(57)【要約】生物学的試料中の被検体（例えば、抗原、ＤＮＡ等）を検出するためのシステムを用いることのできる表層に特定の重合体を有する金属または半導体の複合体が開示される。
2002056020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光の吸収波長の変化または蛍光の発光波長の変化を利用する生物学的被検体の検出システムを構築するための固形物質と重合体との複合体を含んでなる調製物であって、
該被検体が非共有結合的に特異的結合対を形成しうる構成員の１員となりうるものであり、
固形物質が金属および半導体よりなる物質群から選ばれ、
重合体がポリエチレンオキシド（ＰＥＧ）セグメントをベースにするものであり、そして該重合体分子の一つの末端に該特異的結合対を形成しうる構成員のもう一方の１員の残基または該もう一方の１員と共有結合しうる官能基を有し、そしてもう一つの末端に前記固形物質の表面へ安定に結合しうる非共有電子対をもつ官能基または側鎖に非共有電子対をもつ１個もしくはそれ以上の官能基をもつポリマーセグメントを有しており、そして
複合体が非共有電子対をもつ官能基と物質の表面との結合を介して形成されている、
ことを特徴とする調製物。
【請求項２】
固形物質が、金、銀、白金およびアルミニウムよりなる群から選ばれる金属である請求項１記載の調製物。
【請求項３】
固形物質が、蛍光を発光する半導体である請求項１記載の調製物。
【請求項４】
固形物質がＩＩＩ−Ｖ型（または３Ｂ族−５Ｂ族）ならびにＩＩ−ＶＩ型（または２Ｂ族−６Ｂ族）に属する半導体よりなる群から選ばれる請求項１記載の調製物。
【請求項５】
ＩＩＩ−Ｖ型に属する半導体が、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓよりなる群から選ばれ、そしてＩＩ−ＶＩ型に属する半導体がＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＺｅＳｅおよびＺｅＳよりなる群から選ばれる請求項４記載の調製物。
【請求項６】
固形物質がサブミクロンサイズの粒子である請求項１に記載の調製物。
【請求項７】
固形物質が２種以上の蛍光を発光する半導体をそれぞれ含んでなる複合体の組み合わせである請求項３に記載の調製物。
【請求項８】
重合体が、構成員の１員と共有結合しうる官能基として、アルデヒド基を有するものである請求項１に記載の調製物。
【請求項９】
重合体が、非共有電子対をもつ官能基として、メルカプト、スルフ−低級アルキル、第二級アミン残基および第三級アミン残基よりなる群から選ばれる基を有するものである請求項１に記載の調製物。
【請求項１０】
重合体が式（Ｉ）
2002056020.tif 000009
（上式中、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は独立して、原子価結合またはリンカーを表し、但し、ｍが０である場合には、Ｌ１とＬ２は一緒になって原子価結合または１個のリンカーとなることができ、
Ｂは式
2002056020.tif 000010
を表し、ここでＲ１およびＲ２は独立して、水素原子、低級アルキル基であり、そしてｐは２〜５の整数であり、
Ｘは水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基またはアルデヒド基を表すか、あるいは被検体と特異的結合対を形成しうる構成員のもう一方の１員の残基を表すが、但し、Ｘが水素原子のときはＬ３が原子価結合であり、
ｍは０〜１０，０００の整数であり、そして
ｎは１０〜２０，０００の整数である。）
で表される請求項１に記載の調製物。
【請求項１１】
重合体が式（ＩＩ）
2002056020.tif 000011
（上式中、Ｒ１′、Ｒ２′およびＲ３′は独立して低級アルキル基を表し、
Ｌ３′はＣ１−６アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｘ′は水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基またはアルデヒド基を表すか、あるいは被検体と特異的結合対を形成しうる構成員のもう一方の１員の残基を表すが、但し、Ｘ′が水素原子であるときはＬ３′が原子価結合であり、
ｍ′は１〜１０，０００の整数であり、
ｎ′は１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である。）
で表される請求項１に記載の調製物。
【請求項１２】
特異的結合対が、抗原と抗体との対、ビオチンとアビジンとの対、糖とレクチンとの対、ホルモンもしくはシグナル伝達物質と対応する受容体タンパク質との対、酵素とその基質もしくは阻害剤との対、および一定のヌクレオチド配列からなる核酸断片と該配列とストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸断片との対からなる群より選ばれる請求項１に記載の調製物。
【請求項１３】
検出システムにおける被検体の検出に際し、キャピラリー電気泳動の使用を伴う請求項６または１０に記載の調製物。
【請求項１４】
サブミクロンサイズの半導体粒子と、式（ＩＩ）
2002056020.tif 000012
（上式中、Ｒ１′、Ｒ２′およびＲ３′は独立して低級アルキル基を表し、
Ｌ３′はＣ１−６アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｘ′は水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基またはアルデヒド基を表すか、あるいは特異的結合対を形成しうる構成員の１員の残基を表すが、但し、Ｘ′が水素原子であるときはＬ３′が原子価結合であり、
ｍ′は１〜１０，０００の整数であり、
ｎ′は１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である。）
で表される重合体とが該粒子の表面に式（ＩＩ）中の第三級アミン残基を介して結合した形態にある複合体。
【請求項１５】
半導体が、ＩＩＩ−Ｖ型（または３Ｂ族−５Ｂ族）ならびにＩＩ−ＶＩ型（または２Ｂ族−６Ｂ族）に属するものよりなる群から選ばれる請求項１２記載の複合体。
【請求項１６】
ＩＩＩ−Ｖ型に属する半導体が、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓよりなる群から選ばれ、そしてＩＩ−ＶＩ型に属する半導体がＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＺｅＳｅおよびＺｅＳよりなる群から選ばれる請求項１２記載の複合体。
【請求項１７】
式（ＩＩ）におけるＲ１′、Ｒ２′およびＲ３′がそれぞれメチル基であり、Ｌ３′−Ｘ′が基
2002056020.tif 000013
ドの残基、
（ここで、ｑは１〜６の整数である。）
である請求項１３または１４記載の複合体。
【請求項１８】
光の吸収波長の変化または蛍光の発光波長の変化を利用する生物学的被検体の検出システムを構築するための固形物質と重合体との複合体の使用であって、
被検体が非共有結合的に特異的結合対を形成しうる構成員の１員となりうるものであり、該複合体における固形物質が金属および半導体よりなる物質群から選ばれ、該重合体がポリエチレンオキシド（ＰＥＧ）セグメントをベースにするものであり、そして該重合体該重合体分子の一つの末端に該特異的結合対を形成しうる構成員のもう一方の１員の残基または該もう一方の１員と共有結合しうる官能基を有し、そしてもう一つの末端に前記固形物質の表面へ安定に結合しうる非共有電子対をもつ官能基または側鎖に非共有電子対をもつ１個もしくはそれ以上の官能基をもつポリマーセグメントを有しており、そして
該複合体が非共有電子対をもつ官能基と物質の表面との結合を介して形成されている、
ことを特徴とする使用。
【請求項１９】
複合体が式（ＩＩ）
2002056020.tif 000014
（上式中、Ｒ１′、Ｒ２′およびＲ３′は独立して低級アルキル基を表し、
Ｌ３′はＣ１−６アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｘ′は水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基またはアルデヒド基を表すか、あるいは特異的結合対を形成しうる構成員の１員の残基を表すが、但し、Ｘ′が水素原子であるときはＬ３′が原子価結合であり、
ｍ′は１〜１０，０００の整数であり、
ｎ′は１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である。）
で表される重合体とＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＡｓ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＺｅＳｅおよびＺｅＳよりなる群から選ばれる半導体とから形成される請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
請求項１０または１１に記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される重合体のうち、ＸまたはＸ′が非共有結合的に特異的結合対を形成しうる構成員の１員の残基を表す重合体と金、銀、白金およびアルミニウム、ならびに蛍光を発光する半導体との複合体を前記構成員の他の１員に相当する被検体を含む疑いのある生物学的試料と接触させて、該複合体と被検体から形成されたコンジュゲートを検出し、検出されたコンジュゲートのレベルを被検体レベルの指標とすることを特徴とする生物学的試料中の被検体の検出方法。
【請求項２１】
複合体が蛍光を発光する半導体から調製されたものである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該複合体を蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーとして用い、該コンジュゲートに特異的に結合することができ、かつ、該蛍光共鳴エネルギー移動のアクセプターとして作用しうる蛍光性色素で修飾した他の有機化合物をアクセプターとして用いることにより形成されるドナー−アクセプター対を介して該コンジュゲートを検出する請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項１０または１１に記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される重合体のうち、ＸまたはＸ′が非共有結合的に特異的結合対を形成しうる構成員の１員の残基を表す重合体と蛍光を発光する半導体との複合体の、生物学的試料中の被検体を検出するための蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生物学的アッセイシステムに組み込むための複合体およびその複合体を含んでなる調製物に関する。
背景技術
生物学的試料中に存在する被検体を検出する方法として、多種多様な検出手段が提供されてきている。広範に使用されている手段に、光吸収分析を包含する比色を用いるものがある。このような比色を用いる興味深いものとして、メルカプトアルキルオリゴヌクレオチドで修飾した金のナノ粒子プローブに基づくポリヌクレオチドの検出方法が報告されている（Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｖｏｌ．２７７．１９９７、ｐｐ．１０７８−１０８１）。このプローブを用いる方法は高選択的、高感度でオリゴヌクレオチドが検出できることが教示されている。この方法では、標的のポリヌクレオチドとプローブ上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して凝集体が生じると、プローブの粒子と該凝集体との間にプラズモン吸収の変化［一次分散ナノ粒子はピンク色（吸収位置５２０ｎｍ付近）から、粒径増大に伴なって紫色（吸収位置は長波長へシフト）へ］を利用するものである。また、金の薄膜上に２〜７個のエチレンオキシ（またはエチレングリコール）単位を有するメルカプト誘導体が付着した表面についての表面プラズモン共鳴を、生物学的試料中の被検体の検出に利用することも提案されている（Ａ．Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｎｃｔ．Ｂｉｏｌ．５（１９９５）６９９−７０５）。
しかし、これらのプローブおよび表面は、生物学的試料が血液やその他の体液のように、多種多様のタンパク質等の非特異的吸着が生じるおそれがあり、これらが検出結果に悪影響を及ぼす傾向がある。
発明の開示
上記のＥｌｇｈａｎｉａｎ等のプローブが有する高検出感度を保持したまま、生物学的試料中の被検体以外の夾雑物の悪影響を殆ど乃至は全く受けることのない、検出系の提供が望まれるであろう。本発明の目的は、かような検出系に用いることのできる調製物を提供することにある。
本発明者らは、ポリエチレンオキシド（以下、ＰＥＧともいう）セグメントをベースにする重合体の片末端にメルカプト基を初めとする一定の官能基または、そのような官能基を側鎖に有するポリマーセグメントを有する重合体と特定の金属との複合体が、生物学的試料における被検体以外の夾雑物による悪影響を殆ど受けることなく、被検体を選択的かつ高感度で測定するのに使用できることを見出した。しかも、該金属がサブミクロンサイズ（約１０００ｎｍ未満）の微粒子である場合には、該複合体はキャピラリー電気泳動にかけて取り扱うことができるほど水性溶液中で安定であることが確認できた。また、金属に代えて、特定の半導体と前記重合体との複合体も該金属を用いる場合に優るとも劣らない特性を有することを見出した。特に、Ｍ．Ｂｒｕｃｈｅｚ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．ＳＣＩＥＮＣＥ  Ｖｏｌ．２８１．１９９８、ｐｐ．２０１３〜２０１６に記載されているような、生物学的蛍光標識として提案されている半導体ナノ結晶（または粒子）が、上記金属に代えて都合よく使用できることが確認された。
さらに、前記重合体からなる表層を有する半導体ナノ結晶（または粒子）は、被検体の検出系における蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとして使用できることを見出した。
したがって、本発明によれば、光の吸収波長の変化または蛍光の発光波長を利用する生物学的被検体の検出システムを構築するための固形物質と重合体との複合体を含んでなる調製物が提供される。そして、この調製物は、
該被検体が非共有結合的に特異的結合対を形成する構成員の１員となりうるものであり、
該固形物質が金属および半導体よりなる物質群から選ばれ、
該重合体がポリエチレンオキシド（ＰＥＧ）セグメントをベースにするものであり、そして分子の一つの末端に被検体（構成員の１員）と特異的結合対を形成しうる構成員のもう一方の１員の残基またはもう一方の１員と共有結合しうる官能基を有し、もう一つの末端に前記物質の表面へ安定に結合しうる非共有電子対をもつ官能基または側鎖に非共有電子対をもつ１個もしくはそれ以上の官能基をもつポリマーセグメントを有しており、そして
該複合体が非共有電子対をもつ官能基と物質の表面との結合を介して形成される、
ことを特徴とするものである。
また、光の変化または蛍光の発光波長の変化を利用する生物学的被検体の検出システムを構築するための固形物質と重合体との前記複合体の使用も提供される。
さらにまた、前記複合体における重合体分子の一つの末端に被検体（例えば、抗原またはＤＮＡ）に対する第一抗体または第一相補鎖を有し、そして固体物質が半導体からなる複合体を用いる生物学的試料中の被検体の検出方法も提供される。該検出方法の好ましい態様では、被検体に対する第二抗体または第二相補鎖であって、一定の蛍光性色素で修飾されたものを検出用に共存させる。
本発明によれば、金属または半導体表面上で親水性でしかもモビリティの高いＰＥＧが複数ブラシ状構造をとるものと推察されることからも理解できるが、該表面上への被検体以外のタンパク質等の非特異的吸着を避けることができる。一方、被検体はそれぞれ、特異的結合対を形成する構成員間の結合によって、特異的に吸着される。また、該表面へのＰＥＧブラシ状構造物の結合は、水性溶液中で極めて安定であり、例えば、キャピラリー電気泳動処理を経ても、実質的に開裂しない。
また、本発明に従う一定の複合体は、それ自体、本発明者らが知る限り従来技術文献に未載である。したがって、詳細については後述するが、本発明によれば、新規な複合体も提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明に従う、複合体を形成する固形物質は、その形状は任意のものであることができるが、好ましくは、プレート、ストリップ、マイクロチップおよびサブミクロンサイズの微粒子であることを企図している。さらに、複合体の水性溶媒中での安定性を利用する観点に立てば、生物学的な被検体の検出システムにキャピラリー電気泳動を組み込むことのできる微粒子の形態であることが好ましい。サブミクロンサイズの語は、通常、粒子の平均径が１０００μｍ未満であることを意味するが、本発明の目的に沿う場合は、、必ずしも１０００μｍ未満であることに限定されず、極めてサイズが小さい粒子を意味するものとして使用している。しかし、一般的に、内径２５〜１００μｍのキャピラリーを備えたキャピラリー電気泳動を行うことができるサイズであることが、本発明の微粒子のサイズとして理解されている。より具体的には、平均粒径は０．１ｎｍ〜数ミクロン、好ましくは１ｎｍ〜１００ｎｍ、特に好ましくは、１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲にある。このようなサイズの固体物質、（金属または半導体）微粒子の複合体を調製するには市販の微粒子を使用するか、或いは、例えば、それ自体既知の金属または半導体のコロイド状沈殿の生成法、それぞれの塩溶液の脱塩もしくは還元処理等を利用できる。
金属としては、例えば、被検体が複合体に結合することにより、その表面の形状の変化（例えば、厚くなる）に伴ないプラズモン吸収の変化が検出できるものであればその種類を問うことなく使用できる。しかし、好ましいものとしては金、銀、白金、アルミニウムを挙げることができる。一方、半導体は、蛍光を発光する半導体であれば、いずれの種類の半導体であってもよいが、例えば、ＩＩＩ−Ｖ型（または３Ｂ族−５Ｂ族）に属するＩｎＰ、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓ等、ならびにＩＩ−ＶＩ型（または２Ｂ族−６Ｂ族）に属するＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＺｅＳｅおよびＺｅＳ等を好ましいものとして挙げることができる。
以上のような固形物質は重合体との複合体として提供される。本発明の目的に沿う重合体は、ＰＥＧセグメントをベース（もしくは主要部）にするものである。ベースにするとは、ＰＥＧセグメントが固体物質表面上に十分な親水性を付与し、そして生物学的試料における被検体以外の夾雑物の非特異的吸着を回避できるように作用する状態にあることを意味する。別の観点からは、重合体の１分子中にエチレンオキシドの反復単位を３以上好ましくは５以上、特に好ましくは１０以上有することを、ＰＥＧセグメントをベースにすると称している。
重合体は、その分子の一つの末端にある一定の被検体と特異的結合対を形成しうる構成員のもう一方（被検体に対して）の１員の残基またはその１員と共有結合を形成しうる官能基を有する。この官能基は、非共有結合的（例えば、水素結合、疎水結合等）に特異的結合対を形成しうる構成員の１員たる被検体に対するもう一方の１員に共有結合しうるものである。本発明によれば、生物学的試料における被検体として、ポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチド、タンパク質、糖、ホルモン等を意図しており、そして、特異的結合対を形成しうる構成員の組み合わせとしては、抗原と抗体との対、ビオチンとアビジンとの対、糖とレクチンとの対、ホルモンもしくはシグナル伝達物質と対応する受容体タンパク質との対、酵素とその基質もしくは阻害剤との対、および一定のヌクレオチド配列からなる核酸断片と該配列とストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸断片との対の利用を意図している。これらの対の構成員は、いずれが被検体であってもよい。なお、このような被検体を含む生物学的試料はヒトを初めとする哺乳動物由来の生物学的流体（尿、血液、等）や、組織切片が挙げられる。したがって、該官能基は、タンパク質、糖、ヌクレオチド中の官能基、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基等と共有結合を形成しうる基であればよく、限定されるものでないが、それぞれ、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基等であることができる、特に、緩和な還元アミノ化反応により、アミノ基と共有結合を形成しうるアルデヒド基が好ましい。本発明に関し、アルデヒド基は、その保護された形態である、アセタールまたはケタールの形態をも包含する概念で使用している。
重合体は、もう一つの末端に金属または半導体からなる固体物質表面へ安定に結合しうる非共有電子対をもつ官能基または側鎖に非共有電子対をもつ１個もしくはそれ以上の官能基をもつポリマーセグメントを有している。ここにいう、結合は、該表面への官能基を介する化学吸収（吸着）によるものであり、配位結合または半イオン性結合に類するものと推定できる。したがって、かような官能基としては、限定されるものでないが、メルカプト基（−ＳＨ）、スルフ−低級アルキル基（−Ｓ−Ａｌｋ）、第二級アミン残基（＝ＮＨ）、第三級アミン残基（＝Ｎ−）を挙げることができる。なお、本明細書全体を通じて、低級アルキル基と称する場合には、炭素数１〜６個の直鎖もしくは分枝のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ．−ブチル、ｔｅｒｔ．−ブチル、ペンチル、ヘキシル等を挙げることができる。したがって、上記のスルフ−低級アルキルは、メチルチオ（−ＳＣＨ３）、エチルチオ（−ＳＣ２Ｈ５）等を挙げることができる。
このような基または残基を末端に有するとは、重合体のＰＥＧセグメントに適当な二価の基（例えば、アルキレン）および／または他のポリマーセグメント（例えば、ポリラクチド、ポリプロピレンオキシド、等）を介するか、適当な化合物の残余部を介して上記のような官能基が共有結合していることを意味する。したがって、重合体の一方の末端は、例えば、
2002056020.tif 000003
（ここで、ｋは１〜８の整数である）がＰＥＧセグメントに共有結合していてもよいし、或いは、システイニル（Ｃｙｓ−）、メチオニル（Ｍｅｔ−）もしくはアルギニル（Ａｒｇ−）等がＰＥＧセグメントに共有結合していてもよい。また、これらの残基を側鎖にもつポリマーセグメントとは、例えば、上記のようなアミノ酸残基を反復単位とするポリマーセグメントや、ポリアミンセグメントをいい、本発明で用いる重合体では、これらのセグメントが必要により連結基（例えば、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−等）を介してＰＥＧセグメントに共有結合しているか、他のポリアミンセグメントが、同様にＰＥＧセグメントに共有結合している。なお、本発明に関連していうところの「ポリマー」という接頭辞は、当業者に共通に認識されているポリマーだけでなく、反復単位が数個からなるオリゴマーの概念も包含するものとして使用している。以上に挙げた重合体は、殆どが公知であり、また、新規であっても、公知の重合体と同様に製造することができる。
末端にメルカプト基を有する重合体の代表例としては、下記式（Ｉ）で表されるものを挙げることができる。
2002056020.tif 000004
上式中、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は独立して、原子価結合またはリンカーを表し、但し、ｍが０である場合には、Ｌ１とＬ２は一緒になって原子価結合または１個のリンカーとなることができ、
Ｂは式
2002056020.tif 000005
を表し、ここでＲ１およびＲ２は独立して、水素原子、低級アルキル基であり、そしてｐは２〜５の整数であり、
Ｘは水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基またはアルデヒド基を表すか、あるいは特異的結合対を形成しうる構成員の１員の残基を表すが、但し、Ｘが水素原子のときはＬ３が原子価結合であり、
ｍは０〜１０，０００の整数であり、そして
ｎは１０〜２０，０００の整数である。なお、特異的結合対は上記の意味を有する。
これらの重合体は、例えば、特開平１１−３２２９１７号公報に記載の方法に従って製造することができる。
他方、官能基を側鎖にもつポリマーセグメントを有する重合体の代表例としては、下記式（ＩＩ）で表されるものを挙げることができる。
2002056020.tif 000006
上式中、Ｒ１′、Ｒ２′およびＲ３′は独立して低級アルキル基を表し、
Ｌ３′はＣ１−６アルキレンまたは原子価結合を表し、
Ｘ′は水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基またはアルデヒド基を表すか、あるいは特異的結合対を形成しうる構成員の１員の残基を表すが、但し、Ｘ′が水素原子であるときはＬ３′が原子価結合であり、
ｍ′は１〜１０，０００の整数であり、
ｎ′は１０〜２０，０００の整数であり、そして
ｐ′は２〜６の整数である。なお、特異的結合対は式（Ｉ）について定義したのと同義である。
これらの重合体は、例えば、Ｙ．Ｎａｇａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７、１８、８２７またはＫ．Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９９、３２．６８９２−６８９４に記載の方法に従って都合よく製造することができる。これらの重合体のうち、特に、製造の容易さの観点から好ましいものとしては、式（ＩＩ）における、Ｒ１′、Ｒ２′およびＲ３′がそれぞれメチル基であり、Ｌ３′−Ｘ′が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯであり、そして、ｐ′が２である、重合体を挙げることができる。
本発明の複合体の形成は、重合体を溶解しうる溶体、例えば、水、テトラヒドロフラン、低級アルカノール、芳香族炭化水素中で溶媒が液体状態を維持しうる温度において、金属または半導体と重合体（特異的結合対を形成する構成員の１員と共有結合しうる官能基は場合によって保護しておき）を複合体が形成できるのに十分な時間接触させればよい。金属または半導体が微粒子である場合には、それらの原料となりうる塩等の希釈液から微粒子を調製する際に、重合体を共存させてもよい。
通常、金属または半導体の原子またはモル当量当たり、１０倍以上（理論的に上限はない。）、好ましくは１０３〜１０５倍の重合体を金属または半導体と接触させればよい。
こうして、金属または半導体表面上にＰＥＧをベースとする重合体がブラシ状に結合した複合体を得ることができる。重合体の結合割合は、限定されるものでないが、例えば金粒子を用いる場合、複合体全体のゼータ電位が±１ｍＶ以内の中性粒子となるようにするのがよい。
こうして調製された複合体は、例えば、特異的結合対を形成する構成員の１員と共有結合しうる官能基（例えば、アルデヒド基：−ＣＨＯ）が保護されている場合（例えば、アセタール残基：−ＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２）には、さらに必要により、その後保護基（この例ではアセタール）を離脱し、前記１員と共有結合させてもよい。
本発明の調製物は、このような重合体を、必要により、緩衝剤や、溶媒、さらに上記官能基を有する場合には、必要により、上記共有結合を形成しうる縮合剤等と共に含むことができる。
こうして、提供できる調製物または組成物は、重合体が官能基を有する場合には、上述のように、例えば、プローブとしてのオリゴヌクレオチド、抗原もしくは抗体等を複合体に共有結合することにより、生物学的アッセイシステム中に組み込んで使用できる検出手段を提供できる。例えば、蛍光を発光する半導体粒子を用いて複合体を形成した場合、使用する半導体の種類や粒径によって蛍光の発光位置が異なるものを作成できる。したがって、異なる種類の半導体を用いた複合体に、それぞれ異なる、例えばオリゴヌクレオチドプローブを担持させておくと、それらに相補性の核酸もしくはその断片を多重検出しうる検出システムを構築できる。このような使用態様の概念図を図１に示す。
また、上記のように調製した半導体表層に被検体（例えば、抗原またはＤＮＡ）特異的結合対を形成しうる構成員の１員（例えば、第一抗体または相補鎖ＤＮＡ）が共有結合した重合体を有する複合体を用いて生物学的試料中の被検体を検出する場合には、上記抗原またはＤＮＡに対する、それぞれ第二抗体または第二相補鎖（第一相補鎖と重複しない部分で被検体ＤＮＡに相補的である）を蛍光性色素で修飾したものを、該検出系に共存させると、半導体−重合体（第一抗体または第一相補鎖ＤＮＡ）−被検体（抗原またはＤＮＡ）−第二抗体または第二相補鎖からなるコンジュゲートが形成され、半導体と蛍光性色素との組み合わせを選択することにより、半導体から蛍光性色素へのエネルギー移動が起こり、蛍光性色素が本来発光する波長と異なる波長でコンジュゲートを発光させることが可能である。本発明に従う複合体は、このような検出系で使用することもできる。
したがって、本発明によれば、生物学的試料中の被検体（例えば、抗原またはＤＮＡ）の検出方法において、本発明の半導体粒子を含んでなる複合体における重合体が、特異的結合対を形成しうる構成員の一員として被検体に対する、例えば、第一抗体または少なくとも１部は相補性を有する第一相補鎖を重合体の一端に共有結合したものであり、かような重合体と半導体からなる複合体、ならびに被検体に対する第二抗体または第一相補鎖と異なる部分に相補性を有する第二相補鎖であって、蛍光性色素で修飾されたものを、該生物学的試料と一緒にし、そして半導体から蛍光性色素への蛍光共鳴エネルギー移動により生じる蛍光性色素の異なる波長での発光の存在を被検体の存在の指標とすることを特徴とする検出方法が提供できる。かような半導体と蛍光性色素との組み合わせの例は、半導体の発光スペクトルと蛍光性色素の吸収スペクトルとが重複するものが挙げられる（Ｗｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．Ｎｏ．９．２００１，ｐｐ．４６９−４７４参照）。かような組み合わせに使用できる蛍光性色素としては、限定されるものでないが、テキサスレッド、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）、Ｅｏｓｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ  ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）などが挙げられる。
以下、特定の例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。
実施例１：半導体粒子複合体の製造法：
この実施例では、使用重合体（下記式で示されるα−ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＰＡＭＡ）：
2002056020.tif 000007
（上述のＫａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９９、３２、６８９２−６８９４に記載の方法に従って得られた。ＰＥＧ  Ｍｗ＝５０００ｇ／ｍｏｌ、ＰＡＭＡ（ポリ［（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］）の重合度ｍ＝６８）を分散安定剤として用いＣｄＳ半導体粒子を作成した。
蒸留水４０ｍｌ中に、上記α−ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＰＡＭＡ  １．０５×１０−７ｍｏｌを溶解し、ＣｄＣｌ２  ６×１０−５ｍｏｌ、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ  ６×１０−５ｍｏｌの順で添加し、次いで、室温で２４時間撹拌した。こうしてＣｄＳ複合体を得た。
得られたＣｄＳ複合体懸濁液を、装置としてＰ／ＡＣＥ（商標）システムＭＤＱ（ベックマン・コールター株式会社）を用い、そして光源Ａｒレーザー（４８８ｎｍ）にて励起、５２０±１０〜２０ｎｍで蛍光の発光を解析するキャピラリー電気泳動にかけた。なお、粒子（複合体）の移動相として、１００ｍＭリン酸緩衝溶液を用いた（ｐＨ７．５）。
結果を図２に示す。
実施例２：金粒子複合体の製造法：
使用重合体：下記式で示されるα−ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＳＨ（Ｍｎ＝５０００）
2002056020.tif 000008
Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＳＨ：ＨＡｕＣｌ４＝１／６：１（モル比）
の比で混合した水溶液にＨＡｕＣｌ４に対して１０倍モル量のＮａＢＨ４を添加し、還元法により金コロイドを調整した。末端アセタール基をｐＨ２塩酸で処理しアルデヒド基に返還後、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドと反応し、ラクトース−ＰＥＧ−ＳＨで修飾した金コロイド水溶液（平均粒径：８．７ｎｍ）を得た。この金コロイド−リン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．５）を実施例１と同条件でキャピラリー電気泳動した。結果を図３に示す。
なお、Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＳＨは、下記のとおりに製造した。
アルゴン置換した受器中に蒸留テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２０ｍｌと開始剤３，３−ジエトキシ−１−プロパノール０．２ｍｍｏｌ（０．０３２ｍｌ）を加え、さらに当量のカリウムナフタレンを加えて１５分撹拌することでメタル化を行った。その後、エチレンオキシド２２．７ｍｍｏｌ（１，１３５ｍｌ）を加え、室温で２日間撹拌し重合させた。停止剤としてＮ−スクシンイミゾル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）０．４ｍｍｏｌ（０．１２５ｇ）を少量の蒸留ＴＨＦに溶解させ、この溶液に対し前記の重合反応溶液を等圧滴下漏斗にて氷冷下で滴下した。一晩撹拌して停止反応を行った後に、飽和食塩水洗浄・クロロホルム抽出、エーテル再沈、ベンゼン凍結乾燥を経て、ポリマーを回収した。回収したポリマーは１Ｈ−ＮＭＲにて構造を確認し、末端に導入されたＳＰＤＰ残基の量は、２−メルカプトエタノールと反応させることによって遊離した２−チオピリドンのＵＶ吸収によっても確認した。
ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐｙ  ２．０×１０−２ｍｍｏｌ（１００ｍｇ）を蒸留水４ｍｌに溶解させ、さらに５倍ｍｏｌ量のジチオトレイトール０．１ｍｍｏｌ（１５．４２ｍｇ）を加え、室温で３０分撹拌した。反応後、飽和食塩水洗浄・クロロホルム抽出・エーテル再沈を経てポリマー（以下、ＰＥＧ５０００と略記する）を回収した。回収したポリマーは１Ｈ−ＮＭＲによって構造を確認し、さらに２−ピリジルジスルフィド（２−ＰＤＳ）との反応により、末端ＳＨ基の定量を行った。
実施例３：
テキサスレッドアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）０．３μｍｏｌ／Ｌ溶液に調製したビオチン化ＰＥＧ（ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＰＡＭＡ）を表層に有するＣｄＳ粒子を０．０２５、０．２５及び２．５ｍｍｏｌ／ｍＬ加え、蛍光分光器（日立蛍光光度計Ｆ−２５００）を用い４００ｎｍの励起波長にて測定を行った。結果を図４に示す。
このエネルギー移動度をＣｄＳ濃度に対してプロットすると比例関係が得られ（図５参照）、定量性が確認された。
なお、上記ＣｄＳ粒子は次のごとく調製した：
ガラス容器中において未反応ＰＥＧ除去後のα−Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＰＡＭＡ（ＰＥＧ／ＰＡＭＡ＝５０００／１４０００）０．５ｇに酢酸水溶液２２ｍｌを加え、３５℃で５時間撹拌し末端のアセタール基をアルデヒドに変換した。反応後、１０ｍｏｌ／１−ＮａＯＨ３７．４ｍｌを用いて中和し、Ｂｉｏｃｙｔｉｎ  Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（ＰＩＥＲＣＥ社製）１．０×１０−３ｍｏｌ（０．０３８ｇ）を加え２時間撹拌し反応させた。この溶液にＮａＢＨ４を２．６×１０−４ｍｏｌ加え、還元した後、未反応のビオチン、ＮａＢＨ４を除去するために１日間水透析を行った（水交換３回）、透析終了後、凍結乾燥により回収し、１Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、ビオチンの導入を確認した。
バイアルに超純水８ｍｌ、上で調製したｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＰＡＭＡ２．４６５×１０−６ｍｏｌ（０．０４８ｇ）を入れ、３０分間撹拌し溶解させた。その後、スターラーで撹拌中に、ＣｄＣｌ２溶液、Ｎａ２Ｓ溶液（それぞれ２．０×１０−５ｍｏｌ）を順に添加し、１時間撹拌を行った。サンプルは暗所で保管し、１日後、蛍光スペクトル測定を行った。
産業上の利用分野
本発明によれば、生物学的試料中の被検体と安定なコンジュゲートを形成でき、かつ、光の吸収波長の変化または蛍光の発光波長の変化をもたらすことのできる複合体が提供される。したがって、本発明は生物学的試料の検出業またはそのような検出試薬の製造業において利用できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に従う、半導体複合体の調製物を用いる被検体ＤＮＡの多重検出法の概念図である。図中のＲ、ＧおよびＢは、それぞれ、赤、緑および青に着色していることを意味し、それらの記号にアポストロフィが付されているものは対応するものから色調が変化した着色を意味する。
図２は、実施例１で得られたＣｄＳ複合体のキャピラリー電気泳動の結果を示すエレクトロフェログラムである。
図３は、実施例２で得られたＡｕ複合体のキャピラリー電気泳動の結果を示すエレクトロフェログラムである。
図４は、実施例３に記載する本発明に従う、複合体粒子（ビオチン化ＰＥＧを表層に有する半導体ＣｄＳ粒子：特異的結合対を形成しうる構成員がビオチンである。）と蛍光性色素テキサスレッドで修飾したアビジンとの混合液の吸収極大の強度の変化を示す図である。半導体から蛍光性色素への蛍光エネルギーの移動が濃度依存的に生じることが示されている。
図５は、複合体粒子濃度とテキサスレッドで修飾したアビジンの発光強度の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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