(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分として含有する剤形が外用剤である痒疹及び脂漏性皮膚炎から選ばれる皮膚疾患の治療剤。
【請求項２】
痒疹が、結節性痒疹又は亜急性痒疹である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
痒疹が、アトピー性皮膚炎性痒疹である請求項１記載の治療剤。
【請求項４】
外用剤が軟膏剤、クリーム剤、ローション剤又はテープ剤である請求項１項記載の治療剤。
【請求項５】
外用剤が、（ａ）主薬としての１α、２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールと、（ｂ）１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを溶解する脂肪酸エステル類、高級アルコール類及び炭酸プロプレンからなる群から選ばれる一種あるいは二種以上の混合物である疎水性・無水性の溶剤と、（ｃ）白色ワセリン、黄色ワセリン、流動パラフィン及び流動パラフィンのポリエチレンゲルから選ばれる一種あるいは二種以上の混合物である親油性基剤とからなる軟膏剤であって、該疎水性・無水性の溶剤の量が、該軟膏剤の０．０１〜２５．０重量％であり、該脂肪酸エステル類が、アジピン酸ジイソプロピル、オレイン酸デシル、セバシン酸ジエチル、ミリスチン酸イソプロピル、トリアセチン、トリカプロン酸グリセリン、トリカプリル酸グリセリン、トリカプリン酸グリセリン、トリラウリン酸グリセリン、トリリノール酸グリセリン、ジカプリル酸プロピリングリコール、ジペラルゴン酸プロピレングリコール、ジカプリン酸プロピレングリコールからなる群から選ばれた一種叉は二種以上の混合物であり、該高級アルコール類がオクチルドデカノール、セチルアルコール、オレイルアルコールからなる群から選ばれた一種叉は二種以上の混合物である軟膏剤である請求項１項記載の治療剤。
【請求項６】
外用剤が、（ａ）主薬としての１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールと、（ｂ）（ア）５〜２０重量部の白色ワセリン、５〜１５重量部の高級アルコール類からなる固形油分、及び（イ）３〜１０重量部のスクワランからなる液状油分とからなる油相成分と、（ｃ）水相成分、及び（ｄ）２．５〜７．５重量部の２種以上からなる界面活性剤とからなる１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールクリーム剤であって、該固形油分と該液状油分との重量比（該固形油分／該液状油分）が２以上であり、該高級アルコール類がステアリルアルコール及びセチルアルコールとからなり、該ステアリルアルコールと該高級アルコール類との重量比（該ステアリルアルコール／該高級アルコール類）が０．６５〜０．９であるクリーム剤である請求項１項記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分として含有する新規な痒疹及び脂漏性皮膚炎から選ばれる皮膚疾患の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
湿疹・皮膚炎群は、湿疹・皮膚炎型反応（ｅｃｚｅｍａｔｏｕｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を示す炎症性皮膚症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｅｒｍａｔｏｓｅｓ）であり、表皮に海綿状態（ｓｐｏｎｇｉｏｓｉｓ）化、（表皮）肥厚不全角化、（表皮内）炎症細胞の浸潤等が認められる皮膚疾患を一括した呼称である。臨床的には、紅斑、丘疹、水疱、膿疱、結痂、鱗屑などの新旧の小病巣が混在し、掻痒を呈し、急性・亜急性・慢性の経過をとり、慢性化すると苔癬化を示すことが多い。
【０００３】
湿疹・皮膚炎群の分類については、普遍的な病理形態学的統一性はなく、因襲的概念が色濃いとされており、（斉藤脩「臨床医と病理医のための皮膚病理学」シュプリンガー．フェアラーク東京刊．１９９２年、９４頁〜）、若干の概念の重複を避けられないが、通常使用されているものを列挙すると急性、亜急性、又は慢性の湿疹、接触性皮膚炎、貨幣状湿疹、自家感作性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ビダール苔癬、異汗症性皮膚炎、剥離性皮膚炎、日光皮膚炎、口囲皮膚炎、おむつ皮膚炎、神経皮膚炎、脂漏性皮膚炎、主婦湿疹、皮脂欠乏性湿疹等があげられる。
【０００４】
これらの疾患の発症は例えばアトピー性皮膚炎の如く近年増加しつつあるが、その原因については多くの物理的・化学的因子やアレルギー機序が考えられているものの明らかでないものが多い。
【０００５】
これらの疾患の薬物療法には炎症性疾患であるため従来抗炎症剤が使用されており、例えばプロピオン酸クロベタゾール、酢酸ジフロラゾンジフルプレドナート、プロピオン酸デキサメタゾン等の副腎皮質ホルモン（ステロイド）剤や、イブプロフェンピコノール、ウフェナアート、グルチルレチン酸、クロタミトン、スピロフェン等の非ステロイド系薬剤が主に外用剤として使用されている。
【０００６】
しかし、これらの薬物療法が十分なものではないのが現状である。即ち、ステロイド系薬剤については、その対症療法的な有効性は認められているものの、副作用あるいは一時休止後の再発時の症状悪化など（リバウンド現象）が広く知られている。
【０００７】
上記の副作用としては皮膚の感染症、過敏症、下垂体・副腎皮質系機能の抑制、ステロイド褥瘡、眼瞼皮膚への使用による眼圧亢進、緑内障、後嚢白内障等があげられ、眼科については使用が禁じられているものが多い。叉、顔面、首等の疾患部位は該部位の皮膚の薬物の吸収性が高いためステロイド系薬剤の全身的副作用が発症しやすく、該部位へのステロイド系薬剤の塗布は極力避けられている。一方非ステロイド系薬剤については、ステロイド系薬剤と比較して有効性が低い、塗布部位にかぶれが生じやすい、眼科には使用できないものが多い等の欠点があり、治療薬としては不十分といえよう。
【０００８】
上記のような副作用、使用上の懸念等がある上に湿疹・皮膚炎群疾患が特に乳児、幼児、小児や女性あるいは他疾患併発者等の比較的皮膚が敏感な患者に多いことがこのような薬剤を一層使用しにくくしている。従って、湿疹・皮膚炎群患者に対し有効で安全であり、前述の湿疹・皮膚炎群疾患の複数が複合的に発症しているか、併発的に発症している湿疹・皮膚炎群患者や、他疾患併発の湿疹・皮膚炎群患者に対しても有効で安全であり、例えば顔面などの薬物吸収性の高い部位にも使用できる、使用しやすい薬剤が強く望まれている。
【０００９】
ところで、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールは活性型ビタミンＤ3 類に属する化合物である。１α−ヒドロキシコレカルシフェロール、１α，２４−ジヒドロキシコレカルシフェロール、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールなどの活性型ビタミンＤ3 類は、生体内のカルシウムレベルを調節する作用を有し、骨粗鬆症、骨軟化症などのいわゆる骨減少症に有用であることが知られている〔ベイシック・リサーチ・アンド・イッツ・クリニカル・アプリケーション（Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、１０９９〜１１０６（１９７９）〕。
【００１０】
一方、近年において活性型ビタミンＤ3 類の新たな薬理作用、例えば増殖抑制作用、分化誘導作用等が見いだされ、骨減少症以外の他の患者の治療剤としての可能性が検討されている。例えば、関節リウマチ治療剤（特開昭５６−２６８２０号公報）、癌細胞の分化誘導剤（特開昭５７−１４９２２４号公報）等への活性型ビタミンＤ3 類の適用が検討されている。
【００１１】
本発明者らは既に、上記状況に鑑み、活性型ビタミンＤ3 類の新たな治療剤としての可能性について研究した結果、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールが皮膚疾患の一種である乾癬の治療剤として有効であること、更には１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを乾癬治療剤として使用する場合には、特定の溶剤と特定の親油性基剤からなる軟膏剤が特に好適であること等を見い出し、既に、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分として含有し、剤形が１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを溶解する脂肪酸エステル類、高級アルコール類及び炭酸プロピレンからなる群から選ばれる一種あるいは二種以上の混合物である疎水性または無水性の溶剤と、白色ワセリン、黄色ワセリン、流動パラフィン及び流動パラフィンのポリエチレンゲルから選ばれる一種あるいは二種以上の混合物である親油性基剤とからなる軟膏剤であって、該疎水性または無水性の溶剤の量が、該軟膏剤の０．０１〜２５．０重量％である乾癬治療剤を提案した。（特公平３−６８００９号公報参照）。
【００１２】
上記の乾癬は組織学的には表皮層で表皮細胞の浸潤が認められるが、真皮層には異常な変化はないとされている。一方、湿疹・皮膚炎群疾患は表皮層では上記乾癬と同じ変化が認められる他に、真皮層でも好中球、リンパ球、単球等の浸潤、血管拡張浮腫、血管新生、弾性線維の消失、抗原呈示細胞の増加が認められ、その点で乾癬とは異なる病態である。
【００１３】
湿疹・皮膚炎群への活性型ビタミンＤ3 類の適用については従来報告はほとんどなく、唯一ＥＰ―Ａ―０１２９００３号明細書で１α−ヒドロキシコレカルシフェロールあるいは１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを含有する外用剤が開示され、湿疹、乾癬、皮膚炎、乾皮症等への効果が示されている。
【００１４】
しかしながら、ＥＰ―Ａ―０１２９００３号に開示されている１α−ヒドロキシコレカルシフェロールは、活性型である１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの前駆体であり、そのためその活性型ビタミンＤ3 作用（分化誘導、増殖抑制作用等）は弱く、皮膚局所疾患の湿疹・皮膚炎群の治療には実際には適当ではないと考えられるのである。即ち、１α−ヒドロキシコレカルシフェロールを疾患部位の皮膚局所に塗布しても、皮膚中には活性型ビタミンＤ3 である１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールへの転換酵素である２５−ヒドロキシラーゼが少なく、局所で薬効を呈する活性型ビタミンＤ3 への転換は望めない。叉、経口投与等により１α−ヒドロキシコレカルシフェロールを全身的に投与し、肝臓で活性型である１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールに転換させることが出来るが、その場合疾患部位の皮膚局所に分布される１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール量は極めて少なく、その薬効は多くは期待出来ないと考えられる。
【００１５】
また、ＥＰＡ０１２９００３号に開示されている１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールは、その後の研究によって、その局所投与（外用）により高Ｃａ尿症が発生することが報告されている（例えば第７回ビタミンＤワークショッププロシーデイング、Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ社、ベルリン、ニューヨーク、１９８８年刊、Ａ．Ｌａｎｇｎｅｒ  らの報告）。すなわち、同剤の安全性に疑問が投げかけられているのが現状である。
【００１６】
すなわち本発明の目的は、新規な１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分として含有する痒疹及び脂漏性皮膚炎から選ばれる皮膚疾患の治療剤を提供することにある。
【００１７】
また、本発明の目的は、その有効性、安全性に優れた新規な痒疹及び脂漏性皮膚炎から選ばれる皮膚疾患の治療剤を提供することにある。
【００１８】
更に本発明の目的は、その有効性、安全性に優れ、かつ副作用又はリバウンド現象等の低減化された、新規な痒疹及び脂漏性皮膚炎から選ばれる皮膚疾患の治療剤を提供することにある。
【００１９】
また更に、本発明の目的は、その有効性、安全性に優れ、また副作用又はリバウンド現象等が低減化され、かつ、顔面等にも使用できる使用し易い剤形である、新規な痒疹及び脂漏性皮膚炎から選ばれる皮膚疾患の治療剤を提供することにある。
【００２０】
本発明者らはこのような従来技術及び湿疹・皮膚炎群への活性型ビタミンＤ3 類の薬理効果、臨床効果及び安全性を鋭意検討した結果、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールが痒疹及び脂漏性皮膚炎から選ばれる皮膚疾患に対して優れた薬理作用及び治療効果等を有することを初めて見い出し、且つ１α−ヒドロキシコレカルシフェロール、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール等の活性型ビタミンＤ3 類と比べて１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールが、有効性、安全性等の点でより優れていることを見い出して本発明に至った。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
しかして、本発明は１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分として含有する剤形が外用剤である痒疹および脂漏性皮膚炎から選ばれる皮膚疾患の治療剤である。
【００２２】
１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールは公知の化合物であり、例えばジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ），９５，２７４８（１９７３）；ケミカル・ファーマコロジカル・ブレテイン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）、２１，２５６８（１９７８）；米国特許第４０２２８９１号明細書等に記載された方法によりより容易に合成し得るものである。また本発明の１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールとして、安定性に優れている点でその結晶状態にあるもの、例えば特公平３−５９０６３号公報に記載されている１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの１水塩を用いることも好ましい。
【００２３】
本発明の皮膚疾患は、例えば急性、亜急性、又は慢性の、脂漏性皮膚炎、痒疹をいう。
【００２６】
また、同様にアトピー性皮膚炎症状を繰り返しているうちに発症すると言われているアトピー性皮膚炎性痒疹、結節性痒疹、又は亜急性痒疹を好ましいものとして挙げられる。これらのなかでもアトピー性皮膚炎性痒疹をより好ましいものとして挙げられる。
【００２７】
本発明の１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールは局所的に投与される。局所的には外用剤として、軟膏・クリーム等の半固型剤、ローション等の液剤、あるいはテープ剤の剤型で皮膚の疾患部位に直接投与される。
【００２９】
外用剤でもその処方によって、安全性、治療効果等が異なり得るのが、例えば本発明者らが乾癬治療軟膏剤として提案した（特公平３−６８００９号公報）軟膏剤、あるいは乳剤性組成物として別個提案した（特願平５−２１７２６１号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ９４／０１４４３号明細書）クリーム剤は、他の処方より治療効果等に優れており、有用である。
【００３０】
即ち、軟膏剤としては、（ａ）主薬としての１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールと、（ｂ）１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを溶解する脂肪酸エステル類、高級アルコール類及び炭酸プロピレンからなる群から選ばれる一種あるいは二種以上の混合物である疎水性・無水性の溶剤と、（ｃ）白色ワセリン、黄色ワセリン、流動パラフィン及び流動パラフィンのポリエチレンゲルから選ばれる一種あるいは二種以上の混合物である親油性基剤とからなる軟膏剤であって、該疎水性・無水性の溶剤の量が、該軟膏剤の０．０１〜２５．０重量％であり、該脂肪酸エステル類が、アジピン酸ジイソプロピル、オレイン酸デシル、セバシン酸ジエチル、ミリスチン酸イソプロピル、トリアセチン、トリカプロン酸グリセリン、トリカプリル酸グリセリン、トリカプリン酸グリセリン、トリラウリン酸グリセリン、トリリノール酸グリセリン、ジカプリル酸プロピリングリコール、ジペラルゴン酸プロピレングリコール、ジカプリン酸プロピレングリコールからなる群から選ばれた一種叉は二種以上の混合物であり、該高級アルコール類がオクチルドデカノール、セチルアルコール、オレイルアルコールからなる群から選ばれた一種叉は二種以上の混合物である軟膏剤が有用である。
【００３１】
またクリーム剤としては、（ａ）主薬としての１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールと、（ｂ）（ア）５〜２０重量部の白色ワセリンおよび５〜１５重量部の高級アルコール類からなる固形油分、及び（イ）３〜１０重量部のスクワランからなる液状油分とからなる油相成分と、（Ｃ）水相成分と、及び（ｄ）２．５〜７．５重量部の２種以上からなる界面活性剤とを含んでなる１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールクリーム剤であって、該固形油分と該液状油分との重量比（該固形油分／該液状油分）が約２以上であり該高級アルコール類がステアリルアルコール及びセチルアルコールとからなり、該ステアリルアルコールと該高級アルコール類との重量比（該ステアリルアルコール／該高級アルコール類）が約０．６５〜約０．９であるクリーム剤が有用である。
【００３２】
本発明の治療剤の剤形が、例えば上記の軟膏剤であるとき、そのような軟膏剤は特公平３―６８００９号公報の記載に従って得ることができる。
【００３３】
具体的には、上記親油性基剤を単独で、あるいは２種以上を組み合わせ、これに疎水性・無水性の溶剤を添加した後処方して、あるいは基剤にあらかじめ主薬を溶解した疎水性・無水性の溶剤を添加した後処方して、軟膏剤とすることもできる。このような軟膏剤において、疎水性・無水性の溶剤の量は、より好ましくは、０．１〜１０．０重量％である。
【００３４】
また、本発明の治療剤の剤形が上記クリーム剤であるとき、このようなクリーム剤としては、例えば国際出願ＰＣＴ／ＪＰ９４／０１４４３号明細書に記載されたものを好ましいものとして挙げることができる。
【００３５】
より具体的には、
（ａ）主薬としての１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール
（ｂ）（ア）５〜２０重量部の白色ワセリンおよび５〜１５重量部の高級アルコール類からなる固形油分および
（イ）３〜１０重量部のスクワランからなる液状油分
とからなる油相成分、
（ｃ）水相成分、及び
（ｄ）２．５〜７．５重量部の２種以上からなる界面活性剤
とを含んでなる１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールクリーム剤であって、該固形油分と該液状油分との重量比（該固形油分／該液状油分）が約２以上であり、該高級アルコール類がステアリルアルコール及びセチルアルコールとからなり、該ステアリルアルコールと該高級アルコール類との重量比（該ステアリルアルコール／該高級アルコール類）が約０．６５〜約０．９であり、該界面活性剤の５０重量％以上がＨＬＢ値が約５以下の１種以上の界面活性剤であり、該界面活性剤全体のＨＬＢ値は約８〜約１８であるクリーム剤が好ましいものである。
【００３６】
かかるクリーム剤の白色ワセリンは石油から得られる炭化水素類の混合物を脱色して精製したものであり、その規格については例えば日本薬局方に定められるものが使用される。なかでも、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの安定性にとっては純度の高いものが望ましく、例えば過酸化物価が０．５以下のようなものが望ましい。また、高級アルコール類はセチルアルコールとステアリルアルコールとの混合物であり、混合物中のステアリルアルコールの全体に占める重量比は約０．６５から約０．９である。なかでも好ましくは約０．７〜約０．９、特に好ましくは約０．７０〜約０．８５の範囲を挙げることができる。セチルアルコール単品からステアリルアルコールを徐々に増加させるに従って皮膚浸透性は増加傾向にあり、ステアリルアルコールの重量比が約０．７をこえると急激に皮膚浸透性が増大しステアリルアルコール単品で最大になるが、その比率が約０．９をこえるとエマルジョンとしての物理的安定性、特に加熱時の物理的安定性が劣化する傾向がある。
【００３７】
一般に市販されているセチルアルコールやステアリルアルコールはそれぞれ純品でないものもある。例えば、セチルアルコールと称されていてもセチルアルコール約０．７とステアリルアルコール約０．３の混合物もあり、さらにはセトステアリルアルコールといわれるもののようにセチルアルコール約０．６〜約０．３とステアリルアルコール約０．４〜約０．７の混合物もある。本発明のセチルアルコールとステアリルアルコールとはそれぞれ純粋なものを指し、それらの混合比率はそれらを基に計算される。
【００３８】
また、かかるクリーム剤におけるスクワランは、例えば深海にすむサメ類の肝油から得られる炭化水素を還元して得られる飽和炭化水素であり、その規格については例えば化粧品原料基準に定められるものが使用される。
【００３９】
クリーム剤の油相成分には上述した白色ワセリン、高級アルコール類、スクワランの他に、他の固形油分、液状油分を添加してもよい。固形油分として固形パラフィンが挙げられ、その添加量は例えば物理的安定性が維持される範囲内であればよく、例えば固形油分の１／１０重量部以下であることがクリーム剤として適度の硬度を維持できるので好ましい。液状油分としては中鎖脂肪酸トリグリセリド、アシピン酸ジイソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル類が挙げられる。これら液状油分の添加量は例えば１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの皮膚浸透性が維持される範囲内であればよく、スクワランの３／１０重量部以下であることが１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの良好な皮膚浸透性を維持できるので好ましい。
【００４０】
上記クリーム剤の界面活性剤は２種以上の界面活性剤からなり、それらの合計はクリーム剤全体の２．５〜７．５重量部であるのが好ましい。更に好ましくは、この界面活性剤の５０重量％以上はＨＬＢ値が約５以下の１種以上の界面活性剤であり、この界面活性剤全体のＨＬＢ値は約８〜約１８である。より好ましくは約８〜約１２である。
【００４１】
このような５０重量％以上を構成するＨＬＢ値が約５以下の１種以上の界面活性剤としては、例えばソルビタンモノオレート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレート、ソルビタントリオレート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノオレート、プロピレングリコールモノステアレート等からなる群から選ばれる１種以上の界面活性剤があげられる。残りの界面活性剤としては全体のＨＬＢ値が約８〜約１８、より好ましくは約８〜約１２となるようなものであれば特に限定されないが、例えばポリオキシエチレン（３０あるいは４０あるいは６０）ソルビットテトラオレート、ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（１０）モノラウレート、ポリオキシエチレン（２３あるいは２５あるいは３０）セチルエーテル等からなる群から選ばれる１種以上の界面活性剤があげられる。
【００４２】
以上説明したようなクリーム剤は、例えば常法どおり主薬としての１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの必要量を油相成分に界面活性剤とともに加熱溶解し、乳化機中で加熱された水相成分と混合し、ついで乳化し均一な乳化物とし、冷却して製造することができる。かくして得られたクリーム剤は、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの化学的安定性に優れ、しかも１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの皮膚浸透性が向上し、その結果十分な薬理効果を有し、同時に、物理的安定性及び塗布時のべとつき、ギラギラ感がない等のその感触に優れるという効果も備えた製剤である。
【００４３】
本発明の治療剤の剤形としては上述のような外用剤であるが、なかでも、その剤形が例えば軟膏剤、クリーム剤、ローション剤またはテープ剤の組み合わせが好ましい。
【００４４】
なかでも本発明の治療剤において皮膚疾患が急性亜急性、又は慢性の湿疹、前記のような脂漏性皮膚炎、前記のような痒疹である場合に、その剤形がそれぞれ、例えば軟膏剤、クリーム剤、またはローション剤等の外用剤、なかでも前記のような特定の組成の軟膏剤又はクリーム剤である場合を、より好ましい組み合わせとしてあげることができる。
【００４５】
本発明の製剤中には、必要に応じて適当量の保存剤、酸化防止剤、吸収促進剤、保湿剤等を添加してもよい。保存剤としては例えばパラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ホウ酸などが挙げられ、酸化防止剤としては例えばブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエンなどが挙げられる。吸収促進剤としては例えばアジピン酸ジイソプロピル、ジエチルセバケート、炭酸プロピレングリコール、ソルビトールなどが挙げられる。
【００４６】
また、クリーム剤の油相成分には酸化防止剤を添加することができる。酸化防止剤としてはブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ｄｌ−α−トコフェロール等が、より好適にはｄｌ−α−トコフェロールが添加され、その添加量は通常０．００１〜５．０重量部であり、より好適には０．０１〜３．０重量部である。一方、水相成分には保湿剤、防腐剤、キレート剤、緩衝剤等を添加することができる。保湿剤としてはプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等が挙げられ、その添加量は１〜２０重量部、より好適には２〜１５重量部である。防腐剤としてはメチルパラベン、プロピルパラベン、それらの混合物等のパラベン類；クロロブタノール；モノチオグリセロール；ソルビン酸、ソルビン酸カリウム；ベンジルアルコール等が挙げられ、その添加量は０．００１〜１０．０重量部であり、より好適には０．０１〜５．０重量部である。キレート剤としてはクエン酸、クエン酸ナトリウム；エデト酸ナトリウム等が挙げられ、その添加量は０．００１〜５．０重量部であり、より好適には０．０１〜３．０重量部である。緩衝剤としてはリン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム等が挙げられ、水相成分のｐＨを６．５〜８．０に調節するのに必要な量比で添加される。
【００４７】
本発明に必要な１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの量は治療有効必要量であり、投与法にもよるため一概には決められないが、通常１００μｇから０．０１μｇ，より好適には２０μｇ〜０．１μｇ／日であり、例えば錠剤の場合には１錠あたりにそれらの量を含有させれば良い。外用剤の場合、例えば、前記軟膏剤やクリーム剤における主薬としての１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの量は、０．０１μｇ〜１００μｇ／ｇ量となるように含有させれば良い。外用剤の場合、より好ましくは１μｇ／ｇ〜２０μｇ／ｇである。例えば、クリーム剤の場合、通常、クリーム剤中の濃度として約０．００００５〜約０．０１重量％の範囲である。そして、このような外用剤を、疾患の程度により異なるが、単純塗布等により１日２回〜数回投与するかあるいは密封法により１日１回投与するのが好ましい。
【００４８】
かくして本発明により１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分とする新規な剤形が外用剤である痒疹及び脂漏性皮膚炎から選ばれる皮膚疾患の治療剤が提供される。
【００４９】
前記の従来の同疾患治療剤の課題を考慮すると、本発明の治療剤の有効成分である１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールは、表皮細胞に対する増殖抑制作用が１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールより極めて強いこと（実施例１）、皮下組織から真皮層にかけての炎症性細胞の浸潤を抑制し、また表皮層への炎症性細胞の浸潤等の抑制作用を持続したこと等の急性期及び慢性期の炎症を抑制したこと（実施例２）、また、本発明の治療剤は、具体的に、急性ないし慢性のアトピー性皮膚炎等の患者において優れた有効性を示しかつ格別の副作用等の認められなかったこと（実施例６〜実施例１２）、各種疾患に伴うそう痒症等も含め本発明の湿疹・皮膚炎群に有効であることを示す肥満細胞脱顆粒抑制作用が認められたこと（実施例１３）等、及び、特に前記特定の組成の軟膏剤又はクリーム剤を用いる場合には、優れた有効性、安全性を有し、かつ、クリーム剤の場合には、べとつき、ギラギラ感が著しく低減化されたという使用感にも優れた効果が得られた等、かかる治療剤が提供されたことによる治療上の意義は極めて大きい。
【００５０】
【実施例】
以下に実施例により、本発明の効果をより詳細に説明するが、本発明をこれにより限定するものではない。
【００５１】
なお、以下の実施例において１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールを例えば１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 、１α，２４Ｄ3 、１，２４Ｄ３と、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを例えば１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 等と略記することがある。
【００５２】
［実施例１］
１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 の細胞増殖抑制作用
（ＴＰＡにより惹起されるヘアレス・マウス表皮の増殖亢進に対する作用…１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 との比較試験）
ヘアレス・マウス（ＳＫＨ−１，♀，７〜８weeks old;Crl ）頸背部皮膚にＴＰＡ（12-O-Tetradecanoyl  phorbol-13-acetate;Wako ）を塗布して表皮細胞の増殖を亢進させ、これに対する１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 の作用を、ＯＤＣ活性及びＤＮＡ合成を指標として、１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 と比較検討した。
【００５３】
▲１▼ＴＰＡ投与方法：
１００ｎｍｏｌ／ｍｌのアセトン溶液としたＴＰＡを、エーテル麻酔下で固定したヘアレス・マウスの頸背部皮膚２×３ｃｍ2 に、１００μl 塗布した。
【００５４】
▲２▼被検物質投与方法：
所定の濃度のアセトン溶液とした被検物質を、エーテル麻酔下で固定したヘアレス・マウスの頸背部皮膚２×３ｃｍ2 に、ＴＰＡ塗布直後に１００μl 塗布した。
【００５５】
▲３▼ＯＤＣ活性測定
Ｉ）群構成
１．ＴＰＡ（−）
２．ＴＰＡ（＋）／１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 （−）
３．ＴＰＡ（＋）／１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 １．０μｇ／ｈｅａｄ
４．ＴＰＡ（＋）／１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3         １．０μｇ／ｈｅａｄ
各群５〜６例で実施。
II）活性測定方法
塗布４時間後にマウスを頚椎脱臼死させ、塗布部位の皮膚を切り取った。得られた皮膚を５５℃で３０秒加温後、メスで表皮を剥離した。表皮を氷冷下で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．１ｍＭピリドキサルリン酸、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む抽出液０．５ｍｌ中でソニケーションし、３００，０００ｇ×２０分、４℃の条件で遠心した。この遠心上清をＯＤＣ活性測定の酵素液とし、Ｃｈｉｄａ，Ｋ．等の方法１）に従って測定した。タンパク定量はプロテイン・アッセイ（バイオラド社）を用いて行った。
【００５６】
酵素活性は、ｍｇタンパク質当たり１時間に生成する14Ｃ−ＣＯ2 ｎｍｏｌ量として表記した。
（ｎｍｏｌ  ＣＯ2 ／ｈｒ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）
【００５７】
▲４▼ＤＮＡ合成測定
Ｉ）群構成
１．ＴＰＡ（−）
２．ＴＰＡ（＋）／１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 （−）
３．ＴＰＡ（＋）／１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 １０μｇ／ｈｅａｄ
４．ＴＰＡ（＋）／１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3         １０μｇ／ｈｅａｄ
各群４〜５例で実施。
II）測定方法
ＴＰＡは初回のみ、１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 、１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 、およびビークルであるアセトンは、ＴＰＡ塗布直後、及び１０時間間隔で２回（合計３回）塗布した。ＴＰＡ塗布後２３時間目で３Ｈ−チミジン（７４０ｋＢｑ／ｈｅａｄ）を腹腔内投与した。更に１時間後（ＴＰＡ塗布後２４時間後）、マウスを頚椎脱臼死させ、塗布部位の皮膚を切り取った。得られた皮膚を５５℃で３０秒加温後、メスで表皮を剥離した。表皮を氷冷下２ｍｌの０．２Ｎ過塩素酸で２回、２ｍｌのエタノール／エーテル（１／１）で１回洗った後、０．５Ｎ過塩素酸を１ｍ１加え９０℃で１０分間ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ溶液の一部を取り、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。バートン法によりＤＮＡ量を定量し、単位ＤＮＡ量中の放射能（３Ｈ−チミジン（Ｔｈｙ））取込み量（ｄｐｍ／μｇ−ＤＮＡ）を算出した。
【００５８】
▲５▼結果
Ｉ）ＴＰＡ塗布により惹起される表皮ＯＤＣ活性の誘導に対する１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 の作用 (図１）
図１から、表皮ＯＤＣ活性はＴＰＡ塗布によりアセトン塗布群の約１５倍に誘導されたが、この誘導を１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 は塗布量０．１μｇ／ｈｅａｄ以上で抑制したことが判る。塗布量１．０μｇ／ｈｅａｄにおいて１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 はＯＤＣ活性をＴＰＡ単独塗布群の２７％に抑制し、１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の５４％よりも強い抑制作用を示した。
【００５９】
II）ＴＰＡ塗布による表皮ＤＮＡ合成の亢進に対する１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 の作用 （図２）
図２から、表皮細胞のＤＮＡ合成はＴＰＡ塗布によりアセトン塗布群の約２倍に亢進されたが、この亢進を１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 は塗布量１０μｇ／ｈｅａｄで有意に抑制したことが判る。この用量において１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 はＤＮＡ合成をＴＰＡ単独塗布群の５８％に抑制し、その抑制強度は同じ用量の１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の６２％より強力であった。
【００６０】
以上１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 は、ＴＰＡにより惹起されるヘアレス・マウス表皮の増殖亢進、即ち、ＯＤＣ活性の誘導、並びにＤＮＡ合成の亢進を、１，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 より強力に抑制することが明らかとなった。
【００６１】
なお：本実施例における参考文献は以下のものである。
1)Chida K et al.  Inhibition of 1 α-25-dihydroxyvitamin D3 of induction of  epidermal ornithine decarboxylase caused by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate and teleocidineB1,  Cancer Res.,44:1378-1391,(1984)
【００６２】
［実施例２］
１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 の抗炎症作用を示す薬理実験
ヘアレス・マウス（SKH-1,♀，７〜８weeks old ; Crl ）頸背部皮膚にＴＰＡ（１２−０−Tetradecanoylphorbol−１３−acetate ; Wako）を塗布し、塗布部位皮膚に惹起される種々の炎症性変化に対する１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 作用を病理組織学的に評価した。
【００６３】
▲１▼ＴＰＡ投与方法：
１００ｎｍｏｌ／ｍｌのアセトン溶液としたＴＰＡを、エーテル麻酔下で固定したヘアレス・マウスの頸背部皮膚２×３ｃｍ2 に、１００μ１塗布した。
【００６４】
▲２▼１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 投与方法：
１μｇ／ｍｌのアセトン溶液とした１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 を、エーテル麻酔下で固定したヘアレス・マウスの頸背部皮膚２×３ｃｍ2 に、ＴＰＡ塗布直後に１００μ１塗布した。
【００６５】
▲３▼群構成
１）ＴＰＡ（−）
２）ＴＰＡ（＋）／１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 （−）
塗布後３，５，７，９，２４，７２時間後
３）ＴＰＡ（＋）／１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 （＋）
塗布後３，５，７，９，２４，７２時間後
各ポイント３例実施した。
【００６６】
▲４▼抗炎症効果の評価項目
・潰瘍
・びらん
・表皮層の菲薄化
・表皮細胞の萎縮・壊死・変性
・炎症性細胞の浸潤（表皮・真皮）
▲５▼上記項目の評価方法
Hematoxylin-Eosin 染色を施した組織切片を顕微鏡下で観察し、上記の項目について  以下に示した基準によるスコア付けを行った。
【００６７】
−；変化なし
±；軽微
＋；軽度
++；中等度
+++ ；高度
▲６▼結果
【００６８】
【表１】
0003839502.tif 000002
【００６９】
【表２】
0003839502.tif 000003
【００７０】
【表３】
0003839502.tif 000004
【００７１】
【表４】
0003839502.tif 000005
【００７２】
【表５】
0003839502.tif 000006
【００７３】
【表６】
0003839502.tif 000007
【００７４】
【表７】
0003839502.tif 000008
【００７５】
上記結果から、以下のことが明らかである。
【００７６】
ＴＰＡの塗布により、皮下組織から真皮層にかけての炎症性細胞の浸潤、表皮層への炎症性細胞の浸潤および表皮細胞の萎縮・壊死・変性、表皮層の菲薄化は経時的にその重篤度を増し、塗布後２４時間目に最大となった。さらに塗布後２４時間目には、びらん及び潰瘍も認められた。これらの変化は、塗布後７２時間目には減弱あるいは消失した。
【００７７】
ＴＰＡの塗布により惹起されるこれらの変化に対して１，２４（ＯＨ）2 Ｄ3 を塗布することにより、以下の効果が認められた。
【００７８】
1.ＴＰＡ塗布後５時間目で、皮下組織から真皮層にかけての炎症性細胞の浸潤を抑制した。（急性期の炎症抑制）
2.ＴＰＡ塗布後の変化が最も激しい２４時間目では、表皮層への炎症性細胞の浸潤、表皮細胞の萎縮・壊死・変性、表皮層の菲薄化、びらん及び潰瘍の程度あるいは出現頻度が低減した。皮下組織から真皮層にかけての炎症性細胞浸潤については明らかな効果を認めなかった。
【００７９】
3.表皮層への炎症性細胞の浸潤、表皮細胞の萎縮・壊死、表皮層の菲薄化、びらん及び潰瘍の程度あるいは出現頻度に対しては、塗布後７２時間目においてもその効果が持続していた。（慢性期の炎症抑制）
【００８０】
［実施例３］
１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール軟膏剤の調製
１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール０．２ｍｇをアジピン酸ジイソプロピル０．５ｇに溶解し、この溶液を５０℃に加温した白色ワセリン９９．５ｇ中に撹拌しつつ混合して、均一な組成物とし、放冷して無水性の軟膏剤（１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール濃度２μｇ／ｇ）を得た。同様にして１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール０．５ｍｇを用いて５μｇ／ｇの軟膏も得た。
【００８１】
［実施例４］
１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール軟膏剤の調製
１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール０．５ｍｇをアジピン酸ジイソプロピル１．５ｇに溶解し、この溶液を５０℃に加温した白色ワセリン９９．５ｇ中に撹拌しつつ混合して、均一な組成物とし、放冷して無水性の軟膏剤（１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール濃度１５μｇ／ｇ）を得た。
【００８２】
［実施例５］
下記表８に記載の各成分２〜９、１１及び１３をとり混合し８０℃に加熱して溶液とし、そこへ成分１を添加して均一な溶液（溶液Ａ）とした。一方、成分１６に１０、１２、１４、１５を添加して製した溶液（溶液Ｂ）を８０℃に加熱した。真空乳化機（みずほ製）内で溶液Ａと溶液Ｂとを混合して均一な乳化組成物とした後、室温まで冷却して白色のクリーム（実施例５）を得た。
【００８３】
【表８】
0003839502.tif 000009
【００８４】
［実施例６］
アトピー性皮膚炎の患者（１９才，男性  罹病期間４年）の顔面に実施例３の１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール軟膏剤（５μｇ／ｇ）を２ｇ／回、２回／日で投与した結果を表９に記載する。
【００８５】
【表９】
0003839502.tif 000010
【００８６】
皮膚所見及び総合判定の皮膚重症度の判定区分は高度、中等度、軽度、軽微、なしの５区分とした。なお、投与前後において血清カルシウム、リンなど臨床検査への影響はなかった。
【００８７】
［実施例７］
慢性湿疹の患者（１７才、女性  罹病期間１５年）の全身に実施例４の１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール軟膏剤（１５μｇ／ｇ）を１０ｇ／２回、２回／日、単純塗布で投与した結果を表１０に記載する。
【００８８】
【表１０】
0003839502.tif 000011
【００８９】
皮膚所見及び総合判定の皮膚重症度の判定区分は高度、中等度、軽度、軽微、なしの５区分とした。なお、投与前後において血清カルシウム、リンなど臨床検査への影響はなかった。
【００９０】
［実施例８］
アトピー性皮膚炎性痒疹の患者に実施例３の１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール軟膏剤（２μｇ／ｇ）を投与した結果を以下に記載する。
【００９１】
２８才、女性  罹病期間２０年
投与部位  上、下肢
投与方法  ２ｇ／回、２回／日
【００９２】
【表１１】
0003839502.tif 000012
【００９３】
皮膚所見及び総合判定の皮膚重症度の判定区分は高度、中等度、軽度、軽微、なしの５区分とした。なお、投与前後において血清カルシウム、リンなど臨床検査値への影響はなかった。
【００９４】
［実施例９］
結節性痒疹の患者に実施例３の１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール軟膏剤（２μｇ／ｇ）を投与した結果を以下に記載する。
【００９５】
２９才、男性  罹病期間３年
投与部位  上肢
投与方法  １ｇ／回、２回／日、単純塗布
【００９６】
【表１２】
0003839502.tif 000013
【００９７】
皮膚所見及び総合判定の皮膚重症度の判定区分は高度、中等度、軽度、軽微、なしの５区分とした。なお、投与前後において血清カルシウム、リンなど臨床検査値への影響はなかった。
【００９８】
［実施例１０］
亜急性痒疹の患者に実施例３の１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール軟膏剤（２μｇ／ｇ）を投与した結果を以下に記載する。
【００９９】
５８才、男性  罹病期間５カ月
投与部位  上、下肢、躯幹
投与方法  １ｇ／回、２回／日、単純塗布
【０１００】
【表１３】
0003839502.tif 000014
【０１０１】
皮膚所見及び総合判定の皮膚重症度の判定区分は高度、中等度、軽度、軽微、なしの５区分とした。なお、投与前後において血清カルシウム、リンなど臨床検査値への影響はなかった。
【０１０２】
［実施例１１］
脂漏性皮膚炎の患者に実施例３の１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール軟膏剤（２μｇ／ｇ）を投与した結果を以下に記載する。
【０１０３】
５４才、男性
投与部位  顔面
投与方法  ２ｇ／回、２回／日
【０１０４】
【表１４】
0003839502.tif 000015
【０１０５】
［実施例１２］
脂漏性皮膚炎の患者に実施例３の１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロール軟膏剤（２μｇ／ｇ）を投与した結果を以下に記載する。
【０１０６】
８３才、女性
投与部位  顔面
投与方法  ２ｇ／回、２回／日
【０１０７】
【表１５】
0003839502.tif 000016
【０１０８】
なお、表１４及び表１５において皮膚所見、皮膚重症度の判定区分は高度、中等度、軽度、軽微、なしの５区分とした。また実施例１１及び実施例１２のいずれの場合も、投与前後において血清カルシウム、リンなどの臨床検査値への影響はなかった。
【０１０９】
なお、本患者に、実施例５のクリーム剤を用いた場合にも、軟膏剤の場合と同様の治療効果が得られ、副作用も格別なく、かつ、使用感も優れていた。
【０１１０】
［実施例１３］
１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの抗炎症作用、止痒作用を示唆する肥満細胞脱顆粒抑制作用（ＴＰＡにより惹起される肥満細胞の脱顆粒亢進に対する作用）
ヘアレスマウス（ＳＫＨ−１，♀，８weeks old; Crl）背部皮膚にＴＰＡ（12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-acetate; Walco）を塗布して真皮における肥満細胞の脱顆粒を亢進させ、これに対する１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの作用を脱顆粒の程度毎の細胞数の割合で評価した。
【０１１１】
▲１▼ＴＰＡ投与方法：
１００ｎｍｏｌ／１００μｌのアセトン溶液としたＴＰＡをヘアレス・マウスの背部皮膚２×３ｃｍ2 に、１００μ１塗布した。
【０１１２】
▲２▼被験物質投与方法：
１００ｎｇ／１００μｌのアセトン溶液とした１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールをヘアレス・マウスの背部皮膚２×３ｃｍ2 に、ＴＰＡ塗布直後に１００μ１塗布した。
【０１１３】
▲３▼組織切片作製方法
塗布２４時間後にヘアレス・マウス背部塗布部位を採取し、ホルマリン緩衝液で固定後、パラフィン包埋し、厚さ約３μｍで切片を作製した。この切片を脱パラフィン処理後、ギムザ染色液にて染色し、水洗後アルコール／キシレンにて透徹し封入して試料とした。
【０１１４】
▲４▼肥満細胞の脱顆粒評価方法
１固体より１組織切片（各群３切片）を作製し、１切片より無作為に７部位（１群計２１部位）を決めて６ｍｍ幅で垂直方法にスキャンして計数した。肥満細胞は計数部位における総数及びその中の脱顆粒している数を数えた。また、脱顆粒した肥満細胞の中で５０％以上の顆粒が脱顆粒した肥満細胞を高度脱顆粒（Extensive）、１０〜５０％の顆粒が脱顆粒した肥満細胞を中等度脱顆粒（Moderate）と評価した。また、これら以外は脱顆粒しないものとした。
【０１１５】
▲５▼結果
無処置群、対照群〔ＴＰＡ（＋），１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 （−）〕、試験群〔ＴＰＡ（＋），１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 （＋）〕の３群について、肥満細胞中の高度脱顆粒したもの、中等度脱顆粒したもの、及び、脱顆粒しなかったものの割合（％）を表１６に記載した。なお、肥満細胞の総数は３群の間で大きな差はなかった。
【０１１６】
【表１６】
0003839502.tif 000017
【０１１７】
ＴＰＡ塗布により肥満細胞の脱顆粒が亢進し、特に５０％以上脱顆粒した群が増加した。これに対し１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 を投与することにより脱顆粒した肥満細胞の割合が低下し、特に５０％以上脱顆粒した群が有意に減少した。この結果は、著しく脱顆粒した肥満細胞がケミカルメディエーターの放出により炎症をひきおこすことを考慮すると、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシコレカルシフェロールの抗炎症作用、止痒作用等を示唆するものであり、本発明の治療剤が湿疹・皮膚炎群、アトピー性皮膚炎、痒疹型アトピー性皮膚炎、急性・慢心湿疹、脂漏性皮膚炎、痒疹、アトピー性皮膚炎性痒疹、及び各種疾患に伴うそう痒症等に有効であることを薬理学的に支持するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１における１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 の細胞増殖抑制作用のうちＯＤＣ活性を指標として測定した結果を示す。
【図２】図２は、実施例１における１α，２４（Ｒ）−（ＯＨ）2 Ｄ3 の細胞増殖抑制作用のうちＤＮＡ合成を指標として測定した結果を示す。
【図１】
0003839502.tif 000018
【図２】
0003839502.tif 000019