(57)【要約】本発明によれば、β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する形質転換体、該形質転換体を用いた該蛋白質の製造法、およびガラクトース含有複合糖質の製造法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加しているアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と８０％以上の相同性を有する蛋白質であり、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体。
【請求項９】
微生物、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を宿主細胞として得られる請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリである請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物からβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質を採取することを特徴とするβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質の製造法。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースおよび受容体複合糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にガラクトース含有複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からガラクトース含有複合糖質を採取することを特徴とするガラクトース含有複合糖質の製造法。
【請求項１４】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１３に記載の製造法。
【請求項１５】
受容体複合糖質が、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有するオリゴ糖を含む複合糖質である請求項１３に記載の製造法。
【請求項１６】
非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有するオリゴ糖が、ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、およびＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ構造を有するオリゴ糖からなる群より選ばれるオリゴ糖である請求項１５に記載の製造法。
【請求項１７】
ガラクトース含有複合糖質が、ラクト−Ｎ−ビオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）、およびパララクト−Ｎ−ヘキサオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）からなる群より選ばれるガラクトース含有複合糖質である請求項１３に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いたβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質およびガラクトース含有複合糖質の製造法に関する。
背景技術
β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子に関しては、哺乳動物由来の遺伝子［特開平６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２４７９４（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，５８（１９９８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６３，５７１（１９９９）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，５８，３１８（１９９９）］および鳥類由来の遺伝子［Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｐｏｌｏｎｉｃａ．，４５，４５１（１９９８）］が取得されているが、動物由来のβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子をエシェリヒア・コリなどの微生物で活性のある蛋白質として発現させた例はなく、また鳥類由来の該遺伝子についてはエシェリヒア・コリで発現させた例はあるものの［Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｐｏｌｏｎｉｃａ．，４５，４５１（１９９８）］、その活性は微弱であった。
一方、微生物においては、キャンピロバクター・ジェジュニからβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子が取得され、エシェリヒア・コリで活性のある蛋白質として発現されている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，３８９６（２０００）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，５０１（２０００）］。しかし、該蛋白質の基質としては非還元末端にＮ−アセチルガラクトサミンを有し、かつ還元末端が蛍光物質［ＦＣＨＡＳＥ（６（５−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）］で標識されたＧａｌＮＡｃβ１，４［ＮｅｕＡｃα２，３］Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥのみが記載されているだけで、還元末端に修飾のない複合糖質あるいは非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する複合糖質に関する記載はない。
ヘリコバクター・ピロリ２６６９５株においては、そのゲノムＤＮＡの全塩基配列が決定しているが［Ｎａｔｕｒｅ，３８８，５３９（１９９７）］、β１，３−ガラクトース転移酵素として機能付けされた遺伝子産物は知られていない。また、ヘリコバクター・ピロリにおいて、２６６９５株のＨＰ０６１９遺伝子に対応する遺伝子を破壊することによりＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ構造が消失することから、ＨＰ０６１９遺伝子がβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子であろうと予想されているが［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８，５９２８（２０００）］、該遺伝子をエシェリヒア・コリなどの微生物で発現させたという例はなく、詳細な酵素活性に関する記載もない。
ガラクトース含有複合糖質の中でも特にＧａｌβ１，３−Ｒ構造を骨格内に有する複合糖質は、血液型複合糖質であるＬｅｗｉｓａやＬｅｗｉｓｂの合成中間体として重要であるとともに［Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．，３０，１８１（２０００）］、人乳中にも多く含まれており細菌の感染予防効果があると考えられている［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３，２１８（１９９４）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６８５，２１１（１９９６）、Ｌａｎｃｅｔ，３４７，１０１７（１９９６）］。
しかしながら、Ｇａｌβ１，３−Ｒ構造を有するガラクトース含有複合糖質の製造に関しては、人乳からの抽出法［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１７８，７９（１９８８）］、化学合成法［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３１６，１２１（１９９９）］、酵素を用いた方法［Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．，１６，１８９（１９９９）］が報告されているが、いずれもコスト面や生産性の面で問題があり、工業的な製造法は未だ確立されていない。
発明の開示
本発明は、β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いたβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質およびガラクトース含有複合糖質の製造法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ゲノムＤＮＡの配列が決定しているヘリコバクター・ピロリ２６６９５株の配列情報に基づき、ヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３７株からＨＰ０６１９遺伝子に対応するＤＮＡを取得し、その遺伝子産物について活性測定を行った結果、本遺伝子産物がβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有することを見出し本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（１７）に関する。
（１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（２）  配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加しているアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質。
（３）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と８０％以上の相同性を有する蛋白質であり、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質。
（４）  上記（１）〜（３）のいずれか１つの蛋白質をコードするＤＮＡ。
（５）  配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（６）  配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（７）  上記（４）〜（６）のいずれか１つのＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
（８）  上記（７）の組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体。
（９）  微生物、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を宿主細胞として得られる上記（８）の形質転換体。
（１０）  微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である上記（９）の形質転換体。
（１１）  エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリである上記（１０）の形質転換体。
（１２）  上記（８）〜（１１）のいずれか１つの形質転換体を培地に培養し、培養物中にβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物からβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質を採取することを特徴とするβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質の製造法。
（１３）  上記（８）〜（１１）のいずれか１つの形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースおよび受容体複合糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でガラクトース含有複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からガラクトース含有複合糖質を採取することを特徴とするガラクトース含有複合糖質の製造法。
（１４）  培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、上記（１３）の製造法。
（１５）  受容体複合糖質が、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有するオリゴ糖を含む複合糖質である上記（１３）に記載の製造法。
（１６）  非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有するオリゴ糖が、ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、およびＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃからなる群より選ばれるオリゴ糖である上記（１５）の製造法。
（１７）  ガラクトース含有複合糖質が、ラクト−Ｎ−ビオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）、およびパララクト−Ｎ−ヘキサオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）からなる群より選ばれるガラクトース含有複合糖質である上記（１３）の製造法。
本発明の蛋白質は、β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質の中でも、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する受容体複合糖質にβ１，３結合でガラクトースを転移させる活性を有する蛋白質である。本発明の蛋白質は、特にその由来は限定されないが、好ましくは微生物由来の蛋白質、より好ましくはヘリコバクター属に属する微生物由来の蛋白質、さらに好ましくはヘリコバクター・ピロリ由来の蛋白質をあげることができる。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、および配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をあげることができる。
１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換、挿入若しくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは付加があることを意味し、欠失、置換、挿入若しくは付加が同時に生じてもよく、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するためには、配列番号１記載のアミノ酸配列との相同性が、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
本発明のＤＮＡは、上記本発明の蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよく、好ましくは微生物由来のＤＮＡ、より好ましくはヘリコバクター属に属する微生物由来のＤＮＡ、さらに好ましくはヘリコバクター・ピロリ由来のＤＮＡをあげることができる。具体的には、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（２）配列番号２で表される塩基配列を  有するＤＮＡ
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１つのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記（１）〜（３）のいずれか１つのＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ１：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等を用いて、上記パラメーターに基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
［１］本発明のＤＮＡの調製
ヘリコバクター・ピロリ２６６９５株においては、そのゲノムＤＮＡの全塩基配列が決定しており［Ｎａｔｕｒｅ，３８８，５３９（１９９７）］、該ゲノムＤＮＡ配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／Ｇｅｎｏｍｅ／ｏｒｇ．ｈｔｍｌ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ．／ｔｄｂ／）を用いて、該当する遺伝子の配列情報を得ることができる。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、ヘリコバクターに属する微生物より調製することができる。ヘリコバクターに属する微生物としては、例えばヘリコバクター・ピロリをあげることができ、具体的にはヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３７（ＡＴＣＣ４３５０４）株等をあげることができる。
ヘリコバクター・ピロリに属する微生物は、公知の方法［例えば、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，８３３（１９９６）］により培養することができる。
培養後、公知の方法（例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
本発明のＤＮＡを含むＤＮＡ断片は、ゲノムの塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
また、ゲノムの塩基配列に基づいて設計された合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法などにより目的とするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表される配列を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ  ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
配列番号２で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物としては、大腸菌等をあげることができる。
大腸菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＥ８４１５等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する大腸菌として、具体的にはＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ１１６をあげることができる。
［２］本発明の蛋白質の調製
本発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記［１］の方法により取得した本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の製造に用いられる蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明の製造に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＨｅｌｉｘｌ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス  ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・フロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ  ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ  Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明の蛋白質を製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する微生物、昆虫細胞、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明の製造に用いられる蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖付加体等の誘導体を回収することができる
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
上記で取得された蛋白質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
［３］ガラクトース含有複合糖質の調製
上記［２］の培養により得られた形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースおよび受容体複合糖質を水性媒体中に存在せしめることにより、該水性媒体中にガラクトース含有複合糖質を製造することができる。
培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
ガラクトース含有複合糖質の生成において用いられる酵素源は、３７℃で１分間に１μｍｏｌのガラクトース含有複合糖質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
上記方法で用いられるウリジン−５’−二リン酸ガラクトース（以下、ＵＤＰ−Ｇａｌと略す）としては、精製または部分精製されたＵＤＰ−Ｇａｌのほか、微生物を用いて該水性媒体中に生産されるＵＤＰ−Ｇａｌをあげることができる。すなわち、ＷＯ９８／１２３４３に記載の方法に従うことにより、ＵＴＰ前駆体からＵＴＰを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物、ＵＴＰとガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＵＴＰ前駆体、糖、およびガラクトースを該水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＵＤＰ−Ｇａｌを生成蓄積させることができる。
具体的には、ＵＴＰ前駆体としてはオロット酸、ＵＴＰを生産する能力を有する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ＵＴＰとガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物としては、ｇａｌＴ遺伝子［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１４，７７０５（１９８６）］とｇａｌＫ遺伝子［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１３，１８４１（１９８５）］を発現するプラスミドｐＮＴ２５、およびｇａｌＵ遺伝子［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１５，９６５（１９９４）］とｐｐａ遺伝子［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，５９０１（１９８８）］を発現するプラスミドｐＮＴ３２を含有する大腸菌エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＮＴ２５／ｐＮＴ３２（ＷＯ９８／１２３４３）をあげることができる。
ガラクトース含有複合糖質の生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
ガラクトース含有複合糖質の生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ガラクトース含有複合糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ガラクトース含有複合糖質の生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２等の無機塩等を添加することができる。
水性媒体中に生成したガラクトース含有複合糖質の定量はＤｉｏｎｅｘ社製の糖分析装置などを用いて行うことができる［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１（１９９０）］。
反応液中に生成したガラクトース含有複合糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子発現株の造成
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ  ＮＣＴＣ１１６３７株を公知の方法［例えば、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，８３３（１９９６）］により培養した。
培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した、配列番号３および４に記載のＤＮＡを用いて、ヘリコバクター・ピロリ２６６９５株のＨＰ０６１９遺伝子に対応するＤＮＡを含む断片を、下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーとして用い、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ  ＮＣＴＣ１１６３７株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。
該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＰＡＣ３１  ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した
該１．４ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、アガロース１５ｇ／ｌ］に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＧＴ１１６を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）。
実施例２  ラクト−Ｎ−ビオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ）の生産
実施例１で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ１１６株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し２８℃で４時間培養後、４０℃で３時間培養した。該培養液０．１ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ１１６株の湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｎＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＧｌｃＮＡｃ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＵＤＰ−ガラクトース、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液調製し、３７℃で２４時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて以下の分析条件で分析し、反応液中に０．６ｍｍｏｌ／ｌ（２２１ｍｇ／ｌ）のラクト−Ｎ−ビオースが生成蓄積していることを確認した。
分析条件
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ  ＰＡ１０
溶離液：Ａ；Ｈ２Ｏ、Ｂ；５００ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ
グラジエント：０分の溶離液Ｂの濃度を８％とし、２１分かけて２０％にする検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
実施例３  ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）の生産（１）
実施例１で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ１１６株を実施例２記載の方法で培養した。該培養液０．１ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ１１６株の湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｎＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＵＤＰ−ガラクトース、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で２４時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて実施例２に記載した分析条件で分析し、反応液中に４．３ｍｍｏｌ／ｌ（３．１ｇ／ｌ）のラクト−Ｎ−テトラオースが生成蓄積していることを確認した。
実施例４  パララクト−Ｎ−ヘキサオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）の生産
実施例１で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ１１６株を実施例２記載の方法で培養した。該培養液０．１ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ１１６株の湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０））、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｎＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＵＤＰ−ガラクトース、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液を調製し、３７℃で１０時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて実施例２に記載した分析条件で分析し、反応液中に２．２ｍｍｏｌ／ｌ（２．４ｇ／ｌ）のバララクト−Ｎ−ヘキサオースが生成蓄積していることを確認した。
実施例５  ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）の生産（２）
実施例１で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ１１６株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ（ｐＨ７．３）］１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液１２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＴＢ培地［グルコース１０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４２．３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１２．５ｇ／ｌ（ｐＨ無調整）］２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で３０℃で４時間培養した後、４０℃で３時間培養を行った。培養中２８％アンモニア水を用いて培養液のｐＨを７．０に維持し、必要に応じてグルコースを添加した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
公知の方法［Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，８４７（１９９８）］で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５／ｐＮＴ３２株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液１２５ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＴＢ培地２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で３０℃で４時間培養した後、４０℃で３時間培養を行った。培養中２８％アンモニア水を用いて培養液のｐＨを７．０に維持し、必要に応じてグルコースを添加した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０株をグルコース５０ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル酵母社製）１０ｇ／ｌ、尿素５ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１  ５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸５ｍｇ／ｌ、およびビオチン３０μｇ／ｍｌ（ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２５ｍｌの入った３００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で２４時間培養した。
該培養液２０ｍｌを上記と同一組成の液体培地２５０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で２４時間培養した。得られた培養液を種培養液として用いた。
該種培養液２５０ｍｌを、グルコース１５０ｇ／ｌ、肉エキス（極東製薬社製）５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ２０ｍｇ／ｌ（別殺菌）、β−アラニン１５ｍｇ／ｌ（別殺菌）Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１  ５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、ビオチン１００ｍｇ／ｍｌ、尿素２ｇ／ｌ（ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２．２５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で２４時間培養を行った。培養中２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを６．８に維持した。
該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＧＴ１１６株の湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５／ｐＮＴ３２株の湿菌体５０ｇ／ｌ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０株湿菌体１５０ｇ／ｌ、ガラクトース５０ｇ／ｌ、ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ  １００ｇ／ｌ、フラクトース５０ｇ／ｌ、オロット酸５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４２０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５  ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。反応中５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨを用いて該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ２ＰＯ４を添加した。  反応終了後、反応生成物を実施例２記載の方法で分析し、反応液中に６１ｇ／ｌのラクト−Ｎ−テトラオースが生成蓄積していることを確認した。
産業上の利用可能性
本発明により、β１，３ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質を大量に生産することが可能となる。また、該酵素を用いることにより効率的にガラクトース含有複合糖質を製造できる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
2002088364.tif 000002
2002088364.tif 000003
2002088364.tif 000004
2002088364.tif 000005
2002088364.tif 000006
2002088364.tif 000007
2002088364.tif 000008
2002088364.tif 000009
【図面の簡単な説明】
第１図は、１，３−ガラクトース転移酵素発現プラスミドｐＧＴ１１６の造成工程を示す図である。
なお、図中の符号の意味は、以下に示す通りである。
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ＰＬ：ＰＬプロモーター
ｃＩ８５７：温度感受性リプレッサー遺伝子
ＨＰ０６１９：ヘリコバクター・ピロリ由来のβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子
【図１】
2002088364.tif 000010
【国際調査報告】
2002088364.tif 000011
2002088364.tif 000012