(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
１または数個のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／または１または数個のアミノ酸が置換および／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列からなり、かつＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進する、タンパク質。
【請求項３】
１個のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／または１個のアミノ酸が置換および／または欠失された、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
プロテインキナーゼ活性を損ないドミナント・ネガティブ変異体として機能するように１または数個のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／または１または数個のアミノ酸が置換および／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列からなる、タンパク質。
【請求項５】
１個のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／または１個のアミノ酸が置換および／または欠失された、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
置換：Ｋ７０９Ｒを有する、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
配列番号２のＤＮＡ配列を有する、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項１２】
プラスミドベクター、ウイルスベクター、およびリポソームベクターからなる群から選択される、請求項１０または１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のベクターによって形質転換された、宿主細胞（ただし、ヒト細胞にあってはヒトから単離された細胞に限る）。
【請求項１４】
大腸菌、酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、ミンク肺上皮細胞、リンパ細胞、繊維芽細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択されるものである、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の宿主細胞を培養し、そしてその培養物から請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質またはそれらの誘導体を単離することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質またはその誘導体の製造法。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質を含んでなる、悪性腫瘍治療剤。
【請求項１７】
請求項７または８に記載の核酸を含んでなる悪性腫瘍遺伝子治療剤。
【請求項１８】
配列番号１の６５４〜６６９番のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１９】
配列番号１の６５４〜６６９番のアミノ酸配列を含んでなるペプチド。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のペプチドと特異的に反応する、抗体。
【請求項２１】
ポリクローナル抗体である、請求項２０に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、アポトーシス（細胞死）を誘導するタンパク質およびこれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
背景技術
Mitogen-activated protein （ＭＡＰ）キナーゼによるシグナル伝達カスケードは、酵母から脊椎動物に至るまでよく保存された細胞内シグナル伝達経路であり、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）およびＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）を含むタンパク質キナーゼの３つの異なるメンバーより構成される（T. Sturgill & J. Wu, Biochim. Biophys. Acta. 1092, 350 (1991);  E. Nishida & Y. Gotoh, Trends Biochem. Sci., 18, 128 (1993);  B. Errede & D. Levin, Curr. Opin. Cell Biol., 5, 254 (1993);  C. Marshall, Curr. Opin. Genet. Dev., 4, 82 (1994)）。ＭＡＰＫＫＫはＭＡＰＫＫをリン酸化しこれによりＭＡＰＫＫが活性化し、活性化型ＭＡＰＫＫはＭＡＰＫをリン酸化しこれによりＭＡＰＫが活性化する。活性化されたＭＡＰＫは細胞核へ移動し、転写因子の活性を調節し、それによって種々の遺伝子発現が制御される（T. Sturgill & J. Wu, Biochim. Biophys. Acta. 1092, 350 (1991);  E. Nishida & Y. Gotoh, Trends Biochem. Sci., 18, 128 (1993);  B. Errede & D. Levin, Curr. Opin. Cell Biol., 5, 254 (1993);  C. Marshall, Curr. Opin. Genet. Dev., 4, 82 (1994)）。
【０００３】
ＭＡＰＫシグナル伝達経路に関する知見の最近の進歩によって、哺乳動物の細胞では少なくとも明らかに異なる２種類のＭＡＰＫＫＫ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫシグナル伝達経路が機能していることが明らかになった（R. Davis, Trends Biochem. Sci., 19, 470 (1994);  A. Waskiewicz & J. Cooper, Curr. Opin. Cell Biol., 7, 798 (1995);  J. Kyriakis & J. Avruch, J. Biol. Chem., 265, 17355 (1990);  B. Derijard et al., Cell, 76, 1025 (1994);  M. Yan et al., Nature, 372, 798 (1994);  K. Yamaguchi et al., Science 270, 2008 (1995);  J. Kyriakis et al., Nature, 369, 156 (1994);  I. Sanchez et al., Nature, 372, 794 (1994);  B. Derijard et al., Science, 267, 682 (1995);  S. Matsuda et al., J. Biol. Chem., 270, 12781 (1995)）。これらの２種類の経路はそれぞれ、Ｒａｆ−ＭＡＰＫＫ−ＭＡＰＫ経路およびＭＥＫＫ−ＳＥＫ１（またはＭＫＫ４）−ＳＡＰＫ（またはＪＮＫ）経路より成る。
【０００４】
ＭＫＫ３／ＭＡＰＫＫ６（またはＭＫＫ６；ＭＫＫ３に極めて近縁のタンパク質）およびｐ３８タンパク質キナーゼは、それぞれＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫの段階に相当するタンパク質キナーゼであり、これは別のＭＡＰＫシグナル伝達経路を形成していることが知られている（R. Davis, Trends Biochem. Sci., 19, 470 (1994);  A. Waskiewicz & J. Cooper, Curr. Opin. Cell Biol., 7, 798 (1995); J. Han et al., J. Biol. Chem., 271, 2886 (1996);  J. Raingeaud et al., Mol. Cell. Biol., 16, 1247 (1996) ; T. Moriguchi et al., J. Biol. Chem, 271, 13675 (1996) ）。
【０００５】
最近の研究より、ＳＡＰＫおよび／またはｐ３８  ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達カスケードが、アポトーシスを誘導するシグナル伝達経路の少なくとも一部に関係していることが示唆されている（Z. Xia et al., Science, 270, 1326 (1995);  Y.-R. Chen et al., J. Biol. Chem., 271, 631 (1996);  N. Johnson et al., J. Biol. Chem., 271, 3229 (1996);  M. Verheij et al., Nature 380, 75 (1996)）。ここで、アポトーシスは、壊死とは異なる細胞死、すなわち、プログラム細胞死、を意味する。アポトーシスでは、ヌクレオソームごとにＤＮＡが断片化され電気泳動で断片化したＤＮＡが梯子状に観察できる。また、アポトーシスは、ガンの退縮のみならず、自己免疫疾患、ＨＩＶ感染、神経疾患、肝炎、白血病、腎疾患、皮膚疾患、眼疾患および老化等にも関与していると考えられている（三浦正幸、刀祢重信、木崎治俊編集「アポトーシス研究の最前線」、実験医学Ｖｏｌ．１３（１９９５）。
【０００６】
一方、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αは、強力な細胞性アポトーシス開始物質として知られている。最近、これらの細胞性アポトーシス開始物質によってＳＡＰＫシグナル伝達系が活性化されることが示された（J. Kyriakis et al., Nature 372, 794 (1994);  J. Raingeaud et al., J. Biol. Chem., 270, 7420 (1995)）。
【０００７】
しかしながら、ＭＫＫ３−ｐ３８経路およびＳＥＫ１−ＳＡＰＫ経路の上流のＭＡＰＫＫＫに相当するタンパク質や、該経路の活性化のメカニズム、更には、これらの経路を介したアポトーシスの機構については、本発明者らが知る限り報告されていない。
【０００８】
【発明の概要】
今般、本発明者らは、ＳＥＫ１−ＳＡＰＫシグナル伝達経路ばかりでなくＭＫＫ３−ｐ３８シグナル伝達経路をも活性化する、ＭＡＰＫＫＫに相当する哺乳類の新規タンパク質（ＡＳＫ１）を同定した。また、前炎症性サイトカインがＡＳＫ１を活性化し、活性化されたＡＳＫ１がＳＥＫ１−ＳＡＰＫおよびＭＫＫ３−ｐ３８シグナル伝達カスケードを介して細胞のアポトーシス誘導に関与することを見出した。また、本発明者らは、ＡＳＫ１のドミナントネガティブ変異体がＴＮＦ−αが誘導するアポトーシスを阻害することを見い出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は、アポトーシス誘導タンパク質およびそれをコードする塩基配列の提供をその目的とする。
また、本発明は、悪性腫瘍治療剤または悪性腫瘍遺伝子治療剤の提供をその目的とする。
更に、本発明は、アポトーシス誘導タンパク質の部分ペプチドおよびアポトーシス誘導タンパク質と特異的に反応する抗体の提供をその目的とする。
【００１０】
そして、本発明によるアポトーシス誘導タンパク質は、プロテインキナーゼ触媒領域を有し、かつＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進するタンパク質またはその誘導体、である。
【００１１】
【発明の具体的説明】
定義
本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すなわちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられるものとする。従って、本発明において「タンパク質」とは、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているタンパク質だけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含むタンパク質をも意味するものとする。
【００１２】
また、本発明において、「アミノ酸」とは、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意味で用いられるものとする。従って、下記のようにタンパク質において置換されるかまたはタンパク質中に挿入されるアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、それら以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等であってもよい。このようなβ−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニン、γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、また天然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグリシン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３−カルボン酸あるいは二ペコチン酸等が挙げられる。
【００１３】
タンパク質変異体の変異部位は、置換される前のアミノ酸残基（一文字表記）、置換されるアミノ酸の位置、および置換された後のアミノ酸残基（一文字表記）を連続して記載することで表した。例えば、「Ｋ７０９Ｒ」は、７０９番目のアミノ酸残基であるＫ（Lys ：リジン）がＲ（Arg ：アルギニン）で置換されたアミノ酸配列を表す。
【００１４】
本明細書において「タンパク質」とは、ペプチドを含む意味で用いられるものとする。また、本明細書において「本発明によるタンパク質」というときは、その誘導体を含む意味で用いられるものとする。
【００１５】
アポトーシス誘導タンパク質
本発明によるアポトーシス誘導タンパク質は、プロテインキナーゼ触媒領域を有し、かつＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進するタンパク質またはその誘導体である。
アポトーシス誘導タンパク質の起源は特に限定されず、ヒトを含むホ乳類由来のものであっても、それ以外を由来とするものであってもよい。
【００１６】
アポトーシス誘導タンパク質は、プロテインキナーゼ触媒領域を有する。本発明において、「プロテインキナーゼ触媒領域を有する」とは、実施例１と同様の条件において解析した場合に、セリン／スレオニン・プロテインキナーゼ触媒領域の存在が認められることをいう。
アポトーシス誘導タンパク質は、ＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進する。本発明において、「ＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進する」タンパク質とは、実施例３、４および６と同様の条件において実験した場合に、ＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性の亢進が認められたと評価されるタンパク質を意味するものとする。
【００１７】
本発明によるタンパク質は、アポトーシスを誘導するとの性質を有する。前記アポトーシスは、ＳＡＰＫもしくはＪＮＫおよび／またはｐ３８の活性の亢進によって媒介されるものである。
前記ＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性亢進活性は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）によって亢進する。ここで、腫瘍壊死因子としては、例えばＴＮＦαが挙げられる。
【００１８】
本明細書において、「タンパク質の誘導体」とは、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部、および／またはタンパク質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部、および／または、タンパク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による修飾は、例えば、タンパク質中に存在する官能基の保護、安全性ならびに組織移行性の向上、あるいは活性の増強等を目的として行われる。
【００１９】
タンパク質の誘導体としては、具体的には、
（１）タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部の水素原子が、置換または非置換のアルキル基（直鎖、分岐鎖または環状であってもよい）（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、シクロヘキシル基、ベンジル基）、置換または非置換のアシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フタロイル基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカルボニル基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレア型置換基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェニルカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基）等によって置換されたもの、並びに
（２）タンパク質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部が、エステル型の修飾を受けているもの（例えば、その水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−ピコリルにより置換されたもの）、アミド型の修飾を受けているもの（例えば、非置換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロピルアミド）を形成しているもの、並びに
（３）タンパク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミノ基等）の一部もしくは全部が、上述のアミノ基と同様の置換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙げられる。
【００２０】
本発明によるタンパク質の例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または挿入され、および／または前記配列番号１のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠失されたタンパク質であって、プロテインキナーゼ活性を有し、かつＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進するものが挙げられる。すなわち、ここにいう付加(addition)、挿入(insertion) 、置換(substitution)、および欠失(deletion)とは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質のプロテインキナーゼ活性並びにＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進する性質を損なわない（not damage）ようなものをいう。
【００２１】
本発明によるタンパク質は、ＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進する、との性質を有する。また、ＳＥＫ１およびＭＫＫ３はアポトーシスに関与していることが知られている。従って、本発明によるタンパク質は、アポトーシスの機構解明に有用である。
【００２２】
本発明によれば、配列番号１のアミノ酸配列からなり、プロテインキナーゼ活性を損なうように配列番号１のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または挿入され、および／または配列番号１のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠失されたタンパク質またはその誘導体（ドミナントネガティブ変異体）が提供される。
【００２３】
このタンパク質は、プロテインキナーゼ触媒活性領域を有し、かつＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進するタンパク質をプロテインキナーゼ活性を損なうように改変することによって得られる。
【００２４】
この改変タンパク質は、後記実施例において示されるようにＴＮＦ−αによって引き起こされるアポトーシスを阻害する。従って、該改変タンパク質は、ＡＳＫ１が関与する生命現象の解明に用いることができる。
【００２５】
このような置換の例としては、Ｋ７０９Ｒが挙げられる。
【００２６】
塩基配列
本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする塩基配列が提供される。本発明によるタンパク質をコードする塩基配列の典型的配列は、配列番号２に記載されるＤＮＡ配列の一部または全部を有するものである。なお、本明細書において塩基配列とは、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれをも意味するものとする。
【００２７】
前記改変アミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を選択することができる。従って、本発明によるタンパク質をコードする塩基配列とは、配列番号２に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードする配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとする。更にこの塩基配列は、これらに対応するＲＮＡ配列も含む。
【００２８】
本発明による塩基配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよい。また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。ＤＮＡの典型的な取得方法としては、染色体ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行う方法、等が挙げられる。
【００２９】
本発明によるタンパク質をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号２に記載されるＤＮＡ配列の２６８〜４３９２番の配列（オープンリーディングフレームに相当）からなる配列が挙げられる。
【００３０】
ベクターおよび形質転換された宿主細胞
本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供される。更に、本発明によれば、このベクターによって形質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。融合タンパク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、Ｈｉｓ（ヘキサヒスチジン）、ｍｙｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられる。
【００３１】
ベクターとしては、プラスミドベクター（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＨＩＶベクター、ワクシニアウイルスベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等が挙げられる。
【００３２】
本発明によるベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して所望のアミノ酸配列を発現させるためには、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制御する配列や微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいてもよい。また、このベクターは、本発明による塩基配列を反復した形で（例えば、タンデムリピートで）含んでいてもよい。これらは常法に従いベクターに存在させてよく、このベクターによる微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等の形質転換の方法も、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３３】
本発明によるベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
また、宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、並びにＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ７細胞）、ミンク肺上皮細胞（例えば、Ｍｖ１Ｌｕ）、リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、および腫瘍細胞等のような動物細胞が挙げられる。
【００３４】
上記形質転換された宿主細胞を適当な培地で培養し、その培養物から本発明によるタンパク質を得ることができる。従って、本発明の別の面によれば、本発明によるタンパク質の製造法が提供される。形質転換された宿主細胞の培養およびその条件は、使用する細胞についてのそれと本質的に同様であってよい。また、培養液からの本発明によるタンパク質の回収、精製も常法に従って行うことができる。
【００３５】
形質転換される細胞が例えばガン患者体内のガン細胞（例えば、白血病細胞、消化器ガン細胞、肺ガン細胞、スイ臓ガン細胞、卵巣ガン細胞、子宮ガン細胞、メラノーマ細胞、脳腫瘍細胞等）であるときは、その前記の本発明による塩基配列を含むベクターをヒトを含む生体内のガン細胞に適当な方法によって導入し、本発明によるタンパク質を発現させることにより、悪性腫瘍等について遺伝子治療を行うことができる。例えば、本発明によるタンパク質がヒトを含む生体内、特に、悪性腫瘍細胞、で発現されることにより、アポトーシスが誘導され、その結果として悪性腫瘍が退縮し、悪性腫瘍を治療することができると考えられる（後記実施例５参照）。
【００３６】
遺伝子治療用のベクターについては、高久史磨監修の実験医学（増刊号）第１２巻、第１５号「遺伝子治療の最前線」（１９９４年）を参照することができる。
【００３７】
用途／医薬組成物
本発明によるタンパク質は、プロテインキナーゼ触媒領域を有し、かつＳＥＫ１キナーゼ活性および／またはＭＫＫ３キナーゼ活性を亢進する（実施例３および４）。また、本発明によるタンパク質は、不死化細胞のアポトーシスを誘導する（実施例５）。従って、本発明によるタンパク質は、悪性腫瘍の形成および／または転移の抑制に有効であると考えられる。
【００３８】
従って、本発明によるタンパク質は、悪性腫瘍治療剤として用いることができる。ここで、悪性腫瘍としては、例えば、前記ガン細胞が挙げられる。
【００３９】
本発明による悪性腫瘍治療剤は、また、経口または非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下投与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）、好ましくは経口投与することができ、薬剤として経口または非経口投与に適した種々の剤型で、ヒトおよびヒト以外の動物に使用される。
【００４０】
悪性腫瘍治療剤は、例えばその用途に応じて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠などの経口剤、静注および筋注などの注射剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などのいずれかの製剤形態に調製することができる。これらの各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００４１】
薬剤中における本発明のタンパク質の含有量はその剤形に応じて異なるが、通常全組成物中約０．１〜約５０重量％、好ましくは約１〜約２０重量％濃度である。
【００４２】
悪性腫瘍の治療のために必要な投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度などを考慮して適宜決定されるが、通常成人１日当り約０．１〜約５００ｍｇ、好ましくは約０．５〜約５０ｍｇ程度とするのがよく、これを１日１回または数回に分けて投与することができる。
【００４３】
本発明によるタンパク質をコードする塩基配列は、これを有する前記ベクターを用いて標的細胞を形質転換し、悪性腫瘍の形成および／または転移を抑制する様な態様で用いることができる。すなわち、該塩基配列は悪性腫瘍遺伝子治療剤（以下、単に「遺伝子治療剤」ということがある）として用いることができる。遺伝子治療剤の投与方法、有効投与量、および含んでいてもよい担体等は悪性腫瘍治療剤のそれに準ずることができる。
【００４４】
本発明による遺伝子治療剤は、ＨＶＪリポソーム法（金田，実験医学，Vol.12 No.2, 78(184)，1994および森下等，実験医学， Vol.12 No.15 158(1928),1994）、本発明による塩基配列を注射等によってそのまま投与する方法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法（T. M. Klein et al., Bio/Technology 10, 286-291(1992)) 、リポフェクション法によって投与する方法（Nabel et al.：Science 244 ,1285,1990) 、適当なベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等）を使う方法等によって、ヒトを含むほ乳類やその他の動物に投与することができる。
【００４５】
本発明による遺伝子治療剤は、局所的または一時的なアポトーシスの誘導の点から、ＡＳＫ１が生体内に一過的（transient ）に存在する様な態様で投与することが好ましい。このような態様としては、本発明による塩基配列を注射等によってそのまま投与する方法、リポフェクション法、ＨＶＪリポソーム法、アデノウイルスベクターを用いた方法、ワクシニアウイルスベクターを用いた方法のような非経口投与が挙げられる。
【００４６】
本発明による別の面によれば、本発明によるタンパク質または塩基配列の使用、特に、本発明による治療剤の製造における使用および本発明による治療剤としての使用、が提供される。
【００４７】
本発明による更に別の面によれば、本発明によるタンパク質または塩基配列を投与することを含んでなる、悪性腫瘍に罹ったヒトを含むほ乳類やその他の動物の治療法が提供される。この場合の有効投与量、投与方法、および投与形態等は、前記に準ずることができる。
【００４８】
ペプチドおよび抗体
本発明によれば、配列番号１の６５４〜６６９番のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の６５４〜６６９番のアミノ酸配列を含んでなるペプチドが提供される。
【００４９】
配列番号１の６５４〜６６９番のアミノ酸配列を含んでなるペプチドとしては、該アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に任意のアミノ酸配列を付加したペプチドが挙げられ、これには本発明によるタンパク質も含まれる。
【００５０】
このペプチドは、本発明によるタンパク質に対する抗体を得るための抗原として用いることができる。また、本発明によるタンパク質は、前述のようにアポトーシスの機構に密接に関与している。従って、本発明によるペプチドは、これらの機構の解明等に有用である。
【００５１】
本発明によれば、前記ペプチドと特異的に反応する抗体が提供される。本発明において、抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５２】
本発明による抗体は、当業界において通常用いられる方法によって製造することができる。例えば、配列番号１に記載される前記ペプチドを、任意の担体（例えば、ウシ血清アルブミン）とともに動物体内（例えば、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ヒツジ）に注射し、一定期間の後に、その動物の血清を精製することによって得ることができる。
【００５３】
本発明によるペプチドは、本発明によるタンパク質のアミノ酸配列の一部である。従って、本発明による抗体の特異的な反応（すなわち、免疫交差反応）は、本発明によるタンパク質の存在の１つの指標となる。
【００５４】
従って、本発明のもう一つの面によれば、本発明による抗体と特異的に反応するタンパク質、および本発明によるタンパク質であって上記抗体と特異的に反応するもの、が提供される。
【００５５】
【実施例】
実施例１ ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法によるＡＳＫ１  ｃＤＮＡのクローニングとＡＳＫ１のアミノ酸配列の決定
（１）ｃＤＮＡの単離
P. ten Dijke et al., Oncogene, 8, 2879 (1993) 、P. Franzen et al., Cell, 75, 681 (1993) 、およびP. ten Dijke et al., Science, 264, 101 (1994) に記載の方法に従って、degenerate PCR-based strategy を用いて新規のセリン／スレオニン・キナーゼｃＤＮＡの取得を試みた。
その結果、受容体型セリン／スレオニン・キナーゼのファミリーとともに、より遠縁の機能不明のタンパク質キナーゼをコードするヒトｃＤＮＡ断片が幾つか得られた。
【００５６】
まず、セリン／スレオニン・キナーゼ・ファミリーの保存されたサブドメインＶＩＩおよびＶＩＩＩ（S. Hanks et al., Science, 241, 42 (1988)）を由来とするＰＣＲプライマーのセットを用いてＰＣＲ断片を得た。これを用いて、相当するほとんど全長のｃＤＮＡクローンを単離した（以下、このｃＤＮＡにコードされるセリン／スレオニン・キナーゼを、その特徴により、ａｃｔｉｖａｔｏｒ
ｏｆ  ＳＥＫ１  ａｎｄ  ＭＫＫ３（ＡＳＫ１）と呼ぶ）。
【００５７】
具体的には、オリゴ（ｄＴ）を用いてプライムすることにより増幅したλｇｔ１１  ヒト赤白血病細胞（ＨＥＬ細胞）由来ｃＤＮＡライブラリー（M. Poncz et al., Blood, 69, 219 (1987)）を３２Ｐ−標識ＰＣＲ断片でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションおよび陽性のバクテリオファージの精製はH. Ichijo et al., J. Biol. Chem., 268, 14505 (1993) に記載の方法に従って実施した。塩基配列の決定は、シーケナーゼＤＮＡシーケンシング・キット（U. S. Biochemical Corp. ）を用いて、両方のストランドについて実施した。得られた１８クローンの中から、最も長い３つのクローン（クローン２０、２７および７２）について完全に塩基配列を決定した。クローン７２の配列は、オープン・リーディング・フレームの中間付近から始まりポリＡのストレッチまで伸長して終結していた。クローン２０および２７の配列は、ＡＳＫ１  ｃＤＮＡの５′末端部分をカバーし、クローン７２とオーバーラップする部分は配列がそれと完全に一致した。クローン２０およびクローン７２を合わせることにより、ＡＳＫ１  ｃＤＮＡ配列が４５３３塩基対の配列からなり、２６８番目の塩基で始まるＡＴＧコドンに続いて４１２５塩基対のオープン・リーディング・フレームを含み、このオープン・リーディング・フレームには１３７５のアミノ酸からなるタンパク質がコードされ（図１）、このタンパク質（ＡＳＫ１タンパク質）の推定分子量は１５４，７１５Ｄａであることがわかった。
【００５８】
一方、クローン２０の３７５番目のアミノ酸に相当する部位からオープン・リーディング・フレームが始まるもうひとつのクローン（クローン２７）が得られた。クローン２７は、ＡＳＫ１  ｃＤＮＡの８０５〜８０８番目の４塩基が欠失しているために、イン・フレームで上流にストップ・コドンが形成されていた。
【００５９】
ＡＳＫ１のセリン／スレオニン・キナーゼ領域はＡＳＫ１タンパク質の中間に見出され、Ｎ末側とＣ末側に長いフランキング配列が存在していた（図１）。また、ＲＮＡブロット解析を行った結果、５キロ塩基の単一転写産物が、様々なヒト組織に発現していることがわかった（図３）。様々なヒト組織からのｍＲＮＡ（クロンテック社）を用いたブロットは、ランダム・プライミングすることによって標識したＡＳＫ１  ｃＤＮＡをプローブとして実施した。
【００６０】
（２）データ・ベースによるホモロジー検索
キナーゼ領域の外側のＡＳＫ１配列を用いてデータ・ベース・サーチを実施した結果、Ｎ末端の短いアミノ酸配列に、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）型のペプチジル・プロリル  シス−トランス・イソメラーゼに見られるモチーフが存在していた（図１、下線部分）。対照的に、ＡＳＫ１のキナーゼ領域には、ＭＡＰＫＫＫファミリーのメンバーのキナーゼ領域と明らかな配列のホモロジーが認められた。そのホモロジーの程度は、哺乳類のＭＥＫＫ１とは３０．０％、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＳＳＫ２およびＳＴＥ１１とはそれぞれ３２．３％および３０．４％であった。
【００６１】
系統進化学的な比較を行なったところ、ＡＳＫ１は、哺乳類のＭＡＰＫＫＫ（ＲＡＦ−１、ＫＳＲ−１、ＴＡＫ−１およびＴＰＬ−２）とかなり遠縁のタンパク質であるが、酵母のＭＡＰＫＫＫタンパク質であり酵母のＨＯＧ１  ＭＡＰＫ（T. Maeda et al., Science, 269, 554 (1995) ）の上流の調節タンパク質であるＳＳＫ２／ＳＳＫ２２ファミリーに最も類縁性が高いことがわかった（図２）。
【００６２】
ＡＳＫ１のキナーゼ領域と他のＭＡＰＫＫＫのキナーゼ領域との間のアミノ酸配列比較はレーザージーン・プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ社）のクラスタル（clustal ）・コンピュータ・アラインメント・プログラム（D. Higgins & P. Sharp, Comput. Appl. Biosci., 5, 151 (1989) ）を用いて実施した。
【００６３】
実施例２ 酵母を用いたＡＳＫ１キナーゼ活性の分子遺伝学的な解析
ＡＳＫ１と酵母ＭＡＰＫＫＫであるＳＳＫ２／ＳＳＫ２２では、全体的な構造に差異（即ち、ＳＳＫ２やＳＳＫ２２のキナーゼ領域はこれらのタンパク質の最もＣ末端部分に位置する（T. Maeda et al., Science, 269, 554 (1995) ）がある。しかしながら、前述のようにＡＳＫ１はＳＳＫ２／ＳＳＫ２２と類縁性が高いことから、ＡＳＫ１が酵母でキナーゼとして機能し、それによって酵母のＭＡＰＫＫＫの欠損を相補するという可能性があると考え、これについて検討した。
【００６４】
まず、ＡＳＫ１をコードするｃＤＮＡを酵母発現ベクターｐＮＶ１１（H. Shibuya et al., Nature, 357, 700 (1992)）中に導入し、  通常のＹＰＤ培地では生育できるが高浸透圧培地では生育できない酵母変異株ＴＭ２５７−Ｈ１（ｓｓｋ２Δ  ｓｓｋ２２Δ  ｓｈｏ１Δ）（T. Maeda et al., Science, 269, 554 (1995) ）において、ＡＳＫ１が、ＳＳＫ２またはＳＳＫ２２  ＭＡＰＫＫＫのシグナルの欠損を回復させることができるかどうかについて検討した。因みに、ＳＨＯ１は、ＳＨ３領域を含む膜貫通浸透圧センサーであり、ＳＳＫ２／ＳＳＫ２２とは独立的に、ＨＯＧ１活性化を介して高浸透圧に対する種々の応答を導くもうひとつのシグナル経路に関係している。ＳＨＯ１、ＳＳＫ２またはＳＳＫ２２に単一の変異もしくは２つの変異を有する変異株は高浸透圧培地に抵抗性を示す。しかしながら、ＳＨＯ１、ＳＳＫ２およびＳＳＫ２２を同時に破壊すると、高浸透圧培地で酵母が生育できなくなることがわかっている。
【００６５】
そこで、形質転換体が１．５Ｍのソルビトール存在下で生育できるかどうかについて試験した（図４）。具体的には、５つの独立した形質転換体を選択し、１．５Ｍ  ソルビトール存在下または非存在下でＹＰＤプレート上で生育させた。図４は、６日間、３０℃で生育させた後にプレートを撮影した写真である。
ｐＮＶ１１ベクター単独またはＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）（Ｌｙｓ７０９をＡｒｇに置換することによってキナーゼ触媒活性を不活性化した変異ＡＳＫ１）ベクターを用いて形質転換して得た形質転換体も同時にテストした。
【００６６】
その結果、ＡＳＫ１を発現させると、ＴＭ２５７−Ｈ１が高浸透圧環境で生育できるようになったが、ベクターだけを発現させた場合やＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）を発現させた場合には、ＴＭ２５７−Ｈ１が高浸透圧環境で生育できるようにならなかった（図４）。ＡＳＫ１はＰＢＳ２（ＳＨＯ１、ＳＳＫ２およびＳＳＫ２２の下流の標的タンパク質（Maeda, T. et al., Science 269, 554 (1995) ）が変異した酵母株では浸透圧応答を相補できなかった（データ省略）。このことより、ＴＭ２５７−Ｈ１で観察されたＡＳＫ１活性はＰＢＳ−ＨＯＧ１シグナル経路によってメディエートされるが、ＨＯＧ１活性化以外の別の経路によってはメディエートされないことが強く示唆された。
【００６７】
これらの結果と、酵母のＨＯＧ１に相当する哺乳類カウンターパートがｐ３８ＭＡＰキナーゼであるという事実（J. Rouse et al., Cell, 78, 1027 (1994);  J. Han et al., Science, 265, 808 (1994);  J. Lee et al., Nature 372, 739 (1994)）とによって、ＡＳＫ１は新規の哺乳類ＭＡＰＫＫＫであって、ＭＫＫ３をリン酸化することによりＭＫＫ３−ｐ３８のシグナル伝達経路の活性化にかかわっていることが示唆された。
【００６８】
実施例３ 哺乳類細胞を用いたＡＳＫ１キナーゼ活性の細胞生物学的な解析
ＡＳＫ１が哺乳類の細胞でＭＡＰＫＫＫとして機能するかどうかを検討するために、ＡＳＫ１プラスミドを既知のＭＡＰＫおよびＭＡＰＫＫ発現プラスミドとともに、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした（図５）。ＭＡＰＫおよびＭＡＰＫＫのコンストラクトには全てヘマグルチニン（ＨＡ）−エピトープ−タグを付加し、これらをＡＳＫ１とともに、またはＡＳＫ１なしに発現させ、抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降した。具体的には、下記に記載した方法に従って実施した。
【００６９】
アフリカツメガエル（Xenopus ）のＭＡＰＫ（Y. Gotoh et al., EMBO J., 10, 2661 (1991) ）およびアフリカツメガエルＭＡＰＫＫ（H. Kosako et al., EMBO J., 12, 787 (1993) ）のｃＤＮＡは、過去に記載の方法に従ってクローニングした。ラットＳＡＰＫα（ J. Kyriakis et al., Nature, 369, 156 (1994)）、ヒトｐ３８（J. Han et al., Biochim. Biophys. Acta. 1265, 224 (1995) ）、マウスＳＥＫ１（I. Sanchez et al., Nature, 372, 794 (1994)）およびヒトＭＫＫ３（B. Derijard et al., Science, 267, 682 (1995)）のコーディング領域はＰＣＲ法によって増幅した。ＨＡ−タグを哺乳類用発現ベクターｐＳＲα４５６（Y. Takebe et al., Mol. Cell. Biol., 8, 466 (1988) ）のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位中に導入することによって、ｐＳＲα−ＨＡ１を構築した。ＭＡＰＫ、ＳＡＰＫα、ｐ３８、ＭＡＰＫＫ、ＳＥＫ１、およびＭＫＫ３のｃＤＮＡを、ｐＳＲα−ＨＡ１のＢｇｌＩＩ部位中にサブクローニングした。ＡＳＫ１  ｃＤＮＡは別の哺乳類用発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）中に導入した。一過的に発現させるために、ＣＯＳ７細胞を製造業者（ライフ・テクノロジー社）の使用説明書に従って、リポフェクトアミンを用いてトランスフェクトした。抽出液を調製するために、バッファー溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２ｍＭ  β−グリセロホスフェート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＦ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％  デオキシコレート、３ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニル・フルオライド（ＰＭＳＦ）、２０μｇ／ｍｌ  アプロチニン）中で細胞をリシスした。細胞抽出液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して懸濁を除いた。
【００７０】
免疫沈降を行なうために、上清を抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５）とともに、１時間、４℃でインキュベートした。プロテインＡ−セファロース（ファルマシア・バイオテク社）を添加した後、ライゼートをさらに１時間インキュベートした。ビーズを、溶液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  トリトンＸ−１００、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を用いて２回洗浄した後、溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を用いてさらに２回洗浄した後、キナーゼ・アッセイにかけた。
【００７１】
沈降させた免疫複合体をリン酸化アッセイにかけた。アッセイに際しては、基質タンパク質を外から加えた。ここで用いた基質タンパク質は、ＭＡＰＫに対してはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（シグマ社）、ＳＡＰＫに対してはｃ−Ｊｕｎ、ｐ３８に対してはＡＴＦ−２、ＭＡＰＫＫに対してはキナーゼ・ネガティブＭＡＰＫ、ＳＥＫ１およびＭＫＫ３に対してはキナーゼ・ネガティブｐ３８（ＭＰＫ２）とした。ここで用いたＡＴＦ２は過去に記載の方法（S.Gupta et al.,Science 267,389-393(1995)）に従って調製した。ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）−タグを融合したｃ−Ｊｕｎ（S. Matsuda et al., J. Biol. Chem., 270, 12781 (1995)）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合したキナーゼ・ネガティブのアフリカツメガエルＭＡＰＫ（Ｋ５７Ｄ）はH. Kosako et al., EMBO J., 12, 787 (1993) に記載の方法に従って調製した。ヒトｐ３８に対するアフリカツメガエルのカウンターパートであるＭＰＫ２（J. Rouse et al., Cell, 78, 1027 (1994)）は、ＳＥＫ１およびＭＫＫ３の基質タンパク質としてアッセイに使用した。
【００７２】
Ｈｉｓ−タグと融合したキナーゼ・ネガティブのＭＰＫ２（Ｋ５４Ｒ）はT. Moriguchi et al., J. Biol. Chem., 270, 12969 (1995)に記載の方法に従って調製した。ＭＢＰ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、キナーゼ・ネガティブＭＡＰＫおよびキナーゼ・ネガティブＭＰＫ２をリン酸化する活性を測定するために、免疫複合体を、それぞれの基質タンパク質（各３μｇ）とともに、最終量２５μｌの溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（０．３μＣｉ））中で３０分間、３０℃でインキュベートした。反応は、Laemmli´s サンプル・バッファーの添加後、煮沸することによって停止した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）を行なった後、これらのタンパク質のリン酸化をイメージ・アナライザー（ＦｕｊｉＸ  ＢＡＳ２０００）を用いて定量した。
【００７３】
その結果、ＡＳＫ１の発現によって、ＳＡＰＫおよびｐ３８  ＭＡＰキナーゼはそれぞれ７．６倍および５．０倍活性化された。ＭＡＰＫでは極めて弱い活性化しか観察されなかった（図５）。
また、ＡＳＫ１によって、ＭＫＫ３およびＳＥＫ１はそれぞれ１１．８倍および７．０倍まで活性化された。これに対してＭＡＰＫＫの活性化は全く検出されなかった（図５）。
【００７４】
実施例４ インビトロでの組換えタンパク質を用いたカップル・キナーゼ・アッセイ
図５で観察されたＭＫＫ３の活性化がＡＳＫ１による直接的な効果かどうかを検討するため、組換えＳＥＫ１、ＭＫＫ３、ＭＡＰＫＫ６および組換えキナーゼ・ネガティヴｐ３８（ＭＰＫ２）タンパク質を用いてインビトロ・キナーゼ・アッセイを実施した。本実施例では、実施例３に記載の方法に準じて、ＣＯＳ７細胞中に発現させたＡＳＫ１を抗ＡＳＫ１ポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させ、免疫複合体をＡＳＫ１酵素標品とした。免疫沈降に用いた抗ＡＳＫ１ポリクローナル血清は、ＡＳＫ１のアミノ酸６５４〜６６９に相当するペプチド配列（ＴＥＥＫＧＲＳＴＥＥＧＤＣＥＳＤ）に対するもので、H. Ichijo et al., J. Biol. Chem., 270, 7420 (1995)に記載の方法に従って、グルタルアルデヒド法を用いてKeyhole limpet hemocyanin とカップルさせ、Freund´s adjuvant と混合し、ウサギを免疫して作製したものである。この免疫複合体とともに、組換え型ＳＥＫ１、ＭＫＫ３、ＭＡＰＫＫ６と組換え型キナーゼ・ネガティブｐ３８タンパク質を用いて、下記に記載する方法に従って、カップル・キナーゼ・アッセイを実施した。
【００７５】
Y. Gotoh et al., Oncogene, 9, 1891 (1994) に記載の方法に従って、Ｈｉｓ−タグを付加したアフリカツメガエルＭＡＰＫＫおよびヒトＭＫＫ３を大腸菌で発現し、精製した。免疫複合体がＭＡＰＫＫまたはＭＫＫ３を活性化する活性を測定するために、まず０．２μｇのＨｉｓ−ＭＡＰＫＫまたはＨｉｓ−ＭＫＫ３を免疫複合体とともに、最終量２５μｌの溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＡＴＰ）中で１５分間、３０℃でインキュベートした。次いで、０．３μＣｉの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよび３μｇのＧＳＴ−キナーゼ・ネガティブＭＡＰＫ（ＭＡＰＫＫに対して）またはＨｉｓ−キナーゼ・ネガティブＭＰＫ２（ＭＫＫ３に対して）を同一のバッファー（最終量、３５μｌ）中で７分間、２５℃でインキュベートした。その後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、イメージ・アナライザーで解析した。結果は図６に示される通りであった。
【００７６】
ＣＯＳ７細胞からのＡＳＫ１の免疫沈降物は、ＳＥＫ１、ＭＫＫ３およびＭＡＰＫＫ６活性を強く（それぞれ４０倍以上）活性化し、ＡＳＫ１がキナーゼ・アッセイに存在しているときにのみｐ３８のリン酸化が観察された。さらに野生型ｐ３８およびＡＴＦ２を用いることによってＡＳＫ１依存的なｐ３８のリン酸化が、ｐ３８の活性化を誘導することを確認した。対照的に、ＭＡＰＫＫについては、ＭＡＰＫＫが存在していても弱い活性化（２．２倍）が観察されただけであった。
【００７７】
一方、ＲａｆをＭＡＰＫＫＫとしてポジティブ・コントロールに用いた場合には、２７．８倍のＭＡＰＫＫの活性化が観察された（データ省略）。以上の結果（実施例４）および実施例３の結果より、ＡＳＫ１は新規のＭＡＰＫＫＫであり、ＳＥＫ１−ＳＡＰＫ経路およびＭＫＫ３／ＭＡＰＫＫ６−ｐ３８径路を選択的に活性化することが示された。
【００７８】
実施例５ ＡＳＫ１発現によるアポトーシスの誘導
（１）ＡＳＫの発現の確認
メタロチオネイン・プロモーターをベースとした発現プラスミドを安定的にトランスフェクトしたミンク肺上皮細胞株（Ｍｖ１Ｌｕ）を用いることによって、ＡＳＫ１の生物活性を検討した。構成的に発現したＡＳＫ１が細胞死を誘導し、結果として安定な形質転換体の取得に失敗するという可能性を排除するために、メタロチオネイン誘導性プロモーター・システムを用いた。
【００７９】
まず、ＡＳＫ１およびＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）ｃＤＮＡをｐＭＥＰ４ベクター（インビトロジェン社）中の制限酵素切断部位にサブクローニングした。ｃＤＮＡのトランスフェクションは、トランスフェクタム（プロメガ社）を用いて、製造業者の使用説明書に従って実施した。ハイグロマイシンＢによる選択は、M. Saitoh et al., J. Biol. Chem., 271, 2769 (1996)に記載の方法に従って実施した。独立したクローンを幾つかリング・クローニングし、ＡＳＫ１タンパク質の発現を抗ＡＳＫ１血清を用いた免疫沈降（H. Ichijo et al., J. Biol. Chem., 268, 14505 (1993) ）によって決定した。独立した陽性のクローン２つを下記に記載のアッセイに用いたが、どちらのクローンを用いても結果は本質的に同じであった。
【００８０】
［３５Ｓ］メチオニンおよび［３５Ｓ］システイン混合液を用いて、１００μＭ  ＺｎＣｌ２存在下または非存在下で５時間、細胞を代謝標識した。次いで、細胞のライゼートを特異的な抗ＡＳＫ１抗血清を用いた免疫沈降にかけ、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびフルオログラフィーを用いた解析を行なった。
【００８１】
結果は図７に示した通りであった。即ち、ＺｎＣｌ２によって誘導したときにのみ、ＡＳＫ１が強く発現することがわかった。ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）をトランスフェクションした細胞も同じ程度の組換え型タンパク質を発現していることがわかった。
【００８２】
（２）チミジンの取り込みへの効果
ＡＳＫ１が細胞増殖に何らかの効果を示すかどうかを検討するために、ベクター単独（図８、黒四角）、ＡＳＫ１（図８、黒丸）およびＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）（図８、白丸）を用いて安定的にトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞を、１％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と図示した濃度のＺｎＣｌ２を含むＭＥＭ培地中で１６時間インキュベートした。その後、細胞を［３Ｈ］チミジンを用いて１時間パルスラベルし、ＤＮＡ中に取り込まれた［３Ｈ］放射能活性を液体シンチレーション・カウンターによって測定した。結果は図８に示される通りであった。
【００８３】
ＡＳＫ１をトランスフェクトした細胞では［３Ｈ］チミジンの取り込みの劇的な抑制が観察された。これに対して、ベクターのみをトランスフェクトした細胞やＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）ベクターでトランスフェクトした細胞では、［３Ｈ］チミジンの取り込みの抑制は観察されなかった（図８）。
【００８４】
ＺｎＣｌ２による用量依存的な［３Ｈ］チミジンの取り込みの抑制と、ＡＳＫ１の用量依存的な発現と活性化との相関性について検討した。ＡＳＫ１をトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞を、様々な量のＺｎＣｌ２で５時間処理した後、免疫沈降によってＡＳＫ１の発現レベルを決定した（図９上段）。また、細胞を様々な量のＺｎＣｌ２で５時間処理し、免疫沈降によってＡＳＫ１を細胞から回収した後、ＭＫＫ３−ＭＰＫ２カップル・キナーゼ・アッセイにかけた（図９下）。その結果、ＺｎＣｌ２による用量依存的な［３Ｈ］チミジンの取り込みの抑制は、ＡＳＫ１の用量依存的な発現と活性化によく相関していた（図９）。
【００８５】
（３）ＳＡＰＫおよびｐ３８のキナーゼ活性の亢進への効果
次に、ＡＳＫ１活性と内在性のＳＡＰＫおよびｐ３８の活性化との相関性を検討するために下記の実験を実施した。
ＡＳＫ１を安定的にトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞を、図示した濃度のＺｎＣｌ２と５時間インキュベートした。ＳＡＰＫの活性を測定するために、S. Matsuda et al., J. Biol. Chem., 270, 12781 (1995)に記載の方法に従って、各々の細胞抽出液をｃ−Ｊｕｎを基質タンパク質として含むポリアクリルアミドゲル内でのキナーゼ検出アッセイ（イン−ゲルキナーゼ・アッセイ）にかけた。ｐ３８の活性を検出するために、抗ｐ３８ポリクローナル抗体（Ｃー２０、サンタ・クルーズ社）を用いて、０．１％ＳＤＳ存在下で免疫沈降を実施した以外は実施例３に記載の方法に準じて、免疫沈降した。その後、ＡＴＦ２を基質タンパク質として用いてキナーゼ活性を検出した。結果は図１０に示される通りであった。
内在性のＳＡＰＫおよびｐ３８も、ＡＳＫ１活性と相関して活性化されていることがわかった。
【００８６】
（４）細胞の形態変化およびＤＮＡの断片化への効果
さらに、１００μＭ  ＺｎＣｌ２によって細胞を処理し、ＡＳＫ１を継続的に発現させたところ、ＺｎＣｌ２添加後６時間以内に形態変化（すなわち、cytoplasmic shrinkage およびcellular condensation ）が誘導されることがわかった（データ省略）。このような形態変化は、ＡＳＫ１（Ｋ７０９）を発現させた細胞では観察されなかった。細胞を、１００μＭ  ＺｎＣｌ２の存在下または非存在下で、１％ＦＢＳを含むＭＥＭと２６時間インキュベートした。アポトーシスを起こしている細胞に典型的な特徴であるcytoplasmic shrinkage およびcellular condensation が、長時間誘導（２６時間）の後、最も著しくなった（図１１上段）。
【００８７】
ＡＳＫ１によってアポトーシスによる細胞死が誘導されるかどうかについて、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ−メディエーティッド  ｄＵＴＰニック・エンド・ラベリング（ＴＵＮＥＬ）法によって細胞をｉｎｓｉｔｕ染色することにより（図１１下段）、およびゲノミックＤＮＡ断片化により検討した。具体的には、ＡＳＫ１をトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞を１００μＭ  ＺｎＣｌ２存在下または非存在下で、ＦＢＳを含まないＭＥＭ培地中で２５時間培養した。その後、ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出キット（ベーリンガー・マンハイム社）を用いてＴＵＮＥＬ法で染色（図１１下段）、あるいはトータルＤＮＡを単離し、２％アガロースゲル電気泳導にかけた（図１２）。その結果、ＺｎＣｌ２によるＡＳＫ１発現の誘導後に、アポトーシスおよびＤＮＡ断片化が観察された（図１１下段および図１２）。
【００８８】
実施例６ ＴＮＦαによるＡＳＫ１の活性化
本実施例では、ＴＮＦαで細胞を処理することによって、ＡＳＫ１が活性化されるかどうかを検討した。ＡＳＫ１をトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞を、５０μＭ  ＺｎＣｌ２で５時間前処理し、ＡＳＫ１発現を誘導した。その後、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで様々な時間細胞を刺激した。ＴＮＦαで処理した細胞由来のＡＳＫ１免疫沈降物を、ＭＫＫ３およびキナーゼ・ネガティブｐ３８を用いたカップル・キナーゼ・アッセイにかけた（図１３上段および下段および図１４）。
【００８９】
その結果、ＴＮＦαは、ＡＳＫ−１をトランスフェクトしたＭｖＩＬｕ細胞において刺激後５分以内にＡＳＫ１活性を活性化した（図１３上段および下段）。ＴＮＦαによるＡＳＫ１活性化は用量依存的な様式で観察された（図１４）。
次に、ＡＳＫ１をトランスフェクトしていない２９３細胞およびＡ６７３細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで処理した。その結果、ＴＮＦ−αによってアポトーシスが誘導されることが知られている（データ省略）様々なタイプの細胞、即ちヒト２９３胎児腎臓細胞、Ａ６７３ラブドミオサルコーマ（rhabdomyosarcoma）細胞（図１３下段）、Jurkat T細胞およびＫＢ上皮性カルシノーマ細胞（データ省略）において、内在性のＡＳＫ１もまたＴＮＦ−αによって活性化された。
【００９０】
さらに、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）を一過性に２９３細胞（図１５）あるいはJurkat T細胞（図１６）にトランスフェクトさせた。具体的には下記に記載の方法に従って実験を実施した。２９３細胞（２×１０６）を、２μｇのｐｃＤＮＡ３コントロール・ベクターまたはｐｃＤＮＡ３−ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）で、Ｔｆｘ−５０（Promega 社）を用いて製造業者のプロトコールに従って一過性にトランスフェクトさせた。トランスフェクションの８時間後より、細胞をＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）で、３００ｎＭのアクチノマイシンＤ（ActD）の存在下または非存在下で、１６時間処理した。培養プレートより遊離したアポトーシスを起こした細胞を回収し、トータルＤＮＡを単離し、２％アガロース・ゲル電気泳動によって解析した（図１５）。
【００９１】
また、ｐｃＤＮＡ３−ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）をJurkat細胞に、ＤＭＲＩＥ−Ｃ  リエージェント（Life Technologies 社）によって、ｐＨｏｏｋ−１プラスミド（Invitrogen社）とともにトランスフェクトした。因みに、ｐＨｏｏｋ−１プラスミドには、ハプテン  ｐｈＯｘ（4-ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one ）に対する単鎖抗体融合タンパク質がコードされている。従って、ｐｈＯｘをコートした磁石ビーズを用いることによって、トランスフェクトされた細胞を選択的に単離することが可能である。  ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）をトランスフェクトした細胞のポピュレーション（β−ガラクトシダーゼ染色によって測定したコトランスフェクションの効率はほとんど１００％であった）を、  ｐｈＯｘをコートした磁石ビーズによって、Capture-Tec kit （Invitrogen社）を用いて単離した後、細胞を様々な濃度のＴＮＦ−αとともに５．５時間培養した。細胞質の小さく断片化したＤＮＡを、過去に記載の方法（Selins, K. & Cohen, J., J. Immunol. 139, 3199 (1987)）を若干改良した方法によって単離した。３×１０６細胞を２００μｌの緩衝溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）でリシスした。得られたライゼートを、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫと０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ｎとともに、４２℃で１時間インキュベートした。その後、ＤＮＡをエタノール抽出後にフェノール／クロロホルム抽出によって精製した。抽出した細胞質ＤＮＡを２％アガロース・ゲル電気泳動によって解析した（図１６）。
【００９２】
その結果、ＴＮＦ−αによるＤＮＡ断片化は効率的に減少した。尚、ＤＮＡ断片化アッセイにおいて、トランスフェクトされていないJurkat細胞および単離したJurkat細胞（ｐＨｏｏｋ−１および対照のｐｃＤＮＡ３プラスミドでトランスフェクトしたもの）は同様にＴＮＦ−αに感受性であった（データ省略）。このことより、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）がドミナント・ネガティブ変異体として機能することが示唆されたとともに、より重要な事には、ＴＮＦ−αによって誘導されるアポトーシスにＡＳＫ１が必須であることが示唆された。
【００９３】
【配列表】
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【００９４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＡＳＫ１の推定アミノ酸配列を示した図である。２つの独立したクローン（クローン２０およびクローン２７）で想定される翻訳開始部位を矢印で示した。タンパク質キナーゼ領域は太字で示した。Ｎ末端の非触媒領域に見出されたＦＫＢＰ型のペプチジル−プロリル  シス−トランス  イソメラーゼのモチーフは下線で示した。アミノ酸残基の略語は、Ａ：Ａｌａ、Ｃ：Ｃｙｓ、Ｄ：Ａｓｐ、Ｅ：Ｇｌｕ、Ｆ：Ｐｈｅ、Ｇ：Ｇｌｙ、Ｈ：Ｈｉｓ、Ｉ：Ｉｌｅ、Ｋ：Ｌｙｓ、Ｌ：Ｌｅｕ、Ｍ：Ｍｅｔ、Ｎ：Ａｓｎ、Ｐ：Ｐｒｏ、Ｑ：Ｇｌｎ、Ｒ：Ａｒｇ、Ｓ：Ｓｅｒ、Ｔ：Ｔｈｒ、Ｖ：Ｖａｌ、Ｗ：Ｔｒｐ、Ｙ：Ｔｙｒである。
【図２】系統進化学的なＭＡＰＫＫＫの類縁関係を示した図である。
【図３】ＡＳＫ１の組織分布を示したＲＮＡブロット（電気泳動写真）である。
Ｈｅａｒｔ：心臓、Ｂｒａｉｎ：脳、Ｐｌａｃｅｎｔａ：胎盤、Ｌｕｎｇ：肺、Ｌｉｖｅｒ：肝臓、Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ：骨格筋、Ｋｉｄｎｅｙ：腎臓、Ｐａｎｃｒｅａｓ：膵臓、Ｓｐｌｅｅｎ：脾臓、Ｔｈｙｍｕｓ：胸腺、Ｐｒｏｓｔａｔｅ：前立腺、Ｔｅｓｔｉｓ：精巣、Ｏｖｅｒｙ：卵巣、Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：小腸、Ｃｏｌｏｎ：結腸、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ：白血球。
【図４】ＡＳＫ１遺伝子を発現させた間（ＡＳＫ１、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ））または発現させなかった（vector）酵母変異株ＴＭ２５７−Ｈ１の生育（コロニー形成）を示した写真（生物の形態の写真）である。１．５Ｍソルビトール（sorbitol）存在下または非存在下において試験した。
【図５】インビボでのＡＳＫ１によるＭＡＰＫＫおよびＭＡＰＫの活性化を示した写真（電気泳動写真）である。活性化は、基質タンパク質のリン酸化を指標とした。各基質タンパク質の位置は、］印および矢尻印で示した。ＡＳＫ１の共発現によるキナーゼ活性の増加の倍率を、各レーンの上に示した。倍率は、３回の独立した実験の平均値である。分子量はキロダルトン（ｋＤａ）である。
【図６】インビトロでのＡＳＫ１によるＭＡＰＫＫの活性化を示した写真（電気泳動写真）である。ＣＯＳ７細胞にｐｃＤＮＡ３−ＡＳＫ１をトランスフェクトし、細胞のライゼートを免疫前血清（ｍｏｃｋ  ｐｐｔ）または抗ＡＳＫ１抗血清（ＡＳＫ１  ｐｐｔ）で免疫沈降した。免疫複合体またはバッファー溶液（ｂｕｆｆｅｒ）をＨｉｓ−ＭＡＰＫＫ、Ｈｉｓ−ＳＥＫ１、Ｈｉｓ−ＭＫＫ３またはＨｉｓ−ＭＡＰＫＫ６の存在下（＋）または非存在下（−）でインキュベートした後、それぞれのＭＡＰＫＫのキナーゼ活性を、ＭＡＰＫＫにはＧＳＴ−キナーゼネガティヴＭＡＰＫを基質として、ＳＥＫ１、ＭＫＫ３およびＭＡＰＫＫ６にはＨｉｓ−キナーゼ・ネガティヴＭＰＫ２を基質として測定した。写真中「ＫＮ−ＭＡＰＫ」は、ＧＳＴ−キナーゼ・ネガティブＭＡＰＫを、「ＫＮ−ＭＰＫ２」は、Ｈｉｓ−キナーゼ・ネガティブＭＰＫ２を、それぞれ表す。
【図７】安定的にトランスフェクト（transfection）したＭｖ１Ｌｕ細胞でのＡＳＫ１およびＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）のＺｎＣｌ２依存的な発現を示した写真（電気泳動写真）である。
【図８】ＡＳＫ１依存的な［３Ｈ］チミジンの取り込みの抑制を示した図である。黒四角形：ベクター単独、黒丸：ＡＳＫ１、白丸：ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）。図は３回の独立した実験の代表例である。エラー・バーは標準偏差を表わす。
【図９】ＺｎＣｌ２誘導による用量依存的なＡＳＫ１タンパク質の発現（上段）とＡＳＫ１の活性化（下段）を示した写真（電気泳動写真）である。「ｎｏ−ＩＰ」は、免疫沈降を行わずに細胞ライゼートを酵素標品として用いた場合を表わす。
【図１０】ＡＳＫ１依存的な内在性のＳＡＰＫ（上段）およびｐ３８（下段）の活性化を示した写真（電気泳動写真）である。ｐ５４およびｐ４６  ＳＡＰＫ（上段）およびＡＴＦ２（下段）の位置は、矢尻印および矢印でそれぞれ示した。
【図１１】代表的な細胞の形態を位相差顕微鏡で同じ拡大率で撮影した写真（生物の形態の写真）である。ＡＳＫ１依存的な細胞死が示されている。（上段）細胞を１％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地中で、１００μＭ  ＺｎＣｌ２存在下または非存在下で２６時間培養した。代表的な細胞の形態を位相差顕微鏡で同じ拡大率で撮影した写真（生物の形態の写真）である。（下段）細胞をＦＢＳを含まないＭＥＭ培地中で、１００μＭ  ＺｎＣｌ２存在下または非存在下で２５時間培養した。その後、ＴＵＮＥＬ法により染色した。アポトーシスを起こした細胞は、ダーク・ブラウンに染色された部分で示されている。写真（生物の形態の写真）は、上段に比べて高い拡大率で撮影した。
【図１２】ＡＳＫ１依存的なＤＮＡ断片化を示した写真（電気泳動写真）である。
【図１３】様々な細胞におけるＴＮＦαによるＡＳＫ１の活性化の時間経過を示した図および電気泳動写真である。（上段）ＡＳＫ１をトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞におけるＡＳＫ１活性の値を相対値で示した。結果は少なくとも５回の独立した実験からの平均値である。エラー・バーは標準偏差を示している。（下段）ＡＳＫ１をトランスフェクトしたＭｖ１Ｌｕ細胞、ＡＳＫ１をトランスフェクトしていない２９３細胞およびＡ６７３細胞におけるＴＮＦαによるＡＳＫ１活性の時間経過（ｍｉｎ：分）を示した電気泳動写真である。
【図１４】ＴＮＦαの用量依存的なＡＳＫ１の活性化を示した図である。ＡＳＫ１活性の値は平均値で示した。結果は少なくとも５回の独立した実験からの平均値である。エラー・バーは標準偏差を示している。
【図１５】アクチノマイシンＤ存在下または非存在下（none）でＴＮＦ−αで刺激（Stimulation ）した２９３細胞におけるＤＮＡ断片化が、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）のトランスフェクション（Transfection）によって阻害されることを示した電気泳動写真である。
【図１６】ＴＮＦ−αで刺激（Stimulation ）したJurrkat T 細胞におけるＤＮＡ断片化が、ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ）のトランスフェクション（Transfection）によって阻害されることを示した電気泳動写真である。図中、「ｎｏｎｅ」は、トランスフェクションしなかった場合または刺激がなかった場合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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