(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼラチンとスクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸とから成る医療現場で直接架橋させて用いるための医用材料。
【請求項２】
生体接着剤、止血材、血管塞栓材、動脈瘤の封止材のいずれかに適用される請求項１記載の医用材料。
【発明の詳細な説明】
【０００1】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に医療材料として適用されるゼラチンゲルの提供に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゼラチンは生体に含まれるコラーゲンから得られるタンパク質として知られ、安全性に優れ、また、生体内で分解、消失する特性を活かし、医療分野ではカプセル剤をはじめとして多岐に応用されている。また、かかるゼラチンをゲル化し、生体に対する接着剤、止血剤等として用いる試みもなされている。
例えば、術時に患部にゼラチン水溶液とホルムアルデヒド、レゾルシノールを加え、生体上でゼラチンをゲル化させて接着剤として用いる方法がフランスＥ．Ｈ．Ｓ社のキット（商品名：ＧＲＦ  ｇｌｕｅ）として臨床に利用され、また、同様に患部上でゼラチンとポリ−Ｌ−グルタミン酸をカルボジイミドで架橋してハイドロゲルを作成し、同用途に適用することも試みられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ゼラチンは水溶性高分子であるため、水中では一定の形態を保つことができず、従って、前記したようにホルムアルデヒドやレゾルシノールで架橋したり、ゼラチンとポリ−Ｌ−グルタミン酸をカルボジイミドで架橋してハイドロゲルを作成することが試みられているのであるが、これらの架橋剤には毒性の問題があり、特に、患部上で直接架橋させる前記のような接着剤、止血材等の用途においてはこれらの架橋剤が周囲の組織を障害しないよう細心の注意を払う必要がある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、かかる点、毒性の少ない医用材料を提供するもので、ゼラチンとスクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸とから成る医療現場で直接架橋させて用いるための医用材料。生体接着剤、止血材、血管塞栓材、動脈瘤の封止材のいずれかに適用される医療現場で直接架橋させて用いるための医用材料の提供に関する。
即ち、本発明は予めグルタミン酸に活性基を導入し、これをゼラチン水溶液と混合することによって毒性の高い架橋剤を直接生体に触れるさせることなくゲル化させ、これを各種医療用途に適用したものである。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００５】
本発明におけるゼラチンとは生体に含まれるヒト、牛、豚等の骨、あるいは皮膚等から得たものが使用でき、その製法としてはコラーゲンを酸、アルカリ、酵素等により適宜処理して得たものが用いられる。
本発明におけるスクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸は、人体に対し無害であり、反応基（−ＣＯＯＨ基）を多数有するため迅速な反応が可能であるポリ−Ｌ−グルタミン酸のカルボキシル基にカルボジイミドの併用下に細胞毒性の低いｎ−ヒドロキシスクシンイミド、若しくは、ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩を反応させ、活性エステルを導入したものである。
かかる反応物は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸０．１〜２０重量％に対し、ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、若しくは、ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩を０．００１〜１０重量％，カルボジイミドを０．００１〜２０重量％の割合で用い、反応温度０〜１８９℃，反応時間１〜５０時間の適宜の条件を選択して得られる。尚、カルボジイミドとしては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリノエチル）カルボジイミド・メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いることができる。
【０００６】
上記のスクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸とゼラチンとのゲル化反応は、ゼラチン１〜５０重量％に対し、スクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸０．１〜１０重量％加え、好ましくは、３０〜５０℃で反応させる。反応に要する時間は、両者を混合してから２秒〜１０分程度であるが、通常３〜６０秒という極めて短時間の内に反応してゲル化するのでこの程度の時間があれば良い。
尚、両者の配合に際しては、均一なゲルを得やすいことから双方適宜濃度の溶液として混合するのが好ましい。
尚、かかる溶液を作製するための溶媒としては、蒸留水のほか、生理食塩水、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸、リン酸等の緩衝液等、毒性のないものを用いることができる。
【０００７】
以上のようにゲル化されるゼラチンはゲル化を直接患部で行いこれによる作用を発現させる、例えば、生体接着剤、止血材、血管塞栓材、動脈瘤の封止材のいずれかに適用し、好適に用いられる。尚、かかるゲルは当該用途に適用後は生体内で分解し、一定期間経過すると吸収、消失する特性があり、体内に異物として残存することがない。以下、本発明について実施例を挙げて詳細に説明する。
【０００８】
（実施例１）
−ポリ−Ｌ−グルタミン酸のスクシンイミド化の実施例−
表１の割合でポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＰＬＧＡ）、ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＳＩ）、及び、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を混合し、１０ｍｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶かして、室温で振とうしつつ２０時間反応を行った。
反応後、未反応のＥＤＣ、ＨＳＩおよびＥＤＣの反応後生成物である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）ウレア（ＥＤＣ−Ｕｒｅａ）を除去するためにアセトンに再沈させ、更に２回アセトンで、２回ヘキサンで洗浄した後、真空乾燥し、活性基の導入量の異なる本発明にかかわる３種のスクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸（Ｓｕｃ−ＰＬＧＡ）を得た。
なお、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＰＬＧＡ）は、味の素（株）製の商品名（Ａｊｉｃｏａｔ  ｐｏｌｙａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｎ  ＳＰＧ）を塩酸で透析し、ポリ−Ｌ−グルタミン酸としたものを用いた。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
（実施例２）
−毒性試験−
実施例１で用いたＨＳＩ，ＥＤＣ、反応後生成物であるＥＤＣ−Ｕｒｅａの細胞毒性試験をＬ９２９細胞を用いて色素排除法にて行った。
その結果を図１に示したがＥＤＣに対しＨＳＩ，ＥＤＣ−Ｕｒｅａは極めて毒性が低いことを示している。
尚、本発明においてはＥＤＣは実施例１のように洗浄除去されるので実用上問題を生じない。
【００１１】
（図１）
【００１２】
（実施例３）
−ゼラチンのゲル化架橋反応の実施例−
等電点が８．９の新田ゼラチン（株）製ゼラチン（Ｔｙｐｅ  Ｇ−０５４５Ｐ，牛骨由来酸処理ゼラチン）を２０重量％になるように７％ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解させ、ゼラチンを含む水溶液とした。
これを直径１６ｍｍの試験管に５００μｌ採取し、３７℃の恒温水槽に漬け、１ｃｍのスターラーチップで一定速度で攪拌した。そこへ各種濃度に７％ＮａＨＣＯ３水溶液で調製したＳｕｃ−ＰＬＧＡ水溶液を最終添加濃度（純分換算）で１，５，１０，２０，４０ｍｇ／ｍｌとなるよう加えた。そしてＳｕｃ−ＰＬＧＡ水溶液を加えてからゼラチンがゲル化してスターラーチップが止まるまでの時間を測定し、その結果を図２に示した。
【００１３】
（図２）
【００１４】
かかる結果はＳｕｃ−ＰＬＧＡの導入活性基量が多いほど、また、混合液中のＳｕｃ−ＰＬＧＡの濃度が高いほどゲル化時間が短くなる傾向を示し、これの調整によりゲル化時間のコントロールが可能であることを示唆する。しかしながら使用濃度がある一定以上であるとそれに要する時間はほぼコンスタントである。尚、実施例１におけるスクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸の製造、及び、実施例３におけるゼラチンとの反応を化学式として化１に示した。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
（実施例４）
−Ｓｕｃ−ＰＬＧＡの保存安定性試験−
実施例１で得たＳｕｃ−ＰＬＧＡの粉末を作成後９０日間シリカゲルを入れた容器に入れ、冷蔵庫内で保存しておいたものを用い、実施例３に準じてゲル化実験を行った結果を図３に示した。
この結果、図２とほとんど同じ曲線が得られ、この方法でＳｕｃ−ＰＬＧＡは安定して保存できることがわかった。
【００１７】
（図３）
【００１８】
（実施例４）
−実用試験例−
本発明にかかわるゼラチンゲルの応用例として、フィブリン糊のような止血剤が考えられる。そこで兎を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。実験は血管が比較的均一に網目状に存在している脾臓を用いて行った。
体重５ｋｇの日本種白色兎（オス）をネンブタール静脈注射、ケタラール、筋肉弛緩剤の筋肉注射により麻酔させる。次いで電気メスを用いて開腹し、脾臓を露出させ、１８Ｇの注射針を０．６ｍｍの深さまで突き刺して出血創を作成する。その後１分間の出血をろ紙で採取する。作創後１分後に出血部位で以下の方法によりゼラチンをゲル化させる。
用いたゼラチンは実施例３と同じものであり、Ｓｕｃ−ＰＬＧＡはＳｕｃ基の導入が１０：４の実施例１により得たものを用いた。
２０％ゼラチン水溶液（７％ＮａＨＣＯ３）５０μｌを創部に滴下後、ただちに２０ｍｇ／ｍｌのＳｕｃ−ＰＬＧＡ水溶液（７％ＮａＨＣＯ３）５０μｌ（即ち、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌに相当）を添加し、ゼラチンをゲル化させた。
尚、Ｓｕｃ−ＰＬＧＡの７％ＮａＨＣＯ３への溶解は作創と同時に行ったので溶解後１分後にゲル化したことになる。このようなゲル化の後、１分おきに前記と同じように出血を採取し、シアンメトヘモグロビン法を用いて出血量の定量を行った。その結果を図４に示す。これにおいて、創部からの出血はほぼ完全に抑えられたことが、ゼラチンゲルを創部に用いないコントロールとの比較において明らかである。
【００１９】
（図４）
【００２０】
尚、図４においてヨコ軸は経過時間、タテ軸は吸光度の相対値（累積値）を表す。ろ紙に採取した血液をシアンメトヘモグロビン法により定量する。即ち、血液を吸い取ったろ紙を０．７５％ＮＨ４Ｃｌ  ｉｎ  １７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝７．６）に漬け、３７℃で２４時間振とうし、血液を抽出する。抽出液２０μｌに対し、０．７８ｍＭシアン化カリウム、０．６１ｍＭフェリシアン化カリウム液を５ｍｌ加える。これの５４０ｎｍの吸光度を測定する。ゲル添加前の１分間の血液量を示す吸光度を１とし、その後の出血量を相対値で示した。ゲルを添加しない場合、出血は持続するがゲルを添加することによって出血が抑制される。
【００２１】
【発明の効果】
本発明は、毒性の少ない医用材料を提供したもので、生体接着剤、止血材、血管塞栓材、動脈瘤の封止材等、医療現場で直接架橋させて用いる医用材料に用いて従来のようにその適用時の毒性に注意を払う必要がなく、従って、その操作が極めて簡単で好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓｕｃ−ＰＬＧＡの合成に関係する３つの化合物の細胞毒性試験の結果を示した図。
【図２】Ｓｕｃ−ＰＬＧＡの種類と濃度がゲル化時間に与える影響を示した図。
【図３】作成後９０日保存した後のＳｕｃ−ＰＬＧＡの水溶液濃度とゲル化時間の関係を示した図。
【図４】出血創に本発明ゲルを適用したときの出血量の変化を示した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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