を分析した。脂肪酸出発混合物およびエステル化後得た遊離脂肪酸混合物の組成は下記する（ＧＰＣによりメチルエステルを測定）。
0003798467.tif 000004
上記結果は黒スグリ種子油の場合と同様に、遊離脂肪酸画分に一層豊富化した、特にトリ不飽和脂肪酸であったことを示す。ＴＧＡ中の％が低いに拘らず、ＧＬＡはアルファリノレン酸（ＡＬＡ）に比し選択的に豊富化されたことも注目される。