(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＡＴＣＣ−ＨＢ１１７２２のハイブリドーマにより産生される抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体であって、該相補性決定領域（ＣＤＲ）が、配列番号４８の軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基、ＲＳＳＯＳＬＶＨＧＩＧＮＴＹＬＨ、ＫＶＳＮＲＦＳおよびＳＱＳＴＨＶＰＬＴ、ならびに、配列番号５０の重鎖ＣＤＲアミノ酸残基、ＧＹＳＦＳＳＨＹＭＨ、ＧＹＩＤＰＳＮＧＥＴＴＹＮＯＫＦＫＧおよびＧＤＹＲＹＮＧＤＷＦＦＤＶを含む抗体。
【請求項２】
受託番号ＡＴＣＣ−ＨＢ１１７２２のハイブリドーマにより産生される抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体であって、該軽鎖可変領域が配列番号４８のアミノ酸１〜１１４を含み、該重鎖可変領域が配列番号５０のアミノ酸１〜１２２を含む抗体。
【請求項３】
受託番号ＡＴＣＣ−ＨＢ１１７２２のハイブリドーマにより産生される抗ＩＬ−８モノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
請求項１記載の抗体をコードする核酸を含むＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項２記載の抗体をコードする核酸を含むＤＮＡ分子。
【請求項６】
受託番号ＡＴＣＣ−ＨＢ１１７２２のハイブリドーマにより産生される抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸を含むＤＮＡ分子であって、該軽鎖可変領域が配列番号４８のアミノ酸残基１〜１１４を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項７】
受託番号ＡＴＣＣ−ＨＢ１１７２２のハイブリドーマにより産生される抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする核酸を含むＤＮＡ分子であって、該重鎖可変領域が配列番号５０のアミノ酸残基１〜１２２を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項８】
受託番号ＡＴＣＣ−ＨＢ１１７２２のハイブリドーマにより産生される抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸を含むＤＮＡ分子であって、該軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）が、配列番号４８のアミノ酸残基、ＲＳＳＯＳＬＶＨＧＩＧＮＴＹＬＨ、ＫＶＳＮＲＦＳおよびＳＱＳＴＨＶＰＬＴを含む、ＤＮＡ分子。
【請求項９】
受託番号ＡＴＣＣ−ＨＢ１１７２２のハイブリドーマにより産生される抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸を含むＤＮＡ分子であって、該重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）が、配列番号５０のアミノ酸残基、ＧＹＳＦＳＳＨＹＭＨ、ＧＹＩＤＰＳＮＧＥＴＴＹＮＯＫＦＫＧおよびＧＤＹＲＹＮＧＤＷＦＦＤＶを含む、ＤＮＡ分子。
【請求項１０】
受託番号ＡＴＣＣ−ＨＢ１１７２２のハイブリドーマにより産生される抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖまたはＦ（ａｂ’）2よりなる群から選択される抗体断片であって該相補性決定領域（ＣＤＲ）が、配列番号４８の軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基、ＲＳＳＯＳＬＶＨＧＩＧＮＴＹＬＨ、ＫＶＳＮＲＦＳおよびＳＱＳＴＨＶＰＬＴ、ならびに、配列番号５０の重鎖ＣＤＲアミノ酸残基、ＧＹＳＦＳＳＨＹＭＨ、ＧＹＩＤＰＳＮＧＥＴＴＹＮＯＫＦＫＧおよびＧＤＹＲＹＮＧＤＷＦＦＤＶを含む、抗体断片。
【請求項１１】
ヒト化されている、請求項１０記載の抗体断片。
【請求項１２】
哺乳類において潰瘍性大腸炎を処置するための医薬組成物であって、治療的有効量の請求項１の抗ＩＬ−８抗体を含み、該抗ＩＬ−８抗体が、好中球によるＩＬ−８仲介性エラスターゼ放出を阻害することができ、Ｃ５ａ、β−ＴＧまたは血小板因子４に結合しない、医薬組成物。
【請求項１３】
哺乳類がヒトである、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
全身的に投与される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１５】
持続的注入により投与される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ボーラス投与により投与される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１７】
抗体が、請求項２記載の抗体である、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１８】
哺乳類において細菌性肺炎を処置するための医薬組成物であって、治療的有効量の請求項１の抗ＩＬ−８抗体を含み、該抗ＩＬ−８抗体が、好中球によるＩＬ−８仲介性エラスターゼ放出を阻害することができ、Ｃ５ａ、β−ＴＧまたは血小板因子４に結合しない、医薬組成物。
【請求項１９】
哺乳類がヒトである、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
細菌性肺炎が、ストレプトコッカス・ニューモニア、エシェリチア・コリ、またはシュードモナス・アエルギノーサにより惹起される、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２１】
抗体が、請求項２記載の抗体である、請求項１８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本出願は、抗インターロイキン−８（ＩＬ−８）抗体および炎症性疾患の処置におけるそれらの用途に関するものである。
背景
インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、炎症仲介物質に応答して、様々な細胞により分泌される好中球走化性ペプチドである（総説については、ヘバート等、Cancer Investigation、１１（６）巻７４３頁（１９９３）を参照されたい）。ＩＬ−８は、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症性ショック、および多臓器不全のような炎症性疾患の病因に重要な役割を果たし得る。このような炎症性疾患の免疫療法には、抗ＩＬ−８抗体による罹患患者の処置が包含され得る。
スティチャリング等（J.Immunol.、１４３巻１６２８頁（１９８９））は、ＩＬ−８に対する四つのモノクローナル抗体の産生および特性決定を開示している。１９９２年３月１９日公開のＷＯ９２／０４３７２は、ＩＬ−８およびＩＬ−８のペプチド類似体のレセプター相互作用部位と反応するポリクローナル抗体、ならびに患者の炎症性反応を防止するための係る抗体の使用を開示している。セント・ジョン等（Chest、１０３巻９３２頁（１９９３））は、抗ＩＬ−８抗体の治療的使用の可能性を含む、ＡＲＤＳ、敗血症性ショック、および多臓器不全の免疫療法を総説している。セキド等（Nature、３６５巻６５４頁（１９９３））は、ＩＬ−８に対するモノクローナル抗体によるウサギの肺再灌流損傷の防止を開示している。ミュリガン等（J.Immunol.、１５０巻５５８５頁（１９９３））は、ラットの炎症性肺損傷におけるヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体の防護作用を開示している。
本発明は、本発明に係る抗ＩＬ−８モノクローナル抗体が、細菌性肺炎および炎症性腸疾患のようなその他の炎症性疾患の処置で治療的に使用できることを立証するものである。
抗ＩＬ−８抗体はさらに、ＩＬ−８を検定するための試薬としても有用である。例えば、スティチャリング等（Arch.Dermatol.Res.、２８４巻８２頁（１９９２））は、免疫組織化学的研究における試薬としての抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の使用を開示している。コー等（J.Immunol.Methods、１４９巻２２７頁（１９９２））は、ＩＬ−８のための酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）における試薬としての抗ＩＬ−８モノクローナル抗体の使用を開示している。
発明の要約
本発明の一つの態様は、以下の特性：約１ｘ１０-8ないし１ｘ１０-10Ｍの間のＫdでヒトＩＬ−８に結合する能力、ＩＬ−８に応答した好中球走化性を阻害する能力、および好中球によるＩＬ−８仲介性エラスターゼ放出を阻害する能力を有する抗ＩＬ−８モノクローナル抗体（ここで、該モノクローナル抗体はＣ５ａ、β−ＴＧまたは血小板因子４に結合しない）である。
本発明の別の態様は、プラスミドｐａｎｔｉＩＬ−８．２である。本発明のさらなる態様は、ｐａｎｔｉＩＬ−８．２によりコードされているＦａｂ、およびＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆｖ、またはＦ（ａｂ'）2（ここで、該抗体フラグメントはｐａｎｔｉＩＬ−８．２によりコードされている相補性決定領域を有する）より成る群から選ばれる抗体フラグメントである。
本発明の別の態様は、プラスミドｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍ２である。本発明のさらなる態様は、ｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍ２によりコードされているＦａｂ、およびＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆｖ、またはＦ（ａｂ'）2（ここで、該抗体フラグメントはｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍ２によりコードされている相補性決定領域を有する）より成る群から選ばれる抗体フラグメントである。
本発明の別の態様は、本発明に係る抗ＩＬ−８抗体の治療的有効量を投与することからなる、哺乳動物の潰瘍性大腸炎を処置する方法である。
本発明の別の態様は、本発明に係る抗ＩＬ−８抗体の治療的有効量を投与することからなる、哺乳動物の細菌性肺炎を処置する方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗ＩＬ−８モノクローナル抗体５．１２．１４による、ＩＬ−８の仲介する好中球によるエラスターゼ放出の遮断を示すグラフである。
図２は、非標識ＩＬ−８による、125Ｉ−ＩＬ−８の好中球への結合の阻害を示すグラフである。
図３は、陰性のイソタイプ合致Ｆａｂはヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害しないことを立証する図である。
図４は、平均ＩＣ50が１．６ｎＭである、キメラ５．１２．１４による、ヒト好中球への125Ｉ−ＩＬ−８の結合の阻害を示すグラフである。
図５は、平均ＩＣ50が７．５ｎＭである、キメラ６Ｇ．４．２５による、ヒト好中球への125Ｉ−ＩＬ−８の結合の阻害を示すグラフである。
図６は、キメラ６Ｇ４．２．５Ｆａｂおよびキメラ５．１２．１４Ｆａｂによる、ヒトＩＬ−８仲介好中球走化性の阻害を立証する図である。
図７は、ウサギＩＬ−８仲介好中球走化性を阻害する、キメラ６Ｇ４．２．５Ｆａｂおよびキメラ５．１２．１４Ｆａｂの相対的能力を立証する図である。
図８は、種々の濃度のヒトおよびウサギＩＬ−８による、ヒト好中球からのエラスターゼ放出の刺激を示す図である。エラスターゼ放出の相対的な程度を４０５ｎｍの吸光度の測定により定量化した。データは三重の試料の平均値±ＳＥＭを表す。
図９は、キメラ６Ｇ４．２．５Ｆａｂおよびキメラ５．１２．１４Ｆａｂが、ヒトＩＬ−８により刺激されたヒト好中球からのエラスターゼ放出を阻害する能力を示すグラフである。この結果は、１００ｎＭ ＩＬ−８単独により導かれたエラスターゼ放出のパーセンテージを反映するように正規化した。データは、異なる血液ドナーを用いて異なった日に実施された３回の別個の実験の平均値±ＳＥＭを表す。ＩＣ50値を４パラメータの当てはめにより算出した。
図１０は、キメラ６Ｇ４．２．５Ｆａｂおよびキメラ５．１２．１４Ｆａｂが、ウサギＩＬ−８により刺激されたヒト好中球からのエラスターゼ放出を阻害する相対的能力を示すグラフである。この結果は、１００ｎＭ ＩＬ−８単独により導かれたエラスターゼ放出のパーセンテージを反映するように正規化した。データは、異なる血液ドナーを用いて異なった日に実施された３回の別個の実験の平均値±ＳＥＭを表す。ＩＣ50値を４パラメータの当てはめにより算出した。
図１１、ａ−ｊ部は、ウサギ潰瘍性大腸炎モデルにおける以下のパラメータを示すグラフの組である：（ａ）組織のミエロペルオキシダーゼレベル；（ｂ）組織のＩＬ−８レベル；（ｃ）結腸の重量；（ｄ）肉眼的炎症；（ｅ）浮腫；（ｆ）壊死の大きさ；（ｇ）壊死の重篤度；（ｈ）好中球の辺縁趨向；（ｉ）好中球の浸潤；（ｊ）単核球の浸潤。
図１２は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、エシェリチア・コリ、またはシュードモナス・アエルギノーサに感染した動物の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の好中球の数に及ぼす抗ＩＬ−８モノクローナル抗体処置の効果を示すグラフである。６Ｇ４．２．５による処置は、イソタイプ対照マウスＩｇＧで処理された動物と比較して、ＢＡＬ液中に存在する好中球の数を有意に低下させた（図１２）。
図１３は、軽鎖および重鎖の各々のために設計された３個のプライマーのＤＮＡ配列を示す図である。プライマーのハイブリダイゼーションの機会を増大させ、モノクローナル抗体５．１２．１４の軽鎖および重鎖可変領域のクローニングのための第一鎖ｃＤＮＡ合成の効率を高めるため、複数のプライマーを設計した。
図１４は、５．１２．１４軽鎖可変領域の増幅のための１個の前進プライマーおよび１個の逆プライマーのＤＮＡ配列を示す図である。
図１５は、５．１２．１４重鎖可変領域の増幅のための１個の前進プライマーおよび１個の逆プライマーのＤＮＡ配列を示す図である。
図１６は、５．１２．１４軽鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す図である。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線を付したアミノ酸）またはカバット配列比較（星印で示されるアミノ酸）のいずれかにより示される。重要な制限部位をイタリック体で示す。ＳＴIIのシグナルペプチドはアミノ酸−２３ないし−１である。マウス軽鎖可変領域はアミノ酸１ないし１０９である。部分的マウス軽鎖不変領域はアミノ酸１１０ないし１２３である（イタリック体）。
図１７は、５．１２．１４重鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す図である。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線を付したアミノ酸）またはカバット配列比較（星印で示されるアミノ酸）のいずれかにより示される。重要な制限部位をイタリック体で示す。ＳＴIIのシグナルペプチドはアミノ酸−２３ないし−１である。マウス重鎖可変領域はアミノ酸１ないし１２０である。部分的マウス重鎖不変領域はアミノ酸１２１ないし１３０である。
図１８は、マウス軽鎖および重鎖不変領域の残基をヒトの軽鎖および重鎖不変領域の残基に変換するために用いられる増幅プライマーのＤＮＡ配列を示す図である。
図１９は、５．１２．１４軽鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１軽鎖不変領域のコード化配列を示す図である。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線を付したアミノ酸）またはカバット配列比較（星印で示されるアミノ酸）のいずれかにより示される。ヒト不変領域をイタリック体で示す。ＳＴIIのシグナルペプチドはアミノ酸−２３ないし−１である。マウス軽鎖可変領域はアミノ酸１ないし１０９である。ヒト軽鎖不変領域はアミノ酸１１０ないし２１５である。
図２０は、５．１２．１４重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１の重鎖不変領域のコード化配列を示す図である。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線を付したアミノ酸）またはカバット配列比較（星印で示されるアミノ酸）のいずれかにより示される。ヒト不変領域をイタリック体で示す。ＳＴIIのシグナルペプチドはアミノ酸−２３ないし−１である。マウス重鎖可変領域はアミノ酸１ないし１２０である。ヒト重鎖不変領域はアミノ酸１２１ないし２２９である。
図２１は、軽鎖および重鎖の各々のために設計された３個のプライマーのＤＮＡ配列を示す図である。プライマーのハイブリダイゼーションの機会を増大させ、モノクローナル抗体６Ｇ４．２．５の軽鎖および重鎖可変領域のクローニングのための第一鎖ｃＤＮＡ合成の効率を高めるため、複数のプライマーを設計した。
図２２は、６Ｇ４．２．５軽鎖可変領域の増幅のための１個の前進プライマーおよび１個の逆プライマーのＤＮＡ配列を示す図である。
図２３は、６Ｇ４．２．５重鎖可変領域の増幅のための１個の前進プライマーおよび１個の逆プライマーのＤＮＡ配列を示す図である。
図２４は、６Ｇ４．２．５軽鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す図である。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線を付したアミノ酸）またはカバット配列比較（星印で示されるアミノ酸）のいずれかにより示される。有用なクローニング部位をイタリック体で示す。ＳＴIIのシグナルペプチドはアミノ酸−２３ないし−１である。マウス軽鎖可変領域はアミノ酸１ないし１１４である。部分的マウス軽鎖不変領域はアミノ酸１１５ないし１３１である。
図２５は、６Ｇ４．２．５重鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す図である。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線を付したアミノ酸）またはカバット配列比較（星印で示されるアミノ酸）のいずれかにより示される。有用なクローニング部位をイタリック体で示す。ＳＴIIのシグナルペプチドはアミノ酸−２３ないし−１である。マウス重鎖可変領域はアミノ酸１ないし１２２である。部分的マウス重鎖不変領域はアミノ酸１２３ないし１３５である。
図２６は、マウス軽鎖および重鎖不変領域をヒトの軽鎖および重鎖不変領域に変換するためのプライマーを示す図である。
図２７は、キメラ６Ｇ４．２．５軽鎖のためのコード化配列を示す図である。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線を付したアミノ酸）またはカバット配列比較（星印で示されるアミノ酸）のいずれかにより示される。ヒト不変領域をイタリック体で示す。ＳＴIIのシグナルペプチドはアミノ酸−２３ないし−１である。マウス重鎖可変領域はアミノ酸１ないし１１４である。ヒト重鎖不変領域はアミノ酸１１５ないし２２０である。
図２８は、キメラ６Ｇ４．２．５重鎖のためのコード化配列を示す図である。ＣＤＲは、Ｘ線結晶学（下線を付したアミノ酸）またはカバット配列比較（星印で示されるアミノ酸）のいずれかにより示される。ヒト不変領域をイタリック体で示す。ＳＴIIのシグナルペプチドはアミノ酸−２３ないし−１である。マウス重鎖可変領域はアミノ酸１ないし１２２である。ヒト重鎖不変領域はアミノ酸１２３ないし２３１である。
好ましい態様の説明
Ａ．定義
一般に以下の語または句は、説明、実施例、および請求の範囲に使用される時、以下に示す定義を有する。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の断片の少量を、１９８７年７月２８日登録の米国特許第４６８３１９５号に記載のように増幅させる操作または技術を指す。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるよう、目的とされる領域の末端から、またはそれ以上の配列情報が得られる必要があり；これらのプライマーは増幅される鋳型の反対側の鎖と同一または類似の配列であろう。２個のプライマーの５'末端ヌクレオチドは、増幅されたものの末端と一致し得る。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、総ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、および総細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列等の増幅に使用することができる。一般に、ミュリス等、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.、５１巻２６３頁（１９８７）；アーリッヒ編、PCR Technology（ストックトン・プレス、ＮＹ、１９８９）を参照されたい。本明細書に記載のように、ＰＣＲは、核酸の特定の断片を増幅または作成するために、プライマーとしての既知の核酸および核酸ポリメラーゼを使用することからなる、核酸被験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例であるが、唯一の例ではないと考えられる。
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖蛋白である。抗体は特異的抗原に対する結合特異性を示すのに対し、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を欠くその他の抗体様分子の両者を包含する。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルが、そして骨髄腫により高レベルが産生される。
「天然の抗体および免疫グロブリン」は、通常、２個の同一の軽（Ｌ）鎖および２個の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖蛋白である。各々の軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合により重鎖に連結しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖の間で相違する。各々の重鎖および軽鎖はさらに、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド橋を有する。各々の重鎖は一方の端に１個の可変ドメイン（ＶH）、続いて幾つかの不変ドメインを持っている。各々の軽鎖は一方の端に１個の可変ドメイン（ＶL）、そして他方の端に１個の不変ドメインを持っている；軽鎖の不変ドメインは重鎖の第一不変ドメインと並置しており、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並置している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメインの間の界面を形成していると信じられている（クロチア等、J.Mol.Biol.、１８６巻６５１頁（１９８５）；ノヴォトニーおよびヘイバー、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、８２巻４５９２頁（１９８５））。
「可変」という語は、可変ドメインの或る部分が配列の上で抗体間で甚だしく異なっている事実を指し、特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および特異性に用いられる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に平均して分布してはいない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三個のセグメントに集中している。可変ドメインの、より高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ四個のＦＲ領域を含んでおり、これらは大抵βシートコンフィギュレーションを採用しており、三個のＣＤＲによって連結しているが、それらはこのβシート構造を結合するループを形成するか、幾つかの場合にはそのβシート構造の一部を形成している。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて近接して保持されており、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（カバット等、シークエンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタレスト、第５版、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ（１９９１）を参照されたい）。不変ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与している訳ではないが、抗体の抗体依存細胞毒性への参加といったような様々なエフェクター機能を示す。
抗体のパパイン消化は、それぞれが１個の抗原結合部位を伴う「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる二つの等しい抗原結合フラグメント、および、その名称が容易に結晶化する能力を反映している、残りの「Ｆｃ」フラグメントを生成する。ペプシン処理は、二個の抗原結合部位を持ち、なお抗原と交差反応できるＦ（ａｂ'）2フラグメントを生成する。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、緊密に非共有結合している１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体で構成されている。各可変ドメインの三つのＣＤＲが相互作用してＶH−ＶL二量体表面の抗原結合部位を規定しているのはこのコンフィギュレーションにおいてである。まとはめると、６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与している。しかしながら、ただ一つの可変ドメイン（または、或る抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識し結合する能力を持っている。
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の不変ドメインおよび重鎖の最初の不変ドメイン（ＣＨ１）を含んでいる。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体のヒンジ領域由来の１またはそれ以上のシステインを含む数個の残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に加わっている点でＦａｂフラグメントと異なっている。Ｆａｂ'−ＳＨは本明細書において、不変ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持っているＦａｂ'の表記である。Ｆ（ａｂ'）2抗体フラグメントは元々、間にヒンジシステインを持っているＦａｂ'フラグメントの対として生成された。別の、抗体フラグメントの化学的結合もまた知られている。
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの不変ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（ｋ）およびラムダ（１）と呼ばれる極めて明瞭な二つのタイプの一つに割り当てることができる。
重鎖の不変ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。五つの主要な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、があり、これらのうち幾つかはさらにサブクラス（イソタイプ）、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1およびＩｇＡ2、に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖不変ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元コンフィギュレーションは良く知られている。
「抗体」という語は最も広い意味で用いられ、詳細には、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を包含する）および多エピトープ特異性を有する抗体組成物を包含する。
本明細書中使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という語は、実質上均質な抗体の集団から得られた抗体、即ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然に存在する可能な突然変異を除いては同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して作製される異なった抗体を含む常套的（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは抗原上の一つの決定基に対して作製されたものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養によって合成されるという点で有利である。
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、供給源となる種または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスの指定に拘わらず、抗ＩＬ−８抗体の可変（超可変を包含する）ドメインを不変ドメインに（例えば「ヒト化」抗体）、または軽鎖を重鎖に、またはある種由来の鎖を別の種由来の鎖にスプライシングすることにより生成されるハイブリッドおよび組換え抗体、または、ヘテロローガス蛋白の融合物、ならびに、それらが所望の生物活性を示す限り、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2、およびＦｖ）を包含する。（例えば、キャビリー等、米国特許第４８１６５６７号；メイジおよびラモイ、モノクローナル・アンティボディー・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ、７９−９７頁（マーセル・デッカー、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７）を参照されたい。）
したがって、修飾語句「モノクローナル」は、実質上均質な抗体の集団から得られるような抗体の性格を示すものであり、特定の方法によりその抗体を産生することを要求すると解してはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製することができ、または、組換えＤＮＡ法により作製することができる（キャビリー等、上記）。
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重および／または軽鎖の一部は、特定の種から誘導されるまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導されるまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスである、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、および係る抗体のフラグメントを特に包含する（キャビリー等、上記；モリソン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻６８５１頁（１９８４））。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含む、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、抗体の、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2またはその他の抗原結合サブ配列）である。大抵は、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体にも取り入れられたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見いだされない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の挙動をさらに洗練および最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質上全てを含み、ここで、全てまたは実質上全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てまたは実質上全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの不変領域の少なくとも一部をも含むであろう。さらなる詳細については、ジョーンズ等、Nature、３２１巻５２２頁（１９８６）；リーチマン等、Nature、３３２巻３２３頁（１９８８）；およびプレスタ、Curr.Op.Struct.Biol.、２巻５９３頁（１９９２）を参照されたい。
「処置」とは、治療的処置および予防的または防止的方法の両者を指す。処置を必要とする者には、既にその疾患を有する者ならびにその疾患に罹患し易い者またはその疾患が防止されるべき者が包含される。
処置の目的のための「哺乳動物」とは、人間、飼い慣らされたおよび農場の動物、および動物園、競技、または愛玩動物を包含する、哺乳動物に分類される任意の動物、例えば犬、馬、猫、牛等を包含する。好ましくは、本明細書に記載の哺乳動物とは、人間である。
本明細書中使用される蛋白、ペプチドおよびポリペプチドは互換的に用いられ、アミノ酸ポリマーまたは２もしくはそれ以上の相互作用するまたは結合したアミノ酸ポリマーの組を意味する。
本明細書中使用される「炎症性疾患」という語は、典型的には好中球の走化性により惹起される、炎症の際にもたらされる病理学的状態を指す。係る疾患の例は、乾癬を包含する炎症性皮膚疾患；炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性大腸炎）に伴う応答；虚血性再灌流；成人呼吸困難症候群；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；慢性関節リウマチ、ショーグレン症候群、脈管炎のような自己免疫疾患；白血球滲出を含む疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性疾患、敗血症または外傷に続発性の多臓器傷害症候群；アルコール性肝炎、細菌性肺炎、抗原抗体複合体仲介疾患；胸膜炎、肺胞炎、脈管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、および嚢胞性線維症を包含する肺の炎症等を包含する。好ましい適応は、細菌性肺炎および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患である。
Ｂ．発明を実施する様式
１．抗ＩＬ−８抗体の製造
ａ．モノクローナル抗体
本発明に係る抗ＩＬ−８抗体は、好ましくはモノクローナルであり、約１ｘ１０-8ないし１ｘ１０-11、より好ましくは１ｘ１０-9ないし１ｘ１０-10のＫdでＩＬ−８と結合する。本発明に係る抗体は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ検定において、Ｃ５ａ、血小板因子４またはβ−ＴＧのようなＩＬ−８以外のケモカインと、測定し得る程には結合しない。さらに、本発明に係る抗体は、好ましくは、ＩＬ−８で刺激された好中球からのエラスターゼ放出を阻害し、そしてＩＬ−８で刺激された好中球の走化性を阻害する。本発明の一つの態様において、本発明に係る抗体は、ヒトＩＬ−８に加えてヒト以外の種由来のＩＬ−８、例えばウサギＩＬ−８と結合することができる。
本発明の別の態様において、本発明に係る抗ＩＬ−８抗体のＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨ、またはＦ（ａｂ'）2フラグメントが作り出される。これらの抗体「フラグメント」は、酵素的消化のような常套的手段によって作り出され、または組換え技術によって生成することができる。このような抗体フラグメントはキメラ化またはヒト化されていてよい。これらのフラグメントは、下に開示する診断および治療目的にとって有用である。
本発明に係る抗ＩＬ−８モノクローナル抗体は、例えば、コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作成することができ、または組換えＤＮＡ法（キャビリー等、上記）によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫に用いられたＩＬ−８またはＩＬ−８フラグメントと特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することのできるリンパ球を導く。ＩＬ−８に対する抗体は一般に、ＩＬ−８およびアジュバントを動物に複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することによって作成される。動物は通常、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）／トレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）（リビ・イミュノケム・リサーチ、Ｉｎｃ．、ハミルトン、ＭＴ）を伴うＩＬ−８の免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫し、この溶液を複数部位に皮内注射する。２週間後、この動物を追加免疫する。７ないし１４日後、動物を採血し、血清を抗ＩＬ−８力価について検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。
別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。この場合、リンパ球は適当な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（ゴディング、モノクローナル・アンティボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス、５９−１０３頁（アカデミック・プレス、１９８６））。
こうして製造されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖および生存を阻害する１またはそれ以上の物質を含有する適当な培養基に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損しているならば、ハイブリドーマのための培養基は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選ばれた抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体産生を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。これらの中でも好ましい骨髄腫セルラインは、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、Ｕ．Ｓ．Ａ．より入手し得るＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、および、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、Ｕ．Ｓ．Ａ．より入手し得るＳＰ−２細胞から誘導されるもののようなマウス骨髄腫ラインである。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養基をＩＬ−８に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。
ｍＡｂの結合親和性は、例えばマンソンおよびポラード、Anal.Biochem.、１０７巻２２０頁（１９８０）のスキャッチャード分析により決定することができる。
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生すると確定された後、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準法（ゴディング、上記）により増殖させることができる。この目的のための好適な培地は、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。加えて、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、常套的免疫グロブリン精製法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和クロマトグラフィーにより、培養基、腹水液、または血清から適当に分離する。
本発明に係るモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子と特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に分離および配列決定される。本発明に係るハイブリドーマ細胞は係るＤＮＡの好ましい供給源としての役割を有する。分離されたならば、このＤＮＡは発現ベクター中に入れ、次にこれを、この状況以外では免疫グロブリン蛋白を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。該抗体をコードしているＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説には、スケラ等、Curr.Opinion in Immunol.、５巻２５６頁（１９９３）およびプリュックトン、Immunol.Revs.、１３０巻１５１頁（１９９２）が包含される。
このＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖不変ドメインのコード化配列を、ホモローガスなマウス配列の代わりに置換することにより（例えばモリソン等、Proc.Natl.Acad.Sci.、８１巻６８５１頁（１９８４））、または、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の一部または全てを共有結合させることにより、修飾することができる。このようにして、本明細書に記載の抗ＩＬ−８ｍＡｂの結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が製造される。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明に係る抗体の不変ドメインを置換し、または本発明に係る抗体の１個の抗原結合部位の可変ドメインを置換して、ＩＬ−８に対する特異性を有する１個の抗原結合部位、および異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を用いる方法を包含する、合成蛋白化学において既知の方法を用いてインビトロで製造することもできる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエステル結合を形成することにより、組み立てることができる。この目的のための好適な試薬の例は、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダートを包含する。
ｂ．ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野で良く知られている。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターおよび共同研究者の方法（ジョーンズ等、Nature、３２１巻５２２頁（１９８６）；リーチマン等、Nature、３３２巻３２３頁（１９８８）；ベルホーエン等、Science、２３９巻１５３４頁（１９８８））に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより、実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されている、キメラ抗体である（キャビリー等、上記）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基およびことによると幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従うと、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、その齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（シムズ等、J.Immunol.、１５１巻２２９６頁（１９９３）；チョシアおよびレスク、J.Mol.Biol.、１９６巻９０１頁（１９８７））。もう一つの方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループにある、全てのヒト抗体の共通配列から誘導される特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（カーター等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、８９巻４２８５頁（１９９２）；プレスタ等、J.Immunol.、１５１巻２６２３頁（１９９３））。
さらに、抗体は、抗原に対する高親和性およびその他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい態様によれば、親配列および様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を製造する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における当該残基の可能な役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析、が可能となる。このようにして共通および移入配列からのＦＲ残基を選択し、結びつけることができ、その結果、所望の抗体の性格、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、直接且つ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
ｃ．ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫セルラインが、例えば、コズボア、J.Immunol.、１３３巻３００１頁（１９８４）；ブロデュア等、モノクローナル・アンティボディ・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ、５１−６３頁（マーセル・デッカー、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７）；およびボーナー等、J.Immunol.、１４７巻８６頁（１９９１）に記載されている。
免疫時に内因性免疫グロブリンの産生無しにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできる、形質転換動物（例えば、マウス）を作ることが現在可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪH）遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすということが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、ジャコボヴィッツ等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、９０巻２５５１頁（１９９３）；ジャコボヴィッツ等、Nature、３６２巻２５５頁（１９９３）；ブラガーマン等、Year in Immuno.、７巻３３頁（１９９３）を参照されたい。
別法として、ファージデイスプレイ技術（マクカファーティ等、Nature、３４８巻５５２頁（１９９０））を用いてヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生成することもできる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄのような繊維状バクテリオファージの主要なまたは重要性の低いコート蛋白遺伝子のいずれかの中にフレーム内クローニングし、このファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして表示させる。繊維状粒子はこのファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含んでいるため、抗体の機能的性質に基づく選択は、それらの性質を示す抗体をコードしている遺伝子の選択をももたらす。よって、このファージはＢ細胞の性質の幾つかを模倣するものである。ファージデイスプレイは様々な形式で遂行でき、これらの総説については、例えばジョンソン等、Current Opinion in Structural Biology、３巻５６４頁（１９９３）を参照されたい。幾つかのＶ遺伝子セグメントの供給源がファージディスプレイに使用できる。クラックソン等、Nature、３５２巻６２４頁（１９９１）は、免疫されたマウスの脾臓から誘導されたＶ遺伝子の小さな無作為組み合わせライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様性ある列を分離した。免疫されていない人間のドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを組み立てることができ、多様性ある列の抗原に対する抗体（自己抗原を含む）を、マークス等、J.Mol.Biol.、２２２巻５８１頁（１９９１）、またはグリフィス等、EMBO J.、１２巻７２５頁（１９９３）により記載される技術に本質上従って、分離することができる。
天然の免疫応答の際、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する（体細胞突然変異）。導入される変化の幾つかは高い親和性を付与し、後の抗原チャレンジの間に、高親和性表面免疫グロブリンを表示するＢ細胞が専ら複製され分化する。この天然の工程は、「鎖シャフリング」として知られる技術を用いることにより模倣することができる（マークス等、Bio/Technol.、１０巻７７９頁（１９９２））。この方法においては、ファージデイスプレイにより得られる「一次」ヒト抗体の親和性を、免疫されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体（レパートリー）のレパートリーで重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を順次置き換えることによって改善することができる。この技術は、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリーを作成するための方法が、ウォーターハウス等、Nucl.Acids Res.、２１巻２２６５頁（１９９３）に記載されている。
遺伝子シャフリングは、齧歯類抗体からヒト抗体を誘導するのに使用することもでき、この場合、ヒト抗体は、出発齧歯類抗体と類似の親和性および特異性を持っている。「エピトープ刷り込み」とも呼ばれるこの方法に従って、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーに置き換えられ、齧歯類−ヒトキメラが作り出される。抗原による選択が、機能的抗原結合部位を回復させ得るヒト可変部の分離をもたらし、即ち、エピトープがパートナーの選択を支配する（刷り込む）。残っている齧歯類Ｖドメインを置き換えるためにこの工程を反復すると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲ接合による齧歯類抗体の常套的なヒト化は異なり、この技術は、齧歯類のフレームワークまたはＣＤＲを持たない完全なヒト抗体を提供する。
ｄ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。本発明においては、一方の結合特異性はＩＬ−８に対するものであり、他方は他の任意の抗原に対するものである。例えば、ＩＬ−８および神経栄養因子、または二つの異なる型のＩＬ−８ポリペプチドを特異的に結合させる二重特異性抗体は本発明の範囲内にある。
二重特異性抗体を作製する方法は当分野において既知である。常套的には、二重特異性抗体の組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づき、ここでこの二つの重鎖は異なる特異性を持っている（ミルシュタインおよびキュエロ、Nature、３０５巻５３７頁（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ（四部雑種）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、親和クロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、そして生成物の収率は低い。同様の方法は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９およびトラウネッカー等、EMBO J.、１０巻３６５５頁（１９９１）に開示されている。
異なったそしてより好ましいアプローチによると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を、免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。この融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖不変ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖不変領域（ＣＨ１）を、融合物の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、および、所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別々の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。この事により、組み立てに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適の収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での産生が高収率をもたらす時、または、その比率が特に重要性を持たない時は、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。このアプローチの好ましい態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖、そして他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）で構成される。その二重特異性分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にする。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細については、例えばスレッシュ等、Methods in Enzymology、１２１巻２１０頁（１９８６）を参照されたい。
ｅ．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合により連結した二つの抗体で構成される。このような抗体は、例えば、不要な細胞に対する免疫系細胞を標的とするため（米国特許第４６７６９８０号）、そしてＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；およびＥＰ０３０８９）に提唱された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
２．抗ＩＬ−８抗体の用途
ａ．診断的用途
ＩＬ−８の検出または定量を必要とする診断上の適用のため、本発明に係る抗体を、典型的には検出可能な原子団で標識する。検出可能な原子団は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成することのできる任意のものとすることができる。例えば、検出可能な原子団は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉのような放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光または化学ルミネセント化合物；例えば125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、または3Ｈのような放射性同位元素標識；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素とすることができる。
ハンター等、Nature、１４４巻９４５頁（１９６２）；デイヴィッド等、Biochemistry、１３巻１０１４頁（１９７４）；ペイン等、J.Immunol.Meth.、４０巻２１９頁（１９８１）；およびニグレン、J.Histochem.and cytochem.、３０巻４０７頁（１９８２）により記載される方法を包含する、抗体を検出可能な原子団に個別にコンジュゲートさせるための当分野で既知の任意の方法を使用することができる。
本発明に係る抗体は、競合的結合検定、直接および間接サンドイッチ検定、および免疫沈降検定のような既知の任意の検定法に使用することができる。例えば、ゾラ、モノクローナル・アンティボディーズ：ア・マニュアル・オブ・テクニークス、１４７−１５８頁（ＣＲＣプレス、Inc.、１９８７）を参照されたい。
競合的結合検定は、標識された標準（これはＩＬ−８またはその免疫学的に活性な部分とすることができる）が限られた量の抗体との結合について被験試料検定（ＩＬ−８）と競合する能力に依るものである。被験試料中のＩＬ−８の量は、抗体に結合することになる標準の量に逆比例する。結合することになる標準の量の決定を容易にするため、抗体は一般にこの競合の前または後で不溶化し、その結果、抗体に結合する標準および被験体は、非結合のままである標準および被験体から簡便に分離することができる。
サンドイッチ検定は、各々が、検出されるべき蛋白（ＩＬ−８）の相異なる抗原部分、またはエピトープと結合することのできる、二つの抗体の使用を含む。サンドイッチ検定においては、被験試料検体は、固体支持体上に固定された第一の抗体に結合し、その後第二の抗体が該被験体に結合し、こうして不溶性の三部複合体が形成される（米国特許第４３７６１１０号）。第二の抗体は、自身検出可能な原子団で標識されていてよく（直接サンドイッチ検定）、または検出可能な原子団で標識されている抗免疫グロブリン抗体を用いて測定することもできる（間接サンドイッチ検定）。例えば、サンドイッチ検定の一つの型はＥＬＩＳＡ検定であり、この場合、検出可能な原子団は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）である。
ＩＬ−８抗体はまた、組換え細胞培養または天然供給源からのＩＬ−８の親和精製に有用である。例えば、これらの抗体は、培養上清または組織のような供給源からＩＬ−８が精製されるよう、当分野で良く知られる技術により、固体支持体に固定することができる。
ｂ．抗ＩＬ−８抗体の治療用組成物および投与
凍結乾燥塊または水溶液の形の抗ＩＬ−８抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗ＩＬ−８抗体を、所望による生理学上許容し得る担体、賦形剤、または安定剤（レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、上記）と混合することにより、保存用に製造される。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度において受容者にとり非毒性であって、燐酸、クエン酸、およびその他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を包含する抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを包含する単糖類、二等類、およびその他の炭水化素；ＥＤＴＡのようなキレート試薬；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール類；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはトゥイーン、プルロニックまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を包含する。
インビボ投与に使用される抗ＩＬ−８ ｍＡｂは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に無菌濾過膜で濾過することにより、容易に達成される。抗ＩＬ−８ ｍＡｂは、通常、凍結乾燥型または溶液で保存されるであろう。
治療用抗ＩＬ−８ mAb組成物は一般に、無菌取り出し口を有する容器、例えば静脈内溶液袋または皮下注射針が貫通し得る栓を有するバイアル中に入れる。
抗ＩＬ−８ ｍＡｂの投与経路は既知の方法に従い、例えば吸入、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、もしくは病変内径路による注射または注入、浣腸剤もしくは坐剤、または下記のような持続放出系による。好ましくは該抗体は全身的にまたは炎症の部位に投与する。
徐放製剤の適当な例は、成型された物体、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形の半透過性ポリマーマトリックスを包含する。徐放性マトリックスは、ポリエステル類、ヒドロゲル類、ポリラクチド類（Ｕ．Ｓ．３７７３９１９、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー（シドマン等、Biopolymers、２２巻５４７頁（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（ランガー等、J.Biomed.Mater.Res.、１５巻１６７頁（１９８１）およびランガー、Chem.Tech.、１２巻９８頁（１９８２））、エチレンビニルアセタート（ランガー等、上記）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８）を包含する。徐放性抗ＩＬ−８抗体組成物は、リポソームに捕捉された抗ＩＬ−８抗体をも包含する。抗ＩＬ−８抗体を包含するリポソームは、自体既知の方法によって製造される：ＤＥ３２１８１２１；エプシュタイン等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、８２巻３６８８頁（１９８５）；ファング等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、７７巻４０３０頁（１９８０）；ＥＰ５２３２２；ＥＰ３６６７６；ＥＰ８８０４６；ＥＰ１４３９４９；ＥＰ１４２６４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４４８５０４５および４５４４５４５号；ならびにＥＰ１０２３２４。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モルパーセントコレステロール以上である、小さな（約２００−８００オングストローム）単層型のものであり、選択される比率は最適な抗ＩＬ−８抗体療法のために調節される。
治療的に使用される抗ＩＬ−８抗体の「有効量」は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存するであろう。したがって、治療者は、用量を滴定し、最適の治療効果の獲得に要するように投与経路を修飾する必要があろう。典型的には、臨床医は、抗ＩＬ−８抗体を、所望の効果が達成される用量に達するまで投与する。この治療の進行は、常套的検定により容易に監視される。
抗ＩＬ−８抗体による炎症性疾患の処置および防止において、該抗体組成物は、良好な医学実務に合致するやり方で調合され、用量決定され、そして投与されるであろう。このような状況において考慮される因子には、処置される個々の疾患、処置される個々の哺乳動物、患者個人の臨床状態、疾患の原因、抗体の送り込まれる部位、抗体の個々の型、投与方法、投与スケジュール、および医師の知悉するその他の因子が包含される。投与される抗体の「治療的有効量」は、係る考察により決定され、急性または慢性呼吸疾患の処置および炎症反応の低減を包含する該炎症性疾患を防止、緩和、または処置するのに必要な最少量である。このような量は、好ましくは宿主にとって毒性である量または宿主を有意により感染に罹患し易くする量より少ない。
一般的比率として、一用量当たりの非経口的に投与される抗体の初回薬学的有効量は、一日当たり約０．１ないし５０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲であって、使用される抗体の典型的な初回の範囲は０．３ないし２０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．３ないし１５ｍｇ／ｋｇ／日であろう。
しかしながら、上記のように、これらの示唆された抗体の量は、治療上の裁量に著しく支配される。適切な用量およびスケジュールの選択における重要な因子は、上に指摘したように、得られる結果である。
該抗体は、問題の炎症性疾患を防止または処置するために現在使用されている１またはそれ以上の物質と共に調合される必要はないが、所望によりそうしてもよい。例えば、慢性関節リウマチにおいて、該抗体はグルココルチコステロイドと組み合わせて投与することができる。このような別の物質の有効量は、製剤中に存在するＩＬ−８抗体の量、疾患または処置の型、および上で論じたその他の因子に依存する。これらは一般に、上記で使用されたものと同じ用量および投与経路で、または上記で使用された用量の約１ないし９９％が使用される。
以下の実施例は例示のために供するものであって、限定のためのものではない。本明細書中、全ての引用の内容は説明的に引用して本明細書の一部とするものである。
実施例
Ａ．ヒトＩＬ−８に対するモノクローナル抗体の作成および特性決定
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、組換えヒトＩＬ−８（ユビキチンを伴う（ｓｅｒ−ＩＬ−８）72の融合物として産生される）１０μｇを用いて各後肢足底でまたは腹腔内で免疫した（ヘバート等、J.Immunology、１４５巻３０３３−３０４０頁（１９９０））；ＩＬ−８は、ペプロテク、Ｉｎｃ．、ロッキーヒル、ＮＪ）より市販品が入手でき、ＭＰＬ／ＴＤＭ（リビ・イミュノケム・リサーチ・Ｉｎｃ．、ハミルトン、ＭＴ）に再懸濁し、同量のＩＬ−８で２回追加免疫した。これらの実験において、「ＩＬ−８」は、別途明記しない限り、（ｓｅｒ−ＩＬ−８）72を意味することを意図している。ＩＬ−８ １０μｇの最終追加免疫を、融合の３日前に実施した。脾臓細胞または膝窩リンパ節細胞を、３５％ポリエチレングリコールを用いて前記のようにマウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９７）、骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８の非分泌クローンと融合させた。融合の１０日後、培養上清をＥＬＩＳＡによってＩＬ−８に対するモノクローナル抗体の存在についてスクリーニングした。
ＥＬＩＳＡは以下のように実施した。ナンク９６ウェルの免疫プレート（フロー・ラブ、マクリーン、ＶＡ）を、燐酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中の２μｇ／ｍｌのＩＬ−８ ５０μｌ／ウェルを用いて４℃で一夜被覆した。残りの工程は室温で実施した。非特異結合部位を０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロックした。次にプレートを、６７２の増殖しつつある親融合物のウェル由来のハイブリドーマ培養上清５０μｌ／ウェルと共に１時間インキュベートし、次いでアルカリホスファターゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇ（タゴ・Ｃｏ．、フォスターシティー、ＣＡ）の１ｍｇ／ｍｌ保存溶液の１：１０００希釈液５０μｌ／ウェルと共に１時間インキュベートした。プレートに結合した酵素結合抗体のレベルを、重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６、中の０．５ｍｇ／ｍｌのｒ−ニトロフェニルホスファート１００μｌ／ウェルの添加によって決定した。着色反応をＥＬＩＳＡプレート読み取り機（タイタートレック・マルティスキャン、フロー・ラブ、マクリーン、ＶＡ）により４０５ｎｍで測定した。それぞれの工程の合間にプレートを０．０５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。
ＩＬ−８の結合を対照培地の４倍促進した培養上清を陽性として選択した。この基準によると、６７２の増殖しつつある親の融合物ウェルのうち１６（２％）が陽性であった。これら陽性のハイブリドーマセルラインを限界希釈法を用いて少なくとも２回クローニングした。
陽性のハイブリドーマのうち７個を以下のごとくさらに特性決定した。ナンク９６ウェル免疫プレート（フロー・ラブ、マクリーン、ＶＡ）をＩＬ−８で一夜被覆し、ＢＳＡでブロックし、培養上清と共にインキュベートした後、予め定められた量のイソタイプ特異的アルカリホスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇ（フィッシャー・バイオテク、ピッツバーグ、ＰＡ）を添加することにより、このモノクローナル抗体のイソタイプを決定した。プレートに結合したコンジュゲート化抗体のレベルを、上記のようにｒ−ニトロフェニルホスファートの添加によって決定した。
試験されたモノクローナル抗体は全てＩｇＧ1またはＩｇＧ2免疫グロブリンイソタイプに属していた。これらモノクローナル抗体を含有する腹水液は、ＥＬＩＳＡにおいて最大結合の５０％を与える希釈係数の逆数により決定された１００００ないし１０００００の範囲の抗体価を有していた。
これらのモノクローナル抗体が同じエピトープに結合しているか否かを評価するため、競合的結合ＥＬＩＳＡを実施した。ビオチニル化ｍＡｂ対非標識ｍＡｂの比が１：１００においては、ビオチニル化ｍＡｂ５．１２．１４の結合はそのホモローガスなｍＡｂにより有意に阻害されたが、ｍＡｂ４．１．３によっては阻害されず、一方、ビオチニル化ｍＡｂ４．１．３の結合は、ｍＡｂ４．１．３により阻害されたがｍＡｂ５．１２．１４によっては阻害されなかった。モノクローナル抗体５．２．３はｍＡｂ４．１．３と同様に挙動したが、一方モノクローナル抗体４．８および１２．３．９はｍＡｂ５．１２．１４．と同様であった。このように、ｍＡｂ４．１．３およびｍＡｂ５．２．３は、モノクローナル抗体１２．３．９、４．８および５．１２．１４により認識されるエピトープとは異なったエピトープに結合する。
ニトロセルロース紙に固定したＩＬ−８に対する抗体の反応性を評価するため、イムノドットブロット分析を実施した。７つの抗体は全て、紙上に固定されたＩＬ−８を認識したが、一方対照のマウスＩｇＧ抗体は認識しなかった。
これらのモノクローナル抗体が可溶性125Ｉ−ＩＬ−８を捕捉する能力を、放射免疫沈降試験（ＲＩＰ）により評価した。簡潔に述べると、トレーサー125Ｉ−ＩＬ−８（４ｘ１０4ｃｐｍ）を、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ（検定緩衝液）０．２ｍｌ中の種々の希釈のモノクローナル抗ＩＬ−８抗体と共に室温で１時間インキュベートした。予め定められた濃度のヤギ抗マウスＩｇ抗血清（ペル−フリーズ、ロジャーズ、ＡＲ）１００μｌを加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。４℃に保たれた６％ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．８０００）０．５ｍｌの添加により免疫複合体を沈澱させた。４℃で２０分間２０００ｘｇで遠心した後、上清を吸引により除去し、ペレットに残存する放射活性をガンマカウンターで計数した。（沈澱したｃｐｍ−バックグラウンドｃｐｍ）／（合計ｃｐｍ−バックグラウンドｃｐｍ）として特異的結合パーセントを算出した。モノクローナル抗体４．１．３、５．２．３、４．８、５．１２．１４および１２．３．９は125Ｉ−ＩＬ−８を極めて有効に捕捉したが、一方抗体９．２．４および８．９．１は、ＥＬＩＳＡプレート上に被覆されたＩＬ−８に結合することができたとしても、ＲＩＰにおいて可溶性125Ｉ−ＩＬ−８を捕捉することはできなかった（第Ｉ表）。
これらのモノクローナル抗体の解離定数を、競合的結合ＲＩＰ検定を用いて決定した。簡潔に述べると、様々な量の非標識ＩＬ−８による、125Ｉ−ＩＬ−８（検定当たり２００００−４００００ｃｐｍ）への各抗体の結合の競合的阻害を、上に記載されたＲＩＰによって測定した。各ｍＡｂの解離定数（親和性）は、ヴァーサターム−ＰＲＯコンピュータープログラム（シナジー・ソフトウェア、リーディング、ＰＡ）中に提供されるスキャッチャードプロット分析（マンソン等、Anal.Biochem.、１０７巻２２０頁（１９８０））を用いて決定した。これらのモノクローナル抗体（９．２．４および８．９．１を除く）のＫdは、２ｘ１０-8ないし３ｘ１０-10Ｍの範囲であった。３ｘ１０-10ＭのＫdを有するモノクローナル抗体５．１２．１４は、試験された全てのモノクローナル抗体の中で最高の親和性を示した（第Ｉ表）。
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これらのモノクローナル抗体がＩＬ−８活性を中和する能力を評価するため、様々な量の培養上清および精製モノクローナル抗体の存在下においてヒト好中球に結合した125Ｉ−ＩＬ−８の量を測定した。好中球はモノ−ポリリゾルヴィングミディアム（Ｍ−ＰＲＭ）（フロー・ラブ．Ｉｎｃ．、マクリーン、ＶＡ）を用いて調製した。簡潔に述べると、新鮮なヘパリン処理したヒト血液を、血液対培地の比が３．５：３．０でＭ−ＰＲＭにロードし、室温下に３００ｘｇで３０分間遠心した。中間層に濃縮された好中球を集め、ＰＢＳで１回洗浄した。このような調製物は普通、ライツ・ギームサ染色によると９５％以上の好中球を含んでいた。レセプター結合検定は以下のように行った。125Ｉ−ＩＬ−８（５ｎｇ／ｍｌ）５０μｌを、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の非標識ＩＬ−８（１００μｇ／ｍｌ）またはモノクローナル抗体５０μｌと共に室温で３０分間インキュベートした。次にこの混合物を、好中球（１０7細胞／ｍｌ）１００μｌと共に３７℃で１５分間インキュベートした。混合物を、２０％シュクロースおよび０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ０．４ｍｌ上にロードし３００ｘｇで１５分間遠心することにより、125Ｉ−ＩＬ−８結合物質を非結合物資から分離した。上清を吸引により除去し、ペレットに付随する放射活性をガンマカウンターで計数した。
モノクローナル抗体４．１．３、５．２．３、４．８、５．１２．１４、および１２．３．９は、ＩＬ−８対ｍＡｂのモル比１：２５において、ヒト好中球に対するＩＬ−８の結合の８５％以上を阻害した。これに反して、モノクローナル抗体９．２．４および８．９．１は、ヒト好中球上のレセプターに対するＩＬ−８の結合を促進するように見えた。対照のマウスＩｇＧもまた好中球へのＩＬ−８の結合を促進したことから、ｍＡｂ９．２．４および８．９．１によるレセプターへのＩＬ−８の結合の促進は、非特異的であると思われる。したがって、モノクローナル抗体４．１．３、５．１．３、４．８、５．１２．１４、および１２．３．９は可能性ある中和モノクローナル抗体であり、一方、モノクローナル抗体８．９．１および９．２．４は非中和モノクローナル抗体である。
ＩＬ−８により誘発される好中球走化性をブロックする抗ＩＬ−８抗体の能力を以下のように試験した。ＩＬ−８により誘発される好中球走化性は、ボイデンチェインバー法（ラーソン等、Science、２４３巻１４６４頁（１９８９））を用いて測定した。０．１％ＢＳＡを含有するＲＰＭＩに再懸濁したヒト好中球（１０6細胞／ｍｌ）１００μｌを上室に入れ、モノクローナル抗体有りまたは無しのＩＬ−８（２０ｎＭ）２９μｌを下室に入れた。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。下室に遊走した好中球をライツ・ギームサ染色により染色し、顕微鏡下に数えた（倍率１００ｘ）。実験群当たりおよそ１０の異なる視野を調べた。中和モノクローナル抗体５．１２．１４および４．１．３は、ＩＬ−８対ｍＡｂの比１：１０においてＩＬ−８の好中球走化活性のほぼ７０％をブロックした。
ファストゲルシステム（ファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いて精製抗体をＩＥＦポリアクリルアミドゲル（ｐＨ３−９、ファルマシア）に適用することにより、各ｍＡｂの等電点電気泳動（ＩＥＦ）パターンを決定した。ＩＥＦゲルは、試料をロードする前に、１％トリトンｘ１００を含有するファーマライト（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で１０分間前処理した。製造者の指示に従い、ＩＥＦパターンを銀染色により可視化した。モノクローナル抗体は全て異なるＩＥＦパターンを持ち、この事は、これらが異なるクローンに起源することを確認するものである。抗体のｐＩ値を第Ｉ表に列挙する。
これらのモノクローナル抗体は全て、ＩＬ−８の（ａｌａ−ＩＬ−８）７７および（ｓｅｒ−ＩＬ−８）７２型の両者に等しく良好に結合した。ＩＬ−８は、β−ＴＧ（ヴァン・ダンメ等、Eur.J.Biochem.、１８１巻３３７頁（１９８９）；タナカ等、FEB、２３６（２）巻４６７頁（１９８８））およびＰＦ４（デュエル等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、７４巻２２５６頁（１９７７））といったような炎症性サイトカインの血小板因子４（ＰＦ４）ファミリーの或る別の成員と、３０％以上の配列相同性を持つため、これらを、β−ＴＧおよびＰＦ４、ならびにもう一つの好中球活性化因子Ｃａ５との交差反応性の可能性について試験した。β−ＴＧに対して僅かな交差反応性を有していたｍＡｂ４．１．３を除いて、これらの蛋白のいずれとも、検出され得る結合は観察されなかった。
この抗体の一つであるｍＡｂ５．１２．１４をさらに研究して、好中球によるエラスターゼのＩＬ−８仲介放出をブロックできるか否かを決定した。簡潔に述べると、ヒト好中球を、１.０％ＢＳＡ、画分Ｖ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）、α−Ｄ−グルコース２ｍｇ／ｍｌ（シグマ）、４．２ｍＭ重炭酸ナトリウム（シグマ）および０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１（ＪＲＨバイオサイエンス、レネキサ、ＫＳ）を含有するハンクス均衡塩溶液（ジブコ、グランドアイランド、ＮＹ）に再懸濁した。サイトカラシンＢ（シグマ）の保存液をジメチルスルホキシド（シグマ）中に調製し（５ｍｇ／ｍｌ）、２−８℃で保存した。サイトカラシンＢを好中球調製物に添加して最終濃度５μｇ／ｍｌとし、３７℃で１５分間インキュベートした。ヒトＩＬ−８を、１ｍｌポリプロピレン管（ＤＢＭサイエンティフィック、サンフェルナンド、ＣＡ）中でｍＡｂ５．１２．１４（２０μｌ）または陰性の対照抗体と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＩＬ−８の最終検定濃度は５０および５００ｎＭであった。モノクローナル抗体を以下の比率となるように希釈した（ＩＬ−８：Ｍａｂ）：１：５０、１：１０、１：２、１：１、および１：０．２５。サイトカラシンＢで処理した好中球を加え（１００μｌ／管）、２５℃で２時間インキュベートした。この管を１０分間遠心し（２１０ｘｇ、２−８℃）、上清を９６ウェル組織培養プレートに移した（３０μｌ／ウェル）。エラスターゼ基質保存液である、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭメトキシスクシニル−アラニル−アラニル−プロピル−バリル−ｐ−ニトロアニリド（カルビオケム、ラジョーラ、ＣＡ）を調製し、２−８℃で保存した。エラスターゼ基質溶液（蒸留水中の、１．２ｍＭ基質、１．２Ｍ ＮａＣｌ（マリンクロット、パリス、ケンタッキー）、０．１２Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２）を上清に加え（１７０μｌ／ウェル）、３７℃で０．５ないし２時間インキュベートした（対照のＯ．Ｄ．が１．０に達するまで）。吸光度を４０５ｎｍで測定した（ＳＬＴ３４０ ＡＴＴＣプレート読み取り機、ＳＬＴラブ・インストゥルメンツ、オーストリア）。
結果を図１に示す。ＩＬ−８対ｍＡｂ５．１２．１４の比１：１において、この抗体は好中球からのエラスターゼの放出を有効にブロックすることができた。
抗体５．１２．１４を産生するハイブリドーマは１９９３年２月１５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライヴ、ロックヴィル、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ１１５５３が割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下になされた。
Ｂ．ウサギＩＬ−８に対するモノクローナル抗体の作製および特性決定
ウサギＩＬ−８に対する抗体を、ウサギＩＬ−８を免疫原として使用し（Ｃ．ブローダスの好意により提供された；ヨシムラ等、J.Immunol.、１４６巻３４８３頁（１９９１）もまた参照されたい）、抗ヒトＩＬ−８抗体と本質上同じ方法で作製した。この抗体を、ＥＬＩＳＡプレート上に被覆された他のサイトカインに対する結合について上記のように特性決定し；ＭＧＳＡ、ｆＭＬＰ、Ｃ５ａ、ｂ−ＴＧ、ＴＮＦ、ＰＦ４、またはＩＬ−１に対する測定可能な結合は見いだされなかった。
抗体６Ｇ４．２．５を産生するハイブリドーマは１９９４年９月２８日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライヴ、ロックヴィル、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ１１７２２が割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下になされた。
５．１２．１４および６Ｇ４．２．５のための組換えヒト−マウスキメラＦａｂを下記のように組み立てた。キメラ６Ｇ．４．２５Ｆａｂは、下記の詳細のようにキメラ５．１２．１４Ｆａｂと比較される。
１．５．１２．１４−Ｆａｂおよび６Ｇ４．２．５−Ｆａｂによるヒト好中球へのＩＬ−８の結合の阻害
二つのキメラＦａｂ、５．１２．１４−Ｆａｂおよび６Ｇ４．２．５−ＦａｂがＩＬ−８と有効に結合しヒト好中球上のＩＬ−８レセプターへのＩＬ−８の結合を防止する能力を、ＩＬ−８結合の５０％阻害を達成するのに要する濃度ＩＣ50の算出を可能にする競合的結合検定を実施することにより、決定した。
ヒト好中球（５ｘ１０5）を、種々の濃度（０ないし３００ｎＭ）の５．１２．１４−Ｆａｂ、６Ｇ４．２．５−Ｆａｂ、イソタイプ対照（４Ｄ５−Ｆａｂ）または非標識ＩＬ−８の存在下に、０．５ｎＭ125Ｉ−ＩＬ−８と共に４℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、燐酸緩衝化食塩水中の２０％シュクロースおよび０．１％牛血清アルブミンの溶液を通して遠心することにより非結合の125Ｉ−ＩＬ−８を除去し、細胞に結合した125Ｉ−ＩＬ−８の量を、ガンマカウンターで細胞ペレットを計数することによって決定した。図２は、非標識ＩＬ−８による、好中球への125Ｉ−ＩＬ−８結合の阻害を立証するものである。図３は、陰性のイソタイプ合致Ｆａｂはヒト好中球への125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害しないことを証明している。抗ＩＬ−８Ｆａｂ、５．１２．１４Ｆａｂ（図４）および６Ｇ．４．２５Ｆａｂ（図５）のいずれも、それぞれ１．６ｎＭおよび７．５ｎＭの平均ＩＣ50でヒト好中球に対する125Ｉ−ＩＬ−８の結合を阻害することができた。
２．５．１２．１４−Ｆａｂおよび６Ｇ４．２．５による、ＩＬ−８仲介好中球走化性の阻害
ヒト好中球を分離し、数え、０．１％牛血清アルブミンを伴うハンクス均衡塩溶液（ＨＢＳＳと略記；カルシウムおよびマグネシウム無し）に５ｘ１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。この好中球を、カルセインＡＭ（モレキュラー・プローブ、ユージン、ＯＲ）を最終濃度２．０μＭで添加することにより標識した。３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞をＨＢＳＳ−ＢＳＡで２回洗浄し、５ｘ１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。
走化性の実験を、ニューロ・プローブ（キャビン・ジョン、ＭＤ）９６ウェルチェインバー、モデルＭＢＢ９６で実施した。実験試料（緩衝液のみの対照、ＩＬ−８単独またはＩＬ−８＋Ｆａｂ）を、下室に入れたポリフィルトロニクス９６ウェルビュープレート（ニューロ・プローブ・Ｉｎｃ．）にロードした。カルセインＡＭ標識した好中球１００μｌを上室に加え、５μｍ孔の無ＰＶＰポリカーボネートフレーム付きフィルター（ニューロ・プローブ・Ｉｎｃ．）を通して下室の試料の方へ遊走させた。次にこの走化性装置を５％ＣＯ2と共に３７℃で４０ないし６０分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、上室に残存する好中球を吸引し、上室をＰＢＳで３回洗浄した。次いでポリカーボネートフィルターをはずし、遊走していない細胞をＰＢＳで湿らせたゴム雑巾で拭い取り、フィルターを１５分間風乾した。
フィルターの蛍光強度および下室の内容物の蛍光強度を測定し、二つの値を加えることによって、フィルターを通って遊走する好中球の相対的数（好中球遊走指数）を決定した。蛍光強度は、４８５−２０ｎｍ励起フィルターおよび５３０−２５発光フィルターを使用し、コーニング９６ウェルプレートを読み取るように配置されたサイトフルオア２３００蛍光プレート読み取り機（ミリポア・Ｃｏｒｐ．、ベッドフォード、ＭＡ）により、３に設定された感度で測定した。
結果を図６および７に示す。図６は、キメラ６Ｇ４．２．５および５．１２．１４ＦａｂによるヒトＩＬ−８仲介好中球走化性の阻害を立証している。図７は、ウサギＩＬ−８仲介好中球走化性を阻害するキメラ６Ｇ４．２．５および５．１２．１４Ｆａｂの相対能力を立証するものである。
３．種々の濃度の６Ｇ４．２．５および５．１２．１４ＦａｂによるＩＬ−８仲介好中球エラスターゼ放出の阻害
健康な男性のドナーから血液をヘパリン添加した注射筒に採血した。好中球を、デキストラン沈降、リンパ球分離媒質（オーガノン・テクニカ、ダーハム、ＮＣ）上での遠心、およびバーマン等（J.Cell Biochem.、５２巻１８３頁（１９９３））により記載のような、混在する赤血球の低張性溶菌によって分離した。最終的好中球ペレットを、１．０％ＢＳＡ（画分Ｖ、シグマ、セントルイス、ＭＯ）、２ｍｇ／ｍｌグルコース、４．２ｍＭ重炭酸ナトリウム、および０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２を添加したハンクス均衡塩溶液（ジブコ、グランドアイランド、ＮＹ）から成る検定緩衝液に１ｘ１０7細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。この好中球は４℃で１時間以内保存された。
ＩＬ−８（１０μｌ）を、１ｍｌのポリプロピレン管に入れた抗ＩＬ−８Ｆａｂ、イソタイプ対照Ｆａｂ、または緩衝液（２０μｌ）と混合し、３７℃の水浴で３０分間インキュベートした。ＩＬ−８は、用量反応研究（図８）では０．０１ないし１０００ｎＭの範囲の最終濃度で、そして、エラスターゼ放出に及ぼすＦａｂの効果を扱う実験（図９および１０）では１００ｎＭの最終濃度で使用した。Ｆａｂの濃度はおよそ２０ｎＭないし３００ｎＭの範囲であり、その結果Ｆａｂ：ＩＬ−８のモル比は０．２：１ないし３：１となった。サイトカラシンＢ（シグマ）を５μｇ／ｍｌの濃度で好中球懸濁液に加え（ＤＭＳＯ中に作成した５ｍｇ／ｍｌ保存溶液を使用）、細胞を３７℃の水浴で１５分間インキュベートした。次に、サイトカラシンＢ処理された好中球（１００μｌ）をＩＬ−８／Ｆａｂ混合物に加えた。室温で３時間インキュベートした後、この好中球を遠心（２００ｘｇで５分間）によってペレット化し、そして無細胞上清のアリコートを９６ウェルプレートに移した（３０μｌ／ウェル）。エラスターゼ基質、メトキシスクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−バリル−ｐ−ニトロアニリド（カルビオケム、ラジョーラ、ＣＡ）をＤＭＳＯ中の１０ｍＭ保存溶液として作成し、４℃で保存した。エラスターゼ基質作業溶液を使用直前に作成し（１．２ｍＭエラスターゼ基質、１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）、１７０μｌを試料を入れた各々のウェルに加えた。プレートを３７℃の組織培養インキュベーターに３０分間または陽性対照の光学密度の読みが少なくとも１．０に達するまで入れた。吸光度はＳＬＴ３４０プレート読み取り機（ＳＬＴラブ・インストゥルメンツ、オーストリア）を用いて４０５ｎｍで測定した。
図９は、ヒトＩＬ−８により刺激されたヒト好中球からのエラスターゼ放出を阻害するキメラ抗ＩＬ−８Ｆａｂの能力を立証し；図１０は、ウサギＩＬ−８により刺激されたヒト好中球からのエラスターゼ放出を阻害するキメラ抗ＩＬ−８Ｆａｂの相対能力を立証するものである。
Ｂ．実験的大腸炎モデル
慢性の実験的大腸炎の最も広く受け入れられているモデルの一つは、モリス等、Gastroenterology、９６巻７９５頁（１９８９）により最近記載された２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）により誘発される損傷である。簡潔に述べると、５０％エタノール０．２５ｍｌ中の１０ないし３０ｍｇのＴＮＢＳの直腸投与は、結腸重量、肉眼的潰瘍、およびミエロペルオキシダーゼ値の用量依存的上昇により証明される急性および慢性の局所的炎症を作り出す。エタノール中高用量のＴＮＢＳ（３０ｍｇ）は、投与後１週間でピークに達するが少なくとも８週間持続する結腸の損傷をもたらす。結腸の炎症には、第一週目の体重減少、１ないし３週間で９０％の動物に下痢、そして近位の拡張を伴う遠位結腸の狭窄が付随するが、致死率はわずか３％である。慢性相においては、炎症は部分に分かれ線状（横行）潰瘍および結腸の著明な肥厚を伴う。経壁性の急性および慢性炎症は、組織学的には、３ないし５週における外筋および漿膜への炎症細胞の浸潤の漸進的増加が注目される。粘膜および漿膜の肉芽腫が、２ないし３週間目に調査された動物の５５％に、そして損傷の４週間またはそれ以上後にはおよそ２０％の動物に存在する。
本発明に係る抗ＩＬ−８抗体がウサギの急性大腸炎を緩和する能力を研究するため、３０％エタノールに入れた１７−３５ｍｇ／ｍｌのトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ／ＥｔＯＨ）５ｍｌを結腸内に点滴注入することにより、ニュージーランドホワイトウサギ（体重１．８−２ｋｇ）に大腸炎を誘発した（モリス等、Gastroenterology、９６巻７９５頁１９８９）の方法により採用）。５羽のウサギを５ｍｇ／ｋｇの６Ｇ４．２．５で静脈内処置した。３羽の対照ウサギにはＰＢＳを与えた。ＴＮＢＳ／ＥｔＯＨで処置した動物を投薬の２４時間後に安楽死させ、ＩＬ−８、ミエロペルオキシダーゼ（多形核白血球またはヘテロフィルの酵素マーカー）、湿潤結腸重量、肉眼的炎症、および組織病理学のレベルについて結腸組織を調べた。結腸の２個の切片をホルマリン中に保存し、常套的ヘマトキシリンおよびエオシン切片用に標準法で処理した。結腸組織を酵素結合イムノアッセイによりＩＬ−８のレベルについて調べた。処置および非処置ウサギ由来の湿潤結腸重量を測定し比較した。浮腫を、１試料当たり３ないし５の部位で、粘膜下組織の厚さとして測定した。白血球の辺縁趨向を、組織切片中どの血管が影響を受けているかを決定することにより、評価した（例えば、固有層にある上皮下の血管のみを含む表在性、から、粘膜下組織の血管を含む著明まで）。壊死の大きさを、壊死が明らかである結腸のパーセントとして測定した。壊死の重篤度を、結腸の壁の中に貫入している壊死の深さとして測定した。肉眼的炎症は、関係している結腸の長さ全体にわたる炎症の重篤度として定義され、腫脹および着色の程度に基づいて視覚的に採点した。白血球の湿潤は、強拡大（ＨＰＦ）で好中球の数を数えることにより決定した（倍率４０ｘ）。単核球の浸潤は、ＨＰＦで単核球の数を数えることにより決定した（倍率４０ｘ）。
炎症を起こしているウサギ結腸組織中へのヘテロフィル（好中球）の流入を、ＭＰＯレベルの測定により監視した（例えば、ブラドレイ等、J.Invest.Dermatol.、７Ｂ巻２０６頁（１９８２）を参照されたい）。簡潔に述べると、結腸の切片を１５ｍｌポリプロピレン管に入れ、６０℃で２時間インキュベートした。この組織を液体窒素で凍結した。乳鉢と乳棒で組織溶菌液の微細粉末を調製し、１５ｍｌポリプロピレン管に移した。この組織試料を、組織ホモジナイザーを使用して、組織１ｇあたり３．５ｍｌの比で０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ）（ｐＨ６の５０ｍＭ ＫＰＯ4緩衝液中０．５％ｗ／ｖ）中に可溶化した。試料を、液体窒素中で凍結し６０℃の水浴中で融解することにより、２回凍結および融解させた。次にこの試料を、２．５出力レベル、５０％効率サイクルで１０秒間超音波処理した。各試料溶菌液を微量遠心管に移し、室温下に１５６００ｘｇで１５分間遠心した。試料を新しい清浄な微量遠心管に移した。各試料７５μｌおよびウェル当たり０．０３単位に希釈したＨＴＡＢ中のヒトＭＰＯ標準陽性対照（カルビオケム・Ｃｏｒｐ．、サンディエゴ、ＣＡ）７５μｌを９６ウェル平底プレートに三重に移した。ＨＴＡＢ７５μｌ（５０ｍＭ ＫＰＯ4緩衝液、ｐＨ６．０中０．５％ｗ／ｖ）を対照標準ブランクとして加えた。１００μｌのＨ2Ｏ2を各ウェルに加えた。９６ウェルプレート内の反応を、サーモマックスオプティカルプレート読み取り機（モレキュラー・ディヴァイシズ・Ｃｏ．、メンロパーク、ＣＡ）で監視した。蒸留水１．０ｍｌ中の乾燥粉末１０ｍｇでＯ−ジアニシジン（シグマ、セントルイス、ＭＯ）の保存溶液を調製し、０．２ミクロンフィルターを通して吸引した。２５μｌを各ウェルに加えた。このプレートをＯＤ４５０ｎｍで３０分間にわたり３−５分間隔で連続的に読み取った。
漸増する用量のＴＮＢＳ／ＥｔＯＨが投与された動物では、偽似処理された対照動物と比較して、増加したレベルのミエロペルオキシダーゼおよびＩＬ−８が検出された。結腸重量の増加および肉眼的炎症もまた明らかであった。組織学的評価により、血管のヘテロフィルの辺縁趨向および罹患組織における浸潤を伴う、腸壁の粘膜壊死が明らかとなった。
しかしながら、抗ＩＬ−８抗体によるウサギの処置は、ＴＮＢＳ／ＥｔＯＨ誘発大腸炎の重篤度を低減した。ＴＮＢＳ／ＥｔＯＨによる大腸炎誘発の直前に５ｍｇ／Ｋｇ静脈内６Ｇ４．２．５で処置された動物の病変は、３羽の対照動物と比較して５羽のうち４羽の動物において緩和された。抗体による処置は、壊死の大きさおよび重篤度、肉眼的炎症、結腸重量、浮腫、ヘテロフィルの辺縁趨向および浸潤を低減した。結腸のミエロペルオキシダーゼおよびＩＬ−８のレベルは著しく低下した。これらの実験の結果を図１１に示す。これらの観察は、大腸炎の緩和における抗ＩＬ−８抗体の有用性を支持するものである。
Ｃ．細菌性肺炎の際の好中球遊走に及ぼす抗ＩＬ−８の効果
好中球は、ストレプトコッカス・ニューモニアエによる感染を包含する様々な刺激に応答して、肺の中に遊走する。本発明に係る抗ＩＬ−８抗体がこのような好中球遊走を阻害し、それにより肺の炎症を緩和できるか否かを決定するために、ウサギ肺炎モデルを使用した。簡潔に述べると、麻酔したニュージーランドホワイトウサギに、抗ウサギＩＬ−８抗体（クローン６Ｇ４．２．５）または対照マウスＩｇＧのいずれか（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）およびコロイド状炭素（５％）と合したストレプトコッカス・ニューモニアエ、エシェリチア・コリ、またはシュードモナス・アエルギノーサ（３ｘ１０9微生物／ｍｌ）を、総容量０．５ｍｌで気管支内点滴注入した。３時間５０分後、肺血流を測定するため、放射標識したミクロスフェアをウサギに静脈内注射した。４時間の時点で心臓および肺を摘出し、肺を分離した。コロイド状炭素により示される肺炎領域（通常は左下葉）および対側の肺の対応領域を燐酸緩衝化食塩水を用いて洗浄した。洗浄液についての総白血球数を血球計算盤を用いて得、ライト染色した細胞遠心調製物について分画計数を行った。
抗ウサギＩＬ−８抗体による処置は、イソタイプ対照マウスＩｇＧで処置した動物と比較して、ＢＡＬ液中に存在する好中球の数を有意に低下させた（図１２）。したがって、抗ＩＬ−８抗体は肺炎の肺における好中球の遊走を有効に低下させる。
Ｄ．マウス５．１２．１４（抗ＩＬ−８）モノクローナル抗体の可変軽および重領域の分子クローニング
チョムチンスキーおよびサッチ（Anal.Biochem.、１６２巻１５６頁（１９８７））により記載の方法を用いて、１ｘ１０8細胞（ハイブリドーマセルラインＡＴＣＣ ＨＢ−１１７２２）から総ＲＮＡを分離した。カッパ軽鎖またはＩｇＧ２ａ重鎖の不変領域をコードしているマウスＲＮＡの領域（これらの領域のＤＮＡ配列は、シークエンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタレスト、Ｅ．Ａ．カバット等（１９９１）、ＮＩＨパブリケーション９１−３２４２、Ｖ１−３に公開されている）とハイブリダイズさせるべく設計された合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてこのｍＲＮＡを特異的にプライミングすることにより、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。プライマーハイブリダイゼーションの機会および第一鎖ｃＤＮＡ合成の効率を高めるため、軽鎖および重鎖の各々のために３個のプライマーを設計した（図１３）。第一鎖ｃＤＮＡの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡへの増幅は、二組の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー：軽鎖可変領域増幅のための１個の前進プライマーおよび１個の逆プライマー（図１４）ならびに重鎖可変領域増幅のための１個の前進プライマーおよび１個の逆プライマー（図１５）、を用いて達成された。５．１２．１４の軽鎖または重鎖いずれかの最初の８個のアミノ酸のＮ末端配列を用いて、この領域に対応する推定的マウスＤＮＡ配列を作成した。（エドマン分解蛋白配列決定技術を用いて、軽鎖および重鎖可変領域両方のＮ末端から、合計２９のアミノ酸を配列決定した。）この情報を用いて、天然マウスＤＮＡコドンへのプライマーのハイブリダイゼーションの機会を拡大するよう、幾つかのコドンの第三位が変性されており、そしてさらに、軽鎖可変領域前進プライマーおよび重鎖可変領域前進プライマーの両者にとってクローニングベクター中のＳＴII要素の３'末端へのライゲーションが容易になるような、特異な制限部位ＭｌｕＩを含む、前進増幅プライマーを設計した。逆増幅プライマーは、可変／不変接合部付近の軽鎖または重鎖の不変領域の一部に対応するマウスＤＮＡ配列とアニーリングするよう設計した。ベクターｐＢ１３．１（軽鎖）およびｐＢ１４（重鎖）中のヒトＩｇＧ１不変軽領域またはＩｇＧ１不変重領域のいずれかの５'末端へのライゲーションのため、軽鎖可変領域の逆プライマーは特異なＢｓｔＢＩ制限部位を含み、重鎖可変領域の逆プライマーは特異なＡｐａＩ制限部位を含んでいた。これらのプライマーの組を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、およそ４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成した。５．１２．１４をコードしているｃＤＮＡの軽鎖可変領域をベクターｐＢ１３．１にクローニングしてｐＡ５１２１４ＶＬを形成させ、５．１２．１４重鎖可変領域をベクターｐＢ１４にクローニングしてｐＡ５１２１４ＶＨを形成させた。ｃＤＮＡ挿入物をＤＮＡ配列決定により特性決定し、図１６（マウス軽鎖可変領域）および図１７（マウス重鎖可変領域）に示す。
Ｅ．５．１２．１４Ｆａｂベクターの組み立て
最初の組み立て物ｐＡ５１２１４ＶＬにおいて、５．１２．１４マウス軽鎖可変配列の末端と、ヒトＩｇＧ１不変軽鎖配列中の特異なクローニング部位ＢｓｔＢＩとの間のアミノ酸は、マウスＩｇＧ１不変領域の最初の１３アミノ酸に対応するマウス起源のものである（図１６）。故に、このプラスミドは、５．１２．１４マウス軽鎖可変領域とヒト軽鎖ＩｇＧ１不変領域とを分離する、マウス不変領域の余分な部分を含んでいた。この介在する配列は、このキメラのアミノ酸配列を変え、誤って折り畳まれたＦａｂの産生が最も起こりそうである。この問題は、Ａ１０９の後ろでこのｃＤＮＡクローンを直接末端切除し、ポリメラーゼ連鎖反応によりＢｓｔＢＩ部位を可変／不変接合部に再度位置させることによって処理された。図１８は、これらの修飾を施すために使用された増幅プライマーを示している。前進プライマーＶＬ．ｆｒｏｎｔは、ＭｌｕＩクローニング部位を含むＳＴIIシグナル配列の最後の５アミノ酸、および５．１２．１４マウス軽鎖可変配列の最初の４アミノ酸に合うように設計した。この配列は、最初の二つのコドンＤ１（ＴからＣ）およびＩ２（ＣからＴ）の第３位で元のｃＤＮＡから変化させられて特異なＥｃｏＲＶクローニング部位を作り出し、これが後の組み立てに使用された。逆プライマーＶＬ．ｒｅａｒは、ヒトＩｇＧ１不変軽鎖配列の最初の３アミノ酸、および、特異なＢｓｔＢＩクローニング部位を含む５．１２．１４軽鎖可変配列の最後の７アミノ酸に合うように設計された。ＢｓｔＢＩ部位を付加する工程において、幾つかのアミノ酸をコードしているヌクレオチド配列が変えられた：アルギニンへの同類置換を産むＬ１０６（ＴＴＧがＣＴＴに）、Ｋ１０７（ＡＡＡがＣＧＡに）、およびＲ１０８（ＣＧＧがＡＧＡに）。次に、修飾された５．１２．１４軽鎖可変配列をコードしているＰＣＲ生成物を、二部ライゲーションでｐＢ１３．１にサブクローニングした。軽鎖可変領域をコードしているＭｌｕＩ−ＢｓｔＢＩ消化された５．１２．１４ＰＣＲ生成物をＭｌｕＩ−ＢｓｔＢＩ消化されたベクター中にライゲーションして、プラスミドｐＡ５１２１４ＶＬ'を形成させた。この修飾されたｃＤＮＡをＤＮＡ配列決定により特性決定した。５．１２．１４軽鎖のためのコード化配列を図１９に示す。
同様に、重鎖可変領域の末端と、ｐＡ５１２１４ＶＨのヒトＩｇＧ１重鎖不変ドメイン中の特異なクローニング部位ＡｐａＩとの間のＤＮＡ配列を再組み立てし、この領域のアミノ酸をマウスからヒトへと変化させた。これはポリメラーゼ連鎖反応によって行った。マウス５．１２．１４重鎖可変配列の増幅を図１８に示されるプライマーを用いて達成した。前進ＰＣＲプライマーは、ＳＴIIシグナル配列の上流のｐＡ５１２１４ＶＨのヌクレオチド８６７−８８７および重鎖可変領域をコードしている推定的ｃＤＮＡ配列に合うように設計され、特異なクローニング部位ＳｐｅＩを含んでいた。逆ＰＣＲプライマーは、５．１２．１４重鎖可変配列の最後の４アミノ酸、および、特異なクローニング部位ＡｐａＩをも含むヒトＩｇＧ１重鎖不変配列に対応する最初の６アミノ酸に合うように設計された。次に、この修飾された５．１２．１４重鎖可変配列をコードしているＰＣＲ生成物を、発現プラスミドｐＭＨＭ２４．２．２８に二部ライゲーションでサブクローニングした。ベクターをＳｐｅＩ−ＡｐａＩで消化し、重鎖可変領域をコードしているＳｐｅＩ−ＡｐａＩ消化５．１２．１４ＰＣＲ生成物をそれにライゲーションして、プラスミドｐＡ５１２１４ＶＨ'を形成させた。この修飾されたｃＤＮＡをＤＮＡ配列決定により特性決定した。５．１２．１４重鎖のためのコード化配列を図２０に示す。
ｐＡ５１２１４ＶＨ'をＥｃｏＲＶおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化し、ＥｃｏＲＶ−Ｂｐｕ１２０２ＩフラグメントをｐＡ５１２１４ＶＬ'のマウス５．１２．１４軽鎖可変領域をコードしているＥｃｏＲＶ−Ｂｐｕ１１０２Ｉフラグメントに置き換えることによって、５．１２．１４のキメラＦａｂをコードしている第一の発現プラスミドｐａｎｔｉＩＬ−８．１を作成した。したがって得られたプラスミドは、５．１２．１４の軽鎖および重鎖両方のマウス−ヒト可変／不変領域を含んでいた。
ｐａｎｔｉＩＬ−８．１を用いたＦａｂ発現の予備的な分析は、軽鎖および重鎖は細胞内で産生されるが、極めて少量が大腸菌の周辺腔に分泌されることを示した。この問題を是正するため、第二の発現プラスミドを組み立てた。
第二の発現プラスミドｐａｎｔｉＩＬ−８．２は、ベクターとしてプラスミドｐｍｙ１８７を用いて組み立てられた。プラスミドｐａｎｔｉＩＬ−８．２を、ｐｍｙ１８７をＭｌｕＩおよびＳｐｈＩで消化することにより作成し、ｐａｎｔｉＩＬ−８．１のマウス５．１２．１４マウス−ヒトキメラＦａｂをコードしているＭｌｕＩ（部分的）−ＳｐｈＩフラグメントをそれにライゲーションした。したがって得られたプラスミドは、５．１２．１４の軽鎖および重鎖両方のマウス−ヒト可変／不変領域を含んでいた。
プラスミドｐａｎｔｉＩＬ−８．２は、１９９５年２月１０日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローンドライヴ、ロックヴィル、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受理番号ＡＴＣＣ９７０５６が割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダベスト条約およびその規則（ブダベスト条約）の規定の下になされた。
Ｆ．マウス６Ｇ４．２．５モノクローナル抗体の可変軽および重領域の分子クローニング
チョムチンスキーおよびサッチ（Anal.Biochem.、１６２巻１５６頁（１９８７））により記載の方法を用いて１ｘ１０8細胞（ハイブリドーマセルライン６Ｇ４．２．５）から総ＲＮＡを分離した。カッパ軽鎖またはＩｇＧ２ａ重鎖の不変領域をコードしているマウスＲＮＡの領域（これらの領域のＤＮＡ配列は、シークエンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタレスト、カバット等（１９９１）、ＮＩＨパブリケーション９１−３２４２、Ｖ１−３に公開されている）とハイブリダイズさせるべく設計された合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてこのｍＲＮＡを特異的にプライミングすることにより、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。プライマーハイブリダイゼーションの機会および第一鎖ｃＤＮＡ合成の効率を高めるため、軽鎖および重鎖の各々のために３個のプライマーを設計した（図２１）。第一鎖ｃＤＮＡの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡへの増幅は、二組の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー：軽鎖可変領域増幅のための１個の前進プライマーおよび１個の逆プライマー（図２２）ならびに重鎖可変領域増幅のための１個の前進プライマーおよび１個の逆プライマー（図２３）、を用いて達成された。６Ｇ４．２．５の軽鎖または重鎖いずれかの最初の８個のアミノ酸のＮ末端配列を用いて、この領域に対応する推定的マウスＤＮＡ配列を作成した。（エドマン分解蛋白配列決定技術を用いて、軽鎖および重鎖可変領域両方のＮ末端から、合計２９のアミノ酸を配列決定した。）この情報を用いて、天然マウスＤＮＡコドンへのプライマーのハイブリダイゼーションの機会を拡大するよう、幾つかのコドンの第三位が変性されており、そしてさらに、ベクターｐｃｈｉｍＦａｂ中のＳＴII要素の３'末端へのライゲーションを容易にさせるための、軽鎖可変領域前進プライマーのための特異な制限部位ＮｓｉＩ、および重鎖可変領域前進プライマーのための特異な制限部位ＭｌｕＩを含む、前進増幅プライマーを設計した。逆増幅プライマーは、可変／不変接合部付近の軽鎖または重鎖の不変領域の一部に対応するマウスＤＮＡ配列とアニーリングするよう設計した。ベクターｐｃｈｉｍＦａｂのヒトＩｇＧ１不変軽領域またはＩｇＧ１不変重領域のいずれかの５'末端へのライゲーションのため、軽鎖可変領域の逆プライマーは特異なＭｕｎＩ制限部位を含み、重鎖可変領域の逆プライマーは特異なＡｐａＩ制限部位を含んでいた。これらのプライマーの組を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、およそ４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成し、ベクターｐｃｈｉｍＦａｂ中に個別にクローニングして、ｐ６Ｇ４２５ＶＬおよびｐ６Ｇ４２５ＶＨが形成された。ｃＤＮＡ挿入物をＤＮＡ配列決定により特性決定し、図２４（マウス軽鎖可変領域）および図２５（マウス重鎖可変領域）に示す。
Ｇ．６Ｇ４．２．５キメラＦａｂベクターの組み立て
最初の組み立て物ｐ６Ｇ４２５ＶＬにおいて、６Ｇ４．２．５マウス軽鎖可変配列の末端と、ヒトＩｇＧ１不変軽鎖配列中の特異なクローニング部位ＭｕｎＩとの間のアミノ酸は、マウス起源のものである。これらのアミノ酸は、キメラＦａｂが正しい折り畳みができるよう、ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列と適合していなくてはならない。二つのマウスアミノ酸Ｄ１１５およびＳ１２１はヒトＩｇＧ１不変ドメインのβ鎖のループに見いだされるアミノ酸とは劇的に異なっており、これらを、図２６に示されるプライマーを用いる位置指定突然変異生成により、正しいヒトアミノ酸残基Ｖ１１５およびＦ１２１に変換した。これらの特異的突然変異はＤＮＡ配列決定によって確認され、修飾されたプラスミドはｐ６Ｇ４２５ＶＬ'と命名された。コード化配列を図２７に示す。
同様に、重鎖可変領域の末端と、ｐ６Ｇ４２５ＶＨのヒトＩｇＧ１重鎖不変ドメイン中の特異なクローニング部位ＡｐａＩとの間のＤＮＡ配列を再組み立てし、この領域のアミノ酸をマウスからヒトへと変化させた。この工程は、重鎖可変領域の末端付近のＢｓｔＥII部位の発見により容易となった。この部位およびＡｐａＩ部位は、対応するＩｇＧヒトアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの合成断片の付加に使用された。図２６Ｂに示される合成オリゴヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡの２７ｂｐ断片の形成が可能となるよう、互いの相補物として設計された。プラスミドｐ６Ｇ４２５ＶＨは、ベクター配列内にさらなるＢｓｔＥII部位を持っているため、この組み立ては三部ライゲーションとして行われた。ＭｌｕＩ−ＡｐａＩで消化されたｐ６Ｇ４２５ＶＨの５３０９ｂｐフラグメントを、６Ｇ４．２．５重鎖可変領域を有する３８８ｂｐフラグメントおよびヒトＩｇＧ１不変領域の最初の６アミノ酸をコードしている２７ｂｐ合成ＤＮＡフラグメントにライゲーションして、プラスミドp６Ｇ４２５ＶＨ'を形成させた。この合成ＤＮＡ断片の挿入をＤＮＡ配列決定により確認した。このコード化配列を図２８に示す。
ｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍＶＬ'をＭｌｕＩおよびＡｐａＩで消化してＳＴII−マウスＨＰＣ４重鎖可変領域を除去し、それを、ｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍＶＨ'のＳＴII−マウス６Ｇ４．２．５重鎖可変領域をコードしているＭｌｕＩ−ＡｐａＩフラグメントに置き換えることによって、６Ｇ４．２．５のキメラＦａｂをコードしている発現プラスミドｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍ２を作成した。したがって得られたプラスミドは、６Ｇ４．２．５の軽鎖および重鎖両方のマウス−ヒト可変／不変領域を含んでいた。
プラスミドｐ６Ｇ４２５ｃｈｉｍ２は、１９９５年２月１０日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローンドライヴ、ロックヴィル、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受理番号ＡＴＣＣ９７０５５が割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下になされた。
配列表
（１）  一般的情報：
（ｉ）  出願人：ジェネンテク・インコーポレイテッド
インディアナ・ユニバーシティ
（ii）  発明の名称：炎症性疾患の処置のための抗ＩＬ−８モノクローナル抗体
（iii）  配列の数：５８
（iv）  連絡先：
（Ａ）  宛名：ジェネンテク・インコーポレイテッド
（Ｂ）  通り：ポイント・サン・ブルノ・ブールバード４６０番
（Ｃ）  市：サウス・サン・フランシスコ
（Ｄ）  州：カリフォルニア
（Ｅ）  国：アメリカ合衆国
（Ｆ）  ＺＩＰ：９４０８０
（ｖ）  コンピューター解読書式：
（Ａ）  媒体型：５．２５インチ，３６０Ｋbフロッピーデイスク
（Ｂ）  コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ適合
（Ｃ）  オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）  ソウトウエア：Patin（ジェネンテク）
（vi）  本出願のデータ：
（Ａ）  出願番号：
（Ｂ）  出願日：
（Ｃ）  分類：
（Vii）  優先権主張出願のデータ：
（Ａ）  出願番号：０８／２０５８６４
（Ｂ）  出願日：１９９４年３月３日
（viii）  弁理士／代理人  情報：
（Ａ）  氏名：フィッツ，レニー・エイ
（Ｂ）  登録番号：３５，１３６
（Ｃ）  参照／整理番号：８７４Ｐ１ＰＣＴ
（ix）  電話連絡先情報：
（Ａ）  電話番号：４１５／２２５−１４８９
（Ｂ）  ファックス番号：４１５／９５２−９８８１
（Ｃ）  テレックス：９１０／３７１−７１６８
（２）  配列番号１の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１：
0003780315.tif 000003
（２）  配列番号２の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２：
0003780315.tif 000004
（２）  配列番号３の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２３塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３：
0003780315.tif 000005
（２）  配列番号４の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４：
0003780315.tif 000006
（２）  配列番号５の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５：
0003780315.tif 000007
（２）  配列番号６の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号６：
0003780315.tif 000008
（２）  配列番号７の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３５塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号７：
0003780315.tif 000009
（２）  配列番号８の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３５塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号８：
0003780315.tif 000010
（２）  配列番号９の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３５塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号９：
0003780315.tif 000011
（２）  配列番号１０の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３７塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１０：
0003780315.tif 000012
（２）  配列番号１１の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１１：
0003780315.tif 000013
（２）  配列番号１２の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１２：
0003780315.tif 000014
（２）  配列番号１３の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１３：
0003780315.tif 000015
（２）  配列番号１４の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１４：
0003780315.tif 000016
（２）  配列番号１５の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１５：
0003780315.tif 000017
（２）  配列番号１６の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１６：
0003780315.tif 000018
（２）  配列番号１７の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１７：
0003780315.tif 000019
（２）  配列番号１８の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１８：
0003780315.tif 000020
（２）  配列番号１９の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３６９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号１９：
0003780315.tif 000021
（２）  配列番号２０の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：１２３アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２０：
0003780315.tif 000022
（２）  配列番号２１の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：４１７塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２１：
0003780315.tif 000023
（２）  配列番号２２の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：１３０アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２２：
0003780315.tif 000024
（２）  配列番号２３の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３１塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２３：
0003780315.tif 000025
（２）  配列番号２４の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３１塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２４：
0003780315.tif 000026
（２）  配列番号２５の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２１塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２５：
0003780315.tif 000027
（２）  配列番号２６の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３３塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２６：
0003780315.tif 000028
（２）  配列番号２７の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：７１４塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２７：
0003780315.tif 000029
（２）  配列番号２８の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２３８アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２８：
0003780315.tif 000030
（２）  配列番号２９の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：７５６塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号２９：
0003780315.tif 000031
（２）  配列番号３０の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２５２アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３０：
0003780315.tif 000032
（２）  配列番号３１の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３１：
0003780315.tif 000033
（２）  配列番号３２の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３２：
0003780315.tif 000034
（２）  配列番号３３の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２３塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３３：
0003780315.tif 000035
（２）  配列番号３４の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３４：
0003780315.tif 000036
（２）  配列番号３５の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３５：
0003780315.tif 000037
（２）  配列番号３６の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３６：
0003780315.tif 000038
（２）  配列番号３７の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３７塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３７：
0003780315.tif 000039
（２）  配列番号３８の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３７塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３８：
0003780315.tif 000040
（２）  配列番号３９の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３７塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号３９：
0003780315.tif 000041
（２）  配列番号４０の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３５塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４０：
0003780315.tif 000042
（２）  配列番号４１の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４１：
0003780315.tif 000043
（２）  配列番号４２の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４２：
0003780315.tif 000044
（２）  配列番号４３の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４３：
0003780315.tif 000045
（２）  配列番号４４の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４４：
0003780315.tif 000046
（２）  配列番号４５の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４５：
0003780315.tif 000047
（２）  配列番号４６の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４６：
0003780315.tif 000048
（２）  配列番号４７の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３９１塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４７：
0003780315.tif 000049
（２）  配列番号の４８情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：１３１アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４８：
0003780315.tif 000050
（２）  配列番号４９の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：４０５塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号４９：
0003780315.tif 000051
（２）  配列番号５０の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：１３５アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５０：
0003780315.tif 000052
（２）  配列番号５１の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５１：
0003780315.tif 000053
（２）  配列番号５２の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３８塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５２：
0003780315.tif 000054
（２）  配列番号５３の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：３１塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５３：
0003780315.tif 000055
（２）  配列番号５４の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５４：
0003780315.tif 000056
（２）  配列番号５５の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：７２９塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５５：
0003780315.tif 000057
（２）  配列番号５６の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２４２アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５６：
0003780315.tif 000058
（２）  配列番号５７の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：７６２塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５７：
0003780315.tif 000059
（２）  配列番号５８の情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２５３アミノ酸
（Ｂ）  型：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（xi）  配列：配列番号５８：
0003780315.tif 000060
【図１】
0003780315.tif 000061
【図２】
0003780315.tif 000062
【図３】
0003780315.tif 000063
【図４】
0003780315.tif 000064
【図５】
0003780315.tif 000065
【図６】
0003780315.tif 000066
【図７】
0003780315.tif 000067
【図８】
0003780315.tif 000068
【図９】
0003780315.tif 000069
【図１０】
0003780315.tif 000070
【図１１Ａ】
0003780315.tif 000071
【図１１Ｂ】
0003780315.tif 000072
【図１１Ｃ】
0003780315.tif 000073
【図１１Ｄ】
0003780315.tif 000074
【図１１Ｅ】
0003780315.tif 000075
【図１１Ｆ】
0003780315.tif 000076
【図１１Ｇ】
0003780315.tif 000077
【図１１Ｈ】
0003780315.tif 000078
【図１１Ｉ】
0003780315.tif 000079
【図１１Ｊ】
0003780315.tif 000080
【図１２】
0003780315.tif 000081
【図１３】
0003780315.tif 000082
【図１４】
0003780315.tif 000083
【図１５】
0003780315.tif 000084
【図１６】
0003780315.tif 000085
【図１７】
0003780315.tif 000086
【図１８】
0003780315.tif 000087
【図１９】
0003780315.tif 000088
【図２０Ａ】
0003780315.tif 000089
【図２０Ｂ】
0003780315.tif 000090
【図２１】
0003780315.tif 000091
【図２２】
0003780315.tif 000092
【図２３】
0003780315.tif 000093
【図２４】
0003780315.tif 000094
【図２５】
0003780315.tif 000095
【図２６】
0003780315.tif 000096
【図２７Ａ】
0003780315.tif 000097
【図２７Ｂ】
0003780315.tif 000098
【図２８Ａ】
0003780315.tif 000099
【図２８Ｂ】
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