(57)【要約】本発明は、利己的遺伝子と共に外来遺伝子を導入することにより、外来遺伝子により形質転換した個体の比率を増加させる方法である。利己的遺伝子と当該遺伝子の導入対称である宿主生物に新たな形質を付与するための外来遺伝子を組み込んだ、組み換えベクターであり、当該ベクターを作成し、当該組み換えベクターを前記宿主生物の染色体に導入することにより、前記外来遺伝子が導入され、かつ目的とする機能を有する形質転換固体の、全固体に対する比率を増加させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
利己的遺伝子と当該遺伝子の導入対象である宿主生物に新たな形質を付与するための外来遺伝子を共に組み込んだ、組み換えベクター。
【請求項２】
前記利己的遺伝子が細菌由来の利己的遺伝子である、請求の範囲第１項記載の組み換えベクター。
【請求項３】
前記利己的遺伝子が、ｃｃｄＡＢ遺伝子、Ｋｉｓ／Ｋｉｄ（ＰｅｍＩ／ＰｅｍＫ）遺伝子、ｐａｒＤ／Ｅ遺伝子、ｐｈｄ／ｄｏｃ遺伝子、Ｍｅｄｅａ遺伝子、染色体不分離遺伝子、ｐｓｒ遺伝子及び制限−修飾系遺伝子より成る群より選択された、請求の範囲第１項記載の組み換えベクター。
【請求項４】
前記利己的遺伝子がｃｃｄＡＢ遺伝子であり、前記外来遺伝子がｗｈｉｔｅ＋遺伝子である、請求の範囲第１項記載の組み換えベクター。
【請求項５】
前記宿主生物が有性生殖を行う生物である、請求の範囲第１項から第３項いずれかの項記載の組み換えベクター。
【請求項６】
前記宿主生物が昆虫である、請求の範囲第５項記載の組み換えベクター。
【請求項７】
請求の範囲第１項から第６項いずれかの項記載の組み換えベクターを導入した、形質転換体。
【請求項８】
利己的遺伝子と当該遺伝子の導入対象である宿主生物に新たな形質を付与するための外来遺伝子を共に組み込んだ組み換えベクターを作製し、当該組み換えベクターを前記宿主生物の染色体に導入することにより、前記外来遺伝子が導入され、かつ目的とする機能を有する形質転換個体の、全個体に対する比率を増加させる方法。
【請求項９】
前記利己的遺伝子が細菌由来の利己的遺伝子である、請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１０】
前記利己的遺伝子がｃｃｄＡＢ遺伝子、Ｋｉｓ／Ｋｉｄ（ＰｅｍＩ／ＰｅｍＫ）遺伝子、ｐａｒＤ／Ｅ遺伝子、ｐｈｄ／ｄｏｃ遺伝子、Ｍｅｄｅａ遺伝子、染色体不分離遺伝子、ｐｓｒ遺伝子及び制限−修飾系遺伝子より成る群より選択された、請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１１】
前記利己的遺伝子がｃｃｄＡＢ遺伝子であり、前記外来遺伝子がｗｈｉｔｅ＋遺伝子である、請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主生物が有性生殖を行う生物である、請求の範囲第８項から第１０項いずれかの項記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主生物が昆虫である、請求の範囲第１２項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、利己的遺伝子と共に外来遺伝子を導入することにより、外来遺伝子により形質転換した個体の比率を増加させる方法に関する。
背景技術
これまでにも、生物に外来遺伝子を導入し、形質転換した個体を作製する技術は存在しており、実験生物学における慣用技術として用いられていた。その様な技術により遺伝的形質が変化した生物が、子孫を残して自分と同じ遺伝子を次代に伝える事が出来るかは、その生物の環境への適応度に依存していた。人為的に形質を転換した生物は、環境への適応という意味では野生種の生物と比較して劣る場合がしばしばあり、形質転換した種を集団中に広める場合の障害となっていた。少なくとも、形質転換した種を集団中において、積極的にその比率が増加するようにできる手段はこれまで存在しなかった。
そこで、形質転換した個体を集団中において積極的に広めることを可能とする手段を提供することが、本発明の課題である。その様な手段は、ある遺伝子を有する個体集団の比率を制御する為の基本技術となり得るために、広範囲の応用可能性がある。
発明の開示
上記課題を達成するために、本発明者らはいわゆる「利己的遺伝子」に注目した。有性生殖の場における利己的遺伝子とは、その遺伝子を染色体上に受け継いだ個体のみが生き残るように働き、受け継がない個体を殺してしまう遺伝子を意味する。細菌における利己的遺伝子も、分裂によって生まれた二つのうち、その遺伝子を受け継ぐもののみが生存し続けるが、細菌における利己的遺伝子は、染色体ではなく細胞質のプラスミドに存在していると考えられている。以下、本願明細書中において、「利己的遺伝子」という記載は、上記の特性を有する遺伝子を意味するものとする。
上述した利己的遺伝子の特性から、利己的遺伝子と目的とする外来遺伝子とを１つのセットとして「抱き合わせて」導入すると、集団中における目的とする外来遺伝子を有する個体の比率を高くすることができる。導入する外来遺伝子としては種々の有用遺伝子を選択することが可能であり、本発明は、集団中における特定遺伝子の発現頻度の制御を初めて可能としたものである。本発明以前には、形質が転換した生物の集団中における発現頻度は環境により左右されており、人為的に制御する手段は存在しなかった。利己的遺伝子を組み込んだベクターを作り、他の有用外来遺伝子をそのベクターにのせて宿主生物に持ち込むことにより、利己的遺伝子の働きによってその有用遺伝子を宿主個体群全体に広めることを可能としたのが、本発明の技術である。目的とする宿主に適したベクターを選択する事により、原理的には本発明の方法はあらゆる宿主に対して用いることが可能である。
発明を実施するための最良の形態
最も詳しく研究されている利己的遺伝子としては、細菌の「毒−毒消しシステム」が挙げられる。このシステムは、染色体外のＦ’因子、Ｒ’因子と呼ばれるプラスミドが細菌体から失われるのを防ぐように働く。このシステムは、二つの対になった遺伝子から組み立てられており、プラスミドに含まれている。その一つは殺害因子（ｋｉｌｌｅｒ　ｆａｃｔｏｒ）すなわち「毒」をつくり、もう一方は毒の活性を抑える（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）「毒消し」をつくる。この二つの遺伝子は普通一つのオペロンに組み込まれていて、両者の発現はまとめて一緒に制御されている。その為、毒は毒消しといつも一緒に作られることになり、細菌に悪影響を及ぼさない。しかし、利己的遺伝子を持つ細菌が分裂し二つの娘細胞ができたとき、その一方にだけ利己的遺伝子のプラスミドが伝わって、もう一方には伝わらなかった場合、分裂時に親細菌の細胞質から受け継いだ殺害因子の蛋白質によって利己的遺伝子の伝わらなかった細胞は殺されてしまう。殺害因子の蛋白質は壊れにくくずっとそこに残るのに対して、抑制因子の蛋白質は簡単に分解されてしまうからである。こうした機構により、利己的遺伝子を持った細菌だけが生き残っていくことになり、利己的遺伝子のプラスミドが失われることを防いでいる。
利己的遺伝子は、細菌のみならず高等真核生物にも存在する。実際、多細胞生物においては、その繁殖がおおかた有性生殖によっているので、利己的遺伝子の作用は細菌と比較して、ずっと顕著に現れる。細菌の場合は自己が死滅することを防ぐだけで、もともとそれを持っていない細菌に危害を加えるものではなかった。ところが、真核生物の利己的遺伝子は染色体に含まれており、その生物体群全体を支配しようとするものである。即ち、利己的遺伝子を有する個体とそうでない個体が交雑すると、この遺伝子を引き継いだ子供だけが生き延びる事により、個体群の中に占める利己的遺伝子を有する個体の割合は急速に高まる。
その一例として、コクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ　ｃａｓｔａｎｅｒｕｍ）という小麦粉などを食する貯穀害虫において発見された、Ｍａｔｅｒｎａｌ−ｅｆｆｅｃｔ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｒｒｅｓｔ（Ｍｅｄｅａ）という利己的遺伝子が挙げられる。Ｍｅｄｅａをヘテロにもつ雌（Ｍ／＋）がＭｅｄｅａを欠く雄（＋／＋）と交尾すると、子供のうちＭｅｄｅａのヘテロ接合体（Ｍ／＋）は正常に発生するが、Ｍｅｄｅａを持たない残り半分の個体（＋／＋）は死滅する。こうした交配が数世代繰り返されると、個体群サイズが小さければ集団中でのＭｅｄｅａ遺伝子頻度は顕著に上昇すると考えられる。
一方、雄がＭｅｄｅａのヘテロ（Ｍ／＋）であり、雌がＭｅｄｅａを欠く（＋／＋）場合には、子供が死ぬことはない。Ｍｅｄｅａを有する雌と雄の交配の向きによって結果が左右されることから、利己的遺伝子が作用を発揮するには、母親の影響（ｍａｔｅｒｎａｌ　ｅｆｆｅｃｔ）が作用していると考えられる。このことは、Ｍｅｄｅａにおいても毒−毒消しシステムが作用しているという推察を呼び起こす。卵子の細胞質に含まれる殺害因子と抑制因子の両方が、受精時に蛋白質又はｍＲＮＡの形で次世代へ伝えられるが、利己的遺伝子を受け継がなかった子供では、抑制因子の持続的供給ができないために、殺害因子の蛋白質により殺されてしまう。尚、殺害因子は抑制因子と比較して頑丈で壊れにくいと考えられる。精子は非常に小さい生殖細胞であり、細胞質を殆ど有さずに遺伝子を伝えるのみであるので、卵子の様に殺害因子の蛋白質やｍＲＮＡを伝えるということはない。
本発明において、上記の大腸菌のＦ’因子安定化システム（ｃｃｄＡ及びｃｃｄＢ）を、トランスポゾンのＰ因子ベクターに組み込んでショウジョウバエに持ち込むことを試みた。このシステムにおいて、ｃｃｄＢ遺伝子は殺害因子で、細胞分裂の進行に必須な酵素である、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ（ＤＮＡジャイレース）を阻害する働きがある。この酵素はあらゆる生物で必須であり、その構造と機能は種を越えて共通であるので、細菌で阻害作用のある蛋白質がショウジョウバエの酵素に対しても阻害作用を及ぼすことを期待した。その結果、細菌の利己的遺伝子はショウジョウバエにおいても有効であり、下記の実施例で示される様に、利己的遺伝子が導入された集団が有意に拡大している事が示された。ここで、内在性の利己的遺伝子ではなく、異種生物の利己的遺伝子を導入するということは、重要である。即ち、自己が有する内在性の利己的遺伝子は、利己的遺伝子が発生してから何世代も経過していると考えられることから、既に全集団に広まっているために無効であると考えられる。
利己的遺伝子を用いる事により、集団の中において一定の形質を有する個体の比率を操作することが可能になるため、種々の目的の応用に用いることが可能である。とりわけ、害虫駆除・防除に本発明の遺伝子を用いる事は有望である。具体的には、性決定遺伝子の活性型を利己的遺伝子と抱き合わせにして害虫個体群に導入し、その個体群中に広めることにより、個体群の性比のバランスが極端に偏り、個体群のサイズを縮小することができる。より具体的には、メスをオスに変えることができれば、この様な効果を達成することができる。
例えば、ショウジョウバエにおいて、Ｓｅｘｌｅｔｈａｌ（Ｓｘｌ）遺伝子はメスの性決定因子であるが、当該遺伝子産物が結合する標的ＲＮＡはｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（ｔｒａ）である。Ｔｒａの補助因子にＴｒａ２がある。そのｔｒａの機能を阻害するために、Ｔｒａ２の２重鎖ＲＮＡを生成する人工遺伝子を作成してメスに導入し、メスをオス化することができる。この手段によるオス化については、Ｂｅｌｏｔｅらにより成功したことが報告されている（Ｆｏｒｔｉｅｒ，Ｅ　ａｎｄ　Ｂｅｌｏｔｅ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｇｅｎｅｓｉｓ，２４０−２４４）。
また、ショウジョウバエにおいてメスの性染色体組成はＸＸであり、オスの性染色体組成はＸＹであるが、オスとメスで異なるＸ染色体量の補正を行うために、オスではＸ染色体の活性が倍増している。Ｘ染色体が活性化される機構にも上記Ｓｘｌ遺伝子が関与していることが知られている。Ｓｘｌ遺伝子産物が結合する標的遺伝子は、ｍａｌｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｅｔｈａｌ２（ｍｓｌ２）遺伝子のｍＲＮＡであり、オスではｍｓｌ２が機能しているが、メスではＸ染色体量が多い為に、上記のＸ染色体の活性が倍増する機構が抑制されている。ｍｓｌ２の変異型であるｍｓｌ２−ＮＯＰＵは、ｍｓｌ２がメスにも発現してしまう変異であり、ｍｓｌ２変異はオスでは無害であるが、メスでは致死的である。利己的遺伝子と共に、この様な変異遺伝子を有するオスを広めることにより、集団中におけるオスの割合を高めることができる。ただし、利己的遺伝子はメス（母親）によって集団中に広まるので、導入遺伝子頻度が十分高まるまでｍｓｌ２遺伝子は発現しないようにし、ｍｓｌ２が集団中に広まった後、発現させる必要がある。下記するような方法、例えば利己的遺伝子を組み込んだ２つのベクターをつくり、その両者がたまたま交配によって同一の個体に入りこんだ時、始めて「毒」が働くようなシステムを作成する等の方法がその用途に使用できる。
類似の方法を用いて、ショウジョウバエのみならず、チチュウカイミバエ、ミカンコミバエ、タマネギバエ、イエバエ、ニクバエ、チェチェバエ等の昆虫の性比を操作することが可能であると考えられる。
また、個体群中に特定の化学物質に感受性となる遺伝子を広めておいて、後にその化学物質を作用させて、その化学物質に感受性の害虫集団だけを駆逐することができる。具体例として、以下の様な例を挙げることができる。即ち、ヘルペスシンプレックスウィルスチミジンキナーゼを利己的遺伝子と共に導入して野外集団に広めた後、トリフルオロチミジン（ＴＦＴ）を散布すると、チミジンキナーゼの作用により導入遺伝子を有する集団だけがＴＦＴ感受性となり、その集団を除去することができる。類似の手法を用いて、他の化学物質に対して感受性を与えることができる。哺乳類のアデノシンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）を利己的遺伝子と共に導入して広めた後、８−アザ−アデニンを散布して、その集団を除去することができる。また、哺乳類のヒポキサンチンフォスフォリボシル−トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を利己的遺伝子と共に導入した後、６−チオグアニンを散布して、その集団を除去することができる。また、植物のニトレートリダクターゼを対象植物群に利己的遺伝子と共に導入した後、亜塩素酸で処理することにより、その集団を除去することができる。
また、利己的遺伝子を組み込んだ２つの独立ベクターをつくり、その両者がたまたま交配によって同一の個体に入り込んだ時、始めて「毒」が働くというシステムを作成することができる。この方法であれば、「毒」を持つ個体が「自家中毒」で失われ、利己的遺伝子ベクターが広まらないという可能性を排除できる。
具体的には、毒遺伝子のコード領域とプロモーターの間に、酵母の組み換え誘導酵素Ｆｌｉｐｐａｓｅの標的配列であるＦＲＴをはさみ、これを一つのベクターに持たせる。もう一方のベクターにはｆｌｉｐｐａｓｅを組み込む。この二つのベクターが同一個体内で出会うと、その時初めてＲＦＴがｆｌｉｐｐａｓｅにより外されて「毒」の発現が起こる。
Ｆｌｉｐｐａｓｅ−ＦＲＴに代えて、Ｃｒｅ−ＩｏｘＰを用いても、同様の結果を得ることができる（Ｓｉｅｇａｌ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ　Ｈａｒｔｌ，Ｄ．Ｌ．１９９６，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１４４，７１５−７２６）。一方、「毒」としては蛋白質毒ならば原理上いかなるものでも使用可能である。害虫の防除、駆除目的であれば、人畜への毒性がなく、昆虫に対して特異的に作用する毒を発現させる。たとえば、サソリのつくる“ｉｎｓｅｒｔ　ｔｏｘｉｎ”、クサグモ毒のａｇｅｌｅｎｉｎなどである（川西述史、１９９４、分子から見た脳、講談社）。
これらの蛋白質毒は、体外に散布しても浸透せず効果がないので、遺伝子導入により内部から作用させなければならない。またＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓのδ−ｔｏｘｉｎ（ＢＴ毒）や、Ｂａｃｕｌｏ　ｖｉｒｕｓ毒も昆虫特異的であり、利用できる。
またＧＡＬ４−ＵＡＳシステムを用いることができる。即ち、ＧＡＬ４が条件的に発現する人工遺伝子を入れた集団をつくっておき、その一方でＵＡＳに毒遺伝子をつないだ人工遺伝子を入れた集団も別途作成する。それぞれの集団内で人工遺伝子を含む個体が増え、空間的にも拡がっていくが、ＵＡＳはＧＡＬ４の結合を受けた時にだけ転写を活性化するので、ＵＡＳ−ｔｏｘｉｎ遺伝子はそれ単独では毒を発現しない。ＧＡＬ４はそれ自身は無害であるため、各々は増えていく。しかしあるところでこの二つの個体群が出会って交雑すると、子世代では体の中にＧＡＬ４人工遺伝子とＵＡＳ−ｔｏｘｉｎ遺伝子が同在するので、たちまち毒作用が発揮され、集団の退縮をもたらす。
また、利己的遺伝子を用いて、ヒトにとって有用な遺伝子の増幅をすることができる。例えば、蚊のマラリア耐性遺伝子を利己的遺伝子により蚊の個体群に広め、マラリア原虫に汚染された蚊の集団をマラリアを持たない蚊に置き換えることができる。この耐性遺伝子は、蚊が本来持っている遺伝子のある特殊なアレルである。利己的遺伝子を用いてマラリアを持たない集団を広めることは、感染源をなくすという意味で、ヒトにとって大いに利益がある。耐性遺伝子に代えて、病原体に対するモノクローン抗体をつくる遺伝子（ｃＤＮＡ）を用いれば、より広い疾病への適用が可能である。マラリアに加え、日本脳炎、黄熱病、ライム病、エキノコックス等を対象に、この方法によりその媒介動物（カやダニなど）の集団を病原菌を有さない個体に置き換えることができる。
本発明の方法に適した利己的遺伝子としては、下記の実施例において用いているｃｃｄＡ／Ｂ遺伝子を挙げることができる。ｃｃｄＡ／Ｂ遺伝子システムは、ｃｃｄＢ遺伝子がＤＮＡトポイソメラーゼＩＩを阻害し、ｃｃｄＡ遺伝子がその毒を中和するという、いわゆる「毒−毒消しシステム」の代表的な例である。ｃｃｄＡ／Ｂ遺伝子の他に、Ｋｉｓ／Ｋｉｄ（ＰｅｍＩ／ＰｅｍＫ）、ｐａｒＤ／Ｅ、ｐｈｄ／ｄｏｃ，制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子の対である制限−修飾系遺伝子（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ；Ｋｕｓａｎｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２，１１０９５−１１０９９）等の毒−毒消しシステムもまた知られており、これらのシステムを用いることもできる。ここで、制限−修飾系遺伝子の例として、制限酵素であるエンドヌクレアーゼと、制限酵素分解から宿主を防御する修飾酵素のシステムが挙げられる。より具体的には、制限酵素がＥｃｏＲＩであり、修飾系遺伝子がメチラーゼであるシステム等が挙げられる。この系において、制限酵素は毒として、修飾酵素は毒消しとして作用している。また、上述した、コクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ　ｃａｓｔａｎｅｕｍ）のＭａｔｅｒｎａｌ−ｅｆｆｅｃｔ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｒｒｅｓｔ（Ｍｅｄｅａ）、利己的遺伝子の対立遺伝子を有する子孫を殺してしまうことが知られているショウジョウバエの染色体不分離遺伝子群（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｄｉｓｔｏｒｔｅｒ）、スズメバチのｐｓｒ染色体等を、利己的遺伝子として用いることができる。
また、上記した制限酵素がＥｃｏＲＩであり修飾系遺伝子がメチラーゼであるシステムの他に、他の制限酵素遺伝子と修飾遺伝子の対である制限−修飾系遺伝子を具現化したＰＣａｓｐｅｒ−ＳａｕＲ／Ｍ利己的ベクターとして、ＳａｕエンドヌクレアーゼとＳａｕメチラーゼの組み合わせがある。そのベクターの構造を示すマップを第６図に、またその構築手順を以下に具体的に説明する。
まず、Ｓａｕ９６１メチラーゼ遺伝子（Ｓｚｉｌａｋ他、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８，４６５９−４６６４）は、相補的な付着末端を有するＰＣＲ断片の形で、改変したｐＣａｓｐｅｒｈｓベクター（本来のヒートショック・ターミネータの代わりにＳＶ４０ポリアデニレーション配列を有するもの）のＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩサイトを利用してクローニングできる。隣接する全てのクローニングサイトがこの操作により切断不能となり、クローン化したＤＮＡ断片は、いかなるＰＣＲエラーも無い配列が確認できる。
次いで、プラスミドｐＰ（ＧＡＬ４：：ＶＰ１６−ｎｏｓ．ＵＴＲ）（ｖａｎＤｏｒｅｎほか、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８，２４３−２４６）からｎａｎｏｓ遺伝子の５’側（プロモータ）と３’側（非翻訳領域）の二つの調節配列を得、続くステップで前記のプラスミドのＢａｍＨＩサイトに挿入し、さらにＫｐｎＩとＭｌｕＩサイトを持つ合成リンカーをこの二つの配列の間に挿入する。
ｎａｎｏｓの調節配列は、トランスジーンの産物を母親経由で卵に伝播させ、胚特異的にその発現を保証するものと期待できる。ショウジョウバエの遺伝情報データベース、ＦｌｙＢａｓｅによると、ｎａｎｏｓプロモータは、雌（母個体）の生殖巣哺育細胞に遺伝子の発現を誘導する作用（母性効果）があり、胚発生以降にはその子個体の生殖細胞に遺伝子発現を誘導する作用（接合子効果）があると考えられる。ｎａｎｏｓ遺伝子の５’および３’非翻訳領域はＧＡＬ４レポータｍＲＮＡを卵の後極に局在させ、後極においてのみその翻訳を可能にする。実際、ＧＡＬ４活性が後極に選択的に見出され、その活性は、後部内胚葉原基にも一過性に認められる。ｌａｃＺおよびＧＦＰレポータの発現はステージ８（胚帯伸長期）以降の胚発生期と幼虫期を通じて生殖細胞原基（極細胞）に観察される。ＧＡＬ４活性は雄の精巣の生殖細胞にも存在しているが、哺育細胞には存在しない。
一方、Ｓａｕ９６Ｉエンドヌクレアーゼ遺伝子は、相補的な付着末端を有するＰＣＲ断片の形で、新たに付加されたＫｐｎＩ−ＭｌｕＩサイトを利用してクローニングすることができる。
これらの利己的遺伝子を導入する対象である宿主生物は特に限定されるものでなく、本技術分野において通常用いられているベクターを、宿主により適宜選択して用いることができる。具体的には、表１に記載された宿主−ベクターの組み合わせを用いて、目的とする遺伝子と利己的遺伝子を導入することが可能であり、その他の宿主−ベクター系を適宜用いることが可能である。
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実施例
既に記載した様に、大腸菌のｃｃｄオペロンは、細菌の「毒−毒消しシステム」の代表例である。本発明では、ｃｃｄオペロンを取り出す材料として、大腸菌のＪＭ１０９系統を用いた。ｃｃｄオペロンは毒消しをつくるｃｃｄＡ遺伝子と、毒をつくるｃｃｄＢ遺伝子の２つから出来ている。ｃｃｄオペロンはＪＭ１０９をはじめとする大腸菌の一部の系統に存在して、Ｆ’と呼ばれるプラスミドがそれらの大腸菌から失われるのを阻止している。ｃｃｄオペロンはＪＭ１０９系統の破砕物から、以下の配列をプライマーとするＰＣＲ法によって増幅して得た。
５’　ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３’
ＴＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧ
５’　ＸｂａＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３’
ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧ
これらのプライマーにはその一端にＥｃｏＲＩあるいはＸｂａＩの制限酵素部位があるので、それらを利用すれば得られたＰＣＲ産物を簡単にクローニングできる。まず、それぞれの制限酵素でｐＵＣ１９ベクターとＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を切断し、ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターに挿入した。続いてその塩基配列を決定して、クローニングした配列に突然変異などの異常が生じていないことを確認した。次に、ショウジョウバエ形質転換用のベクターであるｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ（Ｐｉｒｒｏｔｔａ，Ｖ．（Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ａｎｄ　Ｄ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ４３７−４５６）を同じ制限酵素で切断して、ｐＵＣ１９ベクター上にクローニングした。ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位を用いて挿入した。こうして得られたものが利己的遺伝子オペロンを含むショウジョウバエ形質転換ベクターのｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢである。ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢの構造を第１図（ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢ）に示す。第１図、及び以下の第２図と第３図において、Ｐｒはプロモーター、Ｔはターミネーターを、それぞれ示す。またｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢ中には、ショウジョウバエの眼の色を白から赤に変えるｗｈｉｔｅ＋（ｗ＋）遺伝子が組み込まれているために、眼の色により利己的遺伝子の導入を確認する事が可能である。以下に述べる利己的遺伝子の挙動の確認は、この様にして作成したｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢのベクターを用いて行った。
その他に、ｃｃｄＡとｃｃｄＢの転写が独立に起きる様に工夫したコンストラクトを作成した。まず、ｃｃｄＡ遺伝子をｐＣａＳｐｅＲ−ａｃｔ（Ｒ）プラスミド（Ｔｈｕｍｍｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ　７４：４４５−４５６）にクローニングした（第２図左上）。また、ｃｃｄＢ遺伝子の前後に熱ショックプロモーターとｈｓｐ７０ターミネーターをつないで中間産物のｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＢ、（図２右上）を得、それを先のプラスミドのＳＶ４０ターミネーターより更に下流に挿入した。このプラスミド（ｐＣａＳｐｅＲ−ａｃｔＡ−ｈｓ−ｃｃｄＢ、第２図下）では、ｃｃｄＡ遺伝子がアクチンプロモーター（ａｃｔ）の働きで常時発現するのに対し、ｃｃｄＢ遺伝子の発現は熱ショックを受けた時にのみ起こると期待される。
また、ｃｃｄＡ遺伝子とｃｃｄＢ遺伝子を重複型ＰＣＲ法（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ＰＣＲ；Ｈｏ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ　７７：５１−５９）により連結し、両者の融合蛋白質ができるようにしたものを作成した。この融合遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで切断したｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ中に挿入するところは、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢ作成の場合と同様である。この融合遺伝子を含むプラスミドを、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢ−ｆｕｓｅｄ（第３図上）とする。
ｃｃｄＢ遺伝子をｐＵＡＳＴベクター（Ｂｒａｎｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１８：４０１−４１５）に挿入し、ＧＡＬ４−ＵＡＳシステムにより形質転換ショウジョウバエの特定組織にそれぞれ発現させるようにしたｐＵＡＳＴ−ｃｃｄＢ（第３図下）を作成した。ＧＡＬ４を発現する細胞はｃｃｄＡＢ遺伝子産物の毒、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害蛋白質の働きで殺されてしまうと思われる。ＧＡＬ４発現部位が一部の組織、例えば眼だけに限られている場合（ｓｅｖ−ＧＡＬ４やＧＭＲ−ＧＡＬ４をＧＡＬ４発現誘導に用いる）には、細胞死が起こるのもその組織に限定されている筈である。
ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢで形質転換したショウジョウバエからゲノムＤＮＡを抽出し、それを鋳型として先に述べたプライマーを用いてＰＣＲを行った。同じＰＣＲプライマーを用いて、大腸菌のｃｃｄＡＢオペロンを増幅できるか否かも調べた。理論上予想されるサイズを持った特異的バンドが、このＰＣＲによって実際に得られた。結果を第４図に示す。第４図において、レーン１と２はショウジョウバエｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢ形質転換系統＃１１と＃４のゲノム遺伝子を用いたＰＣＲで増幅した結果である。＃１１と＃４は、どちらの系統も同じコンストラクトがゲノムに入っているが、染色体上の挿入部位が異なっている。第４図の結果より、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢが形質転換ショウジョウバエのゲノムに挿入されていることが確認できた。
ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢで形質転換したショウジョウバエにｃｃｄＡＢ遺伝子のｍＲＮＡが発現しているかどうかをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。
形質転換ショウジョウバエから抽出したｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ファルマシア）によりｃＤＮＡを合成した。プライマーは前項で用いたものと同じである。ショウジョウバエからのＲＮＡ抽出物にはあらかじめＤＮａｓｅ処理を施し、ゲノムＤＮＡの混入による疑似陽性反応が生ずる危険性を排除した。この実験で、予想されるサイズを持った単一のバンドが検出された。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した結果を、＃１１と＃４につき、第４図のレーン３と４においてそれぞれ示す。この結果から、ショウジョウバエに導入したｃｃｄＡＢオペロンからｍＲＮＡの転写が起こっていることが確認できた。
既に述べた様に、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢプラスミドには、ｃｃｄＡＢ遺伝子以外にショウジョウバエの眼の色を白から赤に変えるｗｈｉｔｅ＋（ｗ＋）遺伝子が組み込まれている。形質転換ショウジョウバエは眼が赤であり、しかもそれが特定の染色体に連関した遺伝様式を示すことから、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢが染色体に挿入されていること、そして発現していることは明らかである。ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢを第三染色体に持つショウジョウバエの形質転換系統＃４を、挿入のない白眼の系統とクロスし、Ｆ１のヘテロ接合体ｗ；＋／＋；ｃｃｄＡＢ／＋の同胞交配を行ったところ、ｃｃｄＡＢを持たないＦ２個体の割合がメンデルの法則から予測されるものより遙かに少ないことが分かった。第５図に、大腸菌プラスミドに由来するｃｃｄＡＢ遺伝子のキイロショウジョウバエにおける挙動を示す。
ｃｃｄＡＢ遺伝子形質転換体ヘテロ接合体を同胞交配して生まれた子世代での、赤眼個体（利己的遺伝子を持つもの）と白眼個体（利己的遺伝子を持たないもの）の割合を、メンデルの法則から予想される分離比と比較して示す。ｃｃｄＡＢ遺伝子を含むｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢコンストラクトを導入されたキイロショウジョウバエ形質転換体ｃｃｄＡＢ＃４系統は、もともと眼色が白いｗｈｉｔｅ（ｗ）変異体であるが、上記コンストラクトに眼を赤くするＷ＋遺伝子がマーカーとして入っているため、赤眼となっている。コンストラクトは第三染色体に入っており、ｗ遺伝子座はＸ染色体にあるので、この系統の遺伝子型は、Ｗ；＋／＋；ｃｃｄＡＢ／ｃｃｄＡＢと表記される。
これを、コンストラクトを持たない白眼の系統ｗ（ｗ；＋／＋；＋／＋）と掛け合わせると、子世代（Ｆ１）は全ての個体が、ｗ；＋／＋；ｃｃｄＡＢ／＋のヘテロ接合体となる。次にＦ１同士の掛け合わせを行うと、Ｆ２では三種類の遺伝子型個体、すなわちｗ；＋／＋；ｃｃｄＡＢ／ｃｃｄＡＢとｗ；＋／＋；ｃｃｄＡＢ／＋とｗ；＋／＋；＋／＋が１：２：１の割合で生ずることがメンデルの分離の法則から予想される。ｗ＋遺伝子は優性の発現をするので、前二者は赤眼となり、最後のもののみ白眼となる。従って、赤眼個体と白眼個体は３：１の割合で生ずることが予想される（第５図左側）。
実験結果は明らかにこれとは異なり、赤眼個体が全体の８９％（６５１個体）を占め、白眼のものは１１％（７８個体）に過ぎなかった（第５図右側）。この結果は、ｃｃｄＡＢ遺伝子を持たない個体のうち半数以上（５７％）が成虫になるまでに死亡していることを意味している。つまりｃｃｄＡＢ遺伝子を持たないものは殺されていることが考えられる。即ちこの結果は、ｃｃｄＡＢを持つ母親から生まれた子のうち、ｃｃｄＡＢを持たないものが死によって除去されることを意味しており、ｃｃｄＡＢが大腸菌内に於いてのみならず、真核多細胞生物のショウジョウバエ体内でも利己的遺伝子として働くことを示している。
産業上の利用可能性
本発明により、利己的遺伝子と共に外来遺伝子を導入することにより、外来遺伝子により形質転換した個体の比率を有効に増加させる方法が得られた。
本発明は、ある遺伝子を有する固体集団の比率を制御するための基本技術となりうるために、広範囲の応用可能性がある。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢプラスミドの構造を示す模式図である。
第２図は、ｐＣａＳｐｅＲ−ａｃｔ−ｃｃｄＡ−ｈｓ−ｃｃｄＢプラスミドの構造を示す模式図である。
第３図は、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢ−ｆｕｓｅｄプラスミド及びｐＵＡＳＴ−ｃｃｄＢプラスミドの構造を示す模式図である。
第４図は、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−ｃｃｄＡＢをＰＣＲにより増幅して、検出を行った結果を示す写真である（図面の代わりに写真を提出）。
第５図は、全個体に対する遺伝子が導入されて、眼の色が赤変した個体の割合を示すグラフである。
第６図は、ｐＣａＳｐｅＲ−ｈｓ−Ｍ−ｎｏｓ−Ｒプラスミドの構造を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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