(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドフルクトース化合物と、タンパク質とが結合体化した、ヒトヘモグロビンＡ１ｃに特異的に結合する抗体を作製する際の免疫原として用いられるタンパク質結合体であって、
該ペプチドフルクトース化合物は式ＶＩ：
【化１１】
0003801133.tif 000027
で示され、
該タンパク質はＣＧＧである、
タンパク質結合体。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質結合体で感作されたマウスの脾臓細胞と、骨髄腫由来の細胞株とを融合後、融合された細胞をクローニングして得られるモノクローナル抗体産生細胞であって、該モノクローナル抗体産生細胞は、ヒトヘモグロビンＡ１ｃに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するモノクローナル抗体産生細胞であって、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６３７またはＦＥＲＭ  ＢＰ−７６３６である、モノクローナル抗体産生細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技  術  分  野
本発明は、ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略称する）に対する抗体の作製に使用可能な免疫原であるペプチドフルクトース化合物、およびその化合物とタンパク質とのタンパク質結合体、ならびにそのペプチドフルクトースのタンパク質結合体を用いて得られる抗血清および抗体に関する。
【０００２】
背  景  技  術
従来、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を作製する際に必要となる免疫原としては、一般にＨｂＡ１ｃそのものを用いてきた。ＨｂＡ１ｃは、全ヘモグロビン量の９０％をしめるヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０と略称する）に構造が似ている。ＨｂＡ０は、そのβ鎖のＮ末端が糖鎖に結合していないのに対して、ＨｂＡ１ｃはβ鎖のＮ末端にフルクトースが結合しているという相違点のみしか有していない。したがって、免疫原としてＨｂＡ１ｃそのものを用いれば、作製される抗体の大部分はＨｂＡ０をも認識する。このようなヘモグロビンに対する抗体のうちで、目的とするＨｂＡ１ｃのみを認識できるものはわずかである。従来はそのような抗体群の中からＨｂＡ１ｃに結合するものだけを選別する作業を行っていた。
【０００３】
そのような選別作業は労働集約的であり、かつ、コストもかかるものである。そこで、ＨｂＡ１ｃのみを認識するエピトープを用いることが考えられる。しかし、エピトープを用いた抗血清または抗体の作製においては、エピトープのみでは充分に抗原性または免疫原性を有しないことが多く、アジュバントまたはキャリアを同時に用いて動物に免疫することが行われる。しかし、キャリアとエピトープとを用いて動物に免疫することは、従来労働集約的であり、かつ、必ずしも効率よく目的の抗血清または抗体を得られないことが多く、したがって、コストもかかるものであった。さらに、目的とする抗体の獲得には確率的な要因が存在し、確実な方法であるとはいえない。ＨｂＡ０と交叉反応性を有しないモノクローナル抗体、および確実にかつ簡便にそのような抗体を得ることのできる作製方法なども従来確立されていない。
【０００４】
そこで本発明は上記の問題点に鑑み、確率的な要因を排し、ＨｂＡ０との交叉反応性を有さない、好ましくは抗ＨｂＡ１ｃ抗体のみを確実に作製することが可能な免疫原であるタンパク質結合体を提供することを目的とする。本発明はさらに、ＨｂＡ０との交叉反応性を有さない、ＨｂＡ１ｃに対して特異性をもったそのような抗体を、将来においても安定的に供給することのできる抗体産生細胞を提供することをも目的とする。
【０００５】
発  明  の  要  旨
上記目的を達成するために、本発明は以下を提供する。
【００１７】
１つの局面において、本発明は、ペプチドフルクトース化合物と、タンパク質とが結合体化した、タンパク質結合体であって、
該ペプチドフルクトース化合物は式ＶＩ：
【化１１】
0003801133.tif 000002
で示され、
該タンパク質はチキン−γグロブリン（ＣＧＧ）である、
タンパク質結合体を提供する。
【００２１】
さらに別の局面において、本発明は、本発明のペプチドフルクトース化合物または本発明のタンパク質結合体で感作されたマウスの脾臓細胞と、骨髄腫由来の細胞株とを融合後、融合された細胞をクローニングして得られるモノクローナル抗体産生細胞を提供する。このモノクローナル抗体産生細胞は、ヒトヘモグロビンＡ１ｃに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する。１つの実施形態において，本発明は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６３６またはＦＥＲＭ  ＢＰ−７６３７であるモノクローナル抗体産生細胞を提供する。
【００２５】
発  明  の  詳  細  な  説  明
以下に、本発明において用いられる用語を説明するが、特に言及しない限り、本明細書において用いられる用語は、当該分野において通常用いられる意味を有することに留意されたい。
【００２６】
用語「ペプチドフルクトース化合物」とはペプチドおよびフルクトースとを含む化合物をいう。代表的なペプチドフルクトース化合物は、以下の構造をしている。
【００２７】
【化７】
（Ｉ）
0003801133.tif 000003
【００２８】
ここで、Ｒ１は、−ＳＨ基を有する任意の分子であり、このＲ１は、（ｂ）において共有結合でＲ２のカルボキシ末端と結合されており、そしてＲ２は、１以上のＨｂＡ１のアミノ酸配列由来のアミノ酸または上記アミノ酸と機能的に等価なアミノ酸アナログを含み、そのアミノ末端でフルクトースと結合されている。
【００２９】
用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、互換的に使用されて、２以上のアミノ酸（天然または非天然）がペプチド結合で重合したポリマーをいう。
【００３０】
用語「アミノ酸」は、アミノ基（−ＮＨ２）およびカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を同一分子内に有する有機化合物、および、当該分野で用いられるのと同様に、プロリン、ヒドロキシプロリンのようなイミノ基を有するイミノ酸も包含する。本明細書において使用されるアミノ酸は、天然アミノ酸（アスパラギン（以下、Ａｓｎと略称する）、アスパラギン酸（以下、Ａｓｐと略称する）、アラニン（以下、Ａｌａと略称する）、アルギニン（以下、Ａｒｇと略称する）、イソロイシン（以下、Ｉｌｅと略称する）、グリシン（以下、Ｇｌｙと略称する）、グルタミン（以下、Ｇｌｎと略称する）、グルタミン酸（以下、Ｇｌｕと略称する）、システイン（以下、Ｃｙｓと略称する）、セリン（以下、Ｓｅｒと略称する）、チロシン（以下、Ｔｙｒと略称する）、トリプトファン（以下、Ｔｒｐと略称する）、スレオニン（以下、Ｔｈｒと略称する）、バリン（以下、Ｖａｌと略称する）、ヒスチジン（以下、Ｈｉｓと略称する）、フェニルアラニン（以下、Ｐｈｅと略称する）、プロリン（以下、Ｐｒｏと略称する）、メチオニン（以下、Ｍｅｔと略称する）、リジン（以下、Ｌｙｓと略称する）およびロイシン（以下、Ｌｅｕと略称する））または非天然アミノ酸であり得る。このアミノ酸は、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸、ω−アミノ酸などであり得る。このアミノ酸は、Ｌ型またはＤ型であり得るが、Ｌ型が好ましい。
【００３１】
用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。非天然のアミノ酸には、−ＳＨ基を有するものも包含される。そのような例としては、ホモシステインが挙げられる。
【００３２】
「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する物性または機能を有する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。そのような物性または機能が類似するか否かの判定は、本明細書に記載されるように、他の化合物との結合が実質的に同一か否かを決定することによって行われ得る。
【００３３】
本発明のペプチドフルクトース化合物において、機能を実質的に変化させずにアミノ酸の置換などを行う方法は、化学合成、または遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸をコードするＤＮＡ配列のコドンを変化させることを含むが、これらに限定されない。
【００３４】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００３５】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００３６】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることことが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００３７】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
本明細書中において、機能的に等価なペプチドフルクトース化合物を作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００３９】
用語「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、上記のように当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。
【００４０】
１つの局面において、本発明のペプチドフルクトースは、以下の式（Ｉ）：
【００４１】
【化８】
（Ｉ）
0003801133.tif 000004
【００４２】
で示されるペプチドフルクトース化合物である。このペプチドフルクトース化合物は、代表的に、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造であるフルクトース−バリン−ヒスチジンに加えて、−ＳＨ基を有する部分（例えば、システイン残基）が導入されていることから、タンパク質との結合が容易であり、タンパク質と結合させることによりタンパク質結合体を作製することができる。
【００４３】
また、本発明のタンパク質結合体は、式（Ｉ）で示されるペプチドフルクトース化合物と、ヘモグロビンを除くタンパク質とが結合体化していることを特徴とする。このタンパク質結合体は、代表的に、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造であるフルクトース−バリン−ヒスチジンと、ヘモグロビンを除くタンパク質とを有していることから、ヘモグロビンＨｂＡ０とは共通する構造を持たない。従って、このタンパク質結合体を免疫原として用いることにより、ヘモグロビンＨｂＡ０とは交叉反応性を有しない、好ましくはＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンとは交叉反応性を有しない抗ＨｂＡ１ｃ抗体を確実に作製することができる。
【００４４】
ここで、ペプチドフルクトースのタンパク質結合体は、式（Ｉ）で示されるペプチドフルクトース化合物は、ヘモグロビンを除くタンパク質と、−ＳＨ基において、好ましくは、ジスルフィド結合を介して結合している。システインのようなチオール基を有する官能基のチオール基を介してタンパク質と結合させることにより、容易にタンパク質結合体を作製することができるとともに、タンパク質との反応量の制御やタンパク質への導入量の測定が可能となる。−ＳＨ基導入の他の有利な効果としては、結合後に比較的安定なジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成することなどが挙げられる。
【００４５】
タンパク質としては、ヘモグロビンを除くタンパク質であれば特に限定なく用いることができ、例えば、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）、チキン−γ  グロブリン（以下、ＣＧＧと略称する）、スカシ貝ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略称する）などが挙げられる。
【００４６】
前記式（Ｉ）において、Ｒ２が下記式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で示される残基を含むことが好ましい。
【００４７】
【化９】
（ＩＩ）                                            （ＩＩＩ）
0003801133.tif 000005
【００４８】
このペプチドフルクトース化合物は、フルクトース−バリン−ヒスチジンに加えて、さらにＨｂＡ１ｃの特徴的構造であるロイシン−スレオニンが導入されていることから、これを用いることにより、ＨｂＡ１ｃとの結合力がより強く、かつ／または選択性の高い抗ＨｂＡ１ｃ抗体を作製することができる。
【００４９】
上記式（Ｉ）において、Ｒ２が、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造であるアミノ酸またはアミノ酸の多量体を多く有すると、ＨｂＡ１ｃとの結合力がより強い抗ＨｂＡ１ｃ抗体を作製することができるので好ましい。ただし、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造であるアミノ酸の多量体の数が多くなり過ぎると、得られる抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、ＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンとの交叉反応性が大きくなり得る。そこで、Ｒ１及びＲ２における、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造であるアミノ酸の多量体の数は、得られる抗ＨｂＡ１ｃ抗体の、ＨｂＡ１ｃとの結合力及びＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンとの交叉反応性の観点から調整される。
【００５０】
ここで、本発明のタンパク質結合体を作製するためのタンパク質としては、ＣＧＧのようなタンパク質を用いることが好ましい。ＣＧＧは、マウスタンパク質との類似性がなく、免疫惹起能力が高いタンパク質である。また、水溶性に富むこともまた、本発明における使用に適切な理由の一つである。そのようなタンパク質には、本発明のペプチドフルクトース化合物を、１分子あたり１０個以上導入することができ、好ましくは、１分子あたり２０個以上、より好ましくは１分子あたり２５個以上、さらにより好ましくは３０個以上、導入することができる。このように１分子あたりに多くの本発明のペプチドフルクトース化合物によって、より効率的に抗血清または抗体を産生することが可能となる。
【００５１】
ペプチドフルクトース化合物とタンパク質との結合に使用する試薬としては、システインのようなチオール基を有する残基のチオール基と反応できる官能基と、タンパク質中のアミノ基またはカルボキシル基と反応できる官能基とを有している化合物であれば用いることができる。そのような化合物としては、例えば、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミド  エステル（以下、ＧＭＢＳと略称する）、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（以下、ＳＭＣＣと略称する）、スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（以下、ＳＭＰＢと略称する）、４−スクシンイミジルオキシカルボニルメチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（以下、ＳＭＰＴと略称する）、Ｏ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−１−プロピオネート（以下、ＳＰＤＰと略称する）が挙げられる。この中では、入手しやすく、かつ、ペプチドフルクトースのタンパク質への導入数を測定することができる試薬が好ましく、そのような試薬には、ＳＰＤＰが挙げられる。
【００５２】
また、本発明の抗血清は、前記ペプチドフルクトースのタンパク質結合体を動物に投与することにより、前記動物の血液中に産生されることを特徴とする。この抗血清は、ＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンとの交叉反応性が小さく、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造を認識することができる。
【００５３】
また、抗血清を産生するための動物としては、従来、免疫動物として用いられているものであれば特に限定なく使用することができ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマなどが挙げられる。また、本発明のペプチドフルクトースのタンパク質結合体を免疫したマウスなどの脾臓細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより、抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を作製することが可能となる。本発明の抗体は、ヒト化されていてもよい。抗体をヒト化する方法は、当該分野で周知である。
【００５４】
上記目的を達成するため、本発明のモノクローナル抗体は、式（Ｉ）に示す構造式を含むペプチドフルクトース化合物とタンパク質との結合体からなる免疫原で感作されたマウスの脾臓細胞と、骨髄種由来の細胞ラインとを融合後、クローニングして得られるモノクロナール抗体産生細胞によって培養上清中に産生される。
【００５５】
また、本発明のモノクローナル抗体産生細胞は、ペプチドフルクトースとタンパク質との結合体からなる免疫原で感作されたマウスの脾臓細胞と、骨髄種由来の細胞ラインとを融合後、クローニングして得られ得る。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体は、本発明のペプチドフルクトース化合物またはタンパク質結合体を免疫原として用いて免疫化したマウスの脾臓細胞と、骨髄腫由来の細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）が産生する。したがって、融合細胞（ハイブリドーマ）を増殖させる際の培養上清を、たとえば、プロテインＡセファロースゲルなどを充填した抗体精製用のカラムを用いて精製することで、目的とする抗体を得ることができる。
【００５７】
本発明のペプチドフルクトース化合物は、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造であるフルクトース−バリン−ヒスチジンを有しており、これをタンパク質と結合させることで、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を得るための有効な免疫原となる。
【００５８】
また、本発明のモノクローナル抗体産生細胞は、上述のごとく免疫化したマウスの脾臓細胞と、たとえばｐ３ｘ６３・Ａｇ８・６５３などの骨髄腫由来の細胞とを、ポリエチレングリコールなどの融合促進試薬を用いて融合し、その結果、数多く作製される融合細胞のなかから、たとえば酵素免疫測定法（以下ＥＬＩＳＡと略称する）などの評価法を用いて、ＨｂＡ１ｃには反応するがＨｂＡ０には反応しないような抗体を産生するものだけを選択することによって得ることができる。
【００５９】
実  施  例
以下、本発明を、実施例により詳しく説明する。以下に提供される実施例は、本発明の例示的な実施形態を示すものであり、なんら本発明の限定を意図しないことが理解されるべきである。なお、本実施例においては、タンパク質の例示としてＣＧＧを用いた。
【００６０】
（実施例１：ペプチドフルクトースの作製）
本実施例では、以下に示す手順により、下記式（Ｖ）で示すペプチドフルクトースを作製した。
【００６１】
【化１０】
（Ｖ）
0003801133.tif 000006
【００６２】
１．Ｗａｎｇ樹脂（固相）へのＣｙｓ基の導入
１２．９５ｇ（３０ｍｍｏｌ）のＮ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−ｔ−ブチルチオシステイン（以下、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）と略称する）を５０ｍｌのクロロホルムに溶解し、これに３．０９５ｇ（１５ｍｍｏｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、ＤＣＣと略称する）を加えて１０分間室温で撹拌した。生じた沈澱（ジシクロヘキシル尿素）を濾別し、濾液を減圧下で乾固した。乾固物を５０ｍｌのジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略称する）に溶解し、これに１０ｇのＷａｎｇ樹脂（結合性ＯＨ基：１ｍｍｏｌ／ｇ）を加え、懸濁液とした。この懸濁液に０．７３３ｇ（６ｍｍｏｌ）のジメチルアミノピリジン（以下、ＤＭＡＰと略称する）を加え、室温で６０分間撹拌した。反応液を濾別し、樹脂をＤＭＦで２回、クロロホルムで２回洗浄した後、真空下で一晩乾燥して１１．８ｇの乾燥樹脂（以下、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎと略称する）が得られた。
【００６３】
次に、樹脂へのＣｙｓ基の導入度を以下のような方法で測定した。乾燥樹脂１００ｍｇに５ｍｌの５０％ピペリジン／ＤＭＦ混合溶液を加え、室温で５分間撹拌した。樹脂を除いた濾液の３０１ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は６６．４であった。３０１ｎｍの吸収は樹脂に導入されたＦｍｏｃ−Ｃｙｓ基が、ピペリジンによって脱保護を受けた結果生成したフルオレニルメチルピペリジン（以下、Ｆｍｐと略称する）に由来するものである。したがって、遊離したＦｍｐの量がすなわち導入されたＣｙｓ基の量である。Ｆｍｐの濃度［Ｆｍｐ］は、数式（数式１）のように求めることができる。ただし、Ｆｍｐの３０１ｎｍにおけるモル吸光係数を７８００とする。
【００６４】
【数１】
（数式１）
0003801133.tif 000007
【００６５】
樹脂の反応性ＯＨ基は１ｍｍｏｌ／ｇであることから、反応性ＯＨ基の濃度は０．０２Ｍであると概算できる。したがって、Ｃｙｓ基の樹脂への導入率は、数式（数式２）のように求めることができる。
【００６６】
【数２】
（数式２）
0003801133.tif 000008
【００６７】
２．Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＲｅｓｉｎへのＨｉｓ基の導入
１０ｇ（４．３ｍｍｏｌ、Ｃｙｓ換算）のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎを５０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦに分散し、室温で１０分間撹拌した。溶媒を濾別除去した後、再び２０％ピペリジン／ＤＭＦの反応を繰り返した。樹脂を５０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄し、少量をメタノール液としてニンヒドリンテストを行い、アミノ基がフリーの状態であることを確認した。この樹脂を２０ｍｌのＤＭＦに分散し、これに８．４４７ｇ（１０．７５ｍｍｏｌ）のフルオレニルメトキシカルボニルトリチルヒスチジン  ペンタフルオロフェニルエステル（以下、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｏｐｆｐと略称する）を加え、室温で２時間撹拌した。樹脂を５０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄した後、少量をメタノール液としてニンヒドリンテストを行い、フリーのアミノ基が存在しないことを確認した。その後、樹脂をクロロホルムで３回洗浄し、真空下で一晩乾燥して、１１．２ｇの乾燥樹脂（以下、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎと略称する）を得た。
【００６８】
樹脂へのＨｉｓ基の導入度は、前記の場合と同様に測定した。Ｈｉｓ基の導入率は、３８％であった。
【００６９】
３．Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎへのバリン（以下、Ｖａｌと略称する）基の導入
１１ｇ（４．２ｍｍｏｌ、Ｈｉｓ換算）のＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎを１００ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦに分散し、室温で１０分間撹拌した。溶媒を濾別除去した後、再び２０％ピペリジン／ＤＭＦの反応を繰り返した。樹脂を５０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄し、少量をメタノール液としてニンヒドリンテストを行い、アミノ基がフリーの状態であることを確認した。この樹脂を２０ｍｌのＤＭＦに分散し、これに５．２３４ｇ（１０．５３ｍｍｏｌ）のフルオレニルメトキシカルボニルバリン  ペンタフルオロフェニルエステル（以下、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｏｐｆｐと略称する）を加え、室温で２時間撹拌した。樹脂を５０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄した後、少量をメタノール液としてニンヒドリンテストを行い、フリーのアミノ基が存在しないことを確認した。その後、樹脂をクロロホルムで３回洗浄し、真空下で一晩乾燥して、１０．０ｇの乾燥樹脂（以下、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎと略称する）を得た。
【００７０】
樹脂へのＶａｌ基の導入度は、前記の場合と同様に測定した。Ｖａｌ基の導入率は、２１％であった。
【００７１】
４．樹脂からのペプチド鎖の脱離
９ｇのＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎを１００ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦに分散し、室温で１０分間撹拌した。溶媒を濾別除去した後、再び２０％ピペリジン／ＤＭＦの反応を繰り返した。樹脂を１００ｍｌのＤＭＦで３回洗浄し、少量をメタノール液としてニンヒドリンテストを行い、アミノ基がフリーの状態であることを確認した。この樹脂をクロロホルムで３回洗浄した後、１００ｍｌの５０％クロロホルム／トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略称する）混合溶媒に分散し、室温で２時間撹拌した。樹脂を濾別し、１００ｍｌのクロロホルム／ＴＦＡ＝４／１の混合溶媒で２回洗浄した。濾液、洗浄液をすべて集めて、減圧下で濃縮した。残渣を少量のＴＦＡに溶解し、約３００ｍｌのエーテル中に分散した。遠心分離して上清を除去した後、得られた沈澱のエーテル洗浄を２回繰り返して、真空下で一晩乾燥した。０．６３ｇの粗生成物（Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ）が得られた。
【００７２】
５．アマドリ転位反応によるペプチド鎖へのフルクトースの導入
５００ｍｇ（１．１２６ｍｍｏｌ）の合成ペプチド（Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ）と２７０ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）のグルコースとを、２５ｍｌのピリジン／酢酸＝１／１混合溶媒中に溶解し、遮光下室温で５日間撹拌した。真空下で溶媒を除去した後、残渣を２５ｍｌの水に溶解して再び真空下で濃縮した。これを少量の水に溶解し、強酸性イオン交換樹脂であるＤｏｗｅｘ５０ＷＸ８カラム（Ｓｉｇｍａ製、直径３．５ｃｍ×長さ２５ｃｍ）にチャージした。約２Ｌの水で洗浄してグルコースを除去した後、１Ｎアンモニア水で生成物を溶出し、これを凍結乾燥した。これを０．１Ｍのトリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ＝８．２）に溶解し、アフィゲル６０１カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、直径１．７ｃｍ×長さ２０ｃｍ）にチャージした。１Ｌの０．１Ｍトリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ＝８．２）、次いで１Ｌの水で洗浄し、最後に０．１％の蟻酸で溶出して、これを凍結乾燥した。５０ｍｇのペプチドフルクトース（フルクトース−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ）粗精製物が得られた。（表１）に、生成物の重メタノール中でのＮＭＲのケミカルシフト及び各ピークの帰属を示す。
【００７３】
【表１】
0003801133.tif 000009
【００７４】
（ペプチドフルクトースのタンパク質結合体の作製）
本実施例では、タンパク質としてＣＧＧを用いた。
【００７５】
１．ＣＧＧのピリジルジチオプロピオニル化（ＣＧＧ−ＳＰＤＰの作製）
２００ｍｇ（１．３３×１０−３ｍｍｏｌ）のＣＧＧを５０ｍｌのリン酸バッファーサリン（以下、ＰＢＳと略称する）に溶解し、撹拌しながら５ｍｌのＳＰＤＰ／エタノール溶液（ＳＰＤＰ＝４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１００等量）を滴下した。室温で３０分間撹拌した後、生じた沈澱物を遠心分離（１０分間、２００００ｒｐｍ）により除いた。得られた上清をセファデックスＧ２５Ｍカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、直径２ｃｍ×長さ８０ｃｍ）でゲル濾過し、８０ｍｌのＣＧＧ−ＳＰＤＰ／ＰＢＳ溶液を得た。
【００７６】
ＣＧＧ１分子あたりのＳＰＤＰの結合数を次のように決定した。得られたＣＧＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液のうち１ｍｌを用いて２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は、３．７３であった。
【００７７】
これに１００ｍＭのジチオスイレイトール（以下、ＤＴＴと略称する）水溶液５０μｌを加え、５分間放置した後３４３ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は、２．８０であった。
【００７８】
ＤＴＴ還元によって放出されたピリジン−２−チオンの３４３ｎｍにおける分子吸光係数を８．０８×１０３とするとその濃度［ピリジン−２−チオン］は数式（数式３）のように求めることができる。
【００７９】
【数３】
（数式３）
0003801133.tif 000010
【００８０】
この濃度はＣＧＧに導入されたＳＰＤＰの濃度に等しい。また、ＳＰＤＰの２−ピリジルジスルフィド基が２８０ｎｍおける吸光度に寄与することからＣＧＧ濃度の計算には次のような補正が必要である。ＣＧＧに起因する２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０，ＣＧＧ）は数式（数式４）のように求めることができる。ただし、２−ピリジルジスルフィド基の２８０ｎｍにおける分子吸光係数を５．１×１０３とする。
【００８１】
【数４】
（数式４）
0003801133.tif 000011
【００８２】
したがって、ＣＧＧの濃度［ＣＧＧ］、及びＣＧＧ１分子当たりに導入されたＳＰＤＰの分子数［ＳＰＤＰ］／［ＣＧＧ］は数式（数式５）のように求めることができる。ただし、ＣＧＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を１．９９×１０５とする。
【００８３】
【数５】
（数式５）
0003801133.tif 000012
【００８４】
２．ペプチドフルクトースのＣＧＧ結合体の作製
５０ｍｌのＣＧＧ−ＳＰＤＰ／ＰＢＳ溶液に４０ｍｇ（７．１８×１０−２ｍｍｏｌ）のピリジルジチオ誘導体を加え、４℃で一晩撹拌した。生じた沈澱物を遠心分離（１０分間、２００００ｒｐｍ）により除いた後、３４３ｎｍにおける吸光度（Ａ３４３）を測定したところ、３．５２であった。得られた上清をセファデックスＧ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、直径２ｃｍ×長さ８０ｃｍ）でゲル濾過して４８ｍｌのペプチドフルクトースのＣＧＧ結合体を得た。
【００８５】
ＣＧＧ１分子当たりのペプチドフルクトースの結合数を次のように決定した。反応直後のＡ３４３が３．５２であることより、放出されたピリジン−２−チオンの３４３ｎｍにおける分子吸光係数を８．０８×１０３とすると、その濃度［ピリジン−２−チオン］は数式（数式６）のように求めることができる。
【００８６】
【数６】
（数式６）
0003801133.tif 000013
【００８７】
この濃度はＣＧＧに導入されたペプチドフルクトースの濃度に等しい。ＣＧＧの濃度は１．４０×１０−５Ｍであったことから、ＣＧＧ１分子当たりに導入されたペプチドフルクトースの分子数［ペプチドフルクトース］／［ＣＧＧ］は数式（数式７）のように求めることができる。
【００８８】
【数７】
（数式７）
0003801133.tif 000014
【００８９】
（実施例２：ペプチドフルクトースの作製）
本実施例では、以下に示す手順により、下記式（ＶＩ）で示すペプチドフルクトースを作製した。
【００９０】
【化１１】
（ＶＩ）
0003801133.tif 000015
【００９１】
１．Ｗａｎｇ樹脂（固相）へのＣｙｓ基の導入
実施例１と同様の方法により、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎを作製した。
【００９２】
２．Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＲｅｓｉｎへのＴｈｒ基の導入
１９．２ｇ（７．６６８ｍｍｏｌ、Ｃｙｓ換算）のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎを５０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦに分散し、室温で１０分間撹拌した。溶媒を濾別除去した後、再び２０％ピペリジン／ＤＭＦの反応を繰り返した。樹脂を５０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄し、少量をメタノール液としてニンヒドリンテストを行い、アミノ基がフリーの状態であることを確認した。この樹脂を２０ｍｌのＤＭＦに分散し、これに９．７１９ｇ（１９．１７ｍｍｏｌ）のフルオレニルメトキシカルボニルスレオニン  ペンタフルオロフェニルエステル（以下、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏｐｆｐと略称する）を加え、室温で２時間撹拌した。樹脂を５０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄した後、少量をメタノール液としてニンヒドリンテストを行い、フリーのアミノ基が存在しないことを確認した。その後、樹脂をクロロホルムで３回洗浄し、真空下で一晩乾燥して、１７．２ｇの乾燥樹脂（以下、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎと略称する）を得た。
【００９３】
樹脂へのＴｈｒ基の導入度は、実施例１の場合と同様に測定した。Ｔｈｒ基の導入率は、４２％であった。
【００９４】
３．Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＲｅｓｉｎへのＬｅｕ基の導入  １５．２ｇ（６．４４４ｍｍｏｌ、Ｃｙｓ換算）のＦｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎを５０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦに分散し、室温で１０分間撹拌した。溶媒を濾別除去した後、再び２０％ピペリジン／ＤＭＦの反応を繰り返した。樹脂を５０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄し、少量をメタノール液としてニンヒドリンテストを行い、アミノ基がフリーの状態であることを確認した。この樹脂を２０ｍｌのＤＭＦに分散し、これに８．３６１ｇ（１６．１１ｍｍｏｌ）のフルオレニルメトキシカルボニルロイシン  ペンタフルオロフェニルエステル（以下、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏｐｆｐと略称する）を加え、室温で２時間撹拌した。樹脂を５０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄した後、少量をメタノール液としてニンヒドリンテストを行い、フリーのアミノ基が存在しないことを確認した。その後、樹脂をクロロホルムで３回洗浄し、真空下で一晩乾燥して、１３．４ｇの乾燥樹脂（以下、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎと略称する）を得た。
【００９５】
樹脂へのＬｅｕ基の導入度は、前記の場合と同様に測定した。Ｌｅｕ基の導入率は、２６％であった。
【００９６】
４．Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＲｅｓｉｎへのＨｉｓ基の導入
実施例１と同様の方法により、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎを作製した。
【００９７】
５．Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＲｅｓｉｎへのＶａｌ基の導入
実施例１と同様の方法により、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−Ｒｅｓｉｎを作製した。
【００９８】
６．樹脂からのペプチド鎖の脱離
実施例１と同様の方法により、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓを作製した。
【００９９】
７．アマドリ転位反応によるペプチド鎖へのフルクトースの導入
実施例１と同様の方法により、フルクトース−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓを作製した。
【０１００】
（ペプチドフルクトースのタンパク質結合体の作製）
本実施例では、タンパク質としてＣＧＧ、ＢＳＡ及びＫＬＨを用いた。
【０１０１】
１．ＣＧＧ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−フルクトースの作製
２００ｍｇ（１．３３×１０−３ｍｍｏｌ）のＣＧＧを約１０ｍｌのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら、１ｍｌのエタノールに溶解した、２０．９ｍｇ（０．０６６７ｍｍｏｌ、５０ｅｑ．）のＳＰＤＰ溶液をゆっくりと加えた。室温で３０分間撹拌した後、セファデックスＧ２５Ｍカラムを用いて精製し、２４ｍｌ（２．０７ｍｇ／ｍｌ）のＣＧＧ−ＳＰＤＰ溶液を得た。ＳＰＤＰのＣＧＧへの導入数を以下に示した方法で測定した。
【０１０２】
０．５ｍｌのＣＧＧ−ＳＰＤＰ溶液を採取し、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を測定したところ、６．０３であった。次にこれに１００ｍＭのジチオスレイトール溶液２５μｌを加え、３分間静置した後、３４３ｎｍにおける吸光度（Ａ３４３）を測定したところ、４．６７であった。３４３ｎｍにおける吸光はＤＴＴ還元によって放出されたピリジン−２−チオンに由来するもので、この量が導入されたＳＰＤＰの量と等しい。従って、ＳＰＤＰの濃度［ＳＰＤＰ］は数式（数式８）に示すように計算することができる。ただし、ピリジン−２−チオンの３４３ｎｍのモル吸光係数を８０８０とする。
【０１０３】
【数８】
（数式８）
0003801133.tif 000016
【０１０４】
２８０ｎｍの吸光はタンパク質由来のものであるが、導入されたＳＰＤＰが２８０ｎｍに吸光を持つことから、ＣＧＧの濃度［ＣＧＧ］を計算するには、数式（数式９）に示す補正が必要である。ただし、ＳＰＤＰの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を５１００、ＣＧＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を１．９９×１０５とし、（Ａ２８０，ＳＰＤＰ）はＳＰＤＰに起因する２８０ｎｍにおける吸光度、（Ａ２８０，ＣＧＧ）はＣＧＧに起因する２８０ｎｍにおける吸光度を表す。
【０１０５】
【数９】
（数式９）
0003801133.tif 000017
【０１０６】
従って、ＣＧＧ１分子あたりに導入されたＳＰＤＰの分子数［ＳＰＤＰ］／［ＣＧＧ］は数式（数式１０）に示すようになる。
【０１０７】
【数１０】
（数式１０）
0003801133.tif 000018
【０１０８】
得られたＣＧＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液（２．３２ｍｇ／ｍｌ、１３．５ｍｌ）を室温で撹拌しながら、０．１ｍｌのＰＢＳに溶解した、１１．７ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ、２ｅｑ．ＳＰＤＰ）のフルクトース−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓを滴下し、室温で３時間穏やかに撹拌した。反応の追跡は、反応液の３４３ｎｍにおける吸光度で行った。セファデックスＧ２５Ｍカラムを用いて精製し、３２ｍｌ（０．８８５ｍｇ／ｍｌ）のＣＧＧ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−フルクトースを得た。以下、このペプチドフルクトースのタンパク質結合体をＦ−ＣＧＧと略称する。
【０１０９】
２．ＫＬＨ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−フルクトースの作製
５７．８ｍｇ（５．７８×１０−４ｍｍｏｌ）のＫＬＨを約１０ｍｌのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら、１ｍｌのエタノールに溶解した、２．７ｍｇ（０．００８６７ｍｍｏｌ、１５ｅｑ．）のＳＰＤＰ溶液をゆっくりと加えた。室温で３０分間撹拌した後、セファデックスＧ２５Ｍカラムを用いて精製し、２８ｍｌ（１．４７ｍｇ／ｍｌ）のＫＬＨ−ＳＰＤＰ溶液を得た。ＳＰＤＰのＫＬＨへの導入数を以下に示した方法で測定した。
【０１１０】
０．５ｍｌのＫＬＨ−ＳＰＤＰ溶液を採取し、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を測定したところ、１．８８であった。次に、これに１００ｍＭのジチオスレイトール溶液２５μｌを加え、３分間静置した後、３４３ｎｍにおける吸光度（Ａ３４３）を測定したところ、０．３６５であった。３４３ｎｍにおける吸光はＤＴＴ還元によって放出されたピリジン−２−チオンに由来するもので、この量が導入されたＳＰＤＰの量と等しい。従って、ＳＰＤＰの濃度［ＳＰＤＰ］は数式（数式１１）に示すように計算することができる。ただし、ピリジン−２−チオンの３４３ｎｍのモル吸光係数を８０８０とする。
【０１１１】
【数１１】
（数式１１）
0003801133.tif 000019
【０１１２】
２８０ｎｍの吸光はタンパク質由来のものであるが、導入されたＳＰＤＰが２８０ｎｍに吸光を持つことから、ＫＬＨの濃度［ＫＬＨ］を計算するには、数式（数式１２）に示す補正が必要である。ただし、ＳＰＤＰの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を５１００、ＫＬＨの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を１．１２×１０５とし、（Ａ２８０，ＫＬＨ）はＫＬＨに起因する２８０ｎｍにおける吸光度を表す。
【０１１３】
【数１２】
（数式１２）
0003801133.tif 000020
【０１１４】
従って、ＫＬＨ１分子あたりに導入されたＳＰＤＰの分子数［ＳＰＤＰ］／［ＫＬＨ］は数式（数式１３）に示すようになる。
【０１１５】
【数１３】
（数式１３）
0003801133.tif 000021
【０１１６】
得られたＫＬＨ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液（２．６５ｍｇ／ｍｌ、１５．５ｍｌ）を室温で撹拌しながら、０．１ｍｌのＰＢＳに溶解した、８．８１ｍｇ（０．０１２ｍｍｏｌ、１０ｅｑ．ＳＰＤＰ）のフルクトース−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓを滴下し、室温で３時間穏やかに撹拌した。反応の追跡は、反応液の３４３ｎｍにおける吸光度で行った。セファデックスＧ２５Ｍカラムを用いて精製し、３２ｍｌ（１．１３ｍｇ／ｍｌ）のＫＬＨ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−フルクトースを得た。以下、このペプチドフルクトースのタンパク質結合体をＦ−ＫＬＨと略称する。
【０１１７】
３．ＢＳＡ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−フルクトースの作製
２００ｍｇ（０．００３０３ｍｍｏｌ）のＢＳＡを約１０ｍｌのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら、１ｍｌのエタノールに溶解した、４．７３ｍｇ（０．０１５２ｍｍｏｌ、５ｅｑ．）のＳＰＤＰ溶液をゆっくりと加えた。室温で３０分間撹拌した後、セファデックスＧ２５Ｍカラムを用いて精製し、１６ｍｌ（１０．４ｍｇ／ｍｌ）のＢＳＡ−ＳＰＤＰ溶液を得た。ＳＰＤＰのＢＳＡへの導入数を以下に示した方法で測定した。
【０１１８】
０．５ｍｌのＢＳＡ−ＳＰＤＰ溶液を採取し、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を測定したところ、９．１８であった。次に、これに１００ｍＭのジチオスレイトール溶液２５μｌを加え、３分間静置した後、３４３ｎｍにおける吸光度（Ａ３４３）を測定したところ、３．６３であった。３４３ｎｍにおける吸光はＤＴＴ還元によって放出されたピリジン−２−チオンに由来するもので、この量が導入されたＳＰＤＰの量と等しい。従って、ＳＰＤＰの濃度［ＳＰＤＰ］は数式（数式１４）に示すように計算することができる。ただし、ピリジン−２−チオンの３４３ｎｍのモル吸光係数を８０８０とする。
【０１１９】
【数１４】
（数式１４）
0003801133.tif 000022
【０１２０】
２８０ｎｍの吸光はタンパク質由来のものであるが、導入されたＳＰＤＰが２８０ｎｍに吸光を持つことから、ＢＳＡの濃度［ＢＳＡ］を計算するには、数式（数式１５）に示す補正が必要である。ただし、ＳＰＤＰの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を５１００、ＢＳＡの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を４．３６×１０４とし、（Ａ２８０，ＢＳＡ）はＢＳＡに起因する２８０ｎｍにおける吸光度を表す。
【０１２１】
【数１５】
（数式１５）
0003801133.tif 000023
【０１２２】
従って、ＢＳＡ１分子あたりに導入されたＳＰＤＰの分子数［ＳＰＤＰ］／［ＢＳＡ］は数式（数式１６）に示すようになる。
【０１２３】
【数１６】
（数式１６）
0003801133.tif 000024
【０１２４】
得られたＢＳＡ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液（１０．４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｌ）を室温で撹拌しながら、０．１ｍｌのＰＢＳに溶解した、１０．３ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ、２ｅｑ．ＳＰＤＰ）のフルクトース−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓを滴下し、室温で３時間穏やかに撹拌した。反応の追跡は、反応液の３４３ｎｍにおける吸光度で行った。セファデックスＧ２５Ｍカラムを用いて精製し、２４ｍｌ（６．５１ｍｇ／ｍｌ）のＢＳＡ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−フルクトースを得た。以下、このペプチドフルクトースのタンパク質結合体をＦ−ＢＳＡと表示略称する。
【０１２５】
（抗血清の作製及びその性能評価）
作製したペプチドフルクトースのタンパク質結合体のうち、Ｆ−ＣＧＧ及びＦ−ＫＬＨを免疫原として用い、以下の方法により抗血清の作製を行った。（表２）に、抗血清の作製に用いた、免疫原と免疫動物の組み合わせを示す。
【０１２６】
【表２】
（表２）
0003801133.tif 000025
【０１２７】
免疫時には、Ｆ−ＣＧＧまたはＦ−ＫＬＨと、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）とをホモジナイザで混合し、この混合物を免疫動物に投与した。前記混合物における最終タンパク濃度は１ｍｇ／ｍｌである。２種類の免疫原を用いて、図１に示した免疫スケジュールに従って免疫を行った。初回免疫後７週経過した時点で得られた抗血清について、ＥＬＩＳＡを用いて性能の評価を行った。ＥＬＩＳＡ条件を（表３）に、免疫原がＦ−ＣＧＧの場合の評価結果を図２に、免疫原がＦ−ＫＬＨの場合の評価結果を図３に示す。図２及び図３において、横軸は血清希釈率、縦軸は測定波長４９２ｎｍでの吸光度を表す。なお、図２及び図３において、血清希釈率が無限大における測定点は、血清が存在しない試料についての測定結果を表す。
【０１２８】
【表３】
（表３）
0003801133.tif 000026
【０１２９】
Ｆ−ＣＧＧを免疫原とした抗血清及びＦ−ＫＬＨを免疫原とした抗血清ともに、血清希釈率が１０５〜１０６において力価がみられ、ＩｇＧの産生量がＩｇＭの産生量よりも多いことから、良好な性能を有することがわかる。
【０１３０】
（実施例３：モノクローナル抗体の作製）
本実施例においては、免疫原として用いる結合体作製用のタンパク質としてＣＧＧおよびＫＬＨを用いた。また、骨髄腫由来の細胞としてはｐ３ｘ６３・Ａｇ８・６５３を用い、細胞選択の際の評価法としてはＥＬＩＳＡを採用した。そしてＥＬＩＳＡでの評価用として、ＢＳＡをタンパク質とする結合体を作製した。
【０１３１】
（免疫原となる結合体の作製）
１．ＣＧＧのピリジルジチオプロピオニル化（ＣＧＧ−ＳＰＤＰの作製）
２００ｍｇ（１．３３×１０−３ｍｍｏｌ）のＣＧＧを５０ｍｌのリン酸バッファーサリン（以下、ＰＢＳと略称する）に溶解し、撹拌しながら５ｍｌのＳＰＤＰ／エタノール溶液（ＳＰＤＰ＝４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１００等量）を滴下した。室温で３０分間撹拌した後、生じた沈澱物を遠心分離（１０分間、２００００ｒｐｍ）により除いた。得られた上清をセファデックスＧ２５Ｍカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、直径２ｃｍ×長さ８０ｃｍ）でゲル濾過し、８０ｍｌのＣＧＧ−ＳＰＤＰ／ＰＢＳ溶液を得た。
【０１３２】
ＣＧＧ１分子あたりのＳＰＤＰの結合数を次のように決定した。得られたＣＧＧ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液のうち１ｍｌを用いて２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は、３．７３であった。
【０１３３】
これに１００ｍＭのジチオスイレイトール（以下、ＤＴＴと略称する）水溶液５０μｌを加え、５分間放置した後３４３ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は、２．８０であった。
【０１３４】
ＤＴＴ還元によって放出されたピリジン−２−チオンの３４３ｎｍにおける分子吸光係数を８．０８×１０３とするとその濃度［ピリジン−２−チオン］は数式（数Ａ）のように求めることができる。
【０１３５】
（数Ａ）
［ピリジン−２−チオン］  ＝  ２．８０／（８．０８×１０３）
＝  ３．４７×１０−４（Ｍ）
この濃度はＣＧＧに導入されたＳＰＤＰの濃度に等しい。また、ＳＰＤＰの２−ピリジルジスルフィド基が２８０ｎｍおける吸光度に寄与するのでＣＧＧ濃度の計算には次のような補正が必要である。ＣＧＧに起因する２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０，ＣＧＧ）は数式（数Ｂ）のように求めることができる。ただし、２−ピリジルジスルフィド基の２８０ｎｍにおける分子吸光係数を５．１×１０３とする。
【０１３６】
（数Ｂ）
Ａ２８０，ＣＧＧ  ＝  ３．７３−（３．４７×１０−４×５．１×１０３）
＝  １．９６
したがって、ＣＧＧの濃度［ＣＧＧ］、及びＣＧＧ１分子当たりに導入されたＳＰＤＰの分子数［ＳＰＤＰ］／［ＣＧＧ］は数式（数Ｃ）のように求めることができる。ただし、ＣＧＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を１．９９×１０５とする。
【０１３７】
（数Ｃ）
［ＣＧＧ］  ＝  １．９６／（１．９９×１０５）
＝  ９．８５×１０−６（Ｍ）
［ＳＰＤＰ］／［ＣＧＧ］  ＝  ３．４７×１０−４／（９．８５×１０−６）
＝  ３５．２
２．ペプチドフルクトースとＣＧＧとの結合体作製
５０ｍｌのＣＧＧ−ＳＰＤＰ／ＰＢＳ溶液に４０ｍｇ（７．１８×１０−２ｍｍｏｌ）のピリジルジチオ誘導体を加え、４℃で一晩撹拌した。生じた沈澱物を遠心分離（１０分間、２００００ｒｐｍ）により除いた後、３４３ｎｍにおける吸光度（Ａ３４３）を測定した。Ａ３４３＝３．５２であった。得られた上清をセファデックスＧ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、直径２ｃｍ×長さ８０ｃｍ）でゲル濾過して４８ｍｌのペプチドフルクトースのＣＧＧ結合体を得た。
【０１３８】
ＣＧＧ１分子当たりのペプチドフルクトースの結合数を次のように決定した。反応直後のＡ３４３が３．５２であることより、放出されたピリジン−２−チオンの３４３ｎｍにおける分子吸光係数を８．０８×１０３とすると、その濃度［ピリジン−２−チオン］は数式（数Ｄ）のように求めることができる。
（数Ｄ）
［ピリジン−２−チオン］  ＝  ３．５２／（８．０８×１０３）
＝  ４．３５×１０−４（Ｍ）
この濃度はＣＧＧに導入されたペプチドフルクトースの濃度に等しい。ＣＧＧの濃度は１．４０×１０−５Ｍであったことから、ＣＧＧ１分子当たりに導入されたペプチドフルクトースの分子数［ペプチドフルクトース］／［ＣＧＧ］は数式（数Ｅ）のように求めることができる。
（数Ｅ）
［ペプチドフルクトース］／［ＣＧＧ］  ＝  ４．３５×１０−４／１．４０×１０−５
＝  ３１．１
３．ＫＬＨとペプチドフルクトースとの結合体作製
５４ｍｇのＫＬＨと５．４２ｍｇ（３０ｅｑ．）のＳＰＤＰとを用いて、前述のＣＧＧの場合と同様の操作を行って、ピリジルジチオプロピオニル化ＫＬＨ（ＫＬＨ−ＳＰＤＰ）を作製し、ＫＬＨ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液２８ｍｌを得た（濃度１．４７ｍｇ／ｍｌ）。ＫＬＨ１分子あたりのＳＰＤＰの導入数は３．０であった。
【０１３９】
得られたＫＬＨ−ＳＰＤＰ溶液のうち、１５．５ｍｌ（４１．１ｍｇ）を用いて、前述の場合と同様にペプチドフルクトース（６．４ｍｇ）との反応を行い、３３．３ｍｇ（３．３３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｌ）のペプチドフルクトースのＫＬＨ結合体を得た。ＫＬＨ１分子あたりのペプチドフルクトースの導入数は２．７であった。
【０１４０】
４．ＢＳＡとペプチドフルクトースとの結合体作製
ＥＬＩＳＡでの評価用としてペプチドフルクトースとＢＳＡとの結合体を作製した。２００ｍｇのＢＳＡと４．７３ｍｇ（５ｅｑ．）のＳＰＤＰとを用いて、前述のＣＧＧ、ＫＬＨの場合と同様の操作を行って、ピリジルジチオプロピオニル化ＢＳＡ（ＢＳＡ−ＳＰＤＰ）を作製し、ＢＳＡ−ＳＰＤＰのＰＢＳ溶液１６ｍｌを得た（濃度１０．４ｍｇ／ｍｌ）。ＢＳＡ１分子あたりのＳＰＤＰの導入数は２．８であった。
【０１４１】
得られたＢＳＡ−ＳＰＤＰ溶液１６ｍｌを用いて、前述の場合と同様にペプチドフルクトース（７．４ｍｇ）との反応を行い、１５６．２ｍｇ（６．５１ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｌ）のペプチドフルクトースのＢＳＡ結合体を得た。ＢＳＡ１分子あたりのペプチドフルクトースの導入数は２．５であった。
【０１４２】
（モノクローナル抗体産生細胞およびモノクローナル抗体の作製方法）
１．マウスの免疫
生後約８週のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）１０匹を５匹ずつ２つのグループに分け、前述のように作製した２種類の免疫原（ＣＧＧ結合体、ＫＬＨ結合体）をそれぞれ腹腔内に１００μＬずつ注射した。
【０１４３】
２．抗体産生のチェック
免疫注射後、７７日を経過したマウスについて、眼静脈より５０〜１００μＬの血液を遠心管に採取した。血清を遠心分離し、ＥＬＩＳＡ法（後出）による抗体価の評価を行ったところ、全てのマウスについて抗ＨｂＡ１ｃ抗体の産生が確認された。
【０１４４】
３．マウスのブースト
前述の抗体価の評価で、特に力価の高かったマウス（ＣＧＧ結合体を免疫原として用いたグループ）についてマウスの脾臓を肥大させるためにブースト（弱い免疫原の注射）を行った。免疫原はフルクトースのＣＧＧ結合体をＰＢＳで希釈して得た１ｍｇ／ｍＬ溶液を、アジュバントを加えずにそのまま用いた。
【０１４５】
４．細胞融合
ブースト後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出し、平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞ライン（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）と融合した。フィーダー（成長因子を供給する細胞）として同じマウスの脾臓細胞を用い、９６ウェルプレート２枚の上で１５％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むＨＡＴ培地で培養した。１週間後、１５％のＦＣＳを含むＨＴ培地と交換した。
【０１４６】
５．クローニング
ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定を行い、力価の高いものから上位５ウェルを選択した。
【０１４７】
ウェルあたり１個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート５枚に分注した。フィーダーとして生後５週のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時上清についてＥＬＩＳＡ法による抗体価測定を繰り返し、ＨｂＡ１ｃに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞群を最終的に選別し、２００ｍｌ中で５ｘ１０５  細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。
【０１４８】
６．最終的に選別された細胞は、上清を遠心分離し、５×１０６  細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルホキシド＝９：１の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１４９】
７．２−メルカプトピリジン結合ゲル（ＨｉＴｒａｐ  ＩｇＭ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）
を用いたアフィニティークロマトグラフィにより細胞培養上清からモノクローナル抗体を精製した。このモノクローナル抗体は、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ製）による検定の結果、ＩｇＭであることを確認した。
【０１５０】
（ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定）
前述の抗体作製時に得られた抗血清、培養上清の評価はＥＬＩＳＡ法を用いて行った。その測定条件および測定方法を以下に記載する。
【０１５１】
１．抗原のコーティング
ペプチドフルクトースのＢＳＡ結合体を、０．１ｍｇ／ｍｌおよび０．０４％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで希釈して（ＢＳＡ・ＰＢＳ・Ａｚ）ＢＳＡの濃度として０．１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液を調製した。マイクロプレート（塩化ビニル製９６ウェルプレート  Ｃｏｓｔａｒ製）に抗原溶液を１００μＬ／ウェル注入し、２０℃で一晩静置した。アスピレータで抗原溶液を除去した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【０１５２】
また、測定の必要に応じて、コート用の抗原として精製ＨｂＡ１ｃ、および精製ＨｂＡ０を用いた。この場合、抗原の濃度は０．０２ｍｇ／ｍｌとし、ウェルに注入後４℃で一晩静置した。
【０１５３】
２．ブロッキング
１％ＢＳＡ・ＰＢＳ・Ａｚを２００μＬ／ウェル注入し、３０分間室温で静置した。その後、アスピレータでＢＳＡ・ＰＢＳ・Ａｚを除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。即日に以降の実験を行わないときは、この状態で、水で湿したろ紙と共に４℃で保存した。
【０１５４】
３．抗体の反応
上記手順で調整したプレートを用いて、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ・Ａｚで種々の希釈率に希釈した抗体溶液（血清、培養上清、精製抗体など）１００μＬ／ウェルを注入した。室温で３時間静置した後、アスピレータで抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【０１５５】
４．二次抗体の反応
０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ、もしくはＩｇＭ抗体ヤギ由来（ＫＰＬ製）を１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したもの（二次抗体溶液）１００μＬ／ウェル注入し、室温で３０分静置した。アスピレータで二次抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【０１５６】
５．基質の反応および停止
ｏ−フェニレンジアミン（生化学用）４０ｍｇを、１０ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、使用直前に３０％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（基質溶液）を１００μＬ／ウェル注入し、室温で静置した。３〜５分後、４Ｎ硫酸を２５μＬ／ウェル注入して反応を停止した。
【０１５７】
６．測定
マイクロプレートリーダ（東ソー製）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【０１５８】
（抗体価測定の結果）
上記の方法によって、細胞融合の直前に採取した抗血清（免疫後７７日）の抗体価の測定結果を図４に、クローニングによって選択した２クローン（４Ｆおよび８Ｅ）の培養上清より精製分取したモノクローナル抗体の抗体価の測定結果を図５（４Ｆ）および図６（８Ｅ）に示す。
【０１５９】
図４の結果は免疫後７７日時点での抗血清が、擬似抗原であるＢＳＡ−ペプチドフルクトースと、ＨｂＡ１ｃとに同様の結合能を有していることを示している。また、ＨｂＡ０に対してはほとんど結合能を示さないことから、この抗血清は当初の目的どおりＨｂＡ１ｃのフルクトース結合部位を認識するものであると考えられる。
【０１６０】
また、細胞融合後のクローニングによって選択した２種類のクローン（４Ｆ，８Ｅ）は、結合半値でそれぞれ１×１０−９Ｍ、３×１０−９Ｍの結合能を有していることを示している。
【０１６１】
寄託
本発明において得られたハイブリドーマ２株を、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に２００１年６月２２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７６３７およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７６３６として寄託した。
【０１６２】
産  業  上  の  利  用  可  能  性
以上のように、本発明のペプチドフルクトースは、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造であるフルクトース−バリン−ヒスチジンに加えて−ＳＨ基が導入されていることから、タンパク質との結合が容易であり、タンパク質と結合させることによりタンパク質結合体を作製することができる。
【０１６３】
また、本発明のペプチドフルクトースのタンパク質結合体は、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造であるフルクトース−バリン−ヒスチジンと、ヘモグロビンを除くタンパク質とを有していることから、ＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンとは共通する構造を持たないため、これを免疫原として用いることにより、ＨｂＡ０とは交叉反応性を有さず、好ましくは、ＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンとは交叉反応性を持たない抗ＨｂＡ１ｃ抗体を確実に作製することができる。
【０１６４】
本発明は（Ｉ）に示す構造式を含むペプチドフルクトースとタンパク質との結合体からなる免疫原で感作されたマウスの脾臓細胞と、骨髄種由来の細胞ラインとを融合後、クローニングして得られるモノクローナル抗体産生細胞であり、その産生細胞が作り出すものモノクローナル抗体である。したがって、ヒトヘモグロビン中のＨｂＡ１ｃに対して特異性をもつモノクローナル抗体、およびこれを産生する抗体産生細胞を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の１実施形態において用いた免疫スケジュールを示す。
【図２】  図２は、本発明の１実施形態（Ｆ−ＣＧＧ）の抗血清の性能評価を示す図である。
【図３】  図３は、本発明の１実施形態（Ｆ−ＫＬＨ）の抗血清の性能評価を示す図である。
【図４】  図４は、本発明の１実施形態の抗血清について、免疫後７７日での抗体価を示す図である。
【図５】  図５は、本発明の１実施形態のモノクローナル抗体（４Ｆ）の抗体価を示す図である。
【図６】  図６は、本発明の１実施形態のモノクローナル抗体（８Ｅ）の抗体価を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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