(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモシステインチオラクトンに、チオエステルを立体選択的に不斉加水分解する能力を有し、フザリウム属に属する微生物及びアグロバクテリウム属に属する微生物から選ばれる微生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させて、立体配置がＬである光学活性体を加水分解した後、反応液よりＬ−ホモシステインを回収することを特徴とするＬ−ホモシステインの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−ホモシステインの製造方法に関し、詳細には医薬、農薬の重要な合成中間体であるＬ−ホモシステインを、微生物反応を利用して製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
Ｌ−ホモシステインは、医薬、農薬の分野における重要な合成中間体である。これまでに知られているＬ−ホモシステインの製造方法は、Ｌ−メチオニンを原料とする化学的な合成方法のみであった。しかしながらこの方法は、高価なＬ−メチオニンを用いるなど、工業的には不利であった。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題点について検討を重ねた結果、特定の微生物の作用によりホモシステインチオラクトンを立体選択的に加水分解し、Ｌ−ホモシステインが製造できることを見出し、本発明を完成するにいたった。
即ち、本発明はホモシステインチオラクトンに、チオエステルを立体選択的に不斉加水分解する能力を有し、フザリウム属に属する微生物及びアグロバクテリウム属に属する微生物から選ばれる微生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させて、立体配置がＬである光学活性体を加水分解した後、反応液よりＬ−ホモシステインを回収することを特徴とするＬ−ホモシステインの製造方法に存する。
【０００４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明においては、原料としてホモシステインチオラクトンを用い、これに微生物の菌体又は該菌体処理物を作用させて、Ｌ−ホモシステインを製造する。
本発明において使用する微生物は、ホモシステインチオラクトンを立体選択的に加水分解する能力を有するものであればいずれを用いても良いが、好ましい例としては例えばフザリウム属を挙げることが出来る。
【０００５】
また、好ましい種としては例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・パリドロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍ）またはアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）などを挙げることが出来る。
上記の微生物の具体的な菌株としては、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＩＦＯ３０７０１、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）ＩＦＯ９９５５、フザリウム・パリドロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐａｌｌｉｄｏｒｏｓｅｕｍ）ＩＦＯ３０２００の菌株またはアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＭＣＩ３６２４を挙げることが出来る。
【０００６】
上記微生物は、野生株、変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
また、上記の菌株のうちＩＦＯ３０７０１、ＩＦＯ９９５５、ＩＦＯ３０２００は公知の菌株であり、（財）発酵研究所（ＩＦＯ）から容易に入手することが出来る。
ＭＣＩ３６２４株は、本発明者らにより天然土壌から分離された細菌であり、工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６９３９として寄託されている。
ＭＣＩ３６２４株の菌学的性質は以下の通りである。
【０００７】
ＭＣＩ３６２４株の同定結果
１．形態的性質
（１）細胞の形              桿状
（２）細胞の多形性          なし
（３）運動性                なし
（４）胞子の有無            なし
【０００８】
２．培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養      ３０℃  １〜２日間培養後  円形、半レンズ状、うす黄、不透明、光沢のコロニーを形成。コロニー表面は平滑
（２）肉汁液体培養          混濁が見られるが、液面における膜の形成はない
（３）肉汁ゼラチン穿刺培養  ゼラチン液化なし
（４）リトマス・ミルク      弱いアルカリ
【０００９】
３．生理学的性質
0003743172.tif 000002
0003743172.tif 000003
【００１０】
４．化学分類学的性質
（１）主要なイソプレノイドキノン    ユビキノン  Ｑ１０
（２）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量          ５９．７  モル％
【００１１】
５．分類学的考察
（１）属の同定
本菌株ＭＣＩ３６２４株は１）グラム陰性桿菌、２）絶対好気性、３）芽胞を形成しない、４）運動性なし、５）Ｏ−Ｆテストは酸化型、６）硝酸塩還元能及び脱窒素能を有する、７）硫化水素を生成しない、８）主要なイソプレノイドキノンはユビキノンＱ１０を有する、８）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は５９．７モル％などの特徴を持っている。これらの特徴から、本菌株はバージェイズマニュアル・システマティック・バクテリオロジー［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第１巻、２３４〜２５６頁（１９８４）に記載されているリゾビアシーエ科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に含まれる、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に帰属することが示唆された。
【００１２】
（２）種の同定
現在、１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列の解析結果から、アグロバクテリウム属とリゾビウム属は属レベルでまとまった菌群であることが判明している。従って本菌株の種を決定するため、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列（１４４６塩基）を決定した。得られた結果に基づいてデータベース検索を行ったところ、本菌株はアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に最も近縁であることが判明した。
【００１３】
インターナショナル  ジャーナル  オブ  システマティック  バクテリオロジー［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第４３巻、６９４−７０２頁（１９９３）によると、アグロバクテリウム属にはアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム  ラディオバクター（Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム  リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム  ビティス（Ａ．ｖｉｔｉｓ）及びアグロバクテリウムルビ（Ａ．ｒｕｂｉ）の５種が知られているが、アグロバクテリウム  ツメファシエンスとアグロバクテリウム  ラディオバクターは１６Ｓ  ｒＲＮＡの解析から同一種として統合され、アグロバクテリウム  ラディオバクターとなっている。従って本菌株はアグロバクテリウム  ラディオバクターと９９．６％の相同値を示し、他種（相同値９４．５〜９７．８％）より高い相同性を示した。さらに生理学的性質においても、１）３７℃での生育、２）クエン酸の資化性、３）エリスリトール及びアラビトールの資化性、４）硝酸塩の還元などの点で明らかに他種とは区別された。
以上の結果から、本菌株ＭＣＩ３６２４株をアグロバクテリウム  ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）と同定した。
【００１４】
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体及び／または菌体処理物として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体または菌体処理物から、ホモシステインチオラクトンに作用しこれをＬ−ホモシステインへ変換する能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００１５】
以下に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
本発明の製造方法において微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については定法通り行うことができる。本微生物の培養の為に用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、肉エキス、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトン、コーンスティープリカーその他が適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。更に、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドその他のビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。また、チオラクトンやラクトン類を添加することも有効である。培養は、好気的条件下に、ｐＨ約３〜８、温度約２０〜３５℃の適当な範囲に制御しつつ１５〜１００時間行う。
【００１６】
ホモシステインチオラクトンに上記微生物を作用させてＬ−ホモシステインを製造する方法として、本微生物を培養し、得られた菌体懸濁液にホモシステインチオラクトンを添加し反応させＬ−ホモシステインを得る方法、培地にホモシステインチオラクトンを添加し培養と反応を同時に行う方法、あるいは培養終了後、ホモシステインチオラクトンを添加して更に反応を行う方法等を用いることができる。反応温度は１５〜４０℃が好ましく、ｐＨ４〜１０の範囲である。ホモシステインチオラクトン濃度は０．１〜５０％の範囲が望ましく、必要ならばホモシステインチオラクトンは反応の間、追補添加される。また、必要に応じて金属イオンを添加することにより反応が促進される場合がある。
培養及び反応で得られたＬ−ホモシステインの採取方法としては晶析などの通常の分離・精製方法により行うことができる。
【００１７】
【実施例】
いかに実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
実施例１
グルコース  １０．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン  ５．０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５．０ｇ／Ｌ及びコーンスティープリカー  ５．０ｇ／Ｌ（ｐＨ６．０）の組成からなる液体培地５０ｍＬに、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）  ＩＦＯ３０７０１を接種し、２７℃で７２時間好気的に培養した。培養終了後、菌体を集め５０ｍＭ塩化カリウム水溶液で洗浄した。これに１０．０ｇ／Ｌのホモシステインチオラクトンを含む１００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を加え、全量を５０ｍＬとし３０℃で２４時間反応させた。反応終了時のホモシステイン生成蓄積量は６．５ｇ／Ｌであり、得られたＬ−ホモシステインの光学純度は６０％ｅ．ｅ．であった。
【００１８】
実施例２
第１表に示す微生物の菌体をそれぞれ、グルコース  １０．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン  ５．０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５．０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー５．０ｇ／Ｌ（ｐＨ６．０）の組成からなる液体培地５０ｍＬに接種し、２７℃で７２時間好気的に培養した。培養終了後、菌体を集め５０ｍＭ塩化カリウム水溶液で洗浄した。これに１０．０ｇ／Ｌのホモシステインチオラクトンを含む１００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を加え、全量を５０ｍＬとし３０℃で２４時間反応させた。得られた結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
第１表                                ホモシステイン  光学純度  絶対配置
微生物                                    （ｇ／Ｌ）（％ｅ．ｅ．）
フザリウム・ソラニＩＦＯ９９５５            ３．１      ５０      Ｌ
フザリウム・パリドロセウムＩＦＯ３０２００  ３．５      ４５      Ｌ
【００２０】
実施例３
ニュートリエントブロス  ８．０ｇ／ｌ、シュークロース  ５．０ｇ／ｌ、酵母エキス  １．０ｇ／ｌの組成からなる液体培地１０ｍｌに、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＭＣＩ３６２４を接種し、２８度で２４時間好気的に培養した。培養終了後、菌体を集め、０．８５％塩化ナトリウムで懸濁し菌体懸濁液０．８ｍｌを得た。この菌体懸濁液０．４ｍｌに２５０ｍＭのホモシステインチオラクトンを０．４ｍｌ、ｐＨ７．０の１Ｍリン酸緩衝液０．２ｍｌを加え、３７度で２４時間反応させた。反応終了時のホモシステインの蓄積量は５０ｍＭであり、得られたＬ−ホモシステインの光学純度は７９．６％ｅ．ｅ．であった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の微生物を用いたＬ−ホモシステインの製造方法は従来の方法に比べ安価な方法であることから、Ｌ−ホモシステインの工業的な生産を行う際に非常に有効である。