(57)【要約】試料中のＤＮＡ断片の両端に、オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるアダプターが付加されて、試料中のＤＮＡ断片に存在しない制限酵素認識部位が形成され、かつ、少なくとも両端の制限酵素認識部位の間が制限酵素認識部位も含めて二本鎖とされたＤＮＡ断片を準備し、準備された二本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、変性したＤＮＡ断片を、一部のＤＮＡ断片が一本鎖のままで残る条件でハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした二本鎮ＤＮＡ断片を、アダプター内にのみ切断部位を有する制限酵素により切断し、得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、切断前のアダプターの塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、試料中のＤＮＡ断片の量を各ＤＮＡ断片間で均一化する方法、および、その方法により均一化を行うことを含むサブトラクション法。
2002103007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＤＮＡ断片の量を各ＤＮＡ断片間で均一化する方法であって、
試料中のＤＮＡ断片の両端に、オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるアダプターが付加されて、試料中のＤＮＡ断片に存在しない制限酵素認識部位が形成され、かつ、少なくとも両端の制限酵素認識部位の間が制限酵素認識部位も含めて二本鎖とされたＤＮＡ断片を準備し、
準備された二本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、
変性したＤＮＡ断片を、一部のＤＮＡ断片が一本鎖のままで残る条件でハイブリダイズさせ、
ハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ断片を、アダプター内にのみ切断部位を有する制限酵素により切断し、
得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、切断前のアダプターの塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う
ことを含む方法。
【請求項２】
サブトラクティブハイブリダイゼーションを１回以上行うことを含む、細胞間の遺伝子発現の差異を検出する方法であって、少なくとも１回のサブトラクションハイブリダイゼーションの前または後に請求項１記載の方法により均一化を行うことを含む方法。
【請求項３】
少なくとも１回のサブトラクティブハイブリダイゼーションが、両端にアダプターが付加された二本鎖ＤＮＡ断片を生じるものであり、そのサブトラクションハイブリダイゼーションの後に均一化を行う請求項２記載の方法。
【請求項４】
サブトラクティブハイブリダイゼーションが２回以上行われ、１回目のストラクティブハイブリダイゼーションが、両端にアダプターが付加された二本鎖ＤＮＡ断片を生じるサブトラクションハイブリダイゼーションである請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法により発現の差異が検出された遺伝子をクローニングすることを含む、細胞間で発現が相違する遺伝子のライブラリーを製造する方法。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法により発現の差異が検出された遺伝子の断片を調製することを含む、細胞間で発現が相違する遺伝子に特異的なプローブを製造する方法。
【請求項７】
試料中のＤＮＡ断片の両端に付加するための、オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるアダプター、アダプター内に切断部位を有する制限酵素、および、その制限酵素による切断前のアダプターの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＰＣＲ用プライマーを含む、請求項１記載の方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、試料中のＤＮＡの量を各ＤＮＡ間で均一化する方法、細胞間の遺伝子発現の差異を検出する方法、細胞間で発現が相違する遺伝子のライブラリーの製造方法、及び、細胞間で発現が相違する遺伝子に特異的なプローブの製造方法に関する。
背景技術
細胞の分化、発生などの生命現象や細胞の癌化などの病態、薬物に対する応答などを理解する上で、遺伝子発現変動の解明は一つのアプローチとして頻繁に用いられている。そのための細胞間の遺伝子発現の差異を検出する方法として、サブトラクション法やディファレンシャルディスプレイ法などが知られている。
サブトラクション法については、従来のサブトラクション法に比べて、より感度が高く、バックグラウンドの低い方法として、ＰＣＲを用いたサブトラクション法（レプレゼンテーショナルディファレンスアナリシス（ＲＤＡ）法）が開発され、普及しつつある。この方法では複数回のサブトラクションハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、非常に低いバックグラウンドを実現しており、比較的遺伝子発現の差の少ない細胞集団間でのサブトラクションに有用であると考えられている。しかし、問題点として、発現量の多い遺伝子がより濃縮されてしまうために、発現量の少ない遺伝子は単離することが出来ないことが分かってきている。この点を克服する方法として、サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）法が開発されている。この方法は、遺伝子の発現量の差をある程度均一化しながらサブトラクションを行う方法で、発現量の少ない遺伝子も単離できるとされている。均一化の方法としては、アダプターを付加したテスターとアダプターを付加しないドライバーとの間での部分的なハイブリダイゼーションを行い、一本鎖として残ったＤＮＡをサプレッションＰＣＲにより増幅する方法が用いられている。
発明の開示
本発明は、発現量の少ない遺伝子であっても、発現量の相違に基づいて遺伝子を単離することを可能にする新たな均一化の方法を提供することを課題とする。また、本発明は、この方法により均一化を行うことを含む、細胞間の遺伝子発現の差異を検出する方法、および、この検出方法により細胞間で発現が相違する遺伝子のライブラリーを製造する方法を提供することを課題とするものである。
本発明者らは、ＲＤＡ法に均一化のステップを加えることができれば、発現量の少ない遺伝子であっても、発現量の相違に基づいて遺伝子を単離することが可能になると考え、研究した結果、ＲＤＡ法における反応液中のＤＮＡ量を各ＤＮＡ間で均一化するのに使用できる均一化方法を見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
本発明は、以下のものを提供する。
（１）  試料中のＤＮＡ断片の量を各ＤＮＡ断片間で均一化する方法であって、
試料中のＤＮＡ断片の両端に、オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるアダプターが付加されて、試料中のＤＮＡ断片に存在しない制限酵素認識部位が形成され、かつ、少なくとも両端の制限酵素認識部位の間が制限酵素認識部位も含めて二本鎖とされたＤＮＡ断片を準備し、
準備された二本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、
変性したＤＮＡ断片を、一部のＤＮＡ断片が一本鎖のままで残る条件でハイブリダイズさせ、
ハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ断片を、アダプター内にのみ切断部位を有する制限酵素により切断し、
得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、切断前のアダプターの塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う
ことを含む方法。
（２）  サブトラクティブハイブリダイゼーションを１回以上行うことを含む、細胞間の遺伝子発現の差異を検出する方法であって、少なくとも１回のサブトラクションハイブリダイゼーションの前または後に（１）の方法により均一化を行うことを含む方法。
（３）  少なくとも１回のサブトラクティブハイブリダイゼーションが、両端にアダプターが付加された二本鎖ＤＮＡ断片を生じるものであり、そのサブトラクションハイブリダイゼーションの後に均一化を行う（２）の方法。
（４）  サブトラクティブハイブリダイゼーションが２回以上行われ、１回目のストラクティブハイブリダイゼーションが、両端にアダプターが付加された二本鎖ＤＮＡ断片を生じるサブトラクションハイブリダイゼーションである（３）の方法。
（５）  （２）〜（４）のいずれか１項に記載の方法により発現の差異が検出された遺伝子をクローニングすることを含む、細胞間で発現が相違する遺伝子のライブラリーを製造する方法。
（６）  （２）〜（４）のいずれか１項に記載の方法により発現の差異が検出された遺伝子の断片を調製することを含む、細胞間で発現が相違する遺伝子に特異的なプローブを製造する方法。
（７）  試料中のＤＮＡ断片の両端に付加するための、オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるアダプター、アダプター内に切断部位を有する制限酵素、および、その制限酵素による切断前のアダプターの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＰＣＲ用プライマーを含む、（１）の方法に使用するためのキット。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、試料中のＤＮＡ断片の量を各ＤＮＡ断片間で均一化する方法（以下、「均一化方法」ともいう）であって、
（ａ）試料中のＤＮＡ断片の両端に、ＤＮＡ断片にない制限酵素認識部位を形成するオリゴデオキシリボヌクレオチドからなるアダプターが付加され、かつ、少なくとも両端の制限酵素認識部位の間が制限酵素認識部位も含めて二本鎖とされたＤＮＡ断片を準備し、
（ｂ）準備された二本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、
（ｃ）変性したＤＮＡ断片を、一部のＤＮＡ断片が一本鎖のままで残る条件でハイブリダイズさせ、
（ｄ）ハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ断片を、アダプター内にのみ切断部位を有する制限酵素により切断し、
（ｅ）得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、切断前のアダプターの塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う
ことを特徴とする。
試料としては、ＤＮＡ断片を含む限り限定されない。ＤＮＡ断片としては、例えば、細胞から調製したｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡまたはその断片、サブトラクションハイブリダイゼーションにより得られる、細胞間で発現が相違する遺伝子のＤＮＡ断片などが挙げられる。
本発明による均一化の原理を図１を参照して説明する。二本鎖ｃＤＮＡを変性させてから、再びハイブリダイズ（アニーリング）させると、量の多いものから順に二本鎖形成していき、少ないものは二本鎖になりにくい。したがって、ある程度反応の進んだ時点で、一本鎖のままで残っているものだけを増幅すれば、存在量の差を補正できる。本発明では、一本鎖のままで残っているものだけを増幅するために、制限酵素による分解を採用したことに主たる特徴がある。以下、工程毎に説明する。
（ａ）の工程では、試料中のＤＮＡ断片の両端に、オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるアダプターが付加されて、試料中のＤＮＡ断片に存在しない制限酵素認識部位が形成され、かつ、少なくとも両端の制限酵素認識部位の間が制限酵素認識部位も含めて二本鎖とされたＤＮＡ断片を準備する。
アダプターの塩基配列は、ＤＮＡ断片の塩基配列を考慮して、（４）の工程で使用される制限酵素によりアダプター内でのみ切断されるようなものとする。これにより、（ｄ）の工程で使用される制限酵素はアダプター内のみに切断部位を有するものとなる。アダプターの長さは、通常には２０〜３０塩基である。
制限酵素認識部位が形成されるとは、アダプターが付加されたＤＮＡ断片が制限酵素認識部位を有することを意味し、アダプター内に制限酵素認識部位が存在すること、及び、アダプターとＤＮＡ断片との連結により制限酵素認識部位が形成されることの両方を包含する。試料中のＤＮＡ断片が両端に共通の塩基配列を有している場合には、アダプターとＤＮＡ断片との連結により制限酵素認識部位が形成されるような、アダプターの塩基配列を設計することは容易である。
二本鎖とされる部分は、少なくとも、制限酵素認識部位も含む両端の制限酵素認識部位の間であり、全長であってもよい。
ＤＮＡ断片が一本鎖の場合には、遺伝子工学の分野で通常の手段により、二本鎖とする。アダプターの付加は、二本鎖とする前でも後でもよい。すなわち、一本鎖のＤＮＡ断片とアダプターを連結し、次いで必要な部分を二本鎖としてもよいし、ＤＮＡ断片とアダプターをそれぞれ二本鎖として、次いでそれらを連結してもよいし、ＤＮＡ断片を二本鎖とし、一方の鎖にアダプターを連結し、次いで一本鎖部分をフィルインして必要な部分を二本鎖としてもよい。ＤＮＡ断片が二本鎖の場合には、アダプター付加の方法としては、上記の後者の２つの方法が挙げられる。連結は、遺伝子工学の分野で通常の方法により行うことができる。
また、ＤＮＡ断片がアダプターに相当する塩基配列を両端に有している二本鎖である場合には、そのまま用いればよい
（ｂ）の工程では、（ａ）の工程で準備された二本鎖ＤＮＡ断片を変性させる。
変性は、遺伝子工学の分野で通常の方法により行うことができる。例えば、加熱による変性が挙げられ、この場合条件としては、二本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列によって異なるが、例えば９４〜１００℃で３〜５分の条件が挙げられる。
（ｃ）の工程では、（ｂ）の工程で変性したＤＮＡ断片を、一部のＤＮＡ断片が一本鎖のままで残る条件でハイブリダイズさせる。
変性したＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションは、アニーリングとも呼ばれるものであり、遺伝子工学の分野で通常の方法により行うことができる。この過程では、存在量の多いＤＮＡ断片は早くハイブリダイズし、存在量の少ないＤＮＡ断片は遅くハイブリダイズする。この結果、一本鎖のままで残るＤＮＡ断片の存在量の差は小さくなっていく。従って、一部のＤＮＡ断片が一本鎖のままで残る条件でハイブリダイズさせることにより、各ＤＮＡ断片の一本鎖の量は均一化される。このことから理解されるように、本発明において「均一化」とは、ＤＮＡ断片の量の差を小さくすることを包含する。
一部のＤＮＡ断片が一本鎖のままで残る条件とは、完全に二本鎖が形成される前に、次の工程の処理が開始できるものであればよい。例えば、温度を下げることによりハイブリダイゼーションを開始し、完全に二本鎖が形成される前にハイブリダイゼーションを終了させればよい。この場合の具体的な条件としては、ＤＮＡ断片の塩基配列によって異なるが、例えば６５〜７０℃で１２〜２０時間の条件が挙げられる。一部のＤＮＡ断片が一本鎖のままで残っているか否かは、ゲル電気泳動によって確認でき、当業者であれば適切な条件を選択することは容易である。ＤＮＡ断片濃度やハイブリダイズさせる時間を調節することで、ある程度多いものだけを減らしたり、反対に非常に量の少ないものを増加させることも可能になると考えられる。
（ｄ）の工程では、（ｃ）の工程でハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ断片をアダプター内にのみ切断部位を有する制限酵素により切断する。
制限酵素は、アダプター及び試料中のＤＮＡ断片の配列に基づいて適宜選択される。アダプター内には、アダプターとＤＮＡ断片の連結部位も包含される。
切断の条件としては、制限酵素によって異なるが、例えば、３０〜３７℃、ｐＨ７．５〜８．５で３０〜１２０分の条件が挙げられる。
（ｅ）の工程では、（ｄ）の工程で得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、切断前のアダプターの塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う。
ＰＣＲは通常の方法によって行うことができる。当業者であれば、鋳型及びプライマーの塩基配列を考慮して適切な条件を設定することは容易である。プライマーの長さは、通常には、２０〜３０塩基である。アダプターとして用いたオリゴヌクレオチドをプライマーとしてもよい。
本発明は、本発明の均一化方法に使用するためのキットも提供する。このキットは、試料中のＤＮＡ断片の両端に付加するための、オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるアダプター、アダプター内に切断部位を有する制限酵素、および、その制限酵素による切断前のアダプターの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＰＣＲ用プライマーを含む。
アダプター、制限酵素及びＰＣＲ用プライマーは、上記の本発明の均一化方法に関して説明した通りである。
本発明のキットは、アダプター、制限酵素及びＰＣＲ用プライマーの他に、制限酵素による切断に必要な試薬類（緩衝液など）やＰＣＲに必要な試薬類（緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ等）の一部または全部を含んでいてもよい。  サブトラクティブハイブリダイゼーションは、異なる２種の細胞から調製されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしなかったｃＤＮＡを分離することにより、特異的な（すなわち、細胞間で発現量の異なる）ｃＤＮＡを検出するものである。この方法の効率を左右する重要な点はハイブリダイゼーションの効率である。発現量の少ないものは、発現量の多いものに比べてハイブリダイゼーションの効率が低いため、発現量の少ない遺伝子を単離することは難しい。従って、本発明の均一化方法をサブトラクティブハイブリダイゼーションと組み合わせることにより、試料中のＤＮＡ断片の量を均一化することにより、発現量の低い遺伝子においても、細胞間の遺伝子発現の差異を検出することが可能になる。
従って、本発明は、サブトラクティブハイブリダイゼーションを１回以上行うことを含む、細胞間の遺伝子発現の差異を検出する方法（以下、「検出方法」ともいう）であって、少なくとも１回のサブトラクションハイブリダイゼーションの前または後に本発明の均一化方法により均一化を行うことを含む方法も提供する。
本発明の検出方法は、少なくとも１回のサブトラクションハイブリダイゼーションの前または後に本発明の均一化方法により均一化を行うこと以外は、通常のサブトラクティブハイブリダイゼーションを１回以上行うことを含む、細胞間の遺伝子発現の差異を検出する方法と同様でよい。
少なくとも１回のサブトラクティブハイブリダイゼーションが、両端にアダプターが付加された二本鎖ＤＮＡ断片を生じるものである場合には、本発明の均一化方法の上記（ａ）の工程が簡略化できるので、そのサブトラクションハイブリダイゼーションの後に均一化を行うことが好ましい。
サブトラクティブハイブリダイゼーションを２回以上行うことによって、発現量の差が小さい場合でも、検出可能になることが知られている。このようなサブトラクティブハイブリダイゼーションを２回以上行う方法としてはレプレゼンテーショナルディファレンスアナリシス（ＲＤＡ）法が知られている。
ＲＤＡ法では、以下のようなサブトラクティブハイブリダイゼーションが複数回行われる。アダプターと呼ばれるオリゴヌクレオチドを付加したｃＤＮＡ断片（テスター）と、アダプターを付加していないｃＤＮＡ断片（ドライバー）とを、変性させた後にハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズした二本鎖のうち、アダプターの部分が一本鎖になっているものの相補鎖を合成して全長を二本鎖とした後、アダプターに相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行う。アダプターを付加していないｃＤＮＡ断片をドライバーとして大過剰に加えることにより、テスター特異的なものだけが両端にアダプターを持つ二本鎖を形成し、このようなｃＤＮＡ断片だけがＰＣＲで増幅されることになる。例えばテスターに対して１００倍量のドライバーを用いた場合、非特異的なものは、１００分の１に減少することになり、したがって特異的なものは１００倍濃縮されることになる。しかし、テスターとドライバーにおける存在量の差が非常に少ない場合、１００倍程度の濃縮では特異的な遺伝子を単離することは困難である。そこで、２回以上（通常には３〜４回）のサブトラクション操作を繰り返して、非特異的なものを完全に除去することで、より差の少ない細胞間で特異的に発現する遺伝子を単離することが可能になっている。
しかしながら、発現量の少ないものは、発現量の多いものに比べてハイブリダイゼーションの効率が低いため、サブトラクティブハイブリダイゼーションを繰り返すに従い、量の差がさらに開いていくことになると考えられる。通常のＲＤＡ法では、例えば、１回目で１００倍量、２回目で８００倍、３回目で４０００００倍とドライバーの比率をかなり上げている。これはバックグラウンドを下げるために有効であると考えられる。しかし、ドライバーに用いることのできるｃＤＮＡ量には限界があり、実際にはテスターの量を減らすことで、比率を高くしている。このために、発現量の少ないものの二本鎖形成頻度はますます下がっていくことになり、量の多いものばかりが優先されて増幅されることになる。
従って、ＲＤＡ法のような、サブトラクティブハイブリダイゼーションが２回以上行われる方法において、少なくとも１回のサブトラクティブハイブリダイゼーションの前または後に本発明の均一化方法により均一化を行うことが好ましい。また、ＲＤＡ法におけるサブトラクティブハイブリダイゼーションでは、両端にアダプターが付加された二本鎖ＤＮＡ断片が生じるので、ＲＤＡ法におけるアダプターが本発明の均一化方法におけるアダプターとして使用できるものであれば、ハイブリダイゼーションの後に行うことが好ましい。
サブトラクティブハイブリダイゼーションと均一化は、１回目のサブトラクションの後に、均一化を行い、それから２回目以降のサブトラクションを行うことが好ましい。特に、ある程度多いものだけを減らすような条件で均一化を行うことで、比較的少ないものも単離しやすくなると考えられる。
本発明の均一化方法と組み合わせたＲＤＡ法においては、上述のように、サブトラクションを行うにしたがって存在量の差が開くのを押えるために、テスター：ドライバーの比率を下げて、テスター濃度を上げるようにすることが好ましい。例えば、サブトラクティブハイブリダイゼーションの１回目で３０〜５０倍、２回目で１００〜３００倍、３回目で１０００〜５０００倍のドライバーを用いる条件が挙げられる。発現量の差を補正するための均一化のステップは１回目と２回目のサブトラクティブハイブリダイゼーションの間に入れることが好ましい。
ＲＤＡ法では、最初にクローニングした特異的なｃＤＮＡ断片をドライバーに加えることで、さらに他の種類のｃＤＮＡ断片を増幅でき、効率よく多くの種類の遺伝子を単離できる。
遺伝子の発現量の差をある程度均一化しながらサブトラクションを行う方法としては、サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）法が知られている。しかしながら、ＳＳＨ法では、サブトラクションハイブリダイゼーションは一度行うだけなので、バックグラウンドを十分に除くことは不可能で、発現量の程度によっては特異的なｃＤＮＡがバンドとして見えるほどの濃縮は期待できないことがある。本発明の均一化方法と組み合わせたＲＤＡ法では、複数回のサブトラクティブハイブリダイゼーションが行われるので、一層発現量の少ない遺伝子でも単離できると考えられる。
本発明の検出方法により遺伝子発現の差異を検出する細胞は、特に限定されず、異なる組織に由来する細胞間、同じ細胞であっても異なる条件下で培養された細胞間での遺伝子発現の差異の検出に本発明の検出方法を適用することができる。
さらに、本発明は、本発明の検出方法により発現の差異が検出された遺伝子をクローニングすることを含む、細胞間で発現が相違する遺伝子のライブラリーを製造する方法、及び、本発明の検出方法により発現の差異が検出された遺伝子の断片を調製することを含む、細胞間で発現が相違する遺伝子に特異的なプローブを製造する方法を提供する。
遺伝子のクローニングによるライブラリーの製造及び遺伝子の断片の調製によりプローブの製造は、遺伝子が本発明の検出方法により発現の差異が検出された遺伝子であることの他は、通常の方法により行うことができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１
［プロトコール］
（１）アダプターの調製
配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ａｄ２Ｓ及びａｄ２Ａ）をアニーリングさせてアダプターを調製する。アニーリングは以下の条件で行う。ＴＥは、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を示す。
反応液組成
０．２  Ｍ  ＮａＣｌ                      ２μｌ
５００μＭ  ａｄ２Ｓ（ｉｎ  ＴＥ）        ９μｌ
５００μＭ  ａｄ２Ａ（ｉｎ  ＴＥ）        ９μｌ
反応の温度及び時間
９４℃  ５分→５０℃  ５分→４７℃  ５分→４４℃  ５分→４１℃  ５分→３８℃  ５分→３５℃  ５分→３２℃  ５分→２９℃  ５分→４℃
アニール後、３０μｌ  ＴＥを加えて、１００μＭのアダプター（ａｄ２）溶液とする。
同様に、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ａｄ３Ｓ及びａｄ３Ａ）、配列番号５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ａｄ４Ｓ及びａｄ４Ａ）、配列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ａｄ５Ｓ及びａｄ５Ａ）、配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ａｄ１３Ｓ及びａｄ１３Ａ）、ならびに配列番号１１及び１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ａｄ１４Ｓ及びａｄ１４Ａ）を用いて、アダプター（それぞれ、ａｄ３、ａｄ４、ａｄ５、ａｄ１３及びａｄ１４）溶液を調製する。
（２）ｃＤＮＡ合成
試料から、ＴＡＫＡＲＡ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（以下、キアクイックという）を用いて精製する（２０μｌ  ＴＥで溶出）。精製されたｃＤＮＡを１００μｌ系でＲｓａＩ消化（ＴＡＫＡＲＡ  ＡｆａＩ）し、キアクイックを用いて精製する。１μｇ  ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ使用の場合、２０μｌ  ＴＥで溶出する。１μｇ全ＲＮＡ使用の場合は、５０μｌ  ＴＥで溶出し、エタノール沈殿後、２μｌ  ＴＥに溶解する。
（３）ｃＤＮＡとアダプターａｄ２の結合
ＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ２を用いてｃＤＮＡとアダプターａｄ２を結合させる。ｃＤＮＡ  １μｌ、１００μＭ  ａｄ２  １μｌ、ＩＩ液  ２μｌ及びＩ液  ４μｌを混合し、１６℃で２時間反応させ、アダプターａｄ２が付加されたｃＤＮＡの溶液（ａｄ２  ｌｉｇ  ｃＤＮＡ）を得る。
（４）アダプターａｄ２が付加されたｃＤＮＡの増幅
以下の条件でＰＣＲを行う。
反応液組成
１０×ＥｘＴａｑ                      ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                  ４μｌ
ＥｘＴａｑ                            ０．２５μｌ
１００μＭ  ａｄ２Ｓ                  ０．５μｌ
ａｄ２  ｌｉｇ  ｃＤＮＡ              １μｌ又は０．１μｌ
ＤＷ                                ３９．２５μｌ
反応の温度及び時間
７２℃  ５分→（９４℃  ３０秒→６５℃  ３０秒→７２℃  ２分）×１５サイクル→７２℃  ２分
反応液の１０μｌを泳動してみて、鋳型が１μｌのときにで増えきっていて（約５００ｎｇ／μｌ）、０．１μｌのときでもそれなりの量が見えていれば、１０７以上の種類が含まれていると考えられる。
鋳型が１μｌの方の残り４０μｌをキアクイックを用いて精製し（４０μｌＴＥで溶出）、増幅されたｃＤＮＡの溶液（ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ）を得る。
（５）テスターおよびドライバーの作製
ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐに含まれるｃＤＮＡは一本鎖になっているものが多いので、以下の条件で再びＰＣＲを行う。
反応液組成
１０×ＥｘＴａｑ                      ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                  ４μｌ
ＥｘＴａｑ                            ０．２５μｌ
１００μＭ  ａｄ２Ｓ                  ０．５μｌ
ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ              ０．５μｌ
ＤＷ                                ３９．７５μｌ
反応の温度及び時間
９４℃  ２分→（９４℃  ３０秒→６５℃  ３０秒→７２℃  ２分）×５サイクル→７２℃２分
テスター用には１本、ドライバー用にはサブトラクション１サイクルにつき５本、計２０本ＰＣＲを行い、反応液の１０μｌを泳動してチェックした後（約１００ｎｇ／１０μｌ）、残りをキアクイック（テスター１本、ドライバー４本のカラムで）を用いて精製し（２０μｌ  ＴＥで溶出）、増幅されたｃＤＮＡの溶液（ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ（５ｃｙｃｌｅｓ））を得る。これを、以下の条件でＲｓａＩ消化する。
反応液組成
ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ（５ｃｙｃｌｅｓ）    ２０μｌ
１０×Ｔ                                      １０μｌ
ＢＳＡ                                        １０μｌ
ＲｓａＩ（１０ｕ／μｌ）                        ２μｌ
ＤＷ                                          ５８μｌ
（テスター１本、ドライバー４本）
ドライバー用は３７℃で２時間反応後、７０℃で５分の処理で制限酵素を失活させて完成ドライバー溶液（ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ  ＲｓａＩ）を得る。
テスター用は３７℃で１時間反応後、キアクイックで精製し（２０μｌ  ＴＥで溶出）、消化産物（ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ  ＲｓａＩ）を得る。
ＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ２を用いて消化産物とアダプターａｄ３を結合させる。ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ  ＲｓａＩ  ３μｌ、１００μＭ  ａｄ３  １μｌ、ＩＩ液  ４μｌ及びＩ液  ８μｌを混合し、１６℃で１時間反応させ、７０℃で５分の処理で制限酵素を失活させ、完成テスター溶液（ｃＤＮＡ  ａｄ３  ｌｉｇ）を得る。
（６）サブトラクション１回目
テスター溶液（ｃＤＮＡ  ａｄ３  ｌｉｇ）１６μｌ及びドライバー溶液（ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ  ＲｓａＩ）１００μｌを混ぜて（Ｔ：Ｄ＝１：４０）、キアクイックを用いて精製し（５０μｌ  ＴＥで溶出）、エタノール沈殿させる。
ｃＤＮＡ（テスター＆ドライバー混合物）５０μｌ、３Ｍ  酢酸ナトリウム  ５μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ  グリコーグン  １μｌ及びエタノール  １２５μｌを混ぜてすぐに５分間遠心する。７０％エタノールでリンスして乾燥後、１×ＰＣＲバッファー  １μｌに溶かし、ＰＣＲチューブに移して、ミネラルオイルを重層する。９８℃５分間ののち、１×ＰＣＲバッファー＋１Ｍ  ＮａＣｌ  １μｌを加えて混ぜ、９８℃５分→６８℃１６時間の処理を行う。
ＴＥ１０μｌを加えて新しいチューブに回収し、以下の条件でＰＣＲを行う。
反応液組成
１０×Ｔａｑ                ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ        ４μｌ
Ｔａｑ                      ０．５μｌ
１００μＭ  ａｄ３Ｓ        ０．５μｌ
処理試料                    ２μｌ
ＤＷ                      ３８μｌ
反応の温度及び時間
７２℃  ５分→（９４℃  ３０秒→６５℃  ３０秒→７２℃  ２分）×１０サイクル→４℃
５本分を１本のカラムでキアクイックを用いて精製し、エタノールで沈殿させる。７０％エタノールでリンスし、乾燥してからＴＥ  ５μｌ、１０×ムングビーンバッファー  ５μｌ、ＤＷ  ３８．５μｌ、及び、ムングビーンヌクレアーゼ  １．５μｌを加えて室温で２０分静置する。
０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ  ５μｌ、及び、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ７．６／１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ４５μｌを加えてから、キアクイックで精製し（３０μｌＴＥで溶出）、精製物（Ｓ１  ｐｕｒｅ）を得る。
以下の条件でＰＣＲを行う。
反応液組成
１０×Ｔａｑ                ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ        ４μｌ
Ｔａｑ                      ０．２５μｌ
１００μＭ  ａｄ３Ｓ        ０．５μｌ
Ｓ１  ｐｕｒｅ              ２μｌ
ＤＷ                      ３８．２５μｌ
反応の温度及び時間
９４℃  ２分→（９４℃  ３０秒→６５℃  ３０秒→７２℃  ２分）×１２サイクル→７２℃  ２分
反応液の１０μｌを泳動してみて、完全に増幅していることを確認する。反応液の残りをキアクイックを用いて精製し（４０μｌ  ＴＥで溶出）、増幅産物（Ｓ１  ａｍｐ）を得る。バンドのパターンを確認したい場合は２回目のＰＣＲを、５，７サイクルの条件でも行い、泳動してみる。
（７）均一化（ノーマライゼーション）
Ｓ１  ａｍｐをＴＥで５倍希釈したもの１μｌに、２×ＰＣＲバッファー１μｌを加えて、ミネラルオイルを重層して９８℃５分間ののち、１×ＰＣＲバッファー＋１Ｍ  ＮａＣｌ  ２μｌを加えて混ぜ、９８℃５分→６８℃１６時間の処理を行う。
１０×Ｔ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、ＢＳＡ  １０μｌ、ＲｓａＩ  ３μｌ、及び、ＤＷ  ７３μｌを加えて、３７℃１時間の処理ののち、キアクイックを用いて精製し（２０μｌ  ＴＥで溶出）、精製物（Ｎ１  ｐｕｒｅ）を得る。
以下の条件でＰＣＲを行う
反応液組成
１０×ＥｘＴａｑ                      ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                  ４μｌ
ＥｘＴａｑ                            ０．２５μｌ
１００μＭ  ａｄ３Ｓ                  ０．５μｌ
Ｎ１  ｐｕｒｅ                        ２μｌ
ＤＷ                                ３８．２５μｌ
反応の温度及び時間
９４℃  ２分→（９４℃  ３０秒→６５℃  ３０秒→７２℃  ２分）×１１〜１５サイクル→７２℃２分
反応液の１０μｌを泳動してみて、約５０ｎｇ（薄く見えるぐらい）になっているサイクル数のサンプルの残りをキアクイックを用いて精製し（２０μｌ  ＴＥで溶出）、ＲｓａＩで消化する（３７℃１時間）。これをキアクイックを用いて精製し（２０μｌ  ＴＥで溶出）、消化産物（Ｎ１  ａｍｐ  ＲｓａＩ）を得る。
ＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ２を用いて消化産物とアダプターａｄ４を結合させる。Ｎ１  ａｍｐ  ＲｓａＩ  ２μｌ、１００μＭ  ａｄ４  １μｌ、ＩＩ液  ３μｌ及びＩ液  ６μｌを混合し、１６℃で１時間反応させ、７０℃で５分の処理で制限酵素を失活させ、２回目用テスター溶液（Ｎ１  ａｍｐ  ａｄ４  ｌｉｇ）を得る。
（８）サブトラクション２回目
テスター溶液（Ｎ１  ａｍｐ  ａｄ４  ｌｉｇ）１２μｌ及びドライバー溶液（ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ  ＲｓａＩ）１００μｌを混ぜて（Ｔ：Ｄ＝１：１００）、キアクイックを用いて精製し（５０μｌ  ＴＥで溶出）、エタノールで沈殿させる。
以降、１回目のサブトラクションと同様に行う（ムングビーンヌクレアーゼ処理後のＰＣＲは３〜７サイクル）。
反応液の１０μｌを泳動してみて、約５０ｎｇ（薄く見えるぐらい）になっているサイクル数のサンプルの残りをキアクイックを用いて精製し（２０μｌ  ＴＥで溶出）、ＲｓａＩで消化する（３７℃１時間）。これをキアクイックを用いて精製し（２０μｌ  ＴＥで溶出）、消化産物（ＮＳ２  ａｍｐ  ＲｓａＩ）を得る。
ＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ２を用いて消化産物とアダプターａｄ５を結合させる。ＮＳ２  ａｍｐ  ＲｓａＩ  １／５希釈１μｌ、１００μＭ  ａｄ５  １μｌ、ＩＩ液  ２μｌ及びＩ液  ４μｌを混合し、１６℃で１時間反応させ、７０℃で５分の処理で制限酵素を失活させ、３回目用テスター溶液（ＮＳ２  ａｍｐ  ａｄ５  ｌｉｇ）を得る。
（９）サブトラクション３回目
テスター溶液（ＮＳ２  ａｍｐ  ａｄ５  ｌｉｇ）８μｌ及びドライバー溶液（ｃＤＮＡ  ａｄ２  ａｍｐ  ＲｓａＩ）１００μｌを混ぜて（Ｔ：Ｄ＝１：１０００）、キアクイックを用いて精製し（５０μｌ  ＴＥで溶出）、エタノールで沈殿させる。
以降、１回目のサブトラクションと同様に行う（ムングビーンヌクレアーゼ処理後のＰＣＲは６、８、１２サイクルで行う）。
このときに、増幅された種類が少なければ、二本鎖で終了していると考えられるので、そのまま、ＴＡベクターなどにクローニングする。もし、種類が多い場合には、１００倍に希釈して、５サイクルのＰＣＲを行い、二本鎖にしてからクローニングする。
実施例２
［実験系の精度検証１（モデル系）］
実施例１に記載の方法により、どの程度の発現量および発現量の差まで遺伝子が単離可能なのか調べるために、血管内皮細胞株ＭＳ１より調製したｃＤＮＡにバクテリオファージφＸ１７４由来ＤＮＡ  ＲｓａＩ消化断片を加えたものをテスターおよびドライバーに用いて、φＸ１７４断片が単離できるかどうか検討した。
図２のＡに、テスターとしてＭＳ１  ｃＤＮＡに６種類のφＸ１７４  ＲｓａＩ断片をいずれも１／１０５の割合で加えたものを、ドライバーとしてＭＳ１  ｃＤＮＡを用いて、実施例１に記載の方法（Ｎ−ＲＤＡ法）および均一化の工程を省略した方法（ＲＤＡ法）を行った場合の最終的なＰＣＲ産物の電気泳動を示す。レーン１は加えた６種類のφＸ１７４  ＲｓａＩ断片（Ｆ１〜Ｆ６）、レーン２はＲＤＡ法の３回目のサブトラクション後の増幅産物、レーン３はＮ−ＲＤＡ法の３回目のサブトラクション後の増幅産物の泳動の結果を示す。いずれの方法も６種類のうち５種類が増幅されており、１／１０５の割合で存在する特異的な断片のほとんどを単離できることが明らかになった。
図２のＢではＡと同様に１／１０６の割合でφＸ１７４  ＲｓａＩ断片を加えた場合の結果を示す。この割合ではいずれの方法でもφＸ１７４  ＲｓａＩ断片は増幅されなかった。したがって、これらの方法の限界が１／１０５から１／１０６の間であることが明らかになった。
図３のＡでは、６種類のφＸ１７４  ＲｓａＩ断片を、図に示した割合で加えた場合の結果（３回目のサブトラクション後の増幅産物の泳動の結果）を示す。ＲＤＡ法では、１／１０４の割合で加えたＦ１とＦ４が効率良く増幅され、１／１０５の割合で加えたＦ２の増幅も見られた。一方、Ｎ−ＲＤＡ法では、ＲＤＡ法に比べてＦ２の量が増加しており、さらにＦ５の増幅も見られたことから、均一化の効果が出ていることが確認された。
次に、１０倍の発現の差でも単離できるかどうか検討するために、ドライバーにも同じφＸ１７４  ＲｓａＩ断片をテスターの１０分の１の割合で加えて実験を行った（図３のＢ）。ＲＤＡ法では、テスターに１／１０４の割合で含まれているもの（Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５）に関しては１０倍の差でも増幅されてくることが確認できたが、１／１０５で存在するものは増幅されなかった。これに対して、Ｎ−ＲＤＡ法では、１／１０５で含まれるＦ２、Ｆ４も増幅された。
さらに、最も現実に近いモデルとして、存在量およびテスターとドライバー間の存在量比の異なるφＸ１７４  ＲｓａＩ断片を加えた場合について検討した（図３のＣ）。その結果、ＲＤＡ法では特異的で量の多いＦ３が優先されて増幅し、かろうじてＦ１、Ｆ４、Ｆ５の増幅が確認できた。これに対してＮ−ＲＤＡ法ではＦ１、Ｆ４、Ｆ５の量が増加し、さらにＦ２の増幅が見られた。
以上の結果から、いずれの条件でも均一化の効果が確認され、なるべく多くの遺伝子を一度に単離するためにはＮ−ＲＤＡ法が非常に有効であることが明らかである。
実施例３
［実験系の精度検証２（ヒト正常各種組織由来血管内皮細胞間のサブトラクション）］
いくつかのヒト正常組織由来血管内皮細胞間でのサブトラクションを行った。材料として、さい帯静脈内皮（ＶＥ）、さい帯動脈内皮（ＡＥ）、皮膚毛細血管内皮（ＡＤＭ）、扁桃内皮（ＴＥ）、及び、脳毛細血管内皮（ＢＭＥ）を用いた。また、比較的差の大きい細胞間の比較として、マウス血管内皮細胞株ＭＳ１とマウス上皮細胞株Ｅｐｈ４の間でサブトラクションを行った。
サブトラクションを行った組み合わせを図４に示す。血管内皮細胞間のサブトラクションでは数本から数十本のバンドが増幅された。これに比べてＭＳ１／Ｅｐｈ４のサブトラクションでは非常に多くのバンドが増幅された。この結果は、発現の特異的な遺伝子の種類数を反映していると考えられる。
次に、増幅された遺伝子が実際に特異的な発現を示すのかどうか確認するために、血管内皮細胞間のサブトラクションで増幅されたバンドをクローニングし、各血管内皮細胞より調製したｃＤＮＡに対してサザンブロットを行った（図５）。その結果、１２種類のうち１１種は完全に特異的あるいは１０倍以上の発現の差があることが認められ、残りの１種についても数倍の差があることが明らかになった。以上の結果から、Ｎ−ＲＤＡ法は、実際に比較的差の少ない細胞間でも低いバックグラウンドで発現の特異的な遺伝子を単離できる方法であることが確認された。
産業上の利用の可能性
本発明の方法によれば、試料中のＤＮＡ断片量を均一化することができる。この均一化方法をサブトラクションハイブリダイゼーションと組み合わせることにより、発現量の少ない遺伝子であっても、発現量の相違に基づいて遺伝子を単離することが可能になる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の均一化の原理の説明図である。
図２は、Ｎ−ＲＤＡ法の精度検証の結果を示す電気泳動写真である。
図３は、Ｎ−ＲＤＡ法の精度検証の結果を示す電気泳動写真である。
図４は、Ｎ−ＲＤＡ法の精度検証の結果を示す電気泳動写真である。ＶＥ：さい帯静脈内皮細胞、ＡＥ：さい帯動脈内皮細胞、ＡＤＭ：皮膚毛細血管内皮細胞、ＴＥ：扁桃内皮細胞、ＢＭＥ：脳毛細血管内皮細胞、ＭＳ１：マウス血管内皮細胞株、Ｅｐｈ４：マウス上皮細胞株。
図５は、Ｎ−ＲＤＡ法で単離したクローンの各種血管内皮細胞での発現の結果を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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