(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝液を収容し第１電極が浸漬された第１容器と、
緩衝液を収容し第２電極が浸漬された第２容器と、
前記第１容器と前記第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして連絡した密閉流路と、
前記第２電極に正電位を印加するとともに前記第１電極に負電位を印加する電源部と、
前記電源部を制御して前記第２電極と前記第１電極間に所定の定電圧を印加する制御部と、
前記密閉流路に設けられ、内部を通過するＤＮＡの通過量を検出する検出部を備え、
前記密閉流路には、前記緩衝液の中に、
ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差から前記ＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートと、
第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、該第２の塩基配列が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとに対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートと、
さらにＤＮＡ試料とが充填され、
前記定電圧を印加することにより前記密閉流路内のＤＮＡが電気泳動され、前記検出部が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡの通過量をそれぞれ測定することを特徴とする遺伝子診断装置。
【請求項２】
前記密閉流路が、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液で充たされ、且つ該緩衝液の中に前記分離用ＤＮＡコンジュゲートと前記遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とが分離状態で、リニアポリマーを挟んでこの順序で充填された分離用密閉流路カートリッジであって、該分離用密閉流路カートリッジを交換可能に装着する分離部が設けられたことを特徴とする請求項１記載の遺伝子診断装置。
【請求項３】
前記密閉流路が１以上設けられたことを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子診断装置。
【請求項４】
前記遅延用ＤＮＡコンジュゲートが１種類以上含まれていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子診断装置。
【請求項５】
前記分離用ＤＮＡコンジュゲート及び／または前記遅延用ＤＮＡコンジュゲートがビニル化したＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子診断装置。
【請求項６】
前記密閉流路内の液体を２０℃〜６０℃に調整して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子診断装置。
【請求項７】
前記密閉流路が内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子診断装置。
【請求項８】
前記密閉流路が溝のある板と紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子診断装置。
【請求項９】
前記密閉流路を加熱し、２重螺旋のＤＮＡ試料を引き離して１本鎖のＤＮＡ試料とする高温部を設けたことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子診断装置。
【請求項１０】
第１容器に緩衝液を収容して第１電極を浸漬するとともに第２容器にも緩衝液を収容して第２電極を浸漬し、前記第１容器と前記第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして密閉流路で連絡し、次いで、該密閉流路内の緩衝液の中に、前記ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差から前記ＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、続いて、第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとが該第２の塩基配列に対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、さらにＤＮＡ試料を加え、その後、前記第２電極に正電位を印加するとともに前記第１電極に負電位を印加し、該第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加して、前記密閉流路内のＤＮＡ試料を電気泳動させ、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離し、正常ＤＮＡの定量または異常ＤＮＡの定量、または、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの比率、もしくは、異常ＤＮＡを検出することを特徴とする遺伝子診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子異常の有無を簡単、正確に検出できる遺伝子診断装置及び遺伝子診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全ての疾患には、遺伝性要因と環境要因が種々の確率で関与しているが、先天性代謝異常症・癌・糖尿病・高血圧・アルツハイマー・自己免疫疾患・アトピー・肥満・アルコール依存などの疾患は、遺伝性要因が非常に大きな割合を占めている。一方、環境要素の寄与が大きい疾患は感染症や外傷の後遺症から誘因される疾患等である。
【０００３】
ところで、近年分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝的要素、すなわち遺伝子の関与がかなり正確に解明されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。現在、最も注目されているのはＳＮＰｓ（スニップス）と呼ばれるものである。これは、ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、個人間の遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。
【０００４】
人を含め地球上の全ての生命体遺伝子（または遺伝子の全集合体を意味するゲノム）は、共通の４つの塩基から成り立っており、この塩基の配列によって様々なタンパク質が作られ、各生物特有の生命活動が行われている。全ての生物に共通する４つの塩基とは、アデニン（Ａと表記される）、グアニン（Ｇと表記される）、チミン（Ｔと表記される）、シトシン（Ｃと表記される）である。人の遺伝子は、約３０〜３２億塩基配列で構成されているといわれているが、各個人で数百から１０００塩基に１ヶ所程度の割合で他の人と１つの塩基が異なっている場所が存在する。通常、この１塩基の変化が、あるヒト集団の全人口中１％以上の頻度で存在しているものを、ＳＮＰｓと呼んでいる。
【０００５】
従って、全遺伝子（ゲノム）中には、３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しているといわれ、現在世界中でＳＮＰｓの探索が続けられている。ＳＮＰｓが注目されている理由は、ＳＮＰｓの分類により、統計的に各個人の遺伝子が関与しているといわれている多くの疾患に対する罹患率が推測できると考えられているからである。例えば、乳がんを例にとると、乳がんにかかった患者群と正常な群とのＳＮＰｓの比較により、乳がんにかかりやすい人に共通のＳＮＰｓを特定することができる。そして、健康診断時に、遺伝子を調査しそのＳＮＰｓを持った人、すなわち現在は正常でも将来乳がんにかかりやすい体質の人を見つけることが可能になる。
【０００６】
この診断によって、乳がんにかかりやすい体質の人は、頻繁に検査をすることで万一癌に罹患しても、超早期に治療が行え生存の可能性が向上する。それと同様のことが、糖尿病や高血圧などの生活習慣病についても言え、世界中で多くの人が苦しんでいる病気に対して発病の前から食事や生活指導を正確にすることが可能になる。
【０００７】
また、病気の治療に用いている薬剤に関してもＳＮＰｓは重要な役割を期待されている。治療の際に用いられる薬剤は全ての人に均等に効果を示すものではない。一般に薬剤は、ある割合の人には効果があっても他の人には全く効果が無く、かえって副作用等で逆の結果を招くことがあることも広く知られている。因みに、アメリカにおける死亡原因の中で薬剤による副作用が上位に位置しているのは周知のことである。薬剤の効果はその人がもつ体質に深く関与しており、その体質もＳＮＰｓの分類によって区別可能であると言われている。すなわち、ＳＮＰｓの解析による分類で、ある薬剤に対してあらかじめ効果や感受性が予測でき適正な処方をすることが可能になり、患者個々人の体質に合わせた最適な薬剤の投与や副作用の危険性の回避が期待されている。このような医療のことをテーラーメイド医療またはオーダーメイド医療と呼び、将来の実用化が確実視されている。
【０００８】
また癌は、正常な細胞においては重要な役割をする遺伝子上の特定の部位に例えば紫外線や変異原性物質の作用によって突然変異が生じることによって引き起こされることがわかっている。ある特定の遺伝子上の変異を読み取ることで細胞が癌化しているか否かを早い段階から診断できるようになる。そして、犯罪捜査における犯人の特定や曖昧な親子関係の確定さらには本人であるか否かの識別にもＳＮＰｓは、威力を発揮する。前述したように、各個人には３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しており、両親からそれぞれ別々のＳＮＰｓを引き継ぐため、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓをもつ人間は絶対に存在しないと言われている。これが個人の完全な特定を可能にする理由である。
【０００９】
このように、特定の遺伝子中の１塩基に起きた変異を観察することで医療をはじめ様々の事柄に多大な貢献をもたらす可能性がある。しかしながら現在、特定の遺伝子の変異を観察する方法は以下に述べるような非常に複雑な操作あるいは高価な装置を必要とし、ランニングコストも非常に嵩むため、広く利用されるまでには至っていない状況にある。
【００１０】
現在最も一般的に用いられているＳＮＰｓを調べる方法は、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）と呼ばれている方法である。遺伝子は１種類のタンパク質を形成するための塩基配列情報をもったＤＮＡの単位であるから、塩基配列を端から読んでいけばＳＮＰｓが解明することができる。シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、最も一般的に行われているのは以下に述べるジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。この方法を含めいずれの方法も、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動かキャピラリー電気泳動によって１塩基長の長さの違いを分離・識別できる技術が基になって成り立っている。
【００１１】
ジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）は、酵素的シーケンシングとも呼ばれ、１本鎖鋳型ＤＮＡの相補的鎖を合成するためにＤＮＡポリメラーゼを用い、さらに人工的につくった特殊な４種類のジデオキシヌクレオチドを利用するのが特徴である。シーケンシング操作としては、塩基配列を行いたい１本鎖ＤＮＡの３’末端を相補する合成塩基配列をプライマーとして用い、そのプライマーからＤＮＡポリメラーゼと均等に加えられたデオキシヌクレオチドを酵素反応によって伸長させる操作を行うが、この時同時に４つの反応容器を準備しておき、それぞれにＡＴＧＣ４つの塩基の３’末端に水酸基を持たない、従ってこれ以上ＤＮＡ伸長反応を続けることができない塩基アナログであるジデオキシヌクレオチドを別々に少量混入させておく。これにより、伸長中のＤＮＡの末端にジデオキシヌクレオチドが付加された時点でＤＮＡ合成がストップし、それぞれの反応容器中に様々な長さを持った、しかし端は必ず加えた塩基アナログである２本鎖ＤＮＡが形成される。この反応容器にＳ１エンドヌクレアーゼを反応させ、１本鎖ＤＮＡを全て消化し２本鎖ＤＮＡのみとする。こうして得られた４つの反応容器のＤＮＡ鎖をゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動し、分離されたＤＮＡを短い方（速く移動したもの）から順に読めば、鋳型鎖と相補的なＤＮＡの塩基配列がわかる。この際、泳動結果の識別は、例えば加えるジデオキシヌクレオチドのリンまたはイオウを放射性標識したり蛍光を発する化学物質を結合させたりして行う。放射性標識の場合はフィルムへの露光での検出、蛍光化学物質の場合はレーザービームを照射し蛍光を検出する。最近では、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの４種類の塩基アナログを、それぞれ４種類の蛍光波長の異なる試薬により標識し、その４色の蛍光を同時に検出する方法も開発されている。
【００１２】
このように、従来は被験者から分離・精製した遺伝子の正確な塩基配列をこのジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）あるいはその他の塩基配列決定法により決定し、正常あるいは標準的な塩基配列と比較することによってＳＮＰｓの有無や突然変異の有無の確認、個人の識別等を行っている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
以上説明したように、従来からの遺伝子配列決定法を利用した、遺伝子診断や遺伝子による個人の識別は、ターゲットとする遺伝子を単離したのち、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定用装置を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行っていたため、実験に膨大な作業量と非常に長い時間、さらには多大のランニングコストを要していた。また塩基配列決定のための自動化した装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、しかも高価な試薬を大量に必要とするものであった。
【００１４】
そこで、従来のこのような問題を解決するため本発明は、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる遺伝子診断装置を提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本発明は、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判定できる遺伝子診断方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の遺伝子診断装置は、密閉流路には、緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートと、第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、該第２の塩基配列が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとに対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートと、さらにＤＮＡ試料とが充填され、定電圧を印加することにより密閉流路内のＤＮＡが電気泳動され、検出部が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡの通過量をそれぞれ測定することを特徴とする。
【００１７】
これにより、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる。
【００１８】
また、本発明の遺伝子診断方法は、密閉流路内の緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、続いて、第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとが該第２の塩基配列に対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、さらにＤＮＡ試料を加え、その後、第２電極に正電位を印加するとともに第１電極に負電位を印加し、該第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加して、密閉流路内のＤＮＡを電気泳動させ、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離し、正常ＤＮＡの定量または異常ＤＮＡの定量、または、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの比率、もしくは、異常ＤＮＡを検出することを特徴とする。
【００１９】
これにより、一塩基違いの遺伝子異常でも短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、安価に、非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
請求項１に記載された発明は、緩衝液を収容し第１電極が浸漬された第１容器と、緩衝液を収容し第２電極が浸漬された第２容器と、第１容器と第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして連絡した密閉流路と、第２電極に正電位を印加するとともに第１電極に負電位を印加する電源部と、電源部を制御して第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加する制御部と、密閉流路に設けられ、内部を通過するＤＮＡの通過量を検出する検出部を備え、密閉流路には、緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートと、第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、該第２の塩基配列が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとに対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートと、さらにＤＮＡ試料とが充填され、定電圧を印加することにより密閉流路内のＤＮＡが電気泳動され、検出部が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡの通過量をそれぞれ測定することを特徴とする遺伝子診断装置であるから、第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加し、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、次いで、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させ、更に、分離用ＤＮＡコンジュゲートにより正常ＤＮＡの泳動速度を異常ＤＮＡの泳動速度に対して低下させることができる。
【００２１】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、両コンジュゲートや試料の各濃度調整および両コンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００２２】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながら、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧を印加したとき一番先に泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、遅延用ＤＮＡコンジュゲートのほか、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、コンジュゲートとの作用をなかなか振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。
【００２３】
このように電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ所定の電圧を印加するだけで良いから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができ、小型、軽量、低ランニングコストの安価な装置とすることができ、診断の自動化がきわめて容易である。
【００２４】
請求項２に記載された発明は、密閉流路が、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液で充たされ、且つ該緩衝液の中に分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とが分離状態で、リニアポリマーを挟んでこの順序で充填された分離用密閉流路カートリッジであって、該分離用密閉流路カートリッジを交換可能に装着する分離部が設けられたことを特徴とする請求項１記載の遺伝子診断装置であるから、予めリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液と、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ試料とを充填した分離用密閉流路カートリッジを用意しておくことができ、測定毎に分離部に分離用密閉流路カートリッジを交換して装着すればよく、測定を簡単に且つ容易に行うことができる。
【００２５】
請求項３に記載された発明は、密閉流路が１以上設けられたことを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子診断装置であるから、密閉流路ごとに遅延用ＤＮＡコンジュゲートと分離用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ結合制御剤を変化させて、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの分離環境を密閉流路ごとに変化させることができる。
【００２６】
請求項４に記載された発明は、遅延用ＤＮＡコンジュゲートが１種類以上含まれていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、泳動速度を遅延用ＤＮＡコンジュゲートの比率を変えることで変化させることができる。
【００２７】
請求項５に記載された発明は、分離用ＤＮＡコンジュゲート及び／または遅延用ＤＮＡコンジュゲートがビニル化したＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを明確に分離して測定することが可能となる。
【００２８】
請求項６に記載された発明は、密閉流路内の液体を２０℃〜６０℃に調整して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを温度調整により分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートに結合したり離脱させたりすることが可能であり、結合力を温度で調整でき、分離後それぞれを検出部で測定することが可能となる。
【００２９】
請求項７に記載された発明は、密閉流路が内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００３０】
請求項８に記載された発明は、密閉流路が溝のある板と紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００３１】
請求項９に記載の発明は、前記密閉流路を加熱し、２重螺旋のＤＮＡ試料を引き離して１本鎖のＤＮＡ試料とする高温部を設けたことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、ＤＮＡ試料を１重鎖とする前処理を行うことなくそのまま用いることができるので、更に診断の自動化を図ることが可能である。
【００３２】
請求項１０に記載された発明は、第１容器に緩衝液を収容して第１電極を浸漬するとともに第２容器にも緩衝液を収容して第２電極を浸漬し、第１容器と第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして密閉流路で連絡し、次いで、該密閉流路内の緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、続いて、第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとが該第２の塩基配列に対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、さらにＤＮＡ試料を加え、その後、第２電極に正電位を印加するとともに第１電極に負電位を印加し、該第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加して、密閉流路内のＤＮＡを電気泳動させ、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離し、正常ＤＮＡの定量または異常ＤＮＡの定量、または、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの比率、もしくは、異常ＤＮＡを検出することを特徴とする遺伝子診断方法であるから、第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加し、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、次いで、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させ、更に、分離用ＤＮＡコンジュゲートにより正常ＤＮＡの泳動速度を異常ＤＮＡの泳動速度に対して低下させることができる。
【００３３】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、両コンジュゲートや試料の各濃度調整および両コンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００３４】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながら、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧を印加したとき一番先に泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、遅延用ＤＮＡコンジュゲートのほか、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、コンジュゲートとの作用をなかなか振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。
【００３５】
このように電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ所定の電圧を印加するだけで良いから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができる。
【００３６】
以下、本発明の実施の形態における遺伝子診断装置と遺伝子診断方法について、図面を参照しながら説明する。
【００３７】
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観図、図２は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の上蓋開放外観図、図３は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の装置構成図、図４は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の制御回路要部図、図５は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との導入状態図である。
【００３８】
図１において、１は遺伝子診断装置の電源スイッチ、２は装置の種々の操作を行うための操作ボタン、３は表示パネル、４は上蓋、５は装置の筐体である。図２、図３、図４において、６は電気泳動を行うための電気泳動部、７は電気泳動部６を支える支持台、８は電気泳動を行うための制御や後述する吸引ポンプ２０、検出部１５の制御を行い、検出したデータを演算する基板からなる制御演算部である。９は電源ボックス、９ａは電源ボックス９内に設けられた電源部である。電源部９ａは、本遺伝子診断装置ではＤＮＡの種類や濃度、処理条件ごとに異なった最適印加電圧値が存在するため、後述のＤＮＡ試料２３から異常ＤＮＡと正常ＤＮＡを分離するのに最も適した泳動が行えるように所定の電圧を制御演算部８の制御により印加する。１０はＤＮＡの２重螺旋（以下、２本鎖）を引き離すための高温部、１１は高温部１０と後記する分離部１２の温度を独立にするための断熱部、１２は正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡとを分離するための所定温度に調整するとともに、この部分で正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離する分離部、１３は高温部１０の温度を調整する第１温調器、１４は分離部１２の温度を調整する第２温調器である。
【００３９】
この分離部１２内の構成の詳細については後述するが、測定開始時には、図５に示すように分離用ＤＮＡコンジュゲート２１が分離部１２の位置、また遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２が断熱部１１付近、ＤＮＡ試料２３が高温部１０付近になるように配置する。そして、このように設定された配置と電圧制御、濃度調整、温度制御等を行うことにより、電気泳動させながら本遺伝子診断装置はＤＮＡ試料２３を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに数分〜十数分で分離するものである。
【００４０】
このうちＤＮＡ試料２３は、本実施の形態１においては２本鎖を備えたまま高温部１０に充填、配置され、第１温調器１３を用いて（９０℃以上の所定温度±５℃）の温度になるように加熱、制御される。この加熱により導入されたＤＮＡの２本鎖が１本鎖に自動的に分離される。続いて、分離部１２では分離用ＤＮＡコンジュゲート２１（場合によっては一部の遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２も）が泳動作用を受けながら水素結合の結合力の差によってＤＮＡ試料２３を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離できるように、高温部１０の温度より少なくとも１０℃低温、すなわち１５℃〜８０℃、望ましくは２０℃〜６０℃の温度範囲の所定温度に保つように制御される。正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとを分離するためにはＤＮＡの分離に適したこの所定の温度から±１℃の範囲で制御するのがよい。さらに、断熱部１１は、本来、分離部１２と高温部１０の間を熱的に遮断して温度調整するために設けられるものであるが、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２はこの付近に配置され、温度的には高温部１０の９０°以上の温度と分離部１２の２０℃〜６０℃の温度との中間温度に置かれ、この温度下での水素結合の結合力差により泳動作用を受けながら正常ＤＮＡと異常ＤＮＡをノイズＤＮＡから分離することができる。
【００４１】
１５は電気泳動するＤＮＡ試料の通過量を測定する検出部である。図４に基づいて検出部１５について説明すると、１５ａは紫外線を照射するＤ2ランプ、１５ｂは紫外線を受光するフォトダイオード、１５ｃはフォトダイオード１５ｂが検出した微弱電流を増幅するプリアンプ、１５ｄはデジタル量に変換するＡ／Ｄコンバータである。これらの詳細は後述する。１６は電気泳動のときに正電位を印加する電極（本発明の第２電極）、１７は電気泳動のときに負電位を印加する電極（本発明の第１電極）であり、制御演算部８が電源部９ａを制御し、電極１６と電極１７との間に所定の定電圧を印加し、最も適当な電気泳動を生じさせる。図３、図４、図５において、１８は電気泳動のときの電荷の運搬とＤＮＡ試料のｐＨを安定させるための緩衝液、１８ａは緩衝液１８を収容する陰極側の容器（本発明の第１容器）、１８ｂは緩衝液１８を収容する陽極側の容器（本発明の第２容器）、１８ｄはＤＮＡ結合制御剤とリニアポリマーを緩衝液１８に添加したリニアポリマーゲルであり、電気泳動時にＤＮＡ試料２３が早い速度で泳動しないように泳動を邪魔する働きを持つものである。この働きにより、ＤＮＡ試料２３は遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２や分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とキャピラリー管１９内で充分遭遇する機会を持つことが可能となる。なお、１９は電気泳動のときにＤＮＡ試料２３を泳動するためのキャピラリー管（本発明の密閉流路）、２０はキャピラリー管１９の中に緩衝液１８やＤＮＡ試料２３、リニアポリマーゲル１８ｄなどの試薬を注入するための吸引ポンプである。容器１８ａの緩衝液１８の中には電極１７が浸漬され、容器１８ｂの緩衝液１８の中に電極１６が浸漬される。容器１８ａと容器１８ｂ内の緩衝液１８は、キャピラリー管１９内の緩衝液１８によって連通される。従って、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２にも緩衝液１８が液のベースとして混入しており、キャピラリー管１９中全ての部分で同じ濃度の緩衝液１８が存在している。電極１６と電極１７間に電圧を印加すると、キャピラリー管１９内に電気泳動が誘発され、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２、ＤＮＡ試料２３は負に帯電しているため、容器１８ａ側から容器１８ｂ側へ分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２、ＤＮＡ試料２３が移動するが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２には分子量が大きい高分子がついているため、電気泳動によってＤＮＡ試料２３の移動量と比較するとほとんど移動はしない。
【００４２】
次に、本発明の遺伝子診断装置で測定を行うために必要な詳細について説明する。本遺伝子診断装置で測定するＤＮＡ試料２３は、人の細胞や血液等から入手したＤＮＡである。約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの方法を利用して目的の部分を目的の長さに切り出して測定用に数を増加させる作業が必要である。ただ、このＰＣＲに関しては本遺伝子診断装置の説明に必要がないため具体的な説明を省略する。
【００４３】
ＰＣＲなどで取り出した目的のＤＮＡは塩基数でいうと６個程度〜１０００個程度であるが、約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡの中に、同じＤＮＡ配列が存在しないと確率的に考えられる個数としては、５０個程度であればよい。しかし、これは総数が５０個程度あればよいということであるから、数回に分けてＤＮＡを切り取る場合は６個〜１２個ずつに分けるのでもよい。そして、本発明者らの実験によると、本遺伝子診断装置で正常ＤＮＡと１塩基違いの異常ＤＮＡを分離する場合、塩基の個数は６個〜１２個が最も効率よく分離できるという結果を得ている。ただ、この異常ＤＮＡの分離はＤＮＡ試料２３の濃度（μＭ、但し、Ｍ＝モル／リットル）、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡの濃度（モル％）、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２のＤＮＡの濃度（モル％）、測定温度、その他と密接な関係があるため、適正な条件にしないと分離が起こらないから、このような条件を設定することができるか否かに留意する必要がある。例えば、ＤＮＡ試料２３の濃度は１〜１０（μＭ）が適当であり、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２に含まれるＤＮＡが、基本となるリニアポリマーのモルに対して０．０００２〜０．０５（モル％）程度が適当であるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２のそれぞれのＤＮＡ総量は、ＤＮＡ試料２３の濃度の２０〜６００倍とするのが望ましい。以上説明したように本遺伝子診断装置のＤＮＡ試料は上述のＰＣＲなどにより前処理によって得られる６個程度〜１０００個程度の塩基配列を持つＤＮＡ試料が必要であり、適正な条件設定が必要である。
【００４４】
次に、図３、図４、図５のキャピラリー管１９について説明すると、キャピラリー管１９にゲルを入れて電気泳動を行うと、電気浸透流と呼ばれる液の流れが発生してしまうため、本遺伝子診断装置ではこの現象が起きないようにする必要がある。このためキャピラリー管１９の内壁をアクリルアミドなどでコーティングするのがよい。電気浸透流の発生が阻止できるならコーティング方法は他の方法でもよい。例えば、一般に販売されているコーティングキャピラリー管を使用するのでもよい。なお、キャピラリー管１９としては内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管が、紫外線を９０％以上透過でき、且つ後述するように紫外線を利用してＤＮＡを検出するとき、紫外線の通過量を容易に検出できるから最も適当である。そして、溝のある板と、紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせでキャピラリー管１９に相当する密閉流路を構成するのでも、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出を容易に行うことができる。なお、溝のある板を紫外線が透過可能な板にした場合は透過光を検出し、溝のある板を紫外線が不透過の板にした場合は、異常ＤＮＡを反射光で検出する。反射光を検出する場合には溝形状を均一な反射面とするため矩形断面にする等の工夫が必要である。
【００４５】
容器１８ａ，１８ｂの中やキャピラリー管１９に収容する緩衝液１８は、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．２〜ｐＨ８程度）緩衝液等を利用するのが適当である。このうちキャピラリー管１９に収容する緩衝液１８に必要に応じて混入されるＤＮＡ結合制御剤としては、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２に対するＤＮＡの結合を促進する塩化マグネシウム等の結合促進剤と、離脱を促す尿素等の離脱剤の２種類が存在する。この２種類のＤＮＡ結合制御剤は、２種類の混合割合や、物質（例えば、結合促進剤として他の電解質）を選ぶことで、ＤＮＡに対する多様な泳動速度の制御が可能になるものである。リニアポリマーゲル１８ｄに含まれるリニアポリマーとしては、ポリアクリルアミドを用いることができ、これは分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２のコンジュゲート作成にも利用されるため、相性がよく適当である。
【００４６】
次に、キャピラリー管１９への充填順序であるが、図５に示すように先ずキャピラリー管１９内にリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液１８を含んだリニアポリマーゲル１８ｄを導入し、続いて以下詳述する分離用ＤＮＡコンジュゲート２１を加える。分離用ＤＮＡコンジュゲート２１導入後にリニアポリマーゲル１８ｄを導入してもよい。図５の場合導入後に分離状態で導入している。続いて、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と分離状態で遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２を加える。分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と同様に、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の導入後にリニアポリマーゲル１８ｄを導入してもよい。図５の場合導入後に分離状態で導入している。その後、緩衝液１８もしくは純水で希釈したＤＮＡ試料２３を導入して電気泳動する。
【００４７】
本実施の形態１では、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２を作成するのにアクリルアミドとＤＮＡを重合させているため、ＤＮＡとの重量差、構造差は大きく、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の泳動速度（０．６ｃｍ／分〜０．７ｃｍ／分）は、ＤＮＡの最適の泳動速度（１３ｃｍ／分〜２０ｃｍ／分）の１／２０〜１／３０程度であって、非常に動きが鈍く相対的に擬似的に固定されているといってもよいような状態が実現される。従って、測定開始時、充填物を収容したキャピラリー管１９を高温部１０、断熱部１１、分離部１２の間で位置を調整しながら、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１を分離部１２内付近にし、断熱部１１付近から高温部１０にかけて遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２を置くようにし、高温部１０には後述のＤＮＡ試料２３を配置する。このようにすることにより、高温部１０でＤＮＡ試料２３の２本鎖を１本鎖に分離できる。そして、高温部１０から断熱部１１にかけて遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２を充填したので速度差でノイズＤＮＡを分離でき、分離部１２で正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離することができる。
【００４８】
なお、遺伝子診断装置のキャピラリー管１９にＤＮＡ試料２３や分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、リニアポリマーの各溶液を交換的に導入する機構、例えば図３に示した吸引ポンプ２０のほかに、各ＤＮＡ試料２３や分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、リニアポリマーの各溶液をそれぞれ保管する容器と、その容器を自動的に交換し、それをキャピラリー管１９に接続する機構を装備するのが望ましい。
【００４９】
さらに、キャピラリー管１９を１本または複数本単位でユニット化し、これを交換用の分離用密閉流路カートリッジとして、分離部１２と高温部１０、断熱部１１に装着可能にし、分離部１２内の第２温調器１４、あるいは高温部１０内の第１温調器１３で温度制御するようにするのも適当である。キャピラリー管１９内に、予めリニアポリマーゲル１８ｄとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液１８を充填し、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２とＤＮＡ試料２３を分離状態で充填して分離用密閉流路カートリッジとして用意しておくことが可能になる。このように構成することで、測定を行うたびに分離用密閉流路カートリッジごと交換するため、分離用密閉流路カートリッジごとに分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２、ＤＮＡ試料２３の配置を予め設定できるから、測定が簡単に行え、且つ正確な測定が行える。なお、この分離用密閉流路カートリッジでは、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２とＤＮＡ試料２３を分離状態にするため、その間にリニアポリマーゲル１８ｄを挟んで充填している。それぞれの中にリニアポリマーゲル１８ｄを混合させて充填するのでもよい。
【００５０】
続いて、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２について説明する。図６（ａ）は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図、図６（ｂ）は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図である。図６（ａ），（ｂ）において、２１は分離用ＤＮＡコンジュゲート、２２は遅延用ＤＮＡコンジュゲートである。ＤＮＡは二本鎖を形成するものとこれを分離した一本鎖のものと存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣがそれぞれ水素結合し易い性質をもち、ＤＮＡの二本鎖においてはＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一本鎖のＤＮＡがＡＴＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１に記載）と配列されている場合、残りの鎖のＤＮＡは、ＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号２に記載）という塩基配列をもっている。この関係は相補的関係と呼ばれるもので、この相補関係を充たす限り、ＡとＴ、ＧとＣがそれぞれ水素結合により結合し、二本鎖を形成する。本発明ではこの関係を利用するために、図６（ａ）に示すように分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡ部分にはＤＮＡ試料の正常ＤＮＡに相補的な塩基配列を持たせている。従って、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡの塩基配列がＡＴＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１に記載）を含み、異常ＤＮＡがＡＴＣＡ*ＣＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号３に記載）で、＊で示した部分で正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの塩基が異なっている場合、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡ部分の配列（本発明の第１の塩基配列）をＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号２に記載）とすると、異常ＤＮＡはＡ*において分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と相補的ではなくなるため水素結合せず、水素結合全体の結合力はＤＮＡ試料の正常ＤＮＡの方が異常ＤＮＡより１塩基分の結合力分だけ大きくなる。その結果、後で説明する電気泳動時に正常ＤＮＡの方が異常ＤＮＡより強い結合力で長い時間分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と結合するため、正常ＤＮＡは異常ＤＮＡより相対的に遅延するようになる。というのは、電気泳動時結合力だけでなく電気泳動による引離力も作用するから、多数のＤＮＡが断続的に結合と離脱を繰り返すような結合状態となるからである。そして、この泳動速度を平均的にみると、長い時間結合する正常ＤＮＡの方が異常ＤＮＡより泳動速度が低下することになる。ＤＮＡ試料の中には、２本鎖のＤＮＡのうち測定対象ではない分離した残りの１本鎖ＤＮＡのように正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ以外のＤＮＡも含まれており、このＤＮＡが後で説明する電気泳動時にノイズとして作用するが、このノイズＤＮＡは分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡとはほとんど無反応で結合しないから、最も速い泳動速度をもち分離されることになる。
【００５１】
そして、あらかじめノイズＤＮＡを正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群から確実に分離するために、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２に正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの両方が共通にもつ塩基配列に相補的な塩基配列（本発明の第２の塩基配列）を持たせれば、電気泳動時に正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群の方だけが遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と水素結合し、この分だけノイズＤＮＡより泳動速度が低下する。従って、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群がノイズＤＮＡより相対的に遅延し、ノイズＤＮＡを区別してその影響を排除することが可能となる。ノイズＤＮＡが結合するのは偶然に塩基が水素結合する場合であり、確率的にきわめて低い。なお、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の塩基配列（本発明の第２の塩基配列）は、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの両方を遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と水素結合させてノイズＤＮＡから分離するから、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ双方がもつ塩基配列と相補的でなければならず、図６（ｂ）に示すように、例えばＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号４に記載）にするのが望ましい。なお、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡだけに確実に結合できる塩基配列を選ぶためには、両者に対してだけ結合する確率を高くするため、塩基配列の長さは長い方がよい。また、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のそれぞれのＤＮＡ総量は、ＤＮＡ試料の濃度の２０〜６００倍とするのが適当である。
【００５２】
次に、このような分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の作成・合成方法について説明する。ビニル化ＤＮＡを合成するために、ＰＣＲによって、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２用のＤＮＡを切り出す。上述の例では、ＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号２に記載）が分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡであり、ＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号４に記載）が遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２のＤＮＡとなる。
【００５３】
次に、目的の塩基配列を有するＤＮＡの５’末端をアミノ化（通常は、ヘキシル基を介してアミノ化）する。このようにして得られたアミノ化ＤＮＡを２．６ｍＭになるように滅菌した超純水を加えて希釈する。次いで、ＭＯＳＵ（メタクリロイドオキシスクシンイミド）を７１．３８８ｍＭになるようにＤＭＳＯ（ディメチルスルオキシド）で希釈する。そして、このようにして得たアミノ化ＤＮＡとＭＯＳＵを１：５０の比率になるように加えて調整する。さらに、この調整溶液に対して、ｐＨ調整用としてｐＨ９になるように炭酸水素ナトリウムと水酸化ナトリウムで調整した溶液を、アミノ化ＤＮＡの量と等量加える。
【００５４】
そして、得られた溶液を一晩振とうする。その後、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：高速液体クロマトグラフィー）を使用して、振とうした溶液中のビニル化ＤＮＡを、アミノ化ＤＮＡ，ＭＯＳＵ，その他と分離する。ビニル化ＤＮＡは溶離液（ＴＥＡＡ；トリエチルアミンー酢酸とアセトニトリルの混合溶液）を含んでいるため、さらに真空乾燥機能を持った遠心エバポレーターで減圧濃縮する。
【００５５】
次いで、重合溶液である１０％のＡＡＭ（アクリルアミド）を５３μｍｏｌ窒素置換する。さらに、重合開始剤である１．３４％のＴＥＭＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）を超音波で脱気した滅菌超純水で希釈する。これを重合開始剤である１．３４％のＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）を同じく超音波で脱気した滅菌超純水で希釈する。さらに濃縮したビニル化ＤＮＡを滅菌した超純水で希釈する。そして、１００μｌのＤＮＡコンジュゲートを合成するために、上記のＡＡＭを３４μｌ、上記のＴＥＭＤとＡＰＳを各々５μｌ、ビニル化ＤＮＡがＡＡＭに対して０．０１％モル〜０．０５％モルになるように加え、１００μｌになるように滅菌超純水を追加して、６０分程度放置しておくとアクリルアミド化されたＤＮＡコンジュゲートが得られる。
【００５６】
なお、未反応のビニル化ＤＮＡを除去するために、適当な大きさの孔径選択したゲルろ過を数十回に分けて行うと、純度の高いＤＮＡコンジュゲートが得られる。本実施の形態１では、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の間で合成法は同じであるが、両者異なる合成法にすることもできる。
【００５７】
続いて、本実施の形態１の遺伝子診断装置の動作について説明する。先ず遺伝子診断装置内に、ＤＮＡ試料や各溶液を導入したキャピラリー管１９をセットし、図３、図４に示すように両端に容器１８ａ，１８ｂ内の緩衝液１８を浸す。この電極１６と電極１７間に電源部９ａによって後述する所定電圧を印加する。適当な電圧幅としては、望ましくは１０〜２０キロボルトが好ましいが、電解質や電極の状態により１００ボルト〜３０キロボルトでもよい。例えば、低電解質濃度の場合や、電極面積が大きな場合は電圧を低電圧にする。そして、最初から所定電圧を印加するのでなく、定電圧を印加する前に準備用の３０キロボルト以上の高電圧を印加し、ノイズＤＮＡをいち早く分離すれば、測定を迅速に行うことができる。
【００５８】
ここで、所定の電圧を印加する理由を説明すると、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と分離用ＤＮＡコンジュゲート２１に対するＤＮＡ試料の結合力と、電気泳動力による引離力との差が、ＤＮＡの泳動速度や移動差に大きな影響を与えるため、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡの分離が最も効果的に行われる所定の定電圧を印加して電気泳動する必要があるからである。すなわち、この電圧は最も泳動しにくい正常ＤＮＡを電気泳動することができるという条件と、高電圧にすると正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの分解能が低下するので、分解能を上げるため、できるだけ低電圧でなければならないという条件の２つを充たす電圧である。従って、予め印加する電圧として最適な電圧をＤＮＡごと、条件ごとに調べておき、当初３０キロボルト程度以上の準備電圧を短時間印加した後、この電圧を印加するようにする。なお、キャピラリー管１９内のＤＮＡは負に帯電しており陽極側に進むため、電源部９ａは電極１６を正電位、電極１７を負電位になるように印加する必要がある。また、電気泳動に当たっては、泳動時間を長くしすぎると、キャピラリー管１９内で緩衝液１８が乾燥するので、必要以上に長い時間泳動を行うのは避けなければならない。
【００５９】
電圧が印加されるとＤＮＡ試料は泳動され、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群は遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２との結合力が同等であるから、断続的な結合と離脱を繰り返しながらまったく同様に泳動していくため、ノイズＤＮＡと、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群との間に大きな移動差が生じる。そして、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１は正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとの結合力に一塩基分の差があり、泳動されていくとき両者間に移動速度差が生じ、両者の間で移動差を生じる。
【００６０】
次に、分離が行われる高温部１０と分離部１２、断熱部１１の説明を行う。上述したように、高温部１０でＤＮＡの２本鎖を離すために９０℃以上の（所定温度±５℃）になるように第１温調器１３を用いて制御する。また、分離部１２では、ＤＮＡ試料の状態によっても異なるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２とＤＮＡ試料の結合力の差に基づいて、正常ＤＮＡや異常ＤＮＡ、あるいはノイズＤＮＡを分離できるように、高温部１０の温度より１０℃程度低温、すなわち１５℃〜８０℃、望ましくは２０℃〜６０℃の温度範囲の所定温度に保たなければならない。実施の形態１の遺伝子診断装置では、キャピラリー管１９を覆っている分離部１２の下部に、シリコンラバーヒーターやニクロム線等と熱電対やサーマル等の温度センサーを配置し、第２温調器１４で所定の温度±１℃以下になるように管理する。ただ、環境温度によっては室温が目的の所定温度を超える場合もあり、シリコンラバーヒーターやニクロム線等に代えて、ペルチェ等の暖・冷可能な部品を使うのがよい。また、断熱部１１はガラスウールや発砲剤、雲母、多孔質セラミックス等の断熱材もしくは、中身を真空にしたものを使用するのでもよい。断熱部１１付近では遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２が、高温部１０と分離部１２の中間温度となるから、これを利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとをノイズＤＮＡから分離することができる。
【００６１】
続いて、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と分離用ＤＮＡコンジュゲート２１の作用で泳動速度に差が生じ、移動差が生じた正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ、ノイズＤＮＡを、どのようにして検出するか説明する。図７は、泳動開始からの経過時間を横軸にして吸光度を縦軸にしたときの経過時間と吸光度の関係図である。検出は紫外線の照射が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ、ノイズＤＮＡによって遮光されたときの吸光度を測定することで行う。実施の形態１においては、図５に示すようにキャピラリー管１９の一部でガラス部を露出させ、Ｄ2ランプ１５ａから波長２６０ｎｍの紫外線を照射し、このとき得られる紫外線照射光をフォトダイオード１５ｂで検出し、吸光度を測定している。制御演算部８によって電源部９ａを制御してＤ2ランプ１５ａを発光させ、フォトダイオード１５ｂで検出した電流はプリアンプ１５ｃで増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５ｄでデジタル量として吸光度に制御演算部８で換算される。制御演算部８はタイマ（図示しない）を内蔵し、泳動開始時間からの経過時間を測定することができる。図７において、時間的に早い方（Ｉ）が、ＤＮＡコンジュゲートと結合しないノイズＤＮＡ、時間が中位の（ＩＩ）が異常ＤＮＡ、時間が遅い（ＩＩＩ）が正常ＤＮＡである。
【００６２】
この関係図よりピークの高さと時間とピークの数を読み取れば、ピークの数からＤＮＡ試料に異常ＤＮＡが含まれていることが分かる。すなわち、ピークの数から異常ＤＮＡが存在するか否かが判定できる。なお、印加する電圧やＤＮＡ濃度、ＤＮＡの長さ（塩基の個数）によってはピークの数を異常ＤＮＡとノイズＤＮＡだけにすることができるから、このときは異常ＤＮＡの通過量だけを測定する。また、ピークの高さを比べるのは、同じ条件下で電気泳動されたＤＮＡ中の泳動速度差のある２つの集合の吸光度差を示すから、異常ＤＮＡと正常ＤＮＡの存在比率に相当し、存在比率の判定が可能になる。異常ＤＮＡの存在量の判定は、標準ＤＮＡ試料の検出ピーク波形から得られた標準データを制御演算部８に予め入力しておき、そのデータと測定したデータを比較して換算すればよい。
【００６３】
以上説明したように、本実施の形態１の遺伝子診断装置と遺伝子診断方法によれば、細胞や血液等から取り出したＤＮＡの中で、特定のＤＮＡを制限酵素などで取り出したＤＮＡ試料中に含まれる正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの存在比率等が分かることにより、遺伝子診断、判定ができる。
【００６４】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２における遺伝子診断装置及び遺伝子診断方法について図１，図２，図４〜図８に基づいて説明する。図８は本発明の実施の形態２における遺伝子診断装置の装置構成図である。実施の形態２の遺伝子診断装置は、実施の形態１の遺伝子診断装置をＤＮＡ試料としてＤＮＡの１本鎖のものに対応させたものであり、基本的に実施の形態１の遺伝子診断装置と同一であるから、特徴部分の説明を行うにとどめ、詳細な説明は実施の形態１に譲って省略する。
【００６５】
図８に示すように、実施の形態２の遺伝子診断装置では、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と１本鎖のＤＮＡ試料２３を直接分離部１２内に導入する。すなわち、電気泳動部６を基本的に分離部１２だけで構成している。実施の形態１の高温部１０、断熱部１１は存在しない。分離用密閉流路カートリッジの形式で導入する場合は、この順序で分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２とＤＮＡ試料２３が充填されたキャピラリー管１９を、測定ごとに交換して分離部１２に装着する。
【００６６】
実施の形態１においては、２本鎖のＤＮＡ試料２３が供給され、これを自動的に１本鎖にするために高温部１０が設けられている。しかし、実施の形態２においてはＤＮＡ試料２３として供給されるのが１本鎖のＤＮＡであり、２本鎖のＤＮＡを分離する必要がないため高温部１０と断熱部１１が不要になっている。従って、測定開始時には、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２が分離部１２付近、ＤＮＡ試料２３が分離部１２の入口付近になるように配置さえすれば、測定を直ちに実行できる。そして、分離部１２の第２温調器１４は、実施の形態１と同様に１５℃〜８０℃、望ましくは２０℃〜６０℃の温度範囲の所定温度に保つように制御される。このように温度制御することで、ＤＮＡ試料２３を、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２によって、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに分離することができる。
【００６７】
このように、実施の形態２の遺伝子診断装置は、高温部１０と断熱部１１が不要であるから、診断装置の構成が簡単化でき、制御も容易で、扱い易いものとすることができる。
【００６８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、以下のような有利な効果が得られる。
【００６９】
請求項１に記載された遺伝子診断装置は、第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加し、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、次いで、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させ、更に、分離用ＤＮＡコンジュゲートにより正常ＤＮＡの泳動速度を異常ＤＮＡの泳動速度に対して低下させることができる。
【００７０】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、両コンジュゲートや試料の各濃度調整および両コンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００７１】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながら、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧を印加したとき一番先に泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、遅延用ＤＮＡコンジュゲートのほか、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、コンジュゲートとの作用をなかなか振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ所定の電圧を印加するだけで良いから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができ、小型、軽量、低ランニングコストの安価な装置とすることができ、診断の自動化がきわめて容易である。これにより、癌・糖尿病・高血圧・アルツハイマーなどの様々な遺伝子の変異に起因する疾患に関して、その疾患に対する発症の危険性を予知し、発症前の予防あるいは極めて早期の発見をすることができる。また、各個人が持つ遺伝子の多様性を調査することで、薬品の副作用と効果の有無をあらかじめ推測し各個人に最も適合した医薬品を提供することが可能になる。さらに、突然変異が起き癌化してしまった組織から採取した遺伝子の変異を速やかに決定して利用することができる。個人を特定し、犯罪捜査や親子関係の特定、各個人のセキュリティーの確保に決定的な信頼性を遺伝子診断装置によって付与することができる。
【００７２】
請求項２に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が分離用密閉流路カートリッジであるから、予めリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液と、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ試料とを充填した分離用密閉流路カートリッジを用意しておくことができ、測定毎に分離部に分離用密閉流路カートリッジを交換して装着すればよく、測定を簡単に且つ容易に行うことができる。
【００７３】
請求項３に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が１以上設けられたから、密閉流路ごとに遅延用ＤＮＡコンジュゲートと分離用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ結合制御剤を変化させて、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの分離環境を密閉流路ごとに変化させることができる。
【００７４】
請求項４に記載された遺伝子診断装置は、遅延用ＤＮＡコンジュゲートが１種類以上含まれているから、泳動速度を遅延用ＤＮＡコンジュゲートの比率を変えることで変化させることができる。
【００７５】
請求項５に記載された遺伝子診断装置は、分離用ＤＮＡコンジュゲート及び／または遅延用ＤＮＡコンジュゲートがビニル化したＤＮＡであるから、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを明確に分離して測定することが可能となる。
【００７６】
請求項６に記載された遺伝子診断装置は、分離部が内部の液体を２０℃〜６０℃に調整して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離するから、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを温度調整により分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートに結合したり離脱させたりすることが可能であり、結合力を温度で調整でき、分離後それぞれを検出部で測定することが可能となる。
【００７７】
請求項７に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管であるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００７８】
請求項８に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が溝のある板と紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせであるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００７９】
請求項９に記載の発明は、２重螺旋のＤＮＡ試料を引き離して１本鎖のＤＮＡ試料とすることを特徴とする請求項１〜８に記載の遺伝子診断装置であるから、ＤＮＡ試料を１重鎖とする前処理を行うことなくそのまま用いることができるので、更に診断の自動化を図ることが可能である。
【００８０】
請求項１０に記載された遺伝子診断方法は、第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加し、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、次いで、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させ、更に、分離用ＤＮＡコンジュゲートにより正常ＤＮＡの泳動速度を異常ＤＮＡの泳動速度に対して低下させることができる。
【００８１】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、両コンジュゲートや試料の各濃度調整および両コンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００８２】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながら、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧を印加したとき一番先に泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、遅延用ＤＮＡコンジュゲートのほか、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、コンジュゲートとの作用をなかなか振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ所定の電圧を印加するだけで良いから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができる。この遺伝子診断方法によれば、遺伝子の変異に起因する疾患に関して、その疾患に対する発症の危険性を予知し、予防と極めて早期の発見をすることができる。また、各個人が持つ遺伝子の多様性を調査することで、薬品の副作用と効果の有無をあらかじめ推測し、各個人に最も適合した医薬品を提供することが可能になる。さらに、癌化してしまった組織から採取した遺伝子の変異を速やかに決定することができる。個人を特定し、犯罪捜査や親子関係の特定、各個人のセキュリティーの確保に決定的な信頼性を与えることができる。
【００８３】
【配列表】
0003781687.tif 000002
0003781687.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観図
【図２】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の上蓋開放外観図
【図３】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の装置構成図
【図４】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の制御回路要部図
【図５】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との導入状態図
【図６】（ａ）本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図
（ｂ）本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図
【図７】経過時間と吸光度の関係図
【図８】本発明の実施の形態２における遺伝子診断装置の装置構成図
【符号の説明】
１  電源スイッチ
２  操作ボタン
３  表示パネル
４  上蓋
５  筐体
６  電気泳動部
７  支持台
８  制御演算部
９  電源ボックス
９ａ  電源部
１０  高温部
１１  断熱部
１２  分離部
１３  第１温調器
１４  第２温調器
１５  検出部
１５ａ  Ｄ2ランプ
１５ｂ  フォトダイオード
１５ｃ  プリアンプ
１５ｄ  Ａ／Ｄコンバータ
１６，１７  電極
１８  緩衝液
１８ａ，１８ｂ  容器
１８ｄ  リニアポリマーゲル
１９  キャピラリー管
２０  吸引ポンプ
２１  分離用ＤＮＡコンジュゲート
２２  遅延用ＤＮＡコンジュゲート
２３  ＤＮＡ試料
【図１】
0003781687.tif 000004
【図２】
0003781687.tif 000005
【図３】
0003781687.tif 000006
【図４】
0003781687.tif 000007
【図５】
0003781687.tif 000008
【図６】
0003781687.tif 000009
【図７】
0003781687.tif 000010
【図８】
0003781687.tif 000011