(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシチンをホスホリパーゼＡ２で部分加水分解してリゾレシチンを製造する際、反応液が、レシチンと水非混和性溶剤と水からなる水中油型乳液であることを特徴とするリゾレシチンの製造方法。
【請求項２】
レシチンをホスホリパーゼＡ２で部分加水分解してアシル基が飽和脂肪酸であるリゾレシチンを製造する際、反応液が、二つのアシル基が飽和脂肪酸であるレシチンと水非混和性溶剤と水からなる水中油型乳液であることを特徴とするアシル基が飽和脂肪酸であるリゾレシチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リゾレシチンの新規な製造方法に関する。リゾリン脂質は、食品、医薬の分野で、培養細胞に対する生化学的機能が注目されている。特に、アシル基が飽和脂肪酸であるリゾレシチンは空気酸化に対する安定性が高いことから利用が期待されており、本発明は効率の良いリゾレシチンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リゾレシチンの製造法として以下の方法が知られている。
（１）天然物由来の牛脳、豚脳、鶏卵、大豆ホモジネートなどのリン脂質にパンクレアチンを作用させてリン脂質／酵素複合体を形成させ、次に、これをジエチルエーテルまたはジエチルエーテルとエタノールの混合溶媒（容量比；５０：１または２５：１）に抽出した後、反応させてリゾレシチンを得る方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第１９５巻、１９９〜２０６ページ］。
（２）リン脂質１重量部に対して、水分を０．１〜１．０重量部添加し、ホスホリパーゼを用いて、リン脂質を加水分解する方法［特開昭６３−４４８９３号］。
（３）ホスフォコリン含有率の高いリン脂質をホスホリパーゼＡ２または、ホスホリパーゼＡ２を含有する複合酵素を用いて加水分解するにあたり、該リン脂質に対して１〜４倍モルの水（０．０２〜０．０９重量部）の存在下、有機溶媒中で反応する方法［特開平２−１１３８９１号］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
（１）の方法は、溶剤としてジエチルエーテルを用いているので、これに対するリン脂質／酵素複合体の溶解性は極めて低く、工業的な製造には適さない。またジエチルエーテルは引火性が極めて高いことも問題となる。さらに、文献中には溶剤をクロロホルムとしたとき反応が進まなくなることが記載されている。
（２）の方法は、原料を天然物由来の牛脳、豚脳、鶏卵、大豆ホモジネートなどのレシチンとしたときの方法である。しかし、この方法の適用は限られ、二つのアシル基が飽和脂肪酸であるレシチンはゲル状または固体状であるから、これらのレシチンを原料とすると酵素が基質であるレシチンに均一に混合できず、反応が局部的にしか進行しなくなる。
（３）の方法は、リン脂質を有機溶剤溶液中に溶解させ、微量の水の存在下に酵素を固体状に分散させて有機溶剤中で反応する方法である。したがって、酵素を反応終了後に容易に濾別できる。しかし、この反応では溶剤の量を増やすと、希釈によりレシチンが酵素と接触し難くなるため、反応の効率が低下する。特に、二つのアシル基が飽和脂肪酸であるレシチンを原料としたときには、溶解に多量の溶剤を使用することになるために、反応が殆ど進行しなくなる。
本発明の目的は、従来の製造方法の問題点を解決し、リゾレシチンの効率の良い製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、レシチンを油／水界面に濃縮させて効率良く部分加水分解するリゾレシチンの製造方法である。
本発明の第一の発明は、レシチンをホスホリパーゼＡ２で部分加水分解してリゾレシチンを製造する際、反応液がレシチンと水非混和性溶剤と水からなる水中油型乳液であることを特徴とするリゾレシチンの製造方法であり、また第二の発明は、レシチンをホスホリパーゼＡ２で部分加水分解してアシル基が飽和脂肪酸であるリゾレシチンを製造する際、反応液が、二つのアシル基が飽和脂肪酸であるレシチンと水非混和性溶剤と水からなる水中油型乳液であることを特徴とするアシル基が飽和脂肪酸であるリゾレシチンの製造方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明におけるリゾレシチンとは、その構成アシル基の種類が、飽和脂肪酸あるいは不飽和脂肪酸であるリゾレシチンの単体もしくは２種類以上の混合物である。具体的には、アシル基が飽和脂肪酸である１−カプロイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ウンデカノイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、 １−ラウロイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−トリデカノイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン  １−ペンタデカノイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ヘプタデカノイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ステアロイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリンなどのリゾレシチン、アシル基が不飽和脂肪酸である１−パルミトオレオイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−オレオイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、 １−リノレオイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−リノレノイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−アラキドイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−エイコサペンタノイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ドコサヘキサノイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリンの単体あるいは、それらの２種類以上の混合物が挙げられる。
【０００６】
本発明の原料となるレシチンは、例えば、その二つの構成アシル基の種類が、飽和脂肪酸である１、２−ジカプロイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジウンデカノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、 １、２−ジラウロイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジトリデカノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジミリストイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジペンタデカノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジヘプタデカノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、水素添加大豆レシチン、水素添加卵黄レシチンなどのレシチン、二つの構成アシル基の種類が飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の混合型である１−カプロイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ウンデカノイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、 １−ラウロイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−トリデカノイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ミリストイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ペンタデカノイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−パルミトイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ヘプタデカノイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ステアロイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−カプロイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ウンデカノイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、 １−ラウロイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−トリデカノイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ミリストイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ペンタデカノイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−パルミトイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ヘプタデカノイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ステアロイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−カプロイル−２−リノレノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、 １−ラウロイル−２−リノレノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ミリストイル−２−リノレノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−パルミトイル−２−リノレノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ステアロイル−２−リノレノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ミリストイル−２−アラキドノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ミリストイル−２−エイコサペンタノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン  １−パルミトイル−２−エイコサペンタノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−ステアロイル−２−エイコサペンタノ���ル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリンなどのレシチン、二つの構成アシル基が不飽和脂肪酸である１、２−ジパルミトオレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジオレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、 １、２−ジリノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジリノレノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジアラキドイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジエイコサペンタノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１、２−ジドコサヘキサノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−オレオイル−２−リノレオイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン、１−オレオイル−２−リノレノイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリンなどのレシチンが挙げられ、あるいは、それらの２種類以上の混合物が挙げられる。
【０００７】
本発明において原料とするレシチンは、構成単位の１位のアシル基がリゾレシチンのアシル基になることから目的とするリゾレシチンの種類において選択される。原料となるレシチンの純度は７０％以上、できれば９０％以上の純度が望ましい。純度が低いとき、水中油型乳液が形成できず反応が進まなくなる。
【０００８】
本発明において、水非混和性溶剤とは、水との乳化時に油／水界面を形成する溶剤であり、かつ、レシチンを溶解できる溶剤である。例えば、塩化メチル、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、塩化エチル、塩化エチレン、１，１，２−トリクロル−１，１，２−トリフルオルエタン、テトラクロルジフルオルエタン、クロルニトロエタン、ジクロルエチルエーテル、トルエン、キシレン、ベンゼン等の単独及び混合物が挙げられる。特に、塩化メチル、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、塩化エチル、塩化エチレン、１，１，２−トリクロル−１，１，２−トリフルオルエタン、テトラクロルジフルオルエタン、クロルニトロエタン、ジクロルエチルエーテル等のハロゲン系溶剤は、二つのアシル基が飽和脂肪酸であるレシチンを原料としたときも多量に溶解でき、さらに、乳化の際に油滴の粒子径の小さな水中油型乳液を得やすい点で優れている。
【０００９】
水非混和性溶剤の使用量は、レシチンの溶解性によって設計されるが、重量基準でレシチン１部に対して５〜１００倍が適している。使用量が少ないと、レシチンが充分に溶解できずに、反応液がゲル状、あるいはスラリーとなり、水中油型乳液を形成できない。また、使用量が多いと、レシチンが希釈され，油／水界面への分配が減少することにより反応が進み難くなる。
【００１０】
本発明に用いる水は、水道水、イオン交換水、蒸留水、注射用水などを挙げることができる。使用する水の量は、重量基準でレシチン１部に対して２〜２００部が適している。水の量が少ないと、水中油型乳液を形成できない。水の量が多すぎると、水相の酵素が希釈されてレシチンと接触できる割合が減少することから、反応が進み難くなる。
【００１１】
本発明において、レシチンの界面活性剤としての性質が水中油型乳液の形成に適しているため、水非混和性溶剤と水との比を調整する必要があり、その比を０．０１〜２、さらに好ましくは０．１〜１（重量比）の範囲に調整することが好ましい。水非混和性溶剤に対する水の量が多すぎると、希薄な水中油型乳液が形成されることから工業的生産には適さなくなる。水非混和性溶剤に対する水の量が少なすぎると安定な水中油型乳液を形成できなくなり、反応の効率が著しく低下する。
【００１２】
本発明において、反応液中の油滴粒子の粒径は、レシチン、水非混和性溶剤および水の使用量、または乳化時の条件により支配されるものであるが、その平均粒径は２００μｍ以下、好ましくは１００μｍ以下、さらに好ましくは１０μｍ以下の範囲が好ましい。粒子径を小さくすると、油／水界面の面積が増加し反応は進み易くなる。一方、粒径を小さく維持するためには撹拌あるいは分散時に過大なエネルギーを与えることになり、レシチンや酵素を著しく劣化させることになる。このため、粒径が１μｍ以下の水中油型乳液を作製することは工業的には適さない。
【００１３】
本発明において、水中油型乳液は、レシチン、水非混和性溶剤及び水を機械的に乳化して得られる。乳化は、通常の撹拌機あるいは乳化機によってなされる。このとき、超音波照射機、高圧型乳化機も利用できる。反応液は、三者の混合物を直接に乳化しても構わないが、まずレシチンの非水混和性溶剤溶液を作製し、次にこの溶液中に水を加え、あるいは、この溶液を水に加えた後に乳化して作製することが均一な反応液を得るうえで好ましい。
【００１４】
本発明において、酵素の活性を高める目的で、水に塩化カルシウム、塩化マグネシウムを加えてもよい。その添加量は、水相における濃度が０．１ｍＭから２Ｍの範囲であることが好ましい。また、ＰＨを調整する目的で水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムを加えてもよく、さらに、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などの緩衝液を用いてもかまわない。そのＰＨは、４〜１１の範囲であり、６〜９が好ましい。
【００１５】
本発明において、酵素（パンクレアチン）は、豚膵臓由来であり、ホスホリパーゼＡ２活性を示すものである。その添加量は、リン脂質１ｇ当たり１００〜５０００国際単位、好ましくは５００〜２０００国際単位が適している。酵素は、乳化前に加えてもよいが、高圧型乳化機など乳化に過大なエネルギーを与える場合はその劣化を避けるため、分散後に加えることが好ましい。
反応は系が平衡となり、酵素反応が終了するまで行うことが好ましく、反応時間は５〜４８時間が好ましい。
【００１６】
【実施例】
実施例１〜６および比較例１〜４
５００ｍＬの酵素反応槽に、１０ｇの１，２−ステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＳＰＣ、純度：９９．９％）を０〜２０００ｇの塩化メチレンに溶解した溶液（リン脂質／溶剤＝１／０〜８０重量比）を加えた。これに、４０，０００国際単位の豚膵液由来のホスホリパーゼＡ２（パンクレアチン）を含む１〜２０００ｇの１０ｍＭ  ＣａＣｌ2水溶液（リン脂質／水＝１／０．０５〜１６０重量比、ＰＨ９．０）を加え、撹拌機にて乳化した。
乳化の状態を、肉眼と光学顕微鏡にて観察した。実施例１〜６に示す組成の反応液は白濁した乳液であり、粒径が１０〜５００μｍの油滴が水に分散している様子が顕微鏡下に観察された。比較例１〜４に示す組成の反応液は乳液とはならず、粉体，ペーストあるいは酵素懸濁液であった。
反応液を攪拌しながら４０℃の温度に維持し、反応を進行させた。２４時間後には、原料のＤＳＰＣは、酵素反応により加水分解し、目的のリゾレシチンである１−ステアロイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＭＳＰＣ）が生成した。その反応率をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により調べた。結果を表１に示す。
【表１】
0003791058.tif 000002
【００１７】
実施例１〜６に示すように反応液が水中油型乳液である場合、いずれも反応率も高く（６０〜９５％）、効率よくＭＳＰＣを製造できることがわかる。
比較例１〜４に示すように、反応液が粉体、ペースト、あるいは溶剤中での酵素懸濁液の場合には反応率が２０％以下と低いことがわかる。
【００１８】
実施例７
５００ｍＬの酵素反応槽に、１０ｇの１，２−ステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＳＰＣ、純度：９９．９％）を１００ｇの塩化メチレンに溶解した溶液を加えた。これに、４０、０００国際単位の豚膵液由来のホスホリパーゼＡ２（パンクレアチン）を含む１０００ｇの１０ｍＭ  ＣａＣｌ2水溶液（ＰＨ９．０）を加え撹拌機にて乳化した。
撹拌後の状態を、光学顕微鏡にて観察したとき、粒径が１０〜１００μｍの油滴が水に分散している様子が観察された（平均粒径  ４０μｍ）。
次に、この反応漕を超音波バスに入れ、超音波照射して乳液をさらに分散させた。
超音波照射後の状態を、光学顕微鏡にて観察したとき、１〜１０μｍの油滴が水に分散している様子が観察された（平均粒径  ５μｍ）。この反応液を、攪拌しながら４０℃の温度に維持し、反応を進行させた。２４時間後には、原料のＤＳＰＣは、酵素反応により加水分解し目的のリゾレシチンである１−ステアロイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＭＳＰＣ）が生成した。その反応率をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により調べたところ、９５％であった。
【００１９】
実施例８
５００ｍＬの酵素反応槽に、１０ｇの１，２−ステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＳＰＣ、純度：９９．９％）を１００ｇの塩化メチレンに溶解した溶液を加えた。これに、４０、０００国際単位の豚膵液由来のホスホリパーゼＡ２（パンクレアチン）を含む１０００ｇの１０ｍＭ  ＣａＣｌ2水溶液  ＰＨ９．０）を加えた。この反応液を均一になるよう手で静かに振った。
この状態を、光学顕微鏡にて観察したとき、５００μｍ以上の油滴が水に分散している様子が観察された。
この反応液を、４０℃の温度に維持し、静置して反応を進行させた。２４時間後には、原料のＤＳＰＣは、酵素反応により加水分解し、目的のリゾレシチンである１−ステアロイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＭＳＰＣ）が生成した。その反応率をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により調べたところ、５０％ であった。
【００２０】
実施例９
５Ｌの酵素反応槽に、１００ｇの１，２−ラウリトイル−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＬＰＣ）を６００ｇのクロロホルムに溶解した溶液を加えた。これに、２００、０００国際単位の豚膵液由来のホスホリパーゼＡ２（パンクレアチン）を含む０．１Ｍトリス−１０ｍＭ  ＣａＣｌ2水溶液（４００ｍｌ、ＰＨ８．０）を加え、撹拌し乳液とした。光学顕微鏡にて観察したとき、粒径が１０〜１００μｍの油滴が水に分散している様子が観察された（平均粒径  ３０μｍ）。
反応液を攪拌しながら４０℃の温度に維持し、反応を進行させた。２４時間後には、原料のＤＬＰＣは、酵素反応により加水分解し、目的の飽和型リゾリン脂質である１−ラウリトイル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＭＬＰＣ）が生成した。その反応率をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により調べたところ、９０％であった。
【００２１】
実施例１０
５Ｌの酵素反応槽に、１００ｇの水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ）を８００ｇの塩化メチレンに溶解した溶液を加えた。これに、４００、０００国際単位の豚膵液由来のホスホリパーゼＡ２（パンクレアチン）を含む１０ｍＭ  ＣａＣｌ2水溶液（５００ｍｌ、ＰＨ９．０）を加え、撹拌して乳化した。光学顕微鏡にて観察したとき、粒径が１０〜１００μｍの油滴が水に分散している様子が観察された（平均粒径  ５０μｍ）。
反応液を攪拌しながら４０℃の温度に維持し、反応を進行させた。２４時間後には、原料のＨＳＰＣは、酵素反応により加水分解し、目的のリゾリン脂質である１−アシル−２−ヒドロキシ−sn−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＭＡＰＣ）が生成した。その反応率をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により調べたところ、９０％以上であった。
【００２２】
実施例１１
１０Ｌの酵素反応槽に、１００ｇの大豆レシチン（ＳＰＣ）を１０００ｇのクロロホルムに溶解した溶液を加えた。これに、４００、０００国際単位の豚膵液由来のホスホリパーゼＡ２（パンクレアチン）を含む１０ｍＭ  ＣａＣｌ2水溶液（１０００ｍｌ）を加えた。さらに、溶液を撹拌して乳化し、これに５Ｎ−水酸化ナトリウムを加えて、反応液のＰＨを９．０に調節した。光学顕微鏡にて観察したとき、粒径が１０〜１００μｍの油滴が水に分散している様子が観察された（平均粒径  ３０μｍ）。
反応液を攪拌しながら４０℃の温度に維持し、反応を進行させた。２４時間後には、原料のＳＰＣは、酵素反応により加水分解し、目的のリゾリン脂質である大豆リゾレシチン（ＭＳＰＣ）が生成した。その反応率をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により調べたところ、９０％であった。
【００２３】
【発明の効果】
レシチンをホスホリパーゼＡ２で部分加水分解してリゾレシチンを製造する際に、特定の反応液を水中油型乳液とする本発明の方法を用いると、効率よく製造することができる。
アシル基が飽和脂肪酸であるリゾレシチンの製造も、原料を二つのアシル基が飽和脂肪酸であるレシチンとして、本発明の方法で効率よく製造できる。