(57)【要約】アミノオリゴ糖誘導体の合成反応工程およびその金属錯体を形成する工程で生成する不純物、副生物および過剰の溶出液等の除去を効果的に行い、高度に精製されたアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体を得る。アミノオリゴ糖誘導体を含む粗反応液を、金属イオンとの錯化工程と精製工程とに供するアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法であって、該精製工程は、溶媒抽出法、陰イオン交換法、濾過膜分離法、電気透析法または吸着法による少なくとも１段階の工程からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）または（２）：
2002051854.tif 000008
（式中、ｍまたはｎは１〜８の整数を示す。Ｘは二官能性配位子を示す。）で示されるアミノオリゴ糖誘導体を含む粗反応液を、金属イオンとの錯化工程と精製工程とに供するアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法であって、該精製工程は、溶媒抽出法、陰イオン交換法、濾過膜分離法、電気透析法または吸着法による少なくとも１段階の工程からなることを特徴とするアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項２】
精製工程が、陰イオン交換法による工程からなる請求の範囲第１項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項３】
精製工程が、陰イオン交換法による工程と、吸着法による工程とからなる請求の範囲第１項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項４】
精製工程が、溶媒抽出法、濾過膜分離法、電気透析法または吸着法による少なくとも１段階の工程と、陰イオン交換法による工程とからなる請求の範囲第１項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項５】
精製工程が、溶媒抽出法、濾過膜分離法または電気透析法による少なくとも１段階の工程と、陰イオン交換法による工程と、吸着法による工程とからなる請求の範囲第１項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項６】
精製工程が、溶媒抽出法としてメタノール抽出法、陰イオン交換法として高速液体クロマトグラフィー法およびオープンカラムクロマトグラフィー法、濾過膜分離法として逆浸透膜法および限外濾過膜法、吸着法として活性炭吸着法、ならびに電気透析法よりなる群から選ばれる方法による少なくとも１段階の工程からなる請求の範囲第１項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項７】
錯化工程の前に、少なくとも１段階の精製工程を行なう請求の範囲第１項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項８】
錯化工程の前に行なわれる精製工程が溶媒抽出法による工程である請求の範囲第７項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項９】
錯化工程の前に行なわれる精製工程が、溶媒抽出法による工程と、これに引き続く陰イオン交換法による工程とからなる請求の範囲第８項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項１０】
錯化工程の前に行なわれる精製工程が、さらに、陰イオン交換法による工程に引き続く濾過膜分離法による工程を備えている請求の範囲第９項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【請求項１１】
陰イオン交換法が高速液体クロマトグラフィー法であり、濾過膜分離法が逆浸透膜法である請求の範囲第１０項記載のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬品原体の反応に伴う不純物、未反応物、副生物、その他の過剰な溶媒等の試薬類の除去を種々の精製法から選ばれた少なくとも１段階の工程により行い、高度に精製された医薬品原体を得る方法に関する。さらに詳しくは、ＭＲＩまたはＸ線イメージングの造影剤として有用なアミノオリゴ糖誘導体の高度に精製された金属錯体の製造方法に関する。
背景技術
一般に、医薬品原体の合成反応を行った際に、反応生成物は、未反応物、不純物、副生物の他、精製工程等で用いられる溶媒等の過剰な試薬が混在して得られる。これらの不純物等を精製除去する方法として高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーや限外ろ過、電気透析等の膜を用いる方法等が用いられる。例えば、特開平１１−２９５９３号にはアミノ基を含む分子とキレート化剤との結合方法において、膜を用いる方法及び／又はクロマトグラフィーにより不純物、副生物などを除いた後金属イオンを反応させて錯体化する方法が記載されている。しかしながら、医薬品原体の合成反応に伴う不純物や副生物は、その種類や合成法に応じて様々であり、膜を用いる方法やクロマトグラフィーには多くの異なる方法があるにもかかわらず具体的に記載されていないので、一律に適用することは困難である。
かかる現状に鑑み、本発明は、アミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法において、アミノオリゴ糖誘導体の合成反応工程およびその金属錯体を形成する工程で生成する不純物、副生物および過剰の溶出液等の除去を効果的に行い、高度に精製されたアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体を得ることができるようにすることを目的とする。
発明の開示
本発明は、下記式（１）または（２）：
2002051854.tif 000002
（式中、ｍまたはｎは１〜８の整数を示す。Ｘは二官能性配位子を示す。）で示されるアミノオリゴ糖誘導体を含む粗反応液を、金属イオンとの錯化工程と精製工程とに供するアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法であって、該精製工程は、溶媒抽出法、陰イオン交換法、濾過膜分離法、電気透析法または吸着法による少なくとも１段階の工程からなることを特徴とするアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造方法である。
すなわち、本発明の製造方法によれば、アミノオリゴ糖誘導体を含む粗反応液を、金属イオンとの錯化反応と、溶媒抽出法、陰イオン交換法、濾過膜分離法、電気透析法または吸着法による少なくとも１段階の精製工程とに供することにより、高度に精製されたアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体が得られる。精製工程は、溶媒抽出法としてメタノール抽出法、陰イオン交換法として高速液体クロマトグラフィー法およびオープンカラムクロマトグラフィー法、濾過膜分離法として逆浸透膜法および限外濾過膜法、吸着法として活性炭吸着法ならびに電気透析法よりなる群から選ばれる方法による少なくとも１段階の工程で構成することが好ましい。
また、精製工程は複数段階の工程から構成することが好ましい。この場合、各工程は上記各種精製方法から選ばれた異なる方法によるものとすることが好ましく、特に、陰イオン交換法による工程とその他の精製方法による工程とを組み合わせることが特に好ましい。かかる工程の組み合わせとしては、陰イオン交換法による工程と吸着法による工程との組み合わせ、溶媒抽出法、濾過膜分離法、電気透析法または吸着法による少なくとも１段階の工程と陰イオン交換法による工程との組み合わせ、溶媒抽出法、濾過膜分離法または電気透析法による少なくとも１段階の工程と陰イオン交換法による工程と吸着法による工程との組み合わせ等がある。これら複数の精製工程のうち、少なくとも１段階の精製工程を錯化工程の前に行ない、残りの段階の精製工程を錯化工程の後に行なっても良い。錯化工程の前に行なわれる精製工程としては、溶媒抽出法による工程が挙げられ、それに引き続き陰イオン交換法による工程を行なうこともでき、さらに引き続いて濾過膜分離法による工程を行なうこともできる。
上記式（１）又は（２）で示されるアミノオリゴ糖誘導体は、アミノオリゴ糖の還元末端を還元開裂して安定化した後、そのアミノ基に二官能性配位子として、エチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと略す。）、ジエチレントリアミン五酢酸（以下ＤＴＰＡと略す。）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（以下ＤＯＴＡと略す。）等のポリアミノポリカルボン酸をアミド結合して得られる。
上記アミノオリゴ糖としては、構成単糖の繰り返し単位が３〜１０であるキトサンオリゴ糖や構成単糖の繰り返し単位が３〜１０であるガラクトサミンオリゴ糖などが挙げられ、具体的にはキトサン３糖、キトサン４糖、キトサン５糖、キトサン６糖等のキトサンオリゴ糖、ガラクトサミン３糖、ガラクトサミン４糖、ガラクトサミン５糖、ガラクトサミン６糖等のガラクトサミンオリゴ糖が例示される。
本発明における粗反応液とは、アミノオリゴ糖誘導体を合成する際に得られる溶媒、未反応物、不純物および副生物等を含む反応液をいい、さらに、錯化工程後のアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体及び未反応遊離金属等を含有する反応液も包含する。例えば前記の如く還元末端を還元開裂させて安定化したアミノオリゴ糖（以下還元アミノオリゴ糖と略す。）に、無水ＤＴＰＡを水溶液中で反応させＤＴＰＡをアミド結合させる。その際に、結合したＤＴＰＡが複数の還元アミノオリゴ糖とアミド結合やエステル結合を形成して高分子化したり、ＤＴＰＡがアミノオリゴ糖の一部のアミノ基のみに結合し、未反応のアミノ基が残っているアミノオリゴ糖−ＤＴＰＡ結合体（以下欠損体と略す。）や、無水ＤＴＰＡが還元アミノオリゴ糖の分子内で２つのアミド結合を形成して環化する場合や未反応の無水ＤＴＰＡに由来するＤＴＰＡ等、目的とする還元アミノオリゴ糖の全てのアミノ基にＤＴＰＡが結合した化合物の他に、目的物より低分子量の化合物や高分子量の化合物等が副生物として混合した反応液が得られる。このような副生物、未反応物等を含む反応液を粗反応液と言う。
本発明の製造方法によれば、錯化工程において、ＤＴＰＡ等の二官能性配位子が結合したアミノオリゴ糖誘導体に、金属イオンとして、原子番号５７〜７０のランタノイド系の常磁性金属イオン、好ましくはＧｄ又はＤｙ、または、原子番号８２，８３のＰｂ、Ｂｉ等の非常磁性金属イオンを配位させて、アミノオリゴ糖誘導体の金属錯体が得られる。常磁性金属イオンの錯体はＭＲＩイメージングに、非常磁性金属イオンの錯体はＸ線イメージングに有用である。
錯化工程における金属イオンとの錯化反応は、例えば、アミノオリゴ糖誘導体を含む液にＧｄＣｌ３溶液の適量を滴下し、ｐＨ５〜７で室温下に撹拌することにより行われる。この錯化工程は、有機溶媒を用いた溶媒抽出法による精製工程に粗反応液を供してＤＴＰＡ等の未反応配位子の大部分を除去した後に行うのが好ましい。
精製工程は、溶媒抽出法、陰イオン交換法、濾過膜分離法、電気透析法または吸着法から選ばれた方法により行なうことができる。陰イオン交換法は、陰イオン交換樹脂を用いて行なうことができ、アミノオリゴ糖誘導体の粗反応液から前記低分子量化合物や高分子量化合物等の副生物と分離精製するのに好適である。陰イオン交換樹脂は高速液体クロマトグラフィー法の如く加圧下に用いてもよいし、オープンカラムクロマトグラフィーの如く常圧のイオン交換樹脂充填カラムを用いてもよく、これらの併用でもよい。陰イオン交換樹脂としては、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリメタクリレート等のメタクリル系基材、スチレンジビニルベンゼン共重合体、ポリスチレン等のスチレン系基材、シリカ系基材、アクリル系基材およびこれらの表面を親水性ポリマーで覆ったゲル基材に第４級アンモニウム基、ジエチルアミノエチル基、ジエチルアミノ基、第４級ポリエチルイミン基等の官能基を結合したものが用いられる。
溶媒抽出法は、粗反応液中に含まれる目的物および副生物と未反応の二官能性配位子とを分離精製するのに好適である。溶媒系としては水−有機溶媒系を用いるのが好ましく、この場合、目的物及び副生物等の反応生成物はオイル状の液相を形成して沈降し、未反応の二官能性配位子はオイル状の液相から分離した上層に抽出される。有機溶媒としては、アルコール類が好適に用いられ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が例示されるが、中でもメタノールは好ましい。
吸着法は、低分子量化合物や遊離金属を吸着分離するのに好適である。吸着剤としては、活性炭等の炭素系吸着剤、ゼオライト系吸着剤、シリカ系吸着剤、アルミナ系吸着剤、スチレン−ビニルベンゼン共重合体やアクリル系重合体等の吸着樹脂等が用いることができるが、活性炭を用いるのが好ましい。
電気透析法は、塩類等比較的低分子の微量不純物を除去するのに好適であり、特に、イオン交換樹脂の溶出液に由来する微量の残留ＮａＣｌや活性炭に由来する微量金属塩等の分離除去に有効である。分画分子量約１００の電気透析膜が好適に用いられる。
濾過膜分離法としては、逆浸透膜法、限外濾過膜法が挙げられ、膜の特性に応じて使い分けられる。逆浸透膜法は、陰イオン交換法で用いた多量の溶出液を除去してアミノオリゴ糖誘導体を濃縮するのに有効である。限外濾過膜法は、特に高い分子量を有するものを除去するのに有効である。限外濾過膜法を精製工程の最終段階においてエンドトキシンの除去等に用いる場合、分画分子量約２０，０００の限外濾過モジュールが好ましく用いられる。
さらに、本発明の製造方法によって得られたアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の水溶液は、凍結乾燥法または噴霧乾燥法によって乾燥することによって、アミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の粉末として回収できる。この粉末は、薬学的に許容されたｐＨ調節剤、溶解剤その他の添加物とともに無菌的に溶解し、ＭＲＩあるいはＸ線イメージングの造影剤として提供することができる。
本発明の実施形態の具体例として、例えば、前記粗反応液としてキトサン３糖の還元末端還元体（以下還元キトサン３糖と略す。）とＤＴＰＡとの反応液を用いた工程が例示できる。粗反応液には、還元キトサン３糖とＤＴＰＡ結合体（以下ＣＨ３−ＤＴＰＡと略す。）の他、それらの未反応物と前述したような低分子量化合物や高分子量化合物等が含まれる。まず、この粗反応液のメタノール抽出を行う。これにより、目的物のＣＨ３−ＤＴＰＡおよびその他の副生物等はオイル状液相を形成して沈降し、大部分の未反応ＤＴＰＡはそのオイル状液相の上層の液相に移行するので、オイル状液相を分取する。得られたオイル状液相を陰イオン交換樹脂カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー法によりＣＨ３−ＤＴＰＡを分取し、次いで逆浸透膜法を用いて高速液体クロマトグラフィーの溶出液を除去してＣＨ３−ＤＴＰＡを濃縮する。この濃縮されたＣＨ３−ＤＴＰＡを含む溶液にＧｄＣｌ３溶液を滴下してＣＨ３−ＤＴＰＡとＧｄイオンとの錯体を形成し、次いでオープンカラム陰イオン交換樹脂法によりさらに残留している微量の未反応ＤＴＰＡや低分子量化合物、高分子量化合物等を除去する。次いで、活性炭吸着法、電気透析法、限外濾過膜法を用いて遊離のＧｄイオン、陰イオン交換法の溶出液およびエンドトキシンの除去処理を順次行うことにより、高度に精製されたＣＨ３−ＤＴＰＡ−Ｇｄ錯体の水溶液を得ることができる。このようにして得られた高度に精製されたＣＨ３−ＤＴＰＡ−Ｇｄ錯体水溶液は、約２０％の水溶液として得られるが、前記の如く凍結乾燥または噴霧乾燥によりＣＨ３−ＤＴＰＡ−Ｇｄ錯体の粉末として得られ、造影剤の原薬として用いられる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１　粗反応液のメタノール抽出
還元キトサン３糖とＤＴＰＡとのアミド結合物ＣＨ３−ＤＴＰＡを含む粗反応液約６１ｇ（５０ｍＬ）を正確に計量し、１２Ｎ塩酸でｐＨ調整を行った後、メタノールを撹拌しながら約１５分以上かけてゆっくり滴下した。滴下終了後、滴下終了時の温度３０−３５℃を保ちつつさらに１５分間撹拌を行い、３０分静置した。液は澄明な上層とオイル状の下層の２相に分離した。上層には主として未反応のＤＴＰＡが移行し、オイル状の下層には主としてＣＨ３−ＤＴＰＡと前記の如き低分子量化合物や高分子量化合物等の副生物が移行したことをＨＰＬＣによって確認した。各相の分析を行い、ＣＨ３−ＤＴＰＡの回収率および未反応ＤＴＰＡの除去率を求めた。結果を表１に示す。
2002051854.tif 000003
実施例２　高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるＣＨ３−ＤＴＰＡの分離
実施例１で得られたオイル状液相に含まれるＣＨ３−ＤＴＰＡ、低分子量化合物および高分子量化合物の分離を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。分離条件は下記の通りである：
装置：ＳＨＩＭＡＺＵ　ＬＣ−８Ａ（島津製作所製）
樹脂：Ｐｏｒｏｓ５０　ＨＱ（アプライドバイオシステム社製）
カラムサイズ：３０Φ×２５０ｍｍＬ
流速：７０ｍＬ／ｍｉｎ
線速度：１０ｃｍ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ　２１０ｎｍ
吸着成分の溶出：５０−１５０ｍｍｏｌ／Ｌ（低分子量化合物の溶出）、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＣＨ３−ＤＴＰＡの溶出）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ（高分子量化合物の溶出）の３種類の濃度の食塩溶液を用いて、ステップワイズ溶出を行った。結果を表２に示す。
2002051854.tif 000004
実施例３　逆浸透膜による塩の除去
実施例２においてＨＰＬＣで分取されたＣＨ３−ＤＴＰＡ溶出液５５Ｌを試料として用意した。なお、この溶液のＣＨ３−ＤＴＰＡ濃度は０．０６％で、残りはＨＰＬＣの溶出液として用いたＮａＣｌ溶液であった。また、ポリアミド製の直径４インチのモジュール（Ｄ：分画分子量３００）およびスルホン化ポリエーテルスルホン製の直径２インチのモジュール（Ｅ：分画分子量５００）を用意した。そして、試料のｐＨをそれぞれの膜の特性に適合した値に調整した後、試料が約８Ｌになるまで脱塩濃縮した。その後、原液タンクの試料量が変化しないように純水を加水しつつ伝導度が一定になるまで脱塩操作を行った。結果を表３に示す。
2002051854.tif 000005
実施例４　イオン交換樹脂カラムによる精製
実施例３によって得られた脱塩後のＣＨ３−ＤＴＰＡ溶液にＧｄＣｌ３溶液の適量を滴下し、ｐＨ５〜７で室温下に撹拌して、ＣＨ３−ＤＴＰＡ−Ｇｄ錯体形成を行った。ＣＨ３−ＤＴＰＡ−Ｇｄ錯体形成を行った液には、目的成分のＣＨ３−ＤＴＰＡ−Ｇｄ錯体の他にＨＰＬＣでは除去しきれなかった微量の低分子量化合物や高分子量化合物およびそれらのＧｄ錯体等が存在するので、それらの除去を塩素型陰イオン交換樹脂（ＩＲＡ６７：オルガノ社製）を用いて下記のとおり行った。
陰イオン交換樹脂ＩＲＡ６７（Ｃｌ型）を、２１ｍｍΦ×５８ｍｍＬのガラスカラムに充填した。このカラムに前記の如くにして得られたＣＨ３−ＤＴＰＡ−Ｇｄ錯体溶液を６４０ｍＬ（試料負荷量３．２ｇ、負荷率０．１６ｇ／ｍＬ（試料／樹脂））を通過せしめ、次いで脱イオン水１０００ｍＬで水洗した後、溶離液として濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ、３０ｍｍｏｌ／Ｌ　、５０ｍｍｏｌ／Ｌの食塩水を順次陰イオン交換樹脂カラムを通過させ、各フラクションを採取して分析を行った。表５に結果を示す。Ａ，Ｂ，ＣはそれぞれＣＨ３−ＤＴＰＡ−Ｇｄ、低分子量化合物、高分子量化合物を示す。また各フラクションには成分Ａ、Ｂ、Ｃは合計約１０ｍｇ／Ｌ程度含まれており、その他は溶出液の食塩水である。表５は溶出液を除いたＡ、Ｂ、Ｃ各成分の割合を純度として示した。フラクションＦ４、Ｆ５、Ｆ６がフラクションＡの純度９７％以上を示したので、次の精製工程に供することにした。目的成分Ａの回収率は約８５％であった。結果を表４に示す。
2002051854.tif 000006
実施例５　活性炭吸着による低分子量化合物、高分子量化合物および遊離ガドリニウムの除去
実施例４で得られたフラクションＦ４、Ｆ５、Ｆ６にはまだ微量の低分子量化合物、高分子量化合物の他、ＣＨ３−ＤＴＰＡと錯体を形成し得なかった遊離ガドリニウムが存在するので、さらに活性炭吸着によって除去精製した。活性炭として太閤活性炭（商品名：二村化学製）を用い、０．９％（ｗ／ｖ）のＡ成分純度９８％以上のフラクションには７．５ｇ／Ｌ　、０．９％（ｗ／ｖ）の９７％−９８％のフラクションには１５ｇ／Ｌの活性炭粉末を添加し、常温で６０分間撹拌後活性炭をろ過して、分析した。結果を表５に示す。かくして、純度９９％以上に精製されたＣＨ３−ＤＴＰＡ−Ｇｄ錯体の水溶液が得られることが示された。
2002051854.tif 000007
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、アミノオリゴ糖誘導体の合成工程で生成する不純物、副生物、過剰の塩類等を有効に除去して、高度に精製されたアミノオリゴ糖誘導体の金属錯体の製造を行うことが可能となる。
【国際調査報告】
2002051854.tif 000009
2002051854.tif 000010