(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝炎・肝癌・ヒトWilson病モデルＬＥＣラットのうち、以下の異常行動：
(a)歩行中の連続的な頭部振動；
(b)突然の旋回運動；
(c)後方への頭部伸長運動
を示すことを特徴とする多動性障害モデルラット。
【請求項２】
請求項１のラットを、Wistar系WKAHラットに戻し交配することによって樹立したコンジェニック系統の多動性障害モデルラット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、多動性障害モデルラットに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ヒトの注意欠陥多動性障害の原因解明と予防・治療法の確立に有用な多動性障害モデルラットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
現在、学級崩壊が大きな社会的問題となってきているが、その中核を占める児童には注意欠陥多動性障害（attention deficit hyperactive disorder：ＡＤＨＤ）と呼ばれる症候群が認められる（文献１）。このＡＤＨＤは以前は微細脳機能不全症候群のうちの多動症候群として扱われてきたが、現在は独立した疾患として位置づけられている。ＡＤＨＤ児童の増加は欧米でも大きな社会問題となっており（文献２）、その数は全児童の約４％と推定されている（文献３）。
【０００３】
ＡＤＨＤ発症の原因は不明であるが、最近の家族性ＡＤＨＤの解析から、この疾患がドーパミン受容体Ｄ４の異常に関連している可能性が指摘されている（文献４）。ただし、その原因が明確に特定されているわけではない。また、原因が不明であることから、有効な予防法や治療法も確立していないのが現状である。
【０００４】
ＡＤＨＤの原因解明と予防・治療法の確立のためには、この疾患の動物モデルの樹立が急務である。ＡＤＨＤが行動異常を主たる症状の一つとする疾患であることから、動物個体の行動分析とその発症過程の解析は不可欠である。
【０００５】
ＡＤＨＤの動物モデルとしては、以前は薬物による異常行動の誘発（文献５）、低生殖ラットでの多動形質個体の選別（文献６、７）等が利用されてきたが、現在では高血圧自然発症ラット（spontaneous hypertensive rat：ＳＨＲ）にみられる多動（hyperactivity）ラットが最もよく利用されている（文献８−12）。
【０００６】
しかしながら、ＳＨＲにみられる多動が、ヒトにおける多動性障害を必ずしも反映するものではなく、また遺伝性に関しても未だ不明である（文献13）。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、ヒトＡＤＨＤに類似した多動性障害を発現し、しかも好ましくは、その多動性障害が単一遺伝子異常によるものであるモデル動物を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、肝炎・肝癌・ヒトWilson病モデルＬＥＣラットのうち、以下の異常行動：
(a)歩行中の連続的な頭部振動；
(b)突然の旋回運動；
(c)後方への頭部伸長運動
を示すことを特徴とする多動性障害モデルラットを提供する。
【０００８】
また、この出願は、前記のラットを、Wistar系WKAHラットに戻し交配することによって樹立したコンジェニック系統の多動性障害モデルラットをも提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の多動性障害モデルラットについて詳しく説明する。
１：異常行動ラットの発見
北海道大学実験生物センターで進めている肝炎・肝癌・ヒトWilson病モデルLECラットのオリジナル系統の維持過程で、1995年１月出生（近交世代66代）の１腹仔中メス２頭に通常のラットとは異なる以下のような行動上の特徴を持つ個体が見出された。その後、これらメスの子孫にも同様の行動異常が出現したので、これらを従来のLEC系統維持ラインとは分離し、解析に用いた。
【００１０】
異常行動の内容は、１）歩行中、絶えず頭部を小さく振る、２）突然、旋回運動をしたり、頭部を大きく後方にそらす行動をする、３）一般のラットは尾を持ち体を引き揚げた場合、四肢を一旦伸ばした後、少ししてその状態から逃れようと体をよじり出すが、この異常行動のラットは、体を持ち上げた瞬間に体を左右に大きくよじり（くねらせる）、時には持たれた尾を中心に、空中で円を描くように回転する。この異常行動は、生後２週の巣より這い出す時期（幼若期）に認められ始め、正常行動の個体とは区別がつくようになった。現在12ヶ月齢の老齢に達したものがいるが、その行動は基本的に上記の特徴を維持している。
２：行動学的解析
２-１：方法
(A)  新規環境テスト：LEC系統維持ラインから分離したLECの３個体（８週齢１頭、６週齢２頭）を対象に、通常の飼育ケージ(265Ｗ× 426Ｄ× 200Ｈ）内における行動を30分間直接観察した（ケージ交換場面）。また、同様の行動異常５個体（８週年齢）を対象にopen field（直径120cm, 20cmH）の円型容器での行動を観察した（open field場面）。対象として両テストにおいて同年齢のWKAH（Wistar King-Aptekman Hokkaido）５個体を用いた。
(B)  Water maze test：ウォーターメイズを用い、５個体（８週齢）の学習特性の検討を行った。対象として同年齢のWKAH５個体を用いた。
(C)  育児行動の解析：行動異常個体と正常個体を交配させ、妊娠率、育児行動ならびに繁殖効率を解析した。
２-２：結果
(A)  ケージ交換テストでは、正常対象であるWAKHラットでは主に壁に沿って頻繁に匂いを嗅ぐようにして動く「探索行動」が見られ、約８分間続いた。一方、行動異常ラットでは探索行動は見られず、ケージ内をランダムにかつ、早く動き回る行動が15分間続いた。周囲の状況に馴化させるとWAKHラットはあまり動き回らないが、行動異常ラットは数分後に頭を後ろに反らすような行動を取りながら、突然激しく動き回ることを繰り返した。Open field観察では対象WKAHに比較して、１）常に動き回る、２）立ち上がり探索行動が見られなかった。
(B)  Water maze testでは水に入れた途端に身体を旋回させるような動きを強く示し、水面に浮かぶ動作は見られず、グルグル水中にもぐりこむ運動を繰り返し、溺れた。
【００１１】
ＡＤＨＤを特徴づける症状として、精神遅滞が見られないにも関らず、１）注意集中困難、２）多動、３）衝動性を示すことが挙げられている。これらの特徴について、以上の結果を分析すると、生後哺乳時に正常同胞に比べ哺乳が遅れること、ケージ交換テストやopen field testのいずれの場面でも明確な探索行動が見られず、また本来ラットは高い接触走性(thigmotactic)を持ち、壁に沿って動く傾向が強いにもかかわらずランダムの移動を繰り返した等の点から注意欠陥の存在が推測される。また、ケージ交換テストにおいて活動が安定し落ち着くまで正常ラットに比べ２倍以上の時間を要し、さらに一旦安定した後も急激な活動を繰り返しており、このラットが多動性と衝動性とを示していることが示唆される。
【００１２】
また、行動解析で最も注目された点はwater maze testでの所見である。正常ラットの場合、ウォーターメイズに入れられると足場を見つけるまでランダムに泳ぎ続け、足場を見つけるとその位置を空間手掛りをもとに学習する。その結果、試行を繰り返す毎に要する時間が短縮し、最終的には目には見えていない足場に向けて泳ぐようになる。ところが、この発明の行動異常ラットはウォーターメイズに入れられた途端、パニック症状を引き起こし、身体を旋回させるような動きを強く示し泳ぐことすら困難になり溺れた。一般に動物は身体的な異常がない限り水に入れられた場合、無条件で水に浮くことができ泳げるため溺れることはない。しかし、行動異常ラットは先述したようにケージ内でも突然旋回運動を示すことがあり、メイズで示した行動はこれと同形のものであり、衝動性の高いものとみなすことができる。したがって、行動異常ラットが溺れたのは、過剰なストレスを受けたことにより正常な身体制御ないし行動統制ができなくなり旋回行動が強く引き出されたことに原因があると考えられる。こうした統制を逸脱した行動は衝動性による行動とみなすことができる。
(C)  繁殖行動の解析では、正常個体を雌にした場合は、雄が行動異常ラットでも正常ラットでも100％の妊娠率で、繁殖効率もほぼ同様な値を示した（表１）。しかし雌が行動異常の場合には、個体によるばらつきが大きく見られた。例えば、稀ではあるが雄雌ともに異常なペアでも正常ペアと変わらず妊娠、出産を行うものもあったが、多くの場合、雌が異常の場合には妊娠そのものが成立しなかった。また、妊娠育児行動の観察では、正常の雌は、妊娠すると床敷ですり鉢状の巣を作成し、その中で出産して産仔を一カ所に集め、授乳の際は巣の中に横臥し仔に授乳する。一方、行動異常の雌は、巣を作ることはなく、出産した仔はケージ内に分散され、出産を確認した時点（出産後12時間以内）でほとんどの産仔は死亡するまで満足な育児行動を取ることができず、繁殖効率は低値を示した。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
以上のとおり、繁殖行動に関しては、雄雌ともに異常であっても、正常個体のペアと変わりなく妊娠、出産を行うことができた。ところが雄が正常であっても雌が異常の場合は、妊娠そのものが成立しなかったり、仮に出産しても満足な育児行動を取ることができず繁殖効率が低値を示すものがあった。こうした組合わせによる違いが生じる原因は、繁殖行動における雄雌の働きの違い、あるいは行動の複雑さを反映しているものと考えられる。つまり、行動異常は行動として単純あるいは短時間で済む雄の繁殖行動（交尾）には影響をほとんど与えないが、複雑あるいは持続性を必要とする雌の繁殖行動（巣作り、保育、授乳等）に影響を与えるためと考えられる。また、異常行動の雌間の繁殖効率などに差が見られたことから、今回見出した行動異常は個体により発現する程度に差がある可能性が考えられる。
【００１５】
また、異常行動の雌の場合、妊娠率が低いのは受入姿勢（ロードシス）を維持できないために交尾が成立しない等の行動上の理由によるのか、もしくは胎児の発育が阻害される等の生理上の理由によるのかは明らかではない。しかし、育児行動についてみると正常雌ラットに比べ、異常行動ラットでは妊娠後の巣作り行動の欠如、出産後の産仔の分散や授乳姿勢が取れないなどの著明な違いがあり、この為繁殖率に差異が生じた。
３：遺伝特性の検討
３-１：方法
行動異状ラットの遺伝様式は、以下の交雑実験を行い仔における行動異常と正常の分離比を求めた。
【００１６】
・行動異常雌×行動異常雄
・行動異常雌×正常雄
・正常雌×行動異常雄
・（正常雌×行動異常雄）F1×（正常雄×行動異常雄）F1
(A)  Wilson 病の病因遺伝子と行動異常遺伝子との連鎖分析
（WKAH×行動異常）F1に行動異常ラットを戻し交配して得た57頭を、生後60週まで観察し黄疸発症の有無を調べ、黄疸未発症個体については血中セルロプラスミン活性をoxidase活性法により測定した。この結果から、黄疸発症もしくは、血中セルロプラスミン活性が低下したものをLEC型、黄疸未発症で血中セルロプラスミン活性の高いものをWKAH型として連鎖分析を行った。
(B)  毛色遺伝子と行動異常遺伝子との連鎖分析
上記(A)での戻し交配に用いた57個体について、行動異常と、野生色、シナモン色の毛色に注目して連鎖分析を行った。
３-２：結果
行動異常雌×行動異常雄の仔は雌雄ともすべて行動異常を示した。行動異常雌×正常雄、正常雌×行動異常雄の仔は雌雄ともすべて正常であった。（正常雌×行動異常雄）F2は正常：行動異常がほぼ３：１に分離した（表２）。また、連鎖分析において調べた戻し交配で得られた57頭を、行動異常に着目して分離比を調べると、正常：行動異常がほぼ１：１に分離した（表３）。以上よりこの行動異常形質は、常染色体単一性劣性遺伝様式をとることが示唆された。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
【表３】
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【００１９】
(A)  Wilson病の病因遺伝子と行動異常遺伝子との連鎖分析
戻し交配により得られた57頭の仔は、行動異常でLEC型が15頭、行動異常でWKAH型が17、正常でLEC型が９頭、正常でWKAH型が16頭であり、分離比はほぼ１：１：１：１に(0.2＜ｐ＜0.3)分かれた（表４）。これにより、肝炎の病因遺伝子と行動異常遺伝子は連鎖していないことが示唆された。
【００２０】
【表４】
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【００２１】
(B)  毛色遺伝子と行動異常遺伝子との連鎖分析
戻し交配の57頭を、毛色と行動異常について分離すると（表５）、行動異常でシナモン色が29、行動異常で野生色が３、正常でシナモン色が１、正常で野生色が24に分かれ、交叉率は7.02％となり、この行動異常形質がシナモン色を支配する遺伝子と連鎖している可能性が示唆された。
【００２２】
【表５】
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【００２３】
以上の遺伝学的解析から、この異常行動を支配する遺伝子は単一遺伝子であることが示された。このことは一つの遺伝子異常で多様な異常行動を誘発していることを示唆しており、この発明のモデル動物が、行動異常を遺伝子レベルで解析可能であることが確認された。
４：コンジェニックラットの作成
４-１：方法
遺伝学的検討により、この異常行動は常染色体単一劣性遺伝様式を取り、またWilson病の遺伝子とは連鎖していないことがわかった。そこで、肝炎遺伝子と、この異常行動の病因遺伝子を分離し、異常行動遺伝子のみを固定するため、ウィスター系のWKAH（Wistar King-Aptekman Hokkaido ）ラット（文献17）に、cross-intercross交配により異常行動遺伝子を導入し、コンジェニック系の作成を試みた。
４-２：結果
作成したコンジェニック系統ラットは、はLECで見られた肝炎・肝癌の発症は無く、行動異常の遺伝子のみを保持していた。
５：病理組織学的解析
５-１：方法
異常５個体と同年齢対象WKAH５個体とをエーテル麻酔後、左心室より４％paraformaldehydeを灌流することにより固定し、paraffin切片を作成した。通常のHematoxylin-eosin染色のほかにKluver-Barrera染色、Bodian染色を行った。また免疫染色としてglial fibrillary acidic protein(GFAP, DAKO, Denmark),ED-1(anti-rat microglia/macrophage, SEROTEC, England), Neurofilament triplet protein(DAKO)を行った。
５-２：結果
異常ラットの脳は大きさ重量とも対象ラットと同じであり、萎縮などは見られなかった。組織学的に大脳皮質、大脳基底核、小脳、脳幹運動核などの神経細胞に著変は見られず、また白質も正常対象ラットとの間に病的な差異は認められなかった。免疫染色でもaerrogliaやmicrogliaの活性化などは観察されなかった。
【００２４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、単一遺伝子の異常により行動異常を呈する多動性障害モデルラットが提供される。これによって、行動異常の分子機構が明らかにされるものと期待される。さらに異常行動に対する薬物療法の対象動物としても利用価値が高く、基礎的事項の解析と臨床応用との両面においてこの動物モデルは有用である。
【００２５】
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