(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コドンの間に、リコンビナーゼ認識配列が挿入されたことを特徴とする動物細胞感染用の組換えアデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスおよびその製造方法に関する。さらに、該組換えＤＮＡウイルスの製造に用いられる、リコンビナーゼの認識配列をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡウイルスベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】
これまで遺伝子導入のウイルスベクターとしてレトロウイルスが良く用いられたが、このウイルスは分裂している細胞にしか導入できないことや宿主細胞の染色体に組み込まれてしまうことにより、特に遺伝子治療においてはその安全性の観点より問題があり、その応用範囲は限られていると考えられている。
アデノウイルスベクターは、種々の動物培養細胞で１００％近い導入効率を示すこと、またレトロウイルスと異なり積極的な染色体組み込みの機構を持たないこと、さらに、休止期の細胞でも遺伝子導入出来るという利点もあり、外来遺伝子導入実験のベクターとしての応用範囲は極めて広く、近い将来は遺伝子治療の主要技術の一つとして確立するであろうと考えられている。
【０００３】
アデノウイルスベクターの利用は遺伝子治療技術の一つとして、また神経系などの高度に分化した細胞での発現研究の面で急速に普及してきている。遺伝子治療技術としては、既に構築され機能している組織へ直接投与することにより機能を担っている生細胞へ直接欠損した遺伝子を補う、いわゆる in vivo遺伝子治療の方法として研究が精力的に進められている。既に嚢胞性繊維症では、米国で５グループが実際に患者への実験治療を認められており、筋ジストロフィー症、家族性高コレステロール血症、また脳腫瘍等に対して活発に研究されるようになった。一方でアデノウイルスベクターは休止期の細胞へも遺伝子導入が可能であり、分化した細胞や、特に神経系への遺伝子導入方法として、初代培養や動物個体への遺伝子導入実験が注目されている。以上より、アデノウイルスベクターは、神経系を含む多くの分化、未分化細胞への遺伝子治療導入だけでなく、動物個体への直接注入・投与による遺伝子発現が可能であることから、特に遺伝子治療への応用が期待されている。
【０００４】
しかし、アデノウイルスはレトロウイルスと異なり、積極的な染色体組み込みの機構を持たないことから、発現が一時的である。その期間は１〜２週間から、長くても２ヶ月程度である。そのため治療効果を継続させる必要がある場合には、なるべく長期間細胞内でアデノウイルスが安定に存在し、アデノウイルス中に挿入された外来遺伝子の発現産物を産生し続けることが望ましい。そして、最近、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子領域の存在がアデノウイルスの細胞内安定性に悪影響を及ぼしていることが分かってきた。
従って、本発明の目的は、動物細胞内に導入されたアデノウイルスベクターが、細胞内でより安定に存在し、外来遺伝子産物を産生し続け得る組換えアデノウイルスベクターの系を構築することにあり、さらに、かかる系を遺伝子治療用に提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記の問題を解決するために鋭意検討し、アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子領域とＬ３遺伝子領域の間に外来ヌクレオチドを導入し得る領域が存在することを発見した。この領域には常法によりそのまま外来ヌクレオチドを導入することができるが、一旦適当なリンカーを常法により導入して必要な制限酵素部位を導入した後外来ヌクレオチドを導入してもよい。外来ヌクレオチドとしては、動物細胞に感染させた後その細胞内で発現することが望まれるポリペプチドをコードする外来遺伝子でもよく、またその外来ヌクレオチドがそのまま細胞中に共存する酵素の基質となるものであってもよい。
さらに、本発明者らは、上記の領域に外来ヌクレオチドとしてリコンビナーゼの認識配列を導入することにより、動物細胞内で発現しうるリコンビナーゼ遺伝子を挿入した動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスベクターと併用すれば動物細胞内でアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子領域を欠失させることができるようなアデノウイルスベクターの系を動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクターとして構築できることを見い出した。
【０００６】
ここに、リコンビナーゼとは、特異的なＤＮＡ組換え酵素で、数十塩基からなる特異的なＤＮＡ配列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断・鎖の交換と結合の全行程を行う。そこで、この酵素を発現する組換えアデノウイルスベクターと、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側にこの認識配列を同じ向きに２コピーを持つ組換えアデノウイルスベクターを作製し、両方を細胞に共感染させると、発現したリコンビナーゼにより２つの認識配列間の再構成が起き、挟まれた部分が環状分子として切り出される。従って、こうして得られるＥ２Ａ遺伝子領域を欠失したアデノウイルスベクターは、Ｅ２Ａ遺伝子領域を含むアデノウイルスベクターに比して顕著に安定になり、遺伝子治療に有利に使用できると期待できる。
【０００７】
しかし、従来はＥ２Ａ遺伝子領域の右側（図１参照）すなわちＥ３領域内には外来ＤＮＡ配列を導入できることが知られていたが、Ｅ２Ａ遺伝子領域の左側には外来ＤＮＡ配列を挿入できる部位の存在は知られていなかった。今回本発明者らにより、Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コドンとの間に外来ＤＮＡ配列を導入できる部位が存在することが発見された。これにより、初めてＥ２Ａ遺伝子の機能を損なわずまたアデノウイルスの増殖の機能を保持したままＥ２Ａ遺伝子領域を挟んでリコンビナーゼ認識配列を導入できることが明らかにされたのである。
本発明は、かかる知見に基づいて、さらに研究を進めて完成するに至ったものである。
【０００８】
即ち、本発明の要旨は、Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コドンの間に、リコンビナーゼ認識配列が挿入されたことを特徴とする動物細胞感染用の組換えアデノウイルス、に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明における動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクターは、アデノウイルスのように細胞に感染後染色体外でしか存在し得ないようなＤＮＡウイルス由来のベクターであれば、特に制限されることなく用いることができる。例えば、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、パポパウイルスベクター等が挙げられる。以下、リコンビナーゼ遺伝子又はリコンビナーゼ認識配列をもつ動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクターの好適な例として、アデノウイルスベクターを用いて本発明を説明する。
【００１０】
本発明に用いられるアデノウイルスは、動物を自然宿主とするものであり、特にヒトを宿主とするヒトアデノウイルスが好適に用いられる。ヒトアデノウイルスのゲノムは、約３６ｋｂｐの２本鎖線状ＤＮＡであって、ＤＮＡ鎖両端にはおよそ１００ｂｐからなる逆方向反復塩基配列があり、そのＤＮＡ鎖両端の５’末端にはＥ２Ｂ遺伝子産物が切断加工された５５ｋのタンパク質が共有結合しているという特異な構造をしている。
【００１１】
本発明に用いられるアデノウイルスのゲノムは、Ｅ１遺伝子領域特にＥ１Ａ遺伝子領域を欠失していることが好ましい。これは、アデノウイルスの細胞ガン化活性に関与するＥ１Ａ遺伝子領域を欠失させることにより、アデノウイルスを無毒化し、ゲノム中に組み込んだ外来の遺伝子配列のみを発現させるためである。必ずしもＥ１Ａ遺伝子領域の全てを欠失させる必要はないが、例えば１．３〜９．３％の断片を除去すれば、目的は達成される。
また、本発明に用いられるアデノウイルスのゲノムは、Ｅ３遺伝子領域を欠失させてもよい。特に、Ｅ３遺伝子領域の７９．６〜８４．８％を欠失させたものが好ましい。アデノウイルスの複製には不要であるからである。
したがってＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を持続的に発現しているヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）を除き、宿主細胞内で増殖することができないという特徴を有する。
【００１２】
しかしながら、実際にヒトや動物に投与した場合、Ｅ１Ａ蛋白と同様の機能を有する蛋白が細胞中に存在し、これによりわずかにアデノウイルス蛋白が発現する。これが細胞免疫を引起し、ウイルスＤＮＡを保持する細胞が攻撃を受け排除されることがわかっている。現在使用されているＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ欠損型アデノウイルスベクターによる遺伝子発現が短期間である原因はここにある。これを防ぐためには、Ｅ２Ａ遺伝子の機能を欠失させることが有効であることがＹａｎｇらにより明らかにされた（Nature Genetics, vol.7, 362-369, 1993)。これは、温度感受性のＥ２Ａ遺伝子変異株を利用したものであるが、動物に投与した場合、Ｅ２Ａ遺伝子の機能発現が抑制されるものの機能発現を完全に止めることができない。Ｅ２Ａ遺伝子の機能発現を完全に止める手段としてはＥ２Ａ遺伝子領域を欠失させることが考えられるが、Ｅ２Ａ遺伝子産物はアデノウイルスゲノムの複製に必須であるため、Ｅ２Ａ遺伝子を欠失したアデノウイルス自身は２９３細胞においても増殖できない。
本発明は、Ｅ２Ａ遺伝子の両端にリコンビナーゼ認識配列を配置した組換えアデノウイルスとリコンビナーゼ発現用アデノウイルスを動物培養細胞に共感染させ、細胞内で発現したリコンビナーゼによりＥ２Ａ遺伝子欠失型感染性ウイルス粒子を作製するというものである。Ｅ２Ａ遺伝子産物は少なくともリコンビナーゼ発現用アデノウイルスから十分量補充される。得られるＥ２Ａ遺伝子欠失型ウイルスはＥ２Ａ遺伝子の発現が皆無であるため、目的とする遺伝子の発現期間が大幅に延長することは間違いない。
【００１３】
リコンビナーゼの認識配列の挿入位置は、Ｅ２Ａ遺伝子領域の右側には従来から知られている領域があるが、Ｅ２Ａ遺伝子領域の左側については、Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コドンの間であって、得られる組換えアデノウイルスの増殖を阻害しない部位が選択される。Ｅ２Ａ遺伝子領域やＬ３遺伝子領域の一部欠失あるいはポリＡ付加シグナル領域が一部欠失することになると、得られる組換えアデノウイルスの増殖が阻害されるため好ましくない。
【００１４】
本発明に用いられるプロモーターとしては、動物ウイルス遺伝子プロモーターおよび動物細胞遺伝子プロモーターが挙げられる。前者の例としてはＳＶ４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝子プロモーター等があり、また、後者の例としては、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモーター等がある。しかし本発明には、ＣＡＧプロモーターが特に有利に用いられる。このプロモーターは、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびウサギβグロビン由来のポリＡ配列からなるハイブリッドプロモーターであり、高発現ベクターとして特開平３−１６８０８７号公報に開示されている。その調製は同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開平３−１６８０８７、１３頁２０行〜２０頁１４行および２２頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ，ＨｉｎｄIII で切り出すことにより行うことができ、本発明に利用することができる。
【００１５】
本発明に用いられるリコンビナーゼは、特異的なＤＮＡ組換え酵素で、特定の塩基配列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断、鎖の交換と結合の全行程を行う。かかる酵素としては、大腸菌のバクテリオファージＰ１がコードするもの（リコンビナーゼＣｒｅ）がある。これはバクテリオファージＰ１内のｌｏｘＰ（Abremskiら、J. Biol. Chem.1984、1509−1514；および Hoessら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029）配列を基質とする。即ち、ｌｏｘＰ配列がリコンビナーゼＣｒｅの認識配列となる。また、他のリコンビナーゼとして酵母の２μプラスミド由来のＦＬＰ遺伝子がコードするリコンビナーゼが挙げられる（James R. Broarchら、Cell、29、227-234)。さらに、チゴサッカロマイセス・ルーイイのｐＳＲ１プラスミド由来のものも使用できる。これはＲ遺伝子にコードされる（Matsuzaki ら、Molecular and Cellular Biology、８、955-962 (1988)) 。これらの中では、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼが本発明に特に好適である。
【００１６】
リコンビナーゼ遺伝子は、例えば、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子の場合は、バクテリオファージＰ１のＤＮＡのリコンビナーゼ遺伝子をコードする部分をポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を用いて増幅して本発明に使用することができる。その他のリコンビナーゼ遺伝子の場合も同様にＰＣＲ法を用いて調製することができる。この場合に使用するプライマーは、リコンビナーゼ遺伝子の全配列がカバーされるように選択され、さらに組換えアデノウイルスベクターの構築の便宜のため、各プライマーの外側に適当な制限酵素切断配列を付加したものを使用することが好ましい。
【００１７】
上記のリコンビナーゼの認識配列（基質となる配列）は数十ｂｐであり、例えばｌｏｘＰ配列は３４ｂｐであり、全て、塩基配列が知られているので（Abremskiら、J. Biol. Chem.1984、1509-1514 ；および Hoessら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029) 、常法により化学合成して本発明に使用することができる。
【００１８】
本発明に用いられるポリＡ配列としては、特に限定されるものでないが、ウサギβグロビン由来のものが特に好ましい。
【００１９】
本発明においては、リコンビナーゼ遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込む場合に、同時に核移行シグナル配列を組み込むことが好ましい。例えば、ＳＶ４０の核移行シグナルが利用できる。これは、アデノウイルスベクターにより感染細胞の細胞質内で発現したリコンビナーゼがその認識配列を有するアデノウイルスベクターに作用するには、核内に移行する必要があり、核移行シグナル配列はこれを促進する（Daniel Kalderon ら、Cell. 39、499-509 (1984)) からである。
【００２０】
本発明に使用される外来遺伝子としては、上記のハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）あるいはその他のプロモーターにより発現することができる遺伝子であれば、特に限定されるものではなく、有用性の観点から、ヒトの欠損遺伝子に対応する正常遺伝子の配列（例えばアデノシンデアミナーゼ、ジストロフィン、低密度リポ蛋白レセプター、α−１アンチトリプシン、血液凝固第８因子、血液凝固第９因子、ガラクトシダーゼα、もしくはβ）、サイトカイン類（例えばインターロイキン−１〜１２、インターフェロン−α，βもしくはγ、腫瘍壊死因子−αもしくはβ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、インシュリン、インシュリン様成長ホルモン）、神経栄養因子類、非自己抗原遺伝子（例えばアロＨＬＡ（ＨＬＡ−Ｂ７））、ウィルス抗原等をコードするヌクレオチド配列、ガン抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＲＢ、ＷＴ−１、ＮＭ２３、ＮＦ−１）、ガン遺伝子であるＲａｓ等のアンチセンス配列、またはチミジンキナーゼやシトシンデアミナーゼのような自殺遺伝子と呼ばれるものが挙げられる。
【００２１】
本発明の組換えアデノウイルスベクターに組み込まれるプロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列は上流からこの順に配向していても逆の順に配向していてもよい。
【００２２】
次に、本発明の組換えアデノウイルスの製造方法について説明する。
（１）  まず、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側にある同方向を向いた二つのリコンビナーゼ認識配列、プロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターの製造方法について述べる。便宜上、リコンビナーゼとしてはリコンビナーゼＣｒｅを、その認識配列としてはｌｏｘＰを、プロモーターおよびポリＡ配列としては前記のＣＡＧプロモーターを、外来遺伝子としてはＬａｃＺ遺伝子を使用する場合について述べるが、その他のリコンビナーゼ、その認識配列、プロモーターおよびポリＡ配列を使用する場合も実質的に同様の手法を利用することができる。
【００２３】
（ａ）（ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔの構築）
▲１▼  ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１の構築
ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Niwaら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩリンカーとのリガーゼ反応を行う。次に、得られたプラスミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行う。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリンカーとのリガーゼ反応を行い、ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１を取得する。
元の制限酵素部位の消失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の後、アガロースゲル電気泳動により確認する。
【００２４】
▲２▼  ｐＡｄｅｘ１ｃの構築
実施例１▲２▼（ｉ）〜（vi）に記載の方法により構築する。その概要は以下のとおりである。
Ｅ１遺伝子領域を欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％を含むプラスミド（ｐＵＡＦ０−１７Ｄ）、５型アデノウイルスＤＮＡにＢａｍＨリンカーを結合させた後ＨｉｎｄIII 消化して得られるフラグメント（２．８ｋｂ、アデノウイルスゲノムの左側末端の８％に当たる）をｐＵＣ１９に挿入して得られるプラスミド（ｐＵＡＦ０−８）、およびアデノウイルスＤＮＡをＨｉｎｄIII 消化して得られる３．４ｋｂフラグメント（アデノウイルスゲノムの左側末端の８−１７％に当たる）をｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII 部位へ挿入して得られるプラスミド（ｐＵＡＦ８−１７）とを調製し、ついでｐＵＡＦ０−８由来の４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントと、ｐＵＡＦ８−１７由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをつなぎ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 部位へ挿入してｐＵＡＦ０−１７Ｄを得る。
【００２５】
さらに、５型アデノウイルスＤＮＡをＢｓｔ１１０７とＥｃｏＲＩで消化し２１．６ｋｂのフラグメントを得る。また、アデノウイルスゲノム由来のｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋｂ）を調製する。
一方、charomid９−１１(I. Saito & G. Stark, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p8664-8668, 1986) をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーションする。ついでそのＥｃｏＲＩ部位へＢａｍＨＩリンカーを挿入し、シャロミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１を調製する。
【００２６】
上記のｐＵＡＦ０−１７ＤのＢａｍＨＩ−Ｂｓｔ１１０７フラグメント（２．９ｋｂ）とアデノウイルスゲノムのＢｓｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩフラグメント（６．５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６Ｉで消化したｃｈｄＲＢＲ７−１１とライゲーションする。その後、in vitroパッケージングし、ＤＨ５αへ感染させる。形質転換株から目的のフラグメントをもつものを単離し、ｐＡｄｅｘ１ｃと名づける。
【００２７】
▲３▼  カセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗの構築
ＣｌａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐＡｄｅｘ１ｃと、５’末端リン酸化を施した下記の合成リンカー（１）（配列番号：２）（ＳｗａＩ、ＣｌａＩ、ＳａｌＩ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩで消化する。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＳｗａＩ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造のコスミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけ、リンカー由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションを行い、セルフアニーリングによる環状化を行う。ついでイン・ビトロ・パッケージングを行い、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩおよびＮｒｕＩ同時消化により確認する。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認により目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図１）を取得する。
合成リンカー
0003770333.tif 000002
【００２８】
▲４▼  カセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗの構築
▲１▼で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄIII およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカーとのライゲーションを行う。リガーゼを熱失活させた後、Ｐｓｐ１４０６Ｉで消化する。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を切り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個連結した構造の断片を得るために行う。このあと、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣｌａＩで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤＮＡ断片と前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションさせる。リガーゼを熱失活させた後、ＣｌａＩを添加し、セルフアニーリングにより生じた環状コスミドを切断する。ついで、イン・ビトロ・パッケージングに用いる。
更に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ同時消化により確認する。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐと４．８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、２．７及び２．５ｋｂの断片を生じる。この確認により目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取得する。
【００２９】
▲５▼  カセットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築
ＳｗａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを、5'末端リン酸化を施した下記の合成リンカー（２）（配列番号：３）（ＣｌａＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた後、ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させる。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰａｃＩ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造のコスミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させ、セルフアニーリングによる環状化を行う。リガーゼを熱失活させた後、イン・ビトロ・パッケージングに用いる。次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同時消化により確認する。目的とする方向に挿入された場合５５２ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの断片を生じる。これを確認することにより目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得する。
合成リンカーの構造
0003770333.tif 000003
【００３０】
（ｂ）（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築その１）
ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製
▲１▼  ｐＡ６０Ｘ９９Ｘの作製
ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔをＢａｍＨＩで切断した後、熱処理によりＢａｍＨＩを失活させる。次にＴ４ＤＮＡリガーゼにより一晩結合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製）を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得る。
【００３１】
▲２▼  ｐＡ６０Ｘ９９の作製（アデノウイルス以外のＸｂａＩ部位の除去）
ｐＡ６０Ｘ９９ＸをＸｂａＩ処理し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位のうち１ヶ所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。次に、この断片をＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両末端を平滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで一晩結合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製する。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩおよびＸｂａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片すなわちプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図３）を得る。
【００３２】
▲３▼  ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９の作製（ＢｓｒＧＩ部位へのｌｏｘＰの挿入）
ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏｌで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両末端を平滑化する。その後フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱する。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ６０μｌに溶解する。これと５’末端リン酸化ＫｐｎＩリンカー（宝酒造製）、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合させる。次に、Ａｓｐ７１８（ベーリンガー製）で消化する。反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
【００３３】
なお、上記のｐＵＬＬ２ｒは以下のようにして調製する。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計されているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得る。
0003770333.tif 000004
（下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
【００３４】
一方、プラスミドｐＡ６０Ｘ９９（１０μｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。このＤＮＡ断片と前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ反応液中で一晩結合させる。これに滅菌水、ＢｓｒＧＩ反応ｂｕｆｆｅｒを加え、７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、ＢｓｒＧＩで処理してセルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ６０Ｘ９９を切断する。次いでこの反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製する。
【００３５】
挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するため、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液をアガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入された場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。また、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得する。
【００３６】
▲４▼  ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９の作製（ＸｂａＩ部位へのｌｏｘＰの挿入）
ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏＩを含む反応系１００μｌ中で切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両末端を平滑化する。ついで、フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱する。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥに溶解する。これと５’末端リン酸化ＳｐｅＩリンカー（宝酒造製）、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させる。さらに、ＳｐｅＩを加え消化した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
【００３７】
一方、ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９を、ＸｂａＩで切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡを回収する。このＤＮＡ断片と前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させ、ついでこれをＸｂａＩで処理し、セルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９を切断する。この反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製する。
【００３８】
挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するため、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液をアガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入された場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。また、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とする方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入された場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的のプラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得する。
【００３９】
▲５▼  ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製
ｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔを、Ｃｓｐ４５Ｉ（東洋紡製）で切断し、次いで、同反応液中でＢａｍＨＩ、さらにＥｃｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によるチェックを行う。２１ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。なお、Ｃｓｐ４５１およびＥｃｏＲＩによる切断は２１ｋｂのＢａｍＨＩＤＮＡ断片を回収する際、他の断片が混入するのを防ぐためである。
【００４０】
ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩで切断した後、フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５によりゲル濾過する。回収したＤＮＡ断片と前述の２１ｋｂのＤＮＡ断片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた後、これをイン・ビトロ・パッケージングに用いる。
【００４１】
即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用い、残りは−８０℃に凍結する。ギガバックＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなったコスミドをある程度選択することができる。本発明では、１０個のコロニーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的のクローン（ウイルスゲノムが正しく連結されたクローン）を容易に得ることができる。コスミドの扱い方については、常法（斎藤  泉他、実験医学：７：183-187, 1989)に従って行う。
【００４２】
パッケージングされたコスミドを大腸菌ＤＨ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）に感染させる。即ち、Ａｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートとＡｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）に各種の濃度で接種し、一晩培養する。ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制限酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの割合を調べる。コロニーは丸ごと寒天ごと取りＡｐ+ ＬＢで一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製する。次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＤｒａＩ切断により確認する。目的とする方向に挿入された場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入された場合１．４ｋｂの断片を生じる。これにより目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得する。
【００４３】
（ｃ）（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築その２）
ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔの作製
▲１▼  ｐＵＣＡ６０６５の作製
ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。同様の操作によりｐＵＣ１９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断し、２．７ｋｂの断片を回収する。次に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミドｐＵＣＡ６０６５を得る。
【００４４】
▲２▼  ｐ２ＬＡ６０６５の作製
ｐＵＣＡ６０６５をＢａｍＨＩおよびＡｆｌIII で切断し、７８０ｂｐの断片を調製し、また、同プラスミドをＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩで切断し、３．６ｋｂの断片を調製する。これら両断片とｌｏｘＰ配列を含む下記のリンカーＤＮＡ（配列番号：１１）を混合しリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカーＤＮＡが１つ挿入された、目的とするプラスミドｐ２ＬＡ６０６５を得る。
0003770333.tif 000005
【００４５】
▲３▼  ｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９の作製
ｐ２ＬＡ６０６５をＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩ（あるいはＢｇｌＩ）により切断し、１．５ｋｂの断片を調製する。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９を得る。
【００４６】
▲４▼  ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔの作製
ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ作製の際の▲５▼と同様の操作により、ｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔからｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔを作製する。
【００４７】
（ｄ）（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築その３）
ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔの作製
▲１▼  ｐＨＳＧＡ６０６５の作製
ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。ｐＨＳＧ２９９（宝酒造）をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断し、同様の操作により２．７ｋｂの断片を回収する。次に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミドｐＨＳＧＡ６０６５を得る。
【００４８】
▲２▼  ｐ２ＬＤ６０６５の作製
ｐＨＳＧＡ６０６５をＢｓｒＧＩおよびＤｒａＩで切断し４．４ｋｂの断片を調製し、これとｌｏｘＰ配列を含む下記のリンカーＤＮＡ（配列番号：１２）を混合し、リガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカーＤＮＡが１つ挿入された目的とするプラスミドｐ２ＬＤ６０６５を得る。
0003770333.tif 000006
【００４９】
▲３▼  ｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９の作製
ｐ２ＬＤ６０６５をＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩ（あるいはＢｇｌＩ）により切断し１．５ｋｂの断片を調製する。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９を得る。
【００５０】
▲４▼  ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔの作製
ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ作製の際の▲５▼と同様の操作により、ｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔからｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔを作製する。
【００５１】
（ｅ）アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複合体（Ａｄ５  ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製
▲１▼  アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５  ｄｌＸ（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985))またはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを用いる。Ａｄ５  ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ  １０本分）に、Ａｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを２９３細胞にそれぞれ感染させ、培養を行う。
即ち、Ａｄ５−ｄｌＸまたはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／ｍｌ）を０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はがれた細胞を遠心分離により集める。アデノウイルス粒子のほとんどはメディウム中ではなく細胞の核内にいるので感染細胞からウイルスを精製できる利点がある。（以下の操作は非無菌的に行う。）
【００５２】
▲２▼  得られた細胞をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、密封型ソニケーターを用いて細胞を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させる。
▲３▼  得られた破砕物を遠心分離により沈澱を除いた後、超遠心分離機  ＳＷ２８チューブに塩化セシウム溶液（比重１．４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッション遠心による濃縮を行う。
▲４▼  界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移す。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取する。同時にもう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たす。
これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけた。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配ができたチューブに乗せ替える。さらに、３５ｋｒｐｍ、４℃４時間以上超遠心にかける。
【００５３】
▲５▼  白いウイルスのバンドを分取し、等量の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満たす。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出される。
【００５４】
▲６▼  上記のチューブを、５５ｋｒｐｍ、１５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有無を確認する。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集める。
▲７▼  ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡ−ＴＰＣの量をＯＤ260 から通常のＤＮＡと同様に算出する。
▲８▼  得られたＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺＤＮＡ−ＴＰＣを、次のステップのｌｏｘＰ挿入組換えアデノウイルス作成のため、充分量のＡｇｅＩで２時間切断し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムでゲル濾過後、−８０℃に保存する。
【００５５】
（ｆ）ｌｏｘＰ挿入組み換えアデノウイルスの作製
なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端にＳＶ４０の核移行シグナルを付加したものである。
▲１▼  １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意する。
▲２▼−１．（Ａｄ５ｄｌＸ２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製）
発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ  ＤＮＡの８μｇとＡｇｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行う。６ｃｍシャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続ける。
一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直す。細胞数が各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播く。
【００５６】
▲２▼−２．（Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＡ３ＬまたはＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製）
発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミドｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔ  ＤＮＡの８μｇとＡｇｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行う。６ｃｍシャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続ける。
一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直す。細胞数が各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播く。
【００５７】
▲２▼−３．（Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＤ３ＬまたはＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製）
発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミドｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔ  ＤＮＡの８μｇとＡｇｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行う。６ｃｍシャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続ける。
一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直す。細胞数が各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播く。
【００５８】
▲３▼  ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加える。２９３細胞がやせてきたら早めに加える。
ウイルスが増殖し細胞が死滅したウエルが７〜２０日の間に現れる。ウエルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペットで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチューブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存する。
▲４▼  １５〜２５日で判定は終了する。比較的遅く細胞が死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選び、超音波破砕後、５０００ｒｐｍ１０分遠心して得られた上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０℃に保存する。早めにウイルス増殖が起こったウエルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。
【００５９】
▲５▼  ２４穴プレートに２９３細胞を用意し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加する。
▲６▼  約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次ウイルス液作製と同様に超音波破砕と遠心分離で上清を得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０℃に保存する。他の１ウエルの死滅した細胞を５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけを−８０℃に保存する（セルパック）。１０種類のウイルス株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全ＤＮＡを抽出する。セルパックには、４００μｌのcell DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDTA)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの10%SDSを加える。
【００６０】
▲７▼  ５０℃で１時間処理した後、フェノール・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、ついでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かす。その１５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列にＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミドカセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのアガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較する。ＸｈｏＩは挿入したｌｏｘＰ配列内に認識部位があるので、ｌｏｘＰが２個挿入された切断パターンを示すクローンを選択する。説明できないバンドが薄く見えるクローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があるので廃棄する。
【００６１】
ここで得られるｌｏｘＰ挿入組換えアデノウイルスＡｄ５ｄｌＸ２Ｌ３Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＡ３Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＤ３Ｌ等と、目的の外来遺伝子発現ユニットを含むコスミドを用いて、公知の組換えアデノウイルス作製方法、例えばＣＯＳ−ＴＰＣ法（「実験医学別冊」バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入と発現・解析法、４３〜５８頁）に従って、目的の外来遺伝子発現ユニットとｌｏｘＰが挿入された組換えアデノウイルスを作製することができる。
【００６２】
（ｇ）Ｅ２Ａ遺伝子欠損アデノウイルスの作製と構造確認
組み換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅをそれぞれｍｏｉ＝１０および３で２９３細胞に感染させ、培養を行う。４日目に細胞を回収し、前述の方法によりＤＮＡを調製する。ｌｏｘＰで挟まれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が切り出された構造を有するＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａｃＺの生成を２つの方法で確認する。
なお、Ａｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡＮＬａｃＺおよびＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺに関しても同様の操作により構造が確認できる。
【００６３】
１．ＳｍａＩ消化
ＳｍａＩ消化の後、ゲル電気泳動した結果、ｌｏｘＰで挟まれた領域が切り出されて生ずる４．７ｋｂの断片が認められる。このバンドとＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺ、Ａｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅ、およびＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａｃＺにおいて共通して見られる４．４５ｋｂのバンドの濃さの比較から、回収した組換えアデノウイルス中の約何％がＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａｃＺであるかが分かる。
【００６４】
２．ＰＣＲによる確認
調製したＤＮＡ０．１ｎｇをテンプレートとし、通常の条件でＰＣＲを行い、生成物をアガロースゲル電気泳動により分析する。用いるプライマーは、下記に示すオリゴヌクレオチド（１）（配列番号：５）、オリゴヌクレオチド（２）（配列番号：６）、オリゴヌクレオチド（３）（配列番号：７）およびオリゴヌクレオチド（４）（配列番号：８）が好ましい。
0003770333.tif 000007
ＰＣＲ反応液組成は、１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３）中、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．２ｍＭのｄＮＴＰ  mixture および各０．２μＭのプライマー、０．１ｎｇのテンプレートＤＮＡおよび０．５ｕｎｉｔのＴａｑ  ポリメラーゼを含むものが好ましい。
ＰＣＲ反応条件としては、二本鎖解離を９５℃で１．５分、アニーリングを６４℃で１．０分、伸長反応を７０℃で１．０分、反応サイクル３０回、が好ましい１例である。
プライマーとして（１）と（４）を用いた場合、３９３ｂｐと推定されるバンドが検出され、Ｅ２Ａ遺伝子が欠失したＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａｃＺの存在が明らかとなり、また、（２）と（３）を用いた場合、２２１ｂｐと推定されるバンドが検出され、Ｃｒｅ遺伝子産物により切り出された環状のＥ２Ａ遺伝子の存在も裏付けられ、Ａｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺからｌｏｘＰではさまれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が切り出されたＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａｃＺの生成が明らかになる（図６）。
【００６５】
（２）  次に、プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターの製造方法について説明する。
以下に、リコンビナーゼ遺伝子としてリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を使用した場合について述べるが、他のリコンビナーゼ遺伝子の場合もほぼ同様である。
【００６６】
▲１▼  ＰＣＲ法で調製したリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子およびプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造製）とをそれぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａＩ（宝酒造製）で同時消化したのち混合・ライゲーションし、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれたプラスミドｐＵＣＣｒｅを得る。
▲２▼  ＣＡＧプロモーターを含むカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔを制限酵素ＳｗａＩ（Boehringer製）で処理したものと、ｐＵＣＣｒｅを制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａＩ（宝酒造製）で同時消化したのちＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両端を平滑化したものとを混合する。ついでカセットコスミドを沈澱させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで結合させ、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を組み込んだカセットコスミドを得る。
【００６７】
ＣＡＧプロモーター以外のプロモーターを使用する場合は、まず、アデノウイルスゲノム（３６ｋｂ）の全長のうち、複製に不要なＥ３領域（１．９ｋｂ）とＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ領域（２．９ｋｂ）を欠失させた約３１ｋｂのゲノムＤＮＡをもつカセットコスミドを作成し、他方、使用しようとするプロモーター、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子およびポリＡ配列を含むプラスミドを作製し、適当な制限酵素で処理してアデノウイルスゲノムのＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ欠失部位にリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子発現ユニットを組み込んだカセットコスミドを得る。
▲３▼  次に、得られたカセットコスミドを、ラムダ・インビトロ・パッケージングキットであるギガパックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いて、インビトロ・パッケージングを行う。
【００６８】
▲４▼  一方、アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複合体（Ａｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣ）を調製する。アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ｄｌＸ（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985) ）を用い、Ａｄ５ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ瓶１０本分）に感染させ、培養を行う。ウイルス粒子を回収し、塩酸グアニジン処理・超遠心によりＤＮＡ−ＴＰＣを分離・回収する。
こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣを次のステップの組換えアデノウイルス作製のため充分量のＥｃｏＴ２２Ｉで処理する。
【００６９】
▲５▼  最後のステップとして、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を組み込んだカセットコスミドとＥｃｏＴ２２Ｉで処理したＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣを混合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用いてリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行う。ウイルスの増殖のため細胞が死滅したものからウイルス液を回収しプロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを得る。
【００７０】
本発明の方法により上記のようにして得られる、目的の外来遺伝子発現ユニットを有し、Ｅ２Ａ遺伝子の機能が完全に欠失した本発明の組換えアデノウイルスの高力価ウイルス溶液は、適宜希釈して局所注入（中枢神経系・門脈など）、経口（腸溶剤を用いる）投与、経気道投与、経皮投与等の投与方法により共感染させ、遺伝病を含む各種疾患の治療に用いることができる。
【００７１】
【実施例】
以下、実施例、参考例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
なお、実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatis ら編、第２版（１９８9 ）、Cold Spring Harbor Laboratory 」に記載の方法に準じて行った。また、ＤＮＡ制限酵素および修飾酵素は、宝酒造、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社から購入し、製造者指示書に従って使用した。
【００７２】
実施例１（ｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔの構築）
▲１▼  ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１の構築
ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Niwaら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩリンカーとのリガーゼ反応を行った。次に、得られたプラスミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行った。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリンカーとのリガーゼ反応を行った。元の制限酵素部位の消失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の後、アガロースゲル電気泳動により確認した。
【００７３】
▲２▼  ｐＡｄｅｘ１ｃの構築
（ｉ）Ｅ１遺伝子領域を欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％を含むプラスミド（ｐＵＡＦ０−１７Ｄ）の調製
５型アデノウイルスＤＮＡをＳ１処理して平滑末端とし、その平滑末端にＢａｍＨリンカーを結合させ、その後ＨｉｎｄIII 消化し、目的のフラグメント（２．８ｋｂ、アデノウイルスゲノムの左側末端の８％に当たる）をアガロースゲル電気泳動で分離・回収し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 消化したｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 部位へ挿入した。得られた目的のプラスミドをｐＵＡＦ０−８と名づけた。
【００７４】
（ii）アデノウイルスＤＮＡをＨｉｎｄIII 消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、目的の３．４ｋｂのフラグメント（アデノウイルスゲノムの左側末端の８−１７％に当たる）をゲルから回収し、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII 部位へ挿入した（ｐＵＡＦ８−１７と命名）。
ｐＵＡＦ０−８の塩基番号（ここでいう塩基番号はアデノウイルスＤＮＡ由来）４５４番目のＰｖｕII部位をＣｌａＩリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変換した。そして、このプラスミドをＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ消化し、４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントをアガロースゲル電気泳動で回収した。
ｐＵＡＦ８−１７の塩基番号３３２８番目のＢｇｌII部位をＣｌａＩリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変換した。そしてこのプラスミドをＨｉｎｄIII ／ＣｌａＩ消化し、２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをアガロースゲル電気泳動で回収した。
ｐＵＡＦ０−８由来の４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントと、ｐＵＡＦ８−１７由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをつなぎ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 部位へ挿入した。得られたプラスミドをｐＵＡＦ０−１７Ｄと命名した。このプラスミドはＥ１遺伝子領域を欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％を含む。
【００７５】
（iii)アデノウイルスゲノムのＢｓｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）の調製
５型アデノウイルスＤＮＡをＢｓｔ１１０７とＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、目的の２１．６ｋｂのフラグメントを回収した。
【００７６】
（iv）アデノウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋｂ）の調製
ｐＸ２Ｓ（I. Saito et. al., J. of Virology, vol. 54, p711-719, 1985)のＳａｌＩ部位をＳｗａＩリンカー（メーカー名）を用いてＳｗａＩ部位へ変換しｐＸ２Ｗを得た。ｐＸ２ＷをＥｃｏＲＩとＳｗａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、目的の６．５ｋｂのフラグメントを回収した。
【００７７】
（ｖ）シャロミド（ｃｈｄＲＢＲ７−１１）の調製
charomid９−１１(I. Saito & G. Stark, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p8664-8668, 1986) のＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩを除くため、charomid９−１１をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーションした。これを用いて形質転換し、目的のシャロミドを単離し、charomid６−１１と名づけた。charomid６−１１のＥｃｏＲＩ部位へＢａｍＨＩリンカーを挿入し、得られたシャロミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１と名づけた。
【００７８】
（vi）ｐＡｄｅｘ１ｃの調製
ｐＵＡＦ０−１７ＤのＢａｍＨＩ−Ｂｓｔ１１０７フラグメント（２．９ｋｂ）とアデノウイルスゲノムのＢｓｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩフラグメント（６．５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６Ｉで消化したｃｈｄＲＢＲ７−１１とライゲーションした。その後、in vitroパッケージングし、大腸菌ＤＨ５αへ感染させた。形質転換株から目的のフラグメントをもつものを単離し、ｐＡｄｅｘ１ｃと名づけた。
【００７９】
▲３▼  カセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗの構築
ＣｌａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱により回収したｐＡｄｅｘ１ｃ（１μｇ）と、５’末端リン酸化を施した下記の合成リンカー（１）（配列番号：２）０．０１μｇ（ＳｗａＩ、ＣｌａＩ、ＳａｌＩ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させた。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＳｗａＩ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造のコスミドを得るために行った。次に、反応液をＳｐｕｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー由来の小断片を除去した後、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させ、セルフアニーリングにより環状化を行った。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させ、１μｌをイン・ビトロ・パッケージングに用いた。次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩおよびＮｒｕＩ同時消化により確認した。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認により目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図１）を取得した。
合成リンカー
0003770333.tif 000008
【００８０】
▲４▼  カセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗの構築
▲１▼で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄIII およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカーとのリガーゼ反応を行った。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、Ｐｓｐ１４０６Ｉを添加し、反応させた。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を切り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個連結した構造の断片を得るために行った。このあと、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣｌａＩで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤＮＡ断片１μｇと前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片０．１μｇをＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、これの１／４量にＣｌａＩを添加し（最終容量２０μｌ）、セルフアニーリングにより生じた環状コスミドを切断した。１μｌをイン・ビトロ・パッケージングに用いた。
次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ同時消化により確認した。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐと４．８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、２．７および２．５ｋｂの断片を生じる。この確認により目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取得した。
【００８１】
▲５▼  カセットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築
ＳｗａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱により回収したｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗ（１μｇ）と、5'末端リン酸化を施した下記の合成リンカー（２）（配列番号：３）（０．０１μｇ）（ＣｌａＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させた。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰａｃＩ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造のコスミドを得るために行った。次に、反応液をＳｐｕｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー由来の小断片を除去した後、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させ、セルフアニーリングによる環状化を行った。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた１μｌをイン・ビトロ・パッケージングに用いた。次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同時消化により確認した。目的とする方向に挿入された場合５５２ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの断片を生じる。これを確認することにより目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得した。
合成リンカーの構造
0003770333.tif 000009
【００８２】
実施例２（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築）
▲１▼  ｐＡ６０Ｘ９９Ｘの作製
ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（０．５μｇ）をＢａｍＨＩ（１５ｕｎｉｔ）を含む反応系２０μｌ中で切断した後、熱処理（７０℃、１５分間）によりＢａｍＨＩを失活させた。次にその１／４量を用いリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中でＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量２０μｌで一晩結合させた。次いでこの反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得た。
【００８３】
▲２▼  ｐＡ６０Ｘ９９の作製（アデノウイルス以外のＸｂａＩ部位を除去する）ｐＡ６０Ｘ９９Ｘ（５μｇ）をＸｂａＩ（１０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ中で５分間反応させ、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位のうち１ヶ所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。次に、この断片０．２μｇをＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）５ｕｎｉｔを含む反応系５０μｌ中で反応させ両末端を平滑化し、さらに、これの１／５量、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量２０μｌ）中で一晩結合させた。次いでこの反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製した。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩおよびＸｂａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片を生じる、すなわち図１の構造を有するプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図３）を得た。
【００８４】
▲３▼  ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９の作製（ＢｓｒＧＩ部位へのｌｏｘＰの挿入）
ｐＵＬＬ２ｒ（３０μｇ）をＸｈｏｌ（１５０ｕｎｉｔ）を含む反応系１２５μｌ中で切断した後、熱処理（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）１２ｕｎｉｔを含む反応系中で両末端を平滑化し、その後フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱した。沈澱物を遠心分離により取得し、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液（ＴＥ）６０μｌに溶解した。次に、これの１／２量と５’末端リン酸化ＫｐｎＩリンカー（宝酒造製）０．２μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合させた。次に、熱処理（７０℃、１５分間）によりリガーゼを失活させた後、Ａｓｐ７１８（１００ｕｎｉｔ）を含む反応系８０μｌ中で消化した。反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。
【００８５】
なお、上記のｐＵＬＬ２ｒは以下のようにして調製した。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計されているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得た。
0003770333.tif 000010
（下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
【００８６】
一方、プラスミドｐＡ６０Ｘ９９（１０μｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ反応液（最終容量２５μｌ）中で一晩結合させた。これの１／２量に滅菌水、ＢｓｒＧＩ反応ｂｕｆｆｅｒを加えて１８μｌとしてから、７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた。さらに、２０ｕｎｉｔのＢｓｒＧＩを加え（最終容量２０μｌ）３７℃で１時間反応させることによりセルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ６０Ｘ９９を切断した。次いでこの反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製した。
【００８７】
挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するため、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液をアガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入された場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。また、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得した。
【００８８】
▲４▼  ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９の作製（ＸｂａＩ部位へのｌｏｘＰの挿入）
ｐＵＬＬ２ｒ（２０μｇ）をＸｈｏＩ（１００ｕｎｉｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断した後、熱処理（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）８ｕｎｉｔを含む反応系において両末端を平滑化し、その後フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱した。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ３０μｌに溶解した。これの全量と５’末端リン酸化ＳｐｅＩリンカー（宝酒造製）０．４μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合させ、７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた。さらに、ＳｐｅＩ（５４ｕｎｉｔ）を加え消化した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。
【００８９】
一方、ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（１０μｇ）を、ＸｂａＩ（１００ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌにおいて切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１６μｌ）中で一晩結合させた。これに５倍希釈したＴＥ１４μｌを加え、７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた。次いでこれの１／４量に２０ｕｎｉｔのＸｂａＩを添加し（最終容量２０μｌ）、セルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９を切断した。この反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製した。
【００９０】
挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するため、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液をアガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入された場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。また、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とする方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入された場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的のプラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得した。
【００９１】
▲５▼  ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製
ｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔ（１０μｇ）を、Ｃｓｐ４５Ｉ（４０ｕｎｉｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断し、次いで、同反応液中にＢａｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）、さらにＥｃｏＲＩ（４０ｕｎｉｔ）を順次添加した。２１ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。なお、Ｃｓｐ４５１およびＥｃｏＲＩによる切断は２１ｋｂのＢａｍＨＩＤＮＡ断片を回収する際、他の断片が混入するのを防ぐためである。
【００９２】
ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（５μｇ）を、ＢａｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ中で切断した後フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５によりゲル濾過した。回収したＤＮＡ断片０．５μｇと前述の２１ｋｂのＤＮＡ断片０．５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、１μｌをイン・ビトロ・パッケージングに用いた。
【００９３】
即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を１／４スケールで用い、残りは−８０℃に凍結した。ギガバックＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなったコスミドをある程度選択することができる。本実験では、１０個のコロニーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的のクローン（ウイルスゲノムが正しく連結されたクローン）を容易に得ることができた。コスミドの扱い方については、常法（斎藤  泉他、実験医学：７：183-187, 1989)に従って行った。
【００９４】
パッケージングされたコスミドを大腸菌ＤＨ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に感染させた。即ち、３枚のＡｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍｌのＡｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、１／２０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養した。
ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制限酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの割合を調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍｌのＡｐ+ ＬＢで、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製した。次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＤｒａＩ切断により確認した。目的とする方向に挿入された場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入された場合１．４ｋｂの断片を生じる。これにより目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得した。
【００９５】
実施例３
（アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複合体（Ａｄ５  ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製）
▲１▼  アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５  ｄｌＸ（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985))またはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを用いる。Ａｄ５  ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ  １０本分）にまたＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを２９３細胞にそれぞれ感染させ、培養を行った。
即ち、Ａｄ５−ｄｌＸまたはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／ｍｌ）を０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はがれた細胞を遠心分離により集めた。アデノウイルス粒子のほとんどはメディウム中ではなく細胞の核内にいるので感染細胞からウイルスを精製できる利点がある。（以下の操作は非無菌的に行う。）
【００９６】
▲２▼  得られた細胞をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、密封型ソニケーターを用いて細胞を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させた。
▲３▼  得られた破砕物を遠心分離により沈澱を除いた後、超遠心分離機  ＳＷ２８チューブに塩化セシウム溶液（比重１．４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッション遠心による濃縮を行った。
【００９７】
▲４▼  界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移した。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取した。同時にもう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たした。
これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけた。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配ができたチューブに乗せ替えた。さらに、３５ｋｒｐｍ、４℃４時間以上超遠心にかけた。
【００９８】
▲５▼  白いウイルスのバンドを分取し、等量の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満たした。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出された。
【００９９】
▲６▼  上記のチューブを、５５ｋｒｐｍ、１５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有無を確認する。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集めた。
▲７▼  ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡ−ＴＰＣの量をＯＤ260 から通常のＤＮＡと同様に算出した。
▲８▼  得られたＡｄ５ｄｌＸおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡ−ＴＰＣを、第３ステップの組換えアデノウイルス作成のため、充分量のＡｇｅＩで２時間切断し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムでゲル濾過後、−８０℃に保存した。
【０１００】
なお、ＤＮＡ−ＴＰＣは制限酵素による切断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処理・エタノール沈澱はできない。濃縮法は塩化セシウム平衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。１０Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ−ＴＰＣを得ることができた。
▲９▼  一部を分取し、泳動用ＢＰＢ  ｂｕｆｆｅｒを１０μｌ加えた後に、１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１０分間反応させて末端蛋白を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル電気泳動で分離し、完全切断を確認した。
ＡｇｅＩ切断ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素ｂｕｆｆｅｒを、遠心ゲル濾過によって除いた後、分注し−８０℃に保存した。
【０１０１】
実施例４
（ｌｏｘＰ挿入組み換えアデノウイルス（Ａｄ５ｄｌＸ２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺ）の作製）
なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端にＳＶ４０の核移行シグナルを付加したものである。
▲１▼  １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。
▲２▼  発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ  ＤＮＡの８μｇとＡｇｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行った。６ｃｍシャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続けた。
一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直した。細胞数が各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播いた。
【０１０２】
▲３▼  ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９３細胞がやせてきたら早めに加えた。
ウイルスが増殖し細胞が死滅したウエルが７〜２０日の間に現れた。ウエルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペットで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチューブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存した。
▲４▼  １５〜２５日で判定は終了した。比較的遅く細胞が死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選び、超音波破砕後、５０００ｒｐｍ１０分遠心分離して得られた上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０℃に保存した。
早めにウイルス増殖が起こったウエルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。
【０１０３】
▲５▼  ２４穴プレートに２９３細胞を用意し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。
▲６▼  約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次ウイルス液作製と同様に超音波破砕と遠心分離で上清を得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０℃に保存した。他の１ウエルの死滅した細胞を５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけを−８０℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイルス株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全ＤＮＡを抽出した。セルパックには、４００μｌのcell DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDTA)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの10%SDSを加えた。
【０１０４】
▲７▼  ５０℃で１時間処理した後、フェノール・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、ついでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。
その１５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列にＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミドカセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのアガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較した。ＸｈｏＩは挿入したｌｏｘＰ配列内に認識部位があるので、ｌｏｘＰが２個挿入された切断パターンを示すクローンを選択する。説明できないバンドが薄く見えるクローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があるので廃棄した。
【０１０５】
実施例５
（Ｅ２Ａ遺伝子欠損アデノウイルスの作製と構造確認）
組み換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅをそれぞれｍｏｉ＝１０および３で２９３細胞に感染させ、培養を行った。なお、ＮＣｒｅは、ＮＬａｃＺと同様、ＳＶ４０の核移行シグナルをＣｒｅのＮ末端に付加したものである。
４日目に細胞を回収し、前述の方法によりＤＮＡを調製した。ｌｏｘＰで挟まれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が切り出された構造を有するＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺの生成を２つの方法で確認した。
【０１０６】
１．ＳｍａＩ消化
ＳｍａＩ消化の後、ゲル電気泳動した結果、ｌｏｘＰで挟まれた領域が切り出されて生じる４．７ｋｂの断片が認められた。このバンドとＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺ、Ａｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅ、およびＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺにおいて共通して見られる４．４５ｋｂのバンドの濃さの比較から、回収した組換えアデノウイルス中の約３０％がＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺであることが分かった。
【０１０７】
２．ＰＣＲによる確認
調製したＤＮＡ０．１ｎｇをテンプレートとし、下記の条件でＰＣＲを行い、生成物をアガロースゲル電気泳動により分析した。用いたプライマーは、下記に示すオリゴヌクレオチド（１）（配列番号：５）、オリゴヌクレオチド（２）（配列番号：６）、オリゴヌクレオチド（３）（配列番号：７）およびオリゴヌクレオチド（４）（配列番号：８）である。
0003770333.tif 000011
ＰＣＲ反応液組成（総容量２０μｌ）
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３）      １０    ｍＭ
ＫＣｌ                              ５０    ｍＭ
ＭｇＣｌ2                             １．５ｍＭ
ｄＮＴＰ  mixture                     ０．２ｍＭ
プライマー                          各０．２μＭ
テンプレートＤＮＡ                    ０．１ｎｇ
Ｔａｑ  polymerase                    ０．５ｕｎｉｔ
ＰＣＲ反応条件
二本鎖解離  ：  ９５℃            １．５分
アニーリング：  ６４℃            １．０分
伸長反応    ：  ７０℃            １．０分
反応サイクル：                    ３０回
その結果を図６に示す。
プライマーとして（１）と（４）を用いた場合、３９３ｂｐと推定されるバンドが検出され、Ｅ２Ａ遺伝子が欠失したＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺの存在が明らかとなった（図６、レーン１）。
また、（２）と（３）を用いた場合、２２１ｂｐと推定されるバンドが検出され、Ｃｒｅ遺伝子産物により切り出された環状のＥ２Ａ遺伝子の存在が裏付けられた（図６、レーン２）。
以上、１および２の結果から、Ａｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺからｌｏｘＰではさまれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が除去されたＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺの生成が明らかになった。
【０１０８】
参考例１
＜リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子およびＣＡＧプロモーターを有する組換えアデノウイルスベクターの作製＞
（１）リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子発現用カセットコスミドの作製
▲１▼  リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ（ＡＴＣＣ１１３０３−Ｂ２３）をテンプレートとし、５’−プライマーとして下記の（配列番号：９）のオリゴヌクレオチドを、３’−プライマーとして下記の（配列番号：１０）のオリゴヌクレオチドを、耐熱性ポリメラーゼとしてＮＥＢ社製のＶｅｎｔR を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行い、生成物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１ｋｂのバンドを切り出し、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
0003770333.tif 000012
（下線部分は、制限酵素の認識部位である。）
【０１０９】
ＰＣＲ反応条件
緩衝液：  １０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２ｍＭのＭｇＳＯ4 、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＮＥＢ社添付の緩衝液を使用）
耐熱性ポリメラーゼ：  ２ユニット
ｄＮＴＰ：  ４００μＭ
プライマー：    １μＭ
Ｐ１ファージＤＮＡ：  １ｎｇ
２本鎖解離温度：    ９５℃      １．５分間
アニーリング温度：  ６０℃      １．５分間
伸長反応温度：      ７４℃      ２．０分間
反応サイクル：  ２０回
【０１１０】
この断片およびｐＵＣ１９（宝酒造製）をそれぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａＩ（宝酒造製）により同時消化したのち、回収し、モル比が約３：１になるように混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）を用いてligation反応を行った。さらに、この反応混液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天プレートから形質転換株を拾い、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＣｒｅを得た。
【０１１１】
次に、ＣＡＧプロモーターを含むカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔをＳｗａＩで切断したもの１μｇと、ｐＵＣＣｒｅをＰｓｔＩおよびＸｂａＩにより同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）により両端を平滑化して得た約１ｋｂの断片０．１μｇとを混合した。
【０１１２】
▲２▼  次に、混合液にエタノールを加えてコスミドを沈澱させた。沈澱物を遠心分離により取得し、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液（ＴＥ）の５倍希釈液に溶解した。
▲３▼  得られたコスミドをリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中でＡＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量７μｌで一晩結合させた。ついで滅菌水、ＳｗａＩ反応ｂｕｆｆｅｒを加えて４８μｌとしてから７０℃１０分でリガーゼを熱失活させた。
この際、プラズミドと異なり、コスミドでは、環状ではなく直鎖状タンデムに結合した巨大分子が効率よくパッケージされる。
【０１１３】
▲４▼  ２μｌのＳｗａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製）を加え、２５℃で１時間切断した。
ＳｗａＩ切断を行う意味は、カセットコスミドが発現ユニットをくわえ込むことなく再結合するとＳｗａｌ認識配列が再生されるため、このステップで発現ユニットの組み込まれていないコスミドを再切断し、コロニーを作らなくするためである。この方法はインサートをもつカセットコスミドだけを選択する強力な方法である。
▲５▼  常法（Molecular Cloning vol.3 E.34）に従い、カセットコスミドのフェノール抽出、遠心分離、ついでゲル濾過を行った。
▲６▼  再度、Ｓｗａｌ切断を行った。即ち、ＳｗａＩ反応ｂｕｆｆｅｒ中、５μｌのＳｗａＩを加え、２５℃で２時間切断した。その理由は上記の通りである。
【０１１４】
▲７▼  得られたコスミドの１μｌについてイン・ビトロ・パッケージングを行った。
即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を１／４スケールで用い、残りは−８０℃に凍結した。ギガバックＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなったコスミドをある程度選択することができる。本実験では、１０個のコロニーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的の向き（左向き）のクローンを容易に得ることができた。
コスミドの扱い方については、常法（斎藤  泉他、実験医学：７：183-187, 1989)に従って行った。
【０１１５】
▲８▼  パッケージングされたコスミドを大腸菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）に感染させた。
即ち、３枚のＡｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍｌのＡｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、１／２０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養した。
ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、全酵素切断によりインサートが入ったものの割合を調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍｌのＡｐ+ ＬＢで、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製した。
▲９▼  次に、制限酵素切断により、発現ユニットの向きと構造を確認した。
なお、ＮｒｕＩとリガーゼを用いて、発現単位を含むが大部分のアデノウイルスＤＮＡを欠失したプラスミドを作製し、ＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡクローン化の最終確認をした。
【０１１６】
（２）アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複合体（Ａｄ５  ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製
▲１▼  アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５  ｄｌＸ（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985))を用いた。Ａｄ５  ｄｌＸを２９３細胞（Ｒｏｕｘ  １０本分）に感染させ、培養を行った。
即ち、Ａｄ５−ｄｌＸのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／ｍｌ）を０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はがれた細胞を１５００ｒｐｍ、５分にて遠心分離して集めた。アデノウイルス粒子のほとんどはメディウム中ではなく細胞の核内にいるので感染細胞からウイルスを精製できる利点がある。（以下の操作は非無菌的に行った。）
【０１１７】
▲２▼  得られた細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の２０ｍｌに懸濁し、密封型ソニケーターを用い、２００Ｗ、２分（３０秒×４）で細胞を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させた。
ウイルスを細胞内から放出させるには５ｍｌ以下なら凍結融解５回でもよいが、それ以上の容量ではソニケーターが便利である。ただし、必ず密封型（専用カップのあるもの）を用いる。通常の投げ込み型は、たとえ安全キャビネットの中でも危険性がある。
【０１１８】
▲３▼  得られた破砕物を遠心分離（１０ｋｒｐｍ、１０分）により沈澱を除いた後、超遠心機  ＳＷ２８チューブに１５ｍｌの塩化セシウム溶液（比重１．４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッション遠心（２５ｋｒｐｍ、１時間、４℃）による濃縮を行った。
▲４▼  界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移した。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取した。同時にもう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たした。
これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけた。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配ができたチューブに乗せ替えた。さらに、３５ｋｒｐｍ、４℃４時間以上超遠心にかけた。
【０１１９】
▲５▼  白いウイルスのバンドを分取し、等量の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満たした。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出された。エチジウムブロミドは後で除く方法が確立されていないため利用できなかった。
【０１２０】
▲６▼  上記のチューブを、５５ｋｒｐｍ、１５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有無を確認した。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集めた。
▲７▼  ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣの量をＯＤ260 から通常のＤＮＡと同様に算出した。
【０１２１】
▲８▼  得られたＡｄ５ｄ１Ｘ  ＤＮＡ−ＴＰＣを、第３ステップの組換えアデノウイルス作成のため、充分量のＥｃｏＴ２２Ｉで２時間切断した後、−８０℃に保存した。
【０１２２】
なお、ＤＮＡ−ＴＰＣは制限酵素による切断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処理・エタノール沈澱はできなかった。濃縮法は塩化セシウム平衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。１０Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ−ＴＰＣを得ることができた。
▲９▼  一部を分取し、泳動用ＢＰＢ  ｂｕｆｆｅｒを１０μｌ加えた後に、１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１０分間反応させて末端蛋白を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル電気泳動で分離し、完全切断を確認した。
ＥｃｏＴ２２Ｉ切断ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素ｂｕｆｆｅｒを、遠心ゲル濾過によって除いた後、分注し−８０℃に保存した。
【０１２３】
（３）組換えウイルスの分離と高力価ウイルス液の作製
▲１▼  １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。
▲２▼  発現ユニットを組み込んだｐＡｄｅｘ１ｗ  ＤＮＡの８μｇ（３〜９μｇが適当である）とＥｃｏＴ２２Ｉで切断したＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行った。６ｃｍシャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続けた。
一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直した。細胞数が各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播いた。
【０１２４】
▲３▼  ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエルに５０μｌの５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９３細胞がやせてきたら早めに加えた。
ウイルスが増殖し細胞が死滅したウエルが７〜１５日の間に現れた。ウエルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペットで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチューブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存した。
▲４▼  １５〜１８日で判定は終了した。比較的遅く細胞が死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選び、凍結融解６回後、５ｋｒｐｍ１０分遠心して得られた上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０℃に保存した。
早めにウイルス増殖が起こったウエルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。
【０１２５】
▲５▼  ２４穴プレートに２９３細胞を用意し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。
▲６▼  約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次ウイルス液作製と同様に６回の凍結融解と遠心で上清を得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０℃に保存した。２次ウイルス液の力価は１０7 〜１０8 ＰＦＵ／ｍｌ程度であった。他の１ウエルの死滅した細胞を５ｋｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけを−８０℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイルス株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全ＤＮＡを抽出した。セルパックには、４００μｌのcell DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDTA)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの10%SDSを加えた。
【０１２６】
▲７▼  ５０℃で１時間処理した後、フェノール・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、ついでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。
その１５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列にＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミドカセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのアガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較した。発現ユニット内の切断点からアデノウイルスゲノムの左端までのバンドが正確に出現しているものを選択した。また、説明できないバンドが薄く見えるクローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があるので廃棄した。
アデノウイルスＤＮＡは細胞あたり１０，０００コピーに増殖するので、細胞ＤＮＡと一緒に全ＤＮＡを抽出し制限酵素切断によりウイルスＤＮＡのバンドをみることができる。Ｘｈｏｌなどのように認識配列にＣＧを含む酵素は、細胞ＤＮＡを切断しないので、パターンが見やすい。これ以外の酵素を用いるときは、非感染２９３細胞ＤＮＡをコントロールにおくことが必要であった。（ヒト細胞の反復配列由来のバンドが出現した）。
【０１２７】
▲８▼  Ｘｈｏｌ切断で同定された目的のウイルス株の２次ウイルス液の０．１ｍｌを、コラーゲンコートした１５０ｃｍ2 ボトル（培地は２５ｍｌ）の２９３細胞へ感染させた。
３日後に細胞が死滅したら、死細胞ごと２５ｍｌの培地を無菌的に密閉型ソニケーター２００ｗ最高出力２分（３０秒×４回）で破砕してウイルスを遊離させた。
３ｋｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して沈澱を除去し、５ｍｌ凍結用チューブに２ｍｌずつ１３本に分注し、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存し、３次ウイルス液を調製した。３次ウイルス液は本発明の組換えアデノウイルスを含む液であり、１０9 ＰＦＵ／ｍｌ程度の高力価のものであった。
なお、３次ウイルス液５μｌを２４穴プレートの２９３細胞１ウエルに感染し、増殖したウイルスＤＮＡの酵素切断パターンを上記の方法で確認した。もし、欠失ウイルスあるいは親ウイルスとの混合物であることが疑われたら、２次ウイルス液の段階で既にわずかに混在していた欠失ウイルスが増殖が早いため見えてきた可能性があるので、全ての３次シードを廃棄して、別の２次ウイルス液から改めてやり直すか、その１次ウイルス液から限界希釈法により、目的のウイルスを純化した。
【０１２８】
【発明の効果】
本発明により、広範な動物細胞に外来遺伝子を安定な形で導入することのできる組換えＤＮＡウイルスを提供することができる。また、本発明はこの組換えＤＮＡウイルスの簡易な製造方法を提供する。特に、本発明の組換えアデノウイルスは遺伝病の治療に有用である。
【０１２９】
【配列表】
0003770333.tif 000013
【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、コスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗの構造を示す概念図である。
【図２】図２は、コスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔの構造を示す概念図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＡ６０Ｘ９９の構造を示す概念図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９の構造を示す概念図である。
【図５】図５は、プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９の構造を示す概念図である。
【図６】図６は、組換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅを２９３細胞に共感染させた後に回収した細胞からＤＮＡを抽出し、これをテンプレートとしてＰＣＲを行った結果を示す図である。レーン１はプライマー（１）と（４）を用いた場合、レーン２はプライマー（２）と（３）を用いた場合の電気泳動図をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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