(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリＢリンパ芽細胞にニワトリの免疫脾臓細胞が融合された、ウアバイン耐性、ＨＡＴ感受性およびＩｇ発現能を有するチミジンキナーゼ欠損株化融合細胞
【請求項２】
株化融合細胞がＭｕＨＩ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４４２）又はＭｕＨ４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４４３）である請求項１記載の株化融合細胞
【請求項３】
ニワトリＢリンパ芽細胞にニワトリの免疫脾臓細胞が融合された、ＨＡＴ感受性およびＩｇ発現能を有するチミジンキナーゼ欠損株化融合細胞をウアバインを含む培地で培養し、ウアバイン耐性細胞を分離することを特徴とする請求項１記載の株化融合細胞の取得方法
【請求項４】
請求項１記載の株化融合細胞に抗原で免疫されたニワトリ脾臓細胞がさらに融合されているＩｇＧ産生能を有する融合細胞を培地に培養することを特徴とするニワトリＩｇＧの製造方法
【請求項５】
株化融合細胞がＭｕＨＩ（ＦＥＲＭＢＰ−５４４２）又はＭｕＨ４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４４３）である請求項３又は４記載の方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はニワトリより得られたＩｇ発現能を有する株化融合細胞、その製造方法、この株化融合細胞に免疫したニワトリ脾細胞を融合したＩｇＧ産生能を有する融合細胞及びこの融合細胞を利用した抗体の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ニワトリ免疫グロブリンＩｇＧは哺乳動物由来のＩｇＧとの交叉反応性が非常に低いことが知られている（Ｈａｄｇｅ,Ｄ.,ｅｔ ａｌ,Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ., ２１，６９９〜７０７，１９８４）。また、ニワトリＩｇＧはプロテインＡと結合しないことも知られている(Ｇｕｓｓ，Ｂ.ｅｔａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ.,５，１５６７〜１５７５，１９８６）。さらに、ニワトリ抗体は哺乳動物血清の補体系を活性化せずリューマチ因子とも反応しないという利点も有している（Ｌａｒｓｓｏｎ,Ａ.,ｅｔ ａｌ，Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０８，２０５〜２０８，１９８８）。そこで、ニワトリ抗ヒト補体抗体を用いてＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ免疫複合体を測定する分析法が最近確立された(Ｌａｒｇｓｏｎ,Ａ.,ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１３，９３〜９９，１９８８）。これらの事実はニワトリ抗体が哺乳動物免疫分野において極めて有用なものであることを示している。従って、ニワトリモノクローナル抗体を供給できれば鳥類の免疫分野のみならず哺乳動物免疫分野においても有効な手段として利用されるものと思われる。
【０００３】
本発明者はニワトリモノクローナル抗体作製用の親細胞株を樹立するべく鋭意研究を行ない、マウスミエローマ細胞と同様にニワトリＢ細胞株から、ハイブリドーマの選択に必要な酵素欠損株の作出を検討し、チオグアニン耐性細胞のなかから安定生育細胞を取得した。しかしながら、このチオグアニン耐性細胞はいずれもＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）耐性を有していた。そこで、さらに研究を重ねた結果、安定して増殖可能なＨＡＴ感受性のチミジンキナーゼ欠損細胞株(ＨＵ３Ｒ株)が樹立できた。この株化細胞に免疫したニワトリ脾臓細胞を融合させて培養することによりニワトリモノクロナール抗体を培地中に蓄積させることができることを見出した（特開平２−１８６９８０号公報、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ., ８９，４１６〜４１９，１９８９）。
【０００４】
しかしながら、このＨＵ３Ｒ細胞を融合させたハイブリドーマは産生抗体がＩｇＭであってＩｇＧでないばかりでなく、継代培養中に抗生産生能を急速に失ってしまった。
【０００５】
本発明者らはさらに検討を進め、上記ハイブリドーマのチミジンキナーゼ欠損細胞(Ｒ２７Ｈ株)を取得してこれにさらに抗原で免疫したニワトリ脾臓細胞を融合させて新たなハイブリドーマを作製した（Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３９，２１７〜２２２，１９９１，ＷＯ９２／０１０４３）。これにより、安定した特異抗体産生能を有するハイブリドーマを得ることが可能となり、これらの細胞株を用いたいくつかのニワトリモノクローナル抗体が作製され、その応用例も報告がなされている（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ＆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ，５２７〜５３４,１９９２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３２，９１〜９６，１９９２）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、このＲ２７Ｈ細胞株を用いた融合実験において、もとのニワトリＢ系細胞株内に保持されるニワトリレトロウィルスでトランスホームされたと思われる細胞の増殖が頻繁に認められ、最終的にこの実験で新たに生成したハイブリドーマのみを選択的に増殖させることができなくなる場合が起こるという新たな問題点が明らかとなった。
【０００７】
すなわち、レトロウイルスでトランスホームされたと思われる細胞は、ＨＡＴ培地中で増殖可能である、ハイブリドーマに比べて増殖速度が速い、細胞融合後の出現頻度がハイブリドーマの出現頻度に比べて高頻度である、短期間ではあるが抗体の分泌が認められるなどの性質を有していた。したがって、このような細胞の増殖は新たに生成したハイブリドーマの増殖を阻害してしまうという短所を有することが明らかとなったことから、今後、細胞融合法によるニワトリモノクローナル抗体の作製に新たな改善策を考える必要性がでてきた。
【０００８】
本発明の目的は、ニワトリモノクローナルＩｇＧ抗体作製用親細胞株としてこれを用いて作製したハイブリドーマを優先して選択的に増殖させうる細胞を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討の結果、前記Ｒ２７Ｈ株にさらにＮａ+、Ｋ+ −ＡＴＰアーゼの特異阻害剤であるウアバイン耐性を付与した細胞がこの目的を達成しうるものであることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、ニワトリＢリンパ芽細胞にニワトリの免疫脾臓細胞が融合された、ウアバイン耐性、およびＩｇ発現能を有するチミジンキナーゼ欠損株化融合細胞に関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この細胞は、ニワトリＢリンパ芽細胞にニワトリの免疫脾臓細胞が融合された、Ｉｇ発現能を有するチミジンキナーゼ欠損株化融合細胞をウアバインを含む培地で培養し、ウアバイン耐性細胞を分離することを特徴とする請求項１記載の株化融合細胞の取得方法によって作製することができる。
【００１２】
チミジンキナーゼ欠損株化細胞はニワトリのＢリンパ芽細胞より取得する。ニワトリの種類は問うところではないが、例えば、白色レグホン種、白色ロック種等を利用できる。
【００１３】
ニワトリＢリンパ芽細胞株はニワトリＢリンパ芽細胞をニワトリレトロウイルスで癌化させることによって得られる。
【００１４】
得られた自己増殖性を有するＢリンパ芽細胞株を変異処理し、チミジンキナーゼ欠損細胞を選択する。変異は紫外線照射等の物理的手段によって行なってもよく、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、ニトロソグアニジン、ＩＣＲ−１９１等の薬剤を利用して行なってもよい。変異細胞からチミジンキナーゼ欠損細胞の分離は例えばトリフロロチミジン（ＴＦＴ）、ブロモデオキシウリジン等のチミジン類似物質を含む培地で培養してクローニングすればよい。培地は通常の細胞培養用培地でよく、例えばＲＰＭＩ１６４０培地、ダルベッコ変法イーグル培地等に牛胎児血清（ＦＢＳ）等を５〜１５％添加した培地を利用すればよい。培養条件も通常の細胞培養と同様でよく、例えば５〜１０％程度ＣＯ2を加えた空気の雰囲気において３７〜４１℃程度で培養すればよい。
【００１５】
こうして得られたチミジンキナーゼ欠損株化細胞は自己増殖性を有しているがＨＡＴ培地中で培養すると死滅する。また、抗ニワトリＩｇの抗体及びフルオレセイン標識第２抗体を用いた間接蛍光抗体法により測定したところいずれもこのニワトリＩｇを合成しない。この細胞をＨＵ３Ｒ細胞と命名した。
【００１６】
ＨＵ３Ｒ細胞に免疫したニワトリ脾細胞を細胞融合させる。脾細胞の調製は抗原、例えば不活性ニューカッスル病ウイルスをアジェバントとともに数回ニワトリに注射して飼育した後、摘出すればよい。融合は脾臓を摘出してポリエチレングリコール、電気融合法、ＨＶＪウイルス等の公知の細胞融合手段を用いて行う。
【００１７】
得られた融合細胞をさらに変異処理しチミジンキナーゼ欠損株の選択を行なう。これらの処理は融合細胞の増殖が安定するまで継代培養したのちに行なうことが好ましい。変異処理とチミジンキナーゼ欠損株の選択は前述と同様に行なえばよい。また、必要により変異手段、条件等を変更して行なってもよい。Ｉｇの発現はＩｇの一部であるγ鎖、μ鎖及びＬ鎖を検出することによって行なうことができ、これらの鎖の検出は公知の方法に従って行なえばよい。例えば、抗ニワトリＩｇの抗γ鎖抗体とフルオレセイン標識第２抗体等を用いた間接蛍光抗体法とか流動細胞計測法等を利用できる。γ鎖、μ鎖又はＬ鎖のいずれかが確認できればＩｇの発現を確認できたことになる。
【００１８】
こうして得られたチミジンキナーゼ欠損株化細胞はＨＡＴ感受性およびＩｇ発現能を有している。この細胞の例としてＲ２７Ｈ１(ＦＥＲＭ ＢＰ−３４７５）、Ｒ２７Ｈ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４７８）等を挙げることができる。
【００１９】
この細胞に次にウアバイン（Ｏｕａｂａｉｎ）耐性を付与する。付与方法としては、この細胞をまず紫外線照射等の物理手段あるいはＥＭＳ、ニトロソグアニジン、ＩＣＲ−１９１等の薬剤処理によって変異させ、変異細胞をウアバインを含む培地で培養してクローニングすればよい。培地は通常の細胞培養用培地でよく、例えばＲＰＭＩ１６４０培地、ダルベッコ変法イーグル培地等に牛胎児血清（ＦＢＳ）等を５〜１５％添加した培地を利用すればよい。耐性の付与にあたってはまず１×１０-7〜１×１０-5Ｍ程度のウアバイン濃度で培養を開始し、細胞の増殖に従って濃度を増していくことが好ましい。最終濃度としては５×１０-5〜５×１０-4Ｍ程度が適当である。培養条件も通常の細胞培養と同様でよく、例えば５〜１０％程度ＣＯ2を加えた空気の雰囲気において３７〜４１℃程度で培養すればよい。
【００２０】
得られたウアバイン耐性株はＨＡＴ培地中で培養し、培養開始後５〜６日後に完全に死滅することを確認する。また抗ニワトリＩｇ抗体とフルオレセイン標識２次抗体等を用いた間接蛍光抗体法等によりＩｇの発現は確認できる。
【００２１】
こうして得られたＩｇ発現能を有する株化融合細胞に、さらにニワトリの免疫脾臓細胞を融合させる。免疫方法及び融合方法は前述と同様でよい。免疫の発現に使用する抗原はこの免疫されたニワトリ脾細胞が融合後の細胞にＩｇＧ産生能を付与すると思われるところから、この抗原は所望のＩｇＧに応じて選択する。
【００２２】
ＩｇＧの産生はこの融合細胞を前述の方法と同様に培養すればよく、１〜３０日間程度培養することによって培養上清中にＩｇＧを産生、蓄積させることができる。ＩｇＧの分離方法も公知の手段を利用すればよく、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール分画法、リバノール分画法、ＰＥＧ分画法等を適用できる。
【００２３】
【実施例】
ウアバイン耐性・ＨＡＴ感受性細胞株の作製
１．ニワトリ細胞株
本実施例で用いたＲ２７Ｈ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４７５）およびＲ２７Ｈ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４７８）は、これまでの研究で樹立された親細胞である。Ｒ２７Ｈ１およびＲ２７Ｈ４は１０μｇ／ｍｌ濃度のＴＦＴを含む１０％ＦＢＳ加イスコフ変法ダルベッコ（ＩＭＤＭ）培地を用い、３８．５℃ ５％ＣＯ2インキュベーター内で培養し、２〜４日毎に継代を行った。
【００２４】
２．ウアバイン耐性株の作製
ウアバインは５×１０-3Ｍを保存溶液とした。まず、ウアバイン７２．８８ｍｇを最終容量２０ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））に溶解させ、０．４５μｍ滅菌フィルターでろ過滅菌後、滅菌チューブへ分注し、使用時まで遮光して４℃で保存した。
【００２５】
変異形質の誘導は、Ｒ２７Ｈ１あるいはＲ２７Ｈ４を２×１０5個／ｍｌとなるように５％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地へ浮遊させ、３８．５℃ ５％ＣＯ2インキュベーター内で６時間培養を行った後６００μｇ／ｍｌとなるようにＥＭＳを添加してさらに２４時間培養を行った。培養後ＥＭＳを除くために、細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地へ浮遊させ、変異形質を発現させるためにさらに培養を行った。
【００２６】
変異形質を発現（２〜４日）させた後、１×１０-5Ｍウアバインを含む１０％ＦＢＳ加ＩＭＤＭ培地へ１×１０5個／ｍｌとなるように浮遊させ、組織培養用９６ウェルプレートへ１００μｌずつ分注し、３８．５℃ ５％ＣＯ2インキュベーター内で培養を行った。数日後、増殖してきた細胞を同培地で増殖させ、同培地で増殖が安定したところで培地中の試薬濃度を徐々に上げていき、最終濃度を１×１０-4Ｍとなるようにした。
【００２７】
３．軟寒天法によるウアバイン耐性株のクローニング
得られたウアバイン耐性株のクローニングを行うために、ウアバイン（１×１０-4Ｍ）を含む軟寒天中で培養を行った。培養開始約２週間後、軟寒天中で非常に良く増殖してきたと思われるコロニーをウアバイン（１×１０-4Ｍ）を含む増殖培地で培養を行い、得られたクローン中特に増殖の良いと思われるクローンを選出した。これらのクローンをＨＡＴ培地で培養を行ったところ、いずれの細胞も培養開始後５〜６日目までに完全に死滅した。従って、これらのクローンは細胞融合のための親細胞として使用可能と思われたので、これらのクローンをそれぞれＭｕＨ１（ＦＥＲＭＢＰ−５４４２）およびＭｕＨ４（ＦＥＲＭＢＰ−５４４３）と命名した。
【００２８】
ウアバイン耐性・ＨＡＴ感受性細胞株の性状
１．クローニングで得られた細胞株のＨＡＴ培地における感受性
クローニングで得られた細胞株のＨＡＴ培地に対する感受性を調べた。供試細胞を１×１０5個／ｍｌとなるように１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地へ浮遊させ、組織培養用９６ウェルプレートへ１００μｌずつ分注した後、最終濃度がヒポキサンチンおよびチミジンをそれぞれ１×１０-4Ｍおよび１．６×１０-5Ｍとなるように、アミノプテリンは０．０５〜２×１０-7Ｍとなるように加えた培地を１００μｌずつ分注した後、３８．５℃ ５％ＣＯ2インキュベーター内で培養を行う。培養開始後０、２、４、６、８、１０および１４日目にそれぞれ３ウェルずつの細胞を回収し、死細胞率を算定する。
【００２９】
２．ウアバイン耐性株に発現する細胞質内免疫グロブリン（ｃＩｇ）の検出法
ウアバイン耐性株のｃＩｇ発現を間接蛍光抗体法によって調べた。まず、供試細胞をチューブに移し、冷ＰＢＳ(−)で３回洗浄した後、エタノールで洗浄しておいたカバーグラスに高濃度の細胞浮遊液を少量滴下して、パスツールピペットで均一に塗抹し風乾させる。風乾後、カバーグラスを試験管に入れ、−２０℃に冷やしておいた酸アルコール（酢酸：エタノール＝５：９５）を充分に入れ、−２０℃１５分で固定終了とする。風乾後、１次抗体としてウサギ抗トリＬ鎖、ウサギ抗トリμ鎖およびウサギ抗トリγ鎖を、それぞれ５０倍、８０倍および６０倍に希釈したものをカバーグラスの上に適当量のせ、湿潤箱内に入れ３７℃で２時間あるいは４℃で一昼夜反応させる。反応終了後、冷ＰＢＳ(−)で５回洗浄を行った後、２次抗体として４０倍希釈したフルオレセイン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧをのせ、湿潤箱内に入れ３７℃で反応させる。１時間後、充分に洗浄した後、スライドガラスに無蛍光グリセリンとＰＢＳ（−）を９：１の割合で混合した溶液で封入した後、蛍光顕微鏡で観察した。
【００３０】
３．細胞増殖速度の測定法
ウアバイン耐性細胞株の倍加時間を測定した。まず、供試細胞を最終濃度が２×１０5個／ｍｌとなるように１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地へ浮遊させ、組織培養用２４ウェルプレートに１ｍｌずつ分注した後、３８.５℃ ５％ＣＯ2インキュベーターで培養を行う。毎日、３ウェルずつ細胞を回収し、生細胞数および死細胞数を数え、培養開始１週間後、それぞれの数値を片対数グラフにとり、増殖曲線を作成した後、下記の計算式で倍加時間を算出した。
【００３１】
倍加時間（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ；ｇ）は
ｇ＝（ｔ2−ｔ1）１３．３２×ｌｏｇ（ｘ2／ｘ1）
（ｔ1，ｔ2；時間、ｘ1，ｘ2；総生細胞数）
の計算式で求めることができる。計算式には、グラフの最初の直線となる部分の数値を回帰して直線式を求め、この直線上の適当な２点をとり、その数値を代入する。
【００３２】
４．ニワトリ免疫グロブリンの検出
ウアバイン耐性株の培養上清中のニワトリ免疫グロブリンの検出をウエスタン・ブロット法を用いて行った。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）には１０％アクリルアミドゲルを用い、泳動用サンプルにはウアバイン耐性株を血清不含ＩＭＤＭ培地で２４時間培養した後、５０％硫安塩析で得られた試料と２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）を含むサンプル緩衝液を混合し、１００℃で３分間煮沸したものを用いて、ミニスラブゲルの１レーン当たりサンプルを３〜５μｇ入れ２０〜４０ｍＡで泳動を行った。その後、セミドライ法でニトロセルロース膜に転写し、酵素抗体法による発色バンドを観察した。
【００３３】
酵素抗体法の１次抗体としてニワトリ免疫グロブリンに対する抗体は、ニワトリＩｇＧもしくはニワトリＩｇＭ(４００μｇ／ｍｌ)を含むＰＢＳ（−）溶液を２５０μｌとり、等量のＦＣＡと混合した。この混合物をＢａｌｂ／ｃ雌マウス腹腔に免疫し、その後２次免疫としてニワトリＩｇＭもしくはＩｇＧ溶液を１２５μｌ静脈に免疫した。その後、マウスミエローマＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４と公知の方法で細胞融合を行い作製した。こうして、本発明者らが作製したマウスモノクローナル抗体（腹水）抗ニワトリＬ鎖（１：３０００）、抗ニワトリγ鎖（１：３０００）および抗ニワトリμ鎖（１：３０００）、２次抗体としてペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：３００）、基質にはジエチルアミノベンチジン（ＤＡＢ）を用いた。
【００３４】
５．結果
得られたＭｕＨ１、ＭｕＨ４の２クローンについてｃＩｇの有無を調べた。その結果、表１に示したようにＭｕＨ１ではμ鎖、ＭｕＨ４ではμ鎖およびＬ鎖の発現が認められた。得られた２クローンはニワトリ免疫グロブリンを発現していたことから、それらの産生性についてＥＬＩＳＡ法およびウエスタン・ブロッティング法により各細胞の培養上清中のニワトリ免疫グロブリンの検出を行った。その結果、図１に示したようにＭｕＨ４の培養上清中にはμおよびＬ鎖の分泌が認められたが、ＭｕＨ１ではニワトリ免疫グロブリンの分泌は認められなかった。また、各細胞の倍加時間を調べたところ、いずれのウアバイン耐性株はＲ２７Ｈ１およびＲ２７Ｈ４と比較して２〜３時間遅かった（表１）。
【００３５】
ＭｕＨ１およびＭｕＨ４についてＨＡＴ培地中のアミノブテリン濃度に対する感受性を調べた。その結果、図２に示すように０．５×１０-7Ｍアミノプテリン濃度ではＭｕＨ４は培養開始後５日目までに、またＭｕＨ１は培養開始後２日目には完全に死滅した。さらに、ＭｕＨ１についてアミノプテリン低濃度下での感受性を調べたところ０．２５あるいは０．１×１０-7Ｍアミノプテリン濃度では培養開始後４日目に約９５％の細胞の死滅が認められたが、一部増殖してくる細胞が認められた。
【００３６】
【表１】
0003753392.tif 000002
【００３７】
ＭｕＨ１とＭｕＨ４を親細胞株としたヒトＩｇＧ免疫ニワトリ脾臓細胞との細胞融合
１．免疫ニワトリ
本実施例では、ホワイトレグホン・ＣＢ系を免疫ニワトリとして用いた。
【００３８】
２．抗原と免疫スケジュール
本実施例ではヒトＩｇＧを抗原として用いた。ヒトＩｇＧを２００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ（−）で調製を行い、試料５００μｌ（１００μｇ）をそれぞれ等量のＦＣＡと混合して４〜６週齢のニワトリの胸筋に接種した後、初回免疫後３〜４週間後に２次免疫として２００μｇのヒトＩｇＧをニワトリの翼下静脈に接種した。各免疫後のニワトリ血清の力価はＥＬＩＳＡ法によって測定した（図３）。
【００３９】
３．細胞融合
Ａ．培地の調製
培地には１０％ＦＢＳ加ＩＭＤＭをハイブリドーマ用培地として用いた。
また、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンをそれぞれ最終濃度１×１０-4Ｍ、２×１０-7Ｍおよび１．６×１０-5Ｍとなるように１５％ＦＢＳを含むハイブリドーマ用培地へ加えたものをＨＡＴ培地として用いた。
【００４０】
Ｂ．ニワトリ脾細胞の調製
ニワトリを心臓採血によりしゃ血を充分に行った後、脾臓を摘出した。摘出した脾臓の被膜を剥離し、ハサミで粗砕した後、血清不含ＲＰＭＩ１６４０培地約１０ｍｌを入れたガラス製ホモジナイザーに入れ２〜３回動かし、細胞浮遊液を作製し、これをステンレス製メッシュ(＃２００)に通した後、２７３Ｇで５分間遠心を行った。遠心後、上清を完全に除去し、血清不含ＲＰＭＩ１６４０培地約４０ｍｌを加え、細胞浮遊液から赤血球を除去するために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ約２ｍｌを加えた１５ｍｌ遠心管に、細胞浮遊液約４ｍｌを静かに重層し、７１５Ｇで１０分間遠心を行った。遠心後、上清とＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの間に位置する細胞を取り、適量の血清不含ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、遠心により３回洗浄を行い、ニワトリ脾細胞浮遊液を得た。
【００４１】
Ｃ．細胞融合
親細胞をポリプロピレン製５０ｍｌ遠心管に回収し、血清不含ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄を行った。調製・洗浄された親細胞と抗原免疫脾細胞をそれぞれ１：５の割合で混合し、２６７Ｇで５分間遠心を行い、上清を完全に吸引除去し、遠心管の底を軽くたたいて細胞の凝集をほぐし、３８℃に温めておいたＰＥＧ１５００溶液１ｍｌを１分間かけて添加した。このとき、遠心管を左右前後に振渣させながら、時々ピペットの先端で液を攪拌した。ＰＥＧ溶液添加後、３８℃に温めておいた血清不含ＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌを約５分間かけて徐々に添加した後、さらに同培地を約３０ｍｌ加えて３００Ｇで５分間遠心した。遠心後、上清を静かに吸引除去し、１０％ＦＢＳを含むハイブリドーマ用培地を加え、軽く細胞沈渣をほぐした後、組織培養用９６ウェルプレートに１００μｌずつ分注し(脾細胞数５又は８×１０5／ウェル）、３８．５℃ ５％ＣＯ2インキュベーター内で培養を行った。
【００４２】
融合後２４時間後、２倍濃度のＨＡＴ培地を１００μｌずつ加え、融合後２日目以降は２〜４日毎に通常濃度のＨＡＴ培地で培地交換を行い、１０〜１４日後からＨＴ培地に換えて１週間培養を行った。その際、一部のプレートは融合後７日目から２×１０-5Ｍのウアバインを含む培地で培養した。また、ＨＡＴはヒポキサンチンおよびチミジンをそれぞれ最終濃度１×１０-4Ｍおよび１．６×-5Ｍ、アミノプテリンは０．５〜０．８×１０-7Ｍとした。
【００４３】
その結果表２に示したように、Ｒ２７Ｈ４を用いた場合ではすべてのウェルで細胞の増殖が認められ、そのうちのほとんどウェルでハイブリドーマでないと思われる小さい細胞の増殖が認められた。
【００４４】
ＭｕＨｌはＨＡＴ選択開始後２日目頃から細胞の死滅が認められはじめ、４〜５日目頃にはほとんどの細胞は死滅した。一方、ＭｕＨ４はＨＡＴ選択開始後細胞の増殖が認められた後、選択開始後４日目頃から細胞の死滅が認められはじめ、６〜８日目頃にはほとんどの細胞は死滅した。いずれの細胞についても融合後７〜８日目頃からハイブリドーマの出現が認められはじめ、出現したハイブリドーマは安定して増殖した。これらの親細胞の融合効率は、１ウェル当たりのまき込み数を脾細胞で５あるいは８×１０5個のとき、それぞれＭｕＨｌは６０.７６％および７３．９６％で、ＭｕＨ４は２０．４９％および１７．３６％であり、ＭｕＨｌはＭｕＨ４より高率であった。また、ハイブリドーマでないと思われる小さい細胞の増殖については全く認められなかった。
【００４５】
４．ハイブリドーマのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡ法
特異抗体検出のために各々１μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ(−)で希釈したヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＧ−ＦｃあるいはヒトＩｇＧ−Ｆａｂを５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一昼夜反応させて固相化させたＥＬＩＳＡ用プレートを用いた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むＰＢＳ(−)（Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）でプレートを５回洗浄した後、１％ｇｅｌａｔｉｎ加ＰＢＳ(−)を各ウェルに２００μｌずつ加え、３７℃で１時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ハイブリドーマの出現が認められたウェルの上清５０μｌを加え、３７℃で２時間反応させた後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ）で３０００倍に希釈したＨＲＰＯ−ヤギ抗トリＩｇＧ５０μｌ（１：３０００）をプレートの各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、フェニレンジアミンを含む基質溶液１００μｌをプレートの各ウェルに加え、遮光状態で３０分間室温で反応させた後、２ＭＨ2ＳＯ4を各ウェルに５０μｌ加え、反応を停止させる。反応停止後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４６】
５．特異性検出のためのウエスタン・ブロッティング法
ＥＬＩＳＡ法で陽性を示したハイブリドーマ培養上清の特異性をウエスタン・ブロッティング法を用いて調べた。
【００４７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥには１０％アクリルアミドゲルを用い、サンプルにはヒトＩｇＧ−ＦｃおよびヒトＩｇＧ−Ｆａｂとサンプル緩衝液（−２ＭＥ）を混合し、１００℃で５分間煮沸したものを用いて、ミニスラブゲルの１ｌａｎｅ当たりヒトＩｇＧ−Ｆｃ０．１μｇおよびヒトＩｇＧ−Ｆａｂ０．３μｇを入れ泳動を行った。なお、ヒトＩｇＧ−ＦｃはＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で精製したものを用いた。
【００４８】
酵素抗体法は、各ハイブリドーマ培養上清を反応させた後、２次抗体としてＨＲＰＯ−ヤギ抗トリＩｇＧ（１：３００）を用いた。なお、対照としてＨＲＰＯ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：３００）を反応させた。
【００４９】
６．融合細胞のスクリーニング結果
融合後、増殖してきたハイブリドーマについて特異抗体産生のスクリーニングをＥＬＩＳＡ法により行った。その結果、表２に示したようにＭｕＨｌおよびＭｕＨ４で特異抗体産生ハイブリドーマの出現が認められた。これらのハイブリドーマの抗体産生能は非常に安定であり、軟寒天培養法によるクローニングを行った全てのハイブリドーマで、特異抗体産生性クローンを得ることに成功した。これらのクローンより産生された抗体の特異性についてＥＬＩＳＡ法およびウエスタン・ブロッティング法によって調べた。
【００５０】
【表２】
0003753392.tif 000003
【００５１】
【表３】
0003753392.tif 000004
【００５２】
その結果、表３に示したようにＥＬＩＳＡ法では調べた８つのうち７つがヒトＩｇＧ−Ｆｃと、１つ（ＣＨＭ１−ＨｕＩｇ１）がヒトＩｇＧ−Ｆａｂと反応を示した。一方、ウエスタン・ブロッティング法ではＥＬＩＳＡ法でヒトＩｇＧ−Ｆｃと反応を示した７つのうち、全てがヒトＩｇＧ−Ｆｃである分子量約５０Ｋダルトンのタンパクと反応し、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂとの反応は認められなかった。また、残り１つ（ＣＨＭ１−ＨｕＩｇ１）はヒトＩｇＧ−Ｆａｂ（約５０Ｋダルトン）と反応が認められたのに対し、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ中の分子量約５０Ｋダルトンのタンパクとの反応は認められず分子量約１００Ｋダルトン以上のタンパクと反応が認められた。これらの抗体のうちヒトＩｇＧ−Ｆｃに反応を示した２つ（ＣＨＭ１−ＨｕＩｇ３およびＣＨＭ４−ＨｕＩｇ１）およびヒトＩｇＧ−Ｆａｂに反応を示した１つ（ＣＨＭ１−ＨｕＩｇ１）についてウエスタン・ブロッティング法による結果を図４に示した。
【００５３】
ＭｕＨ１又はＭｕＨ４細胞とヒトＩｇＧ免疫鶏脾臓細胞との融合細胞の性状
１．特異抗体のニワトリ免疫グロブリンタイプ検出のためのＥＬＩＳＡ法
特異抗体のニワトリ免疫グロブリンタイプ検出はＥＬＩＳＡ法で行った。なお、特異抗体の鶏免疫グロブリンタイプ検出のために１μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）で希釈したヒトＩｇＧを５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一昼夜反応させて固相化させたＥＬＩＳＡ用プレートを用い、各ハイブリドーマの培養上清を反応させた後、２次抗体として前出のマウスモノクローナル抗体（腹水）抗ニワトリＬ鎖（１：５００００）、抗ニワトリγ鎖（１：５００００）および抗ニワトリμ鎖（１：５００００）、３次抗体としてＨＲＰＯ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：３０００）を用いた。
【００５４】
２．ヒトＩｇＧに対する反応
ＭｕＨ１およびＭｕＨ４由来特異抗体産生ハイブリドーマ８クローンが産生するニワトリ免疫グロブリンについてヒトＩｇＧに対して特異性を有するニワトリ免疫グロブリンのタイプをＥＬＩＳＡ法によって調べたところ、表４に示したように調べた８クローン全てにおいてγ鎖およびＬ鎖を有する抗体はヒトＩｇＧに対して反応を示したが、μ鎖を有する抗体はヒトＩｇＧに対して全く反応性を示さなかった。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
３．特異抗体産生量測定のためのＥＬＩＳＡ法
抗体産生性ハイブリドーマから産生される抗体量をＥＬＩＳＡ法で検出した。なお、培養上清は５×１０-5ウアバイン添加および無添加１０％ＦＢＳ加ＩＭＤＭ培地で各々培養していた特異抗体産生性ハイブリドーマを５×１０5個／ｍｌとなるように各々の培地へ浮遊させ、３８．５℃ ５％ＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養を行って得られた上清を用いた。
【００５７】
ＥＬＩＳＡ法には、ニワトリＩｇＭ産生量測定のためにヤギ抗トリＩｇＭ−Ｆｃ（１：５００，５０μｌ／ウェル）あるいはニワトリＩｇＧ測定のためにヤギ抗トリＩｇＧ−Ｆｃ（１：５００，５０μｌ／ウェル）を固相化させたＥＬＩＳＡ用プレートを用いて、ブロックエースでブロッキングした後、各ハイブリドーマ培養上清（１：１０〜１：１２８０希釈）５０μｌおよびコントロールとして１〜３００ｎｇ／ｍｌにＰＢＳ（−）で希釈したニワトリＩｇＭ（５０μｌ／ウェル）あるいはニワトリＩｇＧ（５０μｌ／ウェル）を反応させ、２次抗体として前出のマウスモノクローナル抗体(腹水)抗ニワトリμ鎖（１：１０００００）および抗ニワトリγ鎖（１：１０００００）を用い、３次抗体としてＨＲＰＯ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：３０００）を用いた。
【００５８】
４．特異抗体産生性ハイブリドーマの抗体産生能
特異抗体産生性ハイブリドーマにおける抗体産生能をＥＬＩＳＡ法によって検討を行った。なお、ウアバイン添加培地中で抗体産生量を調べたハイブリドーマはウアバイン添加培地中で増殖が安定した細胞を用いた。その結果、表５に示したようにウアバイン添加および非添加でわずかな抗体産生量の低下は認められたものの、調べたほとんどのハイブリドーマにおいて顕著な差は認められなかった。また、各ハイブリドーマにおける抗体産生量はＭｕＨ１由来ハイブリドーマのほうがＭｕＨ４由来と比較して全体的に多い傾向が認められ、そのＩｇＧ産生量はＭｕＨ４由来ハイブリドーマでいずれも１μｇ／ｍｌ以下であったのに対して、ＭｕＨ１由来ハイブリドーマでは調べた４つのうち３つがウアバイン非添加条件で２μｇ／ｍｌ以上であった。特にμ鎖の産生が認められなかったＣＨＭ１−ＨｕＩｇ３ではＩｇＧの産生量が非常に多く５μｇ／ｍｌ以上であった。一方、ＩｇＭ産生量は、ＭｕＨ１由来ハイブリドーマではＩｇＧの産生量とほぼ同量であったのに対し、ＭｕＨ４由来ハイブリドーマではＩｇＧ産生量の１〜４倍量であり、ＭｕＨ４の３〜８倍量であった。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
【発明の効果】
以上のように、チミジンキナーゼ欠損、ウアバイン耐性株化細胞ＭｕＨｌ、およびＭｕＨ４細胞を親細胞とした細胞融合により、高効率で特異抗体産生細胞が得られた。得られた抗体産生細胞の増殖性は安定していた。またレトロウイルストランスホーム細胞と思われる細胞の増殖は全く認められなかった。抗体産生能も安定しており、ニワトリＩｇＧを大量に産生することを可能にしたと考えられる。本発明によりニワトリモノクローナル抗体の作製が可能となり、ニワトリ免疫系の基礎研究はもちろん医薬、診断薬分野における抗体の利用を広くする効果をもつ。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の細胞の培養上清を電気泳動後ウエスタンブロッティング法で調べた発色パターンを示す図である。
【図２】  ＨＡＴ培地におけるアミノプテリン濃度を変えて本発明の細胞を培養し、死細胞率の経時変化を調べた結果を示すグラフである。
【図３】  本発明の細胞に融合させたヒトＩｇＧ免疫ニワトリ血清の力価を示すグラフである。
【図４】  本発明の細胞にヒトＩｇＧ免疫ニワトリ脾臓細胞を融合させた細胞の培養上清を電気泳動後ウエスタンブロッティング法で調べた発色パターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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