(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性タンパク質の活性化方法であって、該方法は、以下の工程：
変性タンパク質に界面活性剤を添加してタンパク質・界面活性剤複合体を形成する工程、および
該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去する工程、
を包含し、該高分子量アミロースの平均分子量が３５００を超える、方法。
【請求項２】
変性タンパク質に変性剤を添加して、該変性タンパク質を解きほぐされた状態にする工程をさらに包含し、該変性剤添加工程が、前記変性タンパク質に界面活性剤を添加する工程の前に行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高分子量アミロースが、低級アルコールを包接している包接化合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記低級アルコールが、ブタノールである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記高分子量アミロースの平均分子量が、１万から２０００万である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記高分子量アミロースの平均分子量が、２万から１１００万である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記高分子量アミロースが、酵素を用いて合成されたアミロースである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸ナトリウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドおよびミリスチルサルフォベタインからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記変性タンパク質が、αヘリックス構造領域を含むタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記変性タンパク質が、βシート構造領域を含むタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記変性タンパク質が、分子内Ｓ−Ｓ結合を有するタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
αヘリックス構造領域を含む変性タンパク質を活性化する方法であって、該方法は、以下の工程：
該変性タンパク質に過剰量のポリオキシエチレン系界面活性剤を添加し、タンパク質・界面活性剤複合体を形成して該タンパク質同士の凝集を防ぐ工程；および
該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して、該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去することにより、該タンパク質を活性を有する高次構造に再度折り畳ませて、該タンパク質を活性化する工程、
を包含し、該高分子量アミロースの平均分子量が３５００を超える、方法。
【請求項１３】
前記ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、およびスクロース脂肪酸エステルからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
βシート構造領域を含む変性タンパク質を活性化する方法であって、該方法は、以下の工程：
該変性タンパク質に過剰量のイオン性界面活性剤を添加し、タンパク質・界面活性剤複合体を形成して該タンパク質同士の凝集を防ぐ工程；および
該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して、該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去することにより、該タンパク質を活性を有する高次構造に再度折り畳ませて、該タンパク質を活性化する工程、
を包含し、該高分子量アミロースの平均分子量が３５００を超える、方法。
【請求項１５】
分子内Ｓ−Ｓ結合を有する変性タンパク質を活性化する方法であって、該方法は、以下の工程：
該変性タンパク質に過剰量のイオン性界面活性剤を添加し、タンパク質・界面活性剤複合体を形成して該タンパク質同士の凝集を防ぐ工程；および
該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して、該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去することにより、該タンパク質を活性を有する高次構造に再度折り畳ませて、該タンパク質を活性化する工程、
を包含し、該高分子量アミロースの平均分子量が３５００を超える、方法。
【請求項１６】
前記イオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸ナトリウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、およびミリスチルサルフォベタインからなる群より選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種類の高分子量アミロース、および少なくとも１種類の界面活性剤を備える、タンパク質再折り畳み用キットであって、該高分子量アミロースの平均分子量が３５００を超える、キット。
【請求項１８】
前記高分子量アミロースが、低級アルコールを包接している包接化合物である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記低級アルコールが、ブタノールである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記高分子量アミロースの平均分子量が、１万から２０００万である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
前記高分子量アミロースの平均分子量が、２万から１１００万である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記高分子量アミロースが、酵素を用いて合成されたアミロースである、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸ナトリウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、およびミリスチルサルフォベタインからなる群より選択される、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変性タンパク質の活性化方法に関する。より詳細には、本発明は、変性タンパク質に界面活性剤を添加してタンパク質・界面活性剤複合体を形成する工程、および該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去する工程、を包含する、変性タンパク質の活性化方法に関する。さらに本発明は、少なくとも１種類の高分子量アミロース、および少なくとも１種類の界面活性剤を備える、タンパク質再折り畳み用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質は、複数のＬ−α−アミノ酸がペプチド結合により連結したポリペプチド鎖を含む。タンパク質のアミノ酸の配列の順序を１次構造という。タンパク質は、高次構造といわれる立体的なコンフォメーションをとっている。タンパク質が機能を果たすためには、正しい高次構造を取ることが必須である。タンパク質の高次構造には、２次構造、３次構造、および４次構造が含まれる。２次構造としてはαヘリックス構造、βシート構造などが知られており、こうした２次構造がさらに折り畳まれて３次構造を形成している。３次構造の安定化要因としては、疎水結合、水素結合、システイン残基間のＳ−Ｓ結合などが挙げられる。３次構造をとっている複数のポリペプチド鎖が非共有結合で会合することにより、４次構造が形成される。
【０００３】
タンパク質分子がほぼ生理的条件でとっている固有の構造を生（ｎａｔｉｖｅ）と呼ぶ。種々の原因により１次構造は変化せずに高次構造のみが破壊され、生の状態から物性が変化することを、「変性する」という。タンパク質の高次構造は、加熱、凍結、紫外線およびＸ線の照射などの物理的な原因に加えて、極端なアルカリ性、有機溶媒、尿素、グアニジン塩酸などの変性剤、界面活性剤などの化学的な原因によっても破壊され得る。タンパク質の構造は、変性によって、秩序正しく折り畳まれたコンパクトな構造から、不規則な凝集体様構造に、または折り畳みが解きほぐされた状態であるランダム構造に変化する。変性状態には、不規則な凝集体様の状態および折り畳みが解きほぐされた状態が含まれる。
【０００４】
上記のような変性状態にあるタンパク質を、正しい高次構造を有した状態に再度折り畳む「再折り畳み」は、タンパク質を産業上利用しようとする上で、非常に重要な技術である。たとえば、物質生産のための反応に利用した酵素を一旦加熱または変性剤の添加により変性させて酵素活性を失活させることによりその反応を停止させ、得られた生産物を回収した後、変性した酵素を再び正しい高次構造を有した状態に再折り畳みして活性化し、再利用することも可能となる。
【０００５】
また、異種タンパク質を大腸菌宿主内で生産した場合、多くのタンパク質は、しばしば、インクルージョンボディと呼ばれる、不溶性でかつ不活性な状態となることがある。しかし、再折り畳みが可能であれば、このような不溶性タンパク質を尿素、グアニジン塩酸などの変性剤で可溶化した後、正しい高次構造を有した状態に再折り畳みして活性化することも可能となる。
【０００６】
変性状態にあるタンパク質を、正しい高次構造を有した状態に再度折り畳みし直す、再折り畳みにおいては、解決しなければならない２つの段階的な問題がある。すなわち、１段階目の問題は、解きほぐされた状態にあるタンパク質同士の凝集を防ぐことであり、そして２段階目の問題は解きほぐされた状態からタンパク質を如何に正しく折り畳み直すかである。
【０００７】
生体内でのタンパク質の折り畳みでは、この２つの段階に分子シャペロンと名付けられた一群の介添え役のタンパク質が関与している。分子シャペロンとは、合成直後のタンパク質に結合してタンパク質が不規則に折り畳まれるのを妨げて運搬されやすい状態に保つ機能、またはうまく折り畳みができないタンパク質の折り畳みを助けるなどの機能を有するタンパク質である。
【０００８】
生体内における翻訳終了直後のタンパク質、すなわち、新生タンパク質は、正しい高次構造を取っていない。新生タンパク質には、翻訳終了直後から、ＤｎａＪなどと名付けられている一群の分子シャペロンが結合する。これらの分子シャペロンは、折り畳み過程の上流に働き、新生タンパク質が凝集することおよび異常な構造を取ることを防ぐ。この後、新生タンパク質に、ＧｒｏＥと名付けられている分子シャペロンが作用する。ＧｒｏＥは、折り畳みの下流で働く。新生タンパク質は、ＧｒｏＥの機能によって、徐々に正しい高次構造を取り始め、最終的に活性を有したタンパク質に折り畳まれる。折り畳みの過程において、折り畳みの介添え役であった分子シャペロンは離れていく。
【０００９】
最近、生体内での分子シャペロンの機能を試験管内で再現し、変性タンパク質の活性を試験管内で回復させることをめざして、人工シャペロンの構築が試みられている。Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３９６１−３３９７１（１９９８））は、人工シャペロンを用いて変性タンパク質の折り畳みを行う方法を報告している。この方法では、タンパク質の凝集を防ぐ役割をする人工シャペロンとして非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ  １００およびアルキル基の鎖長の短いポリオキシエチレン系の界面活性剤を使用して、タンパク質・界面活性剤複合体を形成させた後に、界面活性剤を除去するための物質（以下、本明細書において「界面活性剤除去剤」ともいう）として低分子環状α−１，４−グルカンであるβシクロデキストリン（以下、βＣＤと略記）を添加し、このタンパク質・界面活性剤複合体から徐々に界面活性剤を除去することによって、変性タンパク質に自然に高次構造を取らせる。
【００１０】
その後、Ｓｉｌｖａｋａｍａ  Ｓｕｎｄａｒｉら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４４３，２１５−２１９（１９９９））は、同様の人工シャペロン系において、タンパク質・界面活性剤複合体から徐々に界面活性剤を除去するための物質として、低分子環状α−１，４−グルカン（シクロデキストリン）だけでなく、低分子量の直鎖状α−１，４−グルカンも有効であることを開示した。
【００１１】
さらに近年、町田ら（特願平２０００−７１５３３）は、同様の人工シャペロン系において、界面活性剤と、界面活性剤を除去するための物質との組み合わせをさまざまに変化させることの、３種の異なるタンパク質の活性回復への影響を詳細に調べ、以下のような結果を得ている：
（１）重合度が４０〜１５０程度の高分子量の環状α−１，４−グルカンは、重合度が６〜８程度の低分子環状α−１，４−グルカンと比較して、より迅速かつ効果的な活性回復が可能である；および
（２）それぞれのタンパク質は、使用する界面活性剤および界面活性剤を除去するための物質によって活性の回復程度が異なる。したがって、より高い活性回復のためには、目的タンパク質に応じて、界面活性剤と、界面活性剤を除去するための物質との組合せを適切に選択して用いることが重要である。
【００１２】
この様に、人工シャペロンの技術は変性タンパク質の活性化方法として非常に有効であることが明白となった。しかし、変性タンパク質の活性回復の程度は、選択する界面活性剤および界面活性剤を除去するための物質によって大きく影響を受けることもわかってきた。
【００１３】
人工シャペロンとして使用可能な数多くの界面活性剤が当該分野で公知である。
【００１４】
一方、界面活性剤を除去するための物質としては、現在高分子量および低分子量の環状α−１，４−グルカン（特願平２０００−７１５３３）、ならびに低分子の直鎖状α−１，４−グルカン（Ｓｉｌｖａｋａｍａ  Ｓｕｎｄａｒｉら、前出）が公知である。これらのグルカンは、変性タンパク質を活性化する効果に優れていることが見出されていた。
【００１５】
一方、一般に市販されており入手可能なアミロースとしては、澱粉をイソアミラーゼなどの枝切り酵素により分解して得られる低分子量アミロース（平均分子量約２９００）、天然澱粉からアミロペクチンを除去したアミロース画分などがある。低分子量アミロースは分子量が小さく、包接能力が弱いという欠点があるため変性タンパク質の活性化において用いるのは好ましくない。アミロース画分は水溶性が著しく悪く、脂質などの不純物が多く、α−１，６−結合からなる分岐構造があり、かつ分子量分布が広いなどという欠点があるため、変性タンパク質の活性化において用いるのは好ましくない。
【００１６】
一方、類似のグルコースポリマーであるα−１，６−グルカンについては、変性タンパク質を活性化する効果が全くないことが判明していた（Ｓｉｌｖａｋａｍａ  Ｓｕｎｄａｒｉら、前出）。さらに同じ環状α−１，４−グルカンであっても、その重合度によりタンパク質の活性化効果に違いがあること、つまり、高重合度の環状α−１，４−グルカンの方が、低重合度の環状α−１，４−グルカンよりも、活性化程度が高いことも判明していた（特願平２０００−７１５３３）。
【００１７】
このように、同じグルコースのポリマーであっても、その結合の仕方、重合度などにより、タンパク質の活性化効果に違いが見られることが、すでに明らかとなっていた。このように、界面活性剤を除去するための物質については、どのような物質に効果が期待できるかについての理解は不充分であり、選択の幅が十分でないという問題があった。
【００１８】
さらに、これまでの研究の中では、高重合度の環状α−１，４−グルカンに最も高い活性化効果が確認されているが、実際には高重合度の環状α−１，４−グルカンの製造は困難であり、未だ市販されておらず、実用性の面から問題がある。
【００１９】
このような状況のもと、変性タンパク質を活性化する高い効果を有し、かつ実用性に優れた、界面活性剤を除去するための物質の開発が求められていた。また、自発的折り畳み能が低く、分子シャペロンの介添えなしには正しい高次構造を取ることが困難もしくは不能であるタンパク質が、短時間で、かつ活性を有する正しい高次構造を取るように、折り畳みさせるために有用でありかつ実用性が高い、変性タンパク質の活性化方法が求められていた。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、変性タンパク質の効率的な活性化方法を提供すること、およびタンパク質再折り畳み用キットを提供することを目的とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、高重合度の直鎖状α−１，４−グルカンである高分子量アミロースが、界面活性剤を除去するための物質として低分子量の直鎖状α−１，４−グルカンよりも効果的に機能し、変性タンパク質の効率的な活性化に役立つこと、および高分子量アミロースを用いて変性タンパク質を活性化する方法が、各種変性タンパク質に汎用的に利用可能であることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。また、高分子量アミロースは、ホスホリラーゼを用いて合成することにより、大量に供給することが可能であり、高分子量の環状α−１，４−グルカンよりも実用性に優れている。
【００２２】
以上のことから、高分子量アミロースと各種界面活性剤とを組み合わせることによって、実用性および汎用性に優れたタンパク質再折り畳み用キットを提供することが可能となった。
【００２３】
本発明の変性タンパク質の活性化方法は、以下の工程：変性タンパク質に界面活性剤を添加してタンパク質・界面活性剤複合体を形成する工程、および該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去する工程、を包含する。
【００２４】
１つの実施態様では、本発明の方法は、変性タンパク質に変性剤を添加して、該変性タンパク質を解きほぐされた状態にする工程をさらに包含し、該変性剤添加工程が、上記変性タンパク質に界面活性剤を添加する工程の前に行なわれる。
【００２５】
１つの実施態様では、上記高分子量アミロースは、低級アルコールを包接している包接化合物であり得る。
【００２６】
１つの実施態様では、上記低級アルコールは、ブタノールであり得る。
【００２７】
１つの実施態様では、上記高分子量アミロースの平均分子量は、１万から２０００万であり得、好ましくは、２万から１１００万であり得る。
【００２８】
１つの実施態様では、上記高分子量アミロースは、酵素を用いて合成されたアミロースであり得る。
【００２９】
１つの実施態様では、上記界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸ナトリウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドおよびミリスチルサルフォベタインからなる群より選択され得る。
【００３０】
１つの実施態様では、上記変性タンパク質は、αヘリックス構造領域を含むタンパク質、βシート構造領域を含むタンパク質、または分子内Ｓ−Ｓ結合を有するタンパク質であり得る。
【００３１】
本発明のαヘリックス構造領域を含む変性タンパク質を活性化する方法は、以下の工程：該変性タンパク質に過剰量のポリオキシエチレン系界面活性剤を添加し、タンパク質・界面活性剤複合体を形成して該タンパク質同士の凝集を防ぐ工程；および該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して、該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去することにより、該タンパク質を活性を有する高次構造に再度折り畳ませて、該タンパク質を活性化する工程、を包含する。
【００３２】
１つの実施態様では、上記ポリオキシエチレン系界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、およびスクロース脂肪酸エステルからなる群より選択され得る。
【００３３】
本発明のβシート構造領域を含む変性タンパク質を活性化する方法は、以下の工程：該変性タンパク質に過剰量のイオン性界面活性剤を添加し、タンパク質・界面活性剤複合体を形成して該タンパク質同士の凝集を防ぐ工程；および該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して、該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去することにより、該タンパク質を活性を有する高次構造に再度折り畳ませて、該タンパク質を活性化する工程、を包含する。
【００３４】
本発明の分子内Ｓ−Ｓ結合を有する変性タンパク質を活性化する方法は、以下の工程：該変性タンパク質に過剰量のイオン性界面活性剤を添加し、タンパク質・界面活性剤複合体を形成して該タンパク質同士の凝集を防ぐ工程；および該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して、該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去することにより、該タンパク質を活性を有する高次構造に再度折り畳ませて、該タンパク質を活性化する工程、
を包含する。
【００３５】
１つの実施態様では、上記イオン性界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸ナトリウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、およびミリスチルサルフォベタインからなる群より選択され得る。
【００３６】
本発明のタンパク質再折り畳み用キットは、少なくとも１種類の高分子量アミロース、および少なくとも１種類の界面活性剤を備える。
【００３７】
１つの実施態様では、上記高分子量アミロースは、低級アルコールを包接している包接化合物であり得る。
【００３８】
１つの実施態様では、上記低級アルコールは、ブタノールであり得る。
【００３９】
１つの実施態様では、上記高分子量アミロースの平均分子量は、１万から２０００万であり得、好ましくは２万から１１００万であり得る。
【００４０】
１つの実施態様では、上記高分子量アミロースは、酵素を用いて合成されたアミロースであり得る。
【００４１】
１つの実施態様では、上記界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸ナトリウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、およびミリスチルサルフォベタインからなる群より選択され得る。
【００４２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４３】
本発明では、変性タンパク質の活性化方法が提供される。本発明の活性化方法は、変性タンパク質に界面活性剤を添加してタンパク質・界面活性剤複合体を形成する工程、および該タンパク質・界面活性剤複合体に、高分子量アミロースを添加して該高分子量アミロースにより該界面活性剤を除去する工程、を包含する。
【００４４】
本発明の方法による変性タンパク質の活性化の模式図を図１に示す。
【００４５】
本明細書において、「変性タンパク質」とは、タンパク質の一次構造は変化せずに高次構造のみが破壊されて、活性が失われているかまたは活性が低下したタンパク質をいう。具体的には例えば、生の状態を１００％として９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下に活性が低下したタンパク質をいう。
【００４６】
変性タンパク質は、正しい高次構造と異なる高次構造になっているために活性が失われているかまたは低下している全てのタンパク質をいう。正しい高次構造と異なる高次構造とは、不規則に凝集した状態であってもよいし、解きほぐされた状態であってもよい。変性タンパク質は、界面活性剤との結合が容易になるように、解きほぐされた状態であることが好ましい。
【００４７】
本明細書において、「解きほぐされた状態」とは、タンパク質が生の状態で有している水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力などの結合が破壊されている状態をいう。１つの実施態様では、タンパク質のポリペプチド鎖中の結合の回転角がポリペプチドのアミノ酸配列とは無関係な角度になっている状態をいう。
【００４８】
凝集した状態とは、タンパク質が正しい高次構造と異なる高次構造に折り畳まれることをいう、あるいは、複数のタンパク質が正しくない高次構造で集まった結果、活性が失われたかまたは低下した状態をいう。
【００４９】
本発明の方法によって活性化される変性タンパク質に制限はないが、その例としては、生の状態で活性を有するタンパク質が変性したタンパク質が挙げられる。生の状態で活性を有するタンパク質としては、酵素、生理活性ポリペプチドなどが挙げられる。
【００５０】
本明細書において、「変性タンパク質の活性化」とは、変性タンパク質の活性が回復することをいう。例えば、活性が１０ポイント以上回復することが好ましく、２０ポイント以上の回復がより好ましく、３０ポイント以上の回復がさらにより好ましく、４０ポイント以上の回復がさらにより好ましく、さらに好ましくは５０ポイント以上である。変性タンパク質が変性していない状態（生の状態）で本来有していた少なくとも１つの生理的活性（例えば、酵素活性）を１００％として、変性により活性が５０％未満に低下した場合、変性タンパク質に何らかの操作を加えることによって、生の活性を基準として少なくとも約５０％、代表的には約６０％、好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、さらにより好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約１００％にまで活性が回復することをいう。
【００５１】
このような生の状態、変性状態および活性化状態は、周知の各種の活性測定方法により活性を測定することにより容易に判断することができる。
【００５２】
酵素の例としては、臨床診断用酵素、医薬品用酵素、食品加工用酵素、洗剤用酵素、繊維加工用酵素、紙・パルプ関連酵素、飼料用酵素、化粧品用酵素、化学工業用酵素、遺伝子工学用酵素、研究用酵素などが挙げられる。
【００５３】
酵素は、好ましくは、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、リポキシゲナーゼなどの酸化還元酵素；アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、リゾチームなどの加水分解酵素；アミノ基転移酵素、糖転移酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ホスホリラーゼなどの転移酵素；アルギン酸リアーゼ、炭酸脱水素酵素Ｂ（本明細書では以下、ＣＡＢと略記することもある）、クエン酸シンターゼ（本明細書では以下、ＣＳと略記することもある）などの脱離酵素；キシロースイソメラーゼ、ホスホグルコムターゼなどの異性化酵素；およびＤＮＡリガーゼ、グルタミン合成酵素などの合成酵素である。
【００５４】
酵素は、より好ましくはクエン酸シンターゼ、炭酸脱水素酵素Ｂ、リゾチームである。
【００５５】
生理活性ポリペプチドの例としては、抗体、ペプチド性ホルモン、サイトカイン、受容体タンパク質などが挙げられる。
【００５６】
生理活性ポリペプチドは、好ましくは、抗体；インスリン、成長ホルモン、グルカゴン、アンギオテンシン、甲状腺刺激ホルモンなどのペプチド性ホルモン；インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子などのサイトカイン；およびインスリン受容体、ステロイド受容体、サイトカイン受容体などの受容体タンパク質である。
【００５７】
本発明の方法に用いられる変性タンパク質は、変性される前の生の状態では、種々の２次構造領域を有し得る。２次構造領域の例としては、αヘリックス構造領域およびβシート構造領域が挙げられる。３次構造を安定化する構造の例として、分子内Ｓ−Ｓ結合が挙げられる。変性される前の生のタンパク質のほとんどはαヘリックス構造領域で構成されていてもよい。ほとんどがβシート構造領域で構成されていてもよい。または種々の割合のαヘリックス構造領域およびβシート構造領域から構成されていてもよい。またαヘリックス構造領域およびβシート構造領域以外の構造の領域を必要に応じて有してもよい。好ましくは、実質的にαヘリックス構造領域からなるタンパク質または実質的にβシート構造領域からなるタンパク質である。また、変性タンパク質は、生の状態で分子内Ｓ−Ｓ結合によって安定化されているタンパク質であってもよい。
【００５８】
変性タンパク質は、生の状態から、加熱；凍結；紫外線およびＸ線の照射などの物理的な原因によって変性した変性タンパク質であってもよいし、極端なアルカリ性；有機溶媒、尿素、塩酸グアニジンの変性剤；界面活性剤などの化学的な原因によって変性した変性タンパク質であってもよい。
【００５９】
凝集した状態の変性タンパク質を活性化する場合には、界面活性剤を添加する前に変性剤を添加して、変性タンパク質の構造を解きほぐされた状態にすることが好ましい。
【００６０】
本明細書において、「変性剤」とは、界面活性剤以外の物質であって、タンパク質の変性を起こす化学物質をいう。変性剤の例としては、尿素、塩酸グアニジン、有機溶媒などが挙げられる。
【００６１】
本明細書において、「界面活性剤」とは、分子内に親水性原子団および疎水性原子団を有する両親媒性物質をいう。本発明の活性化方法に用いられる界面活性剤は、任意の界面活性剤であり得る。本発明に用いる界面活性剤として、各種のカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤を有効に使用し得る。好ましくは、界面活性剤は、タンパク質が変性される前の生の状態で有する構造に合わせて選択される。
【００６２】
例えば、変性される前に生の状態でαヘリックス構造を有していたタンパク質については、非イオン性界面活性剤が好ましく、一般式ＣnＨ2n+1（ＯＣＨ2ＣＨ2）xＯＨと表され、通常ＣｎＥｘと略記されるアルキルポリオキシエチレンエーテル系界面活性剤がより好ましい。さらに好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロール脂肪酸エステルなどの非イオン性界面活性剤を特に有効に利用し得る。この他に、オクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドなどの非イオン性界面活性剤を用いることもできる。
【００６３】
上記ポリオキシエチレン系界面活性剤のうち、ポリオキシエチレンソルビタンエステル系界面活性剤は、ＣｎソルビタンＥｘと略記される。ポリオキシエチレンソルビタンエステル系界面活性剤の中でも、ポリオキシエチレン鎖の長さが４〜１００の範囲のものが好ましく、ポリオキシエチレン鎖の長さが４〜２１の範囲のものがより好ましく、そしてポリオキシエチレン鎖の長さが２０のものが最も好適に用いられる。ここで、「長さ」とは、ポリオキシエチレン残基−（ＯＣＨ2ＣＨ2）−の繰り返しの数をいう。ポリオキシエチレン鎖の長さが４〜２１の範囲のポリオキシエチレンソルビタンエステル系界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２１、Ｔｗｅｅｎ６１、Ｔｗｅｅｎ８１（Ａｔｌａｓ  Ｐｏｗｄｅｒ社、Ｓｉｇｍａ社などから販売される）などが挙げられる。ポリオキシエチレン鎖の長さが２０のポリオキシエチレンソルビタンエステル系界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０（Ａｔｌａｓ  Ｐｏｗｄｅｒ社、Ｓｉｇｍａ社などから販売される）などが挙げられ、この中でも特に、アルキル基の長さが、それぞれ１６および１８である、Ｔｗｅｅｎ４０およびＴｗｅｅｎ６０が、タンパク質を良好な分散状態に保つことができ、したがってタンパク質の凝集防止効果が高いという点から好ましい。
【００６４】
ポリオキシエチレンソルビタンエステル系界面活性剤のポリオキシエチレン鎖の長さが長すぎる場合または短すぎる場合、タンパク質を分散状態に保つ能力が弱まり、目的とするタンパク質の凝集防止効果が低下しやすい。
【００６５】
生の状態でβシート構造および分子内Ｓ−Ｓ結合の少なくとも一方を有する変性タンパク質に対しては、カチオン性またはアニオン性界面活性剤を特に有効に利用し得る。カチオン性界面活性剤の例としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（本明細書では以下、ＣＴＡＢと略記することもある）などが挙げられる。アニオン性界面活性剤の例としては、デオキシコール酸ナトリウム、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォン酸、ミリスチルサルフォベタイン（本明細書では以下、ＳＢ３−１４と略記することもある）などが挙げられる。カチオン系界面活性剤が好ましい。特にＣＴＡＢ、ＳＢ３−１４が好ましい。
【００６６】
界面活性剤は、通常、適切な溶媒または溶液に溶解し、溶液として用いられる。界面活性剤を溶解するための溶液は、タンパク質を変性させない程度のｐＨおよび塩濃度を有する溶液であれば、任意の溶液を用い得る。溶液は緩衝液が好ましい。このような緩衝液としては、対象とする酵素または生理活性ポリペプチドの活性および安定性に対して悪影響を及ぼさない緩衝液であれば、任意の緩衝液を用い得る。緩衝液の例としては、Ｔｒｉｓ−硫酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッド緩衝液などが挙げられる。
【００６７】
界面活性剤を溶解するための溶液のｐＨの範囲は、代表的にはｐＨ３．０〜１０．０であり、より好ましくはｐＨ５．０〜９．０の範囲である。
【００６８】
界面活性剤を含む溶液の濃度および添加量は、添加後の界面活性剤の濃度が、代表的には、０．０００１重量％〜５重量％の濃度、好ましくは０．００１重量％〜３重量％の濃度、より好ましくは０．００５重量％〜２重量％の濃度、最も好ましくは０．０１重量％〜１．５重量％の濃度になるようであれば、どのような濃度および添加量であってもよい。
【００６９】
変性タンパク質を含む溶液と界面活性剤を含む溶液とは公知の任意の方法で混合し得る。変性タンパク質に界面活性剤を添加し得る。添加の後、得られる混合液を必要に応じてほぼ均一となるように穏やかに攪拌する。その後、必要に応じて適切な温度で適切な時間放置する。代表的には、室温で数分間〜数日間、好ましくは約５分間〜約１日、より好ましくは約１０分間〜一晩、さらにより好ましくは約１時間放置する。ここで、室温とは、約２０〜２５℃をいい、一晩とは、約５〜１０時間をいう。
【００７０】
一般に、変性剤（例えば、グアニジン塩酸または尿素）が結合することによって解きほぐされた状態にある変性タンパク質を、試験管内で正しい高次構造を有した状態（すなわち、活性を有する状態）に再折り畳みするためには、まず、変性剤が結合した変性タンパク質から、希釈、透析などの手段により、徐々に変性剤を除いていくことにより、変性タンパク質を再折り畳みさせ、正しい立体構造を取らせる。しかし、この場合、変性剤が除かれるに従ってタンパク質が凝集するなどの問題が生じることが多い。本発明では、再折り畳みの段階でのこの問題を解決するために、タンパク質同士の凝集を防ぐ機能を果たす人工シャペロンとして界面活性剤を使用する。界面活性剤が人工シャペロンとして機能することにより、大過剰の溶液で変性剤を希釈する際に生じるタンパク質の凝集の問題を解決することができる。
【００７１】
本明細書において、「折り畳まれた状態」とは、タンパク質が、活性を発現するために必要な高次構造をとっている状態をいう。「再折り畳みする」および「再度折り畳ませる」とは、一旦変性して活性が失われたかもしくは活性が低下したタンパク質が、再度、折り畳まれた状態をとり活性を回復することをいう。
【００７２】
変性タンパク質を含む溶液と界面活性剤を含む溶液とが混合されると、変性タンパク質と共存している変性剤は希釈され、界面活性剤は変性タンパク質とともにタンパク質・界面活性剤複合体を形成して、変性タンパク質同士が凝集するのを防ぐ。なお、「タンパク質・界面活性剤複合体」という場合、界面活性剤がタンパク質の近傍に存在することによって、タンパク質が解きほぐされた状態が安定化されている状態をいう。タンパク質と界面活性剤との間に化学結合が形成されている必要はない。
【００７３】
次に、この解きほぐされた状態のタンパク質、すなわちタンパク質−界面活性剤複合体から、界面活性剤を除去し、タンパク質を正しく折り畳ませる。この機能を発揮する人工シャペロンとして、高分子量アミロースを使用する。高分子量アミロースは、その包接能力によって界面活性剤を取り込み、その結果、タンパク質・界面活性剤複合体から、界面活性剤が徐々に除かれ、それに伴って変性タンパク質の活性化が少しづつ起きる。すなわち、タンパク質はゆっくりと正しい高次構造に再度折り畳まれていき、正しい高次構造に折り畳まれることにより、その活性が回復する。
【００７４】
本発明の方法に用いられる高分子量アミロースは、変性タンパク質が生の状態で有する高次構造の種類によらず、すなわち、どのような変性タンパク質に対して用いる場合であっても、好適に使用される。
【００７５】
本明細書においては、「高分子量アミロース」とは、好ましくは平均重合度が約２０を超える、すなわち、平均分子量が約３５００を超える、直鎖状のα−１，４−グルカンをいう。高分子量アミロースの平均分子量は、好ましくは、約１万〜３００万であり、より好ましくは約２万〜２００万であり、さらにより好ましくは約６０万〜１１０万である。
【００７６】
一般にアミロースの性質は重合度に応じて大きく変化することが知られている。例えば、低分子量のアミロースは溶解性が低く、またたとえ溶解しても迅速に不溶性の沈殿を形成することが知られている。一方、高分子量のアミロースは包接能力が高く、水溶液は安定であり、沈殿をなかなか形成しない。従って実用的には、様々な分子量のアミロースをテストして、最も効果のあるアミロースを利用することが望まれる。特に、平均分子量６０万を超える高分子量アミロースは、水溶性を示すため、低分子量の不溶性アミロースと比較して取り扱いが非常に改善され、本発明において特に好適に用いられる。
【００７７】
高分子量アミロースの中でも比較的分子量の低い不溶性アミロースを用いる場合には、高分子量アミロースを低級アルコールを包接している包接化合物とすることにより、高分子量アミロースの溶解性を改善することができる。
【００７８】
包接化合物を製造するために用いられる低級アルコールの例としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、および３−ヘキサノールなどが挙げられる。アルコールは、好ましくは、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノールなどであり、さらに好ましくは１−ブタノールおよび１−ペンタノールである。アミロースは、アルコールを包接することにより溶解性が改善される。
【００７９】
アルコールを包接しているアミロース−アルコール包接化合物は、アミロースを含む溶液に適量のアルコールを添加して、アミロース−アルコール包接化合物の結晶を形成させ、得られた結晶を遠心分離によって回収し、乾燥することにより入手され得る。例えば、１−ブタノールを用いてアミロース−ブタノール包接化合物を製造する場合には、アミロースを含む溶液に約１／３０容量〜当量、好ましくは約１／２０容量〜約１／５容量、より好ましくは約１／１０容量の１−ブタノールを添加して混合することにより、アミロース−ブタノール包接化合物を沈澱させ、この沈澱を遠心分離によって回収し、回収することにより入手され得る。アミロース−ブタノール包接化合物を、１回目の遠心分離によって回収された後に、約３０℃〜約１００℃、好ましくは約６０℃〜約９０℃の熱水に溶解し、次いで再度１−ブタノールを添加することによって、より純粋なアミロース−ブタノール包接化合物が得られ得る。
【００８０】
高分子量アミロースは、合成したアミロースであってもよいし、天然に存在するアミロースであってもよい。好ましくは、酵素（例えば、ホスホリラーゼ）を用いて合成したアミロースである。ホスホリラーゼにより酵素合成された酵素合成アミロースは、分子量分布が均一であること、望む分子量のアミロースが生産できること、不純物を含まないこと、α−１，６結合からなる分岐構造がないこと、などから好適に用いられ得る。
【００８１】
高分子量アミロースは、当該分野で公知の方法によって合成され得る。例えば、北村ら（澱粉科学  ｖｏｌ．３６、２５７−２６４、１９８９）の方法に従って合成され得る。例えば、グルコース−１−リン酸およびマルトペンタオースを、適切な溶液中でホスホリラーゼの存在下で種々の比で混合して反応溶液を得、得られた反応溶液を適切な温度（例えば、３０℃〜５０℃）にて１時間〜数日間インキュベートすることによって合成され得る。合成される高分子量アミロースの平均分子量は、用いるグルコース−１−リン酸と、マルトペンタオースとの重量の比率を適切に変化させることにより調整され得る。例えば、グルコース−１−リン酸と、マルトペンタオースとのモル比率を約１：０．０１〜１：０．０００１にした場合、得られる高分子量アミロースの平均分子量は、約１万〜約１００万となり得る。反応後、反応溶液を加熱することによってホスホリラーゼを失活させ、次いで代表的には１０，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、上清液を取り出することにより、反応溶液から酵素を除去し得る。
【００８２】
このようにして合成された高分子量アミロースは、当該分野で公知の種々の方法により精製され得る。例えば、酵素が除去されている上清液に低級アルコールを添加して室温で１２時間静置することにより、アミロース−低級アルコール包接化合物を再結晶させ得る。次いで、１０，０００×ｇにて１５分間の遠心分離を行い、アミロース−低級アルコール包接化合物の沈澱を回収し、風乾することにより、アミロース−低級アルコール包接化合物の粉末を生成し得る。包接化合物でない高分子量アミロースを得る場合には、アミロース−低級アルコール包接化合物の沈澱を、熱水に溶解後、当量のエタノールを加えてアミロースを沈澱させ、代表的には１０，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、さらにエタノールでの沈澱洗浄を数回繰り返した後凍結乾燥することにより、純粋なアミロースを生成し得る。
【００８３】
本発明の方法による、変性タンパク質の活性化の過程は、タンパク質の活性を測定することにより評価することができる。タンパク質が酵素である場合は、その酵素に適した酵素活性測定方法を用いる。タンパク質が、生理活性ポリペプチドの場合には、当該生理活性の測定方法が利用できる。
【００８４】
実際にある対象タンパク質の変性状態からの活性化に、本発明の方法を利用しようとする場合、最良の結果を得るためには、いくつかの界面活性剤と種々の分子量の高分子量アミロースとを組み合わせてテストすることが好ましい。本発明のタンパク質再折り畳み用キットは、この目的を容易に達成することを目的としたものである。具体的には、本発明のタンパク質再折り畳み用キットは、少なくとも１種類（より好ましくは複数）の界面活性剤と、少なくとも１種類（より好ましくは複数）の高分子量アミロースを備える。また、界面活性剤除去剤として、高分子量アミロースに加えて、環状α−１，４−グルカンおよび低分子量の直鎖状α−１，４−グルカンなどをキットに加えることも可能である。この再折り畳み用キットは、発現系において、インクルージョンボディを形成するなどの問題を抱えている多くの有用なタンパク質の再折り畳みに利用し得る。
【００８５】
【実施例】
以下の実施例に従って、本発明についてより具体的に説明する。本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８６】
以下に示す実施例においては、本発明の活性化方法が汎用的に多くのタンパク質に対して適用可能であることを示すために、あえて２次構造が異なる３種のタンパク質をモデルタンパク質として用いた。つまり、天然状態では２次構造のほとんどがαヘリックス構造領域からなるクエン酸シンターゼ、天然状態では２次構造の８０％近くがβシート構造領域からなる炭酸脱水素酵素Ｂ、および天然状態ではαヘリックス領域およびβシート構造領域の両者を含み、かつ分子内Ｓ−Ｓ結合を有するリゾチームの３種類のタンパク質を用いた。
【００８７】
これら３種のタンパク質は、自然界に存在するタンパク質のとる代表的な高次構造であるαヘリックス、βシート、および分子内Ｓ−Ｓ結合をそれぞれ有しており、なおかつ、自発的折り畳み能が低く、分子シャペロンなどの介添えなしに正しい高次構造をとるとは考え難い。そのため、この３種のモデルタンパク質を、変性状態から活性を有する高次構造へと折り畳みすることのできる方法は、多くのタンパク質に適応可能であり、かつ汎用性に優れた方法である。
【００８８】
（実施例１：高分子量アミロースの調製）
高分子量アミロースを、北村ら（澱粉科学  ｖｏｌ．３６、２５７−２６４、１９８９）の方法にしたがって調製した。具体的には、グルコース−１−リン酸およびマルトペンタオースを酵素ホスホリラーゼ（０．６単位／ｍｌ）の存在下で、１０ｍＭマレイン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で３５℃にて１８時間インキュベートすることにより、酵素反応を行い、高分子量アミロースを合成した。酵素を用いて合成された高分子量アミロースの平均分子量は、用いたグルコース−１−リン酸と、マルトペンタオースとのモル比率を１：０．００５、１：０．００１、１：０．０００３、および１：０．０００１４に変化させることにより、平均分子量２万、８万、３０万、および７０万の４種に変化した。酵素反応終了後、反応溶液を９０℃にて１０分間加熱することにより酵素を失活させ、次いで１０，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、上清液を取り出すことにより、失活した酵素を除去した。
【００８９】
得られた上清液に、１／１０容量の１−ブタノールを添加して室温で１８時間静置することにより、アミロース−ブタノール包接化合物の結晶を形成させた。このアミロース−ブタノール包接化合物は、アミロースが１−ブタノールを包接している包接化合物である。１０，０００×ｇにて１５分間の遠心分離を行い、沈殿を回収した。得られた沈澱を９０℃の熱水に溶解した。沈澱が溶解した溶液に、再び１／１０容量の１−ブタノールを添加して室温で１８時間静置することにより、アミロース−ブタノール包接化合物を再結晶させた。１０，０００×ｇにて１５分間の遠心分離を行い、アミロース−ブタノール包接化合物の沈殿を回収したのち、少量の飽和１−ブタノール水溶液に懸濁して保存した。
【００９０】
平均分子量７０万のアミロースについては、アミロース−ブタノール包接化合物の沈殿を、９０℃の熱水に溶解後、当量のエタノールを加えてアミロースを沈澱させ、１０，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、さらに沈澱をエタノールでの沈澱洗浄を数回繰り返した後に凍結乾燥することにより、包接していないアミロース粉末を得た。
【００９１】
（実施例２：クエン酸シンターゼ（ＣＳ）の変性および活性化１）
（１）変性ＣＳ溶液の調製
ジチオトレイトールを含有するグアニジン塩酸水溶液にクエン酸シンターゼ（ＣＳ）の３．２Ｍ硫酸アンモニウム懸濁液（ベーリンガー・マンハイム社製）を添加して混合溶液を得た。混合溶液中のＣＳ濃度は２．４ｍｇ／ｍｌであり、グアニジン塩酸の濃度は６Ｍであり、そしてジチオトレイトールの濃度は４０ｍＭであった。この混合溶液を２５℃で１時間反応させることによって、ＣＳの高次構造を破壊し、ＣＳの酵素活性が完全に失活した変性ＣＳ溶液を調製した。
【００９２】
（２）変性ＣＳの活性化
用時調製した界面活性剤水溶液（０．１重量％  Ｔｗｅｅｎ  ４０、０．７１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．６））を、上記（１）の変性ＣＳ溶液１容量に対して、７０容量の割合で添加し、室温で１時間放置し、界面活性剤・ＣＳ複合体を形成させた。これにより、界面活性剤・ＣＳ複合体溶液が得られた。界面活性剤・ＣＳ複合体溶液８０容量に対して２０容量の高分子量アミロース水溶液（上記実施例１で得られた平均分子量７０万の高分子量アミロース）（５重量％水溶液）を添加し、２５℃で２時間反応させ、ＣＳを再度折り畳ませて活性化した。２時間の反応終了後、得られた反応液を前処理として０．２μｍのポアサイズのセルロースアセテートフィルターに通すことにより、反応液中の凝集物を除去し、濾液を得た。この濾液について以下の（３）で酵素活性を測定した。
【００９３】
（３）ＣＳの酵素活性の測定
上記（２）で得た再折り畳みされたＣＳを含む濾液２０μｌを、基質としてアセチルＣｏＡおよびオキザロ酢酸を溶解させた反応液３８０μｌに加え、酵素活性測定用溶液４００μｌを得た。酵素活性測定用溶液の２５℃で４１２ｎｍにおける吸光度を、分光光度計を用いて溶液調製後０．５秒毎に６０秒間測定した。測定した吸光度から酵素反応の初速度を算定した。酵素反応の初速度を、酵素活性の尺度とした。反応液の組成は、酵素活性測定用溶液中での最終濃度として溶媒を水として１５８ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、０．０２２ｍＭアセチルＣｏＡ、０．４８ｍＭ  オキザロ酢酸、０．４８ｍＭジチオビスであった。
【００９４】
酵素活性は、未変性のＣＳを同じ濃度となるように上記の反応液で希釈した場合の酵素活性を１００％として表した。
【００９５】
（４）結果
ＣＳの活性は、変性により１００％失われた後、本実施例の活性化方法により１００％回復した。
【００９６】
（実施例３：ＣＳの変性および活性化２）
界面活性剤としてＴｗｅｅｎ  ６０を用いた以外は実施例２と同じ操作を行って変性ＣＳを活性化した。
【００９７】
その結果、ＣＳの活性は、変性により１００％失われた後、本実施例の活性化方法により１００％回復した。
【００９８】
（実施例４：炭酸脱水素酵素Ｂ（ＣＡＢ）の変性および活性化１）
（１）変性ＣＡＢ溶液の調製
６Ｍのグアニジン塩酸水溶液にＣＡＢ（シグマ社製）の水溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）を添加して２５℃で１６時間反応させることによって、ＣＡＢの高次構造を破壊し、ＣＡＢの酵素活性が完全に失活した変性ＣＡＢ溶液を調製した。
【００９９】
（２）変性ＣＡＢの活性化
新鮮に調製した界面活性剤水溶液（０．１重量％ＣＴＡＢ、２３  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−硫酸緩衝液（ＰＨ７．８））を上記（１）の変性ＣＡＢ溶液１容量に対して、７００容量の割合で添加して室温で１０分間放置し、界面活性剤・ＣＡＢ複合体を形成させた。これにより、界面活性剤・ＣＡＢ複合体溶液が得られた。
【０１００】
次に、界面活性剤・ＣＡＢ複合体溶液３５容量に対して１５容量の割合で、別途調製した高分子量アミロース水溶液（上記実施例１で得られた平均分子量７０万の高分子量アミロース）を添加し（最終濃度は０．９重量％）、２５℃で１晩反応させ、ＣＡＢを再度折り畳ませて活性化した。
【０１０１】
一晩の反応終了後、得られた反応液を前処理として反応液をポアサイズ０．２μｍのセルロースアセテートフィルターに通すことにより、反応液中の凝集物を除去し、濾液を得た。この濾液について以下の（３）で酵素活性を測定した。
【０１０２】
（３）ＣＡＢの酵素活性の測定
上記（２）で得た再折り畳みされたＣＡＢを含む濾液４５０μｌを、基質としてパラニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡＣ）を溶解させた反応液５０μｌに加え、酵素活性測定用溶液５００μｌを得た。酵素活性測定用溶液の２５℃で４００ｎｍにおける吸光度を、分光光度計を用いて溶液調製後０．５秒毎に６０秒間測定した。測定した吸光度から酵素反応の初速度を算定した。酵素反応の初速度を、酵素活性とした。反応液の組成は、酵素活性測定用溶液中での最終濃度として溶媒を水として５２ｍＭ  ｐＮＰＡＣ、２３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−硫酸緩衝液（ｐＨ７．８）であった。
【０１０３】
酵素活性は、未変性のＣＡＢを同じ濃度となるように上記の反応液で希釈した場合の酵素活性を１００％として表した。
【０１０４】
（４）結果
ＣＡＢの活性は、変性により１００％失われた後、本実施例の活性化方法により１００％回復した。
【０１０５】
（実施例５：ＣＡＢの変性および活性化２）
界面活性剤としてＳＢ３−１４を用いた以外は実施例４と同じ操作を行って変性ＣＡＢを活性化した。
【０１０６】
その結果、ＣＡＢの活性は、変性により１００％失われた後、本実施例の活性化方法により１００％回復した。
【０１０７】
（実施例６：ＣＡＢの変性および活性化３）
高分子量アミロースとして平均分子量２万のアミロース−ブタノール包接体を用い、高分子量アミロースの反応液中での最終濃度を０．２重量％とした以外は実施例４と同じ操作を行って変性ＣＡＢを活性化した。
【０１０８】
その結果、ＣＡＢの活性は、変性により１００％失われた後、本実施例の活性化方法により１００％回復した。
【０１０９】
（実施例７：ＣＡＢの変性および活性化４）
界面活性剤としてＳＢ３−１４を用いた以外は実施例６と同じ操作を行って変性ＣＡＢを活性化した。
【０１１０】
その結果、ＣＡＢの活性は、変性により１００％失われた後、本実施例の活性化方法により８０％回復した。
【０１１１】
（実施例８：リゾチームの変性および活性化１）
（１）変性リゾチーム溶液の調製
ジチオトレイトールを含有するグアニジン塩酸水溶液にリゾチーム水溶液を添加して混合溶液を得た。混合溶液中のリゾチームの濃度は１５ｍｇ／ｍｌであり、グアニジン塩酸の濃度は５Ｍであり、そしてジチオトレイトールの濃度は５０ｍＭであった。この混合溶液を２５℃で１６時間反応させることにより、リゾチームの高次構造を破壊し、リボチームの酵素活性が完全に失活した変性リゾチーム溶液を調製した。
【０１１２】
（２）変性リゾチームの活性化
新たに調製した界面活性剤水溶液（０．１重量％  ＣＴＡＢ、２ｍＭ  ＤＬ−シスチン、２３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ８．１））を、上記（１）で得た変性リゾチーム溶液１容量に対して１００容量の割合で添加し、室温で１晩放置し、界面活性剤・リゾチーム複合体を形成させた。これにより、界面活性剤・リゾチーム複合体溶液が得られた。
【０１１３】
続いて、この界面活性剤・リゾチーム複合体溶液１４０容量に対して６０容量の割合で、別途調製した高分子量アミロース水溶液（上記実施例１で得られた平均分子量７０万の高分子量アミロース）を添加し（最終濃度は０．９重量％）、２５℃で１時間反応させ、リゾチームを再度折り畳ませて活性化した。１時間の反応終了後、得られた反応液を前処理として０．２μｍのポアサイズの酢酸アセテートフィルターに通すことにより、反応液中の凝集物を除去し、濾液を得た。この濾液について以下の（３）で酵素活性を測定した。
【０１１４】
（３）リゾチームの酵素活性の測定
上記（２）で得た再折り畳みされたリゾチームを含む濾液２０μｌを、基質としてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓを懸濁させた反応液５００μｌに加え、酵素活性測定用溶液５２０μｌを得た。酵素活性測定用溶液の２５℃で４５０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計を用いて溶液調製後０．５秒毎に６０秒間測定した。測定した吸光度から酵素反応の初速度を算定した。酵素反応の初速度を、酵素活性の尺度とした。反応液の組成は、酵素活性測定用溶液中での最終濃度として溶媒を水として０．１６ｍｇ／ｍｌ  Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ６．２）であった。
【０１１５】
酵素活性は、未変性のリゾチームを同じ濃度となるように上記の反応液で希釈した場合の酵素活性を１００％として表した。
【０１１６】
（４）結果
リゾチームの活性は、変性により１００％失われた後、本実施例の活性化方法により８０％回復した。
【０１１７】
（実施例９：リゾチームの変性および活性化２）
界面活性剤としてＳＢ３−１４を用いた以外は実施例８と同じ操作を行って変性ＣＳを活性化した。
【０１１８】
その結果、リゾチームの活性は、変性により１００％失われた後、本実施例の活性化方法により８０％回復した。
【０１１９】
（実施例１０：リゾチームの変性、およびブタノール包接化合物を利用しての活性化３）
高分子量アミロースとして平均分子量２万、８万、または３０万の異なる３種のアミロース−ブタノール包接体を用い、いずれのアミロース−ブタノール包接体を用いた場合も高分子量アミロースの濃度が反応液中で０．９重量％になるように添加された以外は実施例９と同じ操作を行って変性リゾチームを活性化した。
【０１２０】
その結果、どの分子量のアミロースを用いた場合も、リゾチームの活性は、変性により１００％失われた後、本実施例の活性化方法により７０％回復した。
【０１２１】
（実施例１１：低分子量アミロースとの効果の比較）
アミロースとして平均分子量２千９百、７０万、または２万の異なる３種のアミロース−ブタノール包接体を、最終濃度が０．９重量％となるように用いた以外は実施例９と同じ操作を行って変性リゾチームを活性化した。平均分子量２千９百のアミロース−ブタノール包接体は、比較のための低分子量アミロースであった。低分子量アミロースによる活性化は、１８０分間の活性化後、５０％であった。一方、平均分子量７０万の高分子量アミロースによる活性化および平均分子量２万の高分子量アミロースによる活性化は、１８０分間の活性化後、それぞれ、８０％および７０％であった。
【０１２２】
図２にリゾチームの活性化の経時変化を示す。高分子量のアミロースは、低分子量アミロースよりも高い程度の活性化を示した。
【０１２３】
【発明の効果】
本発明の方法によって、自発的折り畳み能が低く、かつ分子シャペロンの介添えなしには正しい高次構造をとることができないタンパク質を、短時間で、かつ活性を有する正しい高次構造を取るように、折り畳みさせることが可能である。また、本発明によって、本発明の方法を容易に実現可能とするに有用な、少なくとも１種類の高分子量アミロース、および少なくとも１種類の界面活性剤を備える、タンパク質再折り畳み用キットが提供される。このキットを構成している各成分は、均一な品質のものを大量に供給することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法による変性タンパク質の活性化の模式図である。
【図２】図２は、各種分子量のアミロースを用いた変性リゾチームの活性化の経時変化を示すグラフである。横軸は、アミロースとのインキュベーション時間、縦軸はリゾチームの酵素活性を示す。白丸は分子量７０万のアミロース、黒丸は分子量２万のアミロース、そして三角は分子量２千９百のアミロースを用いた場合のリゾチームの酵素活性を示す。
【図１】
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【図２】
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