(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
0003757236.tif 000012
式中、
Ｒ1はファルネシルまたはゲラニル−ゲラニルを表し；
Ｒ2は基ＣＯＯＨまたは基ＣＯＯＭ、式中、Ｍはカチオンであり；
Ｒ3およびＲ6はそれぞれ独立して水素であり、
Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して水素，塩素またはフッ素であり、
ＸはＳを表すが、ただし
Ｒ4およびＲ5がそれぞれ独立して塩素またはフッ素を表す場合には、Ｒ4とＲ5のいずれか一方が水素であり、かつ、Ｒ1がファルネシルである、
の化合物。
【請求項２】
式：
0003757236.tif 000013
を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物を有効成分とする癌の治療または軽減のための医薬組成物。
【請求項５】
癌の治療または軽減用の医薬組成物を調製するための請求項2に記載の化合物の使用方法。
【請求項６】
請求項２に記載の化合物からなるプレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＰＰＭＴａｓｅ）の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、プレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ酵素の阻害剤として有用な新規ファルネシル誘導体、およびその癌治療における使用に関する。本発明はまた、これらの新規化合物を含んで成る医薬組成物、そしてより詳細には癌の治療または軽減のためのそのような医薬組成物に関する。
発明の背景
Ｒａｓタンパク質は、チロシンキナーゼ成長−因子レセプターの発信において鍵となる役割を果たす（Egan,S.E.およびWeinberg,R.A.,Nature,365,781-782(1993);McCormick,F.,Nature,363,15-16(1993)）。これらのタンパク質はグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）に結合し、そして成長因子のシグナルをＭＡＰキナーゼカスケードに伝達する。これらは、raf1キナーゼの活性化が直接的なras-raf相互作用を通して起こる形質膜と関連をもっている（Zheng,X.F.ら、Nature,364、308-313(1993);Warne、P.H.,Nature,364,352-353(1993)）。成長因子信号伝達の終結には、タンパク質のＧＴＰ−結合ｒａｓからＧＤＰ状態への加水分解が関与する。発癌性ｒａｓタンパク質はＧＴＰを加水分解しないので、永久に活性状態である。これは活性化されたｒａｓタンパク質を発現する腫瘍細胞の制御されていない細胞成長に貢献している。突然変異したｒａｓタンパク質はヒトの癌で高い頻度で見い出される（Bos,J.L.Cancer Res.,49,4682-4689(1989);Barbacid,M.,An.Rev.,Biochem,56,779-829(1987)）。結腸および膵臓の癌腫のような腫瘍の種類の中には、活性化されたｒａｓが50％より高く存在することがある。したがって、ｒａｓ活性を変化させる薬学的方法は、特定の種類のヒトの癌を治療するために使用できる。
ｒａｓ発癌タンパク質の活性を阻害するための薬学的研究が最近記載された（Kohl,N.E.ら、Science,260,1934-1937(1993);James G.L.,Science,260,1937-1942(1993)）。ＣＡＡＸファルネシルトランスフェラーゼの特定の細胞−活性阻害剤が、ｒａｓ−依存性の細胞成長を阻害し、そして活性化ｒａｓを発現する細胞の形質転換した表現型を変えることが実証された。これらの研究は、ｒａｓ発癌タンパク質のファルネシル化には、それらの膜固定および形質転換活性が絶対的に必要であることを示す初期の実験により方向づけられていた（Hancock,J.F.ら、Cell,57,1167-1177(1989);Casey,P.J.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86.8323-8327(1989)）。ｒａｓタンパク質のファルネシル化の後に、それらのＡＡＸのタンパク質溶解的除去、続いてファルネシルシステインのカルボキシルメチル化が行われるので、プロテアーゼまたはメチルトランスフェラーゼの阻害剤は、ｒａｓ活性に影響を与えることができると期待された。もしそうであれば、ｒａｓプロセッシングの最終的な、そして可逆的段階（すなわちカルボキシルメチル化）のみを阻害することが有利なはずであった。しかし、ｒａｓ発癌タンパク質プロセッシングおよび活性の点突然変異分析で、ファルネシル化が膜固定および活性を付与するのに十分であることが示された（カトー．Ｋら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,6403-6407(1992)）。また、N-アセチル-トランス-トランス-ファルネシル-L-システイン（ＡＦＣ）（プレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＰＰＭＴａｓｅ）の基質）が、ｒａｓ−形質転換ＮＩＨ3Ｔ3細胞中でｒａｓメチル化を阻害できるが、その成長は阻害しないことが報告された（Volker,C.,ら、J.Biol.Chem,226,21515-21522(1991)）。ｒａｓタンパク質の第３の修飾を阻害する、プレニル化タンパク質の酵素的メチル化の遮断は、新生物的な細胞成長を制御するのに有用であることが判明した（米国特許第5,202,456号明細書）。
メチル化はｒａｓ成熟経路の最終段階であり、そしてこれのみが真に可逆的な段階である。この段階の阻害が、ｒａｓタンパク質のファルネシル化またはタンパク質溶解の先行する不可逆的な段階の阻害よりも、非−腫瘍細胞中に存在する正常なｒａｓタンパク質に対して害が少ないといういことは理の当然である。ＰＰＭＴａｓｅはｒａｓプロセッシングのカスケード中の最後の酵素であり、そしてその基質認識部位は、ｒａｓのカルボキシ−末端ファルネシルシステインに結合する類似部位と幾つかの類似性を共有するということが予想される。したがって、ＰＰＭＴａｓｅインヒビターは、非腫瘍細胞の機能について重要なプレニル化タンパク質のプロセッシングに影響を及ぼす事なく、ｒａｓ機能に重要なファルネシルシステイン認識部位ドメインを認識し、そして遮断することができる。
ｒａｓ活性の遮断に有用となることができ、かつ抗−腫瘍剤として使用できるＰＰＭＴａｓｅインヒビターが大変望ましい。
成長−因子レセプター信号伝達におけるｒａｓの中心的役割から、ｒａｓ機能を遮断するファルネシル誘導体も成長因子に関連する非腫瘍性のヒトの疾患に有用であり得る。ＡＦＣおよび関連するファルネシル誘導体は、血小板凝集および好中球走化性を阻害することが示された（Philips,M.R.,ら、Science,259,977-980(1993);Akbar,H.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90.868-872(1993)）。したがって、有力なＰＰＭＴａｓｅインヒビターはマクロファージが関与する敗血症ショック症候群、ｂＥＧＦ−依存性カルテノサイト増殖に関与する乾癬、ならびに血小板の活性化およびＰＤＧＦ−依存性平滑筋増殖が関与する再狭窄およびアテローム性硬化症の緩和にも有用である、というのは当然だろう。
発明の要約
本発明は、
（ａ）式Ｉ：
0003757236.tif 000002
式中、
Ｒ1はファルネシル、ゲラニルまたはゲラニル−ゲラニルを表し；
ＺはＣ−Ｒ2またはＮを表し；
Ｒ2はＨ、ＣＮ、基ＣＯＯＲ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8およびＳＯ2ＮＲ7Ｒ7を表し、式中、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して水素、アルキル、アルケニルならびに基ＣＯＯＭおよびＳＯ3Ｍであり、式中、Ｍはカチオンであり；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素、カルボキシル、アルキル、アルケニル、アミノアルキル、ニトロアルキル、ニトロ、ハロ、アミノ、モノ−またはジ−アルキルアミノ、メルカプト、メルカプトアルキル、アジドまたはチオシアナトであり；
ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨまたはＳｅを表す
の化合物；および
（ｂ）式中ＺがＮである式（Ｉ）の化合物の四級アンモニウム塩およびＮ−オキシド、
から成る群の員である化合物を提供する。
式（Ｉ）を有する化合物の例には以下のものがある：
（ｉ）以下の式IIのファルネシル−チオサリチル酸（ＦＴＳ）：
0003757236.tif 000003
（ii）以下の式IIIを有する2-クロロ-5-ファルネシルアミノ安息香酸（ＮＦＣＢ）
0003757236.tif 000004
（iii）以下の式IVを有するファルネシルチオニコチン酸（ＦＴＮ）
0003757236.tif 000005
以下に用語“該化合物”は、上記式ＩからIVの化合物またはこれら化合物の２つ以上の組み合わせを表す時に使用する。
本発明はさらに、有効成分として該化合物を医薬的に許容できるキャリアーと一緒に含んで成る医薬組成物を提供する。特別な態様は、そのような医薬組成物の癌治療または軽減に関する。
本発明はまた、該化合物を医薬組成物の調製に使用すること、より詳細には癌の治療または軽減のための医薬組成物を調製するために使用することに関する。
本発明は該化合物をＰＰＭＴａｓｅインヒビターとして使用することも対象とする。
本発明の別の観点によれば、該化合物はＰＰＭＴａｓｅ酵素を試料から単離するために使用される。
この観点に従えば、該化合物は例えば共有結合のような、それ自体は周知な手段により固体支持体上に固定化される。試料は固定化された化合物上に、ＰＰＭＴａｓｅが該化合物に特異的に結合できるような条件下で加えられる。固定化されたＰＰＭＴａｓｅを含んで成るこの固定化支持体は、液体相から分離され、そして非結合分子が次に洗い出される。最後に、ＰＰＭＴａｓｅ酵素のみが固体支持体から回収される。
また本発明は、癌の治療が必要な個体に薬学的に有効量の該化合物を投与することにより、癌を治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＰＭＴａｓｅの２つの合成基質（ＡＦＣおよびＦＴＰ）ならびにＰＰＭＴａｓｅの２つの阻害剤（ＦＴＳおよびＦＴＡ）の構造式を示す；
図２は、シナプトソームの膜調製物中の、ＦＴＳおよびＦＴＡによるＰＰＭＴａｓｅ活性の用量依存性阻害を示す；
図３は、100μM FTSまたは100μM FTAによるインタクトHEC1A、ras-形質転換rat1およびメラノーマ細胞中の、内因性21-24KDa小GTP-結合タンパク質のメチル化阻害を示す；
図４は、200μm FTSによるインタクトなras-形質転換rat1細胞中のrasタンパク質のメチル化阻害を示す；
図５は、10および50μM FTSの不在または存在下で5日間成長した後のMTT染色ras-形質転換rat1細胞を示す；
図６は、MTT法で測定した50μM FTSの、rat1およびras-形質転換rat1細胞の生存能に対する効果を示す；
図７は、処置3、7および10日後の非形質転換rat1およびras-形質転換rat1細胞の成長に対する、様々な濃度（0.1-50）μMのFTAおよびFTSの効果を示す；
図８は、処置3日後のHEC1A細胞の成長に対する、様々な濃度（0.1-50）μMのFTAおよびFTSの効果を示す；
図９は、rat1細胞（左）、未処理(A)、および50μM FTS(B)または50μM FTA(C)処理；ならびにRas-形質転換rat1細胞（右）、未処理(D)、および5μM FTS(E)または10μM FTA(F)処理（100倍）の写真を示す；
図１０は、10μM FTS(B)または50μM FTA(C)の不在(A)または存在中でのHEC1A細胞の成長の写真を示す（100倍）；
図１１は、ＰＰＭＴａｓｅ阻害剤としてのファルネシル誘導体のＫｉと、ras-形質転換rat1細胞の成長阻害剤としてそのＥｃ50値との間の相関を示す；
図１２は、典型的な実験で提供された８匹の溶媒処理および８匹のＦＴＳ処理（3.2mg/kg、日）のヌードマウスで実際に測定された腫瘍の大きさを示し（Ha-ras-形質転換細胞移植および同日に開始した薬剤の全身投与）；そして
図１３は、Ha-ras-形質転換細胞移植の37日後の3匹の対照および3匹のＦＴＳ処理（1.6mg/kg、隔日）ヌードマウスの写真を示す（細胞移植および全身投与は同日に開始した）。
発明の詳細な説明
材料：
N-アセチル-L-システイン，3-メルカプトプロピオン酸およびメルカプト酢酸を米国のシグマ（Sigma）から購入した。トランス，トランス-ファルネシルブロミド、チオサリチル酸および5-アミノ-2-クロロ安息香酸を米国のアルドリッチ（Aldrich）から購入した。S-アデノシル-L-メチオニンを米国のシグマから購入し、［メチル-3H］-S-アデノシル-L-メチオニン（AdoMet，75Ci/mmol）を米国のＲＣＩから購入し、そして［メチル-3H］メチオニン（15Ci/mmol）を米国のデュポンNEN(DuPont NEN)から購入した。他の全ての化学品はメルク（Merck）、アルドリッチまたはシグマからのA.R.等級のものであった。ゲル電気泳動サプライは米国のバイオラッド（Bio-Rad）から、そしてゲル電気泳動用のタンパク質マーカーはスウェーデンのファルマシア−ＬＫＢ（Pharmacia-LKB）からのものだった。組織培養補足物（培地、血清および抗生物質）はイスラエルのバイト−ヘメック（Beit-Haemek）のものだった。組織培養プレートは、英国のコーニング（Corning）からのものだった。カラムクロマトグラフィー用（メルク製品#7733）および薄層クロマトグラフィー用（メルク製品#5575）のシリカ-ゲルは、独国のメルクからのものだった。
ファルネシル誘導体の合成：
ＰＰＭＴａｓｅ用の合成基質として役立つN-アセチル-フェルネシル-L-システイン（AFC）およびファルネシルチオプロピオン酸（ＦＴＰ）、ならびにＰＰＭＴａｓｅ活性の阻害剤として役立つS-トランス，トランス-ファルネシルチオ酢酸（ＦＴＡ）は、以前に詳細に記載された方法（Tanら、J.Biol.Chem,266,10719-10722(1991)）をわずかに変更して、トランス，トランス-ファルネシル−ブロミドおよびN-アセチル-L-システイン，3-チオプロピオン酸およびメルカプト酢酸から調製した。類似体はシリカゲルカラムで精製し、そしてプロトン核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）により、質量分析により、そしてヨウ素蒸気で視覚化したＴＬＣにより分析した。
1Ｈ−ＮＭＲデータはBruker AMX360-WB NMRスペクトロメーターにより、重水素化したクロロホルム（ＣＤＣｌ3）溶媒およびテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部対照として使用して測定した。
マススペクトル（ＭＳ）は、Du-Pont 49113スペクトロメーターを使用して測定した。ＡＦＣ、ＦＴＰおよびＦＴＡに関する1Ｈ−ＮＭＲおよびマススペクトルデータは、Tanら、同上により得られたデータと同一であった。
ＦＴＳ（ファルネシルチオサリチル酸）の合成：
チオサリチル酸（0.9g、6mmol）、グアニジン炭酸塩（1.3g、7mmol）およびトランス，トランス-ファルネシルブロミド（1.7g、6mmol）を、75mlのアセトン中で室温にて一晩混合した。アセトンを蒸発させた後、クロロホルムを２−３滴の2N HClと一緒に加えた。混合物を水で洗浄し、そして有機相を分離し、そして硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に蒸発させた。黄色い油状物が得られた。この生成物をシリカ−ゲルカラムで、クロロホルムおよび酢酸エチル（5:1-1:5）の混合物、および酢酸エチルを溶出液として使用して精製した（85％収量）。
ＦＴＡの特性決定
IUPAC名：（3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-トリエニル）-2-チオ安息香酸。
外観：淡い黄色味がかった油状物。
マススペクトル：
ｍ／ｅ３５８（Ｍ+），２２２、２０４、１５２、１３６、１２１、１０７、９３、８１、６９、６８。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，δ）１．５５（３Ｈ，ｓ）、１．５７（３Ｈ，ｓ）、１．６（３Ｈ，ｓ）、１．６７（３Ｈ，ｓ）、１．９７（ｍ，４Ｈ）、２．０２（ｍ，４Ｈ）、３．４５（ｂｓ，２Ｈ）、５．１（ｍ，２Ｈ）、５．２５（ｍ，１Ｈ）、７．０（ｍ，１Ｈ）、７．２（ｍ，３Ｈ）、７．９（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
使用した略号は：単重項（ｓ）、幅広い単重項（ｂｓ）、多重項（ｍ）。
ＮＦＣＢ（5-アミノ-ファルネシル-2-クロロ安息香酸）の合成：
5-アミノ-2-クロロ安息香酸（1.58gr、5.8mmol）を75mlの乾燥アセトン中に溶解した。グアニジン炭酸塩（1.3gr、7mmol）およびトランス，トランス-ファルネシルブロミド（1.3gr、4.6mmol）を加え、反応物を室温にて2〜3時間混合した。さらに1.3grの炭酸グアニジンを室温で一晩混合しながら加えた。反応混合物を濾過し、そして固体フィルターをアセトンで洗浄した。フィルターを合わせ、蒸発させた。生成物をシリカ−ゲルカラムで、クロロホルムおよび酢酸エチルを溶出液として使用して精製した。
ＮＦＣＢの特性決定
IUPAC名：5'-（3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-トリエニル）アミノ-2'-クロロ安息香酸。
外観：白色の固体物質。
マススペクトル：
ｍ／ｅ３７５／３７７（Ｍ+）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，δ）：１．５５、１．５７、１．６０、１．６７（４singlets，１２Ｈ）、１．９７（ｍ，４Ｈ）、２．０（ｍ，４Ｈ）、３．８（ｄ，２Ｈ）、５．１（ｍ，４Ｈ）、６．６（ｍ，１Ｈ）、７．０５（ｄ，１Ｈ）；７．１（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
5-アミノ-FTS（5-アミノ-ファルネシル-チオサリチル酸）の合成：
5-アミノ-2-クロロ安息香酸（1.5gr、5.5mmol）を水に溶解し、そしてNaHS(1.2gr、0.022mmol)を加えた。混合物を2時間還流し、そして水を蒸発させて2.1grの灰色の固体物質（5-アミノ-2-メルカプト-安息香酸）を得た。生成物の一部（3.6gr、3.5mmol）を最少容量のジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し、そしてKHCO3（0.4gr、4mmol）を加えた。１時間連続して混合した後、1gr（3.5mmol）のトランス-ファルネシルブロミドを加え、そして反応を一定に撹拌しながら室温で一晩行った。このDMFおよび水を蒸発させ、そしてこのようにして得た固体物質をメタノールに溶解し、そして不溶性物質を除去するために濾過した。可溶性物質をシリカ−ゲルカラムで、メタノールおよびクロロホルム（1:9-9:1）の混合物で精製した。期待された生成物をさらに、メタノール／2％アンモニア（Rf0.4）で展開した調製用のシリカ−ゲルプレートで精製した。
5-アミノ-ＦＴＳの特性決定
IUPAC名：5'-アミノ-2'-（3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-（トリエニル）チオ安息香酸。
外観：淡い黄色味がかった油状物。
マススペクトル：
ｍ／ｅ３０２、２５６、２３５、２０４、１７１、１３５（分子ピークは見えなかった）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ6）；１．５３（ｓ，６Ｈ）、１．６０（ｓ，３Ｈ）、１．６５（２，３Ｈ）、１．９−２．１（ｍ，８Ｈ）、３．８（ｄ，２Ｈ）、５−５．２（２ｍ，３Ｈ）、６．４（ｄｄ，１Ｈ）、６．６５（ｂｓ，１Ｈ）、６．９５（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ。
ファルネシル-チオニコチン酸（ＦＴＮ）の合成：
2-メルカプトニコチン酸（0.6gr、6mmol）、グアニジン炭酸塩（1.3gr、7mmol）およびトランス，トランス-ファルネシルブロミド（1.7g、6mmol）を75mlの乾燥アセトン中で室温にて一晩混合した。蒸発後、クロロホルムを２−３滴の2N HClと一緒に加えた。混合物を水で洗浄し、そして有機相を集め、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして蒸発させた。生成物をシリカ−ゲルカラムで、クロロホルムおよび酢酸エチルの混合物を溶出液として精製した。生成物をＴＬＣ、マススペクトルメトリーおよびＮＭＲにより特性決定した。
ＦＴＮの特性決定
IUPAC名：2′-（3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-トリエニル）チオ-ピリジン-3′カルボン酸。
マススペクトル：m/e 359（M+）
1Ｈ−ＮＭＬ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，δ）：１．５５、１．５７、１．６０、１．６７（４ｓ，１２Ｈ）、２．０５（ｍ，４Ｈ）、２．１０（ｍ，４Ｈ）３．７５（ｄ，２Ｈ）、５．１（ｍ，２Ｈ）、５．４（ｍ，１Ｈ）、７．０（ｍ，１Ｈ）、８．２５（ｍ，１Ｈ）、８．５（ｍ，１Ｈ）、９．６（ｍ，Ｈ）ｐｐｍ。
シナプトソーム膜調製物を使用したプレニル化合成基質のメチル化の評価：
メチル化の基質としてＡＦＣを使用し、そしてメチルの供与体として［メチル-H3］標識AdoMetを使用した。酵素プレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＰＰＴＭａｓｅ）の供給源として、この酵素が豊富である膜として知られているラット小脳膜を使用した（Ben-Baruch,Biochem.Biophys.Res.Commun.195,282-288(1993)）。
オスのチャールズ リバー 成長ラットを、小脳のシナプトソーム膜を調製するために使用した。小脳を断頭後に取り出し、そして50mM Tris-HCl pH7.4、3mM EDTA、1mM EGTA、5単位/mlのアプロチニンおよび5μg/mlのペプスタチンを含む0.32Mのスクロース中（緩衝液Ａ）で均一化し、10％（重量／容量）のホモジネートを得た。核画分を10分間、600×ｇ遠心により得、そしてシナプトソーム画分を20分間、14,500×gの遠心により得た。使用する様々な種類の細胞膜は、上記緩衝液Ａ中で60分間、100,000×gで遠心して調製した。
ペレットを均一化緩衝液中に再懸濁し、そして-70℃に保存した。メチル化アッセイは37℃で、50mM Tris-HCl緩衝液pH7.4中で、75-125μgタンパク質、25μM［メチル-3H］AdoMet（300,000cpm/mmol）をメチル供与体として、そして150μMのAFCをメチル化基質として（DMSO中のストック溶液として調製）、50μlの全量で行った。DMSO濃度はすべてのアッセイで4％であった。
反応は10分後に、500μlのクロロホルム メタノール（1:1）を加えて終了し、続いて250μlのH2Oを加え混合し、続いて相分離を行った。125μlのクロロホルム相部分を、40℃で乾燥させ、そして200μlの1N NaOH/1％SDS溶液をそれに加えた。このように生成した［3Ｈ］メタノールを、既に記載されているように（Haklaiら、Cell Mol.Neurbiol.,11,415-431(1991);Lennerら、Cell Mol.Neurobiol.,12,333および3351(1992);Ben-Baruchら、Biochem.Biophy.Res.Commun.,195,282-288(1993)）、気相平衡法により計数した。典型的なバックグラウンドカウント（すなわち、ＡＦＣを加えない場合のメチル化のカウント）は、50-100cpmであり、一方基質としてＡＦＣが存在する典型的なメチル化のカウントは、500-6000cpmであった。アッセイは３連で行い、そしてバックグラウンドのカウントを引いた。インタクトな細胞中の内因性の基質のメチル化、および［α-32Ｐ］ＧＴＰ−ブロットオーバーレイアッセイおよびゲル電気泳動は、すでに記載されたように行った（Haklaiら、同上(1991);Lennerら、同上(1993)）。
インビトロでの様々な細胞系に対するファルネシル誘導体の効果
細胞系：
使用した細胞系はrat1、-EJ、これらはVal-12活性化ヒトHa-ras遺伝子を安定して発現しているart1細胞である（Land Hら、Nature,304,596-602(1983)）；V-raf-3T3、これらはV-raf遺伝子を安定して発現している3T3細胞である（Xu,N.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.90,6741-6745)；RB-22、これらはラットErb-B2遺伝子を安定して発現している3T3細胞である（Pelesら、EMBO J.10,2077-2086(1991)）；CO60細胞（SV40-CHO）、これらはSV-40 T-抗原遺伝子を安定して発現しているCHE細胞である（Lavi、Proc.Natl.Acad.Sci.78,6144-6148(1981)）；ヒト子宮内膜腫細胞系HEC1A、これらは活性化K-rasを発現する細胞である（エノモトT.,Cancer Res.,50,6139-6145）；マウスB16F10メラノーマ細胞、ラットクロム親和性細胞腫PC12細胞、373細胞CHEおよびCOS細胞であった。
細胞培養法：
HEC1A、V-raf-3T3およびSV40-CHE細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）、4mM L-グルタミン、10μg/mlストレプトマイシンおよび10U/mlペニシリンを含むダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中で成長させた。Rat1および-EJ細胞を、12.5U/mlのニオスタチンを補足した以外は同じ培地中で成長させた。RB-22細胞を、4mM L-グルタミン、10μl/mlストレプトマイシン、10U/mlペニシリンを含有する改良DMEM（1mMピルビン酸ナトリウム、20mM重炭酸ナトリウム）/10％FCS中で成長させた。PC-12細胞をDMEM15％FCS/5％ウマ血清および上記抗生物質中で成長させた。
HEC1A細胞を24ウェルプレートに、5×103細胞/ウェルの密度でまき、そして1mlの培地を供給した。細胞を37℃、95％／5％の空気／ＣＯ2の湿潤環境下で成長させた。使用した全ての種類の他の細胞は、2×103細胞/ウェルの密度24ウェルプレートにまき、そして適当な培地を供給した。
培養物をファルネシル誘導体または溶媒で、示したようにプレーティングの３時間後か、またはプレーティングの１日後のいずれかに処理した。薬剤をDMSO中に、所望の最終薬剤濃度（0.1-50μM）および0.1％DMSOとなるように調製した。対照培養物は、0.1％DMSOのみを受容した。培養物に実験の6、7および9日に薬剤または溶媒含有培地を供給した。
細胞は薬剤処理の開始後3、7および10日に計数した。計数のために、細胞をプレートからトリプシン／EDTAではがし、そしてDMEM/10％FCSの存在中で低速遠心により回収した。このペレット化細胞を小容量のDMEM/10％FCSに再懸濁し、そして顕微鏡下で計数した。細胞の生存能を、（3-（4,5-ジメチルチオゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）で染色し、染色された、またはされていない細胞を顕微鏡で検査するか、あるいは各ウェル中の全染色を分光光度的測定（ＯＤ490 690）により評価した。非生存細胞はトリパンブルー除外法により評価した。
生化学的方法のために使用した細胞
生化学的方法のために、HEC1A、rat1およびras-形質転換rat1細胞を上記培地中で、1×104細胞／ウェルの密度で成長させた。
B16F10メラノーマ細胞を、RPMI1640/10％ウシ血清、2mMグルタミンおよびHEC1A細胞用抗生物質中で、1×404細胞／ウェルの密度で成長させた。シナプトソーム膜調製用にAFCを上記のような基質として使用して、４つの種類の全ての細胞がＰＰＭＴａｓｅ活性を測定するために使用された。通常、150μgの膜のタンパク質を10分間のインキューベーション時間でこのアッセイに使用した。
HEC1A、rat1、ras-形質転換rat1細胞およびB16F10メラノーマ細胞も、100-300μCi/ml［メチル−3Ｈ］メチオニン（これはまたＰＰＭＴａｓｅ活性の指標でもある）で内因性タンパク質を代謝的標識化に使用した。代謝的標識化法はいたるところに記載されており（Haklaiら、同上(1991)；Lennerら、同上(1992)）、そしてrasのY13-159 Abでの免疫沈降はClarkeら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,4643-4647(1988)）に詳細に記載された。
ヌードマウスを対象とした腫瘍成長に対するＦＴＳの効果：
オスのヌードマウス（CD1-Nu）を、イスラエル、レホボットのワイズマン科学研究所（Weizmann Institute of Science）から入手した。5-8匹のマウス群（3-4週齢、25±2gr体重）を、対照およびＦＴＳ処置の両実験に使用した。細胞（Ha-ras形質転換rat1(EJ)細胞、2×106細胞/100μl PBS）を計画的に投与（s.c.）した。細胞移植および薬剤投与は同時に開始した。EJ細胞をコンフルエント培養物から調製した。細胞をトリプシン／EDTAではがし、そしてDMEM/10％FCS、続いてPBSで３回洗浄した。2×107細胞/mlの懸濁液を調製し、そして調製の15-30分以内に実験に使用した。
FTSをエタノール中にストック溶液（0.225M）として調製した。これを薬剤投与の直前にPBSで希釈し、そして1.35mM FTS、0.6％エタノール溶液を得た。このような条件下でFTSは投与に要する時間、溶液中に留まった。
実験マウスは、それぞれ毎日または1日おきに100μlのFTS溶液を受容した。対照はPBS中の0.6％エタノールの適当な投与を受けた。腫瘍の成長を毎日観察することにより、そしてミリメートルのカリパスを使用して大きさを測定することにより監視した（２次元的な腫瘍の大きさを通常、週に２回測定した）。
結果
膜調製物中のＰＰＭＴａｓｅ活性に対するＦＴＡおよびＦＴＳの効果
表Ｉは、メチル化の合成基質としてＡＦＣを含む、または含まない、ラット小脳のシナプトソーム膜由来ＰＰＭＴａｓｅのメチルトランスフェラーゼ活性を表している。活性は形成した［Ｈ3−メチル］エステルの量により測定した。
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表IIは様々なＰＰＭＴａｓｅ阻害剤の阻害定数（ki）を示す：
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表Ｉから、ＦＴＡおよびＦＴＳの両方がＡＦＣの効率的な阻害剤であるが、ＦＴＳはそれ自体がメチル化の基質として役立たないことが分かる。同様に、ＮＦＣＢ、ＦＴＮおよび5-アミノ-FTSも効率的な阻害剤であるが、ＰＰＭＴａｓｅの基質として役立たない（表II）。
図２は、様々なＦＴＡおよびＦＴＳ濃度で、シナプトソーム膜中に存在するＰＰＭＴａｓｅによる100μM AFCのメチル化阻害の典型的な曲線である。この図から、ＦＴＡおよびＦＴＳの両方が、およそ同様な能力でＡＦＣ基質のメチル化を用量−依存的様式で阻害することが分かる。しかし、ＦＴＳのＩＣ50（ＡＦＣメチル化の50％阻害を生じる濃度）値が10μMであるのに対し、ＦＴＡはわずか23μMであり、それぞれの阻害定数（Ki）は1.5μMおよび4μMであった。したがってＰＰＭＴａｓｅ阻害において、ＦＴＳはＦＴＡよりもおよそ２倍効果的である。
表IIから、様々な阻害剤の能力の順序はＦＴＳ＞ＮＦＣＢ≒ＦＴＡ＞ＦＴＮ＞5-アミノＦＴＳであった。
表IIIは、ＡＦＣのメチル化により測定した時、４種の細胞系から得られた膜中のＰＰＭＴａｓｅ活性に対するＦＴＡおよびＦＴＳ両方の阻害活性を示す。
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表IIIから、ＰＰＭＴａｓｅ活性が試験した全ての膜で明らかであることが分かる。ＦＴＡおよびＦＴＳの両方が、正常細胞を含む試験した全ての４種の細胞系中のＰＭＴａｓｅによるＡＦＣのメチル化を阻害した。
インタクトな細胞中のＰＰＭＴａｓｅ活性に対するＦＴＡおよびＦＴＳの効果：
上記表IIは、合成基質のメチル化をアッセイすることによりＰＰＭＴａｓｅ活性を測定したが、図３はこの活性を100μMのFTAまたはFTSの存在または不在下にて、インタクトなHEC1A、ras-形質転換rat1およびメラノーマ細胞中に存在する様々な内因性ｒａｓ−様プレニル化ＧＴＰ−結合タンパク質のメチル化により測定する。図３は［メチル-3Ｈ］メチオンで代謝的に標識した、細胞の150μgの膜タンパク質を添加したゲルに見られるメチル化21-24kDaタンパク質の量を表す。この図から、ＦＴＡおよびＦＴＳの両方が、内因性の21-24kDaタンパク質のメチル化も阻害できたことが分る。［α−32Ｐ］ＧＴＰ−ブロットオーバーレイアッセイ（Haklaiら、同上(1991)）の使用により、これら21-25KDaタンパク質がＧＴＰ−結合タンパク質であることを実証できた（データは示さず）。図４はＦＴＳ（100μM）が、［メチル−3Ｈ］メチオニン標識ｒａｓ形質転換ｒａｔ１細胞から免疫沈降したｒａｓタンパク質のメチル化を阻害することを示す。
上記の結果から、ＦＴＡおよびＦＴＳの両方がインタクトな細胞中に浸透し、そしてこれら細胞の内因性タンパク質のメチル化をこのように遮断することにより、ＰＰＭＴａｓｅ活性を阻害できることが明らかである。
毒性試験
インビトロ
細胞の生存に対するＦＴＡおよびＦＴＳの両方の長期的効果を測定するために、生存細胞のみを染色するＭＴＴを使用して比色法を採用し（Mosmen,F.J.,Immunol.Meth.,65,55-63(1983)、ならびに死細胞のみを染色するトリパンブルー排除染色法を採用した。細胞を50μMのＦＴＡまたはＦＴＳと一緒に、最高５日間培養物中でインキューベーションした。この濃度は上記で算出したＦＴＳおよびＦＴＡのKi値の10-30倍である。対照として0.1％DMSO（薬剤無し）でインキューベーションした細胞を使用した。
対照およびＦＴＳまたはＦＴＡ処理HEC1A、rat1およびras-形質転換rat1細胞の顕微鏡検査を行い、そして95％より多くの細胞（薬剤処理および未処理の両方）が、ＭＴＴで染色され、それらの生存能力を示していることが明らかであった。対照的に、トリパンブルー排除染色法では、5％未満の細胞がこれらの条件下で染色され、細胞死が無いことを示唆していることが明らかであった。
図５は、MTT-染色ras形質転換rat1細胞の典型的な例を示す（対照およびＦＴＳ処理、培養５日）。rat1細胞またはras-形質転換rat1細胞のいずれかで薬剤誘導細胞死が無いことは、図６に示すように、MTT染色後の分光光学的測定によっても判定された。データは、細胞のプレーティング後、24時間の対数期中に、ＯＤ490 690が対照または薬剤処置細胞のいずれでも増加しなかったことを示す。
さらに数種類の細胞を上記の条件にさらした別の実験で、95％より多くの細胞が生存していることが示された。これらの実験は、培養物中のB16F10マウスメラノーマ、PC-12、3T3、CHOおよびCOS細胞系、ウシ毛細管内皮細胞、ラット脳星状細胞、ラット脳プライマリーニューロン細胞で行い、全てにおいて同様な結果を得た。
インビボ
インタクトな動物での毒性試験を、Ｃ５７ブラックおよびバルブ−Ｃマウスで行った。
Ｃ５７ブラックマウス：各々が９匹のマウスを含んで成る４群を使用した。群の動物は、1％DMSOを含有する塩溶液中の150μM FTSを100μls.c.注射で受容した（0.21mg薬剤/kg体重）。薬剤を2週間、３日毎に注射した。対照として使用した２つの群は、同期間中に溶媒／塩溶液を受容した。第３（薬剤処置）および第４（対照）の動物を、治療の濃度、頻度および期間に関して同様な様式で、しかしs.c.の代わりにi.p.で処置した。薬剤処置した１８匹の動物のうち１匹のみが死んだ（i.p.注射）。１８匹の対照中、２匹のマウスが死んだ（１匹はi.p.そして１匹はs.c.注射）。これらの結果は、ＦＴＳが少なくとも最高0.21mg/kgの投与量ではＣ５７マウスに対して毒性ではないことを示している。
バルブ−Ｃマウス：５匹の７群のマウスを使用した。マウスは一回のi.p.ＦＴＳ投与（DMSO中）、または溶媒のみを受容した。この実験で使用した投与量は、0.5mg/kgから268mg/kgの範囲であった。以下の表IVに示すように、全てのマウスは最高の投与量でのみ死亡した。134mg/kgで、５匹のうちの２匹が死亡し、そして50mg/kg以下で全てのマウスが生存していた。すべてを総合すると、これらの結果はＦＴＳに関してＬＤ50（動物の50％が死亡する投与量）が、大変高く、すなわち100mg/kgより高い。
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細胞の成長に対するＦＴＳおよびＦＴＡの効果
細胞の成長に対するＦＴＳおよびＦＴＡの効果を、３種類の細胞について試験した：非形質転換rat1細胞；Ha-ras-形質転換rat1細胞およびヒト子宮内膜腫HEC1A細胞。
細胞を2×103／ウェルの密度でまき、そして１日後、溶媒または薬剤のいずれかを与えた。上記のように薬剤処置の３、７または１０日後、細胞を回収し、そして各ウェル中の細胞数を直接計数することにより評価した。図７から、ＦＴＡまたはＦＴＳのいずれも正常なrat1細胞の成長に対して有意な効果をもたないことが分かる。対照的に両化合物はras-形質転換rat1細胞の成長に対して有意な効果を有した。この効果は少なくとも３日の遅れが明らかであった。処置の７および１０日後に観察された、約40-60％の細胞成長の阻害はＦＴＡまたはＦＴＳのいずれかにより誘導された。この阻害は用量−依存的であり、そして最大の阻害が〜5μM(FTS)から50μM(FTA)の薬剤濃度で起こり、これはＦＴＳがＦＴＡよりも10倍低濃度で活性であることを示している。
さらに細胞がプレーティングの同日に薬剤を受容したことを除いて、１組の実験を図７と関連して上記に記載したものと同様に行った。これら実験結果は、ＦＴＳに関しては図６に類似する結果が得られたが、ＦＴＡに関しては異なっていた。後者の薬剤では、ras-形質転換rat1細胞−成長の阻害が培養中すでに３日後に観察された。これはＭＴＴ法（図６と関連して説明した）の使用により確認され；図に示されるように、対照およびＦＴＡ処理培養物で３日目に観察されたOD490 690は同様であったが、ＦＴＳ処理培養物ははるかに低かった。これはＦＴＳ処理培養物中の細胞数がより少ないことを示している。
ras-形質転換rat1細胞で行ったものと同様な実験を、HEC1A細胞についても行い、そして結果を図８に示す。この図で分かるように、ＦＴＡおよびＦＴＳの両方が、これらの細胞の成長を用量−依存的様式で阻害し、そしてこの効果は処置の３日後にすでに明らかであった。しかしＦＴＳはＦＴＡよりもはるかに能力があった。約50％阻害の最大効果は、50μM FTAと比較して10μM FTSで生じた。
ras-形質転換rat1およびHEC1A細胞の形質転換した表現型に対するＦＴＳおよびＦＴＡの効果
図９Ａで分かるように、rat1繊維芽細胞は単層状態で培養中に成長し、一方Ha-ras-形質転換rat1細胞は多層凝集状態で成長し、悪性の形質転換を示している（図９Ｄ）。形質転換した細胞を5μM FTS（図９Ｅ）または10μM FTS（図９Ｆ）で５日間インキューベーションし、形質転換した表現型を変えた。２つの化合物は非−形質転換細胞の形態に対しては効果が無かった（図９Ｂおよび９Ｃ）。
HEC1A細胞も多層凝集状態で成長した（図１０Ａ）。示すように、これらの細胞を10μM FTS（１０Ｂ）または50μM FTS（１０Ｃ）でインキューベーションすると、形質転換したヒト細胞で多層凝集形成に有意な変化が起こった。
ras-形質転換rat1の細胞成長および表現型に対する、5-アミノＦＴＳ、ＦＴＮおよびＮＦＣＢの効果
ＦＴＳおよびＦＴＡのように、調製した３つの他のファルネシル誘導体、すなわち5-アミノＦＴＳ、ＦＴＮおよびＮＦＣＢは、ＰＰＭＴａｓｅの阻害剤である（表II）。これらの細胞成長に対する効果を、図７および８（ras-形質転換rat1細胞）との関連で記載したものと同一の実験で研究した。これらの実験結果は、ＮＦＣＢおよびＦＴＮがＦＴＳおよびＦＴＡで得られた結果と同様の効果を有したが、5-アミノＦＴＳは活性ではなかった（最高200μMの薬剤濃度で）。様々なファルネシル誘導体の用量−依存性曲線から評価されたEC50値（細胞の成長を50％阻害する薬剤濃度）（薬剤処置の７日目）を、表Ｖに要約する。示された能力の順位はＦＴＳ＞ＮＦＣＢ≒ＦＴＡ＞ＦＴＮである。表Ｉ（ＰＰＭＴａｓｅに関するKi）に示すデータと一致して、Ki値とEC50値の間には良い相関がある（図１１）。
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ras-依存性成長-信号伝達経路に対するＦＴＳの選択性
有力なＰＰＭＴａｓｅ阻害剤ＦＴＳを、ras-依存性成長-信号伝達経路に対する薬剤の選択性を調べるために使用した。これらの実験で、Erb-B2（ｒａｓ経路中、ｒａｓの上流で作用する）で形質転換した細胞、およびV-rafまたはT-抗原（ｒａｓに無関係に作用する）により形質転換した細胞を研究した。細胞を2×103細胞／ウェルの密度でまき、そしてまいた日に溶媒（対象）または25μM ＦＴＳのいずれかを与えた。細胞を実験５日目に計数した。これらの実験結果を以下の表VIに要約する：
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見ると分かるように、25μM FTS（ras-形質転換細胞に対して最大の効果を引き起こす濃度）は、Erb-B2-形質転換細胞の成長を阻害するのに十分であった。しかし、この濃度でV-ras計質転換またはT-抗原-形質転換細胞の成長に対して、ＦＴＳは効果が無いことが観察された。表VIの結果は、Rat1細胞中のbＦＧＦおよびＥＧＦの有糸分裂促進効果がＦＴＳにより阻害されることも示している。
Ha-ras-形質転換細胞を移植したヌードマウスを対象とした腫瘍成長に対するＦＴＳの効果
Ha-ras-形質転換rat1細胞（2×106）を、ヌードマウスの右後方脚の皮下に移植した。マウスには細胞移植の開始日に、溶媒（ＰＢＳ中の0.6％エタノール）またはＦＴＳの全身性s.c.注射を行った。２組の実験を行った。１組のマウスは3.6mg/kg FTSを毎日受容した。腫瘍の大きさは実験の10日から始めて、3-4日毎に測定した。図１２は８匹の対照（溶媒処理）および８匹のＦＴＳ−処置マウスについて、この実験で記録された実際に測定した腫瘍の大きさを表す；このデータは腫瘍の十分な抑制を示唆している。注目すべきは、８匹のＦＴＳ処置マウスのうちの６匹が2cm2以下の腫瘍を発生し、そして２匹が4cm2より大きい腫瘍を発生したことである。８匹の対照のうち、６匹が4cm2以上の大きさの腫瘍を発生し、そして２匹が2cm2以下の腫瘍を発生した。別の組の実験では、マウスは1.6mg/kg FTSを１日おきに受容した。ＦＴＳの腫瘍成長に対する抑制効果はこれらの実験でも同様に観察された。これは３匹の対照および３匹のＦＴＳ処置マウスの写真で実証される（図１３）。
医薬組成物
効果的投与量：0.35-7mgの式IIの化合物／Kg体重
組成：中性またはＮａ+、Ｋ+またはＮＨ+塩状態のいずれかの式Ｉまたは式IIの化合物、あるいは上記ＩおよびIIの混合物を以下のキャリアーの１つと混合する：
（ａ）0.02％−0.05％のアルキル没食酸溶液中。
（ｂ）レシチンを含有する0.02％−0.05％のブチル化ヒドロキシアニソール溶液中。
（ｃ）レシチンおよび0.01％のクエン酸または0.01％のリン酸を含有する0.02％−0.05％のブチル化ヒドロキシシアニソール溶液中。
上記の組成は非経口的投与に適する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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