(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有し、哺乳動物細胞の染色体分断と細胞死を促進する酵母蛋白質CIA1をコードする酵母遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列からなる精製ポリヌクレオチドを保有する組換えベクターを含有する、哺乳動物細胞の細胞死促進剤。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を有し、哺乳動物細胞の細胞死を促進する精製酵母蛋白質CIA1を含有する、哺乳動物細胞の細胞死促進剤。
【請求項３】
非ヒト哺乳動物細胞の細胞死を促進する方法であって、請求項１または２の細胞死促進剤を細胞に接触させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、哺乳動物細胞の染色体分断と細胞死を促進する出芽酵母蛋白質CIA1と、その利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
活性化細胞死（またはアポトーシス）は現在のところ多細胞的な概念として捉えられているが、徐々に単細胞的な概念としても受け取られつつある。しかしながらこのような細胞死に対して、多細胞および単細胞；有核細胞および原核細胞等の系統発生的に広汎な生物種における包括的な理解は欠けている。
【０００３】
このような細胞死に対する包括的な理解は、生命に対する基礎的な解明に役立つと共に、新しい癌治療の開発や新しいタイプの殺菌剤や抗真菌剤の創製などといった産業上有用な応用開発にとっても極めて重要である。
【０００４】
この出願の発明者らは、ヒストンのシャペロンとして機能する核因子 CIA1の遺伝子を欠損したSaccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）が、核の断片化、染色質断片化および凝縮、ミトコンドリア膜電位の減少およびプロトンポンプ機能不全、チトクロームc放出、および細胞拡大などの表現型を示して死滅することを見出している（Genes Cells 6, 1043-1054, 2001）。この単細胞酵母における細胞死の表現型は大部分がアポトーシス的であり、わずかに壊死性であるため、この死は「プロトタイプ的活性化細胞死」と名付けられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の発明者らは、酵母のプロトタイプ的細胞死を促進する蛋白質CIA1についてさらに研究を重ねた結果、このCIA1が哺乳動物細胞（ヒト癌細胞）の細胞死を促進することを見出した。
【０００６】
この出願の発明は以上のとおりに新規な知見に基づいてなされたものであって、哺乳動物細胞（ヒト癌細胞）の細胞死を促進する酵母蛋白質を提供することを課題としている。
【０００７】
またこの出願の発明は、この因子の利用発明を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の(1)〜(12)の発明を提供する。
(1)  酵素配列番号２のアミノ酸配列を有し、哺乳動物細胞の染色体分断と細胞死を促進する酵母蛋白質CIA1をコードする酵母遺伝子。
(2)  cDNAが配列番号１の塩基配列を有する請求項１の酵母遺伝子。
(3)  前記発明(1)の酵母遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチド。
(4)  前記発明(3)のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
(5)  前記発明(4)の組換えベクターによる形質転換体細胞。
(6)  配列番号２のアミノ酸配列を有し、哺乳動物細胞の細胞死を促進する精製酵母蛋白質CIA1。
(7)  前記発明(3)のポリヌクレオチドの発現産物である前記発明(6)の精製酵母蛋白質CIA1。
(8)  配列番号２のアミノ酸配列における一部連続配列からなるポリペプチド。(9)  前記発明(4)の組換えベクターを含有する細胞死促進剤。
(10)  前記発明(6)または(7)の精製酵母蛋白質CIA1、もしくは前記発明(8)のポリペプチドを含有する細胞死促進剤。
(11)  哺乳動物細胞の細胞死を促進する方法であって、前記発明(9)または(10)の細胞死促進剤を細胞に接触させる工程を含む方法。
(12)  哺乳動物細胞が、哺乳動物体内の細胞である前記発明(11)の方法。
【０００９】
以下、この出願の発明について、実施形態を詳しく説明する。なお、この出願において「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は特定塩基数の断片を意味するものでなく、一応の目安として100bp以上の断片をポリヌクレオチド、100bp未満の断片をオリゴヌクレオチドとするが、例外も存在する。同様に、ポリペプチドについても特定範囲のアミノ酸残基数に限定されるものではない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
発明(1)は、CIA1蛋白質をコードする酵母遺伝子であり、この酵母遺伝子は、さらに具体的には、転写されるmRNAから合成されるcDNAが配列番号１の塩基配列を有している（発明(2)）。
【００１１】
この発明(1)の遺伝子は、例えば、配列番号１の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして酵母ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBN（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法およびSDA（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００１２】
発明(3)は、発明(1)のゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するmRNA、mRNAから合成したcDNAから精製されたポリヌクレオチド（DNA断片やRNA断片）である。例えば、cDNAは酵母細胞から抽出したポリ(A)＋RNAを鋳型として、公知の方法（Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982； Gene, 150, 243-250, 1994）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−として、酵母細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR法を用いて、目的cDNAを合成することもできる。このようにして調製cDNAは、具体的には配列番号１の塩基配列を有している。
【００１３】
発明(3)のポリヌクレオチドはまた、発明(1)のゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するmRNA、mRNAから合成したcDNAから精製されたポリヌクレオチドの一部連続配列からなるポリヌクレオチドである。すなわち、この部分ポリヌクレオチドの一態様は、配列番号１におけるコード領域（ORF）の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００１４】
これらのポリヌクレオチドは、発明(4)の組換えベクターの形態で、例えばCIA1蛋白質の遺伝子工学的な製造に使用することができるほか、発明(9)の薬剤成分としても使用することもできる。
【００１５】
発明(4)の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜なものを使用する。例えば、cDNAまたはそのORF領域をインサートとしてこの発明のCIA1蛋白質を生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、発明(1)のゲノム遺伝子DNAをインサートとする場合には、BAC（Bacterial Artificial Chromosome）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。
【００１６】
これらの組換えベクターは、例えばCIA1蛋白質の遺伝子工学的な製造に使用することができるほか、発明(9)の薬剤成分としても使用することもできる。
【００１７】
発明(5)の形質転換体細胞は、例えば、前記発明(4)の組換えベクターを用いてCIA1蛋白質を製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。また、アデノウイルス等に由来する形質転換細胞は、発明(9)の薬剤成分としても使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
【００１８】
発明(6)のCIA1蛋白質は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、酵母と同様に哺乳動物細胞の細胞死を促進する。
【００１９】
このCIA1蛋白質は、酵母細胞から単離する方法、配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができるが、好ましくは、前記発明(3)のポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的に製造することができる。すなわち、インビトロ転写翻訳系や、発明(5)の形質転換細胞の培養物から単離精製されるCIA1蛋白質（発明(7)）である。
【００２０】
例えば、CIA1蛋白質をインビトロ転写翻訳系で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、RNAポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ転写翻訳系に添加すれば、目的とするCIA1蛋白質をインビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T7、T3、SP6などが例示できる。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pBluescript IIなどが例示できる。
【００２１】
CIA1蛋白質を、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、目的の酵素を発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的蛋白質を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescript II、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。
【００２２】
さらに、CIA1蛋白質を真核細胞で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成する。このベクターを真核細胞内に導入して培養すれば、目的とする蛋白質を発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYES2などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓由来細胞HEK293T、サル腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２３】
形質転換細胞で発現させたCIA1蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２４】
なお、細胞で発現した蛋白質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾された蛋白質もこの発明の酵素蛋白質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、メチル化などである。
【００２５】
発明(8)は、配列番号２のアミノ酸配列における一部連続配列からなるポリペプチドである。すなわち、このポリペプチドは、CIA1蛋白質の活性部分を構成する任意領域に対応する蛋白質断片と同一のアミノ酸配列からなり、例えば、化学合成によってペプチドを合成する方法や、部分ポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的に作成する方法、あるいは前記発明(6)または(7)のCIA1蛋白質を適当なプロテアーゼで消化する方法等によって作成することができる。
【００２６】
以上の発明(6)〜(8)のCIA1蛋白質またはポリペプチドは、発明(10)の薬剤成分等として使用することができる。
【００２７】
発明(9)は、前記発明(4)の組換えベクターを含有する細胞死促進剤である。また、発明(10)は、前記発明(6)〜(8)のCIA1蛋白質またはポリペプチドを含有する細胞死促進剤である。これらの細胞死促進剤は、例えば制癌剤として使用することができる。すなわち、癌細胞は正常な調節経路に異常が生じていることによって細胞死を免れ、異常に増殖していると考えられる。CIA1蛋白質はその哺乳動物細胞（ヒト癌細胞）に対する細胞死促進作用によって癌細胞を死滅させることから、制癌効果が期待できる。
【００２８】
発明(9)の細胞死促進剤は、CIA1蛋白質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを、生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に組み込んで製剤化することができる。
【００２９】
また、発明(10)の細胞死促進剤は、例えばCIA1蛋白質と薬理学的に許容される担体溶液とを混合して製剤化することができる。
【００３０】
そして、これらの細胞死促進剤は、発明(11)および発明(12)の方法において使用することができる。すなわち、発明(11)の方法はこれらの細胞死促進剤を哺乳動物細胞に接触させる工程を含む哺乳動物細胞の細胞死促進方法である。この方法は、例えば培養条件下にある細胞、または哺乳動物の体内（好ましくは人体内）にある細胞を対象とするものであり、具体的には体内の癌細胞に対する抗癌剤として使用する。
【００３１】
例えば、体内に存在する細胞に対して使用する場合、発明(9)の細胞死促進剤は、遺伝子治療の手法により体内に導入することができる。その場合に、CIA1蛋白質をコードするポリヌクレオチドの血中濃度が約0.1μM〜約10μMに達するように、十分な量を投与することが好ましい。また発明(10)の細胞死促進剤は、例えばマイクロインジェクション法により癌組織に局所注入することができる。あるいは、最近開発された脂質による細胞内導入法（BioPORTER（Gene Therapy Systems社、米国）、Chariot（Active Motif社、米国）等）を採用することによっても癌組織に蛋白質またはポリペプチドを導入することができる。このような注入形態において、蛋白質またはポリペプチドの含有量は、担体溶液1mlに対して、1ng〜10mg程度とすることができる。また、特に人体内への投与を対象とする発明(10)の細胞死促進剤の場合には、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻孔内、気管内、または直腸内等の経路によって投与するために製剤化することができる。また、製剤化のための担体は、これらの投与経路に依存するが、例えば、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、およびこの技術分野で公知のその他の材料を含む。また、「薬剤的に許容される」という用語は、細胞、細胞培養、組織、または生体のような生物学的システムに適合し、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しないような非毒性材料を意味する。薬剤的に許容される製剤化の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００３２】
以下、この発明の蛋白質機能解析のために行った実験を示す。
(1)  クローニング
CIA1蛋白質をコードするcDNAは、出芽酵母データベースの情報を参考にゲノムPCRを行い、全長ORFを含む断片を単離し、pBluescript II SK(-)にサブクローニングして配列を決定した。配列番号１にCIA1 cDNAの塩基配列を、配列番号２にCIA1蛋白質のアミノ酸配列を示す。
(2)  出芽酵母細胞の操作
W303株に由来する出芽酵母細胞を使用した。また、CIA1欠損細胞は、以下の方法によって作製した。
【００３３】
組み換えDNA技術を用いて、配列番号１を全て含むCIA1遺伝子全長フラグメントのうち、制限酵素NdeIとAccIで切り出される約0.7kbの遺伝子断片部位を約1.1kbのURA3遺伝子断片（制限酵素HindIIIとSmaIで切り出される遺伝子断片）で置き換えた。次に、この組み換え遺伝子断片のうち、制限酵素EcoRIとHindIIIで切り出される約1.1kbの遺伝子断片をW303 MAT alpha/aの遺伝型で示されるW303株由来の２倍体細胞に形質転換し、ウラシルを含まない培地で生育する株を得た。この株のCIA1遺伝子座で遺伝子組み換えが起こっていることはゲノムPCR解析で確認した。胞子形成条件下でこの２倍体の胞子を取得し、ウラシルを含まない培地で生育し、かつCIA1遺伝子座にURA3遺伝子断片が挿入された１倍体を分離した。この株は機能的なCIA1遺伝子を欠損した１倍体酵母株であり、CIA1欠損酵母細胞と呼称する。また、CIA1遺伝子座にURA3遺伝子断片を組み込んでいない株を野生型酵母細胞と呼称する。
(3)  哺乳動物細胞の操作
HeLaおよびCOS7細胞を使用した。細胞は5% FBS-DMEM（Nissui）中で37℃、5% CO2存在下、48時間で前培養した。前記のCIA1 cDNAを動物細胞導入用の蛋白質非結合ベクター（pSG-5）にクローニングし、細胞をこのベクターの存在下で培養を行うことにより形質転換させた。動物細胞導入用の蛋白質非結合ベクター（pSG-5）に組み込んだ出芽酵母蛋白質CIA1を培養後24時間のCOS7細胞（アカゲザル腎細胞）、HeLa細胞(ヒト子宮頚部癌細胞)ともに37(C、5%-CO2存在下で48時間培養した後、染色解析に用いた。
(4)  顕微鏡検査法
酵母および哺乳動物細胞の分析には、文献（Genes Cells 6, 1043-1054, 2001）の記載に従い、差分干渉対照（DIC）補助を受けた光学、蛍光、共焦点レーザースキャニング、および透過型電子顕微鏡（TEM）を用いた。
(5)  染色技術
細胞の生存度の決定は、酵母細胞についてはLIVE/DEAD Yeast Viability Kit（FUN-1、Calcofluore white M2R；Molecular Probes）を、哺乳類細胞についてはLIVE/DEAD Reduced Biohazard Viability/Cytotoxity Kit（SYTO 10、ethidium homodimer-1；Molecular Probes）を用いて行った。酵母と哺乳類細胞の核および染色体の形態変化は、DAPI（Sigma）（Genes Cells 6, 1043-1054, 2001）を用いて同定した。
【００３４】
DNA断片化の同定は、TUNEL染色をin situ Cell Death Detection KitのPOD（Molecular Probes）およびStableDAB（KPL）と共に用いることにより行った。細胞膜転座の同定は、アネキシンV、Alexa Fluor 594複合体（Molecular Probes）を用いたアネキシンV染色により行った。これらの染色手順はいずれも製造業者の指示に従って行った。酵母の染色を行う前に、文献（J. Cell Biol, 139, 729-734, 1997）の記載に従い、細胞壁をβ-glusulase（Roche）およびlyticase（Arthrobacteluteus sp., Sigma）を用いて処理した。
(6)  CIA1発現哺乳動物細胞の細胞死の解析
CIA1を発現した哺乳動物細胞を37(C、5%-CO2存在下で48時間培養し、特異的染色法（すなわちDAPIおよびTUNEL）を実施することにより、核・染色体DNAの分断化などのアポトーシスの特徴を調べた。結果は図１（DAPI染色：COS7細胞）、図２（TUNEL染色：COS7細胞）および図３（TUNEL染色：HeLa細胞）に示したとおりである。哺乳動物細胞はいずれの染色においても強い陽性を示し、広範囲の核分断化と染色体DNAの分断化が確認された。このことから、酵母蛋白質CIA1を哺乳動物細胞に発現させることによって、その細胞に自発的な細胞死（アポトーシス）をもたらす効果が確認された。また、酵母蛋白質CIA1をヒト癌細胞に発現させることで特異的な細胞死がもたらされたことから、この発明の制癌効果が検証された。
(7)  CIA1欠損酵母細胞の細胞死の解析
CIA1を欠損した出芽酵母細胞を30(Cで72時間培養し、特異的染色法（すなわちTUNELおよびアネキシンV）を実施し、DNA断片化や細胞膜転座などアポトーシス特徴を調べた。結果は図４（TUNEL染色）および図５（アネキシンV染色）に示したとおりである。CIA1を欠損した出芽酵母細胞はいずれの染色においても強い陽性を示し、広範囲のDNA分断化と細胞膜の転座が確認された。このことから、酵母蛋白質CIA1を酵母（真菌類）から欠損させることによって、その細胞に自発的な細胞死（哺乳類アポトーシスに類似した細胞死）をもたらす効果が確認された。
【００３５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、哺乳動物細胞の細胞死を促進する酵母因子が提供される。また、この因子を有効成分とする制癌剤等の細胞死促進薬剤が提供される。
【００３６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Japan Science and Technology Corporation
<120> Yeast factors that promote chromosome fragmentation
and mammalian apoptotic cell death
<130> NP01505-YS
<140>
<141>
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 840
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(840)
<300>
<302> Two new S-phase-specific genes from Saccharomyces
cerevisiae
<303> Yeast
<304> 13
<305> 11
<306> 1029-1042
<307> 1997
<313> 1 TO 840
<300>
<308> GenBank/L07593.1
<309> 1997-09-10
<400> 1
atg tca att gtt tca ctg tta ggc atc aaa gtc tta aac aac ccg gca   48
Met Ser Ile Val Ser Leu Leu Gly Ile Lys Val Leu Asn Asn Pro Ala
1               5                  10                  15
aag ttc act gat cca tat gag ttt gaa atc act ttt gaa tgc tta gaa   96
Lys Phe Thr Asp Pro Tyr Glu Phe Glu Ile Thr Phe Glu Cys Leu Glu
20                  25                  30
tct tta aaa cat gac tta gag tgg aaa cta acc tat gtt ggg tcc tct   144
Ser Leu Lys His Asp Leu Glu Trp Lys Leu Thr Tyr Val Gly Ser Ser
35                  40                  45
cgt tct cta gac cat gac cag gaa ttg gat tcc att ctg gta ggc ccc   192
Arg Ser Leu Asp His Asp Gln Glu Leu Asp Ser Ile Leu Val Gly Pro
50                  55                  60
gtt ccc gta ggt gtt aat aaa ttt gtg ttt tct gct gac cct ccc tcc   240
Val Pro Val Gly Val Asn Lys Phe Val Phe Ser Ala Asp Pro Pro Ser
65                  70                  75                  80
gcc gag ctg att cct gcg agt gaa ttg gtt agt gtg act gtt att cta   288
Ala Glu Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Val Ser Val Thr Val Ile Leu
85                  90                  95
tta agt tgt tct tat gac ggg aga gag ttt gtt agg gtc ggt tac tac   336
Leu Ser Cys Ser Tyr Asp Gly Arg Glu Phe Val Arg Val Gly Tyr Tyr
100                 105                 110
gtg aat aat gag tac gat gaa gaa gag tta aga gaa aat ccg cca gca   384
Val Asn Asn Glu Tyr Asp Glu Glu Glu Leu Arg Glu Asn Pro Pro Ala
115                 120                 125
aag gta caa gta gat cat att gta aga aat ata ctg gct gaa aag cca   432
Lys Val Gln Val Asp His Ile Val Arg Asn Ile Leu Ala Glu Lys Pro
130                 135                 140
agg gta aca agg ttt aac att gtt tgg gat aat gaa aat gaa ggg gat   480
Arg Val Thr Arg Phe Asn Ile Val Trp Asp Asn Glu Asn Glu Gly Asp
145                 150                 155                 160
tta tac cca cct gaa cag ccc ggc gta gat gat gaa gag gag gag gac   528
Leu Tyr Pro Pro Glu Gln Pro Gly Val Asp Asp Glu Glu Glu Glu Asp
165                 170                 175
gat gaa gaa gaa gat gac gat gaa gat gat gaa gac gac gaa gat gac   576
Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp
180                 185                 190
gat caa gaa gat gga gag gga gag gcg gaa gaa gcg gca gag gag gaa   624
Asp Gln Glu Asp Gly Glu Gly Glu Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu Glu
195                 200                 205
gaa gag gag gaa gag aag act gaa gac aac gaa acg aat ctt gaa gaa   672
Glu Glu Glu Glu Glu Lys Thr Glu Asp Asn Glu Thr Asn Leu Glu Glu
210                 215                 220
gag gag gaa gac ata gaa aat agt gac ggc gat gag gaa gaa gga gaa   720
Glu Glu Glu Asp Ile Glu Asn Ser Asp Gly Asp Glu Glu Glu Gly Glu
225                 230                 235                 240
gaa gag gtg ggg tct gta gac aag aat gaa gat ggt aat gat aag aag   768
Glu Glu Val Gly Ser Val Asp Lys Asn Glu Asp Gly Asn Asp Lys Lys
245                 250                 255
agg agg aaa ata gaa ggg ggg tcc acg gat att gaa tcc act cca aag   816
Arg Arg Lys Ile Glu Gly Gly Ser Thr Asp Ile Glu Ser Thr Pro Lys
260                 265                 270
gat gcg gca cgt tca acg aat taa                                   840
Asp Ala Ala Arg Ser Thr Asn
275                 280
<210> 2
<211> 279
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
Met Ser Ile Val Ser Leu Leu Gly Ile Lys Val Leu Asn Asn Pro Ala
1               5                  10                  15
Lys Phe Thr Asp Pro Tyr Glu Phe Glu Ile Thr Phe Glu Cys Leu Glu
20                  25                  30
Ser Leu Lys His Asp Leu Glu Trp Lys Leu Thr Tyr Val Gly Ser Ser
35                  40                  45
Arg Ser Leu Asp His Asp Gln Glu Leu Asp Ser Ile Leu Val Gly Pro
50                  55                  60
Val Pro Val Gly Val Asn Lys Phe Val Phe Ser Ala Asp Pro Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Glu Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Val Ser Val Thr Val Ile Leu
85                  90                  95
Leu Ser Cys Ser Tyr Asp Gly Arg Glu Phe Val Arg Val Gly Tyr Tyr
100                 105                 110
Val Asn Asn Glu Tyr Asp Glu Glu Glu Leu Arg Glu Asn Pro Pro Ala
115                 120                 125
Lys Val Gln Val Asp His Ile Val Arg Asn Ile Leu Ala Glu Lys Pro
130                 135                 140
Arg Val Thr Arg Phe Asn Ile Val Trp Asp Asn Glu Asn Glu Gly Asp
145                 150                 155                 160
Leu Tyr Pro Pro Glu Gln Pro Gly Val Asp Asp Glu Glu Glu Glu Asp
165                 170                 175
Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp
180                 185                 190
Asp Gln Glu Asp Gly Glu Gly Glu Ala Glu Glu Ala Ala Glu Glu Glu
195                 200                 205
Glu Glu Glu Glu Glu Lys Thr Glu Asp Asn Glu Thr Asn Leu Glu Glu
210                 215                 220
Glu Glu Glu Asp Ile Glu Asn Ser Asp Gly Asp Glu Glu Glu Gly Glu
225                 230                 235                 240
Glu Glu Val Gly Ser Val Asp Lys Asn Glu Asp Gly Asn Asp Lys Lys
245                 250                 255
Arg Arg Lys Ile Glu Gly Gly Ser Thr Asp Ile Glu Ser Thr Pro Lys
260                 265                 270
Asp Ala Ala Arg Ser Thr Asn
275
【図面の簡単な説明】
【図１】出芽酵母CIA1を発現した哺乳類細胞COS7（サル培養細胞）のDAPI染色像である。動物細胞導入用の蛋白質非結合ベクター（pSG-5）に組み込んだ出芽酵母蛋白質CIA1を培養後24時間のCOS7細胞（アカゲザル腎細胞）に導入し、37(C、5%-CO2存在下で48時間培養した細胞を核染色蛍光色素DAPIにより染色した。対照細胞としては遺伝子を含まないベクターを導入した細胞を用い、同様の染色を行なった。DAPI染色は細胞内のDNAを染色する法で、これにより細胞の核・染色体の形状が観察できる。その結果、上図に示すようにCIA1発現細胞では対照株（Control）に比べ明らかな染色体の分断が観察された。これは、アポトーシスと呼ばれる自発的な細胞死の特徴である。CIA1蛋白質は、哺乳類細胞の核・染色体を分断させるアポトーシス誘因活性を持つことがわかる。
【図２】出芽酵母CIA1を発現した哺乳類細胞COS7（サル培養細胞）のTUNEL染色像である。図1と同様に、酵母核内因子CIA1を発現したCOS7細胞を37(C、5%-CO2存在下で48時間培養し、2.5%グルタールアルデヒドで固定したのち2重鎖DNA断片を特異的に標識するTUNEL法により染色した。対照細胞は遺伝子を含まないベクターを導入したもので、CIA1発現細胞と同様の染色を行なった。TUNEL染色は、DNAの断裂部位を検出する染色方法で、染色体DNAが核内で分断しているかどうかが確認できる。その結果、左図に示すようにCIA1発現細胞では茶色（濃色）に標識された細胞が多く観察された。これは、細胞内で染色体DNAが分断化していることを示唆する現象であり、自発的細胞死（アポトーシス）の特徴の一つである。右図は対照細胞で、TUNEL染色を行ってもほとんど着色は観察されなかった。このようにCIA1発現培養細胞では染色体DNAの分断が特異的に起こったことから、CIA1蛋白質が、哺乳類細胞の染色体DNAを分断させるアポトーシス誘因活性を持つことがわかる。
【図３】出芽酵母CIA1を発現した哺乳類細胞HeLa（ヒト子宮頚部癌細胞）のTUNEL染色像である。図2と同様に、HeLa細胞に酵母核内因子CIA1を発現され37(C、5%-CO2存在下で48時間培養したのち、2.5%グルタールアルデヒドで固定してTUNEL法を行なった（左図）。右図は遺伝子を含まないベクターを導入した細胞を対照として、同様の染色を行なった結果である。TUNEL染色解析の結果、左図に示すようにCOS7細胞同様にCIA1発現HeLa細胞でも茶色（濃色）に標識された細胞が多く観察され、対照細胞ではほとんど見られなかった。このことから培養細胞の種類によらず、CIA1蛋白質は哺乳動物細胞においてアポトーシス誘因活性を持つことがわかる。
【図４】出芽酵母CIA1を欠損した出芽酵母細胞のTUNEL染色像である。酵母導入用のFlag-tag vector（pAK021）に組み込んだ酵母核内因子CIA1を出芽酵母W303-1aに発現させ、30(Cで72時間培養したのち2.5%グルタールアルデヒドで固定しTUNEL法により染色した（上図）。実験対照として、遺伝子を含まないベクターを導入し、同様の染色を行なった（下図）。その結果、CIA1発現出芽酵母では茶色（濃色）に標識された細胞が多く観察されたが、対照株ではそうした着色はほとんど見られなかった。CIA1蛋白質が存在しないと、出芽酵母の染色体DNAが分断することがわかる。このことからCIA1蛋白質は、出芽酵母においてアポトーシス様の細胞死を内在的に制御する活性を持っていることが示唆された。なお、下図に示す野生型株（CIA1遺伝子を欠損していない細胞）ではTUNEL染色で着色が認められなかったことから、染色体DNAは分断していないことが確認される。
【図５】出芽酵母CIA1を欠損した出芽酵母細胞のAnnexin V染色像である。図４と同様に、CIA1発現出芽酵母を30(Cで72時間培養し、2.5%グルタールアルデヒドで固定したのちAnnexin Vにより細胞膜反転の有無を検出した（上図）。下図には、遺伝子を含まないベクターを導入した株（対照株）を同様にAnnexin V染色した結果を示す。Annexin Vは、細胞膜の反転により露出するフォスファチジルセリンを特異的に染色する。このような細胞膜の反転は、アポトーシスの初期に見られる現象であり、細胞死が自発的であるかどうかを検出する指標となっている。出芽酵母CIA1遺伝子を欠損させた出芽酵母細胞の多くはAnnexin Vでリング様に細胞膜が縁取られ、細胞膜が反転した細胞が顕著に出現することが判明した。即ち、CIA1蛋白質は出芽酵母においてアポトーシス様の細胞死を内在的に制御する活性を持っていることが示唆される。なお、下図に示す野生型株（CIA1遺伝子を欠損していない細胞）では細胞膜は反転していないことが確認できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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