(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
4′ガラクトシルラクトースを配合したことを特徴とする乳幼児向け消化管感染防御用栄養組成物。
【請求項２】
4′ガラクトシルラクトースを、固形分100g あたり0.1mg〜5g 配合した請求項１記載の乳幼児向け消化管感染防御用栄養組成物。
【請求項３】
4′ガラクトシルラクトースが、乳から分離調製されたものである請求項1または2記載の乳幼児向け消化管感染防御用栄養組成物。
【請求項４】
4′ガラクトシルラクトースが、乳糖または乳糖含有組成物にβガラクトシダーゼおよび／またはβグルコシダーゼを作用させて糖転移反応により調製されたものである請求項1または2記載の乳幼児向け消化管感染防御用栄養組成物。
【請求項５】
4′ガラクトシルラクトースが、微生物菌体を用いて調製されたものである請求項1または2記載の乳幼児向け消化管感染防御用栄養組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オリゴ糖含有消化管感染防御用栄養組成物（以下、消化管感染防御栄養組成物という）、特に、４′ガラクトシルラクトースを配合した消化管感染防御栄養組成物に関する。本発明のオリゴ糖含有消化管感染防御栄養組成物は、これを摂取することにより、乳幼児や児童等の消化管の感染防御に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの母乳（以下母乳という）は、オリゴ糖の宝庫といわれ、現在までに１３０種以上のオリゴ糖が存在することが報告されている。一方、牛乳の糖質は、ほとんどが乳糖で占められており、母乳に比較してオリゴ糖としての種類も量も著しく少ないことが知られている。従って、通常の牛乳を原料として製造される乳幼児用栄養組成物には実質的にオリゴ糖は含まれていない。このため、これまで６′ガラクトシルラクトースやシアリルラクトースを配合することで、乳児用栄養組成物の成分ならびに機能を母乳に近づける努力がなされてきた。またビフィズス菌を増やすというオリゴ糖の機能に着目して、母乳には含まれないオリゴ糖成分、例えばフラクトオリゴ糖やラクチュロースなどを添加した育児用調製粉乳や、その他の栄養組成物の製造も行われている。さらにその他様々な食品や飲料に種々のオリゴ糖が配合され、利用されている。しかし、乳児にとって最良の栄養源は母乳であることから、乳幼児用の食品は、母乳中に存在する成分を配合することにより、その機能も母乳に近づけることが望ましい。ただしそのためには、母乳中に存在するオリゴ糖成分を明らかにすると共に、これらオリゴ糖の生理機能を解明することが必要である。
【０００３】
母乳中のこれらオリゴ糖の乳児生体内における機能については不明な点が多く、その機能の解明が待たれている。解明されている機能としては、例えば６′ガラクトシルラクトースは乳児の腸管内においてビフィズス菌を特異的に増加させることが知られており、またシアリルラクトースは消化管において、例えば病原性大腸菌による感染やコレラトキシンによる下痢を防ぐ効果のあることが知られている。さらに、母乳中に存在するオリゴ糖成分の多くが、細胞表層に存在する複合糖質の糖鎖と同一の構造を持つことから、母乳オリゴ糖は、乳児の体内において細胞間の情報伝達あるいは免疫系の発達にも関与しているものと推測されている。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】
上記したように、母乳中のオリゴ糖成分やその機能について、一部明らかにされつつあるが、しかしまだ全容が明らかになっているわけではなく、むしろ不明な点が多い。本発明は、このような技術的現状に鑑みてなされたものであり、乳幼児にとって最良の栄養源である母乳を特徴づける成分であるオリゴ糖に着目し、研究を進めた結果、母乳中に新規なオリゴ糖を見出し、この新規なオリゴ糖の生理活性効果についての機能を明らかにすると共に、乳幼児用栄養組成物に付与したものである。すなわち、本発明は、母乳中に存在するオリゴ糖成分を乳幼児用栄養組成物に配合することで、成分組成ならびに機能を母乳に近づけた乳幼児用消化管感染防御栄養組成物を提供することを課題とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、４′ガラクトシルラクトースを配合したことからなる消化管感染防御栄養組成物である。また、本発明は、４′ガラクトシルラクトースを、固形分１００g あたり０．１mg〜５g 配合した上記の消化管感染防御栄養組成物である。また、本発明は、４′ガラクトシルラクトースが、乳から分離調製されたものである上記の消化管感染防御栄養組成物である。また、本発明は、４′ガラクトシルラクトースが、乳糖または乳糖含有組成物にβガラクトシダーゼを作用させて糖転移反応により調製されたものである上記の消化管感染防御栄養組成物である。また、本発明は、４′ガラクトシルラクトースが、微生物菌体を用いて調製されたものである上記の消化管感染防御栄養組成物である。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の消化管感染防御栄養組成物は、特に、乳児用として調製された調製乳、蛋白質分解乳、フォローアップミルク、特殊栄養調製乳あるいは幼児用として調製された離乳食や食品であって、またこれらの乾燥粉末化された粉乳類や離乳食が好適である。しかし、その他、児童が摂取するアイスクリーム、発酵乳、ゼリー等の一般食品であってもよい。また消化管感染防御栄養組成物の形態としては、固形状、液状、粉体状あるいはゲル状等の使用しやすい形態であればいずれであってもよい。
【０００７】
本発明で消化管感染防御栄養組成物に配合するオリゴ糖は、Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースで示される４′ガラクトシルラクトースと呼ばれる公知のオリゴ糖で、本発明者らが母乳中に存在することを始めて見出したものである。そして、この４′ガラクトシルラクトース（以下オリゴ糖という）の生理効果を把握するために検討を行った結果、消化管における感染防御機能を有することが、後述する試験例から明らかにすることができた。
【０００８】
このオリゴ糖の調製は、母乳や動物乳例えば牛、ヤギ、ヒツジ等の乳から単離して調製する方法、または動植物あるいは微生物由来の酵素を乳糖に作用させて糖移転反応により調製する方法、さらには微生物菌体等を利用して調製する方法等がある。母乳や動物乳から単離して調製する方法は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ４を用いたゲルろ過クロマトグラフィやＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡー１（Ｄｉｏｎｅｘ社製）カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィを用いたり、母乳あるいは動物乳を透析し、さらにこの透析外液を活性炭カラムクロマトグラフィ、アミノカラムクロマトグラフィ等に供することによっても単離することができる。また、動植物あるいは微生物由来の酵素を乳糖または乳糖含有組成物に作用させて糖移転反応により調製する方法は、例えば、アスペルギルス  オリゼ(Aspergillus oryzae)、バチルス  サーキュランス(Bacillus circulans)、またはサッカロマイセス  ラクティス（Saccharomyces lactis） 等の動植物由来、または微生物由来のβガラクトシダーゼ、あるいはアーモンド由来のβグルコシダーゼ等の酵素を用いることができる。これらの酵素を固形率が５〜６０％の乳糖含有溶液に添加して、５〜６５℃において１〜２４時間程度作用させて糖移転反応により得ることができる。さらに、微生物菌体を利用して調製する方法については、クリプトコッカス  ラウレンティ(Cryptococcus laurentii ) 等の微生物菌体や固定化菌体を利用して調製する方法が知られている（戸羽隆宏，Ｊｐｎ．Ｊ．ＤａｉｒｙＦｏｏｄ  Ｓｃｉ．，３４，１６９−１８２，１９８５：小澤修，別冊フードケミカル−４，１１５−１２２，１９９０）。この方法は、乳糖、ホエー、脱脂乳あるいは全乳等の乳製品を原料に、上記の菌体を５〜６５℃において１〜２４時間作用させるものである。上記のようにして調製したオリゴ糖は、その製造工程の任意の段階で他の原材料あるいは製品に配合することができる。さらに、製造工程の任意の段階で微生物、動物あるいは植物由来のβガラクトシダーゼを作用させて、または微生物菌体を利用して、目的のオリゴ糖を生産させてもよい。また、上記の調製方法によって得られたオリゴ糖を精製する必要がある場合は、ゲルろ過法、膜ろ過法、イオン交換樹脂法、電気透析法等の一つ以上で処理してもよい。上記のように調製された４′ガラクトシルラクトースからなるオリゴ糖は、本発明の消化管感染防御栄養組成物の固形分１００g あたり０．１mg〜５g 、好ましくは、５mg〜５g 配合する。配合量が０．１mg以下であると、目的とする生理効果が認められず、一方、５g 以上になると、オリゴ糖の難消化性に起因する下痢症状の発生率が高くなるという問題がある。
【０００９】
本発明の消化管感染防御栄養組成物は、蛋白質、糖質、脂質、ビタミン類およびミネラル類を主成分として構成されるが、これらの成分と共に上記の方法によって得られたオリゴ糖が配合される。本発明の感染防御栄養組成物を構成する蛋白質は、脱脂乳、カゼイン、チーズホエー、ホエー蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエー蛋白質分離物（ＷＰＩ）等の乳蛋白質や、これらの分画物であるαs-カゼイン、β−カゼイン、α−ラクトアルブミンおよびβ−ラクトグロブリン等であり、また卵黄蛋白質、卵白蛋白質、オボアルブミン等の卵蛋白質、あるいは脱脂大豆蛋白質、分離大豆蛋白質、濃縮大豆蛋白質等の大豆蛋白質を挙げることができる。また、これら以外の、例えば、小麦グルテン、魚肉蛋白質、畜肉蛋白質、コラーゲン等の蛋白質を用いてもよい。さらにはこれらの蛋白質の分画物や酸または酵素で処理したペプチドあるいは遊離アミノ酸であってもよい。遊離アミノ酸は、窒素源としての他に、特定の生理作用を付与するために用いることもでき、これらの遊離アミノ酸としては、タウリン、シスチン、システイン、アルギニン、グルタミン等を挙げることができる。蛋白質やペプチドあるいは遊離アミノ酸の配合量は、固形分あたり５〜３０重量％である。また糖質としては、上記の４′ガラクトシルラクトースを必須成分として配合し、これにその他の糖質として、デンプン、可溶性多糖類、デキストリン、ショ糖、乳糖、麦芽糖、ブドウ糖や果糖等の単糖類、さらに６′ガラクトシルラクトース、フラクトオリゴ糖、ラクチュロースなどのその他のオリゴ糖を挙げることができ、これらの糖類の中からいずれか１種以上を配合する。糖質の配合量は、消化管感染防御栄養組成物の固形分あたり、４０〜８０重量％配合することが好ましい。また、用途によっては、アスパルテームのような人工甘味料を用いることができる。この人工甘味料の配合量は、固形分あたり０．０５〜１．０重量％が適当である。
【００１０】
脂質としては、乳脂肪、ラード、牛脂および魚油等の動物性油脂、大豆油、菜種油、コーン油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、サフラワー油、エゴマ油、アマニ油、月見草油、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）および綿実油等の植物性油脂、更にはこれらの分別油、水添油、エステル交換油のいずれか１種以上用いることができる。脂質は、栄養組成物の固形分あたり、４０重量％以下配合することが好ましい。しかし、栄養組成物の用途によっては無脂肪とすることもできる。また、ビタミンとミネラルについては、「日本国際酪農連盟発行、乳幼児食品を含む特殊用途食品のＣＯＤＥＸ規格及び関連衛生作業規則、CAC/VOL.IX- 第１版及びSupplement 1,2,3,4 (1993) 」、「食品と科学社発行、1993年版指定品目食品添加物便覧（改訂第３１版）(1993)」および「食品と科学社発行、届け出制食品添加物・食品素材天然物便覧（第１２版）(1992)」に記載されているビタミン類およびミネラル類のうち栄養組成物に使用可能なものの中からいずれか１種以上用いることができる。ビタミン類の具体例としては、ビタミンＡ、Ｂ類、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ類、葉酸、パントテン酸、β−カロチン、ニコチン酸アミド、カルニチン、コリン、イノシトール、ビオチン等を挙げることができ、ビタミン類の総配合量としては、栄養組成物の固形分あたり、１０mg〜５g 重量％が好ましい。またミネラル類については、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、銅、亜鉛、リン、塩素、マンガン、セレン、ヨウ素等であって、ミネラル類の総配合量として栄養組成物の固形分あたり、１mg〜５g 重量％配合されることが好ましい。尚、本発明の消化管感染防御栄養組成物は、上記の成分の他に、栄養組成物に配合することが可能ないかなる成分、例えば、食物繊維、ヌクレオチドのような核酸、フレーバー類、着色料等を含んでいてもよい。
【００１１】
以下、試験例により本発明の効果を確認すると共に、実施例を示し具体的に説明する。
【試験例】
【試験例１】
（オリゴ糖の調製）乳糖２kgを１０kgの温湯に溶解し、これに６００Ｕのバチルス  サーキュランス(Bacillus circulans)由来のβガラクトシダーゼを加え、４０℃で２０時間反応させた後、１２０℃で３秒間加熱殺菌して酵素を失活させ、清澄化して、約１２kgのオリゴ糖含有溶液を得た。この溶液を、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ４（Biorat社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィ（１０×２００ｃｍ）に供してオリゴ糖画分を回収し、さらに、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡー１カラム（Dionex社製）に、２５mMＮａＯＨ条件下で通液して、オリゴ糖をカラムに吸着させた後、１００mMＮａＯＨで溶出し、４′ガラクトシルラクトースを回収した。さらに、これをＤｏｗｅｘ  ５０Ｗ（Ｈ+ 型）の樹脂（ Dowex社製）１Ｌが充填されているカラムに通液し、脱塩・中和した。このオリゴ糖溶液を凍結乾燥、粉砕して、４′ガラクトシルラクトースからなる純粋なオリゴ糖粉末８００g を得た。尚、４′ガラクトシルラクトースの純度は、リクロゾル部−ＮＨ2(Cica-Merk 社製) を用いた高速液体クロマトグラフィーによる面積法 [日本食品工業学会誌第36巻  第4 号326頁 (1989)]により測定した。
（調製粉乳の調製）牛乳４８kgに乳清蛋白質（ＷＰＣ）１．４８kgと乳糖６．２４kgを添加溶解し、これに水溶性ビタミン類、およびミネラル類を０．１２kg添加溶解した。さらに脂溶性ビタミン類を溶解した調製脂肪を４．０kg混合して均質化した後、常法に従って、殺菌、濃縮、乾燥し、粉乳１７．４kgを得た。
（試験乳の調製）上記でそれぞれ調製したオリゴ糖粉末と調製粉乳を混合して、オリゴ糖含有量が、それぞれ固形分１００g あたり、０、０．１、５０、５００、１０００、３０００、５０００mgになるように両者を混合した。また、各試験乳の糖質含有量が等しくなるように、乳糖をそれぞれ固形分１００g あたり６．０、６．０、５．９５、５．５、５．０、３．０、１．０g ずつ添加混合した。これらの調製粉乳を、固形率１３重量％になるように温湯に溶解し、試験乳１〜７とした。このそれぞれの試験乳１００mlあたりのオリゴ糖含有量は、０、０．０１３、６．５０、６５．０、１３０、３９０、および６５０mgであった。
（大腸菌付着阻止確認試験）カニクイザル３５頭を７群に分け、上記で調製した試験乳１〜７をそれぞれ連続して１０日間与え、１１日目に糞便を回収した。糞便１g （湿重量）をホモゲナイザーを用いてリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５mlに懸濁した後、遠心分離により沈澱を除去し、水溶性画分を回収した。この水溶性画分とイーグル培地を１：９の割合で混合した溶液に、ハートインフュージョン培地で培養した病原性大腸菌タイプ０５５株（ATCC12014）とタイプ０１１１ab(ATCC29552) を１０8 個／mlとなるように懸濁し、室温で１時間放置した。この大腸菌懸濁液を、イーグル培地中で継代培養したヒト小腸由来株４０７株に加え、３０℃で１時間静置した。その後、大腸菌懸濁液と細胞を分離し、細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、メタノールで固定した後、ギムザ染色し、顕微鏡下で細胞４０７株に付着している大腸菌数を計測した。各試料について、細胞５０個ずつを計測し、その平均値をもって付着菌数とし、付着率Ａにより評価した。その結果を表１に示す。尚、付着率Ａは次式で求めた。
Ａ（％）＝ＸS ／ＸC ×１００
ＸC ：コントロール（糞便画分無添加）の付着菌数
ＸS ：各試料の付着菌数
【００１２】
【表１】
0003789146.tif 000002
【００１３】
表１から明らかなように、オリゴ糖含有調製乳で飼育した群の糞便水溶性画分は、オリゴ糖を配合しない調製乳で飼育した群に比較して、大腸菌の細胞への付着率が低く、阻害効果があることが判る。感染は、病原菌やウィルスが宿主細胞に付着することから始まるが、病原菌やウィルスの細胞付着を阻止できれば、感染を防ぐことができる。従って、本試験例により、４′ガラクトシルラクトースを経口的に摂取すると、消化管における大腸菌の感染を防御できることが明らかとなった。
【００１４】
【実施例】
【実施例１】
（オリゴ糖の調製）脱脂した母乳２００Ｌを濃縮し、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ４を用いたゲル濾過クロマトグラフィ（１０×２００ｃｍ）に供した。さらに得られたオリゴ糖画分を、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡー１カラム（Dionex社製) に２５mMＮａＯＨ条件下で通液してオリゴ糖を吸着させ、１００mMＮａＯＨで吸着したオリゴ糖を溶出させた。この溶液をＤｏｗｅｘ  ５０Ｗ（Ｈ+ 型）の樹脂１Ｌが充填されているカラムに通液し、脱塩・中和した。このようにして得たオリゴ糖溶液を凍結乾燥、粉砕して、４′ガラクトシルラクトースからなる純粋なオリゴ糖粉末１．２g を得た。
（オリゴ糖含有育児用調製粉乳の製造）脱脂乳５．０４kgに、乳清蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）を１５８g と乳糖を９２４g 添加溶解した。これに水溶性ビタミン類（ビタミンＢ1 、Ｂ2 、Ｂ6 、Ｂ12、Ｃ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、コリン、イノシトール）およびミネラル類（炭酸カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、硫酸銅、硫酸亜鉛）をそれぞれ７．５g 添加溶解し、さらに脂溶性ビタミン類（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、β−カロチン）を溶解した調製脂肪を５７８g 添加・混合した。これを均質化し、常法に従って殺菌処理した後、濃縮・乾燥して、調製粉乳２．１kgを得た。得られた調製粉乳に上記で調製したオリゴ糖粉末を添加・混合して、固形分１００g あたり５５mgのオリゴ糖を含有する育児用調製粉乳を得た。
【００１５】
【実施例２】
（オリゴ糖の調製）ウシ初乳１０，０００Ｌを脱脂し、さらに濃縮した後、上記実施例１と同様にクロマト処理し、凍結乾燥、粉砕して、４′ガラクトシルラクトースからなる純粋なオリゴ糖１０g を得た。
（オリゴ糖含有育児用調製粉乳の製造）乳清蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）８８０g と乳糖５．２kgを、２０kgの温湯に溶解し、さらに牛乳７．５kg、および所定量のアルカリで溶解したカゼイン４９０gを加えた。これに水溶性ビタミン類、およびミネラル類( いずれも実施例１に同じ）をそれぞれ７５g 並びに上記で調製したオリゴ糖粉末１０g を添加溶解し、さらに脂溶性ビタミン類（実施例１に同じ）を溶解した調製脂肪２．５kgを添加・混合した。これを均質化し、常法に従って殺菌処理した後、濃縮・乾燥して、固形分１００g あたり１００mgのオリゴ糖を含有する育児用調製粉乳を１０kg得た。
【００１６】
【実施例３】
（オリゴ糖の調製）乳糖１０kgを５０kgの温湯に溶解し、これに４０００Ｕのバチルス  サーキュランス(Bacillus circulans)由来のβガラクトシダーゼを加え、４０℃で２０時間反応させた後、１２０℃で３秒間加熱殺菌して酵素を失活させ、清澄化して約６０kgのオリゴ糖含有溶液を得た。この溶液は、４′ガラクトシルラクトースからなるオリゴ糖３．５kgと乳糖５．５kg、単糖１．０kgを含有していた。
（オリゴ糖含有育児用調製粉乳の製造）乳清蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）９．４kgと乳糖４７kgを、３００kgの温湯に溶解し、さらに所定量のアルカリで溶解したカゼイン７．１kgを加えた。これに水溶性ビタミン類、およびミネラル類( いずれも実施例１に同じ）をそれぞれ１kgを添加・溶解し、さらに脂溶性ビタミン類（実施例１に同じ）を溶解した調製脂肪２７．４kgと上記で調製したオリゴ糖含有溶液５０kgを加えて混合した。これを均質化し、常法に従って殺菌処理した後、濃縮・乾燥して、固形分１００g あたり２．９g のオリゴ糖を含有する育児用調製粉乳を１００kg得た。
【００１７】
【実施例４】
（ヨーグルトの調製）全粉乳１．０kgを５．０kgの温湯に溶解し、これにアルギン酸カルシウムで固定化したクリプトコッカス  ラウレンティ(Cryptococcus laurentii)菌体を加え、４５℃で１２時間攪拌反応させ、４′ガラクトシルラクトースからなるオリゴ糖を産生させた。清澄化により菌体を除去し、１２０℃で３秒間殺菌した。これにラクトバチルス  ブルガリクス(Lactbacillus bulgaricus) とストレプトコッカス  サーモフィラス(Streptococcus  thermophilus) をスターターとして接種して、５００ml容の容器に分注し、常法によりヨーグルトを製造した。このヨーグルトのオリゴ糖含有量は、製品固形分あたり１．５重量％であった。
【００１８】
【発明の効果】
従来の乳幼児用栄養組成物は、牛乳を原料として調製したものであるため、４′ガラクトシルラクトースからなるオリゴ糖を実質的に含有していなかった。本発明は、母乳中に４′ガラクトシルラクトースからなるオリゴ糖が含有されていることを始めて見出し、かつこのオリゴ糖の生理活性効果を確認して乳幼児用栄養組成物に配合しているため、組成および機能をより母乳に近づけることが可能となった。すなわち本発明のオリゴ糖含有乳幼児用消化管感染防御栄養組成物は、消化管における感染を防御することが可能となり、母乳栄養児と同様の良好な発育に寄与する消化管感染防御栄養組成物となった。