(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列の第５９番目から第１１４７番目までの配列からなるＤＮＡ又はこの配列を有するＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるブタ補体インヒビター。
【請求項４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はこの塩基配列を有するＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はブタ補体インヒビターをコードするＤＮＡに関する。より詳細は、ブタ補体活性を抑制するインヒビター蛋白をコードするＤＮＡ、それから発現されるブタ補体インヒビター蛋白及び補体インヒビター遺伝子のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、臓器移植は各国で広く行われており、特に優れた免疫抑制剤（シクロスポリン、ＦＫ５０６など）の開発により、ヒトからヒトへの臓器移植の拒絶反応は解決された。しかし、臓器提供者（ドナー）の不足が深刻な問題となっている。このような問題から、動物臓器のヒトへの移植、即ち異種移植が研究されている。例えば、欧米では年間約３５００例の心臓移植が行われているものの、この例数は心臓移植を必要としている患者の約２〜３割にしか満たないのが現状である。ドナー動物として、ヒトの近縁種（例えば、ヒヒ、チンパンジーなどの霊長類）を用いることは、ドナー動物数が少ないことや知能の高いことによる倫理的な点から問題が多い。それに対して、家畜をドナー動物とする場合には問題が少ない。特に、ブタは大量に飼育されており供給が容易であること、ブタの臓器の大きさはヒトの臓器に近いこと、系統の保存などの基盤が確立されていることなどの利点を有し、ブタの臓器をヒトに移植する研究が行われている。
ブタの臓器をヒトに移植した場合に生じる拒絶反応のうち、ＭＨＣの関与する細胞性免疫による急性の拒絶反応(Acute rejection)は、ブタとヒトでは遠縁種の関係にあり、ＭＨＣの類似性がないので、起こり難いと予測されている。また、万一、このような拒絶反応が生じた場合でも、上述の優れた免疫抑制剤の使用により、回避できると考えられている。
しかし、ヒトの血中にはブタに対する抗体が既に存在する（自然抗体と称される）。その結果、ブタの組織がヒトに移植されると、ヒト血中の自然抗体がブタの組織（抗原）を認識し、抗原・抗体複合体が形成され、この抗原・抗体複合体がヒトの補体を活性化し、活性化されたヒトの補体が移植されたブタの組織を壊死させる（拒絶）。このような現象は、移植後速やかに（１時間以内）に起こるので、超急性拒絶(Hyperacute rejection)と呼ばれている。
【０００３】
補体の活性化による超急性拒絶を抑制する薬剤は開発されていない。ヒトの組織はヒトの補体による損傷を受けない。これは、ヒトの組織には補体の活性化反応を抑制する因子が発現しているからであり、この因子は補体インヒビター（又は補体制御因子）と称されている。補体インヒビターとしては、ＤＡＦ(Decay accelating factor, CD55)、ＭＣＰ(Membrane cofactor protein, CD46)、ＣＤ５９の３つが重要である。なお、ＤＡＦ及びＭＣＰはＣ３ｂ及びＣ３／Ｃ５転換酵素の崩壊亢進により、ＣＤ５９はＣ９ステップの阻害により補体の活性化を阻止すると考えられている。
補体インヒビターは種による特異性があり、ブタ補体インヒビターはブタの補体活性を阻止することはできても、ヒトの補体活性を阻止することはできない。そのため、ブタの組織がヒトに移植されてヒトの補体系が活性化されたとき、ブタの補体インヒビターではそれを抑制することはできない。その結果、ヒトに移植されたブタ組織は壊死することになる。
【０００４】
前記のような、ブタの臓器をヒトに移植する際の問題点を解決するには、遺伝子工学的方法により、ブタの臓器にヒトの補体インヒビターを予め発現させておけばよい。ブタの心臓を移植する場合には、ブタの血管内皮細胞にヒトの補体インヒビターを予め発現させておけばよい。
このような観点から、ヒトの補体インヒビター遺伝子を組み込んだ遺伝子組換ブタ（トランスジェニックブタ）の研究が盛んに行われている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、ヒト補体インヒビターを組み込んだトランスジェニックブタを用いて、異種移植を行うことが研究されている。現在のところ、このトランスジェニックブタ作製に使用されているプロモーターはヒト補体インヒビター由来のもの又はウイルス由来のものが用いられている。しかし、補体インヒビターのブタでの発現には、ブタ由来の補体インヒビターのプロモーターがより有効であると考えられる。そこで、上記のプロモーターを獲得するためには、まず、ブタ補体インヒビターのｃＤＮＡを得る必要がある。しかしながら、いままでブタ補体インヒビターのｃＤＮＡについては知られていない。
本発明者等は、かかる観点から、ブタ補体インヒビターのｃＤＮＡの発現クローニングを行ったところ、細胞にブタ補体に対する抵抗性を付与し、ヒトＭＣＰに高い相同性を示すｃＤＮＡを得た。また、この過程で、新たなｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法を見出した。
本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明はブタ補体インヒビターのｃＤＮＡ、それから発現されるブタ補体インヒビター蛋白及び補体インヒビター遺伝子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、
▲１▼配列番号１で示される塩基配列又はこの塩基配列の一部からなるＤＮＡ；
▲２▼配列番号１で示される塩基配列の第５９番目から第１１４７番目までの配列からなるＤＮＡ又はこの配列を有するＤＮＡ；
▲３▼配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるブタ補体インヒビター；
▲４▼配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はこの塩基配列を有するＤＮＡ；
▲５▼ｃＤＮＡライブラリーを宿主に導入した後、宿主に対する抗体及び補体成分を加え、生存宿主を分離することからなる補体インヒビター遺伝子を有するクローンのスクリーニング方法；
に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明にかかる配列番号１に示される塩基配列は、ブタ補体インヒビターをコードするｃＤＮＡ（以下、ｐＭＣＰｃＤＮＡという）であり、かかるｃＤＮＡは、例えば、以下の方法により調製することができる。
【０００８】
まず、ｍＲＮＡの調製を行う。ｍＲＮＡの調製は常法に準じて行うことができ、例えば、ブタ補体インヒビターを発現している細胞、組織などから通常の方法、例えば、グアニジウムチオシアネート法、ホットフェノール法、リチウム塩を用いる方法などを用いて全ＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに通すことによりｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製することができる。なお、この工程で、抽出細胞としては、補体インヒビターの高発現部位と考えられるブタ血管内皮細胞を用いるのが好ましく、ブタ血管内皮初代培養株又はブタ血管内皮樹立細胞株ＰＡＥ細胞(J. Biol. Chem. 262, 4098, 1987参照)が好適に使用される。
【０００９】
次に、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、通常の方法（例えば、Gublerら、Gene, 25, 263, 1983)又は市販のｃＤＮＡ合成キット（例えば、ファルマシア社製、アマシャム社製、ベーリンガー・マンハイム社製等）を利用して行うことができる。
得られたｃＤＮＡは、必要に応じて長塩基対のものを分別した後、常法に準じファージベクターであるλｇｔ１１に挿入したり、又は適当なプラスミドベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを調製する。
【００１０】
かくして調製されたｃＤＮＡライブラリーからｐＭＣＰｃＤＮＡのクローニングを行う。ｐＭＣＰｃＤＮＡのクローニングは、慣用のプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法、標識化特異抗体を用いる方法などにより行うことができるが、本発明者らは、抗補体活性による新たなスクリーニング法を見出しており、この方法が好適に用いられる。
即ち、ｃＤＮＡライブラリーを適当な細胞に挿入した後、当該細胞に対する抗体（抗血清）及び補体成分（目的種の血清、この場合にはブタ血清）を加え補体活性を刺激し、抗補体作用を有する細胞を選択することにより、目的とするｃＤＮＡを含む細胞のクローニングを行うことができる。より詳細には、後記の実施例に示されるように、プラスミドベクターライブラリーを常法に準じてヒトリンパ芽球細胞ＪＹ２５細胞(J. Immunology 141, 4283, 1988参照)に導入し、抗生物質含有培地で培養することにより細胞の予備選択を行う。なお、プラスミドベクターは抗抗生物質遺伝子を含んでいるので、当該ベクターが導入された細胞は抗生物質含有培地中でも生存・増殖することができる。抗生物質含有培地による予備選択は、細胞の選択性を高めるために行われるが、場合によっては省略することもできる。
次いで、予備選択された細胞に抗ＪＹ２５抗体（抗血清）及び補体成分（目的種の血清、この場合にはブタ血清）を添加して補体活性を刺激する。ｐＭＣＰ遺伝子を含むプラスミドが導入されている細胞は、細胞中で補体インヒビターが発現されており、補体の活性化が阻害されるので、当該細胞は生存することができる。この抗生物質含有培地による選択及び補体による選択を繰り返すことにより、目的とするｃＤＮＡ（ｐＭＣＰｃＤＮＡ）を含む細胞のクローンを得ることができる。
この方法によれば、ブタ補体インヒビター（ｐＭＣＰ及びそれ以外のブタ補体インヒビター）のｃＤＮＡを容易に採取することができる。また、ブタ以外にも、この方法を各種動物のｃＤＮＡライブラリーに適用することにより、各種動物の補体インヒビターのｃＤＮＡを採取することができる。
【００１１】
かくして選別されたクローンからのｐＭＣＰｃＤＮＡ（又はその一部を含むｃＤＮＡ断片）の単離は、慣用のｃＤＮＡ単離法に準じて行うことができ、更に必要に応じて当該ｃＤＮＡをサブクローニングし、ｐＭＣＰｃＤＮＡ（又はその一部）を単離してもよい。なお、得られたＤＮＡが、ｐＭＣＰｃＤＮＡの一部を含むｃＤＮＡである場合には、当該ＤＮＡをプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、全長のｐＭＣＰｃＤＮＡを有するクローンを選別することができる。
得られたｐＭＣＰｃＤＮＡの塩基配列は、例えば、ジデオキシ法などの慣用の方法又は市販のＤＮＡシークエンサー（例えば、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定することができる。
【００１２】
上述の方法により、ｐＭＣＰｃＤＮＡのクローニング及び塩基配列の決定を行うことができ、後記の実施例で得られたｐＭＣＰｃＤＮＡは１３６５ｂｐの塩基長(配列番号１)を有し、ブタ補体インヒビターをコードする領域は１０８９ｂｐであった。そして、そのうち、約６００ｂｐの翻訳領域ではヒトＭＣＰｃＤＮＡと高い相同性（約７０％）を示した。配列番号１の塩基配列より推定されるブタ補体インヒビターの総アミノ酸数は３６３残基（配列番号２）であった。
【００１３】
かくして得られたｐＭＣＰｃＤＮＡは、それを用いた慣用の遺伝子工学的方法により、十分量のブタ補体インヒビターを生産することが可能となるので、ブタ補体インヒビターの生産に有用である。例えば、ｐＭＣＰｃＤＮＡを、適当なベクターに組み込んで発現ベクターを調製し、これを適当な宿主に導入して得た組換体を培養することによりブタ補体インヒビターを得ることができる。なお、ベクターに組み込むＤＮＡ断片として、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片又はそれを含むＤＮＡ断片を用いてもよい。
ベクターとしては、必要に応じて、発現のために必要なプロモター、ＳＤ配列、ターミネター、エンハンサー、各種マーカーなどを有するものを用いることができ、また宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母等の微生物、動植物細胞などを用いることができる。なお、宿主細胞の種類により、目的ペプチドの糖鎖の種類やグリコシル化度の異なるものが産生されること；宿主細胞中で発現された前駆体ペプチドのＮ及び／又はＣ末端アミノ酸配列がシグナル・ペプチダーゼなどによりプロセッシングを受け、種々の末端アミノ酸配列を有するペプチドが得られることなどは、当業者において周知である。
【００１４】
また、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる本発明のブタ補体インヒビターは、ブタの補体の活性化を阻止する作用を有しており、またヒト補体の活性化に対しても阻止性を有しており、補体の活性化を阻害する薬剤として有用である。
なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる本発明のブタ補体インヒビターに関し、当該インヒビターと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【００１５】
【発明の効果】
以上のように、本発明のｐＭＣＰｃＤＮＡを用いることにより、ブタ補体インヒビターを遺伝子工学的に生産することが可能となり、十分量のブタ補体インヒビターを提供することができる。ｐＭＣＰｃＤＮＡ塩基配列よりブタ補体インヒビターのアミノ酸配列を決定することができるので、このアミノ酸配列からブタ補体インヒビターをコードするＤＮＡを合成することができ、これを用いてもブタ補体インヒビターを遺伝子工学的に生産することが可能である。遺伝子工学的方法によれば、天然に存在する蛋白質のアミノ酸配列のみならず、塩基配列を修飾することにより、一又は二以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失した蛋白質や、他の蛋白との融合蛋白質を生産することができる。更に、本発明のｐＭＣＰｃＤＮＡは、ブタ補体インヒビターのプロモーター領域の解析に有用である。
また、本発明のスクリーニング方法によれば、各種動物の補体インヒビターのｃＤＮＡを容易に採取することができる。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
１）ブタ血管内皮細胞からの全ＲＮＡ抽出とｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡの精製
ブタ血管内皮細胞初代培養株又はＰＡＥ細胞（１×１０8細胞）を１５ｃｍシャーレ１０枚に加え、更に５．５Ｍ ＧＴＣ（グアニジンチオシアネート）溶液を３ｍｌ／シャーレに添加した。この際、溶液は多量のＤＮＡのため粘性を有するが、１８ゲージの注射針のついたシリンジ（３０ｍｌ）にて溶液の吸引排出を２０〜３０回繰り返すことによりＤＮＡを細断し、粘性を低下させた。
次いで、高速遠心（８００ｒｐｍ）して残渣を除去し、上清をポリアロマーチューブ（４０ｍｌ）に入れたＣｓＴＦＡ溶液（１７ｍｌ）の上に重層し一晩超遠心した。上部のＧＴＣ層と中間のＤＮＡ層をそっと取り除き、残りは廃棄した。チューブを逆さまにし余分な水分を取り除き、チューブの底から２ｃｍを切取り氷の上に置いた。チューブの底のＲＮＡをブルーチップの先で擦り取り、６００μｌの４Ｍ ＧＴＣ溶液に溶かし込んだ。軽く遠心し、不溶物を落した。６００μｌ当たり１５μｌの１Ｍ酢酸と４５０ｍｌのエタノールを加え、−２０℃で３時間以上冷した後マイクロチューブ中（４℃）１０分間遠心した。
【００１８】
上清を除き、ＲＮＡを１ｍｌの新しく調製したＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に迅速に溶解した。軽く遠心し、上清を採取した。上清３３０μｌ当たり１３μｌの２Ｍ ＮａＣｌを加え、−２０℃で数時間以上冷却して、全ＲＮＡを調製した。
全ＲＮＡからのｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分離精製は、クロンテック社のｍＲＮＡ精製キット（原理はオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを用いたアフィニティーグロマトグラフィー）を使用して行った。即ち、ｄＴ樹脂を充填したカラムを洗浄用緩衝液で数回洗浄し、その後サンプルを乗せ、再度洗浄用緩衝液で洗浄し、次いで溶出用緩衝液でｄＴ樹脂に付いていたＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を溶出し、エタノール沈殿後ｃＤＮＡの調製に使用した。
【００１９】
２）ｃＤＮＡライブラリー作製
上記で得られたｍＲＮＡ（４μｇ）に蒸留水を加えて１７μｌにし、６８℃で５分間加熱した。氷上で１０分間冷却した後、以下のものを加えた。
x5 ファースト ストランド緩衝液      6 μl
0.1M DTT                            3 μl
RNasin                              1 μl
リンカープライマー(1.6μg/μl)    3.3 μl
dNTP溶液 (10mM)                     2 μl
添加後、速やかに撹拌し、次いで４３℃２分間放置し、Super scriptIIを添加し、４３℃で１時間インキュベートした後、氷上に置いた。
次いで、上記の反応液に氷上で下記のものを添加した。
ddH2O                           134.3 μl
x5 セカンド ストランド緩衝液       48 μl
dNTP溶液 (10mM)                     4 μl
0.1M DTT                            9 μl
氷上で５分間放置し、以下のもの添加した。
DNAポリメラーゼ I (5U/μl)         12 μl
RNaseH (1.5U/μl)                 2.7 μl
添加後、速やかに撹拌し、１６℃１５０分間インキュベートし、T4 DNA ポリメラーゼ(3U/μl)４μｌを添加した。１６℃１５分間次いで３７℃１０分間インキュベートした。２５０μｌのフェノール／クロロホルムで抽出し、更にフェノール／クロロホルムに１００μｌ ＴＥを加えて抽出し、抽出液をまとめ、これに以下のものを添加した。
3M 酢酸ナトリウム                  40 μl
キャリヤー (グリコーゲン)          10 μl
100% エタノール                     1 ml
添加後、−２０℃で一晩（又は−８０℃で１時間）インキュベートした後、遠心（15,000 rpmで２０分間）し、７０％エタノールで洗浄し、遠心（15,000 rpmで５分間）し、１５μｌ ＴＥに溶解した。
【００２０】
上記で得た溶解液（４μｌ）に氷上で、以下のものを添加した。
x10 リゲーション緩衝液              2 μl
SalI アダプター (1μg/μl)        1.2 μl
ddH2O                             9.8 μl
T4 DNAリガーゼ                     10 ユニット(3μl程度)
添加後、８℃一晩インキュベートし、７０℃３０分間加熱し不活化した。
次いで、この溶液（２０μｌ）に以下のものを添加した。
x10 NotI 緩衝液 (東洋紡H)          ４ μl
x10 トリトン                        4 μl
x100 BSA                          0.4 μl
ddH2O                             5.6 μl
NotI (500U/μl)                     4 μl
添加後、３７℃２時間インキュベートし、７０℃３０分間加熱不活化した。
【００２１】
上記の溶液に以下のものを添加した。
1M NaCl                             7 μl
ddH2O                              22 μl
グリコーゲン (10μg/μl)            1 μl
添加後、小型遠心型ゲル濾過装置に付し(3,000 rpm 3分間)、ミリポアフィルター(UFCP3 TK50)で脱塩し、遠心(10,000 rpm 5分間)した後、上清を除去し、１００μｌ ＴＥを加えて遠心(10,000 rpm 15分間)した。上清を除去した後、更に１００μｌ ＴＥを加えて遠心(10,000 rpm 15分間)し、上清を除去し、１００μｌ (1/10)ＴＥを加えて遠心(10,000 rpm 20分間)した。上清を除去後、３０μｌ (1/10)ＴＥに分散し、フィルターを逆さまにし遠心(5,000 rpm 5秒 2回)することによりｃＤＮＡを得た。
【００２２】
氷上で以下の試料を混合した。
cDNA                              30 μl
発現ベクター[pMSF＋(HygroB)]      21 μl
x10 リゲーション緩衝液            12 μl
ddH2O                             56 μl
T4 DNA リガーゼ (4.6U/μl)       1.5 μl
混合後、８℃一晩放置し、７０℃３０分間加熱して非働化した後、ミリポアフィルター(UFCP3 TK50)で脱塩した。その後、遠心(10,000 rpm 15分間)し、上清を除去し、１００μｌ ＴＥを加え遠心(10,000 rpm 15分間)した。上清を除去した後、更に１００μｌ ＴＥを加えて遠心(10,000 rpm 15分間)し、上清を除去し、１００μｌ (1/10)ＴＥを加えて遠心(10,000 rpm 20分間)した。上清を除去後、３０μｌ (1/10)ＴＥに分散しフィルターを逆さまにし遠心(5,000 rpm 5秒)することによりｃＤＮＡライブラリー３０μｌを得た(1.2x106クローン, 平均サイズ:1.5kbp)。得られたｃＤＮＡライブラリーの構造の概要を図１に示す。
【００２３】
３）ｐＭＣＰｃＤＮＡのクローニング
対数増殖期にあるヒトリンパ芽球細胞ＪＹ２５細胞(１ｘ１０8／１０キュベット）をＨｅＢＳ(800μl)に分散させ、これに上記のｃＤＮＡライブラリー（２０μｌ／１０キュベット）を加え、エレクトロポレーション(250V 960μF)した。 細胞を、２００ｍｌのＤ．ＭＥＭ［２０％ＦＣＳ、ＩＴ（インスリン／トランスフェリン）、ＰＳ（ペニシリン／ストレプトマイシン）含有］に分散させ、２４時間培養した。次いで、４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有するＤ．ＭＥＭ（１０％ＦＣＦ、ＩＴ、ＰＳ含有）に再分散させ、１０〜１４日培養した（１ｘ１０7細胞）後、ＰＢＳで洗浄した。
洗浄した細胞を補体セレクションに付した。即ち、細胞に、セレクション用Ｄ．ＭＥＭ(10ml FCS＋10ml ブタ血清＋80ml D.MEM＋1ml 抗JY25抗体＋667μg 抗DAF抗体＋100μg 抗MCP抗体含有)を添加し、３７℃２時間インキュベートした。反応後、Ｄ．ＭＥＭで１回洗浄し、生存細胞数をトリパンブルー染色で数えた（生存細胞数：０．１〜１％）。なお、抗ＤＡＦ抗体及び抗ＭＣＰ抗体は選択性を高めるために加えた。生細胞をＰＢＳで洗浄後、１００ｍｌ Ｄ．ＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に再分散させ、２４時間培養した。
その後、上記のハイグロマイシンＢ含有培地での培養及び補体セレクションを２回繰り返した（生存細胞数は最終的に２０％になった）。
【００２４】
上記で得られた生存細胞（１ｘ１０6）を遠心(1,000 rpm 5分間)した後、細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで、０．６％ＳＤＳ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合液４００μｌを加え、十分に混合し、室温で２０分間放置した。５Ｍ ＮａＣｌ １００μｌを加えて十分に混合し(細胞は白く変色した)、４℃で一晩放置した後、遠心(15,000 rpm 15分間)し、上清を採取した。得られた上清に、フェノール/クロロホルム(200μl+200μl)を加え、遠心(12,000 rpm 2-3分間)し、上清を採取した。上清に、１０μｌ（４μｇ）のポリアクリルアミドを添加し、更に１ｍｌのエタノールを加え、−８０℃で２時間放置した。７０％エタノールを加えて洗浄後、沈殿を２０μｌ ＴＥに分散した。
【００２５】
上記で得たｃＤＮＡ(2μl)を５０μｌの大腸菌(MC1061)にエレクトポレーション(2.5kV 25μF 400Ω)した。各キュベット(計10キュベット)のサンプルに９５０μｌのＳＯＣ培地を直ちに添加した。撹拌(20 rpm)しながら３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートしたサンプルは以下のように取り扱った。
(1)プレートにサンプル(15μlサンプル/プレート)を塗布し、４℃でプレートを保存した。
(2)残りのサンプルは２ｍｌのＴＢＫ+に添加し、撹拌しながら３７℃で一晩培養した後、ミニ精製（プラスミドＤＮＡの少量調製）した。ミニ精製したｃＤＮＡ(2mlサンプル)を２０μｌ ＴＥに分散させた。得られたｃＤＮＡにおいて、１０μｌは制限酵素(Xhol+NotI)で切断し、アガロースゲルを用いてｃＤＮＡのサイズをチェックした。また、残りのサンプルは、ＪＹ２５細胞にエレクトロポレーションし前述の補体セレクション法により選択し、生存細胞数を求めた。
【００２６】
上記のチェックを行った後、前記の保存プレートのうち、高生存率プレートから４０コロニーを採取し、コロニーを２ｍｌのＴＫＢ+で一晩培養した。培養物をミニ精製し、制限酵素(Xhol+NotI)で切断し、各ｃＤＮＡの挿入サイズをチェックし、サイズによりクローンを分類した。このうち、ｃＤＮＡの長さ及び頻度より適当と思われるｃＤＮＡ及びバルクｃＤＮＡ（対照）をＪＹ２５細胞に再度エレクトロポレーションし、前述の補体セレクション法により分析した。その結果を図２に示す。図２に示されるように、バルクｃＤＮＡを導入した細胞[JY25(-pMCPcDNA)]においては生存率が極めて悪いが、選別したｃＤＮＡ(pMCPcDNA)を含む細胞[JY25(+pMCPcDNA)]は高い生存率を示し、ブタ補体に対して抵抗性を示した。
【００２７】
高い生存率を示した細胞からｃＤＮＡを分離し、制限酵素(Xhol+NotI)で切断し、ｐＢＳＩＩＫＳ+に結合させ、常法に準じて塩基配列の決定を行った。その結果、当該ｃＤＮＡは塩基数１３６５ｂｐの塩基配列（配列番号１）を有し、ブタ補体インヒビターをコードする領域は１０８９ｂｐであった。そして、そのうち、約６００ｂｐの翻訳領域ではヒトＭＣＰと高い相同性（約７０％）を示した。配列番号１の塩基配列より推定されるブタ補体インヒビターの配列を配列番号２に示す。当該インヒビターの総アミノ酸数は３６３残基であった。
【００２８】
【配列表】
0003803752.tif 000002
0003803752.tif 000003
0003803752.tif 000004
0003803752.tif 000005
【００２９】
0003803752.tif 000006
0003803752.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｃＤＮＡライブラリーの概要を示す図である。
【図２】本発明のｐＭＣＰｃＤＮＡを含むＪＹ２５細胞について、補体セレクション法による生存率を示す図である。
【図１】
0003803752.tif 000008
【図２】
0003803752.tif 000009