(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カナリーポックスウイルスゲノムの非必須領域内で、哺乳類病原体の抗原をエンコードするＤＮＡの存在により人工的に修飾された組換えカナリーポックスウイルス。
【請求項２】
ＤＮＡが適切なプロモーターから下流に存在する、請求項１記載の組換えカナリーポックスウイルス。
【請求項３】
プロモーターがＰｉワクシニアプロモーター、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｈ（ＨＨ及びＨ６）ワクシニアプロモーター、１１Ｋワクシニアプロモーター、２５．８ＫＤ  ＦＰ−１ファウルポックスプロモーター及びＡｍＥＰＶ  ４２Ｋエントモポックスプロモーターからなる群から選択される、請求項２記載の組換えカナリーポックスウイルス。
【請求項４】
組換えカナリーポックスウイルスは、ＤＮＡ及びプロモーターが非必須領域の座Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６に挿入されているカナリーポックスウイルスである、請求項３記載の組換えカナリーポックスウイルス。
【請求項５】
抗原が狂犬病抗原、狂犬病Ｇ抗原、ウシ白血病ウイルスのｇｐ５１、３０エンベロープ抗原、ネコ白血病ウイルスのＦｅＬＶエンベロープ抗原及び単純ヘルペスウイルスの糖タンパクＤ抗原からなる群から選択される、請求項１、２、３または４記載の組換えカナリーポックスウイルス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は１９８８年４月２５日出願の米国特許出願第１８６，０５４号のＣＩＰ出願であり、このＣＩＰ出願はさらに１９８７年１０月２０日出願の米国特許出願第１１０，３３５号のＣＩＰ出願であり、これはさらに１９８７年８月２８日出願の米国特許出願第０９０，７１１号のＣＩＰ出願である。
【０００２】
本発明は、合成組換えアビポックスウイルスを用いて、非鳥類脊椎動物を含む脊椎動物において免疫応答を誘起する方法に関する。さらに詳細に言えば、本発明は脊椎動物、特に哺乳類において、脊椎動物病原体の抗原決定基をコードしかつ発現させるＤＮＡを含有する合成組換えアビポックスウイルスを脊椎動物に接種することによって、脊椎動物病原体に対する免疫学的応答を誘起する方法、及びかかる修飾アビポックスウイルスから成るワクチン類に関する。さらに、本発明は、修飾アビポックスウイルス、その製造及び使用方法、修飾アビポックスウイルスの製造において生産される、或いは中間体として関与するＤＮＡ配列、及びかかる配列の製造方法に関する。
【０００３】
発明の背景
アビポックス、即ちアビポックスウイルスは、家禽に感染するポックスウイルスと近縁の属である。アビポックス属には、ファウルポックス（ｆｏｗｌ  ｐｏｘ）、カナリーポックス（ｃａｎａｒｙ  ｐｏｘ）、ジュンコポックス（ｊｕｎｃｏ  ｐｏｘ）、ピジョンポックス（ｐｉｇｅｏｎ  ｐｏｘ）、クエイルポックス（ｑｕａｉｌ  ｐｏｘ）、スパロウポックス（ｓｐａｒｒｏｗ  ｐｏｘ）、スターリングポックス（ｓｔａｒｌｉｎｇ  ｐｏｘ）、及びターキーポックス（ｔｕｒｋｅｙ  ｐｏｘ）種が含まれる。ファウルポックス種はニワトリに感染するもので、水痘とよばれるヒトの病気と混同してはならない。アビポックス属は他のポックスウイルスと多くの特徴が共通しており、脊椎動物を宿主とするポックスウイルスとしてアビポックスと同じ亜科に属する。ワクシニアとアビポックスを含むポックスウイルス類は、宿主の真核細胞内で複製する。これらのウイルス類はそれらが大きいこと、複雑であること、及び細胞質内の部位で複製されることで特徴付けられる。しかし、ワクシニアとアビポックスは異なる属であり、ウイルス分類国際委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）の第４回報告書、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７巻、４２〜４４頁（１９８２）に報告されているように、おのおのの分子量、抗原決定基、及び宿主となる種が異なっている。
【０００４】
アビポックスウイルスは、ヒトを含む哺乳類などの非鳥類脊椎動物に増殖性の感染はしない。さらに、哺乳類(ヒトを含む)の培養細胞に接種してもアビポックスは増殖しない。アビポックスを接種した哺乳類の培養細胞において、細胞毒性作用のため細胞は死ぬが、ウイルスの増殖性感染の証拠は見られない。
【０００５】
哺乳類などの非鳥類脊椎動物に生きたアビポックスを接種すると、接種部分にワクシニアの接種と類似した病巣が形成される。しかし、ウイルスの増殖性の感染は起こらない。にもかかわらず、このようにして接種を受けた哺乳類がアビポックスウイルスに対して免疫学的に応答することが今回判明した。これは予想外の結果である。
【０００６】
死滅病原体又はかかる病原体の精製抗原成分から成るワクチンは、有効な免疫応答を誘起させるためには、ウイルス生ワクチンよりも大量に注入しなければならない。このことは、生ウイルス接種がはるかに効率的なワクチン接種法であることによる。比較的少量の接種でも、問題の抗原がウイルス複製時に増幅されることから、有効な免疫応答を誘起させることができる。医学的観点から見れば、ウイルス生ワクチンは死滅病原体又は精製抗原ワクチンを接種するよりも効果が大きく、しかもより長時間持続する免疫性を付与する。従って、死滅病原体又はかかる病原体の精製抗原成分より成るワクチンは、生ウイルスの時よりもワクチン物質を大量に製造する必要がある。
【０００７】
既に述べてきたことから明らかなように、ウイルス生ワクチンを使用することは医学的にもまた経済的にも利点がある。かかるウイルス生ワクチンのひとつとして、ワクシニアウイルスから成るワクチンが挙げられる。このウイルスは、組換えＤＮＡ法を用いて哺乳類病原体の抗原の遺伝子配列を示すＤＮＡを挿入するのに有用なウイルスのひとつであることが、従来技術において公知である。
【０００８】
従って、病原性生物の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列を含有する、任意の起源の（例えば、ウイルス、原核生物、真核生物、合成）ＤＮＡをワクシニアゲノムの非必須領域に挿入することによって、組換えワクシニアウイルスを作製することができる方法が従来技術において開発された。これらの方法で作製されるある種の組換えワクシニアウイルスは哺乳類に種々の哺乳類病原体に対する特異的免疫を誘起させるために用いられている。これらに関しては全て米国特許第４，６０３，１１２号に記載されており、本明細書中に引用してある。
【０００９】
非修飾ワクシニアウイルスは、天然痘の予防接種に比較的安全でかつ有効なものとして使用されてきた長い歴史がある。しかし、天然痘根絶前の、非修飾ワクシニアウイルスが広く投与されていた時は、中程度の危険ではあるが、全身的ワクシニア感染という形で実際に合併症が起きる危険があり、特に湿疹又は免疫抑制に罹患している者では危険が伴っていた。ワクシニア接種により生じる可能性のある合併症として、稀ではあるが、ワクチン接種後の脳炎がある。これらの反応のほとんどは、湿疹のような皮膚疾患、又は免疫系不全の者、又は家族に湿疹又は免疫反応不全の者がいる人達に接種したことが原因であった。ワクシニアは生きたウイルスであり、通常、健常人に対しては無害である。しかし、接種後数週間にわたり個人間で伝染する。正常の免疫応答が不全である者が接種、又は最近接種を受けた者からの接触伝染により感染した場合、重大な結果をもたらすことがある。
【００１０】
従って、当技術における生ウイルスの接種の利点を有しながら既に述べた問題を軽減又は消失させるような方法は、現行技術の状態をはるかに上回る望ましい利点を持つことがわかる。このことは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）として公知の疾患が発症している現在において、極めて重要となっている。本疾患の犠牲者は重大な免疫不全に罹患していて、他の者にとっては安全な生ウイルスと直接接触、又は生ウイルス製剤から成るワクチン接種を最近受けた人と接触することにより伝染した場合、かかるウイルス製剤により簡単に傷害を受ける。
【００１１】
発明の目的
本発明の目的は、病原性生物に対して脊椎動物を免疫することができるワクチンにして、ウイルス生ワクチンの利点を有しつつ、特に非鳥類脊椎動物を免疫するために用いたとき、既に列挙したようなウイルス生ワクチンの欠点も死滅ウイルスワクチンの欠点もほとんど又は全く有さないワクチンを提供することである。
【００１２】
本発明はさらに、かかるワクチンに使用する合成組換えアビポックスウイルスを提供することを目的とする。
【００１３】
本発明はさらに、鳥類及び非鳥類脊椎動物において、哺乳類のような非鳥類脊椎動物の場合には動物体内において感染したウイルスの産生を伴った増殖性の複製を行うことのできない合成組換えアビポックスウイルスを脊椎動物に接種することによって、免疫応答を誘起させる方法を提供することを目的とする。哺乳類のような非鳥類脊椎動物に接種した場合、かかるウイルスは、非ワクチン接種宿主に広がる可能性を自己限定し低下させる。
【００１４】
本発明はさらに、脊椎動物において抗原に対する免疫応答を誘起させる方法にして、該脊椎動物に対する病原体の抗原決定基を含有しかつ発現させる合成組換えアビポックスウイルスを含有するワクチンを脊椎動物に接種することを含む方法を提供することを目的とする。
【００１５】
また、遺伝子産物をコードし、かつ脊椎動物中でウイルスが増殖的複製をすることなく遺伝子産物を発現させるＤＮＡを含有する組換えウイルスを脊椎動物に接種することによって、脊椎動物中で遺伝子産物を発現させる方法を提供することも本発明の目的である。
【００１６】
さらに、抗原をコードし、かつ脊椎動物中でウイルスが増殖的複製をすることなく抗原を発現させるＤＮＡを含有する組換えウイルスを脊椎動物に接種することによって、抗原に対する免疫応答を脊椎動物に誘起させる方法を提供することも本発明の目的である。
【００１７】
発明の説明
本発明の一つの態様は、アビポックスゲノムの非必須領域における病原体の抗原をコードしかつ発現させる任意の起源のＤＮＡの存在によって、修飾された合成組換えアビポックスウイルスを脊椎動物に接種することによって、前記病原体に対する免疫応答を脊椎動物中に誘起させる方法に関する。
【００１８】
別の態様においては、本発明は脊椎動物の細胞内では増殖的複製はしないがかかる細胞中で遺伝子産物又は抗原を発現する組換えウイルスを用いて、脊椎動物中で遺伝子産物を発現させる或いは脊椎動物に抗原に対する免疫応答を誘起させる方法に関する。
【００１９】
もう一つの態様においては、本発明は任意の起源、特に非アビポックス起源のＤＮＡをアビポックスゲノムの非必須領域に挿入することによって修飾した合成アビポックスウイルスに関する。
【００２０】
抗原をコードしかつ発現させる外来（即ち、非アビポックス）遺伝子を有する人工的に修飾したアビポックスウイルス組換え体は、前記抗原に対する脊椎動物宿主の免疫応答の発生を誘起させて、外来病原体に対する免疫応答の発生を誘起させるが、かかる組換え体は、本発明においては、死滅或いは弱毒化させた生きた生物を用いている従来のワクチンの欠点を、特に非鳥類脊椎動物に接種して用いるときに、有さない新規なワクチンを作製するのに用いられる。
【００２１】
アビポックスウイルス類は鳥類又は鳥類の細胞系においてのみ増殖的に複製でき、また継代することができることをここでもまた述べておく必要がある。鳥類宿主細胞から採取した組換えアビポックスウイルスは、ワクシニアウイルスによる哺乳類の接種と同様の方法で哺乳類のような非鳥類脊椎動物に接種すると、接種による病変が生じるが、アビポックスウイルスの増殖的複製は起こらない。このような接種を受けた非鳥類脊椎動物でアビポックスウイルスは増殖的複製を行わないにもかかわらず、ウイルスの発現は充分に起こり、その結果、接種された動物はこの組換えアビポックスウイルスの抗原決定基及び該ウイルスの外来遺伝子にコードされた抗原決定基に対して免疫学的に応答する。
【００２２】
鳥類に接種すると、かかる合成組換えアビポックスウイルスはその中に存在する任意の起源の外来ＤＮＡによってコードされる抗原に対する免疫応答を誘起するばかりでなく、宿主内でこのウイルスの増殖的複製を起こしてアビポックスベクター自体に対する予想された免疫学的応答を引き起こす。
【００２３】
数人の研究者らが、組換えファウルポックス、詳細には家禽を防護するための動物用ワクチンとして使用するためのウイルスを作製することを提案して来た。ボイル（Ｂｏｙｌｅ）及びクーパー（Ｃｏｕｐａｒ）、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７、１５９１−１６００（１９８６）及びビンズ（Ｂｉｎｎｓ）ら、Ｉｓｒ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．４２、１２４−１２７（１９８６）。哺乳類に特異的免疫を誘起する方法として組換えアビポックスウイルスを使用することに関し、提言されたことも全くなかったし、また実際に報告されたこともなかった。
【００２４】
スティックル（Ｓｔｉｃｋｌ）とマイヤー（Ｍａｙｅｒ）はＦｏｒｔｓｃｈｒ．  Ｍｅｄ．９７（４０）、１７８１−１７８８（１９７９）で、アビポックス、詳細にはファウルポックスウイルスのヒトヘの注射について記載している。しかし、これらの研究は、癌の化学療法の後遺症にかかっている患者における非特異性免疫を増強するために通常のファウルポックスを使用することだけに関している。組換えＤＮＡ技術は全く用いられていない。脊椎動物病原体の抗原をコードするＤＮＡをアビポックス中に挿入することも、また脊椎動物に特異的免疫を誘起する方法についても全く示唆されていない。その代わり、この先行技術はヒト宿主の一般的かつ非特異的な強壮効果に基づいている。
【００２５】
遺伝子組換えを基礎としたより完全な検討を加えることによって、本発明の修飾組換えウイルス類がいかに作製されるかの理解に役立つであろう。
【００２６】
遺伝子組換えは、一般にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の相同性部分を二つのＤＮＡらせん間で交換することである。（あるウイルスでは、リボ核酸（ＲＮＡ）がＤＮＡに置き代わることができる。）核酸の相同性部分は、ヌクレオチド塩基の同じ配列を持つ核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）の部分である。
【００２７】
遺伝子組換えは、感染した宿主細胞内で新規ウイルスゲノムの複製或いは産生時に自然に起きることもある。従って、ウイルス遺伝子間の遺伝的組換えは、二種以上の異なるウイルス又は他の遺伝子構造体に同時に感染した宿主細胞内で起きるウイルス複製サイクル中にも起こりうる。第一のゲノムのＤＮＡ部分が、第一のウイルスゲノムＤＮＡと相同のＤＮＡを有する同時感染した第二のウイルスゲノムの部分を組み立てる際に交換して用いられる。
【００２８】
しかし、組換えは、また、完全には相同とは言えない異なるゲノムにおけるＤＮＡ部分間でも起こり得る。例えば、このような部分がゲノムのある部分と相同な第一のゲノムに由来するが、ただし第一のゲノム内の相同ＤＮＡ部分に遺伝子マーカー又は抗原決定基をコードする遺伝子が挿入されているような場合にも、組換えは起こり得るし、その組換えによる産物もその遺伝子マーカー又は抗原決定基の存在により検出できる。
【００２９】
挿入ＤＮＡ遺伝子配列が修飾感染性ウイルスによって良好に発現されるためには二つの条件が必要となる。
【００３０】
まず第一に、修飾ウイルスが生存可能であり続けるためには、挿入は前記ウイルスの非必須領域内でなければならない。ファウルポックスもアビポックスウイルスもこれまで示唆されてきたところによると、ワクシニアウイルスに関して記述されて来た非必須領域と類似の領域を有していない。したがって、本発明のファウルポックスの非必須領域は、ファウルポックスゲノムを断片に切断しこの断片を大きさで分離しこれらの断片を増幅させるためのプラスミド構造体に挿入することによって発見された(プラスミドとは、大腸菌を含む多くの細菌で染色体外要素として見出された小さな環状ＤＮＡ分子である。抗原決定基遺伝子又は他の遺伝子マーカーのようなＤＮＡ配列をプラスミドに挿入する方法は、当技術で周知であり、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ニューヨーク［１９８２］に詳細に記載されている)。次に、遺伝マーカー及び／又は抗原をコードする遺伝子をクローン化されたファウルポックス断片に挿入した。所定の組換えに成功した断片は遺伝マーカー又は抗原の回収が良好であることによって実証でき、かかる断片はファウルポックスゲノムの非必須領域に挿入されたＤＮＡより成る断片であった。
【００３１】
挿入ＤＮＡ発現のための第二の条件は、挿入されたＤＮＡと適切な関係にあるプロモーターが存在することである。プロモーターは、発現させるＤＮＡ配列の上流に位置するように置かなければならない。アビポックスウイルスの性質は充分に解明されておらず、またアビポックスプロモーターについてもこれまで当技術で同定されていないので、本発明の一部では他のポックスウイルスの公知のプロモーターを発現させるＤＮＡの上流に効果的に挿入する。ファウルポックスプロモーターはまた、本発明の方法を実施しかつ本発明の産物を作るために用いられ成功している。本発明によって、ファウルポックスプロモーター、ワクシニアプロモーター及びエントモポックスプロモーターが組換えポックスウイルスの転写を促進することが判明した。
【００３２】
ボイル（Ｂｏｙｌｅ）とクーパー（Ｃｏｕｐａｒ）はＪ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏ１．  ６７、１５９１（１９８６）で、ワクシニアプロモーターが「（ファウルポックス）ウイルスで作用することが予測される」という推測を発表した。この著者らは、ファウルポックスＴＫ遺伝子の場所を確認しクローン化（ボイル（Ｂｏｙｌｅ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６、３５５−３６５［１９８７］）して、これをワクシニアウイルスに挿入した。このＴＫ遺伝子は発現したが、恐らくそれは、ワクシニアポリメラーゼの機能によってこのファウルポックスＴＫプロモーターの配列が認識されたことによるのだろう。しかし、彼らの推測にもかかわらず、この著者らはファウルポックスウイルスにワクシニアプロモーターを挿入することはしなかったし、またファウルポックスゲノム中で外来ＤＮＡ配列が発現することも観察しなかった。他のポックスウイルス由来のプロモーター、例えばワクシニアプロモーターがアビポックスゲノム中で実際に遺伝子の転写を促進させることは本発明以前には公知でなかった。
【００３３】
好ましい実施例の説明
ファウルポックス及びカナリーポックスウイルスが、本発明の外来ＤＮＡを取り込み組換えによって修飾される好ましいアビポックス種として特に用いられた。
【００３４】
ファウルポックスは、特にニワトリに感染するアビポックスの一種であるが、哺乳類には感染しない。本明細書中でＦＰ−５と呼ばれるファウルポックス株は、アメリカン・サイエンティフィック・ラボラトリーズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（シェーリング社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）の一部門）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ワイオミング州、米国獣医免許番号１６５、通し番号３０３２１、から入手可能なニワトリ胚由来の市販ファウルポックスウイルスワクチン株である。
【００３５】
本明細書中でＦＰ−１と呼ばれるファウルポックス株は、生後1日目のニワトリのワクチンに用いるための改良ドゥベット（Ｄｕｖｅｔｔｅ）株である。この株はＯ  ＤＣＥＰ２５／ＣＥＰ６７／２３０９オクトーバー１９８０と呼ばれる市販ファウルポックスウイルスワクチン株であり、インスティチュート・メリークス社（ｌｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｉｎｃ．）から入手可能である。
【００３６】
カナリーポックスはアビポックスの一つの種である。ファウルポックスと同様に、カナリーポックスは特にカナリヤに感染するが、哺乳類には感染しない。本明細書中でＣＰと呼ばれるカナリーポックス株は、ＬＦ２  ＣＥＰ５２４  ２４１０  ７５と呼ばれる市販カナリーポックスワクチン株であり、インスティチュート・メリークス社から入手可能である。
【００３７】
本発明の遺伝子組換えによってこれらのアピポックスウイルスに挿入されたＤＮＡ遺伝子配列には、原核生物由来のＬａｃ  Ｚ遺伝子、非鳥類（特に哺乳類）病原体のひとつの抗原である狂犬病糖タンパク(Ｇ)遺伝子、アビポックスウイルス以外の病原性鳥類ウイルスの抗原であるターキーインフルエンザ赤血球凝集素遺伝子、哺乳類ウイルスの一つであるウシ白血病ウイルスのｇｐ５１，３０エンベロープ遺伝子、鳥類ウイルスの一つであるニューカッスル病ウイルス（テキサス（Ｔｅｘａｓ）株）の融合タンパク質遺伝子、哺乳類ウイルスであるネコ白血病ウイルスのＦｅＬＶエンベロープ遺伝子、鳥類ウイルス／家禽の病気であるラウス関連ウイルスのＲＡＶ−１  ｅｎｖ遺伝子、鳥類ウイルスであるチキン／ペンシルバニア（Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）／１／８３インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子、鳥類ウイルスである感染性気管支炎ウイルス（Ｍａｓｓ  ４１株）のマトリックス遺伝子とペプロマー遺伝子、哺乳類ウイルスである単純ヘルペスウイルスの糖タンパクＤ遺伝子(ｇＤ)が含まれている。
【００３８】
前記Ｌａｃ  Ｚ遺伝子の単離は、カサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）らがＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １００、２９３−３０８（１９８３）に記載している。狂犬病Ｇ遺伝子の構造は、例えば、アニリオニス（Ａｎｉｌｉｏｎｉｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９４、２７５−２７８（１９８１）に開示されている。
【００３９】
ワクシニアヘの組み込み及び本ベクター内での発現は、キーニィ（Ｋｉｅｎｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、１６３−１６６（１９８４）によって検討されている。ターキーインフルエンザ赤血球凝集素遺伝子は、カワオカ（Ｋａｗａｏｋａ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５８、２１８−２２７（１９８７）によって述べられている。ウシ白血病ウイルスｇｐ５１，３０  ｅｎｖ遺伝子は、ライス（Ｒｉｃｅ）らがＶｉｒｏｌｏｇｙ  １３８、８２−９３（１９８４）に記載している。ニューカッスル病ウイルス（テキサス株）の融合遺伝子は、プラスミドｐＮＤＶ１０８としてインスティチュート・メリークス社から入手可能である。ネコ白血病ウイルスｅｎｖ遺伝子は、ギルホット（Ｇｕｉｌｈｏｔ）らがＶｉｒｏｌｏｇｙ  １６１、２５２−２５８（１９８７）に記載している。ラウス関連ウイルス１型は二つのクローン、ｐｅｎ  ＶＲＶＩＰＴとｍｐ１９ｅｎｖ（１９０）としてインスティチュート・メリークス社から入手可能である。チキンインフルエンザＮＰ遺伝子は、プラスミドｐＮＰ３３としてセイント・ジュード小児研究病院（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａ１）のヨシヒロ・カワオカ（Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ  Ｋａｗａｏｋａ）から入手できる。ＩＢＶ  Ｍａｓｓ４１マトリックス遺伝子及びペプロマー遺伝子の感染性気管支炎ウイルスのｃＤＮＡクローンは、プラスミドｐＩＢＶＭ６３として、インスティチュート・メリークス社から入手できる。単純ヘルペスウイルスｇＤ遺伝子は、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）らのＳｃｉｅｎｃｅ  ２１８、３８１−３８４（１９８２）に記載されている。
【００４０】
以下に更に詳細に記載した組換えアビポックスウイルスには、ワクシニアプロモーター三種のうちのひとつを組み込む。ワクシニアのＡｖａ  I  Ｈ領域由来のＰｉプロモーターはワックスマン（Ｗａｃｈｓｍａｎ）らがＪ．  ｏｆ  Ｉｎｆ．  Ｄｉｓ．  １５５、１１８８−１１９７（１９８７）に記載している。さらに詳細に言えぱ、このプロモーターはＬ変異ＷＲワクシニア株のＡｖａ  I  Ｈ（Ｘｈｏ  I  Ｇ）断片に由来し、この中で前記プロモーターは右から左への転写を指示する。このプロモーターの地図上での位置はＡｖａ  I  Ｈの左端からおよそ１．３Ｋｂｐ（キロベースペア）、ワクシニアゲノムの左端からおよそ１２．５Ｋｂｐであり、Ｈｉｎｄ  IIIＣ／Ｎ結合の約８．５Ｋｂｐにある。このプロモーターの配列は、
【化１】
0003826055.tif 000002
であり、上記配列中カッコ内の記号はリンカー配列である。
【００４１】
前記Ｈｉｎｄ  III  Ｈプロモーター(本明細書中で「ＨＨ」及び「Ｈ６」とも呼ばれる)は、標準的な転写マッピング法で明らかとなった。これは、下記の配列を有する。
【００４２】
【化２】
0003826055.tif 000003
この配列は、ローゼル（Ｒｏｓｅｌ）ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏ１．  ６０、４３６−４４９（１９８６）によって読み取り枠の上流の配列として記載されたものと同一である。
【００４３】
１１Ｋプロモーターは、ウィテック（Ｗｉｔｔｅｋ）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４９、３７１−３７８（１９８４）及びバーソレット（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ，Ｃ）他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、２０９６−２１００（１９８５）に記載のとおりである。
【００４４】
本発明の組換えアビポックスウイルス類は、当技術で公知の合成アビポックスウイルス組換え体を作製する前述の米国特許第４，６０３，１１２号に開示の方法と同様に二段階で作製した。
【００４５】
最初に、ウイルスに挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列を、アビポックスウイルスの非必須領域と相同のＤＮＡを挿入した大腸菌（Ｅ．ｃｏ１ｉ）プラスミド構造体に入れる。これとは別に、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモーターに結合させる。プロモーター・遺伝子結合物を次にプラスミド構造体中に入れ、アビポックスＤＮＡの非必須領域と相同のＤＮＡに対し両端で隣接させる。得られたプラスミド構造体を大腸菌内で増殖させて増幅させる。(プラスミドＤＮＡは、外来遺伝物質を保有し増幅するために用いられるが、この方法は当技術で周知である。例えば、これらのプラスミド技術については、クレウェル（Ｃｌｅｗｅｌｌ）がＪ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１０、６６７−６７６（１９７２）に記載している。宿主大腸菌から増幅プラスミドを単離する技術は、これも当技術で周知であり、例えば、クレウェルらがＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．
ＵＳＡ  ６２、１１５９−１１６６（１９６９）に記載している。)
【００４６】
大腸菌内で増殖後単離した増幅プラスミド物質を次に第二段階に用いる。即ち、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列を含有するプラスミドをアビポックスウイルス（ファウルポックス株ＦＰ−１又はＦＰ−５等）と共に例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）のような培養細胞にトランスフェクションさせる。プラスミド中の相同ファウルポックスＤＮＡとウイルスゲノム間の組換えによって、このゲノムの非必須領域において非ファウルポックスＤＮＡ配列の存在によって修飾されたアビポックスウイルスが出来る。
【００４７】
本発明及び本発明の多くの利点については例示した以下の実施例でより理解が深まることであろう。
【００４８】
実施例１ ファウルポックスＲＮＡ転写因子によるワクシニアプロモーターの認識を示唆する過渡的発現のアッセイ
ワクシニアウイルスプロモーター配列に結合し、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原(ＨＢｓＡｇ)をコードする配列を含有するいくつかのプラスミド構造体を作製した。各プラスミドの５０μｇを、細胞1個当たり１０ｐｆｕのファウルポックスウイルス又はワクシニアウイルスに感染したＣＥＦ細胞にトランスフェクションさせた。感染を２４時間進行させ、次に、凍結・融解を三回連続繰り返して溶解させた。
【００４９】
この溶解質中のＨＢｓＡｇの量を、アボット・ラボラトリーズ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の診断薬部（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）から市販されているオースリア（ＡＵＳＲＩＡ）II−１２５Ｉキットを用いて評価した。ＨＢｓＡｇの有無を、製造者が事前に設定した陰性カットオフ値に対する未知検体の正味計数(バッググラウンド値を減じた検体値)の比として示す。これを、Ｐ／Ｎ(陽性／陰性)比として示す。この結果を表Ｉに示す。
【００５０】
異なるワクシニアプロモーター配列３種、つまり、ＤＮＡ複製前のワクシニア感染初期に見られるＰｉプロモーター、ＤＮＡ複製開始後のワクシニア感染後期に見られるｌｌＫプロモーター、ワクシニア感染の初期及び後期の両期に見られるＨｉｎｄ  III  Ｈ(ＨＨ)プロモーター、を用いた。これらのプロモーターについては、本明細書において既に記載してある。
【００５１】
上記データから、感染細胞の溶解質中に産生されたＨＢｓＡｇが、ファウルポックス又はワクシニア転写因子によってワクシニアプロモーターが認識された結果であることが示唆される。
【００５２】
【表１】
0003826055.tif 000004
【００５３】
実施例２ ＬＡＣ  Ｚ遺伝子含有組換えファウルポックスウイルスｖＦＰ−１の作製
ファウルポックスウイルスの非必須領域内のひとっの断片を以下のようにしてその位置を同定して単離した。
【００５４】
ヌクレアーゼＢａｌ ３１を用い、ＦＰ−５ＤＮＡの一本鎖末端のヘアピンループを除去した。ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ(大)フラグメントを用いてブラントエンドを生じさせた。ループ除去後、Ｂｇｌ  IIによる制限酵素消化によって前記断片を作製した。この消化によって一連のＦＰ−５断片ができたが、これらはアガロースゲル電気泳動で分離した。
【００５５】
８．８ＫｂｐのＢｇｌ  IIブラントエンドを有する断片を単離し、Ｂａｍ  ＨIとＳｍａ  Iで切断してある市販のプラスミドｐＵＣ９と連結させた。生成したプラスミドをｐＲＷ６９８と命名した。
【００５６】
ファウルポックス断片の大きさを小さくするため、このプラスミドをＨｉｎｄ  IIIで切断してさらに二つの断片を生じさせた。６．７Ｋｂｐの断片を捨て、残る４．７Ｋｂｐの断片を二つ連結し、新規プラスミドｐＲＷ６９９を作製した。
【００５７】
このプラスミドに１１Ｋプロモーターで転写促進されるＬａｃ  Ｚ遺伝子を組み込むため、ｐＲＷ６９９をＥｃｏＲVで切断した。このＥｃｏＲVは前記プラスミドを１ヵ所でのみ切断する。この挿入座をＦ３と名付けた。この１１Ｋプロモーターで転写促進されるＬａｃ  ＺセグメントをブラントエンドのＰｓｔ  I−Ｂａｍ  ＨI断片として挿入し、新規プラスミドｐＲＷ７０２を作製した。このＬａｃ  Ｚクローンは、前記引用文献中でカサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）らが記載しているようにｐＭＣ１８７１由来である。前記１１Ｋプロモーターは、Ｂａｍ  ＨIリンカーによりＬａｃ  Ｚ遺伝子の第８コドンに連結された。
【００５８】
米国特許第４，６０３，１１２号記載のワクシニアに関する組換え技術を用い、このｐＲＷ７０２プラスミドを次にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で増殖させたファウルポックスウイルスＦＰ−５に組換えた。この時、ｖＦＰ−１を作製するため以下の操作を用いた。ｐＲＷ７０２  ＤＮＡ５０μｇを全ゲノムファウルポックスＤＮＡ０．５μｇと混合し、最終容量を1００μｌとした。２．５ＭＣａＣｌ２を１０μｌ、及び４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭデキストロースから調製した２×ＨＥＢＳ緩衝液（ｐＨ７）１１０μｌをこれに添加した。室温に３０分間置いた後、５ｐｆｕ／細胞となるように希釈したファウルポックスウイルスプール２００μｌを添加した。その後、この混合物を、初代ＣＥＦ単層を含む６０ｍｍディッシュ上に接種した。この時、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有イーグル（Ｅａｇｌｅｓ）培地０．７ｍｌも添加した。このプレートを３７℃で２時間インキュベートした後、２％ＦＢＳ含有イーグル培地３ｍｌを添加し、プレートを３日間インキュベートした。細胞を、凍結・融解を３回連続的に繰り返すことによって溶解させた後、新形成ウイルス粒子を組換え体存在下にアッセイした。
【００５９】
１１Ｋプロモーターで転写促進されるＬａｃ  Ｚ遺伝子をファウルポックスＦＰ−５ゲノム中に組み換えたことによる挿入が成功したことの証拠は、Ｌａｃ  Ｚ遺伝子の発現を試験することによって得られた。Ｌａｃ  Ｚ遺伝子は酵素β−ガラクトシダーゼをコードし、この酵素はクロモゲンである５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を切断し青色のインドリル誘導体を放出させる。青色プラークを陽性組換え体として選択した。
【００６０】
Ｌａｃ  ＺのファウルポックスＦＰ−５ゲノムヘの挿入とその発現の成功は、ｖＦＰ−１感染ＣＥＦ、ＢＳＣ（サル腎細胞株−ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＶＥＲＯ（サル腎細胞株−ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８１）、及びＭＲＣ−５（ヒト二倍体肺細胞株−ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）を用いた標準法及び市販の抗血清とのβ−ガラクトシダーゼの免疫沈降によっても確認した。
【００６１】
組換えウイルスｖＦＰ−１によるβ−ガラクトシダーゼの発現を、さらに、ウサギ及びマウスにこのウイルスを接種し、接種動物血清中のβ−ガラクトシダーゼタンパクに対して生じた抗体の力価の接種後の上昇を測定しそれが良好であることによって、インビボでも確認した。
【００６２】
特に、前記組換えｖＦＰ−１を感染宿主細胞から精製し、ウサギ２匹の両側のそれぞれ２ヵ所に皮内注射した。各ウサギに総計で１０８ｐｆｕを接種した。
【００６３】
一週間おきに動物から採血し、その血清を市販の精製β−ガラクトシダーゼ標品を抗原として用いたＥＬＩＳＡアッセイで検出した。
【００６４】
この組換えｖＦＰ−１を接種されたウサギとマウスの双方ともに、β−ガラクトシダーゼタンパクに対する免疫応答を生じていることがＥＬＩＳＡ法で検出された。両種において、接種一週後にこの応答が検出できた。
【００６５】
実施例３ ファウルポックスウイルスＦＰ−５からの狂犬病Ｇ遺伝子及びＬＡＣ  Ｚ含有組換えウイルスｖＦＰ−２の作製
０．９ＫｂｐのＰｖｕ  II断片をＦＰ−５から得、標準的手法によりｐＵＣ９の二つのＰｖｕ  II部位間に挿入した。生成した構造物ｐＲＷ６８８．２はＨｉｎｃ  II部位を２ヵ所、およそ３０ｂｐ離れた位置にＰｖｕ  II断片内に非対称的に有しており、これによってこの断片から長腕と短腕を形成させる。
【００６６】
オリゴヌクレオチドアダプターを、Ｐｓｔ  I及びＢａｍ  ＨI部位を導入するための公知の技術を用いて、これらのＨｉｎｃ  II部位間に挿入し、プラスミドｐＲＷ６９４を作製した。これらの挿入座をＦ１と名付けた。
【００６７】
次に、このプラスミドをＰｓｔ  IとＢａｍ  ＨIで切断し、既に述べた連結１１Ｋワクシニアプロモーターを有するＬａｃ  Ｚ遺伝子を挿入して新規プラスミドｐＲＷ７００を作製した。
【００６８】
Ｐｉプロモーターで転写促進される狂犬病Ｇ遺伝子を作製するため、狂犬病Ｇ遺伝子の５’末端に近接したＢｇｌ  II部位（キーニイ（Ｋｉｅｎｙ）ら、上記引用文献参照）をブラントエンドにし、既に述べたＰｉプロモーターの一本鎖部分を埋めたＥｃｏ  ＲI部位に連結した。
【００６９】
この構造体をｐＲＷ７００のＰｓｔ  I部位に挿入し、その中に外来遺伝子配列Ｐｉ−狂犬病ＧｌｌＫ−Ｌａｃ  Ｚを有するｐＲＷ７３５．１プラスミドを作製した。この挿入は、ＦＰ−５ドナー配列のＰｖｕ  II−Ｈｉｎｃ  II長腕がＬａｃ  Ｚ遺伝子に対して３’側になるように、プラスミド中で位置づける。
【００７０】
得られた最終構造体は、既に述べた組換えファウルポックスウイルスｖＦＰ−２作製法によってニワトリ胚線維芽細胞に感染／トランスフェクションさせることによってファウルポックスウイルスＦＰ−５と組み換えた。この組換えウイルスはＸ−ｇａｌ染色によって選択した。
【００７１】
前記Ｌａｃ  Ｚ遺伝子と狂犬病Ｇ遺伝子の両者が適切に挿入されかつ発現されたことを、下記の様々な追加方法で確認した。
【００７２】
特異抗体を用いた免疫蛍光法によって狂犬病抗原の位置を決定すると、ｖＦＰ−２ウイルスに感染した鳥類細胞又は非鳥類細胞表面上で狂犬病ウイルスが良好に発現していることが示された。
【００７３】
既に述べたように、ｖＦＰ−２ウイルスに感染した鳥類又は非鳥類細胞による狂犬病抗原及びβ−ガラクトシダーゼの発現は、免疫沈降法で確認した。
【００７４】
本発明のｖＦＰ−２に関する実施態様が狂犬病Ｇ遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保有する組換えウイルスの成功例であることのもうひとつの証拠は、ウサギ２匹にｖＦＰ−２ウイルスを接種することによって得られた。二匹のウサギに対して1匹当たり１×１０８ｐｆｕのｖＦＰ−２を皮内に接種した。１週間おきにウサギから採血して血清をＥＬＩＳＡで試験し、狂犬病糖タンパク質及びβ−ガラクトシダーゼタンパク質の特異抗体の存在を検出した。
【００７５】
下記の表IIに載せたように、ウサギ２０５は接種1週間後において抗β−ガラクトシダーゼ抗体をＥＬＩＳＡ試験で検出可能な量で示した。これは２週目には４０００分の１の力価に上昇し、接種後５週まで持続した。抗原捕獲ＥＬＩＳＡアッセイを用いるとウサギ２０５の血清は、接種後３週から１０週まで検出可能量の抗狂犬病抗体を示した。
【００７６】
【表２】
0003826055.tif 000005
【００７７】
実施例４Ａ ファウルポックスウイルスＦＰ−１からの転写促進される狂犬病Ｇ遺伝子含有組換えウイルスｖＦＰ−３の作製
本実施例は、前記狂犬病Ｇ遺伝子がＦＰ−５以外のファウルポックス株、特にＦＰ−１と呼ばれるファウルポックスウイルスの別の株によって完全に発現されることを示すものである。
【００７８】
実施例３のように、ＦＰ−５におけるのと同様に０．９ＫｂｐのＰｖｕ  II断片が非必須領域を含有するとの仮定のもとに、ＦＰ−１からこの断片を得た。
【００７９】
この断片をｐＵＣ９の二つのＰｖｕ  II部位に挿入し、ｐＲＷ７３１．１５Ｒと命名したプラスミドを作製した。
【００８０】
このプラスミドは、Ｐｖｕ  II断片内に約３０ｂｐ離れた非対称の位置に二つのＨｉｎｃ  II部位を有し、これによって、本断片の長腕と短腕を形成する。
【００８１】
市販のＰｓｔリンカー、（５’）−ＣＣＴＧＣＡＧＧ−（３’）を二つのＨｉｎｃ  II部位に挿入してプラスミドｐＲＷ７４１を作製した。
【００８２】
ＨＨプロモーターで転写促進される狂犬病Ｇ遺伝子をＰｓｔ  I部位でこのプラスミドに挿入し、新規プラスミドｐＲＷ７４２Ｂを作製した。ＣＥＦ細胞の感染／トランスフェクションによってこのプラスミドをＦＰ−１と組み換えることによって、ウイルスｖＦＰ−３を得た。
【００８３】
前記ＨＨプロモーターによって転写促進される読み取り枠のＡＴＧ翻訳開始コドンを、ＨＨプロモーター内のＥｃｏ  ＲV部位と前記狂犬病Ｇ遺伝子内のＨｉｎｄ  III部位とをっなぐ合成オリゴヌクレオチドを用いて狂犬病Ｇ遺伝子の開始コドン上に重ねた。かかるＨＨプロモーターによって転写促進される狂犬病Ｇ遺伝子の５’末端を公知の技術を用いて修飾し、Ｐｓｔ  I部位をひとつ含有させた後、この構造体をｐＲＷ７４１のＰｓｔ  I部位に連結させ、ｐＲＷ７４２Ｂを作製した。このプラスミド中におけるこの構造体の位置は、実施例３で既に述べたｐＲＷ７３５．１におけるものと同じである。
【００８４】
実施例２に述べたように、組換えを行った。生成した組換え体をｖＦＰ−３と呼ぶ。
【００８５】
ｖＦＰ−３ウイルスに感染した鳥類及び非鳥類細胞の両者による狂犬病抗原の発現は、既に述べた免疫沈降法及び免疫蛍光法で確認した。
【００８６】
本発明のｖＦＰ−３に関する実施態様が狂犬病Ｇ遺伝子を発現する組換えウイルスの成功例であることのもうひとつの証拠が、組換えウイルスをウサギ２匹に皮内接種することによって得られた。ウサギ２匹を１匹当たり１×１０８ｐｆｕのｖＦＰ−３で皮内接種した。これらのウサギは双方ともに、典型的なポックス病巣を生じ、これは接種５〜６日後に最大の大きさに達した。ウサギから毎週採血して血清をＥＬＩＳＡで試験し、前記狂犬病糖タンパクに特異的な抗体の存在を検出した。
【００８７】
５匹のラットそれぞれにｖＦＰ−３を５×１０７ｐｆｕ皮内接種した。全部の動物に病巣が残った。
【００８８】
ウサギ及びラットともに、接種後２週間までに検出可能なレベルの狂犬病に特異的な抗体を産生した。親のＦＰ−１ウイルスを皮内接種された対照のウサギ２匹は、検出可能なレベルの抗狂犬病抗体を全く示さなかった。この抗体の応答が実験に用いた動物体内における狂犬病抗原の組換えウイルスによるデノボ合成によって誘起されたのではなくて、接種ウイルスと共に持ち込まれたか又は組換えファウルポックスウイルス膜に組み込まれたかによって偶然に狂犬病抗原が導入されて起こった可能性を除外するために、このｖＦＰ−３ウイルスを化学的に不活化し、ウサギに接種した。
【００８９】
精製ウイルスを４℃で一晩、０．００１％のβ−プロピオラクトンの存在下に不活化した後、遠心分離によりペレットとした。ペレットにしたウイルスを１０ｍＭトリス緩衝液中に集めて超音波処理し、力価を検定して感染ウイルスが全く残っていないことを確めた。ウサギ２匹に不活化ｖＦＰ−３を皮内接種し、同量の未処理の組換え体を別の２匹に皮内接種した。病巣の大きさをモニターした。
【００９０】
未処理ｖＦＰ−３を受けたウサギ２匹共、接種後５日で４−５＋等級の典型的な病巣を生じた。不活化ウイルスを接種したウサギもまた病巣を生じたが、これらは接種後５日で２＋等級であった。
【００９１】
ウサギを一週おきに採血し、血清をＥＬＩＳＡで試験し、狂犬病の特異抗体及びファウルポックスの特異抗体の存在を調べた。結果を以下の表IIIに示した。
【００９２】
【表３】
0003826055.tif 000006
【００９３】
この試験においては、力価終末点（血清希釈の逆数として示す）を、抗原投与前の血清の吸収値を差引いた後、任意に０．２と定めた。ウサギ２９５と３１８は共に生きたウイルスを投与され、狂犬病糖タンパク及びファウルポックスウイルス抗原に対し免疫応答を生じた。ウサギ３０３と３２０もファウルポックスウイルス抗原に対しては免疫応答を生じたがその力価は低かった。このウサギはどちらも狂犬病糖タンパクに対して検出可能な応答を生じなかった。
【００９４】
この知見から、ウサギに生じた免疫応答が組換えウイルスが保有する狂犬病糖タンパク遺伝子のデノボ発現に起因し、接種ウイルス内に偶然に持ち込まれた糖タンパクに対する反応ではないことが示唆される。
【００９５】
実施例４Ｂ ファウルポックスウイルスＦＰ−１からの転写能のない狂犬病Ｇ遺伝子含有組換えウイルスｖＦＰ−５の作製
組換えによってファウルポックスゲノム中に挿入された外来遺伝子の発現には、プロモーターの存在が必要である。ＨＨプロモーターを欠いていること以外ｖＦＰ−３と同一の組換え体ｖＦＰ−５を作製してこのことを示した。この組換え体に狂犬病遺伝子が存在することを核酸のハイブリッド形成により確認した。しかし、このウイルスに感染したＣＥＦ細胞培地中に狂犬病抗原は全く検出されなかった。
【００９６】
実施例５ ファウルポックスウイルスが非鳥類細胞で複製するか否かを決定するためのインビトロ継代実験
鳥類１種及び非鳥類２種の３種の細胞系に対しＦＰ−１親株又は組換えｖＦＰ−３を接種して実験を行った。ＣＥＦ、ＭＲＣ−５、及びＶＥＲＯのそれぞれ２枚の皿に、ＦＰ−１又はｖＦＰ−３を細胞１個当り１０ｐｆｕの接種の多重度で接種した。
【００９７】
３日後に、それぞれについて一枚の皿から細胞を採取した。凍結・融解を連続三回繰り返し、前記ウイルスを放出させた後、同細胞系統の新鮮単層に再接種した。これを、６回連続的に継代し、実験の最後に各継代の検体の力価を検定してＣＥＦ単層上におけるウイルス感染性を調べた。
【００９８】
結果を表IVＡに示した。この結果から、ＣＥＦ細胞でＦＰ−１及びｖＦＰ−３の双方の連続継代が可能であること、しかし、前記非鳥類細胞系統２種のいずれにおいても不可能であることが示唆された。感染性ウイルスは、ＶＥＲＯ又はＭＣＲ−５細胞中において、３又は４継代後には検出できない。
【００９９】
二番目の皿は直接滴定で検出不能のウイルスが増幅後に許容ＣＥＦ細胞で検出できるかどうかを決めるために用いられた。
【０１００】
３日後に、二番目の皿の細胞をかき取って採取し、この細胞の３分の1を溶解し新鮮ＣＥＦ単層上に接種した。細胞変性効果(ＣＰE)が最大となった時又は接種後７日目に、この細胞を溶解しウイルスの収率を滴定した。結果を表IVＢに示す。ＣＥＦ細胞中における継代を用いて存在するウイルスの全てを増幅した時、このウイルスは４又は５継代後には検出できなかった。
【０１０１】
絶えず感染している細胞を確立しようと試みたが失敗した。
【０１０２】
さらに、非鳥類細胞において連続してウイルスが発現する証拠を検出することを試みた。上記のウイルスの力価の検定に用いた検体を標準イムノドットアッセイに使用した。このアッセイでは、抗ファウルポックス抗体及び抗狂犬病抗体を用い、それぞれの抗原の存在を検出した。これらのアッセイの結果で力価検定の結果を確認した。
【０１０３】
【表４】
0003826055.tif 000007
【０１０４】
【表５】
0003826055.tif 000008
【０１０５】
実施例６ 他のファウルポックスＦＰ−１組換え体：ｖＦＰ−６、ｖＦＰ−７、ｖＦＰ−８及びｖＦＰ−９
組換えウイルスｖＦＰ−６とｖＦＰ−７を以下の操作で作製した。
【０１０６】
ＦＰ−１の５．５Ｋｂｐ  Ｐｖｕ  II断片をｐＵＣ９の二つのＰｖｕ  II部位間に挿入し、プラスミドＰＲＷ７３１．１３を作製した。次に、このプラスミドをその唯一のＨｉｎｃ  II部位で切断し、ＨＨ−プロモーターを有しかつブラントエンドとした狂犬病Ｇ遺伝子を挿入してプラスミドｐＲＷ７４８Ａ及びｐＲＷ７４８Ｂを作製した。これらのプラスミドは、その挿入の向きが反対であることを示している。プラスミドｐＲＷ７４８ＡとＢを次に別々に用いて、ＦＰ−１ウイルスと共にＣＥＦ細胞にトランスフェクションさせ、組換えによってそれぞれｖＦＰ−６及びｖＦＰ−７を作製した。この遺伝子座を座ｆ７と名付けた。
【０１０７】
ＦＰ−１の１０Ｋｂｐ  Ｐｖｕ−II断片をｐＵＣ９の二つのＰｖｕ  II部位間に挿入しｐＲＷ７３１．１５を作製した。このプラスミドを次に唯一のＢａｍ  ＨI部位で切断し、次に１１Ｋプロモーターを有するＬａｃ  Ｚ遺伝子断片を挿入し、この挿入の向きが逆であるｐＲＷ７４９ＡとｐＲＷ７４９Ｂを作製した。これらのドナープラスミドをＦＰ−１と組換えて、それぞれｖＦＰ−８及びｖＦＰ−９を得た。この遺伝子座を座ｆ８と名付けた。
【０１０８】
ｖＦＰ−８及びｖＦＰ−９は、Ｘ−ｇａｌによって検出されるＬａｃ  Ｚ遺伝子を発現した。ｖＦＰ−６とｖＦＰ−７は、狂犬病特異抗血清によって検出される狂犬病Ｇ遺伝子を発現した。
【０１０９】
実施例７ 狂犬病生ウイルスによる攻撃から動物を保護するためのｖＦＰ−３による免疫
メスのＳＰＦマウス（４−６週齢）２０匹のグループを、マウス1匹当たり０．７乃至６．７  ＴＣＩＤ５０の範囲の投与量で足趾にｖＦＰ−３  ５０μｌを接種した（ＴＣＩＤ５０、即ち組織培養感染量は、組織培養細胞の５０％が細胞変性効果を受ける量である）。接種後１４日目に各群のマウス１０匹を屠殺し、血清検体をＲＦＦＩ試験のアッセイ用に採取した。残りの１０匹のマウスに対し、狂犬病ＣＶＳ株を大脳に１０ＬＤ５０の量で接種して攻撃した後、１４日目に生存数を数えた。
【０１１０】
結果を以下の表VＡに示した。
【０１１１】
【表６】
0003826055.tif 000009
【０１１２】
本実験を１２．５ＬＤ５０の量の狂犬病ウイルスで攻撃して繰り返した。結果を下記の表VＢに示す。
【０１１３】
【表７】
0003826055.tif 000010
【０１１４】
イヌ、ネコ各２匹に対して、組換えｖＦＰ−３の１ｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の８倍量を一回静脈接種し免疫した。さらに、年齢及び体重が同等のイヌ２匹とネコ４匹を非ワクチン接種対照群とした。一週おきに全動物から採血した。９４日目に、各イヌに対してインスティチュート・メリークス社から入手した狂犬病ウイルスＮＹ株の唾液腺ホモジネート０．５ｍｌを２回、側頭筋に接種して攻撃した。総投与量は大脳経路によるマウスＬＤ５０の1万倍に相当した。ネコ６匹を同様に、同ウイルスサスペンジョンの０．５ｍｌを２回、首の筋肉に接種して攻撃した。ネコ１匹当たりの総投与量は、大脳経路のマウスＬＤ５０の４万倍に相当した。動物を毎日観察した。非ワクチン接種の動物は全て、狂犬病の症状を示して表VIに示した日に死亡した。ワクチン接種を受けた動物は攻撃に対して生き残り、対照動物の最後の１匹が死亡した３週間後まで観察した。結果を以下の表VIに示した。
【０１１５】
【表８】
0003826055.tif 000011
【０１１６】
さらに、組換えウイルスｖＦＰ−２とｖＦＰ−３を幾つかの異なる経路でウシに接種する実験を行った。
【０１１７】
接種動物に対し、抗狂犬病抗体を６、１４、２１、２８及び３５日に試験した。以下の表VIIＡに示に示すように、全動物が狂犬病抗原に対し血清学的反応を示した。
【０１１８】
【表９】
0003826055.tif 000012
【０１１９】
ウシはすべて接種して５５日目にｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の８倍量を再接種され、この狂犬病抗原に対し既往反応を示した。１４２１番を除くウシ全てに対し、ワクチン再接種による追加免疫を行った。１４２１番のウシには再度筋注で接種した。ＲＦＦＩ力価を５５、５７、６３、７０、７７及び８６日後に測定した。
【０１２０】
結果を表VIIＢに示した。
【０１２１】
【表１０】
0003826055.tif 000013
【０１２２】
１４２３番の動物のデータがｖＦＰ−２による以外、全てのデータはｖＦＰ−３である。
【０１２３】
ウシ、ネコ及びウサギも既知量のファウルポックスウイルスを皮内接種し、約１週後に動物からかさぶたを採取した。これらを破砕後生理的食塩水中に懸濁し、ウイルス量を測定するために力価を検定した。
【０１２４】
残存量の感染ウイルスしか回収できなかった。このことから、インビボでは全く増殖性感染が起こらないことが示唆される。
【０１２５】
実施例８ ｖＦＰ−３によるニワトリの接種
組換えファウルポックスウイルスｖＦＰ−３をニワトリに接種し、このベクターの増殖的複製を許容する系における組換えファウルポックスウイルスによる外来ＤＮＡの発現を示した。
【０１２６】
白色レグホーンニワトリに対し、ｖＦＰ−３をｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の９倍量で筋肉から、又はｖＦＰ−３を１ｏｇ１０ＴＣｌＤ５０の３倍量で翼に貫通させて接種した。血液検体を採取し、ワクチン接種２１日後に狂犬病抗体力価をＲＦＦＩ試験で調べた。接種したニワトリの２１日目の力価は、対照群の２１日目の力価に比し非常に高かった。すなわち、非感染対照群の平均力価は０．６であったが、筋肉接種したニワトリの平均は１．９、貫通接種したニワトリの平均は１．２であった。
【０１２７】
実施例９ ターキーインフルエンザＨ５  ＨＡ抗原を発現する組換えファウルポックスｖＦＰ−１１
本発明の組換えアビポックスウイルスを用いて鳥類病原体に対して鳥類を免疫することができる。
【０１２８】
したがって、Ｈｉｎｄ  IIIプロモーターで転写促進されるＡ／ターキー／アイルランド／１３７８／８３（ＴＹＨＡ）の赤血球凝集素遺伝子（Ｈ５）を含有する、ファウルポックスウイルスＦＰ−１由来の新規プラスミドｐＲＷ７５９（下記に記載）を用いて、親ウイルスＦＰ−１に同時に感染しているＣＥＦ細胞にトランスフェクトした。組換えファウルポックスウイルスｖＦＰ−１１を本明細書中で既に述べた技術によって得た。
【０１２９】
ｖＦＰ−１１感染細胞による赤血球凝集素分子の合成は、特異的抗Ｈ５抗体と標準的手法を用い、代謝により放射性標識した感染細胞溶菌液からの免疫沈降で確認した。分子量約６３Ｋｄ（キロダルトン）の赤血球凝集素前駆体の特異的免疫沈降と分子量４４Ｋｄ及び２３Ｋｄの２つの分解生成物が明らかとなった。非感染ＣＥＦ細胞又は親ウイルスＦＰ−１感染細胞の溶菌液からはこのようなタンパクは全く沈降しなかった。
【０１３０】
組換えファウルポックスｖＦＰ−１１に感染した細胞中で産生されるＨＡ分子が細胞表面上で発現されることを調べるために、免疫蛍光による研究を行った。組換えファウルポックスウイルスｖＦＰ−１１に感染したＣＥＦ細胞は表面を強く蛍光染色された。親ウイルスＦＰ−１に感染した細胞では、全く蛍光が検出されなかった。
【０１３１】
プラスミドｐＲＷ７５９を以下のようにして作製した。ｐＲＷ７４２Ｂ(実施例4参照)をＰｓｔ  Iによる部分消化で直線状とし、この断片をＥｃｏ  ＲVで再切断し、狂犬病Ｇ遺伝子を除去し、約３．４Ｋｂｐの残存断片上にＨＨプロモーターを残した。これをアルカリホスファターゼ処理して、ＡＴＧにおいてこのＨＨプロモーターとＴＹＨＡを結合するため合成オリゴヌクレオチドを挿入し、ｐＲＷ７４４を作製した。
【０１３２】
このプラスミドをＤｒａ  Iで部分消化し直線状となし、この直線状断片をＳａｌ  Iで切断して大きい方の断片を再び単離しアルカリホスファターゼ処理した。
【０１３３】
最後に、カワオカらがＶｉｒｏｌｏｇｙ  １５８、２１８−２２７（１９８７）で開示したように、この単離されたＴＹＨＡのＳａｌ  I−Ｄｒａ  Iコード配列をｐＲＷ７４４ベクターに挿入することによってｐＲＷ７５９を作製した。
【０１３４】
実施例１０ インフルエンザ生ウイルスによる攻撃から鳥類を防御するためのｖＦＰ−１１による免疫
組換えファウルポックスウイルスｖＦＰ−１１の免疫原性を調べるため、ニワトリと七面鳥でワクチン接種と攻撃実験を行った。
【０１３５】
無菌白色レグホーンに対し、２日齢及び５週齢において、家禽にファウルポックスウイルスを商業的にワクチン接種する際に用いられる倍針（ｄｏｕｂｌｅ  ｎｅｅｄｌｅ）で翼網穿刺してワクチン接種を行った。ｖＦＰ−１１を６×１０５ｐｆｕ含有する約２μｌを各ニワトリに投与した。年長のニワトリはワクチン接種前に採血し、また、全てのニワトリに対し、攻撃前及び２週後に採血した。
【０１３６】
比較のため、もう一群のニワトリに不活性化Ｈ５Ｎ２株の油中水型エマルジョンから成る従来のＨ５ワクチンを接種した。
【０１３７】
不活性化Ｈ５Ｎ２ワクチンは、１１日齢胚のニワトリ卵で増殖したＡ／マラード（Ｍａ１１ａｒｄ）／ＮＹ／１８９／８２（Ｈ５Ｎ２）から調製した。ＨＡ力価８００／０．１ｍｌ及び感染力価１０８．５／０．１ｍｌの感染した漿尿液を０．１％プロピオラクトンで不活性化し、ストーン（Ｓｔｏｎｅ）ら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．、２２、６６６−６７４（１９７８）及びブルッグ（Ｂｒｕｇｈ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｉｎｔｅｒ．  Ｓｙｍ．  ｏｎ  Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、２８３−２９２（１９８６）に記載の如く、油中水型エマルジョン中に懸濁した。０．２ｍｌの容量のワクチンを静脈経路で２日齢、５週齢のＳＰＦ白色レグホーンニワトリの大腿筋肉内側皮膚に投与した。
【０１３８】
３群、４群のニワトリに対しては、親ウイルスＦＰ−１を投与するか、全くワクチンを投与しなかった。
【０１３９】
各ニワトリの外鼻孔に０．１ｍｌを投与し、病原性の高いＡ／ターキー／アイルランド／１３７８／８３（Ｈ５Ｎ８）又はＡ／チック（Ｃｈｉｃｋ）／ペン（Ｐｅｎ）／１３７０／８３（Ｈ５Ｎ２）インフルエンザウイルスをＬＤ５０の約１０３倍量でニワトリに攻撃した。２日齢ニワトリはワクチン接種後６週目に攻撃し、５週齢ニワトリはワクチン接種後５週目に攻撃した。ニワトリを、顔面及びトサカの膨潤及びチアノーゼ、さらに足の出血(こうしたニワトリはしばしば立つことができなかった)などによって示唆される病気の徴候、麻痺及び死亡について毎日観察した。死亡のほとんどが感染後４〜７日に起きた。感染後３日目に、各生存ニワトリの気管及び総排出腔から線捧で検体を取り、胚発生卵に接種してウイルスのスクリーニングを行った。野生型又は組換えファウルポックスウイルスを接種したニワトリは、翼網に典型的な病巣を発症した。針を刺した部位に３日目までに膿疱が形成され、細胞浸潤がかさぶた形成とともに続き、７日目までに回復した。二次的な病巣は形成されず、非ワクチン接種の接触したニワトリに伝染した証拠は全く見られなかった。攻撃実験の結果を表VIIIに示し、関連血清学的所見を表IXに示す。
【０１４０】
【表１１】
0003826055.tif 000014
【０１４１】
【表１２】
0003826055.tif 000015
【０１４２】
ファウルポックス−Ｈ５組換え体（ｖＦＰ−１１）又はアジュバント中不活化Ｈ５Ｎ２インフルエンザワクチンを接種したニワトリは、相同のＴｙ／Ｉｒｅ（Ｈ５Ｎ８）インフルエンザウイルス及び関連してはいるが明らかに異なるＣｋ／Ｐｅｎｎ（Ｈ５Ｎ２）インフルエンザウイルスによる攻撃から防御された。これとは対照的に、親ＦＰＶを接種されたニワトリの大半又はワクチンを全く投与されなかったニワトリの大半は、病原性の高いインフルエンザの臨床症状を示し、顔面及びとさかの膨潤及びチアノーゼ、足の出血及び麻痺が含まれていた。これらのニワトリの大部分は死亡した。ワクチン接種済のニワトリは検出可能な量のＴｙ／Ｉｒｅを示さなかったが、Ｃｋ／Ｐｅｎｎの場合、検出可能であった。
【０１４３】
不活化及び組換えワクチンの双方ともにＨＩ及びＴｙ／Ｉｒｅの中和抗体を誘起したが、攻撃前にファウルポックスーＨ５組換え体ｖＦＰ−１１で誘起した抗体のレベルではＨＡを阻害せず、また非相同Ｃｋ／Ｐｅｎｎ  Ｈ５を中和しなかった。にもかかわらず、ニワトリは、Ｔｙ／Ｉｒｅ及びＣｋ／Ｐｅｎｎインフルエンザウイルスの双方による攻撃から防御された。
【０１４４】
ｖＦＰ−１１ワクチン接種によって誘発されたＨ５インフルエンザに対する免疫は少なくとも４から６週間持続し、かつ、交差反応性であった。さらにこの応答の持続と特異性を調べるために、４週齢のニワトリの一群に対して、既に述べたようにｖＦＰ−１１を翼網に接種後、１月毎に交差反応性のＣｋ／Ｐｅｎｎウイルスで攻撃した。また、攻撃前にＨＩ抗体は全く検出できなかった。にもかかわらず、４ヵ月以上もニワトリは防御された。
【０１４５】
ｖＦＰ−１１により発現されたＨ５は、また七面鳥において防御的免疫応答を誘起する。異系交配白色七面鳥を、２日齢、４週齢において、既に述べたように翼網接種によりワクチン接種した。結果を表Ｘに示した。
【０１４６】
【表１３】
0003826055.tif 000016
相同Ｔｙ／Ｉｒｅウイルスによる攻撃に対し、有意の生存が双方の年齢群で見られた。非ワクチン接種の接触七面鳥をワクチン接種七面鳥と一緒に飼い、組換えウイルスの伝染を試験した。これらの七面鳥は攻撃に耐え生存することがなかった。
【０１４７】
実施例１１ ニワトリインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）遺伝子発現ファウルポックスＦＰ−１組換えｖＦＰ−１２の作製
プラスミドｐＮＰ３３は、インフルエンザウイルス  チキン／ペンシルバニア／１／８３核タンパク質遺伝子（ＮＰ）のｃＤＮＡクローンを含有する。およそ１．６ＫｂｐのＮＰ遺伝子の５’と３’末端のみが決定されていた。ＮＰをブラントエンドの５’Ｃｌａ  I−Ｘｈｏ  I  ３’断片として、ｐＮＰ３３からＳｍａ  Iで消化しておいたｐＵＣ９に移して、上記断片の３’末端がｐＵＣ９のＥｃｏ  ＲI部位に連結するようにして、ｐＲＷ７１４を作製した。ＮＰの翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は下記のアンダーラインを付したＡｈａ  II部位を有していた：ＡＴＧＧＣＧＴＣ。既に述べたワクシニアＨ６プロモーターを、二本鎖合成オリゴヌクレオチドでこのＮＰに結合した。この合成オリゴヌクレオチドは、Ｅｃｏ  ＲV部位からそれのＡＴＧまでのＨ６配列を含有しており、Ａｈａ  II部位でＮＰコード配列に入る。このオリゴヌクレオチドは、Ｂａｍ  ＨI末端とＥｃｏ  ＲI末端双方に適合できるように合成されており、これをｐＵＣ９に挿入してｐＲＷ７５５を作成した。Ｂａｍ  ＨI適合末端から始まる二本鎖合成オリゴヌクレオチドの配列（ＡＴＧはアンダーラインを引いた）は:
GATCCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGTCG
GCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCGCAGCTTAA
であった。
【０１４８】
ｐＲＷ７５５のＡｈａ  IIによる直線型部分消化産物を単離し、Ｅｃｏ  ＲIで切断した。かかるＡＴＧ部位に一つのＡｈａ  II切断部位を含有しＥｃｏ  ＲIで再切断したｐＲＷ７５５断片を単離してホスファターゼで処理した後、以下のｐＲＷ７１４消化産物のベクターとして用いた。
【０１４９】
ｐＲＷ７１４のＡｈａ  II直線部分消化産物をＥｃｏ  ＲIで再切断した。ＮＰコード配列含有の約１．６Ｋｂｐ  Ａｈａ  II−Ｅｃｏ  ＲI単離断片を上記のｐＲＷ７５５ベクターに挿入してｐＲＷ７５７を作製した。完全Ｈ６プロモーターは、Ｅｃｏ  ＲV部位の上流(３’側)の配列を添加することによって形成した。プラスミドｐＲＷ７４２Ｂ(実施例４に記載)は、ｐＵＣ９’のＮｄｅ  I部位とともに切断されたＥｃｏ  ＲV部位の下流（３’側）のＨ６配列を有していた。ｐＲＷ７４２  Ｂ  Ｅｃｏ  ＲV−Ｎｄｅ  I断片をホスファターゼで処理し、下記のｐＲＷ７５７断片のベクターとして用いた。
【０１５０】
ｐＲＷ７５７の直線部分Ｅｃｏ  ＲV消化産物を単離後、Ｎｄｅ  Iで消化し再び単離した。このｐＲＷ７５７断片をｐＲＷ７４２Ｂベクターに挿入しｐＲＷ７５８を形成した。ｐＲＷ７５８のＥｃｏ  ＲI断片はＨ６プロモーターによる全ＮＰを含み、ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメントでブラントエンドにした後、ｐＲＷ７３１．１３  Ｈｉｎｃ  II部位に挿入しｐＲＷ７６０を作製した。ｐＲＷ７３１．３  Ｈｉｎｃ  II部位は、実施例６でｖＦＰ−６とｖＦＰ−７の作製に用いたＦＰ−１座である。
【０１５１】
ファウルポックスＦＰ−１を救援ウイルスとして用い、プラスミドｐＲＷ７６０をインビトロ組換え試験で使用した。子孫プラークをアッセイし、インシトゥプラークハイブリッド形成を用いてプラークを精製した。遺伝子の発現を、ヤギのポリクローナル抗ＮＰ抗血清を用いた免疫沈降実験で確認した。ｖＦＰ−１２に感染したＣＥＦ細胞の溶解液から特異的に沈降したこのタンパク質の大きさはおよそ５５ＫＤであり、報告されたインフルエンザウイルスの核タンパク質の範囲内であった。
【０１５２】
実施例１２ エビアンインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）と赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を発現するファウルポックスウイルス二重組換えｖＦＰ−１５の産生
Ａ／Ｔｙｒ／Ｉｒｅ／１３７８／８３からの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子については、ｖＦＰ−１１（実施例９）の作製で既に述べた。二重組換え体を作製するのに際し、先ずＨＡ遺伝子を、プラスミドｐＲＷ７３１．１５を用いて、ｖＦＰ−８の作製のところで定義した座ｆ８に移した。
【０１５３】
ｖＦＰ−１１の作製に用いたプラスミドはｐＲＷ７５９であった。Ｈ６プロモーターに結合した赤血球凝集素遺伝子を、Ｐｓｔ  I部分消化によってこのプラスミドから移した。この断片を次にＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメントでプラントエンドとし、ｐＲＷ７３１．１５ブラントエンドのＢａｍ  ＨI部位に挿入してｐＲＷ７７１を作製した。
【０１５４】
プラスミドｐＲＷ７７１を次に、救援ウイルスとしてｖＦＰ−１２を用いるインビトロ組換え試験に用いた。ｖＦＰ−１２組換えウイルスは、プラスミドｐＲＷ７３１．１３において定義した座ｆ７でＨ６プロモーターに連結した核タンパク質遺伝子を含有する。両方の挿入部を有する組換えプラークを選択し、インシトゥ  ハイブリッド形成でプラークを精製して赤血球凝集素の表面発現をプロテインＡ−β−ガラクトシダーゼ結合イムノアッセイで確認した。両方の遺伝子の発現を二重組換えウイルスｖＦＰ−１５と感染細胞溶解液からの免疫沈降によって確認した。
【０１５５】
実施例１３ 組換えカナリーポックスウイルスの作製
以下の実施例では、カナリーポックスゲノムの非必須挿入座4個の確認と組換えカナリーポックスウイルス4種ｖＣＰ−１６、ｖＣＰ−１７、ｖＣＰ−１９及びｖＣＰ−２０の作製について示す。
【０１５６】
組換えカナリーポックスｖＣＰ−１６を以下のように作製した。
【０１５７】
３．４ＫｂｐのＰｖｕ  IIカナリーポックスＤＮＡ断片をｐＵＣ９にクローン化し、ｐＲＷ７６４．２を生じさせた。Ｅｃｏ  ＲI部位がこの断片内に非対称に1ヵ所だけ見出され、短腕７００ｂｐ、長腕２．７Ｋｂｐが生じた。このプラスミドをＥｃｏ  ＲＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いてブラントエンドとした。ブラントエンドのＨ６／狂犬病Ｇ遺伝子を次にこの部位に連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換するのに用いた。生成したプラスミドｐＲＷ７７５をインビトロ組換え試験に用いた。免疫スクリーニングで陽性の子孫プラークを選択し、プラークを精製した。生成した組換え体をｖＣＰ−１６と命名し、挿入座をＣ３と名付けた。
【０１５８】
上記の作製に用いたプラスミドｐＲＷ７６４．２は、前記Ｅｃｏ  ＲI部位からの約２．４Ｋｂｐ離れた唯一のＢｇｌ  II部位を含有していた。同一のクローニング方針を用いて、Ｈ６／狂犬病Ｇ遺伝子をこの部位でプラスミドｐＲＷ７６４．２に連結し、ｐＲＷ７７４を作製した。このプラスミドを用いて、Ｃ４と命名した挿入座を持つ組換え体ｖＣＰ−１７を作製した。
【０１５９】
プラスミドｐＲＷ７６４．５は、カナリーポックスＤＮＡの８５０ｂｐのＰｖｕ  II断片を有し、片方の末端から４００ｂｐの断片内に非対称な唯一のＢｇｌ  II部位を有している。先に述べたクローニング手法と同一手法を用いて、Ｈ６プロモーターに連結した狂犬病Ｇ遺伝子をこの部位に挿入し、ｐＲＷ７７７を作製した。作製された安定組換えウイルスをｖＣＰ−１９と命名し、挿入座をＣ５と名付けた。
【０１６０】
プラスミドｐＲＷ７６４．７は、片方の末端から３００塩基離れた唯一のＢｇｌ  II部位を持つ１．２Ｋｂｐ  Ｐｖｕ  II断片を含有する。このプラスミドをＢｇｌ  IIで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでブラントエンドとした。ブラントエンドで１１Ｋプロモーターで転写促進されるＬａｃ  Ｚ遺伝子を挿入してプラスミドｐＲＷ７７８を作製した。このプラスミドを用いて作製した安定組換えウイルスをｖＣＰ−２０と命名し、挿入座をＣ６と名付けた。
【０１６１】
実施例１４ ニューカッスル病ウイルスを発現するファウルポックスウイルス組換えｖＦＰ−２９の作製
プラスミドｐＮＤＶ１０８はＮＤＶテキサス株の融合遺伝子ののｃＤＮＡクローンであり、約３．３ＫｂｐのＨｐａ  I  ｃＤＮＡ断片から成り、融合タンパク質をコードする配列とｐＢＲ３２２のＳｃａ  I部位にクローン化されるＮＤＶをコードしたもう一っの配列を含有する。下記に、挿入プラスミドの作製段階を述べる。
【０１６２】
（１）  プラスミドｐＣＥ１１の作製
ＦＰＶ挿入ベクターのｐＣＥ１１は、ｐＲＷ７３１．１３のＨｉｎｃ  II部位にポリリンカーを挿入することによって作製した（座ｆ７と命名）。ｐＲＷ７３１．１３は、ＦＰ−１ＤＮＡの５．５Ｋｂｐ  Ｐｖｕ  II断片を含有する。非必須座は、既に実施例６で述べた安定組換え体ｖＦＰ−６の作製においてＨｉｎｃ  II部位で定義した。Ｈｉｎｃ  II部位に挿入したポリリンカーは以下の制限酵素部位を有している。つまり、Ｎｒｕ  I、Ｅｃｏ  ＲI、Ｓａｃ  I、Ｋｐｎ  I、Ｓｍａ  I、Ｂａｍ  ＨI、Ｘｂａ  I、Ｈｉｎｃ  II、Ｓａｌ  I、Ａｃｃ  I、Ｐｓｔ  I、Ｓｐｈ  I、Ｈｉｎｄ  III及びＨｐａ  Iである。
【０１６３】
（２）  プラスミドｐＣＥ１９の作製
このプラスミドは、ｐＣＥ１１をさらに修飾したもので、ワクシニアウイルス転写終結信号ＡＴＴＴＴＴＮＴ（Ｌ．ユーエン（Ｙｕｅｎ）及びＢ．モス（Ｍｏｓｓ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０、３２０−３２３［１９８６］）（この場合ＮはＡである）がｐＣＥ１１のＳａｃ  IとＥｃｏ  ＲI部位間に挿入されており、その結果Ｅｃｏ  ＲI部位が消失している。
【０１６４】
（３）  ＮＤＶコード配列の挿入
融合タンパク質遺伝子の５’末端のヌクレオチド２２個以外の全てを含有する１．８Ｋｂｐのゲルで精製したＢａｍ  ＨI断片をｐＵＣ１８のＢａｍ  ＨI部位に挿入し、ｐＣＥ１３を形成した。このプラスミドを、コード配列の５’末端の上流の１２塩基のところでベクターを切断するＳａｌ  Iで消化した。クレノーフラグメントで末端を埋め、このプラスミドをさらに、Ｓａｌ  I部位の１８塩基上流で切断するＨｉｎｄ  IIIで消化した。好ましい実施態様のところで既に述べたワクシニアウイルスＨ６プロモーター及び両端にポリリンカー配列を含有し、かつゲルで精製した１４６塩基のＳｍａ  I-Ｈｉｎｄ  III断片をこのベクターに連結し、大腸菌細胞に形質転換した。生成プラスミドをｐＣＥ１６と命名した。
【０１６５】
ＮＤＶ融合タンパク質遺伝子の開始ＡＴＧコドンをＨ６プロモーターの３’末端に配列させ、かつＮＤＶの５’末端から欠けているヌクレオチド２２個をｐＣＥ１６に補うため、相補的合成オリゴヌクレオチドをＥｃｏ  ＲVとＫｐｎ  I部位を末端とするよう設計した。このオリゴヌクレオチド配列は
5'ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-GGC-TCC-
AGA-TCT-TCT-ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C3'
であった。
【０１６６】
作製したｐＣＥ１６を次にＥｃｏ  ＲVとＫｐｎ  Iで消化した。Ｅｃｏ  ＲV部位は、Ｈ６プロモーター内で開始ＡＴＧの２４塩基上流に生じる。Ｋｐｎ  I部位は、ＮＤＶコード配列内で前記ＡＴＧの２９塩基下流に生じる。
【０１６７】
オリゴヌクレオチドをアニールし、リン酸化し、前記の直線型プラスミドに連結させた。得られるＤＮＡを大腸菌細胞を形質転換するのに用いた。このプラスミドをｐＣＥ１８と命名した。
【０１６８】
このＮＤＶコード配列をＦＰＶ挿入ベクターに挿入するために、ｐＣＥ１８（ポリリンカー領域で切断）のゲルで精製した１．９Ｋｂｐ  Ｓｍａ  I−Ｈｉｎｄ  III断片を上述のｐＣＥ１９の７．８Ｋｂｐ  Ｓｍａ  I−Ｈｉｎｄ  III断片に連結した。転写終結信号は、Ｓｍａ  I部位の下流16塩基に生じる。得られたプラスミドをｐＣＥ２０と命名した。
【０１６９】
プラスミドｐＣＥ２０を、ファウルポックスウイルスＦＰ−１を救援ウイルスとして用いるインビトロ組換え試験に使用した。得られた子孫をＣＥＦ単層に塗布し、このプラークを、ポリクローナル抗ＮＤＶニワトリ血清を用いたβガラクトシダーゼ連結プロテインＡイムノスクリーンに供した。陽性染色プラークを選択し、プラークの精製を４回行った後、単一集団とした、この組換え体をｖＦＰ−２９と命名した。
【０１７０】
実施例１５ ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープ（ｅｎｖ）糖タンパクを発現するアビポックスウイルスの作製
ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子は、ｐ７０＋Ｐ１５Ｅポリプロテインをコードする配列を含有する。ＦｅＬＶ遺伝子はまず、この遺伝子の５’側にワクシニアＨ６プロモーターを並置させてプラスミドｐＳＤ４６７ｖＣに挿入させた。プラスミドｐＳＤ４６７ｖＣは、ワクシニア赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を含有する１８０２ｂｐのＳａｌ  I／Ｈｉｎｄ  III断片を最初にｐＵＣ１８ベクターに挿入することによって誘導した。ＨＡ遺伝子の位置については既に明らかにされていた（シダ（Ｓｈｉｄａ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５０、４５１−４６２、［１９８８］）。ＨＡ遺伝子産物をコードする読み取り枠の大半は欠損しており（ヌクレオチド４４３からヌクレオチド１３１１）、Ｂｇｌ  II・Ｓｍａ  I・Ｐｓｔ  I及びＥｇａ  I制限酵素部位を含有する多重クローニング部位を挿入した。得られるｐＳＤ４６７ｖＣプラスミドは、マルチクローニング部位の４４２ｂｐ上流及びこれらの制限部位の４９１ｂｐ下流にワクシニア隣接腕を含有している。これらの隣接腕は遺伝物質をマルチクローニング部位に挿入して、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のHA部位へ組換えることができる。得られた組換え子孫はＨＡ陰性であった。
【０１７１】
Ｈ６プロモーターは好ましい実施態様で既に述べた完全配列より成る４つのオーバーラップオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって合成した。得られた１３２塩基より成る断片は、５’末端にＢｇｌ  II制限部位を有し、３’末端にＳｍａ  I部位を持っていた。Ｂｇｌ  IIとＳｍａ  I制限部位を介してこれをｐＳＤ４６７ｖＣに挿入した。得られたプラスミドをｐＰＴ１５と命名した。Ｈ６プロモーターのすぐ下流にあるｐＰＴ１５の唯一のＰｓｔ  I部位にこのＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子を挿入した。生成したプラスミドをｐＦｅＬＶｌＡと命名した。
【０１７２】
ＦＰ−１組換え体の作製のため、２．４ＫｂｐのＨ６／ＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列をＢｇｌ  II消化とＰｓｔ  I部分消化でｐＦｅＬＶｌＡから切り離した。
【０１７３】
Ｂｇｌ  II部位はＨ６プロモーター配列の５’境界にある。Ｐｓｔ  I部位はエンベロープ糖タンパク質読み取り枠の翻訳終結信号の４２０ｂｐ下流にある。
【０１７４】
この２．４Ｋｂｐ  Ｈ６／ＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列をＢａｍ  ＨI及びＰｓｔ  I消化ｐＣＥ１１に挿入した。ＦＰ−１挿入ベクターｐＣＥ１１は、マルチクローニング部位を非必須Ｈｉｎｃ  II部位に挿入することによりｐＲＷ７３１．１３から得た。この挿入ベクターは、ＦＰ−１ゲノムの座ｆ７で外来遺伝子を保有するＦＰ−１組換え体を産生できる。組換えＦＰ−１／ＦｅＬＶ挿入プラスミドをここでｐＦｅＬＶＦＩと命名した。この構造体はＡＴＧ置換に対して完全ATGを与えない。
【０１７５】
完全ＡＴＧ：ＡＴＧ構造体を作るため、約１．４ＫｂｐのＮｒｕ  I／Ｓｓｔ  II断片１個をワクシニアウイルス挿入ベクターｐＦｅＬＶＩＣから誘導した。Ｎｒｕ  I部位は、ＡＴＧから２４ｂｐ上流の位置のＨ６プロモーターに生じる。Ｓｓｔ  II部位は、ＡＴＧから１．４Ｋｂｐ下流で翻訳終結信号の１Ｋｂｐ上流に位置する。このＮｒｕ  I／Ｓｓｔ  II断片を、Ｓｓｔ  II消化とＮｒｕ  I部分消化で作製した９．９Ｋｂｐ断片に連結した。この９．９Ｋｂｐ断片は、ｐＵＣベクター配列である５．５ＫｂｐのＦＰ−１隣接腕、ｅｎｖ遺伝子の下流部分に当る１．４ＫｂｐのＦｅＬＶ配列、及びＨ６プロモーターの５’側のほとんどの配列（約１００ｂｐ）を含有している。得られたプラスミドをｐＦｅＦＬＶＦ２と命名した。ＡＴＧ構築のためのこのＡＴＧをヌクレオチド配列分析で確認した。
【０１７６】
もうひとつのＦＰ−１挿入ベクターｐＦｅＬＶＦ３は、推定免疫抑制領域（シアンシオロ（Ｃｉａｎｃｉｏｌｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０、４５３−４５５［１９８５］）（コード配列のヌクレオチド１５４８から１６２８まで）に相当するＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列を除去することによって、ｐＦｅＬＶＦ２から誘導した。これは、約１ＫｂｐのＳｓｔ  II／Ｐｓｔ  I断片(上述の部位)をワクシニアウイルス挿入ベクターｐＦｅＬＶｌＤから単離することによって完成した。このプラスミドｐＦｅＬＶｌＤは、免疫抑制領域（ヌクレオチド１５４８から１６２８まで）に相当するｅｎｖ配列がオリゴヌクレオチドによる突然変異誘発によって欠損していたことを除いては、ｐＦｅＬＶｌＧと同様であった(マンデッキ（Ｍａｎｄｅｃｋｉ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３、７１７７−７１８１［１９８７］）。ヌクレオチド１５４８から１６２８までを欠損している１ＫｂｐのＳｓｔ  II／Ｐｓｔ  I断片を、ｐＦｅＬＶＦ２から誘導した残りのＨ６：ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子を含有する１０．４ＫｂｐのＳｓｔ  II／Ｐｓｔ  I断片へ挿入した。
【０１７７】
挿入プラスミドｐＦｅＬＶＦ２とｐＦｅＬＶＦ３は、救援ウイルスＦＰ−１のインビトロ組換え試験に用いた。この組換え体の子孫をＣＥＦ単層に塗付し、組換えウイルスをＣＥＦ単層上のプラークハイブリッド形成によって選択した。ハイブリッド分析により同定した組換え子孫を選択し、プラーク精製を４回行い均質集団とした。全ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子を保有するＦＰ−１組換え体をｖＦＰ−２５と命名し、免疫抑制領域の欠損した全遺伝子を含有するＦＰ−１組換え体をｖＦＰ−３２と命名した。この二つの組換え体は共にウシの抗ＦｅＬＶポリクローナル血清（アンチボディーズ社（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、デービス（Ｄａｖｉｓ）、カリフォルニア）を用いた免疫沈降によって、適切な遺伝子産物を発現していることが示された。これらのＦＰ−１組換え体がＣＲＦＫ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ９４）中で前記の外来ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子を発現することも重要であり、この細胞株はネコ由来である。
【０１７８】
カナリーポックス（ＣＰ）組換え体の作製のため、前記のＨ６：ＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列を含有する２．２Ｋｂｐ断片を、Ｓｍａ  IとＨｐａ  I消化によってｐＦｅＬＶＦ２から切り離した。このＳｍａ  I部位は、Ｈ６プロモーター配列の５’境界にある。Ｈｐａ  I部位は、エンベロープ糖タンパク質読み取り枠の翻訳終結信号の下流１８０ｂｐに位置している。
【０１７９】
２．２ＫｂｐのＨ６／ＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列を挿入プラスミドｐＲＷ７６４．２の非必須Ｅｃｏ  ＲI部位に挿入し、続いてＥｃｏ  ＲI部位をブラントエンドにした。この挿入ベクターはＣＰゲノムの座Ｃ４中に外来遣伝子を保有するＣＰ組換え体を産じさせる。この組換えＣＰ挿入プラスミドをここでｐＦｅＬＶＣＰ２と命名した。この構造体は、ＡＴＧ置換に対して完全ＡＴＧを１個提供する。
【０１８０】
挿入プラスミドｐＦｅＬＶＣＰ２を、救援ウイルスとしてＣＰを用いるインビトロ組換え試験に用いた。この組換え体の子孫をＣＥＦ単層に塗布した後、ウシ抗ＦｅＬＶ市販ポリクローナル血清（アンチボディーズ社、デービス、カリフォルニア）を用いたβガラクトシダーゼ結合プロテインＡイムノスクリーン法により、組換えウイルスを選択した。染色陽性プラークを選別し、プラークの精製を４回行った後、均質集団とした。完全ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子を発現する組換え体をｖＣＰ−３６と命名した。
【０１８１】
実施例１６ ラウス関連ウイルスタイプ１（ＲＡＶ−１）エンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子を発現するファウルポックスウイルス組換え体ｖＦＰ−２２の作製
ＲＡＶ−１エンベロープ遺伝子のクローンｐｅｎｖＲＶ１ＰＴは、Ｍ１３ｍｐ１８中にＫｐｎ  I-Ｓａｃ  I断片としてクローン化された配列をコードする１．１ＫｂｐのＲＡＶ−１  ｅｎｖ  ＤＮＡを含有している。この断片は５’末端はそのままであるが、３’側の配列一部を欠損しており、以下の操作に用いられた。ゲルで精製した１．１ＫｂｐのpｅｎｖＲＶIから誘導したＥｃｏ  ＲI−Ｐｓｔ  I断片を、ｐＵＣ９のＥｃｏ  ＲIとＰｓｔ  I部位に挿入し、ｐＲＷ７５６を作製した。このプラスミドをＫｐｎ  IとＨｉｎｄ  IIIで消化し、ベクター中のＡＴＧの５９塩基上流で切断した。既に述べたワクシニアＨ６プロモーターを含有する１４６塩基対のＫｐｎ  I−Ｈｉｎｄ  III断片を挿入し、プラスミドｐＣＥ６を作製した。
【０１８２】
ＲＡＶ  ｅｎｖ遺伝子の開始ＡＴＧが、外来配列の欠損したＨ６プロモーターの３’末端に隣接していることを確認するために、末端のＥｃｏ  ＲVとＢａｎ  II部位で二つの相補的合成オリゴヌクレオチドを作製した。このオリゴヌクレオチド配列は、
ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-AGG-CGA-GCC-3'
であった。
【０１８３】
プラスミドｐＣＥ６を、Ｈ６プロモーター内でＡＴＧの２４塩基上流で切断するＥｃｏ  ＲV及びＲＡＶ  ｅｎｖをコードする配列内でＡＴＧの７塩基下流で切断するＢａｎ  IIで消化した。このＤＮＡ断片を連結し大腸菌細胞の形質転換に用いた。得られたプラスミドｐＣＥ７は、最終構築のためのＨ６プロモーターと正確な５’配列を与えた。
【０１８４】
クローンｍｐ１９ｅｎｖ（１９０）は、制限酵素によるマッピングで全ＲＡＶ−１  ｅｎｖ遺伝子を含有することがわかった。全遺伝子を含有するｍｐ１９ｅｎｖ（１９０）の１．９ＫｂｐのＫｐｎ  I−Ｓａｃ  I断片をｐＵＣ１８のＫｐｎ  IとＳａｃ  I部位に挿入し、ｐＣＥ３を形成した。このプラスミドを、ＲＡＶ−１をコードする配列内で開始ＡＴＧの１３２塩基下流で切断するＨｐａ  I及びこの遺伝子の３’末端で切断するＳａｃ  Iで消化した。既に述べたＦＰＶ挿入ベクターｐＣＥ１１をＳｍａ  IとＳａｃ  Iで消化し、このプラスミドをポリリンカー領域で切断した。ｐＣＥ３のＨｐａ  I−Ｓａｃ断片でｐＣＥ１１で連結し、ｐＣＥ１４を作製した。
【０１８５】
プラスミドｐＣＥ７を次にＸｈｏ  IとＨｉｎｄ  IIIで消化し、Ｈ６プロモーターと正確な５’配列を含む３３２塩基対断片を生じさせた。プラスミドｐＣＥ１４を、このベクターのポリリンカー領域で切断するＨｉｎｄ  III及びコード配列で切断するＸｈｏ  Iで消化した。このＤＮＡをｐＣＥ７から得たＨｉｎｄ  III−Ｘｈｏ  I断片と連結し、最終ＲＡＶ−１エンベロープ遺伝子構造体のｐＣＥ１５を形成した。
【０１８６】
このプラスミドを、ファウルポックスＦＰ−１を救援ウイルスとするインビトロ組換え試験に用いた。組換え体子孫をＣＥＦ単層に塗付し、抗ＲＡＶ−１ポリクローナル血清を用いたβ−ガラクトシダーゼ連結プロテインＡイムノアッセイでプラークをスクリーニングした。染色陽性プラークを選別後４回プラークの精製を行い、単一集団を得た。産生された組換え体をｖＦＰ−２２と命名した。ｖＦＰ−２２感染ＣＥＦ溶解液を用いた免疫沈降実験から、エンベロープ遺伝子の遺伝子産物２個に対応する見掛けの分子量７６．５Ｋｄと３０Ｋｄを有する２つのタンパクが特異的に沈降していることが示された。前駆体遺伝子産物は全く見られなかった。
【０１８７】
予備試験で、ｖＦＰ−２２接種ニワトリでこのＲＡＶ−１エンベロープ遺伝子産物に対する免疫応答が誘起された。
【０１８８】
実施例１７ ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）のｇｐ５１，３０エンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子を発現するアビポックスウイルス組換え体の作製
（１）  ｐＢＬＶＦ１とｐＢＬＶＦ２の作製
プラスミドｐＢＬＶＦ１とｐＢＬＶＦ２はＢＬＶのｇｐ５１，３０ｅｎｖ遺伝子を含有する。両プラスミドにおいて、ＢＬＶ  ｅｎｖ遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターの転写制御下にあり、ファウルポックス隣接腕（座ｆ７）間でクローンされる。この二つのプラスミドのヌクレオチド配列は、コドン２６８位と２６９位を除いて等しい。（ｐＢＬＶＦ１はこれらの二つの位置でアミノ酸Ａｒｇ−Ｓｅｒ含有タンパクをコードし、一方、ｐＢＬＶＦ２はアミノ酸Ｇｌｎ−Ｔｈｒ含有タンパクをコードする。）
【０１８９】
ｐＢＬＶＦ１とｐＢＬＶＦ２を以下の手順で作製した。プラスミドｐＮＳ９７−１は全ＢＬＶ  ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドであるが、これをＢａｍ  ＨIで切断し、Ｍｓｔ  IIで部分的に切断した。ｇｐ５１，３０遺伝子を全て含む２．３Ｋｂｐ断片をアガロースゲル上で単離し、スティッキーエンドを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼI（クレノーフラグメント）で埋めた。Ｐｓｔ  Iリンカーを断片の末端に連結し、Ｐｓｔ  I消化した後に、ｐＴＰ１５のＰｓｔ  I部位（実施例１５）に連結した。これによって、ＢＬＶ遺伝子がワクシニアプロモーターＨ６に隣接して配置される。（ｐＴＰ１５は、ワクシニアゲノムの非必須座でクローン化されたワクシニアＨ６プロモーターを含有する。）
【０１９０】
このプラスミドを次にＥｃｏ  ＲVで切断し、Ａｖａ  IIで部分切断する。５．２Ｋｂｐ断片を単離し、オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＣＧＡＣＧ−３’と５’−ＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ−３’を用いてこのプラスミドを再び環状とした。これによって、ＢＬＶ遺伝子とＨ６プロモーター間の不要塩基を除去する。
【０１９１】
得られたプラスミドをＰｓｔ  Iで切断しＢｇｌ  IIで部分切断し、プロモーターＨ６で転写促進されるＢＬＶ遺伝子を含有する１．７Ｋｂｐ断片を、既に述べたファウルポックスウイルス挿入ベクターｐＣＥ１１のＢａｍ  ＨI−Ｐｓｔ  I部位に座ｆ７を用いてクローン化した。これによって、Ｈ６プロモーターを持つＢＬＶ遺伝子がファウルポックス隣接腕間に配置される。このプラスミドをｐＢＬＶＦ１と命名した。
【０１９２】
同一の手順を用いてｐＢＬＶＦ２を作製したが、Ｈ６プロモーターを有するＢＬＶ遺伝子をｐＣＥ１１にクローニングする前にインビトロ変異導入操作をさらに行った。この変異導入は、下記の手順で行った。プラスミドｐＮＳ９７−１をＸｍａ  Iで切断しＳｔｕ  Iで部分切断した。５．２Ｋｂｐ断片を単離し、オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＧＧＧＴＣＡＧＡＣＡＡＡＣＴＣＣＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＡＧＧ−３’と５’−ＣＣＴＡＡＧＧＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＧＡＣＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＡＣ−３’を用いて、このプラスミドを再び環化した。これによって、コドン２６８と２６９のヌクレオチド配列がＣＧＣ−ＡＧＴからＣＡＡ−ＡＣＴに変化する。
【０１９３】
（２）  組換えウイルス類の作製
前記プラスミドｐＢＬＶＦ１とｐＢＬＶＦ２を、ＦＰ−１を救援ウイルスとして用いたインビトロ組換え試験に用いた。組換え子孫はインシトゥ  プラークハイブリッド形成で選択し、この基準で集団が純粋であると判定されたら、プラークをＢＬＶｇｐ特異モノクローナル抗体調製物を用いたβガラクトシダーゼ・プロテインＡイムノアッセイでスクリーニングした。プラスミドｐＢＬＶＦ１とｐＢＬＶＦ２からそれぞれ作られた組換え体ｖＦＰ２３とｖＦＰ２４は共に、イムノスクリーンで染色陽性を示し、感染細胞表面上で免疫学的に認識可能な糖タンパクが発現されていることを示唆していた。
【０１９４】
プラスミドｐＢＬＶＫ４とｐＢＬＶＫ６は、それぞれ、前記のＢＬＶ  ｅｎｖｇｐ５１，３０遺伝子とＢＬＶ  ｇｐ５ｌ，３０開裂マイナス遺伝子が含有している。両遺伝子ともに、ｐＲＷ７６４．２の唯一のＥｃｏ  ＲI部位（座Ｃ３）（ｐＲＷ７６４．２にっいては、実施例１３に述べられている）にクローン化され、ワクシニアＨ６プロモーターの転写制御下にある。
【０１９５】
このプラスミドは以下の手順で誘導された。ｐＢＬＶＦ１とｐＢＬＶＦ２を制限酵素Ｈｉｎｄ  IIIで切断した。オリゴヌクレオチドＢＫＬ  １（ＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡ）をこの部位にクローン化し、ＢＬＶ遺伝子の３’側にＥｃｏ  ＲI部位を作製する。このＢＬＶ遺伝子の５’側にもＥｃｏ  ＲI部位があるので、これらのプラスミド（ｐＢＬＶＫ１とｐＢＬＶＫ２）をＥｃｏ  ＲIで切断し、Ｈ６プロモーターで転写促進されるＢＬＶ遺伝子を含有する断片をｐＲＷ７６４．２のＥｃｏ  ＲI部位にクローン化した。得られたプラスミドをそれぞれ、ｐＢＬＶＫ４とｐＢＬＶＫ６と命名した。これらのプラスミドを、カナリーポックスを救援ウイルスとしたインビトロ組換え試験に用いた。組換え体を選別し、イムノアッセイで検出されたこの糖タンパクの表面における発現を基準として精製した。プラスミドｐＢＬＶＫ４とｐＢＬＶＫ６からのそれぞれの組換え体をｖＣＰ２７とｖＣＰ２８と名付けた。
【０１９６】
ファウルポックス組換え体ｖＦＰ２３とｖＦＰ２４を、さまざまな経路でヒツジとウシに接種した。動物に二回接種し、二回目は一回目の４５日後とした。血清検体を第一回接種の５週間後と第二回接種の２週後に採取した。ｇｐ５１に対する抗体を競合的ＥＬＩＳＡ試験で測定し、力価は競合を５０％阻害する血清希釈の逆数として表わした。結果を表XIに示した。
【０１９７】
検査したいずれの種も一回目の接種後には検出可能な免疫応答を示さなかった。ヒツジもウシも共に第二回接種後に大幅な抗体上昇を示した。
【０１９８】
【表１４】
0003826055.tif 000017
【０１９９】
実施例１８ 感染性気管支炎ウイルスＭａｓｓ  ４１マトリックス遺伝子を発現するファウルポックスウイルスＦＰ−１紐換えｖＦＰ−２６の作製
プラスミドｐＩＢＶＢ６３は、Ｍａｓｓ４１株のマトリックス遺伝子の感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）ｃＤＮＡクローンを含有する。ｐＩＢＶＢ６３の８Ｋｂｐ  Ｅｃｏ  ＲI断片は、上流（５’側）にペプロマー遺伝子を持つマトリックス遺伝子を含有し、さらにその上流にＥｃｏ  ＲV部位がある。プラスミドｐＲＷ７１５は、ｐＵＣ９の二つのＰｖｕ  II部位を結合するＥｃｏ  ＲIリンカーを有している。ｐＩＢＶＭ６３由来の８ＫｂｐのＥｃｏ  ＲI断片をｐＲＷ７１５のＥｃｏ  ＲI部位に挿入し、ｐＲＷ７６３を作製した。プラスミドｐＲＷ７６３の５’側Ｅｃｏ  ＲI部位を欠損したプラスミドｐＲＷ７７６を作製し、このマトリックス遺伝子下流（３’側）の唯一のＥｃｏ  ＲI部位を残した。単離したｐＲＷ７６３のＥｃｏ  ＲI部分消化直線型産物を、Ｅｃｏ  ＲVで再び切断した。最大の断片を単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでブラントエンドとし、自己連結してｐＲＷ７７６を産生した。構造体ｐＲＷ７７６は全ＩＢＶペプロマー遺伝子と全マトリックス遺伝子を持ち、このマトリックス遺伝子のあとに唯一のＥｃｏ  ＲI部位が続く。
【０２００】
約０．９Ｋｂｐのマトリックス遺伝子の５’及び３’末端だけの配列が決定されていた。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）に始まるマトリックス遺伝子の５’配列には、以下のアンダーラインを付したＲｓａ  I部位を含有する。ＡＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＡＣ。
【０２０１】
既に述べたＨ６プロモーターを合成オリゴヌクレオチドでこのマトリックス遺伝子に結合した。この合成オリゴヌクレオチドはＥｃｏ  ＲV部位からＡＴＧまでのＨ６配列を含有しており、一番目のＲｓａ  I部位を介してマトリックスコード配列に挿入した。このオリゴヌクレオチドは、ｐＵＣ９に挿入できるようにＢａｍ  ＨIとＥｃｏ  ＲI端を持つように合成され、ｐＲＷ７７２を作製した。Ｅｃｏ  ＲI末端はＲｓａ  I部位の３’側となる。Ｂａｍ  ＨI適合末端から始まる、この二本鎖合成オリゴヌクレオチド（ＡＴＧはアンダーラインで示した）の配列は
【化３】
0003826055.tif 000018
である。
【０２０２】
ｐＲＷ７７２のＲｓａ  I部分消化直線型産物を単離し、Ｅｃｏ  ＲIで再切断した。このＲｓａ  I部位で１回切断しＥｃｏ  ＲIで再切断した箇所を持つｐＲＷ７７２断片をホスファターゼ処理し、以下のｐＲＷ７７６消化産物のベクターとして用いた。
【０２０３】
単離したｐＲＷ７７６の直線状Ｒｓａ  I部分消化産物をＥｃｏ  ＲIで再び切断した。Ｅｃｏ  ＲI部位はマトリックス遺伝子の３’末端をすぐ越えたところにある。上記のＲｓａ  I部位からマトリックスをコードする配列を含有する約０．８ＫｂｐのＲａｓ  I−Ｅｃｏ  ＲI単離断片を上記のｐＲＷ７７２ベクターに挿入し、ｐＲＷ７８３を作製した。完全なＨ６プロモーターは、Ｅｃｏ  ＲV部位の５’に配列を添加することによって形成した。Ｈ６プロモーターの５’末端はブラントエンドにしてｐＵＣ９のＳａｌ  I部位に挿入しＥｃｏ  ＲI部位を生じさせるＨｉｎｆ  I部位であったが、このＨ６プロモーターの５’はｐＵＣ９のＨｉｎｄ  III部位である。この５’Ｈ６プロモーターを含有するＨｉｎｄ  III−Ｅｃｏ  ＲV断片をｐＲＷ７８３  Ｈｉｎｄ  IIIとＥｃｏ  ＲV部位の間に挿入し、ｐＲＷ７８６を作製した。ｐＲＷ７８６  Ｅｃｏ  ＲI断片はＨ６プロモーターを持つ完全マトリックス遺伝子を含有しており、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでブラントエンドにし、ｐＲＷ７３１．１５のブラントエンドのＢａｍ  ＨI部位(座ｆ８)へ挿入してｐＲＷ７８９を作製した。このｐＲＷ７３１．１５  Ｂａｍ  ＨI部位は、実施例６でｖＦＰ−８の作製に用いたＦＰ−１座である。
【０２０４】
プラスミドｐＲＷ７８９をｖＦＰ−２６の作製に用いた。組換えプラークを選別しインシトゥ  プラークハイブリッド形成で処理した。
【０２０５】
予備試験において、ｖＦＰ−２６を接種したニワトリはＩＢＶマトリックスタンパクに対する免疫応答が誘起された。
【０２０６】
実施例１９ 感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）ペプロマーを発現するファウルポックスウイルスＦＰ−１組換えｖＦＰ−３１の作製
感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）Ｍａｓｓ４１のｃＤＮＡクローンｐＩＢＶＭ６３とそのサブクローンｐＲＷ７７６は、実施例１８におけるｖＦＰ−２６の作製に関して既に説明した。サブクローンｐＲＷ７７６は４Ｋｂｐ  ＩＢＶペプロマー遺伝子を含有し、この遺伝子のあとに、３’末端に唯一のＥｃｏ  ＲI部位を持つマトリックス遺伝子を持つ。約４ＫｂｐのＩＢＶヘプロマー遺伝子の５’と３’末端の配列だけが決定されていた。唯一のＸｂａ  I部位で二つの遺伝子に分離される。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）で始まるペプロマー遺伝子の５’末端は、以下のアンダーラインを付したＲｓａ  I部位を有する。ＡＴＧＴＴＧＧＴＡＡＣＡＣＣＴＣＴＴＴＴＡＣＴＡＧＴＧＡＣＴＣＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＡＣ。
【０２０７】
既に述べたＨ６プロモーターを、合成オリゴヌクレオチドでぺプロマー遺伝子に結合した。この合成オリゴヌクレオチドは、Ｎｒｕ  Ｉ部位からＡＴＧに至るＨ６プロモーター配列を含有しており、その第一番目のＲｓａ  Ｉ部位を介してペプロマーコード配列に挿入された。このオリゴヌクレオチドを、ｐＵＣ９に挿入するためにＢａｍ  ＨI及びＥｃｏ  ＲIに適合する末端を合成し、ｐＲＷ７６８を作製した。Ｅｃｏ  ＲI末端はＲｓａ  I部位の３’となる。Ｂａｍ  ＨI適合末端で始まる二本鎖合成オリゴヌクレオチドの配列（ＡＴＧはアンダーラインで示した)は
【化４】
0003826055.tif 000019
である。単離されたｐＲＷ７６８の直線型Ｒｓａ  I部分消化産物をＥｃｏ  ＲIで再び切断した。上記のＲｓａ  I部位で１ヵ所切断し、Ｅｃｏ  ＲIにより再切断された部位を含むｐＲＷ７６８断片を単離し、ホスファターゼで処理し、以下のｐＲＷ７７６消化産物のベクターとして用いた。
【０２０８】
単離されたｐＲＷ７７６の直線型Ｒｓａ  I部分消化産物をＥｃｏ  ＲIで再び切断した。上記のＲｓａ  I部位で１回切断しＥｃｏ  ＲI部位までを含有する５ＫｂｐのｐＲＷ７７６断片を単離した。この断片は、上記のペプロマーＲｓａ  I部位からマトリックス遺伝子の３’末端のＥｃｏ  ＲI部位に至るＩＢＶ配列を含有する。このｐＲＷ７７６断片を上記のｐＲＷ７６８ベクターに挿入し、ｐＲＷ７８８を作製した。このマトリックス遺伝子を上述のＸｂａ  Ｉ部位に移した。４ＫｂｐのｐＲＷ７８８  Ｎｒｕ  I−Ｂａｍ  ＨIブラントエンド断片をｐＲＷ７６０  Ｎｒｕ  I−Ｂａｍ  ＨＩブラントエンドベクターに挿入することによって、５’Ｈ６プロモーターをＮｒｕ  I部位に付加し、ｐＲＷ７９０を作製した。ベクターｐＲＷ７６０については実施例１１で述べてあり、簡単に言えば、非必須ＦＰ−１座ｆ７に隣接するＨ６プロモーターで転写促進されるワクシニアインフルエンザ核タンパク質である。このｐＲＷ７６０ベクターは、Ｎｒｕ  I部位から核タンパク質末端のＢａｍ  ＨIまでの３’Ｈ６配列を除去することによって作製された。ｐＲＷ７９０は、ｐＲＷ７３１．１３  Ｈｉｎｃ  II部位中のＨ６プロモーター保有ＩＢＶペプロマーである。ドナープラスミドｐＲＷ７９０をＦＰ−１と組み換え、ｖＦＰ−３１を生成した。ｖＦＰ−３１感染細胞から調製したＣＥＦ溶解液を用いて免疫沈降実験を行い、分子量約１８０Ｋｄの前駆体タンパクが少量、及び９０Ｋｄの分解生成物が少量、特異的に沈降していることが示された。
【０２０９】
実施例２０ 単純ヘルペスウイルスｇＤを発現するファウルポックスウイルスＦＰ−１組換えｖＦＰ−３０の作製
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型株ＫＯＳ糖タンパクＤ遺伝子（ｇＤ）をｐＵＣ９のＢａｍ  ＨI部位に、５’Ｂａｍ  ＨI連結Ｈｐａ  IIから３’ＢａｍＨI連結Ｎｒｕ  Iまでの断片としてクローン化した。５’末端はｐＵＣ９  Ｐｓｔ  I部位に隣接している。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）で始まるＨＳＶｇＤの５’配列は、以下のアンダーラインを付したＮｃｏ  I部位を含有する。
【０２１０】
【化５】
0003826055.tif 000020
【０２１１】
既に述べたワクシニアＨ６プロモーターを合成オリゴヌクレオチドでＨＳＶｇＤ遺伝子に結合させた。Ｎｒｕ  IからＡＴＧに及びさらにｇＤコード配列のＮｃｏ  I部位に至るＨ６プロモーターの３’部分を含有する。このオリゴヌクレオチドは、Ｐｓｔ  I適合５’末端を持つように合成した。ｐＵＣ９のｇＤクローンをＰｓｔ  IとＮｃｏ  Iで切断し、５’ＨＳＶ配列を除去し、合成オリゴヌクレオチドと置き換えることによって、ｐＲＷ７８７を得た。この二本鎖合成オリゴヌクレオチドの配列は、
【化６】
0003826055.tif 000021
である。ｐＲＷ７８７をＮｒｕ  IとＢａｍ  ＨIで消化すると、Ｎｒｕ  I部位からＨＳＶｇＤコード配列を通りＢａｍ  ＨI部位に至る３’Ｈ６プロモーターを含有する約１．３Ｋｂｐの断片ができる。このｐＲＷ７６０ベクターをＮｒｕ  IとＢａｍ  ＨIで切断することについては、実施例１１で述べた。この１．３Ｋｂｐ断片をｐＲＷ７６０ベクターに挿入しｐＲＷ７９１を作製した。このｐＲＷ７９１ベクターは、ｐＲＷ７３１．１３の非必須ＦＰ−１  Ｈｉｎｃ  II部位（座ｆ７）に、完全ワクシニワプロモーターで転写促進されるＨＳＶｇＤ遺伝子を含有する。
【０２１２】
ドナープラスミドｐＲＷ７９１をＦＰ−１と組み換えてｖＦＰ−３０を得た。糖タンパクの表面発現が、プロテインＡ−β−ガラクトシダーゼ連結イムノアッセイ及びＨＳＶ−１特異血清を用いた組換えプラーク中で検出された。
【０２１３】
実施例２１ ポックスウイルスベクター中における外来遺伝子の発現制御のためのエントモポックスプロモーターの使用
（ａ）  背景  昆虫のポックスウイルスは現在エントモポックスウイルス亜科（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）に分類されており、甲虫類（Ｃｅｌｅｏｐｔｅｔａ）、鱗翅類（Ｌｉｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、直翅類（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）の目に属する昆虫から単離されるエントモポックスウイルスにそれぞれ対応する三つの属(Ａ、Ｂ、Ｃ)にさらに細く分類される。本来エントモポックスウイルスは宿主範囲が狭く、如何なる脊椎動物中でも複製しないことが知られている。
【０２１４】
本研究で用いたエントモポックスウイルスは、元々インド産の感染したアムサクタ・モーレイ（Ａｍｓａｃｔａ  ｍｏｏｒｅｉ）（鱗翅類：アークチルダエ（ａｒｃｔｉｌｄａｅ））の幼生から単離したものである（ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）とグラナドス（Ｇｒａｎａｄｏｓ）、Ｊ．  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．  Ｐａｔｈｏ１．  １２、１４１−１４３［１９６８］）。このウイルスはＡｍＥＰＶと命名されており、Ｂ属の種型である。
【０２１５】
野生型ＡｍＥＰＶをＲ．グラナドス（Ｇｒａｎａｄｏｓ）博士（ボイス・トンプソン・インスティチュート（Ｂｏｙｃｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｌｎｓｔｉｔｕｔｅ）、コーネル大学（Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））から、感染したエスチグメヌ・アクレア（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ  ａｃｒｅａ）の幼生由来感染血リンパとして入手した。このウイルスはリマントリア・ジスパー（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐｅｒ）（マイマイガ）の卵巣組織由来の無脊椎細胞系統であるＩＰＬＢ−ＬＤ６５２Ｙ中で複製することがわかった（グッドウィル（Ｇｏｏｄｗｉ１１）ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １４、４８５−４９４［１９７８］）。この細胞を、４％ウシ胎児血清及び４％ニワトリ血清を添加したＩＰＬ−５２８培地で２８℃で増殖させた。
【０２１６】
野生型ウイルスをＬＤ６５２Ｙ細胞でプラークアッセイし、Ｖ１と命名したプラーク１個を以下の実験のため選択した。この単離物は、感染サイクル後期の感染細胞の細胞質において、数多くの封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ：  ＯＢｓ）を産生する。
【０２１７】
（ｂ）  プロモーター同定  ＡｍＥＰＶプロモーターの同定とマッピングを以下のようにして完了した。最近感染したＬＤ６５２Ｙ細胞（感染後４８時間）の総ＲＮＡを単離し、３２Ｐで標識される最初のｃＤＮＡ鎖を作製するのに用いた。このｃＤＮＡを、ＡｍＥＰＶの制限消化物含有ブロットのプローブとして用いた。このサザンブロットで２．６ＫｂのＣｌａ  I断片上に強いシグナルが検出され、この断片が強く発現された遺伝子をコードすることを示していた。本断片をプラスミドベクターにクローン化し、そのＤＮＡ配列を決定した。
【０２１８】
配列データの分析により４２Ｋｄのポリペプチドをコードすることのできる読み取り枠が明らかになった。感染４８時間後における総ＲＮＡのインビトロ翻訳とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる生成物の分離によって、約４２Ｋｄのポリペプチドが１個明らかとなった。
【０２１９】
（ｃ）  エントモポックスプロモーター制御下において外来遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスの作製
エントモポックスプロモーターが脊椎動物ポックスウイルス系で機能するか否かを調べるため、以下のプラスミドを作製した。５’末端でＢｇ１  II部位に隣接する４２Ｋ遺伝子翻訳開始シグナル(以下でＡｍＥＰＶ４２Ｋプロモーターと呼ぶ)の５’側の１０７塩基及びＥｃｏ  ＲI部位で終結するＢ型肝炎ウイルスプレＳ２のコード領域の３’末端の最初の14塩基を含有するオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。下記にこのＡｍＥＰＶ４２Ｋプロモーター配列を述べる。
【０２２０】
【化７】
0003826055.tif 000022
【０２２１】
このＡｍＥＰＶ４２Ｋプロモーターを以下のようにしてＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）に連結した。赤血球凝集素（ＨＡ）分子をコードするワクシニアウイルスゲノムの非必須領域におけるワクシニアウイルス腕（ＨＡ腕については、実施例１５で記載；ＨＡ領域はシダ（Ｓｈｉｄａ）がＶｉｒｏｌｏｇｙ１５０、４５１−４６２［１９８６］に記載）に隣接した、プレＳ２コード領域（タイプａｙｗがガリバート（Ｇａｌｉｂｅｒｔ）らによって記載、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１、６４６−６５０［１９７９］）及びＢ型肝炎ウイルス表面抗原を含有するｐＵＣプラスミドを作製した。前述のオリゴヌクレオチドを、ＨＢＶｓＡｇのコード領域の唯一のＥｃｏ  ＲI部位及びＨＡワクシニア腕の唯一のＢｇｌ  II部位を用いてこのプラスミド中に挿入した。得られた組換えワクシニアウイルスをｖＰ５４７と命名した。
【０２２２】
エントモポックス４２Ｋプロモーターの制御下における挿入ＨＢＶｓＡｇのコード配列の発現を、イムノアッセイを用いて確認した。哺乳類細胞系統ＢＳＣ−４０の当量培養液を親ワクシニアウイルス又は組換えｖＰ５４７で感染させた。感染後２４時間で細胞を溶解させ、この溶解液を順次希釈してニトロセルロース膜にのせた。この膜を最初はヤギ抗ＨＢＶ血清でインキュベートし、次いで、１２５ＩプロテインＡとインキュベートした。洗浄後この膜をＸ線フィルムに露光させた。陽性シグナルがｖＰ５４７感染培養液で検出されたが、親ウイルス感染培養液では検出されず、哺乳類細胞中のワクシニアウイルスによって、ＡｍＥＰＶ４２Ｋプロモーターが認識されることを示唆していた。
【０２２３】
上記の結果を、感染哺乳類細胞中でＨＢＶｓＡｇを検出するためのオースリアアッセイ（詳細については実施例１を参照）を用いて確認した。ＡｍＥＰＶ４２Ｋ又はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに結合したＨＢｓＡｇ含有ワクシニアウイルス組換え体を用いてＢＳＣ−４０細胞を感染させ、ｓＡｇ発現レベルをオースリア試験でアッセイした。表XIIに示すように、４２Ｋプロモーターを用いたＨＢｓＡｇ発現レベルが顕著であることがデータからわかる。
【０２２４】
【表１５】
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【０２２５】
さらに、脊椎動物ポックスウイルス環境下におけるＡｍＥＰＶ４２Ｋプロモーター制御の一時的特性を確認するための実験を行った。後期ウイルス転写を阻害し、これによってＤＮＡ複製を阻害するシトシンアラビノシド４０μｇ／ｍｌの存在又は非存在下において、ＢＳＣ−４０細胞の当量培養液をｖＰ５４７で感染させた。感染２４時間後においての発現レベルをオースリア試験でアッセイした。この結果から、この４２Ｋプロモーターがワクシニアウイルス複製系中の初期プロモーターとして認識されることが示唆された。
【０２２６】
哺乳類の系における外来遺伝子の発現にＡｍＥＰＶ４２Ｋプロモーターを使用することが無脊椎動物の系における遺伝子発現にオートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｔｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶポリヘドリンプロモーターを使用すること（ラッコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）とサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６、４７−５５［１９８８］）とは明らかに異なることに注目すべきである。ポリヘドリンプロモーターは、哺乳類細胞中の転写機構によっては認識されない（ティラ（Ｔｊｌａ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２５、１０７−１１７［１９８３］）。哺乳類細胞においてＡｍＥＰＶ４２Ｋプロモーターを使用することが、昆虫以外のウイルスベクター中の外来遺伝子を非無脊椎細胞中で発現させるのに昆虫ウイルスプロモーターが利用された最初の例である。
【０２２７】
アビポックスウイルス類が同様に４２Ｋエントモポックスプロモーターを認識するかどうかを調べるため、下記の実験を行った。ＣＥＦ細胞の同一の培養液に対し、細胞１個当たり１０ｐｆｕのファウルポックスウイルス、カナリーポックスウイルス、又はワクシニアウイルスを接種し、同時に１） ４２Ｋプロモーターに連結したＨＢＶプレーＳ２＋ｓＡｇコード配列を含有するプラスミド４２Ｋ．１７、又は２） 既に述べたワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結したＨＢＶｓＡｇのコード配列を含有するプラスミドｐＭＰ１５．ｓｐｓＰのどちらかのプラスミド２５ｇで形質転換した。２４時間後に培養液を凍結して細胞を溶解させ、オースリア試験を用いて溶解液におけるＨＢＶｓＡｇの存在を分析した。
【０２２８】
表XIIIに示した結果を定量的に検討すべきである。この結果、ファウルポックス及びカナリーポックス双方の転写機構が４２Ｋプロモーターを認識でき、かつ、連結ＨＢＶｓＡｇコード配列の転写を可能とすることが示唆される。発現レベルはワクシニアウイルスＨ６プロモーターで得られるよりも低いが、陰性対照で得られたバックグラウンドレベルよりも充分に高い。
【０２２９】
【表１６】
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【０２３０】
実施例２２ 生狂犬病ウイルス攻撃に対してマウスを防御するためのＶＣＰ−１６による免疫処置
４〜６週齢マウス２０匹の群の足蹠蹄に２つの組換え体（ａ） ｖＦＰ−６（実施例６に記載したファウルポックス狂犬病組換え体）及び（ｂ） ｖＣＰ−１６（実施例１３に記載したカナリーポックス狂犬病組換え体）のどちらかの所定量希釈液５０乃至１００μｌを接種した。
【０２３１】
１４日に各群からマウス１０匹を屠殺し血清を採取した。実施例７に記載したＲＦＦＩ試験を用いて血清中の抗狂犬病力価を計算した。各群の残りのマウス１０匹に対し、実施例７で用いた狂犬病ウイルスＣＶＳ株を脳内接種して攻撃した。各マウスは、マウスのＬＤ５０の１６倍に相当する３０μｌを投与された。２８日に生存マウスを調べ、５０％防御量（ＰＤ５０）を計算した。結果を表XIVに示す。
【０２３２】
ｖＦＰ−６の接種から判明したマウスの防御レベルは、実施例７で検討したファウルポックス組換え体ｖＦＰ−３の接種で示された結果を確認するものである。ｖＣＰ−１６の接種よってもたらされる防御レベルはかなり高い。算出ＰＤ５０を基準とした時、狂犬病の攻撃に対する防御においては、ファウルポックス狂犬病組換え体よりもカナリーポツクス狂犬病組換え体の方が１００倍有効である。
【０２３３】
【表１７】
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【０２３４】
実施例２３ 外来遺伝子発現のためのファウルポックスプロモーターエレメントの使用
Ｉ．２５．８キロダルトン（ＫＤ）の遺伝子産物をコードするファウルポックス遺伝子の同定
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色してファウルポックス（ＦＰ−１）感染ＣＥＦ溶解液中に存在するタンパク質種を染色することによって、見掛けの分子量２５．８ＫＤの主要な分子種が明らかとなった。このタンパク質は非感染細胞溶解液中には存在しなかった。感染後特定の時期に合成されたタンパク質を３５Ｓ−メチオニンで放射性標識するパルス実験から、ＦＰ−１誘発タンパクが豊富にあることが示され、かつ、このタンパクが感染後６時間から５４時間までに合成されることが示唆された。ピークレベルでは、このＦＰ−１  ２５．８ＫＤのタンパク質は、細胞溶解液中に存在する総タンパクのおよそ５％から１０％までを占める。
【０２３５】
ＦＰ−１誘発２５．８ＫＤタンパク質が多量に存在することから、この遺伝子産物をコードする遺伝子が強力なＦＰ−１プロモーターエレメントによって制御されていることが示唆された。ポックスウイルス組換え体内における外来遺伝子発現への使用に関して、このプロモーターエレメントの位置を決定するために、感染５４時間後にＦＰ−１感染ＣＥＦ細胞からポリゾーム調製物を得た。ＲＮＡをこのポリゾーム調製物から単離して、ウサギ網状赤血球のインビトロ翻訳系に用いたとき、主に２５．８ＫＤのＦＰ−１タンパク質を産生した。
【０２３６】
このポリゾームＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１２−１８をプライマーとして用いる最初のｃＤＮＡ鎖合成の鋳型として用いた。この最初のｃＤＮＡ鎖を、ＦＰ−１ゲノム消化産物のサザンブロット分折におけるハイブリッド形成プローブとして用いた。これらのハイブリッド形成分析の結果から、前記２５．８ＫＤタンパク質をコードする遺伝子が１０．５Ｋｂｐ  Ｈｉｎｄ  III断片に含まれていることが示唆された。次にこのゲノムＨｉｎｄ  III断片を単離して市販ベクターｐＢＳ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラ・ホヤ（Ｌａ  Ｊｏ１１ａ）、カリフォルニア）に連結し、このクローンをｐＦＰ２３Ｋ−１と命名した。ｐＦＰ２３Ｋ−１の消化物のプローブとして最初のｃＤＮＡ鎖を用いてハイブリッド形成分析を行ったところ、２５．８ＫＤタンパク質遺伝子が３．２ＫｂｐのＥｃｏ  ＲV小断片に位置することが判明した。この断片をｐＢＳ中でクローン化し、ｐＦＰ２３Ｋ−２と命名した。
【０２３７】
約２．４ＫｂｐのこのＦＰ−１  Ｅｃｏ  ＲV断片の塩基配列はサンガーのジデオキシチェインターミネーター法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ、７４、５４６３−５４６７［１９７７］）で決定した。配列の分析から、分子量２５．８ＫＤの遺伝子産物をコードする読み取り枠（ＯＲＦ）が明らかになった。このＯＲＦをｐＢＳベクター中でバクテリオファージＴ７ポリメラーゼによりインビトロランオフ転写すると、ウサギ網状赤血球インビトロ翻訳系（プロメガ・バイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン）に用いた場合見掛けの分子量２５．８ＫＤのポリペプチド種を産生するＲＮＡ種が得られた。このポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で、ＦＰ−１感染ＣＥＦｓ溶解液中で観察される豊富な２５．８ＫＤのタンパク質と泳動度が同じである。これらの結果から、これが、ＦＰ−１が誘発した多量に存在する２５．８ＫＤ遺伝子産物をコードする遺伝子であることが示唆される。
【０２３８】
II.  ＦＰ−１及びワクシニア組換え体においてネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）ｅｎｖ遺伝子を発現させるためのＦＰ−１  ２５．８ＫＤ遺伝子の上流プロモーターエレメントの使用
ＦＰ−１  ２５．８ＫＤ遺伝子制御領域（ＦＰ  ２５．８Ｋプロモーター）及び２１ｂｐの２５．８ＫＤ遺伝子コード配列を含有する２７０ｂｐ  Ｅｃｏ  ＲＶ／Ｅｃｏ  ＲＩ断片をｐＦＰ２３Ｋ−２から単離した。ＰＦｅＬＶ  ２５．８Ｆ１とｐＦｅＬＶ  ２５．８１Ａを誘導するために用いたＦＰ  ２５．８Ｋプロモーター領域のヌクレオチド配列を以下に示す。この２７０個のヌクレオチド配列は、２５．８ＫＤ遺伝子産物の開始コドン（ＡＴＧ）の上流の２４９個のヌクレオチドとコード配列の最初の２１ｂｐを示す。
【０２３９】
【化８】
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【０２４０】
この断片をブラントエンドとしてＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列を含有するＳｍａ  Ｉ消化ＦＰ−１挿入ベクター（ｐＦｅＬＶＦ１：実施例１５参照）へ挿入した。この挿入ベクターは、ＦＰ−１ゲノムのｆ７座による組換えを可能とした。このＦＰ  ２５．８Ｋプロモーター上流配列をＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子の５’側に挿入しそれらが正しい配向であることを配列分析で確認した。この挿入は、ＡＴＧ置換に対して完全ＡＴＧを付与することはないが、しかし、前記２５．８ＫＤ遺伝子によって提供されたＡＴＧはこのＦｅＬＶ  ｅｎｖ  ＡＴＧの枠外にあるので、融合タンパクは形成されない。ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子の上流にＦＰ２５．８ＫＤプロモーターを含有するＦＰ−１挿入プラスミドをｐＦｅＬＶ２５．８Ｆ１と命名した。
【０２４１】
ワクシニアウイルス挿入ベクターｐＦｅＬＶ１ＡはＦｅＬＶ遺伝子を保有しており（実施例１５参照）、このベクターを用いて同様の構造体を調製した。このＨ６プロモーターを、Ｂｇｌ  IIとＳｍａ  Iによる消化でｐＦｅＬＶｌＡから切断した。Ｂｇｌ  II制限部位をブラントエンドとした後、ＦＰ２５．８Ｋプロモーターを含有するブラントエンド化Ｅｃｏ  ＲV／Ｅｃｏ  ＲI断片（２７０塩基）をＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子の５’側に隣接するように挿入した。この構造体を配列分析で確認した。この組換え体にもＡＴＧ置換に対して完全なＡＴＧはないが、２５．８ＫＤ遺伝子のＡＴＧはＦｅＬＶ遺伝子のＡＴＧを持つ枠内にはない。ワクシニア（コペンハーゲン株）挿入ベクターはＦｅＬＶ遺伝子の５’側に隣接する２５．８ＫＤ遺伝子上流領域を保有しておりｐＦｅＬＶ２５．８１Ａと命名した。
【０２４２】
この挿入プラスミドｐＦｅＬＶ２５．８Ｆ１とｐＦｅＬＶ２５．８１Ａを、救援ウイルスとしてのＦＰ−１（ｐＦｅＬＶ２５．８Ｆ１）とワクシニアウイルスコペンハーゲン株（ｐＦｅＬＶ２５．８１Ａ）によるインビトロ組換えに用いた。この組換えの子孫を適当な細胞単層に塗付後、組換えウイルスをβガラクトシダーゼ連結プロテインＡイムノスクリーンとウシ抗ＦｅＬＶ血清（アンチボディーズ社、デービス、カリフォルニア）によって選択した。予備的結果から、このＦＰ２５．８Ｋプロモーターがポックスウイルス組換え体中における外来遺伝子の発現を制御できることが示唆された。
【０２４３】
実施例２４ 家禽中におけるｖＦＰ−６とｖＣＰ−１６の安全性及び有効性
アビポックス組換え体２種ｖＦＰ−６とｖＣＰ−１６（実施例６と実施例１３に記載）を１８日齢ニワトリ胚、１日齢ニワトリ及び２８日齢ニワトリに接種し、これらのニワトリの反応を３つの基準、すなわち１） 孵化率、ワクチンに対する反応及び死亡率に及ぼすワクチンの影響、２） 狂犬病糖タンパク質で誘起された免疫応答、３） ファウルポックス抗原で誘起された免疫応答、に基づいて評価した。以下に実施した実験を記す。
【０２４４】
Ａ．  安全性試験  １８日齢２０匹を１群とし、これらの漿膜腔にｖＦＰ−６又はｖＣＰ−１６のいずれかのｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の３．０又は４．０倍量を接種した。孵化後ニワトリを１４日間観察し、血清を採取した。ニワトリ胚に接種した組換え体２種は卵の孵化率に全く影響を及ぼさず、またニワトリは１４日の観察期間において健常のままであった。
【０２４５】
１日齢のＳＰＦニワトリ１０匹からなる群に対し、筋注で前記組換え体のいずれかのｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の３．０倍量を接種した。ニワトリを２８日間観察し、接種後１４日と２８日において血清検体を採取した。いずれの組換え体でも接種部位でワクチン反応は全く見られず、ニワトリは２８日の観察期間中健常であった。
【０２４６】
２８日齢ニワトリ１０匹から成る群に対し、組換えウイルスのいずれかを接種した。投与量は、筋肉経路で３．０  ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０又は皮膚（翼網）経路で３．０  ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のいずれかとした。ニワトリを２８日間観察し、接種後１４日と２８日に血清検体を採取した。いずれの組換え体を筋注しても、反応は全く見られなかった。皮膚接種によりファウルポックスは極めて小さいワクチン反応が生じたが、病巣の大きさは異なっていた。カナリーポックス接種によって、接種部位に通常の皮膚病巣が生じた。病巣部は全て、実験終了時までに退縮した。
【０２４７】
Ｂ．  免疫反応  実施例７で先に述べたＲＦＦＩ試験を用いて、狂犬病糖タンパクに対する抗体レベルを評価した。各群の結果を、２３．４ＩＵを含有する標準血清をもととし各血清の力価幾何平均を国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｔｓ）（ＩＵ）に換算して表わした。最小陽性レベルを１  ＩＵと定め、陽性ニワトリのパーセントを求めるに用いた。アビポックスウイルス類に対する抗体を、ファウルポックスウイルス株を抗原として用いたＥＬＩＳＡ法で検査した。各血清検体を２０分の１及び８０分の１に希釈した。陽性血清と陰性血清を用いて標準曲線を描いた。最小陽性レベルは、種々の値の陰性血清の平均プラス２標準偏差で算出した。
【０２４８】
血清学的検査結果を、ｖＦＰ−６については表XVに、ｖＣＰ−１６については表XVIに示した。
【０２４９】
ｖＦＰ−６又はｖＣＰ−１６のいずれかを接種した胚で、狂犬病抗原又はファウルポックス抗原に対する限定された血清学的反応が観察された。前記ファウルポックスベクターは、カナリーポックスよりも多くのニワトリにおいて両方の抗原に対する血清学的反応を誘起したが、この反応もやはりさまざまであった。
【０２５０】
１日齢でｖＦＰ−６を接種されたニワトリは、良好な血清学的反応を示し、全てのニワトリが接種後２８日までに狂犬病抗原及びファウルポックス抗原に対し血清陽性であった。ｖＣＰ−１６接種に対する反応ははるかに低く、２８日目で狂犬病糖タンパクに対しニワトリの４０％が血清陽性でありアビポックス抗原に対しニワトリの１０％が血清陽性であった。
【０２５１】
２８日齢で筋肉経路でｖＦＰ−６を接種したニワトリは、接種後１４日までに両方の抗原に対して１００％のセロコンバージョンをしていた。皮膚接種後ニワトリの大部分もセロコンバージョンしていたが、狂犬病抗原及びアビポックス抗原の双方に対し得られた力価は低かった。既に述べたように、筋肉及び皮膚経路の双方でｖＣＰ−１６を接種されたニワトリはさまざまな反応を示し、筋肉内接種の狂犬病に対し、最大７０％のセロコンバージョンを示した。カナリーポックス接種後のアビポックス抗原に対する低レベルのセロコンバージョンは、このウイルス類間の血清学的近縁性の程度を反映しているのかもしれない。
【０２５２】
前記の結果から、ｖＦＰ−６及びｖＣＰ−１６の両方ともにある年齢域のニワトリに接種しても安全であることが示唆された。ファウルポックスベクターｖＦＰ−６は、ニワトリにおける免疫反応惹起に関しより効果的であるように思われる。しかしアビポックスウイルスであるファウルポックス及びカナリーポックスの両方の組換え体は、卵中における免疫化に有効であるということは重要である。
【０２５３】
【表１８】
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【０２５４】
【表１９】
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【０２５５】
実施例２５ 子豚にｖＦＰ−６を接種することの安全性と免疫原性
１群子豚３匹から成る２群に対し、２投与経路のひとつで組換えｖＦＰ−６を接種した。
【０２５６】
ａ）  子豚３匹に筋肉内接種で８．１  ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を投与し、
ｂ）  子豚３匹に経口接種で同量を投与した。
【０２５７】
全動物から週間隔で採血後、同経路・同投与量で３５日目に追加接種した。子豚の臨床徴候を毎日観察した。血清は、ＥＬＩＳＡ法及び血清中和検査で抗ファウルポックス抗体を調べた。狂犬病抗体をＲＦＦＩ試験でアッセイした。
【０２５８】
子豚は全て良好な健康状態を保ち、接種後病巣部は全く見られなかった。体温曲線は正常で、接種動物と非接種動物間で全く違いがなかった。
【０２５９】
ＥＬＩＳＡ及び血清中和で測定したところ、筋肉内経路及び経口経路で接種を受けた子豚の両方ともが、ファウルポックス抗原に対する血清学的反応を誘起した。二次接種後において、二次反応が著明であった（結果を示さず）。ＲＦＦＩ試験で測定すると、全子豚が狂犬病糖タンパクに対する免疫学的反応を発症し、両経路による追加効果は顕著である。これらの結果を表XVIIに示す。
【０２６０】
前記結果から、ファウルポックス／狂犬病組換え体の接種が子豚において無害であること、及びこの組換え体は経口又は筋肉内接種による狂犬病糖タンパクに対し顕著な免疫応答を誘起させることができることが示唆される。
【０２６１】
【表２０】
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