(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、コリネ型細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する蛋白質。
【請求項２】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３３１〜３９４１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３３１〜３９４１からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コリネ型細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コリネ型細菌の新規遺伝子に関し、詳しくは界面活性剤耐性遺伝子に類似した遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸は、これらのアミノ酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。この方法では、コリネ型細菌は生育にビオチンを要求する一方、培地中に過剰量のビオチンが存在すると、Ｌ−グルタミン酸が蓄積しないことが知られている。従って、従来のＬ−グルタミン酸の製造法においては、ビオチン濃度を制限した培地で培養するか、あるいはビオチンを充分量含有する培地を用いる場合には、培養の初発または途上でビオチン作用抑制物質として界面活性剤またはラクタム系抗生物質を培地に含有させて培養するかのいずれかの方法が採用されている。しかしながら、特に培地の炭素源として廃糖蜜等の安価ではあるが過剰量のビオチンを含有する原料を使用する場合、培地に添加することが必要なビオチン作用抑制物質が製造コスト高の原因となっていた。
【０００３】
これに対し、本発明者らは、コリネバクテリウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する蛋白質（ＤＴＳＲ蛋白）をコードする遺伝子（ｄｔｓＲ遺伝子）の存在を突き止め、この遺伝子が破壊されたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、野生株がほとんどＬ−グルタミン酸を生成しない量のビオチンが存在する条件においても著量のＬ−グルタミン酸を生成すること、及び、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、ｄｔｓＲ遺伝子を増幅すると著量のＬ−リジンを生産する能力が付与されることを見出している（ＷＯ９５／２３２２４号国際公開パンフレット）。
【０００４】
また、本発明者らは、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与することにより、ビオチン存在下でも安定してＬ−グルタミン酸を発酵生産することができること、及び、このようなビオチン作用抑制物質に対する温度感受性株にＬ−リジン生産性を付与することにより、ビオチン存在下でも、安定してＬ−リジンとＬ−グルタミン酸を同時に発酵生産することができることを見出している（ＷＯ９６／０６１８０号国際公開パンフレット）。
【０００５】
このような、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性に関与する遺伝子として、上記ｄｔｓＲ遺伝子が挙げられるが、この遺伝子がコードするＤＴＳＲ蛋白のアミノ酸配列は、当該蛋白質は Proc.Nati.Acad.Sci.USA vol.83 (1986) 8049-8053; Proc.Nati.Acad.Sci.USA vol.83 (1986) 4864-4868 ; Gene vol. 122 (1992) 199-202 において、プロピオニルコエー（ＣｏＡ）カルボキシレース(PCC)蛋白質βサブユニットとして記載されている蛋白質と相同性があることが判明している。プロピオニルコエー  カルボキシレースは、αケトグルタレートを２−ハイドロキシグルタレート、プロピオニルコエー、Ｄ−メチルマロニルコエー、Ｌ−メチルマロニルコエーを経てスクシニルコエーに変換する代謝経路のうちの１反応を触媒する酵素であり、同代謝経路はＴＣＡサイクルにおいてαケトグルタレートデヒドロゲネースに触媒される反応をバイパスする経路のようである。また、プロピオニルコエー  カルボキシレースはビオチンを補酵素とする酵素である。
【０００６】
これらのことから、プロピオニルコエー  カルボキシレースが触媒する反応、さらにはこの反応を含む上記代謝経路又はその一部が、界面活性剤耐性に関与していることが示唆される。したがって、界面活性剤耐性に関与する遺伝子には、ｄｔｓＲ遺伝子以外にも、プロピオニルコエー  カルボキシレース αサブユニット、あるいは上記代謝経路の各反応を触媒する他の酵素もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子が含まれる可能性が高いと考えられた。また、本発明者らはＤＴＳＲタンパク欠損株が培養にオレイン酸を必要とすることを見出しており、ビオチンを補酵素とするアセチルコエー  カルボキシレースがプロピオニルコエー  カルボキシレースに構造が類似していることから、脂肪酸代謝経路の各反応を触媒する酵素もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子も、界面活性剤耐性に関与している可能性があると考えられた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、コリネ型細菌の界面活性剤等のビオチン作用抑制物質に対する耐性に関与する遺伝子を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ｄｔｓＲ遺伝子をクローニングしたときに、ＤＴＳＲ蛋白質をコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）のすぐ下流に別のＯＲＦが途中まで存在することを見出した。そして、このＯＲＦ全長を含むクローンを取得することに成功し、このＯＲＦがコードする蛋白質がＤＴＳＲ蛋白質と相同性を有することを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質である。
（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有する蛋白質。
【００１０】
上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３３１〜３９４１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２３３１〜３９４１からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１１】
以下、上記のいずれかのＤＮＡを、「本発明の遺伝子」又は「ｄｔｓＲ２遺伝子」、これらのＤＮＡがコードする蛋白質を「ＤＴＳＲ２蛋白質」ということがある。
【００１２】
また、本発明にいうコリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargey's Manual of Determinative Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）を含み、またコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、野生型コリネ型細菌の染色体ＤＮＡの各種断片を、コリネ型細菌で機能するベクターと連結して各種組換えＤＮＡを作成し、この組換えＤＮＡをコリネ型細菌の界面活性剤感受性変異株に導入して形質転換を行い、形質転換株の中から界面活性剤感受性が失われた株を選択し、界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換えＤＮＡを回収し、ベクターに連結されている野生型コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ断片の構造を解析することによって、ｄｔｓＲ遺伝子のすぐ下流にあるＯＲＦとして得られたものである。このように、本発明の遺伝子は、ＷＯ９５／２３２２４号国際公開パンフレットに記載されているｄｔｓＲ遺伝子の取得方法と同様にして取得することができる。以下に、コリネ型細菌の界面活性剤感受性変異株を利用して本発明の遺伝子を取得する方法を説明する。
【００１４】
界面活性剤感受性変異株とは、野生型のコリネ型細菌の生育に影響を与えない濃度の界面活性剤が存在する培地中で生育が悪くなるコリネ型細菌の変異株をいう。例えば界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートの場合、コリネ型細菌の界面活性剤感受性変異株は０．１〜１mg/dlの濃度の上記界面活性剤が培地中に添加されると生育が野生株と比較して悪くなる。一方、野生型のコリネ型細菌は０．１〜１mg/dlの濃度の上記界面活性剤が添加された培地中でも生育に大きな変化はみられない。このような界面活性剤感受性変異株としては、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＪ１１０６０が挙げられる。同株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３６７８が付与されている。
【００１５】
上記のようなコリネ型細菌の界面活性剤感受性変異株から、例えば斎藤らの方法（H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)）に従い染色体ＤＮＡを回収する。回収した染色体ＤＮＡを制限酵素を用いて切断し、コリネ型細菌で機能するベクターに連結し、各種組換えＤＮＡを得る。
【００１６】
この各種組換えＤＮＡをコリネ型細菌の界面活性剤感受性変異株に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。
【００１７】
次に、形質転換株を、一旦、界面活性剤を含まないＭ−ＣＭ２Ｇ寒天プレート（グルコース５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、ＤＬ−メチオニン０．２ｇ、寒天１５ｇ及びクロラムフェニコール４ｍｇを純水１Ｌに含む。ｐＨ７．２）に塗布して数万個のコロニーを形成させる。当該コロニーを３０ｍｇ／Ｌの界面活性剤（Tween40）を含むＭ−ＣＭ２Ｇプレートにレプリカし、界面活性剤含有Ｍ−ＣＭ２Ｇプレート上で良好な生育を示すものを取得することにより、界面活性剤感受性を失った株を取得できる。
【００１８】
界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換えＤＮＡを、野生型コリネ型細菌の染色体ＤＮＡと同様にして調製し、ベクターに連結されている野生型コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。
上記のようにして得られる本発明の遺伝子の例として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９株から得られるｄｔｓＲ２遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列において、ｄｔｓＲ２遺伝子は、塩基番号２３３１〜３９４１に相当する。また、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号３５９〜１９８７は、ｄｔｓＲ遺伝子のコード配列である。また、ｄｔｓＲ２遺伝子がコードするＤＴＳＲ２蛋白質のアミノ酸配列を配列番号３に、ｄｔｓＲ遺伝子がコードするＤＴＳＲ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１９】
尚、本発明の実施例では、上記のようにして得られたＤＮＡ断片は、本発明の遺伝子の３’末端側を一部欠いていた。そのため、配列番号４（配列番号１の塩基番号３６２４〜３６５３に相当する）および配列番号５（配列番号１の塩基番号３７２１〜３７５０に相当する）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）により、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株から、本発明の遺伝子の３’末端側部分を増幅することによって、この部分を取得し、塩基配列を決定した。
【００２０】
本発明の遺伝子は、その塩基配列が明らかにされたので、配列番号１に示す塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによってコリネ型細菌の染色体ＤＮＡライブラリーから選択することによって取得することができる。また、本発明の遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡから本発明の遺伝子全長を増幅することによっても取得することができる。なお、ｄｔｓＲ遺伝子を含むプラスミドｐＤＴＲ６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＤＴＲ６（プライベートナンバーＡＪ１２９６７）株は、１９９４年２月２２日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１６８として寄託され、１９９５年２月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９９４が付与されている。この菌株から調製されるｐＤＴＲ６に含まれるｄｔｓＲ遺伝子及びその下流の領域は、上記ハイブリダイゼーションのプローブに使用することができる。
【００２１】
本発明の遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２３３１〜３９４１で表される塩基配列を有するＤＮＡの他に、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含む。また、配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有する蛋白質であっても、コリネ型細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する機能を有する限り、そのような蛋白質をコードするＤＮＡは、本発明の遺伝子に含まれる。
【００２２】
配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、コリネ型細菌の野生株又は変異株から、配列表の配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２３３１〜３９４１で表される塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを単離することによって、取得され得る。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは温度が完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ〜（Ｔｍ−３０）℃、好ましくはＴｍ〜（Ｔｍ−２０）℃の範囲で、かつ１×ＳＳＣ、好ましくは０．１×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。なお、配列表の配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２３３１〜３９４１で表される塩基配列とｄｔｓＲ遺伝子のコード配列とはストリンジェントな条件ではハイブリダイズしない。
【００２３】
また、上記のような変異を有するＤＴＳＲ２蛋白質をコードするＤＮＡは、部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、不可又は逆位を起こすように塩基配列を改変することによって得られる。また、このような変異を有するｄｔｓＲ２遺伝子は、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、ｄｔｓＲ２遺伝子を含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びｄｔｓＲ２遺伝子を含むＤＮＡを保持する微生物を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。変異処理した後、変異処理されたＤＮＡ又は変異処理された微生物から、これらがコードし又は産生するＤＴＳＲ２蛋白質がコリネ型細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する機能を保持し、かつ、ＤＴＳＲ２蛋白質のアミノ酸配列が変異したものを選択することによって、変異を導入することができる位置、又は変異が生じた位置を決定することができる。導入される変異の位置は、ＤＴＳＲ２蛋白質の機能に実質的に影響のない限り、特に制限されない。また、導入される変異の数は、蛋白質の立体構造における変異されるアミノ酸の位置や種類によっても異なり、ＤＴＳＲ２蛋白質の機能に実質的に影響のない限り、特に制限されないが、通常、１〜２０個、好ましくは１〜１０個である。
【００２４】
ｄｔｓＲ２遺伝子がコードするＤＳＴＲ蛋白質は、ｄｔｓＲ遺伝子がコードするＤＴＳＲ蛋白質と相同性が高く、同様の機能を有すると推定される。したがって、ｄｔｓＲ２遺伝子は、ｄｔｓＲ遺伝子と同様に、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リジン等の製造に用いるコリネ型細菌の育種等に利用できることが期待される。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００２６】
【実施例１】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９(コリネバクテリウム属細菌の野生株）の染色体ＤＮＡの調製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９をＴ−Ｙ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ（Ｄｉｆｃｏ）１％、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）０．５％、ＮａＣｌ０．５％（ｐＨ７．２））１００ｍｌに接種し、温度３１．５℃で８時間培養し、培養物を得た。この培養物を3,000r.p.m.で１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ ６０μｇ 及び制限酵素 Sau3AＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＳＯ4及び１ｍＭ  ジチオスレイトール含有（ｐＨ  ７．４））におのおの混合し、温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してSau3AＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片 ５０μｇ を得た。
【００２７】
【実施例２】
プラスミドベクターＤＮＡを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム属細菌の双方の菌体内で自律複製可能なプラスミドベクターＤＮＡ（ｐＳＡＣ４）２０μｇ 及び制限酵素BamHＩ２００ユニットを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するため、Molecular Cloning 2nd editon（J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis, Cold Spring  Harbor Laboratory Press, p1.56 (1989)）の方法で バクテリアルアルカリホスファターゼ（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。
【００２８】
このBamHＩで消化されたｐＳＡＣ４を１μｇ、実施例１で得られたSau3AＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片を１μg、及び２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭ ＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ  ＤＨ５を形質転換し、これを１７０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地上にまき、約20,000個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
【００２９】
【実施例３】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１０６０の形質転換
上記で述べた約20,000個のコロニーより、組換えＤＮＡの回収を行なった。回収の方法は上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。
【００３０】
５０のバッチに分けた組換えＤＮＡ混合物を電気パルス法を用いた形質転換の常法（特開平２−２０７７９１号公報）に従い、界面活性剤に対する感受性が上昇した変異株ＡＪ１１０６０株に導入した。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ培地上に接種し、３１．５℃で静置培養を行ない、約20,000個の形質転換体を出現させた。次にこれらの形質転換体を界面活性剤３０ｍｇ／ｌを含む同プレートにレプリカし、この中で界面活性剤に対して耐性を示し上記プレート上で生育可能であった株を数株得た。
【００３１】
上記で得られた数株からそれぞれ組換えＤＮＡを抽出し、同ＤＮＡを用いてＡＪ１１０６０株を再形質転換した。ここでも界面活性剤に対して耐性を示した株を得た。これらの株の１株が保持していた組換えＤＮＡをｐＤＴＲ６、他の１株が保持していた組換えＤＮＡをｐＤＴＲ９８と命名した。ｐＤＴＲ６を導入したＡＪ１１０６０菌は、３ｇ／Ｌの界面活性剤を添加した液体培地での生育阻害が抑制されていた（ＷＯ９５／２３２２４号国際公開パンフレット参照）。
【００３２】
【実施例４】
ＤＮＡの調製
上記で得られた組換えＤＮＡを含有するＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ９８から常法に従いプラスミドを調製し、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９に導入した。得られたエシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＤＴＲ９８をトリプトン１％、酵母エキス０．５％及びＮａＣｌ ０．５％からなる培地２０ｍｌに温度３７℃で２４時間前培養し、得られた培養液２０ｍｌを上記と同じ組成の培地１ｌに接種し、温度３７℃で３時間培養したのち、０．２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更に同一温度で２０時間培養を行い、培養液を得た。次いで、この培養液を3,000r.p.m.で１０分間遠心処理して湿潤菌体２ｇを得、これを２０ｍｌの２５％ショ糖を含有する３５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、更にこれにリゾチーム（シグマ社製）１０ｍｇ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）８ｍｌ及び２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ｍｌを各々添加し、温度６０℃で３０分間保温処理し、溶菌液を得た。この溶菌液に、５Ｍ ＮａＣｌ溶液１３ｍｌを添加し、温度４℃で１６時間処理した後、15,000r.p.m.で３０分間遠心分離した。得られた上清液を、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理を行いＤＮＡを沈澱させた。
【００３３】
この沈澱物を減圧乾燥処理した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６ｍｌに溶解し、さらにこれに塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド（１９ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを添加し、39,000r.p.m.で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、ＤＮＡを単離した。又更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析を行い純化された組換えＤＮＡ  ｐＤＴＲ９８を約５００μｇを得た。
【００３４】
【実施例５】
クローン化ＤＮＡの塩基配列の解析
実施例４で得られた組換えＤＮＡ  ｐＤＴＲ９８を用い、クローン化ＤＮＡ断片（約４．８ｋｂｐ）のうち約３．８ｋｂｐの塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用い Sangerの方法に従って行った。その結果、ｐＤＴＲ９８が有するクローン化ＤＮＡ断片は、ｄｔｓＲ遺伝子のコード領域全長を含み、さらにその下流に、ＤＴＳＲ蛋白質と高い相同性を示す蛋白質をコードするＯＲＦを含む約１ｋｂｐの領域を含んでいた。このクローン化ＤＮＡ断片の塩基配列は、配列表配列番号１の塩基番号１〜３８６９に相当する。
【００３５】
上記のＯＲＦにはターミネーションコドンは検出されなかったので、この領域の下流の領域を、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、増幅することによって取得した。ＰＣＲは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたキット（LA PCR in vitro cloning Kit、宝酒造社製）を用い、プライマーは、配列番号４（配列番号１の塩基番号３６２４〜３６５３に相当する）および配列番号５（配列番号１の塩基番号３７２１〜３７５０に相当する）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用して行った。具体的にはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株の染色体遺伝子を常法により取得し、このＤＮＡの１μgを制限酵素ＥｃｏＲＩにて完全分解した。次に、このＤＮＡと、上記キットに含まれているＥｃｏＲＩカセットプライマー、及び配列番号４のプライマーとを用い、９４℃、３０秒；５５℃、２分；７２℃、１分からなるサイクルを３０回繰り返した。次に、この反応液を１００倍に希釈し、その１μｌを鋳型として、配列番号５のプライマーとキットに含まれているカセットプライマーＣ２とを用いて、再びＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は上記と同じサイクルで行った。
【００３６】
増幅された約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を、上記と同様の方法で決定した。このＤＮＡ断片は、上記ＯＲＦを重複して含み、さらにターミネーションコドンを含んでいた。この遺伝子をｄｔｓＲ２遺伝子、この遺伝子がコードする蛋白質をＤＴＳＲ２蛋白質と命名した。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、新規遺伝子であるｄｔｓＲ２遺伝子が提供される。この遺伝子は、コリネ型細菌のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性に関与する遺伝子であるｄｔｓＲ遺伝子に高い相同性を有しており、各種アミノ酸の生産等に利用できることが期待される。
【００３８】
【配列表】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【００４２】
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