(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一又は二以上の流体試料を分析する方法であって、前記試料に任意に存在する一又は二以上の分析物の存在量若しくは種類の同定のための分析方法において：
（ａ）所定の径を有する一又は二以上の丸いウェルを備えた装置を準備する段階であって、前記ウェルは所定厚の基板を露出するものであり、前記基板は通り抜けチャンネルを方向決めするものであり、ウェルにおいて曝された基板の領域は少なくとも一の前記分析物に対して特有の少なくとも一の結合物質を備えるものであるという段階と、
（ｂ）装置の一又は二以上のウェルに一定量の試料流体を加える段階と、
（ｃ）ウェルにおける基板に交互の圧力差であって、基板におけるチャンネルの毛管圧力より低い圧力差を付与することによって、ウェルにおいて基板を抜ける交互の流れを発生する段階であって、試料に存在する分析物と結合物質との間の反応が可能となるように、試料流体の液体ボリュームに、基板の上側から基板の下側へ基板のチャンネルを抜けて行きかつ少なくとも一度は戻るように力が付与されるという段階と、
（ｄ）ウェルのいずれかで生成された信号を読む段階と、
（ｅ）前記の一又は二以上の分析物の存在、量及び／又は種類の同定を前記信号から決定する段階と、を備え、
基板のチャンネルを抜ける下方への流れを装置の下において減圧を付与することによって形成し、前記減圧は、全試料流体が基板のチャンネルを通り抜けかつウェルにおいて基板の下にぶら下がる小滴を形成するまで維持し、次いで、基板のチャンネルを抜ける上方への流れを十分な過圧まで圧力を上げることによって形成し、前記過圧は、全流体が上方へ再度チャンネルを通り抜けかつ基板の上面において小滴を形成するまで維持し、分析物と結合物質との間の最適接触を確保するのに必要な回数だけこれらの段階を繰り返す方法。
【請求項２】
信号を読む前に基板を洗浄する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加えられる試料流体の量は、ウェル、基板及び試料流体の寸法及び材料特性のうちの少なくとも一方をもとに決定される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
各ウェルに加えられた試料流体の量は以下の式に従うＶmax2を超えない請求項３に記載の方法。
【数１】
0003801916.tif 000004
ここで、 Ｒウェル＝ウェルの径 ｄ＝基板の厚さ θ＝試料流体と基板面との間の接触角 γ＝試料流体の表面張力 ρ＝試料流体の比重 ｇ＝重力加速度
【請求項５】
各ウェルに加えた試料流体の量は以下の式に従うＶmaxを超えない請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【数２】
0003801916.tif 000005
ここで、 Ｒウェル＝ウェルの径 ｄ＝基板の厚さ θ＝試料流体と基板面との間の接触角
【請求項６】
試料ボリュームは、Ｖmax2の最小値を超えない請求項４に記載の方法。
【請求項７】
膜の上面から信号を読むことによって基板を通る流れの変化の間、分析物と結合物質との間の反応を連続的にモニターする請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
流体が基板を通り抜け、基板の下に小滴としてぶら下がる時はいつでも、信号が読まれる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アッセイを実施する装置であって、その装置は、所定厚の基板を露出する所定の径を有する一又は二以上の丸いウェルを備え、前記基板は方向決めされた通り抜けチャンネルを有し、チャンネルは基板の少なくとも一の領域に第１の結合物質を備え、基板は上部カバーと底部カバーとの間に配置し、ウェルは上部カバー及び底部カバーの両カバーにおいて対応する位置に形成された穴で形成されている装置を用いて、一又は二以上のアッセイを自動実施する機器であって：
（ａ）流体の制御された量を装置の少なくとも一のウェルに加える手段と、
（ｂ）十分な時間の間、各ウェルにおける基板に制御された圧力差を付与し及び／又は維持する手段と、を備え、
基板のチャンネルを抜ける下方への流れを装置の下において減圧を付与することによって形成し、前記減圧は、全試料流体が基板のチャンネルを通り抜けかつウェルにおいて基板の下にぶら下がる小滴を形成するまで維持し、次いで、基板のチャンネルを抜ける上方への流れを十分な過圧まで圧力を上げることによって形成し、前記過圧は、全流体が上方へ再度チャンネルを通り抜けかつ基板の上面において小滴を形成するまで維持し、分析物と結合物質との間の最適接触を確保するのに必要な回数だけこれらの段階を繰り返すことができる機器。
【請求項１０】
基板が電気化学的に製造された金属酸化物膜である請求項９に記載の機器。
【請求項１１】
金属酸化物膜がアルミニウム酸化物から成る請求項１０に記載の機器。
【請求項１２】
各ウェルにおける基板がスポット状のアレイを備え、そのスポットが異なる結合物質を備える請求項９に記載の機器。
【請求項１３】
異なる結合物質がオリゴヌクレオチドである請求項１２に記載の機器。
【請求項１４】
流体を加える手段が、試料流体用溜まり及び／又はウェルの洗浄流体用溜まりに接続されている請求項９に記載の機器。
【請求項１５】
装置の周辺に温度制御手段を備えた請求項９に記載の機器。
【請求項１６】
装置が容器の壁におけるカバーとして配備され、圧力差を付与する手段が容器の圧力を変化することによって作動する請求項９に記載の機器。
【請求項１７】
容器が開閉可能な流体出口に接続され、流体をその出口を通って容器から排出することができる請求項１６に記載の機器。
【請求項１８】
各ウェルにおける基板の最上面から信号を読むことができるリーダーを備えた請求項９に記載の機器。
【請求項１９】
流体を加える手段及び圧力差を付与する手段のためのプログラマブルコントローラを備えた請求項９に記載の機器。
【請求項２０】
流体を加える手段が、流体の所定の特性及びウェルの寸法をもとに、各ウェルに加えられる試料流体の加えられるボリュームを制御するようにプログラムされた制御ユニットに接続されている請求項１９に記載の機器。
【請求項２１】
前記の加えられるボリュームが、以下の式で計算されるＶmax2又はＶmaxに等しい請求項２０に記載の機器。
【数３】
0003801916.tif 000006
【数４】
0003801916.tif 000007
ここで、 Ｒウェル＝ウェルの径 ｄ＝基板の厚さ θ＝試料流体と基板面との間の接触角 γ＝試料流体の表面張力 ρ＝試料流体の比重 ｇ＝重力加速度
【請求項２２】
基板のチャンネルは、基板の少なくとも一の領域に第１の結合物質を備え、基板は上部カバーと底部カバーとの間に配置し、ウェルは上部カバー及び底部カバーの両カバーにおいて対応する位置に形成された穴で形成されている請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）流体の制御された量を装置の少なくとも一のウェルに加える手段と、
（ｂ）十分な時間の間、各ウェルにおける基板に制御された圧力差を付与し及び／又は維持する手段と、を備えた、一又は二以上のアッセイを自動実施する機器を用いて実施する請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分析（アッセイ）を実施する装置であって、その装置は通り抜けチャンネルを方向決めする基板を備え、前記チャンネルは試料に適用するためにの表面に開口され、試料への適用のための面の少なくとも一の領域におけるチャンネルは分析物に結合することができる第１の結合物質を備えているという装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
こうした装置は、国際公開第９５／１１７５５号パンフレットにおいて“ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定”との発明の名称で開示されている。この装置はチャンネルを具備する基板を備えている。ここで、このチャンネルは実質的に基板の表面に直交する方向に指向されている。３つのタイプの基板が開示されている。第１のタイプは、多数の中空のグラスファイバーから成る。これは、エッチング可能なコアを有するグラスファイバーを積み重ねてスタックを形成し、そのスタックに平坦な端部を備え、その端部を研磨し、通常、酸を用いてコアをエッチングする。第２のタイプの基板は、結晶シリコンウェハーを電気化学的にエッチングすることによって製造する。第１に、チャンネルの位置はそのサイズと共に、標準的なフォトリソグラフィ法を用いて画定する。第３の基板は、無機基板の核トラック（nuclear track）エッチングによって製造する。基板を重くエネルギーを持った荷電粒子に曝し、湿式エッチングを行う段階を備えたこの方法は、基板の表面にわたってランダムに散在したチャンネルを有する基板を製造する。高めの孔密度及び多孔性を有すると、チャンネルが融着する可能性が高くなり、それは融着していないチャンネルと比べて低い流れ抵抗を示すものである。
【０００３】
３つの全タイプの基板は、労働集約型の製造工程、及び／又は、高価な開始材料及び切断及び研磨のような無駄な作業、及び／又は、高価な設備のため、非常に高価である。また、基板は30％以下の比較的低い多孔率によって特徴付けられる。さらに好都合なことには、80％までの高い多孔率が実現可能であるが、比較的低いチャンネル密度であり、それは、基板の特定の領域のチャンネルの有効表面積が、同程度の多孔性であるがより高いチャンネル密度（及び、結果的により狭めのチャンネル）を有する基板と比較して低いという短所を有する。国際公開第９５／１１７５５号パンフレットで開示されているようなシリコンベースの基板は光透過性ではない。従って、そのような基板は、基板に固定した分析物の検出のために、光マーカーシステムの使用の有利性を低下させる。人気のある光マーカーシステムは例えば、酵素誘導カラー反応、生体若しくは化学ルミネセンス、又は、光ルミネセンスをもとにしている。後者の場合、励起光及び放射ルミネセンス光のいずれも、基板材料を通過しなければならない。
【０００４】
適正に方向決め（指向）された通り抜けチャンネルを有する基板を備えた他の装置が欧州特許出願ＥＰ９８／０４９３８号に係属中であり、その内容は本明細書に参考文献として組み込まれている。
【０００５】
欧州特許出願ＥＰ９８／０４９３８号では、多孔性基板が電気化学的に製造された金属酸化物膜である装置が開示されている。
【０００６】
通り抜け指向チャンネルを有する金属酸化物膜は、金属シートの電気化学的エッチングを介して廉価に製造可能である。問題の金属は、タンタル、チタン及びアルミニウム、二又は三以上の金属の合金、ドーピングされた金属及び合金の中のいずれかである。金属酸化物膜は透明であり、特にウェットなら、種々の光学技術を用いた分析が可能である。このような膜は、十分に制御された径及び好都合な化学面特性を備えた膜を用いてチャンネルを方向決めする（方向付けする）。分析に使用するときは、電気化学的に製造された金属酸化膜の表面の少なくとも一領域におけるチャンネルは、分析物に結合できる第１の結合物質を備える。好適な実施形態では、金属酸化膜はアルミニウム酸化物から成る。
【０００７】
従って、アルミニウム酸化物膜は、異なる第１の結合物質を備える高密度領域に適応するものでもよい。通り抜け指向チャンネルを有するアルミニウム酸化物膜は、Rigbyらによって開示されている（Trans.Inst.Metal Finish., 68(3), p95(1990)）。これらの膜は、ウィルスを精製するため、及び、センサーとしての目的のために酵素を蓄えるために用いられ、欧州特許出願第９８／０４９３８号公開公報に開示されているように、例えば、プローブをもとにした分析用の装置ににおける物質として非常に適していることがわかっている。
【０００８】
このような分析で用いる試薬は、基板のチャンネルに固定され、試料流体は試薬と接触するようにチャンネルを介して力を付与される。
【０００９】
国際公開第８７／０７９５４号パンフレットでは、いわゆるマニホルド真空装置の変形例が記載されている。例えば、96ウェルマイクロタイタープレートにおけるウェルのベースの透過性は、ウェルの多孔性のベースに圧力差を連続的に付与し、次いで流体がベースを通り抜けるようすることによって、ウェルにおける流体の混合を改良するために用いられている。この手順によって、構成要素（例えば、ビード、ミクロスフェア、又は、ウェルにおける小さな流体試料の他の部材）のよりよい混合が可能となり、泡立たせ、渦かき回し、若しくは、プレートを旋回することによる試料流体のかき回しのような機械的混合法の代替となることが示された。
【００１０】
例えば、国際公開第８７／０７９５４号パンフレットに示されているように、抗原結合（束縛）グラスファイバーがフィルタの中に形成され、マニホルドプレートのウェルにベースとして用いられている。酵素免疫測定法は、非常によく見える紫の沈殿物がフィルタによって捕獲されるのに十分大きく形成されているように、実施される。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、適正に方向決めされた通り抜けチャンネルを有する基板を備えた流れ通り抜け（流通）装置に試料流体を接触させる最適の方法を提供することである。従って、本発明は、試薬が固定された適正方向決め通り抜けチャンネルを有する流通装置を用いて分析を実施する新しくかつ自明でない方法を提供するものである。基板におけるチャンネルの毛管圧力によって実施される。基板と装置の寸法をもとに、試料流体をチャンネルの試薬に接触させる最適な方法を提供する。
【００１２】
本発明によれば、基板の物理的なパラメータ、装置及び試料ボリュームをもとに、試料流体を分析するための非常に効率的でかつ敏感な方法を提供することができる。
【００１３】
本発明は、一又は二以上の流体試料を分析する方法であって、前記試料に任意に存在する一又は二以上の分析物の存在、量あるいは種類の同定を行う方法に関するものであって、その方法は：
（ａ）所定の径を有する一又は二以上の丸いウェルを備えた装置を準備する段階であって、前記ウェルは所定厚の基板を露出するものであり、前記基板は適正方向決め通り抜けチャンネルを有し、ウェルにおいて曝された基板の領域は少なくとも一の前記分析物に対して特有の少なくとも一の結合物質を備えるものであるという段階と、
（ｂ）装置の一又は二以上のウェルに一定量の試料流体を加える段階であって、加える一定量の試料流体はウェル及び基板の寸法をもとに計算されるという段階と、
（ｃ）ウェルにおいて基板を抜ける交互の流れを形成する段階であって、試料に存在する分析物と結合物質との間の反応に対して望ましい条件で、試料流体の液体ボリュームに対して、基板の上側から基板の下側へ基板のチャンネルを抜けて行きかつ少なくとも一度戻るように力が付与される段階と、
（ｄ）ウェルのいずれかで生成された信号を読む段階と、
（ｅ）前記の一又は二以上の分析物の存在、量、及び／又は種類の同定を前記信号から決定する段階と、を備えている。
【００１４】
必要なら、例えば、束縛自由（bound-free）段階が必要な分析の場合には、信号を読む前に基板を洗ってもよい。
【００１５】
本発明による方法を用いると、分析を実施している間に、試料流体の混合、及び、試料流体と結合物質が固定される通り抜けチャンネルの各々の内側面との間の接触がが促進される。
【００１６】
装置における基板は、試料に存在する一又は二以上の分析物に対して特有の一又は二以上の結合物質を備えた通り抜けチャンネルを方向決めする。試料流体の小滴が基板の上面にのせられると、基板のチャンネルを通し、チャンネルにおける結合物質に接触するようにされている。
【００１７】
基板におけるチャンネルは毛管であり、非常に高い毛管圧力を有する。膜面において過剰ボリュームを毛管を吸うときはいつでも、この毛管圧はチャンネルが空になるのを防止する。これは、結局、全ての流れが止まり、膜の他の側に形成された小滴は、圧力差によってはそれ以上影響されないことを意味している。
【００１８】
本発明を用いることによって、この効果は、試料流体と基板との間の接触を基板に固定された結合物質を用いて改良するために利用することができることがわかっている。
【００１９】
本発明の思想の一つは、試料ボリュームのサイズを制御すること、あるいは、それを装置（若しくはその周辺部材）の設計パラメータに合わせること、及び、結合物質が固定される基板を用いて実施する生化学分析の感度及びパフォーマンスを改良するために上述の効果を利用することである。
【００２０】
各生化学分析では、用いる試料ボリュームが決定されるとき、考慮しなければならないパラメータがある。ある分析物に対して正である試料のボリュームは、分析における検知可能な信号を生成するのに十分な分析物を含んでいるはずである。ある分析物に予想される濃度が非常に低いときは、他の方法をとらない限り（例えば、試料流体濃度、信号の増幅、あるいは例えば、核酸が検出されるときは、核酸増幅法によって試料における“ターゲットの塩基配列”の量を指数関数的に増加する）、大量の試料流体が必要となる。
【００２１】
他方、試料ボリュームは小さすぎるべきではない。結合物質が基板上に固定されれば、試料ボリュームは、表面を濡らすか、又は、表面とボリュームとの間での十分な接触を保証することができるのに十分大きくあるべきである。多くの生化学アッセイに対しては、大なり小なり標準試料ボリュームがある。
【００２２】
【発明の実施の形態】
図１では、流体が、負の圧力が付与されるまで、どのように膜の上部で球形状の小滴を形成するかを示した図であり、小滴は装置から吸い込まれている。その結果、小滴の形状および膜を抜ける均一の流れが効果的に混合する。
図２は、圧力の反転がどのように工程を反転されるかを示した図であり、結局、膜の上部に小滴がある。
図３は、装置の関連パラメータが、広がる前に、最大の小滴サイズを決定するのを示した図である。
図４は、関連パラメータが、自重のために、小滴が装置から落ちる前に、最大の小滴サイズを決定するのを示した図である。
【００２３】
本発明の方法では、装置は、所定の径を有する一又は二以上の丸いウェル（well）を備えた装置を用いてもよい。各ウェルでは、通り抜け指向チャンネルを有する基板が露出され、ウェルで露出された基板の領域は、少なくとも一の前記分析物に特定の少なくとも一の結合基板を備える。
【００２４】
多くの丸いウェルは、例えば、基板を上部カバーと底部カバーとの間に配置することによって一のプレートに備えてもよく、上部カバー及び底部カバーの両方において同じ位置に形成され穴によって形成される（図１参照）。分析を実施するために各ウェルに配置された液体ボリュームを、試料の流体及び膜の両方の特徴をもとに最適化できる。
【００２５】
本発明の方法では、試料ボリュームサイズは、特に装置及び基板の設計パラメータをもとに調整してもよい：試料ボリュームはある最大値を超えるべきでない。装置のあるウェルに塗布される最大値を超えない試料ボリュームは、流体の重量による基板に落ちる。
【００２６】
しかしながら、この最大値以下の重量を有する試料流体のボリュームは、流体の表面張力のために、基板の下面に付着したままである。
【００２７】
最大値以下のボリュームを有する試料を用いるときは、これによって、基板のさらなる効率化を図ることができる。
【００２８】
この最大値以下のボリュームを有する試料は、試料のボリュームが完全にもとの位置（塗布される基板の最上面上の）に戻るまで、基板を抜ける逆流を生成することによって、基板におけるチャンネルの内面に接触できる。手順は繰り返すことができ、基板を介する交互の流れは必要なだけの頻度で生成することができ、試料流体と結合物質の多くが位置する基板の内面との間で最適接触が保証されている。
【００２９】
試料流体のボリュームは、試料流体がその自重のために基板から落ちないように制御されているのが好ましい。
【００３０】
これによって、ある寸法を有する装置によって扱うことができる最大ボリューム試料において制限がかかる。基板の寸法より、ある試料ボリュームが分析の実施を可能とするのに必要不可欠ならば、装置は（自重のために装置を抜けて落ちる試料ボリュームの使用を防止するために）それに従って調整してもよい。試料ボリュームが決定的でないならば、所定寸法の装置は使用でき、試料ボリュームを装置の寸法に合わせて調整してもよい。いずれの方法でも、装置及び基板の寸法は試料ボリューム及び試料流体の他の特性に“合う”べきである。毛管チャンネルを通って流れるときに表面に付着したままの最大のボリュームを計算することができる。
【００３１】
ここで、重要な大きさは流体特性（γ：表面張力、ρ：比重、ｇ：重力加速度）、ウェルの寸法及び基板の寸法である。基板の下面に付いたままの最大ボリューム（Ｖmax2）とそれらの大きさとの間の関係は以下の式に従う：
【数５】
0003801916.tif 000002
ここで、
Ｒウェル＝ウェルの径
ｄ＝基板の厚さ
θ＝試料流体と基板面との間の接触角
γ＝試料流体の表面張力
ρ＝試料流体の比重
ｇ＝9.8m/s2
【００３２】
液体試料ボリュームが基板から落ちるのを防止するため、試料ボリュームはＶmax2を超えないのが好ましい。
【００３３】
膜の面上の試料流体の小滴は自動的に球形形状をとる。表面と液体との間の接触角は材料に特徴的であり、常に90度以下である。形成する球状小滴は、毛管チャンネルの寸法と基板に対する接触角とによって決まる速度で、基板の毛管チャンネルに直ちに引き込まれる。
【００３４】
本発明の方法では、試料ボリュームのより適当な混合が可能となる。有効こんごうが小滴形状及び基板を介した一様流れの結果であることがわかった。
【００３５】
本発明の好適な実施形態では、試料ボリュームと装置のパラメータとはその効果を利用し、流体の混合を最大にするのに調整される。試料に存在する分析物は結局、基板上に固定された結合物質に接触する。
【００３６】
試料ボリューム上の圧力差の混合効果は、装置のウェルにおける液体表面の形状に関係する。
【００３７】
ウェル上に球形面を有する小滴を形成する試料ボリュームを用いる。
【００３８】
改良された混合効果を保証するために、効率的試料ボリュームを選択すべきである。
【００３９】
試料ボリュームが大きいときは、ウェルは溢れ、試料ボリュームの小滴形状は乱され、又は、試料は他のウェルに止まる。いずれの方法でも、同じ試料流体は一の特定ウェルにおける基板のチャンネルを介してポンプで汲み上げることは保証できない。試料のボリュームは、ウェルの寸法によって影響される。装置におけるウェルは所定の深さと半径を有する。ある試料ボリュームを特定のウェルに限定しておきたいなら、試料ボリュームを計算するときにウェルの寸法を考慮しなければならない。また、特定の分析に対して、ある試料ボリュームが必要ならば、ウェルの寸法は所定の試料ボリュームに従って調整しなければならない。
【００４０】
試料と装置の材料との間の接触角とウェルの幾何学的形状とが、広がりが生ずる前の、使用できる最大の試料ボリュームを決定する。この大きな試料ボリュームの間の関係はＶmaxであり、他のパラメータは以下の式に従う：
【数６】
0003801916.tif 000003
ここで、
Ｒウェル＝ウェルの径
ｄ＝基板の厚さ
θ＝試料流体と基板面との間の接触角
【００４１】
本発明の好適な実施形態では、上述で示した全要求を満足する試料ボリュームを使用してもよい。従って、試料流体の小滴は下面で装置から落ちることを保証するために、試料ボリュームはＶmax2を超えない。試料流体も、装置のウェルは試料を付けるときに溢れないことを保証するために、Ｖmaxを超えない。従って、試料ボリュームはＶmax2及びＶmaxの低い値を超えないことが最も好ましい。
【００４２】
試料ボリュームは、圧力差の存在による影響下で基板を抜けて通る。基板を抜ける流れは一様である。基板においてチャンネル（毛管）の非常に高い毛管圧力のため、基板の上面上に残る試料がなくなると、自動的に流れは止まる。
【００４３】
ウェル内の基板の毛管圧力は通常、流れを生ずるために付与する圧力差よりかなり高い。こうして、大きな圧力差を付与することによって、“基板から液体を押し出す”ことは実質的には不可能である。基板を抜ける流れは、実施される分析に従って最適化すべきである。もちろん、流れは分析物を結合物質に結合することができるようにすべきである。
【００４４】
膜の洗浄は例えば、基板にわたる一定の圧力下でウェルにおいて基板の最上部上の液体を洗い出すために多数の小滴を塗布することによって実施することができる。一様な流れのために、基板の全部分は一様によく洗浄される。
【００４５】
ドロップレットの蓄積したボリュームがＶmax2を超えるとき、洗浄液が落ちる。洗浄段階の最後で付いた小滴を除去するために、例えば、特定形状の親水性のカウンタープレートを用いてもよい。
【００４６】
さらに、本発明は、通り抜け指向チャンネルを有する基板を有する装置、本発明の方法を用いた使用に最適な設計及び寸法、並びに、本発明による方法を自動的に実施できる装置を提供するものである。
【００４７】
本発明の方法を用いる装置は好ましくは、所定の径を有する一又は二以上の丸いウェルを備え、基板の所定サイズのを露出し、その基板は通り抜け指向チャンネルを有し、チャンネルは基板の少なくとも一の領域に第１の結合物質を備え、基板は上部カバーと底部カバーとの間に配置し、ウェルは、上部カバーと底部カバーの両方において同じ位置に作られた穴によって形成する（図１）。
【００４８】
このように装置を構成することによって、所定の試料ボリュームの使用に調整される装置を設計し、製造することが可能となる。基板は上部カバー及び底部カバーに形成した穴によって画定されたウェルで曝される。各ウェルの深さは、カバープレートの厚さを調整することによって選択することができる。試料ボリュームは、上部カバープレートに形成された丸い穴と、プレート材料と試料流体に対して有効な接触角とによって画定されたウェルで入れることができる。圧力差が装置にわたって付与されるとき、試料ボリュームはウェルにおいて基板を通って引かれ、底部カバープレートに形成された丸い開口で基板からぶら下がった小滴として現れる。
【００４９】
プレートを形成する材料は従来公知の材料、例えば、マイクロタイタープレートを形成する材料であってもよい。プレートの材料は、基板からの信号の検出を隠さない。
【００５０】
分析結果は、基板の面を見ることによって読むことができる。これは従来方法で実施することができる。
【００５１】
本発明による装置は、例えば、装置の異なるウェルにおける異なる分析物を調べることによって、同時に多くの分析物を検出するために使用することができる。装置は、例えば、各ウェルにおける異なる試料に対して同様の分析を実施することによって多くの試料を選別するのに用いてもよい。
【００５２】
基板に結合された結合物質は、核酸プローブ、抗体、抗原、レセプター、ハプテン、及び、レセプター用のリガンドから成る群から選択する。
【００５３】
本発明による装置が使用できる分析は、ハイブリダイゼーション、免疫測定法（イムノアッセイ）、レセプター／リガンド分析等による塩基配列決定を含んでもよい。
【００５４】
装置はＤＮＡ塩基配列情報を得るために用いられるとき、大きな列の領域を備え、各領域は、第１の結合物質として、異なる塩基対配列のオリゴヌクレオチドプローブを備える。装置における各ウェルの基板は、スポット状のアレイを備えることができ、各スポットは異なる結合物質を備えている。一の装置は多くのウェルを有することができるので、多くのアレイを一の装置に配置することができ、又は、アレイは異なるウェルにわたって分割できる。
【００５５】
（部分的に）未知の塩基配列を有するＤＮＡ若しくはＲＮＡフラグメントを含む試料を基板に接触するようにすると、特定のハイブリダイゼーションパターンが生じる。このパターンからＤＮＡ／ＲＮＡの塩基配列情報を導出することができる。このような“ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定”は従来周知である（例えば、Fodor, S.P.A.らによるScience 251, 767-773(1992)やSouthern, E.M.らによるNucleic Acids Res. 22, 1368-1373(1994)を参照されたい）。
【００５６】
本発明による装置は、多数の分析物のために、血液のような生体試料を選別するために使用してもよい。アレイは、例えば、結腸、ブドウ球菌、肺炎等に対して特別のオリゴヌクレオチドプローブを備えた領域から成ってもよい。生体試料は、欧州特許出願ＥＰ０．３８９．０６３に記載されているように準備することができる。この試料は基板に接触するようにすれば、その結果のハイブリダイゼーションパターンは、例えば、適当な光学マーカーと組み合わせたＣＣＤカメラを用いて読むことができる。
【００５７】
バクテリアに対する選別の他に、装置は、例えば、ＨＩＶ及びＨＣＶウィルス等の異なる特殊型の分類やウィルスの検出に適している。ウィルス分類が潜在的ドラッグ抵抗を決定するのに決定的であってもよい。通常、それには、ウィルスＲＮＡに単一点状変異を検出する能力を要する。
【００５８】
装置は、サンドイッチ型免疫測定法を実施するのにも適している。この場合には、第２の抗体を結合される分析物に結合するのに用いられるのが好ましく、各分析物に対する第２の抗体は、第３のラベルがされた抗体によって認識される。これは、第２及び第３の抗原が異なる種類のから導かれ、かつ、他の種類の抗体に対しては第３の抗原があげられるならば、実現される。各特別の分析物に対する第２の抗体をラベル化することは避けられる。
【００５９】
装置は、GeysenらによるProc.Natl.Acad.Sci.USA 81, 3998-4002（1984）に開示された“ペップスキャン（pepscan）”を実施するのにも適している。この場合には、基板の異なる領域に付く第１の結合物質は、異なる塩基配列のアミノ酸を構成する。基板は特定の分析物を含む液体に接触するようにされると、異なるアミノ酸塩基配列に対する分析物の特別の親和性を示すような反応パターンを生じる。
【００６０】
結合物質は基板に共有結合するのが好ましい。
【００６１】
これによって、基板からの結合物質の損失が最小になる。有機化合物の金属酸化物への共有結合は、例えば、Chu.C.Wら（J. Adhesion Sci.Technol., 7, 417-433(1993))及びFadda.M.Bら（Biotechnology and Applied Biochemistry, 16, 221-227(1992)）が開示した方法を用いることによって、周知である。
【００６２】
基板は、好適にはアルミニウム酸化物から成る電気化学的に製造した金属酸化物膜であるのが好ましい。
【００６３】
本発明はさらに、本発明の方法を実施するための装置に関する。
【００６４】
本発明による装置は：
−装置の少なくとも一のウェルに制御された量の流体を付加する手段と、
−各ウェルにおいて、基板に制御された圧力差を付与し及び／又は十分長い時間の間維持する手段と、を備えている。
【００６５】
装置は、装置の回りの温度を制御する手段も備えるのが好ましい。装置は、各ウェルにおいて一定の温度を保証するために装置を中に配置するインキュベータを備えてもよい。本発明による装置は、ウェルに制御された試料流体を付加することができる。試料流体をウェルに塗布する手段として、装置は、異なる各ウェルに液体を加えるために基板上を移動することができるピペットを備える。装置は、移動可能でかつ異なるウェルに向くことができる一のピペット、又は、特に各ウェル用に異なるピペットを備えてもよい。流体を塗布する手段は、試料流体溜め及び洗浄流体溜まり等に接続してもよい。各ウェルに加える流体の量を制御することができ、調整することができるように、装置を構築すべきである。装置は、プログラマブルコントローラは合致する試料ボリュームを計算することができることをもとに、装置に関連パラメータを提供することができる必要なプログラマブルコントローラを備えるのが好ましい。
【００６６】
装置は、装置に圧力差を付与する手段を備えてもよい。
【００６７】
圧力差はプログラマブルユニットによって調整してもよい。
【００６８】
装置は、一度必要な入力、例えば、試料及び基板についての詳細を入力したら、全自動で厳密な圧力差及び試料流体量で分析を実施してもよい。
【００６９】
装置に圧力差を付与することができるように、それを容器全体をカバーとして配置してもよい。圧力差を付与する手段はこの場合、容器の圧力を変化させることによって作動しもよい。
【００７０】
容器を、開閉できる流体出口に接続すると、その出口を介して容器からどんな液体も取り出すことができるので便利である。
【００７１】
装置は、各ウェルにおいて基板の上面からの信号を読むことができるリーダーを備えるのが好ましい。
【００７２】
リーダーは、分析を完全に実施したときに信号を読んでもよいが、分析中に信号の成長を保存するのに用いてもよい。この場合、分析物と結合物質との間の反応は、流体が基板を抜けて、基板の下に小滴としてぶら下がるときにはいつでも、膜の上面から信号を読むことによって基板から抜ける流れを変更する間、連続してモニターしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】   流体が、負の圧力が付与されるまで、どのように膜の上部で球形状の小滴を形成するかを示した図であり、小滴は装置から吸い込まれている。その結果、小滴の形状および膜を抜ける均一の流れが効果的に混合する。
【図２】   圧力の反転がどのように工程を反転されるかを示した図であり、結局、膜の上部に小滴がある。
【図３】   装置の関連パラメータが、広がる前に、最大の小滴サイズを決定するのを示した図である。
【図４】   関連パラメータが、自重のために、小滴が装置から落ちる前に、最大の小滴サイズを決定するのを示した図である。
【図１】
0003801916.tif 000008
【図２】
0003801916.tif 000009
【図３】
0003801916.tif 000010
【図４】
0003801916.tif 000011