(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子または植物に、種子の発芽または植物の成長に必要な量のラミナリンを施用する工程を含む、種子発芽または植物成長を促進する方法。
【請求項２】
葉に噴霧することによって、または土壌に、ラミナリンを施用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
有効量のラミナリンを含有する組成物を調製することを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ラミナリンに、農業上許容され得る担体または賦形剤が加えられる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
上記組成物が、固体形態または液体形態である、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
固体形態が、粉末形態であるかまたは顆粒形態である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
液体形態が、水溶液である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
上記組成物が、微量元素、殺真菌剤、殺虫剤、除草剤、成長ホルモン、リポアミノ酸およびベタインから選ばれる少なくとも１種類の添加物質を含有する、請求項３〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
上記組成物が、固体形態で提供され、そして０．００５〜５０重量％のラミナリンを含有する、請求項３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
上記組成物が、液体形態で提供され、そして０．００５〜１０重量％のラミナリンを含有する、請求項３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
葉に噴霧することによって施用するために、１リットルあたり０．００５〜１００ｇの薬量でラミナリンを用いる、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
種子に施用するために、１００kgあたり１〜１００ｇの薬量でラミナリンを用いる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、種子発芽および植物成長促進剤としてのラミナリンの用途に関する。
ラミナリンは、褐藻類に貯蔵された重合体であること、および藻類の性質によってその構造が僅かに異なる多糖類からなることが公知である。
一般的に述べると、ラミナリンは、β（１→３）結合によって結合された、線状の主鎖に分布する２０〜６０のＤ−グルコピラノシド単位、およびβ（１→６）結合によってこの主鎖に結合された側鎖からなる。
これらの鎖のいくつかは、マンニトール１単位からなる還元末端単位を有する。この構造内でのマンノース単位の存在も注目される。
一般的には、ラミナリンは褐藻綱類、特にヒバマタ目またはコンブ目の褐藻から抽出される。
ラミナリンを得るためには、様々な抽出方法を用いることができる。
例えば、Blackら［Appl.Chem.、第１巻（1951年）５０５〜５１７ページ］によって記載された方法が参照され得る。
より一般的には、ラミナリン以外の成分（細胞壁多糖類、塩類など）を連続的に除去することを可能にするいかなる抽出法を用いても、褐藻類からラミナリンを得ることができる。
とりわけ、これらの方法は、摩砕、酸性または塩基性媒体中での沈澱、限外濾過および透析を含む工程を用いる。
ラミナリンはまた、例えばSigma Chimie ＳＡＲＬによって市販されている。
更に、硫酸化されたラミナリンは、価値ある薬理学的特性、特に、抗凝固および低コレステリン血症の特性を有することも公知である［K.C.Guvenら：Introduction to Applied Physiology、（1990年）６７〜９２ページ］。
様々な学術書が、ラミナリンの誘発特性を記載し、植物の防御反応を増進するためのその用途を示唆している。
このように、Netzerらは、S.oxysporumという病原体による感染がラミナリナーゼの誘発を触発することを明らかにしている［Biological Abstracts第６８巻、第１号（1979年）］。
同様に、Bonhoffらは、フィトアレキシンおよびカロースの誘発剤としてのラミナリンの特性を明らかにしている［Biological Abstracts第８６巻、第４号（1988年）］。
更に、黒崎ら［Biological Abstracts第８５巻、第２号（1988年）］およびPearce［Biological Abstracts第７４巻、第８号（1982年）］は、とりわけ木質化に関して、ラミナリンの誘発効果を確認しているが、同時に、これらの効果は、既知の誘発剤のそれと比較して弱いことを述べている。
この技術水準は、当業者にラミナリンを植物の防御反応を増進するために用いることを示唆するかもしれない。
本発明の基礎となっている事実、すなわちラミナリンが、α−アミラーゼ誘発剤の特性を有し、それが種子発芽および植物成長に対する促進作用の原因であることが発見された。
誘発は、代謝物が植物細胞によって認識される段階、および生理学的応答があるシグナルによって引き起こされる段階に基づく過程であることが指摘される。したがって、誘発剤は、植物がその環境に適応するのを可能にする反応を植物に起こさせることが可能なあらゆるシグナルに相当する。
全く予想外なことに、ラミナリンは、植物における成長過程の指標酵素の活性化、および処理された細胞の蛋白質分解活性の刺激を誘発することが発見された。
したがって、ラミナリンおよびそれを含有する組成物は、植物成長、細胞伸長および種子発芽に対する促進作用を発揮することによって、農産物の生産収量を増大させることが立証される。
上記のように、本発明は、種子発芽および植物成長促進剤としてのラミナリンの用途に関する。
本発明によるこの用途の一つの特有の特徴によれば、ラミナリンは、葉を経由してまたは土壌に施用される。
本発明の別の特有の特徴によれば、この用途は、要すれば、農業上許容され得る担体または賦形剤を含む有効量のラミナリンを含有する組成物の調剤を含む。
一つの特有の特徴によれば、本組成物は、固体形態、特に粉末もしくは顆粒の形態で、または液体形態、特に水溶液の形態で提供される。
別の特有の特徴によれば、本組成物は、微量元素、殺真菌剤、殺虫剤、除草剤、成長ホルモン、リポアミノ酸およびベタインから選ばれた少なくとも１種類の添加物質も含有する。
用い得る除草剤の例は、カルバミン酸塩、シクロヘキサジオン類、スルホニル尿素類、トリアジン類またはウラシル類を含む群に属する化合物である。
用い得る殺真菌剤の例は、ジチオカルバミン酸塩、ヒダントイン類、イミダゾール類またはトリアゾール類を含む群に属する化合物である。
好都合には、本組成物は、固形であるときは０．００５〜５０重量％、好ましくは１〜２５重量％のラミナリンを、そして液体形態であるときは０．００５〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％のラミナリンを含有する。
一般的に述べると、本発明による用途に適合する組成物は抽出された粉末形態のラミナリンに慣用の添加物、例えば固体担体および／または溶剤を混合することによって調製される。界面活性物質、分散剤または乳化剤も用いられるであろう。
水和剤または顆粒の製造に用い得る固体担体の例は、微細に粉砕されたカオリンまたは粘土である。
液体形態で提供されたとき、これらの組成物は、好ましくは、ラミナリンを水に希釈することによって得られるであろう。
特に水に不溶性である添加物質との混合物の場合、油または乳化し得る濃縮物をベースとした噴霧用組成物を調製することも可能である。
本発明による用途の枠内でのラミナリンを施用して好結果を得ることができる植物の例は、下記のとおりである：
リンゴ果樹、ナシ果樹およびブドウ樹などの果実作物；
コムギ、トウモロコシおよびコメなどの穀物；
ダイズ、ヒマワリおよびナタネなどの油脂に富む植物；
ニンジン、トマト、カリフラワーおよびバレイショなどの野菜。
一般に、ラミナリンは、葉に施用するには１リットルあたり０．００５〜１００ｇ、種子に施用するには１００kgあたり１〜１００ｇの施用量で用いなければならない。
下記の非限定的実施例を援用して、本発明を説明する。
まず第一に、実施例１および２は、褐藻からラミナリンを抽出するための２方法を示すものである。
実施例１および２に記載の方法を実施することによって得られた抽出物のＮＭＲスペクトルは、市販用ラミナリンの特徴的ピークを含んでいる。
実施例１
褐藻からのラミナリンの抽出法
８月に収穫されたマコンブ属の一種（Laminaria saccharina）の新鮮な藻３００ｇを、フランス国特許第7435162号明細書に記載の方法を用いて凍結粉砕（−４０℃）する。
こうして得られた生成物は、５０〜１００μmの平均粒径および１０〜１２％の固体含量を有する。
この生成物３００ｇに０．３％の硫酸０．９リットルを徐々に加える。約８０℃の温度の水浴上で、攪拌しつつ１時間抽出する。
この操作を２回反復する。
中和した後、得られた抽出物を、約１重量％の投与量のポリビニルピロリドンで処理する。これは、抽出物９０ml中にポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）９ｇを導入することによってなされる。ＰＶＰを約２時間放置して濁らせる。得られた溶液を抽出物約０．９リットルに加え、混合物を３０分間攪拌し、次いで、減圧下でワットマンＧＦ／Ａ濾紙で濾過する。
このようにして得られた液体を、５０，０００ダルトンの多孔度を有する「Carbosep」型の炭素−セラミック管状膜での接触限外濾過に付す。操作中は、１バールの圧力を濾過カラム上に維持する。
これによって、約０．８リットルの体積および５．５のpHを有する濾液が得られる。次いで、５００または１，０００ダルトンの多孔度を有するSpectra/Por型のセルロースエステル膜で濾液を透析する。次いで、透析物を凍結乾燥して、純ラミナリンに相当する乾燥粉末７ｇが得られる。
実施例２
褐藻からラミナリンを抽出する代替的方法
アスコフィルム属（Ascophyllum nodosum）類の新鮮な藻３００ｇを登録商標StefanのＶＣＭ５型のナイフミルで摩砕する。得られた生成物は、１mm未満の粒径および１０〜１２％の固体含量を有する。塩化カルシウムの２％水溶液０．９リットルをこの生成物３００ｇに加え、特にアルギン酸塩を沈澱させる。
約６０℃の温度の水浴上で、攪拌しつつ７時間、第一の抽出を実施する。次いで、濾過によって第一の抽出物を回収し、摩砕生成物３００ｇを塩化カルシウムの２％水溶液０．９リットル中で、第２回目は第一の抽出と同じ条件、すなわち約６０℃の温度の水浴上で、しかし今回は攪拌しつつ一晩、抽出する。次いで、第二の抽出物も濾過によって回収する。
次いで、このようにして得られた二つの抽出物を併せ、透析濾過に付して、無機塩類を除去する。
これは、Millipore社から市販されている、１，０００ダルトンの多孔度を有するカセットを装備し、やはりMillipore社によって市販されているProconポンプが付設されているPellicon装置系を用いてなされた。
抽出物のイオン含量の減少は、抵抗率の規則的な測定によって追跡する。
透析濾過は、残渣の抵抗率が約１，０００オーム・cmとなるまで継続する。
次いで、強い交換体型、例えばAmberlite ＩＲＡ４００、または弱い交換体型、例えばAmberlite ＩＲ４５の陰イオン交換樹脂のカラムで残渣を処理する。
下記の二通りの手法のいずれかを用いることができる：
−バッチ法：陰イオン交換樹脂の水酸化ナトリウムによる再生、および脱無機質化した水による洗浄の後に、残渣を含有する容器内に樹脂を直接置く。混合物を１時間攪拌し、傾瀉し、濾過物を回収する、または
−カラムクロマトグラフィー：陰イオン交換樹脂の水酸化ナトリウムによる再生、および脱無機質化した水による洗浄の後に、直径２〜３cm、高さ２０cmのガラスカラムに樹脂を導入する。次いで、濾過物をカラム頂に堆積させ、樹脂内に徐々に浸透させる。次いで、脱無機質化した水でカラムを洗浄する。
次いで、５００または１，０００ダルトンの多孔度を有するSpectra/Por型のセルロースエステル膜で溶出液を透析する。次いで、透析物を凍結乾燥して、純ラミナリンに相当する乾燥粉末７ｇが得られる。
実施例３
ラミナリンの特性の立証
ラミナリンおよびそれを含有する組成物の特性を、下記の実験を行うことによって立証した。
実験１
種子発芽試験
種子発芽に対するラミナリンの影響を、下記のプロトコールを用いて評価した：
予め浸漬することなく、ニンジン、レタスおよびキクヂシャの種子を、直径５cmのペトリ皿内の下記の溶液中で１０を処理単位として発芽させる：
−水溶液（対照用処理単位）、
−成長物質［１０-6モルの濃度のキネチンまたはインドール酢酸（ＩＡＡ）］を含有する溶液、および
−異なる濃度のラミナリンを含有する溶液。
ペトリ皿を暗所で２５℃の囲いの中に置く。
１０日後に得られた結果を下記の表にまとめた：
0003753733.tif 000002
したがって、試験した実験条件下では、ラミナリンは下記の濃度で最適活性を有する：
−ニンジンの種子に対しては０．８μｇ／ml、
−レタスの種子に対しては０．６、０．８および１μｇ／ml、ならびに、
−キクヂシャの種子に対しては０．４、０．６および０．８μｇ／ml。
上記により、結果は、異なる種類の種子の発芽に対するラミナリンの影響を立証している。
実験２
コムギ子葉鞘の伸長
コムギの種子を暗所で２５℃で発芽させる。
３日後、子葉鞘は２．５〜３cmの長さに達する。子葉鞘を切開した後、長さ８mmの断片を摘出する。
オーキシンの内在的生成の中心である頂端帯域がラミナリンに協調的に干渉するか、または拮抗的に干渉するかを判定するために、一方は頂端帯域を含み、他方は含まない２処理単位を試験した。
それぞれの実験について、１０の子葉鞘断片からなる２処理単位を、直径５cmのペトリ皿中の試験生成物（１０-6モルのＩＡＡ、および異なる濃度のラミナリン）の水溶液５mlと接触させる。
暗所中で２５℃で２０時間インキュベーション後に、伸長を測定した。
得られた結果を下表にまとめた：
0003753733.tif 000003
試験した実験条件下では、ラミナリンは０．１および０．２μｇ／mlの濃度で最適活性を有する。
ラミナリンは、コムギ子葉鞘の伸長に非常に有利な活性を有する。したがって、それは成長調節物質として作用する。
実施例４．
α−アミラーゼに対するラミナリンの特性の立証
下記の実験を実施することによって、α−アミラーゼに対するラミナリン、およびそれを含有する組成物の特性を立証した：
プロトコール
キイチゴ属の一種（Rubus fructicosus）の細胞またはプロトプラストの懸濁液、すなわちクエン酸ナトリウム緩衝液５０mlに懸濁した２．４ｘ１０6個の細胞を、誘発剤の存在または不在下で、８０rpmで振盪攪拌しつつ室温で６０分間インキュベーションする。
試験した誘発剤は、実施例１および２で製造した、純ラミナリンに相当する乾燥粉末（以下それぞれ「Ｅ１」および「Ｅ２」という。）に相当する。
この誘発試験に用いたＥ１およびＥ２の濃度は、１リットルあたり０．１ｇである。
実験の終了時点で、遠心分離（５００ｇ、４℃で５分間）によって細胞またはプロトプラストを回収し、ＮａＣｌ（１モル）で強化した５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH７．２）に溶解する。遠心分離（７，３００ｇ、４℃で１０分間）によって回収した細胞を、ショ糖もマンニトールも含まないクエン酸ナトリウム緩衝液の存在下で２回洗浄した後、ＮａＣｌ（１モル）で強化した５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH７．２）に溶解する。
組成物Ｅ１およびＥ２の潜在的誘発能力を測定するのに用いたα−アミラーゼ活性を、下記のプロトコールに従って分析する：
誘発されたか、または誘発されなかった細胞から、＋４℃で酵素抽出物を調製する。ＮａＣｌ（１モル）で強化した５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH７．２）に溶解した細胞（体積比１／５）を、Polytronホモジナイザーで摩砕する；試料は、操作全体を通じて砕氷中に保つ。摩砕した生成物を遠心分離し（１，２００ｇ、４℃で１５分間）、ＰＭ１０という膜を装備したAmiconセルでの限外濾過（分離域値：10,000ダルトン）によって上清を濃縮し、次いで、Ultrafrecユニット（Millipore社）の助けで、蒸留水に対して透析する（分離域値：１０，０００ダルトン）。
基質（可溶性澱粉５０μｇ）の存在下、０．１モル酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．０）または０．１モルリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）２００μｌ中で、酵素抽出物（蛋白質１０μｇ）を４０℃で様々な時間（１〜６時間）インキュベーションした後に、α−アミラーゼ活性を検定する。１００℃で１０分間加熱することによって、反応を停止させる。
α−アミラーゼ活性の検定は、ソモジの方法（1952年）を用い、遊離された還元糖の定量に基づく。盲検は、酵素抽出物を全く含有しないか、または１００℃に加熱された抽出物を含有する反応媒体からなる。
酵素活性（Ａ）は、酵素反応１時間あたり、かつ蛋白質１mgあたり遊離されたグルコース当量のマイクロモルで表される。
結果：
１．結果の表現
酵素の活性化（Ｒ）は、誘発された細胞またはプロトプラストで測定された活性の、未処理の細胞またはプロトプラストで測定された活性に対する比として定義され、未処理の細胞またはプロトプラストの活性を自由裁量で１００に設定する。
２．結果：α−アミラーゼ活性の誘発
得られた結果は図１にプロットしてある。
この図にプロットされたそれぞれの値は、誘発実験の際に得られた３通りの実験データを処理した結果得られたものである。
ラミナリンに基づく組成物Ｅ１は、３００％というα−アミラーゼ活性Ｒを細胞で誘発するのに対し、ラミナリンに基づく組成物Ｅ２は、６００％というα−アミラーゼ活性を誘発する。
結論
得られた結果は、実施例２で製造した組成物、および、より少ない程度で、実施例１で製造したそれは、最初の発芽段階の際に特に必要とされる、成長過程の指標酵素であるα−アミラーゼの活性を刺激する能力があることを示す。
したがって、ラミナリンは、種子発芽および植物成長促進剤として用いることができる。
実施例１および２で製造したラミナリンを含有する農業用途のための異なる組成物を、実施例５〜８に示す。
実施例５
実施例１で製造したラミナリンに基づく、液肥形態での農業用途のための組成物
実施例１で製造したラミナリンは、１種類またはそれ以上の微量元素、例えばモリブデン塩およびマンガン塩とともに水溶液として用いることができる。
ラミナリン１ｇを水７５８ｇに溶解し、次いで、塩化マンガン２１５ｇおよびモリブデン酸ナトリウム２６ｇを加える。混合物を攪拌して、溶解を完全なものにする。
これによって、０．１重量％のラミナリン含有量、１重量％のモリブデン含有量、および１重量％のマンガン含有量を有する組成物が与えられる。この組成物は、葉に吹き付けることによって、植物成長刺激剤および欠乏補正剤として用いることができる。
実施例６
実施例２で製造したラミナリンに基づく、殺真菌剤を伴う農業用組成物
ラミナリン１ｇを水６９９ｇに溶解する。
Bourgeois社によって市販されている、活性物質であるマンネブを８０％含有する殺真菌剤Manganil８０（製品第ＡＰＶ7000073号）３００ｇをこの溶液に懸濁する。
０．１％のラミナリンおよび２４％のマンネブを含有するこの懸濁液は、０．１〜５０ml／リットルの施用量で葉の表面に吹き付けることによって用いることができる。
この組成物は、特にブドウおよびトマトのウドンコ病に対する殺真菌性防護作用と同時に植物成長に対する促進作用を発揮する。
実施例７
種子被覆用製剤として用いられる、実施例１で製造したラミナリンに基づく組成物
実施例１で製造したラミナリンは、蛋白質に富むエンドウの類型（Ascona属の品種）の種子の薄膜被覆のための水溶液として用いることができる。
植物消毒処理を受けていても、または受けていなくてもよいエンドウの種子を、軸の周囲に回転する種子の一団に非常に高速度で物質を吹き付けるという原理に基づくＨＥＧＥという登録商標の薄膜被覆機械で薄膜被覆する；これは偏心変位を生起して、種子と薄膜被覆製品との間の完全な親和を確保する。
この方法を用いて、実施例１で製造したラミナリンを５％含有し、分散剤を加えて製剤／種子の接触を向上させた水溶液４mlで薄膜被覆された１処理単位のエンドウの種子５００ｇを調製する。
このようにして、種子の薄膜被覆のためのこの組成物は、種子発芽および植物成長に対する促進作用を有する。
実施例８
農業用途のための錠剤の調製に用いられる、実施例２で製造したラミナリンに基づく組成物
実施例２で製造した粉末形態のラミナリンは、屋内植物に灌水するか、またはそれらの葉に噴霧するための錠剤の調製に用いることができる。
実施例２で製造したラミナリン０．５ｇを、カオリン型の脱水剤０．５ｇとともに乳鉢中で摩砕かつ混合する。次いで、得られた粉末を、固定された打ち抜き型１基、および垂直方向に運動するポンチ２基（上部１基および下部１基）を含む交互作動型の打錠機中で圧縮する。
得られた顆粒または錠剤１ｇは、次いで、機械から排出し、灌水缶または噴霧器中で水に溶解することによって、用いることができる。
【図１】
0003753733.tif 000004