(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）エチレンジアミン四酢酸およびその金属塩の中から選ばれた少なくとも１種の物質並びに（ｂ）アルファ型チオニンおよびベータ型チオニンの中から選ばれた少なくとも１種の物質を有効成分として含有することを特徴とする食中毒原因細菌及び／又はう蝕性細菌用殺菌性組成物。
【請求項２】
（ａ）エチレンジアミン四酢酸およびその金属塩の中から選ばれた少なくとも１種の物質の含有量が０．１ｍＭ以上１．５ｍＭ未満であり、（ｂ）アルファ型チオニンおよびベータ型チオニンの中から選ばれた少なくとも１種の物質の含有量が１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下である請求項１記載の食中毒原因細菌用殺菌性組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチドとキレート剤を含む殺菌性組成物に関し、詳しくはエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤と麦類由来の抗菌性ペプチドを有効成分として含有する殺菌性組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本における食中毒で発生件数が最も多い原因菌は、サルモネラ菌と腸炎ビブリオ菌であり、さらに近年では、病原性大腸菌Ｏ−１５７による食中毒も増加傾向にある。また、セレウス菌による米飯製品の食中毒も、件数は少ないが毎年発生している。
様々な食品中に混入しているこれらの食中毒原因菌を殺菌することは、食中毒の防止の有効である。一方、う蝕（虫歯）や歯周病も細菌によって引き起こされるため、これら細菌を殺菌することも重要な課題である。
しかしながら、化学合成された食品保存料や殺菌剤は、消費者から敬遠される傾向にある。そのため、より低い濃度で効率よく作用させる工夫や、植物由来の天然物を用いてこれらの細菌等を制御することが多数試みられている。
【０００３】
植物由来の抗菌物質としては、カラシやワサビの成分であるアリルイソチオシアネートやペクチン分解物等があるが、これらは独特の香り有していたり、十分な殺菌効果を奏するためには高濃度の添加を必要とすることが多い（食品微生物制御の化学、幸書房、２０４−２５４頁、１９９８年）。
また、う蝕性細菌が資化できない甘味料として、キシリトール等の糖アルコールがあるが、このものは多量に摂取すると、下痢を引き起こすことが知られている（食品と開発、２９巻４号、４−７頁、１９９４年）。
さらに、歯周病細菌の増殖阻害やコラゲナーゼ阻害に有効な物質として、植物由来のものではリグニン（特開２０００−２４７９００号公報）やポリフェノール（特開平１１−３０２１４２号公報）等があるが、これらも十分な効果を得るには、比較的高濃度で用いることが必要である。
【０００４】
そこで、安全な物質であり、無臭かつ低濃度で作用する食品用並びに口腔用殺菌剤が求められている。
麦類由来のペプチドであるアルファ型およびベータ型チオニンは、糸状菌や酵母の増殖を阻害する作用があることは知られているが、細菌に対する増殖阻害効果に関しては報告例は少なく、僅かに大腸菌の増殖に対する５０％阻害濃度が２５０μｇ／ｍＬと極めて弱いことが報告されている（The Journal of Biological Chemistry 、267 巻、2228-2233 頁、1992年) にすぎない。
さらに、その他の食中毒原因細菌やう蝕性細菌、歯周病菌に対するチオニンの抗菌性に関する報告は、これまでに全くない。
【０００５】
一方、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、各種金属イオンに対するキレート作用を有しており、高濃度（１０ｍＭ、二ナトリウム塩で換算すると、３３６２ｐｐｍ）では、大腸菌や腸炎ビブリオ菌に対して抗菌性を示すことが報告されている（日本細菌学雑誌、４７巻、６２５−６２９頁、１９９２年）が、う蝕性細菌や歯周病細菌に対する抗菌効果は知られていない。
また、ＥＤＴＡおよびその金属塩は、食品の色安定効果があるため、アメリカ合衆国等では食品添加物として使用されている。しかし、その許容濃度は二ナトリウム塩で３６−５００ｐｐｍである（Code of Federal Rrgulations, Title 21: Food and drugs, US Government Printing Office, 1998年) 。したがって、ＥＤＴＡおよびその金属塩を単独で食品保存料として用いても、安全な濃度範囲では抗菌効果を期待することはできない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、食中毒原因細菌、う蝕性細菌を殺菌する作用を低濃度で有し、かつ安全性の高い組成物を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、（ａ）エチレンジアミン四酢酸およびその金属塩の中から選ばれた少なくとも１種の物質並びに（ｂ）アルファ型チオニンおよびベータ型チオニンの中から選ばれた少なくとも１種の物質を有効成分として含有することを特徴とする食中毒原因細菌及び／又はう蝕性細菌用殺菌性組成物である。
請求項２記載の本発明は、（ａ）エチレンジアミン四酢酸およびその金属塩の中から選ばれた少なくとも１種の物質の含有量が０．１ｍＭ以上１．５ｍＭ未満であり、（ｂ）アルファ型チオニンおよびベータ型チオニンの中から選ばれた少なくとも１種の物質の含有量が１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下である請求項１記載の食中毒原因細菌用殺菌性組成物である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の殺菌性組成物は、ＥＤＴＡおよびその金属塩の中から選ばれた少なくとも１種の物質とアルファ型チオニンおよびベータ型チオニンの中から選ばれた少なくとも１種の物質を有効成分として含有する。
ＥＤＴＡは、種々の金属イオンと結合するが、目的とする抗菌作用を有している限り、いずれも本発明に使用できる。例えば、ＥＤＴＡの金属塩としてはナトリウム塩、カリウム塩などが好適なものであり、特にＥＤＴＡの二ナトリウム塩、四ナトリウム塩などが好ましい。
ＥＤＴＡおよびその金属塩は、単独で用いられる他、２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０００９】
また、本発明に用いるチオニンは、大麦、小麦、燕麦、ライ麦等の麦類の穀粒粉から、食塩水や塩酸、クエン酸などの酸によって抽出することにより得られる他、チオニン遺伝子を含む組換え微生物や植物を用いて生産することもできる。アルファ型とベータ型チオニンは、いずれも約４５個のアミノ酸で構成され、そのうちシステインが約８個含まれており、しかもそれらのシステインの一部またはすべてがジスルフィド結合により、内部架橋している構造であることを特徴とする。
麦類の抽出液を硫安塩析等により濃縮し、さらに高速液体クロマトグラフィー等を用いることによって、チオニンを精製することができるが、精製途中の粗精製物であっても抗菌作用を有しているものは、本発明に使用することができる。アルファ型とベータ型のチオニンは、これらを単独で用いてもよく組み合わせて用いてもよい。
大麦からのチオニンの抽出・精製法の一例は、Planta、１７６巻、２２１−２２９頁（１９８８年) に記載されており、他の麦類から抽出・精製する場合も、この方法に準じて行うことが可能である。
【００１０】
大麦、小麦、燕麦のチオニンの全アミノ酸配列（Plant Molecular Biology 、２６巻、２５〜３７頁、１９９４年）やライ麦チオニンのアミノ酸組成（Journal of Agricultural and Food Chemistry、２６巻、７９４〜７９６頁、１９７８年）は、既に知られている。なお、麦の品種によっては、公知のアミノ酸組成や配列と比べて、１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換したり、付加もしくは欠失するペプチドが存在するが、目的とする抗菌作用を有しているかぎり、これらも本発明に用いるチオニンに包含される。
【００１１】
ＥＤＴＡおよびその金属塩は、食品の色安定効果があるため、多くの国で食品添加物として認められている。
しかも、ＥＤＴＡ等の安全性評価はすでに確立されており、食品添加物としての１日の摂取許容量（ＡＤＩ）は２．５ｍｇ／体重ｋｇである（ＦＡＯ／ＷＨＯ： Codex Alimentarius Commission, List of additives evaluated for their safety in use in food.ＣＡＣ／ＦＡＬ  1-1973, 1973年) 。
また、アメリカ合衆国では、ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を食品に３６〜５００ｐｐｍの濃度範囲で添加することが認められている（Code of Federal Regulations, Title 21: Food and drugs, US Government Printing Office, 1998年) 。
【００１２】
また、チオニンについては、トリプシン等の消化酵素で速やかに分解される（老田、日本食品科学工学会誌、４７巻、４２４−４３０頁、２０００年）ことから、腸内細菌への影響は極めて小さいと考えられる。さらに、モルモットに１０３〜２２９ｍｇ／ｋｇ体重のチオニンを１回経口投与し、投与後７日間観察したが、異常は認められなかったと報告されている（Cereal Chemistry, １９巻、３０１−３０７頁、１９４２年）。
【００１３】
本発明の殺菌性組成物は、様々な有害微生物に対して適用することができ、例えば食中毒原因細菌、う蝕性細菌などを挙げることができる。
また、本発明の殺菌性組成物は、様々な形態とすることができ、例えばＥＤＴＡおよびその金属塩とチオニンを同時に種々の食品に添加してもよい。ＥＤＴＡおよびその金属塩とチオニンは耐熱性があるため、食品への添加後に当該食品を加熱殺菌することができる。
【００１４】
食品中に含まれる食中毒原因細菌を殺菌するには、腸炎ビブリオ菌の場合は、０．１〜０．５ｍＭのＥＤＴＡおよびその金属塩と２〜１００μｇ／ｍＬのチオニンを、サルモネラ菌の場合は、０．１〜１．４９ｍＭのＥＤＴＡおよびその金属塩と２〜１００μｇ／ｍＬのチオニンを、大腸菌の場合は、０．５〜１．４９ｍＭのＥＤＴＡおよびその金属塩と１０〜１００μｇ／ｍＬのチオニンを同時に食品に加えるとよい。ただし、添加するＥＤＴＡおよびその金属塩の濃度が低い程、高濃度のチオニンの添加を必要とする。
なお、０．１〜１．４９ｍＭのＥＤＴＡ−２Ｎａは３３．６〜５００ｍｇ／Ｌに換算され、アメリカ合衆国における安全基準である５００ｐｐｍ以下である。しかし、１．５０ｍＭ以上のＥＤＴＡ−２Ｎａを食品へ添加すると、副作用が生起するおそれがある。
【００１５】
本発明の殺菌性組成物は、前記したように、食品に添加する他、歯磨き粉やうがい薬等の各種口腔用製品に添加して用いることもできる。その場合、０．５〜１０ｍＭのＥＤＴＡおよびその金属塩と４〜１００μｇ／ｍＬのチオニンを添加すればよく、このものを日常的に使用することによって、歯のう蝕を治療したり、予防することが可能である。
【００１６】
以下に、実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００１７】
製造例１
大麦の１種である裸麦の「イチバンボシ」穀粒をサイクロンミルで粉末状にしたもの１００ｇに蒸留水３００ｍＬを加え、４℃で１時間攪拌後、遠心分離し、上清を除いた。
次に、沈殿物に２００ｍＬの１Ｍ食塩水を加え、４℃で２時間攪拌したのち、遠心分離を行った。得られた上清を硫安（５０〜９０％飽和）塩析し、回収した沈殿物をリン酸緩衝液を用いて懸濁した。その遠心上清を高速液体クロマトグラフィーに供することにより、精製大麦アルファ型およびベータ型チオニンを得た。なお、カラムは、Wakosil 5C4-200, 4.6mmφ×250mm （和光純薬）を用い、０．１％トリフルオロ酢酸と０→４０％（０→４０分）アセトニトリルを含む水（ｐＨ２．１）による濃度勾配溶出を流速０．５ｍＬ／分で行い、集めた画分は遠心濃縮器で乾固させ、アミノ酸分析およびマススペクトル分析により、アルファ型およびベータ型チオニンであることを確認した。「イチバンボシ」穀粒粉末１Ｋｇあたりに換算して、３７ｍｇのアルファ型チオニンおよび１２ｍｇのベータ型チオニンをそれぞれ得た。
【００１８】
製造例２
市販薄力小麦粉１００ｇに０．１５Ｎ塩酸３００ｍＬを加えて攪拌後、３７℃で３０分間静置し、再び攪拌した後に遠心分離し、得られた上清に１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下して中和した。これを、再度遠心分離した。
このようにして得た上清を硫安（５０〜９０％飽和）塩析し、回収した沈殿物をリン酸緩衝液を用いて懸濁した。その遠心上清を、製造例１と同じ条件で高速液体クロマトグラフィーに供することにより、精製小麦アルファ型チオニンを得た。
集めた画分は遠心濃縮器で乾固させ、アミノ酸分析およびマススペクトル分析により、アルファ型チオニンであることを確認した。薄力小麦粉１Ｋｇあたりに換算して、４０ｍｇのアルファ型チオニンを得た。
【００１９】
実施例１
歯周病菌（Prevotella nigrescens 、Fusobacterium nucleatum)を５μｇ／ｍＬのヘミンと１μｇ／ｍＬのメナジオンを添加したＧＡＭブイヨン培地（日水製薬社製）に接種し、アネロメイト（日水製薬社製）に封入して３７℃で嫌気的に２日間培養した。
う蝕性細菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）をブレインハートインフージョン培地（Difco 社製）に、バチルス・セレウス（Bacillus cereus)を感受性測定用培地（日水製薬社製）に、その他の食中毒原因細菌などの細菌はＬＢ培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、食塩０．５％、ｐＨ７．２）に接種して３７℃で１日間培養した。
次いで、各培地に所定量のチオニンやＥＤＴＡを添加してから、菌濃度が約１×１０6 ／ｍＬになるように接種し、歯周病菌は２日間、他の菌は１日間の培養後、希釈平板培養によって生菌数を測定し、生菌数が１００分の１以下に低下した場合を最少殺菌濃度（ＭＢＣ）、生菌数が増加しなかった場合を最少阻害濃度（ＭＩＣ）とした。結果を第１表、第２表および第３表、並びに図１に示す。
【００２０】
第１表から明らかなように、小麦アルファ型チオニン単独添加では、供試菌体のうちサルモネラ菌（Salmonella typhimurium JCM 6977 株) と腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus IFO 12711 株) 以外は、ＭＩＣが５０μｇ／ｍＬ以上であった。一方、ＥＤＴＡ−２Ｎａ単独添加では、サルモネラ菌、大腸菌（Escherichia coli) およびストレプトコッカス・ミュータンスのＭＢＣは１０ｍＭ以上であったのに対し、他の菌のＭＢＣは１ｍＭ以下であった。
次に、小麦アルファ型チオニン１０μｇ／ｍＬとＥＤＴＡ−２Ｎａ  ０．０２−１０ｍＭを同時に添加した場合は、食中毒原因細菌の場合、ＥＤＴＡ−２ＮａのＭＢＣは単独添加の場合と比べていずれも低下したが、歯周病菌では、このような相乗効果は認められなかった
また、サルモネラ菌（S. typhimurium JCM 6977 株) や大腸菌（E. coli JCM 5491株) に対して、ＥＤＴＡやＥＤＴＡ−四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ−４Ｎａ）でも、ＥＤＴＡ−２Ｎａと同等もしくはそれ以上の相乗効果が認められた（第２表）。
さらに、サルモネラ菌（S. typhimurium JCM 6977 株) や大腸菌（E. coli JCM 5491株) および腸炎ビブリオ菌（V. parahaemolyticus IFO 12711 株）について、異なる濃度のＥＤＴＡ−２Ｎａ存在下で小麦アルファ型チオニンのＭＢＣを調べたところ、図１に示した結果が得られた。試験は、ＬＢ培地で３７℃で１日間培養した結果である。図中の●はサルモネラ菌、○は大腸菌、□は腸炎ビブリオ菌を示す。また、ＥＤＴＡ−２Ｎａ共存下でのチオニンの抗菌力は、小麦由来のものと大麦由来のもの、さらにはアルファ型とベータ型の間で殆ど差がなかった（第３表）。
【００２１】
【表１】
0003757268.tif 000002
0003757268.tif 000003
*1  小麦アルファ型チオニン
*2  小麦アルファ型チオニン共存下でのEDTA-2NaのMBC(mM)
【００２２】
【表２】
0003757268.tif 000004
0003757268.tif 000005
*  小麦アルファ型チオニン
【００２３】
【表３】
0003757268.tif 000006
0003757268.tif 000007
*  EDTA-2Na (1mM)を含むLB培地を使用
【００２４】
実施例２
ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans JCM 5705) に対する小麦アルファ型チオニンのＭＩＣは、ブレインハートインフージョン培地（Difco 社製）では５０μｇ／ｍＬであった（第１表参照）が、０．５％ショ糖を含むペプトン水（ポリペプトン１％、ＮａＣｌ１％、ｐＨ７．０）におけるＭＩＣは４μｇ／ｍＬであり、ショ糖からの酸生成も２日間殆ど認められなかった。すなわち、この培地に菌濃度が２×１０6 個／ｍＬとなるようにストレプトコッカス・ミュータンスを接種し、３７℃で培養したときの培地のｐＨの変化を調べた（図２参照）。この図は、ストレプトコッカス・ミュータンスの酸生成に及ぼす小麦アルファ型チオニンの影響について示したものであり、図中の○は小麦アルファ型チオニン無添加を、□は３μｇ／ｍＬ添加を、△は４μｇ／ｍＬ添加を、▽は５μｇ／ｍＬ添加を、それぞれを示す。
【００２５】
なお、ヒトの唾液には通常１〜４ｍＭのカルシウムが含まれ（Archives of Oral Biology, ４４巻、１１１−１１７頁、１９９９年）、さらにカルシウムによってチオニンの酵母に対する抗菌性が減殺されることが報告されている（Agricultural and Biological Chemistry 、３７巻、２２８９−２２９４頁、１９７３年）。
そこで、チオニンによるストレプトコッカス・ミュータンスの酸生成阻害について、カルシウムの影響を調べたところ、酵母と同様の阻害抑制効果が認められたが、さらにカルシウムと同じモル濃度のＥＤＴＡ−２Ｎａを添加することにより、酸生成阻害に対するカルシウムによる抑制は解消された（図３参照）。すなわち、前記の０．５％ショ糖を含むペプトン水に菌濃度が２×１０6 個／ｍＬとなるようにストレプトコッカス・ミュータンスを接種し、３７℃で２４時間培養した後の培地のｐＨを測定して調べた。図中の○はＣａＣｌ2 のみの添加を、●はＣａＣｌ2 とＥＤＴＡ−２Ｎａを同時添加した場合を示す。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、（ａ）エチレンジアミン四酢酸およびその金属塩の中から選ばれた少なくとも１種の物質並びに（ｂ）アルファ型チオニンおよびベータ型チオニンの中から選ばれた少なくとも１種の物質を有効成分として含有する殺菌性組成物が提供される。
【００２７】
これら（ａ）、（ｂ）成分は、いずれも低濃度で殺菌作用を発揮するので、本発明に係る殺菌性組成物を各種食品へ添加することにより、食中毒原因細菌を効果的に殺菌することができる。また、う蝕性細菌を殺菌するために、各種口腔用製品に当該殺菌性組成物を添加することによって、う歯の予防、治療が期待できる。
本発明に用いるエチレンジアミン四酢酸とその金属塩やチオニンの水溶液は、いずれも無色透明で無臭であるので、食品等の風味に影響を与えない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  食中毒原因細菌を、異なる濃度のＥＤＴＡ−２Ｎａを含むＬＢ培地にて３７℃で１日間培養した場合の小麦アルファ型チオニンのＭＢＣを示したものである。
【図２】  う蝕性細菌の酸生成に及ぼす小麦アルファ型チオニンの影響を示したものである。
【図３】  小麦アルファ型チオニンによるう蝕性細菌の酸生成阻害に及ぼすＣａＣｌ2 とＥＤＴＡ−２Ｎａの影響を示したものである。
【図１】
0003757268.tif 000008
【図２】
0003757268.tif 000009
【図３】
0003757268.tif 000010