(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、被検化合物が特定の疾患を治療するための候補化合物となるか否かを判定する方法。
（ａ）（ｉ）被検化合物で処理した疾患細胞由来のcDNA、および
（ｉｉ）疾患に関連するクラスターを構成する複数のクラスター遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のcDNAと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程、
（ｃ）基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたcDNAを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｄ）被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する工程。
【請求項２】
以下の（ａ）から（ｅ）の工程を含む、特定の疾患を治療するための候補化合物をスクリーニングする方法。
（ａ）（ｉ）被検化合物で処理した疾患細胞由来のcDNA、および
（ｉｉ）疾患に関連するクラスターを構成する複数の遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のcDNAと（ｉｉ）の基板を接触させる工程、
（ｃ）基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたcDNAを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｄ）被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する工程、
（ｅ）被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を、対照細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現レベルに回復させる被検化合物を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、特定の疾患の治療のための候補化合物の判定およびスクリーニングに関する。
背景技術
特定の疾患の治療用化合物の同定のための典型的なハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法においては、単純なアッセイが開発されている。例えば、２つのタンパク質間の相互作用が特定の疾患での病態生理学的プロセスのひとつとして同定されると、その相互作用を特異的にブロックする薬剤を同定できるアッセイが構築される。しかしながら、このアッセイは、人工的な遺伝子導入によってコードされたタンパク質間の特殊なイベントを、人工的なレポーターアッセイによって検出するという原理に基づいているため、この方法において単離された化合物が実際に天然状態の細胞において生物学的な効果を有するかどうか不明であるという欠点があった。
また、天然状態の細胞を用いたスクリーニングは通常の実験スケールで行うことは可能であるが、一度に多数の検体、特に多数の遺伝子についてハイスループットで行うには限界があった。
そこで、実際に天然状態の細胞においても効果が期待できる疾患治療のための化合物を効率的に同定しスクリーニングしうる方法の開発が期待されていた。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、天然の細胞内においても生物学的な効果が期待できる疾患治療のための候補化合物を判定およびスクリーニングするための新規な方法を提供することにある。
マイクロアレイは一度のアッセイで何千もの遺伝子の発現を並行して解析することができ、その複数の実験によるデータを基にして、さらなる解析を行うことにより、共制御される遺伝子群をクラスターとして分類、同定することができる。酵母における研究では、このようなクラスターを生じさせる変異は、クラスターの上流のパスウェイに位置する遺伝子に高頻度に起こることが立証されている（Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｖｉａ  ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｃｅｌｌ  ２０００；１０２（１）：１０９−１２６）。本発明者らは、かかる事実に着目し、ある疾患に関連した遺伝子（疾患遺伝子）の下流に位置するクラスターとして同定される遺伝子群（クラスター遺伝子）の発現を指標とすることにより、疾患遺伝子の発現をモニターすることが可能であると考えた。即ち、本発明者らは、クラスター遺伝子の発現を、疾患遺伝子の発現のレポーターとして利用できると考えた。
そこで、次ぎに、本発明者らは、かかる着想を疾患治療の候補化合物のスクリーニングに応用すべく鋭意研究を行った。その結果、疾患遺伝子の発現の天然の指標としてのクラスター遺伝子の発現をマイクロアレイ上で網羅的に検出することによる、疾患治療のための候補化合物を効率的に同定しスクリーニングする方法を開発することに成功した。
本発明の方法においては、まず、特定の疾患に関連するクラスターを構成する複数の遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを固定した基板を作製する。次いで、この基板上のオリゴヌクレオチドに対し、被検化合物処理した疾患に関連する細胞由来のｃＤＮＡを接触させ、被検化合物処理した疾患に関連する細胞におけるクラスター遺伝子の発現をモニターする。次いで、処理に用いた被検化合物の中から、クラスター遺伝子の発現を正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復させるような化合物を選択する。これにより、疾患治療の候補化合物を取得することができる。この方法でレポーターとして使用するクラスター遺伝子は、天然状態で細胞内に存在することから、化合物の細胞に対する効果を直接反映する。従って、上記方法によって取得される化合物は、疾患の治療の際に、実際に効果を奏することが大いに期待される。
即ち、本発明は、細胞内においても生物学的な効果が期待できる疾患治療のための候補化合物の新しい判定およびスクリーニング方法に関し、より具体的には、
〔１〕以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、被検化合物が特定の疾患を治療するための候補化合物となるか否かを判定する方法、
（ａ）（ｉ）被検化合物で処理した疾患細胞由来のｃＤＮＡ、および
（ｉｉ）疾患に関連するクラスターを構成する複数のクラスター遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のｃＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程、
（ｃ）基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｄ）被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する工程、
〔２〕以下の（ａ）から（ｅ）の工程を含む、特定の疾患を治療するための候補化合物をスクリーニングする方法、
（ａ）（ｉ）被検化合物で処理した疾患細胞由来のｃＤＮＡ、および
（ｉｉ）疾患に関連するクラスターを構成する複数の遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のｃＤＮＡと（ｉｉ）の基板を接触させる工程、
（ｃ）基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｄ）被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する工程、
（ｅ）被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を、対照細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現レベルに回復させる被検化合物を選択する工程、
〔３〕〔２〕に記載の方法によって単離される、特定の疾患を治療するための候補化合物、を提供するものである。
本発明は、被検化合物が特定の疾患を治療するための候補化合物となるか否かを判定する方法を提供する。
本発明の方法においては、まず、（ｉ）被検化合物で処理した疾患細胞由来のｃＤＮＡ、および（ｉｉ）疾患に関連するクラスターを構成する複数の遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する（工程（ａ））。
本発明における「疾患細胞」とは、疾病を呈する生物由来の細胞を意味する。好ましくは、患部組織における細胞である。また、疾患を代表する株化された細胞（例えば、疾患が癌であれば、癌細胞株）もまた本発明の「疾患細胞」に含まれる。
疾病を呈する生物としては、特に制限はない。ヒトの疾患の治療薬の候補化合物をスクリーニングする目的であれば、好ましくは哺乳動物（例えば、ラットやマウスなどのヒト疾患のモデル哺乳動物）であり、最も好ましくはヒトである。例えば、治療すべき疾患と、好ましい疾患細胞の例として以下のものを挙げることができる。
癌：癌組織、癌細胞株
増殖性疾患：前立腺肥大、子宮筋腫、子宮内膜症等の疾患由来細胞株、モデル動物細胞もしくは患者細胞
循環器疾患：高血圧、動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈再狭窄等の疾患由来細胞株、モデル動物細胞もしくは患者細胞
その他糖尿病、炎症性疾患、免疫疾患、感染症等への適用も考えられる。
本発明において「被検化合物で処理した疾患細胞」とは、被検化合物と直接接触させた疾患細胞、および被検化合物を接種した生物由来の細胞の双方を含む意である。例えば、疾患細胞がヒト疾患のモデル哺乳動物由来である場合には、被検化合物を投与した疾患モデル動物由来の細胞も本発明の「被検化合物で処理した疾患細胞」に含まれる。
疾患細胞の被検化合物での処理は、例えば、単離細胞であれば、Ｓｃｈｅｒｆら（Ｕ  Ｓｃｈｅｒｆ，Ｄ  Ｔ  Ｒｏｓｓ，Ｍ  Ｗａｌｔｈａｍ，Ｌ  Ｈ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ  Ｋ  Ｌｅｅ，Ｌ  Ｔａｎａｂｅ，Ｋ  Ｗ  Ｋｏｈｎ，Ｗ  Ｃ  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｔ  Ｇ  Ｍｙｅｒｓ，Ｄ  Ｔ  Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄ  Ａ  Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｍ  Ｂ  Ｅｉｓｅｎ，Ｅ  Ａ  Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｙ  Ｐｏｍｍｉｅｒ，Ｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｐ  Ｏ  Ｂｒｏｗｎ  ＆  Ｊ  Ｎ  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０００，２４．２３６−２４４）の文献に記載の方法によって行うことができる。また、生物個体であれば、化合物を経口的または非経口的に投与することにより行うことができる。
本発明のスクリーニングに用いられる被検化合物としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる
疾患細胞からのｃＤＮＡの調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。ｃＤＮＡの調製の好ましい態様においては、まず疾患細胞から全ＲＮＡの抽出を行う。全ＲＮＡの抽出は、当業者にとって周知の方法、例えば次のようにして行うことができる。全ＲＮＡ抽出には純度の高い全ＲＮＡが調製できる方法であれば、既存の方法およびキット全て用いることが可能である。例えばＡｍｂｉｏｎ社“ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ”を用い前処理を行った後、ニッポンジーン社”Ｉｓｏｇｅｎ”を用いて全ＲＮＡの抽出を行う。基本的にはそれらの添付プロトコールに従えばよい。即ち細胞をハーベストし、ＰＢＳで洗浄後ＲＮＡ  ｌａｔｅｒに再懸濁後４℃に少なくとも１時間置く。１５Ｋ、５分間遠心後上清を除きペレットを細分化する。２ｘ１０６ｃｅｌｌｓあたり１ｍｌのＩｓｏｇｅｎを加え完全に混合し、５分間室温放置、その後クロロホルム抽出を２回行う。その後イソプロパノール処理、８０％エタノールで洗浄後乾燥させ、ＲＮＡｓｅフリーの水に懸濁、溶解する。
次いで、抽出した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡの合成を行い、ｃＤＮＡ試料を調製する。全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、当業者に周知の方法で実施することができる。
調製したｃＤＮＡ試料には、必要に応じて、検出のための標識を施す。標識物質としては、検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、蛍光物質、放射性元素等を挙げることができる。標識は、当業者によって一般的に行われる方法で実施することができる（Ｌ  Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９９，１１７−１２２）。
例えばｃＤＮＡ合成および蛍光標識を次のようにして行うことができる。基本的には逆転写反応時に蛍光標識したｄＵＴＰを用いることによって行う。例えば１０ｍｇの全ＲＮＡに２ｍｌのランダムヘキサマー（２ｍｇ／ｍｌ）、２ｍｌのオリゴｄＴプライマー（０．５ｍｇ／ｍｌ）とＲＮＡａｓｅ  ｆｒｅｅ−Ｈ２０を全量１０μｌになるように混合し、７０℃で１０分間加温する。１分間氷上で冷却後保冷したまま直ちに１５ｍｌのｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｉｘ、２．５ｍｌのＣｙ  ｄＵＴＰ（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１ｍｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）および２．０μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを混合し、４２℃で２時間反応させる。反応後氷上で冷却し２０ｍｌ  ５ｘ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍｌ水と１ｍｌ大腸菌ＤＮＡリガーゼを加え、１６℃で１時間後直ちに４．５ｍｌの２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を加え反応を止める。５ｍｌの１．０Ｍ  ＮａＯＨを添加混合し、７０℃で１０分間加温する。５ｍｌの１．０Ｍ  ＨＣｌを加え中和する。
本発明において「クラスター」とは、ある疾患に関連する遺伝子（疾患遺伝子）の作用機序において、下流にある共通のパスウェイに属する遺伝子群を意味する。クラスターを構成する遺伝子の同定は、例えば下記の方法によって行うことができる。各実験で同一の対照サンプルを用いて行った１連のアッセイでは、多くの異なるサンプルの発現プロファイルが比較解析される。一般に２次元クラスタリング法が用いられ、多数サンプルに対する個々の遺伝子の発現プロファイルが順序付けられる（Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｇｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ  １９９９；Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）。クラスタリング技術を用いた典型的な出力データを図１に単純化して示した。これらクラスタリングの方法はヒエラルキカル（階層的）であり、結果として最も類似した遺伝子発現プロファイルを持つサンプル同士は１つの軸に整列化され、また最も類似したサンプル発現プロファイルをもつ遺伝子は他方の軸上に整列化されることになる。このように１つの軸上に整列した遺伝子群が、クラスター遺伝子として同定される。
本発明のクラスター遺伝子として抽出される遺伝子数は、該遺伝子がレポーターとして機能するために、複数の遺伝子を抽出することが好ましく、一般にクラスター遺伝子として抽出される遺伝子数が多いほど、レポーターとしての精度が上昇する。強力なレポーターとして機能させるために、クラスターとして抽出するのに要求される最小限の遺伝子数は、それぞれのクラスターごとに実験的、経験的に決定されるが、通常１０個以上、好ましくは２０個以上、より好ましくは５０個以上である。一般的にはクラスター遺伝子として抽出される遺伝子数は１０〜２０で十分であると想定される。既にガンにおいてはクラスタリングされるいくつかの遺伝子が同定されている（Ａｌｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｐｅｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。さらにより多くのガンが現在分析されているため、現存するクラスターが再確認されたり、新たなクラスターが同定発見されてくることが予想される。これらのほとんどのクラスターは１０以上の遺伝子を含んでおり、本発明における強力なレポーターとして機能することが期待される。
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にマイクロアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。マイクロアレイで用いられる命名法はこれまでサザンブロティングのような従来のハイブリダイゼーション技術において用いられてきたものとは若干異なる。マイクロアレイにおいてはスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２１  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｐａｇｅ  １参照）。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する場合がある。
マイクロアレイ技術の利点は、ハイブリダイゼーションの溶液量が非常に少なく、固定されたヌクレオチドプローブに、細胞の全ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含む非常に複雑なターゲットをハイブリダイズすることできることである。一般にマイクロアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用しすることができる。ヌクレオチドの固定（マイクロアレイ）には２つのタイプがあり、一つはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたマイクロアレイであり、もう一つは主としてＳｔａｎｆｏｒｄ大学で開発されたｃＤＮＡマイクロアレイである。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、クラスター遺伝子と特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドであれば特に制限はない。本発明のヌクレオチドプローブには、オリゴヌクレオチド、またはｃＤＮＡが含まれる。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、クラスター遺伝子と実質的にハイブリダイズし、クラスター遺伝子以外の遺伝子とは実質的にハイブリダイズしないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、検出するクラスター遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明においてその発現を検出したいクラスター遺伝子に応じて、その種類の数が決定される。例えば、クラスター遺伝子として１０個抽出した場合、１０個それぞれの遺伝子と特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブを基板に固定する。その際、それぞれの遺伝子に対応したヌクレオチドプローブは必ずしも１種類に限定される必要はなく、検出したいクラスター遺伝子の任意の領域と相補性を有する複数種のヌクレオチドプローブの混合物であってもよい。
基板に結合するヌクレオチドプローブの長さは、通常ｃＤＮＡを固定する場合１００〜４０００ベースであり、好ましくは２００〜４０００ベースであり、さらに好ましくは５００〜４０００ベースである。オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１５〜５００ベースであり、好ましくは３０〜２００ベースであり、さらに好ましくは５０〜２００ベースである。
本発明の好ましい態様として、複数の疾患に対する治療用候補化合物のスクリーニングを行うことができる。この場合、複数の疾患に関連するそれぞれのクラスターから抽出される複数種のクラスター遺伝子を、それぞれ基板に固定する。
基板へのオリゴヌクレオチドの固定の工程は、一般に「プリント」とも呼ばれる。具体的には、例えば以下ようにプリントすることができるが、これに限定されるものではない。数種のオリゴヌクレオチドプローブを４．５ｍｍ  ｘ  ４．５ｍｍの一つの領域内にプリントする。その際、それぞれのアレイをプリントするのには一つのピンを用いて行うことが可能である。従って４８ピンのツールを用いた場合、４８回の繰り返したアレイを一つの標準的な顕微鏡用スライドにプリントすることが可能である（図４）。これはとりも直さず４８の異なる化合物を一枚のスライド上でアッセイできることを意味している。
本発明においては、次いで、工程（ａ）（ｉ）のｃＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる（工程（ｂ））。
本工程により、クラスター遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な基板上のヌクレオチドプローブに対し、ｃＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には下記のハイブリダイゼーションの条件を示すことができる。
バッファー：５ｘＳＳＣ，１％  ＳＤＳ，５０％  ホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）
反応温度：４２℃
反応時間：１２−１６時間
洗浄ストリンジェンシー：１ｘＳＳＣ、４２℃１０分
１つの基板上で独立した複数のアッセイを行うためには、ハイブリダイゼーションの際に、周辺の試料同士が混ざるのを防ぐ必要があるため、物理的バリアを形成することが好ましい。例えば、基板自体または基板の表層物質を物理的に仕切ることによって分割された領域を作製することができる。具体的には、例えば下記の３つの方法を挙げることができる（図３）。一つ目はスライド内に溝を切ることである（図３Ａ）。充分な深さと量があれば過剰量のハイブリダイゼーションバッファーがあっても周辺のエリアを汚染することなくこれらの溝内に排出、保持されコンタミネーションを防ぐことができる。二つ目はそれぞれのアレイを隔離するためのラバーシール、またはプラスチックシールを使用することである（図３Ｂ）。最後はアレイの周辺に単一物質、もしくは混合物質をプリントし、ハイブリダイゼーション溶液の浸潤を防ぐバリアを作ることである（図３Ｃ）。例えば、グリッダーのソリッドピンをバリアの目的でプリントすることができる。また、疎水性の物質をプリントすることで、アレイ間のバッファーの流出を防ぐことができる。このように基板表面上にバリアを組み立ててプリントすることによって、１つの表層に独立した多数のハイブリダイぜーションが可能となる。
本発明においては、次いで、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を測定する（工程（ｃ））。
本発明においては、ｃＤＮＡ試料中にクラスターを構成する遺伝子由来のｃＤＮＡが存在する場合、基板に固定されたヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとがハイブリダイズする。従って、ハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出することにより、クラスター遺伝子の発現量を測定することができる。ハイブリダイズしたｃＤＮＡの検出は、ｃＤＮＡ試料を標識した物質の種類に応じて当業者においては適宜行うことができる。例えば、ｃＤＮＡが蛍光物質によって標識された場合、スキャナーによって蛍光シグナルを読み取ることによって検出することができる。
本発明においては、次いで、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する（工程（ｄ））。
本発明の好ましい態様においては、疾患細胞および対照細胞のそれぞれの細胞におけるクラスター遺伝子の発現量を同時に測定する。本発明において「対照細胞」とは、疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、被検化合物処理により、正常な状態へ回復することを判定するのに適した細胞を意味する。対照細胞は、好ましくは正常細胞である。本発明の方法においては、２種類の細胞由来のｃＤＮＡ試料について、異なる蛍光物質で標識を施すことにより、１回の測定でそれぞれの細胞におけるクラスター遺伝子の発現量を同時に測定することができる。例えば、上記それぞれのｃＤＮＡ試料の一方を蛍光物質であるＣｙ５で、他方をＣｙ３で標識することができる。それぞれの蛍光シグナルの相対強度は、疾患細胞および対照細胞それぞれにおけるクラスター遺伝子の発現量に応じた相対量を示す（Ｄｕｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１０−１４，１９９９）。このように測定される発現量が、疾患細胞および正常細胞それぞれにおいて実質的に同等であれば、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量は、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているものと判定される。このとき疾患細胞を処理した化合物は、発現レベルが回復したクラスター遺伝子によって特徴づけられる疾患に対し、治療効果を有することが期待される。
本発明の好ましい態様においては、種々の疾患に対するそれぞれのクラスター遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドプローブが結合した基板を利用して、これら疾患に対する被検化合物の効果の判定を行い、該化合物が効果を奏することが期待される疾患を特定することができる。発現量が正常レベルへ回復したクラスター遺伝子に対し、その機能的に上流に位置する疾患遺伝子は、該化合物の標的となるものと推定される。
さらに本発明は、上記の判定方法を利用した、特定の疾患を治療するための候補化合物のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法においては、上記工程（ａ）〜（ｄ）に次いで、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を、対照細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現レベルに回復させる被検化合物を選択する（工程（ｅ））。
本発明の方法によれば、特定の疾患を治療するための候補化合物をハイスループットスクリーニングすることが可能である。こうして本発明の方法によりスクリーニングされた化合物は、人工的なレポーターを利用してスクリーニングされた化合物と比較して、天然の細胞内における生物学的な効果が得られる高い期待を有する。このように本発明のスクリーニングにより単離された化合物もまた、本発明に含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］二次元クラスタリング解析
多数遺伝子の多数癌サンプルにおける二次元クラスタリング解析を行った。図１は、１６の異なった遺伝子パネルに対する３８の異なった癌サンプルのスクリーニングの仮想結果を示す。全ての癌サンプルは、共通の対照サンプルに対して解析を行った。
図１では２次元クラスタリングによって癌サンプルと遺伝子の両方がグループもしくはクラスターに順序付けられる。１６の異なる遺伝子はそれぞれ８個の遺伝子からなる２つのクラスターに分割され、それぞれのクラスターはその中の全てのテストサンプルの中で類似した発現パターンをとっている遺伝子群である。同様に３８の癌は１９個ずつの２つのクラスターに分割され、それぞれは解析した遺伝子の中で類似した発現パターンをもつ癌サンプルからなる。しばしば同一のクラスターに分類された既知遺伝子の機能を参照比較することにより、他の遺伝子が既知遺伝子と関連した機能をもつことが明らかになる。例えば繊維芽細胞における８６１３の遺伝子の血清添加に対する発現応答を時間的変化で追った結果では、１０個の異なったクラスターに分類されることが明らかになった（Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）。このようなクラスターは組織再構成、細胞壁維持や特殊な化合物の生合成といったような特定の細胞過程に関与する遺伝子で構成されている。
［実施例２］ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）マイクロアレイ
疾患の細胞株を一つの化合物で処理し、クラスターの応答性を指標に用いた。即ちこれらのクラスターの遺伝子発現が正常レベルに回復するような化合物の同定を、ＨＴＳマイクロアレイ解析系により行った。このアッセイにおいては無処置の疾患組織を対照としてひとつの化合物で処理した疾患組織との比較を行った。
結果を図２に示す。横列の１１の遺伝子はひとつの疾患に対して同定されたひとつのクラスターである。正常組織（右側アレイ）と比較して疾患組織（左側アレイ）において上昇しているクラスターの発現を低下させる様な化合物はさらに詳細な評価を行う対象候補である。この解析法では化合物のターゲットそのものは直接同定できないが、そのターゲットは影響があったクラスターの中、もしくはさらに上流にあるものと推定できる。
産業上の利用の可能性
本発明は、細胞内においても生物学的な効果を有する疾患治療のための候補化合物のハイスループットスクリーニング方法を提供する。本発明の方法においては、治療のための候補化合物のスクリーニングをする際に、細胞中に本来存在する遺伝子の発現を指標とすることから、被検化合物の細胞に対する効果を直接反映しており、本発明の方法によって取得される化合物は、疾患の治療薬として実際に効果を奏することが大いに期待される。また、本発明の方法では、一回の解析により、種々の疾患のための治療用候補化合物のスクリーニングを同時に行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、多数遺伝子の多数癌サンプルにおける二次元クラスタリング解析を示す写真である。赤色（主にタイプＢ／クラスター１からなる領域、およびタイプＡ／クラスター２からなる領域）は全てのサンプルにおいて中央値を越える発現を示した遺伝子を示す。緑色（主にタイプＡ／クラスター１からなる領域、およびタイプＢ／クラスター２からなる領域）は中央値以下に発現した遺伝子を示す。色の強度（濃淡）はテスト（癌）対  対照サンプル間においての発現の割合に相関する。
図２は、ハイスループットスクリーニングマイクロアレイの結果を示す写真である。横列の１１の遺伝子は一つの疾患に対して同定された一つのクラスターである。主に右パネルの上から４、５、８、１０、１１、１２列目の１１の遺伝子は赤色であり、主に左パネル８列目、および右パネル１、２、３列目は緑色である。
図３は、アレイ間でのバリアを作ることが可能な３種の基板の概要を示す図である。Ａはそれぞれのアレイ間でのチャンネル、Ｂは高くしたシール、Ｃはソリッドピンを用いたその他のバリアまたは疎水性物質のプリントを示す。
図４は、一枚のスライドに４８の異なるテストサンプルを解析するための４８のエリアに物理的に分けたスライドの図である。それぞれのエリアはシングルピンでプリントする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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