(57)【要約】溶着後のウェルの容積を超える量の液体をウェルにスポットし、その余分の液体をウェルから押し出して空気がウェル内にほとんど残存しないように液体を密閉することにより、微量の試料及び試薬を微小な空間で反応させ、信号となる蛍光を効率的に取り出すことができるマイクロウェルアレイ及びその密閉方法を提供する。複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、各々のウェルの縁部近傍は、周囲よりも高くなった隆起部を形成していることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
2002025289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、各々のウェルの縁部近傍は、周囲よりも高くなった隆起部を形成していることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項２】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、各々のウェルの縁部近傍は、周囲よりも高くなった溶着用隆起部を形成していることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項３】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、カバーの、カバーで容器を覆ったときに各ウェルの縁部近傍に対応する位置には、周囲よりも高くなった隆起部を形成していることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項４】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、カバーの、カバーで容器を覆ったときに各ウェルの縁部近傍に対応する位置には、周囲よりも高くなった溶着用隆起部を形成していることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項５】
前記隆起部は環状であってその頂部の断面は凸状であることを特徴とする請求項１ないし４に記載されたマイクロウエルアレイ。
【請求項６】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、各々のウェルの周囲またはカバーの当該ウェルの周囲に相当する位置の少なくとも一方には、ウェルをカバーによって覆った際にウェルから溢れた液の少なくとも一部を収容することができる溝が形成されていることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項７】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うカバーを具備し、該カバーと液体の入った該ウェルとがウェルごとに溶着されていることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項８】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うカバーを具備し、該カバーと液体の入った該ウェルとがウェルごとに超音波溶着されていることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項９】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、該容器と該カバーの実質的な厚みがいずれも、該容器と該カバーに接触する液体の熱をウェル内に伝導することができる厚さであることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１０】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、該容器と該カバーの実質的な厚みがいずれも０．１５〜３．０ｍｍの範囲であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１１】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に溶着した状態でのマイクロウェルアレイの実質的な厚みが０．３〜４．０ｍｍの範囲であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１２】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に溶着した状態でのウェルを直接定義する部分の肉厚が、０．０５〜０．４ｍｍの範囲であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１３】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該ウェル近傍のには、該ウェルと該カバーを溶着するのに必要な体積を有する溶接用リブが設けられていることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１４】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該ウェル近傍には、断面形状が三角形状の溶接用リブが設けられていることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１５】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該ウェル近傍の溶着用リブの底辺の肉厚が０．２〜１．０ｍｍの範囲であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１６】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該ウェル近傍の溶着用リブの底辺が０．２〜１．０ｍｍの範囲、高さが０．２〜０．８ｍｍの範囲、該ウェルを取り囲むリブの直径が０．５〜４．０ｍｍの範囲であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１７】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に接合したウェルを取り囲む溶着部分の幅が、０．３〜２．５ｍｍの範囲であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１８】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該マイクロウェルアレイが恒温槽中に浸漬された際、該ウェル内の液体温度が数分以内に均一になるような容積を該ウェルが有することを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項１９】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該ウェルの容積が０．１〜１．４μｌの範囲であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項２０】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に接合した後のウェルの容積が０．１〜１．４μｌの範囲であることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項２１】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うカバーを具備し、該ウェルと該カバーとは各ウェルを液密に密閉しており、ウェル内部で液体が沸騰しても、ウェルの密閉性が保持されることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項２２】
前記ウェルの密閉性は前記ウェルと前記カバーとを超音波溶着して得られたものであることを特徴とする請求項１６に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項２３】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うカバーを具備し、該ウェルと該カバーとは各ウェルを液密に密閉しており、ウェル内部で液体が沸騰しても、外部から機械的な力を加えることなくウェルの密閉性が維持できることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項２４】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うカバーを具備し、該ウェルと該カバーとは各ウェルを液密に密閉しておりウェル内部で、９０〜１００℃に加熱された液体が沸騰しても、ウェルごとの密閉性を維持することができることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項２５】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うカバーを具備したマイクロウェルアレイにおいて、該ウェルと該カバーとは各ウェルを液密に密閉しており、該マイクロウェルアレイを沸騰した液中に浸漬させても、ウェルごとの密閉性を維持することができることを特徴とするマイクロウェルアレイ。
【請求項２６】
さらに、ほぼ平板状で可撓性を有する材料からなる中間体を容器とカバーの間に介在させたことを特徴とする請求項１ないし２５のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項２７】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーとを具備し、カバーの、ウェルにカバーで容器を覆ったときに各ウェルに対応する位置には、ウェルをカバーによって封止した際に、各ウェル内に押し込まれる凸部が形成されていることを特徴とする請求項１ないし２６のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項２８】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器のウェルに液体を注入し、容器を覆うようにカバーを被せ、容器とカバーを密着させるように押圧力を加えて、次に、当該押圧力を維持しながら超音波を照射することによって、該容器のウェルに入った液体がウェルから弾き出されることがないように該ウェルと該カバーとを、ウェル毎に超音波溶着することを特徴とする液体の密閉方法。
【請求項２９】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを用い、ウェルに液を注入し、カバーを容器に押し付けた後、該カバーと該容器を溶接することにより該液体を各ウェルに封止することを特徴とする液体の密閉方法。
【請求項３０】
前記の液は、ＤＮＡまたはたんぱく質を含む液であることを特徴とする請求項２８ないし２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶接は超音波溶着によって行うことを特徴とする請求項２９ないし３０のいずれかに記載の液体の密閉方法。
【請求項３２】
前記超音波溶着のために照射される超音波は、前記ウェルに封入されたＤＮＡまたはたんぱく質を実質的に損傷させないものであることを特徴とする請求項２８または３１に記載の方法。
【請求項３３】
該容器のウェルと該カバーを、０．０５から０．８秒の間、超音波振動により溶着することで、液密に封止することを特徴とする請求項２８または３１に記載された液体の密閉方法。
【請求項３４】
前記溶接を行う際、溶融する隆起部の長さ１ｃｍあたり、０．３ないし１００Ｎの力を加えつつ、超音波ホーンの振動を開始することを特徴とする請求項２８、３１または３２のいずれかに記載の液体の密閉方法。
【請求項３５】
該容器と該カバーとが各ウェルごとに超音波溶着によってウェルの封止を行うことができる材料からなることを特徴とする請求項１ないし２７のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３６】
各ウェルの裏面が平面状であることを特徴とする請求項１ないし２７および３５のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３７】
前記ウェルの下または上に、光を反射する反射面が設けられていることを特徴とする請求項１ないし２７および３５、３６のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３８】
前記請求項１ないし２７、および、３５ないし３７のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイを用い、先に接触式の分注機により液体を分注し、その後非接触式の分注機により液体を分注することを特徴とする液体の分注方法。
【請求項３９】
先に接触式の分注機によりウェルごとに異なる液体を分注し、その後非接触式の分注機により液体を分注することを特徴とする請求項３８に記載された液体の分注方法。
【請求項４０】
先に接触式の分注機により液体を分注し、その液体を乾燥させ、その後非接触式の分注機により液体を分注することを特徴とする請求項３８または３９のいずれかに記載された液体の分注方法。
【請求項４１】
各ウェルの水平断面が円形であることを特徴とする前記請求項１ないし２７、および、３５ないし３７のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項４２】
前記マイクロウェルアレイの外周部に沿ってスカート部を形成したことを特徴とする前記請求項１ないし２７、３５ないし３７、４１のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項４３】
前記マイクロウェルアレイに形成されたスカート部の角に、貫通穴を形成したことを特徴とする請求項４２に記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項４４】
該容器と該カバーには挿入部と受け部が形成され、挿入部を受け部にはめ込むことによって該容器と該カバーを係止することができることを特徴とする前記請求項１ないし２７、３５ないし３７、４１ないし４３のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項４５】
前記容器及び前記カバーがプラスチック材料から形成されることを特徴とする前記請求項１ないし２７、３５ないし３７、４１ないし４４のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項４６】
前記容器と前記カバーが、メチルペンテンコポリマーあるいはポリカーボネートから構成されることを特徴する請求項４５に記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項４７】
前記容器と前記カバーの少なくとも一方が、光学的に透明な材料で形成されていることを特徴とする前記請求項１ないし２７、３５ないし３７、４１ないし４６のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項４８】
前記容器のウェルあるいは前記カバーのウェル側の表面に、液状の試薬または検体を分注し、担持させたことを特徴とする前記請求項１ないし２７、３５ないし３７、４１ないし４７のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項４９】
前記容器のウェルあるいは前記カバーのウェル側の表面に、液状の試薬または検体を非接触式の分注機により分注し、担持させたことを特徴とする前記請求項１ないし２７、３５ないし３７、４１ないし４９のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項５０】
試薬または検体の少なくとも一方を前記容器のウェルに担持させ、他の一方をカバー表面に担持させ、前記ウェルと前記カバーを超音波溶着して接合し、各ウェルごとに試薬と検体を反応させるようにしたことを特徴とする前記請求項１ないし２７、３５ないし３７、４１ないし４９のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイの使用方法。
【請求項５１】
前記請求項１ないし２７、３５ないし３７、４１ないし５０のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイの製造方法であって、サイドゲートから樹脂を流し込んで該容器と該カバーを射出成形することを特徴とする製造方法。
【請求項５２】
超音波溶着装置において、発振時の力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることができ、かつ、最大発振出力が４．１〜５．０ｋＷであることを特徴とする超音波溶着装置。
【請求項５３】
超音波溶着装置において、ホーンの振幅が３０〜４０ミクロン、発振時の力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることができ、かつ、最大発振出力が４．１〜５．０ｋＷであることを特徴とする超音波溶着装置。
【請求項５４】
ホーンの振幅が３０〜４０ミクロン、発振時の力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることができ、最大発振出力が４．１〜５．０ｋＷ、溶着時間が０．０５〜０．８秒の時間内で超音波を照射することができることを特徴とする超音波溶着装置。
【請求項５５】
ホーンの振幅が３０〜４０ミクロン、発振時の力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることができ、かつ、最大発振出力が４．１〜５．０ｋＷある超音波溶着装置により、前記請求項１ないし２３、３１ないし３３、３７ないし４６のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイを、０．０５〜０．８秒の時間内でウェルごとに溶着することを特徴とする密閉方法及び密閉することができる超音波溶着装置。
【請求項５６】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に分注し、その後該カバーと該ウェルをウェルごとに液密に溶着することを特徴とする密閉・分注方法。
【請求項５７】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に分注し、その後該カバーと該ウェルをウェルごとに溶着し、試薬と検体を反応させた後、あるいは試薬と検体を反応させながら、ウェルごとの蛍光強度を分析することにより、ウェルごとの反応の度合いを解析することを特徴とする解析方法。
【請求項５８】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に分注し、その後該カバーと該ウェルをウェルごとに溶着し、試薬と検体を反応させた後、あるいは試薬と検体を反応させながら、ウェルごとの蛍光強度を分析することにより、ウェルごとに遺伝子を解析することを特徴とする遺伝子の解析方法。
【請求項５９】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に分注し、その後該カバーと該ウェルをウェルごとに溶着し、試薬と検体を反応させた後、あるいは試薬と検体を反応させながら、ウェルごとの蛍光強度を分析することにより、ウェルごとに遺伝子の多型を解析することを特徴とする遺伝子の多型解析方法。
【請求項６０】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、そのマイクロウェルアレイに分注する試薬及び検体に対応したバーコードを添付して、工程ごとに、または、マイクロウェルアレイごとに進捗をバーコードで管理できるようにし、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に分注し、その後該カバーと該ウェルをウェルごとに溶着し、試薬と検体を反応させた後、あるいは試薬と検体を反応させながら、ウェルごとの蛍光強度を分析することにより、ウェルごとの反応の度合い、遺伝子、および遺伝子の多型の内の少なくともいずれか１つを解析することを特徴とする解析方法。
【請求項６１】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、該ウェルにそれぞれ異なるＤＮＡを分注し、次に試薬を複数の該ウェルに分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、多型のタイピングを行うことを特徴とする遺伝子の多型解析方法。
【請求項６２】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、複数の該ウェルに試薬を分注し、次に該ウェルにそれぞれ異なるＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、多型のタイピングを行うことを特徴とする遺伝子の多型解析方法。
【請求項６３】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、該カバー表面に試薬を分注し、次に該ウェルにそれぞれ異なるＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、多型のタイピングを行うことを特徴とする遺伝子の多型解析方法。
【請求項６４】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、該カバー表面にそれぞれ異なる試薬を分注し、次に該ウェルにＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、遺伝子の多型を解析することを特徴とする遺伝子の診断方法。
【請求項６５】
複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、該ウェルにそれぞれ異なる試薬を分注し、次に該ウェルにＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、遺伝子の多型を解析することを特徴とする遺伝子の診断方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、極微量の溶液を密閉させる場合に利用されるマイクロウェルアレイ、当該マイクロウェルアレイを使用した液体の密閉方法、当該マイクロウェルアレイへの液体の分注方法、当該マイクロアレイの製造方法、当該マイクロアレイ用の溶着装置、および、当該マイクロアレイを用いた解析方法に関する。
背景技術
多くの化合物の中から、選択的に必要な化合物を選り分ける場合に使用される技術の一つとして、ＨＴＳ（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、ハイスループットスクリーニング）技術がある。ＨＴＳ技術は、大量の生物学的情報を一度に取り扱うことができ、化学反応や蛍光の検出を試験管などで一回ずつ行うよりも、コスト・時間の点で圧倒的に有利であるために、近年特に注目されている技術である。
例えば、現在急速に普及しつつあるＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発現解析を目的としているが、これもＨＴＳ技術から派生した技術であり、１枚のスライドガラスの表面に数千から数万のプローブｃＤＮＡ（遺伝子）をスポットし、検体から取り出したｍＲＮＡを逆転写することにより得られたターゲットｃＤＮＡとハイブリダイゼーションを行わせることにより、遺伝子ごとの発現量を並列的に比較・処理することができる有力な解析手段である。
このＤＮＡマイクロアレイでは、ターゲットとなるｃＤＮＡとプローブとなるｃＤＮＡをバッファー溶液中でハイブリダイゼーション反応させた後、スライドガラスを洗浄・乾燥し、各スポットから発せられる蛍光を光スキャナーで測定しているが、アッセイによっては、反応と信号の検出を溶液の状態で行わなければならない場合も多い。例えば、ＳＮＰタイピング（中村祐輔編集「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」、ｐ．９３〜ｐ．１４９、中山書店、２０００年６月発行）に用いられるＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＲＣＡ法などではＤＮＡと酵素との反応、及び反応の結果得られる蛍光の検出を、溶液のままの状態で行わなければならない。
Ｉｎｖａｄｅｒ法は、原理がＶ．Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７（１９９９）２９２−２９６．に記載されているが、この方法を用いることにより、ゲノムＤＮＡ中の多型を選択的に検出することができる。すなわち、実験方法として、ゲノムＤＮＡ２００ｎｇ程度を分注し、それに試薬２０μＬ（蛍光標識試薬＋酵素＋Ｉｎｖａｄｅｒプローブの混合液）を混合する。そして、溶液から発する蛍光強度を測定することにより、検出したいＤＮＡの配列（いわゆる多型）がゲノムＤＮＡ中に存在するかどうかを判定（タイピング）することができる。
現在、溶液の反応を大量に行う場合には、一つのウェル当り数十から数百μＬの容積を持つ９６ウェルマイクロタイタープレートあるいは３８４ウェルマイクロタイタープレートに反応試薬を分注し、サーマルサイクラーで熱処理するのが一般的である。加熱する際、液体が蒸発してウェルから出ていかないようにサンプルを保持しているウェルを密閉する必要があり、通常粘着剤の付いた可撓性のシートあるいはフィルムでウェルを覆っている。特に、ＤＮＡを変性する場合には、水の沸騰温度に近い９５℃で加熱しなければならないため、シート（あるいはフィルム）にウェルの内側より大きな圧力がかかる。この時、蒸発した溶液をウェルから逃さないようにするために、ウェルを完全に密閉している。
こうした熱処理を伴うアッセイを効率的に行うために、９６ウェルマイクロタイタープレートあるいは３８４ウェルマイクロタイタープレートの材質、形状、化学的・物理的特性はこれまで用途に応じて種々の工夫がなされてきた。例えば、特表平１１−５０７５０８には、マイクロプレートの各ウェルをシールする際、弾力圧縮性のリッジがパッドの表面に形成されている可撓性を有するパッドを、ウェルの開口部に押し当てることによって、ウェル内部を液密な状態に保持し、加熱・攪拌工程の後にパッドをウェルから剥がし易くすることを特徴とする発明が示されている。米国特許第６１０６７８３号は、各ウェルをシールする際のクロスコンタミネーションの低減を目的とした構成を開示するものである。
一方、特開平１０−２２１２４３には、隣接ウェル間の光クロストークを減らすために不透明な材料でウェルの側壁を構成し、ウェルの上下方向から光の発光を計測できるよう底面部を透明性の高い材料で形成したマイクロプレートが開示されている。米国特許第５４８７８７２号は、ウェルの上下方向からの発光の計測を容易にするために、ウェルの底部を紫外線透過性の材料で構成したマイクロタイタープレートを開示するものである。
発明の開示
反応に用いられる酵素（構造的にはたんぱく質）や反応生成物の検出に用いられる蛍光色素が非常に高価なこと、検体等から抽出できるゲノムＤＮＡの量（２０ｃｃの血液から採取できるＤＮＡは１００〜２００μｇ）が限られていることから、これまで微量の検体からＤＮＡの配列、疾患、遺伝などに関する多くの情報を引き出すことは難しかった。そのため、微量の溶液を狭い空間に密閉し、溶液から発せられた光信号を高感度に検出することによって、一つのウェル当りに必要な試薬や試料を極力少なくするアッセイが望まれている。
しかしながら、従来使われてきたマイクロタイタープレートのウェル容積をただ単に小さくしても、ウェルの密閉方法自体を根本的に変えなければ、恒温水槽中で長時間ウェル内の溶液をインキュベート（熱処理）したり、沸騰させたりすることはできない。このことは、たとえば水が９５℃で沸騰して蒸気になると、常温（２５℃）時の体積の約１６００倍になるため、密閉したウェルの内部から、１６００倍近くの圧力がかかることになり、従来のシール方法ではウェルの密閉性を維持することができないことからも明らかである。
溶液を液密にシールする前者の発明により、サーマルサイクラーで熱処理している間の溶液の減少を最小限に抑えることができる。また、ウェルの底面部に透明性を持たせる後者の発明により、検出される蛍光の量を高めることが可能である。しかしながら、ＴａｑＭａｎ法やＩｎｖａｄｅｒ法などの溶液反応を行わせる場合には、これらの発明を利用しても、一つのウェルに数十μＬ〜数百μＬ程度の溶液や数百ｎｇのゲノムＤＮＡを依然として割り当てなければならない。またマイクロタイタープレートはウェルの容積が大きいために、ウェル内の蛍光試薬全体を光によって励起することが困難である。加えて、ウェルから発せられた蛍光は、容積の大きいウェルの側壁などで散乱されたり、底面部から透過して散逸するため、プレートリーダーなどを用いても、蛍光を高い収率で検出することができない。その結果、マイクロプレートを利用する限り、蛍光試薬・酵素・検体試料を大幅に削減し、並列的に大量のデータを取得することは難しい。
また近年、ＩＣＡＮ法、Ｌａｍｐ法など等温でＤＮＡを増幅する技術が開発されているが、従来発明されたウェルのシール方法を使う限りにおいては、恒温水槽中で、長時間ウェルを液密に維持することが難しい。
このような実状のもとに本発明は創案されたものであって、その目的は、マイクロタイタープレートを使用した場合に、試薬の量が少なくとも５．０μＬ以上でなければ反応・検出できないと考えられてきた反応系を、数μＬ以下、場合によっては０．５μＬ以下の微量な溶液でも、空気をほとんど介在させないようにマイクロウェルに密閉し、かつ、ウェルを高密度に配置してアレイ化することによって、微量の検体試料を反応・検出して、並列的に処理し、大量の情報を引き出すことが出来るマイクロウェルアレイを提供することである。また、マイクロウェルアレイを構成する容器、カバーとしてプラスチック材料から成るものを使用することによって、低コストなマイクロウェルアレイを実現することが可能である。
本発明の１つの実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数のウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、各々のウェルの縁部近傍は、周囲よりも高くなった隆起部を形成している。この構成によれば、容器とカバーの密着性を容易に確保できるので微量な溶液の封入に好適である。また、容器とカバーを超音波振動によって溶着させる場合には、超音波振動が当該隆起部に集中し、容易に溶着することができるので好適である。このことは特に、ウェルに収容された液にＤＮＡやタンパク質が含まれる場合、これらに損傷を与えることなく溶着を行うことが可能になるために特に好適である。さらに、容器にカバーを取り付けて密閉する際に、マイクロウェルから液があふれることが有っても、上記隆起部によって、あふれた液が隣接するマイクロウェルの内部に混入してクロスコンタミネーションが起きることが防止される。
本発明の他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数のウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、各々のウェルの縁部近傍は、周囲よりも高くなった溶着用隆起部を形成している。この構成によれば、容器とカバーを超音波振動によって溶着させる場合に、超音波振動が当該溶着されるべき隆起部に集中し、容易に溶着することができるので好適である。
本発明の他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数のウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、カバーには、カバーで容器を覆ったときに各ウェルの縁部近傍に対応する位置に、周囲よりも高くなった隆起部が形成されている。この構造の場合にも上述の構造と同様に、カバーに設けられた隆起部の存在によって、容器とカバーの密着性を容易に確保できるので微量な溶液の封入に好適である。また、超音波振動によって容器とカバーの溶着を行う際に、超音波エネルギーを当該部分に集中させることができるので特に好適である。容器にカバーを密着させる際にウェル内の液が溢れることがあっても、容器とカバーの間に形成された空間に収容されるので上記動揺にクロスコンタミネーションを防止することができる。
本発明の他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数のウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、カバーには、カバーで容器を覆ったときに各ウェルの縁部近傍に対応する位置に、周囲よりも高くなった溶着用隆起部が形成されている。この構造の場合にも上述の構造と同様に、カバーに設けられた隆起部の存在によって、超音波振動によって容器とカバーの溶着を行う際に、超音波エネルギーを当該部分に集中させることができるので特に好適である。
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、前述のウェルの縁部近傍またはカバーに形成された隆起部は、例えば、円形、四角形等の環状、すなわち、ウェルの周囲を囲んだ形状になっており、その頂部が好ましくは凸面状であって、平面ではない。この構造は、容器とカバーとを密着させて超音波振動によって溶着させる場合、振動のエネルギーが集中する容器とカバーの接触部分の領域を小さくする効果があり、溶着が一層容易になるので好適である。
本発明の１つの側面によれば、複数のウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、容器の、各々のウェルの周囲またはカバーの当該ウェルの周囲に対応する位置の少なくとも一方には、ウェルをカバーによって覆った際にウェルから溢れた液を収容することができる溝が形成されていることを特徴とするマイクロウェルアレイが提供される。マイクロウェルに検体試料を注入して密閉する際に、同時に空気が閉じこめられないようにするためには、マイクロウェルから余剰の検体試料があふれ出ることが起こりえるが、上記の構成によれば、ウェルからあふれた液を容器のウェルの周囲に設けられた溝で受け止めることが出来るので、隣接するウェルの液と混合されてクロスコンタミネーションを生じることが排除される。当該構成は、特に容器とカバーが薄型で、これらを組み合わせた状態での厚さも薄い場合に特に有効である。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該カバーと液体の入った該ウェルとがウェルごとに溶着されている。容器とカバーとを溶着することによって、接着剤等が不要になるために溶剤の溶出等の問題を生じることがなく、接着部分にも容器とカバーが一体構造である場合と同等の強度が得られ、さらに、接着前の容器とカバーの取り扱いが容易になる等の効果がある。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該カバーと液体の入った該ウェルとがウェルごとに超音波溶着されている。容器とカバーとを超音波によって溶着することによって、マイクロ植えるあれ以前体の温度を上昇させることなく、つまり溶着部分のみのを局部的に昇温し、て数秒以内で液密な接合が実現できるため、低コストになり、しかも作業性及び生産性が飛躍的に向上する。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、該容器と該カバーの実質的な厚みがいずれも、該容器と該カバーに接触する液体の熱を伝導することができる厚さである。ここで「実質的な厚み」とは、スカート部などを含まないウェルを定義する壁面を構成するカバーの厚みあるいは容器の厚みを指す。この構成によれば、恒温槽中にマイクロウェルアレイを浸漬した際に、周囲の液体からウェル内部に効率的に熱エネルギーが伝播される厚みを持たせることにより、インキュベーションを効果的に行うことができる。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、該カバーと該容器の実質的な厚みがいずれも０．１５〜３．０ｍｍの範囲である。この厚みを０．１５〜３．０ｍｍの範囲にすることによって、水槽やサーマルサイクラーの熱を効果的にウェル内部に伝導させると共に、取り扱う際に破損させないだけの十分な強度を持たせることができる。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に溶着した状態でのマイクロウェルアレイの実質的な厚みが０．３〜４．０ｍｍの範囲である。ここで「実質的な厚み」とは、スカート部などを含まないウェル近傍におけるカバーの上面から容器の下面までの厚さを指す。この厚みを０．３〜４．０ｍｍの範囲にすることによって、カバーと容器を溶着した後に、熱を効果的にウェル内部に伝えることができると共に、取り扱う際に破損させないだけの十分な強度を持たせることができる。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に溶着した後のウェルをを直接定義する部分の厚さが、０．０５〜０．４ｍｍの範囲である。このような構成によって、仮に他の部分の肉厚が厚くても、この０．０５〜０．４ｍｍの範囲内の肉厚を持つ個所から熱を効果的にウェル内部に伝えることができ、化学反応を行わせる際に有効である。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、該ウェル近傍のには、該ウェルと該カバーを溶着するのに必要な体積を有する溶接用リブが設けられている。このようにリブの断面を、溶着後の強度を確保するために十分に大きな断面積を有するように設定することにより、ウェルごとの密閉性を維持することが可能となる。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、、該ウェル近傍には、断面形状が三角形状の溶接用リブが設けられている。リブの底辺、すなわち、溶着前のリブの幅を上記範囲に設定することにより、超音波装置の出力に対する負担を低減でき、過負荷にならないような安定した条件で溶着することができる。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、該ウェル周囲の溶着用リブの底辺の肉厚が０．２〜１．０ｍｍの範囲である。リブの底辺、すなわち、溶着前のリブの幅を上記範囲に設定することにより、超音波装置の出力に対する負担を低減でき、過負荷にならないような安定した条件で溶着することができる。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるとともに、該ウェルのそれぞれを液密に密閉するカバーを具備し、ウェル周囲の溶着用リブの底辺の肉厚が０．２〜１．０ｍｍの範囲、高さが０．２〜０．８ｍｍの範囲、ウェルを取り囲むリブの直径が０．５〜４．０ｍｍの範囲である。この構成によれば、超音波装置の出力に対する負担を低減でき、高さとリブの直径を上記範囲に設定することによって、リブの高さバラツキを吸収し、しかも溶着に負担がかからないようにすることができる。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に接合した状態でのウェルを取り囲む溶着部分の幅、すなわちドーナッツ状に溶けた部分の幅が、０．３〜２．５ｍｍの範囲である。この構成によれば、溶着後にウェル内部の液体が沸騰しても、該カバーと該ウェルの密閉性を十分に維持することができる。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該マイクロウェルアレイが恒温槽中に浸漬された際、該ウェル内の液体温度が数分以内に均一になるような容積を該ウェルが有する。熱が効果的に、かつ均一に伝わる容積にすることによって、ウェル内での化学反応を効率的に行うことが出来る。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該ウェルの容積が０．１〜１．４μｌになることを特徴とするマイクロウェルアレイ。本発明の別の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に接合した後のウェルの容積が０．１〜１．４μｌになる。ウェルの容積を当該範囲にすることによって、ウェルの容積を測定限界にまで低減して多量なサンプルの取り扱いを可能にすることができる。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に溶着した後では、ウェル内部で液体が沸騰しても、ウェルの密閉性を保持することができる。本発明によって実現されるこの強固な密閉性は、接着剤等を使用した従来の密閉方法では実現することのできなかった強度を有するものである。このために、マイクロウェルアレイを、機械的な密閉補助手段なしで、直接高温処理することが可能になった。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、超音波を照射することにより該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に溶着した後では、ウェル内部で液体が沸騰しても、ウェルの密閉性が保持されている。すなわち、上記の密閉性は、この実施例においては、容器とカバーを超音波で溶着することによって実現されるものである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該ウェルと該カバーとをウェルごとに液密に溶着した後のウェル内部で液体が沸騰しても、外部から密閉性を保持するための機械的な力を加えることなくウェルの密閉性が維持できる。すなわち、従来のマイクロウェルアレイは、大気圧下において、ある程度の密閉が可能ではあったが、ウェル部の液体が沸騰するような環境下では密閉が破れていたところ、本発明のマイクロウェルアレイでは、シール構造の改良によってウェル自体がこの内圧に耐えることができる構造を有するものである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該ウェルと該カバーとをウェルごとに接合した後のウェル内部で、９０〜１００℃に加熱された液体が沸騰しても、ウェルごとの密閉性が保持される。すなわち、上記においてウェル内部の液体が沸騰する温度とは、具体的には例えば、９０〜１００℃であり、本発明のマイクロウェルアレイはこの温度におけるウェル内の液体の沸騰圧力を保持することができるものである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、マイクロウェルアレイは、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備し、該ウェルと該カバーとをウェルごとに接合した後に、該マイクロウェルアレイを沸騰した水溶液中に浸漬させても、ウェルごとの密閉性が保持される。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイにはさらに、ほぼ平板状で可撓性を有する材料からなる中間体を容器とカバーの間に介在させてある。当該構造のマイクロアレイの場合には、カバーを容器に押し付けて密封を図る際、中間体が可撓性を有するので、中間体をマイクロウェルの上部に容易に密着させることができる。また、中間体がマイクロウェルの上縁部に接触して変形することにより、マイクロウェル内部の空気を排出するよう作用するので、好適である。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイにはさらに、前記カバーの、カバーで容器を覆ったときに各ウェルに対応する位置には、ウェルをカバーによって封止した際に、各ウェル内に押し込まれる凸部が形成されている。当該構造を有するマイクロウェルの場合には、カバーを容器に押し当てた際に、前記凸部が各ウェルの中に押し込まれることによって、ウェル内に存在する可能性のある気泡を、場合によっては液とともに、ウェルの外に排出することができるので好適である。
本発明の他の実施形態によれば、カバーまたは中間体を容器に押し付けた後、カバーと容器を溶接することにより各ウェルに液体を封止する方法が提供される。当該方法によれば、密封動作と溶着による封止動作を同時に実施することができるために作業効率が向上し、さらに、接着剤を使用しないためにウェル内の液の汚染を防止することができる。
本発明の他の実施形態によれば、上記の各ウェルに封止される液体はＤＮＡまたはタンパク質を含む液である。この場合には、容器とカバーとが溶接されているので当該液が外気に触れることなく確実に密封され、また、密封された以降の取り扱いが簡便である。
本発明のさらに他の実施形態によれば、ウェルにＤＮＡまたはタンパク質を含む液を封止したマイクロウェルアレイは、容器とカバーが超音波によって溶着されたものである。超音波振動によって振動エネルギーを溶着部分に集中させることによって、ＤＮＡまたはタンパク質に損傷を与えずに封止が可能なので、ＤＮＡまたはタンパク質の有効性を損なうことなく密封することができる。
本発明のさらに他の好適な実施形態によれば、容器とカバーを溶着させる際の超音波照射は、溶着に十分であって同時にＤＮＡまたはタンパク質を実質的に損傷させないものの中から選択される。本明細書において、ＤＮＡまたはタンパク質を実質的に損傷させないとは、少なくとも以降の解析が可能な程度のＤＮＡまたはタンパク質がウェルに残存していることを意味する。超音波の照射エネルギー等を上記の範囲から適宜選択することによって、解析に最も好適な封止を可能にする密閉方法を得ることができる。
本発明のさらに他の実施形態によれば、該容器のウェルと該カバーを、０．０５秒から０．８秒の間、超音波を照射することで溶着し、液密に封止する。当該条件の下で超音波溶着を行うことによって、確実な密封を図ると同時に、超音波エネルギーを小さくすることができる。
本発明のさらに他の実施形態によれば、溶融する隆起部の長さ１ｃｍあたり、０．３ないし１００Ｎの力を加えつつ、超音波ホーンの振動を開始する。当該条件の下で超音波溶着を行うことによって、確実な密封を図ると同時に、超音波エネルギーを小さくすることができる。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイの容器とカバーとが各ウェルごとに超音波溶着によって容易にウェルの封止を行うことができる材料からなる。当該構成によれば、ウェル内に収容された検体試料に影響を与えることなく、容器とカバーとの超音波溶着を容易に行うことができる。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイはさらに、各ウェルの裏面が平面状である特徴を有する。当該構造であれば平らなヒートブロックの上にマイクロウェルアレイを配置し、加熱することができる。また、複数のマイクロウェルアレイを重ね置くことができ、さらに成形が容易である特徴を有する。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイのウェルの内壁面またはカバーの下面に、光を反射する反射面が設けられている。当該構成によれば、反射面を背景として蛍光等の測定を行えば、測定される傾向の量が増量されるので、測定感度を実質的に向上させることができる。さらに、ウェルの内壁面を反射面とした場合は、隣接するウェル方向への蛍光の漏れを防止する効果も有するので、クロストークを低減することができる。
本発明のさらに別の側面によれば、前述のマイクロウェルアレイを用い、先に接触式の分注機により液体を分注し、その後非接触式の分注機により液体を分注する分注方法が提供される。当該方法によれば、接触式の分注機による高速分注と非接触式の分注機によるクロスコンタミネーションのない分注の長所をともに生かすことができる。
本発明の他の実施形態によれば、先に接触式の分注機によりウェルごとに異なる液体を分注し、その後非接触式の分注機により液体を分注する。当該方法によれば、後に分注する液体は非接触式の分注を用いて分注するので、クロスコンタミネーションが生じることがない。
本発明のさらに他の実施形態によれば、先に接触式の分注機により液体を分注し、その液体を乾燥させ、その後非接触式の分注機により液体を分注する。当該方法によれば、異なる液を複数回分注してもコンタミネーションを生じることがない。さらに、後に分注する液体は非接触式の分注を用いて分注するので、クロスコンタミネーションが生じることがない。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイの各ウェルの水平断面は円形である。当該構造の場合には、ウェルの内壁面に気泡が付着する可能性が低く、また、上面を超音波溶着封止する際に振動エネルギーが均一に分布するために照射すべき振動エネルギーが少なくなる利点がある。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイの外周部に沿ってスカート部が形成されている。当該構成によって、マイクロウェルアレイの外形を概ね直方体、または、平板上とすることができ、重ね置く場合等において取り扱いが一層容易になる。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイに形成されたスカート部の角に、貫通穴が形成されている。当該構成においては、液の注入や蛍光の測定時に、スカート部に形成された貫通孔を標準位置として位置あわせすることで位置合わせが容易になる利点がある。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイの容器とカバーには挿入部と受け部が形成され、挿入部を受け部にはめ込むことによって該容器と該カバーを係止することができる。当該構成によれば、カバーと容器の固定が容易に行われるだけでなく、両者の位置合わせも容易である。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイの前記容器及び前記カバーがプラスチック材料から形成されている。当該構成によれば、一体成形によってマイクロウェルアレイの製造原価を低減することができ、さらに、超音波による溶着とも整合的である。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイの容器とカバーが、メチルペンテンコポリマーあるいはポリカーボネートから構成されることで、前記一体成形と超音波による溶着の可能性を有するだけでなく、透明度が高いために蛍光の測定を効率的に行うことができる。
本発明のさらに他の実施形態によれば、マイクロウェルアレイの容器とカバーの少なくとも一方が、光学的に透明な材料で形成されている。当該構成によれば、蛍光の測定を効率的に行うことができる。
本発明の他の実施形態によれば、前述のマイクロウェルアレイを構成する、前記容器のウェルあるいは前記カバーの表面に、液状の試薬または検体を分注し、担持させる。このような構成によって、それぞれのウェルに収容される試薬又は検体あるいはそれらの組み合わせを独立に制御することができる。
本発明の他の実施形態によれば、試薬又は検体の分注は非接触式の分注機によりおこなう。このことによって、ウェル間の試薬又は検体のクロスコンタミネーションの可能性を一層低減することができる
本発明の他の実施形態によれば、試薬または検体の少なくとも一方を前記容器のウェルに担持し、他の一方をカバー表面に担持し、前記ウェルと前記カバーを超音波溶着して接合し、各ウェルごとに試薬と検体を反応させる。この方法によって、試薬と検体とは超音波溶着の際に初めて互いに接触することになるために、混合前には個別に保持することが望ましい試薬と検体との組み合わせ等の場合には極めて好適である。また、この方法によれば、接触式の分注機のみで分注を実施することができ、クロスコンタミネーションの可能性も低減できる。
本発明の別の側面によれば、マイクロウェルアレイは、サイドゲートから樹脂を流し込んで該容器と該カバーを射出成形することによって製造される。当該製造方法は、本発明に基づくマイクロウェルアレイに必要な、製作精度および平坦度を実現するためには好ましい方法である。
本発明の別の側面によれば、前記容器とカバーの超音波溶着を実施するための超音波溶着装置は、発振時の力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることができ、かつ、最大発振出力が４．１〜５．０ｋＷである。容器とカバーが接触する、ウェルの周囲の突起部分を震動によって溶かして溶着するためには、従来の超音波溶着装置の能力を超えた上記の能力が必要である。
本発明の超音波溶着装置の他の実施例では、ホーンの振幅が３０〜４０ミクロン、発振時の力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることができ、かつ、最大発振出力が４．１〜５．０ｋＷである。このような特性を有するホーンを使用することによって、マイクロウェルアレイに対して、本発明が目的とする容器とカバーとの強固な密閉を実現することができる。
本発明の超音波溶着装置の他の実施例では、ホーンの振幅が３０〜４０ミクロン、発振時の力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることができ、最大発振出力が４．１〜５．０ｋＷ、溶着時間が０．０５〜０．８秒の時間内で超音波を照射することができる。ホーンは容器とカバーの溶着に必要な超音波振動エネルギーを照射することができると同時に、測定対象の分子を破壊しないことが求められるが、上記の条件のホーンによって当該要件が満足される。
本発明の超音波溶着装置の他の実施例では、ホーンの振幅が３０〜４０ミクロン、発振時の力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることができ、かつ、最大発振出力が４．１〜５．０ｋＷであり、０．０５〜０．８秒の時間内でウェルごとに溶着することができる。当該超音波溶着装置によれば、超音波振動エネルギーを各ウェルに分散して、各ウェルを溶着することができる。
本発明の他の側面によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に、分注機により分注し、その後超音波溶着装置により該カバーと該ウェルをウェルごとに液密に溶着することを特徴とする密閉・分注方法が提案される。当該密閉・溶着方法を実施することによって、各ウェルに収容された試薬又は検体を、クロスコンタミネーションの可能性を最小限にして、強固に密封することができる。
本発明の他の側面によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に、分注機により分注し、その後超音波溶着装置により該カバーと該ウェルをウェルごとに溶着し、試薬と検体を反応させた後、あるいは試薬と検体を反応させながら、蛍光評価装置によりウェルごとの蛍光強度を分析することにより、ウェルごとの反応の度合いを解析することを特徴とする解析方法が提案される。当該方法によって、ごく微量の試薬又は検体をもちいて、反応の度合いを高精度に解析することができる。
本発明の他の側面によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に、分注機により分注し、その後超音波溶着装置により該カバーと該ウェルをウェルごとに溶着し、試薬と検体を反応させた後、あるいは試薬と検体を反応させながら、蛍光評価装置によりウェルごとの蛍光強度を分析することにより、ウェルごとに遺伝子を解析することを特徴とする遺伝子の解祈方法が提供される。当該方法によって、ごく微量の試薬又は検体をもちいて、遺伝子解析を高精度に実施することができる。
本発明の他の側面によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に、分注機により分注し、その後超音波溶着装置により該カバーと該ウェルをウェルごとに溶着し、試薬と検体を反応させた後、あるいは試薬と検体を反応させながら、蛍光評価装置によりウェルごとの蛍光強度を分析することにより、ウェルごとに遺伝子の多型を解析することを特徴とする遺伝子の多型解析方法が提供される。当該方法によって、ごく微量の試薬又は検体をもちいて、遺伝子の多型解析を高精度に実施することができる。
本発明の他の好適な実施例によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、該ウェルにそれぞれ異なるＤＮＡを分注し、次に試薬を複数の該ウェルに分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、多型のタイピングを行うことを特徴とする遺伝子の多型解析方法が提供される。当該解析手法を使用することにより、ごく微量な溶液の状態における蛍光強度分析を通じて容易に遺伝子の多型解析を行うことができる。
本発明の他の好適な実施例によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、複数の該ウェルに試薬を分注し、次に該ウェルにそれぞれ異なるＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、多型のタイピングを行うことを特徴とする遺伝子の多型解析方法が提供される。当該解析手法を使用することにより、ごく微量な溶液の状態における蛍光強度分析を通じて容易に遺伝子の多型解析を行うことができる。
本発明の他の好適な実施例によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、該カバー表面に試薬を分注し、次に該ウェルにそれぞれ異なるＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、多型のタイピングを行うことを特徴とする遺伝子の多型解析方法が提供される。当該解析手法を使用することにより、ごく微量な溶液の状態における蛍光強度分析を通じて容易に遺伝子の多型解析を行うことができる。
本発明の他の好適な実施例によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、該カバー表面にそれぞれ異なる試薬を分注し、次に該ウェルにＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、遺伝子の多型を解析することを特徴とする遺伝子の診断方法が提供される。当該解析手法を使用することにより、ごく微量な溶液の状態における蛍光強度分析を通じて容易に遺伝子の診断を行うことができる。
本発明の他の好適な実施例によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、該ウェルにそれぞれ異なる試薬を分注し、次に該ウェルにＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、遺伝子の多型を解析することを特徴とする遺伝子の診断方法が提供される。当該解析手法を使用することにより、ごく微量な溶液の状態における蛍光強度分析を通じて容易に遺伝子の診断を行うことができる。
本発明の他の側面によれば、複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、そのマイクロウェルアレイに分注する試薬及び検体に対応したバーコードを添付して、工程ごとに、また、マイクロウェルアレイごとに進捗をバーコードで管理できるようにし、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に、分注機により分注し、その後超音波溶着装置により該カバーと該ウェルをウェルごとに溶着し、試薬と検体を反応させた後、あるいは試薬と検体を反応させながら、蛍光評価装置によりウェルごとの蛍光強度を分析することにより、ウェルごとの反応の度合いを解析することを特徴とする解析方法が提供される。本方法によれば、多数又は多種類の試薬等を使用した解析を行う際のデータの取り扱いをより簡便にし、錯誤によるミスの可能性を低減することができる。
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記容器あるいは前記カバーの少なくとも一方は、再度ゲートから樹脂を流し込んで射出成形することによって製造される。当該製造方法を採用することにより、容器あるいはカバーの厚さが小さくなった場合にもそりのない平坦度の高いものを得ることができる。
本発明の他の側面によれば、上述のようなマイクロウェルアレイを用い、各ウェルに液体を分注し、液体をウェルから押し出すように前記カバーまたは前記中間体を容器に押し付けることによって、該ウェル内への空気の混入を防ぐように各ウェルに液体を封止することを特徴とする液体の密閉方法が提供される。当該方法によって液体を密閉することによって、空気のウェルへの混入を排除することができ、後の昇温処理において空気の膨張によるウェル内の内圧膨張を防止することができる。
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記溶接は超音波溶着によって行う。超音波溶着によって、ウェルに収容された検体試料に対する汚染等の影響を最も小さくしつつ、ウェルの密封を実施することができる。特に、容器とカバーが接触する部分、つまり、ウェルの縁部またはカバーの接触部分の形状を適宜選択することによって超音波溶着に必要なエネルギーを低減することが可能で、液への影響は実質的に無視することができる程度に抑えることができる。
上記は本発明が提供する解決手段とその効果を例示したものであって、上記の解決手段の上記以外の効果、本発明が提供する上記以外の解決手段とそれらによって得られる効果は、以下の発明の実施の形態の記載に基づいて当業者は容易に理解するはずである。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の好適な実施の形態を図面を参照しつつ説明する。
これまで超音波はＤＮＡや細胞を破壊する目的で使用されてきている。たとえば、ゲノムＤＮＡを超音波によって破砕し、短い断片を形成した上で、塩基配列をシークエンサーで読みとるショットガン法がそのよい例である。また、細胞に超音波を印加することにより、細胞膜を破壊することも試みられてきた。しかしながら、本発明で考案されたように、容器の構造や超音波による溶接条件を工夫することにより、これまで破壊目的に使用されてきた超音波技術を、微量溶液やＤＮＡ、たんぱく質の封止に利用できることが明らかとなり、従来では考えられなかった応用を実現したという意味において、本発明の意義は非常に大きい。
図１は本発明のマイクロウェルアレイの斜視図である。この例では、３８４個の独立したウェルがプラスチック容器の表面に、縦横の間隔が４．５ｍｍになるように形成されている。ここで「独立した」とは、別々のウェルに入っている液体が混合することなく、完全に分離されている状態を指している。カバーを上方からウェルに向けて押し付けることにより、ウェルに充填された微量の液体を空気がほとんど混入しないように、液密に密閉することができる。またカバーと容器の位置を確実に一致させるために四隅にスルーホールとガイドピンを設けており、押し付けた時にカバーと容器を簡便に接合するため、図のようにはめ込み部を形成した。図２は図１のＡ−Ａ‘に沿っての断面図であり、図のようにウェルは、ウェルの開口部、隆起部、液体の逃げ溝から構成されている。ここで隆起部はカバーと容器を溶接する際に溶融し接着する部分である。
一般に、プラスチック材料どうし、あるいはほかの材料との接着には溶接、溶剤、接着剤による方法がある。溶接は、プラスチックなどを加熱溶融させて接着する方法で、外部加熱式（ガスポットジェット、ヒートシール、赤外線、インパルスシール法など）と内部加熱式（高周波ウェルダー、ミシン、マイクロ波、超音波シール法など）がある。また振動により溶着する振動溶着法も溶接に含まれる。本発明の好適な実施例ではカバーと容器を超音波ウェルダーにより超音波溶着するが、振動溶着、溶剤や接着剤を併用することももちろん可能である。
ウェルの垂直断面形状は、微量の液体を分注するスポッティング装置のニードル（針）を入れ易くするため、台形の形状にした。高密度にウェルを配置する際（例えば９６００ウェル）には、台形にするたけのスペースが確保できない場合もあり、断面形状は長方形でも構わない。従って、ウェルの密度とニードルのサイズ・形状によって、三角形、四角形などの多角形や、半円形など、最適な断面形状を決めることが必要である。
液体押し出し部（凸部）は、ウェルに充填された液体を逃げ溝に押し出し、ウェルに空気が残存しないようにするためのものであるが、ウェルに満たされる液体がウェルの開口部からはみ出て表面張力により盛り上がっている場合には、液体押し出し部を形成しなくても、空気が残存しないように液体を密閉することが可能である。仮に空気がウェル内に多量に残り、密閉した後もウェル内に空孔が存在すると、光が乱反射するだけでなく、光を発する溶液自体の量が減り、その結果として溶液から出射される蛍光の光量が低下する。また、空孔が残存しているウェルと残存していないウェルの間で蛍光強度が大きく異なると、ウェル間で信号がばらつく原因となり、定量的な解析ばかりでなく、定性的な解析も難しくなる。従って、ウェル内にできる限り気泡が残らないように溶液を密閉することが大切である。
この液体押し出し部は、溶着時に溶融した隆起部がウェルの上方を遮らないようにする作用も、上記機能に加えて持ち合わせている。すなわち、隆起部が溶融する際、隆起部を構成する樹脂が溶け出し、容器とカバーの間に広がるが、この液体押し出し部を形成することにより、溶け出した樹脂が、ウェル上方を覆うことを防止することができ、光の透過性を維持する上で、非常に有効である。
またこの例では、超音波のエネルギーを集中させるための隆起部が容器の表面に形成されているが、カバーの表面に設けられていても同様な効果が期待できる。図３は他の好適なウェル周囲の垂直断面形状の例を示す。図３（Ａ）は、ウェル周囲に形成された隆起部の裾野が、ウェルの一部と繋がっている場合を示す。このような状態においては、溶着時に溶けた隆起部の一部がウェルに溶け出し、ウェルの容積を小さくしてしまうだけでなく、溶け出ることにより、ウェル内の液体を加熱する場合がある。さらにウェル内の液体が、隆起部に蓄積されるはずの摩擦熱の一部を吸収し、カバーとウェルが溶着しにくくなる場合もある。従って、ウェル周囲の隆起部頂部の形状は、図３（Ｂ）〜（Ｈ）のように凸面状であることがより好ましい。
また、図４にはめ込み部の断面形状を示した。図４のようにプラスチックをフック状の形状を持つように加工することにより、フックの部分を内側に折り曲げるようにしてカバーを容器にはめ込むことができる。
上記液体の逃げ溝は、ウェルの開口部を囲むように周囲に形成してあるが、ウェルから押し出された液体が溜まる溝であれば、その形状や位置は限定されるものではない。例えば、図５の平面図に示すように、ウェルの列と列との間に直線状に逃げ溝を形成しても良いし、図６のように４個のウェルに囲まれた位置に形成しても良い。また、カバーの表面に設けられていても同様な効果が期待できる。
上記例では、ウェルの外形を円形にし、超音波のエネルギーが均等に印加されるように設計したが、外形は四角や三角などの多角形やその他の形状でも密閉できる構造になっていればもちろん構わない。
ここでカバーと容器は一般的な射出成形の方法で形成することができる。材料としては、耐薬品性、耐熱性に優れたポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン、メチルペンテンコポリマー（ＴＰＸ）などのプラスチック材料が挙げられ、特に紫外・可視・赤外光領域など、利用する波長領域で光の透明性の高いメチルペンテンコポリマーやポリカーボネートが適しているが、ポリカーボネートは材料費がポリプロピレンの４倍近くになる。メチルペンテンコポリマーはポリカーボネートと比較すると柔らかく、材料費も高いが、樹脂の流動性が良いため、射出成形の際、肉厚の薄い成形品を作りやすいという長所を有している。従って、求められる特性とコストに応じて、材料を選択することが重要である。
容器の表面に形成されたウェルとカバーは溶接により接着するが、各ウェルを液密に密閉する必要があることから、カバーの形状は、反りのない平坦な形であることが望ましい。カバーが反っている場合には、カバーをウェルに押し付けた際に、ウェルに充填した溶液と接触しない部分がカバー表面に生じ、カバーとウェルの間に空気が介在することになる。その結果溶接する際に、ウェル内に多量の空気が混入する可能性がある。従って、カバーの厚さには、平坦性を維持できるだけの最低限の厚みと、熱伝導性を確保できるだけの薄さが要求され、０．１５ｍｍ〜３．０ｍｍのものが適しており、より好ましくは０．２５ｍｍ〜１．５ｍｍのものが適している。
一方、容器の表面形状もカバー同様に平坦でなければ、カバーとの溶接が容易でなくなり、液体の密閉性が維持できないが、容器の裏面形状は必ずしも平坦である必要はない。しかしながら、容器の裏面、特に各ウェルの直下に対応する裏面部分を図２のように平坦にすることにより、平らなヒートブロックの上にマイクロウェルアレイを配置し、加熱することができる。現在一般に用いられているマイクロタイタープレートなどでは、各ウェルが円錐の外形を有しており、ヒートブロックもそれに合わせて円錐状の彫り込みが必要である。また、ヒートブロックの彫り込み部分とマイクロタイタープレートの円錐状になった側面が精度良く接触しない場合には、３８４穴のマイクロタイタープレートの各ウェルを均一に、かつ効率よく加熱することができない。このことから、マイクロウェルアレイの裏面を平坦にすることにより、形状が複雑かつ、高い加工精度の要求されるヒートブロックを使う必要がなくなり、ホットプレートなどの安価な機器を用いて加熱することが可能となる。さらに、マイクロタイタープレートの場合には、通常、粘着剤の付いたフィルムで、各ウェルをシールするが、粘着剤によるこのようなシール方法では、水槽中で各ウェルを液密に保つことはできない。
加えて、マイクロタイタープレートのウェル内部の水溶液が沸騰するレベルの温度にまで加熱する場合には、粘着剤の付いたシール用のフィルムでは密閉を維持することができず、機械的な力でウェルの上から抑えなければ、ウェル内部の溶液が蒸発してしまう。従って、現在市販されているサーマルサイクラー等の加熱器には、マイクロタイタープレートに貼り付けたフィルムを機械的に押し付ける蓋が備わっている。しかし、本発明のマイクロウェルアレイでは、ウェルごとに超音波溶着により液密に密閉されていることから、たとえウェル内部の溶液が沸騰する温度に加熱されようとも十分に密閉性を維持することができ、ウェル内の溶液が、ウェル外部に蒸発する危険性はない。すなわち、ＤＮＡを変性させるために９０〜１００℃にマイクロウェルアレイを水槽中で加熱しても、ウェルの密閉性を維持することが可能である。このような完全な密閉が可能になるのは、マイクロウェルアレイを構成するカバーの一部と容器の一部を摩擦熱により溶かして接合するからである。そのため、溶着された各ウェルの密閉性、すなわち、各ウェルの機械的な密閉強さは、マイクロウェルアレイの材料であるプラスチックそのものの機械的な強さと同等となる。この結果、従来実施されてきた粘着剤による密閉の強さとは比較にならないほど強力な密閉が、超音波溶着により実現できる。以上のことから、マイクロウェルアレイを用いれば、ウェル内の溶液を、加熱器等を使わずに、水槽中でインキュベート（熱処理）することが可能である。また、何千枚ものマイクロウェルアレイを、たとえば、恒温水槽中に入れて、同時に大量に熱処理することができ、加熱器を何千台も備える必要なく、安価にしかも高速に処理することが可能となる
加えて、容器の裏面が平坦であると、容器の裏側に沿って、光を反射する特性を持つ物体を置くことにより、図７のように、ウェル内の蛍光試薬等から発せられる検出用の光を、容器裏面の方向へ逃がすことなく、容器上方に配置された検出装置の方へ検出用の光を反射することが可能である。試薬から発せられる蛍光は、通常全方向に出射することから、反射する物体を裏面側に配置することにより、検出装置により測定できる蛍光を約２倍に高めること、すなわち、Ｓ／Ｎ比を２倍にすることができる。一方、容器裏面の方から励起光を入射し、裏面側に光検出器を配置している場合には、カバー上方に光を反射する物体を配置することにより同様な効果を実現することができる。一般にアルミニウムやステンレス等の金属の表面を研磨した反射材、アルミニウム・金などの高反射率を持つ金属を固体の表面にコーティングした部材等が光を反射する性質を持っている。さらに、容器の裏面、あるいは、ウェルの内壁に、蒸着やスパッタリング等によって金属をコーティングすることにより、光を反射する特性を持たせることも可能である。もちろん市販の鏡を利用しても同じような効果を得ることができる。
容器とカバーを溶接した後のマイクロウェルアレイについても平坦性と良好な熱伝導性が必要であることから、容器とカバーを合わせた厚さが、０．３〜４．０ｍｍ、好ましくは０．５〜３．０ｍｍ、であることが求められる。容器、カバーを合わせた厚さが０．３ｍｍを下回ると、剛性が小さくなり、溶接時３８４穴のウェルに均一に圧力をかけて溶着することが難しくなる。
図８のように、マイクロウェルアレイの外周部に沿ってスカート部を形成すると、マイクロウェルアレイが反りにくくなると共に、汎用の分注装置のステージなどにマイクロウェルアレイを設置する際、特別なアダプターを使うことなく取り付けることができる。また、図８のようにスカート部の角に貫通穴を設けることにより、水槽中でインキュベートする際に、容器裏面に溜まった気泡がこの貫通穴を通って外へ逃げることができ、容器裏面全体を均一に加熱することが可能となる。
さらに射出成形により容器とカバーを形成する際には、一般的なピンゲートでも良いが、本発明の場合のように肉厚が薄い場合には、ピンゲートでは樹脂が流れにくく、反りが大きくなり、シリンジなどで微量の溶液を分注する際、各ウェルに確実に溶液をスポットすることが難しくなるため、図８のようにサイドゲートから樹脂を流し込むことが望ましい。
ウェルを高密度に配置すると、隣接するウェルからの光の漏れ、すなわち、光クロストークの影響が無視できなくなる場合があるが、その場合には、例えば、容器の原材料に顔料や微細金属粉末を混ぜ、容器を不透明にすることによって防止することが可能である。
図９は、図１に示されるマイクロウェルアレイにゲノムＤＮＡ（検体）をスポッティングし、乾燥後反応試薬（液体）を分注・密閉する工程を示している。ここでいうＤＮＡとは、動植物の細胞に含まれている状態のままのＤＮＡ、すなわち細胞に含有された状態のＤＮＡを指しているのではなく、酵素と反応させるためにＤＮＡとして細胞から取り出されたものや、溶液の中に剥き出しに溶け込んでいるＤＮＡ、あるいは、増幅や化学合成されたＤＮＡ等を指している。図９Ａでは、微量のＤＮＡをスポッティングし、水溶液を乾燥させた状態にあり、図９Ｂでは、ＤＮＡと反応させる試薬をウェルの容積より３〜９割程度多めに非接触式の分注機によりスポッティングする。液体には表面張力の作用があり、ウェルに納まらない部分の液体は盛り上がるようにしてウェルからこぼれずに保持されている。次に、図９Ｃ、９Ｄに示されるようにウェルに充填された液体をカバーの押し出し部によりウェルの外側へ押し出すことにより、ウェルに空気がほとんど残らないように密閉することができる。さらに図９Ｅのように超音波によりウェルの隆起部をカバーに押し当て、隆起部を溶融させることにより、隆起部とカバーの接触部が接合し、ウェルを液密にシールすることができる。
図９のように、ウェルに液体をスポッティングする際、ウェルの容積より３〜９割程度多めにスポッティングすることが望ましいが、液体の濃度が非常に高い場合には、気泡が多少混入しても反応が進行し、かつ検出用の蛍光が多量出射されることから、図１０のように溶着後のウェルの容積程度の液をスポッティングしておくことで、反応・検出が確保できる場合もある。従って、反応・検出の感度と、ウェルに充填する試薬の濃度を勘案し、最適量をスポッティングすることが必要である。
ところで、各ウェルに溶液を分注する際、最初は容器が洗浄されているため、接触式の分注機により溶液を分注することができるが、続いて別の溶液を分注する際には、接触式の分注機を用いると、最初の溶液と２回目の溶液が混ざってしまいコンタミネーションの原因となることから、２回目の分注では、図１１のように非接触式の分注機により溶液を分注することが望ましい。ここで、接触式の分注機とは、マイクロウェルアレイに分注する際、シリンジやチップ、あるいは、液滴の付着した状態のシリンジやチップなどの先をウェルに接触させることにより、スポットする液体をウェルに分注する装置を指す。一方非接触式の分注機とは、シリンジやチップなどの先をウェルに接触させずに、空気圧、バルブ、圧電素子、熱膨張などによって押し出すことにより分注できる装置を指している。本発明のマイクロウェルアレイでは、ウェルの容積が小さく、開口部も狭いケースがあることから、２回目以降の分注では、非接触式の分注機により分注することが望ましい。
また溶液をウェルに分注した後に溶液を乾燥させることにより、異なる溶液を各ウェルに繰り返し分注することが可能である。ＤＮＡや蛍光試薬は、乾燥してもその性質が劣化することがほとんどなく、また、酵素についても、乾燥させることができる場合が多い。そのため、アッセイの際に共通する成分となる試薬は、ウェルあるいはカバー表面にあらかじめ一緒に分注し、乾燥させた後に、ウェルごとに異なる試薬を分注機でウェルに添加するという方法をとることもできる。さらに、試薬または検体の少なくとも一方を容器のウェルに分注して担持し、他の一方をカバー表面に担持し、ウェルとカバーを超音波溶着して接合し、ウェルごとに試薬と検体を反応させるようにすることも可能である。
カバーと液体の入った容器とを超音波により溶接する際には、超音波を溶接部に照射する必要がある。超音波溶着は、超音波電気エネルギーを機械的振動エネルギーに変換し、圧力を印加することによって溶着される２つの部品の接合面に、強力な摩擦熱を発生させ、プラスチックを溶融し溶着を行う。ここで、溶着部分に伝達されるエネルギーは、一般に
超音波のエネルギー  ∝（力）×（超音波の周波数）
×（ホーンの振幅）×（溶着に要する時間）
∝（出力）×（溶着に要する時間）
と表現できるため、上記式の右辺の積算量が一定である限りは、溶着部分に一定のエネルギーを供給することができる。従って、力を低く設定する必要がある条件下でも溶着時間を長くしたり、ホーンの振幅を上げることによって、溶着部分に伝達されるエネルギーを一定に保つことができる。本発明のように溶着する部品のサイズが比較的大きく、かつ、溶着する隆起部の全体の長さが大きい場合には、超音波装置の出力に上限があるため、通常溶着時間を長くすることによってエネルギーを大きくしている。
しかしながら本発明のように、溶着により接合しようとする容器に液体、たんぱく質（酵素）、ＤＮＡ等が入っている場合には、超音波振動を長い時間印加すると、ＤＮＡ、あるいは、たんぱく質が切断されたり、高温のため活性を失ったりするため、ウェル内での化学反応が進行しなくなる。また、液体も振動の時間が長く続くことにより、ウェルから弾き飛ばされることになる。図１２は、ＴＰＸ（メチルペンテンコポリマー）により成形したマイクロウェルアレイのウェルに、インベーダー試薬（酵素・蛍光など）とＤＮＡを入れて、超音波により各ウェルを液密に密閉した際、反応後に検出される蛍光の量を溶着時間に対してプロットした実験結果である。この時、力は、溶着部分の長さ１ｃｍ当たり約４０Ｎ、超音波の周波数は２０ｋＨｚ、ホーンの振幅は３６ミクロンであった。溶着時間が０．０５〜０．８秒の範囲内では、酵素が働き、酵素反応の結果切り離される蛍光分子が、図１２のように検出される。しかし溶着時間が０．８秒を超えると、検出される蛍光の量が低下していき、１秒間溶着すると蛍光は全く検出されなかった。このことから、ＤＮＡやたんぱく質の超音波による密閉は、０．８秒以内で実施しなければならないことが本発明の実験により確認された。
図１３は、ＴＰＸ（メチルペンテンコポリマー）により成形したマイクロウェルアレイのウェルに、インベーダー試薬（酵素など）とＤＮＡを入れて、超音波により各ウェルを液密に密閉した際の、ウェルに残った液量とホーンの振動を開始する時点でカバーに加えられている力（発振加圧）の関係を示している。この時、超音波の周波数は２０ｋＨｚ、ホーンの振幅は３６ミクロン、溶着時間は０．２５秒であった。図１３のように、溶融する隆起部の長さ１ｃｍあたり、０．３〜１００Ｎの力が加わった時点、より好ましくは、３０〜１００Ｎの時点で、ホーンの振動を開始するとウェルに気泡がほとんど混入することなく、密閉することができる。ここで、「隆起部の長さ」とは、この場合、ウェルの周りに形成された溶融する部分の長さを指している。例えば、直径０．１９ｃｍの隆起部の長さの合計は、３８４穴のマイクロウェルアレイ全体で、
０．１９ｘπｘ３８４＝２２９ｃｍ
となる。従って、超音波振動を開始する際、マイクロウェルアレイ全体に仮に５０００Ｎの力が加わっていたとしたら、
５０００／２２９＝２２Ｎ／ｃｍ
となり、溶融する隆起部の長さ１ｃｍあたり、２２Ｎの力が加わったと解釈できる。０．３Ｎ未満の圧力で振動を開始すると、ウェル内の液体が振動でウェルから弾き出されるため、溶着時間を短くしたり、ホーンの振幅を小さくしても、液体を気泡が混入することなく密閉することは困難である。このようにホーンの発振前にカバー全体に力を加えておくことで、すなわち、加圧発振させることで、カバーとウェル周囲の隆起部を十分に密着させ、ウェル内の液体を外部に流出させることなく、密閉することが可能である。
通常、ＴＰＸやＰＣからなるプラスチック部品の超音波溶着では、ホーンの振幅としてそれぞれ４５ミクロン、６０ミクロン程度の振幅が必要とされるが、本発明のようにウェル内に液体が入っている場合には、溶着時に液体がウェルから弾き出されることを抑制するため、ホーンの振幅を４０ミクロン以下に設定することが好ましい。一方、振幅の下限として３０ミクロンを下回る振幅では、超音波振動のエネルギーが溶着部分に効率よく伝達されないため、溶着に必要な摩擦熱が十分に供給されず、溶着不良になる。さらに発振時の加圧力として、溶着部の単位長さあたり３０〜１００Ｎ／ｃｍの力を加えることが望ましいため、本発明の例では、
２２９ｃｍ  ×  ３０〜１００Ｎ／ｃｍ  ＝  ６８７０〜２２９００Ｎ
すなわち、最大加圧力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることができる加圧機構を備えていることが望ましい。
実際に、上記３８４個のウェルが形成されたマイクロウェルアレイにＤＮＡを分注して乾燥させ、その後０．４μｌ（ウェル容積は０．６μｌ）の試薬を入れ、カバーをして、各ウェルごとに超音波により溶着した。その際、ホーンの振幅を３６ミクロン、溶着時間を０．２５秒、発振時の加圧力を１００００Ｎに設定したところ、溶着時の最大発振出力は４．１〜５．０ｋＷであった。溶着時、ウェル内の試薬はウェルから弾き出されることなく、超音波溶着後のウェル周縁部の溶着性、密閉性は、共に良好であった。
さて、上記のマイクロウェルアレイ、分注機、超音波溶着装置を用い、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法などでＳＮＰ（一塩基多型）のタイピングを行う場合には、作業の流れ（システム）として図１４（ａ）に示すように次の番号順に実施する必要がある。ここでは３８４穴のマイクロウェルアレイを用いた場合のＳＮＰ頻度解析の方法を説明する。
（１）  それぞれのマイクロウェルアレイに、分注する検体と試薬の情報に対応したバーコードを貼り付ける。また３８４種類のＤＮＡ（検体、すなわち３８４人のＤＮＡ）が入ったマザープレートにもバーコードを添付する。
（２）  マイクロウェルアレイの容器表面のウェルに分析の対象となる３８４種類のＤＮＡを、別々のウェルに接触式の分注機により適量分注し、水分を蒸発させて乾燥させる。この時、マイクロウェルアレイに貼られたバーコードの検体に対応する番号と、マザープレートの検体番号が一致するような組み合わせを選択する。また、分注が終了すると、工程を管理しているサーバーには、バーコードが貼られたマイクロウェルアレイの最初の分注作業が終了したという情報が伝えられる。
（３）  容器表面のウェルに全ウェル共通の試薬（マイクロウェルアレイごとに異なる）を非接触式の分注機により分注する。この時に用いる試薬の種類と、マイクロウェルアレイに貼られた試薬に対応するバーコード番号が一致するような組み合わせを選ぶ。分注後、分注し終わったマイクロウェルアレイのバーコードをバーコードリーダーで読み取ると、工程を管理しているサーバーに、バーコードが貼られたマイクロウェルアレイの２回目の分注作業が終了したという情報が伝えられる。
（４）  分注直後、ウェル内の試薬が乾燥する前に、カバーを容器に押し付けて、各ウェルとカバーを超音波により溶着する。
（５）  恒温水槽、あるいは、サーマルサイクラー等の加熱装置にマイクロウェルアレイをセットし、試薬と検体（ＤＮＡ）を一定時間反応（インキュベーション）させる。
（６）  反応後、マイクロウェルアレイを蛍光評価装置（プレートリーダー）にセットし、マイクロウェルアレイのバーコードをバーコードリーダーによって読み取らせた後、蛍光の強度をウェルごとに読み取らせる。測定後、工程を管理しているサーバーに、バーコードが貼られたマイクロウェルアレイの蛍光分析作業が終了したという情報が伝えられる。
（７）  特定の塩基配列と蛍光の色が対応していることを利用し、検出した蛍光の色と強度に応じて、３８４種類のＤＮＡのＳＮＰ配列情報を分析し、ＳＮＰの頻度を解析（タイピング）する。
上記バーコードの番号は、例えば下記のように記載されている。
△△△─○○○
ここで、△△△はマイクロウェルアレイに分注する試薬の種類を示す番号、○○○はマイクロウェルアレイに分注するＤＮＡの種類を示す番号である。
以上に説明したＳＮＰの頻度解析方法は、ウェルにＤＮＡと試薬を順に分注し、混合させた後に反応させる場合である。しかしながら、別の方法として、カバー表面に接触式の分注機で試薬（あるいはＤＮＡ）を分注・乾燥し、ウェルにＤＮＡが入った水溶液（あるいは試薬）を接触式の分注機で分注し、ウェルの水分が蒸発して乾燥する前に、カバーを容器に押し付けて、カバー表面の試薬とウェル内のＤＮＡを混合・反応させることも可能である（図１４（ｃ））。この他にも図１４（ｂ）に示す方法もある。
上記ＳＮＰの頻度解析（タイピング）方法では、３８４種類のＤＮＡを個々のウェルに分注し、共通の試薬を３８４個のウェルに分注するが、遺伝子の診断にマイクロウェルアレイを用いる場合には、３８４種類の試薬をあらかじめ３８４個のウェルに分注し、乾燥させた後に、一個人のＤＮＡを３８４個のウェル全体に分注することにより、一個人の３８４種類のＳＮＰ情報、すなわち３８４種類の遺伝情報を得ることができる（図１４（ｅ））。
このような遺伝子診断を行う際の作業の流れは具体的には、下記のようになる。
（１）  それぞれのマイクロウェルアレイに分注する検体と試薬の情報に対応したバーコードを貼り付ける。また３８４種類の試薬（３８４種類の遺伝子に対応する試薬）の入ったマザープレートにもバーコードを添付する。
（２）  マイクロウェルアレイの容器表面のウェルに分析の対象となる３８４種類の試薬をそれぞれ別々のウェルに接触式の分注機により適量分注し、水分を蒸発させて乾燥させる。この時、マイクロウェルアレイに貼られたバーコードの試薬に対応する番号と、マザープレートの試薬番号が一致するような組み合わせを選択する。また、分注が終了すると、工程を管理しているサーバーには、バーコードが貼られたマイクロウェルアレイの最初の分注作業が終了したという情報が伝えられる。
（３）  容器表面の全ウェルに一個人のＤＮＡを非接触式の分注機により分注する。この時に用いるＤＮＡ（一個人）と、マイクロウェルアレイに貼られたＤＮＡ（一個人）に対応するバーコード番号が一致するような組み合わせを選ぶ。分注後、分注し終わったマイクロウェルアレイのバーコードをバーコードリーダーで読み取ると、工程を管理しているサーバーに、バーコードが貼られたマイクロウェルアレイの２回目の分注作業が終了したという情報が伝えられる。
（４）  分注直後、ウェル内の混合溶液が乾燥する前に、カバーを容器に押し付けて、各ウェルとカバーを超音波により溶着する。
（５）  恒温水槽、あるいは、サーマルサイクラー等の加熱装置にマイクロウェルアレイをセットし、試薬と検体（ＤＮＡ）を一定時間反応（インキュベーション）させる。
（６）  反応後、マイクロウェルアレイを蛍光評価装置（プレートリーダー）にセットし、マイクロウェルアレイのバーコードをバーコードリーダーによって読み取らせた後、蛍光の強度をウェルごとに読み取らせる。測定後、工程を管理しているサーバーに、バーコードが貼られたマイクロウェルアレイの蛍光分析作業が終了したという情報が伝えられる。
（７）  特定の塩基配列と蛍光の色が対応していることを利用し、検出した蛍光の色と強度に応じて、一個人に対する３８４種類のＳＮＰ（遺伝子）のタイプを分析し、診断を行う。
上記方法の他にも図１４（ｄ）に示す方法によって遺伝子の診断を実施することが可能である。
図１５は本発明の別のマイクロウェルアレイの斜視図である。ここでも３８４個のウェルがプラスチック容器の表面に、縦横の間隔が４．５ｍｍになるように形成されており、中間体を上方から容器に押し当てることによりウェルに充填された液体を密閉することができる。カバーと容器の位置を確実に一致させ、簡便に接合させるため、図１と同様に四隅にスルーホールとガイドピン、はめ込み部を設けている。中間体とは、フィルム、シート、粘着剤、接着剤などから構成される密閉用の材料を指し、具体的には、「粘着剤＋シート＋粘着剤」、「粘着剤＋フィルム＋粘着剤」、「接着剤＋シート＋粘着剤」、「接着剤＋フィルム＋粘着剤」、「接着剤＋シート＋接着剤」、「接着剤＋フィルム＋接着剤」、「粘着剤＋シート」、「接着剤＋フィルム」、「シートのみ」、「粘着剤のみ」、「接着剤のみ」などの組み合わせが挙げられる。平坦で、かつ、固い材質からなるカバーだけではシールすることができない場合に、合成樹脂などの可撓性を有する物質から構成される中間体を使用することにより、密閉することができる。そして、粘着剤や接着剤を使用することにより、密閉性を高めることができる。ここで、シートとは厚さ０．１０ｍｍ以上に延ばされたプラスチックのことであり、フィルムとは厚さ０．１０ｍｍ未満に薄く延ばされたプラスチックのことである。
以上のような中間体の組み合わせにより、作業性を高めることが可能である。例えば、密閉作業を行う際、粘着剤を予めシートの両面に塗布し、シート片面の離型紙を剥がしてカバーにシートを貼り付け、カバーとシートを一体型にする。そして、シートの他方の面についている離型紙を剥がして、この一体となったカバーとシートを容器表面に形成されたウェルに押し付ける。このようにして、ウェルを液密にシールすることが可能である。
また別の方法として、カバーの表面に予め粘着剤を塗布した後、この粘着剤と一体となったカバーを容器表面のウェルに押し付けることができる。また、中間体として、例えば弾力性を有するシート単体を利用することももちろん可能である。
シートの材質としては、ウェル内の液体を密閉することができる弾力性を有するポリオレフィン、ポリエチレン、シリコーンゴム、ポリウレタンゴム、エラストマー等が望ましい。またその形態として、ウェルの隆起部に接触している部分が局部的に圧縮され、高い密閉性を維持することができる発泡シートが特に望ましい。
中間体の厚さは、薄すぎると液体を密閉することができないこと、また、厚すぎると熱伝導性が低下することから、０．１ｍｍ〜１．５ｍｍのものが適しており、より好ましくは０．３ｍｍ〜１．０ｍｍのものが適している。
ここでもカバーの形状は、反りのない平坦な形であることが望ましい。カバーが反っている場合には、カバーによって中間体をウェルに押し付けた際に、ウェルと接触しない部分が中間体表面に生じ、その結果中間体とウェルの間に空気が介在する。そのため接合した際に、ウェル内に空気が混入する可能性がある。従って、カバーの厚さとしては、平坦性を維持できるだけの最低限の厚みと、熱伝導性をある程度確保できる０．１５ｍｍ〜３．０ｍｍのものが適しており、より好ましくは０．２５ｍｍ〜１．５ｍｍのものが適している。
検出する蛍光の量が少ない場合には、中間体を構成する材料として、光を反射するフィルムあるいはシートを使用することにより、検出する蛍光量を増やすことが可能である。またフィルム、シート、あるいはカバーの表面に真空蒸着やスパッタリング法により、金やアルミニウム等の反射用の金属膜をコーティングして、反射量を高めることもできる。この場合、励起光・蛍光ともに、容器の裏面側から照射・検出することになる。
別の方法として、ウェルの内壁に光反射用の金属膜をコーティングし、透明な中間体を使うことによって、励起光をカバー側から照射することも可能である。このように熱伝導性、光学特性など、中間体の特性を制御することにより目的とするアッセイに最適な条件を提供することができる。
図１６は図１５のＢ−Ｂ‘に沿っての断面図であり、図のようにウェルは、ウェルの開口部、隆起部、液体逃げ溝から構成されている。中間体は、この例では、弾力性を有するシートであり、カバーに下向きの圧力を加えることによってシートを隆起部に押し付け、シートによりウェルに入っている液体を密閉することができる。シートを挟んでカバーを容器に固定するには、図１５のようにはめ込み部を形成し、カバーに形成した挿入部を、容器に形成した受け部にはめ込むことにより、作業性よく簡便に固定することができる。
図１７は、図１５に示されるマイクロウェルアレイにゲノムＤＮＡをスポッティングし、乾燥後反応試薬（液体）を分注・密閉する工程を示している。図１７Ａでは、微量のＤＮＡをスポッティングし、図１７Ｂでは、ＤＮＡと反応させる試薬をウェルの容積より３〜９割程度多めにスポッティングする。液体には表面張力の作用があり、ウェルに納まらない部分の液体も盛り上がるようにしてウェルからこぼれずに保持されている。次に、図１７Ｃ、１７Ｄに示されるようにウェルに充填された液体を中間体によりウェルの外側へ押し出すことにより、ウェルに空気が残らないように密閉することができる。
図１５に示される本発明では、中間体が不透明な場合、ウェルの上方からウェル内の溶液に光をあてることはできないが、容器を上下逆さまにすることにより、中間体に遮られることなく光（励起光など）をウェルに照射することができる。そして、光を照射したのと同じ方向から蛍光を検出することが可能である。
図１５に示される本発明では、ウェル内に液体を密閉する際、ウェル内部の液体に超音波のエネルギーが直接伝わらないため、ウェル内部の液体を一時的にでもプラスチックの溶着温度（２００〜２５０℃）にさらしたくない場合に特に有効である。
またカバーと容器を強固に接合し、かつ、ウェルと中間体全体を液密にする場合には、図１８のように、容器の外周部に接着剤を流し込む細長い溝（凹部）を形成し、そこに接着剤を流し込んで、カバーに形成した凸部を凹部にはめ込むようにして接着することが可能である。あるいは外周を隆起部で囲み、超音波溶着することにより、シールすることもできる。
マイクロウェルアレイは、標準的なサイズの場合、縦が約８ｃｍ、横が約１２ｃｍと比較的面積が広いことから、ウェルを覆っている中間体全体に均一な圧力がかかりにくく、その結果、ウェルの密閉性にバラツキが生じる場合がある。この場合、図１９のように、例えば４個のウェルに囲まれた位置に接着剤を流し込む溝（凹部）を設け、そこに接着剤を流し込んで、カバーに形成した凸部をその容器の溝にはめ込むことにより、均一な密閉性を保持することが可能である。
また別のケースとして、マイクロウェルアレイの中央部に位置するウェルを覆っている中間体にカバーの圧力がかかりにくく密閉性が悪くなることもある。この場合には、図２０のように、マイクロウェルアレイの中央部に、はめ込み部と周囲の隆起部を設け、中間体がウェルから離れるのを防ぐことが可能である。
さらに別のケースとして、シートやフィルムの表面に予め粘着剤や接着剤を塗布して中間体を構成し、中間体をウェルに被せた際に、中間体と容器とを接着させ、ウェルを液密にシールすることもできる。この場合、塗布材料の厚さも中間体の厚さに含めて考える。従って、上記と同様に、密閉性及び熱伝導性を考慮すると、シートあるいはフィルムと、塗布した材料をあわせた厚さが、０．１５ｍｍ〜３．０ｍｍのものが適しており、より好ましくは０．２５ｍｍ〜１．５ｍｍのものが適している。
このように、「中間体」という表現には、カバーと容器の間に挟まれるシート、フィルム、接着剤、粘着剤がすべて含まれ、「中間体の厚さ」は、密閉性及び熱伝導性の観点から、そうした材料の厚さを合計した厚さが相当する。
ウェル内の液体を密閉するには、上記図１及び図１５以外にも、例えば、図２１〜図２４に示される方法で行うことができる。図２１では容器に隆起部を設ける代わりに、カバーに液体押し出し部を形成し、ウェルに充填した溶液を液体逃げ溝に押し出すことで、気泡がウェル内に混入しないように密閉している。図２２では液体押し出し部が中間体に形成してあり、この中間体をウェルに押しつけることで、ウェルからはみ出ている余分の溶液を、ウェル内に気泡が残存しないように逃げ溝に押し出すことができる。図２３では、液体の逃げ溝を設けていないが、カバーに形成された押し出し部により、余分の液体をウェルの外側に押し出し、ウェル内への気泡の混入を防ぐことができる。また図２４では、カバー側に液体押し出し部と超音波溶着のための隆起部を設けることにより、ウェルに気泡が残存しないように密閉することができる。
（実施例および比較例）
以下に本発明の実施例および比較例を示し、さらに詳細に説明を行う。
（実施例１〜９）
実験
カバー及び容器は、金型を加工し、メチルペンテンコポリマー及びポリカーボネートをその金型で射出成形することにより作製した。カバーのサイズは、８１ｍｍ×１２３ｍｍ×０．４ｍｍ、容器のサイズは８１ｍｍ×１２３ｍｍ×１．６ｍｍである。容器の表面に３８４個の断面が台形状のウェルを形成し、その大きさは、開口部の直径１．３ｍｍ、底面部の直径１．１ｍｍ、深さ０．８ｍｍ（容積０．９μＬ／ｗｅｌｌ）、あるいは、開口部の直径１．１ｍｍ、底面部の直径０．９ｍｍ、深さ０．１３ｍｍ（容積０．１μＬ／ｗｅｌｌ）とした。また隆起部の高さは０．４ｍｍ、内径を１．４ｍｍ、外径を２．４ｍｍ、逃げ溝の内径を３．０ｍｍ、外径を４．０ｍｍ、深さを０．６ｍｍとした。カバーに形成した液体押し出し部の高さは０．２ｍｍ、外径は０．９ｍｍである。
初めに、マイクロウェルアレイに検体と試薬に対応するバーコードを添付し、また３８４種類のＤＮＡ（検体、すなわち３８４人のＤＮＡ）が入ったマザープレートにもバーコードを添付した。その後実験台の上に置いた容器の各ウェルに、接触式のスポッティング装置により３８４種類のゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ、２０ｎｇ／μＬ、４０ｎｇ／μＬ）を１μＬずつ、または０．２μＬ分注した。容器を大気中に放置して溶媒を蒸発させた後、波長５７０ｎｍに蛍光強度のピークを持つＩｎｖａｄｅｒ法の試薬約１．６μＬ、または０．２μＬを非接触式のスポッティング装置にて各ウェルに分注した。試薬を分注した後、ウェルから余分にはみ出ている試薬をウェルから押し出すようにカバーをウェルに押し当て、ウェル内の液体を密閉した。そして各ウェルの開口部の隆起部とカバーを超音波装置により溶着接合した。超音波の周波数が２０ｋＨｚ、ホーンの振幅が３６ミクロン、最大発振出力が５．０ｋＷの超音波溶着装置を使用した。９５℃で５分間ＤＮＡを変性した後、６３℃の恒温槽中で４時間反応させ、反応終了後プレートリーダーで蛍光強度を測定し、ＳＮＰの頻度を解析（タイピング）した。各工程が終了するごとにバーコードをバーコードリーダーで読み取り、サーバーとなるコンピューターで各マイクロウェルアレイの工程ごとの進捗度を管理した。ウェルの密閉状態は、溶着直後においても、また４時間の反応終了後もともに気泡の混入が認められず良好であった。ゲノムＤＮＡの量、ウェル容積、溶着時間、発振加圧を表１のように変えた。また実施例８では、光を反射する鏡を容器裏面に配置した。結果を表１に示す。
（実施例１０〜１８）
実験
カバー及び容器は、金型を加工し、メチルペンテンコポリマー及びポリカーボネートをその金型で射出成形することにより作製した。カバーのサイズは、８１ｍｍ×１２３ｍｍ×０．４ｍｍ、容器のサイズは８１ｍｍ×１２３ｍｍ×１．６ｍｍである。容器の表面に３８４個の断面が台形状のウェルを形成し、その大きさは、開口部の直径１．６ｍｍ、底面部の直径１．４ｍｍ、深さ０．６ｍｍ（容積１．１μＬ／ｗｅｌｌ）のものと、開口部の直径１．６ｍｍ、底面部の直径１．４ｍｍ、深さ０．８ｍｍ（容積１．４μＬ／ｗｅｌｌ）のものの２種類とした。隆起部の高さは０．５ｍｍ、内径を１．６ｍｍ、外径を２．０ｍｍ、逃げ溝の内径を２．５ｍｍ、外径を３．１ｍｍ、深さを０．６ｍｍとした。また、カバーと容器の間に挟む中間体として、ポリオレフィンの発泡シート（０．５ｍｍ厚）を使用した。
初めに、マイクロウェルアレイに検体と試薬に対応するバーコードを添付し、また３８４種類のＤＮＡ（検体、すなわち３８４人のＤＮＡ）が入ったマザープレートにもバーコードを添付した。その後、実験台の上に置いた容器の各ウェルに、接触式のスポッティング装置により３８４種類のゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ、２０ｎｇ／μＬ、４０ｎｇ／μＬ）を１μＬずつ分注した。容器を大気中に放置して溶媒を蒸発させた後、波長５７０ｎｍに蛍光強度のピークを持つＩｎｖａｄｅｒ法の試薬約１．６μＬ及び２．０μＬを非接触式のスポッティング装置にて各ウェルに分注した。試薬を分注した後、ウェルから余分にはみ出ている試薬をウェルから押し出すようにシート、カバーの順にウェルに押し当て、ウェル内の液体を密閉した。そしてマイクロウェルアレイの外周部の隆起部を超音波装置により溶着し、液密な状態にして、９５℃で５分間ＤＮＡを変性した後、６３℃の恒温水槽中で４時間反応させ、反応終了後プレートリーダーで蛍光強度を測定し、ＳＮＰの頻度を解析（タイピング）した。各工程が終了するごとにバーコードをバーコードリーダーで読み取り、サーバーとなるコンピューターで各マイクロウェルアレイの工程ごとの進捗度を管理した。その際、容器を上下逆さまにして、シートに遮られていないウェルの側から光を照射し、蛍光も同じ側から検出した。ウェルの密閉状態は、溶着直後においても、また４時間の反応終了後もともに気泡の混入が認められず良好であった。超音波の周波数が２０ｋＨｚ、ホーンの振幅が３６ミクロン、最大発振出力が５．０ｋＷの超音波溶着装置を使用した。ゲノムＤＮＡの量、溶着時間、発振加圧は表１に示した。
【実施例１９】
実験
カバー及び容器は、金型を加工し、メチルペンテンコポリマー及びポリカーボネートをその金型で射出成形することにより作製した。カバーのサイズは、８１ｍｍ×１２３ｍｍ×０．４ｍｍ、容器のサイズは８１ｍｍ×１２３ｍｍ×１．６ｍｍである。容器の表面に３８４個の断面が台形状のウェルを形成し、その大きさは、開口部の直径１．３ｍｍ、底面部の直径１．１ｍｍ、深さ０．８ｍｍ（容積０．９μＬ／ｗｅｌｌ）とした。また隆起部の高さは０．４ｍｍ、内径を１．４ｍｍ、外径を２．４ｍｍ、逃げ溝の内径を３．０ｍｍ、外径を４．０ｍｍ、深さを０．６ｍｍとした。カバーに形成した液体押し出し部の高さは０．２ｍｍ、外径は０．９ｍｍである。
初めに、マイクロウェルアレイに検体と試薬に対応するバーコードを添付し、また３８４種類のＤＮＡ（検体、すなわち３８４人のＤＮＡ）が入ったマザープレートにもバーコードを添付した。その後実験台の上に置いた容器の各ウェルに、接触式のスポッティング装置により３８４種類のゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）を１μＬずつ分注した。容器を大気中に放置して溶媒を蒸発させた後、波長５７０ｎｍに蛍光強度のピークを持つＴａｑＭａｎ法の試薬約１．６μＬを非接触式のスポッティング装置にて各ウェルに分注した。試薬を分注した後、ウェルから余分にはみ出ている試薬をウェルから押し出すようにカバーをウェルに押し当て、ウェル内の液体を密閉した。そして各ウェルの開口部の隆起部とカバーを超音波装置により溶着接合し、液密な状態にした。超音波の周波数は２０ｋＨｚ、ホーンの振幅は３６ミクロンであった。サーマルサイクラーにて、９５℃で１０分間ＤＮＡを変性した後、（９５℃で１分、６０℃で３分）というインキュベーションのサイクルを４０回行った。反応終了後プレートリーダーで蛍光強度を測定し、ＳＮＰの頻度を解析（タイピング）した。各工程が終了するごとにバーコードをバーコードリーダーで読み取り、サーバーとなるコンピューターで各マイクロウェルアレイの工程ごとの進捗度を管理した。ウェルの密閉状態は、溶着直後においても、また反応終了後もともに気泡の混入が認められず良好であった。超音波の周波数が２０ｋＨｚ、ホーンの振幅が３６ミクロン、最大発振出力が５．０ｋＷの超音波溶着装置を使用した。ゲノムＤＮＡの量、溶着時間、発振加圧を表１のように変えた。結果を表１に示す。
（比較例１〜３）
実験
カバー及び容器は、金型を加工し、メチルペンテンコポリマー及びポリカーボネートをその金型で射出成形することにより作製した。カバーのサイズは、８１ｍｍ×１２３ｍｍ×０．４ｍｍ、容器のサイズは８１ｍｍ×１２３ｍｍ×１．６ｍｍである。容器の表面に３８４個の断面が台形状のウェルを形成し、その大きさは、開口部の直径１．３ｍｍ、底面部の直径１．１ｍｍ、深さ０．８ｍｍ（容積０．９μＬ／ｗｅｌｌ）、あるいは、開口部の直径１．１ｍｍ、底面部の直径０．９ｍｍ、深さ０．０３ｍｍ（容積０．０２μＬ／ｗｅｌｌ）とした。また隆起部の高さは０．４ｍｍ、内径を１．４ｍｍ、外径を２．４ｍｍ、逃げ溝の内径を３．０ｍｍ、外径を４．０ｍｍ、深さを０．６ｍｍとした。カバーに形成した液体押し出し部の高さは０．２ｍｍ、外径は０．９ｍｍである。
初めに、実験台の上に置いた容器の各ウェルに、スポッティング装置により３８４種類のゲノムＤＮＡ（４０ｎｇ／μＬ）を１μＬずつ、または０．２μＬ分注した。容器を大気中に放置して溶媒を蒸発させた後、波長５７０ｎｍに蛍光強度のピークを持つＩｎｖａｄｅｒ法の試薬約１．６μＬ、または０．２μＬをスポッティング装置にて各ウェルに分注した。試薬を分注した後、ウェルから余分にはみ出ている試薬をウェルから押し出すようにカバーをウェルに押し当て、ウェル内の液体を密閉した。そして各ウェルの開口部の隆起部とカバーを超音波装置により溶着接合した。９５℃で５分間ＤＮＡを変性した後、６３℃の恒温槽中で４時間反応させ、反応終了後プレートリーダーで蛍光強度を測定した。ウェルの密閉状態は、溶着直後においても、また４時間の反応終了後もともに気泡の混入が認められず良好であった。超音波の周波数が２０ｋＨｚ、ホーンの振幅が３６ミクロン、最大発振出力が５．０ｋＷの超音波溶着装置を使用した。溶着時間、発振加圧、ウェル容積を表１のように変えた。測定結果を表１に示す。表１から明らかなように、ウェル容積が０．０２μＬの際には、液量が少なすぎるために反応性が悪く、蛍光も検出できなかった。
（比較例４〜１０）
実験
３８４ウェルマイクロタイタープレートに、１０ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎｇ、１００ｎｇのゲノムＤＮＡを分注し、それぞれのウェルに２０μＬあるいは４０μＬのＩｎｖａｄｅｒ法の試薬（波長５７０ｎｍに蛍光強度のピークを持つ）を分注した。各ウェルを液密な状態にするため、キャップを被せ、９５℃で５分間ＤＮＡを変性した後、６３℃に設定したサーマルサイクラーで４時間反応させ、反応終了後プレートリーダーで蛍光強度を測定した。結果を表１に示した。
（比較例１１）
実験
３８４ウェルマイクロタイタープレートに、１０ｎｇのゲノムＤＮＡを分注し、それぞれのウェルに２０μＬのＴａｑＭａｎ法の試薬（波長５７０ｎｍに蛍光強度のピークを持つ）を分注した。各ウェルを液密な状態にするため、キャップを被せ、９５℃で１０分間ＤＮＡを変性した後、（９５℃で１分、６０℃で３分）というインキュベーションのサイクルを４０回行った。反応終了後プレートリーダーで蛍光強度を測定した。結果を表１に示す。
（超音波溶着実験に関する実施例２０〜２１と比較例１２〜１３）
実験
カバー及び容器は、金型を製作し、メチルペンテンコポリマー及びポリカーボネートをその金型で射出成形することにより作製した。カバーのサイズは、８１ｍｍ×１２３ｍｍ×０．４ｍｍ、容器のサイズは８１ｍｍ×１２３ｍｍ×１．６ｍｍである。容器の表面に３８４個の断面が台形状のウェルを形成し、その大きさは、開口部の直径１．３ｍｍ、底面部の直径１．１ｍｍ、深さ０．８ｍｍ（容積０．９μＬ／ｗｅｌｌ）とした。また隆起部の高さは０．４ｍｍ、内径を１．４ｍｍ、外径を２．４ｍｍ、逃げ溝の内径を３．０ｍｍ、外径を４．０ｍｍ、深さを０．６ｍｍとした。カバーに形成した液体押し出し部の高さは０．２ｍｍ、外径は０．９ｍｍである。
初めに、実験台の上に置いた容器の各ウェルに、スポッティング装置により水を１μＬずつ分注した。水を分注した後、ウェルから余分にはみ出ている水をウェルから押し出すようにカバーをウェルに押し当て、ウェル内の水を密閉した。そして各ウェルの開口部の隆起部とカバーを超音波装置により溶着接合した。超音波の周波数が２０ｋＨｚ、最大発振出力が５．０ｋＷの超音波溶着装置を使用した。溶着時の最大発振出力は４．１〜５．０ｋＷであった。その後、９５℃で５分間加熱した後、６３℃の恒温槽中に４時間置いた。ウェルの密閉状態は、溶着直後においても、また４時間後も、ともに気泡の混入が認められず良好であった。溶着時間、発振加圧、ホーンの振幅を表２のように変えた。表２から明らかなように、ホーンの振幅は、３０μｍ〜４０μｍに設定することが、ウェルを液密にする上で極めて好ましいものであった。
表１及び表２から明らかなように、メチルペンテンコポリマーまたはポリカーボネートからなるマイクロウェルアレイを使用することによって、従来のマイクロタイタープレートと比較し、約１０分の１のＤＮＡ及び試薬量で、同等の蛍光強度を得ることができた。また、ホーンの振幅、溶着時間と発振加圧を最適化することにより、安定した測定が実現できるようになった。加えて、反射体をマイクロウェルアレイ裏面に配置することにより、検出できる蛍光の強度を約２倍に高めることができた。
上記のように、本発明によれば、溶着後のウェルの容積にほぼ等しい量、あるいは、それを超える量の液体をウェルにスポットし、その液体をカバー、中間体によって、ウェルから押し出すことにより、空気がウェル内にほとんど残存しないように液体を密閉すること可能である。そして蛍光試薬を微少な空間に閉じこめることによって、蛍光試薬全体を効果的に励起し、かつ、発せられた蛍光を光の反射体を利用して効率よく検出することができる。ここでは、３８４ウェルを例にとって説明したが、上記発明は、１５３６ウェルや９６００ウェルなど、様々なマイクロウェルアレイに適応可能であることは自明である。
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図２５ないし３４は、本発明に基づくマイクロウェルアレイの１つの実施例を示す図面である。図１５に示すように、当該マイクロウェルアレイは、概略平板状であり、上面にマイクロウェルがＸＹ方向に規則的に配列されている。図面上カバーは透明なカバーであるとして示したが、必ずしも透明である必要はない。ただし、少なくともカバーと本体の内の一方が光透過性の材料からなっていれば、発光検出のためには好ましい。図２６は、図２５に示したマイクロウェルアレイの１つの実施例を上から見た様子を示す図面である。図から明らかなように、この実施例では３８４個のマイクロウェルが形成されており、本体のマイクロウェル相互間には溝を形成してマイクロウェルからの溢水を収容してクロスコンタミネーションを防止する構造である。図２７と２８は、図２５に示したマイクロウェルアレイの側面図である。マイクロ植えるアレイの強度確保と、重ねて保持する際の便宜等を考慮してマイクロウェルアレイは一定の高さを有するが、当該高さは周囲の垂直壁によって定められており、周辺部以外の下部は中空であることがわかる。図２９は、マイクロウェルアレイをしたからみた底面図である。
図３０には、図２５に示したマイクロウェルアレイの図中ＡＡで示す部分の断面図を示す。本体とカバーが重なり合っている様子と、本体中央部の下部が中空である様子が示されている。図３１は、図２５においてＢＢで示す部分の断面図であるが、カバーに設けた突起を本体に設けた貫通孔に貫入させることによって相互に位置決めされる様子が示されている。図３２は、図３０においてＣＣで示した部分の拡大断面図である。マイクロウェルアレイ周囲に形成された隆起部と、カバーに形成された突起部相互の位置関係が明瞭に示されている。図３３は、図２５に示したマイクロウェルアレイのカバーの下面を示す図面である。本実施例の場合には、各マイクロウェルに対応する位置に突起が形成されている。当該カバーを側方からみた状態を示したものが図３４である。
図３５は、３８４個のマイクロウェルを形成した点においては前出の実施例と同じであるが、マイクロウェル相互間に溝のない本発明の他の実施例を示す斜視図である。図３６および図３７から明らかなように、本体に溝が形成されていない点において前出の実施例と異なるが、その他の点においては前出の実施例と同一である。
図３８は、９６個のマイクロウェルを形成したさらに別の実施例に係るマイクロウェルアレイを示す斜視図である。縦横の寸法等、外形は前出の実施例と同じであり、本体に形成されたマイクロウェルの大きさと個数のみが異なっている。形状および外形を規格化することによって、マイクロウェルアレイを取り扱うための種々の装置を共通化を通じて、作業効率の向上に寄与することができる。
図３９は、前出の実施例とは逆にマイクロウェルを非常に多数形成したマイクロウェルアレイの実施例を示すものである。この場合にも形状および外形を規格化することによって作業効率を向上させることができる点は前述の通りであるが、必ずしも図に示した形状に限定する必要がないことは自明である。
前出の図面は、本発明に基づくマイクロウェルアレイの具体的なイメージを説明するために現実的な形状を比較的忠実に図示したものであるが、本発明の技術的思想を実現するためには、必ずしも前出のような形状をとる必要はなく、前出の形状以外にも多くのバリエーションが可能なことは当業者には自明である。したがって、本発明の特許権の範囲には、特許請求の範囲に記載された特徴を有するこれら多くのバリエーションと、さらにそれらの均等物とが含まれる。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、溶着後のウェルの容積にほぼ等しい量、あるいは、それを超える量の液体をウェルにスポットし、液体がウェルの容積よりも多ければその余分の液体をカバー、中間体によって、ウェルから押し出し、空気がウェル内にほとんど残存しないように液体を密閉し、信号となる蛍光を効率的に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のマイクロウェルアレイを説明するための斜視図である。
図２は、本発明のマイクロウェルアレイを説明するための断面図である。
図３は、本発明の別のマイクロウェルアレイを説明するための断面図である。
図４は、本発明のはめ込み部を説明するための断面図である。
図５は、本発明の液体逃げ溝を説明するための断面図である。
図６は、本発明の液体逃げ溝を説明するための断面図である。
図７は、本発明の反射体を配置する方法を説明するための図面である。
図８は、本発明のスカート部、ゲート位置、貫通穴を配置する方法を説明するための図面である
図９は、本発明の液体の密閉方法を説明するための図面である。
図１０は、本発明の別の液体の密閉方法を説明するための図面である。
図１１は、本発明の分注方法を説明するための図面である。
図１２は、超音波溶着の時間と反応性の関係を説明するための図面である。
図１３は、発振時の力と残存する液量の関係を説明するための図面である。
図１４は、本発明の遺伝子解析方法を説明するための図面である。
図１５は、本発明の別のマイクロウェルアレイを説明するための斜視図である。
図１６は、本発明のマイクロウェルアレイを説明するための断面図である。
図１７は、本発明の別の液体の密閉方法を説明するための図面である。
図１８は、本発明の接着剤用凹部と超音波溶着用隆起部を説明するための図面である。
図１９は、本発明の接着剤用凹部あるいは超音波溶着用隆起部を説明するための図面である。
図２０は、本発明のはめ込み部と超音波溶着用隆起部を説明するための図面である。
図２１は、本発明の別の液体の密閉方法を説明するための図面である。
図２２は、本発明の別の液体の密閉方法を説明するための図面である。
図２３は、本発明の別の液体の密閉方法を説明するための図面である。
図２４は、本発明のタイピング方法と遺伝子診断方法を説明するための図面である。
図２５は、３８４個のマイクロウェルを形成し、マイクロウェル相互間に溝を形成した本発明のマイクロウェルアレイの１実施例の斜視図である。
図２６は、図２５に示したマイクロウェルアレイの１つの実施例を上から見た様子を示す図面である。
図２７は、図２５に示したマイクロウェルアレイの側面図である。
図２８は、図２５に示したマイクロウェルアレイの他の側面図である。
図２９は、図２５に示したマイクロウェルアレイをしたからみた底面図である。
図３０は、図２５に示したマイクロウェルアレイの図中ＡＡで示す部分の断面図である。
図３１は、図２５に示したマイクロウェルアレイの図中ＢＢで示す部分の断面図である。
図３２は、図３０においてＣＣで示した部分の拡大断面図である。
図３３は、図２５に示したマイクロウェルアレイの蓋の下面を示す図面である。
図３４は、図３３に示す蓋を側方から見た様子を示す側面図である。
図３５は、３８４個のマイクロウェルを形成し、溝のない本発明の１実施例を示す斜視図である。
図３６は、図３５に示したマイクロウェルアレイの１つの実施例を上から見た様子を示す図面である。
図３７は、図３６に示すマイクロウェルアレイの部分拡大断面図である。
図３８は、９６個のマイクロウェルを形成した本発明の１つの実施例のマイクロウェルアレイの斜視図である。
図３９は、極めて多数のマイクロウェルを形成した本発明の１つの実施例のマイクロウェルアレイの斜視図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年2月18日(2002.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（補正後）複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことのできるカバーを具備し、ウェルに液体が注入された状態で、カバーが容器に接合されてなるマイクロウェルアレイ。
【請求項２】
（補正後）各々のウェルの縁部近傍、またはカバーの、カバーで容器を覆ったときに各ウェルの縁部近傍に対応する位置には、接合前において周囲よりも高くなった隆起部が形成されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項３】
（補正後）前記隆起部が溶着用隆起部であることを特徴とする請求項２に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項４】
（補正後）前記隆起部は環状であってその頂部の断面は凸状であることを特徴とする請求項２または３に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項５】
（補正後）各々のウェルの周囲またはカバーの当該ウェルの周囲に相当する位置の少なくとも一方には、ウェルをカバーによって覆った際にウェルから溢れた液の少なくとも一部を収容することができる溝が形成されていることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項６】
（補正後）カバーと液体の入ったウェルとがウェルごとに接合されていることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項７】
（補正後）接合が超音波溶着によりなされていることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項８】
（補正後）カバーがウェルのそれぞれを液密に密閉するもので、容器とカバーの実質的な厚みがいずれも、該容器と該カバーに接触する液体の熱をウェル内に伝導することができる厚さであることを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項９】
（補正後）容器とカバーの実質的な厚みがいずれも０．１５〜３．０ｍｍの範囲であることを特徴とする請求項８に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１０】
（補正後）ウェルとカバーとをウェルごとに液密に接合した状態でのマイクロウェルアレイの実質的な厚みが０．３〜４．０ｍｍの範囲であることを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１１】
（補正後）ウェルとカバーとをウェルごとに液密に接合した状態でのウェルを直接定義する部分の肉厚が、０．０５〜０．４ｍｍの範囲であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１２】
（補正後）カバーがウェルのそれぞれを液密に密閉するもので、ウェル近傍に、該ウェルと該カバーを接合するのに必要な体積を有する溶接用リブが設けられていることを特徴とする請求項１ないし１１のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１３】
（補正後）溶接用リブが断面三角形状であることを特徴とする請求項１２に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１４】
（補正後）溶接用リブの底辺の肉厚が０．２〜１．０ｍｍの範囲であることを特徴とする請求項１２または１３に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１５】
（補正後）溶接用リブの底辺が０．２〜１．０ｍｍの範囲、高さが０．２〜０．８ｍｍの範囲、該ウェルを取り囲むリブの直径が０．５〜４．０ｍｍの範囲であることを特徴とする１２ないし１４のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１６】
（補正後）カバーがウェルのそれぞれを液密に密閉するもので、ウェルとカバーとをウェルごとに液密に接合したウェルを取り囲む接合部分の幅が、０．３〜２．５ｍｍの範囲であることを特徴とする請求項１ないし１５のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１７】
（補正後）マイクロウェルアレイが恒温槽中に浸漬された際、ウェル内の液体温度が数分以内に均一になるような容積を該ウェルが有することを特徴とする請求項１ないし１６のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項１８】
（補正後）ウェルの容積が０．１〜１．４μｌの範囲であることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項１９】
（補正後）ウェルとカバーとをウェルごとに液密に接合した後のウェルの容積が０．１〜１．４μｌの範囲であることを特徴とする請求項１ないし１８のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項２０】
（補正後）カバーがウェルのそれぞれを液密に密閉するもので、ウェル内部で液体が沸騰しても、ウェルの密閉性が保持されることを特徴とする請求項１ないし１９のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項２１】
（補正後）外部から機械的な力を加えることなくウェルの密閉性が維持できることを特徴とする請求項２０に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項２２】
（補正後）前記ウェルの密閉性は前記ウェルと前記カバーとを超音波溶着して得られたものであることを特徴とする請求項２０または２１に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項２３】
（補正後）ウェル内部で、９０〜１００℃に加熱された液体が沸騰しても、ウェルごとの密閉性を維持することができることを特徴とする請求項２０ないし２２のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項２４】
（補正後）マイクロウェルアレイを沸騰した液中に浸漬させても、ウェルごとの密閉性を維持することができることを特徴とする請求項２０ないし２３のいずれかに記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項２５】
（補正後）ほぼ平板状で可撓性を有する材料からなる中間体を容器とカバーの間に介在させたことを特徴とする請求項１ないし２４のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項２６】
（補正後）カバーの、ウェルにカバーで容器を覆ったときに各ウェルに対応する位置には、ウェルをカバーによって封止した際に、各ウェル内に押し込まれる凸部が形成されていることを特徴とする請求項１ないし２５のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項２７】
（補正後）該容器と該カバーとが各ウェルごとに超音波溶着によってウェルの封止を行うことができる材料からなることを特徴とする請求項１ないし２６のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項２８】
（補正後）各ウェルの裏面が平面状であることを特徴とする請求項１ないし２７のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項２９】
（補正後）各ウェルの水平断面が円形であることを特徴とする前記請求項１ないし２８のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３０】
（補正後）前記マイクロウェルアレイの外周部に沿ってスカート部を形成したことを特徴とする請求項１ないし２９のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３１】
（補正後）前記マイクロウェルアレイに形成されたスカート部の角に、貫通穴を形成したことを特徴とする請求項３０に記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３２】
（補正後）該容器と該カバーには挿入部と受け部が形成され、挿入部を受け部にはめ込むことによって該容器と該カバーを係止することができることを特徴とする請求項１ないし３１のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３３】
（補正後）前記容器及び前記カバーがプラスチック材料から形成されることを特徴とする請求項１ないし３２のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３４】
（補正後）前記容器と前記カバーが、メチルペンテンコポリマーあるいはポリカーボネートから構成されることを特徴する請求項３３に記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３５】
（補正後）前記容器と前記カバーの少なくとも一方が、光学的に透明な材料で形成されていることを特徴とする前記請求項１ないし３４のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３６】
（補正後）前記ウェルの下または上に、光を反射する反射面が設けられていることを特徴とする請求項１ないし３５のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３７】
（補正後）前記容器のウェルあるいは前記カバーのウェル側の表面に、液状の試薬または検体を分注し、坦持させたことを特徴とする請求項１ないし３６のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３８】
（補正後）前記容器のウェルあるいは前記カバーのウェル側の表面に、液状の試薬または検体非接触式の分注機により分注し、坦持させたことを特徴とする請求項１ないし３７のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項３９】
（補正後）前記液体がＤＮＡまたはタンパク質を含む液であることを特徴とする請求項１ないし３８のいずれかに記載されたマイクロウェルアレイ。
【請求項４０】
（補正後）複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを形成し、ウェルに液を注入し、カバーを容器に押し付けて、該カバーと該容器を接合して液を各ウェルに封止することを特徴とするマイクロウェルアレイの製造方法。
【請求項４１】
（補正後）前記接合は超音波溶接装置を用いる超音波溶接によって行うことを特徴とする請求項４０に記載の製造方法。
【請求項４２】
（補正後）容器のウェルに液を注入し、容器を覆うようにカバーを被せ、容器とカバーを密着させるように押圧力を加えて、次に、当該押圧力を維持しながら超音波を照射することによって、該容器のウェルに入った液がウェルから弾き出されることがないように該ウェルと該カバーとを、ウェル毎に超音波溶接することを特徴とする請求項４０または４１に記載の製造方法。
【請求項４３】
（補正後）前記の液は、ＤＮＡまたはたんぱく質を含む液であることを特徴とする請求項４０ないし４２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４４】
（補正後）前記超音波溶接のために照射される超音波は、前記ウェルに封入されたＤＮＡまたはたんぱく質を実質的に損傷させないものであることを特徴とする請求項４３に記載の製造方法。
【請求項４５】
（補正後）容器のウェルとカバーを、０．０５から０．８秒の間、超音波振動により溶着することで、液密に封止することを特徴とする請求項４０ないし４４のいずれかに記載された製造方法。
【請求項４６】
（補正後）前記溶接を行う際、溶融部の長さ１ｃｍあたり、０．３ないし１００Ｎの力を加えつつ、超音波ホーンの振動を開始することを特徴とする請求項４０ないし４５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４７】
（補正後）先に接触式の分注機により液体を分注し、その後非接触式の分注機により液体を分注することを特徴とする請求項４０ないし４６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４８】
（補正後）先に接触式の分注機によりウェルごとに異なる液体を分注し、その後非接触式の分注機により液体を分注することを特徴とする請求項４７に記載の製造方法。
【請求項４９】
（補正後）先に接触式の分注機により液体を分注し、その液体を乾燥させ、その後非接触式の分注機により液体を分注することを特徴とする請求項４７または４８に記載の製造方法。
【請求項５０】
（補正後）サイドゲートから樹脂を流し込んで容器とカバーを射出成形することを特徴とする請求項４０ないし４９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５１】
（補正後）試薬または検体を、ウェル内部あるいはカバー表面に分注し、その後該カバーと該ウェルをウェルごとに液密に溶着することを特徴とする請求項４０ないし５０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５２】
（補正後）試薬または検体の少なくとも一方を前記容器のウェルに担持させ、他の一方をカバー表面に担持させ、前記ウェルと前記カバーを超音波溶着して接合し、各ウェルごとに試薬と検体を反応させるようにしたことを特徴とする請求項４０ないし５０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５３】
（補正後）マイクロウェルアレイの製造に使用される超音波溶着装置において、発振時の力として７０００〜２３０００Ｎの力を加えることが可能な加圧機構を具備し、かつ、４．１〜５．０ｋＷの最大発振出力を有することを特徴とする超音波溶着装置。
【請求項５４】
（補正後）ホーンの振幅が３０〜４０ミクロンであることを特徴とする請求項５３に記載の超音波溶着装置。
【請求項５５】
（補正後）溶着時間が０．０５〜０．８秒の時間内で超音波を照射することができることを特徴とする請求項５４に記載の超音波溶着装置。
【請求項５６】
（補正後）０．０５〜０．８秒の時間内でウェルごとに溶着することを特徴とする請求項５３ないし５５のいずれかに記載の超音波溶着装置。
【請求項５７】
（補正後）複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイに、試薬または検体を、該ウェル内部あるいは該カバー表面に分注し、その後該カバーと該ウェルをウェルごとに溶着し、試薬と検体を反応させた後、あるいは試薬と検体を反応させながら、ウェルごとの蛍光強度を分析することにより、ウェルごとに反応の度合いまたは遺伝子を解析することを特徴とする解析方法。
【請求項５８】
（補正後）遺伝子の多型を解析することを特徴とする請求項５７に記載の解析方法。
【請求項５９】
（補正後）マイクロウェルアレイに、そのマイクロウェルアレイに分注する試薬及び検体に対応したバーコードを添付して、工程ごとに、または、マイクロウェルアレイごとに進捗をバーコードで管理できるようにすることを特徴とする請求項５７または５８に記載の解析方法。
【請求項６０】
（補正後）ウェルにそれぞれ異なるＤＮＡを分注し、次に試薬を複数の該ウェルに分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、多型のタイピングを行うことを特徴とする請求項５７ないし５９のいずれかに記載の解析方法。
【請求項６１】
（補正後）複数のウェルに試薬を分注し、次に該ウェルにそれぞれ異なるＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、多型のタイピングを行うことを特徴とする請求項５７ないし５９のいずれかに記載の解析方法。
【請求項６２】
（補正後）該カバー表面に試薬を分注し、次に該ウェルにそれぞれ異なるＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、多型のタイピングを行うことを特徴とする請求項５７ないし５９のいずれかに記載の解析方法。
【請求項６３】
（補正後）複数の独立したウェルがアレイ状に配置された容器と、容器を覆うことができるカバーを具備したマイクロウェルアレイを用いて、該カバー表面または該ウェルの何れか一方にそれぞれ異なる試薬を分注し、次に該ウェルにＤＮＡを分注し、該ウェルと該カバーとを溶着させた後、試薬とＤＮＡを反応させ、その後各ウェルの蛍光強度を分析することにより、遺伝子の多型を解析することを特徴とする遺伝子の診断方法。
【国際調査報告】
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