(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて受容基質に硫酸基を転移する方法。
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ硫酸転移酵素活性を有するタンパク質を用いて受容基質に硫酸基を転移する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃに特異的に作用するＧａｌ：→３′硫酸転移酵素（Ｇａｌ３ＳＴ−４）及びそれをコードするＤＮＡ等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
硫酸化は、種々の複合糖質におけるもっとも多様なグリカン鎖の修飾の一つである。硫酸化糖鎖は、粘膜防御系、硫酸化糖タンパク質の半減期の調節、細胞間の相互作用、糖タンパク質の生理機能などと関連しており、粘液糖タンパク質中の硫酸化グリカン率は、嚢胞性繊維症や結腸ガンにおいて変化する（FASEB J. 10, 1137-1146, 1996、Glycoproteins and Disease(Montreuil, J., Vliegenthart, J. F. G., and Schachter, H., eds), 351-393, Elisevier Science B. V., Amuterdam,1996、Trends Glycosci. Glycotechnol. 9, 379-398, 1997）。しかし、こうした諸現象における正確な分子機構や、種々の糖タンパク質における硫酸化の上記以外の意義については、未だ不明である。
【０００３】
Ｏ結合およびＮ結合したグリカンにおけるＳＯ3→３Ｇａｌ構造がチログロブリン（J. Biol. Chem. 263, 14351-14358, 1988、FEBS Lett. 241, 246-250, 1988、J. Biol. Chem. 266, 4237-4243, 1991）、胎便糖タンパク質（Eur. J. Biochem. 182, 139-152, 1989）、嚢胞性繊維症患者（Biochem. J. 275, 199-206, 1991、J. Biol. Chem. 269, 18794-18813, 1994、Carbohydr. Res. 295, 157-177, 1996）及び慢性気管支炎患者（Glycoconj. J. 14, 113-125, 1997）の呼吸器粘液糖タンパク質、卵巣嚢腺腫糖タンパク質（Biochemistry 31, 9126-9131, 1992）、LS174T-HM7結腸癌ムチン（J. Biol. Chem. 272, 31957-31968, 1997）、Ｔａｍｍ-Ｈｏｒｓｆａｌｌ糖タンパク質（Eur. J. Biochem. 256, 471-487, 1998）、スルホムチン（Glycobiology 8, 1237-1242, 1998）、卵管ムチン（Eur. J. Biochem. 266, 370-382, 1999）を含むさまざまな糖タンパク質において発見されている。こうした糖タンパク質における硫酸残基は、Ｇａｌβ1→３／４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ1→３ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌβ1→３Ｇａｌ構造のＣ−３′に結合している。ＳＯ3→３Ｇａｌ構造の分布は、硫酸化糖類の構造研究が困難なため、現在まで十分に解明されていない。しかし、糖タンパク質特異的βＧａｌ−３′硫酸転移酵素（Ｇａｌ3ＳＴ−２）遺伝子が、さまざまなヒト組織中のいたるところに発現しているため、硫酸化糖鎖は、広範囲に分布していると思われる（J. Biol. Chem. 276, 267-274, 2001）。
【０００４】
硫酸化糖類の生合成に関連して、現在までに２０種以上の硫酸転移酵素のｃＤＮＡがクローニングされている（Biochim. Biophys. Acta 1474, 115-127, 2000）。これらの硫酸転移酵素の中で、Ｇａｌ：→３硫酸転移酵素がガラクトースのＣ−３硫酸化を触媒しており、現在までに３種類のＧａｌ：→３硫酸転移酵素がクローニングされている。その一つはガラクトシルセラミド(ＧａｌＣｅｒ)、ラクトシルセラミド(ＬａｃＣｅｒ)、及びガラクトシルジアシルグリセロール(ＧａｌＤＧ)（J. Biochem. (Tokyo) 119, 421-427, 1996）を利用するグリコリピド特異的なセレブロシド硫酸転移酵素（ＣＳＴ又はＧａｌ3ＳＴ−１）（J. Biol. Chem. 272, 4864-4868, 1997）であり、二つ目はＧａｌβ1→３／４ＧｌｃＮＡｃのみならず、Ｇａｌβ1→３ＧａｌＮＡｃをも利用するＧＰ３ＳＴ又はＧａｌ３ＳＴ−２である（J. Biol. Chem. 276, 267-274, 2001）。三つめは、Ｇａｌβ1→４ＧｌｃＮＡｃを利用するＧａｌ３ＳＴ−３である（J.Biol. Chem. 2001(in press)）。３つの酵素のアミノ酸配列は約４０％が一致していることから、Ｇａｌ：→３硫酸転移酵素ファミリーの存在が示唆されている（J. Biol. Chem. 276, 267-274, 2001、J.Biol. Chem. 2001(in press)）。
【０００５】
Chandrasekaranらは、ヒトの各種組織において、組織依存的に２種の異なるＧａｌ：３−Ｏ−硫酸転移酵素（グループＡとＢ）が分布発生することを報告（Glycobiology 7, 753-768, 1997）している。グループＡの硫酸転移酵素は、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−アリル及び３−Ｏ−ＭｅＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→３）ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−Ｂｎを、適切な受容体として認識するが、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−アリル及びＧａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−アリルを認識しない。一方、グループＢの硫酸転移酵素は若干広い基質特異性を有している。Chandrasekaranらは、グループＡのＧａｌ：→３硫酸転移酵素が、乳癌、卵巣腫瘍数種類、転移性卵巣腫瘍数種類に対し優生であり、また乳癌における特異的活性は、正常乳組織における特異的活性より高いことを報告している（Glycobiology 7, 753-768, 1997）。それとは対照的に、Brockhausenらは、ヒト乳房上皮細胞株のＭＴＳＶ１−７におけるＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎの硫酸転移酵素活性は、３種の乳癌細胞株の同活性より高いことを報告（Eur. J. Biochem. 233, 607-617, 1995）している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、Ｏ−結合型硫酸化糖鎖の酵素合成を可能とし、硫酸化糖鎖の大量調製並びに複合糖質性医薬品及び機能性食品への応用が期待できるＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃに特異的に作用する新規なＧａｌ：→３′硫酸転移酵素や、かかる硫酸転移酵素の遺伝子を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究し、かかるＧａｌ：→３硫酸転移酵素ファミリーの新規メンバーをスクリーニングするために、Ｇａｌ3ＳＴ−１アミノ酸配列を用いてＥＳＴデータベースを調べ、Ｇａｌ：→３硫酸転移酵素の４番目のメンバーＧａｌ３ＳＴ−４を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて受容基質に硫酸基を転移する方法（請求項１）に関する。
【０００９】
また本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ硫酸転移酵素活性を有するタンパク質を用いて受容基質に硫酸基を転移する方法（請求項２）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の硫酸転移酵素として使用する方法の対象となるタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃに特異的に作用するＧａｌ：→３′硫酸転移酵素；Ｇａｌ３ＳＴ−４）や、該配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ硫酸転移酵素活性を有するタンパク質を挙げることができる。また、上記硫酸転移酵素活性としては、好ましくはガラクトースのＣ−３硫酸化を触媒する酵素活性、より好ましくはＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃに特異的に作用する酵素活性を挙げることができる。なお、本発明のタンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来はヒトに限定されるものではない。
【００１２】
本発明の硫酸転移酵素遺伝子として使用する方法の対象となるＤＮＡとしては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｇａｌ３ＳＴ−４）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ硫酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡや、かかるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ硫酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを例示することができる。
【００１３】
これらＤＮＡは、そのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒト遺伝子ライブラリーやヒトｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができる。また、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種癌細胞由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、Ｇａｌ３ＳＴ−４遺伝子と同効な目的とする硫酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１４】
本発明の融合タンパク質としては、上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したＧａｌ３ＳＴ−４等の精製や、当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１５】
本発明の抗硫酸転移酵素抗体として使用する方法におけるタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記Ｇａｌ３ＳＴ−４等のタンパク質又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、生体内における硫酸転移酵素の作用機序を明らかにする上で有用である。
【００１６】
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のタンパク質若しくはエピトープを含むその断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００１７】
本発明のタンパク質に対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本発明のタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本発明のタンパク質やその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、硫酸化糖類を指標とした癌の診断や治療に使用できる可能性がある。
【００１８】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質の機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００１９】
本発明はまた、上記本発明のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞を硫酸転移酵素発現用として使用する方法に関する。かかる本発明のタンパク質をコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００２０】
また、発現系としては、上記本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２１】
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる本発明のタンパク質は、後述するように有用物質のスクリーニングに用いることができる。上記細胞膜を得る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いることができる。また、かかる本発明のタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本発明のタンパク質を得ることができる。上記本発明のタンパク質の精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００２２】
本発明の硫酸転移酵素欠損モデル動物として使用する方法において、上記本発明のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本発明のタンパク質を発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、本発明の硫酸転移酵素過剰発現モデル動物として使用する方法において、タンパク質を過剰発現する非ヒト動物としては、野生型非ヒト動物に比べてかかる本発明のタンパク質を大量に産生する非ヒト動物を具体的に提示することができる。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本発明のタンパク質欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本発明のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本発明のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、Ｇａｌ３ＳＴ−４ノックアウトマウスやＧａｌ３ＳＴ−４トランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００２４】
例えば、ＧＡＬ３ＳＴ−４タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＧＡＬ３ＳＴ−４ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ヒトＧＡＬ３ＳＴ−４と相同性を有するマウスＧＡＬ３ＳＴ−４をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたマウスＧＡＬ３ＳＴ−４をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンのマウスＧＡＬ３ＳＴ−４をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
【００２５】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のＧＡＬ３ＳＴ−４ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＧＡＬ３ＳＴ−４ノックアウトマウスにＧＡＬ３ＳＴ−４発現能が欠失しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＧＡＬ３ＳＴ−４の発現をウエスタンブロット法等により直接調べる方法がある。
【００２６】
ＧＡＬ３ＳＴ−４のトランスジェニックマウスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等に由来するＧＡＬ３ＳＴ−４をコードするｃＤＮＡに、チキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したＧＡＬ３ＳＴ−４をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００２７】
また、上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ、本発明のタンパク質、本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質、本発明のタンパク質に対する抗体、本発明のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞等は、硫酸転移酵素活性促進又は抑制物質のスクリーニングに用いることができる。硫酸転移酵素活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、例えば、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を発現している細胞膜と、被検物質とを用いる方法や、前記本発明のタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本発明のタンパク質のノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等を挙げることができる。また、上記本発明のタンパク質を発現している細胞と被検物質とを用いる方法や、本発明のタンパク質のノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と被検物質とを用いる方法等は、本発明のタンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法に用いることができる。
【００２８】
上記本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を発現している細胞膜と被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本発明のタンパク質又は細胞膜表面に発現している本発明のタンパク質と、被検物質とを接触せしめ、該本発明のタンパク質の硫酸転移酵素活性を測定・評価する方法を具体的に挙げることができる。また、本発明のタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本発明のタンパク質を発現している細胞と被検物質とを接触せしめ、該本発明のタンパク質の硫酸転移酵素活性や本発明のタンパク質の発現量の変化を測定・評価する方法を具体的に挙げることができる。
【００２９】
前記本発明のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本発明のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物と、被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、これら非ヒト動物から得られる細胞又は組織と、被検物質とをインビトロで接触せしめ、該本発明のタンパク質の硫酸転移酵素活性や本発明のタンパク質の発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本発明のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本発明のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる細胞又は組織における該本発明のタンパク質の硫酸転移酵素活性や本発明のタンパク質の発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本発明のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本発明のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物における該本発明のタンパク質の硫酸転移酵素活性や本発明のタンパク質の発現量の変化を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができる。
【００３０】
上記スクリーニング方法により得られる硫酸転移酵素活性促進物質や発現促進物質は、硫酸転移酵素活性の促進や本発明のタンパク質の発現の促進を必要としている患者の治療等に用いることができる。また、上記スクリーニング方法により得られる本発明の硫酸転移酵素活性抑制物質や発現抑制物質は、硫酸転移酵素活性の抑制や本発明のタンパク質の発現の抑制を必要としている患者の治療等に用いることができる。
【００３１】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部は、硫酸化糖類を指標としうる癌の診断用プローブとすることができ、また、この癌の診断用プローブや本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いると、嚢胞性繊維症、慢性気管支炎、卵巣嚢腺、結腸癌等の疾病を診断しうる可能性がある。上記診断用プローブとしては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましい。かかる検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、かかる検体を使用する場合、ＰＣＲ等により増幅したものを用いてもよい。
【００３２】
【実施例】
以下に、実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例Ａ［材料と方法］
Ａ−１（材料）
３'−ホスホアデノシン−５'−ホスホ［35Ｓ］硫酸（ＰＡＰＳ、９６．９ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）及びＵＤＰ−［3Ｈ］Ｇａｌ［４，５−3Ｈ（Ｎ），１１１０ＧＢｑ／ｍｍｏｌ］は、NEN Life Science Products,Inc.から購入した。Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐ−ニトロフェニール（ｐＮＰ）、Ｎ−アセチルラクトサミン（タイプ２）、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ、及びＧａｌβ１→３（ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐＮＰ（コア２−Ｏ−ｐＮＰ）は、フナコシ（株）から購入した。ラクト−Ｎ−ビオースＩ（タイプ１）、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ベンジル（Ｂｎ）、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｏ−Ｂｎ、ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ウシ脳由来のガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）、ウシ由来のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）、及び全小麦粒由来のガラクトシルジアシルグリセロール（ＧａｌＤＧ）は、Sigma Chemical Co.から購入した。ストレプトコッカス６６４６Ｋ由来のβ−ガラクトシダーゼは、生化学工業から購入した。ＲＣＡ（Ricinus communis agglutinin）−Ｉ−アガロース（４ｍｇ／ｍｌゲル）は、豊年製油会社から購入した。ＰＮＡ（Peanuts agglutinin）−アガロース（４．５ｍｇ／ｍｌゲル）は、E-Y Laboratories,Inc.から購入した。ＰＶＬ（Psathyrella velutina lectin）を所定の方法（J. Biol. Chem. 264, 173-177, 1989）により調製し、製造者プロトコルにしたがって、レクチンをＣＮＢｒ−活性セファロース4Ｂ（Pharmacia）と結合させた。
【００３３】
Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃは、ヒト母乳から単離した（Methods Enzymol. 28, 262-271, 1972）。また、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３（６）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃは、ＧM1−ガングリオシド蓄積症患者の尿から採取した（J. Biol. Chem. 256, 4789-4798, 1981）。Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃは、ヒドラジン分解−再アセチル化処理及び弱酸性加水分解により、卵黄ＳＧＰ（Biochim. Biophys. Acta 1335, 23-32, 1997）から調製した。
【００３４】
ＳＯ3→３Ｇａｌβ１→３（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃα１-Ｏ-Ｂｎは、日本免疫研究所（高崎）の矢澤博士から提供された（Clin. Exp. Metastasis 18, 37-43, 2000）。硫酸化オリゴ糖を、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）-１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2−中で、ストレプトコッカス６６４６Ｋ由来のβ-ガラクトシダーゼ(１０ｍＵ)とタチナタマメβ-Ｎ-アセチルヘキソサミニダーゼ(３Ｕ)を用いて分解した。分解物はＲＣＡ-Ｉ-アガロースカラム（１．５×２．８ｃｍ）に通し、通過画分はさらにPVLセファロースカラム（１．５×２．８ｃｍ、４．５ｍｇ／ｍｌゲル）に通した。通過物であるＳＯ3→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１-Ｏ-Ｂｎを、Ｓｅｐ-Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（Walters）で脱塩し、真正の化合物として使用した。
【００３５】
Ａ−２（Ｇａｌ３ＳＴ−４のｃＤＮＡクローニング）
ヒトＧａｌ３ＳＴ−１（J. Biol. Chem. 272, 4864-4868, 1997）のアミノ酸配列に基づいて、National Center for Biotechnology Information（National Institutes of Health、Bethesda, MD）のＥＳＴデータベースと高い相同性を示す１つの配列（Genbank アクセッション番号AW961058）を見い出した。Gene Trapper cDNA Positive Selection Systemを、製造者の指示通りに使用してｃＤＮＡクローンを得た。簡単に説明すると、５'−ＧＣＣＣＴＡＧＣＧＡＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡ−３'（１４４０−１４６３に相当するヌクレオチド配列；図１参照）で示されるオリゴヌクレオチドをビオチン化してプローブとして用いた。精巣ｃＤＮＡを、真核発現ベクターＰＣＭＶ−ＳＰＯＲＴにクローンしたSuperScript ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（Life Technologies）を、ＧｅｎｅII及びエキソヌクレアーゼIII分解により、一本鎖に分解した。この一本鎖ｃＤＮＡをビオチン化したプローブでハイブリダイズし、標的ｃＤＮＡを、ストレプトアビジン結合パラマグネティックビーズで捕捉した。この標的ｃＤＮＡを遊離させ、再び二本鎖にしてから、ＤＨ５α細胞に形質転換した。６０個のコロニー中、１個のコロニーが、Ｇａｌ３ＳＴ−４のｃＤＮＡを有していた。ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴに含まれるこのＧａｌ３ＳＴ−４のｃＤＮＡを、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−Ｇａｌ３ＳＴ−４と命名し、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(PE Biosystems）を用いて配列決定した。
【００３６】
Ａ−３（ＣＯＳ−７細胞におけるＧａｌ３ＳＴ−４の発現）
LIPOFECTIN Reagent（Life Technologies）を指示通りに使用して、３５ｍｍディッシュ上のＣＯＳ−７細胞に、上記プラスミド（１μｇ）をトランスフェクトした。４８時間後に該細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）−０．２５Ｍスクロース中で、ディッシュから剥離し、ホモジナイズした。このホモジナイズした細胞を、１００，０００×ｇで１時間、超遠心分離にかけた。沈殿した無処理の膜を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）において懸濁し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００３７】
Ａ−４（硫酸転移酵素活性分析）
０．１Ｍのカコジル酸塩ナトリウム（ｐＨ６．３）、１０ｍＭのＭｎＣｌ2、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．１ＭのＮａＦ、２ｍＭのＡＴＰ−Ｎａ2、６．５μＭの［35Ｓ］ＰＡＰＳ（２．８×１０5ｄｐｍ）、１ｍＭのＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐＮＰ、及び適当に希釈した上記無処理の膜画分から成る反応液２０μｌを３７℃で１時間インキュベートした。この［35Ｓ］で標識した産物を、ペーパー電気泳動（ピリジン／酢酸／水＝３：１：３８７、ｐＨ５．４）により精製した。［35Ｓ］硫酸化Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐＮＰ及びＰＡＰＳのＲｆ価は、ブロモフェノールブルーのＲｆ価を１．０とした場合、それぞれ０．６９及び１．８９である。水抽出後、放射能測定を行った。糖脂質を受容基質として使用した場合には、カワノ他（Anal. Biochem. 182, 9-15, 1989）が報告している手法により、［35Ｓ］で標識された産物を検出した。
【００３８】
Ａ−５（［35Ｓ］標識産物の同定）
上記［35Ｓ］で標識した産物を、過ヨウ素酸酸化した（Methods Enzymol. 8, 26-52, 1966）。標識したオリゴ糖を、２０μｌの７５ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム−７５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）に溶かし、４℃で２４時間、暗所でインキュベートした。余分な過ヨウ素酸塩は、２μｌの２０％エチレングリコールを加えて処理した。室温で１時間後、０．１Ｍ水素化ホウ素ナトリウムを含む３００μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）を加え、室温で１時間静置した。酢酸を加えて該溶液を酸性化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ+ｆｏｒｍ）のカラム（０．５×３ｃｍ）に通した。この溶出液を乾固させ、メタノールを用いて、繰り返し乾固させることで残留ホウ酸を除去した。この残留物を、１００μｌの０．０５ＮＨ2ＳＯ4を用い、８０℃で１時間、加水分解した。ＮａＯＨで中和した混合物を、ろ紙電気泳動にかけた。［35Ｓ］で標識された産物を水抽出し、薄層プレート（Kieselgel 60F254, Merck, ）上にアプライし、ピリジン／エチルアセテート／酢酸／水＝５：５：１：３、又は１−ブタノール／エタノール／水＝４：１：１の溶媒で展開した。このときの放射能を、放射クロマトグラムスキャナーでモニターした。
【００３９】
過ヨウ素酸酸化におけるポジティブコントロールとして、［3Ｈ］Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎを以下の方法で調製した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭのＭｎＣｌ2、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、５ｍＭのＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎ、２．５μＭのＵＤＰ−［3Ｈ］Ｇａｌ（３．３×１０6ｄｐｍ）、２５０μＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ、及びブタ結腸粘膜から得た粗膜画分を含む２０μｌの溶液を、３７℃で１時間インキュベートした。上記反応液をろ紙電気泳動にかけた後、中性画分をさらにピリジン／エチルアセテート／酢酸／水＝５：５：１：３に調整した溶媒でペーパークロマトグラフィーにかけた。Ｒｆ値が０．７２である放射性画分（［3Ｈ］Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎ）を水抽出した。ＰＮＡは、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ構造を特異的に認識することから、［3Ｈ］Ｇａｌ残基の結合位置は、そのＰＮＡ−アガロースカラムへの結合性によって確認した（J. Biol. Chem. 250, 8518-8523, 1975）。以前に報告した手法（Glycobiology 10, 919-929, 2000）により、ヒトＧｌｃＮＡｃ：→６硫酸転移酵素を用いて、６−［35Ｓ］ｓｕｌｆｏ−ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｏ−Ｂｎ合成を行った。
【００４０】
Ａ−６（Ｇａｌ３ＳＴ−４によるアシアロフェツイン（asialofetuin）の［35Ｓ］硫酸化）
アシアロフェツイン（Sigma社製）４０μｇを、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐＮＰを含まない上述の酵素反応溶液に溶かし、３７℃で１６時間インキュベートした。反応物の半分を、５０μｌの１Ｍ ＮａＢＨ4−０．０５Ｎ ＮａＯＨで、３７℃で２４時間弱アルカリ化処理した。酢酸で酸性化した後、上記溶液を、ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８カラムに通し、溶出液を上述の手法により、蒸散させた。残りの半分を、グリコペプチダーゼＦＤｅ−Ｎ−グリコシル化セット（宝酒造）を用い、Ｎ−グリカナーゼ分解した。遊離の［35Ｓ］で標識したオリゴ糖をろ紙電気泳動により分析した。
【００４１】
Ａ−７（ノーザンブロット分析）
ノーザンブロット分析には、Human Multiple Tissue Northern Blot Membrane（CLONTECH）を製造者の指示に従って使用した。ノーザンブロットメンブレンの各列におけるｍＲＮＡ量を、β−アクチンのｍＲＮＡ発現レベルでノーマライズした。製造者のマニュアルに従い、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ Life Science Products Inc.）を用い、Random Primed DNA Labeling Kit（Roche Dignostics GmbH）により、ｃＤＮＡ断片（1-1423；図1A参照）から、［32Ｐ］で標識したプローブを調製した。上記メンブレンを、ExpressHyb Solution（CLONTECH）中で、６８℃で２時間プレハイブリダイズし、次に、同じ溶液中で、［32Ｐ］で標識したプローブと共に６８℃で１６時間ハイブリダイズした。このノーザンブロットメンブレンを、室温の２×ＳＳＣ−０．０５％ＳＤＳで洗浄し、続いて５０℃の０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで洗浄した。ＦＬＡ−２０００（富士フィルム）で放射線を測定した。
【００４２】
実施例Ｂ［結果］
Ｂ−１（ヒトＧａｌ３ＳＴ−１の相同ｃＤＮＡ分子のクローニング）
本発明者らは、ＥＳＴデータベースの中に、ヒトＧａｌ３ＳＴ−１配列（J. Biol. Chem. 272, 4864-4868, 1997）と類似した短い配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＷ９６１０５８）を見い出した。また、ＥＳＴにその配列が存在する２４塩基長のセンスオリゴヌクレオチドを調製し、Gene TrapperのｃＤＮＡの陽性選択系のプローブとして用い、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１個のクローンを得て、その塩基配列を決定した（図１）。その結果、２４６０ｂｐのｃＤＮＡには、２３６ｂｐの５'非翻訳領域、１４５８ｂｐの１本のオープンリーディングフレーム、及び３'側にポリ（Ａ）＋尾部を含む７６６ｂｐの非翻訳領域が存在していた。また、Kozakの法則（J. Cell. Biol. 108, 229-241, 1989）による翻訳開始部位、及びその上流領域には、インフレームストップコドンが存在していた。このオープンリーディングフレームから、１個のＮ−結合型（N-linked）グリコシル化部位の可能性がある分子量５４，１７３Ｄａの４８６アミノ酸残基のタンパク質が想定された。
【００４３】
上記想定されるアミノ酸配列のヒドロパシープロット分析を行ったところ、Ｎ末端領域に、長さが２２アミノ酸残基である１個の明らかな疎水性セグメントが見い出された。このことから、このタンパク質が、膜貫通II型のトポロジーを備えていることが推定できた（図２Ａ）。このｃＤＮＡ配列を、ヒトゲノムプロジェクトデータベースと比較し、そのゲノム組織及び染色体の局在性を明らかにした（図２Ｂ）。この遺伝子は、ヒト染色体７ｑ２２に、少なくとも４つのエクソンと１０ｋｂのスパン（spans）を含んでいる。このイントロン／エクソン結合は、ＧＴ／ＡＧルールに則っている（Annu. Rev. Biochem. 50, 349-383, 1981）。
この遺伝子のコード領域は、３つのエクソン（エクソン２、３、及び４）にあり、２つのイントロンが、上記ｃＤＮＡの３６１塩基と３６２塩基の間（Arg４２のところ）、並びに６６５塩基と６６６塩基の間（Glu１４３とVal１４４の間）にそれぞれ挿入されていた（図１）。
【００４４】
Ｇａｌ３ＳＴ−４と命名された上記のタンパク質のアミノ酸配列は、ヒトＧａｌ３ＳＴ−１（J. Biol. Chem. 272, 4864-4868, 1997）、ヒトＧａｌ３ＳＴ−２（J. Biol. Chem. 276, 267-274, 2001）及びヒトＧａｌ３ＳＴ−３(J.Biol. Chem. 2001(in press))と、それぞれ３３％、３９％、及び３０％一致していた（図３）。これらのタンパク質群には高度に保存された２つの領域（図３、下線及び二重線）があり、該２つの領域には推定上のＰＡＰＳ結合モチーフがあり（Trends Biochem. Sci. 23, 129-130, 1998）、このモチーフは、今までにクローンされた全ての硫酸転移酵素に共通して保存されている（Biochim. Biophys. Acta 1474, 115-127, 2000）。その他、Ｃ末端ドメインには比較的保存された領域が存在していた（図３、Ｇａｌ３ＳＴ−４の２９９−３１４及び３５８−３７４）。Ｇａｌ３ＳＴ−４のｃＤＮＡと相同な他の配列を検索すると、長さが２１７６ｂｐで、Ｇａｌ３ＳＴ−４のｃＤＮＡの完全長オープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡクローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー ＡＫ０２２１７８）を１個見い出した。
【００４５】
Ｂ−２（本発明のＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ：→３'硫酸転移酵素の特徴）
本発明の硫酸転移酵素をＣＯＳ−７細胞で発現させ、粗製膜画分を酵素源として調製した。Ｇａｌ３ＳＴ−４のｃＤＮＡを含有するｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴベクターであるｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−Ｇａｌ３ＳＴ−４をトランスフェクトした細胞の膜画分は、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎをアクセプターとして硫酸転移酵素活性（５．６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質）を示した。ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴのトランスフェクタント由来の膜画分、及び野生型は、共に硫酸転移酵素活性を示さなかった。［35Ｓ］硫酸化産物である［35Ｓ］ＳＯ3―→（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎ）を、ろ紙電気泳動にかけ精製したところ、６６４６Ｋβ−ガラクトシダーゼによる分解に耐性を示し、ＲＣＡ−Ｉ−アガロースカラムを通過した。標準Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎが、ＲＣＡ−Ｉアガロースカラムに滞留した結果から、硫酸がガラクトース残基に転移されたことが示された。電気泳動における［35Ｓ］硫酸化産物の泳動位置は、標準［35Ｓ］ＳＯ3→６ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎの泳動位置と近いことから、この産物が、一硫化二糖（monosulfated  disaccharide）であることが示された。［35Ｓ］硫酸残基の結合位置を決定するために、かかる［35Ｓ］硫酸化産物を、過ヨウ素酸酸化した。
【００４６】
［3Ｈ］Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎについても酸化して、反応のポジティブコントロールとした。１−ブタノール／エタノール／水＝４：１：１で構成される溶媒系で展開したＴＬＣで分離したところ、［3Ｈ］Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎ及び上記の酸化産物は、Ｒｆ価がそれぞれ０．４５及び０．５６の位置に移動した。ガラクトースが、Ｃ−４及び５の位置における環状プロトン上で［3Ｈ］により標識されているので、後者（酸性化産物）は、理論的には［3Ｈ］グリセロールである。この結果は、酸化反応が十分進行していることを示していた。
【００４７】
［35Ｓ］ＳＯ3→（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎ）から得た反応産物をろ紙電気泳動にかけた（図４Ａ）。この反応産物は、無処理の［35Ｓ］で標識した産物と同位置に移動した。［35Ｓ］硫酸が、ガラクトース残基のＣ−２、Ｃ−４若しくはＣ−６位置、又はＮ−アセチルガラクトサミン残基に転移された場合には、過ヨウ素酸酸化の結果、ＣＨ2ＯＨ−ＣＨ（ＯＳＯ3―）−ＣＨ2ＯＨ，ＣＨ2ＯＨ−ＣＨ（ＯＳＯ3―）−ＣＨＯＨ−ＣＨ2ＯＨ，ＣＨ2ＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨ2（ＯＳＯ3―）、又はＳＯ3―→ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎがそれぞれ産生される。［35Ｓ］ＳＯ3―→６ＧａｌＮＡｃβ１−Ｏ−Ｂｎ及びその過ヨウ素酸酸化、並びに還元産物である［35Ｓ］ＳＯ3―−ＯＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2ＯＨは、ろ紙電気泳動において、［35Ｓ］ＳＯ3―→（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎ）より速く移動した（図４Ａ）。この結果から、［35Ｓ］硫酸は、ＧａｌＮＡｃ残基、又はＧａｌのＣ−２、４若しくは６位には結合せず、ＧａｌのＣ−３位置に結合することがわかった。
【００４８】
さらに、上記反応産物を、別の溶媒系を用いてＴＬＣにかけた（図４Ｂ及びＣ）。この反応産物の構造を、標準ＳＯ3―→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎと共にＴＬＣによりさらに確認した（図４Ｄ）。この反応産物は、標準オリゴ糖及び過ヨウ素酸酸化したオリゴ糖と同じ位置まで展開された。この結果は、［35Ｓ］硫酸がＧａｌ残基のＣ−３位置に結合し、ここでクローンされた酵素がＧａｌ３：→３硫酸転移酵素であることを示している。
【００４９】
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐＮＰを受容基質に用いたとき、この酵素の至適ｐＨは６〜７であった（図５）。この酵素の活性は、ＭｎＣｌ2存在下においては、約２．２倍に増加した（表１）。ＥＤＴＡは、かかる活性に何ら影響を及ぼさないことから、Ｇａｌ３ＳＴ−４は、本質的に二価陽イオンを必要としないと考えられる。ＭｎＣｌ2存在下においてこれらのアッセイを行ったときには、上記活性に対するＮＥＭ及びＤＴＴの阻害効果は小さかった。
【００５０】
【表１】
0003794935.tif 000002
【００５１】
表２にＧａｌ３ＳＴ−４のアクセプター基質特異性を示す。Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ構造を有する、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１―Ｏ―ｐＮＰ、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｂｎ、及びコア２−Ｏ−ｐＮＰオリゴ糖は、何れもＧａｌ３ＳＴ−４に対する基質として適していた。対照的に、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ（１型）、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ（２型）、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃOH及びＧａｌＣｅｒは基質としての性質に乏しい。これらの結果から、Ｇａｌ３ＳＴ−４は、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃピラノシド構造に対し、高い特異性を示すことが示唆された。Ｇａｌ３ＳＴ−４の特異性は、ＧａｌＣｅｒ、Ｇａｌβ１→３／４ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃをそれぞれ適した基質として認識するＧａｌ３ＳＴ−１、Ｇａｌ３ＳＴ−２及びＧａｌ３ＳＴ−３の特異性とは大きく異なっていた（J. Biol. Chem. 276, 267-274, 2001、J. Biochem. (Tokyo) 119, 421-427, 1996、J.Biol. Chem. 2001(in press)）。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
高濃度のアクセプター基質によって、Ｇａｌ３ＳＴ−４活性は阻害される（図６）。Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐＮＰ（●）及びコア２−Ｏ−ｐＮＰ（○）の活性はそれぞれ、１．５及び１ｍＭで最大となり、それぞれ３及び１．５ｍＭを越えると顕著に減少した。２種の基質の低い方の濃度で得たデータだけを使って測定したＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐＮＰ及びコア２−Ｏ−ｐＮＰのＫｍ値は、それぞれ０．２４及び０．２３ｍＭであった（表３）。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
Ｂ−３（Ｇａｌ３ＳＴ−４によるアシアロフェツインへの［35Ｓ］硫酸の取込み）
二本鎖、三本鎖のＮ−グリカン及びＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃから成るＯ−グリカンを有するアシアロフェツインにおけるＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃに対し、Ｇａｌ３ＳＴ−４が特異的に硫酸を付加できるかどうかを調べた（J. Biol. Chem. 262, 16135-16141, 1987、J. Biol. Chem. 263, 18253-18268, 1988）。アシアロフェツインをＧａｌ３ＳＴ−４と共にインキュベートしてから、［35Ｓ］硫酸化産物の内半分を弱アルカリ処理することにより、Ｏ−グリカンを特異的に分離し、残り半分の産物はＮ−グリカナーゼにより分解した。表４に示すように、［35Ｓ］硫酸化オリゴ糖は、Ｎ−グリカナーゼによる分解によってではなく、アルカリ処理により分離した。これらの結果は、Ｇａｌ３ＳＴ−４がＯ−グリカンのＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ残基に対し特異的に作用することを示している。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
Ｂ−４（ノーザンブロット分析）
多種多様なヒトの組織の中でも、２．５ｋｂのＧａｌ３ＳＴ−４のｍＲＮＡは、胎盤、胸腺、精巣、卵巣、脊髄、気管及び副腎において高度に発現し、脳、肺、脾臓、前立腺、小腸、結腸、胃、甲状腺及びリンパ節における発現は中程度だった（図７）。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によると、Ｏ−結合型硫酸化糖鎖の酵素合成を可能とし、硫化糖鎖の大量調製並びに複合糖質性医薬品及び機能性食品への応用が期待できるＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃに特異的に作用する新規なＧａｌ：→３′硫酸転移酵素や、かかる硫酸転移酵素の遺伝子を提供することができる。
【００５９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION
<120> Novel sulfotransferase and its gene
<130> A031P79
<140>
<141>
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 2460
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (237)..(1694)
<400> 1
ggcgggaggg cccggcccga tttcccttgc tgctcccctt gtggcctgac gctgacagag 60
gcaaaaatct gctaactcag ggggcagact caaccaagac tgtgagcagg cctggggaat 120
gaccccccga tctccaacca gtgccttccg cagctgcacg gctgtctcca gctgtctctg 180
cccctcttcc tggccctggc tccatctctc tgtcacctca cccttccctg tgccac atg 239
Met
1
ggc cct ctc tct cct gcc agg acg ctg cgg ctc tgg gga cct cgg agc   287
Gly Pro Leu Ser Pro Ala Arg Thr Leu Arg Leu Trp Gly Pro Arg Ser
5                  10                  15
ctg ggg gtg gct ctg gga gtc ttc atg acc att ggc ttt gca ctc cag   335
Leu Gly Val Ala Leu Gly Val Phe Met Thr Ile Gly Phe Ala Leu Gln
20                  25                  30
ctc ttg gga ggg ccc ttc cag agg agg cta cct ggg cta cag ctc cga   383
Leu Leu Gly Gly Pro Phe Gln Arg Arg Leu Pro Gly Leu Gln Leu Arg
35                  40                  45
cag ccc tcg gcc cca tcc cta cga cca gcc ctt ccg tcc tgc cca ccc   431
Gln Pro Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Leu Pro Ser Cys Pro Pro
50                  55                  60                  65
cgg cag cga ctg gtg ttc ctg aag aca cat aaa tcc ggg agc agc tct   479
Arg Gln Arg Leu Val Phe Leu Lys Thr His Lys Ser Gly Ser Ser Ser
70                  75                  80
gtg ctg agc ctg ctt cac cgc tat ggg gac cag cac ggg ctg cgc ttc   527
Val Leu Ser Leu Leu His Arg Tyr Gly Asp Gln His Gly Leu Arg Phe
85                  90                  95
gcc ctc cct gcc cgc tac cag ttt ggc tac cca aag ctc ttc cag gcc   575
Ala Leu Pro Ala Arg Tyr Gln Phe Gly Tyr Pro Lys Leu Phe Gln Ala
100                 105                 110
tct agg gta aaa ggc tac cgc cca cag ggt gga ggc acc cag ctc ccc   623
Ser Arg Val Lys Gly Tyr Arg Pro Gln Gly Gly Gly Thr Gln Leu Pro
115                 120                 125
ttc cac atc ctc tgt cac cac atg agg ttc aac ctg aaa gag gta ctt   671
Phe His Ile Leu Cys His His Met Arg Phe Asn Leu Lys Glu Val Leu
130                 135                 140                 145
cag gtc atg cct tct gac agc ttc ttt ttt tcc att gtc cga gac cca   719
Gln Val Met Pro Ser Asp Ser Phe Phe Phe Ser Ile Val Arg Asp Pro
150                 155                 160
gcg gct ctg gct cgc tct gcc ttc tcc tac tat aaa tcc acc tca tca   767
Ala Ala Leu Ala Arg Ser Ala Phe Ser Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Ser
165                 170                 175
gcc ttc cgc aag tca cca tct ttg gct gcc ttc ctg gcc aat cct cga   815
Ala Phe Arg Lys Ser Pro Ser Leu Ala Ala Phe Leu Ala Asn Pro Arg
180                 185                 190
ggc ttc tac agg cct ggg gcc cgt ggg gac cac tac gct cgc aac tta   863
Gly Phe Tyr Arg Pro Gly Ala Arg Gly Asp His Tyr Ala Arg Asn Leu
195                 200                 205
cta tgg ttt gac ttt ggc ctg ccc ttt ccc cca gag aag agg gcc aag   911
Leu Trp Phe Asp Phe Gly Leu Pro Phe Pro Pro Glu Lys Arg Ala Lys
210                 215                 220                 225
aga ggg aat att cat ccc ccc aga gac ccc aac ccc cca cag ctg cag   959
Arg Gly Asn Ile His Pro Pro Arg Asp Pro Asn Pro Pro Gln Leu Gln
230                 235                 240
gtc ttg cct tct ggt gct ggc cct cga gcc caa acc ctc aat ccc aat   1007
Val Leu Pro Ser Gly Ala Gly Pro Arg Ala Gln Thr Leu Asn Pro Asn
245                 250                 255
gcc ctc atc cat cct gtt tcc act gtt act gat cat cgc agc cag ata   1055
Ala Leu Ile His Pro Val Ser Thr Val Thr Asp His Arg Ser Gln Ile
260                 265                 270
tca agc cct gcc tct ttc gat ttg ggg tct tca tcc ttc atc cag tgg   1103
Ser Ser Pro Ala Ser Phe Asp Leu Gly Ser Ser Ser Phe Ile Gln Trp
275                 280                 285
ggt ctg gca tgg ctg gac tct gtc ttt gac ctg gtc atg gtg gct gag   1151
Gly Leu Ala Trp Leu Asp Ser Val Phe Asp Leu Val Met Val Ala Glu
290                 295                 300                 305
tac ttc gat gag tca ttg gtt ctg ctg gca gat gcc ctg tgc tgg ggt   1199
Tyr Phe Asp Glu Ser Leu Val Leu Leu Ala Asp Ala Leu Cys Trp Gly
310                 315                 320
cta gat gac gtg gtg ggc ttc atg cac aat gcc cag gct gga cat aag   1247
Leu Asp Asp Val Val Gly Phe Met His Asn Ala Gln Ala Gly His Lys
325                 330                 335
cag ggc ctc agc act gtc agc aac agt gga ctg act gcg gag gac cgg   1295
Gln Gly Leu Ser Thr Val Ser Asn Ser Gly Leu Thr Ala Glu Asp Arg
340                 345                 350
cag ctg act gca cgg gcc cga gcc tgg aac aac ctg gac tgg gct ctc   1343
Gln Leu Thr Ala Arg Ala Arg Ala Trp Asn Asn Leu Asp Trp Ala Leu
355                 360                 365
tat gtc cac ttc aac cgc agt ctc tgg gca cgg ata gag aaa tac ggc   1391
Tyr Val His Phe Asn Arg Ser Leu Trp Ala Arg Ile Glu Lys Tyr Gly
370                 375                 380                 385
cag ggc cgg ctg cag aca gct gtg gcc gag ctc cgg gct cgc cga gag   1439
Gln Gly Arg Leu Gln Thr Ala Val Ala Glu Leu Arg Ala Arg Arg Glu
390                 395                 400
gcc cta gcg aaa cat tgt ctg gta ggg ggt gag gct tct gac ccc aaa   1487
Ala Leu Ala Lys His Cys Leu Val Gly Gly Glu Ala Ser Asp Pro Lys
405                 410                 415
tac atc act gat cgc cgg ttc cgc ccc ttc cag ttt ggg tca gct aag   1535
Tyr Ile Thr Asp Arg Arg Phe Arg Pro Phe Gln Phe Gly Ser Ala Lys
420                 425                 430
gtt ttg ggc tat ata ctt cgg agt gga ttg agc ccc caa gac caa gag   1583
Val Leu Gly Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Ser Pro Gln Asp Gln Glu
435                 440                 445
gaa tgt gag cgc cta gct acc cct gag ctc cag tac aag gac aag ctg   1631
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Thr Pro Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Lys Leu
450                 455                 460                 465
gat gcc aag cag ttc ccc cct acc gtc tca ctg ccc ctc aag act tca   1679
Asp Ala Lys Gln Phe Pro Pro Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Thr Ser
470                 475                 480
agg cca ctc tcc cca taaacatcag actacagatt taggtggaag agcagccatg   1734
Arg Pro Leu Ser Pro
485
tttgaagggc acatgtgatg agtggggggc agcaagatgc catttctgca tctcccagaa 1794
gggatgagtc tttgtcccga tgcaagcccc ctcttcgctg ggctcccagc agtgcttccc 1854
tcctccaccc tccactcatt ttgttctttc cccccaactt tttttttttt ttgaaacgga 1914
gtcttgctct gtcccccagg ctggagtgca gtggcatgat ctcggctcac tgcaacctct 1974
gcctcccagg ttcaagcgat tctcctgcct cagcctccag agtagctagg attacagata 2034
cgtgccacca tacccggcta atttttatat ttttagagac agggattcaa catgttggtt 2094
aggctggtct tgaactcctc acctcaggtg atccacatga ctctgcctcc caaagtgctg 2154
ccattacagg cgtgagccac taggcctgac ctccccttcc cctttcctgc cccaaggcag 2214
atccacatca ccgaagctcc ctagaggggc aaaagatgga gtgagccaca ggaagtttgg 2274
ggcgtggtga gttggaatga tacgtccatt tctctatgaa atatttgcta ctagactgtt 2334
catttctctc tgacatgttt gttgaatgaa taaataattt gaaacttaaa aaaaaaaaaa 2394
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2454
aaaaaa                                                            2460
<210> 2
<211> 486
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gly Pro Leu Ser Pro Ala Arg Thr Leu Arg Leu Trp Gly Pro Arg
1               5                  10                  15
Ser Leu Gly Val Ala Leu Gly Val Phe Met Thr Ile Gly Phe Ala Leu
20                  25                  30
Gln Leu Leu Gly Gly Pro Phe Gln Arg Arg Leu Pro Gly Leu Gln Leu
35                  40                  45
Arg Gln Pro Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Leu Pro Ser Cys Pro
50                  55                  60
Pro Arg Gln Arg Leu Val Phe Leu Lys Thr His Lys Ser Gly Ser Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Leu Ser Leu Leu His Arg Tyr Gly Asp Gln His Gly Leu Arg
85                  90                  95
Phe Ala Leu Pro Ala Arg Tyr Gln Phe Gly Tyr Pro Lys Leu Phe Gln
100                 105                 110
Ala Ser Arg Val Lys Gly Tyr Arg Pro Gln Gly Gly Gly Thr Gln Leu
115                 120                 125
Pro Phe His Ile Leu Cys His His Met Arg Phe Asn Leu Lys Glu Val
130                 135                 140
Leu Gln Val Met Pro Ser Asp Ser Phe Phe Phe Ser Ile Val Arg Asp
145                 150                 155                 160
Pro Ala Ala Leu Ala Arg Ser Ala Phe Ser Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser
165                 170                 175
Ser Ala Phe Arg Lys Ser Pro Ser Leu Ala Ala Phe Leu Ala Asn Pro
180                 185                 190
Arg Gly Phe Tyr Arg Pro Gly Ala Arg Gly Asp His Tyr Ala Arg Asn
195                 200                 205
Leu Leu Trp Phe Asp Phe Gly Leu Pro Phe Pro Pro Glu Lys Arg Ala
210                 215                 220
Lys Arg Gly Asn Ile His Pro Pro Arg Asp Pro Asn Pro Pro Gln Leu
225                 230                 235                 240
Gln Val Leu Pro Ser Gly Ala Gly Pro Arg Ala Gln Thr Leu Asn Pro
245                 250                 255
Asn Ala Leu Ile His Pro Val Ser Thr Val Thr Asp His Arg Ser Gln
260                 265                 270
Ile Ser Ser Pro Ala Ser Phe Asp Leu Gly Ser Ser Ser Phe Ile Gln
275                 280                 285
Trp Gly Leu Ala Trp Leu Asp Ser Val Phe Asp Leu Val Met Val Ala
290                 295                 300
Glu Tyr Phe Asp Glu Ser Leu Val Leu Leu Ala Asp Ala Leu Cys Trp
305                 310                 315                 320
Gly Leu Asp Asp Val Val Gly Phe Met His Asn Ala Gln Ala Gly His
325                 330                 335
Lys Gln Gly Leu Ser Thr Val Ser Asn Ser Gly Leu Thr Ala Glu Asp
340                 345                 350
Arg Gln Leu Thr Ala Arg Ala Arg Ala Trp Asn Asn Leu Asp Trp Ala
355                 360                 365
Leu Tyr Val His Phe Asn Arg Ser Leu Trp Ala Arg Ile Glu Lys Tyr
370                 375                 380
Gly Gln Gly Arg Leu Gln Thr Ala Val Ala Glu Leu Arg Ala Arg Arg
385                 390                 395                 400
Glu Ala Leu Ala Lys His Cys Leu Val Gly Gly Glu Ala Ser Asp Pro
405                 410                 415
Lys Tyr Ile Thr Asp Arg Arg Phe Arg Pro Phe Gln Phe Gly Ser Ala
420                 425                 430
Lys Val Leu Gly Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Ser Pro Gln Asp Gln
435                 440                 445
Glu Glu Cys Glu Arg Leu Ala Thr Pro Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Lys
450                 455                 460
Leu Asp Ala Lys Gln Phe Pro Pro Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Thr
465                 470                 475                 480
Ser Arg Pro Leu Ser Pro
485
【図面の簡単な説明】
【図１】    本発明のヒトＧａｌ３ＳＴ−４ｃＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列を示す図である。
【図２】    （Ａ）本発明のヒトＧａｌ３ＳＴ−４アミノ酸配列のヒドロパシープロット分析を示す図である。
（Ｂ）本発明のヒトＧａｌ３ＳＴ−４の遺伝子の構造を示す図である。
【図３】    Ｇａｌ３ＳＴ―４、Ｇａｌ３ＳＴ―１、Ｇａｌ３ＳＴ―２、Ｇａｌ３ＳＴ―３のアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図４】    ヒトＧａｌＳＴ―４を用いた[35Ｓ]ＳＯ3―→（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１―Ｏ―Ｂｎ）反応産物の分析結果を示す図である。
【図５】    各種ｐＨにおけるＧａｌ３ＳＴ―４の相対活性の結果を示す図である。
【図６】    Ｇａｌ３ＳＴ―４活性においてのアクセプター濃度の効果の結果を示す図である。
【図７】    Ｇａｌ３ＳＴ―４転写物のノーザンブロット分析の結果を示す図である。
【図１】
0003794935.tif 000006
【図２】
0003794935.tif 000007
【図３】
0003794935.tif 000008
【図４】
0003794935.tif 000009
【図５】
0003794935.tif 000010
【図６】
0003794935.tif 000011
【図７】
0003794935.tif 000012