【手続補正書】
【提出日】平成30年6月14日(2018.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の核酸をアセンブルするためのインビトロの方法であって、
（ａ）第１の核酸を第１のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第１のヌクレアーゼ剤が、第１の標的部位で前記第１の核酸を切断して、第１のダイジェストされた核酸を産生する、接触させることと、
（ｂ）前記第１のダイジェストされた核酸を、第２の核酸、第１の結合体オリゴ、エキソヌクレアーゼ、並びに必要に応じて、１つ以上のさらなる核酸及び／又は１つ以上のさらなる結合体オリゴと接触させることであって、前記第１の結合体オリゴは約５０ｂｐ〜約４００ｂｐである、接触させることと、
（ｃ）前記結合体オリゴを、前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸、並びに必要に応じて、前記１つ以上のさらなる核酸及び／又は前記１つ以上のさらなる結合体オリゴとアセンブルして、アセンブルされた核酸を形成することであって、ここで、アセンブルされる核酸はオーバーラップ配列を有し、前記オーバーラップ配列は互いにアニーリングし、互いの伸長の鋳型として機能する、形成することと、
を含む、方法。
【請求項２】
２つ以上の２本鎖核酸をシームレスにアセンブルするためのインビトロの方法であって、
（ａ）第１の核酸を第１のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第１のヌクレアーゼ剤が、第１の標的部位で前記第１の核酸を切断して、第１のダイジェストされた核酸を産生し、ここで、前記切断は、シームレスアセンブリが生じる前記第１の核酸の末端から２本鎖断片を除去する、接触させることと、
（ｂ）前記第１のダイジェストされた核酸を、第２の核酸、第１の結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、前記結合体オリゴは約５０ｂｐ〜約４００ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡであり、かつ
（ｉ）前記第１のダイジェストされた核酸に相補的である第１の相補的配列と、
（ｉｉ）スペーサーと、
（ｉｉｉ）前記第２の核酸に相補的である第２の相補的配列と
を含み、前記スペーサーは、前記断片と同一である配列を含み、
ここで、前記第１の相補的配列と、前記断片と同一である前記配列との間に核酸塩基は存在せず、前記第２の相補的配列と、前記断片と同一である前記配列との間に核酸塩基は存在せず、
ここで、前記エキソヌクレアーゼは、前記第１及び第２の相補的配列を曝露する、接触させることと、
（ｃ）前記結合体オリゴを、前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸とアセンブルすることであって、ここで、アセンブリによって前記断片が再構築される、アセンブルすることと
を含む、方法。
【請求項３】
工程（ｃ）における前記アセンブルすることが、
（ｉ）前記結合体オリゴの前記第１の相補的配列を前記第１のダイジェストされた核酸に、そして、前記結合体オリゴの前記第２の相補的配列を前記第２の核酸にアニーリングすることであって、必要に応じて、さらに、前記第１のダイジェストされた核酸及び／又は前記第２の核酸の３’末端を伸長することを含む、アニーリングすることと、
（ｉｉ）前記結合体オリゴを、前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸にライゲーションすることとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が、
（ｉ）前記第２の核酸を第２のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、ここで、前記第２のヌクレアーゼ剤が、第２の標的部位で前記第２の核酸を切断して、前記結合体オリゴの前記第２の相補的配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、前記第１のダイジェストされた核酸は、前記第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、接触させること；又は
（ｉｉ）前記第２の核酸を制限酵素と接触させることであって、ここで、前記制限酵素は、前記第２の核酸を切断して、前記結合体オリゴの第２の相補的配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、前記第１のダイジェストされた核酸は、前記第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、接触させること
をさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
（Ｉ）前記結合体オリゴの前記第１の相補的配列が、１５〜１２０の相補的塩基であり、前記結合体オリゴの前記第２の相補的配列が、１５〜１２０の相補的塩基であり、
必要に応じて、ここで、前記結合体オリゴの前記第１の相補的配列が、２０〜８０の相補的塩基であり、前記結合体オリゴの前記第２の相補的配列が、２０〜８０の相補的塩基であり；及び／又は
（ＩＩ）前記断片が少なくとも２０ｂｐであり；及び／又は
（ＩＩＩ）前記スペーサーが、約２０ｂｐ〜約１２０ｂｐであり；及び／又は
（ＩＶ）前記結合体オリゴが、約１００ｂｐ〜約３００ｂｐである、
請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の結合体オリゴが、同じ反応において、又は連続的に、前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸にアセンブルされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも３つの核酸がアセンブルされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
２つ以上の核酸をアセンブルするためのインビトロの方法であって、
（ａ）第１の核酸を少なくとも第１のヌクレアーゼ剤及び第２のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第１のヌクレアーゼ剤は、第１の標的部位で前記第１の核酸を切断し、そして、前記第２のヌクレアーゼ剤は第２の標的部位で前記第１の核酸を切断して、第１のダイジェストされた核酸を産生する、接触させることと、
（ｂ）前記第１のダイジェストされた核酸を、第１の結合体オリゴ、第２の核酸、第２の結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記第１の結合体オリゴ及び／又は前記第２の結合体オリゴが、約５０ｂｐ〜約４００ｂｐであり、
前記第１の結合体オリゴが、
（ｉ）前記第１のダイジェストされた核酸に相補的である第１の相補的配列と、
（ｉｉ）前記第２の核酸に相補的である第２の相補的配列と、を含み、
前記第２の結合体オリゴが、
（ｉ）前記第２の核酸に相補的である第１の相補的配列と、
（ｉｉ）前記第１のダイジェストされた核酸に相補的である第２の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第１の結合体オリゴ、前記第２の結合体オリゴ、前記第１のダイジェストされた核酸及び第２の核酸の相補的配列を曝露する、接触させることと、
（ｃ）前記第１のダイジェストされた核酸、前記第１の結合体オリゴ、前記第２の核酸、及び前記第２の結合体オリゴをアセンブルすることと、を含む、方法。
【請求項９】
工程（ｃ）における前記アセンブルすることが、
（ｉ）前記第１の結合体オリゴの前記第１の相補的配列を前記第１のダイジェストされた核酸にアニーリングすること、前記第１の結合体オリゴの前記第２の相補的配列を前記第２の核酸にアニーリングすること、前記第２の結合体オリゴの前記第１の相補的配列を前記第２の核酸にアニーリングすること、及び前記第２の結合体オリゴの前記第２の相補的配列を前記第１のダイジェストされた核酸にアニーリングすることであって、
ここで、必要に応じて、前記アニーリングされた相補的配列の３’末端を伸長することをさらに含む、アニーリングすることと、
（ｉｉ）前記第１の結合体オリゴを前記第１のダイジェストされた核酸にライゲーションすること、前記第１の結合体オリゴを前記第２の核酸にライゲーションすること、前記第２の核酸を前記第２の結合体オリゴにライゲーションすること、及び前記第２の結合体オリゴを前記第１のダイジェストされた核酸にライゲーションすることと
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記２つ以上の核酸が、２本鎖核酸であり、前記第１のヌクレアーゼ剤は、前記第１の核酸を第１の標的部位で切断して第１の２本鎖破断を産生し、前記第２のヌクレアーゼ剤は、前記第１の核酸を第２の標的部位で切断して第２の２本鎖破断を産生する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
（Ｉ）前記第１の結合体オリゴが、直鎖状２本鎖ＤＮＡであり、及び／又は前記第２の結合体オリゴが、直鎖状２本鎖ＤＮＡである；及び／又は
（ＩＩ）前記第１の結合体オリゴの前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列が、それぞれ１５〜１２０の相補的塩基であり、及び／又は前記第２の結合体オリゴの前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列が、それぞれ１５〜１２０の相補的塩基であり、必要に応じて、ここで、前記第１の結合体オリゴの前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列が、それぞれ２０〜８０の相補的塩基であり、及び／又は前記第２の結合体オリゴの前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列が、それぞれ２０〜８０の相補的塩基である、
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の結合体オリゴが、約５０ｂｐ〜約４００ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡであり、及び／又は前記第２の結合体オリゴが、約５０ｂｐ〜約４００ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡであり、
ここで、必要に応じて、前記第１の結合体オリゴが、約１００ｂｐ〜約３００ｂｐであり、及び／又は前記第２の結合体オリゴが、約１００ｂｐ〜約３００ｂｐである、
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の結合体オリゴが、前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列の間にスペーサーをさらに含み、及び／又は前記第２の結合体オリゴが、前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列の間にスペーサーをさらに含み、
ここで、必要に応じて、
（Ｉ）前記第１の結合体オリゴの前記スペーサー、前記第２の結合体オリゴの前記スペーサー、又は両方が、アセンブリの成功を確認するための、薬物耐性遺伝子、レポーター遺伝子、検出のための配列、ＰＣＲに好適な配列、又は１つ以上の制限酵素部位を含む；及び／又は
（ＩＩ）前記第１の結合体オリゴの前記スペーサーが、約２０ｂｐ〜約１２０ｂｐであり、及び／又は前記第２の結合体オリゴの前記スペーサーが、約２０ｂｐ〜約１２０ｂｐである、
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
同じ反応において、又は連続的に、前記第１のダイジェストされた核酸が前記第１の結合体オリゴにアセンブルされ、前記第１の結合体オリゴが、前記第２の核酸にアセンブルされ、前記第２の核酸が、前記第２の結合体オリゴにアセンブルされ、前記第２の結合体オリゴが、前記第１のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のダイジェストされた核酸が、前記第２の核酸にシームレスにアセンブルされる、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤による前記切断が、シームレスアセンブリが生じる前記第１の核酸の末端から２本鎖断片を除去し、
ここで、前記第１の結合体オリゴは、前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列の間にスペーサーをさらに含むか、又は前記第２の結合体オリゴは、前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列の間にスペーサーをさらに含み、
ここで、前記スペーサーは、前記断片と同一である配列を含み、ここで、前記第１の相補的配列と、前記断片と同一である前記配列との間に核酸塩基は存在せず、前記第２の相補的配列と、前記断片と同一である前記配列との間に核酸塩基は存在しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）が、前記第２の核酸を第３のヌクレアーゼ剤と接触させることをさらに含み、ここで、前記第３のヌクレアーゼ剤は、第３の標的部位で前記第２の核酸を切断して第２のダイジェストされた核酸を産生する、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）が、前記第２の核酸を第３のヌクレアーゼ剤及び第４のヌクレアーゼ剤と接触させることをさらに含み、前記第３のヌクレアーゼ剤は第３の標的部位で前記第２の核酸を切断し、前記第４のヌクレアーゼ剤は第４の標的部位で前記第２の核酸を切断して、第２のダイジェストされた核酸を産生する、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の結合体オリゴが、１本鎖ＤＮＡである、請求項１及び８〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
第１のヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡを含み、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含み、前記第１のヌクレアーゼ剤は、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直ぐ隣接している標的部位を標的とし、
必要に応じて、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（Ｉ）前記第１の核酸、前記第２の核酸、又は両方の核酸が、約２０ｋｂ〜約４００ｋｂの長さのベクターである；及び／又は
（ＩＩ）アセンブルされた核酸が、３０ｋｂ〜１Ｍｂの長さである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の核酸、前記第２の核酸、又は両方の核酸が、少なくとも１０ｋｂである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
（Ｉ）前記第１の核酸、前記第２の核酸、又は両方の核酸が、細菌人工染色体を含む；及び／又は
（ＩＩ）前記第１の核酸、前記第２の核酸、又は両方の核酸が、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む；及び／又は
（ＩＩＩ）前記第１の核酸が、第１の細菌人工染色体を含み、前記第２の核酸が、第２の細菌人工染色体を含み、目的の遺伝子が、前記第１及び第２の細菌人工染色体に及んでおり、前記アセンブリは、前記目的の遺伝子の配列を形成する、
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
（Ｉ）前記第１の核酸が、環状核酸又は直鎖状核酸である；及び／又は
（ＩＩ）前記アセンブルされた核酸が、環状核酸又は直鎖状核酸である、
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。