(57)【要約】本発明は、破骨細胞形成シグナルを制御する方法を提供する。ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化することにより、破骨細胞形成の過程を抑制できることを見出した。ＩＩ型ＩＦＮシグナルの活性化により、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＴＲＡＦ６蛋白質の発現がダウンレギュレートされ、破骨細胞形成が抑制された。ＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）は、用量依存的に破骨細胞形成を抑制する作用を示した。ＩＩ型ＩＦＮによる破骨細胞形成抑制には、Ｓｔａｔ１を介するシグナルが重要であることが判明した。本発明により、自己免疫性関節炎を含む、病的骨破壊を伴う疾患に対する多くの新たな治療戦略が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞前駆細胞におけるＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制する工程を含む、破骨細胞形成シグナルを制御する方法。
【請求項２】
破骨細胞前駆細胞におけるＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制する工程を含む、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかを制御する方法。
（ａ）破骨細胞形成
（ｂ）ＲＡＮＫシグナル伝達
（ｃ）ＴＲＡＦ６発現またはその機能
（ｄ）骨吸収
【請求項３】
破骨細胞前駆細胞におけるＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程を含む、炎症性骨破壊の抑制方法。
【請求項４】
ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達がＳｔａｔ１を介するシグナル伝達である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の促進または抑制が、ＩＩ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進または抑制である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＩＩ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進を、下記（ａ）または（ｂ）に記載の工程により行う、請求項５に記載の方法。
（ａ）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドの投与
（ｂ）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを発現するベクターの投与
【請求項７】
リガンドがＩＦＮ−γである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収に及ぼす化合物の効果を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、破骨細胞前駆細胞におけるＲＡＮＫシグナル伝達、並びにＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、を含む方法。
【請求項９】
（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、破骨細胞前駆細胞におけるＲＡＮＫシグナル伝達、並びにＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、
（ｃ）対照の条件下に比べ、該（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１０】
ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達がＳｔａｔ１を介するシグナル伝達である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の促進が、ＩＩ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＩ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進を、下記（ａ）または（ｂ）に記載の工程により行う、請求項１１に記載の方法。
（ａ）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドの投与
（ｂ）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを発現するベクターの投与
【請求項１３】
リガンドがＩＦＦ−γである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドまたは該リガンドを発現するベクターを含む、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の薬剤。
（ａ）破骨細胞形成抑制剤
（ｂ）ＲＡＮＫシグナル伝達抑制剤
（ｃ）ＴＲＡＦ６抑制剤
（ｄ）骨吸収抑制剤
【請求項１５】
ＩＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドがＩＦＮ−γである、請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドまたは該リガンドを発現するベクターを含む、骨破壊を抑制するための医薬組成物。
【請求項１７】
自己免疫性関節炎における骨破壊の予防または治療に用いられる、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は破骨細胞形成シグナルを制御する方法に関する。より具体的には、破骨細胞形成を制御する方法に関する。
背景技術
骨量は、骨芽細胞性骨形成（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ　ｂｏｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と破骨細胞性骨吸収（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｉｃ　ｂｏｎｅ　ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）の協調的なバランスの上に維持されている。骨吸収の異常は、骨粗鬆症、骨関節炎、転移性骨癌、ならびに慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）および歯周病などの炎症性骨疾患を含む様々な骨代謝疾患に関与している。従って、破骨細胞による骨吸収を効果的に調節することが極めて重要である。しかしながら、病的骨吸収を制御できる有効な治療法は確立されていない。
免疫応答は宿主にとって重要な防御機構であるが、免疫系は骨吸収にも関与しており、ある種の自己免疫状態などで見られる長期にわたる異常な活性化は、エフェクター細胞による組織破壊を引き起こすことがある（Ｒｏｏｄｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７，１２２９−４１（１９９９）；Ｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ．２０，３４５−５７（１９９９））。例えば自己免疫性関節炎においては、破骨細胞による骨吸収の増強により深刻な骨破壊が進み、進行性の関節破壊がもたらされる（Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　４０２，３０４−９（１９９９）；Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４，１３７−４６（１９９９））。このような関節組織では、Ｔ細胞におけるＲＡＮＫＬの発現が重要な役割を果たしている。ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　κＢ　ｌｉｇａｎｄ，別名ＴＲＡＮＣＥ／ＯＰＧＬ／ＯＤＦ）は破骨細胞形成に必須のＴＮＦファミリー因子であり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて活性化Ｔ細胞がＲＡＮＫＬを産生して破骨細胞形成を誘導することが報告されている（Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３９７，３１５−２３（１９９９）；Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　４０２，３０４−９（１９９９）；Ｈｏｒｗｏｏｄ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６５，１４４−５０（１９９９））。しかしながら、活性化Ｔ細胞が、ＲＡＮＫＬの作用を相殺することにより骨のホメオスタシスの維持に関与する作用を持つことは知られていない。ＲＡＮＫＬに加え、Ｔ細胞で発現する他の免疫調節因子も破骨細胞形成を調節しているが（Ｒｏｏｄｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７，１２２９−４１（１９９９）；Ｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ．２０，３４５−５７（１９９９）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７，３５４４−９（１９８６））、その調節の分子機構は知られていない。
発明の開示
本発明は、破骨細胞形成シグナルを制御する方法を提供することを課題とする。本発明の方法により、破骨細胞形成を制御することができる。具体的には、本発明は破骨細胞形成に関与するＲＡＮＫＬシグナル伝達の作用を制御する方法を提供する。さらに本発明は、破骨細胞形成に関与するＴＲＡＦ６の発現もしくはその機能、またはその両方を制御する方法を提供する。本発明により、骨吸収および骨破壊を制御することが可能となる。また本発明は、これらの制御に用いるための薬剤を提供することを課題とする。また本発明は、破骨細胞形成または骨破壊を制御するための医薬を提供することを課題とする。
本発明者らは、破骨細胞形成の調節機構にＩＩ型インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ；ＩＦＮ）を介したシグナル伝達が関与している可能性を検証するため、ＩＦＮ−γ受容体（ＩＦＮ−γＲ）の成分の１つであるＩＦＮＧＲ１を欠損したマウス（ＩＦＮ−γＲ−／−マウス）を用いてエンドトキシンによる骨吸収の誘導を行い、ＩＩ型ＩＦＮシグナルの欠損が及ぼす破骨細胞形成への影響を調べた。その結果、ＩＦＮ−γＲ−／−マウスは、野生型マウスに比べ破骨細胞形成が増強され、骨破壊の顕著な増悪化が起こることを見出した。最近、自己免疫性関節炎において、活性化Ｔ細胞がＲＡＮＫＬの発現を通して破骨細胞形成を促進し、骨消失を調節していることが報告されている（Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　４０２，３０４−９（１９９９））。これに対し本発明者らの得た知見は、活性化Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γの産生を通して破骨細胞形成を負に調節する能力も保持していることを示すものである。すなわち、Ｔ細胞によるＲＡＮＫＬおよびＩＦＮ−γの発現のバランスが、破骨細胞形成の調節および骨組織の維持に重要であることが判明した。
ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞が破骨細胞形成に及ぼす影響を調べるため、次にｉｎ　ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成系において活性化Ｔ細胞の影響を調べた。具体的には、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて破骨細胞前駆細胞である骨髄単球・マクロファージ系前駆細胞（ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ；ＢＭＭｓ）をＭ−ＣＳＦ存在下でＲＡＮＫＬで刺激して破骨細胞形成を誘導する系において、ＢＭＭを活性化Ｔ細胞と共培養する実験を行った。その結果、抗ＣＤ３抗体で活性化させたＴ細胞と共にＢＭＭを共培養した場合には、ＢＭＭの破骨細胞形成は強く阻害されることが判明した。ＩＦＮ−γＲ−／−由来のＢＭＭを用いた場合、活性化Ｔ細胞による破骨細胞形成の阻害効果は失われた。また、活性化Ｔ細胞の培養上清は、ＢＭＭの破骨細胞形成を阻害する作用を示したが、この阻害効果は抗ＩＦＮ−γ抗体により中和されることが確認された。これらの結果から、ＩＦＮ−γはＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞形成を抑制することが明らかとなった。ＲＡＮＫＬによるＢＭＭの破骨細胞形成は、活性化Ｔ細胞の代わりに組み換えＩＦＮ−γを用いた場合でも阻害され、過剰量のＲＡＮＫＬ存在下においても、極めて低いレベルのＩＦＮ−γが破骨細胞形成を強く阻害した。
ＩＦＮ−γによる破骨細胞形成阻害のシグナル伝達経路をさらに詳細に調べるため、ＩＦＮ−γＲ−／−、Ｓｔａｔ１−／−、またはＩＲＦ−１−／−マウス由来のＢＭＭを用いて、ＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成に及ぼすＩＦＮ−γの効果を検証した。その結果、ＩＦＮ−γＲ−／−マウスまたはＳｔａｔ１−／−マウスでは、ＩＦＮ−γによる破骨細胞形成の抑制能が顕著に低下したが、ＩＲＦ−１−／−マウスでは野生型マウスと同様のＩＦＮ−γによる阻害効果が観察された。この事実は、Ｓｔａｔ１（ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−１）を介するシグナル伝達の活性化が、破骨細胞形成の抑制に本質的な役割を果たすことを示している。このことから、ＲＡＮＫＬシグナル伝達経路のＩＦＮ−γによる抑制には、Ｓｔａｔ１（ＧＡＦ）を介し、ＩＲＦ−１に非依存的な遺伝子誘導経路が重要であることが示された。
ＲＡＮＫＬがその受容体であるＲＡＮＫを刺激すると、ＲＡＮＫはアダプター蛋白質であるＴＲＡＦ（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ）ファミリーを誘導し、ＮＦ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ）−κＢおよびＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−Ｊｕｎ　Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｋｉｎａｓｅ／ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）経路を活性化する（Ｄｏｕｇａｌｌ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１３，２４１２−２４（１９９９）；Ｈｓｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ　９６，３５４０−５（１９９９））。ＲＡＮＫＬで誘導されるＮＦ−κＢとＪＮＫの活性化を、ＩＦＮ−γ処理したＢＭＭにおいて調べたところ、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫ両者の活性化はＩＦＮ−γにより阻害されることが判明した。また、ＲＡＮＫシグナル伝達経路の下流のエフェクター分子であるＴＲＡＦ６の発現が、ＩＦＮ−γにより顕著に低下することが見出された。ＢＭＭにおいてＴＲＡＦ６遺伝子を外来的に導入して強制発現させたところ、このＢＭＭはＩＦＮ−γによる破骨細胞形成の阻害に対して抵抗性を示し、ＲＡＩＮＫＬ刺激によりＮＦ−κＢおよびＪＮＫの活性化が起こり破骨細胞への分化が誘導された。これらの分化した細胞はカルシトニン受容体を発現し、象牙（ｄｅｎｔｉｎ）切片上で骨吸収活性を示した。これらの結果は、ＩＦＮ−γによる破骨細胞形成の抑制の少なくても一部が、ＴＲＡＦ６発現の低下を介していることを示している。
本発明は、Ｔ細胞の活性化において、ＩＦＮ−γが石灰化組織の破壊を保護するという、ＩＦＮ−γの新たな生物学的機能を明らかにする。本発明により得られた知見は、破骨細胞の形成は、ＲＡＮＫＬとＩＦＮ−γとの間のバランスによって調節されていることを示している。ＩＦＮ−γ受容体欠損マウスで観察されたコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）における所見（Ｍａｎｏｕｒｙ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，５５０１−６（１９９７）；Ｖｅｒｍｅｉｒｅ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．ｍｍｕｎｏｌ．１５８，５５０７−１３（１９９７））は、破骨細胞分化に対するこのＩＦＮ−γの抑制効果により、少なくとも部分的に説明することが可能である。例えば、エンドトキシン誘導性の骨吸収モデルで見られるように、急性免疫反応期においてはＩＦＮ−γ産生が増強され、ＲＡＮＫＬの発現増加を相殺して異常な破骨細胞形成は抑制されると考えられる。これに対し、慢性関節リウマチにおける慢性滑膜炎においては、このバランス作用はＲＡＮＫＬ発現の方に傾くと思われる。これに関して、関節炎を起した関節には、有意なＴ細胞の浸潤が見られるにもかかわらずＩＦＮ−γの発現は抑制されており（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．＆　Ｚｖａｉｆｌｅｒ，Ｎ．Ｊ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．３３，７６８−７３（１９９０）；Ｋｉｎｎｅ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１３６０，１０９−４１（１９９７））、一方、ＲＡＮＫＬの発現は増強されている（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４３，２５９−６９（２０００）；Ｇｒａｖａｌｌｅｓｅ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４３，２５０−８（２０００））ことは注目に値する。すなわち、ＩＦＮ−γの欠乏とＲＡＮＫＬの発現増強が、関節炎における破骨細胞形成の活性化に貢献していると考えられる。従って、この関節の破骨細胞前駆細胞におけるＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進させることによって、破骨細胞の異常形成を抑制し、骨破壊を防止することが可能となる。
また本発明により、ＩＦＮ−γを介する破骨細胞形成の抑制において、ＴＲＡＦ６は重要な標的分子であることが示された。これは、炎症性骨疾患を含む病的骨吸収に対する特異的治療薬開発にとって、ＴＲＡＦ６を標的とした薬剤を開発することが極めて重要であることを示している。
本発明により、以下のような骨代謝疾患に対する新たな治療的アプローチが可能となる。
１）破骨細胞の生成および活性の制御は骨代謝疾患の予防および治療に有効である。特に自己免疫性関節炎に対して効果を有する。
２）ＲＡＮＫＬシグナル伝達経路の阻害は、自己免疫性関節炎を含む骨代謝疾患における有効な治療戦略となる。
３）ＴＲＡＦ６は、自己免疫性関節炎を含む骨代謝疾患の予防および治療における有効な標的分子である。
４）ＩＩ型ＩＦＮ（例えばＩＦＮ−γ）は自己免疫性関節炎を含む骨代謝疾患の予防および治療に有効である。
このように本発明者らは、破骨細胞形成の新規な調節機構を解明し、破骨細胞による異常な骨吸収を制御する方法を開発するに至った。すなわち本発明は、破骨細胞形成シグナルを制御する方法、並びに該制御に用いるための薬剤および医薬に関し、より具体的には、
（１）破骨細胞前駆細胞におけるＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制する工程を含む、破骨細胞形成シグナルを制御する方法、
（２）破骨細胞前駆細胞におけるＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制する工程を含む、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかを制御する方法、
（ａ）破骨細胞形成
（ｂ）ＲＡＮＫシグナル伝達
（ｃ）ＴＲＡＦ６発現またはその機能
（ｄ）骨吸収
（３）破骨細胞前駆細胞におけるＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程を含む、炎症性骨破壊の抑制方法、
（４）ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達がＳｔａｔ１を介するシグナル伝達である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（５）ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の促進または抑制が、ＩＩ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進または抑制である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（６）ＩＩ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進を、下記（ａ）または（ｂ）に記載の工程により行う、（５）に記載の方法、
（ａ）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドの投与
（ｂ）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを発現するベクターの投与
（７）リガンドがＩＦＮ−γである、（５）または（６）に記載の方法、
（８）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収に及ぼす化合物の効果を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、破骨細胞前駆細胞におけるＲＡＮＫシグナル伝達、並びにＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、を含む方法、
（９）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、破骨細胞前駆細胞におけるＲＡＮＫシグナル伝達、並びにＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、
（ｃ）対照の条件下に比べ、該（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１０）ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達がＳｔａｔ１を介するシグナル伝達である、（８）または（９）に記載の方法、
（１１）ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の促進が、ＩＩ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進である、（８）または（９）に記載の方法、
（１２）ＩＩ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進を、下記（ａ）または（ｂ）に記載の工程により行う、（１１）に記載の方法、
（ａ）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドの投与
（ｂ）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを発現するベクターの投与
（１３）リガンドがＩＦＮ−γである、（１１）または（１２）に記載の方法、（１４）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドまたは該リガンドを発現するベクターを含む、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の薬剤、
（ａ）破骨細胞形成抑制剤
（ｂ）ＲＡＮＫシグナル伝達抑制剤
（ｃ）ＴＲＡＦ６抑制剤
（ｄ）骨吸収抑制剤
（１５）ＩＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドがＩＦＮ−γである、（１４）に記載の薬剤、
（１６）ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドまたは該リガンドを発現するベクターを含む、骨破壊を抑制するための医薬組成物、
（１７）自己免疫性関節炎における骨破壊の予防または治療に用いられる、（１６）に記載の医薬組成物、に関する。
本発明はＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制することにより、破骨細胞形成シグナルを制御する方法に関する。本発明において「破骨細胞形成シグナル」とは、破骨細胞形成を誘導する過程および破骨細胞形成により誘導される過程における作用または該作用の一部を指す。これらの作用には、遺伝子の発現、細胞の形態および機能変化を含む表現型の変化、ならびにこれらの表現型の変化により引き起こされる代謝活動などが含まれる。ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することによって、破骨細胞形成シグナルは阻害され骨吸収が抑制される。逆にＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を抑制することによって、破骨細胞形成シグナルの阻害が低下し骨吸収が促進される。
破骨細胞は、造血幹細胞を起源とするマクロファージ・単球系細胞（ＣＦＵ−Ｍ）より分化した単核の破骨細胞前駆細胞が融合して形成される多核巨細胞である（Ｕｄａｇａｗａ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：７２６０，１９９０）。一般に成熟した破骨細胞は、酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）、カルシトニン受容体、ヴィトロネクチン受容体、およびＭ−ＣＳＦ受容体（ｃ−Ｆｍｓ）を発現し、骨吸収能を示す。破骨細胞形成は、これらの指標の少なくとも１つをもとに判断することができる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系において、骨髄単球・マクロファージ系前駆細胞（ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ；ＢＭＭｓ）は、Ｍ−ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；マクロファージコロニー刺激因子）存在下でＲＡＮＫＬの刺激により破骨細胞に分化する。これらの因子以外にも、炎症性関節炎などにおける骨破壊には、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｕｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）−α、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）−２、およびＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）などのサイトカインや増殖因子が関与している。破骨細胞が骨吸収を行う際には、明帯（ｃｌｅａｒ　ｚｏｎｅ）と呼ばれるアクチンに富んだ部位で骨に接触し、波状縁（ｒｕｆｆｌｅｄ　ｂｏｒｄｅｒ）という膜陥入構造を形成し、プロトンポンプによる酸性環境下でマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カテプシンなどの基質分解酵素を自ら産生することにより骨基質が分解される。本発明によれば、このような破骨細胞の分化および骨吸収などを誘導する破骨細胞形成シグナルを、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の調節により制御することができる。すなわち、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することにより骨破壊を抑制し、逆にＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を抑制することによって、骨破壊を促進することができる。
また、上記のように、一般に破骨細胞の形成は、Ｍ−ＣＳＦ存在下、ＲＡＮＫＬにより誘導される。ＲＡＮＫＬは細胞表面に発現するＲＡＮＫ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　κＢ）のリガンドであり、ＲＡＮＫを介したシグナル伝達を誘導する。ＲＡＮＫの活性化により、シグナルはＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、および他のＴＲＡＦファミリー因子を含むエフェクター分子を介して下流に伝達され、破骨細胞への分化および活性化を促し破骨細胞を形成させる。破骨細胞の形成には、ＲＡＮＫＬ以外にＴＮＦαおよびＩＬ−１も関与しており、ＴＮＦαはＩ型およびＩＩ型ＴＮＦ受容体を介して、またＩＬ−１はＩＬ−１受容体を介して破骨細胞形成シグナルを伝達する。また、ＴＲＡＦファミリー因子は、ＴＮＦ受容体およびＩＬ−１受容体を介するシグナルにも関与しており、例えばＴＲＡＦ６はＩＬ−１受容体のアダプター分子としても機能する。ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制することにより、これらの破骨細胞形成シグナルをそれぞれ抑制または促進することが可能である。
実施例２に示されるように、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制することにより、特にＲＡＮＫシグナル伝達を効果的に制御することができる。Ｍ−ＣＳＦに依存するＢＭＭの増殖に対しては、ＩＦＮ−γは比較的穏やかな抑制効果を示す一方、ＲＡＮＫシグナルにより誘導される破骨細胞形成は、極めて低いレベルのＩＦＮ−γでも強い阻害作用を示した（図３）。さらにＩＦＮ−γは、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬに依存して分化するＢＭＭｓの破骨細胞形成を阻害するのみならず、Ｍ−ＣＳＦ非依存性のマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７のＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成も阻害する。これらの知見は、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することにより、ＲＡＮＫシグナル伝達を特に選択的に抑制することができることを示している。逆にＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を抑制することにより、ＲＡＮＫシグナル伝達の阻害を低下させることができる。「ＲＡＮＫシグナル伝達」とは、ＲＡＮＫを介した一連のシグナル伝達またはその一部を指し、ＲＡＮＫの下流のシグナル分子の活性化や発現の上昇、標的遺伝子発現の誘導、ＲＡＮＫの活性化により引き起こされる細胞の形質変化などを含む。これらには、ＴＲＡＦ６の発現上昇、ＴＲＡＦ６の活性化、ＴＲＡＦ６を介するシグナル伝達、ＮＦ−κＢの活性化、ＪＮＫの活性化（リン酸化）を含むＭＡＰＫシグナル伝達の活性化が挙げられる。またこれらには、破骨細胞形成、並びにＴＲＡＰ、カルシトニン受容体、およびヴィトロネクチン受容体等の破骨細胞で発現される遺伝子の発現誘導、さらには骨吸収能の獲得などが挙げられる。
また、実施例３に示されるように、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の促進は、ＴＲＡＦ６の発現を顕著に阻害することが判明した。イムノブロット解析の結果は、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の促進が、ＴＲＡＦ６蛋白質レベルを有意に低下させることを示している（図６ｃ）。従って、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することにより、ＲＡＮＫシグナルによるＴＲＡＦ６発現を抑制することが可能である。ＴＲＡＦ６の発現を抑制することによりＴＲＡＦ６の機能は抑制される。ＴＲＡＦ６の機能としては、例えばＴＲＡＦ６が関与するシグナル伝達が挙げられる。すなわち、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することにより、ＴＲＡＦ６が関与するシグナル伝達を抑制することができる。ＴＲＡＦ６はＲＡＮＫシグナル伝達以外にも、ＣＤ４０、ｐ７５ＮＴＲ、およびＴｏｌｌ／ＩＬ−１受容体ファミリーのシグナル伝達にも関与していることが示唆されている。例えば、ＴＲＡＦ６はＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）−２やＴＬＲ−４などを含むＬＰＳ／エンドトキシンシグナルにも関与している。本発明の方法を用いてＴＲＡＦ６発現を制御することにより、これらのＴＲＡＦ６を介するシグナル伝達を制御し得る。ＴＲＡＦ６の発現または機能を阻害する方法が、破骨細胞を抑制する創薬の際の１つの代替戦略ともなることが示唆される。
本発明において「ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達」とは、ＩＩ型ＩＦＮにより誘導されるシグナル伝達またはその一部を言う。すなわち、ＩＩ型ＩＦＮにより誘導されるシグナル伝達、ＩＩ型ＩＦＮ受容体の活性化により誘導されるシグナル伝達、およびＩＩ型ＩＦＮ受容体の下流のエフェクター分子により誘導されるシグナル伝達などは、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達に含まれる。本発明においてＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達は、好適には、ＩＩ型ＩＦＮ受容体の活性化により誘導されるシグナル伝達を言う。
ＩＩ型ＩＦＮとしてはＩＦＮ−γが挙げられ、ＩＦＮ−γはＩＩ型ＩＦＮ受容体（ＩＦＮ−γＲ）のリガンドとして機能してＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化する。ＩＩ型ＩＦＮ受容体にＩＦＮ−γ等のリガンドが結合すると、ＩＩ型ＩＦＮ受容体はＪＡＫファミリー（ＪＡＫ１およびＪＡＫ２等）のチロシンキナーゼの活性化を通してＳｔａｔファミリー（Ｓｔａｔ１等）がリン酸化される。Ｓｔａｔ１ダイマーはＧＡＦ（ＩＦＮ−γ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ）とも呼ばれ、このリン酸化されたダイマーが核に移行しＧＡＳ（ＩＦＮ−γ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に結合して標的遺伝子群の転写を促進する。このように、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達としては、Ｓｔａｔ１（ＧＡＦ）を介するシグナル伝達が挙げられる。また、ＩＲＦ−１もＩＦＮ−γの標的遺伝子の発現を増強する。
ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化するには、例えばＩＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドを作用させる。ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドとしては、ＩＦＮ−γが挙げられる。また、ＩＲＦ−１の発現によりＩＦＮ−γ発現を誘導してもよい。また、ＩＩ型ＩＦＮ受容体の下流のシグナル伝達を活性化することもできる。なかでも、Ｓｔａｔ１を介するシグナル伝達を促進することが好ましい。例えば、ＧＡＦ活性化を促進することにより、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化することができる。また、ＧＡＳ応答性の遺伝子群の発現を促進することにより、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化することもできる。
ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を抑制するには、例えばＩＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドを取り除いたり、リガンドと受容体との結合を阻害する。例えば、リガンドに対する抗体を投与することによりリガンドを中和することができる。また、ＩＦＮ−γ発現を抑制する因子、すなわち他のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０を含む）などや、転写抑制因子によりＩＦＮ−γ発現を抑制してもよい。また、ＩＩ型ＩＦＮ受容体の下流のシグナル伝達を抑制してもよい。
また、例えば活性化型ＪＡＫを細胞で発現させるなど、細胞内におけるＪＡＫファミリーのチロシンキナーゼ活性を上昇させることにより、Ｓｔａｔ１の二量体化を促進してＩＩ型ＩＦＮシグナルを促進することも可能である。逆にＪＡＫを阻害すればＩＩ型ＩＦＮシグナルを抑制することができる。また、Ｓｔａｔ１は核内でＣＢＰ／ｐ３００等の転写コアクチベーターと結合して転写活性が促進される。そこで、ＣＢＰ／ｐ３００等を過剰発現したり、これらとＳｔａｔ１との結合能を高めれば、ＩＩ型ＩＦＮシグナルは亢進する。逆に、ＣＢＰ／ｐ３００等とＳｔａｔ１との結合を阻害すれば、ＩＩ型ＩＦＮシグナルを阻害することができる（Ｈｏｒｖａｉ，Ａ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：１０７４−１０７９（１９９７））。
ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の制御を行う標的となる細胞は、破骨細胞前駆細胞である。本発明において「破骨細胞前駆細胞」とは、破骨細胞に分化し得る細胞を指す。このような細胞としては、破骨細胞に分化し得るマクロファージ・単球系細胞等が含まれる。具体的には、骨髄マクロファージ系細胞や滑膜マクロファージなどの、骨軟骨組織に存在するマクロファージ系細胞（例えばマクロファージ・単球系前駆細胞など）などが挙げられる。また、造血幹細胞なども含まれる。細胞が由来する生物種に特に制限はない。ＲＡＮＫＬシグナル伝達系およびＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達系は、哺乳動物において広く保存されており、ヒト細胞等においても、これらのシグナル分子群はマウス細胞と共通しており、その機能についても同様であることが知られている。従って、例えばヒトおよびサルを含む霊長類に由来する破骨細胞前駆細胞に対して、本発明に従いＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の制御を行うことにより、該細胞の破骨細胞形成を制御することが可能である。
例えば、ヒト末梢血単核細胞からのｉｎ　ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成におけるＩＦＮ−γの効果を調べるには、健常者から末梢血を採取し、ＲＰＭＩ　１６４０で１：１に希釈し、フィコール／プラークに重層して４００ｇで３０分間遠心する。単離した末梢血単核細胞（１０６細胞／ウェル）を２４ウェルのマルチウェルプレートに加える。これらの細胞は２０％ウマ血清を含むα−ＭＥＭ中、１００ｎｇ／ｍｌ　ＲＡＮＫＬおよび１０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ−ＣＳＦの存在下、かつ組み換えヒトＩＦＮ−γの存在下または非存在下で１０日間培養し、ヒト破骨細胞形成を検出することにより実施することができる。
ＩＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドとは、ＩＩ型ＩＦＮ受容体に結合して受容体を活性化させる分子を指す。ＩＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドを用いてシグナル伝達を促進する場合、用いられるＩＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドとしては、該受容体に結合し、受容体を活性化させる限り特に制限はない。リガンドには天然のリガンド、天然のリガンドの誘導体、リガンドとして作用する他の蛋白質、および人工的なリガンド等が含まれる。リガンドは蛋白質またはペプチドであっても、非ペプチド性化合物であってもよい。ペプチド性のリガンドは、組み換え体であってよく、また、修飾されていてもよい。また、リガンドは製剤化されたものであってもよい。また、グリコール結合体（ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ＩＦＮ）など、他の化合物と結合したものであってもよい。
ＩＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドとしては例えばＩＦＮ−γが挙げられる。また、その誘導体も含まれる。本発明においてＩＦＮ−γには、野生型ＩＦＮ−γのみならず、野生型分子の誘導体も含まれる。例えば、野生型ＩＦＮ−γに１または複数のアミノ酸を付加、欠失、置換、および／または挿入した蛋白質や、主鎖または側鎖が修飾された蛋白質なども、本発明においてＩＦＮ−γに含まれる。またＩＦＮ−γには、全てのＩＦＮ−γ型サブタイプ、およびＩＦＮ−γ様活性を示す誘導体などが含まれる。
これらのＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを投与して、ＩＩ型ＩＦＮ受容体にリガンドを相互作用させることにより、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することができる。リガンドの投与は、標的細胞の受容体に結合し得るように、適宜公知の投与方法に従って行えばよい。
リガンド自体を用いる代わりに、リガンドを発現するベクターを用いることも考えられる。ペプチド性のリガンドは、これをコードする核酸を発現させることにより産生させることができる。例えばＩＦＮ−γまたはこれらの派生体などを発現するベクターを細胞に導入すれば、導入細胞から産生されたこれらの分子がＩＩ型ＩＦＮ受容体に結合してＩＩ型ＩＦＮシグナルを活性化する。本発明においてベクターは、ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを発現することができる限り制限はなく、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むポリヌクレオチド自体、および該ポリヌクレオチドを含む複合体の形態であってよい。リガンドを発現するベクターの作製には、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含む公知のベクター系を用いることができる。ウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられる。生体へのベクターの投与は、直接ベクターを投与するｉｎ　ｖｉｖｏ法、またはベクターを導入した細胞を投与するｅｘ　ｖｉｖｏ法により行うことができる。
ｅｘ　ｖｉｖｏ法により遺伝子を導入する場合、例えばレトロウイルスベクターを好適に用いることができる。レトロウイルスベクターは、導入遺伝子を宿主染色体に組み込むため、長期間安定した発現が期待できる。例えば関節に対する遺伝子導入においては、体外に取り出した滑膜細胞に対して遺伝子導入を行い、遺伝子が導入された細胞を再び関節に移植することが考えられる。ｉｎ　ｖｉｖｏ法により遺伝子を導入する場合、例えばアデノウイルスベクターを用いることができる。アデノウイルスは高濃度に濃縮が可能であり、導入遺伝子がホストのゲノムに組み込まれないため安全性も高い。実際に、滑膜細胞に対してのアデノウイルスベクターの遺伝子導入効率は高いことが報告されており、関節に対する遺伝子導入に用いることが可能である。その他、ｎａｋｅｄ　ＤＮＡの投与や、センダイウイルスリポソームを用いた方法などにより、非ウイルスベクターを用いた細胞または生体への遺伝子導入を行うこともできる。ベクターを投与する対象となる細胞は特に制限はない。ベクターやベクターを導入した細胞は、生産されたリガンドが破骨細胞前駆細胞に作用し得るように投与される。例えば骨軟骨部位へ局所投与することができる。
また、ベクターを導入した細胞に限らず、ＩＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドを産生する細胞であれば、この細胞を投与することも考えられる。本発明におけるＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドの投与には、そのリガンドを産生する細胞の投与などのリガンドの間接的な投与も含まれる。天然にＩＦＮを産生する細胞としては、ＩＦＮ−γであればＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞などのリンパ球が挙げられる。
また、体内にあるＩＩ型ＩＦＮ産生細胞からのＩＩ型ＩＦＮ産生を促進することにより、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することもできる。このためには、ＩＩ型ＩＦＮ産生細胞からのＩＦＮ産生を促進する刺激を与えればよい。実施例に示すように、活性化されたＴ細胞はＩＦＮ−γを放出して破骨細胞の形成を抑制した。従って、例えばＴ細胞を活性化させることにより、ＩＦＮ−γ産生を促進させることができる。一般にＩＩ型ＩＦＮ産生は、ウイルスや微生物の感染、エンドトキシン、合成低分子、抗生物質、多糖体、核酸、マイトジェン、免疫増強剤の投与などによって誘導される（Ｍａｙｅｒ，Ｅ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，”Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ　ａｎｄ　Ｏｔｈｅｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ”（インターフェロンおよび他の調節性サイトカイン），１９９８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）。
以上のような方法により、ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを受容体に相互作用させれば、破骨細胞前駆細胞においてＲＡＮＫＬなどにより誘導される破骨細胞形成が阻害され、骨吸収を抑制することができる。本発明の方法によれば、例えば自己免疫性関節炎における骨破壊を抑制することができる。骨破壊を抑制する対象となる個体に制限はなく、例えばヒト、およびマウス、ラット、ウサギ、サルなどの非ヒト哺乳動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒト骨破壊性疾患に対する予防法または治療法を開発するためのモデルとする上でも有用である。これにより、例えば自己免疫性関節炎における骨破壊を予防する新たな方法を開発することができる。
例えば、個体を用いてＩＦＮ−γの破骨細胞形成抑制の効果を解析するには、実施例１に記載したような炎症性骨破壊のエンドトキシン誘導モデルを利用することができる。具体的には、７〜８週齢のマウス（ｎ＝２０）の頭蓋冠に、リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ社）を２５ｍｇ／ｋｇ−体重で局所投与し、同じ部位に続く４日間にわたって組み換えＩＦＮ−γ（例えば１００００Ｕ／ｄａｙ）（ｎ＝１０）または対照の生理食塩水（ｎ＝１０）を皮下投与することにより、ＩＦＮ−γの局所注入の治療効果を検査することができる。ＬＰＳ注入の５日後に、以前の記載に従って海綿骨梁の骨面のミリメートルあたりの破骨細胞数、および破骨細胞で覆われた骨面（侵食面）の割合を解析する（Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７，４２３１−６（１９９９））。
例えば炎症部位へのＩＦＮ−γ投与を毎日または間隔をおいて行うことにより、破骨細胞形成および骨吸収の阻害を検査することができる。これにより、骨破壊疾患におけるＩＦＮ−γの臨床適用の条件をより詳細に検討することが可能である。骨破壊は、複数の骨髄腫および転移性骨癌を含む腫瘍、並びに自己免疫性関節炎などの炎症状態にしばしば付随していることから、ＩＦＮ−γは癌や関節炎で誘導される骨破壊に対する治療に特に効果を有する可能性がある。骨破壊部位へのＩＦＮ−γの局所送達は投与量を低く抑えることができるため、副作用を低減することが可能である。
また、ヒト疾患における病的骨吸収に対するＩＩ型ＩＦＮの効果を調べるには、慢性関節リウマチ患者由来の培養滑膜細胞からのｉｎ　ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成の系を利用すればよい。この系は、リウマチ滑膜（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ｓｙｎｏｖｉｕｍ）で観察される病的破骨細胞形成のｅｘ　ｖｉｖｏモデルである（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．，４３，２５９（２０００））。滑膜組織を切り離し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ　ｐｕｒｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）および０．１５ｍｇ／ｍｌ　ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＲＰＭＩ　１６４０を２０倍の容量加えて混合し、振盪しながら３７℃で９０分間インキュベートする。細胞懸濁液を７０ｍｍのｃｅｌｌ　ｓｔｒａｉｎｅｒを通して濾過し、最終的に２０％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を含むα−ＭＥＭ中に細胞を懸濁する。単離した滑膜細胞（１０６細胞／ウェル）は２４ウェルのマルチウェルプレートに撒き、１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ　Ｄ３［１，２５（ＯＨ）２Ｄ３］（１０−７Ｍ）および２ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＭ−ＣＳＦの存在下、かつ組み換えヒトＩＦＮ−γの存在下または非存在下で２０日間培養する。３日おきに、培地の半分を交換する。このｅｘ　ｖｉｖｏ破骨細胞形成モデルにおいて、組み換えＩＦＮ−γの破骨細胞形成に対する抑制効果を検出することができる。このような方法により、ＩＩ型ＩＦＮの局所的または全身的投与によりヒト骨疾患における骨吸収を抑制するための新たな戦略を開発することか可能である。
また、最近、蛋白質の機能抑制の方法の一つとして、抗体誘導療法や、ＤＮＡワクチンによる抗体誘導療法が開発されている。これらの免疫学的手法を用いて破骨細胞形成シグナルに関与する分子の機能を遮断することにより、骨吸収や骨破壊を制御することが可能である。本発明は、破骨細胞形成シグナルに関与する分子に対する抗体を誘導することにより、破骨細胞形成を調節する方法を提供する。好ましい一態様においては、ＲＡＮＫＬシグナル伝達に関与する蛋白質に対する免疫反応を誘導することにより、破骨細胞形成の調節を行う。例えば、癌の骨転移やリウマチなどの病的骨破壊疾患一般に対して、ＲＡＮＫＬシグナル伝達を行う蛋白質に対する免疫反応を誘導することにより、骨破壊を抑制するための抗体誘導療法を実施することができる。ＲＡＮＫＬシグナル伝達に関与する蛋白質としては、例えばＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＦ６、ｃ−Ｆｏｓ、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、Ｆｒａ−１、およびＦｒａ−２などが挙げられるがこれらに制限されない。特に好ましい標的蛋白質としては、ＲＡＮＫＬおよびＲＡＮＫが挙げられる。
また、好ましい他の態様においては、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達に関与する蛋白質に対する免疫反応を誘導することにより、破骨細胞形成の調節を行う。ＩＩ型ＩＦＮシグナルは破骨細胞形成に抑制的に働くことから、このシグナル伝達を抑制することにより、破骨細胞形成を促進することができる。骨形成が亢進する病態に対してＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達に関与する蛋白質に対する免疫療法を実施することにより、破骨細胞形成を促進して骨量の増加を抑制することが可能である。ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達に関与する蛋白質としては、ＩＦＮ−γなどのＩＩ型ＩＦＮ、その受容体、およびＳｔａｔ１などが挙げられるがこれらに制限されない。特に、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−γ受容体は、免疫反応の誘導のための標的として好ましい。
破骨細胞形成シグナルに関与する蛋白質を標的とした免疫反応は、これらの蛋白質または抗原性を有する部分蛋白質を抗原として投与することにより誘導される。例えば、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫあるいはそれらの部分蛋白質を抗原として投与し、抗体を誘導する。抗原蛋白質は、適宜アジュバントと組み合わせて投与することができる。ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫに対する免疫反応を誘導する方法を利用してＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫの結合を抑制すること（抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＲＡＮＫ抗体の誘導療法を含む）により、破骨細胞形成は抑制され、骨吸収を低下させることができる。また、ＩＩ型ＩＦＮまたはその受容体に対する免疫反応を誘導する方法を利用してＩＩ型ＩＦＮ−ＩＩ型ＩＦＮ受容体の結合を抑制すること（抗ＩＩ型ＩＦＮ抗体、抗ＩＩ型ＩＦＮ受容体抗体の誘導療法を含む）により、破骨細胞形成の抑制が解除され、骨吸収を促進することができる。本発明は、このような阻害抗体の誘導法による骨吸収の制御により、病的骨破壊または骨形成を病態とする疾患に対する治療を行う方法を提供する。
また、破骨細胞形成を調節するために、抗体以外の可溶性因子を利用することも可能である。例えば、ＲＡＮＫＬに対するデコイ受容体として知られるＯＰＧは、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの結合を阻害することによりＲＡＮＫＬシグナル伝達を遮断する。ＯＰＧが関節炎に対して治療効果を有することは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４３，２５９−２６９（２０００））およびｉｎ　ｖｉｖｏ（Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　４０２：３０４−３０９（１９９９））で示されている。これらのデコイを利用すれば、破骨細胞形成に関わるＲＡＮＫやＩＩ型ＩＦＮ等のリガンドの作用を阻害することができる。デコイとして機能する蛋白質は、天然の可溶性受容体などを用いることもできるし、また、膜結合型受容体の細胞外領域の部分蛋白質を製造して利用することもできる。例えば、ＲＡＮＫのリガンド結合領域を含む部分ペプチドによりＲＡＮＫＬを捕捉すれば、ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合を阻害し、破骨細胞形成を抑制することができる。また、ＩＩ型ＩＦＮに結合するデコイを用いれば、ＩＩ型ＩＦＮシグナルを遮断して破骨細胞形成を促進することができる。また、リガンドに結合する蛋白質ではなく、受容体に結合するが受容体を活性化しない因子を用いてシグナルを遮断することもできる。このような因子は、リガンドの変異体や受容体結合部を含む部分ペプチドであってもよく、また非ペプチド性化合物などであってもよい。本発明は、デコイなどによりＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ間、あるいはＩＩ型ＩＦＮ−ＩＩ型ＩＦＮ受容体間の結合を阻害することにより、骨吸収を制御して病的骨破壊または骨形成を病態とする骨疾患に対する治療を行う方法に関する。また、生体が内因性に持つデコイに対する阻害抗体を上記のように誘導させれば、骨吸収をより多様に制御することも可能と考えられる。
ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の制御により破骨細胞形成シグナルを調節する方法を利用すれば、これに影響を与え得る化合物のアッセイ系やスクリーニング系を構築することができる。これらの系では、例えば破骨細胞形成、ＲＡＮＫシグナル伝達、ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または骨吸収に対する調節を指標として、化合物の効果が検証される。例えば、被検化合物の存在下において、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達による上記の調節効果がどのように変化するかを調べれば、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達によるこれらの制御を促進または抑制する化合物を見出すことができる。
具体的には、（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収に及ぼす化合物の効果を検出する方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、破骨細胞形成を誘導し得る条件で破骨細胞前駆細胞におけるＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、を含む方法である。
この検出における「破骨細胞を誘導し得る条件」とは、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達が活性化されなければ、破骨細胞形成が誘導される条件を指す。このような条件とは、例えば破骨細胞前駆細胞においてＲＡＮＫシグナル伝達を促進する条件である。
この検出方法は、特にＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達による（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収、の抑制に及ぼす化合物の促進または抑制効果を検出するために有用である。例えば、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する条件下においても、（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収が誘導されるならば、用いた被検化合物は、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達によるこれらの抑制作用を低下させる活性を有していると判断される。また、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する条件下において、被検化合物が、（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収の阻害をさらに上昇させるならば、用いた被検化合物は、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達によるこれらの抑制作用を上昇させる活性を有している可能性がある。さらにＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達が阻害されている条件下で同様の検出を行えば、化合物の効果がＩＩ型ＩＦＮシグナルに依存しているのかを知ることもできる。このような検出のためには、例えばＩＩ型ＩＦＮの中和抗体によりＩＦＮを中和したり、実施例で用いられたようなＩＦＮ−γＲ−／−の個体や細胞を用いることができる。
用いられる細胞は、破骨細胞に分化し得る細胞であれば制限はなく、例えば骨髄マクロファージ系細胞等が利用される。ＲＡＮＫシグナル伝達を促進するには、例えばＲＡＮＫのリガンドであるＲＡＮＫＬを投与すればよい。ＩＦＮシグナルを活性化しなければ破骨細胞形成が誘導されるように、必要に応じてＭ−ＣＳＦや他のサイトカイン・増殖因子を投与する。ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する方法は、上記した方法により行えばよい。具体的には、例えばＩＮＦ−γなどのＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを投与することができる。被検化合物を含む試料としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清などが挙げられる。
本発明の検出方法を用いれば、（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物のスクリーニングを行うことができる。このスクリーニング方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、破骨細胞形成を誘導し得る条件で破骨細胞前駆細胞におけるＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、
（ｃ）対照の条件下と比べ、該（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物を選択する工程、を含む方法である。
上記の検出方法と同様に、「破骨細胞を誘導し得る条件」とは、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達が活性化されなければ、破骨細胞形成が誘導される条件を指す。このような条件とは、例えば破骨細胞前駆細胞においてＲＡＮＫシグナル伝達を促進する条件である。また、このスクリーニング方法は、上記の検出方法と同様に、ＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達による（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収、の抑制作用を上昇または低下させる化合物をスクリーニングするために利用できる。
対照の条件としては特に制限はないが、例えば被検化合物を含む試料の非存在下における場合が挙げられる。すなわち、上記の工程（ｃ）において、被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比べ、該（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を上昇または低下させる化合物を選択することにより、これらを調節する化合物を得ることができる。また、対照の条件としては、破骨細胞形成、ＲＡＮＫシグナル伝達、ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または骨吸収を調節し得る他の化合物の存在下における場合を挙げることもできる。このような態様も、工程（ａ）における被検化合物を含む試料の非存在下における場合に含まれる。この場合、上記の工程（ｃ）において、対照の化合物の存在下における場合と比べ、該（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を上昇または低下させる化合物を選択する。このようなスクリーニングにおいては、ある化合物に比べより高い効果を有する化合物を得ることができる。また、工程（ｃ）において、工程（ａ）よりも低い用量の被検化合物を用いた場合を挙げることもできる。これにより化合物の用量依存性が明らかとなる。
本発明の検出方法およびスクリーニング方法は、例えば実施例２に記載したような破骨細胞形成のｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ系を用いて行うことができる。具体的には、例えば、非接触性骨髄細胞（２４穴プレートの１ウェル当たり５×１０５細胞）を１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含むα最小必須培地（α−ＭＥＭ）で２日間培養し、１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＲＡＮＫＬ、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、さらに適当な濃度のＩＦＮ−γの存在下でさらに３日間培養して破骨細胞を形成させる系を利用できる。ここに被検化合物を含む試料を添加して培養する。また、ｉｎ　ｖｉｖｏの系であれば、例えば実施例で用いたようなエンドトキシン誘導性骨吸収動物モデルを用いた系が挙げられる。
破骨細胞形成は、例えば文献（Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ　９５，３５９７−６０２（１９９８））に従って観察することがでる。具体的には、例えば個体であれば、骨切片を作成して骨吸収を観察することができる。また、顕微鏡観察により多核巨細胞を同定したり、ＴＲＡＰ染色や、カルシトニン受容体またはヴィトロネクチン受容体の発現の検出などの公知の検出法により、ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ両方で破骨細胞形成を検出することができる。ＲＡＮＫシグナル伝達であれば、例えばＮＦ−κＢやＪＮＫの活性化などを実施例に記載の方法等により検出することができる。また、ＴＲＡＦ６発現であれば、ＴＲＡＦ６　ｍＲＮＡの発現をノーザンブロットやＲＴ−ＰＣＲ等により検出したり、ＴＲＡＦ６蛋白質をイムノブロットや免疫沈降、ＥＬＩＳＡ等により検出することができる。ＴＲＡＦ６の機能であれば、例えば上記のＲＡＮＫシグナル伝達と同様、ＮＦ−κＢやＪＮＫの活性化などにより検出することができる他、先に記載したように、ＣＤ４０、ｐ７５ＮＴＲ、またはＴｏｌｌ／ＩＬ−１受容体ファミリーなどＴＲＡＦ６を介する他のシグナル伝達の活性化を検出することによって評価することもできる。例えばＪＮＫに限らず、ＭＡＰキナーゼ経路の他のシグナル分子のリン酸化を指標としてもよく、また、ＴＲＡＦ６に結合するＴＡＫ１またはＥＣＳＩＴ（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｉｎ　Ｔｏｌｌ　ｐａｔｈｗａｙｓ）などの分子との結合や修飾を指標とすることも考えられる。骨吸収であれば、例えば象牙切片上での骨吸収活性を公知の方法により検出することができる。
この検出の結果、被検化合物を含む試料の添加により、対照の条件下（例えば試料非存在下で検出した場合など）と比較して（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収が有意に促進または抑制されていれば、用いた被検試料はＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達によるこれらの制御を調節する化合物の候補となる。このスクリーニング方法により単離される化合物は、破骨細胞形成を制御するために有用であり、骨代謝疾患の予防薬や治療薬の開発の上でも有用である。
スクリーニングにより選択された医薬候補化合物は、上記本発明の検査方法を用いて、臨床適用のための詳細な投与条件を決定することができる。すなわち、上記検査方法を用いて投与量、投与間隔、投与ルートを含む投与条件を検討し、適切な予防または治療効果を得られる条件を決定することができる。同様に、ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドの臨床適用のための詳細な投与条件を決定するには、（ａ）破骨細胞形成を誘導し得る条件で破骨細胞前駆細胞にＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを接触させる工程工程、（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ＴＲＡＦ６発現もしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、を含むＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンドの効果を検出する方法を用いることができる。具体的には、本明細書に記載された方法を利用して実施することができる。
また、本発明は、ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンド、または該リガンドを発現するベクターを含む、破骨細胞形成シグナルの制御に用いられる薬剤に関する。本発明は、ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンド、または該リガンドを発現するベクターを含む、以下の薬剤を提供する。
（ａ）破骨細胞形成抑制剤
（ｂ）ＲＡＮＫＬシグナル伝達抑制剤
（ｃ）ＴＲＡＦ６抑制剤
（ｄ）骨破壊抑制剤
ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンド、および該リガンドを発現するベクターは、先に記載したものを用いることができる。本発明において薬剤には、試薬および医薬が含まれる。これらの薬剤は、リガンドやベクター自体を用いる他、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、他の蛋白質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等と適宜組み合わせて組成物としてもよい。これらは混ぜ合わさっていてもよく、使用時に混合されるまで分離されていてもよい。本発明の薬剤は、破骨細胞形成を抑制する作用を有すること、ＲＡＮＫＬシグナル伝達を抑制する作用を有すること、ＴＲＡＦ６蛋白質の発現またはその活性を抑制する作用を有すること、または骨破壊抑制を抑制する作用を有することが、該薬剤の容器、包装箱、または添付される説明書等に記載されているか、あるいは該薬剤に関連付けられていることが好ましい。関連付けられているとは、該薬剤、その容器、包装箱、または添付される説明書等から、該薬剤が上記作用を有するという情報を直接的または間接的に入手可能であることを言う。例えばこれらの薬剤の作用または用途が別途発行される印刷物に記載されていたり、あるいはウェブ上に開示されている場合などが含まれる。本発明の薬剤は、培養細胞系や個体に適用することができる。対象となる個体は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。特に、ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンド、または該リガンドを発現するベクターを含む本発明の医薬組成物は、ヒト骨破壊疾患に対する予防薬および治療薬として有用である。
ＩＩ型ＩＦＮ受容体リガンド、該リガンドを発現するベクター、または上記薬剤を医薬組成物として用いる場合は、リガンドやベクター自体を直接患者や個体に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。組成物におけるリガンドやベクターの含有率は適宜決定すればよい。
患者への投与は、有効成分の性質に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われうるがそれらに限定されない。また、全身的または局所的に投与され得る。ＩＦＮ等の薬剤の投与による全身的な副作用が問題となる場合には、局所投与により投与量を抑えることができる。投与量、投与方法は、医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。実施例に示すように、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系において１Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γが破骨細胞形成をほぼ完全に抑制した。例えばｉｎ　ｖｉｖｏにおいても、標的とする破骨細胞前駆細胞周辺で、このような有効濃度を維持できるように薬剤の投与量を決定することができる。投与は１回から数回に分けて行うことができる。
本発明の医薬組成物は、特に炎症性骨吸収および炎症性骨破壊の防止に有用である。「炎症性骨吸収および骨破壊」とは、炎症を伴う骨吸収および骨破壊を言う。例えば関節炎においては、滑膜に含まれる滑膜マクロファージからの破骨細胞形成が促進され、パンヌスが骨へと侵入する前線領域で活発な骨吸収が起こっている。特に慢性関節炎においては、この骨吸収により長期的な関節破壊が進行する。本発明の医薬組成物を投与することにより、この病的骨吸収を抑制することができる。このような炎症性骨吸収を伴う関節炎としては、特に慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）を含む自己免疫性関節炎が挙げられる。慢性関節リウマチは、自己免疫性の慢性炎症性疾患であり、増殖した滑膜が活発に骨軟骨へと侵入し、多発性の関節破壊をもたらす。本発明の医薬組成物は、この関節炎性骨破壊を防止するために好適に用いられる。また、本発明の医薬組成物が適用され得る他の炎症性骨吸収としては、歯周病が挙げられる。
また、本発明の医薬組成物は、巨細胞腫、癌骨転移、および色素性絨毛結節滑膜炎（ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ　ｖｉｌｌｏｎｏｄｕｌａｒ　ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ；ＰＶＳ）を含む、破骨細胞による骨吸収亢進を病態とする様々な疾患に対しても適用され得る。また、骨粗鬆症および癌の高カルシウム血症の治療への適用も期待される。さらに、Ｐａｇｅｔ病、肝炎やエイズに伴う骨量減少、白血病や多発性骨髄腫に伴う骨吸収・骨破壊、人工関節周囲の骨吸収（ルースニング）に対する予防および治療にも適用され得る。本発明の医薬組成物は、該組成物が上記に示した疾患の少なくとも１つに対して適用できることがその容器、包装箱、または添付される説明書等に記載されているか、あるいは該組成物に関連付けられていることが好ましい。本発明により、破骨細胞の形成および機能の制御による新たな治療介入が可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において引用された文献は、全て本明細書の一部として組込まれる。
実験に用いたＩＦＮ−γＲ−／−マウスおよびＩＲＦ−１−／−マウスの作製は以前記載されている（Ｈｕａｎｇ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９，１７４２−５（１９９３）；Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　７５，８３−９７（１９９３））。これらの変異マウスと遺伝的に同一のバックグランドを持つＣ５７ＢＬ／６マウスを野生型コントロールとして用いた。Ｓｔａｔ１−／−マウス（Ｍｅｒａｚ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　８４，４３１−４２（１９９６））はＴａｃｏｎｉｃ社から購入した。
［実施例１］　ＩＦＮ−γによるＴ細胞を介した破骨細胞形成の調節
エンドトキシンによる骨吸収の誘導は骨吸収モデル系として確立されており、この系において、これまでにＴ細胞が重要な役割を果たしていることが明らかにされている（Ｕｋａｉ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ．Ｒｅｓ．３１，４１４−２２（１９９６）；Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７，４２３１−６（１９９９））。この骨吸収モデル系を利用して、ＩＦＮ−γ受容体（ＩＦＮ−γＲ）の成分の１つであるＩＦＮＧＲ１を欠損したマウス（ＩＦＮ−γＲ−／−マウス）（Ｈｕａｎｇ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９，１７４２−５（１９９３））における破骨細胞形成を解析した。７〜８週齢のＩＦＮ−γＲ−／−マウスおよびＩＦＮ−γＲ＋／−マウス（ｎ＝１０）の頭蓋冠に、リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ社）を２５ｍｇ／ｋｇ−体重で局所投与し、５日後に安楽死させ以前の記載（Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．６７，４２３１−６（１９９９））に従って解析を行ったところ、破骨細胞形成の増強と骨破壊の顕著な増悪化が起こることが判明した（図１）。この観察結果から、Ｔ細胞を介した過程が関与する骨組織の維持に、ＩＦＮ−γが重要な機能を持っていることが示唆された。
ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞が破骨細胞形成に及ぼす影響を調べるため、次に活性化Ｔ細胞または休止脾臓Ｔ細胞と骨髄単球・マクロファージ系前駆細胞（ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ；ＢＭＭｓ）とのｉｎ　ｖｉｔｒｏ共培養系において、Ｍ−ＣＳＦ存在下でＲＡＮＫＬで刺激する実験を行った。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成を観察するため、非接触性骨髄細胞（２４穴プレートの１ウェル当たり５×１０５細胞）を１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ社）を含むα−最小必須培地（α−ＭＥＭ）で２日間培養し、ＢＭＭとして用いた。これらのＢＭＭは１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）および１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦの存在下でさらに３日間培養し破骨細胞を形成させた。多核細胞の観察は以前記載したように行った（Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ　９５，３５９７−６０２（１９９８））。Ｔ細胞の活性化のため、精製ＣＤ３＋脾臓細胞（＞９３％）をＲＰＭＩ１６４０で培養し、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ε抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）で１日間刺激した。活性化Ｔ細胞またはＴ細胞培養上清の添加は、ＢＭＭ培養へのＲＡＮＫＬの添加と同時に行った。培地は４８時間おきに交換した。
図２ａに示すように、抗ＣＤ３抗体で活性化させたＴ細胞と共に共培養した場合には、ＢＭＭの破骨細胞形成は強く阻害されたが、休止Ｔ細胞では阻害されなかった。この条件では、ほとんどのＢＭＭは成熟マクロファージに分化した。活性化Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γＲ−／−のＢＭＭと共培養しＲＡＮＫＬで刺激した場合には、活性化Ｔ細胞の抑制効果は完全に失われた（図２ｂ）。これらのＩＦＮ−γＲ−／−ＢＭＭは、活性化Ｔ細胞の共培養において、組み換えＲＡＮＫＬが存在しなくても低い効率で破骨細胞に分化したことから、破骨細胞形成に対するＴ細胞の効果は、ＲＡＮＫＬとＩＦＮ−γのバランスに依存していることが示唆される。活性化Ｔ細胞の培養上清は、組み換えＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成を抑制する作用を示し、この抑制効果はＩＦＮ−γに対する抗体により中和されることが確認された。これらの結果から、ＩＦＮ−γはＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞形成のＴ細胞による抑制にとって必須であることが示された。
［実施例２］　ＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞形成における、ＩＦＮ−γのＳｔａｔ１活性化経路を介した抑制
上記のＲＡＮＫＬ刺激によるＢＭＭの破骨細胞形成のｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ系に組み換えマウスＩＦＮ−γ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）を添加しその効果を検証した。組み換えＩＦＮ−γの添加はＢＭＭ培養へのＲＡＮＫＬの添加と同時に行った。その結果、ＢＭＭの破骨細胞形成に対するＩＦＮ−γの顕著な阻害効果が観察された（図３および４）。過剰量のＲＡＮＫＬ存在下において、極めて低いレベルのＩＦＮ−γが破骨細胞形成を強く阻害した（図３）。一方、ＲＡＮＫＬではなくＭ−ＣＳＦに依存するＢＭＭの増殖に対しては、ＩＦＮ−γは比較的僅かな抑制効果を示した（図３）。さらにＩＦＮ−γは、Ｍ−ＣＳＦ非依存性のマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７のＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成も阻害することが判明した。これらの結果から、ＩＦＮ−γはＲＡＮＫＬシグナル伝達経路を選択的に抑制することが示唆される。細胞においてＩＦＮ−γのシグナルは、転写因子Ｓｔａｔ１（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，２２７−６４（１９９８））の活性化を介して伝達される。活性型Ｓｔａｔ１はＩＦＮ−γ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ（ＧＡＦ）とも呼ばれ、直接、または転写因子ＩＲＦ−１（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１３３３，Ｍ９−１７（１９９７））を介してＩＦＮ−γの標的遺伝子群の発現を誘導する。図５に示されるように、破骨細胞形成におけるＩＦＮ−γの阻害効果は、ＩＦＮ−γＲ−／−マウスまたはＳｔａｔ１−／−マウスでは完全に失われたが、ＩＲＦ−１−／−マウスでは失われなかった。また、同様にＩＲＦ−９−／−マウスを用いてＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで誘導されるＢＭＭｓからの破骨細胞形成に対するＩＦＮ−γの効果を調べたところ、ＩＦＮ−γの阻害効果が観察されたことから、ＩＲＦ−９はＩＦＮ−γによる阻害には必要ないことが判明した（図５ｂ）。このことから、ＲＡＮＫＬシグナル伝達経路の抑制には、Ｓｔａｔ１（ＧＡＦ）を介し、ＩＲＦ−１およびＩＲＦ−９に非依存的な遺伝子誘導経路が重要であることが示された。
［実施例３］　ＩＦＮ−γによるＲＡＮＫＬシグナル伝達の阻害は、ＴＲＡＦ６の蛋白発現抑制を介する
ＲＡＮＫＬがその受容体であるＲＡＮＫを刺激すると、ＲＡＮＫはアダプター蛋白質であるＴＲＡＦファミリーを誘導し、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫ経路を活性化する（Ｄｏｕｇａｌｌ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１３，２４１２−２４（１９９９）；Ｈｓｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ　９６，３５４０−５（１９９９））。ＴＲＡＦファミリーの中でも、ＴＲＡＦ６はＲＡＮＫＬシグナル伝達に重要であることが知られており、ＴＲＡＦ６−／−マウスは骨吸収を行う破骨細胞が欠損し、大理石骨病の表現型を示す（Ｌｏｍａｇａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１３，１０１５−２４（１９９９）；Ｎａｉｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　４，３５３−６２（１９９９））。破骨細胞形成のＩＦＮ−γによる抑制の標的を調べるため、ＲＡＮＫＬで誘導されるＮＦ−κＢとＪＮＫの活性化を、ＩＦＮ−γ処理したＢＭＭにおいて調べた。ゲルシフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｓｈｉｆｔ　ａｓｓａｙ；ＥＭＳＡ）の結果、ＲＡＮＫＬで誘導されるＮＦ−κＢの活性化は、ＩＦＮ−γ処理したＢＭＭでは顕著に阻害された（図６ａ）。さらに、ＲＡＮＫＬで誘導されるＪＮＫの活性化もＩＦＮ−γにより阻害された（図６ｂ）。ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦで刺激したＢＭＭにおいて、ＲＡＮＫＬシグナル伝達経路の下流のエフェクター分子をイムノブロットで解析したところ、ＩＦＮ−γによりＴＲＡＦ６の発現が特異的かつ顕著に阻害されることが判明した（図６ｃ）。この結果は、ＩＦＮ−γによる蛋白質分解系の誘導がＴＲＡＦ６の分解に関与していることを示すものである。
［実施例４］　ＴＲＡＦ６遺伝子発現による破骨細胞形成への影響
ＴＲＡＦ６発現の阻害が、ＩＦＮ−γが媒介する破骨細胞形成の抑制に重要であるかを調べるため、ＴＲＡＦ６を外来的に発現させたＢＭＭをＲＡＮＫＬで刺激し、ＩＦＮ−γによる破骨細胞形成の阻害を観察する実験を行った。
ＴＲＡＦ６　ｃＤＮＡの下流にｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）−増強緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）をコードするレトロウイルスベクター（ｐＭＸ−ＴＲＡＦ６−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）は、マウス全長ＴＲＡＦ６遺伝子の２．０ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩ断片をｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｎｏｓａｋａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１８，４７５４−６５（１９９９））の同一部位に挿入し、以前の記載（Ｎｏｓａｋａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１８，４７５４−６５（１９９９））に従って作製した。レトロウイルスのパッケージングは、これらのｐＭＸベクターとｐＰＡＭｐｓｉ２（Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４４１：１０６−１１０（１９９８））を２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトすることにより行った。作製したレトロウイルスベクターをＢＭＭに感染させ、フローサイトメトリーとイムノブロットによる解析を行ったところ、このＴＲＡＦ６発現ウイルスと、コントロールに用いたＥＧＦＰのみを発現するウイルス（ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）は、効率良くＢＭＭに遺伝子を導入できることが判明した（図７）。
次に、ＩＦＮ−γによる破骨細胞形成阻害に及ぼす、ＴＲＡＦ６発現の効果を検証した。レトロウイルスをＢＭＭに感染させ、４８時間後にＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γを培地に添加した。ＲＡＮＫＬ添加の３日後に、ＴＲＡＰ染色および骨吸収アッセイ（Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ　９５，３５９７−６０２（１９９８））により破骨細胞形成を評価した。
興味深いことに、ＢＭＭにおけるＴＲＡＦ６の過剰発現は、ＩＦＮ−γによる破骨細胞形成の抑制に対して抵抗性を示した（図８）。これらの細胞では、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＮＦ−κＢおよびＪＮＫの活性化が観察された。ＩＦＮ−γの存在下でさえ、ＧＦＰ陽性細胞の約５０％が酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ陽性（ＴＲＡＰ＋）の多核細胞に分化したことは特筆すべきである（図８）。これらの分化した細胞はカルシトニン受容体を発現し、象牙切片上で骨吸収活性を示した。これらの結果は、ＩＦＮ−γによる破骨細胞形成の抑制の少なくても一部を、ＴＲＡＦ６発現の低下で説明できることを示している。
産業上の利用の可能性
本発明は、これまで知られていなかったＩＦＮ−γと骨のホメオスタシス、すなわち破骨細胞形成の抑制による骨量の維持との間の結びつきを明らかにした。ジーンターゲティングによりＩＦＮ−γＲを破壊すると、炎症時の破骨細胞形成が増強され、炎症に伴う骨破壊の増悪を引き起こす。これは、元来、抗ウイルス応答に関してその効果が確立されたサイトカインが持つ生理機能の興味深い一例である。本発明により、ＩＩ型ＩＦＮシグナルを介して破骨細胞形成を抑制する方法が提供された。本発明の方法によれば、ＩＦＮ−γの投与などのＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達の活性化により、破骨細胞形成を抑制することが可能となる。破骨細胞形成を制御することにより、異常な骨代謝を制御することができる。本発明の方法は、自己免疫性関節炎を含む、病的骨破壊を伴う疾患を予防または治療するために有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＩＦＮ−γＲ＋／−マウスまたはＩＦＮ−γＲ−／−マウスにおける、生理食塩水またはＬＰＳを注入された頭蓋骨の組織切片（酒石酸耐性酸フォスファターゼ［ＴＲＡＰ］およびヘマトキシリンによる染色）を示す写真である。破骨細胞特異的酵素ＴＲＡＰによる染色で示される破骨細胞形成の増強に注意。ＬＰＳ非投与の場合、ＩＦＮ−γＲ＋／−マウスではＴＲＡＰ陽性細胞は少数しか見られない。またＩＦＮ−γＲ−／−マウスでも、ごく少数のＴＲＡＰ陽性細胞が観察される。ＬＰＳ投与の場合、ＩＦＮ−γＲ＋／−マウスでは骨吸収が誘導され、吸収腔の骨との接触面にＴＲＡＰ陽性細胞が観察される。ＩＦＮ−γＲ−／−マウスではＩＦＮ−γＲ＋／−マウスに比べ著しく増悪した骨吸収が見られ、広範囲の骨表面に破骨細胞の侵食が見られる。海綿骨梁（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ　ｂｏｎｅ）表面の１ｍｍ当たりの破骨細胞数、および破骨細胞で覆われた骨表面（侵食表面）の割合を測定した（Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７，４２３１−６（１９９９））。この形態計測により、ＩＦＮ−γＲ−／−マウスでは破骨細胞数と侵食表面が２倍以上増加することが判明した。
図２は、ＩＦＮ−γによるＴ細胞を介した破骨細胞形成の調節を示す図である。ａは活性化Ｔ細胞による破骨細胞形成の抑制を示す。抗ＣＤ３抗体で刺激した脾臓Ｔ細胞または休止Ｔ細胞を、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＢＭＭと共培養した。３日後にＴＲＡＰ＋細胞を計数した。ｂはＩＦＮ−γＲ−／−ＢＭＭにおける、Ｔ細胞を介した破骨細胞形成の抑制の喪失を示す。ＩＦＮ−γＲ−／−ＢＭＭを上記と同様に活性化Ｔ細胞または休止Ｔ細胞と共培養した。
図３は、ＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞形成およびＢＭＭ増殖に及ぼすＩＦＮ−γの効果を示す図である。ＩＦＮ−γは、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたＢＭＭにおける破骨細胞の形成に対しては顕著な阻害効果を示したが、Ｍ−ＣＳＦ依存性の破骨細胞前駆ＢＭＭの増殖に対しては僅かな阻害作用を示した。
図４は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成系の顕微鏡像（ＴＲＡＰ染色）を示す写真である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢＭＭをＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）単独で培養した（上パネル）。この条件では、細胞は単核でＴＲＡＰ陰性であった。ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下では、ＢＭＭは高い効率でＴＲＡＰ＋で多核の破骨細胞に分化した（中央のパネル）。ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下では破骨細胞形成は抑制された（下パネル）。細胞は融合しておらず単核で、ＴＲＡＰ陰性であった。
図５は、ＩＦＮ−γによる破骨細胞形成の抑制におけるＩＦＮ−γＲとＳｔａｔ１の必要性を示す図および写真である。ａ，ＩＦＮ−γＲ、Ｓｔａｔ１、またはＩＲＦ−１を欠損したマウスに由来するＢＭＭの破骨細胞形成におけるＩＦＮ−γの効果を、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で調べた。破骨細胞数（％）は、ＩＦＮ−γ処理した培養中でのＴＲＡＰ＋多核細胞数を、ＩＦＮ−γを含まないコントロールの培養中での数で除して求めた。ｂ，野生型マウス、あるいはＳｔａｔ１、ＩＲＦ−９、またはＩＲＦ−１欠損マウス由来のＢＭＭｓからの破骨細胞形成におけるＩＦＮ−γ（１０Ｕ／ｍｌ）の効果の比較を示した。
図６は、ＲＡＮＫＬシグナル伝達の下流のエフェクター分子に対するＩＦＮ−γの効果を解析した結果を示す写真である。
ａはＮＦ−κＢ活性のＥＭＳＡ解析を示す。ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激後、ＩＦＮ−γの存在下または非存在下で２４時間プレインキュベートしたＢＭＭから核抽出液を調製し、イムノグロブリンκＢエンハンサー由来のＮＦ−κＢ結合部位を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて以前に記載した通りに解析を行った（Ｌｏｍａｇａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１３，１０１５−２４（１９９９））。複合体は、抗Ｒｅｌ　Ａ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）によりスーパーシフトが起こり（レーン７）、過剰量の非標識プローブにより複合体形成が阻害された（レーン８）。
ｂはＪＮＫ活性化阻害効果を示す。ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激後、ＩＦＮ−γの存在下または非存在下で２４時間プレインキュベートしたＢＭＭを、抗リン酸化ＪＮＫ抗体および抗ＪＮＫ抗体（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｓ社）を用いたイムノブロットにより解析した。
ｃは破骨細胞の分化におけるＲＡＮＫＬシグナル伝達に関与する下流のエフェクター分子の発現に及ぼすＩＦＮ−γの効果を示す。ＲＡＮＫＬ添加後２４時間おきに、ＢＭＭの全細胞溶解物を特異抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）を用いたイムノブロットにより解析した。
図７は、初代ＢＭＭへのレトロウイルス遺伝子導入効率を示す図および写真である。感染２日後に、ＢＭＭをフローサイトメトリーにより解析し（上パネル）、イムノブロットを行った（下パネル）。ＴＲＡＦ６ウイルスを感染させたＢＭＭのＴＲＡＦ６蛋白質レベルは、コントロールＢＭＭの約１０倍であった。
図８は、ＩＦＮ−γによる破骨細胞形成阻害に及ぼすＴＲＡＦ６過剰発現の効果を示す図および写真である。レトロウイルス感染の２日後にＢＭＭ培養にＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ（１０Ｕ／ｍｌ）を添加した。３日後、ＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡で同定し、ＴＲＡＰ染色を行った（左パネル）。上段はＴＲＡＰ染色した細胞を示す。ウイルス非感染細胞およびＥＧＦＰ発現ウイルスベクター（ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）感染細胞では、ＴＲＡＰ陽性の破骨細胞は見られない。これに対し、ＴＲＡＦ６発現ウイルスベクター（ｐＭＸ−ＴＲＡＦ６−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）を感染させた細胞では多数のＴＲＡＰ＋多核細胞が形成された。下段はＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す。ほとんどのＴＲＡＰ＋多核細胞はＧＦＰ陽性であり、ＩＦＮ−γ存在下でもＧＦＰ陽性細胞の５０％以上がＴＲＡＰ＋多核細胞に分化した（右パネル）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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