(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を含有する全血試料のグルコース濃度測定用試薬ストリップにおいて、
（ａ）比較的大きい細孔を有する試料側と比較的小さい細孔を有する試験側とを有する異方性膜であって、試料側に試料を受容し、その試料を試験側に通過させるように適合された該膜及び、
（ｂ）該膜に含浸された試験試薬であって、
（１）グルコースと酸素とから過酸化水素を生成するための成分、
（２）指示薬の変色を起こすように該過酸化水素と反応するための該指示薬及び、
（３）アクリル酸ポリマーであって、その濃度が約０．１〜約４％Ｗ／Ｖの範囲にあり、グルコース濃度測定に対して赤血球の影響を低減させる該アクリル酸ポリマーを含む該試験試薬
を含む該試験ストリップ。
【請求項２】
膜のための熱可塑性支持体をさらに含む請求項１記載の試薬ストリップ。
【請求項３】
グルコースと酸素とから過酸化水素を生成するための成分がグルコースオキシダーゼを含む請求項１または２記載の試薬ストリップ。
【請求項４】
指示薬が、ペルオキシダーゼならびに、（ａ）３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩（ＭＢＴＨ）と３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）との組合せ、（ｂ）ＭＢＴＨと３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸（ＤＣＨＢＳ）との組合せ及び（ｃ）［３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン］Ｎ−スルホニルベンゼンスルホン酸一ナトリウム（ＭＢＴＨＳＢ）と８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム（ＡＮＳ）との組合せからなる群から選択される組成物を含む請求項１〜３のいずれかに記載の試薬ストリップ。
【請求項５】
指示薬がペルオキシダーゼとＭＢＴＨＳＢ−ＡＮＳとを含む請求項４記載の試薬ストリップ。
【請求項６】
アクリル酸ポリマーの分子量が約２００，０００〜約４，０００，０００の範囲である請求項１〜５のいずれかに記載の試薬ストリップ。
【請求項７】
アクリル酸ポリマーの分子量が約７５０，０００である請求項６記載の試薬ストリップ。
【請求項８】
試料を受容し、検出可能割合の試料を試料側に通すために膜の試料側に取り付けられた多孔性輸送層をさらに含む請求項１〜７のいずれかに記載の試薬ストリップ。
【請求項９】
試験試薬が、指示薬の変色を抑制する抑制剤をさらに含む請求項１〜８のいずれかに記載の試薬ストリップ。
【請求項１０】
赤血球を含有する全血試料のグルコース濃度の測定方法において、
（ａ）異方性膜を準備する段階であって、該異方性膜は、
（１）比較的大きい細孔を有する試料側と比較的小さい細孔を有する試験側とを有し、
（２）グルコースと反応して試験側の色を変化させることができる試験試薬で含浸され、該試薬はグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、被酸化性染料又は染料カップル及び濃度が約０．１％〜約４％Ｗ／Ｖであるアクリル酸ポリマーを含むようにしてなる該異方性膜を準備する段階であり、
（ｂ）該膜の試料側に血液を塗布する段階及び
（ｃ）試料側の変色を測定して血液中のグルコース濃度を測定する段階を含む該測定方法。
【請求項１１】
血液中のグルコース濃度が約５０〜約４００ｍｇ／ｄｌの範囲である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
血液のヘマトクリットレベルが約２５％〜約６０％である請求項１０または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は全血試料中のグルコース濃度を測定するための乾性試薬ストリップに関し、より詳細には血液試料のヘマトクリットに比較的無感応のストリップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物学的流体試料のグルコース濃度を、試験するのに、酵素系組成物を加えた乾性試薬ストリップが診療所、医院、病院及び家庭で広く使用されている。実際に、試薬ストリップは国内の数百万人の糖尿病患者の多くにとって日常必需品となっている。糖尿病は血液化学的に危険な異常を生じ得るので、糖尿病は視力喪失、腎不全及びその他の重大な医学的結果をもたらす。これらの結果の危険性を最小にするため、大部分の糖尿病患者は自らを定期的に試験し、それに従ってグルコース濃度の調整を、例えば食事制限及び／又はインスリン注射の実施によって行わねばならない。一部の患者は自身の血糖濃度を１日に４回又はそれ以上も試験せねばならない。
【０００３】
糖摂取量を調節するための食事制限及び／又はインスリン注射を行わねばならない糖尿病患者及びこれに関して血糖濃度を頻繁に試験して指導を受けねばならない糖尿病患者にとって、グルコース測定のための迅速で廉価、かつ正確な試薬ストリップを入手することは特に重要である。
【０００４】
公知の試薬ストリップは、ストリップに塗布された血液試料のグルコース濃度に依存して異なった色を呈する指示薬を含有する。これらのストリップの一部は、グルコースをグルコン酸と過酸化水素とに酸化することができるグルオキシダーゼといった酵素を含んでいる。これらのストリップはまた、被酸化性染料と、過酸化水素の存在下で被酸化性染料の酸化を選択的に触媒することができる過酸化活性を有する物質も含有している（例えば、１９９０年６月１９日発行のフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）らの米国特許第４，９３５，３４６号を参照）。
【０００５】
試験が家庭、医院、クリニック又は病院で行われるにしろ、グルコース測定の正確さと再現性は極めて重要である。呈色試薬ストリップの場合、変色が顕著で、血液中のグルコース以外の化合物の変動に無感応であることが望ましい。目読試薬ストリップの場合、視力が弱った糖尿病患者が、グルコース濃度に依存して有意な変色を示す試験試薬を所有することは特に重要である。所与の波長における吸光度及び／又は反射率の変化によって示される変色もメーター読みストリップの正確さにとって重要である。
【０００６】
試薬ストリップの性能は種々の妨害因子の存在によって影響されることがあり、臨床化学的な妨害物の影響を除く必要性が幾人かのものによって認められている。例えば、１９９４年１月１９日発行のアーター（Ａｒｔｅｒ）らの欧州特許出願第９３３１２９０，８号に、水性流体中の分析物の測定のための分析素子が開示されている。この素子は流体中に存在する遊離スルフヒドリル基を結合できる試薬を含んでいる。アーターらの主な関心はアセトアミノフェノン、サリチレート、クレアチニン、コレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド類、グルコース及び尿酸といった分析物の検出である。彼等は、ペルオキシダーゼ結合レドックス化学によって検定される過酸化水素を生成する酵素を用いている。妨害スルフヒドリル基（例えば、ある種の投薬を受けている人の血清中に現れるＮ−アセチルシステイン）は流体中に存在して、分析物の不在下でさえ、酸化／還元を開始させる。アーターらはスルフヒドリル基と反応し、結合する試剤を加えることによって、妨害遊離スルフヒドリル基の問題に取り組んでいる。適当な試剤物質としてマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、硝酸銀及び塩化金が挙げられる。
【０００７】
１９９３年２月９日発行のイスメイル（Ｉｓｍａｉｌ）らの米国特許第５，１８５，２４７号に、種々の組成物の添加により安定化された酵素系試験ストリップが開示されている。このストリップは熱安定性を付与する試剤の中のイミダゾールを含むが、イミダゾールは、酸化水銀とサルコシンとを含有する「アスコルベート妨害組成物」にストリップが含浸されている場合に有効であるに過ぎない。試剤に重金属酸化物を加えることは、この酸化物が有毒であるため、一般に望ましくない。
【０００８】
１９９３年１２月１５日発行のマチンガー（Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ）らの欧州特許出願第９３３０３６４３，６号に全血中のグルコースを測定するための試薬ストリップが開示されている。このストリップは、変色してグルコース濃度を示す試薬系を含有した試験パッドを有する。試験パッドは、比較的大きい細孔を主要面の近くに有し、反対の面に比較的小さな細孔を有する異方性膜から形成されている。パッドの大細孔面に多孔性の輸送媒体が取り付けられている。全血試料は輸送媒体に塗布され、この媒体は検出可能量の試料をパッドの大細孔側に輸送する。次いで、試料中のグルコースが反対側に向って移動し、そこで試薬と反応して、パッドの小細孔側から見ることができ、かつ試料中のグルコース濃度を示す変色を起こす。
【０００９】
カイザー（Ｋｉｓｅｒ）らの米国特許第５，３０６，６２３号に、全血から赤血球を分離するための分離マトリックスを含む血糖試験ストリップが開示されている。試験試薬は分離された成分と反応して、血液中のグルコース濃度を示す変色を起こす。分離層に含めるのに開示された成分の中にポリアクリル酸ポリマー（カーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ））がある。これらの「分離成分」（特に説明なしに「ヘマトクリット調節剤」とも呼ぶ）は一般に別個の分離層中に存在するが、カイザーらはまた、信号発生成分と血液分離成分とを含む試薬を含有した単層マトリックスを開示している。いずれの場合も、具体的には、分離成分は７％〜３５％Ｗ／Ｖの範囲の量で含まれる。実際には、この濃度ではカーボポールはこれらの試薬中で使用することはできない。
【００１０】
血糖を測定する試薬ストリップの変色に妨害因子が影響を与えることは知られている。例えば、グルコース測定の際の変色低下は一般に血液中の赤血球の濃度（ヘマトクリット）と相関があると思われる。
【００１１】
グルコース含有血液にさらしたとき、グルコース濃度連続値に従って顕著に変色する試薬ストリップが求められている。理想的には試薬ストリップは、２５％〜６０％ヘマトクリットの範囲に亘って変化するヘマトクリットレベルを有する全血にさらされた場合でさえ、約４０〜５００ｍｇ／ｄｌの範囲に亘って正確なグルコース濃度を与えるべきである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、全血試料中のグルコース濃度を迅速に、かつ正確に測定するための試薬ストリップ及び方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明に従えば、赤血球を含有する全血試料のグルコース濃度測定用試薬ストリップは、
（ａ）比較的大きい細孔を有する試料側と比較的小さい細孔を有する試験側とを有する異方性膜であって、試料側に試料を受容し、その試料を試験側に通過させるように適合された該膜及び
（ｂ）該膜に含浸された試験試薬であって、
（１）グルコースと酸素とから過酸化水素をつくるための成分、
（２）指示薬の変色を起こすように該過酸化水素と反応するための該指示薬及び、
（３）アクリル酸ポリマーであって、その濃度が約０．１〜約４％Ｗ／Ｖの範囲にあり、グルコース濃度測定に対して赤血球の影響を低減させる該アクリル酸ポリマーを含む該試験試薬
を含む。
【００１４】
本発明の方法において、赤血球を含有する全血試料のグリコース濃度の測定方法は、
（ａ）異方性膜を準備する段階であって、該異方性膜は、
（１）比較的大きい細孔を有する試料側と比較的小さい細孔を有する試験側とを有し、
（２）グルコースと反応して試験側の色を変化させることができる試験試薬で含浸され、該試験はグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、被酸化性染料又は染料カップル及び濃度が約０．１％〜約４％Ｗ／Ｖであるアクリル酸ポリマーを含むようにしてなる該異方性膜を準備する段階、
（ｂ）該膜の試料側に血液を塗布する段階及び
（ｃ）試料側の変色を測定して血液中のグルコース濃度を測定する段階を含む。
【００１５】
本発明の試薬ストリップは、グルコース濃度の範囲に亘って、未測定の血液試料中のグルコース濃度を比較的簡単、迅速に測定することができる。この試薬ストリップは、約２５％〜６０％ヘマトクリットの範囲内のヘマトクリットレベルを有する全血試料について実質的に一定値のグルコース濃度を与える。
【００１６】
本発明のストリップは、赤血球を含有した、試料側に塗布される全血試料を受容するのに適している。試料容積は測定することも、妥当な範囲内に調節することも必要ない。膜の多孔度は、流体が例えば毛管作用で試料側から試験側に通過することを可能にする。したがって、試験試薬は血液中のグルコースと反応して試験側上又はその近くで変色を起こすことができる。変色は試料中のグルコース濃度に依存する。血液中のグルコース濃度は、例えば次の様々な方法で測定することができる。試験側の色を検量された対照又は色チャートと比較する方法，反射測光法，又はグルコース濃度範囲に対応する一連のセグメントを準備し、特定の時間的制限内で変色する最後のセグメントを書き留めてグルコース濃度を測定する方法。変色の検出を困難にする、濃く着色した赤血球は、試料側の大細孔から試験側の小細孔まで変化している異方性膜の試料側の近くでろ過により除かれる。多くの種類の材料が本発明の試薬ストリップの各種成分に使用することができる。これらの材料の一部はカイザーらの、１９９４年４月２６日と１９９５年５月２３日に発行されたそれぞれ米国特許第５，３０６，６２３号と同第５，４１８，１４２号に開示されている。
【００１７】
試薬ストリップは、グルコースを過酸化水素に変えるグルコースオキシダーゼといった成分及び試料中に存在するグルコースから生成される過酸化水素を検出する１種又は２種以上の成分を含む。過酸化水素を検出するための成分はペルオキシダーゼであってよく、好ましくはセイヨウワサビのペルオキシダーゼであり、反応の過程で変色する「指示薬」と一緒に用いられる。指示薬は被酸化性染料又は染料カップルであってよい。
【００１８】
試験試薬は、ヘマトクリット（全血試料中の赤血球の百分率）の変動が測定グルコース濃度に与える影響を低減させるアクリル酸ポリマーをさらに含む。
【００１９】
本発明の試料ストリップ及び方法は、約４０〜５００ｍｇ／ｄｌの範囲のグルコース濃度と約２５％〜６０％の範囲のヘマトクリットレベルとを有する血液試料中のグルコース濃度の測定を可能にする。
【００２０】
本発明は全血中の血糖濃度を測定するための乾性試薬ストリップである。このストリップのキイとなる要素は試験試薬を加えた多孔性膜である。ストリップは塗布される血液試料中のグルコースに応答して変色する。
【００２１】
膜は均一組成物のものでよく、又は被覆された基体であってもよい。膜は試料側と変色が観察される試験側とを有する。好ましくは膜は異方性であり、より好ましくは広い範囲の細孔寸法を有する。例えば、細孔寸法の勾配は最大細孔対最小細孔の比は約１００〜４００の範囲である。細孔が最小である側の膜では、空孔容積は比較的小さく、典型的には膜の厚さの２０％までを構成する層内では膜の材料は、一般に極めて緻密である。この層内では細孔寸法は好ましくは、約０．１〜約０．８ミクロンの範囲であり、呼称寸法は好ましくは約０．３〜０．４ミクロンである。大細孔側では細孔寸法は好ましくは約４０〜約１２５ミクロンの範囲である。血液が試料（大細孔）側に塗布されると、試料は膜に浸透するにしたがって、次第に小さくなっている細孔に出会う。結局は、赤血球といった固形物はもはや浸透できない膜内位置に到達する。まだ溶解グルコースを含有した試料の残部は試験側まで浸透する。膜のこの異方性が、固形物のろ過が行われている間でも膜を通過する比較的大きな流量を可能にする。
【００２２】
試料が膜を通過するとき、試薬との反応により試験側の近くの空孔で光吸収性染料が形成又は漂白される。
【００２３】
ポリスルホン類及びポリアミド類（ナイロン）は適当な膜材料の例である。同等の性質を有するその他のポリマーも使用することができる。ポリマーを変性して、膜の表面が中性、陽性又は陰性となるように電荷構造を与える他の官能基を導入することができる。
【００２４】
膜を形成する多孔性材料をつくる好適な方法は支持コアを用いないでポリマーを流延することである。このような膜は例えば、メリーランド州チモニウム市メンテック社（Ｍｅｎｔｅｃ  Ｉｎｃ．）から入手できる異方性ポリスルホン膜である。厚さ約２００ミクロン未満の膜が通常用いられ、約１１５〜１５５ミクロンが好ましい。膜がナイロン又は異方性ポリスルホンである場合、約１３０〜１４０ミクロンの厚さが特に好ましい。
【００２５】
膜は成分混合物に浸漬して膜を飽和させることによって試験試薬で処理することができる。好ましくは、成分の少なくとも一部は膜に順次付与される。過剰の試薬は、例えばエアーナイフ、ドクターブレード及びガラス棒といった機械的手段で除くことができる。次いで、膜は乾燥される。試薬は膜の小細孔（試験）側近く集まる傾向がある。
【００２６】
試験試薬は、（１）グルコースを過酸化水素に変えるための成分、（２）過酸化水素を検出するための成分及び（３）測定されるグルコース濃度に対する血液試料のヘマトクリットレベルの影響を減少させる成分を含む。試薬は、赤血球といった固形分を膜に付着させるか閉じ込めて、生物学的流体から固形物を有効に除去する分離成分を任意にさらに含むことができる。付加的成分も以下に及び実施例に記載の通り含ませることができる。
【００２７】
グルコースを過酸化水素に変えるのに好適な成分として、黒色アスペルギルス又はペニシリュウムから通常得られる酵素が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコース及び酸素と反応してグルコノラクトン及び過酸化水素を生成する。最適なグルコースオキシダーゼ濃度は指示薬系の組成に依存する。例えば、指示薬系がＭＢＴＨＳＢ−ＡＮＳ（以下に説明）であれば、約５００〜１０，０００Ｕ．／ｍｌの範囲のグルコースオキシダーゼが適当であり、より好ましくは約７００〜２，０００Ｕ．／ｍｌ、最も好ましくは約１，０００Ｕ．／ｍｌである。一般に、グルコースオキシダーゼの濃度が高い程、反応は速く進行し、またその逆である。
【００２８】
こうして生成された過酸化水素は、過酸化水素と指示薬との間の反応を選択的に触媒するペルオキシダーゼを含む過酸化水素検出用成分と反応する。ペルオキシダーゼは種々の基質から水素原子を除くことができる酸化剤として過酸化水素を用いる。適当なペルオキシダーゼはフェリプロトポルフィリン及び植物から得られるレッドヘミンを含有することができる。動物から、例えば動物の甲状腺から、得られるペルオキシダーゼも適当である。セイヨウワサビのペルオキシダーゼは過酸化水素を検出するための構成成分として特に好適である。
【００２９】
好ましくはペルオキシダーゼによって触媒された過酸化水素は直接又は間接に反応して、所定波長領域で光を吸収する指示薬染料を形成又は分解する。好ましくは、指示薬染料は、試料又は試薬が強く吸収する波長とは異る波長で強く吸収する。指示薬の酸化体は、膜の試験側の変色を明示する着色、淡着色又は無色の最終生成物であってよい。即ち、試薬は漂白される着色領域によって、あるいは発色する無色領域によって試料中のグルコースの存在を示すことができる。
【００３０】
本発明に有用な指示薬として１成分及び２成分発色性基質の両方がある。１成分系として芳香族アミン、芳香族アルコール、アジン及びテトラメチルベンジジン塩酸塩といったベンジジンが挙げられる。適当な２成分系として、１成分がＭＢＴＨ、ＭＢＴＨ誘導体（例えば、引用により本明細書に組み入れられる米国特許出願第０８／３０２，５７５に開示されたものを参照）又は４−アミノアンチピリンであり他の成分が芳香族アミン、芳香族アルコール、共役アミン、共役アルコール又は脂肪族アルデヒドであるものが挙げられる。２成分系の例は３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩（ＭＢＴＨ）と３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）との組合せ、ＭＢＴＨと３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸（ＤＣＨＢＳ）との組合せ、及び［３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン］Ｎ−スルホニルベンゼンスルホン酸一ナトリウム（ＭＢＴＨＳＢ）と８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム（ＡＮＳ）との組合せである。ＭＢＴＨＳＢ−ＡＮＳが好適である。
【００３１】
グルコース測定に対する血液試料のヘマトクリットの影響を減少するための成分はアクリル酸ポリマー（−ＣＨ2 −ＣＨ−ＣＯＯＨ）n である。そのようなポリマーは商標カーボポール（ＣＡＲＢＯＰＯＬ）により一般に知られている。好ましくは、ポリマーの分子量は、約２００，０００〜約４，０００，０００である。分子量約７５０，０００が最も好ましい。好適濃度は約０．１〜４．０％Ｗ／Ｖの範囲であり、約０．５％が最も好適である。
【００３２】
本発明の方法は、グルコース濃度が約５０〜４００ｍｇ／ｄｌの生物学的流体について実施するのが最も好適である。本発明の方法は、グルコース濃度の好適範囲内で用いられ、特にヘマトクリットレベルが好適範囲２５〜６０％である場合、試料中のグルコース濃度の単位当りの変色が従来の試薬ストリップに比較してばらつきが小さい。この有益な効果はグルコースレベルが高いほど大きい。
【００３３】
本発明の試薬ストリップの好適態様において、試薬は変色反応を抑制する抑制剤を含む。この態様において、膜に塗布又は含浸される試験試薬は試験ストリップ表面全体に均一ではない。その代わりとして、試薬は膜に一連の平行縞、即ち、「結果セグメント」（“ｒｅｓｕｌｔ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ”）として好ましく塗布され、その際、隣接の結果セグメント内の抑制剤は段階的に抑制剤濃度が増加している。したがって、次に来る各セグメントは、そのセグメントを変色させるのに段階的により高いグルコース濃度を必要とする。この設計のストリップは「直読式」であり、即ち、直接定量目視読取り値を与える。この態様の詳細は１９９５年３月２７日出願の同時係属米国特許出願第４１１，２３８号に記載されていて、引用により同特許出願を本明細書に加える。
【００３４】
本発明の別の態様において、試薬は抑制剤を含まないが、試薬含浸膜に加えて、膜の試料側に取付けた第２層の多孔性輸送媒体を含む。この「二重層」態様において、輸送媒体は、全血試料を受容して、検出可能量の試料を膜の試料受け表面に輸送するように適合されている。試料は毛管作用によって移動させることができる。輸送媒体は、血液試料の過剰量を保持するための溜めを形成するように、試験パッドの一端又は２端以上を越えるように延びているのが好ましい。したがって、輸送媒体は、血液約１０〜約５０μｌ、好ましくは約３５μｌを保持し、かつ血液約３〜約１０μｌを膜に送ることができることが好ましい。
【００３５】
輸送媒体は綿又は紙といった天然繊維、並びにポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン及びその他のポリマーからつくることができる。ポリエチレンは好適な輸送媒体材料であり、例えば、ジョージア州フェアバーン市ポレックス社（Ｐｏｒｅｘ  Ｃｏｒｐ．）から入手できる多孔性ポリエチレンがある。任意に、試薬ストリップのこの態様は、膜の試験側に取り付けられ、かつ変色を測定できる開口を有する支持層を含むことができる。膜の試験側での変色は血糖濃度が得られる光学センサーによって測定されるのが好ましい。
【００３６】
測定が光学センサーによって（即ち、反射測光法によって）行われる場合、試験側を光源にさらす前後に、１つは２つ以上の検量された参照反射カラーガイドが光源にさらされる。例えば、光をカラーガイド及び試験側から順次センサーに向って反射させることができる。
【００３７】
センサーは、参照体と試験側が順次光源にさらされると変化する信号を発生する。信号の変化は次いで、同様の目視手段と既知グルコース濃度を用いて予め作成された数式に従って試料中のグルコースの濃度レベルに定量的に関係づけられる。この態様の詳細は１９９５年６月２２日提出の同時係属中の米国特許出願第４９３，４３５号に記載されており、同出願を引用により本明細書に加える。
【００３８】
次に、本発明を図面を参照してさらに説明する。図１は全血試料中のグルコース量を測定するための本発明の膜１０を示す。膜１０は、アーチ状態で図示されているが、柔軟で、使用時は一般に平坦な面状である。膜は血液試料が塗布される試料側１２と、変色がグルコースの存在をそこで又はその近くで示す試験側１４とを有する。変色はグルコースと細孔１６に含浸された試薬との相互作用により起こる。好ましくは、細孔寸法は試料側１２の近くで比較的大きく、試験側１４に近づくにつれて寸法が小さくなる。細孔寸法の勾配は試料側１２の近くで赤血球をとじ込めるのに役立つので、赤血球の色はグルコースの存在を示す変色を見る能力を妨害しない。
【００３９】
直読式試験ストリップにおいて、図１の膜は、当該技術分野でよく知られている適当な熱可塑性フィルムであってよい２枚のカバーシートにはさまれる。図２と図３は試験ストリップ２０のそれぞれ試料側２２と試験側２４の平面図である。使用時、血液試料は試料側２２にある開口２６に加えられる。試料はストリップの長手方向に頂部と底部に向って毛管作用によって拡散し、膜を透過する。ベント孔２８は試料がストリップ中に流れ込むのを容易にする。
【００４０】
任意な透明の窓３０，３２から試料が現れることにより、充分な量の試料が測定のために供給されたことが確認される。試験側２４の３４といった指示薬サークルは発色反応に必要な酸素を侵入させ、血糖濃度を示すように標識される。試験が進むにつれて、指示薬サークルは、試料中の血糖濃度がサークルに対応する量に一致又はこれを越えていれば順次変色する。任意な化学タイマーサークル３６は適当な時間がストリップ読取りのために経過したことを示す。（タイマーに関する詳細は１９９５年３月２７日提出の同時係属米国特許出願第４１１，２３８号に記載されている）。図３に描いた結果は試料のグルコース濃度が少なくとも１２０ｍｇ／ｄｌであるが１５０ｍ／ｄｌより低いことを示している。図３では、グルコースとの反応によって生じる変色は無色から着色する場合である。しかし、系はまた、グルコース誘導酸化によって破壊されて着色物から無色への変色に対応する指示薬染料を用いて作用することもできる。
【００４１】
図４は、図１の膜１０の大細孔側が輸送媒体４０に付着された二重層試薬ストリップの透視図である。小細孔側は任意の支持体４２に付着されている。支持体４２は開口４４を有し、この開口を通して光学センサー（図示せず）は血液試料中のグルコースと膜１０中の試薬との相互作用によって試験表面に発現される色を検出することができる。
【００４２】
以下の実施例は、試料のヘマトリクリットの変動に対する感応性の低減における本発明の試薬ストリップのアクリル酸ポリマーの有効性を示す。これらの実施例は限定を意図するものでは決してない。
【００４３】
【発明の実施の形態】
数品種のポリアクリル酸をウィスコンシン州ミルウォーキー市のアルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から購入し、精製しないで用いた。参照材料として、オハイオ州クリーブランド市のビー・エフ・グッドリッチ（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ）から購入したカーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）９１０（ポリアクリル酸）を用いた。アルドリッチとビー・エフ・グッドリッチとから購入したポリアクリル酸は極めて類似した物理的及び化学的性質を示した。
【００４４】
ポリアクリル酸をアセトニトリルに懸濁させ、撹拌中の酵素溶液（表１）にゆっくり投入した。得られた混合溶液を０．１Ｍクエン酸二ナトリウムで調整した。得られた黄褐色溶液を、カリフォルニア州サン＝ディエゴ市のメンテック社（Ｍｅｎｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．）製造のポリスルホン膜に塗布した。この塗布膜を空気循環炉内で５６℃で１０分間乾燥し、その間に膜の色は淡黄色に変った。乾燥膜に染料溶液（表２）を塗布し、上記と同様に再び乾燥した。次いで、膜を血液測定用にストリップ状に切断した。
【００４５】
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【００４６】
0003850497.tif 000003
【００４７】
３つの異なる分子量のポリアクリル酸とカーボポール９１０を用いてストリップを作製し、３つのヘマトクリット値−２５％、４３％及び６０％の全血試料のグルコース濃度の測定に用いた。結果は、ポリアクリル酸を含まない対照を用いて得られた結果と共に表３に示されている。各ポリアクリル酸は大体重合のレベルに応じて異なるヘマトクリット抑制度合を示した。分子量が増すにつれてヘマトクリットに対する効果が大体低下したが、反応完了までの時間は増大し、色強度は低下した。さらに、高分子量ポリマーは難溶性であり、そのために製造工程にとっては余り望ましくない。したがって、ポリアクリル酸の最適分子量は選択に妥協を含み、約７５０，０００である。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
以上の説明及び実施例が本発明の実施を例示するものであることは当業者には理解できるであろう。本発明の範囲と精神を逸脱することなく、本明細書に示した詳細の変更を行うことができる。
【００５０】
以下に本発明の好ましい実施態様を示す。
（Ａ）  赤血球を含有する全血試料のグルコース濃度測定用試薬ストリップにおいて、
（ａ）比較的大きい細孔を有する試料側と比較的小さい細孔を有する試験側とを有する異方性膜であって、試料側に試料を受容し、その試料を試験側に通過させるように適合された該膜及び、
（ｂ）該膜に含浸された試験試薬であって、
（１）グルコースと酸素とから過酸化水素を生成するための成分、
（２）指示薬の変色を起こすように該過酸化水素と反応するための該指示薬及び、
（３）アクリル酸ポリマーであって、その濃度が約０．１〜約４％Ｗ／Ｖの範囲にあり、グルコース濃度測定に対して赤血球の影響を低減させる該アクリル酸ポリマーを含む該試験試薬
を含む該試験ストリップ。
（１）膜のための熱可塑性支持体をさらに含む上記実施態様（Ａ）記載の試薬ストリップ。
（２）グルコースと酸素とから過酸化水素を生成するための成分がグルコースオキシダーゼを含む上記実施態様（Ａ）記載の試薬ストリップ。
（３）指示薬が、ペルオキシダーゼならびに、（ａ）３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩（ＭＢＴＨ）と３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）との組合せ、（ｂ）ＭＢＴＨと３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸（ＤＣＨＢＳ）との組合せ及び（ｃ）［３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン］Ｎ−スルホニルベンゼンスルホン酸一ナトリウム（ＭＢＴＨＳＢ）と８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム（ＡＮＳ）との組合せからなる群から選択される組成物を含む上記実施態様（Ａ）記載の試薬ストリップ。
（４）指示薬がペルオキシダーゼとＭＢＴＨＳＢ−ＡＮＳとを含む上記実施態様（３）記載の試薬ストリップ。
（５）アクリル酸ポリマーの分子量が約２００，０００〜約４，０００，０００の範囲である上記実施態様（Ａ）記載の試薬ストリップ。
【００５１】
（６）アクリル酸ポリマーの分子量が約７５０，０００である上記実施態様（５）記載の試薬ストリップ。
（７）試料を受容し、検出可能割合の試料を試料側に通すために膜の試料側に取り付けられた多孔性輸送層をさらに含む上記実施態様（Ａ）記載の試薬ストリップ。
（８）試験試薬が、指示薬の変色を抑制する抑制剤をさらに含む上記実施態様（Ａ）記載の試薬ストリップ。
（Ｂ）  赤血球を含有する全血試料のグルコース濃度の測定方法において、
（ａ）異方性膜を準備する段階であって、該異方性膜は、
（１）比較的大きい細孔を有する試料側と比較的小さい細孔を有する試験側とを有し、
（２）グルコースと反応して試験側の色を変化させることができる試験試薬で含浸され、該試薬はグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、被酸化性染料又は染料カップル及び濃度が約０．１％〜約４％Ｗ／Ｖであるアクリル酸ポリマーを含むようにしてなる該異方性膜を準備する段階であり、
（ｂ）該膜の試料側に血液を塗布する段階及び
（ｃ）試料側の変色を測定して血液中のグルコース濃度を測定する段階を含む該測定方法。
（９）血液中のグルコース濃度が約５０〜約４００ｍｇ／ｄｌの範囲である上記実施態様（Ｂ）記載の方法。
（１０）血液のヘマトクリットレベルが約２５％〜約６０％である上記実施態様（Ｂ）記載の方法。
【００５２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の試薬ストリップにより、全血試料中のグルコース濃度を、赤血球の妨害を受けずに迅速かつ正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の試薬ストリップの膜を示す透視図である。
【図２】本発明の直読試薬ストリップの試料側を示す平面図である。
【図３】図２のストリップの試験側を示す平面図である。
【図４】本発明の二重層試薬ストリップを示す透視図である。
【符号の説明】
１０  膜
１２  膜の試料側
１４  膜の試験側
１６  細孔
２０  試験ストリップ
２２  試験ストリップの試料側
２４  試験ストリップの試験側
２６  開口
２８  ベント孔
３０，３２  透明窓
３４  指示薬サークル
３６  化学タイマーサークル
４０  輸送媒体
４２  支持体
４４  開口
４６  試験表面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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