(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列からなる請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターで形質転換された細胞宿主。
【請求項６】
請求項５記載の細胞宿主を培地で培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの製造法。
【請求項７】
請求項１記載のポリペプチドを含んでなる、抗ヘリコバクターピロリ抗体測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なポリペプチドとそれをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養することによる該ポリペプチドの製造法、およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（ヘリコバクターピロリ、以前はCampylobacter pyloriとして知られていた）は１９８３年に慢性胃炎生検材料から検出される螺旋状の細菌として発見されたグラム陰性桿菌である〔Warren,J.R & Marshall,B. ランセット(Lancet),i:1273,1983〕。
その発見以後、本菌の慢性胃炎および十二指腸潰瘍における意義が注目を集め、その研究は生物学的にも医学的にも重要なテーマの一つとなった。特に疾病に至るまでの細胞傷害機序等の解明や新しい検査法の開発が注目されている。
ヘリコバクターピロリ（以下、ＨＰと略記する。）の検出法には培養法、ウレアーゼテスト、呼気テスト、組織学的検査、血清学的方法がある。特に血清学的方法は血清中の抗ＨＰ抗体を検出する方法であり、非侵襲的で大量の検体を処理できる点で優れている。
血清中の抗ＨＰ抗体は多様であるため、抗体測定に用いる抗原の調製方法や、種類により、その測定感度や、特異性が異なり、その結果、抗ＨＰ抗体を測定することの臨床的意義も多種多様である。
例えば、抗ＨＰ抗体検出用抗原としてＨＰ全菌体の溶解物を用いる検出法〔Rathbone,B.J.Lancet,ii:1217,1985〕では、他のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属との交差抗体により擬陽性判定が生じる場合や、抗原間の相互作用、抗原調製工程での変性により逆に擬陰性となる場合もある。
Rathboneらは菌体からの酸性グリシン抽出物などで抗原を部分精製すれば、特異性，感度ともにＨＰ全菌体の細胞溶解物より向上すると報告している〔Rathbone,B.J:Serological response to Helicobacter pylori.ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ガストリエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー(Eur.J.gastroenterol.Hepatol.),4(Supple.1):S21〜S23,1992〕。また更に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で高度に精製されたウレアーゼ等を検出用抗原とした方法では特異性は高くなるがＨＰ菌株間の遺伝的多様性の問題により感度は低下する傾向があると報告している。
【０００３】
またＨＰの多様な抗原成分に対応する抗体のうち血清診断上の有用性や胃，十二指腸疾患の病態との関連において重要なものが検索された。von WulffenらはＩｇＧ，ＩｇＡ型抗体が有用でとくに１１０ＫＤ，２２ＫＤ抗原に対する抗体がこれらの病態で特徴的に現れるとしている〔von Wulffen H,Heesemann J,Bulzow GW et al:ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（J．Clin．Microbiol．）24:716-720,1986〕。Goodwinらは酸性グリシン抽出物を抗原としてＥＬＩＳＡを行っており、主たる抗原分子は６４ＫＤ，６２ＫＤ，５７ＫＤで、加えて８４ＫＤ，３３ＫＤ，２８ＫＤ，２５ＫＤであるとしている。Hirschlらは１２８ＫＤの抗原が有用であるとしている〔Goodwin CS,Blincow E,Peterson G et al:ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ（J．Infect．Dis．）155:488-494,1987〕。Stacey,NewellらはＨＰＬＣにより各抗原成分を分画しており、ＨＰ由来のウレアーゼに対する抗体が血清診断上有用であるとしている〔Stacey AR,Hawtin PR,Newell DG:ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド・マイクロバイオロジカル・インフェクシャス・ディジーズ（Eur．J．Clin．Microbiol．Infect．Dis．）9:732-737,1990〕。Evans DJらは６００ＫＤ以上のhigh molecular weight cell-associated proteinを抗原としたＥＬＩＳＡを設定している〔Evans Jr DJ,Evans DG,Grahm DX et al:ガストロエンテロロジー（Gastroenterology）96:1004-1008,1989〕。
一方、杉山らはモノクローナル抗体により精製したＨＰ由来の抗原を用いて血液中の抗ＨＰ抗体の検出を試みている。その結果、ＣＰ２抗原と名付けた抗原（分子量約６０ＫＤ）がＨＰの検出特異性に優れ、かつその抗体価は胃炎病態と相関性が高いことを報告している〔Sugiyama, T. et al：ガストロエンテロロジー（Gastroenterology）101, 77-83, 1991、および杉山敏郎ほか日本消化器病学会誌、８５、１１２８、１９８８〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法でＨＰ抗原を実際に得るためには、これまでＨＰ菌体から直接単離することが必要であった。しかし、ＨＰ菌体を得るためには微好気条件下で１０％馬血清を含む高価な液体培地を用いる必要や、５日程度の長い培養を行う必要がある。さらに全菌体に対する目的の抗原の含有量が少なく分離精製が困難であり、産業として利用可能なほど大量の抗原精製物を得ることは困難であった。
特異抗原として特に有用と思われるＣＰ２抗原についてもその分離精製は困難かつ複雑であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、主にＨＰの特異的かつ定量的な検査を可能にする抗原（ＣＰ２抗原）として利用されるＨＰ由来のポリペプチドの産業上の利用性を高めるためには、その遺伝子を取得し、遺伝子工学的技術による大量製造を可能にする必要があると考えたもので、該ポリペプチドの一次構造を示すアミノ酸配列、それをコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを含むベクターおよび該ベクターを導入した形質転換体を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＨＰのＣＰ２抗原遺伝子のクローン化に成功し、その塩基配列からＣＰ２抗原たる本発明ポリペプチドの一次構造の決定に成功して本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で示されるアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチド、
（２）配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で示されるアミノ酸配列又はその一部をコードするＤＮＡ、
（３）配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ、
（４）（２）又は（３）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（５）（４）記載の組換えベクターで形質転換された細胞宿主、
（６）（５）記載の細胞宿主を培地で培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする（１）記載のポリペプチドの製造法、
（７）（１）記載のポリペプチドを含んでなる、抗ヘリコバクターピロリ抗体測定用試薬、
（８）（２）又は（３）記載のＤＮＡ又はこれらのＤＮＡに相補的なＤＮＡであり且つヘリコバクターピロリ遺伝子にハイブリダイズする性質を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを有するヘリコバクターピロリ遺伝子検出用試薬、
（９）（２）又は（３）記載のＤＮＡおよびそれらに相補的なＤＮＡからなる群から選ばれる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含有する、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）によるヘリコバクターピロリ遺伝子検出用試薬、
（１０）試薬が２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含有し、該オリゴヌクレオチドプライマーが次の性質：
（ｉ）一方のプライマーがヘリコバクターピロリ遺伝子鎖とハイブリダイズし、他方のプライマーが上記遺伝子鎖と相補的な遺伝子鎖とハイブリダイズするものであり、かつ
（ii）増幅反応の結果合成された連鎖反応生成物がその相補体から分離された場合に他のプライマーの連鎖反応生成物の合成のための鋳型として機能することができる、
を有するものである（９）記載の試薬、
に関する。
【０００６】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３の何れかで示されるアミノ酸配列又はその一部を有するものであれば特に限定されないが、より具体的には、該アミノ酸配列又はその一部を有するものであって且つ抗ヘリコバクターピロリ抗体との反応性を有するものが好ましく挙げられる。尚、抗ヘリコバクターピロリ抗体との反応性を有する限り、この配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で示されるアミノ酸配列又はその一部である、ポリペプチド又はオリゴペプチドを構成するアミノ酸のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、他のアミノ酸で置換、或いは他のアミノ酸が挿入されて得られるポリペプチド等、所謂修飾ポリペプチド又は修飾オリゴペプチドも、本発明のポリペプチドの範疇に含まれる。
【０００７】
本発明のＤＮＡは、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３の何れかで示されるアミノ酸配列又はその一部をコードし得るＤＮＡであれば何れのものでもよいが、より具体的には、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３の何れかで示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡが好ましく挙げられる。
即ち、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３の何れかで示されたアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチドおよびそれと同等の生物学的活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
本発明のＤＮＡは、いかなる方法で得られるものであってもよい。たとえばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成により得られるＤＮＡ、およびこれらを適当に組み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。
また本発明のＤＮＡを、相応するＲＮＡで代用することも可能な場合があることは言うまでもない。
本発明のＨＰ抗原のためのポリペプチドをコードするＤＮＡは、該ポリペプチドのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、ＨＰゲノムＤＮＡから単離する方法、化学合成する方法等により取得することができる。
例えばＨＰ由来のポリペプチドをコードするＤＮＡをＨＰゲノムＤＮＡから単離する方法としては、以下の方法が例示される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
（１）まずＨＰを微好気条件下において液体培地で培養し、遠心分離法によりＨＰ菌体を分離する。分離したＨＰ菌体を好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），プロテアーゼＫにより溶菌させた後、フェノール／クロロホルム抽出によりタンパク質を変性除去した後、エタノール沈澱法により精製ＨＰゲノムＤＮＡを調製する〔Slhavy,T.J.etal“Experiments with Gene Fusions"p.137-139(1984)〕。
得られたＤＮＡを適当な制限酵素による部分消化、または超音波処理等により細分化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージベクター，コスミドベクター，プラスミドベクター等に組み込むことによりゲノムＤＮＡライブラリーを構築する。
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に限定されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。ただし、後述の免疫学的スクリーニング法に供する場合は、宿主内でＨＰ抗原を発現させうるプロモーターを有したベクターである必要がある。
プラスミドにＤＮＡを組み込む方法としては、例えばManiatis,T.ら，モレキュラークローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル〔モレキュラー・クローニング（Moleculer Cloning）、A Laboratory Manual）,cold  Spring Harbor Laboratory,1,82 (1982)〕に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunh,T.V.らの方法〔Hyunh,T.V.,ＤＮＡクローニング・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning．a practical approach）1,49(1985)〕などが挙げられる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターを原核細胞や真核細胞の適当な宿主に導入する。
上記の方法によって構築されたＤＮＡライブラリーから該ＨＰ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離する方法としては、下記の方法が例示される。
例えば、該ＨＰ由来ポリペプチドの部分アミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成した後、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーション法〔Crunstein,M.and Hogness,D.S.:プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）72:3961(1975)〕またはプラークハイブリダイゼーション法〔モレキュラー・クローニング（Moleculer Cloning）,A Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory,1,82 (1982)〕により、目的のＤＮＡを含有するクローンを選択する。また該ＨＰ由来ポリペプチドに対する抗体（例えば、抗ＣＰ２抗体）により抗原抗体反応を利用して目的のＤＮＡを有するクローンを選択する方法、或いは該ポリペプチド遺伝子の特定領域をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を用いて増幅し、該ＨＰ由来ポリペプチド遺伝子を単離する方法などがある。単離した結果、該遺伝子の全領域が取得されていない場合は、単離したＤＮＡ断片もしくはその一部をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションによって再度ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、最終的には全遺伝子領域を取得することができる。
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法〔Maxam,A.M.and Gilbert,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:560(1977)〕あるいはヂデオキシヌクレオチド合成鎖停止法〔Messing,Jらヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Res）9,309(1981)〕によって決定し、ＨＰ由来ポリペプチド遺伝子の存在を確認することができる。かくして得られるクローンからＨＰ由来ポリペプチド遺伝子の全部または一部を制限酵素によって切り出すことにより取得できる。
【０００９】
（２）ＨＰ由来のポリペプチドの部分アミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成した後、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、上記（１）と同じく調製されたＨＰゲノムの例えばＢａｍＨＩ等の制限酵素消化産物とサザンブロットハイブリダイゼーションを行い、目的とする遺伝子付近の制限酵素地図を作製する。
調製したＨＰゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化しＤＮＡを断片化する。ＤＮＡ片をゲル電気泳動またはゲルろ過等の分子量分画法により分画し、作製した制限酵素地図を参考にして目的の遺伝子を含むＤＮＡ片が含まれる画分を分取する。分取したＤＮＡ片群をプラスミドベクターもしくはファージベクターに組み込むことにより、限定的なＨＰゲノムＤＮＡライブラリーを構築する。
ＨＰ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むクローンは、前述の32Ｐでラベルしたプローブによるコロニーハイブリダイゼーション法またはプラークハイブリダイゼーション法により選択する。また該ポリペプチドに対する抗体（例えば、抗ＣＰ２抗体）により抗原抗体反応を利用して目的のＤＮＡを有するクローンを選択する方法、或いは該ポリペプチド遺伝子の特定領域をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を用いて増幅し、該ポリペプチド遺伝子を単離する方法などがある。単離した該ポリペプチド遺伝子の全領域が取得されていない場合は、単離したＤＮＡ片もしくはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして、前述の様にＨＰゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションを行い、他の様々な制限酵素消化により得られるＤＮＡ断片群から目的の遺伝子の残りの部分を含むＨＰゲノムＤＮＡ断片を推測する。これを前述の方法で分画し分取したＤＮＡ片群で再度ＨＰゲノムＤＮＡライブラリーを構築し、単離したＤＮＡ片もしくはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして目的のＤＮＡを含有するクローンを選択することにより、最終的に全遺伝子領域を取得することができる。かくして得られるクローンからＨＰ由来ポリペプチド遺伝子の全部または一部を制限酵素によって切り出すことにより取得できる。
【００１０】
さらに本発明は、上述のＨＰ由来ポリペプチド又はオリゴペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターである。
当該組換えベクターは、上述のＨＰ由来ポリペプチド又はオリゴペプチドをコードするＤＮＡを含有し、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に限定されず、自体公知の組換えベクターの構築方法〔例えばモレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1, 82 (1982)等〕により構築されたもの等である。
本発明の組換えベクターを構築する際に使用されるベクターとしては、プラスミドベクター及びファージベクター等の原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に限定されず、天然のプラスミド，人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント），合成プラスミド等が用いられる。
また、本発明の組換えベクターは、簡便には当業界において入手可能なベクターに、該ポリペプチド又はオリゴペプチドをコードするＤＮＡを常法により組み込むことにより調製することもできる。かかるベクターとして具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等の大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド、例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４等の枯草菌由来プラスミド等が例示される。また、ファージとしてはλファージなどのバクテリオファージが、更にレトロウイルス、ワクシニアウィルス、核多角体ウィルスなどの動物や昆虫のウィルスが例示されるが、好ましくはプラスミドベクターまたはバクテリオファージベクターが挙げられる。
また、ＨＰ由来ポリペプチド又はオリゴペプチドをコードするＤＮＡを発現させ、これらタンパク質を生産させる目的を達成するためには、本発明の組換えベクターを構築する際に、当該ＤＮＡを発現ベクターに組み込むことが望ましい。
これら発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであって、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中でＨＰ検出用抗原タンパク質ＤＮＡを発現させる機能、換言すれば、目的の抗原タンパク質を生産させる機能を有するものであれば特に限定されない。
当業界において入手可能なかかる発現ベクターとしては、宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉの場合は、例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３，ｐＴｒｃＨｉｓ，ｐＭＡＬ−ｃ２，ｐＭＡＬ−ｐ２、もしくはその人工的修飾物（該ベクターを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）等が、宿主細胞が酵母の場合は、例えばプラスミドｐＲＳ４０３，ｐＲＳ４０４，ｐＲＳ４１３，ｐＲＳ４１４，ｐＹＥＳ２等が、また宿主細胞が動物細胞の場合は、例えばプラスミドｐＲＳＶｎｅｏ  ＡＴＣＣ  ３７２２４，ｐＳＶ２ｄｈｆｒ  ＡＴＣＣ  ３７１４５，ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ  ＡＴＣＣ  ３７２２４，ｐＳＶ２ｎｅｏ  ＡＴＣＣ  ３７１４９等が，宿主細胞が昆虫細胞の場合は、例えばオートグラフィカル カリホルニカ（Autographica californica）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）、ボンビックス モリ（Bombyx mori）核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）等が好ましく挙げられる。
宿主細胞として細菌、特にＥ．ｃｏｌｉを用いる場合、本発明の組換えベクターは、プロモーター−オペレーター領域，開始コドン，本発明ＨＰ由来ポリペプチド又はオリゴペプチドをコードするＤＮＡ，終止コドン，ターミネーター領域等を含んでなるものが一般的である。
また、宿主細胞として酵母または動物細胞を用いる場合、本発明の組換えベクターは、プロモーター，開始コドン，本発明ＨＰ由来ポリペプチド又はオリゴペプチドをコードするＤＮＡ，終止コドン等を含んでなるものが一般的である。尚、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ，エンハンサー配列，本発明由来ポリペプチド又はオリゴペプチドの５’側及び３’側の非翻訳領域を組換えベクターに組み込むことは任意である。
【００１１】
細菌中で本発明のＨＰ由来ポリペプチドを発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター，オペレーターおよびShine-Dalgarno(SD)配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば、宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｃ（ｔｒｐ−ｌａｃ）プロモーター，Ｔａｃプロモーター，Ｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプロモーター，１ｐｐプロモーターなどを含むものが例示される。酵母中で本発明ポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬＯ１プロモーター，ＳＰ０２プロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また宿種が動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター，レトロウイルスのプロモーター，核多角体ウイルスのプロモーターなどが挙げられる。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
また、発現には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して発現を誘導する方法やエンハンサーの利用も効果的な方法である。
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。
終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡなど）が例示される。
ターミネーター領域としては、天然または合成のターミネーターが挙げられる。  エンハンサー配列としては、ＳＶ４０のエンハンサー配列（７２ｂｐ）、ポリオーマ，アデノ，パピローマ等のＤＮＡ腫瘍ウイルス、レトロウイルスＬＴＲ（Long Terminal Repeat）、免疫グロブリンＨ鎖，Ｌ鎖遺伝子などが例示される。発現ベクターは、プロモーター，開始コドン，本発明のＨＰ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ，終始コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することにより調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカーなど）を用いることができる。
【００１２】
本発明の形質転換体（以下、形質移入体を包含する概念で用いる）は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
宿主細胞としては、例えば微生物〔細菌（例えば、エシェリキア属菌、バチルス属菌），酵母（例えば、サッカロマイセス属など），動物細胞および昆虫細胞など〕が挙げられる。具体的には、エシェリキア属ではエシェリキア・コリ（Escherichia coli）DH1,M103,JA221,HB101,C600,XL-1 Blue,JM109,TOP10などが例示される。バチルス属菌ではバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis ）MI114,207-21などが挙げられる。酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）AH22,AH22R-,NA87-11A,DKD-5Dなどが挙げられる。動物細胞としてはサル細胞COS-7,Vero,チャイニーズハムスター細胞CHO，マウスＬ細胞，ヒトＬ細胞などがあげられる。昆虫細胞としてはBmN4,Sf9などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
宿主細胞として、一般的にＤＮＡ配列クローニングおよびベクターの組立てのためには原核細胞が好ましい。組立てられたベクターは、次に適当な宿種細胞に形質転換され、この場合原核細胞および真核細胞を使用することができる。
発現ベクターの宿主細胞への導入〔形質転換（形質移入を含む）〕は従来公知の方法を用いて行うことができる。
細菌（例えば、E.coliやBacillus subutilis）の場合は、例えばCohenらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1972)69,2110〕、プロトプラスト法〔モレキュラー・ジーン・オブ・ジュネティクス（Mo1.Gene.Genet.）,(1979)168,111〕またはコンピテント法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）,(1971)56,209〕等によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1978)75,1927〕やリチウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）,(1983)153,163〕等によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法〔ウィロロジー（Virology）,(1973)52,456〕等によってそれぞれ形質転換することができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明のＨＰ由来ポリペプチドは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することにより製造することができる。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩類（例えば塩化カルシウム，リン酸ニ水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばアンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでもよい。
培養は当業界において知られている方法に従って行われる。培養条件、例えば温度，培地のｐＨおよび発酵時間は、該ポリペプチドの抗原としての最高力価が得られるように適宜選択される。
なお、下記に宿主に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれに限定されるものではない。
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。その際、ｐＨは５〜８であるほうが望ましい。
宿主がE.coliの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、ＹＴ培地、ＳＯＢ培地〔モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）, A Laboratory Manual, Cold Spring  Harbor Laboratory, 1, 82 (1982)〕、Ｍ９培地〔Miller.ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・モレキュラー・ジュネティクス（J.Exp.Mol.Genet.）,(1972)p.431,Cold Spring Harbor Laboratory,New York〕が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気，撹拌をしながら、通常１４〜４２℃、好ましくは２８から３９℃、約３〜２４時間行うことができる。
宿主がBacillus属菌の場合、必要により通気，撹拌をしながら、通常１４〜４２℃好ましくは２８〜３９℃、約３〜９６時間行うことができる。
宿主が酵母である場合、培地として、例えばバスチアン等によって開発された培地〔Bostian.K.L.et.al(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,4505〕が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常１４〜４２℃、好ましくは２０〜３５℃で約１２時間〜１０日間行われ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の牛胎児血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science）(1952)122,501〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,(1959)8,396〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（J.Am.Med.Assoc.）,(1967)199,519〕，１９９培地〔プロシージングス・オブ・ソサイエティ・オブ・エクスペリメンツ・オブ・バイオロジカル・メディスン（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.）,(1950)73,1〕等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であることが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で好ましくは３４〜３８℃約１２〜７２時間行われ、必要に応じて通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's培地〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,8404〕等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であることが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃好ましくは２５〜３０℃で約１２時間〜１０日間行われ、必要に応じて通気や撹拌を行うこともできる。
【００１４】
本発明のＨＰ由来ポリペプチドは、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得できる。
すなわち、本発明のＨＰ由来ポリペプチドが、培養物のうち培養液中に存在する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養液から天然または合成タンパク質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って該ポリペプチドを精製，単離する。
単離，精製法としては、例えば塩析，溶媒沈澱法等の溶解度を使用する方法、透析，限外濾過，ゲル濾過，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法等の分子量の差を利用す方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
一方、本発明のＨＰ由来ポリペプチドが培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を遠心分離法などの常法に従って菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチームおよび凍結融解などの方法により細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方法で該ポリペプチドを含有する粗精製画分を得る。そして、当該粗精製画分を、先に示した常法に従い、単離，精製することができる。
【００１５】
本発明のポリペプチドは、例えば自体公知の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等の免疫学的測定法に於ける抗原として用いることにより試料中の抗ＨＰ抗体の検出を行うことができる。
更に具体的には、例えば先ず適当な担体に固定化させた該ポリペプチドと試料とを反応させて該ポリペプチド−抗ＨＰ抗体複合体を形成させ、これに標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させた後に該標識を利用して抗ＨＰ抗体を測定する方法、或いは、該ポリペプチドを標識し、次いで試料と反応させ、常法によりＢ／Ｆ分離した後に該標識物を利用して抗ＨＰ抗体を測定する方法等が挙げられる。尚、免疫学的測定法に利用する該ポリペプチドは、抗ＨＰ抗体に対する抗原として使用可能なものであれば該ポリペプチドの一部分でも良いし、化学合成等によって得られる該ポリペプチドの一部分のペプチド鎖であってもよい。また、該ポリペプチド、該ポリペプチドの一部分及び該ペプチド鎖を含有する融合タンパク質等のポリペプチドであってもよい。
このように、これらペプチドは抗ＨＰ抗体測定用試薬として用いることができ、例えば上記の如きポリペプチド、該ポリペプチドの一部分、該ペプチド鎖又はこれらを含有するポリペプチド等を固定した例えばマイクロプレート、ビーズ等の担体、酵素標識抗ヒトイムノグロブリン抗体及び発色又は発光或いは蛍光を示す基質を含有する抗ＨＰ抗体測定用キットを用いて酵素免疫測定法を行えば、試料中のＨＰを特異的且つ高感度に検出することができる。
更に、これらペプチドは、抗ＨＰ抗体との反応性を有していること、即ち、抗ＨＰ抗体が認識する抗原決定基を有していることから、生体内に於いて、抗ＨＰ抗体を産生させる能力（ＨＰに対する特異的な免疫力を高める能力）を有するものである。従って、本発明のペプチドは、ＨＰの感染や感染した後の発症の予防を行う、所謂ＨＰに対するワクチンとしての利用も可能である。
また、本発明のＤＮＡ、及びこれに相補的なＤＮＡの塩基配列に基づいてＰＣＲ法のためのオリゴヌクレオチドプライマーを適宜作製すれば、例えば、胃液或いは胃や十二指腸等の病理組織などを試料としてＰＣＲ法により試料中のＨＰを特異的且つ高感度に検出することもできる。更に、同様に本発明のＤＮＡ、或いはそれらに相補的なＤＮＡの塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを適宜作製し、これを標識プローブとして利用しハイブリダイゼーション法を行えば、試料中のＨＰを特異的且つ高感度に検出することもできる。
このようにこれらＤＮＡはＨＰ検出試薬として用いることができ、例えば上記の如く適宜選択されたオリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びその基質であるｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含有するＨＰ遺伝子検出キットを用いてＰＣＲ法やリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ligase Chain Reaction）法等を行えば、試料中のＨＰを特異的且つ高感度に検出することができる。
現在知られているＰＣＲ法としてはＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ＰＣＲ single-strand conformation polymorphism）法、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription ＰＣＲ）法、ＬＡ−ＰＣＲ（long and accurate ＰＣＲ）法、inverse−ＰＣＲ法、ＳＳＰ−ＰＣＲ（single specific ＰＣＲ）法等があり、これらについては羊土社「バイオマニュアルＵＰシリーズ、ＰＣＲ法の最新技術」、林 健志 編等、１９９５年２月５日第１刷、１９９５年１０月２５日第２刷発行を参照されたい。またＬＣＲ法については東京化学同人、「現代用語百科、バイオテクノロジー編（第２版）」丸野内 棣 等、１９９４年６月１日発行を参照されたい。
上記オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法による試薬は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含有し、該オリゴヌクレオチドプライマーが次の性質：
（ｉ）一方のプライマーがヘリコバクターピロリ遺伝子鎖とハイブリダイズし、他方のプライマーが上記遺伝子鎖と相補的な遺伝子鎖とハイブリダイズするものであり、かつ
（ii）増幅反応の結果合成された連鎖反応生成物がその相補体から分離された場合に他のプライマーの連鎖反応生成物の合成のための鋳型として機能することができる、
を有するものであることが好ましい。
上記のような様々なＰＣＲを行う際のプライマーについては、下記の配列などが例として挙げられる。
特にこれらのようにＨＰ株間で共通の配列（ホモロジー）を示すものはＨＰ遺伝子の検出に有効である。
0003849080.tif 000002
或いは、例えば上記の如く適宜選択されたポリヌクレオチドプローブ又はオリゴヌクレオチドプローブを含有するＨＰ遺伝子検出キットを用いてハイブリダイゼーション法を行えば、試料中のＨＰを特異的且つ高感度に検出することもできる。上記ＨＰ遺伝子としては、ＤＮＡの他、ＲＮＡも含むものである。
以下の実施例において使用される、プラスミド，例えば制限酵素、Ｔ４リガーゼ等の酵素及びその他の物質は市販のものを用い、その使用方法については、常法に従った。また、ＤＮＡのクローニング，宿主細胞の形質転換，形質転換体の培養，得られる培養物からのＨＰ特異的検出用ポリペプチド抗原の採取，精製等における操作方法は、当業界でよく知られているもの、或いは文献等により知ることができる方法である。
以下に参考例、実施例を挙げるが、本発明はかかる記載により何ら限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】
〔実施例１〕ＣＰ２抗原をコードするＤＮＡの塩基配列、およびＣＰ２抗原のアミノ酸配列の決定
（１）ＣＰ２抗原のＮ末端アミノ酸配列の決定
ＨＰ（ATCC 43504;Rockville,MD）を１０％のウマ血液を含むＢｒｕｃｅｌｌａ（Difco Laboratories,Detroit,MD）アガープレートに接種し、３７℃で５日間微好気条件下で培養した。生育したＨＰコロニーを４５０ｍｌの１０％ウマ血清を含むＢｒｕｃｅｌｌａ培地に接種し微好気条件下，３７℃で５日間培養した。菌体を遠心分離（6000rpm）で回収し、ＰＢＳ（0.1M Sodium-phosphate,pH7.4, 0.15M NaCl）で洗浄した。菌体を超音波で破砕および可溶化し、プレップセル（バイオラッド社、タンパク分取用電気泳動装置）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥの約６０ＫＤ付近の画分〔抗ＣＰ２モノクローナル抗体（Sugiyama,T et al, Gastroenterology 101, 77-83, 1991）に反応する画分〕を分取した。これを３回繰り返した後、同ＣＰ２モノクローナル抗体を固定化したセファロース４Ｂカラムに導入した。カラムに吸着したタンパク質画分を０．２Ｍグリシン塩酸緩衝液で溶出し精製ＣＰ２抗原画分を得た。これを更にプレップセルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、電気泳動的に単一となったＣＰ２抗原をアミノ酸配列の分析に用いた。
上記精製ＣＰ２抗原を自動プロテインシーケンサー（ＡＢＩ社、４７７−Ａ型）に掛け、そのＮ末端アミノ酸配列を調べた結果、下記の２０個のアミノ酸配列が明らかになった。
Met Val Asn Lys Asp Val Lys Gln Thr Thr Ala Phe Gly Ala Pro Val Trp AspAsp Asn
この配列は、ＨＰのカタラーゼのＮ末端配列として報告されている配列、Met Val Asn Lys Asp Val Lys Gln Thr Thr Ala Phe Gly Ala Pro Valと完全に一致していた（Westblom, T.U. et al, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., vol11. No.6, 522-526, June 1992）。
【００１７】
（２）ＨＰゲノムＤＮＡの調製
約０．５ｇ（湿重量）のＨＰ菌体（ATCC43504）を氷冷した１０ｍｌのＰＢＳ（0.1M Sodium-phosphate,pH7.4, 0.15M NaCl）で遠心分離により２回洗浄した後、２．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した。これに１２０μｌの１０％ＳＤＳおよび０．５ｍｌのＳＴＥＰ（0.5% SDS,50mM Tris-HCl(pH7.5),0.4M EDTA 1mg/mlプロテアーゼＫ）を加え、５０℃で２時間反応させた。反応後ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を２ｍｌ加え、５ｍｌのフェノール／クロロホルムで２回抽出し、タンパク質を除去した。更に等量のエーテルで２回抽出した後、２．５倍量のエタノールを加え、遠心分離によりＤＮＡおよびＲＮＡ混合物を沈澱として回収した。沈澱を乾燥させた後、１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、２００μｇのＲＮａｓｅＡを加え３７℃で１時間保温した。等量のフェノール／クロロホルムで２回抽出した後、エーテルで抽出し、エタノール沈澱により約１ｍｇの精製ＤＮＡを得た。
（３）ＣＰ２抗原遺伝子のクローニング
ＣＰ２抗原Ｎ末端の配列情報から推定し合成したオリゴヌクレオチド（１７塩基）をγ32Ｐ−ＡＴＰで標識してプローブとし、ＨＰゲノムＤＮＡの各種制限酵素（PstI, HindIII, StuI, HaeIII, Sau3AI, SacI, XbaI, BamHI, ApaI, ClaI, XhoIなど）消化産物のサザンブロットハイブリダイゼーション分析を行った。この結果、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩでＨＰゲノムＤＮＡを消化することにより、プローブと反応する目的のＤＮＡは、約４００塩基の断片となることが明らかとなった。
２００μｇのＨＰゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで３７℃，１６時間消化し、消化産物のアガロースゲル電気泳動を行い、プローブと反応する約４００塩基のＤＮＡ片が泳動された位置のゲルを分離した。分離したゲルから電気泳動によりＤＮＡを溶出し、フェノール／クロロホルム抽出法で精製した。精製したＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、沈澱を７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させ約４００塩基のＤＮＡ片群を得た。これをpBLuescriptIISK+のＢａｍＨＩ部位に挿入したもので大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、アガープレート上に数千の形質転換体のコロニーを得た。
アガープレート上のコロニーをニトロセルロース膜に転写し、アルカリ変性溶液（1.5M NaCl,0.5M NaOH）に５分間浸し、溶菌およびＤＮＡの変性を行った。次にニトロセルロース膜を中和溶液（1M Tris-HCl pH8.0,1.5M NaCl）に５分間浸し、２×ＳＳＣ（0.3M NaCl,0.03M クエン酸ナトリウム）に５分間浸した後、８０℃で２時間加熱し膜上のＤＮＡを固定した。その膜をハイブリダイゼーション溶液〔6×SSC,0.1% SDS,20mM Tris-HCl(pH8.0),0.125% カゼインナトリウム,2.5mM EDTA,100μg/ml 変性サケ精子DNA〕に４２℃で１時間浸した後、γ32Ｐ−ＡＴＰで標識した前述のオリゴヌクレオチド（１７塩基）を加え、５０℃から３０℃まで１時間あたり−４℃の温度勾配で反応させた後、さらに３０℃で８時間反応させた。ニトロセルロース膜を溶液から取り出し２×ＳＳＣで１５分間，室温で２回洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィーで陽性と判定したコロニーを純化し、ＣＰ２抗原のＮ末端側の遺伝子を含む４４０塩基のＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＳＫＣ５を得た。
この結果と前述のサザンブロットハイブリダイゼーション分析の結果より得られた制限酵素地図から類推するとＣＰ２抗原のＣ末端側の遺伝子はＰｓｔＩとＳａｕ３ＡＩで断片化される約６００ｂｐのＤＮＡ片に含まれることが考えられた。そこで、残りの領域を取得するために下記のようにクローニング実験を進めた。
２００μｇのＨＰゲノムＤＮＡをＨａｅIIIで部分消化し、消化産物のアガロースゲル電気泳動を行い、プローブと反応する４．５Ｋｂｐ〜３ＫｂｐのＤＮＡ片の画分を分離した。さらにこの画分をＰｓｔＩで３７℃，３時間消化し、消化産物のアガロースゲル電気泳動を行い、プローブと反応する約１．８ＫｂｐのＤＮＡ片を分離した。分離したＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで３７℃，１時間消化し、消化産物をプラスミドベクター（pMAL-c2）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ切断面を持つものにクローニングした。この結果、ＣＰ２抗原Ｃ末端側の遺伝子を含むＤＮＡ片約６００ｂｐが挿入されたプラスミドｐＭＢＰ２６が得られた。
ｐＳＫＣ５とｐＭＢＰ２６に含まれるＣＰ２抗原遺伝子の塩基配列をDNA Taq Polymeraseを用いたジデオキシ法により決定した。この配列を参考にして作製した２種類の合成オリゴヌクレオチドAAGATGGTTAATAAAGATGTG（配列番号：１の18〜38番目の塩基）及びAAAATCAATGCTGTATTGAGC（配列番号：１の1800〜1820番目の塩基の逆鎖）をプライマーとしてＰＣＲ法（94℃、300秒：94℃、90秒，60℃、120秒，72℃、180秒を30サイクル：72℃、120秒）を行なうことにより、ＣＰ２抗原構造遺伝子を含む断片を増幅した。得られた増幅断片の両末端を平滑化し、リン酸基を付加した後、pTrcHis発現ベクター（Invitrogen社製）の平滑化されたEcoRI切断面を持つものにクローニングし、ＣＰ２抗原構造遺伝子を含むプラスミドｐＴｒｃＣＰ２を得た。
得られたプラスミドｐＴｒｃＣＰ２から、DNA Taq Polymeraseを用いたジデオキシ法により、挿入断片（CP2断片）の塩基配列を決定した。
その配列の解析の結果、ＣＰ２抗原構造遺伝子の配列１５１５ｂｐを含むＨＰゲノムＤＮＡ配列１８２９ｂｐ（配列番号：１）が明らかとなった。これにより５’末端から数えて２１塩基目から始まるＡＴＧを翻訳開始配列とする５０５アミノ酸残基からなるＣＰ２抗原のアミノ酸配列（配列番号：１）が明らかとなった。
この配列の結果をゲネティックス遺伝子解析ソフト（ＳＤＣソフトウエア開発社）のＥＭＢＬ、およびＧｅｎＢａｎｋのデータバンクでホモロジーサーチしたところ、ラットやヒトなどのカタラーゼと５０％以上の相同性を示した。
【００１８】
〔実施例２〕組換えＣＰ２抗原タンパク質の発現
得られた発現ベクターｐＴｒｃＣＰ２をE.coli（JM109）に形質転換したものをＬＢ培地で一晩培養した後、培養液の２０μｌを約３ｍｌのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００が０．６になるまで培養した。これを２本用意し、内１本にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加え、更に３時間培養した。培養が終了した２本のサンプル共に遠心分離（5000rpm,10min）後、２倍量のSDS-PAGE loading Buffer〔125mM Tris-HCl(pH6.8), 4%SDS, 0.2% BPB, 20% glycerol〕を加え、３分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、ＩＰＴＧによって誘導されて発現した組換えＣＰ２抗原蛋白を確認することができた。
【００１９】
〔実施例３〕組換えＣＰ２抗原タンパク質と抗ＣＰ２モノクローナル抗体（Sugiyama,T et al, Gastroenterology 101, 77-83, 1991）との反応
実施例２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、更にセミドライブロッター（ザルトリウス社）を用いて、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。次いで、該ニトロセルロース膜をブロッキング溶液（１％  BSA，20mM  Tris-HCl  pH7.5，150mM  NaCl）中で１時間振蕩した後、抗ＣＰ２モノクローナル抗体（マウス由来）を加え更に１時間振蕩した。ニトロセルロース膜を該溶液から取り出し、ＴＢＳＴ〔20mM  Tris-HCl  pH7.5，150mM  NaCl，0.05％  Tween20（V/V）〕で５分間３回洗浄後、ＴＢＳ（20mM  Tris-HCl  pH7.5，150mM  NaCl）で更に５分間５回洗浄した。次に該ニトロセルロース膜を、ブロッキング溶液で希釈したアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液に１時間浸した後、該溶液から取り出し、ＴＢＳＴで５分間３回洗浄し、更にＴＢＳで１０分間５回洗浄した。洗浄後、該ニトロセルロース膜を発色液（0.3mg/ml Nitro Blue Tetrazolium,0.15mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolil Phosphate,100mM Tris-HCl pH9.5,100mM NaCl,5mM MgCl2 ）中で発色させた。
この結果、組換えＣＰ２抗原タンパク質と抗ＣＰ２モノクローナル抗体が反応することが認められた。
【００２０】
〔実施例４〕異なる一次構造を持つＣＰ２抗原遺伝子の取得
（１）ＨＰ菌体（ATCC43504）からのＣＰ２抗原遺伝子の取得
実施例１（１）でＨＰ菌体（ATCC43504）から調製したＨＰゲノムＤＮＡに対して、実施例１で決定したＣＰ２抗原構造遺伝子を含むＨＰゲノム配列（配列番号：１）に基づいて合成した２種類のオリゴヌクレオチドAAGATGGTTAATAAAGATGTG（配列番号：１の18〜38番目の塩基）及びAAAATCAATGCTGTATTGAGC（配列番号：１の1800〜1820番目の塩基の逆鎖）をプライマーとしてＰＣＲ法（94℃、300秒：94℃、90秒，60℃、120秒，72℃、180秒を30サイクル：72℃、120秒）を行なうことにより、ＣＰ２抗原構造遺伝子を含む断片を増幅した。得られた増幅断片の両末端を平滑化し、リン酸基を付加した後、pBluescriptベクターのSmaI切断面を持つもの、及びpTrcHis発現ベクターの平滑化されたEcoRI切断面を持つものにクローニングし、ＣＰ２抗原構造遺伝子を含むプラスミドｐＢｌｕｅＰＣＲ１及びプラスミドｐＨｉｓＰＣＲ１を得た。
得られたプラスミドｐＢｌｕｅＰＣＲ１から、ディレーションキット（ニッポンジーン社製）を用いて様々な塩基長のディレーションミュータントを作製し、ALFred AutoRead Seqencing kit（ファルマシア社製）を用いたジデオキシ法により、挿入断片（CP2-PCR1断片）の塩基配列を決定した。
その配列の解析の結果、ＣＰ２抗原構造遺伝子の配列１５１５ｂｐを含むＨＰゲノム配列１８０３ｂｐ（配列番号：２）が明らかとなった。これにより、このCP2-PCR1断片中のＣＰ２抗原構造遺伝子は、実施例１で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子と、塩基配列が２個、また、それを翻訳した場合のアミノ酸配列が２個異なったものであることが明らかとなった。
CP2-PCR1断片中のＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列と、実施例１で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列とのホモロジーの比較結果を、図１に示す。
（２）ＨＰ臨床菌株からのＣＰ２抗原遺伝子の取得
慢性胃炎患者（24歳、男性）の胃から採取したＨＰ菌体から、実施例１（１）と同様の方法によりＨＰゲノムＤＮＡを調製した。
得られたＨＰゲノムＤＮＡに対して、上記（１）と同様の２種類の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＰＣＲ法（94℃、300秒：94℃、90秒，60℃、120秒，72℃、180秒を45サイクル：72℃、120秒）を行ない、ＣＰ２抗原構造遺伝子を含む断片を増幅した。得られた増幅断片の両末端を平滑化し、リン酸基を付加した後、pBluescriptベクターのSmaI切断面を持つものにクローニングし、ＣＰ２抗原構造遺伝子を含むプラスミドｐＢｌｕｅＰＣＲ２を得た。更に、得られたプラスミドｐＢｌｕｅＰＣＲ２から、BamHI及びXhoIによって挿入断片（CP2-PCR2断片）を切り出し、pTrcHis発現ベクターのBamHI／XhoI切断面を持つものにクローニングして、ＣＰ２抗原構造遺伝子を含むプラスミドｐＨｉｓＰＣＲ２を得た。
得られたプラスミドｐＢｌｕｅＰＣＲ２から、上記（１）と同様に、ディレーションキット（ニッポンジーン社製）を用いて様々な塩基長のディレーションミュータントを作製し、ALFred AutoRead Seqencing kit（ファルマシア社製）を用いたジデオキシ法により、挿入断片（CP2-PCR2断片）の塩基配列を決定した。
その配列の解析の結果、ＣＰ２抗原構造遺伝子の配列１５１５ｂｐを含むＨＰゲノム配列１８１０ｂｐ（配列番号：３）が明らかとなった。これにより、このCP2-PCR2断片中のＣＰ２抗原構造遺伝子は、実施例１で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子と、塩基配列が63個、また、それを翻訳した場合のアミノ酸配列が15個異なったものであることが明らかとなった。
CP2-PCR2断片中のＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列と、実施例１で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列とのホモロジーの比較結果を、図１に示す。
尚、図１中、Ｇはグリシンを、Ａはアラニンを、Ｖはバリンを、Ｌはロイシンを、Ｉはイソロイシンを、Ｓはセリンを、Ｔはトレオニンを、Ｄはアスパラギン酸を、Ｅはグルタミン酸を、Ｎはアスパラギンを、Ｑはグルタミンを、Ｋはリジンを、Ｒはアルギニンを、Ｃはシステインを、Ｍはメチオニンを、Ｆはフェニルアラニンを、Ｙはチロシンを、Ｗはトリプトファンを、Ｈはヒスチジンを、Ｐはプロリンを夫々示す。
また、図１中の、上段CP2は、実施例１で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列を、中段CP2-PCR1は、実施例４（１）で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子（CP2-PCR1）のアミノ酸配列を、また、下段CP2-PCR2は、実施例４（２）で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子（CP2-PCR2）のアミノ酸配列を夫々示す。
更に、図１中の＊印は、ＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列のうち、三者の間で違いが認められるアミノ酸であることを示す。
図１の結果から、ＨＰ由来のＣＰ２抗原構造遺伝子には、同一菌株内での小さな変異や菌株の違いによる大きな変異が生じていること、換言すれば、ＨＰ由来のＣＰ２抗原には幾つかの変異型が存在することが判る。
また、この結果は、Westblom,T.U.らによるカタラーゼ活性陰性を示すＨＰ変異株の報告（Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., Vol 11, No.6, 522-526, June 1992）とも一致する。
【００２１】
〔実施例５〕組換えＣＰ２抗原タンパク質の発現と抗ＣＰ２モノクローナル抗体との反応
実施例４で得られた２種類の組換えベクターｐＨｉｓＰＣＲ１及びｐＨｉｓＰＣＲ２をE.coli（TOP10）に夫々形質転換したものを、実施例２と同様の方法で培養した。培養終了後、実施例２と同様に遠心分離処理し、実施例２と同様の方法で夫々ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、組換えＣＰ２抗原タンパク質の発現の有無を確認した。更に、実施例３と同様のウェスタンブロッティング法で、組換えＣＰ２抗原タンパク質と抗ＣＰ２モノクローナル抗体との反応性を確認した。
CP2−PCR1組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２(ａ)に、また、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた、抗ＣＰ２モノクローナル抗体とのウェスタンブロッティング分析の結果を図２(ｂ)に夫々示す。
また、CP2−PCR2組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３(ａ)に、また、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた、抗ＣＰ２モノクローナル抗体とのウェスタンブロッティング分析の結果を図３(ｂ)に夫々示す。
尚、図中の各レーン番号は以下の試料を使用した結果を夫々示す。
0003849080.tif 000003
また、図２(ａ)及び図３(ａ)中の→印は、組換えＣＰ２抗原タンパク質の位置を示し、また、図２(ｂ)及び図３(ｂ)中の→印は、組換えＣＰ２抗原タンパク質と抗ＣＰ２モノクローナル抗体との反応シグナルの位置を示す。
図２(ａ)及び図３(ａ)の結果から明らかなように、組換えベクターｐＨｉｓＰＣＲ１及びｐＨｉｓＰＣＲ２を夫々含む形質転換体は、何れもＩＰＴＧにより約６０ＫＤの組換えＣＰ２抗原タンパク質（CP2-PCR1組換えタンパク質及びCP2-PCR2組換えタンパク質）を効率よく誘導発現するようになることが判る。
尚、該組換えタンパク質は、何れもヒスチジン残基の６量体を含む融合タンパク質として発現しているので、ＨＰ産生タンパク質中のＣＰ２抗原に比べて、若干その分子量が大きい。
また、図２(ｂ)及び図３(ｂ)の結果から明らかなように、CP2-PCR1組換えタンパク質及びCP2-PCR2組換えタンパク質は、何れもＨＰ由来のＣＰ２抗原に対する抗体、即ち、抗ＣＰ２モノクローナル抗体との反応性を有するものであることが判る。
更に、本発明の組換えＣＰ２抗原タンパク質（約６０ＫＤ）よりも分子量の小さいタンパク質が認められるが、これは、宿主細胞内での分解作用を受けて、該組換えＣＰ２抗原タンパク質が切断されたものと考えられる。これらの組換えタンパク質も、抗ＣＰ２モノクローナル抗体との反応性を有していることから、本発明に於ける配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で示される配列の一部分の配列も、ＨＰ特異的検出用抗原等として使用可能であることが示唆された。
【００２２】
〔実施例６〕組換えＣＰ２抗原タンパク質と患者血清との反応
実施例４で得られた２種類の組換えベクターｐＨｉｓＰＣＲ１及びｐＨｉｓＰＣＲ２をE.coli（TOP10）に夫々形質転換したものを、５０ｍｌのＳＯＢ培地（2% トリプトファン、0.5% イーストエキストラクト、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4）で、ＯＤ600が0.6になるまで夫々培養し、更にＩＰＴＧが最終濃度１ｍＭになるように加え、２〜５時間培養して、ＩＰＴＧによる誘導発現を行った。培養終了後、遠心分離（5000rpm,10min）処理により菌体を集め、１０ｍｌの溶菌緩衝液（6M Guanidium Hydrochloride、20mM Sodium phosphate、500mM Sodium chloride）に夫々懸濁した。得られた懸濁液を超音波処理して菌体を破砕した後、遠心分離（3000G、15min）処理して沈殿物を除き、得られた上清をProBondレジンカラム（Invitrogen社製：ニッケルカラム）に夫々アプライしてCP2-PCR1及びCP2-PCR2組換えＣＰ２抗原タンパク質をアフィニティー精製した（組換えＣＰ２抗原タンパク質は、ヒスチジン残基の６量体を有する融合タンパク質として発現しているためニッケルにアフィニティーを示す。）。得られた組換えＣＰ２抗原タンパク質を、実施例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後セミドライブロッター（ザルトリウス社）を用いて、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。次いで、該ニトロセルロース膜を３ｍｌのブロッキング溶液〔25% block Ace（大日本製薬製）,1% BSA含有するTBS buffer〕中で１時間室温に置いた後、十二指腸潰瘍患者（ＨＰ感染者）の血清を５μｌ加えて、更に１時間反応させた。反応後、該ニトロセルロース膜を取り出してTBST buffer洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体（カッペル社製）を加えたブロッキング溶液中で１時間反応させた。また対照として、患者血清の代わりに、健常者（ＨＰ非感染者）の血清を用いて同様にウェスタンブロッティング分析を行った。
CP2-PCR1組換えタンパク質とCP2-PCR2組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４(ａ)に、また、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた、十二指腸潰瘍患者血清とのウェスタンブロッティング分析の結果を図４(ｂ)に夫々示す。
また、CP2-PCR1組換えタンパク質とCP2-PCR2組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５(ａ)に、また、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた、正常（健常者）血清とのウェスタンブロッティング分析の結果を図５(ｂ)に夫々示す。
尚、図中の各レーン番号は以下の試料を使用した結果を夫々示す。
0003849080.tif 000004
また、図４(ａ)及び図５(ａ)中の→印は、組換えＣＰ２抗原タンパク質の位置を示し、また、図４(ｂ)中の→印は、組換えＣＰ２抗原タンパク質と血清中のＨＰに対する抗体との反応シグナルの位置を、図５(ｂ)中の→印は、組換えＣＰ２抗原タンパク質と血清中のＨＰに対する抗体との反応シグナルが生ずるであろう位置を夫々示す。
図４(ａ)及び図５(ａ)の結果から明らかなように、発現ベクターｐＨｉｓＰＣＲ１及びｐＨｉｓＰＣＲ２を夫々含む形質転換体培養物から、約６０ＫＤの精製組換えＣＰ２抗原タンパク質（精製CP2-PCR1組換えタンパク質及び精製CP2-PCR2組換えタンパク質）が得られることが判る。尚、該組換えタンパク質は、何れもヒスチジン残基の６量体を含む融合タンパク質として発現しているので、ＨＰ産生タンパク質中のＣＰ２抗原及びＨＰ菌体から精製したＣＰ２抗原に比べて、若干その分子量が大きい。
また、図４(ｂ)の結果から明らかなように、得られた精製組換えＣＰ２抗原タンパク質は、何れもＨＰ産生タンパク質中のＣＰ２抗原及びＨＰ菌体から精製したＣＰ２抗原と反応する抗ＣＰ２抗体と反応する性質、即ち、十二指腸潰瘍患者（ＨＰ感染者）血清中の抗ＣＰ２抗体と反応することが判る。また、図５(ｂ)の結果から明らかなように、得られた精製組換えＣＰ２抗原タンパク質は、正常（健常者）血清中の成分とは反応しないことも判る。
以上のことから、本発明の組換えＣＰ２抗原タンパク質を用いれば、患者（ＨＰ感染者）血清中に存在するＨＰに対する抗体を検出し得ること、即ち、ＨＰに感染しているか否かを血清から判定し得ることや、本発明の形質転換体を培養し、その培養物から該組換えＣＰ２抗原タンパク質を分離精製すれば、ＨＰを特異的に検出するための抗原として有用なポリペプチドを容易に且つ大量に得られることが判る。
【００２３】
〔実施例７〕サンドイッチＥＬＩＳＡ法による組換えＣＰ２抗原の評価
９６穴プレートに１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＰ２モノクローナル抗体１００μｌずつ分注し、４℃で終夜放置して抗体を固相化した。該プレートは、固相化処理後、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）で３回洗浄した。
次いで、該プレートのウェルに４００μｌのブロッキング液（ＰＢＳ、２５％ｂｌｏｃｋＡｃｅ）を分注して室温で６時間放置してブロック処理した後、ＰＢＳで洗浄を３回行なった。
ブロック処理を行ったプレートのウェルに、１０μｇ／ｍｌ濃度の組換えＣＰ２抗原（実施例６で得られたＣＰ２−ＰＣＲ１、ＣＰ２−ＰＣＲ２）溶液を１００μｌずつ分注して４℃で終夜放置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。
次に、ブロッキング液で１０００倍希釈した胃潰瘍や胃ガン、十二指腸潰瘍などの患者血清（１０検体）、あるいは正常（健常者）血清（５検体）をそれぞれ１００μｌずつ分注し、４℃で終夜放置した後、ＰＢＳで５回洗浄した。
発色液［ｏ−フェニレンジアミン１０ｍｇ、３０％過酸化水素水１０μｌ、リン酸クエン酸緩衝液（０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍリン酸水素ナトリウム、ｐＨ５．０）１０ｍｌ］を１００μｌずつ分注し、室温で５分間反応させた後、１Ｎ硫酸１００μｌで反応を停止させた。
各ウェルの吸光度を、Ｔｍａｘプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）にて計測した（ｍｅａｓｕｒｅ：４９０ｎｍ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：６２０ｎｍ）。
ＣＰ２−ＰＣＲ１組換えタンパク質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、正常（健常者）及び患者血清中の抗ＨＰ抗体に由来する呈色量を測定した結果を表１及び図６（ａ）に夫々示す。
また、ＣＰ２−ＰＣＲ２組換えタンパク質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、正常（健常者）及び患者血清中の抗ＨＰ抗体に由来する呈色量を測定した結果を表１及び図６（ｂ）に夫々示す。
【００２４】
【表１】
0003849080.tif 000005
【００２５】
表１及び図６（ａ）及び（ｂ）から明らかな如く、本発明の組換えＣＰ２抗原、ＣＰ２−ＰＣＲ１及びＣＰ２−ＰＣＲ２を用いて抗ＨＰ抗体を測定すると、何れも患者血清と正常（健常者）血清との間で明らかな有意差が生じることが判る。
従って、本発明の組換えＣＰ２抗原を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行った場合でも、血清中の抗ＨＰ抗体を感度良く検出できることが判る。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドは、抗ＨＰ抗体を特異的に検出するための抗原として或いはＨＰに対するワクチンとして利用することができる。
また、本発明のＤＮＡを利用すれば、遺伝子工学的手法によりＨＰ特異的検出用抗原として利用できるポリペプチドを容易に且つ大量に製造することができ、更に本発明のＤＮＡを利用してオリゴヌクレオチドプライマー或いはプローブを作製すれば、ＰＣＲ法或いはハイブリダイゼーション法等によりＨＰを検出することも可能である。
本発明の方法によれば、従来取得が困難であったＨＰの特異的検出を可能にするポリペプチド抗原を、容易にかつ大量に取得することができる。
【００２７】
【配列表】
0003849080.tif 000006
0003849080.tif 000007
0003849080.tif 000008
0003849080.tif 000009
【００２８】
【配列番号：２】
0003849080.tif 000010
0003849080.tif 000011
0003849080.tif 000012
0003849080.tif 000013
【００２９】
【配列番号：３】
0003849080.tif 000014
0003849080.tif 000015
0003849080.tif 000016
0003849080.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：１）、実施例４（１）で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：２）及び実施例４（２）で得られたＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：３）を比較したものである。図中、＊印は、ＣＰ２抗原構造遺伝子のアミノ酸配列のうち、三者の間で違いが認められるアミノ酸であることを示す。
【図２】（ａ）は実施例５で得られた、CP2-PCR1組換えタンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示したものである。
（ｂ）は実施例５で得られた、CP2-PCR1組換えタンパク質と抗ＣＰ２モノクローナル抗体とのウェスタンブロッティング分析の結果を示したものである。
【図３】（ａ）は実施例５で得られた、CP2-PCR2組換えタンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示したものである。
（ｂ）は実施例５で得られた、CP2-PCR2組換えタンパク質と抗ＣＰ２モノクローナル抗体とのウェスタンブロッティング分析の結果を示したものである。
【図４】（ａ）は実施例６で得られた、CP2-PCR1組換えタンパク質とCP2-PCR2組換えタンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示したものである。
（ｂ）は実施例６で得られた、CP2-PCR1組換えタンパク質又はCP2-PCR2組換えタンパク質と、十二指腸潰瘍患者血清とのウェスタンブロッティング分析の結果を示したものである。
【図５】（ａ）は実施例６で得られた、CP2-PCR1組換えタンパク質とCP2-PCR2組換えタンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示したものである。
（ｂ）は実施例６で得られた、CP2-PCR1組換えタンパク質又はCP2-PCR2組換えタンパク質と、正常（健常者）血清とのウェスタンブロッティング分析の結果を示したものである。
【図６】（ａ）は、実施例７で得られた、CP2-PCR1組換えタンパク質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、正常（健常者）血清及び患者血清中の抗ヘリコバクター・ピロリ（ＨＰ）抗体に由来する呈色量を測定した結果を示したものである。
（ｂ）は、実施例７で得られた、CP2-PCR2組換えタンパク質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、正常（健常者）血清及び患者血清中の抗ＨＰ抗体に由来する呈色量を測定した結果を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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