(57)【要約】本発明は、（ａ）薬剤感受性の高い酵母細胞にＡＢＣタンパク質遺伝子を導入することによって、細胞膜部位にＡＢＣタンパク質を発現している形質転換酵母細胞を作製し、（ｂ）細胞膜部位に存在するＡＢＣタンパク質によって細胞外に輸送され、かつ酵母細胞に対し細胞毒性を有する物質と被検物質の存在下で、該形質転換酵母細胞を培養し、（ｃ）その増殖の程度を前記被検物質の非存在下で培養した場合と比較することを特徴とするＡＢＣタンパク質の能動輸送を促進する物質または阻害する物質を効率的にスクリーニングする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）薬剤感受性の高い酵母細胞にＡＢＣタンパク質遺伝子を導入することによって、細胞膜部位にＡＢＣタンパク質を発現している形質転換酵母細胞を作製し、（ｂ）細胞膜部位に存在するＡＢＣタンパク質によって細胞外に能動輸送され、かつ酵母細胞に対し細胞毒性を有する物質と被検物質の存在下で、該形質転換酵母細胞を培養し、（ｃ）その増殖の程度を前記被検物質の非存在下で培養した場合と比較することを特徴とするＡＢＣタンパク質の能動輸送を促進する物質または阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載の方法でスクリーニングされたＡＢＣタンパク質の能動輸送を促進または阻害する物質について、さらにＡＢＣタンパク質が発現していない薬剤感受性の高い酵母細胞に対する増殖阻害作用を測定することを特徴とするＡＢＣタンパク質の能動輸送を促進または阻害する細胞毒性の低い物質をスクリーニングする方法。
【請求項３】
ＡＢＣタンパク質遺伝子が、多剤耐性の獲得に関与する遺伝子である請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
多剤耐性の獲得に関与する遺伝子が、酵母のＰＤＲ５遺伝子である請求の範囲第３項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
薬剤感受性の高い酵母細胞が、野生株よりも薬剤の細胞膜透過性が増大している変異株酵母細胞であることを特徴とする請求の範囲第１〜４項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
変異株酵母細胞が、細胞膜脂質合成遺伝子に変異を有する変異株であることを特徴とする請求の範囲第５項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
細胞膜脂質合成遺伝子に変異を有する変異株が、ＳＹＲ１／ＥＲＧ３遺伝子の欠損変異株または遺伝子破壊株であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
薬剤感受性の高い酵母細胞にＡＢＣタンパク質遺伝子を導入することによって、細胞膜部位にＡＢＣタンパク質を発現している形質転換酵母細胞。
【請求項９】
請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得られた化合物。
【請求項１０】
下記式（１）；
2003008644.tif 000032
で示される部分構造を有し、分子量１１９３．７であって、かつ、ＡＢＣタンパク質が有する物質輸送を阻害する作用を有する化合物またはその還元体、エーテル体もしくはエステル体。
【請求項１１】
放線菌Ｅ−４２０株の培養上清から得られることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の化合物またはその還元体、エーテル体もしくはエステル体。
【請求項１２】
一般式（２）Ａ−Ｂ−Ｃ｛式中、Ａは式（３）；
2003008644.tif 000033
（式中、Ｒ１は水素またはＣ１−６の低級アルキル基を表す。Ｒは水素または水酸基の置換基を表す。ｍは３，４または５を表す。また、括弧内は、−ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ＝ＣＨ−を表す。）
を表し、
Ｂは式（４−１）；
2003008644.tif 000034
（式中、Ｒは、構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｎは４，５または６を表す。）
または、式（４−２）；
2003008644.tif 000035
（式中、Ｒは、構成単位ごとにまたは置換基ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｐは０，１または２を表す。Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨを表す。）
を表し、
Ｃは式（５）Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｚ（式中、Ｄは式（６）；
2003008644.tif 000036
（式中、Ｒは構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｓは４，５または６を表す。）
を表し、
Ｅは式（７）；
2003008644.tif 000037
（式中、ＲおよびＲ１は、構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｔは２，３または４を表す。）
を表し、
Ｆは式（８）；
2003008644.tif 000038
（式中、Ｒ２は、構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、また、構成単位内で同一であっても異なっていてもよく、ＯＲ（Ｒは前記定義に同じ。）、水素またはＣ１−６の低級アルキル基を表す。ｕは１または２を表す。）
を表し、
Ｇは式（９）；
2003008644.tif 000039
（式中、Ｒは構成単位ごとにまたは置換基ごとに同一であっても異なっていてもよく前記定義に同じ。Ｒ１は構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく前記定義に同じ。Ｒ３は構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、Ｃ１−６の低級アルキル基を表す。ｖは３，４または５を表す。ｗは１，２または３を表す。）
を表し、
Ｚは置換基を表す。）
を表す。｝で示される化合物を含有することを特徴とするＡＢＣタンパク質阻害剤。
【請求項１３】
請求の範囲第１２項に記載の一般式（２）において、記号Ａで表される基が下記式（１０）；
2003008644.tif 000040
（式中、Ｒは水素または水酸基の置換基を表す。）
であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のＡＢＣタンパク質阻害剤。
【請求項１４】
請求の範囲第１２項に記載の一般式（２）において、記号Ｂで表される基が下記式（１１）；
2003008644.tif 000041
（式中、Ｒは置換基ごとに同一であっても異なっていてもよく水素または水酸基の置換基を表す。）
であることを特徴とする請求の範囲第１２項または第１３項に記載のＡＢＣタンパク質阻害剤。
【請求項１５】
請求の範囲第１２項に記載の一般式（２）において、ｓが５、ｔが３、ｕが１または２、ｖが４およびｗが２であることを特徴とする請求の範囲第１２〜１４項のいずれかに記載のＡＢＣタンパク質阻害剤。
【請求項１６】
下記式（１２）；
2003008644.tif 000042
で示される化合物、そのエーテル体もしくはエステル体、または
下記式（１３）；
2003008644.tif 000043
で示される化合物、そのエーテル体もしくはエステル体を
含有することを特徴とするＡＢＣタンパク質阻害剤。
【請求項１７】
ＡＢＣタンパク質が、多剤耐性の獲得に関わるＡＢＣタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１２〜１６項のいずれかに記載のＡＢＣタンパク質阻害剤。
【請求項１８】
ＡＢＣタンパク質が、酵母のＰＤＲ５であることを特徴とする請求の範囲第１７項記載のＡＢＣタンパク質阻害剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＡＢＣタンパク質の能動輸送機能を促進する物質（以下、単に「ＡＢＣタンパク質の促進物質」という）または該機能を阻害する物質（以下、単に「ＡＢＣタンパク質の阻害物質」という）をスクリーニングする方法、および該スクリーニング方法によって得られるＡＢＣタンパク質の促進または阻害物質に関する。
背景技術
ＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質はよく保存されたＡＴＰ結合領域（ＮＢＦ）を１分子内に２つ有し、ＡＴＰによって駆動もしくは制御される１２から１８回膜貫通領域をもつ膜タンパク質の総称である。ＡＢＣタンパク質は細菌から酵母、植物、哺乳類に至る広い生物種に分布する最も大きい遺伝子ファミリーの一つであり、現在までに５００以上のＡＢＣタンパク質関連遺伝子が同定されている。また、ＡＢＣタンパク質は、トランスポーター、チャネル、受容体（レギュレーター）という多様な機能に分化し、それぞれの生物で重要な生理機能を果たしている。特にヒトにおいては、現在４０以上のＡＢＣタンパク質遺伝子が同定され、それぞれの遺伝子の異常が様々な疾病を引き起こすことが明らかになっており、ＡＢＣタンパク質の生体防御機構としての重要性が認識されている。
かかるＡＢＣタンパク質のうち、多剤耐性の獲得に関与しているＡＢＣタンパク質が注目を集めている。
最初に同定された多剤耐性の獲得に関与するＡＢＣタンパク質はヒトおよびマウスのＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質とも呼ばれる）である。ＭＤＲ１は、抗がん剤を投与すると、がん細胞が作用機構や化学構造の異なる多数の抗がん剤に対して同時に耐性を獲得する「獲得性多剤耐性」というがん治療上の問題を研究する過程で見出された。すなわち、高度に抗がん剤耐性を獲得した培養細胞で増幅している遺伝子を単離し、その遺伝子を薬剤感受性細胞で発現させると細胞は様々な抗がん剤に対して耐性になることから、その遺伝子は多剤耐性（Ｍｕｌｔｉ  ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の頭文字をとってＭＤＲ１と名づけられた（Ｕｅｄａ，Ｋ．，Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ，Ｃ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，３００４−３００８（１９８７））。ＭＤＲ１は様々な脂溶性の薬剤をＡＴＰ加水分解のエネルギーを利用して細胞内から細胞外へ排出するポンプとして機能することによって、その細胞を多剤耐性にすることが明らかとなっている。
また、ＭＤＲ１は脳や精巣の毛細血管内皮、胎盤絨毛膜、小腸や毛細胆管の管腔側膜、腎近位尿細管、造血幹細胞などで発現していることから、体内に有害な生体異物が侵入しないように機能しているだけでなく、血流中に入った生体異物から脳などの重要な器官や胎児を保護していると考えられている（植田和光、蛋白質・核酸・酵素、４６，５８８−５９５（２００１））。ＭＤＲ１は有害物質に対するバリアーとして働いているが、ＭＤＲ１はすべての脂溶性有害物を排出できるわけではない。ＭＤＲ１が排出できなかった脂溶性有害物の多くは、細胞内でグルタチオンやグルクロン酸と抱合体化され無毒化されて、別のＡＢＣタンパク質であるＭＲＰ１（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）によって細胞外へ排出される。
このような異物排出に関与するＭＤＲ１類縁遺伝子はヒトだけに発現しているのではなく、例えば酵母においては基質特異性の少しずつ異なる何種類ものＡＢＣタンパク質遺伝子が存在していることが知られている（宮川都吉、高橋英俊、バイオサイエンスとインダストリー、５８，３９７−４００（２０００））。おそらく異物排出という機能は単細胞生物である酵母では重要であり、進化の過程で遺伝子重複が起こったと考えられている。
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母）では、異物排出に関与するＡＢＣタンパク質として、ＭＤＲ１と類縁性の高いＰＤＲ５およびＳＮＱ２、酵母接合因子の分泌に関与するＳＴＥ６、カドミウム排出に関与するＹＣＦ１、および有機アニオントランスポーターであるＹＲＳ１／ＹＯＲ１が知られている（Ｂａｕｅｒ、Ｂ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４６１，２１７−２３６（１９９９））。この中でも、ＰＤＲ５は、シクロヘキシミド、セルレニン、コンパクチン、スタウロスポリン、スルフォメチュロン・メチル、トリフルオロペラジン、ローダミンなどの種々の薬剤を能動輸送で細胞外に排出し、酵母をこれらの薬剤に対して耐性にすることが知られている（Ｈｉｒａｔａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２６，２８５−２９４（１９９４））。また、ＰＤＲ５のホモログであるＳＮＱ２は、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイドなどの薬剤に対する耐性に関わることが知られているが、ＳＮＱ２が細胞外に排出することができる化合物としては２，３の化合物しか知られていない（Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１８１５０−１８１５７（１９９５））。
以上のように、ＡＢＣタンパク質は細菌から哺乳類に至る広い生物種に分布し、ヒトのＡＢＣタンパク質遺伝子の異常がさまざまな疾病を引き起こすことが明らかになり、ＡＢＣタンパク質の生体防御機構としての重要性が認識されていることから、特にＡＢＣタンパク質の能動輸送機能を調節する物質、すなわちＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質が求められ、これら物質のスクリーニング方法が研究されてきた。特に、ＡＢＣタンパク質の阻害物質については、上記のような多剤耐性を抑制する薬剤（多剤耐性拮抗剤）として有用であることから、該阻害物質のスクリーニング方法については特に盛んに研究されている。
上述したように、ＭＤＲ１遺伝子を薬剤感受性の動物細胞へ導入・発現させると細胞は様々な抗がん剤に対して耐性になる（Ｕｅｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｓｉ．ＵＳＡ，８４，３００４−３００８（１９８７））。このＭＤＲ１発現薬剤耐性細胞を用いてＭＤＲ１の能動輸送を阻害する薬剤をスクリーニングする方法が開発されている。その結果、ベラパミルなどのカルシウムチャネルブロッカーがＭＤＲ１の能動輸送による薬物排出機能を阻害し、細胞を薬剤感受性にすることがわかった。
しかし、上記スクリーニング方法は、動物細胞を用いることから微生物の培養上清などの多数の被検物質をスクリーニングするためには多大の時間と労力を要した。また、ベラパミルなどのカルシウムチャネルブロッカーは、それ自体細胞毒性が強いため、ＭＤＲ１による多剤耐性を克服する薬剤とはならなかった。
そこで、本発明者らは、より簡便で効率的な多剤耐性拮抗剤のスクリーニング方法を開発すべく、宿主として動物細胞を用いる代わりに、真核微生物である酵母を宿主として用いる方法を試みた。その結果、ヒトＭＤＲ１遺伝子を酵母で発現させるとＭＤＲ１遺伝子産物であるＰ−糖タンパク質が、酵母の膜画分においてヒト細胞と同じ配向性で発現している事を知見した。そして該膜画分と、Ｐ−糖タンパク質と親和性が高いことが知られているアジドピンを用いて、Ｐ−糖タンパク質阻害物質、すなわち、多剤耐性拮抗剤をスクリーニングする方法を開発した（特開平２−２５７８７３）。すなわち、該スクリーニング方法とは、Ｐ−糖タンパク質が発現している酵母の膜画分において、試験物質がＰ−糖タンパク質に対するアジドピンの結合をどれだけ阻害するかを測定するという方法である。
しかし、上記方法は操作が煩雑で、微生物の培養上清などの多数の被検物質を効率よくスクリーニングするには十分ではなかった。
また、発明者らは、１９９９年４月の日本農芸化学会大会（日本農芸化学会誌，７３巻，２２２（１９９９））および１９９９年９月の日本生化学会大会（生化学会誌，７１巻，８１２（１９９９））において、放線菌Ｅ−４２０株の生産するＰＤＲ５の能動輸送を阻害する物質を開示している。
しかし、このＰＤＲ５阻害物質の評価は、ＰＤＲ５発現酵母の細胞毒性物質に対する感受性の変化、すなわち細胞毒性物質によるＰＤＲ５発現酵母の増殖阻害効果の変化によって行ったため、ＰＤＲ５の能動輸送を阻害する活性を効率よく評価することは困難であり、そのため該阻害物質の精製はできなかった。
発明の開示
本発明の目的は、ＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質の効率的なスクリーニング方法および当該スクリーニング方法によって見いだされたＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質の提供にある。
特に、本発明の目的は、がん化学療法での最大の課題であるＭＤＲ１遺伝子の増幅・発現による多剤耐性を克服する薬剤が望まれていることから、ＭＤＲ１の能動輸送を阻害し、かつ細胞毒性の低い物質のスクリーニング方法および当該スクリーニング方法によって見いだされた物質を含有する多剤耐性を克服する薬剤の提供にある。
また、本発明の目的は、当該スクリーニング方法によって見いだされたＡＢＣタンパク質の促進物質を含み、体内に有害な異物が侵入しないようにするための、または、血流中の異物から脳などの器官や胎児を保護するための生体防御機能を維持または亢進する薬剤の提供にある。
本発明者らは、特開平２−２５７８７３において開示したＭＤＲ１発現酵母を用いて、ＭＤＲ１の能動輸送機能を阻害する物質のスクリーニングを試みた。しかし、酵母は本来制がん剤に対して耐性であるため、該ＭＤＲ１発現酵母の制ガン剤に対する感受性の変化、すなわち制ガン剤によるＭＤＲ１発現酵母の増殖阻害効果の変化により、ＭＤＲ１の能動輸送機能を阻害する物質をスクリーニングすることが困難であった。
より具体的には、酵母は本来制がん剤に対しすでに十分耐性であるため、当該酵母でＭＤＲ１遺伝子を発現させても耐性が増加したことを評価するのは著しく困難であった。すなわち、宿主酵母細胞の増殖を阻止するための制がん剤の濃度は、動物細胞の増殖を阻止するための濃度の１０００倍以上の高濃度を用いなければならなかったから、ＭＤＲ１遺伝子を発現させた形質転換酵母の該制がん剤に対する耐性を評価することは、該制がん剤の溶解度の点からも実質的に不可能であった。従って、ＭＤＲ１遺伝子を発現させた形質転換酵母の制がん剤耐性を評価できない以上、ＭＤＲ１トランスポーターの能動輸送による該制がん剤を排出する機能を促進または阻害する被験物質の評価を、該制がん剤に対する耐性の変化で評価することはできなかった。
本発明者らは、上記問題点に鑑み、ＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質の簡便かつ効率的なスクリーニング方法の最大の課題は、酵母が種々の薬剤に対して耐性が高いことにあると考え、鋭意研究を重ねた結果、薬剤感受性の高い酵母細胞、例えばＳＹＲ１／ＥＲＧ３変異株を宿主として用いるスクリーング方法を創案し、かかる方法が上記問題点を解決することを知見した。より詳しくは、例えばＳＹＲ１／ＥＲＧ３変異株などの薬剤感受性の高い酵母細胞に、ＡＢＣタンパク質遺伝子を導入し、細胞膜部位に該ＡＢＣタンパク質を発現させた形質転換酵母を指示菌として用い、例えば制がん剤などの当該ＡＢＣタンパク質の能動輸送機能により細胞外に輸送される物質と被検物質とを共存させて、該ＡＢＣタンパク質による能動輸送に及ぼす被検物質の影響を評価する方法であれば、酵母細胞が本来制がん剤に対し耐性を示すことによる上記問題点を解決することを知見した。
より具体的には、（１）薬剤感受性の高い酵母細胞として酵母細胞膜構成成分の１つであるエルゴステロールの合成欠損変異株であるＳＹＲ１／ＥＲＧ３欠損株を宿主として用い、（２）ＡＢＣタンパク質遺伝子として酵母の多剤耐性遺伝子であるＰＤＲ５遺伝子をＳＹＲ１／ＥＲＧ３欠損株に導入して形質転換酵母を作製し、該形質転換酵母の細胞膜部位にＰＤＲ５を発現させ、（３）ＰＤＲ５の能動輸送によって細胞外に排出され、細胞毒性を有するシクロヘキシミドまたはセルレニンと、被検物質の共存下で、（４）指示菌、すなわち前記形質転換酵母の増殖の程度を測定し、前記被検物質の非存在下での増殖の程度と比較するというスクリーニング方法を創案した。該スクリーニング方法において、シクロヘキシミドまたはセルレニンによる指示菌の増殖阻害が被検物質によって促進されるもの、すなわち被検物質が存在しない場合に比して被検物質が存在する場合のほうが指示菌の増殖が抑えられているときは、その被検物質はＡＢＣタンパク質の阻害物質である。一方、シクロヘキシミドまたはセルレニンによる指示菌の増殖阻害が被検物質によって抑制されるもの、すなわち被検物質が存在しない場合に比して被検物質が存在する場合のほうが指示菌の増殖が増大しているときは、その被検物質はＡＢＣタンパク質の促進物質である。
そして、ＰＤＲ５トランスポーターの阻害剤として知られている免疫抑制剤ＦＫ５０６を用いて、上記方法がＡＢＣタンパク質の促進または阻害物質をスクリーニングする方法として有効であることを確認した。すなわち、シクロヘキシミドまたはセルレニンとＦＫ５０６とを共存させると、ＦＫ５０６の非存在下に比して指示菌の増殖が抑制された。すなわち、ＦＫ５０６によりシクロヘキシミドまたはセルレニンの細胞外への排出が阻害され、シクロヘキシミドまたはセルレニンによる指示菌の増殖阻害が促進された。また、ＰＤＲ５トランスポーターによって細胞外に排出されることが知られている蛍光色素ローダミンとＦＫ５０６とを共存させると、ＦＫ５０６の非存在下に比して蛍光色素ローダミンの細胞内蓄積量が増大した。
したがって、本スクリーニング方法を用いれば、ＦＫ５０６と同一の作用を有する物質、つまりＡＢＣタンパク質の阻害物質を簡便かつ効率的にスクリーニングすることができる。また、ＡＢＣタンパク質の促進物質もまた同様である。
また、本発明に係るＡＢＣタンパク質阻害剤のスクリーニング方法において、上記（１）〜（４）の操作に加えて、シクロヘキシミドまたはセルレニンなどのＰＤＲ５の能動輸送によって細胞外に排出される物質を共存させることなしに、被検物質による指示菌の増殖阻害を評価すれば、医薬候補物質の評価に必要な当該被検物質の細胞毒性も同時に評価できる点も本発明の特徴である。
さらに本発明は、上記スクリーニング方法によって得られるＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質を提供することができる。本発明によって得られたＡＢＣタンパク質の阻害物質の１つとして、酵母ＰＤＲ５の能動輸送を阻害する放線菌Ｅ−４２０株由来のＫＰＩがある。またＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質を含む医薬組成物、より具体的には上記ＫＰＩを含む多剤耐性を克服する医薬組成物も本発明の１つである。
すなわち、本発明は、
（１）  （ａ）薬剤感受性の高い酵母細胞にＡＢＣタンパク質遺伝子を導入することによって、細胞膜部位にＡＢＣタンパク質を発現している形質転換酵母細胞を作製し、（ｂ）細胞膜部位に存在するＡＢＣタンパク質によって細胞外に能動輸送され、かつ酵母細胞に対し細胞毒性を有する物質と被検物質の存在下で、該形質転換酵母細胞を培養し、（ｃ）その増殖の程度を前記被検物質の非存在下で培養した場合と比較することを特徴とするＡＢＣタンパク質の能動輸送を促進する物質または阻害する物質をスクリーニングする方法、
（２）  前記（１）に記載の方法でスクリーニングされたＡＢＣタンパク質の能動輸送を促進または阻害する物質について、さらにＡＢＣタンパク質が発現していない薬剤感受性の高い酵母細胞に対する増殖阻害作用を測定することを特徴とするＡＢＣタンパク質の能動輸送を促進または阻害する細胞毒性の低い物質をスクリーニングする方法、
（３）  ＡＢＣタンパク質遺伝子が、多剤耐性の獲得に関与する遺伝子である前記（１）または（２）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（４）  多剤耐性の獲得に関与する遺伝子が、酵母のＰＤＲ５遺伝子である前記（３）に記載のスクリーニング方法、
に関する。
また、本発明は、
（５）  薬剤感受性の高い酵母細胞が、野生株よりも薬剤の細胞膜透過性が増大している変異株酵母細胞であることを特徴とする前記（１）〜（４）に記載のスクリーニング方法、
（６）  変異株酵母細胞が、細胞膜脂質合成遺伝子に変異を有する変異株であることを特徴とする前記（５）に記載のスクリーニング方法、
（７）  細胞膜脂質合成遺伝子に変異を有する変異株が、ＳＹＲ１／ＥＲＧ３遺伝子の欠損変異株または遺伝子破壊株であることを特徴とする前記（６）に記載のスクリーニング方法、
（８）  薬剤感受性の高い酵母細胞にＡＢＣタンパク質遺伝子を導入することによって、細胞膜部位にＡＢＣタンパク質を発現している形質転換酵母細胞、に関する。
また、本発明は、
（９）  前記（１）〜（７）のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得られた化合物、
（１０）  下記式（１）；
2003008644.tif 000002
で示される部分構造を有し、分子量１１９３．７であって、かつ、ＡＢＣタンパク質が有する物質輸送を阻害する作用を有する化合物またはその還元体、エーテル体もしくはエステル体、
（１１）  放線菌Ｅ−４２０株の培養上清から得られることを特徴とする前記（１０）に記載の化合物またはその還元体、エーテル体もしくはエステル体、
に関する。
また、本発明は、
（１２）一般式（２）Ａ−Ｂ−Ｃ｛式中、Ａは式（３）；
2003008644.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素またはＣ１−６の低級アルキル基を表す。Ｒは水素または水酸基の置換基を表す。ｍは３，４または５を表す。また、括弧内は、−ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ＝ＣＨ−を表す。）
を表し、
Ｂは式（４−１）；
2003008644.tif 000004
（式中、Ｒは、構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｎは４，５または６を表す。）
または、式（４−２）；
2003008644.tif 000005
（式中、Ｒは、構成単位ごとにまたは置換基ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｐは０，１または２を表す。Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨを表す。）
を表し、
Ｃは式（５）Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｚ（式中、Ｄは式（６）；
2003008644.tif 000006
（式中、Ｒは構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｓは４，５または６を表す。）
を表し、
Ｅは式（７）；
2003008644.tif 000007
（式中、ＲおよびＲ１は、構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｔは２，３または４を表す。）
を表し、
Ｆは式（８）；
2003008644.tif 000008
（式中、Ｒ２は、構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、また、構成単位内で同一であっても異なっていてもよく、ＯＲ（Ｒは前記定義に同じ。）、水素またはＣ１−６の低級アルキル基を表す。ｕは１または２を表す。）
を表し、
Ｇは式（９）；
2003008644.tif 000009
（式中、Ｒは、構成単位ごとにまたは置換基ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。Ｒ１は構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく前記定義に同じ。Ｒ３は構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、Ｃ１−６の低級アルキル基を表す。ｖは３，４または５を表す。ｗは１，２または３を表す。）
を表し、
Ｚは置換基を表す。）
を表す。｝で示される化合物を含有することを特徴とするＡＢＣタンパク質阻害剤、
に関する。
また、本発明は、
（１３）  前記（１２）に記載の一般式（２）において、記号Ａで表される基が下記式（１０）；
2003008644.tif 000010
（式中、Ｒは水素または水酸基の置換基を表す。）
であることを特徴とする前記（１２）に記載のＡＢＣタンパク質阻害剤、
（１４）  前記（１２）に記載の一般式（２）において、記号Ｂで表される基が下記式（１１）；
2003008644.tif 000011
（式中、Ｒは置換基ごとに同一であっても異なっていてもよく水素または水酸基の置換基を表す。）
であることを特徴とする前記（１２）または（１３）に記載のＡＢＣタンパク質阻害剤、
（１５）  前記（１２）に記載の一般式（２）において、ｓが５、ｔが３、ｕが１または２、ｖが４およびｗが２であることを特徴とする前記（１２）〜（１４）のいずれかに記載のＡＢＣタンパク質阻害剤、
に関する。
また、本発明は、
（１６）  下記式（１２）；
2003008644.tif 000012
で示される化合物、そのエーテル体もしくはエステル体、または
下記式（１３）；
2003008644.tif 000013
で示される化合物、そのエーテル体もしくはエステル体を
含有することを特徴とするＡＢＣタンパク質阻害剤、
に関する。
また、本発明は、
（１７）  ＡＢＣタンパク質が、多剤耐性の獲得に関わるＡＢＣタンパク質であることを特徴とする前記（１２）〜（１６）のいずれかに記載のＡＢＣタンパク質阻害剤、
（１８）  ＡＢＣタンパク質が、酵母のＰＤＲ５であることを特徴とする前記（１７）記載のＡＢＣタンパク質阻害剤、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられるＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質遺伝子としては、ＡＴＰ結合領域（ＮＢＦ）を１分子内に少なくとも２つ有し、ＡＴＰによって駆動もしくは制御される約６、１２または１８回程度の膜貫通領域をもつ膜タンパク質をコードする遺伝子であればよい。そのようなＡＢＣタンパク質遺伝子としては、例えばヒト由来の遺伝子として、ＭＤＲ１（Ｕｅｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２），５０５−５０８（１９８７））、ＭＲＰ１（Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８，１６５０−１６５４（１９９２））、ＳＵＲ１（Ｇｌａｓｅｒ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７，１８５−１８８（１９９４））、ＡＢＣ１（Ａｄａｍｓ  ＭＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５５，６３２−６３４（１９９２））などが挙げられ、酵母由来の遺伝子として、ＰＤＲ５（Ｇｏｆｆｅａｕ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，９８−１０２（１９９７））、ＳＮＱ２（Ｇｏｆｆｅａｕ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，５４６（１９９６））、ＳＴＥ６（Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９，３７１−３７８（１９９４））、ＹＣＦ１（Ｓｚｃｚｙｐｋａ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２２８５３−２２８５７（１９９４））、ＹＲＳ１／ＹＯＲ１（Ｇｏｆｆｅａｕ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，５４６（１９９６））などが挙げられるが、特に好ましくはＰＤＲ５が用いられる。
本発明においては、上述したＡＢＣタンパク質遺伝子を導入する宿主として、薬剤感受性の高い酵母細胞を用いることを特長とする。薬剤感受性の高い酵母細胞としては、特に限定されないが、酵母細胞膜の薬剤透過性が向上した変異株を用いるのが好ましい。かかる変異株としては、細胞膜脂質合成遺伝子に変異を有する変異株が好ましい。細胞膜脂質合成変異株は、公知の変異株のいずれであってもよい。具体的には、かかる細胞膜脂質合成遺伝子に変異を有する変異株としては、例えば、該遺伝子の全部または一部が欠損している変異株、該遺伝子の全部または一部が置換されている変異株、該遺伝子の一部が逆位されている変異株、該遺伝子の一部が重複されている変異株、該遺伝子の一部が転座されている変異株、該遺伝子が遺伝子断片の挿入により中断されている変異株などが挙げられる。また、本発明において用いる上記宿主として、細胞膜脂質合成遺伝子の遺伝子破壊株も好適に用いられる。かかる遺伝子破壊株は、細胞膜脂質合成遺伝子の内部に栄養要求性などのマーカー遺伝子を挿入した遺伝子を作製し、作製された遺伝子組換えＤＮＡを酵母に導入して染色体上のマーカー遺伝子と相同組換えさせることによって、作製することができる。
なお、遺伝子破壊株の作製方法、酵母の形質転換方法、遺伝子組換えＤＮＡの作製方法などの手法は、例えば、モレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８９））に詳細に開示されている。
本発明においては、上記宿主として、酵母細胞膜構成成分の１つであるエルゴステロールの合成遺伝子であるＳＹＲ１／ＥＲＧ３遺伝子が欠損している変異株、またはかかる遺伝子が破壊されている遺伝子破壊株を用いるのが好ましい。なお、ＳＹＲ１／ＥＲＧ３遺伝子の遺伝子破壊株とは、上記手法によって作製されたＳＹＲ１／ＥＲＧ３遺伝子の遺伝子破壊株のことであり、該遺伝子が翻訳されないか、または該遺伝子の遺伝子産物であるエルゴステロールの合成酵素が正常な機能を有しない、すなわちエルゴステロールの合成ができない株をいう。本発明においては、特に、ＳＹＲ１／ＥＲＧ３遺伝子欠損株を用いるのが好ましい。
本発明においては、薬剤感受性の高い酵母細胞に、ＡＢＣタンパク質遺伝子を導入する方法としては、自体公知の方法、例えばモレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８９））に記載されている方法に従ってよい。
上記のようにして作製される形質転換酵母においては、細胞膜部位にＡＢＣタンパク質を発現していることが特に好ましい。
本発明に係るスクリーニング方法においては、細胞膜部位に存在するＡＢＣタンパク質によって細胞外に輸送され、かつ酵母細胞に対し細胞毒性を有する物質（以下、単に「ＡＢＣタンパク質輸送物質」という。）と被検物質の存在下で、該形質転換酵母細胞を培養する。
上記ＡＢＣタンパク質輸送物質は、ＡＢＣタンパク質の能動輸送により細胞外に排出される。上述したように、酵母細胞において異物から自己を守るための防御機構が働くからである。従って、本発明に係るスクリーニング方法においては、上記物質と被検物質との共存下、該形質転換酵母細胞を培養することで、被検物質のＡＢＣタンパク質の能動輸送に与える影響を評価することができる。
ここで、被検物質としては特に限定されず、放線菌などの微生物の培養液であってもよいし、化学合成によって合成されたものでもよい。また、タンパク質であってもよいし、低分子化合物であってもよいし、高分子化合物でもよい。
上記ＡＢＣタンパク質輸送物質は、酵母細胞に対し細胞毒性を有することが望ましい。形質転換酵母の増殖能の変化により、被検物質のＡＢＣタンパク質の能動輸送に与える影響を容易に評価することができるからである。具体的には、被検物質の存在下における形質転換酵母の増殖の程度が、被検物質の非存在下における形質転換酵母の増殖の程度よりも大きい場合は、上記ＡＢＣタンパク質輸送物質が酵母細胞の細胞内から排出されているためであるから、被検物質はＡＢＣタンパク質の能動輸送を促進する物質であると評価できる。一方、被検物質の存在下における形質転換酵母の増殖の程度が、被検物質の非存在下における形質転換酵母の増殖の程度よりも小さい場合は、上記ＡＢＣタンパク質輸送物質が酵母細胞の細胞内に蓄積されているためであるから、被検物質はＡＢＣタンパク質の能動輸送を阻害する物質であると評価できる。
本発明においては、上記ＡＢＣタンパク質輸送物質として、細胞膜部位に存在するＡＢＣタンパク質によって細胞外に輸送され、かつ酵母細胞に対し細胞毒性を有すれば、特に限定されず、いずれを用いてもよい。具体的には、脂溶物質などが挙げられ、より具体的には、例えばシクロヘキシミド、セルレニン、コンパクチン、スタウロスポリン、スルフォメチュロン・メチル、トリフルオロペラジン、ローダミンなどが挙げられる。前記物質は、実施例で用いた酵母のＰＤＲ５が輸送できる物質である。
本発明に係るスクリーニング方法において、上述してきたように、被検物質の存在下における形質転換酵母の増殖の程度が被検物質の非存在下における形質転換酵母の増殖の程度よりも大きい場合、かかる被検物質はＡＢＣタンパク質の能動輸送を促進する物質である。
かかるＡＢＣタンパク質の促進物質は、生体防御機能を維持または亢進するための医薬組成物として有用である。より具体的には、（ａ）例えば脳や精巣の毛細血管内皮、胎盤絨毛膜、小腸や毛細胆管の管腔側膜、腎近位尿細管、造血幹細胞に入った毒物を排出し、体内に有害な生体異物が侵入しないようにする機能、または、（ｂ）血流中に入った生体異物から脳などの重要な器官や胎児を保護する機能などの生体防御機能を維持または亢進するための医薬組成物として有用である。
一方、本発明に係るスクリーニング方法において、上述してきたように、被検物質の存在下における形質転換酵母の増殖の程度が被検物質の非存在下における形質転換酵母の増殖の程度よりも小さい場合、かかる被検物質はＡＢＣタンパク質の能動輸送を阻害する物質である。
かかるＡＢＣタンパク質の阻害物質は、多剤耐性の獲得の予防または多剤耐性の発現の抑制のための医薬組成物として有用である。かかる物質は単独で、またはＡＢＣタンパク質の能動輸送により細胞外に排出され、耐性が生じることとなる薬剤と組み合わせて、医薬組成物として用いられる。前記「ＡＢＣタンパク質の能動輸送により細胞外に排出され、耐性が生じることとなる薬剤」としては、例えばアントラサイクリン類、ビンカアルカロイド類、エトポシド類およびタキソールなどの抗がん剤が代表例として挙げられる。かかる制がん剤と、上記ＡＢＣタンパク質の阻害物質とを組み合わせることにより、多剤耐性を発現するいずれの癌の治療にも用いることができる医薬組成物を提供できる。前記医薬組成物が治療薬として有用である癌は、特に限定するものではないが、例えば乳癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、頸部癌、子宮癌、膀胱癌、脳腫瘍、副腎癌、多発性骨髄腫、耳鼻咽喉癌（食道、喉頭、咽頭を含む）、白血病、リンパ腫、肉腫およびカルシノイド腫瘍などが挙げられる。
本発明に係るスクリーニング方法によって得られるＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質は、その構造等は特に問わない。
より具体的には、ＡＢＣタンパク質の阻害物質としては、以下の化合物が挙げられる。
例えば、下記式（１）；
2003008644.tif 000014
（式中、＊はＣＨ２−を表す。以下も同様である。）で示される部分構造を有し、分子量１１９３．７である化合物が挙げられる。かかる化合物は、放線菌Ｅ−４２０株の培養上清から、具体的には、下記実施例に記載の方法で得ることができる。
ＡＢＣタンパク質の阻害物質としては、上記化合物の還元体、エーテル体またはエステル体も挙げられる。かかる誘導体は、上記化合物に対し、当技術分野で公知の反応手段を用いて容易に変換することができる。
例えば、上記化合物の還元体は、該化合物を還元剤の存在下に反応を行うことによって作製することができる。そのような方法としては、例えば還元剤の存在下において、約−３０〜２００℃程度、瞬時〜７日程度の期間、還元反応を行う方法が挙げられる。このような還元剤としては、例えば水酸化ホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウムまたは水素化トリアセトキシホウ素ナトリウムなどの水素化金属錯体などが挙げられる。
上記化合物のエステル体を製造する方法としては、例えば酸によって加溶媒分解する方法が挙げられる。例えば塩化メチレン、アニソール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸イソプロピル、メタノールまたはエタノールなどの溶媒もしくはそれらと水との混合溶媒中か、または溶媒の非存在下で、例えばギ酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、塩酸または硫酸などを用いて、約０〜１００℃程度の範囲内の温度で約１０〜２４時間程度処理することにより製造することができる。
また、塩基によって加溶媒分解する場合には、例えば炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸カリウム等の無機塩基、またはトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアニリンもしくはピリジン等の有機塩基などを、約−２０〜８０℃程度の範囲内の温度で約１０〜２４時間程度作用させることにより製造することができる。
上記化合物のエーテル体は、酸触媒を用いた脱水によって製造することができる。また、上記化合物を自体公知の方法によりアルコキシドに変換したのち、該アルコキシドとハロアルカンとを反応させることによっても製造することができる。かかる反応はＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ反応として知られており、その反応手段は当技術分野で十分に確立されているので、かかる手法に従えばよい。
上記式（１）で示される部分構造を有し、分子量１１９３．７である化合物として、具体的には、上記式（１）で示される部分構造に下記式で表される基が結合している化合物が挙げられる。該化合物は、ＡＢＣタンパク質の阻害剤として好適に用いることができる。
上述の上記式（１）で示される部分構造に結合し得る好ましい基としては、式（１４−１）；
2003008644.tif 000015
式（１４−２）；
2003008644.tif 000016
または、式（１４−３）；
2003008644.tif 000017
が挙げられる。
ＡＢＣタンパク質の阻害物質の他の具体例としては、例えば一般式（２）Ａ−Ｂ−Ｃで表される化合物が挙げられる。
一般式（２）において、記号Ａで表される基は、
式（３）；
2003008644.tif 000018
（式中、Ｒ１は水素またはＣ１−６の低級アルキル基を表す。Ｒは水素または水酸基の置換基を表す。ｍは３，４または５を表す。また、括弧内は、−ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ＝ＣＨ−を表す。）
で示される。
中でも、記号Ａで表される基が下記式（１０）；
2003008644.tif 000019
（式中、Ｒは上記定義に同じ。）
で示される基であることが好ましい。
一般式（２）において、記号Ｂで表される基は、
式（４−１）；
2003008644.tif 000020
（式中、Ｒは構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく前記定義に同じ。ｎは４，５または６を表す。）
または、式（４−２）；
2003008644.tif 000021
（式中、Ｒは、構成単位ごとにまたは置換基ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｐは０，１または２を表す。Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨを表す。）
で示される。
中でも、記号Ｂで表される基が下記式（１１）；
2003008644.tif 000022
（式中、Ｒは置換基ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。）
で示される基であることが好ましい。
一般式（２）において、記号Ｃで表される基は式（５）Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｚで示される。
記号Ｄで表される基は式（６）；
2003008644.tif 000023
（式中、Ｒは構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｓは４，５または６を表す。）
で示される。
なかでも、ｓが５の場合が好ましい。
記号Ｅで表される基は、式（７）；
2003008644.tif 000024
（式中、ＲおよびＲ１は構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。ｔは２，３または４を表す。）
で示される。
中でも、ｔは３の場合が好ましい。
記号Ｆで表される基は、式（８）；
2003008644.tif 000025
（式中、Ｒ２は構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、また、構成単位内で同一であっても異なっていてもよく、ＯＲ（Ｒは前記定義に同じ。）、水素またはＣ１−６の低級アルキル基を表す。ｕは１または２を表す。）
で示される。
記号Ｇで表される基は、式（９）；
2003008644.tif 000026
（式中、Ｒは、構成単位ごとにまたは置換基ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。Ｒ１は構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、前記定義に同じ。Ｒ３は構成単位ごとに同一であっても異なっていてもよく、Ｃ１−６の低級アルキル基を表す。ｖは３，４または５を表す。ｗは１，２または３を表す。）
で示される。
中でも、ｖは４の場合が好ましく、ｗは２の場合が好ましい。
記号Ｚで表される基は、置換基を表す。Ｚはいずれの置換基でもよく、例えば炭化水素基、ハロゲン（好ましくは、フッ素、塩素、臭素）、アルカノイル基（好ましくはＣ１〜８）、アルカノイルオキシ基（好ましくはＣ１〜８）、アルカノイルアミノ基（好ましくはＣ１〜８）、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基（好ましくはＣ２〜８）、ハロアルキルカルボニル基（好ましくはＣ２〜８）、アルコキシ基（好ましくはＣ１〜８）、ハロアルコキシ基（好ましくはＣ１〜８）、アミノ基、アルキルアミノ基（好ましくはＣ１〜８）、ジアルキルアミノ基（好ましくはＣ１〜１６）、環状アミノ基、アルキルアミノカルボニル基（好ましくはＣ２〜８）、カルバモイル基、水酸基、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、アルキルチオ基（好ましくはＣ１〜８）、アルキルスルホニルオキシ基（好ましくはＣ１〜８）、アルキルスルホニルアミノ基（好ましくはＣ１〜８）または複素環基などが挙げられる。
かかる置換基は、所望によりさらに置換されていても良い。置換基の種類、数および位置は化学的に許容される範囲であれば、特に限定されない。
上記「炭化水素基」としては、例えば、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ３−１０シクロアルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ７−１６アラルキルなどが挙げられる。
より具体的には、Ｃ１−１５アルキルは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどのＣ１−１５アルキル、好ましくは低級（Ｃ１−６）アルキルなどが挙げられる。
Ｃ３−８シクロアルキルとしては、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが挙げられる。
Ｃ２−１０アルケニルは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、例えばビニル、アリール（ａｌｌｙｌ）、クロチル、２−ペンテニル、３−ヘキセニルなど、好ましくは低級（Ｃ２−６）アルケニルなどが挙げられる。
Ｃ３−１０シクロアルケニルとしては、例えば２−シクロペンテニル、２−シクロヘキセニル、２−シクロペンテニルメチル、２−シクロヘキセニルメチルなどが挙げられる。
Ｃ２−１０アルキニルは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、例えばエチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ペンチニル、３−ヘキシニルなどの炭素数２〜１０のアルキニル、好ましくは低級（Ｃ２−６）アルキニルなどが挙げられる。
Ｃ６−１４アリールとしては、例えばフェニル、ナフチルなどのＣ６−１４アリール、好ましくはＣ６−１０アリール、さらに好ましくはフェニルなどが挙げられる。
Ｃ７−１６アラルキルとしては、例えばフェニル−Ｃ１−４アルキル（例えばベンジル、フェネチルなど）などが挙げられる。
上記「アルカノイル基」としては、炭素数１〜８の直鎖状または分枝状のアルカノイル基が好ましく、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基またはピバロイル基などが挙げられる。
上記「アルカノイルオキシ基」としては、炭素数１〜８の直鎖状または分枝状のアルカノイルオキシ基が好ましく、例えば、ホルミルオキシ基、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基またはピバロイルオキシ基などが挙げられる。
上記「アルカノイルアミノ基」としては、炭素数１〜８の直鎖状または分枝状のアルカノイルアミノ基が好ましく、アセチルアミノ基、プロピオニルアミノ基、ブチリルアミノ基またはピバロイルアミノ基などが挙げられる。
上記「アルコキシカルボニル基」としては、炭素数２〜８の直鎖状または分枝状のアルコキシカルボニル基が好ましく、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基またはペンチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
上記「ハロアルキルカルボニル基」としては、炭素数２〜８の直鎖状または分枝状のハロアルコキシカルボニル基が好ましく、例えば、フルオロアセチル基、ジフルオロアセチル基、トリフルオロアセチル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、ブロモアセチル基、ジブロモアセチル基、トリブロモアセチル基、３−クロロプロピオニル基または４−クロロブチリル基などである。好ましくはフルオロアセチル基、ジフルオロアセチル基、トリフルオロアセチル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基またはトリクロロアセチル基などが挙げられる。
上記「アルコキシ基」とは、炭素数１〜８の直鎖状または分枝状のアルコキシ基が好ましく、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基またはヘキシルオキシ基などが挙げられる。
上記「ハロアルコキシ基」とは、前記「アルコキシ基」にハロゲン原子が置換したものを表し、例えばフルオロメトキシ基、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、クロロメトキシ基、ジクロロメトキシ基、トリクロロメトキシ基、ブロモメトキシ基、ジブロモメトキシ基、トリブロモメトキシ基、ヨードメトキシ基、ジヨードメトキシ基、トリヨードメトキシ基、２−フルオロエトキシ基、２，２−ジフルオロエトキシ基、２，２，２−トリフルオロエトキシ基、２−クロロエトキシ基、２，２−ジクロロエトキシ基、２，２，２−トリクロロエトキシ基、２−ブロモエトキシ基、２，２−ジブロモエトキシ基、２，２，２−トリブロモエトキシ基、３−クロロプロポキシ基または４−クロロブトキシ基などが挙げられる。
上記「アルキルアミノ基」とは、アミノ基に炭素数１〜８の直鎖状または分枝状のアルキル基が置換したものを表し、例えばメチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、イソペンチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ペンチルアミノ基またはヘキシルアミノ基などが挙げられる。
上記「ジアルキルアミノ基」とは、アミノ基に炭素数１〜８の直鎖状または分枝状のアルキル基が二置換したものを表し、アルキル基の種類は異なってもよい。例えばジメチルアミノ基、エチルメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、メチルプロピルアミノ基、エチルプロピルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基、ジイソブチルアミノ基、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基、ジペンチルアミノ基、ジイソペンチルアミノ基、ジ−ｔｅｒｔ−ペンチルアミノ基またはジヘキシルアミノ基などが挙げられる。
上記「環状アミノ基」とは、アミノ基が環状になったものを表し、好ましくは４〜８員環アミノ基であって、例えばアゼチジニル基、ピロリジニル基、ピペリジノ基、さらにヘテロ原子として酸素原子、硫黄原子、窒素原子を有するモルホリノ基、チオモルホリノ基またはピペラジニル基などであり、ピペラジニル基の４位窒素原子には低級アルキル基またはアリール基などが置換してもよい。
上記「アルキルアミノカルボニル基」とは、「アルキルアミノ」部が前記「アルキルアミノ基」で示したものを表し、例えばメチルアミノカルボニル基、エチルアミノカルボニル基、プロピルアミノカルボニル基、イソプロピルアミノカルボニル基、ブチルアミノカルボニル基、イソブチルアミノカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノカルボニル基、ペンチルアミノカルボニル基、イソペンチルアミノカルボニル基、ｔｅｒｔ−ペンチルアミノカルボニル基またはヘキシルアミノカルボニル基などが挙げられる。
上記「アルキルチオ基」としては、炭素数１〜８の直鎖または分枝鎖アルキルチオ基が好ましく、例えばメチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ペンチルチオ基、ｔｅｒｔ−ペンチルチオ基またはヘキシルチオ基などが挙げられる。
上記「アルキルスルホニルオキシ基」としては、炭素数１〜８の直鎖または分枝鎖アルキルスルホニルオキシ基が好ましく、例えばメチルスルホニルオキシ基、エチルスルホニルオキシ基、プロピルスルホニルオキシ基、イソプロピルスルホニルオキシ基、ブチルスルホニルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルスルホニルオキシ基、ペンチルスルホニルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルスルホニルオキシ基またはヘキシルスルホニルオキシ基などが挙げられる。
上記「アルキルスルホニルアミノ基」とは、アミノ基に炭素数１〜８の直鎖または分枝鎖アルキルスルホニル基が置換したものを表し、例えばメチルスルフホニルアミノ基、エチルスルホニルアミノ基、プロピルスルホニルアミノ基、イソプロピルスルホニルアミノ基、ブチルスルホニルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルスルホニルアミノ基、ペンチルスルホニルアミノ基、ｔｅｒｔ−ペンチルスルホニルアミノ基またはヘキシルスルホニルアミノ基などが挙げられる。
複素環基としては、例えば、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニルなどの１〜２個のヘテロ原子を含有する飽和の５〜６員複素環基などが挙げられる。また、例えば、フラン、チオフェン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、テトラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアゾールなどの窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれた１〜２種のヘテロ原子１〜４個を含有する５〜６員の芳香族複素環などが挙げられる。
上記一般式（２）；Ａ−Ｂ−Ｃで表される化合物において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３で表される低級アルキル基としては、特に限定されず、上述のような置換基が挙げられる。
上記一般式（２）；Ａ−Ｂ−Ｃで表される化合物において、Ｒで表される水酸基の置換基としては、特に限定されない。
具体的には、水酸基における置換基としては、（１）置換されていてもよい炭化水素基が挙げられる。炭化水素基としては、上述のような置換基が挙げられる。
また、水酸基における置換基としては、（２）ヘテロ原子を含有していてもよいシクロアルキルも挙げられる。より具体的には、例えば、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニルなどの１〜２個のヘテロ原子を含有する飽和の５〜６員複素環基などが挙げられる。
さらに、水酸基における置換基としては、（３）ホルミルまたは置換されていてもよいアシルも挙げられる。より具体的には、例えば炭素数２〜４のアルカノイル（例えばアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリルなど）、炭素数１〜４のアルキルスルホニル（例えばメタンスルホニル、エタンスルホニルなど）などが挙げられる。
（１）置換されていてもよい炭化水素基、または（３）置換されていてもよいアシルにおける置換基としては、ハロゲン（例えば、フッ素，塩素、臭素、ヨウ素など）、ニトロ、シアノ、水酸基、置換されていてもよいチオール基（例、チオール、Ｃ１−４アルキルチオなど）、置換されていてもよいアミノ基（例、アミノ、モノＣ１−４アルキルアミノ、ジＣ１−４アルキルアミノ、テトラヒドロピロール、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピロール、イミダゾールなどの５〜６員の環状アミノなど）、エステル化またはアミド化されていてもよいカルボキシル基（例、カルボキシル、Ｃ１−４アルコキシカルボニル、カルバモイル、モノＣ１−４アルキルカルバモイル、ジＣ１−４アルキルカルバモイルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ１−４アルキル（例、トリフルオロメチル、メチル、エチルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシなど）、ホルミル、Ｃ２−４アルカノイル（例、アセチル、プロピオニルなど）、Ｃ１−４アルキルスルホニル（例、メタンスルホニル、エタンスルホニルなど）、置換されていてもよい５〜６員の芳香族複素環（例、フラン、チオフェン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、テトラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアゾールなどの窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれた１〜２種のヘテロ原子１〜４個を含有する５〜６員の芳香族複素環など；なお、該複素環が有していてもよい置換基としては、ハロゲン（例、フッ素，塩素、臭素、ヨウ素など）、ニトロ、シアノ、水酸基、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲン化されていてもよいＣ１−４アルキル（例、トリフルオロメチル、メチル、エチルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ１−４アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシなど）、ホルミル、Ｃ２−４アルカノイル（例、アセチル、プロピオニルなど）、Ｃ１−４アルキルスルホニル（例、メタンスルホニル、エタンスルホニルなど）などが挙げられる。）などが挙げられる。
一般式（２）で表される化合物は、放線菌の培養上清から単離することができる式（１）で示される部分構造を有する上記化合物から当技術分野において知られている公知の方法によって容易に製造することができる。
本発明に係るＡＢＣタンパク質の阻害物質は、一般式（２）で表される化合物の薬理学的に許容される塩であっても良い。「薬理学的に許容される塩」としては、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
本発明に係るＡＢＣタンパク質の阻害物質の他の具体的な化合物としては、下記式（１２）；
2003008644.tif 000027
で示される化合物またはそのエーテル体もしくはエステル体が挙げられる。
本発明に係るＡＢＣタンパク質の阻害物質のさらに他の具体的な化合物としては、下記式（１３）；
2003008644.tif 000028
で示される化合物、またはそのエーテル体もしくはエステル体が挙げられる。
なお、上記式（１２）または式（１３）で表される化合物のエーテル体もしくはエステル体は、上述したような公知の方法を用いて容易に製造することができる。
本発明は、上述してきたＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質を含む医薬組成物を提供する。
かかる医薬組成物は、上述してきたＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質を、そのままもしくは自体公知の薬理学的に許容しうる担体などと混合して哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サルなど）に対して用いることができる。
投与量は、疾患の種類、その状態の重篤度、患者の年令、体重、性別及び使用する診断または治療物質の種類など、種々の因子によって左右される。熟達した臨床医ならば、患者を診断しまたは処置するために必要な化合物または医薬組成物の有効量は容易に決定または処方することができる。簡便には、当業者ならば初めは比較的少用量を使用し、次いで最大応答が得られるまでその用量を増大させる。
本発明に係る医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの固形製剤；又はシロップ剤、注射剤などの液状製剤など、公知の剤形をとっていてよい。また、本発明に係る医薬組成物は、経口投与することもできるし、非経口的に投与することもできる。
上記「薬学的に許容される担体」としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。
また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
実施例
［実施例１］  ＰＤＲ５トランスポーター阻害物質のスクリーニング系の構築
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母は細胞膜の薬剤透過性が低いため薬剤に対する耐性が高く、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母を薬剤に対する感受性の変化でＰＤＲ５トランスポーター阻害物質のスクリーニングに用いることはできなかった。
一方、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母のエルゴステロール合成変異株（Δｓｙｒ１／ｅｒｇ３）が種々の薬剤に対する感受性が高くなることことが知られており（Ｈｅｍｍｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，４８２−４８６（１９９５））、細胞膜のエルゴステロールの欠損が細胞膜の透過性を高めると考え、エルゴステロール合成変異株（Δｓｙｒ１／ｅｒｇ３）をＰＤＲ５トランスポーター阻害物質のスクリーニングにおいて指示菌として用いることとした。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ａ（野生型）のＳＹＲ１／ＥＲＧ３遺伝子破壊株ＫＨＷ１（Δｓｙｒ１／ｅｒｇ３：：ＨＩＳ３）から、ＰＤＲ５を欠失した二重遺伝子破壊株ＫＨＷ２（Δｓｙｒ１／ｅｒｇ３：：ＨＩＳ３  Δｐｄｒ５：：ＬＥＵ２）、酵母の別の薬剤排出ＡＢＣトランスポーターであるＳＮＱ２を欠失した二重遺伝子破壊株ＫＨＷ４（Δｐｄｒ５：：ＬＥＵ２  Δｓｎｑ２：：ＨＩＳ３）、およびＰＤＲ５とＳＮＱ２を欠失した三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３（Δｓｙｒ１／ｅｒｇ３：：ＨＩＳ３  Δｐｄｒ５：：ＬＥＵ２  Δｓｎｑ２：：ＨＩＳ３）を作成した。多重遺伝子破壊株の作成は、ＬＥＵ２遺伝子またはＨＩＳ３遺伝子をマーカーとした遺伝子破壊用プラスミドによって宿主菌株を形質転換し、ロイシンまたはヒスチジン要求性の回復を指標に各薬剤耐性遺伝子がＬＥＵ２またはＨＩＳ３遺伝子の挿入により破壊された菌株を選択することによって行った。各多重遺伝子破壊株はシクロヘキシミドおよびセルレニンに対する感受性の増大で確認し、ＰＤＲ５およびＳＮＱ２の遺伝子破壊はサザーンハイブリダイゼーションによって確認した。
上記の各薬剤耐性遺伝子破壊株および野生株を宿主とし、ＰＤＲ５遺伝子を高コピー数プラスミドｐＹＩ（Ｈｉｒａｔａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２６，２８５−２９４（１９９４））に挿入したｐＹＩ−ＰＤＲ５またはｐＹＩを形質転換した酵母のシクロヘキシミドおよびセルレニンに対する薬剤感受性を最小阻止濃度（ＭＩＣ）で測定した結果を第１表に示した。ＭＩＣの測定は、各種濃度の薬剤を含むＳＤ−ウラシル寒天培地（Ａｄａｍｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１４７−１４９（１９９７））上に、滅菌水に懸濁した各菌株の懸濁液（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を、各スポットあたり約４ｘ１０４ｃｅｌｌｓになるようにスポットし、３２℃で２日間培養後、各酵母菌株の増殖が認められない薬剤の最小濃度を知ることによって測定した。測定結果を第１表に示した。
2003008644.tif 000029
ＳＹＲ１遺伝子破壊株（ＬＨＷ１＋ｐＹＩ）のシクロヘキシミドおよびセルレニンに対する感受性は、野生株（Ｗ３０３−１Ａ＋ｐＹＩ）に比べて各々４倍および２倍増大した。三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３のシクロヘキシミドおよびセルレニンに対するＭＩＣ値は、各々０．０１μｇ／ｍｌおよび０．２μｇ／ｍｌであるのに対して、野生株Ｗ３０３−１Ａのシクロヘキシミドおよびセルレニンに対するＭＩＣ値は、各々０．１６μｇ／ｍｌおよび０．８μｇ／ｍｌであった。従って、三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３のシクロヘキシミドおよびセルレニンに対する感受性は、野生株から各々１６倍および４倍増大したことになる。
次に、寒天ウェル拡散法による増殖阻害アッセイよって、ＰＤＲ５トランスポーターによるシクロヘキシミドおよびセルレニンの排出を阻害する物質をスクリーニングする方法を構築した。
ＳＤ−ウラシル培地で増殖した酵母細胞を１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように４ｍｌ、５０℃に溶解した軟寒天に懸濁し、必要な場合はシクロヘキシミドあるいはセルレニンなどの薬剤を加え混合した後、同濃度の薬剤を含むＳＤ−ウラシル培地の上に積層した。軟寒天が固化した後、軟寒天の部分に直径８ｍｍの穴をあけ、その中に被検物質を５０μｌ注ぎ込んだ。このプレートを３２℃で４８時間培養した後、ウェルの周囲の増殖阻止円の濃度を測定することにより、被検物質のＰＤＲ５トランスポーターによるシクロヘキシミドおよびセルレニンの排出を阻害する活性を評価した。
増殖阻害活性の単位を以下のように定義した。即ち、三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３（Δｓｙｒ１／ｅｒｇ３：：ＨＩＳ３  Δｐｄｒ５：：ＬＥＵ２  Δｓｎｑ２：：ＨＩＳ３）を用い、８〜２００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを標準物質として、上記寒天ウェル拡散法によって測定した阻止円の直径をシクロヘキシミド濃度の対数に対してプロットすると、第１図に示すように直線関係があることがわかった。ｐＹＩを含むＫＨＷ３に対して、２０ｍｍの阻止円を示す増殖阻害活性を１ｍｌあたり２０阻害単位（ＩＵ／ｍｌ）と定義し、上記シクロヘキシミドの標準曲線を用いて、被検物質の阻害単位を算定した。
上記寒天ウェル拡散法によるＰＤＲ５トランスポーター阻害物質のスクリーニングを行う際の、シクロヘキシミドおよびセルレニンの適切な濃度を知るために、４種のアッセイプレートを用意した。（１）被検物質の細胞毒性をしらべるために、ｐＹＩを含む三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３（Δｓｙｒ１／ｅｒｇ３：：ＨＩＳ３  Δｐｄｒ５：：ＬＥＵ２  Δｓｎｑ２：：ＨＩＳ３）をＳＤ−ウラシル寒天培地にスプレッドしたアッセイプレート。（２）ＰＤＲ５遺伝子を高発現させるためにｐＹＩ−ＰＤＲ５を含む三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３を、薬剤を含まないＳＤ−ウラシル寒天培地にスプレッドしたアッセイプレート。（３）（２）と同じ形質転換酵母を、シクロヘキシミドを含むＳＤ−ウラシル寒天培地にスプレッドしたアッセイプレート。（４）（２）と同じ形質転換酵母を、セルレニンを含むＳＤ−ウラシル寒天培地にスプレッドしたアッセイプレート。
第１表に示したように、この４種のアッセイプレートを用いて、ｐＹＩ−ＰＤＲ５を含む三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３およびｐＹＩベクターを含むＫＨＷ３のＭＩＣを測定した結果、ｐＹＩ−ＰＤＲ５を含む三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３の増殖は阻害しないが、ベクターｐＹＩを含むＫＨＷ３の増殖阻害を起こすシクロヘキシミドおよびセルレニンの濃度を、各々０．０４μｇ／ｍｌおよび０．４μｇ／ｍｌとし、この濃度でＰＤＲ５トランスポーター阻害物質のスクリーニングを行った。
ＰＤＲ５トランスポーターの機能を阻害するが、それ自体は細胞毒性がない被検物質は、（１）および（２）のプレートにおいては阻止円を形成せず、（３）および（４）のプレートでは、細胞内のシクロヘキシミドおよびセルレニンを細胞外に排出するＰＤＲ５トランスポーターの機能が阻害されるために、阻止円が形成される。ＰＤＲ５トランスポーターの阻害物質ではあるが、その物質自体が細胞毒性を示す場合は、（１）および（２）のプレートでも阻止円が形成され、（３）および（４）のプレートでは（１）および（２）のプレートよりも大きな阻止円が形成される。この場合、ＰＤＲ５トランスポーター阻害物質自体が、ＰＤＲ５トランスポーターによって細胞外に排出される場合は、（２）のプレートには阻止円が形成されないが、（１）、（３）および（４）のプレートよりも小さな阻止円が形成される。従って、この方法は細胞毒性のないＰＤＲ５トランスポーター阻害物質の効率的なスクリーニング方法であることを示している。
［実施例２］  ＦＫ５０６によるＰＤＲ５トランスポーター阻害物質のスクリーニング方法の検証
免疫抑制剤ＦＫ５０６はＰＤＲ５トランスポーターによるデキサメタソンおよびアゾールの輸送を阻害することから、ＰＤＲ５トランスポーター阻害物質であることが推測されているが（Ｅｇｎｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌ．，９，５２３−５４３（１９９８））、このＦＫ５０６をモデル化合物として、上記スクリーニング方法におけるＦＫ５０６の増殖阻害効果、即ちＰＤＲ５トランスポーター阻害活性を調べることにより、上記寒天ウェル拡散法によるＰＤＲ５トランスポーター阻害物質のスクリーニング方法を検証した。
ｐＹＩベクターを含む三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３（ＫＨＷ３＋ｐＹＩ）およびＰＤＲ５を高発現するプラスミドｐＹＩ−ＰＤＲ５を含むＫＨＷ３（ＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５）を指示菌として用い、シクロヘキシミドは０．０４μｇ／ｍｌ、セルレニンは０．４μｇ／ｍｌになるようにＳＤ−ウラシル培地に加えた。５０μｌのＦＫ５０６溶液（１２．５μｇ／ｍｌ）をウェルに添加し、３２℃で４８時間培養した。第２図に示すように、ＦＫ５０６はＫＨＷ３＋ｐＹＩの増殖を阻害しないし、ＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５の増殖も阻害しないが、ＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５の増殖は、シクロヘキシミドとＦＫ５０６、またはセルレニンとＦＫ５０６を共存させると阻害された。またＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５の増殖は、シクロヘキシミドまたはセルレニン単独では阻害されなかった。この結果は、ＦＫ５０６がＰＤＲ５トランスポーターの機能、すなわち薬剤の細胞外への排出を阻害し、その結果シクロヘキシミドまたはセルレニンが酵母細胞内に蓄積し、酵母の増殖が阻害されたことを示している。
ＦＫ５０６がＰＤＲ５トランスポーターの薬剤排出機能を阻害することを確認するために、ＦＫ５０６がローダミン６Ｇの細胞外排出に及ぼす効果を調べた。ローダミン６ＧはＰＤＲ５トランスポーターにより細胞外へ排出されることが知られているが（Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３１５４３−３１５４８，（１９９６））、酵母細胞とＦＫ５０６およびローダミン６Ｇを共存させた場合、ＰＤＲ５トランスポーターによってローダミン６Ｇの細胞外への排出が阻害されるため、細胞内にローダミン６Ｇが蓄積する、という仮説を証明するため以下の実験を行った。上記酵母菌株、ＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５およびＫＨＷ３＋ｐＹＩを種々の濃度のローダミン６Ｇを含むＳＤ−ウラシル培地で、３２℃、２４時間、マイクロタイタープレート中で静置培養して、５４０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、増殖度を調べた。ローダミン６Ｇ無添加時の増殖度が５０％になるローダミン濃度をＩＣ５０とした。第３図に示したように、ＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５は細胞毒性のあるローダミン６Ｇに対して耐性を示し、ＩＣ５０は９．５μｇ／ｍｌだったのと比較して、ＫＨＷ３＋ｐＹＩはローダミン６Ｇに対する感受性が著しく高く、ＩＣ５０は０．０５μｇ／ｍｌであった。この結果は、上記スクリーニング方法においてローダミン６ＧがＰＤＲ５トランスポーターによって排出されることを示している。
ローダミン６Ｇの細胞内蓄積に及ぼすＦＫ５０６の効果を、蛍光光度計による細胞内のローダミン６Ｇの濃度を測定することにより調べた。ＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５、ＫＨＷ３＋ｐＹＩおよびｐＹＩを含む野生株（Ｗ３０３−１Ａ＋ｐＹＩ）をＳＤ−ウラシル培地で培養し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で２５μｇ／ｍｌのＦＫ５０６と３２℃、２時間保持した。１μｇ／ｍｌのローダミン６Ｇと３２℃で３０分、保持した後、ＰＢＳで洗浄して、Ｆ−２０００型蛍光光度計（日立製作所）製を用いて、５２９ｎｍの励起光、５５３ｎｍの蛍光で細胞内のローダミン６Ｇ濃度を測定した。
第４図に示したように、ＫＨＷ３＋ｐＹＩは、ＦＫ５０６存在下のＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５と同等レベルのローダミン６Ｇを蓄積したが、ＦＫ５０６非存在下のＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５およびＷ３０３−１Ａ＋ｐＹＩのローダミン６Ｇ蓄積量は、ＦＫ５０６存在下のＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５の蓄積量に比べて低かった。
以上の結果は、ＦＫ５０６がＰＤＲ５トランスポーターの特異的阻害物質であることを示していると共に、上記ＰＤＲ５トランスポーター阻害物質のスクリーニング方法が有効であることを示している。また、ＰＤＲ５を別のＡＢＣトランスポーターであるＳＮＱ２に代えて、同様の寒天ウェル拡散法によるＦＫ５０６のＳＮＱ２トランスポーター阻害活性を調べたところ、ＦＫ５０６にＳＮＱ２トランスポーター阻害活性は認められなかった。従って、ＦＫ５０６のＡＢＣトランスポーター阻害活性はＰＤＲ５トランスポーターに特異的であり、上記寒天ウェル拡散法によって、細胞毒性のないＰＤＲ５トランスポーターの特異的な阻害物質を効率的にスクリーニングすることができることが確認された。
［実施例３］  ＰＤＲ５トランスポーター阻害物質ＫＰＩの精製と物理化学的性質
１０，０００株以上の放線菌を、グルコースブイヨン培地（１％グルコース、１％肉エキス、１％ポリペプトン、０．３％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で培養し、培養上清を実施例１に記載した寒天ウェル拡散法によって、細胞毒性の低いＰＤＲ５トランスポーター阻害物質のスクリーニングを行った。培養上清５０μｌを直径８ｍｍのウェルに添加し、プレートを３２℃、２日間培養した。シクロヘキシミドまたはセルレニンを含む寒天培地で、指示菌をＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５とした場合に増殖阻害による阻止円が認められるが、薬剤無添加培地で指示菌をＫＨＷ３＋ｐＹＩとした場合には阻止円の大きさが極めて小さい培養上清を複数見いだした。その中でＰＤＲ５トランスポーター阻害活性の強い放線菌Ｅ−４２０株の培養上清から、ＰＤＲ５トランスポーター阻害物質を精製した。放線菌Ｅ−４２０株は、菌学的諸性質および１６ＳｒＲＮＡの配列解析などからキタサトスポーラ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ）属であることがわかったので、本菌をＫｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．とした。また、放線菌Ｅ−４２０株の生産するＰＤＲ５トランスポーター阻害物質をＫＰＩ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ＰＤＲ５  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）とした。１阻害ユニット（ＩＵ）は、実施例１に記載したように、２０ｍｍの阻止円を示す増殖阻害活性を１ｍｌあたり２０阻害単位（ＩＵ／ｍｌ）とするという定義に基づいて算定した。
Ｅ−４２０株をグルコースブイヨン培地で培養して得た培養上清４Ｌから、ＫＰＩを精製した。培養上清４Ｌをエバポレーターで５倍に濃縮後、１−ブタノールで抽出し、減圧乾固後の残留物を溶媒Ａ（クロロホルム：メタノール：水＝６０：３０：８，ｖ／ｖ／ｖ）に溶解した。溶解物をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社製、スウェーデン）に添加し、カラムを溶媒Ａとメタノールで洗浄後、溶媒Ａと溶媒Ｂ（クロロホルム：メタノール：４Ｍ酢酸ナトリウム＝６０：３０：８，ｖ／ｖ／ｖ）の直線濃度勾配で溶出した。活性画分を集め、１−ブタノールで抽出し濃縮後、溶媒Ｃ（クロロホルム：メタノール：水＝７０：３０：２，ｖ／ｖ／ｖ）で平衡化したイアトロビーズ６ＲＳ−８０６０カラム（１．５ｘ８０ｃｍ，イアトロン社製）に添加した。活性画分を溶媒Ｃと溶媒Ｄ（クロロホルム：メタノール：水＝３０：７０：４，ｖ／ｖ／ｖ）の直線濃度勾配で溶出した。ＰＤＲ５トランスポーター阻害物質ＫＰＩは、さらにセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーで精製し、放線菌Ｅ−４２０株の培養上清４Ｌから、７％の収率で約４ｍｇの精製ＫＰＩを得た。
ＫＰＩの物理化学的性質を第２表に示した。ＫＰＩは薄黄色の非結晶化合物で、明確な融点を有さず、１８０℃以上で分解した。ＫＰＩの分子量はＦＡＢ−ＭＡＳＳ分析によって１，１９３であり、ＦＡＢ−ＭＳ−ＭＳ分析によってｍ／ｚ１０４２．４２にフラグメントのピークが認められた。ＫＰＩはピリジンおよびジメチルスルフォキシドには溶解するが、水、酢酸エチルおよびクロロホルムには溶解しなかった。ＫＰＩはｐＨ７．０からｐＨ９．０の間で安定で、６５℃、２５分間の加熱後も９０％以上のＰＤＲ５トランスポーター阻害活性が残存していた。ＫＰＩのメタノール溶液は、２５８ｎｍ、２７０ｎｍおよび２８０ｎｍの紫外部に極大吸収をもち、共役トリエン構造を有することが推定されが、この共役トリエン構造は酸性でも安定であった。
ＫＰＩのＮＭＲ分析をＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、ＲＯＥＳＹ、ＴＯＣＳＹおよびＨＳＱＣの各手法で行った。ピリジン−ｄ５中での１３Ｃ−ＮＭＲ分析の結果から５０のピークが確認されたが、炭素原子の正確な数を定めることはできなかった。酸素原子が結合した２０個の炭素原子が見いだされたが（９９．９，８１．２，８０．４，７８．９，７７．７，７６．９，７５．８，７４．９，７４．７，７３．８，７３．２，７３．０，７２．８，７１．８，７１．７，７１．２，７０．９，７０．８，６９．５，６９．０ｐｐｍ）、そのうちの１つ（９９．９ｐｐｍ）はアセタール炭素であることがわかった。第５図に、１Ｈ−ＮＭＲ分析で明らかになったＫＰＩの部分構造を示した。
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［実施例４］  ＫＰＩの生物学的性質
ＫＰＩのＰＤＲ５トランスポーターに対する阻害活性を、実施例１に記載の寒天ウェル拡散法によって詳細に解析した。ｐＹＩベクターを含む三重遺伝子破壊株ＫＨＷ３（ＫＨＷ３＋ｐＹＩ）およびＰＤＲ５を高発現するプラスミドｐＹＩ−ＰＤＲ５を含むＫＨＷ３（ＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５）を指示菌として用い、シクロヘキシミドおよびセルレニンを共存させた場合の増殖阻害による阻止円の大きさを、両薬剤を共存させない場合の阻止円の大きさと比較して、ＰＤＲ５トランスポーターに対するＫＰＩの阻害活性を評価した。実施例１に記載したように、１阻害ユニット（ＩＵ）は、実施例１に記載したように、２０ｍｍの阻止円を示す増殖阻害活性を１ｍｌあたり２０阻害単位（ＩＵ／ｍｌ）とするという定義に基づいて算定した。
第６図に示したように、ＫＰＩ（６μｇ／ｍｌ）は、実施例１に記載の寒天ウェル拡散法でＫＨＷ３＋ｐＹＩおよびＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５に対して、各々、２５ＩＵ／ｍｌおよび３０ＩＵ／ｍｌのＰＤＲ５トランスポーター阻害活性を有していたが、シクロヘキシミドおよびセルレニンを共存させると、ＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５に対する増殖阻害活性は、各々４倍および３倍増大した。この結果は、ＫＰＩがＰＤＲ５トランスポーターの機能、すなわち薬剤の細胞外への排出を阻害し、その結果シクロヘキシミドまたはセルレニンが酵母細胞内に蓄積し、酵母が死滅したことを示している。また、ＰＤＲ５のホモログで、４−ニトロキノリンオキシドの細胞外への排出を行っているＳＮＱ２について、ＫＰＩのＳＮＱ２トランスポーターに対する阻害効果がなかったことから、ＫＰＩはＰＤＲ５トランスポーターを特異的に阻害することがわかった。
ＫＰＩがＰＤＲ５トランスポーターの薬剤排出機能を阻害することを確認するために、ＫＰＩの蛍光色素ローダミン１２３の細胞外排出に及ぼす効果を、実施例２に記載の方法で調べた。ローダミン１２３の細胞内蓄積に及ぼすＫＰＩの効果を、蛍光光度計による細胞内のローダミン１２３の濃度を測定することにより調べた。ＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５、ＫＨＷ３＋ｐＹＩおよびｐＹＩを含む野生株（Ｗ３０３−１Ａ＋ｐＹＩ）をＳＤ−ウラシル培地で培養し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で０、２０、３０μｇ／ｍｌのＫＰＩと３２℃、２時間、保持した。次に、１μｇ／ｍｌのローダミン１２３と３２℃で３０分、保持した後、ＰＢＳで洗浄して、Ｆ−２０００型蛍光光度計（日立製作所）製を用いて、５０５ｎｍの励起光、５３４ｎｍの蛍光で細胞内のローダミン１２３濃度を測定した。
第７図に示したように、ＫＰＩ非存在下でのＷ３０３−１Ａ＋ＰＹＩおよびＫＰＩ存在下でのＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５のローダミン１２３の蓄積量は、低かったが、２０および３０μｇ／ｍｌのＫＰＩ存在下でのＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５のローダミン１２３の蓄積量はＫＰＩの濃度に依存して増加し、ＫＰＩ非存在下でのＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５の蓄積量の、各々、３倍および４倍に達し、ＫＰＩ非存在下でのＫＨＷ３＋ｐＹＩの蓄積量と同等のレベルであった。
以上の結果は、ＫＰＩがＰＤＲ５トランスポーターの特異的阻害剤であることを示していると共に、実施例１に記載のＰＤＲ５トランスポーター阻害剤のスクリーニング方法が有効であることを示している。また、ＰＤＲ５を別のＡＢＣトランスポーターであるＳＮＱ２に代えて、同様の寒天ウェル拡散法によるＫＰＩのＳＮＱ２トランスポーター阻害活性を調べたところ、ＫＰＩにＳＮＱ２トランスポーター阻害活性は認められなかった。従って、ＫＰＩのＡＢＣトランスポーター阻害活性はＰＤＲ５トランスポーターに特異的であり、上記寒天ウェル拡散法によって、細胞毒性の低いＰＤＲ５トランスポーターの特異的な阻害物質を効率的にスクリーニングすることができることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明においては、薬剤感受性の高い酵母細胞を宿主として用いることにより、該宿主に導入したＡＢＣタンパク質遺伝子の遺伝子産物であるＡＢＣタンパク質の能動輸送に対して被検物質が示す阻害活性または促進活性を効率よく評価することできる。すなわち、薬剤感受性の高い酵母細胞にＡＢＣタンパク質遺伝子を導入することによって細胞膜部位にＡＢＣタンパク質を発現している形質転換酵母細胞を作製し、かかる細胞を用いることによって、微生物の培養上清などの多数の被検物質の中から、ＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質を効率よくかつ簡便にスクリーニングすることができる。
本発明はまた、上記スクリーニングに方法によって得られるＡＢＣタンパク質の促進物質または阻害物質を提供する。
ＡＢＣタンパク質の促進物質またはそれを含む医薬組成物は、生体防御機能を維持または亢進する医薬として有用である。一方、ＡＢＣタンパク質の阻害物質またはそれを含む医薬組成物は、多剤耐性の獲得の予防または発達の抑制のための医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、寒天ウェル拡散法によって測定した阻止円の直径とシクロヘキシミド濃度の対数の関係を示す。
第２図は、寒天ウェル拡散法による被検物質のＰＤＲ５トランスポーター阻害活性を示す。
第３図は、ＰＤＲ５トランスポーターによる細胞内のローダミン６Ｇの濃度変化を示す。黒丸はＫＨＷ３＋ｐＹＩ−ＰＤＲ５を示し、白丸はＫＨＷ３＋ｐＹＩを示す。
第４図は、蛍光光度計による細胞内のローダミン６Ｇの濃度を示す。
第５図は、ＮＭＲ分析によるＫＰＩの部分構造を示す。
第６図は、寒天ウェル拡散法によるＰＤＲ５トランスポーターに対するＫＰＩの阻害活性を示す。
第７図は、ＫＰＩ濃度に対する細胞内におけるローダミン１２３の蓄積量を蛍光度により示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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