(57)【要約】本発明は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）の成熟化に伴い発現が顕著に上昇する配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する単離されたヒト樹状細胞膜分子およびその変異体、それらをコードするＤＮＡ、ならびに、膜分子または変異体を用いて樹状細胞を分離または検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する単離されたヒト樹状細胞膜分子、あるいは該アミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加を含む、免疫応答を制御し得るその変異体。
【請求項２】
細胞外ドメインに相当する配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列を有する蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質である、請求項２に記載の変異体。
【請求項４】
他の蛋白質がヒト由来である、請求項３に記載の変異体。
【請求項５】
配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列を有する蛋白質とヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインとの融合蛋白質である、請求項３に記載の変異体。
【請求項６】
Ｔ細胞の増殖および活性化を抑制する作用を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞膜分子またはその変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞膜分子またはその変異体をコードするＤＮＡまたはその相補体。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸配列またはその部分配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のＤＮＡまたはその相補体。
【請求項９】
配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のＤＮＡまたはその相補体。
【請求項１０】
配列番号２、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される塩基配列を有する、請求項７に記載のＤＮＡまたはその相補体。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞膜分子もしくはその変異体またはそれらの断片と特異的に免疫結合する抗体あるいはその断片。
【請求項１２】
前記ヒト樹状細胞膜分子の細胞外領域を認識することを特徴とする、請求項１１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１３】
ポリクローナル抗体、ペプチド抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１１または１２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１４】
前記断片がＦ（ａｂ’）２である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１５】
Ｔ細胞の増殖および活性化を亢進する作用を有する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１６】
Ｔ細胞と樹状細胞との細胞比率に応じてＴ細胞の増殖を亢進または抑制する特徴を有する、請求項項１１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１７】
Ｂ細胞によるＩｇＭ産生を抑制する活性を有する、請求項項１１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１８】
請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を用いてヒトまたは他の動物由来の成熟樹状細胞を分離する方法。
【請求項１９】
請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を用いて成熟樹状細胞を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒト樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　Ｃｅｌｌ；以下ＤＣともいう）、特に成熟樹状細胞に発現する膜分子、該膜分子をコードするＤＮＡ、該膜分子に対する抗体、ならびに該抗体を用いた成熟ＤＣ分離法および成熟ＤＣ検出法に関する。
発明の背景
自己免疫疾患の発症には（ｉ）遺伝的背景、（ｉｉ）組織炎症反応のため遊離された本来免疫系にさらされることのなかった自己抗原の曝露や、ウイルス・細菌などの炎症反応から派生する局所環境、すなわち活性化されたＴ細胞の認識ペプチドの相同性によるいわゆる交差反応性Ｔ細胞の活性化などからくる局所環境の変化、さらには（ｉｉｉ）細胞膜上での副刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の異常発現によるトレランスの破綻が起こり誘導された自己反応性Ｔ細胞の存在、などからなる要素が関わっていると想定される。
正常組織の刺激を受けていない抗原提示細胞は、自己抗原を提示していたとしても副刺激分子の発現が制御されているため、Ｔ細胞はアナジーに陥っており活性化されず自己寛容が維持されている。しかし、免疫異常状態においては過剰あるいは継続する副刺激分子の発現異常により自己反応性Ｔ細胞の活性化が生じた結果、自己免疫疾患が生じるのではないかという可能性が示唆されている。特にＣＤ２８／ＣＤ１５２とＣＤ８０／ＣＤ８６間で生じるシグナルはＴ細胞活性化のコントロールに重要かつユニークな働きをしており、このシグナルを調節することによる免疫治療がマウス実験モデルにおいて試行され、実際ヒトに対する治験も行なわれ始めている。
樹状細胞（ＤＣ）は、生体内では骨髄に存在するＣＤ３４陽性細胞を前駆細胞として分化・成熟し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、免疫応答の誘導、維持、拡大、調節において重要な役割を担っていることが知られている。１９９０年代に入って、ＤＣを前駆細胞からサイトカインで分化・誘導できるようになり、大量のＤＣを扱えるようになって分子・細胞・生体レベルにおいてＤＣの免疫応答における役割の重要性が明らかになってくると共に、免疫制御の標的として注目されるようになった。
これまでの生物学的研究成果から、ヒト単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ；Ｍｏともいう）をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４存在下で培養することによりＤＣ（ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ＤＣ；ｍｏ−ＤＣともいう）を誘導することが可能であることが明らかとなっている［Ｊ．Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌ．、５９巻、２０８−２１８頁（１９９６年）］。このｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化誘導系は人工的な部分があるものの、実際にＤＣとしての機能を有することが明らかとなってきた。ＤＣの重要な機能は、抗原の細胞内への取り込み作用（食作用）及びその抗原の情報をＴ細胞に伝えてＴ細胞を刺激活性化することである。また、ＤＣは分化の段階によって未成熟ＤＣ（Ｉｍｍａｔｕｒｅ　ＤＣ）と成熟ＤＣ（Ｍａｔｕｒｅ　ＤＣ）の二つに分別することができる。未成熟ＤＣ内に取りこまれた抗原は細胞内でプロセシングを受け、抗原由来のペプチドとしてＤＣ表面のＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される。ＣＤ４陽性の抗原特異的ヘルパーＴ細胞は、抗原受容体で抗原由来のペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体を認識し、共刺激分子からの刺激なども加わり、感作、活性化される。また、ＤＣによりＭＨＣクラスＩ分子を介してＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）も刺激、活性化される。食作用は未成熟ｍｏ−ＤＣで強く、成熟ｍｏ−ＤＣでは弱くなる。Ｔ細胞への抗原提示能は、それに関与するＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の程度と一致して、未成熟ｍｏ−ＤＣでは弱く、成熟ｍｏ−ＤＣになると強くなる。
ところで、抗原取込能から抗原提示能という機能変化に伴って細胞表面上に提示される膜分子の変化が起こることは想像に難くないが、この成熟化（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の過程でどのような事象が起こっているかを考えた場合に、細胞膜表面上に新たに発現した分子の発現はすべてｍＲＮＡの発現から起こるとは限らないという事実が存在する。例えば未熟な（Ｉｍｍａｔｕｒｅ）段階から発現が見られるＨＬＡ−ＤＲが成熟化に伴ってｍＲＮＡ及びタンパク質の発現量の変化をほとんど伴わずに細胞内から細胞膜表面上に移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）するということが知られている。また、実際のｍＲＮＡの発現量とタンパク質の発現量を比較した場合にほとんど相関がない場合や、ｍＲＮＡは発現しているのにタンパク質として翻訳されていない場合も存在する［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２３１巻、１−６頁（１９９７年）］。これまで遺伝子側からは増幅可能なこと、大量に解析することが可能なこと、ハンドリングが容易なこと、数々の手法が編み出せることなどから精力的に解析がなされてきたが、実際に発現しているタンパク質の変化を追うことができれば、そのような変化は細胞内の事象をよりよく反映しており現実に近いものということができるというのも事実である。
ＤＣに関しては、上述の知見に加えて、ＤＣにいくつかのサブセットが存在することも明らかになっているが、そのようなサブセットは未成熟、成熟で機能が異なることが知られている。しかしサブセット間でのそのような機能の違いが何に起因するのか、その答えは得られていない。少なくとも細胞内シグナリングに関与すると考えられる膜分子、特にＤＣの成熟化に伴って発現する膜分子、の解明が待たれるところである。
前述のように、生体内に存在する強力なＡＰＣであるＤＣは活性化刺激に伴い成熟化すると、Ｂ７ファミリーに属するＣＤ８０／ＣＤ８６を高発現することが知られている。自己免疫疾患との関わりについては、例えば慢性関節リウマチの関節液や乾癬の病巣部組織内、アレルギー性接触性皮膚炎の皮膚組織に存在するＤＣはＣＤ８０／ＣＤ８６が異常発現になっていることが知られている。
ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞の活性化を強力に増強させる特徴を有する。このＣＤ２８によるシグナルの存在によりＩＬ−２の産生及びＩＬ−２レセプターの発現が増強され、増殖反応が亢進し、結果的にＴ細胞の様々なエフェクター機能が増強されることになる。ＣＤ２８シグナルはＩＬ−２だけでなくＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＭ−ＣＳＦなど様々なサイトカイン産生も増強させる。またＣＤ４０リガンドのようなＴ細胞活性化抗原やＩＬ−８，ＲＡＮＴＥＳなどのケモカイン発現にも関与している。ＣＤ８０あるいはＣＤ８６のＣＤ２８への結合がＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴｈ１あるいはＴｈ２への分化誘導に関与していることを示す多くの報告がある。しかし、ＣＤ８０はＴｈ１、ＣＤ８６はＴｈ２といったような一面的なものではなく、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞の分化方向の決定は、ＣＤ２８およびＣＤ１５２シグナル以外にも抗原あるいはＡＰＣそのものから規定されてくる様々な因子によって影響を受けると考えられる。しかしながら、ＣＤ２８シグナルが特にナイーブＴ細胞のＴｈ２分化・活性化において他の分子の機能によって代償されない重要な役割を担っていることが、（ｉ）ＣＤ２８ノックアウトマウスにおけるＴｈ２サイトカイン依存性の免疫グロブリンであるＩｇＧ１，ＩｇＧ２ｂの選択的産生障害［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１巻、６０９−６１２頁（１９９３年）］や（ｉｉ）Ｄ０１１−１０ＴＣＲトランスジェニックマウスＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８０／ＣＤ８６ダブルノックアウトマウス由来ＡＰＣによる抗原刺激によるＴｈ２分化の選択的阻害［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１巻、２７６２−２７７１頁（１９９８年）］などの結果から裏付けられている。また、ＣＤ２８シグナルのもうひとつの重要な役割として、ｂｃｌ−ｘＬのようなサバイバル因子の発現を増強させ、抗原刺激を受けた後のＴ細胞のアポトーシスを抑制することが挙げられる。
ＣＤ２８が恒常的にＴ細胞に発現しているにもかかわらず、組織細胞においてＣＤ８０／ＣＤ８６の発現が制御されているために、たとえ自己抗原に反応するＴ細胞が存在しても過剰な免疫反応が起こらないような仕組みになっている。このトレランス誘導システムが破綻した場合には、自己免疫疾患やアレルギー疾患等の様々な疾患が引き起こされる可能性を秘めている。膵島β細胞にＣＤ８０あるいはＣＤ８６を強制発現させただけでは膵臓への炎症性リンパ球浸潤は認められるが、自己免疫性糖尿病であるインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の発症には至らず、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子、ＴＮＦ−α、あるいは自己抗原としてのウイルスタンパク質をＣＤ８０とともに発現させてはじめてβ細胞の破綻を伴うＩＤＤＭを発症させることができる。このことはＣＤ２８−ＣＤ８０／ＣＤ８６シグナルに加え、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）シグナルの強化を促すような環境下に置かれてはじめて自己免疫疾患が発症する可能性が示唆されている。
いくつかのヒト臓器特異的自己免疫疾患においてＣＤ８０／ＣＤ８６の発現がＤＣやマクロファージのようなプロフェッショナルＡＰＣにおける発現が報告されている。このように正常組織のＡＰＣにおいては制御下にあるＣＤ８０／ＣＤ８６が、疾患局所においては異常発現している例が数多く見つかってきており、自己免疫疾患との関連が示唆されている。
現在、自己免疫疾患の治療は副作用の多い非特異的な免疫抑制剤が中心である。副刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）阻害では、抗原特異的な抑制及び投与終了後における持続効果があり、投与期間短縮による副作用の軽減や感染症防御免疫反応の維持が期待できる。免疫系細胞の相互作用や機能が明らかになっていくのにしたがってより効果的な治療が行なわれることが期待される。活性化Ｔ細胞に発現がみられるＣＤ２８ファミリーの分子としてＩＣＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）やＰＤ−１が見つかってきている。これらはそれぞれＢ７ファミリーに属するＢ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ１がそのリガンドであることが明らかとなり、複数のＢ７ファミリーとＣＤ２８ファミリーを介したＡＰＣによるＴ細胞に対する副刺激作用の差異の解明が待たれるところである。
本発明者らは、ＤＣの機能発現に重要となるＤＣの成熟化に着目し、ＤＣの成熟によって発現量が上昇する膜分子の同定を中心とした探索研究を、プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）によるＤＣの成熟により発現が調節される膜分子の網羅的同定を基に実施してきた。プロテオミクスとは、タンパク質について、遺伝子のゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に対応した言葉であり、タンパク質の大規模研究を行うものである。タンパク質の発現量、翻訳後の修飾や相互作用などの性質を研究し、例えば正常細胞とがん細胞において発現タンパク質レベルで何が起こっているか、細胞内ネットワークやプロセスなどの全体的な生物学的情報を得るものである。
ＤＣに特異的に存在する膜分子が同定されるならば、該膜分子に対する抗体の作製や、医療分野での該抗体の利用が可能となるだろう。
本発明の目的は、強力なＡＰＣである成熟ＤＣ上に発現している本分子を標的としてＤＣの機能制御による自己免疫疾患等を制御することである。
また、該分子は成熟ＤＣなどのＡＰＣに発現し、Ｔ細胞活性化に関わる分子と予想されることから、該分子を特異的に認識する抗体を使用して成熟ＤＣ等のＡＰＣを分離する方法、および検出する方法を提供することである。
発明の概要
本発明者らは、ＤＣの成熟化により発現が調節される膜分子を探索研究した結果、未成熟ＤＣと成熟ＤＣとの間で、成熟ＤＣ特異的に発現がみられる新規膜分子を同定し、この分子がＤＣの成熟化に伴い、そのタンパク質レベルでの発現が顕著に上昇することを今回見出した。この膜分子は従来知られているＢ７ファミリーに属する４種の分子（Ｂ７−１，Ｂ７−２，Ｂ７−Ｈ１，Ｂ７−Ｈ２）とホモロジーを有していることが明らかとなった。これまで知られているＢ７ファミリーに属する４種の分子間のホモロジーは細胞外ドメインについてアミノ酸一致で２５％前後であり、本膜分子と最もホモロジーの高い分子は細胞外ドメインについてＢ７−Ｈ１で３１％であった。また本膜分子はＢ７ファミリーに特徴的な２つのイムノグロブリン（Ｉｇ）ドメインの２つの繰り返し構造を有し、計４つのＩｇドメインからなることが推定されており、立体構造の保持に必須のＳ−Ｓ結合に関わるＣｙｓ残基の位置が保存されていた。これらのことから本膜分子は、新規の副刺激分子であることが予想された。
最近の研究成果から１）ＤＣは不均一な細胞集団でありいくつかのサブセットが存在すること［Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、１５巻、４０９−４１９頁（１９９７年）］、２）ＤＣサブセットはＴ細胞活性化において異なる機能（アポトーシス誘導、Ｔ細胞のＴｈ１，Ｔｈ２への分化誘導など）をもつこと［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３巻、１１８３−１１８６頁（１９９９年）］、３）ＤＣを介して免疫応答を制御することが可能であること（ＤＣ療法、ＤＣ特異的な薬剤、抗体、サイトカインなど）、が明らかになってきた。
ヒトＤＣサブセットとしては大別して、ミエロイド系ＤＣとリンパ球系ＤＣとがある。ミエロイド系ＤＣには２つの分化経路が存在することが示されており［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８４巻、６９５−７０６頁（１９９６年）］、ＣＤ３４陽性の造血幹細胞をＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−ａｌｐｈａで培養する系ではＣＤ１４陽性ＣＤ１ａ陰性およびＣＤ１４陰性ＣＤ１ａ陽性の前駆細胞が出現し、前者からは真皮（ｄｅｒｍａｌ）ＤＣ、後者からは表皮ランゲルハンス細胞に分化することが知られている。本発明者らが用いたｍｏ−ＤＣは生体内では前者由来のＤＣと類似しており、ミエロイド系ＤＣに属すると考えられている。一方、ヒトリンパ球系ＤＣは、形質細胞様のＣＤ４陽性Ｔ細胞がＩＬ−３存在下で未熟なＤＣ（ＣＤ１１ｃ陰性、ＣＤ１４陰性）へと分化し、ＩＬ−３とＣＤ４０リガンドの刺激によりＤＣとして機能的に成熟することが知られている［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８５巻、１１０１−１１１１頁（１９９７年）］。また、ｍｏ−ＤＣはＣＤ４０リガンドあるいはエンドトキシンによる刺激によりナイーブＴ細胞をＴｈ１に分化・誘導する機能を有する所謂ＤＣ１に分化するという報告がある［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３巻、１１８３−１１８６頁（１９９９年）］。このように本発明者らが用いたｍｏ−ＤＣは少なくともＤＣ１に分化し得る一群であることがわかる。また、末梢血には少なくとも２つのＤＣサブセットが存在しており、系統マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１４）陰性、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、ＣＤ１１ｃ陽性と系統マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１４）陰性、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、ＣＤ１１ｃ陰性、ＣＤ１２３強陽性の表現型を示す。それらＤＣは成熟した後、前者はＤＣ１、後者はナイーブＴ細胞をＴｈ２に分化・誘導する機能を有する所謂ＤＣ２であることが知られている［Ｂｌｏｏｄ、９５巻、２４８４−２４９０頁（２０００年）］。
このように、本膜分子はｍｏ−ＤＣの成熟化に伴い発現が顕著に上昇していることなどの知見から、Ｔ細胞活性化に関連する分子であることが考えられ、免疫応答を制御するための標的分子としても期待される。
一方、抗原をパルスした自己の末梢血ＤＣを用いた癌ワクチンのパイロットスタディも行なわれており［Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．、２巻、５２−５８頁（１９９６年）］、本膜分子の成熟ＤＣでの発現の特異性を利用して、特異的抗体を用いてパルス後のＤＣの成熟化を確認することができる。また、その際の成熟ＤＣと未成熟ＤＣとの分離、成熟ＤＣの検出などにも有用である。
上記の知見に基き本発明を要約すると以下のようになる。
（１）　配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する単離されたヒト樹状細胞膜分子、あるいは該アミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加を含む、免疫応答を制御し得るその変異体。
（２）　細胞外ドメインに相当する配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列を含む上記（１）に記載の変異体。
（３）　配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列を有する蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質である、上記（２）に記載の変異体。
（４）　他の蛋白質がヒト由来である、上記（３）に記載の変異体。
（５）　配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列を有する蛋白質とヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインとの融合蛋白質である、上記（３）に記載の変異体。
（６）　Ｔ細胞の増殖および活性化を抑制する作用を有する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のヒト樹状細胞膜分子またはその変異体。
（７）　上記（１）〜（６）のいずれかに記載のヒト樹状細胞膜分子またはその変異体をコードするＤＮＡまたはその相補体。
（８）　配列番号１のアミノ酸配列またはその部分配列をコードするヌクレオチド配列を含む、上記（７）に記載のＤＮＡまたはその相補体。
（９）　配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、上記（７）に記載のＤＮＡまたはその相補体。
（１０）　配列番号２、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される塩基配列を有する、上記（７）に記載のＤＮＡまたはその相補体。
（１１）　上記（１）〜（６）のいずれかに記載のヒト樹状細胞膜分子もしくはその変異体またはそれらの断片と特異的に免疫結合する抗体あるいはその断片。
（１２）　前記ヒト樹状細胞膜分子の細胞外領域を認識することを特徴とする、上記（１１）に記載の抗体またはその断片。
（１３）　ポリクローナル抗体、ペプチド抗体またはモノクローナル抗体である、上記（１１）または（１２）に記載の抗体またはその断片。
（１４）　前記断片がＦ（ａｂ’）２である、上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の抗体またはその断片。
（１５）　Ｔ細胞の増殖および活性化を亢進する作用を有する、（１１）〜（１４）のいずれかに記載の抗体またはその断片。
（１６）　Ｔ細胞と樹状細胞との細胞比率に応じてＴ細胞の増殖を亢進または抑制する特徴を有する、上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載の抗体またはその断片。
（１７）　Ｂ細胞によるＩｇＭ産生を抑制する活性を有する、上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載の抗体またはその断片。
（１８）　上記（１１）〜（１７）のいずれかに記載の抗体またはその断片を用いてヒトまたは他の動物由来の成熟樹状細胞を分離する方法。
（１９）　上記（１１）〜（１７）のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を用いて成熟樹状細胞を検出する方法。
本明細書中で使用する本発明の抗体に関する「特異的に免疫結合する」という用語は、本発明の抗体が本膜分子のみが有するエピトープと免疫学的に交差反応し、そのようなエピトープをもたないタンパク質と交差反応しないことを意味する。このようなエピトープは、例えば本発明の膜分子のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列とを整列比較することによって、本質的に異なる配列部分（連続する少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも８アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸）を選択することによって決定できる。
本明細書中で使用する「免疫応答を制御し得る」という用語は、本発明の天然型膜分子と同じまたは実質的に同じかまたはそのレベルを超えるＴ細胞活性化能を有していてもよいし、あるいは、Ｔ細胞の活性化を抑制もしくは阻害する能力を有していてもよいことを意味する。
発明の詳細な説明
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
新規膜分子及びそれをコードするＤＮＡ
上述したように、本発明は、本膜分子がＤＣにおいて成熟化に伴って成熟ＤＣ特異的に発現がみられるという知見に基いている。
本発明のヒト樹状細胞膜分子は、ヒト単球から分化誘導したｍｏ−ＤＣをリポポリサッカライドで刺激し、その可否に基いて成熟ＤＣを得たのち、細胞膜を調製し、その可溶性タンパク質についてコンカナバリンＡセファロースクロマトグラフィー、小麦胚アグルチニンセファロースクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの手法を用いて膜タンパク質を分画し、ＬＣ／ＭＳ（特にＴｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ社製ＬＣＱ）による微量分析にかけて同定された（後述の実施例１〜５参照）。さらにＬＣ／ＭＳ法で同定された複数の部分アミノ酸配列に基くプライマーを合成し、成熟ＤＣ由来ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い本発明の膜分子の遺伝子断片を増幅し取得し、この遺伝子断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションにより本発明の膜分子の遺伝子を含むクローンを選抜し、その塩基配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号１）を決定した（後述の実施例６参照）。
本発明の新規膜分子は、ハイドロパシープロット解析（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５７巻，１０５−１３２頁，１９８２年）の結果、５２５あるいは５３４アミノ酸残基からなり、具体的には４５６または４６５残基からなるシグナル配列及び細胞外領域、２４残基の膜貫通領域、４５残基の細胞内領域を有していると予測される。さらにホモロジー検索およびモチーフ検索により、細胞外領域は８ヶ所のアスパラギン結合型糖鎖結合部位、８ヶ所のＩｇドメイン形成に必要なＣｙｓ残基をもつ４つのＩｇスーパーファミリーに属する構造を有している。細胞外のＩｇドメインはＮ末端からＶｓｅｔ，Ｃｓｅｔ，Ｖｓｅｔ，Ｃｓｅｔからなる構造であり、Ｖｓｅｔ−Ｃｓｅｔという単位が繰り返された構造を有する新規の分子であることが判明した。
本発明の膜分子は、遺伝子クローニングおよびＤＮＡ組換え技術を利用することによって、大量合成が可能である。そのための一般的な技術として、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）やＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されるような標準技術を使用できる。
上記標準技術によりヒト成熟ＤＣからｍＲＮＡを取り出しｃＤＮＡライブラリーを作製する。配列番号３または４に記載された配列に基き合成した特異的プローブを用いて該ライブラリーをスクリーニングし目的のｃＤＮＡを得ることができる。あるいは、配列番号３または４の配列に基いて目的分子の成熟配列を含む配列を増幅するためのセンスおよびアンチセンスプライマーを合成し、該ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行い、目的のｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは自動サーマルサイクラー（ａｕｔｏｍｅａｔｅｄ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）を用いて実施するのがよく、その反応は、耐熱性ポリメラーゼ（Ｔａｑなど）、鋳型ＤＮＡおよびプライマーの存在下、ＤＮＡの変性（例えば９４℃，１５〜３０秒）、プライマーのアニーリング（例えば５５℃，３０秒〜１分）、および４種類の基質（ｄＮＴＰ）の共存下での伸長反応（例えば７２℃，３０秒〜１０分）を１サイクルとして約２５〜４０サイクル実施し、さらに７０〜７５℃で５〜１５分加熱することによって行うことができる。プライマーのサイズは通常少なくとも１５ヌクレオチドである。
本発明の膜分子をコードするｃＤＮＡは、適当な転写／翻訳調節配列を含む発現ベクター（例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスなど）に組み込まれて、適当な宿主細胞（真核または原核細胞）の形質転換またはトランスフェクションまたは形質導入に使用することができる。
転写／翻訳調節配列には、使用する宿主／ベクター系に応じて選択されたプロモーターおよびエンハンサーを含めることができる。プロモーターとして、細菌系では例えばＰＬ，ＰＲ，Ｐｔｒｐ，Ｐｌａｃなど、酵母系では例えばＰＨＯ５，ＧＡＰ，ＡＤＨ，ＡＯＸ１プロモーターなど、動物細胞ではＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスプロモーター、ヒートショックプロモーターなどを挙げることができる。
宿主細胞にはエシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属などの原核細胞、サッカロマイセス属、ピチア属などの酵母類、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの動物細胞が挙げられる。その他、昆虫細胞や植物細胞も使用可能である。
発現ベクターは、宿主に応じて種々のものが市販または寄託されており、あるいは文献等の刊行物に記載されており、それらを使用できる。例えば細菌用としてｐＱＥ（キアゲン社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（ストラタジーン社）、ｐＥＴ（ノバジェン社）などである。ベクターによって宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションする方法として、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は適当な培養培地中で培養されて目的遺伝子を発現させ、産生した本発明の膜分子を培地中から、または宿主細胞中から回収する。細胞から回収する場合には、培養終了後、細胞を遠心分離等により分離し、水性緩衝液に懸濁し、音波処理、フレンチプレス、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。膜分子の単離精製は、タンパク質の精製に用いられる一般的方法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動法、脱塩法、有機溶媒沈殿法などを任意に組合わせて行うことができる。
本発明のヒト樹状細胞膜分子およびその変異体は、Ｔ細胞の増殖および活性化を抑制する作用を有する（後述の実施例１８〜２１参照）。
変異体
本発明はまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒト樹状細胞膜分子に加えて、該アミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加を含む、免疫応答を制御し得るその変異体も提供する。本発明の変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、好ましくはその細胞外領域のアミノ酸配列と好ましくは８０％以上、特に９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するのがよい。本明細書中で使用する「相同性」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列または塩基配列間での配列の同一性または類似性を意味し、配列は例えば対角線図形法や頻度分布法などを含む慣用的方法で比較しうる。
天然型膜分子と高い相同性（好ましくは８０％以上）を有しかつＴ細胞の活性化を制御する能力を有している限り、いかなる変異体も本発明の範囲内である。このような変異体は例えば、部位特異的突然変異法、ＰＣＲ法などを用いて天然型膜分子に対し所望の改変（欠失、置換、挿入および／または付加）を導入することによって製造しうる（上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌら参照）。そのような改変として、例えば保存的アミノ酸間の置換、例えば酸性アミノ酸（アスパラギン酸とグルタミン酸）間、塩基性アミノ酸（リシンとアルギニン）間、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンなど）間の置換が挙げられる。
本発明の変異体の例は、細胞外ドメインに相当する配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
本発明の変異体の他の例は、配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列を有する蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質である。他の蛋白質は、好ましくはヒト由来であり、たとえばヒトＩｇＧ１　Ｆｃドメインが例示される。
本発明の変異体をヒトまたはマウスなどの他の動物由来のライブラリー等から得る場合には、配列番号２に示される塩基配列に基いてプローブを作製し、中度または高度のストリンジェント条件化でのハイブリダイゼーションの後、高ストリンジェント条件下で洗浄することによって目的の変異体をコードする遺伝子を取り出し、これを適当なベクターに組み込み、発現させることによって目的の変異体を得ることができる。高ストリンジェント条件の例は、０．５Ｍ　ＮａＨＰＯ４，７％ＳＤＳ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，６５℃でのハイブリダイゼーション、その後の０．１×ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳ，６８℃での洗浄である（上記のＡｕｓｕｂｅｌら参照）。ハイブリダイゼーション条件は温度、イオン強度、プライマー長などを適宜選択することによって決定できるが、通常、温度が高いほど、またイオン強度が低いほどストリンジェンシーが高まる。したがって当業者は適するハイブリダイゼーション条件を選択可能である。
本発明にはまた、配列番号１のアミノ酸配列またはその部分配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはその相補体も含まれる。具体的には、配列番号１の２９〜４６５位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはその相補体を例示できる。さらに具体的には、そのようなＤＮＡは配列番号２、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される塩基配列を有する。
さらに本発明には、配列番号２に示される塩基配列と好ましくは８０％以上、特に９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％の相同性を有する、上記変異体をコードするＤＮＡまたはその相補体も包含される。
抗体
Ｂ７ファミリーの性質から推測して成熟ＤＣ、活性化マクロファージ、活性化単球等にも本膜分子の発現が見られることが予想される。この知見を利用することにより活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）を特異的に認識する本膜分子に対する抗体を得ることができる。
上記の特性を有するいずれの抗体も本発明に包含されるが、目的の抗体を得るための抗原エピトープは、本膜分子のアミノ酸配列（配列番号１）において抗原性の高い領域、表在性がある領域、二次構造をとらない可能性のある領域、他のタンパク質（特にＢ７ファミリーの他のタンパク質）とホモロジーがないか又は低い領域から選択されうる。ここで抗原性の高い領域は、Ｐａｒｋｅｒらの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５巻、５４２５−５４３２頁（１９８６年）］によって推定可能である。表在性がある領域は、例えばハイドロパシーインデックスを計算しプロットすることによって推定可能である。二次構造をとらない可能性のある領域は、例えば、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎの方法［Ａｄｖ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　Ｒｅｌａｔ　Ａｒｅａｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．、４７巻　４５−１４８頁（１９７８年）］によって推定可能である。さらに、特にＢ７ファミリーの他のタンパク質とホモロジーがないか又は低い領域は、本膜分子のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列との相同性比較によって推定可能である。
上記の手法で推定された本膜分子の部分アミノ酸配列を基に、ペプチド合成法を利用することによって該アミノ酸配列からなるペプチドを合成することができる。目的のペプチドは、例えば、Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻、３４１−３４７頁（１９８６年）］によって開発された固相ペプチド合成に基いた市販のペプチド合成機を使用して合成し、保護基を脱離後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独もしくは組合わせた方法により精製する。得られた精製ペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）やアルブミンなどのキャリヤタンパク質と結合し免疫原として使用することができる。
さらに、遺伝子組換え本膜分子を免疫原として本膜分子に対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を公知の手法により作製することもできる。この場合、本膜分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または他のタンパク質に関して用いられる「組換え」という用語は、これらのタンパク質が宿主細胞内で組換えＤＮＡによって生産されたものであることを意味する。宿主細胞としては、原核生物（例えば大腸菌のような細菌）及び真核生物（例えば酵母、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞等）のいずれも使用され得る。
本発明の「抗体」はペプチド抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれでもよい。「抗体」は、マウスまたは他の適した宿主動物を免疫に用いられたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、産生するであろうリンパ球を引き出すために、皮下、腹腔内、または筋肉内の経路によって、抗原あるいは抗原発現細胞により免疫化することによって得られる。さらに宿主動物としてはヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、所望のヒト抗体を取得してもよい［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７巻、７２２−７２７頁（２０００年）、国際公開公報ＷＯ９６／３３７３５、ＷＯ９７／０７６７１、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／３７７５７参照］。そのかわりに、リンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。宿主動物から得られた血清から、抗原に結合する画分を集め、精製することにより、ポリクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールのような適当な融合試薬を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体を作製することができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、１９８６年）。例えば本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法［Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁（１９７５年）］を用いても、組換えＤＮＡ法（Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許　第４８１６５６７号）を用いても作製することができる。
抗原タンパク質は本膜分子のタンパク質の全てまたは部分配列をコードするＤＮＡを、大腸菌や酵母、昆虫細胞、動物細胞などで発現させることにより調製することができる。遺伝子組換え本膜分子は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独もしくは組合わせた方法により精製し、この精製標品を免疫原として用いる。
また、本発明の抗体は、無傷の抗体であってもよいし、あるいは（Ｆａｂ’）２やＦａｂなどの抗体断片であってもよい。
また、定常領域をヒトの定常領域に置き換えたキメラ抗体（例えばマウス−ヒトキメラ抗体；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許４８１６５６７及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、６８５１頁（１９８４年））、定常領域および超可変領域（または、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）を除く全ての可変領域をヒトの配列に置き換えたヒト化抗体（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、４２８５頁、１９９２年及びＣａｒｔｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、１６３頁、１９９２年）も本発明の抗体に含まれる。
また、このようにして得られた本発明の抗体に対する抗体、すなわち抗イディオタイプ抗体もまた本発明に含まれる。
このようにして得られた本膜分子に対する各種抗体は、その特徴を生かすことができる様々な用途に使用可能である。本膜分子が成熟ＤＣに特異的に発現が見られる分子であることを利用して、本抗体を蛍光性物質（ローダミン、フルオレサミンなど）で標識し、周知のＦＡＣＳを用いて目的のＤＣを検出・分離したり、ｍｏ−ＤＣのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの分化を確認することができる。さらに、本膜分子はＤＣの成熟化に伴って発現量が顕著に上昇するタンパク質であることから、本抗体を用いてＦＡＣＳにより未成熟ＤＣと成熟ＤＣを分離することもできる。本膜分子の検出に関しては、ＦＡＣＳでの検出にとどまるものではない。例えばウェスタンブロッティングにおいて本抗体を１次抗体として作用させることにより検出可能であることが予想されるし、タンパク質レベルでの発現確認を行うことができる。また本抗体を固相（ポリスチレンビーズ、マイクロタイターウエル表面、ラテックスビーズなど）に結合して不均一系で、あるいは均一系で、免疫学的反応を行って相同な膜分子を検出、定量（蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイなどの方法使用）することができる。この場合、免疫学的反応は競合反応であってもよいし非競合反応であってもよい。また２つ以上の抗体（モノクローンまたはポリクローン）を用いるサンドイッチ法による反応も使用できる。上記における検出、定量のためには、当業界で公知のいずれの免疫学的手法も用いることができる。
その他、本膜分子の機能を評価する用途にも使用可能である。成熟ＤＣは強力なＡＰＣであり、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介したＣＤ４陽性のＴ細胞を刺激活性化及びＭＨＣクラスＩ分子を介したＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を刺激活性化することが知られている。これら機能を制御し得るか否かを確認するために、アロジェニックＭＬＲ（Ｍｉｘｅｄ　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）での機能を抑制しうるか否かの確認、抗原特異的にＣＴＬを誘導した場合にその機能を抑制しうるか否かの確認、さらにＤＣの抗原提示に関わる分子か否かの確認等のｉｎ　ｖｉｔｒｏでのアッセイにも使用可能である。
本発明の抗体はさらに、ｉｎ　ｖｉｖｏで免疫応答を制御するために使用することもできる。本発明の膜分子は、前述したとおり、副刺激分子であると予想され、Ｔ細胞活性化に直接あるいは間接的に関わる膜分子であると予想される。後述の実施例１８〜２１に見られるように、本発明の膜分子はＴ細胞の増殖および活性化を抑制する作用を有している。このため、本発明の抗体が本膜分子と細胞上のカウンターレセプターとの結合を阻害する抗体であればＴ細胞の活性化を亢進することが予想される。実際、後述の実施例２２および２３では、該抗体によるＴ細胞の増殖および活性化が増強されることが確認された。一方、実施例２４においては、自己リンパ球混合試験において、混合するＴ細胞とＤＣとの細胞比に応じて、該抗体がＴ細胞の増殖を亢進したり、あるいは逆に抑制することが確認された。このことは本発明の抗体がＴ細胞の増殖もしくは活性化を亢進または抑制するように作用することを示唆している。さらに実施例２５に示されるように、本発明の抗体は、Ｂ細胞によるＩｇＭ産生を抑制する活性も有することが判明した。このように本発明の膜分子の機能制御可能な抗体を作用させることでＤＣの機能さらにはＴ細胞の機能を制御することによって免疫応答を制御し得ることが期待される。
さらには本膜分子および本膜分子のカウンターレセプターの可溶化型分子（すなわち、細胞外領域に相当する分子）およびこれら分子に対する抗体にも免疫応答を制御する活性が期待される。
本発明の抗体類または本膜分子の可溶化型分子を用いて本膜分子のカウンターレセプターを取得することも可能である。可溶化型本膜分子カウンターレセプターは直接本膜分子に作用し、ＤＣ上の本膜分子を介したシグナルを制御し得るし、カウンターレセプターを発現した細胞のカウンターレセプターを介したシグナルをブロックし得る。また、本膜分子のカウンターレセプターと本膜分子の相互作用をモジュレートできる低分子物質や本膜分子のカウンターレセプター及び本膜分子に関わる細胞内シグナル経路をモジュレートする低分子物質もシグナルの制御に有用である。
本発明の抗体類または本膜分子の可溶化型分子、本膜分子のカウンターレセプターの可溶化型分子、上記低分子を治療に用いる場合には、例えば癌、自己免疫疾患、臓器移植、感染症、アレルギーなどの疾患の治療に適用可能である。
投与法および投与剤型は特に制限されないが、静脈、動脈内投与、筋内投与、経口投与、座剤投与などであり、薬学的に許容可能な賦形剤や希釈剤と組合わせて経口用または非経口用に処方することができるが、好ましくは非経口投与である。投与は１日あたり１回かまたは数回に分けて行い、投与量は患者の重篤度、年齢、性別、体重などの条件に応じて決定され、副作用を併発しない範囲である。
実施例
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例によって限定されないものとする。
実施例１　ＤＣの細胞膜の調製
細胞膜タンパク質の場合、元々発現量が低いこと、またハンドリングが難しいことが挙げられる。これを解決する手段の一つとして、より純度の高い細胞膜を取得する方法を確立することが必要である。細胞膜表面をコートし、これを均一に破砕することで、比重の重くなった細胞膜を密度勾配遠心により取得する方法で純度の高いＤＣ細胞膜を調製した［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８巻、１００６２−１００７２頁（１９８３年）］。
ターゲットとしている膜分子の発現量の少なさとハンドリングの難しさから、大量のヒトＤＣを集めるためにアフェレーシス産物（単核球画分）から単球を分離してｍｏ−ＤＣを大量調製した。ＬＰＳ（リポポリサッカライド）刺激あり、なしを同数の細胞で実施し、同数（５×１０８細胞）の未成熟ＤＣと成熟ＤＣを得た。
実施例２　タンパク質の高感度検出とｉｎ　ｇｅｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｍａｎｎら［Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６８巻、８５０−８５８頁（１９９６年）］の手法に従って銀染色によりタンパク質を検出した。酵素消化法についてはトリプシンを用いたｉｎ　ｇｅｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ法［Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２２４巻、４５１−４５５頁（１９９５年）］により行い、以下で使用する分析サンプルとした。
実施例３　膜タンパク質の分画
実施例１で得られた細胞膜より界面活性剤を用いて細胞膜タンパク質を可溶化した後、コンカナバリンＡセファロースにアプライし、界面活性剤含有緩衝液にて洗浄した。これら素通り画分をＣｏｎＡ　ＦＴと称した。吸着画分はメチル−ａｌｐｈａ−Ｄ−グルコピラノシドと界面活性剤を含有した緩衝液で溶出した（ＣｏｎＡ　ＥＬ）。ＣｏｎＡ　ＦＴは小麦胚アグルチニンセファロースに再度アプライし、界面活性剤含有緩衝液にて洗浄した。これら素通り画分をＷＧＡ　ＦＴと称した。吸着画分はＮ−アセチルグルコサミンと界面活性剤を含有した緩衝液で溶出した（ＷＧＡ　ＥＬ）。ＣｏｎＡ　ＥＬ、ＷＧＡ　ＥＬ、ＷＧＡ　ＦＴを分子同定サンプルとした。これら画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開した後、実施例２の手法によりタンパク質を検出し、短冊状に切ったゲルをゲル内消化（ｉｎ　ｇｅｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）して分析サンプルとした。
実施例４　ＬＣ／ＭＳによる微量分析
ＬＣ／ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ社製ＬＣＱ）を用いて、実施例３で得たサンプルを分析した。９５％溶液Ａ（０．１％ギ酸）および５％溶液Ｂ（０．０８％ギ酸、８０％アセトニトリル）で平衡化したＰｅｐＭａｐ逆相カラム（内径０．０７５ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）（ＬＣパッキングス社製）にかけ、１８０ナノリットル／分の流速で、５分洗浄後、６７．５分かけて溶液Ｂの比率を５０％まで直線的に上げることにより順次溶出しＭＳに導入した。ＭＳに導入されたサンプルは次の繰り返しサイクルでデータ取得を行い、その配列情報を得ることとした。１．Ｆｕｌｌ　ＭＳ　Ｓｃａｎ：ｍ／ｚ＝０〜２０００のレンジでの親イオンの分子量の観測。２．Ｚｏｏｍ　ＭＳ　Ｓｃａｎ：Ｆｕｌｌ　ＭＳ　Ｓｃａｎで同定された親イオンの価数の観測。３．ＭＳ／ＭＳ　Ｓｃａｎ：Ｚｏｏｍ　ＭＳ　Ｓｃａｎで測定された分子にＨｅガスをあてた場合に生じる娘イオンの観測。理論的なｂ，ｙシリーズとどれだけの本数がどれだけの強度でマッチングするかをスコア化してランクをつける同定法（ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズム）により同定した［アメリカン・ソサイアティ・フォー・マス・スペクトロメトリー、５巻、９７６−９８９頁（１９９４年）］。
実施例５　本膜分子の同定
実施例４の手法により同定された分子のうち、成熟ＤＣのみから新規分子である本膜分子が同定された。同定対象となったフラグメントはｍ／ｚ＝１３１０．８の２価イオンとｍ／ｚ＝９９５．８の２価イオンであり、そのＭＳ／ＭＳのパターンは本膜分子の部分アミノ酸配列（２６残基）ＳＰＴＧＡＶＥＶＱＶＰＥＤＰＶＶＡＬＶＧＴＤＡＴＬＲ（配列番号３）と部分アミノ酸配列（１８残基）ＮＰＶＬＱＱＤＡＨＳＳＶＴＩＴＰＱＲ（配列番号４）に非常に良く帰属された。これら部分配列のｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　ＤＮＡ　ｄａｔａｂａｓｅに対するホモロジーサーチの結果、これら部分配列を有する塩基配列は他に存在しないことが明らかとなった。
実施例６　本膜分子の遺伝子クローニング
実施例５で同定された２つの部分アミノ酸配列をヒトゲノムデータベースに対してサーチを実施したところ、ＡＣ０２２１８８に乗っている遺伝子であることが判明した。さらに本膜分子の遺伝子はゲノム上重複があることが推定され、実施例５で同定した部分アミノ酸配列は重複している部分に乗っていることが明らかとなった。そこで、実施例５で明らかとなった部分アミノ酸配列に対応する遺伝子配列をもとにプライマーを合成し、成熟ＤＣ　ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを実施した。プライマーはそれぞれ２０ｍｅｒで、センスプライマー５’−ＡＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＴ−３’（配列番号５）とアンチセンスプライマー５’−ＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＧＧＧＧＴ−３’（配列番号６）を用いた。この結果、約８００ｂｐの本膜分子の遺伝子断片を取得した。この遺伝子断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションにより本膜分子の遺伝子を含むクローンを選抜し、塩基配列を決定した。推定オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）構造を配列番号２に、推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
本膜分子の推定アミノ酸配列の一次構造についてＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５７巻、１０５−１３２頁、１９８２年）に従い、ハイドロパシープロット解析を行なった（図１）。その結果、本膜分子はＮ末端にシグナル配列を有するＩ型の細胞膜貫通タンパク質であることが明らかとなった。本膜分子は５３４アミノ酸残基からなり、ハイドロパシープロット解析結果から、４６５残基からなるシグナル配列（配列番号１の１〜２８位）および細胞外領域（配列番号１の２９〜４６５位）、２４残基の膜貫通領域、４５残基の細胞内領域を有していると予想される。さらにホモロジー検索並びにモチーフ検索の結果から細胞外領域は８ヶ所のアスパラギン結合型糖鎖付加部位、８ヶ所のイムノグロブリン（Ｉｇ）ドメイン形成に必要なシステイン残基を持つ４つのイムノグロブリンスーパーファミリーに属する構造を有していた。また、この細胞外のＩｇドメインはＮ末端側からＶ　ｓｅｔ、Ｃ　ｓｅｔ、Ｖ　ｓｅｔ、Ｃ　ｓｅｔという構造であることが類推され、Ｖ　ｓｅｔ−Ｃ　ｓｅｔという単位では繰り返し構造を取っており、アミノ酸配列に関しても９５％のホモロジーを有していた。またこのＶ　ｓｅｔ−Ｃ　ｓｅｔという単位で最もホモロジーの高い分子はＢ７−Ｈ１（Ｂ７−ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｌ）でアミノ酸一致で３１％であった。細胞外のＶ　ｓｅｔ−Ｃ　ｓｅｔという単位はＢ７ファミリーに共通する構造であるが、本膜分子のようにＢ７ファミリーと一次配列でホモロジーを持ったＶ　ｓｅｔ−Ｃ　ｓｅｔという単位が繰り返されている構造を有した分子はこれまで知られていない。
実施例７　本膜分子に対するペプチド抗体の設計とペプチド合成並びにペプチド抗体作製
本膜分子に対する特異的ペプチド抗体を作製するために本膜分子の推定アミノ酸配列から設計を行なった。まず、Ｐａｒｋｅｒの法則（前述）に従い抗原性の高い部分を選択し、これらの中からＣｈｏｕとＦａｓｍａｎの方法（前述）に基づき表在性がある部分、２次構造を取らない可能性のある部分、さらに糖鎖付加が予想されない部分、システイン残基を含まない部分について、シングルペプチドを合成した。選んだ領域は、以下のアミノ酸位置からなる配列：ＳＰＴＧＡＶＥＶＱＶＰＥＤＰＶＶＡＬＶＧＴＤＡＴＬＲ（配列番号１の２４２〜２６７位）である。これらシングルペプチドを精製し、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で１ｍｇ／ｍｌのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に対してコンジュゲートした。このＫＬＨ−結合ペプチド（１００μｇ）を免疫原として８回繰り返しウサギに免疫し、ペプチド抗体を作製した。
実施例８　本膜分子の命名と推定構造予測
本膜分子は、構造的にＩｇスーパーファミリーの中でもＢ７ファミリーに属することから、ＢＲＩＧＨＴ（Ｂ７　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｉｇ　Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と命名した。また、ＢＲＩＧＨＴは、マウスカウンターパートのアミノ酸配列予測並びに後述の実施例１０におけるＮ末端アミノ酸配列分析から、５３４アミノ酸残基から構成されるＩ型膜蛋白質で、２８残基のシグナル配列、４３７残基の細胞外領域、２４残基の膜貫通領域、４５残基の細胞内領域を有していると予想された。
実施例９　ペプチド抗体の精製並びにウエスタン解析による評価
実施例７に記載の免疫したウサギの抗血清は配列番号１の２４２〜２６７位に記載するペプチドに対する力価が２０００００倍以上に上昇した。本抗血清をＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてＩｇＧのみを特異的に結合させ、ＰＢＳにより洗浄後、０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．８）により結合したＩｇＧ溶出した。溶出液は１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）を加えることで速やかに中和した。中和したＩｇＧフラクションは濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（内径１０ｍｍ×長さ３００ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによりＰＢＳに置換し、精製標品とした。得られたペプチド抗体標品を用いて、可溶化型組換え体ＢＲＩＧＨＴ（実施例１１に記載）並びに単球由来ＤＣであるｍｏ−ＤＣを用いたウエスタン解析を実施した。４／２０グラジエントゲル（第一化学薬品製）を用いて還元条件で煮沸（９５℃、５分）したサンプルをゲル１枚あたり２５ｍＡの定電流で１．５ｈｒ泳動後、ＰＶＤＦ膜にゲル１枚あたり１５０ｍＡの定電流で１ｈｒ転写した。転写ＰＶＤＦ膜はブロックエース（雪印社製）などでブロッキング後、本ペプチド抗体を１次抗体として２μｇ／ｍｌの濃度で、二次抗体としてＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（ＤＡＫＯ社製）を用いて反応させ、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）等のＨＲＰ発色試薬を用いることでＢＲＩＧＨＴを検出できることが明らかとなった。単球由来ＤＣ（ｍｏ−ＤＣ）では成熟化に依存的に発現が上昇する１００ｋＤａ付近にブロードなバンドとして検出された。（図２参照）
実施例１０　ＣＨＯ細胞によるＢＲＩＧＨＴ可溶化型組換え体の産生
ＢＲＩＧＨＴ可溶化型組換え体について次の（ｉ）、（ｉｉ）の２種類についてＣＨＯ細胞にて発現させた。（ｉ）ＢＲＩＧＨＴ細胞外ドメイン（配列番号１の２９−４６５位）とヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインをフュージョン蛋白質として発現させたもの（ＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇと称する）。（ｉｉ）ＢＲＩＧＨＴ細胞外ドメイン（配列番号１の２９−４６５位）を発現させたもの（ＢＲＩＧＨＴ−ＳＦと称する）。動物細胞発現用ベクターｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇの場合にはＥｃｏＲＩサイトとＡｐａＩサイトの間に配列番号７に記す遺伝子を、ＢＲＩＧＨＴ−ＳＦの場合にはＥｃｏＲＩサイトとＮｏｔＩサイトの間に配列番号８に記す遺伝子を組み込み、組換え大腸菌を作成し、大量にプラスミドを調製した。調製したプラスミドをトランスフェクション試薬ＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中でＣＨＯ細胞に遺伝子導入を行なった。ＢＲＩＧＨＴ発現細胞はＧＦＰの発現を指標としたＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いてシングルセルソートを行なった後、Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）による薬剤耐性クローンを取得した。無血清ＤＦ培地中で３日間培養した上清についてペプチド抗体を用いたウエスタン解析により高発現株を取得した。
実施例１１　ＢＲＩＧＨＴ−ＩｇおよびＢＲＩＧＨＴ−ＳＦの精製
ＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇ：無血清ＤＦ培養上清を限外濾過膜（ＹＭ１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて１０倍まで濃縮し、ＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇのみを特異的に結合させ、ＰＢＳにより洗浄後、０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．８）により結合したＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇ溶出した。溶出液は１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）を加えることで速やかに中和した。中和したＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇフラクションは濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（内径１０ｍｍ×長さ３００ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによりＰＢＳに置換し、精製標品とした。ＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇ標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて非還元条件化２００−２２０ｋＤａ、還元条件化１００−１２０ｋＤａのブロードなバンドとして検出される（図３）。
ＢＲＩＧＨＴ−ＳＦ：無血清ＤＦ培養上清を限外濾過膜（ＹＭ１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて１０倍まで濃縮し、ＷＧＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてＢＲＩＧＨＴ−ＳＦを結合させ、ＰＢＳにより洗浄後、ＰＢＳ＋０．１Ｍ　Ｎ−アセチルグルコサミンにより溶出した。溶出液は透析により２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に置換し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画した。１００％溶液Ａ（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０））および０％溶液Ｂ（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）（東ソー社製）にかけ、１ｍｌ／分の流速で、５分洗浄後、５０分かけて溶液Ｂの比率を５０％まで直線的に上げることにより順次溶出した。溶出されたＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇフラクションに等量の２．５Ｍ硫酸アンモニウムを加え、疎水クロマトグラフィーにより分画した。１００％溶液Ａ（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、１．２Ｍ硫酸アンモニウム）および０％溶液Ｂ（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８））で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）（東ソー社製）にかけ、１ｍｌ／分の流速で、１０分洗浄後、５０分かけて溶液Ｂの比率を１００％まで直線的に上げることにより順次溶出した。溶出されたＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇフラクションは濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（内径１０ｍｍ×長さ３００ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによりＰＢＳに置換し、精製標品とした。ＢＲＩＧＨＴ−ＳＦ標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて非還元条件化６５−８０ｋＤａ、還元条件化７０−９０ｋＤａのブロードなバンドとして検出される。（図４参照）
ＢＲＩＧＨＴ−ＩｇならびにＢＲＩＧＨＴ−ＳＦ両組換え体は、抗ＢＲＩＧＨＴペプチド抗体を用いたウエスタン解析により特異的に染色が見られること、さらにアミノ酸配列分析装置（Ｍｏｄｅｌ３７７、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を用いたＮ末端アミノ酸配列分析より、両組換え体とも２９位のＬｅｕ残基をＮ末端アミノ酸とするＢＲＩＧＨＴのコードするアミノ酸配列が得られたことから、可溶化型組換え体であることを確認できている。
実施例１２　抗ＢＲＩＧＨＴポリクローナル抗体の作製と精製
ＢＲＩＧＨＴ−ＳＦ（１００μｇ）を免疫原として８回繰り返しウサギに免疫し、抗ＢＲＩＧＨＴポリクローナル抗体（以下、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　ｐＡｂと称する）を作製した。免疫したウサギの抗血清はＢＲＩＧＨＴ−ＳＦに対する力価が２０００００倍以上に上昇した。本抗血清をＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてＩｇＧのみを特異的に結合させ、ＰＢＳにより洗浄後、０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．８）により結合したＩｇＧ溶出した。溶出液は１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）を加えることで速やかに中和した。中和したＩｇＧフラクションは濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（内径１０ｍｍ×長さ３００ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによりＰＢＳに置換し、精製標品とした。
同時にコントロール抗体として正常ウサギより血清を得、同様の精製手順によりＩｇＧフラクションを調製し、精製標品とした（以下、ｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧと称する）。
実施例１３　ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　ｐＡｂのＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびビオチン標識ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　ｐＡｂ　Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの調製
実施例１２で得られたａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　ｐＡｂ並びにｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧをペプシンで消化することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを得た。２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中でａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　ｐＡｂあるいはｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧを１ｍｇ／ｍｌ、ペプシンを０．１ｍｇ／ｍｌとし、３７℃でｏ／ｎ（？）消化した。この操作により得られたａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　ｐＡｂのＦ（ａｂ’）２フラグメント（以下ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２と称す）あるいはｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメント（以下ｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２と称す）は濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（内径１０ｍｍ×長さ３００ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによりＰＢＳに置換するとともに未消化並びに他の消化断片、ペプシンを除去し、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２およびｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２の標品とした。
ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２並びにｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２は、ビオチン化試薬を反応させることで標識することができる。１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）に置換したａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２あるいはｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２（２ｍｇ／ｍｌ，１ｍｌ）に１０ｍＭ　Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（同仁化学製）を２μｌ加え、氷冷下、１時間反応させた後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（内径１０ｍｍ×長さ３００ｍｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによりＰＢＳに置換し、ビオチン標識ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２（以下ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２−ｂｉｏｔｉｎと称す）およびビオチン標識ｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２（以下ｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２−ｂｉｏｔｉｎと称す）標品とした。
実施例１４　健常人末梢血単核細胞の分離
健常人より採取した末梢血は、凝固しないようにＣＰＤ液含有の採血バック（ＴＥＲＵＭＯ社製）に採血後、遠心（６００Ｇ、室温、５分）により血漿と血球画分を分離した。血漿を除いた血球画分をＰＢＳで稀釈してから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に重層し、比重遠心（４００Ｇ、室温、３０分間）により単核細胞を分離した。単核細胞に混入した赤血球は、塩化アンモニウム緩衝液（０．８３％　ＮＨ４Ｃｌ−Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　２０ｍＭ，ｐＨ６．８）で室温２分間処理して溶血し、５％　ＦＣＳ含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳ−ＦＣＳと称す）で単核細胞を洗浄した。この細胞集団を健常人末梢血単核細胞として用いた。
実施例１５　末梢血単核細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性化とフローサイトメーターによるＢＲＩＧＨＴの細胞表面上での発現解析
実施例１４の方法で分離した末梢血単核細胞を２．５×１０６個／ｍｌとなるように１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に浮遊し、６ウェル培養皿（＃３０４６、Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種した。培地には最終濃度で、５μｇ／ｍｌ　ＰＨＡ（生化学工業製）または、１μｇ／ｍｌ　ＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ社製）または、５０ｎｇ／ｍｌ組換え体ヒトＧＭ−ＣＳＦ（キリンビール社）＋５０ｎｇ／ｍｌ組換え体ヒトＩＬ−３（キリンビール社）または、５ｎｇ／ｍｌ　ＰＭＡ（ＳＩＧＭＡ社製）＋２５０ｎｇ／ｍｌ　Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、２日間培養した。
末梢血単核細胞またはｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性化した末梢血単核細胞をＰＢＳ−ＦＣＳで洗浄後、５％　ＦＣＳ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（以下ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ−ＮａＮ３と称す）１ｍｌに懸濁した。１００μｇのヒトＩｇＧを添加し、氷冷下、１０分間放置した後、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２−ｂｉｏｔｉｎ　２０μｇを添加し、氷冷下、３０分間放置した。対照群の細胞にはｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２−ｂｉｏｔｉｎ　２０μｇを添加し、氷冷下、３０分間放置した。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ−ＮａＮ３で洗浄後、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合ストレプトアビジン（ＢＤ　ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を添加し、氷冷下、３０分間放置した。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ−ＮａＮ３で洗浄後、ヒト分化血球に特異的な抗原に対するＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはＡＰＣ（Ａｌｏｐｈｉｃｏｃｙａｎｉｎｅ）またはＰｅｒＣＰ標識抗体すなわち、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体（ＢＤ　ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を添加し氷冷下、２０分間インキュベーションの後、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によりＢＲＩＧＨＴとヒト分化血球に特異的な抗原の発現を解析した。ＢＲＩＧＨＴは末梢血単核細胞中のＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６をそれぞれ発現する細胞集団の細胞膜上には発現が認められないが、ＬＰＳおよび組換え体ヒトＧＭ−ＣＳＦ＋組換え体ヒトＩＬ−３で活性化したＣＤ１４陽性細胞で発現が認められた。また末梢血単核細胞中のＤＣ１に分化すると考えられる細胞集団すなわち系統マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）陰性、ＨＬＡ−ＤＲ陽性、ＣＤ１１ｃ陽性細胞においては発現は認められないが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで組換え体ヒトＧＭ−ＣＳＦ＋組換え体ヒトＩＬ−３で活性化することによりこの細胞集団での発現の上昇が認められた。（図５参照）
実施例１６　ヒト単球由来ＤＣにおけるＢＲＩＧＨＴの発現分布の解析
健常人末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを用いた密度勾配遠心法により分離した単核細胞を１×１０８個／ｍｌとなるように２％ヒト血漿を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ｐｌａｓｍａ）に浮遊し、抗ヒトＣＤ１４抗体結合磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を添加し氷冷下、３０分間放置した。細胞をＰＢＳ−ｐｌａｓｍａで洗浄後、マグネットによる磁場内に設置した分離カラムＬＳ＋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）に供してＣＤ１４陽性細胞を分離した。ヒト単球を含むＣＤ１４陽性細胞を１×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％　ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊し、５０ｎｇ／ｍｌ組換え体ヒトＧＭ−ＣＳＦ（キリンビール社）と１００ｎｇ／ｍｌ組換え体ヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、６ウェル培養皿（＃３０４６、Ｆａｌｃｏｎ社製）で培養を行なった。５日間培養した細胞をヒト単球由来の未成熟ＤＣ（Ｉｍｍａｔｕｒｅ　ＤＣ）とし、培養５日目の細胞に１０ｎｇ／ｍｌ　ＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加してさらに１日間培養した細胞をヒト単球由来の成熟ＤＣ（Ｍａｔｕｒｅ　ＤＣ）とした。ヒト単球由来ＤＣの成熟度合いは、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ８６の発現上昇をフローサイトメトリーで解析することで確認した。
成熟または未成熟のヒト単球由来ＤＣをＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ−ＮａＮ３　１ｍｌに懸濁した。１００μｇのヒトＩｇＧを添加し、氷冷下、１０分間放置した後、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２２０μｇを添加し、氷冷下、３０分間放置した。対照群の細胞にはｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２２０μｇを添加した。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ−ＮａＮ３で洗浄後、ＰＥ標識抗ウサギＩｇＧ抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）を添加し、氷冷下、３０分間放置した。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ−ＮａＮ３で洗浄後、フローサイトメーターにより本膜分子の発現を解析した。ＢＲＩＧＨＴは、組換え体ヒトＧＭ−ＣＳＦと組換え体ヒトＩＬ−４存在下でヒト単球より誘導した未成熟ＤＣの細胞表面上で発現が認められ、またＬＰＳ刺激によるＤＣの成熟に伴い発現の上昇が認められた。（図６参照）
実施例１７　活性化Ｔ細胞に発現するＢＲＩＧＨＴカウンターレセプターの解析
ＢＲＩＧＨＴは、そのアミノ酸配列が既知のＢ７ファミリーに属する副刺激分子と相同性が高いことから、機能においても副刺激分子としてＴ細胞上のカウンターレセプターを介してＴ細胞の活性化の制御に関わる分子であることが予想される。副刺激分子とそのカウンターレセプターとの結合を解析する方法としては、可溶化型組換え体を用いたカウンターレセプター発現細胞との結合実験が考えられるが、実際ヒトＩｇＧ１　Ｆｃ領域とＣＤ８０またはＣＤ８６との可溶化型キメラ蛋白質と、Ｔ細胞に発現するカウンターレセプターＣＤ２８との結合をフローサイトメーターで検出することができる。実施例１０並びに１１に記載のＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇを用いてＴ細胞上のカウンターレセプターの発現解析を行なった。健常人末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを用いた密度勾配遠心法により単核細胞を分離し、Ｐａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、Ｔ細胞以外の細胞を除去するネガティブセレクション法により純度９９％以上のＣＤ３陽性Ｔ細胞を調製した。Ｔ細胞を活性化する目的で、分離したＣＤ３陽性Ｔ細胞を２×１０６個／ｍｌとなるように１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊し、５μｇ／ｍｌ　ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（生化学工業製）を添加して、２４または４８時間培養を行なった。末梢血から分離直後およびＰＨＡにより活性化させたＴ細胞を回収しＰＢＳ−ＦＣＳで洗浄後、３％　ＦＣＳ、０．０２％　アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＮａＮ３）に懸濁し、２００μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇを添加して４℃、１時間放置した。対照群として、２００μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌの精製されたヒトＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し同様にインキュベーションを行なった。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＮａＮ３で洗浄後、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２を添加して４℃、３０分間放置した。さらに、細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＮａＮ３で洗浄後、ＰＥ標識抗ウサギＩｇＧ抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）を添加し、氷冷下、３０分間放置した。細胞を洗浄後、フローサイトメーターによりＢＲＩＧＨＴ−ＩｇのＴ細胞への結合を解析した。ＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇは、末梢血より分離直後のＣＤ３陽性Ｔ細胞には結合しないが、ＰＨＡ存在下２４時間培養し活性化されたＴ細胞に結合を示した。一方、ＰＨＡ存在下４８時間の培養を行なったＴ細胞へのＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇの結合は認められなかった。以上の結果から、ＢＲＩＧＨＴカウンターレセプターは活性化されたＴ細胞上に存在すること、その発現はＴ細胞活性化初期段階において一過性に上昇することが示唆された。（図７参照）
実施例１８　ＢＲＩＧＨＴ−ＩｇのＴ細胞増殖に対する抑制作用
ＢＲＩＧＨＴが副刺激分子としてＴ細胞活性化の制御に関わる分子であるかどうかをｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖試験を用いて調べた。Ｔ細胞の増殖にはＴ細胞上に発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した刺激が必要であり、生体内ではＤＣなどの抗原提示細胞が提示する抗原をＴＣＲが認識することでＴ細胞に増殖シグナルが入る。ＴＣＲはＴ細胞膜上でＣＤ３サブユニット群と複合体を形成しており、ＴＣＲからの抗原刺激はＣＤ３サブユニットのリン酸化を介して細胞内へと伝えられる。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞に抗ＣＤ３抗体を作用させるとＴＣＲからの抗原刺激と同様の増殖シグナルを入れられることが知られており、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖試験として用いられている。また、同時に抗ＣＤ２８抗体や可溶化型ＣＤ８０分子、可溶化型ＣＤ８６分子を培養系に加えることでＣＤ２８分子を介した副刺激分子のＴ細胞増殖に対する作用を調べることができる［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻、７２１−７３０頁、１９９１年］。そこで、抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞増殖刺激下におけるＢＲＩＧＨＴの作用、さらには抗ＣＤ３抗体に加えて抗ＣＤ２８抗体からの活性化刺激が存在する条件でのＢＲＩＧＨＴのＴ細胞増殖に対する作用を調べた。具体的には、平底９６ウェル培養皿（＃１１７２、Ｆａｌｃｏｎ社製）に５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で段階稀釈した抗ＣＤ３抗体（ＢＤ　ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を５０μｌ／ウェルで分注し、４℃、一晩放置することで抗体を培養皿に固相化した。培養皿を洗浄後、５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で稀釈したＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇ、対照群として精製ヒトＩｇＧ１または可溶化型ヒトＣＤ８０（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を分注して、３７℃、４時間放置して固相化した。抗ＣＤ２８抗体を用いる場合には、抗ＣＤ３抗体の固相化後に段階稀釈した抗ＣＤ２８抗体の固相化を行ない、その後ＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇの固相化を行なった。抗体および可溶化型分子を固相化した培養皿は、ＰＢＳで洗浄後Ｔ細胞増殖試験に用いた。Ｔ細胞は、健常人末梢血から単核細胞を分離し、Ｐａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）により精製した純度９９％以上のＣＤ３陽性Ｔ細胞を用いた。１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に浮遊させたＴ細胞を、１×１０５個／ウェル／２００μｌずつ上記の固相化培養皿に播種し、３７℃、３日間、５％　ＣＯ２存在下で培養した。培養３日目の培養皿に３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を０．２５μＣｉ／ウェルとなるように添加し、さらに３７℃、１８〜２０時間、５％　ＣＯ２存在下で静置した。Ｍｉｃｒｏ９６　Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＳＫＡＴＲＯＮ社製）を用いて、Ｐｒｉｎｔｅｄ　Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ　Ａ（Ｗａｌｌａｃ社製）へ細胞に取り込まれた３Ｈチミジンを回収し、乾燥後Ｂｅｔａｐ；Ｓｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ社製）によく浸し、パッケージング後、β線量を１２０５　ＢＥＴＡＰＬＡＴＥ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）で活性測定した。固相化したＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇは、抗ＣＤ３抗体刺激下で増殖��るＴ細胞に対して、抑制効果を示した。また、抗ＣＤ３抗体による増殖刺激に加えてＣＤ２８分子を介した副刺激によりＴ細胞の増殖を促進させた条件下においても、固相化したＢＲＩＧＨＴ−ＩｇはＴ細胞の増殖に対して抑制効果を示した。（図８参照）
実施例１９　ＢＲＩＧＨＴの同種異系リンパ球混合培養に対する抑制作用
主要組織適合抗原（ＭＨＣ）の異なる同種異系の移植においては、Ｔ細胞が非自己（組織不適合）のＭＨＣ分子複合体（アロ抗原）を認識することで活性化し拒絶反応を引き起こす。ヒトのＭＨＣはＨＬＡ（ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）と呼ばれ、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの属するクラスＩ抗原と、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲの属するクラスＩＩ抗原があり、さらにそれぞれの分子が多型性を有するため、ヒトのＨＬＡの組み合せは数千通り可能となり、他人の間では組織不適合になる可能性がきわめて高くなっている。現在臨床的には臓器移植時の拒絶反応の抑制には、シクロスポリンＡやＦＫ５０６といった免疫抑制剤が用いられているが、これらの免疫抑制剤の問題点は免疫反応を非特異的に抑制してしまうため副作用が強く、またＴ細胞に免疫寛容を誘導することができないため、慢性拒絶には効果が弱い。一方、副刺激分子を介するシグナルの制御によってＴ細胞に免疫寛容を誘導したり、慢性拒絶を抑制できることがマウスの移植モデルの実験から明らかとなってきており［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、１１１０２−１１１０５頁、１９９２年］［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻、７８９−７９２頁、１９９２年］［Ｎａｔｕｒｅ、３８１巻、４３４−４３８頁、１９９６年］、ＢＲＩＧＨＴを介するシグナルの制御による免疫拒絶反応の抑制や免疫寛容の誘導が期待される。同種異系リンパ球混合培養は、組織適合抗原の異なる（以下便宜上ドナーＡ、ドナーＢという）リンパ球を混合培養することで、アロ抗原に反応するＴ細胞の増殖をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて調べる試験であるが、さらに、ドナーＡの末梢血からｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導した単球由来ＤＣ（ｍｏ−ＤＣ）とドナーＢの末梢血から分離したＴ細胞のみを混合培養することでも同様のアロ抗原に対するＴ細胞の反応性を調べることができる。そこで、固相化したＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇの存在下において、同種異系のＤＣとＴ細胞を用いた混合培養を行ない、Ｔ細胞のアロ抗原反応性に対するＢＲＩＧＨＴの作用を調べた。具体的には、平底９６ウェル培養皿（＃１１７２、Ｆａｌｃｏｎ社製）に５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で段階稀釈したＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇまたは対照群として精製ヒトＩｇＧ１を５０μｌ／ウェルで分注して、３７℃、４時間放置して固相化を行なった。可溶化型分子を固相化した培養皿は、ＰＢＳで洗浄後混合培養試験に用いた。実施例１６に記載の方法に従いドナーＡの末梢血より誘導し、ＬＰＳで活性化させた単球由来成熟ＤＣを１×１０５個／ｍｌとなるように１０％ヒト血漿を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（以下ＲＰＭＩ−１０％　ｐｌａｓｍａと称する）に浮遊させた。また、実施例１７に記載の方法に従いドナーＢの末梢血より分離した純度９９％以上のＣＤ３陽性Ｔ細胞を１×１０６個／ｍｌとなるようにＲＰＭＩ−１０％　ｐｌａｓｍａに浮遊させた。単球由来ＤＣ浮遊液とＣＤ３陽性Ｔ細胞浮遊液各々１００μｌずつをＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇを固相化した９６ウェル培養皿上で混合した。また対照群として、混合する前に単球由来ＤＣ浮遊液に抗ＣＤ８０抗体と抗ＣＤ８６抗体を各々５ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、���０分間静置したものをＴ細胞浮遊液と混合した。混合した細胞は３７℃、４日間、５％　ＣＯ２存在下で培養した後、３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を０．２５μＣｉ／ウェルとなるように添加して、さらに３７℃、１８〜２０時間、５％　ＣＯ２存在下で静置した。Ｍｉｃｒｏ９６　Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＳＫＡＴＲＯＮ社製）へ、Ｐｒｉｎｔｅｄ　Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ（Ｗａｌｌａｃ社製）を用いて細胞に取り込まれた３Ｈチミジンを回収し、乾燥後Ｂｅｔａｐ；Ｓｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ社製）によく浸し、パッケージング後、β線量を１２０５ＢＥＴＡＰＬＡＴＥ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）で活性測定した。固相化したＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇは、濃度依存的にアロ抗原反応性のＴ細胞の増殖を抑制した。またこのＢＲＩＧＨＴを介した抑制活性は、抗ＣＤ８０抗体と抗ＣＤ８６抗体によりＣＤ２８を介した副刺激を部分的に抑制した条件においても認められることから、これらの副刺激の経路とは独立してＴ細胞に作用することが示唆された。（図９参照）
実施例２０　ＢＲＩＧＨＴによる同種異系リンパ球混合反応におけるサイトカインｍＲＮＡの発現抑制
実施例１９の結果から、固相化したＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇがアロ抗原反応性のＴ細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。そこで、同種異系リンパ球混合反応での各種サイトカインｍＲＮＡ発現に対するＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇの作用を調べた。具体的には、平底２４ウェル培養皿（Ｆａｌｃｏｎ社　＃１１４７）を用いて、実施例１９と同様に４μｇ／ｍｌの濃度でＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇまたは対照群として精製ヒトＩｇＧ１の固相化を行なった。実施例１６に記載の方法に従いドナーＡの末梢血より誘導した単球由来未成熟ＤＣをＲＰＭＩ−ｐｌａｓｍａに浮遊させた。また、実施例１７に記載の方法に従いドナーＢの末梢血より分離した純度９９％以上のＣＤ３陽性Ｔ細胞を同様にＲＰＭＩ−１０％　ｐｌａｓｍａに浮遊させた。０．９×１０５個／ウェルの単球由来ＤＣと１．２×１０６個／ウェルＣＤ３陽性Ｔ細胞をＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇを固相化した２４ウェル培養皿上で混合した。３７℃、２１時間、５％　ＣＯ２存在下で培養した後、プレートより細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。ＧＥＡｒｒａｙ　ＫＩＴ（Ｓｕｐｅｒ　Ａｒｒａｙ社）のプロトコールに従い、ヒトサイトカイン遺伝子特異的なプライマーセットを使用して、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　１０μｇより、［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）存在下でＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＮａｓｅ　Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を用いた逆転写反応により、３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを作製した。ＢＲＩＧＨＴ−ＩｇまたはヒトＩｇＧ１が固相化された混合培養から得たそれぞれの３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを用いて、ヒトサイトカイン遺伝子特異的なｃＤＮＡフラグメントがスポットされたメンブラン（Ｓｕｐｅｒ　Ａｒｒａｙ社）に対して、ハイブリダイぜーションを行なった。メンブランを洗浄後、スポットの放射活性をＦＵＪＩＸバイオイメージングアナライザーＢＡＳ−２０００ＩＩ（冨士写真フィルム社製）にて解析を行なった。それぞれのサイトカイン遺伝子の発現量は、同じメンブラン上にスポットされたβ−ａｃｔｉｎの放射活性により補正を行なった。すなわち、以下の補正式に従ってそれぞれのサイトカインｍＲＮＡの相対的発現量を算出した。サイトカインｍＲＮＡ相対的発現量＝（サイトカインスポットの放射活性−バックグラウンドの放射活性）÷（β−ａｃｔｉｎスポットの放射活性−バックグラウンドの放射活性）。結果を図１０に示す。固相化されたＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇにより、同種異系リンパ球混合反応中のＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α　ｍＲＮＡ発現の顕著な抑制が認められた。
実施例２１　ＢＲＩＧＨＴによる同種異系リンパ球混合反応におけるサイトカイン分泌の抑制
同種異系リンパ球混合反応における各種サイトカイン分泌に対するＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇの作用を調べた。具体的には、平底９６ウェル培養皿（Ｆａｌｃｏｎ社　＃１１７２）を用い、実施例１９に記載の方法と同様に段階稀釈したＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇまたは対照群として精製ヒトＩｇＧ１の固相化を行なった。実施例１６に記裁の方法に従いドナーＡの末梢血より誘導した単球由来の未成熟ＤＣを１．５×１０５個／ｍｌとなるようにＲＰＭＩ−１０％　ｐｌａｓｍａに浮遊させた。また、実施例１７に記載の方法に従いドナーＢの末梢血より分離した純度９９％以上のＣＤ３陽性Ｔ細胞を１．５×１０６個／ｍｌとなるようにＲＰＭＩ−１０％　ｐｌａｓｍａに浮遊させた。単球由来ＤＣ浮遊液とＣＤ３陽性Ｔ細胞浮遊液各々１００μｌずつをＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇを固相化した９６ウェル培養皿上で混合した。混合した細胞を３７℃、３日間、５％　ＣＯ２存在下で培養した後、培養上清を回収した。培養上清中に分泌されたＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−１０をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社製）により測定した。図１１に結果を示す。同種異系リンパ球混合反応におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−１０の培養上清中への分泌が、ＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇの固相化濃度に依存して抑制された。つまり、固相化されたＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇが同種異系リンパ球混合反応における上記サイトカイン蛋白質産生においても抑制効果を示すことが明らかとなった。
実施例２２　ａｕｔｏ　ＰＢＭＣに対するａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２の作用
実施例１４に記載の方法に従い健常人末梢血単核細胞を調製し、１×１０８個／ｍｌとなるように２％ヒト血漿を含むＰＢＳ（以下ＰＢＳ−２％　ｐｌａｓｍａと称する）に浮遊し、抗ヒトＣＤ１４抗体結合磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を添加し氷冷下、３０分間放置した。細胞をＰＢＳ−２％　ｐｌａｓｍａで洗浄後、マグネットによる磁場内に設置した分離カラムＬＳ＋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）に供してＣＤ１４陽性細胞を分離した。このカラムに吸着しなかった細胞を回収し培養に供した。この画分をＣＤ１４陰性ＰＢＭＣと称する。ＣＤ１４陰性ＰＢＭＣを５％ヒト血漿入りＲＰＭＩ１６４０培地（以下ＲＰＭＩ−５％　ｐｌａｓｍａと称する）に１．０×１０６個／ｍｌの濃度で懸濁し、平底９６ウェル培養皿（＃３０７２、Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに２００μｌずつ播種し、下記に記す量のａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２あるいはｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２を添加した後、３７℃、３日間ないし４日間、５％　ＣＯ２存在下で培養した。培養３日目ないし４日目の培養皿に１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を１０μｌ／ウェルとなるように添加し、さらに３７℃、１４時間、５％　ＣＯ２存在下で静置した。Ｍｉｃｒｏ９６　Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＳＫＡＴＲＯＮ社製）を用いて、Ｐｒｉｎｔｅｄ　Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ　Ａ（Ｗａｌｌａｃ社製）へ細胞に取り込まれた３Ｈチミジンを回収し、乾燥後Ｂｅｔａｐ；Ｓｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ社製）によく浸し、パッケージング後、β線量を１２０５　ＢＥＴＡＰＬＡＴＥ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）で活性測定した。
設定した群は（ｉ）ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２（１．７２ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ／ウェルで添加した、（ｉｉ）ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２（１．７２ｍｇ／ｍｌ）を３μｌ／ウェルで添加し、ＲＰＭＩ−５％　ｐｌａｓｍａを７μｌ／ウェルで添加した、（ｉｉｉ）ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２（１．７２ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ／ウェルで添加し、ＲＰＭＩ−５％　ｐｌａｓｍａを９μｌ／ウェルで添加した、（ｉｖ）ｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２（１．４８ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ／ウェルで添加した、（ｖ）ｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２（１．４８ｍｇ／ｍｌ）を３μｌ／ウェルで添加し、ＲＰＭＩ−５％　ｐｌａｓｍａを７μｌ／ウェルで添加した、（ｖｉ）ｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２（１．４８ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ／ウェルで添加し、ＲＰＭＩ−５％　ｐｌａｓｍａを９μｌ／ウェルで添加した、（ｖｉｉ）ＲＰＭＩ−５％　ｐｌａｓｍａを１０μｌ／ウェルで添加した、以上７群である。一群３ウェルずつ同じ条件にした。液体シンチレーションカウンターによる測定値は、同じ条件の３つのウェルの値を平均して、これを各群の実験値とした。
この結果、複数の個体に由来する培養細胞において、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２添加群（ｉ）あるいは（ｉｉ）のカウントが対象群であるｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２添加群（ｉｖ）あるいは（ｖ）よりも顕著に高くなった。このカウントの上昇は添加するａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２の量に依存する傾向を示した。よって、ヒト末梢血ＣＤ１４陰性ＰＢＭＣでは、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２により細胞増殖活性の増強が得られることが明らかとなった。（図１２参照）
実施例２３　ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２作用後の健常人末梢血単核細胞のフローサイトメーターによる解析
１．０×１０６個／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ−５％　ｐｌａｓｍａに懸濁した細胞懸濁液を、平底４８ウェル培養皿（＃３０７８、Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに１ｍｌずつ播種し、下記に記す量のａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２あるいはｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２を添加した後、３７℃、９日間、５％　ＣＯ２存在下で培養した。この細胞を抗ＣＤ４−ＡＰＣ標識（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ標識（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、抗ＣＤ２５−ＰＥ標識（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ標識（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、抗ＴＣＲαβ−ＰＥ標識（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔａｒ社製）、抗ＣＤ５６−ＡＰＣ標識（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔａｒ社製）、以上の抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて解析した。設定した群は（ｉ）ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２（１．７２ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルで添加した、（ｉｉ）ｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２（１．４８ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルで添加した、（ｉｉｉ）ＲＰＭＩ−５％　ｐｌａｓｍａを５０μｌ／ウェルで添加した、以上３群である。この結果、（ｉ）の細胞において大型化し顆粒を含む形態をとる細胞（Ｌａｒｇｅ　ｇｒａｎｕｌａｒ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＬＧＬ）が（ｉｉ）や（ｉｉｉ）と比較して多く見られた。この細胞の表面抗原を解析すると、ＴＣＲαβ陽性細胞が８２％、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞が９７％、ＣＤ４陽性細胞が６８％、ＣＤ２５陽性細胞が８２％となった。以上のことから、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２を添加して培養することによりＬＧＬ様の細胞が増え、これらの細胞の多くは活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞であることが明らかとなった。（図１３参照）
実施例２４　スーパー抗原により活性化させた自己のリンパ球混合反応試験（ａｕｔｏ　ＭＬＲ）におけるａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２の作用
実施例１６に記載の方法に従い単球由来ＤＣを調製し、同じ健常人の末梢血から単核細胞を分離し、Ｐａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）により純度９９％以上のＣＤ３陽性Ｔ細胞を調製した。この単球由来ＤＣとＣＤ３陽性Ｔ細胞を混合しａｕｔｏ　ＭＬＲを平底９６ウェル培養皿（＃３０７２、Ｆａｌｃｏｎ社製）を用いて実施した。スーパー抗原の一種であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ（ＳＥＥ）を刺激抗原として、最終濃度０．３ｎｇ／ｍｌあるいは０．１ｎｇ／ｍｌあるいは０．０３ｎｇ／ｍｌとなるように直接反応系に添加した。Ｔ／ＤＣの細胞比を１０、２０、４０とし、Ｔ細胞数は１．５×１０５個／２００μｌ／ウェルとした。ＤＣにａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２あるいはｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２を最終濃度１０，２，０．４，０μｇ／ｍｌとなるように添加し氷冷下３０分間３０分反応させ、上記記載量のＳＥＥを加えさらに氷冷下３０分間反応させた後、Ｔ細胞を加え３７℃、２日間、５％　ＣＯ２存在下で培養した。培養３日目ないし４日目の培養皿に１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を１０μｌ／ウェルとなるように添加し、さらに３７℃、１４時間、５％　ＣＯ２存在下で静置した。Ｍｉｃｒｏ９６　Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＳＫＡＴＲＯＮ社製）を用いて、Ｐｒｉｎｔｅｄ　Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ　Ａ（Ｗａｌｌａｃ社製）を用いて細胞に取り込まれた３Ｈチミジンを回収し、乾燥後Ｂｅｔａｐ；Ｓｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ社製）によく浸し、パッケージング後、β線量を１２０５　ＢＥＴＡＰＬＡＴＥ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ社製）で活性測定した。
この結果、複数の個体に由来する培養細胞において、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２添加群のカウントは対象群であるｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２添加群と異なる値を示していた。よって、自己のリンパ球混合反応試験において、主にＴ／ＤＣの細胞比依存的にａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２によるＴ細胞に対する作用が見られることが明らかとなった。（図１４参照）
実施例２５　ＤＣによるＢ細胞からのＩｇＭ産生に対するａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２の作用
抗体産生による液性免疫反応の主役であるＢ細胞の増殖にはＤＣが関与していることが報告されている［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８５巻、９４１−９５２頁、１９９７年］。特にｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてはＩＬ−２添加時のＩｇＭ産生にはＤＣとＢ細胞の直接的な細胞間相互作用が関与していることが知られている。健常人末梢血からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ社製）を用いた密度勾配遠心法により分離した単核細胞を１×１０８個／ｍｌとなるように２％ウシ血清を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−２％　ＦＣＳ）に浮遊し、抗ヒトＣＤ１９抗体結合磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を添加し氷冷下、３０分間放置した。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳで洗浄後、５％　ＢＳＡ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ−ＥＤＴＡ）に懸濁し、マグネットによる磁場内に設置した分離カラムＬＳ＋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）に供してＣＤ１９陽性細胞を分離した。また実施例１６に記載の方法により単球由来未成熟ＤＣを調製し、５０ｎｇ／ｍｌ組換え体ヒトＴＮＦ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｔｅｃｈｎｅ社製）を添加し、３７℃、３日間、５％　ＣＯ２存在下で培養することによりＴＮＦ−α成熟ＤＣを分化誘導した。サンプルとして２μｇ／ウェル／５０μｌのａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２、ｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２を平底９６ウェル培養皿（＃３０７２、Ｆａｌｃｏｎ社製）に添加し１０％　ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に浮遊させたＴＮＦ−α成熟ＤＣを、１×１０４，３．３×１０３，１．１×１０３，３．７×１０２，０個／ウェル／５０μｌずつ播種し、３７℃、３０分、５％　ＣＯ２存在下で静置した。７５００ｒａｄのＸ線照射により増殖を停めたＣＤ４０Ｌ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　Ｌ　ｃｅｌｌ（２．５×１０３個／ウェル／５０μｌ）とＢ細胞（２×１０４個／ウェル／５０μｌ）、５０ｕｎｉｔ／ｍｌ組換え体ヒトＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を添加し、３７℃、１５日間、５％　ＣＯ２存在下で培養した。この上清中のＩｇＭ量をキャプチャー抗体としてｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　ＩｇＭ（ＤＡＫＯ社製）、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体としてｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｆ（ａｂ’）２ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　ＩｇＭ（ＤＡＫＯ社製）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定したところ、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２は対照群のｎｏｒｍａｌ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２に比べてＩｇＭの産生について抑制傾向を示した。（図１５参照）
配列表フリーテキスト
配列番号５−人工配列の説明：センスプライマー。
配列番号６−人工配列の説明：アンチセンスプライマー。
配列番号７−人工配列の説明：ＢＲＩＧＨＴ細胞外ドメイン（２９−４６５）とヒトＩｇＧ１　Ｆｃドメインとの融合タンパク質。
産業上の利用可能性
本発明により、ＤＣを他の血球系細胞から選択的に高い純度で分離することができるのみならず、成熟ＤＣと未成熟ＤＣとの分離も可能とすることから、ＤＣ療法への該細胞の供給を可能とする。分離されたＤＣは、抗原をパルスしたのち、再び患者に戻すことにより癌ワクチンとして利用するなどの用途が期待される。また、本膜分子に対する抗体あるいは本膜分子の可溶化型分子を用いてＤＣとＴ細胞との相互作用を亢進または抑制することで免疫応答を制御し得ることも期待される。
本明細書で引用した全ての刊行物および特許出願の全体を参考として本明細書に取り入れるものとする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本膜分子の推定アミノ酸配列の一次構造についてＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５７巻、１０５−１３２頁、１９８２年）に従って行ったハイドロパシープロットを示す。
図２は、実施例７のペプチド抗体を用いる可溶化型組換え体ＢＲＩＧＨＴおよび単球由来ＤＣ（ｍｏ−ＤＣ）のウエスタン解析の結果を示す。
図３は、還元条件および非還元条件下でのＢＲＩＧＨＴ−ＩｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
図４は、還元条件および非還元条件下でのＢＲＩＧＨＴ−ＳＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
図５は、末梢血単核細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性化とフローサイトメトリーによるＢＲＩＧＨＴの細胞表面上での発現解析の結果を示す。
図６は、ヒト単球ＤＣにおけるＢＲＩＧＨＴの発現分布の解析結果を示す。
図７は、活性化Ｔ細胞に発現するＢＲＩＧＨＴカウンターレセプターの解析結果を示す。
図８は、ＢＲＩＧＨＴ−ＩｇのＴ細胞増殖に対する抑制作用を示す。
図９は、ＢＲＩＧＨＴの同種異系リンパ球混合培養に対する抑制作用を示す。
図１０は、ＢＲＩＧＨＴによる同種異系リンパ球混合反応におけるサイトカインｍＲＮＡの発現抑制を示す。
図１１は、ＢＲＩＧＨＴ−Ｉｇによる同種異系リンパ球混合反応におけるサイトカイン分泌の抑制を示す。
図１２は、ヒト末梢血ＣＤ１４陰性ＰＢＭＣにおけるａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２による細胞増殖活性の増強作用を示す。
図１３は、ａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２作用後の健常人末梢血単核細胞のフローサイトメトリー解析結果を示す。
図１４は、スーパー抗原により活性化させた自己のリンパ球混合反応試験（ａｕｔｏ　ＭＬＲ）におけるａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２のＴ細胞に対する作用を示す。
図１５は、ＤＣによるＢ細胞からのＩｇＭ産生に対するａｎｔｉ−ＢＲＩＧＨＴ　Ｆ（ａｂ’）２の抑制作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１３】
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【図１３】
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【図１３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１４】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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