(57)【要約】抗老化剤のスクリーニング系を構築するのに有用な新規の形質転換細胞、それを用いたスクリーニング方法および抗老化剤を提供し、正常な細胞に、（ａ）ｐ３８タンパク質をリン酸化することのできるタンパク質、もしくは、（ｂ）ｐ３８タンパク質、ｐ３８タンパク質の変異体、ｐ３８タンパク質のキナーゼドメイン、ｐ３８タンパク質変異体のキナーゼドメイン、またはそれらを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞、この形質転換細胞を利用するスクリーニング方法およびスクリーニング方法により得られる化合物を有効成分とする抗老化剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常な細胞に、
（ａ）ｐ３８タンパク質をリン酸化することのできるタンパク質、もしくは、
（ｂ）ｐ３８タンパク質、ｐ３８タンパク質の変異体、ｐ３８タンパク質のキナーゼドメイン、ｐ３８タンパク質変異体のキナーゼドメイン、またはそれらを含む融合タンパク質をコードする遺伝子
を導入した形質転換細胞。
【請求項２】
正常な老化細胞または細胞老化を誘導する遺伝子を導入した正常な細胞と
（１）被検物質を接触させる工程
（２）細胞における老化指標を分析する工程
を含む化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
細胞における老化指標を分析する工程が、被験物質を接触させない細胞を比較対照として細胞の老化指標を分析する工程である請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
老化指標が、Ｓ期細胞の割合変化、細胞の形態変化、細胞老化特異的な酵素活性の変化、増殖能の変化である請求項２または３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞老化を誘導する遺伝子を導入した正常な細胞が、請求項１記載の形質転換細胞または正常な細胞に、
（ｃ）ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質、ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質の変異体、ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質のキナーゼドメイン若しくはそれらを含む融合タンパク質、あるいは、
（ｄ）ｐ３８ＭＡＰＫ経路を活性化するタンパク質またはその融合タンパク質をコードする遺伝子
を導入した形質転換細胞である請求項２〜４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項２〜５の何れかのスクリーニング方法により得られる化合物を含有する抗老化剤。
【請求項７】
請求項２〜５の何れかのスクリーニング方法により得られる化合物がｐ３８タンパク質またはｐ３８ＭＡＰＫ経路においてｐ３８タンパク質の下流に位置する分子の阻害作用を有する化合物である請求項６記載の抗老化剤。
【請求項８】
阻害剤がｐ３８タンパク質の阻害剤である請求項７記載の抗老化剤。
【請求項９】
請求項２〜５の何れかのスクリーニング方法により得られる化合物がｐ３８タンパク質またはｐ３８ＭＡＰＫ経路においてｐ３８タンパク質の下流に位置する分子の阻害剤を有効成分とする抗老化医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規の形質転換細胞、抗老化剤のスクリーニング方法および抗老化剤に関する。
背景技術
細胞老化は、本来、細胞増殖を行うべき細胞が、増殖刺激に反応して細胞分裂を行えない状態を示す。老化細胞は、大きく扁平な核をもち、細胞老化特異的βガラクトシダーゼ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ＳＡ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）活性をもつことを特徴とする。細胞老化した細胞（老化細胞）は、形態学的な変化の他にも、遺伝子発現パターンなどに特徴的な変化を示す。
細胞老化が引き起こされる原因は様々である。例えば、ヒト正常線維芽細胞は、細胞老化の研究に最も汎用される細胞であるが、これに電離放射線を作用させたり、これを高酸素分圧下で培養すると、細胞老化が引き起こされることが知られている。また、近年では、ヒト正常線維芽細胞に活性化癌遺伝子ＲＡＳを強制発現すると、細胞老化が１週間程度で急速に誘導されることが報告されている。
しかしながら、最も良く研究されている細胞老化は、正常な細胞が有限回の分裂の後に老化細胞に至る分裂寿命（テロメア依存的）による細胞老化である。
これらの異なる原因により生じる細胞老化は、最終的には同じ表現型を示すため、同一の分子機序により生じるものと考えられているが、その詳細については明らかでない。
分裂寿命に基づく細胞老化は、正常な細胞であれば、細胞の種類によって異なる細胞分裂回数の後に老化細胞となる現象である。最もよく用いられるヒト正常線維芽細胞であれば、胎児由来の細胞の場合、約６０〜８０回の細胞分裂の後に、老化表現型を示す。この現象は、１９６２年にヘイフリック（Ｈａｙｆｌｉｃｋ）によって報告されたが、長らく、細胞内でどのような機構によって分裂回数が記録されているのかは不明であった。近年、染色体末端テロメアのＤＮＡ複製がいわゆる「末端複製問題」のために完全ではなく、細胞分裂のたびにテロメア長は約５０〜２００塩基対程度短小化すること、そして、この短小化がある閾値に達すると、細胞老化が引き起こされることが示された。しかしながら、テロメア長の短小化によりどのようにして細胞老化が起こるのか、また、その分子機構が他の原因で生じる細胞老化と同一なのかどうか明らかでない。
一方、ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）経路は、細胞質内にあって細胞内外の刺激によって活性化され、下流にある不活型のタンパク質キナーゼをリン酸化して活性化するタンパク質キナーゼのカスケードである。最終標的キナーゼのＭＡＰＫは、特定の転写因子をリン酸化して活性化し、その転写因子によって一群の遺伝子の発現が誘導されることで、細胞は刺激に対して反応する。
最終標的キナーゼＭＡＰＫをリン酸化する上流のキナーゼは、ＭＡＰＫＫ（ＭＡＰ２Ｋ）と呼ばれ、前記ＭＡＰＫＫをリン酸化する上流のキナーゼは、ＭＡＰＫＫＫ（ＭＡＰ３Ｋ）と呼ばれる。複数のＭＡＰＫ経路が存在し、それぞれに、ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫＫＫが知られている。
最も早く発見され、解析されている古典的ＭＡＰＫ経路は、Ｒａｆ−Ｍｅｋ−Ｅｒｋからなり、主に増殖因子などの細胞外刺激に反応して、Ｒａｓを介した後、活性化される。Ｍｅｋの特異的阻害剤としては、ＰＤ９８０５９が知られている。
一方、ストレスやアポトーシスを誘導する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインによって誘導されるＭＡＰＫとして、ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ）およびｐ３８タンパク質が知られている。また、ＪＮＫおよびｐ３８タンパク質のＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫＫＫは、単一ではなく、それぞれ複数が知られている。
ｐ３８タンパク質の機能を特異的に阻害する化合物として、ＳＢ２０３５８０が知られており、この化合物は、炎症性のサイトカインであるインターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−８またはＴＮＦの産生を抑制し、炎症性疾患の治療剤として有用であることが知られている（ＷＯ９７／３３８８３）。
発明の開示
本発明者は、細胞老化が引き起こされる原因を鋭意探求したところ、複数の原因による細胞老化誘導において、ｐ３８ＭＡＰＫ経路が直接的な役割を果たすことを見出した。ｐ３８ＭＡＰＫ経路は、先述のように、ストレスまたはアポトーシスを誘導するＭＡＰＫ経路として知られていたものの、細胞老化との関係はこれまで全く知られていなかった。
さらに、本発明者は、この知見を元に、ｐ３８タンパク質をリン酸化することにより活性化することのできるタンパク質をコードする遺伝子を、若い細胞に導入することによって、前記若年細胞に細胞老化を急速に誘導することができることも見出した。
このようにして得られる新規老化細胞は、数十回以上の自然分裂を経て得られる天然の老化細胞に比べて、遥かに短時間で調製することが可能であり、抗老化剤のスクリーニング系を構築する上で、非常に有用である。
さらに、本発明者は、ｐ３８タンパク質に対する公知の阻害剤が、前記の新規老化細胞および天然の老化細胞に対して抗老化作用を示すことも新たに見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
本発明の目的は、抗老化剤のスクリーニング系を構築するのに有用な新規の形質転換細胞、それを用いることのできるスクリーニング方法および抗老化剤を提供することにある。
さらに詳しくは、本発明の目的は、正常な細胞に、
（ａ）ｐ３８タンパク質をリン酸化することのできるタンパク質、あるいは、
（ｂ）ｐ３８タンパク質、ｐ３８タンパク質の変異体、ｐ３８タンパク質のキナーゼドメイン、ｐ３８タンパク質変異体のキナーゼドメイン、またはそれらを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、正常な老化細胞または細胞老化を誘導する遺伝子を導入した正常な細胞と
（１）被検物質を接触させる工程
（２）細胞における老化指標を分析する工程
を含む化合物のスクリーニング方法を提供することにある。
さらに、本発明の別の目的は、上記のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する抗老化剤およびｐ３８タンパク質の阻害剤を有効成分として含有する、抗老化剤を提供することにある。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の形質転換細胞は、正常な細胞に、
（ａ）ｐ３８タンパク質をリン酸化することのできるタンパク質、あるいは、
（ｂ）ｐ３８タンパク質、ｐ３８タンパク質の変異体、ｐ３８タンパク質のキナーゼドメインまたはｐ３８タンパク質変異体のキナーゼドメインまたはｐ３８タンパク質、ｐ３８タンパク質の変異体、ｐ３８タンパク質のキナーゼドメイン、もしくは、ｐ３８タンパク質変異体のキナーゼドメインを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を導入し、形質転換させることにより、取得することができる。
本明細書において「ｐ３８タンパク質」とは、細胞内シグナル伝達を担う、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーに属するセリン／スレオニンキナーゼの１つであって、分子量約３８０００の触媒サブユニットからなる単量体の酵素を意味する。本発明の形質転換細胞を調製するために用いることのできる宿主細胞は、ｐ３８を発現する細胞であり、本発明で用いることのできる特定の遺伝子を導入することにより（必要に応じて、適当なリガンドを更に作用させることにより）細胞老化が誘導される前記細胞である限り、例えば、動物の種類、由来する組織、あるいは、細胞の分裂回数（すなわち、若い細胞であるか、老化細胞であるか）についても、特に限定されるものではない。
宿主細胞は、例えば、哺乳動物由来の細胞が好ましく、哺乳動物由来の正常な細胞がより好ましい。哺乳動物由来の正常な細胞としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラットまたはハムスター由来の正常な細胞（例えば、正常線維芽細胞、正常ケラチノサイト、正常乳腺上皮細胞または正常血管内皮細胞など）を挙げることができる。さらに前記宿主細胞としては、ヒト由来の正常な細胞を用いることが好ましく、ヒト正常線維芽細胞を用いることがより好ましい。ヒト正常線維芽細胞としては、例えば、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−７５）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１７１）、ＭＢＣ−５またはＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１８６）を挙げることができる。
また、「正常な細胞」とは、癌化していない状態の細胞、すなわち、有限寿命を有する細胞を意味する。
ある細胞が若い細胞であるか、老化細胞であるかは、例えば、単位「ＰＤ」により表わすことができる。
本明細書において「ＰＤ」とは、ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇｓの略であり、細胞がこれまでに行なった細胞分裂回数を示す単位として使用する。なお、各細胞の分裂回数は、通常、ばらつきを有するので、ＰＤは、細胞集団の個々の細胞における平均値である。例えば、ヒト線維芽細胞の場合、一般に、若い細胞とは、０〜５０ＰＤの細胞（好ましくは、３０〜４５ＰＤの細胞）を意味し、老化細胞とは、６０〜８０ＰＤの細胞（好ましくは、６０〜６５ＰＤの細胞）を意味する。
宿主細胞としては、若い細胞または老化細胞のどちらも使用することが可能であるが、細胞分裂可能な若い細胞（すなわち、分裂寿命を迎えておらず、細胞分裂を活発に行なう能力を保持している細胞）を用いることが好ましい。以下に示す遺伝子導入により急速に得られる老化表現型が、遺伝子導入前の表現型と大きく異なり、判別が容易であるからである。
本発明の形質転換細胞を調製するのに用いることのできる導入遺伝子は、
（ａ）ｐ３８タンパク質をリン酸化することのできるタンパク質（以下、「ｐ３８タンパク質キナーゼ」と称する）、あるいは、
（ｂ）ｐ３８タンパク質、ｐ３８タンパク質の変異体、ｐ３８タンパク質のキナーゼドメイン、ｐ３８タンパク質変異体のキナーゼドメイン、またはそれらを含む融合タンパク質（以下、「ｐ３８タンパク質またはその誘導体」と称する）をコードすることのできる遺伝子である限り、特に限定されるものではない。
ｐ３８タンパク質キナーゼ（ａ）としては、ｐ３８タンパク質をリン酸化することができる限り、特に限定されるものではないが、例えば、
（ａ１）ｐ３８ＭＡＰＫ経路においてｐ３８タンパク質を直接リン酸化するＭＡＰＫとして公知である、ＭＫＫ６タンパク質またはＭＫＫ３タンパク質；
（ａ２）ＭＫＫ６タンパク質またはＭＫＫ３タンパク質（ａ１）の天然または人工の変異体であって、ｐ３８タンパク質をリン酸化する活性が維持または増強されたＭＫＫ６タンパク質変異体またはＭＫＫ３タンパク質変異体；
（ａ３）ＭＫＫ６タンパク質若しくはＭＫＫ３タンパク質（ａ１）の各キナーゼドメインまたはＭＫＫ６タンパク質変異体若しくはＭＫＫ３タンパク質変異体（ａ２）の各キナーゼドメイン；
（ａ４）ＭＫＫ６タンパク質若しくはＭＫＫ３タンパク質（ａ１）と、受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質またはＭＫＫ６タンパク質変異体若しくはＭＫＫ３タンパク質変異体（ａ２）と、受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質；あるいは、
（ａ５）ＭＫＫ６タンパク質若しくはＭＫＫ３タンパク質の各キナーゼドメインと、受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質またはＭＫＫ６タンパク質変異体若しくはＭＫＫ３タンパク質変異体の各キナーゼドメインと、受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質
を挙げることができる。
なお、本明細書において「ｐ３８タンパク質をリン酸化する」とは、ｐ３８タンパク質それ自体を直接リン酸化することを意味する。
前記のＭＫＫ６タンパク質またはＭＫＫ３タンパク質（ａ１）としては、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラットまたはハムスター）由来のＭＫＫ６タンパク質またはＭＫＫ３タンパク質を挙げることができ、ヒトまたはマウスＭＫＫ６タンパク質またはＭＫＫ３タンパク質を用いることが好ましく、ヒトまたはマウスＭＫＫ６タンパク質を用いることがより好ましく、ヒトＭＫＫ６タンパク質を用いることが特に好ましい。例えば、ヒトＭＫＫ６タンパク質では、５３番目〜３１４番目のアミノ酸残基からなる領域が、キナーゼドメインであり、ヒトＭＫＫ３タンパク質では、３５番目〜２６９番目のアミノ酸残基からなる領域が、キナーゼドメインである。
前記のＭＫＫ６タンパク質変異体またはＭＫＫ３タンパク質変異体（ａ２）としては、例えば、ＭＫＫ６タンパク質またはＭＫＫ３タンパク質の天然のアレル変異体、あるいは、公知の遺伝子工学的手法［例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：５６６２−５６６６，１９８４）］により人工的に変異を導入した変異体などを挙げることができる。より具体的には、ヒトＭＫＫ６タンパク質における２０７番目のセリン（Ｓｅｒ２０７）および２１１番目のスレオニン（Ｔｈｒ２１１）が、それぞれグルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）に置換されている構成的活性型変異体（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：１２４７−１２５５，１９９６）を挙げることができる。
ＭＫＫ６タンパク質若しくはＭＫＫ３タンパク質またはそれらの変異体の各キナーゼドメイン（ａ３）としては、例えば、ヒトＭＫＫ６タンパク質における５３番目〜３１４番目のアミノ酸残基からなる配列を含むヒトＭＫＫ６タンパク質断片（好ましくは、ヒトＭＫＫ６タンパク質における５３番目〜３１４番目のアミノ酸残基からなる配列からなるヒトＭＫＫ６タンパク質断片）、あるいは、ヒトＭＫＫ３タンパク質における３５番目〜２６９番目のアミノ酸残基からなる配列を含むヒトＭＫＫ３タンパク質断片（好ましくは、ヒトＭＫＫ３タンパク質における３５番目〜２６９番目のアミノ酸残基からなる配列からなるヒトＭＫＫ３タンパク質断片）を挙げることができる。
ＭＫＫ６タンパク質もしくはＭＫＫ３タンパク質またはそれらの変異体と受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質（ａ４）、あるいは、ＭＫＫ６タンパク質もしくはＭＫＫ３タンパク質またはそれらの変異体の各キナーゼドメインと受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質（ａ４）における、前記受容体は、前記融合タンパク質を宿主細胞中で発現させた場合に、受容体の活性化（すなわち、リガンドの受容体リガンド結合ドメインへの結合）により、融合タンパク質のもう１つの構成成分（例えば、ＭＫＫ６タンパク質若しくはＭＫＫ３タンパク質またはそれらの変異体、あるいは、ＭＫＫ６タンパク質若しくはＭＫＫ３タンパク質またはそれらの変異体の各キナーゼドメイン）を活性化することができる受容体である限り、特に限定されるものではない。このような受容体としては、例えば、ステロイド受容体（例えば、エストロゲン受容体）を挙げることができ、例えば、ヒトエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインは、ヒトエストロゲン受容体の２８２番目〜５９５番目のアミノ酸残基からなる領域である。
ｐ３８タンパク質またはその誘導体（ｂ）としては、例えば、
（ｂ１）ｐ３８タンパク質；
（ｂ２）ｐ３８タンパク質（ｂ１）の天然または人工の変異体であって、ｐ３８タンパク質のリン酸化能（すなわち、ｐ３８タンパク質が、その下流のタンパク質をリン酸化する活性）が維持または増強されたｐ３８タンパク質変異体；
（ｂ３）ｐ３８タンパク質（ｂ１）のキナーゼドメインまたはｐ３８タンパク質変異体（ｂ２）のキナーゼドメイン；
（ｂ４）ｐ３８タンパク質（ｂ１）またはｐ３８タンパク質変異体（ｂ２）と、受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質；あるいは、
（ｂ５）ｐ３８タンパク質またはｐ３８タンパク質変異体の各キナーゼドメイン（ｂ３）と、受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質
を挙げることができる。
前記のｐ３８タンパク質（ｂ１）としては、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラットまたはハムスター）由来のｐ３８タンパク質を挙げることができ、ヒトｐ３８タンパク質を用いることが好ましい。例えば、ヒトｐ３８タンパク質では、２４番目〜３８８番目のアミノ酸残基からなる領域が、キナーゼドメインである。
前記のｐ３８タンパク質変異体（ｂ２）としては、例えば、ｐ３８タンパク質の天然のアレル変異体、あるいは、公知の遺伝子工学的手法（例えば、部位特異的突然変異誘発法）により人工的に変異を導入した変異体などを挙げることができる。
前記のｐ３８タンパク質またはｐ３８タンパク質変異体の各キナーゼドメイン（ｂ３）としては、例えば、ヒトｐ３８タンパク質における２４番目〜３８８番目のアミノ酸残基からなる配列を含むヒトｐ３８タンパク質断片（好ましくは、ヒトｐ３８タンパク質における２４番目〜３８８番目のアミノ酸残基からなる配列からなるヒトｐ３８タンパク質断片）を挙げることができる。
ｐ３８タンパク質またはｐ３８タンパク質変異体と受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質（ｂ４）、あるいは、ｐ３８タンパク質またはｐ３８タンパク質変異体の各キナーゼドメインと受容体のリガンド結合ドメインとの各融合タンパク質（ｂ５）において、前記受容体は、前記融合タンパク質を宿主細胞中で発現させた場合に、受容体の活性化（すなわち、リガンドの受容体リガンド結合ドメインへの結合）により、融合タンパク質のもう１つの構成成分であるｐ３８タンパク質もしくはその変異体またはそれらのキナーゼドメインを活性化することができる受容体である限り、特に限定されるものではない。このような受容体としては、例えば、ステロイド受容体（例えば、エストロゲン受容体）を挙げることができる。
本発明の形質転換細胞を調製する際に、導入遺伝子を宿主細胞に導入する方法は、特に限定されるものではなく、公知の遺伝子導入法を用いて実施することができる。公知の遺伝子導入法としては、例えば、レトロウイルスを用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：９１４６−１９５０，１９９５）、アデノウイルスベクターを用いる方法、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１：１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（ＥＭＢＯＪ．，１：８４１−８４５，１９８２）等を挙げることができる。
本発明の形質転換細胞は、
（ａ）ｐ３８タンパク質をリン酸化することのできるタンパク質若しくはそのキナーゼドメインまたはそれらを含む融合タンパク質、あるいは、
（ｂ）ｐ３８タンパク質若しくはそのキナーゼドメインまたはそれらを含む融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されているため、前記遺伝子導入前には、細胞分裂を活発に行なう能力を保持していたにもかかわらず、細胞老化が急速に誘導され、細胞分裂を行なう能力が失われている。
なお、導入遺伝子として、受容体との融合タンパク質をコードする遺伝子を用いる場合には、前記受容体のリガンドを形質転換細胞に作用させることが、細胞老化の誘導に必要である。
本発明の形質転換細胞は、数十回以上の自然分裂を経て得られる天然の老化細胞に比べて、遥かに短時間で調製することが可能であり、抗老化剤のスクリーニング系を構築する上で、非常に有用である。
本発明における抗老化剤のスクリーニング方法は、正常な老化細胞または細胞老化を誘導する遺伝子を導入した正常な細胞と
（１）被検物質を接触させる工程
（２）細胞における老化指標を分析する工程
を含む。
本発明のクリーニング方法に使用できる細胞としては、ｐ３８を発現できる細胞であれば特に限定されないが、例えば、正常な老化細胞、前記の形質転換細胞および正常な細胞に、
（ｃ）ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質、ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質の変異体、ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質のキナーゼドメイン、若しくは、それらを含む融合タンパク質、あるいは、
（ｄ）ｐ３８ＭＡＰＫ経路を活性化するタンパク質またはその融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を挙げることができる。
上記の形質転換細胞（ｃ）および（ｄ）を調製するのに用いることのできる導入遺伝子は、
（ｃ）ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質、ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質の変異体、ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質のキナーゼドメインもしくはそれらを含む融合タンパク質、あるいは、
（ｄ）ｐ３８ＭＡＰＫ経路を活性化するタンパク質をコードすることのできる遺伝子である限り、特に限定されるものではない。
ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質の上流に位置するタンパク質とは、ｐ３８経路のＭＡＰＫＫタンパク質を直接的または間接的にリン酸化することができるｐ３８ＭＡＰＫ経路に含まれるタンパク質である限り、特に限定されるものではないが、例えば、ＭＬＫ、ＭＥＬＫ、ＡＳＫ１、ＴＡＫ１およびＭＴＫ１などのＭＡＰ３Ｋなどのタンパク質などを挙げることができる。
また、ｐ３８ＭＡＰＫ経路のＭＡＰＫＫタンパク質とは、例えば、ＭＭＫ３、ＭＭＫ６およびＭＭＫ４などのｐ３８タンパク質をリン酸化するタンパク質を意味する。
本発明においてｐ３８ＭＡＰＫ経路を活性化するタンパク質とは、ｐ３８ＭＡＰＫ経路を活性化するｐ３８ＭＡＰＫ経路に属さないタンパク質であれば、特に限定されないが、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ経路を活性化するサイトカイン、ＰＡＫ１およびＧＣＫなどのＭＡＰＫＫＫキナーゼ、古典的ＭＡＰＫ経路に含まれるタンパク質およびそれらの変異体並びにそれらを含む融合タンパク質などが挙げられ、好ましくは、ＲａｆおよびＲａｆを含む融合タンパク質を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法に使用することのできる被検物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物、種々の公知化合物、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１：８１３５−８１７３，１９９５）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物を化学的または生物学的に修飾した化合物を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法において、正常な老化細胞または細胞老化を誘導する遺伝子を導入した正常な細胞と被検物質とを接触させる方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記細胞を培養中の培地に、被検物質を添加することにより、あるいは、通常の培地（すなわち、被検物質不含培地）を、予め被検物質を添加した培地に、置き換えることにより、あるいは、予め被検物質を添加した培地に、上記細胞を加えることにより、実施することができる。なお、導入遺伝子として、受容体との融合タンパク質をコードする遺伝子を用いる場合には、被検物質と接触させる前に、予め、前記受容体のリガンドを形質転換細胞に作用させることにより、細胞老化を誘導しておくことが必要である。
本発明のスクリーニング方法では、正常な老化細胞または細胞老化を誘導する遺伝子を導入した正常な細胞と被検物質とを接触させた後、前記細胞における老化指標の変化を観察することにより、前記被検物質が抗老化作用を有するか否かを判定することができる。この際、コントロールとして、被検物質と未接触の正常な老化細胞または細胞老化を誘導する遺伝子を導入した正常な細胞を一緒に用いると、老化指標の変化がより明確になるので好ましい。
本明細書において、「抗老化作用」とは、抗細胞老化作用を意味し、ここで、「細胞老化」とは、分裂寿命による細胞老化、すなわち、細胞分裂寿命により細胞増殖を停止することを意味する。
前記「抗細胞老化作用」には、例えば、
（１）細胞分裂能を失った老化細胞において、細胞分裂能を再生させる細胞分裂作再生作用と、
（２）細胞分裂能の低下速度を遅らせる細胞老化遅延作用とが含まれる。
本発明のスクリーニング方法で観察することのできる「老化指標」としては、細胞老化の有無または程度を示す指標である限り、特に限定されるものではなく、例えば、細胞増殖速度、細胞質の形態変化、細胞老化特異的な酵素活性の変化またはＳ期細胞の割合などを挙げることができる。
具体的には、老化指標として細胞増殖速度を分析する場合には、被検物質と接触させた場合の細胞増殖速度が、コントロール（被検物質と未接触の老化細胞）に比べて速くなれば、前記被検物質が抗老化作用を有すると判定することができる。
老化指標として細胞質の形態変化を分析する場合には、老化細胞の細胞質は一般に扁平な形状をとるため、被検物質と接触させた場合に、扁平な細胞質が細くなれば、前記被検物質が抗老化作用を有すると判定することができる。
老化指標として細胞老化特異的な酵素活性の変化を分析する場合には、細胞老化特異的な酵素としては、例えば、β−ガラクトシダーゼを挙げることができる。
被検物質と接触させた場合の細胞老化特異的な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の活性が、コントロール（被検物質と未接触の老化細胞）に比べて低下すれぱ、前記被検物質が抗老化作用を有すると判定することができる。
老化指標としてＳ期細胞の割合を分析する場合には、細胞増殖が活発な細胞群では、通常、Ｓ期細胞の割合が高いため、被検物質と接触させた場合に、Ｓ期細胞の割合が、コントロール（被検物質と未接触の老化細胞）に比べて高くなれば、前記被検物質が抗老化作用を有すると判定することができる。
本発明のスクリーニング方法により得られた物質は、抗老化作用、すなわち、細胞分裂再生作用および／または細胞老化遅延作用を有し、従って、抗老化剤、すなわち、細胞分裂再生剤または細胞老化遅延剤の有効成分として有用である。
より具体的には、本発明のスクリーニング方法により得られた物質は、例えば、ｐ３８タンパク質の阻害作用、あるいは、ｐ３８タンパク質より下流の細胞老化シグナル伝達カスケードを構成する細胞老化シグナル伝達分子の阻害作用を有する。
本発明の抗老化剤は、有効成分として、ｐ３８タンパク質の阻害剤を含有する。
ｐ３８タンパク質の阻害剤としては、種々の化合物が知られており、例えば、ＷＯ９５／３１４５１に記載のピラゾール化合物、ＷＯ９７／３３８８３に記載のピリミジン化合物、あるいは、ＷＯ９８／２７０９８に記載の窒素含有ヘテロ環誘導体を挙げることができる。
公知のｐ３８タンパク質阻害剤としては、より具体的には、例えば、ＶＸ−７４５、ＶＸ−９５４、ＶＸ−７０２、ＳＢ２０３５８０”４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルフイニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−ピリジン”、ＳＢ２２００２５、ＲＷＪ−６８３５４、ＲＰＲ−６８３５４、ＲＰＲ−２００７６５Ａ、ＳＣ−ＸＸ９０６、ＨＥＰ−６８９（ＳＢ−２３５６９９）またはＬＬ−Ｚ−１６４０２を挙げることができる。
本発明の抗老化剤の有効成分であるｐ３８タンパク質阻害剤としては、
一般式（１）
2003008577.tif 000002
［式中、Ｒ１は、場合により炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、アミノ基およびモノ−またはジ−アルキル（各アルキル部分の炭素数＝１〜６）アミノ基からなる群から独立して選んだ置換基１または２で置換されていることのあるピリジル基であり；Ｒ２は、水素原子または炭素数１〜１０のアルキル基であり；Ｒ３は、場合によりハロゲン原子、炭素数１〜５のアルキル基および−（ＣＨ２）ｎＹからなる群から独立して選んだ置換基１〜３で置換されていることのあるフェニル基であり；Ｒ４は、場合によりハロゲン原子１または２で置換されていることのあるフェニル基であり；Ｙは、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ５または−ＮＲ６Ｒ７であり；Ｒ６は、水素原子または炭素数１〜１０のアルキル基であり、Ｒ７は、水素原子、ベンジル基または炭素数１〜１０のアルキル基であるか、あるいは、Ｒ６およびＲ７は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、場合により酸素原子を有していることのある６員の複素環式環を形成することができ；Ｒ５は、炭素数１〜１０のアルキル基であり；ｍは、０、１または２であり；ｎは、０または１である］で表される化合物が好ましい。
さらに、本発明の抗老化剤の有効成分であるｐ３８タンパク質阻害剤としては、前記一般式（１）において、Ｒ１が非置換の４−ピリジル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ５（但し、ｍは１または２であり、Ｒ５は炭素数１〜４のアルキル基である）で置換されたフェニル基であり、Ｒ４が、ハロゲン原子で置換されたフェニル基である化合物が好ましく；更に、Ｒ３およびＲ４における置換基が、それぞれパラ位に結合している化合物がより好ましく；更に、Ｒ３が、−ＳＯＲ５（但し、Ｒ５が炭素数１〜４のアルキル基である）で置換されたフェニル基であり、Ｒ４が、フツ素原子、塩素原子またはヨウ素原子で置換されたフェニル基である化合物が更に好ましく；更に、Ｒ３が、−ＳＯＣＨ３で置換されたフェニル基であり、Ｒ４が、フッ素原子で置換されたフェニル基である化合物（すなわち、ＳＢ２０３５８０）が特に好ましい。
本発明の抗老化剤には、細胞分裂再生剤と細胞老化遅延剤とが含まれる。
細胞分裂再生剤としては、具体的には、例えば、創傷部位の回復を促進させる創傷治療剤；血管内皮細胞の脱落および／または損傷などが原因となりうる動脈硬化症（特に閉塞性動脈硬化症）の予防および／または治療剤；再生医療における組織培養の増殖促進剤；肝硬変などにおける肝機能回復剤；高齢者貧血などにおける貧血改善剤；高齢者免疫不全などにおける免疫回復剤；慢性炎症消化管疾患などにおける粘膜上皮機能回復剤；あるいは、発毛・養毛剤などを挙げることができる。
細胞老化遅延剤としては、例えば、動脈硬化防止剤；肝硬変などにおける肝機能低下防止剤；高齢者などにおける貧血防止剤；高齢者などにおける免疫低下防止剤；慢性炎症消化管疾患などにおける粘膜上皮機能低下防止剤；あるいは、脱毛防止・養毛剤などを挙げることができる。
本発明の抗老化剤は、適当な製剤用担体を用いて通常の方法に従い、製剤組成物として調製することができる。担体としては、通常の薬剤に汎用される各種の担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤または界面活性剤等を使用することができる。
本発明の抗老化剤の投与形態は、特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、注射剤、坐剤、外用剤（軟膏剤、貼付剤等）等の非経口剤；エアゾール剤等；錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、丸剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の経口剤を挙げることができる。
前記各種薬剤は、通常の方法により製剤化することができる。
錠剤、散剤、細粒剤または顆粒剤等の経口用固形製剤の形態に成形するに際しては、担体として、例えば、賦形剤（乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、無水第二リン酸カルシウム、アルギン酸等）；結合剤（単シロップ、ブドウ糖液、デンプン溶液、ゼラチン溶液；、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース並びにこれらの水および／またはエタノール溶液等）；崩壊剤（デンプン、アルギン酸、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム等）；放出制御剤（高級脂肪酸，高級脂肪族アルコール、カカオ脂、水素添加油、水溶性高分子、胃溶性高分子、腸溶性高分子等）；吸収促進剤（第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンモノオレエート等の界面活性剤等）；吸着剤（デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、コロイド状ケイ酸等）；滑沢剤（精製タルク、ステアリン酸塩、ケイ酸類、ポリエチレングリコール等）を使用することができる。
錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、胃溶性被覆錠、腸溶性被覆錠または水溶性フィルムコーティング錠とすることができる。
カプセル剤は、上記で例示した各種の担体と混合し、硬質ゼラチンカプセルまたは軟質カプセル等に充填して調製することができる。
液体製剤は、水性または油性の懸濁液、溶液、シロップまたはエリキシル剤であることができ、これらは通常の添加剤を用いて常法に従い、調製することができる。
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、ラノリン、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、ハードファット等に適当な吸収促進剤を添加して使用することができる。
注射剤の形態に成形するに際しては、担体として、例えば、希釈剤（水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール等）；ｐＨ調整剤または緩衝剤（クエン酸、酢酸、リン酸、乳酸、およびこれらの塩；硫酸、水酸化ナトリウム等）；安定化剤（ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸等）を使用することができる。なお、この場合、等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖、マンニトールまたはグリセリンを医薬製剤中に含有することができ、通常の溶解補助剤、無痛化剤または局所麻酔剤等を添加することもできる。
軟膏剤、例えば、ペースト、クリームまたはゲルの形態に調整する際には、通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤または保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合および製剤化することができる。基剤としては、例えば、白色ワセリン、ポリエチレン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ジメチルポリシロキサン類、カルボキシビニルポリマーまたはベントナイト等を使用することができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類等を使用することができる。
貼付剤を製造する場合には、通常の支持体に、前記軟膏、クリーム、ゲルまたはペースト等を常法により塗布することができる。支持体としては、綿；スフ；化学繊維からなる織布または不織布；軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム等を使用することができる。
本発明の抗老化剤の投与方法は、特に限定されないが、例えば、製剤の形態、患者の年齢、性別、若しくはその他の条件または患者の症状の程度に応じて、適宜、経口または非経口投与することができる。
本発明の抗老化剤の有効成分の投与量は、例えば、用法、患者の年齢、性別、疾患の形態またはその他の条件等に応じて適宜選択することができるが、通常成人に対して１日１〜２０００ｍｇを１回から数回に分割して投与することができる。
実施例
以下、参考例および実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１
（１）細胞の培養
本参考例では、ヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を用いて、細胞採取後４２回分裂を行なった活発に増殖をする若い細胞と、６１回分裂した老化細胞との間の、種々の老化指標の違いを確認した。
なお、前記細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いて培養し、継代培養は１：４比で行なった。この際、１回の継代を２ＰＤとした。これに従い、３０〜４０ＰＤの細胞を若年細胞とし、６０ＰＤの細胞を老化細胞とした。
（２）細胞老化特異的βガラクトシダーゼ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）活性の検出
細胞老化特異的βガラクトシダーゼ活性は、Ｄｉｍｒｉらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：９３６３−９３６３，１９９５）により検出した。
具体的には、ヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若年細胞および老化細胞を、それぞれ、ＰＢＳで洗浄した後、０．５％グルタルアルデヒド水溶液で固定した。固定後、染色液［リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ６．０）中に、１ｍｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシダーゼ）、５ｍｍｏｌ／Ｌフェロシアン化カリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウムおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムを溶解したもの］中に細胞を浸漬し、３７℃で５時間以上反応させた。
染色した各細胞の顕微鏡写真を図１に示す。図１において、写真（ａ）は若年細胞（４２回分裂）の結果であり、写真（ｂ）は老化細胞（６１回分裂）の結果である。βガラクトシダーゼ活性を有すると、実際には、細胞が青色に染色されるが、図１に示す白黒写真では、黒色で示される。
図１に示すように、老化細胞［写真（ｂ）］は、若い細胞［写真（ａ）］に比べて細胞質が扁平であり、しかも、βガラクトシダーゼ活性が確認された。
（３）ｐ３８タンパク質のリン酸化状態の確認
本参考例では、全ｐ３８タンパク質を検出可能な抗体と、リン酸化型ｐ３８タンパク質（すなわち、活性型ｐ３８タンパク質）のみを特異的に検出可能な抗体とを、それぞれ用いたウエスタンプロッティングにより、ヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若年細胞および老化細胞中のｐ３８タンパク質のリン酸化状態を確認した。
具体的には、参考例１（１）と同様にして培養したヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若年細胞および老化細胞（約５×１０６個）を、それぞれ、溶解用緩衝液［ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ；１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，０．５％ＮＰ−４０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡ，３ｍｍｏｌ／Ｌグリセロリン酸，０．１μ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４，１μｇ／ｍＬロイペプチン，１ｍｍｏｌ／Ｌフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）］０．１ｍＬで溶解した。
続いて、タンパク質量として３０μｇに相当する各抽出サンプルを、常法により、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。市販のブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬）を用いて、膜をブッロキング処理した後、一次抗体反応および二次抗体反応を順次実施した。
なお、一次抗体としては、ウサギ抗ｐ３８抗体（ＮＥＢ社；リン酸化の有無を問わず、全てのｐ３８タンパク質と反応する抗体）およびウサギ抗リン酸化ｐ３８抗体（ＮＥＢ社；リン酸化されたｐ３８タンパク質と反応するが、リン酸化されていないｐ３８タンパク質とは反応しない抗体）を使用し、二次抗体としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識化抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を使用した。ペルオキシダーゼ活性の検出は、市販の検出用キット（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）およびＸ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて実施した。
結果を図２に示す。なお、陽性対照として、若年細胞（４２ＰＤ）をアニソマイシン（ａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ）処理した細胞の結果も併せて示す。細胞をアニソマイシン処理すると、ｐ３８タンパク質が活性化（リン酸化）されることが知られている。細胞のアニソマイシン処理は、溶解用緩衝液で溶解する前に、３０μｍｏｌ／Ｌアニソマイシンおよび１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で３０分間培養することにより実施した。
図２において、レーン１は、若年細胞（４２ＰＤ）の結果を示し、レーン２は、老化細胞（６１ＰＤ）の結果を示し、レーン３は、陽性対照（すなわち、アニソマイシン処理した若年細胞）の結果を示す。
図２に示すように、３種類の細胞の間で、全ｐ３８タンパク質の発現量に差は見られなかった。一方、活性型ｐ３８タンパク質については、若年細胞では少なく、アニソマイシン処理した若年細胞では増加しており、老化細胞では、それ以上に顕著に増加していた。よって、ｐ３８タンパク質は、分裂寿命によって生じるヒト正常線維芽細胞の細胞老化において活性化されていることが示された。
実施例１
（１）ヒト正常線維芽細胞におけるｐ３８タンパク質阻害剤の効果
本実施例では、前記参考例１で用いたのと同じヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若い細胞（４２回分裂）および老化細胞（６１回分裂）を用いて、ｐ３８タンパク質阻害剤であるＳＢ２０３５８０の効果を比較した。具体的には、形質転換細胞の代わりに、参考例１（１）と同様にして培養したヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若い細胞（４２回分裂）および老化細胞（６１回分裂）を用いたこと以外は、後述の実施例２（２）の操作を繰り返した。
結果を図３に示す。図３において、折れ線ａは、ＳＢ２０３５８０存在下における若い細胞の細胞増殖曲線であり、折れ線ｂは、ＳＢ２０３５８０不在下における若い細胞の細胞増殖曲線であり、折れ線ｃは、ＳＢ２０３５８０存在下における老化細胞の細胞増殖曲線であり、折れ線ｄは、ＳＢ２０３５８０不在下における老化細胞の細胞増殖曲線である。図３における記号「＋ＳＢ」は、１０μｍｏｌ／ＬのＳＢ２０３５８０で処理したことを意味する。
また、各処理群におけるＳ期細胞の割合を、後述の実施例２（３−ａ）に記載の手順に従って、ＦＡＣＳ解析により決定した結果を、図４に示す。図４における記号「＋」は、１０μｍｏｌ／ＬのＳＢ２０３５８０で処理したことを意味する。
さらに、参考例１（２）に記載の手順に従って、各処理群の細胞形状およびβガラクトシダーゼ活性を分析した。
若い細胞は、図３（折れ線ａおよび折れ線ｂ）に示すように、ＳＢ２０３５８０の有無に関わらず、良く増殖（倍化時間＝２日間程度）し、図４に示すように、Ｓ期の細胞も２０％程度あった。ＳＢ２０３５８０未処理の老化細胞は、ゆっくりと増殖（倍化時間＝６日間程度）し（図３の折れ線ｄ参照）、Ｓ期の細胞は５％程度であり（図４参照）、具体的データは示さないが、形態的にも細胞老化特異的βガラクトシダーゼ陽性の扁平な細胞質をもつ特徴的な形態を示した。一方、ＳＢ２０３５８０で処理した老化細胞は、未処理の場合に比べて増殖が冗進し（図３の折れ線ｃ参照）、７２時間のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識で示されるＳ期の細胞は２５％程度と有意に増加し（図４参照）、形態的にも細胞老化特異的βガラクトシダーゼ陽性の程度が低く、扁平な細胞質が細くなり、若い細胞に類似した形態をとった。これらの結果から、ｐ３８タンパク質阻害作用を有する化合物であるＳＢ２０３５８０が、分裂寿命を迎えた細胞に細胞増殖を部分的に再開させることが示された。
実施例２
（１）本発明の形質転換細胞の作製
本実施例では、以下に述べる手順に従って、ヒトＭＫＫ６タンパク質をコードするヒトＭＫＫ６遺伝子、あるいは、前記ＭＫＫ６の構成的活性型変異体（以下、ＭＫＫ６ＥＥタンパク質と称する）をコードするＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を、レトロウイルスを用いる遺伝子導入法により、ヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若年細胞に導入し、本発明の形質転換細胞を作製した。
ここで、ＭＫＫ６タンパク質とは、ｐ３８タンパク質をリン酸化して活性化するＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）である。また、ＭＫＫ６ＥＥタンパク質は、ＭＫＫ６タンパク質における２０７番目のセリン（Ｓｅｒ２０７）および２１１番目のスレオニン（Ｔｈｒ２１１）が、それぞれグルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）に置換されている変異体（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：１２４７−１２５５，１９９６）である。
ＭＫＫ６遺伝子は、鋳型としてプラスミドｐＳＲα−ＭＫＫ６（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１３６７５−１３６７９，１９９６）を用い、配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとの組み合わせを用いるＰＣＲ法によって、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅することにより取得した。なお、前記ＰＣＲは、９４℃（５分間）の保温の後、９４℃（３０秒間）と５２℃（３０秒間）と７２℃（１分間）とからなるサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃（１０分間）保温することにより実施した。また、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子は、常法、すなわち、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：５６６２−５６６６，１９８４）に従って、前記ＭＫＫ６遺伝子を遺伝子工学的に改変することにより取得した。
得られたＭＫＫ６遺伝子およびＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を、それぞれ、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するレトロウイルスベクターｐＭＸｐｕｒｏ（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２４：３２４−３２９，１９９６）にサブクローニングした。
レトロウイルスによる遺伝子導入は、公知方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：９１４６−９１５０，１９９５）に従って実施した。すなわち、各遺伝子を含むレトロウイルスＤＮＡ（あるいは、対照としてのレトロウイルベクターｐＭＸｐｕｒｏ）６μｇを、パッケージング細胞であるＮＸ細胞［４×１０６個／１０ｃｍディッシュ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，３８：８９５−９０５，１９８１）］にトランスフェクションした。４８時間後、培養上清を回収し、ウイルス溶液として使用した。
ターゲット細胞であるヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若年細胞（４２ＰＤ；５×１０５個／１０ｃｍディッシュ）を、ポリブレン（終濃度＝８μｇ／ｍＬ）添加したウイルス上清中で、８時間培養した。ウイルス上清を一度除去した後、新しいウイルス上清［ポリブレン（終濃度＝８μｇ／ｍＬ）含有］を再び添加し、更に８時間培養した。感染操作を実施した各細胞を、ピューロマイシン（２．５μｇ／ｍＬ）含有ＤＭＥＭ中で３日間培養した。
感染操作を実施してから４日目に、培地を、２．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するＤＭＥＭに置き換え、更に、６日間培養した。なお、６日間の培養期間中は、毎日、培地交換を実施した。この６日間における１日おきの相対的細胞数を、市販のキット［Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＷＳＴ−１  ａｓｓａｙ）、ＤＯＪＩＮＤＯ社］を用いて測定した。
ＷＳＴ−１法は、細胞内の乳酸脱水素酵素などの関与する脱水素反応の活性を比色定量することを利用して、間接的に細胞増殖能の程度を知る方法である。
具体的な測定方法および相対細胞数の算出は、以下の方法で行なった。すなわち、９６ウェルプレートの各ウェルに対して、それぞれ、１０００個の細胞を２４時間前培養した。培養液にＷＳＴ−１試薬を添加し、ＣＯ２インキュベーターで４時間、呈色反応を行なった。反応後、プレートリーダーで測定した（測定波長＝４５０ｎｍ）。これらは、増殖期間中の各測定日（０日目、２日目、４日目および６日目）で各３検体について測定し、平均値を各測定日のデータとした。各測定日での測定値の相対細胞数は、０日目の測定値の平均を１とし、算出した。結果を図５（ａ）に示す。
図５では、感染操作を実施してから４日目を「０日」とした。また、図５において、記号「ＷＴ」は、ＭＫＫ６遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わし、記号「ＥＥ」は、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わし、記号「Ｖ」は、ベクターのみ（レトロウイルベクターｐＭＸｐｕｒｏ）を導入した細胞（対照）の結果であることを表わす。
図５（ａ）に示すように、４日目には、ＭＫＫ６遺伝子を発現している本発明細胞（ＷＴ）と、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を発現している本発明細胞（ＥＥ）とは、ベクターのみを感染させた対照細胞（Ｖ）に比べて、有意に細胞増殖速度が低下した。また、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を発現している本発明細胞（ＥＥ）の場合には、細胞がコンフルエントとなる前に完全に増殖停止した。
（２）本発明の形質転換細胞における、ｐ３８タンパク質阻害剤の効果
本実施例では、実施例２（１）で得られた本発明の形質転換細胞２種における、ｐ３８タンパク質阻害剤であるＳＢ２０３５８０の効果を確認した。
具体的には、感染操作を実施してから４日目に、１０μｍｏｌ／Ｌ−ＳＢ２０３５８０（シグマ社）を含有するＤＭＥＭに置き換えたこと以外は、実施例２（１）に記載のレトロウイルス感染操作および前記操作により得られた細胞の培養操作を繰り返した。結果を図５（ｂ）に示す。
図５（ｂ）の記号「＋ＳＢ」は、培地にＳＢ２０３５８０を添加した場合の結果であることを表わす。なお、図５（ａ）の記号「−ＳＢ」は、培地にＳＢ２０３５８０を添加しなかった場合の結果であることを表わす。
図５（ａ）に示すＭＫＫ６遺伝子またはＭＫＫ６ＥＥ遺伝子による増殖抑制効果は、図５（ｂ）に示すように、ｐ３８タンパク質阻害剤であるＳＢ２０３５８０により阻害された。
また、具体的なデータは示さないが、参考例１（１）と同様にして培養したヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の老化細胞（６１ＰＤ）に対しても、ＳＢ２０３５８０は抗老化作用を示した。
（３）本発明の形質転換細胞における各種老化指標の確認
（３−ａ）ＦＡＣＳ解析によるＳ期細胞の割合
実施例２（１）と同様の操作を繰り返して得られた、本発明の形質転換細胞２種およびベクターのみを導入した対照細胞１種について、蛍光標示式細胞分取器（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）解析により、Ｓ期細胞の割合を確認した。各細胞としては、６日間の培養期間経過後の細胞、すなわち、図５における「６日間」の細胞を使用した。
具体的には、６日間の培養期間経過後の各細胞を、１０μｍｏｌ／Ｌブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）含有のＤＭＥＭ培地中で、４時間標識した。続いて、細胞を７０％エタノールで固定し、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸で３０分間処理した。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌホウ酸ナトリウムで中和した後、ＦＩＴＣ標識化抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）で１時間反応した。反応終了後、細胞を洗浄バッファー［０．５％Ｔｗｅｅｎ２０および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ］で洗浄し、５μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰｒｏＰｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ；ＰＩ）含有ＰＢＳ溶液に懸濁させた。サンプルは、２次元フローサイトメトリーによって解析した。結果を図６に示す。
図６（ａ）の記号「Ｖｅｃｔｏｒ」は、ベクターのみ（レトロウイルベクターｐＭＸｐｕｒｏ）を導入した細胞（対照）の結果であることを表わし、図６（ｂ）の記号「ＭＫＫ６ＷＴ」は、ＭＫＫ６遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わし、図６（ｃ）の記号「ＭＫＫ６ＥＥ」は、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わす。図６における各縦軸は、ＢｒｄＵ染色度を示し、各横軸は、ＰＩ染色度を示す。
図６に示すように、ＭＫＫ６遺伝子を発現している本発明細胞（ＭＫＫ６ＷＴ）と、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を発現している本発明細胞（ＭＫＫ６ＥＥ）とは、ベクターのみを感染させた対照細胞（Ｖｅｃｔｏｒ）に比べて、Ｓ期細胞の割合が有意に減少した。
（３−ｂ）細胞老化特異的βガラクトシダーゼ活性
実施例２（１）と同様の操作を繰り返して得られた、本発明の形質転換細胞２種およびベクターのみを導入した対照細胞１種（いずれも、６日間の培養期間経過後の各細胞、すなわち、図５における「６日目」の各細胞）を用いたこと以外は、参考例１（２）に記載の操作を繰り返した。結果を図７に示す。
図７（ａ）の記号「Ｖｅｃｔｏｒ」は、ベクターのみ（レトロウイルベクターｐＭＸｐｕｒｏ）を導入した細胞（対照）の結果であることを表わし、図７（ｂ）の記号「ＭＫＫ６ＷＴ」は、ＭＫＫ６遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わし、図７（ｃ）の記号「ＭＫＫ６ＥＥ」は、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わす。
図７に示すように、ＭＫＫ６遺伝子を発現している本発明細胞（ＭＫＫ６ＷＴ）と、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を発現している本発明細胞（ＭＫＫ６ＥＥ）とは、扁平な形態を示し、しかも、細胞老化特異的βガラクトシダーゼ活性が著しく増加していた。
次に、実施例２（１）と同様の操作を繰り返して得られた、本発明の形質転換細胞２種およびベクターのみを導入した対照細胞１種（いずれも、６日間の培養期間経過後の各細胞；ＳＢ２０３５８０未処理細胞）と、実施例２（２）と同様の操作を繰り返して得られた、本発明の形質転換細胞２種およびベクターのみを導入した対照細胞１種（いずれも、６日間の培養期間経過後の各細胞；ＳＢ２０３５８０処理細胞）とを用いたこと以外は、参考例１（２）に記載の操作を繰り返した後、各群当たり、独立した３検体について、顕微鏡下で、それぞれ任意に２００個の細胞を選択し、その中に含まれるβガラクトシダーゼ陽性細胞の数をカウントすることにより、βガラクトシダーゼ陽性細胞の割合を算出した。結果を図８に示す。
図８において、記号「Ｖ」は、ベクターのみ（レトロウイルベクターｐＭＸｐｕｒｏ）を導入した細胞（対照）の結果であることを表わし、記号「ＷＴ」は、ＭＫＫ６遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わし、記号「ＥＥ」は、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わす。また、図８の横軸に示す「ＳＢ」列において、記号「＋」は、ＳＢ２０３５８０処理細胞の結果であることを表わし、記号「−」は、ＳＢ２０３５８０未処理細胞の結果であることを表わす。
図８に示すように、細胞老化特異的βガラクトシダーゼ陽性細胞の増加は、ＳＢ２０３５８０により阻害されることが判明した。
（３−ｃ）ｐ３８タンパク質のリン酸化状態
実施例２（１）と同様の操作を繰り返して得られた、本発明の形質転換細胞２種およびベクターのみを導入した対照細胞１種（いずれも、６日間の培養期間経過後の各細胞）を用いたこと、そして、一次抗体として、更に、抗ＭＫＫ６抗体（ｓｃ−１９９２；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、抗ｐ１６抗体（ｓｃ−４６８；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、抗ｐ２１抗体（ｓｃ−８１７；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、抗ｐ５３抗体（ｓｃ−２６３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）および抗アクチン抗体（ベーリンガーマンハイム社）を用いたこと以外は、参考例１（３）に記載の操作を繰り返した。なお、ｐ１６タンパク質およびｐ２１タンパク質は、それぞれ、老化細胞に特徴的なタンパク質として公知のタンパク質である。また、アクチンは、若年細胞と老化細胞とで発現量に差異が認められないことが知られているタンパク質である。結果を図９に示す。
図９において、記号「ｍｏｃｋ」は、ベクターのみ（レトロウイルベクターｐＭＸｐｕｒｏ）を導入した細胞（対照）の結果であることを表わし、記号「ＭＫＫ６ＷＴ」は、ＭＫＫ６遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わし、記号「ＭＫＫ６ＥＥ」は、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子を導入した本発明の細胞の結果であることを表わす。
図９に示すように、ＭＫＫ６またはＭＫＫ６ＥＥ遺伝子導入細胞では、対照に比べ、大量のＭＫＫ６タンパク質を発現していた。全ｐ３８タンパク質の発現量は、３種類の細胞で変化はなかったのに対して、活性型ｐ３８タンパク質の発現量は、対照に比べてＭＫＫ６遺伝子導入細胞で有意に増加し、ＭＫＫ６ＥＥ遺伝子導入細胞では著しく増加していた。また、老化細胞に特徴的なｐ１６タンパク質およびｐ２１タンパク質の各発現量が、ＭＫＫ６またはＭＫＫ６ＥＥ遺伝子導入細胞で増加していた。これらの結果より、ｐ３８タンパク質の活性化によって、細胞老化が若い細胞に直接的に誘導されることが明らかとなった。
実施例３
活性化Ｒａｓの強制発現によりヒト正常線維芽細胞が急速に細胞老化表現型を示すことは、既に報告されている（Ｃｅｌｌ，８８：１５９３−６０２，１９９７）。この過程は、Ｒａｓの下流にある古典的ＭＡＰＫ、すなわち、Ｒａｆ−Ｍｅｋ−Ｅｒｋを経て誘導されることが示されている（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２：３００８−３０１９，１９９８、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２：２９９７−３００７，１９９８）。このことを利用して、Ｚｈｕらは、エストロゲンあるいはタモキシフェンによってＲａｆを活性化し、細胞老化を誘導する系を報告した（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２：２９９７−３００７，１９９８）。これは、エストロジェンレセプター遺伝子と活性化Ｒａｆ遺伝子のキナーゼ領域をコードする配列を融合させたものである。
（１）上記方法に準じ、ＷＩ−３８細胞に遺伝子導入し、タモキシフェン投与によって細胞老化が誘導できる系を構築し、細胞老化の誘導を試験した。
結果を図１０および図１１に示す。１ｎＭ以上のタモキシフェンを投与することにより、細胞増殖の停止、細胞老化特異的βガラクトシダーゼ陽性細胞の増加が認められ、細胞老化が誘導された。図１０は、タモキシフェン（４−ＨＴ）の投与濃度による細胞の形態の変化であり、図１１は、投与したタモキシフェン（４−ＨＴ）の濃度と最初の細胞数を１とした相対的な細胞数を示している。
（２）（１）で構築した系を用いて、１０ｎＭのタモキシフェンによってＲａｆの活性化を誘導し、同時に２５μＭのＰＤ９８０５９（Ｍｅｋ阻害剤）とＳＢ２０３５８０（ｐ３８阻害剤）を添加し、両者のＲａｆ誘導性細胞老化誘導に対する影響を観察した。結果を図１２、図１３、図１４および図１５に示す。
図１２は、活性化Ｒａｆの誘導後の各細胞における細胞増殖の割合を示す。図１２においてタモキシフェンは、記号「４−ＨＴ」で示され、２５μＭのＰＤ９８０５９を投与した系は、記号「＋ＰＤ」で示される。
図１３は、活性化Ｒａｆの誘導後の各細胞におけるβガラクトシダーゼ陽性細胞の割合を示す。図１３においてタモキシフェンは、記号「４−ＨＴ」で示され、２５μＭのＰＤ９８０５９を投与した系は、記号「＋」で示される。
図１４は、活性化Ｒａｆの誘導後の各細胞における細胞増殖の割合を示す。図１４においてタモキシフェンは、記号「４−ＨＴ」で示され、２５μＭのＳＢ２０３５８０を投与した系は、記号「＋ＳＢ」で示される。
図１５は、活性化Ｒａｆの誘導後の各細胞におけるβガラクトシダーゼ陽性細胞の割合を示す。図１５においてタモキシフェンは、記号「４−ＨＴ」で示され、２５μＭのＳＢ２０３５８０を投与した系は、記号「＋」で示される。
ＰＤ９８０５９は、Ｒａｆの活性化により誘導される細胞増殖の停止および細胞老化特異的βガラクトシダーゼ陽性細胞の増加を部分的に抑制した。しかしながら、ＳＢ２０３５８０は、Ｒａｆの活性化により誘導される細胞増殖の停止および細胞老化特異的βガラクトシダーゼ陽性細胞の増加をＰＤ９８０５９より強く抑制した。この知見より、Ｒａｆの活性化により誘導される細胞老化に、古典的ＭＡＰＫとストレス誘導性ＭＡＰＫｐ３８の両者が関与しているが、特にｐ３８の関与が大きいことが明確になった。
産業上の利用可能性
本発明の形質転換細胞は、本発明のスクリーニング系を構築するのに有用な細胞であり、また、本発明のスクリーニング方法によれば、抗老化剤として有効な物質をスクリーニングすることができる。さらに本発明のスクリーニング方法で選択された化合物は抗老化剤として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１  ヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若年細胞および老化細胞におけるβガラクトシダーゼ活性の有無を示す図面に代わる顕微鏡写真である。
図２  抗ｐ３８抗体を用いる、図１に示す各細胞溶解液のウエスタンブロッティングの結果を示す図面に代わる写真である。
図３  ｐ３８タンパク質阻害剤ＳＢ２０３５８０の存在下または不在下における、ヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若年細胞および老化細胞の細胞増殖曲線を示すグラフである。
図４  ｐ３８タンパク質阻害剤ＳＢ２０３５８０の存在下または不在下での、ヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の若年細胞および老化細胞における、Ｓ期細胞の割合を示すグラフである。
図５  ｐ３８タンパク質阻害剤ＳＢ２０３５８０の不在下［グラフ（ａ）］または存在下［グラフ（ｂ）］における、本発明の形質転換細胞の細胞増殖曲線を示すグラフである。
図６  ＦＡＣＳ解析による、本発明の形質転換細胞のＳ期細胞の割合を示すグラフである。
図７  本発明の形質転換細胞におけるβガラクトシダーゼ活性の有無を示す図面に代わる顕微鏡写真である。
図８  本発明の形質転換細胞におけるβガラクトシダーゼ活性を定量化した結果を示すグラフである。
図９  本発明の形質転換細胞のウエスタンブロッティングの結果を示す図面に代わる写真である。
図１０  本発明の形質転換細胞におけるタモキシフェン添加濃度による形態変化を示す図面に代わる顕微鏡写真である。
図１１  本発明の形質転換細胞におけるタモキシフェン添加濃度による、活性化Ｒａｆの誘導による増殖割合の経日変化を示すグラフである。
図１２  本発明の形質転換細胞におけるタモキシフェンおよびＰＤ９８０５９の添加有無による増殖割合の経日変化を示すグラフである。
図１３  本発明の形質転換細胞におけるタモキシフェンおよびＰＤ９８０５９の添加有無によるβガラクトシダーゼを定量化した結果を示すグラフである。
図１４  本発明の形質転換細胞におけるタモキシフェンおよびＳＢ２０３５８０の添加有無による増殖割合の経日変化を示すグラフである。
図１５  本発明の形質転換細胞におけるタモキシフェンおよびＳＢ２０３５８０の添加有無によるβガラクトシダーゼを定量化した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2003008577.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月14日(2003.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
細胞老化を誘導する遺伝子を導入した正常な細胞と
（１）被検物質を接触させる工程
（２）細胞におけるｐ３８の活性化を介する老化指標を分析する工程
を含む化合物のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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