(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）次の（ｉ）及び（ii）を含有するユニラメラリポソーム：
（ｉ）二分子膜形成性ホスファチジルコリン並びに１モル％〜２０モル％の１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノジオレイルプロパン（ＡＬ−１）、±−オレオイル−２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−２）、不斉±−１，２−ジアシル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−３〜ＡＬ−５）及び±−１，２−ジデカノイル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−６）からなる群から選ばれる融合性を有するイオン化し得る脂質を含有する二分子膜と、
（ii）第一のｐＨを有する水溶液を有する内部区画、及び
（ｂ）第二のｐＨを有する上記リポソームの外側の水溶液
を含有するリポソーム組成物であって、
内部水溶液の第一のｐＨは二分子膜中の融合性を有するイオン化し得る脂質のｐＫaより小さく、外側水溶液の第二のｐＨは二分子膜中の融合性を有するイオン化し得る脂質のｐＫaよりも大きく、
それによって、二分子膜を横切るｐＨ勾配が存在し、また
それによって、融合性を有するイオン化し得る脂質が二分子膜の内側単分子膜内に蓄積されることを特徴とする、
リポソーム組成物。
【請求項２】
ユニラメラリポソームが大ユニラメラリポソームである請求項１のリポソーム組成物。
【請求項３】
水溶液が緩衝水溶液である請求項１のリポソーム組成物。
【請求項４】
緩衝水溶液のｐＨが４．０である請求項３のリポソーム組成物。
【請求項５】
緩衝水溶液がクエン酸塩緩衝液である請求項４のリポソーム組成物。
【請求項６】
二分子膜の５モル％から１０モル％が融合性を有するイオン化し得る脂質である請求項１のリポソーム組成物。
【請求項７】
融合性を有するイオン化し得る脂質が１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノジオレイルプロパンである請求項１のリポソーム組成物。
【請求項８】
二分子膜が更に、中性のヘッドグループ及び少なくとも１つの不飽和アシル鎖を含む脂質を含有する請求項１のリポソーム組成物。
【請求項９】
脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求項８のリポソーム組成物。
【請求項１０】
リポソームが生理活性剤を含む請求項１のリポソーム組成物。
【請求項１１】
生理活性剤が、核酸、殺菌剤、抗癌剤又は抗炎症剤である請求項１０のリポソーム組成物。
【請求項１２】
外側の水溶液が薬理学的に許容され得る水溶液である請求項１のリポソーム組成物。
【請求項１３】
二分子膜形成性ホスファチジルコリン並びに１モル％〜２０モル％の１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノジオレイルプロパン（ＡＬ−１）、±−オレオイル−２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−２）、不斉±−１，２−ジアシル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−３〜ＡＬ−５）及び±−１，２−ジデカノイル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−６）からなる群から選ばれる融合性を有するイオン化し得る脂質を含有する二分子膜を有し、上記融合性を有するイオン化し得る脂質が二分子膜の内側単分子膜内に蓄積されている、脱水ユニラメラリポソーム。
【請求項１４】
（ａ）二分子膜形成性ホスファチジルコリン；１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノジオレイルプロパン（ＡＬ−１）、±−オレオイル−２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−２）、不斉±−１，２−ジアシル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−３〜ＡＬ−５）及び±−１，２−ジデカノイル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−６）からなる群から選ばれる融合性を有するイオン化し得る脂質；及び二分子膜中の融合性を有するイオン化し得る脂質のｐＫaより小さいｐＨを有する水溶液とから、
二分子膜の５モル％〜２０モル％が融合性を有するイオン化し得る脂質であり、そして水溶液は得られるリポソームの内側と外側の両方にあるようにリポソームを調製し、
（ｂ）リポソームの外側の水性媒体のｐＨを、二分子膜中の融合性を有するイオン化し得る脂質のｐＫaよりも高くし、それによって、該二分子膜を横切るｐＨ勾配が存在し、またそれによって、融合性を有するイオン化し得る脂質が二分子膜の内側単分子膜内に蓄積されるようにし、そして
（ｃ）このｐＨ勾配を低下せしめて、内部水溶液のｐＨが二分子膜中の融合性を有するイオン化し得る脂質のｐＫaより大きくなるようにすること
を包含する、ヒト以外の細胞膜へのリポソームの融合を制御する方法。
【請求項１５】
リポソームが生理活性剤を含む請求項１４の方法。
【請求項１６】
細胞がヒト以外の哺乳動物の細胞である請求項１４の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）の後に、該リポソームがヒト以外の哺乳動物に投与される請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９２年１２月４日出願の米国特許出願第９８５，６７３号の一部継続出願であり、融合性（fusogenic、他の脂質二分子膜への増強された融合性）リポソーム、該リポソームの製造方法及び該リポソームの他の脂質二分子膜（lipid bilayer）への融合を制御する方法に関する。
リポソームは、両親媒性脂質分子の一つ又はそれ以上の二分子膜からなる自己集合構造体であり、そのそれぞれが、内部水性容積を取り囲んでいる。脂質二分子膜を構成する両親媒性脂質分子は、一つ又は二つの非極性(疎水性)アシル鎖に共有結合で結合されている極性(親水性）ヘッドグループ領域を含んでいる。疎水性アシル鎖と脂質分子を取り囲んでいる水溶液との間のエネルギー的に好ましくない接触によって、極性ヘッドグループが水溶液に向かって配向し、一方、アシル鎖が二分子膜の内部に向かって配向するように、脂質分子が再配列されると一般に信じられている。その最終結果は、二つの相対する単分子膜（monolayer）からなるエネルギー的に安定な脂質二分子膜構造となり、アシル鎖が、水性媒体と接触するのを有効に遮蔽する。
リポソームは種々の方法で調製することができる。Banghamの方法（J．Mol．Bio.，１３巻、２３８〜２５２頁（１９６５年））により，“通常の”マルチラメラ（multilamellar）リポソーム（ＭＬＶ）が作られる。“通常の”ＭＬＶは、その水性区画間に不均等な溶質分布を持つことができ、それによって区画間に浸透圧が生じる。Lenk等（米国特許第４，５２２，８０３号、同第５，０３０，４５３号及び同第５，１６９，６３７号）、Fountain等（米国特許第４，５８８，５７８号）及びCulliS等（米国特許第４，９７５，２８２号）は、水性区画のそれぞれに取り込まれた溶質の分布が実質的に等しい、即ち、ラメラ間の溶質分布が実質的に等しいマルチラメラリポソームの製造方法を開示している。実質的に等しいラメラ間溶質分布を持つということは、これらＭＬＶの水性区画間の浸透圧がより小さいことを意味し、従って、一般に、通常のＭＬＶよりも安定であるといえる。ユニラメラ（unilamellar）リポソームは、音波処理（Paphadjopoulos等（１９６８年）参照）又は押出（Cullis等、米国特許第５，００８，０５０号及びLoughrey等、米国特許第５，０５９，４２１号）により、ＭＬＶから製造できる。
リポソームには、生理活性剤を受動的に（passively）、即ち、水溶性の剤である場合には、リポソームが形成される媒体中に分子を可溶化することにより、あるいはリポソームが調製される脂質溶液に脂質溶解性の剤を加えることにより、装填することができる。イオン化し得る生理活性剤も、リポソーム膜を横切る電気化学電位勾配を創設し、次いで剤をリポソームの外側の媒体に加えることによってリポソームに装填することができる（Bally等、米国特許第５，０７７，０５６号参照）。
リポソーム内に取り込まれた薬剤は、毒性を低減するか、効能を高めることにより、又はその両方によって治療指数を高めることができる。更に、循環系における他の粒状物質と同様に、リポソームは、洞様毛細血管を有する組織中における細網内皮系の食細胞によって摂取され、それによってしばしば細胞内感染部位へと向けられる。
生体膜の融合は、エンドサイトーシス、受精及び蛋白質の細胞内輸送を始めとする多様な細胞輸送機能における重要なプロセスである。リポソームと細胞の融合は、リポソームの最外層二分子膜が、細胞の原形質膜と単一化することと定義される（Huang（１９８３年）参照）。融合が起こるためには、最外層の脂質二分子膜の脂質が、細胞の原形質膜の脂質と混合しなければならない。脂質間に融合が起こるメカニズムとして提案されているものは、帯電ヘッドグループの中和を包含し、非二分子膜形成性（nonbilayer-preferring）構造を生ずる脂質種の形が効果的に変化することになる。これらは、膜融合の造核部位として作用するミセル又は二分子膜におけるその他の欠陥を順次生ずる（Cullis及びHope（１９７８年））。
リポソームを使用した研究により、リポソームが融合する傾向と成分脂質が六角形のＨ11相のような非二分子膜を取る傾向との間の相関関係が実証され、例えば、反転ミセル又はその他の二分子膜欠陥のような非二分子膜構造が、融合事象における中間構造であることを示唆するに至った（例えば、Cullis等（１９７８年）参照）。脂質の組成は、リポソームが非二分子膜構造を取る傾向に寄与していると考えられる（例えば、Martin及びMacDonald（１９７６年）、Martin及びMacDonald（１９７６年）、Weismann等（１９９７年）参照）。例えば、負に帯電しているリン脂質（例えば、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）等）を含む膜は、Ｃａ++のような２価の陽イオンの存在下で融合することが示されている（Hope等（１９８３年））。合成陽イオン脂質は、高濃度の負に帯電した対イオンを用いて、融合することが示されている（Duzgunes等（１９８９年））。不飽和ジグリセリド類も有力なフーソゲン（fusogen）であると考えられている（Das及びRand（１９８６年））。更に、帯電していない脂質は、非二分子構造をより容易に取ることができ、従って、その帯電した形のものよりも融合性が高いと考えられる（例えば、Gruner等（１９８５年）参照）。
陽イオン脂質は、哺乳動物の細胞形質移入（トランスフェクション）の効率を増大させるのに有効であることが判っている（例えば、Malone等（１９８９年）、Konopka等（１９９１年）参照）。これらの適用をリポソームでカプセル化された物質の生体内搬送にまで拡張すると、陽イオン脂質に起因する細胞毒、溶血及び凝固応答の増大の問題が生じる（Senior等（１９９１年））。これらの影響は、正電荷の閾レベル以上で生ずるようであり、陽イオン種の性質に大きく依存するとは考えられない。新規な陽イオンヘッドグループを合成することによって、陽イオン種の毒性の影響を解決しようとする試みが為されているが、大部分は未解決のままである。これら脂質を目的とする薬剤搬送へ適用できる可能性があれば、陽イオン濃度を低減することによって、毒性副作用の低減が計られ、これらの化合物の生体内融合性を制御する能力が、望ましいものとなる。
反対電荷を有する小胞個体群（population）間の融合も実証されている（Stamatos等（１９８８年））。誘導された脂質不斉を使用するリポソームの制御された融合について、従来、発表されている（Eastman等（１９９１年）、Eastman等（１９９２年）、Redelmeier等（１９９０年）。しかしながら、これらは、陰イオン性のイオン化し得る脂質を使用するものであり、この陰イオン脂質を移送するために用いられるｐＨ勾配は、陽イオン薬剤をリポソームに装填するためのそれとは逆である（Bally等、米国特許第５，０７７，０５６号参照）。これらの薬剤装填リポソームの制御された融合は、類似の融合性陽イオン脂質によってよりよく行なわれるであろう。
リポソームと生体膜の融合により、リポソームの内容物を細胞に搬送することができる。リポソームの水性内容物の細胞質への注入は、カルボキシルフルオレセインの蛍光デクェンチング（dequenching）によって示されている（Weinstein等（１９７７年）、Huang等（１９７８年））。その他の報告も、リポソームに取り込まれた生理活性物質（例えば、ｃＡＭＰ、リシン（ricin）、アクチノマイシンＤ、Ｃａ++、ｍＲＮＡ、ウイルス及びウイルスのゲノム）を、リポソーム脂質二分子膜と細胞膜との融合によって、細胞内部に導入できることを示している（例えば、Paphadjopoulos等（１９７４年）、Dimitriadis及びButters（１９７９年）、Theoharides及びDouglas（１９７８年）、Ostro等（１９７８年）、Dimitriadis（１９７８年）、Wilson等（１９７９年）、Fraley等（１９８０年））。しかしながら、他の研究では、融合はリポソームの細胞との相互作用の主たるメカニズムではないことを示唆している（例えば、Szoka等（１９８０年）、Hagins及びYoshikami（１９８２年）、Pagano及びTakeichi（１９７７年）参照）。
上記刊行物は参考のために挙げたが、これら刊行物は、いずれも、イオン化し得る陽イオン脂質及び膜内外ｐＨ勾配を有するリポソームを含むリポソーム組成物を開示しておらず、二分子膜内外分布を制御するためのこのような勾配の使用、従って、イオン化し得る脂質の融合可能性も開示していない。
発明の要旨
本発明は、（ｉ）中性の二分子膜形成性（bilayer-preferring）脂質並びにプロトン化し得る陽イオンヘッドグループ及び不飽和アシル鎖を有する融合促進有効量のイオン化し得る脂質からなる最外層の脂質二分子膜と、（ｉｉ）第一のｐＨを有する水溶液を含む最外層脂質二分子膜に隣接する区画とを有するリポソームとを含有するリポソーム組成物を提供する。この組成物は、第二のｐＨを有するリポソームの外側の水溶液をも含んでおり、第一のｐＨは最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaより小さく、第二のｐＨは最外層脂質二分子膜中のイオンし得る脂質のｐＫaよりも大きく、それによって、最外層脂質二分子膜を横切るｐＨ勾配が存在し、またそれによって、イオン化し得る脂質が最外層脂質二分子膜の内側単分子膜内に蓄積される。
該リポソームは、ユニラメラリポソームであることができ、ユニラメラリポソームは、大ユニラメラ（large unilamellar）リポソームであることが好ましい。該リポソームは、マルチラメラリポソームであってもよく、マルチラメラリポソームが、その水性区画内に取り込まれた溶質を含んでおり、該マルチラメラリポソームの各々の水性区画に含まれる溶質の濃度が実質的に等しいことが好ましい。リポソーム中の内部水溶液は、緩衝水溶液であることが好ましく、更に好ましくは、ｐＨが約４．０の緩衝水溶液である。ｐＨが４．０の緩衝水溶液は、クエン酸塩緩衝液であることが好ましい。
イオン化し得る脂質の融合促進有効量とは、代表的には、リポソームの最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質の濃度を、約１モル％〜約２０モル％にするのに十分な量であり、好ましくは、この範囲内において、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質の好ましい融合促進有効量は、最外層二分子膜中のイオン化し得る脂質の濃度を、約５モル％〜約１０モル％にするのに十分な量である。
イオン化し得る脂質の陽イオンヘッドグループは、好ましくはアミノ基であり、不飽和アシル鎖は、好ましくはオレイン酸鎖である。現在好ましい本発明の実施態様に於いては、陽イオンヘッドグループはアミノ基、不飽和アシル鎖はオレイン酸鎖、イオン化し得る脂質は１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノジオレイルプロパン（ＡＬ−１）である。イオン化し得る脂質は、±−オレオイル−２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−２）、不斉±−１，２−ジアシル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−３〜ＡＬ−５）及び±−１，２−ジデカノイル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−６）からなる群からも選ぶことができる。現在、イオン化し得る脂質は、より好ましくは、１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノジオレオイルプロパン（ＡＬ−１）である。
リポソームの外側の水溶液は、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも大きいｐＨを有する緩衝水溶液であることが好ましい。イオン化し得る脂質がＡＬ−１であるときは、外部緩衝水溶液のｐＨは、約７．５であることが好ましい。リポソームは、更に、中性の非二分子膜形成性脂質、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むことができる。リポソームは、生理活性剤を含むことができ、その代表的な例は、核酸、殺菌剤、抗癌剤又は抗炎症剤である。リポソームの外側の水溶液は、薬理学的に許容され得る水溶液であることができ、リポソーム組成物は、医薬組成物であることができる。
本発明は、中性の二分子膜形成性脂質並びに陽イオンヘッドグループ及び不飽和アシル鎖を有する融合促進有効量のイオン化し得る脂質からなる最外層脂質二分子膜を有し、イオン化し得る脂質は、最外層脂質二分子膜の内側の単分子膜内に蓄積されている脱水リポソームを提供するものでもある。
更に、ここにおいては、第二の脂質二分子膜へのリポソームの融合を制御する方法が提供される。この方法は、水溶液中でリポソームを調製することからなり、該リポソームは（１）中性の二分子膜形成性脂質並びにプロトン化し得る陽イオンヘッドグループ及び不飽和アシル鎖を有する融合促進有効量のイオン化し得る脂質からなる最外層の脂質二分子膜と、（２）水溶液を含む最外層脂質二分子膜に隣接する区画とを含んでいる。水溶液のｐＨは、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも小さい。次いで、リポソームの外側の水溶液のｐＨを、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも高くして、それによって最外層脂質二分子膜を横切るｐＨ勾配を確立する。イオン化し得る脂質は、ｐＨ勾配に応じて、最外層脂質二分子膜の内側の単分子膜中に蓄積される。第二の脂質二分子膜へのリポソームの融合が起きるときに、このｐＨ勾配が低下するので、リポソームが第二の脂質二分子膜に融合する。
本発明の方法において用いられるリポソームは、生理活性剤を含むことができ、その代表的な例は、核酸、殺菌剤、抗癌剤又は抗炎症剤である。リポソームが制御された方法で融合される第二の脂質二分子膜は、細胞の原形質膜であることが好ましく、哺乳動物細胞の原形質膜であることが最も好ましい。
本発明は、水溶液がリポソームの内側と外側にあるように、水溶液中に剤を含むリポソームを調製することを包含する、生理活性剤を細胞に導入する方法を提供する。リポソームは、中性の二分子膜形成性脂質並びに陽イオンヘッドグループ及び不飽和アシル鎖を有するイオン化し得る脂質を含む最外層脂質二分子膜からなる。内部水溶液のｐＨは、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも低い。外部水性媒体のｐＨは、最外層脂質二分子膜を横切るｐＨ勾配が存在し、次いで、イオン化し得る脂質が最外層脂質二分子膜の内側の単分子膜内に蓄積されるように、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも高くされる。内部水溶液のｐＨは、細胞がリポソームと接触する前に、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも高くされる。該細胞は、哺乳動物細胞であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
図１  （Ａ）０〜１０モル％のＡＬ−１を含むＥＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームに関するＴＮＳ蛍光の検量線。ｘ軸：ＡＬ−１モル％；ｙ軸：蛍光。誤差バー（error bar）は、示されていない場合は、丸印よりも小さい。（Ｂ）ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）リポソームのＴＮＳ蛍光に及ぼすｐＨ勾配と１０モル％ＡＬ−１の影響を示す蛍光トレース。リポソームは、０モル％のＡＬ−１（下の方のトレース）あるいは１０モル％のＡＬ−１（上の方のトレース）で調製された。内部緩衝液は、３００ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ４．０（下の方のトレース）あるいは２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５（上の方のトレース）であった。ｘ軸：時間（秒）；ｙ軸：蛍光。
図２  ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）リポソームの蛍光に及ぼすｐＨの影響。示されたデータは、重複実験からの平均値を示し、誤差バーは、他に示されていない場合は、丸印よりも小さい。破線は、滴定曲線の逆第一導関数（inverted first derivative）であり、その最高値は、脂質二分子膜中のＡＬ−１については、６．７のｐＫaを示している。ｘ軸：ｐＨ；ｙ軸：％ΔＦ／ΔＦmaxである。
図３  ＲＥＴ蛍光プローブ希釈によるＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）リポソーム及びＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ（３０：２５：５５）リポソームの融合に及ぼす０及び１０モル％ＡＬ−１の影響。示されているデータは、ｐＨ勾配が消失した場合としない場合についての実験の異なるトレースであり、ΔＦmaxは、最終濃度が０．８ｍＭとなるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加することにより求めた。ｘ軸：時間（秒）；ｙ軸：蛍光。
図４  ＲＥＴ蛍光プローブ希釈によるＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５、モル／モル）リポソームの融合に及ぼすＡＬ−Ａ濃度（０〜２０モル％）の影響。ｘ軸：時間（秒）；ｙ軸：蛍光。
図５  ｐＨ４．０及び７．５において、１００ｍＭ酢酸アンモニウム中で、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）中１０モル％ＡＬ−１−ｄ4で調製されたＭＬＶの2Ｈ−ＮＭＲスペクトル。ｘ軸：振動数（ｋＨｚ）。
図６  ＡＬ−１含有リポソームの融合速度に及ぼすＤＯＰＥ濃度の影響。融合測定は、上述のように行われた。ｘ軸：時間（秒）；ｙ軸：％ΔＦ／ΔＦmaxである。
図７  ０及び５モル％ＡＬ−１並びにＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（３５：２０：４５、モル／モル）からなるリポソームの融合。ｘ軸：時間（秒）；ｙ軸：％ΔＦ／ΔＦmaxである。
図８  ｐＨ4.0及び7.5において、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウムで緩衝され、ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌリポソーム中、５モル％のＡＬ−１−ｄ4で調製された凍結融解ＭＬＶの、Ａ：2Ｈ−ＮＭＲ（ｘ軸：振動数（ｋＨｚ））スペクトル、Ｂ：31Ｐ−ＮＭＲ（ｘ軸：δ／ｐｐｍ）。
図９  ＲＥＴ蛍光プローブ希釈によるＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（３５：２０：４５）リポソームの融合に及ぼすアミノ脂質の影響。トレース（一番上から一番下へ）：ＡＬ−１、ＡＬ−５、ＡＬ−４、ＡＬ−３、ＡＬ−６、ＡＬ−２及びブランク。ｘ軸：時間（秒）；ｙ軸：％ΔＦ／ΔＦmaxである。
図１０  合成アミノ脂質構造。
発明の詳細な説明
本発明は、（ｉ）中性の二分子膜形成性脂質並びにプロトン化し得る陽イオンヘッドグループ及び不飽和アシル鎖を有する融合促進有効量のイオン化し得る脂質からなる最外層の脂質二分子膜と、（ii）第一のｐＨを有する水溶液（内部水溶液）を含む最外層脂質二分子膜に隣接する区画とを有するリポソームを含有するリポソーム組成物を提供する。この組成物は、第二のｐＨを有するリポソームの外側の水溶液をも含んでいる。第一のｐＨは、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaより小さく、第二のｐＨは最外層脂質二分子膜中のイオンし得る脂質のｐＫaよりも大きく、それによって、最外層脂質二分子膜を横切るｐＨ勾配が存在し、ｐＨ勾配に応じて、イオン化し得る脂質が、最外層脂質二分子膜の内側単分子膜内に蓄積される。
リポソームは、一つ又はそれ以上の二分子膜からなる自己集合構造体であり、そのそれぞれが、水溶液を含む区画を取り囲んでいる。リポソームの各二分子膜は、極性、親水性ヘッドグループが周囲の水溶液に向かって配向し、一方、疎水性アシル鎖が二分子膜の内部に向かって配向して、周囲の水性相から遠ざかるような、両親媒性脂質分子の組み合わせにより形成される。その結果、脂質二分子膜は、脂質分子の内側及び外側単分子膜の両方を有する。
ユニラメラリポソームは、一つの脂質二分子膜を有し、マルチラメラリポソームは二つ以上の脂質二分子膜を有する。本発明のリポソーム組成物で使用されるリポソームは、ユニラメラリポソーム、好ましくは大ユニラメラリポソーム（ＬＵＶ）であることができる。ＬＵＶは、約５０ｎｍよりも大きい径を有するユニラメラリポソームである。リポソームは、マルチラメラリポソーム（ＭＬＶ）であってもよく、ＭＬＶは、その水性区画内に取り込まれた溶質を含み、各水性区画中の溶質の濃度が実質的に等しいことが好ましい。このようなＭＬＶは、実質的に等しいラメラ間溶質分布を有している。一般的に、本発明のリポソームのサイズは、それらの直径で測定すると、約５０００ｎｍ以下である。リポソームのサイズは、通常の熟練した技術者によく知られ、容易に実施できる技術、例えば準電気光散乱によって測定できる。
ユニラメラリポソームの“最外層脂質二分子膜”は、リポソームにおける単一の脂質二分子膜であり、マルチラメラリポソームにおいては、“最外層脂質二分子膜”は、リポソームの外側の水溶液（“外部水溶液”）と接触している脂質二分子膜である。リポソームは、種々の方法で調製できる（例えば、Cullis等（１９８７年）、Bangham等（１９６５年）、Lenk等（米国特許第４，５２２，８０３号、同第５，０３０，４５３号及び同第５，１６９，６３７号）、Fountain等(米国特許第４，５８８，５７８号）及びCullis等(米国特許第４，９７５，２８２号参照）。
リポソームは、中性（不電荷、非陽イオン／非陰イオン、非プロトン性）ヘッドグループ及び二分子膜形成性アシル鎖からなる中性二分子膜形成性脂質を含む最外層脂質二分子膜を有する。これらのアシル鎖は、対称でも、（長さや炭素原子数が不均一な）非対称のものでもよく、又（隣接炭素原子間に二重結合を含まない）飽和であっても、（隣接炭素原子間に一つ又はそれ以上の二重結合を含む）不飽和であってもよく、一般には、二分子膜に取り込まれた他の脂質のアシル鎖とパック（pack）している適合性のアシル鎖を採用することにより、二分子膜中の非二分子膜形成性脂質の相分離を抑制又は防止していると考えられる。二分子膜形成性脂質は、他の二分子膜形成性脂質及び非二分子膜形成性脂質との関係におけると同様に、それ自身の上に安定な脂質二分子膜を形成することができる。二分子膜形成性脂質は、一般に、そのヘッドグループの表面積とそのアシル鎖の断面積との間に、実質的な類似性を有する。二分子膜形成性脂質のアシル鎖は、一般に、二分子膜中で、互いに略平行に配向されている。二分子膜形成性脂質は、一般に、二分子膜適合性構造を取り、一般に、二分子膜欠陥の生成には係わっていない。中性二分子膜形成性脂質は、卵ホスファチジルコリンのようなホスファチジルコリン又はその他の中性二分子膜形成性脂質であることができる。
リポソームの最外層脂質二分子膜は、プロトン化し得る陽イオンヘッドグループ、即ちプロトンを受容して、正に帯電し、中性となるようにプロトンを放出することができるヘッドグループを有する融合促進有効量のイオン化し得る脂質をも含んでいる。また、イオン化し得る脂質は、不飽和アシル鎖、好ましくは２つの不飽和アシル鎖をも含んでいる。陽イオンヘッドグループは、ジメチルアミノ基又はトリメチルアミノ基のようなアミノ基であることが好ましいが、プロトン化されて正に帯電し、脱プロトン化されて中性となる他の基でもよい。
不飽和アシル鎖は、一般に、非二分子膜形成性である。非二分子膜形成性のアシル鎖は、一般に、二分子膜中においてその鎖が平行に配向するような構造を取らない。そのようなアシル鎖の断面積は、一般的には、二分子膜形成性のアシル鎖とは異なり、互いに等しくなく、ヘッドグループ表面積とも等しくない。これは、非平行配向であるためであると考えられている。非二分子膜形成性のアシル鎖含有脂質を含む二分子膜は、一般に、同じ長さ(炭素原子数)の二分子膜形成性アシル鎖脂質を含む二分子膜と比べて、Ｔm、即ちゲルから流動状態への遷移が起こる温度が低くなる。非二分子膜形成性の脂質が二分子膜に取り込まれると、一般に、二分子膜に欠陥が形成され、二分子膜形成性脂質を用いるよりも不安定になる傾向が増大する。このような欠陥は、一般に、脂質二分子膜の融合に係わっていると考えられる。理論によって制限される意図は全くないが、二分子膜の不安定化、従って、融合には、融合性脂質のヘッドグループの大きさとアシル鎖が占める面積の大きさの間の実質的な不均衡が必要であると考えられる。
好ましい不飽和アシル鎖は、オレイン酸鎖であり、第９と第１０炭素原子間に二重結合を持つ１８の炭素鎖を有するアシル鎖である。しかし、不飽和アシル鎖は、二分子膜中に脂質がしっかりくっついていて、非二分子膜形成性である限り、一般的に、１２〜２４の炭素原子と１〜４の二重結合を有する、例えばパルミトレイン酸塩（炭素原子１６、二重結合１）又はアラキドン酸塩（炭素原子２０、二重結合４）のような他のアシル鎖であってもよい。陽イオンヘッドグループがアミノ基であり、不飽和アシル鎖がオレイン酸鎖であり、イオン化し得る脂質が２つのこのような鎖を含むことが好ましく、１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノジオレオイルプロパン（ＡＬ−１）が好ましい。ＡＬ−１は、光学活性であってもラセミ体、即ち異性体の光学不活性混合物であってもよいが、ラセミ体であることが好ましい。
他の適当なイオン化し得る脂質は、滴定可能なヘッドグループ、即ち、永久的な正電荷を持たず、むしろ周囲のｐＨ変化に応じてプロトン化されたり、脱プロトン化されたりするヘッドグループと、非二分子膜形成性のアシル鎖を有する脂質である。これらとしては、±−オレオイル−２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−２）、不斉±−１，２−ジアシル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−３〜ＡＬ−５）及び±−１，２−ジデカノイル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−６）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの脂質のそれぞれの融合性能力は、例えば、それぞれ等量の脂質でリポソームを調製し、次いでリポソーム融合の相対速度を調べることによって比較することができる。リポソーム融合は、多くの手段、例えば蛍光プローブ希釈実験（例えば、下記実施例４参照）によってモニターすることができる。図９は、イオン化し得る脂質ＡＬ−１、ＡＬ−２、ＡＬ−３、ＡＬ−４、ＡＬ−５及びＡＬ−６を含むリポソームの相対的な融合速度を比較するデータを示す。
リポソームは、第一のｐＨを有する水溶液（内部水溶液）を含む最外層脂質二分子膜に隣接した区画を有する。リポソームは、第二のｐＨを有する水溶液（外部水溶液）に懸濁させる。代表的には、リポソームは水溶液中で調製されるが、水溶液は、リポソームによって取り込まれるとともに、その中で、リポソームは懸濁されている。従って、内部及び外部水溶液は、初めは一般に同一組成及び同一ｐＨを有している。それらのｐＨは、リポソームの最外層脂質二分子膜中におけるイオン化し得る脂質のｐＫaよりも小さい。
化合物のｐＫa、即ちその酸解離定数は、その化合物が半分解離するｐＨ、即ち溶液中に存在する化合物分子の約半分が脱プロトン化されるｐＨである。ｐＫaは、式ｌｏｇ(〔ＨＡ〕／〔Ｈ+〕〔Ａ-〕）によって定義することができ、ここで、ＨＡはプロトン化された化合物、Ａ-は脱プロトン化された化合物である。ヘンダーソン・ハッセルバッハの式（ｐＨ＝ｐＫa＋ｌｏｇ（〔Ａ-〕／〔ＨＡ〕））は、溶液のｐＨと、溶液中に存在する化合物のプロトン化されたもの及び脱プロトン化されたものの相対濃度との間の関係を述べている。脂質二分子膜中のそのｐＫaより大きいｐＨにおいて、二分子膜中に存在するイオン化し得る脂質の半分よりも多くが脱プロトン化され、従って中性となる。イオン化し得る脂質のｐＫaの測定は、よく知られ、容易に実施できる手段、例えばＴＮＳ蛍光滴定によって行うことができる。
内部及び外部水溶液の両方のｐＨが二分子膜におけるそのｐＫaよりも低いときは、イオン化し得る脂質は、実質的にプロトン化され、一般に、最外層脂質二分子膜の内側及び外側の単分子膜の間に、ほぼ均一に分布している。即ち、イオン化し得る脂質の約５０％が内側の単分子膜に、５０％が外側の単分子膜に存在する。
第一のｐＨよりも大きく、二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも大きい第二のｐＨを持つ外部水溶液を得るように、外部水溶液のｐＨを高めることによって、最外層脂質二分子膜を横切るｐＨ勾配を確立する。プロトン化され、帯電したイオン化し得る脂質は、ｐＨ勾配に応じて、最外層脂質二分子膜の内側の単分子膜中に蓄積する。ここで用いられている、“蓄積”とは、二分子膜を横切るｐＨ勾配が存在するとき、最外層二分子膜に存在するイオン化し得る脂質の約５０％以上が、内側の単分子膜内にあるということ、好ましくは約７５〜約１００％、より好ましくは約９０〜約１００％、最も好ましくは約１００％のプロトン化された、イオン化し得る脂質が、ｐＨ勾配に応じて内側の単分子膜内にあることを意味する。
例えば、本発明の好ましい実施態様においては、イオン化し得る脂質はＡＬ−１である。ＡＬ−１と、例えば卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）、又はＥＰＣ、Ｃｈｏｌ及びジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）とで、リポソームを調製することができる。ＥＰＣ、Ｃｈｏｌ及びＤＯＰＥは、中性の脂質であるので、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ又はＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ二分子膜中のＡＬ−１のｐＫaは、約６．７である。従って、ＡＬ−１／ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ又はＡＬ−１／ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソームに関して、第一のｐＨ、即ち内部水溶液のｐＨは、６．７より低く、このようなＡＬ−１含有リポソームに関する第一のｐＨは、好ましくは約４．０である。代表的には、内部水溶液は、緩衝水溶液であり、好ましい緩衝水溶液は現在ではクエン酸緩衝液である。
リポソームがＡＬ−１／ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ又はＡＬ−１／ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥを含む場合は、第二のｐＨ、即ち外部水溶液のｐＨは、６．７より大きく、約７．５であることが好ましい。しかしながら、他の脂質をＡＬ−１／ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ又はＡＬ−１／ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥに混合すると、そこで、ＡＬ−１のｐＫaが影響を受けることがある。ＡＬ−１以外のイオン化し得る脂質は、ＡＬ−１と異なるｐＫaを持つことがある。従って、第一及び第二のｐＨは、リポソームの組成が変わった場合は、その好ましいｐＨ値から変更してもよい。
第一ｐＨが最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaより低いとき、第二のｐＨはそのｐＫaより大きく、イオン化し得る脂質は最外層脂質二分子膜の内側の単分子膜内に蓄積され、イオン化し得る脂質の正電荷は、実質的に外側の単分子膜からなくなっており、外部環境に曝されることから遮蔽される。動物に投与すると、正に帯電した脂質は、毒性副作用を引き起こし、オプソニン作用（opsonization）、即ち、血漿蛋白質のリポソーム外表面への結合、を促進することがあり、それによって、動物の循環からのリポソームの除去（clearance）を促進する。内側の単分子膜に正電荷を蓄積すると、毒性副作用やオプソニン作用の可能性が最少になる。
更に、イオン化し得る脂質の内側の単分子膜への蓄積を誘起するｐＨ勾配は、陽イオン親油性生理活性剤、例えばアントラサイクリン抗腫瘍剤、ドキソルビシン、をリポソームに装填するために使用することもできる（例えばBally等、米国特許第５，０７７，０５６号参照。）。
ｐＨ勾配の低下により、内部ｐＨは、イオン化し得る脂質のｐＫaよりも高くなる。これにより、蓄積されたイオン化し得る脂質は、実質的に脱プロトン化されることになる。次いで、実質的に脱プロトン化された中性のイオン化し得る脂質は、最外層脂質二分子膜の内側及び外側単分子膜の間に、ほぼ均一に分布する。中性のイオン化し得る脂質は、外側の単分子膜内で他の脂質二分子膜に曝された場合、“融合性”である。即ち、リポソームの他の脂質二分子膜への融合を促進することができる。二分子膜中で約７より低いｐＫaを有するイオン化し得る脂質を使用することは、ｐＨ勾配が、例えば動物内において、生理学的ｐＨで低下し、イオン化し得る脂質が実質的に脱プロトン化され、融合性であることを意味する。リポソームの内部ｐＨは、イオン化し得る脂質の実質的な脱プロトン化を誘起するのに、一般に生理学的ｐＨよりも高くする必要はない。実質的に生理学的ｐＨよりも高いｐＫaを有するイオン化脂質は、動物に投与すると、動物内では実質的に脱プロトン化されないので、融合性ではない可能性がある。
イオン化し得る脂質は、“融合促進有効量”で、最外層脂質二分子膜中に存在する。リポソームと他の脂質二分子膜の融合は、リポソームの最外層脂質二分子膜とその他の脂質二分子膜、例えば細胞膜との融合と定義することができる（例えばHuang（１９８３年）参照）。融合が起こるためには、最外層脂質二分子膜の脂質が、その他の脂質二分子膜の脂質と混合しなければならない。理論によって制限される意図は全くないが、融合が起こるためには、脂質上の帯電したヘッドグループは、中和されなければならず、脂質の形態が有効に変化し、非二分子膜形成性の構造を生じるものと考えられる。
本発明の目的のためには、イオン化し得る脂質の“融合促進有効量”は、イオン化し得る脂質が脱プロトン化され、中性になるとき、リポソームの別の脂質二分子膜への融合を促進するのに有効なイオン化し得る脂質の量である。イオン化し得る脂質の融合促進有効量は、一般に、二分子膜が他の二分子膜と融合するのを促進するのに十分な程度の欠陥をその二分子膜中に生成するのに有効である。代表的には、イオン化し得る脂質の“融合促進有効量”は、最外層脂質二分子膜中に約１モル％〜約２０モル％のイオン化し得る脂質の濃度を確立するのに十分な量である。望ましくは、イオン化し得る脂質の融合促進有効量は、最外層脂質二分子膜中に約５モル％〜約１０モル％のイオン化し得る脂質の濃度を確立するのに十分な量である。
リポソームは、中性非二分子膜形成性脂質を含むことも可能である。ここで用いられる場合、“中性非二分子膜形成性脂質”は、非陽イオン、非陰イオンヘッドグループ及び非二分子膜形成性アシル鎖を有する両親媒性脂質である。非二分子膜形成性アシル鎖は、一般に二分子膜中で、平行な配向で配列されておらず、また、一般にそのヘッドグループ表面とアシル鎖断面によって占められる面積は同様ではない。このようなアシル鎖について、最も好ましいパッキング構造は、一般に、非二分子膜構造にある。非二分子膜形成性脂質を含む二分子膜は、一般に、同じ長さ（炭素原子数）の二分子膜形成性アシル鎖脂質を含む二分子膜に比べて、Ｔm、即ちゲルから流動状態への遷移が起こる温度が低くなる。従って、非二分子膜形成性脂質は、一般に、ゲルから流動状態への二分子膜の遷移を促進し、それによって、一般に、二分子膜の他の二分子膜への融合を促進する。本発明の現在の好ましい実施態様においては、中性、非二分子膜形成性脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
リポソームは、当業者によく知られた、あるいは必要以上の実験を行うことなしに当業者が決定できる量及び理由に基づき、蛋白質及び他の脂質、例えばコレステロールやその誘導体を含むことも可能である。
リポソームは、従来の医薬を含む生理活性剤及び動物内あるいは生体内動物細胞で生理活性を有する関連生理活性化合物又は組成物を含むことができる。生理活性剤としては、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗腫瘍剤、代謝拮抗物質、炭水化物、ポリペプチド、ペプチド、蛋白質、毒素、酵素、ホルモン、神経伝達物質、糖蛋白質、リポ蛋白質、免疫グロブリン、免疫モジュレーター、血管拡張剤、染料、放射線標識化合物、放射線不透過性化合物、蛍光性化合物、多糖類、細胞受容体結合分子、抗炎症剤、散瞳性化合物、局部麻酔剤、麻薬、抗緑内障剤、ビタミン、核酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ＭＲＩ及び放射線造影剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
該リポソーム組成物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与され、リポソーム中に取り込まれるか、あるいはリポソームに結合されている生理活性剤を動物の細胞に搬送することができる。該組成物を動物に投与する場合、外部水溶液は、動物にとって耐えられる、即ち、実質的に無毒なものである。従って、外部水溶液は、薬理学的に許容し得る溶液、即ち“キャリアー”である。薬理学的に許容し得るキャリアーは、一般に、目的とする投与経路及び標準的な薬理学的プラクティスに基づいて選択される。静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下又は乳房内経路を経由する非経口投与用若しくは注射用に、リポソーム組成物の無菌溶液が調製され、溶質の全濃度を調整して製品を等張にしてもよい。非経口投与用に用いられる代表的なキャリアーとしては、Ｄ５Ｗ（５％重量／体積  デキストロース／水）のようなデキストロース含有水溶液及び生理学的に容認され得る食塩水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。薬理学的に許容し得るキャリアーとしては、アルコール類、アラビアゴム、ベンジルアルコール類、ゼラチン、ラクトース、アミロース又は澱粉のような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸（silic acid）、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなども挙げられる。それらは、例えば防腐剤、抗酸化剤などの成分を、当業者が決定できる範囲内の量及び理由に基づき、含むことができる。
本発明は、中性、非二分子膜形成性脂質並びにプロトン化し得る陽イオンヘッドグループ及び不飽和アシル鎖を有する融合促進有効量のイオン化し得る脂質からなる最外層脂質二分子膜を有する脱水リポソームであり、イオン化し得る脂質が、最外層脂質二分子膜の内側の単分子膜に蓄積されている脱水リポソームをも提供する。リポソームの脱水により、リポソームの保存期間を延長することができ、脱水リポソームは必要に応じて再構成することが可能である。リポソームは、標準凍結乾燥装置若しくはその同等装置を用いて、凍結で脱水することができる。凍結乾燥は、参照のために記載するSchneider等（米国特許第４、２２９、３６０号）及びJanoff等（米国特許第４，８８０，６３５号）に述べられた方法に従って、リポソーム製品中に１つ又はそれ以上の保護糖を混合した後、行うことが好ましい。保護糖は、脱水が凍結せずに行われる場合には、省略することができ、リポソーム調製工程において十分な水をリポソーム製品内に残すことによって、脱水−再水和プロセスの間のリポソーム二分子膜の実質的な部分の完全性を維持することができる。
本発明は、水溶液中でリポソームを調製することからなり、該リポソームは、中性の二分子膜形成性脂質並びにプロトン化し得る陽イオンヘッドグループ及び不飽和アシル鎖を有する融合促進有効量のイオン化し得る脂質を含む最外層脂質二分子膜を含む、リポソームの第二の脂質二分子膜への融合を制御する方法を提供する。リポソームは、水溶液を含む最外層脂質二分子膜に隣接する区画をも含んでいる。その水溶液のｐＨは、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも低い。次いで、リポソーム外部の水溶液のｐＨを、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも高くするので、最外層脂質二分子膜を横切るｐＨ勾配が生じ、イオン化し得る脂質が、そのｐＨ勾配に応じて最外層脂質二分子膜の内側単分子膜に蓄積する。リポソームが第二の脂質二分子膜と融合する場合は、内部水媒体のｐＨを最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも高くする。リポソームは、ユニラメラリポソーム、好ましくは大ユニラメラリポソーム、あるいはマルチラメラリポソーム、好ましくは実質的に等しいラメラ間溶質分布を持つマルチラメラリポソームであることができる。第二の脂質二分子膜は、細胞の原形質膜が好ましく、その細胞は、哺乳動物の細胞が好ましい。しかしながら、第二の脂質二分子膜は、リポソーム脂質二分子膜又はバクテリアの細胞膜等の他の脂質二分子膜であってもよい。外部水溶液のｐＨは、一般に、その水溶液に、目的とするｐＨを得るのに十分な量の塩基を加えるか、あるいはその外部水溶液を、目的とするｐＨを有する第二の水溶液と交換することにより高くする。
イオン化し得る脂質は、融合促進有効量、即ちリポソームの第二の脂質二分子膜への融合を促進するのに効果的な量で、最外層脂質二分子膜中に存在する。代表的には、イオン化し得る脂質の“融合促進有効量”は、最外層脂質二分子膜中において、約１モル％〜約２０モル％のイオン化し得る脂質の濃度を確立するのに十分な量である。好ましくは、イオン化し得る脂質の融合促進有効量は、最外層脂質二分子膜中において、約５モル％〜約１０モル％のイオン化し得る脂質の濃度を確立するのに十分な量である。
リポソームを第二の脂質二分子膜へ融合させたい場合は、ｐＨ勾配を低減するように、リポソームの内部ｐＨを、二分子膜中におけるイオン化し得る脂質のｐＫaよりも高くする。最外層脂質二分子膜の内側単分子膜中に蓄積された、プロトン化され／帯電したイオン化し得る脂質は、二分子膜に隣接した内部水溶液のｐＨが二分子膜中における脂質ｐＫaよりも高くなると、実質的に脱プロトン化される。次いで、実質的に脱プロトン化され／中性のイオン化し得る脂質は、最外層脂質二分子膜中に、ほぼ均一に分布する。即ち、約５０％が内側単分子膜に、約５０％が外側単分子膜に存在する。外側単分子膜中の中性脂質は、他の脂質二分子膜への融合を促進することができる。該リポソーム組成物を動物に投与し、リポソーム中に貯えられたプロトンが外部環境へ漏出するにつれ、ｐＨ勾配を徐々に動物内で消失させることによって、ｐＨ勾配を低減することができる。リポソームの内部ｐＨが生理学的なｐＨに近づくにつれて、生理学的ｐＨより低いｐＫaを有するイオン化し得る脂質は、実質的に脱プロトン化される。脂質二分子膜を横切ってイオンを運ぶのを促進するイオノホア、例えばニゲリシン（nigericin）、を使用することによっても、あるいは中性の形で脂質二分子膜を横切ることのできるイオン、例えばアンモニウムイオン、を加えることによっても、ｐＨ勾配を低減させることができる。内部ｐＨがｐＫaよりも高くなると、帯電したイオン化し得る脂質は、実質的に脱プロトン化され、中性の脂質が、最外層脂質二分子膜の内側及び外側単分子膜間にほぼ均一に分布される。
本発明の方法で使用されるリポソームは、生理活性剤を含むことが可能である。脂質の融合が制御される第二の脂質二分子膜は、細胞の原形質膜が好ましく、その細胞は、哺乳動物の細胞が好ましい。哺乳動物内、即ち生体内で、リポソームを哺乳動物細胞の原形質膜へ融合させるのが好ましい。代表的には、融合は、リポソーム内容物が哺乳動物細胞の細胞膜に搬送されるように起こる。
また、水溶液中で生理活性剤を含むリポソームを調製することからなり、該リポソームは、中性の二分子膜形成性脂質並びにプロトン化し得る陽イオンヘッドグループ及び不飽和アシル鎖を有する融合促進有効量のイオン化し得る脂質を含む最外層脂質二分子膜を含む、生理活性剤を細胞、好ましくは哺乳動物細胞に導入する方法もここに提供される。その水溶液は、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも低いｐＨを有し、生成したリポソームにより取り込まれると共に、そのリポソームを取り囲む。リポソームは、水溶液を含む最外層脂質二分子膜に隣接する区画をも含んでいる。次いで、リポソーム外部の水溶液のｐＨを、最外層脂質二分子膜中のイオン化し得る脂質のｐＫaよりも高くするので、最外層脂質二分子膜を横切るｐＨ勾配が生じ、イオン化し得る脂質が、そのｐＨ勾配に応じて最外層脂質二分子膜の内側単分子膜内に蓄積する。次いで、例えば、リポソームを動物に投与することにより、あるいはリポソームが細胞と融合する場合は、イオノホアを使用することにより、ｐＨ勾配は低減する。次に、リポソームが細胞に融合し、それによって生理活性剤が細胞に導入されるように、リポソームが細胞に接触する。
本発明は、以下の実施例により更によく理解されるであろう。しかしながら、これらの実施例が、その後に続く請求範囲で規定されているような本発明を単に説明するだけのものであることは、当業者が容易に理解するところである。
実施例
実施例１
脂質及び化学薬品材料
卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキシジアゾール−４−イル）−１，２−ジオレオイル−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン（ＮＢＤ−ＰＥ）及びＮ−（リッサミン（lissamine）ローダミンＢスルフォニル）−１，２−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン（Ｒｈ−Ｐｅ）は、Avanti Polar Lipids（Alabaster，AL）から取得した。オレイン酸、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ニゲリシン、２−ｐ−トルイジニルナフタレン−６−スルホン酸カリウム（ＴＮＳ）及びすべての緩衝液は、Sigma Chemical Co.（St．Louis，MO）から取得した。３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール及び塩化オキサリルは、Aldrich Chemical Co.（Milwaukee，WI）から購入し、９，１０−ｄ２−オレイン酸は、MSD Isotopes（Montreal，PQ）から供給された。有機溶媒は、すべてＨＰＬＣグレードであり、再蒸留せずに使用した。
ＡＬ−１の合成
Levantis及びSilvius（１９９０年）の方法により、本化合物を調製した。１０ｍｌのベンゼンに溶解した１．０ｇ（３．５ｍｍｏｌ）のオレイン酸に、３ｍｌ（３５ｍｍｏｌ）の塩化オキサリルを、撹拌せずに室温で１時間かけてゆっくり添加することにより、塩化オレイルを調製した。真空下で、溶剤と過剰の塩化オキサリルを除去した後、その酸塩化物を５ｍｌのジエチルエーテルに溶解し、更に、０．２０ｇ（１．７ｍｍｏｌ）の３，Ｎ−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオールと０．１５ｇのピリジンを含むエーテル５ｍｌを添加した。得られた混合物を、室温で３０分間撹拌した後、１ｍｌのメタノールで冷却した。真空下で溶剤を除去した。粗生成物を５０ｍｌのヘキサンに溶解し、２×２５ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下でヘキサンを除去すると、わずかに黄色味がかったオイルが得られた。シリカゲル（７０〜２３０メッシュ）のカラムクロマトグラフィーで、酢酸エチルにより溶出したところ、０．９２ｇ（８４％）の純生成物（ＴＬＣ、Ｒｆ＝０．５）が得られた。２００ＭＨｚ、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、ＴＮＳ（Ｊカップリング、インテグレーション（J-coupling，integration））からのδｐｐｍ：５．３（ｄｄ、４Ｈ）、５．１（ｍ、１Ｈ）、４．０（ｄｄ、１ｈ）、２．４（ｄｄ、２Ｈ）、２．２（ｓ、６Ｈ）、２．０〜０．８（ｍ、６２Ｈ）。この方法を、重水素化された類似体（deuterated analog）である、ｒａｃ−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−２，３−ビス（９，１０−ジデュウテリオオレオイル）プロパン（ＡＬ−１−ｄ4）及び±−１，２−ジデカノイル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−６）を調製するのにも用いた。
±−オレオイル−２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−２）及び不斉±−１，２−ジアシル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−３〜ＡＬ−５）の調製
上記のようにして調製した塩化オレオイル（３．４ｍｍｏｌ）を、５ｍｌのＴＨＦに溶解し、２５ｍｌのＴＨＦに溶解した５倍過剰の３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール（２．０ｇ、１７ｍｍｏｌ）及び０．１５ｇのピリジンに添加した。粗１−モノオレオイル−２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＡＬ−２）を単離し、溶離液（Ｒｆ０．４）として酢酸エチル／メタノール（３：１）を使用して、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製した。その後、１当量の塩化アセチル、塩化ブチリル又は塩化デカノイルにより、反応条件でアシル化して、それぞれ、ＡＬ−３、ＡＬ−４及びＡＬ−５を製造した。
ＬＵＶの調製
窒素下で、脂質のクロロホルム溶液を乾燥し、引き続き、高真空下で残留溶剤を１時間除去することにより、公知の方法で、リポソーム様リポソーム（liposomal liposome）を調製した。得られた脂質フィルムを、適当な緩衝液と渦巻き（vortex）混合することにより水和して、マルチラメラリポソーム（ＭＬＶ）を製造した。凍結融解を５回行って、均一な混合物を得た。ＭＬＶを、２枚の細孔サイズが１００ｎｍのポリカーボネートフィルターから１０回押し出して、大ユニラメラリポソームを製造した（例えば、Bally等、米国特許第４，８８５，１７２号、Cullis等、米国特許第４，９７５，２８２号、Cullis等、米国特許第５，００８，０５０号、Loughrey等、米国特許第５，０５９，４２１号参照）。
実施例２
ＴＮＦ蛍光による脂質不斉の測定
リポソームの内側単分子膜へのＡＬ−１の移送を、Eastman等（１９９１年）から採用された方法を用いるＴＮＦ蛍光により実証した。まず、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）に、０、２．５、５．０、７．５及び１０．０モル％のＡＬ−１を含み、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中、全脂質５ｍＭのＬＵＶを用いて、ＡＬ−１濃度の関数としてのＴＮＦ蛍光を検定した。９０μｌの一部を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５μＭ ＴＮＳ、ｐＨ７．５、２．９ｍｌに添加して、５分間にわたって蛍光をモニターした。上述のように、１０モル％ＡＬ−１、内部ｐＨ７．５で調製したリポソームも、比較のために使用した。
結果を図１に示す。ｐＨ勾配を与えた後、ＴＮＦ蛍光により、ＡＬ−１含有リポソームの表面電荷をモニターして、ＡＬ−１の二分子膜を横切る分布に及ぼすｐＨ勾配の影響を実証した。０．５モル％ＡＬ−１の濃度では、表面電荷が増加するにつれて、蛍光が一様に増加することが認められた（図１Ａ参照）。しかし、高濃度では、蛍光が水平となり、減少し始める。この影響は、コレステロールを含まないＥＰＣ内にＡＬ−１を含むリポソームでは認められず、蛍光は、２０モル％ＡＬ−１まで、直線的に増加した。ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）内に１０モル％ＡＬ−１を含むリポソームは、凝集して、ＴＮＳ相互作用のためのリポソーム表面積が減少するという徴候が初期に現れた。
ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）に１０モル％ＡＬ−１を含む場合について、ＴＮＦ蛍光に及ぼすｐＨ勾配の影響を、図１Ｂで説明する。図の一番上の曲線は、１０モル％ＡＬ−１について、内部及び外部がｐＨ７．５で勾配のない状態における、蛍光を時間の関数として示す。一番下の曲線は、小胞に関するもので、内部ｐＨが４、外部ｐＨが７．５であるが、ＡＬ−１は含まれていない。これらの曲線に認められる蛍光の緩やかな減少は、実験の過程でＴＮＳが光漂白（photobleaching）される結果である。残りの曲線は、勾配を有する１０モル％ＡＬ−１についてのもので、リポソームの増加した表面電荷の大部分、従って、ＡＬ−１は、外側の単分子膜から極めて急速に失われたことを示している。４分後、蛍光は、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームのそれと等しく、実質的に、すべてのＡＬ−１が内側単分子膜に移動してしまったことを示した。二分子膜を横切るＡＬ−１の脂質移動は、融合の制御にそれを使用するのに有用である。ＡＬ−２〜ＡＬ−６についても、同様な挙動が認められた（図９参照）。
実施例３
イオン化し得る脂質のｐＫaの測定
リポソーム膜内のＡＬ−１が、その電荷を失うときのｐＨを測定するために、０及び１０モル％ＡＬ−１とＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）を含むＬＵＶを、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ酢酸アンモニウム中で、ｐＨ４．０で調製した。５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ酢酸アンモニウム、２μＭ ＴＮＳ中に、３．０から１０．０までの範囲のｐＨで、全脂質が０．２５ｍＭとなるように試料を希釈した。最終濃度が０．０１μＭとなるようにニゲリシンを添加することにより、小胞膜を横切るｐＨを等しくした。
結果は、図２に提示されており、ｐＨ勾配が存在していない場合の種々のｐＨ値におけるＴＮＳ蛍光を示す。このデータから、ＡＬ−１の共役酸については、ｐＫaが６．７であることが明らかである。合成アミノ脂質ＡＬ−２〜ＡＬ−６について、同様のｐＨ滴定曲線から導かれた結果の比較を表１に示す（下記参照）。リポソームに取り込まれた場合、アミンの酸−塩基特性に及ぼす化学構造の影響は、観察されたｐＫa値及びｐＨ７．５で変化したまま残っているアミノ脂質種の画分の変化として表される。これらの変化は、相対的な炭化水素の鎖長とヘッドグループの極性とによって影響を受けるので、アミンヘッドグループの脂質二分子膜内への浸透の深さに由来することができる。化合物ＡＬ−２は、単一のオレオイル鎖と未置換ヒドロキシル基を有しているだけであり、ｐＫaは約７．５７である。２位置におけるヒドロキシルを酢酸塩でエステル化すると、ＡＬ−３となり、ｐＫaは６．７９に低下し、ｐＨ７．５における中性種の画分は、ＡＬ−１での１１％に比較して、１６％である。残りの化合物ＡＬ−４、ＡＬ−５、ＡＬ−６も、ｐＫa及びｐＨ７．５における相対電荷が、ＡＬ−１のそれらの値に近づくのに十分な炭化水素含有量を有している。
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実施例４
脂質−混合融合測定
Struck等（１９８１年）により記載されているような、蛍光プローブ希釈から生ずる共鳴エネルギー転移の減少によって、融合をモニターした。ｐＨ４．０の３００ｍＭクエン酸塩中で、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）及びＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ（３０：２５：４５）における０及び１０モル％ＡＬ−１により、ＬＵＶを調製した。外部緩衝液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）であった。各ＡＬ−１濃度において、各脂質組成物について、ＮＤＢ−ＰＥ及びＲｈ−ＰＥの両方の０．７モル％を含むリポソームも調製した。標識したリポソームと標識しないリポソームとを１：３の割合で混合し、全脂質が０．２ｍＭとなるように希釈した。セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラムで、外部緩衝液を３００ｍＭスクロース、１ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４．０に交換し、その後、試料を１０ｍＭ脂質に希釈した。融合測定のために、２０μｌの蛍光標識リポソームと、６０μｌの標識していないリポソームとを、３．９２ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に添加した。室温で５分間インキュベートした後、３ｍｌをキュベットに加え、５分間にわたって蛍光をモニターした。励起及び発光波長は、それぞれ、４６５ｎｍ及び５３５ｎｍであり、発光５３０ｎｍカットオフフィルターを用いた。勾配を消失させ、融合を生じさせるために、最終濃度が１００ｍＭとなるように３０秒で酢酸アンモニウムを加えた。ゼロ蛍光（Ｆ0）を、酢酸アンモニウムを加えていないトレースに当てはめ、Ｆmaxを、１００μｌの２５ｍＭトリトンＸ−１００を添加後測定したトレースに当てはめることにより、蛍光の変化のパーセント（％Ｆ／Ｆmax）を求めた。すなわち、
％（Ｆ／Ｆmax）＝１００×（（Ｆ−Ｆ0）／（Ｆmax−Ｆ0））
融合に及ぼすＡＬ−１濃度変更（０〜２０モル％）の影響を検討するために、それぞれ０．５モル％のＮＢＤ−ＰＥとＲｈ−ＰＥを有するものと有しないものについて、内部の、ｐＨ４．０、３００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液と外部の、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）とを用いて、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）を含むリポソームを調製した。標識したリポソームと標識しないリポソームとを１：３の割合で混合し、全脂質が０．２０ｍＭとなるように希釈した。最終濃度が１００ｍＭとなるように酢酸アンモニウムを３０秒で添加することにより、ｐＨ勾配は消失した。
ＡＬ−１含有リポソームの融合速度に及ぼすＤＯＰＥ濃度変更の影響を検討するために、ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ（５５−Ｘ：Ｘ：４５、Ｘ＝０、５、１０、１５、２０）、１０モル％ＡＬ−１を有し、それぞれ０．５モル％のＮＢＤ−ＰＥとＲｈ−ＰＥを有するものと有しないものについて、内部の、ｐＨ４．０、３００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液と外部の、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）とを用いたＬＵＶを調製した。
ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ（３５：２０：４５）リポソームの融合に及ぼすアミノ脂質構造の影響を検討するために、５モル％の上記アミノ脂質（ＡＬ−１〜ＡＬ−６）を有し、内部の、ｐＨ４．０、３００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液と外部の、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）とを用いたリポソームを調製した。融合測定は、上述のように行った。
結果を図３、４、６、７及び９に示す。酸性の内部液を有するリポソームの膜を横切るｐＨ勾配は、ニゲリシンなどのイオノホアにより、あるいは中性アンモニウムの形で膜を横切って、内部ｐＨを高めることができるアンモニウムイオンを添加することにより、消失させることができる。ＡＬ−１が、独占的に内側単分子膜に存在するＬＵＶについては、ｐＨ勾配の消失により、ＡＬ−１が単分子膜間で再分配されるものと期待されよう。ＡＬ−１が脱プロトン化され、二分子膜が不安定な条件下では、リポソームの融合が起こり得る。
膜融合は、蛍光標識脂質ＮＤＢ−ＰＥ及びＲｈ−ＰＥ間のＲＥＴの消失によってモニターした。これらの標識の両方を含むリポソームが、非標識リポソームと融合した場合は、蛍光プローブの得られた希釈液が、ＮＤＢ−ＰＥについて蛍光の増加を示す。これらの標識された脂質のリポソーム間の顕著な交換は、凝集系においてさえも、起こるとは思われず、膜脂質の混合に際してのみ、蛍光が増加する。
１０モル％ＡＬ−１を含むＬＵＶにおける融合を実証するための蛍光プローブ希釈測定の使用を、図３及び４に示す。ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）を含み、ＡＬ−１を含まない非標識及び標識リポソーム（３：１）は、ｐＨ勾配の消失に際し、蛍光の増加を示さない。アンモニウム溶液の添加のために、わずかな蛍光の減少が認められた。１０及び２０モル％のＡＬ−１を含む同様なリポソームでは、３％近辺のΔＦ／ΔＦmaxの値において、蛍光が急激に増大する。これは、正常濃度（０．１８モル％）の４分の１において、蛍光標識でリポソームを調製することにより測定したとき、非標識及び標識リポソームの３：１混合物については、８０％のΔＦ／ΔＦmaxを与えるはずである全体の起こり得る脂質混合の制限量（a limited amount of the total possible lipid mixing）を示しているに過ぎない。観察された低い蛍光増加は、ＡＬ−１ではＥＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム中でｐＨ勾配で制御された融合を引き起こすことができるが、そうするためのその能力が制限されていること示している。約２０％よりも大きいＡＬ−１濃度に関しては、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームにおいて、押し出し後、急激で完全な凝集が認められた。
脂質二分子膜にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むことにより、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームの融合性を高めることができる。図３は、ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ（３５：２０：４５）の融合に及ぼす１０モル％ＡＬ−１の影響を実証する蛍光トレースを示す。アミノ脂質なしでは、酢酸アンモニウムでｐＨ勾配が消失した場合、融合の証拠は極めて少なかった。しかし、ＡＬ−１を含んだ場合は、５分間で、ΔＦ／ΔＦmaxが約１０％に上昇し、１５分間にわたって上昇し続けた。この結果は、制御融合におけるＡＬ−１の有用性を示すものであり、観察される融合の範囲で、脂質組成物の重要性を説明するものである。ＥＰＣの代わりにＤＯＰＥの濃度を増やしていった、１０モル％ＡＬ−１を含有するＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌについての融合測定の結果を、図６に示す。ＤＯＰＥ濃度を３５：２０：４５の脂質比（ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ、モル／モル）まで増大させるにつれて、融合速度が大きくなることは明らかである。この組成は、５分後に、ΔＦ／ΔＦmaxが５％よりも大きくなる。しかし、ＤＯＰＥのこの濃度では、低ｐＨにおいて、リポソームに若干の凝集が認められた。ＤＯＰＥ濃度が高くなると、急激に凝集が起こった。
ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ（３５：２０：４５）リポソームにおいて、ＡＬ−１の濃度を約５モル％まで減らした場合に認められる最良の融合速度を図７に示す。この組成でｐＨ４．０において、安定なリポソームが調製され、外部ｐＨを７．５に上げた場合に、安定なままであった。ｐＨ勾配が消失すると、最初の５分間で、ΔＦ／ΔＦmaxがほぼ直線状に、１０％よりも高い値に上昇する。融合速度は、時間と共に低下したが、１５分の測定時間の間は、融合が継続した。
ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ（３５：２０：４５）リポソームに各アミノ脂質の５モル％を含むリポソームについて、融合を測定することにより、アミノ脂質ＡＬ−１〜ＡＬ−６の融合能力を比較した。結果を図９に示す。単一のオレオイル鎖を有するＡＬ−２は、アミノ脂質を含まないリポソームと比較して、リポソーム融合をほとんど増加させない。融合活性の欠如は、このような二分子膜において、ＡＬ−２のｐＫaが相対的に高く、ＡＬ−２の単一のアシル鎖が占める二分子膜中の面積が相対的に小さいことに起因するものと考えられる。理論によって制限される意図は全くないが、二分子膜の不安定化、即ち、融合には、融合性脂質のヘッドグループの大きさとそのアシル鎖が占める面積の大きさの間の実質的な不均衡が必要であると考えられる。ＡＬ−３を含むリポソームは、実質的により大きい融合速度を示し、ＡＬ−３の第二の鎖を長くして、ブチリル（ＡＬ−４）又はデカノイル（ＡＬ−５）にすると、融合速度が更に大きくなり、ＡＬ−１含有リポソームで達成された速度に近づく。二つのデカノイル鎖を有する化合物ＡＬ−６をリポソームに混合すると、比較的ｐＫaが低いにも拘わらず、限られた混合が行われるにすぎない。
実施例５
2Ｈ−ＮＭＲ分光法
重水素除去水を用い、ｐＨ４．０及びｐＨ７．５において、１００ｍＭ酢酸アンモニウムで、上述のようにして、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）に１０モル％ＡＬ−１−ｄ4を含む凍結解凍ＭＬＶを調製した。サンプル濃度は、全脂質が約１５０ｍＭであった。５．３μｓ９０°パルス及び２００ｍｓ繰り返し遅延（repeat delay）のスピンエコーシークェンスを用いて、３０．７ＭＨｚにおいて、Bruker MSL200分光計で、広幅四重極スペクトルを記録した。温度は、液体窒素フロー系で、２０℃に保持した。ｐＨ４．０のサンプルについて、フリーインダクションディケイ（free induction decay）（ＦＩＤ）信号を、一晩（約２８０，０００スキャン）蓄積し、一方、ｐＨ７．０のサンプルでは、比較できる信号対雑音（signal-to-noise）を、約７７０スキャンで行った。１００Ｈｚ線広がり（line-broadening）を用いて、ＦＩＤを変換した。
実施例６
2Ｈ−ＮＭＲ及び31Ｐ−ＮＭＲ分光法
重水素除去水を用い、ｐＨ４．０及びｐＨ７．５において、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ酢酸アンモニウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌで、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）に５モル％ＡＬ−１−ｄ4を含む凍結解凍ＭＬＶを調製した。サンプル濃度は、全脂質が約２００ｍＭであった。５μｓ９０°パルス、５０μｓパルス間隔、３０．５μｓリングダウン（ring-down）遅延及び３００ｍｓ繰り返し時間を用いて、４６．１７５ＭＨｚにおいて、自家製の３００ＭＨｚ分光計で、2Ｈ−ＮＭＲ広幅スペクトルを記録した。８段階位相サイクリングの四重極エコーシークェンスを用いて、２００，０００スキャンを蓄積した。得られたフリーインダクションディケイ（ＦＩＤ）を１００Ｈｚ線広がりで変換した。２．８μｓパルス及び３０ｓ繰り返しを用いて、８１ＭＨｚにおいて、Bruker MSL200分光計で、高解像度31Ｐスペクトルを記録した。温度は、液体窒素フロー系で、２３℃に保持した。１０００スキャンにわたって、ＦＩＤを蓄積し、５０Ｈｚ線広がりで変換した。
ＮＭＲ分光法の結果を図５及び８に示す。ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ(55:45)リポソームにおける１０モル％ＡＬ−１については、融合の程度が限られていることが認められ、これは、アミノ脂質の脱プロトン化された形が、二分子膜中で安定ではなかったが、この不安定性が、脂質膜に永久的な非二分子膜構造を与えなかったことを示した。このことは、二分子膜中での中性アミンの溶解度が限られていることの結果であったかもしれない。広範囲にわたる融解が起こり得る前に、ＡＬ−１の分離した結晶領域又は流体領域が形成されるのかもしれない。
重水素鎖標識類似体、ＡＬ−１−ｄ4を合成し、１０モル％ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）の濃度で、ＭＬＶに混合することにより、ＡＬ−１の相挙動を調べた。この実験でＭＬＶを使用する際には、ＮＭＲ時間スケールにおいて、ＬＵＶを急激に振り混ぜることを避けた。図４において、ｐＨ４．０の2Ｈ−ＮＭＲスペクトルが、二分子膜中の脂質について期待される大きさの、ＡＬ−１−ｄ4の鎖標識位置に対応する四重極スプリッティングを示している。ｐＨ７．５では、二分子膜のシグナルはもはや存在せず、スペクトルの中央部に強い等方性のピークが現れる。これは、ｐＨ７．５における分離した流体領域に、ＡＬ−１が存在していることの強力な証拠である。中和及びＡＬ−１の再分配に際して認められる限定された融合度は、これらの領域の形成の結果であると考えられる。
図８ＡにおけるｐＨ４．０の2Ｈスペクトルは、脂質二分子膜に取り込まれた脂質のオレオイル鎖に期待される範囲で、四重極重水素スプリッティングを示す。ｐＨ７．５で調製されたサンプルでは、四重極スプリッティングが減少し、これは、二分子膜の水準(オーダー)が低下していること関連しているようであるが、二分子膜は存続している。更に、約１２ｋＨｚのスプリッティングについて明確なシグナルが存在し、これは、Ｈ11相内にあるアミノ脂質のプロトンから生じるものと考えられる。従って、このシグナルの出現は、膜が融合することになる二分子膜の不安定化と一致する。
リン脂質ＥＰＣ及びＤＯＰＥの相挙動における付随する変化は、図８Ｂに示す31Ｐ−ＮＭＲスペクトルで明らかである。ｐＨ４．０の試料については、上部（upfield）にピークがあり、下部（downfield）にショルダーがある、典型的な二分子膜のシグナルが認められた。ｐＨ７．５の試料については、下部のシグナルがわずかに減少し、より強い下部ショルダーとして、Ｈ11シグナルが見られる。
実施例７
凍結粉砕（freeze-fracture）顕微鏡検査
ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）又はＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ（３０：２５：４５）中１０モル％からなるＬＵＶを、ｐＨ４．０において、３００ｍＭクエン酸アンモニウムで、上述のようにして、全脂質濃度を１５０ｍＭにして調製した。セファデックスＧ−２５カラムで、外部緩衝液を１ｍＭクエン酸塩、３００ｍＭスクロース、ｐＨ４．０に交換した。各試料２００μｌに、５０μｌの５００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．５を加えた。サンプルを室温で３０分間保持した後、白金／カーボンレプリカを調製した（Fisher及びBranton（１９７４年）参照）。
実施例８
凍結粉砕（freeze-fracture）顕微鏡検査
ＥＰＣ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ（３０：２５：４５）中５モル％からなるＬＵＶを、ｐＨ４．０において、３００ｍＭクエン酸アンモニウムで、上述のようにして、全脂質濃度を１００ｍＭにして調製した。セファデックスＧ−２５カラムで、外部緩衝液を１ｍＭクエン酸塩、３００ｍＭスクロース、ｐＨ４．０に交換した後、約１０ｍＭ脂質となるように、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で試料を希釈した。対照サンプルを取り除いた後、最終濃度が１００ｍＭとなるように３ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．５を加えて、ｐＨ勾配を消失させた。ｐＨ勾配が存在する対照サンプルの他に、勾配消失後４、１５及び３０分目のサンプルについて、白金／カーボンレプリカを調製した（Fisher及びBranton（１９７４年）参照）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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