(57)【要約】血液や培養液などの細胞を含む試料から核酸を分離精製する方法。本発明の方法では、細胞を破壊して得られる細胞抽出液を不織布からなるフィルターに吸着させ、フィルターを洗浄後、核酸を溶出させる。核酸の溶出にはｐＨ１２以上のアルカリ条件を使用してもよく、また、フィルターに吸着した核酸を活性酸素処理したり、界面活性剤を使用して核酸を溶出することもできる。本発明の方法で分離精製した核酸は、核酸の増幅や塩基配列解析技術に使用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（１）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；および
（３）不織布から核酸を溶出する工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製する方法。
【請求項２】
不織布に吸着された核酸を４０℃から１００℃の温度範囲で加熱して核酸を溶出する請求項１記載の方法。
【請求項３】
不織布に吸着された核酸をｐＨ１２以上のアルカリ条件下で処理して核酸を溶出する請求項１〜２の１項に記載の方法。
【請求項４】
不織布に吸着された核酸を断片化して溶出する請求項１〜２の１項に記載の方法。
【請求項５】
活性酸素を用いて核酸を断片化する請求項４記載の方法。
【請求項６】
還元糖に二価の金属イオンを添加して発生させた活性酸素を用いる請求項５記載の方法。
【請求項７】
活性酸素が過酸化水素である請求項５記載の方法。
【請求項８】
過酸化水素に二価の金属イオンを添加して発生させた活性酸素を用いる請求項５記載の方法。
【請求項９】
酵素を用いて核酸を断片化する請求項４記載の方法。
【請求項１０】
不織布に吸着された核酸を界面活性剤で処理して溶出する請求項１〜２の１項に記載の方法。
【請求項１１】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤、または両性界面活性剤である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程：
（１）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
（３）該不織布に核酸を増幅するための溶液を加えて、該不織布に吸着された核酸を鋳型として核酸を増幅する工程；
（４）該反応液を回収する工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製して増幅する方法。
【請求項１３】
ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法で核酸を増幅する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程：
（１）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
（３）該不織布に塩基配列を検出するための溶液を加えて反応させる工程；
（４）該反応液を測定する工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製して特定の塩基配列を検出する方法。
【請求項１５】
以下の工程：
（１）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
（３）該不織布に塩基配列を検出するための溶液を加えて反応させる工程；
（４）該不織布表面を測定する工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製して特定の塩基配列を検出する方法。
【請求項１６】
ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法で塩基配列を検出する請求項１４〜１５の１項に記載の方法。
【請求項１７】
プローブを用いたハイブリダイゼーションで特定の塩基配列を検出する請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
プライマーと核酸合成酵素による核酸伸長反応で特定の塩基配列を検出する請求項１４〜１５の１項に記載の方法。
【請求項１９】
核酸伸長反応の際に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
核酸伸長反応で生じるピロリン酸を検出することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
以下の工程：
（１）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
を含む、細胞の核酸を吸着した不織布を作製する方法。
【請求項２２】
以下の工程：
（１）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（２）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
（３）該不織布に核酸を標識するための溶液を加えて反応させる工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製して核酸を標識する方法。
【請求項２３】
ビオチン、蛍光、またはハプテンで核酸を標識する請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
不織布に吸着された核酸そのものを標識する請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
不織布の素材がポリエステル、ポリプロピレンまたはナイロンである請求項１〜２４の１項に記載の方法。
【請求項２６】
不織布の素材がポリエチレンテレフタレートである請求項１〜２４の１項に記載の方法。
【請求項２７】
不織布の孔径が２〜１５０μｍである請求項１〜２６の１項に記載の方法。
【請求項２８】
不織布の繊維径が０．３〜２０μｍである請求項１〜２７の１項に記載の方法。
【請求項２９】
粘度増加剤、カオトロピック剤、およびアルコールを含まない細胞抽出液を使用する請求項１〜２８の１項に記載の方法。
【請求項３０】
塩を含む細胞抽出液を使用する請求項１〜２９の１項に記載の方法。
【請求項３１】
細胞抽出液に含まれる塩がナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、リン酸塩、硫酸塩または塩酸塩である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
細胞抽出液に含まれる塩が塩化ナトリウムで、その濃度が１０ｍＭから１０００ｍＭである請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
細胞抽出液に含まれる塩が塩化マグネシウムで、その濃度が１ｍＭから１００ｍＭである請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
細胞抽出液に含まれる塩がリン酸ナトリウムで、その濃度が２ｍＭから１００ｍＭである請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
細胞抽出液に含まれる塩が硫酸アンモニウムで、その濃度が２０ｍＭから１０００ｍＭである請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤を含む細胞溶解液を使用する請求項１〜３５の１項に記載の方法。
【請求項３７】
細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程を８０℃〜１１０℃の温度範囲で行う請求項１〜３６の１項に記載の方法。
【請求項３８】
細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程を還元剤の存在下で行う請求項１〜３７の１項に記載の方法。
【請求項３９】
還元剤がチオール基を含む化合物である請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
細胞抽出液を不織布に接触させる方法が濾過である請求項１〜３９の１項に記載の方法。
【請求項４１】
細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程の後に、不織布を洗浄する工程が続く請求項１〜４０の１項に記載の方法。
【請求項４２】
カオトロピック剤およびアルコールを含まない溶液で不織布を洗浄する請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
細胞溶解液で不織布を洗浄する請求項４１〜４２の１項に記載の方法。
【請求項４４】
０．５Ｍ〜２Ｍの濃度範囲の塩溶液で不織布を洗浄する請求項４１〜４３の１項に記載の方法。
【請求項４５】
（１）不織布を組み込んだ装置；および（２）細胞溶解液、核酸溶出液のいずれかを含む溶液；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製するキット。
【請求項４６】
（１）不織布を組み込んだ装置；および（２）細胞溶解液、洗浄液のいずれかを含む溶液；
を含む、細胞から核酸を抽出し、該核酸を吸着した不織布を作製するキット。
【請求項４７】
固体表面に吸着された核酸をｐＨ１２以上のアルカリ条件下で処理して溶出する方法。
【請求項４８】
固体表面に吸着された核酸を活性酸素で処理して溶出する方法。
【請求項４９】
固体表面に吸着された核酸を界面活性剤で処理して溶出する方法。
【請求項５０】
核酸を吸着した不織布。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、不織布を用いて細胞から高純度の核酸を簡便に調製する方法およびその調製キットに関する。更に本発明は、核酸を吸着した不織布から核酸を増幅する方法、および核酸を吸着した不織布から核酸の塩基配列を検出する方法、更には該方法で使用する核酸を吸着した不織布の作製法およびその作製キットに関する。
背景技術
ＤＮＡのような核酸を細胞から調製するためには、一般的に細胞を含む試料をＳＤＳやＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで処理して可溶化した後、フェノールで蛋白質を変性除去して核酸を精製する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、９．１６−９．２３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）。しかし、手間と時間がかかることから、より簡便な方法が求められている。
より簡便な方法としては、例えばシリカを用いる方法がＥＰ０３８９０６３で開示されている。該方法では、まず細胞をカオトロピック性試薬で処理して細胞を溶解し、核酸を遊離させる。次に、シリカまたはその誘導体から成る核酸結合性坦体に核酸を吸着させて、この坦体をカオトロピック性試薬や有機溶媒で遠心洗浄する。最後に、低塩のＢｕｆｆｅｒで核酸を溶出する。該方法はフェノール法に比較すると簡便であるとはいうものの、まだ多くの工程を含み、遠心操作が必要であるという欠点がある。また、ＰＣＲなどの酵素反応を強く阻害するカオトロピック剤やエタノールを使用するので、これらの物質を完全に除く必要がある、そのため操作が煩雑になり時間がかかる、などの欠点がある。
白血球分離フィルターのような細胞吸着性繊維集合体を用いて末梢血白血球から核酸を調製する方法は、特公平８−２４５８３号や特開平８−２８０３８４号で開示されている。
特公平８−２４５８３号によれば、まず白血球分離フィルターに血液を通して、血液中の白血球をフィルターに吸着させ、血液の他の成分と分離する。このフィルターにＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ；  １ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ｐＨ７．６）を通して洗浄し、ヘモグロビン等の蛋白質を除去する。こうして分離洗浄された白血球をフィルターごと例えば−８０℃で凍結した後、室温で放置して白血球を解凍する。それから繊維状物質にＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ−ｍｉｘ（ＴＥＢｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）を加えて、フィルターの繊維状物質に吸着されていた白血球を繊維状物質から回収する。しかし、特公平８−２４５８３号では、回収された白血球からゲノムＤＮＡを抽出する操作は従来の技術で行っている。すなわち、白血球に１０％  硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤と蛋白分解酵素（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）を加えて、６５℃で１５時間インキュベートし、これにＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅＡ）を加えて３７℃で１時間インキュベートする。それからこれをフェノール試薬で処理し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させて精製する。
特開平８−２８０３８４号では、有核細胞を吸着した後、有核細胞中の核酸または蛋白質を取り出す方法を開示している。核酸または蛋白質を取り出す方法としては、極細繊維集合体に細胞を結合したまま細胞溶解液を通液して溶解するか、あるいは破砕などを行う。この方法の利点は、吸着した細胞をそのまま破砕、溶解処理することが可能なことである。吸着した細胞を脱離することなく、吸着した細胞を破砕し、または溶解することから、吸着した細胞を脱離する方法よりも容易に実施が可能である。しかし、細胞溶解後の核酸精製については従来の技術を用いており、新しい方法は開示されていない。すなわち、まず細胞を吸着した極細繊維集合体を精製水や界面活性剤で処理し、極細繊維集合体を通過した細胞溶解液から通常のフェノール・クロロホルム法で核酸を精製している。
以上のように、白血球分離フィルターのような細胞吸着性繊維集合体を用いて末梢血白血球から核酸を調製する方法は知られていたが、上記の方法では白血球の分離や核酸抽出のステップまでフィルターで行った後は既存の核酸精製法で核酸を精製しなければならず、工程が複雑になり時間と手間がかかるという欠点があった。
最近、フィルターを用いて細胞から核酸を直接精製する方法が、国際公開ＷＯ００／２１９７３号で開示された。該方法では、（１）まず、細胞を含む試料をフィルターにかけて細胞をフィルターに吸着させる。（２）次にフィルターに吸着された細胞を溶解し、（３）フィルターで濾過する。（４）フィルターに吸着された核酸を洗浄する。（５）最後に、核酸をフィルターから溶出する。吸着した核酸は４０℃から１２５℃に加温すると溶出され、溶出ＢｕｆｆｅｒのｐＨは５から１１の範囲で、塩濃度は高くても低くても良い。精製された核酸の吸光度比Ａ２６０／Ａ２８０は１．８であり、ＰＣＲの鋳型として使用可能であった。国際公開ＷＯ００／２１９７３号では、核酸を精製する目的に使用可能なフィルターの例としてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ｆｉｌｔｅｒｓが挙げられており、使用不可能な例としてＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃ  ｆｉｌｔｅｒｓが挙げられている。また、該方法に適したフィルターの特徴として、精製ＤＮＡをフィルターに通しても精製ＤＮＡを捕捉できないこと、細胞を溶解してからフィルターにかけるとＤＮＡの収率が８０％低下して実用的でないことが述べられている。また該方法を用いて血液から核酸を調製する場合、実験者は白血球を溶解する前に赤血球を溶血させる必要がある。また、このような細胞をフィルターに吸着させてから精製する方法では、細胞の種類に応じてフィルターを選択しなければならないという欠点がある。
米国特許第５１８７０８３号および米国特許５２３４８２４号では、血液細胞を界面活性剤で溶解してからポアサイズが０．２μｍから０．８μｍのフィルターにかけてＤＮＡを精製するという方法を開示している。米国特許５２３４８２４号でクレームしている方法は、血球から純粋なＤＮＡを迅速に調製する方法であって次の工程を含む。（１）高剪断力がかからないように２分から４０分かけて界面活性剤と粘度増強剤を含む溶液でゆるやかに細胞を溶解させて細胞のＤＮＡを含む溶解液を調製する。この時、ＤＮＡはフィルターにトラップされるように十分大きな分子量を持っている必要がある。次に、（２）この抽出液を０．２μｍから０．８μｍの孔径を持ったフィルターで濾過してＤＮＡをフィルターにトラップする。それから（３）フィルターを純水中で約１００℃  ５分から１５分間加熱してＤＮＡを抽出する。溶出液は、１００ｍＭ以下のマグネシウムまたはカルシウムを含んでいてもよい。ここで、（１）の粘度増強剤としては、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ（分子量７万から１０万）、水溶性ポリマー、糖、ポリペプチド、ゼラチンなどを使用する。また、この方法で血液からＤＮＡを精製するには、血液を１０倍以上希釈しなければならない。そうしないと、粘度が高すぎて該フィルターで濾過できない。
また、特表２００１−５２０８９４号では（１）核酸類を所定の方向から表面へ投入すること、（２）前記表面上での核酸類の固定化、（３）前記表面からの固定化された核酸類の放出、及び（４）主に投入方向における前記表面から放出された核酸類の除去、の段階により核酸類を単離する方法が開示されている。表面としては膜が使用可能であり、膜は疎水性であっても親水性であっても良い。膜の材質としては、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、ポリエチレン−テトラフルオロエチレン共重合化物、ポリエチレン−クロロトリフルオロエチレン共重合化物、またはポリフェニレンスルフィドが使用できる。膜の細孔は０．００１〜５０μｍ、好ましくは０．０１〜２０μｍ、最も好ましくは０．０５〜１０μｍの直径を有する。核酸類の固定化のために、鉱酸とアルカリ及びアルカリ土類金属類との塩類、アルカリまたはアルカリ土類金属と一塩基もしくは多塩基または多官能性有機酸類とからの塩類、脂肪族または非環式飽和または不飽和炭化水素のヒドロキシル誘導体、フェノールまたはポリフェノール、またはカオトロピック剤が使用できる。
該方法では、核酸の収量を高めるためには吸着時にアルコールやカオトロピック剤を添加しなければならないという欠点がある。例えば、疎水性ナイロン膜である細孔１．２μｍのヒドロロン（Ｈｙｄｒｏｌｏｎ，Ｐａｌｌ）にＲＮＡを吸着させる場合、結合溶液に１Ｍ  ＮａＣｌを使用すると収量が０．１５μｇであるのに対し、３６％エタノール含有１Ｍ  ＮａＣｌを使用すると１．５５μｇになり、収量は実に１０倍異なる。また、結合溶液に３６％エタノール含有５００ｍＭ  イソチオシアン酸グアニジウムまたは３６％エタノール含有１Ｍ  塩酸グアニジニウムを用いると、収量は２．３μｇまたは６．７μｇになる。またカオトロピック剤を使用すると、その後アルコールを含むＢｕｆｆｅｒでよく洗浄し、更に乾燥する必要がある。
また、特表平１１−５０１５０４号では、サンプルを界面活性剤および固体支持体に接触させ、これによって上記サンプル中の可溶性核酸がこの支持体に結合し、次いでこの支持体を結合した核酸とともに上記サンプルから分離することからなる、サンプルから核酸を単離する方法が開示されている。該発明で用いる特に好適な固体支持体として、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳとして販売される磁性粒子を挙げており、実施例もこれにつきる。また、界面活性剤は、如何なる界面活性剤であってもよく、陰イオン性および陽イオン性を含むイオン性であっても、非イオン性または両イオン性であってもよい。
磁性粒子を用いる場合、サンプル容量は通常数μｌから数１０μｌになる。このため、サンプル容量が多い場合はあらかじめ遠心などの操作で細胞を濃縮する、あるいは不要な細胞、物質を除いてから目的の細胞を濃縮するなどの必要が出てくる。例えば、０．５ｍｌの血液に含まれる白血球ＤＮＡを精製する場合、まず溶血して、次に遠心して白血球をペレットにする、などの操作が必要である。また、ＤＮＡはゲル状のＤＮＡ／ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ複合体として回収され、この複合体はピペッティングなどの操作で簡単に破壊される。従って、ゆるやかに洗浄しないと複合体がバラバラになり、ＤＮＡ収量が著しく減少するので注意が必要である。
また、固体表面に吸着された核酸を活性酸素で溶出するという報告はこれまでない。同様に、固体表面に吸着された核酸をアルカリで溶出するという報告もない。
近年、ヒトゲノム解析が急速に進展し、その成果であるゲノム情報を医療の質的改善に結びつけようという試みが活発になってきている。一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ、ＳＮＰｓ）のデータが整備されれば、薬効の個人差を識別し、患者毎に至適薬物と投与量を決定する、いわゆるオーダーメード医療が可能になると期待されている。このようなＳＮＰｓを利用したオーダーメード医療を実現するためには、迅速、正確、かつ安価なＳＮＰｓタイピング技術の開発が不可欠である。ここでいうＳＮＰｓタイピング技術とは、ゲノムの抽出・精製、核酸増幅、塩基配列の解析など検体の処理から検査結果のアウトプットに至るまでのすべての技術を意味する。
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）などの核酸増幅反応で特定の塩基配列を増幅する場合、あるいはＳＮＰｓタイピング技術で塩基配列を解析する場合、増幅や配列解析の対象となる核酸は、通常、溶液状態で反応系に供給される。上記で引用したいずれの方法でも溶液として核酸を回収している（国際公開ＷＯ００／２１９７３号、米国特許第５１８７０８３号、米国特許第５２３４８２４号、特表２００１−５２０８９４号）。核酸調製法としては一般的であるが、溶出には時間がかかり、またそれに適した溶出条件を設定する必要がある。この核酸溶出に要する時間を短くする、あるいは溶出工程そのものを省略して次の検査ステップに進めるなら、検査に要する時間は著しく短縮される。
米国特許第５，７５６，１２６号では、フィルターに吸着された核酸を直接解析する方法について述べられている。該方法では、（１）弱塩基、キレート剤、陰イオン性界面活性剤、及び解析に必要な成分を吸着させた乾燥固体媒体に核酸物質を含有するサンプルを加え、（２）該サンプルを保存し、（３）該サンプルに含まれていた蛋白質またはヘモグロビンを除いて、（４）該サンプルを解析する。米国特許第５，９７２，３８６号では、（イ）蛋白変性剤を吸着させた固体マトリックス、（ロ）解析に必要な成分、（ハ）該成分をマトリックス上に保持するための保持剤、の３要素からなる核酸保存のための乾燥固体媒体を用いて、フィルターに吸着された核酸を直接解析する方法について述べられている。すなわち、（１）該乾燥固体媒体に核酸物質を含有するサンプルを加え、（２）該サンプルを保存し、（３）該サンプルに含まれていた蛋白質またはヘモグロビンを除いて、（４）該サンプルを解析する。
上記２つの特許では乾燥固体媒体の例として、尿酸、トリス、ＥＤＴＡ、ＳＤＳを吸着させたセルロースペーパーを挙げている。この９ｍｍ２に血液３μｌを載せて、あるいは１００ｍｍ２に血液１００μｌを載せて乾燥させ保存し、その後解析する。またここでいう解析とは、ＰＣＲやＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）の電気泳動による解析を指す。該方法には、乾燥固体媒体の作製に手間がかかる、乾燥固体媒体に添加できるサンプルの容量に制限がある、そのため媒体上に固定できる核酸密度が小さい、ヘモグロビンなどの蛋白を除去するためにフェノールやアルコールなどの有機溶媒を使用しなければならない、操作が煩雑であり時間がかかる、などの欠点がある。
また、ＥＰ３８９，０６３では、試料、カオトロピック剤、核酸結合性固相体を混合して固相体に核酸を結合させた後、固相体を分離、洗浄して核酸を分離する方法が述べられている。核酸結合性固相体としては、シリカビーズの他にＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、Ｈｙｂｏｎｄ―Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などのフィルターを例として挙げている。核酸を吸着したフィルターを直接テンプレートとしてＰＣＲする方法についても述べられている。核酸溶液をグアニジンチオシアネート溶液と該フィルターと混合して核酸をフィルターに吸着させて、カオトロピック剤、７０％エタノールで洗浄し、５６℃で乾燥させる。該フィルターをＰＣＲ反応系に直接加えて、標的核酸が増幅できることを示している。該方法では、カオトロピック剤や有機溶媒を使用しなければならない、カオトロピック剤やエタノールはＰＣＲ反応を強く阻害するのでこれらの物質を完全に除く必要がある、そのため操作が煩雑になり時間がかかる、などの欠点がある。また、該フィルターは通常ブロッティングに使用されるもので、血液のような生体材料から核酸を精製する目的には適していない。
更に、国際公開ＷＯ９８／５１６９３号では、サンプル中の細胞を核酸で検出する一般的な方法が述べられており、（１）サンプル中の細胞を固体に結合させ、（２）細胞を溶解し、（３）細胞から遊離した核酸を（１）と同じ固体に結合させて、（４）標的細胞の核酸を検出する。該方法では、まず細胞を固体に結合させる必要があることから、細胞の種類に応じた固体を選択する必要がある、細胞を破壊することなく結合させなければならないので濾過の流速に制限がある、などの欠点がある。
発明の開示
本発明の課題は、血液のような細胞を含む試料から、従来の技術より簡便かつ高収率に細胞の核酸を精製する方法を提供することである。更に本発明の課題は、従来の核酸増幅技術や塩基配列解析技術に使用可能で、かつ迅速、簡便な核酸調製法を供給することにある。
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の工程：
（イ）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（ロ）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；および
（ハ）不織布から核酸を溶出する工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製する方法。
（２）不織布に吸着された核酸を４０℃から１００℃の温度範囲、好ましくは８０℃から９５℃の温度範囲で加熱して核酸を溶出する（１）記載の方法。
（３）不織布に吸着された核酸をｐＨ１２以上のアルカリ条件下で処理して核酸を溶出する（１）〜（２）の１つに記載の方法。
（４）不織布に吸着された核酸を断片化して溶出する（１）〜（２）の１つに記載の方法。
（５）活性酸素を用いて核酸を断片化する（４）記載の方法。
（６）還元糖に二価の金属イオンを添加して発生させた活性酸素を用いる（５）記載の方法。
（７）活性酸素が過酸化水素である（５）記載の方法。
（８）過酸化水素に二価の金属イオンを添加して発生させた活性酸素を用いる（５）記載の方法。
（９）酵素を用いて核酸を断片化する（４）記載の方法。
（１０）不織布に吸着された核酸を界面活性剤で処理して溶出する（１）〜（２）の１項に記載の方法。
（１１）界面活性剤が非イオン性界面活性剤、または両性界面活性剤である（１０）記載の方法。
（１２）以下の工程：
（イ）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（ロ）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
（ハ）該不織布に核酸を増幅するための溶液を加えて、該不織布に吸着された核酸を鋳型として核酸を増幅する工程；
（ニ）該反応液を回収する工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製して増幅する方法。
（１３）ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法で核酸を増幅する（１２）に記載の方法。
（１４）以下の工程：
（イ）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（ロ）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
（ハ）該不織布に塩基配列を検出するための溶液を加えて反応させる工程；
（ニ）該反応液を測定する工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製して特定の塩基配列を検出する方法。
（１５）以下の工程：
（イ）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（ロ）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
（ハ）該不織布に塩基配列を検出するための溶液を加えて反応させる工程；
（ニ）該不織布表面を測定する工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製して特定の塩基配列を検出する方法。
（１６）ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法で塩基配列を検出する（１４）〜（１５）の１つに記載の方法。
（１７）プローブを用いたハイブリダイゼーションで特定の塩基配列を検出する（１５）に記載の方法。
（１８）プライマーと核酸合成酵素による核酸伸長反応で特定の塩基配列を検出する（１４）〜（１５）の１つに記載の方法。
（１９）核酸伸長反応の際に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出することを特徴とする（１８）に記載の方法。
（２０）核酸伸長反応で生じるピロリン酸を検出することを特徴とする（１８）に記載の方法。
（２１）以下の工程：
（イ）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（ロ）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
を含む、細胞の核酸を吸着した不織布を作製する方法。
（２２）  以下の工程：
（イ）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程；
（ロ）細胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程；
（ハ）該不織布に核酸を標識するための溶液を加えて反応させる工程；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製して核酸を標識する方法。
（２３）ビオチン、蛍光、またはハプテンで核酸を標識する（２２）記載の方法。
（２４）不織布に吸着された核酸そのものを標識する（２２）または（２３）に記載の方法。
（２５）不織布の素材がポリエステル、ポリプロピレンまたはナイロンである（１）〜（２４）の１つに記載の方法。
（２６）不織布の素材がポリエチレンテレフタレートである（１）〜（２４）の１つに記載の方法。
（２７）不織布の孔径が２〜１５０μｍである（１）〜（２６）の１つに記載の方法。
（２８）不織布の繊維径が０．３〜２０μｍある（１）〜（２７）の１つに記載の方法。
（２９）粘度増加剤、カオトロピック剤、およびアルコールを含まない細胞抽出液を使用する（１）〜（２８）の１つに記載の方法。
（３０）塩を含む細胞抽出液を使用する（１）〜（２９）の１つに記載の方法。
（３１）細胞抽出液に含まれる塩がナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、リン酸塩、硫酸塩または塩酸塩である（３０）記載の方法。
（３２）細胞抽出液に含まれる塩が塩化ナトリウムで、その濃度が１０ｍＭから１０００ｍＭである（３０）記載の方法。
（３３）細胞抽出液に含まれる塩が塩化マグネシウムで、その濃度が１ｍＭから１００ｍＭである（３０）記載の方法。
（３４）細胞抽出液に含まれる塩がリン酸ナトリウムで、その濃度が２ｍＭから１００ｍＭである（３０）記載の方法。
（３５）細胞抽出液に含まれる塩が硫酸アンモニウムで、その濃度が２０ｍＭから１０００ｍＭである（３０）記載の方法。
（３６）陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤を含む細胞溶解液を使用する（１）〜（３５）の１つに記載の方法。
（３７）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程を８０℃〜１１０℃の温度範囲で行う（１）〜（３６）の１つに記載の方法。
（３８）細胞を破壊して細胞抽出液を調製する工程を還元剤の存在下で行う（１）〜（３７）の１つに記載の方法。
（３９）還元剤がチオール基を含む化合物である（３８）記載の方法。
（４０）細胞抽出液を不織布に接触させる方法が濾過である（１）〜（３９）の１つに記載の方法。
（４１）細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる工程の後に、不織布を洗浄する工程が続く（１）〜（４０）の１つに記載の方法。
（４２）カオトロピック剤およびアルコールを含まない溶液で不織布を洗浄する（４１）記載の方法。
（４３）細胞溶解液で不織布を洗浄する（４１）〜（４２）の１つに記載の方法。
（４４）０．５Ｍ〜２Ｍの濃度範囲の塩溶液で不織布を洗浄する（４１）〜（４３）の１つに記載の方法。
（４５）（イ）不織布を組み込んだ装置；および（ロ）細胞溶解液、核酸溶出液のいずれかを含む溶液；
を含む、細胞を含む試料から細胞の核酸を調製するキット。
（４６）（イ）不織布を組み込んだ装置；および（ロ）細胞溶解液、洗浄液のいずれかを含む溶液；
を含む、細胞から核酸を抽出し、該核酸を吸着した不織布を作製するキット。
（４７）固体表面に吸着された核酸をｐＨ１２以上のアルカリ条件下で処理して溶出する方法。
（４８）固体表面に吸着された核酸を活性酸素で処理して溶出する方法。
（４９）固体表面に吸着された核酸を界面活性剤で処理して溶出する方法。
（５０）核酸を吸着した不織布。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、細胞とは真核細胞、原核細胞、またはウィルスを意味し、特にヒト体細胞、ヒト末梢血白血球、感染症の原因となる真菌、細菌、ウィルスを含む。
本発明において、細胞を含む試料とは血液、尿、髄液、喀痰、体液、細胞浮遊液、細胞培養液など細胞を含むものならどのようなものでもあってもよい。また、それらの試料に何らかの処理をほどこした処理液であっても良い。処理の方法としては、例えば、喀痰のような粘性の高い試料を喀痰処理剤により溶解するなどの方法が考えられる。
本発明において、細胞抽出液とは細胞を破壊して得られる細胞の構成成分を含む混合物のことで、細胞を含む試料に細胞溶解液を作用させて作製することができる。細胞溶解液とは細胞を破壊して核酸を抽出するために用いられる溶液のことで、界面活性剤、酵素、ＥＤＴＡなどを含むが、これらをすべて含む必要はない。酵素としては、蛋白質分解酵素、例えばＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫなどを用いるが、細胞種によってはリゾチーム、リゾスタフィン（スタフィロコッカス属）、β１，３−グルカナーゼ、マンナーゼ、キチナーゼ（真菌類）なども用いられる。ＲＮＡを除いた方が好ましい場合には、ＲＮａｓｅＡのようなＲＮＡ分解酵素を加えれば良い。また、酵素は含まなくとも良い。動物細胞では低張液に接触させるだけで細胞を破裂させることも可能である。ＥＤＴＡはＤＮＡ分解酵素を阻害するために用い、通常２５ｍＭの濃度で使用する。また細胞抽出液は、細胞を含む試料に超音波をかけたり、ホモジナイザーで破砕するなど物理的な力を加えて作製することも可能である。
細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させるには、塩を含む細胞抽出液を使用することが望ましい。塩は細胞溶解液に加えておいても良いし、細胞抽出液を不織布に接触させる際に加えても良い。いろいろな種類の塩が使用可能であるが、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩などが好ましい。核酸吸着を促進する濃度範囲は、塩の種類により異なる。例えば、塩化ナトリウムなら１０ｍＭから１０００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭから２００ｍＭ、塩化マグネシウムは１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは２ｍＭから２０ｍＭ、リン酸ナトリウムは２ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭから１００ｍＭ、硫酸アンモニウムは２０ｍＭから１０００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭから２００ｍＭが核酸を吸着させるのに適した濃度である。また、核酸吸着はｐＨ６〜１１の範囲、好ましくはｐＨ６〜８の範囲で行うことが望ましい。
本発明において、不織布とは短繊維またはフィラメントを、機械的、熱的、化学的な手段を用いて接着または交絡させて作るシート状またはウェブ構造のものである（第２版  繊維便覧  繊維学会編  丸善）。不織布はさまざまな方法で生産されるが、基本的な工程はウェブ（繊維の方向がある程度揃った繊維塊のシート状のもの）の形成工程と、ウェブの接着工程、それに仕上げ工程である。不織布には天然繊維から化学繊維まで種々の繊維が用いられているが、一般的に用いられているのは綿、レーヨン、ポリエステル、ポリプロピレン、ナイロンで、その他アクリル、ビニロン、ガラス繊維、パルプ、炭素繊維なども使用される。ウェブを形成する方式は、湿式、乾式および直接式に大別される。直説法は紡糸直結式ともいわれる方法で、溶融高分子溶液から紡糸された繊維を集めて直接ウェブとする工程である。これに含まれる方法は、スパンレース法、スパンボンド法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、ステッチボンド法などである。本発明にはメルトブロー法でつくられた超極細繊維不織布が最も適している。
本発明において、細胞抽出液を不織布に接触させるとは、例えば細胞抽出液に不織布を浮遊させる、細胞抽出液に不織布を浮遊させて浸透する、細胞抽出液を不織布表面上に流すなどの方法を含む。
本発明において、洗浄は不織布に付着した蛋白質、脂質などの物質を洗い流すために行う。洗浄液には、ＳＤＳやトリトンＸ−１００などの界面活性剤、０．５Ｍ以上のＮａＣｌなどの塩溶液などを使用するが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、付着した物質の種類に応じて選択すればよい。また場合によっては、洗浄工程を省略することも可能である。
本発明において、アルカリ処理とはフィルターをｐＨ１２以上の水溶液に浸すことを意味する。アルカリ溶液としては通常ＮａＯＨ、ＫＯＨなどを用いるが、これらに限定されるものではない。また、アルカリ処理後は中和してｐＨを中性に戻すのが望ましく、中和にはリン酸塩など中性付近に緩衝能のある化合物または酸などが用いられる。
本発明において使用する活性酸素は、狭義の活性酸素である３Ｏ２の１電子還元種であるスーパーオキシド（Ｏ２・−）、２電子還元種である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、電子励起状態の酸素分子種である１重項酸素（１Ｏ２）、及びヒドロキシラジカル（ＨＯ・）、及び広義の活性酸素である、金属―酸素錯体（金属オキソ酸も含む）を主として、これら活性種と生体分子（例えば、不飽和脂肪酸Ｌ）との反応に由来するペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）、アルコキシラジカル（ＬＯ・）、ヒドロキシペルオキシド（ＬＯＯＨ）、一酸化窒素（ＮＯ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。活性酸素については、「活性酸素」（蛋白質核酸酵素、臨時増刊、Ｖｏｌ．３３、ＮＯ．１６）や「抗酸化物質のすべて」（先端医学社）に詳しく記載されている。
活性酸素を発生させる方法としては様々な方法が報告されており、例えば次の様な方法で容易に活性酸素を発生させる事ができる。過酸化水素水は、これ自身が活性酸素であるが、過酸化水素水にＣａ２＋やＦｅ２＋などの二価の金属イオンを添加すると過酸化水素は酸化剤として働きヒドロキシラジカル（ＨＯ・）を発生する。Ｄ−リボース等の還元糖に金属イオンＣｕ２＋を添加すると活性酸素が発生して、細胞障害性や核酸の損傷を引き起こす事も報告されている。抗腫瘍性の抗生物質のブレオマイシンを、鉄（ＩＩ）と酸素、あるいは、鉄（ＩＩＩ）と過酸化水素と共存させると活性酸素錯体種が発生し、ＤＮＡ切断を引き起こすことが知られている。
本発明において特に好適に用いられる活性酸素としては、Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅやＤ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ等の還元糖にＣｕ２＋やＦｅ２＋等の二価金属イオンを添加して得られるヒドロキシラジカル、過酸化水素にＣｕ２＋やＦｅ２＋等の二価金属イオンを添加して得られるヒドロキシラジカル等が挙げられる。二価の金属イオンを添加して活性酸素を発生させる場合、活性酸素反応液中にＥＤＴＡ等の金属キレート剤を添加することにより、活性酸素の発生を停止させ、核酸が過度に損傷を受けることを防ぐことができるため、特に好適に使用され得る。活性酸素を用いた核酸の処理時間は１秒〜１０分、好ましくは１秒〜５分、より好ましくは１０秒〜１分である。
不織布に吸着した核酸を溶出させる場合の好適な条件は、吸着した核酸量や種類にも依存するが、例えばＤ−ｒｉｂｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅに二価の金属イオンとしてＦｅ２＋を添加してヒドロキシラジカルを発生させる場合、Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅの濃度は１ｍＭから１Ｍ、好ましくは１０ｍＭから５００ｍＭ、更に好ましくは５０ｍＭから２００ｍＭである。また、Ｆｅ２＋の濃度は、０．００１ｍＭから１０ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭから１０ｍＭ、更に好ましくは０．０５ｍＭから５ｍＭである。反応温度は３０から６５℃、好ましくは４０から６０℃、更に好ましくは４５から５５℃である。
本発明において、不織布に吸着した核酸を断片化する方法として、活性酸素を用いる方法の他、核酸の特定の配列を認識して切断する制限酵素、任意配列を切断するＤＮａｓｅ等の核酸分解酵素を使って断片化してもよい。また、不織布に紫外線を照射して核酸を断片化するなどの方法も考えられる。本発明において好適に使用される制限酵素としては、ＨａｅＩＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ等が挙げられるがこれらに限定されない。認識する核酸の長さは制限酵素によって異なるが、例えば６塩基認識の制限酵素よりも４塩基認識の制限酵素の方が断片化によって生じる核酸断片がより短くなって不織布からの溶出効率が高まり、より好ましい。酵素を用いる場合、酵素の量（濃度、比率など）は、核酸の量及び酵素の種類に依存する。
本発明において、不織布に核酸を増幅するための溶液を加える、または塩基配列を検出するための溶液を加えるとは、核酸を吸着した不織布の一部または全体を、核酸の溶出操作を行うことなく、そのまま核酸増幅または塩基配列検出のための反応系に供することを意味する。
本発明において、核酸増幅法とはＰＣＲに代表される特定の標的核酸配列を増幅させる方法であり、ＰＣＲ以外にＬｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ―Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）、Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）Ａｓｓａｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＴ）、Ｑ―Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＲＣＡＴ）、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ）などの方法を含むが、これらに限定されるものではない。Ｑ―Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ、ＲＣＡＴ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮなどはＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ（一定温度）で増幅反応を行い、その他のＰＣＲ、ＬＣＲなどはＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｉｎｇ（温度サイクリング）で増幅反応を行う。
本発明において、核酸塩基配列の検出法とは、電気泳動や質量分析計を用いずに、フィルター上で塩基配列解析が可能な技術を指す。これらには、例えば検出に蛍光、発光、発色、ラジオアイソトープを用いる一般的なプローブハイブリダイゼーション法、核酸のインターカレーターを用いる方法やＳＮＰｓタイピング技術が含まれる。ＳＮＰｓタイピング技術の具体例としては、ＩｎｖａｄｅｒＴＭ  Ａｓｓａｙ法、ＴａｑＭａｎＴＭ法、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法、ＬＡＭＰ法、ＵＣＡＮ法などがある。
本発明において、プライマーと核酸合成酵素による核酸伸長反応とは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼなどを用いてプライマー特異的に起こす５’→３’ＤＮＡまたはＲＮＡ合成反応のことである。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどが用いられるが、これらに限定されるものではない。またプライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸伸長反応で特定の塩基配列を検出する方法には、例えば前述のＳＮＰｓタイピング技術のＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｉｏｎ法、ＬＡＭＰ法などがある。
本発明において、カオトロピック剤とは水溶液中の水分子の構造を破壊する物質の総称である。
本発明において、界面活性剤とは１分子の中に親水性部分と親油性部分を共有している化合物を意味し、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤に大別される。イオン性界面活性剤は、更に陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤と両イオン性界面活性剤に大別することができる。本発明において細胞溶解液に使用できる界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤のいずれかであり、陽イオン性界面活性剤は使用できない。陰イオン性界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。両性界面活性剤としては、例えば３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、パルミトイルリゾレシチン、ドデシル−Ｎ−ベタイン、ドデシル−β−アラニン等が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、例えばオクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル等が挙げられる。
本発明において不織布に吸着された核酸そのものを標識するとは、核酸を新規に合成することなく吸着された核酸に直接標識を導入することを意味する。このような標識法としては、例えばＢｉｏｔｉｎやＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、あるいはＲｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｃｙ３、Ｃｙ５などの蛍光物質を非酵素的、化学的に導入する方法があり、そのための試薬も市販されている。一方、本発明において不織布に吸着された核酸を標識するとは、前述の直接標識に加えて、核酸合成酵素と標識ヌクレオチドを用いて核酸の相補鎖を合成して標識することも含む。また本発明においてハプテンとは、単独では免疫原性が低いが担体と化学的に結合すると特異的な抗体産生を誘導できる化合物をいう。例えば前述のＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ標識では、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎはハプテンとして利用されている。
以下、本発明を更に詳しく説明する。本発明者等はカオトロピック剤やエタノールなどの有機溶媒を使用せずに、簡便・迅速に核酸を精製する方法を検討した。その結果、不織布が核酸精製に非常に適していることを見出した。他の多孔質フィルターの場合、例えば比較例２に記載のように８μｍの孔径を持つポリカーボネート製トラックエッチドメンブレンには核酸吸着能がなく、多孔質フィルターであれば何でも核酸精製に使用可能という訳ではなかった。該トラックエッチドメンブレンには２層の薄膜がコーティングされており、最上層はＳｉＣＮである。一方、不織布は孔径が約１０〜約１３０μｍ、繊維径が約１．２〜約２０μｍのものを検討したが、素材に拘わらず血液からの核酸精製に使用できた。すなわち、不織布は、平均孔径が２〜１５０μｍなら使用可能で、特に７〜１３μｍのものが好ましい。また、平均繊維径は０．３〜２０μｍなら使用可能で、特に０．７〜１．７μｍのものが好ましい。また、不織布の素材に関しては、血液からの核酸の収量、精製度に優劣はあるものの、ポリエステル、セルロース、アクリル、ポリプロピレン、ナイロンのいずれであっても、またその組み合わせであっても使用可能であった。また、適当な塩を含む精製ゲノムＤＮＡ溶液にポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）平膜と不織布を浸して振盪すると、驚くべきことにゲノムＤＮＡは不織布には結合したが平膜には結合しなかった。ここでＰＥＴ平膜とは細孔が全くないＰＥＴシートを意味する。ＤＮＡ溶液を不織布に接触させるだけでＤＮＡが不織布に結合したことから、ＤＮＡはフィルター濾過されるというより物理吸着で不織布に結合していると考えられた。以上の結果は、不織布という形態が核酸精製に非常に適していることを示している。
更に検討を重ねた結果、不織布の中でもＰＥＴ不織布、より好ましくは孔径が約１０μｍ、繊維径が約１．２μｍのＰＥＴ不織布が最も優れていることを見出した。精製ゲノムＤＮＡをＰＥＴ不織布に接触させるだけでその８０％から９０％が不織布に吸着した。核酸が不織布に結合するためにはＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＨＰＯ４２−などの塩が必要であったが、特表２００１−５２０８９４号のように核酸収量を増すためにカオトロピック剤やエタノールを添加する必要は全くなく、むしろエタノールを添加すると吸着量は著しく減少した。不織布に結合した核酸を溶出するためには、加熱または核酸の断片化が必要であった。核酸溶出にはＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９５℃、２０分加熱する必要があるが、アルカリ溶液中では時間を５分に短縮でき、更に活性酸素を用いると室温、１０秒で溶出することを見出した。
更に本発明者等は、核酸吸着した不織布に驚くべき特徴があることを見出した。すなわち、吸着した核酸を溶出することなくＰＣＲなどで核酸を増幅したり、不織布上でプローブをハイブリダイズさせたりすることができるばかりでなく、不織布上ではプライマー依存性の核酸伸長反応が起こることを見出した。この方法を用いると同一の不織布上で核酸の精製から検出まで行うことができ、操作時間や工程が著しく単純化された。不織布上での検出は、不織布の表面が平滑で薄いシートであることから可能となった。以上の検討により本発明を完成させるに至った。
以下、本発明を更に詳しく説明する。本発明の特徴の１つは、カオトロピック剤やエタノールなどの有機溶媒を使わず、簡便、迅速に細胞の核酸を精製することができる点にある。カオトロピック剤やエタノールなどの有機溶媒はＰＣＲなどの酵素反応を強く阻害するので、これらを使用する方法では使用後よく洗浄するか、エタノールならよく乾燥させなければならない。本発明ではこれらの試薬を使用せず、従って徹底的な洗浄や乾燥が不要なので、簡便、迅速に細胞の核酸を精製することができるようになった。
また本発明の特徴の１つは、細胞から核酸を遊離させて溶液状態で不織布にかけるため、どのような細胞にも応用できる汎用性の高い方法になっている点にある。細胞は、ヒト白血球のような真核細胞でも大腸菌のような原核細胞であってもウィルスであっても良い。細胞を直接フィルターに捕捉してから溶解する方法では、細胞の種類に応じてフィルターの特性や吸着条件を至適化する必要がある。また細胞を破壊することなくフィルターに結合させなければならないので濾過の流速に制限があり、通常はフィルターをゆっくり通す必要がある。本発明では細胞抽出液をフィルターに通すので、流速を早くすることが可能である。
また本発明の特徴の１つは、細胞抽出液をそのまま不織布に通すだけで核酸が不織布に吸着される点にある。また、フィルターの核酸吸着能力の範囲内であれば、サンプル中に含まれる細胞数やサンプル容量に制限はない。一方、ＦＴＡＴＭのような細胞溶液を基材にしみ込ませてから細胞を溶解する方法では、基材が吸収できるサンプル容量が処理量の上限となるので、大容量のサンプルから核酸を抽出する目的にはあまり適さない。例えば、細胞濃度が低い大容量のサンプルから、サンプル中に含まれる全細胞の核酸を回収したい場合は、遠心など他の手段であらかじめ細胞を濃縮する必要がある。本発明のフィルターには、このようなサンプル容量に関する制限はない。
細胞抽出液の作製法は重要である。細胞抽出液は不溶物がない溶液であることが望ましい。また、細胞抽出液の粘度があまり高いと不織布を通すことが困難になるので望ましくない。ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（終濃度  ０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加した方が好ましいが、必須というわけではない。例えば、室温で血液を溶解する場合、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えた方が核酸の収量は良い傾向にあるが、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫがなくても核酸は精製可能である。一方、５０℃で血液を溶解する場合、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの添加は必須であり、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを添加せずに作製した血液抽出液を不織布にかけると目詰まりを起こして核酸の精製が不可能になる。処理時間は、室温では５分で十分であり、５分以内でも可能である。また、処理時間を６０分まで延長しても問題はない。また、本発明における細胞抽出液の調製に際しては、米国特許第５２３４８２４号のように血液を１０倍以上に希釈する必要はなく、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌのような粘度増強剤を添加する必要もない。更に本発明者等は、喀痰などの粘性の高い試料は８０℃〜１１０℃の温度範囲で加熱処理する、あるいは還元剤の存在下で処理すると、粘性が低下して不織布を通し易くなることを見出した。例えば、喀痰は加熱処理または還元剤処理しないと目詰まりを起こして不織布を通すことができない。加熱処理あるいは還元剤の処理により、喀痰等に含まれている粘性を示す原因となる蛋白質等が変性して、粘性が低下することで、不織布に目詰まりを起こさずに通すことができるようになる。加熱温度は、８０℃以上が好ましい。また、あまり高い温度は、核酸が分解する可能性があるので好ましくなく、１１０℃以下が好ましい。加熱時間は、試料内部まで加温されればよく、上記温度範囲で１分間以上であれば良く、好ましくは１分〜１５分である。還元剤としては、蛋白質を変成させるが、核酸に影響を与えない物質であれば良い。このような還元剤としては、チオール基を含む物質が好ましい。例えば、ジチオスレイトール、システイン、アセチルシステイン、βメルカプトエタノールなどが挙げられる。最適な還元剤処理の濃度や処理時間は、使用する還元剤の還元能力によって変化する。例えばジチオスレイトールの場合においては、濃度が１ｍＭ〜１０ｍＭ程度、処理時間が１分〜１０分程度が好ましい。さらに、加熱処理と還元剤処理は同時に行っても良い。
また、細胞の核酸が分解しない限りどのような方法で保存された試料を使っても本発明で核酸を調製することができる。例えば、細胞を含む試料は、採取または調製直後のものであっても凍結保存した試料であっても良い。血液の場合、新鮮血からも凍結保存血からも核酸を精製できる。
本発明の特徴の１つは、多孔質フィルターとして不織布を使用する点にある。不織布の利点は、米国特許第５２３４８２４号で開示されているフィルターの孔径が０．２から０．８μｍであるのに比較して、本発明で使用される不織布の平均孔径は大きいので大きな流速が得られて目詰まりしにくいことが挙げられる。これは、血液の溶解液のような粘度の高い試料から核酸を精製する場合、特に有利である。例えば、Ａ０４０Ｃ０１の平均孔径は１０μｍである。ここで、不織布の平均孔径とは水銀ポロシメーターによって測定した測定値（メディアン値）をいう。平均孔径は、フィルター要素を構成する繊維の絡み具合や空隙の大きさに関連している指標である。不織布では、繊維の方向が液の流れに垂直な平面方向に揃っており、かつ充填状態が均一で片流れが少ないために、大きな処理速度を維持しながら優れた核酸吸着能力を発揮したものと考えられた。目詰まりが問題となる場合には、繊維径や孔径が異なる不織布を組み合わせて用いることも考えられる。また、磁気ビーズと比較した場合の不織布の利点は、不織布ではフィルター濾過するだけで簡単にＤＮＡ溶液と接触させることが可能だ、という点である。磁気ビーズ法では、効率的にＤＮＡをビーズに接触させるためにできるだけサンプル容量を少なく抑える必要があり、通常は数μｌ〜数１０μｌに限られる。このため、目的とする細胞を遠心などの操作で濃縮する、などの措置を行う。
不織布は、例えばＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートのような親水性コート品もＡ０４０Ｃ０１のような未コート品も核酸精製に使用可能である。Ａ０４０Ｃ０１とＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートの精製ゲノムＤＮＡ吸着性能を比較すると、Ａ０４０Ｃ０１の方が高かった。ここでＡ０４０Ｃ０１とは、ＰＥＴを素材とした旭化成（株）製不織布である。Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートとは、ＨＭ―３（２―ヒドロキシエチルメタアクリレート（以下ＨＥＭＡと略称する）とＮ，Ｎ−ジメチルエチルメタアクリレート（以下ＤＭと略称する）からなる共重合体、ＨＥＭＡ：ＤＭ＝９７：３）をエタノールに溶解した溶液でＡ０４０Ｃ０１をコーティングしたもので、旭メディカル（株）Ｓｅｐａｃｅｌｌ登録商標のメインフィルターとして使用されている。また不織布は、８０℃〜１００℃の温度で表面コート剤などの成分が溶出しないもの、できるだけ目詰まりしにくいものが望ましい。また、不織布の白血球吸着能力と核酸吸着能力には相関関係がない。核酸吸着能力を示す不織布の中には、優れた白血球吸着能力を示すＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートやＡ０４０Ｃ０１があり、またほとんど白血球吸着能力を示さないＥ０５０７０のようなフィルターもある。このことは、本発明で使用可能なフィルターの特性と例えば国際公開ＷＯ００／２１９７３号で要求されるフィルターの特性は異なることを示している。
また本発明は、国際公開ＷＯ００／２１９７３号のような細胞を直接フィルターに捕捉してから溶解する方法に比較すると工程数が少なく、より簡便な方法になっている。例えば血液から核酸を精製する場合、フィルターに核酸を吸着させるまでに国際公開ＷＯ００／２１９７３号では、１）血液を流し、２）溶血液を流して赤血球を破壊し、３）細胞溶解液を流して白血球を破壊する、という３工程が必要になる。本発明では、血液と細胞溶解液を混合してフィルターにかけるだけである。
不織布に吸着された核酸は、特表２００１−５２０８９４号にあるように単にフィルターを水に漬けて１０〜３０℃で１〜２分放置するだけでは溶出しない。不織布に吸着された核酸は、水または低塩Ｂｕｆｆｅｒ中で４０℃〜１００℃の温度範囲、好ましくは８０℃から９５℃の温度範囲で加熱すると溶出される。すなわち、本発明ではＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ中で８０℃、６０分加熱するか、または９５℃で２０分加熱すると核酸が溶出することを見出した。更に、アルカリ処理して溶出する方法を見出したが、この方法を用いるとＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中で溶出するより短時間で吸着ＤＮＡを溶出することができ、極めて有用であった。加熱すると溶出速度は更に早まり、９５℃では５分で溶出された。アルカリ処理すると二本鎖ＤＮＡが一本鎖に変性することはよく知られているので、このような変性によりフィルターに吸着された核酸が溶出しやすくなったと考えられる。また、１．２Ｎ  ＮａＯＨで９０℃  １０分処理すると核酸中のアデニンとシトシン、特にアデニンがより選択的に修飾されることが報告されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６５、ｐ５３７（１９８０））。本発明のアルカリ処理は０．２Ｎ以下のＮａＯＨを使用しているので、上記のような塩基修飾が起こっている可能性は低いと考えられる。実際、アルカリ溶出した核酸はＰＣＲ反応のテンプレートとして使用可能であったし、ハイブリダイゼーションに使用するプローブをアルカリ溶出と同一の条件で処理しても、ハイブリダイゼーションは可能であった。
アルカリ溶出の特徴は溶出核酸の分子量が大きいことである。ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９５℃  ２０分間加熱して溶出すると、核酸は数ｋｂから数１０ｋｂの断片として回収されるが、アルカリ中で９５℃５分間加熱して溶出する場合には数１００ｋｂ以上の断片もあった。サイズの大きなゲノムＤＮＡを調製したい場合には、アルカリ溶出は極めて有用である。また本アルカリ溶出法は、本発明で調製された核酸吸着フィルター、例えば国際公開ＷＯ００／２１９７３号、米国特許第５１８７０８３号、米国特許第５２３４８２４号などで開示された方法によって作製された核酸吸着フィルターから核酸を溶出する場合にも有効である。
更に本発明者らは、酸性条件下での溶出を検討した。その結果、ｐＨ３からｐＨ５の範囲、より好ましくはｐＨ４からｐＨ５の範囲の酸性溶液中で、７０℃から１００℃の温度範囲で加熱すると核酸の溶出が促進されることを見出した。例えば、９５℃では１０分で核酸がフィルターから溶出され、更にこの核酸はＰＣＲのテンプレートとして使用可能であった。しかし、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで溶出した場合と比較するとＰＣＲによる増幅が起こりにくかったことから、酸溶出した核酸は何らかの損傷を受けている可能性がある。実際、ＤＮＡのデオキシリボースとピリミジン塩基とのグリコシド結合は酸性で安定であるが、プリン塩基とのグリコシド結合は酸性で加水分解されていわゆるアプリン酸を生ずることはよく知られている。この反応は塩基特異的な化学分解法として、ＤＮＡ塩基配列決定法であるマクサムーギルバート法で使用されており、この場合ｐＨ２．０に合わせた０．１Ｍ  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  ｆｏｒｍａｔｅで２０℃  ６０分間処理する（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６５、ｐ５３５（１９８０））。本発明で記述されている条件はｐＨ３からｐＨ５の範囲であるが、このような塩基損傷が起こっている可能性がある。
アルカリ溶出では、溶出後にｐＨを中性に戻すという操作が必要であった。本発明者らはそのような後処理が不要な方法として界面活性剤の存在下で溶出する方法を見出した。不織布に吸着された核酸は水または低塩条件下で加熱すると溶出されるが、そこに界面活性剤を添加すると核酸溶出は更に促進される。ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで溶出する場合と比較すると、界面活性剤は溶出温度を下げ、溶出時間を短縮する効果があった。界面活性剤の中でも非イオン性界面活性剤や両性界面活性剤は１％ぐらいの濃度ではＰＣＲやハイブリダイゼーションを阻害しないので、溶出核酸はそのまま使用することができ溶出剤として極めて有用であった。
更に本発明者らは、溶出時の温度制御が不要で、かつ短時間に溶出する方法も見出した。不織布に吸着された核酸を活性酸素処理して溶出させた場合、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中での溶出やアルカリによる溶出より簡便で短時間に吸着ＤＮＡを溶出することができ、極めて有用であった。活性酸素により核酸残基のリン酸エステル結合が切断されて核酸の断片化が起こることはよく知られており、フィルターに吸着した核酸が断片化されてフィルターから容易に溶出されたと考えられる。金属イオンを添加した過酸化水素を用いた場合、金属イオンを添加しない場合と比較すると、添加時のほうがフィルターに吸着したゲノムを短時間に断片化し、溶出させることが出来た。また、過酸化水素水の濃度を高めるとゲノムＤＮＡの断片化に要する時間が短縮されて溶出に必要な時間が短縮した。
活性酸素を核酸に作用させた場合、核酸残基のリン酸エステル結合が切断されるだけでなく、特に核酸の塩基部分への損傷が生じることも知られているが、活性酸素処理を短時間で行う、あるいは、溶出した核酸溶液から活性酸素を迅速に取り除くことで核酸に対する損傷を最小限に抑えることができる。活性酸素を取り除く方法として、例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＴＭ（Ｍａｒｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）等の核酸精製カラムを使って核酸溶出液中の活性酸素を除く方法、限外濾過膜を使って核酸だけを精製して濃縮する方法、また、一般にエタノール沈殿法と呼ばれる塩の存在化で適量のアルコールを添加して核酸を沈殿させて核酸を精製させる方法がある。金属イオンの存在化で活性酸素を産生させたい場合には、金属イオンを含む活性酸素反応液に金属イオンのキレート剤を添加することで活性酸素の発生を止める方法もある。また、一般的にラジカルスカベンジャーと呼ばれる活性酸素消去剤を添加して活性酸素による核酸の切断と損傷を抑えることも可能である。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、スーパーオキシドを消去する事が知られており、アスコルビン酸やグルタチオンはヒドロキシラジカル、スーパーオキシドを消去する事がよく知られている。実際、活性酸素処理にて溶出したゲノムＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＴＭカラムにて精製し、ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用することも可能であったし、ハイブリダイゼーションに使用するプローブを活性酸素溶出と同一の条件で処理しても、ハイブリダイゼーションは可能であった。
更により直接的な方法で、不織布から溶出したゲノムＤＮＡがハイブリダイゼーションのターゲットとして、あるいはプローブとして使用可能であることを示した。すなわち、標品ゲノムＤＮＡをビオチン標識して不織布から溶出したゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせる、あるいは不織布から溶出したゲノムＤＮＡをビオチン標識して標品ゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせた。その結果、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒまたはアルカリ溶液中での加熱溶出、あるいは活性酸素による溶出のいずれの場合も、ターゲットとしてもプローブとしても使用可能であることが実証された。
更に本発明の特徴の１つは、核酸を溶出することなく核酸を吸着した不織布を直接用いてＰＣＲなどの核酸増幅反応や塩基配列検出を行うことができる点にある。すなわち、核酸の抽出・精製から核酸増幅あるいは核酸の抽出・精製から塩基配列検出まで同一フィルター上で実施できる。このことにより、核酸の抽出から検査に至る全工程が著しく単純化され、更に溶出操作が不要なため処理時間も著しく短縮された。また不織布をアレイ状に配置すれば、あるいは同一の不織布上にアレイ状に核酸をスポットすれば、多項目検出が簡単に行える。本発明の使用としては核酸の抽出・精製から核酸増幅まで本発明で行った後、標的塩基配列を電気泳動やＤＮＡマイクロアレイ、あるいは質量分析計を用いる検査法で解析することも可能である。
本発明の不織布に吸着された核酸は遊離しにくいことが特徴であり、このことが特別の固定操作なしで不織布上でプローブをハイブリダイズさせる、あるいは不織布上で核酸伸長反応を起こすことを可能にした。走査電顕で解析すると、繊維状の核酸が不織布の繊維表面上に吸着していることがわかる。電顕で観察される繊維状の核酸の分子量は巨大で、このような長い核酸は多数の点で不織布繊維と相互作用しているので非常に遊離しにくいと考えられる。本発明の核酸吸着フィルターは、溶液中にＭｇ２＋やＮａＣｌなどの塩が含まれると、加熱しても核酸を遊離しにくいという特性を持つ。そのため、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にする通常の熱変性やアルカリ変性条件下でも核酸はフィルターに吸着したままで、従ってＵＶ照射など特別な固定化操作を行わなくてもハイブリダイゼーションが可能となった。一方、核酸増幅反応では、例えばＰＣＲ反応液中にゲノムＤＮＡを吸着した不織布の小片を加えてゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行うと、ＰＣＲ増幅産物は溶液中に回収される。
更に本発明の大きな特徴の１つは、吸着された核酸を鋳型にしたＤＮＡ伸長反応が不織布上で起こるという点にある。上記のようなＰＣＲ増幅産物と異なり、ＤＮＡ伸長鎖は溶液中に遊離せず不織布に吸着したままである。このことを利用して感度の良い検出系を組むことができる。核酸伸長反応を行う際にＤＮＡポリメラーゼの基質となる標識ヌクレオチドを加えれば、標識ヌクレオチドが新規合成ＤＮＡに取り込まれて伸長反応を検出できる。標識ヌクレオチドとしては、例えば蛍光標識ヌクレオチドやＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）標識ヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）などが使用可能である。ＤＩＧシステムの場合、よく知られているように標識抗ＤＩＧ抗体と組み合わせて蛍光、発光、発色による検出が可能である。標識ヌクレオチドの代わりに、ＤＮＡ合成時に生成するピロリン酸を検出しても良い。ピロリン酸は、例えばＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法と同様な反応で、ＡＴＰに変換してルシフェリン−ルシフェラーゼの系で発光させたり、ピロリン酸マグネシウムを形成して白濁させて検出できる。
本発明では不織布に吸着された核酸を直接標識することも可能である。溶液状態の核酸を標識する場合と比較すると、不織布上では未反応の標識試薬を洗浄で簡単に除去できるという利点がある。不織布上で標識された核酸は本発明で記述されている方法で簡単に溶出されるので、これを用いてハイブリダイゼーションなどの検出反応を行うことができる。
本発明の不織布は単位面積当たり多数の細胞あるいは大容量のサンプルを処理できるので、容易に単位面積当たりの核酸固定量（核酸密度）を増加することができる。検査対象となる核酸の量が多くなれば検出も容易になるので、感染症診断のように感度が要求される場合、または核酸増幅が好ましくないような検査でサンプルの入手が比較的容易な場合は、本法は特に有用である。
実施例
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
［実施例１］不織布によるヒト新鮮血からの核酸精製
血液は健常人から採血し、抗凝固剤としてヘパリンナトリウム（清水製薬）を血液１ｍｌあたり１０単位添加した。血液中の白血球数は、ＬｅｕｃｏＣＯＵＮＴ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。血液０．２５ｍｌ中の白血球数は、１．１６ｘ１０６個であった。不織布は旭化成（株）の製品を使用した。不織布を直径１２ｍｍの円盤状に切断して、それを４枚重ねてフィルターホルダー（ＳＷＩＮＮＥＸ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にセットし、フィルターホルダーの上流には１０ｍｌの注射筒、下流には吸引ポンプを設置してフィルターホルダーに接続した。最初に３ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；２５ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５％  ＳＤＳ）で不織布を洗浄した。
次に、０．２５ｍｌのヒト血液にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を０．０５μｇ加えて、更に２ｘ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  ＳＤＳ）を０．２５ｍｌ加えて、室温で５分放置した。この処理で赤血球、白血球は完全に破壊された。この血液抽出液を不織布にかけて直ちに吸引濾過した。それから、吸引しながら８ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを流してフィルターを洗浄した。
次に、３ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、最後に３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を流して不織布を洗浄した。それから、不織布４枚をフィルターホルダーから取り外して、ロック付きのエッペンドルフチューブに入れ、０．５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。これを８０℃で１時間保温した後、溶出液のＡ２６０（２６０ｎｍの吸光度）とＡ２８０（２８０ｎｍの吸光度）をＵＶ−１６００  ＵＶ−可視光スペクトロフォトメーター（島津）で測定した。溶出液のＡ２６０／Ａ２８０が１．８−２．０の範囲にあれば、ほぼ純粋な核酸と考えられる。表１は、Ａ２６０／Ａ２８０が１．８−２．０の範囲にあった不織布をリストアップしたものである。ＤＮＡ濃度は、次の式により算出した（ＵＶ１６００の付属ソフト  ＤＮＡ／蛋白質ＰＲＯＧＲＡＭ  ＰＡＣＫ  Ｖｅｒ２．００）。
ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）＝Ｋ１＊Ａ２６０―Ｋ２＊Ａ２８０
ここで、Ｋ１＝６２．９０    Ｋ２＝３６．００
2003006650.tif 000002
［実施例２］  ヒト精製核酸の解析
実施例１で得られた精製核酸を０．７％  アガロース電気泳動にかけて、そのサイズを確認した。実施例１の溶出液１０μｌに１０ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＳＤＳ；５０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ；０．０５％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ、ＴａＫａＲａ）１．５μｌを加えてよく混和し、全量を０．７％  アガロース電気泳動にかけた。Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（Ａｄｖａｎｃｅ）で５０Ｖ、９０分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。図１に示す通り、精製核酸は数ｋｂ−数１０ｋｂに及ぶいろいろなサイズの核酸断片を含んでいた。
次に、実施例１で得られた精製ＤＮＡがＰＣＲの鋳型と成り得るかを確認した。プライマーには、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ）０．４５ｋｂ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｍｐｌｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（カタログ番号  ５４０５−３）を使用した。実施例１の溶出液を蒸留水で１０倍に希釈して、その５μｌをＰＣＲ反応液（最終濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ８．３；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ；１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｇ３ＰＤＨ  ３’−ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μＭ；Ｇ３ＰＤＨ  ５’−ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μＭ）に加えて５０μｌとした。
これをＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９４℃  ５分  １  ｃｙｃｌｅ；９４℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  １．５分、  ３０  ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ７分  反応させた。ＰＣＲ終了後、反応液１０μｌに１０ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１．５μｌ加えてよく混和し、全量を２％  アガロース電気泳動にかけた。５０Ｖ、４５分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。結果を図２に示す。すべての精製ＤＮＡ画分から４５２ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されており、ＰＣＲの鋳型として使用可能であることが示された。
［実施例３］大腸菌核酸の精製
Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コート（旭化成）を直径１２ｍｍの円盤状に切断して、それを４枚重ねてフィルターホルダー（ＳＷＩＮＮＥＸ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にセットし、フィルターホルダーの上流には１０ｍｌの注射筒、下流には吸引ポンプを設置した。最初に３ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；２５ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５％  ＳＤＳ）で不織布を洗浄した。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５のグリセロールストック５０μｌを３ｍｌのＬＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ）  １ｇ；  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ）  ０．５ｇ；  ＮａＣｌ  １ｇ；  １Ｎ  ＮａＯＨ  ２００μｌ；  蒸留水  １００ｍｌ）に加えて、３７℃  ４．５時間培養して、Ａ６００＝１．５６の培養液を得た。吸光度からＥ．ｃｏｌｉ濃度は約６．２ｘ１０９個／ｍｌと考えられた。この培養液を１．６ｍｌ（Ｅ．ｃｏｌｉ  １０１０個）取って１５，０００ｒｐｍで１分間遠心した。菌の沈殿を０．２５ｍｌのＬＢ培地に懸濁した。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を０．０５μｇ／２．６μｌ加えて、更に２ｘ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  ＳＤＳ）を０．２５ｍｌ加えて、室温で５分放置した。この抽出液を上記で準備したＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートにかけて直ちに吸引濾過した。その後、吸引しながら８ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを流してフィルターを洗浄した。
次に、３ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、最後に３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を流してＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートを洗浄した。それから、４枚のＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートをフィルターホルダーから取り外して、ロック付きのエッペンドルフチューブに入れ、０．５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。これを８０℃で１時間保温した後、溶出液の吸光度を測定した。Ａ２６０／Ａ２８０＝１．８４の精製核酸を６４．１μｇ取得した。
［実施例４］大腸菌核酸の解析
実施例３で得られた精製核酸を０．７％  アガロース電気泳動にかけて、そのサイズを確認した。実施例３の溶出液１０μｌに１０ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＳＤＳ；５０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ；０．０５％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ、ＴａＫａＲａ）１．５μｌを加えてよく混和し、全量を０．７％  アガロース電気泳動にかけた。Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（Ａｄｖａｎｃｅ）で５０Ｖ、９０分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。図３に示す通り、精製核酸は数１００ｂｐから数１０ｋｂの核酸断片を含んでいた。
次に、実施例３で得られた精製ＤＮＡがＰＣＲの鋳型と成り得るかを確認した。ＰＣＲのプライマーには、大腸菌のリボソーム蛋白質Ｌ２５をコードする遺伝子ｒｐｌＹの塩基配列３９３番目のｃから４１３番目のａまでの配列（配列番号１）と塩基配列５６７番目のｃから５８７番目のａまでの相補鎖の配列（配列番号２）を使用し、Ｓｉｇｍａ社に依頼して化学的に合成した。ＰＣＲ増幅産物の長さは１９５ｂｐであった。実施例３の溶出液を蒸留水で４０００倍に希釈して、その１０μｌをＰＣＲ反応液に加えて２５μｌとした（最終濃度  ６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／  １５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４  ｐＨ１０．０；５０ｍＭ  ＫＣｌ；３．５ｍＭ  ＭｇＣＬ２；０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ；１．２５Ｕ  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）；ｐｒｉｍｅｒ  各０．５μＭ）。
これをＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９４℃  ２分  １  ｃｙｃｌｅ；９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  １分、３０  ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ７分  反応させた。ＰＣＲ終了後、反応液１０μｌに１０ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１．５μｌ加えてよく混和し、全量を３％  ＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロース（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）電気泳動にかけた。Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（Ａｄｖａｎｃｅ）で１００Ｖ、４０分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。結果を図４に示す。１９５ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されており、ＰＣＲの鋳型として使用可能であることが確認された。
［実施例５］ヒト凍結保存血からの核酸精製
血液は健常人から採血し、抗凝固剤としてヘパリンナトリウム（清水製薬）を血液１ｍｌあたり１０単位添加した。血液中の白血球数は、ＬｅｕｃｏＣＯＵＮＴ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。血液０．２５ｍｌ中の白血球数は、１．１６ｘ１０６個であった。
０．２５ｍｌの血液をエッペンドルフチューブに入れて−８０℃で凍結した。０．２５ｍｌの凍結保存血に、３７℃に加温した２ｘ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  ＳＤＳ）を０．２５ｍｌ加え、更にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を０．０５μｇ加えて、これを３７℃の水浴で時々加温しながらｖｏｒｔｅｘで撹拌して完全に溶解した。室温で５分放置後、この血液抽出液を不織布にかけて直ちに吸引濾過した。以下、実施例１で記述した方法に従って核酸を調製した。対照として、新鮮血を同様に処理した。結果を表２に示す。凍結保存血からも新鮮血と同じように精製核酸が得られた。
2003006650.tif 000003
［実施例６］不織布に対するゲノムＤＮＡの吸着
６．２０ｘ１０７のヒト末梢血白血球に６２０μｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；２５ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５％  ＳＤＳ）とＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（終濃度  ０．１ｍｇ／ｍｌ、ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を加えて白血球を懸濁した。５０℃で１２時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝２５：２４：１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を加えて完全に混和して１７００ｘｇ、１０分間遠心した。上清を取って、更に同じ操作を２回繰り返した。その上清を透析チューブに移して、４℃で１００容のＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して３回透析した。Ａ２６０／Ａ２８０＝１．７６のゲノムＤＮＡが５３１μｇ得られた。
不織布Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートを直径１２ｍｍの円盤状に切断して、それを４枚重ねてフィルターホルダー（ＳＷＩＮＮＥＸ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にセットした。フィルターホルダーの上流には１０ｍｌの注射筒をセットし、テルフュージョンシリンジポンプＴＥ−３１１（テルモ）で３ｍｌのＰＢＳを流速２６．２ｍｌ／ｈｒで流して不織布を洗浄した。次に、２６．３μｇのゲノムＤＮＡを１ｍｌのＰＢＳに溶かしてＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートで濾過した。その後、３ｍｌのＰＢＳで不織布を洗浄した。濾液はすべて回収した。最後に不織布をフィルターホルダーから取り外して、ロック付きのエッペンドルフチューブに入れ、０．５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。これを８０℃で１時間保温した後、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを回収した。すべての濾液と溶出液の容量と吸光度を測定し、ＤＮＡの回収率を計算した結果を表３に示す。Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートに２６．３μｇのＤＮＡをかけたところ、約６５％のＤＮＡが吸着されて５１％のＤＮＡ（１３．５μｇ）が回収された。なお、ＤＮＡ回収率は次式で計算した。
回収率（％）＝１００＊回収ＤＮＡ（μｇ）／２６．３（μｇ）
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［実施例７］血液の溶解条件
実施例１と同様の条件で実験を行い、血液の処理時間、処理温度、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの有無を検討した。不織布にはＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートを使用した。血液０．２５ｍｌにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、２ｘ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを加えてから、室温または５０℃で、５分〜６０分処理してからＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートで核酸を精製した。結果を図５に示す。ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫなしで５０℃５分〜１５分処理すると、血液抽出液が目詰まりして不織布を通過できなくなり核酸を回収できなかった。また、室温で５分〜６０分処理の範囲では、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ添加または無添加どちらの系でも核酸を精製できた。
［実施例８］白血球吸着能と核酸吸着能
不織布は、Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コート、Ａ０４０Ｃ０１、Ｎ０５０７０、Ｅ０５０７０を用いた。不織布を直径１２ｍｍの円盤状に切断して、それを４枚重ねてフィルターホルダー（ＳＷＩＮＮＥＸ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にセットした。フィルターホルダーの上流は１０ｍｌの注射筒に繋ぎ、注射筒はテルフュージョンシリンジポンプＴＥ−３１１（テルモ）にセットした。不織布は３ｍｌのＥｔＯＨ、次に３ｍｌのＰＢＳを流して前処理した。流速はシリンジポンプで２６．２ｍｌ／ｈｒに設定した。前処理した不織布に血液１ｍｌを流し、次に６ｍｌのＰＢＳで洗浄した。最後に不織布に空気を通して、洗浄液をすべて押し出した。素通りした血液と洗浄液はすべて回収して（合わせて濾液とした）、容量と白血球数を測定した。不織布にかける前の血液と濾液中の白血球数は、ＬｅｕｃｏＣＯＵＮＴ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。白血球吸着率は次の式で算出した。
白血球吸着率（％）＝１００＊（血液１ｍｌの白血球数−濾液の白血球数）／（血液１ｍｌの白血球数）
上記で求めた白血球吸着率と表１のＤＮＡ回収量をプロットしたのが図６である。不織布の白血球吸着能力（白血球除去能力）と核酸吸着能力に相関関係は認められなかった。
［実施例９］アルカリ条件下での核酸溶出
実施例５と同様な条件で実験を行い、アルカリ条件下での核酸溶出を検討した。不織布は旭化成（株）の製品Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートを使用した。０．２５ｍｌの凍結保存血を実施例５の手順で不織布にかけて、最後に３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを流して不織布を洗浄した後、不織布４枚をフィルターホルダーから取り外して、ロック付きのエッペンドルフチューブに入れ、０．５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、または０．２Ｎ  ＮａＯＨを加えて不織布を浸して、ヒートブロックで９５℃  ５分から２０分保温した。反応終了後、３Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４を０．２Ｎ  ＮａＯＨに対して１／１０容（５０μｌ）、０．０５Ｎ  ＮａＯＨに対して１／４０容（１２．５μｌ）加えて中和した。
溶出したＤＮＡの量は、ＯｌｉＧｒｅｅｎ登録商標  ｓｓＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社  商品番号０−１１４９２）を用いて測定した。キット付属の１８残基オリゴヌクレオチドを標準として、Ｅｘ  ４８５ｎｍ、Ｅｍ  ５３５ｎｍで蛍光プレートリーダー  ＡＲＶＯｓｘ−３（ワラックベルトールドジャパン（株））で定量した。不織布からの溶出液をＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈し、更にＲＮＡを除くために、ＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＲＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社  商品番号１１１９９１５）を終濃度２．５μｇ／ｍｌになるように加えて３７℃  ３０分反応させた。この処理でＲＮＡは分解されて、ＯｌｉＧｒｅｅｎの測定系ではほとんど検出できなくなる。このことは、１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡ標品を用いて確認された。
測定結果を図７に示す。ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中９５℃で溶出すると、ＤＮＡ量は２０分まで反応時間の経過と共に増加するが（図７）、その後、溶出ＤＮＡ量はプラトーに達した。一方、同じ量のＤＮＡが、０．０５Ｎまたは０．２Ｎ  ＮａＯＨのアルカリ溶液中では９５℃  ５分で溶出可能であった。
この精製ＤＮＡ１０μｌを０．７％  アガロース電気泳動にかけて、そのサイズを確認した。図８に示した通り、アルカリ条件下で溶出したＤＮＡのサイズは、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで溶出したＤＮＡより大きい傾向にあった。９５℃で５分、１０分、２０分と反応時間が長くなるにつれて溶出ＤＮＡのサイズは減少した。０．０５Ｎ  ＮａＯＨで溶出した方が０．２Ｎ  ＮａＯＨで溶出した場合よりＤＮＡサイズは大きく、いずれの場合もＤＮＡサイズは数ｋｂから数１００ｋｂ以上に及んだ。
次に、アルカリ条件下で溶出した精製ＤＮＡがＰＣＲの鋳型と成り得るかを確認した。ＰＣＲとその解析は、実施例２と同様に行った。すなわち、プライマーには、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ）０．４５ｋｂ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｍｐｌｉｍｅｒ  Ｓｅｔを使用した。結果を図９に示す。アルカリ条件下で溶出した精製ＤＮＡからも４５２ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されており、ＰＣＲの鋳型として使用可能であることが示された。
［実施例１０］アルカリ溶出に対する温度の影響
実施例９と同様な方法で、血液由来の核酸を吸着した不織布Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートを作製し、溶出温度の影響を調べた。溶出は、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで９５℃  ２０分；  ０．０５Ｎ  ＮａＯＨで９５℃または７０℃  １０分；０．２Ｎ  ＮａＯＨで９５℃、７０℃、６０℃、５０℃または４０℃  １０分で行い、溶出したＤＮＡ量を比較した。ＤＮＡ量は、実施例９と同様にＯｌｉＧｒｅｅｎ登録商標  ｓｓＤＮＡ定量キットで測定した。図１０に  示した通り、ＤＮＡの溶出量は温度が高くなるに従って増加し、特に７０℃以上で顕著であった。
［比較例１］酸性条件下でのＤＮＡ溶出
実施例９と同様な方法で、血液由来の核酸を吸着した不織布Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートを作製した。溶出は、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで９５℃  １０分、２０分、または１０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９５℃  １０分行った。溶出後、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を溶出液に加えて中和した。次に、溶出液のＡ２６０（２６０ｎｍの吸光度）とＡ２８０（２８０ｎｍの吸光度）をＵＶ−１６００  ＵＶ―可視光スペクトロフォトメーター（島津）で測定し、溶出核酸量を算出した。結果を表４に示す。ＤＮＡ濃度は、次の式により算出した（ＵＶ１６００の付属ソフト  ＤＮＡ／蛋白質  ＰＲＯＧＲＡＭ  ＰＡＣＫ  Ｖｅｒ２．００）。
ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）＝Ｋ１＊Ａ２６０―Ｋ２＊Ａ２８０
ここで、Ｋ１＝６２．９０    Ｋ２＝３６．００
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この溶出ＤＮＡを実施例９と同様な方法で０．７％  アガロース電気泳動にかけて、そのサイズを確認した。結果を図１１に示す。ｐＨ４．５  ９５℃  １０分で溶出した核酸のサイズは数ｋｂから数１０ｋｂに及んでいた。次に、酸性条件下で溶出した精製ＤＮＡがＰＣＲの鋳型と成り得るかを確認した。これも実施例９と同様な方法で行い、酸性条件下で溶出したＤＮＡもＰＣＲが可能であることを見出した（図１２）。
［参考例１］アルカリ溶出のＤＮＡプローブへの影響
不織布からアルカリ溶出されたＤＮＡがハイブリダイゼーションに使用可能かどうかを評価するために、アルカリ溶出と同じ条件下においたｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ＤＩＧ）標識ＤＮＡを用いてハイブリダイゼーション実験を行った。ＤＮＡのＤＩＧ標識はＲｏｃｈｅ社ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＫｉｔとＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘを使い、ハイブリダイゼーションの検出にはＲｏｃｈｅ社のＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットを用いた。１ｎｇ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）、日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した配列番号３のＤＮＡプライマー（最終濃度０．４μＭ）と配列番号４のＤＮＡプライマー（最終濃度０．４μＭ）を含むＰＣＲ反応液（最終濃度１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＰＣＲバッファー；０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．１９ｍＭ  ｄＴＴＰ；０．０１ｍＭ  ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ；２．６Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＡｍｐｌｉＴａｑ）５０μｌを調製して、これをＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９４℃  ３分  １  ｃｙｃｌｅ；９４℃  ３０秒、６０℃  １分、７２℃  ３分、  ３０  ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ５分  反応させた。標識されたＤＮＡをＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムにて精製し、５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。これに最終濃度が０．０５Ｎ、または０．２ＮとなるようにＮａＯＨを加えて、ヒートブロックで９５℃  ５分から２０分保温し、アルカリ溶出と同じ条件下においた。保温終了後、３Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４を０．２Ｎ  ＮａＯＨに対して１／１０容、０．０５Ｎ  ＮａＯＨに対して１／４０容加えて中和した。このＤＮＡ溶液を再度ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムにて精製を行い、５０μｌのハイブリダイゼーション用のＤＩＧ標識ＤＮＡプローブを得た。０．０１ｎｇから１０μｇのＬａｍｂｄａ  ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にブロットし、アルカリ変性を行って一本鎖にした後、ＵＶクロスリンクにて膜上に固定化した。これをＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ）液中に浸し４２℃にて３時間プレハイブリダイゼーションを行った後、熱変性にて一本鎖にした先のＤＩＧ標識ＤＮＡプローブを添加し４２℃にて１８時間保温させてハイブリダイゼーションを行った。これを２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを使って室温５分間の洗浄を２回行った後、０．１ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを使って６８℃１５分間洗浄の洗浄を２回行った。次に洗浄バッファー（最終濃度０．１Ｍ  マレイン酸；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；０．３％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｐＨ７．５）にて１分間平衡化を行った後、マレイン酸バッファー（最終濃度０．１Ｍ  マレイン酸；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）で１０倍希釈したブロッキング溶液（Ｒｏｃｈｅ）に１時間浸した。これに３μｌのアルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ）を添加し室温にて３０分間おいた。洗浄バッファーを用いて室温にて１５分間の洗浄を２回行い、次にアルカリフォスファターゼバッファー（最終濃度０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．５；０．１Ｍ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）にて２分間平衡化を行い、これに１／１００容のＣＳＰＤ  ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を添加して２０分間３７℃にて保温した後。これをＨｙｐｅｒ  ＥＣＬフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に３０分間感光させ、現像機（Ｋｏｎｉｃａ）にて現像を行った。この結果、アルカリ溶液で処理したＤＮＡプローブは、アルカリ溶液で処理していないＤＮＡプローブとほぼ同じ強度のシグナルを検出することが出来た（図１３）。以上の結果は、実施例９に示したアルカリ条件下で溶出させたＤＮＡはハイブリダイゼーションに使用可能であることを示唆している。
［実施例１１］過酸化水素水による核酸溶出
実施例５と同様な条件で実験を行い、過酸化水素水による核酸溶出を検討した。不織布は旭化成（株）の製品Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートを使用した。０．２５ｍｌの凍結保存血を実施例５の手順で不織布にかけて、３ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍｌの精製水を流して不織布を洗浄した後、そこに３％の過酸化水素水と０．１ｍＭのＣｕＣｌ２からなる活性酸素液１ｍｌを添加してシリンジをゆっくり押し液を不織布全体に浸らせた。室温に１、２、３、５分間室温に置いた後、シリンジを押しラジカル液を全て押し出し、さらに１ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで不織布に吸着した核酸を溶出させた。核酸はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）にて速やかに精製し、溶出液中に含まれる過酸化水素と金属イオンを除いた。
精製した核酸量は、ＯＤ２６０ｎｍを測定して定量を行った。また、この精製核酸を０．７％  アガロース電気泳動にかけて、その断片化の程度を確認した。その結果を図１４に示す。短時間の過酸化水素処理にてフィルターに吸着した核酸が溶出される事が示された。
次に、このラジカル液で溶出し精製したゲノムＤＮＡがＰＣＲの鋳型と成り得るかを確認した。ＰＣＲとその解析は、実施例２と同様に行った。すなわち、プライマーには、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ）０．４５ｋｂ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｍｐｌｉｍｅｒ  Ｓｅｔを使用した。結果を図１５に示す。過酸化水素にて溶出した精製ゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲによる核酸増幅が可能である事が示された。
［実施例１２］還元糖と金属イオンによる核酸溶出
実施例１１と同様の方法にて、ヒトの核酸を吸着させたＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートの不織布を用意した。これをカラムフォルダーから取り出し、２４穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ）に移し、ラジカル液として１００ｍＭ  Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＳＩＧＭＡ）と０．１ｍＭ  ＣｕＣｌ２を各々２５０μｌづつ添加し、攪拌しながら５０℃に置いた。１、３、５、１０、３０分後に、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを５０μｌ添加して、活性酸素の発生を止めた。このうちの１０μｌを０．７％のアガロースゲル電気泳動にかけた。５０Ｖ、４５分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。その結果を図１６に示す。二価の金属イオンを添加した還元糖にて発生させた活性酸素によって、フィルターに吸着した核酸が溶出される事が示された。
次に、このラジカル液で溶出し精製したゲノムＤＮＡがＰＣＲの鋳型と成り得るかを、実施例１１と同じ方法にて確認した。その結果を図１７に示す。二価の金属イオンを添加した還元糖にて発生させた活性酸素によってフィルターから溶出したヒトゲノム精製ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲによる核酸増幅は、短時間の活性酸素反応において可能である事が示された。
［実施例１３］制限酵素による核酸溶出
実施例１１と同様の方法にて、ヒトの核酸を吸着させたＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートの不織布を用意した。これをカラムフォルダーから取り出し、２４穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ）に移し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Ｔａｋａｒａ）２．５μｌを含む酵素溶液５０μｌを添加し、室温あるいは３７℃にて５、１０、３０分間置いた。このうちの５０μｌをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムにて精製し５０μｌの溶出ゲノム溶液を得た。これらのうちの１０μｌを０．７％のアガロースゲル電気泳動にかけた。５０Ｖ、４５分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。その結果を図１８に示す。制限酵素によってフィルターに吸着したゲノムＤＮＡが切断されて溶出される事が示された。
［参考例２］活性酸素溶出のＤＮＡプローブへの影響
不織布から活性酸素にて断片化し溶出させたゲノムＤＮＡが、ハイブリダイゼーションに使用可能かどうかを参考例１と同様な方法で確認した。Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ＤＩＧ）標識ＤＮＡを使ったハイブリダイゼーション実験にて確認した。ＤＮＡのＤＩＧ標識はＲｏｃｈｅ社ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＫｉｔとＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘを使い、ハイブリダイゼーションと検出にはＲｏｃｈｅ社のＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットを用いた。１ｎｇ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）と配列番号３と４記載のＤＮＡプライマー（最終濃度各０．４μＭ）を含むＰＣＲ反応液５０μｌを調製して、これをＤＮＡ  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９４℃  ３分  １  ｃｙｃｌｅ；９４℃  ３０秒、６０℃  １分、７２℃  ３分、  ３０  ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ５分  反応させた。標識されたＤＮＡをＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムにて精製し、５０μｌのＤＩＧ標識ＤＮＡプローブ水溶液を得た。このＤＩＧ標識ＤＮＡプローブに１００ｍＭ  Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ  ５−ｐｈｏｐｈａｔｅと０．０５ｍＭ  ＣｕＣｌ２からなる活性酸素液５０μｌを添加し、５０℃にて２、１０分間おいた。これをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムにて再度精製し、溶液中の活性酸素を取り除き活性酸素処理済みＤＩＧ標識ＤＮＡプローブとした。以下、参考例１と同様に行った。その結果を図１９に示す。活性酸素処理したＤＩＧ標識ＤＮＡプローブにおいても、膜上に固定化したＤＮＡとハイブリダイゼーションが可能であることが示された。
［実施例１４］不織布に吸着されたヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ
０．２５ｍｌの凍結保存血（白血球数  １．１５ｘ１０６個）を実施例１１と同様の方法で処理して、ヒトの核酸を吸着させたＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コート、Ａ０４０Ｃ０１、Ｐ０２０Ａ（ＥＬ）、Ｐ０９０Ｄ、Ｅ０５０７０、Ｎ０５０７０の不織布を用意した。３ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、最後に３ｍｌの精製水を流して不織布を洗浄した後、不織布４枚をフィルターホルダーから取り外して、一番上流（入り口）側の不織布の中央部を３ｍｍ  ｘ  ３ｍｍの長方形に切って、０．５ｍｌのＰＣＲ用チューブの底に入れた。
ＰＣＲのシステムとしては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ）０．４５ｋｂ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｍｐｌｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（カタログ番号  ５４０５−３）を使用した。ＰＣＲ用チューブに不織布の切片を入れて、以下実施例２と同様にＰＣＲ反応液５０μｌを加え、これをＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９４℃  ５分、１  ｃｙｃｌｅ；９４℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  １．５分、３０  ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ７分  反応させた。ＰＣＲ終了後、反応液１０μｌに１０ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１．５μｌ加えてよく混和し、全量を２％  アガロース電気泳動にかけた。５０Ｖ、４５分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。結果を図２０に示す。核酸を吸着したすべての不織布から４５２ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されており、不織布に吸着されたヒトゲノムＤＮＡがＰＣＲの鋳型として使用可能であることが示された。
［実施例１５］不織布に吸着された大腸菌ゲノムＤＮＡのＰＣＲ
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５のグリセロールストック５０μｌを３ｍｌのＬＢ培地に加えて、３７℃  ３．５時間培養して、Ａ６００＝０．９の培養液を得た。吸光度からＥ．ｃｏｌｉ濃度は約３．６ｘ１０９個／ｍｌと考えられた。この培養液を１．４ｍｌ取って１５，０００ｒｐｍで１分間遠心した。菌の沈殿を０．２５ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、以下実施例３と同様に処理して、大腸菌の核酸を吸着させたＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ−３コートを用意した。３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを流して不織布を洗浄した後、不織布４枚をフィルターホルダーから取り外して、一番上流（入り口）側の不織布の中央部を３ｍｍ  ｘ  ３ｍｍの長方形に切って、０．５ｍｌのＰＣＲ用チューブの底に入れた。次に、実施例４と同じＰＣＲシステムを用いて大腸菌のリボソーム蛋白質Ｌ２５をコードする遺伝子ｒｐｌＹをターゲットにしたＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動で解析した。結果を図２１に示す。１９５ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されており、不織布に吸着された大腸菌ゲノムＤＮＡがＰＣＲの鋳型として使用可能であることが確認された。
［実施例１６］不織布に吸着されたヒトゲノムＤＮＡのプローブハイブリダイゼーションによる検出
０．２５ｍｌの凍結保存血（白血球数  １．１５ｘ１０６個）を実施例１１と同様の方法で処理して、ヒトの核酸を吸着させたＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コート及びＡ０４０Ｃ０１の不織布を用意した。３ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、次に３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを流して不織布を洗浄した。
洗浄した不織布をフィルターホルダーから取り出し浮遊細胞培養用の２４ｗｅｌｌプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ）に移し、アルカリ変性にて不織布上に吸着したゲノムＤＮＡの一本鎖化を行った。膜表面へのゲノムＤＮＡの固定化操作をせずに、直ちにこれに０．５ｍｌのハイブリダイゼーションバッファー（５ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ‘ｓ；２ｘＳＳＰＥ；０．２％  ＳＤＳ；１０ｎｇ／ｍｌ  Ｓａｌｍｏｎ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ））を添加し、６５℃にて１時間置き、プレハイブリダイゼーションを行った。
ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子に対するラジオアイソトープ標識ＤＮＡプローブとＬａｍｂｄａ  ＤＮＡに対するラジオアイソトープ標識ＤＮＡプローブとを以下の方法にて調製した。まず、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＧ３ＰＤＨ用Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｍｐｌｉｍｅｒ  Ｓｅｔを使用して次のＰＣＲ反応を行った。１０ｎｇのＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を入れたＰＣＲ用チューブに、最終量が５０μｌとなるようにＰＣＲ反応液（最終濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ８．３；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ；１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｇ３ＰＤＨ  ３‘−ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μＭ；Ｇ３ＰＤＨ  ５’−ｐｒｉｍｅｒ  ０．５μＭ）を加えた。Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡプローブは、１ｎｇ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）、日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した配列番号３のＤＮＡプライマー（最終濃度０．４μＭ）と配列番号４のＤＮＡプライマー（最終濃度０．４μＭ）を入れたＰＣＲ用チューブに、最終量が５０μｌとなるようにＰＣＲ反応液（最終濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ；１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を加えた。これらＰＣＲ反応液をＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９６℃  ５分、１  ｃｙｃｌｅ；９６℃  ３０秒、６０℃  １分、７２℃  ３分、３０  ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ５分  反応させた。ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ産物をそれぞれＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）にて精製を行い、ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子とＬａｍｂｄａ  ＤＮＡそれぞれの部分配列ＤＮＡ断片を得た。これら各々のＤＮＡ断片２０ｎｇを含む４５μｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを９６℃に５分間置いた後速やかに氷中に５分間おきＤＮＡの一本鎖化を行った。これらにＲｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）のＬａｂｅｌｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘと１．８５ＭＢｑのＲｅａｄｙｖｉｅｗ［α―３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加し緩やかに混和した後、３７℃にて１０分間置き標識を行った。これをＢｉｏＳｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｇ−３０（ＢＩＯ  ＲＡＤ）にて精製して未反応の［α―３２Ｐ］ｄＣＴＰを除いた後、再度９６℃に５分間おいた後に氷中に５分間おきＤＮＡの一本鎖化を行い、ラジオアイソトープ標識ヒトＧ３ＰＤＨ  ＤＮＡプローブとＬａｍｂｄａ  ＤＮＡプローブをそれぞれ得た。
ラジオアイソトープ標識プローブの一部をとり、シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した後、全放射活性が等しくなるようにヒトＧ３ＰＤＨプローブとＬａｍｂｄａ  ＤＮＡプローブの比率を変えて混合し、これらを先のプレハイブリダイゼーション液中に添加し、引き続き６５℃にて１８時間置いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、不織布を新たな２４ｗｅｌｌプレートに移し、これに０．５ｍｌの２ｘＳＳＣ、１％  ＳＤＳを添加し６５℃にて１０分間の洗浄を行い、次に０．５ｍｌの０．１ｘＳＳＣ、１％  ＳＤＳを添加し６５℃にて１０分間の洗浄を計２回行った。洗浄後不織布を取り出し、５ｍｌの液体シンチレータの入ったバイアル瓶に移し、シンチレーションカウンターにて不織布に残存している放射活性を測定した。その結果を図２２に示す。Ｇ３ＰＤＨプローブにて不織布上のゲノムＤＮＡが検出され、ヒトＧ３ＰＤＨプローブの比率が低くなるのに依存して検出された放射活性も低くなっており、ヒトＧ３ＰＤＨプローブと不織布上のヒトゲノムに含まれるＧ３ＰＤＨ遺伝子の特異的なハイブリダイゼーションが検出されている事が示された。
［実施例１７］不織布に吸着された核酸の遊離
０．２５ｍｌの凍結保存血（白血球数  １．１５ｘ１０６個）を実施例１１と同様の方法で処理して、ヒトの核酸を吸着させたＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートの不織布を用意した。３ｍｌの精製水を流して不織布を洗浄した後、不織布４枚をフィルターホルダーから取り外して、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。これを５組作製して、各々に表５に記載した溶液を加えてそれぞれの温度、時間で処理した。９５℃処理にはヒートブロックを使用した。相対溶出量（％）とは、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９５℃、２０分処理した時に溶出した核酸量を１００％とした時の各条件での核酸溶出量である。表５の結果は、Ｍｇ２＋や高濃度の塩が含まれる溶液中では９５℃で加温しても核酸は遊離しにくく、またアルカリ変性の条件下でも室温では核酸が遊離しにくいことを示している。
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［実施例１８］不織布に吸着された核酸の電顕写真
不織布Ｐ０３０５０を用いて、実施例１４と同様な方法で核酸吸着フィルターを作製した。精製水を流して不織布を洗浄した後、不織布４枚をフィルターホルダーから取り外して、一番上流（入り口）側の不織布を一枚取って凍結乾燥機ＤＣ−４１（ＹＡＭＡＴＯ製）を用いて凍結乾燥した。また、血液を流さずに他は同一の操作をした不織布をつくり凍結乾燥してこれを対照とした。乾燥した不織布を約５ｍｍ角に切り出して、ＳＥＭ用試料台にカーボンペーストを用いて固定した。これを風乾した後、オスミウムプラズマコーターＯＰＣ−８０（日本レーザー電子製）を用いて厚さ２０ｎｍでオスミウムプラズマコーティングを行い、検鏡用試料とした。この試料を電界放射型走査電子顕微鏡Ｓ−９００（日立製）で加速電圧１ｋＶにてＳＥＭ観察した。図２３の写真から、核酸は繊維状となって不織布繊維の表面に吸着していることが判明した。
［実施例１９］界面活性剤の検討
実施例５と同様な条件で実験を行い、核酸抽出に使用する界面活性剤の種類を検討した。不織布は旭化成（株）の製品Ａ０４０Ｃ０１のＨＭ―３コート品を使用した。０．２５ｍｌの凍結保存血中の白血球数は、１．５０ｘ１０６であった。０．２５ｍｌの凍結保存血に、３７℃に加温した２ｘ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  界面活性剤）を０．２５ｍｌ加えた。界面活性剤は、以下に記述する界面活性剤からいずれか１つを選択して使用した。すなわち、陰イオン性界面活性剤のＳｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）、両性界面活性剤の３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳ）または３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳＯ）、非イオン性界面活性剤のＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｔｅｒｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  ｅｔｈｅｒ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｔｅｒｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｒ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ａｌｋｙｌ  ｅｔｈｅｒ（Ｎｉｓｓａｎ  Ｄｉｓｐａｎｏｌ  ＴＯＣ）、（Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ（Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０）またはＮｏｎｏｘｙｎｏｌ−８．５（Ｎｉｓｓａｎ  Ｎｏｎｉｏｎ  ＮＳ−２０８．５）、陽イオン性界面活性剤のＨｅｘａｄｅｃｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＨＰＣ）、Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＨＰＢ）、Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＨＴＡＣ）またはＨｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＨＴＡＢ）の中からいずれか１つを使用した。２ｘ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた後、更にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を０．０５μｇ加えて、これを３７℃の水浴で時々加温しながらｖｏｒｔｅｘで撹拌して完全に溶解した。室温で５分放置後、この血液抽出液を不織布にかけて直ちに吸引濾過した。次に、同じ界面活性剤を含むＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを８ｍｌ流してフィルターを洗浄した。
更に、３ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を流して不織布を洗浄した。それから不織布４枚をフィルターホルダーから取り外して、ロック付きのエッペンドルフチューブに入れ、０．５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒに不織布を浸して、ヒートブロックで９５℃で２０分保温した。
不織布から溶出したＤＮＡの量は、実施例９と同様にＯｌｉＧｒｅｅｎ登録商標  ｓｓＤＮＡ定量キットを用いて測定した。図２４に示した通り、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤を使用した場合には核酸を精製できたが、陽イオン性界面活性剤を使うと核酸は回収できなかった。
［比較例２］不織布以外の多孔質フィルター
実施例１と同様な条件で実験を行い、不織布以外の多孔質フィルターが核酸精製に使用可能かどうか検討した。多孔質フィルターとしては多孔性ポリウレタンシート（イムガードＩＩＩ―ＲＣのメインフィルター、テルモ）または８μｍの孔径を持ち最上層がＳｉＣＮで薄膜コーティングされているポリカーボネート製トラックエッチドメンブレン（ＯＩＡ  ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ膜、  米国ＢｉｏＳｔａｒ社製）を使用し、対照として旭化成（株）の不織布Ａ０４０Ｃ０１のＨＭ−３コート品を用いた。
フィルターを直径１２ｍｍの円盤状に切断して、多孔性ポリウレタンシートまたはＯＩＡ  ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ膜は１枚、不織布Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ−３は４枚重ねてフィルターホルダー（ＳＷＩＮＮＥＸ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にセットした。フィルターホルダーの上流には１０ｍｌの注射筒、下流には吸引ポンプを設置してフィルターホルダーに接続した。最初に３ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；２５ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５％  ＳＤＳ）でフィルターを洗浄した。
次に、０．２５ｍｌのヒト血液（白血球数  １．６２ｘ１０６個）にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を０．０５μｇ加えて、更に２ｘ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  ＳＤＳ）を０．２５ｍｌ加えて、室温で５分放置した。この血液抽出液をフィルターにかけて直ちに吸引濾過した。以下、実施例１と同様に実験を行い、溶出した核酸量を吸光度で測定した。表６に示した通り、不織布Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ−３と比較すると核酸の収量や純度は劣るものの、多孔性ポリウレタンシートでは核酸精製は可能であったが、ＯＩＡ  ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ膜では核酸を精製できなかった。このことは、孔径が８μｍ程度の多孔質フィルターでも核酸精製に使用できないものがあることを示している。
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［実施例２０］精製ゲノムＤＮＡの吸着条件の検討  １  ―塩の影響―
精製ゲノムＤＮＡを用いて、不織布へのＤＮＡ吸着に対する溶液組成の影響を検討した。ゲノムＤＮＡは、実施例６で精製した標品を使用した。旭化成（株）の不織布Ａ０４０Ｃ０１、Ａ０４０Ｃ０１のＨＭ−３コート品、Ａ０６６Ａ、Ａ０４０Ｂ、Ｅ０１０３０のいずれかを直径１２ｍｍの円盤状に切断して、それを４枚重ねてフィルターホルダー（ＳＷＩＮＮＥＸ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にセットした。次に、不織布を３ｍｌエタノール、更に３ｍｌＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、最後にＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを３ｍｌ流して平衡化した。フィルターホルダーの上流に１０ｍｌの注射筒をつけて、シリンジポンプＨＡＲＶＡＲＤ  ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ  Ｍｏｄｅｌ  ５５−２２１９（ＨＡＲＶＡＲＤ  ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ  Ｉｎｃ）にセットした。
精製ゲノムＤＮＡを溶解するＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒとしては、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／０〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌまたは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）／０〜１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２または０〜１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、または１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）／０〜１０００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を使用した。約８００ｎｇの精製ゲノムＤＮＡを５ｍｌのＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁して、流速２６．２ｍｌ／ｈｒで不織布に通した。更に、６ｍｌのＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄してから、３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを流した。最後に不織布をフィルターホルダーから取り外して、ロック付きのエッペンドルフチューブに入れ、０．５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。これを９５℃で３０分保温した後、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを回収した。
不織布から溶出したＤＮＡの量は、実施例９と同様にＯｌｉＧｒｅｅｎ登録商標  ｓｓＤＮＡ定量キットを用いて測定した。キット付属の１８残基オリゴヌクレオチドを標準として、Ｅｘ  ４８５ｎｍ、Ｅｍ  ５３５ｎｍで蛍光プレートリーダーＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＧＥＭＩＮＩ  ＸＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で測定した。結果を図２５、図２６、図２７、図２８に示す。ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、リン酸、（ＮＨ４）２ＳＯ４などの塩はゲノムＤＮＡの吸着を促進することが判明した。
［実施例２１］精製ゲノムＤＮＡの吸着条件の検討  ２  ―エタノールの影響―
実施例２０と同様な方法で、不織布へのＤＮＡ吸着に対するエタノールの影響を検討した。ゲノムＤＮＡは、実施例６と同じ方法で精製した。不織布は、旭化成（株）の不織布Ａ０４０Ｃ０１、Ａ０６６ＡまたはＥ０１０３０を使用した。精製ゲノムＤＮＡを溶解するＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒとしては、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）／０〜４０％  エタノールを使用した。約８００ｎｇの精製ゲノムＤＮＡを５ｍｌのＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁して、流速２６．２ｍｌ／ｈｒで不織布に通した。更に、６ｍｌのＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄してから、３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを流した。最後に不織布をフィルターホルダーから取り外して、ロック付きのエッペンドルフチューブに入れ、０．５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。これを９５℃で３０分保温した後、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを回収した。
不織布から溶出したＤＮＡの量は、ＯｌｉＧｒｅｅｎ登録商標  ｓｓＤＮＡ定量キットを用いて測定した。図２９に示した通り、精製ゲノムＤＮＡを溶解するＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒにエタノールを添加するとＤＮＡ回収量は減少した。
［実施例２２］ＤＮＡの振盪吸着
精製ゲノムＤＮＡ溶液にＰＥＴ不織布またはＰＥＴ平膜を添加して振盪し、ＤＮＡが吸着するかどうかを検討した。ゲノムＤＮＡは、実施例６と同じ方法で精製した。不織布は、旭化成（株）の不織布Ａ０４０Ｃ０１、Ａ０６６ＡまたはＥ０１０３０を使用した。直径１２ｍｍの円盤状に切断したＰＥＴ不織布またはＰＥＴ平膜４枚をポリプロピレン製の１５ｍｌ試験管（ＩＷＡＫＩ）に入れた。この試験管に、まず３ｍｌのエタノールを加えて不織布を湿らせた。エタノールを吸引して除き、次に３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて不織布を洗浄し、同じく吸引除去した。最後に、同じように３ｍｌのＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒで不織布を処理した。Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒには、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５０ｍＭ  ＮａＣｌまたは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）／２ｍＭ  ＭｇＣｌ２または５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、または１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）／０．２〜１．０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４のいずれかを使用した。
次に、不織布の入った試験管に５ｍｌのＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて、ここに約８００ｎｇの精製ゲノムＤＮＡを添加してよく撹拌した。この試験管をＭＩＸ−ＲＯＴＡＲ  ＶＭＲ−５（ＩＵＣＨＩ）に載せて、８０ｒｐｍで３０分処理した。次に、試験管内のＤＮＡ溶液を吸引除去して、６ｍｌのＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて、同じく８０ｒｐｍで１５分処理した。Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを除いた後、３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて、同じく８０ｒｐｍで１５分処理した。試験管から不織布を取り出してロック付きのエッペンドルフチューブに入れ、これに０．５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて９５℃で３０分保温した。不織布から溶出したＤＮＡの量は、ＯｌｉＧｒｅｅｎ登録商標  ｓｓＤＮＡ定量キットを用いて測定した。図３０に示した通り、ゲノムＤＮＡはＰＥＴ不織布に吸着して回収されたが、ＰＥＴ平膜には吸着しなかった。このことは、不織布という形状がＤＮＡ吸着に重要であることを示している。
また、図３１では１０ｍＭリン酸に対する硫酸アンモニウムの添加効果をみた。特に不織布Ｅ０１０３０では、硫酸アンモニウムはＤＮＡ吸着を著しく促進した。また、この振盪吸着の場合、実施例２０の濾過吸着と異なり、Ａ０４０Ｃ０１よりＥ０１０３０の方がＤＮＡを良く吸着し、約８割のＤＮＡが回収された。このことは、吸着の条件によって核酸精製に最適な不織布が異なることを示している。
［実施例２３］不織布のスクリーニング
実施例１と同様な実験を行ってＤＮＡ精製に使用できる不織布をスクリーニングした。血液は５人の健常人から採血し、血液０．２５ｍｌ中の白血球数は０．９４〜１．９１ｘ１０６個であった。使用した不織布の一覧表を表７に示した。これらはすべて旭化成（株）の製品である。ここで、平均孔径は水銀ポロシメーターによって測定し、平均繊維径はＳＥＭ写真から算出した。
０．２５ｍｌのヒト血液にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを０．０５μｇ加えて、更に２ｘ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを０．２５ｍｌ加えて、室温で５分放置した。以下実施例１と同様に処理して、最後に３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを流して不織布を洗浄した。それから、不織布４枚をフィルターホルダーから取り外して、ロック付きのエッペンドルフチューブに入れ、０．５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。これを８０℃で１時間保温した後、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを回収した。
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回収した溶液中に含まれる核酸量は、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈した後、ＯｌｉＧｒｅｅｎ登録商標  ｓｓＤＮＡ定量キットを用いて測定した。結果を図３２に示した。また核酸の純度は、溶出液のＡ２６０（２６０ｎｍの吸光度）とＡ２８０（２８０ｎｍの吸光度）をＵＶ−１６００  ＵＶ―可視光スペクトロフォトメーター（島津）で測定して、Ａ２６０／Ａ２８０を求めて評価した。結果を図３３に示した。核酸の収量、純度は異なるものの、規格、素材の異なる様々な不織布が核酸精製に使用可能であった。
［実施例２４］不織布によって精製した核酸精製品中のＲＮＡ
実施例３で調製した大腸菌核酸中にＲＮＡが含まれることをＯｌｉＧｒｅｅｎ登録商標  ｓｓＤＮＡ定量キットで確認した。ＯｌｉＧｒｅｅｎ測定系は、ＤＮＡばかりでなくＲＮＡも検出する。従って、核酸溶液をＲＮａｓｅ処理してＲＮＡを選択的に分解した後の測定値とＲＮａｓｅ未処理の測定値を比較すれば、核酸溶液に含まれているＲＮＡ量を見積もることができる。このことは、ｒＲＮＡを用いたＣｏｎｔｒｏｌ実験で確認した。
不織布からの溶出液を１５０μｌ取り、これにウシ膵臓ＤＮａｓｅ―ｆｒｅｅＲＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社、商品番号１，１１９，９１５）を０．３７５μｇ／０．７５μｌ加えた（終濃度  ２．５μｇ／ｍｌ）。ＣｏｎｔｒｏｌはＲＮａｓｅ溶液の代わりにＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて、以下同様に処理した。３７℃で３０分ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ後、氷冷してＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで４０倍に希釈し、この１００μｌを取ってＯｌｉＧｒｅｅｎで定量した。ＲＮａｓｅ未処理の核酸量は７５．３μｇであったが、ＲＮａｓｅ処理すると１０．０μｇに減少した。従って、核酸溶液にはＤＮＡが約１０μｇとＲＮＡが約６５μｇ含まれていたことになり、不織布によりＤＮＡもＲＮＡも精製可能であることが示された。
［実施例２５］  検体の加熱処理
喀痰は、ボランティアから採取し、６名分の試料を混合して、０．２ｍｌづつエッペンドルフチューブに分注して、−２０℃で凍結保存した。また、大腸菌ＤＨ５（ＴＯＹＯＢＯ）のグリセロールストックから、プラスチック製ディスポーザブル白金耳でＬＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ）  １ｇ；Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ）  ０．５ｇ；  ＮａＣｌ  １ｇ；  １Ｎ  ＮａＯＨ  ２００μｌ；蒸留水  １００ｍｌ）に植菌した。この液体を、３７℃、１６時間培養して、Ａ６００＝３．５の培養液を得た。培養液中の大腸菌濃度は、吸光度から約１．４ｘ１０１０個／ｍｌと見積もられた。この培養液を用いて、２×１０６個／ｍｌ、２×１０５個／ｍｌ、２×１０４個／ｍｌの菌体懸濁液を調製した。先の分注した喀痰試料を溶解し、その容器に、この懸濁液を５０μｌずつ加え、大腸菌添加喀痰試料とした。
不織布は旭化成（株）の製品Ａ０４０Ｃ０１を使用した。不織布を直径１２ｍｍの円盤状に切断して、それを４枚重ねてフィルターホルダー（ＳＷＩＮＮＥＸ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にセットし、フィルターホルダーの上流には１０ｍｌの注射筒、下流には吸引ポンプを設置してフィルターホルダーに接続した。最初に３ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；２５ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５％  ＳＤＳ）で不織布を洗浄した。
大腸菌添加喀痰試料に、２×Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  ＳＤＳ）を０．２５ｍｌを加え、９８℃で１分間処理を行った。冷却後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を０．０５ｍｇを加えて、これを３７℃の水浴上で時々撹拌しながら５分処理した。この大腸菌添加喀痰試料抽出液を不織布にかけて吸引濾過した。次いで、吸引しながら８ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを流してフィルターを洗浄した。最後に、３ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を流して不織布を洗浄した。
その後、フィルターホルダーから不織布４枚を取り外して、一番上流（入り口）側の不織布を取り出しエッペンドルフチューブに入れた。これに０．２ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、９５℃で２０分間処理して溶出操作を行った。この溶出液を用いてＰＣＲ反応により、大腸菌およびヒト由来のＤＮＡの検出を行った。
まず、溶出液中の大腸菌ＤＮＡの検出は以下の方法で行った。ＰＣＲのプライマーに、大腸菌のＰｒｏｔｅｉｎＰＩＩ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列１２８３番目のｇから１３０２番目のａまでの配列（配列番号５）と塩基配列２２２９番目のｔから２２４８番目のｇまでの相補鎖の配列（配列番号６）を使用し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に依頼して化学的に合成した。溶出液１０μｌをＰＣＲ反応液に加え、全量を２５μｌとした（最終濃度  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．３．；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ；１．２５Ｕ  Ｔａｑ（Ｓｈｉｇｍａ）；上記プライマー  各０．５μＭ）。これをＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９４℃  ２分、１  ｃｙｃｌｅ；９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  １分、  ４０  ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ５分  反応させた。
また、溶出液中のヒト由来ＤＮＡの検出は以下の方法で行った。ＰＣＲのプライマーに、Ｈｕｍａｎ  ＨＧＦＲ（ｈｅｐａｔｏｃｉｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列４８３番目のｃから５０２番目のｃまでの配列（配列番号７）と塩基配列１０３９番目のｃから１０５８番目のｃまでの相補鎖の配列（配列番号８）を使用し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に依頼して化学的に合成した。溶出液１０μｌをＰＣＲ反応液に加え、全量を２５μｌとした。（最終濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．３．；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ；１．２５Ｕ  Ｔａｑ（Ｓｈｉｇｍａ）；上記プライマー  各０．５μＭ）。これをＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９４℃  ２分、１  ｃｙｃｌｅ；９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、７２℃  １分、  ４０  ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ５分  反応させた。それぞれのＰＣＲを終了後、各反応液１０μｌに１０ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１．５μｌ加えてよく混和し、全量を１．５％アガロース（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）電気泳動にかけた。Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（Ａｄｖａｎｃｅ）で１００Ｖ、３０分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。結果を図３４，３５に示す。図３４からわかるように、大腸菌添加喀痰試料において、試料中に１０３個相当以上の大腸菌が存在すれば、大腸菌由来の９６６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されている。図３５に示したようにヒト由来５７７ｂｐのＰＣＲ産物は、大腸菌の添加量にかかわらず検出されている。従って、本実施例に示した加熱による試料の処理と、それに続く不織布による核酸精製によって試料中に存在する菌ＤＮＡが抽出精製され、その検出が可能であることが確認された。
［実施例２６］  検体の還元剤処理
実施例２５に従って調製した大腸菌添加喀痰試料に、２×Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  ＳＤＳ）を０．２５ｍｌを加え、更に１０％  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ溶液を５μｌ添加し、室温で撹拌しながら２分間の処理を行った。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を０．０５ｍｇを加えて、これを３７℃の水浴上で時々撹拌しながら５分処理した。この大腸菌添加喀痰試料抽出液を不織布Ａ０４０Ｃ０１にかけて吸引濾過した。次いで、吸引しながら８ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを流してフィルターを洗浄した。最後に、３ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を流して不織布を洗浄した。
その後、フィルターホルダーから不織布４枚を取り外して、一番上流（入り口）側の不織布を取り出しエッペンドルフチューブに入れた。これに０．２ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、９５℃で２０分間処理して溶出操作を行った。この溶出液を用いて、実施例２５と同様のＰＣＲ反応により大腸菌およびヒト由来のＤＮＡの検出を行った。結果を図３６，３７に示す。図３６から明らかなように、大腸菌添加喀痰試料において、試料中に１０３個相当以上の大腸菌が存在すれば、大腸菌由来の９６６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されている。また、図３７に示したようにヒト由来５７７ｂｐのＰＣＲ産物は、大腸菌の添加量にかかわらず検出されている。従って、本実施例に示した還元剤による試料の処理と、それに続く不織布による核酸精製によって試料中に存在する菌ＤＮＡが抽出精製され、その検出が可能であることが確認された。
［比較例３］  加熱処理または還元剤処理を行わずに大腸菌添加喀痰試料から核酸を精製する場合
実施例２５と同様にして、大腸菌を添加した喀痰試料、および核酸吸着フィルターを作製した。大腸菌添加喀痰試料に、２×Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  ＳＤＳ）を０．２５ｍｌを加えた後、実施例２５で行った加熱処理、あるいは実施例２６で行った還元剤による処理を行わずに、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を０．０５ｍｇを加えて、これを３７℃の水浴上で時々撹拌しながら５分処理した。この時、実施例２５あるいは実施例２６とは異なり、喀痰は透明で均一な状態に溶けることなく、不均一に塊が残って濁っている状態であった。
次に、この大腸菌添加喀痰試料抽出液を不織布にかけて吸引濾過しようとした。この時、溶けずに残っていた喀痰成分の塊が、不織布表面上にはりついてしまい、吸引濾過が困難であった。さらに吸引を続けると、液体部分は吸引濾過できたが、不織布表面上にはりついた喀痰成分の塊を完全に濾過することはできず、以降の操作を継続することが困難であった。
［実施例２７］不織布上での核酸伸長反応
不織布上に吸着したゲノムＤＮＡをテンプレートして、不織布上で核酸伸長反応が起きるかどうかを調べた。ＤＮＡのＤＩＧ標識はＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）とＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使い、ハイブリダイゼーションと検出にはＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
０．２５ｍｌの凍結保存血（白血球数  １．１５ｘ１０６個）を実施例１１と同様の方法で処理して、ヒトの核酸を吸着させたＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートの不織布を用意した。３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを流して不織布を洗浄した後、この不織布を０．２ｍｌのＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂバッファー（Ｒｏｃｈｅ）を含む２４穴プレートに入れて４２℃において２時間置いた。これに、日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した配列番号９のＤＮＡプライマーｂＡＣＴ１と配列番号１０のＤＮＡプライマーｂＡＣＴ２を添加し、４２℃にて１８時間置いた。適当な洗浄液で洗浄して余分なプライマーを取り除いた後、酵素反応液（最終濃度１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＰＣＲバッファー；０．２ｍＭｄＡＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．１９ｍＭ  ｄＴＴＰ；０．０１ｍＭ  ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ；５Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢｉｏＬａｂｓ））を２００μｌ添加し、３７℃にて１８時間置いた。適当な洗浄液にて洗浄を行い、アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質にて核酸伸長反応中に取り込まれたＤＩＧを検出した。その結果を図３８に示す。添加したプライマー量に依存して検出できるシグナルが増加しており、不織布上でプライマー依存的に核酸伸長反応が起こっていることが示された。
［実施例２８］ＬＡＭＰ法による不織布上での核酸の増幅および検出
不織布上に吸着したゲノムＤＮＡをテンプレートにして、ＬＡＭＰ法による核酸の増幅が可能かどうかを調べた。ＬＡＭＰ法はＬｏｏｐａｍｐ牛胚性判別キット（栄研化学）を使用した。まず以下の方法にてウシゲノムＤＮＡを、不織布として旭化成（株）の製品Ａ０４０Ｃ０１に吸着させた。０．２５ｍｌのウシ保存血液（（株）日本バイオテスト研究所）に、３７℃に加温した２ｘ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  ＳＤＳ）を０．２５ｍｌ加え、更にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＰＣＲ−Ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を０．０５μｇ加えて、これを３７℃の水浴で時々加温しながらｖｏｒｔｅｘで撹拌して完全に溶解した。室温で５分放置後、この血液抽出液を不織布にかけて直ちに吸引濾過した。それから、吸引しながら８ｍｌのＤｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを流してフィルターを洗浄した。次に、３ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を流して不織布を洗浄した。この不織布を３ｍｍ四方の大きさに裁断し、これを０．５ｍｌマイクロチューブに入れた。これにＬｏｏｐａｍｐのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  ＩＩ  ４０μｌとＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μｌを添加し、６３℃にてインキュベーションを行った。１時間後増幅溶液の濁度を調べ、また、一部をアガロース電気泳動にかけた。この結果は、ＬＡＭＰ法により不織布に吸着されたウシゲノムＤＮＡをテンプレートにした核酸増幅が起こることを示している（図３９）。
［実施例２９］溶出ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション
実施例９および１１にて示した溶出法にて得られたゲノムＤＮＡがハイブリダイゼーションに使用可能かどうかを調べた。まず、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１μｇにＢｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍ−ｌｉｎｋ（Ｒｏｃｈｅ）を１μｌと全量が２０μｌとなるように水を添加し、８５℃にて１時間インキュベーションを行った後、５μｌの反応停止液を添加し、ビオチン標識ゲノムＤＮＡ溶液を得た。次に、各溶出法にて得たゲノムＤＮＡをナイロンフィルターＨｙｂｏｎｄＮ＋（Ａｍｅｒｃｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にドットし、アルカリ液による変性とＵＶクロスリンクによる固定化を行った。これにハイブリダイゼーション溶液Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、４２℃にて１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、先のビオチン標識ゲノムＤＮＡを添加し４２℃にて１８時間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄を行った後、アルカリフォスファターゼ標識アビジンを反応させ、次にアルカリフォスファターゼ基質ＣＳＰＤ（Ｒｏｃｈｅ）を添加して反応させ、適当な時間Ｘ線フィルムに露光してシグナルの検出を行った。図４０及び図４１に示した通り、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、アルカリ、過酸化水素のいずれの溶出法で得られたゲノムＤＮＡもハイブリダイゼーションに使用可能であった。
［実施例３０］溶出ゲノムＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション
実施例９および１１にて示した溶出法にて得られたゲノムＤＮＡがハイブリダイゼーション用のプローブとして使用可能かどうかを調べた。まず、不織布から溶出させたヒトゲノムＤＮＡ各１μｇにＢｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍ−ｌｉｎｋ（Ｒｏｃｈｅ）を１μｌと全量が２０μｌとなるように水を添加し、８５℃にて１時間インキュベーションを行った後、５μｌの反応停止液を添加し、ビオチン標識溶出ゲノムＤＮＡ溶液を得た。次に、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とλＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）をナイロンフィルターＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（Ａｍｅｒｃｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にドットし、アルカリ液による変性とＵＶクロスリンクによる固定化を行った。これにハイブリダイゼーション溶液Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、４２℃にて１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、先のビオチン標識した各種溶出法のゲノムＤＮＡを添加し４２℃にて１８時間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄を行った後、アルカリフォスファターゼ標識アビジンを反応させ、次にアルカリフォスファターゼ基質ＣＳＰＤ（Ｒｏｃｈｅ）を添加して反応させ、適当な時間Ｘ線フィルムに露光して、シグナルの検出を行った。結果を図４２に示す。ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、アルカリ、過酸化水素のいずれの溶出法で得られたゲノムＤＮＡもハイブリダイゼーション用のプローブとして使用可能であった。
［実施例３１］界面活性剤による核酸溶出
０．２５ｍｌの凍結保存血（白血球数  １．１６×１０６個）を実施例１１と同様の方法で処理して、ヒトの核酸を吸着させたＡ０４０Ｃ０１の不織布を用意した。５ｍｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを流して不織布を洗浄した後、不織布４枚をフィルターホルダーから取り外して、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。これに実施例１９で使用した界面活性剤の中から、両性界面活性剤のＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、非イオン性界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｎｉｓｓａｎ  Ｄｉｓｐａｎｏｌ  ＴＯＣ、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０、Ｎｉｓｓａｎ  Ｎｏｎｉｏｎ  ＮＳ―２０８．５を選んで、これらの０．５％水溶液を０．５ｍｌ加えた。更にＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを０．５ｍｌ加えた系を用意した。これらを８０℃で２０分間加熱して、不織布に吸着された核酸を溶出した。不織布から溶出したＤＮＡの量は、実施例９と同様にＯｌｉＧｒｅｅｎ登録商標  ｓｓＤＮＡ定量キットを用いて、溶出液をＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈して測定した。結果を図４３に示す。ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９５℃  ２０分間加熱した時の溶出量を１００％として表示した。ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを用いた場合と比較すると、いずれの界面活性剤も核酸溶出を促進した。
溶出した核酸を電気泳動した結果を図４４に示す。溶出した核酸をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムで濃縮して、その１０μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。界面活性剤の存在下で溶出された核酸はＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで溶出した核酸と同じような分子量を持っていた。次に、界面活性剤の存在下で溶出した精製ＤＮＡがＰＣＲの鋳型と成り得るかを確認した。ＰＣＲとその解析は実施例２と同様に行ったが、プライマーはＣｌｏｎｔｅｃｈ社のＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ）Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｍｐｌｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（カタログ番号  ５４０６−３）を使用した。結果を図４５に示す。界面活性剤で溶出した精製ＤＮＡからも９８３ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されており、ＰＣＲの鋳型として使用可能であることが示された。
［参考例３］界面活性剤のＰＣＲへの影響
陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤についてＰＣＲへの影響を調べた。
ＰＣＲのプライマーとして、配列番号１１記載の合成ＤＮＡを５’プライマー、配列番号１２記載の合成ＤＮＡを３’プライマーとし、それぞれ最終濃度が０．４μＭとなるように、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）５ｎｇを含むＰＣＲ反応液（最終濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ８．３；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ；０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ；０．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））に加えた。
これに、実施例１９で使用した陰イオン性界面活性剤のＳＤＳ、両性界面活性剤のＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、非イオン性界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｎｉｓｓａｎ  Ｄｉｓｐａｎｏｌ  ＴＯＣ、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０またはＮｉｓｓａｎ  Ｎｏｎｉｏｎ  ＮＳ―２０８．５をそれぞれ最終濃度が１％、０．５％、０．１％となるように添加し、ＰＣＲの反応液を２０μｌとした。
これをＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９４℃  ３分  １  ｃｙｃｌｅ；９４℃  ３０秒、６０℃  １分、７２℃  ３分、  ３０  ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ７分  反応させた。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌに１０ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１μｌ加えてよく混和し、全量を１．５％  アガロース電気泳動にかけた。５０Ｖ、４５分間泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してＢｉｏＩｍａｇｅ  Ｇｅｌ  Ｐｒｉｎｔ  ２０００ｉ／ＶＧＡで撮影した。結果を図４６に示す。
溶出時に用いた濃度の界面活性剤のうちＳＤＳ以外は、ＰＣＲに影響しないことが示された。一方ＳＤＳは、０．１％でもＰＣＲに影響を及ぼすことが示された。
〔実施例３２〕不織布に吸着させた核酸のビオチン化
不織布上に吸着した核酸を直接標識することが可能かどうか調べた。０．２５ｍｌの凍結保存血（白血球数  １．１６×１０６個）を実施例１１と同様の方法で処理して、ヒトの核酸を吸着させたＡ０４０Ｃ０１の不織布を用意した。これを４等分に切断し、０．５ｍｌマイクロチューブに入れ、９５μｌの水と５μｌのＢｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍ−Ｌｉｎｋ（Ｒｏｃｈｅ）に加え、８５℃にて１時間置いてビオチン化を行った。上清を別のチューブに移し、９５℃にて５分間置いて核酸を一本鎖化した後氷冷してプローブ１とした。Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍ−Ｌｉｎｋを反応させた前述の不織布を１００μｌのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを入れたチューブに移して９５℃にて２０分間置き、不織布から核酸溶出と核酸の一本鎖化を同時に行った。その後これを氷冷し、プローブ２とした。１００ｎｇから０．１ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とＬａｍｂｄａ  ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）とをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Ａｍｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にドットし、アルカリ変性とＵＶクロスリンクによる固定化を行った。これを適当な密閉容器に移しＥａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ）を加えた。４２℃にて１時間置いた後、１ｍｌのＥａｓｙ  Ｈｙｂに対し２０μｌのプローブ１またはプローブ２を添加し、引き続き４２℃に１８時間置いてプローブをハイブリダイズさせた。これを２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを使って室温５分間の洗浄を２回行った後、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを使って６８℃１５分間の洗浄を２回行った。次に、洗浄Ｂｕｆｆｅｒ（最終濃度０．１Ｍマレイン酸；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；０．３％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｐＨ７．５）にて１分間平衡化を行った後、マレイン酸Ｂｂｕｆｅｒ（最終濃度０．１Ｍマレイン酸；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）で１０倍に希釈したブロッキング溶液（Ｒｏｃｈｅ）に１時間浸した。５ｍｌの液量に対し１μｌのアルカリホスファターゼ標識アビジン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を添加し、ゆっくりと浸透させながら室温にて３０分間置いた。洗浄Ｂｕｆｆｅｒを用いて室温にて１５分間の洗浄を２回行い、次にアルカリホスファターゼＢｕｆｆｅｒ（最終濃度０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．５；０．１Ｍ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）にて２分間平衡化を行い、これに２／１００容のＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ）を添加して発色反応を行った。この結果を図４７に示す。プローブ１、プローブ２ともにＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜上にドットされたヒトゲノムＤＮＡにハイブリダイズしており、不織布上にトラップされた核酸がビオチン標識されていることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明の方法によれば、白血球や細菌などの細胞を含む試料から核酸を容易に精製することが可能である。また本発明を用いれば、核酸を吸着したフィルターから迅速に核酸を溶出することができる。最後に本発明の方法によれば、不織布を用いて白血球や細菌などの細胞を含む試料から核酸を迅速に精製し、更にその不織布上で核酸増幅や塩基配列検出などを直接行うことが可能である。これにより、試料の処理から核酸増幅、または塩基配列検出に至る工程の簡素化が可能となり、短時間で処理できるようになった。
配列表フリーテキスト
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、血液から精製した核酸の０．７％  アガロース電気泳動
Ｌａｎｅ１  １ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  Ｍａｒｋｅｒ７ＧＴ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）；  Ｌａｎｅ３  Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートで精製した核酸；  Ｌａｎｅ４  Ａ０４０Ｃ０１；  Ｌａｎｅ５  Ｐ０２０Ａ（ＥＬ）；  Ｌａｎｅ６  Ｐ０２０Ｃ；  Ｌａｎｅ７  Ｐ０９０Ｄ；Ｌａｎｅ８  Ｎ０５０７０；  Ｌａｎｅ９  Ｅ０５０７０
図２は、ＰＣＲ増幅産物の２％  アガロース電気泳動
血液から精製した核酸を鋳型としてＧ３ＰＤＨ遺伝子のＰＣＲを行った。Ｌａｎｅ１  １００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  ネガティブコントロール；  Ｌａｎｅ３  ポジティブコントロール；  Ｌａｎｅ４  Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コート；  Ｌａｎｅ５  Ａ０４０Ｃ０１；  Ｌａｎｅ  ６  Ｐ０２０Ａ（ＥＬ）；  Ｌａｎｅ７  Ｐ０２０Ｃ；  Ｌａｎｅ８  Ｐ０９０Ｄ；Ｌａｎｅ９  Ｎ０５０７０；  Ｌａｎｅ１０  Ｅ０５０７０
図３は、大腸菌から精製した核酸の０．７％  アガロース電気泳動
Ｌａｎｅ１  １ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  Ｍａｒｋｅｒ７ＧＴ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）；  Ｌａｎｅ３  Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートで精製した核酸
図４は、ＰＣＲ増幅産物の３％  アガロース電気泳動
大腸菌から精製した核酸を鋳型としてリボゾーム蛋白Ｌ２５遺伝子のＰＣＲを行った。Ｌａｎｅ１  ＢｉｏＭａｒｋｅｒ  Ｌｏｗ（ＢｉｏＶｅｎｔｕｒｅｓ）；Ｌａｎｅ２  ネガティブコントロール；  Ｌａｎｅ３  ポジティブコントロール；Ｌａｎｅ４  Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートで精製した核酸
図５は、血液の処理時間
■  室温、＋ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ；  □  室温、−ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ；●  ５０℃、  ＋ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ；  ○  ５０℃、  −ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ
図６は、不織布の白血球吸着率とＤＮＡ回収量
図７は、アルカリ条件下でのＤＮＡ溶出
ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．２Ｎ  ＮａＯＨ、または０．０５Ｎ  ＮａＯＨに核酸を吸着させた不織布を浸し、９５℃で５分から２０分保温して溶出されるＤＮＡ量を測定した。
◆  ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ；  ■  ０．２Ｎ  ＮａＯＨ；  ▲  ０．０５Ｎ  ＮａＯＨ
図８は、アルカリ条件下で溶出した核酸の０．７％  アガロース電気泳動
Ｌａｎｅ１  １ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  Ｍａｒｋｅｒ７ＧＴ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）；  Ｌａｎｅ３  ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、９５℃  ２０分；  Ｌａｎｅ４  ０．２Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  ５分；  Ｌａｎｅ５  ０．２Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  １０分；  Ｌａｎｅ６  ０．２Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  ２０分；  Ｌａｎｅ７  ０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  ５分；Ｌａｎｅ８  ０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  １０分；  Ｌａｎｅ９  ０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  ２０分
図９は、ＰＣＲ増幅産物の２％  アガロース電気泳動
アルカリ条件下で溶出した核酸を鋳型としてＧ３ＰＤＨ遺伝子のＰＣＲを行った。
Ｌａｎｅ１  １００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  ネガティブコントロール；  Ｌａｎｅ３  ポジティブコントロール；Ｌａｎｅ４  ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、９５℃  ２０分；  Ｌａｎｅ５  ０．２Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  ５分；  Ｌａｎｅ６  ０．２Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  １０分；  Ｌａｎｅ７  ０．２Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  ２０分；  Ｌａｎｅ８  ０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  ５分；  Ｌａｎｅ９  ０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  １０分；Ｌａｎｅ１０  ０．０５Ｎ  ＮａＯＨ、９５℃  ２０分
図１０は、アルカリ溶出に対する温度の効果
2003006650.tif 000016
ＯＨ
図１１は、酸性条件下で溶出した核酸の０．７％  アガロース電気泳動
Ｌａｎｅ１  １ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  Ｍａｒｋｅｒ７ＧＴ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）；  Ｌａｎｅ３  ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、９５℃  ２０分；  Ｌａｎｅ４  １０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、９５℃  １０分
図１２は、ＰＣＲ増幅産物の２％  アガロース電気泳動
酸性条件下で溶出した核酸を鋳型としてＧ３ＰＤＨ遺伝子のＰＣＲを行った。Ｌａｎｅ１  １００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  ネガティブコントロール；  Ｌａｎｅ３  ポジティブコントロール；  Ｌａｎｅ４  ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、９５℃  ２０分；  Ｌａｎｅ５  １０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、９５℃  １０分
図１３は、アルカリ溶出のＤＮＡプローブへの影響
ＤＩＧ標識ＤＮＡプローブを０．０５Ｎ  ＮａＯＨにて９５℃にて５分間処理（スポット１、２）と未処理（３、４）。固定化したＬａｍｂｄａ  ＤＮＡ量は、１０ｎｇ（スポット１、３）と１ｎｇ（スポット２、４）。
図１４は、過酸化水素にて溶出した核酸の０．７％  アガロース電気泳動０．１ｍＭ  ＣｕＣｌ２を含む３％  過酸化水素にて溶出した。
Ｌａｎｅ１  １ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  過酸化水素処理  室温１分；  Ｌａｎｅ３  過酸化水素処理  室温２分；  Ｌａｎｅ４  過酸化水素処理  室温３分；  Ｌａｎｅ５  過酸化水素処理  室温５分
図１５は、過酸化水素溶出の核酸を鋳型にしたＰＣＲ増幅産物の２％  アガロース電気泳動
０．１ｍＭ  ＣｕＣｌ２を含む３％  過酸化水素にて溶出した核酸を鋳型としたヒトＧ３ＰＤＨ部分配列のＰＣＲによる増幅。Ｌａｎｅ１  １００ｂｐ  ＤＮＡｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  過酸化水素処理  室温１分；Ｌａｎｅ３  過酸化水素処理  室温２分；  Ｌａｎｅ４  過酸化水素処理  室温３分；  Ｌａｎｅ５  過酸化水素処理  室温５分
図１６は、還元糖と金属イオンにて溶出した核酸の０．７％  アガロース電気泳動
１００ｍＭ  Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅと０．１ｍＭ  ＣｕＣｌ２を含む活性酸素液にて溶出させた。
Ｌａｎｅ１  １ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  ５０℃  １分；  Ｌａｎｅ３  ５０℃  ３分；  Ｌａｎｅ４  ５０℃  ５分；  Ｌａｎｅ５  ５０℃  １０分；  Ｌａｎｅ６  ５０℃  ３０分；  Ｌａｎｅ７  ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒによる溶出  ９５℃  ２０分（コントロール）
図１７は、還元糖にて溶出した核酸を鋳型にしたＰＣＲ増幅産物の２％  アガロース電気泳動
１００ｍＭ  Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅと０．１ｍＭ  ＣｕＣｌ２を含む活性酸素液にて溶出させた核酸を鋳型としたヒトＧ３ＰＤＨ部分配列のＰＣＲによる増幅。Ｌａｎｅ１  １００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  ５０℃  １分；  Ｌａｎｅ３  ５０℃  ３分；  Ｌａｎｅ４  ５０℃  ５分；  Ｌａｎｅ５  １００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ；Ｌａｎｅ６  ５０℃  １０分；  Ｌａｎｅ７  ５０℃  ３０分
図１８は、不織布から制限酵素にて溶出した核酸の０．７％  アガロース電気泳動
Ｌａｎｅ１  １ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  室温  ５分間；  Ｌａｎｅ３  室温  ５分間（カラム精製）；  Ｌａｎｅ４  室温  １０分間；  Ｌａｎｅ５  室温  １０分間（カラム精製）；  Ｌａｎｅ６  室温  ３０分間；  Ｌａｎｅ７  室温  ３０分間（カラム精製）；  Ｌａｎｅ８  ３７℃  ５分間；  Ｌａｎｅ９  ３７℃  ５分間（カラム精製）；  Ｌａｎｅ１０  ３７℃  １０分間；  Ｌａｎｅ１１  ３７℃  １０分間（カラム精製）；  Ｌａｎｅ１２  ３７℃  ３０分間；  Ｌａｎｅ１３  ３７℃  ３０分間（カラム精製）；  Ｌａｎｅ１４  １ｋｂ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；
図１９は、活性酸素にて処理のハイブリダイゼーションへの影響
最終濃度５０ｍＭ  Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ  ５−ｐｈｏｐｈａｔｅと２５μＭ  ＣｕＣｌ２にて処理したＤＩＧ標識ＤＮＡプローブとナロンメンブレンに固定化したＤＮＡとのハイブリダイゼーション。コントロールとして、活性酸素未処理とＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９５℃にて２０分間処理したＤＩＧ標識ＤＮＡプローブを用いた。
図２０は、不織布に吸着されたヒトゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ
血液から抽出した核酸を不織布に吸着させてＧ３ＰＤＨ遺伝子のＰＣＲを行った。
Ｌａｎｅ１  １００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；  Ｌａｎｅ２  ネガティブコントロール；  Ｌａｎｅ３  ポジティブコントロール；  Ｌａｎｅ４  Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コート；  Ｌａｎｅ５  Ａ０４０Ｃ０１；Ｌａｎｅ６  Ｐ０２０Ａ（ＥＬ）；  Ｌａｎｅ７  Ｐ０９０Ｄ；  Ｌａｎｅ８  Ｎ０５０７０；  Ｌａｎｅ９  Ｅ０５０７０
図２１は、不織布に吸着された大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ
大腸菌から抽出した核酸をＡ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コートに吸着させてリボソーム蛋白Ｌ２５遺伝子のＰＣＲを行った。Ｌａｎｅ１  ＢｉｏＭａｒｋｅｒ  Ｌｏｗ（ＢｉｏＶｅｎｔｕｒｅｓ）；  Ｌａｎｅ２  ネガティブコントロール；  Ｌａｎｅ３  ポジティブコントロール；  Ｌａｎｅ４  Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コート
図２２は、不織布に吸着されたヒトゲノムＤＮＡの検出
０．２５ｍｌの血液から抽出したヒトゲノムを吸着させた２種類の不織布Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ―３コート、Ａ０４０Ｃ０１へのラジオアイソトープ標識ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション。１μｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ｈｇＤＮＡ）と１μｇ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ（λＤＮＡ）を固定化したＨｙｂｏｎｄ―Ｎ＋ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｉｃａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）をコントロールとした。凡例は、ヒトＧ３ＰＤＨプローブとＬａｍｂｄａ  ＤＮＡプローブの混合比率を示す。いずれも全放射活性が４４８，０００ｃｐｍとなるように混合した。
図２３は、不織布に吸着された核酸の走査電子顕微鏡像
Ａ：不織布Ｐ０３０５０（対照）、Ｂ：血液中の核酸を吸着させた不織布Ｐ０３０５０
図２４は、細胞溶解液に使用する界面活性剤の検討
Ｘ−１１４（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ＴＯＣ（Ｎｉｓｓａｎ  Ｄｉｓｐａｎｏｌ  ＴＯＣ）、Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ＣＡ６３０（Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０）、ＮＳ―２０８．５（Ｎｉｓｓａｎ  Ｎｏｎｉｏｎ  ＮＳ―２０８．５）、ＨＰＣ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＨＰＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）、ＨＴＡＣ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＨＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）
図２５は、精製ゲノムＤＮＡ吸着のＮａＣｌ濃度依存性
◆  Ａ０４０Ｃ０１；  ▲  Ａ０６６Ａ；  ■  Ａ０４０Ｂ
図２６は、精製ゲノムＤＮＡ吸着のＭｇＣｌ２濃度依存性
◆  Ａ０４０Ｃ０１；  ▲  Ａ０６６Ａ；  ■  Ａ０４０Ｂ；  ●  Ｅ０１０３０
図２７は、精製ゲノムＤＮＡ吸着のＨＰＯ４２−濃度依存性
◆  Ａ０４０Ｃ０１；  ▲  Ａ０６６Ａ；  ■  Ａ０４０Ｂ；  ●  Ａ０４０Ｃ０１／ＨＭ−３
図２８は、精製ゲノムＤＮＡ吸着の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度依存性
◆  Ａ０４０Ｃ０１；  ■  Ａ０６６Ａ；  ▲  Ｅ０１０３０
図２９は、精製ゲノムＤＮＡ吸着に対するエタノールの効果
１０ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）にエタノールを添加して、精製ゲノムＤＮＡ吸着に対する影響を調べた。
2003006650.tif 000017
図３０は、精製ゲノムＤＮＡの振盪吸着１
■  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ；
2003006650.tif 000018
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図３１は、精製ゲノムＤＮＡの振盪吸着２
■  １０ｍＭ  リン酸（ｐＨ７．４）；  □  １０ｍＭ  リン酸（ｐＨ７．４）／０．２Ｍ  硫酸アンモニウム；  □１０ｍＭ  リン酸（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ  硫酸アンモニウム；  □１０ｍＭ  リン酸（ｐＨ７．４）／１．０Ｍ  硫酸アンモニウム
図３２は、不織布のスクリーニング  −ＤＮＡ回収量−
検体は新鮮血を使用した。Ｇｒ１〜Ｇｒ５は使用した血液の供血者が異なることを示す。
図３３は、不織布のスクリーニング  −ＤＮＡ純度  Ａ２６０／Ａ２８０−
図３１と同一サンプルの吸光度比Ａ２６０／Ａ２８０を測定した。
図３４は、大腸菌添加喀痰からの核酸精製１  −加熱処理−
実施例２７の大腸菌由来核酸の検出結果。ＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動で解析した。
Ｌａｎｅ１  ＤＮＡ分子量マーカー；  Ｌａｎｅ２  １０５個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ３  １０４個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ４  １０３個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ５  大腸菌未添加の喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物
図３５は、大腸菌添加喀痰からの核酸精製２  −加熱処理−
実施例２７のヒト由来核酸の検出結果。ＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動で解析した。
Ｌａｎｅ１  ＤＮＡ分子量マーカー；  Ｌａｎｅ２  １０５個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ３  １０４個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ４  １０３個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ５  大腸菌未添加の喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物
図３６は、大腸菌添加喀痰からの核酸精製１  −還元剤処理−
実施例２８の大腸菌由来核酸の検出結果。ＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動で解析した。
Ｌａｎｅ１  ＤＮＡ分子量マーカー；  Ｌａｎｅ２  １０５個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ３  １０４個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ４  １０３個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ５  大腸菌未添加の喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物
図３７は、大腸菌添加喀痰からの核酸精製２  −還元剤処理−
実施例２８のヒト由来核酸の検出結果。ＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動で解析した。
Ｌａｎｅ１  ＤＮＡ分子量マーカー；  Ｌａｎｅ２  １０５個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ３  １０４個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ４  １０３個の大腸菌添加喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物；  Ｌａｎｅ５  大腸菌未添加の喀痰試料から得られた核酸抽出液のＰＣＲ増幅産物
図３８は、不織布上での核酸伸長反応
Ｋｌｅｎｏｗ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ酵素反応溶液に２種のプライマーｂＡＣＴ１とｂＡＣＴ２とを各１０μｇ、１００ｎｇ、１ｎｇ、０ｎｇハイブリダイズさせて３７℃にて伸長反応を起こさせた。
図３９は、ＬＡＭＰ法による不織布上での核酸の増幅及び検出
Ｌｏｏｐａｍｐにて増幅させたウシゲノムＤＮＡの１％アガロースゲル電気泳動。Ｌａｎｅ１  分子量マーカー；  Ｌａｎｅ２  テンプレートとしてヒトゲノムＤＮＡを吸着させた不織布；  Ｌａｎｅ３  テンプレートとしてウシゲノムＤＮＡを吸着させた不織布；  Ｌａｎｅ４  テンプレートとして不織布に吸着させたウシゲノムＤＮＡをＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中で熱溶出させた上清；  Ｌａｎｅ５テンプレート無し；Ｌａｎｅ６  テンプレートとしてキット付属のコントロールウシゲノムＤＮＡ
図４０は、不織布によって精製されたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション１
ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ溶出法とアルカリ溶出法を検定した。不織布によって精製されたＤＮＡ溶液各１μｌをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜上にドットして、ハイブリダイゼーションのターゲットとして使用した。
図４１は、不織布によって精製されたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション２
ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ溶出法と過酸化水素溶出法を検定した。不織布によって精製されたＤＮＡ溶液各１μｌをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜上にドットして、ハイブリダイゼーションのターゲットとして使用した。
図４２は、不織布によって精製されたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション３
不織布によって精製されたＤＮＡを標識して、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用し、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ溶出法、アルカリ溶出法、過酸化水素溶出法を検定した。
図４３は、界面活性剤による核酸の溶出
０．５％の界面活性剤を含む水溶液またはＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒを５００μｌ加えて８０℃  ２０分間加熱し、不織布に吸着した核酸を溶出した。ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ中で９５℃  ２０分間加熱した時の核酸溶出量を１００％とした。
図４４は、界面活性剤で溶出した核酸の電気泳動
図４３の溶出サンプルをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラムで濃縮精製して０．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。
図４５は、界面活性剤で溶出した核酸のＰＣＲ増幅産物の電気泳動
図４３の溶出サンプルを鋳型として、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子のＰＣＲを行った。
図４６は、ＰＣＲ産物の電気泳動
ゲノム溶出に使用した界面活性剤をＰＣＲ反応系に添加し、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子のＰＣＲを行った。ＤＮＡ  Ｍａｋｅｒとして１ｋｂラダー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を使用した。
図４７は、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍ−Ｌｉｎｋ標識核酸プローブによるハイブリダイゼーション
ヒトゲノムＤＮＡまたはＬａｍｂｄａ  ＤＮＡをドットした膜にＢｉｏｔｉｎＣｈｅｍ−Ｌｉｎｋ標識核酸プローブ１または２をハイブリダイズさせた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2003006650.tif 000026
【図８】
2003006650.tif 000027
【図９】
2003006650.tif 000028
【図１０】
2003006650.tif 000029
【図１１】
2003006650.tif 000030
【図１２】
2003006650.tif 000031
【図１３】
2003006650.tif 000032
【図１４】
2003006650.tif 000033
【図１５】
2003006650.tif 000034
【図１６】
2003006650.tif 000035
【図１７】
2003006650.tif 000036
【図１８】
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【図１９】
2003006650.tif 000038
【図２０】
2003006650.tif 000039
【図２１】
2003006650.tif 000040
【図２２】
2003006650.tif 000041
【図２３Ａ】
2003006650.tif 000042
【図２３Ｂ】
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【図２４】
2003006650.tif 000044
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2003006650.tif 000049
【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【国際調査報告】
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