(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源として酢酸又はプロピオン酸を含むと共に窒素源としてアンモニア化合物を含む培養液から成る培地でシトロバクター属細菌であるＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２２）のバクテリアを培養し、このバクテリアによりキチン・キトサン様物質を菌体外に産生させ、産生されたキチン・キトサン様物質を培養液培地中に蓄積し、次に、前記キチン・キトサン様物質を蓄積した培養液培地を先ず遠心分離処理し、精製分離した培養上清のｐＨをアルカリ剤により１２〜１３に調整した培養上清を沸騰液中に一定時間保つアルカリ沈殿処理をし、更に、アルカリ沈殿処理により回収した回収物を膜濾過処理することにより、前記培養液培地からゲルろ過クロマトグラフィによる分子量分析の結果が０．２万〜３５０万に分布すると共に、赤外吸収スペクトルが少なくともＯＨ伸縮振動、ＣＨ伸縮振動、ＮＨ伸縮振動による吸収帯に加えて、アミド基に由来するアミドＩ吸収帯及びアミドII吸収帯にキチン・キトサン特有のスペクトルパターンを有するグルコサミンを主成分としてこれにＮ−アセチルグルコサミンを含む水溶性のキチン・キトサン様物質を抽出することを特徴とするバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法。
【請求項２】
培養温度が３０℃前後で培養ｐＨが７〜１０である請求項１に記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法。
【請求項３】
前記キチン・キトサン様物質の加水分解物のＬＣ−ＭＳ分析によるマススペクトルがグルコサミンと同様のマススペクトルを有する請求項１に記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法。
【請求項４】
前記キチン・キトサン様物質の加水分解物の1H-ＮＭＲ分析によるスペクトルが、グルコサミンと同様のスペクトルを有する請求項１に記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法。
【請求項５】
前記キチン・キトサン様物質の加水分解物のＧＣ−ＭＳ分析によるスペクトルが、グルコサミンと同様のマススペクトルを有する請求項１に記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水処理分野で凝集剤として利用されるだけでなく、医療分野では人口皮膚・縫合糸・薬効調整剤・免疫強化剤として、農業分野では作物の病害防除・収量向上のために、日用品分野では健康食品・食品添加剤・化粧品・整髪料・抗菌衣料・生分解性プラスチックなどに、工業分野ではバイオリアクター・中高分子の分離精製技術など幅広い分野に利用されるキチン・キトサン様物質の製造方法に関し、更に詳細には、従来、主としてエビ・カニ等の甲殻から得ていたキチン・キトサン様物質を、バクテリアにより製造する新規なキチン・キトサン様物質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、カニやエビの甲殻は不要物として大量に廃棄されてきたが、これらの甲殻から抽出されるキチン・キトサンが、汚泥凝集作用において優れた効果を発揮するだけでなく、生体との関係性を初めとして一般産業分野においても優れた性質を有することが分かってきたため、近年キチン・キトサンに対する需要が急激に高まってきている。
【０００３】
その理由を詳述すると、第１に、キチン・キトサンは生体との適合性が極めて良好であり、医療分野において人口皮膚・縫合糸・薬効調整剤・免疫強化剤として利用が増大している。また、キチン・キトサン自体やこれを分解して得られるキチンオリゴ糖やキトサンオリゴ糖が生体の免疫増強作用を有することが分かり、同時に感染微生物の増殖阻止作用も有することが分かり、これらの作用を活用して新たな薬剤の開発が考えられている。
【０００４】
第２に、キチン・キトサンは生体のみならず植物体との適合性もよく、農業分野おいて作物の病害防除や収量向上のために利用されつつある。マッタケやシイタケなどのキノコやチーズ全体を蔽うカビ等の菌類の細胞壁がキチンを主成分として形成されていることからも理解できる。
【０００５】
第３に、食品分野では健康食品・食品添加剤として、また日用品分野では化粧品・整髪料・抗菌衣料・生分解性プラスチックなどに多用されつつある。これらもキチン・キトサンと生体との良好な関係を証明するものである。また、工業分野ではバイオリアクター・中高分子の分離精製技術などにもその利用の道を広げている。
【０００６】
一方、 キチン・キトサンの製法としては、水産加工場の廃棄物として集中的かつ大量に放出されるエビ・カニなどの甲殻を化学処理する方法が主流である。しかし、甲殻のキチンは炭酸カルシウムのような無機塩類、たんぱく質及び色素を含む脂質と共存し、相互に強く結合している。
【０００７】
従って、キチン以外の成分を除去するため、次のような化学処理が施される。まず、甲殻を水洗・乾燥・粉砕して甲殻粉末を作る。次に、この甲殻粉末から無機塩類を除去するため脱灰処理が施される。即ち、甲殻粉末を希塩酸に二昼夜浸漬して、カルシウムなどを塩化カルシウムとして溶解除去する。
【０００８】
更に、灰分を除去した甲殻粉末からたんぱく質を除去するためにアルカリ処理を施す。具体的には、甲殻粉末を薄い水酸化ナトリウム水溶液に入れ、３６時間煮沸し続ける。最後に得られるのが粗製キチンで、これを更に精製して精製キチンが得られる。
【０００９】
次に、キトサンの従来製法について説明する。一般的に、キチンはＮ−アセチルグルコサミンのポリマーであり、キトサンはグルコサミンのポリマーである。従って、キトサンを製造するには、キチン分子を構成するＮ−アセチルグルコサミンからアセチル基を除去、即ちキチンを脱アセチル化することが必要になる。
【００１０】
キチンを脱アセチル化するには、アルカリ処理により行う。つまり、キチンを３０〜５０％の濃い水酸化ナトリウム水溶液中で加熱処理すると、キチン分子中のアセチル基は水酸化ナトリウムのナトリウムイオンと反応して酢酸ナトリウムになる。この酢酸ナトリウムは水溶性であるから、アルカリ処理後の水洗によって除去できる。
【００１１】
どの程度アセチル基がはずれたかの度合いを脱アセチル化度と云う。キチンのアルカリ処理において用いる水酸化ナトリウムの濃度、処理時間、処理温度を変えることによって、各種の脱アセチル化度のキトサンが得られる。脱アセチル化度を大きくするには、水酸化ナトリウムの濃度を高くし、処理時間を長くし、処理温度を高めることが必要である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、エビやカニの甲殻からキチンを抽出するには、強酸や強アルカリ処理のような扱い難い工程が必要になる。また、たんぱく質除去処理においてキチンの純度を高めるために、処理液の濃度や処理温度を高めたり、処理時間を長くすると、必然的にキチンの低分子化が起こる。産業的には高分子キチンが必要とされる分野も多く、従来製法の改善が要求されていた。
【００１３】
また、キチンは各種の溶媒に溶解し難いため、化学的な加工が困難な物質である。一方、キトサンはキチンより溶解性が優れているから、まずキチンを脱アセチル化してキトサンを作り、 このキトサンを溶解処理して化学的加工を施し、この中間物質をアセチル化してキチン誘導体を合成するというような煩雑なプロセスを辿ることも多い。
【００１４】
このように、キトサンはキチンを脱アセチル化して得られるが、脱アセチル化は過酷な強アルカリ処理によって行われるため、キトサンの低分子化を必然的に伴う。キトサンは脱アセチル化度や分子量の違いによって物理的・化学的性質が微妙に異なるため、応用分野毎にその目的に添ったグレードが求められる。従って、キトサンの製造には、従来よりも脱アセチル化度や分子量の精細な制御が要求されている。
【００１５】
これらの従来欠点を根本的に解消するには、カニやエビ等の甲殻を原料とする従来の製造方法に束縛されることなく、全く独創的なキチン・キトサンの製造方法が要求される。
従って、本発明の目的は、カニやエビ等の甲殻を原料としない全く新規で独創的なキチン・キトサンの製造方法を実現することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
請求項１の発明は、炭素源として酢酸又はプロピオン酸を含むと共に窒素源としてアンモニア化合物を含む培養液から成る培地でシトロバクター属細菌であるＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２２）のバクテリアを培養し、このバクテリアによりキチン・キトサン様物質を菌体外に産生させ、産生されたキチン・キトサン様物質を培養液培地中に蓄積し、次に、前記キチン・キトサン様物質を蓄積した培養液培地を先ず遠心分離処理し、精製分離した培養上清のｐＨをアルカリ剤により１２〜１３に調整した培養上清を沸騰液中に一定時間保つアルカリ沈殿処理をし、更に、アルカリ沈殿処理により回収した回収物を膜濾過処理することにより、前記培養液培地からゲルろ過クロマトグラフィによる分子量分析の結果が０．２万〜３５０万に分布すると共に、赤外吸収スペクトルが少なくともＯＨ伸縮振動、ＣＨ伸縮振動、ＮＨ伸縮振動による吸収帯に加えて、アミド基に由来するアミドＩ吸収帯及びアミドII吸収帯にキチン・キトサン特有のスペクトルパターンを有するグルコサミンを主成分としてこれにＮ−アセチルグルコサミンを含む水溶性のキチン・キトサン様物質を抽出することを特徴とするバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法である。
【００２１】
請求項２の発明は、培養温度が３０℃前後で培養ｐＨが７〜１０である請求項１に記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法である。
【００２４】
請求項３の発明は、前記キチン・キトサン様物質の加水分解物のＬＣ−ＭＳ分析によるマススペクトルがグルコサミンと同様のマススペクトルを有する請求項１に記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法である。
【００２５】
請求項４の発明は、前記キチン・キトサン様物質の加水分解物の1H-ＮＭＲ分析によるスペクトルが、グルコサミンと同様のスペクトルを有する請求項１に記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法である。
【００２６】
請求項５の発明は、前記キチン・キトサン様物質の加水分解物のＧＣ−ＭＳ分析によるスペクトルが、グルコサミンと同様のマススペクトルを有する請求項１に記載のバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造方法である。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本出願人等は、既に特開平１１−２７６１６０号公報において、シトロバクタ−属細菌ＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２２）が新規な凝集剤産生微生物であり、このバクテリアが従来とは異なる全く新規な微生物凝集剤を産生することを見出した。また、この微生物凝集剤が従来から用いられている無機凝集剤や合成高分子凝集剤と同程度の凝集効果を発揮することを発見し、しかもこの微生物凝集剤は環境を汚染しない安全な凝集剤であることを開示した。
【００２８】
このシトロバクター属細菌ＴＫＦ０４株はシトロバクタ−・フロインジイとの高い相同性が認められたが、生理特性やＤＮＡ塩基配列において若干の相違が認められたので、新規なバクテリアであると考え、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２２として寄託した。従って、工業技術院微生物工業技術研究所から所定の手続に基づき、ＴＫＦ０４株を入手することができる。
【００２９】
前記微生物凝集剤の研究に引き続き、 本発明者等は、このシトロバクター属細菌ＴＫＦ０４株が産生する微生物凝集剤の具体的化学物質を特定する研究を続行した。以後、このＴＫＦ０４株が産生する物質、即ち微生物凝集剤をＢＦ０４と称し、このＢＦ０４の化学物質の同定プロセスを説明する。
【００３０】
まず、ＢＦ０４をゲルろ過クロマトグラフィにかけて、凝集活性を有する画分の分子量を推定した。分子量分布は製造条件を変えるとかなり変動することが分かった。得られたサンプルの分子量分布の最大幅は０．２万〜３５０万であった。図１はＢＦ０４のサンプル群から選ばれた比較的低い方の分子量分布曲線の一例である。ＢＦ０４は実線で表され、主ピークが約３２０ｋＤａに位置し、その左右の裾野が２００ｋＤａ〜５００ｋＤａに分布している。
【００３１】
点線で表示するものは参考のために表示した各種の標準たんぱく質の分子量分布で、６６９ｋＤａはチログロブリン、４４０ｋＤａはフェリチン、２３２ｋＤａはカタラーゼ、１４０ｋＤａは乳酸デヒドロゲナーゼ、６７ｋＤａは牛血清アルブミンである。
【００３２】
また、成分分析により、ＢＦ０４の有機成分にはたんぱく質や脂質はほとんど含まれておらず、主要成分は、エルソン・モルガン反応で定量されるヘキソサミンであることが分かった。フェノール硫酸法により多量の糖が含まれていることも確認され、ＢＦ０４がアミノ基を有した糖類であることが分かった。
【００３３】
図２はＢＦ０４のフーリエ変換赤外分光分析によるＦＴ−ＩＲ吸収スペクトルである。（ａ）はＢＦ０４、（ｂ）はキチン、（ｃ）はキトサンを示している。ＢＦ０４には約３５００（ｃｍ-1）及び１０００〜２０００（ｃｍ-1）に特徴的な吸収スペクトルが見られる。これらの吸収スペクトル成分の基本構造は、（ｂ）及び（ｃ）から分かるように、キチン或いはキトサンに特有のＯＨ伸縮振動（３４４０〜３４８０ｃｍ-1）、ＣＨ伸縮振動（２８７８〜２９６０ｃｍ-1）、ＮＨ伸縮振動（３２６０〜３２７０ｃｍ-1）、アミド基に由来するアミドI吸収帯（１６５０〜１５６０ｃｍ-1）及びアミドII吸収帯（１５５０〜１５６０ｃｍ-1）の存在を示唆している。
【００３４】
上述から、ＢＦ０４はキチン・キトサンに関連する物質であると推定できる。このことを実証するために、キチン・キトサン様物質を構成分子にまで分解する分解酵素をＢＦ０４に処理した。分解酵素として、セルラーゼ、キチナーゼ及びキトサナーゼが選ばれた。キチナーゼ、キトサナーゼはキチン、キトサンを分解する酵素である。その結果、ＢＦ０４に見られた凝集活性が、これらの分解物には見られなくなった。つまり、酵素分解による低分子化が凝集活性を消失させたと理解できる。キチン・キトサンが凝集活性を有することは以前から知られているから、この結果よりＢＦ０４がキチン・キトサン様物質であることが強く支持された。
【００３５】
構成する単糖類を明らかにするために、ＢＦ０４を酸で加水分解し、この加水分解物に対し薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ分析）、ガスクロマトグラフィ質量分析（ＧＣ−ＭＳ分析）、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ分析）及びＮＭＲ分析を行った。一方、市販のキチン、キトサンの酸加水分解物及びそれらの構成成分であるグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンの標準品に対しも、ＴＬＣ分析、ＧＣ−ＭＳ分析、ＬＣ−ＭＳ分析、ＮＭＲ分析を行い、ＢＦ０４加水分解物に対する上記の分析結果と比較した。
【００３６】
ＢＦ０４のＴＬＣ分析（薄層：Silica Gel G plate／Analtec Inc., USA, 展開溶液：ｎ−ブタノール：ギ酸：水＝２：３：１）では、Ｒf＝０．４８〜０．４９に明確なスポットが見られたが、D-グルコサミン標準品ではＲf＝０．４９に同様のスポットが見られ、両者が誤差範囲内で同一物質であることを示した。真正のキチン及びキトサンの加水分解物のＲfは夫々０．４７〜０．４８及び０．４８〜０．４９であった。従って、 ＢＦ０４の加水分解物がグルコサミンであり、キチン及びキトサンの加水分解物とほぼ同等であることが強く支持された。
【００３７】
前述したように、キチンを構成する単糖類はＮ−アセチルグルコサミンであるが、キチンを酸加水分解すると、キチンは加水分解されると同時に脱アセチル化も受け、その結果キチンの加水分解物はＮ−アセチルグルコサミンでなくグルコサミンとなる。つまり、キチンとキトサンの加水分解物はグルコサミンという同一物質になることを付記しておく。
【００３８】
図３はＢＦ０４加水分解物のＬＣ−ＭＳ分析により得られたマススペクトルである。分子量が１８０に第１ピーク、１６２に第２ピークが特徴的に観察された。他方、 図４はグルコサミン標準品のＬＣ−ＭＳマススペクトルである。分子量が１８０に第１ピーク及び１６２に第２ピークを有することが同様に観察された。この結果から、ＢＦ０４を構成する単糖類がグルコサミンであることが分かった。
【００３９】
図５はＢＦ０４加水分解物（ａ）とグルコサミン（ｂ）を夫々アルジトールアセチル化しそれらの誘導体をＧＣ−ＭＳ分析することによって得られたマススペクトルである。両者ともスペクトルの分布が酷似しており、特にｍ／ｚ値が１１４に第1ピークがあり、９６に第2ピークがあり、８４に第3ピーク及び１３９に第4ピーク、２４１に分子イオンピークがある点で一致している。
【００４０】
図6はＢＦ０４加水分解物（ａ）とグルコサミン（ｂ）の1Ｈ−ＮＭＲ分析図である。横軸は化学シフトのδ値（ｐｐｍ）で、縦軸は信号強度を示す。両者を比較すると、スペクトルの全体像が一致していることが分かる。
【００４１】
以上に示すように、ゲルろ過クロマトグラフィ分析、ＦＴ−ＩＲ分析、分解酵素分析、ＴＬＣ分析、ＧＣ−ＭＳ分析、ＬＣ−ＭＳ分析及び1Ｈ−ＮＭＲ分析の全ての結果は、ＢＦ０４がキチン・キトサン様物質であることを支持している。
【００４２】
従って、ＴＫＦ０４株によって生成されるＢＦ０４はグルコサミンのポリマー物質であるキトサンを主成分とし、またそれらの誘導体を含むキチン・キトサン様物質であることが明らかとなった。この研究を通して、本発明者等はバクテリアによりキチン・キトサン様物質を生成する事実を初めて発見し、 この発見に基づいてキチン・キトサン様物質をバクテリアにより製造する本発明方法を完成したものである。
【００４３】
本発明者等により既に特開平１１−２７６１６０号公報において開示されているように、ＴＫＦ０４株が培地中に産生するＢＦ０４は汚泥凝集性が極めて高く、その凝集性能はカオリン凝集性によって代表されることが分かっている。この前段階の研究では、ＢＦ０４がキチン・キトサン様物質であるとは断定出来なかったが、本発明の研究において、ＢＦ０４がキチン・キトサン様物質であることが確定された。
【００４４】
キチン・キトサンが凝集性能を有することは一般に知られているので、ＢＦ０４がキチン・キトサン様物質であることは、そのカオリン凝集性能によって判定することが可能である。また、カオリン凝集性能が低下するとＢＦ０４自体の低分子化が生起していると判断できる。従って、以後の実施例においては、カオリン凝集性能が極めて高いことによりキチン・キトサン様物質が生成されていることの証左と考える。
【００４５】
【実施例】
以下に、本発明に係るキチン・キトサン様物質を生成するＴＫＦ０４株の採集・選別方法、ＴＫＦ０４株の培養方法及びＢＦ０４の抽出精製方法につき実施例により詳細に説明する。
【００４６】
[実施例１：ＴＫＦ０４株の採集・選別・同定]
ＴＫＦ０４株は、既に本発明者等により自然界から採集・選別され、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２２として寄託されており、所定の手続に従って入手することができる。しかし、このような株分けの方法によらず一般的に自然界から入手する方法につき以下に説明しておく。
【００４７】
細菌源のサンプルは広範囲の環境領域から得られた。具体的には、農業・森林・庭の分野から１４種の汚泥、台所排水溝から９種の生物膜、スカムを含む９種の活性スラッジ、４種の河水サンプル、家庭配水管から４種の汚泥として採集された。これらのサンプルは次に述べるＡＰ培地で培養された。
【００４８】
本発明で用いられる基本培地（以後、ＢＭ培地と呼ぶ）は、１．０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．０ｇのＫ2ＨＰＯ4，０．０５ｇのＮａＣｌ，０．２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，１．０ｇのＣａＣｌ2，０．０１ｇのＦｅＣｌ3と０．１ｇのイーストエキスをイオン交換水１Ｌに分散させて得られる。このＢＭ培地１Ｌに炭素源として７．０ｇの酢酸ナトリウムと３．０ｇのプロピオン酸ナトリウムを混入させたものが酢酸・プロピオン酸培地（以後、ＡＰ培地と呼ぶ）である。
【００４９】
前記ＡＰ培地を構成する酢酸、プロピオン酸は市販品でもよいが、下廃水汚泥に含まれる有機性汚泥の嫌気性消化により得られたものでもよい。つまり有機性汚泥を嫌気性菌で消化すると、大量の有機酸が得られる。埋立地が無くなりつつある現在、汚泥の減容処理は極めて緊急の課題であり、有機汚泥を消化して有機酸を製造する方法は、汚泥の容積減少に役立つばかりでなく、低価格の有機酸を提供できる点で画期的である。
【００５０】
前記有機汚泥の嫌気性消化は、酸発酵細菌である通性嫌気性菌や偏性嫌気性菌が行う有機酸発酵であり、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等の低級脂肪酸が生成され、特に酢酸やプロピオン酸がその中心である。従って、この嫌気性消化により得られる低級脂肪酸は本発明におけるＡＰ培地の炭素源（基質とも云う）として積極的に活用することが望まれる。
【００５１】
従って、前記ＡＰ培地に含有される酢酸やプロピオン酸の濃度比は、有機性汚泥の嫌気性消化液におけるそれらの濃度比に合致するように調整されることが望ましい。つまり、製造原価を低くするためにＴＫＦ０４株の採集・選別や培養を嫌気性消化液を用いることが望ましいので、実験に用いられる酢酸やプロピオン酸の濃度条件を汚泥消化有機酸の濃度条件に合致させることが望まれるからである。
【００５２】
ＡＰ培地のｐＨは２Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）のＮａＯＨまたはＨＣｌで７．２に調整された。試験管の中に１０ｍＬのＡＰ培地を作り、このＡＰ培地中に前記サンプルを植種した。この試験管を３０℃に保持して、回転数１２０ｒｐｍの回転振とう器や往復振とう器で培養した。バクテリアの増殖は培養液の濁度で判定され、そのために波長６６０ｎｍの光を用いたＯＤ660による濁度測定が行われた。
【００５３】
サンプルのＡＰ培地での培養は３〜１０日間行われ、所定濃度に達した培地はカオリン懸濁液に投入され、カオリン凝集効果が測定された。カオリン凝集活性試験は次のように行われた。カオリン粒子（３００mesh、Kishida Chemical, Osaka）をイオン交換水に濃度５０００ｍｇ／Ｌで懸濁させる。ＴＫＦ０４株の培養液１ｍＬをサンプルとしてカオリン懸濁液１０ｍＬとともに試験管に投入し、試験管ミキサーで３０秒間攪拌した後、５分間静置する。この後、カオリン懸濁液のＯＤ550（Ａとする）をスペクトロフォトメータで測定する。一方、サンプルの代わりに１ｍＬのイオン交換水を投入した試験管をコントロールとして同条件下でＯＤ550（Ｂとする）を測定する。凝集活性値ＧはＧ＝（Ｂ−Ａ）／Ｂ＊１００（％）で与えられる。３回測定の平均値を凝集活性値とする。
【００５４】
所定以上のカオリン凝集活性値を示したサンプルがＢＦ０４産生菌と判定された。１５６４個の菌サンプルをＡＰ培地で培養した結果、１０４個の菌コロニーがカオリン凝集活性を示した。特に、台所排水溝の生物膜から得られたＴＫＦ０４株が最高のカオリン凝集活性を示した。
【００５５】
分類研究のために、長谷川の手法（「微生物の分類と同定」、学会出版センター（東京）、１９８５年）に基づいてＴＫＦ０４株の形態学的かつ生理学的試験がなされた。ＡＰＩ２０Ｅの菌同定キット（BioMerieux S.A., Marcy l'Etoile, France）が予備的同定のために用いられた。バージイマニュアル（Bergey's manual of systematic bacteriology、第１巻、Williams and Wilkins Co., Baltimore(1986)）に従って最終的な菌の同定が行われた。
【００５６】
その結果、ＴＫＦ０４株はグラム陰性菌で、桿菌であり、運動性がある。また、カタラーゼ陽性で、オキシダーゼ陰性で、嫌気性条件下でグルコースから酸を生成する。前記菌同定キットでは９４．７％の確率でＴＫＦ０４株はシトロバクタ・フロインジイと同定できる。ＴＫＦ０４株の１６Ｓ ｒＲＮＡの６００塩基以上の遺伝子解析の結果を、ＢＬＡＳＴを用いながらＧｅｎＢａｎｋにあるシトロバクタ・フロインジイと比較した。しかし、近似はしているものの完全な一致はみられず、他の生理学的試験結果を踏まえて、種まで特定することはせず、ＴＫＦ０４株はシトロバクタ属の菌種であると判断するに留めた。
【００５７】
［実施例２：ＴＫＦ０４の培養］
図７は本発明に係るバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造装置の概略構成図である。培養装置２に炭素源として有機酸ＣＳを投入し、また他の栄養塩類ＮＳも投入する。培養装置２内にはＴＫＦ０４株を混入した培養液が充填されている。後述する所定条件でＴＫＦ０４株を培養すると、ＴＫＦ０４株は培養液中にＢＦ０４を産生し、培養液中のＢＦ０４濃度が増加する。一定濃度に達した培養液を分離精製装置４に移送する。分離精製装置４ではＢＦ０４、即ちキチン・キトサン様物質ＣＣを濃縮精製して分離し、残留液ＳＬを排出する。
【００５８】
培養装置２には培養液が内蔵される。酢酸ナトリウムを基質（炭素源）として振とうフラスコを用いた回分培養でＢＦ０４生産の最適化を行った結果、植種量５％、酢酸ナトリウム１０ｇ／Ｌ、酵母エキス０．５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌの条件で構成された培養液に最大の凝集活性が認められた。下記に示す凝集力価Ｈで表すと約９００になる。
【００５９】
凝集力価Ｈは２種の異なる試料量（ａ１、ａ２）で活性測定を行い、得られた凝集活性値（Ｇ１、Ｇ２）により次式で算出する。試料量（ａ１、ａ２）は凝集試験で添加する１ｍＬ中の量を希釈を考慮して求める。
H=(10/a1)−[10(G1-50)(a2-a1)｝／[a1・a2(G1-G2)]
この凝集力価Ｈは、試料１ｍＬが何ｍＬのカオリン懸濁液の凝集活性を５０％とできるかを示す。この凝集力価Ｈは、凝集活性値Ｇと同様に、培養液の凝集力の強さ、換言すれば培養液中のキチン・キトサン様物質の濃度を反映し、凝集力価が大である程キチン・キトサン様物質濃度も大と判断できる。
【００６０】
前記最良培養条件を得る前に、培養条件は種々に変更され、最適の培養条件が探索された。まず、ＴＫＦ０４株の炭素源依存性が調べられた。結果は表１に示されている。
0003797851.tif 000002
【００６１】
この結果から分かるように、酢酸或いはプロピオン酸を基質とした場合にのみ高いカオリン凝集活性を示したが、他に増殖に利用できた乳酸、酪酸、オレイン酸、ヘキサデカン、グルコース、ラクトース等では凝集活性を示さなかった。つまり、ＴＫＦ０４株が凝集活性を示すＢＦ０４、即ちキチン・キトサン様物質を産生するには、酢酸やプロピオン酸などの低級脂肪酸で培養することが必要であることが分かる。
【００６２】
窒素源の種類による培養効果を調べるために、酢酸培地又はプロピオン酸培地に各種の窒素源を投入して、ＴＫＦ０４株の菌体増殖と産生されたＢＦ０４の凝集活性が調べられた。培地として酢酸培地とプロピオン酸培地の2種類が用いられ、それぞれの培地に対して結果を表2に示す。ここで、酢酸培地はＢＭ培地に酢酸を７．０ｇ／Ｌ添加し、プロピオン酸培地はＢＭ培地にプロピオン酸を３．０ｇ／Ｌ添加したものである。
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【００６３】
表２から分かるように、ＮａＮＯ3は効果が小さく、また肉エキスの効果も他と比べると低い。しかし、これら以外の窒素源は共通して効果がある。つまり、窒素源に関しては各種の窒素化合物を幅広く利用することが可能である。
【００６４】
次に、ＴＫＦ０４株の菌体増殖とＢＦ０４の凝集活性に関して、ＡＰ培地の培養温度条件を調べた。図８はＴＫＦ０４株の菌体増殖に関する培養温度の効果を示している。培養温度は３段階に分けられ、▲は２０℃、■は３０℃、●は３７℃の場合を示す。１００時間の培養試験で、常に３７℃のときに最大の菌体増殖を示した。つまり、ＴＫＦ０４の繁殖率は３７℃で最大になる。
【００６５】
図９はＢＦ０４のカオリン凝集活性に関する培養温度の効果を示している。図６と同様に、培養温度は３段階に分けられ、▲は２０℃、■は３０℃、●は３７℃の場合を示す。ＴＫＦ０４を３０℃で培養したときに産生されるＢＦ０４が常に最大の凝集活性を示すことが分かった。この結果は菌体増殖の場合と異なる。
【００６６】
以上をまとめると、凝集活性は温度にかなり依存しており、最良温度は３０℃である。一方、菌体増殖に関する最良温度は３７℃であり、両者間には７℃の開きがあった。しかし、キチン・キトサン様物質の最大生成量は凝集活性により決められるから、キチン・キトサン様物質の生成には３０℃の温度条件が好適であると結論できる。しかも、培養後２０〜８０時間の間に産生されたＢＦ０４の凝集活性が極めて大きい。この間に、大分子量のキチン・キトサン様物質を得ることができることを示す。
【００６７】
また、図８及び図９から次のようなことが分かる。ＴＫＦ０４の菌体増殖とＢＦ０４の凝集活性とは並行して増加して行き、特に、ＡＰ培地中での対数成長期に凝集活性が増加する。その後も菌体増殖が続いている間は、凝集活性の大きいＢＦ０４の産出が行なわれているが、一定時間後に菌体が減少するようになると、それにともない凝集活性の大きいＢＦ０４の産出も減少してゆく。
【００６８】
更に、ＴＫＦ０４株の菌体増殖とＢＦ０４の凝集活性に関して、ＡＰ培地の培養ｐＨ条件を調べた。図１０はＴＫＦ０４株の菌体増殖に関する培地の初期ｐＨの効果を示している。初期ｐＨは７段階に分けられ、●はｐＨ５．０、▲はｐＨ６．０、■はｐＨ７．０、○はｐＨ７．２、△はｐＨ８．０、□はｐＨ９．０及び◇はｐＨ１０．０である。酸性側を示す●と▲では菌体増殖はゼロであるが、塩基性では、つまりｐＨが７．２〜１０．０では高い菌体増殖を示している。
【００６９】
図１１はＢＦ０４の凝集活性に関する培地の初期ｐＨの効果を示している。図１０と同様の各種ｐＨに関して凝集活性が調べられた。酸性側を示す●及び▲では凝集活性は低いが、ｐＨが７．２〜１０．０では培養時間にかかわらず高い凝集活性を示した。また、ｐＨ７．０の中性では、高凝集活性を示す培養時期が塩基性側よりもやや狭くなることが分かった。この傾向は図１０と同様である。
【００７０】
以上から、ｐＨ条件をまとめると、ＴＫＦ０４株は培地の初期ｐＨが７．２〜１０．０の範囲で増殖できることが分かった。しかも、このｐＨ範囲内では、初期ｐＨの違いはＢＦ０４の凝集活性にほとんど影響を与えないことも分かった。従って、培養条件としてはかなり広いｐＨを利用することができる。
【００７１】
また、ジャーファーメンターを用いたスケールアップ試験を行ったが、回分培養では前述と同様の培地を用いた場合にも凝集力価は１００程度にとどまった。しかし、培養系のｐＨを８に維持するために、酢酸と酢酸アンモニウムを３．５：１〜５．５：１で混合した溶液を適宜流下するfed-batch 培養を行ったところ、菌体濃度は約２日後に２０ｇ／Ｌに達し、凝集力価は２０００〜２５００にも達した。
【００７２】
［実施例３：ＢＦ０４の精製・分離］
ＴＫＦ０４株の産生するＢＦ０４の活性は主に細胞外に認められたため、培養液から遠心分離により細胞を除去し、その上清からＢＦ０４の回収を試みた。培養液からの生産物回収の常法である硫安沈殿、ヘキサン等を用いた溶媒抽出、酸性沈殿、アルカリ沈殿、エタノール等を用いた溶媒沈殿などを検討した結果、培養上清のｐＨをＮａＯＨで１２〜１３に調整し、沸騰浴中に１０分程度保つアルカリ沈殿法、及び培養上清の２倍容の冷エタノールを添加し、―２０℃で１０〜２０分静置するエタノール沈殿法で、カオリン凝集活性を有するＢＦ０４の沈殿を回収することができた。
【００７３】
アルカリ沈殿法では得られたＢＦ０４に凝集活性の多少のロスが認められたが、エタノール沈殿法では安定してほぼ１００％の凝集活性を有するＢＦ０４の回収が可能であった。従って、このエタノール沈殿法を本発明の標準法として採用することにした。
【００７４】
分離回収されたＢＦ０４は乾重量ベースで灰分を約５０％含んでおり、水に対して難溶であったが、ｐＨ２〜３の塩酸溶液に溶解し、透析することで脱塩され、凍結乾燥後の有機成分が８０％以上の若干水溶性が高い白色粉末の粗精製物を得ることができた。この粗精製法によれば、フラスコ回分培養及びジャーファーメンター流下培養によって得られた培養液上清から、それぞれ２００ｍｇ／Ｌ及び５００ｍｇ／Ｌ程度のＢＦ０４が得られた。このＢＦ０４が本発明が最終目的物とするキチン・キトサン様物質である。
【００７５】
エタノール沈殿法は工業レベルでの適用では経済的とはいえないため、より効率的な方法として、膜ろ過によるＢＦ０４の濃縮について検討した。分画分子量５００００の限外ろ過を培養液上清に施した濃縮では、ほぼ１００％の凝集活性の回収が認められ、約１０倍程度にまで濃縮が可能となった。ただ、この濃縮品には分子量が５００００以下の培地成分が濃縮されて混入することがある。
【００７６】
従って、より分画分子量の大きなろ過膜を適用して、不純物の混入が少ない濃縮法を行うことができる。また、エタノール沈殿で培養液に加えるエタノール量を２倍容から等容に減少させた場合でも、一晩保持すればほぼ完全に凝集活性を有するＢＦ０４の沈殿物を回収できることが明らかとなった。従って、エタノール沈殿法を膜ろ過法と組み合わせればより効率的でコスト削減できる濃縮法を提供できる。これはアルカリ沈殿法と膜ろ過法の組み合わせでも同様である。
【００７７】
［実施例４：ＢＦ０４の物質分析と凝集効果］
次に、培養・濃縮・分離されたＢＦ０４がキチン・キトサン様物質であることが種々の科学的方法により決定された。
第１に、ゲルろ過クロマトグラフィにより、多種類のＢＦ０４の分子量は１０万〜３５０万に広く分布することが分かった。これはＢＦ０４の製造条件により分子量分布がかなり変動し、種々の分子量分布を有したＢＦ０４の製造が可能になることを示している。
【００７８】
第２に、ＢＦ０４の成分分析が行われ、その結果は表３に与えられている。グルコサミンが最大成分であった。タンパク質は含まれず、有機窒素はグルコサミンとＮ−アセチルグルコサミンで説明できる。
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【００７９】
第３に、ＦＴ−ＩＲ分析は、ＢＦ０４がキチン・キトサンに類似した透過パターンであることを示している。第４に、ＴＬＣ分析は、ＢＦ０４の加水分解物の主要成分がグルコサミンであることを示し、しかもこのグルコサミンはキチン・キトサンの加水分解物と同じ成分である。
【００８０】
第５に、ＢＦ０４は２時間のキチナーゼ処理によって凝集活性を完全に消失し、また２時間のキトサナーゼとセルラーゼ処理によって凝集活性がかなり減少することが分かった。詳細は表４に掲載されている。酵素処理の前後における凝集活性値に格段の変化が生じていることが分かる。
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【００８１】
以上の全ての結果は、ＢＦ０４がキチン又はキチン誘導体（例えば、キトサン）に類似した構造を持つことを示している。
【００８２】
従って、ＢＦ０４がキチン・キトサン様物質であることが判明した。キチン・キトサンが凝集活性を有することは従来から知られており、ＢＦ０４が強い凝集活性を有する事実もこのことから理解できる。次に、ＢＦ０４の凝集力について検討してみる。
【００８３】
ＢＦ０４のカオリン凝集性能がカチオンの添加によってどのように変化するかが検討された。カオリン懸濁液の中に０．１ｍＬのカチオン溶液を添加した。Ｎａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｆｅ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+のカチオン源としてＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＦｅＣｌ2、ＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏが選ばれた。
【００８４】
図１２は１価のカチオン添加による凝集活性の変化図である。●は無添加、▲はＫＣｌ添加、■はＮａＣｌ添加を表す。ＢＦ０４だけの無添加の場合（●）が広範囲のカチオン濃度に対して凝集活性が一番高いことが分かる。
【００８５】
図１３は２価のカチオン添加による凝集活性の変化図である。●は無添加、▲はＣａＣｌ2添加、■はＭｇＣｌ2添加、◆はＦｅＣｌ2添加を表す。図１０と同様に、ＢＦ０４だけの無添加の場合（●）がカチオン濃度の全領域に対して凝集活性が一番高い。
【００８６】
図１４は３価のカチオン添加による凝集活性の変化図である。●は無添加、▲はＡｌＣｌ3添加、■はＦｅＣｌ3添加を表す。無添加（●）とＡｌＣｌ3（▲）は同程度にカチオン濃度の全領域に対して凝集活性が高い。ＦｅＣｌ3は高濃度側で凝集活性が低下する。
【００８７】
以上から、ＢＦ０４は単独で使用されたときに最も高い凝集活性を示すことが分かる。つまり、カチオンを一切添加する必要がないので、低価格で最高度の凝集効果を発揮できることを意味する。本発明で用いられるＢＦ０４はバクテリア産生のキチン・キトサン様物質であり、従来の甲殻から得られるキチン・キトサンよりも強力な凝集力を有するものと理解される。
【００８８】
従来、頻繁に使用されている合成高分子系凝集剤の典型はＰＡＡ（ポリアクリルアミド）であり、無機系凝集剤の典型はＰＡＣ（ポリアルミニウムクロライド）であった。ＢＦ０４のカオリンに対する凝集力はＰＡＡより僅かに小さく、ＰＡＣよりかなり大きいことが分かった。従って、従来の高分子系凝集剤や無機系凝集剤に替えてＢＦ０４を使用できる。また、ＢＦ０４はｐＨが２〜１１の範囲内でもカオリン凝集性能を有し、しかも３〜９５℃の範囲で有効に凝集効果を発揮できる良好な特性を有している。
【００８９】
前述したように、キチン・キトサンは、水処理分野では凝集剤として、医療分野では人口皮膚・縫合糸・薬効調整剤・免疫強化剤として、農業分野では作物の病害防除・収量向上のために、日用品分野では健康食品・食品添加剤・化粧品・整髪料・抗菌衣料・生分解性プラスチックなどに、工業分野ではバイオリアクター・中高分子の分離精製技術などの幅広い分野に利用される。
従って、キチン・キトサン様物質であるＢＦ０４もこれらの分野に多角的に利用展開することができる。本発明では主に凝集剤としての側面を取り上げて説明してきた。しかし、凝集剤に限定されるものではなく、キチン・キトサンが利用できる全分野に利用できることは当然である。
【００９０】
本発明者等は、ＴＫＦ０４株の培養条件を種々に変更しながら、産生されるキチン・キトサン様物質の分子量分布を測定したが、平均分子量や分布幅がかなり変動することを見出した。キチン・キトサンの有する凝集活性などの性質はその分子量に依存する面があり、従って培養条件の変更によって性質の異なるキチン・キトサン様物質を自在に製造することが可能となった。
【００９１】
本発明では、キチン・キトサン様物質を産生するバクテリアとしてＴＫＦ０４株に注目し、このＴＫＦ０４株の培養条件を各方面から検討して、本発明をなすに到った。しかし、本発明の方法は、キチン・キトサン様物質を産生するバクテリアであれば、基本的に適用できるものであり、他のこの種バクテリアを用いたキチン・キトサン様物質の製造方法も本発明に包含されるものである。
【００９２】
本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲における種々の変形例、設計変更などをその技術的範囲内に包含するものである。
【００９３】
【発明の効果】
請求項１の発明によれば、ＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２２）のバクテリアを培養してキチン・キトサン様物質を培地に産生・蓄積させ、この培地を精製分離してキチン・キトサン様物質を抽出分離できるから、全く新しいキチン・キトサン様物質の製造方法を完成したものであり、培養条件を種々変更することによって、グルコサミンを主成分としこれにＮ−アセチルグルコサミンを含む水溶性の各種の性状を有したキチン・キトサン様物質を自在に製造することができる。
また、培養液培地を用いているため、培養液から高速かつ大量に濃縮したキチン・キトサン様物質を回収することができる。
更に、自然環境に幅広く生息するシトロバクター属細菌のＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２２）を用いてキチン・キトサン様物質を製造することができ、且つ、ＴＫＦ０４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７２２）は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されているから、簡単に株分けを行うことができると共に直ちに実施できる利点がある。
加えて、キチン・キトサン様物質を蓄積した培養液培地を遠心分離法と、遠心分離した培養上清をアルカリ剤によりｐＨを１２−１３に調整してこれを沸騰液中に一定時間保持するアルカリ沈殿法と、法膜濾過とを組み合せた方法によりキチン・キトサン様物質を分離精製するようにしているため、工業的に高い収率でもって高能率で、しかも高純度のキトサンを主成分としてこれにキチンを含んだキチン・キトサン様物質を抽出することができるうえ、アルカリ沈殿処理により除タンパクが行える。そのため、本発明により製造したキチン・キトサン様物質は、高純度を必要とする医薬品用としても十分に対応することができる。
そのうえ、平均分子量が０．２万〜３５０万のキチン・キトサン様物質を製造することができ、平均分子量や分子量分布の異なる各種のキチン・キトサン様物質を製造できる。従って分子量に依存する各種物性を有したキチン・キトサン様物質を製造することができる。
また、赤外吸収スペクトルが、少なくともＯＨ伸縮振動、ＣＨ伸縮振動、ＮＨ伸縮振動による吸収帯に加えて、アミド基に由来するアミドＩ吸収帯、アミドII吸収帯にキチン・キトサン特有のスペクトルパターンを有するキチン・キトサン様物質を製造することができる。
【００９８】
請求項２の発明によれば、培養温度を３０℃前後、培養ｐＨを７〜１０に設定してキチン・キトサン様物質を製造でき、極めて制御しやすい温度条件・ｐＨ条件であるため培養を効率よく行うことができる。
【０１０１】
請求項３の発明によれば、キチン・キトサン様物質の加水分解物のＬＣ−ＭＳ分析によるマススペクトルがグルコサミンと同様のマススペクトルを有するキチン・キトサン様物質を製造できる。
【０１０２】
請求項４の発明によれば、キチン・キトサン様物質の加水分解物の1H-ＮＭＲ分析によるスペクトルが、グルコサミンと同様のスペクトルを有するキチン・キトサン様物質を製造することができる。
【０１０３】
請求項５の発明によれば、加水分解物のアルジトールアセチル誘導体化後のＧＣ−ＭＳ分析のマススペクトルが、グルコサミンと同様のマススペクトルを有するキチン・キトサン様物質を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＢＦ０４の分子量分布曲線の内、比較的低い方の分子量分布図である。
【図２】ＢＦ０４、キチン、キトサンのフーリエ変換赤外分光分析によるＦＴ−ＩＲ吸収スペクトルである。
【図３】ＢＦ０４加水分解物のＬＣ−ＭＳ分析により得られたマススペクトルである。
【図４】グルコサミン標準品のＬＣ−ＭＳマススペクトルである。
【図５】（ａ）ＢＦ０４加水分解物と（ｂ）グルコサミンのアルジトールアセチル誘導体化後のＧＣ−ＭＳマススペクトルである。
【図６】（ａ）ＢＦ０４加水分解物と（ｂ）グルコサミンの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７】本発明に係るバクテリアによるキチン・キトサン様物質の製造装置の概略構成図である。
【図８】ＴＫＦ０４株の菌体増殖に関する培養温度の効果図である。
【図９】ＢＦ０４のカオリン凝集活性に関する培養温度の効果図である。
【図１０】ＴＫＦ０４株の菌体増殖に関する培地の初期ｐＨの効果図である。
【図１１】ＢＦ０４の凝集活性に関する培地の初期ｐＨの効果図である。
【図１２】１価のカチオン添加による凝集活性の変化図である。
【図１３】２価のカチオン添加による凝集活性の変化図である。
【図１４】３価のカチオン添加による凝集活性の変化図である。
【符号の説明】
２は培養装置、４は分離精製装置、ＣＳは有機酸、ＮＳは栄養塩類、ＣＣはキチン・キトサン様物質、ＳＬは残留液。
【図１】
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【図２】
0003797851.tif 000007
【図３】
0003797851.tif 000008
【図４】
0003797851.tif 000009
【図５】
0003797851.tif 000010
【図６】
0003797851.tif 000011
【図７】
0003797851.tif 000012
【図８】
0003797851.tif 000013
【図９】
0003797851.tif 000014
【図１０】
0003797851.tif 000015
【図１１】
0003797851.tif 000016
【図１２】
0003797851.tif 000017
【図１３】
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【図１４】
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