(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y又はScから選択される金属のイオンにより錯体化された、
式
【化１】
0003850870.tif 000012
の化合物又は医薬上許容されるその塩である錯体。
【請求項２】
金属イオンが153Sm、166Ho、90Y、149Pm、159Gd、140La、177Lu、175Yb、47Sc、又は142Prである請求項１の錯体。
【請求項３】
金属イオンが153Sm、166Ho、90Y又は177Luである請求項１の錯体。
【請求項４】
抗体又は抗体断片に、請求項１〜３のいずれかの錯体をアミノ基を介して共有結合させることにより形成された結合体。
【請求項５】
抗体又は抗体断片がモノクロナール抗体又はその断片である請求項４の結合体。
【請求項６】
医薬上許容されるキャリアーとともに請求項４又は５の結合体を含む医薬配合剤。
【請求項７】
式
【化２】
0003850870.tif 000013
の化合物又は医薬上許容されるその塩。
【発明の詳細な説明】
本発明は腫瘍選択性抗体に放射性金属イオンを結合するのに有用な新規の電荷変性キレート化剤に関する。
官能化キレート又は二官能性コーディネーターはガン又は腫瘍細胞エピトープ又は抗体に結合することができることで知られている。このような抗体／キレート結合体の放射性核種の錯体は、放射性核種をガン又は腫瘍細胞に輸送する手段として診断及び／又は治療用途に有用である。例えば、MearesらのAnal.Biochem.,124,68〜78(1984);及びKrejcarekらのBiochem.and Biophys.Res.Comm.,77,581〜585(1977)を参照されたい。
金属イオンの抗体のようなタンパク質への結合は、抗体に共有結合した。ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）（米国特許第4,479,930号及び第4,454,106号）又はエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）（米国特許第4,662,420号）のカルボキシメチル化アミン誘導体のような非環式キレートによる錯体化により達成されてきた。このような非環式錯体は、しかし、酸誘導された脱錯体化又は血清中のカルシウム又は亜鉛による競争的なキレート結合のいずれかの結果としてインビボで不安定である傾向がある。安定性の欠如は健康な組織（例えば、骨髄）に細胞毒性的な影響を有する、錯体化されていない金属原子を体内にもたらす。
抗体のラベリングのための非環式キレートの使用の代わるのはマクロ環状リガンドの使用である。診断又は治療用途のための、特定のマクロ環状二官能性キレート化剤及びその銅キレート結合体の使用は米国特許第4,678,667号及びMoiらのInorg.Chem.,26,3458〜3463(1987)中に開示されている。アミンカルボン酸官能基の、残りの二官能性キレート分子への結合は、環状ポリアミン主鎖の環炭素を通して結合されている。このように、片方の末端で環状ポリアミンの環炭素と結合した結合剤は、そのもう片方の末端でタンパク質と反応性することができる官能基とも結合されている。
診断及び治療用における使用のための二官能性キレート化剤として作用することができるテトラアザ環状分子は1990年8月16日の公開特許出願第0 382 582号に記載されている。環のアミンから出ている少なくとも1つの側鎖は燐酸エステルである。結合基はテトラアザマクロ環状分子の環炭素に結合している。
米国特許第4,994,560号はポリアミンを含む二官能性キレート化剤に錯体化したロジウムを開示しており、ここで、ポリアミンキレート化剤はポリアザマクロ分子であることができ、ここで、結合基はポリアミンのいずれか1つの炭素又は窒素原子に共有結合している。このようなポリアミンはロジウム（III）と顕著に不活性な錯体を形成するが、ランタニド（III）金属イオンの放射性キレート化に適切でない。
銅及びランタニド（III）金属イオンと不活性錯体を形成することができ、且つ、抗体と結合することができるカルボキシメチル化テトラマクロ環状分子は記載されている［WO 87/05030,WO 89/04176,及びMoiらのJ.Am.Chem.Soc.,110,6266(1988)］。公開PCT特許出願第WO 89/02788号は多数の第二アミン基がカルボキシメチル化されている二官能性キレート化剤を記載している。
本発明はカルボキシメチル化環状マクロ分子を提供し、ここで、カルボキシレートの少なくとも1又は2個はカルボキシアミドで置換されている。これらのキレート化剤は抗体結合性であり、ランタニド及び動的に不活性である他の置換不安定な金属イオンと錯体を形成する。抗体結合体の代謝時に、これらのキレートは急速な全体の体のクリアランスを示し、そして、特定の場合には、予想に反して、より低い傾向の骨中での吸収率を有する。より低い骨の吸収率は、より低い毒性の放射性医薬となることが期待される。このキレートは、また、急速にキレート-タンパク質結合体を形成する。
本発明は金属イオン、特に稀土類型の化学的性質を有する［放射性］金属イオンと錯体を形成する新規の二官能性キレート化剤に関する。このように形成された錯体は抗体又は抗体断片と共有結合して結合体を形成することができ、そして治療及び診断用の目的で使用されることができる。錯体及び/又は結合体はインビボ又はインビトロの使用のために調製されうる。調製された結合体の好ましい用途は、動物、特に人間のガンの処置である。
病気の状態、例えば、ガンの診断及び/又は処置のための非放射性金属を含む本発明の錯体及び/又は結合体の使用も可能である。例えば、蛍光免疫誘導療法の議論のためにK.PetterssonらのClinical Chemistry,29,60〜64(1983)及びC.MearesらのAcc.Chem.Res.,17,202〜209(1984)を参照されたい。
より詳細には、本発明は式
0003850870.tif 000002
（式中、各Qは独立に、水素、(CHR5)pCO2R;又は(CHR5)pC(O)N(R6)2であり、但し、少なくとも1個のQは(CHR5)pC(O)N(R6)2であり;
Rは各場合に独立に水素、ベンジル又はC1-4アルキルであり;
各R5は独立に水素、C1-4アルキル又は-(C1-2アルキル)フェニルであり;
各R6は独立に水素、C1-9アルキル又は-(C1-2アルキル)フェニルであり;
X及びYは各々独立に水素であるか、又は、隣接のＸ及びＹとともにアルケン又はアルキンを生じるように別の炭素-炭素結合を形成してよく;
nは0又は1であり;
mは0〜10の整数であり;
pは1又は2であり;
rは0又は1であり;
但し、X及び/又はYが別の炭素-炭素結合を形成するときにnは1だけであり;
R2及びR4は独立に水素、アミノ、イソチオシアナト、セミカルバジド、チオセミカルバジド、マレイミド、ブロモアセトアミド又はカルボキシルであり;
R3はC1-4アルコキシ、-OCH2CO2H、ヒドロキシ又は水素であり;
但し、R2及びR4は両方ともは水素であることができないが、R2及びR4のうちの片方は水素でなければならない。）の化合物又は医薬上許容されるその塩に関する。
ここで使用されるときに、「アルキル」という用語は直鎖又は分枝鎖アルキルを意味する。
本発明は稀土類型金属イオン錯体、特に放射性の中性又は荷電性の稀土類型金属イオン錯体及び上記の錯体と抗体又は抗体断片で形成された結合体に関する。「放射性」という用語は核から粒子及び/又は電磁放射線を放射する金属イオンを意味する。アミド変性側鎖の使用はカルボキシル化側鎖を含む従来技術で知られるキレート化剤と比較して、アミド変性側鎖を含むキレート化剤が、よりゆるやかな条件下で、タンパク質、例えば、抗体と結合しうるという点で有利である。結合体の急速な形成は治療及び/又は診断の目的での放射性化合物の製造において重要である。
1個のアミド変性側鎖を含む本発明のキレート化剤は従来技術で既知のキレート化剤、例えば、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸及びその二官能性誘導体よりも骨中への吸収の傾向を有することも分かった。
更に、本発明は本発明の結合体及び医薬上許容されるキャリアーを有する配合剤、特に医薬上許容されるキャリアーが液体である配合物をも含む。本発明は、哺乳動物の病気の状態、特にガンの診断又は処置の方法をも含み、この方法は配合剤の有効量を哺乳動物に投与することを含む。「哺乳動物」という用語は特に人間を含む。
ここで使用されるときに、「キレート化剤」という用語は金属イオンをキレート化する又は分離することができる化合物を意味する。「キレート」という用語はキレート化又は分離した金属イオンを有するキレート化剤を意味する。
「二官能性キレート化剤」という用語は金属イオンをキレート化することができる部分と、生体分子に共有結合する手段として作用するように活性化又は官能化されることができる、キレート部分に共有結合したリンカー/スペーサー部分とを有する化合物を意味する。
「生体分子」という用語は、特定の生体標的サイトを認識するように機能するあらゆるタンパク質、抗体、抗体断片、ホルモン、抗原又はハプテンを意味する。このような生体分子は官能化されたキレートと結合されたときに、結合した金属イオンを特定の標的組織に輸送するように機能する。好ましくは、生体物質は抗体又は抗体断片である。
ここで使用されるときに、「抗体」という用語はあらゆるポリクロナール、モノクロナール、キメラ抗体又は異種抗体、好ましくはモノクロナール抗体を意味する。「抗体断片」という用語はFab断片及びF(ab')2断片、並びに、所望のエピトープに特異性を有する抗体のあらゆる部分を含む。
「結合体」という用語は、ここで使用されるときに、二官能性キレート化剤又は二官能性キレートに結合した生体物質の錯体を意味する。「抗体/キレート結合体」という用語は二官能性キレート（即ち、キレート化された金属イオンを有する二官能性キレート化剤）と共有結合した抗体を意味する。
本発明の二官能性キレート化剤と錯体を形成しうる金属は、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y及びScを含む。好ましい放射性稀土類金属イオンは153Sm、166Ho、90Y、149Pm、159Gd、140La、177Lu、175Yb、47Sc、及び142Prを含む。興味のある他の放射性金属イオンは47Sc、99mTc、186Re、188Re、97Ru、105Rh、109Pd、197Pt、67Cu、198Au、199Au、67Ga、68Ga、111In、113mIn、115mIn、117mSn、及び212Pb/212Biである。「金属イオン」という言葉とともに「放射性」という用語が使用されるときに、それは粒子及び/又はプロトンを発することができる稀土類金属の1種以上の同位体、例えば、153Sm、166Ho、90Y、149Pm、159Gd、140La、177Lu、175Yb、47Sc、及び142Prを意味する。
ここで使用されるときに、「医学上又は医薬上許容される塩」とは、哺乳類動物の治療又は診断において有用であるために充分に無毒性である、式(I)の化合物のあらゆる塩を意味する。このように、塩は本発明に有用である。有機又は無機の源から標準的な反応により形成される塩の代表例は、例えば、硫酸、塩酸、塩素酸、燐酸、酢酸、琥珀酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、パルミチン酸、コール酸、パルモイン酸（palmoic）、粘液酸、グルタミン酸、d-しょうのう酸、グルタル酸、グリコール酸、フタル酸、酒石酸、蟻酸、ラウリン酸、ステアリン酸、脂環式酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、安息香酸、ケイ皮酸及び他の適切な酸を含む。有機又は無機の源から標準的な反応により形成される塩、例えば、アンモニウム塩、アルカリ金属イオン塩、アルカリ金属土類塩、及び他の同様の塩をも含む。特に好ましいのは塩が塩化物、又は、酢酸塩のアニオン緩衝塩又はその混合物である、式(I)の化合物の塩である。
式(I)の好ましい化合物は、次式に示すように、X及びYが各々Hであり、そしてrが0である化合物
0003850870.tif 000003
（式中、各Qは独立に水素、(CHR5)pCO2R;又は(CHR5)pC(O)N(R6)2であり、但し、少なくとも1個のQは(CHR5)pC(O)N(R6)2であり;
Rは各場合に独立に水素、ベンジル又はC1-4アルキルであり;
mは0〜5の整数であり;
pは1又は2であり;
R2及びR4は独立に水素、アミノ、イソチオシアナト、セミカルバジド、チオセミカルバジド、カルボキシル、ブロモアセトアミド又はマレイミドであり;
R3はC1-4アルコキシ、-OCH2CO2H、ヒドロキシ又は水素であり;
各R5は独立に水素又はC1-4アルキルであり;
各R6は独立に水素、C1-9アルキル又は-(C1-2アルキル)フェニルであり;
但し、R2及びR4は両方ともは水素であることができないが、R2及びR4のうちの片方は水素でなければならない。）又は医学上許容されるその塩を含む。
ここに記載される二官能性キレート化剤［式(I)又は(II)のいずれかにより表される］は、金属イオンキレート（ここで錯体とも呼ばれる）を形成するようにして、稀土類型金属イオン、特に放射性稀土類型金属イオンをキレート化する、又は分離するために使用されうる。錯体は、官能化部分［式(I)又は(II)中、「R2」又は「R4」として表される］の存在のために、官能化されたキャリアー、例えば、官能化されたポリマーキャリアーに結合することができ、又は、好ましくはタンパク質、より詳細には抗体又は抗体断片と共有結合することができる。このように、ここに記載される錯体（稀土類金属イオン、特に放射性の稀土類金属イオンと錯体化された式I又はIIにより表される）は抗体又は抗体断片と共有結合することができ、そして、ここで、「結合体」と呼ばれる。
ここに記載の結合体に使用されうる抗体又は抗体断片は当業界によく知られる技術により製造されうる。高度に特異的なモノクロナール抗体は当業界によく知られる複合化技術により製造されうる。例えば、Kohler及びMilstein［Nature,256,495〜497(1975)及びEur.J.Immunol.,6,511〜519(1976)］を参照されたい。このような抗体は、通常、高度に特異的な反応性を有する。放射性金属イオン結合体において、あらゆる所望の抗原又はハプテンに向かう抗体は使用されうる。好ましくは、放射性金属イオン結合体中に使用される抗体は所望のエピトープに高度に特異性を有するモノクロナール抗体又はその断片である。本発明において使用される抗体は、例えば、腫瘍、バクテリア、真菌、ウィルス、寄生虫、マイコプラズマ、分化及び他の細胞膜抗原、病原体表面抗原、トキシン、酵素、アレルゲン、薬及び他の生体活性物質に向かうことができる。抗体及び抗体断片の幾つかの例は、CC-11、CC-46、CC-49、CC-49F(ab')2、CC-83、CC-83F(ab')2及びB-72.3［CC-49、CC-83及びB72.3抗体に関してはD.ColcherらのCancer Res.,48,4597〜4603(1988年8月15日)を参照されたい。］ヒブリドーマ細胞系B72.3はAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、寄託番号HB8108である。種々のCC抗体は1989年1月26日に公開の国際公開第WO89/00692号及び1990年5月3日に公開の第WO90/04410号に開示されている。他のネズミのモノクロナール抗体は腫瘍関連抗原、TAG-72のエピトープに結合する。抗原のより完全なリストは米国特許第4,193,983号に見られ、これを引用によりここに取り入れる。本発明の放射性金属イオン結合体は種々のガンの診断及び処置に特に好ましい。
本発明のキレート化剤により金属イオンをキレート化する方法は、当業界でよく知られている。金属イオンは、キレート化剤もしくは二官能性キレート化剤を放射性核種の溶液に加えることによりキレート化剤もしくは二官能性キレート化剤と錯体化されうる。キレートはpH1〜10で水性溶液中において混合したときに容易に形成される。好ましくは、反応はpH5〜7の媒体中で行われる。20〜27℃の周囲温度は金属イオンのキレート化に進んで使用されうる。使用される金属イオンの量はトレース量からキレートと等モル量を越える量でありうる。
本発明の結合体は、好ましくは、先ずキレートを形成させ、そしてその後、抗体又は抗体断片を結合させることにより製造される。このように、本方法はリガンドを調製すること又は得ること、金属との錯体を形成させること、そしてその後、抗体を加えることを含む。別には、ラベリングした抗体結合体を製造する方法は、先ず、二官能性キレート化剤の抗体への結合を行うこと、そして次いで放射性核種BFCラベリングした抗体を生じるようにキレート化することを含む。本発明の結合体の形成をもたらすいかなる適切な方法も本発明の範囲である。
アミド変性側鎖を含む本発明のキレート化剤は、ゆるやかな条件で、カルボキシル化側鎖のみを含むキレート化剤より急速に抗体と結合することが発見された。急速な結合は、短い結合時間が放射線分解の量を減じ、そして副生成物、例えば、抗体凝集体及びキレート劣化生成物の形成を減じるという点で治療及び/又は診断のための放射性結合体を製造するのに有利である。
本発明の結合体及び特定の場合には本発明の錯体は配合剤として使用されてもよい。この配合剤は、抗体及び/又は金属イオンを含む式(I)の化合物、及び、医学上許容されるキャリアー、又は付形剤を含む。このように、この配合剤は医学的に許容されるキャリアーと錯体（金属イオン+リガンド）、結合体（金属イオン+リガンド+抗体）又は（リガンド+抗体）とからなることができる。このような配合剤の製造方法はよく知られる。この配合剤は懸濁液、注入溶液又は他の適切な医薬配合剤の形であってよい。補助剤を含む、又は含まない医薬上許容される懸濁媒体は使用されてよい。
本発明の配合剤はリガンドと錯体化した活性放射性核種を含む固体又は液体の形である。これらの配合剤は2成分（即ち、リガンド及び金属、錯体及び抗体、又はリガンド/抗体及び金属）が使用前の適切な時間で混合されるようにキットの形であることができる。予備混合されても、又はキットとしてであっても、配合剤は、通常、医学上許容されるキャリアーを必要とする。
本発明の注入可能な組成物は懸濁液の形であっても、又は溶液の形であってもよい。適切な配合剤の製造において、一般に、塩の水溶性は酸の形よりも塩の形のほうが大きいことが認識されるであろう。このようなキャリアーは適切な溶剤、必要ならばベンジルアルコールのような保存剤及び緩衝剤を含む。有用な溶剤は、例えば、水、水性アルコール、グリコール、燐酸もしくは炭酸エステルを含む。このような水性溶液は体積基準で50%以下の有機溶剤を含む。
注入可能な懸濁液は、補助剤を含む、又は含まない、キャリアーとして液体懸濁媒体を必要とする本発明の組成物である。懸濁媒体は、例えば、水性ポリビニルピロリドン、不活性油、例えば、植物油もしくは高度に精製された鉱油、又は水性カルボキシメチルセルロースであることができる。医学上許容される補助剤は、懸濁液中に錯体を維持するために必要ならば、増粘剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギン酸塩の中から選択されうる。多くの界面活性剤も懸濁剤として有用であり、例えば、レシチン、アルキルフェノール、ポリエチレンオキシド付加物、ナフタレンスルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルである。
液体懸濁液媒体の親水性、密度及び表面張力に影響を与える多くの物質は、個々の場合において、注入可能な懸濁液を製造する際に補助しうる。例えば、シリコーン消泡剤、ソルビトール及び砂糖は全て懸濁剤として有用である。
配合剤の「有効量」は治療のために使用される。投与量は処置される病気により変化するであろう。インビトロでの診断は本発明の配合剤により行われうるが、インビボでの診断も考えられる。本発明の結合体及び配合剤は、また、放射線免疫誘導外科（RIGS）に使用されうるが、この目的のために使用されうる他の金属は99mTc、111In、113mIn、67Ga及びGa68を含む。
本発明の幾つかのキレートの用途は、磁気共鳴画像、例えば、式(I)の錯体、特に式(VI)のGd+3との錯体、種々の目的でのポリマー支持体上への結合、例えば、診断剤としてのポリマー支持体上への結合、及び選択抽出によるランタニド金属又は擬ランタニド金属イオンの除去を含む。
二官能性リガンドのタンパク質への共有結合を可能にする、12員環マクロ環状分子（例えば、遊離塩基マクロ環状分子、1,4,7,10-テトラアザシクロデカン）へのリンカー部分を付加するための合成経路はChengらの1989年6月2日出願の米国特許出願第07/370,956号に開示されており、この開示をここに引用により取り入れる。一般に、この方法は、モノ-N-官能性ポリアザマクロ環状分子を生じるように、ポリアザマクロ環状分子を約1〜3当量の適切な求電子種（例えば、あらゆる適切な置換α-ハロカルボン酸エステル）とをプロトン移動を促進させない溶剤中で反応させることを含み、このことは米国特許第5,064,956号に開示されており、その開示を引用によりここに取り入れる。
出発物質として使用される置換α-ハロ酸エステルの製造は当業界でよく知られる。1つのアプローチは現場で生じるハロゲン化酸の塩素化又は臭素化を含み、例えば、D.N.Harppら、J.Org.Chem.,40,3420〜27(1975)に記載されている。このアプローチは反応性ベンジル基を含みうるアルカノール酸の排他的なα-ハロゲン化を可能にする。ハロゲン化酸を置換するための一般的な方法は有機酸と塩化チオニル又は塩化スルフリルの反応を含み、例えば、E.SchwenkらのJ.Amer.Chem.Soc.,70,3626〜27(1944)に記載されている。両方の方法はよく市販されている遊離カルボン酸を利用する。
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカンのようなポリアザ環状分子はT.J.RichmanらのOrg.Synthesis,58,86〜98(1978)のように、当業界に既知の方法により製造されうる。
モノ-N-官能性マクロ環状分子のカルボキシル化はブロモ酢酸誘導体及び適切な塩基を使用してDesreuxの方法により行われうる［J.F.Desreux,Inorg.Chem.,19,1319〜24(1980)］。
ブロモ酢酸のベンジル又は優先的にはt-ブチルエステルを使用すべきである。というのは、生成物を含む得られるエステルはシリカゲルクロマトグラフィーを使用して精製されるからである。重要なことには、精製後の不安定なエステルの除去はアミド官能基を保存するゆるやかな条件で鉱酸（30〜40℃の塩酸）での加水分解により行われる。驚くべきことに、類似のメチルエステル5はアミド基を失うことなしに加水分解されることができなかった。
ポリアザマクロ環状分子へのアミド側鎖の付加は、適切な有機溶剤、例えば、クロロホルム中でα-ハロアミドとポリアザマクロ環状分子を反応させることにより行われうる。α-ハロアミドの製造手順は、通常、第一又は第二アミンをハロゲン化α-ハロ酸と反応させることを含み、当業界によく知られる。
本発明の化合物を製造するために必要な全ての出発物質は市販により入手可能であるか、又は既知の文献の記載から製造されうる。
Q基のうちの１つがカルボキシアミドである、本発明のキレート化合物剤を製造する一般的な合成手順はスキーム1に与えた通りである。示した条件により1種類のみの化合物が示されているが、式(I)中、r=0又は1、n=0又は1、そしてm=0〜10である他の同様な部分もこの方法で製造されうる。
0003850870.tif 000004
次のスキーム2において、Q基のうちの2個がカルボキシアミドである式(I)の化合物は製造される。示した条件により1種類のみの化合物が示されているが、式(I)中、r=0又は1、n=0又は1、そしてm=0〜10である他の同様な部分もこの方法で製造されうる。
0003850870.tif 000005
放射性核種は幾つかの方法で製造されうる。核反応器中で核種は中性子により衝撃され、放射性核種を生じる。例えば、
Sm+中性子→Sm+ガンマ
放射性核種を得るための別の方法はリニアアクセレーター又はサイクロン中で粒子により核種を衝撃することである。更に別の方法は分裂生成物の混合物から放射性核種を単離することである。本発明に使用される核種を得る方法は重要ではない。
本発明は次の実施例を考察することにより更に明らかになるであろう。それらは本発明の純粋な例示が意図される。
用語
BFC=二官能性キレート化剤
DTPA=ジエチレントリアミンペンタ酢酸
HEPES=N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸
HPLC=高速液体クロマトグラフィー
IRMA=免疫放射線メトリックアッセイ（immuno-radio-metric assay）
PA-DODADA=1,4,7,10-テトラアザ-1-N-（1-カルボキシ-3（4-アミノフェニル）プロピル）-7-N-（1-カルボキシメチル）-ビス-4,10-N,N-（カルボキシアミドメチル）シクロドデカン
PA-DOTA=1-［2-（4-アミノフェニル）エチル］-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸
PA-DOTAMA=1,4,7,10-テトラアザ-1-N-（1-カルボキシ-3（4-アミノフェニル）プロピル）-ビス-4,7-N,N-（カルボキシメチル）-10-N-（カルボキシアミドメチル）シクロドデカン
PBS=ホスフェート緩衝サリン（120mMのNaCl、2.7mMのKCl及び10mMのホスフェートを含む、pH7.4）
SCN=イソチオシアナト
TLC=薄層クロマトグラフィー
一般実験
質量スペクトルはVG ZAB-MS高解像質量スペクトロメーター（特に指示がないかぎり、ジチオエリトリトール/ジチオトレイトールのマトリックスを使用した、キセノンによる陽イオン高速原子衝撃-「マジックボレット」）で得られた。1H及び13C NMRスペクトルはVarian VXR-300スペクトロメーターを使用して得られた。赤外スペクトル(IR)はNicolet SSX FT/IR又はBeckman Acculab装置上で記録された。
元素分析は、主要なクロマトグラフィー生成物に関して、特に指示がないかぎり更なる精製を行わないで報告され、それらはPerkin Elmer 2400 CHNアナライザーを使用することにより決定された。全ての試料は、分析直前に一晩真空乾燥（50〜60℃、10mm）された。使用した全ての溶剤はHPLCグレードであり、それらは更なる精製なしに使用された。有機化合物の全ての調製のクロマトグラフィーは文献（Stil,C.W.;Kahn,M;Mitra,A.,J.Org.Chem.,1978,43,pp.2923〜2624）（Merk Grade 60,230〜400メッシュシリカゲル、60A-Aldrich Chemical Co.）に記載のフラッシュクロマトグラフィー技術を使用することにより、特に指示がないかぎり次の溶剤系を使用して行われた。
1)溶剤系1:
クロロホルム
メタノール
濃水酸化アンモニウム
2/2/1のv/v比
2)溶剤系2:
クロロホルム
メタノール
濃水酸化アンモニウム
12/4/1のv/v比
これらの溶剤系及び市販のAnaltechシリカプレート（250ミクロン、Analtech Inc.）を使用してRf値は報告される。
全てのパーセントは特に指示がないかぎりモルパーセントで与えられる。
化合物の構造の同定は前述のスキーム中の化合物番号を参照することにより示す。
出発物質の製造
例A:d,1-2-ブロモ-4-（4-ニトロフェニル）ブタン酸のt-ブチルエステル（化合物1）の合成
6mLの四塩化炭素及び15mLの塩化チオニル（0.2モル）の溶液に、12.5gの4-（4-ニトロフェニル）ブタン酸（0.06モル、FW=209.20）を窒素雰囲気下で加えた。この溶液を1時間還流させ、塩化水素及び二酸化硫黄の急速な初期放出を伴った。それから、N-ブロモ琥珀酸イミド（11.5g、0.062モル）をスラリー状態で20mLの四塩化炭素中に加え、そして48%臭素酸触媒3滴をこの温かい溶液に加え、その時、臭素の開放が観測された。深赤色の溶液を更に35分間還流し、その後、急速に赤色を呈した。短路蒸留器のヘッドをポットに接続し、未反応の塩化チオニル及び四塩化炭素を留去した（総量で30mL）。ポット中の溶液を冷却し、攪拌しながらジオキサン（100mL）中に注いだ。この暗色の溶液を攪拌されている8%ジオキサン水溶液250mLにゆっくりと加えた。その後、ジオキサンをロータリーエバポレーターで除去し、暗色の油に150mLのメチレンクロリドを加え、次いでロータリーエバポレーターでこの溶剤を除去した。別の250mL部分のメチレンクロリドを加え、溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして濾過した。この溶液に、18時間にわたって窒素雰囲気下で攪拌しながら、ジクロロヘキシルカルボジイミド（14.4g、0.07モル）、4-N,N-ジメチルアミノピリジン（0.7g）及び10mLのt-ブタノールを加えた。TLC分析（50:50  メチレンクロリド:四塩化炭素）は新規の生成物（Rf=0.40視覚、ホスホモリブデン酸）を示した。混合物を濾過してジクロロヘキシルウレアを除去し、得られた溶液を2x150mL部分の水、2x150mL部分の5%酢酸水溶液及び2x150mL部分の水で抽出した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして溶剤を除去した。得られた油を、50:50メチレンクロリド:四塩化炭素で予備溶離されたフラッシュシリカゲルの1.5x14インチのカラムに入れ、1（5.8g,0.169モル）を28%収率で無色の油の表題の生成物、d,1-2ブロモ-4-（4-ニトロフェニル）ブタン酸のt-ブチルエステルとして与えた。この生成物は
1H NMR(CDCl3)δ8.18(d,2H,Jab=8.7Hz),7.38(d,2H,Jab=8.7Hz),4.07(dd,1H,J1=8.1Hz,J2=6.4HzメチンH),2.84(m,4H),2.32(m,4H),1.49(s,9H);
13C NMR(CDCl3)δ168.9,148.1,146.9,129.5,124.0,82.7,46.3,35.5,33.0,27.5;
1R(CDCl3フィルムNaClプレート上)cm-1 2979,2933,1732(エステル),1602,1520,1346,1142.
を特徴とした。
例B:1,4,7,10-テトラアザ-1-N-（1-カルボ-t-ブトキシ-3-（4-ニトロフェニル）プロピル）シクロドデカンのモノヒドロブロミド塩（化合物3）の合成
25mLのペンテン安定化クロロホルム中の1.90gの環状遊離塩基（化合物2、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン）（10.5ミリモル、FW=172.28）の攪拌されている溶液に、例Aの手順により製造された3.44gの臭化物1（9.50ミリモル、95%純度の1で補正して）を攪拌しながら5分間にわたって窒素雰囲気下で加えた。この反応溶液を室温（T=25℃）で48時間攪拌した。TLC分析（12:4:1-溶剤系2）はモノアルキル化生成物、1,4,7,10-テトラアザ-1-N-（1-カルボ-t-ブトキシ-3-（4-ニトロフェニル）プロピル）シクロドデカン（Rf=0.78ニンヒドリン、ヨウ素、及び紫外活性vsマイナー（ninhydrin,iodine and ultraviolet active versus a minor）、高Rf=0.81）への変換を示した。この黄色のクロロホルム溶液を、クロロホルム中10%メタノールで予備溶離されている、1.5x14インチのフラッシュシリカゲルカラムに入れた。その後、薄黄色のバンドを通過するまでこの油をこの溶剤で溶離し、その後、溶剤系1を入れた。オレンジ色のバンドは3であることを証明する主要なUV活性フラクションを直ぐに優位になった。この物質を含むこの混合フラクションを回収し、粘性の油（3.7g、7.67ミリモル）として80%の収率で3のモノヒドロブロミド塩を提供した。油は最小量のクロロホルム中に溶解され、この溶液をエーテルで滴定してガムを提供し、この溶剤中に放置時に白色粉末（70〜110℃で褐色の油に分解される）となり、それは真空乾燥時に分析時に純粋な3であることが証明され、
1H NMR(CDCl3)δ8.13(d,2H,Jab=8.6Hz),7.48(d,2H,Jab=8.8Hz),3.71(s,3H),3.23(dd,1H,J1=8.2Hz,J2=6.3Hz),2.5-3.0(m,20H),2.65(m,2H),1.46(s,9H);
13C NMR(CDCl3)δ171.9,149.7,146.4,129.6,123.7,81.4,64.8,48.9,48.1,46.6,45.3,45.4,32.5,30.5,27.9;
1R(CDCl3フィルムNaClプレート上)cm-1 2979,2936,2844,1718(エステル),1602,1519,1457,1343;
を特徴とする。
例C:1,4,7,10-テトラアザ-1-N-（1-カルボ-t-ブトキシ-3-（4-ニトロフェニル）プロピル-ビス-4,7,N,N-（カルボ-t-ブトキシメチル）シクロドデカンのモノヒドロブロミン塩（化合物4）の合成
386mgの5-ブチルブロモアセテート（2.00ミリモル）及び400mgのジイソプロピルエチルアミン（3.1ミリモル）を含む21mLのクロロホルムに、48時間にわたって攪拌しながら、例Bで製造した3のヒドロブロミド塩516mg（1.00ミリモル）を加えた。溶剤を除去し、粗生成物をクロロホルム中の5%のメタノールで予備溶離された1x6インチのフラッシュシリカゲルカラムに入れた。この溶剤での溶離時に第一のUV活性フラクション（Rf=0.81、溶剤系中、Rf=0.51、クロロホルム中の10%のメタノール中）の単離は分析的に純粋なヒドロブロミド塩として4（211mg、0.28ミリモル）を提供した。この化合物は、更に、
1H NMR(CDCl3)δ10.1(broads,1H),8.17(d,2H,Jab=8.6Hz),7.46(d,2H,Jab=8.8Hz),3.2-3.4(m,5H),2.6-3.2(m,18H),2.13(m,1H),1.98(m,1H),1.50(s,9H),1.44(s,9H),1.43(s,9H);
13C NMR(CDCl3)δ171.3,170.7,169.6,149.2,146.6,129.4,123.8,82.0,81.8,81.5,66.9,58.7,51.5,50.9,49.6,48.4,47.7,46.9,32.5,31.2,28.0,27.9,27.8;
1R(CDCl3フィルムNaClプレート上)cm-1 2985,1724(エステル),1602,1520,1456,1370 1347,1151;
を特徴とした。
例D:1,4,7,10-テトラアザ-N-（1-カルボ-t-ブトキシ-3（4-ニトロフェニル）プロピル）-ビス-4,7-N,N-（カルボ-t-ブトキシメチル）-10-N-（カルボキシアミドメチル）シクロドデカン（化合物5）及びニトロ基の還元
1mLのクロロホルムに、例Cで製造した89mg（0.119ミリモル）の臭化水素塩5、21.3mg（0.159ミリモル、1.23当量）のブロモアセトアミド、及び80mg（0.62ミリモル、5.2当量）のジイソプロピルエチルアミンを加え、その後、溶液を5mm NMR（核磁気共鳴）管に入れた。NMR管をNMRスペクトロメーター（プローブT=50℃）中に入れ、4の第四炭素（82.0,81.8,81.5ppm）の消失がモニターされた。5（81.1,80.7,80.5）の3つの新しい第四炭素のシグナルの対応した増加が5時間以内に完了し、
1H NMR(CDCl3)δ8.15(d,2H,J=8.4Hz),7.38(d,2H,J=8.4Hz),3.2-3.4(m,6H),2.6-3.2(m,18H),2.13(m,1H),1.85(m,1H),1.48(s,9H),1.46(s,9H),1.41(s,9H);
13C NMR(CDCl3)δ174.3,171.6,170.3,149.3,146.2,129.1,123.4,81.0,80.7,80.4,62.6,57.0,56.4,56.1,55.5,55.0,53.1,52.8,52.0,51.6,48.4,46.0,32.6,31.0,28.1,27.9,27.7
を特徴とする。
クロロホルムは5のクロロホルム溶液から蒸発され、残った薄黄色のガラス状固体を水中で70%のエタノール10mL中に溶解した。炭素上のパラジウム触媒（100mg,Lancaster Synthesis Ltd.の炭素上10%のPd）を窒素雰囲気下で加え、そして攪拌された溶液中に水素ガスを18時間スパージした。この溶液を短いパッドのセライトを通して濾過し、溶剤を蒸発させて対応するアミノ化合物5bを白色のガラス状固体（150mg粗生成物、Hunig塩素を含む）として提供した。
1R(CDCl3フィルムNaClプレート上)cm-1 3317,2982,2936,1724(エステル),1688（アミド）,1602,1456,1392 1368,1157.
例E:1,4,7,10-テトラアザ-1-N-（1-カルボ-t-ブトキシ-3（4-ニトロフェニル）プロピル-7-N-（カルボ-t-ブトキシメチル）シクロドデカン（化合物7）のモノヒドロブロミド塩
12mLのクロロホルムに、例Bで製造した516mg（1.00ミリモル）の臭化水素塩3、及び198mg（1.00モル）のt-ブチルブロモアセテートを窒素雰囲気下で溶解させ、そして、溶液を一晩還流させた。クロロホルム中10%のメタノールで溶離された1x6インチのフラッシュシリカゲルカラム中にこの濃厚溶液を入れた。この溶剤での溶離は薄黄色の不透明なバンドを提供した。それは分析的に純粋なジエステルの分離不可能な1,4:1,7の位置異性体の75:25の異性体混合物として分離され、38%収率であり、（Rf=0.14、クロロホルム中10%メタノール）であり、
1H NMR(CDCl3)δ8.17(d,2H,Jab=8.5Hz),7.52(75%)及び7.31(25%)(2d,2H総計,Jab=8.8Hz),3.23(t,1H,J=6.4Hz),2.5-3.1(m,18H),1.8-2.2(m,2H),1.50及び1.44(少量側は2つのシングレット(25%)1,4-ジエステルt-ブチル基),1.46及び1.39(多量側は(75%)1,7-ジエステルt-ブチル基)-これら4つの共鳴の総計は9H;
13C NMR(CDCl3)δ171.9,171.3,170.7,169.8,149.8,149.0,146.5,129.6,129.4,123.8,123.7,82.1,81.8,81.6,81.3,65.9,65.6,57.0,51.4,49.3,49.1,47.1,47.0,44.5,46.6,32.5,31.0,30.8,27.9,27.8,27.8;
1R(CDCl3フィルムNaClプレート上)cm-1 2979,2942,2856,1724,1602,1520,1456,1354,1152;
を特徴とする。
例F:1,4,7,10-テトラアザ-1-N-（1-カルボ-t-ブトキシ-3-（4-アミノフェニル）プロピル）-7-N-（1-カルボ-t-ブトキシメチル）-ビス-4,10-N,N-（カルボキシアミドメチル）シクロドデカン（化合物9）
7mLのクロロホルム中に、175mg（0.289ミリモル）のジエステル7、82mg（0.594ミリモル）のブロモアセトアミド及び116mg（0.90ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンを25℃で攪拌しながら溶解させた。この溶液を窒素雰囲気下で48時間攪拌させた。48時間後、クロロホルムをロータリーエバポレーターで除去し、そして得られた薄黄色のガラスを水中70%エタノールの10ml中に溶解させた。炭素上のパラジウム触媒（120mg,炭素上10%Pd、Lancaster Synthesis Ltd.）を窒素雰囲気下で加え、そして、攪拌されている溶液を通して18時間水素ガスをスパージした。TLC分析（溶剤系1）はニンヒドリンポジティブ、紫外線（254nm）活性スポットを示した。溶液をセライトを通して濾過し、溶剤を蒸発させ、143mgの9を白色のガラス状態で提供した。
この物質の1H NMR分析はニトロ基の還元を示す6.98ppm及び6.66ppmで2つの広いダブレットを示した。
1R(CDCl3フィルムNaClプレート上)cm-1 3310,2980,934,2836,1721(エステル),1672（アミド）,1623,1517,1368,1152.
例1:1,4,7,10-テトラアザ-1-N-（1-カルボキシ-3-（4-アミノフェニル）プロピル）-ビス-4,7-N,N-（カルボキシメチル）-10-N-カルボキシアミドメチル）-シクロドデカン（PA-DOTAMA）（化合物6）の合成
例Dで製造した粗アミノ誘導体5b（130mg)を10mLの濃塩酸10mL中に溶解させ、溶剤を除去し（温度は40℃を越えず、10mm〜0.1mm）白色固体として6を提供した。この白色固体を酸洗浄したフラッシュシリカゲルのカラム（1x12インチで10gのゲル、Alltech Inc.）であり、3:3:1クロロホルム:メタノール:濃水酸化アンモニウムにより既に溶離されたカラムに入れた。
三酸モノアミド6（Rf-0.19、同溶剤中）は非吸湿性の白色固体（52mg、0.100ミリモル）として得られ、4からの83%の全体での収率であった。異性体比はHPLC分析（95:5の酢酸ナトリウム（Ph=6）:アセトニトリル、10分間、1mL/分、254nm、ガード付き100mm Econosphere C18コラムを使用）により決定され、材料は97%純度を上回ることを示した。次の条件でのこの材料のNMRスペクトルはC-N1結合に関して制約された回転から生じるジアステレオマーアミド対と一致した。
1H NMR(D2Oジオキサンとともに、国際標準,pH=4.5,30℃)δ7.21(m,2H),7.01(m,2H),1.8-3.9(m,27H):
13C NMR(D2Oジオキサンとともに、国際標準,pH=4.5,30℃)δ180.5,180.0,177.5,177.3,175.3,174.9,173.0,142.9,141.5,137.3,136.4,132.9,122.0,121.6,69.0(ジオキサン),65.1,65.0,58.9,58.6,58.5,58.2,54.6,53.8,53.2,52.1,51.6,51.3,50.7,50.4,49.7,49.0,48.7,54.0(“ダブレット”),29.6,29.1;
MS（FAB「マジックブレット」トマリックス中）m/e(1%)523(100%,(M+H)+),545(38%,(M+Na)+),561(M+Ca-H)+).
この物質は続くキレート化の研究に直接的に使用された。
例2:1,4,7,10-テトラアザ-1-N-（1-カルボキシ-3-（4-アミノフェニル）プロピル）-7-N-（1-カルボキシメチル）-ビス-4,10-N,N-カルボキシアミドメチル）シクロドデカン（PA-DODADA）（化合物10a/b）
例Fにおいて単離された化合物9（143mg）を6Nの塩酸に溶解し、10分後に溶剤を真空（40℃10-mm）で除去した。得られた白色固体を、2:2:1のクロロホルム：メタノール：濃水酸化アンモニウムで溶離されていた、酸洗浄したフラッシュシリカゲル（1cm、15gゲル、Alltech Inc.）に入れた。対称の1,7-二酸（Rf=0.32、同一の溶剤中）はこれらの条件下で1,4-二酸（Rf=0.20）から調製するように分離できず、この両方の化合物を含むフラクションはプールされ、80:20の異性体混合物10（80mg、0.134ミリモル）を7から58%の全体収率で提供した。異性体比はHPLC分析（95:5 0.05Mクエン酸アンモニウム、pH=6:アセトニトリルから30分間で30:70、1mL/分、254nm、ガード付きの100mm Econosphere C18カラム）により決定され、物質が96%純度を上回ることを示した。
MS（FAB「マジックブレット」トマリックス中）m/e(1%)522(100%,(M+H)+),544(28%,(M+Na)+).
この物質を続くキレート化の研究に直接的に使用した。
例3:［Lu(PA-DOTAMA］の製造
過剰のルテニウム（Lu3+）イオン（400μLの5mL Lu(OAc)34H2O、0.05M酢酸ナトリウム中）を［PA-H(NH4)2DOTAMAの溶液（100μLの5mMのPA-H(NH4)2DOTAMA、蒸留水中）に加えた。生成物のHPLCクロマトグラフは保持時間が3.53分と3.66分である2つのピーク（2つのジアステレオマーの生成による）を含んだ（100mm Econosphere C183μカラム、10分間で95:5〜30:70、pH=6.0、0.05M酢酸アンモニウム:アセトニトリル、1mL/分、254nm、Hewlett-Packard 1090液体クロマトグラフ）。遊離リガンド、PA-H(NH4)2DOTAMAは1.85分の保持時間を有した。
例4:SCN-PA-DOTAMAの製造
出発のアミド、PA-H(NH4)2DOTAMA（23mg）を3mLの蒸留水中に溶解し、チオホスゲン（15.8μL）を加えた。この混合物をMixxor（商標）中で約2分間激しく攪拌した。過剰のチオホスゲンを1mLのクロロホルムで3回抽出した。水性層を20mLのアセトニトリルに加え、そして溶剤を室温でロータリーエバポレーターで除去した。この固体を真空ラインで室温にて2時間乾燥した。
高速原子衝撃質量スペクトル、m/e 565及び587（それぞれ、陽イオン、［M+H+］+及び［M+Na+］+）及びm/e 563及び585（それぞれ、陰イオン、［M-H+］-及び［M-Na+］-）
この生成物を約4mLの蒸留水に溶解し、-70℃で保存した。
例5:［Lu(SCN-PA-DOTAMA］の製造
ルテニウムトリクロリド（LuCl3 6H2O、5.0mg）を1mLのSCN-PA-DOTAMA溶液（例4に記載のように製造された）に加え、そして、得られた溶液はpHメーターを使用して約pH=6.4に0.10M水酸化ナトリウムの添加により滴定された。この溶液を室温でロータリーエバポレーターで蒸発乾固し、真空ラインで乾燥した。回収された生成物のHPLCの保持時間は6.25分及び6.28分であった（2つのヂアシテレオマー、100mm Econosphere（商標）C18 3μカラム、10分間で95:5〜30:70、pH=6.0、0.05M酢酸アンモニウム:アセトニトリル、1mL/分、254nm、Hwelett-Packard 1090液体クロマトグラフ）
高速原子衝撃質量スペクトル、m/e 737及び759（それぞれ、陽イオン、［M+H+］+及び［M+Na+］+）及びm/e 735（陰イオン、［M-H+］-）。
例6:［Lu(PA-DODADA］Clの製造
異性体混合物としての出発のアミド、PA-(NH4)2DODADA（20mg）及びLuCl3 6H2Oを2mLの蒸留水中に溶解させた（pH=6.0）。この溶液をオイルバス中で90℃で30分間加熱した。その後、溶液をロータリーエバポレーターで除去し、試料を真空炉中で50℃で乾燥した。生成物のHPLCクロマトグラフは保持時間4.58及び4.66分の2つのピーク（多種の異性体の生成による）を含んだ（例5のように調製）。遊離リガンド、PA-(NH4)2DODADA（2主の異性体）は2.88及び3.12分の保持時間を有した。高速原子衝撃質量スペクトル、m/e 694（陽イオン、M+）及びm/e 692及び729（陰イオン、［M+-2H+］-及び［M+-H++Cl-］-）。
例7:SCN-PA-DATAMA-177Luの製造
0.05Nの塩酸中の177Lu（0.7mM）25μl及びHEPES緩衝剤（1.0M、pH7.0）の混合物に4μlのSCN-PA-DOTAMA溶液（5mM H2O中）を加えた。これを約5秒間攪拌し、そして室温で5分間放置し、その後、PRP-1Mini-Clean（商標）（Alltech Associates,Inc.,Deerfield,ILの登録商標）カートリッジ（80μl）上で精製した。SCN-PA-DOTAMA-177Lu錯体の収率はGF-250カラム（duPont（商標）Zorbax Bioシリーズ、9.4mmIDX25cm）上で10%アセトニトリルを含むクエン酸緩衝剤（0.25M,pH7.0）で溶離されたHPLC分析により決定されて約75%であった。HPLC系はUV（280nm）及び放射線デュアルディクテーター（Applied Biosystems Inc.,CAのSpectro 757 UVディテクター及びBerthold Analytical Inst.,GermanyのHPLC放射線ディテクター）を備えていた。
177Lu錯体を精製するために、キレート混合物をPRP-1カートリッジ上に装填し、800μlの洗浄緩衝剤（50mM炭酸塩中10%アセトニトリル、pH9.5）で洗浄した後、800μlのアセトニトリル、400μlの水及び800μlの同洗浄緩衝剤で予備処理し、SCN-PA-DOTAMA-177Lu錯体はアセトニトリル緩衝剤（2:1）混合物中で溶離された。最初の50μlの溶出液は捨てられた。所望の製品は次の50μlで出てきた。SCN-PA-DOTAMA-177Lu錯体は例5で製造された試料のHPLCの保持時間の比較により同定された。
例8:PA-DOTAMA-177Lu F(ab')2結合体の製造
F(ab')2CC-49はLamoyi及びNisonoffのJ.Immunol.Methods,56,235〜243(1983)に記載の手順によりIgG CC49の酵素消化により製造され、炭酸塩緩衝剤（50mM,pH9.5）に交換され、そして約16mg/mlに濃縮された。170μlの抗体溶液（25nmole）に、例7に記載のように製造した30μlのSCN-PA-DOTAMA-177Lu錯体（8.7nmole;3.8mCi）を加えた。この溶液を約5分間攪拌し、室温（約22℃）で2時間放置した。結合の進行はGF-250カラム上、HPLCで追跡された。177Luの53%が抗体と結合し、抗体当たりのBFCの平均数は2時間後に約0.2であると評価された。止めた後、177LuラベリングしたF(ab')2はSephadex G-25カラム（2.2ml;Isolab Inc,Akron,OhioのQS-2B）でduPont Sorvalセントリーフュージ（モデルRT 6000B、2900rpm）上で遠心ゲル濾過により4℃で2分間精製された。
177LuラベリングしたF(ab')2の一体性はGF-250でのHPLC（Silvakoff,BioChrom,1(1),42〜48(1986)）、放射線透過写真と組み合わせた電気泳動及び免疫放射線-メトリックアッセイ（IRMA）による免疫反応性により確認された。
例9:SCN-PA-DODADA-177Lu錯体の製造
PA-(NH4)2DODADA（水中、4μlの5mM溶液）を25μlの177Lu（0.05Nの塩酸中0.7mM）と混合した。この溶液に25μlのHEPES緩衝剤（1.0M、pH7）を加えた。それを攪拌してサンドバス中で30分間90℃で加熱した。キレート化の収率は177Lu活性を基準に86%であった。同定は例6に記載のように製造した純粋な試料との比較により行われた。
177Luキレートは室温での10μlのチオホスゲン溶液（アセトニトリル中1%）の添加により誘導された。反応を5〜15分間続けた後、177Lu-SCN-PA-DOTADA錯体は例7に記載のようにPRP-1 Mini-Clean（商標）カートリッジで精製された。
例10:PA-DODADA-177LuラベリングされたF(ab')2CC-49の製造
PA-DODADA-177LuのF(ab')2CC-49への結合は例8に記載されたように行われた。SCN-PA-DODADA-177Luの抗体への結合速度はDOTAMA及びDOTA（PCT出願第WO89/02788参照）に観測されたよりもかなり速かった。即ち、炭酸塩緩衝剤（pH9.5）、室温（22℃）及び抗体濃度約1.25x10 -4Mで、SCN-PA-DOTAMA-177Luの約37%及びSCN-PA-DOTA-177Luの30%未満と比較して、1時間で50%以上の反応であった。Lu-177ラベリングされた抗体の一体性は例8に記載のような生化学の標準的な技術により確認された。
例11:生体分散の比較のためのPA-DOTA-177LuラベリングされたF(ab')2CC49の製造
全体の抗体結合体は例8、10及び11のように製造されたが、そのままのモノクロナール抗体CC49（全体のIgG）は使用された。再び、SCN-BFCキレートの抗体への結合速度はSCN-DODADA>SCN-DOTAMA>SCN-DOTAの順である。
例13:177Lu Pa-DOTAMA及び177Lu Pa-DADA抗体結合体のインビトロでの安定性
実験はリソソームの（lysosomal）pH4〜5で、または他のキレート化剤、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）の存在下での177Lu BFC錯体の安定性の試験をするように設計された。このようにして、例8、10及び11で製造された抗体結合体は酢酸塩緩衝剤中（0.2M;pH4及びpH6）、又はDTPA溶液（0.25M,PBS中pH7.4）中で、室温で、抗体濃度約10μMで培養された。抗体からのLu-177ラベルの損失はGF-250カラム上でのHPLCにより決定された。表Iに要約され、そして抗体に結合したままであったパーセントLu-177として表記された結果は、異なるBFCから誘導された3種の結合体の比較の安定性を示す。
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例14:177Lu-PA-DOTAMA、PA-DOTADA及びPA-DOTAラベリングされたF(ab')2及びIgG CC49の動物の生体分散
約生後4週間のBalb/cマウス（Charles River Breeding Laboratoriesから購入））で、177Lu-BFCラベリングされた抗体にインビボでの局所化は決定された。メスのBalb/cマウスは、50μlのPBS中約10μCiの177Luラベリングされた抗体（7〜10μg）を尾の静脈を通して各々注入した。マウスは種々の時間間隔で死んだ。死亡後、選択された器官/組織を切り取り、重量測定し、ガンマカウンターで放射性を測定した。各組織の1分当たりの計数（CPM）は測定され、そして100x注入された投与量当たりの1グラムの組織当たりのCPMとして表記された（投与量/グラム）。CC49F(ab')2に結合したキレートPA-DOTA,PA-DOTAMA及びPA-DODADAの結果を表IIA、B及びCに与える。
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結果は生体分散に関して、CC49のF(ab')2断片に結合したときに、PA-DOTA、PA-DOTMA及びPA-DODADA二官能性キレート化剤の間の同様性を示す。データは、また、PA-DOTA F(ab')2結合体と比較してPA-DOTAMA F(ab')2結合体に関しては骨による177Luの吸収性が、長時間で特に低いことを示す。
CC49IgGへ結合したキレートの生体分散を表IID及びEに示す。
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データは、より長時間（3週間）で、PA-DOTAMAの結合体の骨による吸収性はPA-DOTAの結合体と比較して低いことを示す。
本発明の他の態様はここで開示した本発明の明細書及び実施を考慮することから当業者に明らかであろう。明細書及び実施例は単に例示と考えられることを意図し、本発明の真の範囲及び実効部分は次の請求の範囲により示される。