(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９４として生命工学工業技術研究所に寄託されているブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２株に含有されるプラスミドシャトルベクターと同一であり、かつ、複製開始点、ｐＵＢ１１０に由来するＲｅｐタンパク質をコードする配列、ネオマイシン耐性遺伝子、ｐＵＣ１１９に由来するＣｏｌＥ１  ｏｒｉ領域、ｐＵＣ１１９に由来するアンピシリン耐性遺伝子を有し、かつ、配列番号１の塩基配列で示されるＰ２プロモーター、大腸菌由来のｌａｃオペレーター、ＳＤ配列、分泌シグナルペプチドをコードする配列、マルチクローニングサイト及びＨＳ遺伝子を含む領域の塩基配列が下図に示すものであり、かつ、その制限酵素地図が下図に示すものであるプラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２。
【図１】0003753945.tif 000008
【請求項２】
請求項１のプラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２を含有し、国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９４として生命工学工業技術研究所に寄託されているブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２株。
【請求項３】
請求項１に記載のプラスミドシャトルベクターにタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を組み込んでなる組換えプラスミドによって形質転換されたブレビバチルス・チョウシネンシス。
【請求項４】
ブレビバチルス・チョウシネンシスが、国際寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３として生命工学工業技術研究所に寄託されているブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５であること、を特徴とする請求項３に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス。
【請求項５】
請求項１に記載のプラスミドシャトルベクターにタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を組み込んでなる組換えプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体から抽出したプラスミドを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換すること、を特徴とする形質転換方法。
【請求項６】
請求項１に記載のプラスミドシャトルベクターにタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を組み込んでなる組換えプラスミドによって形質転換されたブレビバチルス属細菌を培養し、その培養液に分泌、蓄積された目的タンパク質を採取すること、を特徴とするタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクターおよび該プラスミドシャトルベクターを用いたブレビバチルス属細菌の形質転換方法に関する。また特には、ブレビバチルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、大腸菌ではその発現が著しく抑えられる遺伝子発現調節領域を持つブレビバチルス属細菌でその遺伝子発現に適したプラスミドシャトルベクターに関する。更には、該形質転換方法により形質転換された形質転換体を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
鵜高らは、菌体外に多量のタンパク質を分泌し、また菌体外プロテアーゼ活性が弱いという大腸菌、枯草菌にない優れた特徴を持つブレビバチルス属（従来のバチルス属の分類から分離）細菌を宿主とする遺伝子組み換えタンパク質の発現系の開発に成功した。（特許第２０８２７２７号、特開昭６２−２０１５８３号公報、Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９−１２４５（１９８７）、鵜高重三、日本農芸化学会誌６１，６６９−６７６（１９８７）、Ｔａｋａｏ，Ｍ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，７５−８０（１９８９）、Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８６，３５８９−３５９３（１９８９））。また、これまでにブレビバチルス属細菌を宿主とした発現系によるα−アミラーゼ（特許第２０８２７２７号）、ヒト上皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦ）（特許第２７８７５８５号）の生産などが報告されている。
【０００３】
一方、これまでに、ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌６１，６６９−６７６（１９８７））、ｐＮＨ３００（Ｓｈｉｇａ，Ｙ．ら，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５８，５２５−５３１（１９９２））、ｐＮＨ４００（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｔ，ら，Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，７４５−７４９（１９９５））、ｐＨＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＴ系プラスミド（特許２７２７３９１号）などが報告されている。特に、本発明者らは、ブレビバチルス属細菌の形質転換に有用なプラスミドベクターとしてｐＮＹ３０１他のｐＮＹ系プラスミド（特開平１０−２９５３７８号公報）を特許出願した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、ブレビバチルス属細菌を宿主として用いるタンパク質の分泌生産系は、遺伝子組換えによるタンパク質生産において有用な系のひとつである。しかしながら、従来、ブレビバチルス属細菌の形質転換効率は、大腸菌の形質転換効率に比べて低く、そのため大腸菌に比較するとブレビバチルス属細菌を用いた組換え遺伝子発現プラスミドの構築は困難であるという欠点があった。例えば、エレクトロポレーション法（Ｔａｋａｇｉ，Ｔ．ら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１９８９））を用いた場合、大腸菌での形質転換効率は１０10ＣＦＵ／ｕｇＤＮＡに達するが、ブレビバチルス属のブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）（従来は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）。Ｓｈｉｄａ  Ｏ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６，９３９−９４６（１９９６）において分類学的位置の変更があった。）の場合、１０7ＣＦＵ／ｕｇＤＮＡに過ぎなかった。またエレクトロポレーション法以外の方法を用いた場合、ブレビバチルス属細菌の形質転換効率は更に低下することが知られていた。
【０００５】
特に複雑な高次構造を持ったタンパク質、例えば１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなるコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）によって生産されるコレラトキシン（ＣＴ）（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｉｎｔｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２４；７６０−７６９（１９７９））などのタンパク質をコードした遺伝子によるブレビバチルス属細菌の形質転換および該形質転換体によるタンパク質生産には、これまで多大な困難があった。
【０００６】
この課題に対する解決策のひとつとして、形質転換操作が容易な他の宿主細胞、例えば大腸菌内でも複製可能なプラスミドベクター（以下、「シャトルベクター」という。）を用い、まず、その宿主細胞を用いて組換え遺伝子発現プラスミドの構築を行い、更に、その組換え遺伝子発現プラスミドを用いてブレビバチルス属細菌の形質転換をエレクトロポレーション法などにより行う方法が考えられる。
【０００７】
シャトルベクターおよびシャトルベクターを用いた形質転換方法は、当業者に公知の技術である。たとえば大腸菌と枯草菌間のシャトルベクターとしては、特許公開昭６３−１９８９８６号公報、特許公開２０００−１９７４９１号公報などが報告されている。しかしながら、これまでブレビバチルス属細菌の遺伝子組換えによる形質転換作業および該形質転換体による組換え遺伝子発現に利用可能なプラスミドシャトルベクターおよび該プラスミドシャトルベクターを用いたブレビバチルス属細菌の形質転換方法は知られていなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ブレビバチルス属細菌を宿主とした発現系において、目的タンパク質を菌体外に分泌するという有用性に着目し、また、上記した欠点を解決する新規宿主−ベクター系の開発の必要性を痛感し、大腸菌およびブレビバチルス属細菌を宿主とすることができ、遺伝子組換えに使用可能な新規プラスミドシャトルベクターを開発することとした。
【０００９】
そこで上記目的を達成するため、本発明者らは、数多くのプラスミドベクターの中から特に本発明者らが既に特許出願したプラスミドベクターｐＮＹ３０１がブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のプロモーター及び分泌シグナル配列を含有している点に改めて着目し、このプラスミドベクターｐＮＹ３０１をもとに、各種のＤＮＡ配列をＰＣＲ法等によって合成したりあるいは既知の配列から切り出したりし、更にこれらのＤＮＡ断片を該プラスミドベクターに組み込み、組み込まれることを確認しただけでなく、得られたプラスミドによる形質転換の確認、形質転換体における発現の確認等、デリケートにして莫大な数の各種処理、操作を試行錯誤した結果、遂に目的とする新規なプラスミドシャトルベクターの創製に成功した。
【００１０】
そして、このようにして創製するのに成功した新規プラスミドシャトルベクターを大腸菌およびブレビバチルス属細菌に導入し、得られた細菌を培養したところ、何れの宿主においても該プラスミドシャトルベクターの複製が行われた。また該プラスミドシャトルベクターを用いた組換え遺伝子発現において、ブレビバチルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、大腸菌ではその発現が著しく抑えられることを見出したこと、更に他の公知の方法では、ブレビバチルス属細菌の形質転換体が得られない場合においても、該プラスミドシャトルベクターの使用により形質転換が可能なことを確認し本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、上記課題を解決するためにブレビバチルス属細菌の遺伝子組換えによる形質転換および該形質転換体によるタンパク質生産に有用な大腸菌とブレビバチルス属細菌との間のプラスミドシャトルベクターおよび該プラスミドシャトルベクターを用いた形質転換方法を提供する。特には、ブレビバチルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、大腸菌ではその発現が著しく抑えられる遺伝子発現調節領域を持つブレビバチルス属細菌での遺伝子発現およびタンパク質生産に適したプラスミドシャトルベクターを提供する。更に該プラスミドシャトルベクターを用いたブレビバチルス属細菌の形質転換方法、および該プラスミドシャトルベクターを用いて形質転換されたブレビバチルス属細菌を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００１３】
本発明のプラスミドシャトルベクターは、大腸菌およびブレビバチルス属細菌のいずれにおいても複製可能なプラスミドシャトルベクターであり、ブレビバチルス属細菌において機能し得るプロモーター、およびブレビバチルス属細菌および大腸菌に対する選択マーカー遺伝子をコードしたＤＮＡ配列を有する。
【００１４】
本発明のプラスミドシャトルベクターは、大腸菌およびブレビバチルス属細菌で自律複製可能である。したがって、大腸菌を用いて本発明のプラスミドシャトルベクターへのＤＮＡ断片の挿入などの操作により組換え遺伝子発現プラスミドを構築することができ、更に該組換え遺伝子発現プラスミドを用いてブレビバチルス属細菌の形質転換を行うことができる。
【００１５】
本発明のプラスミドシャトルベクターが有するブレビバチルス属細菌で機能し得るプロモーターは、ブレビバチルス属細菌で機能するものであれば、特に限定されないが、好ましくはブレビバチルス属細菌に由来するプロモーターである。特に好ましい例としてブレビバチルス・ブレビス４７（従来は、バチルス・ブレビス４７）由来のＭＷＰプロモーター領域（特公平１−５８９５０号公報、特公平７−１０８２２４号公報）、または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８６３）（従来は、バチルス・ブレビス、本菌株は、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）と同一菌株である。）由来のＨＷＰプロモーター領域（特開平４−２７８０９１号公報、特開平６−１３３７８２号公報）に含まれるプロモーター、例えばＰ２プロモーター（配列番号１：図１）などを挙げることができる。
【００１６】
更に本発明のプラスミドシャトルベクターは、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターの３′末端側にリボソーム結合領域（ＳＤ配列）、発現タンパク質を分泌するためのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。ＳＤ配列は、例えばＳＤ１（配列番号３：図３）やＳＤ２（配列番号４：図４）などのブレビバチルス・チョウシネンシスのＨＷＰ遺伝子発現調整領域に由来する配列を用いることができる。また、分泌シグナルペプチドとしては、例えば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８６３）のＨＷＰプロモーター領域に含まれるシグナルペプチドなどを使用することができる。特に好ましい例として、Ｒ２Ｌ６型などの改変ＨＷＰシグナル配列（特開平７−１７０９８４号公報）を挙げることができる（このＲ２Ｌ６型改変シグナルペプチドについて、そのアミノ酸配列を配列番号５に示し、それをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２１に示す。また両者の配列を図５に示す。図中、上段に塩基配列、下段にアミノ酸配列を示す。）
【００１７】
また本発明のプラスミドシャトルベクターは、細菌中での複製に必要な複製制御領域をコードするＤＮＡ配列を含む。複製制御領域は、ブレビバチルス属細薗および大腸園の両方に対して同ーのものを使用しても、各々に対して異なったものを使用しても構わない。ブレビバチルス属細菌における複製制御領域は、Ｒｅｐタンパク質遺伝子と複製開始点からなる。ブレビバチルス属細菌において複製制御領域として機能し得る配列は、ブレビバチルス属細菌において複製増殖するプラスミドに含まれ、プラスミドの複製制御領域として作用するＤＮＡ配列であるならば、特に限定されないが、特に好ましい例としてプラスミドｐＵＢ１１０由来のＲｅｐタンパク質遺伝子および複製開始点をコードするＤＮＡ配列を挙げることができる。
【００１８】
また大腸菌においては複製制御領域として複製開始点が必要である。大腸菌において機能し得る複製開始点をコードするＤＮＡ配列としては、大腸菌において複製増殖するプラスミドに含まれ、プラスミドの複製開始点として作用するＤＮＡ配列であるならば、特に限定されないが、好ましくは、プラスミドの複製開始点として作用するＯＲｌ領域を含むＤＮＡ配列である。特に好ましくは、大腸菌を用いた遺伝子組換え操作に通常用いられている、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などのｐＵＣ系又はｐＢＲ３２２などのプラスミドベクターのＯＲＩ領域をコードするＤＮＡ配列である。
【００１９】
更にブレビバチルス属細菌と大腸菌のいずれにおいても機能し得る複製制御領域をコードするＤＮＡ配列として、グラム陽性菌においてもグラム陰性菌においても機能し得る複製制御領域であるｐＬＳ１／ｐＥ１９４プラスミドファミリー（Ｄｅｌ  Ｓｏｌａｒ，Ｇ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，７８９−７９６（１９９３））に属するプラスミドの複製制御領域を挙げることができる。たとえばラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus  acidophilus）由来のプラスミドｐＬＡ１０６のｏｒｉ、ＲｅｐＡ、ＲｅｐＢで構成される複製制御領域（Ｓａｎｏ，Ｋ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４８，２２３−２２６（１９９７））をコードするＤＮＡ配列などが使用可能である。
【００２０】
更に、本発明のプラスミドシャトルベクターが有するブレビバチルス属細菌および大腸菌に対する選択マーカーとして機能し得る配列は、ブレビバチルス属細菌および大腸菌の両方に対して同一のものを使用しても、各々に対して異なったものを使用しても構わない。選択マーカーとして機能し得る配列として、薬剤耐性遺伝子を使用することができる。例えば、ブレビバチルス属細菌に対しては、ブレビバチルス属細菌並びにその近縁関係にあるバチルス属細菌などに由来の薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ配列などを使用することができる。特に好ましい例として、プラスミドベクターｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号公報）に含まれるネオマイシン耐性遺伝子やｐＨＴ１１０に含まれるエリスロマイシン耐性遺伝子（特許２７２７３９１号）を挙げることができる。また、大腸菌に対しては、例えば、公知の大腸菌由来の薬剤耐性遺伝子であるカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などをコードするＤＮＡ配列が使用可能である。更にブレビバチルス属細菌と大腸菌のいずれにおいても機能し得る薬剤耐性遺伝子としてゼオシン耐性遺伝子などが使用可能である。
【００２１】
更に本発明のプラスミドシャトルベクターは、組換え遺伝子の大腸菌での発現を抑える機能を持つＤＮＡ配列を含むことができる。たとえばｌａｃＩ遺伝子を有する大腸菌の場合、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーター配列の３’末端側に大腸菌由来のｌａｃオペレーター配列（配列番号２：図２）を含むことができる。
【００２２】
本発明のプラスミドシャトルベクターは新規であり、例えばｐＮＣＭＯ２は、大きさが５，２２４ｂｐのプラスミドベクターである。ｐＮＣＭＯ２の制限酵素地図およびプロモーターを含む一部の塩基配列を図２１に示した。ｐＮＣＭＯ２のプロモーター領域は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨＷＰプロモーター領域に由来するＰ２プロモーター、大腸菌に由来するｌａｃオペレーター、ＳＤ配列、分泌シグナルペプチドをコードする配列としてＲ２Ｌ６型改変シグナルペプチドをコードする配列、マルチクローニングサイトおよびターミネーターとしてＨＳ遺伝子（特開平９−２２４６７７号公報）を含む。該マルチクローニングサイトは、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトをクローニングサイトとして使用することができる。
【００２３】
また、プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２は、ブレビバチルス属細菌に対する選択マーカー遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子、ブレビバチルス属細菌中での複製に必要なｐＵＢ１１０由来のＲｅｐタンパク質遺伝子と複製開始点、大腸菌の複製開始点としてｐＵＣ１１９に由来するＣｏｌＥ１  ｏｒｉ領域、大腸菌に対する選択マーカー遺伝子としてｐＵＣ１１９に由来するアンピシリン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を持つ。
【００２４】
本発明のプラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の構築には、ｐＮＹ３０１、ｐＮＨ３２６およびｐＮＵ２１０などを用いる。プラスミドｐＮＹ３０１は、特開平１０−２９５３７８号において、プラスミドｐＮＨ３２６は、Ｋａｊｉｎｏ，Ｔ．，ら．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，６３８−６４２（２０００）において、またｐＮＵ２１０は、Ｕｄａｋａ，Ｓ．，ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２３−３３（１９９３）において、それぞれ公開されており公知のプラスミドである。また、その他の本発明のプラスミドシャトルベクターの構築に使用されるプラスミドは、市場で購入することが可能である。
【００２５】
プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２を保持するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２は、平成１２年１２月１２日通商産業省工業技術院（現、経済産業省産業技術総合研究所）生命工学工業技術研究所の特許微生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９４が付されている。
【００２６】
本発明の発現プラスミドの構築に用いる宿主は、大腸菌に属する菌株ならば特に限定されないが、特に好ましい例として大腸菌ＪＭ１０９を挙げることができる。大腸菌ＪＭ１０９は、公知の菌株であり市場で購入することが可能である。
【００２７】
大腸菌を用いて本発明のプラスミドシャトルベクターから組換え遺伝子発現プラスミドを構築する方法は、当業者に公知の標準的な分子生物学的技術に基づいた方法を適宜使用することができる。例えば、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラポラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））に記載の方法などが挙げられるが、具体的な詳細は、実施例に示した。
【００２８】
本発明の組換え遺伝子の発現に用いる宿主には、ブレビバチルス属細菌のいずれの株に属するものでも使用できるが、好ましくはブレビバチルス・チョウシネンシスである。特に好ましい例として、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８６３）やその変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）などを挙げることができる。
【００２９】
本発明のシャトルベクターと大腸菌により構築された組換え遺伝子発現プラスミドを用いたブレビバチルス属細菌を形質転換する方法には、エレクトロポレーション法などの当業者に公知の形質転換方法を使用することができる。
【００３０】
本発明の形質転換体の培養に用いる培地には炭素源、窒素源の他、無機塩類が必要に応じて含められる。また、糖と無機塩類を主とする合成培地を用いて培養してもよい。栄養要求性を示す菌株を用いる場合には、その生育に必要な栄養物質を培地に添加することが望ましい。さらに、必要であれば、培地に抗生物質や消泡剤などを加えてもよい。
【００３１】
また培養条件は、培地の初発ｐＨを５．０〜９．０、好ましくは６．５〜７．５に調節する。培養温度は、通常１５℃〜４２℃、好ましくは２４〜３７℃であり、培養時間は通常１６〜３６０時間、好ましくは２４〜１４４時間である。これにより本発明の方法により形質転換されたブレビバチルス属細菌は、培養液中にタンパク質を生成、蓄積する。
【００３２】
培養終了後、培養物からの目的タンパク質の採取は、溶媒抽出、限外濾過、硫安分画、ＨＰＬＣ、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動などの当業者に公知のタンパク質精製方法を適宜組合わせることにより可能である。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
【実施例１】
プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の構築
（１）プラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１の構築
プラスミドベクターｐＵＣ１１９をテンプレートとしてプライマー１（配列番号６：図６）およびプライマー２（配列番号７：図７）を用いてＰＣＲ法により増幅し、得られたＰＣＲ産物をＮｓｉＩで切断し、大腸菌の複製開始点であるＣｏｌＥ１  ｏｒｉ領域とアンピシリン耐性遺伝子を含む約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００３５】
ＰＣＲは、ＰＣＲキット（宝酒造社製）を使用し、プライマーを各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位、ｄＮＴＰ２００μＭ、ｐＵＣ１１９テンプレートＤＮＡ  １ｎｇ、１００μｌ  Ｔａｑ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭ  Ｍｇ++、５０ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を混合し、９６℃で３０秒保持した後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）、プライマーのアニーリング（５４℃、６０秒）、プライマーの伸長（７０℃、６０秒）を２５サイクルさせることによって行った。以下、この条件を条件１とする。
【００３６】
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨＷＰプロモーター領域由来のＰ５プロモーターおよび分泌シグナルペプチドとして天然型ＨＷＰシグナルペプチド配列を含むプラスミドベクターｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７６号）のＳｓｅ８３８７Ｉサイトに先に得た約２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）をＣａＣｌ2法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １，  ８２，  （１９８９））により形質転換し、得られたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドは、大腸菌とブレビバチルス属細菌において複製可能な新規なプラスミドシャトルベクターであり、ｐＮＣ３０１と命名した。
【００３７】
プラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨＷＰプロモーター領域由来のＰ５プロモーター、ブレビバチルス属に対する選択マーカー遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子、大腸菌の複製開始点としてＣｏｌＥ１  ｏｒｉ領域、大腸菌に対する選択マーカー遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子を含む。また更に分泌シグナルペプチドをコードする配列として天然型ＨＷＰシグナルペプチドをコードする配列を含む。（図２２）
以下、図２３を参照しながら、プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の構築について説明する。
【００３８】
（２）プラスミドｐＮＣの構築
プラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１よりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のＨＷＰプロモーター領域を除いたｐＮＣ３０１全長をプライマー３（配列番号８：図８）とプライマー４（配列番号９：図９）を用いた条件１のＰＣＲ法により増幅し、増幅された約５ｋｂｐの断片をＢｃｌＩで処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりセルフライゲーションを行った。このＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９にＣａＣｌ2法で形質転換し、プラスミドｐＮＣを得た。ＰＣＲの反応条件は、（変性温度：９４℃〜６０ｓｅｃ、アニール温度：５４℃−１２０ｓｅｃ、ＤＮＡ鎖伸長温度：７０℃〜１８０ｓｅｃを１サイクルとして２５回繰り返す）とした。
【００３９】
（３）プラスミドｐＧＥＭ−ＴＰ２の構築
プラスミドｐＮＵ２１０（Ｕｄａｋａ，Ｓ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２３−３３（１９９３））に含まれるＨＷＰプロモーター領域由来のＰ２プロモーターをコードするＤＮＡ配列をプライマー５（配列番号１０：図１０）とプライマー６（配列番号１１：図１１）を用いて条件１のＰＣＲ法により増幅し、約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。プライマー６にはｌａｃオペレーター配列が含まれるため、このＤＮＡ断片はＰ２プロモーターの３′末端側にｌａｃオペレーター配列を含む。このＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９をＣａＣｌ2法により形質転換し、得られたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラスミドを抽出し、ｐＧＥＭ−ＴＰ２を得た。
【００４０】
（４）プラスミドｐＧＥＭ−ＴＰ２+の構築
プラスミドｐＮＨ３２６（Ｋａｊｉｎｏ，Ｔ．，ら．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６６，  ６３８−６４２（２０００））に含まれるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨＷＰプロモーター領域のＳＤ１とＳＤ２配列とＲ２Ｌ６型の改変ＨＷＰシグナルペプチドをコードする配列（特開平７−１７０９８４号）（配列番号５、配列番号２１：図５）およびマルチクローニングサイトを含むＤＮＡ配列を、プライマー７（配列番号１２：図１２）とプライマー８（配列番号１３：図１３）を用いて、条件１の条件でＰＣＲ法により増幅し、約２７０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｓｉＩとＨｉｎｄIIIで処理し、ｐＧＥＭ−ＴＰ２のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。このＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９をコンピテントセル法により形質転換し、ｐＧＥＭ−ＴＰ２+を得た。
【００４１】
（５）プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の構築
更にｐＧＥＭ−ＴＰ２+をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理し、得られた約４００ｂｐの断片をｐＮＣのＢｃｌＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９にＣａＣｌ2法で形質転換した。得られたアンピシリン耐性株からプラスミドを抽出し、新規なプラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２を得た（図２３）。プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の構築の概要を図２２、図２３に示す。このようにして得た新規プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の制限酵素地図及びプロモーター等を含む一部の塩基配列を図２１に示した。上記と同様にして本プラスミドシャトルベクターを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）を形質転換し、得られた形質転換体（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ  ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２）をＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９４として生命研に国際寄託した。
【００４２】
【実施例２】
ｐＮＣＭＯ２、ｐＮＣ３０１の形質転換効率
ｐＮＣＭＯ２、ｐＮＣ３０１の形質転換効率を表１に示す。両ベクターの大腸菌ＪＭ１０９に対する形質転換効率は十分に高いものであった。ｐＮＣＭＯ２のブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に対する形質転換効率はｐＮＣ３０１に比べて低いが、構築済みのプラスミドを挿入する目的には十分高いものであった。なお、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換はＣａＣｌ2法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｒｅｓｅ，１，８２，（１９８９））を用いて行い、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換はエレクトロポレーション法（Ｔａｋａｇｉ，Ｈ．ら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１９８９））を用いて行った。エレクトロポレーションはジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、１０００オーム、２５μＦ、１．８ｍｓｅｃの条件で行った。
【００４３】
0003753945.tif 000002
【００４４】
【実施例３】
プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２とプラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１のＢＬＡの生産での比較
【００４５】
（１）組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびｐＮＣ３０１ＢＬＡの構築
バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来α−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子をｐＨＹ４６３１（Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６９，１２３９−１２４５（１９８７））をテンプレートとしてプライマー９（配列番号１４：図１４）およびプライマー１０（配列番号１５：図１５）を用いてＰＣＲ法で増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し、ＢＬＡ遺伝子を含んだ約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。実施例１で構築したプラスミドベクターｐＮＣＭＯ２およびｐＮＣ３０１を制限酵素ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し、先に得たＢＬＡ遺伝子を含んだ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、およびｐＮＣ３０１ＢＬＡを得た（図２４）。更にプラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびｐＮＣ３０１ＢＬＡ、各々を用いてＣａＣｌ2法により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、ｐＮＣ３０１ＢＬＡ各々を保持する形質転換体、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡを得た。
また、ＢＬＡ遺伝子としては、ＢＬＡ遺伝子を含有するプラスミド、例えばｐＨＴ１１０ＢＬＡ（特許第２７２７３９１号）から切り出したＤＮＡ断片を使用することも可能であった。
【００４６】
（２）大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよび大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡによるＢＬＡの生産
それぞれの形質転換体を、２ｘＹＴ培地を１．５ｍｌ分注した培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液を、菌体を破砕する為に、ソニケーターで３０秒間処理し、その処理液中のアミラーゼ活性を可溶性澱粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０（１９７３））を用いて測定した（図２５）。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡは、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡと比較すると約７０分の１のアミラーゼしか生産せず、大腸菌における遺伝子発現が効率的に抑制されていた。
【００４７】
また、３％澱粉を含むＬＡ寒天培地上に大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡを植菌し３７℃で一晩培養し、コロニーを形成させ、それぞれのハロー形成能および生育を比較した（図２６：図面代用写真）。その結果、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡは、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡと比較すると、コロニー周囲のハローのサイズが小さいことから、ＢＬＡの発現が抑えられていた。また、生育したコロニーの大きさから大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡのほうが増殖が早いことが判明した。これは大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡではＢＬＡの発現が効率よく抑えられており、その結果菌株にかかるストレスが低減され増殖がよくなったためと考えられる。
【００４８】
更に大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡを１ｍＭ  ＩＰＴＧを含んだ寒天培地で培養したところ形成されたハローの大きさが、ＩＰＴＧを含まない寒天培地上で培養した同菌株と比較してほとんど変わらなかった（図２７：図面代用写真）。ｐＮＣＭＯ２が持つ大腸菌での発現抑制効果は、ｌａｃオペレーターの挿入する抑制効果に加えて、Ｐ２プロモーター活性がＰ５プロモーター活性と比較すると大腸菌中で非常に低いことによると考えられた。
【００４９】
（３）ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３０１ＢＬＡによるＢＬＡの生産
（１）で得たプラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびｐＮＣ３０１ＢＬＡ各々でブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５をエレクトロポレーション法で形質転換し、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、ｐＮＣ３０１ＢＬＡ各々を保持する形質転換体、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３０１ＢＬＡを得た（図２４）。エレクトロポレーションは、ジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、１０００オーム、２５μＦ、１．８ｍｓｅｃの条件で行った。各々の形質転換体を、１．５ｍｌのＴＭＮ培地を含んだ試験管に接種し、３０℃で２日間振とう培養した。この培養液を遠心分離し、その培養上清のアミラーゼ活性を可溶性澱粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０（１９７３）を用いて測定した（図２８）。ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３０１ＢＬＡの約２２倍のアミラーゼを生産したことから、ｐＮＣＭＯ２はブレビバチルス属細菌中においてｐＮＣ３０１よりも遥かに効率的に遺伝子を発現できることが示された。
【００５０】
【実施例４】
組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＹ３２６ＣＴの構築
（１）ＣＴＡ遺伝子およびＣＴＢ遺伝子の取得
コレラ菌染色体ＤＮＡ（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３０６，５５１−５５７（１９８３））をテンプレートとして、合成した２種類のプライマー１１（配列番号１６：図１６）、プライマー１２（配列番号１７：図１７）を用いてコレラトキシン（ＣＴ）のＡサブユニット遺伝子（ＣＴＡ）（０．７ｂｐ）をＰＣＲ法で増幅した。同様に２種類のプライマー１３（配列番号１８：図１８）、プライマー１４（配列番号１９：図１９）を用いてＣＴのＢサブユニット遺伝子（ＣＴＢ）（０．３ｂｐ）を増幅した。
【００５１】
（２）プラスミドｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＡおよびプラスミドｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と先に得たＣＴＡ遺伝子あるいはＣＴＢ遺伝子をＴ４リガーゼを用いて連結し、ＣＴＡ遺伝子、ＣＴＢ遺
伝子を保持するプラスミドｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＡ、ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢを得た。
【００５２】
（３）プラスミドｐＮＹ３２６ＣＴＡの構築
プラスミドｐＮＹ３２６（ｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号）のシグナルペプチドをＲ２Ｌ６型（配列番号５、２１：図５）に変換したもの）をＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで処理し３．６ｋｂｐの断片を得た。さらに、ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＡをＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで処理し、ＣＴＡ遺伝子を含有する０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得、先に得た３．６ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５をエレクトロポレーション法で形質転換し、得られたネオマイシン耐性株よりプラスミドを抽出し、ＣＴＡ遺伝子を保持するｐＮＹ３２６ＣＴＡを得た。
【００５３】
（４）プラスミドｐＮＹ３２６ＣＴＢの構築
同様の方法でｐＮＹ３２６をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理して３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらにｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理してＣＴＢ遺伝子を含有する０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得、先に得た３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を形質転換し、ネオマイシン耐性株を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してＣＴＢ遺伝子を保持するプラスミドｐＮＹ３２６ＣＴＢを得た。
【００５４】
（５）ｐＮＹ３２６ＣＴによるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換の試行
ｐＮＹ３２６ＣＴＢをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで処理し、４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらに、ｐＮＹ３２６ＣＴＡをテンプレートとして２種類のプライマー１５（配列番号２０：図２０）、プライマー１１（配列番号１６：図１６）を用いて、ＣＴＡ遺伝子をＳＤ２配列を含めた形（ＳＤ−ＣＴＡ遺伝子（０．８ｋｂｐ））でＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで処理して０．４ｋｂｐの断片を得、先に得たｐＮＹ３２６ＣＴＢ由来の４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５をエレクトロポレーション法で形質転換し、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ寒天培地（１％ペプトン、０．２％酵母エキス、０．５％肉エキス、１％グルコース、０．００１％  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％  ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、０．０００１％  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）に塗布をして、ネオマイシン耐性を持つ株を選択しようとしたが、耐性株が得られなかった。エレクトロポレーションはジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、１０００オーム、２５μＦ、１．８ｍｓｅｃの条件で行った。
【００５５】
【実施例５】
組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴの構築
（１）プラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴＢの構築
ｐＮＣＭＯ２をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理して５．２ｋｂｐの断片を得た。さらに、ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理してＣＴＢ遺伝子を含有する０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得、先に得た５．２ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した（図２９）。連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、プラスミドを抽出してＣＴＢ遺伝子を保持するｐＮＣＭＯ２ＣＴＢを得た。
【００５６】
（２）プラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴの構築
ｐＮＣＭＯ２ＣＴＢをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで処理し５．５ｋｂｐの断片を得た。実施例４（５）で得たＳＤ−ＣＴＡ遺伝子（０．８ｋｂｐ）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで処理して０．８ｋｂｐの断片を回収し、先に得た５．５ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した（図２９）。連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してＣＴＢ遺伝子を保持するプラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴを３株得た。何れの株もシーケンスの結果ＣＴＢ遺伝子が正しくプラスミドに連結されていることが解った。ここで得た株を大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＣＴとした。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＣＴより抽出したｐＮＣＭＯ２ＣＴで、エレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を形質転換したところ、同プラスミドを保持する形質転換体が多数個得られた。得られた株をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴとした。エレクトロポレーションは、ジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、１０００オーム、２５μＦ、１．８ｍｓｅｃの条件で行った。
【００５７】
（３）ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴによるＣＴの発現
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴを中試験管を用いてネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地３ｍｌで３０℃で２日間振とう培養を行い、その培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルー染色、およびウサギＣＴポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により解析を行った。ＣＴＡおよびＣＴＢの推定分子量は、それぞれ２８ｋＤａ、１２ｋＤａであり、それぞれが相当の分子量の位置に染色バンドを示した。バンドの濃さよりＣＴＡの分泌生産量は７０ｍｇ／ｌ、ＣＴＢの分泌生産量は３０ｍｇ／ｌと推定した。そのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを図面代用写真に示す（図３０）。また、培養上清をＣＴを特異的に結合するガラクトース樹脂を用いて精製したあと（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６，７１−７９（１９９４））。精製分画を加熱処理せずに泳動した場合、バンドが約９０ｋＤａの位置にシフトしたことから、発現されたサブユニットは１Ａ５Ｂ構造を取っている事が推測された。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクターが提供される。また本発明のプラスミドシャトルベクターは、実施例３におけるＢＬＡ遺伝子の発現の結果が示すように大腸菌において遺伝子の発現が抑制され、ブレビバチルス・チョウシネンシス中において効率的な遺伝子の発現を行うことができる。更に実施例４および実施例５におけるＣＴの発現により示されたように、本発明におけるプラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２は、特に複雑な遺伝子構築を必要とする組換え遺伝子発現プラスミドの構築および該組換え遺伝子発現プラスミドにより形質転換された形質転換体によるタンパク質の生産に有用である。
【００５９】
【配列表】
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0003753945.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐ２プロモーターを示す。
【図２】Ｌａｃオペレータ配列を示す。
【図３】ＳＤ配列（ＳＤ１）を示す。
【図４】ＳＤ配列（ＳＤ２）を示す。
【図５】Ｒ２Ｌ６型の改変シグナルペプチド（上段に塩基配列、下段にアミノ酸配列）を示す。
【図６】ＰＣＲクローニングプライマー１を示す。
【図７】ＰＣＲクローニングプライマー２を示す。
【図８】ＰＣＲクローニングプライマー３を示す。
【図９】ＰＣＲクローニングプライマー４を示す。
【図１０】ＰＣＲクローニングプライマー５を示す。
【図１１】ＰＣＲクローニングプライマー６を示す。
【図１２】ＰＣＲクローニングプライマー７を示す。
【図１３】ＰＣＲクローニングプライマー８を示す。
【図１４】ＰＣＲクローニングプライマー９を示す。
【図１５】ＰＣＲクローニングプライマー１０を示す。
【図１６】ＰＣＲクローニングプライマー１１を示す。
【図１７】ＰＣＲクローニングプライマー１２を示す。
【図１８】ＰＣＲクローニングプライマー１３を示す。
【図１９】ＰＣＲクローニングプライマー１４を示す。
【図２０】ＰＣＲクローニングプライマー１５を示す。
【図２１】プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の制限酵素地図を示す。
【図２２】プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の構築の過程を示す。
【図２３】同上続きを示す。
【図２４】組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびｐＮＣ３０１ＢＬＡの構築の過程を示す。
【図２５】大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよび大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡの生産性を示す。
【図２６】大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよび大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡによるハロー形成能および生育を示す図面代用写真である。
【図２７】大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡによるＢＬＡ発現に対するＩＰＴＧの効果を示す図面代用写真である。
【図２８】ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３０１ＢＬＡによるＢＬＡの生産性を示す。
【図２９】組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴの構築の過程を示すものである。
【図３０】形質転換体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴの培養物のクマシーブリリアントブルー染色像およびウェスタンブロッティング像を示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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