(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるルナシンポリペプチド又はヘキサ-Asp/Gluが後に続くArg-Gly-Aspモチーフを少なくとも含んでなるその活性断片をポリペプチド重量で少なくとも５０％と、ポリペプチド重量で１０％未満のボーマン・バークインヒビターポリペプチドとを含む癌化学予防のための製剤。
【請求項２】
ポリぺプチド重量で少なくとも９０％の前記ルナシンポリペプチドと、ポリペプチド重量で１％未満のボーマン・バークインヒビターポリペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
ルナシンポリペプチドが配列番号：１の残基３３−４３を含む、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
ルナシンポリペプチドが配列番号：１の残基２１−４３を含む、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項５】
ルナシンポリペプチドが配列番号：１の残基１０−４３を含む、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項６】
ルナシンポリペプチドが配列番号：１の残基１−４３を含む、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項７】
ルナシンポリペプチドが配列番号：１の残基１−４３から成る、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項８】
経口投与用である、請求項１ないし７の何れか一項に記載の製剤。
【請求項９】
皮膚への局所適用用である、請求項１ないし７の何れか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
ルナシンポリペプチドの投与のために、保持された生理的液体中に導入される、請求項１ないし７の何れか一項に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（導入）
（発明の分野）
発明の分野は、化学防御効果を有する大豆タンパク質である。
【０００２】
（背景）
食事の要素が、異なる種類の癌の病因学において重要な役割を担うという概念は、疫学的なデータによってはっきりと裏付けられている(World Cancer Fund,1997)。例えば、多量の大豆タンパク質産物を含む食事が、全体的に低い癌死亡率、特に、結腸、乳癌、及び前立腺癌の全体的に低い癌死亡率に関連していることを示唆する多くの証拠があり、大豆の癌予防効果の原因となりうる大豆中の特定化合物の同定へ勢いを与えた(Messina及びBarnes, 1991; Kennedy, 1995)。
大豆由来プロテアーゼインヒビターであるボーマン・バークインヒビター(BBI)は、特に有効な化学防御剤であることが示されている(Kennedy, 1998)。BBIは、確定した配列と構造の8kDのタンパク質として特徴付けられているが(Birk, 1985による総説)、BBIの有効性を証明した殆どの研究はBBIC、すなわちBBIに富む大豆抽出物を使用している。BBICは、(1)幾つかの異なった発癌物質によって誘発される、(2)三つの異なる動物モデル系(ラット、マウス及びハムスター)及びインビトロ形質転換系(Kennedyら, 1993)における、(3)幾つかの組織／器官(結腸、肺、食道及び口上皮）における、(4)幾つかの異なるルート(腹膜内、静脈注射、局所、食事)によって動物に投与された場合の、(5)異なる種類の腫瘍(扁平上皮癌、腺癌、血管肉腫、など)が関与した、(6)血管肉腫を生じる異なる細胞型(結合組織(肝臓と同様にインビトロの繊維芽細胞)と同様に肝臓上皮細胞、結腸、肺、食道及び頬嚢)における発癌の抑制に極めて効果的である。従って、BBICの化学防御能力は、種々の異なる発癌アッセイ系において証明され、1992年にはFDAの新規治験薬の地位(IND第34671)、現在はヒト臨床試験に達している。
【０００３】
（引用文献）
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【０００４】
（発明の要約）
本発明は、ルナシンの有効量を栄養補助剤として送達するための方法及び組成物を提供する。一般的な調製物は、ルナシン(lunasin)ポリペプチドの活性単位用量、及び製薬的に許容可能な賦形剤を含んでなる組成物を含み、少なくともポリペプチド重量で50％の前記ルナシンポリペプチド、及びポリペプチド重量で10％未満のボーマン・バークインヒビターポリペプチドを含んでなる前記組成物である。他の実施態様では、組成物は、ポリペプチド重量で少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは100％の前記ルナシンポリペプチド、及びポリペプチド重量で2％未満、好ましくは0.5％未満、更に好ましくは0.1％未満、最も好ましくは0％ のボーマン・バークインヒビターポリペプチドを含む。調製物は、経口摂取、経皮送達において良く知られた技術を使用した局所的に肌に接触すること、血液、滑液、組織液などの保持生理体液へ取り込むことを含む、当該分野において良く知られた任意の多種多様の簡便送達方法(例えば、Goodman及びGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 19編を参照のこと)によって送達又は投与してもよい。
本発明は、また、ルナシンポリペプチドを必須純度まで精製し、前記ルナシンポリペプチドを製薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせて経口的に活性単位用量にすることで、対象となる調製物を作製する方法を提供する。ルナシンの原材料は、大豆、組み換え体ルナシンポリペプチド発現系、合成により生産されたルナシン、又はそれの抽出物或いは分画であってもよい。適切な賦形剤及び用量は、既存のBBICデーターに導かれて経験的に容易に定められる。
【０００５】
（本発明の特定の実施態様の詳細な説明）
以下に示す特定の実施態様と実施例の説明は、例示のために提供されるもので、発明の限定をもたらすものではない。禁忌を示すか又は他に注記しない限り、この説明と明細書全体を通して、「ａ」及び「ａｎ」という用語は「一」もしくは「それ以上」を意味し、「又は」という用語は「及び／又は」を意味し、ポリヌクレオチド配列は逆ストランド並びにここで記載される代替のバックボーンを含むものと理解される。
我々は、我々がルナシンと命名した、大豆種子から分離した2Sアルブミンの小さなサブユニットペプチドが、哺乳類細胞において発現すると抗有糸分裂作用を有することを示した（Galves AF及びde Lumen BO, 1999及びUSSN08/938,675）。微小管の機能を破壊する他の抗有糸分裂剤とは異なり、我々は、ルナシン遺伝子が細胞内へ導入されて発現した場合には、ルナシンは優先的にルナシン-トランスフェクト細胞中の低アセチル化クロマチンへ結合し、これが有糸分裂の間に動原体タンパク質の置換の原因となることを示した。
【０００６】
ルナシンポリペプチドは、また、機能性RGD(arg-gly-asp)モチーフを含む。外因的に哺乳類細胞培養へ応用した場合には、ルナシンは、RGDトリペプチドを通して細胞膜インテグリンへ結合し、続いて膜の代謝回転を通して細胞質へ入り込む。受動拡散によって、及び分裂前中期(核膜の分解が起こる時）に核へ入り込む比較的少量のルナシンは、低アセチル化クロマチンの領域へ効果的に結合するのに十分である。しかしながら、ルナシンを構成的に大量に発現するルナシン-トランスフェクト細胞とは異なり、内在化ルナシンは、細胞が正常な有糸分裂を経る際には動原体集合に作用しないと思われる。代わって、ルナシンは、発癌剤による正常胚繊維芽細胞の癌性腫瘍への形質転換を阻害する。脱アセチル化ヌクレオソーム領域に対するルナシンの結合親和性は、クロマチンのアセチル化及び変異腫瘍抑制遺伝子による細胞内の発癌遺伝子の活性化を防ぐことによる、代理腫瘍サプレッサーとしてのルナシンの抗発癌作用と一致する。また、ルナシンの細胞接着特性は、細胞外マトリックスへの付着及び増殖のための転移性細胞に必須の膜インテグリンへの競合的な結合によって、癌の広がりを防ぐという付加的利益を与える。
【０００７】
更に、我々は、インビボ及びインビトロの動物モデルの異なる型の癌に対して、化学防御性があると示された大豆由来のプロテアーゼインヒビターであるボーマン・バークインヒビター(BBIC)が、ルナシンを主要成分として含むことを証明した。実際に、免疫枯渇によるBBICからのルナシンの除去は、C3H細胞の発癌物質媒介形質転換を阻害するBBICの能力を有意に減じる。更には、等モル濃度を使用し、ルナシンが発癌物質誘発腫瘍形成の予防においてBBICより有効であることが見出された。これらの発見は、ルナシンがBBICの活性抗発癌性成分のひとつであることを示している。
【０００８】
従って、ここにおいて使用されている用語、ルナシンは、天然大豆ルナシンポリペプチドを含む化合物(Odaniら, 1987  によって同時に精製及び配列決定された(Ser Lys Trp Gln His Gln Gln Asp Ser Cys Arg Lys Gln Leu Gln Gly Val Asn Leu Thr Pro Cys Glu Lys His Ile Met Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp(配列番号：１））、及び少なくともヘキサ-Asp/Gluモチーフが続くArg-Gly-Aspモチーフを少なくとも含むその活性断片に相当する。好ましいルナシンポリペプチドは、配列番号：１の残基33−43、好ましくは21−43、さらに好ましくは10−43及び最も好ましくは1−43を含む。インビトロ及び動物モデルにおいて、発癌を阻害するのに効果的であると示された模範的なルナシン-del化合物（再びN→C命名法の慣例を使用）は：
ルナシン-del-1：MRG-配列番号：１の残基32-43融合
ルナシン-del-2：α-チューブリン-配列番号：１の残基32-43融合
ルナシン-del-3：β-チューブリン-配列番号：１の残基27-42融合
ルナシン-del-4：MAP2-配列番号：２の残基5-43融合
ルナシン-del-5：Mapmodulin-配列番号：１の残基32-43融合
ルナシン-del-6：GFP-配列番号：１の残基32-43融合
ルナシン-del-7：MAP4-配列番号：１の残基23-42融合
ルナシン-del-8：FLAGG-配列番号：１の残基9-43融合
ルナシン-del-9：CYCLIN A-配列番号：１の残基32-43融合
ルナシン-del-10：CYCLIN B1-配列番号：１の残基32-43融合
ルナシン-del-11：CYCLIN B2配列番号：１の残基19-42融合
ルナシン-del-12：CYCLIN B3-配列番号：１の残基13-43融合
ルナシン-del-13：SH2-オクタ-アスパラギン酸融合
ルナシン-del-14：SH3-オクタ-アスパラギン酸融合
ルナシン-del-15：配列番号：１、残基27-34-MRG-オクタ-アスパラギン酸融合
ルナシン-del-16：配列番号：１、残基27-34-配列番号：１、残基27-34-オクタ-アスパラギン酸融合
ルナシン-del-17：MRG-テトラ-アスパラギン酸-テトラグルタミン酸融合
を含む。
【０００９】
ルナシンペプチドは、発癌物質媒介によるC3H10T1/2マウス繊維芽細胞の腫瘍細胞への形質転換を阻害する。BBICの化学防御特性を判定するのに使用したのと同じインビトロ形質転換アッセイを使用した実験は、10nMほどに低いルナシンペプチド(10nMから10mM）の外因的な応用が、発癌性物質、MCA(3-メチルコラントレン)及びDMBA(7,12-ジメチルべンズアントラセン)による正常マウス胚繊維芽細胞の腫瘍病巣への形質転換を阻害することを示した。酸性カルボキシ末端(ルナシン-del-C）及びRGD細胞接着モチーフ(ルナシン-GRG）の除去は、阻害効果を取り除いたので、これらのドメインが必須であることを示した。
【００１０】
ルナシンは、大豆由来のボーマン・バークプロテアーゼインヒビター(BBIC) の主要成分で、癌予防基質として知られている。研究されている癌予防基質の他の潜在的なクラスとは異なり、プロテアーゼインヒビターは、我々がルナシンにも当てはまることを見出した幾つかの特徴を有する。最も劇的な違いは、不可逆的に発癌へ作用するそれらの能力である。インビトロ又はインビボのどちらかでBBICの投与を止めた場合、悪性細胞又は腫瘍は、使用されているアッセイ系では現れない(Kennedy, 1994)。対照的に、ビタミンE、β-カロチン及びレチノイドなどの化学防御剤は、インビトロ系において可逆的な効果を持つ−形質転換細胞は、これら化学防御物質が発癌物質処理培養細胞から除去されると現れる。また、プロテアーゼインヒビターは、他の薬剤がかなり高い濃度(mM)のみで効力があるが、極端に低いレベル(nM)で効力があるという点で、他の化学防御薬剤とは異なる。BBICによる発癌抑制の用量反応は、BBICの用量レベルが数次数の変化の範囲で同じ抑制効果を有するという点で通常ではない。三番目に、かなり多くの異なった癌を抑制するプロテアーゼインヒビターの驚くべき能力は、プロテアーゼインヒビターを殆どの化学防御薬剤とは異なるものにする。それらの抗癌特性は、特定の器官／組織に限定されない。
【００１１】
BBICのように、ルナシンは2Sアルブミンファミリーの同じクラスに属し、両物質は同じ方法で調製できる。我々は、ルナシンが商業的に入手可能なBBIC調製物(Sigma)の主要成分であることをウェスタンブロット分析によって見出した。模範的なブロットでは、トリプシンインヒビター(Sigma T 9128, タイプII-S大豆可溶性粉末)の粗調製物を含むレーン３は、イムノブロットにおいて照らし出される主要タンパク質バンドを16kDaに示した。BBIは、溶液中で二量体化することが知られている8kDaタンパク質である。BBIC(Sigma T9777, ボーマン・バークインヒビター 、大豆凍結乾燥粉末）を含むレーン４は、8kDa及び16kDaの２つのタンパク質バンドを示し、両バンドともにイムノブロットで照らし出された。２つのシステインを有するルナシンは、１４のシステイン残基を有するBBI(単量体及び二量体として)とジスルフィド結合を形成することができる。これは、ルナシンが主要な成分としてBBICに見出されることを示している。更には、我々は、ルナシン抗体アフィニティーカラム及び樹脂処理によるルナシンの除去が、C3H細胞の形質転換を阻害するBBICの能力を有意に減じることを示した。この証明は、C3H細胞の発癌物質媒介形質転換を阻害するルナシンの能力とともに、ルナシンがBBICにおいて主要活性化学防御分子のひとつであることをを示している。実際に、我々のデーターは、BBICが、ルナシンが胃腸管において消化されることを防ぐであろうことを示している。現在、哺乳類細胞の内側へ入り込み、そしてクロマチン機能を修飾するというルナシンの能力は、栄養価のある薬又は栄養補給剤としてのルナシンの使用ガイダンス、特に抗発癌剤としての使用ガイダンスのみならず、BBICの化学防御特性を説明する合理的機構を提供する。例えば、同等の服用量及び投与経路においてルナシンをBBIへ置き換えることは、細胞及び動物研究での有効性を提供する(米国特許第5,618,679; 5,616,492; 5,614,198; 5,505,946; 5,376,373; 5,338,547号を参照のこと）。
【００１２】
クロマチン修飾及び腫瘍抑制。我々の仮説は、ルナシンのクロマチン結合能力が、ルナシン遺伝子の抗有糸分裂特性及びルナシンペプチドの癌予防特性の基礎を構成するメカニズムであるということである。一連の研究は、クロマチン修飾が腫瘍抑制経路と関連していることを示唆している(DePinho, 1998; Brehmら, 1998；Magnahi-Jaulin, 1998；Pazin及びKadonaga, 1997；Hassigら, 1997；Lahertyら, 1997）。例えば、哺乳類細胞において、網膜芽細胞腫タンパク質Rbは、E2F(Rbによって制御されている転写因子のファミリー）及びHDAC1(クロマチン構造を調節する主要な哺乳類ヒストンデアセチラーゼ）と複合体となっている。Rbは、DNA及びヌクレオソーム間の堅い会合を引き起こすコアヒストンを脱アセチル化するHDAC1を補充することでE2F-制御プロモーターを抑制し、それによりDNAのエレメントを認識するための転写因子の結合を弱める。Rb/HDAC/E2F複合体は、抑制の解除及び完全な形質転換状態を引き起こす形質転換ウイルスの標的となることが可能である。クロマチンの低アセチル化領域へのルナシンの結合は、異なった状況で腫瘍形成を抑制する可能性がある。高次構造の変化を引き起こす凝縮染色体において、脱アセチル化がDNAとヌクレオソームのより堅い会合を起こす一方で、脱アセチル化はまた、ルナシンがヒストン末端配列と結合することを可能にし、可逆的なアセチル化／脱アセチル化プロセスを防ぐリジン残基上の正電荷を露出する。結果として、遺伝子発現は、幾分は永久的に抑制される。動物研究は、ルナシンは事実上消化を生き残り、吸収され、そして組織に達することを示す。我々の証拠は、ルナシンは、RGDモチーフによって細胞に内在化し(すなわち、-RGD-モチーフが除去されている場合は、内在化はない）、その4kDaサイズのために受動拡散によって、そして核膜が崩れる時である分裂前中期に核の内部へ入り込むことを示している。結果的に、ルナシンは、ヌクレオソームのコアヒストンへ結合し、上記に記載したように転写を抑制することによって発癌物質の存在下で細胞の形質転換を阻害する。
【００１３】
この明細書中で引用した全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物及び特許出願が特別にかつ独立して参考として取り入れられることが明示されているように、ここに出典明示して取り入れる。上記の発明は、理解を明確にするために、例示及び実施例によって幾分詳細に記述したが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それらにある種の変更及び修正がなし得ることが容易に明らかになるであろう。