(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘弾性を有しないフコース硫酸含有多糖溶液に、溶液のｐＨよりも等電点の高いタンパク質を添加することを特徴とするタンパク質で架橋された粘弾性を有するフコース硫酸含有多糖の製造方法。
【請求項２】
フコース硫酸含有多糖溶液に、溶液のｐＨよりも等電点の高いタンパク質を添加することを特徴とするフコース硫酸含有多糖の粘弾性の増強方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は医薬品、糖鎖工学研究用試薬、又は化粧品等として有用な海藻由来の硫酸化糖及び硫酸化多糖に関する。
【０００２】
【従来の技術】
褐藻類に属する海藻には硫酸化多糖が含まれていることが知られており、フコース硫酸を構成糖の主成分とするフコイダンの構造は褐藻類の種類によってかなり異なることが報告されている。
また硫酸化多糖由来の硫酸化糖に関しても褐藻類の種類によってかなり異なることが報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、試薬、医薬等として有用な新規な構造を有する硫酸化糖及び硫酸化多糖を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために褐藻類由来の硫酸化多糖について鋭意検討した結果、ポリ陽イオン物質で架橋された硫酸化多糖及び該硫酸化多糖の製造方法を確立し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明の第１の発明は、粘弾性を有しないフコース硫酸含有多糖溶液に、溶液のｐＨよりも等電点の高いタンパク質を添加することを特徴とするタンパク質で架橋された粘弾性を有するフコース硫酸含有多糖の製造方法に関する。
【００１１】
本発明の第２の発明は、フコース硫酸含有多糖溶液に、溶液のｐＨよりも等電点の高いタンパク質を添加することを特徴とするフコース硫酸含有多糖の粘弾性の増強方法に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に関して具体的に説明する。
本発明に使用される褐藻類の種類は本発明の硫酸化多糖を含有すれば良く特に限定はないが、例えばガゴメ昆布、マ昆布、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、ジャイアントケルプ、レッソニア  ニグレセンス等の昆布目海藻は特に本発明の硫酸化多糖を多く含んでおり、原料として好適である。
【００１４】
本発明の硫酸化多糖の製造には、まず褐藻類から水系溶媒により本発明の硫酸化多糖の抽出液を得る。抽出に供する海藻は生海藻でも良いが、抽出液を得る前に褐藻類を乾燥したり、乾燥粉末にしたりしてもよい。
【００１５】
また、その乾燥物を６０〜１００％のアルコールやアセトン等で洗浄したりすれば、本発明の硫酸化多糖への着色性物質の混入が大幅に減少するため、後の本発明の硫酸化糖の製造に有利である。
【００１６】
本発明の硫酸化多糖の褐藻類からの水系溶媒による抽出は、好ましくはエチルアルコール存在下で行うのが良く、好ましくはエチルアルコール５〜４０％、更に好適にはエチルアルコール８〜１５％の存在下での水系溶媒により、本発明の硫酸化多糖が選択的に抽出される。
【００１７】
また、褐藻類から本発明の硫酸化多糖を抽出する際に、塩化カルシウムや酢酸カルシウム等、アルギン酸と沈殿を形成する無機塩を使用するとアルギン酸の混入が大幅に減少するため、後の精製に有利である。
【００１８】
本発明の硫酸化多糖の抽出温度は５０°Ｃ以下が好ましく、好適には１５〜３０℃である。
【００１９】
また、抽出のｐＨは、温度との兼ね合いもあるが、本発明の硫酸化多糖は、酸やアルカリに対して不安定なので、ｐＨ６〜８程度の中性域での抽出が好ましい。
【００２０】
また抽出はかくはん下で行えば良いが、非せん断の条件下で行うのが最適であり、これらの条件下により、本発明の硫酸化多糖を効率よく得ることができる。
【００２１】
なお上記褐藻類の抽出液には中性糖、タンパク質等の不純物が混入していることが多い。中性糖の除去は通常、排除分子量１０万以下程度の限外ろ過により容易に達成できる。タンパク質の除去には、プロテアーゼ処理等が有効である。
【００２２】
本発明の硫酸化多糖から低分子物質である本発明の硫酸化糖を製造する際には、上記硫酸化多糖に、該多糖に選択的に作用し本発明の硫酸化糖を遊離させる作用を有するエンド型硫酸化多糖分解酵素を作用させれば良い。該エンド型硫酸化多糖分解酵素としては特に限定はないが、その一例としては後述の実施例１−（１）に記載のアルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）の生産するエンド型硫酸化多糖分解酵素を使用すればよい。
【００２３】
本発明の硫酸化多糖に上記エンド型硫酸化多糖分解酵素を作用させた後、得られる反応生成物はそのまま使用することも可能であるが、薬品や試薬として使用する場合、反応液中から本発明の硫酸化糖を精製することが望ましい。精製に際しては、限外ろ過法、陰イオン交換樹脂や、疎水性クロマト用樹脂、ゲルろ過用樹脂等を用いれば良い。
【００２４】
本発明の硫酸化糖は生褐藻類に上記エンド型硫酸化多糖分解酵素を直接作用させて得られる分解物中より精製しても良く、乾燥海藻、アルコール洗浄海藻、本発明の硫酸化多糖含有物等に上記エンド型硫酸化多糖分解酵素を作用させ、得られる分解物中より精製しても良い。なお上記酵素反応時においては反応溶液中から本発明の硫酸化糖を分離する工程を組合せることにより、本発明の硫酸化糖の生成効率が上昇する。
【００２５】
本発明の硫酸化糖としては一般式〔Ｉ〕においてｎ＝１〜５の各硫酸化糖等が例示されるが、本発明の硫酸化多糖に上記エンド型硫酸化多糖分解酵素を作用させる場合の酵素作用条件により種々の分子量の硫酸化糖を調製することができ、得られた各硫酸化糖を例えばゲルろ過法や限外ろ過法を用いて分子量分画し、分画物中より各硫酸化糖を上記精製手段で単離することができる。ゲルろ過法の例としては、セルロファインＧＣＬ−３００を使用し、例えば分子量２５０００超、分子量２５０００〜１００００超、分子量１００００〜５０００超等の任意の分子量画分を調製でき、セルロファインＧＣＬ−９０を用い、例えば分子量２００００以下の画分を分子量２００００〜１５０００超、分子量１５０００〜１００００超、分子量１００００〜５０００超等の任意の分子量画分を調製できる。
【００２６】
限外ろ過法としては、例えば限外ろ過膜や限外ろ過用ホロファイバーを用いることにより、分子量分画を行うことができ、例えばダイセル社製ＦＥ１０−ＦＵＳ０３８２を用いることにより分子量３００００以下の画分を、同ＦＥ−ＦＵＳ−６５３を用いることにより分子量６０００以下の画分を調製することができ、これらのゲルろ過法、限外ろ過法を組合せることにより、任意の分子量分画物を調製することができ、調製物より目的の硫酸化糖を単離することができる。したがって本発明の硫酸化糖は一般式〔Ｉ〕においてｎ＝５超の硫酸化糖を包含するものである。
【００２７】
本発明の硫酸化多糖及び本発明の硫酸化糖の塩としては、医薬的に許容される塩があり、公知の方法にて変換することができる。
【００２８】
本発明により得られた硫酸化糖若しくは硫酸化多糖又はそれらの塩はフコース残基の含有率、その硫酸化度が極めて高く、フコース硫酸含有多糖の構造研究用試薬として、またフコース硫酸含有多糖の生理機能研究用試薬として有用である。
【００２９】
なお、本発明の硫酸化糖及び本発明の硫酸化多糖の硫酸基について述べれば、硫酸基の数は硫酸化多糖の抽出条件、硫酸化糖の製造条件によって変動し得るものである。例えば硫酸基のエステル結合は一般に酸に弱く、またフコースの２位、３位に結合している硫酸エステルはアルカリに弱い。すなわち本発明の硫酸化糖及び本発明の硫酸化多糖の硫酸基の数は特に限定されるものではなく、条件を設定することにより任意の硫酸基含量とすることができる。
【００３０】
本発明の硫酸化糖若しくは硫酸化多糖又はそれらの塩はフコース残基のメチル基による疎水性を併せ持つため、様々な塩基性有機物やタンパク質に高い親和性を有する。したがって本発明の硫酸化糖若しくは硫酸化多糖又はそれらの塩は保水性が優れているだけでなく、その疎水性や荷電等のため例えば肌の角質層への親和性が高く、本発明の硫酸化糖若しくは硫酸化多糖又はそれらの塩は化粧料の素材として極めて有用である。
【００３１】
本発明の硫酸化糖若しくは硫酸化多糖又はそれらの塩は化粧料として使用可能な任意の物質と混合して使用可能である。一般的には、水、アルコール類、油脂類、脂肪酸類、グリセロール、無機塩類、防腐剤、界面活性剤、ビタミン類、アミノ酸類、糖類等と混合し、ローション、乳液、クリーム等として使用できる。
【００３２】
本発明の硫酸化多糖含有物は、例えばガゴメ昆布、マ昆布、ワカメ、クロメ、ジャイアントケルプ、レッソニア  ニグレセンス等の褐藻類の生海藻や乾燥海藻或いはそれらをエタノール等の有機溶媒を６０％以上含む溶液で洗浄したもの（以下、これらを海藻原料と称す）から、抽出する。抽出液は例えば、水、塩化カリウムや塩化ナトリウム等の塩類及び／又は４０％以下のエタノール等の有機溶媒を含む水溶液等を用いることができる。例えば、上記の海藻原料を上記の抽出液中に浸漬し、５０℃以下で放置、あるいはかくはんすることにより、本発明の硫酸化多糖含有物を製造することができる。本発明の硫酸化多糖含有物とは、本発明の硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化多糖を含有すれば限定はなく、得られた硫酸化多糖含有物中には、本発明の硫酸化多糖以外にも、多糖類、アルギン酸、アミノ酸類、糖アルコール類、油脂類、無機塩類、タンパク類等を含有しても良い。本発明の硫酸化多糖含有物は本発明の硫酸化多糖の生理活性により、ウイルス阻害作用、受精阻害作用、抗炎症作用、血管内皮肥厚抑制作用、血栓形成抑制作用、脂血清澄作用、血清コレステロール低下作用、抗アレルギー作用等を示し、医薬品の原料として有用である。本発明の硫酸化多糖含有物は本発明の硫酸化多糖の生理活性により、保湿作用、メラニン色素合成阻害作用等を示し、化粧料の原料として有用である。本発明の硫酸化多糖含有物中に含有される本発明の硫酸化多糖の一例としては、フコースを構成糖とし、フコース１分子当たりおよそ２分子の硫酸基を含む硫酸化多糖がある。当該硫酸化多糖の硫酸基には、海水中あるいは抽出液中に存在する陽イオン、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、鉄等が対イオンとして結合しうる。通常、海藻から抽出した当該硫酸化多糖は、海藻由来のタンパク質によって架橋されており、強い粘弾性を示すのでゲルろ過法による分子量測定は不適当であるが、例えば、１Ｍ以上の塩化ナトリウム等の高塩濃度下で、１時間以上かくはんすれば、その架橋を解離させることができ、ゲルろ過法で当該硫酸化多糖の分子量を測定することができ、プルランを標準物質とした場合、分子量は約一千万の測定値となる。
【００３３】
また本発明の硫酸化多糖含有物としては、藻類からポリ陽イオン物質と硫酸化多糖の架橋の非破壊条件下で抽出する工程を包含する製造方法で製造されるポリ陽イオン物質で架橋された硫酸化多糖又は硫酸化多糖の溶液に、溶液のｐＨよりも等電点が高いポリ陽イオン物質を添加することによって製造されるポリ陽イオン物質で架橋された硫酸化多糖等も包含される。
【００３４】
硫酸化多糖はその性質として吸水性、保水性、粘性、曳糸性、粘弾性等が挙げられるが、これらの性質は例えば原料からの抽出条件の僅かな差により大きく変動する。これらの性質は化粧品や潤滑剤、保湿剤として使用する際に非常に有用な性質であるが、これまで、再現性良く硫酸化多糖を製造したり、これらの性質をコントロールすることは困難であった。
【００３５】
すなわち、硫酸化多糖を化粧品や潤滑剤、保湿剤又はある種の医薬品等として利用する場合はその吸水性、保水性、粘弾性等の再現性が良くないと、使用感や、性能の再現性も無くなり商品化時に大きな問題となっていたが、本発明により、吸水性、保水性、粘弾性等の安定した本発明の硫酸化多糖含有物、その製造方法及びその用途が提供される。
【００３６】
すなわち、本発明者らは本発明の硫酸化多糖とタンパク質等のポリ陽イオンとの相互作用について鋭意検討し、硫酸化多糖がある条件下でポリ陽イオン物質と共存すると著しく粘弾性が高まることを見出した。
また、本発明者らは褐藻類に含まれる硫酸化多糖は、天然の形では褐藻類が持つタンパク質と架橋をしており、ある条件下ではその架橋を維持したまま粘弾性の高い硫酸化多糖含有物として得られることを見出した。
【００３７】
本発明において、硫酸化多糖とは特に限定されるものではなく、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ラムナン硫酸、コンドロイチン硫酸等の硫酸化多糖が例示される。
【００３８】
また本発明においてポリ陽イオン物質とは特に限定されるものではなく、タンパク質やポリペプチド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリグルコサミン、ポリガラクトサミン等のポリ陽イオン物質が包含される。
【００３９】
硫酸化多糖とポリ陽イオン物質を架橋させる際、使用する硫酸化多糖の等電点よりも高いｐＨで、使用するポリ陽イオン物質の等電点よりも低いｐＨで、共存する電解質の濃度は使用する硫酸化多糖とポリ陽イオン物質の架橋を妨げない程度に低く、添加するポリ陽イオン物質量は硫酸化多糖の総荷電を中和するよりも少ないという条件下でポリ陽イオン物質で架橋した硫酸化多糖は、その粘弾性が著しく高まる。
【００４０】
ポリ陽イオン物質として、ゼラチンやコラーゲンの様に等電点の比較的高いタンパク質を使用する場合は、正の荷電が多く硫酸化多糖を架橋しやすいので、粘弾性を付与し易い。しかし、等電点が比較的低いタンパク質でも、硫酸化多糖溶液のｐＨを使用するタンパク質の等電点よりも下げれば、ゼラチンやコラーゲンのように硫酸化多糖に強い粘弾性を付与することができる。
【００４１】
本発明のポリ陽イオン物質で架橋した硫酸化多糖は、藻類より調製することができる。例えば褐藻類に含まれているフコース硫酸含有硫酸化多糖は抽出する方法により抽出効率や性質がかなり異なる。
【００４２】
単に短時間で大量のフコース硫酸含有硫酸化多糖を得る目的の場合は、海藻を粉砕し、水あるいは酸、塩、アルカリ等の水溶液により加熱かくはん抽出すれば容易にフコース硫酸含有硫酸化多糖を抽出することができる。
【００４３】
しかしながらこうして得られたフコース硫酸含有硫酸化多糖は、藻類内に存在していた形態と比較すると分子量が小さく粘弾性もほとんどない。したがって化粧品として使用した場合硫酸化糖の効能はあるが使用感にぬめりや潤滑性等の特徴はなく、潤滑剤としての使用もほとんど不可能である。
【００４４】
ところが、藻類を５０℃以下、好ましくは３０℃以下程度で、水あるいは中性付近の水溶液に浸し、かくはん速度も、せん断力がほとんど生じない様な速度で、例えば抽出された粘弾性の強い物質が藻類から引きはがされない程度に設定すると、フコース硫酸含有硫酸化多糖は藻類中のタンパク質で架橋した形態で抽出される。
【００４５】
このタンパク質で架橋されたフコース硫酸含有硫酸化多糖は新鮮鶏卵白様の性質すなわち粘弾性を呈する。
【００４６】
タンパク質とフコース硫酸含有硫酸化多糖の架橋は比較的容易に解離する。タンパク質で架橋されたフコース硫酸含有硫酸化多糖は、かくはんするとかくはん軸を伝って液が巻き上がってくるが（ワイセンベルク効果）、長時間せん断力が強くかかるかくはんを継続すると粘弾性が低下し、液面はかくはん軸に接する部分でむしろ窪む様になる。また加熱や高濃度の塩類の添加、プロテアーゼ処理等によっても、タンパク質とフコース硫酸含有硫酸化多糖の架橋は解離し、その粘弾性は消失する。
【００４７】
すなわち、上記のように抽出されたタンパク質で架橋されたフコース硫酸含有硫酸化多糖の強い粘弾性はフコース硫酸含有硫酸化多糖そのものが持っているのではなく、フコース硫酸含有硫酸化多糖とタンパク質が架橋しているときに存在する性質である。
【００４８】
したがって、一度、粘弾性を喪失したフコース硫酸含有硫酸化多糖について、粘弾性を回復させることも可能であり、該フコース硫酸含有硫酸化多糖にタンパク質等のポリ陽イオン物質を添加すると容易に粘弾性を回復することができる。タンパク質等のポリ陽イオン物質の添加量により粘弾性の強度も自在に調整できる。すなわち本発明により、硫酸化多糖にポリ陽イオン物質を添加することを特徴とする硫酸化多糖の粘弾性を増強する方法が提供される。
【００４９】
例えば、タンパク質等のポリ陽イオン物質の等電点よりやや低いｐＨの環境で硫酸化多糖、例えばフコース硫酸含有硫酸化多糖の荷電が中和されない程度の量混合すれば、タンパク質等のポリ陽イオン物質の混合量とフコース硫酸含有硫酸化多糖溶液の粘弾性には正の相関がある。
【００５０】
当然のことながら、硫酸化多糖、例えばフコース硫酸含有硫酸化多糖溶液のｐＨが、加えるポリ陽イオン物質の等電点よりもはるかに低かったり、加えるポリ陽イオン物質の量がフコース硫酸含有硫酸化多糖の荷電を中和させてしまう量の場合は、沈殿が形成され粘弾性は低下する。
【００５１】
タンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖を得るために使用される海藻は特に限定されるものではなく、ガゴメ昆布、とろろ昆布、ま昆布、カジメ、アラメ、ワカメ、モズク、オキナワモズク等フコース硫酸含有硫酸化多糖を含む褐藻類ならどんな種類でも使用することができる。
【００５２】
褐藻類も生海藻、乾燥海藻、塩漬海藻等どんな形態でも使用できる。
【００５３】
本発明の、タンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖を抽出する前に、６０〜１００％程度のアルコール等で海藻を洗浄すると、海藻に付着した塩類、着色性物質等を除去できる。本発明の、タンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖を抽出する際には、水、塩類を含む水、アルコール類を含む水など様々な溶媒が使用できるが、塩類はフコース硫酸含有硫酸化多糖とタンパク質の架橋を解離させその粘弾性を下げる働きがあるので、塩類は１００ｍＭ以下が好ましい。またアルコール類は３０％以下が好ましい。
【００５４】
抽出温度は５０℃以下が好ましく、好適には５〜３０℃が好ましい。抽出時のかくはんはなくてもよいが、抽出液が静止していると、抽出時間が長時間必要となる。かくはんする際には、上述したようにタンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖の粘弾性が必要以上低下しないようなかくはん速度を選べば良い。ただし、かくはん速度よりもせん断力の強さの方が粘弾性に与える影響がはるかに大きいので、低かくはん速度で非せん断の条件下で抽出するのが好ましい。
【００５５】
なおかくはんにより低下した粘弾性を回復させるにはポリ陽イオン物質、例えばゼラチン、コラーゲン等を添加すれば良い。
【００５６】
すなわち低粘弾性硫酸化多糖にポリ陽イオンを添加することにより硫酸化多糖の粘弾性が増強し、構成成分として、低粘弾性硫酸化多糖とポリ陽イオン物質を少なくとも含有する組成物が提供され、該組成物は粘弾性の強い組成物として、化粧料、潤滑剤等の種々の用途に有用である。
【００５７】
本発明のポリ陽イオン物質で架橋した硫酸化多糖は、抽出液をそのまま使用しても良いが、更に精製して使用しても良い。
【００５８】
本発明のポリ陽イオン物質で架橋した硫酸化多糖を有効成分として含有する医薬、例えば本発明のポリ陽イオン物質で架橋した硫酸化多糖を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば口内用剤を製造することができる。
【００５９】
本発明の口内用剤は、例えば、だ液の分泌が不十分で口腔が乾燥して口の開閉等が不自由なとき口に含むと症状が極めて改善される。
【００６０】
また、本発明のポリ陽イオンで架橋した硫酸化多糖は潤滑剤としても使用することができる。本発明の潤滑剤は非常に滑らかで極めて良好な潤滑作用を有し、様々な医療器具あるいは医薬品等を肛門あるいは膣に挿入する際など極めて良好な潤滑作用を示す。また、性交時やマッサージの際の潤滑剤としても使用することができる。
【００６１】
本発明のポリ陽イオン物質で架橋した硫酸化多糖は化粧料として使用可能な任意の物質と混合して使用可能である。一般的には、水、アルコール類、油脂類、脂肪酸類、グリセロール、無機塩類、防腐剤、界面活性剤、ビタミン類、アミノ酸類、糖類等と混合し、ローション、乳液、クリーム等として使用できる。
【００６２】
本発明のポリ陽イオンで架橋した硫酸化多糖は化粧品として使用するとその粘弾性のため滑らかな使い心地で使用感が良く、しかも肌に塗布したときはそのぬめりは瞬時にして肌に吸着されるという性質をもつ。使用後のべたつきもなく化粧品として非常に好ましい性質である。この性質は硫酸化多糖としてフコース硫酸含有硫酸化多糖を用いた場合、特に上記の好ましい性質が顕著である。
【００６３】
本発明の硫酸化糖、本発明の硫酸化多糖は抗原として使用することができる。抗体の作製は常法によりおこなわれるが、例えば本発明の硫酸化糖又は本発明の硫酸化多糖をアジュバンドとともにウサギ等の動物に免疫することによって、ポリクローナル抗体を調製することができる。またモノクローナル抗体は抗原を免疫して得られた抗体産生Ｂ細胞とメラノーマ細胞を融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、この細胞を培養することによって調製することができる。これらの抗体は本発明の硫酸化糖、本発明の硫酸化多糖の精製に使用することができる。また海藻中の本発明の硫酸化多糖の同定に使用することができる。例えば、本発明の抗体を使用し、海藻抽出液中の本発明の硫酸化多糖含量を容易に測定でき、高含有抽出液を効率よく調製することが可能になる。例えばガゴメ昆布、レッソニア  ニグレセンス、マ昆布等の抽出液中には本発明の硫酸化多糖が高含有されていることが判明し、本発明の硫酸化多糖の工業的製造を効率よく行うことができる。また、本発明の硫酸化糖、本発明の硫酸化多糖を認識する抗体は、本発明の硫酸化糖、本発明の硫酸化多糖の生理機能の解明に有用であり、例えば本発明の硫酸化糖、本発明の硫酸化多糖の受精阻害作用機作、ウイルス感染阻害機作、生体内での代謝等の解析に有用である。
【００６４】
本発明の硫酸化糖は糖鎖工学用物質として有用であり、特公平５−６５１０８号公報記載の方法により２−アミノピリジル化（ＰＡ化）を行い、ＰＡ化物を調製すれば、糖鎖工学用物質として極めて有用な物質を提供することができる。
【００６５】
更に、本発明の硫酸化糖及び／又は本発明の硫酸化多糖を有効成分とし、抗ガン剤、がん転移抑制剤、抗ウイルス剤、受精阻害剤、抗炎症剤、血管内皮肥厚抑制剤、血栓形成抑制剤、脂血清澄剤、血清コレステロール低下剤等の医薬品を製造することができ、これらの医薬品の投与を必要とする疾病の治療又は予防に使用することができる。また本発明の硫酸化多糖含有物も、これらの医薬品原料として使用できる。なお本発明の硫酸化糖、本発明の硫酸化多糖、本発明の硫酸化多糖含有物から選択されるものを含有、希釈及び／又は添加してなる、上記生理活性を有する食品又は飲料を提供することができる。また本発明の硫酸化糖、本発明の硫酸化多糖、本発明の硫酸化多糖含有物から選択されるものを有効成分とする化粧品を提供することができる。
【００６６】
【実施例】
以下に本発明を実施例によって更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００６７】
参考例１
（１）アルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース  ０．２５％、ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分間）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０２％、下記参考例２に記載の硫酸化多糖  ０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファメンターに入れて１２０℃、２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、６００ｍｌの硫酸化多糖に選択的に作用するエンド型硫酸化多糖分解酵素液を調製した。
【００６８】
（２）乾燥したガゴメ昆布２Ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間かくはんし、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、３０ｍｌの上記参考例１−（１）で調製したエンド型硫酸化多糖分解酵素、１０％のエタノール、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭのイミダゾールを含む２０リットルの緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で４８時間かくはんした。この懸濁液を網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過し、残渣を５０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０％のエタノールで洗浄した。更にその残渣を１０リットルの５０ｍＭ塩化カルシウムを含む１０％のエタノール中に懸濁し、３時間かくはん後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、１６時間かくはんし、直径３２μｍのステンレス金網でろ過、洗浄した。
【００６９】
こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量３０００のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。
【００７０】
このろ過液をロータリーエバポレーターで約３リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に０．１Ｍとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ５０ｍＭの酢酸カルシウムにより平衡化させたＤＥＡＥ−セルロファイン（樹脂量４リットル）にかけ、５０ｍＭの酢酸カルシウム及び５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０ｍＭ〜８００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。この時の分取量は１本当り５００ｍｌで行った。分取した画分をセルロースアセテート膜電気泳動法［アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７巻、第１９７〜２０２頁（１９７０）］により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約０．４Ｍで溶出される硫酸化糖（フラクションナンバー６３付近）が均一であることが判明した。また、約０．６Ｍの濃度で溶出される硫酸化糖（フラクションナンバー６７付近）も電気泳動的にほぼ均一であった。
【００７１】
そこで、まずフラクションナンバー６３の液を１５０ｍｌに濃縮後、濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ４Ｍの塩化ナトリウムにより平衡化したＰｈｅｎｙｌ−セルロファイン（樹脂量２００ｍｌ）にかけ、４Ｍの塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液５０５ｍｌを得た。
【００７２】
得られた脱塩液のうち４０ｍｌを１０％のエタノールを含む０．２Ｍの塩化ナトリウムによって平衡化させたセルロファインＧＣＬ−９０のカラム（４．１ｃｍ×８７ｃｍ）にかけて、ゲルろ過を行った。分取は１フラクション当り９．２ｍｌで行った。
【００７３】
全フラクションに対して総糖量の分析をフェノール硫酸法〔アナリティカル  ケミストリー（Analytical Chemistry）、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕により行った。
【００７４】
この結果、硫酸化糖は１つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー６３〜７０を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、１１２ｍｇの硫酸化糖の乾燥品を得た。
【００７５】
乾燥品の一部を取り糖組成分析及び質量分析を行った。
また、乾燥品のうちの１０ｍｇを常法により重水置換し、ＮＭＲ分析に供した。
【００７６】
糖組成分析の結果、本硫酸化糖はフコースのみからなる硫酸化糖であることが判明した。
【００７７】
ＡＰＩ−III 質量分析機（パーキンエルマー・サイエクス社）を用いた、硫酸化糖の質量分析の結果を図１に示し、以下に解析結果を示す。すなわち図１は硫酸化糖の質量分析の結果を示す図であり、縦軸は相対強度（％）を、横軸はｍ／ｚ値を示す。
【００７８】
分子量は、全硫酸基がナトリウム塩になっている状態で２２６４±１という結果が得られた。つまり、構成糖がフコースだけの硫酸化糖であることから、フコースが７分子、硫酸基が１２分子結合したもので、その硫酸基がすべてナトリウム塩になっているもので、理論的分子量は２２６５であることが判明した。
【００７９】
つまり、本物質をＭとすると、図１中の主なシグナルは下記のように帰属することができる。
ｍ／ｚ  １１０９．０５--- 〔Ｍ−２Ｎａ＋  〕２−  （理論値  １１０９．５）
７３１．４５--- 〔Ｍ−３Ｎａ＋  〕３−  （理論値    ７３２）
５４２．７５--- 〔Ｍ−４Ｎａ＋  〕４−  （理論値    ５４３．２５）
４３０．０５--- 〔Ｍ−５Ｎａ＋  〕５−  （理論値    ４３０）
この結果、本物質はフコース７分子、硫酸基１２分子のオリゴ糖である。
【００８０】
次に、フコースの結合様式、及び硫酸基の結合位置を決定するために、ＪＮＭ−α500 型核磁気共鳴装置（日本電子社製）を用い、ＮＭＲ分析を行った。構成糖の結合様式は  １Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。  １Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を、１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。
【００８１】
ＮＭＲの帰属の結果を以下に示し、上記手順により得られた硫酸化糖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図３にそれぞれ示した。但し、１Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はジオキサンの化学シフト値を３．５３ｐｐｍに、１３Ｃ−ＮＭＲではジオキサンの化学シフト値を６６．５ｐｐｍとして表した。測定は両方共に６０℃で行った。すなわち図２は上記手順により得られた硫酸化糖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図３は上記手順により得られた硫酸化糖の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。図２、図３において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，Ａ−１−Ｈ）、５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｂ−１−Ｈ）、５．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｅ−１−Ｈ）、５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ−１−Ｈ）、５．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｃ−１−Ｈ）、５．１６（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｄ−１−Ｈ）、５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｇ−１−Ｈ）、４．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｂ−４−Ｈ）、４．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ａ−４−Ｈ）、４．６５（１Ｈ，ｍ，Ｅ−４−Ｈ）、４．６４（１Ｈ，ｍ，Ｄ−４−Ｈ）、４．６２（１Ｈ，ｍ，Ｃ−４−Ｈ）、４．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，Ｆ−４−Ｈ）、４．３７（１Ｈ，ｍ，Ｅ−２−Ｈ）、４．３６（１Ｈ，ｍ，Ｇ−３−Ｈ）、４．３５（１Ｈ，ｍ，Ｃ−２−Ｈ）、４．３３（１Ｈ，ｍ，Ｂ−２−Ｈ）、４．３２（１Ｈ，ｍ，Ｃ−３−Ｈ）、４．３０（１Ｈ，ｍ，Ａ−２−Ｈ）、４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｆ−２−Ｈ）、４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｆ−５−Ｈ）、４．２５（１Ｈ，ｍ，Ｄ−５−Ｈ）、４．２４（１Ｈ，ｍ，Ｃ−５−Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｍ，Ｅ−５−Ｈ）、４．１８（１Ｈ，ｍ，Ｂ−３−Ｈ）、４．１８（１Ｈ，ｍ，Ｆ−３−Ｈ）、４．１７（１Ｈ，ｍ，Ａ−３−Ｈ）、４．１７（１Ｈ，ｍ，Ｅ−３−Ｈ）、４．１６（１Ｈ，ｍ，Ｄ−３−Ｈ）、４．１４（１Ｈ，ｍ，Ａ−５−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｍ，Ｂ−５−Ｈ）、３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｄ−２−Ｈ）、３．９７（１Ｈ，ｍ，Ｇ−４−Ｈ）、３．９６（１Ｈ，ｍ，Ｇ−５−Ｈ）、３．７８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝４．３，１０．４Ｈｚ，Ｇ−２−Ｈ）、１．３４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｄ−５−ＣＨ３のＨ３）、１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｅ−５−ＣＨ３のＨ３）、１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ａ−５−ＣＨ３のＨ３）、１．１１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｃ−５−ＣＨ３  のＨ３  ）、１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｂ−５−ＣＨ３のＨ３）、１．０６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ−５−ＣＨ３のＨ３）、１．０４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｇ−５−ＣＨ３のＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ９９．２（Ｇ−１−Ｃ）、９８．９（Ｃ−１−Ｃ）、９８．３（Ｂ−１−Ｃ）、９７．１（Ｅ−１−Ｃ）、９４．６（Ｆ−１−Ｃ）、８９．３（Ａ−１−Ｃ）、８９．３（Ｄ−１−Ｃ）、８１．３（Ｆ−４−Ｃ）、８０．６（Ｂ−４−Ｃ）、７８．６（Ａ−４−Ｃ）、７７．９（Ｇ−３−Ｃ）、７７．５（Ｃ−４−Ｃ）、７７．４（Ｅ−４−Ｃ）、７５．９（Ｂ−３−Ｃ）、７５．４（Ａ−２−Ｃ）、７４．８（Ｆ−２−Ｃ）、７４．５（Ｂ−２−Ｃ）、７４．２（Ｄ−３−Ｃ）、７３．９（Ａ−３−Ｃ）、７３．９（Ｄ−２−Ｃ）、７３．６（Ｃ−２−Ｃ）、７３．０（Ｄ−４−Ｃ）、７３．０（Ｅ−２−Ｃ）、７０．９（Ｃ−３−Ｃ）、７０．６（Ｄ−５−Ｃ）、７０．１（Ｇ−４−Ｃ）、６９．９（Ｅ−３−Ｃ）、６８．０（Ｂ−５−Ｃ）、６７．５（Ａ−５−Ｃ）、６７．５（Ｅ−５−Ｃ）、６６．９（Ｃ−５−Ｃ）、６６．７（Ｇ−５−Ｃ）、６６．５（Ｆ−３−Ｃ）、６６．３（Ｆ−５−Ｃ）、６５．６（Ｇ−２−Ｃ）、１６．０（Ｃ−５−ＣＨ３のＣ）、１５．９（Ｂ−５−ＣＨ３のＣ）、１５．８（Ｅ−５−ＣＨ３のＣ）、１５．８（Ｆ−５−ＣＨ３のＣ）、１５．４（Ｇ−５−ＣＨ３のＣ）、１５．３（Ａ−５−ＣＨ３のＣ）、１３．１（Ｄ−５−ＣＨ３  のＣ）
【００８２】
なお、ＮＭＲのピークの帰属の番号は下記式〔II〕の通りである。
【化２】
0003762234.tif 000002
【００８３】
以上の結果より、本物質は下記式 〔III〕で表される硫酸化糖であることが判明した。
【化３】
0003762234.tif 000003
【００８４】
（３）参考例１−（２）に記載した、ＤＥＡＥ−セルロファインのフラクションナンバー６７に関しても６３と全く同様に精製して凍結乾燥品を得た。
【００８５】
この標品は、ＨＰＬＣによる分析の結果６３よりも分子量の大きな硫酸化糖であることが判明したが、ＮＭＲの分析結果によると６３とほぼ同じスペクトルが得られた。
【００８６】
図４にフラクションナンバー６７の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した。但し、溶媒は重水を用い、  １Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はジオキサンの化学シフト値を３．５３ｐｐｍとして表した。測定は６０℃で行った。すなわち図４はフラクションナンバー６７の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
【００８７】
この結果、フラクションナンバー６７は６３が数分子結合した構造を持つことが強く示唆された。そこで、フラクションナンバー６７を参考例１−（１）記載のエンド型硫酸化多糖分解酵素により分解して分解物をＨＰＬＣにより分析したところ、反応生成物の多くが参考例１−（２）に記載したＤＥＡＥ−セルロファインのフラクションナンバー６３から得た硫酸化糖と同じ位置に溶出されてきた。
【００８８】
なお、ＨＰＬＣの分析条件は下記の通りである。
カラム  Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＢ８０２．５
カラム温度  ２５℃
溶液    ５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
検出    示差屈折率検出器  Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１
【００８９】
上記フラクションナンバー６７、６３につきプルラン（昭和電工社製）を標準物質としたゲルろ過法により分子量を測定したところ、６３はプルラン換算で分子量約８５００、フラクションナンバー６７は分子量約２６０００であり、フラクションナンバー６７はフラクションナンバー６３の硫酸化糖の３量体であることが判明した。
【００９０】
また７糖残基の繰り返しの結合位置はフラクションナンバー６７の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを詳細に検討することにより、式〔II〕中のＦのフコースの３位にα−（１→３）結合でつながっていることが明らかとなった。
【００９１】
また上記の方法に準じ、上記手順により得られた硫酸化多糖の分解物中より、  〔ＩＩＩ〕で表される硫酸化糖の５量体、すなわち一般式〔Ｉ〕においてｎ＝５で表される硫酸化糖を得た。
【００９２】
参考例２
（１）乾燥したガゴメ昆布２Ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間かくはんし、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、９５℃に加温した４０リットルの５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５に懸濁し、時々かくはんしながら９５℃で２時間処理し、硫酸化多糖を抽出した。
【００９３】
抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を３．５リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。
【００９４】
両ろ液を合わせた後、３０℃まで温度を下げ、３０００Ｕのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを４リットル加え２５℃で２４時間かくはんした。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを備えた限外ろ過器により４リットルに濃縮し、更に、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。
【００９５】
非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を５℃まで温度を下げ、０．５Ｎ塩酸によりｐＨを２．０とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．０とした。
【００９６】
次に、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過器により限外ろ過を行い、２０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ８．０により完全に溶媒置換後、再度ｐＨを８．０として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約９５ｇの硫酸化多糖を調製した。
【００９７】
（２）参考例２−（１）記載の硫酸化多糖の乾燥標品１０ｇをとり、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、５０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液ｐＨ８．０に溶解し、２０ｍｌの参考例１−（１）に記載のエンド型硫酸化多糖分解酵素を添加して２５℃で２４時間反応後、反応液を排除分子量３５００の透析チューブで充分透析し、透析液（低分子物）を濃縮後、排除分子量３００の膜を装着した電気透析器により脱塩し、このうちの一部をセルロファインＧＣＬ−９０（４．１×８７ｃｍ）によりゲルろ過した。分取量は１本当り１０ｍｌで行った。
【００９８】
このフラクションナンバー６３番付近をセルロースアセテート膜電気泳動及びＨＰＬＣにより分析した結果、参考例１−（２）に記載の式  〔ＩＩＩ〕で表される構造を持った硫酸化糖と同じ挙動を示すことが判明し、硫酸化多糖から式〔ＩＩＩ〕で表される硫酸化糖を調製した。また同様にして、  〔ＩＩＩ〕で表される硫酸化糖の３量体、５量体、すなわち一般式〔Ｉ〕においてｎ＝３、５でそれぞれ表される硫酸化糖を得た。
【００９９】
参考例３
参考例２−（１）記載の硫酸化多糖を１リットル当り５グラムとなるように、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液ｐＨ８．０に溶解した液を１０リットル調製した。この硫酸化多糖溶液２リットルに３０ｍｌの参考例１−（１）記載のエンド型硫酸化多糖分解酵素を添加して、排除分子量３０００の限外ろ過用ホロファイバーを装着させた限外ろ過機にかけ、２５℃でろ過速度を１時間当り２００ｍｌとして運転した。運転中酵素反応溶液には、ろ過された液量と同量の上記硫酸化多糖溶液を添加した。硫酸化多糖溶液が添加された後には、上記の緩衝液のみを同様に添加した。
【０１００】
以下参考例１−（２）と同様に、ろ過液を濃縮後遠心分離して上清を得、次いでこの上清を脱塩後、酢酸カルシウムにより沈殿を形成させ、遠心分離により上清を得た。得られた上清について参考例１−（２）と同様にＤＥＡＥ−セルロファインにより精製し、式  〔ＩＩＩ〕で表される硫酸化糖を調製した。
【０１０１】
参考例４
ガゴメ昆布５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて、２５℃で３日間攪拌し、網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過して、硫酸化多糖の抽出物を得た。
【０１０２】
該抽出物を１００ｍｌとり、排除分子量１２０００の透析用チューブに入れて５リットルの水に対して２回透析を行った。非透析画分を凍結乾燥し、硫酸化多糖を得、該硫酸化多糖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図５）、赤外吸収（ＩＲ）スペクトル（図６）を測定した。すなわち図５は上記手順により得られた硫酸化多糖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。但し、溶媒は重水を用い、１Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。また図６は上記手順により得られた硫酸化多糖のＫＢｒ法によるＩＲスペクトルを示す図であり、縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃｍ−１）を示す。なおＩＲスペクトルはＦＴＩＲ−８０００ＰＣ赤外分光光度計（島津製作所製）を用い測定した。
【０１０３】
図５に示されるように上記手順により得られた硫酸化多糖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、図４で示される硫酸化糖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルとほぼ同一であり、上記手順により得られた硫酸化多糖は一般式〔Ｉ〕で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化多糖である。
【０１０４】
上記手順により得られた硫酸化多糖の抽出物に、４Ｍの塩化ナトリウムを添加し強かくはん下混合し、終濃度を１Ｍ塩化ナトリウム溶液とし、これをＨＰＬＣにより分析し、上記手順により得られた硫酸化多糖の分子量を測定した。上記手順により得られた硫酸化多糖はプルラン標準物質の分子量換算で平均分子量約１３００万であった。ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
装  置：Ｌ−６２００型ＨＰＬＣ（日立製作所製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＢ−８０６ＨＱ（８×３００ｍｍ）（昭和電工社製）
溶離液：５０ｍＭ塩化ナトリウム
検  出：示差屈折率検出器Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１（昭和電工社製）
カラム温度：２５℃
【０１０５】
また上記手順により得られた硫酸化多糖溶液に参考例１―（１）記載のエンド型硫酸化多糖分解酵素を作用させたところ一般式〔Ｉ〕で表される硫酸化糖が検出された。
【０１０６】
参考例５
ガゴメ昆布５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて内径４０ｃｍの容器で２５℃で２日間、１分当り２００回転の速度でかくはんし、海藻のタンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖を抽出した。抽出物は強い粘弾性を呈し、かくはん軸を伝って抽出液が巻き上げられるワイセンベルク効果を呈した。
【０１０７】
通常ガゴメ昆布のフコース硫酸含有硫酸化多糖含量は最大でも乾燥海藻の５％程度であるから、本抽出液のフコース硫酸含有硫酸化多糖濃度は、最大でも０．０５％である。
【０１０８】
しかし、市販のフコース硫酸含有硫酸化多糖（フコイダン：シグマ社製）の水溶液は、０．０５％はもとより、２％にまで濃度を上げても全く粘弾性を呈さず、上記手順により得られた海藻のタンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖とは異なる性質であった。
【０１０９】
本抽出液中のタンパク質量を、プロテインアッセイ（バイオラッド社製）により測定したところ７．５μｇ／ｍｌであった。
【０１１０】
本抽出液にアクチナーゼＥ（タンパク質分解酵素、科研製薬社製）を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で作用させるとその粘弾性が極度に低下した。
【０１１１】
また、本抽出液５ｍｌに参考例１−（１）に示したアルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９  （ＦＥＲＭ  ＢＰ―５７４７）の生産するエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素含有液を１０μｌ添加し作用させると、その粘弾性が完全に消失した。
【０１１２】
以上の結果から、褐藻類の抽出物の粘弾性を担っているのはタンパク質で架橋されたフコース硫酸含有硫酸化多糖であること及び褐藻類のフコース硫酸含有硫酸化多糖を特殊な条件で抽出すると、本発明のタンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖が効率良く抽出できることが判明した。
【０１１３】
得られた抽出液を皮膚に塗布すると、最初強いぬめりがあるが、軽く擦り込めばぬめりが肌に吸着され、べたつきもなく、肌はしっとりとし、肌を整える化粧品として極めて有効なものであることも判明した。
【０１１４】
参考例６
（１）ガゴメ昆布５０ｇを細断し、２リットルの８０％エタノールで洗浄後、５リットルの１ｍＭ塩化カリウム及び０．０７５％のエチルパラベンを含む水溶液中にて内径２０ｃｍの容器で２５℃で２日間、１分当り２００回転の速度でかくはんし、タンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖を抽出した。
【０１１５】
抽出物は強い粘弾性を呈し、かくはん軸を伝って抽出液が巻き上げられるワイセンベルク効果を呈した。この抽出液の性質は参考例５の抽出液と同等であった。本抽出液はエタノールに過敏な肌を持つ人の化粧品として有効である。
【０１１６】
（２）乾燥したガゴメ昆布２Ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業製）により粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間かくはんし、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、９５℃に加温した４０リットルの５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５に懸濁し、時々かくはんしながら９５℃で２時間処理し、フコース硫酸含有硫酸化多糖を抽出した。
【０１１７】
抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を３．５リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。こうして得られた抽出液を２５℃まで冷却した。本抽出液は参考例５及び参考例６−（１）にそれぞれ記載の抽出液より多くのフコース硫酸含有硫酸化多糖を含んでいるが粘弾性を呈さなかった。また、本抽出液は排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により充分脱塩後にも強い粘弾性を呈することはなかった。しかしながら硫酸化多糖特有の粘性は呈した。すなわち、抽出温度が高すぎると本発明のタンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖は調製できないことが判明した。
【０１１８】
（３）ガゴメ昆布５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて内径４０ｃｍの容器で２５℃で２日間、１分間当り８００回転の速度でかくはんし、フコース硫酸含有硫酸化多糖を抽出した。抽出物の粘弾性は弱く、かくはん時もワイセンベルク効果を呈さなかった。この抽出液は、肌に塗布時、フコース硫酸含有硫酸化多糖特有のしっとりとさせる効果はあるものの、参考例５や参考例６−（１）のタンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖のもつ特有のぬめりがほとんどなく、使用感は全く別物であった。しかしながら、含有タンパク質濃度は７．５μｇ／ｍｌであり、参考例５の抽出液と同じであった。この結果、かくはん速度が速すぎると、すなわち、かくはん時にせん断力が強く加わるとタンパク質とフコース硫酸含有硫酸化多糖の架橋が破壊されることが判明した。
【０１１９】
実施例１
参考例６−（１）で得られた抽出液を内径２０ｃｍの容器で１分間当り６００回転のかくはん速度で室温で１８時間かくはんを行ったところ、相対粘弾性値が２．０から１．２に低下した。粘弾性が低くなったフコース硫酸含有硫酸化多糖溶液に様々な量の１％のゼラチン水溶液を添加したところ、粘弾性が回復した。粘弾性とゼラチンの終濃度の関係を下記表１に示す。
【０１２０】
下記表１において粘弾性は相対値で示しており、被検液を内径２ｍｍのシリコンチューブから重力により垂直に流し、出口の下方１〜５ｃｍ程度のところでガラス棒により流れ落ちる被検液を水平方向に押したとき、流れが切断されることなく押されうる最大距離（ｃｍ）をもって相対粘弾性値とした。なお、被検液の液面から被検液の出口までの距離は２０〜２１ｃｍであり、水の相対粘弾性値は０であった。
【０１２１】
【表１】
0003762234.tif 000004
【０１２２】
上記の結果から、参考例６−（１）の海藻のタンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖はせん断力の強いかくはんによりその粘弾性が低下するが、適当なｐＨや塩濃度の条件下で適当量のゼラチンを添加することによってその粘弾性を回復することができることが判明し、粘弾物を得ることができた。なお、粘弾物は透明なゼリー様の外観を有するゾル状の性状のものである。
【０１２３】
また、ゼラチンの添加量が多すぎると粘弾性は消失するので、フコース硫酸含有硫酸化多糖の量に応じて増減する必要があることも判明した。
【０１２４】
参考例７
だ液の分泌が不十分なため口腔の乾燥が甚だしく、口の開閉にも不自由する８０歳の女性において、これまで何を使用しても症状の改善が見られなかったが、参考例５の抽出液を口腔に使用したところ、口腔の乾燥、口唇のひび割れ等が改善され、口の開閉の不自由さが著しく改善された。また、３カ月以上の連続使用を行ってもその効果は続いた。
【０１２５】
参考例８
ガゴメ昆布５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて内径４０ｃｍの容器で２５℃で２日間、１分当り１２０回転の速度でかくはんし、本発明の海藻のタンパク質で架橋したフコース硫酸含有硫酸化多糖を抽出した。抽出物は強い粘弾性を呈し、かくはん軸を伝って抽出液が巻き上げられるワイセンベルク効果を呈した。抽出物を網目３２μｍのステンレス金網でろ過し、高粘弾性フコース硫酸含有硫酸化多糖溶液を調製した。
【０１２６】
該フコース硫酸含有硫酸化多糖溶液４６リットルに、１ｇのパームオイル（花王社製：化粧品用）を１リットルのエタノールに溶解したパームオイル溶液１リットルをかくはんしながら添加し、更に１リットルのグリセロールを添加し、化粧水を調製した。本化粧水は高粘弾性フコース硫酸含有硫酸化多糖の保湿効果とパームオイルの乾燥防止効果を合わせ持ち、界面活性剤を添加することなくパームオイルが均一に効率よく分散され、油分のべたつきがなく、のびの良い使用感の良い化粧水となった。またパームオイルの代わりにヤシ油（花王社製：化粧品用）を使用し、同様に化粧水を製造した。この化粧水も使用感の良い、化粧水であった。
【０１２７】
実施例２
参考例６−（３）で調製した抽出液に、終濃度が０．０２％となるようにゼラチン及び香料を添加しゼラチン使用の化粧水を得た。また同様にコラーゲンを添加しコラーゲン使用の化粧水を得た。それぞれの化粧料は高粘弾性のフコース硫酸含有硫酸化多糖を含有し、添加タンパク質との相乗作用により、保湿性に優れたのびの良い化粧水となった。
【０１２８】
以上、上記の化粧水を使用するとその粘弾性のため滑らかな使い心地で使用感が良く、しかも肌に適量を塗布したときはそのぬめりは瞬時にして肌に吸着されるという性質を有した。また使用後のべたつきもなく化粧品として非常に好ましい性質であった。
【０１２９】
参考例９
参考例４で調製した硫酸化多糖の抽出物を、化粧水として使用した。この化粧水は滑らかな使い心地で使用感が良く、しかも肌に塗布したとき、そのぬめりは瞬時にして肌に吸着されるという性質を有した。また使用後のべたつきもなく化粧品として非常に好ましい性質であった。また、本化粧水を使用した場合、手の甲や顔面のしみが薄くなるという効果を示した。
【０１３０】
【発明の効果】
本発明により医薬品、あるいは糖鎖工学研究用試薬として有用な硫酸化糖若しくは硫酸化多糖又はそれらの塩が提供された。この硫酸化糖若しくは硫酸化多糖又はそれらの塩はその保水性等により化粧料の素材として極めて有用である。
【０１３１】
また本発明により、高い粘弾性を有する硫酸化多糖及びその製造方法が提供される。また該高粘弾性硫酸化多糖を有効成分として含有する医薬、化粧料も提供される。本発明の医薬は例えば口内用剤として有用である。また本発明の高粘弾性硫酸化多糖は保水性及び潤滑性が優れているだけでなく、その疎水性のため肌の角質層への親和性が高く肌へのなじみも極めてよく、本発明の硫酸化多糖、特に高粘弾性のフコース硫酸含有多糖は化粧料の素材として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】硫酸化糖の質量分析の結果を示す図である。
【図２】硫酸化糖の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】硫酸化糖の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】フラクションナンバー６７の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５】本発明の硫酸化多糖の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６】本発明の硫酸化多糖のＩＲスペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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