(57)【要約】本発明はボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的にかつ高収率で生産せしめるために特定アミノ酸を添加した糸状菌培地にボーベリオライド生産菌ＦＯ−６９７９株あるいはその変異株を培養し、培養物中にボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的に生産蓄積させ、該培養物よりボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を大量に高収率で採取することを可能にした選択製造法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボーベリオ生産菌ＦＯ−６９７９株あるいはその変異株を用い、ボーベリオライドＩ物質あるいはボーベリオライドＩＩＩ物質を選択的にかつ高収率で生産せしめるための培養培地に、特定アミノ酸を添加したことを特徴とするボーベリオライドＩ物質あるいはボーベリオライドＩＩＩ物質の選択培地。
【請求項２】
培地が糸状菌培地である請求の範囲第１項に記載の選択培地。
【請求項３】
ボーベリオライドＩ物質の選択生産の場合の培地に添加される特定アミノ酸が、Ｌ−ロイシンあるいはＬ−ロイシンに容易に変換される塩やエステル体などの誘導体である請求の範囲第１項に記載の選択培地。
【請求項４】
ボーベリオライドＩＩＩ物質の選択生産の場合の培地に添加される特定アミノ酸が、Ｌ−イソロイシンあるいはＬ−イソロイシンに容易に変換される塩やエステル体等の誘導体である請求の範囲第１項に記載の選択培地。
【請求項５】
請求の範囲第１項に記載の選択培地にボーベリオライド生産菌ＦＯ−６９７９株あるいはその変異株を培養し、培養物中にボーベリオライドＩ物質あるいはボーベリオライドＩＩＩ物質を選択的に生産蓄積させ、該培養物よりボーベリオライドＩ物質あるいはボーベリオライドＩＩＩ物質を高収率で採取することを特徴とするボーベリオライドＩ物質あるいはボーベリオライドＩＩＩ物質の選択製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はボーベリオライド生産菌（Ｂａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９株あるいはその変異株を用い、ボーベリオライドＩ物質あるいはボーベリオライドＩＩＩ物質（以下、ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質と呼称することもある）を選択的にかつ高収率で生産せしめるために既知の糸状菌培地に特定のアミノ酸を添加したボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質の選択培地およびそれらの選択製造法に関する。
背景技術
従来の技術
ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質［特願平１０−８３６５９号（特開平１１−２７９１９５号公報）］は、ボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９株より生産され、マクロファージ泡沫化を阻害する物質として、動脈硬化症の予防、治療薬として有用であることが既に報告されている（生田目ら、ジャーナル  オブ  アンド  バイオテックス、５２巻、１〜６頁、１９９９年）。
これらのボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質はその理化学的性状が互いに類似し、その分離精製には、培養液を有機溶媒を用いて抽出し、抽出液を減圧下で有機溶媒を留去後、得られた粗物質について、逆相系樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー、順相系樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーを行うことによって、高純度のボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を得ていた。
発明の開示
発明が解決しようとする課題
しかしながら、ボーベリオライドＩ物質およびＩＩＩ物質は理化学的性状が類似しているために、両成分を分離するために、多くの精製工程を必要とすることから一度に大量のボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を取得することは困難であると共に精製に多大な時間を要し、収率低下などを招くなどの種々の問題があった。そこで、ボーベリオライドＩ物質およびＩＩＩ物質を効率よく大量に製造し得る簡便な方法が強く求められていた。
本発明はボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を培地中で効率よく産生させるためのボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質の選択培地、および該選択培地からボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を大量に製造するための効率的な選択製造法を提供するものである。
課題を解決するための手段
ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を直接醗酵法により収率よく大量に蓄積せしめたという報告は未だ知られていないことから、本発明者らはボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質の生産のための優れた培養、精製法の検討を行った。その結果、菌株としてボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９株を用い、ボーベリオライド物質を生産せしめる既知の糸状菌培地に、Ｌ−ロイシンあるいはＬ−イソロイシンなどの特定アミノ酸を添加して培養することにより、ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的に生産せしめることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明に用いられる菌株はボーベリア  エスピー  ＦＯ−６９７９（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．ＦＯ−６９７９）として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年３月１８日に寄託され、受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１６７１６であった。その後、本菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて、平成１１年３月１６日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に国際寄託へ移管され、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−６６８１である。
本発明は上記の知見に基づいて完成されたものであって、ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質の両物質を選択的に生産させることにより、精製法を培養物からの抽出後、カラムクロマトグラフィーで行うことにより高い純度のボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質の大量精製が可能となった。即ち、本発明はボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９株あるいはその変異株を用い、特定のアミノ酸を添加した特定物質産生のための選択培地で培養し、培養物中にボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的に蓄積させ、該培養物よりボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を採取することを特徴とするボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質の選択製造法である。
本発明をより具体的に説明すれば、ボーベリオ生産菌ＦＯ−６９７９株あるいはその変異株を用い、ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的にかつ高収率で生産せしめるために糸状菌培地に特定のアミノ酸を添加したことを特徴とするボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質の選択培地に関する。ボーベリオライドＩ物質の選択生産の場合の選択培地は、既知の糸状菌培地に添加される特定アミノ酸が、Ｌ−ロイシンあるいはＬ−ロイシンに容易に変換される塩やエステル体などの誘導体が用いられる。ボーベリオライドＩＩＩ物質の選択生産の場合の選択培地は、既知の糸状菌培地に添加される特定アミノ酸が、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシンあるいはＬ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシンに容易に変換される塩やエステル体等の誘導体が用いられる。
本発明において用いられる特に好ましいアミノ酸としては、ボーベリオライドＩ物質の選択生産の場合は、Ｌ−ロイシンであり、ボーベリオライドＩＩＩ物質の選択生産の場合は、Ｌ−イソロイシンである。これらの特定アミノ酸を既知の糸状菌培地に添加した選択培地に、ボーベリオライド生産菌ＦＯ−６９７９株あるいはその変異株を培養し、培養物中にボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的に生産蓄積させ、該培養物よりボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を高収率で採取するボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質の選択製造法に関する。
本発明で使用されるボーベリオライド物質生産菌としては、前述のボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９菌株が好ましい例として挙げられるが、菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株を含め、ボーベリア属に属し、ボーベリオライド物質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株も含め、ボーベリア属に属し、ボーベリオライド物質を生産する菌株は、全て本発明において使用することができる。
本発明を実施するに当たっては、通常用いられる糸状菌培地に特定のアミノ酸を添加した選択培地からボーベリア属に属するボーベリオライド物質生産菌を培養することにより行われる。通常用いられる培地の栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉等の糖類、大豆油などの植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
消化し得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スチープ・リカー、麦芽エキス、カゼインなどが単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン類などが適宜添加される。
本発明において用いられる既知の糸状菌培地としては、例えばグルコース１．０％、トリペプトン０．５％、イーストエクストラクト０．３％、マルトエクストラクト０．３％、アガー０．１％の組成のものが用いられる。この糸状菌培地に添加する特定アミノ酸は、ボーベリオライドＩ物質の選択的生産の場合には、Ｌ−ロイシンあるいはＬ−ロイシンに容易に変換される塩やエステル体などの誘導体を植菌時からボーベリオライドＩ物質の生産がはじまる前に添加される。また、ボーベリオライドＩＩＩ物質の選択的生産の場合には、Ｌ−イソロイシンあるいはＬ−イソロイシンに容易に変換される塩やエステル体等の誘導体を上記のボーベリオライドＩ物質の場合と同様に添加される。添加量としては、ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質が最良に生産される範囲が選択されることは勿論であるが、例えば０．１％〜０．３％の範囲が好ましい。
培養するにあたり、発泡の激しいときには、必要に応じて液体パラフィン、動物油、食物油、シリコン油、界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、前記の栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい。少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他の機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込みなど既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したものを使用する。培養温度は、本ボーベリオライド物質生産菌が本ボーベリオライド物質を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は２５〜３５℃、好ましくは２７℃前後で培養するのがよい。培養ｐＨは、通常は５〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は、培養条件によっても異なるが、通常は７２〜１２０時間程度である。
このように、ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的に生産させた培養物より、ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を採取するには、脂溶性物質などを採取する公知の方法を用いることができる。例えば、培養液を除去した菌体をアセトン、メタノールなどの有機溶媒でボーベリオライド物質を抽出し、減圧濃縮することにより菌体中の水分と水に不溶な析出物が得られる。これをろ過することにより、水分を除去した後、析出物をヘキサンなどのようなボーベリオライド物質が溶解しない有機溶媒により洗浄した後、減圧濃縮して乾固することにより、ボーベリオライド物質を含む濃縮物が得られる。ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を採取するには、得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーの方法により分離採取することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
実施例１
５０ｍｌ容大試験管にグルコース２．０％、ポリペプトン０．５％、イーストエクストラクト０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、アガー０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％を水道水で溶解した培地（ｐＨ６．０に調整）１０ｍｌを仕込み、綿栓後、蒸気滅菌し、寒天培地上に生育させたボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６８１）の胞子懸濁液（１０７ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）を１０μｌ無菌的に植菌し、２７℃で３日間、振とう培養して種培養液を得た。
一方、５００ｍｌ容三角フラスコにグルコース１．０％、トリプトン０．５％、イーストエクストラクト０．３％、マルトエクストラクト０．３％、アガー０．１％を水道水で溶解した培地（ｐＨ６．０に調整）を１００ｍｌ仕込み、蒸気滅菌し、前記の種培養液１ｍｌを無菌的に移植し、２７℃で攪拌培養を開始した。２４時間後、これらの培養液に、ろ過滅菌したアミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｄ−ａｌｌｏ−イソロイシン、Ｌ−ａｌｌｏ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシンあるいはＬ−イソロイシン）水溶液を最終濃度０．１％で無菌的に添加した。これをさらに２７℃で６日間、攪拌培養した。
培養開始から２４時間毎に３ｍＬの培養液を無菌的に採取し、ＫＵＢＯＴＡ  ＫＮ−７０遠心器（ＫＵＢＯＴＡ社製、日本国）を用いて、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心して上清と菌体に分離し、菌体を３ｍＬのメタノールに溶解し、そのうち１μｌについてＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ｓｅｒｉｅｓ  １１００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｗｌｌｅｔ  Ｐａｋａｒｄ社製、米国）を用いて、高速液体クロマトグラフィー［カラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（２．１×１５０ｍｍ、５μｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社、米国）、流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：３０〜７０％ＣＨ３ＣＮ／０．０５％Ｈ３ＰＯ４、２０ｍｉｎ］を行った。
上記のようにして培養したボーベリオライドＩ物質およびＩＩＩ物質の生産量は下記の式に従って算出した。
ボーベリオライドの培養液中の溶液（μｇ／ｍｌ）＝［ボーベリオライド
標品の濃度（μｇ／ｍｌ）×培養液由来のボーベリオライドのピーク面積］
÷ボーベリオライド標品のピーク面積
により生産量を算出した。その算出結果は、下記の第１表にそれぞれ示すとおりであった。
2002077203.tif 000002
以上の結果から明らかなように、ボーベリオライドＩ物質およびボーベリオライドＩＩＩ物質の生産量は、アミノ酸を添加しない培地での培養は４日目に最大となり、特にボーベリオライドＩ物質では１３μｇ／ｍｌ、ボーベリオライドＩＩＩ物質では２３μｇ／ｍｌ［（モル比で３６：６４）、第１図参照］とそれぞれ算出された。
これに対し、本発明の特定アミノ酸を糸状菌培地に添加した場合には、ボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質の高い選択的生産が認められた。特に培地にＬ−ロイシンを添加した培養では、ボーベリオライドＩ物質を選択的に高生産させることが可能となり、４日目での生産量は７４μｇ／ｍｌ［（モル比で９３：７）、第２図参照］と算出された。また、Ｌ−イソロイシンを培地に添加した培養では、ボーベリオライドＩＩＩ物質を選択的に高生産させることが可能となり、４日目での生産量は８０μｇ／ｍｌ［（モル比で３：９７）、第３図参照］と算出された。
実施例２
５００ｍｌ容三角フラスコにグルコース２．０％、ポリプトン０．５％、イーストエクストラクト０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、アガー０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％を水道水で溶解した培地（ｐＨ６．０に調整）１００ｍｌを仕込み、綿栓後、蒸気滅菌し、寒天培地上に生育させたボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＯ−６９７９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６８１）の胞子懸濁液（１０７ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）を１００μｌ無菌的に植菌し、２７℃で３日間振とう培養して種培養液を得た。
一方、３０リットル容ジャー培養装置（三ツワ社製）にグルコース１．０％、トリプトン０．５％、イーストエクストラクト０．３％、マルトエクストラクト０．３％、アガー０．１％を水道水で溶解した培地（ｐＨ６．０に調整）を２０リットル仕込み、蒸気滅菌し、上記の種培養液２００ｍｌを無菌的に移植した。これを２７℃で攪拌培養を開始した。２４時間後、この培養液にろ過滅菌したＬ−ロイシン水溶液を最終濃度０．１％で無菌的に添加した。これをさらに２７℃で４日間攪拌培養して得られた培養液２０リットルを、国産式Ｓ型超遠心分離機Ｓ−６型（国産精工社製、日本国）を用いて、１００００回転で上清と菌体に分離し、菌体を１８リットルのアセトンで処理してろ過した後、ろ液を減圧濃縮して水溶液および析出物を得た。
この析出物を２００ｍｌヘキサンで洗浄し、不溶の粗物質３ｇを得た。これをシリカゲル（３００ｇ、シリカゲル６０、メルク社製、米国）のカラムにチャージし、クロロホルム−メタノール（１００：０、１００：１、１００：２、１００：３、０：１００）の溶液各１．８リットルで段階的に溶出させた。クロロホルム−メタノール＝１００：２画分を集め、減圧乾固して、ボーベリオライドＩ物質（純度９５％以上）を４３０ｍｇ得た。
実施例３
前記の実施例２と同様の方法に従って種培養液を得て、３０リットル容ジャー培養装置（三ツワ社製、日本国）にグルコース１．０％、トリプトン０．５％、イーストエクストラクト０．３％、マルトエクストラクト０．３％、アガー０．１％を水道水で溶解した培地（ｐＨ６．０に調整）を２０リットル仕込み、蒸気滅菌し、前記の種培養液２００ｍｌを無菌的に移植し、２７℃で攪拌培養を開始した。２４時間後、この培養液にろ過滅菌したＬ−イソロイシン水溶液を最終濃度０．１％で無菌的に添加した。
これをさらに２７℃で４日間攪拌培養して得られた培養液２００リットルを、国産式Ｓ型超遠心分離機Ｓ−６型（国産精工社製、日本国）を用いて１００００回転で上清と菌体に分離し、菌体を１８リットルのアセトンで処理し、ろ過した後、ろ液を減圧濃縮して水溶液および析出物を得た。この析出物を２００ｍｌヘキサンで洗浄し、不溶の粗物質３ｇを得た。これをシリカゲル（３００ｇ、シリカゲル６０、メルク社製、米国）のカラムにチャージし、クロロホルム：メタノール（１００：０、１００：１、１００：２、１００：３、０：１００）の溶液各１．８リットルで段階的に溶出させた。そしてクロロホルム：メタノール＝１００：２画分を集め、減圧乾固して、ボーベリオライドＩＩＩ物質（純度９５％以上）を４５０ｍｇ得た。
産業上の利用可能性
本発明のボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的にかつ高収率で生産せしめるために特定アミノ酸を添加した糸状菌培地にボーベリオライド生産菌ＦＯ−６９７９株あるいはその変異株を培養し、培養物中にボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的に生産蓄積させ、該培養物よりボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を抽出後、精製を行うことにより高い純度のボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を選択的に効率よくかつ大量に製造し得る。
【図面の簡単な説明】
第１図はアミノ酸添加なしの糸状菌培地にボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を生産させた場合の２１０ｎｍでの吸光度曲線である。
第２図は糸状菌培地に特定アミノ酸としてＬ−ロイシンを添加してボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を生産させた場合の２１０ｎｍでの吸光度曲線である。
第３図は糸状菌培地に特定アミノ酸としてＬ−イソロイシンを添加してボーベリオライドＩ物質あるいはＩＩＩ物質を生産させた場合の２１０ｎｍでの吸光度曲線である。
【図１】
2002077203.tif 000003
【図２】
2002077203.tif 000004
【図３】
2002077203.tif 000005
【国際調査報告】
2002077203.tif 000006
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2002077203.tif 000008