(57)【要約】酸化還元酵素（例えば、グルコース酸化酵素、コレステロール酸化酵素、フルクトシルアミン酸化酵素、グルコース脱水素酵素）と、電子伝達蛋白質（例えば、シトクロームＣ、シトクロームｂ５６２、シトクロームｃ５５１）とを有する酵素電極、ならびに該酵素電極を作用極として用いることを特徴とするセンサーが開示される。この酵素電極は、高い応答電流値を与えることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元酵素と電子伝達蛋白質とを有する酵素電極。
【請求項２】
酸化還元酵素がピロロキノリンキノンを補酵素とする酸化還元酵素である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項３】
酸化還元酵素がフラビンを補酵素とする酵素である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項４】
酸化還元酵素が、グルコース酸化酵素、コレステロール酸化酵素、乳酸酸化酵素、アルコール酸化酵素、ガラクトース酸化酵素、ビリルビン酸酸化酵素、フルクトシルアミン酸化酵素、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−３−脱水素酵素からなる群より選択される、請求項１記載の酵素電極。
【請求項５】
電子伝達蛋白質がシトクロームＣである、請求項１記載の酵素電極。
【請求項６】
電子伝達蛋白質がシトクロームｂ５６２である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項７】
電子伝達蛋白質が配列番号６のＡｌａ２４からＡｒｇ１２９または配列番号８のＡｌａ２４からＡｒｇ１２９のアミノ酸配列を有する蛋白質である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項８】
電子伝達蛋白質がシトクロームｃ５５１である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項９】
酸化還元酵素がグルコース酸化酵素であり、電子伝達蛋白質がシトクロームｂ５６２である請求項１記載の酵素電極。
【請求項１０】
酸化環元酵素がコレステロール酸化酵素であり、電子伝達蛋白質がシトクロームｂ５６２である請求項１記載の酵素電極。
【請求項１１】
酸化還元酵素が乳酸酸化酵素であり、電子伝達蛋白質がシトクロームｂ５６２である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項１２】
酸化還元酵素がフルクトシルアミン酸化酵素であり、電子伝達蛋白質がシトクロームｂ５６２である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項１３】
酸化還元酵素がグルコース脱水素酵素であり、電子伝達蛋白質がシトクロームｂ５６２である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項１４】
酸化還元酵素がピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）であり、電子伝達蛋白質がシトクロームｂ５６２である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項１５】
酸化還元酵素がフラビンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、電子伝達蛋白質がシトクロームｂ５６２である、請求項１記載の酵素電極。
【請求項１６】
グルコース脱水素酵素とシトクロームＣとが化学的に架橋された状態で電極上に装着されていることを特徴とする酵素電極。
【請求項１７】
グルコース脱水素酵素とシトクロームｂ５６２とが化学的に架橋された状態で電極上に装着されていることを特徴とする酵素電極。
【請求項１８】
架橋がグルタルアルデヒドを用いて行われたものである、請求項１６または１７に記載の酵素電極。
【請求項１９】
シトクロームｂ５６２が大腸菌由来シトクロームｂ５６２である請求項６、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７および１８のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項２０】
作用極として請求項１−１９のいずれかに記載の酵素電極を用いることを特徴とするセンサー。
【請求項２１】
電子メディエーターをさらに含む、請求項２０記載のセンサー。
【請求項２２】
電子メディエーターが、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート、フェロセンおよびその誘導体から選択される、請求項２１記載のセンサー。
【請求項２３】
ＰＱＱＧＤＨとシトクロームＣとが架橋された状態で電極上に装着されており、電子メディエーターがフェリシアン化カリウムである、請求項２１記載のセンサー。
【請求項２４】
ＰＱＱＧＤＨと大腸菌シトクロームｂ５６２とが架橋された状態で電極上に装着されており、電子メディエーターがフェリシアン化カリウムである、請求項２１記載のセンサー。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酵素電極およびこれを用いるバイオセンサーに関する。
背景技術
酵素電極とは、金電極、白金電極、カーボン電極等の電極表面上に酵素が固定化されている電極である。酵素電極は、酵素の反応特異性を利用して、種々の生理活性物質を特異的に検出するバイオセンサーとして広く用いられている。
例えば、血糖値を簡便かつ迅速に測定しうるグルコースセンサーが開発されている。グルコースセンサー素子としては、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）が最もよく用いられている。ＧＯＤは、熱に安定であり、安価に大量に供給される酵素であるため、頻繁に用いられてきた。さらに、電極への印加電圧を低下させて夾雑物質の影響を低くするために、測定系にフェリシアン化カリウム等の種々の電子メディエーターを加えることが試みられている。また、溶存酸素濃度に影響されないメディエーター型のセンサー素子としてグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）を用いることができる。例えば補酵素結合型のＰＱＱグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の使用が試みられている（特開平１０−２４３７８６、ＷＯ００／６６７４４、ＷＯ００／６１７３０）。
また、コレステロール酸化酵素、フルクトシルアミン酸化酵素等を用いて、それぞれ血中のコレステロールやフルクトシルアミンの濃度を測定するための酵素電極も研究されている（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８（１１），８６９−８７１，２０００）。
しかし、これらの酸化還元酵素を酵素電極に応用する場合、電極の応答電流値が低いことが問題であった。これは、これらの酸化還元酵素から電極への、あるいは電子メディエーターへの電子移動速度が低いことが原因である
従って、本発明は、より高い応答電流値を得ることができる酵素電極を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、電極上に酸化還元酵素とともに電子伝達蛋白質を固定化することにより、高い応答値を有する酵素電極が得られることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、酸化還元酵素と電子伝達蛋白質とを有する酵素電極を提供する。
酸化還元酵素とは、酸化還元反応を触媒する酵素をいう。好ましくは、酸化還元酵素は、ピロロキノリンキノンを補酵素とする酸化還元酵素、またはフラビンを補酵素とする酸化還元酵素である。より好ましくは、酸化還元酵素は、グルコース酸化酵素、コレステロール酸化酵素、乳酸酸化酵素、アルコール酸化酵素、ガラクトース酸化酵素、ビリルビン酸酸化酵素、フルクトシルアミン酸化酵素、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−３−脱水素酵素からなる群より選択される。
電子伝達蛋白質とは、生体の酸化還元系において、電子供与体から電子を受け取って還元され、次いで電子受容体に電子を渡して酸化されることのできる蛋白質をいう。好ましくは、電子伝達蛋白質はシトクロームｂおよびシトクロームＣであり、さらに好ましくはシトクロームｂ５６２である。また、好ましくは電子伝達蛋白質として用いるシトクロームｂ５６２は大腸菌由来のシトクロームｂ５６２である。また、電子伝達蛋白質として用いるシトクロームｂ５６２としてはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはその他の細菌に由来するシトクロームｂ５６２も利用できる。さらに好ましくは該シトクロームｂ５６２は、大腸菌により組換え生産された蛋白質である。
電子伝達蛋白質を酸化還元酵素とともに電極上に固定化することにより、酸化還元酵素から電極への、あるいは電子メディエーターへの電子伝達を促進することができ、このことにより応答電流値の高い酵素電極を得ることができる。図１に、本発明の１つの態様である、ＰＱＱグルコース脱水素酵素、シトクロームｂ５６２および電子メディエータを用いた系における電子伝達を示す。
特に好ましくは、本発明の酵素電極は以下の酸化還元酵素と電子伝達蛋白質の組み合わせから選択される：グルコース酸化酵素とシトクロームｂ５６２、コレステロール酸化酵素とシトクロームｂ５６２、乳酸酸化酵素とシトクロームｂ５６２、フルクトシルアミン酸化酵素とシトクロームｂ５６２、グルコース脱水素酵素とシトクロームｂ５６２、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）とシトクロームｂ５６２、フラビンを補酵素とするグルコース脱水素酵素とシトクロームｂ５６２。
本発明の酵素電極は、これらの酸化還元酵素と電子伝達蛋白質とを電極表面上に固定化することにより製造することができる。好ましくは、これらの酸化還元酵素と電子伝達蛋白質とは化学的に架橋された状態で電極上に装着される。架橋は、例えばグルタルアルデヒドを用いて行うことができる。
また、本発明の特に好ましい態様においては、本発明の酵素電極は、電子メディエーターを含まない系においても、高い応答電流値を与えることができる。
別の観点においては、本発明は、作用極として上述の本発明の酵素電極を用いることを特徴とするセンサーを提供する。
本明細書において用いる場合、センサーとは、目的とする被検物質の濃度を電気化学的に測定する測定系をいい、通常は、作用極（酵素電極）、対極（白金等）、および参照極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）等の３電極を含む。あるいは、通常の簡易血糖値システムに多様されている作用極と対極とから構成される２電極系でもよい。センサーはさらに、緩衝液および被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を含む。センサーは、バッチ型であってもフロー型であってもよい。このような、酵素センサーの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｐ．Ｆ．Ｔｕｎｅｒ，Ｉｓａｏ  Ｋａｒｕｂｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒｏｇｅ  Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７に記載されている。
好ましくは、本発明のセンサーはさらに電子メディエーターを含む。電子メディエーターとは、本発明の酸化還元酵素から電極への電子伝達を媒介しうる非蛋白質性の金属錯体、有機化合物などの酸化還元物質をいい、例えば、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート、フェロセンおよびこれらの誘導体が挙げられる。
発明を実施するための最良の形態
本発明の酵素電極は、その表面に酸化還元酵素および電子伝達蛋白質が固定化されていることを特徴とする。本発明の酵素電極は、酸化還元酵素が単独で固定化されている酵素電極よりも高い応答性を示す。
本発明において用いることができる酸化還元酵素の例としては、グルコース酸化酵素、コレステロール酸化酵素、乳酸酸化酵素、アルコール酸化酵素、ガラクトース酸化酵素、ビリルビン酸酸化酵素、フルクトシルアミン酸化酵素、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−３−脱水素酵素が挙げられる。特に好ましくは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（本明細書において「ＰＱＱＧＤＨ」と称する）である。ＰＱＱＧＤＨは、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する酵素であり、グルコースセンサーの素子として用いることができる。ＰＱＱＧＤＨは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株においてその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６）。
本発明の酵素電極においては、好ましくは水溶性ＰＱＱＧＤＨ、特に好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨを用いる。これは同細菌から単離精製した酵素でもよく、あるいはＫｏｊｉ  Ｓｏｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２６，４９１−４９６（２０００）に示されるように大腸菌などで組換え生産された酵素でもよい。あるいはＷＯ００／６１７３０に示されているような耐熱性が向上した改良型ＰＱＱＧＤＨあるいはＷＯ００／６６７４４に示されているような基質特異性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨでもよい。
本発明において用いられる酸化還元酵素は、天然の酸化還元酵素の構造の一部が化学的に改変されている改変型酸化還元酵素であってもよい。このような改変型酵素は、例えば、酵素蛋白質の１またはそれ以上のアミノ酸残基を他の天然のまたは天然に存在しないアミノ酸残基で置換することにより、あるいは１またはそれ以上のアミノ酸を欠失させるかまたは付加することにより製造することができる。
本発明に用いる電子伝達蛋白質の例としてはシトクロームＣが挙げられる。シトクロームＣとしては特に由来は限定されないが、たとえばシグマ社から販売されている馬心臓由来シトクロームＣを用いることができる。また同様に電子伝達蛋白質としてシトクロームｂ５６２を用いることができる。シトクロームｂ５６２としては由来は限定されないが、たとえば大腸菌由来シトクロームｂ５６２を用いることができる。大腸菌由来シトクロームｂ５６２は大腸菌を培養し、その細胞破砕液から精製し、調製してもよい。大腸菌からシトクロームｂ５６２を調製する方法は、例えば、Ｅ．Ｉｔａｇａｋｉ  ａｎｄ  Ｌ．Ｐ．Ｈａｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３２，１０１２−１０１９（１９６８）、Ｆ．Ｌｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４８，４２７−４４８（１９８１）に記載されている。また、大腸菌由来シトクロームｂ５６２はペリプラズムに分泌される蛋白質であるため、細胞外膜を浸透圧ショックなどの方法により破壊することにより、シトクロームｂ５６２を精製し、調製してもよい。
あるいは大腸菌Ｂ株由来シトクロームｂ５６２の構造遺伝子を大腸菌ゲノムから単離し、これを大腸菌で機能するｐＴｒｃ９９Ａのような発現ベクターに挿入し、組換え大腸菌を作成した後、組換え大腸菌を培養し、その細胞破砕液からシトクロームｂ５６２を精製し、調製してもよい。大腸菌Ｂ株由来シトクロームｂ５６２の遺伝子配列は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２（２），３０９−３１３（１９９１）に記載されている。
また、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株からＢ株由来シトクロームｂ５６２と類似する遺伝子がクローニングされている（Ｔｏｗｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１４３，１０９−１１１（１９９３））。この遺伝子は不活性であり、Ｂ株由来のシトクロームｂ５６２と比べ、Ｎ末端の７残基が欠失しており、かつシトクロームｂ５６２蛋白質中に３箇所の変異がある（Ｉｌｅ４０Ｖａｌ，Ａｌａ１２３Ｓｅｒ，Ｇｌｎ１２６Ｌｙｓ；ただし、Ｂ株由来ｂ５６２のＮ末端のＭｅｔを１として表す）。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株由来のシトクロームｂ５６２遺伝子の成熟蛋白質（配列番号６のＡｌａ２４からＡｒｇ１２９）をコードする領域を大腸菌で機能する分泌発現ベクターに挿入して組換え大腸菌を作成し、この大腸菌からシトクロームｂ５６２を調製してもよい。または、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ株由来のｂ５６２遺伝子の成熟蛋白質（配列番号８のＡｌａ２４からＡｒｇ１２９）をコードする領域を大腸菌で機能する分泌発現ベクターに挿入して組換え大腸菌を作成し、この大腸菌からシトクロームｂ５６２を調製してもよい。あるいは、Ｂ株由来のシトクロームｂ５６２遺伝子の一部とＫ株由来のシトクロームｂ５６２遺伝子の一部とを連結させ、これを大腸菌で機能するｐＴｒｃ９９Ａのような発現ベクターに挿入し、組換え大腸菌を作成した後、組換え大腸菌を培養し、その細胞破砕液からキメラシトクロームｂ５６２を調製してもよい。さらに、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｎｕｌｉｕｍ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｍｉａｅ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓ．ｐｈｅｕｍｏｎｉａｅ等の細菌に由来するシトクロームｂ５６２を用いてもよい。
また、本発明において用いられる電子伝達蛋白質は、天然の蛋白質の構造の一部が化学的に改変されている改変型電子伝達蛋白質であってもよい。このような改変型蛋白質は、例えば、蛋白質の１またはそれ以上のアミノ酸残基を他の天然のまたは天然に存在しないアミノ酸残基で置換することにより、あるいは１またはそれ以上のアミノ酸を欠失させるかまたは付加することにより製造することができる。
本発明の酵素電極に用いる電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。特に好ましいものはカーボンペースト電極である。
本発明の酵素電極を製造するためには、酸化還元酵素と電子伝達蛋白質を混合して混合蛋白質を調製する。この混合蛋白質は、酵素電極において被検物質（例えばグルコース）の存在を認識し、その酸化還元反応を触媒し、その結果生じる電子を電極に伝達するよう作用する。酸化還元酵素と電子伝達蛋白質との混合比は一般にはモル比で、１：１〜１：１００００、好ましくは１：１０〜１：５０００、さらに好ましくは１：５０〜１：１０００である。得られた混合蛋白質は、そのままカーボンペーストなどの電極材料と混合して電極に装着することができる。あるいは一般の酵素固定化方法を用いて固定化酵素を調製したあとに電極上に装着してもよい。例えば、両者を混合した後にグルタルアルデヒドなどの二架橋性試薬で架橋処理する、光架橋性ポリマーや導電性ポリマーや酸化還元ポリマーなどの合成ポリマーあるいは天然高分子マトリックス中に包括固定する方法があげられる。このようにして調製した混合蛋白質をカーボンペーストと混合あるいはカーボンペーストと混合した後にさらに架橋処理することにより調製した混合物をカーボンあるいは金、あるいは白金などで構成される電極上に装着する。
さらにこのようにして電極上に複合蛋白質を装着するときに同時に電子メディエーターを固定することも可能である。典型的には、ＰＱＱＧＤＨとシトクロームＣまたはシトクロームｂ５６２とを混合し、これをさらにカーボンペーストと混合した後に凍結乾燥する。これをカーボン電極上に装着し、その状態でグルタルアルデヒド水溶液に浸し、複合蛋白質を架橋し、酵素電極を作成する。
本発明のセンサーは、作用極として上述の酵素電極を有することを特徴とする。対極としては例えば白金電極を、参照電極としては例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いることができる。本発明のセンサーは、さらに電子メディエーターを含むことができる。電子メディエーターとしては、特に限定されないが、例えばフェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート、フェロセンおよびその誘導体などを用いることができる。好ましくはフェリシアン化カリウムを用いる。
被検試料、例えばグルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、電子メディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極としてＰＱＱＧＤＨとシトクロームＣあるいはシトクロームｂ５６２を固定化した酵素電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにグルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００１−７０４２１号および２００１−２８１９８５号の明細書に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
実施例
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１  組換えシトクロームｂ５６２の調製
Ｎｉｋｋｉｌａ，Ｈ．，Ｇｅｎｎｉｓ，Ｒ．Ｂ．ａｎｄ  Ｓｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２（２），３０９−３１３（１９９１）及びＴｏｗｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１４３，１０９−１１１（１９９３）にしたがい、以下の２組のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、それぞれを用いて大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ株のゲノムに対してＰＣＲ法によりシトクロームｂ５６２の構造遺伝子領域を増幅した。それぞれの大腸菌からのゲノムＤＮＡの抽出方法は常法に従った。ＰＣＲプライマーとして、フォワード側に制限酵素ＮｃｏＩにより認識される配列およびシトクロームｂ５６２の分泌のためのＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ株由来のシグナル配列の領域を増幅あるいは付加させる配列を含むプライマー（Ｂ  ＣｙｂＣ  Ｆｗ  ＮｃｏＩ）と含まないプライマー（ＣｙｂＣ  Ｆｗ  ｗ／ｏ  ＳＰ）をデザインし、リバース側に制限酵素Ｂａｍ  ＨＩにより認識される配列を含むプライマー（Ｂ  ＣｙｂＣ  Ｒｅｖ  Ｂａｍ  ＨＩ，Ｋ  Ｃｙｂ  Ｒｅｖ  Ｂａｍ  ＨＩ）をデザインした。
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Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α株に対してはＢ  ＣｙｂＣ  Ｆｗ  ＮｃｏＩ−Ｋ  Ｃｙｂ  Ｒｅｖ  Ｂａｍ  ＨＩあるいはＣｙｂＣ  Ｆｗ  ｗ／ｏ  ＳＰ−Ｋ  ＣｙｂＣ  Ｒｅｖ  Ｂａｍ  ＨＩのプライマーの組み合わせ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ株に対してはＢ  ＣｙｂＣ  Ｆｗ  ＮｃｏＩ−Ｂ  ＣｙｂＣ  Ｒｅｖ  Ｂａｍ  ＨＩあるいはＣｙｂＣ  Ｆｗ  ｗ／ｏ  ＳＰ−Ｂ  ＣｙｂＣ  Ｒｅｖ  Ｂａｍ  ＨＩのプライマーの組み合わせでＰＣＲを行い、それぞれの対応する遺伝子領域を増幅した。
それぞれの増幅遺伝子断片を大腸菌での発現ベクターであるｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−Ｂａｍ  ＨＩサイトに挿入し、シトクロームｂ５６２発現用ベクターとしてそれぞれ、ｐＴｒｃ９９Ａ−ＫｃｙｂＣとｐＴｒｃ９９Ａ−ＫｃｙｂＣ  ｗ／ｏ  ＳＰおよびｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｃｙｂＣとｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｃｙｂＣ  ｗ／ｏ  ＳＰ，を構築した。これらをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株に形質転換し、シトクロームｂ５６２を生産する組換え大腸菌を作成した。
なお、クローニング及び発現に用いたＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ株のシトクロームｂ５６２の構造遺伝子配列とアミノ酸配列を配列番号５及び６に、またクローニング及び発現に用いたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ株のシトクロームｂ５６２の構造遺伝子配列とアミノ酸配列を配列番号７及び８に示す。
このようにして作成した組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地にて３７℃で振とう培養し、集菌後、超音波破砕により細胞抽出液を得た。その結果、いずれの発現ベクターが形質転換されている組換え大腸菌においてもシトクロームｂ５６２由来の赤色が確認されシトクロームｂ５６２が水溶性蛋白質として生産されていることが明らかとなった。
この中で生産性の高かった形質転換体は発現ベクターとしてシグナル配列を含むシトクロームｂ５６２遺伝子が挿入されたｐＴｒｃ９９Ａ−ＫｃｙｂＣとｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｃｙｂＣが形質転換された株であり、いずれも大腸菌で発現され、ペリプラズムに大量にＥ．ｃｏｌｉＫ株およびＢ株由来のシトクロームｂ５６２が生産された。これらの組換え大腸菌を用いて、酵素電極作成に用いるシトクロームｂ５６２の調製を行った。
ｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｃｙｂＣあるいはｐＴｒｃ９９Ａ−ＫｃｙｂＣが形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬ培地にて３７℃で発酵槽にて培養した。対数増殖期にさしかかったところで、組換え遺伝子の誘導発現を行うためにＩＰＴＧを３００μＭ添加し、さらに、定常期にさしかかるまで培養を行った。集菌後、超音波破砕機により破砕し、細胞抽出液を得た。これをｐＨ７．２の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液で透析脱塩ののち、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌによる陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。得られた蛋白質はＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分子量１２．３ｋＤａであることが確認され、また、スペクトル解析からシトクロームｂ５６２の特徴的な５６２ｎｍにおける還元スペクトルが観察され、精製したシトクロームｂ５６２が調製された。
実施例２  ＰＱＱＧＤＨとシトクロームＣが固定化された酵素電極の作成
常法により精製したＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨ酵素溶液（３９００Ｕ・ｍｇ−１ｐｒｏｔｅｉｎ）にＰＱＱ１μＭ、ＣａＣｌ２１ｍＭとなるように加え、３０分暗所室温でインキュベートした。これを、１００倍量の１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で１晩透析した。シグマ社（Ｎｏ．Ｃ−７７５２）から購入した馬心臓由来シトクロームＣ（以下ｃｙｔ．ｃと表記することもある）を１ｍＭとなるように１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１００倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析したものを調製した。
このようにして調製したＰＱＱＧＤＨ（２５ｕｎｉｔ，０．６４ｘ１０−１０ｍｏｌ）、ｃｙｔ．ｃサンプル（酵素の１００倍モル量、０．６４ｘ１０−８ｍｏｌ）を同時にカーボンペースト２０ｍｇと混合し凍結乾燥した。これをよく混合した後、すでにカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。
この電極（酵素電極）を、１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０分室温で撹拌し、さらに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で２０分室温で攪拌した。この電極は１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で１時間以上室温で撹拌し、平衡化した。
実施例３  ＰＱＱＧＤＨとシトクロームＣ（ｃｙｔ．ｃ）と電子メディエーターとしてのフェリシアン化カリウムから構成されるセンサーを用いるグルコースの計測
恒温セルに１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を入れ、メディエーターとして、終濃度１０ｍＭフェリシアン化カリウムを加え、総量を１０ｍｌとした。そこに作用電極として実施例２で作成したＰＱＱＧＤＨおよびシトクロームＣが固定されているカーボンペースト電極（酵素電極）、対極として白金電極、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を挿入し、センサーを作成した。
測定は全て２５℃で行った。印加電位＋４００ｍＶ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの電位を印加した。電流が定常になったところで、適当な濃度のグルコースを加えて増加した電流値を計測した。グルコースを加えていないときの電流値を０Ａとした。
ＰＱＱＧＤＨ単独を固定してある酵素電極、ＰＱＱＧＤＨとそのモル数の１００倍量のｃｙｔ．ｃを固定してある酵素電極を用い、フェリシアン化カリウムを電子メディエーターとしたときのグルコース試料注入に対する応答を図２に示す。このように、ＰＱＱＧＤＨとそのモル数の１００倍量のｃｙｔ．ｃを固定している酵素電極のほうがはるかに大きな応答を示し、感度が高いことが示された。
図３にはＰＱＱＧＤＨ単独を固定してある酵素電極、ＰＱＱＧＤＨとそのモル数の１００倍量のｃｙｔ．ｃを固定してある酵素電極を用い、フェリシアン化カリウムを電子メディエーターとしたときのキャリブレーションカーブを示した。それぞれの電極のグルコース濃度４．２ｍＭでの応答電流値を比較した。グルコース濃度４．２ｍＭでの各電極の応答電流値はＰＱＱＧＤＨ単独固定化酵素電極では０．５ｎＡ、ＰＱＱＧＤＨとそのモル数の１００倍量のｃｙｔ．ｃを固定している酵素電極では２２ｎＡが得られた。ｃｙｔ．ｃを固定化することによって、ＰＱＱＧＤＨのグルコースに対する応答電流値が酵素単独の電極に比べ、約４０倍になったことがわかった。
また、電極に固定化するｃｙｔ．Ｃの量を変えて測定したところ、ｃｙｔ．ｃの固定化量にほぼ比例して応答電流値に増加がみられた（データ示さず）。
実施例４  ＰＱＱＧＤＨとシトクロームｂ５６２が固定化された酵素電極の作成
常法により精製したＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨ酵素溶液（３９００Ｕ・ｍｇ−１ｐｒｏｔｅｉｎ）にＰＱＱ１μＭ、ＣａＣｌ２１ｍＭとなるように加え、３０分暗所室温でインキュベートした。これを、１００倍量の１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で１晩透析した。実施例１で示した方法で調製したシトクロームｂ５６２（ｃｙｔ．ｂ５６２）を１ｍＭとなるように１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１００倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析したものを調製した。
このようにして調製したＰＱＱＧＤＨ（２５ｕｎｉｔ，０．６４ｘ１０−１０ｍｏｌ）、ｃｙｔ．ｂ５６２サンプル（酵素の１００倍モル量、０．６４ｘ１０−８ｍｏｌ）を同時にカーボンペースト２０ｍｇと混合し凍結乾燥した。これをよく混合した後、すでにカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。
この電極（酵素電極）を、１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０分室温で撹拌し、さらに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で２０分室温で攪拌した。この電極は１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で１時間以上室温で撹拌し、平衡化した。
実施例５  ＰＱＱＧＤＨとシトクロームｂ５６２と電子メディエーターとしてのフェリシアン化カリウムから構成されるセンサーを用いるグルコースの計測
恒温セルに１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を入れ、メディエーターとして、終濃度１０ｍＭフェリシアン化カリウムを加え、総量を１０ｍｌとした。そこに作用電極として実施例４で作成したＰＱＱＧＤＨおよびｃｙｔ．ｂ５６２が固定されているカーボンペースト電極（酵素電極）、対極として白金電極、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を挿入し、センサーを作成した。
測定は全て２５℃で行った。印加電位＋４００ｍＶ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの電位を印加した。電流が定常になったところで、適当な濃度のグルコースを加えて増加した電流値を計測した。グルコースを加えていないときの電流値を０Ａとした。
ＰＱＱＧＤＨ単独が固定されている酵素電極、固定されているＰＱＱＧＤＨに対して当モル数のｃｙｔ．ｂ５６２が固定されている酵素電極、固定されているＰＱＱＧＤＨに対して１００倍量のモル数のｃｙｔ．ｂ５６２が固定されている酵素電極、また前述と同量のｃｙｔ．ｂ５６２が固定されていてＰＱＱＧＤＨを含まない電極について、それぞれの応答電流値のグルコース濃度依存性を図４に示した。それぞれの電極のグルコース濃度５．０ｍＭでの応答電流値を比較した。グルコース濃度５．０ｍＭでの各電極の応答電流値は、ＰＱＱＧＤＨ単独固定化酵素電極は１．０ｎＡ以下、ｃｙｔ．ｂ５６２単独固定化電極が０ｎＡ、固定されているＰＱＱＧＤＨに対して当モル数のｃｙｔ．ｂ５６２が固定されている酵素電極では５ｎＡ，固定されているＰＱＱＧＤＨに対して当モル数のｃｙｔ．ｂ５６２が固定されている酵素電極では６５ｎＡが得られた。ｃｙｔ．ｂ５６２を固定化することによって、ＰＱＱＧＤＨのグルコースに対する応答電流値が、ＰＱＱＧＤＨ単独で固定化されている電極に比べ、約６０倍以上になったことがわかった。
実施例６  ＰＱＱＧＤＨとシトクロームｂ５６２が固定化された酵素電極の作成
実施例４と同様にして調製したＰＱＱＧＤＨ（２５ｕｎｉｔ，０．６４ｘ１０−１０ｍｏｌ）、ｃｙｔ．ｂ５６２サンプル（酵素の１００倍モル量、０．６４ｘ１０−８ｍｏｌ）を同時にカーボンペースト２０ｍｇと混合し凍結乾燥した。これをよく混合した後、すでにカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。
この電極を、１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０分室温で撹拌し、さらに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で２０分室温で攪拌した。この電極（酵素電極）は１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で１時間以上室温で撹拌し、平衡化した。
実施例７  ＰＱＱＧＤＨとシトクロームｂ５６２が固定化された酵素電極を用いるグルコースの計測
恒温セルに１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を入れ、メディエーターを添加せずに総量を１０ｍｌとした。そこに作用電極として実施例６で作成したＰＱＱＧＤＨおよびｃｙｔ．ｂ５６２が固定されているカーボンペースト電極（酵素電極）、対極として白金電極、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を挿入し、センサーを作成した。
測定は全て２５℃で行った。印加電位＋４００ｍＶ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの電位を印加した。電流が定常になったところで、適当な濃度のグルコースを加えて増加した電流値を計測した。グルコースを加えていないときの電流値を０Ａとした。
固定されているＰＱＱＧＤＨと当モル量のｃｙｔ．ｂ５６２が固定されている酵素電極、固定されているＰＱＱＧＤＨと１００倍量のｃｙｔ．ｂ５６２が固定されている酵素電極のキャリブレーションカーブを図５に示した。それぞれの電極のグルコース濃度５．０ｍＭでの応答電流値を比較した。グルコース濃度１０ｍＭでの各電極の応答電流値は、固定されているＰＱＱＧＤＨと当モル量のｃｙｔ．ｂ５６２が固定されている酵素電極では０ｎＡ、固定されているＰＱＱＧＤＨと１００倍量のｃｙｔ．ｂ５６２が固定されている酵素電極では３０ｎＡが得られた。すなわち、ＰＱＱＧＤＨとｃｙｔ．ｂ５６２を固定化した電極を用いることにより、センサーに電子メディエーターを添加しない条件でもグルコースが計測できることが示された。
実施例８  グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）および組換えｃｙｔ．ｂ５６２が固定化されている酵素電極およびメディエーターを用いるセンサー
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼ（１０１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）５ユニットとＥ．ｃｏｌｉによって組換え生産したＣｙｔｂ５６２  ４．３ｘ１０−８ｍｏｌ（ＧＯＤに対して１００倍モル量に相当する、０．６ｍｇ）とカーボンペースト２０ｍｇとを混合し、凍結乾燥した後にカーボンペースト電極に装着した。この電極を１％グルタルアルデヒド水溶液中で３０分間放置し、蛋白質同士を架橋した。このようにして作成した酵素電極を作用極とし、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極にＰｔ電極を用いた。この電極を１０ｍＭフェリシアン化カリウムをメディエーターとして含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に浸漬し、２５℃でバッチ方式でグルコース添加に伴う応答電流値を測定した。印加電位は＋４００ｍＶ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌとした。比較対照として、Ｃｙｔｂ５６２を含まないＧＯＤ固定化電極を同一の方法で作成し、グルコース添加に伴う応答を測定した。
結果を図６に示す。Ｃｙｔｂ５６２を混合しない比較対照の電極においてもグルコース添加により応答電流値の増加がみられる（内側のグラフ；黒丸）。しかし、本システムでの計測においてはその応答値はグルコース１０ｍＭにおいて３ｎＡ程度である。これに対して、Ｃｙｔｂ５６２を混合したＧＯＤ電極においては良好な応答性を示し、グルコース１０ｍＭにおいては６０ｎＡ以上とＣｙｔｂ５６２なしの場合の２０倍以上の応答を示した。
実施例９  グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびｃｙｔ．ｂ５６２が固定化されている酵素電極を用いる直接電子移動型センサー
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼ（６９Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）５ユニットとＥ．ｃｏｌｉによって組換え生産したＣｙｔｂ５６２  ４．３ｘ１０−８ｍｏｌ（ＧＯＤに対して１００倍モル量に相当する、０．６ｍｇ）とカーボンペースト２０ｍｇとを混合し、凍結乾燥した後にカーボンペースト電極に装着した。この電極を１％グルタルアルデヒド水溶液中で３０分間放置し、蛋白質同士を架橋した。このようにして作成した酵素電極を作用極とし、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極にＰｔ電極を用いた。この電極を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に浸漬し、最クリックボルタもグラム（ＣＶ）を２５℃で観測した。掃印速度は５０ｍＶ／ｓｅｃとし、−３００ｍＶから＋３００ｍＶの範囲で電位を掃印した。さらにこの時バッチ方式で２０ｍＭグルコース添加に伴うＣＶの変化を測定した。
本実験の結果、電位＋３００ｍＶ（ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ）付近における電流値がグルコース添加によって明らかに増加していた。このような応答はＧＯＤを単独で固定化した系では観測されない。このことから、ＧＯＤとともにＣｙｔｂ５６２を固定化した酵素電極を用いて、人工電子メディエーターを介さない直接電子移動型のセンサーを構築できることが明らかとなった。
さらに電位を＋２５０ｍＶ（ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌとして）と固定したときの、本電極のグルコースに対するキャリブレーションカーブを図７に示す。それぞれの電極のグルコース濃度５．０ｍＭでの応答電流値を比較したところ、ＧＯＤ単独が固定された電極は応答電流値が観測されなかったが、ｂ５６２とともに固定した電極においては、グルコース濃度に依存した応答電流値が観測された。すなわち、ＧＯＤとｃｙｔ．ｂ５６２を固定化した電極を用いることにより、センサーに電子メディエーターを添加しない条件でもグルコースが計測できることが示された。
実施例１０  コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＤ）およびｃｙｔ．ｂ５６２が固定化されている酵素電極およびメディエーターを用いるセンサー
コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＤ；１２．７７Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）１．５ユニット（５．２６ｘ１０−１０ｍｏｌ）とＥ．ｃｏｌｉによって組換え生産したＣｙｔｂ５６２  ５．２６ｘ１０−８ｍｏｌ（ＣＯＤに対して１００倍モル量に相当する、０．７８９ｍｇ）とカーボンペースト２０ｍｇとを混合し、凍結乾燥した後にカーボンペースト電極に装着した。この電極を１％グルタルアルデヒド水溶液中で３０分間放置し、蛋白質同士を架橋した。このようにして作成した酵素電極を作用極とし、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対極にＰｔ電極を用いた。この電極を１０ｍＭフェリシアン化カリウムをメディエーターとして含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に浸漬し、２５℃でバッチ方式でコレステロール添加に伴う応答電流値を測定した。印加電位は＋４００ｍＶ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌとした。比較対照として、Ｃｙｔｂ５６２を含まないＣＯＤ固定化電極を同一の方法で作成し、コレステロール添加に伴う応答を測定した。コレステロール溶液は５．０ｍｇのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００と５００ｍｇのコレステロールとを混合、加熱融解後９０ｍｌの蒸留水を添加し煮沸冷却後、４．０ｇのコール酸ナトリウム塩を添加し溶解させた後、蒸留水を加え全量１００ｍｌとしたものを標準溶液として調製した。
結果を図８に示す。Ｃｙｔｂ５６２を混合しない比較対照の電極においてもコレステロール添加により応答電流値の増加がみられる（内側のグラフ；白丸）。しかし、本システムでの計測においてはその応答値はコレステロール濃度０．０２ｍＭで約１ｎＡ程度であり、またこれ以上の濃度においてもほぼ応答は飽和していた。これに対して、Ｃｙｔｂ５６２を混合したＣＯＤ電極においては良好な応答性を示し、コレステロール０．０２ｍＭにおいては２ｎＡ以上とＣｙｔｂ５６２なしの場合の２倍以上の応答を示した。さらに高濃度のコレステロールに対しても応答は飽和せず、０．５ｍＭ以上の濃度測定も可能であった。その時の応答値は２０ｎＡ以上とＣｙｔｂ５６２を用いない電極の応答値の最大値の２０倍近い値となった。
実施例１１  フルクトシルアミン酸化酵素（ＦＡＯＤ）およびシトクロームｂ５６２が固定化されている酵素電極およびメディエーターを用いるセンサー
Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１株由来のフルクトシルアミン酸化酵素（特開２０００−２７０８５５）を用いた。フルクトシルアミン酸化酵素を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で１晩透析した。ＦＡＯＤの活性測定は、２５℃において、１５ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、２０ｍＭフェノール、２０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ、１Ｍフルクトシルバリンをそれぞれ２０μｌ添加し、５００ｎｍの吸光度の変化を分光光度計を用いて測定した。このとき１分間に１μｍｏｌのＨ２Ｏ２が生成される酵素活性を１Ｕとし、モル吸光係数は１２８８０ｍＭ−１とした。
ＦＡＯＤ（０．４ｕｎｉｔ，５．０８ｘ１０−９ｍｏｌ）、ＦＡＯＤおよび酵素の２０倍モル量のｃｙｔｂ５６２（１．０１ｘ１０−７ｍｏｌ）、またはＦＡＯＤおよびｃｙｔｂ５６２および同タンパク量のＢＳＡを用いて、実施例２と同様にＦＡＯＤが固定化された酵素電極を作成した。恒温セルに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れ、メディエーターとして、終濃度１ｍＭ  ｍ−ＰＭＳを加え、総量を１０ｍｌとし、アルゴンを通気した。作用電極として作製したカーボンペースト電極を用い、対極として白金電極、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。測定は全て２５℃、印加電位＋１００ｍＶ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌで行った。電流が定常になったところで、適当な濃度のフルクトシルバリン溶液を加えて増加した電流値を計測した。フルクトシルバリンを加えていないときの電流値を０Ａとした。各電極のキャリブレーションカーブを図９に示す。ＦＡＯＤをＣｙｔｂ５６２とともに固定化した場合、フルクトシルバリンに対する応答電流値は、ＦＡＯＤのみ、ＦＡＯＤ＋１００ＢＳＡの電極に比べ、約４倍高かった。なお、ｍ−ＰＭＳを含まない系においてはいずれの電極でもフルクトシルバリンに対する応答は得られなかった。
実施例１２  ｃｙｔｂ５６２類似蛋白質のデータベース検索
ゲノム情報が公開されているさまざまな生物由来のアミノ酸配列に対してＥ．ｃｏｌｉＢ由来水溶性ｃｙｔｂ５６２とのホモロジー検索を行った（図１０）。Ｅ．ｃｏｌｉの他株のほかにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  ＣＬ１８とＹｅｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＯ９２にも水溶性ｃｙｔｂ５６２と高い相同性を示す配列が見られた。Ｙ．ｐｅｓｔｉｓはグラム陰性細菌であり、ペストの病原菌である。またグラム陰性短桿菌で、家畜の出血性敗血症などの感染症の原因菌として知られているＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ＰＭ７０にも相同性を示す配列が得られた。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６のＰｓｋｐＡタンパク質６１９残基中の２１０〜２８０残基に低い相同性領域を確認した。Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔａｉｎ  Ａ（ＰｓｐＡ）タンパク質は脳炎などの感染症の原因であるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの幼児用の免疫として考えられているタンパク質であり、この６１９残基中の前半部のαヘリックス領域と相同性が存在した。
また、これらのアミノ酸ホモロジー検索の結果をもとにポリペプチド間での保存残基を検索した。この結果、ヘム鉄と配位するＮ末端側のＭｅｔ７、Ｃ末端側のＨｉｓ１０２が保存され、配列全体ではＣ末端領域が保存されていることがわかった（図１１）。この結果をもとにｃｙｔｂ５６２の立体構造上で保存されている残基を三次元で表示させると、４番目のαヘリックスに保存されたアミノ酸残基が多く存在することと、ヘム鉄と接近する６１・６５番目（シグナル配列を除く）のＰｈｅ残基や１０５番目のＴｙｒ残基、ヘム鉄と配位する１０２番目のＨｉｓ残基を含む芳香族環を持つ残基の保存も確認できた。この結果はｃｙｔｂ５６２と構造が類似しているｃｙｔｃ’のヘム近傍に位置する芳香族アミノ酸（８２Ｐｈｅ，８６Ｔｒｐ，１２５Ｐｈｅ）が保存されている報告と一致する（ＰＣ  Ｗｅｂｅｒ，ＦＲ  Ｓａｌｅｍｍｅ（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，７７０２−７７０４）。ｃｙｔｃ’はｃｙｔｂ５６２と同様に４−αヘリックスバンドルを形成し、この立体構造が同じ領域のアミノ酸残基の相同性は、１７％と低い。しかし、両タンパク質の構造解析からｃｙｔｃ’・ｃｙｔｂ５６２のヘム鉄と配位する１０２Ｈｉｓ（ｃｙｔｂ５６２）１２２Ｈｉｓ（ｃｙｔｃ’）の立体的な位置が一致することと、ヘム近傍の対応する位置にある芳香族アミノ酸（ｃｙｔｂ５６２：６１Ｐｈｅ，６５Ｐｈｅ，１０５Ｔｙｒ）（ｃｙｔｃ’：８２Ｐｈｅ，８６Ｔｒｐ，１２５Ｐｈｅ）の残基とヘムとの配置類似性があることが示された（ＰＣ  Ｗｅｂｅｒ，ＦＲ  Ｓａｌｅｍｍｅ（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，７７０２−７７０４；Ｈａｍａｄａ  Ｋ，ＰＨ  Ｂｅｔｈｇｅｔ  ａｎｄ  ＦＳ  Ｍａｔｈｅｗｓ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７  ９４７−９６２；ＰＤ  Ｂａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ＡＲ  Ｆｅｒｓｈｔ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，８６５７−８６７０）。ｃｙｔｂ５６２のヘムは内部の疎水残基のポケットに位置し、プロトヘムとその側鎖のプロピオン酸が溶媒に露出した状態で１０２Ｈｉｓと７Ｍｅｔに配位されている。このとき、ヘム近傍に存在する６５Ｐｈｅの側鎖はプロトヘムと平行に位置し、水素結合を形成している。また、６１Ｐｈｅ，１０５Ｔｙｒもプロトヘムと相互作用していることから、これらの残基がヘムの配向に重要な残基であると考えられる。また、ヘム鉄と配位するＨｉｓ１０２（ｃｙｔｃ’：１２２）やＭｅｔ７（ｃｙｔｃ’：１６  ｎｏｔ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）の立体的な位置はｃｙｔの１，４番目のヘリックスによって決まり、とくにホロ型、アポ型における４番目のαヘリックスの形が変化しないことと、４番目のヘリックス上にあるｃｙｔｃ’ヘムとチオール結合するＣｙｓ１１８，１２１の立体的な位置がｃｙｔｂ５６２の９８Ａｒｇ，１０１Ｔｙｒの立体的な位置と一致していることから、４番目のαヘリックスの構造はタンパク質−ヘム相互作用に重要であると考えられる。これは、図１１に示されるアライメントの結果より、４番目のヘリックスに対してよく保存されていたことと一致する。このような４αヘリックスバンドルという特徴的な構造と、ヘムとの相互作用を強めていると考えられる芳香族アミノ���とαヘリックス上の残基の保存によって、ヘムが特定の配向を取り、共通した配置をとると考えられる。この結果、配置されたヘムの露出が高いために、溶媒の影響（ｐＨ）を受けやすいと考えられる。
実施例１３  Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来シトクロームＣｂ５６２の調製
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＭＧＨ７８５７８の公開されたゲノム情報をもとに、ＢＬＡＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂの水溶性シトクローム（ｃｙｂＣ）ｂ５６２のアミノ酸・塩基配列とのホモロジー検索を行い、相同性の高い領域を確認した。この領域を挟み、制限酵素サイト（ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ）を有するプライマーを設計し、これを用いて、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＣＴＣ４１８ゲノムに対してＰＣＲ増幅を行ったところ、約４００ｂｐの増幅断片が得られた。この塩基配列は、ｃｙｂＣ遺伝子と比較すると、遺伝子レベルで７０％、アミノ酸レベルで６７％の相同性を有していた（図１２）。
このＰＣＲ産物のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、実施例１に記載の発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ中にサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のシトクロームＣｂ５６２（ＫＮｃｙｔ．ｂ）をコードする遺伝子を含む大腸菌を培養した結果、赤い菌体を得た。この菌体のペリプラズム・水溶性・膜画分のスペクトルを観察したところ、両菌体のペリプラズム画分・水溶性画分にシトクロームの酸化型（４１８ｎｍ）および還元型（４２８ｎｍ，５６２ｎｍ）に特徴的なピークが認められた。
ＫＮｃｙｔ．ｂの精製は以下のように行った。ＫＮｃｙｔ．ｂをコードする遺伝子を含む大腸菌ＤＨ５αをＬＢ倍地，３７℃，２００ｒｐｍ，７Ｌスケールで培養した後、７，０００×ｇ，５ｍｉｎ，４℃にて集菌、５０ｍＭ  ｐ．ｐ．ｂ．（ｐＨ７．０）で洗浄後，−８０℃で一晩凍結した。この菌体を５０ｍＭ  ｐ．ｐ．ｂ．（ｐＨ７．０）に懸濁して融解し、遠心分離（１０，０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）し、上清にｐＨ４〜５となるようにＨＣｌを加え、４℃で１時間撹拌し、その後ｐＨ７となるようにＮａＯＨを加えた。超遠心分離（５，００００ｒｐｍ，６０ｍｉｎ，４℃）を行って上清を回収し、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で一晩透析した。このサンプルに対し、フェリシアン化カリウム（終濃度１０ｍＭ）を添加して、Ｃｙｔｂ５６２を酸化した後、ＰＤ−１０により脱塩した。このサンプルを陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ−５ＰＷ，Ａ；１０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．２，Ｂ；３００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．２，グラジエント８０％、９カラム容量）およびゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００，３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．２，）を行いて、精製ｃｙｔｂ５６２を得たのちＰＥＧ濃縮を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、１４ｋＤａ付近にシングルバンドが認められた。
ＫＮｃｙｔ．ｂの濃度は以下のようにして求めた。３００ｎｍ〜６００ｎｍの酸化型スペクトルを測定し、酸化型に特徴的なピーク（４１８ｎｍ，５３３ｎｍ）を確認した後に還元剤（ハイドロサルファイトナトリウム）を加え、還元型に特徴的なピーク（４２７ｎｍ，５３１ｎｍ，５６２ｎｍ）を測定した。還元型のＡＢＳ５６２ｎｍ−ＡＢＳ５７８ｎｍの吸光度の差スペクトルを求めて、Ｅ．ｃｏｌｉＢ由来ｃｙｔｂ５６２のモル吸光係数を用いて以下の計算式：
2002073181.tif 000004
にしたがって計算した。
実施例１４  Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のシトクロームＣｂ５６２の酸化還元電位
ＰＱＱＧＤＨ−Ｂに、ＰＱＱ、ＣａＣｌ２（各終濃度１μＭ・１ｍＭ）を加え、室温でホロ化（３０分）させた後、サンプル中からの過剰なＰＱＱを除くため一晩透析（１０ｍＭ  ＭＯＰＳｐＨ７．０，１ｍＭ  ＣａＣｌ２）を行った。これを酵素サンプルとして、０．５ＵのＧＤＨ−Ｂに対して特定倍モル量のＫＮｃｙｔ．ｂを加え、グルコース（終濃度５０ｍＭ）を添加して、単位時間あたりの還元型ｃｙｔｂ値の増加を５６２ｎｍと５７８ｎｍの差スペクトルより求めた。ＰＱＱＧＤＨ−Ｂ存在下におけるグルコース添加によって還元ピークの増加が見られた。また、ＰＱＱＧＤＨ−Ｂの濃度（ｍｏｌ／ｌ）に対するＫＮｃｙｔ．ｂの還元型の増加において濃度依存性が見られた（図１３）。すなわち、ＫＮｃｙｔ．ｂとＰＱＱＧＤＨ−Ｂとの間の直接電子移動が確認された。
実施例１５  ＰＱＱＧＤＨとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のシトクロームＣｂ５６２が固定化された酵素電極およびこれを用いるグルコースの計測
ＰＱＱＧＤＨ（２５ｕｎｉｔ，０．６４ｘ１０−１０ｍｏｌ）および実施例１３で調製したＫＮｃｙｔ．ｂ５６２サンプル（酵素の１００倍モル量、０．６４ｘ１０−８ｍｏｌ）を用いて、実施例２と同様に酵素電極を作成した。
恒温セルに１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を入れ、メディエーターとして、終濃度１０ｍＭフェリシアン化カリウムを加え、総量を１０ｍｌとした。作用電極としてＰＱＱＧＤＨおよびＫＮｃｙｔ．ｂが固定されているカーボンペースト電極（酵素電極）、対極として白金電極、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を挿入し、センサーを作成した。測定は実施例３と同様に行った。ＰＱＱＧＤＨおよびＫＮｃｙｔ．ｂが固定化されている電極は、ＰＱＱＧＤＨのみが固定化されている電極と比較して、グルコースに対する応答電流値が有意に高かった。
産業上の利用性
本発明の酵素電極およびこれを用いるバイオセンサーは、血糖値を測定するグルコースセンサーとして、血中のコレステロールやフルクトシルアミンの濃度を測定するセンサーとして有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＱＱグルコース脱水素酵素、シトクロームｂ５６２および電子メディエータを用いた系における電子伝達を示す。
図２は、ＰＱＱグルコース脱水素酵素とシトクロームＣを架橋固定化し、電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いたセンサー（Ａ）と、ＰＱＱグルコース脱水素酵素を単独で固定化し電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いたセンサー（ｂ）のグルコース試料注入への応答を示す。
図３は、ＰＱＱグルコース脱水素酵素とシトクロームＣを架橋固定化し電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いたセンサー（Ａ）と、ＰＱＱグルコース脱水素酵素を単独で固定化し電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いたセンサー（ｂ）のグルコース試料注入への応答電流値のグルコース濃度依存性を示す。
図４は、ＰＱＱグルコース脱水素酵素とシトクロームｂ５６２を架橋固定化し電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いたセンサーと、ＰＱＱグルコース脱水素酵素を単独で固定化し電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いたセンサーのグルコース試料注入への応答電流値のグルコース濃度依存性を示す。図中、ＧＢ２５Ｕ＋１００ｃｙｔ  ｂ−５６２は、ＰＱＱＧＤＨ２５Ｕに対して１００倍量のモル数のｃｙｔｂ５６２を固定化してある電極、ＧＢ２５Ｕ＋１ｃｙｔ  ｂ−５６２は、ＰＱＱＧＤＨ２５Ｕに対して１倍量のモル数のｃｙｔｂ５６２を固定化してある電極、１００ｃｙｔ  ｂ−５６２は、上記ＧＢ２５Ｕ＋１００ｃｙｔ  ｂ−５６２ｃｙｔｂ５６２と同量ｃｙｔｂ５６２だけが固定化してある電極、ＧＢ２５Ｕ  ｏｎｌｙは、ＰＱＱＧＤＨが２５Ｕだけ固定されている電極を示す。
図５は、ＰＱＱグルコース脱水素酵素とシトクロームｂ５６２を架橋固定化し、電子メディエータを添加しないで作成したセンサーの、グルコース試料注入への応答電流値のグルコース濃度依存性を示す。図中、ＧＢ２５Ｕ＋１００ｃｙｔ  ｂ−５６２は、ＰＱＱＧＤＨ２５Ｕに対して１００倍量のモル数のｃｙｔｂ５６２を固定化してある電極、ＧＢ２５Ｕ＋１ｃｙｔ  ｂ−５６２は、ＰＱＱＧＤＨ２５Ｕに対して１倍量のモル数のｃｙｔｂ５６２を固定化してある電極を示す。
図６は、グルコース酸化酵素とシトクロームｂ５６２を架橋固定化し、電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いたセンサーの、グルコース試料注入への応答電流値のグルコース濃度依存性を示す。
図７は、グルコース酸化酵素とシトクロームｂ５６２を架橋固定化し、電子メディエータを添加しないで作成したセンサーの、グルコース試料注入への応答電流値のグルコース濃度依存性を示す。
図８は、コレステロール酸化酵素とシトクロームｂ５６２を架橋固定化し、電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いたセンサーの、コレステロール試料注入への応答電流値のコレステロール濃度依存性を示す。
図９は、フルクトシルアミン酸化酵素とシトクロームｂ５６２を架橋固定化し、電子メディエータを添加しないで作成したセンサーの、フルクトシルバリン試料注入への応答電流値のフルクトシルバリン濃度依存性を示す。
図１０は、種々の通性嫌気性腸内細菌のゲノム中の、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ由来ｃｙｔ．ｂ５６２と相同性を示す配列の同一性および類似性を示す。
図１１は、種々の通性嫌気性腸内細菌のゲノム中の、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ由来ｃｙｔ．ｂ５６２と相同性を示す領域のアミノ酸配列を示す。
図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ由来ｃｙｔ．ｂ５６２とＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来ｃｙｔｂ５６２のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子の配列を示す。枠で囲まれているアミノ酸残基はヘム鉄に配位する保存アミノ酸である。
図１３は、ＰＱＱＧＤＨの存在下においてグルコースを添加したときのＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来シトクロームｂ５６２の還元を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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