(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステリルエステルと中性脂質とを含む混合物からステリルエステルを分離する方法であって、
該混合物中の中性脂質を加水分解、ケン化分解あるいはエステル交換する工程、および
該ステリルエステルを２５０〜３００℃、１．３３Ｐａ（０．０１ｍｍＨｇ）以下の蒸留にて分離する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記中性脂質の加水分解あるいはエステル交換が、エステラーゼで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エステラーゼがリパーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物が植物油脱臭留出物の蒸留残渣である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
ステリルエステルと中性脂質とを含む混合物からステリルエステルの純度が高められた画分を取得する方法であって、
該混合物に遊離脂肪酸または脂肪酸のアルコールエステルを添加し、該中性脂質中のジグリセリドをトリグリセリドに変換する工程、および
該ステリルエステルを２５０〜３００℃、１．３３Ｐａ（０．０１ｍｍＨｇ）以下の蒸留にて得る工程、を含む方法。
【請求項６】
前記中性脂質中のジグリセリドのトリグリセリドへの変換がエステラーゼで行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記エステラーゼがリパーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物が植物油脱臭留出物の蒸留残渣である、請求項５から７のいずれかの項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ステリルエステル（ステロールの脂肪酸エステル)を効率よく、高純度に精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ステロールの血中コレステロール値を低減させる機能が注目され、サラダ油、ドレッシング、マーガリン等にステロールあるいはステロール／ステリルエステル混合物が添加された商品が開発されている。そして、現在、ステロールあるいはステリルエステルの需要が高まりつつある。これらのステロールあるいはステリルエステルは、一般に植物油の精製工程の副産物中に存在するが、精製が困難であり、収率よく高純度のステリルエステルを得る新しい方法の開発が望まれている。
【０００３】
これまでに、リパーゼを触媒として高純度のステロールを脂肪酸でエステル化し、ステリルエステルを製造する方法が開示されている（特公平５−３３７１２号公報）。しかし、この方法では、高純度ステリルエステルを製造するには、高純度ステロールを原材料として使用しなければならず、製造されたステリルエステルはステロールより高価格となる。特開２０００−３０２７７７号公報には、ビタミン、ステロール、脂肪酸、中性脂質、炭化水素などを含む混合物を、水を含む反応系でリパーゼ処理し、中性脂質の加水分解と同時にステロールを脂肪酸でエステル化してステリルエステルに変換した後、ステリルエステルを蒸留残渣として分離精製する方法が記載されている。この方法は植物油脱臭留出物を原料として用い、トコフェロールを精製する際に副産物として精製できるため高純度ステリルエステルの製造方法として優れている。
【０００４】
この公報に記載の方法は、植物油脱臭留出物を蒸留して、その留分を原料として用い、植物油脱臭留出物の残渣（通常、スカム残渣といわれている）は廃棄物として廃棄されている。このスカム残渣中には、ステリルエステルが２０〜７０％含まれているため、その利用が求められているにも係わらず、ステリルエステルの有効な分離方法がない。そのため、このステリルエステルを含むスカム残渣は、未だに産業廃棄物として処理されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、近い将来のステロール、ステロール／ステリルエステル混合物、ステリルエステルの大量需要を予想すると、まだ利用されていない原料から高純度ステロールあるいはステリルエステルを効率よく精製する方法が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ステリルエステルを含む混合物を出発原料として用い、ステリルエステルを高純度に精製する方法、特に、前記植物油脱臭留出物の蒸留残渣（スカム残渣）からステリルエステルを高純度に精製する方法を開発することを目的として研究を行い、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、ステリルエステルと中性脂質とを含む混合物からステリルエステルを分離する方法であって、該混合物中の中性脂質を加水分解、ケン化分解あるいはエステル交換する工程、および、該ステリルエステルを分離する工程、を含む方法を提供する。
【０００８】
好ましい実施態様においては、前記中性脂質の加水分解あるいはエステル交換が、エステラーゼで行われる。
【０００９】
好ましい実施態様においては、前記エステラーゼがリパーゼである。
【００１０】
好ましい実施態様においては、前記ステリルエステルの分離が、高温、高真空下の蒸留である。
【００１１】
さらに好ましい実施態様においては、前記混合物が植物油脱臭留出物の蒸留残渣である。
【００１２】
さらに、本発明は  ステリルエステルと中性脂質とを含む混合物からステリルエステルを分離する方法であって、該混合物に遊離脂肪酸または脂肪酸のアルコールエステルを添加し、該中性脂質中のジグリセリドをトリグリセリドに変換する工程、および、該ステリルエステルを分離する工程、を含む方法を提供する。
【００１３】
好ましい実施態様においては、前記中性脂質中のジグリセリドのトリグリセリドへの変換がエステラーゼで行われる。
【００１４】
また、  好ましい実施態様においては、前記エステラーゼがリパーゼである。
【００１５】
好ましい実施態様においては、前記ステリルエステルの分離が、高温、高真空下の蒸留である。
【００１６】
さらに好ましい実施態様においては、前記混合物が植物油脱臭留出物の蒸留残渣である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
（定義）
本発明においてステロールとは、β-シトステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、スティグマステロールなどの、主に植物由来のステロールをいうが、これらに限定されない。
【００１８】
ステリルエステルは、ステロールの脂肪酸エステルをいう。本発明においては、長鎖脂肪酸エステルが特に好ましく用いられる。長鎖脂肪酸としては、炭素数が１２〜２４程度の、飽和または不飽和の、直鎖または分岐脂肪酸が好ましく用いられる。
【００１９】
中性脂質とは、特に断わらない限り、長鎖脂肪酸とグリセロールから構成される脂質をいい、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドをいう。
【００２０】
また低級アルコールとは、炭素数１〜１０程度の直鎖あるいは分岐のアルコールをいい、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノールなどが例示される。
【００２１】
（出発材料）
ステリルエステルと中性脂質とを含む混合物としては、特に制限はない。植物、微生物などいずれの起源のものでもよく、好ましくは植物由来のもの、さらに好ましくは、植物油脱臭留出物蒸留残渣（スカム残渣）が用いられる。例えば、植物油脱臭留出物を１．３３〜２６．６６Ｐａ（０．０１〜０．２ｍｍＨｇ）の真空下で、180〜280℃で蒸留した蒸留残渣が、本発明の出発原料として用いられる。なお、この蒸留条件は一例であり、流下膜式蒸留装置、遠心式分子蒸留装置、高真空精密蒸留装置などの方法では、真空度、温度等の条件は変化することはいうまでもない。
【００２２】
Ａ．第１発明
本発明の第１の特徴は、このステリルエステルと中性脂質とを含む混合物中の中性脂質を加水分解、ケン化分解あるいは低級アルコールでエステル交換し、脂肪酸あるいは脂肪酸エステルを生成させる点にある。この反応において、ステリルエステルは加水分解、ケン化分解あるいはエステル交換をほとんど受けることがなく、反応液中のステリルエステルと脂肪酸あるいは脂肪酸エステルの沸点あるいは各種の溶媒に対する溶解度も大きく異なるため、ステリルエステルと脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとの分離が容易となる。
【００２３】
ステリルエステルと中性脂質とを含む混合物中の中性脂質を加水分解、ケン化分解あるいは低級アルコールでエステル交換し、脂肪酸あるいは脂肪酸エステルを生成させる方法には、酵素的方法と化学的方法とがある。
【００２４】
（酵素法による加水分解）
酵素を触媒とする加水分解には、エステラーゼが用いられる。エステラーゼはエステル結合を加水分解する酵素をいい、ステリルエステルを加水分解せず中性脂質を加水分解する酵素であれば、微生物、植物、動物などいずれの起源の酵素であってもよい。特にリパーゼが好ましく用いられる。なお、リパーゼは水分量を限定することによりエステル化反応を優先して行うことができる。
【００２５】
使用する酵素の形態は、遊離型であってもよいし、固定化したものを用いてもよい。反応系はステリルエステル／中性脂質混合物、水、酵素からなる混液を攪拌しながらインキュベートすればよい。水の量は、好ましくは５〜９０重量％、より好ましくは２０〜７０重量％である。反応温度は、酵素が失活することなく、効率よく反応が進行する温度に設定すればよく、操作性を考慮して２０〜５０℃が好ましい。反応のｐＨは特に調整および制御する必要はない。有機溶媒は特に添加する必要はないが、もし加えるとすれば、ヘキサン、t-ブタノール、アセトン等が用いられる。酵素量は反応条件（反応温度、水分量、攪拌速度など）によって変化するため、適宜決定すればよい。反応時間も条件によって変わるため、適宜決定すればよい。一例を挙げると、リパーゼの場合、反応混液１ｇ当たり５〜３０００Ｕになるように添加し、反応時間は、操作性を考え、３〜７２時間程度が好ましい。なお、リパーゼの１Ｕは、オリーブ油を基質として用いた加水分解反応で、１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量をいう。
【００２６】
（化学法による加水分解およびケン化分解）
化学的な方法を利用した中性脂質の分解には、通常、油脂の分解に適用されている方法を採用することができる。例えば、高温・高圧、無触媒で加水分解する方法、アルカリ触媒（ＮａＯＨ、ＫＯＨなど）を用いた加水分解、ＮａＯＨ、ＫＯＨなどの存在下でのケン化分解などがある。ステリルエステルの加水分解をできるだけ抑え、中性脂質の加水分解を優先して進行させるには、低級アルコール（メタノール、エタノールなどが好ましい）存在下での、ＮａＯＨ、ＫＯＨなどによるケン化分解が好ましい。この反応では、反応系中に存在する中性脂質由来の脂肪酸量に対して等モル〜５モル等量のアルカリを加え、ステリルエステル／中性脂質の混合物に対して重量比で０．３〜２．０倍量の水と、重量比で０．１〜１０倍量の低級アルコールを加えて加圧下、または還流させながらケン化分解を行う。反応時間は反応条件によって異なるため規定できないが、１〜２４時間が好ましい。なお、化学的な方法を採用したときには、ステリルエステルもある程度加水分解されるおそれがある。
【００２７】
（酵素法によるエステル交換）
酵素を触媒とする中性脂質のエステル交換反応は、低級アルコールとエステラーゼの存在下で行われる。水を含んだ反応系中では加水分解が進行する可能性があり、エステル交換に加えて加水分解も進行する。従って、中性脂質だけを効率よく低級アルコールでエステル交換するには、水を加えない反応系を構築することが好ましい。ステリルエステルと中性脂質を主成分とする混合物と、低級アルコール（メタノール、エタノールが好ましい）、および酵素からなる反応混液を、攪拌あるいは振盪しながらインキュベートすることにより選択的エステル交換を行うことができる。
【００２８】
酵素としては、反応系中でステリルエステルをエステル交換せず中性脂質と低級アルコールを認識し、エステル交換反応を触媒する酵素であれば、微生物、植物、動物などいずれの起源の酵素であってもよい。エステラーゼ、特にリパーゼが好ましく用いられる。使用する酵素の形態は、遊離型であってもよいし、固定化したものを用いてもよいが、遊離型酵素を用いるときは可能な限り少量の水に溶かした酵素製剤を少量添加し、反応系中の水分量を高めない配慮をすることが好ましい。より好ましくは、固定化酵素を触媒として用い、反応系には水を加えない方がよい。また、固定化酵素を触媒として用いるときには、固定層型バイオリアクターを用いた反応系も効果的である。
【００２９】
添加する低級アルコールの量は、中性脂質に含まれている脂肪酸量に対して等モル〜２モル等量で充分であるが、反応効率を高めるためにこれ以上加えても良い。ただ、ステリルエステル／中性脂質の混合物に溶解度以上の低級アルコールを加えると、リパーゼはエマルションになったアルコール滴と接触するため、不可逆的な失活を起こしてしまう（JAOCS, 76, 789-793, 1999; JAOCS, 77, 355-360, 2000）。この不可逆的な失活は低級アルコールを溶解度の限度内で逐次添加することによって防ぐことができる。反応温度は酵素が失活することなく、効率よく反応が進行する温度に設定すればよく、操作性を考慮して２０〜５０℃が好ましい。反応のｐＨは特に調整および制御する必要はない。有機溶媒は特に添加する必要はないが、もし加えるとすればヘキサン、t-ブタノール、アセトン等を用いることもできる。酵素量は反応条件（低級アルコールの量、反応温度、攪拌速度など）によって変化するが、３時間〜５日程度の反応で平衡状態に達する酵素量に設定することが好ましい。
【００３０】
（化学法によるエステル交換）
化学的な方法を利用した中性脂質の低級アルコールによるエステル交換には、通常、油脂のエステル交換反応に適用されている酸触媒あるいはアルカリ触媒を用いる方法を採用することができる。この反応では、ステリルエステル／中性脂質の混合物に、その重量に対して０．１〜３％のアルカリ触媒（ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｎａ−メチラート、Ｎａ−エチラートなどが好ましい）あるいは酸触媒（硫酸、塩酸などが好ましい）と、重量比で０．１〜１０倍、好ましくは２〜６倍のの低級アルコール（メタノール、エタノールが好ましい）を加えて還流させながらエステル交換反応を行う。なお添加する低級アルコール量を増やすと、選択性が上昇して中性脂質が優先的にエステル交換されるようになる。反応時間は反応条件によって異なるため規定できないが、１〜２４時間が好ましい。なお、化学的な方法を採用したときには、ステリルエステルもある程度エステル交換されることがある。
【００３１】
Ｂ．第２発明
本発明の第２の特徴は、ステリルエステルと中性脂質とを含む混合物に遊離脂肪酸または脂肪酸のアルコールエステルを添加し、中性脂質中のジグリセリドをトリグリセリドに変換する点にある。この中性脂質中の部分グリセリド（主としてジグリセリド）を、酵素あるいは化学触媒を用いて遊離脂肪酸（好ましくは長鎖遊離脂肪酸あるいはその低級アルコールエステル）でエステル化し、トリグリセリドに変換することにより、ステリルエステルはほとんど反応を受けることがなく、反応液中のステリルエステルと生じたトリグリセリドとの沸点あるいは各種の溶媒に対する溶解度が大きく異なるため、ステリルエステルとトリグリセリドとの分離が容易となる。
【００３２】
（酵素法によるトリグリセリド化）
酵素法による中性脂質のトリグリセリド化は、ステリルエステルと中性脂質との混合物、長鎖脂肪酸（またはそのエステル）、酵素からなる反応液を攪拌あるいは振盪しながらインキュベートするとよい。用いられる酵素としては、反応系中で部分グリセリドと長鎖脂肪酸のエステル化を効率よく触媒する酵素であれば、微生物、植物、動物などいずれの起源の酵素であってもよい。酵素としてはエステラーゼが好ましく、リパーゼがさらに好ましい。使用する酵素の形態は、遊離型であってもよいし、固定化したものを用いてもよい。遊離型酵素を用いるときは可能な限り少量の水に溶かした酵素製剤を少量添加する配慮が好ましい。より好ましくは、固定化酵素を触媒として用い、反応系には水を加えない方がよい。また、固定化酵素を触媒とするときには固定層型バイオリアクターの利用も効果的である。
【００３３】
この反応系において、エステル化反応によって生成してくる水はエステル化率の上昇を妨害する。したがって、減圧、窒素ガスの吹き込み、モレキュラーシーブスの添加などの手段により生成水を除去すると反応の効率を上げることができる。反応系に加える長鎖脂肪酸の量は、部分グリセリドのトリグリセリド化に必要な理論モル等量から10倍モル等量程度加えるとよい。反応温度は酵素が失活することなく、効率よく反応が進行する温度に設定すればよく、操作性を考慮して２０〜５０℃が好ましい。反応のｐＨは特に調整および制御する必要はない。有機溶媒は特に添加する必要はないが、もし加えるとすればヘキサン、ｔ−ブタノール、アセトン等が用いられ。酵素量は反応条件（低級アルコールの量、反応温度、攪拌速度など）によって変化するが、３時間〜５日程度の反応で平衡状態に達する酵素量に設定することが好ましい。
【００３４】
（化学法によるトリグリセリド化）
化学的な方法を利用した部分グリセリドの遊離脂肪酸（長鎖脂肪酸）または脂肪酸低級アルコールエステルによるトリグリセリド化反応には、油脂のエステル化に通常適用されている方法を採用することができる。本発明に適した反応形態としては、例えばステリルエステルと中性脂質との混合物に、部分グリセリドのトリグリセリド化に必要な理論等量から１０倍モル等量の長鎖脂肪酸を加え、減圧下で窒素ガスを吹き込みながら、１５０℃〜３００℃で攪拌しながら０．５〜２４時間加温するとよい。また、この反応においてアルカリ触媒（ＫＯＨ、ＮａＯＨなど）や金属触媒（ＳｎＯ、ＺｎＯなど）を用いると、反応温度を下げることができ、反応時間も短縮できる。
【００３５】
Ｃ．ステリルエステルの分離
上記第１発明および第２発明の方法で中性脂質が加水分解あるいはケン化分解された、エステル交換された、あるいはトリグリセリド化された反応液から、ステリルエステルが分離される。ステリルエステルの分離方法としては、蒸留、膜分離、溶媒分画、クロマトグラフィー、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３６】
特に、第１発明の加水分解反応およびエステル交換反応によって得られた反応物からステリルエステルを精製するには、蒸留および溶媒分画（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、アセトン、ヘキサンなどによる分画）が好ましく、第２発明のエステル化反応によって得られた反応物からステリルエステルを精製するには蒸留が好ましい。
【００３７】
（溶媒分画）
第１発明による中性脂質の加水分解、ケン化分解あるいはエステル交換された反応液からステリルエステルを分離する方法に適している。加水分解反応物およびケン化分解反応物中にはステリルエステルと脂肪酸が主成分として含まれており、エステル交換反応物中にはステリルエステルと脂肪酸エステルが主成分として含まれている。脂肪酸および脂肪酸エステルは低級アルコール（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノールなど、およびこれらの混合溶媒）には溶解するが、ステリルエステルは溶解しにくいという性質を利用し、ステリルエステルを不溶性画分として回収できる。
【００３８】
（蒸留による分離方法）
第１および第２の発明による方法により、中性脂質が加水分解、ケン化分解、あるいはエステル交換されて生じる脂肪酸および脂肪酸エステル、あるいはトリグリセリド化されて生じるトリグリセリドは、ステリルエステルとの沸点の差が大きくなることから、蒸留方法が好ましい分離方法として採用される。これまで、分子蒸留によりステリルエステルを留出させて精製する方法は開示されていなかったが、本発明でこの分子蒸留による精製方法が好ましい精製手段の一つであることを見い出した。反応液を分子蒸留に負荷すると、脂肪酸あるいは脂肪酸エステルを留分として除去でき、得られた蒸留残渣を高温・高真空下で蒸留するとステリルエステルが留分として得られ、トリグリセリドや未知高沸点物質は残渣として除去することができるため、高純度のステリルエステルが得られる。さらにこの蒸留によって、脱色もできるため製品の品質を飛躍的に高めるという効果が得られる。
【００３９】
蒸留装置としては、流下膜式蒸留装置、遠心式分子蒸留装置、高真空精密蒸留装置などを挙げることができる。蒸留する温度と真空度は、用いる蒸留装置によって異なるので、適宜決定すればよいが、高温、高真空下で蒸留することにより、ステリルエステルが留分として回収される。高温条件とは、２５０〜３００℃をいい、好ましくは２６０〜３００℃、より好ましくは２７０〜２８０℃をいう。高真空とは、１．３３Ｐａ（０．０１ｍｍＨｇ）以下をいい、好ましくは０．６７Ｐａ（０．００５ｍｍＨｇ）以下、より好ましくは、０．６７〜０．１３３Ｐａ（０．００５〜０．００１ｍｍＨｇ）である。０．４０Ｐａ（０．００３ｍｍＨｇ）前後が好ましい。ステリルエステルを留分として回収する好ましい条件は、温度２５０〜３００℃、真空度１．３３Ｐａ（０．０１ｍｍＨｇ）以下であり、より好ましくは、温度２６０〜３００℃、真空度０．６７Ｐａ（０．００５ｍｍＨｇ）以下であり、さらに好ましい条件は、温度２７０〜２８０℃、真空度０．６７〜０．１３３Ｐａ（０．００５〜０．００１ｍｍＨｇ）である。温度２７０〜２８０℃、真空度０．４０Ｐａ（０．００３ｍｍＨｇ）前後での蒸留が、好ましく用いられる。これらの条件は、一般的なものであり、用いる装置、条件により、変動することがあり得ることは、前記の通りである。
【００４０】
第１の発明により中性脂質から生じたグリセロールは水洗で除去され、脂肪酸および脂肪酸エステルは、１．３３〜６６．６５Ｐａ（０．０１〜０．５ｍｍＨｇ）、１５０℃〜２００℃で留出させることができる。また、反応液中に微量存在しているトコフェロール、ステロール、炭化水素などは、１．３３〜２６．６６Ｐａ（０．０１〜０．２ｍｍＨｇ）、１８０℃〜２８０℃で蒸留することにより、留出させることができる。従って、ステリルエステルは、上記成分から分離可能である。すなわち、植物油脱臭留出物の残渣中のステリルエステルは、脂肪酸および脂肪酸エステルが留分として回収され、さらにトコフェロール、ステロール、炭化水素などが留分として留去された残渣中に存在し得る。そして、その純度は９０％以上になり得るが、わずかながら未知の高沸点物質が含まれていると考えられる。従来は、未知の高沸点物質、トリグリセリドおよびステリルエステルとの分離ができなかったが、本発明では、さらに前記高温・高真空下で蒸留するとステリルエステルを留出させることができることを認め、未知の高沸点物質、トリグリセリドを残渣として除去する方法の確立に成功した。
【００４１】
本発明の第２の方法により中性脂質のトリグリセリド化（エステル化）反応によって得られた反応物からステリルエステルを精製するときにも、蒸留法による精製は効果的である。原料中に含まれ、反応後もそのままの分子形態で残存している遊離脂肪酸は１．３３〜６６．６５Ｐａ（０．０１〜０．５ｍｍＨｇ）、１５０℃〜２００℃で蒸留することにより、またトコフェロール、ステロール、炭化水素などは、１．３３〜２６．６６Ｐａ（０．０１〜０．２ｍｍＨｇ）、１８０℃〜２８０℃で蒸留することにより留出させることができる。これらの留分を除去した後の残渣画分の主成分はステリルエステルとトリグリセリドである。この残渣を、本発明の高温・高真空条件（１．３３Ｐａ（０．０１ｍｍＨｇ））以下、２５０〜３００℃）で蒸留すると、ステリルエステルを留分として回収し、トリグリセリドが残渣として残るので、純度７０％以上のステリルエステルを精製することができる。
【００４２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、この実施例が本発明を限定しないことはいうまでもない。
【００４３】
なお、実施例において、出発原料、反応生成物などの定量、定性分析は以下の方法によった。ステロール、ステリルエステル、脂肪酸、ジグリセリド、およびトリグリセリドはガスクロマトグラフィー、あるいはＴＬＣ／ＦＩＤアナライザーにより分析した。ガスクロマトグラフィーは、ＤＢ−１ｈｔキャピラリーカラム（J&W Scientific社；０．２５ｍｍ×５ｍ）を用い、１２０〜２８０℃は１５℃／分で、２８０〜３７０℃は１０℃／分でそれぞれ昇温し、３７０℃で１分間維持した。注入口および検出器（ＦＩＤ）の温度は３８０℃であった。また、ＴＬＣ／ＦＩＤアナライザー（イヤトロスキャン）による分析は、ベンゼン：クロロホルム：酢酸（容量比で５０：２０：０．７）で展開した後、さらにヘキサン：ジエチルエーテル（容量比で６５：５）で展開してから定量した。
【００４４】
（原料の調製例）
原料であるステリルエステルと中性脂質を含む混合物を調製し、得られた混合物の成分を分析した。薄膜式蒸留機を用い、大豆油脱臭留出物１０ｋｇを４．０Ｐａ（０．０３ｍｍＨｇ）、２５０℃で蒸留し７．１ｋｇの留分と２．９ｋｇの残渣を得た。残渣画分の組成を表１に示す。
【００４５】
【表１】
0003853181.tif 000002
【００４６】
この残渣画分には、ステリルエステルが約４３重量％、中性脂質が約４０重量％含まれていた。
【００４７】
（実施例１）ステリルエステル／中性脂質混合物の酵素による加水分解
サンプル瓶（５０ｍｌ容量）に前記調製例により得られたステリルエステルと中性脂質混合物３ｇ、水３ｍｌ、反応液１ｇ当たり１２Ｕのリパーゼ量からなる反応液を３０℃で攪拌しながら１６時間インキュベートした。用いた酵素は、Candida cylindracea（名糖産業(株)製、商品名：Lipase OF）、Rhizopus delemar（田辺製薬(株)製、商品名：タリパーゼ）、Pseudomonas aeruginosa（東洋紡績(株)製、商品名：LPL）、Pseudomonas sp.（天野エンザイム(株)製、商品名：Lipase-PS）、Pseudomonas glumae（旭化成(株)製）、およびAlcaligenes sp.（名糖産業(株)製、商品名：Lipase-QLM）であった。反応終了後の反応液中に存在する成分を表２に示す。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
この結果より、いずれのリパーゼを用いてもステリルエステルに影響を与えることなく、中性脂質を選択的に加水分解することができることがわかった。中でも、Candida cylindraceaのリパーゼ（Lipase-OF; 名糖産業）を触媒として用いると、少ない酵素量で中性脂質をほぼ完全に加水分解できることが分かった。
【００５０】
（実施例２）ステリルエステル／中性脂質混合物の酵素法による加水分解
原料の調製例で得られたステリルエステル／中性脂質混合物１ｋｇ、水４００ｇ、反応混液１ｇ当たり２０ＵのCandida cylindraceaのリパーゼ（名糖産業, Lipase-OF）からなる反応混液を４０℃で、攪拌しながらインキュベートした。反応の経時変化を表３に示す。
【００５１】
【表３】
0003853181.tif 000004
【００５２】
この反応条件下、約１０時間で、夾雑している中性脂質をほぼ完全に加水分解することができた。
【００５３】
（実施例３）ステリルエステル／中性脂質混合物の化学法によるケン化分解
原料の調製例で得られたステリルエステル／中性脂質混合物１００ｇ、水１００ｇ、メタノール５０ｇ、および１１．４ｇのＫＯＨ（中性脂質中の脂肪酸に対して１．５モル等量）からなる反応液を、還流しながら４時間反応させた。反応前後の反応液中の成分を表４に示す。
【００５４】
【表４】
0003853181.tif 000005
【００５５】
設定した反応条件下で中性脂質は完全にケン化分解されたが、ステリルエステルは一部しかケン化分解されない為、アルカリ触媒を用いたメタノール中でのケン化分解を行っても中性脂質を選択的に加水分解できることが分かった。
【００５６】
（実施例４）ステリルエステル／中性脂質混合物の酵素法によるエステル交換原料の調製例で得られたステリルエステル／中性脂質混合物１０ｇ、メタノール０．３９ｇ（中性脂質に含まれている脂肪酸量に対して等モル）、および固定化Candida antarcticaリパーゼ（Novozym 435：ノボザイムズ）０．４ｇからなる反応混液を３０℃で振盪しながらインキュベートした。反応１日後にさらに０．３９ｇのメタノールを添加し、合計３日間反応を行った。反応の経時変化を表５に示す。
【００５７】
【表５】
0003853181.tif 000006
【００５８】
３日間の反応で中性脂質はほぼ完全に脂肪酸メチルに変換され、原料中に含まれていた微量の遊離脂肪酸もメチルエステルに変換された。
【００５９】
（実施例５）ステリルエステル／中性脂質混合物のアルカリ触媒を用いたエステル交換
原料の調製例で得られたステリルエステル／中性脂質混合物１００ｇ、メタノール２５ｇ、および０．６ｇのＫＯＨからなる反応液を、還流しながら６時間反応させた。 反応前後の反応液中の成分を表６に示す。
【００６０】
【表６】
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【００６１】
設定した反応条件下で中性脂質は完全にエステル交換されたが、ステリルエステルは一部しかエステル交換されず、アルカリ触媒を用いた化学反応でも中性脂質を選択的にエステル交換できることが分かった。
【００６２】
（実施例６）高純度ステリルエステルの精製
実施例２で得られた、２４時間反応後の反応液を油−水分離し、９１０ｇの油層を得た。この油層を薄膜式蒸留機に負荷し、ステリルエステルの高純度精製を試みた。まず、１８０℃、２６．６６Ｐａ（０．２ｍｍＨｇ）で留分１を３９９ｇ回収した。次いで残渣画分を２５０℃、４．０Ｐａ（０．０３ｍｍＨｇ）で蒸留し、留分２を７３ｇ回収した。得られた残渣画分をさらに２８０℃、０．４０Ｐａ（０．００３ｍｍＨｇ）で蒸留し、３５５ｇ留分３と６３ｇの残渣３を得た。それぞれの蒸留分画画分の成分を表７に示す。
【００６３】
【表７】
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【００６４】
加水分解後の油分に存在したステリルエステルの内、９５％は２５０℃、４．０Ｐａの蒸留で残渣画分に回収された。この残渣中に含まれている高沸点物質の除去と脱色を目的とし、２８０℃、０．４０Ｐａ（０．００３ｍｍＨｇ）で蒸留したところ、８５％の回収率で純度９６．８％のステリルエステルを精製することができた。
【００６５】
本実施例で、蒸留法を採用することにより脂肪酸または脂肪酸エステルとステロールおよびステリルエステルは効率よく分離できることが分かった。実施例４に示した酵素法による選択的エステル交換の反応液中の成分は、脂肪酸の代わりに脂肪酸メチルが含まれている以外、本実施例に示した加水分解反応物と同じ組成である。したがって、実施例４の反応液からステリルエステルを精製するのにこの蒸留法が適用できる。
【００６６】
また、実施例３に示したアルカリ触媒を用いた選択的ケン化分解の反応液中には、遊離脂肪酸、ステロール、ステリルエステルが混在しており、実施例５に示したアルカリ触媒を用いた選択的メタノリシスの反応液中には脂肪酸メチル、ステロール、ステリルエステルが混在していたが、本実施例に準じた蒸留条件を設定すれば、高純度ステリルエステルを収率よく精製することもできる。
【００６７】
（実施例７）ステリルエステル／中性脂質混合物のエステル化と蒸留による精製
原料の調製例で調製したステリルエステル／中性脂質混合物１ｋｇに大豆油由来の脂肪酸２２０ｇ（ジグリセリドとステロール量に対して３モル等量）を加え、１３．３〜２６．６ＫＰａ（１００〜２００ｍｍＨｇ）の減圧下で窒素を吹き込みながら２３５〜２５０℃で攪拌しながら３時間反応を行った。反応前後の反応液成分を表８に示す。この条件下でジグリセリドのエステル化反応は効率よく進行し、ほぼ完全にトリグリセリドに変換された。また、ステロールの一部もエステル化され、ステロールエステルに変換されることが分かった。
【００６８】
得られた反応液１ｋｇを薄膜蒸留機に負荷し、ステリルエステルの精製を試みた。まず、１８０℃、２６．６６Ｐａ（０．２ｍｍＨｇ）で蒸留し、１３６ｇの留分１を回収した。得られた残渣を２５０℃、４．０Ｐａ（０．０３ｍｍＨｇ）で蒸留し、留分２を６７ｇ回収した。得られた残渣画分をさらに２８０℃、０．４０Ｐａ（０．００３ｍｍＨｇ）で蒸留し、４７５ｇの留分３と４３６ｇの残渣３を得た。それぞれの蒸留分画画分の成分を表８に示す。
【００６９】
【表８】
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【００７０】
ステリルエステルを留出させる条件で、トリグリセリドも共沸したため、ステリルエステルの純度を７７％以上に高めることはできなかった。しかし、ステリルエステルを食用油に溶解した形態で製品化することも考えられるため、ステリルエステルの精製という本来の目的は達成できた。
【００７１】
【発明の効果】
ステリルエステルと中性脂質を含む混合物中の中性脂質を選択的に加水分解あるいはケン化分解する、エステル交換する、あるいはエステル化することにより、ステリルエステルが容易に分離されるようになる。特に、高温・高真空条件下、分子蒸留により、高純度のステリルエステルが得られる。