(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに波長が異なる複数のレーザ光を発生する光源と、
前記光源からの前記複数のレーザ光を対物レンズを介して試料に供給する照明光学系と、
前記複数のレーザ光の照射により前記試料から発する蛍光又は反射光を取得して試料像を得る観察系と、
前記照明光学系によって照明された前記試料を透過したレーザ光を検出して前記試料像を得る透過光検出装置と、
前記透過光検出装置に入射するレーザ光の波長を選択する波長選択装置と、
前記複数のレーザ光の波長成分毎の強度ゆらぎ量を記憶する記憶装置と、
前記波長成分毎の強度ゆらぎ量のうち最も小さな強度ゆらぎ量に対応する波長を判定する判定装置と、
前記判定された波長を選択するように波長選択装置を制御する制御装置と、
を備えることを特徴とするレーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、試料に励起光であるレーザ光を照射することによって生じた光を検出して試料像の観察を可能にするレーザ顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
図４は、従来のレーザ顕微鏡の一例であるレーザスキャンタイプのコンフォーカル顕微鏡システムの概要を説明する図である。
【０００３】
このコンフォーカル顕微鏡システムでは、試料に単一の励起光を照射して蛍光観察を行う場合、励起フィルタユニット２によってレーザ光源１から発生した励起光のうちで試料に付した蛍光色素に最適な波長を選択するとともに、対物レンズ３によって試料面４上に集光された励起光をスキャナ５を用いて２次元的にスキャンする。そして、試料面４に付した蛍光色素から発生して励起光の光路を逆行してきた蛍光を例えばダイクロイックミラー１１で分離した後に蛍光検出器６で検出し、そのアナログ出力をＡ／Ｄコンバータ７でデジタル信号にし、コンピュータ８を用いて試料の画像を作成している。
【０００４】
この際、必要に応じて、試料面４に照射した励起光のうち試料を通過した透過光を透過光検出器９で検出し、そのアナログ出力も蛍光検出と同様にＡ／Ｄコンバータ１０でデジタル化し、コンピュータ８を用いて透過像を作成することも行われる。
【０００５】
複数の蛍光波長で多重励起して試料を観察する場合は、それぞれ異なった吸収波長及び蛍光波長をもつ蛍光色素を用いる。このような蛍光色素に対応する複数波長の励起光を励起フィルタユニット２で選択して試料面４に供給し、試料面４の蛍光色素から戻って来たそれぞれの波長に対応する複数の蛍光を、ダイクロイックミラー１１、１２、１３で分離し、各波長毎に設けた蛍光検出器６、ｌ４、１５で検出し、各蛍光検出器６、１４、１５からのアナログ信号をＡ／Ｄコンバータ７、１６、１７でデジタル化してコンピュータ８で画像を構成している。透過像観察に際しては、複数の励起光で照明した試料面４を通過した透過光を透過光検出器９で検出して、前述と同様にコンピュータ８で画像を作成している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような多重励起を行う際の透過像観察では、透過した全ての励起光を検出しているが、励起に用いているレーザ光の波長によってレーザ出力の安定性が異なる。このため、安定性の悪い波長のレーザ光が含まれる場合、透過光検出器９からの検出出力が安定せず、レーザ出力のゆらぎが観察画像においてピクセルの強度のゆらぎ（ノイズ）として現れてしまう。
【０００７】
本発明は、このような従来の問題点を鑑みてなされたもので、多重励起時の透過像観察において、観察画像内のピクセル強度のゆらぎを少なくすることができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明のレーザ顕微鏡は、互いに波長が異なる複数のレーザ光を発生する光源と、前記光源からの前記複数のレーザ光を対物レンズを介して試料に供給する照明光学系と、前記複数のレーザ光の照射により前記試料から発する蛍光又は反射光を取得して試料像を得る観察系と、前記照明光学系によって照明された前記試料を透過したレーザ光を検出して前記試料像を得る透過光検出装置と、前記透過光検出装置に入射するレーザ光の波長を選択する波長選択装置と、前記複数のレーザ光の波長成分毎の強度ゆらぎ量を記憶する記憶装置と、前記波長成分毎の強度ゆらぎ量のうち最も小さな強度ゆらぎ量に対応する波長を判定する判定装置と、前記判定された波長を選択するように波長選択装置を制御する制御装置と、を備えることを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係るレーザ顕微鏡の具体的な実施形態を図面を参照しながら説明する。
【００１２】
〔第１実施形態〕
図１は、第１実施形態のレーザ顕微鏡であるコンフォーカル顕微鏡システムの基本的構造を示すブロック図である。
【００１３】
このコンフォーカル顕微鏡システムは、照明光学系として、観察に必要な複数の励起光を発生するレーザ光源１と、これらの励起光の中から観察に用いる蛍光色素に最適な波長を選択するための励起フィルタユニット２と、励起フィルタユニット２を通過した励起光を反射する分離用ダイクロイックミラー２１と、この励起光を試料面４上でスキャンさせるためのスキャナ５と、励起光を集光して試料面４上に投影するための対物レンズ３とを備える。
【００１４】
ここで、レーザ光源１は、例えば３波長出力が可能なＫｒＡｒレーザとする。このＫｒＡｒレーザは、波長４８８ｎｍ、５６８ｎｍ、６４７ｎｍの励起光を出力することができる。これらの励起光は、ミラー２０を介して励起フィルタユニット２に入射する。この励起フィルタユニット２は、試料に付した蛍光色素の種類に応じて、上記励起光のうち１波長以上の必要な励起光を選択的に透過させる複数のバンドパスフィルタを光路上に交換可能に配置できるようになっている。励起フィルタは、１波長、２波長、３波長（組み合わせは任意）を選択できる。３波長使いたい場合は、３波長透過するフィルタを選択する。
【００１５】
また、このコンフォーカル顕微鏡システムは、観察系として、前述の照明光学系の構成要素を兼ねている対物レンズ３、スキャナ５、及び分離用ダイクロイックミラー２１のほか、対物レンズ３によって集光されスキャナ５でデスキャニングされて第１ダイクロイックミラー２１を通過した蛍光を一旦集光するレンズ２２と、ピンホール２３と、ピンホール２３を通過した励起光を各蛍光波長ごとに分割する第１〜第３ダイクロイックミラー１１、１２、１３と、第１〜第３ダイクロイックミラー１１、１２、１３で分割した各波長毎の蛍光を個別に光電変換して検出する第１〜第３蛍光検出器６、ｌ４、１５とを備える。
【００１６】
また、このコンフォーカル顕微鏡システムは、透過光検出系として、試料面４を通過した透過光や試料面４から発生した蛍光を集光する結像レンズ９１と、透過光や蛍光を光電変換して検出する透過光検出器９とを備えている。
【００１７】
また、このコンフォーカル顕微鏡システムは、波長選択ユニット４０として、試料面４と透過光用検出器２との間に配置されて、３波長成分からなる励起光や蛍光のうち例えば４８８ｎｍの光だけを透過させるバンドパスフィルタ４１を備える。このバンドパスフィルタ４１は、図示のように透過光の光路上にある動作位置（実線）と、透過光の光路上から退避した退避位置（点線）との間で可動になっている。バンドパスフィルタ４１が動作位置に移動した場合、レーザ光源１であるＫｒＡｒレーザの他の波長（５６８ｎｍ、６４７ｎｍ）の励起光が透過光用検出器９に入射することを防止できる。
【００１８】
さらに、このコンフォーカル顕微鏡システムは、処理制御装置として、第１〜第３蛍光検出器６、ｌ４、１５や透過光検出器９からの電気的な検出信号をデジタル化するＡ／Ｄコンバータ７、１６、１７、１０と、これらのＡ／Ｄコンバータ７、１６、１７、１０からのデジタル信号に適当な処理を施して試料の状態を画像化して表示するコンピュータ８０とを備える。なお、コンピュータ８０は、励起フィルタユニット２を制御して試料面４に入射させる励起光の波長を適宜設定する。また、コンピュータ８０は、スキャナ５の動作を制御して励起光が試料面４上において必要な間隔及び速度で走査されるようにする。スキャナ５に対する制御信号は、Ａ／Ｄコンバータ７、１６、１７、１０からのデジタル信号を画像化する際に参照される。また、コンピュータ８０は、波長選択ユニット４０を制御してバンドパスフィルタ４１を実線で示す動作位置と点線で示す退避位置のいずれかに移動させる。バンドパスフィルタ４１を実線で示す動作位置に移動させると、レーザ光源１であるＫｒＡｒレーザの波長４８８ｎｍの安定した励起光のみが透過光検出器９に入射し、波長５６８ｎｍ、６４７ｎｍの光が持つノイズが透過光用検出器９に入射することを防止できる。
【００１９】
図１の装置の動作について簡単に説明する。このコンフォーカル顕微鏡システムでは、蛍光観察を行う際に、レーザ光源１からのＫｒＡｒレーザ光の波長（４８８ｎｍ，５６８ｎｍ，６４７ｎｍ）に対応する吸収波長を持つ蛍光色素を試料に付する。そして、レーザ光源１からの励起光をスキャナ５、対物レンズ３等を介して試料面４に配置した試料上にスポット状に入射させるとともにスポット状の励起光を試料面４上でスキャンする。そして、試料面４に存在する蛍光色素から発生して逆行してきた蛍光を第１〜第３検出器６、１４、１５で検出し、そのアナログ出力をＡ／Ｄコンバータ７、１６、１７でデジタル化し、コンピュータ８０を用いて試料の画像を作成している。
【００２０】
この際、励起光のうち試料面４を透過する透過光を透過光検出器９で検出し、そのアナログ出力も蛍光検出と同様にＡ／Ｄコンバータ１０でデジタル化して、コンピュータ８０を用いて透過像を作成することも行われる。レーザ光源１からのＫｒＡｒレーザ光は、各波長でのノイズレベルが異なることが多く、４８８ｎｍの光が最も安定していることが多い。そこで、４８８ｎｍを含む複数波長での透過光観察時には、バンドパスフィルタ４１を透過光の光路上の動作位置に配置して、複数の励起光のうち４８８ｎｍの光だけが透過光検出器９に到達するようにする。このようにすることで、ＫｒＡｒレーザの他の波長（５６８ｎｍ、６４７ｎｍ）の光が持つノイズを取り除くことができ、よりノイズの少ない透過像観察が可能となる。
【００２１】
〔第２実施形態〕
以下、図２を参照して、第２実施形態のコンフォーカル顕微鏡システムについて説明する。なお、第２実施形態の装置は、第１実施形態の装置の変形例であり、同一部分には同一の符号を付して重複した説明を省略する。
【００２２】
第２実施形態のコンフォーカル顕微鏡システムは、第２実施形態の装置の変形例であり、透過光検出器９の出力から得られたデジタル画像から、コンピュータ８０を用いてノイズレベルを計算して、透過像観察に最適なバンドパスフィルタを自動的に判定するシステムである。
【００２３】
波長選択フィルタユニット１４０は、レーザ光源１からの複数の励起光を選択的に透過させる複数のバンドパスフィルタ１４１、１４２、１４３を備える。これらのバンドパスフィルタ１４１、１４２、１４３のいずれかを光路上に配置すれば、その透過波長に対応する励起光のみを透過光検出器９に供給することができる。全てのバンドパスフィルタ１４１、１４２、１４３を光路上から退避させれば、全ての励起光を透過光検出器９に供給することもできる。
【００２４】
以下、図３のフローチャートを参照して、第２実施形態のコンフォーカル顕微鏡システムの動作について説明する。予め、試料としてカバーグラスのみを試料面４に配置し、透過光検出器９からの検出出力がレーザ出力に対応するものになるように設定する。そして、波長選択フィルタユニット１４０をコンピュータ８０側から操作していずれか１つのバンドパスフィルタ１４１、１４２、１４３を光路上に配置する（ステップＳ１）。これにより、単一波長の励起光のみを選択して透過光検出器９に入射させることができる。次に、選択された励起光を試料面４上で走査しながら透過光を検出してノイズを測定する（ステップＳ２、Ｓ３）。この時のノイズの測定方法としては、例えば透過デジタル画像全体における輝度分布の標準偏差を計算する。得られた標準偏差が小さいければ強度ゆらぎ量すなわちノイズが少ないと考えることができる。次に、全ての励起波長でノイズ測定が終了したか否かを判断する（ステップＳ４）。全ての励起波長でのノイズ測定が終了していなければ、ステップＳ１に戻って別のバンドパスフィルタを光路上に配置して、再度ステップＳ２、Ｓ３でノイズ測定を実行する。全ての励起波長でノイズ測定が終了している場合、得られた標準偏差を基に各励起波長におけるノイズレベルに順位付けを施し、このような順位をコンピュータ８０内に設けた記憶装置に記憶しておく（ステップＳ５）。試料の観察時には、試料を試料面４に配置し、現在使用している蛍光色素に対応する励起波長をユーザがコンピュータ８０に入力する。コンピュータ８０は、励起フィルタユニット２を制御して対応するバンドパスフィルタを選択する（ステップＳ６）。次に、コンピュータ８０は、観察に用いられている波長で最もノイズの少ない励起波長を判定し、波長選択フィルタユニット１４０を制御してこの励起波長を透過させるバンドパスフィルタを選択させ、この励起波長に対応する透過像を自動的に作成する（ステップＳ７）。これにより、ピクセル強度のゆらぎが少ない、すなわちノイズの少ない透過像観察が可能となる。
【００２５】
なお、各励起波長におけるノイズレベルの順位付けは、これを一度コンピュータ８０のメモリに記憶しておけば、その後の透過像の観察に際しては、レーザ光源１を交換しない限りノイズレベルの順位付け処理（ステップＳ１〜Ｓ４）を繰返す必要はない。ただし、各励起波長におけるノイズレベルの順位付けを定期的に実行することで、レーザ光源１の特性変動によってノイズレベルに変動が生じた場合であってもこれに対応することができる。
【００２６】
以上、実施形態に即してこの発明を説明したが、この発明は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、以上の透過像観察では、通常の吸収を観察しているが、微分干渉や位相差等の一般の光学顕微鏡で行われている手法で観察する際にも、複数の透過励起光からノイズの少ないもののみを選択して検出することができる。
【００２７】
また、単一の透過波長だけではなく、比較的安定な複数波長を選択して透過像を検出することもできる。
【００２８】
【発明の効果】
上記課題を解決するため、本発明のレーザ顕微鏡によれば、前記照明光学系によって照明された前記試料を透過したレーザ光を検出して前記試料像を得る透過光検出装置と、前記透過光検出装置に入射するレーザ光の波長を選択する波長選択装置とを備えるので、試料に供給される複数のレーザ光の中に安定性の良くないレーザ光が含まれている場合であっても、前記波長選択装置でその波長成分をカットしたノイズの少ない透過像を得ることができ。
【００２９】
また、好ましい態様によれば、前記光源から前記試料に供給されるレーザ光の波長に関する情報に基づいて前記波長選択装置による波長の選択を制御する制御装置をさらに備えるので、試料に供給されるレーザ光の変更等に応じて適当な波長を選択してこの波長に対応するレーザ光のみを透過光検出装置に導くことができる。
【００３０】
また、好ましい態様によれば、前記制御装置が、前記光源が発生する前記複数のレーザ光の波長成分毎の強度ゆらぎ量を記憶する記憶装置と、前記光源から前記試料に供給されるレーザ光に対応する前記強度ゆらぎ量のうち最も小さな強度ゆらぎ量に対応する波長を判定する判定装置とを備えるので、試料に供給されるレーザ光の変更等に応じて簡易に最適な波長を選択してこの波長に対応するレーザ光のみを透過光検出装置に導くことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１実施形態のコンフォーカル顕微鏡システムの構造を説明するブロック図である。
【図２】第２実施形態のコンフォーカル顕微鏡システムの構造を説明するブロック図である。
【図３】図２のコンフォーカル顕微鏡システムの動作を説明するフローチャートである。
【図４】従来のコンフォーカル顕微鏡システムの構造を説明する図である。
【符号の説明】
１  レーザ光源
２  励起フィルタユニット
３  対物レンズ
４  試料面
５  スキャナ
７，１６，１７，１０  Ａ／Ｄコンバータ
６，ｌ４，１５  蛍光検出器
９  透過光検出器
１１，１２，１３  ダイクロイックミラー
６，ｌ４，１５  蛍光検出器
２１  分離用ダイクロイックミラー
２２  レンズ
２３  スリット
４０，１４０  波長選択ユニット
４１，１４１，１４２，１４３  バンドパスフィルタ
８０  コンピュータ
９１  結像レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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