(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列から成るセルラーゼ。
【請求項２】
請求項１記載のセルラーゼを含む組成物。
【請求項３】
請求項１記載のセルラーゼをコードするＤＮＡを含む組成物。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ組成物を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項３記載のＤＮＡ組成物で形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
セルラーゼを発現させる方法であって：
(a)請求項１記載のセルラーゼをコードするＤＮＡで微生物を形質転換し、
(b)前記微生物を含む発酵培地を調製し、
(c)前記発酵培地を、前記セルラーゼの発現をもたらす時間および条件下で維持し、そして、
(d)前記セルラーゼを含む前記発酵培地を回収する
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１記載のセルラーゼを含む洗剤組成物。
【請求項８】
請求項１記載のセルラーゼを布地に接触させることを特徴とする布地を処理する方法。
【請求項９】
請求項１記載のセルラーゼをセルロースベースパルプに接触させることを特徴とするセルロースベースパルプを処理する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
Ａ．技術分野
本発明は、新規セルラーゼ組成物に関する。本発明はさらに、好ましくはバシルス  ｓｐ．から派生された新規セルラーゼ組成物に関する。本発明はさらに、そこに添加された新規セルラーゼを有利に有すると技術的に認識されている組成物での新規セルラーゼの利用であって、洗剤組成物、セルロース含有織物の処理、パルプおよび紙の処理、高フルクトースコムシロップ（ｃｏｍ−ｓｙｒｕｐ）またはエタノールの製造のためのデンプンの処理における添加剤としてのもの、を含むものに関する。
Ｂ．技術の現状
セルラーゼは、セルロース中の１、４β−Ｄ−グルコシド結合を加水分解可能な酵素である。セルロース分解酵素は、伝統的には３つの主要なクラスに分けられてきており：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼおよびβ−グルカナーゼ（Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８７），ＴＩＢＴＥＣＨ  ５，２５５−２６１）；数多くの細菌、酵母およびカビによって生産されることが知られている。
セルロース分解酵素の利用のために開発されてきた用途の中で主要なものは、（森林）セルロースパルプを（バイオ）エタノール製品のための糖に分解すること、「ストーンウオッシュ」および「バイオポリッシュ」等の布地の処理および洗剤組成物に関与するものである。このように、セルラーゼは、泥の除去、即ちクリーニングのための洗剤組成物において有用であることが知られている。例えば、英国出願第２０７５０２８号、第２０９５２７５号、および第２０９４８２６号は、洗剤がセルラーゼを取り込んでいる場合には改善された洗浄性能を有することを既述している。それに加えて、英国出願第１３５８５９９号は、綿含有織物の粗さを減少させるために洗剤中においての利用を記述している。
布地の処理におけるセルラーゼの別の有用な特徴は、それらの色をより活性化することによる使用された織物の再生である。例えば、綿含有織物のを繰り返し洗濯すると、機械的作用によって引き起こされた、しばしば「ピル（ｐｉｌｌｓ）」と呼ばれる崩壊し、無秩序化したフィブリンによるものであると信じられている織物の灰色がかった外観という結果となる。この灰色がかった外観は、染色された織物においては特に目立つ。その必然的な結果として、セルラーゼの、無秩序化した上層の繊維を除去し、そのように織物の全体の外観を改善する能力は価値がある。
上記の特性のいくつか、または全てを有する数多くのセルラーゼ組成物に関連した技術における知識にもかかわらず、例えば、布地の処理において、洗剤組成物の成分として、パルプおよび紙の処理において、およびバイオマス変換において有用である多様な特徴のスペクトルを有する新規セルラーゼに対する継続している需要が存在する。出願人は、そのような特性の補足を有していて、そのような公知のセルラーゼの用途において有用である特定のセルラーゼを発見した。
発明の概要
洗剤、布地処理およびパルプと紙工業においての利用のために好ましい特性を有する新規セルラーゼを提供することが本発明の１つの目的である。
本発明によれば、セルラーゼはバシルス  ｓｐ．ＣＢＳ６７０．９３より入手可能、または派生可能であり、または前記セルラーゼの派生体である。ＣＢＳ６７０．９３はＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ），Ｂａａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに預託番号ＣＢＳ６７０．９３として、１９９３年１２月２３日に預託されている（ＣＢＳ６７０．９３）。好ましくは、新規セルラーゼは図２のアミノ酸配列（配列番号２）、またはそれに対する８９％より多くの配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するその派生体を含む。本発明はまた、図２のアミノ酸配列（配列番号２）、またはそれに対する９２．５％より多くの配列類似性、好ましくは９７．５％より多くの配列類似性を有するその派生体に向けられている。
別の実施態様によれば、図２（配列番号２）に従ったアミノ酸配列、またはそれに対する８９％より多くの配列同一性、好ましくは９５％以上の配列同一性を有するその派生体をコードしているＤＮＡを含む組成物が提供される。または、図２のアミノ酸配列（配列番号２）、またはそれに対する９２．５％より多くの配列類似性、好ましくは９７．５％より多くの配列類似性を有するその派生体をコードしているＤＮＡを含む組成物が提供される。
本発明のさらに別の態様においては、適当な微生物を、本発明に従ったアミノ酸配列をコードしているＤＮＡによって形質転換する方法が提供されている。付加的には、本発明に従ったＤＮＡにより形質転換された微生物が提供される。
特に好ましい本発明の実施態様においては、セルラーゼはバシルス  ｓｐ．ＣＢＳ６７０．９３から派生された、約５０ｋＤの計算上の分子量を有しているセルラーゼである。約５０ｋＤのセルラーゼは、約４の計算上の等電点、および４０℃では約６−１０、６０℃では約７のＣＭＣに対する至適ｐＨを有している。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＢＳ６７０．９３から派生された約５０ｋＤのセルラーゼの、４０℃および６０℃でのｐＨ特性を示している。
図２は、ＣＢＳ６７０．９３から派生された５０ｋＤのセルラーゼの、ＤＮＡ配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を、成熟酵素を得るため分泌の際に分解される、下線が引かれたリーダーペプチドとともに示す。
発明の詳細な説明
「派生体」とは、天然のタンパク質から、１またはそれより多くのアミノ酸を天然タンパク質のＣ−またはＮ−末端の何れかまたは両方に添加すること、天然のタンパク質のアミノ酸配列の中の多数の異なったサイトを１またはそれより多くを置換すること、天然のタンパク質の何れかまたは両方の末端またはアミノ酸配列中の１またはそれより多くのサイトにおいて１またはそれより多くのアミノ酸を欠失させること、または天然のアミノ酸配列の１またはそれより多くのサイトに１またはそれより多くのアミノ酸を挿入することによって派生されたタンパク質を示す。酵素派生体の調製は、好ましくは天然タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を改変し、そのＤＮＡ配列で適当な宿主を形質転換し、派生体酵素を生成するために改変ＤＮＡ配列を発現することにより実行される。本発明の派生体には、プレカーサーアミノ酸配列（例えば、本発明の野生型または天然状態の酵素）と比較して改変されたアミノ酸配列を含み、特徴的なプレカーサー酵素の本質は維持しているがいくつかの特定の面で改変された特性を有するペプチドが含まれる。例えば、改変セルラーゼは増加された最適ｐＨまたは増加された耐熱性を有していてもよいが、その特徴的セルロース分解活性を保持しているであろう。派生体にはまた、酵素分子内のアミノ酸残基の化学修飾も含まれる。
セルラーゼはバシルス  ６７０．９３から、そのようなセルラーゼが、その生物から得られうるセルラーゼのアミノ酸配列に対応しているアミノ酸配列を有している場合は「得られうる」。このように、本発明の５０ｋＤセルラーゼと同一のアミノ酸配列を有する、異なったバシルスから派生されたセルラーゼは、バシルス  ６７０．９３から「得られうる」。
「宿主細胞」とは、本発明の組換えＤＮＡベクターの宿主および発現ビークルとして機能する能力を有する細胞を意味する。本発明に従った好ましい実施態様においては、「宿主細胞」はバシルスの細胞を意味する。
「ＤＮＡ構築物」または「ＤＮＡベクター」とは、上記の新規セルラーゼまたはセルラーゼ派生体の何れかをコードしている、１またはそれより多くのＤＮＡ断片を含むヌクレオチド配列を意味する。
好ましい実施態様においては、セルラーゼはＣｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂｅａｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから、ブタペスト条約に基づいて１９９３年１２月２３日に預託された微生物預託番号ＣＢＳ  ６７０．９３（ＰＣＴ／ＥＰ９４／０４３１２に記載）を通して得られる。ここにおいて用いられるように、預託された種はＣＢＳ  ６７０．９３として称されるであろう。より好ましい実施態様においては、本発明のセルラーゼは、ＣＢＳ  ６７０．９３から派生された約５０ｋＤのセルラーゼ（成熟タンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算）である（ここにおいて「５０ｋＤセルラーゼ」と称される）。この約５０ｋＤのセルラーゼは成熟タンパク質について、約４のｐＩ、および、４０℃で約６−１０、６０℃で約７のＣＭＣに対するｐＨ至適を有する。
約５０ｋＤのセルラーゼのアミノ酸配列をコードしている遺伝子は、ＣＡＯＳ／ＣＡＭＭ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｉｊｉｍｅｇｅｎ，Ｈｏｌｌａｎｄを利用して、様々なライブラリー（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬ、およびＰＩＲ）においてアクセス可能な配列データと比較することにより解析した。本発明のＤＮＡ配列によりコードされているセルラーゼと、出版されたかまたは公知のセルラーゼ遺伝子配列との比較のためのデータベースの検索により、バシルス  ｓｐ．Ｎ−４（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．，ｖｏｌ．１６８，ｐｐ．４７９−４８５（１９８６）のセルラーゼＣｅｌＡと顕著なアミノ酸同一性が見られることが判明した。
約５０ｋＤのセルロースは、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８５，ｐｐ．２４４４−２４４８（１９８８）に記載されているＴＦａｓｔＡプログラムを用いては、もっとも近い刊行されたセルラーゼ配列に、配列の８９％が同一で、配列の９２．５％が類似であることが示された。このＴＦａｓｔＡデータ検索プログラムはＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７０５）より市販されている。このように、本発明は図２中のものに従ったアミノ酸配列を有するセルラーゼまたはそれに対する８９％より多くの配列同一性、好ましくは９５％以上の配列同一性を有する派生体を含む。本発明はさらに、図２（配列番号２）に従ったアミノ酸配列に対して、９２．５％より多くの配列類似性、好ましくは９７％より多くの配列類似性を有するアミノ酸配列を有するセルラーゼも含む。
本発明は、セルラーゼの製造のための工程もまた開示する。１つの実施態様においては、セルラーゼは適当な生物、例えばバシルスｓｐ．ＣＢＳ６７０．９３を、セルラーゼを生産するような条件の下で培養することにより調製されてもよい。好ましくは、このような条件には、セルラーゼの生産を最大にするためのバシルスの培養について一般に提案されているものが含まれ、そしてセルロース派生基質を単一のエネルギー源として、必要な塩、イオンおよび他の良く知られた成分と組み合わせて用いる事も含む。一般に、細胞を培養するために用いられる培地は、何れの細菌培養に好適な従来の培地であってもよい。細胞は同化可能な炭素および窒素を他の必須の栄養とともに含む栄養培地で好気的条件下で培養されても良い。好適な炭素源はシュクロース、グルコースおよびデンプン等の炭水化物、または穀物種子、麦芽、米およびモロコシ等の炭水化物含有材料である。培地中に取り込まれる炭水化物の濃度は大幅に、例えばグルコース相当として計算されたパーセンテージで２５％までから１−５％で変動しうるが、通常は８−１０％が好適である。栄養培地中の窒素源は無機または有機質のものである。好ましい無機窒素源は硝酸塩またはアンモニア塩である。バクテリアの培養に関与する発酵工程において規則的に用いられる有機窒素源の中には、大豆粉、綿種子粉、ピーナツ粉、カゼイン、トウモロコシ、トウモロコシ漬酒、酵母エキス、尿素およびアルブミンがある。付加的には、栄養培地は標準微量基質もまた含むべきである。
セルラーゼは培地から従来の手順により回収されてもよいが、それには、遠心または濾過により、必要であれば細胞の破砕後に、上清または濾液のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）成分を、硫酸アンモニウム等の塩によって沈殿させ、続いてイオン交換カラム、吸着クロマトグラフィー等の多様なクロマトグラフィー的工程による精製、または同様の技術的に認識されている工程が含まれる。本発明に従ったアルカリセルラーゼの製造のためには、セルロースをベースとしたエネルギー源を含む培地を用いてアルカリ条件下で培養することが好ましい。
好ましくは、本発明に従ったセルラーゼは、遺伝子工学技術を用いて、適当な宿主細胞をセルラーゼをコードしている遺伝子で形質転換し、宿主細胞の増殖およびセルラーゼの発現に好適な条件下でセルラーゼを発現させることにより生産される。第１の段階として、クロモソーマルＤＮＡは、Ｓａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｍｉｕｒａ（Ｓａｉｔｏ  ＆  Ｍｉｕｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．６１９（１９６３））の方法、または同様の方法により、ドナー細菌菌株から得られ得る。このように得られたクロモソーマルＤＮＡの制限酵素分解によって、アルカリセルラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が提供された。この目的のためには、前記遺伝子の領域を分解しない限りは何れの制限酵素が用いられてもよい。その他には、遺伝子を分解する制限酵素が、部分分解のみを可能とするように減少された濃度または保温時間で、用いられてもよい。好ましい制限エンドヌクレアーゼはＳａｕ３Ａである。その結果生じる消化混合物から、適当な断片（２−６ｋｂ）を単離することが出来、好適な宿主を、ＤＮＡ構築物、例えば約１．９ｋｂの本発明の５０ｋＤセルラーゼをコードしていて適当なベクター配列に連結されているＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構築物等で形質転換するために用いた。この連結混合物は、続いて好適な宿主中に形質転換された。
本発明のセルロースをコードしている遺伝子は、λファージ（発現）ベクターおよびＥ．コリ宿主細胞を用いてクローン化することが可能である。（他には、保存領域上に設計されたコンセンサスプライマーを用いたＰＣＲクローニングも用いられてもよい。）出願人は、本発明のセルラーゼをコードしている遺伝子の形質転換およびＥ．コリ中での発現が活性な酵素となることを発見した。Ｅ．コリにおける第１のクローニング段階の後、本発明のセルラーゼ遺伝子は、より好ましい産業発現宿主である、バシルス、ストレプトマイセス種等、アスペルギルスまたはトリコデルマ等の糸状菌、またはサッカロマイセス等の酵母等に移すことが可能である。これらの宿主生物中で得られる高レベル発現および分泌は、セルラーゼがそこから続いて回収され得る発酵培地へのセルラーゼの蓄積を可能とする。
好ましくは、発現宿主は、バシルス種、より好ましくはバシルス  リケニフォルミスまたはバシルス  スブチリスを含む。特に好ましい実施態様においては、産物セルラーゼが発酵培地もしくはその濃縮物中においてプロテオリシスに晒されないことを確実とするためにプロテアーゼ遺伝子を欠失させてある。好ましい一般的な、プロテアーゼ欠失バシルス株のための形質転換および発現プロトコルは、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５２６４３６６号、ここに参考文献として取り込まれている、に提供されている。また好ましくは、形質転換されたバシルス宿主の発酵は、約６．９のｐＨで行われる。アスペルギルスの形質転換および発現は、例えば、Ｂｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５３６４７７０号に記載されていて、ここに参考文献として取り込まれている。宿主細胞がバシルスである場合に好ましいプロモーターはａｐｒＥプロモーターである。
ＣＢＳ６７０．９３から派生された今回の約５０ｋＤのセルラーゼはグリシン、酢酸アンモニウム、ホウ酸ナトリウム、および／またはトリスを含むバッファーシステムにおいて有用であることが示された。このセルラーゼはＣＭＣに対してマグネシウムの存在により活性化されカルシウムの存在により阻害されることが判明した。カルシウムのマグネシウムに対する約７５０ｐｐｍ：２５０ｐｐｍの割合は、活性の利益ありという結果もまた得られた。
本発明に従って、上記のセルラーゼ組成物は、技術的に認識された、洗剤におけるセルラーゼの利用方法に従って、洗剤組成物中で用いられてもよい。このセルラーゼのアルカリｐＨにおける素晴らしい活性は、このセルラーゼは高ｐＨ洗剤において特に有用であるという結果となる。
本発明は、以下の実施例においてより詳細に説明されるであろうが、これらの実施例は説明の目的で提供されており、発明の限定として解釈されるべきではない。
実施例１
アルカリ土壌および水試料からのセルラーゼの検索および単離
アルカリ土壌および水試料からのセルラーゼ産生微生物の単離のために２つの方法を応用した。１つの方法においては、土壌および水試料を０．８５％生理食塩水溶液に懸濁し、直接、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）−寒天拡散アッセイにおいてセルラーゼ生産コロニーの検出のために用いた。第２の方法においては、土壌および水試料は、セルロース含有液体最少培地またはＧＡＭ培地中で１−３日間、４０℃で保温することにより、セルロース含有菌株を濃縮した。細菌増殖を示した培養を、ＣＭＣ−寒天拡散アッセイにおいてセルラーゼ生産コロニーの検出のために用いた。ＣＭＣ−寒天拡散アッセイおよび濃縮工程は、ｐＨ約９．７、１％ＫＮＯ3、０．１％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％ＫＨ2ＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１％Ｎａ2ＣＯ3、４％ＮａＣｌおよび０．２５％ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−４８８８）を含む最少培地を用いた。固体化のためには、１．５％寒天を添加した。
ＣＭＣ−寒天拡散アッセイのために、コロニーまたは液体画分が試験されるかに応じて２つの工程の１つが用いられた。コロニーの試験には、０．８５％生理食塩水溶液中の細胞懸濁液を、ＣＭＣ含有最少培地にプレートした。４０℃で１−３日の保温の後、プレートをレプリカプレートし、親プレートに０．１％コンゴレッドを１５分間満たした。プレートは１Ｍ  ＮａＣｌで３０分間脱色した。コロニーのまわりにクリアーゾーンを示した菌株は、可能性のあるセルラーゼ産生微生物として単離された。液体画分は、酵素溶液または発酵液体培地の４０μｌのアリコートをピペットで取り、ペトリ皿中の５ｍｍの最少培地層からくり貫かれたウェル中に入れられた。４０℃、１６時間の保温の後、セルラーゼ活性をコンゴレッド／ＮａＣｌ処理により検出した。クリアーゾーンの直径がＣＭＣ活性の尺度である。
２つの検索方法の何れかを用いてクリアーゾーンを示した菌株を、増殖およびセルラーゼの単離のために選択した。コロニーを、保温シェーカー（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）中の１００ｍｌの振とうフラスコ中の２５ｍｌのＧＡＭ−培地中で、２５０ｒｐｍ、４０℃で７２時間発酵させた。培養液体培地中のＣＭＣａｓｅ活性は、ｐＨ９、４０℃で、発酵培地中のセルラーゼの存在を実証するために決定した。酵素生産のために用いられた混合培地（ＧＡＭ）は、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ）０．５％、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）０．５％、グルコース  Ｈ2Ｏ  １％、ＫＨ2ＰＯ4  ０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０２％、Ｎａ2ＣＯ3  １％、ＮａＣｌ  ４％を含んでいた。ｐＨは９．５に４Ｍ  ＨＣｌによって調整し、その後に１％ＣＭＣを添加した。
上記の方法を用いて、セルラーゼ産生微生物を単離し、それらはさらに小型直線状桿菌、場合によってはペアとなり、運動性であると特徴付けられた。終点（ｔｅｒｍｉｎａｌ）から副終点（ｓｕｂ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）の胞子は、透明な膨張している胞子嚢を有し楕円形である。ＧＡＭ寒天上のコロニーは、クリーム色のような白で、糸状の周辺部と不規則な表面を有してダル（即ち光沢がない）として見られた。１６ＳｒＲＮＡ配列分析により、この微生物はバシルス属の種として分類された。この生物はここにおいてＣＢＳ６７０．９３として言及され、その預託番号によりＣｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに預託されている。
実施例２
ＤＮＡの単離、形質転換およびセルラーゼの発現
好アルカリバシルス株ＣＢＳ６７０．９３を、Ｅ．コリでの発現クローニングのためのドナー株として選択した。クロモソーマルＤＮＡは、Ｓａｉｔｏ  ＆  Ｍｉｕｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．６１９（１９６３）に記載された方法で単離した。
単離されたクロモソーマルＤＮＡは、制限酵素Ｓａｕ３Ａにより、連続的に希釈した酵素溶液を用いて、３７℃で１時間、Ｒｅａｃｔ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，Ｍｄ，ＵＳＡ）を用いて供給者に推薦されている条件下で部分消化した。消化されたＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動で分画し、適当な画分（２−６ｋｂ）をゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを供給者（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａ．，ＵＳＡ）によって記述されたプロトコルに従って用いて単離した。
クロモソーマルＤＮＡのＳａｕ３Ａ断片は、ゲノム遺伝子ライブラリーを、ＢａｍＨ１消化ＣＩＡＰ処理ＺＡＰ発現ベクター中に供給者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ，ＵＳＡ）によって記述されたプロトコルに従って構築するために用いた。ｐＢＫ−ＣＭＶファージミド、クローン化されたＤＮＡインサートを含有、をＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ベクターから切り出し、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＸＬＯＬＲ中に形質転換した。
組換えクローンを、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，ｖｏｌ．１６０，ｐｐ．５９−７４（１９８８）によって記述されたように寒天拡散によりスクリーニングした。コロニーの周囲にクリアーゾーンを示した株を単離した。単離された組換体のＣＭＣａｓｅ活性は、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）４％、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ）８％、ラクトース０．２％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む４＊ＹＥＰ培地で４８時間発酵させた後に決定した。組換体タンパク質を精製し（実施例３）、アミノ酸配列を決定した（配列番号２）。
セルラーゼ産生組換体のプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを供給者（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）によって記述されたプロトコルに従って用いて単離した。プラスミドは約１．９ｋｂのクロモソーマルＤＮＡのインサートを含有していた。１９３３ｂｐの断片の塩基配列を、Ｎ末端アミノ酸配列から派生された変性オリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして１．９ｋｂインサート上に位置させるために用いて決定した。１９３３ｂｐ断片は、それから２３アミノ酸のリーダー配列を含む４６７アミノ酸のタンパク質が推定できる１４２２ｂｐのオープンリーディングフレームを含んでいた。前記セルラーゼをコードしている遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）および単離された単一のセルラーゼの推定配列（配列番号２）は、続いて決定することができ、図２に記載されている。
実施例３
セルラーゼの精製
実施例２からのセルラーゼ産生クローンは、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）４％、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ）８％、ラクトース０．２％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む混合培地（４＊ＹＥＰ）で増殖させた。発酵液体培地は培養液から遠心分離（８０００ｒｐｍ）により分離した。上清中のセルラーゼを、硫酸アンモニウムで沈殿させた（６５％飽和）。沈殿物は２５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７＋５ｍＭ  ＥＤＴＡに、伝導率７ｍＳ／ｃｍが達成されるまで溶解させた。この溶液をＱ−セファロースＦＦ（直径５ｃｍ、長さ１０ｃｍ）陰イオン交換カラムに充填し、その後でカラムを２５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７＋５ｍＭ  ＥＤＴＡで、吸光度０．２ＡＵまで洗浄した。２５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７中で０から０．５ＭのＮａＣｌグラジエントを８０分間にカラムにかけ、１０分間で０．５から１Ｍのグラジエントを続けた。溶出は第１のグラジエントで生じた。溶出後、カラムは１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄（アップフロー；ｕｐｆｌｏｗ）し、再び２５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７＋５ｍＭ  ＥＤＴＡで平衡化した。溶出特性に依存して、得られたセルラーゼは約８０％までの純度を有していた。
実施例４
本発明に従ったセルラーゼの特性
本発明の約５０ｋＤのセルラーゼのｐＨ／温度特性を決定するために、さまざまなｐＨおよび温度でＣＭＣに対する活性を測定した。約５０ｋＤのセルラーゼを含む溶液は、バッファー中に、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）に希釈されて組み合わせられた（ｐＨは１００ｍｌの１Ｍリン酸、１００ｍｌクエン酸および、４Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ４、５、６、７、８、９または１０に調整されたｐＨを有する６００ｍｌの蒸留水の混合物を含むバッファーを用いて調整し、その後１１まで蒸留水を用いて増量された）。酵素溶液は、ｐＨ７、４０℃で０．０５Ｕ／ｍｌまで希釈した。各々のバッファーシステムを、実際のｐＨを確認するために、０．５ｍｌのバッファー、０．５ｍｌの基質（１％ＣＭＣ）および０．１ｍｌの１０ｍＭリン酸バッファーを混合した後に試験した。ｐＨ４、５、６、７、８、９および１０のための溶液の実際のｐＨは、それぞれ４．２、５．２、６．２、７、８、８．７および９．９であった。
この結果は、図１に表示されており、セルラーゼの素晴らしいアルカリ活性を示している。校正曲線の傾きは、酵素基質混合物のｐＨに依存しているが、それは２つのグルコース標準が各々のｐＨにおいてとられた（５００ｍｇグルコース。Ｈ２）／１００ｍｌ  １０または２５回希釈、という理由による。
セルラーゼ活性は、改変ＰＡＨＢＡＨ法（Ｌｅｖｅｒ  Ｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７２，４７，２７３−２７９およびＬｅｖｅｒ  Ｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７７，８１，２１−２７）を用いて以下のように行った。ｐＨ／温度特性は、ｐＨ７、４０℃で測定された存在量−反応特性の直線部分に適合している一定の酵素濃度を用いて決定された。この酵素濃度は、決定された他の全ての条件の下での活性測定に用いられた。試験管を２５０μｌの５０ｍＭ  グリシンバッファーｐＨ９中の２．５％  ＣＭＣ（低粘度ＣＭＣはＳｉｇｍａより購入）および適当なバッファーで希釈された２５０μｌの５０ｋＤセルラーゼのアリコートで満たした。試験管を３０分間４０℃でウォーターバス中で保温し、その後に１．５ｍｌの毎日新鮮であるように調製されたＰＡＨＢＡＨ溶液（１００ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨ中の１％  ＰＡＨＢＡＨと１００ｍｌビスマス溶液（４８．５ｇビスマス硝酸塩、２８．２ｇ酒石酸カリウムナトリウムおよび１２．０ｇのＮａＯＨ）を添加した。混合物を７０℃で１０分間加熱し、その後に２分間氷冷した。４１０ｎｍでの吸収を測定した。酵素試料のバックグラウンド吸収を排除するために、対照実験を以下のように行った：試験管を前出の試験管と同じ条件下で保温した。保温後、１．５ｍｌ  ＰＡＨＢＡＨおよび酵素調製物を添加した（この順序で）。１ユニット（Ｕ）は、１分あたり、生産品グラムあたり、ＣＭＣ相当体から還元糖として測定された１μｍｏｌのグルコースを生産する酵素量として定義された。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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