(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）セムリキ森林熱ウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部、および（ｉｉ）生物活性をもつ物質をコードする異種ＲＮＡを含んでなる、自己複製および転写能を有する組換えセムリキ森林熱ウイルスＲＮＡ分子であって、
ここで、該異種ＲＮＡは翻訳増強活性をもつセムリキ森林熱ウイルス塩基配列の下流に位置し、そして該セムリキ森林熱ウイルス塩基配列に機能し得るように連結されており、かつ、該翻訳増強活性をもつ塩基配列はセムリキ森林熱ウイルスの完全なキャプシド遺伝子または該キャプシド遺伝子の５’部分であって、該キャプシド遺伝子領域の５’末端から少なくとも８１個の連続する塩基を含有するキャプシド遺伝子のヌクレオチドを含んでなる該キャプシド遺伝子の５’部分を含み、そして、
該セムリキ森林熱ウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部が、該キャプシド遺伝子または該キャプシド遺伝子の５’部分以外のセムリキ森林熱ウイルス構造遺伝子からなるセムリキ森林熱ウイルスの塩基配列をほぼ完全に欠失していることを特徴とする組換えＲＮＡ分子ＲＮＡ分子。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えＲＮＡ分子であって、細胞中に導入された後に該ＲＮＡ分子が、その分子の５’領域によってコードされたセムリキ森林熱ウイルスのレプリカーゼを用いて複製され、そしてセムリキ森林熱ウイルスサブゲノムプロモーターによってｍＲＮＡに転写され、かつ、異種ＲＮＡが、該翻訳増強塩基配列の下流のセムリキ森林熱ウイルスサブゲノム領域中に挿入されており、そして異種遺伝子産物が、該遺伝子の５’部分によってコードされる完全なキャプシドタンパク質またはキャプシドタンパク質のアミノ末端部分をもつ融合産物として該ｍＲＮＡから細胞で発現される、ことを特徴とする組換えＲＮＡ分子。
【請求項３】
翻訳増強塩基配列が、
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の配列を有するキャプシド遺伝子の最初の８１個の塩基を含んでなる、請求項１または２記載の組換えＲＮＡ分子。
【請求項４】
翻訳増強塩基配列が、
0003786956.tif 000015
の配列を有するキャプシド遺伝子の最初の１０２個の塩基を含んでなる、請求項１または２記載の組換えＲＮＡ分子。
【請求項５】
異種ＲＮＡが融合産物として発現され、該融合産物がキャプシドタンパク質の自己分解的プロテアーゼ活性によって、その融合部位で切断される、請求項２〜４のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子。
【請求項６】
異種ＲＮＡ配列が抗原決定基を含むタンパク質またはポリペプチドをコードしており、該タンパク質またはポリペプチドが免疫原性または抗原性である、請求項１〜５のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子。
【請求項７】
翻訳増強活性が該翻訳増強配列の非存在下において提供される翻訳活性より少なくとも８倍高い活性を提供する請求項１〜６のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子の完全長に相補的なＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項９】
さらに、細胞中で組換えＲＮＡ分子を転写するためのプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含み、そしてさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド複製に必要なＤＮＡ配列を含んでなる、請求項８記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
プロモーターがＳＰ６である、請求項９記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組換えＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む形質転換細胞。
【請求項１２】
動物またはヒトの細胞である、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の細胞を含む細胞系であって、該ＲＮＡまたはＤＮＡ分子により安定に形質転換されている、細胞系。
【請求項１４】
生物活性物質をコードする異種ＲＮＡ配列のイン  ビトロでの発現方法であって、請求項１〜７のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子、または請求項８、９、もしくは１０記載の組換えＤＮＡによる細胞の形質転換、次いで異種ＲＮＡ配列の発現を可能にする条件下で該形質転換細胞を増殖し、こうして該異種ＲＮＡ配列の遺伝子発現産物を発現させることを特徴とする異種ＲＮＡ配列のイン  ビトロでの発現方法。
【請求項１５】
形質転換がトランスフェクションによって達成される請求項１４記載の方法
【請求項１６】
形質転換が細胞培養中の細胞の感染によって達成される請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子発現産物が、細胞から分離され、場合によって精製される、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
生物活性物質をコードする異種ＲＮＡ配列のイン  ビボでの発現方法であって、野生型のセムリキ森林熱ウイルスのコートによって包まれた請求項１〜７のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子からなるゲノムを含む感染性組換えセムリキ森林熱ウイルス粒子により非ヒト動物の細胞を感染させ、次いで該非ヒト動物において該異種ＲＮＡ分子を発現させた後、該動物由来の体液を集めて発現産物を回収することを含んでなる異種ＲＮＡ配列のイン  ビボでの発現方法。
【請求項１９】
野生型セムリキ森林熱ウイルスのコートによって包まれた組換えセムリキ森林熱ウイルスＲＮＡゲノムを含む組換えセムリキ森林熱ウイルスの生産方法であって、
（ｉ）該組換えＲＮＡゲノムと、セムリキ森林熱ウイルス構造タンパク質の発現能を有し、そしてセムリキ森林熱ウイルス構造タンパク質のコーディング配列を含み、かつ、シスに働く複製シグナルを含むが、包膜化シグナルは含まないヘルパーＲＮＡとによる細胞の同時形質転換する工程、
（ｉｉ）細胞をインキュベーションする工程、および
（ｉｉｉ）感染性組換えセムリキ森林熱ウイルス粒子を含む培地を集める工程、を含んでなり、かつ、該組換えＲＮＡゲノムが請求項１〜７のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子を含むことを特徴とする組換えセムリキ森林熱ウイルスの生産方法。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子と、セムリキ森林熱ウイルス構造タンパク質の発現能を有し、そしてセムリキ森林熱ウイルス構造タンパク質のコーディング配列を含み、かつ、シスに働く複製シグナルを含むが、包膜化シグナルは含まないヘルパーＲＮＡとを含んでなり、かつ、野生型セムリキ森林熱ウイルスのコートによって包まれた該組換えＲＮＡを含む感染性組換えセムリキ森林熱ウイルス粒子を生産することができる形質転換細胞。
【請求項２１】
野生型セムリキ森林熱ウイルス・コートによって包まれた請求項１〜７のいずれかに記載の組換えＲＮＡ分子からなるゲノムを含んでなる感染性組換えアルファウイルス粒子。
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般に、ポリヌクレオチド分子、およびそれらのヒトまたは動物細胞への導入後、目的生産物の生産のためのそれらの使用に関する。
より具体的には、本発明は、アルファウイルスゲノムの少なくとも一部および翻訳増強活性をもつアルファウイルス塩基配列の下流に挿入された異種ＲＮＡを含むアルファウイルス発現ベクターに向けられる。そのようなベクターは、細胞培養または生体における真核細胞中への該ベクターの導入後、目的の生産物をコードし、そして該異種ＲＮＡに相補的であるＤＮＡまたはｃＤＮＡの増強された発現レベルを達成するために使用できる。
分子生物学における近代技術は、医薬品およびバイオテクノロジー産業に対して全く予測できなかった多くの可能性を開いた。例えば、今日では、いかなる遺伝子（一旦、同定された）をもＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）分子としてクローン化し、そしてそれを原核および／または真核細胞中で発現させることができる。これは、治療用および／またはワクチンのような予防用に、イン・ビトロにおける対応するタンパク質の生産を容易にした。近年、また、遺伝子発現技術の可能性は、あらゆる動物においてそして人間においてさえ、イン・ビボ使用に対しても拡大されてきた。この最近の進展の例証は、ヒトの遺伝子治療（１）および遺伝的免疫（２）である。イン・ビボまたはイン・ビトロで外来遺伝子を発現させるために、コーディング配列を含む遺伝子セグメントまたは対応するｃＤＮＡが、通常、いわゆる発現ベクター中に挿入される。このベクターは、細胞内で、遺伝子またはそのｃＤＮＡの転写および翻訳のために必要なすべての要素を備えている。今日では、細菌および酵母細胞のための非常に効率的な発現ベクターが存在している。しかしながら、これは、哺乳動物のような動物細胞の場合には当てはまらない。このことは、哺乳動物に特異的な改変をもつタンパク質が、病気の治療目的または予防のために生産され、単離される必要がある時、あるいは生物体全体での発現、例えば動物またはヒトの生体における発現が求められる場合には、大きな問題を生じることになる。それ故、非常に一般的に言えば、哺乳動物のような動物細胞における使用のための新規な発現ベクターであって、
（ｉ）タンパク質発現効率が増強され、
（ｉｉ）宿主細胞特異性が拡大され、そして
（ｉｉｉ）安全性が高められた、
ベクターに対する大きな要望が存在する。
近年、全く新規タイプのＤＮＡ発現ベクターが、哺乳動物のような動物細胞における使用のために開発された。これらのベクターは、アルファウイルスゲノムに基づいている。
アルファウイルスは、ウイルスのスパイクタンパク質を含有するエンベロープによって囲まれたヌクレオキャプシド中に包まれた陽極性の一本鎖ＲＮＡゲノムをもつ、トガウイルス科に属する一属である。
アルファウイルス属は、その中に、すべて近縁であるシンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルスおよびベネズエラ、西部および東部ウマ脳炎ウイルスを含む。特に、シンドビスおよびセムリキ森林熱ウイルスは、広く研究されており、そしてこれらのウイルスのライフサイクル、複製様式等は、よく知られており、したがって、ここで特に議論されることを要しない。
アルファウイルスは、動物細胞中で非常に効率的に複製し、そのような細胞におけるタンパク質および核酸の生産のためのベクターとして、それらを価値あるものにしている。
シンドビスウイルスに基づく発現系は、米国特許第5 091 309号および同第5 217 879号に開示されている。米国特許第5 091 309号のシンドビスウイルスベクターは、そこに挿入された異種ＲＮＡをもつ、シンドビス欠陥干渉性（ＤＩ）ＲＮＡ由来のＲＮＡを含む。米国特許第5 217 879号では、自己複製および自己パッケージング組み換えシンドビスウイルスＲＮＡ分子が、異種コーディング配列および宿主細胞中でシンドビスウイルス・サブゲノムメッセンジャーＲＮＡ合成を導くことができる少なくとも１つのシンドビスウイルス結合領域を含むことが開示されている。ＲＮＡ転写物は、プロモーター、例えばＳＰ６の制御下プラスミドに挿入されたシンドビスウイルスｃＤＮＡの転写によってイン・ビトロで合成される。
また、Xiong et a1., Science, Vo1 243, 1989, 1188-1191（３）は、シンドビスウイルスに基づく遺伝子発現系を開示している。この系は、広範囲の動物細胞において有効であると言われる。昆虫、トリ、およびヒト細胞を除く哺乳動物細胞における細菌ＣＡＴ(クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子の発現が、そこに開示されている。
Bio/Technology, Volume 9, pages 1356-1361, 1991（４）では、
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ＳＦＶレプリコンに基づく動物細胞発現ベクターを開示している。外来ＤＮＡコーディング配列が、これらのベクター中に挿入される場合には、多量の外来タンパク質が得られる。
W0 92/10578によれば、アルファウイルスＲＮＡゲノムに由来し、そして動物細胞に効率的に感染できるＲＮＡ分子が、提供されるが、そのＲＮＡ分子は、該アルファウイルスＲＮＡの複製に必須である完全なアルファウイルスゲノム領域を含み、さらに、該宿主細胞でその機能を発現できる外因性ＲＮＡ配列を含むが、該外因性ＲＮＡ配列は、その発現には必須ではないＲＮＡ分子の一領域に挿入されている。WO 92/10578によれば、そのようなＲＮＡ分子は、トランスフェクションのいかなる手段によっても、または感染性アルファウイルス粒子中に該ＲＮＡ分子をパッケージングして、その後動物細胞へ感染させることによっても、動物細胞中に転移できる。両方の場合、トランスフェクションまたは感染されたＲＮＡ分子は、標的動物細胞中で複製し、そして該ＲＮＡ分子中に挿入された外因性ＲＮＡ配列を発現することができるであろう。そのような分子および細胞中でのそれらの発現のための戦略は、ワクチンとして、または、感染やがんを予防または治療するためのワクチンに対する戦略として使用できる。この文献では、ＳＦＶが、アルファウイルスを具体的に説明するために使用された。
アルファウイルスゲノムに基づく上記発現ベクターは、初期の哺乳動物タンパク質発現系よりも高いタンパク質発現効率を促進することが示された。また、それらは、ほとんど全ての高等な真核生物細胞の種類においても働くことが示された。さらにまた、それらは、ウイルスの拡散を防ぐべく高度に厳格な安全性を補足されている。ＨＩＶスパイク・タンパク質のような、病気の予防に使用される重要なタンパク質は、この系を用いて生産されており、そしてそのようなタンパク質は、他の系で生産された場合よりも、自然に近い構造をもつことが示された（６）。また、アルファウイルスは、遺伝的免疫感作のためにも使用されて成功している（７）。
本発明は、アルファウイルス発現ベクターの有意義な、そして予期せぬ改良に向けられる。
より具体的には、本発明によって、翻訳増強活性をもつヌクレオチド塩基配列が、アルファウイルスゲノム中に存在することが発見された。これまで既知のアルファウイルスベクターの発現レベルに比較して、本発明により得ることができる目的の物質の発現レベルは、約１０倍に増加される。
かくして、本発明は、一般に、真核生物細胞における異種ＤＮＡの発現、発現を達成するために使用されるアルファウイルスゲノムの少なくとも一部を含むアルファウイルスベクター、さらに、翻訳増強活性をもつヌクレオチド塩基配列の下流に、実質的に隣接して挿入された異種ＤＮＡに相補的なＲＮＡを含む該ベクターに向けられる。
本発明によれば、翻訳増強活性（または翻訳エンハンサーとも呼ばれる）をもつそのような塩基配列は、アルファウイルス・キャプシド遺伝子の５’部分または完全なキャプシド遺伝子を含む。適切には、この翻訳エンハンサーは、アルファウイルスベクターにとって内因性である。しかしながら、その他のアルファウイルス種起源の外因性翻訳エンハンサーが、少なくとも場合によっては使用されてもよい。
かくして、また、本発明は、アルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部、および翻訳増強活性をもつアルファウイルス塩基配列の下流に位置する生物活性をもつ物質をコードする異種ＲＮＡを含む、自己複製および転写能をもつ組み換えアルファウイルスＲＮＡ分子に関するが、該翻訳増強塩基配列は、完全なアルファウイルス・キャプシド遺伝子または該遺伝子の５’部分を含んでなる。
本発明の適切な実施態様は、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）ゲノムに基づく発現ベクターに関する。完全なＳＦＶキャプシド遺伝子は、２６７個のアミノ酸残基をコードしており、したがって、８０１個の塩基を含む。
ＳＦＶでは、翻訳増強活性は、このキャプシド遺伝子の最初の１０２個の塩基に存在することが発見されたが、該活性は、野生型キャプシドタンパク質の約８５％のレベルで、タンパク質生産を引き起こした。これは、既知のＳＦＶベクターに比較して約１０倍の増加である。
また、最初の８１個の塩基を含む該遺伝子の配列は、程度は低いけれども発現レベルの増加をもたらす。
かくして、本ＳＦＶ翻訳エンハンサーは、キャプシド遺伝子の少なくとも最初の８１個の塩基、好ましくは、最初の１０２個の塩基、そしてほとんど８０１個の塩基、すなわち完全なキャプシド遺伝子に対応する塩基配列を含む。
５’から３’末端へと読み進んで、最初の１０２個の塩基を含んでなるＳＦＶキャプシド遺伝子の該５’部分の配列は、
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である。
また、実質的に保存された増強活性をもつこの塩基配列の改変（例えば、塩基欠失、置換および／または付加）は、本発明によって包含される。
次に具体的に説明される実施例において、翻訳エンハンサーの存在は、ＳＦＶについて例証された。種々のアルファウイルス種間の相同性を考慮すると、翻訳増強の類似機構が、すべてのアルファウイルスに存在することが期待できる。しかしながら、異なるアルファウイルス間の配列は、Ｃ遺伝子領域の５’末端においてかなり変わっているので、ＲＮＡ分子の二次および三次構造の特徴におけるある種の類似性が、翻訳増強効果に関与していることが、もっとも可能性がある。このことは、正確な配列そしてまた多分翻訳増強領域の長さが、異なるアルファウイルス間で変わるのであろうということを意味している。
また、本発明は、本組み換えアルファウイルスＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子に関するが、そのＤＮＡ分子は、また、細胞において組み換えＲＮＡ分子を転写するために、ＳＰ６のようなプロモーターをコードするＤＮＡ配列、およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド増殖に必要な特性をコードするさらなるＤＮＡ配列を含んでもよい。
増強された翻訳能をもつ本アルファウイルスベクターは、これまで既知のアルファウイルスベクターと同じ目的のために使用できる。かくして、それらは、真核生物細胞、特に哺乳動物細胞において、生物活性をもつ物質、例えばタンパク質またはポリペプチドの生産に非常に有用であると考えられ、それらの物質は、生物工学または医療目的に使用できる。例えば、異種ＲＮＡは、適切には、治療活性または予防活性、例えば免疫原性または抗原性をもつタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードしてもよい。発現が達成される該真核生物細胞は、細胞培養物としても利用できるし、また生体、例えば動物またはヒト生体の一部分を構成してもよい。また、本発明は、本組み換えＲＮＡまたはＤＮＡ分子により形質転換された細胞、および該ＲＮＡまたはＤＮＡ分子により安定に形質転換された細胞系に関する。
前述のように、アルファウイルス発現ベクターは、アルファウイルスのゲノムに基づく。これは、陽極性の一本鎖ＲＮＡ分子からなる。感染細胞において、このＲＮＡの５’側２／３が、翻訳と同時にそして翻訳後に４種の成熟タンパク質に切断されるウイルスの非構造ポリタンパク質に対するｍＲＮＡとして働く（８．９）。これらのタンパク質は、陰極性の中間体をへてゲノムＲＮＡを複製するウイルスポリメラーゼ複合体を形成する（１０）。また、この中間体は、ウイルスゲノムの３’側１／３と共直線性であるサブゲノムＲＮＡ分子の合成の鋳型として機能する。このサブゲノム転写物（または２６ＳｍＲＮＡとも呼ばれる）は、ウイルス構造ポリタンパク質に翻訳される。未成熟のポリタンパク質鎖から自分自身を自己触媒的に切断する、このポリタンパク質のプロセッシングは、アミノ末端キャプシド（Ｃ）タンパク質によって開始される（１１．１２．１３．１４）。構造ポリタンパク質の残りの部分は、翻訳と同時に小胞体の膜に挿入され、そしてスパイクタンパク質ｐ６２およびＥ１が、シグナルペプチダーゼ仲介の切断反応によって遊離される（１５．１６．１７）。アルファウイルス発現ベクターは、適切には、構造ポリタンパク質をコードする領域の少なくとも一部が欠失され、そしてクローニング部位（３．４）によって置換された、ウイルスゲノムの改変ｃＤＮＡコピーから構築される。異種ｃＤＮＡは、この部位に挿入でき、対応する組み換えアルファウイルスゲノムは、イン・ビトロ転写によって生産できる。宿主細胞にトランスフェクションされる場合には、組み換えゲノムは、アルファウイルスの非構造コーディング領域および５’と３’複製シグナルの両方を含むので、野生型方式で複製される。しかしながら、ウイルス構造タンパク質の代わりに、サブゲノムＲＮＡが、ここに、異種タンパク質の合成を導く。また、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）発現系（４）は、イン・ビボのパッケージング系を補足され、それによって組み換えゲノムは、ウイルス構造タンパク質を提供するパッケージング欠失ヘルパーゲノムとの同時トランスフェクションに続いて、ＳＦＶ様粒子中に詰め込まれる（４．５）。これらの組み換え粒子は、イン・ビボまたはイン・ビトロのいずれでも細胞を感染するのに使用できる。組み換え粒子の宿主細胞範囲は、アルファウイルス・スパイクによって決定され、それ故、非常に広範である。感染細胞は、組み換えゲノムと、また多量の異種タンパク質とを生産するであろう。しかしながら、ウイルス構造タンパク質は、組み換えゲノムにはコードされていないので、新しいウイルス粒子は作られず、それ故、ウイルスの拡散は起きない。
したがって、本発明の１つの態様は、野生型アルファウイルス・コートによって包まれた組み換えアルファウイルスＲＮＡゲノムを含む組み換えアルファウイルスを生産する方法、該組み換えＲＮＡゲノムとアルファウイルス構造タンパク質の発現能を含有するヘルパーＲＮＡとによる、細胞の同時トランスフェクションのような同時形質転換によって本組み換えＲＮＡ分子を含み、そしてシスに働く複製シグナルであるが包膜シグナルではないアルファウイルス構造タンパク質のコーディング配列を含む該ＲＮＡゲノム、細胞の培養、および感染性組み換えアルファウイルス粒子を含む媒体の回収に向けられる。
また、本発明は、感染性粒子を生産するこれらの形質転換細胞および感染性粒子それ自体に関する。
先に示されたように、動物（ヒトを含む）起源の広範囲の宿主細胞が、本発明により使用できる。そのような宿主細胞は、鳥類、哺乳類、両生類、昆虫類および魚類の細胞から選ぶことができる。哺乳類細胞の具体例は、ヒト、サル、ハムスター、マウスおよびブタの細胞である。適切な鳥類細胞は、ニワトリ細胞である。
さらにまた、本発明は、イン・ビトロまたはイン・ビボの両方で使用できる。定義によって、イン・ビトロは、生体外で行われる方法を意味し、反対に、イン・ビボは、方法が生体内で行われることを意味する。
本発明によれば、「形質転換」は、一般に、真核生物であっても原核生物であっても、細胞の内部への外因性ポリヌクレオチド配列の導入を意味することを意図し、そして外因性ポリヌクレオチド配列は、染色体外物（エピソーム）として細胞の細胞質中に、核中に、留まってもよく、または細胞ゲノム中に安定に組み込まれてもよい。形質転換の様式は、決定的ではなく、現在既知であるか、将来に開発されるかもしれないいずれの方法も、本発明により使用できる。
本発明のさらなる態様は、細胞培養または動物もしくはヒト個体における、本感染性組み換えアルファウイルス粒子を用いる細胞の感染を含む、生物活性物質をコードする異種ＲＮＡ配列を発現する方法に関する。
適切には、動物において達成される場合のそのような発現は、該動物に有益な何らかの効果を起こすだけでなく、該動物において生産される発現産物は、該動物から、例えば血液のような体液、乳または腹水において回収できるであろう。
また、本発明は、生理的に投与しうる形状において本組み換えＲＮＡを含む医薬調製物に関する。そのような調製物は、感染性組み換えアルファウイルス粒子を生産する本同時形質転換細胞またはそのような感染性粒子それ自体を含んでもよい。
次の実験部分では、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）が、本発明を具体的に説明するために使用された。初期に記述されたＳＦＶ発現系は、サブゲノム２６ＳＲＮＡの５’側の不翻訳リーダー配列中か配列直後に、異種ＤＮＡのクローニング部位をもつ３種の異なるプラスミドベクター（ｐＳＦＶ１−３）を提供する（４）。実施例２では、数種の異なる異種タンパク質の発現レベルが、初期のＳＦＶベクターを用いた場合および完全な２６ＳＲＮＡリーダーに続く完全なＣタンパク質遺伝子が、異種タンパク質遺伝子を先導する新規ＳＦＶベクター（＝ＳＦＶＣ−ベクター）を用いた場合について比較される。異種産物が、初期のベクターからよりも実質的に高いレベルにおいて、ＳＦＶＣ−ベクターから生産され、そして全Ｃ−融合タンパク質が、Ｃタンパク質のオートプロテアーゼ活性により別々の真正産物に切断されたことが証明される（図２）。定量では、発現レベルにおいて約１０倍差があることを示している。
実施例３では、Ｃ遺伝子における増強効果の存在する場所を研究するために、Ｅ．コリＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子融合物が用いられた。具体的には、Ｃ遺伝子の種々の分量の５’部分が、ＬａｃＺ遺伝子の第２コドンに融合された。これらの組み換え構築物の発現では、増強効果が、Ｃ遺伝子の最初の１０２個の塩基内に置かれることを示す。
実施例４では、本発明者らは、その効果が、ＲＮＡ複製と転写のレベルにおいて発現されるか否かを解析した。ゲノムＲＮＡおよびサブゲノムＲＮＡの生産は、実施例３記載のＬａｃＺ組み換え体の高低生産変異体において比較された。ＲＮＡレベルにおける差異は見られず、それ故、Ｃ遺伝子セグメントの増強効果は、翻訳レベルで存在しなければならない。このセグメントは、翻訳開始を増進する特異的ＲＮＡ構造を含む可能性がもっとも高い。
図の説明
図１
Ａ．組み換えサブゲノムＲＮＡ分子の概要
表示プラスミドのイン・ビトロ転写物によりトランスフェクションされた細胞において生産されるサブゲノムＲＮＡ分子の略図が示される。不翻訳５’リーダー配列の部分のみが、ｐＳＦＶ１構築物に存在するのに対して、全リーダー配列は、ｐＳＦＶ３構築物（４）に存在することに注意。
Ｂ．ｐＳＦＶＣ’シリーズのプラスミドにおけるＣタンパク質アミノ酸
コドン数
図２
Ｃ遺伝子の存在がタンパク質生産を増強する
ＢＨＫ−２１細胞は、次のプラスミドのＲＮＡ転写物によりトランスフェクションされた；ｐＳＦＶ１−Ｐ６２、ｐＳＦＶＣ−ｐ６２、ｐＳＦＶ１−ＴＲ、ｐＳＦＶＣ−ＴＲ、ｐＳＦＶ１−Ｐｒ６５ｇａｇ、ｐＳＦＶＣ−Ｐｒ６５ｇａｇ、ｐＳＦＶ３−ＬａｃＺ、ｐＳＦＶＣ−ＬａｃＺ、ｐＳＦＶｍＳＱＬおよびｐＳＦＶＣ−Ｐｒ６５ｇａｇ（それぞれ、列１〜１０）。トランスフェクション後８時間目に、細胞は、３０分間（列１〜６）または１５分間（列７〜１０）３５Ｓ−メチオニンでパルスラベルされ、そして１５分間（列１〜１０）チェイスされた。細胞は、ＮＰ−４０（列１〜６）またはＳＤＳ（列７〜１０）を用いて溶解され、そして１．６ｘ１０５細胞に対応する一定分量が、ＳＦＶ  Ｅ２に対する（列１〜２）、トランスフェリンレセプターに対する（列３〜４）またはモロニーマウス白血病ウイルスに対する（列５〜６）抗体のいずれかを用いて抽出されるか、あるいはサンプルバッファーと直接混合され（列７〜１０）、そして還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥと続く蛍光光度法によって解析された。
図３
Ｃ遺伝子由来の塩基１０２個のセグメントがタンパク質発現の増強に関与する  ＢＨＫ−２１細胞が、指示されるｐＳＦＶ３−ＬａｃＺ、ＳＦＶＣ’−ＬａｃＺシリーズの６種のメンバーおよびｐＳＦＶＣ−ＬａｃＺのＲＮＡ転写物によりトランスフェクションされた。トランスフェクション後８時間目に、細胞は、１５分間３５Ｓ−メチオニンでパルスラベルされ、１５分間チェイスされ、次いで、ＳＤＳを用いて溶解された。細胞溶解液の一定分量（１．２ｘ１０４細胞に対応する）が、サンプルバッファーと混合され、そして還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。β−ガラクトシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の量は、実施例２記載のように定量され、メチオニン含量における差異について修正された。Ｃ’−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の可変Ｃ’部分の長さに対する、タンパク質合成の相対速度（ＳＦＶｍＳＱＬ  Ｃタンパク質合成のパーセンテージとして表される）が示される。
図４
塩基１０２個の長さをもつＣ遺伝子セグメントによる発現増強は、増進された複製によってもまた転写によっても仲介されない。
細胞は、ｐＳＦＶｍＳＱＬ（列１）、ｐＳＦＶＣ’−ＬａｃＺ（列２）、ｐＳＦＶ３−ＬａｃＺ（列３）、ｐＳＦＶ１−Ｐｒ５５ｇａｇ（列５）からのＲＮＡ転写物、またはバッファーのみ（列４）によりトランスフェクションされた。アクチノマイシンＤが、トランスフェクション後２時間に添加された。トランスフェクション後４時間目に、１４Ｃ−ウリジンが添加され、そして細胞は、４時間ラベルされた。総ＲＮＡが抽出され、１．４ｘ１０５細胞に対応する一定分量が、変性条件下アガロースゲル上で解析された。乾燥ゲルのオートラジオグラムが示される。
実施例
実施例１
ここでは、本発明者らは、２６ＳｍＲＮＡリーダーか、完全なＣ遺伝子の３’末端か、またはＣ遺伝子の５’部分のいずれかに、融合される異種遺伝子を用いるＳＦＶベクターの構築を記述する。全ての構築物は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー，ポルトン  ダウン，サリスバリー，ウィルトシャー，ユー．ケー．（European Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, U.K.）に；寄託番号91112826で寄託されたプラスミドｐＳＰ６−ＳＦＶ４（４）中の完全なＳＦＶｃＤＮＡ分子を用いて実施された。図１には、種々のベクター構築物から生産される種々のｍＲＮＡ分子のコーディング領域が、略図により示される。ベクター構築物は次のとおりである：
（ｉ）ｐＳＦＶＣ−ｐ６２、これは、Ｃ遺伝子との野生型融合物としてのＳＦＶｐ６２スパイク・サブユニットの遺伝子を含有する。それは、２個の終止コドンが、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４中の位置９８６６〜９８７１における、Ｅ１のＮ末端部分をコードする領域に、部位特異的突然変異によって導入されたｐＳＰ６−ＳＦＶ４の小ＮｓｉＩ／ＳｐｅＩ断片（２．６ｋｂｐ）に、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４からの大ＳｐｅＩ／ＮｓｉＩ断片（１２ｋｂｐ）を連結させることによって構築された。
（ｉｉ）ｐＳＦＶ１−ｐ６２、これは、２６ＳｍＲＮＡリーダー配列の位置３１において、５’ＳＦＶサブゲノム領域に融合されたＳＦＶｐ６２スパイク・サブユニットの遺伝子を含有する（ＳＦＶ−１ベクター変異体）（４）。これは、（ｉ）における小ＮｓｉＩ／ＳｐｅＩ断片（２．６ｋｂｐ）に、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４／ΔＣからの大ＳｐｅＩ／ＮｓｉＩ断片（１１ｋｂｐ）を連結させることによって構築された。ｐＳＰ６−ＳＦＶ４／ΔＣは、Ｃ遺伝子の欠失によってｐＳＰ６−ＳＦＶ４から構築された（１８）。
（ｉｉｉ）ｐＳＦＶ１−ＴＲ、これは、２６ＳＲＮＡリーダー配列の位置３１において、５’ＳＦＶサブゲノム領域との融合物中に、ヒトのトランスフェリン・レセプター遺伝子を含有する（４）。
（ｉｖ）ｐＳＦＶＣ−ＴＲ、これは、完全な２６ＳＲＮＡリーダー配列を包含する５’ＳＦＶサブゲノムと全Ｃ遺伝子との融合物中に、ヒトのトランスフェリン・レセプター遺伝子を含有する。ＣとＴＲ遺伝子の実際の融合は、ＰＣＲによって実施された（１９．２０）。融合ＤＮＡの増幅のために使用された末端プライマーは：
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使用された融合プライマーは：
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（ＴＲ遺伝子断片プライマー）であった。ｐＳＦＶＣ−ＴＲは、ｐＳＦＶ−Ｃの１０６７９−ｂｐ  ＳｐｅＩ−Ｃｓｐ４５Ｉ断片（１８）およびｐＳＦＶ１−ＴＲの２７４４−ｂｐ  ＮｄｅＩ−ＳｐｅＩ断片（４）に、８９６−ｂｐ  Ｃｓｐ４５Ｉ−ＮｄｅＩ融合断片を連結させることによって構築された。ＰＣＲ反応に由来するｐＳＦＶＣ−ＴＲの８９６−ｂｐ  Ｃｓｐ４５Ｉ−ＮｄｅＩ断片は、塩基配列決定によってチェックされた。
（ｖ）ｐＳＦＶ１−Ｐｒ６５ｇａｇ、これは、２６ＳｍＲＮＡリーダー配列の位置３１において、５’ＳＦＶサブゲノムとの融合物中に、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）ｇａｇ前駆体の遺伝子を含有する。これは、Ｐｒ６５ｇａｇ遺伝子を含むｐＮＣＡ（Colicelli，1988）からの１７７０−ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を、ｐＧＥＭ−１およびｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（Promega）におけるサブクローニング段階を通して、ｐＳＦＶ１中に挿入することによって構築された。サブクローニング段階は、Ｐｒ６５ｇａｇ遺伝子に隣接する５’ＢａｍＨと３’ＳｍａＩ部位を導入した。５’非コーディングＭ−ＭｕＬＶ配列は、次の２種の重複するオリゴヌクレオチド；
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から作成された合成１３５−ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を用いて５’１７７−ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を置換することによって欠失された。
（ｖｉ）ｐＳＦＶＣ−Ｐｒ６５ｇａｇ、これは、完全な２６ＳＲＮＡリーダー配列を含むＳＦＶ５’サブゲノム領域とＣ遺伝子との融合物中に、Ｍ−ＭｕＬＶｇａｇ前駆体遺伝子を含有する。このプラスミドは、Ｐｒ６５ｇａｇ遺伝子の第２コドンヘのＳＦＶ  Ｃ遺伝子のＰＣＲ融合によって構築された。使用された融合プライマーは：
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（Ｐｒ６５ｇａｇ遺伝子断片プライマー）であった。融合ＤＮＡの増幅のための末端プライマーは：
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次いで、ｐＳＦＶＣ−Ｐｒ６５ｇａｇが、ｐＳＦＶ−Ｃからの１０６７９−ｂｐ  ＳｐｅＩ−Ｃｓｐ４５Ｉ（１８）およびｐＳＦＶｌ−Ｐｒ６５ｇａｇの２４９２−ｂｐＰｓｔＩ−ＳｐｅＩ断片に、５６２−ｂｐ  Ｃｓｐ４５Ｉ−ＰｓｔＩ  Ｃ−Ｐｒ６５ｇａｇ融合断片を連結させることによって構築された。ＰＣＲ反応から生成されるｐＳＦＶＣ−Ｐｒ６５ｇａｇの５６２−ｂｐ  Ｃｓｐ４５Ｉ−ＰｓｔＩ断片は、塩基配列決定によってチェックされた。
（Ｖｉｉ）ｐＳＦＶ３−ＬａｃＺ、これは、完全な不翻訳リーダー配列（ＳＦＶ３ベクター、（４））の後の２６ＳＲＮＡ中の位置５３において、５’ＳＦＶサブゲノム領域との融合物中に、アミノ酸残基２〜１０２５をコードするＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子を含有する（４）。
（ｖｉｉｉ）ｐＳＦＶＣ−ＬａｃＺ、これは、完全な２６ＳｍＲＮＡリーダー配列を包含するＳＦＶ５’サブゲノムと完全なＣ遺伝子との融合物中に、上記ＬａｃＺ遺伝子を含有する。これは、ｐＳＦＶ３−ＬａｃＺからの小ＬａｃＺ含有ＢａｍＨＩ断片（３ｋｂｐ）を、ｐＳＦＶＣＢａｍＨＩ中に挿入することによって構築された。ｐＳＦＶＣＢａｍＨＩは、直接ＢａｍＨＩ部位へと続く構造ＳＦＶゲノムのＣタンパク質遺伝子のみを含有する。このプラスミドは、ＰＣＲにより生成されたＣ遺伝子の４４０−ｂｐ  Ｃｓｐ４５Ｉ−ＢａｍＨＩ  ３’末端断片およびｐＳＦＶ１
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の８７４−ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片に、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４からの大ＳｐｅＩ−Ｃｓｐ４５Ｉ断片（１０６７９−ｂｐ）を連結させることによって構築された。ＰＣＲ反応に使用されたプライマーは：
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（３’末端プライマー）であった。
（ｉｘ）ｐＳＦＶＣ’−ＬａｃＺ、これは、完全な２６ＳｍＲＮＡリーダーを包含する５’サブゲノム領域とＣ遺伝子の５’部分との融合物中に、ＬａｃＺ遺伝子を含有する。これは次のように構築された：ｐＳＰ６−ＳＦＶ４のＣタンパク質遺伝子における連続欠失は、位置７７８１におけるＣｓｐ４５Ｉ部位から始まる、ヌクレアーゼＢａｌ  ３１による限定消化によって作成された。末端は、クレノウフラグメントおよびＴ４ポリメラーゼによって平滑にされ、そしてＢａｍＨＩリンカーの混合物（８−、１０−および１２量体；Promega, Madison, WI, USA）に連結された。欠失シリーズからの大ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ断片（約１０．３ｋｂｐ）は、小さい、ｐＳＦＶ３−ＬａｃＺからのＢａｍＨＩ−ＳＰｅＩ断片を含有するＬａｃＺ遺伝子に連結された。
（ｘ）ｐＳＦＶｍＳＱＬ、これは、対照プラスミドであり、完全なＳＦＶゲノムを含有する。それは、ｐ６２の成熟切断部位を特定する構造遺伝子領域に変異を保持する。これらの変異のために、ｐ６２サブユニットは、Ｅ２およびＥ３に切断されない（２１．５）。
使用されるすべての分子生物学技術の詳細な方法は、Molecular Cloning（２２）に記載されている。
実施例２
Ｃ遺伝子の存在がタンパク質生産を増強する
ＲＮＡは、プラスミドｐＳＦＶ１−ｐ６２、ｐＳＦＶＣ−ｐ６２、ｐＳＦＶ１−ＴＲ、ｐＳＦＶＣ−ＴＲ、ｐＳＦＶ１−Ｐｒ６５ｇａｇ、ｐＳＦＶＣ−Ｐｒ６５ｇａｇ、ｐＳＦＶ１−ＬａｃＺ、ｐＳＦＶＣ−ＬａｃＺおよびｐＳＦＶｍＳＱＬを、鋳型として用いてイン・ビトロで合成された。これらは、ＢＨＫ−２１細胞中にトランスフェクションされ、そして８時間後に、細胞は、図２の説明で示されたように、１５または３０分間３５Ｓ−メチオニンにより代謝的にラベルされた。図２は、単独（列１，３，５および７）か、またはＣタンパク質と縦並び（列２，４，６，８および１０）で発現された場合の相同ｐ６２タンパク質（列１および２）、トランスフェリン・レセプター（列３および４）、Ｍ−ＭｕＬＶｇａｇ前駆体タンパク質（列５，６および１０）、β−ガラクトシダーゼタンパク質（列７および８）の合成の相対レベルを示す。構造ＳＦＶタンパク質（Ｃ，ｐ６２およびＥ１）の合成は、列１０に示される。細胞溶解液（列１〜６）または全細胞溶解液の一定量（列７〜１０）からの免疫沈降が示される。
ｐＳＦＶ１に基づく組み換えゲノムから発現される場合、ＳＦＶｐ６２、ＴＲおよびＭ−ＭｕＬＶｇａｇ（それぞれ、列１，３および５）は、すべて比較的低レベルで合成された。しかしながら、これらのタンパク質が、Ｃ融合タンパク質として発現される場合には、それらの発現レベルにおける劇的な増加が得られた（列２，４および６）。定量的には、その増加が全３種のタンパク質について約１０倍であることが示された。ウイルス構造ポリタンパク質からＣタンパク質を遊離する自己分解的切断は、また、人工のＣ−Ｐｒ６５ｇａｇおよびＣ−ＴＲポリタンパク質において明らかに効果的であった；未切断の融合タンパク質（列４および６）を表すであろう遅く移動するポリタンパク質の兆候はなかった。
ｐＳＦＶ１に基づくゲノムでは、２６Ｓリーダー配列の５’部分のみが存在するのに対して、ｐＳＦＶＣから得られるサブゲノムは、５’リーダー全体を含有する。したがって、その結果は、リーダー配列の３’部分またはＣ−配列の存在が発現レベルに影響することを示している。どの領域が、発現の増強に関与するかを見いだすために、ＳＦＶ３−ＬａｃＺゲノム（リーダー配列全体を含む）（図２、列７）かＳＦＶＣ−ＬａｃＺゲノム（リーダー配列全体に加えてＣ遺伝子配列を含む）（図２、列８）のいずれかによりトランスフェクションされた細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ生産のレベルが比較された。後者のゲノムは、未切断Ｃ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（アミノ酸の長さ１．２６３、約１４５ｋＤａ）の合成を支配した。定量的には、Ｃ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の発現は、ＳＦＶ３−ＬａｃＺゲノムからのβ−ガラクトシダーゼ発現よりも約８倍高いことが示された。この増加は、ＳＦＶＣに比較してＳＦＶ１について先に観察されたのと同じくらい大きかった。これらの観察から、発現ベクターにおけるＣ遺伝子の存在は、ＳＦＶに誘導される生産に対して強いポジティブな影響を及ぼすことが結論された。Ｃ−β−ガラクトシダーゼ構築における切断の阻害に関するもっとも可能性のある理由は、キャブシド・プロテアーゼによって切断される部位から数えて位置＋２のプロリン残基の存在である。
野生型類似のＳＦＶゲノムからのタンパク質生産レベルと、ＳＦＶＣゲノムからのそれとを相関させるために、ＳＦＶＣ−Ｐｒ６５ｇａｇＲＮＡ（図２、列１０）によりトランスフェクションされた細胞におけるＣおよびｇａｇ前駆体の量に対して、ｐＳＦＶｍＳＱＬ（図２、列９）のイン・ビトロ転写物によりトランスフェクションされた細胞において生産されたＣタンパク質の量が比較された。トランスフェクション後８時間のＣタンパク質の量は、２種のトランスフェクション物では差が認められなかった。さらにまた、Ｐｒ６５ｇａｇおよびＳＦＶスパイク・タンパク質は、同レベルで生産されたので、このことから、発現ベクター中へのＣ遺伝子の導入が、野生型ＳＦＶ感染における構造タンパク質について通常得られるレベルまで、異種タンパク質の生産を増強することが分かる。
この実施例では、ＲＮＡ転写およびトランスフェクションは、次のように実施された：ＳｐｅＩで直鎖化されたプラスミドのＲＮＡ転写物は、前記（４）のようにイン・ビトロで合成され、そしてＢＨＫ２１細胞（American Type Culture Collection）中にエレクトロポレーションによってトランスフェクションされた。簡単に言えば、８ｘ１０６細胞（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含のＰＢＳ０．８ｍｌに懸濁された)が、０．４ｃｍエレクトロポレーション・キュベット（Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Sweden）中で、イン・ビトロで生成されたＲＮＡ（転写混合物２０μｌ）と混合され、そして０．５８ｋＶ、２５μＦで２回の連続パルス（Bio-Rad Gene Pulser，パルス調整ユニットなし)に曝された。その細胞は、１０％（ｖ／ｖ）トリプトースリン酸ブロス（Gibco, Madison, Wi, USA）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を補足されたＢＨＫ−２１培地（Gibco）ｐＨ７．３からなる完全ＢＨＫ培地１５ｍｌに懸濁され、３．３ｃｍ組織培養ディッシュに平板注入（３ｍｌ／ディッシュ）され、そして３７℃でインキュベートされた。
３５Ｓ−メチオニンによる代謝ラベルは、既知（Wahlberg and Garoff 1989）のように実施され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、次のように実施された：洗浄された免疫複合体または細胞溶解液のサンプルが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（最終濃度；０．１５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８，０．１９ｇ／ｍｌグリセロール、３１ｍｇ／ｍｌＳＤＳ、３．８ｍＭＥＤＴＡ、０．７７ｍＭメチオニン、０．１５ｍｇ／ｍｌブロムフェノールブルーおよび３８．５ｍＭジチオトレイトール）と混合され、９５℃で３分間加熱され、そしてヨードアセトアミド（最終濃度０．１０Ｍ）によりアルシレート（ａｌｃｙｌａｔｅ）された。最後に、タンパク質は、既知（Maizel 1971）のように１１％アクリルアミドゲル上で分離された。電気泳動後、ゲルは、１０％（ｖ／ｖ）トリクロロ酢酸および４０％（ｖ／ｖ）メタノール中に浸漬され、３０分間インキュベートされ、そして乾燥された。放射能ラベルされた物質を含むゲルは、オートラジオグラフィーのためにＫｏｄａｃＸＡＲフィルムに露光された。
定量は、次のように行われた：放射能ラベルされた物質を含む乾燥アクリルアミドゲルが、Ｂａｓ−ＩＩＩ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｌａｔｅ（Fuji Photo Film Corp.）に露光された。映像プレートシグナルがデジタル化され、そして乾燥ゲルの種々の部分における放射能の量が、Ｆｕｊｉ  Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓ２０００（Fuji Photo Film Corp.）を用いて解析された。
実施例３
Ｃ遺伝子の５’部分からの１０２個の塩基セグメントが発現増強を仲介している。
発現増強の機構を明らかにする第１段階として、全Ｃ遺伝子配列かその一部分のみかどちらが、高レベルのタンパク質生産を促進するのに十分であるかという疑問が投じられた。この目的のために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に融合されたＣ遺伝子の５’部分の増強部分（Ｃ’）を含む種々のプラスミド（Ｃ’−ＬａｃＺキメラ）が構築された（図１）。これらのプラスミドは、イン・ビトロでのＲＮＡ転写の鋳型として使用され、そのＲＮＡが、ＢＨＫ−２１細胞中にトランスフェクションされ、そして細胞は、次のように１５分間パルスラベルされ、１５分間チェイスされた：
トランスフェクション後８時間に、細胞は、ＰＢＳで２回洗浄され、メチオニンを欠き２０ｍＭＨＥＰＥＳを補足したＥａｇｌｅｓ最小必須培地１．０ｍｌが添加され、そして細胞は、３０分間３７℃でインキュベートされた。
培地が除去され、同じ培地１．０ｍｌ中３５Ｓ−メチオニン３．７ＭＢｑ（１００μＣｉ）が添加され、そして細胞は、１５分間または３０分間インキュベートされた（パルス）。ラベル用培地が除去され、２０ｍＭＨＥＰＥＳを補足したＥＭＥＭ１．０ｍｌが添加され、そして細胞は、さらに１５分間または３０分間インキュベートされた（チェイス）。チェイスの最後に、細胞はＰＢＳで２回洗浄され、そして５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌおよび０．２ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍｇ／ｍｌＳＤＳまたは１０ｍｇ／ｍｌＮｏｎｉｄｅｔＰ４０（ＮＰ−４０）溶解バッファー、最終ｐＨ７．６の０．３０ｍｌ中で溶解された。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ；０．２ｍＭ）、Ｎ−エチルマレイミド（０．１ｍＭ）およびペプスタチンＡ（１μｇ／ｍｌ）が、使用前にその溶解バッファーに添加された。ＳＤＳ溶解バッファーで破壊された細胞は、室温で２０分間音波処理された。ＮＰ−４０で溶解された細胞からの細胞核は、遠心によって沈降された（１４，０００ｘｇで５分）。
免疫沈降は次のように実施された：
トランスフェリン・レセプターは、ＯＫＴ９モノクローナル抗ＴＲ抗体（T.Ebelより贈与される）により、Ｍ−ＭｕＬＶｇａｇ前駆体は、ポリクローナル抗ＭｕＬＶ血清（ＨＣ１８５；Quality Biotechnology Incorporated）により、そしてｐ６２は、モノクローナル抗Ｅ２抗体（ＵＭ５．１；Boere et a1.1984）により沈降された。３５Ｓ−メチオニンラベル細胞のＳＤＳ溶解液の一定分量（１００μｌ）が、１０ｍｇ／ｍｌＮＰ−４０溶解バッファーにより１０倍希釈され、そして適当な抗体の過剰量が、タンパク質Ａ−セファロース・スラリー（Pharmasia, Uppsala, Sweden; １０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中５０％ｗ／ｖ，ｐＨ７．５）４０μｌとともに添加され、そしてサンプルは、＋４℃で１６時間、十分に回転された。また、結合抗体が必要とされる場合は、ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Dacopatts, Glostrup, Denmark）が添加された。免疫複合体は、実施例２に記載のように前述の時間（分）洗浄された。トランスフェクション効率は、イン・サイチュウでのβ−ガラクトシダーゼ染色によって判定されるように、すべての場合において９５％よりも高かった。チェイス期間の終わりに、細胞は、ＳＤＳ中で溶解され、細胞溶解液の一定分量が、還元的条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。融合タンパク質に関わる放射能の量が実施例２記載のように定量された。図３は、融合タンパク質中のＣタンパク質由来のアミノ酸の数の関数としての融合タンパク質生産（ＳＦＶｍＳＱＬ  Ｃタンパク質生産の％として表された）を示す。より長い構築物（Ｃタンパク質由来のアミノ酸残基３４個以上を含む）からのタンパク質生産は、野生型Ｃタンパク質生産の８５％のレベルに達した。これは、実施例２に記載のＳＦＶＣ−ＬａｃＺ構築物から得られるものと同様に高い。より短いもの（Ｃタンパク質由来のアミノ酸残基、それぞれ１６、１９および２７個を含む）は、かなり低いレベルで生産された。かくして、その結果は、５’の部分１０２個の長さのＣ遺伝子（ｂ１）が、発現の増強を仲介していることを例証する。この実施例において、ＲＮＡ転写、トランスフェクション、ラベリングおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥは、実施例２記載のように実施された。組織培養ディッシュ中のメタノール固定のＢＨＫ−２１細胞のβ−ガラクトシダーゼ染色は、Sanes（２３）の記載のように実施例された。
実施例４
長さ１０２個の塩基のＣ遺伝子セグメントによる発現増強は翻訳の増進をとおして仲介される。
短い長さのＣ遺伝子配列のみが、最適なタンパク質生産に必要とされる事実は、その効果が、イン・トランス（すなわち、キャプシド・ポリペプチド鎖による）に仲介される可能性をないものとする。転写か翻訳かいずれかの効率に影響するシスの作用（すなわち、ＲＮＡに仲介される）機構が、一層可能性のある説明になると思われる。Ｃ遺伝子セグメントが、ゲノムおよびサブゲノムのＲＮＡレベルに影響するか否かを決定するために、これらの２種のＲＮＡ種の細胞内レベルが、「高い」か「低い」かいずれかの生産性ゲノムによりトランスフェクションされた細胞において測定された。トランスフェクション細胞は、すべての残存宿主細胞ＲＮＡ合成を抑制するために、アクチノマイシンＤの存在下で培養された。トランスフェクション後４時間に、１４Ｃ−ウリジンが添加され、そして細胞は４時間インキュベートされた。全ＲＮＡが、ラベルされた細胞から調製され、変性条件下で、１．０％アガロースゲルによる電気泳動にかけられた。ゲルは乾燥され、種々のバンドの放射能の量が、実施例２記載のように定量された。図４は、乾燥ゲルのオートラジオグラフィーを示す：列１，ＳＦＶ−ｍＳＱＬ；列２，高生産性ＳＦＶＣ’ｂ７−ＬａｃＺ；列３，低生産性ｐＳＦＶ３−ＬａｃＺ；列４，ＲＮＡなしの偽トランスフェクション；および列５，ＳＦＶ１−Ｐｒ５５ｇａｇ、これはヒト免疫不全ウイルス・タイプＩのＧａｇ前駆体のコーディング配列を含む。ＳＦＶ１−Ｐｒ５５ｇａｇゲノムのサブゲノムＲＮＡは、ＳＦＶ−ｍＳＱＬおよびＳＦＶＣ−ＬａｃＺゲノムのそれよりも短い約１５００塩基であり、したがって、これらの転写物の同定を容易にする。サブゲノムＲＮＡは、すべてのトランスフェクションにおいて匹敵するレベルで合成されることが分かった。定量では、合成レベルが、ほとんど２の係数で変化し、タンパク質生産のレベルと相関しないことが示された。また、ゲノムＲＮＡのレベルにも、何らの有意な違いが検出されなかった。かくして、種々のゲノムの複製のみならず転写もまた影響されなかった。それ故、タンパク質生産の増加は、翻訳効率の増進の結果であると結論される。
この実施例では、１４Ｃ−ウリジン・ラベルは、次のように実施された：トランスフェクションされた細胞が、直接、平板注入され、３７℃で２時間インキュベートされた。次いでアクチノマイシンＤ１．０μｇ／ｍｌが、培地に添加され、そしてインキュベートが２時間継続された。トランスフェクション後４時間に、培地が除去され、１４Ｃ−ウリジン（２．１ＧＢｑ／ｍｍｏｌ；ＮＥＣ−１６７，Dupont）の７５ｋＢｑが、完全ＢＨＫ培地１．５ｍｌに添加され、そして細胞が３７℃で４時間インキュベートされた。ラベル用培地が除去され、そして細胞は、フェノールに基づく核酸抽出反応混液（ＴｒｉｚｏｌＴＭ；Gibco）１．０ｍｌの添加によって溶解された。
ＲＮＡ精製および変性アガロースゲル電気泳動は、次のように実施された：１４Ｃ−ウリジンでラベルされた細胞からの全ＲＮＡは、製造元（Gibco）記載のようにＴｒｉｚｏｌＴＭによって精製され、ＲＮａｓｅ不含のＨ２Ｏ  ２０μｌに溶解された。一定分量が、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動用に調製され、そしてＲＮＡは、既述（Sambrook 1989）のように、１．０％Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロース（FMC Bioprod ucts, USA）ゲルにおいて分離された。電気泳動後、ゲルは、１０％トリクロロ酢酸に浸漬され、室温で３０分間インキュベートされ、乾燥された。放射能ラベルされたＲＮＡバンドは、オートラジオグラフィーによって可視化され、実施例２記載のように定量された。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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