(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共反応物含有試料における分析物分子を検出するための微細組立された装置であって、
（ａ）転化用要素、
（ｂ）前記転化用要素の上面全体に接触し、前記分析物および共反応物を、前記転化用要素によって検出することのできる反応生成物へ転化する触媒作用を及ぼすことのできる少なくとも１つの触媒が含有された支持マトリックスを備えている第１層、
（ｃ）前記第１層の外端面又は内端面に接触して隣接しており、前記分析物分子および共反応物を前記第１層へ移送することのできる第２層、および
（ｄ）これらの第１層および第２層に接触して覆っており、共反応物を透過させることはできるが前記分析物分子を実質的に透過させることはできない層として設けられ、該層を貫通して伸長するように微細組立され、前記分析物の前記第１層への移送を可能にする少なくとも１つの開口を有する第３層、を備えている微細組立された装置。
【請求項２】
第２層が、第１層の周囲を越えて延びている請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項３】
前記第３層における少なくとも１つの開口が、第１層まで延びている請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項４】
開口が、第３層の平面上にある請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項５】
開口が、第２層の周囲内にある請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項６】
第２層における開口が、少なくとも０．０１マイクロメートル×１．０マイクロメートルである請求項５に記載の微細組立された装置。
【請求項７】
前記第３層における少なくとも１つの開口が、第２層の表面まで延びている請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項８】
前記第３層に複数の開口を備えている請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項９】
複数の開口が、実質的に円形である請求項８に記載の微細組立された装置。
【請求項１０】
開口の直径が、０．５マイクロメートル〜１００マイクロメートルである請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項１１】
前記開口の直径が、２マイクロメートル〜１０マイクロメートルである請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項１２】
前記開口の直径が、４．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートルである請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項１３】
開口が、長方形である請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項１４】
開口が、１マイクロメートル〜２０マイクロメートルの短辺と、１０マイクロメートル〜３０００マイクロメートルの長辺との大きさを有している請求項１３に記載の微細組立された装置。
【請求項１５】
開口が、３マイクロメートル〜１２マイクロメートルの短辺と、５０マイクロメートル〜２０００マイクロメートルの長辺との大きさを有している請求項１３に記載の微細組立された装置。
【請求項１６】
開口が、５マイクロメートルの短辺と、１０００マイクロメートルの長辺との大きさを有している請求項１３に記載の微細組立された装置。
【請求項１７】
複数の開口が、実質的に環状である請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項１８】
第２層の表面まで延びる複数の開口を備えている請求項７に記載の微細組立された装置。
【請求項１９】
第１層は、マトリックス成分が、タンパク質物質、ゼラチン、ハイドロゲル、親水性有機ポリマーおよびポリビニルアルコールからなる群から選択され、かつ、光活性物質が、重クロム酸塩、塩化第二鉄、スチリルピリジニウム塩およびスチルビゾニウム塩からなる群から選択された光形成可能な物質を含んでなる請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項２０】
第２層は、マトリックス成分が、タンパク質物質、ゼラチン、ハイドロゲル、親水性有機ポリマーおよびポリビニルアルコールからなる群から選択され、かつ、光活性物質が、重クロム酸塩、塩化第二鉄、スチリルピリジニウム塩およびスチルビゾニウム塩からなる群から選択された光形成可能な物質を含んでなる請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項２１】
触媒が、１つの酵素又は酵素の組合せである請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項２２】
１つの酵素又は酵素の組合せが、グルコースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチナーゼおよびクレアチニナーゼコレステロールエステラーゼからなる群から選択された請求項２１に記載の微細組立された装置。
【請求項２３】
第２層が、光形成可能なゼラチン又はポリビニルアルコールの層を含んでなる請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項２４】
第３層が、シリコーンコポリマー、ポリウレタン、アセチルセルロース、シロキサン−非シロキサンコポリマー、テトラフルオロエチレンポリマー、有機ネガ型フォトレジスト、有機ポジ型フォトレジスト、ポリイミド又は光形成可能なポリイミドからなる群から選択された請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項２５】
共反応物が酸素である請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項２６】
分析物分子が、グルコース、クレアチン、コレステロール、ラクテート、ピルベート、サルコシン又はビリルビンからなる群から選択された請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項２７】
第１層が、０．０１マイクロメートル〜２ミリメートルの厚さを有し、第２層が、０．０１マイクロメートル〜２ミリメートルの厚さを有し、第３層が、０．０１マイクロメートル〜２ミリメートルの厚さを有している請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項２８】
触媒反応が、電気化学的に検出可能な反応生成物を作り出す請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項２９】
電気化学的に検出可能な反応生成物が、酸素、過酸化水素、レドックスメディエーター、二酸化炭素、水素イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、アンモニアイオン、カルシウムイオン、フッ素イオンからなる群から選択された請求項２８に記載の微細組立された装置。
【請求項３０】
転化用要素が、電流測定型、電位差測定型又は電気伝導度測定型の電極である請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項３１】
触媒反応が、光学的に検出可能な反応生成物を作り出す請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項３２】
転化用要素が、光検出器である請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項３３】
第２層が、第１層を完全に覆い、部分的に覆い、又はその端部に当接している請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項３４】
第２層が、１以上の干渉化学種を非干渉化学種に転化するための１以上の試薬を含有している請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項３５】
第１層に直接接触していない第２層の部分が、１以上の干渉化学種を非干渉化学種に転化するための１以上の試薬を含有している請求項１に記載の微細組立された装置。
【請求項３６】
１以上の試薬が、アスコルビン酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチナーゼ、カタラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼからなる群から選択された請求項３４および３５に記載の微細組立された装置。
【請求項３７】
酸素含有液体試料における分析物分子を検出するための微細組立された平板状装置の製造方法であって、
平坦な表面に転化用要素を微細組立し、
酵素および支持マトリックスを備え、該酵素が前記転化用要素で検出することができるように前記分析物および酸素を転化することのできるものである第１層を、前記転化用要素の上面全体に微細組立し、
分析物分子および酸素の双方を透過させ第１層へ移送することのできる第２層を前記第１層の外端面又は内端面に接触させて隣接するように微細組立し、
酸素を透過させることはできるが前記分析物を透過させることはできないポリマーを含んでなる第３層を前記第１層および第２層に接触させて上方に設定し、
前記第３層を覆う光形成可能な層を設定し、
前記光形成可能な層における所定位置に幾何学的に制御された１以上の開口を形成するためのパターンを有するマスクを通して前記光形成可能な層を露光し、
前記パターンを現像し、
前記分析物を前記第１層へ移送することのできる、所定位置に幾何学的に制御された１以上の開口を有する第３層を形成するために、前記光形成可能な層を、前記第３層までエッチングできるエッチング剤に接触させること、を含んでなる微細組立された平板状装置の製造方法。
【請求項３８】
第１層は、マトリックス成分が、タンパク質物質、ゼラチン、ハイドロゲル、親水性有機ポリマーおよびポリビニルアルコールからなる群から選択され、かつ、光活性物質が、重クロム酸塩、塩化第二鉄、スチリルピリジニウム塩およびスチルビゾニウム塩からなる群から選択された光形成可能な物質を含んでなる請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第２層は、マトリックス成分が、タンパク質物質、ゼラチン、ハイドロゲル、親水性有機ポリマーおよびポリビニルアルコールからなる群から選択され、かつ、光活性物質が、重クロム酸塩、塩化第二鉄、スチリルピリジニウム塩およびスチルビゾニウム塩からなる群から選択された光形成可能な物質を含んでなる請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
酵素又は酵素の組合せが、グルコースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチナーゼおよびクレアチニナーゼコレステロールエステラーゼからなる群から選択された請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
第３層が、シリコーンコポリマー、ポリウレタン、アセチルセルロース、シロキサン−非シロキサンコポリマー、テトラフルオロエチレンポリマー、有機ネガ型フォトレジスト、有機ポジ型フォトレジスト、ポリイミド又は光形成可能なポリイミドからなる群から選択された請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
分析物分子が、グルコース、クレアチン、コレステロール、ラクテート、ピルベート、サルコシン又はビリルビンからなる群から選択された請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
酸素含有液体試料における分析物分子を検出するための微細組立された平板状装置の製造方法であって、
平坦な表面に転化用要素を微細組立し、
酵素および支持マトリックスを備え、該酵素が前記転化用要素で検出することができるように前記分析物および酸素を転化することのできるものである第１層を、前記転化用要素の上面全体に微細組立し、
分析物分子および酸素の双方を透過させ第１層へ移送することのできる第２層を前記第１層の外端面又は内端面に接触させて隣接するように微細組立し、
酸素を透過させることはできるが前記分析物を透過させることはできない光形成可能な第３層を前記第１層および第２層に接触させて上方に設定し、
所定位置に幾何学的に制御された１以上の開口を形成するためのパターンを有するマスクを通して前記光形成可能な層を露光し、
前記分析物を前記第１層へ移送することのできる、所定位置に幾何学的に制御された１以上の開口を有する第３層を形成するために、前記パターンを現像すること、を含んでなる微細組立された平板状装置の製造方法。
【請求項４４】
第１層は、マトリックス成分が、タンパク質物質、ゼラチン、ハイドロゲル、親水性有機ポリマーおよびポリビニルアルコールからなる群から選択され、かつ、光活性物質が、重クロム酸塩、塩化第二鉄、スチリルピリジニウム塩およびスチルビゾニウム塩からなる群から選択された光形成可能な物質を含んでなる請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
第２層は、マトリックス成分が、タンパク質物質、ゼラチン、ハイドロゲル、親水性有機ポリマーおよびポリビニルアルコールからなる群から選択され、かつ、光活性物質が、重クロム酸塩、塩化第二鉄、スチリルピリジニウム塩およびスチルビゾニウム塩からなる群から選択された光形成可能な物質からなる請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
酵素又は酵素の組合せが、グルコースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチナーゼおよびクレアチニナーゼコレステロールエステラーゼからなる群から選択された請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
第３層が、シリコーンコポリマー、ポリウレタン、アセチルセルロース、シロキサン−非シロキサンコポリマー、テトラフルオロエチレンポリマー、有機ネガ型フォトレジスト、有機ポジ型フォトレジスト、ポリイミド又は光形成可能なポリイミドからなる群から選択された請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
分析物分子が、グルコース、クレアチン、コレステロール、ラクテート、ピルベート、サルコシン又はビリルビンからなる群から選択された請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
【０００２】
本発明は、血液などの流体に存在する分子（分析物）の検出に関するものである。より詳しくは、本発明は、電流測定型触媒ベースセンサーを用いた生体外での有機分子の検出に関するものである。本発明の具体的な実施形態においては、微細組立方法により形成されかつ新規な装置設計の備わったセンサーは、血液および他の体液の中に存在するグルコース、ラクテート、コレステロール、ピルビン酸塩、サルコシン、ビリルビンおよびクレアチニンが含まれるさまざまな分子の検定を行うために用いることができる。
【０００３】
（発明の背景）
【０００４】
さまざまな有機分子のレベルについて血液などの体液を検定することは、疾病状態の治療に有用である。たとえば、真性糖尿病は血糖値の調整不良によることを特徴とする疾病である。この疾病のうち、成人発症型糖尿病が含まれる軽度なものの伝統的治療には、食餌療法と運動療法とが含まれていた。しかしながら、より重度の場合には、インシュリンの投与が必要である。インシュリン投与の１つの欠点は、インシュリンショックのおそれであり、これは、故意でない過剰投薬による血糖値の急激な減少（グルコース不均衡）によって起きる。しかしながら、インシュリンショックは、グルコース不均衡の最も重度の発現にすぎない。慢性グルコース不均衡（過剰投薬および過少投薬の双方による）の重大さは、広く文書に記載されており、また、血管やさまざまな体器官を損傷することを含んでいる。四肢の血行不良と同様に、失明が一般的な症状である。
【０００５】
血糖値を正確に測定すれば、患者へのインシュリン投与量を調整することができるであろうし、また、慢性グルコース不均衡の影響を防止することができるであろう。グルコース測定を試みた従来技術の一例は、米国特許第３，５４２，６６２号に開示されたようなグルコースセンサーである。この装置では、酵素含有膜が、検定を受ける流体と第１酸素センサー電極との間に置かれる。酵素を含有しない同様の膜が、その流体と第２参照酸素センサー電極との間に置かれる。その酵素含有膜を通る酸素拡散のある部分は、その酵素により触媒作用を受けたグルコースとの等モル反応によって使い果たされ、それゆえ、第１酸素センサー電極による検出には利用することができない。膜が酵素を含有しない第２の参照酸素センサー電極によって酸素の濃度が求められる。この濃度は、酵素によって促進された反応のないときに検出されたと思われる。これら２つの電極によって検出された酸素の差はグルコース濃度を示している。
【０００６】
この装置の問題点は、血液中の酸素およびグルコースの値が化学量論的な値よりも小さいということである。特に、酸素の量は、グルコースをすべて変化させるのに必要な量よりも少ない。したがって、そのようなセンサーは、酸素の制約を受けることになり、また、高いグルコース濃度では正確に反応しないものになるおそれがある。
【０００７】
グルコースおよび酸素の値を化学量論的なバランスにするために、また、それによって、血液中に認められる全範囲のグルコース濃度にわたって正確な結果をもたらす装置を作るために、酵素層へ到達するグルコースの量を酸素に比べて減らすようなセンサーを設計することが提案された。このことは、グルコースよりも酸素をかなり多く透過させることのできる膜層をもたらすことで、理論的には達成されるであろう。以下でいっそう詳しく説明する米国特許第４，６５０，５４７号によれば、このような概念についての一般的説明がもたらされる。
【０００８】
しかしながら、このようなアプローチを実施することは、膜の透過性を正確かつ再現可能に調整することができないという従来技術のために、これまで困難であった。そのような正確な調整がなければ、酵素層へ到達するグルコースフラックスを充分に減らすことができないであろう。たとえばアスコルビン酸塩や尿酸塩のような干渉分子の存在によっても問題の起きるおそれがある。腎機能を測定するのに用いられるクレアチニン値を求めることは、これらの干渉物の排除が要求される分析物の一例である。
【０００９】
米国特許第４，９３３，０４８号は、イオン交換のための開口が残るハイドロゲル層を覆って微細組立（製造）された（microfabricated)、水透過性でイオン不透過性の膜に関するものである。この’０４８号特許の図２には、イオン不透過性層を超えて延びるハイドロゲル層を備えることで開口の形成された構造が示されている。これに代えて、イオン不透過性層は、下にある電極の周囲を超えて形成された孔のあるハイドロゲル層の全体を覆うものでもよい（第７欄第１行）。この孔はレーザー穿孔法又は他の方法によって形成してもよい。電極から距離をおいて開口が形成されており、この小さい開口の機能は、インピーダンスの低い電気分解の接続部をもたらすことである。
【００１０】
微細組立されていない、すなわち「マクロ」電極を用いているグルコースセンサーは知られている。たとえば、ユー．・フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｕ）およびピー．・アベル（Ａｂｅｌ，Ｐ）の「人工内部臓器のアメリカ社会における商取引」（Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｏｒｇａｎｓ）１９８２年、第２８巻、第２４５〜２４８ページ（フィッシャーら）、ダブリュー．リーワルド（Ｒｅｈｗａｌｄ，Ｗ）の「プフリューゲル記録集」（Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈｉｖ）１９８４年、第４００巻、第３４８〜４０２ページ、米国特許第４，４８４，９８７号、第４，５１５，５８４号および第４，６７９，５６２号、そして英国特許出願第２，１９４，８４３号を参照されたい。しかしながら、これらの文書には、薄膜製造法の見地については何も説明されていない。
【００１１】
フィッシャーらの文書には、機械的に穿孔されたテフロン（登録商標）膜の備わった、微細組立されていないグルコースセンサーが開示されている。グルコースは、酸素がそのテフロン（登録商標）を通過することのできる穿孔を通ってだけ入ることができ、したがって、酵素層における化学量が調整されるとともに、その反応が直線状になる。穿孔の寸法をどのようにして最適化又は調整するかについては教示がない。このフィッシャーらの文書は微細組立の使用についてもまた言及していない。東独特許第ＤＤ２８２５２７号は、この刊行物に相当するように思われるが、そこに発明者としてフィッシャーの名前はない。
【００１２】
米国特許第４，４８４，９８７号は、親水性マトリックスの中に疎水性領域があって、グルコースが親水性マトリックスを透過することができるものの疎水性領域を透過することができず、酸素が双方の領域を透過することができるような層をもたらすという思想に基づいた、直線状にされたグルコースセンサーに関するものである（図１の記載を参照されたい）。図４に示す代わりの実施形態では、疎水層には、グルコース分子が通過することのできる、間隔をおいて配された小さい開口が含まれている。しかしながら、’９８７号特許には、それらの開口の寸法又は位置の調整をどうするかについての教示はまったく、また微細組立についての言及はない。
【００１３】
米国特許第４，６５０，５４７号には、親水性酵素含有層の上に疎水性ガス透過膜が配され、その親水層の周囲すなわち周縁端の厚さ面だけが試料にさらされているグルコースセンサーが開示されている（図５）。グルコースは、その周囲だけでその親水層に入ることができ、また、その層の表面に平行に拡散することができるのに対して、酸素は、その疎水層の表面全体を横断して供給することができる（第６欄第３行）。
【００１４】
「分析化学」（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ）１９８５年第５７巻第２３５１ページによれば、白金ワイヤ電極とガス透過性円柱状コーティングとの間の隙間が酵素ゲルで満たされている関連の円柱状装置を作るための教示がもたらされている。しかしながら、微細組立については教示がまったくない。米国特許第４，８９０，６２０号は、一対のセンサーでの示差測定に基づいた同様の構造および方法に関するものである。移植可能なものは米国特許第４，７０３，７５６号に開示されている。
【００１５】
ラクテートおよびクレアチニンに関しては、センサーの文献は比較的少ない。「臨床化学」（Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ）１９８３年第２９巻第５１ページには、過酸化水素の製造に関連する３つの酵素を用いる電流測定型クレアチニンセンサーが提案されている。この文書にも、一方のセンサーによりクレアチンが測定され、他方のセンサーによりクレアチンとクレアチニンとが測定される示差測定が含まれている。これらのセンサーは、アセチルセルロース−グルタルアルデヒド法を用いて作られた。「分析化学」（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ）１９９５年第６７巻第２７７６ページには、そのクレアチニン酵素を電極の上に固定するための電子重合についての教示がある。「分析化学会報」（Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ）１９９６年第３２５巻第１６１ページには、ポリ（カルバモイル）スルホン酸ハイドロゲルが用いられている。上記の諸文書のどれにも、微細組立の使用に関する教示はない。しかしながら、電極上に酵素ゲル層を作るための微細分散については、「分析化学会報」（Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ）１９９６年第３１９巻第３３５ページに開示されている。
【００１６】
米国特許第５，２００，０５２号および第５，０９６，６６９号で例示された分析物センサーの最近の進歩は大きいにもかかわらず、その技術には、微細組立方法の改良と分析物フラックスのより大きい調整との必要性が残されている。その技術には、センサー測定における干渉分子の影響を減らす又は取り除くための必要性がさらにある。
【００１７】
アイスタット社（ｉ−ＳＴＡＴ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に譲渡された米国特許第５，２００，０５１号に記載された、微細組立されたセンサーによるグルコースの測定には、酵素層を覆うために、シリコーンコポリマーから作られた薄くて切れ目のない分析物弱化層（ＡＡ層）が用いられている。この層によれば、酸素は自由に透過することができるがグルコースはあまり透過することができない膜がもたらされる。これによって、血液中に認められたグルコース濃度の全範囲にわたって直線状の反応が可能になる。’０５１号特許から明らかなように、酸素は、血液中に一般に存在するレベルが低いものであるにもかかわらず、酵素反応を維持するためには、化学量論的な量だけ必要である。このような目標はこの膜を用いることで達成される。’０５１号特許には、第１２欄第５７行から始まり、いっそう詳しい説明は第３８欄第１９行から始まる、微細組立された分析物弱化層の一般的性質に関する考察が含まれている。ＡＡ層のエッチング処理は、第５８欄第５行から始まって考察されている。グルコースを測定するための開口した周囲のある構造は’０５１号特許の図７Ａおよび図８Ａに示されている。しかしながら、グルコースの移動はポリシロキサンコポリマー層を通して起きる。
【００１８】
全体的に微細組立されたセンサー、すなわち、薄膜技法と微細製造法とによって均一に量産されたセンサーは、’０５１号特許より以前の臨床的設定では有用性が示されなかった。’０５１号特許では、商業的に実用可能なバイオセンサーの量産に伴う複雑さの程度は、当業者がかつて知覚したものよりもいっそう手に負えないものであることが示された。主に関係するのは、存在する商業的な微細組立製造方法に関連した、本来的には厳しい物理的および化学的な処理の両立性であった。
【００１９】
エレクシオン（Ｅｌｅｃｃｉｏｎ）による記事（「エレクシオン，エム．エレクトロニクス」（Ｅｌｅｃｃｉｏｎ，Ｍ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）１９８６年６月２日、第２６〜３０ページ）には、マイクロセンサーに関する技術のそのときの電流状態が記載されており、特定のイオン、ガスおよび生物学的物質の検出を含む研究の活動領域についての簡単な言及がある。電界効果トランジスター（ＦＥＴ）の分野における進歩は注目すべきものであり、現在の製造方法についての問題および規制が考察されている。
【００２０】
現在の臨床的設定において、開業医は、全血などの複雑な生物学的流体における１以上の成分の分析を一般に必要とすることに留意するのは重要である。このような分析には、器具の汚染を防止し又はそれに続く測定を簡単にするために、現在、濾過および遠心などの全血のある量の処理が必要である。血液試料は分析が行われる遠隔の中央研究所へ送られることがよくある。したがって、患者および医師は、たいていの場合、何時間も時には何日も利用することのできない価値ある情報を奪われることになる。もし、希釈されない試料についての分析が行われ、また、器具又はセンサーがリアルタイム測定を遂行するのに利用可能なものであれば、実質的な利点が予想されるのは明らかであろう。これは、米国特許第５，０９６，６６９号（アイスタット社に譲渡された）に記載された注意箇所血液分析システムを使用することにより達成することができる。
【００２１】
米国特許第５，２００，０５１号および第５，０９６，６６９号で例示された化学センサー技法の最近の進歩は大きいにもかかわらず、その技術には、微細組立方法の改良と分析物フラックスのより大きな制御との必要性が残されている。センサー測定における干渉分子の影響を減らすか、又は取り除くための技術的なさらなる必要性がある。
【００２２】
（発明の開示）
【００２３】
したがって、本発明の１つの特徴は、分析物の拡散速度すなわちフラックスを正確に制御（調整）することのできる化学センサーを提供することである。
【００２４】
本発明の別の特徴は、拡散フラックス速度調整のために１以上の開口のある層を備え、かつ、酵素層へ入る共反応物および分析物の化学量論比を制御するための化学センサーを提供することである。
【００２５】
本発明の別の特徴は、出力特性が、試料中の共反応物濃度によって制限されることがなく、かつ、センサーの応答が、試料中に一般に認められる分析物濃度の全範囲にわたって基本的に直線状であるセンサーを提供することである。
【００２６】
本発明の別の特徴は、使い捨てであって、乾燥状態で貯蔵することができ、校正物質の流体に接触すると急速に湿る化学センサーを提供することである。
【００２７】
本発明のさらに別の特徴は、物理的な大きさ（寸法）および出力特性の双方に関して装置から装置へ高度な整合性をもって製造することのできる化学センサーを提供することである。
【００２８】
本発明のさらに別の特徴は、微細組立された開口と、分析物分子と相互作用することのできる触媒（酵素であってもよい）を含有した層との間に挟まれ、選択された分析物分子を透過させることができる性質と、幾何学的に制御され微細組立された拡散層又は拡散隔膜が備わった化学センサーを提供することである。
【００２９】
本発明のさらに別の特徴は、干渉物の化学種が酵素層へ到達する前にそれを特別にふるい落とす層の備わった化学センサーを提供することである。
【００３０】
本発明の別の特徴は、使い捨てであって、試験用血液試料の使い捨てカートリッジの中に臨床でかつ遠隔位置で組み入れることのできる化学センサーを提供することである。
【００３１】
本発明のさらに別の特徴は、電気化学的光学技法および、たとえば音響センサーなどの、実質的に平坦な組立にとって扱いやすい他の感知用技法が組み入れられる化学センサーを提供することである。
【００３２】
本発明のさらに別の特徴は、上記化学センサーの製造方法を提供することである。
【００３３】
これらの特徴および、以下でいっそう詳しく記述される他の特徴は、たとえば酸素のような共反応物も含有される液体試料における分析物分子を検出するために微細組立された装置によって達成される。この装置は、転化用要素と、この転化用要素の表面に接触する第１側部を有し、前記分析物および共反応物を、前記転化用要素によって検出することのできる反応生成物へ転化する触媒作用を及ぼすことのできる少なくとも１つの酵素が含有された支持マトリックスを備えている第１層と、この第１層に接触し、前記の分析物分子および共反応物を移送することのできる第２層と、この第１層および第２層を覆っているとともに、前記共反応物を透過させることはできるが前記分析物分子を実質的に透過させることはできない第３層であって、その分析物の第１層への調整された移送を可能にする、第３層を貫通して伸長する微細組立された少なくとも１つの開口を有する第３層とを備えている。
【００３４】
本発明を完全に理解するためには、次の詳細な説明を図面とともに読むべきである。
【００３５】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
【００３６】
本発明は、さまざまな流体における構成成分（分析物）を測定するのに有用な、全体に微細組立された化学センサーに関するものである。以下の詳細な説明の大部分は血液などの生物学的流体に認められる分析物を測定するための化学センサーの使用に関するものであるが、本発明には非生物学的用途におけるセンサーの使用も同様に包含される、ということを理解すべきである。同様に、「分析物」という用語は、分散液を含む血液の中に含まれ又は溶かされたイオン形および非イオン形の双方の化学種すなわち分子を包含するように広く解釈するべきである。用語「化学センサー」および「バイオセンサー」は、この明細書において交換可能に用いられる。
【００３７】
本発明の微細組立方法によれば、再製造性と載置（上張り：オーバーレイ）構造の大きさ的な特徴に制御を与える方法で、平坦なウェハーを覆う複数の薄膜と関連構造とが設定される。本発明では、そのような再製造性と大きさ的な制御とは、化学センサーの量産のためのウェハーレベルで実現された。ここでの化学センサーは、生物学的に活性の巨大分子と、いっそう容易に検出できる化学種へ、選択された分析物分子を転化するのに必要な他の試薬とを組込む化学センサーである。
【００３８】
本発明は、新規な電気化学的検定方法と、目的の生物学的化学種（分析物）の存在および／または濃度を決定するのに有用な、全体として微細組立された新規なバイオセンサーとに関するものでもある。本発明は、直接検出可能な電気化学的な酸化又は還元を受けないが、電気活性な又は光学的に検出可能な化学種の濃度変化を作り出す基質転化剤、一般には酵素、との反応を受ける基質又は分析物に関するものでもある。これらの変化は測定されて、目的の分析物の濃度に比例して関連付けられる。加えて、本発明は、そのセンサーを作るための方法に関連している。
【００３９】
本発明の、全体として微細組立された化学センサーには複数の構成要素が含まれている。次は、本発明の化学センサーを形成するための一般的説明である。
【００４０】
転化用要素が、実質的に平坦な表面、一般にはシリコンウェハー、又は光学的に透明な物質に形成される。光学的検出に基づくバイオセンサーについては、その転化用要素は、他の層が加えられる光学的に透明な表面であってもよい。励起波長を供給しかつ光検出器をそのような表面に取り付けるための手段は従来技術でよく知られている。たとえば、電流測定型、電位差測定型および電気伝導度測定型などの電気化学的検出に基づくバイオセンサーについては、これらの基本的なセンサーを微細組立し又は要素を平坦な表面へ転化するための手段は、米国特許第５，２００，０５１号に開示されており、それは参照によって全体としてこの明細書に組み入れられる。そして、追加の構造は、結果として生じた転化用要素の上に設立される。その追加の構造は、干渉する化学的種に対する隔膜として作用し、一方で目的の検出可能な小さい化学的部分の移送を可能にする選択透過性層、又は半透過性固体被膜を含んでいてもよい。これらの検出可能な化学的部分は、典型的には電気的に活性の分子であり、従来技術で知られた低分子量のイオン種、酸素、過酸化水素および小さいレドックスメディエーターを含んでいてもよい。これに代えて、検出可能な化学的部分は、一般に酵素検定に用いられかつ従来技術でよく知られた染料又は光学的に検出可能な化学種であってもよい。
【００４１】
その半透過性固体被膜は、基本的なセンサーに感光性を与えて予め選択されたイオン種（たとえばアンモニアイオン）にすることのできる物質、化合物又は分子をさらに備えていてもよい。もっとも注目すべきは、本発明に記載された支持マトリックスであり、このマトリックスには、所定の分析試料における特定の分析物を転化用要素で検出可能なかつ／または定量的に測定可能な化学種に転換するための主要な手段を構成するさまざまな生物活性分子を支持するのに必要な物理的および化学的性質が備わっている。その技法は、前記マトリックスを、全体として微細組立されたバイオセンサーにおけるある所望の領域に集中させ、又はパターン形成させることが開示されている。このバイオセンサーは、広範囲の生物活性分子を受け入れる万能性と同様に、バイオ層の容量的性質に対する最適な制御をすることができる。
【００４２】
加えて、本発明は、このバイオセンサーの特定の実施形態において、試料中に高濃度で存在する選択された分析物化学種の移送に対する隔膜として機能する載置構造として作用する物質を開示するものでもある。このような分析物隔膜（ＡＢ）層では、定められた寸法で特定箇所に配された開口であって、調整された分析物の拡散フラックスを可能にする開口の存在を通して、広範囲の分析物濃度にわたって直線状のセンサー応答が可能になる。さらにまた、シロキサン−非シロキサンのコポリマーからなるのが好ましい、載置されたＡＢ層によれば、下にある構造に直接接触して邪魔になりあるいはそれを汚し、また、そのバイオセンサーの信頼性を偶発的に減らす結果となる、きわめて大きい分子又は試料における他の汚染成分を排除することができる。ＡＢ層を形成するための適切な物質は、米国特許第５，２００，０５１号に記載されており、その中に記載されたさまざまなシロキサン−非シロキサンのコポリマーを含んでいる。これらのコポリマーに加えて、さまざまなポリウレタン、アセチルセルロース、テトラフルオロエチレンポリマー、有機ネガ型フォトレジスト、有機ポジ型フォトレジスト、ポリイミドおよび光形成可能なポリイミドを用いてもよい。
【００４３】
そのＡＢ層が適切な構造および組成であれば、それは、ガス透過可能な膜としても機能することができる。本発明の一つの実施形態では、そのようなガス透過可能な膜には、ごく小さい分子だけが通過することができるという実際的な利点がある。これらの分子は、分析物分子が転化用要素において検出することのできる化学種に転換される反応における共反応物として作用することができる。
【００４４】
本発明のＡＢ層は、基質ウェハー又は介在構造の上に設定される。その介在構造は、容量的、位置的および幾何学的な制御を受け、その制御は、本発明の全体にわたる微細組立方法における他のステップ、及び自動化されたウェハーレベルのバイオセンサーの量産の概念と、互換可能なものである。
【００４５】
上で言及されたＡＢ層からかなり離れるが、分子量反応型透過膜として機能することのできる半透過性固体被膜は、本発明の方法によって設定することのできるいくつかの層の間にある。選択透過性層とも称されるこの半透過性固体被膜の組成および最終厚さに左右されるが、所定のしきい値を超える分子量を有する分子がそのような膜に入りまた膜を通して拡散するのを効果的に排除することができる。この選択透過性層の機能および実用性を一般的に例示すると、約１２０以上の分子量を有する分子は、約５〜約１０ナノメートルの厚さを有する固体被膜によって効果的にブロックされる。排除された分子の大きさにわたって、また、その固体被膜を通って拡散することのできるいっそう小さい分子の移送速度にわたって調整の度合いを変化させることで、約２〜約５０ナノメートルの範囲の厚さを有する固体被膜を得ることができる。ある種の物質では、これらの選択透過性層は、１ナノメートルほど薄くてもよく、１００ナノメートルほど厚くてもよい。
【００４６】
電流測定型グルコースバイオセンサーの好ましい実施形態では、イリジウムの層がシリコンウェハーの上にスパッタされ、次いで、確立された微細組立方法を用いてパターン形成され、転化用要素としての電極（直径２００マイクロメートル）が形成された。その後、そのイリジウム電極を覆って、過酸化水素の移送を可能にする選択透過性層が、参照によりその全体がこの明細書に組み入れられる米国特許第５，２１２，０５０号に従ってパターン形成された。そして、光形成可能な重クロム酸ゼラチンと酵素グルコースオキシダーゼとの混合物がそのウェハーの上にスピンコートされ、米国特許第５，２００，０５１号の教示に従って、約１．０マイクロメートルの厚さの層をその電極を直接覆ってパターン形成された。次いで、第２ゼラチン拡散チャンネル（すなわち、厚さが約１．０マイクロメートルの層）がパターン形成された。このチャンネルは、部分的に酵素層を覆い、酵素層の周囲を５０マイクロメートルだけ越えて延びている。そして、シロキサン−非シロキサンのコポリマーから形成された厚いＡＢ層がそのウェハーの上にスピンコートされ、そして、米国特許第５，２００，０５１号に開示された方法に従ってパターン形成され、最初の２層を取り囲む層が設定された。
【００４７】
しかしながら’０５１号特許に記載された実施形態とは異なり、そのＡＢ層の厚さ（たとえば約１．０マイクロメートル）は、この層を通して検出可能なグルコースの透過を直接排除するためには充分である。しかしながら、ＡＢ層はまだ自由に酸素を透過することができる。次いで、重クロム酸ゼラチンから作られたキャップ層が、’０５１号特許に記載されたのと同様の方法で設定された。ただし、マスクについては、ＡＢ層における特定の位置に形成されるべき開口を設けるために、新規な設計が用いられた。このＡＢ層が’０５１号特許に開示された標準方法でエッチングされると、グルコースが通過することのできる拡散隔膜層の上方の領域（しかし、酵素層のすぐ上方の領域ではない）におけるＡＢ層に小さい開口（たとえば５マイクロメートルの直径）が形成された。好ましくは、この開口の大きさは、少なくとも約０．０１マイクロメートル×１．０マイクロメートルであり（長方形）、円形の場合には約０．５マイクロメートル〜約１００マイクロメートルの直径を有している。望ましくは、この直径は約２マイクロメートル〜約１０マイクロメートルである。長方形開口では、短辺が約１マイクロメートル〜約２０マイクロメートル、長辺が約１０マイクロメートル〜約３０００マイクロメートルになる。長方形開口の寸法は、短辺が約３マイクロメートル〜約１２マイクロメートル、長辺が約５０マイクロメートル〜約２０００マイクロメートルであるのが望ましい。好ましい実施形態では、長方形開口の寸法は約５マイクロメートル×１０００マイクロメートルである。
【００４８】
この開口は、その厚さが上記の直径と同様に変化することのできる環形であってもよい。
【００４９】
ある環境では、拡散層の一部に、たとえばアスコルビン酸塩および尿酸塩などの特定の干渉物分子を排除することのできる１以上の酵素も含まれているのが望ましい。たとえば、その拡散層にアスコルビン酸オキシダーゼ又はウリカーゼなどを組み入れることができる。
【００５０】
本発明のバイオセンサーは、銀−塩化銀照合電極とともに、電流滴定的に操作することができる。この照合電極は、装置の外部にあるか、又は米国特許第５，２００，０５１号に開示されたように、イリジウム電極の近傍に組み入れられる。微細組立されたセンサーを活性化させて水性試料および全血試料において信頼できるデータを求めるための手段は、米国特許第５，１１２，４５５号に開示されており、それは全体参照によってこの明細書に組み入れられる。一般的に、これには、照合電極のあるセンサーの反応を校正流体および試料流体の両方と比較すること、信号測定値を関連付けること、およびその後にその信号関係に基づいて試料流体における分析物化学種の濃度を決定することが含まれている。ここで記載した装置によれば、糖尿病患者からの試料に認められたグルコース（分析物分子）の濃度の全範囲（およそ１〜３０ミリモル）にわたって一般にごく低い酸素（共反応物）濃度（およそ５０ミリモル）を有する静脈全血において、信頼できるグルコース測定値が得られる。
【００５１】
これらの新しい装置では、開口はｘ−ｙ次元の一方だけ又は両方においてミクロン大であるのが実際的である。したがって、開口はたとえば、５マイクロメートルの円形小孔、寸法５マイクロメートル×１０００マイクロメートルの長孔、又は５マイクロメートルの幅で１０００マイクロメートルの周囲のあるリングにすることができる。加えて、開口は、転化用要素のすぐ上方に又は転化用要素の近傍に設けることができまたは、ＡＢ層をパターン形成して拡散層の外側周囲に露出端を残すことで形成することができる。
【００５２】
別の案は、ｚ−ｘ次元又はｚ−ｙ次元に開口を作ることである。これは、ＡＢ層をパターン形成して第２層の周囲に露出端を残すことで形成することができる。これにより、第２層の高さ（厚さ、ｚ次元）を開口の一次元で調整することができ、露出した周囲を他の次元で調整することができる。第２層を調整された厚さ範囲０．０１マイクロメートル〜２マイクロメートルでウェハーの上へスピンコートすることができるので（これは微細組立技術でよく知られている）、この方法を用いることで、ｚ−ｘ平面およびｚ−ｙ平面に、０．０１マイクロメートルｚ次元および１．０マイクロメートルｘ次元と同じほど小さく、実質的に長方形の開口を組み立てることが可能である。これには、分析物分子の触媒層へのフラックスを調整するための手段が設けられている。開口における特定の寸法は、当業者によって決定することができ、それはとりわけ、所望の分析物フラックスとその反応の化学量論との関数である。
【００５３】
これらの幾何学における正確な寸法調整は、微細組立を用いてのみ達成することができる。共反応物透過可能で分析物透過不可能なＡＢ層として作用するために、シロキサン−非シロキサンコポリマーの代わりに、ネガ型およびポジ型の有機フォトレジスト、ポリウレタン、アセチルセルロース、ポリイミドおよび光形成可能なポリイミドなどを用いることができる。これらの物質が光形成可能である箇所では、開口は露出および現像によって直接形成することができる。そうでないときには、シロキサン−非シロキサンコポリマーに関するパターン形成法が前記のように必要である。
【００５４】
重クロム酸ゼラチン、ゼラチン含有塩化第二鉄、および米国特許第５，２００，０５１号に記載された他の光活性体に加えて、他のさまざまなハイドロゲル物質、たとえば、酵素層および拡散（干渉物ふるい分け）層の双方を形成するための光形成可能なポリビニルアルコールを用いることも可能である。たとえばクレアチナーゼなどの、ある種の酵素については、このようなポリビニルアルコールによって、高い活量レベルを維持することが可能になる。
【００５５】
バイオセンサーに適用することのできる一般的理論は、従来技術でよく知られている。たとえば、米国特許第４，４８４，９８７号には、酵素層におけるそれらへの容積濃度に関する方程式が開示されている。’９８７号特許とは異なり、本発明の実施形態には、分析物拡散層が含まれている。ゼラチン層又はポリビニルアルコール層における典型的な分析物分子についての拡散係数Ｄが１０−６ｃｍ−２ｓ−ｌであれば、拡散長さｌは、ｌ＝（２Ｄｔ）１／２から概算することができる。この式によれば、これらの分子はその層の第１および第２平面において約１０マイクロメートル拡散することができることが示唆されている。この拡散係数は、その層におけるクロスリンクの度合い、たとえば、多かれ少なかれ、そのマトリックスにおけるフォトイニシエーター又はフォトクロスリンカーによって、またはグルタルアルデヒド又は別のクロスリンカーでのその後の処理によって調整することができる。空隙率を増大させかつ拡散係数を増大させるための方法は、パターン形成の前に、そのマトリックスにアルブミン又は他の球状プロテインを添加することである。このようにして、拡散層の長さ、厚さおよび組成を変化させることにより、共反応物のレベルが低いときでも、この装置が分析物分子に対し拡大された直線状の出力反応を示す反応時間と程度とを調整することが可能になる。たとえば、転化用要素を覆う、開口層と酵素層との間における１０〜２００マイクロメートルの平坦な拡散層を用いるのが有利であることがわかった。従来技術によって適用されたアプローチとは異なり、商業的な利用性のために必要な再製造性を考案するために、正確な調整と高水準の装置とを達成することは、微細組立方法を用いることによってのみ可能である。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態は図に示されている。図１には、第１実施形態が示されており、ここで、バイオセンサーは、数字１０で全体として示されている。転化用要素１２が平坦面１４を覆って配されており、酵素層１６がその転化用要素１２を覆って位置している。酵素層１６および転化用要素１２を取り囲んで拡散層１８があり、拡散層１８には端面２０が備わっている。酵素層１６および拡散層１８を覆って分析物隔膜層２２が配されている。この分析物隔膜層２２における光形成用開口に用いられたキャップ２４が層２２を覆って配されている。グルコース又はクレアチニンなどの分析物は、酸素と同様に、拡散層１８を通して端面２０を通して拡散する。しかしながら、分析物隔膜層２２では、酸素（および同様な寸法の他の分子）だけが通過することができ、分析物を含むいっそう大きい分子は通過が阻止される。したがって、酵素層１６への酸素拡散は、分析物の拡散が起きるときよりもかなり広い表面積にわたって起き、それによって、分析物濃度に比べて低い血液サンプルの酸素濃度は補償される。そして、酸素および分析物は、酵素層１６では実質的に化学量論的濃度にある。ＡＢ層２２には、酵素層１５および／または拡散層１８の表面を分析物にさらす１以上の開口（図示略）が含まれている。
【００５７】
図１のバイオセンサーの変形例は図２に示されている。この実施形態では、図１１の拡散層１８は干渉物除去層３０に置き換えられている。干渉物除去層３０には、分析を干渉するポテンシャルの備わった分子と反応する１以上の酵素又は触媒が含まれている。この干渉物除去層３０は、拡散層１８の場合と同様の物質から構成することができ、それによって、拡散層と干渉物除去との二重の機能がもたらされる。
【００５８】
好ましい実施形態では、図２のセンサーにおけるさまざまな要素は、Ｈ２Ｏ２電気酸化のための電気触媒として機能する貴金属電極が含まれるセンサーと、たとえばアスコルビン酸塩および尿酸塩のような、過酸化水素よりも大きいレドックス活性種がその電極表面に到達するのを防止するように機能するガンマアミノシラン層と、非電気化学反応性分析物分子を過酸化水素に転化するための酵素層と、拡散層と、その酵素層の中へ直接透過するグルコースおよびクレアチニンなどの分析物分子を取り除くが、酸素および水を自由に透過させる、約０．１〜２マイクロメートル厚さからなるＡＢ層とを備えている。標準的なグルコース法と同様な方法でキャップ層が設けられるが、特定箇所に形成されるべき開口のためにマスクが設けられる。そのＡＢ層が標準的な方法でエッチングされると、ＡＢ層に、分析物分子が通過することのできる開口が作られる。したがって、このような設計では、酵素層における基質の拡散は、ＡＢ層における開口の数および寸法、そして拡散経路の長さによって調整される。
【００５９】
図３には、拡散層４０および干渉物除去層４２の両方が含まれるという点以外は図１および図２と同様の実施形態が示されている。
【００６０】
図４の実施形態は、分離された拡散層および干渉物除去層が含まれるという点で図３と同様なものである。しかしながら、この実施形態では、干渉物除去層５０は、ＡＢ層５２およびキャップ５４を越えて延びているとともに、キャップ５４の上面５６の一部を覆っている。
【００６１】
図５の実施形態では、ＡＢ層６０は酵素層６２を覆っている。キャップ６６およびＡＢ層６０を通してピンホール６４が設けられ、基質が拡散層６８に接触することができるようにされている。この実施形態では、電極６６および酵素層６２は、拡散層６８から外側に位置している。
【００６２】
図６には、拡散層が干渉物除去層７０に置き換えられているという点以外は図５と同様の実施形態が示されている。
【００６３】
図７には、図５および図６と同様に構成されかつ干渉物除去層８０および拡散層８２が組み入れられている実施形態が示されている。
【００６４】
図８によれば、キャップ９２を覆って配された干渉物除去層９０と、酵素層９６の端部を覆うためのＡＢ層９４とがもたらされる。
【００６５】
この方法のパラメーターは、米国特許第５，２００，０５１号に記載されたものに広げられる。米国特許第５，２１２，０５０号では、白金電極およびイリジウム電極（直径２００〜３６０マイクロメートル）が、標準ガンマアミノシラン法とともに用いられている。グルコースオキシダーゼが、重クロム酸塩化されたゼラチン層に、約０．１〜２．０マイクロメートル厚さで固定される。標準的なＡＢエッチング時間は、開口の過少エッチング又は過剰エッチングが起きないように、すなわち開口直径の正確な調整がもたらされるように、最適なものにされた。
【００６６】
クレアチニンの決定は、干渉物を除去するためのふるい分け層が必要な分析物のよい例である。クレアチニンの測定では、クレアチニンを過酸化水素へ転化するために、３つの酵素が利用される。これらの酵素は、それぞれ以下の反応の触媒作用を及ぼすＣＮＨ（クレアチニナーゼとも称されるクレアチニンアミドハイドロラーゼ）、ＣＲＨ（クレアチナーゼとも称されるクレアチンアミジノハイドロラーゼ）およびＳＡＯ（サルコシンオキシダーゼ）である。
クレアチニン‥‥＞クレアチン＋Ｈ２Ｏ
クレアチン‥‥＞サルコシン＋尿素
サルコシン＋酸素‥‥＞グリシン＋ホルムアルデヒド＋Ｈ２Ｏ２
【００６７】
血液には当然、クレアチニンおよびクレアチンが含まれるという事実によって、反応は複雑になる。したがって、クレアチニンが正確に測定される前に、内生のクレアチンを取り除く必要がある。当業者は、酵素層へ到達するクレアチニンはそれがどのようなものであっても、クレアチニンの決定において間違ったバックグランド信号を作り出すであろうということを理解するであろう。この問題は、クレアチニンセンサーの一部としてクレアチンふるい分け層を作ることで解決される。
【００６８】
たとえば、図３に示された装置は、クレアチンに対する拡散層と干渉物除去層とが備わったクレアチニンセンサーである。その機能は、内生クレアチンを不干渉性物質に転化させることで、その内生クレアチンの酵素層への拡散を防止しようとすることである。この層には、酵素ＣＲＨ、ＳＡＯおよびカタラーゼ（ＣＡＴ）が含まれる。カタラーゼは、過酸化水素を水と酸素とに転化させ、それによって、過酸化水素が転化用要素に拡散するのを防止する。酵素のこのような組合せによれば、クレアチニンは、そのふるい分け層を通って反応することなく拡散し酵素層へ到達することができる、ということに留意すべきである。
【００６９】
この例では、両方の層の酵素は、光形成可能なポリビニルアルコール耐性スチリルピリジニウム群（ＰＶＡ−ＳｂＱ）に固定される。この酵素層は、下にある白金電極の周囲の内部に限定されている。これに対して、拡散層と干渉物除去層とは、その電極の周囲を越えて（２０〜５０マイクロメートル）延びている。そして、ＡＢ層（約１〜２マイクロメートル）が、これらの層を覆ってスピンコートされている。このＡＢ層の厚さは、クレアチニン（およびクレアチン）がその酵素層の中へ透過するのを排除するのに充分であるが、酸素および水がまだ自由に透過することができるような厚さである。そして、このＡＢ層は、それがふるい分け層を完全には取り囲まず、それによって、クレアチニン（およびクレアチン）のための拡散経路をもたらすように、パターン形成されている。完全なクレアチニン微細組立方法は添付の表に記載されている。
【００７０】
別の実施形態では、たとえば、ＡＴＰ、グリセロール、レドックスメディエーター分子、有機染料分子などの酵素以外の試薬は、信頼できるセンサー動作のために、酵素又はふるい分け層に必要である。これらの物質は、酵素又はふるい分け層のマトリックス蒸着法の一部として導入し、同層が作られた後でＡＢ層が蒸着される前に注入し、微細組立された開口が形成された後にそれらの開口を通して吸着させ、又はそのセンサーに試料が接触するのに先立って補正過程の一部としてそれらの開口を通して吸着させることさえできる。
【００７１】
ラクテートの転化は酵素ラクテートオキシダーゼによる触媒作用で行われ、白金電極で検出される過酸化水素が作られる。
【００７２】
好ましい実施形態では、白金電極（３６０マイクロメートルの直径）は、酵素層（３６０マイクロメートルの直径、ポリビニルアルコール耐性スチリルピリジニウム群およびラクテートオキシダーゼ）の上にパターン形成されたガンマアミノシラン層（上記したもの）でコーティングされている。拡散層（直径５６０マイクロメートル、厚さ１．０マイクロメートル）は、酵素層の上にパターン形成されており、その周囲を越えて延びている。シロキサン−非シロキサン層が、同心の環状開口（幅４０マイクロメートル）以外で全体構造を取り囲んでパターン形成されている。この開口によって、ラクテートが、酵素層の周囲を越えて拡散層の４０マイクロメートル部分へ入ることができる。図１１には、生理学的試料に認められるラクテート濃度の範囲に対応する水性試料ではこのセンサーの反応が基本的に直線状であることが示されている。図１２には、全血試料において商業的に確立されたラクテート検定に相関関係のある結果がもたらされることが示されている。
【００７３】
この開示に基づいた他の関連する実施形態は、当業者にとって明らかであるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明における１つの実施形態の概略図であって、基質（分析物分子）は端面拡散層を通過するときだけ酵素層に入ることができるのに対して、酸素（共反応物）はガス透過層を通ることができる構造を示す。
【図２】  基質は端面干渉物除去層を通過するときだけ酵素層に入ることができるのに対して、酸素はガス透過層を通ることができる別の実施形態を示す概略図である。
【図３】  基質は端面干渉物除去層および端面拡散層を通過するときだけ酵素層に入ることができるのに対して、酸素はガス透過層を通ることができる別の実施形態を示す概略図である。
【図４】  本発明における１つの実施形態の概略図であって、基質は端面干渉物除去層および端面拡散層を通過するときだけ酵素層に入ることができるのに対して、酸素はガス透過層を通ることができる構造を示す。この実施形態では、干渉物除去層はガス透過層を越えて延びている。
【図５】  基質はガス透過層におけるピンホール又は長孔状開口および拡散層を通過するときだけ酵素層に入ることができるのに対して、酸素はガス透過層を通ることができる別の実施形態を示す概略図である。
【図６】  基質はガス透過層におけるピンホール又は長孔状開口および干渉物除去層を通過するときだけ酵素層に入ることができるのに対して、酸素はガス透過層を通ることができる別の実施形態を示す概略図である。
【図７】  基質はガス透過層におけるピンホール又は長孔状開口、干渉物除去層および拡散層を通過するときだけ酵素層に入ることができるのに対して、酸素はガス透過層を通ることができる別の実施形態を示す概略図である。
【図８】  基質はガス透過層におけるピンホール又は長孔状開口および拡散層を通過するときだけ酵素層に入ることができるのに対して、酸素はガス透過層を通ることができる別の実施形態を示す概略図である。
【図９】  図３の実施形態におけるクレアチンおよびクレアチニンの双方に対する反応を示すグラフであり、干渉物ふるい分け層がクレアチンを除去するために設計されている。生理学的範囲にわたる等モルのクレアチンおよびクレアチニンの濃度に対する反応は、基本的に直線状であり、クレアチンの約９０％がふるい落とされたことが示されている。そのふるい分け層における長さと酵素負荷とが増大すると、クレアチンのふるい分け時にさらに改善され、したがって、この装置のクレアチニンへの特異性が増大することができることに留意すべきである。
【図１０】  患者から得られた実際の血液試料における、微細組立されていない商業的に利用可能なクレアチニン検定に対する、図３の実施形態のための比較例を示すグラフである。これらのデータによれば、新しい装置は等価の結果をもたらすので臨床的に用いることができることが示されている。これらのデータは、米国特許第５，１１２，４５５号の教示に従って得られたものである。
【図１１】  本発明のラクテートセンサーの反応を示すグラフである。
【図１２】  全血試料におけるラクテート検定に対するラクテートセンサーの相関関係のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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