(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）発現されるいずれのpIXタンパク質も不活性となるようにpIXコード領域の欠失または突然変異を含み、かつ35kbより大きなサイズのゲノムを有するヘルパーアデノウイルスと、
（ｂ）（ｉ）左側ITRおよび右側ITRならびにパッケージングシグナルを含むウイルスゲノム、および
（ii）そこに挿入された少なくとも１つの外来核酸配列、
を有する35kb以下のヘルパー依存性アデノウイルスベクターと、
を宿主細胞へ導入することを含んでなる、パッケージングされたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを作製するための方法であって、該宿主細胞が該ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの複製、発現およびパッケージングを可能にするが、該ヘルパーアデノウイルスのパッケージングは可能にしない前記方法。
【請求項２】
それ自身の核酸はpIXタンパク質の欠損もしくは不活性のためにビリオン内にパッケージングできないが、イン・トランスで作用して、左側ITRおよび右側ITRならびにパッケージングシグナルを含む35kb以下のサイズの第２のヘルパー依存性ベクターの複製を補完する、35kbより大きいゲノムサイズを有するヘルパーアデノウイルスの作製方法であって、
（ａ）発現されるいずれのpIXタンパク質も不活性となるようにpIXをコードするDNA配列が修飾されているかまたは欠失しているアデノウイルスDNAを含む第１のベクター、および
（ｂ）細菌の複製起点および抗生物質耐性遺伝子を含むAd5ゲノムに追加の核酸配列が挿入されている第２のベクター、
をアデノウイルスベクターの複製を可能にする宿主細胞に導入して、上記ヘルパーアデノウイルスを得ることを含む前記方法。
【請求項３】
pIXコード領域の欠失または突然変異およびスタッファーヌクレオチド配列が挿入されているE3領域を含む、35kbよりも大きいサイズのゲノムを含むヘルパーアデノウイルス。
【請求項４】
（ａ）発現されるいずれのpIXタンパク質も不活性となるようにpIXコード領域の欠失または突然変異を含み、かつ35kbより大きなサイズのゲノムを有するヘルパーアデノウイルス、
（ｂ）ヘルパーアデノウイルスの複製および増殖をサポートするためのE1アデノウイルスタンパク質を発現する少なくとも１つの第１の宿主細胞であって、そこに導入された該ヘルパーアデノウイルスの複製をサポートする第１の宿主細胞、
（ｃ）(i)左側ITRおよび右側ITRならびにパッケージングシグナルを含み、かつその最大35,500bpまでの欠失を含むウイルスゲノムと、
(ii)そこに挿入されている少なくとも１つの外来核酸配列と、
を有する35kb以下のヘルパー依存性アデノウイルスベクター、および
（ｄ）ヘルパーアデノウイルスの存在下で該ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの複製および発現を可能にするが、該ヘルパーアデノウイルスのパッケージングは可能にしない、少なくとも１つの第２の宿主細胞、
を含んでなる、パッケージングされたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを提供するためのキット。
【請求項５】
(Ａ)（ａ）発現されるいずれのpIXタンパク質も不活性となるようにpIXコード領域の欠失または突然変異を含み、かつ35kbより大きなサイズのゲノムを有するヘルパーアデノウイルスと、
（ｂ）（ｉ）左側ITRおよび右側ITRならびにパッケージングシグナルを含むウイルスゲノム、および
（ii）そこに挿入された少なくとも１つの外来核酸配列
を有する35kb以下のヘルパー依存性アデノウイルスベクターと、
を宿主細胞へ導入すること、但し、該宿主細胞は該ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの複製、発現およびパッケージングを可能にするが、該ヘルパーアデノウイルスのパッケージングは可能にしないものであること、および
(Ｂ)15kb以上35kb以下のゲノムサイズを有するパッケージングされたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを回収すること、
を含んでなるパッケージングされたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを作製するための方法。
【請求項６】
(Ａ)（ａ）発現されるいずれのpIXタンパク質も不活性となるようにpIXコード領域の欠失または突然変異を含み、かつCreリコンビナーゼにより認識されるloxP部位に挟まれたパッケージングシグナルを有する修飾された初期領域１(E1)を含む、35kbより大きなサイズのゲノムを有するヘルパーアデノウイルスと、
（ｂ）（ｉ）左側ITRおよび右側ITRならびにパッケージングシグナルを含むウイルスゲノム、および
（ii）そこに挿入された少なくとも１つの外来核酸配列、
を有する35kb以下のヘルパー依存性アデノウイルスベクターと、
を宿主細胞へ導入すること、但し、該宿主細胞は該ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの複製、発現およびパッケージングを可能にし、かつCreリコンビナーゼを発現するが、該ヘルパーアデノウイルスのパッケージングは可能にしないものであること、および
(Ｂ)15kb以上35kb以下のゲノムサイズを有するパッケージングされたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを回収すること、
を含んでなるパッケージングされたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを作製するための方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、哺乳動物細胞内での遺伝子輸送のための増大した安全性および安定性を有するアデノウイルスベクターの構築に関する。本明細書に記載のベクター系は、同時係属特許出願第08/473,168号に記載のヘルパー依存性の系の改善および改変である。
発明の背景
アデノウイルス（Ad）は、線状DNAゲノムを含む正二十面体の、エンベロープを持たないカプシドを特徴とするDNAウイルスの１つの科である。
ヒト・アデノウイルス５型（Ad5）は、初期のウイルス機能と後期のウイルス機能とに分けられる約36kbの線状二本鎖ゲノムを有する（Berkner 1992, Curr. Topics Micro. Immunol. 158:39-66を参照）。本発明の実施形態で用いられる代表的なアデノウイルス５型（Ad5）ゲノムは36kbの線状二重らせんである。その配列は公表されている。［Chroboczek, J., Bieber, F.およびJacrot, B.(1992) The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285;引用により本明細書に組み入れる］。
許容細胞に感染すると、Ad5ウイルスゲノムから転写される最初の領域、すなわち従来のマップの左端にあるE1Aは、他のウイルスの初期および後期遺伝子のトランス型活性化に関与するタンパク質をコードする。同じくゲノムの左端にあるE1Bは、宿主細胞、ならびにウイルスRNAおよびタンパク質の合成を調節するタンパク質をコードし、細胞をE1A誘導アポトーシスから保護する。したがって、E1AおよびE1BによりコードされるE1の機能はウイルス複製には必須である。E1欠失ウイルスは、Ad5のE1を含み発現する293細胞系で増殖させることができる（Grahamら, 1977）。
Ad5の必須の初期領域1Aおよび1B（E1AおよびE1B）を取り除くことにより、E1補完(E1-complementing)293細胞系で生育および増殖が可能な条件付き（conditional）ヘルパー非依存性Adが得られる（Grahamら, 1977, J.Gen. Virol. 36:59-72）。外来遺伝子はこの複製欠損性Adにクローニングされており、これらのベクターは、組換えウイルスワクチンとして遺伝子治療のための哺乳動物細胞への遺伝子の送達用に、または実験研究のための汎用発現ベクターに、と広く用いられている。Adはまた、遺伝学的および生化学的に十分に特性決定されており、操作が簡単で、しかも非常に高い力価にまで増殖させることができる、という利点を有する。さらに、アデノウイルスは、どのような新生物形成性疾患とも関連していない比較的安全なベクターであり、通常、免疫能を有する（immuno-competent）個体において比較的穏やかな感染を引き起こす。
E1欠失Adベクターは4.7kb程度（野生型ゲノムの最大105％まで）のDNA挿入断片を収容することができ、必須でないE3領域で欠失させればクローニング容量をさらに８kb程度まで増大させることができる（Bettら, 1993, J. Virol. 67:5911-5921）。しかしながら、ゲノムサイズを野生型DNA含量の105％より大きく増大させるDNA挿入断片を含むAdベクターは生存不可能であるか不安定であるかのいずれかであり、しばしばDNA再編成を受けて該ベクターの全体サイズを低下させる（Ghosh-Choudhuryら, 1987, EMBO J. 6:1733-1739;Bettら, 1993, J. Virol. 67:5911-5921）。これは多分、DNA含量の増大によってカプシドが不安定になるためである。したがって、「第一世代」のAdベクター（すなわち、E1欠失および／またはE3欠失）中のDNA挿入断片のサイズは、十分なAdコード配列を保持してヘルパー非依存的な増殖を可能とする必要性により制限されており、そのため、ゲノムから欠失させることが可能な「非必須」領域のサイズが制限され、ビリオンの安定性を維持する必要が生じる。
アデノウイルスのカプシドの安定性は、少なくとも部分的に、プロテインIX（pIX）により付与される。pIXは、正二十面体の「面」を形成するヘキソン（hexon）と結合していることが示されている（Furcinittiら, 1989, EMBO J. 8:3563-3570）。pIXは、最初はビリオン形成に必ずしも必要ではないと考えられていたが（ColbyおよびShenk 1981, J. Virol. 39:977-980）、全長ウイルスDNA分子のパッケージングには必要である（Haj-AhmadおよびGraham 1986, J. Virol. 57:267-274）。pIXの欠失または不活性化により、35kbのウイルスDNA（野生型ゲノムの約97％）のみを収容できるカプシドを有する、熱に不安定なビリオンが生じる。つまり、pIXの欠失または不活性化は、野生型ゲノムのサイズよりも小さいウイルスDNAを含むビリオンの選択手段を提供する。
これまでは、Ad（アデノウイルス）DNAパッケージングを達成するのに必要なAd DNAの下限を特定することはできなかった。何故ならば、Ad DNAの複製およびビリオンの形成に必要なタンパク質を全て産生可能にするのに十分なタンパク質コード領域を保持する必要があったからである。ヘルパー依存性の系を開発することによってこの問題は多少解決されている。ヘルパー依存性の系において、ヘルパーウイルスは、実質上全てのウイルス特異的コード配列を欠くヘルパー依存性ベクターのパッケージングにイン・トランス（in trans）で必要な機能を全て提供するものである。ヘルパー依存性ベクターは、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要とされるシス作用性エレメントのみを含む、Ad DNAの複製およびパッケージングに必要な配列は、ゲノムの左端および右端の約500bp内に含まれているので（GrableおよびHearing 1992, J. Virol. 66:723-731）、ヘルパー依存性ベクターは理論上、数百塩基対から野生型Adのサイズより大きなサイズまでの範囲とすることができ、潜在的に最大約37kbまでの外来DNAを担持する。しかしながら、野生型Adよりも実質的に小さいDNAを有するAdベクターは、DNA再編成および多量体化(multimerization)を受けることが実証されている（Fisherら, 1996, Virol. 217:11-22）。
外来遺伝子を哺乳動物細胞へ輸送するためのベクターとしての第一世代のAdベクターのあらゆる利点にもかかわらず、現在のヘルパー非依存性ベクターは、低レベルで発現すると、宿主内での形質導入細胞(transduced cell)に対する免疫応答の誘導をもたらし得る多くのウイルス遺伝子を保持し（Dongら, 1996, Hum. Gene Ther. 7:319-33 1）、その結果、該形質導入細胞が取り除かれる。遺伝的欠陥を修正するためには長期にわたる安定な発現が必要であるため、この免疫応答によって最終的に遺伝的疾患（例えば、嚢胞性繊維症）の治療に対する現行ベクターの有用性が制限される。全部ではないにしても大部分のウイルス特異的コード配列を取り除くことによってウイルス遺伝子の発現を低下させようと試みた結果、Adベクターを作製するためのヘルパー依存性の系が開発された（Mitaniら, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3854-3858）; Fisherら, 1996, Virol. 217:11-22; Kochanekら, 1996, PNAS 92:5731-5736; Parksら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci.印刷中）。以前に、本発明者らは、loxP部位に挟まれている（flanked）パッケージングシグナルを有するヘルパーウイルスを利用したヘルパー依存性の系を開発した（Parksら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci.印刷中）。概略的な原理を図１に示す。Creリコンビナーゼを構成的に発現する293細胞系（293Cre; ChenおよびGraham, 未発表の結果）が感染を受けると、パッケージングシグナルはヘルパーウイルスから効率的に切除されて該ヘルパーウイルスをパッケージング不能にした。しかしながら、このヘルパーウイルスのDNAは、複製してウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントのみを含有するヘルパー依存性ベクターのパッケージングにイン・トランスで必要とされる全ての機能を提供することができるものであった。本発明者らは、ヘルパーウイルスに感染した293Cre細胞内でヘルパー依存性ベクターを連続継代することによって、該ヘルパー依存性ベクターを大量に得ることができた（４×108個の293Cre細胞から1010個の形質導入粒子が得られ、この際のヘルパーウイルスの初期混入レベルは約0.3〜１％であった）。CsCl浮遊密度勾配で分画した後、最終的なベクター調製物は0.01％未満のヘルパーウイルス混入を含んでいた。このレベルは、現在まで報告されているあらゆる他のヘルパー依存性の系におけるレベルよりも低いものである。観察されたヘルパーウイルスのベクターへの混入は、Cre媒介性切除事象を免れるヘルパーウイルスDNA（約10％）が原因であり、したがって感染性（infectious）ビリオンにパッケージングされ得る。現在のところ、何故これらのDNAがCreによって切断されないのかについては判明していないが、それは293Cre細胞内でのCreタンパク質の飽和によるものかもしれない。ベクターストックへのヘルパーウイルス混入の理由が何であっても、残存するヘルパーウイルスを取り除くような系の修飾が望ましいことは明らかである。ヘルパー依存性ベクターの改善された調製方法を提供することが本発明の目的である。本明細書に記載の発明は、単独でベクターの増殖のために用いることもできるし、あるいはCre／loxPヘルパー依存性の系と組合せて、ヘルパーウイルスが混入しないベクター作製のための手段を提供することもできる。
発明の概要
本発明の目的は、簡易かつ有用な改善されたヘルパー依存性アデノウイルスベクター系を提供することであり、この系により高容量のアデノウイルスクローニングベクターを開発することが可能となる。本発明は、pIX欠損Adビリオンが約35kbよりも大きなDNAをパッケージングできないようにする、該ビリオンに課されるDNAサイズパッケージングの制約（constraint）を利用するものである。この制約を用いて、それ自身のDNAをパッケージングしないヘルパーアデノウイルスを開発することができる。さらに、本発明の１つの実施形態は、この方法論をCre−loxPヘルパー依存性の系と組合せて、ベクター調製物中のヘルパーウイルスの量を低減させる。そのようなヘルパーウイルスは、DNAを感染性ビリオンにパッケージングできないが、複製して、Adコード配列の実質的部分を欠くヘルパー依存性アデノウイルスベクターとして知られている第２のベクターをパッケージングするための全ての機能をイン・トランスで提供することができる。
本発明によれば、pIX欠損ビリオン内でのパッケージングの上限よりも大きいサイズのゲノムを有するヘルパーウイルスが提供される。本発明の１つの実施形態は、２つのベクターからのヘルパーウイルスの構築である。好ましくは、その第１のベクターには、pIXをコードするDNA配列を欠失しているか、またはそのDNA配列中に突然変異を含んでいる、環化し修飾されたヒト・アデノウイルス５型（Ad5）ゲノムが含まれる。この第１のベクターを、重複ウイルスDNA配列を含む第２のベクターと結合させて感染性Ad5を得る。この感染性Ad5は、修飾されたpIXを有するヘルパーウイルスとして知られ、かつpIX欠損ビリオン内でのパッケージングの上限よりも大きいゲノムサイズを有する。あるいはまた、ヘルパーウイルスのサイズは、「スタッファー（stuffer）」DNAとして知られる追加のDNA配列をアデノウイルスゲノムに挿入することによって増大させることが可能である。細菌性プラスミドはヘルパーウイルスを得るための好ましいベクターである。しかしながら、例えば酵母プラスミドなどの他のベクターを用いてヘルパーウイルスを構築してもよい。
本明細書に記載のヘルパーウイルスは、それ自身のパッケージングを可能にするために適当なタンパク質（特にpIX）を産生することはできないが、ヘルパー依存性ベクターDNAをpIX欠損ビリオンにパッケージングできるように適度に小さくしたサイズ（すなわち、約35kb未満）のゲノムを有し、ウイルスゲノムの実質的部分を欠いているヘルパー依存性ウイルスベクターのパッケージングに必要な機能を全て生じ得る。そのようなヘルパーウイルスおよびヘルパー依存性ベクターDNAは、適切な宿主細胞に同時感染させると複製できるが、ヘルパー依存性ベクターDNAだけがパッケージングされ得る。場合により、ベクターおよび得られるウイルスの特定の領域を欠失させてもよく、例えば、感染性ウイルスの形態でのウイルスゲノムの複製を許容する細胞内での該ウイルスゲノムの複製を妨げずに該ウイルスゲノムからAdのE1またはE3領域内の配列を削除できる。
ヘルパーウイルスの作製に用いられるベクターおよび得られるヘルパーウイルスはまた、部位特異的リコンビナーゼにより認識され得る配列を含んでいてもよい。例えば、Creリコンビナーゼが本発明での使用に好適である。適切に構築されたウイルスゲノムに作用するCreによって触媒される組換えにより、ウイルスゲノムの左端近傍にあり、感染性粒子へのアデノウイルスDNAのパッケージングに必要である、パッケージングシグナル（ψ）として知られるヌクレオチド配列の切除が起こる。この例および他の例におけるCreリコンビナーゼの使用は、これに限定しようとするものではない。何故ならば、他の部位特異的組換え系が存在しており、それらも使用できるからである。１つの例（しかし、これに限定しようとするものではない）は酵母FLPリコンビナーゼおよびその認識配列の使用であり（O'Gormanら, 1991, Science 251:13-51）、これはこの例および他の例におけるCreタンパク質と容易に置き換われるであろう。
あるいはまた、Adパッケージングシグナル中に突然変異を有し、そのためにDNAパッケージングの効率が低下しているヘルパーウイルスを作製するためのベクター、および得られるヘルパーウイルスは、本発明での使用に好適である。
本発明の第２の実施形態は、第２のウイルス（すなわちヘルパーウイルス）により供給されるウイルス産物の不在下ではウイルスとして複製できないAdゲノムを有するヘルパー依存性ベクターを提供する。本発明の１つの実施形態では、ヘルパー依存性ベクターは、Ad DNAの複製およびパッケージングに必要なウイルス配列だけを含む細菌性プラスミドから誘導される。これらの配列は、通常はゲノムの左端に位置するウイルス逆方向末端反復配列（ITR）およびパッケージングシグナル（ψ）を含む約500pbのウイルスDNAを含有する。細菌性プラスミド構築物において、左側ITRの左端は右側ITRと頭−尾の様式で結合している。好ましくは、ヘルパー依存性ウイルスベクターはまた、外来DNA配列の挿入に適する制限酵素部位も含む。場合により、ヘルパー依存性ベクターの作製に用いられる細菌性プラスミドは、ウイルスDNA配列の実質的な欠失を含んでいてもよく、この欠失に外来DNAの大きな挿入物が置き換わって、全体のサイズが最大35kbの長さになる。そのようなゲノムは、ヘルパーウイルスにより供給されるウイルス産物の不在下ではウイルスとして複製できない。
本発明のもう１つの目的は、最適DNAパッケージング長を有するヘルパー依存性ベクターを提供することである。本発明のAdは、パッケージング上限を有するだけでなく、野生型ゲノムの長さの約75％に相当するパッケージング下限も有する。この最小値よりも小さいサイズのDNAはパッケージングされるが、これらのDNAは明らかに低い効率でパッケージングされ、その結果ウイルスの回収率が低下する。Fisherら(1996)は、突然変異させたパッケージングシグナルを有するヘルパーウイルスを用いたヘルパー依存性の系を開発し、この系を用いて5.5kbのベクターを増幅した。最終的なウイルスストックを分析したところ、ベクターDNAがDNA再編成および多量体化を受けていることが示された。このことは、約27kbより小さいベクターが低い効率でパッケージングされることを示す本発明者らの結果と一致する。再編成を受け、そのためにサイズがこの下限より大きくなっているベクターDNAは、高度に選択されて、より小さいベクターにより量的に多くなる（outgrow）と思われる。
本発明の第３の実施形態は、Creリコンビナーゼを供給する哺乳動物細胞系、例えばヒト細胞系である。あるいはまた、Creは、適切な細胞内でこのCreタンパク質を発現する別の供給源、例えば細菌性プラスミドまたはAd由来のベクターから供給されてもよい。
本発明の第４の実施形態は、Ad pIXタンパク質を発現する哺乳動物細胞系、例えばヒト細胞系を提供する。あるいはまた、pIXは、適切な細胞内でこのpIXタンパク質を発現する別の供給源、例えば細菌性プラスミドまたはAd由来のベクターから供給されてもよい。
本発明の好ましい実施形態において、pIXコード配列の欠失または突然変異を含み、かつpIXの不在下ではパッケージングされないが許容条件下では増殖できるようなサイズのゲノムを有するヘルパーウイルスが提供され、ウイルスゲノムの実質的部分が欠失していてパッケージング可能な全体サイズを有する外来DNAで置き換わっている第２のウイルス（すなわちヘルパー依存性ベクター）の複製をサポートするのに用いられる。非許容条件下（すなわちpIXの不在下）では、本明細書に記載のヘルパーウイルスDNAは感染性ビリオンにパッケージングできないが、約35kbよりも小さいサイズのヘルパー依存性ベクターDNAはpIXを欠くビリオンカプシド中にパッケージングできる。
先に同時係属特許出願第08/473,168号において記載したように、本発明のヘルパー依存性ベクターのパッケージングは、ヘルパーウイルスDNAからのウイルスパッケージングシグナルのCre媒介除去により、ヘルパーウイルスDNAと比べて増強され得る。しかしながら、本明細書に記載の発明は、Cre／loxP系のようにヘルパーウイルスDNAからパッケージングシグナルを除去する必要なしに、低減したヘルパーウイルス力価を示す改善されたヘルパー依存性ベクター系を提供する。
本発明の第５の実施形態は、パッケージングされたヘルパー依存性ベクターを得るためのキットを提供する。
したがって本発明を要約すると以下のようになる。
1．  （ａ）発現されるいずれのpIXタンパク質も不活性となるようにpIXコード領域の欠失または突然変異を含み、かつ約35kbより大きなサイズのゲノムを有するヘルパーアデノウイルスと、
（ｂ）（ｉ）左側ITRおよび右側ITRならびにパッケージングシグナルを含むウイルスゲノム、および
（ii）そこに挿入された少なくとも１つの外来核酸配列
を有する約35kb以下のヘルパー依存性アデノウイルスベクター
とを宿主細胞へ導入することを含んでなる、パッケージングされたアデノウイルスヘルパー依存性ベクターを作製するための方法であって、該宿主細胞が該ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの複製、発現およびパッケージングは可能にするが、該ヘルパーアデノウイルスのパッケージングは可能にしない前記方法。
2．前記ヘルパー依存性アデノウイルスベクターがウイルスゲノムの最大約35,500bpまでの欠失を含む、上記１に記載の方法。
3．前記ヘルパーアデノウイルスのゲノムが、リコンビナーゼにより認識される部位に挟まれているパッケージングシグナルを有する修飾された初期領域１（E1）を含む、上記１に記載の方法。
4．前記ヘルパーアデノウイルスが、Creリコンビナーゼにより認識されるloxP部位に挟まれているパッケージングシグナルを含む、上記１または３に記載の方法。
5．前記宿主細胞がCreリコンビナーゼを発現し、そしてヘルパーアデノウイルスのパッケージングシグナルを挟んでいるloxP部位の間での部位特異的な組換えを触媒して該パッケージングシグナルの切除を誘導し、それによって、ヘルパーアデノウイルスのゲノムはビリオン内にパッケージングできないが、イン・トランス（in trans）で作用して前記ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの複製を補完できるウイルス機能を提供することができるヘルパーアデノウイルスが得られる、上記３に記載の方法。
6．前記ヘルパーアデノウイルスが欠失または突然変異したパッケージングシグナルを含む、上記１に記載の方法。
7．前記ヘルパー依存性アデノウイルスベクターが、約27kbと約35kbの間または約13kbと約18kbの間のいずれかである、上記１に記載の方法。
8．前記ヘルパー依存性アデノウイルスベクターが約27kbと約35kbの間であり、かつ外来DNA挿入断片の少なくとも２つの反復コピーを含む、上記１に記載の方法。
9．上記１に記載の方法により作製される、パッケージングされたヘルパー依存性アデノウイルスベクター。
10．それ自身の核酸はpIXタンパク質の欠損もしくは不活性のためにビリオン内にパッケージングできないが、イン・トランスで作用して、左側ITRおよび右側ITRならびにパッケージングシグナルを含む約35kb以下のサイズの第２のヘルパー依存性ベクターの複製を補完する、約35kbより大きいゲノムサイズを有するヘルパーアデノウイルスの作製方法であって、
（ａ）アデノウイルスDNAを含む第１のベクター；但し、発現されるいずれのpIXタンパク質も不活性となるようにpIXをコードするDNA配列が修飾されているかまたは欠失している、および
（ｂ）細菌の複製起点および抗生物質耐性遺伝子を含むAd5ゲノムに追加の核酸配列が挿入されている第２のベクター
をアデノウイルスベクターの複製を可能する宿主細胞に導入して、上記ヘルパーアデノウイルスを得ることを含む前記方法。
11．前記ヘルパー依存性アデノウイルスベクターがウイルスゲノムの最大約35,500bpまでの欠失を含む、上記10に記載の方法。
12．前記第２のベクターが、ウイルスゲノムのE3領域に付加された核酸配列を含む、上記10に記載の方法。
13．前記第１のベクターがpLC8ΔpIX、pLC8ΔpIXc、pD47E1およびpXCΔSacからなる群から選ばれる、上記10に記載の方法。
14．前記第２のベクターがpBHG10luclおよびpBHG10stuff21からなる群から選ばれる、上記10に記載の方法。
15．前記ヘルパーアデノウイルスがAdLC8ΔpIX、AdLC8ΔpIXlucl、AdD47E1lucl、AdXCΔSaclucI、AdXCΔSacstuff21およびAdD47E1stuff21からなる群から選ばれる、上記10に記載の方法。
16．pIXコード領域の欠失または突然変異およびスタッファーヌクレオチド配列が挿入されているE3領域を含む、約35kbよりも大きいサイズのゲノムを含むヘルパーアデノウイルス。
17．Creリコンビナーゼにより認識されるloxP部位に挟まれているパッケージングシグナルを含む、上記16に記載のヘルパーアデノウイルス。
18．AdLC8ΔpIX、AdLC8ΔpIXlucl、AdD47E1lucl、AdXCΔSaclucI、AdXCΔSacstuff21およびAdD47E1stuff21からなる群から選ばれる、上記16に記載のヘルパーアデノウイルス。
19．pIXタンパク質を含む初期領域１（E1）タンパク質を発現し、かつ機能性pIXタンパク質の発現を妨げるpIXコード領域の欠失または突然変異を有する少なくとも１つのヘルパーアデノウイルスの複製をサポートする、但し該ヘルパーアデノウイルスは場合によりさらにヌクレオチド約340とヌクレオチド約4000との間に位置するE1の内部に欠失を有してもよい、宿主細胞。
20．VK10-9、VK2-20およびVK4-24からなる群から選ばれる、上記19に記載の宿主細胞。
21．（ａ）ヘルパーアデノウイルスの複製および増殖をサポートするためのE1アデノウイルスタンパク質を発現する少なくとも１つの第１の宿主細胞；但し、この少なくとも１つの第１の宿主細胞はそこに導入された該ヘルパーアデノウイルスの複製をサポートし、該ヘルパーアデノウイルスは約35kbよりも大きいゲノムサイズでかつ発現されるいずれのpIXタンパク質も不活性になるようにpIXコード領域の欠失または突然変異を含むゲノムを有し、
（ｂ）(i)左側ITRおよび右側ITRならびにパッケージングシグナルを含み、かつその最大約35,500bpまでの欠失を含むウイルスゲノムと、
(ii)そこに挿入されている少なくとも１つの外来核酸配列と
を有する約35kb以下のヘルパー依存性アデノウイルスベクター、および
（ｃ）ヘルパーウイルスの存在下で該ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの複製および発現を可能にするが、該ヘルパーアデノウイルスのパッケージングは可能にしない、少なくとも１つの第２の宿主細胞
を含んでなる、パッケージングされたヘルパー依存性アデノウイルスベクターを提供するためのキット。
22．前記ヘルパーアデノウイルスのゲノムが、リコンビナーゼにより認識される部位に挟まれているパッケージングシグナルを有する修飾された初期領域１（E1）を含む、上記21に記載のキット。
23．前記リコンビナーゼが、前記ヘルパーアデノウイルスのloxP部位の間での部位特異的組換えを触媒するためのCreリコンビナーゼである、上記22に記載のキット。
24．前記第２の宿主細胞が、前記ヘルパーアデノウイルスの部位の間での部位特異的組換えを触媒するためのリコンビナーゼを発現し、それにより、該ヘルパーアデノウイルスのDNAをパッケージング不能にする、上記21に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
図１は、Cre／loxPヘルパー依存性の系の概略図である。
図２は、pIX不在下での選択的DNAパッケージングの概略図である。
図３は、Cre／loxP系およびCre／loxP／ΔpIX系で用いられるヘルパーウイルスの概略図である。
図４は、pIXを欠き、かつloxPに挟まれているパッケージングシグナルを含んでいるヘルパーウイルスの構築の概略図である。
図５は、ルシフェラーゼ発現カセットを含むE3スタッファー（stuffer）配列を含有するpBHG10lucl由来プラスミドの構造の概略図である。
図６は、LacZ遺伝子およびプラスミドpBR322から誘導されるDNAセグメントを含むE3スタッファー配列を含有するpBHG10由来プラスミドpBHG10stuff21の構造の概略図である。
図７は、パッケージングシグナル（ψ）を挟んでいるloxP部位を有するAd配列を含有し、かつpIXまで達しているE1欠失を有するプラスミドpLC8Δp1Xcの構造の概略図である。
図８は、ゲノムの左端からヌクレオチド5788までのAd配列を有し、かつpIXまで達しているE1欠失を有するプラスミドpXCΔSacの構造の概略図である。
図９は、ヘルパー依存性ベクターの概略図である。
図10は、Cre／loxP／ΔpIXヘルパー依存性の系の概略図である。
図11は、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターのマップの概略図であり、そこにおいて、ベクターのサイズは約15kbから約33kbの範囲である。
図12は、ヘルパー依存性ベクターの増幅をゲノムサイズの関数として示すグラフである。
図13は、同時感染を受けた293Cre細胞内での連続継代によるヘルパー依存性ベクターの増幅を示すグラフである。
図14は、CsCl浮遊密度勾配でのヘルパー依存性ベクターAdRP1001（29.7kb）、AdRP1005（21.3kb）およびAdRP1009（15kb）の分画の結果を示すグラフである。
図15は、AdLC8cluc感染293Cre細胞内で増幅させた後のヘルパー依存性ベクターAdRP1001、AdRP1005およびAdRP1009から得たDNAのサザンブロットハイブリダイゼーション分析を示すオートラジオグラフである。
発明の詳細な説明
本明細書に記載の組換えAdベクターは、典型的にはE1に欠損があるか（「第一世代」のベクター）またはE1に加えて他の領域（例えばE2またはE4）に欠損があり（「第二世代」のベクター）、その結果、ウイルスのアテニュエーション（転写減衰；attenuation）および条件付きの(conditional)増殖が起こる現在使用されている他のベクターとは著しく異なる。本明細書のヘルパー依存性ベクター系は、ウイルスDNAのコード配列が実質的に欠失しているベクターを用いるものであり、このベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングに必要な全ての機能を提供するがそれ自身はパッケージングされることができないヘルパーアデノウイルスの存在下で、該ヘルパー依存性アデノウイルスベクターが複製されて感染性ビリオン内にパッケージングされるように設計されている。本発明者らは、先に、loxPに挟まれているパッケージングシグナル（ψ）のCre媒介切除によりパッケージング不能にされているヘルパーウイルスが、ウイルスITRおよびパッケージングシグナルを含むAdベクターの作製に必要な全ての機能を提供できることを示した（Parksら, Proc. Natl. Acad. Sci. 印刷中）。しかしながら、このパッケージングシグナルの切除は、293Cre細胞系では100％の効率で起こらず、約10％のウイルスDNAがCre媒介切除事象を免れてビリオン中にパッケージングされ、その結果、ベクターストックにヘルパーウイルスが混入した。本明細書に記載の発明は、この残存するヘルパーウイルスを取り除いてヘルパーウイルスが混入していないベクターストックを得るように設計されているものである。
ウイルスDNAの複製およびビリオン粒子中へのウイルスDNAのパッケージングのためには、ウイルスDNAのわずか３つの領域がイン・シス（in cis）で必要であることが知られている。これらは、左側の逆方向末端反復配列（ITR）（bp１〜およそ103）、パッケージングシグナル（約194〜358bp）（HearingおよびShenk, 1983, Cell, 33:695-703; GrableおよびHearing 1992, J. Virol., 64:2047-2056）、および右側ITRである。ウイルスゲノムの他の領域は全て、イン・トランスで作用してウイルスの複製および感染性ウイルスの作製を可能にするウイルス産物の産生にのみ必要であると思われる。したがって、必須のウイルスタンパク質およびRNAが全てヘルパーウイルスによって提供される場合には、ウイルスDNAの複製およびパッケージングのためにイン・シスで必要とされる上記の配列を除くウイルスDNAの大部分が欠失しているヘルパー依存性ベクターを設計し構築することができる。
アデノウイルスでは、pIXがビリオンの安定化に関与し、pIX欠損カプシドは野生型ゲノムの約97％（約35kb, Ghosh-Choudhuryら, 1987, EMBO J. 6:1733-1739）より大きいサイズのDNAをパッケージングできない。このアデノウイルスの特徴は、ウイルスDNAの選択的なパッケージングを達成するのに利用することができる。例えば、pIX欠損ウイルスDNAの混合集団では、35kbよりも大きなゲノムはパッケージングされないが、一方、35kbより小さなゲノムはパッケージングできて、感染性ビリオンを形成するようになる。
本発明は、この選択的なパッケージング上の制約を利用して、そのゲノムがpIX欠損ビリオンにおけるパッケージングの上限よりも大きくなるように、すなわち約35kbよりも大きくなるようにpIX欠損ヘルパーウイルスを構築することによって改善されたヘルパー依存性ベクター系を作製するものである。pIXを安定に発現する細胞系の使用、またはpIXを発現するプラスミドもしくはウイルスの導入のいずれかによってpIXがイン・トランスで得られる場合には、ヘルパーウイルスのDNAは効率的にパッケージングされる。pIX発現が起こらない場合には、ヘルパーウイルスのDNAは複製され、ビリオン形成に必要なタンパク質全てが（pIXを除いて）産生される。しかしながら、ヘルパーウイルスはサイズが大きいためにパッケージングされない。ヘルパーウイルスによってもたらされるウイルスの機能は、適切なシス作用性エレメント（すなわち、ウイルスのパッケージングシグナルおよび逆方向末端反復配列）を含むベクターの複製を補完（complement）するのに用いることができる。但し、この場合、ヘルパー依存性ベクターのDNAは、pIX欠損ビリオンにとって許容され得るサイズの範囲内にある（図２）。本発明は、Adベクターのゲノムが27〜37kbのサイズの「ウインドウ」内にある場合に該Adベクターが最も効率的に回収し得ることを実証している。pIX欠損ヘルパーウイルスを用いて回収されるベクターの場合、このウインドウの上限は約35kbまで低下するであろう。
本発明が属する技術分野の水準をさらに十分に説明するために、本明細書中で引用する全ての刊行物は引用により本出願に組み入れるものとする。
本発明を理解する上で、本明細書中で用いられる全ての技術的および科学的用語が、特に定義しない限り、当業者が通常理解する意味と同じ意味を有するものであることに注目することは重要である。本明細書中で用いられる技法もまた、特に明記しない限り、当業者に公知の技法である。
特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件など、もしくはそれらの或る幾つかのサブクラスについての言及は、それらに限定しようとするものではなく、その議論がなされている特定の文脈において興味のあるものであるか、または重要であると当業者が認めるであろう関連物質の全部を包含すると解釈すべきである。例えば、ある緩衝液系または培養培地を別のものと置き換えて、提案される方法、物質または組成物の使用が目指す最終目的と同じ目的を達成するために、別の、しかし公知の方法を用いることが可能な場合が多い。
本明細書中で用いられる用語は本発明を限定しようとするものではない。例えば、「遺伝子」という用語は、DNA、cDNA、RNA、または遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドを包含する。「外来遺伝子」とは、それが発現される生物または細胞型以外の生物または細胞型から得られた遺伝子を意味する。この用語はまた、ゲノム内で正常な場所から転座している同じ生物由来の遺伝子をいう。
「核酸」、「RNA」、「DNA」などの用語の使用において、本発明者らは、特定の工程において使用可能な化学的構造を限定しようとするものではない。例えば、RNAが通常DNAと置換え可能であることは当業者には周知であり、「DNA」という用語の使用はこの置き換えを包含するものと解釈すべきである。さらに、種々の核酸類似体および核酸誘導体を作製することが可能であり、これらが互いに、ならびにDNAやRNAにハイブリダイズすることが知られており、そのような類似体および誘導体の使用もまた、本発明の範囲内である。
遺伝子または核酸の「発現」とは、細胞内の遺伝子発現だけでなく、クローニング系および任意の他の意味内容における核酸の転写および翻訳も包含する。「リコンビナーゼ」という用語は、組換えを誘導、媒介または促進する酵素、ならびに、核酸配列の再編成、または第2の核酸配列からの第1の核酸配列の切除、もしくは第2の核酸配列への第1の核酸配列の挿入を引き起こし、媒介し、もしくは促進する他の核酸修飾酵素を包含する。
リコンビナーゼの「標的部位」は、リコンビナーゼによって認識される（すなわち、切除、切断または誘導されて結合し直す）核酸配列または核酸領域である。
「遺伝子産物」なる用語は、主に核酸によってコードされるタンパク質およびポリペプチドをいうが、さらに他の核酸によってコードされる核酸（例えば、ｔRNAおよびsNRPのような非コードおよび調節RNA）を包含する。
「発現の調節」なる用語は、所与の遺伝子産物の合成、分解、利用性（availability）または活性を増大または低下させる事象または分子をいう。
本発明はまた、本明細書中で用いられる細胞型および細胞系の使用に限定されない。各種の組織（乳房、上皮、結腸、リンパ球、他）または各種の種（ヒト、マウス、他）に由来する細胞もまた、本発明での使用に好適である。
本発明では、組換え核酸および該組換え核酸によってコードされる遺伝子産物の生成および発現を検出することが重要である。本明細書中で用いられる検出方法としては、例えば、クローニングおよび配列決定、オリゴヌクレオチドのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応およびその変法（例えば、7-deaza GTPを用いるPCR）の使用、単一のヌクレオチドプライマーによって誘導される伸長アッセイの使用、所与のストリンジェント条件下で相補的配列に優先的に結合することが示され得る標的特異的オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション法、およびサンドイッチハイブリダイゼーション法が挙げられる。
配列決定は、標識したプライマーまたはターミネーターを用いる市販の自動配列決定装置により、または配列決定用ゲルベース法（gel-based methods）を用いて行うことが可能である。配列分析はまた、標的DNAまたはRNA分子上で互いに直隣接してアニールするオリゴヌクレオチド配列のライゲーションをベースとする方法（WuおよびWallace, Genomics, 4:560-569 (1989); Landrenら, Science, 241:1077-1080 (1988); Nickersonら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:189-193(1991)）によっても行われる。リガーゼにより媒介される共有結合性の接着は、オリゴヌクレオチドが正確に塩基対形成している場合にのみ起こる。リガーゼ連鎖反応（LCR）は、標的の増幅のために熱安定Taqリガーゼを用いるものであるが、この反応は、後期発症性（late onset）糖尿病の突然変異遺伝子座を調べるのに特に有用である。反応温度を上昇させれば、ライゲーション反応を高ストリンジェンシーで行うことが可能になる（Barany,F., PCR Methods and Applications 1:5-16 (1991)）。
ハイブリダイゼーション反応は、フィルターをベースとするフォーマットで行うことが可能であり、この場合、標的核酸はニトロセルロース膜またはナイロン膜に固定され、オリゴヌクレオチドプローブを用いて釣り上げられる。いずれの公知のハイブリダイゼーションフォーマットも使用可能であり、サザンブロット、スロットブロット、「逆」ドットブロット、溶液ハイブリダイゼーション、固相支持体ベースのサンドイッチハイブリダイゼーション、ビーズ上、シリコンチップ上およびマイクロタイターウェル上のハイブリダイゼーションフォーマットが挙げられる。
検出用オリゴヌクレオチドプローブはサイズが10〜1,000塩基の範囲である。この検出用オリゴヌクレオチドプローブを用いて必要な標的の識別を達成するために、ハイブリダイゼーション反応は通常約20℃から約60℃の範囲で、最も好ましくは約30℃から約50℃の範囲で行う。当業者には公知のように、完全二重らせんとミスマッチ二重らせんとの最適な識別は、温度および／または塩濃度の操作またはストリンジェンシー洗浄においてホルムアミドを含ませることによって達成される。
本明細書に記載のクローニングおよび発現ベクターは、当業界で公知の種々の方法のいずれかにより細胞または組織に導入する。そのような方法は、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992)（引用により本明細書に組み入れる）、およびAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1989)（これも、引用により本明細書に組み入れる）に記載されている。これらの方法には、例えば、安定な、または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。
タンパク質産物または組換えおよび非組換えコード配列は、免疫法を用いて分析することができる。例えば、タンパク質またはその断片をアジュバントと共に宿主動物に注入して、免疫応答が生じるようにする。組換え断片と結合する免疫グロブリンは抗血清として採取され、場合によってはアフィニティークロマトグラフィーまたは他の手段によってさらに精製される。さらに、脾臓細胞は、免疫したマウス宿主から採取し、骨髄腫細胞に融合させて、抗体分泌性ハイブリドーマ細胞のバンクを作製してもよい。このハイブリドーマのバンクは、組換えによって得られた断片と結合する免疫グロブリンを分泌するクローンについてスクリーニングされる。さらに具体的にいうと、改変ポリペプチドに選択的に結合する免疫グロブリンは、野生型タンパク質による前吸収（pre-absorption）、または改変ポリペプチドに結合するが野生型ポリペプチドには結合しない特定のイディオタイプに基づくハイブリドーマ細胞系のスクリーニングのいずれかによって選別される。
最終的には所望の改変ポリペプチドを発現することができる核酸配列は、種々の異なるポリヌクレオチド（ゲノム、またはcDNA、RNA、合成オリゴヌクレオチド、他）から、そして種々の異なる方法によって形成される。
このDNA配列は、該配列を発現調節配列に機能しうるように連結した（すなわち、該発現調節ベクターの機能を確実にするように配置した）後で、宿主内で発現される。これらの発現ベクターは、典型的には、宿主生物内でエピソームまたは宿主染色体DNAの組込み部分として複製可能なものである。通常、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性またはハイグロマイシン耐性に基づくマーカー）を含んで、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出および／または選択を可能にする。更なる詳細は米国特許第4,704,362号に見出すことができる。
改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、コードされたポリペプチド産物が産生されるようにコード配列の転写を促進する配列（発現配列）、およびその翻訳を促進する配列が含まれる。そのようなポリヌクレオチドの構築は当業界では周知である。例えば、そのようなポリヌクレオチドには、プロモーター、転写終結部位（真核生物発現宿主においてはポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、および場合により真核生物発現宿主で用いるためのエンハンサー、および場合によりベクターの複製に必要な配列が含まれる。
大腸菌（E. coli）は、本発明のDNA配列のクローニングに特に有用な1つの原核生物宿主である。使用に好適な他の微生物宿主としては、バラチス・サチリス（Bacillus subtilis）のようなバチラス類（bacilli）、サルモネラ種（Salmonella）やセラチア種（Serratia）および各種のシュードモナス種（Pseudomonas）のような他の腸内細菌類が挙げられる。発現ベクターは、これらの原核生物宿主内で作製され、典型的には宿主と適合する発現調節配列、例えばラクトースプロモーター系、β-ラクタマーゼプロモーター系またはλファージ由来のプロモーター系を含む。これらのプロモーターは典型的には（場合によってはオペレーター配列と一緒になって）発現を調節するものであり、例えば転写および翻訳を開始および完了させるためのリボソーム結合部位配列を有する。
発現には酵母のような他の微生物が用いられる。サッカロミセス（Saccharomyces）は好適な宿主であり、所望により3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素に関与するプロモーター、ならびに複製起点、終結配列などの発現調節配列を有する適切なベクターを有している。
微生物に加えて、哺乳動物組織細胞培養物が本発明のポリペプチドの発現および産生に用いられる。真核生物細胞が好ましい。その理由は、完全な（無傷の）ヒト・タンパク質を分泌できる多くの好適な宿主細胞系が当業界で開発されており、CHO細胞系、各種COS細胞系、HeLa細胞、骨髄腫細胞系、Jurkat細胞などが挙げられるからである。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーような発現調節配列、ならびにリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列のような必要とされる情報プロセシング部位を含む。好ましい発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシ・パピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。目的とするDNAセグメント（例えば、改変ポリペプチドをコードするポリペプチド）を含有するベクターは周知の方法により宿主細胞へと移送されるが、この方法は細胞宿主の種類に応じて異なる。例えば、原核生物細胞の場合には塩化カルシウム・トランスフェクションが一般に用いられるが、他の細胞宿主の場合にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが有効である。
本発明のアデノウイルスベクターを作製するためのキットが提供され、このキットは１つ以上の容器をきっちりとはめ込んだ状態で収容するように仕切られている保持容器（carrier）を含んでおり、第１の容器はヘルパーウイルスを複製および増殖させるための宿主細胞系内に入れたヘルパーウイルスを含み、第2の容器はヘルパー依存性ベクターを含み、第3の容器はヘルパー依存性アデノウイルスベクターを複製、発現およびパッケージングするための細胞系を含み、その他の容器は本発明の方法を行うのに必要な試薬および溶液を含む。
本発明の方法はまた、診断に使用するための試験キットの開発に容易に適している。そのようなキットは１つ以上の容器をきっちりとはめ込んだ状態で収容するように仕切られている保持容器を含み、第1の容器は適切に標識されたDNAプローブを含んでいる。他の容器は、その標識されたプローブの存在位置の特定に有用な試薬、例えば酵素基質を含んでいる。さらに他の容器は、使用上の説明書と共に、制限酵素、緩衝液などを含んでいる。
本発明は全ての記載されている知見または本明細書中に明確に記載されている実施形態の使用に限定されないことに注目することも重要である。それらを組合せることは実に好ましいことではあるが、本発明では必ずしも全ての態様を同時に使用する必要はない。
本明細書に提供される実施例は本発明を例証するものであり、いかなる意味においてもそれらの実施例に限定しようとするものではなく、本発明がもたらす結果を達成するためにどのような別の手段を用いればよいのかは、当業者には容易に明らかになるであろう。
本明細書に記載のヘルパーウイルスは、pIXコード配列を欠損（defective）または欠失（deleted）させて設計される。本発明の１つの実施形態では、ヘルパーウイルスは、Cre／loxPに関する同時係属特許出願第08/473,168号においてCre／loxPヘルパー依存性の系で用いられたように、loxPに挟まれているパッケージングシグナルも含有する。pIXヘルパー依存性の系の機能に完全に必須ではないが、Cre媒介切除によるヘルパーウイルスのパッケージングシグナルの除去によって、感染細胞内で或る特定のパッケージング因子についての競合が低減され、最終的に該ベクターのパーッケージングが増大する。他の組換え系が利用可能であるので、この例は、これに限定しようとするものではない。例えば、「FLP」リコンビナーゼは、本発明での使用に適するもう１つのリコンビナーゼである。
あるいはまた、ヘルパーウイルスのパッケージングシグナルの突然変異を利用して、ヘルパーウイルスDNAのパッケージングの効率を低下させることが可能である。Cre／loxPヘルパー依存性の系に関する特許出願第08/473,168号に概説されているCre／loxP系で用いられるヘルパーウイルスと本発明で用いられるヘルパーウイルスとの比較を図３に示す。先願で使用されているヘルパーウイルスAdLC8は、ウイルスパッケージングシグナルを挟んで並行方向に並んでいる２つのloxP部位、ネオマイシン（neo）耐性遺伝子およびE1およびE3領域の欠失を含む（図３Ａ）。AdLC8は、通常はE1欠失Adの増殖を許容する293細胞のような細胞内で複製可能である。しかしながら、Creリコンビナーゼを発現する細胞に感染すると、パッケージングシグナルは切除されて、ウイルスDNAをパッケージング不能にする。AdLC8はヘルパーウイルスとしてCre／loxPヘルパー依存性の系において有効に機能することが示されている（Parksら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 印刷中）。同様に、同じくE1およびE3が欠失しているがE3にルシフェラーゼ発現カセットを有する第2のヘルパーウイルスAdLC8cluc（Parksら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 印刷中）も、ヘルパーウイルスとして有効に機能する。本発明では、pIXコード領域が欠損または欠失している新規なヘルパーウイルスが構築される。
この例では、これに限定するものではないが、この新規なヘルパーウイルスは、AdLC8と同様に、pIXコード配列も取り除くように伸びているE1欠失を含んでおり、これを本例ではAdLC8ΔpIXと命名する（図３Ｂ）。AdLC8ΔpIXはE3領域に置き換わる大きなスタッファー（stuffer）配列を含んでおり、この配列がヘルパーウイルスのサイズを約36.3kbまで増大させる。本例において、スタッファー配列をE3に挿入することには２つの利点がある。第1には、その大きなスタッファーDNAが該ウイルスのゲノムをpIX欠損カプシド内へのパッケージングのサイズ限度よりも十分に大きなものに増大させ、これにより、pIX欠損を補完しない細胞へのヘルパーウイルスのパッケージングを阻止することである。第2には、ヘルパーウイルスと293細胞および293由来細胞に含まれるAd配列との間の組換えにより、Adのパッケージング上限よりも大きなウイルスDNAが得られ、複製可能なアデノウイルス（RCA）の形成を阻止することである。
図４に示す例では、pD47E1から得たXba1／Bst1 1071断片、つまり適当なpIX欠失を有するAd配列を含むプラスミドを用いてpLC8内の対応領域と置き換えて、pLC8ΔpIXを得る。これにより、loxPに挟まれているパッケージングシグナルおよびITRを含むプラスミドにpIX欠失が導入される。pLC8ΔpIXおよび第2のベクターpBHG10-stufferをE1およびpIXの両欠損を補完する細胞に同時トランスフェクトすると、これらは組換えを起こして、AdウイルスAdLC8ΔpIXとして回収できる。pBHG10-stufferは、E1領域およびE3領域を除くAdゲノムのコード配列の大部分を含むプラスミドである。この場合、pBHG10のE3領域にはスタッファー配列が含まれる。本発明での使用に好適なスタッファー配列は、λファージDNA由来の配列、大腸菌lacZ遺伝子の部分、およびpBR322のようなプラスミドに由来する配列である。これらの例は好適なスタッファー配列であり、これらに限定しようとするものではない。何故ならば、ヒト、昆虫、ウイルスまたは酵母のような他の多くの生物のDNAに由来する配列も同様に好適であるからである。pBHG10-stufferにはウイルスパッケージングシグナルも欠けており、そのため、それ自身が感染性ビリオン中にパッケージングされることは不可能である。本発明のヘルパーウイルスの獲得のために適するスタッファー配列を含む他の第2のベクターの例としては、pBHG101uc1（図５）およびpBHG10stuff21（図６）が挙げられる。
ヘルパーアデノウイルスAdLC8ΔpIXが得られたら、次に該ヘルパーアデノウイルスを、標準的な技法を用いて、VK2-20やVK4-24（KrougliakおよびGraham 1995, Hum. Gene Ther., 6:1575-1586）のようなpIX補完細胞系内で「救済（rescue）」し増殖させる。
VK2-20およびVK4-24細胞系は293細胞から誘導されたものであり、これらはまたAdLC8ΔpIX中のE1欠失も補完することができる。AdLC8ΔpIX（以下、ヘルパーウイルスと称す）は、pIX以外の、E1欠失ウイルスの増殖を許容する細胞内でのAdゲノムの複製およびパッケージングに必要な全ての因子を生ずることができる。この例およびその他の例において、E1領域もしくはE3領域の除去またはloxPに挟まれているパッケージングシグナルの取り込み（inclusion）はこれらに限定しようとするものではない。何故ならば、その他の欠失を含むこと、または欠失を含まないことを同様に親プラスミドに遺伝子操作して、ヘルパーウイルスを得、上記に示す例に代えて好適に用いることが可能であるからである。例えば、本発明のヘルパーウイルスを得るのに適する他の第1のベクターとしては、pLC8ΔpIXから、制限エンドヌクレアーゼSwaIでの分解によるneoコード配列の除去および該ベクターの連結により誘導されるpLC8ΔpIXc（図７）、ならびにpXCΔSac（図８）が挙げられる。
本発明は、Cre／loxPに関する特許出願に記載のベクターと同様の、Adゲノムの実質的な部分が欠損しているヘルパー依存性ベクターの開発を提供する。このヘルパー依存性ベクターの一例を図９に示す。ヘルパー依存性ベクターpRP1001は、ITRおよびパッケージングシグナル（ψ）を含むアデノウイルスDNA、細菌の複製起点（ori）、アンピシリン耐性（Amp）遺伝子、ネズミ・サイトメガロウイルス前初期プロモーター（MCMV）、β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）、ポリアデニル化シグナル（pA）、およびλDNAを含んでいる。pRP1001と適切なヘルパーウイルス（例えば、AdLC8ΔpIX）とを適切な宿主細胞に同時感染させて、パッケージングされたヘルパー依存性ベクターAdRP1001を得る。
このヘルパー依存性ベクターのゲノムは、ウイルス複製にin cisで必要とされる配列のみ、つまり、約500bpのAd DNAからなるAdのITRおよびパッケージングシグナルのみを含むことが必要である。場合によっては、他のウイルス配列が存在してもよく、さらにはスタッファー配列および外来遺伝子をコードする他のDNAセグメント、ならびにプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルのような調節エレメントも存在してもよい。
本発明の第3の実施形態は、本発明のウイルス成分の複製をサポートできる細胞系を提供する。リコンビナーゼを発現する哺乳動物細胞系が本発明での使用に好適である。Creリコンビナーゼを発現する哺乳動物細胞系が好ましい。Creリコンビナーゼを発現する細胞系は、上記のヘルパーウイルスおよびヘルパー依存性ウイルスで同時感染させることが可能である。そのような細胞系の1つの例は、それに限定するものではないが、既に開発されて特性決定されている293Cre4細胞系である（ChenおよびGraham 1996, 未発表の結果）。293Cre4細胞は、ヒト・サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびサルウイルス40ポリアデニル化配列の調節下にあるバクテリオファージP1 Creリコンビナーゼからなる発現カセットならびにネオマイシン耐性カセットを含むプラスミドでトランスフェクトすることにより構築された。ネオマイシン耐性コロニーを選択することにより幾つかの293Cre細胞系が同定されるが、これらの細胞系は既に分析され、Creリコンビナーゼを安定に発現することが示されている。293Cre細胞に感染すると、AdLC8のパッケージングシグナルはヘルパーウイルスDNAの約90％から効率的に切除される（Parksら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci.印刷中）。
本発明の第4の実施形態である、本発明のウイルス成分の複製をサポートし、Ad pIXを発現し、かつ先述の例に記載のプラスミドでトランスフェクトされ得る細胞系もまた開発した。好ましくは、この細胞系はヒト細胞系である。しかしながら、ゴールデンハムスター（Syrian hamster）、マウス、ウシ、ブタ、またはイヌの細胞などの他の細胞系もまた好適である。これらの例は限定しようとするものではない。何故ならば、他の種に由来する細胞も本発明での使用に適するからである。pIX遺伝子を含むAd5 DNAの531bpの断片を、誘導性メタロチオネイン・プロモーターの調節下、またはヒト・サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびサルウイルス40ポリアデニル化配列の制御下に置き、293細胞にトランスフェクトして、pIXを安定に発現する幾つかのクローンを同定した（KrougliakおよびGraham 1995, Hum. Gene Ther. 6:1575-1586）。細胞系VK2-20、VK4-24およびVK10-9はpIX欠損Adを補完することができ、ウイルス力価は野生型ウイルスと同等である。
このヘルパー依存性ベクターの力価は、ヘルパーウイルスに感染した293Cre細胞の連続継代により増大させることができる。AdLC8ΔpIX感染細胞内でヘルパー依存性ベクターを増幅させるための一般的な戦略の例を図10に示す。AdLC8ΔpIXをVK2-20（すなわち、pIX欠損を補完し、ヘルパーウイルスDNAのパッケージングを可能にする細胞系）内で増殖させる。pIX欠損を補完しない細胞系である293Creに感染すると、ウイルスパッケージングシグナルはAdLC8ΔpIXから切除され、ウイルスをパッケージング不能にする。ウイルスパッケージングシグナルを除去することにより、確実にパッケージング因子がヘルパーウイルスDNAへの結合によって「薄め」られないようになる。パッケージングシグナルのCre媒介切除を免れるヘルパーウイルスDNAは非常に大きいので（すなわち、約35kbよりも大きい）、pIX細胞環境ではパッケージングできない。しかしながら、組換ウイルスDNAおよび非組換えウイルスDNAの双方が、適当なサイズ（27〜35kb）のAdベクターをパッケージングするのに必要な機能の全てを提供できる。このようにして、２つの異なる機構、すなわち、ウイルスパッケージングシグナルのCre媒介切除およびpIX欠損ウイルスに課されるDNAサイズの制約、を用いて、ベクター調製物からの全てのヘルパーウイルスの完全な除去を確実なものにする。ヘルパーウイルスDNAと比較してヘルパー依存性ベクターDNAのパッケージングを増大させるために、これら２つの機構は別個に用いることが可能であるかもしれないが、それらを一緒に用いれば、そのような増大の程度はより高まるであろう。
パッケージング効率に及ぼすヘルパー依存性ベクターのDNAサイズの影響を調べるために、ψおよびITR、ならびにマウス・サイトメガロウイルス前初期プロモーター（MCMV）およびサルウイルス40ポリアデニル化（pA）シグナルの制御下にあるβ-ガラクトシダーゼ（lacZ）レポーター遺伝子を含む15.1〜33.6kbの範囲にある一連のプラスミドを構築した（図11）。これらのプラスミドを用いて293細胞をトランスフェクトし、18時間後にヘルパーウイルスAdLC8cluc（Parksら, 1996）に5PFU／個（細胞）の重複感染度（MOI）で感染させた。CPE（約48時間の後感染）が完了した後、細胞を掻き集めて培地中に入れ、凍結／解凍してウイルスを放出させた。この粗ウイルス溶解物のアリコート（60mmのプレート当たり500μl）を用いて293の単層に感染させ、20時間後に該単層を染色して、β-ガラクトシダーゼを発現しているウイルスの存在についてアッセイした。AdLC8clucまたはベクターDNAのいずれかを欠くトランスフェクション／感染物から調製した対照の抽出物で感染させた培養物では、青く染色された細胞は全く検出されなかった。27kbよりも大きなプラスミドは、β-ガラクトシダーゼ導入粒子（青色形成ユニット、BFU）の回収により示されるように、パッケージング可能な線状分子へと効率的に転換された（図12）。26kbより小さいゲノムを有するベクターは、大きなベクターと比較して有意に低い頻度で回収され、その平均回収率は大きなベクターの回収率の半分より低いものであった（トランスフェクトされたDNAのpmol当たり175BFU対452BFU）。このことから、ビリオン形成の間に、野生型ゲノムの約75％よりも小さいDNA分子は効率的にパッケージングされないことが示唆される。奇妙なことに、AdRP1009（野生型アデノウイルスゲノムのサイズの約半分）は、サイズが21.3〜25.7kbの範囲の他の小さなベクターよりも高い効率でパッケージングされた。
ベクターDNAのリン酸カルシウム媒介トランスフェクションにより生じるBFUの低い回収率は、線状複製DNA分子への非効率的な転換のような、非効率的なパッケージング以外の他の要因によるものかもしれない。したがって、本発明者らはさらに、最初のトランスフェクションから得たウイルス溶解物をAdLC8cluc感染283Cre4細胞による連続継代に供することによって、パッケージング効率に及ぼすベクターの長さの影響を調べた。第1継代では、293Cre4細胞を500μlのベクター含有溶解物で感染させた。追加のヘルパーウイルスは添加しなかった。その理由は、AdLC8clucは最初のトランスフェクションで用いた293細胞内で複製可能であり、ベクター含有溶解物中に大量に存在していたからである。CPEが完了した後、感染細胞を掻き集めて培地に入れ、凍結／解凍して、lacZをコードするウイルスの存在について再度アッセイした。第1回目の増幅の後、本発明者らは各ウイルスについての「バースト（burst）」サイズを調べた。ウイルスのインプット量は、最初のトランスフェクション後のベクターの力価に基づいて算出した。ウイルスのアウトプットは、293Cre4細胞内での第1回目の増幅後に得られるベクターの総量とし、バーストサイズ（平均放出数）はこの総ウイルス収量を上記ウイルスインプットで除算したものとして算出した。全体サイズが約21kb〜26kbの間のベクターは10〜30の範囲のバーストサイズを生じ、一方、27kbより大きなベクターは270〜330の範囲のバーストサイズ、すなわち小さなベクターで観察されるものよりも平均約17倍大きいバーストサイズを有する（図12）。AdRP1009（15.1kb）は、依然として他の小さなベクターよりも効率的であり、95、すなわち27kbより小さい他のベクターよりも約３〜10倍大きなバーストサイズを有していた。
ベクターをAdLC8cluc感染293Cre4細胞内でさらに連続継代に供し、ベクターの回収率を調べた。同様の量の各ベクターを第1継代のための接種物として用いた。AdRP1008、AdRP1001、およびAdRP1002（27.7〜33.6kb）をそれぞれ増幅させたところ、ウイルス力価が10〜100倍増大したが（図13）、26kbより小さいベクターの回収率は全ての継代にわたって低下した。野生型ゲノムの約75％未満を有するベクターDNAを低効率で複製またはパッケージングし、これよりも大きいベクターを同じ効率でパッケージングした。
野生型Adゲノムの約半分のサイズのベクターは他の小さなベクターよりも高い効率で複製される、という本発明者らの観察は、２通りの説明ができる。すなわち、パッケージングされたベクターはトランスフェクトプラスミドの共有結合二量体であり、これによってパッケージングされたベクターのサイズを約30kb（このサイズは非常に効率的にパッケージングされるはずである）まで増大させる、ということが考えられる。多量体となったDNAのパッケージングはエプスタイン・バー（Epstein-Barr）ウイルスにおいて観察されている（BlossおよびSugden 1994）。あるいはまた、ビリオンは該ベクターの２個の単量体コピーを含んでいてもよく、この場合もまた、封入されるDNAのサイズを30kbまで増大させる。後者は可能性がないわけではない。何故ならば、単一のファージ頭部への複数のDNAのパッケージングは最近PIにおいて報告されたばかりであるからである（Corenら, 1995）。これらの機構のいずれか一方によっても、Adベクターによってコードされる外来遺伝子の２個のコピーのビリオンへの取込みが起こるだろう。
これら２つの機構を区別するために、AdRP1009（15kb）、AdRP1005（21.3kb）およびAdRP1001（29.7kb）の大規模な調製を行い、得られたベクターをCsCl密度勾配で分画した。ウイルスのバンドから画分を集め、これらの画分の各々を青色形成粒子およびルシフェラーゼ導入粒子の存在についてアッセイした（図14）。ルシフェラーゼ活性はAdLC8clucヘルパーウイルスによって発現される。AdRP1001は、該ベクター（29.7kb）とヘルパーウイルスAdLC8cluc（35.4kb）とのDNA含量の差により生じる密度の差のために、一部ヘルパーウイルスから分離される。AdRP1005およびAdRP1009の双方は、DNA含量が低いために、AdRP1001よりも高い密度で移動すると予想されるであろう。しかしながら、これは観察されなかった。AdRP1005およびAdRP1009は共に、AdRP1001とAdLC8clucとの間のCsCl密度に移動し、このことから、AdRP1005およびAdRP1009ビリオン、元のトランスフェクトプラスミドのサイズに基づいて予想されるように、15kb〜21.3kbの間ではなく、それぞれ29.6kb〜35.4kbの間のDNAを含むことが示唆される。
図10に示す分画したビリオンに含まれるDNAの構造を分析するために、各ベクターについてBFUのピーク画分からDNAを抽出および精製し（図15）、制限酵素分解およびサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。未切断のベクターDNAも分析したところ、AdRP1009（15kb）およびAdRP1005（21.3kb）のいずれもが、トランスフェクトプラスミドに基づいて予想されるサイズではないことが判明した。これらのベクターの双方ともが23kbよりも大きな見かけのサイズを有していた。AdRP1009由来の未切断DNAを含むレーンでは約15kbの微弱なバンドも観察されたが、これは、非共有結合により結合しているAdRP1009の２個の単量体分子のパッケージングか、または単量体AdRP1009ゲノムのたった1個のコピーを含むビリオンの少量の混入に該当するものであろう。HindIIIで切断したベクターDNAの分析から、AdRP1009について得られる制限パターン（元のサイズが15kb、予想されるHindIII制限パターンは11.1、2.9および1.0kbであり、図15に黒い矢印で示す）は、図15に白い矢印で示すようにビリオンDNAが共有結合によって結合している頭−尾および尾−尾コンカテマーを形成する構造と一致し、それぞれ12.1kbおよび1.8kbの診断用制限断片を生じることが示された。AdRP1009の1.0kbのHindIII制限断片は図15では目に見えないが、フィルムをハイブリダイズしたブロットに過剰暴露すると目に見えるようになった。したがって、ビリオン内での有効なパッケージングに必要なサイズの約半分のベクターDNAから出発して、ウイルスの連続継代を行うことにより、コンカテマーを形成しているウイルスDNAが選択されるようになる。したがって、１／３、１／４または１／５などのパッケージに最適なサイズのベクターDNAは、共有結合で結合している三量体、四量体または五量体の種を形成する傾向があるだろう。12.4kb、5.1kb、2.9kbおよび1.0kbの予想HindIII制限パターンを有するAdRP1005由来のウイルスDNA（最初は21.3kbのサイズ）は、再編成されてより複雑な構造になっている、全体サイズが30kbよりも大きいベクターを生じた。予想どおり、Adパッケージング効率の下限（lower cutoff）よりも大きなベクターDNAを有するAdRP1001の制限パターンは、構造的に元のトランスフェクトプラスミドから予想されるものと同一であり、そのため再編成を受けなかった。共有結合で結合しているコンカテマー種を形成し得るサイズのベクターDNAを使用することは、遺伝子治療で用いられるベクターの開発に有効である。何故ならば、遺伝子の複数のコピーが存在するため、同レベルの外来タンパク質の発現を達成するために必要とされるベクターが少ないからである。同様に、外来遺伝子の２個以上のタンデムコピーを含むベクターを構築することが可能であり、ベクターのサイズがパッケージング限度の27kbよりもほんの少し大きければ、この並び（arrangement）を安定に維持できるであろう。再編成を受けて１コピーの外来遺伝子が取り除かれているベクターDNAは低い効率でパッケージングされ、これに基づいて選択されるであろう。アデノウイルスのパッケージングの下限を明確に実証することにより、より安定なベクターの設計が可能になり、既存のAdベクターと同レベルの発現を達成するのに必要なウイルス負荷（virus loads）が低い多コピー数の外来遺伝子を発現するベクターの開発へとつながり得る。
上述の例はそれらに限定しようとするものではない。本明細書に開示されている実施形態には種々の改変をなし得ることが理解されるであろう。当業者であれば、ゲノムが大きすぎてpIXビリオン中にパッケージングされないが別の挿入物や欠失を含むヘルパーウイルスを、同様にして構築できるであろう。他の配列をE3に挿入することも可能であろうし、ウイルスのE3配列を保持することも可能であろうし、挿入物をウイルスゲノム内の他の位置に導入して適当なサイズのゲノムを有するヘルパーウイルスを得ることも可能であろう。同様に、当業者であれば、適切なヘルパーウイルスの存在下で複製可能な他の形態のベクターを構築できるであろう。したがって、上記の説明は、それらに限定しようとするものではなく、単に好ましい実施形態を例示しているにすぎないと理解すべきである。当業者であれば、本明細書に添付する請求の範囲の範疇内で他の改変を思い付くであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図８】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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