(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルに近接して配置されかつ光軸を規定する対物レンズを含み、前記対物レンズは光の入射ビームを受取るように位置決めされかつ前記ビームをサンプルに向け、その上に照らされたスポットを作り出し、前記対物レンズは前記スポットから発せられた蛍光を集束して蛍光レトロビームを形成し、前記対物レンズは外部の入射ひとみを規定し、前記外部の入射ひとみは前記対物レンズから十分に離れており、前記外部の入射ひとみは走査装置に近接して位置決めされ、前記対物レンズは、入射ひとみでアフォーカルであり、さらに、
前記入射ビームを発するためのビーム源と、
前記光軸にあり、前記サンプルの表面上の前記スポットを走査するための手段と、
前記ビーム源と前記対物レンズとの間の前記光軸に位置決めされ、前記入射ビームを前記蛍光レトロビームから分離するための手段とを含み、
前記走査手段は、前記対物レンズによって形成された前記蛍光レトロビームを前記分離手段に向け、前記分離手段は前記レトロビームを検出器に向ける、光学走査システム。
【請求項２】
前記対物レンズはテレセントリックである、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項３】
前記分離手段はダイクロイックフィルタである、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項４】
前記分離手段はフレネルレフレクタである、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項５】
前記ビーム源と前記分離手段との間に位置決めされ、前記入射ビームの直径を変化させるための手段をさらに含む、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項６】
前記ビーム源は、コリメートする光学素子に光学的に結合された光の非コヒーレント源である、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項７】
前記ビーム源は、コリメートする光学素子に光学的に結合された発光ダイオードを含む、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項８】
前記走査手段は、システムのひとみに位置決めされた凹面鏡を含む、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項９】
前記走査手段は、システムのひとみに位置決めされた凸面鏡を含む、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項１０】
前記走査手段は、レンズのひとみに位置決めされた屈折走査デフレクタを含む、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項１１】
前記走査手段は、システムのひとみに位置決めされた回折走査デフレクタを含む、請求項１に記載の光学走査システム。
【請求項１２】
前記走査手段は、システムのひとみに位置決めされた回転するペンタプリズム走査デフレクタを含む、請求項１に記載の光学走査システム。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、特に蛍光撮像で用いられるレーザ走査撮像システムに関する。
背景技術
蛍光顕微鏡法は、分子生物学、生化学および他の生命科学の分野においてしばしば用いられる。そのような用途の１つは、抗体を用いて特定の抗原を識別することである。抗体とは、感染に対する防衛として脊椎動物により作り出された蛋白質である。それらは何百万もの異なった形からなり、各々がさまざまな結合部位を有し、その生成を誘導する抗原を特定的に認識する。抗原を識別するために、蛍光染料に結合された特定の抗体を含む細胞のサンプルが与えられる。細胞は次いでそれらの蛍光に対して評価される。抗体の正確な抗原の特定性を利用すれば、蛍光特性を有する細胞は特定の抗原を含むことがわかる。
元来、細胞の蛍光は、従来の顕微鏡法を用いて目視検査により手動で評価された。これは時間がかかりコストが高いということが判明した。高速の自動化されたシステムに対する要求が明らかになった。共焦点顕微鏡のような多くの高速撮像システムが、細胞のサンプルを分析するのに利用可能である。照明光学素子および集束光学素子は、それらの相対的な幾何学的配置とともに、他のシステムの素子のパラメータを大部分決定する。
先行技術の高速撮像システムが図１に示され、対物レンズの表面がサンプルの法線に対し垂直であるようにサンプル１１の上方に位置決めされたＦシータ対物レンズ１０を含む。レーザ光源１２がビーム１３を生ずる。対物レンズ１０はビーム１３を向けてサンプルの表面上のスポットを照らす。振動する反射面１４が、１つの軸に沿って前後にビーム１３を偏向させるように光源１２と対物レンズ１０との間でシステムのひとみ１５に配置される。サンプルは、第１の走査方向に対して垂直の方向にサンプルを移動させるためにテーブル上に置かれ、それによってサンプルの表面上に２次元の走査パターンを生じさせる。対物レンズは同軸方向の集束用に設計されておらず、その結果、サンプルの表面から反射された光は、対物レンズとは別個でありかつそれから離れているコンデンサアセンブリ１６により集束される。そのような幾何学的配置は、その結果システムのフットプリントを増大させ、光学的複雑さを増大させ、および立体角の集束の限界をもたらす。集束された光は次いで光検出器１７上に結像される。従来のＦシータレンズの設計は主として単色光照明用である。その結果、そのようなレンズには良好な多色光性能が欠けている。したがって、対物レンズ１０は、広帯域の波長にわたって横方向および軸方向の色収差を表わす。
図１に関し説明されたものと同様の先行技術の高速撮像システムが、リチャード・エル・シューメーカー（Richard L. Shoemaker）らにより、「デジタル撮像解析用超高速レーザスキャナ顕微鏡（“An Ultrafast Laser Scanner Microscope for Digital Imaging Analysis”）」、生物医学工学に関するＩＥＥＥトランザクション（IEEE Transactions on Biomedical Engineering）、１９８２年２月、第ＢＭＥ−２９巻、No.２第８２〜９１頁で開示される。これら２つのシステムの間の主な相違は走査装置に関する。シューメーカーらは、サンプルの表面にわたってスポットを走査するのに、検流計スキャナの代わりに回転多面体鏡の使用を必要としている。
別の先行技術の高速撮像システムがサワムラ（Sawamura）らへの米国特許第４，２８４，８９７号において開示され、ここでは、レーザ光は２つの検流計ミラーと１つのダイクロイックミラーとを介して反射され、対物レンズを介してビームを向けてサンプルの表面上のスポットを照らす。検流計ミラーは、サンプルの表面全体にわたってスポットが走査できるように適切な方向に揺動される。照明スポットに応答してサンプルは蛍光を発する。コンデンサレンズの役割をする対物レンズは、第１のダイクロイックミラーを介して光を送り戻す。第１のダイクロイックミラーの後ろには第２のダイクロイックミラーが位置決めされ、これは、蛍光を、細胞質により生じた光と細胞核により生じた光とに分割する。細胞質の蛍光および細胞核の蛍光は、それぞれの光検出器に送られる。
先行技術のシステムの不利な点とは、サンプル上にビームを走査しまたはマクロサイズのサンプルから発せられた光を集束するのに、照明光学素子に加えて付加的な光学素子を必要とし、それによってシステムのコストおよび大きさを増大させるということである。
したがって、この発明の目的は、マクロスケールのサンプルの点ごとの蛍光撮像を与えるような、高速、低コストのレーザ走査システムを提供することである。
この発明のさらなる目的は、既存の同軸方向の照明システムおよび集束システムよりも大きな走査フィールドを与えるような、先行技術のシステムよりも実質的に小さな大きさの蛍光撮像システムを提供することである。
発明の開示
これらの対物レンズは、外部ひとみを有しかつ色消しであるテレセントリックレンズをそれら双方が互いに近接するようにサンプルの上方に位置決めすることにより達成された。レンズはシステムの対物レンズを形成する。この対物レンズは、サンプルに最も近接しておりかつその前側焦点としてサンプルを有する、システムのレンズとして定義される。レーザは、対物レンズを介して向けられてサンプルの表面上のスポットを照らすコヒーレント光のコリメートされたビームを生成し、それによって、蛍光を発するようサンプルの小領域を刺激する。スポットは通常、回折の法則により規定される限界に近い直径を有する。対物レンズはコンデンサの役割も果たし、サンプルにより発せられた蛍光を集束する。対物レンズは、入射ビームが進む同一経路に沿ってはいるが反対方向に、集束された光を向けて戻す。波長を弁別するダイクロイックフィルタが、蛍光を入射ビームから分離してその蛍光を光検出器に向けて、蛍光を発するサンプルの表面を表わす信号を生成するためにレーザと対物レンズとの間の光軸に沿って置かれる。サンプルの全視野を得るには、システムのひとみに位置決めされた走査中心を有する反射素子を備えた２次元の走査装置が、サンプルの表面全体にわたってスポットを走査する。表示装置が設けられ、走査装置と同期されてサンプルの像を再生する。
【図面の簡単な説明】
図１は、先行技術のレーザ走査顕微鏡の単純化された側面図である。
図２は、この発明の光学成分の斜視図である。
図３は、図２に示された対物レンズを通過する走査ビームの詳細な図である。
図４は、この発明に従った、サンプルの像を再生するためのビデオディスプレイシステムを含む、図２に示される光学成分の単純化された側面図である。
この発明を実行するための最良のモード
図２は、光の入射ビーム１９を生成するレーザ１８を示す。レーザがコヒーレント光のコリメートされたビームを生成することが好ましい。しかしながら、コリメートする光学素子に光学的に結合される非コヒーレント光源を用いて、入射光ビーム、たとえば発光ダイオードを作ることが可能である。
ビーム１９は２次元の走査装置２０で反射され、コンデンサの役割もする色消対物レンズ２１を介して向けられる。コリメートされた光が対物レンズに入ることの１つの利点は、それによってシステムを、対物レンズを変化させることに対して感知しにくいものにするということである。対物レンズ２１はビーム１９を向けてサンプル２３上のスポット２２を照らし、それによってサンプルの小領域を刺激して蛍光を発する。蛍光は対物レンズ２１により集束され、入射ビーム１９の同一経路に沿ってはいるが反対方向にレトロビーム２４として向けて戻される。ダイクロイックフィルタ２５が蛍光を入射ビームから分離し、光検出器２６にレトロビーム２４を結像する。ダイクロイックフィルタ２５は、それがレーザ光は透過し、蛍光は反射するように用いられ得る。その代わりに、蛍光が光検出器２６にあたるようにレーザ光が反射され、蛍光が透過されてもよく、これは図２に示される好ましい実施例である。入射ビームを蛍光から分離することができる限りは、どんな型のビームスプリッタを用いてもよいということを理解すべきである。たとえば、分離を達成するために偏光感知ビームスプリッタを用いてもよい。この実施例は、ビームスプリッタと対物レンズとの間に位置決めされた１／４波長板を含んでもよい。このことによって、１／４波長板から射出する入射ビームは円偏光であるようになるだろう。また、所望のごとくレトロビーム２４をさらに形づくるために付加的な焦点合わせ光学素子２７とバックアパーチャ２８とがあってもよい。サンプル２３は、サンプル２３の表面全体にわたってラスタ走査態様でスポット２２を走査することにより点ごとに照らされ、その全視野の像を得る。
図３を参照して、対物レンズ２１は同軸方向の照明および集束を与える。入射ビーム１９に関し、対物レンズ２１は像面においてアフォーカルである。対物レンズはテレセントリックであることが好ましい。対物レンズがテレセントリックであることはその結果、サンプル２３の表面は、対物レンズ２１を射出する入射ビーム１９に対していつも直角になる。入射ビーム１９に関し、対物レンズの面はサンプル２３に近接している。ビーム１９は、３つの異なる位置で対物レンズ２１に入るものとして示され、入射ビーム１９は各々の位置でさまざまな入射角を有する。入射ビーム１９の対物レンズ２１への入射角にかかわらず、対物レンズ２１から射出する入射ビーム１９はサンプル２３の表面に対し直角である。このテレセントリック対物レンズを有する１つの利点とは、そのことによって、焦点位置の誤差に対してシステムの倍率が比較的敏感でないようにするということである。さらに、対物レンズ２１の色消しによって、光の広帯域の波長、たとえば、主波長にほぼ２００ｎｍを加えたものまたはそれを上回るものにわたってそれが動作できるようにし、一方システムの効果的な解像度以下で軸方向および横方向の収差を維持する。これによって、対物レンズ２１がさまざまな波長のレーザで動作することが可能となりかつ多様なフルオロクロームから光を集束できるようになる。
対物レンズの２つの実現化例の仕様は以下のとおりである。
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上で表にされた仕様が、この発明で用いられるレンズを単に例示しているにすぎないということに注目することは重要である。パラメータはシステムを特定の動作に適合させるよう必要に応じて変更されてもよい。
再び図２を参照して、対物レンズ２１の重要な特徴は、それがシステムの外部ひとみ２９を規定するということであり、これは走査の中心に位置決めされる。２次元の走査を与える走査機構であればどんなものが用いられてもよく、たとえば回転多面体鏡、回転ホログラフィスキャナまたは振動プリズムを用いてもよい。また、音響光学デフレクタまたはペンタプリズム走査デフレクタを用いてもよい。しかしながら、好ましい実施例は、入射ビームの経路において１つのビーム反射素子を有する走査システムを用いることであり、これは２つの垂直軸を中心として旋回可能である。反射素子は平面鏡３０であるが、これは不可欠ではない。なぜなら屈折偏向素子または回折偏向素子を用いてもよいからである。鏡は、分岐したブラケット３２によりスピンドル３１上に支持され、したがって軸Ａを中心として旋回可能である。鏡３０は、当該技術における既知の任意の手段によって移動されてもよいが、これは典型的には検流計ミラーである。ブラケット３２はある端部でホイール３３に装着され、これはステッパモータ３４により駆動される。モータ３４はホイール３３を駆動して、軸Ｂを中心として鏡３０を旋回させる。
図４を参照して、レトロビーム２４が、サンプル２３の表面上の複数の点から発するものとして示される。レトロビーム２４は光検出器２６上に結像される。どんな光検出器を用いてもよいが、光電子増倍管を用いることが好ましい。光電子増倍管からの信号は、電気接続３５を通過して、ビデオ表示スクリーン３７を含むビデオ表示システムの信号プロセッサ３６にまでいく。光電子増倍管２６からの信号は、出力線３８を介してプロセッサ３６から表示スクリーン３７まで送られるイメージ信号の強度を変調する。走査信号発生器３９が、電気接続４０を介して走査装置２０に電気信号を与える。走査装置は、発生器３９の信号に応答して移動する。光電子増倍管からの信号はデジタル化され、メモリ内にストアされ、かつ同時にディスプレイ上に走査され得る。
この発明の明らかな延長は、反射撮像の分野にある。つまり、反射されたレーザビームは、蛍光ビームの代わりに検出器で集束され得る。もし第２のダイクロイックビームスプリッタが第１のダイクロイックビームスプリッタの後ろに位置決めされるならば、反射ビームおよび蛍光ビームの両方が検出器で読出され得るだろう。または同様の態様で、多数の二次的なビームスプリッタおよび検出器を用いることにより多数の蛍光表示が検出されてもよい。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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