(57)【要約】ホップの育種や遺伝子マーカー等に使用可能な新規カルコンシンターゼ様遺伝子の塩基配列および前記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を明らかにして、配列表の配列番号１または４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質およびこれらの変異タンパク質、配列表の配列番号２または５に記載の塩基配列を有する核酸およびこれらの変異核酸を得る。それによって前記カルコンシンターゼ様遺伝子若しくはそれがコードするタンパク質の提供、および該タンパク質の機能を含めてそれらの情報の提供が可能となった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つカルコンシンターゼ様活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
配列表の配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項４】
配列表の配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有することを特徴とする核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸または該核酸と相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つカルコンシンターゼ様活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項６】
請求項４に記載の塩基配列の一部からなる塩基配列を有することを特徴とする核酸。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ホップの新規カルコンシンターゼ様遺伝子およびタンパク質に関する。
背景技術
ホップはビールの爽快な苦味と香りを与える主要な原料であるが、このホップにおいても球果に含まれるルプリン腺毛内で二次代謝産物が多く分泌され、これら二次代謝産物がビールの苦味や香りに大きく寄与していることが明らかになってきた。さらに、近年では、これらの二次代謝産物が薬理作用を有していることが示されている。例えば、ビールの苦味物質の素の１つであるフムロンには骨粗鬆症に対して効果があることが示されている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（１），１５８，１９９７）。また、ホップのプレニルフラボノイドであるキサントフモールや８−プレニルナリンゲニン等には、抗癌活性があることが示されている（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｘｏｌｏｇｙ  ３７，２７１−２８５（１９９９），Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８０，５８０−５８５（２００１））。こうした経緯から、ホップにおいても、苦味物質、精油成分といったルプリン腺毛中に蓄積される二次代謝産物に主眼をおいた様々な品種改良が行われている。
しかしながら、ホップは雌雄異株の植物であり、特に雄株はビールの原料となる球果を付けず、商業上重要視されないことからあまり研究がなされておらず、醸造上有用な遺伝形質についてもほとんど明らかにされていない。そのため、従来の交配による育種法では、経験と勘に頼る部分が多く、特に醸造品質については実際に球果が着生するまで全く予想が付かないというのが現状である。
一方、今日では、ホップを含めた各種の植物において遺伝子工学、細胞工学といったバイオテクノロジーの技術を用いて、付与したい形質に関する遺伝子を植物へ直接導入する形質転換法が確立されつつある。またＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等のような、遺伝子マーカーを用いた分子選抜技術もイネやムギ類等において確立されつつあり、従来の育種法における問題点の解決策として期待されている。ここで必要とされるのが導入する遺伝子や遺伝子マーカーとなり得る遺伝子断片である。ホップについて言えば、特にビール原料、薬効成分という見地から考えた場合、ルプリン腺毛より分泌される二次代謝産物の質、量は重要であり、その生合成に影響を及ぼしている遺伝子そのものが、形質転換法においての導入遺伝子や分子選抜技術における遺伝子マーカーになり得る。このような見地から、本発明者らはこれまでにビールの苦味成分である樹脂成分や、薬効成分として注目されているフラボノイド類の生合成を触媒するカルコンシンターゼ様遺伝子の一つであるパレロフェノンシンターゼ遺伝子を単離している（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５，１５０−１５５，２００１、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢＯ１５４３０）。
ところでホップ以外の植物においてもカルコンシンターゼに関する研究は行われており、例えばキク科のオオセンボンヤリ（Ｇｅｒｂｅｒａ  ｈｙｂｒｉｄａ）は複数個のカルコンシンターゼ様遺伝子を持っており、これら遺伝子の翻訳産物の基質特異性はそれぞれ異なることが報告されている（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８，４７−６０，１９９５）。このように類似遺伝子が複数個ある場合、それぞれの遺伝子の差およびその翻訳産物の性質の差を把握することで、それぞれの遺伝子を形質転換法における導入遺伝子や分子選抜技術における遺伝子マーカーとして使う際に目的に応じて使い分けることが出来るためにより効率的な育種が可能となる。
しかしながら、ホップにおいては前述したバレロフェノンシンターゼ遺伝子以外にカルコンシンターゼ様遺伝子は単離されておらず、他のカルコンシンターゼ様遺伝子の単離が望まれていた。
発明の開示
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ホップの育種や遺伝子マーカー等に使用可能な新規カルコンシンターゼ様遺伝子の塩基配列および前記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を明らかにし、その遺伝子若しくはタンパク質の提供、およびそれらの情報の提供を可能とすることを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ホップから複数の新規カルコンシンターゼ様遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の新規カルコンシンターゼ様タンパク質は、配列表の配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで、前記タンパク質は、前記配列表の配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つカルコンシンターゼ様活性を有することを特徴とするタンパク質であってもよい。
また、本発明の核酸は、配列表の配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードすること特徴とする核酸である。
さらに、本発明の核酸は、配列表の配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する核酸である。ここで、本発明の核酸は、配列表の配列番号２または配列番号５に記載の核酸或いは該核酸と相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つカルコンシンターゼ様活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする核酸であってもよい。また、本発明の核酸は、配列表の配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列の一部からなる塩基配列を有することを特徴とする核酸であってもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明における「核酸」とは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または誘導化された活性なＤＮＡ若ＬくはＲＮＡでありうるポリヌクレオチドを指し、好ましくはＤＮＡおよび／またはＲＮＡをいう。この場合、前記核酸の形態としては、例えば、ゲノミックＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡが挙げられる。
また、本発明における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、２つの核酸断片が、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ）」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２および１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズすることをいう。
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、約４５℃で６．０ｘＳＳＣでハイブリダイゼーションを行なった後に、５０℃で２．０ｘＳＳＣで洗浄することをいう。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．１ｘＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温（約２２℃）から高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
まず、本発明の新規カルコンシンターゼ様タンパク質について説明する。
本発明のタンパク質は、配列表の配列番号１に記載の３９４アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するホップのカルコンシンターゼ様タンパク質、および、配列表の配列番号４に記載の３９９アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するホップのカルコンシンターゼ様タンパク質である。
また、本発明のタンパク質は、カルコンシンターゼ様活性を有するタンパク質であれば、配列表の配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
さらに、多くのタンパク質には糖鎖が付加され、１若しくは複数のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加することにより糖鎖の付加を調節することができる。したがって、配列表の配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、前記糖鎖の付加を調節されたタンパク質も上述のカルコンシンターゼ様活性を有する限り、本発明のタンパク質に包含される。
ここで、「アミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加」とは、天然由来の変異および人為的な変異を導入されたアミノ酸配列を含む。
次に、本発明の新規カルコンシンターゼ様遺伝子について説明する。
本発明の核酸には、前記のカルコンシンターゼ様タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸が包含される。すなわち、１つのアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）は複数存在するため、配列表の配列番号１または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸の塩基配列は多岐に渡る。このように、核酸の転写産物のアミノ酸配列が前記配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するような核酸は、全て本発明の核酸に包含される。ここで、「タンパク質をコードする」とは、ＤＮＡが２本鎖である場合には、相補２本鎖のいずれか一方がタンパク質をコードする塩基配列を有するものを含むことを意味するため、本発明の核酸には配列表の配列番号１または配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を直接コードする塩基配列からなる核酸若しくはその相補的な塩基配列からなる核酸も包含される。
また、本発明の核酸には、配列表の配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有し、ホップカルコンシンターゼ様タンパク質をコードする核酸（ｃＤＮＡ）も包含される。
さらに、本発明の核酸には、前記配列番号２に記載の１１８５塩基数の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、または配列番号５に記載の１２００塩基数の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であり、且つカルコンシンターゼ様活性を有するタンパク質をコードする核酸も包含される。このような核酸は、上記の条件を満たす限りその塩基配列は特に制限されない。さらに、本発明の核酸には前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に相補的な塩基配列を有する核酸も包含される。具体的には、例えば、前記配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する核酸の塩基のいくつかに欠失、置換、挿入、付加等があり、且つカルコンシンターゼ様活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。ここで、欠失、置換、挿入、付加とは、１〜１０塩基の短い欠失、置換、挿入、付加のみならず、１０〜１００塩基の長い欠失、置換、挿入、付加も含む。また「塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加」とは、天然由来の変異および人為的な変異を導入された塩基配列を含む。
また、「カルコンシンターゼ様活性」とは、マロニルＣｏＡとクマロイルＣｏＡを基質としてカルコンを合成するカルコンシンターゼ、マロニルＣｏＡとクマロイルＣｏＡを基質としてスチルベンを合成するスチルベンシンターゼ、マロニルＣｏＡとクマロイルＣｏＡを基質としてベンザルアセトンを合成するベンザルアセトンシンターゼ、マロニルＣｏＡとイソバレリルＣｏＡを基質としてフロルイソバレロフェノンを合成するバレロフェノンシンターゼ等、カルコンシンターゼ・スーパーファミリーと呼ばれる一連の
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Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓａｎｋａｗａ，Ｕ．，Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１，ｐｐ．７４９−７７１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ］。
これら一連のカルコンシンターゼ様酵素によって合成される物質の多くが、植物のファイトアレキシンや色素、香り成分などの基本骨格となっていることが知られている。また、これらカルコンシンターゼ様酵素によって合成される物質を基本骨格に持つものの幾つかは、薬効成分としても知られている。例えば、ラズベリーにおいては、ベンザルアセトンシンターゼによって合成されるベンザルアセトンは、ラズベリーの香り成分であるラズベリーケトンの前駆体である一方、カビの増殖を抑えることも知られている（Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０，７９１−７９９，１９９６）。また、ダイオウ（ｒｈｕｂａｒｂ）に含まれ、抗炎症活性を持つことで知られるｌｉｎｄｅｌｅｙｉｎ等のフェニルブタノングルコシドも、ベンザルアセトンを基本骨格としている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，３３５４−３３５９，２００１）。
ホップにおいて、その抗癌作用が注目されているキサントフモールや８−プレニルナリンゲニン等のプレニルフラボノイド類は、カルコンシンターゼやバレロフェノンシンターゼによって合成されるカルコンを前駆体としている（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．５９（４）：１６３−１６６，２００１）。さらに、ビールの苦味の素となるホップの樹脂成分は、バレロフェノンシンターゼによって合成されるフロルイソパレロフェノンを前駆体としている。
したがって、上記の配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する核酸を検出することにより、ホップのフラボノイド系の薬効成分や樹脂成分、香り成分、ファイトアレキシンの代謝系の制御や、これらに関する形質の遺伝子マーカーとして利用することができる。前記の核酸の検出には配列表の配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列の全ては必要ではなく、例えば、その一部をＰＣＲにより増幅し塩基配列の決定またはＲＦＬＰ等のような遺伝子解析手段を用いて検出を行えばよい。したがって、本発明の核酸には、配列表の配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列の一部からなる核酸も包含される。
次に、本発明の核酸およびタンパク質の単離方法について説明する。
本発明の核酸は、以下の（１）〜（３）のステップを経て単離することができ、（４）〜（５）のステップにおいて、単離された遺伝子がどの組織で転写されているかを確認することが可能である。
（１）ホップゲノミックＤＮＡの調製
ホップゲノミックＤＮＡの調製は公知の方法で行うことができ、例えばＷａｇｎｅｒらの方法に従って行うことができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，２０９７−２１００（１９８７））。
（２）カルコンシンターゼ様遺伝子の単離
カルコンシンターゼ様遺伝子の部分断片は、ホップのパレロフェノンシンターゼおよびシロイヌナズナ、オオムギ等、遺伝子配列が既知となっている他の植物のカルコンシンターゼのアミノ酸配列を基にプライマーを設計し、ＰＣＲ法によって単離できる。さらに、得られた部分断片の前後に存在する未知の遺伝子領域は、得られた部分断片の塩基配列を基にプライマーを設計し、逆ＰＣＲ法（Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ）といった公知の方法を用いることで単離することができ、例えばＬｉｕらの方法で行うことができる（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２５，６７４−６８１（１９９５））。これらＰＣＲを用いた方法によりホップのバレロフェノンシンターゼ以外のカルコンシンターゼ様遺伝子を単離することができる。
（３）塩基配列の決定
単離された遺伝子の塩基配列は公知の方法で決定することができる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」に添付されたプロトコールに従って行うことができる。また、ここで決定された塩基配列に基づいて、既知の遺伝子の塩基配列との相同性検索を行うことができる。
（４）各組織画分における全ＲＮＡの調製
全ＲＮＡの調製は任意の組織画分において公知の方法で行うことができ、例えば、Ｃｈａｎｇらの方法で行うことができる（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ．１１，１１３−１１６（１９９３））。
（５）ノーザンハイブリダイゼーション解析（以下、ノーザン解析）
単離したカルコンシンターゼ様遺伝子がどの組織で発現しているかを確認するには、単離したカルコンシンターゼ遺伝子をプローブとしてノーザン解析を行えばよい。ノーザン解析は公知の方法で行うことができ、例えば、「ＤＩＧ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，ｐｐ９８−１０６（２０００））に記載された方法で行うことができる。
（６）カルコンシンターゼ様遺伝子のｃＤＮＡの単離
カルコンシンターゼ様遺伝子のｃＤＮＡは、公知の方法を用いて単離することができ、例えば、（２）で単離したカルコンシンターゼ様遺伝子のゲノミックＤＮＡの塩基配列に基づいてプライマーを設定し、全ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法により単離すればよい。この場合の具体的な方法は、例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製の「Ｔｉｔａｎ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ」に添付のプロトコール等に記載の方法を用いることができる。
別法として、例えばＰＣＲ、制限酵素による消化、Ｔ４  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＤＮＡ末端の平滑化、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅによるリン酸化、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応等を用いることにより、単離したカルコンシンターゼ様遺伝子のゲノミックＤＮＡからイントロンを除いた、ｃＤＮＡと同等の遺伝子断片を作製することができる。
（７）単離したカルコンシンターゼ様遺伝子によってコードされるタンパク質の機能解析
単離したカルコンシンターゼ様遺伝子によってコードされるタンパク質は、カルコンシンターゼ様遺伝子のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、このベクターを大腸菌に導入することにより大腸菌の菌体内で発現させることができる。前記のようなカルコンシンターゼ様遺伝子によってコードされるタンパク質の発現および前記タンパク質の精製は、例えば「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）に添付のプロトコールに記載の方法で精製することができる。また、この大腸菌で発現、精製したカルコンシンターゼ様タンパク質の機能は公知の方法で確認することができ、例えば、森田らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９，１９０−１９５，２０００）で確認することができる。
（８）本発明に係る遺伝子またはタンパク質への変異の導入
本発明に係る遺伝子の塩基配列に１若しくは複数の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加といった変異を導入する方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、亜硫酸ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシンをウラシルに置換するトランジション変異を起こさせる方法、マンガンを含む反応液中でＰＣＲを行いＤＮＡ合成時のヌクレオチド取り込みの正確さを低下させることにより変異を導入する方法等のランダムな変異の導入方法、アンバー変異を導入する方法等の部位特異的に変異を導入する方法が挙げられる。
また、本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入若しくは付加といった変異を導入する方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、例えば、前述のようにして準備された変異遺伝子を用いて組み換えタンパク質を転写・合成する方法が挙げられる。
（９）本発明の核酸またはタンパク質の利用
本発明の新規カルコンシンターゼ様タンパク質が、ファイトアレキシンの基本骨格となる物質（ベンザルアセトン、スチルベン等）を合成する場合、上記のようにして単離されたカルコンシンターゼ様遺伝子を利用して、植物におけるファイトアレキシンの代謝系の制御やこれらの形質を司る遺伝子の検出が可能となる。
また、上述の新規カルコンシンターゼ様タンパク質が、例えばラズベリーの香り成分の前駆体であるベンザルアセトン等の物質を合成する場合、上記のようにして単離されたカルコンシンターゼ様遺伝子を利用して、ホップ球果に蓄積する香り成分、すなわちビールの香りに寄与する物質の代謝系の制御やこれらの形質を司る遺伝子の検出が可能となる。
一方、上述の新規カルコンシンターゼ様タンパク質が、ダイオウに含まれる抗炎症活性を持つｌｉｎｄｌｅｙｉｎ等のフェニルブタノングルコシドの前駆体（ベンザルアセトン等）や、ホップに含まれる抗癌活性を持つキサントフモール等のプレニルフラボノイド等の薬効成分の基本骨格となる物質（カルコン等）を合成する場合、本発明の核酸を用いることにより、ホップ中、これら薬効成分の代謝系の制御が可能となるばかりか、これらの形質の遺伝子マーカーとして利用することが可能となる。
さらに、上述の新規カルコンシンターゼ様タンパク質が、ビールの苦味成分の素となるホップの樹脂成分の前駆体（フロルイソパレロフェノン等）を合成する場合、本発明の核酸を用いることにより、ホップにおける樹脂成分の代謝系の制御が可能となる。また、このような形質の遺伝子マーカーとして利用することが可能となる。
さらに、類似の遺伝子が複数個その植物体に存在する場合、それぞれの遺伝子間ないしその翻訳産物間で性質が異なることは充分考えられる。ホップにおいて、樹脂成分、香り成分、薬効成分、ファイトアレキシンの改良を形質転換法や分子選抜技術を用いて行う場合、複数個の類似遺伝子の中で最もこれらの成分の生合成に寄与しているものに着目することが、効率的な育種につながる。したがって、本発明のカルコンシンターゼ様遺伝子を含むホップの一連のカルコンシンターゼ様遺伝子の樹脂成分、香り成分、薬効成分、ファイトアレキシンの生合成への寄与度を調査し、最も寄与度の高い遺伝子を形質転換法における導入遺伝子や分子選抜技術における遺伝子マーカーとして着目することで、ホップの樹脂成分、香り成分、薬効成分、ファイトアレキシンの改良をより効率的に行うことが可能となる。
また、本発明で単離されたカルコンシンターゼ様遺伝子を用いて遺伝子工学的手法により製造されたカルコンシンターゼ様タンパク質を用いることにより、試験管内で植物の二次代謝産物の生産を行うことが可能となる。
以上のように、本発明の核酸は遺伝子マーカー等に利用可能であるが、利用方法としては特に制限はなく、例えば、以下の方法を用いることができる。
（ａ）ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
本発明の核酸配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブとして使用することによって、ホップにおいて発現している遺伝子の検出をすることが可能である。また、前記プローブを使用することによって、ホップにおける遺伝子発現の分布を同定することも可能である。
本発明の核酸の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション法については特に制限はないが、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）、ＤＮＡチップ法、マイクロアレー法が挙げられる。
本発明の核酸をハイブリダイゼーション用プローブとして使用する場合は、少なくとも２０個の塩基配列からなる核酸が必要であり、４０個以上の塩基からなることが好ましく、６０個以上の塩基からなることがより好ましい。また、前記プローブは容易に検出できるように標識して用いることが好ましい。検出可能な標識は、目視によって、または機器を用いるかのいずれかによって検出され得るいかなる種類、部分であってもよい。通常使用される検出可能な標識は、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ等の放射性標識；ビオチン標識；蛍光標識；酵素；金コロイド複合体等が挙げられる。
ハイブリダイゼーションの方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて実施することができる。
（ｂ）ＰＣＲに用いるプライマー
遺伝子を検出する方法には他にも、開示された塩基配列の任意の配列をプライマーとしてＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法を用いることにより可能である。例えば、検定したいサンプルからＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。このような方法は当事者にとって周知の方法によって行うことができる。
本発明の遺伝子配列をＰＣＲ用プライマーとして使用する場合は、１０〜６０個の塩基の長さが必要であり、本発明の遺伝子配列のうち、１０〜６０個の連続した塩基を有する核酸が好ましく用いられる。さらに好ましくは、１５〜３０個の塩基を有する核酸が用いられる。また一般的には、プライマー配列中のＧＣ含量が４０％から６０％が好ましい。さらに、増幅に用いる２つのプライマー間のＴｍ値に差がないことが好ましい。またプライマーの３’末端でアニールせず、プライマー内で２次構造をとらないことが好ましい。
（ｃ）核酸のスクリーニング
本発明において開示された塩基配列の一部、または全部を使用することによって様々な組織や細胞で発現している遺伝子発現の分布を検出することが可能である。例えば、本発明において開示された塩基配列の一部、または全部をハイブリダイゼーションのプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用することによって、遺伝子発現の分布を検出することが可能である。
また、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等を用いても遺伝子発現の分布を検出することが可能である。すなわち本発明により開示された塩基配列の一部、または全部を直接チップ、アレイ上に張り付けことができる。そこに細胞から抽出したＲＮＡを蛍光物質等でラベルし、ハイブリダイズさせ、その遺伝子がどの細胞で高発現しているかを解析することが可能である。またチップ、アレイ上に張り付けるＤＮＡは本発明により開示された塩基配列の一部、または全部を用いたＰＣＲの反応産物であってもよい。
（実施例）
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１  （ホップゲノミックＤＮＡの調製）
ホップゲノミックＤＮＡの調製は以下のようにして行った。
ホップの葉を液体窒素中で凍結粉砕し、２％ＣＴＡＢ溶液（２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド、０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、１％β−メルカプトエタノール）に懸濁して、６５℃で３０分間保温した。この溶液をクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出後、３／４倍量のイソプロパノールを加えてＤＮＡおよびＲＮＡを析出させた。析出したＤＮＡおよびＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｓａｌｔ  ＴＥバッファー（１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、ＲＮａｓｅを加えて６０℃で保温し、ＲＮＡを分解した。得られた溶液に２倍量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを析出させ、７０％エタノールで洗浄後、水に溶かし、ゲノミックＤＮＡサンプルとした。
実施例２  （カルコンシンターゼ様遺伝子の単離）
塩基配列が既知のシロイヌナズナ、オオムギ、エンドウ、ペチュニアのカルコンシンターゼおよびホップのカルコンシンターゼ様遺伝子のひとつであるバレロフェノンシンターゼのアミノ酸配列のうち、これらの遺伝子を通じて比較的保存されている領域に相当する遺伝子の塩基配列を基に、プライマー１（配列番号７）とプライマー２（配列番号８）を作製した。これらのプライマーを用いてホップゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、図１の断片１を得た。
次に、得られた増幅断片の塩基配列を実施例３に従って決定した。ここで得られた塩基配列からプライマー３（配列番号９）、プライマー４（配列番号１０）、プライマー５（配列番号１１）、プライマー６（配列番号１２）を設計し、逆ＰＣＲ法（Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ）を用いて図１の断片２および断片３を得た。すなわち、ホップゲノミックＤＮＡを制限酵素ＭｆｌＩで消化し、宝酒造社の「ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１」を用いて、添付されたプロトコールに従い、分子内ライゲーション（Ｓｅｌｆ  ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を行った。これらの反応液の一部を鋳型として、プライマー３（配列番号９）とプライマー５（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲを行った。次に、これらＰＣＲ反応液の一部を鋳型として、プライマー４（配列番号１０）とプライマー６（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、二種類のＤＮＡ断片（断片２、断片３）を得た。逆ＰＣＲ法（Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ）の原理を図２に示す。得られた二種類のＤＮＡ断片はカルコンシンターゼ様遺伝子由来のＤＮＡ断片である。
次に、ホップゲノミックＤＮＡを鋳型として、図１の断片２の塩基配列を基に設計したプライマー７（配列番号１３）およびプライマー８（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、他方、図１の断片３の塩基配列を基に設計したプライマー９（配列番号１５）およびプライマー１０（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、ホップのカルコンシンターゼ様遺伝子である断片４と断片５を得、それぞれの遺伝子をｃｈｓ２とｃｈｓ３とした。いずれのＰＣＲもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社の「Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ」を用いて、添付されたプロトコールに従って行った。遺伝子に単離に用いたプライマーの塩基配列を表１に示す。
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実施例３  （ホップカルコンシンターゼ様遺伝子の塩基配列の決定）
実施例２において得られた各遺伝子断片はそれぞれｐＣＲ２．１にサブクローニングした後に塩基配列を決定した。断片４（ｃｈｓ２遺伝子由来）および断片５（ｃｈｓ３遺伝子由来）をｐＣＲ２．１にサブクローニングしたものについてはそれぞれｐＧＣＨＳ２、ｐＧＣＨＳ３とした。塩基配列の決定はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」およびＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＢＩ３７３Ｓ型）を用い、添付のプロトコールに従って行った。遺伝子断片４および遺伝子断片５の塩基配列を配列表の配列番号３、配列番号６にそれぞれ示す。また、予想されるエクソン部分から推定されるｃｈｓ２、ｃｈｓ３のｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号４、配列番号７にそれぞれ示す。さらに、予想されるエクソン部分にコードされたアミノ酸配列を配列番号１、配列番号４にそれぞれ示す。
配列番号１および配列番号４のアミノ酸配列をホップのバレロフェノンシンターゼ（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢＯ１５４３０）および既知のホップカルコンシンターゼ様タンパク質（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ３０４８７７）と比較したところ、配列番号１のアミノ酸配列はバレロフェノンシンターゼに対して７２．８％の相同性を、既知のホップカルコンシンターゼ様タンパク質に対して６８．３％の相同性を持っており、配列番号４のアミノ酸配列はバレロフェノンシンターゼに対して７７．９％の相同性を、既知のホップカルコンシンターゼ様タンパク質に対して７２．９％の相同性を持っていた。
実施例４  （各組織画分および全ＲＮＡの調製）
全ＲＮＡを抽出する組織として、開花後１５日、３０日、４８日の球果より、それぞれの苞画分、ルプリン画分を調製した。ここで苞画分とはルプリン腺毛のほとんど存在しない球果の外苞を主として集めた画分であり、ルプリン画分とは球果からルプリン腺毛以外の組織を極力除いた主としてルプリン腺毛からなる画分である。これらの組織画分を液体窒素中で凍結粉砕し、２％ＣＴＡＢ溶液（２％セチルトリメチルアンモニウムブロミド、０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、５％β−メルカプトエタノール）に懸濁して、６５℃で１０分間保温した。クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出後、１／３倍量の１０Ｍ塩化リチウムを加え、一晩放置し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、沈殿を水に溶かした。ここで全ＲＮＡを実施例５において利用する場合は、水の代わりにＤＮａｓｅ反応バッファー（１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、５ｍＭ塩化マグネシウム）に溶かし、ＤＮａｓｅを加えて３７℃で保温し、ＤＮＡを分解した。これらの溶液に更に１／３倍量の１０Ｍ塩化リチウムを加え、一晩放置し、１５０００ｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、再度水に溶解して全ＲＮＡサンプルとした。ルプリン画分においては、開花後３０日、４８日のサンプルからはＲＮＡがほとんど抽出されなかったことから、ルプリン腺毛においては、開花後３０日以降においては遺伝子の転写がほとんど行われていないことが推察された。
また同様の方法を用いて、人工気象庫内で栽培した若いホップ植物体の葉からもＲＮＡを抽出した。
実施例５（ノーザンハイブリダイゼーション解析）
単離したカルコンシンターゼ遺伝子の経時的な変化を確認するために、ノーザンハイブリダイゼーション解析（以下ノーザン解析）を行った。
先ず、実施例３において作製したプラスミドｐＧＣＨＳ２、ｐＧＣＨＳ３を制限酵素ＫｐｎＩで消化して直鎖状としたものを鋳型として、「ＤＩＧ  ＲＮＡラベリングキット（ＳＰ６／Ｔ７）」（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｅｓ社）を用いてＦＰＰシンターゼ遺伝子のＲＮＡプローブを作製した。作製方法はキットに添付のプロトコールにしたがって行った。次に実施例４で調製した開花後１５日、３０日、４８日の球果から採取した苞画分の全ＲＮＡについて各２．５μｇずつ、変性アガロースゲル（１．２％アガロース、０．６６Ｍホルムアルデヒド、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を用いて電気泳動を行った。蒸留水中でゲルを４０分ずつ３回振とうしてゲル中のホルムアルデヒドを抜いた後、２０ｘＳＳＣ（０．３Ｍクエン酸ナトリウム、３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いて分画されたＲＮＡをナイロンメンブレンに転写した。ハイブリダイゼーションは６８℃で一晩、前述したＲＮＡプローブを用いて行った。なおハイブリダイゼーションバッファーの組成は５ｘＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳ、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、５０％ホルムアミド、２％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）とした。ハイブリダイゼーション後、洗浄液（１％ＳＤＳ、２ｘＳＳＣ）を用いて６８℃、３０分間の洗浄処理を２回、さらに、洗浄液（０．１％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣ）で６８℃、３０分間の洗浄処理を２回行った。洗浄後、プローブと融合したＲＮＡ断片の検出を行った。検出はＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社より供与された「ＤＩＧシステムを用いてハイブリダイゼーションを行うためのユーザーガイド」に記載のプロトコールに従って行った。
図３に示したように、ｃｈｓ２は開花後１５日の苞画分において最もシグナルが弱く、４８日の苞画分において最もシグナルが強いことから、球果登熟後期に発現が強くなると結論された。一方、ｃｈｓ３については、どのサンプルにおいてもシグナルの強度に大きな変化は見られなかった。
実施例６（カルコンシンターゼ様遺伝子のｃＤＮＡの単離）
カルコンシンターゼ様遺伝子の１つであるｃｈｓ２のｃＤＮＡは、実施例３において推察された、配列番号４に記載の塩基配列の両末端配列にＢａｍＨＩ認識配列を付加した配列を有するプライマーを設計し、実施例４で得た葉より抽出した全ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ法により単離した。すなわち、プライマーはプライマー７（配列番号１３）およびプライマー８（配列番号１４）を用い、ＲＴ−ＰＣＲは「Ｔｉｔａｎ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用い、添付のプロトコールに従って行った。こうして得られたカルコンシンターゼ様遺伝子であるｃｈｓ２のｃＤＮＡをｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターにサブクローニングし、ｐＣＨＳ２−１０１とした。前記サブクローニングされたｃｈｓ２のｃＤＮＡは、「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＤＮＡシークエンサーＡＢＩ３７３Ｓ型（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、添付されたプロトコールにしたがって塩基配列の決定を行った。この結果、得られたｃｈｓ２のｃＤＮＡの塩基配列は、実施例３において推察された、配列番号４に記載の塩基配列に一致することを確認した。
一方、実施例２において単離した、もう１つのホップカルコンシンターゼ様遺伝子であるｃｈｓ３については、図４に示される方法を用いて、ｃＤＮＡと同等のＤＮＡ断片を作製した。すなわち、実施例２において単離された配列番号５に示される遺伝子断片を鋳型として、プライマー７（配列番号１３）とプライマー１１（配列番号１７）のプライマーセット、およびプライマー８（配列番号１４）とプライマー１２（配列番号１８）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。次に、プライマー８とプライマー１２のプライマーセットによって増幅した断片をｐＣＲ２．１にサブクローニングし、ＰｍａｃＩで消化した。このＰｍａｃＩ部位に、プライマー７とプライマー１１のプライマーセットによって増幅した断片を、宝酒造社の「Ｔａｋａｒａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ」を用いて、添付されたプロトコールに従い挿入し、ｐＣＨＳ３−１０１とした。すなわち、ｃｈｓ２のゲノミックＤＮＡからイントロンを除いたｃＤＮＡと同等の遺伝子断片が得られた。
実施例７（単離したカルコンシンターゼ様遺伝子によってコードされるタンパク質の機能解析）
単離したカルコンシンターゼ様遺伝子によってコードされるタンパク質（ＣＨＳ２、ＣＨＳ３）がどのような活性を有するかを確認するために、実施例５において単離したカルコンシンターゼ様遺伝子のｃＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）に付属の発現ベクターｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ部位に組み込んだ後、大腸菌に導入してカルコンシンターゼ様遺伝子を大腸菌内で発現させ、その発現産物を精製した。前記大腸菌内でのカルコンシンターゼ様遺伝子の発現および発現産物の精製は、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）に添付のプロトコールにしたがって行った。また、精製された発現タンパク質は透析チューブを用いて、０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）、１．４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロールの溶液を透析外液として脱塩処理を行った。
次に、発現タンパク質の酵素活性を測定するために、５４μＭのｐ−クロマイルＣｏＡ、１０８μＭのマロニルＣｏＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ８．０）を含む溶液に酵素５μｇを加え、５００μｌの反応系で３０℃、２時間酵素反応を行った。次に２０％ＨＣｌを５０μｌ加え、反応を停止し、１ｍｌの酢酸エチルで抽出した。乾燥後、５０μｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含むメタノールに溶解し、４０μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した。ＨＰＬＣは次の条件で行った。カラム；ＴｏｓｏｈのＯＤＳ−８０Ｔｓ、ＵＶ検出波長；１９８−４００ｎｍ、溶出速度；０．８ｍｌ／ｍｉｎ、温度；２５℃。なお、溶媒は３０−７０％（０．１％ＴＦＡを含む）を用い、グラジェントプログラムは３０％（０−５分）、３０％→６０％（５−１７分）、６０％（１７−２５分）、６０％→７０％（２５−２７分）、７０％（２７−３５分）、７０％→１００％（３５−４０分）とした。さらに得られたピークに対して、質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を行った。
ＣＨＳ２を酵素として用いた結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。ＨＰＬＣのチャートにおいて、基質由来のｐ−クマル酸のピーク（１５−１６分）の他に、ベンザルアセトンの位置（１８−１９分）にピークが検出された（図５Ａ）。また、このピークをＬＣ−ＭＳで分析したところ、その分子量は１６２であり（図５Ｂ）、これはベンザルアセトンの分子量と同一であることから、ＣＨＳ２はベンザルアセトンシンターゼ活性を持つことが明らかとなった。一方、ＨＰＬＣのチャートにおいて、２２分の位置に未知物質のピークが検出された（図５Ａ）。このピークをＬＣ−ＭＳで分析したところ、その分子量は２２４であることが明らかとなった（図５Ｃ）。
ＣＨＳ３を酵素として用いた結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。ＨＰＬＣのチャートにおいて、基質由来のｐ−クマル酸のピーク（１５−１６分）の他に、ＣＨＳ２の反応で検出された未知物質と同じ２２分の位置にピークが検出された（図６Ａ）。このピークをＬＣ−ＭＳで分析したところ、その分子量はＣＨＳ２の反応で検出された未知物質と同じ２２４であり、ＣＨＳ２の反応で検出された未知物質と同一物質であることが明らかとなった（図６Ｂ）。
次に、ＣＨＳ２およびＣＨＳ３の反応至適ｐＨおよび反応至適温度について調べた。反応至適ｐＨは、前述反応溶液において、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液のｐＨをそれぞれ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５に調整して測定した。また、ｐＨ８．０、８．５、９．０については、０．１Ｍトリス−ＨＣｌの緩衝液を用いて反応を行った。反応至適温度については、前述反応溶液において、反応温度をそれぞれ１６℃、２５℃、３０℃、３７℃として測定を行った。活性の強さは反応産物のピークエリアの面積で算出した。結果を図７Ａ〜７Ｄに示す。ＣＨＳ２の反応至適ｐＨは、８．５（リン酸カリウム緩衝液使用時）、反応至適温度は１６℃、ＣＨＳ３の反応至適ｐＨは、８．０（トリス−ＨＣｌ衝液使用時）、反応至適温度は１６℃であった。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明によれば、ホップの育種や遺伝子マーカー等に使用可能な新規カルコンシンターゼ様遺伝子の塩基配列および前記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列が明らかとなり、その遺伝子またはタンパク質の提供、およびそれらの情報の提供が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の核酸の単離等に用いたプライマーの設定箇所を示した模式図である。
図２は、逆ＰＣＲ法の原理を示した模式図である。
図３は、開花後の球果における、本発明の核酸の発現をノーザン解析によって検出したオートラジオグラフィーの写真である。
図４は、本発明の核酸のうち、ｃｈｓ３のｃＤＮＡと同等のＤＮＡ断片の作製法を示した模式図である。
図５Ａは、本発明のタンパク質であるＣＨＳ２の反応によって生成される物質のＨＰＬＣチャートを示した図である。
図５Ｂは、図５ＡのＨＰＬＣチャート中、▲２▼で示されるピークの質量分析スペクトルを示した図である。
図５Ｃは、図５ＡのＨＰＬＣチャート中、▲３▼で示されるピークの質量分析スペクトルを示した図である。
図６Ａは、本発明のタンパク質であるＣＨＳ３の反応によって生成される物質のＨＰＬＣチャートを示した図である。
図６Ｂは、図６ＡのＨＰＬＣチャート中、▲２▼で示されるピークの質量分析スペクトルを示した図である。
図７は、ＣＨＳ２およびＣＨＳ３のそれぞれの反応至適ｐＨと反応至適温度を示す図である。図７Ａは、ＣＨＳ２に関して、反応生成物のピークエリアの面積をｐＨに対してプロットした図である。図７Ｂは、ＣＨＳ２に関して、反応生成物のピークエリアの面積を温度に対してプロットした図である。図７Ｃは、ＣＨＳ３に関して、反応生成物のピークエリアの面積をｐＨに対してプロットした図である。図７Ｄは、ＣＨＳ３に関して、反応生成物のピークエリアの面積を温度に対してプロットした図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【国際調査報告】
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