(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象蛋白を含有する乳試料を正に荷電している薬剤と接触させて対象蛋白の有意な損失を伴わずに安定化された乳試料から対象蛋白が単離されうるようにし；次いで
安定化された乳試料から対象蛋白を生物学的に活性な形態で単離すること
からなる乳試料からの対象蛋白の単離方法。
【請求項２】
接触段階において対象蛋白の溶解性が安定化される請求項１記載の方法。
【請求項３】
乳試料がヒトを除くトランスジェニック哺乳動物から得られるものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
トランスジェニック哺乳動物が、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスからなる群より選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
対象蛋白が天然に存在する乳成分である請求項１記載の方法。
【請求項６】
対象蛋白がトランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌される成分である請求項３記載の方法。
【請求項７】
対象蛋白が治療薬である請求項３記載の方法。
【請求項８】
治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター（longer-acting tissue-type plasminogen activator）である請求項７記載の方法。
【請求項９】
治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
対象蛋白が免疫グロブリンである請求項３記載の方法。
【請求項１１】
正に荷電している薬剤を含有している乳試料のｐＨが５．０ないし９．０の範囲である請求項３記載の方法。
【請求項１２】
正に荷電している薬剤が、アルギニン、イミダゾールおよびビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）からなる群より選択される請求項３記載の方法。
【請求項１３】
正に荷電している薬剤がアルギニンである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１の方法を用いて対象蛋白を単離し、該単離した対象蛋白を細胞培養培地に含めることからなる細胞培養培地における改良方法。
【請求項１５】
請求項１の方法を用いて対象蛋白を単離し、該単離した対象蛋白を食品に含めることからなる食品における改良方法。
【請求項１６】
接触段階における条件が、対象蛋白がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象蛋白を含有する乳試料のｐＨを調節することを包含する請求項３記載の方法。
【請求項１７】
乳試料が調節されるｐＨが５．０ないし９．０の範囲である請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
対象蛋白が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターであり、乳試料が調節されるｐＨが４．６ないし５．４である請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
全乳蛋白の一部がカゼインを含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項２０】
さらに、安定化された乳試料を濾過し、濾過された乳試料から対象蛋白を単離することからなる請求項１記載の方法。
【請求項２１】
対象蛋白が、濾過された乳試料からクロマトグラフィーにより単離される請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
対象蛋白を含有する乳試料を正に荷電している薬剤と接触させ、濾過により処理可能な乳試料を生成し；次いで
濾過により処理可能な乳試料から対象蛋白を単離すること
からなる乳試料からの対象蛋白の単離方法。
【請求項２３】
乳試料がヒトを除くトランスジェニック哺乳動物から得られるものである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
蛋白が治療薬である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
蛋白が免疫グロブリンである請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
正に荷電している薬剤が、アルギニン、イミダゾールおよびＢｉｓ−Ｔｒｉｓからなる群より選択される請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
正に荷電している薬剤がアルギニンである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
さらに、濾過により処理可能な乳試料を濾過すること、次いで濾過された試料から対象蛋白を単離することからなる請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
対象蛋白が、濾過された乳試料からクロマトグラフィーにより単離される請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
請求項２２の方法を用いて対象蛋白を単離し、該単離した対象蛋白を細胞培養培地に含めることからなる細胞培養培地における改良方法。
【請求項３３】
請求項２２の方法を用いて対象蛋白を単離し、該単離した対象蛋白を食品に含めることからなる食品における改良方法。
【請求項３４】
対象蛋白がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象蛋白を含有する乳試料のｐＨを調節し；
全乳蛋白の一部の溶解性を安定化する条件下で、対象蛋白を含有する乳試料を正に荷電している薬剤と接触させて対象蛋白の有意な損失を伴わずに安定化された乳試料から対象蛋白が単離されるようにし；次いで
安定化された乳試料から対象蛋白を生物学的に活性な形態で単離すること
からなる乳試料から対象蛋白を単離する方法。
【請求項３５】
乳試料がヒトを除くトランスジェニック哺乳動物から得られる請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
蛋白が治療薬である請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターである請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
乳試料が調節されるｐＨが５．０ないし９．０の範囲である請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
対象蛋白が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターであり、乳試料が調節されるｐＨが４．６ないし５．４である請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
調節および接触段階が同時に行われる請求項３４記載の方法。
【請求項４２】
接触段階が調節段階の前に行われる請求項３４記載の方法。
【請求項４３】
正に荷電している薬剤が、アルギニン、イミダゾールおよびＢｉｓ−Ｔｒｉｓからなる群より選択される請求項３５記載の方法。
【請求項４４】
全乳蛋白の一部がカゼインを含んでいる請求項３５記載の方法。
【請求項４５】
全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象蛋白を含有する乳試料を正に荷電している薬剤と接触させて対象蛋白の有意な損失を伴わずに安定化された乳試料から対象蛋白が単離されうるようにすることからなる、対象蛋白を含有する乳試料中の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化する方法。
【請求項４６】
接触段階における条件が、対象蛋白がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象蛋白を含有する乳試料のｐＨを調節することを包含する請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
接触段階において対象蛋白の溶解性が安定化される請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
全乳蛋白の一部がカゼインを含んでいる請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
乳試料がヒトを除くトランスジェニック哺乳動物から得られるものである請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
蛋白が治療薬である請求項４５記載の方法。
【請求項５１】
治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターである請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
正に荷電している薬剤；および
前もって全乳蛋白の一部を除去することによる有意な損失を伴わずに安定化された乳試料からの対象蛋白の単離を可能にする程度にまで、対象蛋白を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定化を行うための正に荷電している薬剤の使用に関する説明書
からなる、対象蛋白を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化するためのキット。
【請求項５４】
さらに、対象蛋白がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の一部の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象蛋白を含有する乳試料のｐＨを調節するための薬剤を入れておく容器からなる請求項５３記載のキット。
【請求項５５】
蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーター（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）である請求項３記載の方法。
【請求項５６】
蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーターである請求項２４記載の方法。
【請求項５７】
蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーターである請求項３６記載の方法。
【請求項５８】
蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーターである請求項５０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
天然の乳成分は、ヒトの食事に取り入れられてから長い歴史があり、比較的単離し易いため、長い間研究対象となってきた（スウェイスグッド,エイチ・イー（Swaisgood,H.E.）,ディベロップメンツ・イン・デイリー・ケミストリー−Ｉ：ケミストリー・オブ・ミルク・プロテイン（Developments in Dairy Chemistry-I:Chemistry of Milk Protein）,（ニューヨークのアプライド・サイエンス・パブリッシャーズ（Applied Science Publishers）,１９８２年）。最近になって、研究者らは、対象とする特定の蛋白をトランスジェニック動物の乳腺組織に合成させることにより、乳中に通常は産生されない蛋白の便利な源として乳を利用している。例えば、研究者らは、β−ラクトグロブリン遺伝子およびヒト・抗血友病因子IX遺伝子の暗号配列からなる融合遺伝子をヒツジ・生殖細胞系に導入した（クラーク,エイ・ジェイ（Clark,A.J.）ら,（１９８９年５月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第７巻：４８７〜４９２頁）。結果的に、乳を分泌するトランスジェニックヒツジはその乳中に因子IXを分泌した。同様に、ヤギ・生殖細胞系を操作して、ヒト・長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター（longer-acting tissue-type plasminogen actinator）の暗号配列に結合したネズミ・乳清酸性蛋白の遺伝子由来の調節配列を含む融合遺伝子を取り込ませた（エバート,ケイ・エム（Ebert,K.M.）ら,（１９９１年９月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第２巻：８３５〜８３８頁）。トランスジェニック乳ヤギ由来の乳は、修飾された組織プラスミノゲンアクチベーターを含有していた。
トランスジェニック家畜の乳中の治療薬のごとき対象蛋白の生産は、哺乳動物細胞培養系における複雑な組み換え蛋白の慣用的な生産に典型的に付随する経費が軽減された、かかる蛋白の大規模生産を提供する。乳中における蛋白のトランスジェニック発現は、組み換え蛋白発現という伝統的な方法に優る利点を提供するが、いくつかの問題もある。これらの問題は、乳中における組み換え蛋白の活性の保持および実行可能な商業的生産のための精製度にまで蛋白を精製することを包含する。
乳からの対象蛋白の伝統的単離方法は、しばしば、沈降（スウェイスグッド,エイチ・イー（Swaisgood,H.E.）,ディベロップメンツ・イン・デイリー・ケミストリー−Ｉ：ケミストリー・オブ・ミルク・プロテイン（Developments in Dairy Chemistry-I:Chemistry of Milk Protein）,（ニューヨークのアプライド・サイエンス・パブリッシャーズ（Applied Science Publishers）,１９８２年）、沈殿（コーセ（Kothe）ら,米国特許第４６４４０５６号；グローブス,エム・エル（Groves,M.L.）ら,（１９８５年）バイオケミ・エト・バイオフィジ・アクタ（Biochem.et.Biophys.Acta）第８４４巻：１０５〜１１２頁；マッケンジー,エイチ・エイ（McKenzie,H.A.）,ミルク・プロテインズ：ケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Milk Proteins:Chemistry and Molecular Biology）,ニューヨークのアカデミック・プレス（Academic Press）,１９７１年,８８頁）またはレニンもしくはキモトリプシンを用いる酵素的凝固（スウェイスグッド,エイチ・イー（Swaisgood,H.E.）,ディベロップメンツ・イン・デイリー・ケミストリー−Ｉ：ケミストリー・オブ・ミルク・プロテイン（Developments in Dairy Chemistry-I:Chemistry of Milk Protein）,（ニューヨークのアプライド・サイエンス・パブリッシャーズ（Applied Science Publishers）,１９８２年）のいずれかによる主要乳成分の分画を、その最初の段階として必要としていた。これらの方法に伴う問題は、除去されるべき乳成分の沈殿中への捕捉による対象蛋白の損失が原因である低収率、および酸沈殿にしばしば必要とされる低ｐＨによる対象蛋白の生物学的活性の損失を包含する。デンマン,ジェイ（Denmen,J.）ら,（１９９１年９月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第９巻：８３９〜８４３頁参照。そのうえ、乳からの対象蛋白の伝統的単離方法は、主要乳成分の沈降、沈殿または凝固を必要とするため、乳試料は、容易に濾過により処理できない。
発明の概要
本発明は、乳からの蛋白のごとき対象成分の単離方法に関する。本発明は、少なくとも部分的には、伝統的方法を用いて乳試料から得られた対象とする生物学的に活性な成分の低収率は、本質的には、最初の分画段階の沈殿に対象成分が捕捉されるためであるという認識に基づく。本発明方法は、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化する安定化剤を提供することにより、対象成分の不活性化および捕捉を回避するものである。安定化した乳試料から沈降または沈殿するというよりはむしろ、そして対象成分と結合するというよりはむしろ、全乳蛋白の少なくとも一部は可溶性のままであり、その結果、対象成分の精製の間に除去される。さらに、本発明方法は、先行方法のような低ｐＨを必要としないため、ｐＨ感受性対象成分の不活性化が回避される。
本発明は、対象成分を含有する乳試料から対象成分をその生物学的活性形態で単離する方法に関する。より詳細には、本発明は、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触させることによる、乳試料からの対象成分の単離方法に関する。安定化後、有意な損失を伴わずに、対象成分をを単離することができ、安定化した乳試料から対象成分をその生物学的に活性な形態で単離することができる。
さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料を、乳試料を濾過により処理可能な形態にする安定化剤と接触させることによる、乳試料からの対象成分の単離方法に関する。次いで、対象成分は、濾過により処理可能な乳試料から単離される。
さらに本発明は、上記方法および対象成分を含有する乳試料中の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化する方法を用いて単離された対象成分に関する。単離された対象蛋白を、細胞培養用培地への添加物、食料品、医薬組成物として使用することができる。さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料の全蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させるキットを使用するための説明書を伴った上記方法に使用される試薬を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、１２種の異なる濃度のアルギニンに関し、乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す写真である。
図２は、１２種の濃度のアルギニンに関し、図１で示したアルギニン可溶化段階から得られた上清の長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター（ＬＡ−ｔＰＡ）に対する相対蛋白濃度を示す。
図３は、１２種の異なるイミダゾール濃度に関し、乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す写真である。
図４は、１２種の異なるイミダゾール濃度に関し、図３で示したイミダゾール可溶化段階からの上清のＬＡ−ｔＰＡ活性に対する相対蛋白濃度を示す。
図５は、１０種の異なる濃度のビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）に関し、乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す写真である。
図６は、１０種の異なるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度に関し、図５で示したＢｉｓ−Ｔｒｉｓ可溶化段階からの上清のＬＡ−ｔＰＡ活性に対する相対蛋白濃度を示す。
図７Ａ〜７Ｅは、ｐＨを変化させた場合の種々の濃度のアルギニンに関する、乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す５枚の写真である。
図８は、乳試料のｐＨの調節前にアルギニンを乳試料に添加した場合に、アルギニンにより媒介される全乳蛋白の一部の可溶化の際得られた上清のＬＡ−ｔＰＡ活性に対する相対蛋白濃度を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、対象成分の有意な損失を伴わずに、対象成分を含有する乳試料から対象成分を単離する方法に関する。該方法は、全乳蛋白のうち少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触させて対象成分が安定化された乳試料から単離されうるようにすることを包含する。次いで、対象成分は生物学的に活性な形態で、安定化された乳試料から単離される。
「対象成分」なる語は、該対象成分に有意な悪影響を伴わずに、上記方法を用いて乳から単離されうる、乳試料中に存在する物質を包含する。対象成分は、乳試料中の天然物質であってもよく、あるいは乳試料中に通常は存在しない物質であってもよいが、トランスジェニック動物の乳腺組織において、最終的にはかかる動物の乳中に誘導される物質を目的とする。対象成分は遊離形態であってもよく、あるいは乳中に存在する他の物質中、例えば、乳脂肪球および／または乳脂肪球を含んでいる膜の中に捕捉または封入されていてもよい。（例えば、ディトリオ（DiTollio）ら,（１９９２年）バイオテクノロジー（Biotechnology）第１０巻：７４〜７７頁参照）。対象成分の例は、カゼイン、ラクトフェリン、β−ラクトグロブイン、免疫グロブリンのごとき蛋白、オレイン酸、パルミチン酸およびミリスチン酸のグリセリドのごとき脂質、ラクトースおよびより複雑なオリゴ糖のごとき多糖、またはビタミンＡおよびビタミンＢ複合体のごときビタミン、リン、カリウム、鉄、マグネシウム、銅ならびにカルシウムのごときミネラルと一緒になった上記成分のいずれかを包含する。例えば、対象成分を、正常な分泌経路を通して乳中に産生させることができる。蛋白の正常な分泌経路は、粗面小胞体での蛋白の合成、小胞体内腔中の蛋白の通過、次いで、ゴルジ体への輸送を包含しうる。最終的には、蛋白（または糖鎖付加蛋白）は、細胞質中につまみ出され、その結果、細胞質膜に融合する小胞中に詰められる。別の分泌経路は、嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーター（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）の場合のように、膜から対象成分を含有する乳脂肪球を泡のように放出することを包含する。
天然乳成分は、培養において、ある種の細胞の無血清下での増殖時に添加するのに有用であることがわかっている。ステイマー,ケイ・エス（Steimer,K.S.）ら,（１９８１年１１月）ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー（J.Cell Physiol.）第１０９巻（２）：２２３〜２３４頁（上皮細胞および線維芽細胞）；ステイマー,ケイ・エス（Steimer,K.S.）およびクラグスブルン,エム（Klagsbrun,M.）（１９８１年２月）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell.Biol.）第８８巻（２）：２９４〜３００頁（正常および形質転換線維芽細胞）参照。乳成分は食品にも使用されうる。例えば、乳成分の餌への混合は、最終産物の栄養価を増大させる。例えば、ルデル,エイチ・ダブリュウ（Rudel,H.W.）ら,米国特許第５１７８８９４号参照。別法として、乳成分を、冷凍乳製品デザート類のごとき乳製品に添加してボディーやテクスチャーを成分に付加し、温度不安定性を減少させることもできる（ファング,ブイ・ティー（Huang,V.T.）ら,米国特許第５１７５０１３号）。乳成分をチーズ製造に使用することもできる（イー,ジェン−ジュング（Yee,Jen-Jung）ら,米国特許第５１６５９４５号）。
さらに、「対象成分」なる語は、非トランスジェニック哺乳動物から得られる乳試料中に通常は存在しないがトランスジェニック哺乳動物から得られる乳試料中に分泌される化合物をも包含する。かかる対象成分の例は治療薬を包含する。治療薬は、適当な条件下で適量投与した場合、哺乳動物に治療効果をもたらす薬剤である。望ましい治療効果は、治療すべき疾病または症状による。上記適量または症状は、個体により決定され、治療すべき個体の大きさ、治療すべき徴候の重大さ、および選択された治療薬の投与経路によるであろう。治療薬の例は、インシュリン、長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター（ＬＡ−ｔＰＡ）、アンチトロンビンIII、ａ−１−抗−トリプシン、可溶性ＣＤ４、インターロイキン−２、免疫グロブリン、嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーター、および凝固因子VIIIならびにIXを包含する。
「トランスジェニック哺乳動物」なる語は、例えば、その生殖細胞または体細胞のごとき細胞が、遺伝的に、外来ＤＮＡセグメントが導入されるように操作されている哺乳動物をいう。トランスジェニック哺乳動物の例は、トランスジェニックウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット、およびマウスを包含する。典型的には、低費用で対象成分の大規模生産を行うためには、産生する乳量に応じて哺乳動物を選択すべきである。好ましくは、大量の乳を産生できるという理由で、ウシ、ヒツジおよびヤギのごとき大型のトランスジェニック家畜が選択される。
「生物学的に活性のある」なる語は、その意図された機能を発揮することを可能にする対象成分に関する活性を包含する。該対象成分は、天然に存在するものと同等の活性を有することはないが、それに非常に近い活性を有する。
「乳試料」なる語は、対象成分を含有する哺乳動物由来の乳を含んでいる試料を包含する。乳試料は、哺乳動物から直接得られる試料であってもよく、あるいは、意図された機能を発揮するために、対象成分または安定化剤の能力に悪影響を及ぼさないやり方で処理された試料であってもよい。さらに、意図された機能を発揮させるために、対象成分または安定化剤の能力に悪影響を及ぼさない薬剤を用いて乳試料を濃縮または希釈してもよい。乳試料中の乳量は、対象成分の存在を確認するに十分な量である。
「安定化剤」なる語は、全乳蛋白および／または対象成分の少なくとも一部を可溶化および／またはその溶解性を維持させる化合物を包含する。「〜の溶解性を維持」なる語は、後の処理段階、例えば、ｐＨ調節の間において、全乳蛋白の一部を乳試料から沈殿させないでおき、乳試料のさらなる処理または対象成分の単離を妨害させないでおく程度の溶解性の維持を包含する。この溶解性の維持は、一定値の溶解性の維持である必要はないが、適当な範囲での溶解性の維持であってよい。かかる薬剤の例は、アミノ酸および正に荷電したバッファーのごとき１価および多価カチオン性薬剤である。正に荷電した有用なバッファーは、アルギニン、イミダゾールおよびＢｉｓ−Ｔｒｉｓを包含する。安定化剤のｐＨは、典型的には、該薬剤が正に荷電するように選択される。
「溶解性を安定化」なる語は、全乳蛋白の少なくとも一部を可溶化および／またはその可溶化の維持を包含する。カゼインのごときある種の主要乳蛋白は、本質的には乳中において部分的に不溶性または不溶性形態である。乳のｐＨの低下は、これらの乳蛋白の少なくとも一部の沈殿を生じさせうる。しかしながら、対象成分の単離には、対象成分が可溶性のままであるように乳試料のｐＨを調節することが必要となりうる。さらに、乳試料のｐＨの調節は、全乳蛋白の少なくとも一部の沈殿を促進する傾向がある。ｐＨ調節の前、調節中、後において、可溶化剤は、これらの蛋白を可溶化そして／またはそれらの溶解性を維持する。さらに、別の対象とする成分の単離は、それを可溶化またはその溶解性を維持するためのｐＨ調節を必要としないが、沈殿した乳蛋白による妨害なしに全乳蛋白の少なくとも一部を可溶化させ、そして／またはその溶解性を維持してさらなる乳試料の処理を行うには、やはり、可溶化剤は必要である。
安定化剤の濃度は、安定化剤が対象成分の機能特性を保存し、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させるように選択される。例えば、対象成分が酵素である場合、高イオン強度は酵素活性を減少させる可能性があるため、バッファー濃度は可能なかぎり低くすべきである。それゆえ、乳からの特定の対象成分の単離に必要な安定化剤の濃度は、安定化剤自体の特性および単離される対象成分の特性に応じて変更されよう。例えば、約０．３Ｍのアルギニン濃度は、ＬＡ−ｔＰＡの機能特性の保存および全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定化において、０．３Ｍのイミダゾールよりも効果的である。
安定化剤が乳試料と接触して安定化された乳試料を生成する条件は、対象成分の機能特性が保存され、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化されるように選択される。通常の当業者は、通常の実験のみにより、乳試料のｐＨ、単離に使用する薬剤濃度、および対象成分の機能特性ならびに全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定性に影響しうる他の因子のごとき条件を操作することができよう。
乳試料対象成分を含有する乳試料のｐＨは、通常には、対象成分がその溶解性および機能特性を保持し、全乳蛋白の一部の溶解性が安定化されるようなレベルに調節される。ｐＨが調節されるレベルは、いくつかの因子により決定されうる。対象成分が、その天然のおよび／または生物学的な活性形態にあるｐＨ範囲は、これらの因子に包含される。例えば、酵素のごときある種の対象成分は、狭いｐＨ範囲において活性でありうるし、この範囲外のｐＨに曝露することは不可逆的な活性の損失を引き起こす可能性がある。それゆえ、対象成分の機能的形態または天然型の対象成分を得るためには、許容される範囲内にｐＨを調節しなくてはならない。約０．５ないし約０．９のｐＨ範囲は、生物学的活性を有する多くの対象成分がその活性を保持する典型的な範囲の例である。「約５．０」なる語は、下記において定義される。「約９．０」なる語は、ｐＨ９．０と同一または同様の影響を対象成分に及ぼす９．０に近いｐＨを包含し、例えば、好ましくは８．５およびそれ以上、より好ましくは８．８およびそれ以上を包含する。
ｐＨ調節において考慮すべき別の因子は全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化されるレベルである。対象蛋白を含有する乳試料のｐＨは、一般的には、乳成分が乳から沈殿するレベルよりも低くなってはならない。例えば、２０℃、約４．６においてカゼインは沈殿する。ｐＨは、対象成分が不溶性になるのを防止するレベルに維持されるべきである。例えば、ヒト・長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター（ＬＡ−ｔＰＡ）含有乳試料のｐＨを約５．０まで低下させるとＬＡ−ｔＰＡは可溶化のままである。「約５．０」なる語は、ｐＨ５．０と同一または同様の影響を対象成分に及ぼす５．０に近いｐＨを包含し、例えば、好ましくは４．６ないし５．４、より好ましくは４．８ないし５．２を包含する。
「有意な損失」なる語は、上記の対象成分単離方法が、対象成分の商業的生産を成功させないような対象成分の損失を包含する。好ましくは、本発明方法は、対象成分の損失が５０％未満、より好ましくは約２０％未満、最も好ましくは約１０％未満である。慣用的乳処理方法は、対象成分が沈降物、沈殿物または凝固物中に捕捉されるため、対象成分の有意な損失を引き起こす。例えば、クラーク,エイ・ジェイ（Clark,A.J.）ら,（１９８９年５月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第７巻：４８７〜１９２頁は、トランスジェニックヒツジから得た乳試料から酸沈殿を用いて乳カゼインを除去した場合、約２．０ないし２．５％の抗血友病因子IXの回収率を報告している。これは損失が約９８％と解釈される。デンマン,ジェイ（Denman,J.）ら,（１９９１年９月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第９巻：８３９〜８４３頁は、トランスジェニック乳ヤギから得た乳試料から酸沈殿を用いて乳カゼインを除去した場合、約２５％のＬＡ−ｔＰＡ回収率、よって７５％の損失を報告している。さらにデンマンらは、レニン処理および酸沈殿のごとき他の最初の分画段階は、ＬＡ−ｔＰＡ収率の有意な増加を提供しなかったと報告している（デンマン,ジェイ（Denman,J.）ら,（１９９１年９月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第９巻：８３９〜８４３頁）。
「全乳蛋白の少なくとも一部」なる語は、部分的に不溶性または不溶性形態で乳中に通常存在する少なくとも１種の蛋白の少なくとも一部を包含する。溶解性が安定化されている全乳蛋白の一部は、要するに、その除去が対象成分の単離において無意味な段階よりも多くを構成するものでなくてはならない。種々の乳蛋白の一部の溶解性が安定化されうるか、または１種もしくはそれ以上の乳蛋白の全体の溶解性が安定化されうる。下記実施例において、アルギニンおよびイミダゾールは、下記実施例における全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化し、蛋白のうち少なくともカゼイン族、すなわち乳蛋白の少なくとも１つのタイプの全体または実質的に全体の溶解性を安定化させた。
慣用的方法を用いて、対象成分を安定化された乳試料から単離することができることが理解されるべきである。分離または単離方法の選択は、単離されるべき対象成分のタイプおよび乳試料中に存在する対象成分の量による。さらに、安定化された乳試料からの対象成分の単離または分離を、単一方法もしくは連続した複数の方法を用いて行うことができる。これらの方法は、濾過およびクロマトグラフィー法を包含する。濾過の例は、デッドエンド濾過フィルターユニットおよびクロスフロー濾過を包含する。クロマトグラフィー法の例は、イオン交換、疎水性、アフィニティー、およびゲル濾過クロマトグラフィー法を包含する。同様に、対象成分の単離前または後における乳試料の分画によるさらなる処理を、上記分離方法を用いて行うことができる。例えば、蛋白または他の成分の分画を、単離すべき成分の特性に応じた種々のクロマトグラフィー法のいずれかにより行うことができる。蛋白は、最も頻繁には、溶液中の蛋白混合物を多孔性固体マトリックスを有するカラムに通過させるカラムクロマトグラフィーにより分画され、蛋白がカラムの底部から流出するにつれて、蛋白を、それらの元々の機能的状態で分別収集することができる。使用するマトリックスの種類、例えば電荷（イオン交換クロマトグラフィー）、疎水性（疎水性クロマトグラフィー）、特定の化学官能基への結合能（アフィニティークロマトグラフィー）およびサイズ（ゲル濾過クロマトグラフィー）に応じて蛋白が分離される。高度な分析のため、高性能液体クロマトグラフィーを使用してもよい。当業者は、必要な純度にまで対象とする乳成分を単離するために、通常の実験により、上記分離方法の順序および回数を変更することができよう。
さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触させ、濾過により処理可能な乳試料を生成することによる、乳試料からの対象成分の単離方法に関する。次いで、対象成分を、濾過により処理可能な乳試料から単離することができる。対象成分および安定化剤なる語は上記定義に同じである。
「濾過により処理可能」なる語は、安定化された乳試料がフィルターを通過し濾液の一部となりうる程度にまで全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化されている乳試料を包含する。フィルターは、乳または乳類似物質の処理に典型的に使用されるタイプのものである。孔は乳中の成分により詰まるため、一般的には、フィルターは、典型的に乳処理に使用されるサイズの孔を有するものである。本発明の乳試料の処理に使用できるフィルターのタイプの例は、約０．２μｍないし約５．０μｍの範囲の孔サイズを有する。次いで、当業者に知られた順序の蛋白単離法のいずれかにより、対象成分を濾液から単離することができる。
さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料中の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる方法に関する。該方法は、対象成分の有意な損失なく全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、乳試料を安定化剤と接触させることを包含する。「安定化剤」、「溶解性を安定化させる条件下」および「全乳蛋白の少なくとも一部」なる語は上記定義に同じである。
また本発明は、対象成分を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させるためのキットに関する。該キットは、安定化剤を保持する容器、および有意な損失を伴わずに安定化された乳試料からの対象成分の単離を可能にする程度にまで、対象成分を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定化を行うための安定化剤の使用に関する説明書を包含する。さらに該キットは、対象成分の生物学的活性が保持され、全乳蛋白の一部の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで試料のｐＨを調節するための薬剤を保持するための容器を包含していてもよい。
「ｐＨを調節するための薬剤」なる語は、通常の当業者が乳試料のごとき溶液のｐＨを調節するのに用いる化合物を包含する。かかる薬剤は、ＨＣｌおよび酢酸のごとき酸、ＮａＯＨのごとき塩基を包含する。さらに、ＣＯ2のごとき気体によってもｐＨを調節することができる。乳試料のｐＨを調節するための薬剤が液体である場合、ｐＨ調節剤の送達の便利な手段を提供する容器の例は、ピペットまたは医療用ドロッパーの付いたバイアル、ビン等を包含する。
さらに限定的であってはならない下記実施例により、本発明はさらに説明される。本願のすべての部分（発明の背景を含む）において引用されるすべての文献および交付された特許の内容は、参照により特別に取り入れられる。本発明は、以下の実施例によりさらに説明される。
実施例１：  アルギニンを安定化剤として用いる、長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター（ＬＡ−ｔＰＡ）を含有するトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化
エバート,ケイ・エム（Ebert,K.M.）ら（１９９１年９月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第９巻：８３５〜８３８頁の方法に従って得た乳を分泌するトランスジェニック乳ヤギから得た乳試料を−２０℃で凍結保存し、分析前に３７℃の水浴中で融解した。乳ヤギの乳中に生成された対象成分はＬＡ−ｔＰＡ、すなわち野生型ｔＰＡよりも長い循環半減期を示すヒト・組織型プラスミノゲンアクチベーターの糖鎖付加変種であった（トランスジェニック乳ヤギの乳中に生成されるＬＡ−ｔＰＡの特徴付けについては、デンマン,ジェイ（Denman,J.）らの上で引用した文献参照）。
次いで、１．０Ｍ酢酸を用いて乳試料のｐＨを６．７から５．０にした。次いで、乳試料を５００μｌずつ１２個に分け、それらを１．５ｍｌポリプロピレン試験管に入れた。異なる量の２．０Ｍアルギニン−ＨＣｌ（ｐＨ５．５）を各試験管に添加して０．０Ｍから１．０Ｍの範囲のアルギニン濃度とした（表Ｉ）。リン酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ）を添加して最終体積を１．０ｍｌとした。
アルギニン  ｐＨ５．５
0003801196.tif 000002
試験管を、ブリンクマン（Brinkman）５３１５型遠心機で１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。試験管を取り、写真を取って各アルギニン濃度についてのカゼインペレットのサイズを調べることにより可溶化の程度を示した（図１）。上清を定量分析用に取った。図１は、１２種の異なるアルギニン濃度についての乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す。０．４Ｍより低いアルギニン濃度については、蛋白（おそらく、大部分がカゼインからなるであろう）のペレットがはっきりと認められた。０．４Ｍより高いアルギニン濃度については、蛋白ペレットはほとんどないかまたは認められなかった。
２８０ｎｍにおける吸光度測定により上清の蛋白濃度を算出した。１２個の上清それぞれをＰＢＳで１：５０に希釈し、ベックマン（Beckman）ＤＵ−６分光器で読むことにより２８０ｎｍにおける吸光度を読み取った。１２個の試料それぞれには、乳のかわりにＰＢＳを用い、さらにＰＢＳで１：５０に希釈したブランクを付けた。ＬＡ−ｔＰＡ活性を、ラウ,ディー（Lau,D.）ら,（１９８７年９月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第５巻：９５３〜９５８頁のごとく、プラスミン基質（Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−パラニトロアニリド）を用いるアミド分解活性の間接的測定において測定した。結果を図２に示す。必要な希釈は１：５０００００であった。図２は、アルギニン量を増加させるにつれ、乳試料中の全蛋白濃度およびＬＡ−ｔＰＡ活性の双方の増加が見られたことを示す。これらの結果は、アルギニンは全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させうることができ、それにより、ＬＡ−ｔＰＡ単離量を増加させることができることを示す。
実施例２：  イミダゾールを安定化剤として用いる、ＬＡ−ｔＰＡを含有するトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化
アルギニンのかわりに２．０Ｍイミダゾールを用いる以外は実施例１記載の方法に従った。表IIは、試験したイミダゾール濃度範囲を示す。図３は、イミダゾール濃度範囲についての乳試料の可溶化の程度を示す写真である。約０．７Ｍより低いイミダゾール濃度については、蛋白（おそらく、大部分がカゼインからなるであろう）のペレットがはっきりと認められた。約０．７Ｍより高いイミダゾール濃度については、蛋白ペレットはほとんどないかまたは認められなかった。図４は、１２種のイミダゾール濃度に関するＬＡ−ｔＰＡ活性に対する上清の相対的蛋白濃度を示す。アルギニンの場合と同様に、イミダゾールは、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させることができ、それにより、ＬＡ−ｔＰＡ単離量を増加させることができた。図４は、乳試料中のイミダゾール濃度の増加に従い、乳試料中の全蛋白濃度およびＬＡ−ｔＰＡ活性の増加が起こったことを示す。
イミダゾール  ｐＨ７．０
0003801196.tif 000003
実施例３：  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを安定化剤として用いる、ＬＡ−ｔＰＡを含有するトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化
アルギニンのかわりに１．７Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを用いる以外は実施例１記載の方法に従った。表IIIは、実験に用いたＢｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度範囲を示す。
ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ｐＨ６．０
0003801196.tif 000004
図５は、蛋白ペレットのサイズを示すことにより、試験したＢｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度の範囲についての乳試料の可溶化の程度を示す。０．２Ｍ程度の濃度では蛋白ペレットはほとんどないかまたは認められなかった。図６は、１０種のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度範囲に関するＬＡ−ｔＰＡ活性に対する上清の相対的蛋白濃度を示す。図６は、乳試料中のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度が増加するにつれ、乳試料中の全蛋白濃度およびＬＡ−ｔＰＡ活性の増加が見られたが、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度が約０．６５Ｍおよびそれ以上の場合はＬＡ−ｔＰＡ活性が減少したことを示す。
実施例４：  異なるｐＨにおいてアルギニンを可溶化剤として用いる、ＬＡ−ｔＰＡを含有するトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化
乳試料の最初のｐＨは６．７であった。この点から試料のｐＨを所望のｐＨ、例えば、４．３、６．０、７．０および８．０に調節した。試験される安定化剤のｐＨが６．７である場合には、乳試料のｐＨを調節しなかった。同様に、２．０ＭのアルギニンのｐＨを試料のｐＨに調節し、それを試料に添加して最終試料のｐＨ変動を防止した。次いで、ｐＨを調節した試料を５００μｌずつに分け、１．５ｍｌポリプロピレン試験管に入れた。種々の量の２．０Ｍアルギニンを乳試料に添加して種々のｐＨにおいて種々の濃度のアルギニンを含有する乳試料を得た。ＰＢＳを添加して最終体積を１．０ｍｌとした。
試験管を、ブリンクマン（Brinkman）５３１５型遠心機で１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。試験管を取り、写真を取って、ｐＨ４．３、６．０、７．０および８．０における各アルギニン濃度についてのカゼインペレットのサイズを調べることにより可溶化の程度を示した。写真を図７に示す。図７に示すように、ｐＨ６．０においてアルギニンは、約０．５ないし約１．０Ｍの濃度において乳蛋白の溶解性に対する最良の安定化剤として作用した。ｐＨ７．０における約０．６ないし１．０Ｍの範囲の濃度のアルギニンもまた、乳蛋白の溶解性に対する良好な安定化剤であった。ｐＨ４．３においては、アルギニンは、約０．１Ｍないし約１．０Ｍの濃度範囲において、乳蛋白の溶解性をほとんど安定化しなかった。
実施例５：  最初にアルギニン添加、次いで、乳試料のｐＨを調節することによる、トランスジェニック乳ヤギの乳からのＬＡ−ｔＰＡの単離
２．０Ｍアルギニン（ｐＨ５．５）をｐＨ調節前に添加すること以外は、実施例１記載の方法に従った。実験において試験したアルギニン濃度範囲は実施例１において試験したものと同じであり、表Ｉに示す。図８は、１２種のアルギニン濃度についてのＬＡ−ｔＰＡ活性に対する上清の相対的蛋白濃度を示す。アルギニン濃度の増加に伴い、全乳蛋白濃度およびＬＡ−ｔＰＡ活性の双方が増加した。しかしながら、ＬＡ−ｔＰＡ活性はピークを形成し、約１．０Ｍのアルギニン濃度において約１．２０ｅ＋６ＩＵ／ｍｌのレベルであり、対照的に、実施例１においては、同じアルギニン濃度について、ピークＬＡ−ｔＰＡ活性は約１．５０ｅ＋６ＩＵ／ｍｌであった。
実施例６：  アルギニンを安定化剤として用いる、トランスジェニックマウスの乳からのアンチトロンビンIIIの単離
乳を分泌するトランスジェニックマウスから得た乳試料を−８０℃で凍結し、分析前に室温で融解した。マウスの乳中の対象成分はヒト・アンチトロンビンIIIであった。
体積が非常に小さかったため、乳試料のｐＨを調節しなかった。次いで、乳試料を５００μｌずつに分け、１．５ｍｌポリプロピレン試験管に入れた。２．０Ｍアルギニン５００μｌを１の試験管に入れ、１．０Ｍイプシロン−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を４００μｌのＰＢＳとともに他の試験管に入れて各試験管中の体積を１．０ｍｌとした。０．４５μｍのフィルターユニット（マサチューセッツ州ベッドフォード（Bedford）のミリポア（Millipore）社製）を用いて試験管の内容物を濾過した。結果は、アルギニン含有試料は容易に濾過され、初発アンチトロンビンの回収率は８３％であったことを示す。ＥＡＣＡを伴う材料は濾過が困難で、アンチトロンビン回収率は５０％であった。
実施例７：  アルギニンを安定化剤として用いる、トランスジェニック乳ヤギの乳からのＬＡ−ｔＰＡの単離
乳を室温で融解し、１．０Ｍ酢酸を用いてｐＨを５．０に調節し、同体積の１．０Ｍアルギニンで希釈し、公称孔径０．２２μｍのフィルター（ニューヨークのボヘミア（Bohemia）のザルトリウス（Sartorius）社製）、次いで、絶対孔径０．２０μｍのフィルター（マサチューセッツ州ベッドフォード（Bedford）のミリポア（Millipore）社製）によりデッドエンド濾過した。ＬＡ−ｔＰＡを、最初にＴＳＫ−ブチルカラムに結合させることにより、濾液から精製した。カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１００ｍＭアルギニン−ＨＣｌ、０．０１％ツイン８０で平衡化し、次いで洗浄し、次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭアルギニン−ＨＣｌおよび７０％エチレングリコールを用いて段階的に溶離した。溶離物の収集を、１．０ＡＵＦＳにおける２８０ｎｍの吸光度をモニターすることにより行った。ベースラインより上であることが検知された時点で収集を開始した。この最初の段階は、酵素を濃縮し実質的に精製する手段を提供する。この工程からのＬＡ−ｔＰＡの回収率は、アルギニン無添加の場合は２５ないし５０％であるが、これとは対照的に、初発活性の９５％であった。
均等物
当業者は、通常の実験以上のものを用いずに、本明細書記載の本発明の特定の具体例の多くの均等物を認識し、あるいは確認することがすることができよう。かかる均等物は、下記の請求の範囲に包含される。
【図１】
0003801196.tif 000005
【図２】
0003801196.tif 000006
【図３】
0003801196.tif 000007
【図４】
0003801196.tif 000008
【図５】
0003801196.tif 000009
【図６】
0003801196.tif 000010
【図７Ａ】
0003801196.tif 000011
【図７Ｂ】
0003801196.tif 000012
【図７Ｃ】
0003801196.tif 000013
【図７Ｄ】
0003801196.tif 000014
【図７Ｅ】
0003801196.tif 000015
【図８】
0003801196.tif 000016