(57)【要約】本発明は、一般式（Ｉ）2002053569.tif 000022（式中、Ｒ１とＲ２は互いに異なり、その一方は飽和又は不飽和の炭素数８から２２の脂肪酸残基であり、その一方は水素原子またはアセチル基であり、Ｘは発色基である）で表わされるリゾリン脂質、および当該リン脂質を基質として用いることを特徴とするリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法、リゾホスホリパーゼＤの活性を阻害する物質のスクリーニング方法ならびにそれらの方法に有用な試薬、試薬キットを提供し、本発明の新規リゾリン脂質を基質として使用することにより、特異的、且つ高感度のリゾホスホリパーゼＤ活性測定が可能となる。また、安全で簡易に検出可能な発色基を使用することにより、多数の試料を迅速に測定することが可能となる。
2002053569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
2002053569.tif 000021
（式中、Ｒ１とＲ２は互いに異なり、その一方は飽和又は不飽和の炭素数８から２２の脂肪酸残基であり、その一方は水素原子またはアセチル基であり、Ｘは発色基である）で表わされるリゾリン脂質。
【請求項２】
当該脂肪酸残基がリノール酸残基、オレイン酸残基、パルミチン酸残基およびミリスチン酸残基からなる群より選択されるものである、請求の範囲１記載のリゾリン脂質。
【請求項３】
発色基がｐ−ニトロフェニル基またはα−ナフチル基である、請求の範囲１または２に記載のリゾリン脂質。
【請求項４】
請求の範囲１に記載のリゾリン脂質を有効成分として含有する、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用試薬。
【請求項５】
試料中のリゾホスホリパーゼＤの活性を測定する方法であって、試料に請求の範囲１記載のリゾリン脂質を添加し、当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼＤとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量することを特徴とする測定方法。
【請求項６】
試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、請求の範囲５記載の測定方法。
【請求項７】
卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも１種の疾患の診断に利用することを特徴とする、請求の範囲６記載の測定方法。
【請求項８】
請求の範囲１記載のリゾリン脂質を含む、試料中のリゾホスホリパーゼＤ活性測定用キット。
【請求項９】
試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、請求の範囲８記載の測定用キット。
【請求項１０】
卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも１種の疾患の診断用である、請求の範囲８記載の測定用キット。
【請求項１１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表配列番号１に記載の塩基配列からなる、リゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１２】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、リゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つリゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質
【請求項１３】
請求の範囲１１記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１４】
請求の範囲１１記載の遺伝子を機能的に含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求の範囲１３または１４記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１６】
請求の範囲１４記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を蛋白質の発現が可能な条件下で培養し、得られる培養物からリゾホスホリパーゼＤ活性を有する物質を採取することを含むリゾホスホリパーゼＤの製造方法。
【請求項１７】
請求の範囲１６記載の製造方法によって製造されるリゾホスホリパーゼＤ。
【請求項１８】
リゾホスホリパーゼＤが請求の範囲１１記載の遺伝子によりコードされる蛋白質である、請求の範囲４記載のリゾホスホリパーゼＤ活性測定用試薬。
【請求項１９】
リゾホスホリパーゼＤが請求の範囲１２記載の蛋白質である、請求の範囲４記載のリゾホスホリパーゼＤ活性測定用試薬。
【請求項２０】
請求の範囲１１記載の遺伝子によってコードされる蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用の管理血清。
【請求項２１】
請求の範囲１２記載の蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用の管理血清。
【請求項２２】
リゾホスホリパーゼＤの活性を阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法；
（１）リゾホスホリパーゼＤを含有する試料に被検物質を添加する工程、
（２）リゾホスホリパーゼＤを含有する試料に請求の範囲１記載のリゾリン脂質を添加する工程、
（３）当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼＤとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量する工程、および
（４）発色の程度によって示されるリゾホスホリパーゼＤ活性を被検物質未添加の場合と比較する工程。
【請求項２３】
リゾホスホリパーゼＤが請求の範囲１１記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、請求の範囲２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
リゾホスホリパーゼＤが請求の範囲１２記載の蛋白質である、請求の範囲２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
請求の範囲１に記載のリゾリン脂質とリゾホスホリパーゼＤを含有する試料とを含む、リゾホスホリパーゼＤの活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
【請求項２６】
リゾホスホリパーゼＤが請求の範囲１１記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、請求の範囲２５記載のキット。
【請求項２７】
リゾホスホリパーゼＤが請求の範囲１２記載の蛋白質である、請求の範囲２５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規リゾリン脂質、当該リゾリン脂質を含有するリゾホスホリパーゼＤ活性測定用試薬、および当該リゾリン脂質を用いることを特徴とするリゾホスホリパーゼＤ活性の測定方法に関する。さらに本発明は該方法を利用するリゾホスホリパーゼＤ活性を阻害する物質のスクリーニング方法ならびにその為のキットに関する。
背景技術
ホスホリパーゼＤ（以下ＰＬＤともいう）は、リン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断する酵素である。ＰＬＤの中で、特にリゾリン脂質を基質とするものは、リゾホスホリパーゼＤ（以下ＬＰＬＤともいう）と呼ばれ区別されている。以前から動物の組織中にＬＰＬＤが存在することが報告されており（Ｗｙｋｌｅ　ＲＬら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１８４，１４９−１５５，１９７７；Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　９２０，８５−９３，１９８７）、さらには組織だけでなく、ラットの血漿（Ｔｏｋｕｍｕｒａ　Ａ．ら、Ｌｉｐｉｄｓ　３３，１００９−１０１５，１９９８）、ヒト血清（徳村彰ら、脂質生化学研究４２，４１−４４，２０００）においてもその存在が報告されている。しかしながらこれまでＬＰＬＤの精製ならびにクローニングに成功したという報告はなかった（Ｌｉｓｃｏｖｉｔｃｈ　Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４５，４０１−４１５，２０００）。
ＬＰＬＤは、生体内において主にリゾホスファチジルコリン（以下ＬＰＣともいう）等を基質とし、リゾホスファチジン酸（以下ＬＰＡともいう）の生成に寄与すると考えられている。近年、ＬＰＡは、細胞増殖の促進、平滑筋収縮、癌細胞の浸潤促進等、様々な生理活性を有することが示されている（板東浩二ら、実験医学１８，１８４−１９１，２０００）。またＬＰＡは、卵巣癌、子宮体癌、子宮頸癌（Ｘｕ　Ｙ．ら、ＪＡＭＡ　２８０，７１９−７２３，１９９８）、動脈硬化性疾患（Ｓｉｅｓｓ　Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６，６９３１−６９３６，１９９９）等の診断マーカーとして注目されており、その産生を担うＬＰＬＤの活性を測定することは、これらの疾患の診断において極めて重要であると考えられる。さらに、ＬＰＡレセプターの阻害が、アテローム性動脈硬化性疾患や心臓血管性疾患を予防および治療するための一つの手段になることが示唆されている（Ｓｉｅｓｓ　Ｗ．ら、上述、１９９９）。このことは、ＬＰＡを産生するＬＰＬＤを阻害する物質（ＬＰＬＤ活性阻害剤）もまた当該疾患の予防および治療に用いられるという可能性を示すものである。
これまでＬＰＬＤの活性測定法としては、放射標識したＬＰＣを試料と混合し、一定時間反応後、脂質を抽出、薄層クロマトグラフィーにて分離し、そのバンドの放射活性を測定する方法が知られているが、実用的なものではなかった。
一方、基質反応部位に発色基を付加し、酵素分解により遊離した発色性化合物を測る酵素活性測定法としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質としたアルカリホスファターゼ活性測定法、ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールを基質としたホスホリパーゼＤ活性測定法（Ａｒｒｉｇｏ　Ｐ．Ｄ’ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　３０４，２４９−２５４，１９９５、米国特許第５０１１９６４号公報）等が知られているが、リゾホスホリパーゼＤ活性測定法については未だ報告されていない。
発明の開示
本発明の目的は、試料中のリゾホスホリパーゼＤ（ＬＰＬＤ）活性を、特異的かつ簡便に測定する方法、および当該測定に有用な基質を提供することにある。さらに本発明の別の目的は当該測定方法を利用してＬＰＬＤ活性を阻害する物質をスクリーニングすることであり、かかるスクリーニングに有用な試薬やキットを提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、発色基を付加した基質を用い、遊離した発色性化合物の発色を指標としてＬＰＬＤ活性を測定する方法を見出した。また、今まで報告のなかったＬＰＬＤに関する分子生物学的知見を得ることに成功し、かかる知見をもとに当該活性測定方法ならびにスクリーニング方法の有用性を確認して本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）一般式（Ｉ）
2002053569.tif 000003
（式中、Ｒ１とＲ２は互いに異なり、その一方は飽和又は不飽和の炭素数８から２２の脂肪酸残基であり、その一方は水素原子またはアセチル基であり、Ｘは発色基である）で表わされるリゾリン脂質。
（２）当該脂肪酸残基がリノール酸残基、オレイン酸残基、パルミチン酸残基およびミリスチン酸残基からなる群より選択されるものである、上記（１）記載のリゾリン脂質。
（３）発色基がｐ−ニトロフェニル基またはα−ナフチル基である、上記（１）または（２）に記載のリゾリン脂質。
（４）上記（１）に記載のリゾリン脂質を有効成分として含有する、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用試薬。
（５）試料中のリゾホスホリパーゼＤの活性を測定する方法であって、試料に上記（１）記載のリゾリン脂質を添加し、当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼＤとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量することを特徴とする測定方法。
（６）試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、上記（５）記載の測定方法。
（７）卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも１種の疾患の診断に利用することを特徴とする、上記（６）記載の測定方法。
（８）上記（１）記載のリゾリン脂質を含む、試料中のリゾホスホリパーゼＤ活性測定用キット。
（９）試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、上記（８）記載の測定用キット。
（１０）卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも１種の疾患の診断用である、上記（８）記載の測定用キット。
（１１）以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表配列番号１に記載の塩基配列からなる、リゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（１２）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、リゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つリゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質
（１３）上記（１１）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（１４）上記（１１）記載の遺伝子を機能的に含む発現ベクター。
（１５）上記（１３）または（１４）記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
（１６）上記（１４）記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を蛋白質の発現が可能な条件下で培養し、得られる培養物からリゾホスホリパーゼＤ活性を有する物質を採取することを含むリゾホスホリパーゼＤの製造方法。
（１７）上記（１６）記載の製造方法によって製造されるリゾホスホリパーゼＤ。
（１８）リゾホスホリパーゼＤが上記（１１）記載の遺伝子によりコードされる蛋白質である、上記（４）記載のリゾホスホリパーゼＤ活性測定用試薬。
（１９）リゾホスホリパーゼＤが上記（１２）記載の蛋白質である、上記（４）記載のリゾホスホリパーゼＤ活性測定用試薬。
（２０）上記（１１）記載の遺伝子によってコードされる蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用の管理血清。
（２１）上記（１２）記載の蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用の管理血清。
（２２）リゾホスホリパーゼＤの活性を阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法；
（１）リゾホスホリパーゼＤを含有する試料に被検物質を添加する工程、
（２）リゾホスホリパーゼＤを含有する試料に上記（１）記載のリゾリン脂質を添加する工程、
（３）当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼＤとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量する工程、および
（４）発色の程度によって示されるリゾホスホリパーゼＤ活性を被検物質未添加の場合と比較する工程。
（２３）リゾホスホリパーゼＤが上記（１１）記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、上記（２２）記載のスクリーニング方法。
（２４）リゾホスホリパーゼＤが上記（１２）記載の蛋白質である、上記（２２）記載のスクリーニング方法。
（２５）上記（１）に記載のリゾリン脂質とリゾホスホリパーゼＤを含有する試料とを含む、リゾホスホリパーゼＤの活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
（２６）リゾホスホリパーゼＤが上記（１１）記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、上記（２５）記載のキット。
（２７）リゾホスホリパーゼＤが上記（１２）記載の蛋白質である、上記（２５）記載のキット。
発明の詳細な説明
本発明においてＬＰＬＤとは、リゾリン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断する酵素である。具体的には、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子によってコードされた蛋白質、あるいは以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質である。
（ａ）配列表配列番号１に記載の塩基配列からなる、リゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｄ）（ｃ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つリゾホスホリパーゼＤ活性を有する蛋白質
特に、本発明のＬＰＬＤは、以下の３つのアミノ酸配列を有する蛋白質であることが好ましい。
2002053569.tif 000004
本発明においてリゾホスホリパーゼＤは、リゾホスホリパーゼＤ活性を有する限りその由来に特に限定はなく、天然に存在する生物起源のものの他、自然もしくは人工の突然変異体、外来のリゾホスホリパーゼＤ遺伝子を導入して得られる形質転換体由来のものも全て包含される。
人工的に突然変異体を作製する方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発が挙げられる。より具体的には当該方法を用いて配列表配列番号１に示される塩基配列に任意の変異をもたらすことにより、変異リゾホスホリパーゼＤを得ることができる。かくして得られる変異リゾホスホリパーゼＤは、リゾリン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断するというリゾホスホリパーゼＤ活性を有している。
本発明のリゾホスホリパーゼＤは、（１）該酵素を産生する細胞または組織の培養物を原料として、あるいは全血、血清、血漿、尿および唾液等の生体試料から単離精製する方法、（２）化学的に合成する方法または（３）遺伝子組換え技術等によりリゾホスホリパーゼＤを発現するように操作された細胞から精製する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。
本発明のリゾホスホリパーゼＤの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち適当な液体培地中で、リゾホスホリパーゼＤを発現している細胞を培養し、得られる培養物から公知の方法で抽出、精製される。当該抽出、精製の方法は目的生成物の存在する画分に応じて適宜公知の手法が用いられる。
具体的には次のようにして行なわれる。まず、培養物をそのまま濾過又は遠心分離等の常法に付して細胞又は上清を回収する。細胞中に該酵素が蓄積されている場合には、当該回収した細胞を適当な緩衝液中に懸濁して、さらに界面活性剤を適当な濃度で加えて膜を可溶化する。次いで得られる粗抽出液を、必要ならば界面活性剤の存在下で、一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって該酵素を単離精製する。
該酵素が培養培地中に存在する場合には、まず培養物を濾過又は遠心分離に付して沈澱物（細胞等の固形物）を除去することにより、溶液部分のみを得、それを一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって目的物質を単離精製する。塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。より具体的には、例えば、減圧濃縮、凍結乾燥、常用の溶媒による抽出、ｐＨ調整、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の常用の吸着剤による処理、結晶化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精製することができる。
化学合成による本発明のリゾホスホリパーゼＤの製造は、例えば配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列を基にして、該アミノ酸をペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。
さらに本発明において、ＬＰＬＤは、天然に存在する、全血、血清および血漿などの生体試料を精製過程に付すことによっても得ることができる。例えば、ＬＰＬＤを含有する試料を、以下の工程に付すことによって得られ得る。
工程１：ポリエチレングリコール沈殿
工程２：ブルーセファロース６ＦＦカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程３：コンカナバリンＡセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程４：ＢｉｏＡｓｓｉｓｔＱカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程５：ＨｉＴｒａｐ　Ｈｅｐａｒｉｎカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程６：ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＰＨＥカラムを用いる疎水性クロマトグラフィー
工程７：Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ　ＣＨＴ−ＩＩカートリッジを用いるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
各工程における精製の程度は、ＨＰＬＣで検出されるピークの数や強さ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出されるバンドの数、濃さ等で蛋白質として確認することができ、また、ＬＰＬＤ活性を指標に確認することもできる。
ＬＰＬＤ活性の測定は、例えば、ＬＰＬＤがリゾホスファチジルコリンを基質としてリゾホスファチジン酸とコリンを生成する反応を利用して、リゾホスファチジルコリンを各工程で得られた各分画で処理して、産生されるコリンの量を測定することにより実施される。さらに、後述する本願発明のＬＰＬＤ活性測定方法を用いてもよい。
リゾホスホリパーゼＤ遺伝子のクローニングは、通常、以下の方法により行なわれる。まず、リゾホスホリパーゼＤを含む試料から、通常の方法に従って該酵素を完全または部分精製しＮ末端アミノ酸配列をエドマン法により決定する。決定された部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーまたはプローブとして用いて、既存のリゾホスホリパーゼＤを産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡライブラリーからクローニングする。
あるいは、完全または部分精製されたリゾホスホリパーゼＤの全部または一部を抗原として該酵素またはそのサブユニットに対する抗体を常法に従って作製し、リゾホスホリパーゼＤを産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡライブラリーから、抗体スクリーニングにより該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。
さらに、上述の方法とは別に、本発明のリゾホスホリパーゼＤをコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法を用いて直接クローニングすることもできる。すなわち、該酵素活性を有する細胞または組織由来のゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡ（もしくはｍＲＮＡ）を鋳型とし、増幅断片がリゾホスホリパーゼＤのコード領域をカバーするような適当なオリゴヌクレオチドの対をプライマーとして用いて、常法に従ってＰＣＲを行うことにより当該酵素のコード領域を含むＤＮＡ断片を増幅することができる。
得られたＤＮＡインサートの塩基配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシターミネーション法等の公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。
本発明のリゾホスホリパーゼＤをコードする遺伝子は、配列表配列番号１に示される塩基配列から実質的になるＤＮＡの、全部または一部を含むものである。ここで「実質的になるＤＮＡ」とは、上記特定の塩基配列からなるＤＮＡに加えて、ストリンジェントな条件（本発明では、塩基配列において約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいい、ストリンジェンシーはハイブリダイズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができる）において、上記の特定塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡを意味する。
本発明の遺伝子はいかなる方法で得られるものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノミックライブラリーから調製されるゲノミックＤＮＡ、化学的に合成されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅させて得られるＤＮＡ及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡ等が含まれる。
本発明はまた、上記のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクターに関する。本発明の組換えベクターは、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当分野において入手可能なクローニングベクターまたは発現ベクターに上記のいずれかのＤＮＡを適当な制限酵素部位を利用して挿入することによって調製することができる。
特に、本発明の組換えベクターはリゾホスホリパーゼＤをコードする遺伝子を機能的に含む発現ベクターである。ここで「機能的に」とは、そのベクターに適合する宿主細胞内で該遺伝子（ＤＮＡ）が転写され、それにコードされる蛋白質が産生され得るように該遺伝子が配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、リゾホスホリパーゼＤをコードする遺伝子、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。本発明の組換えベクターは、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター等が包含される。
当該組換えベクターは、簡便には当分野において入手可能な発現ベクターに本発明のリゾホスホリパーゼＤをコードするＤＮＡを常法により機能的に連結することによって調製することができる。用いる発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主内でリゾホスホリパーゼＤを発現し、生産する機能を有するものであれば特に制限されないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子を含有することが好ましい。例えば哺乳動物細胞を形質転換する場合、動物ウイルス、例えばＳＶ４０、ＲＳＶ、ＭＭＬＶ等のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが制限酵素部位、好ましくはマルチクローニング部位を介して連結したプラスミドに、ｐＳＶ２−ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ等のプラスミド由来の選択マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素等）を挿入したプラスミドが使用できる。
本発明の形質転換細胞は上述のリゾホスホリパーゼＤをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。宿主細胞は使用する発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞或いは人工的に樹立された組換え細胞等種々の細胞が利用できる。具体的には、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母等の真菌類、動物細胞または昆虫細胞等が例示される。好ましくは哺乳動物細胞、特にラット由来細胞、ハムスター由来細胞（ＣＨＯ、ＢＨＫ等）、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ　Ｔ３等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｌｏ等）およびヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍体線維芽細胞由来細胞、ミエローマ細胞、Ｎａｍａｌｗａ等）が挙げられる。
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、哺乳動物細胞に導入する場合、リン酸カルシウム共沈澱法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リソソーム法等が挙げられる。
本発明のリゾホスホリパーゼＤは上記のごとく調製される発現ベクターを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性デンプン、ショ糖等が、窒素源としては、例えばアンモニウム塩、硝酸塩、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、馬鈴薯抽出液等が例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等）、ビタミン類、抗生物質（テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、アンピシリン等）〕を含んでいてもよい。
培養は当分野において知られている方法により行われる。培養条件は蛋白質の発現が可能な条件であって、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は当該酵素が大量に生産されるように適宜選択される。
例えば、宿主が動物細胞である場合、培地としては例えば約５〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１９９培地等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であることが好ましく、培養は通常３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
本発明のリゾホスホリパーゼＤは上記培養により得られる培養物から、前述のリゾホスホリパーゼＤを発現している細胞の培養物からの単離・精製と同様にして採取することができる。
かくして得られた精製ＬＰＬＤあるいは組換えＬＰＬＤは、例えば表１に記載されるような基質特異性を有する。
2002053569.tif 000005
反応生成物の中でも特にリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、細胞増殖の促進や平滑筋収縮、癌細胞の浸潤促進等の生理活性を有し、スフィンゴシン１−リン酸は、癌細胞の走化性運動調節や細胞増殖等の生理活性を有する、生体内で重要な物質である。
さらに精製ＬＰＬＤあるいは組換えＬＰＬＤを免疫抗原として用いて当業者は常法に従って抗体を作成することができる。また、配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列をもとにして、部分アミノ酸配列に対応するペプチド抗体を作成することも可能である。
免疫抗原は好ましくはアジュバントと混合させて調製する。該抗原の免疫性が低い場合は、該抗原にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のキャリアタンパクを結合させたものを用いることが好ましい。免疫化の対象として用いられる動物は例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、マウス等の哺乳動物が使用される。免疫にはこれらの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フットパット内あるいは腹腔内に１乃至数回注射することにより行われる。通常、初回免疫から約１〜２週間毎に１〜４度免疫を行いさらに約１〜４週間後に最終免疫を行って、最終免疫より数日後に免疫感作された動物から、特異抗体を抗血清として得る。マウスやモルモット等に免疫して、従来公知の方法を用いてモノクローナル抗体を作製することもできる。該抗体は必要に応じて適宜精製して用いることが好ましい。精製方法としては具体的には、硫酸アンモニウム沈澱法、プロテインＡを用いた方法および抗原ポリペプチドおよび／またはペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いる方法等が例示される。
得られた特異抗体は、ＬＰＬＤのさらなる精製やＬＰＬＤと、ＬＰＬＤが関与していると考えられている種々の疾患、現象を研究するツールとして有用である。
本発明のＬＰＬＤ活性測定方法ならびにＬＰＬＤの活性を阻害する物質のスクリーニング方法において基質として使用するリゾリン脂質は、下記一般式（Ｉ）
2002053569.tif 000006
（式中、Ｒ１とＲ２は互いに異なり、その一方は飽和又は不飽和の炭素数８から２２の脂肪酸残基であり、その一方は水素原子またはアセチル基であり、Ｘは発色基である）によって表される。
本発明において、「飽和又は不飽和の炭素数８から２２の脂肪酸残基」とは、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸等の飽和脂肪酸の残基、およびマッコウ酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、α−エレオステアリン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和脂肪酸の残基等が例示され、好ましくはリノール酸残基、オレイン酸残基、パルミチン酸残基、ミリスチン酸残基である。
一般式（Ｉ）中、Ｘにおける「発色基」とは、当該リゾリン脂質から遊離することにより、可視可能な光線又は紫外線を吸収する物質又は蛍光を発する物質（以下発色性化合物ともいう）あるいはその前駆体となり得る残基を意図する。ここで前駆体とは、さらに別の発色用試薬と反応させることにより可視可能な光線又は紫外線を吸収する物質又は蛍光を発する物質となるものをいう。
具体的な発色基としては、例えば置換フェノール部〔例えば、ｐ−ニトロフェノール、５−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−安息香酸、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−（５−ヒドロキシ−２−ニトロフェニル）アンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル）アンモニウムクロリド、３−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、５−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼンスルホン酸およびｏ−ニトロフェノール等〕を含む残基、ナフトールまたはナフトール部〔例えば、α−ナフトール、４−アミノ−１−ナフトール、４−ヒドロキシ−１−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、４−ヒドロキシ−１−ナフトエ酸、３−アミノ−１−ナフトール、４−ヒドロキシ−２−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、４−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、８−アミノ−１−ナフトール、８−ヒドロキシ−１−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、８−ヒドロキシ−１−ナフトエ酸、５−アミノ−１−ナフトール、５−ヒドロキシ−１−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、５−ヒドロキシ−１−ナフトエ酸および２−ニトロ−１−ナフトール等〕を含む残基、置換ウンベリフェロン部〔４−メチルウンベリフェロン、３−アミノ−４−メチルウンベリフェロン、３−トリメチルアンモニウム−４−メチルウンベリフェロンクロリド、４−メチル−５−アミノウンベリフェロン、４−メチル−６−アミノウンベリフェロン、５−トリメチルアンモニウム−４−メチルウンベリフェロンクロリド、６−トリメチルアンモニウム−４−メチルウンベリフェロンクロリド、４−メチルウンベリフェロン−５−スルホン酸、４−メチルウンベリフェロン−６−スルホン酸、３−トリメチルアンモニウム−４−メチルウンベリフェロン−５−スルホン酸エステル、３−トリメチルアンモニウム−４−メチルウンベリフェロン−５−カルボン酸クロリドおよび３−トリメチルアンモニウム−４−メチルウンベリフェロンクロリド等〕を含む残基等が挙げられる。
置換フェノール部を含む残基として、好ましくはｐ−ニトロフェニル基であり、ｐ−ニトロフェニル基が結合した本発明のリゾリン脂質を酵素分解することによって発色性化合物であるｐ−ニトロフェノールが遊離される。ｐ−ニトロフェノールは４００ｎｍ付近（好ましくは４０５ｎｍ）に吸収極大を有する。
ナフトールまたはナフトール部を含む残基として、好ましくはα−ナフチル基であり、α−ナフチル基が結合した本発明のリゾリン脂質を酵素分解することによって発色性化合物前駆体であるα−ナフトールが遊離される。α−ナフトールはジアゾ化により発色性化合物となり得る。
置換ウンベリフェロン部を含む残基として、好ましくは４−メチルウンベリフェリル基であり、４−メチルウンベリフェリル基が結合した本発明のリゾリン脂質を酵素分解することによって発色性化合物である４−メチルウンベリフェロンが遊離される。４−メチルウンベリフェロンは蛍光性化合物であり、分光蛍光光度計等によってその蛍光を定量することができる。
測定の容易性から、発色基として好ましくは、ｐ−ニトロフェニル基またはα−ナフチル基である。
本発明の一般式（Ｉ）で表されるリゾリン脂質は、公知の方法を適宜組み合わせて好適に製造することができる。後述の合成例で詳細が説明されるが、例えば商業的に入手可能なリン脂質を出発原料として用い、当該出発原料をホスホリパーゼＣで酵素分解し、得られるジグリセリドと、商業的に入手可能な発色基を有する化合物とを、溶媒中、縮合剤の存在下で反応させることによって発色基が結合したリン脂質が得られる（当該リン脂質の合成方法としては、他にＡｎａｌｙｔｉｃａ．Ｃｈｉｍｉｃａ．Ａｃｔａ．３０４，２４９−２５４，１９９５に記載された方法に準じた方法を用いることもできる）。当該リン脂質をホスホリパーゼＡやリパーゼにより酵素分解し、本発明のリゾリン脂質を得ることができる。より具体的には以下のような方法が例示される。
市販の大豆由来のホスファチジルコリン又は卵黄由来のホスファチジルコリンを出発原料として用い、これらの出発原料をホスホリパーゼＣ（例えばウェルッシュ菌由来）で酵素分解し、得られる大豆由来又は卵黄由来のジグリセリドと市販の４−ニトロフェニルホスホロジクロライドを無水ピリジン等の溶媒中、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライド等の縮合剤と反応させることによって、大豆由来又は卵黄由来ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールが得られる。かくして得られた化合物からホスホリパーゼＡ２（例えばコブラ毒由来）による酵素分解により、本発明の新規な大豆由来又は卵黄由来の１−アシルホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールを、また、リパーゼ（例えばクモノスカビ由来）による酵素分解により、本発明の新規な大豆由来又は卵黄由来の２−アシルホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールを得ることができる。
別法として、市販の大豆由来ホスファチジルコリンを出発原料として、ホスホリパーゼＡ２又はリパーゼにより酵素分解によって得られる大豆由来１−アシルホスファチジルコリン又は大豆由来２−アシルホスファチジルコリンと無水酢酸をクロロホルム等の溶媒中、４−ジメチルアミノピリジン及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミン等の触媒の存在下反応させ、大豆由来１−アシル−２−アセチル−ジグリセリド又は大豆由来１−アセチル−２−アシル−ジグリセリドを得る。これらの化合物に前記と同様の方法により、ｐ−ニトロフェニル基を導入し、本発明の新規な大豆由来１−アシル−２−アセチル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール又は大豆由来１−アセチル−２−アシル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールが得られる。
本発明は、上記リゾリン脂質を有効成分として含有する、ＬＰＬＤ活性測定用試薬を提供する。当該測定用試薬は、後述のＬＰＬＤ活性を阻害する物質のスクリーニング方法においても、その活性を測定する際に使用することができる。当該測定用試薬には基質としてのリゾリン脂質に加え、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、防腐剤等の添加剤を含んでいてもよく、さらに必要に応じて酵素の活性化剤や夾雑物質の影響緩和剤を配合することもできる。本発明の測定用試薬の形態は、乾燥粉末状、液状等特に制限されるものではない。また、乾燥粉末状に製した場合等、使用時に溶解、希釈等の処理が必要な場合には、当該処理に必要な要素（例えば緩衝液等）を後述する本発明のＬＰＬＤ活性測定用キットあるいはＬＰＬＤ活性を阻害する物質のスクリーニング用キットに含めておいてもよい。溶解、希釈等の処理に必要な溶液は、基質の溶解性に応じて選択され、緩衝液等の水系のものであっても、有機溶媒系であってもかまわない。また、第１反応試薬と第２反応試薬との組み合わせのように、反応液中への添加時期が異なる２種類以上の試薬を適宜組み合わせたものでもよいし、１試薬系であってもよい。
さらに、本発明は、上述の発色基を有するリゾリン脂質を基質として用いることを特徴とするＬＰＬＤの活性を測定する方法、ならびにＬＰＬＤの活性を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。当該測定方法ならびにスクリーニング方法は共通して以下の工程を有する。
（１）試料に一般式（Ｉ）で表されるリゾリン脂質（上述）を添加し、当該リゾリン脂質と試料中のＬＰＬＤとを反応させる。
（２）上記（１）の工程により遊離した発色性化合物の量を比色定量する。
但し、当該発色性化合物がその前駆体として遊離された場合には、適当な発色用試薬を用いて発色性化合物に変換した後、当該化合物の量を比色定量する。
本発明のＬＰＬＤの活性を阻害する物質のスクリーニング方法では、上記工程に加え、当該ＬＰＬＤを含有する試料に、被検物質を添加する工程、および当該被検物質を添加した場合に遊離する発色性化合物の量と、被検物質未添加の場合に遊離する発色性化合物の量とを比較する工程を含む。この比較する工程は、それぞれの場合に観察される発色の程度を比色定量する（後述）ことによって実施される。
「被検物質」とは、ＬＰＬＤ活性に及ぼす影響を調べようとする対象全てを意図し、既知であっても、新規なものであってもよい。また、合成されたものであっても天然に存在するものであっても構わない。その態様もＬＰＬＤとリゾリン脂質との反応を阻害しない限りは特に限定されず、化合物として精製されたものであっても未精製の組成物の状態でもよく、また、固体状であっても液状であってもよい。液状の場合、その溶媒は特に限定されない。
「試料」とは、ＬＰＬＤの存在の有無ならびにその活性の程度を測定する対象すべてを意味し、ＬＰＬＤが存在する可能性がある各種生体試料をはじめ、当該測定のための標準試料や対照試料、ＬＰＬＤ不含の各種緩衝液も包含される。より具体的には、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、腹水、髄液等の臨床検査で用いられる体液成分、動物や植物の細胞抽出液といった基礎研究で使用されるもの等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法で用いられる「ＬＰＬＤを含有する試料」としては、上記「試料」に準じたものが挙げられる。既知量のＬＰＬＤを含有する試料に加え、本発明では、被検物質未添加の場合とその活性の程度を比較することによりスクリーニングを行うので、ＬＰＬＤを含有する同一の試料であれば、そこに含まれるＬＰＬＤの絶対量について特に定める必要はなく、かかる試料も本発明のスクリーニング方法において使用可能である。
好ましくは該「ＬＰＬＤを含有する試料」としては、既知量の高度に精製されたＬＰＬＤを含有する試料、より好ましくは既知量の組換えＬＰＬＤを含有する試料が用いられる。特に試料が血清の場合、既知量の高度に精製されたＬＰＬＤを含有する血清あるいは既知量の組換えＬＰＬＤを含有する血清は、本願発明の活性測定方法ならびにスクリーニング方法の対照試料、標準試料として有用な管理血清として用いることができる。
既知量の高度に精製されたＬＰＬＤを含有する試料は、上述のようにＬＰＬＤを含有する試料を、精製過程に付すことによって得ることができる。より詳細な手順は実施例に後述する。あるいはＬＰＬＤ不含のまたはＬＰＬＤ含有量が既知の試料に既知量の高度の精製されたＬＰＬＤを添加することによって調製することができる。
既知量の組換えＬＰＬＤを含有する試料は、既知量の組換えＬＰＬＤ（上述）を試料に添加することによって得ることができる。
基質であるリゾリン脂質と試料との反応条件は、使用する基質や試料の種類、状態により適宜好適に設定されるが、通常、以下の通りである。
反応温度
当該基質が安定であり、且つＬＰＬＤの活性を維持し得る温度であれば特に限定されないが、測定の容易性、自動化等を考慮すれば、通常２５〜４０℃、好ましくは３５〜４０℃程度で測定する。
反応時間
本発明は遊離した発色性化合物の量を比色定量することを含むものであり、吸光度の経時的変化を測定することによって実施される。従って、リゾリン脂質と試料との反応開始後ただちにモニタリングを開始する。基質から発色性化合物を遊離するには、その基質の種類や、他の反応条件によっても異なるが、通常５分〜数時間で反応を行う。従って本発明では好ましくは５分〜１時間吸光度の変化をモニタリングする。
反応ｐＨ
ＬＰＬＤが当該基質と反応し、その酵素反応を測定し得るｐＨであれば特に限定されない。また、用いる発色基によっては、ＬＰＬＤ活性のｐＨと発色反応のｐＨが異なっていてもよい。例えば、発色基としてｐ−ニトロフェニル基を用いた場合、ＬＰＬＤ反応によって遊離したｐ−ニトロフェノールは、アルカリ条件下でのみ発色する（金島才二ら、臨床検査４１、１０２５−１０２８、１９９７）。よって、ＬＰＬＤ活性の至適ｐＨが酸性域、あるいは中性付近である場合にはＬＰＬＤを含んだ試料と、当該基質とを一定時間反応させた後、アルカリ条件下で発色反応を行うことが可能である。ただし、ＬＰＬＤ活性の至適ｐＨがアルカリ域である際には、ＬＰＬＤ反応と発色反応を同一ｐＨにて同時に行うことができる。
基質濃度
基質濃度は、その基質の種類や、他の反応条件によっても異なるが、夾雑成分の影響を受けにくく、且つ、試料中のＬＰＬＤと十分に反応し得る量であれば特に限定されず、好適な量が適宜設定される。具体的には最終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｍｏｌ／Ｌ程度である。１ｍｍｏｌ／Ｌよりも少ないと、ブランクとの差が小さく有意な値が得にくい。
遊離した発色性化合物は比色定量することによってその量を測定する。当該比色定量の方法は発色性化合物の種類によって適宜選択され、当分野で公知の手法によって実施される。例えば発色性化合物がｐ−ニトロフェノールの場合、得られる黄色の発色を４００ｎｍ付近の吸光度の変化として分光光度計等によって測定する。発色性化合物が４−メチルウンベリフェロンの場合、分光蛍光光度計等によってその蛍光を測定する。α−ナフトールの場合、ジアゾ化剤を用いてカップリング反応を行うことにより、発色性化合物、即ちアゾ化合物とし、当該化合物の発色を分光光度計等によって測定する。ジアゾ化剤としては、例えばＦａｓｔ　Ｒｅｄ　ＴＲ、ｐ−ジアゾベンゼンスルホン酸等が挙げられる。ジアゾ化剤等、さらなる発色用試薬が必要な場合には、当該試薬を後述の本発明のＬＰＬＤ活性測定用キット、ＬＰＬＤの活性を阻害する物質のスクリーニング用キットに含めておいてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、被検物質および基質である本発明のリゾリン脂質の試料中への添加の時期は、被検物質のＬＰＬＤ活性に及ぼす影響が十分に反映されるように適宜設定される。例えば、当該影響が速やかに現れる場合には、被検物質と基質であるリゾリン脂質の添加をほぼ同時に行うことができるが、通常、被検物質と試料中のＬＰＬＤとをあらかじめ十分に反応させた後、基質である本発明のリゾリン脂質を添加し、本発明のＬＰＬＤ活性測定を実施する。
本発明においては、本発明のＬＰＬＤ活性測定あるいはＬＰＬＤの活性を阻害する物質のスクリーニングに必要とされる各成分をまとめて梱包しキットとしてもよい。
かかるキットには、基質となるリゾリン脂質に加えて、必要に応じて溶解溶液や、発色用試薬等の反応に必要な要素が含まれる。好ましくは、標準溶液および対照溶液が含められる。さらに、当該測定に必要な要素の他に、反応用容器や、マニュアル等も併せて梱包しておくことも、簡便性という観点から好ましい。ＬＰＬＤ活性を阻害する物質のスクリーニング用キットには、ＬＰＬＤを含有する試料を含めることが好ましい。該「ＬＰＬＤを含有する試料」としては、好ましくは「既知量の高度に精製されたＬＰＬＤを含有する試料」であり、特に好ましくは「既知量の組換えＬＰＬＤを含有する試料」である。当該キットにＬＰＬＤを含有する試料をあらかじめ含めておくことで、同一試料を用いて、被検物質添加時および未添加時のＬＰＬＤ活性の変化を測定することができる。
本発明のスクリーニング方法によって得られるＬＰＬＤ活性を阻害する物質は、当該ＬＰＬＤ阻害作用によりＬＰＡの産生を抑制することができ、ＬＰＡの過剰な、あるいは異常な産生に起因すると考えられる種々の疾患に好適に使用することができる。例えば、動脈硬化症の予防、治療に用いることができる。
実施例
以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。また、特に断りのない限り、以下の実施例で使用する試薬等の各材料は、商業的に入手可能であり、添付のマニュアルに基づいて使用することができる。
実施例１：１−アシルリゾホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの合成（１）大豆由来１−リノレオイル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール：
（１）大豆由来１，２−ジリノレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの合成
大豆由来のジリノレオイルグリセロール２．６８ｇ（４．３ｍｍｏｌ）と４−ニトロフェニルホスホロジクロライド０．９１６ｇ（３．６ｍｍｏｌ）をＰ２Ｏ５上で約２時間乾燥させた後、無水ピリジン１０ｍＬを添加し十分に懸濁後、塩化２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル２．７１ｇ（８．９５ｍｍｏｌ）を加えて室温下一晩反応させた。この反応液に水を入れて混合、攪拌し、さらにエタノール、トルエンを加えて、減圧濃縮乾固した。得られた乾固物にジエチルエーテルを加えて、不溶部分を除去し、可溶部分を得て、これを少量のクロロホルムに溶解し、同溶媒系で活性化したシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付してクロロホルム−メタノール系の溶出液を用いて精製を行い、黄色油状物１．４５ｇを得た。
（２）大豆由来１−リノレオイル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール
上記（１）で得られた黄色油状物５６４ｍｇをジエチルエーテル２０ｍＬに溶解し、次いでホスホリパーゼＡ２（コブラ毒由来；和光純薬工業株式会社）１００ｍｇをｐＨ６．５の０．１ｍｏｌ／Ｌホウ酸−リン酸緩衝液１０ｍＬ及び１ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム０．１ｍＬに溶解した後、お互いを混合し、４８時間反応させた。反応後ジエチルエーテル画分を減圧濃縮し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルム−メタノール系の溶出液を用いて精製を行い、黄色油状物として表題化合物２５２ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）ｍ／ｚ　５５４［ｍ−Ｈ］−
ＮＭＲ（溶媒ＣＤＣｌ３）
１Ｈ−ＮＭＲ：０．８７−０．９２（ｍ，３Ｈ），１．２７−１．４８（ｍ，２０Ｈ），２．０５−２．１１（ｍ，４Ｈ），２．７６−２．７９（ｍ，２Ｈ），３．５５−４．０７（ｍ，４Ｈ），４．５３（ｓ，１Ｈ），５．３３−５．４１（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．３５（ｄ，２Ｈ），８．０６−８．０９（ｄ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ：１３．５２（ｍｅｔｈｙｌ），２２．０４−３３．４２（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ，１０ｓｉｇｎａｌｓ），６２．０５（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ），７４．９６（ｍｅｔｈｙｎｅ），１１９．５８　ａｎｄ　１２４．８９（ａｒｏｍａ），１２７．３６，１２７．６５，１２９．３７　ａｎｄ　１２９．７４（ｖｉｎｙｌ　Ｃ），１４２．９８　ａｎｄ　１５６．９４（ａｒｏｍａ），１７３．５４（Ｃ＝０）
実施例２：１−アシルリゾホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの合成（２）
卵黄由来１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール：
（１）卵黄由来ジアシルホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの合成
卵黄由来のジアシルグリセロール１．７５ｇ（２．９５ｍｍｏｌ）と４−ニトロフェニルホスホロジクロライド０．６８６ｇ（２．６８ｍｍｏｌ）ならびに塩化２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル２．０２ｇ（６．７ｍｍｏｌ）を用いて実施例１（１）に準じて合成、精製を行うことにより黄色油状物１．４１ｇを得た。
（２）卵黄由来１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール
上記（１）で得られた黄色油状物５７３ｍｇをホスホリパーゼＡ２（コブラ毒由来；和光純薬工業株式会社）１２３ｍｇを用いて、実施例１（２）に準じて加水分解し、精製を行うことにより黄色油状物として表題化合物２２１ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）ｍ／ｚ　５５６［ｍ−Ｈ］−
ＮＭＲ（溶媒ＣＤＣｌ３）
１Ｈ−ＮＭＲ：０．８７−０．９１（ｍ，３Ｈ），１．２８−１．４８（ｍ，２２Ｈ），２．０２−２．１１（ｍ，４Ｈ），２．７８−２．７９（ｍ，２Ｈ），３．５５−４．０６（ｍ，４Ｈ），４．５２（ｓ，１Ｈ），５．３３−５．３６（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．３５（ｄ，２Ｈ），８．０７−８．１０（ｄ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ：１３．５６（ｍｅｔｈｙｌ），２２．１５−３３．４３（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ，１０ｓｉｇｎａｌｓ），６２．４０（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ），７５．０２（ｍｅｔｈｙｎｅ），１１９．５９　ａｎｄ　１２４．９１（ａｒｏｍａ），１２７．６４，１２９．０７　ａｎｄ　１２９．５７（ｖｉｎｙｌ　Ｃ），１４３．００　ａｎｄ　１５７．０３（ａｒｏｍａ），１７３．５５（Ｃ＝０）
実施例３：２−アシルリゾホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの合成（１）
大豆由来１−ヒドロキシ−２−リノレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール：
実施例１（１）で得られた化合物１．４５ｇをジエチルエーテル５０ｍＬに溶解し、次いでリパーゼ（クモノスカビ由来：生化学工業株式会社）１ｇをｐＨ６．５の０．１ｍｏｌ／Ｌホウ酸−リン酸緩衝液１４ｍＬ及び１ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム０．１ｍＬに溶解した後、お互いを混合し、４８時間反応させた。反応後ジエチルエーテル画分を減圧濃縮し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルム−メタノール系の溶出液を用いて精製を行い、黄色油状物として表題化合物５６８ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）ｍ／ｚ　５５４［ｍ−Ｈ］−
ＮＭＲ（溶媒ＣＤＣｌ３）
１Ｈ−ＮＭＲ：０．８７−０．９２（ｍ，３Ｈ），１．２３−１．４７（ｍ，２０Ｈ），２．０４−２．１７（ｍ，４Ｈ），２．７５−２．７９（ｍ，２Ｈ），３．６２−４．１２（ｍ，４Ｈ），４．９６−４．９８（ｍ，１Ｈ），５．３２−５．４１（ｍ，２Ｈ），７．２７−７．３１（ｄ，２Ｈ），８．０１−８．０４（ｄ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ：１３．５２（ｍｅｔｈｙｌ），２２．０４−３３．６６（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ，１０ｓｉｇｎａｌｓ），５９．７４　ａｎｄ　６４．３１（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ），７２．１２（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），１１９．５０　ａｎｄ　１２４．８６（ａｒｏｍａ），１２７．３６，１２７．６４，１２９．３７　ａｎｄ　１２９．７４（ｖｉｎｙｌ　Ｃ），１４２．９４　ａｎｄ　１５６．８３（ａｒｏｍａ），１７３．４０（Ｃ＝０）
実施例４：２−アシルリゾホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの合成（２）
卵黄由来１−ヒドロキシ−２−オレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール：
実施例２（１）で得られた化合物７１４ｍｇをリパーゼ７００ｍｇを用いて、実施例３に準じて加水分解し、精製を行うことにより表題化合物３７４ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）ｍ／ｚ　５５６［ｍ−Ｈ］−
ＮＭＲ（溶媒ＣＤＣｌ３）
１Ｈ−ＮＭＲ：０．８７−０．９１（ｍ，３Ｈ），１．２４−１．４７（ｍ，２２Ｈ），２．０２−２．１７（ｍ，４Ｈ），２．７７−２．８３（ｍ，２Ｈ），３．６３−４．１２（ｍ，４Ｈ），４．９７（ｓ，１Ｈ），５．３６（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．３１（ｄ，２Ｈ），８．０２−８．０４（ｄ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ：１３．５５（ｍｅｔｈｙｌ），２２．１４−３３．６６（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ，１１ｓｉｇｎａｌｓ），５９．７７　ａｎｄ　６４．３２（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ），７２．０５（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），１１９．５７　ａｎｄ　１２４．８８（ａｒｏｍａ），１２７．３５，１２７．６５，１２９．０４　ａｎｄ　１２９．５７（ｖｉｎｙｌ　Ｃ），１４３．０２　ａｎｄ　１５６．７９（ａｒｏｍａ），１７３．４３（Ｃ＝０）
実施例５：活性測定１（反応ｐＨ）
（１）試薬の調製
試薬Ａ：Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０２％）
試薬Ｂ：試薬Ａを分取し、それぞれｐＨ７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６に調整した後、２倍に希釈して、ｐＨの異なる試薬Ｂを調製した。
試薬Ｃ：ｐＨ４．５
クエン酸１水和物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０１％）、上記実施例で調製した１−ヒドロキシ−２−リノレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール（実施例３；１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
（２）試料
市販の管理血清２種類、それぞれ検体１（コンセーラ：日水製薬株式会社製）および検体２（リピッドセーラムＩＩ：栄研化学株式会社製）、さらに血清中のアルブミン画分における活性を調べるために、５％ヒト血清アルブミン（脂肪酸フリー：シグマ社製）溶液を用いた。
（３）測定
マイクロプレートに、各試料１０μＬおよび試薬Ｂ１５０μＬを分注し、３７℃で約５分間加温した。これに試薬Ｃを５０μＬ添加した後、経時的に主波長４０５ｎｍ、副波長５４０ｎｍの吸光度を測定し、ＬＰＬＤの作用によって遊離したｐ−ニトロフェノールに依存する、１分間あたりの吸光度変化量からＬＰＬＤ活性を求めた。活性は、反応液１ｍＬあたり、１分間に遊離したｐ−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図１に示す。ｐＨがアルカリ側の方が活性は強いが、ヒト血清アルブミン画分中の活性も上昇する。よってｐＨ８以下ではよりアルブミンの影響を少なくした活性測定が可能となる。
実施例６：活性測定２（基質）
（１）試薬の調製
試薬Ａ：ｐＨ８．０
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０１％）
試薬Ｂ：ｐＨ４．５
クエン酸１水和物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０１％）
試薬Ｃ：上記実施例で調製した、大豆由来１−ヒドロキシ−２−リノレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール（実施例３；基質Ａ）、大豆由来１−リノレオイル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール（実施例１；基質Ｂ）、卵黄由来１−ヒドロキシ−２−オレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール（実施例４；基質Ｃ）、卵黄由来１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール（実施例２；基質Ｄ）の１００ｍｍｏｌ／Ｌ相当の溶液を、それぞれ試薬Ｂで１０倍希釈し、試薬Ｃとして使用した。
（２）試料
試料として、ヒト血清を用い、血清中のアルブミン画分における活性を調べるために、５％ヒト血清アルブミン（脂肪酸フリー：シグマ社製）溶液を、さらにホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）との反応性を調べるため、ストレプトマイセス属由来のＰＬＤ（商品略号ＰＬＤＰ：旭化成工業株式会社）の５Ｕ／ｍＬ溶液を使用した。
（３）測定
マイクロプレートに、各試料１０μＬおよび試薬Ａ１５０μＬを分注し、３７℃で約５分間加温した。これに試薬Ｃを５０μＬ添加した後、経時的に主波長４０５ｎｍ、副波長５４０ｎｍの吸光度を測定し、ＬＰＬＤの作用によって遊離したｐ−ニトロフェノールに依存する、１分間あたりの吸光度変化量からＬＰＬＤ活性を求めた。活性は、反応液１ｍＬあたり、１分間に遊離したｐ−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図２に示す。ヒト血清アルブミンに対する応答性は基質ＢやＤといった、１−アシル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの方が、基質ＡやＣといった１−ヒドロキシ−２−アシル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールよりも高いのに対し、ヒト血清に対する応答性は１−ヒドロキシ−２−アシル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの方が１−アシル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールよりも高い。このことから、特に１−ヒドロキシ−２−アシル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールを基質として用いた場合に、アルブミンの影響をより少なくしてＬＰＬＤ活性を測定することができる。
またこれらの基質は、反応の強弱はあるものの、すべてストレプトマイセス属由来のＰＬＤの基質となり得ることがわかった。ＰＬＤが正常ヒト血清中に存在するという報告はないが、ＰＬＤが試料中に混在している場合には、上記基質のうち、基質Ａまたは基質Ｂを使用することが好ましい。
実施例７：活性測定３（基質濃度）
（１）試薬の調製
試薬Ａ：ｐＨ８．０
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０１％）
試薬Ｂ：ｐＨ４．５
クエン酸１水和物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０１％）
試薬Ｃ：基質として上記実施例で調製した大豆由来１−ヒドロキシ−２−リノレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール（実施例３）を用い、それぞれ０，０．５，１．０，２．０，３．０，５．０，１０，２０，３０，５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように試薬Ｂで希釈し、試薬Ｃとした。
（２）試料
試料として、ヒト血清を用い、血清中のアルブミンの反応を調べるために、５％ヒト血清アルブミン（脂肪酸フリー：シグマ社製）溶液を使用した。
（３）測定
マイクロプレートに、各試料１０μＬおよび試薬Ａ１５０μＬを分注し、３７℃で約５分間加温した。これに試薬Ｃを５０μＬ添加した後、経時的に主波長４０５ｎｍ、副波長５４０ｎｍの吸光度を測定し、ＬＰＬＤの作用によって遊離したｐ−ニトロフェノールに依存する、１分間あたりの吸光度変化量からＬＰＬＤ活性を求めた。活性は、反応液１ｍＬあたり、１分間に遊離したｐ−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図３に示す。基質の終濃度として、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上の添加が望ましい。
実施例８：活性測定４（試料の希釈直線性）
（１）試薬の調製
試薬Ａ：ｐＨ８．０
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０１％）
試薬Ｂ：ｐＨ４．５
クエン酸１水和物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０１％）、
大豆由来１−ヒドロキシ−２−リノレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール（実施例３；２０ｍｍｏｌ／Ｌ）
（２）試料
試料として、ヒト血清を生理食塩水にて５段階希釈したものを使用した。
（３）測定
マイクロプレートに、各試料１０μＬおよび試薬Ａ１５０μＬを分注し、３７℃で約５分間加温した。これに試薬Ｂを５０μＬ添加した後、経時的に主波長４０５ｎｍ、副波長５４０ｎｍの吸光度を測定し、ＬＰＬＤの作用によって遊離したｐ−ニトロフェノールに依存する、１分間あたりの吸光度変化量からＬＰＬＤ活性を求めた。活性は、反応液１ｍＬあたり、１分間に遊離したｐ−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図４に示す。図４に示すように原点を通過する良好な直線が得られた。このことは、本発明の活性測定法が、ヒト血清中のＬＰＬＤ活性を、定量的に測定し得ることを示している。
実施例９：リゾホスホリパーゼＤの精製（ウシリゾホスホリパーゼＤ）
以下の工程は、（３）の溶出時以外、全て４℃で行った。
（１）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿
原料となるウシ胎児血清（ＦＣＳ）２Ｌに対して５０％ＰＥＧをゆっくりと添加し、ＰＥＧ終濃度５％とした。１０分間攪拌した後、２０，４００ｇで６０分間遠心し、その上清を回収した。さらに終濃度が１０％になるまで５０％ＰＥＧをゆっくりと添加した後、２０，４００ｇで６０分間遠心し、得られた沈殿物を緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））４００ｍＬに懸濁させた。
（２）ブルーセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー
前記懸濁液を、緩衝液Ａで平衡化したブルーセファロース６ＦＦ（ファルマシア社、カラムサイズ、５０ｍＬ）に添加し、緩衝液Ａで洗浄した。緩衝液Ａ中でのＮａＣｌの直線濃度勾配（０−２Ｍ）により、ＬＰＬＤを自然落下にて溶出させ、ＬＰＬＤ活性を示す画分を集めた。
（３）コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー
前記活性画分を、緩衝液Ｂ（５００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）で平衡化したＣｏｎＡセファロース（ファルマシア社、カラムサイズ、３ｍＬ）に添加し、緩衝液Ｂで洗浄した。これを室温にて緩衝液Ｃ（５ｍＭのα−メチルマンノシドを含む緩衝液Ｂ）により、ＬＰＬＤを自然落下にて溶出させ、ＬＰＬＤ活性を示す画分を集め、緩衝液Ａにて透析した。
（４）ＢｉｏＡｓｓｉｓｔＱカラムを用いる陰イオン交換クロマトグラフィー
前記透析物を緩衝液Ｄ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））で平衡化したＢｉｏＡｓｓｉｓｔＱ（東ソー社、カラムサイズ０．８ｍＬ）に添加し、緩衝液Ｄで洗浄した。緩衝液Ｄ中でのＮａＣｌの直線濃度勾配（０−２Ｍ）により、ＬＰＬＤを１．０ｍＬ／分にて溶出させ、ＬＰＬＤ活性を示す画分を集めた。
（５）ヘパリンカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
前記活性画分を緩衝液Ｅ（１０％グリセロールを含む緩衝液Ａ）にて１０倍希釈したものを、緩衝液Ｅで平衡化したＨｉＴｒａｐ　Ｈｅｐａｒｉｎカラム（ファルマシア社、カラムサイズ、１ｍＬ）に添加し、緩衝液Ｅで洗浄した。緩衝液Ｅ中でのＮａＣｌの直線濃度勾配（０−２Ｍ）により、ＬＰＬＤを０．５ｍＬ／分にて溶出させ、ＬＰＬＤ活性を示す画分を集めた。
（６）ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＰＨＥカラムを用いる疎水性クロマトグラフィー
前記活性画分に５Ｍ　ＮａＣｌを添加し、ＮａＣｌ終濃度が２Ｍになるようにした。これを緩衝液Ｆ（２Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）で平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＰＨＥ（ファルマシア社、カラムサイズ、１ｍＬ）に添加し、緩衝液Ｆで洗浄した。これを１ｍＭ　ＥＤＴＡによりＬＰＬＤを１．０ｍＬ／分にて溶出させ、ＬＰＬＤ活性を示す素通り画分を集めた。
（７）ハイドロキシアパタイト（ＨＡＴ）を用いる非特異的吸着
前記活性画分を緩衝液Ｇ（１０％グリセロールを含む１ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４））により１０倍希釈したものを、緩衝液Ｇで平衡化したＨＡＴ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、カラムサイズ１ｍｌ）に添加し、緩衝液Ｇで洗浄した。緩衝液Ｇ中でのＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨの直線濃度勾配（１−１５０ｍＭ）により、ＬＰＬＤを０．８ｍＬ／分にて溶出させた後、ＬＰＬＤ活性を示す画分を集め、ウシホスホリパーゼＤの部分精製品を得た。
（８）各画分のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定
原料であるＦＣＳ、ならびに上記（１）〜（７）で得られた各画分のそれぞれについてリゾホスホリパーゼＤ活性を測定することにより精製の程度を確認した。
各画分のリゾホスホリパーゼＤの活性の測定は、反応混合液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．０５％トリトンＸ−１００、１ｍＭリゾホスファチジルコリン）中で行った。前記反応混合液に試料（ＦＣＳ、（１）〜（７）で得られた各画分のいずれか）を加え１００μＬとし、３７℃で６０分間加温した。その内、１５μＬを測定試液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．３７５ｍＭ　Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、０．２５ｍＭ　４−アミノアンチピリン、０．０１％　トリトンＸ−１００、７．５Ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ、２．５Ｕ／ｍＬ　コリンオキシダーゼ）２００μＬと１０分間反応させた後、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定値は前記反応混合液の代わりに、５０μＭの塩化コリンを用いた際の吸光度を基準に換算した。
結果を精製表として表２に示す。
2002053569.tif 000007
実施例１０：ウシリゾホスホリパーゼＤの部分アミノ酸配列の決定
実施例９で得られたウシリゾホスホリパーゼＤの部分精製品中の蛋白質を、１０％トリクロロ酢酸を用いて沈殿させることによりウシリゾホスホリパーゼＤを濃縮し、１０％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白質を分画した。ＣＢＢ染色後、リゾホスホリパーゼＤ活性とよい相関性を示した分子量約１００ＫＤａの蛋白質のバンドをアクリルアミドゲルから切り出し、リジルエンドペプチダーゼ酵素処理を行った。さらに、得られたペプチド断片をＣ４逆相カラムクロマトグラフィーにより分画した。これらのペプチドのうち、３本について、エドマン法によりアミノ酸配列を決定した。
2002053569.tif 000008
得られた部分アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴ−Ｔプログラムを用い、ホモロジー検索を行ったところ、得られた全ての配列がヒト、マウス、ラットのａｕｔｏｔａｘｉｎ（配列表配列番号２）と極めて高い相同性を示した。ａｕｔｏｔａｘｉｎは、癌細胞の運動性促進因子として知られ、ヌクレオチドピロホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ活性を有し、様々なヌクレオチド化合物に作用することが報告されている蛋白質であるが、当該蛋白質ならびにそれに類似する蛋白質がＬＰＬＤ活性を有し、リン脂質に作用するという報告はない。
実施例１１：組換え宿主細胞におけるＬＰＬＤ活性の発現
実施例１０の結果より、ａｕｔｏｔａｘｉｎにＬＰＬＤ活性があることが予測されたため、ラットのａｕｔｏｔａｘｉｎのｃＤＮＡを用いて形質転換体を作成し、該形質転換体のＬＰＬＤ活性の発現について調べた。
報告されているラットａｕｔｏｔａｘｉｎの配列（配列表配列番号１）から、逆転写酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により、ラットａｕｔｏｔａｘｉｎをコードするｃＤＮＡを単離した。鋳型としては、ラット肝臓由来のＲＮＡから逆転写酵素で合成したｃＤＮＡを使用した。
得られたｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨ　Ｉ／Ｘｈｏ　Ｉ部位に挿入し、ｃＤＮＡのＣ末にはｍｙｃタグを導入した。得られたｃＤＮＡをリポフェクトアミンを用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞へ一過的に導入した。
４８時間後、培養上清を回収し、抗ｍｙｃタグ抗体を用いたウエスタンブロットにより発現を確認し、また上述のＬＰＬＤ活性測定法を用いて、当該組換え宿主細胞がＬＰＬＤを発現していることを確認した。
実施例１２：精製ＬＰＬＤおよび本願発明の基質を用いたＬＰＬＤ活性の測定
（１）１−ミリストイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの合成
（ｉ）１，２−ジミリストイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの合成
ジミリストイルグリセロール２．０２ｇと４−ニトロフェニルホスホロジクロライド１．００ｇをＰ２Ｏ５上、約２時間室温で乾燥させた後、無水ピリジン１２ｍＬを加えて十分に懸濁させた。そこに塩化２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル１．１３ｇを加えて室温にて一晩反応させた。この反応液に水を加えて混合攪拌し、さらにエタノールおよびトルエンを加えて減圧濃縮乾固した。得られた乾固物にクロロホルム−メタノール（２：１）１００ｍＬを加えて溶解後、水を２０ｍＬ加えて分液し、下層を採取した。無水硫酸ナトリウムで水分を乾燥後ろ過し、ろ液を減圧濃縮乾固した。得られた乾固物を少量のクロロホルムに溶解し、同溶媒系で活性化したシリカゲルクロマトグラフィーに付して、クロロホルム−メタノール−水系の溶出液を用いて精製し、白色粉末１．４ｇを得た。
（ｉｉ）１−ミリストイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールの合成
上記（ｉ）で得られた白色粉末６００ｍｇクロロホルム４０ｍＬに溶解し、ついでホスホリパーゼＡ２（シグマ社、コブラ毒由来）９０ｍｇをｐＨ６．５の０．１Ｍホウ酸−リン酸緩衝液２０ｍＬ、および１Ｍの塩化カルシウム溶液０．１ｍＬに溶解した後、お互いを混合し、３５℃で２４時間反応させた。反応液をクロロホルム−メタノール（２：１）１００ｍＬを加えて分液し、その下層を採取した。無水硫酸ナトリウムで水分を乾燥後ろ過し、ろ液を減圧濃縮乾固した。得られた乾固物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して、クロロホルム−メタノール−水系の溶出液を用いて精製し、白色粉末として表題化合物２２３ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）ｍ／ｚ　５０３［ｍ−Ｈ］−
（２）試薬の調製
試薬Ａ：ｐＨ８．０
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０１％）
試薬Ｂ：ｐＨ４．５
クエン酸一水和物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリトンＸ−１００（０．０１％）
試薬Ｃ：１−ミリストイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールを試薬Ｂにて１０ｍｍｏｌ／Ｌ相当になるように溶解し、試薬Ｃとした。
（３）測定
測定には生化学用自動分析装置（東芝製：ＴＢＡ−８０ＦＲ　ＮＥＯ）を用いた。実施例９で得られた精製ＬＰＬＤ（８μＬ）と試薬Ａ（２４０μＬ）とを３７℃で約１５分間予備加温し、試薬Ｃ（８０μＬ）を添加後、経時的に約１５分間、主波長４０５ｎｍ、副波長５０５ｎｍの吸光度を測定し、ＬＰＬＤの作用によって遊離したｐ−ニトロフェノールに依存する、１分間あたりの吸光度変化量からＬＰＬＤ活性を求めた。活性は反応液１ｍＬあたり、１分間に遊離したｐ−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図５に示す。図１同様ｐＨがアルカリ側の方が強い活性が見られた。
精製ＬＰＬＤの代わりに組換えＬＰＬＤを用いた場合についても同様にして測定することができる。
産業上の利用分野
本発明の新規リゾリン脂質を基質として使用することにより、特異的、且つ高感度のＬＰＬＤ活性測定が可能となる。また、安全で簡易に検出可能な発色基を使用することにより、多数の試料を迅速に測定することが可能となる。さらに、本発明の新規リゾリン脂質を基質として使用することにより、ＬＰＬＤ活性を阻害する物質をスクリーニングすることが可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２０００−４０３５３０および特願２００１−０２３７８４を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、反応ｐＨを種々に変化させ、血清試料および５％血清アルブミン溶液について本発明のＬＰＬＤ活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。検体１はコンセーラを、検体２はリピッドセーラムＩＩをそれぞれ示す。
図２は、基質を種々に変化させ、ヒト血清試料、５％血清アルブミン溶液およびＰＬＤの５Ｕ／ｍＬ溶液について本発明のＬＰＬＤ活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。
図２−１はヒト血清試料に対して、図２−２は５％血清アルブミン溶液に対して、図２−３はＰＬＤ５Ｕ／ｍＬ溶液についての結果を示す。
基質Ａ：大豆由来１−ヒドロキシ−２−リノレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール
基質Ｂ：大豆由来１−リノレオイル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール
基質Ｃ：卵黄由来１−ヒドロキシ−２−オレオイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール
基質Ｄ：卵黄由来１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール
図３は、基質濃度を種々に変化させ、ヒト血清試料および５％血清アルブミン溶液について本発明のＬＰＬＤ活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。
図４は、試料としてヒト血清を段階的に希釈したものを用い、本発明のＬＰＬＤ活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。
図５は、反応ｐＨを種々に変化させ、試料として精製ＬＰＬＤ（ＬＰＬＤ精製品）を用い、本発明のＬＰＬＤ活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。基質は、１−ミリストイル−ホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールを用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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