(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１および配列番号：２５からなる群から選択される核酸に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、ヒトグッドパスチャー（ＧＰ）抗原のＮ末端領域に特異的に結合しセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つタンパク質をコードする核酸を含む、単離された核酸。
【請求項２】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１および配列番号：２５からなる群から選択される核酸を含む、単離された核酸。
【請求項３】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも９０％以上の同一性を持ち、ヒトＧＰ抗原のＮ末端領域に特異的に結合しセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つタンパク質を、コードする核酸を含む、単離された核酸。
【請求項４】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸を含む、単離された核酸。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の単離された核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項６】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１および配列番号：２５からなる群から選択される単離された核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項５または６に記載の組換え発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項８】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるポリペプチドと、少なくとも９０％以上の同一性を持ち、ヒトＧＰ抗原のＮ末端領域に特異的に結合しセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つポリペプチドを含む、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるポリペプチドを含む、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８または９のいずれかに記載の実質的に精製されたポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項１１】
抗体がポリクローナル抗体である請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるポリペプチドと、少なくとも９０％以上の同一性を持ち、ヒトＧＰ抗原のＮ末端領域に特異的に結合しセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つタンパク質の存在を検出する方法であって；
ａ）スクリーニングするタンパク質サンプルを調製し；
ｂ）スクリーニングするタンパク質サンプルを抗体−抗原複合体形成を促進する条件下で請求項１０から１２のいずれかの抗体と接触させること；および
ｃ）抗体−抗原複合体の存在が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるポリペプチドと、少なくとも９０％以上の同一性を持つタンパク質の存在を示す、抗体−抗原複合体形成の検出；
からなる方法。
【請求項１４】
検出が、免疫局在化、免疫蛍光分析、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡおよび核酸発現ライブラリースクリーニングからなる群から選択される方法を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１および配列番号：２５からなる群から選択されるポリヌクレオチドに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、ヒトＧＰ抗原のＮ末端領域に特異的に結合しセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つタンパク質をコードする核酸をサンプル中で検出する方法であって、サンプルを高ストリンジェンシー条件下で請求項１から４のいずれかに記載の単離された核酸と接触させること、および複合体形成を検出することからなり、ここで複合体形成は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１および配列番号：２５からなる群から選択されるポリヌクレオチドに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸の、サンプル中の存在を示す方法。
【請求項１６】
ハイブリダイゼーション、逆転写、ＰＣＲ、逆転写を組み合わせたＰＣＲ、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、およびＤＮＡライブラリースクリーニングからなる群から選択される方法により検出を実施する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者の自己免疫状態を検出する方法であって、
患者からの組織または体液サンプルを調製し；
自己免疫状態が存在しない対照組織または体液サンプルを調製し；および
対照サンプルと比較しての組織または体液サンプル中のＧＰＢＰ  ＲＮＡまたはタンパク質発現の変化の検出であって、ここで対照と相対するＧＰＢＰ  ＲＮＡまたはタンパク質発現の変化は自己免疫状態の存在を示し、またこのときＧＰＢＰ  ＲＮＡは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９および配列番号：１１からなる群から選択される核酸と少なくとも９０％以上一致する、ヒトＧＰ抗原のＮ末端領域に特異的に結合しセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つタンパク質をコードする核酸から発現し、ＧＰＢＰ  タンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるタンパク質と少なくとも９０％以上一致しセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ；
ことを含む方法。
【請求項１８】
組織または体液サンプル中のアポトーシスまたは癌形質転換が行われている細胞を検出する方法であって、
患者からの組織または体液サンプルを調製し；
正常な対照組織または体液サンプルを調製し；および
対照サンプルと比較して組織または体液サンプル中のＧＰＢＰ  ＲＮＡまたはタンパク質発現の変化の検出であって、ここで対照と相対するＧＰＢＰ  ＲＮＡまたはタンパク質発現の変化がアポトーシスまたは癌形質転換が行われている細胞の存在を示し、このときＧＰＢＰ  ＲＮＡは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９および配列番号：１１からなる群から選択される核酸と少なくとも９０％以上一致する、ヒトＧＰ抗原のＮ末端領域に特異的に結合しセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つタンパク質をコードする核酸から発現し、ＧＰＢＰ  タンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるタンパク質と少なくとも９０％以上一致しセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ；
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（相互参照）
本出願は１９９９年２月２４日に出願された米国仮出願番号６０／１２１４８３の優先権を請求する。
【０００２】
(政府権限の記載)
本研究はＣｏｍｉｓｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｍｉｎｉｓｔｅｒｉａｌ  ｄｅ  Ｃｉｅｎｃｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉａ（ＣＩＣＹＴ、スペイン）のＰｌａｎ  Ｎａｃｉｏｎａｌ  Ｉ＋Ｄからの許可番号ＳＡＬ９１／０５１３、ＳＡＦ９４／１０５１およびＳＡＦ９７／００６５、Ｆｏｎｄｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｅｓ  Ｓａｎｉｔａｒｉａｓ（ＦＩＳｓｓ、スペイン）からの許可番号９３／０３４３、並びにｌａ  Ｄｉｒｅｃｃｉｏ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｄ’Ｅｎｓｅｎｙａｍｅｎｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｓ  ｉ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏ（Ｃｏｍｕｎｉｔａｔ  Ｖａｌｅｎｃｉａｎａ、スペイン）からの許可番号ＧＶ−３３６６／９５、ＧＶ−Ｃ−ＶＳ−２１−１１８−９６により援助を部分的に受けている；従ってスペイン政府は本発明の権利を保持する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明はプロテインキナーゼ、自己免疫疾患、アポトーシスおよび癌の分野に関する。
【０００４】
（発明の背景）
グッドパスチャー（ＧＰ）病はヒトのみで報告されている自己免疫疾患である。ＧＰ患者では、ＩＶ型コラーゲンα３鎖の非コラーゲン性Ｃ末端ドメイン（ＮＣ１）（「グッドパスチャー抗原」）に対する自己抗体が急速な進行性糸球体腎炎およびしばしば肺出血を引き起こし、これはＧＰ症候群の二つの重要な臨床発現である（１を参照のこと。このセクションでの参照番号は実施例１の参考文献リストに対応する）。
【０００５】
一つ以上の自己免疫疾患を表す有意数の患者により、またこれらの疾患のいくつかが特異的ＭＨＣハプロタイプに対して示す強力で共通した連鎖により、少なくともいくつかの自己免疫障害では共通の発病原因が存在するという考えが示唆される（３１、３２）。自己免疫においては自己抗原が先導部分であり、自己抗原性である自己成分の数は限られている（３１）という実験観察は、これらの自己成分が、免疫系による自己／非自己認識の重要な結果と生物学的特徴を共有することを示唆している。異なるが特異的である自己成分を変化させることにより、引き金となる事象が結果的に異常な抗原処理をする可能性がある。特定のＭＨＣ特異性を発現するある個体では、異常ペプチドが非耐性Ｔセルにより認識され、免疫応答を引き起こす（１）。
【０００６】
我々は以前にＧＰ抗原を探査し、自己免疫発病原因において関連性のある生物学的特徴を同定した。ＮＣＩドメインは種間で、および異なるＩＶ型コラーゲンα鎖（α１からα６）間で高度に保存されているので（２）、天然の自己免疫応答におけるヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１の排他的な関与は、このドメインが発病原因に関連する構造的および／または生物学的特徴を有することを示唆している。これに一致して、ヒト抗原のＮ末端は高度に分岐しており、Ａ型プロテインキナーゼの機能的リン酸化部位を確認する独特の５個の残基モチーフ（ＫＲＧＤＳ９）を含有する（３、４）。さらに、ヒトα３遺伝子は、別法としてスプライシングされ、リン酸化可能なＮ末端領域をも含有する複数の転写物を生じるが、その他のヒト関連または別の種の相同性遺伝子にはそれはない（５から７）。最近の研究ではｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによるＧＰ抗原のＮ末端のリン酸化が別の生成物の存在により上方制御されることが示されている（以下の実施例３を参照のこと）。特異的セリンリン酸化およびプレｍＲＮＡ代替スプライシングはまたアセチルコリンレセプターおよびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を含有するその他の自己抗原の生物学とも関連する（４）。後者は免疫系が中枢神経系の白質を標的とする別の排他的ヒト自己免疫疾患である多発性硬化症（ＭＳ）における主要な抗原であると考えられる。ＧＰ病およびＭＳは同一のＨＬＡ  ＩＩクラスハロタイプ（ＨＬＡ  ＤＲＢ１＊１５０１）と強力な関連性を示すヒト疾患である（３２、３３）。このＨＬＡ特異性を担持するＭＳ患者のＧＰ病による死亡が最近報告されたのに加えて（３４）、これはこれらのヒト疾患における共通の発病原因の存在を支持している。
【０００７】
このように、特異的セリン／スレオニンリン酸化がヒトＧＰ抗原、その他の種のＧＰ抗原、およびその他のヒトα（ＩＶ）鎖からの相同性ドメイン間の主要な生物学的差異であり、発病原因において重要であろう（１、４）。
【０００８】
従って、ヒトＧＰ抗原のＮ末端領域をリン酸化する特異的セリン／スレオニンキナーゼの同定および単離はＧＰ症候群および恐らくその他の自己免疫障害の診断および処置に非常に有利であろう。
【０００９】
（発明の開示）
本発明はヒトＧＰ抗原の独特なＮ末端領域に特異的に結合し、リン酸化するセリン／スレオニンキナーゼの同定および単離に関して当該分野の必要性を満足させるものである。一つの態様では、本発明は種々の形態のグッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）をコードする核酸配列、およびＧＰＢＰコード化配列に機能的に結合した組換え発現ベクターを提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は組換え発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらなる態様では、本発明は実質的に精製されたＧＰＢＰおよびＧＰＢＰに選択的に結合する抗体を提供する。さらに別の態様では、本発明はＧＰＢＰまたはＧＰＢＰをコードするの核酸の存在を検出する方法を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は自己免疫状態またはアポトーシスの存在を検出する方法であって、対照組織に比較して、組織におけるＧＰＢＰの発現の増加の検出からなる方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は自己免疫障害、アポトーシス、または腫瘍を処置するための方法および医薬用組成物であって、ＧＰＢＰの発現または活性を改変する必要性を有する患者において、ＧＰＢＰの発現または活性を改変することからなる方法および医薬用組成物を提供する。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明に引用する全ての参考文献は出展明示により本明細書の一部とする。
【００１４】
本明細書で用いる略語は：ｂｐ、塩基対；ＤＴＴ、ジチオスレイトール；ＤＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＥＧＴＡ、エチレングリコールビス（βアミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；ＧＰ、グッドパスチャー；ｒＧＰΔＩＩＩ、ｒＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／ＶおよびｒＧＰΔＶ、各々スプライシングしたエキソンＩＩＩ、エキソンＩＩＩ，ＩＶおよびＶまたはエキソンＶから得られたグッドパスチャー抗原の代替の形態を表す組換え物質；ＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰ、元来のおよび組換えグッドパスチャー抗原結合タンパク質；ＧＰＢＰΔ２６およびｒＧＰＢＰΔ２６、ＧＰＢＰの元来のおよび組換え代替形態；ＧＳＴ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；ＨＬＡ、ヒトリンパ球抗原；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィ；Ｋｂ、千塩基対；ｋＤａ、千ダルトン；ＭＢＰ、ｒＭＢＰ、元来のおよび組換え２１ｋＤａミエリン塩基性タンパク質；ＭＢＰΔＩＩおよびｒＭＢＰΔＩＩ、エキソンＩＩをスプライシングして得られた元来のおよび組換え１８．５ｋＤａミエリン塩基性タンパク質；ＭＢＰΔＶおよびＭＢＰΔＩＩ／Ｖ、各々エキソンＶ並びにエキソンＩＩおよびＶをスプライシングして得られたミエリン塩基性タンパク質の代替形態；ＭＨＣ、主要組織適合性複合体；ＮＣ１、非コラーゲン性ドメイン；ＰＨ、プレクストリン相同性；ＰＫＡ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ；ＰＭＳＦ、フッ化フェニルメチルスルフォニル；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＴＢＳ、トリス緩衝生理食塩水：である。
【００１５】
本出願では特記しない場合、利用される技術はいくつかの既知の参考文献例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｔａｙｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９））、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編、アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９１））、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙの「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編、アカデミックプレスインコーポレーティッド（１９９０））；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９０））、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、リスインコーポレーティッド、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８７））、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１０９−１２８頁、（Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、ザヒューマナプレスインコーポレーティッド、クリフトン、ニュージャージー州）、およびアンビオン１９９８年カタログ（アンビオン、オースティン、テキサス州）のいずれかに見出すことができる。
【００１６】
本明細書で用いる「ＧＰＢＰ」なる用語はグッドパスチャー結合タンパク質を意味し、その単量体およびオリゴマーの両方を含む。ヒト（配列番号：２）、マウス（配列番号：４）、およびウシＧＰＢＰ配列（配列番号：６）を本明細書にて提供する。
【００１７】
本明細書で用いる「ＧＰＢＰΔ２６」なる用語は配列番号：１４に示す２６個のアミノ酸配列を削除したグッドパスチャー結合タンパク質を意味し、その単量体およびオリゴマーの両方を含む。ヒト（配列番号：８）、マウス（配列番号：１０）、およびウシＧＰＢＰ配列（配列番号：１２）を本明細書にて提供する。
【００１８】
本明細書で用いる「ＧＰＢＰｐｅｐ１」なる用語は配列番号：１４に示す２６個のアミノ酸ペプチドを意味し、その単量体およびオリゴマーの両方を含む。
【００１９】
本明細書で用いる用語「ＧＰ抗原」はＩＶ型コラーゲンのα３ＮＣ１ドメインを意味する。
【００２０】
本明細書で用いる「ＭＢＰ」はミエリン塩基性タンパク質を意味する。
【００２１】
一つの態様では、本発明はＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６、およびＧＰＢＰｐｅｐ１並びにその変異体またはフラグメントをコードする単離された核酸を提供する。一つの態様では、単離された核酸は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３もしくは配列番号：２５またはそのフラグメントと実質的に類似する配列を含む。
【００２２】
別の態様では、本発明はＧＰ抗原またはＭＢＰの代替生成物をコードする単離された核酸を提供する。一つの態様では、単離された核酸は配列番号：４３および配列番号：４４に実質的に類似するペプチドをコードする配列を含む。
【００２３】
本明細書で用いる「実質的に類似した」なる用語は、欠失、付加、または置換など（これらに限定するものではない）の、開示する配列からの保存または非保存変種の一つまたはそれ以上を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質のアミノ酸配列のヌクレオチドであって、得られた核酸および／またはアミノ酸配列は本明細書に開示する配列と機能的に同等であるヌクレオチド配列を意味する。機能的に同等な配列は実質的に同一の方法で機能して実質的に同一の本明細書に開示するタンパク質を製造する。例えば機能的に同等のＤＮＡは本明細書に開示するタンパク質と同一であるか、または一つまたはそれ以上の保存アミノ酸変種、例えば別の非極性残基に関して非極性残基の置換、もしくは荷電した残基に関しては同様に荷電した残基の置換体を有するタンパク質をコードする。これらの変化には当業者によりタンパク質の３次構造を実質的に変化しない置換体として認識されている変化などがある。
【００２４】
実際には、実質的に類似したなる用語は高ストリンジェンシーに対して中程度の条件下で互いにハイブリダイズする２個のタンパク質をコードするＤＮＡを意味し、同一のアミノ酸配列を有するか、またはその構造もしくは機能を変化しない配列における変化を有するタンパク質をコードする。本明細書で用いる実質的に類似したヌクレオチドまたはアミノ酸配列は少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、および最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を共有する。しかしながら、スプライシング変種として生じる前記のレベルの相同性以下であるタンパク質（およびかかるタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ）、または保存アミノ酸置換（または縮重コドンの置換）により改変されたものは本発明の範囲内であることを意図することは認識される。
【００２５】
本明細書で用いるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは核酸ハイブリッドが安定である条件を意味する。当業者に既知であるように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（ＴＭ）に反映する。配列相同性が１％減少する毎にＴＭはおよそ１から１．５℃低下する。概して、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の相関関係である。典型的には、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーション反応を行い、続いてより高度なストリンジェンシー条件に変化して洗浄する。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーに対する言及はかかる洗浄条件に関係する。このように本明細書で用いる中程度のストリンジェンシーとは０．１％  ＳＳＰＥ中３７℃または５５℃で安定したハイブリッドを形成するこれらの核酸配列がハイブリダイズできる条件を意味し、一方高度なストリンジェンシーとは０．１％  ＳＳＰＥ中６５℃で安定したハイブリッドを形成するこれらの核酸配列がハイブリダイズできる条件を意味する。これらの条件が種々のバッファーおよび温度を用いて繰り返すことができ、正確である必要はないことは理解されよう。デンハーツ溶液およびＳＳＰＥ（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９））はその他の適当なハイブリダイゼーションバッファーとして当業者に既知である。
【００２６】
単離された核酸配列は一つまたはそれ以上のイントロンを有するＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを含んでもよい。単離された配列はさらにポリＡ配列、改変コザック配列、およびエピトープタグをコードする配列、搬出シグナル、および分泌シグナル、核局在化シグナル、および原形質膜局在化シグナルなど（これらに限定するものではない）のコードされたタンパク質の発現および／または精製を促進するのに有用なさらなる配列を含んでもよい。
【００２７】
別の態様では、本発明はＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６またはＧＰＢＰｐｅｐ１、およびその変異体またはフラグメントを発現する核酸配列を含む組換え発現ベクターを提供する。一つの態様では、ベクターは配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３もしくは配列番号：２５に示す配列またはそのフラグメントと実質的に類似する核酸配列を含む。
【００２８】
別の態様では、本発明は配列番号：４３、配列番号：４４に示すアミノ酸配列またはそのペプチドフラグメントに実質的に類似するペプチドを発現する核酸配列を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００２９】
「組換え発現ベクター」には核酸コーディンング領域または遺伝子を遺伝子生成物の発現に影響できるいずれかのプロモーターに機能的に連結するベクターをなどがある。哺乳動物系において開示した核酸配列の発現を誘導するのに用いられるプロモーター配列は構成性（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦなどの種々のプロモーターのいずれかにより誘導されるが、これらに限定するものではない）かまたは誘導性（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性などの多くの誘導性プロモーターのいずれかにより誘導されるが、これらに限定するものではない）でよい。原核細胞をトランスフェクトするのに用いられる発現ベクターの構築はまた当業者に既知であり、従って標準的な技術により達成できる。（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９）；Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１０９−１２８頁、ザヒューマナプレスインコーポレーティッド、クリフトン、ニュージャージー州）、アンビオン１９９８年カタログ（アンビオン、オースチン、テキサス州を参照のこと）。
【００３０】
発現ベクターはエピソームとしてかまたは宿主染色体ＤＮＡに組み込むことにより宿主生物内で複製可能でなければならない。好ましい態様では、発現ベクターはプラスミドを含む。しかしながら、本発明は同等の機能を提供するその他の発現ベクター、例えばウイルスベクターを含むことを意図する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は本明細書に開示する組換え発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供し、ここで宿主細胞は原核細胞かまたは真核細胞でよい。細胞を一過性でまたは安定してトランスフェクトできる。当業者に既知のいずれかの技術、例えば標準細菌性形質転換、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、またはリポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介、ポリカチオン媒介またはウイルス媒介トランスフェクションにより（これらに限定するものではない）発現ベクターの原核および真核細胞へのトランスフェクションを達成できる。（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）、リスインコーポレーティッド、ニューヨーク、ニューヨーク州）を参照のこと。）
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は実質的に精製されたＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６およびＧＰＢＰｐｅｐ１並びにその変異体またはフラグメントを提供する。一つの態様では、実質的に精製されたタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４またはそのペプチドフラグメントに実質的に類似している。
【００３３】
別の態様では、本発明はＧＰ抗原およびＭＢＰの実質的に精製された代替生成物を提供する。一つの態様では、実質的に精製されたポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：４３、配列番号：４４またはそのペプチドフラグメントに実質的に類似している。
【００３４】
本明細書で用いる「実質的に精製された」なる用語はそのｉｎ  ｖｉｖｏ細胞環境から分離されているタンパク質を意味する。従って、タンパク質を天然供給源から精製できるか、または組換えタンパク質を前記で開示したトランスフェクトされた宿主細胞から精製できる。好ましい態様では、前記で開示したトランスフェクトされた細胞によりタンパク質を製造し、標準的な技術を用いて精製する。（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス）を参照のこと。）このように原核または真核生物供給源からタンパク質を精製できる。さらに好ましい種々の態様において、タンパク質を細菌、酵母または哺乳動物細胞から精製する。
【００３５】
タンパク質は、タンパク質の精製を促進するのに有用なさらなる配列、例えばエピトープタグおよび輸送シグナルを含んでもよい。かかるエピトープタグの例としては、ＦＬＡＧ（シグマケミカルズ、セントルイス、ミズーリー州）、ｍｙｃ（９Ｅ１０）（インビトロゲン；カールスバッド、カリフォルニア州）、６−Ｈｉｓ（インビトロゲン、ノバゲン、マジソン、ウィスコンシン州）およびＨＡ（ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ）などがあるが、これらに限定するものではない。かかる輸送シグナルの例としては搬出シグナル、分泌シグナル、核局在化シグナルおよび原形質膜局在化シグナルなどがあるが、これらに限定するものではない。
【００３６】
別の態様では、本発明はＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６またはＧＰＢＰｐｅｐ１に選択的に結合する抗体を提供する。一つの態様では、抗体は配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４またはそのペプチドフラグメントからなる群から選択される配列を含むタンパク質に選択的に結合する。宿主動物を完全ＧＰＢＰでか、またはその抗原性ペプチドで免疫することによりかかる抗体を製造できる。抗体はポリクローナル、またはモノクローナル抗体でよい。
【００３７】
別の態様では、本発明は配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５４またはその抗原性フラグメントからなる群から選択される配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドに選択的に結合する抗体を提供する。
【００３８】
既知の方法、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８８）に記載の方法により抗体を製造できる。一例を挙げると、最初の免疫の前に前免疫血清を収集する。実質的に精製した本発明のタンパク質またはその抗原性フラグメントを適当なアジュバントと共に、免疫応答を引き出すのに十分な量および間隔で動物に注射する。一定の間隔で、好ましくは週毎に動物を出血させ、抗体力価を決定する。１次免疫後動物にブースター注射をしてもしなくてもよい。各ブースター免疫後約７日に、または１回免疫後約毎週、動物を出血させ、血清を収集し、一定分量を約−２０℃で保存する。次いで動物から収集した血清を、ＧＰＢＰ関連タンパク質を含まない同一の発現系から製造した非抗原性関連タンパク質が結合するカラムに通すことにより、本発明のタンパク質およびペプチドに対するポリクローナル抗体を直接的に精製できる。
【００３９】
動物から脾臓細胞を得ることによりモノクローナル抗体を製造できる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照のこと）。一例では、近交系マウスを本発明のタンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性フラグメントで免疫することにより目的のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を製造する。腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）経路により、免疫応答を引き出すのに十分な量および間隔でマウスを免疫する。０日にマウスに１次免疫し、約３から約３０週休ませる。免疫したマウスに静脈内（ＩＶ）経路により１回またはそれ以上ブースター免疫する。当業者に既知の標準的な方法により免疫マウスから脾臓を除去することにより、抗体陽性マウスからリンパ球を入手する。安定したハイブリドーマを形成できる条件下で適当な融合パートナーと脾臓リンパ球を混合することによりハイブリドーマ細胞を製造する。抗体製造細胞および融合パートナー細胞をポリエチレングリコール中約３０％から約５０％の濃度で融合させる。当業者に既知の方法により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中成長させることにより融合したハイブリドーマを選別する。成長陽性ウェルから上澄液を収集し、固相イムノラジオアッセイのごときイムノアッセイにより抗体生成に関してスクリーニングする。ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天技術（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｅｒｓｏｎ編、アカデミックプレス（１９７３））のごとき技術により抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞をクローニングする。
【００４０】
かかる抗体応答を生じるために、典型的には本発明のタンパク質を医薬上許容される非経口投与用担体と共に処方する。かかる許容されるアジュバントにはフロイント完全、フロイント不完全、アルミニウム沈殿、コリネバクテリウムパルヴムおよびｔＲＮＡを含有する油中水乳剤などがあるが、これらに限定するものではない。ポリペプチドの濃度およびベヒクルおよびその他の構成成分の選択などのかかる組成物の処方は当業者の範囲内である。
【００４１】
本明細書で用いる抗体なる用語は本発明のタンパク質およびペプチドまたはそのフラグメントと選択的に反応するその抗体フラグメントを含むことを意図する。慣用的な技術を用いて抗体をフラグメント化することができ、そのフラグメントを抗体全体に関して前記したのと同一の方法で有用性に関してスクリーニングできる。例えば抗体をペプシン消化することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じることができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを反応させてジスルフィド結合を還元して、Ｆａｂ’フラグメントを作ることができる。
【００４２】
さらなる態様では本発明は、タンパク質サンプル中の本発明のタンパク質またはペプチドの存在を検出するための方法であって、スクリーニングするタンパク質サンプルを調製し、スクリーニングするタンパク質サンプルを本発明のタンパク質またはペプチドに対する抗体と接触させること、および抗体−抗原複合体の形成を検出することからなる方法を提供する。抗体は前記するポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかでよいが、モノクローナル抗体が好ましい。本明細書で用いる「タンパク質サンプル」なる用語は本発明のタンパク質またはペプチドおよびそのフラグメントを含有し得るいずれかのサンプルを意味し、組織およびその部分、組織切片、完全な細胞、細胞抽出物、精製または部分的に精製したタンパク質サンプル、体液、核酸発現ライブラリーなどがあるが、これらに限定するものではない。従って、本発明のこの態様を用いて、標準的な技術、例えば免疫局在化、免疫蛍光分析、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡおよび核酸発現ライブラリースクリーニングなど（これらに限定するものではない）によりこれらの種々タンパク質サンプル中のＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６、ＧＰＢＰｐｅｐ１、またはＧＰ抗原の代替生成物の存在に関して試験できる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと）。一つの具体例では、その技術により目的のタンパク質またはペプチドの存在または不在のみを決定できる。別法として、その技術により定量し、サンプル中の目的のタンパク質またはペプチドの相対量についての情報を提供できる。定量目的ではＥＬＩＳＡが好ましい。
【００４３】
標準的な検出技術により本発明のタンパク質もしくはペプチド、またはそのフラグメントおよびその抗体またはそのフラグメント間の免疫複合体形成を検出できる。例えば標識抗体または２次抗体を用いることにより免疫複合体を検出できる。標識の選択などのかかる方法は当業者に既知である。（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前記で引用）。別法として、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を検出可能な物質に結合できる。用語「結合した」は検出可能な物質が物理的に抗体に連結しているという意味で用いる。適当な検出可能な物質には種々酵素、補欠分子団、蛍光性物質、発光性物質、および放射性物質などがある。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどがある。適当な補欠分子団複合体の例としてはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどがある。適当な蛍光性物質の例としてはアンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンなどがある。発光性物質の例としてはルミノールなどがある。適当な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈなどがある。
【００４４】
かかる検出方法は種々の目的で有用であり、自己免疫状態の検出、標的とされるまたはアポトーシスが起こっている細胞の同定、組織サンプル中の目的のタンパク質の免疫局在化、ウェスタンブロット分析、関連タンパク質を見出すための発現ライブラリーのスクリーニングなどがあるが、これらに限定するものではない。
【００４５】
さらに別の態様では、本発明はサンプル中のＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６、ＧＰＢＰｐｅｐ１、またはＧＰ抗原の代替生成物をコードする核酸配列の存在を検出する方法であって、スクリーニングする核酸サンプルを調製し、サンプルを本発明の単離された核酸配列またはそのフラグメントから誘導した核酸プローブと接触させること、および複合体形成を検出することからなる方法を提供する。
【００４６】
本明細書で用いる用語「サンプル」はＧＰＢＰ関連核酸を含有し得るいずれかのサンプルを意味し、組織およびその一部、組織切片、完全な細胞、細胞抽出物、精製または部分的に精製した核酸サンプル、ＤＮＡライブラリー、並びに体液などがあるが、これらに限定するものではない。従って、本発明のこの態様を用いて、切片上ハイブリッド形成法、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ＤＮＡライブラリースクリーニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）など（これらに限定するものではない）の標準的な技術により、これらの種々サンプル中のＧＰＢＰ  ｍＲＮＡまたはＤＮＡの存在に関して試験できる。（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。）一つの具体例では、この技術により目的の核酸の存在または不在のみを決定できる。別法として、この技術により定量でき、サンプル中の目的の核酸の相対量に関する情報を提供できる。定量目的では、定量用ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲが好ましい。従って、一例では、ＲＮＡをサンプルから単離し、目的の核酸配列から誘導したオリゴヌクレオチドと接触させ、逆転写酵素と共に適当なバッファーおよび温度条件下でＧＰＢＰ関連ＲＮＡからｃＤＮＡを製造する。次いでｃＤＮＡを目的の核酸配列から誘導したプライマー対を用いるＰＣＲに供する。好ましい態様では、配列番号：５のＲＮＡ発現生成物の存在を検出するようにプライマーを設計し、サンプル中のＧＰＢＰ遺伝子発現の量を対照サンプルのレベルと比較する。
【００４７】
目的の核酸配列を検出するために、標準的な標識技術を用いてプローブ、目的の核酸、またはプローブおよび目的の核酸間の複合体を標識でき、その標識技術には放射性、酵素、化学ルミネサンスまたはアビジンもしくはビオチン標識技術などがあるが、これらに限定するものではなく、これらは全て当業者に既知である。（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編（１９９１）、アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア州）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、（１９９０）、アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア州）を参照のこと。）
【００４８】
かかる核酸検出法は自己免疫状態の診断、標的になるまたはアポトーシスが行われている細胞の同定、切片上ハイブリッド形成法、ノーザンおよびサザンブロット分析およびＤＮＡライブラリースクリーニングなど（これらに限定するものではない）の種々の目的に有用である。
【００４９】
以下の実施例で示すように、ＧＰＢＰは天然発生自己免疫応答において一般に標的とされる組織構造で優先的に発現することが示され、グッドパスチャー症候群（ＧＰ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および扁平苔癬など（これらに限定するものではない）のいくつかの自己免疫状態において高度に発現する。さらに、後記する類似の実験研究法に従ってＧＰ病（α３ＩＶ型コラーゲン）、ＳＬＥ（Ｐ１リボソームリンタンパク質およびＳｍ−Ｄ１小型核リボヌクレオタンパク質）および皮膚筋炎（ヒスチジル−ｔＲＮＡシンターゼ）の自己抗原を表する組換えタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＰＢＰの基質であることが示された。
【００５０】
このように、好ましい態様では、ＧＰＢＰ発現の検出を用いて自己免疫状態を検出する。ＧＰＢＰ発現に関して、試験しているサンプルを対照サンプルと比較し、ここでＧＰＢＰ発現レベルの上昇は自己免疫状態の存在を示す。この具体例では、これはＧＰＢＰには存在するが、ＧＰＢＰΔ２６には存在しないＧＰＢＰｐｒｅｐ１に選択的に結合する抗体を用いるのが好ましい。
【００５１】
さらに、添付の実施例に示すように、ＧＰＢＰは腫瘍の培養細胞株において下方制御され、データはＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６がアポトーシスを誘起する細胞シグナル発生経路に関与している可能性があり、これは自己免疫の病理発生過程において上方制御され、腫瘍成長中に形質転換された細胞を攻撃する自己免疫攻撃を防御するために細胞を形質転換中には下方制御される。このように、本明細書に開示する検出方法を用いて標的化されたまたはアポトーシスが行われている細胞を検出することができる。
【００５２】
別の態様では、本発明は自己免疫障害、腫瘍、を処置する、またはＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６もしくはＧＰＢＰｐｅｐ１に実質的に類似するポリペプチドを含むタンパク質の発現または活性を改変することからなる細胞アポトーシスを防御する必要のある患者においてかかる処置または防御をするための方法を提供する。ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６もしくはＧＰＢＰｐｅｐ１に実質的に類似するポリペプチドを含むタンパク質の発現または活性を改変することは、ＧＰＢＰ発現もしくは活性の特異的誘発因子もしくは阻害因子、ＧＰＢＰ抗体、ＧＰもしくはミエリン塩基性タンパク質代替生成物を用いる遺伝子もしくはタンパク質治療、ＧＰもしくはミエリン塩基性タンパク質代替生成物を発現する宿主細胞を用いる細胞治療、または当業者に既知のその他の技術を用いて達成できる。好ましい具体例では、方法はさらにＧＰ抗原またはＭＢＰの、実質的に精製された代替生成物を投与し、ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６もしくはＧＰＢＰｐｅｐ１に実質的に類似するポリペプチドを含むタンパク質の発現または活性を改変することを含む。本明細書で用いる「発現または活性を改変すること」とはＲＮＡまたはタンパク質生成物のいずれかの発現または活性を改変することを意味する。
【００５３】
別の態様では、本発明はＧＰＢＰ  ＲＮＡまたはタンパク質の発現または活性を改変するための、実質的に精製された有効量のＧＰ抗原またはＭＢＰの代替生成物および医薬上許容される担体を含む医薬用組成物を提供する。
【００５４】
投与用に、活性物質を通常指示された投与経路に適当な一つまたはそれ以上のアジュバントと組み合わせる。化合物をラクトース、スクロース、デンプン粉、アルカノン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリビニルアルコールと混合でき、慣用される投与用に錠剤化またはカプセル化できる。別法として、本発明の化合物を生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、落花生油、綿実油、ゴマ油、トラガントゴム、および／またはその他のバッファーに溶解できる。その他のアジュバントおよび投与様式は医薬の分野で既知である。担体または希釈剤には遅延物質、例えばモノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル単独もしくはワックスと共に、または当業者に既知のその他の物質などがある。
【００５５】
本発明は説明のみを目的とする添付の実施例を参考としてよりよく理解されるであろうが、本明細書に添付の特許請求の範囲で定義するように本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。
【００５６】
（実施例１：ＧＰＢＰの特徴づけ）
ここでヒトＧＰ抗原の独特のＮ末端領域に特異的に結合し、リン酸化する新規の型のセリン／スレオニンキナーゼのクローニングおよび特徴づけについて報告する。
【００５７】
材料および方法
合成重合体−ペプチド。ヒトＧＰ抗原の３から２３残基を表すＧＰｐｅｐ１、ＫＧＫＲＧＤＳＧＳＰＡＴＷＴＴＲＧＦＶＦＴ（配列番号：２６）、およびＳｅｒ９からＡｌａ９へのその変異体であるＧＰｐｅｐ１Ａｌａ９ＫＧＫＲＧＤＡＧＳＰＡＴＷＴＴＲＧＦＶＦＴ（配列番号：２７）をメッドプローブおよびチロンＦＬＡＧペプチド（シグマより入手）により合成された。
【００５８】
オリゴヌクレオチド。以下は、いくつかのその他のＧＰＢＰ特異的オリゴヌクレオチドと同様、ゲノシスおよびＧＩＢＣＯ−ＢＲＬにより合成された：
ＯＮ−ＧＰＢＰ−５４ｍ：
ＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＴＡＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ（配列番号：２８）
ＯＮ−ＧＰＢＰ−５５ｃ：
ＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＴＴＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号：２９）
ＯＮ−ＨＮＣ−Ｂ−Ｎ−１４ｍ：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡＴＧＧ（配列番号：３０）
ＯＮ−ＨＮＣ−Ｂ−Ｎ−１６ｃ：ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＡＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＣＴＧＴ（配列番号：３１）
【００５９】
ヒトＧＰＢＰをコードするｃＤＮＡクローンの単離および特徴づけ−いくつかのヒトλ−ｇｔ１１  ｃＤＮＡ発現ライブラリー（眼、胎児および成人肺、腎臓およびＨｅＬａ  Ｓ３、クロンテックより）をＧＰｐｅｐ１と相互作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡに関してプローブする。標準的な免疫スクリーニング法に従って調製したニトロセルロースフィルター（ミリポア）を遮断し、ＧＰｐｅｐ１  ｍｌあたり１から１０ナノモルと共に３７℃でインキュベートした。特異的に結合したＧＰｐｅｐ１をＭ３／１Ａモノクローナル抗体を用いて検出した（７）。ＨｅＬａ誘導ライブラリーで１個のクローンを同定した（ＨｅＬａ１）。融合タンパク質結合の特異性を組換え真核ヒトＧＰ抗原への類似の結合により確認した。ＨｅＬａ１（０．５ｋｂ）のＥｃｏＲＩ  ｃＤＮＡインサートを用いて同一のライブラリーをさらにスクリーニングし、重複ｃＤＮＡを単離した。ＨｅＬａ１（ｎ４’）の全ｃＤＮＡを含有する最大のｃＤＮＡ（２．４ｋｂ）全長を配列決定した。
【００６０】
ノーザンおよびサザンブロット−製造者の指示書に従って、予め作成したノーザンおよびサザンブロット（クロンテック）をＨｅＬａ１  ｃＤＮＡでプローブした。
【００６１】
組換えタンパク質のプラスミド構築、発現および精製−ＧＰＢＰ誘導した物質。元来のλ−ｇｔ１１  ＨｅＬａ１クローンを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｙ１０８９中溶原として発現した（８）。ＡＰＴＧアガロースカラム（ベーリンガー）を用いて、細胞可溶化液からＧＰＢＰのＮ末端１５０残基を含有する対応するβガラクトシダーゼ誘導融合タンパク質を精製した。ｎ４’のＥｃｏＲＩ  ２．４ｋｂフラグメントをブルースクリプトＭ１３＋ベクター（ストラッタジーン）（ＢＳ−ｎ４’）中サブクローニングし、増幅し、続いてクローニングに使用した。ＥｃｏＲＩ制限部位、翻訳開始のための標準コザックコンセンサス、タグペプチド配列をコードする領域（ＦＬＡＧ、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：３２））、および予測ＭｅｔｉおよびＢａｎ  ＩＩ制限部位を含むＧＰＢＰの最初の１１個の残基をコードする配列、（５’から３’で）含有するＤＮＡフラグメントをＯＮ−ＧＰＢＰ−５４ｍおよびＯＮ−ＧＰＢＰ−５５ｃをハイブリダイズし、修飾Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（アマシャム）で伸長することにより得た。得られたＤＮＡ生成物をＥｃｏＲＩおよびＢａｎＩＩで消化し、ｐＨＩＬ−Ｄ２（インビトロゲン）のＥｃｏＲＩ部位におけるＢＳ−ｎ４’のＢａｎＩＩ／ＥｃｏＲＩ  ｃＤＮＡフラグメントとライゲートし、ｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’を製造した。このプラスミドを用いてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５株のＭｕｔ５形質転換体を得、慣用的な液体培養かまたは発酵法（Ｐｉｃｈｉａ発現キット、インビトロゲン）のいずれかによりＦＬＡＧタグ化組換えＧＰＢＰ（ｒＧＰＢＰ）を発現した。細胞可溶化液を抗ＦＬＡＧ  Ｍ２カラム（シグマ）に負荷し、非結合性物質をトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）または塩を補充したＴＢＳ（２Ｍ  ＮａＣｌまで）で洗い出し、組換え物質をＦＬＡＧペプチドと共に溶出した。培養ヒト腎臓誘導２９３細胞（ＡＴＣＣ１５７３−ＣＲＬ）中に発現するために、ＢＳ−ｎ４’またはｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’のいずれかの２．４または２．０ｋｂＥｃｏＲＩ  ｃＤＮＡインサートをｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）にサブクローニングし、ｐｃ−ｎ４’およびｐｃ−ＦＬＡＧ−ｎ４’を各々製造した。一過性の発現のために用いる場合、トランスフェクションの８時間後、可溶化液を各々ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるのかまたはＦＬＡＧ精製に用いるのかに依存して０．１％  ＳＤＳ含有または不含で、３．５から４μｌ／ｃｍ２の冷却溶解バッファー（ＴＢＳ中１％  ノニデットＰ−４０またはトリトンＸ１００、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を用いて細胞を溶解した。ＦＬＡＧ精製用には、６個に対して４個の１７５ｃｍ２培養皿の可溶化液を溶解バッファーで５０ｍｌまで希釈し、前記のように精製した。安定発現用には、ｐｃ−ｎ４’で細胞を同様にトランスフェクトし、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８で３週間選別した。細菌組換え発現用には、ｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’の２．０ｋｂＥｃｏＲＩ  ｃＤＮＡフラグメントをｐＧＥＸ−５ｘ−１（ファルマシア）のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード化ｃＤＮＡの下流でフレーム内クローニングした。得��らた構築物を用いてＤＨ５α細胞中にＧＳＴ−ＧＰＢＰ融合タンパク質を発現した（９）。
【００６２】
ＧＰ抗原誘導物質。ＯＮ−ＨＮＣ−Ｂ−Ｎ−１４ｍとＯＮ−ＨＮＣ−Ｂ−Ｎ−１６ｃの間でα３特異的ｃＤＮＡを含有するｐＲｃ／ＣＭＶ−ＢＭ４０発現ベクターを用いて２９３細胞中にヒト組換えＧＰ抗原（ｒＧＰ）を生成した。発現ベクターは、Ｂｉｌｌｙ  Ｇ．Ｈｕｄｓｏｎ（カンサス大学医療センター）により提供された、開始Ｍｅｔ、タグペプチド配列（ＦＬＡＧ）に続くＢＭ４０シグナルペプチドおよびポリリンカークローニング部位をコードするｃＤＮＡを含有するｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン）誘導ベクターである。α３特異的ｃＤＮＡを得るために、前記のオリゴヌクレオチドおよび鋳型（クローンＣ２）として前記で報告したα３（ＩＶ）ｃＤＮＡ配列（３）を含有するプラスミドを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施した。ｒＧＰの安定発現のために２９３細胞を得られた構築物（ｆα３ＶＬＣ）でトランスフェクトし、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選別した。回収したｒＧＰを抗ＦＬＡＧ  Ｍ２カラムを用いて精製した。
【００６３】
全ての構築物を制限マッピングおよびヌクレオチド配列決定により確認した。
【００６４】
細胞培養およびＤＮＡトランスフェクション−ヒト２９３細胞を１０％  ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。プロフェクション哺乳類トランスフェクションシステム（プロメガ）のリン酸カルシウム沈殿法を用いてトランスフェクションを実施した。Ｇ４１８に対する抵抗性により安定してトランスフェクトされた細胞を選別した。生存細胞群の中心部分を単離し、クローン化しおよび増幅した。
【００６５】
抗体生成−ＧＰＢＰのＮ末端領域に対するポリクローナル抗体。溶原としてとしてＨｅＬａ１λ−ｇｔ１１を発現する細胞をラエムリサンプルバッファーの存在下で超音波処理により溶解し、７．５％のアクリルアミド調製用ゲル中電気泳動に供した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、目的の融合タンパク質を含有するバンドを切除し、ウサギ免疫に用いた（１０）。ＡＰＴＧアフィニティ精製抗原を用いて反応性に関して抗血清を試験した。アフィニティ精製抗体を得るために、抗血清をＴＢＳで１：５に希釈し、共有結合したアフィニティ精製抗原を含有するセファロース４Ｂカラムに負荷した。結合物質を溶出し、特記しない場合、免疫化学研究に用いた。
【００６６】
ＧＰＢＰに対するモノクローナル抗体。基本的には前記のように（７）ＧＳＴ−ＧＰＢＰを用いてモノクローナル抗体を製造した。ｒＧＰＢＰに対する抗体に関して個々のクローンの上澄を分析した。
【００６７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイ−タンパク質基質０．５から１μｇまたは合成ペプチド１０ナノモルの存在下または不在下、２５ｍＭ  βグリセロホスフェート（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１３２μＭ  γ−３２Ｐ−ＡＴＰ中、全量５０μｌでｒＧＰＢＰ約２００ｎｇを３０℃で一晩インキュベートした。
【００６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏリン酸化アッセイ−２４ウェル皿の個々のウェルに、正常のまたは安定にｐｃ−ｎ４’トランスフェクトした２９３細胞を播種した。細胞が望ましい密度に成長したとき、正常２９３細胞の多くのウェルをｐｃ−ＦＬＡＧ−ｎ４’でトランスフェクトした。１２時間後、培養培地を除去し、リン酸不含ＤＭＥＭ１００μｌ中２０μＣｉ／ウェルのＨ３３２ＰＯ４を加え、４時間インキュベーションを続けた。１％  トリトンＸ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５０ｍＭ  ＮａＦおよび０．２ｍＭ  バナジン酸塩を含有するＴＢＳ  ３００μｌ／ウェルで細胞を溶解し、特異的抗体およびプロテインＡ−セファロースで抽出した。抗ＧＰＢＰ血清を用いた場合、前免疫血清およびプロテインＡ−セファロースを用いて可溶化液を予め清澄化した。
【００６９】
ｒＧＰＢＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱リン酸化−１０ｍＭ  酢酸トリス（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  酢酸マグネシウムおよび５０ｍＭ  酢酸カリウム１００μｌ中ｒＧＰＢＰ１μｇを０．８５単位のウシ腸管アルカリ性ホスファターゼ（ファルマシア）で３０℃で３０分間脱リン酸化した。
【００７０】
再生アッセイ−前記するようにｒＧＰＢＰ１から５μｇを用いてインブロット再生アッセイを実施した（１１）。
【００７１】
ヌクレオチド配列分析−［α］３５Ｓ−ｄＡＴＰ、修飾Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（アマシャム）およびユニバーサルまたはＧＰＢＰ特異的プライマーを用いてジデオキシ鎖終止法によりｃＤＮＡ配列分析を実施した（８から１０）。
【００７２】
３２Ｐホスホアミノ酸分析−免疫精製したｒＧＰＢＰまたは目的の物質を含有するそのＨＰＬＣゲル濾過分画をリン酸化し、加水分解し、１次元（４）または２次元薄層クロマトグラフィ（１２）で分析した。２次元分析を実施する場合、第１の次元のためのバッファーは葉酸：酢酸：水（１：３．１：３５．９）（ｐＨ１．９）であり、第２の次元のためのバッファーは酢酸：ピリジン：水（２：０．２：３７．８）（ｐＨ３．５）であった。アミノ酸をニンヒドリンで現し、３２Ｐホスホアミノ酸をオートラジオグラフィにより現した。
【００７３】
物理学的方法および免疫化学技術−（４）のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを実施した。ＡＢＣペルオキシダーゼ法を用いて、ヒト多重組織対照スライド（バイオメディア、バイオジェネックス）で免疫化学研究を行った（１３）。
【００７４】
コンピューター分析−相同性はＮＣＢＩサーバーでＢＬＡＳＴ２．０（１４）を用いてジーンバンクおよびスイスプロットデータベースに対して、およびゲノミックリサーチサーバーのためのインスティテュートを用いて発現配列タグに関してＴＩＧＲヒューマンジーンインデックスデータベースに対して検索した。スイスインスティテュートオブバイオインフォーマティックスでプロフィールスキャンプログラムを用いて、機能的なパターンおよびプロフィールに関する検索をＰＲＯＳＩＴＥデータベースに対して行った（１５）。２１および２８の両方の残基のウィンドウを有するプログラムコイル（１６）を用いて実験的癌研究に関してスイスインスティテュートで高次コイル構造の予測を行った。
【００７５】
結果
ＧＰＢＰの分子クローニング−ヒトＧＰ抗原の分岐したＮ末端領域と特異的に相互作用するタンパク質を検索するために、この領域および隣接配列を包含する２１残基ペプチド（ＧＰｐｅｐ１；配列番号：２６）、並びにそれに対する特異的モノクローナル抗体を組み合わせていくつかのヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングした。５ｘ１０６以上のファージをスクリーニングし、抗体結合を妨害せずにＧＰｐｅｐ１と特異的に相互作用する融合タンパク質をコードする単一のＨｅＬａ誘導組換え体を同定した。
【００７６】
元来のクローンのｃＤＮＡインサート（ＨｅＬａ１）を用いて５’非翻訳配列の４０８ｂｐ、６２４残基をコードする１８７２ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および３’非翻訳配列の１０９ｂｐを含有する２．４ｋｂ  ｃＤＮＡ（ｎ４’）を単離した（図１）（配列番号：１から２）。その他の構造的特徴が興味深い。第１に予測されるポリペプチド（本明細書で以後ＧＰＢＰと称する）は多くのリン酸化可能な（１７．９％）および酸性（１６％）残基を有し、配列に沿って偏って分布している。最も豊富にある残基である（９．３％）セリンはタンパク質の２個の短い領域に偏好性を示し、これは残りのポリペプチド鎖全体で平均７％以下であるのに比較して、ここではアミノ酸のほぼ４０％からなる。Ｎ末端の、よりセリンに富む領域は主にＳｅｒ−Ｘａａ−Ｙａａ反復を含むことも注目に値する。酸性残基はポリペプチドのＮ末端の４分の３に優先的に位置し、ほとんど１８％の残基が酸性である。これらの残基は最大のポリペプチドのＣ末端の４分の１で９％しか現れず、２個の電気的に対立するドメインを有するポリペプチド鎖になる。Ｎ末端ではポリペプチドはプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインを含有し、これは生物学的活性を呈する細胞膜への多くのシグナル発生タンパク質の補給を意味している（１７）。最終的に、２分した核標的化配列（１８）は高次コイルを形成する全ての構造的要件に全て合致する７個の反復領域の必須部分として存在する（１６）。
【００７７】
タンパク質データバンク検索によりＰＨドメインを有するＮ末端でおよそ１００個の残基内に相同性がほとんど独占されていることが示された。オキシステロール結合タンパク質のＰＨドメインが最も類似しており、ＧＰＢＰとの全体の同一性が３３．５％および類似性が６５．２％である。加えて、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（線虫）コスミドＦ２５Ｈ２（信託番号Ｑ９３５６９）はタンパク質全配列を通して全体の同一性が２６．５％および類似性が６１％を示す仮定ＯＲＦを含有し、これは類似のタンパク質が下等の無脊椎動物に存在することを示している。いくつかのヒト発現配列タグ（信託番号ＡＡ２８７８７８、ＡＡ２８７５６１、ＡＡ３０７４３１、ＡＡ３３１６１８、ＡＡ０４０１３４、ＡＡ１５８６１８、ＡＡ０４００８７、ＡＡ１２２２２６、ＡＡ１５８６１７、ＡＡ１２１１０４、ＡＡ４１２４３２、ＡＡ４１２４３３、ＡＡ２８２６７９、およびＮ２７５７８）は対応するＧＰＢＰ  ｃＤＮＡの枝分かれを有する高度な配列同一性（９８％以上）を有し、これらがヒトＧＰＢＰに相当することを示唆している。興味深いことに、ＡＡ２８７８７８ＥＳＴはＧＰＢＰ５’非翻訳領域に対応する配列内で６７個のヌクレオチドのギャップを示し、これはＧＰＢＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡが別法としてヒト組織においてスプライシングされることを示唆している（図示せず）。
【００７８】
ヒト組織におけるＧＰＢＰ遺伝子の分布および発現を最初にノーザンブロット分析により評価した（図２、パネルＡ）。遺伝子は４．４ｋｂおよび７．５ｋｂの長さの間で２個の主要なｍＲＮＡ種として、およびより短い少数のその他の種として発現される。これらの複数のｍＲＮＡ種間の構造上の関係は解っておらず、その相関的な発現は組織間で変化する。最も高い発現レベルは横紋筋（骨格および心臓の筋肉）に見られ、肺および肝臓では発現レベルは最も低いことが示される。
【００７９】
異なる種からのゲノムＤＮＡのサザンブロット研究分析により、相同性遺伝子は系統発生を通して存在することが示された（図２、パネルＢ）。ヒト由来のプローブに合致するように、ゲノムＤＮＡの起源として累進的に減少するハイブリダイゼーション強度は、進化においてヒトから排除された。
【００８０】
翻訳開始部位の実験的決定−予測ＯＲＦを実験的に確認するために、ｎ４’のｃＤＮＡの２．４ｋｂか、またはＦＬＡＧ配列でタグ化された予測ＯＲＦ（図３Ａ）のみを含有する真核発現ベクターを２９３細胞における一過性発現に使用した。ＧＰＢＰまたはＦＬＡＧ特異的抗体を用いて免疫ブロットにより対応する抽出物を分析した。ＧＰＢ特異的抗体は両方のトランスフェクトされた細胞において類似の主要ポリペプチドに結合するが、操作された構築物により製造されるポリペプチドのみがＦＬＡＧ配列を発現した（図３Ｂ）。これは予測Ｍｅｔでｎ４’  ｃＤＮＡの翻訳開始部位に位置し、提示された１次構造を確認した。さらに、組換えポリペプチドは予測された分子量よりも高い分子量を示し（８０対７１ｋＤａ）、これはＧＰＢＰが翻訳後修飾されていることを示唆している。
【００８１】
酵母ｒＧＰＢＰの発現および特徴づけ−酵母発現およびＦＬＡＧ基盤のアフィニティ精製を組み合わせてｒＧＰＢＰを製造した（図４Ａ）。低Ｍｒを示す複数の関連生成物と共に、〜８９ｋＤａの主要なポリペプチドが得られた。抗ＦＬＡＧおよびＧＰＢＰ特異的抗体の両方により組換え物質が認識され、発現系の適合性が保証された。しかしながら、再度主要生成物により示されたＭｒが予測されたＭｒよりも著明に高く、２９３細胞由来の組換え物質のＭｒよりも高く、ＧＰＢＰが重要な区別される翻訳後修飾を受けているという考えが支持された。ポリペプチド鎖にはリン酸化可能な残基が豊富であるので、組換え物質におけるホスホアミノ酸の存在を調べた。ホスホセリン（Ｐｓｅｒ）、ホスホスレオニン（ＰＴｈｒ）およびホスホチロシン（ＰＴｙｒ）に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いることにより（図示せず）、酵母ｒＧＰＢＰ（図４Ｂ）または２９３細胞由来物質（図示せず）のいずれかの三つの全てのリン酸残基の存在を同定した。さらに５から１０ｍＭの対応するホスホアミノ酸の添加によりその結合を部分的に阻止することにより抗体の特異性を評価した（図示せず）。これはリン酸残基含量が細胞発現系に依存して変化し、Ｍｒの差は主にリン酸化によるものであることを示唆している。脱リン酸化酵母誘導物質は一貫して２９３細胞に由来する物質に類似のＭｒを示し、ホスホアミノ酸含量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動性に相関する（図４Ｃ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ測定のように、２９３細胞におけるｒＧＰＢＰのリン酸化を評価した（図４Ｄ）。対照細胞（レーン１）および安定した（レーン２）または一過性（レーン３）様式のｒＧＰＢＰ発現細胞をＨ３３２ＰＯ４の存在下培養した。する免疫沈澱組換え物質は３２Ｐを含有し、これはｉｎ  ｖｉｖｏでＧＰＢＰのリン酸化を生じ、従ってこれは物理学的過程である可能性があることを示した。
【００８２】
ｒＧＰＢＰはヒトＧＰ抗原のＮ末端領域をリン酸化するセリン／スレオニンキナーゼ−ＧＰＢＰはプロテインキナーゼの古典的な触媒ドメインを定義するのに必要な保存構造を含有しないが、新規非保存プロテインキナーゼ（１９から２７）の最近の同定および特徴づけによりそのリン酸化活性の研究が促進された。Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋の存在下［γ３２Ｐ］ＡＴＰをｒＧＰＢＰ（酵母または２９３細胞（図示せず）のいずれかに由来）に添加した結果、抗ＦＬＡＧおよび特異的抗体の両方により認識される主要なおよび関連する生成物においてＰＳｅｒおよびＰＴｈｒとして３２Ｐが組み込まれ（図５ＡおよびＢ）、これはアフィニティ精製物質がＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼを含有することを示した。この活性をさらに特徴づけするために、ＧＰｐｅｐ１，ＧＰｐｅｐ１Ａｌａ９（Ｓｅｒ９がＡｌａで置換されたＧＰｐｅｐ１変異体）、元来のおよび組換えヒトＧＰ抗原、並びに元来のウシＧＰ抗原を検定した（図５Ｃ）。アフィニティ精製ｒＧＰＢＰは異なった程度で全てのヒト由来物質をリン酸化した。しかしながら、類似の条件でウシ由来基質において測定可能な３２Ｐ組み込みは観察されなかった。ＧＰｐｅｐ１に比較した場合、ＧＰｐｅｐ１Ａｌａ９により示された３２Ｐ組み込みは低度であり、ウシ抗原のリン酸化は欠如し、これはｒＧＰＢＰに存在するキナーゼがヒトおよびウシ抗原を認識し、Ｓｅｒ９がキナーゼの標的であることを示している。
【００８３】
精製系により高品質の物質が提供されるが、プロテインキナーゼ活性と共に夾雑物が存在することは排除できない。夾雑物の存在はまたＦＬＡＧ含有４０ｋＤａポリペプチドの存在によっても示唆され、これはリン酸化アッセイにおいて特異的抗体または３２Ｐの組み込みのいずれとも反応性を示さなかった（図４Ａおよび５Ａ）。プロテインキナーゼ活性を留めるポリペプチドを正確に同定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットの後ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ再生アッセイを実施した（図６）。我々は特異的抗体の使用（レーン１）および切片上３２Ｐ組み込みのオートラジオグラフィによる検出（レーン２）を組み合わせるのに成功し、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ活性を留める１次ポリペプチドとして８９ｋＤａのｒＧＰＢＰ物質を同定した。ｒＧＰＢＰ由来生成物および４０ｋＤａ夾雑物において３２Ｐ組み込みが欠如しているということはさらに再生アッセイの特異性を支持し、キナーゼ活性が８９ｋＤａポリペプチドに存在することを確認する。最近、ポリペプチドに親密に関連するプロテインキナーゼの痕跡がブロット膜から遊離され、標識ステップにおいてポリペプチドに結合し、リン酸化できることが示された（２８）。我々の系においてこの可能性を評価するために、８９ｋＤａのポリペプチドを含有する膜小片を単独でかまたはブロットレーンの別の領域を表す膜片と一緒に用いて復元実験を行った。同時にインキュベートした小片に関わらず（図示せず）、８９ｋＤａポリペプチドで類似の３２Ｐ組み込みが観察され、これは我々のサンプルにおいて同時に精製されたプロテインキナーゼがある場合、これらが同時移動しない限り、これらは再生アッセイにおいて８９ｋＤａポリペプチドをリン酸化していないことを示している。同時移動が関係しないと考えられるが、しかしながら、異なる移動性を示すｒＧＰＢＰ欠損変異体（ＧＰＢＰΔ２６およびＲ３；以下を参照のこと）もまたキナーゼ活性を有し、インブロットで同様に復元され得る（図示せず）。
【００８４】
新規キナーゼの免疫組織化学的局在−ヒト組織におけるＧＰＢＰ発現を研究するために、特異的ポリクローナル（図７）またはモノクローナル抗体（図示せず）を用いて免疫組織化学実験を行った。ＧＰＢＰはヒト組織において広範に発現するが、それは組織および細胞特異性を示す。腎臓では主に細管上皮細胞および糸球体メサンギウム細胞および有足細胞に見出される。肺胞では抗体は肺細胞の染色に加えて基底膜局在化を示唆する直線的パターンを表す。肝臓は柔組織においては低発現を示すが、胆管では高発現を示す。中枢神経系における発現は白質で観察されるが、脳のニューロンでは観察されない。精巣では精原細胞において高発現し、対照的にセルトリ細胞においては発現しない。副腎では髄質に対して皮質細胞において高レベル発現を示す。膵臓では、ＧＰＢＰは外分泌部分に対してランゲルハンス島で優先的に発現される。前立腺では、ＧＰＢＰは上皮細胞で発現されるが、間質細胞においては発現されない（図７）。その他の場所では、ＧＰＢＰは横紋筋、腸管上皮細胞、および小脳のプルキンエ細胞で高発現される（図示せず）。概してＧＰＢＰを高発現する組織では染色パターンは主に細胞基質に拡散している。しかしながら、特定の場所では、加えて核（精原細胞）で、細胞質膜（肺細胞、肝細胞、前立腺上皮細胞、白質）で、または細胞外マトリックス（肺胞）で重要な染色増強がある（図７）。
【００８５】
考察
我々のデータはＧＰＢＰが新規で、非保存セリン／スレオニンキナーゼであることを示している。我々はまたＧＰＢＰがヒトおよびウシＧＰ抗原を認識し、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＧＰ抗原のリン酸化可能な領域を標的化することを明らかにした。いくつかの証拠のラインが、８９ｋＤａポリペプチドがアフィニティ精製ｒＧＰＢＰにおいて唯一のキナーゼであることを示している。第１に、我々は１５０ｍＭ、０．５Ｎ、１Ｍまたは２Ｍの塩の存在下で精製されたｒＧＰＢＰサンプル間で自己およびトランスリン酸化における差異を見出さず（データを示さず）、これはｒＧＰＢＰが親密な結合性キナーゼを担持しないことを示唆している。第２に、ＧＰＢＰ特異的抗体を用いて精製した物質がリン酸化において差異を示さないので（図示せず）、我々のサンプルではＦＬＡＧ含有、酵母誘導キナーゼがない。第３に欠失変異体（ＧＰＢＰΔ２６；以下を参照のこと）は自己およびトランスリン酸化活性を減じ（図示せず）、これは８９ｋＤａポリペプチドがリン酸移動を実施する能力を有するｒＧＰＢＰのほんの一部であることを示している。
【００８６】
ＧＰＢＰはその他の非保存性キナーゼと相同ではないが、Ｎ末端αへリックス高次コイル（２６、２７）、セリンに富むモチーフ（２４）、ホスホアミノ酸の高含量（２７）、２分裂した核局在化シグナル（２７）、および典型的なヌクレオチドまたはＡＴＰ結合モチーフの不在（２４、２７）などのいくつかの構造上の特徴を共有している。
【００８７】
免疫組織化学研究はＧＰＢＰが細胞基質性ポリペプチドであり、原形質膜に結合して核においても見出され、基底膜に結合して細胞外マトリックスに見出される可能性もあり、これはこれらの全方向に到達するための構造上の要件を有していることを示している。核局在シグナルおよびＰＨドメインはそれに各々核および細胞膜に到達する可能性を付与する（１７、２９、３０）。ＧＰＢＰは搬出される構造上の要件を有していないが、そのｍＲＮＡの５’末端非翻訳領域が初めにフレーム内に停止コドンを有する１３０残基の上流ＯＲＦを含む（図１）。単一の塩基対（Ｕ）を挿入するｍＲＮＡ編集過程が機能的なフレーム内出発部位および編集Ｍｅｔのすぐ下流に搬出シグナルを含有する７５４残基のＯＲＦを生じるのであろう（図示せず）。この仮説上の余剰配列の一部（ＰＲＳＡＲＣＱＡＲＲＲＲＧＧＲＴＳＳ（配列番号：３３））を示す合成ペプチドに対するポリクローナル抗体はヒト組織において直線的な血管反応性を示し、これは細胞外基底膜局在を示唆する（データは示さず）。
【００８８】
別法として、スプライシング現象により搬出のための構造上の要件を提供するさらなる未同定エキソンを有する転写物を生じることができた。複数の細胞局在、ＰＴｙｒの高含量、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏチロシンキナーゼ活性の欠損はＧＰＢＰ自体が特異的チロシンキナーゼの標的であり、従って、特異的シグナル発生カスケードに関与している可能性がある。
【００８９】
前記するように、特異的セリンリン酸化およびプレｍＲＮＡ代替スプライシングは、ＧＰ抗原、アセチルコリンレセプターおよびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）などのいくつかの自己抗原の生物学に関連している（４）。後者は多発性硬化症（ＭＳ）、免疫系が中枢神経系の白質を標的化するその他の排他的ヒト自己免疫疾患における主要な抗原であることが疑われる。ＧＰ病およびＭＳは同一のＨＬＡ  ＩＩクラスハロタイプ（ＨＬＡ  ＤＲＢ１＊１５０１）と強力な関連性を示すヒト障害である（３２、３３）。これは、このＨＬＡ特異性を担持するＭＳ患者のＧＰ病による死亡の最近の報告に加えて（３４）、これらのヒト障害における共通の発病原因が存在することを支持している。
【００９０】
特異的なセリンのリン酸化が細胞内タンパク質溶解を変化させることが示されている（３５から４０）。考えられることは、タンパク質リン酸化における変化はプロセシングおよびペプチド展示に影響し、従って自己免疫を媒介する。ＨＬＡ−ＤＲ１５によるＧＰ抗原誘導ペプチド展示は、相対的に乱雑なＤＲ１５分子の優先性よりもプロセシングにより依存し（４１）、これはプロセシングが異常なリン酸化により影響される場合、得られるペプチドはこのＨＬＡにより提示されることを示唆している。我々の最近のデータでは、ＧＰおよびＭＢＰ系の両方で、代替スプライシング生成物の生成が特異的および構造上相同であるＰＫＡ部位のリン酸化を制御するために提供され、これはこのまたは非常に関連性のあるキナーゼがｉｎ  ｖｉｖｏリン酸化酵素であることを示唆している。抗原リン酸化の程度の変化は代替生成物における不均衡によるか、または同一のモチーフのリン酸化を脱制御する侵入性のキナーゼの作用により引き起こされ、素因のある個体において自己免疫応答を導くことができる。ＧＰ抗原の特異的代替生成物の存在がＧＰＢＰによる１次抗原のリン酸化を影響しなかったので、ｒＧＰＢＰは見かけ上制御されない様式で主要ＰＫＡリン酸化部位でヒトＧＰ抗原をリン酸化する（図示せず）。
【００９１】
ＧＰＢＰは偏在して発現されるが、特定の器官および組織では共通の自己免疫応答の標的となる細胞および組織構造の偏好性が示される：ランゲルハンス細胞（Ｉ型糖尿病）；中枢神経系の白質（多発性硬化症）；胆管（胆汁性肝硬変）；副腎の皮質細胞（アジソン病）；横紋筋細胞（重症筋無力症）；精原細胞（男性不妊症）；小脳のプルキンエ細胞（腫瘍随伴性小脳変性症候群）；および腸管上皮細胞（悪性貧血、自己免疫性胃炎および腸炎）。ヒト自己免疫疾患のモデルを想定する場合、前記の観察はすべてこの新規キナーゼが魅力的な候補物質であることを示している。
【００９２】
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１６  Ｌｕｐａｓ，  Ａ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．２１，３７５−３８２
１７  Ｌｅｍｍｏｎ，  Ｍ．Ａ．，  Ｆａｌａｓｃａ，  Ｍ．，  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，  Ｋ．Ｍ．およびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，  Ｊ．（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７，２３７−２４２
１８  Ｂｏｕｌｉｋａｓ，  Ｔ．（１９９３）  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．３，１９３−２２７
１９  Ｃｓｅｒｍｅｌｙ，  Ｐ．およびＫａｈｎ，  Ｃ．Ｒ．（１９９１）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６６，４９４３−４９５０
２０  ＭＡｒｕ，  Ｙ．およびＷｉｔｔｅ．Ｏ．Ｎ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７，４５９−４６８
２１  Ｂｅｅｌｅｒ，  Ｊ．Ｆ．，  ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅ，  Ｗ．Ｊ．，  Ｃｈｅｄｅｄ，  Ｍ．，  Ｔｒｏｎｉｃｋ，  Ｓ．Ｒ．およびＡａｒｏｎｓｏｎ，  Ｓ．Ａ．（１９９４）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．１４，９８２−９８８
２２  Ｃｓｅｒｍｅｌｙ，  Ｐ．，  Ｍｉｙａｔａ，  Ｙ．，  Ｓｃｈｎａｉｄｅｒ，  Ｔ．およびＹａｈａｒａ，  Ｉ．（１９９５）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７０，６３８１−６３８８
２３  Ｄｉｋｓｔｅｉｎ，  Ｒ．，  Ｒｕｐｐｅｒｔ，  Ｓ．およびＴｊｉａｎ，  Ｒ．（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８４，７８１−７９０
２４  Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ，  Ｌ．，  Ｂｏｍｂｌｉｅｓ，  Ｌ．，  Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，  Ｊ．，  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ，  Ｍ．およびＧｅｔｔｅｒｍａｎｓ，  Ｊ．（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５，５５４７−５５５６
２５  Ｃｏｔｅ，  Ｇ．Ｐ．，  Ｌｕｏ，  Ｘ．，  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｍ．Ｂ．およびＥｇｅｌｈｏｆｆ，  Ｔ．Ｔ．（１９９７）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７２，６８４６−６８４９
２６  Ｒｙａｚａｎｏｖ，  Ａ．Ｇ．，  Ｗａｒｄ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｍｅｎｄｏｌａ，  Ｃ．Ｅ．，  Ｐａｖｅｒ，  Ｋ．Ｓ．，  Ｄｏｒｏｖｋｏｖ，  Ｍ．Ｖ．，  Ｗｉｅｄｍａｎｎ，  Ｍ．，  Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅ，  Ｈ．，  Ｔｅｍｐｓｔ，  Ｐ．，  Ｐａｒｍｅｒ，  Ｔ．Ｇ．，  Ｐｒｏｓｔｏｋｏ，  Ｃ．Ｒ．，  Ｇｅｒｍｉｎｏ，  Ｆ．Ｊ．およびＨａｉｔ，  Ｗ．Ｎ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４，４８８４−４８８９
２７  Ｆｒａｓｅｒ，  Ｒ．Ａ．， Ｈｅａｒｄ，  Ｄ．Ｊ．,  Ａｄａｍ，  Ｓ．，  Ｌａｖｉｇｎｅ，  Ａ．Ｃ．，  Ｌｅ  Ｄｏｕａｒｉｎ，  Ｂ．，  Ｔｏｒａ，  Ｌ．，  Ｌｏｓｓｏｎ，  Ｒ．，  Ｒｏｃｈｅｔｔｅ−Ｅｇｌｙ，  Ｃ．およびＣｈａｍｂｏｎ，  Ｐ．（１９９８）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７３，１６１９９−１６２０４
２８  Ｌａｎｇｅｌｉｅｒ，  Ｙ．，  Ｃｈａｍｐｏｕｘ，  Ｌ．，  Ｈａｍｅｌ，  Ｍ．，  Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ，  Ｃ．，  Ｌａｍａｒｃｈｅ，  Ｎ．，  Ｇａｕｄｒｅａｕ，  Ｐ．およびＭａｓｓｉｅ，  Ｂ．（１９９８）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７３，１４３５−１４４３
２９  Ｌｅｍｍｏｎ，  Ｍ．Ａ．およびＦｅｒｇｕｓｏｎ，  Ｋ．Ｍ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２８，３９−７４
３０  Ｒｅｂｅｃｃｈｉ，  Ｍ．Ｊ．およびＳｃａｒｌａｔａ，  Ｓ．（１９９８）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  ２７，５０３−５２８
３１  Ｒｏｉｔｔ，  Ｉ．（１９９４）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎＥｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ３８３−４３９，第8版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ
３２  Ｅｒｌｉｃｈ，  Ｈ．およびＡｐｐｌｅ，  Ｒ．（１９９８）ＭＨＣ疾患関連。Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第二版，Ｄｅｌｖｅｓ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｒｏｉｔｔ，  Ｉ．Ｍ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，ロンドン、イギリス
３３  Ｐｈｅｌｐｓ，  Ｒ．Ｇ．，  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ａ．Ｎ．およびＲｅｅｓ，  Ａ．Ｊ．（１９９６）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７１，１８５４９−１８５５３
３４  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｓａｌｔｉｓｓｉ，  Ｄ．およびＰｅｎｄｅｒ，  Ｍ．Ｐ．（１９９８）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  ９８，１３４−１３５
３５  Ｌｉｔｅｒｓｋｙ，  Ｊ．Ｍ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，  Ｇ．Ｖ．Ｗ．（１９９２）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６７，１５６３−１５６８．
３６  Ｂｒｏｗｎ，  Ｋ．，  Ｇｅｒｓｔｂｅｒｇｅｒ，  Ｓ．，  Ｃａｒｌｓｏｎ，  Ｌ．，  Ｆｒａｎｚｏｓｏ，  Ｇ．およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔ，  Ｕ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７，１４８５−１４８８
３７  Ｃｈｅｎ，  Ｚ．Ｊ．，  Ｐａｒｅｎｔ，  Ｌ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８４，８５３−８６２
３８  Ａｂｅｒｌｅ，  Ｈ．，  Ｂａｕｅｒ，  ａ．，  Ｓｔａｐｐｅｒｔ，  Ｊ．，  Ｋｉｓｐｅｒｔ，  Ａ．およびＫｅｍｌｅｒ，  Ｒ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６，３７９７−３８０４
３９  Ｒｅｇｎｉｅｒ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｓｏｎｇ，  Ｈ．Ｙ．，  Ｇａｏ，  Ｘ．，  Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｄ．Ｖ．，  Ｃａｏ，  Ｚ．およびＲｏｒｔｈｅ，  Ｍ．（１９９７）Ｃｅｌｌ  ９０，３７３−３８３
４０  Ｖｌａｃｈ，  Ｊ．，  Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，  Ｓ．およびＡｍａｔｉ，  Ｂ．（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６，５３３４−５３４４
４１  Ｐｈｅｌｐｓ，  Ｒ．Ｇ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｖ．Ｌ．，  Ｃｏｕｇｈｌａｎ，  Ｍ．，Ｔｕｒｎｅｒ，  Ａ．Ｎ．およびＲｅｅｓ，  Ａ．Ｊ．（１９９８）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，１１４４０−１１４４７
【００９３】
（実施例２：ＧＰＢＰ代替スプライシング）
ここで２６残基のセリンに富むモチーフをコードする７８塩基対（ｂｐ）の長さのエキソンの代替スプライシングにより生じるＧＰＢＰの二つのアイソフォームの存在を報告する。両方のアイソフォーム、ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６は、ポリペプチド自己凝集の結果である高分子凝集体として存在する。ポリペプチド鎖における２６残基ペプチドの存在はより有効に自己相互作用し、より高い特異活性を有する凝集体を形成する分子種に至る。最終的には、ＧＰＢＰがヒト自己免疫の発病原因に関与するという観察を支持する証拠を提示する。
【００９４】
材料および方法
合成ポリマー：
ペプチド．ＧＰｐｅｐ１、ＫＧＫＲＧＤＳＧＳＰＡＴＷＴＴＲＧＦＶＦＴ（配列番号：２６）を実施例１で記載する。ＧＰＢＰｐｅｐ１、ＰＹＳＲＳＳＳＭＳＳＩＤＬＶＳＡＳＤＤＶＨＲＦＳＳＱ（配列番号：１４）はＧＰＢＰの３７１から３９６残基を表し、ゲノシスにより合成された。
【００９５】
オリゴヌクレオチド。以下のオリゴヌクレオチドをライフテクノロジーズインコーポレーティッドにより合成した（５’から３’へ）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−１１ｍ，Ｇ  ＣＧＧ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＴ（配列番号：３４）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−１５ｍ，ＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  Ｃ（配列番号：３５）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−２０ｃ，Ｃ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＧ（配列番号：３６）ＯＮ−ＧＰＢＰ−２２ｍ，ＴＡ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＡＡＧ  Ｇ（配列番号：３７）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−５３ｃ，ＧＡＡＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＡＡＴ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＴＣ（配列番号：３８）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−５６ｍ，ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＴＣ（配列番号：３９）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−５７ｃ，ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＧＴ（配列番号：４０）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−６２ｃ，ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＡＡＣ（配列番号：４１）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−Δ２６，ＣＡ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＣ（配列番号：４２）。
【００９６】
逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）。全ＲＮＡを（１５）に記載するように、異なる対照およびＧＰ組織から調製した。全ＲＮＡ５μｇをレディートゥーゴー  ユープライム  ファーストストランドビーズ（アマシャム  ファルマシア  バイオテック）、および４０ピコモルのＯＮ−ＧＰＢＰ−５３ｃを用いて逆転写した。対応するｃＤＮＡをプライマーＯＮ−ＧＰＢＰ−１１ｍ／ＯＮ−ＧＰＢＰ−５３ｃまたはＯＮ−ＧＰＢＰ−１５ｍ／ＯＮ−ＧＰＢＰ−６２ｃを用いるＰＣＲに供した。１５ｍ−６２ｃで得られた生成物の同一性をさらにＡｌｕ  Ｉ制限により確認した。ＧＰＢＰ転写物を特異的に増幅するために、プライマーＯＮ−ＧＰＢＰ−１５ｍ／ＯＮ−ＧＰＢＰ−５７ｃを用いてＰＣＲを実施した。
【００９７】
ノーザンハイブリダイゼーション研究。予め製造したヒト多重組織および腫瘍培養細胞株ノーザンブロット（クロンテック）をＧＰＢＰにのみ存在する７８ｂｐエキソンを含有するｃＤＮＡで、または両方のアイソフォームを表すｃＤＮＡでプローブした。プライマー対ＯＮ−ＧＰＢＰ−５６ｍおよびＯＮ−ＧＰＢＰ−５７ｃを用いて、ＧＰＢＰを鋳型として用いて、またはプライマー対ＯＮ−ＧＰＢＰ−２２ｍおよびＯＮ−ＧＰＢＰ−２０ｃを用いて、ＧＰＢＰΔ２６を鋳型として用いてＰＣＲにより対応するｃＤＮＡを得た。得られた生成物をランダム標識し、および製造者指示書に従ってハイブリダイズした。
【００９８】
プラスミド構築、組換えタンパク質の発現および精製。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＦＬＡＧタグ化ＧＰＢＰの組替え発現に用いられたプラスミドｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’は別に報告されている（４）。ＯＮ−ＧＰＢＰΔ２６を用いて７８ｂｐエキソンをコードする配列を位置指定突然変異誘発により欠失させ、プラスミドｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’Δ２６を生じた。組換えＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の発現およびアフィニティ精製を（４）の通りに行った。
【００９９】
ゲル濾過ＨＰＬＣ。２５０μｌのサンプルを５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡にしたゲル濾過ＰＥ−ＴＳＫ−Ｇ４０００ＳＷ  ＨＰＬＣカラムに注入した。カラムから０．５ｍｌ／分で物質を溶出し、２２０ｎｍでモニター観察し、微小な分画を収集した。
【０１００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイ。自己、トランスリン酸化およびインブロット復元実験を実施例１に記載のとおりに実施した。
【０１０１】
抗体および免疫化学技術。ポリクローナル抗体をニワトリにおいて７８ｂｐエキソン（ゲノシス）によりコードされる配列を表す合成ペプチド（ＧＰＢＰｐｅｐ１）に対して産生させた。卵黄を水で１：１０に希釈し、ｐＨを５．０に調整した。４℃で６時間後、溶液を遠心（４℃、１００００ｘｇで２５分間）により清澄化し、２０℃、２００００ｘｇで２０重量／容量％  硫酸ナトリウムを添加することにより抗体を沈殿させた。ペレットをＰＢＳ（卵黄あたり１ｍｌ）に溶解し、免疫化学実験に用いた。ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６に対するまたはα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインに対する抗体の生成については前記している（また４，１３を参照のこと）。
【０１０２】
沈降速度。ＶＩＳ−ＵＶスキャナーを装備したオプティマＸＬ−Ａ分析用超遠心（ベックマンインストラメンツインコーポレーティッド）で、Ｔｉ６０ローターおよび１２ｍｍ光学距離のイーポンチャーコールの２重セクターセルを用いて沈降速度の決定を行った。およそ４００μｌのサンプルを２０℃、３００００ｒｐｍで遠心し、２２０ｎｍでラジアル走査を５分毎に取った。ＸＬＡＶＥＬ（ベックマン提供による）プログラムを用いて溶質結合の動きの速度から沈降係数を得た。
【０１０３】
沈降平衡。沈降平衡実験を７０μｌのサンプルを用いる速度実験に関して前記で記載するように実施し、８０００ｒｐｍで遠心した。平衡時の実験濃度勾配をＥＱＡＳＳＯＣプログラム（ベックマン）を用いて分析し、対応する平均分子量を決定した。ＧＰＢＰに関して０．７１１ｃｍ３／ｇおよびＧＰＢＰΔ２６に関して０．７２９ｃｍ３／ｇの部分的特異的容量を対応するアミノ酸組成物から算出した。
【０１０４】
物理的方法および免疫化学技術。（３）で前記するように還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを実施した。ホルマリン固定パラフィン包埋組織に関して、ＡＢＣ過酸化法（４）を用いて、または冷アセトンで固定した凍結ヒト生検に関して間接的免疫蛍光の標準的な方法を用いて免疫組織化学実験を実施した。
【０１０５】
二つのハイブリッド実験。ｐＧＢＴ９およびｐＧＡＤ４２４（クロンテック）を用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）（ＨＦ７ｃ）において自己相互作用実験を実施し、各々ＧＡＬ４結合およびドメイン融合タンパク質の活性化を生じた。製造者の推奨に従って相互作用を評価した。βガラクトシダーゼ活性を切片上ではＸ−ＧＡＬ（０．７５ｍｇ／ｍｌ）を用いて、および溶液中決定ではオルトニトロフェニルβ−Ｄガラクトピラノシド（０．６４ｍｇ／ｍｌ）を用いて評価した。
【０１０６】
結果
二つのスプライシングＧＰＢＰ変種の同定。正常ヒト組織におけるＧＰＢＰ種を特徴づけるために、ＧＰＢＰの全オープンリーディングフレームを隣接する特異的オリゴヌクレオチドを用いて、異なる組織からの全ＲＮＡに関してポリメラーゼ連鎖反応に逆転写を連動させた。骨格筋由来ＲＮＡから（図８Ａ）、および腎臓、肺、皮膚、または副腎由来ＲＮＡから（図示せず）、予測されたよりも小型であることを示す単一のｃＤＮＡフラグメントを得た。入れ子式ＰＣＲ再増幅およびエンドヌクレアーゼ制限マッピングを組み合わせて、全ＲＴ−ＰＣＲ生成物が同一の分子種に対応することを決定した（図示せず）。ヒト筋肉からの２．２ｋｂのｃＤＮＡを全て配列決定し、２６残基モチーフ（アミノ酸３７１−３９６）をコードする７８ヌクレオチド（１５１９−１５９６位置）が存在しない以外は、ＨｅＬａ誘導物質と同一であることを見出した（図８Ｂ）。従って、このより一般的であるＧＰＢＰのアイソフォームをＧＰＢＰΔ２６と称した。
【０１０７】
７８ｂｐがプレｍＲＮＡプロセシング中に転写をスキップするエキソンを表すのかどうかを調べるために、このｃＤＮＡを用いてヒト由来のゲノムライブラリーをプローブし、〜１４Ｋｂのクローンを単離した。サザンブロットハイブリダイゼーションおよびＰＣＲを組み合わせて、ゲノムクローンを特徴づけし、１２４８２ｂｐの隣接ＤＮＡフラグメントを全て配列決定した（配列番号：２５）。配列は（５’から３’で）７６７ｂｐのイントロン配列、９３ｂｐのエキソン、８１８ｂｐのイントロン、７８ｂｐの目的のエキソン配列、９６５０ｂｐのイントロン、９６ｂｐのエキソンおよび９８０ｂｐのイントロン配列（図８Ｃ）を含有した。対応するＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列を比較することにより決定したエキソンイントロン境界は５’および３’スプライシング部位の標準的なコンセンサスに合致し（図８Ｃ）（５）、７８ｂｐ配列のエキソン特性を確認する。プローブとしてゲノムクローンを用いる蛍光切片上ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）によりＧＰＢＰ遺伝子は染色体５ｑ１３に局在した（図示せず）。
【０１０８】
ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の両方に存在する７８ｂｐエキソンかまたは７８ｂｐの隣接配列を表す２６０ｂｐのｃＤＮＡ（１０３ｂｐ５’および１５７ｂｐ３’）を用いるノーザンブロット分析によりヒト由来の標本におけるＧＰＢＰの相対的発現を評価した（図９）。目的の分子種を含有する７８ｂｐは横紋筋（骨格筋および心筋の両方）および脳に好んで発現し、胎盤、肺および肝臓にはあまり発現しなかった。ＧＰＢＰΔ２６とは対照的に、ＧＰＢＰは腎臓、膵臓および癌の培養細胞株では非常に低レベルでしか発現しなかった。
【０１０９】
前記の全ては、ＧＰＢＰが正常ヒト組織では低レベルで発現され、ＧＰＢＰのＲＴ−ＰＣＲにより最初に検出されなかったのはより豊富なＧＰＢＰΔ２６が優先的に増幅されたためであろうということを示している。実際、７８ｂｐエキソン特異的オリゴヌクレオチドを用いて特異的ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った場合、ＧＰＢＰのｃＤＮＡをヒト組織（骨格筋、肺、腎臓、皮膚および副腎）から増幅できた（図示せず）。これはまた、ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の両方を表すｃＤＮＡプローブを用いる場合、ＧＰＢＰΔ２６  ｍＲＮＡがノーザンブロット実験で検出された主要な転写物であることをも示唆している。
【０１１０】
ＧＰＢＰΔ２６の組換え発現および機能上の特徴づけ。２６残基のセリンに富むモチーフの欠如がＧＰＢＰの生化学的特性に影響するかどうかを調べるために、両方のアイソフォーム（ｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰΔ２６）を発現し、精製し、自己およびトランスリン酸化活性を評価した（図１０）。ｒＧＰＢＰに関して前記で報告するように（４をも参照のこと）、単一の主要なポリペプチドおよびいくつかの関連する微少な生成物としてｒＧＰＢＰΔ２６を精製した（図１０Ａ）。しかしながら、ｒＧＰＢＰに比較して、誘導生成物の数および相対量は変化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単純に２６残基の削除のせいにはできないＭｒが表示された。これは２６残基モチーフが重要な構造を有し、および溶液中自己およびトランスリン酸化活性の低減の原因となる機能上の成果がｒＧＰＢＰにより表されたことを示唆する（図１０Ｂ）。興味深いことに、リン酸化がＳＤＳ−ＰＡＧＥ後インブロットで評価され、復元された場合、溶液中アッセイにおいて示された特異的活性における差異は明白ではなく、これは２６残基モチーフが４次構造レベルで重要な機能上の成果を有する可能性があることを示唆した。さらに復元実験によりリン酸塩移動活性が提示されたオープンリーディングフレームを表す主要なポリペプチドに存在し、誘導された微少生成物では検出されないことを示した。
【０１１１】
ｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰ−２６は非常に活性な高分子量凝集体として存在する。アフィニティ精製ｒＧＰＢＰまたはｒＧＰＢＰΔ２６のゲル濾過分析により、２個のクロマトグラフィピーク（ＩおよびＩＩ）を生じ、ＳＡＳ−ＰＡＧＥ実験で決定されるように、共に個々の分子種で予測されたものよりも高ＭＷを示した（各々８９ｋＤａ、８４ｋＤａ）（図１１）。大部分の組換え物質を１５８ｋＤａおよび６６９ｋＤａ分子量マーカーの間で単一のピークとして溶出し、一方限定量のｒＧＰＢＰおよび極微量のｒＧＰＢＰΔ２６をピークＩで溶出した（＞１０００ｋＤａ）。各クロマトグラフィプロフィールを表す分画の一定分量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、染色するか、または３２Ｐ［γ］ＡＴＰの存在下インキュベートし、イムノブロットおよびオートラジオグラフィにより分析した。主要な１次ポリペプチドに加えて、各クロマトグラフィのピークはより大きいまたはより小さい大きさの複数の誘導生成物を含有し、これは１次ポリペプチドが結合して、共有および非共有結合により安定化された高分子量凝集体を形成することを示している（図示せず）。キナーゼ活性もまたクロマトグラフィプロフィールと一致する２個のピークを呈した。しかしながら、ピークＩはピークＩＩよりもより高度な特異的活性を示し、これはこれらの高分子量凝集体がキナーゼのより活性な形態を含有していることを示した。等容量のｒＧＰＢＰ分画番号１３および２０は、タンパク質含量では分画１３はウェスタンブロットおよびクーマシーブルー染色により推測されるより２０倍低いが、匹敵するリン酸化活性を呈した（図１１Ａ）。ｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰΔ２６のピークＩＩでの特異的活性もまた異なり、物質全体に関して示された実験と合致し、従って２６残基のセリンに富むモチーフの存在によりキナーゼがより活性になるにするという仮説を支持している。これらの結果はまたｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰΔ２６の両方が元来の条件下でオリゴマーとして存在し、高分子量凝集体の形成および特異的活性の両方が２６残基のセリンに富むモチーフの存在に大いに依存することをも示唆している。ｒＧＰＢＰの分析用遠心分析によりピークＩが大きな凝集体（１０７Ｄａ以上）を含有することが表された。ｒＧＰＢＰのピークＩＩは２２０±１０ｋＤａ凝集体の相同性集合体を含有し、１１Ｓの沈降係数を有する三量体を表す可能性がある。しかしながら、ｒＧＰＢＰΔ２６のピークＩＩは、いくつかのオリゴマー種を含有する可能性のあるより異種性の集合体からなる。主要な集合体（約８０％）は平均分子量３１０±１０ｋＤａおよび１４Ｓの沈降係数を示した。
【０１１２】
酵母２ハイブリッド系におけるＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６自己相互作用。自己凝集の生理学的関係を評価するために、および２６残基モチーフの役割を決定するために、酵母における２ハイブリッド相互作用系を用いて比較実験を実施した。この型の実験では、ＧＡＬ４転写因子の活性化または結合ドメインのいずれかを含有する融合タンパク質の一部として、相互作用を実験するポリペプチドを発現する。実験するポリペプチドを通して２個の融合タンパク質間の有効な相互作用が転写活性化因子の再構築および引き続いて２個のレポーター遺伝子、ＬａｃＺおよびＨｉｓ３の発現に至り、各々コロニーの色の検出およびＨｉｓ欠損培地における成長が可能になる。異なる濃度のＨｉｓ３遺伝子生成物（３−ＡＴ）の競合阻害因子の存在下、ヒスチジン欠損培地における成長速度による相互作用の強度、および定量比色液体βガラクトシダーゼアッセイを評価した。代表的な実験を図１２に表す。自己相互作用に関してＧＰＢＰΔ２６を検定する場合、レポーター遺伝子の有意な誘導が観察されたが、各融合タンパク質が単独でまたは対照融合タンパク質と共に発現された場合、発現は検出されなかった。ＧＰＢＰを得るためのポリペプチドにおける２６残基モチーフの挿入により、ポリペプチド相互作用において著明に増加した。前記の全データはＧＰＢＰΔ２６がｉｎ  ｖｉｖｏで自己結合し、２６残基のポリペプチド鎖への挿入により、より相互に影響する分子種を生じることを示す。
【０１１３】
ＧＰＢＰはヒト糸球体および肺胞において発現されるが、ウシおよびネズミ糸球体および肺胞では発現されない。ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６は天然に発生する自己免疫応答において一般的に標的化されるヒト細胞および組織において優先的に発現される。ＧＰＢＰの発現を具体的に調べるために、このキナーゼアイソフォームの２６残基モチーフの特徴を表す合成ペプチドに対してポリクローナル抗体を産生させ、凍結またはホルマリン固定し、パラフィン包埋したヒト組織において免疫組織化学実験に用いた（図１３）。概して、これらの抗体は、自己免疫応答の標的である組織構造、例えば胆管、ランゲルハンス島、または中枢神経系の白質に関して両方のアイソフォームを認識する抗体よりも高い特異性を示す（図示せず）。それにも関わらず、最も著明な知見は、試験したいずれの組織でも小さい血管の周囲のＧＰＢＰ選択的抗体の直線的な沈着の存在であり（Ａ）、これはＧＰＢＰが内皮細胞基底膜と結合していることを示唆している。結果的に、糸球体では、抗ＧＰＢＰ抗体はα３（ＩＶ）ＮＣ１を特異的に認識するモノクローナル抗体（１３Ｂを１３Ｃおよび１３Ｄと比較する）によるか、または循環ＧＰ自己抗体により（１３Ｅおよび１３Ｆを比較する）生じる糸球体基底膜染色に非常に類似した血管パターンを示した。これらの観察によりＧＰＢＰが天然の自己免疫応答において標的化される組織構造において発現されるという最初の観察がさらに支持され、これはＧＰＢＰの発現は危険因子であり、自己免疫攻撃に対して宿主組織を脆弱にすることを示唆している。
【０１１４】
この仮説をさらに評価するために、ヒトと比較して天然にはＧＰ病にならない２種の哺乳動物の糸球体においてＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の存在を調べた（図１４）。ＧＰＢＰ特異的抗体はウシおよびネズミの両方の標本の糸球体を染色せず（１４Ａを１４Ｂおよび１４Ｃと比較する）、ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の両方に共通するＮ末端配列を認識する抗体は三つ全ての種のこれらの構造を染色したが、分布および強度は異なっていた（１４Ｄから１４Ｆ）。ウシ腎皮質では、ＧＰＢＰΔ２６はヒトよりも低率で発現されたが、類似の組織分布が示された。しかしながらネズミサンプルでは、ＧＰＢＰΔ２６はヒト糸球体におけるＧＰＢＰの組織分布と非常に類似した組織分布が示された。異なる３種において肺胞を試験した場合、類似の結果が得られた（図示せず）。抗体検出における差異が差次発現よりもむしろ１次構造の差異によるものであることを排除するために、ｃＤＮＡ配列決定により、これらの２種において対応する１次構造を決定した。ウシおよびマウスＧＰＢＰ（配列番号：３から６、および９から１２）は全体的にヒト物質と各々９７．９％および９６．６％の同一性を示した。さらに、マウス２６残基モチーフはヒトと同一であったが、ウシは１個の残基においてのみ分岐した。最終的には、ヒトに類似して、対応する７８ｂｐエキソンに特異的なオリゴヌクレオチドを用いてマウスまたはウシ腎臓全ＲＮＡからＧＰＢＰ  ｃＤＮＡをうまく増幅し、これによりＧＰＢＰが非常に低レベルで発現され、免疫化学技術により検出できないことが示された。
【０１１５】
ＧＰＢＰはいくつかの自己免疫状態において高度に発現される。特異的ＲＴ−ＰＣＲにより異なるＧＰ患者からのいくつかの組織を分析し、ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６  ｍＲＮＡレベルを評価した。対照の腎臓と同様に、ＧＰ腎臓で主に発現されたアイソフォームはＧＰＢＰΔ２６であった。しかしながら、１人の患者の筋肉ではＧＰＢＰが優先的に発現され、一方ＧＰＢＰΔ２６は対照筋肉サンプルにおいて検出された唯一のアイソフォームであった（図１５Ａ）。我々はこの特定の患者からの腎臓サンプルを有していなかったので、対応する標的器官におけるＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６発現を評価できなかった。類似の理由から、腎臓を試験した患者の筋肉におけるＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６レベルを評価できなかった。筋肉細胞は高レベルのＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６を発現し（図９におけるノーザンブロットを参照のこと）、これらは多量の組織を含む。対照的に腎臓におけるＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６の発現はもっと少なく、糸球体は実際に、ＧＰＢＰアイソフォームを発現する唯一の腎臓構造である（図１３を参照のこと）。糸球体は、筋細胞が筋肉にあるよりも相対的に腎臓に余り豊富にない構造であり、糸球体はＧＰ発病過程において免疫攻撃により標的化される構造である。ＲＴ−ＰＣＲ実験を行う場合により豊富でより短いメッセージが優先的に増幅されるのに伴い、これらの因子により正常およびＧＰ腎臓の両方でＧＰＢＰが検出されないことが説明され、従って発病過程における糸球体でのＧＰＢＰ発現の評価を除外できる。それにも関わらず、ＧＰ患者におけるＧＰＢＰレベルの増加はＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６発現がＧＰ発病過程において変化し、ＧＰＢＰ発現の増強がＧＰ病において重要な病因であることを示唆している。
【０１１６】
自己免疫発病過程におけるＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の発現を調べるために、皮下自己免疫過程を試験し、これらを正常皮膚または非自己免疫性皮膚炎を表す対照サンプルと比較した（図１５）。対照サンプルは大抵の末梢ケラチノサイトにおいて限定的なＧＰＢＰ発現を示すが（１５Ｂ、１５Ｅ）、基底層から角質層に広がるケラチノサイトは全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（１５Ｃ、１５Ｆ）または扁平苔癬（１５Ｄ、１５Ｇ）の影響をうける皮膚において豊富なＧＰＢＰを発現した。ＵＶ照射およびアポトーシス誘導時の培養ケラチノサイトで前記した小疱に非常に類似した細胞表面構造においてＧＰＢＰが優先的に発現された（６）。対照的に、ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の両方を認識する抗体は、自己免疫の影響を受けたまたは対照のサンプルの両方において表皮全体を通じて細胞基質性拡散パターンを生じた（図示せず）。これらのデータは対照および自己免疫の影響を受けたケラチノサイト両方において、ＧＰＢＰΔ２６が細胞基質で発現され、細胞分化の間に発現は有意には変化しなかったことを示している。対照的に、成熟ケラチノサイトは実際に唯一のＧＰＢＰ発現細胞であった。しかしながら、小疱形成およびＧＰＢＰ発現は自己免疫応答により影響を受けた表皮において初期分化段階で観察された（１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｆ、１５Ｇ）。これはさらに基底ケラチノサイトで異常なアポトーシスが皮膚に影響する自己免疫の発病過程に関係することを示す以前の観察を支持し（７）、これはアポトーシスおよびＧＰＢＰ発現がこのヒト細胞系に関連していることを示唆している。
【０１１７】
考察
代替プレｍＲＮＡスプライシングは組織分布、細胞内局在、および異なるプロテインキナーゼの機能を制御することが報告されている差次遺伝子発現の基礎的なメカニズムである（８から１１）。この点で、およびＧＰＢＰに非常に類似して、Ｂ−Ｒａｆは複数のスプライシング変種として存在し、ここで特異的エキソンの存在により、より相互に影響し、有効な腫瘍形成性キナーゼになる（１２）。
【０１１８】
ｒＧＰＢＰΔ２６がなおこの新規キナーゼの特徴づけされていない触媒性ドメインを担持することは明らかであるが、ｒＧＰＢＰと比較した場合、自己およびトランスリン酸化活性の両方が大きく低下する。ゲル濾過および２ハイブリッド実験により、このように低下したリン酸移動活性の基礎となるメカニズムにいくらかの見識が提供される。ｒＧＰＢＰの約１から２％がｒＧＰＢＰのリン酸化活性の約３分の１をあらわす非常に高分子量の凝集体に構成され、これは高分子量凝集体がより有効な４次構造を付与することを示している。組換えＧＰＢＰΔ２６は実施にピークＩの物質を伴わず、一貫して低下したキナーゼ活性を示す。しかしながら、ピークＩＩに存在するｒＧＰＢＰΔ２６物質もまたｒＧＰＢＰの相同性分画と比較した場合、リン酸化活性の低下を示すので、凝集体が、２６残基が特異活性を増加させる唯一のメカニズムではないようである。一つの可能性は、ｒＧＰＢＰ由来の凝集体が２６残基モチーフの挿入により引き起こされる４次構造強化のために、より高度な特異活性を表すということである。大量の物質が非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一のポリペプチドとして現れ、８Ｍの尿素または６Ｍのグアニジンのいずれかの存在はクロマトグラフィゲル濾過プロフィールにおいてほとんど影響がないので、オリゴマーは非常に強力な非共有結合により主に繋がれている（図示せず）。どのように２６残基モチーフがより強力で、活性な構造を付与するのかを明らかにすべきであろう。キナーゼの活性化状態を変化させるモチーフをコードするエキソンの存在により誘導される立体配座の変化がＢ−ＲａｆのＳｒｃタンパク質（２４）およびエキソン８ｂおよび１０（１２）のリンカードメインとして提示されている。別法として、２６残基モチーフが構造上の要件、例えばそのリン酸化がＧＰＢＰの全活性化に必要である残基を提供できる。
【０１１９】
ＧＰ抗原（α３（ＩＶ）ＮＣ１）の１次構造が複数の立体配座を生じる複合体折り畳み過程の標的であることを報告した（１３）。単離された立体配列は超分子凝集体のリン酸化および恐らく４次構造形成により特異的に活性化される非最低エネルギー構造である。ＧＰ患者ではα３（ＩＶ）ＮＣ１が立体配座の変化およびコラーゲンＩＶネットワークのジスルフィド安定化を媒介する能力の低下を示す。そしてＧＰ抗体が患者α３（ＩＶ）ＮＣ１配座異性体に対してより強力な親和性を示し、これは立体配座が変化した物質が自己免疫応答を引き起こすことを示している。従って、ＧＰ病ではα３（ＩＶ）ＮＣ１の立体配座形成過程における初期の変化が、免疫系が耐性でない配座異性体の変化を生じ、このように自己免疫応答を媒介するようである。
【０１２０】
その他の証拠（Ｒａｙａら、結果は未発表）により、リン酸化が非最低エネルギー末端にα３（ＩＶ）ＮＣ１の折り畳みを誘導するシグナルであることが示されている。このシナリオでは、ヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１系の三つの特徴はウシまたはネズミのような自然にはＧＰ病にならない種からの対応する抗原系と比較した場合、発病原因と特別な関係にある。第１にヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１のＮ末端はＰＫＡによりおよびＧＰＢＰによりリン酸化されるモチーフを含有する（前記、および２から４をも参照のこと）。第２にヒト遺伝子は代替エキソンスプライシングにより複数の代替生成物を生じる（１４、１５）。エキソンスキッピングにより、１次α３（ＩＶ）ＮＣ１生成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＫＡリン酸化を上方制御する分岐したＣ末端を有する代替生成物を生じる（以下の実施例３を参照のこと）。第３にヒトＧＰＢＰは、ＧＰ病の二つの主要な標的である糸球体および肺胞基底膜に結合して発現される。リン酸化依存性立体配座形成過程はまた非病原性ＮＣ１ドメインの特徴でもあり（１３）、これはリン酸化可能なＮ末端、代替スプライシングによる多様化および糸球体および肺胞基底膜でのＧＰＢＰの発現は全て、α３（ＩＶ）ＮＣ１の立体配座形成過程を脆弱な状態に置く全ての排他的なヒトの特徴であることを示唆している。四つの別個のＧＰ腎臓実験では高レベルおＧＰ抗原代替生成物を発現し（１５；ＢｅｒｎａｌおよびＳａｕｓ、結果は未発表）、ＧＰ患者ではＧＰＢＰ発現の増加が見出された（前記を参照のこと）。代替ＧＰ抗原生成物およびＧＰＢＰの両方のレベル増加はα３（ＩＶ）ＮＣ１のリン酸化依存性立体配座形成過程における結果である、従って発病の可能性を有していると予測される。
【０１２１】
ＧＰＢＰは天然の自己免疫応答により標的化される皮膚において高度に発現される。表皮ではＧＰＢＰはケラチノサイトが成熟中に基底から角質層になるアポトーシス媒介分化過程の細胞表面小疱と結合している（２２、２３）。ＳＬＥ患者からのケラチノサイトはＵＶ誘起のアポトーシスに対して感受性が著明に高められており（６、１８、２０）、ＳＬＥおよび皮膚筋炎では増強されたおよび時期尚早なケラチノサイトアポトーシスの存在が報告されている（７）。一貫して、円盤状狼瘡（図示せず）、ＳＬＥおよび扁平苔癬などのいくつかの皮膚自己免疫状態において基底から表皮の周辺層までアポトーシス体が広がっているのが見出された。自己抗原およびその修飾体はアポトーシスケラチノサイトの細胞表面小疱に密集する（６、１８、２０）。アポトーシス表面小疱は自己抗原（２１）を提供し、循環系に修飾体を放出する可能性がある。（１６から２０）。これはアポトーシス体からの修飾自己抗原の放出が全身性自己免疫応答媒介ＳＬＥおよび強皮症を媒介する免疫化であり得ることを示唆している（１８、１９）。
【０１２２】
ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の両方がｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロテインキナーゼとして作用でき、ＧＰＢＰはＧＰＢＰΔ２６よりもより活性なアイソフォームであるということが示される。さらに酵母からまたはヒト２９３細胞から精製されたＧＰＢＰまたはＧＰＢＰΔ２６を表す組換え物質がα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインを特異的に減成する、関連するタンパク質溶解活性を有した（結果は未発表）。タンパク質溶解活性は真核細胞発現系において生成されたα３（ＩＶ）ＮＣ１に機能するが、細菌において生成された組換え物質には機能せず（結果は未発表）、これはα３（ＩＶ）ＮＣ１プロセシングが原核細胞組換え物質には存在しないいくつかの立体配座形成または翻訳後要件を有することを示している。最終的に、いくつかの自己抗原がアポトーシス性ケラチノサイトにおいてリン酸化および減成を行うことが報告されている（２０）。正確なメカニズムにまで限定はしていないが、前記の全データに鑑み、我々はアポトーシス性小疱で機械的に集めたＧＰＢＰは、リン酸化、立体配座変化および減成などの自己抗原の複雑な改変を行う可能性があることを提示する。従って、ＳＬＥ（Ｐ１リボソームリンタンパク質およびＳｍ−Ｄ１小型核リボヌクレオタンパク質）および皮膚筋炎（ヒスチジルｔＲＮＡシンセターゼ）において自己抗原を表す組換えタンパク質はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＰＢＰの基質であった（結果は未発表）。
【０１２３】
ＧＰＢＰの培養癌細胞株における下方制御はＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６を機械的に繋げた細胞がプログラムされた細胞死を誘起するシグナル発生経路に関与している可能性があることを示唆している。対応するアポトーシス経路は自己免疫発病過程で上方制御して特異的ＭＨＣハロタイプを担持する個体の抗原展示を変化させ；細胞の形質転換中に下方制御して腫瘍成長中の形質転換された細胞への自己免疫攻撃を防御できる。
【０１２４】
実施例２の参考文献
１  Ｓａｕｓ，  Ｊ．（１９９８）グッドパスチャー症候群について：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第二版，Ｖｏｌ．  ２，Ｄｅｌｖｅｓ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｒｏｉｔｔ，  Ｉ．Ｍ．編，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，ロンドン）ｐｐ．  １００５−１０１１．
２    Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，  Ｓ．，  Ｂｅｒｎａｌ，  Ｄ．，  Ｇａｒｃｉａ−Ｓｏｇｏ，  Ｍ．，  Ｅｌｅｎａ，  Ｓ．Ｆ．およびＳａｕｓ，  Ｊ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１９７８０−１９７８４
３    Ｒｅｖｅｒｔ，  Ｆ．，  Ｐｅｎａｄｅｓ  Ｊ．Ｒ．，  Ｐｌａｎａ，  Ｍ．，  Ｂｅｒｎａｌ，  Ｄ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｃ．，  Ｉｔａｒｔｅ，  Ｅ．，  Ｃｅｒｖｅｒａ，  Ｊ．，  Ｗｉｅｓｌａｎｄｅr，  Ｊ．，  Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，  Ｓ．およびＳａｕｓ，Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１３２５４−１３２６１
４  Ｒａｙａ，  Ａ．，  Ｒｅｖｅｒｔ，  Ｆ．，  Ｎａｖａｒｒｏ，  Ｓ．およびＳａｕｓ，Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２６４２−１２６４９．
５  Ｇｒｅｅｎ，  Ｍ．Ｒ．（１９８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０，６７１−７０８．
６  Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，  Ｌ．Ａ．，  Ａｎｈａｌｔ，  Ｇ．およびＲｏｓｅｎ，  Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１３１７−１３３０．
７  Ｐａｂｌｏｓ，  Ｊ．Ｌ：，  Ｓａｎｔｉａｇｏ，  Ｂ．，  Ｇａｌｉｎｄｏ，  Ｍ．，  Ｃａｒｒｅｉｒａ，  Ｐ．Ｅ．，  Ｂａｌｌｅｓｔｉｎ，  Ｃ．およびＧｏｍｅｚ−Ｒｅｉｎｏ，  Ｊ．Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８８：６３−６８．
８  Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，  Ｍ．，  Ｅｄｍａｎ，  Ｃ．Ｆ．およびＳｃｈｕｌｍａｎ，  Ｈ．（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２６，８３９−８５２．
９  Ｎａｉｔｏ，  Ｙ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｙ．，  Ｙｏｋｏｋｕｒａ，  Ｈ．，  Ｓｕｇｉｔａ，  Ｒ．，  Ｎｉｓｈｉｏ，  Ｍ．およびＨｉｄａｋａ，  Ｈ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３２７０４−３２７０８．
１０  Ｂａｙｅｒ，  Ｋ．−Ｕ．，  Ｌｏｅｈｌｅｒ，Ｊ．およびＨａｒｂｅｒｓ，Ｋ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，２９−３６．
１１  Ｍａｎｄａｕｌｅ，  Ｐ．，  Ｅｄａ，  Ｍ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｎ，  Ｆｕｊｉｓａｗａ，  Ｋ．，  Ｍａｔｓｕｏｋａ，  Ｔ．，  Ｂｉｔｏ，  Ｈ．，  Ｉｓｈｉｚａｋｉ，  Ｔ．およびＮａｒｕｍｉｙａ，  Ｓ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，４９１−４９４．
１２  Ｐａｐｉｎ，  Ｃ．，  Ｄｅｎｏｕｅｌ−Ｇａｌｙ，  Ａ．，  Ｌａｕｇｉｅｒ，  Ｄ．，  Ｃａｌｏｔｈｙ，  Ｇ．およびＥｙｃｈｅｎｅ，  Ａ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２４９３９−２４９４７．
１３  米国仮特許出願，出願番号割り当て未定，２０００年２月１１日登録（事件番号９８，７２３−Ｃ）
１４  Ｐｅｎａｄｅｓ  Ｊ．Ｒ．，  Ｂｅｒｎａｌ，  Ｄ．，  Ｒｅｖｅｒｔ，  Ｆ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｃ．，  Ｆｒｅｓｑｕｅｔ，  Ｖ．Ｊ．，  Ｃｅｒｖｅｒａ，  Ｊ．，  Ｗｉｅｓｌａｎｄｅr，  Ｊ．，  Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，  Ｓ．およびＳａｕｓ，  Ｊ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９，７５４−７６０．
１５  Ｂｅｒｎａｌ，  Ｄ．，  Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，  Ｓ．およびＳａｕｓ，  Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１２０９０−１２０９４．
１６  Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，  Ｌ．Ａ．，  Ａｎｈａｌｔ，  Ｇ．Ｊ．およびＲｏｓｅｎ，  Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１６２５−１６３４．
１７  Ｃａｓｉａｎｏ，  Ｃ．Ａ．，  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ｄ．Ｒ．およびＴａｎ，  Ｅ．Ｍ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：７６５−７７０．
１８  Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，  Ｌ．およびＲｏｓｅｎ，  Ａ．（１９９７）Ｌｕｐｕｓ  ６：１７５−１８０．
１９  Ｂｏｌｉｖａｒ，  Ｊ．，  Ｇｕｅｌｍａｎ，  Ｓ．，  Ｉｇｌｅｓｉａｓ，  Ｃ．，Ｏｒｔｉｚ，  Ｍ．およびＶａｒｄｉｖｉａ，  Ｍ．（１９９８）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７３：１７１２２−１７１２７．
２０  Ｕｔｚ，  Ｐ．Ｊ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｐ．（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４１：１１５２−１１６０．
２１  Ｇｏｌａｎ，  Ｔ．Ｄ．，  Ｅｌｋｏｎ，  Ｋ．Ｂ．，  Ｇｈａｖａｒｉ，  Ａ．Ｅ．およびＫｒｕｅｇｅｒ，  Ｊ．Ｇ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１０６７−１０７６．
２２  Ｐｏｌａｌｏｗｓｋａ，  Ｒ．Ｒ．，  Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｉ，  Ｍ．，  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，  Ｒ．，  Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，  Ｌ．Ａ．およびＨａａｋｅ，  Ａ．Ｒ．（１９９４）Ｄｅｖ．Ｄｉｎａｍ．１９９：１７６−１８８．
２３  Ｍａｒｕｏｋａ，  Ｙ．，  Ｈａｒａｄａ，  Ｈ．，  Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ他（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３８：８８６−８９０．
２４  Ｘｕ，  Ｗ．，  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｃ．およびＥｃｋ，  Ｍ．Ｊ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，５９５−６０２．
【０１２５】
（実施例３．エキソンスプライシングによるヒト自己抗原リン酸化の制御）
導入
ＧＰ病ではＩＶ型コラーゲンのα３鎖（ＧＰ抗原）の非コラーゲン性Ｃ末端ドメイン（ＮＣ１）に対する自己抗体により免疫系攻撃が媒介される（１）。ヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１のＮ末端は独特な構造モチーフ、ＫＲＧＤＳ９を有する高度に分岐した親水性領域を含有し、Ａ型プロテインキナーゼの機能的リン酸化部位に必要な部分として細胞付着シグナルを保持している（２，３）。さらに特徴的には、ヒトＧＰ抗原をコードする遺伝子領域は代替エキソンスプライシングにより複数のｍＲＮＡを生じる（４、５）。代替生成物はＣ末端で分岐し、一つを除いて全てがＮ末端ＫＲＧＤＳ９を共有する（４、５）。
【０１２６】
多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系で炎症性脱ミエリン化プラークの存在により特徴づけられる排他的ヒト神経学的疾患である（６）。この疾患が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）などの白質の特異的構成成分に対する、細胞毒性Ｔセルに媒介される自己免疫攻撃により誘起されるということがいくつかの証拠により示されている（７、８）。ヒトでは、プレｍＲＮＡプロセシング中の代替エキソンスプライシングの結果、ＭＢＰ遺伝子が四つの生成物（ＭＢＰ、ＭＢＰΔＩＩ、ＭＢＰΔＶおよびＭＢＰΔＩＩ／Ｖ）を生じる（９）。これらの中でＭＢＰΔＩＩが成熟中枢神経系では最も豊富であり、一方全てのエキソンを含有するＭＢＰ体は実際には存在しない（９）。
【０１２７】
自己免疫応答媒介ＧＰ病およびＭＳにはいくつかの生物学的類似性が存在し、主に；１）両者ともに排他的な疾患であり典型的にはウイルス性インフルエンザ様の疾患後に始まる；２）ＩＩクラス  ＭＨＣのＨＬＡ−ＤＲ領域の同一のハロタイプに強力な連関が存在する；３）代替スプライシングによりいくつかの生成物を生じる；および４）ＧＰ病によるＭＳ患者の死亡が最近報告されている（１０）。
【０１２８】
材料および方法
合成ポリマー：ＧＰΔＩＩＩ由来のペプチド、ＱＲＡＨＧＱＤＬＤＡＬＦＶＫＶＬＲＳＰ（配列番号：４３）およびＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖ由来のペプチド、ＱＲＡＨＧＱＤＬＥＳＬＦＨＱＬ（配列番号：４４）をＢｏｃ−（メドプローブ）またはＦｍｏｃ−（カイロン、リポテック）化学のいずれかを用いて合成した。
【０１２９】
プラスミド構築および組換え発現
ＧＰ由来物質：他の場合に修飾ｐＥｔ１５ｂベクターのＢａｍＨＩ部位に、対応する組換えタンパク質を発現するｃＤＮＡをサブクローニングすることにより（５）、異なるＧＰスプライシング形態を表す構築物を得、ここで開始Ｍｅｔを除く外来性ベクター由来アミノ末端配列を排除した。ベクターをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより余分な配列を除去し、遊離末端をクレノウで埋め、再度ライゲートした。これにより両方の制限部位を再形成し、アミノ終止Ｍｅｔのコドンのすぐ下流にＢａｍＨＩ部位を置いた。
【０１３０】
ＧＰまたはＧＰΔＶ（配列番号：４６）を表す組換えタンパク質を沈殿により精製した（５）。ＧＰΔＩＩＩ（配列番号：４８）またはＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖ（配列番号：５０）を表す組換えタンパク質を含有する細菌性ペレットを４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）中で８Ｍの尿素、および超音波処理により溶解した。４００００ｘｇで遠心した後、上澄を０．２２μｍフィルターに通し、ＦＰＬＣ用にリソースＱカラムに注入した。溶出物をＨＣｌでｐＨ６まで酸性にし、２回目のＦＰＬＣ精製用に４０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）で予め平衡にしたリソースＳカラムに注入した。得られた溶出物中の物質をｉｎ  ｖｉｖｏリン酸化に用いた。
【０１３１】
ＭＢＰ由来物質：中枢神経系からの全ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲによりヒトＭＢＰΔＩＩ（配列番号：５１）を表すｃＤＮＡを得た。ヒトＭＢＰを表すｃＤＮＡはＣ．Ｃａｍｐａｇｎｏｎｉ（ＵＣＬＡ）から進呈された。両方のフラグメントをＣ末端で６ｘＨｉｓコーディング配列を含有するｐＨＩＬ−Ｄ２（インビトロゲン）の修飾体にクローニングし、各々ｐＨＩＬ−ＭＢＰΔＩＩ−ＨｉｓおよびｐＨＩＬ−ＭＢＰ−Ｈｉｓを作った。（１２）に記載するようにこれらのプラスミドを用いて組換え体をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに発現させた。固定金属アフィニティクロマトグラフィ（ＴＡＬＯＮ樹脂、クロンテック）を用いて、変性条件下（８Ｍ  尿素）組換えタンパク質を精製し、製造者の指示書に従って３００ｍＭ  イミダゾールで溶出した。次いでアフィニティ精製物質を５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴの８０容量に希釈することにより復元し、ＹＭ１０型膜（アミコン）を通して限外濾過することにより５０倍に濃縮した。クロンテックの形質転換体変異誘発キットを用いて構築物を含有する元来の配列で位置指定変異誘発によりＳｅｒからＡｌａへの変異体を作り、その結果得られるタンパク質は同様に製造された。
【０１３２】
リン酸化実験。基本的に前記のように（３および１２も参照のこと）リン酸化実験を行った。いくつかの実験では基質をインブロット復元し、次いでｒＧＰＢＰ０．５μｇを含有するリン酸化バッファー１００μｌを積層することにより、室温で３０分間リン酸化した。Ｖ８エンドペプチターゼを用いる消化および免疫沈澱を（３）に記載するように実施した。
【０１３３】
抗体生成。各々配列番号：４３または配列番号：４４に含まれるＧＰΔＩＩＩまたはＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／ＶのＣ末端分岐末端を表す合成ペプチドをグルタルアルデヒドカップリング標準法を用いてチトクロームＣ、ＢＳＡまたはオブアルブミンに抱合させた。得られたタンパク質抱合体をマウス免疫に用いてＧＰΔＩＩＩに特異的なポリクローナル抗体およびＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖに特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ１５３）を得た。ＧＰΔＶに特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ５Ａ）を得るために、配列番号５０を含んだ対応する代替型を表現する組換え細菌性タンパク質を用い、マウスを免疫した。ＧＰ代替体のＮ末端領域を表す配列番号２６に対するモノクローナル（Ｍ３／１、Ｐ１／２）またはポリクローナル（抗ＧＰｐｅｐ１）抗体の生成については前記した（３、５）。
【０１３４】
Ｂｏｃ基に基づくペプチド合成
構築。Ｂｏｃ−ベンジル法を用いて段階的固相合成によりペプチドを構築した。用いた出発樹脂はＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＰＡＭ樹脂（０．５６ｍｅｑ／ｇ、Ｒ４１０８バッチ）であった。用いた脱保護／カップリング方法は：ＴＦＡ（１ｘ１分）、ＴＦＡ（１ｘ３分）、ＤＣＭ（フローフラッシュ）、イソプロピルアルコール（１ｘ３０秒）、ＤＭＦ（３ｘ１分）、カップリング／ＤＭＦ（１ｘ１０分）、ＤＭＦ（１ｘ１分）、カップリング／ＤＭＦ（１ｘ１０分）、ＤＭＦ（２ｘ１分）、ＤＣＭ（１ｘ１分）：であった。各ステップでペプチド樹脂グラムあたり１０ｍｌを用いた。ＤＭＦ中ＢＯＰ、ＨｏｂｔおよびＤＩＥＡの存在下全アミノ酸（５倍過剰）のカップリングを実施した。以下の側鎖保護基を合成するために：セリンにベンジル；リジンに２クロロベンジルオキシカルボニル；アスパラギン酸およびグルタミン酸にはシクロヘキシル；ヒスチジンおよびアルギニンにはトシル：を用いた。
【０１３５】
切断。樹脂からペプチドを切断し、液体フッ化水素（ＨＦ）と反応させることにより十分に脱保護した：ペプチド樹脂グラムあたりＨＦ１０ｍｌを加え、捕捉剤としてｐ−クレゾールの存在下で、混合物を０℃下４５分間保持した。ＨＦを蒸発させた後、粗製反応混合物をエーテルで洗浄し、ＴＦＡに溶解し、エーテルで沈殿させ、乾燥した。
【０１３６】
精製。固定相：シリカＣ１８、１５μｍ、１２０Ａ；移動相：溶媒Ａ：水０．１％  ＴＦＡおよび溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ａ、６０／４０（容量／容量）；勾配：２０から６０％線形Ｂで３０分間；流速：４０ｍｌ／分；および検出はＵ．Ｖ．（２１０ｎｍ）。純度８０％以上の分画をプールし、凍結乾燥した。純度および同一性の対照を分析用ＨＰＬＣおよびＥＳ／ＭＳにより実施した。最終生成物の純度は８８％であり、実験上の分子量は２１９２．９であった。
【０１３７】
Ｆｍｏｃ−基盤のペプチド合成
構築。標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用いてＰｒｏ−クロロトリチル樹脂（０．６８５ｍｅｑ／ｇ）で段階的直線的固相によりペプチドを合成した。用いた脱保護／カップリング方法は：Ｆｍｏｃ  ａａ（０．６６ｇ）、ＨＯＢｔ（０．２６ｇ）、ＤＩＰＣＤＩ（０．２８ｍｌ）で４０分間であり、カイザー試験による対照に従った。試験が陽性であった場合、陰性に変化するまで時間を延長した。次いでＤＭＦ（３１分）、ピペリジン／ＤＭＦ  ２０％（１１分）、ピペリジン／ＤＭＦ  ２０％（１５分）およびＤＭＦ（４１分）。側鎖保護体は：アルギニンにＰｍｃ（ペンタメチルクロメーンスルホニル）、リジンにＢｃｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アスパルギン酸およびセリンにｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、並びにヒスチジンにＴｒｌ（トリチル）：であった。
【０１３８】
切断。ペプチドを切断し、処理切断物をＴＦＡ／水  ９０／１０と反応させることにより十分に脱保護した：樹脂グラムあたりＴＦＡ１０ｍｌを加えた。水は捕捉剤として作用する。２時間後、樹脂を濾過し、得られた溶液を冷ジエチルエーテルで５回沈殿させた。最終沈殿物を乾燥した。
【０１３９】
精製。固定相：クロマシルＣ１８、１０μｍ；移動相：溶媒Ａ：水０．１％ＴＦＡおよび溶媒Ｂ：アセトニトリル０．１％ＴＦＡ；定組成：２８％Ｂ；流速：５５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍ。高純度の分画をプールし、凍結乾燥し、第２巡のＨＰＬＣ精製を行った。純度および同一性の対照を分析用ＨＰＬＣおよびＥＳ／ＭＳにより実施した。最終生成物の純度は９７％であり、実験上の分子量は２１９０．９であった。
【０１４０】
結果
代替スプライシングによるヒトＧＰ抗原のリン酸化の制御。１次抗原（ＧＰ）または個々の代替生成物ＧＰΔＶ（配列番号：４６）、ＧＰΔＩＩＩ（配列番号：４８）およびＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖ（配列番号：５０）を表す細菌性組換えタンパク質を製造し、ＰＫＡによるリン酸化される能力を試験した（図１６、左のパネル）。標準的なＡＴＰ濃度（１５０μＭ）を使用して四つの組換え抗原全てがリン酸化されたが、程度は異なった。代替型は１次ＧＰ抗原よりも効率よく３２Ｐを取り込んだが、このことはこれらがよりよい基質であることを示唆している。これらの抗原が細胞外区画にあると考えられるので、より生理学的なＡＴＰ濃度（０．１から０．５μＭ）でまたリン酸化能力を検定した。これらの条件下では、１次および代替生成物間の３２Ｐ組み込みにおける差異がより明確であり、これは低ＡＴＰ濃度では１次ＧＰ抗原がキナーゼにはあまりよくない基質であることを示した。ＧＰ抗原に存在する三つのＰＫＡリン酸化部位の中で、Ｎ末端Ｓｅｒ９およびＳｅｒ２６が主要なものであり、検定した全ての生成物に共通である（３、５）。従って、全ポリペプチドのリン酸化で観察された差異はまた特異的Ｖ８消化および免疫沈澱後に決定されるように個々のＮ末端領域間にも存在した（図示せず）。これはリン酸化における差異が代替生成物における異なるＣ末端配列の存在によるものであることを強く示唆している。ＧＰΔＩＩＩおよびＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／ＶがＧＰΔＶよりも著明に高い３２Ｐ組み込み率を示し、これらはより短い分岐Ｃ末端領域を有するので（５）、別個にこれらのＣ末端配列を表す合成ペプチド（配列番号：４３、配列番号：４４）を用いてさらに元来の抗原のｉｎ  ｖｉｖｏリン酸化における制御的役割を試験した。ＩＶ型コラーゲンは三つの絡み合ったα鎖からなる三量体分子である。基底膜では、二つのＩＶ型コラーゲン分子がＮＣ１ドメインを介して集まり、細菌性コラゲナーゼ消化により溶解できる六量体ＮＣ１構造を生じる（１）。六量体構造の解離により単量体のＧＰ抗原およびジスルフィド関連の二量体を放出する（１）。以下の一連の実験のために、細胞外様の低ＡＴＰ濃度の存在下、単量体または六量体の両方の元来のＧＰ抗原を用いてリン酸化を実施した（図１６、右パネル）。各特異的ペプチドは存在するが対照ペプチドは存在しない場合（図示せず）、２２ｋＤａの見かけのＭＷを表示する単一のポリペプチドのリン酸化が誘起された。特異的Ｖ８消化および免疫沈澱により対応するポリペプチドが、以前に特徴づけされ、ＰＫＡに最適の基質であると同定されたα３（ＩＶ）ＮＣ１の２２ｋＤａの配座異性体として同定された（１１）。
【０１４１】
代替スプライシングによるＭＢＰのリン酸化の制御。ＭＢＰはＮ末端領域で、ＧＰ抗原生成物に存在するＮ末端部位（Ｓｅｒ９）に構造的に類似する２個のＰＫＡリン酸化部位（Ｓｅｒ８、Ｓｅｒ５７）を含有する（図１７）。全てのＭＢＰタンパク質に存在するＳｅｒ８部位はＧＰ由来のポリペプチドのＳｅｒ９よりも類似の位置にある。加えて、ＭＢＰおよびＧＰΔＩＩＩＳｅｒ８およびＳｅｒ９は各々対応するエキソンＩＩに存在する高度に相同なモチーフの１次構造で類似の距離にある（図１７の曲がった矢印）。ＧＰΔＩＩＩ由来のモチーフはＧＰ抗原系においてＳｅｒ９のＰＫＡリン酸化を上方制御するＣ末端分岐領域と一致する（図１６）。ＭＢＰにおける制御様配列はエキソンＩＩに位置し、最終生成物中のその存在は代替エキソンスプライシングメカニズムに依存する。従って、ＧＰΔＩＩＩに構造比較することにより同定されるＭＢＰモチーフはまたＳｅｒ８のＰＫＡリン酸化をも制御できる。我々はＭＢＰおよびＭＢＰΔＩＩ（配列番号：５４）を表す組換えタンパク質並びに対応するＳｅｒからＡｌａへの変異体を製造し、エキソンＩに存在する２個のＰＫＡリン酸化部位の各々（Ｓｅｒ８およびＳｅｒ９）をノックアウトした。続いてＰＫＡによるｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化を評価した（図１８）。ＭＢＰΔＩＩはＭＢＰよりも良好な基質であり、Ｓｅｒ８は主要なリン酸化部位であり、これはＧＰ抗原系に類似して、代替エキソンスプライシングが全てのＭＢＰ由来代替形態に共通するＮ末端領域に位置する特異的部位のＰＫＡリン酸化を制御することを示した。
【０１４２】
組換えＭＢＰタンパク質のＧＰＢＰリン酸化を評価する類似の実験では、ＧＰＢＰは優先的にＭＢＰをリン酸化し、一方ＭＢＰΔＩＩのリン酸化はほとんど観察されなかった（図１９）。さらに、組換えＳｅｒからＡｌａへの変異体は３２Ｐ組み込みにおいて有意な減少を示さず、これはＧＰＢＰが、ＰＫＡとは反対の方法でＭＢＰ／ＭＢＰΔＩＩをリン酸化し、これらの２個のキナーゼがＭＢＰタンパク質における主要なリン酸化部位を共有しないことを示した。
【０１４３】
これらの全データから、我々はＭＢＰ系においてＰＫＡまたはＧＰＢＰのいずれかにより、代替スプライシングが特異的セリンのリン酸化を制御すると結論づけた。
【０１４４】
ＧＰΔＩＩＩのＣ末端領域を表す合成ペプチドがＧＰＢＰリン酸化に影響する。ＧＰＢＰ活性に及ぼすＧＰΔＩＩＩのＣ末端領域の影響を評価するために、この領域を表すペプチドを二種の異なる化学反応（ＢｏｃまたはＦｍｏｃ）を用いて合成し、ＧＰＢＰを含有するリン酸化混合物に別個に添加した（図２０）。Ｂｏｃ基盤の合成ペプチドはＧＰＢＰ自己リン酸化に陽性に影響するが、Ｆｍｏｃ基盤のものはＧＰＢＰ自己リン酸化を阻止し、これはＧＰおよびＭＢＰ抗原系のいずれかで、代替生成物に由来する制御配列がＧＰＢＰのキナーゼ活性に影響しうることを示唆している。
【０１４５】
考察
我々はα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインが二つの異なるメカニズム：１）代替スプライシング（４、５）および２）１次生成物の立体配座異性体形成（１１）により複雑な構造多様性を作ることを示した。両方のメカニズムによりＰＫＡにより区別される生成物が生じるが、これはＰＫＡリン酸化がα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの生物学において重大な事象であることを示している。リン酸化は少なくとも部分的な折り畳みのみならず、ＩＶ型コラーゲンネットワークのα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの超分子集合体をも導く（１１およびＲａｙａら、結果は未発表）。α３（ＩＶ）ＮＣ１の配座異性体の変化によりＧＰ病を媒介する自己免疫応答に至り（１１）、これは抗原リン酸化の変化が疾患の発病における１次的事象であり得ることを示唆している。従って、いくつかのＧＰ腎臓においてＧＰΔＩＩＩの発現の増加が認められ（４およびＢｅｒｎａｌおよびＳａｕｓ、結果は未発表）、および別のグッドパスチャー患者においてＧＰＢＰの発現の増加が検出された（図１５）。代替ＧＰ抗原生成物の、およびＧＰＢＰの両方の発現増加はα３（ＩＶ）ＮＣ１のリン酸化の安定した状態、従って対応する立体配座形成過程にある結果であると考えられる。ＰＫＡによる異なる構造生成物間の区別はこのキナーゼ、または別の構造的に類似するキナーゼが生理学的抗原立体配座形成過程に関与し、ＧＰＢＰによる抗原リン酸化が発病原因の重要性を有することが強く示唆される。発病過程においてＧＰＢＰは介入性のキナーゼであり、リン酸化依存的立体配座形成過程に干渉する。従って、天然の自己免疫応答により標的化される組織構造においてＧＰＢＰが発現され、ＧＰＢＰの発現増加はいくつかの自己免疫状態に関係する（前記の実施例１および２を参照のこと）。
【０１４６】
代替スプライシングメカニズムはまたＭＢＰ抗原系において特異的セリンのＰＫＡリン酸化を制御する。ＭＢＰはまたＧＰＢＰの基質であり、これはＧＰＢＰが多発性硬化症、およびその他の自己免疫応答において病因的役割を果たし得ることを示唆している。
【０１４７】
前記の全データによりＧＰＢＰが自己免疫疾患の治療に可能性のある標的として同定される。図２０ではＧＰΔＩＩＩ（配列番号：４３）のＣ末端領域を表す合成ペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＰＢＰの作用を変調することを示し、従ってこの、および関連の配列が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＰＢＰの活性を変調するためのペプチド基盤の化合物として同定された。ＰＫＡによるＧＰ抗原リン酸化の誘導はＢｏｃ基盤のペプチドを用いたときに達成されたが、類似のＦｍｏｃ基盤のペプチドを用いたときには達成されなかった。さらに、Ｆｍｏｃ基盤ではなくＢｏｃ基盤のペプチドはＰＫＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ基質であり（図示せず）、これは両方の生成物間に重要な構造上の差異が存在することを示している。両生成物が質量分析法において有意な差異を示さなかったので、一つの可能性は、用いた異なる脱保護方法が生物学的活性に重大な２次構造における立体配座の差異の原因となり得るということである。従って、Ｂｏｃ基盤のペプチドは低温で長期保存したとき、ＰＫＡを誘起する能力を喪失する。
【０１４８】
実施例３の参考文献
１  Ｓａｕｓ，  Ｊ．（１９９８）グッドパスチャー症候群について：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第二版，Ｖｏｌ．  ２，Ｄｅｌｖｅｓ，  Ｐ．Ｊ．およびＲｏｉｔｔ，  Ｉ．Ｍ．編，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，ロンドン），ｐｐ．  １００５−１０１１．
２    Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，  Ｓ．，  Ｂｅｒｎａｌ，  Ｄ．，  Ｇａｒｃｉａ−Ｓｏｇｏ，  Ｍ．，  Ｅｌｅｎａ，  Ｓ．Ｆ．およびＳａｕｓ，  Ｊ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１９７８０−１９７８４
３  Ｒｅｖｅｒｔ，  Ｆ．，  Ｐｅｎａｄｅｓ  Ｊ．Ｒ．，  Ｐｌａｎａ，  Ｍ．，  Ｂｅｒｎａｌ，  Ｄ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｃ．，  Ｉｔａｒｔｅ，  Ｅ．，  Ｃｅｒｖｅｒａ，  Ｊ．，  Ｗｉｅｓｌａｎｄｅr，  Ｊ．，  Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，  Ｓ．およびＳａｕｓ，Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１３２５４−１３２６１
４  Ｂｅｒｎａｌ，  Ｄ．，  Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，  Ｓ．およびＳａｕｓ，  Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１２０９０−１２０９４
５    Ｐｅｎａｄｅｓ  Ｊ．Ｒ．，  Ｂｅｒｎａｌ，  Ｄ．，  Ｒｅｖｅｒｔ，  Ｆ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｃ．，  Ｆｒｅｓｑｕｅｔ，  Ｖ．Ｊ．，  Ｃｅｒｖｅｒａ，  Ｊ．，  Ｗｉｅｓｌａｎｄｅr，  Ｊ．，  Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，  Ｓ．およびＳａｕｓ，  Ｊ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９，７５４−７６０．
６  Ｒａｕｓ，  Ｊ．ＣＭ，多発性硬化症について：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第二版，Ｖｏｌ．  ３，（Ｄｅｌｖｅｓ，  Ｐ．Ｊ．およびＲｏｉｔｔ，  Ｉ．Ｍ．編）１７８６−１７８９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，ロンドン，  １９９８）．
７  Ｐｅｔｔｅ，  Ｍ．，  Ｆｕｊｉｔａ，  Ｋ．，  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｄ．，  Ａｌｔｍａｎｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，  Ｊ．，  Ｇｉｅｇｅｒｉｃｈ，  Ｇ．，  Ｈｉｎｋｋａｎｅｎ，  Ａ．，  Ｅｐｐｌｅｎ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｋａｐｐｏｓ，  Ｌ．およびＷｅｋｅｒｌｅ，  Ｈ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，７９６８−７９７２
８  Ｔｓｃｈｉｄａ，  Ｔ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｋ．Ｃ．，  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｒ．Ｖ．，  ＭｃＦａｒｌａｎｄ，  Ｈ．Ｆ．，  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．およびＢｉｄｄｉｓｏｎ，  Ｗ．Ｅ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，１０８５９−１０８６３．
９  Ｃａｍｐａｇｎｏｎｉ，  Ａ．Ｔ．（１９８８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５１，１−１４．
１０  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｓａｌｔｉｓｓｉ，  Ｄ．およびＰｅｎｄｅｒ，  Ｍ．Ｐ．（１９９８）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  ９８，１３４−１３５
１１  米国仮特許出願，出願番号割り当て未定，２０００年２月１１日登録（事件番号９８，７２３−Ｃ）
１２  Ｒａｙａ，  Ａ．，  Ｒｅｖｅｒｔ，  Ｆ．，  Ｎａｖａｒｒｏ，  Ｓ．およびＳａｕｓ，Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２６４２−１２６４９．
【０１４９】
本発明は前記の特定の好ましい態様により制限されない。通常の熟練した当業者には、本発明の概念から逸脱することなく、開示された好ましい態様に種々の改変を加えることができるだろう。かかる改変は全て本発明の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｎ４’のヌクレオチドおよび誘導アミノ酸配列。示した構造上の特徴は５’から３’末端で：元来のクローン（ＨｅＬａ１）に存在するｃＤＮＡは（点線の囲み）、これはＰＨ相同性ドメイン（黒色）およびＳｅｒ−Ｘａａ−Ｙａａ反復（灰色）を含有する；２分された核局在化シグナルを含有する予想できる高次らせん構造（開いた囲み）の７個の反復（灰色）；並びにセリンに富むドメイン（灰色ボックスで埋められている）である。アスタリスクはフレーム停止コドンを示す。
【図２】  ヒト組織（ノーザンブロット）および真核生物種（サザンブロット）におけるＧＰＢＰの分布。ランダムプライミング３２Ｐ標識ＨｅＬａ１  ｃＤＮＡプローブを用いて、提示したヒト組織（パネルＡ）からのポリ（Ａ＋）ＲＮＡのノーザンブロットにおいて、または提示した真核生物種（パネルＢ）からのゲノムＤＮＡのサザンブロットにおいて相同性メッセージを同定した。高度に厳密な条件下でノーザンハイブリダイゼーションを実施して完全な対合メッセージを検出し、サザンの低厳密性で誤対合のメッセージを検出できた。変性ゲル電気泳動により、または同一のロットからの代表的なブロットをヒトβアクチンｃＤＮＡでプローブする場合、個々のポリＡ＋ＲＮＡの品質および量において評価できる差異は観察されなかった。数字は用いたＲＮＡまたはＤＮＡマーカーの位置および大きさをｋｂで示す。
【図３】  翻訳出発部位の実験的決定。Ａ）では一過性の発現に用いられるｐｃ−ｎ４’およびｐｃ−ＦＬＡＧ−ｎ４’プラスミドに存在する２個のｃＤＮＡが黒線で示されている。対応する予想される（ｎ４’）または操作された（ＦＬＡＧ−ｎ４’）翻訳出発部位の相対位置を示す（Ｍｅｔ）。（Ｂ）では対照（−）、ｐｃ−ｎ４’、ｐｃ−ＦＬＡＧ−ｎ４’または（ＦＬＡＧ−ｎ４’）トランスフェクトした２９３細胞からの抽出物を還元条件下１０％  ゲル中ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア）に移し、指示した抗体でブロッティングした。数字および棒線は分子量をｋＤａで、および分子量マーカーの相対位置を各々示す。
【図４】  酵母および２９３細胞からのｒＧＰＢＰの特徴づけ。（Ａ）では酵母ｒＧＰＢＰの１μｇ（レーン１）または１００μｇ（レーン２および３）を１０％  ゲル中還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。分離したタンパク質をクーマシーブルーで染色する（レーン１）かまたは移動させて抗ＦＬＡＧ抗体（レーン２）かまたはＭａｂ１４すなわちＧＰＢＰに対するモノクローナル抗体（レーン３）でブロッティングした。（Ｂ）では、ＧＰＢＰ発現酵母からの細胞抽出物をＡのように分析し、各々抗ＦＬＡＧ（レーン１）、抗ＰＳｅｒ（レーン２）、抗ＰＴｈｒ（レーン３）または抗ＰＴｙｒ（レーン４）モノクローナル抗体でブロッティングした。（Ｃ）では酵母ｒＧＰＢＰ（レーン１）、脱リン酸化酵母ｒＧＰＢＰ（レーン２）または２９３細胞由来のｒＧＰＢＰ（レーン３）のいずれか２００ｎｇをＢのように指示した抗体を用いて分析した。（Ｄ）では類似の量のＨ３３２ＰＯ４標識トランスフェクトされていない（レーン１）、安定したｐｃ−ｎ４’トランスフェクトされた（レーン２）、一過性のｐｃ−ＦＬＡＧ−ｎ４’発現（レーン３）２９３細胞を溶解し、指示した抗体で沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した。分子量マーカーを図３のように数字および棒線で表す。矢印はｒＧＰＢＰの位置を示す。
【図５】  組換えＧＰＢＰはヒトＧＰ抗原のＮ末端領域を特異的にリン酸化するセリン／スレオニンキナーゼを含有する。リン酸化を評価するために、酵母ｒＧＰＢＰおよそ２００ｎｇを［γ］３２Ｐ−ＡＴＰと共にＧＰ抗原誘導物質の不在下（ＡまたはＢ）または存在下（Ｃ）インキュベートした。（Ａ）では混合物を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％  ゲル）およびオートラジオグラフィに供した。（Ｂ）では混合物を２次元薄層クロマトグラフィによる３２Ｐホスホアミノ酸分析に供した。ニンヒドリン染色ホスホアミノ酸の位置を点線の円で示す。（Ｃ）では指示したＧＰ誘導物質のリン酸化混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％  ゲル）およびオートラジオグラフィによりにより分析する（ＧＰｐｅｐ１およびＧＰｐｅｐ１Ａｌａ９）か、またはＭａｂ１７すなわちヒトおよびウシ由来のＧＰ抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体で免疫沈澱させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）およびオートラジオグラフィにより分析した（ｒＧＰ、ＧＰ）。ｒＧＰＢＰの相対位置（Ａ）、ｒＧＰ抗原および元来のヒトおよびウシＧＰ抗原（Ｃ）を矢印で示す。数字および棒線は前記の図面のように分子量マーカーを意味する。
【図６】  ｒＧＰＢＰに存在するセリン／スレオニンキナーゼのインブロット復元。酵母のｒＧＰＢＰ５μｇをインブロット復元した。抗ＦＬＡＧ抗体（レーン１）およびオートラジオグラフィにより検出される切片上３２Ｐ組み込み（レーン２）により組換え物質を特異的に同定した。数字および棒線は前記の図面のように分子量マーカーを意味する。矢印は８９ｋＤａ  ｒＧＰＢＰポリペプチドの位置を示す。
【図７】  ヒト組織におけるＧＰＢＰの免疫学的局在。ＧＰＢＰのＮ末端領域に対するウサギ血清（１：５０）を用いてヒト組織においてＧＰＢＰを局在化した。示した組織は腎臓（Ａ）、糸球体（Ｂ）、肺（Ｃ）、肺胞（Ｄ）、肝臓（Ｅ）、脳（Ｆ）、精巣（Ｇ）、副腎（Ｈ）、膵臓（Ｉ）および前立腺（Ｊ）である。抗ＧＰＢＰアフィニティ精製抗体または７個の異なるＧＰＢＰ特異的モノクローナル抗体からの培養培地のプール（抗ＧＰＢＰ  Ｍａｂｓ３、４、５、６、８、１０および１４）を用いて類似の結果が得られた。ウサギ前免疫血清はパラレル対照実験においていずれの組織構造をも染色しなかった。拡大図はＢおよびＤは１００倍で、それ以外は４０倍であった。
【図８】  ＧＰＢＰΔ２６はＧＰＢＰのスプライシング変種。（Ａ）正常の骨格筋からの全ＲＮＡをプライマー５３ｃを用いて逆転写し、続いてプライマー１１ｍ−５３ｃ（レーン２）または１５ｍ−６２ｃ（レーン４）を用いるＰＣＲに供した。同一のプライマー対を用いるＧＰＢＰ  ｃＤＮＡ含有プラスミドの対照増幅をレーン１およびレーン３に示す。左および右の数字は塩基対の分子量を意味する。正常な筋肉転写物で喪失した領域を同定し、そのヌクレオチド配列（小文字）および推定アミノ酸（大文字）を（Ｂ）に示す。目的のｃＤＮＡ領域を含むゲノムＤＮＡのクローンを配列決定し、その構造を（Ｃ）に描き、ＧＰＢＰΔ２６でスプライシングした７８ｂｐエキソン（黒色ボックス）、隣接エキソン（灰色ボックス）およびイントロン（線）の位置および相対的な大きさを示す。イントロンおよびエキソンの両方の大きさが得られ、イントロン−エキソン境界のヌクレオチド配列を示し、５’および３’スプライシング部位のコンセンサスを太字で示す。
【図９】  ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の差次的発現。７８ｂｐエキソン（ＧＰＢＰ）または両方のアイソフォーム（ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６）に共通の隣接配列を示すフラグメントを３２Ｐ標識し、これを用いてヒト組織および腫瘍の培養細胞株ノーザンブロット（クロンテック）をハイブリダイズした。膜を最初にＧＰＢＰ特異的プローブでハイブリダイズし、剥離し、次いでＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６プローブで再分析した。洗浄条件はＧＰＢＰ特異的プローブ用（０．１％  ＳＳＰＥ、３７℃または５５℃）にはＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６各々のシグナルを増強するＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６（０．１％  ＳＳＰＥ、６８℃）用ほど厳密ではない。洗浄プログラムが６８℃の場合、ＧＰＢＰプローブではシグナルが検出されなかった（図示せず）。
【図１０】  ＧＰＢＰΔ２６はＧＰＢＰよりも低いリン酸化活性を示す。（Ａ）組換え発現、アフィニティ精製ＧＰＢＰ（ｒＧＰＢＰ）（レーン１）またはｒＧＰＢＰΔ２６（レーン２）を還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシーブルー染色する（レーンあたり２μｇ）かまたはＦＬＡＧ配列（α−ＦＬＡＧ）またはＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６（Ｍａｂ１４）を認識するモノクローナル抗体でブロッティング（レーンあたり２００ｎｇ）した。（Ｂ）ｒＧＰＢＰ（レーン１）またはｒＧＰＢＰΔ２６（レーン２）２００ｎｇを、基質を用いずにｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化し、自己リン酸化を評価する（左）かまたは、５ナノモルＧＰｐｅｐ１を用いてトランスリン酸化活性（右）を測定した。矢印はペプチドの位置を示す。（Ｃ）ｒＧＰＢＰ（レーン１）またはｒＧＰＢＰΔ２６（レーン２）３μｇを材料および方法で記載するようにインブロット復元した。数字および棒線は各々分子量をｋＤａで、および分子量マーカーの相対位置を示す。
【図１１】  ｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰΔ２６は非常に活性な高分子量凝集体を形成する。ｒＧＰＢＰ（Ａ）またはｒＧＰＢＰΔ２６（Ｂ）約３００μｇを材料および方法で記載したゲル濾過ＨＰＬＣに供した。垂直方向の矢印および数字は各々用いた分子量標準の溶出プロフィールおよび分子量（ｋＤａ）を示す。大きな凝集体は空隙容量で溶出され（Ｉ）、サンプルに存在する物質の大部分は６６９および１５８ｋＤａマーカーの間の第２のピークとしてカラムの分画範囲に溶出された（ＩＩ）。指示した微小分画の１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色に供した。同一分画の５μｌを材料および方法に記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化し、ＳＤＳサンプルバッファー中沸騰させることにより反応を停止させる。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、ＰＶＤＦに移し、コダックＸ−オーマットフィルムを用いて１または２時間オートラジオグラフィに供し、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（シグマ）を用いてブロッティングした。
【図１２】  酵母２ハイブリッド系によるＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の自己相互作用。（Ａ）指示した組み合わせのプラスミドでトランスフェクトした細胞をロイシントリプトファン欠損培地（−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ）で選別し、別個の形質転換体を１ｍＭの３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）の存在下または不在下ヒスチジン欠損プレート（−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ）上で再度画線培養し、相互作用を評価した。画線培養の３日後に写真撮影した。（Ｂ）棒線は４個の別個のβガラクトシダーゼ溶液内アッセイのβガラクトシダーゼの任意のユニットの平均値を表す。
【図１３】  ＧＰＢＰは内皮および糸球体基底膜に結合して発現される。ヒト筋肉（Ａ）または腎臓皮質（Ｂ、Ｃ）のパラフィン包埋切片をＧＰＢＰ特異的抗体（Ａ、Ｂ）またはＭａｂ１８９すなわちヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１に特異的なモノクローナル抗体（Ｃ）でプローブした。ヒト腎臓の凍結切片（ＤからＦ）をＭａｂ１７すなわちヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインに特異的なモノクローナル抗体（Ｄ）、ＧＰＢＰ特異的抗体（Ｅ）、またはＧＰ患者からの血清（Ｆ）でプローブした。対照血清（ニワトリ前免疫およびヒト対照）はパラレル実験で組織結合性を示さなかった（図示せず）。
【図１４】  ＧＰＢＰはヒト腎臓皮質において発現するがウシおよびネズミ腎臓皮質では発現しない。ヒト（Ａ、Ｄ）、ウシ（Ｂ、Ｅ）またはネズミ（Ｃ、Ｆ）腎臓の皮質をパラフィン包埋し、ＧＰＢＰ特異的抗体（ＡからＣ）またはＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６特異的抗体（ＤからＦ）のいずれかでプローブした。
【図１５】  ＧＰＢＰはいくつかの自己免疫状態で高度に発現される。増幅プログラムにおいてオリゴヌクレオチド１５ｍおよび６２ｃを用いて、対照の個体から（レーン１）またはＧＰ患者から（レーン２）の骨格筋全ＲＮＡを図８のようにＲＴ−ＰＣＲに供した。凍結（ＢからＤ）またはパラフィン包埋（ＥからＧ）ヒト対照皮膚（Ｂ、Ｅ）またはＳＬＥ（Ｃ、Ｆ）または扁平苔癬（Ｄ、Ｇ）の影響を受けた皮膚をＧＰＢＰ特異的抗体でプローブした。
【図１６】  ＰＫＡによるＧＰ代替スプライシング生成物のリン酸化。左のパネルでは等モル量のｒＧＰの（レーン１）、ｒＧＰΔＶ（レーン２）、ｒＧＰΔＩＩＩ（レーン３）またはｒＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖ（レーン４）（ＧＰ５００ｎｇと等価）を指示したＡＴＰ濃度でリン酸化した。全リン酸化反応混合物の５分の１をゲル電気泳動により分離し、ＰＶＤＦに移し、オートラジオグラフィに供し（図示せず）、四つ全種を認識する特異的モノクローナル抗体であるＭ３／１で、または個々のＣ末端領域に特異的な抗体を用いてタンパク質をブロッティングした（図示せず）。矢印は上から下にＧＰ、ＧＰΔＶおよびＧＰΔＩＩＩ−ＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖの各組換えタンパク質の位置を示し、これらは同一の移動性を表した。右パネル：精製α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインまたはヘキサマーをＧＰΔＩＩＩ（レーン２）またはＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖ（レーン３）のいずれかのＣ末端領域を表すペプチド１０ナノモルの存在下または不在下（レーン１）、ＰＫＡおよび０．１μＭ  ＡＴＰでリン酸化した。指示する場合、精製α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインのリン酸化混合物をＶ８消化し、ヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインのＮ末端に特異的な抗体で免疫沈澱させた（３）。棒線および数字は分子量マーカーの位置および大きさ（ｋＤａ）を示す。
【図１７】  ＧＰΔＩＩＩおよびＭＢＰの配列アラインメント。ＰＫＡのリン酸化部位（囲み）およびＭＢＰおよびＧＰΔＩＩＩのＳｅｒ８および９の部位に関する構造類似性を各々示す（下線）。両方の分子種の対応するエキソンＩＩ（曲がった矢印）の同一性（垂直棒線）および化学的相同性（点線）を示す。コラゲナーゼ切断部位（７２残基）からのＧＰΔＩＩＩ完全配列を、エキソンＩおよびエキソンＩＩの１０個の残基を含むＭＢＰの６９Ｎ末端残基で整列させた。
【図１８】  ＰＫＡによる組換えＭＢＰタンパク質のリン酸化。約２００ｎｇのｒＭＢＰ（レーン１）、もしくは８位置（レーン２）もしくは５７位置（レーン３）でのそれのＳｅｒからＡｌａへの変異体、またはｒＭＰＢΔＩＩ（レーン４）もしくは８位置（レーン５）もしくは５７位置（レーン６）でのそれのＳｅｒからＡｌａへの変異体をＰＫＡおよび０．１μＭ  ＡＴＰでリン酸化した。混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦに移し、オートラジオグラフィに供し（リン酸化）、個々の分子種をロッシュモレキュラーバイオケミカルズ（ウェスタン）から入手のヒトＭＢＰに対するモノクローナル抗体でブロッティングした。
【図１９】  ＧＰＢＰによる組換えＭＢＰタンパク質のリン酸化。約２００ｎｇのｒＭＢＰ（レーン１）、もしくは８位置（レーン２）もしくは５７位置（レーン３）でのそれのＳｅｒからＡｌａへの変異体、またはｒＭＰＢΔＩＩ（レーン４）もしくは８位置（レーン５）もしくは５７位置（レーン６）でのそれのＳｅｒからＡｌａへの変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦに移し、タンパク質を含有する部分をポンソーで可視化し、剥離した。固定したタンパク質を材料および方法で記載したＧＰＢＰで切片上でリン酸化し、オートラジオグラフィに供し（リン酸化）、続いて図１８のようにブロッティングした（ウェスタン）。
【図２０】  ＧＰΔＩＩＩのＣ末端領域によるＧＰＢＰの制御。約２００ｎｇのｒＧＰＢＰを、１５０μＭのＡＴＰを用い、Ｂｏｃ−（レーン２）またはＦｍｏｃ−（レーン３）化学反応のいずれかを用いて合成したＧＰΔＩＩＩ誘導ペプチド５ナノモルの存在下または不在下で（レーン１）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化した。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦに移し、オートラジオグラフィに供して自己リン酸化を評価し、続いて抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（シグマ）を用いてブロッティングし、存在する組換え物質の量を決定した（ウェスタン）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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