(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
環構成原子数が６であり、該構成原子の炭素原子がそれよりも電気的に陰性な置換基を有する非芳香族の環状構造化合物の立体構造異性体を検出する方法において、３以下の結合により隔てられた炭素−水素核間Ｊカップリング定数nＪC,H（ｎは２または３）を求めるために、前記環を構成する炭素と３以下の結合により隔てられた水素とのスピン結合情報のみが二次元チャート上に現れるように混合時間を設定し測定をしてＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトルチャートを作り、該チャート上のＦ２（ファイリング２；横軸）軸方向に１４５〜１７５Ｈｚ隔てたペアとなる相関ピークのＦ１（ファイリング２；縦軸）軸方向のズレより得たnＪC,H値の正負符号または正負符号および絶対値をnＪC,Hインデックスに従い適合させて行う前記環構成原子数が６の化合物の立体構造異性体の構造決定方法。
【請求項２】
ＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトルチャートにおいてＦ１軸方向に１４５〜１７５Ｈｚ隔てた相関ピークのペアのＦ２軸方向のズレの大きさによって与えられるnＪC,H値および／またはそのnＪC,H値の情報を含む相関ピークのズレの方向によって与えられるnＪC,H値の正負の符号を判断の補助情報とすることを特徴とする請求項１に記載の前記環構成原子が６の化合物の立体構造異性体の構造決定方法。
【請求項３】
３つの結合によって隔てられた水素間での磁化移動を選択的に行うために１５〜２０秒の混合時間をＨＥＴＬＯＣ測定のために適用し、さらに必要な相関ピークのすべてをもれなく観測するために観測1ＪC、H値を１６０Ｈｚに設定したことを特徴とする請求項１または２に記載の環構成原子数が６の化合物の構造決定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環構成原子数が６であり、該構成原子の炭素原子が電気的により陰性な置換基を有する非芳香族化合物、例えばアルドヘキソピラノース類やそのアミノ糖などの類縁体を代表とするあらゆる糖ピラノース類、イノシトール（inositol）、キニ酸（quinic acid：１，３，４，５−テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸）、それにコンデュリトール（conduritol）などのＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトルチャート上のＦ１方向に１４５〜１７５Ｈｚ隔てて現れる相関ピークのペアのＦ２方向のズレより求められるnＪC,H値の正負の符号（傾き係数の符号が対角ピーク群の方向と同じ場合を正、違う場合を負とする。）、特にアルドヘキソピラノース類の立体構造異性体の構造を、アルドヘキソースのＣ1Ｈ2、Ｃ2Ｈ1、Ｃ2Ｈ3、Ｃ3Ｈ2、Ｃ3Ｈ4、Ｃ4Ｈ3、Ｃ4Ｈ5、Ｃ5Ｈ4に関する2ＪC,Hの正負の符号をＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトルから求め、2ＪC2,H1の場合は−３Ｈｚ以上か−５Ｈｚ以下かを表すること（イノシトールなど糖化合物の１位に相当するアセタール構造を有さない化合物においては、すべての値を正負の符号を２値化できる）により同定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖類の構造解析には質量分析が有効であり広く用いられているが、同じ分子量のアルドヘキソピラノースを区別するためには酵素による基質特異的な消化やＮＭＲによる詳細な解析が必要とされている。ただ、ＮＭＲによる解析は酵素消化に比べて非破壊的である点で有利である。
このＮＭＲ解析では3ＪHHカップリング定数を手がかりにする方法と、１Ｈ−１Ｈ間のＮＯＥ〔核オーバーハウザー効果（nuclear Overhauser effect）〕に基づく方法があるが、前者では３．５〜４．０ｐｐｍのシグナルの密集領域に含まれる1Ｈシグナルの完全帰属が必要な上にそのシグナルの分裂パターンを解析してＪスピン結合定数を読みとらなければならない欠点がある。後者においては、小さな環状化合物においては、距離情報を一義的に解釈できるようになってきており、立体配座の予測が可能であることから、立体構造の構造解析への利用が一般化して来ているが、（１）一般にＮＯＥシグナルは強度が１０％以下に減少するため、ある特定のＮＯＥシグナルがチャート上にある／ないといった定性的な議論に陥りがちとなり客観的な判断が難しい。（２）したがって、必ずしもＮＯＥのみで構造が決定できない、（３）よって、3ＪHHスピン結合定数のような隣り合う１Ｈ−１Ｈの相対的な配置に関するＮＭＲ情報の解析が別途必要になる、等の欠点がある。
【０００３】
1969年にＣａｓｕおよびＰｅｒｌｉｎによりＤ−グルコース上の2ＪC2,H1値が報告されて以来、糖類の2ＪC,H カップリング定数の絶対値（正負の符号については関心が持たれていない）、特に2ＪC1,H2の値がしばしば報告されてきた。  １９８８年にはＭｏｒａｔ等によって、メチル−２，３，４，６−テトラ−O−アセチルアルドヘキソピラノシドの2ＪC,Hについて完全なセットが報告されているがこれは絶対値であり、正負については関心が持たれていない。
2ＪC,H値の正負については、Ｐｅｒｌｉｎ等およびＢｏｃｋにより、それぞれグルコース誘導体の2ＪC2,H1、2ＪC4,H5および2ＪC5,H4値の正負、およびガラクトース誘導体の2ＪC2,H3、2ＪC3,H2および2ＪC3,H4の正負の報告がある以外、１９８０年代まではあまり関心が持たれていなかった。
【０００４】
前記のように、糖のＮＭＲの研究から、2ＪC、H値が正負の符号を伴って与えられることは以前から知られていた。ところが、糖のnＪC、H値は天然存在比の13Ｃ量 (１．１％) では測定が困難であった。それでも選択的異種核２Ｄ−Ｊスペクトルを用いたnＪC、H値の解析が報告されているが、報告のＮＭＲ測定法では正負を決定することがスペクトルの解像度から不可能である。
一方、13Ｃで位置特異的に標識した糖を用いる研究もなされ、そこでは標識された位置のnＪC、H値はプロトン二重照射法やクロスピーク置換（cross peak displacement）法によって符号とともに求めることが可能であることが示されている。９０年代に入り、13Ｃで標識することなしに感度よくnＪC、H値を求めることが可能なＨＥＴＬＯＣ法（Hetero half-filtered total correlation spectroscopy）が開発された。この方法によると分裂したシグナルのズレの方向によって値の正負（傾き係数の符号が対角ピーク群と同じ場合を正、異なる場合を負とする。）を決定することも可能である。
しかしながら、同じ分子量のアルドヘキソピラノース類の識別を、各立体構造異性体の全体の2ＪC,H値に基づいて系統的に行うという試みは報告されていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、環構成原子数が６であり、該環構成原子の炭素原子が電気的により陰性な置換基を有する非芳香族の環状構造を有する化合物の立体構造異性体を検出（帰属）する新規なＮＭＲ測定法、特にピラノース環を有する糖の立体構造異性体を検出する方法を提供することである。
本発明者等は、環構成原子数が６の環を構成し、電気的により陰性な置換基を持つ炭素原子は、立体配座が１つに安定しており、それに対応したnＪC、H値を一義的に与えることを見出し、該環状構造に含まれる全てのnＪC、H値を測定し、特に各nＪC、H値の正負の組み合わせを対応する立体構造異性体のデータとして蓄積した。そして、未知の試料のＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトル、特に、Ｆ２軸（炭素と遠隔スピン結合している水素に関連：横軸）を４ｋ以上（４０００ポイント以上）×Ｆ１軸（炭素に直結する水素に関連：縦軸）を５１２ポイント以上の条件で集めて作成し（２ｋ×２５６のデータを得、両軸を二倍にゼロファイリングすることによって得る。）た該スペクトルにおいてＦ１方向に１４５Ｈｚ〜１７５Ｈｚ隔たったペアとなるnＪC、HスペクトルのＦ２方向のズレの正負の組み合わせを作成し、該組み合わせを立体構造異性体の前記蓄積データと対比することにより、その構造が決定できることを発見し、前記本発明の課題を解決した。
【０００６】
例えば、アルドヘキソピラノースのピラノース環上の炭素および水素のＣ1Ｈ2、Ｃ2Ｈ1、Ｃ2Ｈ3、Ｃ3Ｈ2、Ｃ3Ｈ4、Ｃ4Ｈ3、Ｃ4Ｈ5、Ｃ5Ｈ4の８つの対の2ＪC,Hの値を前記ＨＥＴＬＯＣなどの二次元ＮＭＲスペクトルで全て求めて、2ＪC,H（Ｈｚ）インデックス（一覧表：蓄積データ）を作り、未知の試料の測定されたＨＥＴＬＯＣの二次元ＮＭＲスペクトルより求めた2ＪC,H値を前記インデックスと対比し適合させて相当する糖の構造を決定することができることを見出した。
【０００７】
更に、前記アルドヘキソピラノースのピラノース環上の炭素および水素の2ＪC,Hの値の正負に関しては、２つ以上の環が結合した化合物においても2ＪC,Hの絶対値に違いがあるものの、やはり立体構造異性体の識別を可能とすることを見出した。
また、１４５Ｈｚ〜１７５Ｈｚ隔たったペアの特定ができない場合でも、ＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトルのＦ１軸側のスペクトルのファミリー情報、および分裂したピークのＦ２側シフト値とそのシグナルの正しい化学シフト値との関係から2ＪC,Hの値の正負を得ることができるから、立体異性体の構造を特定できる情報を確実に得ることができる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、環構成原子数が６であり、該構成原子の炭素原子が電気的により陰性な置換基を有する非芳香族の環状構造化合物の立体構造異性体を検出する方法において、３以下の結合により隔てられた炭素−水素核間Ｊカップリング定数nＪC,H（ｎは２または３）を求めるために、前記環を構成する炭素と３以下の結合により隔てられた水素とのスピン結合情報のみが２次元チャート上に現れるように混合時間を設定してＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトルを測定し、そのチャート上においてＦ１軸方向に１４５〜１７５Ｈｚ隔てたペアとなる相関ピークのＦ２軸方向のズレの正負の符号または符号を含む数値として得たnＪC,H値を、特に2ＪC2,H1の場合は−３Ｈｚ以上か−５Ｈｚ以下かを判断して、
nＪC,Hインデックス（それぞれの立体構造異性体における前記８つのnＪC,H値の正負符号の組み合わせ）に従い適合させて行う前記環構成原子数が６の化合物の立体構造異性体の構造決定方法である。好ましくはＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトルチャートにおいてＦ１方向に１４５〜１７５Ｈｚ隔てた一対の相関ピークのペアおよび／または一次元1Ｈ?ＮＭＲスペクトルをnＪC,H値の相関ピークのズレの正負符号の判断の補助とすることを特徴とする前記環構成原子数が６の化合物の立体構造異性体の構造決定方法であり、より好ましくは、磁化移動を３つの結合を介して選択的に行うために１５〜２０秒の混合時間をＨＥＴＬＯＣ測定のために適用し、さらに観測1ＪC,H値を１６０Ｈｚに設定することにより
nＪC,H値の値情報を有する８つのＨＥＴＬＯＣ相関ピークのほぼすべてを観察可能にしたことを特徴とする前記環構成原子数が６の化合物の構造決定方法である。
【０００９】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．ここでは、環構成原子数が６であり、該構成原子の炭素原子がより電気的に陰性な置換基を有する非芳香族の環状構造化合物として、アルドヘキソピラノース化合物の立体構造異性体の識別法、換言すればそれら異性体の構造決定法について説明するが、他の前記環状構造化合物に適用できる。
電気的に陰性な置換基としては、酸素、窒素、硫黄、ハロゲンなどの原子を含む官能基を挙げることができる。
【００１０】
Ｂ．アルドヘキソピラノース化合物の立体構造異性体のそれぞれについてのnＪC,Hインデックス（それぞれの異性体における前記８つのnＪC,H値の正負の符号の組み合わせ）を蓄積するために各異性体を含む試料のＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトルチャートを作成する。該チャートの作成に使用するＮＭＲ測定装置は、商品名Ｌａｍｂｄａ〔日本電子（株）社製；Ｊｅｏｌ ＮＭ−５００〕で、パルスシーケンスとしてはＨＥＴＬＯＣ（M. Kurz，P．Schmieder，H．Kessler， Angew．Chem．Int．Ed．Engl．1991，30，1329−1331）、対角ピーク消去ＨＥＴＬＯＣ（U. Wollborn, D. Leibfritz,J.Magn.Reson.1992,98,142-146）、高感度ＨＥＴＬＯＣ（D. Uhrin, G. Batta, V. J. Hruby, P. N. Barlow, K. E. Koever,,J.Magn.Reson.1998,130,155-161）を用い、スピン混合時間の条件を１５〜２０ｍｓ（ミリ秒）に設定し、更に、ＨＥＴＬＯＣ二次元ＮＭＲスペクトルのＦ２（ファイリング２；横軸）は４０９６ポイント、そして、Ｆ１（ファイリング１；縦軸）は５１２ポイントの条件で求めた。この条件においては解像度は０．７Ｈｚより小さい。
【００１１】
図１は、α−およびβ-グルコースのＨＥＴＬＯＣスペクトルである。図１の領域Ａ〜Ｃのスペクトルを拡大したものを、図２〜４に示す。図１において、左下から右上に向かっての鎖線は、対角ピーク群を結んだ直線であり、Ｆ１方向に１４５〜１７５Ｈｚ隔てたピークのペアがこの鎖線の勾配と同じ方向にズレている場合を正、反対の方向にずれている場合を負とする。例えば図３の2ＪC1,H2は、ズレは対角ピークの勾配に対して反対方向であるから負である。
【００１２】
ＨＥＴＬＯＣスペクトルは、1Ｈシグナルの帰属をベースに分析される。
ピラノース環上の８つの2ＪC、H値の決定のために必要なＨＥＴＬＯＣ相関ピーク（Ｆ１方向に１４５〜１７５Ｈｚ隔てたペア）は、通常すべて観察できるが、それらのいくつかが、対角ピーク（diagonal peak）のような他の信号と重なってしまうことがある。
このような場合には、一次元1Ｈ−ＮＭＲからそのピークの正しい化学シフトを求め、それとＨＥＴＬＯＣ相関ピークの対の残りの一つとの差値（Ｈｚ）とから注目する2ＪC、H値を決定することができる。それを図３のβ−グルコースの2ＪC1,H2を例に説明する。Ｈ１（Ｆ２）−Ｈ２（Ｆ１）の相関シグナルに相当する２つのピークのうち、上半分のピーク（ピークＡ）の化学シフト１６３３．４Ｈｚと一次元1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける同一ピーク（ピークＣ）の化学シフト１６３０．２Ｈｚとの差値３．２Hｚを２倍することにより2ＪC1,H2の絶対値（約６．４Ｈｚ）が得られる。ピークＡとピークＢとの関係から決定されるべきその正負の符号は、ピークＡとピークＣとの関係から負であることがわかる。このようにして、糖の立体構造異性体のそれぞれについて８つの2ＪC、H値が決定される。
【００１３】
図５〜図８（ガラクトース−１〜ガラクトース−４）には、α−およびβ−ガラクトースのＨＥＴＬＯＣスペクトルを示す。また、図９〜図１３（マンノース−１〜マンノース−５）には、α−およびβ−マンノースのＨＥＴＬＯＣスペクトルを示す。これらのスペクトルにおいて縦軸はＦ１であり、横軸はＦ２である。
【００１４】
前記ＨＥＴＬＯＣスペクトルからのグルコース、ガラクトース、およびマンノースの2ＪC、H値は図１４にまとめられ、2ＪC1,H2以外の値を正（■）、および負（□）の２値に変換した表示を図１５にまとめた。また、2ＪC1,H2値の場合は-３Ｈｚ以上か−５Ｈｚ以下かを判断し、前者を■、後者を□として２値化する。
【００１５】
前記図１５の表示（インデックス）に基づくアルドヘキソピラノースの構造決定方法のフローの一態様を図１６に示す。このフローは糖化合物が有する８個の2ＪC、H値をすべて用いるのではなく、なるべく少ない2ＪC、H値数によってそれぞれの区別が可能となることを目的に作成した。ＨＥＴＬＯＣスペクトルの解析は、〔解析開始ピークの指定〕から始まる。これは2ＪC1、H2値の情報を与えるピークで、H1(F1)-H2(F2)の相関ピークに相当し、たとえばβ−グルコースの該ピークは図３のα，βのペアーである。H1は通常δ４．５−４．７（β-グリコシドの場合）もしくはδ５−５．２（α-グリコシドの場合）に現れるのでこの〔解析開始ピークの指定〕は容易である。この2ＪC1、H2値は環内酸素と環外グリコシド酸素による影響を受けるため、ひとつの酸素官能基からの影響しか受けない他の2ＪC、H値とは異なり配座の違いに基づく値のしきい値は０ Hzとならない。本発明者らが行った検討の限りでは、β配置のＧｌｃ型およびＧａｌ型では−５Ｈｚ以下となり、それらの糖のα配置のものとＭａｎ型の糖では−３Ｈｚ以上の値を与えることが明らかとなっている。−５〜−３Ｈｚの値はなかったのでこの範囲をしきい値にした。
もし与えられた未知試料がα−グルコース構造を含むならば、そのHETLOCスペクトルから求められる2ＪC1、H2値は−３Ｈｚ以上となるので、図１６の開始ピークの指定の直後にまず右側に行く。注目する炭素にひとつの酸素官能基しか結合していないＣ１以外の2ＪC、H値は相対的な配置によって正か負のいずれかの値をととる。したがってそれ以降の2ＪC、H値の解析は正負の符号に基づきフロー上を移動する。すなわち2ＪC2,H1値およびそれに続く2ＪC2,H3、2ＪC3,H2値、2ＪC3,H4値、2ＪC4,H3値、2ＪC4,H5値、そして2ＪC5,H4値は全て負であるから、全て左側に行き、左からグルコースβ、イドースβ、ガラクトースβ、アロースβ、グルコースα、イドースα、ガラクトースα、アルトロースα、アロースα、マンノースα、タロースα、アルトロースβ、マンノースβ、およびタロースβのそれぞれについての２値のインデックスのうち左から４番目のＧｌｃαの２値の標準的な組み合わせ（インデックス）に到達することによりその未知試料がα−グルコース構造を含むと決定される。
ＨＥＴＬＯＣにはもともとＨＯＨＡＨＡによる磁化移動に由来する各水素間のつながりの情報が含まれているので、Ｈ１（Ｆ１）−Ｈ２（Ｆ２）が特定できれば以上に示したような残りの相関ピークの同定は可能である場合が多い。これもＨＥＴＬＯＣ測定法が本発明において重要な役割を果たしているポイントである。
【００１６】
【実施例】
ここでは、前記アルドヘキソピラノース化合物の立体構造異性体の2ＪC、H値のインデックスが、更に二糖類にも適用できることを示すものであるが、前記インデックスの適用範囲は、このようなものに限定されるなく、オリゴ化合物においても適用できる。
【００１７】
実施例１
前記図１７には、スクロースを構成するα−グルコース残基の2ＪC、H値セットが記載されている。すなわち2ＪC1,H2値は−3Hz以上だから■、そのほかの、2ＪC2,H1値、2ＪC2,H3値、2ＪC3,H2値、2ＪC3,H4値、2ＪC4,H3値、2ＪC4,H5値、および2ＪC5,H4値は、全て負であるから□であり、図１５のＧｌｃαの立体配置に帰属される。
図１８は、スクロースのＨＥＴＬＯＣスペクトルを示す。図１９〜２１は図１８の領域Ａ〜Ｃの拡大図である。
【００１８】
実施例２
ここではラクトースの、
２−１，Ｇａｌ（β）−Ｇｌｃ（α）型における、Ｇａｌ（β）構造、
２−２，Ｇａｌ（β）−Ｇｌｃ（α）型におけるＧｌｃ（α）構造、
２−３，Ｇａｌ（β）−Ｇｌｃ（β）型におけるＧａｌ（β）構造、
２−４，Ｇａｌ（β）−Ｇｌｃ（β）型におけるＧｌｃ（β）構造の2ＪC、H値をＨＥＴＬＯＣ測定により解析した例を示す。
それぞれの糖残基の2ＪC、H値を図１７に示す。これらの値から、２値データを作成するとそれぞれ以下のようになり、いずれも図１５に示した単糖類の2ＪC、Hインデックスに一致することが分かる。
２−１：□■□□□■■■    （→図６のＧａｌβに一致）
２−２：■□□□□□□□    （→図６のＧｌｃαに一致）
２−３：□■□□□■■■    （→図６のＧａｌβに一致）
２−４：□■□□□□□□    （→図６のＧｌｃβに一致）
以上のことから、二糖類を構成する糖残基についても本発明を用いれば正しく帰属できることが理解される。
【００１９】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の立体構造異性体の帰属の決定方法を用いれば、ＨＥＴＬＯＣスペクトルから前記環構成原子数が６であり、該構成原子の炭素原子が電気的により陰性な原子を含む置換基を有する非芳香族の環状構造化合物の立体構造異性体の帰属を容易に解析することができるという優れた効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  α−およびβ-グルコースのＨＥＴＬＯＣスペクトル
【図２】  図１のＡ領域の拡大図
【図３】  図１のＢ領域の拡大図
【図４】  図１のＣ領域の拡大図
【図５】  α−およびβ−ガラクトースのＨＥＴＬＯＣスペクトルの一部
【図６】  α−およびβ−ガラクトースのＨＥＴＬＯＣスペクトルの一部
【図７】  α−およびβ−ガラクトースのＨＥＴＬＯＣスペクトルの一部
【図８】  α−およびβ−ガラクトースのＨＥＴＬＯＣスペクトルの一部
【図９】  α−およびβ−マンノースのＨＥＴＬＯＣスペクトルの一部
【図１０】  α−およびβ−マンノースのＨＥＴＬＯＣスペクトルの一部
【図１１】  α−およびβ−マンノースのＨＥＴＬＯＣスペクトルの一部
【図１２】  α−およびβ−マンノースのＨＥＴＬＯＣスペクトルの一部
【図１３】  α−およびβ−マンノースのＨＥＴＬＯＣスペクトルの一部
【図１４】  ガラクトース、グルコース、およびマンノースの2ＪC、H値
【図１５】  アルドヘキソピラノース化合物の立体構造異性体の2ＪC、H値を■、□の２値に変換した表示
【図１６】  図１５の表示（インデックス）をもとに作成したアルドヘキソピラノース化合物の構造決定フローの一態様
【図１７】  α−ラクトース、β−ラクトースおよびスクロースを構成するβ−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース残基の2ＪC、H値
【図１８】  スクロースのＨＥＴＬＯＣスペクトル
【図１９】  図１８のＡ領域の拡大図
【図２０】  図１８のＢ領域の拡大図
【図２１】  図１８のＣ領域の拡大図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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