(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］
Ａ1−Ｘ−Ａ2［１］
（式中、Ｘはリン酸基が導入されたアミノ酸残基であり、Ａ1及びＡ2は下記の如きアミノ酸残基又はペプチド鎖であって、これらの何れか一方は、その末端又は側鎖部分に消光基を有し、他方は、その末端又は側鎖部分にそれ自体蛍光性を有し且つ分子内の消光基によりその蛍光が消光される性質を有する蛍光基を有するものであり、Ａ1は、Ｘに結合した、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜２０個からなるペプチド鎖であって、そのアミノ末端のアミノ基は、蛍光基又は消光基が結合していない場合には、アミノ保護基により保護されたアミノ基又は遊離のアミノ基であり、Ａ2は、Ｘに結合した、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜２０個からなるペプチド鎖であって、そのカルボキシル末端のカルボキシル基は、蛍光基又は消光基が結合していない場合には、カルボキシル保護基により保護されたカルボキシル基又は遊離のカルボキシル基である。）で示され、蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間のアミノ酸残基数が１〜３９個のペプチド誘導体であって、該ペプチド誘導体のアミノ酸配列は、蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間に存在するペプチド結合の内の一つが、Ｘで表されるリン酸基が導入されたアミノ酸残基のリン酸基がプロテインホスファターゼにより脱リン酸化された場合に、プロテアーゼにより選択的に切断され得る配列である、ペプチド誘導体。
【請求項２】
アミノ保護基がｔ-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、2-フェニル-2-プロピル基又はアセチル基であり、カルボキシル保護基がメトキシ基、エトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ベンジル基、ペンタメチルジヒドロベンゾフラニル基又はアミド基である、請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項３】
蛍光基が（7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル基、5-［（2-アミノエチル）アミノ］ナフタレン-1-スルホン酸基、9,10-ジオキサ-syn-3,4,6,7-テトラメチルビマン基から選ばれるものであり、消光基がジニトロフェニル基、4-（4-ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイル基、4-（4-ジメチルアミノフェニルアゾ）スルホニル基から選ばれるものである、請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項４】
リン酸基が導入されるアミノ酸残基が、水酸基を有するアミノ酸残基である、請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項５】
リン酸基が導入されるアミノ酸残基が、チロシン残基、セリン残基又はスレオニン残基である、請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項６】
アミノ酸配列が
-Gly-Asp-Ala-Glu-Tyr-Ala-Ala-Lys-Arg-（配列番号：１）、
-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Gly-Lys-Arg-（配列番号：２）、
-Gly-Glu-Val-Asn-Tyr-Glu-Glu-Lys-Arg-（配列番号：３）、
-Gly-Glu-Pro-Gln-Tyr-Gln-Pro-Lys-Arg-（配列番号：４）、
-Gly-Glu-Lys-Glu-Tyr-His-Ala-Lys-Arg-（配列番号：５）、
-Gly-Asp-Gly-Val-Tyr-Ala-Ala-Lys-Arg-（配列番号：６）、
-Gly-Ser-Ala-Tyr-Gly-Lys-Arg-（配列番号：７）、
-Gly-Gly-Ser-Tyr-Ser-Lys-Arg-（配列番号：８）、
-Gly-Arg-Val-Phe-Ser-Lys-Arg-（配列番号：９）、
-Gly-Asp-Arg-Phe-Thr-Lys-Arg-（配列番号：１０）、
-Gly-Arg-Lys-Phe-Thr-Lys-Arg-（配列番号：１１）、
-Gly-Pro-Gly-Phe-Ser-Lys-Arg-（配列番号：１２）、
-Gly-Thr-Arg-Phe-Ser-Lys-Arg-（配列番号：１３）、又は
-Gly-Lys-Arg-Phe-Ser-Lys-Arg-（配列番号：１４）
を含むものである請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチド誘導体を基質として用いるプロテインホスファターゼの活性測定方法。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチド誘導体をプロテインホスファターゼと反応させ、次いでその生成物に、該ペプチド誘導体に含まれるＸで表されるリン酸基が導入されたアミノ酸残基のリン酸基がプロテインホスファターゼにより脱リン酸化された場合に、蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間に存在するペプチド結合の内の一つを選択的に切断する性質を有するプロテアーゼを反応させ、これにより生ずる蛍光強度の変化を測定することを特徴とするプロテインホスファターゼの活性測定方法。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチド誘導体を含んで成るプロテインホスファターゼ活性測定用試薬。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチド誘導体、及び該ペプチド誘導体に含まれるＸで表されるリン酸基が導入されたアミノ酸残基のリン酸基がプロテインホスファターゼにより脱リン酸化された場合に、蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間に存在するペプチド結合の内の一つを選択的に切断する性質を有するプロテアーゼを含んで成るプロテインホスファターゼ活性測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の利用分野】
本発明は、プロテインホスファターゼ活性測定用として有用なペプチド誘導体と、それを基質として用いたプロテインホスファターゼ活性測定法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
プロテインキナーゼによる蛋白質のリン酸化反応は、細胞間の情報伝達、細胞の増殖や分化の制御等において重要な役割を演じている（ビショップ、J.M.、Cell(1991),64,235-248）。そして、この反応はプロテインホスファターゼによる 脱リン酸化反応によって可逆的にコントロールされている。この意味で、プロテインホスファターゼの研究はプロテインキナーゼの研究と共に重要である。
【０００３】
プロテインホスファターゼの研究のためには、その活性を測定するための基質並びに測定方法が必要である。従来使用されてきた基質と測定方法は以下の通りである。
【０００４】
１）リン酸化アミノ酸残基を含むペプチド誘導体を基質とし、プロテインホスファターゼの作用により遊離したリン酸イオンを比色法により定量する（チョー,H.等,Biochemistry(1991),30,6210-6216）。本方法によるリン酸イオンの検出限界は１ナノモル程度であるが、酵素サンプルにリン酸イオンが混入していると測定を妨害するという問題があった。
【０００５】
２）リン酸化アミノ酸残基を含むペプチド誘導体を基質とし、プロテインホスファターゼの作用による脱リン酸化反応に伴って上昇する吸光度又は蛍光強度を測定する（ジャオ,Z.等,Analytical Biochemistry(1992),201,361-366）。本法での脱リン酸化反応の検出限界は、吸光度法で１ナノモル程度、蛍光法で１０ピコモル程度である。本法は、生体由来試料を測定する場合、該試料中に混在する各種共存物質の影響を受け、精度良く測定することができないという欠点を有する。
【０００６】
３）放射性リン酸で標識したペプチド誘導体又は蛋白質を基質とし、プロテインホスファターゼの作用により遊離したリン酸イオンの放射能を測定する（トンクス,N.K.等,J.Biological Chemistry(1988),263,6722-6730）。放射性リン酸の比活性を、１ピコモル当たり毎分1,000カウントとすると、本法でのリン酸イオンの検出限界は0.1ピコモル程度である。本法は、検出感度が高いので、微弱な酵素活性をも測定できる利点は有するものの、基質の作製が煩雑なことと、放射活性の減衰のために基質を長期間保存できないという欠点を有する。
【０００７】
以上のように、従来から採用されているプロテインホスファターゼ活性測定法には、一長一短があり、必ずしも満足できるものではなく、簡便で高精度に且つ放射性物質を使用しない安全な測定方法の開発が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決すべき課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、プロテインホスファターゼ活性測定用基質として有用なペプチド誘導体、及びこれを基質として用いるプロテインホスファターゼ活性測定法並びにそのための試薬の提供をその課題とする。
【０００９】
本発明は、一般式［１］
Ａ1−Ｘ−Ａ2［１］
（式中、Ｘはリン酸基が導入されたアミノ酸残基であり、Ａ1及びＡ2は下記の如きアミノ酸残基又はペプチド鎖であって、これらの何れか一方は、その末端又は側鎖部分に消光基を有し、他方は、その末端又は側鎖部分にそれ自体蛍光性を有し且つ分子内の消光基によりその蛍光が消光される性質を有する蛍光基を有するものであり、Ａ1は、Ｘに結合した、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜２０個からなるペプチド鎖であって、そのアミノ末端のアミノ基は、蛍光基又は消光基が結合していない場合には、アミノ保護基により保護されたアミノ基又は遊離のアミノ基であり、Ａ2は、Ｘに結合した、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜２０個からなるペプチド鎖であって、そのカルボキシル末端のカルボキシル基は、蛍光基又は消光基が結合していない場合には、カルボキシル保護基により保護されたカルボキシル基又は遊離のカルボキシル基である。）で示され、蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間のアミノ酸残基数が１〜３９個のペプチド誘導体であって、該ペプチド誘導体のアミノ酸配列は、蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間に存在するペプチド結合の内の一つが、Ｘで表されるリン酸基が導入されたアミノ酸残基のリン酸基がプロテインホスファターゼにより脱リン酸化された場合に、プロテアーゼにより選択的に切断され得る配列である、ペプチド誘導体、及びこれを基質として用いるプロテインホスファターゼの活性測定法並びにそのための試薬に関する。
【００１０】
即ち、本発明者は、簡便で高精度に且つ放射性物質を使用しない安全なプロテインホスファターゼ活性測定方法を開発すべく鋭意研究を行った結果、上記した如きペプチド誘導体を基質として用いれば、脱リン酸化されるまでは消光基によりその蛍光が消光されているが、脱リン酸化された後に適当なプロテアーゼを反応させて該蛍光基と該消光基とを切り放すことによって蛍光が生じ、その蛍光強度を利用すればプロテインホスファターゼ活性を簡便且つ高精度に測定し得ることを見出し本発明を完成するに到った。
【００１１】
本発明に係る蛍光基は、蛍光性を有し且つ分子内の消光基によりその蛍光が消光される性質を有する基であり、分子内に存在する消光基の種類によって異なるが、その具体例としては、例えば（7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル基，5-［（2-アミノエチル）アミノ］ナフタレン-1-スルホン酸基，9,10-ジオキサ-syn-3,4,6,7-テトラメチルビマン基等が挙げられる。これら蛍光基は、蛍光基の種類に応じて、常法により末端アミノ酸のα−アミノ基又はα−カルボキシル基或いはアミノ酸残基の側鎖に含まれる例えばアミノ基，カルボキシル基及びチオール基等に適宜結合させれば良い。尚、結合させる際に適当なスペーサーを用いてもよい。
【００１２】
本発明に係る消光基としては、分子内に存在する蛍光基による蛍光を消光する性質があればよく、その具体例としては、例えばジニトロフェニル基，4-（4-ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイル基，4-（4-ジメチルアミノフェニルアゾ）スルホニル基等が挙げられる。これら消光基は、消光基の種類に応じて、常法により末端アミノ酸のα−アミノ基又はα−カルボキシル基或いはアミノ酸残基の側鎖に含まれる例えばアミノ基，カルボキシル基及びチオール基等に適宜結合させれば良い。尚、結合させる際に適当なスペーサーを用いてもよい。
【００１３】
本発明のペプチド誘導体は、例えば以下の一般式で示されるものが挙げられる。
一般式［１］
Ａ1−Ｘ−Ａ2 ［１］
（式中、Ｘはリン酸基が導入されたアミノ酸残基であり、Ａ1及びＡ2は下記の如きアミノ酸残基又はペプチド鎖であって、これらの何れか一方は、その末端又は側鎖部分に消光基を有し、他方は、その末端又は側鎖部分にそれ自体蛍光性を有し且つ分子内の消光基によりその蛍光が消光される性質を有する蛍光基を有するものであり、Ａ1は、Ｘに結合した、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜２０個からなるペプチド鎖であって、そのアミノ末端のアミノ基は、蛍光基又は消光基が結合していない場合には、アミノ保護基により保護されたアミノ基又は遊離のアミノ基であり、Ａ2は、Ｘに結合した、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜２０個からなるペプチド鎖であって、そのカルボキシル末端のカルボキシル基は、蛍光基又は消光基が結合していない場合には、カルボキシル保護基により保護されたカルボキシル基又は遊離のカルボキシル基である。）で示され、蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間のアミノ酸残基数が１〜３９個のペプチド誘導体であって、該ペプチド誘導体のアミノ酸配列は、蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間に存在するペプチド結合の内の一つが、Ｘで表されるリン酸基が導入されたアミノ酸残基のリン酸基がプロテインホスファターゼにより脱リン酸化された場合に、プロテアーゼにより選択的に切断され得る配列である、ペプチド誘導体。
【００１４】
一般式［１］においてＡ1又はＡ2で示される、該消光基を有するアミノ酸残基は、保護されていても良く、リン酸基及び蛍光基を有していないアミノ酸残基であって消光基の結合しているものであれば良い。また、該消光基を有するペプチド鎖は、前記した如き消光基を有するアミノ酸残基を含んだ、リン酸基及び蛍光基を有していないアミノ酸残基からなるものであれば良い。また、Ａ1又はＡ2がペプチド鎖の場合、消光基を有するアミノ酸残基の位置は特に限定されない。更にまた、該ペプチド鎖のアミノ酸残基の数としては、好ましくは消光基を有するアミノ酸残基を含めて２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜５個である。
【００１５】
一般式［１］においてＡ1又はＡ2で示される、該蛍光基を有するアミノ酸残基は、保護されていても良く、リン酸基及び消光基を有していないアミノ酸残基であって蛍光基の結合しているものであれば良い。また、該蛍光基を有するペプチド鎖は、前記した如き蛍光基を有するアミノ酸残基を含んだ、リン酸基及び消光基を有していないアミノ酸残基からなるものであれば良い。また、Ａ1又はＡ2がペプチド鎖の場合、消光基を有するアミノ酸残基の位置は特に限定されない。更にまた、該ペプチド鎖のアミノ酸残基の数としては、好ましくは蛍光基を有するアミノ酸残基を含めて２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜５個である。
【００１６】
本発明のペプチド誘導体に於いて、保護されていても良いアミノ酸残基又はペプチド鎖の保護基としては、カルボキシル末端保護基及びアミノ末端保護基が挙げられる。カルボキシル末端保護基としては、例えばメトキシ基，エトキシ基，ｔ−ブトキシ基等の低級アルコキシ基、例えばベンジル基，ペンタメチルジヒドロベンゾフラニル基等の芳香族炭化水素基等が挙げられる。尚、末端のカルボキシル基は、生体由来試料中に存在する可能性のあるカルボキシペプチダーゼの影響を回避するために、アミド基としておいても良い。アミノ末端保護基としては、例えばｔ-ブトキシカルボニル基，ベンジルオキシカルボニル基，9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基，2-フェニル-2-プロピル基，アセチル基等が具体例として挙げられる。
【００１７】
また、一般式［１］におけるＸとしては、例えばリン酸化チロシン残基，リン酸化セリン残基，リン酸化スレオニン残基等の側鎖に水酸基を有するアミノ酸残基をリン酸化したもの等が挙げられる。
【００１８】
本発明のペプチド誘導体のアミノ酸配列は、本発明の目的にかなうものであれば良く、より具体的には、測定するプロテインホスファターゼの種類及び蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間のペプチド結合を選択的に切断するプロテアーゼの種類に応じて適宜選択すればよい。また、本発明のペプチド誘導体のアミノ酸残基の総数は、通常３〜４１個、好ましくは３〜２２個、より好ましくは３〜１２個である。
【００１９】
これらのアミノ酸配列は、プロテインキナーゼによりリン酸化される、天然に存在する蛋白質のリン酸化される部位を含む適当な範囲を複製したものでも良い。尚、このように天然に存在するものの複製物は、そのままのかたちで用いても良いが、適宜改変して用いた方が望ましい。
【００２０】
即ち、例えばプロテアーゼとして、チロシン残基のような芳香環を有するアミノ酸残基のカルボキシ末端側を選択的に切断する性質を有するキモトリプシンを用いる場合、本発明のペプチド誘導体中には、例えばリン酸化チロシン残基等が必要であるが、その他のアミノ酸残基の中にキモトリプシンと反応する可能性のあるアミノ酸残基、例えばチロシン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、アスパラギン残基、スレオニン残基、メチオニン残基、グルタミン残基、バリン残基等、中でもチロシン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基を含まないようにする方が望ましい。天然型のものがこのようなアミノ酸残基を含有するものである場合、これらアミノ酸残基の代わりにキモトリプシンと反応し難いアミノ酸残基、例えばアラニン残基を組み込むことが望ましい。
【００２１】
また、本発明のペプチド誘導体において、消光基を有するアミノ酸残基と蛍光基を有するアミノ酸残基との間に存在するアミノ酸残基の数が多すぎると消光基の消光作用が弱くなる。そのため、消光基を有するアミノ酸残基と蛍光基を有するアミノ酸残基との間に存在するアミノ酸残基の数は、１〜３９個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個であることが望ましい。
【００２２】
本発明のペプチド誘導体のアミノ酸配列は、Ｘで表されるリン酸基が導入されたアミノ酸残基のリン酸基が、プロテインホスファターゼにより脱離され脱リン酸化された後、蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間に存在するペプチド結合の内の１つが、プロテアーゼにより選択的に切断され得る配列である。
本発明に於けるプロテインホスファターゼとしては、例えばプロテインチロシンホスファターゼ、プロテインセリンホスファターゼ、プロテインスレオニンホスファターゼ等が挙げられる。
また、プロテアーゼとしては、リン酸基を有するアミノ酸残基の種類によって異なるが、例えばキモトリプシン、トリプシン、パパイン、プラスミン等が挙げられる。
【００２３】
本発明のペプチド誘導体の具体例としては、例えば以下のようなものが挙げられる。
Flu-Gly-Asp-Ala-Glu-pTyr-Ala-Ala-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Glu-Gly-Thr-pTyr-Gly-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Glu-Val-Asn-pTyr-Glu-Glu-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Glu-Pro-Gln-pTyr-Gln-Pro-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Glu-Lys-Glu-pTyr-His-Ala-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Asp-Gly-Val-pTyr-Ala-Ala-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Ser-Ala-pTyr-Gly-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Gly-Ser-pTyr-Ser-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Arg-Val-Phe-pSer-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Asp-Arg-Phe-pThr-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Arg-Lys-Phe-pThr-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Pro-Gly-Phe-pSer-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Thr-Arg-Phe-pSer-Lys(Inh)-Arg-NH2
Flu-Gly-Lys-Arg-Phe-pSer-Lys(Inh)-Arg-NH2
（Flu：蛍光基、pTyr：O-ホスホチロシン残基、pSer：O-ホスホセリン残基、pThr：O-ホスホスレオニン残基、Inh：消光基、Lys(Inh)：消光基結合リジン残基。その他の略号は、慣用のアミノ酸残基の略号である。）
【００２４】
本発明のペプチド誘導体は、蛍光基を有するアミノ酸及び消光基を有するアミノ酸を出発原料として用い、リン酸化アミノ酸残基を含むペプチド誘導体の合成に於ける常法であるPostリン酸化方法又はPreリン酸化方法によって合成し得る。Postリン酸化方法は、ペプチド鎖構築後にヒドロキシアミノ酸残基をリン酸化する方法であり、Preリン酸化方法は、予め保護されたホスホアミノ酸誘導体を合成し、これをビルディングブロックとしてペプチド鎖に組み込む方法であるが、一般に、Preリン酸化方法が望ましく、特に、酸化に弱いアミノ酸残基である例えばメチオニン残基，システイン残基，トリプトファン残基等がペプチド鎖中に含まれている場合はそうである。
【００２５】
アミノ酸残基のリン酸化方法としては、リン酸化しようとするアミノ酸残基とアミノ酸残基の遊離の水酸基に対して１〜20当量の例えば塩化スルホニル、三塩化リン等のハロゲン化リン等のリン酸化剤とを、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)等の溶媒（無水）中、例えばピリジン、トリ エチルアミン、NaH等のアルカリ性物質を触媒として0〜40℃、1〜24時間反応さ せる方法が挙げられる。
【００２６】
また、ペプチド鎖の構築は、通常この分野に於いて用いられる常法に従って行えば良く、主鎖のカルボキシル末端側或いはアミノ末端側から、保護されていても良いアミノ酸を１個ずつ結合させていっても、いくつかのフラグメントに分けて合成したものを夫々結合させても良い。
【００２７】
ペプチド結合を生成させるためのカルボキシル基の活性化は、例えばアジド法、混合酸無水物法、ジシクロヘキシルカルボジイミド法、活性エステル法等、通常この分野に於いて用いられている常法に従って行えば良い。
【００２８】
反応温度は、通常-30〜50℃、好ましくは-10〜25℃である。
反応時間は、合成方法により異なるが、通常10分〜24時間、好ましくは30分〜２時間である。
【００２９】
本発明のペプチド誘導体の合成法を、例えば蛍光基を有するアミノ酸としてMca-Gly（Mca：(7-メチルオキシクマリン-4-イル)アセチル基）、例えばリン酸化アミノ酸としてFmoc-Tyr(PO3H2)（Fmoc：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基）及び消光基を有するアミノ酸としてFmoc-Lys(DNP)（DNP：ジニトロフェニル基）を用いた場合を例に挙げて示す。
【００３０】
Mca-Glyは、例えばMca-Pro-Leuの合成法（C.G.ナイト等, FEBS Letters (1992),296,263-266）に従って同様に合成される。Fmoc-Tyr(PO3H2)は、市販品（例えば、 ノバ バイオケム社製等）を使用すればよい。
【００３１】
Fmoc-Lys(DNP)は、常法（H.ナガセ等, Journal of Biological Chemistry (1994),269,20952-20957）に準じて同様に合成される。本発明のペプチド誘導体全体のペプ チド鎖構築は、リン酸基を無保護のままペプチド鎖を構築する方法（E.A.Ottinger,L.L.Shekels,D.A.Bernlohr and G.Barany, Biochemistry (1993),32,4353-4361等）に準じて同様に固相合成により行われる。上記以外の操作及び後処理法は自体公知の方法のそれに準じて行えばよい。
【００３２】
本発明のペプチド誘導体に於いて、それ自体蛍光性を有する蛍光基は、該ペプチド誘導体を構成するアミノ酸残基に結合しており、該ペプチド誘導体分子内に共存する消光基によってその蛍光が消光されている。しかし、プロテインホスファターゼによる脱リン酸化によって、該ペプチド誘導体からリン酸基が脱離され、次いで脱リン酸化されたペプチド誘導体の蛍光基を有するアミノ酸残基と消光基を有するアミノ酸残基との間のペプチド結合が、プロテアーゼにより切断されると、該蛍光基と該消光基とが切り放され、該蛍光基が結合しているペプチド分子内或いはアミノ酸残基内に、該消光基が共存しなくなるので、該蛍光基が元々有する蛍光性が復帰し、蛍光を発するようになる。
【００３３】
本発明のペプチド誘導体を基質として用いれば、例えば血清、血漿、髄液等の生体試料中の、例えばプロテインチロシンホスファターゼ、プロテインセリンホスファターゼ及びプロテインスレオニンホスファターゼ等の活性を簡便且つ高精度に測定し得る。
【００３４】
該活性測定は、例えば以下の如くして行えばよい。
即ち、本発明のペプチド誘導体を適当量含む適当な緩衝液を予め適当な温度にインキュベートしておき、これに例えば血清、血漿、髄液等の生体試料を添加し、同温度で更に１〜３０分間インキュベートする。次いでこれに、バナジン酸ナトリウム溶液等のプロテインホスファターゼ阻害剤を添加して酵素反応を終了させる。この溶液に、例えばキモトリプシン，トリプシン，パパイン及びプラスミン等の、該ペプチド誘導体に含まれるリン酸化アミノ酸残基のリン酸基が脱離された場合に消光基を有するアミノ酸残基と蛍光基が結合したアミノ酸残基との間に存在するペプチド結合の内の１つを特異的に切断するプロテアーゼを添加し、生ずる蛍光強度を測定する。得られた蛍光強度を、予め濃度既知のプロテインホスファターゼ溶液を試料とした以外は同様の操作を行って求めた、蛍光強度とプロテインホスファターゼ活性との関係を表す検量線に当てはめることにより試料中のプロテインホスファターゼ活性を求めることができる。
【００３５】
この際の本発明のペプチド誘導体の使用濃度は、検量範囲をどの程度に設定するかにより変動するが、プロテインホスファターゼとの反応時の濃度として通常0.1〜100μＭ、好ましくは１〜10μＭである。プロテインホスファターゼを反応させる際のｐＨは、プロテインホスファターゼの活性測定を実施し得る範囲であれば良いが、通常４〜９、好ましくは５〜８である。また、インキュベートする温度は、通常20〜40℃である。プロテインホスファターゼ阻害剤の濃度は、阻害剤の種類により若干変動するが反応時の濃度として通常0.01〜10ｍＭ、好ましくは0.1〜１ｍＭである。プロテアーゼの濃度は、プロテア ーゼの種類により若干変動するが、反応時の濃度として通常0.1〜100μg/ml、好ましくは１〜50μg/mlである。
【００３６】
尚、測定対象のプロテインホスファターゼが、使用するプロテアーゼにより失活しない場合には、以下の方法によってもプロテインホスファターゼ活性を求めることができる。
【００３７】
即ち、本発明のペプチド誘導体と上記した如き性質を有するプロテアーゼとを適当量含む適当な緩衝液を予め適当な温度にインキュベートしておき、これに例えば血清、血漿、髄液等の生体試料を添加し、同温度で更にインキュベートしながら、単位時間当たりの蛍光強度変化量を求める。得られた蛍光強度変化量を、予め濃度既知のプロテインホスファターゼ溶液を試料とした以外は同様の操作を行って求めた、蛍光強度変化量とプロテインホスファターゼ活性との関係を表す検量線に当てはめることにより試料中のプロテインホスファターゼ活性を求めることができる。
【００３８】
この際の本発明のペプチド誘導体の使用濃度は、検量範囲をどの程度に設定するかにより変動するが、プロテインホスファターゼとの反応時の濃度として通常0.1〜100μＭ、好ましくは１〜10μＭである。プロテインホスファターゼを反応させる際のｐＨは、プロテインホスファターゼの活性測定を実施し得る範囲であれば良いが、通常４〜９、好ましくは５〜８である。また、インキュベートする温度は通常20〜40℃である。プロテアーゼの濃度は、プロテアーゼの種類により若干変動するが、反応時の濃度として通常0.1〜100μg/ml、好ましくは１〜50μg/mlである。
【００３９】
本発明の測定用試薬は、上記した如き本発明のペプチド誘導体を主要成分として含むものであり、例えば血清や血漿等の生体由来試料や組織抽出液中のプロテインホスファターゼ活性を測定するために使用されるもので、夫々の構成要件の好ましい態様、具体例については上に述べた通りである。
【００４０】
また、本試薬は、凍結乾燥状態でも溶液状態でも提供可能であり、また、プロテインホスファターゼ活性測定を阻害しないものであれば、上記したもの以外に、通常この分野で使用される界面活性剤、防腐剤、緩衝剤等が含まれていても良く、これらの使用濃度は通常この分野で使用される濃度に準じて適宜選択すればよい。
【００４１】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何等限定されるものではない。
尚、実施例に於いて、下記に示す略語を用いた。
Fmoc    ：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基
Mca     ：（7-メトキシクマリン-4-イル）アセチル基
pTyr    ：O-ホスホチロシン残基
Lys(DNP)：Nε-ジニトロフェニルリジン残基
Pbf     ：ペンタメチルジヒドロベンゾフラニル基
tBu     ：ｔ-ブチル基
PyBOP   ：ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt    ：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIEA    ：ジイソプロピルエチルアミン
TFA     ：トリフルオロ酢酸
【００４２】
【実施例】
実施例１．Mca-Gly-Asp-Ala-Glu-pTyr-Ala-Ala-Lys(DNP)-Arg-NH2（本発明のペプチド誘導体）の合成
出発原料としてMca-Gly、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Lys(DNP)及びFmoc-Arg(Pbf)を用い、PyBOP,HOBt及びDIEAを結合試薬として、リン酸基を無保護のままペプチド鎖を構築する方法（E.A.Ottinger,L.L.Shekels,D.A.Bernlohr and G.Barany, Biochemistry ,(1993),32,4353-4361等）に準じた固相法により合成した。即ち、先ず4-(2',4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-methylbenzhydrylamine樹脂（渡辺化学工業（株）製）（以下、ＭＢＨＡ樹脂と略記する。）10mg上に、10当量の所定の保護アミノ酸残基を含むDMF溶液、10当量のPyBOP、10当量のHOBt及び20当量のDIEAを加え、室温で１時間カップリング反応を行うことにより順次アミノ酸残基を導入した。尚、導入したアミノ酸残基の順序はFmoc-Arg(Pbf)（渡辺化 学工業（株）製）、Fmoc-Lys(DNP)（文献(H.ナガセ.等，J.Biological chemistry，(1994),269,20952-20957)を参考にして合成した。）、Fmoc-Ala（渡辺化学工 業（株）製）、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr(PO3H2)（ノババイオケム社製）、Fmoc-Glu(OtBu)（渡辺化学工業（株）製）、Fmoc-Ala、Fmoc-Asp(OtBu)（渡辺化学工業（株）製）、Mca-Gly（文献(C.G.ナイト等, FEBS Letters,(1992),296,263-266)を参 考にして合成した。）であった。反応終了後、ＭＢＨＡ樹脂をメタノールで洗浄し、TFA:水:チオアニソール:フェノール:エタンジチオール(84:5:5:3:3)混合液１mlを加えて室温で２時間攪拌反応させて、目的のポリペプチド誘導体を樹脂から切断すると同時にtBu基（Glu,Aspの側鎖カルボキシル基の保護基）とPbf基（Argの側鎖グアニジノ基の保護基）を切断させた。次に樹脂を濾去し、濾液に窒素ガスを吹きかけて濃縮後エーテルを加え目的物を沈殿させた。沈殿物を集め、デシケーターで乾燥させ、本発明化合物であるペプチド誘導体7.0mg（収率97％）を得た。得られたペプチド誘導体は、アミノ酸分析及び質量分析により目的の化合物であることが判った。
【００４３】
実施例２．Mca-Gly-Glu-Gly-Thr-pTyr-Gly-Lys(DNP)-Arg-NH2（本発明のペプチド誘導体）の合成
出発原料としてMca-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Lys(DNP)及びFmoc-Arg(Pbf)を用い、実施例１と同様にして合成を行った。
尚、Fmoc-Gly及びFmoc-Thr(tBu)は、渡辺化学工業（株）製のものを用い、導入したアミノ酸残基の順序は、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Lys(DNP)、Fmoc-Gly、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Mca-Glyであった。
収量は定量的であり、得られたペプチド誘導体は、アミノ酸分析及び質量分析により目的の化合物であることが判った。
【００４４】
実施例３．Mca-Gly-Asp-Gly-Val-pTyr-Ala-Ala-Lys(DNP)-Arg-NH2（本発明のペプチド誘導体）の合成
出発原料としてMca-Gly、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Ala、Fmoc-Lys(DNP)及びFmoc-Arg(Pbf)を用い、実施例１と同様にして合成を行った。
尚、Fmoc-Valは、渡辺化学工業（ 株）製のものを用い、導入したアミノ酸残基の順序は、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Lys(DNP)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Val、Fmoc-Gly、Fmoc-Asp(OtBu)、Mca-Glyであった。
収量は定量的であり、得られたペプチド誘導体は、アミノ酸分析及び質量分析により目的の化合物であることが判った。
【００４５】
実施例４．Mca-Gly-Ser-Ala-pTyr-Gly-Lys(DNP)-Arg-NH2（本発明のペプチド誘導体）の合成
出発原料としてMca-Gly、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Lys(DNP)及びFmoc-Arg(Pbf)を用い、実施例１と同様にして合成を行った。
尚、Fmoc-Ser(tBu)は、渡辺化学工業（ 株）製のものを用い、導入したアミノ酸残基の順序は、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Lys(DNP)、Fmoc-Gly、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ser(tBu)、Mca-Glyであった。
収量は定量的であり、得られたペプチド誘導体は、アミノ酸分析及び質量分析により目的の化合物であることが判った。
【００４６】
実施例５．Mca-Gly-Gly-Ser-pTyr-Ser-Lys(DNP)-Arg-NH2（本発明のペプチド誘導体）の合成
出発原料としてMca-Gly、Fmoc-Gly、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Lys(DNP)及びFmoc-Arg(Pbf)を用い、実施例１と同様にして合成を行った。
尚、導入したアミノ酸残基の順序は、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Lys(DNP)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Tyr(PO3H2)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Gly、Mca-Glyであった。
収量は定量的であり、得られたペプチド誘導体は、アミノ酸分析及び質量分析により目的の化合物であることが判った。
【００４７】
実施例６．プロテインチロシンホスファターゼ活性の測定
（試薬）
・基質溶液：実施例１で合成したMca-Gly-Asp-Ala-Glu-pTyr-Ala-Ala-Lys(DNP)-Arg-NH2を１μＭ含有する10mMジメチルグルタレート緩衝液（pH6.6）を基質溶液とした。
・キモトリプシン溶液：キモトリプシン（シグマ社製）を0.2％含有する１ｍ Ｍ塩酸（pH３）をキモトリプシン溶液とした。
・プロテインチロシンホスファターゼ溶液：プロテインチロシンホスファターゼ（Yersinia enterocolitica由来、New England Biolabs社製）を１mlにつき１U含有する10ｍＭジメチルグルタレート緩衝液（pH6.6）をプロテインチロシンホスファターゼ溶液とした。尚、１Ｕとは、パラニトロフェニルホスフェートを10mM含む20ｍＭジメチルグルタレート緩衝液（pH6.6）にプロテインチロシンホスファターゼを添加して25℃で反応させた場合に、１分間に１ナノモルのパラニトロフェニルホスフェートを加水分解する酵素量である（以下同じ。）。
（操作法）
基質溶液１ｍｌとキモトリプシン溶液10μｌとを蛍光測定用セル（10mm×10mm）に加え２５℃で５分間インキュベートした。次いでこれにプロテインチロシンホスファターゼ溶液１μｌを加え、２５℃でインキュベートしながらその蛍光強度変化を蛍光光度計（日立Ｆ−３０００。励起波長：328nm、蛍光波長：395nm）で測定した。
（結果）
結果を図１に示す。
図１から明らかな如く、本発明のペプチド誘導体を基質として用いることにより、プロテインチロシンホスファターゼの活性をリアルタイムで精度良く測定し得ることが判る。
【００４８】
実施例７．
（試薬）
・バナジン酸ナトリウム溶液：バナジン酸ナトリウムを水に100ｍＭとなるよ うに溶解したものをバナジン酸ナトリウム溶液とした。
尚、基質溶液、キモトリプシン溶液及びプロテインチロシンホスファターゼ溶液は、実施例６に同じ。
（操作法）
基質溶液１ｍｌを蛍光測定用セルに加え２５℃で５分間インキュベートした。次いでこれにプロテインチロシンホスファターゼ溶液１μｌを加え、２５℃でインキュベートしながら１０分間反応させた。次いでこれにバナジン酸ナトリウム溶液１μｌを加えプロテインチロシンホスファターゼを失活させた後、キモトリプシン溶液10μｌを加え、その蛍光強度変化を蛍光光度計（日立Ｆ−３０００。励起波長：328nm、蛍光波長：395nm）で測定した。
（結果）
結果を図２に示す。
図２から明らかな如く、本発明のペプチド誘導体を基質として用いることにより、プロテインチロシンホスファターゼ活性に対応した蛍光強度が得られること、言い換えれば、該活性を精度良く測定し得ることが判る。
【００４９】
実施例８．プロテインチロシンホスファターゼ活性の測定
（試薬）
・基質溶液：実施例１で合成したMca-Gly-Asp-Ala-Glu-pTyr-Ala-Ala-Lys(DNP)-Arg-NH2を１μＭ含有する20mMジメチルグルタレート緩衝液（pH6.6）を基質溶液とした。
・キモトリプシン溶液：キモトリプシン（Worthington社製）を５％含有する１ｍ Ｍ塩酸（pH３）をキモトリプシン溶液とした。
・バナジン酸ナトリウム溶液：バナジン酸ナトリウムを水に10ｍＭとなるように溶解したものをバナジン酸ナトリウム溶液とした。
・プロテインチロシンホスファターゼ溶液：プロテインチロシンホスファターゼ（Yersinia enterocolitica由来、New England Biolabs社製）を所定ユニット（Ｕ）含有する20ｍＭジメチルグルタレート緩衝液（pH6.6）をプロテインチロシンホスファターゼ溶液とした。
（操作法）
基質溶液200μｌを蛍光測定用セル（５mm×５mm）に加え２５℃で２分間インキュベートした。次いでこれに所定のプロテインチロシンホスファターゼ溶液２μｌを加え、２５℃でインキュベートしながら１分間反応させた。次いでこれにバナジン酸ナトリウム溶液２μｌを加えプロテインチロシンホスファターゼを失活させた後、キモトリプシン溶液２μｌを加え、その蛍光強度変化を蛍光光度計（日立Ｆ−３０００。励起波長：328nm、蛍光波長：395nm）で測定した。
（結果）
結果を図３及び図４に夫々示す。尚、図３のは、蛍光強度変化を測定した結果を示し、図４は、図３の結果から求めた、プロテインチロシンホスファターゼ溶液中の濃度（U/ml）と、蛍光強度変化から求めた脱リン酸化率（％）との関係を表す検量線である。
これらの結果から明らかな如く、本発明のペプチド誘導体を基質として用いることにより、試料中のプロテインチロシンホスファターゼ濃度（U/ml）に対応した蛍光強度が得られること、言い換えれば、該濃度を精度良く測定し得ることが判る。
【００５０】
実施例９．プロテインチロシンホスファターゼ活性の測定
（試薬）
・基質溶液：実施例２で合成したMca-Gly-Glu-Gly-Thr-pTyr-Gly-Lys(DNP)-Arg-NH2を２μＭ含有する20mMジメチルグルタレート緩衝液（pH6.6）を基質溶液とした。
・キモトリプシン溶液：キモトリプシン（Worthington社製）を0.2％含有する１ｍ Ｍ塩酸（pH３）をキモトリプシン溶液とした。
・プロテインチロシンホスファターゼ溶液：プロテインチロシンホスファターゼ（Yersinia enterocolitica由来、New England Biolabs社製）を１mlにつき30U含有する20ｍＭジメチルグルタレート緩衝液（pH6.6）をプロテインチロシンホスファターゼ溶液とした。
（操作法）
基質溶液200μｌとキモトリプシン溶液２μｌとを蛍光測定用セル（５mm×５mm）に加え２５℃で２分間インキュベートした。次いでこれにプロテインチロシンホスファターゼ溶液１μｌを加え、２５℃でインキュベートしながらその蛍光強度変化を蛍光光度計（日立Ｆ−３０００。励起波長：328nm、蛍光波長：395nm）で測定した。
（結果）
結果を図５に示す。
図５から明らかな如く、本発明のペプチド誘導体を基質として用いることにより、プロテインチロシンホスファターゼの活性をリアルタイムで精度良く連続的に測定し得ることが判る。また、この結果から、本方法が、プロテインチロシンホスファターゼと基質との反応を速度論的に解析する際の有力な手段となり得ることも判る。
【００５１】
実施例１０．プロテインチロシンホスファターゼの最大速度（Ｖmax）及びミカエリス定数（Ｋm）の測定
（試薬）
・基質溶液：実施例１で合成したMca-Gly-Asp-Ala-Glu-pTyr-Ala-Ala-Lys(DNP)-Arg-NH2を所定濃度含有する20mMジメチルグルタレート緩衝液（pH6.6）を基質溶液とした。
・キモトリプシン溶液：キモトリプシン（Worthington社製）を5.0％含有する１ｍ Ｍ塩酸（pH３）をキモトリプシン溶液とした。
・プロテインチロシンホスファターゼ溶液：プロテインチロシンホスファターゼ（Yersinia enterocolitica由来、New England Biolabs社製）を１mlにつき20U含有する20ｍＭジメチルグルタレート緩衝液（pH6.6）をプロテインチロシンホスファターゼ溶液とした。
（操作法）
所定の基質溶液200μｌとキモトリプシン溶液２μｌとを蛍光測定用セル（５mm×５mm）に加え２５℃で２分間インキュベートした。次いでこれにプロテインチロシンホスファターゼ溶液１μｌを加え、２５℃でインキュベートしながらその蛍光強度変化を蛍光光度計（日立Ｆ−３０００。励起波長：328nm、蛍光波長：395nm）で測定した。得られた反応タイムコースから各種基質濃度に於ける初速度（１分間当たりの蛍光強度変化）を求めた。
（結果）
結果を図６に示す。尚、図６は、基質濃度（横軸）と所定基質濃度で得られた初速度（縦軸）との関係を表すグラフである。
この結果に基づいて、常法によりプロテインチロシンホスファターゼの最大速度（Ｖmax）及びミカエリス定数（Ｋm）を求めたところ、夫々以下のような値が得られた。
Ｖmax：1.69nmol/unit・min
Ｋm  ：11.0μＭ
以上のことから明らかなように、本発明を利用することにより、プロテインホスファターゼの速度論的研究を容易に行うことができることも判る。
【００５２】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明はこれまでにないペプチド誘導体と、これを基質として用いるプロテインホスファターゼ活性測定法を提供するものであり、以下の如き効果を奏する。
１）蛍光強度を利用して測定を行うため、プロテインホスファターゼ活性を高感度に測定し得る。
２）本発明の試薬は、放射性のリン化合物を含んでいないため、長期間安定に保存可能である。
３）本発明の活性測定方法は、遊離したリン酸イオンを測定する方法ではないので、リン酸イオンが混在する試料についても測定可能である。
４）蛍光性基を適宜選択することにより、蛍光強度測定時の励起波長を、蛋白質の吸収波長とは異なる波長に設定し得るので、組織の粗抽出液をも試料とすることができる。
５）測定対象のプロテインホスファターゼが、測定に使用する上記した如き性質を有するプロテアーゼに抵抗性であるならば、基質の脱リン酸化反応をリアルタイムで追跡することができる。
【００５３】
【配列表】
【００５４】
【配列番号：１】
0003815051.tif 000002
【００５５】
【配列番号：２】
0003815051.tif 000003
【００５６】
【配列番号：３】
0003815051.tif 000004
【００５７】
【配列番号：４】
0003815051.tif 000005
【００５８】
【配列番号：５】
0003815051.tif 000006
【００５９】
【配列番号：６】
0003815051.tif 000007
【００６０】
【配列番号：７】
0003815051.tif 000008
【００６１】
【配列番号：８】
0003815051.tif 000009
【００６２】
【配列番号：９】
0003815051.tif 000010
【００６３】
【配列番号：１０】
0003815051.tif 000011
【００６４】
【配列番号：１１】
0003815051.tif 000012
【００６５】
【配列番号：１２】
0003815051.tif 000013
【００６６】
【配列番号：１３】
0003815051.tif 000014
【００６７】
【配列番号：１４】
0003815051.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例６で得られた、本発明の基質を用いたプロテインチロシンホスファターゼ活性に基づく蛍光強度変化を示す図である。
【図２】実施例７で得られた、本発明の基質を用いたプロテインチロシンホスファターゼ活性に基づく蛍光強度変化を示す図である。
【図３】実施例８で得られた、本発明の基質を用いたプロテインチロシンホスファターゼ活性に基づく蛍光強度変化を示す図である。
【図４】実施例８で得られたプロテインチロシンホスファターゼの濃度と脱リン酸化率（％）との関係を示す検量線である。
【図５】実施例９で得られた、本発明の基質を用いたプロテインチロシンホスファターゼ活性に基づく蛍光強度変化を示す図である。
【図６】実施例１０で得られた、基質濃度（横軸）と所定基質濃度で得られた初速度（縦軸）との関係を表すグラフである。
【図１】
0003815051.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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