(57)【要約】骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）試験物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて破骨細胞前駆細胞および破骨細胞誘導物質と接触させる工程；および（ｂ）試験物質が破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化に与える影響を確認する工程；を含む方法。この方法により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける試験物質の破骨細胞前駆細胞への作用が、迅速かつ簡便に評価できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて破骨細胞前駆細胞および破骨細胞誘導物質と接触させる工程；および
（ｂ）試験物質が破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化に与える影響を確認する工程；
を含む方法。
【請求項２】
破骨細胞誘導物質がＲＡＮＫＬあるいはＴＮＦ−αである請求項１記載の方法。
【請求項３】
試験物質がビタミンＤ誘導体である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）が破骨細胞数を計測することを含む請求項１乃至３記載の方法。
【請求項５】
破骨細胞前駆細胞が骨髄あるいは脾臓由来である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
破骨細胞前駆細胞がマウス由来である請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法によって得られたビタミンＤ誘導体。
【請求項８】
請求項７記載のビタミンＤ誘導体を有効成分として含有する、破骨細胞の形成または活性化過程に異常がみられる疾患の治療薬。
【請求項９】
破骨細胞の形成または活性化過程に異常がみられる疾患が代謝性骨疾患である、請求項８記載の治療薬。
【請求項１０】
代謝性骨疾患が骨粗鬆症である、請求項９記載の治療薬。
【請求項１１】
破骨細胞前駆細胞；
破骨細胞誘導物質；および
所望により好適な培地；
を含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を行うためのキット。
【請求項１２】
ＡＰ−１による転写促進活性を阻害する活性を測定することを特徴とする破骨細胞形成抑制作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
物質がビタミンＤ誘導体である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらにＶＤＲＥを介する転写促進活性を測定し、ＶＤＲＥを介する転写促進活性が活性型ビタミンＤよりも弱く、ＡＰ−１による転写促進活性を阻害する活性が活性型ビタミンＤによりも強いビタミンＤ誘導体を選択することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４に記載の方法によって得られる骨粗鬆症の予防及び／又は治療薬。
【請求項１６】
１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｓ）−｛（２Ｓ）−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ｝−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン、１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｓ）−（２−エチル−２−ヒドロキシブチルチオ）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン、または１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｒ）−（２−エチル−２−ヒドロキシブチルチオ）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエンのいずれかを有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングするための新規な方法に関し、さらに詳細には、破骨細胞前駆細胞に影響を与える物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてスクリーニングするための新規な方法に関する。
背景技術
骨吸収に作用を及ぼす物質は、代謝性骨疾患（例えば、骨粗鬆症、腎性骨異栄養症）等の代謝性骨疾患に対する治療効果が期待できる。こうした物質を治療薬などとして開発するためには、骨吸収に作用を及ぼす物質のスクリーニングが不可欠であり、現在までに様々なスクリーニング法が開発されている。
従来の、骨吸収に作用を及ぼす物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法は、器官培養系を用いる方法と共存培養系を用いる方法に大別される。しかし、骨吸収は様々な因子が複雑に絡み合って生じるため、各種の化合物の作用を正確にかつ簡便に評価することは難しく、ｉｎ  ｖｉｖｏでは骨吸収抑制活性を示す化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニング系では骨吸収促進活性を示すこともある。
器官培養系を用いる方法においては、４５Ｃａ（Ｒａｉｓｚ  ＬＧ  １９６３  Ｎａｔｕｒｅ  １９７：１０１５）あるいは３Ｈ−ｐｒｏｌｉｎｅ（Ｓｔｅｒｎ  ＢＤ，ｅｔ．ａｌ．１９６５  Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：５７７）等でラベルしたマウス胎児の骨（長管骨または頭頂骨）を試験化合物を含む培養液中で培養し、培養液中に遊離された放射性ラベル体の量から骨吸収の強度を評価する。非標識カルシウム（４０Ｃａ）を使用する方法もある（Ｈｏｈｍａｎｎ  ｅｌ，ｅｔ．ａｌ．１９８３  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１２：１２３３）。本系には、成熟破骨細胞以外にも、骨芽細胞、造血系細胞、あるいはそれらの前駆細胞等の多種の細胞が含まれる。従って本系において検出される骨吸収の亢進は、既存の破骨細胞の活性化や破骨細胞への分化促進による破骨細胞数の増加以外に、骨芽細胞からのコラゲナーゼ分泌促進による作用も含まれると考えられる。破骨細胞前駆細胞に直接作用してその分化を抑制することが知られているエストロゲンの作用は、この系では確認されていない。従って、器官培養系を用いる方法は、破骨細胞前駆細胞への直接作用を検出するには適当でない可能性がある。また、操作が煩雑である、大量の放射性元素を使用するなどの問題もある。
共存培養系を用いる方法は、血液幹細胞（破骨細胞前駆細胞）が破骨細胞へ分化する過程の活性化を、産生された破骨細胞の数を指標として評価するものである。破骨細胞前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、骨芽細胞様ストローマ細胞共存下、骨吸収促進因子（副甲状腺ホルモン、プロスタグランディン類など）の刺激によって破骨細胞となる。本系において破骨細胞前駆細胞及び破骨細胞形成支持細胞として使用する細胞は、１）骨髄細胞のみ（須田立雄ら、１９９２  マクロファージ実験マニュアル（徳永徹ら、編）ｐ．６０、講談社、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ，ｅｔ．ａｌ．１９８８  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：１３７３）、２）骨髄細胞または脾臓細胞と頭頂骨由来骨芽細胞様ストローマ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ，ｅｔ．ａｌ．１９８８  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２３：２６００）等が挙げられる。
本系においては、骨芽細胞側から破骨細胞前駆細胞側へのシグナルを遮断するＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）が破骨細胞抑制因子として同定されているが（Ｓｉｍｏｎｅｔ  ＷＳ，ｅｔ．ａｌ．１９９７  Ｃｅｌｌ  ８９：３０９、Ｔｓｕｄａ  Ｅ，ｅｔ．ａｌ．１９９７  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｒａｍｕｎ  ２３４：１３７、Ｙａｓｕｄａ  Ｈ，ｅｔ．ａｌ．１９９８  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ３９：１３２９）、破骨細胞前駆細胞側に直接作用するエストロゲンの作用は、器官培養系同様、この系では確認されていない。従ってこの系も、破骨細胞前駆細胞への直接作用を検出するには適当でない可能性がある。
例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３または１α−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体は、骨粗鬆症モデルラットを用いた実験や臨床試験の結果等から、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨吸収抑制活性を有することが知られており（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ａ，ｅｔ．ａｌ．２０００  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １５：７７０、Ｓａｉｒａｎｅｎ  Ｓ，ｅｔ．ａｌ．２０００  Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  Ｔｉｓｕｅ  Ｉｎｔ  ６７：１２２）、既に骨粗鬆症などの代謝性骨疾患の治療薬として広く臨床で使用されている。薬理量においては、骨吸収抑制活性が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３による骨量維持または増加作用に大きく寄与していると考えられている。
こうした１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の骨吸収抑制活性は、（ａ）小腸からのカルシウム吸収促進、（ｂ）副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の分泌抑制などにより、骨吸収を間接的に抑制するものであり、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニング系では評価できないものと考えられていた。実際、上述の器官培養系においては１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３には骨吸収促進活性しか観察されておらず（赤津拓彦ら、１９８９  実験医学  ７：１２７２）、共存培養系においてもビタミンＤ誘導体は骨芽細胞を介して破骨細胞形成促進因子として作用する。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏで１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の示す骨吸収抑制活性とは整合しないものである。
しかし、近年の研究より、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は上記（ａ）、（ｂ）では説明しきれない骨吸収抑制活性を有することが明らかとなってきている（Ｓａｉｒａｎｅｎ  Ｓ，ｅｔ．ａｌ．２０００  Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  Ｔｉｓｕｅ  Ｉｎｔ  ６７：１２２、Ｅｎｄｏ  Ｋ−１，ｅｔ．ａｌ．２０００  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １５：１７５）。この（ａ）、（ｂ）によらない骨吸収抑制活性が、破骨細胞への直接作用によるものであれば、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニング系では評価できない可能性がある。
近年、破骨細胞形成は、骨芽細胞あるいは骨芽細胞様ストローマ細胞の膜上に存在するＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）の発現が、破骨細胞形成因子によって上昇するために誘導されることが明らかとなった。更に可溶型ＲＡＮＫＬ（ｓｏｌｕｂｌｅ  ＲＡＮＫＬ、ｓＲＡＮＫＬ）でも破骨細胞形成能を有することが報告された。
Ｉｔｏｎａｇａらは、従来のように骨芽細胞あるいは骨芽細胞様ストローマ細胞を活性化する代わりに、一定量のｓＲＡＮＫＬを添加して破骨細胞を誘導する破骨細胞形成系を考案した（Ｉｔｏｎａｇａ  Ｉ，ｅｔ．，ａｌ．１９９９  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６４：５９０）。この系においては、ヒト末梢血単核食細胞由来の破骨細胞前駆細胞を、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、ｓＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）の存在下で２１日間培養後、誘導された破骨細胞が吸収する骨吸収窩の面積を測定している。その結果、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が破骨細胞形成に抑制的に働きうることが示された。この系においては骨芽細胞あるいは骨芽細胞様ストローマ細胞からの影響を無視できるため、試験物質の破骨細胞前駆細胞への直接作用がｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価できるが、培養期間が長いこと、評価方法が煩雑であること等から、さらなる改良が望まれていた。
以上述べたように、従来の器官培養系や共存培養系を使用して、骨吸収に作用する物質をスクリーニングする方法では、試験物質の破骨細胞前駆細胞への直接作用がｉｎ  ｖｉｔｒｏでは十分評価できなかった。また、Ｉｔｏｎａｇａらの方法では、骨芽細胞等の他の細胞からの影響は無視できるが、迅速性や簡便性等の点でさらなる改良が望まれていた。
発明の開示
本発明は、試験物質の破骨細胞前駆細胞への直接作用が、迅速かつ簡便に評価できるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
このような背景を受けて、筆者は試験物質の骨吸収への影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価可能な系を探索し、破骨細胞前駆細胞への直接作用を検討する系を見いだした。そしてこの系が試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの骨吸収抑制あるは亢進作用強度の指標として使用できるのではないかと考え、新規のスクリーニング系として提案するに至った。
すなわち、本発明は
（ａ）試験物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて破骨細胞前駆細胞および破骨細胞誘導物質と接触させる工程、および
（ｂ）試験物質が破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化に与える影響を確認する工程、
を含む、骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
また、本発明の別の側面によれば、上記の方法によって得られたビタミンＤ誘導体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の方法によって得られたビタミンＤ誘導体を有効成分として含有する医薬が提供される。
本発明のまた別の側面によれば、破骨細胞前駆細胞、破骨細胞誘導物質および所望により好適な培地を含むキットが提供される。
さらに、本発明の別の側面によれば、ＡＰ−１による転写促進活性を阻害する活性を測定することを特徴とする破骨細胞形成抑制作用を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。
また、本発明の別の側面によれば、物質がビタミンＤ誘導体であって、さらにＶＤＲＥを介する転写促進活性を測定し、ＶＤＲＥを介する転写促進活性が活性型ビタミンＤよりも弱く、ＡＰ−１による転写促進活性を阻害する活性が活性型ビタミンＤによりも強いビタミンＤ誘導体を選択することを特徴とする、破骨細胞形成抑制作用を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。
さらに加えて、本発明の別の側面によれば、かかる方法によって得られる骨粗鬆症の予防及び／又は治療薬が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明のより具体的な態様、並びに本発明を実施するための方法につき説明するが、本発明は下記の記載によって限定されるものではない。
なお、本発明において、「破骨細胞前駆細胞への直接作用」とは、破骨細胞以外の細胞、例えば、骨芽細胞様ストローマ細胞、骨芽細胞、造血系細胞、あるいはそれらの前駆細胞等を介する作用でないことを意味する。
本発明の方法は、骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）試験物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて破骨細胞前駆細胞および破骨細胞誘導物質と接触させる工程、および（ｂ）試験物質が破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化に与える影響を確認する工程を含む。
本発明の方法に使用される試験物質としては、骨吸収に影響を与える物質が好ましく、特に、破骨細胞前駆細胞へ直接影響を与えることのできる物質が好ましい。こうした物質は、破骨細胞前駆細胞への直接的作用のみでなく、骨芽細胞様ストローマ細胞、骨芽細胞、造血系細胞、あるいはそれらの前駆細胞等を介する作用をさらに有していてもよい。例えば、各種ホルモン（エストロゲン等）、各種ビタミン（ビタミンＤ誘導体等）、各種サイトカインが挙げられ、特にビタミンＤ誘導体が好ましい。
破骨細胞誘導物質とは、直接的あるいは間接的に破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へ誘導する能力を有する物質のことであるが、破骨細胞前駆細胞に直接的に作用して破骨細胞へ誘導できることが望ましい。例えば、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）等が挙げられる。なお、ＲＡＮＫＬは通常膜結合型であるため、培養系では可溶型（ｓＲＡＮＫＬ）を用いることが好ましい。
骨吸収への影響としては、骨吸収の亢進であっても抑制であってもよい。破骨細胞前駆細胞への影響としては、誘導される破骨細胞数の増加あるいは減少、成熟した破骨細胞の活性化、破骨細胞の寿命の調節等が挙げられる。
本発明のスクリーニング法に使用される破骨細胞前駆細胞は、特に限定されないが、骨髄、脾臓、末梢血由来であることが好ましく、骨髄あるいは脾臓由来であることが特に好ましい。また、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ウシ等由来であることが好ましく、マウス由来であることが特に好ましい。例えば、マウスの骨髄由来の破骨細胞前駆細胞を調製するには、まずマウスの脛骨の骨髄腔より骨髄細胞を採取し、血清を含まない培養液で洗浄後、血清含有培養液中に約１〜１０×１０５個／ｍｌ、好ましくは約４×１０５個／ｍｌの濃度で浮遊させることが好ましい。このようにして、採取された骨髄細胞を適当量のＭ−ＣＳＦの存在下で培養することで、破骨細胞前駆細胞を誘導することができる。Ｍ−ＣＳＦ等で誘導された破骨細胞前駆細胞に、破骨細胞誘導物質を作用させることで破骨細胞を誘導することができる。
本発明の方法の工程（ａ）においては、試験物質と破骨細胞誘導物質とを含む好適な培地において破骨細胞前駆細胞を培養する。こうした工程により、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化を誘導する。
培地としては、抗生物質を含むα−ＭＥＭ／ＦＢＳ（ウシ胎児血清）等が好ましく用いられる。培地中にはＭ−ＣＳＦを含む。培養条件は、通常、約３７℃、約５％ＣＯ２の存在下に行われる。培養期間は、試験物質の種類や添加量、使用する破骨細胞前駆細胞の種類や培養時の細胞密度等にもよるが、通常２日〜１０日、好ましくは２〜１週間、さらに好ましくは約３〜５日間である。
本発明の方法の工程（ｂ）においては、試験物質の骨吸収に及ぼす作用を確認するために、試験物質が破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化に与えた影響を、例えば、誘導された破骨細胞の数やその骨吸収能等から評価する。簡便性、迅速性の点からは、誘導された破骨細胞数を測定することが好ましい。破骨細胞数測定のためには、染色して顕微鏡下で計数することが好ましい。染色には、通常の組織化学的染色、免疫組織学的染色等が使用できるが、簡便性、迅速性などの点では、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色等が好ましい。
例えば、試験物質を加えた場合に誘導された破骨細胞数と、試験物質を加えなかった場合に誘導された破骨細胞数と比較することで、試験物質の効果を評価してもよい。あるいは、試験物質の骨吸収に及ぼす作用を評価する基準として、何らかの標準物質を使用してもよい。標準物質の種類は特に限定されず、ホルモン、ビタミン、サイトカイン等、任意の物質を適宜使用できる。例えば１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、エストロゲン、ＴＮＦ−α等を標準物質として使用し、これを加えた場合よりも破骨細胞数の減少あるいは増加効果の高い化合物を選択すれば、骨吸収抑制作用あるいは亢進作用の高い有利な化合物を探索することができる。
さらに、本願の方法の別の態様としては、破骨細胞誘導物質の阻害剤を培養液中に加えれば、試験物質による破骨細胞数の変化がその破骨細胞誘導物質を介する作用なのか介さない作用なのかが検出できる。
こうした本発明の方法により選択されるビタミンＤ誘導体は、骨吸収の異常を伴う疾患、特に骨吸収の抑制あるいは亢進がその発症または進行に関与する疾患の治療薬として有用であると予想される。中でも、破骨細胞の形成または活性化過程に異常がみられる疾患、特に破骨細胞数の減少あるいは増加がその発症または進行に関与する疾患の治療薬として有用である可能性があり、例えば、骨粗鬆症、腎性骨異栄養症等の代謝性骨疾患や、慢性関節リウマチ、変形性関節炎等の関節疾患が挙げられる。
本発明の方法により選択されるビタミンＤ誘導体を疾患の治療薬として用いる場合、その剤型は特に限定されず、用途などに応じて、錠剤、カプセル剤、分散剤、溶液、懸濁液、乳剤など任意の形態をとることができる。
投与経路としては、経口投与でも非経口投与でもよく、非経口投与では静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、外用など任意の投与経路を使用できる。
また、投与量も特に限定されず、患者の体重、性別、病状の度合いなどに応じて適宜設定することができ、一般的には０．００１μｇ／ｋｇ／日〜１０００μｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．１μｇ／ｋｇ／日〜１０μｇ／ｋｇ／日程度である。
また、投与回数も限定されず、上記投与量を一日一回から数回に分けて投与してもよく、投与期間も、数日〜数週間または数週間〜数カ月間に渡って投与することができる。
本発明のキットは、上述の本発明の方法を行うためのものであり、破骨細胞前駆細胞と破骨細胞誘導物質とを含むが、所望により好適な培地を含んでもよい。
破骨細胞誘導物質としては、直接的あるいは間接的に破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へ誘導する能力を有する物質が挙げられる。例えば、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）等が挙げられる。なお、ＲＡＮＫＬを使用する場合には、可溶型を用いることが好ましい。
破骨細胞前駆細胞としては、特に限定されないが、骨髄、脾臓、末梢血由来であることが好ましく、骨髄あるいは脾臓由来であることが特に好ましい。また、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ウシ由来であることが好ましく、マウス由来であることが特に好ましい。本願のキットにおいては、こうした破骨細胞前駆細胞は、容易に培養可能な状態に回復できるような形態で保持されていることが好ましい。例えば、グリセリンやＦＢＳ等を含むα−ＭＥＭ等の培地中で凍結保存した状態や、培養用のフラスコで培養してある状態などである。
また、本発明のキットは、所望により、破骨細胞を検出するための試薬やＭ−ＣＳＦ、培養用プレート、使用説明書、標準物質等を含んでもよい。さらに、破骨細胞誘導物質、Ｍ−ＣＳＦ、試験物質、標準物質等の溶解用バッファーを含んでもよい。破骨細胞を検出するための試薬としては、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）等の他に、放射線、蛍光、酵素等で標識された抗体（例えば、ビトロネクチンレセプター等）等が挙げられる。
本発明のスクリーニング法においては、試験化合物のＶＤＲＥを介する転写促進活性が測定される。ＶＤＲＥとは、ビタミンＤ誘導体などのリガンドが結合したビタミンＤ受容体が結合して作用することによってその下流にある遺伝子の発現が活性化される。ＤＮＡ上の調節配列の１種である。例えば、ビタミンＤの副作用である高カルシウム血症は、ＶＤＲＥを介して生じると考えられている。ＶＤＲＥのＤＮＡ塩基配列は、生物種、並びに同一の生物種の中でも調節の対象となる遺伝子の種類などに応じて異なる場合があるが、本発明においては何れのＶＤＲＥ配列を使用しても構わない。例えば、マウスのオステオポンチン遺伝子のＶＤＲＥ配列を使用してレポーター遺伝子アッセイ系でスクリーニングすることができる。他のＶＤＲＥ配列としては、例えば、ラットオステオカルシン遺伝子、ヒトオステオカルシン遺伝子、ラットカルビンディン−Ｄ９Ｋ遺伝子、ヒトカルビンディン−Ｄ９Ｋ遺伝子、マウスカルビンディン−Ｄ９Ｋ遺伝子、ラット２４−ハイドロキシラーゼ遺伝子、ヒト２４−ハイドロキシラーゼ遺伝子、ニワトリインテグリンβ３遺伝子などが挙げられ、これらも本発明の方法で使用できる。
本発明のスクリーニング法においては、試験化合物の転写因子ＡＰ−１の活性阻害作用が測定される。転写因子とは、一般的には、核内においてＤＮＡからＲＮＡへの転写反応に必要なタンパク質性の因子を意味し、本発明においては特に特定遺伝子の上流の特定の塩基配列を認識して結合することによってその遺伝子の発現を制御する因子を意味する。
ＡＰ−１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）複合体は、Ｊｕｎファミリーのホモ二量体あるいはＦｏｓファミリーのヘテロ二量体から構成され、ＡＰ−１結合部位であるＴＲＥ配列に結合する転写因子である。Ｊｕｎファミリーとしては、ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤが、Ｆｏｓファミリーとしては、ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２が同定されている。
ＡＰ−１結合部位を有する遺伝子としては、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αなどのサイトカインや、ＩＣＡＭ−１などの接着分子、コラゲナーゼなどの酵素が知られており、これらの遺伝子のＡＰ−１結合部位を使用したレポーター遺伝子アッセイも利用可能である。ＡＰ−１結合部位のＤＮＡ塩基配列は、生物種、並びに同一の生物種の中でも調節の対象となる遺伝子の種類などに応じて異なる場合があるが、本発明においては何れのＡＰ−１結合部位の配列を使用しても構わない。
ＶＤＲＥを介する転写促進活性、並びにＡＰ−１の活性阻害作用の測定は、当該技術分野で知られている任意の方法により行うことができ、その方法は特に限定されない。好ましくは、レポーター遺伝子アッセイ法が挙げられる。レポーター遺伝子アッセイ法とは、例えば、ＶＤＲＥ配列、プロモーター配列および好適なレポーター遺伝子をこの順序で連結させたベクターとビタミンＤ受容体の発現ベクターとをそれぞれ構築し、好適な宿主にこれらのベクターを同時にトランスフェクションした後、試験物質を添加して細胞を培養し、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を測定することによって、試験物質のＶＤＲＥを介する転写促進活性を評価する方法である。レポーター遺伝子を含むベクターをトランスフェクションする宿主の種類も特に限定されず、当業者ならば当分野で常用される好適な宿主を適宜選択することができる。宿主細胞の非限定的例としては、ヒト由来細胞では、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、ＣａＣＯ−２、ＳａＯＳ、Ｋ５６２、サル由来細胞では、ＣＶ−１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、マウス由来細胞では、ＰＣ−１２、ＲＯＳ１７／２．８、ハムスター由来細胞では、ＣＨＯ−Ｋ１、ＢＨＫ−２１などが挙げられる。
ベクター宿主にトランスフェクションする方法も特に限定されず、当業者ならば当分野で常用される方法の中から適宜選択することができる。トランスフェクション法の非限定的例としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などが挙げられる。
レポーター遺伝子とは、プロモーターやエンハンサーの転写活性などを調べるためにＤＮＡに組込まれる目印用の遺伝子であり、その発現量を測定できる遺伝子であれば特に限定されないが、一般的には検出が簡単で定量化可能なものが好ましい。例えば、発色または発光反応を触媒する酵素の遺伝子などが好適であり、この場合、細胞溶解液に発色反応の基質を添加することによって呈した発色の程度を測定することにより発現した酵素量、即ち転写促進活性を評価することができる。あるいはまた、ＥＬＩＳＡ法などを使用して、抗体によってタンパク質を定量することによってもレポーター遺伝子の発現量を測定できる。
レポーター遺伝子の具体例としては、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）遺伝子、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子、ｈＧＨ（分泌型ヒト成長ホルモン）遺伝子、ＳＥＡＰ（ヒト分泌型アルカリフォスファターゼ）遺伝子、ＧＦＰ（グリーンフルオレッセントタンパク質）遺伝子およびＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子などが挙げられる。
レポーター遺伝子としてＣＡＴ遺伝子を使用するＣＡＴアッセイでは、転写活性を測定したい調節領域の塩基配列をＣＡＴ遺伝子の上流に接続したレポーター遺伝子ベクターを細胞にトランスデクションなどにより導入して一過性に発現させる。一般的には１２〜７２時間後に細胞抽出液を調製し、それにアセチルＣｏＡとクロラムフェニコールを加えて反応させ、アセチル化されたクロラムフェニコールを薄層クロマトグラフィーなどにより分離同定する。即ち、ＣＡＴアッセイでは、遺伝子の転写活性は、クロラムフェニコールをアセチル化する酵素活性として測定される。
また、ルシフェラーゼは、式：
ルシフェリン＋Ｏ２  →  オキシルシフェリン＋光
で示される発光反応を触媒する発光性酵素の総称である。ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として使用することにより、細胞抽出液に基質と酵素を与えて発光反応を起こさせ、発光の度合いを測定することによりルシフェラーゼの発現量を評価することができる。
上記したようなレポーター遺伝子アッセイ法は、例えば、Ｓ．Ｋ．Ｎｏｒｄｅｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｕｅｓ，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．４５４−４５６（１９８８）などに記載されている当業者に公知の常法により行うことができる。あるいはまた、レポーター遺伝子アッセイ法は、ベーリンガーマンハイム社、クロンテック社またはプロメガ社などから市販されているレポーター遺伝子アッセイ用試薬を使用し、その説明書に従って簡便に行うこともできる。
転写促進活性またはＡＰ−１の活性阻害作用を評価するための別法としては、例えば、ゲルシフトアッセイ法、ラン−オン（Ｒｕｎ−ｏｎ）アッセイ法およびラン−オフ（Ｒｕｎ−ｏｆｆ）アッセイ法などが挙げられる。
ゲルシフトアッセイ法は、ＤＮＡの結合性因子を反応させた後に非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行うと、タンパク質と結合したＤＮＡの移動度が結合していないＤＮＡの移動度より小さくなるので、これをラベルしたＤＮＡを用いて検出するものである。
Ｒｕｎ−ｏｎアッセイ法も、特定の遺伝子の転写活性を調べる方法の一つである。細胞より単離した核を用いて、試験管内で転写合成を行わせると、転写開始点からの新たな合成は起こらず、細胞の状態ですでに転写が開始しているＲＮＡ鎖の継続としての、ＲＮＡが伸長する合成反応のみが観察される。そこで、単離核を用いた系で転写産物をラジオアイソトープで標識し、標識されたＲＮＡから、調べたい遺伝子をプローブにより選択的に検出する。このことにより、特定の遺伝子の核を単離した時点での転写活性を測定し、経時変化や転写の相対量を比較検討することができる。
Ｒｕｎ−ｏｆｆアッセイ法もインビトロ転写法の一つで、鋳型ＤＮＡを直鎖状にし、一定の長さの転写産物を合成する方法である。鋳型ＤＮＡは、転写開始点より数百塩基下流を制限酵素で切断したものを用いる。この直鎖状の鋳型ＤＮＡを用いてインビトロ転写法を行うと、ＲＮＡポリメラーゼは切断部位で鋳型ＤＮＡより解離し転写反応が止まるため、一定の長さのＲＮＡができる。この時、反応中に標識リボヌクレオチドを入れており、ＲＮＡを標識、電気泳動後、オートラジオグラムを作製しＲＮＡ量を測定する。
本発明のスクリーニング法においては、ＶＤＲＥを介する転写促進活性よりもＡＰ−１の活性阻害作用の方が相対的に強い化合物が選択される。これは、ＶＤＲＥを介する転写促進活性よりも転写因子の活性阻害作用が強く発現されることにより、ビタミンＤ誘導体の副作用である血中カルシウム上昇作用がないか弱いところで、骨量増加作用などの有用な生理活性が発現するとの予測に基づくものである。従って、スクリーニングの際にＡＰ−１の活性阻害作用に対する選択性をどの程度に設定するかは、選択される化合物の用途などに応じて適宜選択することができ、特定の値に限定されるべきものではない。
本スクリーニング法の好ましい実施態様においては、ＡＰ−１の活性阻害作用に対する選択性を評価するための基準として標準物質を使用することができる。標準物質の種類は特に限定されず、任意の物質を適宜使用できる。例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を標準物質として使用し、この標準物質よりもＡＰ−１の活性阻害作用に対する選択性が高い化合物を選択すれば、副作用の少ない有利な化合物を探索することができる。
特に、ＶＤＲＥを介する転写促進活性またはＡＰ−１の活性阻害作用を本発明のスクリーニング法で測定する場合、一般的には各試験物質のＥＣ５０値またはＩＣ５０値を測定することで各試験物質のＶＤＲＥを介する転写促進活性またはＡＰ−１の活性阻害作用を評価することができる。また、ＡＰ−１の活性阻害作用に対する選択性は、以下の式：
［試験化合物のＡＰ−１の活性阻害作用を標準物質（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）のものと比較した相対値］／［試験化合物のＶＤＲＥを介する転写促進活性を標準物質（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）のものと比較した相対値］
で表される値で評価し、この値が一般的には１より高い場合、特に好ましくは１０以上の場合を、標準物質（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）よりも転写因子の活性阻害作用に対する選択性が高い化合物として評価することができる。
本発明の破骨細胞形成抑制剤の有効成分となる化合物としては、具体的には１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｓ）−｛（２Ｓ）−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ｝−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン（化合物７）、１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｓ）−（２−エチル−２−ヒドロキシブチルチオ）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン（化合物８）、１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｒ）−（２−エチル−２−ヒドロキシブチルチオ）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン（化合物９）を好適に使用することができる。これらの化合物は、特開平１０−２３１２８４号公報に記載された方法などで製造することができる。
実施例
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
下記の実施例１、２で使用した材料、試薬などは以下の通りである。
６−９週齢のｄｄＹマウスは日本エスエルシー（株）より購入した。α−ＭＥＭ培地（Ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ）、ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン）は、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社より購入した。マウスＭ−ＣＳＦ、マウスＲＡＮＫＬおよびマウスＯＰＧは、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭ社より購入した。マウスＴＮＦ−αは、Ｇｅｎｚｙｍｅ社より購入した。ＴＲＡＰ染色用試薬の基質（ｎａｐｈｔｏｌ  ＡＳ−ＭＸ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と色素（ｆａｓｔ  ｒｅｄ  ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢ  ｓａｌｔ）とは、Ｓｉｇｍａ社より購入した。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は中外製薬株式会社にて製造されたものを使用した。
実施例１
（１）破骨細胞前駆細胞の調製
６−９週齢のマウスを頸椎脱臼にて死亡させた後、脾臓を取り出した。脾臓を裁断して、血清を含まないα−ＭＥＭ中ですりつぶし、遠心して細胞を回収し、培養用α−ＭＥＭ培地（ペニシリン最終濃度５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン最終濃度５０μｇ／ｍｌおよびＦＢＳ最終濃度１０％を含む）で３回洗浄後、再度培養用α−ＭＥＭ培地に４×１０６個／ｍｌの濃度で浮遊させた。こうして得られたマウス脾臓細胞浮遊液を、４８穴平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社、コード番号３０７８）に１穴あたり２×１０６個ずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。３日後に、プレートに付着した細胞のみを残して、浮遊細胞を培地吸引とＰＢＳ（リン酸緩衝液）洗浄によって完全に除去した。こうして得られた付着細胞が単球−マクロファージ系の破骨細胞前駆細胞であり、骨芽細胞様ストローマ細胞は混在しないことを、アルカリフォスファターゼ染色によって確認した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ．ａｌ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１：２７５）。
（２）試験物質の破骨細胞数への影響の検討
上記のようにして調製された破骨細胞前駆細胞を、上述の培養用α−ＭＥＭ培地（ペニシリン最終濃度５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン最終濃度５０μｇ／ｍｌおよびＦＢＳ最終濃度１０％を含む）にｓＲＡＮＫＬ（最終濃度４０ｎｇ／ｍｌ）と１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（最終濃度１×１０−８ｍｏｌ／Ｌ）とを添加した培養液中で、さらに３日間（プレートから浮遊細胞をＰＢＳで洗浄・除去してプレート付着細胞のみを残した時点を起算とする）培養した。
陽性コントロールとしては、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の代わりにＯＰＧ（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）を添加したこと以外は同様の実験を行った。さらに、陰性コントロールとして、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３もＯＰＧも添加しないこと以外は同様の実験を行った。さらに、実験系の手技などによるバックグラウンドが存在しないことを確認するために、Ｍ−ＣＳＦ、ｓＲＡＮＫＬ、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、ＯＰＧのいずれも添加しないこと以外は同様の実験を行った。
培養終了後、プレート中の細胞を２０％ホルマリンにて固定し、従来法に従ってＴＲＡＰ染色を行った。最終的に染色された３核以上の細胞を破骨細胞として、顕微鏡下で１穴あたりの破骨細胞数をすべて数えた。結果を図１に示す。実験は各群ごとにｎ＝３で行った。
図１から明らかなように、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を濃度１０−８ｍｏｌ／Ｌで加えた群においては、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３もＯＰＧも添加しない陰性コントロール群と比べて、約６６％の破骨細胞形成阻害活性が観察された。一方、ＯＰＧ２００ｎｇ／ｍｌを加えた陽性コントロール群では、破骨細胞形成が１００％阻害された。Ｍ−ＣＳＦ、ｓＲＡＮＫＬ、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、ＯＰＧのいずれも添加しない群においては、破骨細胞の形成が認められなかった。
実施例２
ｓＲＡＮＫＬの代わりにＴＮＦ−α（最終濃度５×１０−９ｍｏｌ／Ｌ）を使用したこと以外は、上述の実施例１と同様に実験を行った。結果を図２に示す。実験は各群ごとにｎ＝３で行った。図２に示すように、ＴＮＦ−αによって誘導される破骨細胞形成能は、ＯＰＧの添加によっては遮断されなかったが、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（最終濃度１×１０−８ｍｏｌ／Ｌ）の添加によって約５５％抑制された。
近年、ｓＲＡＮＫＬ以外にＴＮＦ−αによっても破骨細胞前駆細胞から破骨細胞が誘導されることが示されているが、こうしたＴＮＦ−αによる破骨細胞の誘導は、ＲＡＮＫＬによる破骨細胞誘導作用を阻害するＯＰＧでは遮断されないことが明らかとなっている。本実施例の結果は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、ＴＮＦ−αによる破骨細胞形成刺激に対しても抑制的に働くことを示すものであり、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３がＯＰＧとは異なる作用機序で破骨細胞形成を抑制できることが明らかになった。また、本スクリーニング系によって、ＯＰＧでは抑制できない破骨細胞への作用を検出できることも明らかになった。
実施例３〜８
実施例３〜８においては以下の材料、試薬などを使用した。
マウス骨髄細胞は、オス６−９週齢のｄｄＹまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本エスエルシーより購入）、あるいはビタミンＤ受容体欠損マウス（入手先）から両下腿骨を取り出し、シリンジを用いて培地で骨髄を取り出した。細胞数は酸性条件下で血球系を除去してカウントし、４８ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに２ｘ１０５細胞／ｗｅｌｌになるように分配して培養を行った。細胞培養用の培地には１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するα−ＭＥＭを使用した。Ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ（ＩＦＮ−γ）はＰＢＬより購入した。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（細胞増殖／細胞毒性測定用試薬）はＤＯＪＩＮＤＯから購入した。ＴａｑＭａｎ  ＥＺ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定キット）はＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｒｅｍｓから購入した。リン酸化検出キットであるＰｈｏｓｐｈｏ  Ｐｌｕｓ  ＩκＢ−ａ（Ｓｅｒ  ３２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｋｉｔ，Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ  １８０／Ｔｙｒ１８２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｋｉｔ，Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ  １８３／Ｔｙｒ  １８５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｋｉｔ，Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ  ２０２／Ｔｙｒ  ２０４）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＫｉｔはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹから購入した。Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＲＡＮＫ  ａｎｔｉｂｏｄｙは  Ｒ＆Ｄ社から購入した。また、抗ＴＲＡＦ６抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
ビタミンＤ誘導体として下記の化合物を使用した。これらの化合物は国際出願ＷＯ００／４９４０３および特開平１０−２３１２８４号に記載の方法に従って合成した。
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ＲＡＮＫ，ＯＰＧ，ＲＡＮＫＬ，ＶＤＲｍＲＡＮ測定に使用した増幅用プライマー及びプローブは以下の通り。
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実施例３：破骨細胞形成抑制作用
破骨細胞前駆細胞に直接作用してその分化誘導を促す因子としてｓＲＡＮＫＬとＴＮＦ−αが同定された。特にＴＮＦ−αは病的条件下で作用すると考えられている。そこで骨髄細胞から誘導した破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）をこれら２つの因子で刺激した時の１，２５Ｄ３の抑制作用を観察した。マウスから採取した骨髄細胞をＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下３日間培養してプレートに接着性を示す細胞（ＢＭＭφ）を得た。更にＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下、ｓＲＡＮＫＬ（４０ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦα（５ｘ１０９ｍｏｌ／Ｌ）を添加して３日間３７℃で培養を行い破骨細胞を産生させた。ビタミンＤ誘導体の破骨細胞形成抑制効果を観察する際は後半の３日間に各誘導体を添加した。培養終了後に培地を除去し、細胞をホルマリン（２０％ホルマリン）で固定してエタノール−アセトンによる細胞膜破壊を行った。その後ＴＲＡＰ染色を行って３核以上のＴＲＡＰ染色された破骨細胞の数を顕微鏡下でカウントした。骨髄細胞から誘導した破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）をｓＲＡＮＫＬまたはＴＮＦαで刺激した時の１，２５Ｄ３の抑制作用を観察した結果、ｓＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−αいずれの刺激で破骨細胞誘導を行っても、１，２５Ｄ３は濃度依存的にそれらの誘導を抑制した。またその時のＩＣ５０は１０−９〜１０−８ｍｏｌ／Ｌであった（図３）。
実施例４：破骨細胞形成抑制作用に対するＶＤＲ依存性の検討
活性型ビタミンＤは従来のＶＤＲを介する作用以外に、ＶＤＲを介さない作用が知られている。そこで１，２５Ｄ３による破骨細胞形成抑制作用がＶＤＲに依存的な作用であるか否かについて、ＶＤＲ遺伝子欠損マウス（ＶＤＲ−ＫＯマウス）由来の骨髄から調製した破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）を用いて検討した。実験方法は前記実施例３と同様に行った。その結果、ＶＤＲ−ＫＯ由来の破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）を用いた場合には、１，２５Ｄ３  １０−７ｍｏｌ／ｌにおいて全く抑制作用が観察されなかった。このことは活性型ビタミンＤの破骨細胞形成抑制作用はＶＤＲ依存的であることを示す（図４）。
実施例５：破骨細胞形成抑制作用に関する細胞分化段階の検討
骨髄由来のマクロファージ系の細胞が破骨細胞に分化するまでには、（１）Ｍ−ＣＳＦによる破骨細胞前駆細胞への分化過程と、（２）ｓＲＡＮＫＬ＋Ｍ−ＣＳＦによる成熟破骨細胞への分化過程が存在する。活性型ビタミンＤがどちらの過程に主に作用してその抑制作用を発揮するのかを確認するため、図５に示すように添加時期を変えて実験を行った。尚、図５におけるケース１は対象として行った。その結果、養期間中一切１，２５Ｄ３  １０−８ｍｏｌ／Ｌを添加しない場合（図５におけるケース２）、および、１，２５Ｄ３  １０−８ｍｏｌ／Ｌを（１）の分化過程にのみ添加した場合（図５におけるケース４）は同程度に破骨細胞形成が誘導されたのに対し、１，２５Ｄ３  １０−８ｍｏｌ／Ｌを（２）の分化過程のみに添加した場合（図５におけるケース３）、および、１，２５Ｄ３１０−８ｍｏｌ／Ｌを（１）と（２）の両方の分化過程に添加した場合（図５におけるケース５）には、同程度に破骨細胞形成が抑制された。以上の結果から、活性型ビタミンＤはｓＲＡＮＫＬ＋Ｍ−ＣＳＦによる成熟破骨細胞への分化過程において抑制作用を発揮していることが示された（図５）。
実施例６：破骨細胞前駆細胞の延命、増殖に対する作用
実施例５で示された活性型ビタミンＤの主な作用段階であるｓＲＡＮＫＬ＋Ｍ−ＣＳＦによる成熟破骨細胞への分化過程においては、Ｍ−ＣＳＦは破骨細胞前駆細胞の増殖／延命に寄与していると考えられている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，（２０００）Ｂｌｏｏｄ，９６，ｐ４３３５−４３４３）。そこでこれらの細胞に対してｓＲＡＮＫＬを添加しない条件で活性型ビタミンＤを３日間刺激した時の細胞数の変化を検討した。上記と同様にマウスから採取した骨髄細胞をＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下３日間培養して破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）を得た。これらの細胞に対してＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と１，２５Ｄ３  １０−９〜１０−７ｍｏｌ／Ｌを添加し、更に３日間培養した。その後Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を用いて各ｗｅｌｌの培地用量の１／１０量の反応液を培地に直接添加し、３７℃で９０分間反応させた。４５０ｎｍ（参考波長６５０ｎｍ）の吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）で測定して細胞数を比較し、１，２５Ｄ３の細胞増殖性への影響を評価した。その結果１，２５Ｄ３  １０−９〜１０−７ｍｏｌ／Ｌでは細胞数はｃｏｎｔｒｏｌとまったく差を認めなかった。このことは、活性型ビタミンＤは細胞の増殖や延命よりも、ｓＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成刺激を阻害していることを示している（図６）。
実施例７：破骨細胞形成抑制作用に影響する要因の検討
活性型ビタミンＤはＶＤＲを介してＡＰ−１による転写活性を阻害することが知られている（Ａｌｒｏｙ  Ｉ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，ｐ５７８９−５７９９；Ｔｏｗｅｒｓ  ＴＬ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，ｐ１０３８８−１０４８８）。一方で、従来から提唱されているＶＤＲ応答配列（ＶＤＲＥ）を介した転写促進活性を有することも知られている。そこで活性型ビタミンＤの破骨細胞形成抑制活性がＡＰ−１阻害活性とＶＤＲＥ転写活性のいずれの作用に基づくものであるかを検討した。具体的には、１１種類のビタミンＤ誘導体を用いてこれらの活性との相関関係を検討した。ＡＰ−１阻害活性とＶＤＲＥ転写活性の測定は、国際出願ＷＯ００／４９４０３に記載の方法に従った。各化合物の活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ３）に対するＡＰ−１阻害活性比率とＶＤＲＥ転写活性比率との関係を図７に示した。さらに、各化合物の１０−９ｍｏｌ／Ｌにおける破骨細胞形成阻害作用（１，２５Ｄ３に対する％阻害作用）と、活性型ビタミンＤに対するＡＰ−１阻害作用比率およびＶＤＲＥ転写活性比率との相関図を図８に示した。その結果、破骨細胞形成阻害作用はＡＰ−１阻害活性と非常に高い相関が確認された（相関係数Ｒ２＝０．７８）が、ＶＤＲＥ転写活性とはほとんど相関が認められなかった（相関係数Ｒ２＝０．０８）。特に化合物８と化合物９に着目すると、ＡＰ−１阻害活性は両化合物とも１，２５Ｄ３と比較して約２０−３０倍高い一方、ＶＤＲＥ転写活性では化合物９は１，２５Ｄ３と同程度であるのに対し、化合物９は１，２５Ｄ３の１／１０程度の活性しか有していない。しかしながら、両化合物は１，２５Ｄ３と比較して強力な破骨細胞形成抑制作用を示しており、ＡＰ−１阻害活性との相関関係を非常によく反映していることが示された（図９）。これらの結果は、ＡＰ−１阻害活性を測定することで破骨細胞形成阻害作用を有する化合物をスクリーニングすることができることを示す。
実施例８：破骨細胞形成抑制作用メカニズムの検討：その１
ｓＲＡＮＫＬの刺激は破骨細胞前駆細胞膜上に存在するＲＡＮＫを介して細胞内にシグナルが伝えられる。従って、ＲＡＮＫの発現が抑制されたり、あるいはｓＲＡＮＫＬのｄｅｃｏｙ受容体であるｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）の発現が上昇することによって１，２５Ｄ３による破骨細胞形成抑制作用が発揮されている可能性が考えられる（Ｓｉｍｏｎｅｔ  Ｗ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ，８９，ｐ３０９−３１９）。そこで、ＲＡＮＫ，とＯＰＧのｍＲＮＡの発現が１，２５Ｄ３刺激で変化するか否かを調べた。対照としてＶＤＲ，ＲＡＮＫＬのｍＲＮＡの発現も測定した。マウスから採取した（ＢＭＭφ）を得た。これらの細胞に対してＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と１，２５Ｄ３  １０−８ｍｏｌ／Ｌを添加し、更に３日間培養した。培養終了後、細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収し（ＳＶ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａを使用）、ＰＲＩＳＭ  ７７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。内部標準としてＧＡＰＤＨを測定して補正を行った。その結果ＲＡＮＫ  ｍＲＮＡは１，２５Ｄ３刺激で全く変化しなかった。また、ＯＰＧ  ｍＲＮＡは１，２５Ｄ３により発現が抑制された。これらの結果は、１，２５Ｄ３による破骨細胞形成抑制作用がＲＡＮＫｍＲＮＡの発現を抑制したり、ＯＰＧｍＲＮＡの発現を上昇させることによりもたらされているのではないことを示す（図１０）。
実施例９：破骨細胞形成抑制作用メカニズムの検討：その２
ＲＡＮＫを介する細胞内シグナル伝達経路に対する活性型ビタミンＤの作用を検討した。ＲＡＮＫのシグナル伝達に関与する分子としてＩκＢ（Ｗｅｉ  Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，（２００１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４２，ｐ１２９０−１２９５）、ＪＮＫ（Ｗｏｎｇ  ＢＲ，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，ｐ２５１９０−２５１９４）とｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｍ．，ｅｔ．Ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，ｐ３１１５５−３１１６１）が知られていることから、これらの分子のリン酸化を活性の指標として１，２５Ｄ３の影響を調べた。陽性対照としてはこれらの経路を抑制することが知られているＩＦＮ−γを使用した（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ  Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０８，ｐ６００−６０５）。１〜２ｘ１０７個のマウス由来骨髄細胞をＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下３．５ｃｍディッシュ上で３日間培養し、破骨細胞前駆細胞を得た（ＢＭＭφ）。これらの細胞を低濃度のウシ胎児由来血清中（０．３％ＦＢＳ）でＭ−ＣＳＦ存在下（ＩκＢとｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化）または非存在下（ＪＮＫとＥＲＫ１／２のリン酸化）、２４時間培養した。抑制効果を観察したい検体（１，２５Ｄ３  １０−８ｍｏｌ／ＬとＩＦＮ−γ  １００Ｕ／ｍｌ）はこの時から添加した。翌日、組成が同一の新しい培地に交換し、２時間後にｓＲＡＮＫＬ  ８０ｎｇ／ｍｌで１５分間細胞を刺激した。反応終了後直ちに培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｎａｋａｒａｉ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．３０５６６−２２）で細胞を溶解した。超音波破砕を行った後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔにより各タンパク質のリン酸化を測定。その結果１，２５Ｄ３はこれらの活性化には全く影響を及ぼさないことが明らかとなった（図１１）。陽性対象であるＩＦＮ−γはすべてのタンパク質のリン酸化を抑制した。
産業上の利用の可能性
上述のように、本発明のスクリーニング法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験化合物の骨吸収抑制あるは亢進作用強度の検出法として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｓＲＡＮＫＬによる破骨細胞産生誘導に対する１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の抑制効果を示すグラフである。図中のバーは平均値±標準偏差を示す。
図２は、ＴＮＦ−αによる破骨細胞産生誘導に対する１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の抑制効果を示すグラフである。図中のバーは平均値±標準偏差を示す。
図３は、ｓＲＡＮＫＬおよびＴＮＦ−αによる骨髄細胞由来破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞形成におよぼす活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ３）の抑制作用を示す図である。図中ｃｏｎｔｒｏｌは１，２５Ｄ３を添加していない場合を示す。
図４は、正常マウスおよびＶＤＲ遺伝子欠損マウス（ＶＤＲ−ＫＯマウス）から採取した骨髄細胞由来破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞形成におよぼす活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ３）の抑制作用を示す図である。図中ｃｏｎｔｒｏｌは１，２５Ｄ３を添加していない場合を示す。
図５は、活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ３）の添加時期による破骨細胞形成抑制作用を示す図である。
図６は、Ｍ−ＣＳＦによる破骨細胞前駆細胞の増殖作用に対する活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ３）の作用を示す図である。図中ｃｏｎｔｒｏｌは１，２５Ｄ３を添加していない場合を示す。
図７は、各化合物の活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ３）に対するＡＰ−１阻害活性比率とＶＤＲＥ転写促進活性比率との関係を示す図である。図中の数字は化合物番号を示す。
図８は、各化合物の活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ３）に対するＡＰ−１阻害活性比率およびＶＤＲＥ転写促進活性比率と破骨細胞形成抑制作用（１，２５Ｄ３に対する％阻害作用）との関係を示す図である。Ｒ２は相関係数を示す。
図９は、活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ３）、化合物８、および化合物９の各濃度における破骨細胞形成抑制作用を示す図である。図中ｃｏｎｔｒｏｌはいずれの化合物も添加していない場合を示す。
図１０は、骨髄由来破骨細胞前駆細胞における各タンパク質のｍＲＮＡ発現量に対する活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ３：１ｘ１０−８Ｍ）の作用を示した図である。縦軸はいずれも無刺激状態からの変化率を示す。
図１１は、骨髄由来破骨細胞前駆細胞におけるＩκＢ、ＪＮＫ、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化の程度を示す図である。図中＋は添加、−は非添加を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年7月17日(2002.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて破骨細胞前駆細胞および破骨細胞誘導物質と接触させる工程；および
（ｂ）試験物質が破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化に与える影響を確認する工程；
を含む方法。
【請求項２】
破骨細胞誘導物質がＲＡＮＫＬあるいはＴＮＦ−αである請求項１記載の方法。
【請求項３】
試験物質がビタミンＤ誘導体である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）が破骨細胞数を計測することを含む請求項１乃至３記載の方法。
【請求項５】
破骨細胞前駆細胞が骨髄あるいは脾臓由来である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
破骨細胞前駆細胞がマウス由来である請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法によって得られたビタミンＤ誘導体。
【請求項８】
請求項７記載のビタミンＤ誘導体を有効成分として含有する、破骨細胞の形成または活性化過程に異常がみられる疾患の治療薬。
【請求項９】
破骨細胞の形成または活性化過程に異常がみられる疾患が代謝性骨疾患である、請求項８記載の治療薬。
【請求項１０】
代謝性骨疾患が骨粗鬆症である、請求項９記載の治療薬。
【請求項１１】
破骨細胞前駆細胞；
破骨細胞誘導物質；および
所望により好適な培地；
を含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を行うためのキット。
【請求項１２】
ＡＰ−１による転写促進活性を阻害する活性を測定することを特徴とする破骨細胞形成抑制作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
物質がビタミンＤ誘導体である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらにＶＤＲＥを介する転写促進活性を測定し、ＶＤＲＥを介する転写促進活性が活性型ビタミンＤよりも弱く、ＡＰ−１による転写促進活性を阻害する活性が活性型ビタミンＤよりも強いビタミンＤ誘導体を選択することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４に記載の方法によって得られる骨粗鬆症の予防及び／又は治療薬。
【請求項１６】
１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｓ）−｛（２Ｓ）−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ｝−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン、１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｓ）−（２−エチル−２−ヒドロキシブチルチオ）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン、または１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｒ）−（２−エチル−２−ヒドロキシブチルチオ）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエンのいずれかを有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤。
【請求項１７】
工程（ｂ）が、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化に与える抑制作用を確認する工程である請求項１記載の方法。
【請求項１８】
試験物質がビタミンＤ誘導体である請求項１７記載の方法。
【国際調査報告】
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