(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属に属し７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を７β水酸基を有する胆汁酸へ変換する能力を有するバチルス・エスピーＴＴＵＲ ３０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８８２）。
【請求項２】
バチルス属に属し７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を７β水酸基を有する胆汁酸へ変換する能力を有する微生物を７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を含む栄養培地で培養し培養物中に７β水酸基を有する胆汁酸を生成せしめ、これを採取することを特徴とする７β水酸基を有する胆汁酸の製造方法。
【請求項３】
微生物がバチルス・エスピーＴＴＵＲ ３０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８８２）である請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
７β水酸基を有する胆汁酸が、３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン酸、３α，７β−ジヒドロキシ−１２−ケトコラン酸又は３α，７β，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸である請求項２又は請求項３の製造方法。
【請求項５】
胆汁酸を含む栄養培地がｐＨ８〜１０である請求項２、請求項３又は請求項４の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を利胆剤として有用な３α,７β−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（以下「ウルソデオキシコール酸」という。）等の７β水酸基を有する胆汁酸に変換する能力を有する微生物及び当該微生物を利用した７β水酸基を有する胆汁酸の製造方法に関する。
背景技術
胆汁酸の７α水酸基を７β水酸基へ変換する化学的製造法としては、７α水酸基を７位ケト基へ酸化した後、還元反応に付して７β水酸基とする方法が知られている。
胆汁酸の７α水酸基を７β水酸基へ変換する能力を有する微生物としては、Clostridium absonum（US Patent.4,303,754及びJournal of Lipid Research,22,458−465（1981））及びClostridium limosum（Journal of Lipid Research,25,1084−1089（1984））が知られている。また、胆汁酸の７位ケト基を７β水酸基へ変換する能力を有する微生物としては、腸内細菌として分離されたPeptostoreptococcus productus（Acta Med.Univ.Kagoshima.,24（1）,31−8（1982））、Eubacterium aerofaciens（Acta Med.Univ.Kagoshima.,24（1）,43−7（1982））及びRuminococcus sp.PO1−3（J.Biochem.Toyama Medical and Pharmaceutical University,102,613−619（1987））が知られている。
しかしながら、化学的製造法により７α水酸基の７位ケト基への酸化を行う場合には、７α水酸基以外の水酸基（例えば３α水酸基）も同時に一部酸化されるため、その水酸基を保護する必要がある。また、７位ケト基の７β水酸基への還元反応では、還元剤として金属ナトリウムを用いる方法が一般的であり爆発の危険性を有することから操作性及び安全性の面で問題がある。
微生物を利用した７β水酸基を有する胆汁酸の製造方法においては、使用されるClostridium absonum、Clostridium limosum、Peptostoreptococcus productus、Eubactelium aerofaciens及びRuminococcus sp.が生育できる胆汁酸濃度は低く、更に胆汁酸変換率も低いため、工業的規模で胆汁酸を製造することは不可能であった。例えば、Clostridium absonum及びClostridium limosumが３α,７α,12α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸（以下「コール酸」という。）を３α,７β,12α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸（以下「ウルソコール酸」という。）へ60％以上の変換率で変換する際の基質濃度は、それぞれ0.06％（ｗ／ｖ）及び0.4％（ｗ／ｖ）であり、３α,７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（以下「ケノデオキシコール酸」という。）をウルソデオキシコール酸へ60％以上の変換率で変換する基質濃度は、それぞれ0.02％（ｗ／ｖ）及び0.04％（ｗ／ｖ）である（Journal of Lipid Research,22,458−465（1981）、Journal of Lipid Research,25,1084−1089（1984））。また、これらの微生物はいずれも偏性嫌気性菌であり、酸素の存在下では生育できない。このため培養時に空気を遮断又は酸素を除去する目的で窒素置換等しなければならず、特別な操作及び装置を必要とする。
更に、Clostridium absonumは弱いながらヒトに感染した場合ガス壊疽症状を起こすという病原性（Microbiol.Immunol.,23（7）,685−687（1979））を有しており、工業的培養においてはその取扱いに注意しなければならない。なお、この病原性は主に溶血性、レシチナーゼ生産能に起因している（Journal of Lipid Research,22,458−465（1981）及びInfection and Immunity,9,15−19（1974））ので、これらの性質を有するClostridium limosum（BERGEY'S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY Eighth Edition,557−559（1974））も病原性を示すおそれがある。
発明の開示
本発明者らは、かかる現状に鑑み、胆汁酸水酸基変換能を有する微生物について鋭意研究を重ねた結果、バチルス属に属する新規微生物が、通常の微生物が生育できない高濃度の胆汁酸塩を含有する培地中、好気性条件下でも７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を７β水酸基を有する胆汁酸へ高い変換率で変換する能力を有することを発見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明によれば、バチルス属に属する７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を７β水酸基を有する胆汁酸へ変換する能力を有する微生物及び該微生物を７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を含む栄養培地で培養し、培養物中に７β水酸基を有する胆汁酸を生成させ、これを採取することからなる７β水酸基を有する胆汁酸の製造方法が提供される。
本発明者らは、栃木県足利市内の土壌より、通常の微生物が生育できない高濃度の胆汁酸塩を含有する培地において旺盛に生育し、酸素存在下又は不存在下のいずれでも生育可能な通性嫌気性を示す微生物であって、７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を７β水酸基を有する胆汁酸へ変換する能力を有するバチルス属に属する新規微生物を分離し、この菌株をバチルス・エスピーTTUR 302（Bacillus sp.TTUR 302）と命名し、平成６年11月11日、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）、名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託（FERM BP−4882）した。
このバチルス・エスピーTTUR 302（以下「本発明微生物」という。）は、コール酸及びケノデオキシコール酸等の７α水酸基を有する胆汁酸並びに３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸（以下「７−ケトリトコール酸」という。）、３α,12α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸（以下「７−ケトデオキシコール酸」という。）、３α−ヒドロキシ−7,12−ジケト−５β−コラン酸（以下「7,12−ジケトリトコール酸」という。）及び3,7,12−トリケト−５β−コラン酸（以下「デヒドロコール酸」という。）等の７位ケト基を有する胆汁酸を基質としてこれを７β水酸基を有する胆汁酸へ変換する能力を有しているが、基質である胆汁酸を資化又は分解する性質を示さない。
本発明微生物が、コール酸を60％以上の変換率でウルソコール酸へ変換する際の基質濃度は５％（ｗ／ｖ）、ケノデオキシコール酸を60％以上の変換率でウルソデオキシコール酸へ変換する際の基質濃度は0.2％（ｗ／ｖ）であり、高い基質濃度において実用的な変換率で胆汁酸を変換することができる。
また、本発明微生物は通性嫌気性菌であるため、嫌気性菌を取り扱う際に必要とする特別な操作又は装置を必要とせず、菌の操作法及び培養法が簡便である。
更に、本発明微生物は表３に示す通り、ヒトに感染しガス壊疽症状を起こすという病原性の原因である溶血性、レシチナーゼ産生能を示さず、菌の操作及び培養において安全である。
土壌中からの本発明微生物の分離は次の方法によった。
土壌を３％のコール酸ナトリウムを含む培地（グルコース0.1％、ペプトン0.5％、リン酸二カリウム0.2％）に少量懸濁し、30℃で６日間静置培養した。培養液を後述する薄層クロマトグラフィーで分析し、ウルソコール酸を生成した培養液の一部（５％相当量）を３％のコール酸ナトリウムを含む同一組成の培地に接種し30℃で２日間静置培養した。薄層クロマトグラフィーによりウルソコール酸の生成を確認した培養液の一白金耳量を肉汁寒天平板培地に画線培養し、菌株を純粋分離した。これらの菌株を各々５％のコール酸ナトリウムを含む培地（グルコース0.2％、ポリペプトン0.5％、イーストエキス0.5％、リン酸二カリウム0.1％、硫酸マグネシウム７水和物0.02％炭酸ナトリウム0.01％；pH8）で37℃で３日間培養し、培養液中のウルソコール酸の定量によりコール酸からウルソコール酸への変換能の高い菌株を得た。
本発明微生物の菌学的性質は以下の通りであり、これらの試験及び分類方法は「バージーズ・マニュアル・オブ・システマティクバクテオロジー（BERGY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology）」に準拠して行ったものである。
TTUR 302菌の菌学的性質
（ａ）形態学的性質
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（ｂ）培養的性質
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（ｃ）生理学的性質
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以上の検索の結果、本発明微生物は、通性嫌気性の芽胞形成菌であることから、バチルス（Bacillus）属に属する微生物であると考えられる。しかしながら、カタラーゼを産生しないので、一般的なバチルス属微生物とは異なる。
また、バチルス属微生物の中で嫌気的に生育し、かつカタラーゼを産生しないものとしてはB.larvae、B.lentimorbus、B.popilliae等が知られているが、これらの菌との比較を行ったところ、生育温度、生育pH及び栄養要求性等の性質において表４に示した相違点を認めた。
各菌の主な性状の相違点
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したがって、本発明微生物は、これを新菌種として帰属することが適当である。
本発明によれば、ウルソデオキシコール酸等の７β水酸基を有する胆汁酸の生産能を有する微生物を７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を含む栄養培地中で培養することにより、７β水酸基を有する胆汁酸を生成させることができる。
７α水酸基を有する胆汁酸としては、コール酸、３α,７α−ジヒドロキシ−12−ケト−５β−コラン酸及びケノデオキシコール酸が、７位ケト基を有する胆汁酸としては、７−ケトリトコール酸、7,12−ジケトリトコール酸及びデヒドロコール酸が挙げられ、７β水酸基を有する胆汁酸としては、ウルソコール酸、３α,７β−ジヒドロキシ−12−ケト−５β−コラン酸（以下「12−ケトウルソデオキシコール酸」という。）及びウルソデオキシコール酸が挙げられる。
栄養培地中の７α水酸基を有する胆汁酸及び７位ケト基を有する胆汁酸の濃度は、特に限定はないが、0.1〜50％（ｗ／ｖ）、好ましくは0.2〜５％（ｗ／ｖ）の範囲とする。
本発明において使用する培地としては、本発明微生物が培養により増殖しうるものであれば任意のものでよく、例えば炭素源としてはグルコース、フラクトース、麦芽糖、ショ糖、グリセリン、澱粉、フスマ、廃糖蜜等の各種糖質原料が、窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、菜種油粕、各種アミノ酸若しくはアミノ糖等の有機窒素又は硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム若しくは硝酸ナトリウム等の無機窒素が挙げられる。また、このほか、微量の無機金属塩類、ビタミン類、成長促進因子等を添加することが好ましい。
本発明微生物は好気的条件又は嫌気的条件で培養することができる。好気的条件としては、例えば通気撹拌又は往復振とうで、嫌気的条件としては、例えばガスパック等の装置を用いて培養することができる。
培養温度を20〜40℃として、水酸化ナトリウム等で培養液をpH5〜10好ましくはpH8〜10に調整し、1〜6日培養する。
上記培養液から目的とする７β水酸基を有する胆汁酸を採取する方法としては、まず、培養液中の菌及び不要成分を濾過又は遠心分離により除去し、得られた濾液又は上清に塩酸又は硫酸を加えて酸性とし、生成した７β水酸基を有する胆汁酸を沈殿させる。更に、この沈殿物を濾別し、再結晶操作を行い高純度の７β水酸基を有する胆汁酸を得る方法が挙げられる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を実施例をもって説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
各実施例において、生成物の同定は、以下の条件による薄層クロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィーにより行った。
（１）薄層クロマトグラフィー
担体；Kieselgel 60（0.25mm厚、メルク社製）
展開溶媒；クロロホルム／イソプロパノール／酢酸（７／２／１体積比）
発色；リンモリブデン酸−硫酸試薬（リンモリブデン酸1gをメタノール20mlに溶解し、濃硫酸1mlを添加したもの）を噴霧し、胆汁酸スポットが濃青色となるまで加熱発色
（２）高速液体クロマトグラフィー
カラム；イナートシルODSカラム（カラムサイズ4.6φ×250mm、ジーエルサイエンス社製）
移動層；メタノール／精製水／リン酸（60／40／0.02M重量比）流速；1.0m／min
検出；示差屈折
＜実施例１＞
グルコース2g、ポリペプトン5g、イーストエキス5g、リン酸二カリウム1g、硫酸マグネシウム（７水和物）0.2g、コール酸50g、水酸化ナトリウム5g、炭酸ナトリウム1gを精製水1lに溶解し、121℃で15分間滅菌し、培地とした（pH8：コール酸５％（ｗ／ｖ））。
この培地20mlを試験管（３φ×20cm）に分注し、予め上記培地からコール酸及び水酸化ナトリウムを除いた組成の培地20ml入りの試験管中で37℃で20時間振とう培養して増殖させた菌液1mlを無菌的に接種した。これを37℃で４日間振とう培養し、遠心分離で菌体を除去して得られた培養上清に希硫酸を添加して酸性にした。生成した沈殿物を採取し、乾燥して白色粉末0.98gを得た。この一部を採取し高速液体クロマトグラフィーによりウルソコール酸、コール酸、７−ケトデオキシコール酸の生成比率を求めたところ、ウルソコール酸71.8％、コール酸14.0％、7−ケトデオキシコール酸14.2％であった。
＜実施例２＞
実施例１の培地中のコール酸量を１％（ｗ／ｖ）、水酸化ナトリウム量を0.1％（ｗ／ｖ）とし、培養時間を20時間とした以外は実施例１と同様に操作した。培養後に得られた生成物の組成を求めたところ、ウルソコール酸75.0％、コール酸8.4％、７−ケトデオキシコール酸16.6％であった。
＜実施例３＞
実施例１の培地量を40mlとし、培養日数を３日間、培養法を静置培養とした以外は実施例１と同様に操作した。培養後に得られた生成物の組成を求めたところ、ウルソコール酸63.6％、コール酸35.0％、７−ケトデオキシコール酸0.9％であった。
＜実施例４＞
実施例３の培地中のコール酸量を１％（ｗ／ｖ）、水酸化ナトリウム量を0.1％（ｗ／ｖ）とした以外は実施例３と同様に操作した。培養後に得られた生成物の組成を求めたところ、ウルソコール酸82.3％、コール酸17.4％、７−ケトデオキシコール酸0.3％であった。
＜実施例５＞
実施例４の培地中のコール酸を7,12−ジケトリトコール酸に変えた以外は実施例４と同様に操作した。培養後に得られた生成物の組成を求めたところ、ウルソコール酸75.2％、コール酸19.0％、12−ケトウルソデオキシコール酸1.4％、７−ケトデオキシコール酸4.2％であった。
＜実施例６＞
実施例４の培地中のコール酸を７−ケトデオキシコール酸に変えた以外は実施例４と同様に操作した。培養後に得られた生成物の組成を求めたところ、ウルソコール酸81.1％、コール酸16.5％、７−ケトデオキシコール酸1.3％であった。
＜実施例７＞
実施例４の培地中のコール酸を３α,７α−ジヒドロキシ−12−ケト−５β−コラン酸に変えた以外は実施例４と同様に操作した。培養後に得られた生成物の組成を求めたところ、ウルソコール酸81.2％、コール酸15.7％、12ケトウルソデオキシコール酸2.2％であった。
＜実施例８＞
実施例４の培地中のコール酸をケノデオキシコール酸に変えその量を0.2％（ｗ／ｖ）とした以外は実施例４と同様に操作した。培養後に得られた生成物の組成を求めたところ、ウルソデオキシコール酸63.1％、７−ケトリトコール酸3.2％、ケノデオキシコール酸33.5％であった。
＜実施例９＞
実施例４の培地中のコール酸を７−ケトリトコール酸に変えその量を0.5％（ｗ／ｖ）とした以外は実施例４と同様に操作した。培養後に得られた生成物の組成を求めたところ、ウルソデオキシコール酸75.3％、７−ケトリトコール酸8.5％、ケノデオキシコール酸16.0％であった。
産業上の利用可能性
上述のようにバチルス属に属し７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を７β水酸基を有する胆汁酸へ変換する能力を有するバチルス・エスピーTTUR 302を７α水酸基又は７位ケト基を有する胆汁酸を含む栄養培地で培養し、培養物中にウルソデオキシコール酸等の７β水酸基を有する胆汁酸を生成させ、これを採取することからなる７β水酸基を有する胆汁酸の製造方法が提供される。
本発明微生物による胆汁酸製造方法は、従来の化学的製造方法に比べ操作が簡便かつ安全である。また、従来の微生物を利用した製造方法と比較して、本発明微生物が通性嫌気性菌であることから好気的な条件下でも、高い基質濃度条件で胆汁酸への変換を行うことができるので、工業的生産において特に有用である。更に、病原性を示すおそれがある溶血性、レシチナーゼ生産能を有していないので菌の操作及び培養において安全であり、きわめてすぐれた方法である。