(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するアスペルギルス属に属する菌株由来の新規酒石酸エーテル化合物生成酵素。
（１）作用：エポキシこはく酸のエポキシ環に、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類(flavonoids)若しくはその類縁化合物のフェノール性水酸基が作用して、酒石酸残基が１又は２以上エーテル結合した酒石酸エーテル化合物を生成する反応を触媒する。
（２）基質特異性：エポキシこはく酸及びフェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物とを基質とし、それらに特異的に作用し、エポキシこはく酸が(±)−トランス−エポキシこはく酸((±)-trans-epoxysuccinic acid)であるとき、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類：イソフラボン類(isoflavones)、フラボン類(flavones)、フラボノール類(flavonols)、フラバノン類(flavanones)、ジハイドロフラボノール類(dihydroflavonols)、オーロン類(aurones)に、またフラボノイド類縁化合物：クマリン類(coumarins)、カルコン類(chalcones)、クマラノン類(coumaranones)、クロモン類(chromones)、ロテノイド類(rotenoids)によく作用する。
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：(±)−トランス−エポキシこはく酸とゲニステインを基質とした時、至適ｐＨは４．８−５．５であり、安定ｐＨ範囲は、３７℃、３０分間処理で、ｐＨ４．５−８．０である。
（４）Ｋｍ値：(±)−トランス−エポキシこはく酸とゲニステインを基質とした時、Ｋｍ値は、それぞれ２．５８×１０３Ｍと１．０４×１０３Ｍである。
（５）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は、約９３，０００。
【請求項２】
請求項１の新規酒石酸エーテル化合物生成酵素を、エポキシこはく酸及びフェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物との共存下で作用させて、酒石酸エーテル化合物を生成させることを特徴とする、酒石酸エーテル化合物の製造方法。
【請求項３】
エポキシこはく酸が、(±)−トランス−エポキシこはく酸であり、かつフェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物が、イソフラボン類、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、ジハイドロフラボノール類、オーロン類、クマリン類、カルコン類、クマラノン類、クロモン類、ロテノイド類である、請求項２記載の酒石酸エーテル化合物の製造方法。
【請求項４】
エポキシこはく酸のエポキシ環が、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類(但し、ダイゼイン、ゲニステイン及び８−ヒドロキシゲニステインを除く。)若しくはその類縁化合物のフェノール性水酸基と結合して酒石酸残基が１又は２以上エーテル結合してなる、新規酒石酸エーテル化合物。
【請求項５】
酒石酸エーテル化合物が、次の式（１）、（２）、（３）、（４）又は
（５）のいずれかで表される、請求項４記載の新規酒石酸エーテル化合物。
【化１】
0003815588.tif 000017
【化２】
0003815588.tif 000018
【化３】
0003815588.tif 000019
【化４】
0003815588.tif 000020
【化５】
0003815588.tif 000021
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品や機能性食品等として有用な、新規酒石酸エーテル化合物に関するものであり、さらに詳しくは、エポキシこはく酸のエポキシ環に、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物のフェノール性水酸基が作用して、エーテル結合した酒石酸エーテル化合物を生成する反応を触媒する、新規酒石酸エーテル化合物生成酵素、その酵素を用いた、酵素法による酒石酸エーテル化合物の製造法、並びに新規酒石酸エーテル化合物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、酒石酸エーテル化合物であって、イソフラボン誘導体である、2-hydroxy-3-[[3-(4-hydroxyphenyl)-4-oxe-4H-1-benzopyran-7-yl]oxy]- butanedioic acid（特開平9-110857号中の「イソフラボン誘導体Ａ」参照）、2-hydroxy-3-[[5-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-1-benzopyran-7-yl]oxy]-butanedioic acid（特開平9-110857号中の「イソフラボン誘導体Ｂ」参照）、及び2-[[5,8-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-1-benzopyran-7-yl]oxy]-3-hydroxy-butanedioic acid（特開平10-59956号中の「イソフラボン誘導体Ｃ」参照）は、潰瘍、アレルギー疾患の原因となるヒスタミンの生合成に関与するヒスチジン脱炭酸酵素（ＨＤＣ）に対し優れた阻害作用を示し、副作用の無い、医薬品や機能性食品等として大変有用であることが知られている。
【０００３】
従来、フラボノイド若しくはその類縁化合物の多くは、抗酸化作用、抗ＨＤＣ作用、エストロゲン様作用、抗腫瘍作用など多岐にわたる生理活性を有するにも拘らず、水に難溶性であることから、必ずしも生体内で十分にその効果を発現しているとは言えなかった。
【０００４】
フラボノイド若しくはその類縁化合物の配糖体は、水溶性が高いものの、その構造が不安定である。一方、フラボノイドの酒石酸エーテル化合物若しくはフラボノイド類縁化合物の酒石酸エーテル化合物は、構造上非常に安定な化合物である。
【０００５】
この様なことから、水溶性が高く、構造上も安定な酒石酸エーテル化合物、例えばフラボノイド酒石酸エーテル化合物及びその類縁化合物の酒石酸エーテル化合物を得ることは、極めて重要な意義を有する。従来、エーテル化合物の製造は、置換反応による合成、付加反応による合成、離脱反応や縮合反応による合成、酸化反応による合成、還元反応による合成などが行われ、それらはいずれも化学的な反応によるものであり、反応条件や反応試薬などの点で複雑な操作や工程を経たり、また、特別な合成設備を必要とする等の欠点を有している。一方、酵素法により、安価でしかも容易に酒石酸エーテル化合物を生成する方法は、これまで全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来の化学的な反応により酒石酸エーテル化合物を合成する方法が有する欠点を克服し、医薬品や機能性食品等として有用な酒石酸エーテル化合物を生成し得る新規酵素を見つけだすこと、そして該酵素を用いて、酵素法により、水溶性に優れ、構造的に安定な酒石酸エーテル化合物を、安価に、精度よく、しかも容易に製造する方法、並びに新規な酒石酸エーテル化合物を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物が、エポキシこはく酸のエポキシ環にフェノ−ル性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物のフェノール性水酸基と反応し、酒石酸エーテル化合物を生成する、新規な酵素を生産すること、そしてこの酵素を用いれば、種々の酒石酸エーテル化合物を、酵素的に容易に生成し得ることを見出し、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、エポキシこはく酸のエポキシ環に、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物のフェノール性水酸基とが作用して、酒石酸残基が１又は２以上エーテル結合した酒石酸エーテル化合物を生成する反応を触媒する、新規酒石酸エーテル化合物生成酵素であり、また本発明は、前記の新規酒石酸エーテル化合物生成酵素を、エポキシこはく酸及びフェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物との共存下で作用させて、酒石酸エーテル化合物を生成させることを特徴とする、酒石酸エーテル化合物の製造方法であり、さらにまた、本発明は、エポキシこはく酸のエポキシ環が、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物のフェノール性水酸基と結合して酒石酸残基が１又は２以上エーテル結合してなる、新規酒石酸エーテル化合物である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
まず、本発明の新規酒石酸エーテル化合物生成酵素（以下「本酵素」という）の理化学的性質は下記のとおりである。
（１）作用：エポキシこはく酸のエポキシ環に、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物のフェノール性水酸基が作用して、酒石酸残基が１又は２以上エーテル結合した酒石酸エーテル化合物を生成する反応を触媒する。
【００１０】
本発明でいうエポキシこはく酸とは、具体的には、例えば(±)−トランス−エポキシこはく酸、シス−エポキシこはく酸等をいう。また、本発明でいうフェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはフラボノイド類縁化合物化合物とは、フェノール性水酸基を有するそれら化合物であればどのようなものでもよく、例えばフェノール性水酸基を有しているフラボノイド類である、イソフラボン類、フラボン類、フラボノ−ル類、フラバノン類、ジハイドロフラボノール類、オーロン類等を、またフェノール性水酸基を有するフラボノイド類縁化合物としては、クマリン類、カルコン類、クマラノン類、クロモン類、ロテノイド類等をいう。具体的にはイソフラボン類としては、例えばダイゼイン（daidzein）、ゲニステイン（genistein）、4',6,7-trihydroxyisoflavone、biochaninＡ等が、またフラボン類としては、例えばアピゲニン（apigenin）、baicalein等が、またフラボノール類としては、例えばkaempferol、quercetin等が、またフラバノン 類としは、例えばナリンゲニン（naringenin）、hesperetin等が、またジハイドロフラボノール類としては、例えば(+)-taxifolin、phellamurin等が、またオーロン類としては、例えばsulfuretin、leptosidin等が、またクマリン類としては、例えば5,7-dihydroxy-4-methylcoumarin、aesculetin等が、また、カルコン類としては、例えば2',4',6',3,4-pentahydroxychalcone等が、またクマラノン類としては、例えば、6-hydroxy-2H-benzofuran-3-one、6-hydroxy-butylphthalide等が、クロモン類としては、例えばeugenin、eugenitin等が、さらにまたロテノイド類としては、例えば、courmestrol、maackiain等が挙げられる。
【００１１】
そして、エポキシこはく酸と、前記の各種フェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはフラボノイド類縁化合物を共存させることにより、エポキシこはく酸のエポキシ環が、フェノール性水酸基を１又は２以上有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物のそれらのフェノール性水酸基に作用して、酒石酸残基が１又は２以上エーテル結合した酒石酸エーテル化合物を生成する。このように、各種フェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはフラボノイド類縁化合物に作用させることで、それぞれ異なった各種の酒石酸エーテル化合物が生成される。例えば本酵素を、(±)−トランス−エポキシこはく酸とフェノール性水酸基を有するフラボン類を共存させて作用させた場合には、酒石酸エーテル化合物としてフラボン類の酒石酸エーテル化合物が生成される。
【００１２】
（２）基質特異性：本酵素の作用には、前記のごとく、２つの基質を必要とし、一方の基質は、エポキシこはく酸であり、もう一方の基質は、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはフラボノイド類縁化合物である。なお、エポキシこはく酸のほか、エポキシ環を有する化合物、例えばexo-3,4-epoxy-1,2,3,6-tetrahydrophthalic acid等も本酵素の基質となり得る。
本酵素を、その基質となる(±)−トランス−エポキシこはく酸及びフェノール性水酸基を有する、表１に示した各種化合物を存在させ、フェノール性水酸基を有する各種基質に対するゲニステインの活性を１００としたときの相対活性（％）を調べた結果の一例を表１に示す。なお、活性の測定は、後述の力価測定方法と同条件下で行った。
【００１３】
【表１】
0003815588.tif 000002
【００１４】
表１からわかるように、本酵素は、(±)−トランス−エポキシこはく酸の共存下で、フェノール性水酸基を有する、ゲニステイン、ダイゼイン、4',6,7-trihydroxyisoflavone、biochaninＡ等のイソフラボン類、アピゲニン、baicalein等のフラボン類、kaempferol等のフラボノール類、ナリンゲニン等のフラバノン類、(+)-taxifolin等のジハイドロフラボノール類、sulfuretin等のオーロン類、5,7-dihydroxy-4-methylcoumarin、courmestrol等のクマリン類、6-hydroxy-2H-benzofuran-3-one等のクマラノン類、2',4',6',3,4-pentahydroxychalcone等のカルコン類、クロモン類、ロテノイド類の各フェノール性水酸基によく作用する。また、本酵素は、コウジ酸、クマリン酸、バニリン酸のフェノール性水酸基にわずかに作用する。
【００１５】
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：本酵素の至適ｐＨは、１００ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０）、１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．２〜７．０）及び１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用い、（±）−トランス−エポキシこはく酸とゲニステインを基質とした時の各ｐＨにおける本酵素の活性測定を行って求めた。その結果は図１に示すとおりであり、本酵素の至適ｐＨは４．８〜５．５、特にｐＨ５．２近辺である。また、安定ｐＨ範囲は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０）、１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．２〜７．０）、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）、１００ｍＭ  ＴＩＳ−塩酸緩衝液(ｐＨ７．５〜９．０)及び１００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．５）を用い、３７℃、３０分間それぞれ処理した後、本酵素の残存活性を求めた。その結果を図２に示す。図２から、本酵素の安定ｐＨ範囲は、ｐＨ４．５〜８．０である。
【００１６】
（４）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で、分子量は約９３，０００である。
【００１７】
（５）活性化因子：各種金属イオン等による本酵素の作用への影響を調べた結果の一例を表２に示す。なお、表２中の相対活性（％）は、金属イオン無添加のときを１００とした。
【００１８】
【表２】
0003815588.tif 000003
【００１９】
表２からわかるように、、本酵素は、Ｚｎ2+、Ｍｎ2+、Ｃｏ2+、Ｍｇ2+、Ｎｉ2+、Ｃａ2+、Ｆｅ2+などの２価金属イオンにより増強され、ＥＤＴＡ、Ｃｕ2+により強く阻害される。
【００２０】
（６）力価の測定方法：酵素の力価の測定は下記の方法で行い、次式（６）に示す反応式における、2-hydroxy-3-[[5-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-1-benzopyran-7-yl]oxy]-butanedioic acidを１分間に１μｍｏｌ生成する酵素量を１Ｕとする。
【００２１】
【化６】
0003815588.tif 000004
【００２２】
Ａ．試薬の調製；
＜基質溶液＞
基質溶液Ｉ；６０ｍＭ(±)−トランス−エポキシこはく酸(東京化成社製)を５０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(ｐＨ６．０)１００ｍｌに溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調整する。
基質溶液ＩＩ；０．３ｍｍｏｌゲニステイン（genistein、フナコシ社製）をジメチルスルフォキサイド(dimethylsulfoxide)１００ｍｌに溶解して調製する。
＜緩衝液＞
５０ｍｍｏｌ酢酸ナトリウムと４０ｍｍｏｌ硫酸マンガンを蒸留水に溶解した後、酢酸でｐＨを６．０に調整した後、１リットルにする。
Ｂ．反応条件；
１）緩衝液０．１７５ｍｌ、基質溶液Ｉ  ０．１ｍｌ及び酵素液０．０１ｍｌをマイクロチューブに分注し、混合した後、３７℃で５分間予備保温する。
２）前記５分間予備保温した液と基質溶液ＩＩ  ０．０２５ｍｌを混合し、３７℃で１５分間反応させ、その後濃塩酸０．０１ｍｌを加えて反応を停止する。なお、対照液は、酵素液０．０１ｍｌの代わりに緩衝液０．０１ｍｌを添加する以外は、前記と同様にしたものである。
Ｃ．反応生成物の定量；
前記の式（６）の反応で生成した2-hydroxy-3-[[5-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-1-benzopyran-7-yl]oxy]-butanedioic acidを、ＨＰＬＣを用いて定量する。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ（４．６ｍｍ×３０ｍｍ＋４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、和光純薬社製）。溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸、２８．８％アセトニトリルを含む蒸留水。流速：１ｍｌ／ｍｉｎ。検出波長：２６０ｎｍ。
【００２３】
（９）精製方法：本酵素の単離、精製は、常法にしたがって行うことができ、例えば硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換体などによる吸着処理法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などが単独又は適宜組み合わせて用いられる。
【００２４】
（１０）Ｋｍ値：ラインウエーバー・バークのプロットから、(±)−トランス−エポキシこはく酸とゲニステインを基質とした時、Ｋｍ値は、それぞれ２．５８×１０-3Ｍと１．０４×１０-3Ｍである。
【００２５】
（１１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動：アクリルアミド４〜２０％（W/V）の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲルを用い、常法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った結果、図３に示すごとく単一のバンドが認められた。４０ｍＡ、約６０分間通電後の相対移動度（Ｒｆ）は、０．３８である。
【００２６】
次に、本発明の新規酒石酸エーテル化合物生成酵素の製造方法について説明する。先ず、本酵素を生産する微生物としては、例えばアスペルギルス属に属する菌株が挙げられ、その具体例としては、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae）：IFO4206、ATCC20235等が、またアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae) ：ATCC11906、ATCC20245、ATCC20387等が、あるいはアスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii) ：IAM13907、IAM2138、等が挙げられ、それら菌株の変種又は変異株も用いられる。これらの菌株のうち、アスペルギルス・オリゼ IFO4206が、本酵素の生産能に優れていることから、好ましく用いられる。なお、本発明の新規酒石酸エーテル化合物生成酵素は、前記した作用、基質特異性などの主要な理化学的性質を有するものであればよく、その他の理化学的性質が多少の相違を示すものであっても、本発明の酵素として包含される。また前記の微生物は、このような酒石酸エーテル化合物生成酵素を得るための使用菌の一例であって、本発明においては、酒石酸エーテル化合物生成酵素生産能を有するものであればすべて使用できる。
【００２７】
次に、酒石酸エーテル化合物生成酵素生産能を有する微生物を培養するには、液体培養法、固体培養法のいずれも採用できるが、固体培養の方が好ましい。また、微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。この様な培地としては、例えばフスマあるいは蒸煮大豆及び炒後に粉砕した小麦の混合物を挙げることができる。微生物の培養は、２５〜３７℃、好ましくは３０℃前後で３０〜１５０時間、好ましくは１００〜１３０時間行えばよい。こうすることによって、培養物中に本酵素が生成蓄積する。この培養物から本酵素を採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
【００２８】
本酵素は、主に菌体外に存在する酵素であるため、培養物から、水や緩衝液による抽出操作により本酵素を採取するのが好ましい。次いで、培養物のろ過又は遠心分離などにより本酵素の粗酵素液を得る。このようにして得られた粗酵素液から本酵素を必要により単離するには、前記した精製方法が適用できる。以上のようにして得られた本酵素は、フェノール性水酸基を有する化合物の酒石酸エーテル化合物の製造に極めて有用である。
【００２９】
本酵素を用いて本発明の酒石酸エーテル化合物を製造するには、２つの基質となる化合物が必要である。一つは、エポキシこはく酸であり、本発明においては、特に(±)−トランス−エポキシこはく酸が、反応性の高い基質であることから、好ましく用いられる。また、もう一方の基質は、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類であるイソフラボン類（ゲニステイン、ダイゼイン、4',6,7-trihydroxyisoflavone、biochaninＡ等）、フラボン類（アピゲニン、baicalein等）、フラボノール類（kaempferol、quercetin等）、フラバノン類（ナリンゲニン等）、ジハイドロフラボノール類（(+)-taxifolin等）、オーロン類（sulfuretin等）、若しくはフラボノイド類縁化合物であるクマリン類（5,7-dihydroxy-4-methylcoumarin、courmestrol等）、カルコン類(2',4',6',3,4-pentahydroxychalcone等、クマラノン類（6-hydroxy-2H-benzofuran-3-one等）、クロモン類、ロテノイド類等が挙げられる。これらのうち、ゲニステイン、4',6,7-trihydroxyisoflavone、アピゲニン、baicalein、kaempferol、ナリンゲニン、(+)-taxifolin、sulfuretin、5,7-dihydroxy-4-methylcoumarin、2',4',6',3,4-pentahydroxychalcone、courmestrol、6-hydroxy-2H-benzofuran-3-one等は、反応性の高い基質であることから、好ましく用いられる。
【００３０】
本発明の酒石酸エーテル化合物は、エポキシこはく酸のエポキシ環とフェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物のフェノール性水酸基とが結合して酒石酸残基が１又は２以上エーテル結合してなるものであって、前記した２つの基質に、本酵素の精製品又は本酵素の部分精製品、本酵素産生能を有する微生物培養物の粗抽出液を、適宜な量を加えて反応させることによって生成される。なお、本発明の酒石酸エーテル化合物は、本酵素産生能を有する微生物の培養時の培地に、その前駆体となる基質、例えば前記した２つの基質を添加することによっても、その培養液中に生成させることもできる。
【００３１】
本発明の酒石酸エーテル化合物を製造する際の反応条件としては、好ましくは緩衝液を用いた反応液中で、本酵素の安定ｐＨ範囲、安定温度範囲で行えばよく、好ましくはｐＨ４．８〜５．５、３０〜５５℃で３０分〜８０時間、好ましくは４〜２４時間反応させる。以上の操作により、本発明の酒石酸エーテル化合物が反応液中に生成される。このようにして得られたフェノール性水酸基を有する化合物の酒石酸エーテル化合物は、例えば下記の方法を用いて精製することができる。
【００３２】
本発明の酒石酸エーテル化合物を含有する反応液は、そのままか或いは酸性下で、有機溶剤、例えば酢酸エチル、ｎ−プロパノールなどで抽出して濃縮した液を、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」という）に供する。逆相カラムとしては、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ(和光純薬社製)、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ(東ソー社製)等が挙げられる。これにより、酵素反応で新たに生じたピークを分取し、酒石酸エーテル化合物の精製品を得ることができる。
【００３３】
本発明の新規酒石酸エーテル化合物の具体例としては、例えばエポキシこはく酸のエポキシ環が、sulfuretinのＡ環６位のフェノール性水酸基と結合して生成される次式（７）で示されるsulfuretinの酒石酸エーテル化合物、
【００３４】
【化７】
0003815588.tif 000005
【００３５】
またエポキシこはく酸のエポキシ環が、kaempferolのＡ環７位のフェノール性水酸基と結合するか、又はＡ環７位及びＢ環４’位の２つのフェノール性水酸基と結合して生成される次式（８）で示されるkaempferolの酒石酸エーテル化合物、
【００３６】
【化８】
0003815588.tif 000006
（式中のＲは、-OH又は-O-CH(COOH)-CH(OH)-COOHを意味する）。
【００３７】
またエポキシこはく酸のエポキシ環が、naringeninのＡ環７位のフェノール性水酸基と結合するか、又はＡ環７位及びＢ環４’位の２つのフェノール性水酸基と結合して生成される次式（９）で示されるnaringeninの酒石酸エーテル化合物、
【００３８】
【化９】
0003815588.tif 000007
（式中のＲは、-OH又は-O-CH(COOH)-CH(OH)-COOHを意味する）。
【００３９】
またエポキシこはく酸のエポキシ環が、(+)-taxifolinのＡ環７位のフェノール性水酸基と結合して生成される次式（１０）で示される(+)-taxifolinの酒石酸エーテル化合物、
【００４０】
【化１０】
0003815588.tif 000008
【００４１】
あるいはエポキシこはく酸のエポキシ環が、apigeninのＡ環７位のフェノール性水酸基と結合して生成される次式（１１）で示されるapigeninの酒石酸エーテル化合物等を挙げることができる。
【００４２】
【化１１】
0003815588.tif 000009
【００４３】
上記したように、本発明の方法によれば、目的とするフラボノイド若しくはその類縁化合物の酒石酸エーテル化合物を、煩雑な工程や特別の高価な合成設備を必要とすることなく、容易にかつ安全に得ることができる。そして、このようにして得られた本発明の酒石酸エーテル化合物は、フラボン類若しくはその類縁化合物が本来有する、抗潰瘍、抗酸化、抗脱炭酸酵素阻害等の作用を増強させることが期待でき、そして水溶性が高く、構造的に安定であるので、経口投与等による医薬品や機能性食品素材等として有用である。
【００４４】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例１（酒石酸エーテル化合物生成酵素の製造）
本発明の酒石酸エーテル化合物生成酵素を得るため、先ず、アスペルギルス・オリゼを用いて以下に示すごとく培養を行なった。すなわち、水分８０％(w/v)のフスマ３０ｇをフェルンバッファーに入れ、１２１℃で５０分間オートクレーブにて滅菌したものを２００本用意し、それぞれにアスペルギルス・オリゼ(IFO4206)をその保存スラントより２白金耳接種し、３０℃で１週間静置培養した。この培養物からの本酵素の精製は、以下に示す操作により行なった。
【００４５】
ステップ１（粗酵素液の調製）：前記培養物(５．０５ｋｇ)に、０．１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリド(phenylmethyl-sulfonyl fluoride)を含有した５０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(ｐＨ６．０)１２リットルを加え、５℃で一晩抽出した後、ガーゼろ過、セライトろ過を経て粗抽出液を得た。
【００４６】
ステップ２（ＱＡＥ−セファデックスＡ−５０処理）：ステップ１で得た粗抽出液（１３リットル）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した２リットルのＱＡＥ−セファデックスＡ−５０に添加し、酵素活性を有する非吸着区分（１５リットル）と０．１Ｍ ＮａＣｌ溶出区（１５リットル)を得た。酵素活性区分は合わせて限外濾過濃縮し、１０ｍＭ ＭｎＳＯ4、１０％グリセロールを含有した５０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ６．０） (以下、緩衝液Ａという)に対して透析した。
【００４７】
ステップ３（硫酸アンモニウム処理）：ステップ２で得た濃縮した酵素液（１．４リットル）に８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、３０分攪拌後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、３０分間）で上清を除き、沈殿物を９００ｍｌの１Ｍ硫酸アンモニウムを含有した緩衝液Ａに溶解し、遠心分離（５０００ｒｐｍ、３０分間）で沈殿を除いて酵素液を得た。
【００４８】
ステップ４（フェニル−セファロ−スＣＬ−４Ｂ・クロマトグラフィー）：ステップ３で得た酵素液（９００ｍｌ）は、フェニル−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（５ｃｍＩ．Ｄ．×２０ ｃｍ）に吸着させ、０．８Ｍ 硫酸アンモニウム含有緩衝液Ａで洗浄し、次に０．８Ｍ硫酸アンモニウムを含有した緩衝液Ａ（溶離液Ｉ）から３０％エチレングリコールを含有した緩衝液Ａ（溶離液ＩＩ）の直線濃度勾配法にて溶出させ、約８０％溶離液ＩＩにて溶出された活性画分を採取し、限外ろ過濃縮、緩衝液Ａ対し透析し、濃縮酵素液を得た。
【００４９】
ステップ５（Ｃｏｎ Ａ−セファロース・クロマトグラフィー）：ステップ４で得た濃縮酵素液（４５ｍｌ）を０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した緩衝液Ａ（ｐＨ６．０）で平衡化したＣｏｎ Ａ−セファロースのカラム（２ｃｍ Ｉ．Ｄ．× ６．４ｃｍ）に吸着させ、カラムを０．５Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａで、引き続いて１．０Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａで洗浄した後、１．０Ｍ ＮａＣｌ及び１．５Ｍ アルファーメチル−Ｄ−マンノシドを含有した緩衝液Ａで溶出させ、限外濃縮し１０ｍＭ ＭｎＳＯ4、１０％グリセロール含有２０ｍＭ 酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）(以下、緩衝液Ｂと呼ぶ) に対して透析した。
【００５０】
ステップ６（Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５ ・ＨＰＬＣクロマトグラフィー）：ステップ５で得た濃縮酵素液（１ｍｌ）は、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５イオン交換ＨＰＬＣカラム（０．５ｃｍ Ｉ．Ｄ．× ５ｃｍ）に吸着させ、緩衝液Ｂで洗浄後、０〜０．１２５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ｂにて直線勾配法により溶出させ、約０．１Ｍ ＮａＣｌにて溶出された活性区分を採取し、限外濾過濃縮した。
【００５１】
ステップ７（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ・ＨＰＬＣクロマトグラフィー）：ステップ６で得た酵素溶液（０．２５ｍｌ）を、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷゲルろ過ＨＰＬＣカラム（７．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．× ６０ｃｍ×２）に通過させ、０．１ＭＮａＣｌ含有緩衝液Ａにてゲルろ過を行い、溶出された活性画分を採取し、限外濾過濃縮し、１．８Ｍ 硫酸アンモニウム含有緩衝液Ａに対して透析した。
【００５２】
ステップ８（ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ・ＨＰＬＣクロマトグラフィー）：ステップ７で得た酵素溶液（０．１ｍｌ）は、ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ 疎水ＨＰＬＣカラム（７．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×７．５ｃｍ）に吸着させ、１．８Ｍ 硫酸アンモニウム含有緩衝液Ａ で洗浄後、１．８〜０Ｍ 硫酸アンモニウムの直線勾配法により溶出させ、活性画分 約１．２Ｍ 硫酸アンモニウムにて溶出された活性画分を採取し限外濾過濃縮し、緩衝液Ａに対して透析し、精製酵素(０．１３５ｍｌ)を得た。該画分は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図３）により均一と判断された本酵素の精製標品であり、全タンパク量が０．２４２ｍｇ、全活性が３３５ｍＵ、比活性が１３９０ｍＵ／ｍｇであった。
【００５３】
実施例２（新規ｓｕｌｆｕｒｅｔｉｎ酒石酸エーテル化合物の製造）
ａ液：市販のｓｕｌｆｕｒｅｔｉｎ（フナコシ社製）５ｍｇをジメチルスフルホキシド１ｍｌに溶解したもの。
ｂ液：２００ｍＭ(±)−トランス−エポキシこはく酸（東京化成社製）を２０ｍＭ ＭｎＳＯ4（活性化因子として）と１０％グリセロール（安定化因子として）を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）２ｍｌで溶解したもの。
前記のａ液とｂ液とを混合し、これに実施例１と同様にして採取した本酵素０．０１２ｍｌを加え混合した後、３７℃にて４時間保温し酵素反応させた後、濃塩酸０．０５ｍｌを加え反応を停止した。反応液をプレカラム(カラム:Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ １０ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍ、和光純薬社製）を配置した逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ １０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、和光純薬社製）に供した。吸着画分は、０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度勾配により溶出させた。酵素反応により生成した新しいピークを分取し、ロータリーエバポレーターにて濃縮、乾固し、酵素反応生成物５．７ｍｇを得た。
【００５４】
前記の酵素反応生成物の理化学的性質は、以下に示す通りである。
0003815588.tif 000010
溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶。
【００５５】
上記の機器分析等の結果より、この酵素反応生成物は、前記の式（７）で表される、エポキシこはく酸のエポキシ環が、ｓｕｌｆｕｒｅｔｉｎのＡ環６位のフェノール性水酸基とエーテル結合してなる、新規ｓｕｌｆｕｒｅｔｉｎ酒石酸エーテル化合物であると結論した。
【００５６】
実施例３（新規ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ酒石酸エーテル化合物の製造）
実施例２に記載したａ液のｓｕｌｆｕｒｅｔｉｎ  ５ｍｇの代わりに、市販のｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ(フナコシ社製)７ｍｇを用いた以外は、実施例２に記載したと同様にして、反応液を得て、ＨＰＬＣカラムにより反応吸着画分を分取した。酵素反応により生成した新しいピークＩ及びピークＩＩを分取し、ロータリーエバポレーターにて濃縮、乾固し、ピークＩの酵素反応生成物Ｉを１．４ｍｇ、及びピークＩＩの酵素反応生成物ＩＩを４ｍｇ得た。
【００５７】
（１）前記の酵素反応生成物Ｉの理化学的性質は、以下に示す通りである。
0003815588.tif 000011
溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶。
【００５８】
（２）前記の酵素反応生成物ＩＩの理化学的性質は、以下に示す通りである。
0003815588.tif 000012
溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶。
【００５９】
上記の機器分析等の結果より、本実施例の酵素反応生成物Ｉは、前記した式（８）で表されるうちのＲが-OHで示される、エポキシこはく酸のエポキシ環がｋａｅｍｐｆｅｒｏｌのＡ環７位のフェノール性水酸基と結合して酒石酸残基１個がエーテル結合してなる、新規ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ酒石酸エーテル化合物であると結論した。また酵素反応生成物ＩＩは、同式（８）で表されるうちの、Ｒが-O-CH(COOH)-CH(OH)-COOHで示される、エポキシこはく酸のエポキシ環がｋａｅｍｐｆｅｒｏｌのＡ環７位及びＢ環４’位のフェノール性水酸基と結合して酒石酸残基２個がエーテル結合してなる、新規ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ酒石酸エーテル化合物であると結論した。
【００６０】
実施例４（新規ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ酒石酸エーテル化合物の製造）
実施例２に記載したａ液のｓｕｌｆｕｒｅｔｉｎ  ５ｍｇの代わりに、市販のｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ(シグマ社製)１０ｍｇを用いた以外は、実施例２に記載したと同様にして、反応液を得て、ＨＰＬＣカラムにて反応吸着画分を分取した。酵素反応により生成した新しいピークＩ及びピークＩＩを分取し、ロータリーエバポレーターにて濃縮、乾固し、ピークＩの酵素反応生成物Ｉを６．７ｍｇ、及びピークＩＩの酵素反応生成物ＩＩを１．２ｍｇ得た。
【００６１】
（１）前記の酵素反応生成物Ｉの理化学的性質は、以下に示す通りである。
0003815588.tif 000013
溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶。
【００６２】
（２）前記の酵素反応生成物ＩＩの理化学的性質は、以下に示す通りである。
0003815588.tif 000014
溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶。
【００６３】
上記の機器分析等の結果より、本実施例の酵素反応生成物Ｉは、前記した式（９）で表されるうちのＲが-OHで示される、エポキシこはく酸のエポキシ環がｎａｒｉｎｇｅｎｉｎのＡ環７位のフェノール性水酸基と結合して酒石酸残基１個がエーテル結合してなる、新規ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ酒石酸エーテル化合物であると結論した。また酵素反応生成物ＩＩは、同式（９）で表されるうちの、Ｒが-O-CH(COOH)-CH(OH)-COOHで示される、エポキシこはく酸のエポキシ環が、ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎのＡ環７位及びＢ環４’位のフェノール性水酸基と結合して酒石酸残基２個がエーテル結合してなる、新規ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ酒石酸エーテル化合物であると結論した。
【００６４】
実施例５（新規（＋）−ｔａｘｉｆｏｌｉｎ酒石酸エーテル化合物の製造）
実施例２に記載したａ液のｓｕｌｆｕｒｅｔｉｎ  ５ｍｇの代わりに、市販の（＋）−ｔａｘｉｆｏｌｉｎ(フナコシ社製)１２ｍｇを用いた以外は、実施例２に記載したと同様にして、反応液を得て、ＨＰＬＣカラムで反応吸着画分を分取した。酵素反応により生成した新しいピークを分取し、ロータリーエバポレーターにて濃縮、乾固し、（＋）−ｔａｘｉｆｏｌｉｎ酵素反応生成物１１ｍｇを得た。
【００６５】
前記の酵素反応生成物の理化学的性質は、以下に示す通りである。
0003815588.tif 000015
溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶。
【００６６】
上記の機器分析等の結果より、この酵素反応生成物は、前記の式（１０）で表される、エポキシこはく酸のエポキシ環が、（＋）−ｔａｘｉｆｏｌｉｎのＡ環７位のフェノール性水酸基とエーテル結合してなる、新規（＋）−ｔａｘｉｆｏｌｉｎ酒石酸エーテル化合物であると結論した。
【００６７】
実施例６（新規ａｐｉｇｅｎｉｎ酒石酸エーテル化合物の製造）
実施例２に記載のａ液のｓｕｌｆｕｒｅｔｉｎ  ５ｍｇの代わりに、市販のａｐｉｇｅｎｉｎ(フナコシ社製)５ｍｇを用いた以外は、実施例２に記載したと同様にして、反応液を得て、ＨＰＬＣカラムで反応吸着画分を分取した。酵素反応により生成した新しいピークを分取し、ロータリーエバポレーターにて濃縮、乾固し、ａｐｉｇｅｎｉｎ酵素反応生成物１．４ｍｇを得た。
【００６８】
前記の酵素反応生成物の理化学的性質は、以下に示す通りである。
0003815588.tif 000016
溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶。
【００６９】
上記の機器分析等の結果より、この酵素反応生成物は、前記の式（１１）で表される、エポキシこはく酸のエポキシ環が、ａｐｉｇｅｎｉｎのＡ環７位のフェノール性水酸基とエーテル結合してなる、新規ａｐｉｇｅｎｉｎ酒石酸エーテル化合物であると結論した。
【００７０】
【発明の効果】
本発明の酒石酸エーテル化合物生成酵素は、エポキシこはく酸のエポキシ環に、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはフラボノイド類縁化合物のフェノール性水酸基が作用して、酒石酸エーテル化合物を生成する新規な酵素である。そして本酵素を用いれば、従来の化学的合成法のような複雑な操作や工程を伴わず、また、特別な合成設備を設けることなく、酵素法により、簡便に、精度よく、安価に、しかも安全に、エポキシこはく酸のエポキシ環が、フェノール性水酸基を有するフラボノイド類若しくはその類縁化合物のフェノール性水酸基と結合して酒石酸残基が１又は２以上エーテル結合してなる、酒石酸エーテル化合物を製造することができる。本発明の酒石酸エーテル化合物は、フラボン類若しくはその類縁化合物が本来有する、抗潰瘍、抗酸化、抗脱炭酸酵素阻害等の作用を増強させ得ることが期待され、しかも水溶性が高く、構造が安定であることから、経口投与等による医薬品や機能性食品素材等として用いることができるので、本発明は産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本酵素の至適ｐＨを示すグラフ。
【図２】  本酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフ。
【図３】  本酵素の電気泳動図。
【図１】
0003815588.tif 000022
【図２】
0003815588.tif 000023
【図３】
0003815588.tif 000024