(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バシラス（Bacillus）関連農薬の農薬活性を増強する因子を産生し、NRRL B-21445の受託番号で寄託されたEMCC0129の同定特徴を有する突然変異株およびNRRL B-21444の受託番号で寄託されたEMCC0130の同定特徴を有する突然変異株からなる群より選択される、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の突然変異株。
【請求項２】
該バシラス（Bacillus）関連農薬が、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素または農薬的に活性なその断片である、請求項１に記載の突然変異株。
【請求項３】
該バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素または農薬的に活性なその断片が、CryI、CryII、CryIII、CryIV、CryV、CryVIおよび農薬的に活性なその断片よりなる群から選ばれる、請求項２に記載の突然変異株。
【請求項４】
該バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素または農薬的に活性なその断片がCryIAδ−内毒素または農薬的に活性なその断片である、請求項２または３に記載の突然変異株。
【請求項５】
該バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素または農薬的に活性なその断片がCryICδ−内毒素または農薬的に活性なその断片である、請求項２または３に記載の突然変異株。
【請求項６】
該バシラス（Bacillus）関連農薬がバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）胞子である、請求項１に記載の突然変異株。
【請求項７】
該因子が構造１を有する化合物またはその塩である、請求項１から６のいずれか１項に記載の突然変異株。
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【請求項８】
EMCC 0129（NRRL B-21445）株またはEMCC 0130（NRRL B-21444）株である、請求項１から７のいずれか１項に記載の突然変異株。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の突然変異株を培養することを含む、請求項１において定義された因子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は1993年11月３日付け出願第08/146,852号の一部継続出願であり、その出願第08/146,852号は1993年７月20日付け出願第08/095,240号の一部継続出願であり、その出願第08/095,240号は1992年12月14日付け出願第07/990,202号の一部継続出願であり、その出願第07/990,202号は1992年11月５日付け出願第07/971,786号の一部継続出願である。
１．発明の分野
本発明は、バシラス（Bacillus）関連農薬、化学農薬および／または農薬特性を有するウイルスの農薬活性を増強する因子を親株より多量に産生する突然変異体バシラス株、あるいは親株より強い増強活性を有するそのような因子を産生する突然変異バシラス株、およびそのような突然変異株の生産方法に関する。また、本発明は、該因子の入手方法に関する。
２．発明の背景
毎年、農業、林業および公衆衛生に有害な生物が、何百万ドルもの損害を与えている。そのような有害生物を防除するために、種々の対策が講じられている。
１つの対策は、広域のまたは広スペクトルの活性を有する化学農薬を使用することである。しかしながら、化学農薬の使用には多くの欠点がある。特に、その活性スペクトルが広いため、この種の農薬は、益虫や、有害生物に対する寄生生物などの標的でない生物を殺してしまうことがある。また、化学農薬は、動物やヒトに有毒なことが多い。さらに、標的有害生物は、そのような物質に繰返しさらされると、抵抗性を発達させることが多い。
もう１つの対策には、昆虫、真菌および雑草の発生を防除する生物農薬の使用が含まれる。生物農薬は、天然に存在する病原体および／またはこの病原体により産生される物質である。生物農薬を用いる利点としては、生物農薬では、化学農薬と比べて、一般に、標的でない生物や環境に対する害が全体的に少ないことが挙げられる。
２．１．バシラス・スリンジエンシス
最も広く用いられている生物農薬は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）である。バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）は、天然、特に土壌中や昆虫が豊富にいる環境に広く分布する運動性で桿状のグラム陽性細菌である。バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）は、胞子形成期に、パラ胞子（parasporal）結晶性封入体を産生し、これがチョウ目（鱗翅類）、ハエ目（双翅類）およびコウチュウ目（甲虫類）の感受性昆虫の幼虫に摂食されて殺虫性を示す。その封入体の形状、数および組成は様々であることが可能である。それは、27〜140kDaの範囲の大きさとなりうるδ−内毒素と称される１以上のタンパク質よりなる。殺虫性δ−内毒素は、一般に、幼虫の腸内のプロテアーゼにより、より小さな（トランケート化）毒性ポリペプチドに変換され、中腸の破壊を引き起こし、最終的にその昆虫を死に至らしめる
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いくつかのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株が、林業、農業および公衆衛生の分野で生物農薬として広く用いられている。バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）およびバシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp.aizawai）は、鱗翅類に特異的なδ−内毒素を産生する。甲虫類に特異的なδ−内毒素は、バシラス・スリンジエンシス亜種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis）により産生される（Kriegら,1988,米国特許第4,766,203号）。さらに、バシラス・スリンジエンシス亜種イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis）は、双翅類に特異的なδ−内毒素を産生する（Goldberg,1979,米国特許第4,166,112号）。
双翅類害虫に特異的な他のバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株も既に記載されている。双翅類および鱗翅類に有毒なバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）分離株が開示されている（Hodgmanら,1993,FEMS Microbiology Letters 114:17-22）。この分離株由来の精製した結晶性δ−内毒素のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、CryIA(ｂ)毒素、CryIB毒素およびCryIIA毒素と関連した３つのタンパク質種が示された。分子量が140、122、76、72および38kDaのタンパク質よりなる双翅類に活性な結晶を産生するバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）分離株も開示されている（Payne,1994,米国特許第5,275,815号）。EP0480,762は、それぞれ双翅類害虫に対して活性であり、独特の結晶性δ−内毒素パターンを有する５つのビー・ティー（B.t.）株を開示している。
鱗翅類、甲虫類および双翅類以外の有害生物に対する農薬活性を有するいくつかのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株が記載されている。線虫に有毒なδ−内毒素を産生する５つのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株が開示されている（Edwards,PayneおよびSoares,1988,欧州特許出願第0 303 426 B1号）。寄生性原性動物の宿主となったヒトおよび動物の治療に使用できるバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）PS81F株も開示されている（ThompsonおよびGaertner,1991,欧州特許出願第0 461 799 A2号）。ダニ害虫に対する活性を有するいくつかのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）分離株も開示されている。これらの分離株は、35kDa〜155kDaの（広い）範囲の分子量を有するタンパク質よりなる結晶を産生する（Payne,CannonおよびBagley,1992,PCT出願第WO92/19106号）。ハチ目（膜翅類）害虫に対する活性（Payne,Kennedy,Randall,MeierおよびUick,1992,欧州特許出願第0 516 306 A2号）、カメムシ目（半翅類）害虫に対する活性（PayneおよびCannon,1993,米国特許第5,262,159号）、吸虫害虫に対する活性（Hickle,Sick,Schwab,NarvaおよびPayne 1993,米国特許第5,262,399号）およびフシラプテラ（Phthiraptera）目害虫に対する活性（PayneおよびHickle,1993,米国特許第5,273,746号）を有するバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株も開示されている。さらに、オーストラリアヒツジの刈り取られた羊毛から分離されたもう１つの株であるバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）WB3S-16は、ハジラミであるダマリニア・オビス（Damalinia ovis）［フシラプテラ（Phthiraptera）害虫］に有毒だと開示されている（Drummond,MillerおよびPinnock,1992,J.Invert.Path.60:102-103）。
δ−内毒素は、プラスミド上に一般に位置するcry（結晶性タンパク質）遺伝子にコードされる。cry遺伝子は、相対的なアミノ酸相同性および農薬的特異性に基づき、６つのクラスおよびいくつかのサブクラスに分類されている。主なクラスとしては、鱗翅類特異的（cryI）、鱗翅類および双翅類特異的（cryII）、甲虫類特異的（cryIII）、双翅類特異的（cryIV）
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甲虫類および鱗翅類特異的（Tailorら,1992,Molecular Microbiology 6:1211-1217ではcryV遺伝子と称されている）、および線虫特異的（Feitelsonら,1992,Bio/Technology 10:271-275ではcryVおよびcryVI遺伝子と称されている）なものが挙げられる。
δ−内毒素は、組換えＤＮＡ法により得られている。組換えＤＮＡ法により得られたδ−内毒素は、結晶形態であることもあるし、そうでないこともある。
バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）のいくつかの株は、β−外毒素Ｉ型またはスリンジエンシン（thuringiensin）として公知の単独で農薬活性を示す熱安定性殺有害生物性アデニンヌクレオチド類似体を産生することが示されている（Sebestaら,H.D.Burges(編),Microbial Control of Pests and Plant Diseases,Academic Press,New York,1980,pp.249-281）。β−外毒素Ｉ型は、いくつかのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）培養の上清中に見出されている。それは、701の分子量を有し、アデノシン、グルコースおよびアラリン酸（allaric acid）よりなる
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その宿主域には、イエバエ（Musca domestica）、マメストラ・コンフィグラタ・ウォーカー（Mamestra configurata Walker）、ナミハダニ（Tetranychus urticae）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびニセナミハダニ（Tetranychus cinnabarinus）が含まれるが、これらに限定されるものではない。β−外毒素Ｉ型の毒性は、ATPとの競合によるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害によると考えられている。β−外毒素Ｉ型はcryプラスミドにコードされることが、５つのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株で示されている（Levinsonら,1990,J.Bacteriol.172:3172-3179）。β−外毒素Ｉ型は、バシラス・スリンジエンシス亜種スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis）血清型Ｉ、バシラス・スリンジエンシス亜種トルウォルシ（Bacillus thuringiensis subsp.tolworthi）血清型９およびバシラス・スリンジエンシス亜種ダームスタディエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.darmstadiensis）血清型10により産生されることが判明している。
β−外毒素II型として分類されているもう１つのβ−外毒素は、Levinsonら（1990,J.Bacteriol.172:3172-3179）に記載されている。β−外毒素II型は、バシラス・スリンジエンシス亜種モリソニ（Bacillus thuringiensis subsp.morrisoni）血清型8abにより産生されることが判明しており、これは、レプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）に対して活性である。β−外毒素II型の構造は、完全に知られているわけではないが、β−外毒素Ｉ型の構造とは有意に異なっており、この違いは、β−外毒素II型では、アデニンの位置にプソイドウリジン部分が存在する点にあり、リボース環に対する結合は通常はプロトンが占める位置で生じている（Levinson,HickleおよびFinch(編),Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis,ACS Symposium Series,Washington,D.C.,1990,pp.114-136）。さらに、プロトンNMRスペクトルでは、ヌクレオシド塩基に相当するシグナル（7.95ppm）は１つしかなく、リボース型のアノマータンパク質のシグナル（5.78ppm）はない。
バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）から単離されている他の水溶性物質としては、イエバエ（Musca domestica）の幼虫に対して有毒なα−外毒素（Luthy,1980,FEMS Microbiol.Lett.8:1-7）；レシチナーゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼを含む種々の酵素であって、β−外毒素またはδ内毒素と組み合わされた場合にのみ毒性作用が発現されるγ−外毒素（Forsbergら,1976,Bacillus thuringiensis:Its Effects on Environmental Quality,National Research Council of Canada,NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality,Subcomittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena）；β−外毒素と同様の構造を有し、レプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）に対して同様に活性であるσ−外毒素（Argauerら,1991,J.Entomol.Sci.26:206-213）；及び、アンヒドロスリンジエンシン（anhydrothuringiensin）（Prystasら,1975,Coll.Czechosslovak Chem.Comm.40:1775）などが挙げられる。
２．２．ツビッテルマイシン
植物病原体フィトフソラ・メディカギニス（Phytophthora medicaginis）の増殖を阻害しアルファルファへの感染を抑制する物質がバシラス・セレウス（Bacillus cereus）から単離されている（例えば、米国特許第4,877,738号および第4,878,936号を参照されたし）。他の活性は開示されていない。ツビッテルマイシン（zwittermicin）Ａについては以下の構造が明らかとなっている（Heら,Tet.Lett.35:2499-2502）。
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３．発明の目的
当該分野においては、B.t.製剤の致死性を増加させるための努力がなされている。そのための手段としては、致死性の増加した新しい株の探索、現存株を操作する試み、B.t.の胞子および結晶と新規農薬担体、化学殺虫剤または増強物質とを組み合わせることにより、より有効な製剤を設計する試みなどが挙げられる（例えば、米国特許第5,250,515号(トリプシン阻害剤)を参照されたし）。したがって、本発明の目的は、農薬の農薬活性を増強することである。多量の増強物質を産生する株を分離することも本発明の目的である。
４．発明の概要
本発明は、バシラス（Bacillus）関連農薬の農薬活性を増強する因子を産生する突然変異バシラス株であって、該突然変異体により産生される因子の量が、対応する親株により産生される因子の量より多いことを特徴とする突然変異バシラス株に関する。特定の実施形態では、該バシラス株は、バシラス・サチリス（Bacillus subtilus）、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）およびバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）よりなる群から選ばれる。
前記突然変異体により産生される因子は増強物質である。本発明で定義する「増強物質（potentiator）」は、有意な農薬活性を有さない、すなわち例えば、バイオアッセイ（第6節を参照されたし）による測定で約3000μg/gを超えるLC50（LC50は、有害生物の50％を殺すのに必要な物質の濃度である）を有するが、バシラス関連農薬の農薬活性を少なくとも50％増強するよう作用し、幼虫の生育阻害を引き起こさない物質である。第２節で説明したとおり、δ−内毒素、トリプシン阻害剤、外毒素などの農薬活性を増強しうる当該分野で公知の他の物質は、農薬活性を有する。
特定の実施態様では、該因子は水溶性である。本発明の定義では、少なくとも約１mgの物質が１mlの水に溶解しうる場合、物質または化合物は「水溶性」である。また、該因子は、化学農薬および／または農薬特性を有するウイルスの農薬活性を増強することも可能である。
本発明で定義する「バシラス（Bacillus）関連農薬」は、バシラス［例えば、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）またはバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）］株、胞子または物質、例えば、有害生物に対する活性を有するか又はそれを殺すタンパク質またはその断片、あるいは有害生物に対する活性を有するか又はそれを殺すバシラスタンパク質（例えば、バシラス・スリンジエンシスδ−内毒素）またはその断片をコードするバシラス遺伝子を発現しうる微生物、および許容されうる担体（そのような担体の具体例に関しては、以下の第５．2節を参照されたし）である。例えば、該有害生物は、昆虫、線虫、ダニまたは巻貝（snail）であってもよい。有害生物に対する活性を有するか又はそれを殺すバシラスタンパク質またはその断片をコードするバシラス遺伝子を発現しうる微生物は、葉面（植物葉の表面）および／または根圏（植物根を取り囲む土壌）および／または水生環境に生息し、特定の環境（作物および他の昆虫生息場所）で野生型微生物とうまく競合し、有害生物に対する活性を有するか又はそれを殺すバシラスタンパク質またはその断片をコードするバシラス遺伝子の安定な維持および発現を与える。そのような微生物としては、例えば、細菌、例えばバシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クレブシエラ（Klebsiella）、ザントモナス（Xanthomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィルス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacter）、リューコノストク（Leuconostoc）、アルカリゲネス（Alcaligenes）およびクロストリジウム（Clostridium）属；藻類、例えば藍藻（Cyanophyceae）、原核緑藻（Prochlorophyceae）、紅藻（Rhodophyceae）、渦鞭藻（Dinophyceae）、黄金色藻（Chrysophyceae）、プリムネシウム藻（Prymnesiophyceae）、黄緑藻（Xanthophyceae）、ラフィド藻（Raphidophyceae）、珪藻（Bacillariophyceae）、真正眼点藻（Eustigmatophyceae）、クリプト藻（Cryptophyceae）、ユーグレナ藻（Euglenophyceae）、プラシノ藻（Prasinophyceae）および緑藻（Chlorophyceae）科；および真菌、特に酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、スポロボロミセス（Sporobolomyces）、ロドトルラ（Rhodotorula）およびオーレオバシディウム（Aureobasidium）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明で定義する「農薬活性」は、有害生物を殺したりその成長を抑制したり、あるいは有害生物の侵襲から植物を守る場合の有害生物に対する活性の量を示す。
また、本発明は、
（ａ）バシラス（Bacillus）株を変異原で処理し、
（ｂ）工程（ａ）の突然変異したバシラス株を、該突然変異体の選択に適した条件下で増殖させ、そして
（ｃ）工程（ｂ）の突然変異体を選択することを含んでなる、本発明の突然変異体の生産方法に関する。
実質的に純粋な因子は、
（ａ）バシラス（Bacillus）株の突然変異体を適当な条件下で培養し、
（ｂ）工程（ａ）の突然変異体の培養の上清を回収し、そして
（ｃ）工程（ｂ）の上清から該因子を単離して、その実質的に純粋な因子を得ることにより、該突然変異体から得ることができる。
前記突然変異体から得られる因子は、該因子と農薬担体とを含んでなる、また、該因子とバシラス関連農薬、化学農薬および／または農薬特性を有するウイルスとを含んでなる組成物に製剤化してもよい。これらの組成物は、有害生物を防除するのに、該因子と農薬的に許容される担体とを含んでなる組成物に有害生物をさらすることなどによりバシラス関連農薬に対する有害生物の抵抗性を減少させるのに、あるいはバシラス関連農薬の農薬活性を増強するのに用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、Iaを精製するのに用いる一般的な方法を図示する。
図２は、Iaの13C NMRスペクトルを示す。
図３は、IaのプロトンNMRスペクトルを示す。
図４は、Iaのアセチル化誘導体でのnOe実験の結果を示す。
６．発明の詳細な説明
親バシラス株は、例えばバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・リヘニフォルミス（Baicillus licheniformis）またはバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）であることが可能である。親バシラス・スリンジエンシスは、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp.aizawai）、バシラス・スリンジエンシス亜種ガレリアエ（Bacillus thuringiensis subsp.galleriae）、バシラス・スリンジエンシス亜種エントモシダス（Bacillus thuringiensis subsp.entomocidus）、バシラス・スリンジエンシス亜種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis）、バシラス・スリンジエンシス亜種スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種アレスチ（Bacillus thuringiensis subsp.alesti）、バシラス・スリンジエンシス亜種カナディエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.canadiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種ダームスタディエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.darmstadiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種デンドロリムス（Bacillus thuringiensis subsp.dendrolimus）、バシラス・スリンジエンシス亜種フィニチムス（Bacillus thuringiensis subsp.finitimus）、バシラス・スリンジエンシス亜種ケニアエ（Bacillus thuringiensis subsp.kenyae）、バシラス・スリンジエンシス亜種モリソニ（Bacillus thuringiensis subsp.morrisoni）、バシラス・スリンジエンシス亜種スブトキシクス（Bacillus thuringiensis subsp.subtoxicus）、バシラス・スリンジエンシス亜種トウマノフィ（Bacillus thuringiensis subsp.toumanoffi）、バシラス・スリンジエンシス亜種トウマノフィ（Bacillus thuringiensis subsp.toumanoffi）、バシラス・スリンジエンシス亜種ポンディチェリエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.pondicheriensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種シャンドジエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.shandogiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種ソット（Bacillus thuringiensis subsp.sotto）、バシラス・スリンジエンシス亜種ニジェリアエ（Bacillus thuringiensis subsp.nigeriae）、バシラス・スリンジエンシス亜種ユンナネンシス（Bacillus thuringiensis subsp.yunnanensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種ダコタ（Bacillus thuringiensis subsp.dakota）、バシラス・スリンジエンシス亜種ニディアナ（Bacillus thuringiensis subsp.nidiana）、バシラス・スリンジエンシス亜種トウホクエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.tohokuensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種クマモトエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.kumamotoensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種トチギエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.tochigiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種トンプソニ（Bacillus thuringiensis subsp.thompsoni）、バシラス・スリンジエンシス亜種ウハネンシス（Bacillus thuringiensis subsp.wuhanensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種キュウシュウエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.kyushuensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種オストリニアエ（Bacillus thuringiensis subsp.ostriniae）、バシラス・スリンジエンシス亜種トルウォルシ（Bacillus thuringiensis subsp.tolworthi）、バシラス・スリンジエンシス亜種パキスタニ（Bacillus thuringiensis subsp.pakistani）、バシラス・スリンジエンシス亜種ジャポネンシス（Bacillus thuringiensis subsp.japonensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種コルメリ（Bacillus thuringiensis subsp.colmeri）、バシラス・スリンジエンシス亜種ポンディチェリエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.pondicheriensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種シャンドンジエンシス（Bacillus thuringiensis subsp.shandongiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種ネオレオネンシス（Bacillus thuringiensis subsp.neoleonensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種コレアネンシス（Bacillus thuringiensis subsp.coreanensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種シロ（Bacillus thuringiensis subsp.silo）、バシラス・スリンジエンシス亜種メキシカネンシス（Bacillus thuringiensis subsp.mexcanensis）およびバシラス・スリンジエンシス亜種イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis）を含む（これらに限定されるものではない）野生型株であることが可能である。
特定の実施態様では、親バシラス・スリンジエンシス株は、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）である。最も具体的な実施態様では、該親株は、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）EMCC0086株（NRRL B-21147としてNRRLに寄託されている）である。さらに別の特定の実施態様における該突然変異体は、NRRLに寄託されており受託番号NRRL B-21445を有するEMCC0129の同定特徴を有するか、あるいは、NRRLに寄託されており受託番号NRRL B-21444を有するEMCC0130の同定特徴を有する。
６．１．突然変異体の入手方法
親株を変異原で処理して、突然変異事象を誘導してもよい。具体的には、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株を突然変異させ、その親株より実質的に多量の因子を産生しうる突然変異体を選択するための１つの方法では、該親株を
i）変異原で処理し、
ii）その処理された細胞を適当な培地（例えば、NSMP培地）中で培養し、そして
iii）より多量の因子を産生する細胞を選択する。
工程（ｉ）では、該変異原は、例えば、化学変異原であるN−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、N,N′−ジニトロ−N′−ニトロソグアニジンまたはメタンスルホン酸エチル、γ線照射、Ｘ線および／またはUV照射であってもよい。
該細胞は、例えばキャピラリー電気泳動または該因子に対する抗体を用いるイムノアッセイにより、該因子の産生に関してアッセイすることにより選択する。
本発明の高産生突然変異体のもう１つの入手方法では、例えば、液体培地中で親株を増殖させ、突然変異体の選択に適した寒天培地上に該培養ブロスをまいた後、自然突然変異体を選択することを意図してもよい。
本発明の高産生突然変異体の他のスクリーニング方法では、例えば、質量に基づき、遠心分離により直接または質量に関する他の分離手段により、該突然変異体を他の物質から分離することを意図してもよい。
６．２．該因子の入手
本発明のバシラス突然変異体は、当該分野で公知の培地および発酵技術を用いて培養してもよい（例えば、Rogoffら,1969,J.Invertebrate Path.14:122-129;Dulmageら,1971,J.Invertebrate Path.18:353-358;Dulmageら,Microbial Control of Pests and Plant Diseases,H.D.Burges編,Academic Press,N.Y.,1980を参照されたし）。特定の実施態様では、該発酵培地は、加水分解されたタンパク質、加水分解された炭水化物、塩および微量金属を含んでいてもよい。該発酵培地はまた、所望により、１以上のアミノ酸を含んでいてもよい。発酵サイクルが完了したら、当該分野でよく知られている手段（例えば、遠心分離および／または限外濾過）によりB.t.の胞子および結晶を該発酵ブロスから分離することにより、上清を回収することができる。該因子は、当該分野でよく知られている手段（例えば、限外濾過、蒸発および噴霧乾燥）により回収しうる上清中に含まれている。この方法については、後続の節でより詳しく説明する。
該因子の精製は、当該分野で公知の種々の方法により行うことができ、これらの方法としては、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーおよびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、電気泳動的方法、溶解度差による方法、抽出または当該分野で公知の他のいずれかの標準的な技術などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
種々の有害生物に対するバシラス関連農薬、農薬活性を有するウイルスまたは化学農薬の農薬活性に対する因子の増強活性は、人工昆虫飼料への混合、人工飼料への重層、葉への塗布、葉の浸漬および葉面散布などの当該分野で公知の方法によりアッセイしてもよい。そのようなアッセイの具体例については、以下の第7節で説明する。産生される因子の量は、例えばキャピラリー電気泳動により定量してもよい。
該因子は約350〜約1200、特定の実施態様では約350〜約700の分子量を有していてもよい。
該因子は、バシラス関連農薬の農薬活性を少なくとも1.5倍、所望により約1000倍まで、好ましくは約100倍〜約400倍増強する。特定の実施態様では、該因子は、完全長形態の又はタンパク質分解によりプロセシングされたトランケート化形態のCryI（CryIA、CryIBおよびCryICが含まれるが、これらに限定されるものではない）、CryII、CryIII、CryIV、CryVまたはCryVIタンパク質を含む（これらに限定されるものではない）バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素の農薬活性を約1.5倍〜約1000倍増強する。最も具体的な実施態様では、該因子は、B.t.δ−内毒素を約100倍〜約400倍増強する。該因子は、化学農薬および／または農薬特性を有するウイルスの農薬活性を増強することもできる。
該因子は、水溶性であることが可能であり、約100℃までの水中で少なくとも５分間安定であることが可能であり、直射日光に少なくとも約10時間さらされた場合に安定であることが可能であり、および／またはpH約２で約10日間安定であることも可能である。該因子は、13個の炭素原子を有していてもよい。さらに、該因子は、およそδ1.5、3.22、3.29、3.35、3.43、3.58、3.73、3.98、4.07、4.15、4.25、4.35の1H NMRシフト、並びに、およそ31.6、37.2、51.1、53.3、54.0、54.4、61.5、61.6、64.1、65.6、158.3、170.7および171.3の13Cシフトを有していてもよい。
最も具体的な実施態様では、前記因子は、Iaまたはその塩の構造を有する。該塩の形態においても、バシラス関連農薬を増強しうる。
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６．３．該因子を含む組成物
本発明の突然変異体から得られた因子は、単独で；前記定義のとおり有害生物に対する活性を有するか又はそれを殺すか又は植物を有害生物から守るバシラス株、胞子、タンパク質または断片、そのそれ以外の物質であるバシラス関連農薬と；化学農薬および／または昆虫病原性ウイルスと、並びに、許容される担体と共に、農薬組成物、すなわち例えば、懸濁剤、溶液剤、乳濁液、粉剤、分散性顆粒、水和剤、乳剤、エーロゾルまたは含浸顆粒に製剤化することができる。そのようなバシラス株としては、例えば、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）（Abbott Laboratories,Inc.からDIPELTMとして、SandozからJAVELINTMとして、Novo Nordisk A/SからBIOBITTMとして、Novo Nordisk A/SからFORAYTMとして、Novo Nordisk A/SからBIOCOTTMとして、MycogenからMVPTMとして、Novo Nordisk A/SからBACTOSPEINETMとして、およびSandozからTHURICIDETMとしてそれぞれ市販されているもの）、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp.aizawai）（Novo Nordisk A/SからFLORBACTMとして、およびAbbott Laboratories,Inc.からXENTARITMとしてそれぞれ市販されているもの）、バシラス・スリンジエンシス亜種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis）（Novo Nordisk A/SからNOVODORTMとして、SandozからTRIDENTTMとして、MycogenからM-TRAKTMおよびM-ONETMとして、およびAbbott Laboratories,Inc.からDITERRATMとしてそれぞれ市販されているもの）、バシラス・スリンジエンシス亜種イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis）（Novo Nordisk A/SからBACTIMOSTMまたはSKEETALTMのいずれかとして、SandozからTEKNARTMとして、およびAbbott Laboratories,Inc.からVECTOBACTMとしてそれぞれ市販されているもの）、バシラス・スリンジエンシス・クルスタキ／テネブリオニス（Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis）（EcogenからFOILTMとして市販されているもの）、バシラス・スリンジエンシス・クルスタキ／アイザワイ（Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai）（EcoganからCONDORTMとして、およびCiba-GeigyからAGREETMとしてそれぞれ市販されているもの）、及び、バシラス・スリンジエンシス・クルスタキ／クルスタキ（Bacillus thuringiennsis kurstaki/kurstaki）（EcogenからCUTLASSTMとして市販されているもの）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。バシラス関連タンパク質は、CryI、CryII、CryIII、CryIV、CryVおよびCryVIを含む（これらに限定されるものではない）群から選んでもよい。化学農薬は、例えば、ジフルベンズロンなどの昆虫成長制御剤、チオジカルブ、メソミルなどのカーバメイト剤、クロルピリホスなどの有機リン剤、シペルメトリン、エスフェンバレレートなどのピレスロイド剤、氷晶石などの無機フッ素、およびピロールであってもよい。昆虫病原性ウイルスは、バキュロウイルス、例えばオートグラファ・カルフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルスス（NPV）、シングラファ・ファルシフェラ（Syngrapha falcifera）NPV、シジア・ポモネラ（Cydia pomonella）GV（グラニュローシスウイルス）、ヘリオシス・ゼア（Heliothis zea）NPV、ママイガ（Lymantria dispar）NPV、オルジア・シュードツガタ（Orgyia pseudotsugata）NPV、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）NPV、ネオディプリオン・レコンテイ（Neodiprion lecontei）NPV、マツノキハバチ（Neodiprion sertifer）NPV、ハリシナ・ブリリアンス（Harrisina brillians）NPVおよびエンドピザ・ビテアナ・クレメンス（Endopiza viteana Clemens）NPVであってもよい。
該物質およびバシラス関連農薬を含む組成物では、該物質は、少なくとも約0.1g/BIUまたは0.05gの因子（バシラスδ−内毒素および胞子１gあたり）、所望により約300g/BIUまたは150gまでの物質（バシラスδ−内毒素および胞子１gあたり）、好ましくは２g/BIUまたは１gの物質（バシラスδ−内毒素および胞子１gあたり）の量で存在していてもよい。本発明で定義する「BIU」は、バイオアッセイにより決定されるビリオン国際単位である。該バイオアッセイは、標準的な試験昆虫としてトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）または他の有害生物を用いて，標準的なバシラス基準物質と該サンプルとを比較する。効力は、基準となる標準LC50を割り、ついで基準となる標準効力を掛けることにより求める。
もう１つの実施態様では、該組成物は、実質的に純粋な形態の該因子またはバシラスからの乾燥、濃縮または液体形態の上清と、農薬的に許容される担体（その具体例は以下に開示する）とを含んでいてもよい。この組成物は、別々に植物（例えば、トランスジェニック植物）に適用してもよい。特に、該組成物は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）遺伝子を既に含有し発現している植物に適用してもよい。もう１つの実施態様では、該組成物は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）組成物に既にさらされている植物に適用してもよい。もう１つの実施態様では、該組成物は、双翅類害虫の他の環境（例えば、水または土壌）に適用してもよい。該物質は、該組成物中に約0.001％〜約60％（w/w）の濃度で存在する。
また、該物質と農薬的に許容される担体とを含む組成物は、有害生物を防除するための他に、農薬に対する有害生物の抵抗性を減少させるために使用してもよい。あるいは、該組成物は、バシラス関連農薬を増強するために使用してもよい。１つの実施態様における該組成物は、少なくとも約２g物質/BIU、所望により約300g物質/BIUまでの量にて農薬と同時に適用してもよい。もう１つの実施態様では、農薬の後約24時間まで、該組成物を補助剤として適用して、残留農薬の効力を持続させてもよい。
前記組成物は、界面活性剤、不活性担体、保存剤、湿潤剤、摂食刺激物質、誘引剤、カプセル化剤、結合剤、乳化剤、染料、UV防止剤、緩衝剤、流動剤、または製品の取り扱いおよび特定の標的有害生物への適用を容易にする他の成分を加えることにより得てもよい。
適当な界面活性剤としては、アニオン化合物、例えばカルボキシラート（例えば、長鎖脂肪酸の金属カルボキシラート）；N−アシルサルコシナート；脂肪族アルコールエトキシラートとリン酸とのモノまたはジ−エステルまたはそのようなエステルの塩；脂肪族アルコールスルファート、例えばドデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウムまたはセチル硫酸ナトリウム；エトキシ化脂肪族アルコールスルファート；エトキシ化アルキルフェノールスルファート；リグニンスルホナート；石油スルホナート；アルキルアリールスルホナート、例えばアルキル−ベンゼンスルホナートまたは低級アルキルナフタレンスルホナート、例えばブチル−ナフタレンスルホナート；塩またはスルホン化ナフタレン−ホルムアルデヒド縮合物；スルホン化フェノール−ホルムアルデヒド縮合物の塩；またはより複雑なスルホナート、例えばアミドスルホナート、例えばオレイン酸とＮ−メチルタウリンとのスルホン化縮合生成物、またはジアルキルスルホスクシナート、例えばスルホン酸ナトリウムまたはコハク酸ジオクチルなどが挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、脂肪酸アミドまたは脂肪族アルキル−もしくはアルケニル−置換フェノールとエチレンオキシドとの縮合生成物、多価アルコールエーテルの脂肪酸エステル、例えばソルビタン脂肪酸エステル、そのようなエステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタール脂肪酸エステル、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロック共重合体、アセチレングリコール、例えば2,4,7,9−テトラエチル−5−デシン−4,7−ジオール、またはエトキシ化アセチレングリコールなどが挙げられる。カチオン界面活性剤としては、例えば、脂肪族モノ−、ジ−またはポリアミン（アセタート、ナフテナートまたはオレアートとして）；酸素含有アミン、例えばポリオキシエチレンアルキルアミンのアミンオキシド；カルボン酸とジ−またはポリアミンとの縮合により製造されるアミド結合アミン；または第四級アンモニウム塩などが挙げられる。
不活性物質としては、例えば、カオリン、雲母、石膏、肥料、フィロケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩などの無機物質；糖、デンプン、シクロデキストリンなどの有機物質；または木材製品、コルク、トウモロコシ穂軸の粉末、もみ殻、落花生殻、クルミ殻などの植物物質などが挙げられる。
本発明の組成物は、直接施用に適した形態であってもよいし、施用前に適量の水または他の希釈剤による希釈を要する濃縮物または一次組成物であってもよい。農薬成分の濃度は、個々の製剤の性質、特に、それが濃縮物であるか直接使用できるかよって異なる。該組成物は、１〜98％の固体または液体の不活性担体と、０〜50％、好ましくは0.1〜50％の界面活性剤とを含有する。これらの組成物は、市販品に表示されている薬量にて投与することとなるが、好ましくは、乾燥形態では１エーカー当たり約0.01ポンド〜5.0ポンド、液体形態では１エーカー当たり約0.01パイント〜25パイントである。
さらに別の実施態様では、標的有害生物の環境に施用した際の農薬活性を持続させるよう、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の結晶性δ−内毒素および／または因子を製剤化前に処理することができるが、これは、該前処理が該結晶性δ−内毒素または物質を損なわない場合に限られる。そのような処理は、該組成物の特性に悪影響を及ぼさない限り、化学的および／または物理的手段により行うことができる。化学試薬としては、例えば、ハロゲン化剤；アルデヒド、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド；抗感染薬、例えば塩化ゼフィラン（zephiran chloride）；アルコール、例えばイソプロパノール、エタノール；組織学的固定液、例えばブアン（Bouin's）固定液、ヘリー（Helly's）固定液（例えば、Humason,Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Co.,1967を参照されたし）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の組成物は、例えば、有害生物が植物上に出現し始めた時点で、あるいは防護手段として有害生物の出現前に、噴霧または散粉により植物に直接施用することができる。本発明の範囲内の防護すべき植物としては、禾穀類（小麦、大麦、ライ麦、エンバク、イネ、モロコシ類および関連作物）、ビート（テンサイおよび飼料ビート）、石果、ナシ状果、小果樹類（リンゴ、セイヨウナシ、プラム、モモ、アーモンド、サクラ、イチゴ、ラズベリーおよびブラックベリー）、マメ科植物（アルファルファ、インゲンマメ、ヒラマメ、エンドウ、ダイズ）、油料植物（アブラナ、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマ、カカオマメ、ラッカセイ）、キュウリ類（キュウリ、ペポカボチャ、メロン）、繊維植物（棉、アマ、アサ、ジュート）、柑橘果樹類（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、マンダリン）、野菜（ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツおよび他のアブラナ属の植物、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ）、クスノキ科植物（アボガド、セイロンニッケイ、ショウノウ）、落葉樹および針葉樹（シナノキ、イチイ、オーク、ハンノキ、ポプラ、カバノキ、モミ、カラマツ、マツ）、またはトウモロコシ、芝草、タバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウ、ホップ、バナナなどの植物、天然ゴム植物、鑑賞植物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。該組成物は、茎葉、畦間、全面散布用顆粒、「レイバイ（lay-by）」または土壌灌注施用により適用することができる。植物の成長の初期段階は該植物が最も著しく被害を受け得る時であるため、植物の成長の初期段階で有効な有害生物防除を行うことが一般に重要である。必要と考えられる場合には、散布液または粉剤に別の農薬を含有させるのが便利なこともある。好ましい実施態様では、本発明の組成物は、植物に直接施用される。
また、本発明の組成物は、池、湖、小川、河川、よど、および双翅類害虫、特に公衆衛生上重要な害虫が発生しやすい他の場所に直接施用することもできる。該組成物は、噴霧、散粉、振りかけなどにより施用することができる。
本発明の組成物は、チョウ目、例えばアクロイア・グリセラ（Achroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、リンゴコカクモンハマキ（Adoxophyes orana）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、アラバマ・アルジラセア（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、アミエロイス・トランシテラ（Amyelois transitella）、アナガスタ・クエニエラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンセラエ・ペルニイ（Antheraea pernyi）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）、アルキプス種（Archips sp.）、アルジロタエニア種（Argyrotaenia sp.）、アセチス・ミンダラ（Athetis mindara）、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）、ブカラトリクス・スルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、スジマダラメイガ（Cadra cautella）、コリストネウラ種（Choristoneura sp.）、コキリス・ホスペス（Cochylis hospes）、コリアス・ユリセメ（Colias eurytheme）、コルシラ、セファロニカ（Corcyra cephalonica）、シジア・ラチフェレアヌス（Cydia latiferreanus）、シジア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテジェリマ（Datana integerrima）、デンドロリムス・シベリクス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フネラリス（Desmia funeralis）、ジアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、ジアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、ジアトラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、エンノモス・スブシグナリア（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフティニ（Eoreuma loftini）、チャマダラメイガ（Ephestia elutella）、エラニス・チリアリア（Erannis tiliaria）、エスチグメネ・アクレ（Estigmene acrea）、ユーリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella）、ユープロクチス・クリソロエ（Euproctis chrysorrhoea）、ユーキソア・メソリア（Euxoa messoria）、ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレクサ（Helicoverpa subflexa）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘミレウカ・オリビアエ（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）、アメリカシロヒトリ（Hyphantria cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ラムディナ・フィスセラリア・フィスセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ラムディナ・フィスセラリア・ルグブロサ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ヤナギドクガ（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロキソステジ・スチクチカリス（Loxostege sticticalis）、マイマイガ（Lymantria dispar）、マカラ・シルシサリス（Macalla thyrsisalis）、マラコソマ種（Malacosoma sp）、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）、マンジュカ・キンケマクラタ（Manduca quinquemaculata）、マンジュカ・セクスタ（Manduca sexta）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、ナミスジフユナミシャク（Operophtera brumata）、オルギア種（Orgyia sp.）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピリオ・クレスフォン��ス（Papilio cresphontes）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、フリガニジア・カリフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノリクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris napi）、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スルタナ（Platynota sultana）、プラチプチリア・カルジュイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、プロディア・インテルプンクテラ（Plodia interpunctella）、コナガ（Plutella xylostella）、ポンチア・プロトディセ（Pontia protodice）、シューダレチア・ウニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、シトトロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピロノタ・オセラナ（Spilonota ocellana）、スポドプテラ種（Spodoptera sp.）、サウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、チネオラ・ビスセリエラ（Tineola bisselliella）、トリチョプルシア・ニ（Trichoplusia ni）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミゲス・クリアリス（Xylomyges curialis）、イポノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella）；ハエ目、例えばアエデス種（Aedes sp.）、アンデス・ビッタツス（Andes vittatus）、アナストレファ・ルーデンス（Anastrepha ludens）、アナストレファ・サスペンサ（Anastrepha suspensa）、アノフェレス・バルベリ（Anopheles barberi）、アノフェレス・クアドリマクラツス（Anopheles quadrimaculatus）、アルミゲレス・スバルバツス（Armigeres subalbatus）、カリフォラ・スチジアン（Calliphora stygian）、カリフォラ・ビシナ（Calliphora vicina）、セラチチス・カピタタ（Ceratitis capitata）、キロノムス・テンタンス（Chironomus tentans）、クリソミア・ルフィファシエス（Chrysomya rufifacies）、コクリオミイア・マセラリア（Cochliomyia macellaria）、キュレックス種（Culex sp.）、キュリセタ・イノルナタ（Culiseta inornata）、ダキュス・オレアエ（Dacus oleae）、タマネギバエ（Delia antiqua）、タネバエ（Delia platura）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ユーペオデス・コロラエ（Eupeodes corollae）、グロシナ・オーステニ（Glossina austeni）、グロシナ・ブレビパルピス（Glossina brevipalpis）、グリシナ・フシペス（Glossina fuscipes）、グロシナ・モルシタンス・セントラリス（Glossina morsitans centralis）、グロシナ・モルシタンス・モルシタンス（Glossina morsitans morsitans）、グロシナ・モリスタンス・スブモルシタンス（Glossina morsitans submorsitans）、グロシナ・パリディペス（Glossina pallidipes）、グロシナ・パルパリス・ガンビエンシス（Glossina palpalis gambiensis）、グロシナ・パルパリス・パルパリス（Glossina palpalis palpalis）、グロシナ・タチノイデス（Glossina tachinoides）、ハエマゴグス・エクイヌス（Haemagogus equinus）、ハエマトビア・イリタンス（Haematobia irritans）、ヒポデルマ・ボビス（Hypoderma bovis）、ヒポデルマ・リネアツム（Hypoderma lineatum）、リューコピス・ニナエ（Leucopis ninae）、ルシリア・キュプリナ（Lucilia cuprina）、ルシリア・セリカタ（Lucilia sericata）、ルツオミイア・ロングルパイピス（Lutzomyia longlpaipis）、ルツオミイア・シャンノニ（Lutzomyia shannoni）、リコリエラ・マリ（Lycoriella mali）、メイエチオラ・デストラク��ー（Mayetiola destructor）、ムスカ・アウツムナーリス（Musca autumnalis）、イエバエ（Musca domestica）、ネオベリエリア種（Neobellieria sp）、ネフロトマ・スツラリス（Nephrotoma suturalis）、オフィラ・アエネセンス（Ophyra aenescens）、ファエニシア・セリカタ（Phaenicia sericata）、フレボトムス種（Phlebotomus sp.）、フォルミア・レジナ（Phormia regina）、サベセス・シアネウス（Sabethes cyaneus）、サルコファガ・ブラタ（Sarcophaga bullata）、スカトファガ・ステルコラリア（Scatophaga stercoraria）、ストモキシス・カルシトランス（Stomoxys calcitrans）、トクソルヒンチテス・アンボイネンシス（Toxorhynchites amboinensis）、トリプテロイデス・バンブサ（Tripteroides bambusa）などの害虫に対して有効と考えられる。しかしながら、本発明の組成物は、コウチュウ目、例えばレプチノタルサ種（Leptinotarsa sp.）、インゲンマメゾウムシ（Acanthoscelides obtectus）、アズキゾウムシ（Callosobruchus chinensis）、エピラチナ・バリベスチス（Epilachna varivestis）、ピルハルタ・ルテオラ（Pyrrhalta luteola）、アリモドキゾウムシ（Cylas formicarius elegantulus）、リストロノツス・オレゴネンシス（Listronotus oregonensis）、シトフィルス種（Sitophilus sp.）、シクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）、シクロセファラ・イマクラタ（Cyclocephala immaculata）、マクロダクチルス・スブスピノサス（Macrodactylus subspinosus）、ポピリア・ジャポニカ（Popillia japonica）、リゾトログス・マジャリス（Rhizotrogus majalis）、ガイマイゴミムシダマシ（Alphitobius diaperinus）、ヒメコクヌストモドキ（Palorus ratzeburgi）、チャイロコメノゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）、コメノゴミムシダマシ（Tenebrio obscurus）、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）、ヒラタコクヌストモドキ（Tribolium confusum）、トリボリウス・デストラクター（Tribolius destructor）；ダニ（Acari）、例えばオリゴニクス・プラテンシス（Oligonychus pratensis）、リンゴハダニ（Panonychus ulmi）、ナミハダニ（Tetranychus urticae）；ハチ目、例えばイリドミルメックス・フミリス（Iridomyrmex humilis）、ソレノプシス・インビクタ（Solenopsis invicta）；シロアリ目、例えばレチクリテルメス・ヘスペルス（Reticulitermes hesperus）、レチクリテルメス・フラビペス（Reticulitermes flavipes）、イエシロアリ（Coptotermes formosanus）、ズーテルモプシス・アングスチコリス（Zootermopsis angusticollis）、ネオテルメス・コンネクサス（Neotermes connexus）、インシシテルメス・ミノル（Incisitermes minor）、インシシテルメス・イミグランス（Incisitermes immigrans）；ノミ目（Siphonaptera）、例えばセラトフィルス・ガリナエ（Ceratophyllus gallinae）、セラトフィルス・ニガー（Ceratophyllus niger）、ノソプシルス・ファスシアツス（Nosopsyllus fasciatus）、レプトプシラ・セグニス（Leptopsylla segnis）、クテノセファリデス・カニス（Ctenocephalides canis）、クテノセファリデス・フェリス（Ctenocephalides felis）、エチクノファガ・ガリナセア（Echicnophaga gallinacea）、プレックス・イリタンス（Pulex irritans）、キセノプシラ・チェオピス（Xenopsylla cheopis）、キセノプシラ・ベクサビリス（Xenopsylla vexabilis）、ツンガ・ペネトランス（Tunga penetrans）；およびハリセンチュウ目（TYLENCHIDA）、例えばサツマイモネコブセンチュウ（Melodidogyne incognita）、キタネグサレセンチュウ（Pratylenchus penetrans）などの害虫に対して有効と考えられる。
以下に記載する実施例は例示にすぎず、限定的なものではない。
７．実施例：Iaの特徴づけ
Iaは、ここで詳細に説明するとおりに回収し精製する。以下、Iaの特徴づけについて詳細に説明する。
７．１．Iaの回収および精製
バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（B.thuringiensis subsp.kurstaki）EMCC0086株（NRRLにB-21147として寄託されている）を、デンプン、加水分解されたデンプン、グルコースなどの炭素源およびタンパク質、加水分解されたタンパク質、コーンスティープリカーなどの窒素源よりなる培地中、30℃で72時間発酵させる。該発酵において13時間の時点でIaの生成が検出される。活性は、約30時間の時点でピークとなることが判明している。
バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（B.thuringiensis subsp.kurstaki）発酵からの上清を遠心分離により回収し、ついで、Rhone Poulenc UF系を用いて30kDa MW-CO膜を通す限外濾過により清澄化する。この30kDaの濾過により、30kDaの分子量を超えるあらゆる残存細胞残査、結晶性δ−内毒素、胞子、および可溶性タンパク質が除去された。該透過物を蒸発により10倍濃縮する。該透過物を遠心分離し、ついで0.2μで濾過して該ブロスからの不溶物をさらに除去すると、Iaを含有する透明なブロスが残る。
図1に図式的に示す多工程精製法により、Iaの精製を均一になるまで行う。既に大まかに説明した回収プロトコールと組み合わせて、５kDaの限外濾過工程により該精製を続けた。この５kDaの限外濾過からの透過物をSulfopropyl（SP）陽イオン交換樹脂に吸着させ、酢酸アンモニウム溶液で溶出する。ついで、凍結乾燥により該化合物を約30倍濃縮し、BioRad P2サイズ排除カラムを用いて該塩および他の混入物を除去する。P2カラムからのプールを高分解SP HPLC陽イオン交換カラム内で移動させて、均一な化合物を得る。凍結乾燥を繰り返すことにより、該混入塩を除去する。
活性をシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）ミクロバイオアッセイによりモニターし、純度をキャピラリー電気泳動により測定する。Iaの50μｌと、BIOBITTM FC（100μl）から精製したCryIA(c)タンパク質（15μg/ml）の50μｌとからなるサンプルを、固化人工昆虫飼料500μlを含有するゼリートレーの個々のウェルに施用する。種々のサンプルを含有するトレーを風乾する。２〜４匹の２齢または３齢初期のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）を、該乾燥サンプルを含有するウェルに加える。穴のあいたマイラー（mylar）で該ウェルをふさぎ、30℃で２〜３日間インキュベートする。ついで生育阻害程度および死亡率（％）を記録する。典型的には、各サンプルについて、５個の同型ウェルを用いて実験を行う。
７．２．構造の解明
該活性化合物は、水溶性であるが、有機溶媒には溶けないことが判明している。それは正に荷電しており、シリカ薄層クロマトグラフィーで示されるとおり、ニンヒドリンと反応する。該化合物の13CおよびプロトンNMRを、それぞれ図２および３に示す。13C NMRによる実験は、13個の炭素の存在を示した（3−[トリメチルシリル]プロピオン酸を基準とした）。DEPT実験から、３個の四級炭素（C）、７個のメチン（CH）、３個のメチレン（CH2）が存在し、メチル基（CH3）は存在しないことが判明した。1−Dデカップリング及びCOSYなどのプロトンカップリング実験により、８個の炭素を含有する１個の大きなスピン系が同定される。さらに、２個の炭素よりなる小さなスピン系が存在する。炭素プロトン相関実験（HMBC）により、該分子中の各プロトン共鳴をその結合炭素に帰属させることができた。
該活性化合物（13mg）をピリジン中無水酢酸で処理すると、より一層極性が低いアセチル化誘導体が得られた。この誘導体をHPLCにより精製して、３mgの純粋なアセチル化誘導体を得る。質量分析から、該誘導体は７個のアセタートおよび690の分子量（これより、該活性化合物の分子量は396となる）を有することが判明し、偶数個の窒素が存在することが示される。また、６個のアセタートを含有する断片および５個のアセタートを含有する断片が検出される。５個および６個のアセタート娘イオンに関する高分解能データは、645.2594（６個のアセタート）および607.2519（５個のアセタート）であり、これは、Iaが以下の分子式であることを示す：C13H28N6O8。
該活性化合物（13mg）を6N HClで処理すると、ニンヒドリン陽性の誘導体が得られた。これらの結果は、アミド結合が存在することを示す。該誘導体は、薄層クロマトグラフィーにより測定した場合、2,3−ジアミノプロピオン酸と同じRf値を有していた。これらの結果とNMRデータとから、2,3−ジアミノプロピオン酸の存在が示唆される。
Iaの分析に用いるもう１つの技術はnOe（該オーバーハウザー効果）であり、これにより、プロトンが空間を介して互いに接近していることを検出できる。nOeは、Iaアセチル化誘導体上で行う。二次元nOe実験（NOESY）では、8.06ppmのN-Hプロトンと5.17プロトンとの間にnOeが認められる（図４）。
Iaは、以下の構造であることが明らかとなった：
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それは、ウレイドアミドとして分類することができる。成分には、２個のアミド、１個の尿素、２個のアミノ、および５個のヒドロキシルが含まれる。それは、７個のキラル中心を含有する。
７．３．Iaの特性
単離されたIaは、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）およびバシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp.aizawai）の結晶性δ−内毒素殺有害生物性タンパク質のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）に対する活性を、その殺有害生物性タンパク質の形態に関係なく、増強することが判明している。製剤化B.t.k.、単離結晶、完全長（130kDaの分子量）またはトランケート化CryIAタンパク質（〜65kDaの分子量）のすべての農薬活性（殺有害生物活性）が増強される。CryIIおよびCryIC封入体の活性も増強される。また、個々のトランケート化CryIA(a)、(b)および(c)タンパク質の活性も増強することが判明している。Iaと該Cryタンパク質とのインキュベーション時間は、対生物活性に臨界的でないことが判明している。しかしながら、Iaは単独では不活性である。増強レベルは、トランケート化CryIAタンパク質、CryIIおよびCryIC封入体では100〜200倍、また、完全長CryIA(c)では約320倍であることが判明している（それぞれ表ＩおよびIIを参照されたし）。特に、完全長タンパク質の場合、240μg/mlのCryIA(c)単独で得られるのと同じ昆虫死亡率/生育阻害評点が、Iaを用いると、0.75μg/mlのCryIA(c)で得られた。トランケート化CryIA(c)の場合、CryIA(c)のサンプル単独を0.075のOD280で試験した場合と同じ生育阻害評点が、Iaと組み合わせると、同じサンプルの0.0006のOD280で得られた。75μg/mlのCryIIタンパク質単独で得られるのと同じ生育阻害評点および同様の死亡率が、Iaと組み合わせると、0.6μg/mlの濃度のCryII封入体で得られた（すなわち、125倍の増強である）。75μg/mlのCryICタンパク質単独と同様の死亡率および生育阻害評点が、Iaを加えると、0.3μg/mlのCryIC封入体で得られ、これは、250倍の増強レベルを示す。生育阻害を引き起こす濃度のCryIAタンパク質にIaを加えると、死亡が認められた。
Iaは、５分間煮沸しても安定であるが、オートクレーブ（＞190℃）によりすべての活性が失われることが判明している。さらに、それは、直射日光に少なくとも10時間さらされた場合でも安定である。Iaは、pH２で３日間安定であるが、pH12では不安定である。それは、過ヨウ素酸または濃塩酸にされされると、すべての活性を失うことが判明している。
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７．４．バシラス・スリンジエンシスの他の亜種およびバシラスの他の種の評価
いくつかのバシラス種をIa産生に関して評価する。デンプン、加水分解されたデンプン、グルコースなどの炭素源およびタンパク質、加水分解されたタンパク質、コーンスティープリカーなどの窒素源よりなる培地中、供試株を30℃で72時間発酵させる。前記のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）ミクロバイオアッセイにより、Iaの産生に関して該上清を試験する。バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（B.thuringiensis subsp.aizawai）EMCC0087株（NRRL B-21148としてNRRLに寄託されている）およびバシラス・スリンジエンシス亜種ガレリアエ（B.thuringiensis subsp.galleriae）（NRRLに寄託されている）は、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（B.thuringiensis subsp.kurstaki）とほぼ同じ濃度でIaを産生することが判明している。
Iaは、バシラス・サチリス（B.subtilis）、バシラス・セレウス（B.cereus）、Ｂ．ｔ．亜種アレスチ（B.t.subsp.alesti）、Ｂ．ｔ．亜種カナディエンシス（B.t.subsp.canadiensis）、Ｂ．ｔ．亜種ダームスタディエンシス（B.t.subsp.darmstadiensis）、Ｂ．ｔ．亜種デンドロリムス（B.t.subsp.dendrolims）、Ｂ．ｔ．亜種エントモシドゥス（B.t.subsp.entomocidus）、Ｂ．ｔ．亜種フィニチムス（B.t.subsp.fintimus）、Ｂ．ｔ．亜種イスラエレンシス（B.t.subsp.israelensis）、Ｂ．ｔ．亜種ケニアエ（B.t.subsp.kenyae）、Ｂ．ｔ．亜種モリソニ（B.t.subsp.morrisoni）、Ｂ．ｔ．亜種スブトキシクス（B.t.subsp.subtoxicus）、Ｂ．ｔ．亜種テネブリオニス（B.t.subsp.tenebrionis）、Ｂ．ｔ．亜種スリンジエンシス（B.t.subsp.thuringiensis）およびＢ．ｔ．亜種トウマノフィ（B.t.subsp.toumanoffi）、バシラス・セレウス（B.cereus）、バシラス・サチリス（B.subtilis）およびバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（B.thuringiensis subsp.kurstaki）cry- spo-突然変異体においても産生されることが、キャピラリー電気泳動により確認されている。
特に、Iaの濃度を定量するには、50μm×57cmのコーティングされていない毛管、0.2Mリン酸緩衝液（pH6.8）、15KVの電圧、200nmでの検出器が備わっているBeckman P/ACEキャピラリー電気泳動系を用いる。サンプルの容量は20nlであり、作動時間は25分である。
作製されたIaを標準物質として1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、0.156mg/mlおよび0.078mg/mlの濃度で用いて、標準曲線を作成する。直線の検量線を作成する。得られたｙ＝ｍｘ＋ｂの式を用いて、各サンプル中のIaの濃度を求める。
それぞれの実験を行う前に、毛管に緩衝液（0.2Mリン酸，pH6.8）を３分間通す。それぞれ25分間の実験の後、毛管に１N NaOHを１分間通し、該毛管をHPLC水で１分間、0.5Mリン酸で３分間濾過し、HPLC水で１分間濾過する。各ピーク下の面積を合計し、ピーク面積を求め、標準曲線から最終濃度を算出する。
７．５．B.t.製品の評価
種々の商業的に入手可能なB.t.製品中に存在するIaの量を、既に第6.4節に記載したキャピラリー電気泳動により測定する。BACTOSPEINETM、JAVELINTM、NOVODORTM、SPHERIMOSTM、BACTIMOSTM、FORAYTM、FLORBACTMおよびBIOBITTMは、Novo Nordisk A/Sから得られる。XENTARITMおよびDIPELTMは、Abbott Laboratoriesから得られる。AGREETMは、Ciba-Geigyから得られる。MVPTMはMycogenから、CUTLASSTMはEcogenから得られる。
結果を以下の表IIIに示す。これは、Iaが、0.001g Ia/BIU未満から0.071g Ia/BIUまでの範囲の種々の量で存在することを示す。
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７．６．飼料混入バイオアッセイ
３齢のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）幼虫、２齢のヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）幼虫、３齢のスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）幼虫、２齢のヘリオシス・ビレセンス（Heliothis virescens）幼虫、３齢のトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）幼虫、３齢のシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）幼虫、３齢のコナガ（Plutella xylostella）幼虫、３齢のスポドプテラ・リットラリス（Spodoptera littoralis）および３齢のヨトウガ（Mamestra brassicae）幼虫を用いて、人工飼料混入バイオアッセイによりB.t.k.活性を測定する。
B.t.製品にIaを加えることによる増強のレベルを測定するために、そして影響を受ける昆虫の範囲を明確にするために、飼料混入バイオアッセイを行う。シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）に対して高濃度のIa（7.4〜23.7g Ia/BIU）を用いる実験では、精製されたIa（70％の有効成分、30％のアセタート対イオン）を用いて、BIOBITTM FC（FCはフロアブル製剤を表す）を増強する。表IVに記載する残りのデータは、BIOBITTM HPWP（高効力水和剤）がIa（0.658％有効成分）により増強されることを示す。スポドプテラ・リットラリス（S.littoralis）およびヨトウガ（M.brassicae）は、FLORBACTM HPWPおよびIaを用いて試験した。
種々のB.t.製品を秤量し、Iaを加えて0.1〜237g Ia/BIUとする。容量は0.1％TweenTMで調整する。サンプルを１分間音波処理し、ついで最終容量まで希釈する。ニートのサンプル（Iaを含まない）および基準物質も調製する。基準物質は、１ミリグラム当たり16,000国際単位（IU）の効力を有するとされているB.t.k.HD-1-S-1980（NRRLから入手）、および53,000スポドプテラ（Spodoptera）単位/mg（SU）の効力を有するとされているJAVELINTM WGを含む。
水、寒天、糖、カゼイン、小麦胚芽、メチルパラベン、ソルビン酸、あまに油、セルロース、塩およびビタミンよりなる標準人工飼料を、20Lの加熱されたやかん中で調製する。これにより、10〜12個のサンプル（各試験物質は７つの異なる濃度を有する）を試験するのに十分な飼料が得られる。該B.t.溶液を連続希釈して、16mlのアリコートを得る。各アリコートを184gの溶融飼料に加える。次に該混合物をホモジナイズし、ついで40個のセルを担持するプラスチックトレーに注ぐ。各飼料バッチについて３つの対照トレーを調製する。該飼料が冷えて固化したら、齢が判明している１匹の昆虫（２齢〜３齢）を各セルに加え、透明なマイラーの多孔シートで該トレーを覆う。該トレーを棚上に置き、28℃、相対湿度65％で４日間インキュベートする。
４日後、昆虫の死亡率を評価する。各トレーが載るテーブルの上面板を鋭く強打し、動かない幼虫は死亡しているとみなす。死亡率（％）を算出し、該データを平行プロビット分析により分析する。LC50、LC90、回帰直線の勾配、変動係数および効力を推定する。サンプルは、最低３回、あるいは各サンプルについて３つの効力が算出平均の20％以内になるまで実験に付す。Iaの各濃度と関連した活性の増加を算出するために、該サンプル中のB.t.の量を表すよう該B.t./IaサンプルのLC50を補正する。対になったニートサンプルのLC50を、補正されたLC50値で割って、Iaと関連したLC50の減少倍数を求める。
以下の方法を用いて、ロベシア・ボスラナ（Lobesia bothrana）に関してアッセイする。ロベシア・ボスラナ（Lobesia bothrana）による攻撃を受けたブドウつるを未噴霧圃場で採集し、幼虫を取り出す。Iaの一連の希釈物（250μg/ml、500μg/mlおよび1000μg/ml）を水中で調製する。１匹の幼虫をペトリ皿の中央に入れる。その幼虫が飲むのが観察されると、新たに切られたブドウ果実が入ったペトリ皿中にそれを移動させる。その幼虫を22℃で３〜４日間保存する。
表IVに示すとおり、すべての種でLC50の有意な減少が認められる。
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シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）に対する種々の製品がIaにより増強させることを、前記の飼料混入バイオアッセイにより判定する。添加IA/BIU製品の量を、以下の表Ｖに示す。Ia/B.t.製品混合物を、寒天をベースとする小麦胚芽カゼイン飼料に加えた。昆虫をその飼料上に４日間載せ、28℃で維持する。死亡率を記録し、プロビット分析により分析する。LC50、LC90および効力を、Iaを欠く対応製品から算出する。表Ｖに示す結果は、種々の製造元から入手した種々のB.t.k.およびB.t.a.製品がIaにより増強されることを示す。これらの製品に含まれるB.t.株は、前記第5.2節に記載されている。
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７．７．葉面バイオアッセイ
BIOBITTM FCおよびIaを用いて、ブロッコリ植物上の２齢のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）幼虫で葉面バイオアッセイを行う。BIOBITTMFCに対するIaの割合は、２g Ia/BIU BIOBITTM FCと同じである。この処理を、１エーカー当たり20ガロンの担体容量にて、トラックスプレヤーによりブロッコリ植物に適用する。デポジットした散布液が乾燥した後で、その植物から葉を切り取り、2齢のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）幼虫にたからせる。結果を以下の表VIに示す。BIOBITTMFC＋Iaの場合には、8.7BIU/ヘクタールの処理量で100％の死亡率が認められるが、BIOBITTM FC単独の場合の死亡率は、58.8BIU/ヘクタールで92％、17.6BIU/ヘクタールで８％であった。また、処理された植物を、直射日光下に８時間置き、ついで葉を切り取り、上記幼虫にたからせる。日光下で８時間後、BIOBITTM FC単独の場合には、58.8BIU/ヘクタールで27％の死亡率であったが、BIOBITTM FC＋Iaの場合には、8.7BIU/ヘクタールで100％の死亡率であった。
４齢初期の幼虫で行った葉面アッセイにおいては、BIOBITTM FC単独では52BIU/ヘクタールで75％の死亡率であり、BIOBITTM FC（FCはフロアブル製剤である）＋Iaでは13BIU/ヘクタールで100％の死亡率であった。
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７．８．圃場試験
ガーボンゾビーンズ（garbonzo beans）［シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）］による圃場試験は、BIOBITTM FC単独では70 BIU/ヘクタールで51％の防除が得られ、２g Ia/BIU BIOBITTM FCでは40BIU/ヘクタールで89％の防除が得られる（未処理の場合との比較）ことを示した。JAVELINTM WGでは、45BIU/ヘクタールで51％の防除が得られた。
スイートコーン［シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）］による圃場試験は、39.5BIU/ヘクタール、２g Ia/BIU BIOBITTM FCで84％の防除が得られることを示した。
７．９．抵抗性比
感受性および抵抗性のコナガ（Plutella xylostella）のコロニーをバイオアッセイする。抵抗性の蛾は、フロリダで野外採集されたサンプルであり、JAVELINTM WGに集中的にさらされた後、B.t.抵抗性を発達させている。Iaと併用された場合のBIOBITTM HPWPを、葉浸漬バイオアッセイにより分析する。JAVELINTMおよびXENTARITMに対する抵抗性を、Iaを使用しないでアッセイする。直径６cmの円盤状のキャベツ葉を、８つの異なる濃度のB.t.製品またはB.t./Ia製剤の１つに10秒間浸す。濃度範囲は、１〜1000ppmである。その円盤状の葉を２時間風乾し、２齢（0.2〜0.4mg）幼虫が入ったプラスチックペトリ皿に入れる。昆虫25匹/薬量/日を２回反復実験して、昆虫50匹/薬量を得る。27℃で72時間後、死亡率を記録する。薬量死亡率回帰を、プロビット分析により分析する。その感受性の蛾のLC50およびLC90値を割ることにより、抵抗性比を算出する。結果を表VIIに示す。この結果は、２g Ia/BIUおよび４g Ia/BIUによりBIOBITTM HPWPが増強されることを示す。特に、４g Ia/BIUの場合、LC50抵抗性比は２倍減少し、LC90抵抗性比は10倍減少する。
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７．10．突然変異体
７．10．１．株
バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）EMCC0086株（NRRL B-21147）、セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）（A04119）、およびアルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria alternata）（株６、IM-SMP）を用いる。
７．10．2．真菌増殖阻害アッセイ
セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）およびアルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria alternata）の真菌寒天平板を用いて、該因子を産生するバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）株の突然変異体を同定する。該因子は、両方の真菌の増殖を阻害する。
その２つの真菌を、十分な胞子形成が得られるまで、PDA（ジャガイモデキストロース寒天）平板上26℃で10〜14日間増殖させる。UV光期と暗期とを交互にし（それぞれ12時間）、アルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria alternata）をインキュベートする。その平板から胞子を取り出し、無菌水に懸濁させる。セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）の胞子を無菌G1フィルターで濾過する。Burker-TurkまたはFuchs-Rosenthalカウンターを用いて、アルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria alternata）胞子の濃度を１ml当たり約２×105個に調整し、セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）胞子の濃度を１ml当たり約２×106個に調整する。ついで、この胞子懸濁液1.5mlのサンプルを、水中の無菌40％グリセロール1.5mlと混合し、−20℃で１日間凍結し、ついで、使用するまで−80℃で保存する。
胞子サンプル（前記のもの）1.5mlと、最終濃度100μg/mlのストレプトマイシンを含む抗生物質寒天培地No.2（１リットル当たり25.5g）の115mlとを46℃で混合し、該混合物を無菌プラスチックトレー（Nunc No.101875）に移すことにより、該因子の試験平板を調製する。寒天が固化した後、寒天中にmmの穴をあける（１トレー当たり120個の穴）。
無菌水１ml当たり100μgのストレプトマイシン中で、培養のサンプルを連続希釈し、その希釈サンプルの10μlを前記のとおり調製したトレーに分注する。そのトレーを26℃で２日間インキュベートする。陽性対照として、該因子の希釈も同様に行う。
その真菌増殖阻害アッセイの感受性は、どちらの真菌の場合も、１リットル当たり該因子0.05グラム（ほとんど見えない）および１リットル当たり該因子0.1グラム（透明域）の範囲である。
７．10．3．因子のキャピラリーゾーン電気泳動測定
分析前に、遠心分離および／または0.2μmナイロン膜フィルターによる濾過により、全培養ブロスサンプルから細胞および他の不溶物を除く。50μm×47cmのコーティングされていないキャピラリー、0.1Mリン酸（pH6.6）よりなるランニング緩衝液、15KVの電圧および200nmでの検出器を備えたBeckman P/ACEキャピラリー電気泳動系を用いて、該因子を定量する。各作動前に、該毛管に該ランニング緩衝液を２分間通す。ローディングするサンプルの容量は、20nlである。
分析のための作動時間は12分であり、該因子は約8.5分で溶出する。該因子の濃度を、純粋な該化合物の標準曲線に対して決定する。
それぞれの12分の作動の合間に、該毛管に、1N水酸化ナトリウムを0.5分間、0.1N水酸化ナトリウムを0.5分間、HPLC水を0.5分間、そして1.5Mリン酸を0.5分間通す。
７．10．4．バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ株の突然変異誘発
バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）NB75株の胞子を、まず、700Kラドのγ線で処理する。その照射された胞子を連続希釈し、TY寒天平板上にまき、30℃で２日間インキュベートする。その処理からの80個の突然変異体を、TY寒天平板上での単コロニーストリーキングにより精製し、ついで、以下の組成の培地100mlを含有する500ml振とうフラスコに移す：
0003794705.tif 000015
該振とうフラスコを30℃、250rpmで３日間インキュベートする。
該振とうフラスコ培養のそれぞれからサンプル５mlを毎日取り、遠心分離して、該細胞をペレット化する。脱イオン水１ml当たり0.1mgの濃度のストレプトマイシン中で、該上清を２〜10倍希釈し、ついで、第8.2節に記載のとおり、抗真菌活性に関して試験する。ついで、真菌増殖の最大阻害を引き起こす突然変異体の培養サンプルを、第8.3節に記載のとおり、キャピラリーゾーン電気泳動により該因子の量に関して分析する。第１突然変異からの最高産生突然変異体は、NBB-76である。
第１世代突然変異体NBB-76をついで、N,N′−ジニトロ−N′−ニトロソグアニジン（NTG）を用いる第２突然変異に付す。具体的には、オートクレーブする前にpH7.3に調整された以下の組成のTYブロス100mlを含有する500ml振とうフラスコ中、該突然変異株を30℃、240rpmで一晩培養する：
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その一晩培養物を、TY培地を含有する新しい振とうフラスコ中に100倍希釈し、該培養が対数増殖に到達するまで（約４時間）、30℃、240rpmで培養する。該培養の10mlのサンプルを該振とうフラスコから取り出し、ついで0.45μm Nalgene濾過ユニットを用いてジャーム濾過（germfiltered）する。該フィルター上の細胞を、１ml当たりNTG100μgを含有するTM緩衝液10mlに再懸濁する。TM緩衝液は、水酸化ナトリウムでpH６に調整された脱イオン水１リットル当たり6.05gのトリスおよび5.08gのマレイン酸よりなる。該懸濁細胞を37℃で30分間インキュベートし、ついで真空源に接続して、該細胞からNTGを除去する。該細胞を20mlのM9緩衝液で２回洗浄後M9緩衝液10mlに再懸濁して、連続希釈し、TY寒天平板上にまき、30℃で２日間インキュベートする。M9緩衝液は、脱イオン水１リットル当たり8.78gのNa2HPO4−2H2O、３gのKH2PO4、４gのNaCl、および0.2gのMgSO4−7H2Oよりなる。突然変異体を単離し、前記のとおり試験する。第2ラウンドの突然変異から得られた最高産生突然変異体は、EMCC0130である。
第２世代の突然変異体EMCC0130をついで、前記のとおりNTGを用いる第３の突然変異に付す。第３ラウンドの突然変異から得られた最高産生突然変異体は、NBC-217である。
第３世代の突然変異体NBC-217をついで、前記のとおりNTGを用いる第４の突然変異に付す。第４ラウンドの突然変異から得られた最高産生突然変異体は、EMCC0129である。
７．10．５．突然変異体および親株による因子産生
１リットル当たり0.2mlの微量金属で補足され、ついで滅菌前にH3PO4でpH７に調整された以下の成分よりなる培地50mlを含有する250ml振とうフラスコ中で、突然変異体EMCC0130、NBC-217およびEMCC0129並びに親株バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）EMCC0086を増殖させる：
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該振とうフラスコ培養を、30℃、250rpmで３日間インキュベートする。
該突然変異体および該親株により産生された因子の定量分析を、第8.3節に記載のとおり、キャピラリーゾーン電気泳動により行う。定量分析によると、振とうフラスコ中で３日後、突然変異体EMCC0129は培養ブロス１リットルあたり約0.9gの該因子を産生するが、親株は１リットル当たり約0.15gを産生することを示す。突然変異体EMCC0129は、親株より約６倍多くの因子を産生する。
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本明細書に開示している特定の実施態様は本発明のいくつかの態様を例示するものであるため、本明細書に記載し特許請求している発明の範囲は、これらの実施態様により限定されるものではない。同等の実施態様はいずれも、本発明の範囲内にあると意図される。実際、これまでの記載から、本明細書に示し記載しているものに加え、本発明の種々の修飾が当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾も、添付する請求の範囲の範囲内にあると意図される。
本明細書では種々の参照文献を引用しているが、それらの開示の全体を参考として本明細書に組込むこととする。
８．微生物の寄託
バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の以下の株は、ブダペスト条約に従い、Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL),Northern Regional Research Center(1815 University Street,Peoria,Illinois,61604,USA)に寄託されている。
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これらの株は、本特許出願の係属中は、該培養を入手する権利を有すると特許商標庁長官が認めた者でなければ該培養を入手できないことを米国特許法施行規則第1.14条および米国特許法第122条に基づき保証されることを条件として、寄託されている。該寄託は、各寄託株が実質的に純粋な培養であることを表すものである。該寄託は、本出願またはその子出願の対応出願が出願されている国の国内特許法の規定に従い入手することができる。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の指令により付与された特許権の信用を失わせるように本発明を実施することを許可するものではないと理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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