(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を利用してアクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法であって、該微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した後にもニトリルヒドラターゼの活性を保持しているような該微生物の菌体または菌体処理物を水性媒体中でアクリロニトリルと接触させてアクリルアミドを生成させる反応の反応開始時または反応途中のアクリロニトリル濃度が水性媒体中でのアクリロニトリルの飽和濃度以上となるように反応液にアクリロニトリルを添加することを特徴とするアクリルアミドの製造方法。
【請求項２】
反応終了後の反応液中のアクリルアミド濃度が３０重量％以上となるようにアクリロニトリルを添加することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を利用してメタクリロニトリルからメタクリルアミドを製造する方法であって、該微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した後にもニトリルヒドラターゼの活性を保持しているような該微生物の菌体または菌体処理物を水性媒体中でメタクリロニトリルと接触させてメタクリルアミドを生成させる反応の反応開始時または反応途中のメタクリロニトリル濃度が水性媒体中でのメタクリロニトリルの飽和濃度以上となるように反応液にメタクリロニトリルを添加することを特徴とするメタクリルアミドの製造方法。
【請求項４】
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を利用してクロトンニトリルからクロトンアミドを製造する方法であって、該微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した後にもニトリルヒドラターゼの活性を保持しているような該微生物の菌体または菌体処理物を水性媒体中でクロトンニトリルと接触させてクロトンアミドを生成させる反応の反応開始時または反応途中のクロトンニトリル濃度が水性媒体中でのクロトンニトリルの飽和濃度以上となるように反応液にクロトンニトリルを添加することを特徴とするクロトンアミドの製造方法。
【請求項５】
微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した後にもニトリルヒドラターゼの活性を保持しているような該微生物が、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドコッッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属またはシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物であることを特徴とする請求項１から請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した後にもニトリルヒドラターゼの活性を保持しているような該微生物が、シュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila JCM3095）由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現させた遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項１から請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体またはその菌体処理物を用いて、水性媒体中でニトリル化合物より対応するアミド化合物を生成させる反応方法に関する。より詳細には、反応開始時または反応途中の該ニトリル化合物の濃度を水性媒体中での該ニトリル化合物の飽和濃度以上に設定することにより、効率的にニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見されている。該酵素、該酵素を含有する微生物の菌体またはその菌体処理物等を用いて水性媒体中でニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が知られている（特公昭６２−２１５１９）。ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法では、それまでの化学的な方法と比べて、ニトリル化合物の転化率及び選択率が高いメリットがある。しかし、その一方で、酵素反応の基質となるニトリル化合物や生成物であるアミド化合物は一般的に強い生物毒性を有する有機化合物であり、その反応系内の濃度が高くなるにつれて該酵素を急速に失活させることが従来より指摘されている。そのため、工業的にニトリル化合物からアミド化合物を製造するに際しては、反応系内のニトリル化合物及びアミド化合物の濃度を低く保つことにより、ニトリルヒドラターゼ活性を安定に保持して反応を円滑に進行させることが重要であると考えられてきた。
【０００３】
一例を挙げると、ニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に製造する方法として、長沢・山田の報文（遺伝、別冊１号、３６頁から４５頁、１９８８年３月）が知られている。該報文中（３８頁、右段、下から８行目）には、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法について、「静止菌体を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で５〜１５℃、ｐＨ７．０付近でアクリロニトリルと反応させる。このとき、高濃度のアクリロニトリルはニトリルヒドラターゼ活性を阻害するので反応の進行に伴い経時的に分割添加していく」と記載されている。
【０００４】
特公昭５６−３８１１８号公報には、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルを基質とする該水和反応を氷点から１５℃までの低温下で行わせる方法が開示されているが、その際の基質濃度について、「本酵素反応においては基質は反応系内おいて常に溶解状態となるように加えることが適当である」と記載されている。さらに、「回分法による場合には、通常フィーディング方式がとられるが、前記固定化菌体を含む水性懸濁液に温度を氷点〜１５℃に保ちつつアクリロニトリルまたはメタクリロニトリルを撹拌下に滴下すればよい。」と記載されており、ニトリル化合物の分割添加の必要性が示されている。
【０００５】
特公昭５７−１２３４号では、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルよりアクリルアミドまたはメタクリルアミドを連続的に製造するに際して、ニトリル化合物の濃度を反応混合物に対して溶解する範囲内の量で連続的に供給する方法が開示されており、当該公報においてもニトリル化合物の濃度を低くコントロールすることの重要性が示されている。
【０００６】
ニトリルヒドラターゼを用いて水性媒体中でニトリル化合物を水和させてアミド化合物を製造する場合、反応の進行と共に生成したアミド化合物は水性媒体中に蓄積し続けてゆく。生成するアミド化合物の最大の濃度は、個々の微生物由来のニトリルヒドラターゼの性質と反応温度により決定される。すなわち、その反応温度において該酵素とアミド化合物を接触させた場合に、該酵素が直ちに失活してしまうアミド化合物濃度の下限値以上には、反応液中のアミド化合物の濃度は高くなることはない。尚、今後、このアミド化合物の濃度を限界のアミド化合物濃度と記す。
【０００７】
前述の長沢・山田の報文では、「４０％にも達するアクリルアミドの生産は現在の化学的方法によっては不可能とされ、ここにアクリルアミドの工業的製法としての酵素法の有効性が強く示唆された。」とある（３９頁、左段、上から２行目）。このように、工業的には、反応終了時のアミド化合物の濃度が高いことが重要であり、この限界のアミド化合物濃度が高いニトリルヒドラターゼが有用である。
【０００８】
反応液中のニトリル化合物濃度を低くコントロールして反応を行わせた場合、ニトリルヒドラターゼがニトリル化合物及びアミド化合物と接触する時間が相対的に長くなり、限界のアミド化合物濃度までアミド化合物濃度を蓄積させるためには、相対的に反応系内のニトリルヒドラターゼ活性を多くする必要がある。酵素使用量の増大は、工業的なアミド化合物の製造にとって、コスト面から不利になるので、反応液中のニトリル化合物濃度を低くコントロールする反応方法は、必ずしも効率的な反応方法とは言えない。
【０００９】
ところで、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌株は、アミド化合物を対応するカルボン酸化合物に水和する酵素であるアミダーゼを有していることがほとんどである。このため、該微生物菌株を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を生成させた場合、該アミダーゼによって対応するカルボン酸化合物が副成することが知られている。これを避けるためには、アミダーゼ活性を有していない変異微生物菌株を取得したり、アミダーゼ活性が相対的に低くなるような微生物菌体の調製方法を工夫したりする必要があった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、微生物を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造するより効率的な方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の目的はニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を利用してニトリル化合物から対応するアミドを製造する方法において、より少ない菌体量でより高いアミド濃度の反応液を得ることにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述の限界のアミド化合物濃度がある程度以上に高いニトリルヒドラターゼは対応するニトリル化合物に対する耐性も高いことを見出した。そしてそのようなアミド化合物に対する耐性がある程度以上に高いニトリルヒドラターゼを有する微生物の菌体またはその菌体処理物を利用してニトリル化合物から対応するアミドを生成する反応を行うと、その反応液中では、アクリロニトリルやメタクリロニトリル等の生物毒性の強いニトリル化合物による該酵素の失活は急速には進まず、水性媒体中の該ニトリル化合物の濃度が高くなるにつれて該酵素の反応速度が相対的に増加することが判明した。即ち、従来より行われていた反応系内のニトリル化合物の濃度を常に低く制御する必要のない、水性媒体中でのニトリル化合物の飽和濃度以上となるように反応液にアクリロニトリルを添加する反応方法が新たに見出された。
【００１３】
そして、本発明者らによる検討の結果、新たに見いだされた反応方法によれば、同じ酵素量（活性量）を使用した場合に従来の方法に比してより短時間で該ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換できること、より少量の酵素量（活性量）でより高い濃度のアミド化合物水溶液を得ることができることが確認された。
本発明者らは以上の知見を基に本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を利用してニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法であって、該微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した後にもニトリルヒドラターゼの活性を保持しているような該微生物の菌体または菌体処理物を、水性媒体中でニトリル化合物と接触させてアミド化合物を生成させる反応の反応開始時または反応途中のニトリル化合物濃度が水性媒体中でのニトリル化合物の飽和濃度以上となるように反応液にニトリル化合物を添加することを特徴とするアミド化合物の製造方法を提供するものである。
【００１５】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体または菌体処理物を用いて、水性媒体中でニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造するに際して、ニトリル化合物より対応するアミド化合物を生成する反応の開始時またはその途中において、水性媒体中での該ニトリル化合物の飽和濃度以上に該ニトリル化合物を反応系内に添加することにより、効率的かつ短時間でニトリル化合物から対応するアミド化合物を高濃度で生成することが可能となる。
【００１６】
【発明実施の形態】
以下、本発明の詳細について概説する。
本発明におけるニトリル化合物は炭素数が２〜８のニトリル化合物である。その中でも、特にアクリロニトリル、メタクリロニトリル、クロトンニトリルを好適な例として挙げることができる。
【００１７】
本発明におけるニトリルヒドラターゼとは、微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中でニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体を１０℃にて６０分間処理した後にも該ニトリルヒドラターゼの活性が保持されているニトリルヒドラターゼである。
【００１８】
種々の微生物のニトリルヒドラタアーゼのアミド化合物に対する耐性は様々である。アミド化合物としてアクリルアミドを例にとると、ニトリルヒドラターゼをアクリルアミド水溶液中で１０℃にて処理する場合、１０重量％のアクリルアミド水溶液中で６０分後に完全に失活してしまうニトリルヒドラターゼがある一方、５０重量％のアクリルアミド水溶液中で６０分間処理しても失活しないニトリルヒドラターゼがある。このように、前述したニトリルヒドラターゼの限界のアクリルアミド濃度は個々のニトリルヒドラターゼによって異なっている。
【００１９】
工業的には、反応終了時のアミド化合物の濃度が高いことが重要であり、アクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した後に失活しない（活性を保持している）アクリルアミド濃度が３０重量％以上のニトリルヒドラターゼの利用が特に有効である。また、工業的にアミド化合物を生産する場合、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を反応に供することがコスト面から有利である。
【００２０】
即ち、本発明においては、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体をアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した場合に、ニトリルヒドラターゼの活性が保持されるアクリルアミド濃度の上限が３０重量％以上のニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を用いることが好ましい。
【００２１】
本発明における微生物とは、該微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理してもニトリルヒドラターゼの活性を保持している微生物である。具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物を好適な例として挙げることができる。
【００２２】
また、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も本発明でいうニトリルヒドラターゼを産生する微生物に含まれる。尚、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も本発明でいうニトリルヒドラターゼを産生する微生物に含まれる。
【００２３】
本発明における微生物を本発明の製造方法に使用するに際しては、該微生物の菌体あるいは菌体処理物を用いる。菌体は、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。たとえば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させ、続いて、該微生物を遠心分離によって培養液より分離・回収して得る方法が挙げられる。
【００２４】
また、本発明における微生物の菌体処理物は、上記微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られれる後分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニトリルヒドラターゼの活性を有している限りは本発明の菌体処理物に相当する。
【００２５】
本発明における微生物の菌体または菌体処理物は、回分反応に供することもできるし、連続反応に供することもできる。また、懸濁床として用いてもよいし固定床として用いてもよい。その際の反応液中での該微生物の菌体または菌体処理物の濃度は、水性媒体とニトリル化合物の混合に支障をきたさない限り特に制限はされるものではない。
【００２６】
本発明における水性媒体とは、水、または、リン酸塩等の緩衝剤・硫酸塩や炭酸塩等の無機塩・アルカリ金属の水酸化物・アミド化合物等を適当な濃度で溶解させた水溶液を示す。
【００２７】
本発明においては、水性媒体中のニトリル化合物が反応の進行に伴って消費されると同時にニトリル相より供給されることにより、その濃度が飽和濃度前後に相対的に長時間維持されることが重要である。このため、回分反応または連続反応いずれの場合でも、必要なニトリル化合物の全量を反応開始時に一括して添加するか、反応途中における水性媒体中でのニトリル化合物濃度が飽和濃度以上に保たれるようにニトリル化合物を逐次添加することが好ましい。また、回転翼やラインミキサー等の適当な混合装置を使用して、静置下において二相に分離する水性媒体相とニトリル相を十分に混和させることも重要である。
【００２８】
ニトリル化合物を反応開始時に一括添加する場合のニトリル化合物の濃度の下限は、反応開始時において該ニトリル化合物の飽和濃度以上であればよい。一方、その濃度の上限は特に限定されるものではなく、想定する反応終了時のアミド化合物濃度およびニトリル化合物濃度により任意に決定すればよい。また、未反応のニトリル化合物は、反応後に蒸留等の手段により反応液より除去することもできる。よって、想定する反応終了時のアミド化合物濃度に達した時点でもニトリル化合物が過剰となるようにニトリル化合物を添加することもできる。
【００２９】
具体的には、アクリロニトリルがニトリル化合物である場合、水に対する本化合物の飽和濃度は約７重量％であるので、約７重量％以上、５０重量％以下の範囲が好適である。また、メタクリロニトリルまたはクロトンニトリルがニトリル化合物である場合、水に対するこれらの化合物の飽和濃度は約２重量％であるので、約２重量％以上５０重量％以下の範囲が好適である。
【００３０】
本発明における反応は、一般的には常圧下で行われるが、水性媒体中へのニトリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。また、反応温度に関しては、水性媒体の氷点以上であれば特に制限されないが、好ましくは０℃から５０℃、より好ましくは１０℃から３０℃の範囲内で行われる。一方、ｐＨは、ニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限されないが、好ましくはｐＨ６からｐＨ１０、より好ましくはｐＨ７からｐＨ９の範囲内である。
【００３１】
本発明の方法におけるアミド化合物を生成する反応においては、ニトリルヒドラターゼが直ちに失活するようなことはなく、むしろニトリル水和反応は良好に進行する。そればかりか、水性媒体相中のニトリル化合物は、反応の進行に伴って消費されると同時にニトリル相より供給されるため、その濃度は常に飽和濃度付近に維持される。このため、その反応温度における最大の反応速度またはそれに近い速度でニトリル水和反応が進行するので、相対的に短時間かつ効率的に該ニトリル化合物から対応するアミド化合物が生成することになる。
【００３２】
また、ニトリル化合物を水性媒体中での飽和濃度以上に添加した後、反応の進行に伴って反応系内のニトリル化合物濃度は徐々に低下し、水性媒体中の飽和濃度以下になる。これにより反応速度も徐々に低下するが、その時点までは最大の反応速度またはそれに近い速度でニトリル水和反応が進行するので、実質的に短時間かつ効率的に該ニトリル化合物から対応するアミド化合物が生成することになる。
【００３３】
さらに、本発明の製造方法によれば、水性媒体中の該ニトリル化合物の濃度を高くすることによって、微生物菌体中のアミダーゼによる対応するカルボン酸化合物の生成が相対的に抑制されるという副次的な効果を得ることもできる。
【００３４】
得られたアミド化合物は、反応液より遠心分離等の通常の公知の方法により菌体または菌体処理物を分離した後、そのままの水溶液として利用してもよいし、膜濃縮やスプレードライ濃縮等の方法により濃縮して結晶を得ても良い。また、菌体または菌体処理物を分離した後、活性炭、イオン交換樹脂、イオン交換膜等も用いて着色物質等の不純物を除去することにより、アミド化合物の純度をさらに高めることもできる。
【００３５】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。
尚、各実施例及び比較例におけるＨＰＬＣ分析は、カラムとして日本分光製のＦｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−５（２５０×４．６φｍｍ）を用い、４体積％のアセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用した。また、アクリルアミド、メタクリルアミド及びクロトンアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出し、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリロニトリル及びクロトンニトリルは２１０ｎｍの吸光度により検出した。
【００３６】
［実施例１］アクリルアミド濃度耐性の測定（１）
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５）を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００３７】
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【００３８】
該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルの終濃度が１４重量％になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。
【００３９】
続いて、同じ該湿菌体５０ｍｇを４０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩を含む３０重量％のアクリルアミド水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、１０℃にてゆるやかにかくはんさせながら６０分間接触させた。この後、遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを懸濁液より分離した。続いて、５０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行う操作を２回繰り返すことにより該菌体を洗浄した。洗浄した該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルの終濃度が１４重量％になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。
【００４０】
３０重量％のアクリルアミド水溶液と接触させる前の反応速度を１００％とし、１０℃にて６０分間接触させた後の反応速度を相対値として比較した。その結果、相対値は７０％であった。すなわち、活性残存率は７０％であった。
【００４１】
［実施例２］ニトリル化合物の濃度と反応速度の比較
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルが第１表(表１)に示した終濃度になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出し、反応開始時のアクリロニトリル濃度が１重量％の場合の反応速度を１００％として、それぞれのアクリロニトリル濃度場合の相対値を相対反応速度として比較した（第１表(表１)及び第１図(図１)）。
【００４２】
【表１】
0003827420.tif 000003
【００４３】
［実施例３］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（１）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを３６ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応した。反応開始から８時間後にＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝３５．０重量％）しており、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００４４】
［実施例４］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（２）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１２ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。さらに反応開始と同時にアクリロニトリルを１時間当たり１２ｇの速度で２時間添加し、アクリロニトリルを合わせて３６ｇ添加した。反応開始から８時間後に、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝３５．０重量％）しており、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００４５】
［比較例１］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（１）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１時間当たり２ｇの速度で１８時間添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は１７．４重量％であり、アクリロニトリル濃度は０．８重量％であった。すなわち、転化率は９４％であった。さらに、反応開始から２６時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は３３．０重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．９重量％であった。すなわち、転化率は９３％であった。
【００４６】
［比較例２］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（２）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１時間当たり１．２ｇの速度で３０時間添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中のアクリルアミド濃度は１０．３重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．０重量％であった。すなわち、転化率は８８％であった。さらに、反応開始から３８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は３２．６重量％であり、アクリロニトリル濃度は２．１重量％であった。すなわち、転化率は９２％であった。
【００４７】
［実施例５］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（３）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体３．０ｇを９７．０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にメタクリロニトリルを８．６ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から２４時間後に、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはメタクリルアミドのみが存在（濃度＝１０．０重量％）しており、メタクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００４８】
［実施例６］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（４）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にクロトンニトリル（但し、ｃｉｓ体とｔｒａｎｓ体の混合物）を１８．７ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から２４時間後に析出したクロトンアミドの結晶を３０℃にて完全に溶解した後に、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはクロトンアミド（但し、ｃｉｓ体とｔｒａｎｓ体の混合物）のみが存在（濃度＝２０．０重量％）しており、クロトンニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００４９】
［実施例７］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（５）
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に特開平０８−５６６８４号記載のシュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila ）（ＪＣＭ３０９５）を一白菌耳植菌し、５０℃・１３０ｒｐｍにて７２時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００５０】
0003827420.tif 000004
【００５１】
該湿菌体１０．０ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを３６ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝３５．０重量％）しており、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００５２】
［実施例８］アクリルアミド濃度耐性の測定（２）
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に特公平０６−５５１４８号記載のロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８として、前記の寄託機関に特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されており、万人に対し請求により分譲される）を一白菌耳植菌し、３０℃・１３０ｒｐｍにて７２時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００５３】
0003827420.tif 000005
【００５４】
該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルの終濃度が１４重量％になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。
【００５５】
続いて、同じ該湿菌体５０ｍｇを４０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩を含む３０重量％のアクリルアミド水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、１０℃にてゆるやかにかくはんさせながら６０分間接触させた。この後、遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを懸濁液より分離した。続いて、５０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行う操作を２回繰り返すことにより該菌体を洗浄した。洗浄した該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルの終濃度が１４重量％になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。
【００５６】
３０重量％のアクリルアミド水溶液と接触させる前の反応速度を１００％とし、１０℃にて６０分間接触させた後の反応速度を相対値として比較した。その結果、相対値は９５％であった。すなわち、活性残存率は９５％であった。
【００５７】
［実施例９］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（６）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製した。該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを６０ｇ一括添加して、２０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝５０．０重量％）しており、アクリロニトリルおよびアクリル酸は認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００５８】
［実施例１０］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（７）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製した。該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを６０ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は４７．７重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．９重量％であった。すなわち、転化率は９５％であった。さらに、反応開始から１２時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は５０．０重量％、アクリル酸濃度は０．０５重量％であり、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００５９】
［実施例１１］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（８）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製した。該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを２０ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。さらに反応開始と同時にアクリロニトリルを１時間当たり２０ｇの速度で２時間添加し、アクリロニトリルを合わせて６０ｇ添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は４６．７重量％であり、アクリロニトリル濃度は２．６重量％であった。すなわち、転化率は９３％であった。さらに、反応開始から１２時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は５０．０重量％、アクリル酸濃度は０．０５重量％であり、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００６０】
［比較例３］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（３）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製し、該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１時間当たり３ｇの速度で２０時間添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中のアクリルアミド濃度は２３．６重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．７重量％であった。すなわち、転化率は９１％であった。さらに、反応開始から３２時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は４６．１重量％、アクリル酸濃度は０．２重量％であり、アクリロニトリル濃度は２．９重量％であった。すなわち、転化率は９２％であった。
【００６１】
［比較例４］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（４）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製し、該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１時間当たり２ｇの速度で３０時間添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は１６．４重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．５重量％であった。すなわち、転化率は８９％であった。さらに、反応開始から４２時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は４３．５重量％、アクリル酸濃度は０．３重量％であり、アクリロニトリル濃度は４．８重量％であった。すなわち、転化率は８７％であった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来に比べより短期間内に少量の酵素量で高ニトリル濃度の反応液を得ることが可能であり、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率的に製造することが可能となる。しかも、本発明の方法によれば、ニトリル化合物に対応するカルボン酸化合物の副成も抑制される。そのため、本発明の方法は、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物を利用した工業的なアミド化合物の生産にとって極めて有用である。
【００６３】
【配列表】
【００６４】
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【００６５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】反応開始時のアクリロニトリル濃度に対する反応速度を比較した図である。横軸は反応開始時のアクリロニトリル濃度（重量％）、縦軸は相対反応速度（％）を表している。
【図１】
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