(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物と内因性試料成分との内因性的複合体からなる試料中の分析物の検定法であって、
ａ）試料を１５，０００ｐｓｉ以上の圧力にさらすことにより内因性的複合体を解離する解離工程、及び
ｂ）解離した被検体を検出するかまたは測定し、またはその双方を行う検定工程
を含むことを特徴とする改良された検定法。
【請求項２】
分析物を外因的に供給された特異的結合試薬と反応させ、さらに分析物と該試薬を複合化することにより、分析物を検出するかまた測定し、またはその双方を行う請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
圧力が、内因性試料成分から分析物を不可逆的に解離するのに十分に高いものである請求の範囲１記載の方法。
【請求項４】
検定工程を、先ず分析物から内因性試料成分を分離することなく行う請求の範囲３記載の方法。
【請求項５】
解離工程が内因性試料成分から分析物を可逆的に解離するものである請求の範囲１記載の方法。
【請求項６】
解離工程後に、分析物を内因性試料成分から分離する工程を含む請求の範囲５記載の方法。
【請求項７】
分析物をチャンバ−内で固定化し、さらに内因性試料成分をチャンバ−から除去する請求の範囲６記載の方法。
【請求項８】
分離に半透膜を用い、内因性試料成分ではなくて、分析物が該膜を通過し得る請求の範囲６記載の方法。
【請求項９】
チャンバ−が、更に加圧供給領域にチャンバ−を連結する弁つき入口、チャンバ−を捕集領域に連結する弁つき出口、及び該弁つき入口および出口を操作するための制御器類からなる装置の一部分であり、前記方法が、内因性試料成分を除去した後に、該加圧供給領域から物質を導入することにより、分析物をチャンバ−から該捕集領域内へフラッシュすることを含む請求の範囲７記載の方法。
【請求項１０】
分析物が抗原であり、内因性試料成分が該抗原と複合化する試料抗体である請求の範囲２記載の方法。
【請求項１１】
分析物が抗体であり、内因性試料成分が該抗体と複合化する抗原である、請求の範囲２記載の方法。
【請求項１２】
解離工程が、試料を１５，０００ｐｓｉを越える圧力に少なくとも２５ミリ秒さらすことからなる請求の範囲１記載の方法。
【請求項１３】
解離工程が、試料を３０，０００ｐｓｉを越える圧力にさらすことからなる請求の範囲１２記載の方法。
【請求項１４】
解離工程が、更に試料を構造破壊剤にさらすことからなる請求の範囲１記載の方法。
【請求項１５】
構造破壊剤がＤＴＴである請求の範囲１４記載の方法。
【請求項１６】
構造破壊剤が水混和性溶剤である請求の範囲１５記載の方法。
【請求項１７】
解離工程が、試料をキレ−ト化剤、洗浄剤及びカオトロ−プからなる群から選ばれる、分析物と内因性試料成分との再会合を減少させまたは防止する試薬にさらすことからなる請求の範囲１記載の方法。
【請求項１８】
試薬がＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、またはｏ−フェナントロリン、尿素及びチオシアナートからなる群より選ばれる請求の範囲１７記載の方法。
【請求項１９】
分析物がＨＩＶ抗原であり、試料が抗分析物抗体からなるヒト体液である請求の範囲１記載の方法。
【請求項２０】
分析物がＨＩＶｐ２４、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、及びｐ１５からなる群より選ばれる請求の範囲１９記載の方法。
【請求項２１】
分析物がチロキシン、エストラジオ−ル、コルチゾ−ル、及びテストステロンであり、試料が血清グロブリンからなる体液である請求の範囲１記載の方法。
【請求項２２】
分析物がビタミンＢ１２であり、試料がトランスコバラミンからなる請求の範囲１記載の方法。
【請求項２３】
分析物が前立腺特異的抗原であり、試料がα１−アンチキモトリプシンからなる、請求の範囲１記載の方法。
【請求項２４】
分析物が上皮ムチンであり、試料が該記分析物と複合化する内因性抗体である請求の範囲１記載の方法。
【請求項２５】
分析物が全身狼瘡検定におけるＨ１ヒストンに対する抗体であり、試料が内因性Ｈ１ヒストンからなる請求の範囲１記載の方法。
【請求項２６】
検定が結核病原体用のものであり、試料が抗分析物抗体類である請求の範囲１記載の方法。
【請求項２７】
分析物がα−フェトプロテインであり、前記方法が肝細胞がん腫の診断である請求の範囲１記載の方法。
【請求項２８】
分析物がエルジニア腸炎及びエルジニア仮性結核の抗原である請求の範囲１記載の方法。
【請求項２９】
分析物がらい病原体、ミコバクテリアらいの抗原である請求の範囲１記載の方法。
【請求項３０】
分析物が抗−ＤＮＡ抗体類またはそれに結合するＤＮＡである請求の範囲１記載の方法。
【請求項３１】
分析物がイヌ糸状虫抗原である請求の範囲１記載の方法。
【請求項３２】
分析物が成長ホルモンまたは成長ホルモン結合たんぱく質である請求の範囲１記載の方法。
【請求項３３】
分析物がコレステロ−ル、低密度リポたんぱく質、及び高密度リポたんぱく質から選ばれる請求の範囲１記載の方法。
【請求項３４】
分析物が腫瘍に特徴的な抗原である請求の範囲１記載の方法。
【請求項３５】
前記解離工程が、更に外因性結合パートナーの会合からなる請求の範囲１記載の方法。
【請求項３６】
外因性結合パートナーがアプタマ−からなる請求の範囲３５記載の方法。
【請求項３７】
混合物の圧力を時間の経過と共に変化させることにより、該混合物中の内因性結合パートナーと複合化して存在する配位子と、外因的に供給される結合パートナーとの間の会合を制御する方法であって、
ａ）該混合物中の少なくとも数種の複合体を解離するように選ばれた、５００ｐｓｉ以上の第１圧力に混合物をさらすこと、
ｂ）反応混合物の圧力を、常温および常圧での複合体形成に比較して、配位子複合体形成を促進させるように選ばれた５，０００ｐｓｉ以上の第２圧力に変化させること、及び
ｃ）第２の圧力を維持した状態において、分離した配位子と外因的に供給された結合パートナーとを反応させること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
更に、第１温度および第１圧力での混合物中の複合体の解離後、混合物中の配位子を混合物中の結合パートナーから分離して分離された配位子を得ることからなる請求の範囲３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、被検体検出、検定（アッセイ）、混合物から特定の化合物の分離法の一般的分野に関する。
発明の背景
生体分子の検定：検定は、試料中に被検体が存在するか、如何に多く存在するかを決定するのに使用できる。ある場合には、上記検定は、試料中の被検体が、外部から供給される捕獲剤または結合相手と選択的に結合または複合体を形成する（特異的または非特異的に）ことに依存している。
検定に対する内在的結合相手の効果：
しばしば上記試料は、非検体と複合体を形成する内在成分を含み、生成する内在的複合体は非検体の検出を妨害することがある。たとえば、吸光度、蛍光、分子量、または他の非検体特性による検出は、内在的複合体により悪影響を受ける。検出自体が外部から供給される試薬との複合体の形成に依存するときは、内在的複合体中に存在する被検体は、外部から供給される試薬と効果的に複合体を形成することができないことがある（上記検定における検出に要求される）。こうして、内在的複合体は検定の信頼性を妨害する。たとえば、被検体は検出されないか、または検出が不完全である、すなわちそれは偽陰性のまたは非定量的結果を与える。
この問題は、標準酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）で例示でき、この場合には、試料抗原が固定化された抗体により認識され結合可能となるときだけ検出される。被検体と反応する内在的試料抗体は、被検体の少なくともある部分が外部からの検定試薬（抗体）の一つまたは両者と複合体を形成するのを妨害し、それによって検定の有効性を減じる。
病原体の特徴的な抗原または抗体の検定は、内在的結合相手により引き起こされる問題に対し特に敏感である。検定を受ける患者が、被検体抗原にたいし免疫反応を現わしているときは、試料抗原のかなりの部分が、検出できない内在的抗原／抗体複合体中に存在しうる。同様に、抗体が測定しようとする被検体である血清学検定では、検定によって測定しようとする試料抗体の若干が、内在的病原体抗原と複合体を形成することができる。
内在的抗体／抗原複合体の他に、他の内在的複合体が検定を妨害する場合があり、たとえば、種々の血清グロブリンは、チロキシン、エストラジオール、コロチゾル、テストステロンの免疫検定が妨害される。Thorell, J.I., Larson, S.M., "Radioimmunoassay and Related Techniques", C.V. Mosby, St. Louis, 1978参照。ビタミンＢ12検定は、トランスコバラミンの結合により混乱される。Laueet at., Blood 26 :202 (1965)参照。前立腺特異的抗原（PSA）の免疫検定は、セリンプロテアーゼ禁止剤α1-アンチキモトリプシンとの内在的複合体により混乱させられる。Lilja et al., Clin. Chem. 37 : 1618-1625 (1991)参照。
内在的複合体が検定結果に酷く影響する他の分野には、たとえば、免疫検定において、腫瘍の存在を標識するために腫瘍抗原を使用する場合である。しばしば、この腫瘍標識体は内在的複合体によりマスクされる。たとえば、血清チログロブリン自己抗体は、分化甲状腺カルチノーマの検出を妨害する。血清腫瘍抗原の正確な定量を得るのが困難な他の例は、上皮ムチンMUC-1である。Gorevitch et la., Br.J. Cancer, 72 :934-938 (1995) ; Hilgers et al., Sxand. J. Clin. Ob. Invest. Suppl., 221 : 81-86 (1995).
内在的複合体形成に関連付けることができる特別の問題は、ＨＩＶ検定で表面化された。Tsiquaye et al., AIDS, 2: 41-45 (1988) ; McHuch et al., J. Infect. Dis., 158 : 1088-1091 (1988) ; Nishanian et al., J. Infect. Dis., 162: 21-28 (1988) ; Carini et al., Scand. J. Immuno., 26: 1 (1987).この問題が起こり得る他の検定には、上皮ムチン（MUC-1およびPEM）検定（Gorevitch et la., Br. J. Cancer, 72: 934-938 (1995) ; Hilgers et al., Scand. J. Clin. Ob. Invest. Suppl., 221 : 81-86 (1995)）、全身狼瘡検定におけるH1ヒストン（Wesierska-Gadek et al., Arthritis Rheum, 33:1273-1278 81990）、結核病原体検定（Dlugovitzky et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 28 :331-335 (1995)、肝細胞カルチノーマ検出のためのα-フェトプロテン検定（Tsai et al., Br. J. Cancerr, 72: 442-446 (1995)）、エルジニア腸炎およびエルジニア仮性結核の検定（Didenko et al., J. Basic Microbiol., 35:163-170 (1995)）、らい病原体の検定（Sinha et al., Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis., 60 : 396-403 81992)）がある。
溶剤抽出、加熱、たんぱく質沈殿、競争的阻害剤の使用、ｐＨ変化を含め、内在的抗体／抗原複合体を解離し、それにより検定感度を向上するため、種々の方法が記載されてきた。たとえば、Mosier, 米国特許No.4,656,251、Weil et al., J. Immunology, 134 : 1185-1191 (1985)は、イヌ糸条虫抗原検定前に、免疫複合体を破壊するため、イヌ試料を予備加熱することを開示している。米国特許Mosier'251は、複合体を解離するため酸性にし、次いで解離した抗体を加熱により変性することを開示している。Weilは、EDTAを添加し、ついで加熱することを含む方法を開示している（p. 1186, 右欄）。
加速高感度検定：感度はインキュベーション時間を長くする（たとえば一夜）することにより改良できるが、高処理量および自動化も重要な最終目的であり、それは長いインキュベーションに相反するものである。高処理量自動化機器が広く利用されるようになるに伴い、検定結果は一層迅速（すなわち数分以内）に要求される。被検体／結合相手相互作用を促進する要求には、多量の外部からの結合相手の添加により、または最適以上の温度条件を利用して許容される検定時間内にできる限り結合反応を駆動することにより、対応することができる。
生体分子の分離：生物活性化合物の広く受入れられた精製法は、アフィニテイクロマトグラフィである。この方法は、多くの生物活性化合物が異常な特異性をもって他の分子に結合するという前提に基づくものである。これら他の分子は、普通”配位子（リガンド）”と呼ばれる。たとえば、特定の化合物を結合するために同定された配位子には、核酸、ビタミン、炭水化物、脂肪、たんぱく質（たとえば酵素、抗体、受容体）があるが、これらに限定されない。
アフィニテイクロマトグラフィーの第１工程は通常、問題とする化合物に特異的に結合する配位子の確認である。上記配位子は、多くの酵素および他の化合物について既に既知である。一旦配位子が確認され、得られたら、この配位子を固体担体に結合できる。固体担体は、たとえば、多孔性サック内にトラップでき、またはより一般的には多孔性カラム内に固定できる。とりわけ問題とする化合物を含むことが分かっている溶液を、固定化配位子と接触し結合するように、一般にはカラムを通しフラッシュする。
必要な固定化配位子の量は、存在することが期待される所望の化合物の量に依存する。典型的には、各配位子は、化合物の限られた数の分子に結合できる。しかし、多くの複雑性が、実用上、この一般化をより効果のないものとしている。たとえば、特に化合物が比較的大きな分子量のマルチドメイン蛋白質であるときは、立体的束縛が、所定の容積内に存在する化合物の分子数を限定することがある。また、目的とする化合物がしっかりと結合する同じ配位子に弱く結合できる他の望ましくない化合物があり得る。後者の問題は、望ましくない弱く結合する化合物が過剰に（すなわち望む化合物に対し）存在するときは、とくに深刻となる。従って、高親和性、高特異性相互作用を促進することが望ましい。
アフィニテイクロマトグラフィーの典型的分取応用では、所望の化合物を含む不純溶液を、固定化配位子を含む多孔性材料（たとえば床またはカラム）に通す。所望の化合物は配位子に結合し、したがって、それ自体が固定化される。他の化合物を含む溶液中の残存不純物は、追加の新しい緩衝液または溶剤で流し出され、所望の化合物に結合した固定化配位子が残る。
一旦不純物が流し出されると、目的の化合物を固定化配位子との結合関係から遊離できる。この工程を”溶出”と呼ぶ。たとえば、ｐＨ、温度、イオン濃度の変化により、または固定化配位子に比べ化合物に対し一層大きな親和力をもつことが知られている異なる配位子の添加により（すなわち化合物を置換するために）、化合物-配位子複合体を不安定にすることにより、溶出を実施できる。配位子または化合物に対し不可逆的損傷を避ける比較的温和な条件で、溶出を行うことが望ましい。また分離後、簡単な回収を確保する条件で、所望の化合物を溶出することが望ましい。
アフィニテイクラマトグラフィーは時々、結合対の固定化メンバーとして、抗体、酵素または他の結合たんぱく質を使うが、この場合には、特定の配位子または基質が単離または精製しようとする所望の化合物である。免疫アフィニテイクロマトグラフィーと呼ばれる型のアフィニテイクロマトグラフィーは、配位子として抗体を使う。免疫アフィニテイクロマトグラフィーの利点のいくつかは、１）抗体多様性の免疫学的方法が、配位子を見いだす働きをし、そして２）抗体が高い特異性を示すことである。
発明の概要
本発明は、（１）被検体と外部からの結合因子から形成された複合体を検出できるように、内在的結合相手と複合化した被検体の圧力仲介解離、（２）被検体の一層迅速なおよび／または一層敏感な検出を可能にするため、被検体と外部からの結合相手との圧力仲介会合、（３）複雑な混合物から一つの生体分子の分離を可能にするため、生体分子複合体の圧力仲介会合および解離を特徴とするものである。
圧力は、内在的被検体複合体を解離することにより検定を改良し、被検体分子と外部から供給した結合相手とを会合することにより検定速度と感度を改良するために使用できる。汚染された混合物から化合物の分離を改良するために、圧力を使用もできる。
検定：内在的被検体複合体を解離するため、圧力を制御でき、それにより被検体と複合化する外部からの成分を含む試料中に存在する被検体の検出を改良できる。上記のように、上記内在的複合体は、種々の方式で被検体の検出を妨害する可能性がある。そのような妨害の１つの特徴的な例は、被検体と被検体用の外部から供給された特異的結合相手との複合化の測定に依存している検出方式を含む。
本発明の一態様においては、内在的被検体複合体を、制御圧力下に解離し、検出のための被検体有効量を改良する。たとえば、内在的複合体（弱いまたは強い）の圧力誘発解離は、外部からの結合相手にたいする結合（すなわち動力学的または熱力学的）を向上させることにより、被検体検出を改良できる。本発明のこの態様は、被検体と内在試料成分から形成された内在的複合体を解離するのに十分な高い圧力（たとえば好ましくは、少なくとも１５，０００ｐｓｉ、すなわち１０５ＭＰａ、最も好ましくは少なくとも３０，０００ｐｓｉ、すなわち２１０ＭＰａ）に試料をさらす解離工程を特徴としている。この解離工程に次いで、外部からの特異的結合相手を試料被検体と反応させる被検体検出工程がある。本発明のこの方式では、圧力の増加が、内在的複合体の成分の構造破壊（可逆的または不可逆的３次元構造の変化）をまねき、結合相手の解離を促進するものと考えられる。
更に詳しくは、解離圧力は、内在結合成分から被検体を不可逆的に解離するのに十分高くすることができる（必ずしも必要ではないが）。解離が不可逆（たとえば、複合体の１メンバーが、内在的複合体再会合を実質上妨げるように構造的に破壊される）であるときは、被検体から構造的に破壊した結合成分をまず除去することなく、検定工程を実施できる。望むときは、変性剤（たとえば尿素）、水混和性溶剤、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、またはｏ−フェナントロリンのようなキレート化剤、洗剤、またはジチオトレイトール、尿素、チオシアン酸塩のようなカオトロープのような、再会合を妨げまたは減らす試薬を添加できる。この試薬は好ましくは次の検定工程で許容されるべきであり、これらの工程に先立って除去する必要は無い。
可逆解離にたいしては、解離工程後行われる別の工程で、被検体を内在試料成分から除去する。たとえば、外部からの被検体結合試薬を試料と共にチャンバー中で固定化できる。チャンバー圧力を増して、複合体を解離し、その後圧力を維持したまま、内在結合成分をチャンバーから除去する。チャンバーは、内在被検体を通すが、内在試料成分を通さないように選ばれた半透膜であることが可能である。
別の実施態様では（または上記実施態様との組み合わせでは）、温度、圧力または両者を制御し（普通は増す）、混合物中に存在する配位子と外部から供給れた結合相手との間の会合を制御する。たとえば、圧力と温度を、通常の（１気圧、室温）条件に比較し、会合を改良するように維持して、検定を実施する。先ず混合物を、混合物中の内在結合相手から、混合物中の配位子（被検体）を分離する温度および圧力下におき、次いで分離した配位子の温度、または圧力またはその両者を、常温および常圧における複合体形成に比較し、配位子複合体形成を促進するように選ばれた第２の温度または圧力またはその両者に変えることにより、本発明の種々の態様を組み合わせることができる。一般に、第２の温度または圧力は、通常の条件と上記の分離工程で使った温度、圧力との中間である。第２の温度および圧力で、分離した配位子は外部から供給された結合相手と反応する。
加圧供給領域と弁付き入口でチャンバーに連結し、廃物捕集領域と弁付き出口でチャンバーに連結し、制御器が弁付き出口を操作する装置（参考文献として含めた、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３２３２に記載の）を使い、上記方法を実施できる。加圧供給区域から物質を導入することにより、被検体を、チャンバーから流し入れ、捕集室に流し入れる。
本発明は、多様な被検体に対して実施できる。特に、被検体が抗原であることが可能で、本法により、抗原と複合化する内在抗体を解離できる。被検体が抗体の場合、本法により、抗原と抗体の複合体を解離できる。更に、被検体が複数の内在成分と複合化するときは、本法により、このような１つ以上の複合体から被検体を解離できる。
内在的複合体が少なくともある程度、検定を妨害することが知られている場合、上記解離は特に有用である。本発明は、特にａ）試料が抗被検体抗体を含むヒト体液であるＨＩＶ抗原（たとえば、ｐ２４、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｐ１５）、ｂ）試料が血清グロブリンからなる体液である、チロキシン、エストラジオール、コルチゾール、テストステロンのような非たんぱく質被検体、ｃ）試料がトランスコバラミンを含むビタミンＢ12、ｄ）試料がα1-アンチキモトロプシンまたはα2-マクログロブリンを含む前立腺特異的抗原、ｅ）試料が被検体と複合化する内在抗体を含む上皮ムチン、ｆ）試料が内在Ｈ1ヒストンを含む全身狼瘡検定におけるＨ1ヒストンにたいする抗体、ｇ）試料が抗被検体抗体を含む結核病原体、ｈ）方法が肝がん腫瘍の診断であるα−フェトプロテン、ｉ）エルジニア腸炎症またはエルジニア仮性結核の抗原、ｊ）らい病原体、ミコバクテリアらいの抗原、ｋ）抗ＤＮＡ抗体またはそれへのＤＮＡ結合、１）イヌ糸状虫属イミチ抗原またはそれにたいする抗体、ｍ）成長ホルモンまたは成長ホルモン結合たんぱく質、ｎ）コレステロール、ｏ）低密度リポたんぱく質、ｐ）高密度リポたんぱく質、ｑ）がん関連病理学状態の診断、監視、または予後指標として使用できる腫瘍抗原の検定に使用できる。
多くの腫瘍標識において特に懸念されることは、上記標識は良性疾病ではしばしば検出されるが、患者の抗体との複合体形成により初期段階悪性では無くなるということである。たとえば、血清チログロブリン自己抗体は、分化甲状腺がん腫の検出を妨害する。複合体の適当な制御および解離により、腫瘍標識を使って、腫瘍負荷量を定量化でき、たとえば臨床的経過および患者の状態を監視できる。特に、腫瘍抗原負荷量を、時間にわたり順次測定できる。本発明はまた、全被検体水準を、解離した被検体と内在的複合体中に存在する被検体に分離できる。こうして誘導された情報、たとえば自己抗体水準は、臨床的に有用であり得る。遊離の抗原および複合化した抗原が均衡から外れるときは、均衡を体外的に補正して、腫瘍にたいする細胞毒性および体液毒性の両者を増すことができる。
本発明は、内在的複合体を含む検定を向上するだけでなく、抗原および抗体が複合体中に存在するかどうかに関わらず、如何に多くの、またどんな型の抗原および抗体が存在するかを正確に一層良く理解することを可能にする。この能力は、病気およびその経過にたいする免疫応答を追跡する能力を向上できる。
本発明は、内在被検体が始めは被検体と複合化していないが、検定のプロトコールおよび試薬が、上記望ましくない複合体形成を誘発するような検定を改良することもできる。
”内在的複合体”の用語は、検出可能な所望の複合体となっていない限り、検定により誘発される望ましくない複合体、さらに検定成分と形成する複合体をも含む。圧力制御は、上記新規な検定誘発複合体形成を改良することもできる。
本発明はまた、内在的結合複合体の解離が、アプタマーのような外的結合相手の会合を伴う実施態様を含む。
分離：親和力に対する圧力の影響を、アフィニテイクロマトグラフィー法の改良に使用できる。目的の化合物を含む汚染混合物を、圧力依存親和力または活性を有する望む化合物に結合することが既知の分子と、流体接触させることができる。反応器内の圧力を、望む化合物が固定化分子に一層早くまたは一層しっかりと結合するように変化させることができる。汚染物を先ず流し去り、次いで、たとえば更に圧力を変えることにより、精製した化合物を固定化分子から解離できる。
一般に、本発明は、望む化合物と１種以上の汚染物を含む混合物中の、少なくともいくらかの汚染物から望む化合物を分離する方法を特徴としている。この方法は、望む化合物に対し圧力依存親和力をもつ結合分子、および混合物（すなわち結合分子との流体接触で）を提供し、望む化合物の結合分子の親和力を増し、結合した複合体を形成するために各分子と混合物に第１圧力をかける方法を含む。これらの工程は、どの順序でも実施できる。次いで、結合した複合体を、少なくともいくらかの汚染物から分離し、圧力を第２圧力（すなわち望む化合物に対し結合分子の親和力を減らす）に変え、結合分子を最後に望む化合物から分離する。
本文脈において、”親和力”の用語は、結合の動力学および熱力学の両者を記載するのに使用する。そこで、１組の条件が、”試薬にたいする被検体の親和力を増す”と言うときは、その条件は被検体−試薬複合体の形成速度を増す、またはその条件は反応系の平衡を複合体形成の方向に押しやる、またはその両者であると理解すべきである。”増加した配位子複合体形成”はこれと同様な意味を有する。
更に、”圧力依存方式で化合物と会合する分子”の句は、会合速度（すなわち結合分子−望む化合物複体形成）を増すか、または系の平衡を会合の方に移動する、またはその両者を意味する。
第１および第２圧力は、各々、結合分子およびその分子と流体接触する混合物の両者を含む系を通し均一であることができる。
結合分子を、たとえば固体担体（たとえば、重合体ビード、粒子、細片、管、カラム、成形体、重合体マトリクス）に結合させることにより、または結合対の１成分のみを通す半透膜を使うことにより、固定化できる。
流体混合物は、たとえば水、水性溶液、有機溶剤、有機溶液、ガスまたは超臨界流体を含むことができる。
望む化合物および結合分子は、結合した複合体を形成できる次の組のメンバー、ポリペプチド、たんぱく質、抗原、ハプテン、抗体、プリオン、炭水化物、核酸、ステロイド、トリグリセリド、基質、酵素、ホルモンを含むことができるが、これらに限定されない。従って、結合した複合体は、たとえば酵素−基質複合体、配位子−受容体複合体、糖たんぱく質−レクチン複合体、たんぱく質−補因子複合体、核酸−補因子複合体、ハイブリッド形成核酸−標的複合体、ハプテン−抗体複合体または抗原−抗体複合体を含むが、これらに限定されない。
第１圧力、または第１および第２圧力は、常圧より大きくする（たとえば５００と２００，０００ｐｓｉの間、または５，０００と２００，０００ｐｓｉの間）ことができる。
第１圧力を、混合物、結合分子またはその両者を用意する前または後にかけることができる。
ｐＨ、イオン濃度、流体組成または温度を変えて、結合分子から目的の化合物の分離を高めることができる。更に、試薬を添加して、結合複合体を解離させ、目的の遊離化合物と非結合分子を得ることができる。試薬は、たとえば酸、塩基、塩、金属、金属捕捉剤、洗剤、解離剤、カオトロピック剤、水、有機溶剤、キレート化剤、または他の結合相手であることができる。更に詳しくは、試薬はたとえばマグネシウム塩、リチウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム、尿素、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸塩、またはジオキサンであることができる。
所望の化合物は、たとえば酵素（この場合に、結合分子は酵素のための基質であることがでる）、モノクローナル抗体にような抗体（この場合に、結合分子は抗体のための抗原であることができる）、または転写補因子のような補因子（この場合に、ＤＮＡ転写を変性できる）。
所望の化合物の３次元構造は、たとえば第１圧力から第２圧力への移行により変化できる。
別の実施態様では、本発明は、所望の化合物と１種以上の汚染物を含む混合物中の少なくともいくつかの汚染物から、目的の化合物を分離する別の方法を特徴としている。
この方法は、所望の化合物に対して親和力を有し、更に所望の化合物の変性に対して圧力依存活性を有する結合分子を用意することを含む。これは、結合分子が所望の化合物に結合するだけでなく、化合物の変性を引き起こすことを意味する。上記の系の例は、酵素とその基質により与えられる。常圧では、多くの酵素はその基質に結合し、基質を変性し、”生成物”をつくり、次いで生成物を遊離する。
多くの上記の酵素の変性活性は、高い圧力により弱められ、一方、結合親和力は圧力によりしばしば増強される。そこで、酵素の基質への結合能力を精製に利用できるが、圧力は酵素が変性活性を示す水準まで低められない。
この実施態様の方法は、また、上記混合物を結合分子と流体接触させ、化合物の変性のための結合分子の活性を減らす第１圧力においてで結合複合体を形成することを含む。これらの２つの工程は、どの順序でも実施できる。次いで、結合複合体を少なくともいくつかの汚染物から分離する。
いくつかの例では、圧力を第２圧力に変化させ（すなわち化合物の変性に対する結合分子の活性を増加させ）、非結合分子を変性した化合物（すなわち生成物）から最後に分離する。
別として、または追加として、ｐＨ、イオン強度、流体組成、または温度を変えて、非結合分子から目的の化合物の分離を高めることができる。
他の別の方法では、結合複合体を解離させる試薬を与え、結合分子を所望の化合物から分離する。上記の試薬の例は、酸、塩基、金属、金属捕捉剤、洗剤、解離剤、カオトロピック剤、水、有機溶剤、キレート化剤、他の結合相手を含む。特に、試薬は、たとえばマグネシウム塩、リチウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム、尿素、ブアニジン塩酸塩、チオシアン酸塩、またはジオキサンであることができる。
第１圧力は、結合分子および互いに流体接触する混合物を含む系にわたって均一であることがでる。
たとえば、半透膜内での区分けにより、または固体担体（たとえば、重合体ビード、粒子、細片、管、カラム、成形材料、または重合体マトリクス）への結合分子の付着により、結合分子を固定できる。
流体混合物は、たとえば水、水溶液、有機溶剤、有機溶液、ガス、または超臨界流体であることができる。
所望の化合物は、たとえばポリペプチド、核酸分子、抗体、トリグリセリド、ステロイド、プリオン、または炭水化物であることができる。
結合分子は、たとえば酵素であることができ、この場合には結合複合体は酵素−基質複合体であることができる。
一方、所望の化合物は、たとえば酵素であることができ、この場合には結合分子は酵素のための基質であることができる。
第１圧力は、常圧より大であることができる（たとえば５００と２００，０００ｐｓｉの間、または５，０００と２００，０００ｐｓｉの間）。第１圧力を、混合物を与える前にかけることができる。第２圧力も、常圧より大であることができる。
どの実施態様でも、本方法を少なくとも１回（たとえば１、２、３またはそれ以上の回数）繰り返して、混合物からより多くの汚染物を除去することができる。
ふるい分け（スクリーニング）：別の実施態様では、本発明は、標的を結合する分子のための分子ライブラリをふるい分ける方法を特徴としている。この方法は、分子ライブラリのメンバーを、常圧で標的と流体接触させて、複合体を形成し、検出手段を使用し実時間で結合速度と親和力を監視し、複合体を解離させる高い圧力に複合体をかけ、解離したメンバーを固定した標的からフラッシュ除去し、これらの工程をライブラリの他のメンバーで繰り返し、検出手段により集めた結果を分析し、ライブラリのどのメンバーが標的に結合したかを決定する。
ライブラリは、たとえば、たんぱく質、炭水化物、抗体、リボザイム、オリゴヌクレオチド、ペプチド、または小さい有機分子を含むことができる。標的は、たとえばファージデイスプレーまたは他の固定化生体分子であることができる。検出手段は、たとえば放射性同位体検出器、赤外分光計、質量分析計、ガスクロマトグラフ、分光光度計、分光蛍光計、電気化学検出器、表面プラズモン共鳴検出器、核磁気共鳴分光器、走査トンネル顕微鏡、原子力顕微鏡、化学発光分光器であることができる。
変性たんぱく質の再折りたたみ：更に他の実施態様では、本発明は、予め変性したたんぱく質の再折りたたみする方法を特徴としている。この方法は、変性たんぱく質の凝集体を、凝集体を破壊するのに十分高い圧力にかけ、溶解変性ポリペプチド鎖を形成し、圧力を迅速にサイクルさせ、ポリペプチド鎖がその最低エネルギー形態に折りたたむまで、溶解変性ポリペプチド鎖を迅速に多数の形態にサンプルする工程を含む。
ある場合には、凝集体を、感圧緩衝液と混合し、その緩衝液と反対の電荷のイオン化容積を有する固相と接触させる。圧力サイクルは、ｐＨ変動により凝集体を破壊し、固相への可逆結合にり凝集体を分散させると考えられる。緩衝液自体は、固体支持体（固相と同一であることができ、または異なることができる）に共有結合でき、ポリペプチド鎖の再折りたたみのための核形成部位として作用することもできる。ある場合には、還元剤および酸化剤を添加して、ポリペプチド鎖内でジスルフィド結合の再配置させることができる。
断らない限り、ここで使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野において当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。ここで説明するものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および材料を以下に説明する。ここで示した全ての刊行物、特許出願、特許、他の文献は、その全てを引用文献とする。矛盾する場合には、定義を含め、本出願が規定する。更に、材料、方法、実施例は例示だけのものであり、それに限定れる意図はない。
請求した発明の利点は、精製化合物のきれいな分離および単離である。ある種の実施態様では、所望の化合物を、補助試薬の添加なしで、固定化結合分子から溶出できる。充填マトリックスは不必要であり、これは、従来のクロマトグラフィ法の溶出または分画工程において普通であるように、より少ない所望の化合物が非特異的吸着により失われることを意味する。充填マトリクックスは、固定化”捕獲”試薬に対して固相を与えるか、またはサイズ排除クロマトグラフィのような別のルートにより分離を行うための、カラム内部に充填される材料である。本方法で成功して使用される適度な圧力は、従来の方法と異なり、所望の化合物または固定化結合分子に不可逆損傷を引き起こさない。
本発明の他の特徴及び利点は、次の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
図１は、検定試薬に圧力をかけるために使用できる反応器の模式図である。
図２は、図１の反応器のバネシールおよびグランド座金を示す。
図３は、図１の反応の油圧系の模式図である。
図４は、状態図である。
図５は、本発明の分離工程に対する、圧力対時間のプロットである。
図６は、常圧、常温における時間の関数としての、ｐ２４：抗−ｐ２４抗原：抗体結合のプロットである。
図７は、常温で１０分間、圧力の関数としての、ｐ２４：抗−ｐ２４抗原：抗体結合のプロットである。
図８は、常温で６０，０００ｐｓｉで、時間の関数としての、ｐ２４：抗−ｐ２４抗原：抗体結合のプロットである。
発明の詳細な説明
検定：種々の詳細な実施態様を、下記で更に詳細に議論する。これら実施態様の若干は、内因的複合体の不可逆または可逆分離を含む。他の実施態様は、所望の（外因的）複合体の会合を改良する。これら種々の実施態様を達成するため、圧力選択に関する一般的考慮も下記で議論する。
不可逆解離：一般に、不可逆分離は、たとえばたんぱく質の不可逆構造の崩壊（たとえば３次構造の変化）により、少なくとも一つの複合化メンバーを不可逆的に変化させるのに十分な圧力を必要とする。外因的結合相手に結合している被検体に影響を与えないように、被検体ではなくて、内因試料成分の構造を破壊（崩壊）させるのが通常は好ましい。しかし、ある場合には、検定に対し必要な被検体の結合特性に影響を与えることなく、特に厄介な内因的複合体の再会合を防ぐように、被検体を不可逆的に変化させることができる。典型的には、被検体が非たんぱく質抗原であり、内因的複合体が内因抗体を含むときは、抗原に実質的に影響を与えることなく、圧力を利用して内因抗体の構造を不可逆的に破壊できる。血清検定においては、内因抗体が被検体であり、そして宿主感染から生じた抗原の構造を不可逆的に破壊させるのが好ましいであろう。
６０，０００ｐｓｉ以上の圧力が免疫複合体のような内因的複合体の不可逆分離に効果があることが示されている。圧力は被検体を不可逆的に変化させるほど高くはない（たとえば、１５０，０００ｐｓｉ以上ではなく、そして好ましくは８０，０００ｐｓｉ以上ではない）。
不可逆構造破壊の１形態では、ここで引用文献とする、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３２３２、１９９６年３月７日出願の"Pressure Cycling Reactor"に開示のように、試料を小さな圧力容器に入れる。圧力を３０，０００乃至６０，０００ｐｓｉに上げ、次いで検定に必要な複合体形成を可能としまたは向上さえする圧力に戻す。
最適圧力の決定は、他の系成分に悪影響を与えることなく、所望の不可逆構造破壊が起こる範囲の確認を含むことができる。下記のように、被検体結合は一般に温度および圧力に関係する。先ず、被検体溶液を上昇する圧力（たとえば、１，０００から６０，０００ｐｓｉに）にかけ、そしてその後で標準技術で検定して、その検定で使用された構造破壊しきい値を決定する簡単な実験により、被検体の圧力感度を決定できる。次いで、内因的複合体を含む実際試料をしきい値以下の圧力にかけて、不可逆的複合体分離が起こるかどうかを決定できる。
必要なときは、温度を変えて構造破壊を促進できる。たとえば、低温では、圧力誘発構造破壊は周囲温度におけるよりも低い圧力で起こる。高温では、周囲温度におけるよりも高い圧力が構造破壊を促進するのに必要である。更に、カオトロープ（chaotropes）、水混和性有機溶剤、キレート化剤、洗剤（たとえばトリトンＸ−１００）、尿素、チオシアン酸塩、酸、塩基のような試薬の添加により、制御を達成できる。上記試薬の濃度は、周囲圧力での複合体分離をおこさないか、または次の検定工程に影響を与えないように十分低いのが好ましい。高圧は複合体成分をこれら試薬によって傷つけやすくする、そこで、低濃度が効果的でありうる。
一旦試料圧力を減らしたら（たとえば周囲圧力に）、競争および過剰試薬免疫検定および親和性標識形態を含め、多くの熟知の形態のいずれかにより、検定を実施できる。被検体の視覚化および／または定量化を可能にする種々の試薬（たとえば色を出す酵素反応、蛍光反応、放射標識、コロイド金、及びその他の多くのもの）に依存する多くの適当な免疫検定形態が存在することは、当業者が良く認識する所である。
使用できる多くの適当な物理的形態および装置があることも、当業者は理解できる。たとえば、圧力処理した試料を単に圧力バイアルからとりだし、標準固相捕獲形態に適用できる（たとえば、David et al., 米国特許第4,486,530号および第4,376,110号参照）。
上記形態で使用する試薬も、本発明の精神を変えことなく、変化できる、モノクローナル抗体に基づく技術を、問題となっている特異的性質、たとえば他のエピトープの構造的破壊に使用された圧力に感じない試料抗原のエピトープを結合する能力にたいし選択できる。そのような抗体を得るのに使用できる標準モノクローナル抗体選別技術はこの説明から明らかである。
可逆的解離：１実施態様では、圧力が内因的抗体試料複合体を解離し、次いで所望の分画を分離し、相手を検出できる。これを達成できる多数の方法がある。たとえば、抗体により複合化されている抗原を検出することが目的である場合は、固定化抗原を過剰に添加することによって、抗体を効果的に蓄積し、それを系から除去する。この解離の完結は試薬の過剰量に依存する。
他の分離技術は、サイズによる物理的分画（たとえば大きな分子量成分の洗浄を可能にするゲル濾過）、小さな疎水性抗原を抽出するための溶剤の使用、または固定化２次抗体を使用する親和性抽出による解放された抗体の除去を含む。
多くの物理的および免疫学的分離技術が、新未複合化成分の再会合を防ぐために、それを分離し、または他の方法で抑制する手段として、応用できることは、当業者には明らかである。
ここで引用文献とするＰＣＴ／ＵＳ９６／０３２３２から抜粋した図１乃至３は、下記のように、試料上に高圧力を維持するため使用できる装置を開示している。試薬を高圧反応器中に通し、チャンバーから分離した内因試料成分を除去る別の装置が記載されている。
圧力サイクル反応器：図１を参照すると、反応器１０は、たとえばポリエチレン製の、試料カプセル１７を含めるためのチャンバー１５を規定する壁１３をもつ反応モジュール１２を含む。反応モジュール１２の部分１２ａは、カプセル１７をチャンバー１５に置くことを可能にする。チャンバー１５に圧力をかけるための短ストローク圧力伝達空気圧シリンダー１４および圧力伝達油圧シリンダー１６が、基板１８に据えつけられている。反応器モジュール１２は、たとえばステンレス鋼製のトラス２０により支持され、可変容積圧力室２３を規定する。たとえば青銅合金製の軸受け２４により支持され案内されるたとえば直径３／１６インチのピストン２２が、反応室１２中の孔２５とシリンダー１４および１６の間に連通している。ピストン２２は、シリンダー１４および１６と共に、チャンバー１５内の圧力を制御する容器加圧器２１を形成する。反応器モジュール１２はたとえばステンレス鋼から作られ、孔２５は直径約０．１８８インチ、長さ約１インチをもつ。
図２を参照すると、シール３６、たとえばBal Seal Engineering Co. Inc., Santa Ana, CAから入手可能なバネ３６ａおよびバックアップ座金３７、３７ａ及び３７ｂを含むばね活性化シールは、たとえばグランド座金３８により支持され、反応室１２内のピストン２２をシールする。グランド座金３８は、バックアップ座金３７ｂの傾斜した表面３９ａとかみ合う傾斜した表面３９を含む。ばね３６ａは低圧力での密封を確保し、そして高圧力での密封を助ける。バックアップ座金およびグランド座金は加圧下でのシール３６の押し出しを防ぐ作用をする。グランド座金３８は、トラス２０中の棚４０により支持されている。
空気圧シリンダー１４は、通過孔２８をもつ伸長棒２６と共に、たとえば直径２．５インチのピストン１４ａを含む。Ｏ−リング１４ｂはピストン１４ａと空気圧シリンダー１４の内壁１５の間のシールを形成する。空気圧シリンダー１４にエネルギーを与えると、ピストン１４ａ上の圧力が棒２６により案内ベアリング２４に伝達され、ピストン２２の上昇力を創りだす。この力は、入口３０にとりつけられた圧力源（図示していない）から空気圧シリンダーへの圧力を変えることにより、調節できる。空気圧シリンダー１４によりピストン２２にかけられた力は加圧をパルスしている間の反応室１２内の低圧水準を決める。空気圧シリンダー圧は、約１００ｐｓｉまで調節できる（これは反応室１２に約１７，０００ｐｓｉの圧力を発生する）。
油圧シリンダー１６は、空気圧シリンダー棒２６の通過孔２８まで突出した伸長棒３２と共に、たとえば直径１インチのピストン１６ａを含む。油圧棒３２の端３４は、案内ベアリング２４を押している。伸びると、油圧棒３２はピストン２２を上に駆動する。油圧シリンダー１６により発生した圧力および空気圧シリンダー１４により発生した圧力は反応室内の高圧水準を決定する。油圧シリンダー圧は、約１，５００ｐｓｉにセットした上限で、調節できる。油圧ピストン１６ａの断面積対ピストン２２の断面積の比は２８．４：１である。
反応室の温度を制御するため、反応モジュール１２は恒温ジャケット４２により囲まれている。ジャケット４２はそれぞれ入口はめ込みおよび出口はめ込み４４、４６をもち、流体が温度制御加熱／冷却浴（図示してない）から壁１３を囲むチャンバー４８に循環するのを可能にする。反応室１２の頂部および底部の周りには、Ｏ−リング５２、５４があり、恒温ジャケット４２に対し流体シールを与える。熱電対（図示してない）が反応室１２に据えつけられ、反応室の温度を監視する。反応室１２の温度は、約＋／−１℃の精度で、約−１５乃至＋４０℃の範囲内に制御される。壁１３の厚さ、たとえば３／１６インチは、恒温チャンバー４８から試料室１５への伝熱を可能にするのに十分薄いように選ばれ、一方試料室１５にかけられる圧力に耐えるのに十分に厚い。壁１３の厚さおよびシール３６の性能により決定される、反応モジュール１２における最大許容可能圧力は約４０，０００ｐｓｉである。
組み立て物の頂部には、圧力変換器５６、たとえばSensotec, Inc. Columbus, OHから部品番号HP/5651-02-02として入手できる７５，０００ｐｓｉ、＋／−０．５％精度のひずみゲージ型変換器が据えつけられる。圧力変換器５６は反応モジュール１２から離れポート１２ａに接近できる。
図３を参照すると、油圧圧力は、油圧ポンプ６２により油圧シリンダー１６に送られる。油圧系６０はモータ６４により駆動される油圧ポンプ６２、流体溜６３、安全弁６７、逆止弁６５、圧調節弁６６、圧力ゲージ６８、アキュムレータ７０、手動弁７１、４方向制御弁７２、油圧シリンダー１６を含む。
モータ６４は、たとえば３，０００ｐｓｉ最大で０．８ＧＰＭの出力をもつ２ＨＰ電気モータである。実際の系圧は、圧調節弁６６により制御され、約１，５００ｐｓｉにセットした上限まで変動できる。
方向制御弁７２は、たとえばPearse-Pearson, Inc., Milford, MAからBosch part #9810231072として入手できる二重電気ソレノイドにより駆動される３位置ばね中心スプール弁である。両ソレノイドのエネルギーを解放すると、油圧シリンダーポート１９、１９ａの両者はドレンライン７４に連結され、シリンダーピストン１６ａは自由に動くことができる。使用においては、１ソレノイドへのエネルギー付与はポート１９を加圧し、ドレンライン７４を開くように、他のソレノイドにエネルギー付与を止め、ピストン１６ａを強制的に伸ばし、試料室１５を加圧する。試料室内の圧力をパルスするため、両ソレノイドへのエネルギー付与を止め、ピストン１６ａを自由に動くようにし、室１５内の圧力がピストン２２を下に強制し、室内の圧力を解除する（空気圧シリンダー１４によりかけられる圧水準まで）。一方、他のソレノイドのエネルギー付与はポート１９ａを加圧し、ドレインライン７４を開けるように他のソレノイドにエネルギーを付与しないことにより、ピストン１６ａは強制的に引き込められる。チャンバー１５からの圧力の控えめの解除は、一層早い油圧応答時間を与え、そしてピストン２２および棒３２の間の連続接触はピストンと棒の間の衝撃的荷重の発生を避けるから好ましい。方向制御弁７２は２０乃至２５ｍｓまでの時間で迅速にスイッチでき、圧力を油圧シリンダー１６にかけ、チャンバー１５から圧力を解除させる。
水圧アキュムレータ７０は、方向制御弁７２近くに据えられ、応答を増しそして圧変動を減らす。アキュムレータ７０は、たとえば１クオートの容量をもち、ポンプ６２により油圧系ライン圧にたいしチャージされる。逆止弁６５の存在は、ポンプ６２を止めた後も、アキュムレータ７０をチャージしたまま残す。手動弁７１を使用し、アキュムレータのチャージを解き、油圧系の圧を解く。安全弁６７はポンプ６２からの最高送り圧を限定する。
本発明が圧力装置の性質により限定されることを意図していない。４１１ＭＰａの圧力を発生できる”手動”機器系が、商業的に入手でき、その系は加圧媒体としてシリコーン油を使用し、２ｍｌの反応容器をもつ（High Pressure Equipment Company, Erie, PA）。この系の模式図を図1に示す。
ある実験では、高圧装置は、次の成分をもつ装置である。圧発生器１個（最高圧６０，０００ｐｓｉ）cat# 37-5.75-60；圧力計１個cat# 6PG75;弁２個cat#60-11HF4;管継ぎ手２個cat60-23HF4; 1/4インチ×6インチニップル４個cat#60-8M4-2;1/4インチ×2 3 / 4インチニップル２個cat#60-8M4-1;２ｍｌ反応室１個。５ＭＰａ増分をもつ圧力ゲージも系に連結される。
加圧される溶液を、一端でシールされたクリンプである小さな変形できるポリエチレンカプセルに入れる。酵素／基質溶液の１０乃至５０μｌを含むカプセルを、反応容器にいれ、系に連結しそして加圧する。
圧力制御を、温度制御の使用と組み合わせることができることが意図されている。とりわけ、あき時間（たとえば、加圧処理前の試料を混合しそして荷重をかける時間、および分析のため試料をとりだす時間）の間、酵素の制御に有用である。ある実験では、別々の酵素および基質溶液を氷上に維持する。反応室を冷蔵庫（約５℃）内に保持できる。
酵素活性の制御に、圧力と共に温度を使用できる。たとえば、温度の比較的小さい低下（すなわち５℃）が、ある酵素系における消化速度の著しく減少を引きおこすことができ、そこで研究者は酵素の活性を一層大きく制御できる。これは、加圧下でない間に起こる消化を防ぐ（酵素に有害でない可能な程度まで）のに有利であるとき、あき時間の間特に重要であり得る。
望む複合体の改良された会合：分かるように、圧力制御は、選んだ外部からの結合相手への被検体の結合を増強するいことができ、それにより検定速度に対して著しい効果を発揮し、また親和力、感度または特異性を改良する。具体的には、下記で検討する圧力選択技術により結合を改良する圧力形態を選択する。温度および他の検定条件を変更して、所定の検定に対し複合体形成を更に最適化することができる。これらの条件は、圧力室、たとえば上述したような圧力室で達成される。
圧力選択：一般に、圧力感度の範囲を横切る結合相手は構造の可逆的および不可逆的破壊の両者を示す状態図をもち、これら両者を検定操作を改良するのに適用することができる。圧力（および時間、温度、他の制御）の使用を最適化するため、検出される複合体について、また検出を妨害する内在的複合体について、状態図（温度／圧力／会合）を開発することは有用である。上で述べたように、圧力は複合体の平衡に影響を与えるだけでなく、平衡に達する速度にも影響を与える。状態図を提供し、結合相手候補をふるい分けするためには、
１．周囲の条件で（大気圧および一定の室温）結合相手の会合速度を定め、
２．複合体結合相手の一つまたは両者の生の状態の構造を破壊する圧より低い水準に圧力を増大させ、それにより結合速度および平衡に対する圧力の効果を明らかにし、
３．更に圧力水準を増大させ、結合相手の一方また両者の構造の可逆的破壊のための最低圧および最高圧を決め、
４．更に圧力を増大させ、結合相手の一方または両者の構造の不可逆的破壊のための最低圧を決定する。典型的には、温度を一定（５乃至４０℃、熱安定性の試薬により、温度を約９５℃まで上げることができる）に保ち、約２５ミリ秒乃至約１５分の範囲で、一定の圧力パルスを送る。
大気圧から１５０，０００ｐｓｉまでの増分での圧力増加は、４ドメインを規定する。
１．大気圧におけるドメイン、
２．会合の増加速度のドメイン（典型的には６０，０００ｐｓｉ以下）、
３．可逆的会合のドメイン（結合相手の一方または両者の可逆的構造破壊）、典型的には約３０，０００と１００，０００ｐｓｉの間、
４．結合相手の一方または両者の不可逆的構造破壊のドメイン（典型的には、１０，０００と１５０，０００の間）。
所定の結合対に対するこれらドメインの圧力境界を確定するのに必要な工程は、ａ）大気圧下および室温での結合系の会合特性の決定によるベースラインの決定、ｂ）向上された会合のドメインにおける会合速度の決定、ｃ）可逆的構造破壊の範囲の決定、ｄ）不可逆的解離範囲の決定を含む。そのような状態図を開発するためのプロトコールを下記で与える。
図４は、典型的な状態図を示す（Mozhaev et.al., TIBTECH 12 : 496, 1994参照）。かかる状態図に基づき、解離および会合の領域を決定することは、慣例の操作である。前者（解離）は、更に可逆的なものおよび不可逆的なものに分割できる。一旦状態図が分かれば、検定作用のため検定圧を使用し、望む形態（可逆的解離、不可逆的解離、改良した会合）を選択することができる。
一般規則として、適度に高い圧力（すなわち、ある点まで）は、内在的複合体形成を促進するができる。上記状態図は、特定の系についての正確な相境界（会合から解離への変化）に関する指図を提供できる。個々の系の正確な相境界は一般にｐＨと共に変化しうるが、６０，０００ｐｓｉ以上の圧力は、一般に標準緩衝液中で複合体を解離する。一層低い圧力下では、複合体は会合したままとなり、多くの場合、大気圧では一層早い動力学結合かまたは一層強い結合のいずれかとなるか、またはその両者となる。特別の分子機構に限定することなしにいえば、たんぱく質のような被検体の、高圧に対する特異な感度は、異なった１次、２次、３次、４次構造、たとえばオリゴマーたんぱく質のサブユニット相互作用に関連づけられるように思われる。一般に、溶液中のたんぱく質は、圧力／温度反応室に導入できる。圧力を上げると、たんぱく質は、著しい構造破壊なしに、始めは高温に耐えることができる。しかし、圧力を増すと、溶液は最後には転移点に達し、それを越え圧力を増すと、生の状態からたんぱく質の構造をかなり破壊し始める。
状態図はまた、たんぱく質は僅かに高温では構造的に破壊され得るが、温度を比較的一定に保ちながら圧力をかけると、その生の状態を変えることなくたんぱく質は幾分一層高温に耐えることができることを一般的に示している。しかし、温度を約０℃程度の水準に保つときは、圧力の増加は、周囲温度で圧力を増大させる場合よりも早く（すなわち一層低圧で）たんぱく質の構造を破壊でき、高温（たとえば３７℃）では、構造は尚一層高圧で破壊される。典型的には、たんぱく質（被検体）は、６０，０００ｐｓｉ未満の圧力で、そして約１０℃と約４０℃の間の温度で、可逆的に生の構造的に破壊された相に転移できる。
たんぱく質（被検体）は、独立にまたは組合わさって作用する、温度、ｐＨ、または圧力により変性できる。結合剤／配位子相互作用は、それに限定されないけれど、静電的、疎水的、芳香環の重なり、水素結合など（たとえばファンデルワールス相互作用）のような、幾つかの異なる型の相互作用の結果であり得る。これらの種々の相互作用は、互いに建設的にまたは破壊的に妨害することができる。たとえば、生体系の圧力を上げることにより、静電的相互作用を増大すること（たとえば荷電基の水和）、そして減少すること（たとえば静電結合の形成）の両方をすることができる。
結合相手の溶液の圧力を増すと、初めのうちは結合剤／配位子複合体化相互作用は増強される。しかし、圧力を更に上げると、生の生体分子状態の変性が起こり、結合剤／配位子複合体の解離を促進する。この解離は可逆的かまたは不可逆的であり得る。解離感度はまた、溶剤およびｐＨに依存する。臨床検定の結合剤／配位子相互作用の改良は、結合相手を含む反応溶液の圧力を増すことにより得られる。上記のように、二つ効果、すなわち１）結合剤／配位子相互作用の促進、２）内在的複合体相互作用の減少または除去により、改良が得られる。
二つの更なる解決法を使い、内在的複合体を分離することにより検定を増強することができる。この分離は、効果的には不可逆的であることができ、この場合は内在試料成分の連続的な存在は、検定を酷く妨害しない。一方、分離は可逆的であることができ、この場合は検定感度を最大にするために、可能ならば、内在試料成分から被検体を分離すべきである。分離しなくても、たとえば外部からの結合相手が、被検体を結合するため、内在試料成分と競争しなければならない場合には、動力学的または熱力学的利点を得ることができる。
高処理量ふるい分け：分子多様性を利用する工業的技術は、たとえば抗体エピトープに向けることのできる、多数の標的が無作為に発生することを可能にする。小さな分子の作成ブロックの組み合わせのばらばらのまたは方向づけられた合成によりつくられた新規構造の系列を含む組合せライブラリーの迅速合成は、迅速ふるい分け操作を必要とする。分子多様性は、新規なたんぱく質、炭水化物、抗体、リボザイム、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アンチセンス、アプタマー（aptamer）、ＤＮＡ（たとえば一本鎖、二本鎖、または一本鎖突き出しをもった二本鎖）、ＲＮＡ、小さな有機分子の発見に有用である。たとえば、１０5乃至１０8の多くの抗体順序変化またはそれ以上を発生する、目的の化合物に対し免疫応答を発生するため使用できる、変性組み換え、ファージデスプレー技術のような試験管内技術。発生した抗体に対し、非常に大きな組合せ的選択法を実施できる。抗体−抗原複合体の結合親和力を、ここに記載の圧力関連方法により変形でき、一層早い、一層効率的な複合体選択を可能にする。
反応の経過または反応の生成物を監視することが望ましいときは、圧力サイクル反応器は、反応容器内の流体中に存在する成分または反応容器から除去した流体中に存在する成分の特性を検出するため、連結された検出器を含む。検出器はコンピュータ制御でき、分析した成分の関する情報をコンピュータに中継できる。そこで、反応容器内にある間、圧力パルスの前、間または後で成分を分析でき、反応容器から取除いた後でも成分を分析できる。
アプタマー：本発明の一の実施態様は、内在的抗体被検体複合体を解離し、適当な免疫検定試薬または免疫親和性精製により、遊離した被検体の次の検定を容易にすることを特徴としている。被検体と内在抗体および免疫検定試薬との複合体の圧力状態図が十分に異なっているときは、適当な圧力条件で、内在的免疫複合体の解離および選択した外部からの結合相手の会合を同時に増強できる。この目的の達成には、たとえば通常の抗原−抗体複合体とは劇的に異なる圧力状態図をもつ、免疫検定または親和性精製操作に有用な特異的複合化試薬の確認を必要とする。この要求に合う試薬の組は、高親和力を有する特異な被検体と結合するオリゴヌクレオチドの一群である。これらのオリゴヌクレオチドは、しばしばアプタマーと呼ばれる（Annu. Rev. Biochem., 64 :763-797, 1995）。オリゴヌクレオチドとたんぱく質、ポリペプチド、小分子のような配位子との相互作用は、非常に高い親和力と大きな選択性をもって起こる。いろいろな操作が、ばらばらなポリヌクレオチドライブラリーから上記試薬を選択するのに利用できる。たとえば、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）への結合のために行う、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドライブラリーのふるい分けは、０．２ｎＭと低い解離定数をもった生のｂＦＧＦに結合した特異的３０マー順序を生じ、一方変性したｂＦＧＦには結合できず、高い特異性を示した（Proc.Natl., Acad.Sci.USA, 90 :11227-11231, 1993）。核酸−配位子相互作用と抗体−抗原相互作用との基礎となる構造原理は、本質的に異なるから（Gold et al.,前掲、789-790比較）、配位子のアプトマーへの結合および抗体への結合についての圧力状態図が異なる確率は非常に高い。被検体とアプトマーとの状態図を決定し、その状態図を被検体−抗体免疫複合体についての相当する状態図と比較することにより、後者よりも前者の形成に有利な条件を見いだすことができる。
たんぱく質再折りたたみ：多くのたんぱく質が、組み換えＤＮＡ技術を使い製造される。組み換えたんぱく質の商業および研究向け製造で遭遇するありがちな問題は、たんぱく質についてコードする遺伝子の過剰発現が、凝集したまたは非機能性のたんぱく質に導くことがありうることである。過剰生産されたたんぱく質は、生産する細胞内部の封入体中にしばしば含まれる。封入体は、遠心分離または濾過のような手段により他の細胞デブリから容易にとり出され、たんぱく質がうまく分散され活性形に再折りたたまれ得るときだけ有用となる迅速な回収および効果的な精製を与える。再折りたたみに関する最近の操作は、シャペロンたんぱく質、界面活性剤、有機溶剤または尿素、グアニジン塩酸塩のようなカオトロピック剤を添加し、ついで透析によりこれら試薬を除去することを含む。これらの方法は、時間を消費しかねず、大規模で行うときは高価である。
ここに記載の新規方法は、凝集体を迅速に破壊し、透析を用いることなしに個々の活性なたんぱく質としての再折りたたみを許容する。この方法は、凝集体を強力且つ迅速に破壊しおよび／または可逆的なたんぱく質の折りたたみの開きを引き起こす高静水圧の能力を利用する。
再折りたたみする反応混合物は、たとえば感圧性緩衝液および固相樹脂を含み得る。樹脂の電荷に対する圧力効果は、樹脂自身のイオン化容量および緩衝液のイオン化容量の合計であろう。そして樹脂の電荷の大きな変化を許容しよう。そのような樹脂と緩衝液の系は、どのイオン性化合物をも可逆的に結合し遊離するイオン交換系を構成する。
高い静水圧と低いそれとの間のサイクルにより、次のことが起こる。
１）溶液のｐＨが変動し、凝集したたんぱく質の崩壊が生じる。
２）樹脂の電荷が変動し、たんぱく質分子を可逆的に結合し、再凝集に対したんぱく質の再折りたたみをひきおこす。
複数の酸性基をもつたんぱく質は、樹脂が高圧で一層正荷電する樹脂／緩衝液系からは恩恵を得、これに対し多くの塩基性基をもつたんぱく質は、固体が圧力により一層負に荷電する系の選択の動機となる。
ジスルフィド結合により架橋される凝集したたんぱく質は、同時にたんぱく質分子を変性し且つｐＨを上げて、ジチオトレイトールのような還元剤の活性を増し、高圧と感圧性緩衝液とを用い、再折りたたみできる。圧力を下げると、たんぱく質は再折りたたみでき且つたとえば空気または他の酸化剤により再酸化され、正確なジスルフィド結合を形成する。
この新規方法は、再折りたたみ速度を増し、マトリクスからのたんぱく質の遊離を容易にし、高濃度の折りたたまれたたんぱく質を生じる利点をもつ。
分離：与圧は結合速度を変化させることができ、結合親和力に影響を与えることができる。常圧で低い親和力をもつ結合相手は、たとえばより高い圧では高親和力の相手として振る舞うことが可能である。結合親和力の圧力仲介可変制御は、精製法として使用できる。
たとえば、目的の化合物を含む汚染された混合物を既知の分子と流体接触させて、圧力依存親和力をもつ化合物を結合することができる。すなわち、常圧で低親和力、高圧で一層高い親和力（会合増加）、またはその逆（解離増加）。例を以下に記載する。結合相手の遅い解離を容易にし望む化合物のその後の捕集を容易にするため、後者の分子を固定化できる。
会合増加においては、反応容器内の圧力を、望む化合物の導入前、間または後で増すことができる。これは、未結合の汚染物質は流動性液体（たとえば溶剤）若しくはガスでの激しい洗浄によりフラッシュ除去されるから、化合物を固定化結合分子に強固に結合させる。最終工程では、精製した化合物を固定化された結合分子から常圧で解離でき、常圧で集めることができる。
特にたんぱく質の互いの親和力が常圧で比較的低いときは、会合増加のシナリオは、たんぱく質−たんぱく質結合相互作用を記述するのに適当である。親和力は圧力変化により劇的に増加することができるから、これは、含まれるたんぱく質を新規方法による精製に対して理想的にする。たんぱく質−たんぱく質相互作用の例を図５に示す。
図５のＡ点において、一つのたんぱく質が、低圧で固相担体に固定化される。別のたんぱく質を含む混合物が、やはり低圧でＢ点にて導入される。少量の複合体が、たんぱく質間に形成できる（Ｃ点）。しかし、圧力をＤ点でより高い圧に上げると、複合化は著しく高められる。複合体はＥ点で清浄な溶剤により洗浄され得る。複合体は固体担体に結合しているから、複合体自体を失うことなく、複合体を洗浄できる。この工程は、すくなくとも若干の、好ましくは大部分の汚染物質を除去する。最後に圧力を下げ（Ｆ点）、一方のたんぱく質をもう一方のたんぱく質から分離する（Ｆ点）。
解離増加では、最終工程のみ異なる。固定化されたけ結合分子から精製した化合物を常圧で解離する代わりに、圧力を解離を起こすに十分高い第二圧力に上げる。検定に関し上記のように、適度な圧力は結合親和力を増す傾向があり、一方尚一層の高圧（たとえば約３００００ｐｓｉ以上、または６００００ｐｓｉ以上）は、たとえば結合相手の片方の可逆的（または不可逆的）構造破壊を起こし、解離を起こすことができる。解離増加シナリオは、たとえば抗体の抗原への結合の特性付与に適する。抗原−抗体結合定数は、１０5ｍｏｌ-1以下から１０12ｍｏｌ-1以上の範囲であり、最も典型的には約１０8乃至１０10ｍｏｌ-1である。
多くの他のシナリオも尤もらしい。たとえば、検定に関して上述したように、会合および解離速度に影響を与えるように温度と圧力を同時に操作できる。動力学的研究および圧力−温度図を使用し、モデル系の会合および解離特性の予想を助けることもできる。
さらに別の例では、単離しようとする化合物を含む汚染された混合物を、化合物に対し結合しそして酵素触媒活性の圧力依存抑制（すなわち常圧では高活性、高圧では本質的に活性なし、すべての圧力で高い結合親和力）を示す結合分子と流体接触させることができる。この場合、混合物を高圧で結合分子に導入して非反応性結合複合体を形成し、汚染物をフラッシュ除去し、そして試薬を導入して結合複合体を解離させることができる。上記にて用いられたように、酵素触媒活性は、基質を化学的に生成物に変える酵素の能力を指す。
後者の操作は、たとえば酵素の基質の精製に使用できる。酵素は、その基質に大きな選択性と親和力をもって結合する。常圧では、酵素分子は基質分子に結合して、基質分子を生成物分子に変換する。高い選択性で以てその基質に結合する酵素の顕著な能力は、一般に圧力により影響されない。しかし、酵素の触媒活性は、一般に高圧条件では不活性にされる。
斯様に酵素は、高圧下ではその基質に大きな選択性をもって結合するが、基質は生成物に変換されないだろう。たとえば、酵素が固体担体に結合することにより固定化されるときは、基質も固定化され、一方汚染物は洗浄溶液によりフラッシュ除去される。
高圧で酵素−基質複合体の解離を容易にする試薬の添加は、精製した基質を単離させることができる。そのような解離に有用であり得る試薬は、限定されないが、酸、塩基、ＮａＣｌまたはＭｇＢｒ2のような塩、金属捕捉剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような界面活性剤、解離剤、チオシアン酸塩のようなカオトロピック剤、水、ジオキサン、エチレングリコールまたはジメチルスルホキシドのような有機溶剤、キレート化剤、金属イオンのような他の結合相手を含む。非カオトロピック剤も使用でき、例としてはＡＦＣ溶出媒体（Sterogene Biochemicals）または免疫純度の温和なＡｇ／Ａｂ溶出緩衝剤（Pierce）が含まれる。
検定のための製造における内在性リガンドの解離についての文脈で上述したように、酵素−基質複合体の圧力をなお一層高く上げることにより、解離を行うこともできる。この場合、結合分子は理想的には再使用されるから、可逆解離を許容する圧力が好ましい。混合物中に存在する酵素を捕獲するため、固定化された基質を使うことにより、酵素自体も同様に単離できる。
または、目的が、基体自体の単離よりもむしろ、比較的精製された生成物（すなわち基質の酵素反応によって得られた物質）を単離することであるときは、同一操作を再び使用できるが、ただし洗浄後に圧力を下げる。たとえば、圧力の常圧への減少は、酵素にその活性を回復することを許容する。次に、精製した基質を高純度生成物に酵素的に変換できる。酵素は、典型的には元の基質に対する親和力よりも遙に低い親和力を生成物に対して有し、故に生成物を容易に単離できる。
従来の方法は典型的には一層過酷であり、たとえばたんぱく質の不可逆的構造破壊に導くから、適度に高いまたは低い圧力解離は、一般に従来の溶出法（たとえばｐＨ制御溶出のような化学的方法）よりも好ましい。上述のように、非常に高い圧力（たとえば約１０００００ｐｓｉ以上）は不可逆的構造破壊を導くことができる。
本文脈における汚染された混合物は、汚染物質、存在するが試料中に望ましくない物質を含む。汚染物質の例は、望む化合物の製造からの副生物、望む化合物の分解生成物、触媒、自然のまたは市販物質に含まれる不純物、そして残存高沸点溶剤を含む。
大抵の場合、混合物中に２種以上の結合成分があり得、一方としてはより低分子量で小さい寸法であることができ、たとえばペプチド配位子、抗原、或いは核酸プローブであることができる。他方は、受容体、抗体、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ、或いは第一の化合物に結合する他の分子であり得る。各々の成分は各々の役目を果たすことができ、それ故上記例では、配位子または受容体、抗原または抗体、或いはプローブまたは標的が、精製しようとする望む化合物であり得る。他の成分は、好ましくは固体担体或いは膜に固定化された結合分子の形で存在する。
精製しようとする汚染された化合物および固定化された結合分子は両方とも、流体に溶け、懸濁し、または大部分囲まれている。流体は、液体（たとえば酸性、中性、または塩基性の水性若しくは有機溶剤、またはその溶液）、ガス（たとえば不活性ガスまたは希ガス）、または超臨界流体ですらあることができる。
結合分子は、粒子、中空でないまたは中空の重合体ビード、ウエル、管またはカラム、細片、成形材料、重合体マトリクス、濾過器または袋形の半透過性の、多孔質または非多孔質膜、または他の担体材料のような固体担体に固定されることができる。多くの物理的形態をもち、活性化されたまたは特異的反応性の表面をもった種々の重合体からなる固体担体が、研究、臨床、そして生体分離製品で使うために商業的に入手できる。表面に配位子または結合たんぱく質を共有結合的に固定化する多くの方法は、William J. Scouten”Affinity Chromatography: Bioselective Adsorption on Inert Supports”（Wiley-Interscience (1981)）に記載されている。固体担体への分子の結合は、反応物と表面を受動吸着操作するに任せることにより、または特異反応性基を表面に化学（共有）結合させることにより、しばしば達成できる。汚染物質および適合する担体の、限定しない例を表１に示す。
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”結合した複合体”の語句は、望む化合物と固定化された結合分子との実際の組合せを指す。これらの結合複合体は、しばしばその成分により命名される。たとえば、Ａが配位子で、Ｂが受容体のときは、結合複合体は〔ＡＢ〕として表される。好ましくは、ここに記載の複合体は、解離可能なように結合され、それは複合体形成が可逆であることを意味する。一般に結合は、共有結合であり得るが、静電的（たとえば水素結合、ファンデルワールス力、またはイオン結合による）である。大抵の場合、更に圧力を変えることにより、または試薬の添加により、逆工程（すなわち解離）を誘発できる。
以下実施例は本発明の例であが、本発明を限定しない。実施例１−５は、予言的例であり、実施例６−１０は実際の例である。
実施例１
ＨＩＶｐ２４検定用の血清試料製造に用いた圧力変化および固相免疫吸着剤：
工程１：管壁への免疫吸着剤の固定化
圧力装着とほぼ同じ寸法のポリプロピレン管に、予備精製した組換えＨＩＶ−１ｐ２４（Immunodiagnostics, Inc., Bedford,MAから得た）の５乃至１０μｌをｐＨ９．３の０．１Ｍ炭酸カリウム緩衝液で希釈したもの１００μｌづつ分注した。この混合物を、２−８℃の冷蔵庫中で一夜置いた。溶液をデカンテーションし、ＰＢＳ（０．０５Ｍ燐酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、ＰＢＳ）中の２％牛血清アルブミン溶液１００μｌを加えた。この混合液をデカンテーションし、同一溶液の２回目を加え、室温で少なくとも２時間、器壁をブロックした。溶液をデカンテーションし、管を逆さにし、室温で乾燥した。これを、乾燥剤を入れたプラチック袋内に入れしっかり密封して２−８℃で貯蔵し、確実に乾燥した。
工程２：試料調製
工程１に記載の容器に、試験しようとする血清試料５０μｌを加えた。ＰＢＳまたは適当な解離促進剤（たとえばグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５、尿素、または水混和性有機溶剤）を含むＰＢＳの同じ容量を、混合しながら加えた。管を順次高圧装置に挿入し、適当な時間で５０，０００ｐｓｉに圧力を上げた。管を常圧に戻し、室温で少なくとも２時間温置し、試料中の内在性結合物を確実に、管の内壁上の大過剰の固定化抗原に競合的に結合させた。すべてが結合し終わった試料の一部をとり、ＨＩＶｐ２４の従来法の測定にまわした。
実施例２
粒子形態免疫吸着剤の使用：
工程１；ラテックス免疫吸着剤の製造
ＨＩＶｐ２４の吸着したラテックス粒子のバルク製剤は、BangsLaboratories（Carmel, IN）推奨の操作に従い製造した。得られた懸濁液を、使用するまで、２−８℃で冷蔵貯蔵した。
工程２：試料調製
圧力装置とほぼ同じ寸法のポリプロピレン管に、ラテックス免疫吸着剤１００μｌおよび試験しようとする各試料５０μｌを分配した。管を順次高圧装置に挿入し、適当な時間で圧力を５０，０００ｐｓｉに上げた。管を常圧に戻し、室温で少なくとも２時間温置し、試料中の内在性の結合するものを、ラテックス粒子上の大過剰の固定化抗原に確実に競合的に結合させた。管を迅速に約２，０００ｘｇで遠心し、粒子を沈降させた。すべてが結合し終わった試料の一部をとり、従来の試験にまわした。
実施例３
ＨＩＶｐ２４検定用の血清試料製造に用いた圧力変化およびサイズ分画：
工程１：サイズ分画装置
使用直前にＰＢＳ約１ｍｌを通して、Pharmaciaのミクロサイズのゲル濾過カラム装置を準備した。
工程２：試料調製
圧力装置とほぼ同じ寸法の、それぞれが試験する試料５０μｌを含むポリプロピレン管を、実施例１のように圧力をかけ、直ちにフラッシュ凍結した。次いで、各管の密封した底を切り開き、得られた底のない管を、ゲル濾過カラム装置に入れ、解凍した。直ちに冷（４℃）ＰＢＳを、装置製造業者の推奨する速度で、管を通し樹脂床に流し、捕集を開始した。抗体の大部分を含む第１画分を捨て、第２のＨＩＶ−１ｐ２４画分を集め、従来の方法で検定した。
実施例４
ＨＩＶｇａｇ  ｐ２４：ウサギ抗−ｐ２４抗体ペアのための抗原−抗体反応性の圧力−温度状態図の決定
次の操作は、上記状態図を作るためのデータの作成を示す。具体例は、組換えＨＩＶ（ＨＩＶ−１ｂｓ）gag p24およびウサギ抗−ｐ２４を含む。
材料
ポリスチレンマイクロタイタープレート（HiBind, Corning/Costar, Cambridge, MA）を、ＮａＣＯ3、ｐＨ９．２中１μｇ／ｍｌの組換えHIV-III Bp24（ImmunoDiagnostics,Inc.,Beford, MA）懸濁液で４℃一晩被覆して、ＨＩＶ−１ｇａｇ ｐ２４に対する抗体用固相免疫吸着剤を製造した。未反応部位を、ＰＢＳまたはＴｒｉｓ中のSuperBlock（Pierce Chemical, Chicago, IL）で封鎖した。
実験法
組換えHIV-1IIIB gag p24およびウサギ抗−p24HIV-1 IIIB IgGを、共に温置し、免疫複合体試料を形成した。試料の１つを、変形できるプラスチックカプセルに入れ、融点浴オイル（Sigma , St. Louis, MO）を重層した。カプセルを高圧発生装置（Hip, Erie, PA）に入れた。免疫複合体の一部に圧力をかけている間に、対応する試料を常圧で同一温度にさらした。高圧を解除後、試料と、対応する（圧力前処理なしの）対照を、p24被覆したミクロプレートのウエルに入れた。試料を、ミクロタイタープレート中で常温で1時間反応させ、ＨＲＰ−標識第２抗体により捕獲された抗体を検出して、試料中の遊離の（抗原と複合化してない）抗体レベルを定量した。ｐ２４および抗−ｐ２４の濃度が各測定で一定となるように、予備形成免疫複合体、ｐ２４、抗−ｐ２４抗体の量を変えて使用して作り上げた標準曲線から、圧力処理した試料および対照試料の複合体化の度合いを決定した。抗体：抗原複合体の解離または更なる会合は、それぞれ検定における信号強度の増加または減少に転換される。
実施例５
変異体たんぱく質のファージデイスプレーの高スループットスクリーニング：
高圧下、反応室に流体を導入し、反応させ、除去することのできる、圧力を変える装置は、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３２３２に記載され、参照された。この装置は、生体分子結合相互作用をリアルタイムで検出および監視できるよう変更したリアクションチェンバー（反応室）を備えている。この型のチェンバーの例は、外部分光測定のため光窓（たとえばサファイヤ）、または内部分光測定のために、内部流体と直接接触しかつ内部視面を標的とする光ファイバーを含む。内部検出センサーの別の例は、電気化学検出プローブである。
ファージデイスプレー技術の例では、ファージの宿主（たとえば形質転換E. coli細胞）は、その表面にファージの遺伝子IIIカプシドたんぱく質および融合たんぱく質として相当する標的たんぱく質を発現する。各ファージ部分は、リポーター分子（たとえば放射性染料など）で標識されるか、または検出可能な化学構造、たとえば生来の蛍光を持つ。
標的たんぱく質は、固体担体上に予め固定化した標的受容体分子に結合し、それによりファージがスクリーニングされる。それぞれが異なるファージ遺伝子IIIカプシドタンパク質と抗体の融合たんぱく質をもつ発現されたファージ変異体のスクリーニングは、親和力に基づいて行われる。ファージライブラリーをリアクションチェンバーへ順次導入し、圧力を変化させ、蛍光スペクトルのレーザー誘発励起および発光を用いてリアルタイムでの結合速度および相互作用の親和性を観察して、ファージ結合特性を決定する。
親和性分析および特性評価がすんだら、圧力を変化させて生体分子立体電子相互作用を解離させることにより、ファージを反応室から除去する。この操作は、活性化に関連した容積変化に依存して、結合を増強するか攪乱するのだろう。いずれにせよ、親和力分析、特性評価のため、２番目のファージを導入する。複合体の圧力による会合および解離は、迅速なスクリーニングを可能にする。この連続法は、パラレルスクリーニング用に修正できる。
実施例６
抗原−抗体結合促進のため高静水圧力の使用：
抗体の抗原への結合速度促進のため高静水圧を使用することは、組換えHIV-1 IIIB gag p25およびウサギ抗−p24 HIV-1 IIIB IgGを使って示した。常温（〜２２℃）で１０分、６０，０００ｐｓｉ（４２０ＭＰａ）の圧力をかけると、常圧で少なくとも４時間おいた結合と同等の結合水準を生じた。３０，０００ｐｓｉ（２１０ＭＰａ）を１０分かけると、常圧で３０分と同等の結合を生じた。２０，０００ｐｓｉ（１４０ＭＰａ）で１０分の加圧は、常圧に比較し結合にたいする効果はたいしてなかった。実験のプロトコールの詳細は次のとおりである。
ポリプロピレンミクロフュージ管に入れた、１２５μｌの２ｎｇ／μｌウサギ抗−p24 HIV-1 IIIB gag IgG（燐酸緩衝食塩水（ＰＢＣ）ｐＨ７．４）に、１２５μｌの０．２ｎｇ／μｌの組換えHIV-1 IIIB gag p24を加えて、抗原／抗体混合物１００μｌが抗原約１０ｎｇと抗体約１００ｎｇを含むようにした。反応混合物１２０μｌを、変形できるプラスチックカプセルに挿入し、融点浴油（Sigma, St. Louis, MO）を重層した。カプセルを、直ちに常温に保った高圧装置（HiP, Erie, PA）の反応室に入れ、手で操作するピストンを使い、望む高水準（すなわち前節で示したような）に圧力を上げた。
抗体または抗原のどちらかを省いた対照試料も、同じ実験条件にかけた。全実験は常温で実施した。HIV-1 gag p24に対する抗体検出のためのELISA検定は、社内で開発した。ポリプピレンミクロタイタープレート（HiBind, Corning/Costar, Cambridge, MA）を、ＮａＨＣＯ3水溶液（ｐＨ９．２）中組換えHIV-1 IIIB gag p24の１μｇ／ｍｌ懸濁液で、４℃で一夜被覆した。未反応部位を、ＰＢＳ−Ｔｒｉｓ中のSuperBlock（Pierce Chemical, Chicago, IL）で封鎖した。
高圧を望む時間かけた後、ｐ２４被覆のミクロウエルELISA検定を使い、試験試料を測定した。直ちに試験試料の１００μｌをカプセルから取り出し、ｐ２４被覆ミクロプレートのウエルに入れた。非加圧試験溶液１００μｌも平行して試験した。試験試料を、ミクロタイターウエル内で１時間常温で振とうし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗った。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をつけたヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Pierce Chemical）、ＨＲＰの基質である２、２’−アジド−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を使い、固定化ｐ２４抗原に結合する抗体を検出した。
ヤギ抗−ウサギＨＲＰ複合体の１：２，５００希釈物１００μｌをいれてミクロプレートを常温で振とうしてから、ミクロタイタープレートウエルを、ＰＢＳ−Ｔで５回洗った。ＡＢＴＳ１００μｌを加え、プレートを３０分温置後、４０５ｎｍで分光光度計を用いて分析した。
高圧での実験の適当な試薬濃度を選択するため、種々の比の抗体／抗原を使い、常圧で初期試験を実施した。抗体および抗原をポリプロピレンミクロフュージバイアルで混合し、ＥＬＩＳＡ検定で測定する前に、４−６℃で一夜保持した。この研究は、抗−ｐ２４抗体単独（すなわちｐ２４抗原なし）１００ｎｇは、４０５ｎｍに約１．１ＯＤの吸光度を得、（ｉｉ）一夜インキュベート中にｐ２４抗原１０ｎｇが抗体に結合すると、それに続くミクロタイタープレート上に固定したｐ２４抗原への抗体の結合がほぼ最大限に阻害されるという結果をえた。
上記初期データに基づき、１００μｌ当たり抗体１００ｎｇ、抗原１０ｎｇを含む混合物において、常圧での結合の動力学を決定した。抗原／抗体混合物を、常温で異なる時間インキュベーションし、ＥＬＩＳＡ検定にかけた。ＥＬＩＳＡ検定で測定した吸光度を使い、抗体のみの試料（最高吸光度）を零結合、抗原と抗体の一夜インキュベーション（最低吸光度）を１００％結合として、ｐ２４抗原と抗体ｐ２４抗体の結合程度を計算した。
表２及び図６に示したように、常圧、常温で実施した典型的実験では、抗原と抗体の２５％結合が１時間で起こり、２時間で４０％４時間で６５％であった。抗−ｐ２４抗体のｐ２４抗原への結合にたいする高圧の効果を決める実験を開始した。抗−ｐ２４抗体を単独（ｐ２４抗原なし）で６０，０００ｐｓｉ、１０分プレインキュベーとしても、吸光度に認めうる減少は生ぜず、６０．０００ｐｓｉまでの圧力は、抗体が次に抗原に結合する能力に影響しないことをしめした。
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表３および図７は、１０分かけた圧力の関数としての、抗原と抗体の結合（±１０％）を示す。１０，０００ｐｓｉでは、圧力効果は明白でなく、２０，０００ｐｓｉで約１０％結合が観察され、３０，０００ｐｓｉで２０％、４０，０００ｐｓｉで５０％、６０，０００ｐｓｉで８０％であった。
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表４および図８は、時間が異なる６０，０００ｐｓｉの抗原と抗体の結合に対する効果を示す（べた丸は増加を示す）。
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データは、６０，０００ｐｓｉでは結合の増加が迅速に起こり、５分で５０％結合を示している。他のデータ点は、１０分で７９％（±１０％）、２５分で６９％（±１０％）、５０分で８２％（±１０％）に相当し、飽和結合には１０分で達する事を示している。べた四角で記したデータ点は、常圧で６０分後に達した結合を示す。
実施例７
抗原−抗体複合体を破壊するための高静水圧の使用：
抗体：ムチン糖たんぱく質免疫複合体を破壊するために高静水圧の使用を、モデル系で証明した。抗体を、ミクロタイタープレートウエルに固定下したムチン糖たんぱく質に結合した。慣例の設計の高圧室内でミクロウエルに高圧をかけた。固定化抗原からの抗体の解離を、ＥＬＩＳＡ検定により監視した。
ムチン糖たんぱく質に対するマウスモノクローナルＩｇＭ抗体を検出するための固相免疫吸着剤ＥＬＩＳＡ検定を、系内で開発した。ポリスチレンミクロタイタープレート（Hibind, Corning/Costar, Cambridge, MA）を、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中４℃で一夜、１００ｎｇ／ｍｌでエピグリカニンの０．１ｍｌで被覆した。未反応部位を、ＰＢＳ中のSuperBlock（Pierce Chemical, Chicago, IL）で1時間ブロックした。
ミクロウエルを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に１００ｎｇ／ｌ抗体の０．１ｍｌと常温で１時間振とうし、温置する（〜２２℃）ことにより、マウスモノクローナル抗体を、固定化抗原に結合した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄後、結合した抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に抱合したヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Pierce Chemical）と共に温置した。ＰＢＳ−Ｔで５回以上洗浄後、ＡＢＴＳの１００μｌを加え、１時間温置後、プレートを４０５ｎｍで分光光度計で分析した。
抗体の結合に対する圧力の効果を決めるため、固定化抗原および結合抗体を有するミクロウエルに、融点浴油（Sigma, St. Louis, MO）を重ね、手動圧力装置（Hip,Erie,PA）に連結した慣例の設計の高圧装置の反応室に挿入した。高圧を、ミクロウエルに２０分かけた。対応する対照試料に、油を重ね、試験試料に高圧をかけている間、常圧に保持した。全実験は常温で実施した。
高圧を所望の時間かけた後、試験溶液を直ちにミクロウエルの第２セットに移し、ＥＬＩＳＡ検定を使用して、解離した抗体水準を測定した。加圧および対応対照ミクロウエルをＰＢＳ−Ｔで洗い、同じＥＬＩＳＡ操作を使用して、保持された抗体を試験した。
２０，０００、４０，０００、６０，０００および８０，０００ｐｓｉの圧力は、ＥＬＩＳＡ検定で吸光度値の減少を生じ、ミクロウエルに保持された抗体水準を高圧をかけた後測定した。吸光度の減少は、３７％（±１５％）の範囲であった。固定化糖たんぱく質のみ（抗体の不存在下で）への６０，０００ｐｓｉの適用は、ＥＬＩＳＡ検定における次の吸光度の減少は生じなかった。これらのデータは、２０，０００乃至８０，０００ｐｓｉ（１４０乃至５６０ＭＰａ）の範囲で圧力をかけると、固定化ムチン糖たんぱく質から抗体が解離されることを示している。
解離した抗体の次の免疫反応性に対する高圧の効果を、加圧したウエルの上澄液の解離した抗体を検定する別のＥＬＩＳＡ検定で上澄液を検定することにより、明らかにした。２０，０００ｐｓｉおよび４０，０００ｐｓｉで解離した抗体は、固定化ムチン糖たんぱく質に再結合でき、免疫複合体の結合に対するこれら圧力の効果は可逆的であることを示している。これに対し、６０，０００ｐｓｉおよび８０，０００ｐｓｉで解離した抗体は、固相に再結合せず、これらのより高い圧力は抗体構造の不可逆的破壊を起こしたことを示している。
実施例８
フローシステムにおける免疫分離を行うための圧力変化の使用：
ムチン糖たんぱく質、エピグリカニン（ＥＰＧＮ）、を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の通常のミクロタイタープレートの”簡単に壊れる”ウエルの内面に固定化した。ウエルの内面を、ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。ミクロウエルの底に小孔を穿孔し、ここで引用文献とするPCT/US96/03232に記載のような、高圧フロー装置の反応室に入れた。反応室は、約０．１ｍｌの内容積を有していた。
系の内面をＢＳＡで被覆し、他のたんぱく質の引き続く非特異的結合を防ぐ目的で、ＰＢＳ中のＢＳＡ溶液を、約７，０００ｐｓｉの圧力で反応室にポンプ送りした。
ＥＰＧＮに対し特異性を有するＩｇＭマウスモノクローナル抗体（ＡＥ３、１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ中のＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と混合した。この溶液の１ｍｌを、約７，０００ｐｓｉの圧力で、反応室にポンプ送りした。
反応室の入口および出口弁を閉じた。７，０００ｐｓｉの圧力を１０分かけ、ＡＥ３抗体の固相に固定化したＥＰＧＮへの増加した結合を達成するよう試みた。次いで、入口および出口弁を開き、再び７，０００ｐｓｉでＰＢＳの１ｍｌを反応室にポンプ送りし、系を洗浄した。ＥＰＧＮに圧力増強親和力結合により捕獲された抗体は、固相に保持された。
次に、２０，０００ｐｓｉの圧力をＰＢＳ溶液にかけた。再び入口および出口弁を閉じた。２０，０００ｐｓｉの圧力を１０分かけた。入口および出口弁を、再び一旦開けた。さらなるＰＢＳ溶液を２０，０００ｐｓｉで反応室を通してポンプ送りし、０．１ｍｌの画分を集め、上記実施例に記載のＥＬＩＳＡ検定により検定した。７，０００ｐｓｉの圧力をかけて固相に先ず捕獲され、次いで２０，０００ｐｓｉの圧力をかけて結合相手から解離された抗体を含む画分を、下記のＥＬＩＳＡを使用して、増加した吸光度を読みとることにより同定した。
対照試料を、常圧で高圧装置にポンプ送りした。全実験は常温で実施した。
ムチン糖たんぱく質に対するマウスモノクローナルＩｇＭ抗体を検出する固相免疫吸着剤ＥＬＩＳＡ検定を、標準法で系内で開発した。ポリスチレンミクロタイタープレート（HiBid,Corning/Costar, Cambridge, MA）を、燐酸緩衝食塩水（PBS）、ｐＨ７．４中の４℃で一夜、１００ｎｇ／ｍｌでエピグリカニンの０．１ｍｌで被覆した。未反応部位を、ＰＢＳ中のSuperBlock（Pierce Chemical, Chicago IL）で１時間ブロックした。ミクロウエルを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の抗体１００ｎｇ／ｍｌの０．１ｍｌで１時間常温で振とうして温置することにより、マウスモノクローナル抗体を固定化抗原に結合させた。ＰＢＳ−０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄後、結合した抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Pierce Chemical）に抱合したヤギ抗−ウサギＩｇＧと温置した。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、ＡＢＴＳの１００μｌを加えた。１時間の温置後、プレートを４０５ｎｍで読みとった。
７，０００ｐｓｉの圧力は、抗体の固定化抗原への結合を促進した。７，０００ｐｓｉで抗体を捕獲後、ついで２０，０００ｐｓｉの圧力をかけると、固相から抗体が解離した。解離した抗体はまだ免疫反応性であることが、ＥＬＩＳＡ検定で示された。
実施例９
ＰＳＡ免疫複合体の高圧による解離：
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に対する抗体を検出する固相免疫吸着剤ＥＬＩＳＡ検定を、系内で開発した。ポリスチレンミクロタイタープレート（HiBind, Corning/Costar, Cambridge, MA）を、燐酸緩衝食塩水（PBS）,ｐＨ７．４中の６２５乃至１，２６５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＰＳＡ（Sigma Chemicals, St. Louis, MO）の０．１ｍｌで４℃で一夜被覆した。未反応部位を、ＰＢＳ中のSuperBlock（Pierce Chemical, Chicago IL）で1時間ブロックした。抗原被覆したミクロウエルを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の抗−ＰＳＡ抗体（７８−３１２ｎｇ／ｍｌ）の０．１ｍｌと４℃で一夜温置することにより、抗−ＰＳＡマウスモノクローナル抗体（DRG International, Mountainside, NJ）を固定化抗原に結合させた。ウエルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄した。固定化ＰＳＡに結合した抗−ＰＳＡ水準を決定するため、ウエルをセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に抱合したヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Pierce Chemical, Chicago, IL）と反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回以上洗浄後、ＡＢＴＳの１００μｌを加え、プレートを１時間温置後、４０５ｎｍで読みとった。
ＰＳＡ抗原への抗体の結合に対する圧力効果を決めるため、ＰＢＳ中のSuperBlock（Pierce Chemical, Chicago, IL）の０．１ｍｌを、抗−ＰＳＡ抗体が固定化ＰＳＡに結合しているミクロウエルに添加した。ミクロウエルに、融点浴油（Sigma, St. Louis, MO）を重ね、手動圧力装置（HiP, Erie, PA）に結合した慣例の設計の高圧室に、常圧で挿入した。次いで高圧を各ミクロウエルに３０分かけた。解離した抗体を、ＰＢＳ媒体に集めた。対応する対照試料に、油をかさね、試験試料に高圧をかけている間、常圧に保った。高圧を所望の時間かけた後、試験溶液を直ちに固定化ＰＳＡを含むミクロウエルの第２セットに移した。解離した抗体の水準を、上記ＥＬＩＳＡ検定で測定した。加圧したおよび対応する対照ミクロウエルを、ＰＢＳ−Ｔで洗い、同じＥＬＩＳＡ操作を使用して保持された抗体を試験した。
４０℃で６０，０００ｐｓｉで加圧した試料の吸光度は０．９３７であり、一方加圧しなかった対照の吸光度は１．４５７であった。ＰＳＡからの抗−ＰＳＡの解離は、上澄液の吸光度値により確かめた。加圧したウエルの上澄液の吸光度は０．５０４であり、一方常圧に保持した対照の吸光度は０．１１３であった。対応する対照に対する加圧ミクロウエルの吸光度の減少は、固定化ＰＳＡからの抗−ＰＳＡ抗体の圧力誘発解離と一致する。加圧ウエルから除去した上澄液が常圧対照に比べ増加を示すときは、解離が確認される。
圧力をかけている間に温度を４０℃に上げると、ＰＳＡからの抗−ＰＳＡの解離を著しく増加した。８０，０００ｐｓｉおよび２１℃の組み合わせは、加圧ウエルの吸光度を１．５５６から１．０５２に減少させた。これに対し、８０，０００ｐｓｉおよび４０℃の組み合わせは、吸光度を１．４５８から０．７３３に減少させた。後者の場合のより高水準の吸光度の減少は、これらの条件でのより高水準の解離と一致する。このデータの解釈は、上澄液で測定した吸光度の値により確認された。８０，０００ｐｓｉ／４０℃加圧上澄液の吸光度は０．６２９であり、一方、対照の吸光度は０．２４８であった。
実施例１０
たんぱく質へのアプタマーの結合に相当する状態図の決定操作：
Tuerkらの方法（Science, 249: 505-510, 1990）に従い、Sequence 26Bのインビトロ転写により誘導したアプタマーを、Boehringer Mannheim（Indianapolis, IN）製造のビオチンＲＮＡ標識混合物を使用して、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ反応で低水準のビオチン−１６−ＵＴＰを含ませることにより、ビオチンで標識した。ポリスチレンミクロタイタープレート（Hibind, Corning/Costar, Cambridge, MA）をＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．２中４℃で一夜、ｂＦＧＦ（Bachem, Torrance, CA）の１μｇ／ｍｌ溶液と温置することにより、アプタマー用固相吸着剤を製造した。未反応部位は、ＰＢＳ中のSuperblock（Pierce Chemical, Chicago, IL）でブロックした。
ｂＦＧＦおよびビオチニル化アプタマー２６Ｂを一緒に温置し、複合体試料を形成した。試料を、変形できるプラスチックカプセルに入れ、融点浴油（Sigma, St. Louis, MO）を重ねた。カプセルを高圧発生装置（HiP, Erie, PA）に入れた。複合体の一部に圧力をかけながら、対応する試料を、常圧で同じ温度条件にさらした。高圧を解除後、試料および対応対照（すなわち圧力処理なし）を、ｂＦＧＦ被覆のミクロプレトのウエルに入れた。ミクロタイタープレート中の試料を１時間常温で反応させ、ＨＲＰ標識ストレプタビジン（Sigma, St.Louis, MO）で捕獲アプタマーを検出することにより、遊離のアプタマー（ｂＦＧＦと複合化してない）水準を定量した。ｂＦＧＦおよびアプタマーの濃度を各測定で一定となるように、予め形成したｂＦＧＦ−アプタマー複合体およびビオチニル化２６Ｂアプタマーの量を変えて集めた標準曲線から、圧力処理試料および対照試料の複合化の度合いを決定した。ｂＦＧＦ−アプタマー複合体の解離またはさらなる会合は、それぞれ検定においてシグナル強度の増加または減少に転換された。
他の実施態様
上記説明から、当業者は、本発明の精神および範囲から離れることなく、本発明の本質的特徴を確認でき、種々の用法、条件に適合させるため、発明を種々変化、変形できる。ここで引用した全文献は、引用文献とする。
本発明を、詳細な説明に関連し記載したが、上記説明は例示を意図したもので、請求の範囲を限定するものではない。他の様相、利点および変形は、本願の請求の範囲内にある。たとえば、後で加圧下解離できる固定化抗原−抗体複合体で前結合したウエルも、請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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