(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テオブロマ カカオ（Theobroma cacao）の脱脂した胚乳部から水又はアルコール溶液で抽出した抽出物から分画した成分であり、しかも、
1)  水溶性で、
2)  分子量が５０,０００以上であり、
3)  １２１℃、３０分間の加熱に対しても熱安定であり、
4)  ポリフェノールの性質を示し、
5)  経口摂取することにより血中へ移行し、
6)  エンドトキシン（グラム陰性細菌外膜由来リポポリサッカロイド；ＬＰＳ）と特異的に結合する、
性質を有することを特徴とするエンドトキシン活性中和剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、テオブロマ カカオ（Theobroma cacao）の種実からの抽出物の分画成分であるエンドトキシン活性中和剤に関するものである。
【０００２】
すなわち、この発明は、食品として利用されているテオブロマ  カカオの種実、すなわちカカオの実からの抽出物の分画成分がエンドトキシン活性中和剤として有効であることを利用したものであり、人体へ直接使用して生体中におけるエンドトキシの作用を抑制するための製剤として用いることができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
すべてのグラム陰性菌外膜表層に共通に存在するエンドトキシンは腸管バリアー破綻により血中へ移行したり、グラム陰性細菌感染症により血中に遊離されることで多種の細胞や生体成分に結合して、エンドトキシンショック、致死、発熱、炎症、Shwartzman反応、過度の免疫増強作用や凝固−補体系の活性化などを惹起する。
【０００４】
この発明は、このようなエンドトキシンによる弊害を、従来知られていなかったカカオの実からの抽出物の分画成分により防止しようとするものである。
【０００５】
すなわち、食品であるカカオの実からの抽出物の分画成分がエンドトキシン活性を中和・無毒化し、かつ、経口摂取により血中へ移行することはエンドトキシンによって惹起される障害を防止する上で重要なことである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者は、カカオの実の抽出液から分画した分画成分がエンドトキシン活性中和剤として有効であることを見出し、この発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明の発明者の得た知見によると、カカオの実からの抽出物又はその画分成分がエンドトキシン活性中和剤として有効であり、かつ、経口摂取により生体中へ移行することが知れた。
【０００８】
次にこの発明を具体的に説明する。
〔原料〕
この発明に用いる原料のカカオの実は、胚乳部を取り出し、脱脂処理して用いる。すなわち、カカオの実の胚乳部を脱脂したものであるココア、又はそれを更に脱脂処理したものが用いられる。
【００９】
〔抽出物の調製法〕
原料である脱脂したカカオの実、すなわちココアを水又はアルコール溶液に懸濁し、ゆるやかに攪拌して抽出した後、濾過、遠心分離、フィルタープレスなどの公知の方法により抽出残渣と分離した抽出溶液を得た。なお、抽出する場合、酢酸、クエン酸、乳酸、塩酸などの酸を加えた酸性溶液やアンモニア、炭酸アルカリ塩、有機酸アルカリ塩などを加えたアルカリ性溶液として抽出処理してもよい。すなわち、抽出は、ｐＨ２〜１２の範囲で行うことが可能である。
【００１０】
抽出は、常温にて行ってもよいが、好ましい濃度とするには時間がかかるので加熱して行うのがよい。加熱は８０〜１００℃で行うのが望ましい。
〔抽出物の分画〕
上記の方法により得られた抽出溶液を減圧乾燥した後、水で再溶解してものを等容量のクロロホルム、次いで酢酸エチルで溶媒抽出して得られる水層を分離する。
【００１１】
このようにして得られた水層をセファデックスＧ−７５を用いて分子分画クロマトグラフィーにより分離し、分子量５０,０００以上の分画を分取した。この分画したものは、淡褐色をした溶液であり、これをエンドトキシン活性中和剤として用いた。
【００１２】
又、このエンドトキシン活性中和剤は、定性反応により、ポリフェノールであることを確認した。
【００１３】
なお、このようにして得たエンドトキシン活性中和剤は、溶液であるが、これを凍結乾燥、減圧乾燥などにより乾燥物してもよい。
【００１４】
〔エンドトキシン活性中和能の測定〕
このようにして得たエンドトキシン活性中和剤は、エンドトキシン活性を中和することにより、血管内皮細胞上への接着因子（Ｅ−セレクチン）の発現誘導を抑制することで白血球細胞が血管内皮細胞へ接着することを阻害した。すなわち、血管内皮細胞を培養プレートで前培養し、培養プレートの底面に血管内皮細胞の単層を形成させ、そこへ血管内皮細胞の接着因子を誘導する因子（エンドトキシンあるいはＩＬ１−βあるいはＴＮＦ−α）とエンドトキシン活性中和剤を加えて所定時間培養して接着因子の発現誘導を行ってから白血球細胞を加え、一定時間培養後各ウエル内の血管内皮細胞に接着した白血球細胞の数を数えた結果、エンドトキシン活性中和剤を加えずに同様に処理したときの数に比べ、エンドトキシンを誘導因子として用いた場合だけが血管内皮細胞へ接着した白血球細胞の数が極端に少なかったのに対してＩＬ１−β、ＴＮＦ−αを誘導因子として用いた場合は血管内皮細胞へ接着した白血球細胞の数に変化は認められなかった。
【００１５】
なお、血管内皮細胞および白血球細胞の前培養時あるいは両者の接着反応時におけるエンドトキシン活性中和剤の添加には効果が認められなかった。
【００１６】
エンドトキシン活性中和剤は、エンドトキシン活性を中和することにより、マウスマクロファージ様細胞からのエンドトキシンおよびＩＦＮ−γによって誘導される誘導型一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の発現と一酸化窒素の産生も阻害した。すなわち、マウスマクロファージ様細胞を培養プレートで培養し、そこへマウスマクロファージ様細胞の誘導型一酸化窒素合成酵素を誘導する因子（エンドトキシンおよびＩＦＮ−γ）とエンドトキシン活性中和剤を加えて所定時間培養して培地中のＮＯ産生量を測定した結果、エンドトキシン活性中和剤を加えずに同様に処理したときの量に比べ、エンドトキシン単独、エンドトキシンおよびＩＦＮ−γを誘導因子として用いた場合共に培地中のＮＯ産生量が抑制された。
【００１７】
〔ココア中の活性成分の血中移行〕
１２時間以上絶食したボランティアーの人にココア３５ｇを水２８０mlと共に経口摂取させ、１及び３時間後に採血して公知の方法により血清を得た。また、対照として摂取直前に採血を行い、同様に血清を得た。経口摂取後の血清はオブロマ  カカオの種実からの抽出物の分画成分と同様にエンドトキシンにより誘導されるＥ−セレクチンの発現を抑制することによって白血球細胞が血管内皮細胞へ接着することを阻害した。すなわち、血管内皮細胞を培養プレートで培養し、培養プレートの底面に血管内皮細胞の単層を形成させ、そこへ血管内皮細胞の接着因子を誘導する因子（エンドトキシン）と血清を加えて所定時間培養して接着因子の発現誘導を行ってから白血球細胞を加え、一定時間培養後各ウエル内の血管内皮細胞に接着した白血球細胞の数を数えた結果、摂取後１及び３時間目の血清を加えたものは対照に比べてが血管内皮細胞へ接着した白血球細胞の数が減少した。
【００１８】
【実施例】
次に、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
【００１９】
実施例１  （水による抽出処理の例）
カカオの実からの抽出液の調製
脱脂したココア５０ｇに５００mlの沸騰した純水を加えて懸濁し、沸騰した水浴中で攪拌しながら１時間抽出を行った。これを２５℃まで冷却した後、１５，０００×ｇ，１０分間、２５℃で遠心分離して上澄みを得、更にこの上澄みを定性濾紙Ｎｏ２で濾過して得られた４００mlの濾液を水抽出液とした。
【００２０】
抽出液の有機溶媒による分画
この水抽出液３００mlを分液ロートに移し、更にクロロホルム３００mlを加え、１０分間激しく攪拌して均質化した。これを４℃で２日間放置して水層（上層）とクロロホルム層（下層）を分離した。この水層（２７０ml）を再び分液漏斗に戻し、酢酸エチル２７０mlを加えて１０分間激しく攪拌して均質化した後、４℃で２日間放置して水層（下層）と酢酸エチル層（下層）を分離した。この様にして得られた水層（２８５ml）を２００mlまで４０℃で減圧濃縮して混在する有機溶媒を除いたものを水抽出液の水溶性画分とした。
【００２１】
分子分画クロマトグラフィーによる分画
この水溶性画分２mlを４０℃で減圧濃縮し１mlとしたものをセファデクスＧ−７５，medium（ファルマシア社製）カラム（直径１.６cm、長さ９７cm、容積１９０ml）を用い、水を溶出液として分子量により分画した結果が図１.である。各画分の容量は３.０mlである。Ａ２８０は２８０nmにおける吸光度を、Ａ４９０は４９０nmにおける吸光度を示す。
【００２２】
このうち、分子量５０,０００以上の画分である２１番目から２５番目のフラクションを分取して、水抽出液から得たエンドトキシン活性中和剤とした。
【００２３】
実施例２  （８０％エタノールによる抽出処理の例）
カカオの実からの抽出液の調製
脱脂したココア５０ｇに５００mlの８０％エタノールを加えて懸濁し、室温で攪拌しながら１時間抽出を行った。これを１５，０００×ｇ，１０分間、２５℃で遠心分離して上澄みを得、更にこの上澄みを定性濾紙Ｎｏ２で濾過して得られた４５０mlの濾液を得た。この濾液を２５℃で減圧乾燥したものを純水で溶解して４５０mlに容量を合わせたものを８０％エタノール抽出液とした。
【００２４】
抽出液の有機溶媒による分画
この８０％エタノール抽出液３００mlを分液ロートに移し、更にクロロホルム３００mlを加え、１０分間激しく攪拌して均質化した。これを４℃で２日間放置して水層（上層）とクロロホルム層（下層）を分離した。この水層（３１０ml）を再び分液漏斗に戻し、酢酸エチル３１０mlを加えて１０分間激しく攪拌して均質化した後、４℃で２日間放置して水層（下層）と酢酸エチル層（下層）を分離した。この様にして得られた水層（３５０ml）を２００mlまで４０℃で減圧濃縮して混在する有機溶媒を除いたものを８０％エタノール溶液抽出液の水溶性画分とする。
【００２５】
分子分画クロマトグラフィーによる分画
この水溶性画分２mlを４０℃で減圧濃縮し１mlとしたものをセファデクスＧ−７５，mediumカラム（直径１.６cm，長さ９７cm；容積１９０ml）を用い、水を溶出液として分子量により分画した。その溶出パターンは、実施例１に示した図１と同様であった。
【００２６】
実施例１と同様に、分子量５０,０００以上のフラクションである２１番目から２５番目のフラクションの画分を分取して、エタノール溶液抽出液から得たエンドトキシン活性中和剤とした。
【００２７】
実施例１及び２において得た水抽出液並びにエタノール溶液抽出液、水並びにエタノール溶液の抽出液を各々有機溶媒で分画した水溶性画分及びこれらの水溶性画分を分子分画クロマトグラフィーにより分画したそれぞれのエンドトキシン活性中和剤をそれぞれ別々に０.２μmフィルターで滅菌濾過してエンドトキシン活性中和能を測定した。次に、その結果につき、説明する。
【００２８】
試験例１
分子分画クロマトグラフィーによる抽出液中のエンドトキシン活性中和能保有成分の性質
実施例１または実施例２により得た水あるいは８０％エタノール溶液による抽出液から分画したエンドトキシン活性中和剤を酒石酸鉄比色法（食品分析法、ｐ８１３、光琳書房）により測定した結果、ポリフェノールの性質を示した。
【００２９】
また、ポリフェノールの吸光度を求めると２８０nm、４９０nm、５４０nmの波長の所に吸収がみられるが、エンドトキシン活性中和剤の各波長の吸光度を求めた結果、表１のようになった。これより各波長の吸光度の比率を求めた結果、ポリフェノールであることが確認された。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
試験例２
エンドトキシンによる血管内皮細胞上への接着因子（Ｅ−セレクチン）の発現誘導活性中和能の測定
血管内皮細胞としてヒト臍帯静脈内皮細胞（森永生科学研究所製）を用いる。１０％牛胎児血清および５μgゲンタマイシンを含むＭＣＤＢ１０５培地（ＭＣＤＢ１０５（＋）培地、ＳＩＧＭＡ社製）を培地とし、タイプＩコラーゲン（森永生科学研究所製）でコートされたフラスコ（ファルコン製）中で培養された血管内皮細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で回収後、ニグロシン液を用いて生細胞数を数え、５×１０5 生細胞／mlになるようにＭＣＤＢ１０５（＋）培地に懸濁した。この細胞液をタイプＩコラーゲンでコートされた２４穴細胞培養プレート（住友ベークライト製）に５００μｌ（２.５×１０5 生細胞／穴）ずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２  ガス培養器中で一夜培養して単層を形成させた後、培養上清を取り除き、次いで、１.０ml／穴のＭＣＤＢ１０５（＋）培地で洗浄した。
【００３２】
次いで、ＭＣＤＢ１０５（＋）培地を１.０ml／穴ずつ加えて、３時間、３７℃、５％ＣＯ２  ガス培養器中で培養した後、培養上清を取り除き、次いで、１.０ml／穴のＭＣＤＢ１０５（＋）培地で洗浄した。
【００３３】
次いで、接着因子（Ｅ−セレクチン）の発現誘導のため、１.０μg／mlエンドトキシン（大腸菌由来；ＤＩＦＣＯ社製）あるいは２.０ｎｇ／mlＩＬ１−β（ＳＩＧＭＡ社製）あるいは２.０ｎｇ／mlＴＮＦ−α（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＭＣＤＢ１０５（＋）培地を１.０ml／穴ずつ加えて、３時間、３７℃、５％ＣＯ2 ガス培養器中で培養した。次いで、誘導のための培地を除き、１.０ml／穴のＭＣＤＢ１０５（＋）培地で洗浄した。
【００３４】
次いで、１.０×１０6 生細胞／のヒト由来白血球細胞（ＨＬ−６０株、あるいはＵ−９３７株）を含むＭＣＤＢ１０５（＋）培地を１.０ml／穴ずつ加え、１５分間、３７℃、５％ＣＯ2 ガス培養器中で培養した。次いで、ヒト由来白血球細胞を含む培地を除いた後、Ｃａ2＋，Ｍｇを含むＤ−ＰＢＳで血管内皮細胞へ接着しなかったヒト由来白血球細胞を洗浄して除いた後、顕微鏡下で血管内皮細胞へ接着したヒト由来白血球細胞の数を測定し、更に写真に撮影した。写真では、血管内皮細胞が黒色を呈するのに対してヒト由来白血球細胞が白色の粒子として観察され容易に計数する事が出来た。
【００３５】
カカオの実からの抽出成分の各分画を含むＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えた穴の接着ヒト由来白血球細胞数を抽出物添加区の数とし、カカオの実からの抽出液と等容量の純水を含むＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えた穴の接着ヒト由来白血球細胞数を対照区の数として求め、次の式によりカカオの実の抽出液の各分画のエンドトキシン活性中和能を計算した。
【００３６】
【数１】
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【００３７】
１）  エンドトキシンによる血管内皮細胞上への接着因子（Ｅ−セレクチン）の発現誘導活性に対する水抽出液の中和能の特異性
実施例１の水抽出液を２５０分の１量添加したＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えた穴の接着ヒト由来白血球細胞数を抽出物添加区の数とし、水抽出液と等容量の純水を含むＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えた穴の接着ヒト由来白血球細胞数を対照区の数として測定し、その数からエンドトキシン活性中和能を計算した結果を表２に示した。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
誘導反応時に水抽出物を添加し、エンドトキシンを誘導因子として用いた場合だけが血管内皮細胞へ接着したヒト白血球細胞の数が対照区に比べ、減少して中和能を示したのに対してＩＬ１−β、ＴＮＦ−αを誘導因子として用いた場合は血管内皮細胞へ接着した白血球細胞の数に変化は認められなかった。また、血管内皮細胞および白血球細胞の前培養時あるいは両者の接着反応時における水抽出液の添加には効果が認められなかった。
【００４０】
この結果から、水抽出液は、エンドトキシンに特異的に結合することによってその活性を中和すると結論された。
【００４１】
２）  有機溶媒抽出による水溶性画分中のエンドトキシン活性中和能保有成分の挙動
１.０μg／mlエンドトキシン共存下で実施例１および２に記載の水溶性画分を各々１００分の１量添加したＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えて接着因子の誘導を行った穴の接着ヒト由来白血球細胞数を水溶性画分添加区の数とし、水溶性画分と等容量の純水を含むＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えて接着因子の誘導を行った穴の接着ヒト由来白血球細胞数を対照区の数として測定し、その数からエンドトキシン活性中和能を計算した結果を表３に示した。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
水あるいは８０％エタノール抽出物中のエンドトキシン活性中和能保有成分は有機溶媒抽出後も水層に残存することから水溶性であると結論された。
【００４４】
３）  分子分画クロマトグラフィー分画成分のエンドトキシン活性中和能保有成分の挙動
１.０μg／mlエンドトキシン共存下で実施例１及び２により得られたエンドトキシン活性中和剤を１０分の１量添加したＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えて接着因子の誘導を行った穴の接着ヒト由来白血球細胞数が画分と等容量の純水を含むＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えて接着因子の誘導を行った穴の接着ヒト由来白血球細胞数に比べて明らかに減少した画分を図１に示した。図１に示すように、エンドトキシン活性中和能を示した画分は、フラクション２１から２５であった。
【００４５】
すなわち、水あるいは８０％エタノール抽出物中の水溶性画分中のエンドトキシン活性中和能を保有する成分は、分子量５０,０００以上の高分子であると結論された。
【００４６】
４）  分子分画クロマトグラフィーにより得たエンドトキシン活性中和剤の熱安定性
表４に示すように、分子分画して得たエンドトキシン活性中和剤を１２１℃で３０分間加熱処理した前後のものを１０分の１量添加したＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加え、１.０μg／mlエンドトキシン共存下で接着因子の誘導を行った穴の接着ヒト由来白血球細胞数は等容量の純水を含むＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えた穴の接着ヒト由来白血球細胞数に比べて明らかに減少し、かつ、加熱前後での変化が認められなかった。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
水あるいは８０％エタノール抽出物中の水溶性画分中の分子量５０,０００以上の高分子であるエンドトキシン活性中和能保有成分は熱安定性を有すると結論された。
【００４９】
試験例３
エンドトキシンによるマウスマクロファージ様細胞からの誘導型一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の発現と一酸化窒素の産生誘導活性中和能の測定
マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４.１を１０％牛胎児血清および２０μgゲンタマイシン、７.５ｍＭＨＥＰＥＳを含むフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０（＋）培地）（ＳＩＧＭＡ社製）を培地中で培養し、ニグロシン液を用いて生細胞数を数え、１.０×１０6 生細胞／mlになるようにＲＰＭＩ１６４０（＋）培地に懸濁した。この細胞液を２４穴細胞培養プレート（住友ベークライト製）に１.０ml（１.０×１０6 生細胞／穴）ずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２  ガス培養器中で一夜培養して細胞を接着させた後、培養上清を取り除き、次いで、１.０ml／穴のＲＰＭＩ１６４０（＋）培地で洗浄した。
【００５０】
次いで、各穴にＲＰＭＩ１６４０（＋）培地を８００μｌずつ加えて、これに実施例１の水抽出液、水溶性画分あるいは純水を１００μｌずつ加えた後、更に１００ユニット／mlＩＦＮ−γ（ＳＩＧＭＡ社製）、１.０μg／mlエンドトキシン（ＤＩＦＣＯ社製）、両者を含むＲＰＭＩ１６４０（＋）培地あるいはＲＰＭＩ１６４０（＋）培地を加えて、３７℃、５％ＣＯ２  ガス培養器中で２４時間培養した後、培養上清５００μｌ  を遠心チューブへ移し、１分間、１５，０００回転／分、４℃で遠心した。上澄み１００μｌを酵素免疫測定用９６穴プレート（ヌンク社製）の各穴に取り、これに１００μｌ／穴の１０ｍｇ／mlグリースロイミン試薬（和光純薬製）を加えて、３７℃、１０分間反応させた後、５４６nm（対照：６３０nm）の吸光度を測定してＮＯ2−量とする。
【００５１】
図２に示したごとく実施例１の水抽出液、分子分画したエンドトキシン活性中和剤画分はエンドトキシンあるいはＩＦＮ−γ＋エンドトキシンで誘導される誘導型一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の発現を抑制することからエンドトキシン活性中和能を有すると結論された。
【００５２】
試験例４
ココア中のエンドトキシン活性中和能保有成分の血中移行
１２時間以上絶食したボランティアーの人にココア３５ｇを水２８０mlと共に経口摂取させ、１及び３時間後に採血して公知の方法により血清を得た。また、対照として摂取直前に採血を行い、同様に血清を得た。試験例２に記載の方法で求めた１.０μg／mlエンドトキシン共存下で各血清を５分の１量添加したＭＣＤＢ１０５（＋）培地を加えて接着因子の誘導を行った穴の接着ヒト由来白血球細胞数を図３に示した。
【００５３】
経口摂取後の血清を添加した穴は対照の血清を添加した穴に比べて接着細胞数が減少することからココアのエンドトキシン活性を中和する能力を有する成分は経口摂取によって血中へ移行することが確認された。
【００５３】
【本発明の効果】
本発明においてテオブロマ  カカオの種実、すなわちカカオの実からの抽出物又はその画分がエンドトキシン活性中和剤として有効であり、かつ、経口摂取により生体中へ移行することを見出したが、これを応用してエンドトキシンにより引き起こされるエンドトキシンショック、致死、発熱、炎症、Shwartzman反応、過度の免疫増強作用や凝固−補体系の活性化などの障害をココアの経口摂取により穏やかに、かつ、安全に防止することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】水溶性画分の分子分画クロマトグラフィーの各フラクションの２８０nm及び４９０nmの吸光度を示す。なお、活性画分を示す太線部分は、エンドトキシン活性中和能がみられたフラクションを示している。
【図２】試験例３におけるＮＯ発生量を示す図。
【図３】試験例５のココアを摂取したボランティアーから採取した血液から得た血清を用いた場合の接着ヒト由来白血球数を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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