(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化石燃料に含まれる硫化有機分子（ここで、硫化有機分子はジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）、メチル−ベンゾチオフェン（Ｃ１−ＢＴ）、エチル−ベンゾチオフェン（Ｃ２−ＢＴ）、プロピル−ベンゾチオフェン（Ｃ３−ＢＴ）およびアルキル−ジベンゾチオフェン（Ｃ１−Ｃ３−ＤＢＴ）から選択される）のＣ−Ｓ結合を炭素質構造を破壊することなく選択的に開くことができるArthrobacter sp. CBS 208.96 の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
硫化有機分子（ここで、硫化有機分子はジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）、メチル−ベンゾチオフェン（Ｃ１−ＢＴ）、エチル−ベンゾチオフェン（Ｃ２−ＢＴ）、プロピル−ベンゾチオフェン（Ｃ３−ＢＴ）およびアルキル−ジベンゾチオフェン（Ｃ１−Ｃ３−ＤＢＴ）から選択される）のＣ−Ｓ結合を選択的に開裂することによって化石燃料から有機硫黄を除去する方法であって、
(a)   上記化石燃料のエマルジョンまたは懸濁液を、微生物Arthrobacter sp. CBS 208.96 と、ｐＨ５〜９および温度２０〜４０℃で、酸化性雰囲気中で大気圧から３バールまでの圧力で、接触させ、
(b)   (a) で得た反応混合物から、脱硫油相、水性相、および油および水と結合した生体触媒であるArthrobacter sp. CBS 208.96 からなる粘液相を分離し、
(c)   粘液相を脱硫工程(a) にリサイクルし、
(d)   水性相を、硫酸塩を除いてこれを硫黄に変換することができる嫌気性および好気性微生物で処理し、
(e)   硫黄について完全に精製した水を工程(a) にリサイクルする
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
工程(a) において、界面活性剤なしで、化石燃料／水の容積比を１：１〜７：１で水と混合することによって化石燃料のエマルジョンを得る、請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
容積比が３：１である、請求の範囲第３項に記載の方法。
【請求項５】
工程(c) において、粘液相を水で洗浄した後工程(a) にリサイクルし、洗浄水を工程(d) および(e) に記載の方法で処理する、請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項６】
工程(a) において、ｐＨが６．５〜７．５である、請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項７】
工程(a) において、温度が２５〜３５℃である、請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項８】
化石燃料が原油、石油留分、石油留出物および石油留出物の残渣である、請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項９】
連続的に行う、請求の範囲第２〜７項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、炭素質材料に含まれる硫化有機分子のＣ−Ｓ結合を選択的に開くことができるArthrobacter sp.の菌株、および化石燃料からそこに含まれている有機硫黄を選択的に除去する方法におけるその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
化石燃料燃料は、原油およびその留分（fraction）、石油留出物（distillates ）、石油留出物（distillation）の残渣などを表す。
【０００３】
硫黄含量の高い化石燃料を使用すると、時には極めて深刻な環境問題を引き起こす酸性雨の現象の主要な原因であることがよく知られている。この理由により、北米、欧州および日本で既に施行されているかまたは公布されようとしている法律により、硫黄含量の高い化石燃料の消費をできるだけ制限する傾向が見られる。例えば、米国では、環境保護局（ＥＰＡ）は、１９９４年現在、ディーゼル燃料の硫黄の比率を０．２７％から０．０５％未満の値へ減少させることを求めた。
【０００４】
また、ＥＥＣの規制でも、硫黄含量を減少させて米国で既に確立されているものと一致させることを求めている。更に厳しい制限が、スカンジナビア諸国（スウェーデンおよびフィンランド）で施行されている。
【０００５】
これらの新たな規制を満足することができる化石燃料の供給はまもなく尽きてしまうことは明らかであり、化石燃料を最終的に使用する前にこれから硫黄を除去する効率的かつ経済的な技術を見出だすことが必要であろう。
【０００６】
原油は、石油留分および各種の石油製品と同様に、実際には多量の硫黄を含むことが多い。例えば、原油では、硫黄は０．０２５〜５％の割合で含まれ、重質留分でも、硫黄は１０％に達する。原油では、硫黄は元素状硫黄、スルフェートおよび硫化水素の形態で微量に存在するが、これは主として様々に置換された硫化物、チオール、チオフェン、ベンゾおよびジベンゾチオフェンの形態で有機マトリックスに組み込まれている。特に、テキサスの石油のような幾つかの粗生成物では、硫黄の約７０％はジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）およびそのアルキル誘導体の形態で含まれている。
【０００７】
無機硫黄の化合物は、物理化学的処理によって容易に除去することができるが、有機硫黄の除去は大きな問題である。
【０００８】
現在採用されている石油の工業的脱硫の通常の方法では、高圧高温で、金属触媒の存在下にて水素を燃料と反応させることによってＣ−Ｓ結合を還元して硫化水素（Ｈ２Ｓ）とすることから成る水素化脱硫法（ＨＤＳ）が用いられる。このＨＤＳ法では、いわゆる不安定な化合物の脱硫のための技術的な問題が生じるとは思われないが、これ以上の分離は、逆にヘテロ原子を含む芳香族構造を有する有機分子（不応分子(refractory molecules)）の水素化脱硫に対する不応性によって妨げられると思われる。これらの不応分子は、通常は極めて過酷であってかなりの量の炭化水素の分解も引き起こされる水素化脱硫法（強度（deep）ＨＤＳ）の操作条件を必要とする。また、重金属は、知られているように、この方法で用いられる触媒に有害であるので、石油中の重金属の濃度が高いと、水素化脱硫法の使用が限定される。硫化化合物の濃度も重金属の濃度も、精製の際にかなり増加するので、残留燃料油からの有機硫黄の除去の問題は、解決が一層困難である。このため、これらの既知の方法は、この問題に対する許容可能な解決法とはならない。
【０００９】
これは、過去５０年間に、微生物を用いて、予備燃焼相における燃料に含まれる有機硫化化合物を除去する可能性について集中的に研究されてきた理由を説明している。
【００１０】
Ｈ２Ｓを産生する嫌気性硫酸塩−還元剤微生物、および硫酸塩および硫酸のような水溶性の無機形態を形成する好気性酸化微生物を両方共用いることに基づく、有機硫黄を除去するための多数の方法が文献に記載されている。ほとんどの好気性微生物は、Komada (Agr. Biol. Chem., 34, 1320 (1970))によって記載された代謝経路を用いて、モデル分子として用いたジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）を分解する。
【００１１】
この代謝によれば、ＤＢＴは、ベンゼン環の一つから出発して分解してベンゾチオフェンの誘導体を生じるので、分子は未だ硫黄を含んでいる。この化合物は水溶性であるため、水で抽出することによって除去することが技術的には可能であるが、石油のこれらの微生物による処理、および次の硫黄を含む水溶性生成物の除去を含む脱硫工程は、ＤＢＴおよびＤＢＴ様化合物の炭素質構造の除去によるエネルギー力の損失を考慮すれば極めて経費のかかるものとなる。
【００１２】
代謝を誘導して、出発の硫化分子の完全な分解を行う場合にも、同様な結果が得られる。
【００１３】
ＤＢＴから硫黄を除去し、炭素質構造は完全なままでありかつ２−ヒドロキシビフェニルを蓄積するので（図１）、脱硫に特異的であることが示されている（４Ｓとも呼ばれる）代謝経路、スルホキシド−スルホン−スルホン酸塩−硫酸塩によってジベンゾチオフェンから硫黄を除去することができる微生物が当該技術分野で最近報告された。
【００１４】
例えばKilbane らは、代謝「４Ｓ」経路を用いてジベンゾチオフェンから硫黄を除去し、２−ヒドロキシビフェニルを生成することができるRhodococcus rhodochrous の菌株を単離したことを報告している（米国特許第５，３５８，８７０号明細書、米国特許第５，１３２，２１９号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１８６８号明細書、欧州第０  ４４５  ８９６Ａ２号明細書）。
【００１５】
しかしながら、この微生物を用いて操作すると、石油生成物を微生物懸濁液と密接に接触させておくため界面活性剤を使用する必要がある。これらの剤の使用により、その方法の全体のコストがかなり増加し、次に続く相の分離工程が非常に困難になる。
【００１６】
この微生物を用いる方法は、典型的には
１．  炭素源および他の栄養分の存在下での微生物の発酵、
２．  培地からバイオマスの分離、
３．  十分に攪拌した反応装置で、多量の水（油分の容積に対して少なくとも１：１）の存在下で行われる脱硫反応の触媒としてのバイオマスの使用、
４．  反応の一部を形成する相の、適当な装置による分離、
５．  触媒からなるペースト相の、水洗（flushing）および触媒性能を一定に保持するため一定量の再統合の後、脱硫反応装置へのリサイクル（再循環）、
６．  水性相を濾過して、触媒の回収をできるだけ多くする、
７．  出口で水流へカルシウム塩（生（live）また水和した石灰）またはアンモニウム塩（水酸化物イオン）を添加して、硫黄の酸化によって得られる硫酸塩の除去を行なうことができ、（アンモニウムイオンを使用すると、硫酸アンモニウムの溶解度が高いことによりこの塩を分離することができるようにするための溶液の濃度が分かる）、および
８．  高効率分離装置（静電分離装置）を用いる脱硫油相から水の分離
によって行われる。
【００１７】
既知技術のこれらの方法は、下記のような主要な欠点を有する。
主として水性環境でその活性を行う生体触媒の性能を支持する目的での多量の水の使用、
水相中油相の分散を助けかつ基質の生体触媒への伝達現象を促進するための反応混合物での高濃度の（０．５％）界面活性剤の使用、
界面活性剤の使用によって生成したエマルジョンを破壊する目的で、バイオリアクターの出口で相を分離するための高効率装置の使用、
生成した硫酸カルシウムの埋立て地における廃棄の高価格、または別に生成した硫酸アンモニウムの商業的に廃棄する必要性、
脱硫反応装置への硫酸塩の実質的リサイクル（２０℃における硫酸カルシウムの溶解度は０．２／１００ｇであり、硫酸アンモニウムは極めて溶解性である）の結果、生成物阻害の可能性。
【００１８】
Brevibacterium sp. DO の菌株も、文献に記載されており(Van Afferden ら, Arch. Microbiol., 153: 324-328, 1990) 、「４Ｓ」経路の最初の３個の通路に従って、最終的に完全なＤＢＴの無機化を行い、図２に示される工程図に従って安息香酸塩を生成する追加の代謝工程を有する。
【００１９】
Grossmanらは、ＤＢＴおよび４，６−ジエチルジベンゾチオフェンから硫黄を除去することができるArthrobacterの菌株の使用に基づいた生物学的脱硫法を、最近報告している（ＣＡ２０９７２１７号、Appl. and Envirom. Microbiol., 61: 4362-4366, 1995) 。
【００２０】
しかしながら、この方法も欠点を有する。実際に、これらの菌株の脱硫活性は、低濃度（１ｍＭ）の硫酸イオンによって阻害される。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
炭素質材料中に含まれる硫化有機分子のＣ−Ｓ結合を選択的に開裂することができ、分子自体の炭素質構造は分解することがないArthrobacterの新規な菌株によって、界面活性剤を用いることなく上記の既知技術の欠点を解消することができることを見いだした。これにより、生物学的反応装置を用いずに相を分離するため簡単な装置を用いて水の消費を減少させることができる。また、本発明の菌株の脱硫活性は４６ｍＭの濃度の硫酸イオンによっては影響されない。
【００２２】
この菌株の試料を１９９６年２月９日にCentraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)に寄託し、登録番号CBS 208.96を受けた。
【００２３】
発明の具体的説明
【発明の実施の形態】
「４Ｓ」経路によってＤＢＴを分解することができる微生物株を単離するため、硫黄含量の高い原油で汚染された部位の生物学的改良パイロットプラントから採取した土壌を用いた。
【００２４】
単離は、炭素源および単一の硫黄源としてＤＢＴを含む培地で連続集積（enrichment）および精製相によって行った。その結果、ＤＢＴを用いることがてきる株の存在が示された。引き続いて、単一硫黄源としてＤＢＴを含む培地で個々に再培養した、純粋培地での微生物の単離により、ＤＢＴを硫黄源として用いることができる単一菌株を選択することができた。この菌株を、予めＤＳ７の略号で印を付けた。
【００２５】
ＤＢＴは炭素源としても用いられることはないことを明らかにするため、ＤＳ７菌株を、一つはＤＢＴを炭素源としてのみ、他方は炭素および硫黄源として含む２種類の培地ＤＳ３およびＤＳ４で培養した。これらの培地で成長が見られないことから、菌株の部分に対するＤＢＴの使用だけが「４Ｓ」による分解であると仮定された。
【００２６】
この仮定を立証するため、菌株をＤＳ２培地（単一硫黄源としてＤＢＴ）で培養し、ＤＢＴ上の「休止細胞」でバイオマスを用いた。反応生成物を酢酸エチルで抽出し、ＨＰＬＣおよびＧＣ／ＭＳで分析した。分析の結果、「４Ｓ」経路によるＤＢＴの中間体および最終分解生成物（２−ヒドロキシビフェニル）の存在が確かめられた（図３および図４）。
【００２７】
各種の成長相において脱硫に関与する酵素の生成速度論（kinetics）は、炭素源および単一硫黄源としてＤＢＴを含む培地でＤＳ７菌株を培養することによって行った（図５）。得られた結果は、下記のことを示していた。
細菌は、指数増殖期の半分を過ぎた後（２８時間）、その最大酵素活性を発現する、
酵素系の安定性は、バイオマスの長期間の保存（４℃、７日間）の後でも活性が保持されるので、良好である、
菌株ＤＳ７は、直留ガス油、水素化脱硫からのガス油、および石油の大気蒸留から得られる主流（カット：７０〜１６０℃、１６０℃〜２３０℃および２３０〜３５０℃）に含まれる硫化分子の主な群についてその活性を発現する、
菌株ＤＳ７は、外部から薬剤を添加することなく良好なマイクロエマルジョン／マイクロ分散液を形成することができる乳化剤を生成することができ、
相形成マイクロエマルジョン／マイクロ分散液を容易に分離することができる。
【００２８】
菌株ＤＳ７を特徴付けするため、Bergeyの系統的細菌学便覧(Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology)（第１〜４巻）、１９８９年発行、Williams & Wilkins、バルチモアに記載の手続きを参照した。
【００２９】
形態学的および染色特性
グラム反応                              ＋（２４時間後可変性）
形態型                                  多形態性、Ｖ細胞を有する
大きさ                                  ０．６×１μｍ（定常期）
移動性                                  なし
内生胞子                                なし
胞子嚢（capsule ）                      なし
Ziehl-Neelsen                           −（２４時間後）
異染顆粒                                −
【００３０】
培養特性
栄養寒天上のコロニー                    ベージュ／ピンク気味、湿りあり
高さ                                    凸状
色素生産性                              なし
着色（酸で）                            なし
着色（アルカリで）                      なし
表面                                    滑らか、光沢あり
縁（border）                            全体（whole ）
大きさ（直径）                          １．５ｍｍ（２４時間後）
乳化性（emulsionability ）              速やか、水中
色の変化
Ｙ．Ｅ．ブロス（broth ）中              アルカリ性
【００３１】
生理学的特性
β−ガラクトシダーゼ                    ＋
チトクローム−オキシダーゼ              −
カタラーゼ                              ＋
ウレアーゼ                              ＋
ゼラチナーゼ                            −
アルギニンデヒドロラーゼ                −
リジンデカルボキシラーゼ                −
トリプトファンデアミナーゼ              −
硝酸塩→亜硝酸塩還元                    −
硝酸塩→Ｎ２還元                        −
耐性（tolerance ）３３０ｍＭ  ＮａＣｌ  ＋
【００３２】
炭素源の使用
グリセロール                            ＋（酸化）
Ｄ−グルコース                          −
Ｄ−フルクトース                        −
Ｄ−マンノース                          ＋（弱酸化）
ガラクトース                            ＋（弱酸化）
Ｌ−ソルボース                          −
ラムノース                              −
ズルシトール                            −
イノシトール                            ＋（弱酸化）
マンニトール                            ＋（弱酸化）
ソルビトール                            ＋（弱酸化）
エリトリトール                          −
Ｄ−アラビノース                        −
Ｌ−アラビノース                        −
リボース                                ＋（弱酸化）
Ｄ−キシロース                          −
Ｌ−キシロース                          −
アドニトール                            −
アルブチン                              −
エスクリン                              ＋（加水分解）
サリシン                                −
セロビオース                            −
マルトース                              −
ラクトース                              ＋（弱酸化）
メリビオース                            −
スクロース                              −
トレハロース                            −
イヌリン                                −
メレジトース                            −
Ｄ−ラフィノース                        −
可溶性澱粉                              −
グリコーゲン                            −
キシリトール                            −
ゲンチオビース                          −
Ｄ−ツラノース                          −
Ｄ−リキソース                          −
Ｄ−タガトース                          −
Ｄ−フコース                            −
Ｄ−アラビトール                        ＋（弱酸化）
Ｌ−アラビトール                        −
アミグダリン                            −
β−メチル−キシロシド                  −
リンゴ酸塩                              −
酢酸塩                                  −
安息香酸塩                              −
クエン酸塩                              −
グルコン酸塩                            ＋（弱酸化）
α−メチル−Ｄ−グルコシド              −
α−メチル−Ｄ−マンノシド              −
Ｎ−アセチル−グルコサミン              −
【００３３】
形態学的および培養試験の結果に基づいて、本発明の菌株ＤＳ７はMycobacterium 、Nocardia、Nocardioides、Oerskovia およびArachnia種に属することはできないということができる。実際に、これらの種とは異なり、ＤＳ７は厳密な栄養要求を持たず、これは短期間で成長し、寒天付加した(agarized)栄養培地で糸状体（菌糸、気中菌糸体）を生産せず、Ziehl-Neelsen による酸処理に耐性を持たない。
【００３４】
菌株ＤＳ７は、明確な酸化性代謝能を有し、Corynebacterium 属に属する通性(facultative) 呼吸性菌株の不安定性（versatility ）、またはArachnia属に典型的な嫌気生活での成長能を欠いている。
【００３５】
また、その生理学的特徴および用いられる炭素源にたいする独特の挙動により、これがRhodococcus 属に属することは除外することができる。この属に属する菌株は実際に、広汎な炭素化合物を使用する能力を有し、β−ガラクトシダーゼを持たない。特に、R. rhodochrousは、フルクトース、グルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、トレハロースから酸を生産し、ラクトース上では成長しない。Rhodococcus 属に属することの除外は、膜脂質の比較分析によっても支持された。染色性および限定された酵素特性から、これは、ゼラチンの液化能を有しアルカリまたは酸で処理を施すと洗い流すことができない「ほとんどが細胞の莢膜（cellular capsule）」およびオレンジ色の色素を生成するBrevibacterium lines株から識別される。
【００３６】
菌株ＤＳ７の成長因子に対する非要求性（ビタミンまたは他の要素の追加を要求しない）、「標準的な」形態遺伝学的周期（新鮮な培養物ではＶ細胞を有する桿状−楕円状、成熟すると球状）、酸素との反応（好気性菌）、炭素源の使用の仕方（酸化性のみ）、幾つかの酵素活性を精確に発現（ゼラチナーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、染色特性（グラム−可変、Ziehl-Neelsen −陰性、胞子嚢（capsule ）または内生胞子なし）は、試験中のこの菌株がArthrobacter属であると思われる。
【００３７】
酢酸塩および安息香酸塩上でのこの単離菌株の非成長は、同じ型に属してはいるが、これはGrossmanらによって記載されたArthrobacterの株とは異なる種であることを示唆している。
【００３８】
本発明のArthrobacter sp.による脱硫法は、この菌株またはこの菌株から単離された酵素複合体を、水性培地で脱硫を行う基質のエマルジョンまたは懸濁液（または、その逆）と接触させることからなっている。エマルジョンまたは懸濁液は、界面活性剤なしで、機械装置を有する設備または移動（movement）部品のないミキサー、例えばエゼクター装置（ejector systems ）に基づいたミキサーで得られる。混合は、室温および大気圧で、脱硫を行う基質／水性相の容積比が１：１〜７：１、好ましくは３：１で行われる。この方法で、酸化反応装置中の滞留時間であって一般的には石油留分の種類および相対硫黄含量によって変化する時間に対して安定なマイクロエマルジョンまたはマイクロ懸濁液を得ることができる。
【００３９】
本発明の脱硫法は、原油、真空下での大気蒸留の熱処理を行った留分（燃料油）、および強制脱硫を施すＨＤＳプラントから生じるガス油について行なうことができる。
【００４０】
本発明の脱硫法は、回分式（batchwise ）または連続的に行なうことができ、好ましくは連続的に行なうことができ、下記の主要な操作相を特徴とする。
【００４１】
(1)   細菌ＤＳ７の培養
細菌ＤＳ７またはその酵素誘導体からなる生物学的触媒（生体触媒）は、任意の種類の発酵装置、好ましくは連続発酵装置で菌体（cells ）を培養することによって製造する。水性培地は、同化性炭素源、窒素源並びに各種カチオンおよびアニオンを含んでいる。
【００４２】
石鹸製造産業から副生成物として得られるグリセリン性水を、例えば低価格炭素源として用いることができる。本発明の方法で用いることができる窒素源は、例えば硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは炭酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、または尿素から選択することができる。
【００４３】
下記のカチオンおよびアニオンも同様に、本発明の目的に好適である。
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸ホスフェートおよび塩化物。
【００４４】
培地は、脱硫活性を有する酵素複合体の合成を誘導しかつ維持することができ、かつＤＢＴ、石油または高含量の硫化有機分子を有するその誘導体から選択することができる硫黄源も含んでいる。培地の製造に必要な水性相は、下記の工程(4) から得ることができる。
【００４５】
細胞の成長は２０〜３５℃、好ましくは３０℃の温度で、攪拌および曝気下（毎分空気０．５〜１容／反応装置容積）にて行う。ｐＨは、ほぼ中性に維持する。
【００４６】
２．  生体触媒の製造
培養した菌体（cells ）を集めて、バイオテクノロジー産業の典型的な手順および設備を用いて培地から分離する。この方法によれば、引き続いて生物学的脱硫反応に供給されるような流れでそれらを濃縮する。
【００４７】
或いは、菌体を、一層高い触媒活性を有する酵素抽出物の分離工程に付すことができる。これらの操作は、通常のバイオテクノロジー技術（細胞破壊、核酸の分離など）に従って行なうこともできる。
【００４８】
３．  生物学的脱硫反応
反応は、連続または回分式反応装置で行なうことができる。連続反応装置は、プラグフローまたは攪拌型（連続攪拌タンク反応装置、ＣＳＴＲ）のいずれかが好ましい。後者は、一段または多段配置構成で配列することができる。
【００４９】
ＣＳＴＲ多段配置構成が最適である。プラグフロー反応装置では、脱硫を行う基質の懸濁液を、予め形成した水性培地に供給する。
【００５０】
ＣＳＴＲ反応装置では、エマルジョンは、同じ反応装置で製造することができる。従って、それらは、生体触媒を、脱硫を行う油相および硫黄の生物学的酸化工程に要する酸素が得られるガス相（空気、濃縮空気など）と密接するようにして製造される。
【００５１】
菌株ＤＳ７の厳密な親油性を考慮すれば、反応は、界面活性剤なしで水の量を減らして行なうことができる。１：１〜７：１、好ましくは３：１の脱硫を行う材料／水の容積比を用いるのが、好都合である。
【００５２】
油相および水相は向流で供給して、関連の生物学的反応を有する液−液抽出装置に類似の装置を製造することができる。それぞれの段階がミキサーと分離装置とからなるこれらの装置では、新鮮な触媒を、硫酸塩の除去から生じる水を用いて製造することができる（要点５を参照されたい）。この方法では、脱硫活性を最大効率で発揮する。
【００５３】
脱硫反応は、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃の温度、および５〜９、好ましくは６．５〜７．５のｐＨで行われる。
【００５４】
４．  反応装置の出口における相の分離
重力場において適度に増加することができる相分離装置の使用が、この分離に十分である（限定された回転数の遠心分離機、ハイドロサイクロンなど）。
【００５５】
下記の３種類の流れが分離によって得られる。
【００５６】
a)  脱水後、使用のために送ることができる油の脱硫相。水は主として除去が困難な生体触媒と会合しているので、脱水操作は問題とはならない。
【００５７】
b)  通常の手法（遠心分離、濾過など）で除去することができる少量の生体触媒を含む水相。残りの水流を要点(5) に記載の方法で硫酸塩の除去段階に付し、次いで段階(1) にリサイクルする。
【００５８】
c)  主として生体触媒並びに油および水からなる粘液相。この流れは、硫酸塩の含量によっては、直ちに脱硫反応装置にリサイクルし、または水に粘液流を再懸濁し、混合物に遠心分離を施すことによって行われる硫酸塩の除去を施すことができる。残留水流を、要点ｂに記載のものと合わせる。
【００５９】
(5)   硫酸塩の除去
段階(4) から得られる水供給源を合わせて、硫酸塩−還元剤嫌気性細菌を使用して生物学的に硫酸塩を除去する。この処理は、嫌気性フィルター型（固体担体上に吸着したバイオマスを用いて操作する）またはアップ・フロー嫌気性スラッジブランケット型（Up-flow Anaerobic Sludge Blanket type ）（ＵＡＳＢ、凝集したバイオマスで操作する）の通常の嫌気性反応装置中で行なうことができる。
【００６０】
この段階では、硫酸塩は可溶性の硫化物に還元される。微量の硫化水素は、石油工業で用いられる通常のプラントで除去することができ、可溶性硫化物は、例えばThiobacillus、Beggiatoa 、Thiotrix、Thioploca 、Paracoccus属などの好気性または微好気性微生物のバイオマスを用いて次の生物学的段階で再酸化して元素状硫黄とすることができる。
【００６１】
吸着したまたは凝集したバイオマスと共に機能する反応装置を用いて、硫化物の硫黄への酸化反応を行なうこともできる。しかしながら、微好気性微生物の場合には、要求される酸素の供給が限定されているため、バイオマスが回転担体上に吸着されている反応装置（Rotary Biological Contactor,RBC ）を用いるのが好ましく、好気性微生物の場合には、頭部に沈降器（settler ）を有する高さで展開された配置構成を用いることができる。
【００６２】
上記の微生物は中温性であるため、室温に近い温度、好ましくは約３０〜３５℃に制御した温度で用いるのが好ましい。好ましい操作ｐＨは中性に近いが、酸性値に達することもあり、操作圧は大気圧に相当する。
【００６３】
反応装置から出てくる硫黄は、水相およびバイオマスから、固形物の沈降、洗浄および濾過操作、硫黄の融解およびその分離によって分離することができる。硫黄は１３０℃で融解し、硫酸の製造のため市販されているような純度を有する生成物を得ることができる。
【００６４】
硫黄を除去するための一連の操作により、栄養分と一緒に合わせた後、細菌ＤＳ７の培養のため段階(1) に一部をリサイクルし、一部を再使用してバイオマスを再懸濁することができるような含量の硫酸塩を有する水を生成する。これらの操作により、浄化水準の浄化水流であって直接または温和な通常の好気性後処理の後に表面水力装置（Surface hydric systems）に排出することができるようなものも得られる。この後者の操作は、石油工業で普通に利用される水処理プラントで行なうことができる。
【００６５】
下記の実施例は、本発明を一層よく説明するためだけのものであり、発明の範囲を制限するものと考えるべきではない。
【００６６】
【実施例】
例１
Arthrobacter sp.の単離
「４Ｓ」経路によってＤＢＴを分解することができる微生物株を単離するため、有機硫黄含量が約６％のSowedi原油で汚染された（約１．６％（重量／重量））部位の生物学的改良パイロットプラントから採取した土壌を用いた。
【００６７】
土壌１００ｇを水２００ｍｌに添加し、激しく攪拌して、沈澱させた後、２つの上清を５ｍｌずつ採取した。
【００６８】
これらの等分試料を用いて、２種類の異なる培地（ＤＳ１およびＤＳ２）５０ｍｌをそれぞれ入れた２個の２５０ｍｌフラスコに接種した。２回蒸留水中の上記培地の組成を、表１に示す。
表１                                
成分                              ＤＳ１            ＤＳ２            
ＫＨ２ＰＯ４                      10.0 g/l          10.0 g/l
ＮＨ４Ｃｌ                         2.0 g/l           2.0 g/l
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ               0.2 g/l           0.2 g/l
ＤＢＴ                              -                0.5 g/l
コハク酸                           4.0 g/l           4.0 g/l
ＦｅＣｌ３                        10.0 mg/l         10.0 mg/l
ＣａＣｌ２                        20.0 mg/l         20.0 mg/l
ｐＨ（ＮａＯＨで）                6.4   6.4 
【００６９】
２個のフラスコを、３０℃、２００ｒｐｍの軌道（orbital ）ＮＢＳインキュベーターに入れた。同じ培地で７２時間の間隔で、５％（容積／容積）の接種源を用いて、５回連続継代培養を行った。
【００７０】
ＤＳ１培地は、他の栄養素に含まれる硫黄不純物による基本成長を示すためのコントロールとして働いた。ＤＳ２での成長の方が有意に高く、培地に含まれる微生物の部分に対するＤＢＴの硫黄の使用の仮説が証明された。
【００７１】
ＤＳ２で５回継代培養した後に得た培養液（broth ）を用いて、最大寒天付加培地(Nutrient Agar（商品名）、DIFCO)を含むペトリ皿に（各種の希釈倍率で）接種を行い、３０℃で４８時間インキュベーションした。成育した総てのコロニーの中から、形態学的および／または着色特性が互いに明らかに異なる７個を選択した。
【００７２】
７個の菌株は、最初に上記のNutrient Agar （商品名）上での単一のペトリ皿で単離した後、ＤＳ２培地を含むフラスコに接種して、ＤＢＴを硫黄源として用いるそれらの能力を試験した。１個の菌株だけが、これらの条件下で生育可能であることが分かった。
【００７３】
例２
分解経路の証明
A)  硫黄源としてＤＢＴ上で生育可能な唯一の菌株（ＤＳ７と呼ばれる）を、表２に示される組成を有する培地ＤＳ３およびＤＳ４の接種物として用いた。
表２                                
成分                              ＤＳ３            ＤＳ４            
ＫＨ２ＰＯ４                      10.0 g/l          10.0 g/l
ＮＨ４Ｃｌ                         2.0 g/l           2.0 g/l
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                -                0.2 g/l
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ               0.2 g/l           0.5 g/l
ＤＢＴ                             0.5 g/l           0.5 g/l
コハク酸                            -                 -
ＦｅＣｌ３                        10.0 mg/l         10.0 mg/l
ＣａＣｌ２                        20.0 mg/l         20.0 mg/l
ｐＨ（ＮａＯＨで）                7.2  7.2  
【００７４】
これらの培地において、ＤＢＴは、炭素源としてだけ（ＤＳ３、硫黄は硫酸塩として供給）、および硫黄および炭素源（ＤＳ４）としても供給された。
【００７５】
これらの培地上での非生育は、ＤＳ７の脱硫活性の発現として解釈された。
【００７６】
B)  「４Ｓ」経路による中間体および最終生成物（２ＨＢＰ）の存在の試験
菌株ＤＳ７を、ＤＳ２培地上で３０℃で２８時間培養し、培養液を集めて、遠心分離し、リン酸緩衝液１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．２で２回洗浄した。
【００７７】
乾燥物質約１００ｍｇに等しいバイオマスを、同じリン酸緩衝液２５ｍｌに懸濁して、フラスコに入れた。４０ｍＭジベンゾチオフェン／エタノールの溶液０．６２５ｍｌを攪拌しながらフラスコに加えた。従って、反応媒質中のジベンゾチオフェンの初期濃度は１ｍＭであった。得られた混合物２ｍｌずつを密封したアンプルに入れ、２バールの酸素で加圧した。所定のインキュベーション期間の後、酢酸エチル２ｍｌをアンプルに加えて、ＤＢＴおよびその誘導体の抽出を行った。得られた抽出物を、ＨＰＬＣ（図３）およびＧＣ／ＭＳ（図４）によって分析した。
【００７８】
図３および３ａに示した結果は、ＤＢＴは、２時間の反応の後にはほぼ完全に２−ヒドロキシ−ビフェニルに転換されていることを示している。図３に示した２−ヒドロキシビフェニルは、ＤＢＴの２−ＨＢＰおよび発酵相において微生物によって生物吸収した２−ＨＢＰへの直接変換による可能性があることに留意すべきである。「４Ｓ」経路により総てのＤＢＴの分解生成物が存在することは、図３ｂで証明することができる。これらの生成物は、４℃で７日間保存した後に見られるような触媒活性の低下した細胞、または酸素を限定した速度論的実験（run ）でのみ見ることができる。
【００７９】
例３
A)  酵素製造の速度論（kinetics）
各種の成長相での脱硫に関与した酵素の生産傾向を示すため、低濃度の誘導物質を有するように改質した（ＤＢＴの０．５ｇ／ｌからＤＢＴの２０ｍｇ／ｌまで）ＤＳ２培地５００ｍｌを入れた２リットルのフラスコに菌株ＤＳ７を接種した。２５ｍｌの接種物が、エルレンマイヤーフラスコで行った同じ培地での上記培養から得られた。フラスコを上記と同じ条件でインキュベーションした。
【００８０】
培養液のアリクウォットを１６、２２、２８、および３９時間目に採取した。試料について、下記のパラメーターを決定した。６６０ｎｍでの吸光度、乾燥重量、および比脱硫活性。乾燥重量は、バイオマスを２回蒸留水で洗浄した後１０５℃での所定の残留物として決定された。比活性は、２０ｍｌの培養液のアリクウォットについて決定した。これらを８０００ｇで１０分間遠心分離し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．２に再懸濁して、再度遠心分離した。バイオマスを同じ緩衝液に再懸濁して、最終容積を９．７５ｍｌとした。得られた菌体懸濁液を、４０ｍＭ  ＤＢＴ／エタノール０．２５ｍｌを加えた５０ｍｌフラスコに移した。フラスコを３０℃で攪拌しながらインキュベーションし、所定時間毎に混合物のアリクウォットを採取してＨＰＬＣで分析した。得られた結果を、図５に示す。この図から、細菌がその指数増殖期の半分を越えた時点で酵素活性のどの程度の最大発現が記録されるかが分かる。
【００８１】
B)  石油留分による酵素活性の誘導
この目的のため、菌株ＤＳ７を、ジベンゾチオフェンを誘導物質および硫黄源としてのその機能において(a) 硫黄１３６００ｐｐｍを含む石油留分２３０〜３５０℃の０．５ｍｌ／ｌ、(b) 硫黄２０００ｐｐｍを含むＨＤＳからのガス油１ｍｌ／ｌに代えたＤＳ２培地で培養した。培養は、要点Ａに記載した手続きに従って５００ｍｌフラスコで行った。４４時間後に、培養液２０ｍｌに含まれるバイオマスを分析して比活性を測定した。試料(a) に対するこのパラメーターは、乾燥ＤＢＴ４．３ｍｇ／ｇ／時であったが、試料(b) では乾燥ＤＢＴ／時は２．６ｍｇの値となった。これらの結果は、試験を行った石油生成物は酵素複合体の合成を誘導するような物であることを示している。
【００８２】
例４
ガス油の脱硫試験
流動性添加物DODIFLOW（商標名）V 3905-2の残留硫黄含量約２０００ｐｐｍおよび４７ｐｐｍで標準的ＨＤＳ脱硫処理を行ったガス油を用いた。硫黄１０２００ｐｐｍを含む非脱硫ガス油も、同時に実験した。連続培養の後（希釈率０．０９時-1、例２Ａと類似の培地）に得られたバイオマスを遠心分離によって分離し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．２で２回洗浄した。次いで、これを同じ緩衝液に再懸濁して、乾燥生成物の濃度が３８ｍｇ／ｍｌとなるようにした。
【００８３】
菌体懸濁液７．５ｍｌおよびガス油２．５ｍｌを、５３ｍｌボール（bowls ）に入れた。このボールを２．０バールの圧に置き、２００ｒｐｍで攪拌しながら３０℃でインキュベーションした（標準試験）。反応条件下（水性および酸化性環境）での可能な副反応を明らかにするため、菌体細胞懸濁液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に代えた試験を対照として行った。第三の試験も、石油留分および０時間として採取した菌体の存在下で行った。標準および対照試験は、２４時間後に中断した。反応混合物を遠心分離した（８０００ｇ、２０分間）。回収された油相を、原子放射検出機（Atomic Emission Detector（商標名）AED, Mod. HP 5921-A ）を備えたHewlett-Packard 装置(Mod. 5890) を用いてガスクロマトグラフィによって分析した。クロマトグラフィ分離は、J.W.S.のDB-1型の毛細管カラムを用いて行った。０時間の寄与を差し引いた後の結果を、表３に示す。対照試験は、対応する現象を示さなかった点に留意すべきである。
表３                              
ガス油                  硫黄，ｐｐｍ        脱硫％
直留(straight-run)      １０，２００        １３．５
ＨＤＳから                ２，０００        １９．７        
【００８４】
この表から、細菌ＤＳ７は、試験を行なったいずれのガス油でもその活性を示すことが分かる。
【００８５】
また、表４に示したデーターから見られるように、菌体ＤＳ７は試験を行なったガス油に含まれる主要な群の硫化分子に対して活性である。
0003853459.tif 000002
【００８６】
例５
乳化剤の存在および非存在下での脱硫
試験は、ジベンゾチオフェンを０．３および３％の濃度で含むドデカンからなるモデル系を用いて行った。
【００８７】
０．３のＤＢＴを用いて、３種類の異なる試験を行い、菌株ＤＳ７の脱硫活性に対する乳化剤の影響を明らかにした。第一の試験は、乳化剤の添加なしであり、第二および第三は、それぞれTriton N-101を０．２５および０．５％含んでいた。
【００８８】
いずれの試験に対しても、下記の手順を採用した。油相のアリクウォット（２．５ｍｌ）を、容量が５３ｍｌの８個のボール（試験当たり２個）に入れた。乾燥生成物／ｍｌを１２．５ｍｇの比率での菌体を含む緩衝液２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液ｐＨ７．２の７．５ｍｌ（ボール当たり約１００ｍｇの全乾燥生成物）を次にそれぞれのボールに加えた。ボールを閉じて、酸素で２バールとした。８個のボールの内、０時間を表す４個は、酸素を添加した直後に氷浴に入れて、下記の方法で直ちに分析した。他の４個は、３０℃に制御した恒温槽で攪拌下（２００ｒｐｍ）１６時間インキュベーションした。
【００８９】
８個のボールに入れた反応混合物をガラス試験管に移して、８０００ｇで１５分間遠心分離した。ドデカンのアリクウォットを酢酸エチルで適当に希釈して、ＨＰＬＣで分析した。０時間を差し引いた後に得られた結果を、表５に示す。
0003853459.tif 000003
【００９０】
上記の結果は、細菌ＤＳ７は、その脱硫活性を行うことができるようにするのに市販の乳化剤を必要とないことを示している。対照的に、外部からの乳化剤は、かなりの阻害効果があることに留意すべきである。
【００９１】
例６
モデル系での脱硫試験
試験を行って、菌株ＤＳ７の親油性により、この方法の水消費が少なくなることを示した。
【００９２】
この目的のため、それぞれの試験において０．３％ＤＢＴ／ドデカンの溶液および一定量のバイオマスを用いて、３種類の異なる試験を行った。第一のものでは、菌体懸濁液（乾燥生成物１９．８ｍｇ／水１ｍｌ）およびドデカン４ｍｌ（油相：水相比２：１）を用いた。しかし第二のものはドデカン＋ＤＢＴ（比３：１）の容積を６ｍｌに増加して同様にして作成した。２つの試験を、油相：水相の比が１：１である第三のものと比較した。
【００９３】
混合物を６個の５０ｍｌアンプル（２×試験）で反応させた。酸素をアンプルに通じて、１．５バールとし、密封して、攪拌しながら３０℃でインキュベーションした。３個のアンプルは０時間に、他の３個は２０時間後に、減圧した。相分離の後、有機相のアリクウォットを採取して、酢酸エチル（４容／１容）を加え、ＨＰＬＣ分析を行った。
【００９４】
表６に、０時間を差し引いた２０時間後に得られた結果を示す。
0003853459.tif 000004
【００９５】
この表から分かるように、より少量の水の存在下でも脱硫は同様の水準で起こる。
【００９６】
例７
菌株ＤＳ７の脱硫活性に対する硫酸塩の濃度の影響
試験は、３種類の同量の乾燥ＤＳ７バイオマス（１３ｍｇ／ｍｌ）を懸濁した物を用いて行った。
【００９７】
第一（ブランク）は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．２中。
【００９８】
第二は、Ｎａ２ＳＯ４の１５．５ｍＭ（硫黄５００ｐｐｍに相当）を含む同じ緩衝液中。
【００９９】
第三は、Ｎａ２ＳＯ４の４６．５ｍＭ（Ｓ  １５００ｐｐｍ）を含む同じ緩衝液中。
【０１００】
ＤＢＴ（１ｍＭ）を添加した後、３種類の試験を３０℃で２００ｒｐｍの撹拌槽で行った。２および４時間後に、ＤＢＴの残留濃度を測定した。表７に、得られた結果を示す。
0003853459.tif 000005
【０１０１】
例８
石油留分の脱硫試験
総硫黄含量が１．３６％(Belaym 原油）である原油の大気蒸留から得られる下記の留分を用いた。1)  留分７０〜１６０℃、2)  留分１６０〜２３０℃、3)  留分２３０〜３５０℃。それぞれの留分の硫黄含量は、それぞれ４００、２４００、および１３６００ｐｐｍであった。ジベンゾチオフェン１６０ｐｐｍに相当する追加量の硫黄を、それぞれの留分に添加した。これにより、精確な対照化合物を得ることができた。
【０１０２】
石油留分５ｍｌを、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７の５ｍｌと混合した。菌体を、それぞれ乾燥生成物１６および３２ｍｇ／緩衝液１ｍｌに相当する２種類の異なる濃度で用いた。反応混合物を含むアンプルに酸素で１．５バールの圧を加え、密封した。油相と接触させる前に温度を１２１℃に２０分間上昇させることによって菌体を失活させた同じ混合物からなる比較試料を用いた。単一アンプルの全内容物を遠心分離（８０００ｇ、２０分間）し、所定の時間（２４および４８時間）に例４に記載されている方法に従ってＧＣ／ＡＥＤによって分析を行った。クロマトグラフィ分離はJ.W.S.のＤＢ−１型の毛細管カラムを用いて行った。得られた総脱硫水準を、表８に示す。
0003853459.tif 000006
【０１０３】
下記の主要な群の化合物の脱硫水準も、最終留分について測定した：メチル−ベンゾチオフェン（Ｃ１−ＢＴ）、エチル−ベンゾチオフェン（Ｃ２−ＢＴ）、プロピル−ベンゾチオフェン（Ｃ３−ＢＴ）およびアルキル−ジベンゾチオフェン（Ｃ１−Ｃ３−ＤＢＴ）。得られた結果を表９に示す。
0003853459.tif 000007
【０１０４】
例９
水−油エマルジョンの分離試験および触媒の回収
菌体／０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７（乾燥生成物３２ｍｇ／ｍｌ）の均質懸濁液１００ｍｌを、例４に用いた等容の同じ脱硫ガス油と接触させた。容器を閉じて２バールの酸素雰囲気に置き、３０℃で２００ｒｐｍで攪拌を行いながらインキュベーションを行った。比較試験は、Triton N-10 を混合物に０．２５％（容積／容積）の割合で添加することによって行った。２４時間後に、混合物を２０００、４０００および８０００ｇで遠心分離した。回収した様々な相の容積を、表１０に示す。
0003853459.tif 000008
【０１０５】
この表では、いずれの場合にも、乳化剤を添加せずに回収した油相および水相の方が乳化剤を用いたものより高いことが分かる。後者の場合には、回収された水相は実用上に無視し得る程度である点に留意すべきである。
【０１０６】
従って、界面活性剤を使用すると、硫酸塩を除去した後に反応装置にリサイクルされる水相の分離は、極めて困難であると思われる。
【０１０７】
菌株ＤＳ７を用いることによる、乳化剤の使用が必要ないという利点は、明らかである。実際に、低重力で遠心分離をすると、
透明な脱硫した油相、
硫酸塩を分離しようとする透明な水相、および
すべての活性な脱硫細胞を含み、酸化反応装置にリサイクルすることができる乳化相
を分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】４−Ｓ路によるジベンゾチオフェンの分解経路を示す説明図。
【図２】  Brevibacterium sp.に対して提案されたジベンゾチオフェンの分解経路を示す説明図。
【図３】図３（ａ）は、反応の開始時における「休止細胞」からの抽出物のＨＰＬＣによる分析図。ピークは２−ヒドロキシビフェニル（ＲＴ＝１０．８５）、ＤＢＴ（ＲＴ＝１５．３０）に相当する。図３（ｂ）は、最適条件下で２時間反応後の「休止細胞」からの抽出物のＨＰＬＣによる分析図。反応の開始時に含まれるＤＢＴは２−ＨＢＰに変換された。図３（ｃ）は、４℃で７日間保存した細胞試料について行ったＨＰＬＣ分析図。この分析から、「４−Ｓ」経路が確かめられる。ＤＢＴ−ＳＯ（７．７）；ＤＢＴ−スルホン（９．４）。
【図４】「休止細胞」からの抽出物のＧＣ−ＭＳによる分析図。ピークは、それぞれ保持時間６７酢酸エチル、１２９  ２−ヒドロキシビフェニル、２０９  ＤＢＴ、３７２  ＤＢＴオキシドに相当する。
【図５】酵素複合体の生成速度論（kinetics）を示す説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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