(57)【要約】解析装置１０のバックグラウンド算出部３２は、ＤＮＡチップ上に配置されたスポットのシグナル強度を示す値の各々をバックグラウンド値で減じることで得られる減算値の累積度数比に基づく正規確率グラフが、所定の直線性を備えるようなバックグラウンド値を算出する。シグナル強度を示す値から上記バックグラウンド値が減じられた値である補正シグナル強度値の対数変換値は、正規分布となる。したがって、これを標準化することにより、同種のＤＮＡチップ或いは異種のＤＮＡチップから測定されたデータの比較をなすことが可能となる。
2002001477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡチップ上に配置された各スポットのシグナル強度を示す値から構成されるアレイデータを処理して、解析可能なデータを取得するデータ処理方法であって、
前記アレイデータを取得するステップと、
当該アレイデータを構成する各スポットのシグナル強度を示す値を対数変換するステップと、
対数変換された値を、前記ＤＮＡチップのスポットに対応するように配置した変換データを生成するステップとを備えたことを特徴とするデータ処理方法。
【請求項２】
さらに、前記対数変換された値を走査して、その中央値を特定するステップと、
各値から中央値を減じるステップとを備え、前記中央値が減じられた値からなる変換データが生成されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のデータ処理方法。
【請求項３】
さらに、前記対数変換された値を、ｚ−標準化して、標準化された値を算出するステップを備え、標準化された値からなる変換データが生成されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のデータ処理方法。
【請求項４】
さらに、シグナル強度を示す値の各々をバックグラウンド値で減じることで得られる減算値の累積度数比に基づく正規確率グラフが、所定の直線性を備えるようなバックグラウンド値を算出するステップを備え、
当該シグナル強度を示す値の各々をバックグラウンド値で減じることにより得られた値を、対数変換の対象とすることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項の何れか一項に記載のデータ処理方法。
【請求項５】
前記バックグランド値を算出するステップが、
シグナル強度を示す値の最小値を特定するステップと、
前記最小値を含む所定の範囲を設定するステップと、
前記所定の範囲内を、所定の数だけ分割し、上限値、下限値、および、分割により得られる所定数の中間値をバックグラウンド値候補として算出するステップと、
各バックグラウンド値候補について、前記シグナル強度を示す値の各々からバックグラウンド候補値を減じて、減算値を算出して、当該減算値に基づく正規確率グラフを求めるステップと、
前記正規確率グラフのうち、最も直線性に優れたものに利用されたバックグラウンド候補を特定するステップとを有し、
特定されたバックグラウンド候補に関する直線性が十分になるまで、前記上限値および下限値の範囲を変更して、再度、バックグラウンド値候補の算出、正規確率グラフの算出、および、バックグラウンド候補の特定を繰り返すことを特徴とする請求の範囲第４項に記載のデータ処理方法。
【請求項６】
前記所定の直線性を示すステップが、
カイ二乗検定を実行するステップを有することを特徴とする請求の範囲第４項または第５項に記載のデータ処理方法。
【請求項７】
前記バックグラウンド値を算出するステップが、
前記シグナル強度を示す値を参照して、２以上の所定のパーセンタイルにある値を特定するステップと、
前記２以上の特定された値に基づいて、バックグラウンド値を推定するステップとを備えたことを特徴とする請求の範囲第４項に記載のデータ処理方法。
【請求項８】
前記所定のパーセンタイルにある値を特定するステップが、
前記シグナル強度を示す値を参照して、第１四分位ＬＱ、第３四分位ＵＱおよび中央値Ｍを求めるステップを含み、かつ、
前記バックグラウンド値を推定するステップが、
バックグラウンド値ｘ＝（ＵＱ＊ＬＱ−Ｍ２）／（ＵＱ＋ＬＱ−２Ｍ）
ただし、ＵＱ＋ＤＱ−２Ｍ＝０のとき、ｘ＝０
を求めるステップを含むことを特徴とする請求の範囲第７項に記載のデータ処理方法。
【請求項９】
さらに、前記ＤＮＡチップのスポットの配列にしたがって、前記スポットを複数のグループに分類するステップと、
前記グループごとに、当該グループを構成するスポットに関する対数変換値から、その中央値を特定するステップと、
前記対数変換値の各々から、前記中央値を減算するステップとを備えたことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第８項の何れか一項に記載のデータ処理方法。
【請求項１０】
さらに、前記ＤＮＡチップのスポットの配列にしたがって、前記スポットを複数のグループに分類するステップと、
前記グループごとに、当該グループを構成するスポットに関するシグナル強度を示す値から、その中央値を特定するステップと、
前記シグナル強度を示す値の各々を、前記中央値で除算するステップとを備えたことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第８項の何れか一項に記載のデータ処理方法。
【請求項１１】
前記分類するステップが、
前記ＤＮＡチップ中の、１または複数の列、或いは、１または複数の行ごとに、当該列或いは行に含まれるスポットに関する対数値を取得するステップを有することを特徴とする請求の範囲第９項または第１０項に記載のデータ処理方法。
【請求項１２】
請求の範囲第２項に記載のデータ処理方法を利用して、複数のスポットのシグナル強度を示す値を比較する方法であって、
一方のスポットにかかる変換データの値を、他方のスポットにかかる変換データの値で除算するステップを備えたことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求の範囲第３項に記載のデータ処理方法を利用して、複数のスポットのシグナル強度を示す値を比較する方法であって、
一方の標準化された値と他の標準化された値との差分値を算出するステップを備えたことを特徴とする方法。
【請求項１４】
さらに、前記差分値の、所定数のべき乗を算出するステップを備えたことを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡチップ上に配置された各スポットのシグナル強度を示す値から構成されるアレイデータを処理して、解析可能なデータを取得するデータ処理方法を、コンピュータに実行させるためのデータ処理プログラムであって、
前記アレイデータを取得するステップと、
当該アレイデータを構成する各スポットのシグナル強度を示す値を対数変換するステップと、
対数変換された値を、前記ＤＮＡチップのスポットに対応するように配置した変換データを生成するステップとを、前記コンピュータに実行させることを特徴とするデータ処理プログラム。
【請求項１６】
さらに、前記対数変換された値を走査して、その中央値を特定するステップと、
各値から中央値を減じるステップとを、前記コンピュータに実行させ、これにより、前記中央値が減じられた値からなる変換データが生成されることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項１７】
さらに、前記対数変換された値を、ｚ−標準化して、標準化された値を算出するステップを、前記コンピュータに実行させ、これにより、標準化された値からなる変換データが生成されることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項１８】
さらに、シグナル強度を示す値の各々をバックグラウンド値で減じることで得られる減算値の累積度数比に基づく正規確率グラフが、所定の直線性を備えるようなバックグラウンド値を算出するステップを、前記コンピュータに実行させ、当該コンピュータにおいて、当該シグナル強度を示す値の各々をバックグラウンド値で減じることにより得られた値を、対数変換の対象とするように動作させることを特徴とする請求の範囲第１５項ないし第１７項の何れか一項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項１９】
前記バックグランド値を算出するステップにおいて、
シグナル強度を示す値の最小値を特定するステップと、
前記最小値を含む所定の範囲を設定するステップと、
前記所定の範囲内を、所定の数だけ分割し、上限値、下限値、および、分割により得られる所定数の中間値をバックグラウンド値候補として算出するステップと、
各バックグラウンド値候補について、前記シグナル強度を示す値の各々からバックグラウンド候補値を減じて、減算値を算出して、当該減算値に基づく正規確率グラフを求めるステップと、
前記正規確率グラフのうち、最も直線性に優れたものに利用されたバックグラウンド候補を特定するステップとを、前記コンピュータに実行させ、かつ、
特定されたバックグラウンド候補に関する直線性が十分になるまで、前記上限値および下限値の範囲を変更して、再度、バックグラウンド値候補の算出、正規確率グラフの算出、および、バックグラウンド候補の特定を、前記コンピュータに繰り返させることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項２０】
前記所定の直線性を示すステップにおいて、
カイ二乗検定を実行するステップを、前記コンピュータに実行させることを特徴とする請求の範囲第１８項または第１９項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項２１】
前記バックグラウンド値を算出するステップにおいて、
前記シグナル強度を示す値を参照して、２以上の所定のパーセンタイルにある値を特定するステップと、
前記２以上の特定された値に基づいて、バックグラウンド値を推定するステップとを前記コンピュータに実行させることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項２２】
前記バックグランド値を算出するステップにおいて、
前記シグナル強度を示す値から、第１四分位ＬＱ、第３四分位ＵＱおよび中央値Ｍを求めるステップと、
ｘ＝（ＵＱ＊ＬＱ−Ｍ２）／（ＵＱ＋ＬＱ−２Ｍ）
ただし、ＵＱ＋ＤＱ−２Ｍ＝０のとき、ｘ＝０
を求め、求められたｘをバックグラウンド値とするステップとを、前記コンピュータに実行させることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項２３】
さらに、前記ＤＮＡチップのスポットの配列にしたがって、前記スポットを複数のグループに分類するステップと、
前記グループごとに、当該グループを構成するスポットに関する対数変換値から、その中央値を特定するステップと、
前記対数変換値の各々から、前記中央値を減算するステップとを、前記コンピュータに実行させることを特徴とする請求の範囲第１４項ないし第２２項の何れか一項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項２４】
さらに、前記ＤＮＡチップのスポットの配列にしたがって、前記スポットを複数のグループに分類するステップと、
前記グループごとに、当該グループを構成するスポットに関するシグナル強度を示す値から、その中央値を特定するステップと、
前記シグナル強度を示す値の各々を、前記中央値で除算するステップとを、前記コンピュータに実行させることを特徴とする請求の範囲第１５項ないし第２２項の何れか一項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項２５】
前記分類するステップにおいて、前記ＤＮＡチップ中の、１または複数の列、或いは、１または複数の行ごとに、当該列或いは行に含まれるスポットに関する対数値を取得するステップを、前記コンピュータに実行させることを特徴とする請求の範囲第２４項または第２５項に記載のデータ処理プログラム。
【請求項２６】
複数のスポットのシグナル強度を示す値を比較するためにコンピュータを動作させるプログラムであって、
請求の範囲第１６項に記載のデータ処理プログラムを構成するステップを前記コンピュータに実行させ、かつ、
一方のスポットにかかる変換データの値を、他方のスポットにかかる変換データの値で除算するステップをコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
【請求項２７】
複数のスポットのシグナル強度を示す値を比較するためにコンピュータを動作させるプログラムであって、
請求の範囲第１７項に記載のデータ処理プログラムを構成するステップを前記コンピュータに実行させ、かつ、
一方の標準化された値と他の標準化された値との差分値を算出するステップをコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
【請求項２８】
さらに、前記差分値の、所定数のべき乗を算出するステップを、前記コンピュータに実行させることを特徴とする請求の範囲第２７項に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、多数の遺伝子をスポットとして固定させたＤＮＡチップから取得した遺伝子発現データを統計的に解析する手法に関する。
背景技術
ＤＮＡチップとは、スライドガラスなどの基材上に複数の遺伝子を異なるスポットとして固定させたものである。たとえば、マイクロアレイには、数千から数万の遺伝子がターゲットとして固定されている。ターゲットとして、一重鎖のＤＮＡやｍＲＮＡが利用される。
ＤＮＡチップの基材として、種々のコーティングを施したガラスなどからなる板、ナイロンやニトロセルロースからなる膜、中空糸、半導体材料、金属材料、有機物質など核酸を保持できる種々のものが利用できる。また、ターゲットとして、ｃＤＮＡの全部或いはその一部を複製したもの、ゲノムＤＮＡの一部を複製したもの、合成ＤＮＡおよび／または合成ＲＮＡが利用され得る。基材にターゲットを固定するために、フォトリソグラフ法によりガラス板上にオリゴＤＮＡを合成する手法と、スポッター等を利用して基材にターゲットを取り付ける手法とが知られている。
このようなＤＮＡチップに、たとえば、蛍光標識をつけたＤＮＡやＲＮＡ（解析対象）をハイブリタイズさせる。ターゲットと相補的な解析対象が二重鎖を形成する。解析対象には蛍光標識が付されているため、ハイブリダイゼーションの後に、蛍光スキャナにてＤＮＡチップを操作した画像データを取得することができる。このようにして取得された画像データに基づき、何れか一項に記載ののスポットに二重鎖が形成されているかを知ることが可能となる。より具体的には、得られた画像は、ハイブリダイゼーションの結果、各々のＤＮＡに由来するスポットが表示される。したがって、スポットの位置を含む所定の領域のシグナル強度を積算することにより、各スポットのシグナル強度を示す値からなるアレイデータを得ることができる。
たとえば、数千から数万のターゲットが固定されているマイクロアレイにより、多数の遺伝子発現を示すアレイデータを一度の実験操作で得ることができる。この結果、ある一つの遺伝子発現のデータの増減を測定する際に、その対象として多数の遺伝子発現を示すデータ（シグナル強度を示す値）の平均を算出し、これに基づいてデータを標準化するのが一般的である。より具体的には、実験ごとの発現データを比較する前にデータを標準化する。たとえば、Ｊｏｈｈａｎｅｓ　Ｓｃｈｕｃｈｈａｒｄｔらによる「Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）Ｖｏｌ．２８　Ｎｏ．１０）」には、その標準化の一例が開示されている。
取得されたデータの確率分布はノンパラメトリックである。しかしながら、たとえば、Ｔｏｄｄ　Ｒｉｃｈｍｏｎｄらによる「Ｃｈａｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｒｅａｍ：ｐｌａｎｔ　ＥＳＴ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）Ｖｏｌ．３　ｐｐ１０８−１１６）」に開示されているように、取得されたデータを標準化するために、Ｚ−標準やｔ−標準、或いは、各スポットのシグナル強度の積算値を全体の数値の算術平均で除するというような手法が用いられている。
これらはノンパラメトリックな手法ではないため、このような標準化がデータの精度を著しく損ねているという問題点があった。
また、蛍光スキャナにより取得された画像に基づくアレイデータは、必ず、バックグラウンド成分を含む。これは、画像データ全体に存在するバックグラウンドのシグナル強度、および、測定範囲と実際のスポットの大きさや形状が必ずしも一致しないことに起因する。したがって、取得した画像データの数値からバックグラウンド成分を差し引き、真のシグナル値からなるデータを取得することが正確な解析のために重要となる。他の手法、たとえば、電気信号の検出、放射線の検出により取得されたアレイデータでも同様である。
従来、バックグラウンド成分を、特定のスポットやスポットされない部分のシグナル強度をあらわす数値に基づき、画素あたりの平均値や中央値を求め、この値に測定領域の画素数を乗ずることにより推定していた。
或いは、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｅｉｓｅｎが、「ＳｃａｎＡｌｙｚｅ　Ｕｓｅｒ　Ｍａｎｕａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｒａｎａ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／ＥｉｓｅｎＳｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍ）」において提案しているように、スポットごとに、測定範囲の外側近傍の値からバックグラウンド成分を推定する手法も知られている。
しかしながら、上記従来の補正法においては、バックグラウンド値算出のために利用されるスポットや画像中の領域の相違により、上記バックグラウンドの推定値は変化する。つまり、上記相違から種々のバックグラウンド値が推定される可能性があり、何れが適切であるかを判断することができないという問題点があった。特に、ＤＮＡをスポットした領域と、そうでない領域との間で、バックグラウンド値の差が大きくなることがあった。
本発明は、ＤＮＡチップから取得された遺伝子発現のデータを、他のＤＮＡチップからのデータと比較可能にし、また、適切な統計的に解析することが可能となるような手法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者は、ＤＮＡチップから得られるデータ（遺伝子発現による発光量を示すデータ）の対数値が正規分布することを知見した。そこで、各値の対数値をとることで、したがって、各スポットのシグナル強度を示す値を対数変換し、これを標準化（たとえば、ｚ−標準化）することにより、異なる実験の結果や同種の実験結果を正確に比較することが可能となる。また、対数値や標準化された値を記憶し、或いは、比較演算に際して、これら値を利用するため、データ量を著しく小さくすることが可能となる。
より詳細は、本発明の目的は、ＤＮＡチップのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡチップ上に配置された各スポットのシグナル強度を示す値から構成されるアレイデータを処理して、解析可能なデータを取得するデータ処理方法であって、前記アレイデータを取得するステップと、当該アレイデータを構成する各スポットのシグナル強度を示す値を対数変換するステップと、対数変換された値を、前記ＤＮＡチップのスポットに対応するように配置した変換データを生成するステップとを備えたことを特徴とするデータ処理方法により達成される。
本発明によれば、対数変換された値の群は、正規分布をするため、ＤＮＡチップをもちいた実験結果の比較、実験結果の解析に適する。
好ましい実施態様においては、さらに、前記対数変換された値を走査して、その中央値を特定するステップと、各値から中央値を減じるステップとを備え、前記中央値が減じられた値からなる変換データが生成される。
このようにして得られた変換データを、比較対象となる、同様の処理を施されたデータと減算して、スポットごとの比較結果を比で表すことが可能となる。
他の好ましい実施態様においては、さらに、前記対数変換された値を、ｚ−標準化して、標準化された値を算出するステップを備え、標準化された値からなる変換データが生成される。
このようにして得られた変換データを、比較対象となる、同様の処理を施されたデータから減算して、スポットごとの比較結果を差分で表すことが可能となる。
また、本発明においては、上述したように、ＤＮＡチップから得られるデータが対数正規分布するという知見に基づき、本発明においては、より適切なバックグラウンド値を求めることができるようになった。特に、従来、値算出のために利用するスポットや画像中の領域の相違により、バックグラウンド値は変化し、どの値が適切なものであるかを判断できなかった。本発明者は、ＤＮＡチップのスポットのシグナル強度を示す値が対数正規分布するという知見に基づき、対数正規分布となるような補正値が、適切なものであるということを見出した。
本発明のより好ましい実施態様においては、さらに、シグナル強度を示す値の各々をバックグラウンド値で減じることで得られる減算値の累積度数比に基づく正規確率グラフが、所定の直線性を備えるようなバックグラウンド値を算出するステップを備え、当該シグナル強度を示す値の各々をバックグラウンド値で減じることにより得られた値を、対数変換の対象とする。なお、このバックグラウンド値は、正負何れかの値をとり得る。また、この値が０となる場合も考えられる。
上記実施態様において、前記バックグランド値を算出するステップは、シグナル強度を示す値の最小値を特定するステップと、前記最小値を含む所定の範囲を設定するステップと、前記所定の範囲内を、所定の数だけ分割し、上限値、下限値、および、分割により得られる所定数の中間値をバックグラウンド値候補として算出するステップと、各バックグラウンド値候補について、前記シグナル強度を示す値の各々からバックグラウンド候補値を減じて、減算値を算出して、当該減算値に基づく正規確率グラフを求めるステップと、前記正規確率グラフのうち、最も直線性に優れたものに利用されたバックグラウンド候補を特定するステップとを有し、特定されたバックグラウンド候補に関する直線性が十分になるまで、前記上限値および下限値の範囲を変更して、再度、バックグラウンド値候補の算出、正規確率グラフの算出、および、バックグラウンド候補の特定を繰り返すのが望ましい。上記所定の直線性を示すステップは、カイ二乗検定を実行することにより実現することができる。
また、別の好ましい実施態様においては、前記バックグラウンド値を算出するステップが、前記シグナル強度を示す値を参照して、２以上の所定のパーセンタイルにある値を特定するステップと、前記２以上の特定された値に基づいて、バックグラウンド値を推定するステップとを有している。ここで、利用するシグナル強度を示す値の範囲は、有効な測定範囲、つまり、シグナル−レスポンスの直線性が成り立つ範囲であるのが望ましい。
より好ましくは、バックグランド値を算出するステップは、前記シグナル強度を示す値から、第１四分位ＬＱ、第３四分位ＵＱおよび中央値Ｍを求めるステップと、
ｘ＝（ＵＱ＊ＬＱ−Ｍ２）／（ＵＱ＋ＬＱ−２Ｍ）
ただし、ＵＱ＋ＤＱ−２Ｍ＝０のとき、ｘ＝０
を求め、求められたｘをバックグラウンド値とするステップとを有している。
また、本発明の別の実施態様においては、ＤＮＡチップの画像の色合いの縦方向、横方向、或いは、放射状の偏りを補正することができる。
この実施態様は、前記ＤＮＡチップのスポットの配列にしたがって、前記スポットを複数のグループに分類するステップと、前記グループごとに、当該グループを構成するスポットに関する対数変換値から、その中央値を特定するステップと、前記対数変換値の各々から、前記中央値を減算するステップとを備えている。
或いは、前記ＤＮＡチップのスポットの配列にしたがって、前記スポットを複数のグループに分類するステップと、前記グループごとに、当該グループを構成するスポットに関するシグナル強度を示す値から、その中央値を特定するステップと、前記シグナル強度を示す値の各々を、前記中央値で除算するステップとを備えていても良い。
上記実施態様において、分類するステップは、前記ＤＮＡチップ中の、１または複数の列、或いは、１または複数の行ごとに、当該列或いは行に含まれるスポットに関する対数値を取得するステップを有していてもよい。
別の実施態様において、上記データ処理方法を利用して、複数のスポットのシグナル強度を示す値を比較する方法は、一方のスポットにかかる変換データの値を、他方のスポットにかかる変換データの値で除算するステップを備えている。
さらに別の実施態様において、上記データ処理方法を利用して、複数のスポットのシグナル強度を示す値を比較する方法は、一方の標準化された値と他の標準化された値との差分値を算出するステップを備えている。ここでは、さらに、前記差分値の、所定数のべき乗を算出するステップを備えているのがより望ましい。
また、本発明の目的は、ＤＮＡチップのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡチップ上に配置された各スポットのシグナル強度を示す値から構成されるアレイデータを処理して、解析可能なデータを取得するデータ処理方法を、コンピュータに実行させるためのデータ処理プログラムであって、前記アレイデータを取得するステップと、当該アレイデータを構成する各スポットのシグナル強度を示す値を対数変換するステップと、対数変換された値を、前記ＤＮＡチップのスポットに対応するように配置した変換データを生成するステップとを、前記コンピュータに実行させることを特徴とするデータ処理プログラムによっても達成される。
上記ＤＮＡチップの基材には、種々のコーティングを施したガラスなどから作られた板、ナイロンやニトロセルロースなどを基材とする膜、中空糸、半導体、金属、有機物質など、表面に核酸を保持できる任意のものを利用できる。また、ＤＮＡチップ上には、ターゲットとして、ｃＤＮＡの全部或いは一部の複製、ゲノムＤＮＡの複製、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡなどが配置される。
また、チップを作製するには、核酸を用意しておき、これを、吸着、静電気による結合、共有結合により基材上に配置する手法や、基材上で核酸を合成する手法がある。シグナル強度を示す信号の検出には、半導体チップを利用した電気的な手法、蛍光や放射能を検出する手法などが含まれる。
本発明は、上記何れの基材の上に何れのターゲットが形成されたＤＮＡチップからのアレイデータにも適用することができる。また、何れの手法を用いて取得したアレイデータに対しても適用することができる。
なお、本明細書において、ＤＮＡチップとは、基材上にＲＮＡを形成したＲＮＡチップ、マイクロアレイ、マクロアレイ、ドットブロット、リバースト・ノーザンなど、基材の上に核酸が配置された任意のものを含む。
発明を実施するための望ましい形態
以下、添付図面を参照して、本発明の実施の形態につき説明を加える。図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる解析装置のハードウェア構成図である。図１に示すように、解析装置１０は、ＣＰＵ１２と、マウスやキーボードなどの入力装置１４と、ＣＲＴなどから構成される表示装置１６と、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）１８と、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）２０と、ＣＤ−ＲＯＭやＤＶＤ−ＲＯＭなどの可搬記憶媒体２３をアクセスする可搬記憶媒体ドライバ２２と、ハードディスク装置２４と、外部とのデータ授受を制御するインタフェース（Ｉ／Ｆ）２６とを備えている。図１から理解できるように、本実施の形態にかかる解析装置１０として、パーソナルコンピュータなどを利用することができる。
Ｉ／Ｆ２６は、ハイブリタイズされたＤＮＡチップのスポットの発光量を計測して、計測された発光量に基づくデータを生成するリーダまたはスキャナ（図示せず）や通信回路に接続されている。通信回路は、さらに、外部ネットワーク（たとえば、インターネット）に接続されている。
本実施の形態において、可搬記憶媒体２３には、リーダまたはスキャナからのデータを受け入れて、当該データに対して後述する必要なデータ変換処理を実行するプログラム、および、処理が施されたデータを解析するためのプログラムが記憶されている。したがって、可搬記憶媒体ドライバ２２が、可搬記憶媒体２３から、上記プログラムを読み出して、これをハードディスク装置２４に記憶して、これを起動することにより、パーソナルコンピュータが、解析装置１０として作動することが可能となる。或いは、インターネットなどの外部ネットワークを介して、上記プログラムをダウンロードしても良い。
図２は、本実施の形態にかかる解析装置１０の要部を示すブロックダイヤグラムである。図２においては、データに対して必要なデータ変換処理を示す構成部分が示されている。より詳細には、解析装置１０は、データバッファ３０と、データバッファ３０に一時的に記憶されたデータ（基データ）に基づき、そのバックグラウンドを算出するバックグラウンド算出部３２と、バックグラウンド算出部３２にて得られたバックグラウンド値を用いて、データを補正する補正演算部３４と、補正されたデータに対して後述する変換を施すデータ変換部３６と、データ変換が施されたデータを標準化する標準化処理部３８とを有している。
データバッファ３０は、ＲＡＭ１８、場合によってはハードディスク装置２４によりその機能が実現される。データバッファにはリーダまたはスキャナから伝達された、各スポットの発光量を示すデータ、或いは、リーダまたはスキャナから伝達されハードディスク装置２４の所定の領域に予め記憶されていた、各スポットの発光量を示すデータが一時的に記憶される。また、データバッファは、標準化処理部３８によって標準化されたデータを一時的に記憶することもできる。
リーダまたはスキャナからは、ＤＮＡチップをＣＣＤカメラなどで撮影し、スポットごとのシグナル強度を積算したものが、アレイデータとして出力される。或いは、リーダまたはスキャナにおいて、ＣＣＤカメラにて撮影した画像の画像データに基づき、前処理としてバックグラウンド値が算出され、各画素のシグナル強度からバックグラウンド値が差し引かれ、前処理としてのバックグラウンド補正がなされた画像データから、スポットごとのシグナル強度が積算されて、アレイデータとして出力される場合もある。本実施の形態においては、未処理のアレイデータ、前処理（バックグラウンド補正）が施されたデータの何れをも利用することができる。なお、本明細書において、リーダまたはスキャナから伝達される、上記スポットごとのシグナルを累算したデータを、アレイデータ、或いは、本実施の形態にかかるバックグラウンド処理を施すための基礎となるデータという意味で基データと称する。
上記解析装置１０のバックグラウンド算出部３２にて実行される処理につき、図３および図４を参照して説明を加える。
バックグラウンド算出部３２は、まず、データバッファに記憶されたアレイデータに含まれる、スポットごとのシグナル強度の積算値（スポット積算値）を走査して、その最小値を取得する（ステップ３０１）。次いで、バックグラウンド算出部３２は、取得した最小値がゼロ（０）であるか否かを判断し（ステップ３０２）、ゼロである場合には（ステップ３０２でイエス（Ｙｅｓ））、候補値「Ａ」を「−１００」、候補値「Ｂ」を「１００」に設定する（ステップ３０３）。スポット積算値が「０」であることは、発光量がないこと（像としては、黒く表示されていること）を意味している。実際には、スポットのシグナル強度の積算値が「０」であることは、測定の不備、或いは、既に他の手法にてバックグラウンド値が差し引かれていることを意味する。このような場合には、所定の負の値を候補値「Ａ」とし、所定の正の値を候補値「Ｂ」として、適切なバックグラウンド値を見出すための出発点としている。
これに対して、ステップ３０２でノー（Ｎｏ）と判断された場合には、バックグラウンド算出部３２は、候補値「Ａ」を、最小値の半分（１／２・（最小値））、候補値「Ｂ」を、最小値の２倍（２・（最小値））に設定する（ステップ３０４）。なお、候補値「Ａ」とは、バックグラウンド値を特定するために処理で利用する上限値を意味し、候補値「Ｂ」とは、下限値を意味する。
次いで、バックグラウンド算出部３２は、候補値「Ａ」と候補値「Ｂ」の間を９等分して、さらに８つの候補値を取得する（ステップ３０５）。たとえば、最小値が「２０」であり、候補値「Ａ」が「１０」、候補値「Ｂ」が「４０」であれば、以下の値が候補値となる。
候補値「Ｃ１」＝１３．３３
候補値「Ｃ２」＝１６．６７
候補値「Ｃ３」＝２０．００
候補値「Ｃ４」＝２３．３３
候補値「Ｃ５」＝２６．６７
候補値「Ｃ６」＝３０．００
候補値「Ｃ７」＝３３．３３
候補値「Ｃ８」＝３６．６７
このようにして、総計１０個の候補値が得られる。
さらに、基データ（つまりアレイデータ）において、スポット積算値から、各候補値を減じる。これにより、候補値に関連付けられた、１０組のスポット積算値群を得ることができる。このスポット積算値群を、それぞれ、補正データ候補と称する。
次いで、バックグラウンド算出部３２は、各補正データ候補を構成するスポット積算値の対数値を得て、その累積度数比を取得する（ステップ３０７）。この累積度数比をプロットして、１０個の正規確率グラフが作成される（ステップ３０８）。バックグラウンド算出部３２は、正規確率グラフそれぞれについて、最小二乗法などを用いて、グラフの直線性を検定する（ステップ３０９）。１０個の正規確率グラフのうち、もっとも直線性が良好であったものについて、利用された候補値が特定される（ステップ４０１）。これが候補値「Ａ」であれば（ステップ４０２でイエス（Ｙｅｓ））、バックグラウンド算出部３２は、候補値「Ａ」の１／３（１／３・（候補値「Ａ」）を新たな候補値「Ａ」に設定し、かつ、候補値「Ｂ」の１／３（１／３・（候補値「Ｂ」）を新たな候補値「Ｂ」に設定する（ステップ４０３）。ここでは、候補値を見つけ出すための範囲を下側に（小さく）シフトしている。
その一方、当該候補値が、候補値「Ｂ」であった場合には（ステップ４０４でイエス（Ｙｅｓ））、バックグラウンド算出部３２は、候補値「Ａ」を３倍したもの（３・（候補値「Ａ」）を新たな候補値「Ａ」に設定し、かつ、候補値「Ｂ」を３倍したもの（３・（候補値「Ｂ」）を新たな候補値「Ｂ」に設定する（ステップ４０５）。これは、候補値を見つけ出すための範囲を、上側にシフトしたことを意味している。
さらに、候補値が、上記候補値「Ａ」或いは候補値「Ｂ」でない場合であって（ステップ４０４でノー（Ｎｏ）、かつ、ステップ４０５でノー（Ｎｏ））には、さらに、得られた正規確率グラフが、満足のいく直線性を具備しているか否かが判断される（ステップ４０６）。本実施の形態において、「満足のいく直線性」を判断するために、たとえば、有意水準を５％としたχ２検定を行っている。しかしながら、これに限定されるものではなく、他の手法を利用しても良いし、オペレータが自己の判断にて直線性が満足のいうものであることを判断しても良い。
ステップ４０６にてノー（Ｎｏ）と判断された場合には、候補値「Ａ」が、ステップ４０１にて特定された候補値より小さな候補値のうち、特定された候補値に隣接するものに設定される（ステップ４０７）。また、候補値「Ｂ」は、ステップ４０１にて特定された候補値より大きな候補値のうち、特定された候補値に隣接するものに設定される（ステップ４０８）。
たとえば、上に列挙した候補値「Ｃ１」〜候補値「Ｃ８」において、ステップ４０１にて候補値「Ｃ３」が特定されたが、当該候補値を、スポット積算値群から現在した値を利用した正規確率グラフについて、満足のいく直線性が得られなかったと考える。この場合には、候補値「Ｃ２」が新たな候補値「Ａ」となり、候補値「Ｃ５」が新たな候補値「Ｂ」となる。すなわち、ステップ４０７、４０８では、より適切な候補値を探し出すために、候補値を見つけ出すための範囲を狭めている。
ステップ４０３、ステップ４０５、或いは、ステップ４０７および４０８において、新たな候補値「Ａ」および候補値「Ｂ」が得られると、ステップ３０５以下の処理が繰り返される。これに対して、正規確率グラフが満足のいく直線性を備えている場合には（ステップ４０６でイエス（Ｙｅｓ））、この正規確率グラフを得るために利用された候補値が、バックグラウンド値に決定される（ステップ４０９）。
次いで、補正演算部３４が、アレイデータを構成する各シグナル累算値から、ステップ４０９にて取得されたバックグラウンド値を減じたものを算出する。ただし、本実施の形態においては、最終的にバックグラウンド値が得られる直前に実行されたステップ３０６において、１０組の補正データ候補のうちの一組が、各シグナル累算値からバックグラウンド値を減じたものである。したがって、このような補正データ候補が、データバッファ３０に記憶されていれば、補正演算部３４は、新たな演算をすることなく、データバッファ３０から、適切な補正データ候補を読み出せばよい。
バックグラウンド値が減じられたシグナル累算値（補正シグナル累算値）から構成された補正データは、変換処理部３６に伝達される。変換処理部３６は、各補正シグナル累算値を対数変換して、変換されたシグナル累算値を得る。図５（ａ）は、変換処理部３６にて実行される処理の概略を示す図である。図５Ａに示すように、バックグラウンド値が減算された補正シグナル累算値からなる表形式データ領域３０−１から、順次、補正シグナル累算値「ａｉｊ」が取り出され、対数変換されて（符号５００参照）、変換後の表形式データ領域３０−２の対応する位置に、対数変換が施された値（対数変換値）「ｌｎａｉｊ」が配置される。
なお、図３のステップ３０６およびステップ３０７において、補正データ候補および補正データ候補を構成する補正シグナル累算値の対数変換値が算出されている。したがって、選択されたバックグラウンド値に関連する対数変換値が、データバッファ３０に記憶されていれば、変換処理部３６は、補正シグナル累算値に対数変換を施す必要は無く、データバッファ中のデータを読み出せば足りる。
このようにして対数変換値群が得られると、変換処理部３６および標準化処理部３８により図５Ｂに示す処理が実行される。
ここでは、変換処理部３６は、階級の数やクラスの幅を設定して（ステップ５０１）、度数分布表を生成する（ステップ５０２）。本実施の形態においては、この度数分布表に基づくグラフが生成され、これが表示装置１６の画面上に表示される（ステップ５０３）。このステップ５０３および後述するステップ５０５は、本実施の形態にかかる手法の正しさを検証するために設けている。
図６は、このようにして得られた画像の例である。図６において横軸は、補正シグナル累算値を対数変換したもの（対数変換値）、縦軸は、その度数を示している。図６に示す例においては、イネのｃＤＮＡライブラリーから重複を避けてランダムに選択し、ピンあたり３２×１０のマトリクスにスポットしたマイクロアレイ（ｃＤＮＡチップ）を利用している。このマイクロアレイにおいて、有効なスポットの総数は１１５７であった。ハイブリダイゼーションのターゲット作製には、イネ鞘葉由来のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを鋳型に用いて、ｃｙ５で標識したｃＤＮＡを合成した。また、ハイブリダイゼーションの結果は、ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ　Ｖ４．４（Ｍｏｌｏｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）を用いて、画像として取得し、これを、Ａｒｒａｙ　Ｖｉｓｉｏｎ（Ｍｏｌｏｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）プログラムを用いて数値化した。
また、図６においては、算術平均を含む階級を黒塗りのグラフにて示している。
図７は、比較のために、同じアレイデータに基づくヒストグラムを示したものである。図６および図７から、アレイデータ自体はノンパラメトリックであるのに対して、アレイデータから得た対数変換値がパラメトリックであることが理解できるであろう。
本実施の形態においては、さらに、データの比較を可能にするために、標準化処理部３８が、取得した度数分布に基づき、データをｚ−標準化（規準化）する（ステップ５０４）。これにより、グラフの横軸および縦軸を、アレイデータの種別などに係わらず共通にすることができ、データ間の比較が可能となる。
図８は、図６のヒストグラムを得るために利用したマイクロアレイ（ｃＤＮＡチップ）を利用し、異なる温度環境における実験から取得したアレイデータの組に対して、本実施の形態にかかる処理を施して、実験ごとに得られた規準化された後の値を、一枚のグラフ上にプロットしたものである。
図８において、同一の形状の点（たとえば、×印、△印）は、同じ実験にて取得されたものを示している。図８に示すように、グラフ上の点は、細線にて示す標準分布曲線と略重なっており、パラメトリックな手法を用いることの妥当性が示されている。図９の太い折れ線は、比較のために、図７に示す度数分布に基づき、規準化を実行した結果を示すグラフである。図９の細線は、標準分布曲線を示す。図９から、このような形状のヒストグラムでは、パラメトリックな手法が適さないことが理解できるであろう。
このようにして標準化処理部３８により、ｚ−標準化が施されたデータ（標準化データ）は、データバッファ３０に記憶される。この標準化データを用いて、種々の解析、実験の検証などをなすことが可能となる。
このように、本実施の形態によれば、ＤＮＡチップなどの各スポットのシグナル強度を示す積算値の対数値が正規分布するということを知見し、この知見に基づき、バックグラウンド値を算出している。また、上記知見から、積算値（或いはバックグラウンド補正がなされた積算値）を対数変換して、かつ、ｚ−標準化を施すことにより、標準化データを取得している。したがって、この標準化データを利用して、異種或いは同種の実験結果を容易に比較し、実験の検証をなすことが可能となる。
また、本実施の形態にかかるバックグラウンド補正によれば、画像データにおけるスポットの切り出し作業を著しく低減することが可能となる。従来、ＣＣＤカメラで撮影された画像中のスポットの領域は、リーダまたはスキャナに組み込まれたソフトウェアなどにより、ある程度特定される。しかしながら、実際には、スポットと、シグナル強度の値を積算するために切り出される領域とが適切に重なり合っていないことが多い。したがって、研究者は、画像を参照して、スポットごとに、スポットと重なり合うような円形の領域を設定する必要があった。これは、数時間ないし一日を要する作業であった。本実施の形態にかかるバックグラウンド補正を利用すれば、アレイを、各セルの面積が等しくなり、かつ、各セルにスポットが含まれるように、マトリクス状に区切って、当該セルにおけるシグナル強度の積算値を取得すればよい。或いは、それぞれの面積が等しく、かつ、スポットを包含するような（つまりスポットより大きな）円形領域にて、スポットおよびその周辺の各々のシグナル強度を示す値を積算すれば良い。
これは、面積が同じであればバックグラウンド値は、各セルないし各円形領域にて一定であると考えられること、および、補正されたシグナル積算値の対数値が正規分布となるようなバックグラウンド値を算出していることから実現される。
なお、本実施の形態にかかるバックグラウンド値を利用した補正結果を以下に示す説明する。本出願人は、スタンフォード大学において公開されている、複数の生物種に基づく複数の発現データ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ４．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ／ＳＭＤにて公開され、また、この公開データの概要は、Ｇａｖｉｎ　Ｓｈｅｒｌｏｃｋ他の「Ｔｈｅ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２９，ｐｐ１５２−１５５（２００１年））」にも掲載されている。）から、４つを無作為に抽出した。ここでは、実験Ｎｏ．５７３３、実験Ｎｏ．１３００、実験Ｎｏ．５７４５、および、実験Ｎｏ．７４２８を利用している。実験Ｎｏ．７４２８についてはチャンネル２を利用し、他の実験についてはチャンネル１のデータを利用した。
実験ごとに、その値の対数値をｚ−標準化してから層別化して、得られた値を正規確率紙にプロットしている。図１０Ａ〜図１０Ｄは、それぞれ、実験Ｎｏ．５７３３、実験Ｎｏ．１３００、実験Ｎｏ．５７４５、および、実験Ｎｏ．７４２８（チャンネル２）について、本実施の形態にかかる補正法（図３および図４参照）にしたがって補正された値から得られたグラフである。これら図から、グラフが十分な直線性を備えている。このことは、標準化した結果が正規分布していることを示している。
図１１Ａ〜図１１Ｄは、従来の補正法（前述したＭｉｃｈａｅｌ　Ｅｉｓｅｎによる手法）に基づき補正されたものから、同様に、実験ごとに、その値の対数値をｚ−標準化してから層別化して、得られた値を正規確率紙にプロットして得られたグラフである。これら図から、実験Ｎｏ．７４３８のチャンネル２を除くと、グラフの直線性が低く、十分に補正されていないことを示している。
次に、本発明の第２の実施の形態につき説明を加える。第２の実施の形態においては、マイクロアレイの基材の平坦性の問題などからハイブリダイゼーションが不均一になることに起因するデータの偏りを補正することができる。
ハイブリダイゼーションの後のマイクロチップから得た画像において、たとえば、中央部がより白っぽく、周辺になるのにしたがって黒っぽくなっていくものがある。或いは、左右或いは上下方向で、全体の色合いがグラデーション状になっているものもある。これは、たとえば、アレイ基部に利用しているガラスの歪などにより生ずる。
そこで、第２の実施の形態においては、ハイブリダイゼーションが理想的に行われたならば、アレイ中、各列或いは各行のシグナル積算値の中央値が概略同じになるという仮定を設けて、各列或いは各行に共通するデータの補正定数を求め、これを利用して、シグナル値にさらに補正を施している。
図１２Ａは、第２の実施の形態にかかる解析装置の要部を示すブロックダイヤグラムである。図１２Ａにおいて、図２に示す構成部分と同じものには同一の符号を付している。図１２Ａに示すように、第２の実施の形態にかかる解析装置は、補正演算部３４と変換処理部３６との間に、偏り補正演算部４０が設けられている。
図１３は、第２の実施の形態にかかる偏り補正演算部４０にて実行される処理を示すフローチャートである。偏り補正演算部４０は、変換処理部３６により得られた、バックグラウンドが減じられたシグナル積算値の対数値群を取得する。
次いで、偏り補正演算部４０は、マイクロアレイの行および列を示す情報に基づき、当該対数値群を、列ごとのグループに分類する（ステップ１３０２）。各グループに対して、所定の補正定数を求めることにより、偏り補正が実現される。
偏り補正演算部４０は、第１列（列番号＝１（符号１３０３参照））に属する対数値に基づいて、その中央値を特定し（ステップ１３０４）、各対数値から中央値を減じて、偏り補正値を算出する（ステップ１３０５）。つまり、その中央値が、列における偏り補正のための補正定数となる。ステップ１３０４およびステップ１３０５に示す処理は、ｎ個の列の全てに対して実行される（ステップ１３０６、１３０７参照）。
このようにして、得られた偏り補正値群に対して、標準化処理部３８において標準化が施される。本実施の形態にかかる偏り補正を施したデータ、および、偏り補正を施していないデータを比較した散布図を、それぞれ、図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。ここでは、マイクロアレイとして、イネｃＤＮＡをスポットして、各々が３２列１２行のグリッドを１２個備えたマトリクスを、２セット貼り付けたものを利用した。このマイクロアレイに、イネ培養細胞に由来する、ｃｙ５で標識したｃＤＮＡを、ハイブリダイズした。
図１５Ｂは、第１の実施の形態にかかる手法にて、セットごとにバックグラウンド値を算出して、これを利用して値を補正し、さらに、対数変換および標準化を施したデータに基づく散布図である。図１５Ａは、第２の形態にかかる手法にて、偏り補正を行ったデータに基づく散布図である。これらの図において、２本の細い直線は、それぞれ、ｘ軸の値と比較してｙ軸の値が２１／２倍（ルート２倍）、および、（１／２）１／２倍（ルート（１／２）倍）であることを示している。
二つのセットは、同一のアレイチップ上に設けられた一対のスポットの結果に由来する、同一のハイブリダイゼーションであるため、原理的には、Ｘ＝Ｙの直線状に、各点が位置する。図１５Ａおよび図１５Ｂを参照すると、偏り補正により、データの散らばりが小さくなっていることが理解できる。
このように、本実施の形態によれば、ハイブリダイゼーションの不均一などに起因する値の変更を適切に補正することが可能となる。
次に、第３の実施の形態につき説明を加える。第３の実施の形態においては、第２の実施の形態にかかる偏り補正を変形したものである。図１２Ｂは、第３の実施の形態にかかる解析装置の要部を示すブロックダイヤグラムである。図１２Ｂにおいても、第２図に示す構成部分と同じものには同一の符号を付している。第３の実施の形態においては、データバッファ３０とバックグラウンド算出部３２との間に、偏り補正演算部４２が介在し、バックグラウンド値の算出に先立って、アレイデータを構成するシグナル積算値に対して、偏り補正が施される。
図１４は、第３の実施の形態にかかる偏り補正の処理を示すフローチャートである。図１４に示すように、偏り補正演算部４２は、データバッファからシグナル積算値の群を取得すると（ステップ１４０１）、これらを、マイクロアレイの秒および列を示す情報に基づき、列ごとのグループに分類する（ステップ１４０２）。次いで、偏り補正演算部４２は、第１列（列番号＝１（符号１４０３参照）に属する積算値に基づいて、その中央値を特定し（ステップ１４０４）、各積算値を中央値で除算して、偏り補正値を算出する（ステップ１４０５）。つまり、ここでも中央値が、列における偏り補正のための補正定数となる。
ステップ１４０４およびステップ１４０５に示す処理は、ｎ個の列の全てに対して実行される（ステップ１４０６、１４０７参照）。このようにして、得られた偏り補正値群に対して、バックグラウンド算出部３２におけるバックグラウンド値の算出が実行される。
次に、本発明にかかるデータの比較につき説明を加える。第１ないし第３の実施の形態においては、補正されたシグナル積算値を対数変換して対数値を取得し、さらに当該対数値を標準化した値（標準値）を算出している。
これら標準値を用いることにより、以下のような比較が可能となる。
本実施の形態によれば、上記標準値を利用して、ＲＮＡの量の比、つまり、遺伝子発現の比率を見出すことが可能となる。たとえば、あるスポットの標準値と、他のスポットの標準値との差をとり、これに標準偏差を乗じて、その値の１０のべき乗をとることにより、上述した比率を求めることができる。スポットに関する標準値（ｚスコア）が「１」のものと「２」のものとの間の、遺伝子発現の比率の相違を、たとえば、常用対数を用いれば、以下の式にて表すように定量化することができる。
１０＾｛（２−１）＊０・５｝≒３．１
（ここに、０．５は対数値の標準偏差）
つまり、（対数の底）＾｛（標準値の差）＊（対数値の標準偏差）｝という形で、比率の相違を表すことが可能となる。
このような比較は、同一のＤＮＡチップ上の異なるスポット間、異なるＤＮＡチップ上の同一の遺伝子のスポット間など、任意のスポット間でなすことが可能である。スポット間の比較を定量化できることにより、どの遺伝子がどれくらい多く発現しているか、実験間でどの遺伝子がどの程度増加しているかなどを適切に把握することが可能となる。
本発明は、以上の実施の形態に限定されることなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内で、種々の変更が可能であり、それらも本発明の範囲内に包含されるものであることは言うまでもない。
たとえば、本実施の形態によれば、スポットのシグナル強度の最小値を含む所定の範囲を設定し、トライアンドインプルーブメントにより、バックグラウンド値を算出している（図３参照）が、これに限定されるものではない。上記シグナル強度を示す値の第１四分位（Ｌｏｗｅｒ　Ｑｕａｒｔｉｌｅ：ＬＱ）と、第３四分位（Ｕｐｐｅｒ　Ｑｕａｒｔｉｌｅ：ＵＱ）と、中央値（Ｍｅｄｉａｎ：Ｍ）とを利用して、ロバストな推定を行っても良い。理想的に補正されたあとでは、中央値をはさんで各四分位は対称の位置となるため、バックグラウンド値ｘは、以下の式で与えられる。
ｌｎ（ＵＱ−ｘ）−ｌｎ（Ｍ−ｘ）＝ｌｎ（Ｍ−ｘ）−ｌｎ（ＬＱ−ｘ）
これを解くと、
ｘ＝（ＵＱ＊ＬＱ−Ｍ２）／（ＵＱ＋ＬＱ−２Ｍ）
ただし、ＵＱ＋ＤＱ−２Ｍ＝０のとき、ｘ＝０
となる。このｘを、各スポットのシグナル強度を示す値（シグナル積算値）から減じることで、補正されたシグナル積算値を取得しても良い。
或いは、同様の方法で、他のパーセンタイル、たとえば、第３四分位（ＵＱ）と中央値（Ｍ）を用いてバックグラウンド値を推定しても良い。さらに、より多くのパーセンタイルを使って、バックグラウンド値ｘを求め、それらの平均値を取得することで、上記推定値の精度を高めることができる。正規分布において、パーセンタイルとｚ（ゼータ）スコアとは、１対１に対応するから、ｚスコアの差が等しくなるべき任意の２つのパーセンタイルの組み合わせを利用して、上述した式と同様の方程式をたてて、これを解くことにより、バックグラウンド値ｘを求めることができる。
さらに、本実施の形態においてバックグラウンド値を算出するために利用するシグナル積算値の範囲は、ハイブリダイゼーション実験、および、リーダーやスキャナの特性を含めた一連の測定の系においてシグナル−レスポンスに直線性が成り立つ範囲としても良い。
また、図３に示す処理において、シグナル積算値の最小値を含む所定の範囲を設定しているが、これに限定されるものではない。たとえば、
バックグラウンド値／（シグナル積算値の中央値）＝ｃ（一定）
であることを考え、
バックグラウンド値＝ｃ＊（中央値）
のｃを求めるために、同様の処理を実行しても良い。
また、第２の実施の形態および第３の実施の形態においては、スポットを、マイクロアレイ中の１または複数の列からなるグループに分類しているが、これに限定されるものではなく、１または複数の行からなるグループに分類しても良いことは言うまでもない。また、先に説明したように、画像の色合いが、アレイの外延部から中央部に向かって、グラデーション状になっている場合もある。このような場合には、入れ子状になる複数の中空の矩形で、マイクロアレイを分割して、各矩形に含まれるスポットのシグナル積算値を同一のグループに属するようにして、グループごとの偏り補正値を算出しても良い。
また、前記実施の形態においては、標準化としてｚ−標準化を利用しているが、これに限定されるものではなく、他の標準化を適用できることも言うまでもない。
産業上の利用分野
本発明は、同種のＤＮＡチップについて条件を変更した実験結果の比較、異種のＤＮＡチップの実験結果の比較など種々の比較に利用することができる。たとえば、本出願人は、イネを低温で発芽させたときに働く遺伝子を、１万ほどの遺伝子群のなかからスクリーニングしていた。そこで、独立した遺伝子の断片を１万種類はりつけたマイクロアレイをつかって、たとえば
ａ）あたたかいところで発芽したイネ
ｂ）それを低温にさらしたもの
という二種類の組織からＲＮＡをとり、それぞれハイブリダイゼーションを行った。実験はＲＮＡごとに二回おこなった。それぞれの実験結果として、１万個の数字の羅列（相対値）が得られる。これら数字の羅列を比較する適切な方法がないのが現状であった。本実施の形態によれば、上記ａ）、ｂ）のそれぞれの条件による実験結果に基づき、標準化したデータを得て、対応するスポットの値を減算することにより、低温にさらしたときに蓄積量が増加或いは減少するｍＲＮＡを見つけ出し、目的の遺伝子をスクリーニングすることができた。
さらに、標準化したデータであれば、ＤＮＡチップの違い、生物種の違いなどを超えた比較が可能である。たとえば、上記実験ａ）において、「熱ショックタンパク質」という一群のタンパクの遺伝子が、２〜３ｓｔａｎｄａｒｄ　ｕｎｉｔほどの量で検出された。ところが、これらのタンパク質は、標準的な育て方をしたシロイヌナズナという植物の組織からは常に０（ゼロ）ｓｔａｎｄａｒｄ　ｕｎｉｔほどの値として検出される。この差は、偶然や種間差では説明しがたい大きさであった。この結果は、ａ）の実験系が「暑すぎた」ことを示していた。したがって、最初の実験の系をもう少し冷やすことで、スクリーニングをより正確に行うことを見出すことができた。
このように、本発明によれば、使用するするアレイは同一でない場合でも適用可能である。また、比較する前のデータの形式や桁そろいによる制限がない。さらに、たとえば、ヒトとマウスの比較など、種を超えた比較が可能となる。
種を超えた比較が可能であることは、本発明が製薬の分野にて応用可能であることを示す。たとえば、マウスで著しく薬効のある物質が、ヒトには効かなかったと考える。ここでは、健常なマウスに物資を投与したときにある臓器のアレイパターンと、健常なヒトの同じ臓器における類似する物質によるアレイパターンとを比較することで、アナロガスな物質群の一次スクリーニングが可能になる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる解析装置のハードウェア構成図である。
図２は、本実施の形態にかかる解析装置の要部を示すブロックダイヤグラムである。
図３は、本実施の形態にかかる解析装置のバックグラウンド算出部にて実行される処理を示すフローチャートである。
図４は、本実施の形態にかかる解析装置のバックグラウンド算出部にて実行される処理を示すフローチャートである。
図５Ａは、対数変換を説明するダイヤグラム、図５Ｂは、変換処理部および標準化処理部にて実行される処理を示すフローチャートである。
図６は、本実施の形態にかかる手法にて取得したデータのヒストグラムである。
図７は、比較のために従来の手法にて取得したデータのヒストグラムである。
図８は、異なる温度環境における実験から取得したアレイデータの組に対して、本実施の形態にかかる処理を施して、実験ごとに得られた規準化された後の値を、グラフ上にプロットした図である。
図９は、比較のために、図７に示す度数分布に基づき、規準化を実行した結果を示すグラフである。
図１０Ａないし図１０Ｄは、それぞれ、本実施の形態にかかる補正法にしたがって補正された値に基づき作成したグラフである。
図１１Ａないし図１１Ｄは、それぞれ、従来の補正法にしたがって補正された値に基づき作成したグラフである。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、それぞれ、第２および第３の実施の形態にかかる解析装置の要部を示すブロックダイヤグラムである。
図１３は、第２の実施の形態にかかる偏り補正演算部にて実行される処理を示すフローチャートである。
図１４は、第３の実施の形態にかかる偏り補正演算部にて実行される処理を示すフローチャートである。
図１５Ａおよび図１５Ｂは、それぞれ、本実施の形態にかかる偏り補正を施したデータ、および、偏り補正を施していないデータを比較した散布図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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