(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含んでなる、弱毒化イヌパルボウイルス(canine parvovirus)ゲノムをコードするＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号２の５９位のＧがＡ、ＣまたはＴに置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、イヌパルボウイルスゲノムをコードするＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号２の９７位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、イヌパルボウイルスゲノムをコードするＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号２の４７４５位のＴがＡ、ＧまたはＣに置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、イヌパルボウイルスゲノムをコードするＤＮＡ分子。
【請求項５】
配列番号２の４８８１位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、イヌパルボウイルスゲノムをコードするＤＮＡ分子。
【請求項６】
さらに９７位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換された請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
さらに４７４５位のＴがＡ、ＧまたはＣに置換された請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】
さらに４８８１位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換された請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項９】
さらに４７４５位のＴがＡ、ＧまたはＣに置換された請求項３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
さらに４８８１位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換された請求項３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】
さらに４８８１位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換された請求項４に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１２】
さらに４７４５位のＴがＡ、ＧまたはＣに置換された請求項６に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１３】
さらに４８８１位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換された請求項６に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１４】
さらに４８８１位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換された請求項７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１５】
さらに４８８１位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換された請求項９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１６】
さらに４８８１位のＣがＡ、ＧまたはＴに置換された請求項１２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１７】
ＡＴＣＣ寄託番号第ＶＲ２４８９号として寄託されている、ＣＰＶ−３９の６０代継代由来のウイルス。
【請求項１８】
ＡＴＣＣ寄託番号第ＶＲ２４９０号として寄託されているウイルスｖＢＩ４４０。
【請求項１９】
ＡＴＣＣ寄託番号第７５９３８号として寄託されているプラスミドｐＢＩ４４０。
【請求項２０】
請求項２〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子よりなるゲノムを含有するウイルス。
【請求項２１】
請求項１７に記載のウイルスおよび医薬上許容される担体を含んでなるワクチン。
【請求項２２】
請求項１８に記載のウイルスおよび医薬上許容される担体を含んでなるワクチン。
【請求項２３】
請求項２０に記載のウイルスおよび医薬上許容される担体を含んでなるワクチン。
【請求項２４】
請求項２１に記載のワクチンの有効量を非ヒト動物に接種することを含んでなる、イヌパルボウイルス疾患から該動物を防御する方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載のワクチンの有効量を非ヒト動物に接種することを含んでなる、イヌパルボウイルス疾患から該動物を防御する方法。
【請求項２６】
該ワクチンを筋内、皮内、静脈内または皮下経路により投与する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
該ワクチンを１０2ＴＣＩＤ50〜１０7ＴＣＩＤ50の用量で投与する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
該ワクチンを１０7ＴＣＩＤ50を越える用量で投与する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２９】
該動物が野生または家畜のイヌである請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子をベクター中にクローニングし、そして該ベクターを宿主細胞中にトランスフェクションして該弱毒化イヌパルボウイルスのマスター株を得ることを含んでなる、弱毒化イヌパルボウイルスワクチンの製造法。
【請求項３１】
該ＤＮＡがｖＢＩ４４０に由来する請求項３０記載の製造法。
【請求項３２】
該ベクターがpGEM3ZまたはpGEM5Zである請求項３０に記載の製造法。
【請求項３３】
該宿主細胞が、ノーデン・ラボラトリーネコ腎臓細胞、ミンク肺細胞、マディン−ダービーイヌ腎臓細胞またはイヌＡ７２細胞よりなる群から選ばれる請求項３０に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
１．序論
本発明は、弱毒化イヌパルボウイルス（canine parvovirus,ＣＰＶ）疾患に対する獣医学ワクチンとして使用しうる新規ＣＰＶ株に関する。さらに本発明は、獣医学ワクチンとして使用するための、かかる弱毒化ＣＰＶウイルスのゲノムＤＮＡクローンから得たウイルス株、およびその製造法に関する。
２．発明の背景
１９７８年および１９７９年に、それまで知られていなかった疾患の突然発生が多数国のイヌで観察された。イヌで見られるその疾患とネコ汎白血球減少症ウイルス（feline panleukopenia virus,ＦＰＶ）によりネコで発生した疾患またはミンク腸炎ウイルス（mink enteritis virus,ＭＥＶ）によりミンクで発生した疾患との間の比較に注目して（ＦＰＶとＭＥＶは共にパルボウイルスである）、原因微生物であるイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の同定が行われた。ＣＰＶは世界中の飼い犬および野犬集団で流行している。該ウイルスの急速な世界的な広がりは、おそらく、感染イヌの糞便中で見いだされる高ウイルス力価によるものと考えられた（Parrish, C. R., Adv. Virus Res. 38:403-450, 1990）。
２つの臨床的状態、すなわち４〜５月齢以上のイヌにおける腸疾患および３〜１６週齢の子イヌにおける心筋疾患が認められている。ＣＰＶはイヌの重篤疾患および死亡の原因となり、６月齢未満の子イヌが特に感染しやすい（Carmichaelら，Cornell Vet. 73:13-29, 1983）。
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は、一本鎖ＤＮＡの約５，０００塩基のＤＮＡゲノムを有する自律性パルボウイルスである。２個の構造遺伝子（ＶＰ−１およびＶＰ−２）および１個または２個の非構造（ＮＳ）遺伝子を特徴とする（Parrishら，J. Virol, 65:6544-6552, 1991）。
１９７８年に最初に同定されたＣＰＶの起源株（ＣＰＶ−２）は、１９７９年から１９８２年の間に抗原性および遺伝的変異体であるＣＰＶ−２ａにほとんど完全に取って代えられた。その後の抗原性変異体であるＣＰＶ−２ｂが１９８４年頃に出現し、１９８８年までに優勢なウイルス型となった。それは、米国におけるそれ以前の株の大部分と取って代わり、その結果、現在の感染イヌの９０％以上がこの株を保持している。ＤＮＡ配列分析が示すところによれば、ＶＰ１／ＶＰ２遺伝子中の配列変異が連続的な抗原ウイルス型を生じさせ、その結果、ＣＰＶ−２ａ株はＣＰＶ−２とわずか５〜６個のアミノ酸で相違するにすぎず、一方、ＣＰＶ−２ｂはＣＰＶ−２ａとわずか２個のアミノ酸で相違するにすぎなかった（Parrishら，J. Virol 65:6544-6552, 1991）。
これまでのＣＰＶ株に対する防御を誘発させるように設計されたワクチン、例えば、生ワクチン（１９８１年１２月１日付け米国特許第4,303,645号、１９８９年３月７日付け米国特許第4,810,494号）、不活化ワクチン（１９８０年３月１８日付け米国特許第4,193,991号）、異型ワクチン（１９８０年３月１８日付け米国特許第4,193,990号）、組換えサブユニットワクチン（１９９０年１１月２０日付け米国特許第4,971,793号；Lopez de Turisoら，J. Virol. 66:2748-2753, 1992）などが開発された。ＣＰＶカプシド遺伝子のバキュロウイルス（Baculovirus）発現により、ＣＰＶ−２ｂによる攻撃に対しイヌを免疫するのに使用できる中空パルボウイルスカプシドが得られた（Mazzaraら，Vaccines '87 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987, p.419-424; Salikiら，J. Gen. Virol. 73:369-374, 1992）。
異型ワクチン、不活化ワクチンまたは組換えワクチンに対する弱毒化ウイルス由来のワクチンの利点は、該ウイルスが宿主系で増殖できるため免疫応答が長時間維持されることである。
感染イヌで見られるウイルスの最も流行している形態である最も新しいＣＰＶ−２ｂ株に由来する弱毒化ワクチンは、未だ開発されていない。
３．発明の概要
ビルレントＣＰＶ−２ｂ分離株の連続継代由来の弱毒化イヌパルボウイルスを提供することが本発明の目的である。本明細書では、ＤＮＡが野生型ＣＰＶ−２ｂのものとヌクレオチド配列で相違する前記ウイルスを提供する。該弱毒化株からのＤＮＡを用いて感染性分子ＤＮＡクローンを得、今度はこれを細胞中にトランスフェクションして該ウイルスの安定なマスター株を得ることができる。該弱毒化ウイルスは、ＣＰＶ疾患予防用ワクチンとしてイヌに使用することができる。好ましい実施態様では、弱毒化ウイルスｖＢＩ４４０（ＡＴＣＣ寄託第ＶＲ２４９０号）を該ワクチンとして使用する。
４．図面の記載
図１は、完全長ＣＰＶゲノム、およびプラスミドpGEM5Z中にクローニングされた連続断片を生成するよう連結された該ゲノムのサブクローン化断片を図示する。
図２は、pBI440中に検出された、５代継代の対照ゲノムに対する配列変化の位置を図示するものであり、該ＣＰＶゲノムにおけるコーディング領域および二次構造に対する５'および３'の変化を示す。
図３は、pBI440中にクローニングされたＣＰＶ−３９の６０代継代のＤＮＡ配列を示す。
図４は、ＣＰＶ−３９の５代継代のＤＮＡ配列を示す。
５．発明の詳細な記載
本発明の１つの実施態様では、ＣＰＶ疾患に対する獣医学ワクチンとして有用なイヌパルボウイルスの新規弱毒化株を分離した。該弱毒化株のゲノムに基づく感染性分子ＤＮＡクローンを得た。それは、該弱毒化ＣＰＶ株の安定なマスター株を得るのに使用できる。
５．１．弱毒化イヌパルボウイルスの分離
本発明のこの実施態様は、野犬または飼い犬などの動物をＣＰＶに対して防御するワクチンとしてのイヌパルボウイルスの弱毒化株の分離に関する。ＣＰＶのビルレント分離株の弱毒化は、該分離株を弱毒化する突然変異が蓄積するような時間、かかるウイルスを適当な宿主細胞系中（例えば、Carmichaelら，Cornell Vet. 71:408-471, 1981を参照されたし）で連続継代することにより行う。連続継代は、ウイルス分離株による細胞系への感染、該宿主細胞からの該ウイルス子孫の回収、および該ウイルス子孫による宿主細胞への後続感染により次の継代を得ることを意味する。ＣＰＶの継代のための細胞系としては、ノーデン・ラボラトリー（Norden Laboratory）ネコ腎臓（ＮＬＦＫ）、ミンク肺細胞、マディン−ダービー（Madin-Darby）イヌ腎臓細胞、イヌＡ７２細胞、クランデル（Crandell）ネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞などが挙げられる。
ビルレントＣＰＶは、感染イヌの糞便から回収し、ついで組織培養細胞（Appelら，Vet. Rec. 105:156-159, 1979）中で増殖させてもよい。ＣＰＶの分離は、音波処理、または凍結および解凍後のウイルス精製のサイクルによる感染細胞の破壊により行ってもよい（Parrish, Virology 183:195-205, 1991）。
ＣＰＶ−２ｂに対して防御的な弱毒化株の開発に使用しうるＣＰＶ分離株としては、ＣＰＶ−３９、および当業者に公知の他の分離株（Parrishら，J. Virol. 65:6544-6552, 1991）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ＣＰＶのビルレント（病気を発生させる）株の連続継代により、弱毒化された（すなわち、感染性はあるが、病気を発生させる能力を有さない）変異体を分離する。適当な対象集団（すなわちイヌ）で継代分離株を試験して、該感染対象の臨床プロフィールを確認することにより、これらの弱毒化変異体を同定する。ある継代ウイルスがイヌに感染するが病気を発生させる能力を有さないと確認されたら、それは弱毒化されたと特徴づけられる。ついでさらに、この継代ウイルスがＣＰＶ疾患に対するワクチンとして作用する（すなわち、ビルレントＣＰＶによる攻撃に対する防御免疫を付与する）能力に関して特徴づけする。
本発明の１つの実施態様では、ビルレントＣＰＶ−２ｂ分離株をＮＬＦＫ細胞中で連続継代して該弱毒化株を誘導した。連続継代は、ＮＬＦＫ細胞に該ビルレント株を感染させ、該感染細胞を数日間インキュベーションし、該感染細胞を集め、ついで凍結および解凍してウイルスを放出させることにより行った。ついで、先の継代からのイノキュラムを、新鮮な薄く播種されたＮＬＦＫ細胞に適用して、つぎの継代を得た。各継代を同様にして行い、集めた。選択した継代の血球凝集アッセイ（ＨＡ）によりウイルスの終末点希釈を同定し、この希釈を用いて次の継代を得た。
以下に記載する本発明の実施態様では、種々の連続継代を臨床効果に関して試験した。口−鼻または皮下のいずれかの経路により、８〜３５週齢からのイヌに継代ウイルスを接種した。該感染イヌにおける食欲減退、倦怠感、体温上昇、嘔吐／下痢、リンパ球減少、体重減少および糞便放出を毎日監視することにより、継代ウイルスのビルレンス（すなわち病気を発生させる能力）を評価した。１５代継代までビルレンスが保持され、その後の継代で弱毒化が確認された。このウイルスがＣＰＶ疾患の臨床徴候を誘発する能力を示さないことより評価したところ、６０代継代が弱毒化されていた（表１、後記）［第５回パルボウイルス・ワークショップ（the Fifth Parvovirus Workshop, Crystal River, Florida, １９９３年１１月１０〜１４日）で示された抄録］。この株の連続戻し継代をイヌで行ってもビルレンスへの復帰は生じなかった。
５．２．弱毒化株からの感染性ＣＰＶクローンの構築および弱毒化株の生産
自律性パルボウイルスのＤＮＡゲノムは、トランスフェクションにより宿主細胞中に導入された場合、生産的感染を開始する能力を有する。弱毒化ウイルスの感染性ＤＮＡゲノムをベクター中へ操作して宿主細胞中へ導入し、該親弱毒化分離株と遺伝的に同一の子孫ウイルスを得る。当業者に公知の標準的なin vitro組換えＤＮＡ技術（Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, New York, 1989）を用いて、該ウイルスゲノムを運ぶように該ベクターを操作してもよい。該ゲノムを宿主細胞中へ輸送するのに使用しうるベクターとしては、pGEM3Z、pGEM5Z（Promega Corporation, Madison, WI）、および他の同様のプラスミドベクターなどが挙げられる。所望の性質（すなわち弱毒化されていること）を有するウイルスの安定なマスター株を生産してもよい。
また、ウイルスゲノムのプラスミド媒介導入によりウイルス子孫を生産させ得ることを利用して、一定の分子変化を有するウイルスを生産することができる。本発明のこの実施態様では、該ウイルスに所望の性質（例、減弱したビルレンス）を付与する改変ＤＮＡ配列を含有する安定なウイルス株を得ることができる。また、所望の配列変化を該ウイルスゲノムへ導入して該ゲノムからウイルス子孫を得、そして該ウイルス子孫を回収して同定することにより、該ウイルスの種々の性質（すなわち、抗原型、ビルレンスまたは弱毒化）に対する分子変化の影響を評価するのにこのアプローチを用いることができる。さらに、このアプローチは、他の疾患に対する免疫応答を得るために、該ウイルスにより同時輸送される該ウイルスゲノム中に挿入された非相同配列を有するウイルスを構築することに使用することができる。かかる疾患としては、イヌアデノウイルス（canine adenovirus）、イヌジステンパーウイルス（canine distemper virus）、イヌコロナウイルス（canine coronavirus）、レプトスピラ（Leptospira）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一定の分子変化を有するウイルスゲノムの構築は、当業者に公知のオリゴヌクレオチド特異的、リンカースキャン（linker-scanning）またはポリメラーゼ連鎖反応に基づく突然変異誘発技術などの標準的な技術（ZollerおよびSmith, DNA 3:479-488、1984; BotsteinおよびShortle, Science 229:1193, 1985; Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, New York, 1989, Chapter 8）を用いて行うことができる。移動のための適当なベクター中への該ゲノムの連結反応は、当業者に公知の標準的な技術により行ってもよい。ウイルス子孫の生産のための宿主細胞中への該ベクターのトランスフェクションは、カルシウム−リン酸またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、プロトプラストフュージョンなどの標準的な技術および当業者に公知の他の技術（Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）のいずれを用いて行ってもよい。
本発明の１つの実施態様では、ＣＰＶ−２ｂの６０代継代由来の弱毒化株からウイルスＤＮＡを調製しプラスミド中へクローニングして、トランスフェクションにより宿主細胞中へ移した。そのトランスフェクションされた細胞から、子孫ウイルスを生産し回収した。得られたウイルス株（ｖＢＩ４４０）は弱毒化株であることが確認された。ビルレントＣＰＶ−２ｂに対するワクチンとして、このウイルスを使用した。
５．３．弱毒化イヌパルボウイルスの配列
弱毒化表現型の基礎を確定するために、弱毒化ウイルスを分離した後、そのゲノムの配列分析を行ってもよい。これは、該ウイルスＤＮＡを配列決定し、対照ウイルスのゲノム配列に対する該弱毒化分離株のヌクレオチド変化を同定することにより行う。したがって、ビルレント株を弱毒化する分子変化を特徴づけすることができる。
本発明の実施態様では、該弱毒化ウイルス（６０代継代）から分離されたＤＮＡゲノムの配列を決定し、対照ゲノム（５代継代）と比較した。該ビルレント株と該弱毒化株との間のヌクレオチド配列変異を同定した。該弱毒化ウイルスゲノム中、５'および３'非翻訳領域中に４個のヌクレオチド改変が見いだされた（表２）。
本発明は、該対照（５代継代）野生型ＣＰＶ−２ｂの配列（配列番号２）に対する以下の配列改変の１以上を有する弱毒化ＣＰＶ−２ｂウイルスを提供する：
５９位のヌクレオチド      AまたはCまたはT
９７位のヌクレオチド      AまたはGまたはT
４７４５位のヌクレオチド  AまたはGまたはC
４８８１位のヌクレオチド  AまたはGまたはT。
本明細書中に提供する本発明の１つの実施態様では、野生型配列に対して４つの位置（配列番号１）のすべてに改変を有するウイルスゲノムを使用して、弱毒化ウイルス株を得た。他の実施態様は、弱毒化ウイルス子孫を得るための前記部位の１、２または３個の配列変化の導入を含む。かかる改変を有するウイルスゲノムは、クローン化ＤＮＡ中へのヌクレオチド変化の導入ための前記第５．２節で記載した技術のいずれかにより得ることができる。ついで、ゲノムを適当なベクター中に連結して宿主細胞中へトランスフェクションし（後記第５．２節）、ウイルス子孫を生産してもよい。
５．４．ワクチンとしての弱毒化イヌパルボウイルス
本発明は、すべての現存ＣＰＶ株（２、２ａおよび２ｂ型）による攻撃から生じる疾患からイヌを防御するためのワクチンとして使用してもよい。該ワクチンは、弱毒化ウイルス分離株であってもよいし、あるいはその代わりとして、該ワクチンは、弱毒化ウイルスの感染性ゲノムクローンから生産したウイルスよりなるものであってもよい。
該ワクチンの調製は、該弱毒化ウイルスの大規模株を組織培養中で増殖させることにより行ってもよい。あるいは、大規模ウイルス株を得るために、該弱毒化ウイルスのゲノムを含有するプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクションしてもよい。該ウイルスは、例えば、音波処理、または凍結および解凍のサイクルによる破壊により、宿主細胞から回収してもよい（Parrish, Virology 183:195-205, 1991）。
ウイルス収量の測定は、血球凝集アッセイ（Carmichaelら，Am. J. Vet. Res. 41:784-791, 1980）またはプラークアッセイ（Changら，J. Virol. 66:6858-6867, 1988）を用いることにより行ってもよい。
該ワクチンは、弱毒化ウイルス株からのアリコートであるイノキュラムよりなるものであってもよい。該ワクチンは懸濁液として調製してもよいし、あるいはその代わりに、該ワクチンを凍結乾燥させてもよい。該弱毒化ウイルスを、リン酸緩衝生理食塩水など（これに限定されるものではない）の医薬上許容される担体に懸濁させてもよい。
該弱毒化ウイルスは、ワクチン製造のための他の成分および抗原と組み合わせてもよい。該弱毒化ウイルスは、混合ワクチンを得るためにイヌアデノウイルス（canine adenovirus）、イヌジステンパーウイルス（canine distemper virus）、イヌコロナウイルス（canine coronavirus）、レプトスピラ（Leptospira）抗原など（これらに限定されるものではない）の他の抗原と組み合わせて提供されてもよい。かかるワクチンに、ゼラチン、ソルビトール、マンニトール、グルコース、スクロース、デキストラン、アルブミン、ＳＰＧＡ（Bovarnick, J. Bact. 59:509, 1950）など（これらに限定されるものではない）の安定化剤または当業者に公知の他の安定化剤を加えてもよい。
ワクチン候補の評価のための対象集団としては、野生および家畜のイヌ（野犬および飼い犬）などが挙げられる。
ワクチン投与量は、約１０2〜約１０7の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ50）であってもよい。１０7ＴＣＩＤ50を越える投与量を与えてもよい。好ましい実施態様では、該投与量は１０5ＴＣＩＤ50である。弱毒化ウイルス株の等級化された１０倍希釈を対象集団にワクチン接種し、ＨＩ力価について該動物をアッセイすることにより、最小免疫量（ＭＩＤ）を決定してもよい（Carmichaelら，Cornell Vet. 73:13-29, 1983）。
該ワクチンは、皮下、筋内、静脈内などのいくつかの非経口経路により投与してもよい。毎年のブースター注射（shot）など（これらに限定されるものではない）の反復投与を行ってもよい。
該ワクチンの安全性は、副作用が存在しないこと（すなわち、ビルレントウイルスによる攻撃前に該ワクチン投与により試験集団で生じた疾患の証拠）により判定することができる。
ワクチンにより生じた免疫応答は、接種されたイヌからの血清を血球凝集阻止（ＨＩ）力価を用いて試験することにより、アッセイすることができる（Carmichaelら，Am. J. Vet. Res. 41:784-791, 1980）。該弱毒化ウイルスに対する抗体の産生はＨＩ力価の増加と相関しており、この防御応答の生成はワクチン接種と定義される。防御は、１：４０を越えるＨＩ力価の生成と相関しうる。
該ワクチンの効力は、ビルレントＣＰＶにより攻撃された場合に、該ワクチンが対象集団に抵抗性を付与する能力により判定できる。攻撃は、ワクチン接種後ある間隔（例えば、１４日〜２０日）が経過した後で行ってもよい。該ワクチンにより得られる免疫の持続時間は、ワクチン接種された動物におけるＨＩ力価の定期的な評価により、またはビルレントＣＰＶによる攻撃およびＣＰＶ疾患の臨床的徴候の観察により判定してもよい。
本発明の１つの実施態様では、該弱毒化株（ｖＢＩ４４０）の感染性分子クローン由来のウイルスを用いて子イヌにワクチン接種した（後記第９節）。ビルレントＣＰＶによる攻撃の後、該ワクチン接種イヌは疾患徴候を明示しなかった。該ワクチン接種動物の血球凝集阻止（ＨＩ）力価は、該弱毒化ウイルスワクチンに対する血清学的応答の生成を示した。
６．実施例：弱毒化イヌパルボウイルス株の分離
６．１．方法
ビルレントＣＰＶ−２ｂに対する防御を誘発させるウイルス株を生産するために、Texas Veterinary Medical Diagnostic Laboratory（受託番号Ｃ８４１７６０７１，Ｎo２）からＣＰＶ−２ｂ分離株（ＣＰＶ−３９）を得た。この分離株は、モノクローナル抗体のパネルに対して型分類を行うことにより、ＣＰＶ−２ｂ分離株と確認された（Parrishら，J. Virol. 65:6544-6552, 1991）。該ウイルスを初めにＮＬＦＫ細胞中で５回継代してストックウイルス調製物を樹立した。
これらの実験で使用したＮＬＦＫ宿主細胞を、５％ウシ胎仔血清を含む５０％McCoy 5aおよび５０％Leibovitz L15培地の混合物中３７℃で成長させた。
ＮＬＦＫ細胞中でＣＰＶ−３９を連続継代した。ＮＬＦＫ細胞にＣＰＶ−３９を感染させ、該感染細胞を５〜７日間インキュベーションし、ついで該感染細胞を凍結および解凍してウイルス子孫を放出させることにより、連続継代を行った。ついで、これに続く継代を連続的に得るために、該細胞ライゼート（１〜２ml）からのウイルスを、新鮮な薄く播種されたＮＬＦＫ細胞に適用した。各継代を同様に行い集めた。
種々の継代において（継代３、１５、２０、２５、３５、４４、５０および６０）、該ウイルス含有物を組織培養培地中、１０倍で連続希釈し、薄く播種されたＮＬＦＫ細胞上に該希釈物を接種した。４〜５日間インキュベーションした後、該培養を凍結させ解凍し、アカゲザルマカク（rhesus macaque）赤血球のウイルス血球凝集に関して該培地を試験した（ＨＡアッセイ）。ＨＡアッセイで決定された該ウイルスの終末点希釈物を接種した培養を用いて、それぞれの場合の後続の継代を行った。
ＢＢＳ／牛血清アルブミン（ＢＳＡ）中の０．５％v/vアカゲザル赤血球懸濁液０．０５０mlが加えられているバルビトタール緩衝生理食塩水（ＢＢＳ）０．０２５mlと共にウイルス希釈物０．０２５ml／ウェルをインキュベーションすることにより、マイクロタイタープレート中で該ＨＡアッセイを行った。該プレートを振盪して混合し、４℃で放置して細胞を沈殿させた。該ＨＡ力価は、５０％以上の凝集細胞を含有する最後のウェルと判断される。
イヌにおける疾患誘導能に関して、種々の連続継代を試験した。各試験では、８〜３５週齢の２〜５匹の特定病原体除去（ＳＰＦ）ビーグル犬に１０5.5〜１０6.5の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ50）単位の継代ウイルスを口−鼻（ＯＮ）または皮下（ＳＣ）のいずれかの経路で接種した。ビルレンスは食欲減退、倦怠感、体温上昇、嘔吐／下痢および体重減少により評価し、一方、弱毒化は感染後１０日以内のこれらの徴候の減少または不存在により評価した。
６．２．結果
ビルレンスは、１５代継代（＃１５）まで保持され、２０代継代（＃２０）までに大きく減少し、一方、６０代継代（＃６０）は感受性子イヌに臨床的徴候を発生させず（表１）、弱毒化されたと特徴づけされた。非接種対照イヌは臨床的に正常のままであった。
７．実施例：弱毒化株の分子クローンからのウイルスの生産
７．１．方法
薄く播種したＮＬＦＫ細胞に感染させることにより、６０代継代からストックウイルスを調製した。該ウイルス感染細胞を３６時間培養した後、該細胞を溶解し、低分子量ＤＮＡの分離のためのHirt法を修飾して用いることにより該複製型（ＲＦ）ＤＮＡ（二本鎖）を回収した（Parrishら，Amer. J. Vet. Res. 45:2591-2599, 1984）。該回収ＤＮＡを分取アガロースゲル電気泳動により精製し（Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, New York, 1989）、該ウイルスＲＦＤＮＡを該ゲルから電気溶出により回収した（Ausubelら，前掲）。
図１に示すとおり、制限処理し単一の連続配列中に集合させることにより、該ウイルスＤＮＡゲノムをサブクローニングし、ついでプラスミドpGEM5Z中へ連結してプラスミドpBI440を誘導した。このプラスミドの１０μgをＮＬＦＫ細胞中にエレクトロポレーションして（２２０V/３３０uFにて）、該ゲノムからのウイルス感染を開始させた。
該感染性ゲノムクローンのトランスフェクションにより生産したウイルスを、凍結および解凍により、ＮＬＦＫ細胞から回収した。得られたウイルス（ｖＢＩ４４０）を、血球凝集阻止（ＨＩ）アッセイにより（後記第９節を参照されたし）型特異的モノクローナル抗体のパネルに対して試験し、原ＣＰＶ−３９からのこのウイルスの誘導を確認した（Parrishら，J. Virol. 65:6544-6552, 1991）。
８匹の９週齢ビーグル子イヌに、１０5.5〜１０6.5の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ50）単位のｖＢＩ４４０株を皮下接種して、該親ウイルス（６０代継代）の弱毒化表現型が保持されているか否かを判定した。
７．２．結果
ｖＢＩ４４０（６０代クローン化株）を接種した子イヌの臨床的分析が示したところによると、ＣＰＶ様症状が見られなかったことより、このウイルスはＣＰＶ疾患のいずれの徴候も発生させず、したがって、弱毒化されたと特徴づけることができた（表１）。この株の連続戻し継代をイヌで行っても、病気は発症しなかった。
６０代連続継代由来のウイルスをＮＬＦＫ細胞中でさらに１５代継代したところ、この時点で非血球凝集性変異体が出現した。これに対し、ＮＬＦＫ細胞中でのｖＢＩ４４０の１５代継代は明らかな表現型変異を全く示さず、このことは、該弱毒性株由来のウイルスの安定性を示すものである。
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８．実施例：クローン化弱毒化ウイルスの配列分析
８．１．方法
pGEM5Z中へクローニングされた６０代継代のウイルスＤＮＡを含有するプラスミドpBI440をM13ファージベクターmp18およびmp19中へサブクローニングし、既に記載されているプライマー（Parrishら，1991, Virology 183:195-205）を用いるジデオキシ法（Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, New York, 1989）により該ＤＮＡを配列決定した。ＣＰＶ−３９の５代継代（＃５）から調製されたＤＮＡも、pGEM5ZおよびpGEM3Z中へクローニングし、比較対照として配列決定した。
８．２．結果
６０代継代由来の弱毒化ウイルスゲノムの配列を図３に示す（配列番号１）。配列比較で用いた対照ウイルス（５代継代）の配列を図４に示す（配列番号２）。これらのゲノムの間の比較相違を表２に示す。該対照プラスミド（５代継代）中で観察されるものに対するpBI440（６０代継代）中の４個のヌクレオチド変化を同定した。５'末端での２つの変化（４７４５位および４８８１位）が非コーディング領域で生じた。また、３'末端では、５９位および９７位のヌクレオチド変化が非コーディング領域、およびその末端でパリンドローム配列により潜在的に生成したヘアピン内にあった（図２）。
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９．実施例：弱毒化ｖＢＩ４４０によるワクチン接種
９．１．方法
５匹のＳＰＦの１２．５週齢のビーグル子イヌに、１用量（１０5ＴＣＩＤ50／ml）のｖＢＩ４４０を皮下経路によりワクチン接種した。ビルレントＣＰＶ−３９による攻撃まで、２匹の対照子イヌを隔離した。攻撃はワクチン接種の２０日後に行い、３mlのイノキュラム中の１０6.2ＴＣＩＤ50単位による接種よりなるものであった。
白血球を計数するために接種前の血液サンプルを取り、攻撃後８日間、時々血液サンプルを取った。直腸温度などの疾患の徴候に関して毎日２回イヌを観察した。また、同時期に糞便サンプルを集め、各分離単位からのプール化サンプルをリン酸緩衝生理食塩水中の１０％容量の懸濁液として調製し、ついで、ＨＡアッセイを用いてビルレントウイルス放出に関して試験した。
血清学的試験のための血液を、ワクチン接種後０、７および２１日目およびビルレントＣＰＶ−２ｂによる攻撃の１０日後に得た。動物血清を集め、ＢＢＳ中１：５で希釈し、ついで５６℃で３０分間熱不活化することにより、該ワクチン接種動物の血球凝集阻止（ＨＩ）力価測定を行った。該血清に、０．０１０ml５０％パック赤血球を加え、該混合物を４℃で１時間放置した。マイクロタイターウェル中、０．０２５mlＢＢＳおよび熱不活化血清の連続希釈物（０．０２５mlから開始）を加え、ついで、０．０２５mlの希釈抗原を加えた。室温で１時間、該プレートをインキュベーションした後、０．０５０mlの０．５％ＲＢＳ懸濁液を加えた。血清なしの平行プレートを調製することにより抗原対照を調製した。すべてのプレートに衝撃を与え、４℃で４〜１６時間放置した。該ＨＩ力価は、血球凝集を完全に阻止する最高血清希釈の逆数である。
９．２．結果
ワクチン接種動物１４１１〜１４１５において観察された正常体温［表３Ａ、接種後日数（ＤＰＩ）の欄：−１、０］および正常白血球値（表３Ａ、ＤＰＩ欄：０）により示されるとおり、ワクチンｖＢＩ４４０は疾患の徴候を発生させなかった。
ビルレントＣＰＶ−３９による攻撃後の９日間、すべてのワクチン接種動物（１４１１〜１４１５）は正常体温および正常血液値（ＷＢＣおよびＬｙ／ＰＭＮ）を維持した（表３Ａ、ＤＰＩ欄：１〜９）。糞便ＨＡ力価は、該ワクチン接種動物におけるビルレントウイルスの放出を全く示さなかった。ｖＢＩ４４０によるワクチン接種はＣＰＶ−３９による攻撃に対する防御を付与したが、非ワクチン接種動物は攻撃を受けやすかった。
これに対し、該非ワクチン接種動物（１４１８、１４１９）は、攻撃後９日間の経過の５日までに体温上昇を、また４〜７日目に顕著なリンパ球減少（表３Ｂ、Ｌｙ／ＰＭＮ欄：４〜７）を、６日目に白血球減少（ＷＢＣ欄：６）を示した。ＨＡアッセイから判定したところ、４日目および５日目にビルレントウイルスの糞便放出が観察された。
表４Ａ中のＨＩ抗体力価により示されるとおり、ワクチンｖＢＩ４４０は、ビルレントＣＰＶ−３９で攻撃された５匹のワクチン接種された子イヌに血清学的防御を誘発させた。ワクチン接種動物１４１１〜１４１５に関しては、接種前レベルに対して、ワクチン接種後１週間までＨＩ力価が増加し（表４Ａ、接種後１週間）、さらに、ワクチン接種後３週間まで増加した（表４Ａ、接種後３週間）が、このことは、これに続くＣＰＶ−３９による攻撃に対する防御を与える、ｖＢＩ４４０に対する抗体が産生したことを示すものである。これに対し、非ワクチン接種動物１４１８および１４１９では、攻撃前に有意なＨＩ力価は全く検出されなかった（表４Ｂ、攻撃前）。攻撃後１０および２１日目に観察されたＨＩ力価の増加により示されるとおり（表４Ｂ）、攻撃後、非ワクチン接種動物は、疾患経過後のＣＰＶに対する抗体の産生が減少することを示した。
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１０．微生物の寄託
以下の微生物は、１９９４年１０月２８日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）, Rockville, MDに寄託されており、以下の受託番号を割り当てられている。
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本発明は、本明細書中に記載の特定の実施態様により範囲が限定されるものではない。実際、本明細書中に記載の本発明の修飾の他に種々の修飾が、以上の記載および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。かかる修飾は、添付の請求の範囲内に含まれると意図される。
本明細書中には種々の刊行物が引用されているが、これらの開示の全体を出典明示により本明細書の一部とする。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：パリッシュ，コリン  アール．
グルーエンベルグ，アレン
カーマイケル，レーラント  イー．
（ii）発明の名称：弱毒化イヌパルボウイルス
（iii）配列の数：２
（iv）住所：
（Ａ）名宛人：ペニー  アンド  エドモンズ
（Ｂ）通り名：ジ  アメリカズ  アベニュー  １１５５
（Ｃ）市名：ニューヨーク
（Ｄ）州名：ニューヨーク
（Ｆ）郵便番号：１００３６−２７１１
（ｖ）コンピューター読取り可能形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn  リリース#1.0，バージョン#1.25
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）代理人の情報：
（Ａ）代理人名：ゴードン，ジェニファ
（Ｂ）登録番号：３０７５３
（Ｃ）参照／事件番号：７９３７−００６
（ix）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話番号：（２１２）７９０−９０９０
（Ｂ）テレファックス：（２１２）８６９−８８６４／９７４１
（２）配列番号：１
配列の長さ：５０４９
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：不明
配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
起源：
生物名：パルボウイルス
配列：配列番号：１
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（２）配列番号：２
配列の長さ：５０４９
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：不明
配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
起源：
生物名：パルボウイルス
配列：配列番号：２
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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