(57)【要約】２つのサブユニットがジスルフィド結合を介して互いに連結されていることを特徴とする水溶性ＰＱＱＧＤＨが開示される。本発明の水溶性ＰＱＱＧＤＨは、改良された熱安定性を有することを特徴とする。
2002072839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのサブユニットが１またはそれ以上のジスルフィド結合を介して互いに連結されていることを特徴とする水溶性ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項２】
天然に存在するＰＱＱＧＤＨの、１またはそれ以上のシステイン以外のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されている、請求項１記載のＰＱＱＧＤＨ。
【請求項３】
前記ＰＱＱＧＤＨが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来である、請求項１記載のＰＱＱＧＤＨ。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の４１５番目のセリン残基が、システイン残基で置換されている、請求項３記載のＰＱＱＧＤＨ。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の４１４番目のチロシン残基が、システイン残基で置換されている、請求項３記載のＰＱＱＧＤＨ。
【請求項６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の４１４番目のチロシン残基および４１５番目のセリン残基が、両方ともシステイン残基で置換されている、請求項３記載のＰＱＱＧＤＨ。
【請求項７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４０番目のアスパラギン酸残基および４１８番目のチロシン残基が、両方ともシステイン残基で置換されている、請求項３記載のＰＱＱＧＤＨ。
【請求項８】
配列：
2002072839.tif 000016
を含む水溶性ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項９】
配列：
2002072839.tif 000017
を含む水溶性ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項１０】
配列：
2002072839.tif 000018
性ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項１１】
請求項１−１０のいずれかに記載のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項１４】
遺伝子が主染色体に組み込まれている、請求項１３記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項１−１０のいずれかに記載のＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１６】
請求項１−１０のいずれかに記載のＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。
背景技術
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。また、微生物を用いる発酵生産においては、プロセスをモニタリングするためにグルコース濃度を定量する。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）あるいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。しかし、ＧＯＤを用いる方法ではグルコース酸化反応にともない発生する過酸化水素を定量するためカタラーゼあるいはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要があった。Ｇ６ＰＤＨは分光学的手法に基づくグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならない。
このため、これまでのグルコース酵素定量方法に用いられてきたＧＯＤまたはＧ６ＰＤＨにかわる新たな酵素としてＰＱＱＧＤＨの使用が試みられている（特開平１０−２４３７８６、ＷＯ００／６６７４４、ＷＯ００／６１７３０）。ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子として有用である。
ＰＱＱＧＤＨは、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性酵素がある。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株においてその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨは、同一の５０ｋＤａのサブユニットから構成されるホモダイマー酵素である。各サブユニットは、１分子のＰＱＱおよび３個のＣａ＋＋を含む。ダイマー蛋白質は、２つの活性中心を有するが、モノマー酵素はＧＤＨ活性を示さない。したがって、ＧＤＨ活性を示すためには、ダイマー構造が形成されることが必須である。また、水溶性ＰＱＱＧＤＨのＸ線結晶構造解析がおこなわれ、同酵素の高次構造が明らかとなっている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９，３１９−３３３（１９９９），Ａ．Ｏｕｂｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９）５１８７−５１９４（１９９９），Ａ．Ｏｕｂｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９６（２１），１１７８７−１１７９１（１９９９），Ａ．Ｏｕｂｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）。
本発明は、改良された熱安定性を有する改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、２つのサブユニットが１またはそれ以上のジスルフィド結合を介して互いに連結されていることを特徴とする水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供する。
本明細書において「ＰＱＱＧＤＨ」とは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素を意味する。また、「改変型ＰＱＱＧＤＨ」とは、天然に存在するグルコース脱水素酵素の構造の一部が化学的に改変されているＰＱＱＧＤＨを意味する。かかる改変は、例えば、酵素蛋白質の１またはそれ以上のアミノ酸残基を他の天然のまたは天然に存在しないアミノ酸残基で置換することにより、あるいは１またはそれ以上のアミノ酸を欠失させるかまたは付加することにより行うことができる。なお、本明細書においては、ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸の位置は、開始メチオニンを１として番号付けする。したがって、配列番号１に示される最初のアミノ酸残基Ａｓｐは２５番目のアミノ酸残基である。
本明細書において、「ジスルフィド結合」とは、−Ｓ−Ｓ−結合を意味する。また、「サブユニット」とは、ダイマーを構成する各モノマーサブユニットをいう。
好ましくは、本発明の水溶性ＰＱＱＧＤＨは、天然に存在するＰＱＱＧＤＨの、１またはそれ以上のシステイン以外のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されている。また好ましくは、本発明の水溶性ＰＱＱＧＤＨは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来である。
本発明のＰＱＱＧＤＨの特に好ましい態様においては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の４１５番目のセリン残基がシステイン残基で置換されており、２つのサブユニット上のそれぞれのシステイン残基間にジスルフィド結合が形成されている。
また別の好ましい態様においては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の４１４番目のチロシン残基がシステイン残基で置換されており、２つのサブユニット上のそれぞれのシステイン残基間にジスルフィド結合が形成されている。
また別の好ましい態様においては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４０番目のアスパラギン酸残基および４１８番目のチロシン残基が、両方ともシステイン残基で置換されており、２つのサブユニット上のそれぞれのシステイン残基間にジスルフィド結合が形成されている。
本発明のＰＱＱＧＤＨの特に好ましい態様においては、本発明のＰＱＱＧＤＨは、配列：
2002072839.tif 000003
を含む。
また別の好ましい態様においては、本発明のＰＱＱＧＤＨは、配列：
2002072839.tif 000004
を含む。
また別の好ましい態様においては、本発明のＰＱＱＧＤＨは、配列：
2002072839.tif 000005
を含む。
本発明はまた、本発明のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明のＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットおよびグルコースセンサーを提供する。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの酵素蛋白質は高い熱安定性を有し、かつグルコースに対して高い酸化活性を有していることから、グルコースの高感度かつ高選択的な測定に応用できる。特に、酵素生産において調製／精製時の失活が少なく収率が高い、溶液中での安定性が高く酵素の保存が容易である、本酵素を用いてアッセイキットあるいは酵素センサーを作成する過程において失活が少なく、本酵素を用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーの熱安定性が高いことから、保存性に優れるといった利点が期待される。
発明を実施するための最良の形態
改変型ＰＱＱＧＤＨの構造
本発明のＰＱＱＧＤＨは、ホモダイマー構造において、２つのサブユニットが１またはそれ以上のジスルフィド結合を介して連結されており、このことにより、高い熱安定性を示すことを特徴とする。このような連結構造は、ダイマー構造の各モノマーの界面で互いに近接する位置に配置される１またはそれ以上のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換えて、サブユニット間にジスルフィド結合を形成させることにより構築することができる。
水溶性ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に規定されるアミノ酸配列を有し、Ｘ線結晶構造解析に基づいてその高次構造が明らかにされている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９，３１９−３３３（１９９９），ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９）５１８７−５１９４（１９９９））。この推定高次構造にしたがえば、ダイマー酵素が構築されたときに、両方のモノマー上のＳｅｒ４１５がモノマー界面上で互いに近接する位置に配置される。Ｓｅｒ４１５をＣｙｓに置換して、モノマー間にジスルフィド結合を形成させたところ、野生型と比較して非常に高い熱安定性を有する改変型酵素を得ることができた。
これは、ジスルフィド結合の形成により、水溶性ＰＱＱＧＤＨダイマーの４次構造の安定性が増大したためであると考えられる。このことは、架橋化学修飾（特開２０００−２６２２８１）またはテザー構造の構築（特開２００１−３７４８３）を用いてダイマー構造を安定化させることによりＰＱＱＧＤＨの熱安定性が増大するというこれまでの知見とも一致する。
さらに、本発明においては、ＰＱＱＧＤＨ−Ｂのダイマー界面で向き合う位置にあり、かつそれらの側鎖間距離が短いＡｓｎ３４０およびＴｙｒ４１８を両方ともＣｙｓに置換してモノマー間に２か所のジスルフィド結合を形成させることにより、野生型と比較して非常に高い熱安定性を有する改変型酵素を得ることができた。
当業者は、本発明の教示および酵素の推定高次構造に関する情報に基づいて、ダイマー構造において各モノマーの界面で互いに近接する位置に配置されるアミノ酸残基を予測し、この残基をシステインで置換することにより、熱安定性の向上した改変型グルコース脱水素酵素を得ることができる。置換すべきアミノ酸残基は、各モノマーの同じ位置に存在しなくてもよい。すなわち、各モノマーの界面において一方のモノマー上の第１のアミノ酸残基と他方のモノマー上の第２のアミノ酸残基とが近接する位置に配置される場合、これらの第１および第２のアミノ酸残基をともにシステイン残基に置換することができる。この場合には、２か所でジスルフィド結合が形成される。同様にして、３か所以上のジスルフィド結合を有するダイマー構造を構築することも可能である。
本発明の改変型グルコース脱水素酵素においては、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。そのようなアミノ酸残基の欠失、置換、付加のための種々の方法が当該技術分野において知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。当業者は、本明細書の教示にしたがって、そのようなアミノ酸残基の欠失、置換、付加を含むグルコース脱水素酵素が所望のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有しているか否かを容易に試験することができる。例えば、水溶性ＰＱＱＧＤＨの特定の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、基質であるグルコースに対する親和性を改良しうることが報告されている（特開２０００−３１２５８、特開２０００−３５０５８８）。
さらに、当業者は、他の生物に由来する水溶性ＰＱＱＧＤＨについても、その三次元構造を予測し解析することにより、本発明の教示にしたがって２つのモノマーの界面に位置するアミノ酸残基を予測し、これらの残基をシステイン残基に置換してジスルフィド結合を形成させることにより、熱安定性の向上した改変型グルコース脱水素酵素を得ることができる。特に、蛋白質の一次構造、二次構造または三次構造を比較することにより、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨの４１５番目のセリン残基または４１４番目のチロシン残基に相当するアミノ酸残基、または３４０番目のアスパラギン酸残基および４１８番目のチロシン残基の組み合わせに相当するアミノ酸残基の組み合わせを容易に理解することができ、本発明にしたがって、かかる残基をシステイン残基で置換して改変型グルコース脱水素酵素を得ることができる。これらの改変型グルコース脱水素酵素も本発明の範囲内である。
改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の配列は配列番号２で規定される。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子において、目的とするアミノ酸残基をコードする塩基配列を、システイン残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野において知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。
水溶性ＰＱＱＧＤＨは大腸菌において発現させたときにペリプラズム空間に分泌されるため、菌体そのものを用いて容易に酵素活性の検定を行うことができる。得られた形質転換体を６０−７０℃で約３０分処理した後に、グルコースおよび色素としてＰＭＳ−ＤＣＩＰを加え、残存するＰＱＱＧＤＨの活性を目視により判定して、熱処理によっても残存活性を示すクローンを選択し、遺伝子配列を解析してその変異を確認する。
上述のようにして得られた、改変型ＰＱＱＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕するか、またはオスモティックショックによりペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを調製する。
酵素活性の測定方法
本発明のＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。
酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨによるグルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。
熱安定性
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの熱安定性は、酵素を高温（例えば５５℃）でインキュベートし、一定時間ごとにアリコートを取り出して酵素活性を測定し、時間経過にともなう酵素活性の低下をモニターすることにより評価することができる。典型的には、酵素の熱安定性は、熱失活半減期、すなわち酵素活性が５０％に減少するまでに要する時間（ｔ１／２）を指標として表される。あるいは、熱安定性は、酵素を所定温度で所定時間処理した後の酵素活性の残存率（熱処理前の活性に対する熱処理後の活性の比）で表すことができる。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して高い熱安定性を有することを特徴とする。このため、酵素生産において調製／精製時の失活が少なく収率が高い、溶液中での安定性が高く酵素の保存が容易である、本酵素を用いてアッセイキットあるいは酵素センサーを作成する過程において失活が少なく、本酵素を用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーの熱安定性が高いことから、保存性に優れるなどの利点を有する。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願第２００１−７０４１３号の明細書に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
実施例
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例１
改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の構築
配列番号２に示されるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、常法に従って部位特異的変異法によりアミノ酸残基を置換した。部位特異的変異はベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）のマルチクローニング部位に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来ＰＱＱＧＤＨをコードする構造遺伝子を挿入したプラスミドｐＧＢ２（図１）を用いて、図２に示す方法により行った。変異に用いた合成オリゴヌクレオチドターゲットプライマーの配列を以下に示す。
2002072839.tif 000006
ベクタープラスミドｐＫＦ１８ｋ（宝酒造（株））にＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の一部を含むＫｐｎ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片を組み込み、これをテンプレートとした。このテンプレート５０ｆｍｏｌと宝酒造（株）製Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキットに付属のセレクションプライマー５ｐｍｏｌ、リン酸化したターゲットプライマー５０ｐｍｏｌを全体（２０μｌ）の１／１０量の同キットのアニーリングバッファーとともに混合し、１００℃、３分間の熱処理でプラスミドを変性させ、１本鎖にした。セレクションプライマーはｐＫＦ１８ｋのカナマイシン耐性遺伝子上にある二重のアンバー変異を復帰させるためのものである。これを５分間氷上に置き、プライマーをアニーリングさせた。これに３μｌの同キットエクステンションバッファー、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび５μｌの滅菌水を加えて相補鎖を合成した。
これをＤＮＡのミスマッチ修復能欠損株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳに形質転換し、一晩振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。
次に、ここから抽出したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＭＶ１１８４に形質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そしてこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラスミドｐＧＢ２上の野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子のＫｐｎ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片と入れ替え、改変型ＰＱＱＧＤＨの遺伝子を構築した。２か所以上に変異を導入する場合には、上述の工程を繰り返した。このようにして、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４１４Ｃｙｓ／Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ、およびＡｓｐ１６７Ｇｌｙ／Ｓｅｒ２３１Ｌｙｓ／Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓの３つの変異体をコードする遺伝子を作成した。
実施例２
改変型酵素の調製
野生型または改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿入し、構築されたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株に形質転換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ含有）で坂口フラスコを用いて３７℃で一晩振とう培養し、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５００μＭＰＱＱを含む７１のＬ培地に植菌した。培養開始後約３時間でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭになるように添加し、その後１．５時間培養した。培養液から遠心分離（５０００×ｇ、１０分、４℃）で菌体を回収し、この菌体を０．８５％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。集菌した菌体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離（１００００×ｇ、１５分、４℃）で未破砕の菌体を除去した。上清を超遠心分離（１６０５００×ｇ（４００００ｒ．ｐ．ｍ．）、９０分、４℃）し、水溶性画分を得た。
次に、こうして得た水溶性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で一晩透析した。透析したサンプルを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、７５０ｍｌで洗浄した後、０−０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用い、酵素を溶出させた。流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＧＤＨ活性を有する画分を回収し、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。このようにして電気泳動的に均一な改変型ＰＱＱＧＤＨ蛋白質を得た。これを精製酵素標品として以下の実施例において用いた。
実施例３
ジスルフィド結合形成の確認
実施例２で得られたＳｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素を、メルカプトエタノール非存在下で熱変性処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったところ、１００ｋＤａに主バンド、および５０ｋＤａにわずかの量のバンドが認められた。このことから、サブユニット間にジスルフィドが形成されていることが確認された。
実施例４
酵素活性の測定
酵素活性の測定は１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットとした。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
実施例５
熱安定性の評価
実施例２で得られた野生型酵素および各改変型酵素を、１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で１時間以上ホロ化した後、５５℃でインキュベートした。一定時間ごとにアリコートを取り出し、氷上で急冷した。これらのサンプルの酵素活性を実施例４の方法に従って測定した。結果を図３に示す。
Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素およびＡｓｐ１６７Ｇｌｙ／Ｓｅｒ２３１Ｌｙｓ／Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素はいずれも、野生型酵素と比較して５５℃における活性の低下が非常に少なかった。Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ／Ｔｙｒ４１４Ｃｙｓ改変型酵素は、５５℃における熱処理により、１０分間で初期活性の５０％まで低下したが、その後約５０分間、５０％の残存活性が保たれた。半減期、すなわち活性が５０％に低下するのに要する時間（ｔ１／２）を計算したところ、野生型の精製酵素、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素およびＡｓｐ１６７Ｇｌｙ／Ｓｅｒ２３１Ｌｙｓ／Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素の熱失活の半減期は、それぞれ、１４分、１８３分および１３６分であった。
次に、本発明の酵素の温度特性を測定した。実施例２で得られた野生型酵素およびＳｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素の精製酵素標品をそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で１時間以上ホロ化した。次に、１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、指示された温度で１０分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これらの試料の酵素活性を実施例４の方法に従って測定し、熱処理前の活性に対する残存活性として表した。
結果を図４に示す。野生型酵素が６０℃における熱処理により活性が５０％以下に低下したのに対し、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素は、７０℃においても９０％の残存活性を示した。
すなわち、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して高い熱安定性を有することが確認された。
実施例６
酵素活性の評価
実施例２で得られた野生型およびＳｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素を、それぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で１時間以上ホロ化した。これを１８７μｌずつ分注し、３μｌの活性試薬（６ｍＭＤＣＩＰ４８μｌ，６００ｍＭＰＭＳ  ８μｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０  １６μｌ）および各濃度のＤ−グルコース溶液１０μｌを加え、実施例４に示す方法により室温で酵素活性を測定した。基質濃度対酵素活性のプロットから、ＫｍおよびＶｍａｘを求めた。Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素のグルコースに対するＫｍ値は約１６ｍＭであり、ｋｃａｔは３４６１ｓｅｃ−１であった。一方、野生型のＫｍ値は、約２７ｍＭ，ｋｃａｔは３４３６ｓｅｃ−１であった。この結果から、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素は、野生型ＰＱＱＧＤＨに匹敵する高い活性を有する酵素であることがわかる。
実施例７
基質特異性の評価
実施例２で得られた野生型、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素およびＡｓｐ１６７Ｇｌｙ／Ｓｅｒ２３１Ｌｙｓ／Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素について基質特異性を調べた。基質として、それぞれ２０ｍＭのグルコース、アロース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースを用い、１μＭ  ＰＱＱおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下で３０分間インキュベートして、実施例４に示す方法により酵素活性を測定した。値はグルコースを基質としたときの活性に対する相対活性で表した。表１に示されるように、本発明の改変型酵素、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓは野生型酵素と同様の基質特異性を示した。また、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓに置換され、かつＳｅｒ２３１ＬｙｓおよびＡｓｐ１６７Ｇｌｕに置換されている変異酵素はＡｓｐ１６７Ｇｌｕの置換により野生型酵素よりもグルコースに対して基質特異性が高くなっている。
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実施例８
グルコースのアッセイ
改変型ＰＱＱＧＤＨを用いてグルコースをアッセイした。Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素を、１μＭＰＱＱ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で１時間以上ホロ化し、各種濃度のグルコースおよび５μＭＰＱＱ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で酵素活性を測定した。方法は実施例４に記載の酵素活性の測定法に準じ、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度の変化を指標とした。図５に示されるように、Ｓｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて、５ｍＭ−５０ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
実施例９
酵素センサーの作製および評価
５ＵのＳｅｒ４１５Ｃｙｓ改変型酵素にカーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した酵素センサーを用いて、１ｍＭ−１２ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
実施例１０
Ａｓｎ３４０Ｃｙｓ／Ｔｙｒ４１８Ｃｙｓ改変型酵素の調製
ＰＱＱＧＤＨ−Ｂの構造を、Ｏｕｂｒｉｅらの報告（Ｏｕｂｒｉｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８９：５１８７−５１９４；Ｏｕｂｒｉｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：５１８７−５１５９；Ｏｕｂｒｉｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９６：１１７８７−１１７９１）に基づいて、分子モデル可視化ソフトＲａｓ  Ｍｏｌで表示したところ、ＰＱＱＧＤＨ−Ｂのダイマー界面に位置する４ＣＤループ中のＡｓｎ３４０と５ＣＤループ中のＴｙｒ４１８とが向き合う位置にあり、それらの側鎖間距離が４Å以下であったことから、これらのアミノ酸残基をシステインに置換すればジスルフィド結合が形成される可能性があると考えられた。
実施例１に記載の方法にしたがって、部位特異的変異法によりＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子中にＡｓｎ３４０Ｃｙｓ／Ｔｙｒ４１８Ｃｙｓ変異を導入した。用いたプライマーは次のとおりである。
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実施例２に記載の方法にしたがって、この改変型酵素の精製酵素標品を調製した。非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、１００ｋＤａ付近にバンドが認められ、サブユニット間にジスルフィドが形成されていることが確認された。
実施例１１
Ａｓｎ３４０Ｃｙｓ／Ｔｙｒ４１８Ｃｙｓ改変型酵素の活性、熱安定性および基質特異性の評価
実施例１０で調製したＡｓｎ３４０Ｃｙｓ／Ｔｙｒ４１８Ｃｙｓ改変型酵素の酵素活性を実施例４と同様に測定したところ、野生型の活性値は３３４７Ｕ／ｍｇであり、改変型酵素の活性値は２８７７Ｕ／ｍｇであった。また各基質濃度から求めた活性値をもとに算出したＫｍ値は１８ｍＭであり、野生型と同じであった。また、グルコース、ラクトース、２−デオキシグルコース、マルトース、アロース、３−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラクトース、キシロース、マンノースを基質として用いて基質特異性を評価したところ、基質特異性のパターンは野生型と同様であった。
次に、熱安定性を評価するために、熱処理温度を５５℃に固定した状態で０、５、１０、２０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０分間、精製酵素標品を処理し、活性の経時変化を測定した。このとき野生型酵素の熱処理は６０分までとした。結果を図６に示す。ここでは、熱処理時間０分の活性値を１００％として各処理時間後の活性が比活性で表されている。図からわかるように、野生型酵素の半減期は１０分以下であると考えられ、６０分で完全に失活したが、Ａｓｎ３４０Ｃｙｓ／Ｔｙｒ４１８Ｃｙｓ改変型酵素では半減期が６０分以上であり、１８０分のインキュベート後でも２０％の残存活性を示した。また詳細に半減期を求めるために、その比活性の自然対数を時間に対してプロットして残存活性が５０％となる時間を求めたところ、野生型酵素の半減期はおよそ１０分であるのに対し、Ａｓｎ３４０Ｃｙｓ／Ｔｙｒ４１８Ｃｙｓ改変型酵素の半減期は７０分であった。
さらに、２０℃から８０℃までの各温度で１０分間熱処理した後の活性を測定した。結果を図７に示す。ここでは、２０℃のときの活性値を１００％として残存活性が表されている。野生型では５０℃から６０℃にかけて失活が見られ、５０℃では８０％ほど保っていた残存活性も、６０℃になると１０％、７０℃では０％となった。それに対しＡｓｎ３４０Ｃｙｓ／Ｔｙｒ４１８Ｃｙｓ改変型酵素では、５０℃ではほぼ１００％、６０℃でも８０％と高い残存活性を保ち、野生型が完全に失活した７０℃でも２０％の残存活性を示した。
すなわち、Ａｓｎ３４０Ｃｙｓ／Ｔｙｒ４１８Ｃｙｓ改変型酵素は野生型酵素と比較して高い熱安定性を有していた。
産業上の利用性
本発明の改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨは、グルコースセンサーの認識素子として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明において用いたプラスミドｐＧＢ２の構造を示す。
図２は、本発明の改変型酵素をコードする構造遺伝子を作成する方法を示す。
図３は、本発明の改変型酵素の熱安定性を示す。
図４は、本発明の改変型酵素の熱安定性を示す。
図５は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースのアッセイを示す。
図６は、本発明の改変型酵素の熱安定性を示す。
図７は、本発明の改変型酵素の熱安定性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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