(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に配列番号１のアミノ酸配列からなるコバルト輸送活性ポリペプチドをコードする遺伝子DNA。
【請求項２】
上記遺伝子DNAが配列番号２の塩基配列からなる、請求項１記載の遺伝子DNA。
【請求項３】
上記遺伝子DNAがロドコッカス属細菌由来のものである、請求項１または２に記載の遺伝子DNA。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子DNAを含む組換え体プラスミド。
【請求項５】
コバルト型ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子DNAとを含む組換え体プラスミド。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換え体プラスミドにより形質転換された形質転換微生物。
【請求項７】
実質的に配列番号１のアミノ酸配列からなるコバルト輸送活性ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コバルト輸送活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子DNA、このDNAを含む組換え体プラスミド、このDNAおよびニトリルヒドラターゼ遺伝子DNAを含む組換え体プラスミド、および該組換え体プラスミドにより形質転換された形質転換微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニトリル化合物を水和してアミド化合物に変換する酵素はニトリルヒドラターゼ（NHase)として知られており、鉄を含むものとコバルトを含むものが知られている。後者に属するロドコッカス  ロドクロウスJ1株のH型ニトリルヒドラターゼは、その能力の高さからアクリルアミドの工業生産に利用されている。コバルト型のニトリルヒドラターゼを産生する思われる微生物は、ロドコッカス属細菌の他にもリゾビウム属（特開平６-25296号公報）やクレブシエラ属（特開平5-30982号公報）の微生物などが知られている。更に、これらの酵素を含む微生物触媒を、遺伝子組換えの方法によりさらに有用なものに改良していく試みがなされており（特開平4-211379号公報、特開平6-25296号公報、特開平6-303971号公報）、活性向上を含め触媒改良のための有用な方法が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
発明者らは、コバルト酵素であるJ1株L型ニトリルヒドラターゼ遺伝子（特開平4-211379号公報、Biochim. Biophys. Acta 1129, 23-33 (1991)）とその約1.9kb下流に存在するアミダーゼ遺伝子との間に、既知のニッケル輸送ポリペプチドとホモロジーを有するポリペプチドをコードする遺伝子を見いだした。さらに、この遺伝子を組込み発現させた細菌は高いコバルト取り込み活性を有することを見いだし、同一菌体内で上記ニトリルヒドラターゼ遺伝子に加え該遺伝子を発現させることで、ニトリルヒドラターゼ活性が向上することを見いだした。
【０００４】
そこで、本発明の課題はコバルト輸送活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子DNA、このDNAを含む組換え体プラスミド等を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、実質的に配列番号１のアミノ酸配列を有するコバルト輸送活性ポリペプチドの遺伝子DNAである。この遺伝子DNAとしては、ロドコッカス属細菌由来のものが挙げられ、更にこの遺伝子DNAとしては、例えば配列番号２の塩基配列を有するものが挙げられる。なお、ここで「実質的に配列番号１のアミノ酸配列を有するコバルト輸送活性ポリペプチド」における「実質的に」とは、配列番号１のアミノ酸配列を有するコバルト輸送活性ポリペプチドの他にそのポリペプチドがコバルト輸送活性を有する限り前記配列番号１のアミノ酸配列のうちのいくつかのアミノ酸が欠失、置換、挿入等の変化があってもよいことを意味するものである。また、本発明の遺伝子DNAは、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のボリペプチドをコードする縮重異性体をも包含するものであることはいうまでもない。
【０００６】
更に、本発明はさらに上記遺伝子DNAを含む組換え体プラスミドである。
更に、本発明はさらにニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子とコバルト輸送活性ポリペプチドのの遺伝子DNAとを含む組換え体プラスミドである。
【０００７】
更に、本発明は上記組換え体プラスミドにより形質転換された形質転換微生物である。
更に、本発明は実質的に配列番号１のアミノ酸配列を有するコバルト輸送活性ポリペプチドである。
以下に、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明は、下記の工程により実施されるものである。
１）ニトリルヒドラターゼ遺伝子とアミダーゼ遺伝子間の塩基配列の決定：
J1株L型ニトリルヒドラターゼ遺伝子とその下流に存在するアミダーゼ遺伝子との間の塩基配列を決定する。
【０００９】
２） nhlFの発現ベクターへの挿入：
両遺伝子間に見いだされたオープンリーディングフレームをコードする遺伝子nhlFを大腸菌発現ベクターpUC1及びpSTV29に組込みそれぞれプラスミドpLCOexおよびプラスミドpLCOexSTを作製する。なお、プラスミドpLCOexおよびプラスミドpLCOexSTの制限酵素地図はそれぞれ図４および図５に示す。
【００１０】
３）大腸菌形質転換体のコバルト取り込み活性：
作製したプラスミドを大腸菌に導入しコバルト取り込み活性を測定する。
【００１１】
４）J1株染色体DNAの調製：
ロドコッカス  ロドクロウスJ1株より染色体DNAを分離、調製する。
【００１２】
５）DNAライブラリーの作製：
J1株L型ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子を有するプラスミドより、J1株由来の遺伝子部分を切り出しこれを放射線同位元素でラベルしプローブとする。染色体DNAを制限酵素で切断後、サザーンハイブリダイゼーション法（Southern E. M. , J. Mol. Biol. 98 503 (1975)）により目的遺伝子を含有するDNA断片画分を上記プロープを用いて検出しする。この画分をプラスミドベクターpUC18に挿入しライブラリーとする。
【００１３】
６）形質転換体の作製および組換え体DNAの選別：
工程（５）で作製された組換え体DNAのライブラリーによる形質転換体を作製し、その中から工程（５）で作製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法（R. Bruce Wallace. et al. Nuc. Acids Res. 9 879 (1981)）により目的の組換え体DNAを含む形質転換体を選別する。更にサザーンハイブリダイゼーション法により目的の組換え体DNAの再確認を行う。
【００１４】
７）組換え体プラスミドの精製と制限酵素地図の作製：
工程（６）で得られた組換え体よりプラスミドを精製する。こうして得られたプラスミドをpNLU10と称する。これを種々の制限酵素を用いて切断したものについて電気泳動で分析し、制限酵素地図を作成する。
８）調節遺伝子およびNHase遺伝子を含む領域およびロドコッカス属において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え体プラスミドの作製：
工程（７）で得られたプラスミドpNLU10、J1株L型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドpNHJ20Lおよび複合プラスミドベクターpK4より、調節遺伝子およびNHase遺伝子を含む領域およびロドコッカス属において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え体プラスミドpLJK10を作製する。
【００１５】
９）ロドコッカス属細菌の形質転換：
工程（８）で得られたプラスミドpLJK10によりロドコッカス属細菌を形質転換し、J1株由来のニトリルヒドラターゼが発現することを確認する。プラスミドpLJK10から種々の領域を除いたプラスミドpLJK20〜pLJK60を作製する。
【００１６】
10) ロドコッカス属細菌形質転換体のコバルト取り込み活性：
工程（９）で得られたプラスミドpLJK50およびpLJK60を導入した形質転換体についてコバルト取り込み活性を測定する。
【００１７】
なお、ロドコッカス  ロドクロウスJ1株はFERM BP-1478として生命工学工業技術研究所に寄託されている。また、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドpNHJ20Lはこれを含有する形質転換体TG1/pNHJ20L（FERM BP-2778）として、複合プラスミドベクターpK4はこれを含有する形質転換体ロドコッカス  ロドクロウスATCC12674/pK4（FERM BP-3731）として、プラスミドpNLU10はこれを含有する形質転換体JM109/pNLU10（FERM P-14493）として寄託されている。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、実施例において下記の略語を用いた。
TE: 10 mM Tris-HCl (pH7.8)-1 mM EDTA (pH8.0)
TNE: 50 mM Tris-HCl (pH8.0)-1 mM EDTA (pH8.0)-50 mM NaCl
STE: 50 mM Tris-HCl (pH8.0)-1 mM EDTA (pH8.0)-35 mM シュークロース
LB培地: 1.0%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl
2xYT培地: 1.6 % トリプトン、1 % 酵母エキス、0.5% NaCl
MY培地: 1%ポリペプトン、0.3%酵母エキス、0.3%麦芽エキス、1%グルコース
培地A: Tryptone  5g, Yeast extract 5g, Glucose 1g, K2HPO4 1g/l (pH 7.0)
【００１９】
【実施例】
〔実施例１〕
１）ニトリルヒドラターゼ遺伝子とアミダーゼ遺伝子間の塩基配列の決定
J1株L型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む9.4kbDNA断片がpUC19ベクターに組み込まれたプラスミドpNHJ20L（特開平4-211379号公報、Biochim. Biophys. Acta 1129, 23-33 (1991)）に含まれ、ニトリルヒドラターゼ遺伝子とアミダーゼ遺伝子（Eur. J. Biochem. 217, 327-336 (1993)）の間の制限酵素EcoRIで挟まれる約1.5 kbの領域の塩基配列については全く知られていなかった。そこで、この領域の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定はTth DNA polymeraseを用いたチェーンターミネーション法（Sanger F.  Science 214, 1205-1210 (1980)）により行った。塩基配列が決定されていなかった制限酵素EcoRIで挟まれる約1.5 kbの領域を決定した。この前後の領域を含む2,040bpの長さの塩基配列を配列番号３に示した。
【００２０】
その結果、ニトリルヒドラターゼ遺伝子とアミダーゼ遺伝子の間には二つのオープンリーディングフレームが見いだされた。nhlFと名付けた２番目のオープンリーディングフレームにコードされるポリペプチドについてポリペプチドデータベース(SWISS PROT)をホモロジー検索したところ、ニッケル輸送ポリペプチドやウレアーゼのアクセサリーポリペプチドとホモロジーを有することが見いだされた。
【００２１】
２） nhlFの発現ベクターへの挿入
L型ニトリルヒドラターゼがコバルトポリペプチドであることから、nhlFがコバルト輸送ポリペプチドをコードする遺伝子ではないかと考えられた。そこで、PCR法によりnhlFを増幅し発現ベクターpUC19(宝酒造製) および低コピーベクターpSTV29(宝酒造製) に挿入し、プラスミドpLCOex（pUC19由来）およびpLCOexST（pSTV29由来）を作製した。
【００２２】
プラスミドの作製は以下のようにして行った。
これらのベクターpUC19 またはpSTV2910μLに対し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μL、制限酵素HindIIIとPstIをそれぞれ 2μL、滅菌水 13 μLを加え37℃にて２時間反応させた。反応液に等量のTE飽和フェノールを加え攪拌後遠心し上層（水層）と下層に分離させた。上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルムを加え同様の抽出操作を2回繰り返した。上層に3μLの3M酢酸ナトリウムと90μLのエタノールを加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTEに溶解した。一方、次の条件で増幅したPCR生成物を上記と同様の条件でHindIIIとPstIで切断、精製断片を得た。
【００２３】
反応液（100μL）：  67mM Tris-HCl (pH 8.3 )、6.7mM MgCl2、
0.2mM dNTP、鋳型としてpNHJ20L 100ng
1μM プライマー1（センス）：
5'CTGCGAAGCTTAAGGAGGAAATAGGTATGACCAGCACCACC3'
1μM プライマー２（アンチセンス）：
5'GGGTATCTCGGTGGCTGCAGTGATCGTGGGC3'
反応温度：  94℃ 60秒、55℃ 60秒、75℃ 180秒、30サイクル
【００２４】
こうして得られたベクター断片と挿入断片をTAKARAライゲーションキットを用いて4℃で一晩反応させることにより結合させた。これらの反応液を用いて大腸菌を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミドを抽出した。大腸菌の形質転換は以下のように行った。大腸菌JM109株を2xYT培地10mLに37℃で12時間培養後、新規な同培地に前記培養菌を１%植菌し２時間培養した。遠心により集菌した後、冷50 mM CaCl2溶液を 5mL加え、0℃で40分間放置後、再度遠心し、冷50 mM CaCl2溶液0.25 mLに懸濁した。これに上記反応液60μLを加え、０℃で40分間放置後、42℃で２分間ヒートショックを与え、2xYT培地1 mLを加え37℃にて60分間振盪培養した。100 μLずつをアンピシリン50μg / mL含有2xYT寒天培地にまき、37℃で培養した。寒天培地上に生育したコロニーをアンピシリン50μg / mL含有2xYT培地1.5 mLにて培養し、プラスミドを抽出し、目的の挿入断片が組み込まれているかを確認した。
【００２５】
３）大腸菌形質転換体のコバルト取り込み活性
工程２）において作製したプラスミドが導入された形質転換体のコバルト取り込み活性を調べた。大腸菌JM109/pLCOexおよびJM109/pLCOexSTを1mM IPTGを含むLB培地で培養後、集菌し、緩衝液50 mM Tris-HCl, 10mM MgCl2 (pH7.5)にて一回洗浄し、10 mLの同緩衝液に菌体濃度が約0.1 mg dry cell / mLとなるように懸濁した。30℃で5分間放置後、放射性57CoCl2を加えて反応を開始した。5分おきに100μLずつサンプリングし、0.45μmのメンブレンフィルター上に捕集し、乾燥後γカウンターで放射能を計測して、菌体内に取り込まれたコバルトの量を測定した。図１に示すようにnhlFを含むプラスミドを導入した大腸菌は高いコバルト取り込み活性を示し、nhlFはコバルトの取り込みに関与していることが明らかとなった。
【００２６】
〔実施例２〕
１）染色体DNAの調製
ロドコッカス  ロドクロウス J1株(FERM BP-1478)を100mLの培地（グルコース、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4・7H2O、酵母エキス、ペプトン、CoCl2、尿素、水1L、pH7.2）で培養後、集菌した。TENで洗浄後、10mLのTEに懸濁し、0.25M EDTA4mL、リゾチーム10〜20 mg、アクロモプロテアーゼ10〜20 mgおよび10%SDS 10 mLを加え、37℃で3時間放置後、遠心し、上清を得た。2.5M酢酸ナトリウム溶液0.7 mL、ジエチルエーテルを加え遠心し、上層を捨て下層に2倍溶のエタノールを加えガラス棒でDNAを巻き取った。これをTE：エタノール（容積比）2:1、1:9、0:10の各溶液に5分間ずつ浸した後、2〜4 mLのTEに溶かし、RNase AとT1の混合物10μLを加え37℃で処理した。次に、TEで飽和されたフェノールを等量加え、遠心後の上層に等量以上のエーテルを加え、下層を得た。これをクロロホルムを少量添加した2LのTEで一晩透析し、2回目の透析を3〜4時間行い、染色体DNA標品4mLを得た。
【００２７】
２）DNAライブラリーの作製
J1株L型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む9.4kbDNA断片がpUC19ベクターに組み込まれたプラスミドpNHJ20L（特開平4-211379号公報、Biochim. Biophys. Acta 1129, 23-33 (1991)）を制限酵素SacIとEcoRIで切断後、1 kbのSacI-EcoRI断片を1%アガロースゲル電気泳動により分離し、ゲルより切り出し回収した。制限酵素による切断は以下のように行った。pNHJ20L 10μLに対し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μL、制限酵素SacIおよびEcoRIをそれぞれ２μL、滅菌水13μLを加え37℃にて２時間反応させた。
【００２８】
J1株染色体DNAをEcoRIにより切断した標品についてアガロースゲル電気泳動を行った。上記1.35 kb SacI-EcoRI断片を放射性同位元素P32でラベルし、これをプローブとしてサザーンハイブリダイゼーション法により上流域を含む約7.5 kbのDNA断片を検出した。プローブによりハイブリダイズした7.5 kb断片を含むDNA断片画分をアガロースゲルより切り出し、EcoRIで切断したプラスミドベクターpUC18に挿入した。
【００２９】
pUC18の切断は以下のように行った。pUC18 10μLに対し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μL、制限酵素EcoRIをそれぞれ  ２μL、滅菌水 13 μLを加え30℃にて２時間反応させた。反応液に等量のTE飽和フェノールを加え攪拌後遠心し上層（水層）と下層に分離させた。上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルムを加え同様の抽出操作を2回繰り返した。上層に３μLの3M酢酸ナトリウムと90μLのエタノールを加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTEに溶解した。
7.5 kb EcoRI断片を含むDNA断片画分３μLを、上記のようにして調製したEcoRI切断pUC18  1μLとTAKARAライゲーションキットを用いて4℃で一晩反応させることによりpUC18への挿入を行い、DNAライブラリーとした。
【００３０】
３）形質転換体の作製および組換え体DNAの選別
大腸菌JM109株を2xYT培地10mLに37℃で12時間培養後、新規な同培地に1%植菌し2時間培養した。遠心により集菌した後、冷50 mM CaCl2溶液を 5mL加え、0℃で40分間放置後、再度遠心し、冷50 mM CaCl2溶液0.25 mLに懸濁した。これに工程２）で作製した組換え体プラスミドを含有する溶液（DNAライブラリー）を60μLを加え、0℃で40分間放置後、42℃で2分間ヒートショックを与え、2xYT培地1 mLを加え37℃にて60分間振盪培養した。これを100 μLずつアンピシリン50μg / mL含有2xYT寒天培地にまき、37℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニーについてコロニーハイブリダイゼーションを行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子上流域を含む形質転換体を選別した。すなわち、寒天培地上に生育させたコロニーをニトロセルロースフィルター上に移し、菌体を溶かしてDNAを固定した後、これを工程２）で作製したプローブ（1.35 kb断片）で処理し、オートラジオグラフ法で目的の組換え体DNAを含むコロニーを選択した。更に、この選択したコロニーから組換え体プラスミドを抽出し、サザンハイブリダイゼーション法によって上述のプローブとハイブリダイズさせ、選抜したコロニーが目的遺伝子を含む形質転換体であることを再確認した。
【００３１】
４）組換え体プラスミドの精製と制限酵素地図の作製
工程３）で選択した形質転換体を100 mLの2xYT培地にて37℃一晩培養し、集菌後、TNEにより洗浄し、STEを8 mL、リゾチームを10 mg加え、0℃で5分間放置した。0.25 M EDTA 4 mL加え、さらに室温で10 % SDS 2 mL, 5 M NaCl 5 mLを加え、0〜4℃で3時間放置した。これを超遠心し、その上澄みに30 % PEG6000を1/2当量加え、0〜4℃で一晩放置し、遠心後TNEに溶解して7.5 mLとした。CsClを加えた後遠心により除タンパクを行い、臭化エチジウム溶液を300〜500 mg/mL加えシールチューブに移し、熱シールし超遠心を行った。cccDNAを回収し、水飽和イソプロピルアルコールを当量以上加えて臭化エチジウムを除き、TEで透析し精製した組換え体プラスミド約３mLを得た。これをpNLU10と命名した。この組換え体プラスミドを数種の制限酵素を用いて切断し、図２に示される制限酵素地図を作製した。
【００３２】
５）調節遺伝子およびNHase遺伝子を含む領域およびロドコッカス属菌において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え体プラスミドの作製
工程４）で得られたプラスミドpNLU10は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むpNHJ20Lに含まれるJ1株由来のDNA断片と1.35 kbオーバーラップし、更に6.15 kb上流までを含んでいる。pNLU10より6.15 kbのEcoRI-SacI断片を切り出し、プラスミドpBluescript SK+に挿入してプラスミドpNLU20を作製した。次に、pNHJ20Lより9.4 kbのSacI断片を切り出し、pNLU20に正しい向きになるように挿入してプラスミドpNLUD30を作製した。更にpNLUD30より14.55 kbのHindIII断片を切り出し、大腸菌-ロドコッカス属細菌用複合プラスミドベクターpK4に挿入し、プラスミドpLJK10を作製した。pLJK10の作製過程を図３に示す。
【００３３】
６）ロドコッカス属細菌の形質転換
ロドコッカス  ロドクロウスATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、15%PEG6000（ポリエチレングリコール6000）溶液に懸濁した（菌体濃度109 cell / mL以上）。工程（５）で作製したプラスミド DNAまたはベクターDNA 1μgと菌体懸濁液100μLを混合し、氷冷した。ジーンパルサー用のチャンバーにDNAと菌体の混合液を入れ、氷冷した後、静電容量 25 μF，抵抗 400オーム、電場強度20 kV/cmで電気パルス処理を行った。
【００３４】
電気パルス処理液を氷冷下１０分間静置し、３７℃、５分間熱処理後、ＭＹ培地 1mlを加え、２５℃、３時間振とうした。50μg/mlカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布し28℃、2日間培養した。出現したコロニーが明らかにカナマイシン耐性であることを別に作成したカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布することにより確認した。
【００３５】
こうして作製したロドコッカス属細菌組換え体を、誘導物質としてクロトンアミド（2 g /L）を含む培地（グリセロール 10 g、ポリペプトン 5 g、酵母エキス 3 g、麦芽エキス 3 g、KH2PO4 1 g、K2HPO4 1 g、CoCl2・6H2O 0.01 g、(pH7.0) / L）にて28℃2日間培養し、ニトリルヒドラターゼの活性測定を行った。培養液より遠心分離により集菌し、150 mM NaClで洗浄後、0.35 % n-酪酸を含む0.1 M HEPES-KOH(pH7.2)に菌体を懸濁した。活性測定は以下のように行った。適当に水で希釈した菌体懸濁液0.25 mLに100 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.25 mL、12 mMのベンゾニトリルを0.5 mL加え20℃にて10分間反応後、1N HClを0.1 mL加えることにより反応を停止させた。生成するベンズアミドの定量をHPLCにより行った。
【００３６】
ロドコッカス  ロドクロウスATCC12674/pLJK10では、誘導物質を含まない培地で培養した場合にはベンズアミドの生成が0.016 mMと低かったのに対して、クロトンアミドを添加した場合には1.1 mMのベンズアミドが生成していた。ロドコッカス  ロドクロウスATCC12674/pK4（FERM BP-3731) では、いずれの場合もベンズアミドの生成は認められなかった。
【００３７】
pLJK10より欠失プラスミドpLJK20〜60を作製した。プラスミドpLJK20からプラスミドpLJK60までの作製にあたっては、図６に示したようにpNLUD30より8.3 kbのKpnI断片、11.8 kbのEcoRV-HindIII断片、5.45 kbのPstI断片、3.2 kbのKpnI断片をそれぞれ切り出し、pK4に挿入することにより作製した。ただし、pLJK10、pLJK20、pLJK30については、切断断片の末端をTAKARAのBlanting Kitを用いて平滑化してからライゲーションを行った。
【００３８】
７）ロドコッカス属細菌形質転換体のコバルト取り込み活性
ロドコッカス  ロドクロウスATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、15%PEG6000（ポリエチレングリコール6000）溶液に懸濁した（菌体濃度 109cell/mL 以上）。工程(7)で作製したプラスミド pLJK50、pLJK60またはベクターpK4  1μgと菌体懸濁液100μLを混合し、氷冷した。ジーンパルサー用のチャンバーにDNAと菌体の混合液を入れ、氷冷した後、静電容量 25 μF，抵抗 400オーム、電場強度20 kV/cmで電気パルス処理を行った。
【００３９】
電気パルス処理液を氷冷下１０分間静置し、３７℃、５分間熱処理後、ＭＹ培地 1mlを加え、２５℃、３時間振とうした。50μg/mlカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布し28℃、2日間培養した。出現したコロニーが明らかにカナマイシン耐性であることを別に作成したカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布することにより確認した。
これらのコロニーを培地Aにて28℃、24時間培養した。集菌後、氷冷した緩衝液[50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 (pH 7.5)]で一回洗浄し、同緩衝液に再懸濁し菌体懸濁液を得た。
【００４０】
pK4, pLJK50およびpLJK60をそれぞれ含むロドコッカス  ロドクロウス ATCC12674の形質転換体の菌体懸濁液（菌体濃度が約0.1mg.dry cell/ml）10 mlを30℃で5分間プリインキュベートした後、放射性57CoCl2を加え反応を開始した。5分おきに100mlずつサンプリングし、0.45mmのメンブレンフィルター上に捕集し、乾燥後、g-カウンターで放射能を計測して、菌体内に取り込まれたコバルトの量を測定した。結果を図７に示した。nhlFを含まないpLJK60やベクターpK4を導入したロドコッカス  ロドクロウス ATCC12674ではコバルトの取り込みはほとんど認められなかったが、nhlFを含むpLJK50を導入したものでは高いコバルト取り込み活性が認められた。
【００４１】
〔実施例３〕
実施例２において作製した組換え体ロドコッカス  ロドクロウス ATCC12674/pLJK50、ATCC12674/pLJK60およびATCC12674/pK4 を、CoCl2を含む培地Aにて28℃2日間培養し、実施例2と同様の方法によりニトリルヒドラターゼの活性測定を行った。CoCl2の最終濃度は0,1,2,3,4,5μMの6種で行った。
【００４２】
その結果、図８に示すように、nhlFを含むpLJK50を導入したものではnhlFを含まないpLJK60やベクターを導入したものよりも高いニトリルヒドラターゼ活性を示した。図中、黒色の棒グラフはロドコッカス  ロドクロウス ATCC12674/pLJK50を、網かけの棒グラフはロドコッカス  ロドクロウスATCC12674/pLJK60をそれぞれ示す。
【００４３】
【配列表】
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【００４４】
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【００４５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌JM109/pLCOexおよびJM109/pLCOexSTのコバルト取り込み活性を示す図。
【図２】組換え体プラスミドpNLU10の制限酵素地図を示す図。
【図３】組換え体プラスミドpLJK10の作製方法を示す図。
【図４】プラスミドpLCOexの制限酵素地図を示す図。
【図５】プラスミドpLCOexSTの制限酵素地図を示す図。
【図６】組換え体プラスミドpLJK10〜pLJK60にに挿入されているDNA断片を示す図。白抜き四角は本発明において塩基配列を決定した領域を示す。太い矢印は調節遺伝子を示す。
【図７】ロドコッカス  ロドクロウス ATCC12674/pLJK50、ATCC12674/pLJK60およびATCC12674/pK4 のコバルト取り込み活性を示す図。
【図８】ロドコッカス  ロドクロウス ATCC12674/pLJK50およびATCC12674/pLJK60のニトリルヒドラターゼ活性を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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