(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の核酸を真核宿主細胞に導入する方法であって、
（ａ）Ｃａ2+、ＰＯ43-、および所望の核酸を混合して沈殿混合物を形成させ、
（ｂ）該沈殿混合物をインキュベーションしてリン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子を形成させ、この粒子を平均長３００ｎｍまでに成長させ、
（ｃ）（１）沈殿混合物を希釈すると同時に該沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、工程（ｂ）において沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度で成長することができるトランスフェクション混合物を形成させ、そして（２）該沈殿混合物を希釈して希釈された沈殿混合物を形成させ、次いで該希釈沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、工程（ｂ）において沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度で成長することができるトランスフェクション混合物を形成させることからなる群から選ばれる工程を実施し、そして
（ｄ）該トランスフェクション混合物をインキュベーションして該粒子を真核宿主細胞に取り込ませることによりトランスフェクトされた細胞を形成させる、ことを含む方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において該粒子を１００ｎｍまでの平均長に成長させるものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該真核宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において該沈殿混合物が６０秒間までの期間インキュベーションされるものである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）において該沈殿混合物が３０秒間までの期間インキュベーションされるものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
所望の核酸がＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）において、該沈殿混合物が初期Ｃａ2+濃度２５０ｍＭを含むものである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）において、該沈殿混合物が初期濃度５０μｇ／ｍＬの所望のＤＮＡを含むものである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）において、該トランスフェクション混合物が工程（ｂ）の沈殿混合物の初期Ｃａ2+濃度より少なくとも１０倍低い初期Ｃａ2+濃度を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
所望の核酸を浮遊液中の真核宿主細胞に導入する方法であって、
（ａ）Ｃａ2+、ＰＯ43-、および所望の核酸を混合して沈殿混合物を形成させ、
（ｂ）該沈殿混合物をインキュベーションしてリン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子を形成させ、該粒子を平均長３００ｎｍまでに成長させ、
（ｃ）（１）沈殿混合物を希釈すると同時に該沈殿混合物を、浮遊液中の細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、工程（ｂ）において沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度で成長することができるトランスフェクション混合物を形成させ、そして（２）該沈殿混合物を希釈して希釈された沈殿混合物を形成させ、次いで該希釈沈殿混合物を、浮遊液中の細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、工程（ｂ）において沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度で成長することができるトランスフェクション混合物を形成させることからなる群から選ばれる工程を実施し、そして
（ｄ）該トランスフェクション混合物をインキュベーションして該粒子を真核宿主細胞に取り込ませることにより浮遊液中でトランスフェクトされた細胞を形成させる、ことを含む方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）において該粒子を１００ｎｍまでの平均長に成長させるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）において該沈殿混合物を２分間までの期間インキュベーションするものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において該沈殿混合物を１分間までの期間インキュベーションするものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）において該沈殿混合物を３０秒間までの期間インキュベーションするものである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）において該トランスフェクション混合物が少なくとも１Ｌの全容量を含むものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）において該トランスフェクション混合物が少なくとも２０Ｌの全容量を含むものである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
真核宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
該所望の核酸がＤＮＡである請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）において該沈殿混合物が初期ＰＯ43-濃度１．１２５ｍＭを含むものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ａ）において該沈殿混合物が初期濃度５０μｇ／ｍＬの所望のＤＮＡを含むものである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｄ）の後にさらに該粒子を該トランスフェクション混合物中で溶解させ、浮遊液中でトランスフェクトされた細胞を成長させる工程（ｅ）を含むものである請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）において、該沈殿混合物または希釈された沈殿混合物を浮遊液中の真核宿主細胞を含む混合物と混合する前に、浮遊液中の真核宿主細胞を含む混合物中のＣａ2+濃度を７．５ｍＭに増加させるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）において所望の核酸、Ｃａ2+、およびＰＯ43-を取り込みパイプに注入し、工程（ｂ）において沈殿混合物を取り込みパイプ中でインキュベーションし、次いで工程（ｃ）において取り込みパイプの沈殿混合物を、浮遊液中の真核宿主細胞を含む混合物を含む培養器中に注ぎ入れるものである請求項１０の方法。
【請求項２４】
工程（ａ）において所望の核酸、Ｃａ2+、およびＰＯ43-を取り込みパイプに注入し、工程（ｂ）において沈殿混合物を取り込みパイプ中でインキュベーションし、次いで工程（ｃ）において希釈物を、該核酸、Ｃａ2+、およびＰＯ43-取り込み口の下流のポイントで別の取り込みパイプを介して該沈殿混合物に注ぎ入れ、該沈殿混合物を稀釈して稀釈された沈殿混合物を形成させ、次いで工程（ｃ）において、取り込みパイプの稀釈された沈殿混合物を浮遊液中の真核宿主細胞を含む混合物を含む培養容器中に注ぎ入れるものである請求項１０の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）において、該トランスフェクション混合物が工程（ｂ）の沈殿混合物の初期Ｃａ2+濃度より少なくとも１０倍低い初期Ｃａ2+濃度を含むものである請求項１０の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する分野
本発明は核酸トランスフェクションの分野、より詳細にはリン酸カルシウム共沈殿法による真核細胞の核酸トランスフェクション法に関する。
背景および関連技術分野の説明
真核宿主細胞に外来ＤＮＡを導入する能力は、組換えＤＮＡ技術の本質的手段の１つである。真核宿主細胞の外来ＤＮＡによるトランスフェクション法は大きく以下の４つのカテゴリーに分けることができる。（１）マイクロインジェクションまたは微細粒子衝撃法によるクローン化ＤＮＡの直接導入、（２）ウイルスベクターの使用、（３）キャリアー系へのカプセル化、および（４）リン酸カルシウムやジエチルアミノエチル（DEAE）−デキストランのような促進剤の使用。ＤＮＡトランスフェクションの促進剤として使用される試薬のうち、リン酸カルシウムはその単純さと種々の細胞タイプ全般に対して効果があることから依然として最も広く用いられている。
リン酸カルシウムトランスフェクション法の最初のプロトコールはGrahamおよびvan der Ebの、Virology, 52:456-467（1973）に記載された。この方法はWiglerら（Proc. Natl. Acad. Sci., 76:1373-1376（1979））およびChenとOkayama（Mol. Cell. Biol., 7:2745-2752（1987））によって改良された。それにも関わらず、最初のおよび改良されたプロトコールでは、一過性または安定なＤＮＡの伝達に適合した実験においてトランスフェクション効率と発現が比較的低い。したがって、リン酸カルシウムトランスフェクション法の改良が依然として求められている。さらに、浮遊培養、特に大規模な浮遊培養の領域において、リン酸カルシウムトランスフェクション法が求められている。
本目的および他の目的は当業者に明らかであろう。
発明の要約
本発明は、Ｃａ2+、ＰＯ43-、および所望の核酸を混合して沈殿混合物を形成させ、該沈殿混合物をインキュベーションしてリン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子を形成させて該粒子を平均直径約３００nmまでに成長させ、次いで以下の工程からなる群から選ばれる工程を実施することを含む。真核宿主細胞に所望の核酸を導入する方法を提供するものである。（１）沈殿混合物を希釈すると同時に該沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度でさらに成長することができるトランスフェクション混合物を形成させる、および（２）該沈殿混合物を希釈して希釈された沈殿混合物を形成させ、次いで該希釈沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度でさらに成長することができるトランスフェクション混合物を形成させ、そして該トランスフェクション混合物をインキュベーションすることにより該粒子を該真核宿主細胞に取り込ませ、トランスフェクトされた細胞を形成させる。
さらに、本発明は、Ｃａ2+、ＰＯ43-、および所望の核酸を混合して沈殿混合物を形成させ、該沈殿混合物を、約６０秒間までインキュベーションしてリン酸カルシウムと所望の核酸を含む沈殿物を形成させ、次いで以下の工程からなる群から選ばれる工程を実施することを含む、真核宿主細胞に所望の核酸を導入する方法を提供するものである。（１）沈殿混合物を希釈すると同時に該沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度でさらに成長することができるトランスフェクション混合物を形成させる、および（２）該沈殿混合物を希釈して希釈された沈殿混合物を形成させ、次いで該希釈沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度でさらに成長することができるトランスフェクション混合物を形成させ、そして該トランスフェクション混合物をインキュベーションすることにより該粒子を該真核宿主細胞に取り込ませ、トランスフェクトされた細胞を形成させる。
本発明は、Ｃａ2+、ＰＯ43-、および所望の核酸を混合して沈殿混合物を形成させ、該沈殿混合物をインキュベーションしてリン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子を形成させて該粒子を平均直径約３００nmまでに成長させ、次いで以下の工程からなる群から選ばれる工程を実施することを含む、浮遊液中の真核宿主細胞に所望の核酸を導入する方法を提供するものである。（１）沈殿混合物を希釈すると同時に該沈殿混合物を浮遊液中の細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度でさらに成長することができるトランスフェクション混合物を形成させる、および（２）該沈殿混合物を希釈して希釈された沈殿混合物を形成させ、次いで該希釈沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が、沈殿混合物中で成長する速度より実質的に遅い速度でさらに成長することができるトランスフェクション混合物を形成させ、そして該トランスフェクション混合物をインキュベーションすることにより該粒子を該真核宿主細胞に取り込ませ浮遊液中のトランスフェクトされた細胞を形成させる。
【図面の簡単な説明】
図１は、２５μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、１２５ｍＭ Ｃａ2+および０．６ｍＭ ＰＯ43-を用いて形成されたリン酸カルシウム沈澱物のＤＮＡ結合能に対する温度とインキュベーション時間の影響を示すグラフである。影付、白、および黒カラムのインキュベーション時間はそれぞれ１、５および２０分である。
図２は、１２５ｍＭ Ｃａ2+および０．６ｍＭ ＰＯ43-を用いて形成されたリン酸カルシウム沈殿物のＤＮＡ結合能に対するＤＮＡ濃度とインキュベーション時間の影響を示すグラフである。影、白、および黒カラムのインキュベーション時間はそれぞれ１、５および２０分である。
図３は、５０μｇ／ｍＬ ＤＮＡおよび０．７５ｍＭ ＰＯ43-を用いて形成されたリン酸カルシウム沈殿物のＤＮＡ結合能に対するＣａ2+濃度、インキュベーション温度、およびインキュベーション時間の影響を示すグラフである。影、白、および黒カラムのインキュベーション時間はそれぞれ１、５および２０分である。
図４は、細胞の全ポピュレーションのパーセンテージで表した、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）染色陽性の宿主細胞数によって測定したトランスフェクトＣＨＯまたは２９３宿主細胞中のβ−ガラクトシダーゼの一過性発現に対するＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿のインキュベーション時間の影響を示すグラフである。ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿は２５μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、１２５ｍＭ Ｃａ2+および０．７５ｍＭ ＰＯ43-を用いて実施された。影付および黒カラムは、それぞれチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト胎児腎２９３細胞（２９３細胞）宿主を示す。
図５は、ＥＬＩＳＡで細胞培養上清中に検出されたヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）量によって測定されたトランスフェクトＣＨＯまたは２９３細胞におけるｔＰＡの一過性発現に対するＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿のインキュベーション時間の影響を示すグラフである。ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿は２５μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、１２５ｍＭ Ｃａ2+および０．７５ｍＭ ＰＯ43-を用いて実施された。影付および黒カラムは、それぞれＣＨＯおよび２９３細胞宿主を表す。
図６は、ＥＬＩＳＡにより宿主細胞中に検出されたｔＰＡ量によって測定されたトランスフェクトＣＨＯ細胞におけるｔＰＡの一過性発現に対するＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿のインキュベーション時間の影響を示すグラフである。ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿は２５または５０μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、２５０ｍＭ Ｃａ2+および０．７５ｍＭ ＰＯ43-を用いて実施された。白および黒カラムは、それぞれ２５および５０μｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度を表す。
図７は、３７℃における、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび３０ｍＭ Ｎ−３−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．２）を含む溶液中のＣａ2+濃度とＰＯ43-濃度の作用としてのリン酸カルシウムの溶解性を示すグラフである。
図８は、３７℃における、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．９５ｍＭ ＰＯ43-を含む溶液中の、Ｃａ2+濃度とｐＨの作用としてのリン酸カルシウムの溶解性を示すグラフである。
図９は、浮遊培養中でトランスフェクトされた２９３宿主細胞におけるＴＮＫ ｔＰＡの一過性発現に対するＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿混合物のＰＯ43-濃度とトランスフェクション混合物のインキュベーション時間の影響を示すグラフである。発現レベルは、ＥＬＩＳＡにより浮遊培養上清中に検出されたＴＮＫ ｔＰＡの量で示される。ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿法は、５０μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、１２５ｍＭ Ｃａ2+、および０．７５、１．１２５または１．５ｍＭ ＰＯ43-を用いて実施された。各ＰＯ43-濃度の暗い影付カラム（左外）は、２０時間インキュベーションしたトランスフェクション混合物の（「Ｂ」で示す）と２７時間インキュベーションしたトランスフェクション後培養（全体）を示す。各ＰＯ43-濃度の黒カラム（左中）は、２０時間インキュベーションしたトランスフェクション混合物（「Ｂ」で示す）と５２時間インキュベーションしたトランスフェクション後培養（全体）を示す。各ＰＯ43-濃度の白カラム（右中）は、４時間インキュベーションしたトランスフェクション混合物（「Ａ」で示す）と２７時間インキュベーションしたトランスフェクション後培養（全体）を示す。各ＰＯ43-濃度の明るい影付カラム（右外）は、４時間インキュベーションしたトランスフェクション混合物（「Ａ」で示す）と５２時間インキュベーションしたトランスフェクション後培養（全体）を示す。
図１０は、浮遊培養中でトランスフェクトされた２９３細胞におけるＴＮＫ ｔＰＡの一過性発現に対するトランスフェクション混合物のＣａ2+濃度とインキュベーション時間の影響を示すグラフである。発現レベルは、ＥＬＩＳＡにより浮遊培養上清中に検出されたＴＮＫ ｔＰＡの量で示される。ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿は、５０μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、１２５ｍＭ Ｃａ2+、および１．１２５ｍＭ ＰＯ43-を用いて実施された。コントロールトランスフェクションは、細胞浮遊液をＤＮＡおよびＣａ2+のみと接触させる（ＰＯ43-存在下であらかじめ共沈殿させることなしに）ことによって行った。示したＣａ2+濃度は、トランスフェクション混合物中の初期Ｃａ2+濃度である。各Ｃａ2+濃度の暗い影付カラム（左外）は、２０時間インキュベーションしたトランスフェクション混合物（「Ｂ」で示す）および２７時間インキュベーションしたトランスフェクション後培養（全体）を示す。各Ｃａ2+濃度の黒カラム（左中）は、２０時間インキュベーションしたトランスフェクション混合物（「Ｂ」で示す）および５２時間インキュベーションしたトランスフェクション後培養（全体）を示す。各Ｃａ2+濃度の白カラム（右中）は、４時間インキュベーションしたトランスフェクション混合物（「Ａ」で示す）および２７時間インキュベーションしたトランスフェクション後培養（全体）を示す。各Ｃａ2+濃度の明るい影付カラム（右外）は、４時間インキュベーションしたトランスフェクション混合物（「Ａ」で示す）および５２時間インキュベーションしたトランスフェクション後培養（全体）を示す。
図１１は、浮遊培養中でトランスフェクトされた２９３宿主細胞におけるＤＮａｓｅの一過性発現と細胞密度の時間経過を示すグラフである。発現レベルは、ＥＬＩＳＡにより浮遊培養上清中に検出されたＤＮａｓｅの量で示される。トランスフェクションの時間を０時で示す。Ｘ’ｓは、全培養容量のパック細胞容量（ＰＣＶ）パーセンテージで表した細胞密度であり、白抜括弧はＤＮａｓｅ価（μｇ／ｍＬ）を示す。ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿は、全容量６０ｍＬ中、２０μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、２５０ｍＭ Ｃａ2+、および０．７５ｍＭ ＰＯ43-を用いて実施された。該共沈殿物を室温で１〜２分間インキュベーションし、次いで０．１９％ＰＣＶで１Ｌ浮遊培養に加え、トランスフェクション混合物中の初期Ｃａ2+濃度を１５ｍＭとした。３７℃で３．５時間培養した後、該トランスフェクション混合物に新鮮培地１Ｌを加えた。
好ましい態様の詳細な説明
Ａ．定義
本明細書中で用いている用語「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム共沈殿、ウイルスによる形質導入、リポソーム融合、マイクロインジェクション、微細粒子衝撃、およびエレクトロポーレーションなどを含む当該技術分野で知られたあらゆる方法によって宿主細胞に細胞外核酸を導入することと定義される。用語「宿主細胞による核酸の取り込み（uptake）」、「宿主細胞による核酸の取り込み（taking up）」、「宿主細胞による核酸含有粒子の取り込み（uptake）」、および「宿主細胞による核酸含有粒子の取り込み（taking up）」は、付随する物質を有するかまたは有しない細胞外核酸が宿主細胞に入るあらゆる方法を表す。
本明細書で用いている用語［核酸−リン酸カルシウム共沈殿」および「リン酸カルシウム共沈殿」は、溶液中の核酸、Ｃａ2+およびＰＯ43-が不溶性粒子、すなわち、ヒドロキシアパタイト（（Ｃａ5ＯＨ（ＰＯ4）3）2の近似化学式を有し、本明細書中で「リン酸カルシウム」と呼ばれている）と核酸を含む沈殿物を形成する方法を表す。この定義には、そのような粒子をさらに沈殿させるかまたは凝集および／または再配列することによる該粒子の成長も含まれる。
本明細書において用語「リン酸カルシウムトランスフェクション」は、リン酸カルシウムを用いて核酸の宿主細胞への取り込みを促進する宿主細胞のトランスフェクション法を表す。
本明細書において用語「形質転換」は、核酸を染色体統合物または染色体外エレメントとして複製可能とするために核酸を宿主細胞に導入することを表す。
本明細書において用語「細胞壁に欠く真核宿主細胞」は、哺乳動物細胞、鳥類細胞、は虫類細胞、再生類細胞、および魚類細胞のようなすべての脊椎動物細胞、ならびに昆虫細胞、甲殻類細胞および軟体動物細胞、および原生動物細胞などのような多細胞無脊椎動物細胞を含む、その細胞の天然の状態において細胞壁を持たないあらゆる有核細胞、ならびにその天然の細胞壁が取り除かれているかもしくはプロトプラストを形成することができるかまたはプロトプラストを形成するために処理されることができるすべての植物細胞を含む細胞壁が存在しない天然または人工的に誘導された状態にあるあらゆる有核細胞を表す。
本明細書において用語「所望の核酸」は、あらゆる所望のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを表す。
本明細書において用語［所望のＤＮＡ」は、例えば、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、鎖の１本または２本ともが２またはそれ以上のフラグメントからなる２本鎖ＤＮＡ、鎖の１本または２本ともが連続したホスホジエステルバックボーンを有する２本鎖ＤＮＡ、１またはそれ以上の１本鎖部分および１またはそれ以上の２本鎖部分を含むＤＮＡ、ＤＮＡ鎖が完全に相補性である２本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ鎖の一部のみが相補性である２本鎖ＤＮＡ、環状、共有結合的に閉じたＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、共有結合的に架橋したＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、半合成ＤＮＡ、生合成ＤＮＡ、天然の単離ＤＮＡ、酵素消化されたＤＮＡ、切断されたＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、放射性標識ＤＮＡやフルオロクロム標識ＤＮＡのような標識ＤＮＡ、１またはそれ以上の非天然に生じる核酸を含むＤＮＡなどを含む、宿主細胞をトランスフェクトするために選ばれるあらゆるポリデオキシヌクレオチドであると定義される。
本明細書において用語「所望のＲＮＡ」は、例えば、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、鎖の１本または２本ともが２またはそれ以上のフラグメントからなる２本鎖ＲＮＡ、鎖の１本または２本ともが連続したホスホジエステルバックボーンを有する２本鎖ＲＮＡ、１またはそれ以上の１本鎖部分および１またはそれ以上の２本鎖部分を含むＲＮＡ、ＲＮＡ鎖が完全に相補性である２本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ鎖の一部のみが相補性である２本鎖ＲＮＡ、共有結合的に架橋したＲＮＡ、酵素消化されたＲＮＡ、切断されたＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、荷電および非荷電のｔＲＮＡを含むｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、すべての形のウイルスゲノムＲＮＡ、化学的に合成されたＲＮＡ、半合成ＲＮＡ、生合成ＲＮＡ、天然の単離ＲＮＡ、放射性標識ＲＮＡやフルオロクロム標識ＲＮＡのような標識ＲＮＡ、１またはそれ以上の非天然に生じる核酸を含むＲＮＡなどを含む、宿主細胞をトランスフェクトするために選ばれるあらゆるポリリボヌクレオチドであると定義される。
本明細書において用語「所望のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド」および「所望のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ」は、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖が、ＤＮＡ鎖がＲＮＡ鎖と完全に相補性または一部のみが相補性であるハイブリッド、ＤＮＡ鎖および／またはＲＮＡ鎖が不連続ホスホジエステルバックボーンを有するハイブリッド、ＤＮＡ鎖および／またはＲＮＡ鎖が２またはそれ以上のフラグメントからなるハイブリッド、１またはそれ以上の１本鎖部分および１またはそれ以上の２本鎖部分を含むハイブリッド、相補性または部分的相補性ＤＮＡおよびＲＮＡのアニーリングによって作製されるハイブリッド、共有結合的に架橋したハイブリッド、化学的に合成されたハイブリッド、半合成ハイブリッド、生合成ハイブリッド、天然に単離されたハイブリッド、放射標識ハイブリッドや蛍光色素標識ハイブリッドのような標識ハイブリッド、１またはそれ以上の非天然に生じる核酸を含むハイブリッドなどを含むあらゆるハイブリッド核酸であると定義される。
Ｂ．一般方法
一般に、本発明は浮遊培養におけるリン酸カルシウムトランスフェクション法を提供するものである。本発明の方法は、大規模な浮遊培養、例えば容量が少なくとも０．５Ｌの浮遊培養におけるトランスフェクションに特に有用である。本発明は付着細胞培養におけるリン酸カルシウムトランスフェクションの改良法をも提供する。
本発明の方法は、核酸−リン酸カルシウム共沈殿および宿主細胞のリン酸カルシウム促進核酸トランスフェクション法のこれまで知られていなかった特徴を使用する。一般に、リン酸カルシウムトランスフェクションは以下のごとく進行する。核酸はリン酸カルシウム沈殿物中に形成されるリン酸カルシウム粒子と強く結合する。宿主細胞の存在下で、核酸を有するリン酸カルシウム粒子は宿主細胞表面と接触し、核酸は宿主細胞に入り込む。本発明者らは、宿主細胞の核酸取り込み能力と核酸−リン酸カルシウム粒子のサイズの間に相関があること、および宿主細胞の核酸取り込み能力を最大にする最適粒子サイズが存在することをみいだした。本発明はいかなる特定の作用機序にも限定されるものではないが、粒子サイズの限定することによって宿主細胞と接触する粒子数を増加させ、トランスフェクション効率を増大させることができると考えられる。粒子が特定の粒子サイズに達した後に粒子の成長を制限すると、より小さな粒子の凝集や再配列によって生じる粒子数の減少が低下する。粒子サイズを限定することによって、核酸との結合に利用可能な粒子表面面積を最適化し、トランスフェクション効率を増加させることもできる。本明細書に示すように本発明者らは、最適粒子サイズは長さ約３００ｎｍまでのあらゆるサイズであることをみいだした（ここで、「長さ」はWeissとFrockの、「Rapid Analysis of Particle Size Distribution by Laser Light Dcattering」、Power Technology, 14:287（1976）の方法に従ってレーザー光スキャッタリングにより測定した粒子の最も広い部分の直径と定義される）。したがって、本発明の方法は、約３００ｎｍまでの平均長を有する粒子に宿主細胞を曝露することにより宿主細胞による核酸の取り込みを最大にするために計画された。
リン酸カルシウム粒子はあらゆる液体混合物中で安定していないため、該粒子を一定のサイズに保つことはできない。該粒子は、混合物中のリン酸カルシウムの溶解性依存性に、沈殿、凝集、および再配列により成長するか、または溶解する。したがって、本発明は核酸−リン酸カルシウム共沈殿工程中で粒子を最適サイズに成長させ、該粒子を希釈することにより粒子の不溶性を維持しながら粒子の成長速度を低下させ、最適サイズとなった粒子を宿主細胞と接触させる方法を提供するものである。本発明は、粒子が最適サイズより大きく成長し、縮小させて最低サイズまでもどし、宿主細胞と接触させる方法をも提供する。
宿主細胞は少なくとも以下の４通りの方法で最適サイズ化した粒子に曝露することができる。（１）ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿物中で最適サイズ化粒子を形成し、次いで共沈殿物を希釈し、共沈殿物と宿主細胞培養を混合することにより一段階で宿主細胞と希釈した共沈殿物を接触させる。（２）ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿物中で最適サイズ化粒子を形成し、該共沈殿物を希釈し、次いで希釈した共沈殿物を宿主細胞培養と混合する。（３）宿主細胞培養中で最適サイズ化粒子を形成させ、次いで宿主細胞培養を希釈する。（４）最適サイズより大きい粒子を形成させ、該粒子を最適サイズまで小さくさせ、次いでこの粒子を宿主細胞と接触させる。
Ｉ．共沈殿物の希釈と同時の宿主細胞への曝露
ａ．宿主細胞の調整
本発明の方法では、細胞壁を欠くあらゆる真核宿主細胞を用いることができる。本発明の方法では哺乳動物細胞を用いることが好ましい。有用な哺乳動物細胞系の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ACTT CRL 1651）、ヒト胎児腎系（２９３細胞または浮遊培養中で増殖させるためにサブクローンされた２９３細胞、Grahamらの、J. Gen Virol., 36:59（1977））、赤子ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ACTT CCL10）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR（ＣＨＯ、UrlaubとChasinの、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216（1980））、マウスセルトリー細胞（ＴＭ４、Matherの、Biol. Repord., 23:241-251（1980））、サル腎細胞（ＣＶ１、ACTT CCL 70）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ATCC CRL-1587））、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ACTT CCL２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ACTT  CCL34）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ATCC CRL 1442）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ACTT  CCL 75）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ G2、HB 8065）、マウス乳癌（MMT 060562、ATCC CCL51）、ＴＲＩ細胞（Mtherらの、Annuals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68（1982））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝癌細胞系（Hep G2）が含まれる。
選ばれた哺乳動物宿主細胞は、例えば３５℃、５％ＣＯ2大気下、孵卵器中で、１０％子ウシ血清添加ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）を用いて細胞を単層で増殖させるような当該技術分野で知られたあらゆる方法によって培養することができる。特定の細胞タイプには他の方法を用いることができる。例えば、Drosophila細胞系は、Di NoceraおよびDawidの、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:7095-7098（1983）の記載に従って増殖させることができ、魚細胞系はArakiらの、Bull. Res. Inst. Aquaculture, 20:1-9（1991）の記載に従って増殖させることができる。
あるいはまた、浮遊細胞培養を用いることができる。浮遊液中の細胞はスピナーフラスコ中、１００ｍＬから１０Ｌの容量範囲で、またはバイオリアクター中、０．５Ｌ〜10000Ｌの容量範囲で増殖させることができる。浮遊培養中の細胞は、当該技術分野で知られた多くの方法によって達成できる指数増殖期に保つ必要があり、その最も普通の方法は３〜６日ごとに新鮮培地で継代培養することである。標準的技術、方法、および装置については、Lubiniecki編の、Large Scale Mammalian Cell Culture Technology, Marcel Dekker, New York, and Dasle, 1990に記載されている。
植物細胞宿主の場合、本発明に使用するのに適した植物細胞プロトプラスト培養は、LichtensteinとDraplerの、「Genetic Engineering of Plants」、DNA Cloning Volume III：A Practical Approach, Glover編、IRL Press（1985）中，67-119頁に従って製造することができる。
ｂ．ＤＮＡの製造
本発明の方法に用いるあらゆる所望のＤＮＡは、当該技術分野で知られた種々の方法により製造することができる。これらの方法には、Engelsらの、Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734（1989）に記載の、トリエステル、ホスファイト、ホスホラミジト、およびＨ−ホスホネート法のようなあらゆる方法（これらの内容は本明細書の一部を構成する）によって化学的に合成されるがこれらに限定されるものではない。あるいはまた、所望のＤＮＡ配列は存在するクローンからか、または利用できるクローンがないときはＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、該ライブラリークローンから所望のＤＮＡ配列を構築することによって得ることができる。
本発明で使用するＤＮＡ鋳型の適切な量は、ほとんどのグラム陰性細菌宿主中で自己複製するための複製のｐＰＢ３２２起源を保有するプラスミドベクター、Bacillusおよび他のグラム陽性細菌宿主中で自己複製するための複製のｐＣ１９４（Ehrlichの、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1433-1436（1978））起源を保有するプラスミドベクター、またはほとんどの酵母宿主中で自己複製するための複製の起源を保有する２−ミクロン環状（２μプラスミド）ベクターのようなよく知られたクローニングベクターおよび宿主中で該ＤＮＡを増幅させることによって製造することができる。
あるいはまた、該ＤＮＡ鋳型は、Saikiらの、Science, 230:1350（1985）、Mullisらの、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263（1986）、MullisとFaloonaの、Methods Enzymol., 155:335（1987）、およびSaikiらの、Science, 239:487（1988）に記載のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させることができる。
ｃ．ＲＮＡの製造
本発明の方法に用いるあらゆる所望のＲＮＡは、当該技術分野で知られた種々の方法によって製造することができる。これらの方法には、Curent Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York（1990）に一般に記載されているＲＮＡの化学的合成法およびＤＮＡ鋳型のin vitro翻訳法が含まれるがこれらに限定されるものではない。
あるいはまた、所望のＲＮＡは宿主細胞培養から抽出された全細胞ＲＮＡから単離することができる。全細胞ＲＮＡは、哺乳動物細胞中で産生されるＲＮＡの場合はFavaloroらの、Methodes Enzymol.,65:718（1980）、StallcupとWashingtonの、J. Biol. Chem., 258:2802（1983）、Birnboimの、Nucleic Acids Res., 16:1487（1988）、Gilsinらの、Biochemistry, 13:2633（1974）、Ullrichらの、Science, 196:1313（1977）、Strohmanらの、Cell, 10:265（1977）、およびMacDonaldらの、Methods Enzymol., 152:219（1987）に記載の方法のような当該技術分野で知られたあらゆる方法によって宿主細胞培養から単離することができる。
所望のＲＮＡが全細胞ＲＮＡのポリアデニル化ｍＲＮＡ分画である場合は、該ポリアデニル化ｍＲＮＡは、Edmondsらの、Proc. Natl. Acad. Sci., 68:1336（1971）に記載の方法やAvivとLederの、Proc. Natl. Acad. Sci., 69:1408（1972）に記載の方法のような当該技術分野で知られたあらゆる方法を用いてオリゴデオキシチミジレート（オリゴ（ｄＴ））−セルロースカラム・アフィニティ−クロマトグラフィーによって細胞ＲＮＡの大部分から分けることができる。
所望のｍＲＮＡのサイズが知られている場合は、Lemischkaらの、J. Mol. Biol., 151:101（1981）に記載に従って、メチル水酸化水銀の存在下でＲＮＡをアガロースゲル電気泳動するか、またはSchweinfestらの、Proc. Natl. Acad. Sci., 79:4997（1982）の記載に従ってメチル酸化水銀存在下でショ糖密度勾配遠心することによって、該ｍＲＮＡ調製物をさらに精製し、該粒子サイズのｍＲＮＡ分子を得ることができる。
さらに、所望のＲＮＡは、レトロウイルス、タバコモザイクウイルス、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルスのような１本鎖ＲＮＡウイルス、およびロタウイルスやイネ萎病（rice dwarf）ウイルスのような２本鎖ＲＮＡウイルスを含むＲＮＡウイルスの組換えまたは非組換えゲノムから得ることができる。所望のＲＮＡは適切な宿主細胞培養中で選ばれたＲＮＡウイルスを増進させ、ウイルス粒子を回収し、次いで該ウイルス粒子から所望のＲＮＡを抽出することによって単離することができる。例えば、Moloneyネズミ白血病ウイルスのゲノムＲＮＡはSchwartzbergらの、Cell, 37:1043（1984）に記載の方法に従って得ることができる。
ｄ．ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの製造
本発明の方法に用いるのに適したＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、当該技術分野で知られたあらゆる方法によって製造することができる。ある態様において、ＤＮＡ鎖またはフラグメントは上記Ｉ（ｂ）項の記載に従って製造され、ＲＮＡ鎖またはＲＮＡフラグメントは上記Ｉ（ｃ）項の記載に従って製造され、ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖またはフラグメントは一緒に混合され、アニールする。別の態様では、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、上記の所望のＤＮＡ鎖を得、該ＤＮＡ鎖を鋳型に用いたＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼにより相補性ＲＮＡ鎖を合成し、次いで転写反応が終了したらＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを回収することによって製造することができる。あるいはまた、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、上記の所望のＲＮＡ鎖を得、該ＲＮＡ鎖を鋳型に用いてＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼにより相補性ＲＮＡ鎖を合成し、次いで逆転写反応が終了したらＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを回収することによって製造することができる。
ｅ．リン酸カルシウムトランスフェクションの手順
本発明には、所望の核酸、Ｃａ2+、およびＰＯ43+を混合して沈殿混合物を形成し、該沈殿混合物をインキュベーションしてリン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子を形成し、次いでこの粒子を約３００ｎｍまでの平均長に成長させ、該沈殿混合物を希釈すると同時に細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、該粒子が沈殿混合物中で成長した速度より実質的に遅い速度で成長することができるトランスフェクション混合物を形成させ、そして該トランスフェクション混合物をインキュベーションすることにより宿主細胞に該粒子を取り込ませ、トランスフェクトされた細胞を形成する、所望の核酸を真核宿主細胞中に導入するためのあらゆる方法が含まれる。
１．沈殿混合物の形成
Ｃａ2+、ＰＯ43+、および所望の核酸をあらゆる順序で混合することにより、該核酸とリン酸カルシウムが共沈殿している沈殿混合物を形成させることができる。ある態様では、Ｃａ2+とＰＯ43+を混合する前または混合するのと同時に核酸と沈殿混合物を混合することにより、該沈殿混合物中に形成された核酸およびリン酸カルシウムを含む粒子の数を最大にする。核酸をＣａ2+およびＰＯ43+を欠く緩衝液中に懸濁させ、次いでＣａ2+およびＰＯ43+を連続的または同時に該核酸懸濁液と混合することができる。あるいはまた、該核酸をＣａ2+またはＰＯ43+を含む緩衝液中に懸濁させ、次いで適切な対イオンと該核酸懸濁液を混合して共沈殿を開始することができる。
沈殿混合物中の反応体濃度と反応条件は、約３００ｎｍまでの平均長を有する核酸とリン酸カルシウムを含む粒子を産生するように選択される。好まし態様では、反応体濃度と反応条件は、約１００ｎｍまたはそれ以下の平均長を有する粒子を産生するように選択される。粒子形成を決定する主な因子は、混合物中の粒子成長動態と反応時間である。粒子形成速度は所望の粒子サイズを達成するのに必要な反応時間を決定する。粒子成長速度は混合物中の核酸濃度とリン酸カルシウムの溶解性に依存し、またリン酸カルシウムの溶解性は沈殿混合物のＣａ2+濃度、ＰＯ43+濃度、ｐＨ、および温度に依存する。
沈殿混合物のＣａ2+濃度、ＰＯ43+濃度、ｐＨ、および温度は、混合物中の実際のＣａ2+濃度とＰＯ3+濃度より十分低いリン酸カルシウム溶解性を生じ、したがって、リン酸カルシウムと核酸の共沈殿をもたらすＣａ2+およびＰＯ43+イオンの過飽和をもたらすように選ばれる。核酸は該粒子表面に付着して粒子の成長を遅らせるため、核酸濃度も過飽和混合物中の粒子成長動態に影響する。
沈殿混合物において、Ｃａ2+は約１２５ｍＭ〜約３７５ｍＭ、好ましくは約２５０ｍＭ〜約３７５ｍＭの初期濃度で存在することができ、ＰＯ43+は約０．５ｍＭ〜約１．１２５ｍＭ、好ましくは約０．７５ｍＭの初期濃度で存在することができる。該ＰＯ43+濃度では、より高いＣａ2+濃度においてより速い速度と高頻度で粒子形成を生じることができる。したがって、最適核酸濃度は沈殿混合物中のＣａ2+濃度によって変更することができる。沈殿混合物中の約１２５ｍＭ、２５０ｍＭおよび３７５ｍＭの初期Ｃａ2+濃度と約０．７５ｍＭの初期ＰＯ43+濃度を用いるＤＮＡトランスフェクションの態様では、該沈殿混合物中の初期ＤＮＡ濃度はそれぞれ約２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、および７５μｇ／ｍＬまでであり得る。
あるいはまた、該Ｃａ2+濃度では、より高いＰＯ43+濃度を用いることにより所望のリン酸カルシウム結晶形成速度と頻度を得ることができる。したがって、最適核酸濃度は沈殿混合物中のＰＯ43+濃度によって変更することができる。約１．１２５ｍＭの初期ＰＯ43+濃度を用いるＤＮＡトランスフェクションの態様では、初期ＤＮＡ濃度は約５０μｇ／ｍＬまでであり得る。
大規模浮遊培養でのトランスフェクションにおける容量的制約のために、沈殿混合物を接種する前に該浮遊液中のＣａ2+濃度を上昇させることが好ましい。この環境下では、浮遊培養中のＣａ2+濃度の上昇を補うために沈殿混合物のＣａ2+濃度を低下させるのが好都合である。次に、沈殿混合物中の初期ＰＯ43+濃度を上昇させ、所望のリン酸カルシウム粒子形成速度を維持する。ある浮遊培養の態様において、ＰＯ43+とＣａ2+は、それぞれ初期濃度１．１２５ｍＭおよび１２５ｍＭで沈殿混合物中に存在する。
沈殿混合物のｐＨは、約６．８〜約７．６であり得、好ましくは約７．０５である。沈殿混合物の温度は、約０℃〜約３７℃、好ましくは約２０℃〜約３７℃、より好ましくは約３２℃〜約３７℃であり得る。しかしながら、本発明の方法において、前記の温度範囲以外のあらゆる温度を含むあらゆる沈殿混合物のインキュベーション温度を、所望の粒子形成速度を生じる他の反応パラメーターと組み合わせて使用することが予期される。浮遊培養におけるトランスフェクションのある態様において、沈殿混合物は温度約０℃〜約５０℃でインキュベーションされる。
沈殿混合物の所望のｐＨを含むｐＨ範囲で有効なあらゆるｐＨ緩衝液を用いて沈殿混合物の反応体を懸濁させることができる。本発明で使用するのに適した緩衝液には、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１４０ｍＭ ＮａＣｌのような適切な濃度のＮ−３−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝生理食塩液、および２５ｍＭ ＢＥＳおよび１４０ｍＭ ＮａＣｌのようなＮ，Ｎ−ｂｉｓ（３−ヒドロキシエチル）−３−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝生理食塩液が含まれる。
沈殿混合物は、リン酸カルシウムと核酸を含む粒子が約３００ｎｍまでの平均長、好ましくは約１００ｎｍまたはそれ以下の平均長に成長するのに十分なあらゆる期間インキュベーションされる。上記の反応条件下において、沈殿混合物中で形成される粒子は、約６０秒間までのインキュベーション期間の後、約３００ｎｍまたはそれ以下の平均長を有することができる。したがって、沈殿混合物は約６０秒間までインキュベーションすることができる。好ましい態様では、沈殿混合物は約３０秒またはそれ以下の期間インキュベーションされる。しかしながら、本発明には、沈殿混合物中、種々の反応条件下で所望の粒子サイズを得るために他のインキュベーション期間を用いることも含まれる。浮遊液中で細胞をトランスフェクションするためのいくつかの態様において、沈殿混合物を約１時間までの期間インキュベーションすることができるが、好ましくは約２分間までの期間、より好ましくは約１分間までの期間、さらに好ましくは約３０秒間までの期間インキュベーションすることができる。
２．トランスフェクション混合物の形成
リン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子が沈殿混合物中で約３００ｎｍ（またはそれ以下）までの平均長に成長した後、該沈殿混合物を希釈すると同時に細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、トランスフェクション混合物を形成する。真核細胞は、上記Ｉ（ａ）項に記載の浮遊細胞培養または付着細胞培養の形で得られる。本発明が提供する沈殿混合物は、粒子を溶解させることなく沈殿混合物中の該粒子の増殖速度に比べてトランスフェクション混合物中の粒子の増殖速度が実質的に遅くなるように宿主細胞培養と混合することによって希釈し、宿主細胞の最適サイズ化粒子に対する曝露を最大とする。
浮遊細胞培養を用いる好ましい態様では、沈殿および希釈工程は、核酸、Ｃａ2+、およびＰＯ43+を取り込みパイプに供給し、次いで培養容器に移す自動化システム中で達成される。核酸、Ｃａ2+、およびＰＯ43+はあらゆる好都合な順序で取り込みパイプに供給することができる。好ましくは、核酸は、リン酸カルシウム沈殿形成の開始点の上流の取り込みパイプに供給される。あるいはまた、核酸、Ｃａ2+、およびＰＯ43+はほぼ同じ地点で取り込みパイプに供給される。ある態様では、核酸および１または２種類のイオンを含む溶液および対イオンを含む溶液を取り込みパイプに合流する別のチューブラインを通して供給される。取り込みパイプを通過する流速と取り込みパイプの長さは、取り込みパイプ内で核酸−リン酸カルシウム共沈殿を生じるのに所望されるインキュベーション期間を達成するよう調節することができる。好ましくは、浮遊培養は、宿主細胞と最適サイズのリン酸カルシウムと核酸の粒子の接触を最大にするように攪拌される。
本発明の方法は、あらゆるサイズの浮遊培養中の細胞をトランスフェクトするのに使用することができる。好ましくは、本発明の方法は、総量少なくとも約１Ｌ、より好ましくは総量少なくとも約２０Ｌを含む浮遊培養をトランスフェクションするのに使用される。浮遊培養中でトランスフェクションするための所望の細胞密度は、例えば、規定量のたね（種）培養を特定の細胞密度まで増殖させることによって達成することができる。あるいはまた、種培養からの細胞を濾過および／または遠心によって回収し、所望の密度に再浮遊させる。別の態様において、所望の細胞密度は種培養を希釈することによって達成される。
浮遊培養中でトランスフェクションするための細胞密度は、約０．２％〜約５％パック細胞容量（ＰＣＶ）であり得る。しかしながら、本発明は浮遊培養中でのトランスフェクションの許容されるレベルをもたらす、それより高いまたは低い密度を使用することも含まれる。例えば、本発明は、バイオリアクターから細胞を濃縮し、高密度細胞スラリーを得、次いで沈殿混合物をこの細胞スラリーと混合することによって実施することができる。ある態様において、約１０8個／ｍＬ以上の細胞密度が用いられる。別の態様では約１０8個／ｍＬ〜約１０9個／ｍＬの細胞密度が用いられる。濃縮スラリーは、細胞浮遊液をバイオリアクターからHerwaus Sepatech Contifuge（登録商標）17RS（1994 Hereas Instruments Catalog No. 75003571, Hereaus Instruments Gmbh, D63405, Hanau, Germany）のような半連続無菌遠心器にポンプで供給し、該細胞浮遊液を約５００ｘｇ〜約６０００ｘｇ、好ましくは約５３００ｘｇで遠心し、無菌ローターボールに細胞を捕らえることにより得られる。バイオリアクター中の細胞培養の細胞密度に依存して、約１００Ｌまでの浮遊培養を遠心ローターボール中に回収することができる。次に、高密度細胞スラリーを該ボールから取り出し、ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿物と混合してトランスフェクション混合物を形成する。ある態様では、高密度細胞スラリーを、取り込みパイプ中でＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿物と混合することにより、バイオリアクターに入る前にトランスフェクション混合物インラインが形成される。あるいはまた、ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿および高密度細胞スラリーを、それぞれ供給および接種ポートから別々にバイオリアクター中に導入することができる。本発明では、トランスフェクション混合物を形成する前に、高密度細胞スラリー中の細胞濃度を、例えば新鮮増殖培地を加えて補正し、トランスフェクションのための最適濃度とする態様も提供される。特定の宿主細胞をトランスフェクションするのに有用な細胞濃度は日常的試験により容易に決定することができることは理解されよう。
浮遊細胞培養を用いる別の態様では、先の（ｅ）（１）項の記載に従って沈殿混合物を接種する前に、浮遊培養のＣａ2+濃度を上昇させる。好ましい態様では、沈殿混合物を接種する前に浮遊培養中のＣａ2+濃度を約７．５ｍＭに上昇させる。
本発明は、最適粒子サイズに達した後に粒子の成長を制限するために粒子の成長速度を実質的に減少させる。Ｃａ2+濃度の低下、ＰＯ43-濃度の低下、ｐＨの低下、核酸濃度の上昇、蛋白濃度の上昇、温度の低下、またはそれらのあらゆる組み合わせを含むあらゆる方法を用いることが含まれる。ある態様では、沈殿混合物を宿主細胞培養と混合して希釈し、初期Ｃａ2+濃度が約９ｍＭ〜約１７ｍＭのトランスフェクション混合物を形成させる。さらに別の態様では、トランスフェクション混合物は沈殿混合物の初期Ｃａ2+濃度より少なくとも１０倍低い初期Ｃａ2+濃度を有する。好ましい態様では、沈殿混合物は約２５０ｍＭ〜約３７５ｍＭの初期Ｃａ2+濃度を有し、トランスフェクション混合物は約１２ｍＭの初期Ｃａ2+濃度を有する。
好ましくは、粒子成長速度を、トランスフェクション混合物中の血清またはウシ血清アルブミンのような血清蛋白の存在によって実質的に低下させる。蛋白は核酸同様にリン酸カルシウム粒子表面と強く結合することにより粒子の成長を妨げる。ある態様では、トランスフェクション混合物はウシ胎児血清のような約２％〜約１０％血清を含む。別の態様では、トランスフェクション混合物はウシ血清アルブミンのような血清アルブミン約０．２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌを含む。
本発明の方法に使用するトランスフェクション混合物の初期ＰＯ43-濃度は、細胞培養培地中に存在するＰＯ43-によって好都合に得ることができる。他の濃度も適切であるが、血清添加細胞培養培地中の約１ｍＭの該ＰＯ43-濃度は、本発明で使用するのに十分である。
トランスフェクション混合物のｐＨと温度は宿主細胞が耐える生理的レベルに維持される。哺乳動物宿主細胞の場合は、ｐＨを約６．０〜約８．０、好ましくは約７．２〜約７．５の範囲に、温度を約１５℃〜約３９℃、好ましくは約３２℃〜約３７℃の範囲に維持することが好ましい。同様に、トランスフェクション混合物は特定の宿主細胞が容易に最適化される時間インキュベーションされる。
浮遊細胞培養中でトランスフェクションする場合は、リン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子を溶解させないように該粒子の溶解性を可能な限り低くするように、ｐＨ、Ｃａ2+濃度、ＰＯ43-濃度、および温度を正確に調節することができる。好ましい態様では、トランスフェクション混合物をｐＨ約７．２および温度約３７℃で維持し、そのＣａ2+濃度とＰＯ43-濃度を、図７に示すリン酸カルシウム溶解曲線より高いポイントにあるように維持する。別の好ましい態様では、トランスフェクション混合物のＰＯ43-濃度を約１ｍＭに、温度を約３７℃に維持し、Ｃａ2+濃度とｐＨを図８に示すリン酸カルシウム溶解曲線より高いポイントにあるように維持する。
リン酸カルシウム沈殿物は宿主細胞によっては毒性がある。したがって、所望のトランスフェクションの所望のインキュベーション期間後に該沈殿物を溶解させることが好都合であり得る。トランスフェクション混合物中のリン酸カルシウム沈殿物は、例えばトランスフェクション混合物中のｐＨを低下させ、そして／またはＣａ2+濃度を低下させることにより溶解させることができる。Ｃａ2+濃度は、新鮮培養培地をトランスフェクション混合物に加えることによって好都合に低下させることができる。ある浮遊培養の態様では、トランスフェクション混合物は約１分間〜約２４時間、好ましくは約０．５時間〜約１２時間、より好ましくは約３．５時間〜約５時間インキュベーションされ、次いで細胞培養培地約１容量〜約５００容量で希釈され、約１日間〜約１４日間インキュベーションされる。
宿主細胞によっては、トランスフェクションのインキュベーション期間終了時にトランスフェクション混合物をグリセロールやジメチルスルホキシト（ＤＭＳＯ）で衝撃を与えることによりトランスフェクション率が改善される。典型的には、トランスフェクション混合物を約１５％容量／容量濃度のグリセロールに特定の宿主細胞に応じて約３０秒間から約３分間曝露し、次いで新鮮培地中で約１〜６日間インキュベーションする。
あるいはまた、トランスフェクション後に宿主細胞を、グリセロール衝撃を与えることなく新鮮培地中で所望の時間培養することができる。
ＩＩ．共沈殿物の希釈、次いで宿主細胞に対する曝露
本発明には、所望の核酸、Ｃａ2+、およびＰＯ43-を混合し、沈殿混合物を形成させ、該沈殿混合物をインキュベーションしてリン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子を形成させ、この粒子を約３００ｎｍまでの平均長に成長させ、該沈殿混合物を希釈して希釈沈殿混合物を形成させ、該希釈沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合してトランスフェクション混合物を形成させる（ここで、該粒子は該粒子が該沈殿混合物中で成長した速度より実質的に遅い速度で成長することができ、該トランスフェクション混合物は該宿主細胞が該粒子を取り込むようにインキュベーションしてトランスフェクトされた細胞を形成させる）。
ａ．沈殿混合物の形成
沈殿混合物は上記Ｉ（ｅ）（１）項の記載に従って得、インキュベーションされる。所望の核酸−リン酸カルシウム共沈殿の形成後、この沈殿混合物を、あらゆる好都合な方法、例えば、トランスフェクションに用いられる適切な緩衝剤を加えるかまたは細胞培養培地を加えることによって希釈することができる。本発明に使用するのに適した緩衝剤および培地は、上記Ｉ（ａ）およびＩ（ｅ）（１）項に記載されている。希釈剤は、核酸−リン酸カルシウム粒子の成長速度を低下させるが、得られる希釈沈殿混合物中でそのような粒子を溶解させない十分な量で該沈殿混合物に加えられる。
これを宿主細胞と混合してトランスフェクション混合物が形成されるまで、該希釈沈殿混合物は核酸−リン酸カルシウム粒子の、遅いが連続した成長を許す条件下で維持される。遅い粒子成長速度を得るのに適した条件は、上記Ｉ（ｅ）（２）項のトランスフェクション混合物に関する説明中に示している。
ｂ．トランスフェクション混合物の形成
本発明が提供する希釈沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、トランスフェクション混合物を形成させる（ここで、ＤＮＡ−リン酸カルシウム粒子は沈殿混合物中の該粒子成長速度より実質的に遅い速度で増殖するであろう）。真核細胞は上記Ｉ（ａ）項に記載の付着細胞培養または浮遊細胞培養の形で得られ、該細胞培養と希釈沈殿混合物を混合して上記Ｉ（ｅ）（２）に記載のトランスフェクション混合物を形成させる。
希釈沈殿混合物中の粒子の希釈およびトランスフェクション混合物中の粒子の希釈は、全体の希釈が粒子を溶解させることなく粒子の成長速度を実質的に低下させるように選ばれる。好ましい態様では、全体の希釈は沈殿混合物中の初期Ｃａ2+濃度より少なくとも１０倍低いトランスフェクション混合物中の初期Ｃａ2+濃度をもたらす。
別の好ましい態様において、ほとんどの全体の希釈は最適粒子サイズに達した後できるだけ速やかに粒子の成長を遅くするために希釈沈殿混合物の形成をもたらす。
それにも関わらず、本発明には、希釈沈殿混合物の形成をもたらす該希釈がトランスフェクション混合物中の全体希釈に比べて小さい方法も含まれることは理解されよう。そのような態様では、平均粒子サイズが最適範囲を越える前に粒子の成長速度の実質的な低下を達成するために希釈沈殿混合物と宿主細胞培養を速やかに混合させることが好ましい。
あるいはまた、希釈沈殿混合物の形成をもたらす全体の希釈のパーセンテージおよびトランスフェクション混合物の形成をもたらす全体の希釈のパーセンテージは、この２工程間の時間の長さに応じて変化させることができる。短時間の間隔では希釈沈殿混合物においてより小さな希釈を使用できるであろうが、一方、より長い間隔ではトランスフェクション活性の過度の損失を防ぐために希釈沈殿混合物においてより大きな希釈を使用する必要があろう。
好ましくは、希釈沈殿混合物は宿主細胞の、最適サイズの核酸−リン酸カルシウム粒子に対する曝露を最大にするために宿主細胞と速やかに混合される。しかしながら、本発明の態様には、トランスフェクション混合物が形成される時点で、希釈沈殿混合物が宿主細胞に対するいくらかのトランスフェクト能を維持しているという条件で、希釈沈殿混合物が宿主細胞と混合される前のあらゆる期間維持されることも含まれる。
浮遊細胞培養を用いる好ましい態様では、沈殿および希釈工程は、核酸、Ｃａ2+およびＰＯ43-を取り込みパイプに供給して核酸−リン酸カルシウム共沈殿を生じさせ、核酸、Ｃａ2+およびＰＯ43-の取り込み口の下流のある地点で別の取り込みパイプを介して該沈殿混合物に希釈剤を供給し、次いで希釈沈殿混合物を培養容器に移す自動化システムによって達成される。核酸、Ｃａ2+およびＰＯ43-は上記Ｉ（ｅ）（２）項に記載のあらゆる好都合な順序で取り込みパイプに供給することができる。沈殿混合物を含む取り込みパイプの流速と希釈剤取り込みパイプおよび培養容器の取り込み口の下流の位置を調節し、該沈殿混合物の所望のインキュベーション期間と培養容器中で沈殿混合物が希釈されるのと宿主細胞と混合される間の所望の遅れを達成することができる。好ましくは、該浮遊培養を攪拌し、宿主細胞とリン酸カルシウムと核酸の最適サイズ化粒子の接触を最大にする。
形成後、トランスフェクション混合物を上記Ｉ（ｅ）（２）項に記載の条件下でインキュベーションすることができる。
III．宿主細胞培養中の共沈殿物の形成
本発明には、Ｃａ2+、ＰＯ43-、核酸および細胞壁を欠く真核宿主細胞を混合して沈殿混合物を形成させ、該沈殿混合物をインキュベーションしてリン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子を形成させ、この粒子を約３００ｎｍ間での平均長まで成長させ、該沈殿混合物を希釈してトランスフェクション混合物を形成させ（ここで、該粒子は該沈殿混合物中で該粒子が成長したより実質的に遅い速度で成長することができる）、該トランスフェクション混合物をインキュベーションして宿主細胞に該粒子を取り込ませてトランスフェクトされた細胞を形成する、所望の核酸を真核宿主細胞に導入するためのあらゆる方法も含まれる。
ａ．沈殿混合物の形成
適切な宿主細胞培養は上記Ｉ（ａ）項に記載のごとく得ることができる。増殖培地を細胞から除去し、この細胞を、上記Ｉ（ｅ）（１）項に記載の適切な濃度の核酸、Ｃａ2+およびＰＯ43-に曝露して、沈殿混合物を形成させる。本発明の実施において、核酸、Ｃａ2+およびＰＯ43-を混合する順序は重要でないことは理解されよう。細胞は、核酸、Ｃａ2+およびＰＯ43-成分またはその組み合わせのいずれかを含む混合物と接触させるかまたは該混合物中に浮遊させることができる。あるいはまた、細胞は核酸、Ｃａ2+およびＰＯ43-成分と同時にすべて混合することができる。
好ましい態様では、該沈殿混合物は、宿主細胞を、所望の濃度の核酸、Ｃａ2+およびＰＯ43-を含む適切な無血清増殖培地と接触させることによって形成される。蛋白は核酸−リン酸カルシウム共沈殿物の成長を実質的に低下させるので、血清または他の蛋白を含む培地を該沈殿混合物に使用するのは望ましくない。
沈殿混合物の反応条件とインキュベーション期間は、上記Ｉ（ｅ）（１）項に記載のリン酸カルシウムと核酸を含む最適サイズ化粒子を形成するように選ばれる。
ｂ．トランスフェクションの形成
所望のサイズの核酸−リン酸カルシウム粒子の形成後、沈殿混合物を希釈し、トランスフェクション混合物を形成させる（ここで、該粒子は沈殿混合物中の粒子成長速度より実質的に遅い速度で成長するであろう）。ある態様において、沈殿混合物は宿主細胞に適切な血清添加増殖培地を加えることによって希釈される。得られるトランスフェクション混合物を、宿主細胞に核酸−リン酸カルシウム粒子が取り込まれる条件下でインキュベーションし、トランスフェクション細胞を形成させる。そのような方法は上記Ｉ（ｅ）（２）項に記載されている。
IV．共沈殿物の過剰成長の低下とその後の宿主細胞への曝露
さらに本発明には、Ｃａ2+、ＰＯ43-および核酸を混合して沈殿混合物を形成させ、該沈殿混合物をインキュベーションしてリン酸カルシウムと所望の核酸を含む粒子を形成させ、該粒子を約３００ｎｍより大きい平均長まで成長させ、該粒子のサイズを低下させ、粒子が溶解することができる条件下で沈殿混合物をインキュベーションすることにより平均長約３００ｎｍまたはそれ以下の最適サイズ化粒子を形成させ、該最適サイズ化粒子を、細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合してトランスフェクション混合物を形成させ、該トランスフェクション混合物をインキュベーションして、宿主細胞に該粒子を取り込ませトランスフェクトされた細胞を形成させる、所望の核酸を真核宿主細胞に導入するあらゆる方法も含まれる。
ａ．過剰成長粒子の形成
過剰成長した核酸−リン酸カルシウム共沈殿物は、上記Ｉ（ｅ）（１）項に記載のごとく沈殿混合物を作製し、リン酸カルシウムと核酸を含む粒子を約３００ｎｍより大きい平均長まで成長させる条件下で沈殿混合物をインキュベーションすることによって得ることができる。上記Ｉ（ｅ）（１）項に記載の反応条件下で、沈殿混合物中で形成された粒子は、約６０秒間インキュベーションした後に約３００ｎｍまたはそれ以下の平均長を有する。したがって、過剰成長沈殿物は少なくとも６０秒間沈殿混合物をインキュベーションすることによって形成することができる。
ｂ．過剰成長沈殿物の縮小
過剰成長沈殿物を沈殿混合物中で形成させ、次いで沈殿混合物の条件を変化させて該沈殿物中の粒子容積を減少させる。粒子の成長または縮小は、沈殿混合物中のリン酸カルシウムの溶解性に依存するため、粒子の縮小は、沈殿混合物中のリン酸カルシウムの溶解性を増大させることによって達成することができる。上記のように、リン酸カルシウムの溶解性は、Ｃａ2+濃度、ＰＯ43-濃度、ｐＨ、および温度によって決定される。リン酸カルシウムの溶解性は、沈殿混合物中のＣａ2+濃度を低下させ、ＰＯ43-濃度を低下させ、ｐＨを低下させ、そして／または温度を低下させることによって増大させることができる。好ましい態様では、沈殿混合物を適切な緩衝剤で希釈することによりＣａ2+濃度およびＰＯ43-濃度を低下させる。別の態様では、該沈殿混合物を遠心し、適切な緩衝剤中にペレットを再浮遊させ、Ｃａ2+およびＰＯ43-の未飽和溶液を作製することによって希釈を行う。さらに別の好ましい態様では、沈殿混合物のｐＨは沈殿混合物のｐＨを低下させ、Ｃａ2+およびＰＯ43-の未飽和溶液を作製する。
沈殿混合物は、粒子が約３００ｎｍまたはそれ以下の、好ましくは約１００ｎｍまたはそれ以下の最適平均長に達するまで粒子を縮小させる条件下でインキュベーションされる。最適サイズ化粒子を形成するのに必要なインキュベーション期間は、縮小直前の過剰成長した粒子のサイズと沈殿混合物中の溶解速度に応じて異なる。したがって、該インキュベーション時間は、必要な粒子サイズの減少量および沈殿混合物中のＣａ2+およびＰＯ43-の未飽和溶液によって決定される粒子の縮小速度に基づいて選ばれる。
ｃ．トランスフェクション混合物の形成
沈殿混合物中の核酸−リン酸カルシウム粒子を最適サイズに縮小し、次いで沈殿混合物中の条件を再度変化させて最適サイズ化粒子をゆっくり成長させる。ある態様では、沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合し、上記Ｉ（ｅ）（２）項に記載の遅い速度で粒子を成長させる適切なＣａ2+濃度、ＰＯ43-濃度、ｐＨ、および温度でトランスフェクション混合物を形成させる。別の態様では、沈殿混合物のＣａ2+濃度、ＰＯ43-濃度、ｐＨ、および温度、またはこれらのパラメーターのいずれか１つまたはあらゆる組み合わせを増加させて、粒子が遅い速度で成長するＣａ2+およびＰＯ43-の過飽和レベルを達成し、次いで沈殿混合物を細胞壁を欠く真核宿主細胞と混合してトランスフェクション混合物を形成させる。
最後に、トランスフェクション混合物を上記Ｉ（ｅ）（２）項に記載のごとくインキュベーションする。
Ｖ．過剰成長共沈殿物の縮小を含む他の態様
沈殿物と宿主細胞を接触させる前に過剰成長した沈殿物を縮小させる方法に加え、本発明には、過剰成長した核酸−リン酸カルシウム粒子のサイズを小さくすると同時に該粒子で宿主細胞を曝露する方法も含まれる。これらの態様では、沈殿混合物を、希釈すると同時に宿主細胞培養と混合し、粒子のサイズを小さくすることができるトランスフェクション混合物を形成させ、該トランスフェクション混合物が、粒子の平均長が約３００ｎｍまたはそれ以下、好ましくは約１００ｎｍまたはそれ以下に達するまで粒子を縮小させる条件下でインキュベーションされる。粒子の溶解速度（トランスフェクション混合物のＣａ2+濃度、ＰＯ43-濃度、ｐＨ、および温度によって決定される）とインキュベーション時間は、上記IV（ｂ）項に記載の所望の粒子縮小量をもたらすように選ばれる。次に、トランスフェクション混合物の条件を粒子の成長が遅くなるように変化させ、トランスフェクション混合物を宿主細胞が粒子を取り込むようにインキュベーションし、上記IV（ｃ）項に記載の形質転換宿主細胞を形成させる。
あるいはまた、過剰成長した沈殿物を、希釈すると同時に宿主細胞培養と混合し、粒子が完全に溶解するまで粒子のサイズを徐々に縮小するトランスフェクション混合物を形成させ、次いで粒子の平均長が３００ｎｍまたはそれ以下に縮小する時に存在する最適サイズ化粒子を宿主細胞に取り込ませる。好ましい態様では、粒子サイズの縮小は、培養中の宿主細胞がＣＯ2および乳酸を産生する結果、トランスフェクション混合物のｐＨを徐々に低下させることによって生じる。ｐＨの漸減によってトランスフェクション混合物は、Ｃａ2+およびＰＯ43-の過剰飽和からＣａ2+およびＰＯ43-の未飽和へと変化し、得られる粒子サイズの縮小速度が遅いことにより宿主細胞が最適サイズ化粒子に曝露されている期間が最大となる。
別の態様では、宿主細胞培養中の過剰成長粒子の初期溶解に次いで、新鮮過剰成長沈殿物をトランスフェクション混合物と混合し、トランスフェクション混合物中の該沈殿物を溶解させる周期を、所望のトランスフェクションレベルが得られるまで反復する。
本発明には、共沈殿を宿主細胞培養（上記III項に記載）中で生じさせ、これを粒子が最適サイズより大きくなるまで続けさせる方法も含まれる。この態様では、過剰成長した粒子は培養条件を変化させることによって最適サイズまで縮小し、最適粒子サイズに達した後、培養条件を、再度粒子の遅い成長を許し、宿主細胞が粒子を取り込むように変化させ、トランスフェクトされた細胞を形成させる。
さらに、本明細書に記載のすべての方法は、宿主細胞が最適サイズ化粒子に曝露される時間を最大にするために計画されたトランスフェクション混合物のインキュベーション時の粒子の過剰成長／粒子縮小の連続周期を組み合わせるために改良することができる。コンピュータ制御バイオリアクター中の浮遊培養を用いる好ましい態様では、トランスフェクション混合物の条件は、粒子サイズを評価し、細胞と最適サイズ化粒子の接触を最大にするのに必要な条件変化の程度とタイミングを計算するアルゴリズムに従って自動的に変えられる。
さらに本発明の詳細は本発明の範囲をさらに定義する以下の実施例によってさらに知ることができる。本明細書に記載のすべての引用文およびその中のすべての参考文献は本明細書の一部を構成する。
実施例１
材料と方法
１．沈殿物
β−ガラクトシダーゼ発現ベクターｐＳＶβ（Clontech, Palo Alto, CA）またはRefinoらの、Thrombosis and Hematosis, 70:313-319（1993）に記載のｔＰＡ発現ベクターの、種々の量の精製プラスミドＤＮＡを濃度が２５０ｍＭから５００ｍＭまで変化するＣａＣｌ2を含むＴＥ緩衝液（１ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、０．１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．６）溶液中で希釈した。ＤＮＡ／ＣａＣｌ2溶液１容量をホスフェート溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．０５）１容量に速やかに加え、この混合物をゆっくり渦巻き混合して沈殿物の形成を開始させた。種々の温度で種々の時間インキュベーションした後、該混合物の部分標本３００μＬを４５秒間微量遠心し、上清の光学密度を２６０ｎｍ（ＯＤ２６０）で測定することにより結合していないＤＮＡの量を定量した（ＯＤ２６０の１．０はＤＮＡ濃度５０μｇ／μＬに対応する）。
２．トランスフェクション
ＣＨＯ細胞（CHO-DUKX DHFR minus, Urlaub and Chasinの、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220（1980）およびヒト腎２９３細胞（ATCC CRL1573）。トランスフェクション用の細胞は、２％〜１０％ウシ胎児血清を含むＰＳＯ４培地（Genentech, Inc.専売培地）（ダルベッコ改良イーグル培地およびハムＦ１２培地（Gibco BRL 1990カタログ中、カタログ番号430-3000EBおよび430-1700EB, Gaithersburg, MD 20877）の最初の処方から開発）を用い、Ｔ−フラスコまたは５００ｍＬスピナーフラスコ中で３〜４日ごとに定期的に継代培養した。細胞培養は、Tissue Culture:Laboratory Procedures, Doyle, Griffiths and Newell編、J. Wiley and Sons, New York（1992）に記載の一般的方法に従って行った。トランスフェクションの１日前に、指数増殖期の培養から得た細胞を、２ｘ１０5個／ウェルの密度で１２ウェルプレートに接種し、各ウェルに２％〜１０％ウシ胎児血清を添加した増殖培地１ｍＬを加え、細胞培養プレートを５％ＣＯ2大気下、３７℃で２４時間培養した。
個々のウェルに最終Ｃａ2+濃度１２．５ｍＭとなる容量：容量（ｖ／ｖ）比で、沈殿混合物を加えた（種々の温度で種々の時間インキュベーションした後）。ｐＨを７．２またはそれ以上に保つとＣａ2+およびＰＯ43-の過飽和条件が維持された。これを、３〜６時間該沈殿物に曝露し、１５％グリセロールで３０秒間衝撃を与え、１回洗浄し、次いで１〜６日間新鮮増殖培地中でインキュベーションした。２９３細胞を３〜２０時間該沈殿物に曝露し、次いでグリセロール衝撃を与えることなく１〜６時間新鮮増殖培地中でインキュベーションした。
結果および考察
Ａ．リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿の物理化学的パラメーター
１．温度
以下に開示するリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコールは、ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿が少なくとも１０分間行われることを規定しており、ほどんどのプロトコールは２０分間の共沈殿を推奨しているが、標準的条件（１２５ｍＭ Ｃａ2+、０．７５ｍＭ ＰＯ43-、２５μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、２０℃、ｐＨ７．０５）下において、ＤＮＡ／ＣａＣｌ2溶液とホスフェート溶液を混合した後１分間以下でＤＮＡの９５％以上が該沈殿物と結合したことがわかった（図２の２５μｇ／ｍＬ ＤＮＡのデータ参照）。温度の効果の検討を促進するため、低いホスフェート濃度（０．６ｍＭ ＰＯ43-）を用いて結晶の成長速度を低下させた。結晶の成長速度の低下により、ＤＮＡの該沈殿物への結合は０℃〜３７℃の温度で２０分間にわたり観察された（図１）。３７℃で、ＤＮＡ１００％が１分間以内に該沈殿物と結合したが、０℃ではすべてのＤＮＡが２０分間溶液中に残っていた。この結果は、より低い温度でリン酸カルシウムの溶解性が高く、結晶形成頻度の低下と溶液の過剰飽和の低下が生じることによるものである。
２．ＤＮＡ濃度
ＤＮＡ濃度はトランスフェクション効率に影響するため、ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿に対するＤＮＡ濃度の影響について検討した（図２）。沈殿は０．７５ｍＭのホスフェート濃度を用いて２０℃で行った。その結果、ＤＮＡ濃度の２５μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬへのＤＮＡ濃度の増加は沈殿物の結合能を劇的に低下させることが明らかになった（図２）。５０ｇμ／ｍＬの濃度では、９０％以上のＤＮＡが２０分後に溶液中に残っており、４５秒の微量遠心ではペレットはほとんどみられなかった。
３．カルシウム濃度
Ｃａ2+は沈殿混合物中のＰＯ43-濃度より１７０倍高濃度で存在したが、さらなるＣａ2+の増加は沈殿物の形成に大きく影響した（図３）。２５０ｍＭ Ｃａ2+および５０μｇ／ｍＬ ＤＮＡの存在下で、３０〜４５μｇ／ｍＬ ＤＮＡが沈殿物と結合した。ホスフェート濃度（０．７４ｍＭ）、によって沈殿物の絶対量を制限した場合、すべてのホスフェートが沈殿すると沈殿物は最大１２５μｇ／ｍＬとなると予測された。該沈殿物は、３７５ｍＭ Ｃａ2+および７５μｇ／ｍＬ ＤＮＡの存在下で５０μｇ／ｍＬまでのＤＮＡと結合することがわかった。したがって。ＤＮＡは最適条件下で形成される沈殿物の量の約４０％を占めることができる。
Ｂ．ＣＨＯおよび２９３細胞中の一過性発現
ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈殿は標準的条件（２５μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、１２５ｍＭ Ｃａ2+、０．７５ＰＯ43-）下で行った。種々の時間２０℃でインキュベーションした後、沈殿物を指数増殖期の細胞培養と混合した。トランスフェクション効率は、Somesらの、EMBO, 5:3133-3142（1986）の方法に従いＸ−ｇａｌ染色によって発現細胞を確認する細胞内β−ガラクトシダーゼ発現系によるか、またはBennetらの、J. Biol. Chem, 266:5191-5201（1991）の方法に従い分泌されたｔＰＡ産物をＥＬＩＳＡアッセイによって定量するｔＰＡ発現系によって分析される。図４および５に示すように、試験した沈殿物のインキュベーション期間のうちで１分間の沈殿工程が最も高いＤＮＡトランスフェクション効率と発現レベルをもたらした。宿主細胞に４時間曝露した後の沈殿物の光学顕微鏡（位相差、倍率２０Ｘ）による検査では、１分間の沈殿では極めて大量の非常に小さな粒子が形成されたが、２０分間の沈殿ではより大きいがはるかに少ない粒子しか形成されなかったことが示された。２９３細胞およびＣＨＯ細胞の両者における１分間沈殿物の高トランスフェクション効率は、１分間の沈殿では２５μｇ／ｍＬ ＤＮＡ、１２５ｍＭ Ｃａ2+および０．７５ｍＭ ＰＯ43-を含む沈殿混合物において１００％のＤＮＡが結合するのに十分であることを示す上記データと一致している。
高レベルの一過性発現は、２５０ｍＭのＣａ2+濃度（結晶形成頻度を最大にした）および５０μｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度（結晶の成長を飽和させた）を用いることによって達成された。図６に示すように、結晶サイズは非常に短いインキュベーション期間の後に沈殿物と細胞を混合することによって調節された。この条件下で、ＣＨＯ宿主細胞において得られたｔＰＡ産物の力価は、２μｇ／ｍＬと高く、トランスフェクション３日後で通常約１μｇ／ｍＬであった。２９３細胞も２５０ｍＭ Ｃａ2+および５０μｇ／ｍＬ ＤＮＡを用いて３０秒間で形成された沈殿物でトランスフェクションした後により高い一過性発現レベルを生じた。この条件下で、２９３細胞は約２μｇ／１０6細胞／日の一過性の特異的生産性でトランスフェクション後２日目にｔＰＡ５μｇ／ｍＬを生じた。
実施例２
材料と方法
最初のマトリックスプレート試験において、種々の濃度（０．４ｍＭ〜２．５ｍＭ）のＰＯ43-を、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）１ｍＬ中で種々の濃度（２ｍＭ〜１０ｍＭ）のＣａ2+と混合した。プレートを３７℃で一夜インキュベーションした。各ウェルを光学顕微鏡（位相差、倍率２０Ｘ）下で試験し、沈殿物の存在をスコアづけした。
第二のマトリックスプレート試験では、種々の濃度（４．２ｍＭ〜１８．０ｍＭ）のＣａ2+を種々のｐＨ（６．８〜７．６）のＰＳＯ４培地中の３０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．９５ｍＭ ＰＯ43- １ｍＬと混合した。混合物を３７℃で一夜インキュベーションした。各ウェルを光学顕微鏡（位相差、倍率２０Ｘ）下で試験し、沈殿物の存在をスコアづけした。
結果と考察
最初の試験で得られたデータを図７にまとめて示す。図７の曲線上のデータポイントは沈殿物を生じるＣａ2+とＰＯ43-の最低濃度を示す。したがって、図７に示すデータポイントはＣａ2+濃度とＰＯ43-濃度の作用としてのリン酸カルシウム溶解性曲線を描く。最小二乗法による回帰を用いて、Ｃａ2+濃度とＰＯ43-濃度の作用としてのリン酸カルシウムの溶解性が式ｙ＝（４．７０４）（ｘ-0.82699）（ここで、ｙはＣａ2+濃度であり、ｘはＰＯ43-濃度である）と近似していることがわかった。該曲線より上方のあらゆるポイント（ｘ，ｙ）において、リン酸カルシウム粒子は連続的に成長することができる。該曲線より下方のあらゆるポイント（ｘ，ｙ）において、沈殿物は速やかに溶解する。
第二の試験で得られたデータを図８にまとめて示す。図８に示すデータポイントは、Ｃａ2+濃度およびｐＨの作用としてのリン酸カルシウム溶解性曲線を描く。最小二乗法による回帰を用いて、Ｃａ2+濃度とｐＨの作用としてのリン酸カルシウムの溶解性が式ｙ＝（８．６８８６１２）（ｘ-14.075）（ここで、ｙはＣａ2+濃度であり、ｘはｐＨである）と近似していることがわかった。該曲線より上方のあらゆるポイント（ｘ，ｙ）において、リン酸カルシウム粒子は連続的に成長することができる。該曲線より下方のあらゆるポイント（ｘ，ｙ）では、沈殿物は速やかに溶解する。
実施例３
材料と方法
１．沈殿
本明細書において「ｐＰＫ ＴＮＫ ｔＰＡ」と呼んでいる発現ベクターpRK7-T103N,N117Q,KHRR（296-299）AAAA tPA（WO93/24635（1993年12月９日公開）参照）の精製プラスミドＤＮＡ０．２５ｍｇを２５０ｍＭ ＣａＣｌ2溶液を含むＴＥ緩衝液２．５ｍＬ中で希釈した。ＤＮＡ／ＣａＣｌ2溶液は１．５ｍＭ〜４．５ｍＭ ＰＯ43-、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０５）を含むホスフェート溶液２．５ｍＬに速やかに加え、この混合物を静かに渦巻き混合し、沈殿物の形成を開始し、次いで室温で１分間インキュベーションした。
２．トランスフェクション
トランスフェクション用の２９３細胞（ATCC CRL1573）は上記実施例１に記載のごとく継代された。指数増殖期の浮遊培養から細胞を得、１００ｍＬスピナーフラスコ中、０．１２％パック細胞容積（ＰＣＶ）（細胞約０．４−０．５ｘ１０6個／ｍＬ）の密度で新鮮培地１００ｍＬに接種した。浮遊培養の部分標本を遠心し、ペレットになった細胞を所望の細胞密度で新鮮培地に再浮遊する「培地交換」により浮遊培養から細胞を得た。。再浮遊した細胞を、約７０ｒｐｍに設定した磁気攪拌器（magnetically driven impeller）によってスピナーフラスコ中で浮遊状態に保った。細胞接種後約２時間でスピナーフラスコ中のＣａＣｌ2濃度は６．５ｍＭ〜１４．５ｍＭの範囲から選ばれる濃度に増加した（培地中１ｍＭ ＣａＣｌ2の標準濃度から）。
上記工程１に記載のごとくＤＮＡ／リン酸カルシウム共沈殿を１分間インキュベーションした後、共沈殿混合物２ｍＬをスピナーフラスコに速やかに加え、初期ＤＮＡ濃度１ｍｇ／Ｌの培地および初期Ｃａ2+濃度９ｍＭ〜１７ｍＭでトランスフェクション混合物を形成させた。該トランスフェクション混合物をよく混合し、約７０ｒｐｍに設定した磁気攪拌器で攪拌しながら３７℃で４時間インキュベーションした。トランスフェクション混合物を二等分してパート（Ａ）および（Ｂ）とした。パート（Ａ）は新鮮培地１容量と混合され、パート（Ｂ）は無変化条件下でさらに１６時間インキュベーションされ、ついで新鮮培地１容量と混合された。新鮮培地で希釈した後、この混合物を合計２７時間〜５２時間攪拌しながら３７℃でインキュベーションした。遠心して培養上清を回収した。培養上清中に分泌されたＴＮＫ ｔＰＡ産物を、天然配列ｔＰＡで標準化したＥＬＩＳＡ（EPO Pat. Publ. 93,619参照）を用いて定量することによりトランスフェクション効率を分析した。
結果と考察
得られたデータを図９〜１０にまとめて示す。図９は沈殿工程におけるＰＯ43-濃度（ＤＮＡ濃度５０μｇ／ｍＬおよびＣａ2+濃度１２５４ｍＭ）とトランスフェクション工程におけるインキュベーション時間に関する一過性発現の最適化を示す。図９に示すように、一過性発現レベルは沈殿工程ではＰＯ43-濃度１．１２５ｍＭで、またトランスフェクション工程ではインキュベーション時間４時間で最適化される。この条件下において２９３細胞は、約５００ｎｇ／１０6細胞／日の一過性の特異的生産性でのトランスフェクション後５２時間でＴＮＫ ｔＰＡ５００ｎｇ／ｍＬを産生した。
図１０は、トランスフェクション工程におけるＣａ2+濃度とインキュベーション時間（沈殿工程では１２５ｍＭ Ｃａ2+、１．１２５ｍＭ ＰＯ43-、および５０μｇ／ｍＬ ＤＮＡ）に関する一過性発現の最適化を示す。図１０に示すように、一過性発現レベルはトランスフェクション工程ではインキュベーション時間４時間で最適化される。この条件下で２９３細胞は、約５００〜８００ｎｇ／１０6細胞／日の一過性の特異的生産性でトランスフェクション後５２時間でＴＮＫ ｔＰＡ ５００〜７５０ｎｇ／ｍＬを産生した。トランスフェクション工程におけるＣａ2+濃度９ｍＭ、１２．５ｍＭ、および１７ｍＭではほぼ同等な一過性発現レベルを生じた。
１００ｍＬスピナーフラスコ（４時間トランスフェクションインキュベーションの上記の条件下で）を用いるかまたは２５０ｍＬスピナーフラスコ（トランスフェクション混合物１００ｍＬを４時間インキュベーションし、次いで新鮮培地１容量と混合する上記条件を改良した条件で）を用いて得られたＴＮＫ ｔＰＡの最大力価は、５日後で３ｍｇ／Ｌおよび２日後で１．５ｍｇ／Ｌであった。得られた最大一過性特異的生産性はＴＮＫ ｔＰＡ約１ｍｇ／１０6細胞／日であった。
実施例４
材料と方法
１．沈殿
発現ベクターｐＲＫ ＤＮａｓｅ３（1990年７月12日公開の、WO90/07572に記載）の精製プラスミドＤＮＡ１．２ｍｇを５００ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＥ緩衝液３０ｍＬで希釈した。ＤＮＡ／ＣａＣｌ2溶液を、ゆっくり振とうさせながら、２００ｍＬフラスコ中の１．５ｍＭ ＰＯ43-、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０５）を含むホスフェート溶液３０ｍＬに速やかに加え、沈殿物の形成を開始し、室温で１〜２分間インキュベーションした。
２．トランスフェクション
トランスフェクション用の２９３細胞（ATCC CRL1573）は上記実施例１に記載のごとく継代された。トランスフェクションの２日前に指数増殖期の浮遊培養から細胞を得、２Ｌバイオリアクター中、０．０５％パック細胞容積（ＰＣＶ）の密度で新鮮培地１Ｌに接種した。浮遊培養の部分標本を遠心し、ペレットになった細胞を所望の細胞密度で新鮮培地に再浮遊した「培地交換」により成長している浮遊培養から細胞を得た。再浮遊した細胞を、約７０ｒｐｍに設定した磁気攪拌器によって該リアクター中で浮遊状態に保ち、約０．２％ＰＣＶの細胞密度（約０．６−０．８ｘ１０6細胞／ｍＬ）に達するまで３７℃でインキュベーションした。
上記工程１に記載のごとくＤＮＡ／リン酸カルシウム共沈殿を１分間インキュベーションした後、該共沈殿混合物を６０ｍＬシリンジに入れ、該リアクター中に直接注入し、初期ＤＮＡ濃度１．２ｍｇ／Ｌおよび初期Ｃａ2+濃度１５ｍＭでトランスフェクション混合物が形成された。該トランスフェクション混合物を上記のごとく攪拌しながら３７℃で３．５時間該リアクター中でインキュベーションした。新鮮培地１容量を加え、該培養を攪拌しながら３７℃で合計７４時間インキュベーションした。トランスフェクション後１９、２４、４３、５０、および７４時間に培養サンプルを得た。遠心して培養上清を回収した。培養上清中に分泌されたＤＮａｓｅ産物を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によって定量した。マイクロタイタープレートをヤギ抗組換えヒトＤＮａｓｅ抗血清でコートし、コートされたプレートを培養上清と接触させ、プレートを洗浄して非結合ＤＮａｓｅを除去し、次いで結合ＤＮａｓｅをホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したウサギ抗組換えヒトＤＮａｓｅ抗血清で検出した。
結果と考察
下記表Ｉは、トランスフェクション後のＰＣＶ対ＤＮａｓｅの一過性発現についての経時データを示す。
0003815794.tif 000002
表Ｉのデータは図１１にグラフで示している。表Ｉおよび図１１に示すように、トランスフェクトされた細胞培養はトランスフェクション後１９時間に０．２７％ＰＣＶで０．２５μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅを生じ、７４時間後に０．５５％ＰＣＶで２．２μｇ／ｍＬ ＤＮＡａｓｅを生じ、特異的生産性は約５００ｎｇ／１０6／日であった。
実施例５
材料と方法
１．沈殿
発現ベクターｐＲＫ ＴＮＫ ｔＰＡ（WO93/24635）の精製プラスミドＤＮＡ２０ｍｇを２５０ｍＭ ＣａＣｌ2を含むＴＥ緩衝液２００ｍＬ中で希釈した。４０Ｌバイオリアクターに供給する前に一つにまとまる２本のチューブラインと２つのポンプヘッド付ポンプによって、ＤＮＡ／ＣａＣｌ2溶液を、２．５ｍＭ ＰＯ43-、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０５）を含むホスフェート溶液２００ｍＬとインラインで混合する。ポンプ速度と、バイオリアクターエントリーポートにインラインで混合するポイントからのチューブの長さを調節して該リアクター細胞培養中で希釈する前に沈殿混合物のインキュベーションを３０秒間達成する。
２．トランスフェクション
トランスフェクション用の２９３細胞（ATCC CRL1573）は上記実施例１に記載のごとく継代される。トランスフェクションの２日前に、指数増殖期の浮遊培養から細胞を得、４０Ｌバイオリアクター中、０．０５％パック細胞容積（ＰＣＶ）の密度で新鮮培地２０Ｌに接種した。浮遊培養の部分標本を遠心し、ペレットになった細胞を所望の細胞密度で新鮮培地に再浮遊する「培地交換」により成長している浮遊培養から細胞を得る。再浮遊した細胞を、約５０ｒｐｍに設定した磁気攪拌器によって該リアクター中で浮遊状態に保ち、約０．２％ＰＣＶの細胞密度（約０．６−０．８ｘ１０細胞／ｍＬ）に達するまで３７℃でインキュベーションする。０．２％ＰＣＶでｐＨは、７．２−７．５に増加し、２５０ｍＭ ＣａＣｌ2 ８００ｍＬを加えＣａ2+濃度を７．５ｍＭ増加させる。
上記工程１に記載のごとくＤＮＡ／リン酸カルシウム共沈殿を３０秒間インキュベーションした後、該共沈殿混合物を該リアクターに注入し、初期ＤＮＡ濃度１．０ｍｇ／Ｌでトランスフェクション混合物を形成させる。該トランスフェクション混合物を上記のごとく攪拌しながら３７℃で５時間該リアクター中でインキュベーションする。５時間インキュベーション後、新鮮培地２０Ｌを加え、該培養を攪拌しながら３７℃で合計３日間インキュベーションする。遠心および／または濾過により培養上清を回収する。培養上清中に分泌されたＴＮＫ ｔＰＡ産物を、EPO Pat. Publ. 93,619に記載の標準的ｔＰＡ ＥＬＩＳＡを用いて定量することによりトランスフェクション効率を分析する。
【図１】
0003815794.tif 000003
【図２】
0003815794.tif 000004
【図３】
0003815794.tif 000005
【図４】
0003815794.tif 000006
【図５】
0003815794.tif 000007
【図６】
0003815794.tif 000008
【図７】
0003815794.tif 000009
【図８】
0003815794.tif 000010
【図９】
0003815794.tif 000011
【図１０】
0003815794.tif 000012
【図１１】
0003815794.tif 000013