(57)【要約】本発明は、鞭毛を有する微生物において、鞭毛の構成にかかわる遺伝子および鞭毛の運動にかかわる遺伝子からなる群より選ばれる１以上の遺伝子を不活性化または欠失させた微生物、該微生物を用いた、タンパク質、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、脂質あるいはそれらの類縁体等の有用物質の製造法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鞭毛を有する微生物において、鞭毛の構成にかかわる遺伝子および鞭毛の運動にかかわる遺伝子からなる群より選ばれる１以上の遺伝子を不活性化または欠失させた微生物。
【請求項２】
遺伝子が、ｆｌｇＮ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＡ、ｆｌｇＢ、ｆｌｇＣ、ｆｌｇＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｇＦ、ｆｌｇＧ、ｆｌｇＨ、ｆｌｇＩ、ｆｌｇＪ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｈＥ、ｆｌｈＡ、ｆｌｈＢ、ｃｈｅＺ、ｃｈｅＹ、ｃｈｅＢ、ｃｈｅＲ、ｔａｒ、ｃｈｅＷ、ｃｈｅＡ、ｍｏｔＢ、ｍｏｔＡ、ｆｌｈＣ、ｆｌｈＤ、ｆｌｉＹ、ｆｌｉＺ、ｆｌｉＡ、ｆｌｉＢ、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｉＳ、ｆｌｉＴ、ｆｌｉＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｉＧ、ｆｌｉＨ、ｆｌｉＩ、ｆｌｉＪ、ｆｌｉＫ、ｆｌｉＬ、ｆｌｉＭ、ｆｌｉＮ、ｆｌｉＯ、ｆｌｉＰ、ｆｌｉＱ、ｆｌｉＲ、ｈｉｎ、ｆｌｊＢ、ｆｌｊＡ、ａｅｒおよびｔｓｒからなる群およびそれらのホモログ遺伝子群より選ばれる遺伝子である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
微生物が、エンテロバクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、クロストリジューム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇｒｏｕｐ）およびバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）からなる群より選ばれる科に属する微生物である、請求項１または２記載の微生物。
【請求項４】
微生物が、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属およびＢａｃｉｌｌｕｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
微生物が、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｂｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄａｃｕｎｈａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈａｚｄｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｖｙｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群より選ばれる微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物を培地中で培養し、該培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
【請求項７】
有用物質が、タンパク質、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、脂質およびそれらの類縁体からなる群より選ばれる有用物質である、請求項６記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、工業的生産に有用な微生物、該微生物を用いた有用物質の製造法に関する。
背景技術
微生物を用いた有用生産物の製造において、目的とする有用生産物あるいは前駆体の分解系を破壊した微生物を用いることにより、該有用生産物を生産性を向上させることができることは良く知られている。
例えば、プロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡを不活性化した、グラム陰性細菌Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓを用いたプロリン生産〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，４９，７８２−７８６（１９８５）〕、大腸菌Ｋ−１２株のプロリン分解酵素遺伝子ｐｕｔＡを不活性化した菌株を用いたヒドロキシプロリン生産〔Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７４６−７５０（２０００）〕等をあげることができる。
しかしながら、このような方法は、特定の有用化合物の生産にのみ有効な遺伝子の不活性化あるいは遺伝子の欠失であり、他の様々な有用化合物の生産に汎用的に効果のある方法ではない。
現在までに、不活性化あるいは欠失することにより、目的とする様々な有用化合物の生産に汎用的に効果のある遺伝子は知られていない。
発明の開示
本発明は、目的とする様々な有用化合物の生産に汎用的に有効な、特定の遺伝子を不活性化あるいは欠失させた微生物、該微生物を用いた有用化合物の製造方法を提供することを目的とする。
タンパク質、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、脂質あるいはそれらの類縁体等の有用物質の、微生物を利用した製造は、通常、該微生物の攪拌培養により行われる。従って、本発明者らは、運動性を有する微生物において、該運動性はこのような有用物質の製造には必ずしも必要ではないと考え、該微生物の運動性にかかわる様々な遺伝子を不活性化あるいは欠失させ、有用物質の生産効率を比較検討した。
その結果、鞭毛を有する微生物において、該鞭毛の構成にかかわる遺伝子あるいは鞭毛の運動にかかわる１以上の遺伝子を不活性化または欠失させることにより、有用物質の生産効率を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は下記（１）〜（７）を提供するものである。
（１）  鞭毛を有する微生物において、鞭毛の構成にかかわる遺伝子および鞭毛の運動にかかわる遺伝子からなる群より選ばれる１以上の遺伝子を不活性化または欠失させた微生物。
（２）  遺伝子が、ｆｌｇＮ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＡ、ｆｌｇＢ、ｆｌｇＣ、ｆｌｇＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｇＦ、ｆｌｇＧ、ｆｌｇＨ、ｆｌｇＩ、ｆｌｇＪ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｈＥ、ｆｌｈＡ、ｆｌｈＢ、ｃｈｅＺ、ｃｈｅＹ、ｃｈｅＢ、ｃｈｅＲ、ｔａｒ、ｃｈｅＷ、ｃｈｅＡ、ｍｏｔＢ、ｍｏｔＡ、ｆｌｈＣ、ｆｌｈＤ、ｆｌｉＹ、ｆｌｉＺ、ｆｌｉＡ、ｆｌｉＢ、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｉＳ、ｆｌｉＴ、ｆｌｉＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｉＧ、ｆｌｉＨ、ｆｌｉＩ、ｆｌｉＪ、ｆｌｉＫ、ｆｌｉＬ、ｆｌｉＭ、ｆｌｉＮ、ｆｌｉＯ、ｆｌｉＰ、ｆｌｉＱ、ｆｌｉＲ、ｈｉｎ、ｆｌｊＢ、ｆｌｊＡ、ａｅｒおよびｔｓｒからなる群およびそれらのホモログ遺伝子群より選ばれる遺伝子である、上記（１）の微生物。
（３）  微生物が、エンテロバクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、クロストリジューム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇｒｏｕｐ）およびバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ））からなる群より選ばれる科に属する微生物である、上記（１）または（２）の微生物。
（４）  微生物が、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属およびＢａｃｉｌｌｕｓ属からなる群より選ばれる属に属する微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の微生物。
（５）  微生物が、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｂｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄａｃｕｎｈａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈａｚｄｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｖｙｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからなる群より選ばれる微生物である、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の微生物。
（６）  上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の微生物を培地中で培養し、該培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（７）  有用物質が、タンパク質、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、脂質およびそれらの類縁体からなる群より選ばれる有用物質である、上記（６）の製造法。
以下、本発明を詳細に説明する。
発明を実施するための最良の形態
Ｉ．本発明の微生物の造成
（１）造成のために用いることのできる微生物
本発明の微生物を造成するために用いることのできる微生物としては、産業上利用できる微生物であればいかなる微生物も用いることができる。
このような微生物として、エンテロバクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、クロストリジューム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇｒｏｕｐ）、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）等に属する微生物をあげることができ、例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等に属する微生物をあげることができる。
具体的には、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｂｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄａｃｕｎｈａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈａｚｄｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｖｙｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等をあげることができる。
上記微生物は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された微生物であってもよい。
即ち、上記微生物の変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは遺伝子組換えＤＮＡ技術を用いて造成した組換え株のいずれであってもよい。工業的に既に利用されている上記微生物であれば、下記方法により、より有効な本発明の微生物を造成することができる。
（２）本発明の微生物の造成
（ａ）変異処理による方法
上記（１）記載の微生物を、常法に従って培養する。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得する。該菌体を、適切な緩衝剤、例えば、０．０５Ｍ  トリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）等で洗浄後、菌体濃度が１０４〜１０１０細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁する。該懸濁液を用いて常法により変異処理を行う。
常法として、例えば、該懸濁液にＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理する方法をあげることができる。
該変異処理懸濁液を完全培地に塗布し、１５〜３８℃で、１〜４日間培養する。培養後、生育し形成されたコロニーを、軟寒天培地の中央部分にのみ塗布し培養する。運動性を有する菌株は、その運動性により大きく広がったコロニーを形成するが、運動性の無い変異株は中央部にのみ小さなコロニーを形成する。運動性のない株を目的の変異株として選択する。
（ｂ）遺伝子組換えによる方法
微生物の染色体上の目的とする遺伝子を欠失あるいは不活性化させる方法として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）に記載の方法、Ｇ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈらの方法〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７９，６２２８−６２３７（１９９７）〕、Ｂ．Ｌ．Ｗａｎｎｅｒらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０（２０００）〕等の公知の方法を用いることができる。トランスポゾンを利用して染色体上の遺伝子を欠失させることもできる〔Ｇｅｎｅ，２７，１３１−１４９（１９８４）〕。
また大腸菌においては、目的とする遺伝子を破壊するための直鎖ＤＮＡ断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成した後、エレクトロポレーションで菌体内に導入し、遺伝子置換によって目的遺伝子を破壊する方法も知られている〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，１２９６−１２９９（１９９９）〕。
以下、Ｇ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈらの方法に関して詳述する。
該方法においては、自殺遺伝子を組み込んだ温度感受性プラスミドを用いる。温度感受性プラスミドとしてはプラスミドの複製に必須のタンパク質が温度感受性になったもの等を利用でき、具体的にはｐＫＯ３、ｐＫＤ２０等をあげることができる。自殺遺伝子としては、枯草菌由来のｓａｃＢ等をあげることができる。目的とする遺伝子領域の両末端１〜３ｋｂｐ程度の領域と相同な二つのＤＮＡ断片を結合したＤＮＡを、自殺遺伝子を組み込んだ温度感受性プラスミドに導入する。制限温度下で該プラスミドを微生物染色体上へ挿入する。得られた組換え株を自殺遺伝子が作用する条件下で培養し、生育してきた株を、該プラスミドが染色体上から脱落した株として取得する。例えば、自殺遺伝子としてｓａｃＢを利用した場合には、自殺遺伝子が作用する培養条件としては、シュークロースを含む培地で培養する条件をあげることができる。取得された株における染色体の構造解析を行い、目的の遺伝子領域が欠落した株を選抜する。染色体の構造解析は常法に従って行うことができ、例えば、該株の染色体を鋳型とし、破壊したい遺伝子領域周辺の配列をプライマーとして用い、ＰＣＲにて周辺領域の構造を解析する方法等をあげることができる。
次に、Ｂ．Ｌ．Ｗａｎｎｅｒらの方法に関して以下に詳述する。
薬剤耐性遺伝子に、目的とする遺伝子領域の両末端１〜３ｋｂｐ程度の領域と相同なＤＮＡを付加した直鎖ＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。該ＤＮＡをλＲｅｄ組換え系を利用し、微生物染色体上に相同組換えにより組み込む。目的とする遺伝子領域が薬剤耐性遺伝子で置き換わった株を、薬剤耐性株として選抜することができる。取得された株における染色体の構造解析を行い、目的の遺伝子領域が欠落した株であることを確認する。染色体の構造解析は上記方法に準じて行うことができる。
目的とする遺伝子としては、鞭毛を構成するまたは鞭毛運動にかかわる遺伝子であればいずれの遺伝子でも良い。具体的には、ｆｌｇＮ、ｆｌｇＭ、ｆｌｇＡ、ｆｌｇＢ、ｆｌｇＣ、ｆｌｇＤ、ｆｌｇＥ、ｆｌｇＦ、ｆｌｇＧ、ｆｌｇＨ、ｆｌｇＩ、ｆｌｇＪ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｆｌｈＥ、ｆｌｈＡ、ｆｌｈＢ、ｃｈｅＺ、ｃｈｅＹ、ｃｈｅＢ、ｃｈｅＲ、ｔａｒ、ｃｈｅＷ、ｃｈｅＡ、ｍｏｔＢ、ｍｏｔＡ、ｆｌｈＣ、ｆｌｈＤ、ｆｌｉＹ、ｆｌｉＺ、ｆｌｉＡ、ｆｌｉＢ、ｆｌｉＣ、ｆｌｉＤ、ｆｌｉＳ、ｆｌｉＴ、ｆｌｉＥ、ｆｌｉＦ、ｆｌｉＧ、ｆｌｉＨ、ｆｌｉＩ、ｆｌｉＪ、ｆｌｉＫ、ｆｌｉＬ、ｆｌｉＭ、ｆｌｉＮ、ｆｌｉＯ、ｆｌｉＰ、ｆｌｉＱ、ｆｌｉＲ、ｈｉｎ、ｆｌｊＢ、ｆｌｊＡ、ａｅｒ、ｔｓｒ等、あるいはそれらのホモログ遺伝子（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｃｅｌｌｕｌａｒａ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、あるいはｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／Ｃｏｌｉｂｒｉ／を参照）等をあげることができる。欠失または不活性化させる、鞭毛運動にかかわる遺伝子の数は１以上であればよいが、好ましくは３以上、より好ましくは６以上である。
ＩＩ．本発明の微生物を用いた有用物質の製造
上記Ｉで造成した本発明の微生物を用いる有用物質の生産は、通常の微生物の培養法を用いて行うことができる。
該有用物質としては、タンパク質、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、脂質またはそれらの類縁体等をあげることができる。
有用物質の生産に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩、その他使用する微生物の必要とする微量の栄養素を程よく含有するものならば、合成培地または天然培地いずれも使用可能である。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
造成に用いた微生物が、誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物である場合には、培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
有用物質が菌体外に生成、蓄積される場合には、培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、培養液から目的とする該有用物質を単離、精製することができる。
有用物質が菌体内に生成、蓄積される場合には、培養終了後、培養液から菌体を回収した後、機械的あるいは化学的方法等の適切な方法で破砕する。該菌体破砕液から、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、該菌体破砕液から目的とする該有用物質を単離、精製することができる。
産業上の利用可能性
本発明により、有用物質の生産に有用な微生物、該微生物を用いた効率的な有用物質の製造法を提供することができる。
【国際調査報告】
2002097089.tif 000002
2002097089.tif 000003
2002097089.tif 000004
2002097089.tif 000005