(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩の溶液を、その表面に金属イオンを捕捉可能な基が導入され、かつ、分離するために適当な大きさ又は特性を有する担体と接触させて金属イオンを除去したことを特徴とする、アルカリ性フォスファターゼに対する酵素基質。
【請求項２】
乾燥されていることを特徴とする請求項１に記載の酵素基質。
【請求項３】
４−メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩の溶液を、その表面に金属イオンを捕捉可能な基が導入され、かつ、分離するために適当な大きさ又は特性を有する担体と接触させて金属イオンを除去することを特徴とする、アルカリ性フォスファターゼに対する酵素基質の製造法。
【請求項４】
４−メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩の溶液を、その表面に金属イオンを捕捉可能な基が導入され、かつ、分離するために適当な大きさ又は特性を有する担体と接触させて金属イオンを除去した後、乾燥することを特徴とする請求項３に記載の酵素基質の製造法。
【請求項５】
４−メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩の溶液を、その表面に金属イオンを捕捉可能な基が導入され、かつ、分離するために適当な大きさ又は特性を有する担体と接触させて金属イオンを除去したアルカリ性フォスファターゼに対する酵素基質を含んでなる、アルカリ性フォスファターゼの酵素活性測定用の試薬キット。
【請求項６】
前記アルカリ性フォスファターゼに対する酵素基質が乾燥されていることを特徴とする請求項５に記載の試薬キット。
【請求項７】
前記試薬キットは、更に乾燥されたアルカリ性フォスファターゼに対する酵素基質を溶解するための、その表面に金属イオンを捕捉可能な基が導入され、かつ、分離するために適当な大きさ又は特性を有する担体と接触させて金属イオンを除去した水溶液を含むことを特徴とする請求項６に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、改良された酵素基質、改良された酵素基質の製造法更には改良された酵素基質を含んでなる、酵素活性測定用の試薬キットに関するものであり、例えば酵素免疫測定方法等に使用可能な、安定性の向上した、優れた酵素基質等を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、血清、尿等の生体試料中の微量蛋白質等の含有量等は、抗体や抗原を利用した酵素免疫測定を実施することで知ることが可能である。即ち、例えばサンドイッチ法と呼ばれる方法においては、測定されるべき蛋白質等に対する固相化モノクローナル抗体（固相化抗体）と、測定されるべき蛋白質等に対する、前記モノクローナル抗体とは異なるモノクローナル抗体であって酵素と結合させた抗体（標識抗体）とを使用し、測定されるべき蛋白質等の量に相関した（固相化抗体−蛋白質等−標識抗体）とのサンドイッチ複合体を形成させ、このようなサンドイッチ複合体を形成していない標識抗体を分離した後、サンドイッチ複合体中の酵素量をその活性を基に測定して前記測定されるべき蛋白質等の量を推定するのである。
【０００３】
酵素反応に使用する酵素基質は、溶液として又は凍結乾燥した粉末状態で提供されることが多い。実際に酵素反応を行うに際しては、この溶液を希釈又は希釈することなしに使用し、或いは粉末に水等を加えて溶液としてから使用するが、提供された溶液や粉末状態の酵素基質が劣化していた場合、再現性等、酵素活性の測定結果に与える影響は大きい。従って、酵素基質を提供する側から言えば、より長時間に渡って安定で酵素との反応性等が変化しない酵素基質を提供することが必要である。
【０００４】
以上に説明した酵素免疫測定では、酵素は目的とする抗原等を測定するための標識として使用されるが、このような場合以外にも、例えば体液中の酵素含有量を、その酵素活性を測定することで知る方法も頻繁に実施されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
例えば特開平２−１８８５７８号公報には、酵素基質をアルカリ条件下におくことで安定化させることが記載されている。しかし、各種酵素には活性発現に際して最適ｐＨが存在するため、このようにアルカリ条件下で安定化された酵素基質をそのまま使用した場合、当該ｐＨが活性を測定しようとする酵素の最適ｐＨと一致しない場合には測定されるべき酵素活性自体が小さくなってしまい、測定精度が低下するという課題を生じる。一方、このようにアルカリ条件下で安定化された酵素溶液のｐＨを酵素の最適ｐＨに調整することも可能ではあるが、酵素活性測定に先立ってｐＨ調整という工程が付加されることになる。
【０００６】
また例えば米国特第５１４３８２５号公報には、酵素基質溶液へＥＤＴＡやＥＧＴＡ等の金属キレート剤を添加することで、酵素溶液の安定化させることが記載されている。しかし、例えば免疫測定に頻繁に使用されるアルカリ性フォスファターゼ等の、その活性の発現に金属が必要とされる酵素の場合、キレート剤が共存下では酵素活性が阻害される恐れもあり、使用に先立ってキレート剤を除去する等の操作が付加されることになる。
【０００７】
前述のように、酵素基質を凍結乾燥等することにより、溶液として保存等する場合に比べて安定性を向上させることが可能である。しかし、このような凍結乾燥処理を行う場合であっても、より長期間、安定的に品質を保持し得る酵素基質が要求されている。また当然のことであるが、凍結乾燥等された酵素基質は使用に先立って適当な溶液に溶解されることが多く、溶解された後の保存安定性の良好なものが要求される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、より安定な酵素基質を提供すべく鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、金属イオン除去処理を施したことを特徴とする改良された酵素基質であり、好ましくは金属イオン除去処理を施したことを特徴とする、加水分解酵素の酵素基質である。本発明は、このような加水分解酵素の酵素基質の中でも特に、金属イオン除去処理を施したことを特徴とする、アルカリ性フォスファターゼに対する、例えば４−メチルウンベリフェロンリン酸、又はその塩に代表される酵素基質である。
【０００９】
また本発明は、酵素基質溶液を金属イオンを捕捉可能な担体と接触させて金属イオンを除去することを特徴とする改良された酵素基質の製造法であり、好ましくは加水分解酵素の酵素基質溶液を金属イオンを捕捉可能な担体と接触させて金属イオンを除去することを特徴とする改良された酵素基質の製造法である。本発明は、このような加水分解酵素の酵素基質の中でも特に、アルカリ性フォスファターゼに対する酵素基質溶液、例えば４−メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩溶液を金属イオンを捕捉可能な担体と接触させて金属イオンを除去することを特徴とする改良されたアルカリ性フォスファターゼに対する酵素基質の製造法である。
【００１０】
そして本発明は、金属イオン除去処理を施した酵素基質を含んでなる、酵素活性測定用の試薬キットであり、好ましくは金属イオン除去処理を施した加水分解酵素の酵素基質を含んでなる、加水分解酵素活性測定用の試薬キットである。本発明は、このような加水分解酵素の酵素基質の中でも特に、金属イオン除去処理を施したアルカリ性フォスファターゼに対する酵素基質、例えば４−メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩を含んでなる、アルカリ性フォスファターゼ活性測定用の試薬キットである。以下本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明における金属イオン除去処理は、酵素基質が非酵素的に加水分解され、保存中に品質などが劣化するの抑制する効果を有する。金属イオン除去処理は、種々の酵素に対する酵素基質を安定化することが可能であるが、中でも４−メチルウンベリフェロンリン酸又はその塩等、加水分解酵素であるアルカリ性フォスファターゼ等の酵素基質に対して効果的である。この事実は、加水分解酵素の基質が溶液中で非酵素的に加水分解され易い性質を有していることに起因するものと考えられる。
【００１２】
金属イオン除去処理は、例えば金属イオンを捕捉する機能を有するゲルや適当な担体等と接触させることで行うことができる。例えば、基質溶液を前記のようなゲルと接触させる等すれば良い。ゲルとの接触は、長期間の保存等に先立って行われることが好ましい。更に、例えば前記のようなゲルと接触させた後、凍結乾燥等を行えば、従来の凍結乾燥酵素基質以上に安定性の向上した基質を提供することが可能である。本発明の、凍結乾燥された粉末状の酵素基質を溶解するに際しては、金属イオン除去処理を施された溶液を使用することが特に好ましい。従って本発明が提供する、金属イオン除去処理を施され、乾燥された酵素基質を含んでなる試薬キットにおいては、金属イオン除去処理を施した水溶液を含むことが特に好ましい。
【００１３】
例えば金属イオンを捕捉するゲル等については、その表面に金属イオンを捕捉可能な基が導入され、かつ、処理の後に溶液から容易に分離するために適当な大きさ又は特性を有することが好ましい。より具体的には、適当なゲル等をカラムに充填し、基質溶液等をカラムを通過させたり、磁性を有するゲル等を使用し、これを基質溶液等と接触させた後、磁石等を使用して溶液から分離する等しても良い。カラムを使用する場合、使用するカラムの大きさ等については特別の制限はなく、処理するべき基質溶液等の量とゲルの金属イオン等除去能力を比較検討して適宜決定することができる。
【００１４】
本発明者の知見によれば、後の実施例からも明らかではあるが、金属イオン除去処理によって酵素基質の本来の機能である、対応する酵素との反応性という品質は変化することなく、即ち酵素活性の測定に影響を与えることはない。従って、このようにして製造された基質溶液又乾燥基質を、例えば酵素免疫測定法等の酵素活性測定用試薬キットの一構成試薬として使用することで、全体として高い品質を有する試薬キットを提供することが可能である。
【００１５】
【発明の効果】
本発明により、酵素基質の安定性を従来と比較して向上することが可能である。この結果、従来安定性を向上させるために凍結乾燥品として提供されていた酵素基質を、同等の安定性を達成しつつ溶液状態で提供することも可能である。従って本発明によれば、凍結乾燥のような煩雑で各工程での制御が厳しい操作を省くことも可能となる。むろん、本発明は製造された酵素基質溶液を凍結乾燥等することを排除するものではなく、凍結乾燥等を行って乾燥した場合であっても従来の酵素基質に比較して長期安定性を向上することが可能である。本発明は、特に４−メチルウンベリフェロンリン酸等の、酵素免疫測定法で頻繁に使用されるアルカリ性フォスファターゼの基質に対して効果的であり、酵素免疫測定の分野における試薬の長期安定性向上のためにも有効である。
【００１６】
本発明によれば、溶液状態の酵素基質であっても長期間安定的に保存することが可能である。これにより、酵素基質溶液を必要時に必要量調製して使用するという、不便さを解消することも可能である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１  ４ＭＵＰの加水分解速度に与える金属イオン等を除去する処理の効果
（酵素基質の製造）
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ナカライ化学（株）製）４．４６ｇ及びアジ化ナトリウム（ナカライ化学（株）製）１ｇを容器に秤りとり、これに精製水を加えて約９００ｍｌとした。この溶液をｐＨメーターでモニターしながら濃塩酸を加え、ｐＨ１０に調整した後、更に精製水を加え液量を１リットルにした。
【００１９】
以上のようにして調製した溶液に４−メチルウンベリフェロンリン酸（米国ＪＢＬ社製、以下４ＭＵＰという）２５６．２ｍｇ加え、１ｍＭの４ＭＵＰ溶液とした（以下この溶液をベース基質という）。ベース基質に対し鉄溶液（ナカライ化学（株）製）を最終濃度１０ｐｐｍとなるように添加し、対照溶液とした。
【００２０】
（金属イオン等除去カラムの調製）
キレートトヨパールゲル（東ソー（株）製）をガラス製カラム（バイオラッド製、エコノカラム、内径１．０ｃｍ）へ高さが１２．７ｃｍとなるように充填し、洗浄した。この後、上記で調製した対照溶液を０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速にて送液し、カラムを通過した溶液をカラム処理基質とした。
【００２１】
（基質の安定性の測定）
前記のようにして調製した溶液を４、２５、３５、４５℃の保温器へ入れ、一定時間毎に取り出し、蛍光分光光度計（日立Ｆ２０００型、１ｃｍガラス角セル使用）にて測定した。蛍光分光光度計による測定は、励起波長３６３ｎｍ（バンドパス５ｎｍ）、蛍光波長４４７ｎｍ（バンドパス５ｎｍ）で室温にて実施し、４ＭＵＰが加水分解されて生じる４ＭＵ濃度測定のため既知濃度の４ＭＵ（希釈液（０．１４Ｍリン酸緩衝液、０．１ＭＥＤＴＡ（ナカライ化学（株）製、２ナトリウム・２水和物）、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．１）により希釈系列を作成）を測定したものとの相対蛍光強度の比較にて計算した。
【００２２】
結果を図１〜図４に示す。これらの結果からは、（１）ベース基質と比較して対照溶液では４ＭＵの生成が多く、４ＭＵＰの加水分解がより速く進行すること、（２）４ＭＵＰの加水分解反応は温度が高くなるにつれ速まること、（３）カラム処理基質はベース血清と比較して４ＭＵの生成が同程度であり、対照溶液と比較すると４ＭＵの生成は極めて少ないこと、が分かる。
【００２３】
実施例２  ＴＳＨの酵素免疫測定（抗体固定化固相ビーズの調製）
ウォーターストランド法により得た平均直径１．４ｍｍ、平均長さ１．５ｍｍのエチレン−酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）ペレット（東ソー（株）製）を特願昭６１−３８２７９号公報に記載された方法に従って真球化し、フェライト（東ソー（株）製）熱融着させ、更にグリシジルメタアクリレート（ＧＭＡ）でポリマーコーティングした。得られたポリマーコーティングビーズを苛性ソーダ・メタノール溶液で処理して表面層のエポキシ基を開環させジオールにした。
【００２４】
以上のようにして得られたビーズに、以下に示すようにマウス抗ヒトＴＳＨ  （甲状腺刺激ホルモン）モノクローナル抗体（抗体１）を固相化した。まずビーズ１０００００個に対し、特願昭６１−３８２７９号公報に記載された方法に従って５００ｍｇのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：東京化成工業（株）製）を含む乾燥アセトン２５ｍｌと窒素雰囲気下、室温下で３０分間激しく撹拌したて活性化処理を行った。この活性化されたビーズを洗浄後、２．５ｍｇ／２０ｍｌのマウス抗ヒトＴＳＨモノクローナル抗体を加え、室温にて４時間振とうして抗体を粒子に結合させた。
【００２５】
ビーズを洗浄後、１．０％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えブロッキング処理を行った。
【００２６】
標識に用いる酵素として、ウシ小腸由来のアルカリ性フォスファターゼを使用した。
【００２７】
調製した抗体固相化ビーズを用いて、ヒトＴＳＨの酵素免疫測定を行なった。まず抗体固定化ビーズ１２個をプラスチック製カップに入れ、これに５０μｌの標識抗体を加えたものを用意した。これを下部に磁石を有する測定装置（ＡＩＡ−１２００、東ソー（株）製）にセットし、抗原溶液として、０又は４８μＩＵ／ｍｌ濃度のＴＳＨ溶液１００μｌを添加して酵素免疫反応を開始した。反応の条件は、ＴＳＨの抗原抗体反応を進行させるために３７℃にて４０分間、下部の磁石を約８３ストローク／分にて振とうさせながらインキュベートし、その後、反応容器を洗浄液にて洗浄した（Ｂ／Ｆ分離）。
【００２８】
洗浄終了後、実施例１で調製した各種のアルカリ性ホスファターゼの基質である４ＭＵＰを含む溶液１００μｌを分注して酵素反応を実施した。反応は、３７℃にて３、６、１０分間、下部の磁石を約８３ストローク／分にて振とうさせながらインキュベートさせて実施した。酵素反応停止液である希釈液（０．１４Ｍリン酸緩衝液、０．１ＭＥＤＴＡ、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．１）５００μｌを添加して酵素反応を停止させた後、反応が停止された反応用液を希釈液にて希釈し、実施例１で実施した方法と同じ方法で蛍光量を測定した。
【００２９】
結果を図５及び図６に示す。その結果、ベース基質、対照溶液及びカラム処理基質についてほぼ同じ蛍光量（４ＭＵ量）が得られ、カラム処理によりこれらの溶液が酵素活性に影響を及ぼすことがないことが分かる。なお、これらの間で測定結果に差が生じていないのは、基質溶液調製後、あまり時間が経過していないために安定性の差が表面化していないためである。
【００３０】
これらのことから、酵素免疫測定等における酵素活性の測定については、酵素基質中の金属イオンを除去する処理を施すことにより、最適な酵素活性測定、又は、酵素免疫測定に使用出来る酵素基質を提供できることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の実施例１の結果中、４℃の保温器に基質溶液を保存した場合の結果を示すものである。図中、横軸は前記保温器での保存時間を、縦軸は相対蛍光強度を示し、黒丸はベ−ス基質の、黒三角は対象溶液の、黒四角はカラム処理基質の結果をそれぞれ示す。
【図２】図２は本発明の実施例１の結果中、２５℃の保温器に基質溶液を保存した場合の結果を示すものである。図中、横軸は前記保温器での保存時間を、縦軸は相対蛍光強度を示し、黒丸はベ−ス基質の、黒三角は対象溶液の、黒四角はカラム処理基質の結果をそれぞれ示す。
【図３】図３は本発明の実施例１の結果中、３５℃の保温器に基質溶液を保存した場合の結果を示すものである。図中、横軸は前記保温器での保存時間を、縦軸は相対蛍光強度を示し、黒丸はベ−ス基質の、黒三角は対象溶液の、黒四角はカラム処理基質の結果をそれぞれ示す。
【図４】図４は本発明の実施例１の結果中、４５℃の保温器に基質溶液を保存した場合の結果を示すものである。図中、横軸は前記保温器での保存時間を、縦軸は相対蛍光強度を示し、黒丸はベ−ス基質の、黒三角は対象溶液の、黒四角はカラム処理基質の結果をそれぞれ示す。
【図５】図５は本発明の実施例２の結果中、０ＩＵ／ｍｌ濃度のＴＳＨ溶液についての結果を示すものである。図中、横軸は酵素反応時間を、縦軸は相対蛍光強度を示し、黒丸はベ−ス基質の、黒三角は対象溶液の、黒四角はカラム処理基質の結果をそれぞれ示す。
【図６】図６は本発明の実施例２の結果中、４８ＩＵ／ｍｌ濃度のＴＳＨ溶液についての結果を示すものである。図中、横軸は酵素反応時間を、縦軸は相対蛍光強度を示し、黒丸はベ−ス基質の、黒三角は対象溶液の、黒四角はカラム処理基質の結果をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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