(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質の一部である配列番号１記載のペプチド断片を抗原として得られた抗ＪＣウイルス抗体。
【請求項２】
ＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質の一部である配列番号２記載のペプチド断片を抗原として得られた抗ＪＣウイルス抗体。
【請求項３】
ＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質の一部である配列番号３記載のペプチド断片を抗原として得られた抗ＪＣウイルス抗体。
【請求項４】
ＢＫウイルス抗原と交差反応を起こさないことを特徴とする請求項１記載の抗ＪＣウイルス抗体。
【請求項５】
請求項１ないし４記載の抗ＪＣウイルス抗体を含有するＪＣウイルス検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＪＣウイルスの診断や予防・治療に有効な抗ＪＣウイルス抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
〈発明の背景〉
かつては、免疫不全患者でまれにしか見ることのできなかった進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ：Progressive multifocal leukoencephalopathy）が、近年の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：Acquired immune deficiency syndrome）の発生の増加と共に増えてきている。
ＰＭＬは脳神経組織の脱ミエリン病理像を特徴とし、その原因はJCウイルス（ＪＣＶ：JC polyomavirus）の感染によりミエリン生成細胞である寡突起神経膠細胞（oligodendrocyte）が損傷をうけることに起因すると考えられている。また最近では痴呆症の原因の一部としてＪＣＶとの関係が指摘されている。
【０００３】
ＪＣＶは、ヒトのＤＮＡウイルスでパポーバウイルス科ポリオーマウイルス属の一種で、幼・小児期に過半数の人が感染し一生の持続感染を起こす。
FrisqueらはＰＭＬ患者の脳組織よりＪＣＶ（Mad-1株）を分離し、このウイルスのＤＮＡ配列などを解析したところ、polyomavirusであるＢＫウイルス（ＢＫＶ）やＳＶ４０とその構造が類似し、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列とも高いホモロジーを有していることを報告している(Frisque,R.J.et al.,J.Virol.,51,458-469,1984)。
【０００４】
これまでに、脳組織中に存在するＪＣＶを同定するために、多くの方法が応用・検討されてきた。
近年ＰＭＬの診断法はコンピュータ断層撮影（ＣＴ：Computed tomography）や磁気共鳴映像法（ＭＲＩ：Magnetic resonance imaging）などの技術の発達により大きく進歩したが、ＰＭＬの確定診断には脳組織中のＪＣＶの存在を証明する必要があり、患者の血中の抗ＪＣＶ抗体の検査の他、脳組織からのＪＣＶそのものの確認のため、ＤＮＡ解析、抗ＪＣＶ抗体を用いる抗原の検出・免疫組織染色法など様々な方法が試みられている(E.O.Major et al.,Clin. Microbiol. Rev.,5,49-73,1992)。
【０００５】
これらの診断法のうち、サザンブロット解析法やin situハイブリダイゼイション法などによるＤＮＡ解析手法は、特異性、感度、擬陽性の頻度などが原因で、解析データが変化するなど、信頼性・簡便性の観点から問題があると考えられている。
一方免疫組織化学的手法は簡便で信頼性のある方法であるが、ＪＣＶの構成タンパク質のアミノ酸配列がＢＫＶやＳＶ４０のそれと高い相同性を有するゆえ、使用する抗体の特異性がその信頼性を左右する重要なポンイトとなる。
【０００６】
〈従来の技術〉
Knowlesらは分離したＪＣＶをマウスに免疫し、抗ＪＣＶモノクロナール抗体を初めて作成した(W.A.Knowels et al.,J.Med.Viol.,34,127-131,1991)。
Bollagらも同様に、ＪＣＶ株をマウスに免疫し、ＪＣＶのlarge T protein・small t proteinに反応性を有し、ＢＫＶおよびＳＶ４０のそれとは反応性を有しないモノクロナール抗体（monoclonal antibody)  Pab2000を作成した(B.Bollag et al.,Virus Res.,25,223-239,1992)。
ここでlarge T proteinやsmall t proteinはＴ抗原と呼ばれ、パポーバウイルスおよびアデノウイルスなどＤＮＡ型腫瘍ウイルスの遺伝子産物で、細胞の形態学的あるいは造腫瘍性トランスフォーメーションに寄与するタンパク質の総称である。それぞれのウイルスはlarge T、small tなどの２〜３種のＴ抗原を有している。
次にStonerらはＪＣＶのキャプシド（頭殻）タンパク質に対して家兎ポリクロナール抗体を作成し、抗T proteinモノクロナール抗体とこの抗キャプシドタンパク質ポリクロナール抗体を用いて、免疫組織化学的二重染色を行い、ＰＭＬ患者脳組織切片で陽性を示したと報告している(G.L.Stoner et al.,J.Neuroimmunol.,19,223-236,1988)。
このように、免疫学的組織染色を利用した診断については、Ｔ抗原を抗原として用いたものや、ポリオーマウイルスキャプシド抗原を用いたものが開示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように免疫学的組織染色によってＪＣＶ抗原を検出しようとする試みがなされてきたが、１）ポリクロナール抗体または高力価のヒト血清を使用するとＪＣＶとウイルスの性状が酷似するＢＫＶなどと交差反応を起こしてしまうこと、２）また、一般的にポリクロナール抗体は、同一抗原の複数の抗原決定基と反応するため強い親和性（染色性）を示すが、モノクロナール抗体は抗原の一つの抗原決定基と特異的に反応するため、ポリクロナール抗体に比較すると親和性は低いことなどから、実際に免疫組織化学的染色を行う上で、特異性を高めようとすれば染色性が得られず、染色性を高めようとすれば特異性が得られないという問題があった。
【０００８】
Knowlesらの作成した抗体はＪＣＶに対し強く反応するもののＢＫＶにも弱いながら反応し、特異性の点で満足しえるものではなかった。Bollagらの作成した抗体はＴ抗原の一部のみを認識するため、検出できるのはＴ抗原のサブポピュレイション(Subpopulation)だけであり、臨床応用には不十分であった。
また、これらのモノクロナール抗体は上述のように、実際の組織染色性の低さなどの点からも臨床応用には十分ではなかった。
Stonerらの作成した抗キャプシドタンパク質ポリクロナール抗体は、ＪＣＶのみならず、ＢＫＶやＳＶ４０とも反応し特異性がなく、ＪＣＶの検出などには使用できない。
【０００９】
さらに以下のような問題もあった。通常、生体組織はホルマリン固定パラフィン埋設により機械的に保存されているが、従来の抗体では、ホルマリン固定パラフィン埋設組織切片では染色しえなかった(G.L.Stoner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,2271-2275,1986)ためアセトン固定組織を用いていたが、アセトン固定では組織的に不安定であり、ホルマリン固定パラフィン埋設組織で染色しえないのが大きな欠点となっていた。
また、従来作成された抗体は感染細胞を培養し、そこから抽出した抗原を用いているため、正常な脳組織と交差反応を生じる可能性を除去することができなかった。
本発明者等はこれらの問題点を解決すべく抗ＪＣＶ抗体について鋭意研究した結果、ＢＫＶやＳＶ４０とは反応せず、組織染色性に優れる抗ＪＣＶ抗体を見出し本発明を完成した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質の一部である配列番号１、配列番号２または配列番号３記載のペプチド断片を抗原として得られた抗ＪＣウイルス抗体、詳細に述べればＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質の一部であるLys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu(配列番号１)、Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met(配列番号２)、またはVal His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr(配列番号３)のペプチド断片を抗原として得られた抗ＪＣウイルス抗体であり、さらにＢＫウイルスと交差反応を起こさないことを特徴とするＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質の一部である配列番号１記載のペプチド断片を抗原として得られた抗ＪＣウイルス抗体、およびこれらの抗ＪＣウイルス抗体を含有するＪＣウイルス検出試薬に関する。
【００１１】
【発明の実施形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
抗原としてはＪＣＶのキャプシドを構成するＶＰ−１タンパク質の部分ペプチドを用いた。なぜなら、Ｔ抗原はウイルスの感染初期（ＤＮＡ合成開始前）に合成される初期タンパク質であり、これを抗原とする抗体（Ｐａｂ2000など）を用いるよりもウイルスが活性化し、増殖するときに生合成される後期構造タンパク質のキャプシドを抗原として調製した抗体の方が、疾患の発症とあいまって正確にウイルスの活性化を判断することができると考えられるからである。
この抗原ペプチドの選定は以下のように行った。
ＪＣＶのＶＰ−１タンパク質は３５４個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列はＢＫＶのＶＰ−１タンパク質と７８％の相同性をもっている。それゆえＪＣＶ特異的抗体を調製するためにＢＫＶと相同性の低い３つの範囲を抗原ペプチドとした（表１参照）。
【００１２】
【表１】
0003767755.tif 000002
〔表中「・」はＪＣＶとＢＫＶで異なるアミノ酸残基部を示し、「＊」はＪＣＶとＢＫＶで同一のアミノ酸残基部を示す。〕
【００１３】
ペプチド＃１（配列番号１）は60Lysから69Glu（Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu）の１０残基で、対応するＢＫＶペプチドと２つの共通アミノ酸を有する。ペプチド＃２（配列番号２）は60Lysから77Met（Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met）の１８残基で、末端の１０残基がペプチド＃１とオーバーラップしており、対応するＢＫＶペプチドと比較すると８つの共通アミノ酸を有する。ペプチド＃３（配列番号３）は121Valから140Thr（Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr）の２０残基で、対応するＢＫＶペプチドと９つの共通アミノ酸を有する。これらのペプチド配列は、以前から報告されているコンピュータープログラムから予測される抗原性も考慮して選択した（Hopp and Woods,PNAS USA,78,3824,1981;Hopp,Methods in Enzymol.,178,571,1989;Chou and Fasman,Ann Rev Biochem,47,251,1978;Krch'n et al.,Methods in Enzymol.,178,586,1989;Westhof et al.,Nature,311,123,1984;Tainer et al.,Nature,312,127,1984;Karplus and Schulz,Naturwissenschaften,72,212,1985）。さらに、その合成にあたっては、高い抗原性を示すことが期待されるTam JPによって開発されたＭＡＰ系（Maltiple antigen peptide system）を使用して行った（Tam JP,Synthetic Peptide:Approaches to Biological Problems,p3-18,1989;Tam JP,PNAS USA,85,5409,1988;Tam et al.,J.Exp.Med.,171,299,1990;Tam and Lu.,PNAS USA,86,9084,1989）。それぞれのペプチド断片の合成は常法により、ペプチドシンセサイザーを用いて行った。
【００１４】
抗体の調製は、上記のように合成したペプチド＃１〜３を抗原として、常法により行った。
この結果得られた抗体は、ＪＣＶ感染細胞およびＰＭＬ患者の脳組織で優れた免疫学的組織染色性を示した。特に上記ペプチド＃１を抗原として得られた抗体は、ＪＣＶにのみ反応し、ＢＫＶ，ＳＶ４０と交差反応を生じなかった。また、ペプチド＃２，３を抗原として得られた抗体は、ＪＣＶのみならずＢＫＶとも反応するがＳＶ４０とは反応しなかった。従って、ＢＫＶ特異的な抗体とこれらの抗体を併用することによりＪＣＶの感染であるかＢＫＶの感染であるかの判断が可能となる。
また、従来のように感染細胞抽出物を抗原とせず、短いポリペプチド断片を抗原に用いているため、ＪＣＶとの特異性が高く正常脳組織などとは交差反応を生じない。
【００１５】
本発明抗体は特に染色性に優れ、当該抗体によれば通常用いられているホルマリン固定パラフィン埋設組織でも、免疫組織化学的検定に利用することができ、ＪＣＶ感染症、例えばＰＭＬや痴呆症などの確定診断が可能となる。また、キャプシドタンパク質の一部を抗原としているのでホールウイルスで診断することができ、ウイルスが活性化したときに陽性検出ができる。
さらに、本願発明抗体を中和抗体として使用することにより、ＪＣＶ感染症、例えばＰＭＬや痴呆症などを予防・治療することができ、非常に有用である。
【００１６】
本願発明抗体を、予防・治療薬として使用する場合は、注射剤などとして用時調製用の凍結乾燥製剤などとすることができる。
投与量は患者の年齢、症状の程度などの条件により異なるが、例えば1mg〜10g／kg、好ましくは10mg〜１g／kg、さらに好ましくは50mg〜500mg／kgであるが、この範囲には特に限定されず目的とする薬理効果を発揮するのに必要な量を配合すればよい。
本発明に係る予防・治療剤の剤型は本発明の目的を達成できる限り特に限定されないが、通常用いられる方法により、注射剤，輸液などの液体剤、軟膏剤，クリーム剤，ゲルなどの半固形製剤、錠剤，カプセル剤，坐剤などの固形剤、その他ソフトカプセル、リポソームの他、徐放性の製剤などとすることができる。
以上のような製剤を調製するためには、上記成分の他に、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して目的とする剤形にすることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加することができる。
【００１７】
本発明抗体は、ヒト，マウス，家兎の他あらゆる動物などにも応用可能であり、本発明の目的を達成しうる限り、抗体の部分構造、例えば（Ｆab')2やＦab部分だけでも構わない。本発明抗体を診断に応用する場合は、通常使用されている、例えばＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法などに応用が可能である。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１．抗体の調製
前述のように設計し常法により製造したペプチド＃１：Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu（配列番号１）、ペプチド＃２：Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met（配列番号２）およびペプチド＃３：Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr（配列番号３）のそれぞれのペプチド断片に対する抗体は２匹の家兎（日本白色種）を使用して調製した。まず、０日目に、免疫前血清の力価測定用血液をサンプリングした後、家兎に200μｇのペプチドを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ：complete Freund's adjuvant）と共に皮下に注入した。次いで１４，２８および４２日目に100μｇのペプチドと不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ：incomplete Freund's adjuvant）を皮下に注入した。
４９日目に注入したペプチドに対する抗体を含む血液サンプルが得られた。さらに５６日目に100ｍｇのＩＦＡを皮下に注入し、６３日目に家兎から高力価抗体を含む30から50ｍｌの血清を得た。
血清の力価検定はＥＬＩＳＡ法によって、抗体を得るときに使用したペプチド断片に対して行った。ペプチド＃１，＃２および＃３を抗原として得られた抗体は、それぞれＪＣＡｂ１，ＪＣＡｂ２およびＪＣＡｂ３とした。
【００２０】
実施例２．抗体による組織の免疫学的染色
（実験方法）
これらの抗体の特異性は、ＪＣＶおよびＢＫＶ感染培養細胞並びにＰＭＬ患者の脳組織を免疫学的に染色することにより決定した。
ＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞，ＢＫＶ感染２９３細胞およびＳＶ４０感染ＩＭＲ３２細胞をカバーグラス上で培養しアセトンで固定した後、使用するまで−８０℃で保存した。対象としてホルマリン固定したＰＭＬ患者の脳組織のパラフィン埋設断片を使用した。
これらの細胞の免疫学的染色には、ＬＳＡＢキット（Dako社）および上述の高力価血清を５０倍希釈の第一抗体として使用した。
【００２１】
（結果）
ＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞をＪＣＡｂ１，２および３で染色すると、３−４％の細胞の核が染色された。この結果は、これらの細胞について以前報告された結果を支持するものである。また、ＪＣＶ感染細胞の細胞質は染色されなかった。
ＢＫＶ感染２９３細胞をＪＣＡｂ２および３で染色すると、数％の細胞の核が染色されたが、ＪＣＡｂ１では染色されなかった。また、ＢＫＶ感染細胞においても細胞質は染色されなかった。
ＳＶ４０感染ＩＭＲ３２細胞をＪＣＡｂ１，２および３で染色しても、どの抗体でも染色はみられなかった。
今回のホルマリン固定パラフィン埋設したＰＭＬ患者脳組織のＪＣＡｂ１，２および３での免疫学的組織染色の結果は、ＰＭＬ患者脳組織においてＪＣＶが特定の部分に集中するという報告と一致しており、オリゴデンドロサイト（oligodendrocytes:寡突起神経膠細胞）と幾つかのアストロサイト（astrocytes:神経膠星状細胞）では典型的な核の染色が見られた。
また、コントロールとしてウイルスに感染していないＩＭＲ３２細胞，２９３細胞でも染色を試みたが、染色はみられなかった。
上記の実験の結果を以下の表２にまとめて示す。
【００２２】
【表２】
0003767755.tif 000003
〔表中、（＋）は免疫学的に染色されたことを、（−）は染色されなかったことをそれぞれ示す。併せて、染色の様子を図面代用写真で示す。〕
【００２３】
ＪＣＡｂ１は特異的にＪＣＶ感染細胞と反応し（図１）、ＢＫＶ感染細胞およびＳＶ４０感染細胞とは交差反応を生じなかった（図４，７）。
ＪＣＡｂ２および３はＳＶ４０感染細胞とは反応しなかったが、ＪＣＶおよびＢＫＶ感染細胞と反応した（図２，３，５，６）。
また、ＪＣＡｂ１〜３のどの抗体もＰＭＬ脳組織と反応し（図８，９，１０）、コントロールとした未感染細胞とは反応しなかった（図１１，１２）。また、非感染家兎血清とＪＣＡｂ１は反応しなかった。
【００２４】
実施例３．希釈抗体によるＰＭＬ感染脳組織の免疫学的染色
（実験方法）
実施例２の方法にならい、段階的に希釈したＪＣＡｂ１を用いてＰＭＬ患者の脳組織を免疫学的に染色した。対照として正常家兎血清を用いた。
（結果）
上記の実験の結果を以下の表３にまとめて示す。
【００２５】
【表３】
0003767755.tif 000004
〔表中、＊は高バックグラウンド下での測定であることを、ＮＤは実施しなかったことをそれぞれ示す。〕
【００２６】
ＪＣＡｂ１は１：５から１：２５００倍の希釈で陽性細胞を認めた。正常家兎血清は１：５、１：２５００倍では陰性であった。
【００２７】
実施例４．希釈抗体によるＪＣＶ感染細胞及びＢＫＶ感染細胞の免疫学的染色
（実験方法）
実施例３の方法と同様にして、段階的に希釈したＪＣＡｂ１を用いてＪＣＶ感染細胞及びＢＫＶ感染細胞を免疫学的に染色した。対照として正常家兎血清を用いた。
（結果）
上記の実験の結果を以下の表４にまとめて示す。
【００２８】
【表４】
0003767755.tif 000005
〔表中、＊は高バックグラウンド下での測定であることを、ＮＤは実施しなかったことをそれぞれ示す。〕
【００２９】
ＪＣＡｂ１は高濃度下（１：５）でもＢＫＶに交差反応を示さなかった。
以上のように本願発明にかかるＪＣＡｂ１，ＪＣＡｂ２およびＪＣＡｂ３は、ホルマリン固定パラフィン埋設した組織でも反応し、臨床応用可能な十分な免疫学的組織染色性を示すためＪＣＶの確定診断に有用である。特に、ＪＣＡｂ１はＢＫＶやＳＶ４０とは反応せずに、特異的にＪＣＶと反応するためＪＣＶの検出試薬として有用である。
また、これらの抗体はＪＣＶに特異的に反応するため、抗ＪＣＶ抗体としてＪＣＶが引き起こす感染症、例えばＰＭＬや痴呆症などの予防・診断・治療薬としても有用である。
【００３０】
【配列表】
0003767755.tif 000006
【００３１】
0003767755.tif 000007
【００３２】
0003767755.tif 000008
【００３３】
【図面の簡単な説明】
【図１】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色したＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図２】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ２で免疫学的に染色したＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図３】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ３で免疫学的に染色したＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図４】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色したＢＫＶ感染２９３細胞の組織学的構造を示す写真である。
【００３４】
【図５】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ２で免疫学的に染色したＢＫＶ感染２９３細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図６】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ３で免疫学的に染色したＢＫＶ感染２９３細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図７】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色したＳＶ４０感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図８】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色したＰＭＬ感染脳組織の組織学的構造を示す写真である。
【００３５】
【図９】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ２で免疫学的に染色したＰＭＬ感染脳組織の組織学的構造を示す写真である。
【図１０】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ３で免疫学的に染色したＰＭＬ感染脳組織の組織学的構造を示す写真である。
【図１１】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色した非感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図１２】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色した非感染２９３細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0003767755.tif 000017
【図１０】
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【図１１】
0003767755.tif 000019
【図１２】
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