(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１位または２位の炭素が13Cで置換されたフルクトースを含む肝機能診断剤であって、呼気中の13CO2を測定するための肝機能診断剤。
【請求項２】
１位または２位の炭素が13Cで置換されたフルクトースを含むフルクトース代謝疾患診断剤であって、呼気中の13CO2を測定するためのフルクトース代謝疾患診断剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝機能診断剤、詳しくは少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで置換されたフルクトースを含む肝機能診断剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝機能障害のスクリーニングには、血中のトランスアミナーゼ（GPTおよびGOT）、アルカリフォスファターゼ（ALP）、乳酸脱水素酵素（LDH）などの酵素を定量する血液生化学検査が一般的に行われている。これらの酵素は肝障害時に肝臓組織から血中に漏出する。中でも GPT、GOT は肝臓に主に存在する酵素で、正常時では血中濃度が低いのに対し、肝機能障害時には顕著に高くなることから肝障害を鋭敏に検出する優れた指標となっている。しかしながら、肝機能が著しく低下している慢性肝炎や肝硬変時には肝臓組織内の酵素量が低下しているために酵素の漏出量も低下し、障害程度が高いにも関わらず高い値を示さない場合がある（今日の診療 CD-ROM Vol.6 、医学書院刊）。また、漏出した酵素が血中から消失するには時間がかかるため、検査の時点では肝機能障害から回復していても高い値を示す場合もある。したがって、これらの酵素の定量は、肝機能障害の程度を評価する検査法として不充分である。
【０００３】
特に、肝臓外科手術時には、肝臓の障害程度および肝予備能の評価が非常に重要である（消化器診療プラクティス１  肝障害の診断的アプローチ、大久保昭行編、文光堂刊）。肝臓の障害程度の評価には血清ビリルビンの測定、ICG 負荷試験等が、肝予備能の評価にはICG 負荷試験、動脈血中ケトン体比の測定等が主に行われている。しかしながら、これらの検査法にもそれぞれ問題点がある（消化器診療プラクティス１  肝障害の診断的アプローチ、大久保昭行編、文光堂刊）。例えば、血清ビリルビンの上昇は必ずしも肝機能の低下を意味するものではなく、また、術後等の短時間に肝機能がドラスティックに変化する過程を追うことは困難である。ICG 負荷試験は、ICG が肝細胞に取り込まれる際にビリルビンと競合するため、ビリルビンが高値を示している場合には信頼性のある結果を得ることができない。ケトン体測定は動脈血採血の必要があるため、肝機能の低下により血液凝固能が大きく低下している場合には危険があり、また、測定施設間でのばらつきが大きいのも問題である。こうした状況から、検査を行う時点での肝臓の障害程度および肝予備能を、被験者の状態に関わらず安全かつ簡便に評価できる手段が望まれている。
【０００４】
一方、フルクトース投与後の血中フルクトース濃度の減少速度を測定するフルクトース負荷試験が従来より知られており、肝予備能の評価の他、良性果糖尿症、遺伝性果糖不耐症、フルクトース-1,6- ビスホスファターゼ欠損症等の、フルクトース代謝能が低下している疾患の診断に用いられている。フルクトース負荷試験がかかる各疾患の検査や診断に用いられるのは、フルクトースが肝臓特異的な酵素により代謝されることによる（現代の生化学、坪井昭三、佐藤清美、中島邦夫編、金原出版刊）。しかしながら、本試験は、良性果糖尿症、遺伝性果糖不耐症、フルクトース-1,6- ビスホスファターゼ欠損症等のフルクトース代謝疾患の診断には現在も用いられているものの（木崎義郎、澤田淳、日本臨床増刊、現代臨床機能検査上巻、1997年刊、239）、肝機能の評価にはフルクトースの血管からの拡散や腎からの排泄などの要素が加わり、必ずしも肝臓における代謝量を反映しないことから（木崎義郎、澤田淳、日本臨床増刊、現代臨床機能検査上巻、1997年刊、239；平山千里他、総合臨床 17 、2083）、現在はほとんど用いられていない。また、本試験の肝予備能の評価への利用の一例として、フルクトース負荷後、肝臓内の高エネルギーリン酸化合物の動態を31P-MRSを用いて非侵襲に測定することが報告されているが（相野田隆雄他、箱根シンポジウム５、152 、1993、中外医学社刊）、装置が高価であり、また操作が繁雑であることから実用化には至っていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、肝臓の障害程度および肝予備能を、被験者の状態に関わらず安全かつ簡便に評価することのできる、肝機能診断剤を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで置換されたフルクトースを投与し、呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率を測定することにより肝機能疾患を正確に診断することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで置換されたフルクトースを含む肝機能診断剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の肝機能診断剤のフルクトースは、その１〜６位の炭素のうち、少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで置換されたものであればよいが、好適には１位の炭素が13Ｃで置換されたフルクトース、２位の炭素が13Ｃで置換されたフルクトースである。
【０００９】
フルクトースは通常の食物にも含まれ、輸液にも栄養源として積極的に添加される糖であり、また13Ｃは安定同位体であるので放射性同位体と異なり放射線被曝の危険も一切ないので、13Ｃ−置換フルクトースを含む本剤の安全性に問題はない。
【００１０】
本発明の肝機能診断剤を用いる検査は、これを被験者に単回投与あるいは持続投与し、投与後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率を測定する呼気テストにより行う。具体的には、投与後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度を測定し、投与後一定時間（例えば５分、１０分、１５分）経過後における呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))、あるいは投与後一定時間までの呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))の経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）のデータから肝機能の評価を行う。さらに、かかる呼気テストによる評価は、単独でも有用であるが、ビリルビン値等と組み合わせて総合的に判断することがより好ましい。
【００１１】
ここで、呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の測定は、ガスクロマトグラフ−質量分析法（GC-MS)、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法で行うことができる。
【００１２】
また、13Ｃ で置換される炭素位の違いによってそれぞれ特有の評価を行うことが可能である。たとえば、１−13Ｃ−フルクトース、２−13Ｃ−フルクトースは検査を行った時点での肝臓の障害程度および肝予備能を的確に評価できることから、ドラスティックに肝臓の状態が変化する外科手術前後での予後の良否の判断等に有用である。１−13Ｃ−フルクトースはさらに健常者から肝機能障害患者を検出することにも用いることができる。
【００１３】
本発明の肝機能診断剤は、上記の少なくとも１以上の特定位の炭素が13Ｃで置換されたフルクトース（以下、置換フルクトースという）を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、投与経路に応じて経口剤（錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤等）、注射剤などに製剤化される。賦形剤または担体としては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は、投与経路や投与方法によって適宜変更される。例えば、液状担体としては水が用いられる。固体担体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。注射剤の場合、一般に水、生理食塩水、各種緩衝液が望ましい。また、凍結乾燥製剤とし経口剤として用いたり、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩水、電解質溶液等の静脈投与用液体に溶解して投与することもできる。
【００１４】
製剤中における置換フルクトースの含量は、製剤の種類により異なるが、通常10〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％である。例えば注射剤の場合には、通常１〜40重量％となるよう置換フルクトースを添加すればよい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉剤の場合は、置換フルクトースの含量は、約10〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％であり、残部は担体である。
【００１５】
本発明の肝機能診断剤の投与量は、投与による呼気中の13ＣＯ2 の増加を確認できる量が必要であり、患者の年齢、体重、検査目的により異なるが、例えば１回当たりの投与量は成人の場合、１〜2000mg/kg 体重程度である。
【００１６】
本発明の肝機能診断剤は、肝硬変、慢性肝炎、急性肝炎、肝ガン等の肝疾患、肝障害の診断、外科手術前後の肝臓の障害程度および肝予備能の評価に利用できるほか、フルクトース負荷試験が利用されている良性果糖尿症、遺伝性果糖不耐症、フルクトース-1,6- ビスホスファターゼ欠損症等の、フルクトース代謝能が低下している疾患の診断にも利用できる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの何ら限定されるものではない。
【００１７】
【実施例】
〔実施例１〕
本発明に使用する置換フルクトースの13Ｃ標識位置における13Ｃ純度は99 %以上である。その他特に明記しない限り特級試薬を用いた。
尚、実験終了後のラットは過剰量のネンブタールを投与し屠殺した。
【００１８】
［１］方法
(1)   急性肝炎ラットの作成
被験動物として、雄性Sprague-Dawley (SD) ラットを、日本チャールズリバー社より購入した。購入したラットは、23±２℃、湿度 55 ±10% の条件で使用時まで飼育した。8〜10週齢の当該ラットにネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔後、ガラクトサミン塩酸塩（200 mg/ml 生理食塩水溶液）を 1〜1.2 g/kg腹腔内投与した [Koff, S. et al., Proc. Soc. Exptl. Med 137, 696 (1971) ;  Keppler, D. et al., Exp. Mol. Pathology, 9, 279 (1968) ;（疾患別）モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法、内貴正治  監修、126 (1993)] 。2 日後に尾静脈採血を行い血清を分離し、富士ドライケム FDC5500 [（株）富士写真フィルム] により総ビリルビン値を測定した。
【００１９】
(2)  13Ｃ−呼気テスト
(1)で作成した急性肝炎ラットと健常ラットについて、以下の呼気テストを実施した。
ネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔したラットを手術台に固定し、頭部に呼気吸引用のキャップを被せた。ストロークポンプ [バリアブル・ストロークポンプ VS-500、（株）柴田科学工業] を用いて呼気を約 100 ml/min の速度で吸引13ＣＯ2 アナライザー EX-130S [（株）日本分光] のフローセルに導入した。呼気吸引用のキャップとストロークポンプの間にはシリカゲルを充填したカラムを設置して呼気中の水蒸気を除去した。
【００２０】
13ＣＯ2 アナライザーから出力されるデータはＡＤ変換した後パーソナルコンピュータ（Apple Power Macintosh 8500）に取込み、データ処理ソフトウェア Lab VIEW (National Instruments)を用いて 5秒間隔で 100msec毎 10 点のデータを積算平均し、13Ｃatom%、Δ13Ｃ（‰)、炭酸ガス濃度（%)に変換することで連続測定 13 Ｃ−呼気テストを行った。変換したデータはリアルタイムで画面表示した後、ハードディスク中に保存した。１−13Ｃ−フルクトース（ICON社より購入) は生理食塩水に溶解して（100 mg/ml)大腿静脈より 50 mg/kg 投与した。呼気テスト中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントローラー TR-100 (Fine Science Tools INC.）により、37± 0.5℃に維持した。また、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。
【００２１】
［２］結果
健常ラット(n = 4）では１−13Ｃ−フルクトース投与後 15 分までΔ13Ｃ（‰)値が増加し続けた（図１）。急性肝炎ラット(n = 4）の場合も同様に 15 分までΔ13Ｃ（‰)値が増加し続けたが、各時間において健常ラットと比べて有意に低く、15分におけるΔ13Ｃ（‰)値は、健常ラットで59.6± 6.45 ‰、急性肝炎ラットで 45.7 ± 3.89 ‰であった。
【００２２】
したがって、１−13Ｃ−フルクトース投与後一定時間後のΔ13Ｃ（‰)値、あるいは、投与後のΔ13Ｃ（‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００２３】
〔実施例２〕
［１］方法
(1)  部分肝臓切除術
被験動物として、雄性Wistar系ラットを、日本チャールズリバー社より購入した。購入したラットは、23±2 ℃、湿度 55 ±10 %の条件で使用時まで飼育し、体重260± 20 g のラットを実験に用いた。
【００２４】
8〜10週齢のラットにネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔後、大腿静脈より5 % ブドウ糖輸液と分枝鎖アミノ酸輸液（アミノレバン、大塚製薬製）を 3：1 に混合した輸液 10 ml中に１−13Ｃ−フルクトース、または２−13Ｃ−フルクトース（ICON社より購入) を 60 mgを添加し、5 ml/ kg/hour でシリンジポンプによる持続点滴を施行した。点滴開始から 90 分後に開腹し、Higgins and Andersonの方法（Archives of Pathology 12, 183, 1931)に従い肝臓を 2 / 3切除した。肝臓切除は、Pringle 法で15分虚血を加えた群（虚血15分群）、30分虚血を加えた群（虚血30分群）の2群に分けて施行した。
【００２５】
(2)  13Ｃ−呼気テスト
手術台に固定した上記ラットの頭部に円筒形のキャップを被せ、炭酸ガス計CAPSTAR-100(CWE, Inc) を用いて呼気を吸引し、肝臓部分切除前は 10 分間隔で、切除後は20分間隔でハミルトンシリンジで呼気を１回につき約25μｌ採取し（図２）、呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度をガスクロマトグラフ−質量分析計（GC-MS)にて測定した。 GC-MSの分析条件は下記の通りである。呼気テスト中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントローラー TR-100 (Fine Science Tools INC.）により、37± 0.5℃に維持した。また、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。
【００２６】
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【００２７】
[13Ｃ濃度計算方法]
酸素同位体存在比を天然存在比とし、m/z=45, 46のイオンピーク面積より13Ｃ濃度を下式により算出した。m/z=45, 46の面積比 (A45/A46)をａとする（特開平7-120434号に基づく）。
【００２８】
【式１】
13C濃度(%) ＝｛(0.004176-0.0007462a)/(0.9944396＋0.0034298a) ｝×100
【００２９】
[Δ13Ｃ（‰）計算方法]
各時点の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度(13C tmin)とCO2 標準ガスの13Ｃ濃度( 13C std)から下式により算出した。
【００３０】
【式２】
Δ13C （‰）＝｛(13C tmin-13C 0min)/13C std ｝×1000
【００３１】
(3)  ＤＮＡ合成期細胞率の測定
術後24時間後にブロモデオキシウリジン（BrdU）（細胞増殖検出キット、アマシャム社製）を腹腔内投与し、投与1時間後に開腹し肝臓を摘出しホルマリン固定後、抗BrdU抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。
【００３２】
［２］結果
(1)  ＤＮＡ合成期細胞率
肝切除後24時間におけるDNA合成期細胞率（BrdU取込み陽性細胞率）は、肝再生が良好に進行しているかどうかの指標として用いられており、この値が高いほど肝再生が良好に進行していると判定される（箱根シンポジウム4、1991、中外医学社刊）。虚血15分群と虚血30分群でこの肝切除後24時間におけるDNA合成期細胞率を比較すると、虚血30分群では虚血15分群と比べて大きく低下していた（図３）。この結果は、虚血30分群では、長時間の虚血処置により肝臓が障害を受けて肝再生の能力、すなわち、肝予備能が低下したことを示している。
【００３３】
(2)  13Ｃ−呼気テスト
１−13Ｃ−フルクトース持続投与開始後のΔ13Ｃ（‰）値は、肝切除を施行した90分までほぼ直線的に増加を続けたが、増加の傾きは個体間で異なった（図４）。そこで、個体間のばらつきを補正するために、Δ13Ｃ（‰）値が直線的に増加した肝切除前（投与開始から90分まで）の変化の一次近似直線を外挿し、外挿Δ13Ｃ（‰）値と実測値との差を求めることで、肝部分切除後のΔ13Ｃ（‰）値の経時変化の挙動を比較した（図５）。その結果、Δ13Ｃ（‰）値は、肝切除後24時間におけるDNA合成期細胞率の結果から（図２）、肝臓の障害により肝予備能が低下していたことが示されている虚血30分群では虚血15分群と比べて外挿した一次近似直線から大きく低下していた。２−13Ｃ−フルクトースを持続投与した場合も同様なデータ処理を行うと、１−13Ｃ−フルクトースの場合と同様に、虚血30分群では虚血15分群と比べて外挿した一次近似直線から大きく低下していた（図６）。したがって、１−13Ｃ−フルクトース、または２−13Ｃ−フルクトースを持続投与して呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰））の経時変化を測定することで、その時点での肝予備能、肝障害の程度を評価できると考えられる。
【００３４】
〔製剤例１〕  （注射剤）
１−13Ｃ−フルクトース１０重量部に対し、生理食塩水を加え全量を１００重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して注射剤を得た。
【００３５】
〔製剤例２〕  （内服液剤）
２−13Ｃ−フルクトース１０重量部に対し、精製水を加え全量を１００重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、被験者の身体的負担が小さく、正確な検査結果を即時に知ることができ、かつ副作用がなく安全に使用できる肝機能診断剤が提供される。本発明の肝機能診断剤は、検査を行った時点での肝障害程度や肝予備能の評価、術後の予後の良否の判断に有用である。
【００３７】
さらに、本発明の肝機能診断剤によれば、フルクトースが肝臓特異的な酵素によって代謝された後に初めて13ＣＯ2 が生じるため、肝臓における代謝量を正確に反映しない従来のフルクトース負荷試験の問題が解決されうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】１−13Ｃ−フルクトース投与後の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図２】ラットの呼気回収法の模式図を示す。
【図３】肝切除24時間後のBrdU取込み陽性率を示す。
【図４】１−13Ｃ−フルクトース持続投与時の呼気中13ＣＯ2 の増加を示す。
【図５】１−13Ｃ−フルクトース持続投与時の部分肝切除後のΔ13Ｃ（‰）経時変化の挙動を示す。
【図６】２−13Ｃ−フルクトース持続投与時の部分肝切除後のΔ13Ｃ（‰）経時変化の挙動を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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