(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配列を有する調節因子をコードする遺伝子DNA。
【請求項２】
前記調節因子をコードする遺伝子DNAが配列番号２の塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子DNA。
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子DNAを含むプラスミド及びニトリラーゼ遺伝子DNAを含むプラスミドで形質転換された形質転換体。
【請求項４】
請求項３記載の形質転換体を培地中でニトリル類の存在下に培養し、培養物からニトリラーゼを採取することを特徴とするニトリラーゼの製造法。
【請求項５】
ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配列を有する調節因子ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニトリラーゼ遺伝子の発現に関わる調節因子およびそれをコードする遺伝子DNAに関する。さらに、詳しくはアルカリゲネス  フェカリス( Alcaligenes faecalis)JM3株に由来し、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有する調節因子およびそれをコードする遺伝子DNAに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニトリル化合物から対応する有機酸を製造する際の触媒として、微生物あるいは微生物由来の酵素（例えばニトリラーゼ）を用いることにより、温和な条件で有機酸を生成させることができる（特開昭58-201992、同61-40795号、特開平2-84198号、3-251192各公報参照）。
【０００３】
クローン化されたニトリラーゼ遺伝子を有する組換え体によるニトリルの加水分解では、菌体内に同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させることが期待できる。既に、本発明者らはより高い触媒活性を持つ微生物触媒を調製する目的で、Alcaligenes faecalis JM3株のニトリラーゼ遺伝子をクローニングし、大腸菌ラクトースプロモーターの下流に本遺伝子を挿入したプラスミドを作製している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 247-251(1993)）。本プラスミドを導入した大腸菌はＩＰＴＧ（イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトシド）存在下で培養することにより、高いニトリラーゼ活性を示した。一方、本ニトリラーゼ遺伝子を含む約4 kbの断片を挿入したプラスミドを有する大腸菌では、微弱な活性しか認められずIPTGによる誘導も認められなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子並びにこの遺伝子及びニトリラーゼ遺伝子を含む形質転換体を用いてニトリラーゼを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはニトリラーゼ発現が殆どんど認められないのは、ニトリラーゼ遺伝子のプロモーターが機能しておらず、プロモーターが機能するために必要な調節因子をコードする遺伝子（以下調節遺伝子）がJM3株染色体DNA上のどこかに存在するのではないかと考えた。上記の約4 kbの断片を挿入したプラスミドを有する大腸菌をイソバレロニトリル存在下で培養することにより顕著なニトリラーゼ活性が発現することを見いだし、調節遺伝子がこの断片上に存在することを明らかにした。更に、調節遺伝子の位置を同定した後、ニトリラーゼ遺伝子と調節遺伝子を別々のプラスミドに挿入し、これらを同じ大腸菌に導入することにより、調節遺伝子としての働きを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配列を有する調節因子をコードする遺伝子DNAである。そして、上記調節因子をコードする遺伝子DNAとしては、例えば配列番号２の塩基配列からなるDNAがが挙げられる。
さらに、本発明は上記遺伝子DNA及びニトリラーゼ遺伝子DNAを含むプラスミドで形質転換された形質転換体である。
さらに、本発明は上記遺伝子DNAを含むプラスミド及びニトリラーゼ遺伝子DNAを含むプラスミドで形質転換された形質転換体である。
【０００７】
さらに、本発明は上記形質転換体を培地中でニトリル類の存在下に培養し、培養物からニトリラーゼを採取することを特徴とするニトリラーゼの製造法である。上記ニトリル類としては、プロピオニリル、Ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、イソバレロニトリル、ベンゾニトリル、３−シアノピリジンなどが挙げられる。
さらに、本発明はニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配列を有する調節因子ポリペプチドである。
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明は、下記の工程により実施されるものである。
【０００８】
1）ニトリラーゼ遺伝子および調節因子をコードする遺伝子を含むプラスミドの調製、及び該プラスミドを導入した大腸菌形質転換体の作製
2）培地へのニトリル化合物の添加によるニトリラーゼ活性の誘導
3）欠失プラスミドの作製およびこれらを含む大腸菌形質転換体のニトリラーゼ活性測定
4）塩基配列の決定
5）ニトリラーゼ遺伝子、調節遺伝子を別々のプラスミドに挿入し、同じ大腸菌に導入することによる形質転換体の作成及びこの形質転換体を用いたニトリルによるニトリラーゼの誘導発現の確認
【０００９】
なお、ニトリラーゼの誘導発現において、上記形質転換体としてはニトリラーゼ遺伝子及び調節遺伝子を同一のプラスミドに導入したものも用いられる。
本発明で用いられるアルカリゲネス  フェカリス（Alcaligenes faecalis）JM3 株はFERM P-13277として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。本ニトリラーゼ遺伝子を含むプラスミドpNJM30は、これを有する組換え体エッシエリキア  コリ ( Escherchia coli)JM105/pNJM30 （FERM P-13278）およびエッシエリキア  コリ ( Escherchia coli)JM109/pNJM30 （FERM P-13279）としてとして寄託されている。また、本調節因子をコードする遺伝子は、配列番号3の情報を元にして、アルカリゲネス  フェカリス( Alcaligenes faecalis)JM3株の染色体DNAを鋳型としてPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法により容易に増幅させることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、以下の実施例で用いられる制限酵素及びベクターは市販のものである。
【００１１】
【実施例】
１）イソバレロニトリルによる酵素誘導
JM3株ニトリラーゼ遺伝子（特開平６-153968号公報参照) を含むSphI断片をベクターpUC19に挿入して得られたプラスミドpNJM20（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 247-251(1993)）を大腸菌JM109株に導入し形質転換体を得た。大腸菌の形質転換は以下のように行った。大腸菌JM109株（宝酒造(株)製）をLB培地（1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム）10mLに37℃で12時間培養後、新規な同培地に1%植菌し2時間培養した。遠心により集菌した後、冷80 mM CaCl2溶液を 5mL加え、0℃で20分間放置後、再度遠心し、冷80 mM CaCl2溶液0.5 mLに懸濁した。これに上記反応液60μLを加え、0℃で30分間放置後、42℃で2分間ヒートショックを与え、LB培地0.8 mLを加え37℃にて60分間振盪培養した。100 μLずつをアンピシリン50μg / mL含有LB寒天培地にまき、37℃で培養した。寒天培地上に生育したコロニーをアンピシリン50μg / mL含有LB培地1 mLにて培養し、プラスミドを抽出し、pNJM20が導入されているかどうかを確認した。プラスミドの抽出はBirnboimとDoly ( Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)) の方法により行った。
【００１２】
得られた形質転換体をイソバレロニトリルを添加した10mlのLB培地で37℃、8時間培養した。対照実験として無添加の培地を用いて培養した。培養液より遠心分離により集菌し、150 mM塩化ナトリウム溶液で洗浄後、10mMジチオスレイトールを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に菌体を懸濁した。ニトリラーゼ活性測定は以下のように行った。適当に水で希釈した菌体懸濁液0.1 mLに50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.125 mL、20mMのチオフェン-2-アセトニトリルを0.5 mL加え20℃にて10,20,30分間反応後、1N HClを0.2 mL加えることにより反応を停止させた。酵素反応により生成した酸をHPLCにより分析した。
その結果、イソバレロニトリルによる顕著な酵素誘導が認められた。
【００１３】
２）欠失プラスミドの作製とイソバレロニトリルによる誘導
上記プラスミドpNJM20（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 247-251(1993)）からニトリラーゼ遺伝子(nitA)の上流領域、下流領域を欠失させたプラスミドを以下のようにして作製した（図１参照）。
pNJM20を制限酵素SphIで切断し、SphIで切断したpUC19ベクターに挿入しpSS10およびpSS10Rを作製した。pSS10を制限酵素XbaIおよびKpnIで切断後、Kilo-Sequence用Deletion Kit（宝酒造（株）製）を用いて種々の欠失を起こさせ、ライゲーション後、工程１）と同様にして大腸菌JM109株に導入し形質転換体を得た。形質転換体よりプラスミドを抽出し欠失プラスミドpSS20〜pSS50を得た。同様にして、pSS10RよりpSS60R〜pSS90Rを作製した。
【００１４】
制限酵素による切断は以下のように行った。プラスミド溶液10μL、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μL、制限酵素を 2μL、滅菌水 15μLを加え37℃にて2時間反応させた。反応液に等量のTE飽和フェノールを加え撹拌後遠心し上層（水層）と下層に分離させた。上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルムを加え同様の抽出操作を2回繰り返した。上層に3μLの3M酢酸ナトリウムと90μLのエタノールを加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTEに溶解した。ライゲーションはDNA Ligation Kit（宝酒造（株）製）を用いて行った。
【００１５】
これらのプラスミドを大腸菌JM109株に導入し形質転換体を得、工程１）と同様に培養し活性測定した。
結果を図１に示した。この図において、JM3株DNA断片上におけるふたつの矢印は、ニトリラーゼ遺伝子及び本発明において見いだされた調節遺伝子の位置と方向を示す。それぞれのプラスミドにおいて記された領域はベクターpUC19に挿入されたJM3株由来のDNA領域を示し、矢印はベクターpUC19上のlacプロモータの位置と方向を示す。ニトリラーゼ活性の強さを+で現した。-は活性が検出されなかったことを示した。
この図１の結果よりニトリラーゼ遺伝子の上流約0.3 kb、下流約1.5 kbの領域がイソバレロニトリルによるニトリラーゼの誘導発現に必要であることが明らかとなった。
【００１６】
３）塩基配列の決定
ニトリラーゼ遺伝子を含むMspIからMluI部位の1727 bpの塩基配列は既に本発明者らにより報告されている（特開平６-153968号公報参照) 。更に、本発明においてMluI部位からEcoRI部位までの910 bpの配列を決定した。塩基配列の決定はTth DNA polymeraseを用いたチェーンターミネーション法（Sanger F.  Science 214, 1205-1210 (1980)）により行った。ニトリラーゼ遺伝子下流のEcoRV部位からEcoRI部位までの1127  bpの長さの塩基配列を配列番号3に示した。
【００１７】
その結果、この領域には一つのオープンリーディングフレーム（以下ORF）が見いだされ、このORFにコードされるポリペプチドについてタンパク質データベース(SWISS PROT)をホモロジー検索したところ、シュードモナス  プチダ(Pseudomonas putida ) のキシレン代謝系遺伝子の誘導発現を調節するXylSや大腸菌のラムノース代謝系遺伝子の誘導発現を調節するRhaSとホモロジーを有することが見いだされた。このORFはニトリラーゼ遺伝子nitAの調節遺伝子と考えられたことからnitRと命名した。
【００１８】
４）nitRの調節遺伝子としての確認
nitA、nitRを別々のプラスミドに挿入し、同じ大腸菌に導入してイソバレロニトリルによるニトリラーゼの誘導発現を調べた。nitAはベクターpSTV28およびpSTV29に、nitRはベクターpUC18,pUC19に挿入した。即ち、pNA28およびpNA29はそれぞれnitAをベクターpSTV28およびpSTV29に挿入して得られた。pNR18およびpNR19はそれぞれnitRをベクターpUC18,pUC19に挿入して得られた。これらプラスミドの作製と構造を図２に示した。pNA28とpNR18、pNA28とpNR19、pNA29とpNR18およびpNA29とpNR19を同時に含む形質転換体を作製し、工程１）と同様にして活性測定した。結果を図３に示した。IPTGの添加によりnitRを高発現させるとニトリラーゼ活性が上昇した。この場合にはイソバレロニトリルの添加効果は認められなくなっていたが、nitRを高発現させない場合にはイソバレロニトリル添加によりニトリラーゼ活性は上昇した。これらの結果より、nitRがニトリラーゼ発現の調節遺伝子であることが確認された。
【００１９】
【配列表】
0003798474.tif 000002
0003798474.tif 000003
【００２０】
0003798474.tif 000004
0003798474.tif 000005
【００２１】
0003798474.tif 000006
0003798474.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】  JM3株ニトリラーゼ遺伝子周辺の制限酵素地図、本発明において作製されたプラスミド、およびそれらのプラスミドを含む組換え体のニトリラーゼ活性を示す図。
【図２】プラスミドpNA28,pNA29,pNR18およびpNR19の構築図を示す図。
【図３】２種のプラスミドを同時に含む形質転換体のニトリラーゼ活性を示す図。
【図１】
0003798474.tif 000008
【図２】
0003798474.tif 000009
【図３】
0003798474.tif 000010