(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質雄性不稔性を有するブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物のプロトプラストおよび細胞質雄性不稔性に対応する稔性回復遺伝子を有するラファナス属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）植物のプロトプラストを非対称融合させ、次いで得られた融合細胞を培養してコロニーを形成させ、該コロニーから植物体を再生させ、稔性を確認することを特徴とする稔性回復遺伝子が導入されたブラシカ植物の製造方法。
【請求項２】
ラファナス属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）植物のプロトプラストが放射線処理したものであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ラファナス属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）植物のプロトプラストが放射線処理したものであり、該放射線処理が総線量６０ＫＲ以下の放射線を照射することであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
ブラシカ属植物が、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物のプロトプラストがヨード化合物処理したものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
ラファナス属植物が、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、細胞融合法によりラファナス属植物の稔性回復遺伝子をブラシカ属植物に導入する方法および該方法により作成されたブラシカ属植物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
細胞質にある核外遺伝子には、細胞質雄性不稔（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ；以下、「ＣＭＳ」と略すこともある）などの有用遺伝子が存在することが知られている。このＣＭＳは、ハイブリッド植物の作成に深い関連を持つことから、近年注目を集めている。
【０００３】
ブラシカ属植物におけるＣＭＳの利用に関する研究は、自家不和合性のないナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）で特に盛んに行われている。しかしながら、従来より広く利用されてきたのはナタネ品種ポリマ（Ｐｏｌｉｍａ）由来のＣＭＳのみであり、このポリマのＣＭＳは高温条件下、特に２０℃以上で栽培すると稔性が回復してしまう等のＣＭＳの安定性に関して問題があった。そのため、ヘテローシス（雑種強勢）を示すＦ1 （雑種第１代）種子の生産には十分に利用できていなかった。
【０００４】
一方、本願発明者らは先にＸ線照射したダイコン由来のプロトプラストとヨード化合物処理したブラシカ属植物由来のプロトプラストとを融合させ、直接ダイコン由来のプロトプラストからその細胞質遺伝子をナタネ等のブラシカ属植物由来のプロトプラストに導入する方法（特開平１−２１８５３０号公報）、ダイコン由来のサイトプラストとヨード化合物処理したブラシカ属植物由来のプロトプラストとを融合させ、直接ダイコン由来のサイトプラストからその細胞質遺伝子をナタネ等のブラシカ属植物由来のプロトプラストに導入する方法（特開平２−３０３４２６号公報）を提案した。しかしＦ1 種子を生産するためには、稔性回復遺伝子（以下、「Ｒｆ遺伝子」と略す）を有する片親が必要となるが、ダイコン由来のＣＭＳ遺伝子をナタネに導入できても、ナタネにはこれに対応するＲｆ遺伝子が存在しないため、かかるＲｆ遺伝子をダイコンから導入しなければならなかった。遠縁交雑によるダイコンＲｆ遺伝子のナタネへの導入は種々検討されているが、細胞融合法による導入はまだ報告されていないのが現状であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のダイコン等のラファナス属植物のＲｆ遺伝子を上記のナタネ等のブラシカ属植物に導入するべく検討を重ねた結果、予想外にも細胞融合法によりかかる目的が達成されることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち本発明の要旨は、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物のプロトプラストおよび細胞質雄性不稔性に対応する稔性回復遺伝子を有するラファナス属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）植物のプロトプラストを融合させ、次いで得られた融合細胞を培養してコロニーを形成させ、該コロニーから植物体を再生させることを特徴とするブラシカ属植物への稔性回復遺伝子の導入方法、および同方法によりラファナス属植物の稔性回復遺伝子が導入されたブラシカ属植物に存する。
【０００７】
以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明で使用されるブラシカ属植物としては、ラファナス属植物のＣＭＳを導入したもの、正常な細胞質を有する優良品種等のいずれも使用できる。本発明においてはナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）が好ましく、具体的には小瀬菜ダイコンのＣＭＳを導入したナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ，ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒ）またはその優良栽培品種等が挙げられる。
【０００８】
ラファナス属植物としては、ラファナス属植物のＲｆ遺伝子を持つ系統や品種であれば特に制限はされない。本発明においてはダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）が好ましく、具体的には日本の小瀬菜ダイコンや、中国のダイコン品種である園紅、心里美等が挙げられる。
これらのプロトプラストは、常法に従い、下胚軸や幼植物体の葉などを細分し、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解酵素を含む等張溶液中に２５〜３０℃、５〜２０時間処理することによって得ることができる。
【０００９】
精製したプロトプラストは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法で融合させることができる。融合方法としては、プロトプラスト同士をそのまま細胞融合させる対称融合法や、一方の核を不活化したうえで融合させ、特定の遺伝子を限定して導入する非対称融合法が挙げられ、本発明においては後者の非対称融合法が好ましい。具体的には、ラファナス属植物のプロトプラストをＸ線、γ線、紫外線（Ｘ線の場合は、１０〜３００ＫＲ）等の放射線で照射することによって核内の染色体にある程度の損傷を与えておく。またブラシカ属植物のプロトプラストは、２〜４０ｍＭのヨード化合物（ヨードアセトアミド、ヨード酢酸等）を用いて常温下で５〜３０分間処理し、細胞質を不活化させる。
【００１０】
以下、ＰＥＧ法で融合させる場合につき、より具体的に説明する。
プロトプラストを融合させる溶液は、６．７〜４０％のＰＥＧを含むＷ５（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，３，１９６−１９８（１９８４））を用いた（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４３，１５５−１６２（１９８６））。この溶液中に、両方のプロトプラストを３：１〜１：３（ブラシカ属：ラファナス属）の割合で総濃度が１〜４×１０6 個／ｍｌになるように混合し、室温で融合させる。使用されるＰＥＧとしては、ベーリンガー・マンハイム社の分子量１５００のもの等が挙げられる。
【００１１】
上述のようにプロトプラストを融合処理した後、ＰＥＧを除去してプロトプラスト培養培地、例えば０．０５〜０．５ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、０．０２〜０．５ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１〜２．０ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）および０．４Ｍのグルコースを含むＫＭ液体培地（Ｐｌａｎｔａ，１２６，１０５−１１０（１９７５））を加えて培養する。約１週間後に、０．１Ｍのショ糖、０．２〜３．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、０．０２〜０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび０．１〜２．０ｍｇ／ｌのＢＡＰを含むＫＭ培地を等量加え、さらに培養を続けると、３週間前後で直径０．５〜１ｍｍ程度のコロニーが数多く形成される。この時点で、コロニーをカルス増殖培地、例えば０．５〜２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、０．１〜０．５ｍｇ／ｌのＢＡＰ、１〜５％のソルビトール、１〜５％のショ糖、０．５〜２ｇ／ｌのカゼイン加水分解物（ＣＨ）および０．５〜１％の寒天を含むＭＳ固形培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ，１９６２）に移して弱光下で２〜３週間培養すると、ある程度グリーン化したカルスが得られる。
【００１２】
カルスは直ちに再分化培地、例えば０．０１〜０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．５〜２ｍｇ／ｌのＢＡＰ、１〜５％のソルビトール、０．５〜２％のショ糖、０．０５〜０．５ｇ／ｌのＣＨおよび０．５〜１％の寒天を含むＭＳ固形培地に移植して、不定芽を再生させる。本発明においては、再分化してきた不定芽をさらに発根誘導培地、例えば０．０５〜０．２ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．０１〜０．０５ｍｇ／ｌのＢＡＰ、１〜５％のショ糖および０．２％のゲルライト（Ｋｅｌｃｏ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ）を含むＭＳ固形培地に移植することによって、健全な幼植物体が得られる。そして最後に幼植物体は、１０００倍程度に希釈したハイポネックス（村上物産株式会社）を添加したバーミキュライト（昭和バーミキュライト株式会社）に移植して、培養瓶の蓋代わりに通気性の良いミリラップ（ミリポーア社）等を用いることによって、ラファナス属のＲｆ遺伝子が導入されたブラシカ属体細胞雑種植物を得ることができる。  得られた雑種植物から、花粉稔性や染色体数などによってＲｆ遺伝子の導入された個体を選抜することができる。また必要に応じてブラシカ属植物との連続戻交雑を行うことによって、植物学的ならびに細胞学的に安定し、しかもラファナス属植物のＲｆ遺伝子を持ったブラシカ属植物を得ることができる。
【００１３】
【発明の効果】
本発明によれば、生物学的な属の違いにもかかわらず細胞融合、特に非対称細胞融合法を用いることによってラファナス属植物のＲｆ遺伝子を短期間でブラシカ属植物に導入することができる。よって、ラファナス属植物のＣＭＳを利用したブラシカ属植物の雑種第一代（Ｆ1 ）育種の実用化が期待できる。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明につき実施例を挙げて詳細に説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定されるものではない。
実施例１
▲１▼  ダイコンからのプロトプラスト調整
Ｒｆ遺伝子を持つ小瀬菜ダイコンの無菌苗から幼葉を取り、酵素液の中で細分し、２５℃、薄暗い場所にて一晩静置した。酵素液は、０．３５Ｍのショ糖、０．５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび１ｍｇ／ｌのＢＡＰを含むＮＮ６７培地（Ｎｉｔｓｃｈ  ＆  Ｎｉｔｓｃｈ，１９６７）に０．５％のセルラーゼＲ−１０、２％のセルラーゼＲＳ、０．０５％のマセロザイムＲ−１０および０．０２％のペクトリアーゼＹ−２３を加えたものを使用した。
【００１５】
酵素処理した後、酵素液をろ過して未消化物を除去し、ろ液を８００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈澱物を集め、それを０．６Ｍのショ糖液の上に静かに乗せて、さらに８００ｒｐｍで１０分間遠心分離してプロトプラストのバンドを回収した。
▲２▼  Ｘ線照射
上記▲１▼で精製したプロトプラストを１０6 個／ｍｌの濃度に調製し、総線量６０ＫレントゲンのＸ線を照射した。
▲３▼  ナタネからのプロトプラスト調製
ＣＭＳナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ，ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒ）の種を無菌条件下で発芽させて、４〜６日目の下胚軸を酵素液の中で細分し、２５℃、薄暗い場所にて一晩静置した。酵素液は、０．４Ｍのショ糖および０．１％のＭＥＳ（同仁化学研究所株式会社）を含むＮＮ６７培地（Ｎｉｔｓｃｈ  ＆  Ｎｉｔｓｃｈ，１９６７）の無機塩溶液に２％のセルラーゼＲＳおよび０．０１％のペクトリアーゼＹ−２３を加えたものを使用した。酵素処理した後、酵素液をろ過して未消化物を除去し、ろ液を８００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上層のプロトプラスト画分を回収した。
▲４▼  ヨードアセトアミド処理
上記▲３▼で回収したプロトプラストをＷ５溶液中で２×１０5 個／ｍｌの濃度に懸濁し、これに１００ｍＭのヨードアセトアミド液を最終濃度が１０ｍＭになるように加えた。これを室温で１０分間静置した後、８００ｒｐｍで５分間遠心分離してプロトプラストを集め、Ｗ５液で３回洗浄した。
▲５▼  細胞融合
Ｘ線照射した小瀬菜ダイコンのプロトプラストとヨードアセトアミド処理したナタネのプロトプラストとを、２：１の割合で最終濃度が２×１０6 個／ｍｌの濃度となるように混合し、６ｃｍシャーレ上に１００μｌのドロップとして３、４個滴下した。ドロップ内の細胞が沈むまで５分間程度静置した後、４０％ＰＥＧを含むＷ５液１００μｌをそれぞれのドロップに静かに加え、さらに５分間静置した。その後４０％ＰＥＧ液を吸い取り、１３％ＰＥＧおよび６．７％ＰＥＧを含むＷ５液で同様に処理した。
▲６▼  融合細胞の培養
ＰＥＧ液を完全に吸い取った後、０．４Ｍのグルコース、１ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび０．４ｍｇ／ｌのＢＡＰを含むＫＭ液体培地をシャーレごとに３ｍｌ加え、２５±１℃、弱光下で培養を行った。１週間後に０．４Ｍのグルコースの代わりに０．１Ｍのショ糖を含む上記ＫＭ培地を等量加え、さらに２〜３週間培養を続けたところ、数多くのコロニーが形成された。
【００１６】
このコロニーを、１ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、０．２５ｍｇ／ｌのＢＡＰ、３％のソルビトール、２％のショ糖、１ｇ／ｌのＣＨおよび０．５％の寒天を含むＭＳ培地に移植して、増殖させた。増殖されたカルスを０．０２ｍｇ／ｌのＮＡＡ、２ｍｇ／ｌのＢＡＰ、３％のソルビトール、０．５％のショ糖、０．１ｇ／ｌのＣＨおよび０．６％の寒天を含むＭＳ培地に移植して、不定芽の形成を誘導した。
【００１７】
再分化してきた不定芽をさらに０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．０１ｍｇ／ｌのＢＡＰ、３％のショ糖および０．２％のゲルライトを含むＭＳ培地に移植して発根を促したところ、健全な幼植物体が得られた。
葉と根共に発達した幼植物体は、１０００倍希釈のハイポネックスを添加したバーミキュライトに移植して、培養瓶の蓋の代わりに通気性のよいミリラップを用いることによって、容易に体細胞雑種植物を馴化することができた。得られた雑種植物は、高い稔性を示し、ナタネの染色体数（２ｎ＝３８）を有していた。
【００１８】
これらの個体を自殖させたところ、植物学的ならびに細胞学的に安定し、かつダイコンのＲｆ遺伝子をホモで持ったナタネを得ることができた。さらにこれをＣＭＳナタネに交配したところ、通常のナタネ品種を花粉親として交配したときと変わらず、十分量のＦ1 種子が得られ、かつその種子からの植物体は雌性不稔が見られず、高いヘテローシスを示した。