(57)【要約】
2002066496.tif 000007式Ｉ（式中ＸはＯＨ、ＯＳＯ３Ｈ又はＯＣＨ３であり、ＲはＯＨ以外の置換基である）で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする当該化合物と反応性を有する標的物質の修飾剤。
2002066496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉ：
2002066496.tif 000006
（式中ＸはＯＨ、ＯＳＯ３Ｈ又はＯＣＨ３であり、ＲはＯＨ以外の置換基である）
で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする当該化合物と反応性を有する標的物質の修飾剤。
【請求項２】
Ｒが糖質である請求項１記載の修飾剤。
【請求項３】
標的物質がペプチドである請求項１記載の修飾剤。
【請求項４】
ペプチドがオリゴペプチド又はポリペプチドである請求項３記載の修飾剤。
【請求項５】
式Ｉで表される化合物を含有することを特徴とする当該化合物と反応性を有する標的物質の修飾用キット。
【請求項６】
式Ｉで表される化合物のＲが糖質である請求項５記載のキット。
【請求項７】
標的物質がペプチドである請求項５記載のキット。
【請求項８】
ペプチドがオリゴペプチド又はポリペプチドである請求項７記載のキット。
【請求項９】
還元剤を含有する請求項５記載のキット。
【請求項１０】
式Ｉで表される化合物と当該化合物に反応性を有する標的物質を反応せしめて得られる標的物質の修飾物。
【請求項１１】
さらに還元剤を反応せしめて得られる請求項１０記載の修飾物。
【請求項１２】
式Ｉで表される化合物のＲが糖質である請求項１０記載の修飾物。
【請求項１３】
標的物質がペプチドである請求項１０記載の修飾物。
【請求項１４】
ペプチドがオリゴペプチド又はポリペプチドである請求項１３記載の修飾物。
【請求項１５】
ペプチドが抗体である請求項１３記載の修飾物。
【請求項１６】
式Ｉで表される化合物と当該化合物に反応性を有する標的物質を反応させる工程を包含することを特徴とする標的物質の修飾方法。
【請求項１７】
式Ｉで表される化合物のＲが糖質である請求項１６記載の修飾方法。
【請求項１８】
式Ｉで表わされる化合物が３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する糖化合物である請求項１７記載の修飾方法。
【請求項１９】
糖化合物がアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、カラビオース、カラテトラオース、カラヘキサオース、及びカラオクタオースから選択される糖化合物である請求項１８記載の修飾方法。
【請求項２０】
標的物質がペプチドである請求項１６記載の修飾方法。
【請求項２１】
ペプチドがオリゴペプチド又はポリペプチドである請求項２０記載の修飾方法。
【請求項２２】
ペプチドが抗体である請求項２０記載の修飾方法。
【請求項２３】
式Ｉで表わされる化合物と当該化合物に反応性を有する標的物質を中性乃至酸性、１０秒〜７２時間、５〜４５℃の条件下で反応させることを特徴とする請求項１６記載の修飾方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はペプチド等の生理活性物質の修飾剤、修飾用キット、これらを使用して得られる修飾物、およびその修飾方法に関する。本発明により性状の改良された生理活性物質等を提供することができる。
背景技術
オリゴペプチドやポリペプチドは、それぞれ固有のアミノ酸配列、分子量及びアミノ酸配列で規定される立体構造をもち、多くのものは固有の生理機能をもつ生理活性物質である。
組換えＤＮＡ技術は、生体由来のポリペプチドなどで微量成分として単離することが著しく困難であった物質を、微生物などを用いて大量に調製することを可能にした。
またハイブリドーマ技術の確立は、モノクローナル抗体の大量供給を可能にし、抗原の高感度免疫学的測定方法を提供した。
組換えＤＮＡ技術で産生されたポリペプチドは、しばしば、宿主細胞内で変性した不溶物として存在し、その可溶化が望まれている。
またハイブリドーマ技術で得られたモノクローナル抗体も、ときおり、難水溶性の性状を示すことがあり、水溶性の改善が望まれることが多い。
これらの生理活性物質の性状の改善には多くの化学修飾剤が用いられているが、その化学修飾反応条件により、修飾を必要とするこれらの生理活性物質の機能が損なわれる場合もあり、生理活性物質等の修飾を要する標的物質のより穏和で簡便な修飾方法の提供が望まれている。
発明の目的
本発明の目的は、穏和な条件下で、簡便にオリゴペプチドやポリペプチド等の修飾を要する標的物質の修飾を行うことが可能な、修飾剤、修飾用キット、これらを用いて性状が改善された標的物質の修飾物、及び標的物質の修飾方法を提供することにある。
発明の概要
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、下記式Ｉ：
2002066496.tif 000003
（式中ＸはＯＨ、ＯＳＯ３Ｈ又はＯＣＨ３であり、ＲはＯＨ以外の置換基である）
で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする当該化合物と反応性を有する標的物質の修飾剤に関する。
本発明の第２の発明は、式Ｉで表される化合物を含有することを特徴とする当該化合物と反応性を有する標的物質の修飾用キットに関する。
本発明の第３の発明は、式Ｉで表される化合物と当該化合物に反応性を有する標的化合物を反応せしめて得られる標的物質の修飾物に関する。
本発明の第４の発明は、式Ｉで表される化合物と当該化合物に反応性を有する標的物質を反応させる工程を包含することを特徴とする標的物質の修飾方法に関する。
本発明の第５の発明は、式Ｉで表わされる化合物と当該化合物に反応性を有する標的物質との混合物に関する。
本発明の第１〜第５の発明の一態様において、式Ｉで表わされる化合物のＲは糖質である。式Ｉで表わされる化合物としては３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する糖化合物があり、当該化合物としては、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース（以下、これらを総してアガロオリゴ糖と称することがある）、カラビオース、カラテトラオース、カラヘキサオース、及びカラオクタオース（以下、これらを総してカラオリゴ糖と称することがある）から選択される糖化合物がある。
本発明の第１〜第５の発明の一態様において、標的物質はペプチドであり、当該ペプチドとしては、抗体、酵素、ホルモン、サイトカインから選択される生理活性ペプチドが例示される。
本発明の第２の発明の一態様において、還元剤を含有させることができる。
本発明の第４の発明の一態様においては、式Ｉで表わされる化合物と標的物質との反応は、中性乃至酸性、１０秒〜７２時間、５〜４５℃の条件下で行うことができる。
本発明においてペプチドなる用語はオリゴペプチドおよびポリペプチドを包含し、アミノ酸残基１０以下のペプチドをオリゴペプチド、１１以上のペプチドをポリペプチドと定義する。ポリペプチドにはタンパク質が包含される。本発明において、糖質とは、例えば単糖、オリゴ糖、多糖である。オリゴ糖は構成糖１０以下であり、多糖は構成糖１１以上と定義する。
本発明の一態様として、標的物質である抗体を、アガロオリゴ糖を有効成分とする修飾剤により修飾した結果、ガラクトースを含有する、水溶性が改善された抗体が提供される。
発明の詳細な説明
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明に使用する本発明の化合物のＲは標的物質の性状を改変することができればよく、特に限定はないが、例えば、糖質であり、例えば標識化合物であり、例えば、組織特異的親和性物質である。
本発明で使用する式Ｉで表わされる化合物の例としては、３，６−アンヒドロガラクトピラノース、その硫酸化体又はそのメチル化体を還元末端に有する化合物が挙げられる。当該化合物としてはアガロオリゴ糖、カラオリゴ糖が例示され、例えばアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、カラビオース、カラテトラオース、カラヘキサオース、カラオクタオース等があり、これらの化合物から選択される化合物を使用し、簡便に目的の標的物質、例えばペプチドをガラクトース等で修飾することができる。これらのオリゴ糖によるペプチドの修飾は、そのオリゴ糖：ペプチド＝１００〜１：１、オリゴ糖０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ中性乃至酸性領域の緩衝液中、１０秒〜７２時間、５〜４５℃の条件で反応させることができ、その結果、ガラクトース等で修飾されたペプチドの水溶性が顕著に改善される。
本発明の式Ｉで表わされる化合物と当該化合物と反応性を有する標的物質を反応させる工程において、反応条件は修飾物が効率よく得られ、標的物質の本来の生理機能等が損なわれ無ければよく、得に限定はない。
例えば、上記のオリゴ糖から選択される化合物を使用し、ペプチドを修飾する場合は、好適にはオリゴ糖：標的物質＝１００〜１：１、オリゴ糖０．１〜１００ｍＭ、ｐＨ中性乃至酸性領域の緩衝液中、１０秒〜７２時間、５〜４５℃の条件で反応させることにより、本発明の修飾物を得ることができる。
従って、本発明において式Ｉで表わされる化合物と反応性を有する標的物質とは、式Ｉで表わされる化合物：標的物質＝１００〜１：１、式Ｉで表わされる化合物０．１〜１００ｍＭ、ｐＨ中性乃至酸性領域の緩衝液中、１０秒〜７２時間、５〜４５℃の条件で反応させることにより、式Ｉで表わされる化合物のＲで修飾される物質である。当該物質がＲで修飾されているか、否かは、反応後に得られる物質の理化学的性状を常法に従い分析することにより確認することができる。例えば、ペプチドにアガロビオースを反応させ当該ペプチドをガラクトースで修飾した場合は、修飾物の電気泳動を行い、修飾前と修飾後の泳動位置を比較することにより、修飾の有無を確認することができる。また修飾物の加水分解を行い、分解物中に含有されるガラクトースを分析しても良い。例えば標的物質がアミノ酸の場合は、例えばアガロビオースとの反応後、反応生成物を分取し、その構造解析を行えば良い。
本発明において標的物質が生理活性物質である場合は、その生理活性部位に式Ｉで表わされる化合物が反応しない条件を設定することが好ましい。例えば標的物質が抗体の場合は、抗体に抗原を結合させた後に、式Ｉで表わされる化合物を反応させればよく、標的物質が酵素の場合は、酵素を基質と結合させた後に式Ｉで表わされる化合物を反応させればよい。
本発明の修飾物は必要に応じ還元処理を行うことにより、より安定な修飾物を得ることができる。本発明において、還元は通常の還元方法を用いればよく、特に限定はないが、例えばジメチルアミンボランコンプレックス、ピリジルアミンボランコンプレックス、トリメチルアミンボランコンプレックス、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム、又は水素化ホウ素ナトリウム等の試薬を還元剤として用い、通常の方法で還元処理を行えばよい。
本発明の修飾剤としては、式Ｉで表わされる化合物を公知の液状又は固体状の担体と配合し、通常の方法で剤形化すればよい。
本発明の修飾用キット中には、式Ｉで表わされる化合物が含有されておればよいが、必要に応じて、還元剤、コントロール物質、緩衝液等から選択される物が含有されていてもよい。
式Ｉで表わされる化合物と標的物質を反応させることにより、穏和、かつ簡便にＲで修飾された修飾物を得ることができる。反応液中の修飾物は、必要に応じて、通常の精製手段で精製し、精製修飾物として使用することができる。
式Ｉで表わされる化合物、例えばアガロオリゴ糖を使用することにより標的物質、例えばペプチド、例えばモノクローナル抗体を、簡便にガラクトース含有化合物で修飾し、ガラクトース含有化合物で修飾された抗体を得ることができる。
従来、抗体を修飾する場合、その反応条件により抗体の抗原結合性が消失する場合が知られている。そのような修飾をうけた抗体は、保存中に析出し、不溶化する傾向があった。一方、本発明により、穏和な条件での抗体、例えばモノクローナル抗体の修飾が可能になり、得られる修飾物は抗原結合性を損なうことなく、水溶性が顕著に改善され、保存中の不溶化も防止されるという顕著に改善された性質を有する。
式Ｉで表わされる化合物を有効成分として生体に投与することにより、生体内の標的物質をＲで修飾することもできる。投与の剤型としては経口剤でも注射剤でもよく、式Ｉで表わされる化合物を有効成分として常法に従って作製すれば良い。投与の方法は経口投与でも静脈内投与でも筋肉内投与でも良い。式Ｉで表わされる化合物の投与量は、修飾する生体内標的物質により異なるが、一般には１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。
生体内標的物質としては、例えば抗体、酵素が例示され、本発明は生体内標的物質の修飾が必要な疾病、例えばリウマチ等の治療、予防に有用である。
式Ｉで表わされる化合物、例えばアガロオリゴ糖は１ｇ／ｋｇの投与量でマウスに投与しても急性毒性は認められない。
本発明によって、式Ｉで表わされる化合物を有効成分とする標的物質へのＲの付加剤が提供される。また、式Ｉで表わされる化合物を有効成分として使用する標的物質へのＲの付加方法が提供される。
また本発明は式Ｉで表わされる化合物の、標的物質へのＲの修飾剤としての使用を提供する。更に、本発明は式Ｉで表わされる化合物を有効成分とする標的物質へのＲの修飾を要する疾病の治療方法を提供する。
実施例
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）市販寒天（伊那寒天タイプＳ−７、伊那食品工業（株）社製）を脱塩水に１０％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、さらに強陽イオン交換樹脂（ダイヤイオン、三菱化学、ＳＫ−１０４）を水素イオン型にしたものを１％（ｗ／ｖ）になるように添加し、９０℃で３時間反応後、反応液を常温まで低下させ、ろ過により樹脂を除去した。得られたろ液は活性炭処理（活性炭濃度２％（ｗ／ｖ））で着色物質等を除去し、ろ過（ポアーサイズ：１μｍのフィルター）し、中和した後、常法に従って凍結乾燥し、アガロオリゴ糖を調製した。
このアガロオリゴ糖は水分２．３％、ガラクトース９．８％、アガロビオース４４．１％、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース等４３．４％であり、その１％の水溶液のｐＨは４．０であった。
アガロオリゴ糖を以下の条件に準じ、順相ＨＰＬＣを行い、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースをそれぞれ分取した。
2002066496.tif 000004
（２）市販のκ−カラゲナン（シグマ社製）を用い、実施例１−（１）に準じた方法で、カラオリゴ糖を調製し、当該カラオリゴ糖より、カラビオース、カラテトラオース、カラヘキサオース、カラオクタオースをそれぞれ分取した。
実施例２
１００ｍｇ／ｍｌの実施例１−（１）記載のアガロオリゴ糖とＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に１１．１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した牛血清アルブミン（シグマ社製、Ａ０２８１）を１：９の割合で混合し、３７℃で２４時間反応させ、牛血清アルブミンの修飾物を得た。
同様に、１００ｍｇ／ｍｌの実施例１−（１）記載のアガロオリゴ糖とＰＢＳ中に１１．１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したヒト免疫グロブリンＧ（オリエンタル酵母社製、ＩｇＭ−０４）を１：９の割合で混合し、３７℃で２４時間反応させ、ヒト免疫グロブリンＧの修飾物を得た。
上記の牛血清アルブミンの修飾物及びヒト免疫グロブリンＧの修飾物を非修飾物といっしょにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、どちらの修飾物も非修飾物と比べて高分子側にシフトが見られた。すなわち、牛血清アルブミンとヒト免疫グロブリンＧにアガロオリゴ糖が結合したことが強く示唆された。
両タンパク質にアガロオリゴ糖が結合していることを確認するため、両タンパク質の修飾物を透析して遊離アガロオリゴ糖を除去し、さらにＨＰＬＣにより高分子画分のみを集めた。ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
2002066496.tif 000005
分取したフラクションのタンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度を測定することにより求め、両タンパク質画分を集めた。コントロールとして、両タンパク質の非修飾物も同じ条件で分取した。次に得られたタンパク質画分中のガラクトース量を測定した。すなわち分取した各タンパク質画分を充分透析し、２Ｎ  ＨＣｌ中、１００℃、３時間で加水分解した後、乾固して生成した単糖の還元性末端をＧｌｙｃｏＴＡＧおよびＧｌｙｃｏＴＡＧ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（共に宝酒造社製）を用いて２−アミノピリジンで蛍光標識した。常法によりＨＰＬＣで糖組成分析し（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５，２８３−２８４（１９９１））、各タンパク質画分のガラクトース量を測定し、各修飾物と各非修飾物間で比較した。
その結果、牛血清アルブミンの修飾物では、１分子あたり８分子のガラクトースが結合していること、ヒト免疫グロブリンＧの修飾物では１分子あたり３〜４分子のガラクトースが結合していることが判明した。
また実施例１−（１）、（２）で分取した、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロペンタオース、アガロオクタオース、カラビオース、カラテトラオース、カラペンタオース、カラオクタオースをそれぞれ用いて同様に処理し、タンパク質へのガラクトース残基の導入を確認した。
実施例３
実施例２記載のＨＰＬＣにより分取した牛血清アルブミンの修飾物及びヒト免疫グロブリンＧの修飾物を水で充分透析し、凍結乾燥した。両タンパク質の凍結乾燥品を非修飾物の凍結乾燥品と同時に、水、およびＰＢＳに溶解させたところ、いずれの溶媒に対しても溶解性が優れていた。
実施例４
ＳＤラット（チャールズリバー社、３匹、雄、９週齢）に実施例１−（１）に記載のアガロオリゴ糖の生理食塩水溶解物（大塚製薬社製）の静脈内投与（６０ｍｇ／ｋｇ）を連日５回行った。
最終投与の５時間後に、ラット血清を調製し、当該血清中よりプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｈｉｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ：ファルマシア社製）で免疫グロブリンＧを分取した。別に、アガロオリゴ糖非投与群の免疫グロブリンＧも同じ方法で調製し、投与群と非投与群の免疫グロブリンＧに結合したガラクトース含有量を比較した。ガラクトースの定量は実施例２に記載の方法を用いた。
その結果、投与群では非投与群に比べて免疫グロブリン２．５分子あたり、１分子のガラクトースが余分に検出された。
産業上の利用の可能性
本発明により、標的物質の修飾を、従来にない穏和な条件で、かつ簡便に行いうる修飾剤が提供される。この修飾剤は、標識物質の物性の改変に、例えば水溶性の改善等に有用である。また当該修飾剤で修飾された標的物質が提供され、当該標的物質は機能の付加された高機能型標的物質として有用である。
また本発明の修飾剤は生体内での標的物質の修飾を可能にし、生体内での標的物質の修飾を要する疾病の治療剤、予防剤としても有用である。
【国際調査報告】
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