(57)【要約】組織切片の少なくとも一部を認識するペプチド又はタンパク質と、▲１▼所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有し、及び▲２▼該ペプチド又はタンパク質の像と該組織切片の像とを同時に観察することができる、という特徴を有する蛍光物質を含む診断薬を提供する。また、該ペプチド又はタンパク質と、該蛍光物質を用いることによる診断方法及び診断薬キットを提供する。さらにこれらの方法を用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬を提供する。また、該ペプチド又はタンパク質と、該蛍光物質により染色する組織切片を提供する。その他、該蛍光物質を用いたタンパク質の発現及び／又は挙動の解析方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織切片の少なくとも一部を認識するペプチド又はタンパク質と、以下ｉ）及びｉｉ）の特徴を有する蛍光物質とを含む診断薬。
ｉ）  所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ｉｉ）  該ペプチド又はタンパク質の像と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。
【請求項２】
蛍光物質が、所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない長波長側に蛍光物質のストークスシフトを示す請求項１に記載の診断薬。
【請求項３】
組織切片がヒト由来のパラフィン切片又はヒト由来のホルマリン固定パラフィン切片である請求項１又は２に記載の診断薬。
【請求項４】
ペプチド又はタンパク質が抗体である請求項１から３のいずれかに記載の診断薬。
【請求項５】
抗体がモノクローナル抗体である請求項４に記載の診断薬。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、癌反応性のモノクローナル抗体である請求項５に記載の診断薬。
【請求項７】
癌が胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である請求項６に記載の診断薬。
【請求項８】
モノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む請求項５から７のいずれかに記載の診断薬。
【請求項９】
モノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む請求項５から８に記載の診断薬。
【請求項１０】
モノクローナル抗体が、ビオチン標識したモノクローナル抗体である請求項５から９のいずれかに記載の診断薬。
【請求項１１】
蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約８０ｎｍ以上長波長である請求項２から１０のいずれかに記載の診断薬。
【請求項１２】
蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約１５０ｎｍ以上長波長である請求項１１に記載の診断薬。
【請求項１３】
励起波長が、約４５０ｎｍから約５００ｎｍである請求項１から１２のいずれかに記載の診断薬。
【請求項１４】
励起波長が、約４８０ｎｍから約５００ｎｍである請求項１３に記載の診断薬。
【請求項１５】
励起波長が、約４９０ｎｍである請求項１３又は１４に記載の診断薬。
【請求項１６】
蛍光物質が、ペリジニン  クロロフィル  プロテイン又はその蛍光団部分を含む当該タンパク質の断片である請求項１から１５のいずれかに記載の診断薬。
【請求項１７】
ペリジニン  クロロフィル  プロテインが、ストレプトアビジン結合ペリジニン  クロロフィル  プロテインである請求項１６に記載の診断薬。
【請求項１８】
診断薬が、病理組織診断薬である請求項１から１７のいずれかに記載の診断薬。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載の診断薬を用いて組織染色することを特徴とする診断方法。
【請求項２０】
診断方法が、癌と薬剤の反応性を診断することを特徴とする請求項１９に記載の診断方法。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の診断方法を用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬。
【請求項２２】
疾患が、癌である請求項２１に記載の治療薬。
【請求項２３】
癌が胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である請求項２２に記載の治療薬。
【請求項２４】
以下の特徴を有する蛍光物質とタンパク質とを融合することにより得られる融合タンパク質を用いる解析方法。
ｉ）  所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ｉｉ）  該ペプチド又はタンパク質の像と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。
【請求項２５】
蛍光物質が、所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない長波長側に蛍光物質のストークスシフトを示す請求項２４に記載の解析方法。
【請求項２６】
蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約８０ｎｍ以上長波長である請求項２４又は２５に記載の解析方法。
【請求項２７】
蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約１５０ｎｍ以上長波長であることを特徴とする請求項２４から２６のいずれかに記載の解析方法。
【請求項２８】
解析方法が、細胞内におけるタンパク質の発現及び／又は挙動を解析する請求項２４から２７のいずれかに記載の解析方法。
【請求項２９】
請求項１から１８のいずれかに記載の診断薬を用いて組織染色した組織切片。
【請求項３０】
請求項１から１８のいずれかに記載の診断薬を含む診断薬キット。
【請求項３１】
診断薬キットが、癌に対する薬剤の反応性を判定する請求項３０に記載の診断薬キット。
【請求項３２】
請求項３０又は３１に記載の診断薬キットを用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬。
【請求項３３】
疾患が、癌である請求項３２に記載の治療薬。
【請求項３４】
癌が、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である請求項３３に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、診断薬、診断方法又は診断薬キットに関する。さらに、これらを用いて適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療剤に関する。
背景技術
抗癌剤としての高い効果と安全性を得るために、癌細胞に対する抗体を用いた癌ターゲティング剤の研究が進められているが、癌化する細胞の種類により、これを認識する抗体の種類も異なることが知られている。例えば、胃癌及び大腸癌との反応性からスクリーニングされたヒトモノクローナル抗体がＧＡＨ抗体として知られている（特開平４−３４６９１８号公報、特開平５−３０４９８７号公報）。
そこで、このような癌ターゲッティング剤を患者に投与する際には、患者の臨床組織を用いて抗体の反応性を事前に診断することで、より高い効果と安全性が期待されると考えられる。
従来、癌細胞に対する抗体の反応性の検出法としては、細胞を単離した後フローサイトメトリーで解析する方法や、細胞を単離することなく、組織切片を酵素抗体法や蛍光抗体法を用いて染色し解析する方法が用いられている。
フローサイトメトリー法は、血液系細胞や培養細胞の検出方法としては非常に有用であるが、組織切片を直接観察することはできず、組織から細胞を単離する煩雑な操作と、ある程度大きな組織片を用いる必要がある。さらに、フローサイトメトリー装置は高価であり、汎用性に欠けている。
また、組織切片、とくに臨床の現場において、作製の利便性と長期保存が可能である点において汎用されているホルマリン固定パラフィン包埋切片（パラフィン切片）を解析する方法としては、蛍光抗体法や酵素抗体法が知られている。
酵素抗体法は、抗体とｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）等の酵素との複合体を切片に反応させて、その酵素の基質、例えば３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）等の不溶性色素を沈着させて検出する方法である。しかしこの場合、染色強度は酵素反応条件に依存しており、反応が過多になると、色素の非特異的な過剰沈着により、その染色の度合いから正確な評価を得ることが困難な場合がある。そのため、信頼性の高い診断結果を得るためには、反応時間や評価基準を極めて厳重に管理し、標準化する必要がある。
一方、蛍光抗体法は、蛍光色素を用いるため鮮明なコントラストを有し、定量性にも優れた方法である。しかしながら、パラフィン切片を蛍光観察する場合は、切片自体の有する自家蛍光が高いバックグラウンドとなり、抗体染色像の検出が容易ではない。この点を解決し、鮮明なコントラストを有し、かつ、定量性のある蛍光抗体法をパラフィン切片にも応用すべく、これまで幾つかの試みがなされてきた。
例えばフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ラベル抗体で染色後、アゾ色素で対比染色を施し、自家蛍光をＦＩＴＣの緑色蛍光と全く異なる色調に変化させる手法（Ｈａｌｌ，Ｃ．Ｔ．Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．１８４：５４８−５５５，１９６２．Ｈｏｋｅｎｓｏｎ，Ｅ．Ｏ．Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４１：９−１４，１９６６．Ｆｅｙ，Ｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：２７１−２７７，１９７２．Ｓｃｈｅｎｋ，Ｅ．Ａ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２２：９６２−９６６，１９７４．Ｈｏｆｆ，Ｈ．Ｆ．Ａｒｔｅｒｙ  ６（４）：３２８−３３９，１９８０．）が報告されている。また、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）、７−アミノ−４−クマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）のように、励起波長よりもある程度長い波長にストークスシフト（ある蛍光物質に励起波長（Ｅｘ）を照射して得られる蛍光波長（Ｅｍ）の差（Ｅｍ−Ｅｘ））を示す蛍光物質は、顕微鏡に適切なフィルターを設置して励起波長域の自家蛍光を含む短波長側の蛍光を遮断し、目的蛍光だけを分離して検出することができる。また、ＲｉｃｈａｒｄらはＲ−ＰＥよりもさらに長いストークスシフトを有するランタノイドの一種、Ｅｕｒｏｐｉｕｍの錯体を用いてＴｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ法により切片の自家蛍光の影響を低減させている（Ｈａａｓ，Ｒ．Ｒ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４４（１０）：１０９１−１０９９，１９９６）。
これらの手法により自家蛍光の影響を低減することはできるが、得られる画像は暗視野の中に目的蛍光だけが観察されることになり、診断において重要な組織形態の情報は、別の手法で得られた画像と照合して判断する必要がある。
このように、蛍光抗体法の利点を臨床切片に応用すべく検討がなされているが、簡便さや定量性、あるいは組織形態の観察の点等で未だ解決されるべき課題を残している。
発明の開示
本発明の課題は、組織切片を用いた高感度で判定の容易な診断薬及び方法を提供することである。特にターゲティング療法の対象患者を選択するのに有用な診断薬及び方法を提供することにある。
本発明者らは、組織切片が有する自家蛍光により実質的に影響されない波長の蛍光波長を有する蛍光物質とペプチド又はタンパク質とを組み合わせることで、判別の容易な組織切片の染色が可能になることを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
（１）組織切片の少なくとも一部を認識するペプチド又はタンパク質と、以下ｉ）及びｉｉ）の特徴を有する蛍光物質とを含む診断薬。
ｉ）  所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ｉｉ）  該ペプチド又はタンパク質の像と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。
（２）蛍光物質が、所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない長波長側に蛍光物質のストークスシフトを示す前記に記載の診断薬。
（３）組織切片がヒト由来のパラフィン切片又はヒト由来のホルマリン固定パラフィン切片である前記に記載の診断薬。
（４）ペプチド又はタンパク質が抗体である前記に記載の診断薬。
（５）抗体がモノクローナル抗体である前記に記載の診断薬。
（６）モノクローナル抗体が、癌反応性のモノクローナル抗体である前記に記載の診断薬。
（７）癌が胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である前記に記載の診断薬。
（８）モノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む前記に記載の診断薬。
（９）モノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む前記に記載の診断薬。
（１０）モノクローナル抗体が、ビオチン標識したモノクローナル抗体である前記に記載の診断薬。
（１１）蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約８０ｎｍ以上長波長である前記に記載の診断薬。
（１２）蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約１５０ｎｍ以上長波長である前記に記載の診断薬。
（１３）励起波長が、約４５０ｎｍから約５００ｎｍである前記に記載の診断薬。
（１４）励起波長が、約４８０ｎｍから約５００ｎｍである前記に記載の診断薬。
（１５）励起波長が、約４９０ｎｍである前記に記載の診断薬。
（１６）蛍光物質が、ペリジニン  クロロフィル  プロテイン又はその蛍光団部分を含む当該タンパク質の断片である前記に記載の診断薬。
（１７）ペリジニン  クロロフィル  プロテインが、ストレプトアビジン結合ペリジニン  クロロフィル  プロテインである前記に記載の診断薬。
（１８）診断薬が、病理組織診断薬である前記に記載の診断薬。
（１９）前記に記載の診断薬を用いて組織染色することを特徴とする診断方法。
（２０）診断方法が、癌と薬剤の反応性を診断することを特徴とする前記に記載の診断方法。
（２１）前記に記載の診断方法を用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬。
（２２）疾患が、癌である前記に記載の治療薬。
（２３）癌が胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である前記に記載の治療薬。
（２４）以下の特徴を有する蛍光物質とタンパク質とを融合することにより得られる融合タンパク質を用いる解析方法。
ｉ）  所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ｉｉ）  該ペプチド又はタンパク質の像と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。
（２５）蛍光物質が、所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない長波長側に蛍光物質のストークスシフトを示す前記に記載の解析方法。
（２６）蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約８０ｎｍ以上長波長である前記に記載の解析方法。
（２７）蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約１５０ｎｍ以上長波長であることを特徴とする前記に記載の解析方法。
（２８）解析方法が、細胞内におけるタンパク質の発現及び／又は挙動を解析する前記に記載の解析方法。
（２９）前記に記載の診断薬を用いて組織染色した組織切片。
（３０）前記に記載の診断薬を含む診断薬キット。
（３１）診断薬キットが、癌に対する薬剤の反応性を判定する前記に記載の診断薬キット。
（３２）前記に記載の診断薬キットを用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬。
（３３）疾患が、癌である前記に記載の治療薬。
（３４）癌が、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である前記に記載の治療薬。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において組織切片とは、凍結切片等、パラフィン切片、ホルマリン切片、特殊条件で固定したパラフィン切片、培養細胞、組織由来細部等が挙げられるが、好ましくはヒト由来のパラフィン切片又は、ヒト由来のホルマリン固定パラフィン切片が挙げられる。
本発明の組織切片の少なくとも一部を認識するペプチド又はタンパク質とは、例えば抗体等が挙げられ、中でもモノクローナル抗体が挙げられる。また、モノクローナル抗体は、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌等の癌細胞、癌組織に反応する抗体であればいずれも用いることができ、マウスモノクローナル抗体などでも良いが、より好ましくは特開平５−３０４９８７号公報で開示されているビオチン化したヒトモノクローナル抗体（ＧＡＨ抗体）が挙げられる。
ＧＡＨ抗体において、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列は、重鎖可変領域の中でも超可変領域と呼ばれ、同様に配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列は、軽鎖可変領域の中でも超可変領域と呼ばれる。かかる領域は、免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定するものであり、相補性決定部とも呼ばれる。従って、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。すなわち、ＧＡＨ抗体と同様の超可変領域を有する抗体はＧＡＨ抗体と同様に本発明において使用できると考えられる。
従って、本発明に使用されるモノクローナル抗体としてはは、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含むものである。これらのアミノ酸配列は、通常、重鎖及び軽鎖の各鎖の３つの超可変領域に、Ｎ末端側から、配列表の配列番号１、２及び３並びに配列表の配列番号４、５及び６の順でそれぞれ含まれる。本発明においては、癌との反応性を損なわない範囲で一部のアミノ酸を置換、挿入、削除あるいは追加する等の改変を行ったものも、本発明において使用できるモノクローナル抗体に含まれる。
本発明において使用されるモノクローナル抗体は、癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、上記の特定のアミノ酸配列を有するものを選択することによって得ることができる。
ハイブリドーマは、Ａ．Ｉｍａｍらの方法〔Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓａｒｃｈ  ４５，２６３（１９８５）〕に準じて、まず、癌患者から摘出された癌所属のリンパ節から、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞と融合して得られる。得られたハイブリドーマの上清を用いて、パラフォルムアルデヒド固定した各種癌細胞株に対し、エンザイムイムノアッセイにより陽性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングを行う。
さらに、ハイブリドーマの上清から、常法〔Ｒ．Ｃ．Ｄｕｈａｍｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１，２１１（１９７９）〕によりモノクローナル抗体を精製し、蛍光物質でラベルし、生癌細胞株、各種の赤血球、白血球等に対する反応性をフローサイトメトリーで検出することにより、生癌細胞株に対しては反応性を示す抗体を、赤血球、白血球に対しては、反応性を示さない抗体を選別する。また、癌患者から摘出される癌組織から単離される癌細胞、及び同一患者の同一組織の非癌部から単離される正常細胞に対する反応性を比較して、癌細胞に、より多量の抗体が結合し、正常細胞には反応がないか、もしくは健常人由来の抗体と同程度の反応性しかない抗体を選別する。
かくして選別されたハイブリドーマが産生する抗体をコードするＤＮＡの塩基配列は、たとえば、以下の方法によって得られる。抗体産生ハイブリドーマから、チオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法〔Ｃａｓａｒａら，ＤＮＡ，２，３２９（１９８３）〕でｍＲＮＡを調製して、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてそのｃＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、ｃＤＮＡに（ｄＧ）テーリングを行い、このｄＧテールにハイブリダイズするポリＣと、既に遺伝子が取得されているヒト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の各々共通な配列部分をプローブとしてＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。その後、ＤＮＡの末端平滑化を行い、電気泳動法によってゲルから切りだしたＤＮＡをｐＵＣ１１９等のクローニングベクターに挿入し、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）〕によってその塩基配列が決定される。この塩基配列に基づいて、上記特定のアミノ酸配列を有するものを選別できる。
また、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、遺伝子工学的な手法により作製することもできる。
本発明において特に好適なモノクローナル抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が夫々配列表の配列表の配列番号７及び８のアミノ酸配列で表されるものである。重鎖及び軽鎖の定常領域の塩基配列は、例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４，１７７９（１９８６）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５７，１５１６（１９８２）及びＣｅｌｌ  ２２，１９７（１９８０）に記載のものと同じ配列を有するものでよい。
本抗体は、本抗体を産生するハイブリドーマを牛胎児血清含有ｅＲＤＦ、ＲＰＭＩ  １６４０培養液等を用いて培養するか、又は、上記の特定の超可変領域を含む可変領域をコードするＤＮＡにさらに重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡが夫々連結された遺伝子を化学合成し、その遺伝子の発現を可能とする公知の種々の発現ベクター、例えば、動物細胞における発現ベクターとして、ｐＫＣＲＨ２〔三品ら、Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６０５（１９８４）〕から特開平５−３０４９８７号公報の図１又は図２に示した手順で構築することができるｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨとｐＫＣＲＤに挿入し、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハイスター卵巣細胞）等の宿主中で発現させることにより得ることができる。例えば、重鎖遺伝子の両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加したものをｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、またこのプラスミドのＳａｌＩ部位にＤＨＦＲ遺伝子等の選択マーカー遺伝子を挿入する。一方、軽鎖遺伝子の両端にはＥｃｏＲＩ部位を付加したものをｐＫＣＲＤのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、さらにこのプラスミドのＳａｌＩ部位にもＤＨＦＲ遺伝子を挿入する。両プラスミドをＣＨＯｄｈｆｒ−〔Ｕｒｌａｕｂ  Ｇ．＆  Ｃｈａｓｉｎ  Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６（１９８０）〕等の細胞にリン酸カルシウム法で導入し、ヌクレオチドを含まないαＭＥＭ培養液等で増殖する細胞から、さらに抗体を産生する細胞を選別することによって得ることができる。抗体は、これらの細胞を培養した培養液から、プロテインＡをセルロファイン、アガロース等の支持体に結合させたカラム等に吸着し、溶出させること等によって精製される。
抗体としては、全長抗体（抗体全体）又は抗体断片（抗体フラグメント）、又は抗体誘導体等いずれも用いることができる。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗体自体及び抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ（１本鎖抗体）等）のほか、誘導化抗体又はビオチン等を用いて標識した修飾抗体等を包含しており、最も広義に解釈しなければならない。
本発明において、癌とは、例えばペプチド又はタンパク質として抗体を使用する場合、該抗体が反応性を有する可能性のある癌種であれば特に限定するものではないが、例えば胃癌、大腸癌、食道癌、肺癌、乳癌、肝癌、卵巣癌、子宮癌、膵癌等が挙げられる。より好ましくは、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌が挙げられる。
本発明における蛍光物質としては、以下の特徴を有する蛍光物質であればいかなるものでも良い。
ｉ）  所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ｉｉ）  該ペプチド又はタンパク質と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。
このような蛍光物質としては、該組織切片のストークスシフトよりも長波長のストークスシフトを有し、組織を染色するのに実質的に十分な蛍光強度を有する蛍光物質を用いることが好ましく、該組織切片のストークスシフトよりも、約８０ｎｍ以上長波長のストークスシフトを有する蛍光物質がさらに好ましく、約１５０ｎｍ以上長波長のストークスシフトを有する蛍光物質を用いることがより好ましい。なお、ストークスシフトとはある蛍光物質に励起波長（Ｅｘ）で励起して得られる蛍光波長（Ｅｍ）の差（Ｅｍ−Ｅｘ）を意味する。
本発明においては、蛍光物質の励起波長としては、約４５０ｎｍから約５００ｎｍである場合が好ましく、約４８０ｎｍから約５００ｎｍである場合がさらに好ましい。このとき、蛍光波長が約５７０ｎｍから約７５０ｎｍである場合がより好ましい。最も好ましくは、励起波長が約４９０ｎｍであり蛍光波長が約６４０ｎｍから約７５０ｎｍである蛍光物質である。
本発明においては、蛍光物質として上記励起・蛍光特性を有するものであれば、既知の、あるいは、今後開発されるいかなる蛍光物質を用いることもできる。特に限定するものではないが、ペリジニン  クロロフィル  プロテイン（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ  Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＰｅｒＣＰ：ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社）、フィコエリスリンＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、アレクサ  フルオロ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社），ユーロピュームキレート化合物（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ社）、イソギンチャク近縁類（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）より得られる赤色蛍光物質あるいはこの変異体、六放サンゴ（理化学研究所）から得られた赤色蛍光物質あるいはこの変異体、オワンクラゲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）由来の蛍光物質ミュータント等を例示することができるが、好ましくは、渦鞭毛虫（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）のＰｅｒＣＰである。なお、以下、蛍光物質としてＰｅｒＣＰを使用した場合を例として説明する部分もあるが、本発明の蛍光物質としてはＰｅｒＣＰに限定されない。
蛍光物質はペプチド又はタンパク質に直接化学結合してもよく、また中間物質を介して結合することもできる。その結合は既知のあるいは今後開発されるいかなる方法を用いて結合させてもよい。
限定するものではないが、蛍光物質と抗体等のペプチド又はタンパク質との結合はスクシンイミドエステル等を用いた活性エステル法、イソチオシアネートを用いた方法、アルキルハライドを用いた方法、マレイミドを用いた方法、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法あるいはピリジルジ・ジスルフィド法等の架橋方法を用いることができる（酵素免疫測定法、石川栄治ら、医学書院）。
ＰｅｒＣＰを例にとれば、ＰｅｒＣＰを直接抗体に結合してもよく、またアビジン−ビオチン複合体等を介して抗体と結合することができるものが挙げられるが、より好ましくはストレプトアビジン結合ＰｅｒＣＰである。
本発明の別の形態として、ペプチド又はタンパク質と蛍光物質を水溶性高分子、例えばデキストラン、アガロース、セルロース、等の多糖類、ポリエチレングリコール等の合成水溶性高分子を介して結合させることができる。
また、別の形態として蛍光物質をポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン等の合成有機高分子化合物等を用いたマイクロスフェアや、高分子ミセル、リポソーム、リピッドマイクロスファア等に包埋し、この微粒子にペプチド又はタンパク質を結合させることができる。これらの微粒子はアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水酸基等の官能基を導入したものであってもかまわない。
本発明の診断薬は、例えば、病理組織診断薬として用いられる。
本発明においては、上述のペプチド又はタンパク質と上述の蛍光物質とを含む診断薬を上述の組織切片に反応させて組織染色を行い、その染色度合い等を確認することにより診断を行うことができる。
より具体的には、染色した組織切片は実質的にペプチド又はタンパク質の蛍光反応を検出できるいかなる機器を用いても検査することができるが、例えば蛍光顕微鏡を挙げることができる。蛍光顕微鏡で自家蛍光と、例えば、ＰｅｒＣＰ蛍光を同時観察する場合は、励起波長約４５０ｎｍから約５００ｎｍを用い、約５１５ｎｍ以上の蛍光波長を観察する。あるいは自家蛍光像と赤色蛍光像をそれぞれに適した励起波長、蛍光波長で観察し、画像上重ねて使用することができる。
本発明によれば、非特異的染色が少ないため、赤色蛍光の陽性像が、陰性対照のヒトイムノグロブリンを用いた染色像や組織の自家蛍光像（黄緑色から深緑色）と明確に区別できる。従って、色の違いを判定の指標にすることができる。
判定基準は赤色蛍光強度と染色頻度を考慮した肉眼によるスコアリングの他、適切な画像解析ソフトで赤色蛍光強度の数値化を行うことができる。また、切片に結合したＰｅｒＣＰを酸性溶液で抽出して定量してもよい。この方法により、癌と薬剤の反応性を診断することができる。
本発明においては、上記の診断方法を用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬も提供される。この場合の薬剤とは、抗体を有する癌ターゲッティング剤等が挙げられるが、好ましくは特開平５−３０４９８７号公報に記載の抗腫瘍剤が挙げられる。
また、本発明の蛍光物質を用いれば、細胞を構成するタンパク質であって、その発現方法や局在の不明なタンパク質と上記の蛍光物質を融合させることにより、該タンパク質の発現及び／又は挙動を追うことが可能となる。融合タンパク質の作製方法は、公知の方法（「遺伝子導入＆発現解析実験方」羊土社（１９９７年発行））に従って行えば良い。この融合タンパク質を用いることにより、現在汎用されている緑色蛍光物質（Ｇｒｅｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）と同時に、異なるタンパク質の発現及び／又は挙動を検討することが可能となる。
本発明の組織染色した組織切片としては、上記の診断薬を用いて、癌を染色した病理組織が挙げられるが、好ましくはストレプトアビジン結合ＰｅｒＣＰとビオチン化したヒトモノクローナル抗体であるＧＡＨ抗体を用いて染色した、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌等の病理組織が挙げられる。
本発明の診断薬キットとしては、上記の診断薬をキット中に含むことにより、抗原等に対する薬剤の反応性を判定することができるものが挙げられる。以下、抗原を例に説明する。
該診断薬キットは、被検サンプル中の抗原を免疫学的に検出する方法によりなされ、その検出値から薬剤と抗原の反応性を判定するために使用するものである。従って、本発明の該診断薬キットは少なくとも、抗原に対する抗体、蛍光物質から構成されることを特徴とし、さらに、必須ではないが、緩衝液、界面活性剤及び洗浄液から構成されることを特徴とする。免疫学的に検出する方法としては、蛍光物質を直接抗体に化学結合した蛍光ラベル抗体を用い直接抗体の反応性を検出する直接法、蛍光ラベルした２次抗体を介して該抗体の反応を間接的に検出する間接法、あるいは、アビジン（あるいはストレプトアビジン）・ビオチンを介して抗体と蛍光物質を結合するアビジン・ビオチン法等を用いることができる。抗体の蛍光物質における標識化は、公知の方法（「続生化学実験  講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁等参照）に準じて行えばよい。
本発明のキット内のタンパク質は、アジ化ナトリウム等の防腐剤、アルブミン等の安定化剤、糖質等の賦形剤を含むことができる。滅菌状態で室温、冷蔵あるいは凍結状態で保存することができ、必要に応じて窒素ガス等の不活性ガスを充填して保存することができる。タンパク質は溶液、凍結あるいは凍結乾燥した状態でキット化することができ、使用時必要に応じて融解あるいはキットに添付された溶液で溶解し用いることができる。
抗体及び蛍光物質の試薬以外には、緩衝液、界面活性剤、洗浄液、２次抗体、対照用抗体、増感剤の他、採用したアッセイ法で通常使用しているもの（酵素溶液、基質溶液、反応停止液、検体希釈液、退色防止剤、スライド用保存剤等）の中から、適宜選択して使用すればよい。また、非特異的な反応を抑制するため、血清やアルブミン等のブロッキング剤をキット中に含んでいても良い。
本発明のキットは、好ましくは、緩衝液の滅菌バイアル、注射器、フィルター、カラム等によって補うことができる。
蛍光検出を行なう場合、直接法では、蛍光ラベルした抗体を切片に添加し、反応、洗浄後、切片の蛍光を観察すれば良い。間接法の場合、抗体を切片に添加し、反応、洗浄後、蛍光ラベルした２次抗体を添加し、組織に反応した抗体を可視化することができる。また、別の形態としては、抗体と蛍光ラベルした２次抗体をまず混合して、切片に添加し反応性を観察することができる。アビジンとビオチンを使った方法の場合は、ビオチン化した抗体を切片に添加し、反応、洗浄後、アビジン化したＰｅｒＣＰ等の蛍光剤を添加し、組織に反応した抗体を可視化することができる。さらに別の形態としては、抗体を切片に添加し、反応、洗浄後、ビオチン化した二次抗体と反応させ、アビジン化したＰｅｒＣＰ等の蛍光剤を添加し、組織に反応した抗体を可視化することができる。また、別の形態としては、ビオチン化した抗体とアビジン化したＰｅｒＣＰ等の蛍光剤をまず混合して、切片に添加し反応性を観察することができる。さらに別の組み合わせとしてアビジン化した抗体とビオチン化したＰｅｒＣＰ等の蛍光剤を用い上記方法で抗体の反応性を検出することができる。
これらの測定方法や測定キットによる測定の結果、組織と高い反応性を得た場合には、組織の薬剤に対する反応性が高い可能性があると判断し、薬剤の投与を考慮することが適当である。薬剤としては、抗体を有する癌ターゲッティング剤等が挙げられる。癌としては、好ましくは胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌が挙げられ、癌ターゲッティング剤としては、好ましくは特開平５−３０４９８７号公報に記載の抗腫瘍剤が挙げられる。
実施例
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１：胃癌組織に対するＧＡＨ抗体の反応性＞
特開平５−３０４９８７号公報（実施例１、２、３）に記載のＧＡＨ抗体、及び対照としてヒトイムノグロブリンにビオチン化試薬（アマシャム社製）を用いて各々の抗体にビオチン化標識を行った。ヒト胃癌組織のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、５％−ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に室温で１時間浸してブロッキングを行った後、１００μｇ／ｍｌの各ビオチン化抗体溶液と３７℃で２時間反応させた。切片をＰＢＳで洗浄し、４μｇ／ｍｌのＰｅｒＣＰ標識ストレプトアビジン溶液（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）と遮光下、氷冷中で３０分間反応させた。ＧＡＨ抗体の胃癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長４９０ｎｍにおける６８０ｎｍのＰｅｒＣＰの赤色蛍光として検出した。
結果を第１図に示す。ビオチン化ＧＡＨ抗体とＰｅｒＣＰ標識ストレプトアビジン溶液を反応させた胃癌組織切片（第１図ａ）は赤色蛍光が検出された。対照であるビオチン化ヒトイムノグロブリンとＰｅｒＣＰ標識ストレプトアビジン溶液を反応させた胃癌組織切片（第１図ｂ）では赤色蛍光は検出されなかった。
＜比較例１：胃癌組織に対するＧＡＨ抗体の反応性（ＨＲＰ酵素抗体法）＞
対照例として、同組織の連続切片を脱パラフィン処理し、過酸化水素水で内因性のペルオキシダーゼを不活性化した後、５％−ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に室温で１時間浸してブロッキングした。１０μｇ／ｍｌの実施例１に記載の各ビオチン化抗体溶液と３７℃で２時間反応させ、さらにベクタステインｅｌｉｔｅＡＢＣキット（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌＨＲＰ−ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｖｅｃｔｏｒ製）と室温で１時間反応させた。
ＧＡＨ抗体の胃癌組織切片に対する反応性は、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）の赤褐色染色像として検出し、ヘマトキシリンにて核を対比染色した。
結果を第２図に示す。ＧＡＨ抗体染色像（第２図ａ）には赤褐色染色像が認められたもののバックグラウンドとの差別化がつきにくく、加えて対照であるイムノグロブリン染色像（第２図ｂ）と比べてどの程度赤褐色染色像が認められるかの判断が難しかった。
＜実施例２：乳癌組織に対するＧＡＨ抗体の反応性＞
特開平５−３０４９８７号公報（実施例１、２、３）に記載のＧＡＨ抗体にビオチン化試薬（アマシャム社製）を用いてビオチン化標識を行った。ヒト乳癌組織のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、５％−ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に室温で１時間浸してブロッキングを行った後、１００μｇ／ｍｌのビオチン化ＧＡＨ抗体溶液と３７℃で２時間反応させた。切片をＰＢＳで洗浄し、４μｇ／ｍｌのＰｅｒＣＰ標識ストレプトアビジン溶液（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）と遮光下、氷冷中で３０分間反応させた。ＧＡＨ抗体の乳癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長４９０ｎｍにおける６８０ｎｍのＰｅｒＣＰの赤色蛍光として検出した。
結果を第３図に示す。抗体存在下では染色が認められた（第３図ａ）が、抗体非存在下では染色が認められなかった（第３図ｂ）。
＜実施例３：大腸癌組織に対するＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２の反応性＞
特開平５−３０４９８７号公報（実施例１、２、３）に記載のＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２、及び対照としてヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２に対してビオチン化試薬（アマシャム社製）を用いて各々の抗体にビオチン化標識を行った。ヒト大腸癌組織のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、５％−ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に室温で１時間浸してブロッキングを行った後、６６μｇ／ｍｌの各ビオチン化抗体溶液と３７℃で２時間反応させた。切片をＰＢＳで洗浄し、４μｇ／ｍｌのＰｅｒＣＰ標識ストレプトアビジン溶液（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）と遮光下、氷冷中で３０分間反応させた。ＧＡＨ抗体の大腸癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長４９０ｎｍにおける６８０ｎｍのＰｅｒＣＰの赤色蛍光として検出した。
結果を第４図に示す。ビオチン化ＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２とＰｅｒＣＰ標識ストレプトアビジン溶液を反応させた大腸癌組織切片（第４図ａ）は赤色蛍光が検出された。対照であるビオチン化ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２とＰｅｒＣＰ標識ストレプトアビジン溶液を反応させた大腸癌組織切片（第４図ｂ）では赤色蛍光が検出されなかった。
＜実施例４：食道癌組織に対するＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２の反応性＞
特開平５−３０４９８７号公報（実施例１、２、３）に記載のＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２にビオチン化試薬（アマシャム社製）を用いてビオチン化標識を行った。ヒト食道癌組織のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、５％−ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に室温で１時間浸してブロッキングを行った後、６６μｇ／ｍｌのビオチン化ＧＡＨ抗体溶液と３７℃で２時間反応させた。切片をＰＢＳで洗浄し、４μｇ／ｍｌのＰｅｒＣＰ標識ストレプトアビジン溶液（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）と遮光下、氷冷中で３０分間反応させた。ＧＡＨ抗体の食道癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長４９０ｎｍにおける６８０ｎｍのＰｅｒＣＰの赤色蛍光として検出した。
結果を第５図に示す。抗体存在下では染色が認められた（第５図ａ）が、抗体非存在下では染色が認められなかった（第５図ｂ）。
＜参考例１：ＧＡＨ抗原陽性、陰性のｉｎ  ｖｉｖｏ試験（大腸癌組織切片観察）＞
ヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒ−Ｔｃ（ＧＡＨ抗体陽性細胞株、東北大学加齢研より入手）、ＳＷ８３７（ＧＡＨ抗体陽性細胞株、免疫生物研究所より入手）、Ｃａｃｏ−２（ＧＡＨ抗体陰性細胞株、大日本製薬社）をそれぞれヌードマウス皮下に移植して腫瘍を作製し、その腫瘍組織でパラフィン切片を作製した。切片を脱パラフィン処理し、５％−ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に室温で１時間浸してブロッキングを行った後、１００μｇ／ｍｌのビオチン化ＧＡＨ抗体溶液と３７℃で２時間反応させた。切片をＰＢＳで洗浄し、４μｇ／ｍｌのＰｅｒＣＰ標識ストレプトアビジン溶液（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）と遮光下、氷冷中で３０分間反応させた。ＧＡＨ抗体の反応性は蛍光顕微鏡を用い、励起波長４９０ｎｍにおける６８０ｎｍのＰｅｒＣＰの赤色蛍光として検出した。
結果を第６図に示す。ヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒ−Ｔｃ（ａ）及びＳＷ８３７（ｂ）では癌細胞に対して強い赤色蛍光が検出されたが、Ｃａｃｏ−２（ｃ）ではこれらに比べて赤色蛍光は弱かった。
＜参考例２：ＧＡＨ抗原陽性、陰性のｉｎ  ｖｉｖｏ試験（抗腫瘍効果）＞
参考例１に記載の腫瘍細胞株にてヌードマウス腎皮膜下移植モデルを作製し、塩酸ドキソルビシン（ＤＸＲ）（協和発酵社）、ＤＸＲ封入ＰＥＧリポソーム（ＰＬ）、ＧＡＨ結合ＤＸＲ封入ＰＥＧリポソーム（ＰＧＬ）をそれぞれドキソルビシン３ｍｇ／ｋｇ相当量静脈内投与した。対照群には同量の生理食塩液を投与した。これを１週間に１回、計３回投与し、最終投与から１週間後に腫瘍重量を測定したところ、ＧＡＨ抗体陽性細胞株であるＷｉＤｒ−Ｔｃ（第７図ａ）、ＳＷ８３７（第７図ｂ）ではＰＧＬの有意な抗腫瘍効果が得られたのに対し、ＧＡＨ抗体陰性株であるＣａｃｏ−２（第７図ｃ）ではＰＧＬの効果は小さかった。
ここで用いたＰＬ及びＰＧＬはＷＯ００／６４４１３号公報（実施例１）に記載の方法に準じて作製した。すなわち、ＤＸＲを封入したリポソームを作製し、チオール化したＧＡＨ抗体を結合させ、さらにチオール化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させ、ＰＧＬを作成した。また、これらの手順から抗体結合の操作を省くことによってＰＬを作成した。
＜比較例２＞
ＰｅｒＣＰラベル及びＦＩＴＣラベル抗体を用いて、ヒト大腸癌組織切片の染色像を比較した。抗体はビオチン化ＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２を用い、対照抗体としてビオチン化ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２を用いた。
結果を第８図に示す。図中、ＡはＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２（ＦＩＴＣラベル）、Ｂは対照抗体（ＦＩＴＣラベル）、ＣはＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２（ＰｅｒＣＰラベル）をまた、Ｄは対照抗体（ＰｅｒＣＰラベル）を示す。なお、組織切片のみの蛍光像は対照抗体染色像（Ｄ）と同じであった。
＜実施例５  組織切片の自家蛍光＞
実施例１と同様にして作製したヒト大腸癌切片の自家蛍光のスペクトルを固体試料ホルダーを装着した蛍光分光光度計（日本分光製）を用いて測定した。第９図中に各励起波長における蛍光スペクトルを示す。図中Ａは励起波長３５０ｎｍにおける３６０ｎｍから７００ｎｍの蛍光スペクトルを、Ｂは励起波長４９０ｎｍにおける５００ｎｍから７００ｎｍの蛍光スペクトルを、Ｃは励起波長５９５ｎｍにおける６０５ｎｍから７００ｎｍの蛍光スペクトルを示す。それぞれの励起波長でレーリー光の強い影響がある為、レーリー光を遮断するため、受光部に（Ａ）は４２０ｎｍ以上、（Ｂ）は５２０ｎｍ以上、（Ｃ）は６２０ｎｍ以上の蛍光を透過するフィルターＬ−４２、Ｙ−５２、Ｒ−６２フィルター（ケンコー社製）をそれぞれ用いた。第９図に示すように、組織切片は各励起波長においても、広範囲に強い自家蛍光を持つことがわかる。
さらに、この組織切片の励起波長４９０ｎｍにおける自家蛍光スペクトルと各色素の蛍光スペクトルを比較したのが第１０図である。
組織切片（Ａ）に加え、溶液用セルを用い、ＦＩＴＣ溶液（Ｂ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８溶液（Ｃ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６溶液（Ｄ）、及びＰｅｒＣＰ溶液（Ｅ）の励起波長４９０ｎｍにおける５００ｎｍから７００ｎｍの蛍光スペクトルを同様にして取得した。結果を第１１図に示し比較した。自家蛍光（Ａ）とＦＩＴＣ（Ｂ）やＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｃ）の蛍光スペクトルは、重複していることが示された。またＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６（Ｄ）の蛍光も自家蛍光と近接した波長であった。従って、本励起波長においては、約６００ｎｍ以下の蛍光波長では自家蛍光との分離が不明確であることがわかる。一方ＰｅｒＣＰの蛍光（Ｅ）は組織切片の自家蛍光から明確に分離され、自家蛍光の影響を受けないことがわかる。
＜実施例６  組織からの蛍光物質の抽出＞
大腸癌細胞株ＤＬＤ−１（大日本製薬社）、及びＣＯＬＯ２０５（大日本製薬社）、胃癌細胞株ＭＫＮ４５（免疫生物研究所）のヌードマウス皮下移植腫瘍をビオチン標識ＧＡＨ抗体とストレプトアビジンＰｅｒＣＰを用いて免疫染色した。各スライド１０枚分の組織から１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ１．７を用いてＰｅｒＣＰを抽出した。ＪＡＳＣＯ蛍光分光光度計にて励起波長４９０ｎｍにおける蛍光波長６８０ｎｍの赤色蛍光量を測定した。一方、各組織染色像よりＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｖｅｒ．５．５を用いて画像を構成するピクセルの赤色チャンネル強度のヒストグラム平均値と、明るさの指標として輝度ヒストグラム平均値の差を、ＰｅｒＣＰ赤色蛍光定量値として算出したところ、第１１図に示すように抽出測定した蛍光量と画像処理による定量値は良い相関を示した。
＜実施例７  抗サイトケラチン抗体の例＞
実施例１と同様にして作製したヒト胃癌切片に１０μｇ／ｍｌの抗サイトケラチン８／１８マウスモノクロナール抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を添加し３７℃で１時間反応させた。対照としてマウスＩｇＧを用いた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を加え室温で１時間反応させた。再度ＰＢＳで洗浄後、実施例１と同様にストレプトアビジンＰｅｒＣＰ（Ａ）、ストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６（Ｂ，Ｃ）で染色し蛍光を観察した。第１２図に染色像を示す。図中ＡはＰｅｒＣＰの赤色蛍光によって組織中の癌細胞が明確に識別できたが、黄赤色蛍光を有するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６で染色したＢは、組織中の癌細胞の識別が不明瞭であった。一方、対照抗体を用いた染色では  非染色組織と同様に陰性像であった。代表例として対照抗体／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６の陰性像（Ｃ）を示す。
産業上の利用可能性
本発明は、組織切片を用いた高感度で判定の容易な診断薬であり、診断方法として極めて有用である。また、本発明の診断方法を用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療剤を提供することができる。また、本発明の蛍光物質との融合タンパク質を用いたタンパク質の解析方法を提供することも可能である。また、本発明の診断薬を用いて組織染色する組織切片や、癌に対する薬剤の親和性を判定するための診断薬キット、さらに、該診断薬キットを用いて適切な薬剤を選択した上で投与される疾患の治療剤を提供することができる。
なお、本出願は、日本特許出願  特願２００１−２２４０５４号を優先権主張して出願されたものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、胃癌組織のＧＡＨ抗体染色像である。
第２図は、胃癌組織のＧＡＨ抗体染色像（ＨＲＰ酵素抗体法）である。
第３図は、乳癌組織のＧＡＨ抗体染色像である。
第４図は、大腸癌組織のＦ（ａｂ）２化ＧＡＨ抗体染色像である。
第５図は、食道癌組織のＦ（ａｂ）２化ＧＡＨ抗体染色像である。
第６図は、大腸癌細胞株移植腫瘍のＧＡＨ抗体染色像である。
第７図は、大腸癌細胞株移植腫瘍に対するｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果である。
第８図は、ＦＩＴＣ染色像とＰｅｒＣＰ染色像との比較である。
第９図は、組織切片の自家蛍光スペクトル解析である。
第１０図は、各種蛍光物質のスペクトル解析である。
第１１図は、ＰｅｒＣＰ染色像の定量性についての検討である。
第１２図は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６染色像とＰｅｒＣＰ染色像との比較である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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