(57)【要約】アポトーシス制御や糖代謝制御シグナルの異常によって生じる胃癌、卵巣癌、乳癌、膵癌、前立腺癌等の悪性腫瘍、糖尿病等の疾患に対する治療薬、予防薬および診断薬、脳、心臓などの虚血時における細胞死抑制剤、抗癌剤や放射線治療時における正常細胞の細胞死からの保護剤、または既存の治療薬の効果を増強する薬剤が求められている。本発明は、細胞内Ａｋｔ活性を制御する工程、特にＨｓｐ９０とＡｋｔの結合を制御する工程を制御する工程を含有する、アポトーシスを制御する方法、また、アポトーシスの制御を利用した、アポトーシス制御や糖代謝制御シグナルの異常によって生じる疾患の治療または診断に有効な手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のＡｋｔ活性を制御する工程を含有する、アポトーシスの制御方法。
【請求項２】
アポトーシスの制御がアポトーシスの誘導である請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３】
アポトーシスの制御がアポトーシスの抑制である請求の範囲１に記載の方法。
【請求項４】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合の制御である、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項５】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、Ｈｓｐ９０ファミリーに属する少なくとも一つの蛋白質またはその部分ポリペプチドにより行われる、請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｈｓｐ９０ファミリーに属する蛋白質が、Ｈｓｐ９０βまたはＨｓｐ９０αである、請求の範囲５に記載の方法。
【請求項７】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目からなるポリペプチドにより行われる、請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドにより行われる、請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドにより行われる、請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、Ａｋｔファミリーに属する少なくとも一つの蛋白質の部分ペプチドにより行われる、請求の範囲２または４記載の方法。
【請求項１１】
Ａｋｔファミリーに属する蛋白質が、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２またはＡｋｔ３である、請求の範囲１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２２７番目から３０６番目からなるポリペプチドにより行われる、請求の範囲２または４に記載の方法。
【請求項１３】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号５記載のアミノ酸配列の２８９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２９０番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２８６番目から３０６番目からなるポリペプチドにより行われる、請求の範囲２または４に記載の方法。
【請求項１４】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２２７番目から３０６番目において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドにより行われる、請求の範囲２または４に記載の方法。
【請求項１５】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２２７番目から３０６番目のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドにより行われる、請求の範囲２または４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、請求の範囲５から１５のいずれか１項に記載のポリペプチドの細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を変動させる化合物により行われる、請求の範囲１または２に記載の方法。
【請求項１７】
該化合物が、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害するポリペプチドである、請求の範囲１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞内のＡｋｔ活性の制御が、請求の範囲５から１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体またはその抗体断片により行われる、請求の範囲２または４に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目からなるポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列２２７番目から３０６番目からなるポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号５記載のアミノ酸配列の２８９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２９０番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列２８６番目から３０６番目からなるポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列２２７番目から３０６番目において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２２７番目から３０６番目のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチド。
【請求項２６】
請求の範囲１９〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２７】
請求の範囲２６に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２８】
請求の範囲２６または２７記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ベクター。
【請求項２９】
請求の範囲２８に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項３０】
請求の範囲２９に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に細胞内のＡｋｔ活性を制御可能なポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項３１】
請求の範囲１９〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させる工程を含有する、該ポリペプチドの細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を変動させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項３２】
該化合物が、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害する化合物である、請求の範囲３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求の範囲１９〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体またはその抗体断片。
【請求項３４】
請求の範囲１９〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害するポリペプチド、または請求の範囲３３に記載の抗体または抗体断片を有効成分として含有する医薬。
【請求項３５】
請求の範囲１９〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合する蛋白質の活性化または活性低下により引き起こされる疾患の治療薬または予防薬である、請求の範囲３４記載の医薬。
【請求項３６】
請求の範囲請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合する蛋白質の活性化または活性低下により引き起こされる疾患の診断薬である、請求の範囲３４記載の医薬。
【請求項３７】
請求の範囲１９〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害するポリペプチド、または請求の範囲３３に記載の抗体あるいは抗体断片、および抗癌剤を組み合わせてなる医薬組成物。
【請求項３８】
請求の範囲１９〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害するポリペプチド、または請求の範囲３３に記載の抗体あるいは抗体断片、および抗癌剤を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３９】
抗癌剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、植物アルカノイドから選ばれる少なくとも一つの抗癌剤である請求の範囲３７または３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
抗癌剤が、ブスルファン、シクロフォスファミド、イホスファミド、メルファラン、ニトロソウレア、アムサクリン、カルボプラチン、シスプラチン、ダカルバジン、アザシチジン、クラドリビン、シタラビン、フルダラビン、フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、ロイコボリン、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、エトポシド、パクリタキセル、テニポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ゲルダナマイシンおよびラディシコールから選ばれる少なくとも一つである請求の範囲３７〜３９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
＜技術分野＞
本発明は、細胞内のＡｋｔ活性を制御する工程、特にＨｓｐ９０とＡｋｔとの結合を制御する工程を含有する、アポトーシスを制御する方法、細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドの製造方法、該ポリペプチドまたは該抗体を含有する医薬、およびそれらの利用方法に関する。
＜背景技術＞
アポトーシスは、本来生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を意味しており、発生過程での形態、組織の形成、ホメオスタシスの維持、生体防御に深く関わり、細胞分裂（増殖）と表裏一体となって個体の生命維持に重要な役割を持つ。アポトーシスは、細胞外あるいは細胞内からの生理的または病的な様々なシグナルによって誘発される。遺伝子により制御された死の過程で先天的あるいは後天的に異常が生じると、アポトーシスが過剰に誘発されたり抑制されたりして様々な疾患を引き起こすと考えられる。アポトーシスによる過剰な細胞死が発症に関わる疾患としては、劇症肝炎やその他のウイルス疾患、アルツハイマー病などの神経変性疾患、放射線障害などがあげられる。逆にアポトーシス抑制が発症に関わる疾患としては、癌や自己免疫疾患などがあげられる。
また、放射線や薬物がアポトーシスを引き起こすことを利用した、癌治療や免疫抑制療法が行われている。逆に、アポトーシスを抑制することにより生体で重要な役割を果たす細胞を死から守ることは、脳、心臓などの虚血時における細胞死抑制、抗癌剤や放射線治療時における正常細胞の細胞死からの保護などの医学的な治療目的に利用することができる。
Ａｋｔは、ホスホイノシチド  ３−カイネース［ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）］下流のシグナル伝達経路で機能するセリン・スレオニンカイネースとして知られている。Ａｋｔの哺乳動物アイソフォーム（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｉｓｏｆｏｒｍ）としては、これまでに３つのアイソフォーム（Ａｋｔ１／ＰＫＢα、Ａｋｔ２／ＰＫＢβ、Ａｋｔ３／ＰＫＢγ）が知られている［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３５，１−１３（１９９８）］。Ａｋｔ２とＡｋｔ３ともにＡｋｔ１と約８２％のアミノ酸が同一であり、リン酸化されて活性化する時に必要なスレオニン残基、セリン残基も保存されている。サブタイプ間の機能分担等は現時点では明らかにされていない。
ＰＩ３Ｋは、細胞内で増殖因子・サイトカイン等による刺激によって活性化され、ＰＩ  ４，５ビスホスホン酸［ＰＩ  ４，５  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ（ＰＩＰ２）］をＰＩ  ３，４，５トリホスホン酸［ＰＩ  ３，４，５  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ（ＰＩＰ３）］に変換する。ＰＩＰ３がセカンドメッセンジャーとしてＡｋｔに働き、Ａｋｔ１の３０８番スレオニン残基と４７３番セリン残基のリン酸化によってＡｋｔ活性は亢進する。活性化したＡｋｔの基質としては、Ｂａｄ、キャスパーゼ９（ｃａｓｐａｓｅ  ９）、ＩｋＢカイネースなどが知られており、これら基質をリン酸化することによりＡｋｔが不活性化して細胞のアポトーシスを抑制することから、Ａｋｔ活性の亢進は癌細胞の不死化やアポトーシス耐性に関与する可能性が考えられている。癌におけるＡｋｔの発現を調べた報告としては、Ａｋｔ１が大腸癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａの２０％）、Ａｋｔ２が卵巣癌（１５％）、膵癌（１２％）、乳癌（３％）、Ａｋｔ３がエストロゲンレセプターを欠失した乳癌、アンドロゲン非依存性前立腺癌などでそれぞれ高発現しているという報告がある［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３５，１−１３（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２１５２８−２１５３２（１９９９）］。また、脳腫瘍、子宮内膜癌、前立腺癌、乳癌等での遺伝子変異が知られている癌抑制遺伝子であるＰＴＥＮ［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１９４３−１９４７（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５，３５６−３６２（１９９７）］は、発見された当初から、ホスファターゼとホモロジーが高いことが知られていた。ＰＴＥＮは、その後ＰＩ３Ｋによって生成されるＰＩＰ３の脱リン酸化活性を持ち、ＰＩ３Ｋ→Ａｋｔへのシグナルを抑制する機能を持つことが明らかにされている［Ｃｅｌｌ，９５，２９−３９（１９９８）］。細胞におけるＰＴＥＮ活性の消失は、Ａｋｔの恒常的な活性化を引き起こし、アポトーシスが抑制されることにより癌化の引き金となると考えられる。これらのことから、Ａｋｔ活性を抑制する物質は癌細胞に対してアポトーシスを誘導する治療薬、あるいは現在癌治療に用いられている抗癌剤によって誘導される癌細胞のアポトーシスの感受性を増強させる薬剤として有用であると考えられる［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３５，１−１３（１９９８）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１３，２９０５−２９２７（１９９９）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９１，１９２２−１９３２（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，４２４０−４２４５（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４７０，Ｍ２１−Ｍ３５（２０００）］。
Ａｋｔ１の活性はリン酸化、脱リン酸化のバランスによって制御されている。Ａｋｔ１の脱リン酸化にはプロテインホスファターゼ  ２Ａ［ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２Ａ（ＰＰ２Ａ）］が関与することが明らかにされている［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ，９３，５６９９−５７０４（１９９６）］。
最近、ゲルダナマイシン（Ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）で細胞を処理することにより、Ａｋｔ／ＰＫＢセリン・スレオニンカイネースが細胞内で不安定化することから、Ａｋｔが以下に述べるＨｓｐ９０に結合して活性制御を受けている可能性が示唆されている［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１，１９８７（２０００）］。しかしながら、ＡｋｔとＨｓｐ９０が直接結合するか否か、互いの結合領域、結合によるＡｋｔの活性制御などに関しては、何ら明らかにされていない。
また、Ａｋｔの活性化がグルコース代謝を制御していることも明らかにされている。インシュリン刺激によって起こる、６−ホスホフルクトース  ２−カイネース［６−ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｓｅ  ２−ｋｉｎａｓｅ（ＰＦＫ２）］活性化による糖代謝亢進、細胞内グルコース取り込みに関与するグルコーストランスポーター４［ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ４（ＧＬＵＴ４）］の膜局在化によるグルコース取り込みの増加、およびグリコーゲンシンターゼカイネース−３［ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３（ＧＳＫ３）］の不活化によるグリコーゲン合成抑制などにはすべてＰＩ３Ｋを介したＡｋｔの活性化が関与していることが報告されている［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３５，１−１３（１９９８）］。従って、糖代謝異常によって生じる糖尿病等に対しては、Ａｋｔを活性化する物質が有効である可能性が考えられる。
ヒートショックプロテイン（Ｈｓｐ）は細胞が熱ショック等のストレス環境にさらされた時に細胞内で発現する一連の蛋白質群であり、その分子量によって幾つかのファミリーに分類される（Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７など）。これら蛋白質は分子シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）とも呼ばれ、一般的には蛋白質のフォールディング、膜透過、会合、凝集の抑制等がその主な機能と考えられている。
Ｈｓｐ９０は分子量約９０ｋＤａの分子シャペロンによって構成されるＨｓｐ９０ファミリーに属するヒートショック蛋白質である。現在のところ真核生物のＨｓｐ９０ファミリーとしては、Ｈｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、Ｇｒｐ９４、Ｈｓｐ７５／ＴＲＡＰ１などが同定されているが、これらのＨｓｐ９０ファミリー蛋白質は細胞外ストレスがかからない環境下でも細胞内で発現しており、近年Ｈｓｐ９０が細胞増殖や癌化に関わる種々のシグナル伝達因子と特異的に複合体を形成し、細胞周期や細胞増殖シグナルに関与していることが明らかになってきた。細胞内での機能や安定性の保持にＨｓｐ９０ファミリーとの結合が必要であると考えられているシグナル伝達因子としては、ステロイドホルモン受容体（エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、グルココルチコイドレセプターなど）、非受容体型チロシンキナーゼ（ｖ−ｓｒｃなど）、受容体型チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２など）、セリンスレオニンキナーゼ（Ｒａｆ−１、Ｃｄｋ４など）などがあげられる。従って、Ｈｓｐ９０の機能を制御することによってＨｓｐ９０と特異的に結合する細胞内シグナル伝達因子の関わる細胞内情報伝達を変動させることができると考えられる。例えば、種々の癌細胞株でＨｓｐ９０ファミリー蛋白質の発現上昇が報告されていることや、乳癌患者におけるＨｓｐ９０発現量と予後との相関が報告されていることからも、Ｈｓｐ９０の機能が癌などの疾患において重要な働きをしている可能性が考えられている［Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，７９，１２９−１６８（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５６，６７５−６８２（１９９８）、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，１７，３６１−３７３（１９９９）］。
Ｈｓｐ９０に結合してその機能を阻害する化合物としては、ゲルダナマイシン、ハービマイシンＡ（Ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ  Ａ）などのアンサマイシン系化合物とその誘導体、ラディシコール（Ｒａｄｉｃｉｃｏｌ）とその誘導体、ノボビオシン（Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ）などのクマリン系化合物があげられる［Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，１７，３６１−３７３（１９９９）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９２，２４２−２４８（２０００）］。ゲルダナマイシンやラディシコールに関しては、Ｈｓｐ９０のＮ末端領域に位置するＡＴＰ／ＡＤＰ結合領域（１〜２２１番目のアミノ酸配列に含まれる）に結合することが明らかにされている［Ｃｅｌｌ，８９，２３９−２５０（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２３８４３−２３８５０（１９９７）、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ，３，１００−１０８（１９９８）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２，２６０−２６６（１９９９）］。Ｈｓｐ９０は、ｐ５０／Ｃｄｃ３７、ｐ２３などの共シャペロン（ｃｏ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）分子とともに、前述の特異的シグナル伝達因子と分子複合体を形成して機能するが、ゲルダナマイシンやラディシコールなどの低分子化合物がＨｓｐ９０に結合することにより、Ｈｓｐ９０を含む分子複合体の構成が変化し、Ｈｓｐ９０の機能が失われることにより、結果的に分子複合体に結合していたシグナル伝達因子の機能や、細胞内局在、細胞内安定性などを変化させることになり、癌細胞の増殖抑制をはじめとする種々の生物活性を示すと考えられている［Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，１７，３６１−３７３（１９９９）］。一方、ノボビオシンはＨｓｐ９０のＣ末端領域（３８０〜７２８番目のアミノ酸配列に含まれる）に結合することにより、同様の効果を示すと報告されている［Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９２，２４２−２４８（２０００）］。
＜発明の開示＞
本発明は、アポトーシス抑制や糖代謝に関与するＡｋｔの活性制御に関わるＨｓｐ９０上の機能部位を同定し、アポトーシス制御や糖代謝制御シグナルの異常によって生じる胃癌、卵巣癌、乳癌、膵癌、前立腺癌等の悪性腫瘍、糖尿病等の疾患に対する治療薬、予防薬および診断薬、脳、心臓などの虚血時における細胞死抑制剤、抗癌剤や放射線治療時における正常細胞の細胞死からの保護剤、または既存の治療薬の効果を増強する薬剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、Ｈｓｐ９０がＡｋｔと細胞内で結合すること、さらにこのＨｓｐ９０とＡｋｔの結合がＡｋｔの活性（リン酸化）維持に重要であることを初めて見出した。さらにアポトーシス抑制や糖代謝に関与するＡｋｔの活性制御に関わるＨｓｐ９０上の機能部位、および該機能部位に結合するＡｋｔの部位を同定することにより、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（４０）の発明に関する。
（１）  細胞内のＡｋｔ活性を制御する工程を含有する、アポトーシスの制御方法。
（２）  アポトーシスの制御がアポトーシスの誘導である上記（１）記載の方法。
（３）  アポトーシスの制御がアポトーシスの抑制である上記（１）記載の方法。
（４）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合の制御である、上記（１）に記載の方法。
（５）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、Ｈｓｐ９０ファミリーに属する少なくとも一つの蛋白質またはその部分ポリペプチドにより行われる、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）  Ｈｓｐ９０ファミリーに属する蛋白質が、Ｈｓｐ９０βまたはＨｓｐ９０αである、上記（５）記載の方法。
（７）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目からなるポリペプチドにより行われる、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（８）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドにより行われる、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（９）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドにより行われる、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、Ａｋｔファミリーに属する少なくとも一つの蛋白質の部分ペプチドにより行われる、上記（２）または（４）記載の方法。
（１１）  Ａｋｔファミリーに属する蛋白質が、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２またはＡｋｔ３である、上記（１０）に記載の方法。
（１２）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２２７番目から３０６番目からなるポリペプチドにより行われる、上記（２）または（４）に記載の方法。
（１３）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号５記載のアミノ酸配列の２８９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２９０番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２８６番目から３０６番目からなるポリペプチドにより行われる、上記（２）または（４）に記載の方法。
（１４）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２２７番目から３０６番目において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドにより行われる、上記（２）または（４）に記載の方法。
（１５）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２２７番目から３０６番目のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドにより行われる、上記（２）または（４）に記載の方法。
（１６）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、上記（５）〜（１５）のいずれか１項に記載のポリペプチドの細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を変動させる化合物により行われる、上記（１）または（２）に記載の方法。
（１７）  該化合物が、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害するポリペプチドである、（１６）に記載の方法。
（１８）  細胞内のＡｋｔ活性の制御が、上記（５）〜（１５）のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体またはその抗体断片により行われる、上記（２）または（４）に記載の方法。
（１９）  配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目からなるポリペプチド。
（２０）  配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチド。
（２１）  配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチド。
（２２）  配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列２２７番目から３０６番目からなるポリペプチド。
（２３）  配列番号５記載のアミノ酸配列の２８９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２９０番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列２８６番目から３０６番目からなるポリペプチド。
（２４）  配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列２２７番目から３０６番目において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチド。
（２５）  配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列の２２７番目から３０６番目のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチド。
（２６）  上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（２７）  上記（２６）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（２８）  上記（２６）または（２７）記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ベクター。
（２９）  上記（２８）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（３０）  上記（２９）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に細胞内のＡｋｔ活性を制御可能なポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドの製造方法。
（３１）  上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させる工程を含有する、該ポリペプチドの細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を変動させる化合物のスクリーニング方法。
（３２）  該化合物が、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害する化合物である、上記（３１）に記載の方法。
（３３）  上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体またはその抗体断片。
（３４）  上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチド、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害するポリペプチド、または上記（３３）に記載の抗体または抗体断片を有効成分として含有する医薬。
（３５）  上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合する蛋白質の活性化または活性低下により引き起こされる疾患の治療薬または予防薬である、上記（３４）記載の医薬。
（３６）  上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合する蛋白質の活性化または活性低下により引き起こされる疾患の診断薬である、上記（３４）記載の医薬。
（３７）  上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチド、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害するポリペプチド、または上記（３３）に記載の抗体あるいは抗体断片、および抗癌剤を組み合わせてなる医薬組成物。
（３８）  上記（１９）〜（２５）のいずれか１項に記載のポリペプチド、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害するポリペプチド、または上記（３３）に記載の抗体あるいは抗体断片、および抗癌剤を有効成分として含有する医薬組成物。
（３９）  抗癌剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、植物アルカノイドから選ばれる少なくとも一つの抗癌剤である上記（３７）または（３８）に記載の医薬組成物。
（４０）  抗癌剤が、ブスルファン、シクロフォスファミド、イホスファミド、メルファラン、ニトロソウレア、アムサクリン、カルボプラチン、シスプラチン、ダカルバジン、アザシチジン、クラドリビン、シタラビン、フルダラビン、フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、ロイコボリン、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、エトポシド、パクリタキセル、テニポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ゲルダナマイシンおよびラディシコールから選ばれる少なくとも一つである上記（３７）〜（３９）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
細胞内で、Ａｋｔがリン酸化されるとＡｋｔは安定な状態となり、アポトーシスは抑制されている。Ａｋｔが脱リン酸化を受けるとＡｋｔが不安定な状態となりアポトーシスは誘導される。
本発明では、リン酸化されたＡｋｔがＨｓｐ９０と結合して安定化されていることが見出された。さらに、リン酸化されたＡｋｔがＨｓｐ９０と結合して安定な状態を保っているのは、脱リン酸酵素のＡｋｔへの作用部位と、Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合領域とが関与していることをも見出された。
以上のことから、細胞内のＡｋｔ活性を制御することにより、特にＨｓｐ９０とＡｋｔとの結合を制御することで細胞内Ａｋｔ活性を制御することにより、アポトーシスを制御することが可能である。ここで、「細胞内のＡｋｔ活性を制御する」とは、細胞内のＡｋｔ活性を亢進または低下させることを含み、例えば、Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合の制御、リン酸化されたＡｋｔの安定化、Ａｋｔの脱リン酸化などにより行われる。「Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合を制御する」とは、Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合を不安定化または阻害（特に競争阻害）すること、およびＨｓｐ９０とＡｋｔとの結合を安定化または促進することを含む。また、「アポトーシスを制御する」とは、アポトーシスを誘導または抑制することを含む。
Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合を制御する方法は特に限定されないが、好ましくはＨｓｐ９０またはその部分ポリペプチド、Ａｋｔの部分ポリペプチド、Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合を阻害する化合物、ペプチド、抗体および抗体断片等を加えることにより制御される。
Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合は、Ｈｓｐ９０またはその部分ポリペプチドにより制御することがさらに好ましい。Ｈｓｐ９０は特に限定されず、Ｈｓｐ９０ファミリーに属するものであれば、いずれの蛋白質でもよいが、好ましくはＨｓｐ９０βまたはＨｓｐ９０αが用いられる。Ｈｓｐ９０βおよびＨｓｐ９０αはアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１および３、塩基配列がそれぞれ配列番号２および４で示される蛋白質である。アポトーシスを制御するＨｓｐ９０の部分ポリペプチドとしては、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目または配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目からなるポリペプチド（以下、細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するＨｓｐ９０の部分ペプチドを「本発明のＨｓｐ９０ポリペプチド」と略記する）が好ましい。
本発明のＨｓｐ９０ポリペプチドがＡｋｔと結合しＡｋｔが脱リン酸化酵素による作用を受けない場合には、Ａｋｔがリン酸化された状態が保たれてアポトーシスが抑制される。本発明のＨｓｐ９０ポリペプチドがＡｋｔと結合するがＡｋｔに脱リン酸化酵素が作用する場合には、Ａｋｔは脱リン酸化されてアポトーシスが誘導される。
同様に、Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合は、Ａｋｔの部分ポリペプチドにより制御することがさらに好ましい。Ａｋｔは特に限定されず、Ａｋｔファミリーに属するものであれば、いずれの蛋白質でもよいが、好ましくはＡｋｔ１、Ａｋｔ２またはＡｋｔ３が用いられる。Ａｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３はアミノ酸配列がそれぞれ配列番号５、７および９、塩基配列がそれぞれ配列番号６、８および１０で示される蛋白質である。アポトーシスを制御するＡｋｔの部分ポリペプチドとしては、配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列２２７番目から３０６番目からなるポリペプチドが好ましく、特に、配列番号５記載のアミノ酸配列の２８９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２９０番目から３１０番目、または配列番号９記載のアミノ酸配列２８６番目から３０６番目からなるポリペプチド（以下、細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するＡｋｔの部分ペプチドを「本発明のＡｋｔポリペプチド」と略記する）が好ましい。
本発明のＡｋｔポリペプチドがＨｓｐ９０と結合した結果、Ｈｓｐ９０と結合したＡｋｔ量が減少する。Ｈｓｐ９０と結合していないＡｋｔは脱リン酸化酵素による作用を受けた後、アポトーシスが誘導される。
本発明のＨｓｐ９０ポリペプチドおよびＡｋｔポリペプチド（以下、Ｈｓｐ９０ポリペプチドおよびＡｋｔポリヘプチドを「本発明のポリペプチド」と略記する）のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、１残基以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ一もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、一または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
本発明のポリペプチドが細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するためには、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８（１９９０）］等を用いて計算したときに、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する。
また、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と略記する）を包含する。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号２記載の塩基配列の９７９番目から１０２０番目、配列番号４記載の塩基配列の１００３番目から１０４４番目、配列番号６記載の塩基配列の６８５番目から９２７番目、好ましくは８６５番目から９２７番目、配列番号８記載の塩基配列の６９１番目から９３０番目、好ましくは８６８番目から９３０番目、および配列番号１０記載の塩基配列の６７９番目から９１８番目、好ましくは８５６番目から９１８番目の塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。なお、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡは、上記に記載したもの以外に多数存在するが、それらはすべて本発明に包含される。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８（１９９０）］等を用いて計算したときに、配列番号２記載の塩基配列の９７９番目から１０２０番目、配列番号４記載の塩基配列の１００３番目から１０４４番目、配列番号６記載の塩基配列の６８５番目から９２７番目または８６５番目から９２７番目、配列番号８記載の塩基配列の６９１番目から９３０番目または８６８番目から９３０番目、および配列番号１０記載の塩基配列の６７９番目から９１８番目または８５６番目から９１８番目の塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合の測定は、以下の方法により行う。すなわち、Ｈｓｐ９０およびＡｋｔの全長あるいは部分断片をコードするＤＮＡにそれぞれタグをコードするＤＮＡを付加したのちに、該ＤＮＡを細胞内に導入し、細胞を培養する。該細胞を溶解後に、タグに対する抗体を用いて免疫沈降反応を行う。ウエスタン・ブロッティングにより免疫沈降物中の物質の特定を行うことにより、Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合状態を測定することができる。
免疫沈降法とは、蛋白質とそれに対する抗体を反応させることにより、抗原抗体複合体を生じる反応をいう。
ウエスタン・ブロッティングとは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって蛋白質を分離後、該ゲルの蛋白質をニトロセルロース膜、ポリビニリデン・ジフルオロイド膜などに転移し、該蛋白質に対する抗体を用いて蛋白質を検出する方法をいう。
具体的には、Ｈｓｐ９０部分蛋白質と、タグを付したＡｋｔ蛋白質とが細胞内において結合した状態である場合、タグに対するモノクローナル抗体による免疫沈降物は、Ｈｓｐ９０部分蛋白質とＡｋｔ蛋白質との複合体が得られることになる。したがって、該複合体をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したのちに該ゲルをニトロセルロース膜に転移後、Ｈｓｐ９０に対する抗体またはＨｓｐ９０に付したタグに対する抗体を用いることにより、Ｈｓｐ９０がＡｋｔ蛋白質に結合していることを確認することができる。
タグとしては、ＦＬＡＧタグ、Ｖ５タグ、ＨＡタグなどいかなるものでもよい。
細胞内におけるＡｋｔ活性を測定する方法としては、Ａｋｔのリン酸化を測定する方法が挙げられる。すなわち、Ｈｓｐ９０およびＡｋｔの全長あるいは部分断片をコードするＤＮＡにそれぞれタグをコードするＤＮＡを付加したのちに、該ＤＮＡを細胞内に導入し、細胞を培養する。該細胞を溶解後に、タグに対する抗体を用いて免疫沈降反応を行う。ウェスタンブロッティングにより免疫沈降物中の物質の特定を行い、リン酸化されたＡｋｔに対する抗体を用いることにより、Ａｋｔのリン酸化を測定することができる。
アポトーシスを測定する方法としては、細胞内の染色体ＤＮＡを抽出し、該染色体ＤＮＡを電気泳動して解析する方法、細胞を染色したのちに、形態学的な観察により解析する方法、アポトーシス誘導に必須であるプロテアーゼを測定する方法などがあげられる。
細胞内の染色体ＤＮＡを抽出し、該染色体ＤＮＡを電気泳動法して解析する方法を行うことにより、アポトーシスを誘導した細胞のＤＮＡに特徴的なラダーを観察することができる。
細胞を染色したのちに、形態学的な観察により解析する方法を行うことにより、アポトーシスを誘導した細胞の細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表面微絨毛の消失、細胞質の凝集を観察することができる。細胞を染色する溶液としては、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）などがあげられる。
アポトーシス誘導に必須であるプロテアーゼを測定する方法としては、キャスパーゼを測定する方法［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７，１２９５（１９９８）］などがあげられる。具体的には、細胞を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳを含む溶解液中で溶解する。該細胞溶解液とアセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−アスパルト−７−アミノ−４−メチルクマリン（ＤＥＶＤ−ＡＭＣ）をＩＣＥ緩衝液で反応した後に、吸光光度計で測定することにより、キャスパーゼ活性を測定することができる。
以下、本発明のポリペプチドの製造方法を例をあげて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．本発明のポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドの製造方法としては、化学的合成による方法、遺伝子工学的な手法を用いる方法などがあげられる。以下に詳細に説明する。
（１）化学的合成によるポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドは、例えば「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著：丸善）、「第４版実験化学講座２２−有機合成ＩＶ酸・アミノ酸・ペプチド」（相本三郎、楠本正一、竜田邦明、早川芳宏、山本景祚、若宮建昭著：丸善）、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３５．，１６１−２１４（１９９０）」、「ソリッド−フェーズ・ペプタイド・シンセシス（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），メソッズ・イン・エンザイモロジー第２８９巻（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８９）、グレッグ・Ｂ・フィールズ（Ｇｒｅｇｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９９７）」、「ペプタイド・シンセシス・プロトコール（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー第３５巻（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３５）、マイケル・Ｗ・ペニントン（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）、ベン・Ｍ・ダン（Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９９４）」等に記載の通常のペプチド合成法により合成後、精製することによって得ることができる。具体的な合成法としては、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。すなわち、本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするポリペプチドを合成する。
さらに、本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖および／またはペプチドアミノ末端および／またはペプチドカルボキシ末端が化学修飾や保護がなされている場合には、ペプチド合成後に化学修飾するか、あるいは化学修飾されたアミノ酸を用いてペプチド合成するか、あるいはペプチド合成の最終脱保護の反応条件を適当に選ぶ等、ペプチド合成化学の分野において従来公知の方法（「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著：丸善）、「続医薬品の開発−第１４巻−ペプチド合成」矢島治明監修：広川書店）、「生化学実験講座−１−タンパク質の化学ＩＶ−化学修飾とペプチド合成」［日本生化学会編、東京化学同人、「蛋白質の化学修飾」＜上＞＜下＞（大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩）］によって製造することができる。
本発明ポリペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、以後「ＡＣＴ社」と略称する）製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、ノバビオケム社（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）、渡辺化学（株）、ＡＣＴ社、アナスペック社（ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ．）、またはペプチド研究所（株）等から入手することができる。
本発明のポリペプチドの精製は、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて行なうことができる。
（２）遺伝子工学的手法によるポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、後述する方法で作製した本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
また、必要に応じて、本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは本発明のポリペプチドの効率的製造に有用である。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＧＫＡ２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ  ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ  ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ  ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）］記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遣伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ  ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている  ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ  ６〜８、３０〜４０℃、５％  ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｅｘ  Ｃｅｌｌ  ４００、Ｅｘ  Ｃｅｌｌ  ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ  ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ  ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ  ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明のポリペプチドを製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
動物個体を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明のポリペプチドを生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７番目から３４０番目、配列番号３記載のアミノ酸配列の３３５番目から３４８番目、配列番号５記載のアミノ酸配列の２２９番目から３０９番目および２８９番目から３０９番目、配列番号７記載のアミノ酸配列の２３１番目から３１０番目および２９０番目から３１０番目、および配列番号９記載のアミノ酸配列２２７番目から３０６番目および２８６番目から３０６番目からなるポリペプチドをあげることができる。
２．本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から調製することができる。
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞としては、ＡｋｔまたはＨｓｐ９０が発現している組織または細胞であればいかなるものでもよいが、例えば、脳、精巣、心臓、肺などがあげられる。
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて本発明のポリペプチドをコードする遣伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし本発明のペプチドをコードする本発明のＤＮＡを取得することができる。
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞のｍＲＮＡは市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、前述のごとくヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から調製してもよい。ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）、実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）’ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製したヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）］、λ  ＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λ  ＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等があげられる。
ｃＤＮＡを組み込んたベクターを導入する大腸菌としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、オリゴキャップ法［Ｇｅｎｅ，１３８，１７１（１９９４）、Ｇｅｎｅ，２００，１４９（１９９７）、蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）、実験医学，１１，２４９１（１９９３）、ｃＤＮＡクローニング、羊土社（１９９６）、遺伝子ライブラリーの作製法、羊土社（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’末端および３’末端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより本発明のポリペプチドをコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡをプローブとして、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。
また、本発明をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、本発明のＤＮＡを取得することもできる。
取得した本発明のＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中で本発明のポリペプチドをコードしている遺伝子を決定することができる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機Ｍｏｄｅｌ  ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、本発明のＤＮＡを取得することもできる。
３．本発明のポリペプチドを認識する抗体の調製
本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは本発明のポリペプチドの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用いることにより、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、本発明のポリペプチドを認識する抗体（以下、「本発明の抗体」と略記する）を作製することができる。また、本発明の抗体は、それらの抗体断片も包含し、ヒト化抗体等の遺伝子組換え抗体およびその抗体断片であってもよい。
（１）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは本発明のポリペプチドの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）［Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地］で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／ｌ）を加えた培地］１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）］等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明のポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。ポリペプチド量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
４．本発明のポリペプチドの利用方法
（１）本発明のポリペプチドを利用した物質のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドを利用して、該ポリペプチドの細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を変動させる化合物をスクリーニングすることができる。具体的には、本発明のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合や、アポトーシスの誘導または抑制を、定性的または定量的に調べることにより、細胞内のＡｋｔ活性を制御する活性を変動させる化合物を選択することができる。被験物質としては、本発明のポリペプチドを発現する細胞の培養系に加えることができるものであれば特に限定されず、例えば、低分子化合物、高分子化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、遺伝子、ウイルス、細胞などが挙げられる。遺伝子を除く被験物質は、培養培地中に直接添加すればよい。
遺伝子を効率的に細胞内に導入する方法としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクターに乗せて培養系に添加する方法、またはリポソームなどの人工的なベジクル構造に封入して培養系に添加する方法などが挙げられる。その具体的方法としては、組換えウイルスベクターを用いた遺伝子解析に関する報告［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３（１９９５）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，３５８７，１９９０；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，３８１６（１９９５）］に記載の方法を挙げることができる。
Ｈｓｐ９０とＡｋｔとの結合及びアポトーシスの誘導または抑制は、前述した方法により測定することができる。
本発明のスクリーニング方法により、例えば、本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドに結合するＨｓｐ９０、Ａｋｔなどの蛋白質との結合を阻害する化合物を得ることができる。
（２）本発明のポリペプチドの医薬製剤としての利用
本発明のポリペプチド、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害する化合物、及び本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに結合する蛋白質の活性化または活性低下により引き起こされる疾患の治療薬、予防薬、または診断薬等の医薬製剤の活性成分（以下、「本発明の活性成分」と略記する）として使用可能である。ここで、該ポリペプチドと該ポリペプチドに結合する蛋白質との結合を阻害する化合物としては、例えば、上記スクリーニング方法により得られた化合物があげられる。
本発明のポリペプチドに結合する蛋白質の活性化または活性低下により引き起こされる疾病としては、以下の疾病があげられる。アポトーシスによる過剰な細胞死が発症に関わる疾患としては、例えば劇症肝炎やその他のウイルス疾患、アルツハイマー病などの神経変性疾患、放射線障害などがあげられる。アポトーシス抑制が発症に関わる疾患としては、例えば胃癌、卵巣癌、乳癌、膵癌、前立腺癌等の悪性腫瘍や自己免疫疾患などがあげられる。また、糖代謝制御シグナルの異常によって生じる疾患としては、糖尿病等があげられる。
さらに、本発明の活性成分は、脳、心臓などの虚血時における細胞死抑制剤、抗癌剤や放射線治療時における正常細胞の細胞死からの保護剤、または抗癌剤等の既存の治療薬の効果を増強する薬剤として使用される。
抗癌剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、植物アルカロイドがあげられ、さらに具体的には、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｒｉｔａｘｅｌ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ゲルダナマイシンおよびラディシコールがあげられる。
これらの抗癌剤と同時に本発明の活性成分を患者に投与することも可能であるし、別々の容器に封入した組み合わせ（キット）として、スケジュールを決めて別々に投与することも可能である。また、本発明の活性成分に、スペーサーを介して上記の抗癌剤を結合させて生体へ投与してもよい。
患者への投与方法としては、活性成分であるポリペプチドをコードする遺伝子を挿入させた遺伝子治療用に調製した組換えベクターを、患者から取り出した細胞に導入させた後、細胞を生体内に戻す方法、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、レンチウィルス、センダイウィルス等のウィルスベクターに乗せて生体に投与する方法、リポソームなどの人工的なビークル構造に封入して生体に投与する方法、活性成分であるポリペプチドに細胞内への導入効率を高めるペプチド断片、例えば実施例に記載されたＴＡＴペプチド［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，１５６９−１５７２（１９９９）］などを融合させて生体に投与する方法などがあげられる。
抗癌剤と本発明の活性成分の投与比、投与スケジュールは、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度を考慮して決定される。
本発明の活性成分は、医薬製剤として、単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤などがある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
本発明の活性成分の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人一人当り０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．０５〜５０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人一人当り０．００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
＜発明を実施するための最良の形態＞
以下に、本発明の実施例を示すが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例１
Ａｋｔの免疫沈降による細胞内でのＨｓｐ９０とＡｋｔの結合の確認
１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養した、マウス繊維芽細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１６３）ならびにヒト胎児腎細胞２９３Ｔ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１８），８３９２（１９９３）］を回収し、細胞溶解用緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＮａＶＯ３、１２ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭアプロチニン］に懸濁して細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液にコントロールのヒツジＩｇＧまたはヒツジ抗Ａｋｔポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を結合させたプロテインＧアガロースを加え免疫沈降を行なった。免疫沈降物に関して、抗Ｈｓｐ９０抗体（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いたウエスタン・ブロッティングを行ないＡｋｔと共沈してくるＨｓｐ９０の有無を確認した。結果を図１に示す。ＢＡＬＢ／３Ｔ３ならび２９３Ｔいずれの細胞においても、細胞内でＡｋｔとＨｓｐ９０が結合していることが確認できた。
実施例２
変異型Ａｋｔを用いたＡｋｔ上のＨｓｐ９０結合領域の解析
全長のヒトＡｋｔ１遺伝子（ＷＴ）は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ヒト骨肉腫Ｓａｏｓ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）［Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１８２，２９０（２０００）］より取得した。また取得した遺伝子をもとに、ＰＣＲにて、種々のＡｋｔ１遺伝子の断片（配列番号５記載のアミノ酸配列の１−４３３（△Ｃ）、１２０−４８０（△Ｎ）、１２０−４３３（△ＮＣ）、１−１７５、１−２２８、１−３３１、２０５−４８０、３４０−４８０、１−２４６、１−２６７、１−２８８、１−３０９番目に相当するアミノ酸配列を有する欠失変異体をコードする遺伝子断片）を取得した。上記の全長Ａｋｔ１遺伝子ならびに欠失変異体は、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターへサブクローニングして細胞発現用ベクターとした。ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳベクターにサブクローニングしたＶ５タグ付きＨｓｐ９０βとＨｓｐ９０αの全長遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と、上記Ａｋｔ１の全長あるいは欠失変異体を含む発現ベクターをＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、実施例１と同様の方法で細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液から抗ＦＬＡＧ  ｔａｇ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて全長Ａｋｔ１蛋白質あるいはその欠失変異体蛋白質を免疫沈降し、免疫沈降物中のＨｓｐ９０βまたはＨｓｐ９０αの有無を、抗Ｖ５  ｔａｇモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたウエスタン・ブロッティングにて検出した。結果を図２に示す。この結果、Ａｋｔ１のＨｓｐ９０結合領域は、配列番号５に記載のＡｋｔ１のアミノ酸配列の２２９〜３０９番目のアミノ酸配列を有する領域であり、その中でも特に２８９〜３０９番目のアミノ酸配列を有する領域が強い結合に必要であることが明らかとなった。
実施例３
変異型Ｈｓｐ９０を用いたＨｓｐ９０上のＡｋｔ結合領域の解析
全長のヒトＨｓｐ９０β遺伝子（ＷＴ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製より入手した。また、ＰＣＲにて種々のＨｓｐ９０β遺伝子の断片（配列番号１記載のＨｓｐ９０βのアミノ酸配列の１−３０１（△Ｃ）、１−５３０（Ｍｉｄ）、１−６３５、５３４−７２４（△Ｎ）、５３４−６８０、１−３１５、１−３２６、１−３４０、１−３５５、１−３６８、１−４５６に相当するアミノ酸配列を有する欠失変異体をコードする遺伝子断片）を取得した。これら全長Ｈｓｐ９０βならびにＨｓｐ９０β欠失変異体遺伝子は、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターにサブクローニングした。ｐＵＳＥａｍｐベクターに組み込まれた（Ｈｉｓ）６  ｔａｇマウスＡｋｔ１遺伝子はＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入した。該（Ｈｉｓ）６  ｔａｇマウスＡｋｔ１遺伝子と、ＦＬＡＧ  ｔａｇ  Ｈｓｐ９０βの全長あるいは欠失変異体を含む発現ベクターをＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、実施例１と同様の方法で細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液から抗（Ｈｉｓ）６  ｔａｇ抗体を用いてＡｋｔ１を免疫沈降し、免疫沈降物中のＨｓｐ９０βあるいはその欠失変異体の有無を、抗ＦＬＡＧ  ｔａｇ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を用いたウエスタン・ブロッティングにて検出した。結果を図３に示す。この結果、Ｈｓｐ９０βのＡｋｔ結合領域は、配列番号１に記載のＨｓｐ９０βのアミノ酸配列の３２７〜３４０番目のアミノ酸配列を有する領域であることが明らかとなった。
実施例４
Ａｋｔ欠失変異体によるＨｓｐ９０−Ａｋｔ結合阻害とＡｋｔ活性阻害
ＨＡタグを付けたＡｋｔ１欠失変異体遺伝子（ｐＨＭ６ベクターを使用。配列番号５記載のアミノ酸配列の１−３０９、１−２２８、１−２８８番目に相当するアミノ酸配列をコードする遺伝子）、Ｖ５タグを付けたＨｓｐ９０βの全長遺伝子（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｓｐ９０β）、ならびにＦＬＡＧタグを付けたＡｋｔ１全長遺伝子（ｐＦＬＡＧ−Ａｋｔ１）を２９３Ｔ細胞に導入した。その後、細胞を血清除去条件下で２４時間培養し、実施例１の方法で細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液中のＡｋｔ１を抗ＦＬＡＧ  ｔａｇ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）にて免疫沈降した。免疫沈降物中のＡｋｔ１のスレオニン３０８番のリン酸化を抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で、Ａｋｔ１の発現を抗Ａｋｔ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で、Ｈｓｐ９０βの発現を抗Ｖ５ｔａｇモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、Ａｋｔ欠失変異体の発現を抗ＨＡ  ｔａｇモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）でそれぞれウエスタン・ブロッティングを行ない確認した。結果を図４に示す。実施例２ならびに実施例３で明らかとなったＨｓｐ９０βのアミノ酸配列の３２７〜３４０番目のアミノ酸配列を有する領域に結合するＡｋｔ１部分配列（２２９〜３０９番目のアミノ酸配列）を含むＡｋｔ１欠失変異体（１〜３０９番目のアミノ酸配列、および１〜２８８番目のアミノ酸配列）を細胞に導入した場合にのみ、Ａｋｔ１とＨｓｐ９０βの結合ならびにＡｋｔ１のスレオニン３０８番のリン酸化が阻害された。
上記のＨｓｐ９０βとＡｋｔ１の結合阻害がＡｋｔ活性におよぼす影響を調べる目的で、ＦＬＡＧタグを付けたＡｋｔ１全長遺伝子［ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２（ＷＴ）］またはそのベクターコントロール［ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２（Ｍｏｃｋ）］と、ＨＡタグを付けたＡｋｔ１欠失変異体（１〜３０９番目のアミノ酸配列）遺伝子［ｐＨＭ６（１−３０９）］またはそのベクターコントロール［ｐＨＭ６（Ｍｏｃｋ）］を２９３Ｔ細胞に導入し、細胞を血清除去条件下で２４時間培養した後に実施例１の方法で細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液に対して抗Ａｋｔ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と結合させたプロテインＧアガロースを加え免疫沈降を行なった。免疫沈降物のＡｋｔ活性は基質の一つであるＧＳＫ３のリン酸化部位の部分ペプチドを用いたＡｋｔ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて測定した。結果を図５に示す。Ａｋｔ１の部分配列（１〜３０９番目のアミノ酸配列）によってＡｋｔ１とＨｓｐ９０βの結合を阻害した時にＡｋｔ活性が低下することが明らかとなった。
実施例５
Ａｋｔ欠失変異体によるアポトーシス誘導作用
実施例１〜４で示した、Ａｋｔ１の部分配列（１〜３０９番目のアミノ酸配列）によるＡｋｔ１とＨｓｐ９０βの結合阻害とそれに伴うＡｋｔ活性の低下が細胞のアポトーシス誘導に繋がることを証明する目的で、ＦＬＡＧタグを付けたＡｋｔ１部分配列（１〜３０９番目のアミノ酸配列）あるいはそのベクターコントロール（Ｍｏｃｋ）を２９３Ｔ細胞に導入し、血清除去あるいは１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した後に細胞を４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）にて染色した。また上記細胞内のキャスパーゼ−３様プロテアーゼ（ｃａｓｐａｓｅ−３  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）活性をＯｎｃｏｇｅｎｅ，１７，１２９５−１３０４（１９９８）記載の方法で測定した。具体的には、回収した細胞を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＣＨＡＰＳを含む溶解液中で溶解し、得られた細胞溶解液５μｇ蛋白質相当とＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｓｐａｒｔｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｖａｌｙｌ−Ｌ−ａｓｐａｒｔ−７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）（ペプチド研究所社製）をＩＣＥ緩衝液［１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）／１０％グリセロール／２ｍＭジチオスレイトール］中で３７℃、１時間反応させた。反応終了後、キャスパーゼ−３様プロテアーゼ活性によるＡＭＣの遊離をＨｉｔａｃｈｉ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（日立製作所社製）を用いて、励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍにて測定した。結果を図６ならびに図７に示す。Ａｋｔ１の部分配列（１〜３０９番目のアミノ酸配列）導入によって、１０％牛胎児血清存在下でもＭｏｃｋと比較してＤＡＰＩで染色される核の凝集や断片化が観察され、血清非存在下ではその傾向がさらに顕著であった。またキャスパーゼ活性に関しても、ＤＡＰＩ染色で見られるアポトーシス細胞像と相関した亢進がみられ、アポトーシスシグナルが亢進していることが確認された。以上の結果より、Ａｋｔ１の部分配列（１〜３０９番目のアミノ酸配列）により、Ａｋｔ１とＨｓｐ９０βの結合を阻害した時に細胞のアポトーシスが誘導されることが明らかになった。
実施例６
Ａｋｔ欠失変異体によるＶＰ−１６によるアポトーシス刺激に対する感受性増強作用
実施例１〜４で示した、Ａｋｔ１の部分配列（１〜３０９番目のアミノ酸配列）によるＡｋｔ１とＨｓｐ９０βの結合阻害とそれに伴うＡｋｔ活性の低下が抗癌剤によるアポトーシス刺激に対する癌細胞の感受性を増加させることをＶＰ−１６を用いて検証した。具体的には、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベクターへＡｋｔ１欠失変異体遺伝子（Ａｋｔ１のアミノ酸配列１〜３０９番目のアミノ酸配列をコードする遺伝子に相当）をサブクローニングしたものあるいはそのベクターコントロール（Ｍｏｃｋ）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして、２４時間後に培地を３０μｇ／ｍｌ  ＶＰ−１６を含む無血清培地（ＶＰ−１６＋）、あるいはＶＰ−１６を含まない無血清培地（ＶＰ−１６−）へ置換した。さらに２４時間培養後、実施例１に記載の方法で細胞溶解液を調製した。抗ポリ−（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ［ｐｏｌｙ−（ＡＤＰ  ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）］抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、得られた細胞溶解液のウエスタン・ブロッティングを行ない、キャスパーゼ−３による切断によって生じるＰＡＲＰの８５ｋＤａフラグメントを検出することにより、細胞内のアポトーシスシグナルの活性化を解析した。また、観察されるＰＡＲＰ切断がキャスパーゼによる切断であることを検証する目的で、キャスパーゼ阻害剤であるＺ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＤＣＢ（フナコシ社製）を１００μｇ／ｍｌの濃度で添加したもの（Ｚ−Ａｓｐ＋）に関しても同様のウエスタン・ブロッティングを行なった。結果を図８に示す。Ａｋｔ１の部分配列（１−３０９）を導入して、Ａｋｔ１とＨｓｐ９０βの結合阻害をした時に、ＶＰ−１６刺激によって生じるＰＡＲＰの切断が増強されており、ＶＰ−１６によるアポトーシス刺激に対する感受性が増加していることが確認された。
実施例７
Ｈｓｐ９０欠失変異体によるアポトーシス抑制作用
実施例１〜３で示した、Ｈｓｐ９０β上のＡｋｔ結合領域にあたる配列番号１記載のアミノ酸配列の３２７−３４０番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸ペプチドのアポトーシス制御作用を調べる目的で、細胞内導入用ペプチドとしてＴＡＴペプチド［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，１５６９−１５７２（１９９９）］をＨｓｐ９０β（３２７−３４０番アミノ酸）Ｃ末端に結合した、ＨＳＰ３２７−ＴＡＴペプチド（ＬＥＦＲＡＬＬＦＩＰＲＲＡＰ−ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ）とネガティブコントロールとして、Ａｋｔとの結合領域ではない配列番号１記載のアミノ酸配列の２８７−３００番目のアミノ酸配列を有するＴＡＴ結合ペプチドであるＨＳＰ２８７−ＴＡＴペプチド（ＰＩＷＴＲＮＰＤＤＩＴＱＥＥ−ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ）を細胞に添加しアポトーシスへの影響を調べた。具体的には、ヒト繊維芽肉腫細胞ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）をペプチド無処理、０．１μｍｏｌ／Ｌ、または１μｍｏｌ／ＬのＨＳＰ３２７−ＴＡＴまたはＨＳＰ２８７−ＴＡＴペプチドを添加して、血清除去ＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した。その後、細胞を回収し、実施例１に記載の方法で細胞溶解液を調製した。抗ＰＡＲＰ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、得られた細胞溶解液のウエスタン・ブロッティングを行ない、キャスパーゼ−３による切断によって生じるＰＡＲＰの８５ｋＤａフラグメントを検出することにより、細胞内のアポトーシスシグナルの活性化を解析した。その結果を図９に示す。この結果、１μｍｏｌ／ＬのＨＳＰ３２７−ＴＡＴを添加したもののみ、ＰＡＲＰの８５ｋＤａフラグメントの生成が抑制されており血清除去によって起こるＨＴ１０８０細胞のアポトーシスが抑制されていることを確認した。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２０００年８月２２日出願の日本特許出願Ｎｏ．２０００−２５１５２９に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
＜産業上の利用可能性＞
本発明により、アポトーシス抑制や糖代謝に関与するＡｋｔの活性制御に関わるＨｓｐ９０上の機能部位および該Ｈｓｐ９０と結合するＡｋｔ上の機能部位を同定された結果、アポトーシス制御や糖代謝制御シグナルの異常によって生じる胃癌、卵巣癌、乳癌、膵癌、前立腺癌等の悪性腫瘍、糖尿病等の疾患に対する予防薬および治療薬、脳、心臓などの虚血時における細胞死抑制剤、抗癌剤や放射線治療時における正常細胞の細胞死からの保護剤、または既存の治療薬の効果を増強する薬剤等が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＢＡＬＢ／３Ｔ３と２９３Ｔ細胞内でのＨｓｐ９０とＡｋｔの結合を、抗Ａｋｔ抗体による免疫沈降後に抗Ｈｓｐ９０抗体を用いたウエスタン・ブロッティングで検出した実験結果を示す。
図２は、Ａｋｔ１欠失変異体を用いて、Ｈｓｐ９０βとの結合に必須の領域を解析した実験結果を示す。
図３は、Ｈｓｐ９０β欠失変異体を用いて、Ａｋｔ１との結合に必須の領域を解析した実験結果を示す。
図４は、Ａｋｔ１欠失変異体遺伝子を細胞に導入したときの、細胞内でのＨｓｐ９０βとＡｋｔ１の結合を阻害ならびにＡｋｔ１のリン酸化阻害を解析した実験結果を示す。
図５は、Ａｋｔ１欠失変異体遺伝子を細胞に導入して、細胞内でのＨｓｐ９０βとＡｋｔ１との結合を阻害した時のＡｋｔ活性の変化を解析した実験結果を示す。
図６は、Ａｋｔ１欠失変異体遺伝子を細胞に導入して細胞内でのＨｓｐ９０βとＡｋｔ１の結合を阻害した時の、細胞のアポトーシス誘導をＤＡＰＩによる核染色で解析した実験結果を示す。
図７は、Ａｋｔ１欠失変異体遺伝子を細胞に導入して細胞内でのＨｓｐ９０βとＡｋｔ１の結合を阻害した時の、細胞のアポトーシス誘導をキャスパーゼ−３様活性測定で解析した実験結果を示す。
図８は、Ａｋｔ１欠失変異体遺伝子を細胞に導入して細胞内でのＨｓｐ９０βとＡｋｔ１の結合を阻害した時の、ＶＰ−１６よるアポトーシス誘導刺激に対する感受性増強をキャスパーゼの基質であるＰＡＲＰの細胞内切断活性で解析した実験結果を示す。
図９は、Ｈｓｐ９０β上のＡｋｔ結合部位を含んだペプチドを細胞に導入した際の、細胞のアポトーシス誘導刺激に対する感受性低下をキャスパーゼの基質であるＰＡＲＰの細胞内切断活性で解析した実験結果を示す。
なお、図中の符号、ＷＢはウエスタン・ブロッティング、α−Ｈｓｐ９０は抗Ｈｓｐ９０抗体、α−Ａｋｔは抗Ａｋｔ抗体、Ｃｏｎｔ．ＩｇＧはコントロールヒツジＩｇＧ、ＩＰは免疫沈降、ｐＦＬＡＧ−ａｋｔはＦＬＡＧタグを付けたＡｋｔ１全長遺伝子、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｓｐ９０βはＶ５タグを付けたＨｓｐ９０βの全長遺伝子、α−ＦＬＡＧは抗ＦＬＡＧ  ｔａｇ  Ｍ２モノクローナル抗体、α−Ｐ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）は抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）抗体、α−Ｖ５は抗Ｖ５  ｔａｇモノクローナル抗体、α−ＨＡは抗ＨＡ  ｔａｇモノクローナル抗体、ＦＬＡＧ−ＡｋｔはＦＬＡＧタグを付けたＡｋｔ１全長蛋白質、ｃ−Ａｋｔは内在性Ａｋｔ１全長蛋白質、１−３０９  ａｋｔはＦＬＡＧタグを付けたＡｋｔ１部分配列（１−３０９）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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