(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チョウセンニンジン（Panax ginseng）の根から抽出された６種類の多糖類を含む組成物であって、
それら多糖類の分子量が1,800,000〜2,200,000、1,350,000〜1,650,000、620,000〜780,000、105,000〜130,000、23,000〜27,000、5,000〜6,000ダルトンであり、それぞれ11.4〜13.4：3.6〜4.2：4.5〜5.1：0.7〜0.9：40.1〜48.1：31.0〜37.0の重量比で存在する多糖類が、部分的にα（１→３）連結した分岐とともにα（１→６）連結のＤ−グルコピラノース単位を含み、
それら６種類の多糖類が、下記の工程：
i)  １重量部のチョウセンニンジン根を２〜４重量部のメタノールで抽出することにより残渣を得ること；
ii) 工程i)の残渣から３〜５重量部の蒸留水を使用して水可溶性画分を抽出し、得ること；
iii) 工程ii)で得られた水可溶性画分を凍結乾燥すること；
iv) 工程iii)での凍結乾燥画分から４０％エタノールに対し不溶性画分を得てから透析膜を使用して内画分を得ること；
v) セファクリルS-500ゲルクロマトグラフィーにより６画分を得ること；および
vi) ＤＥＡＥ−セファデックスA-50クロマトグラフィーに工程ｖ)で得られた多糖類組成物を通すこと；
により調製され、
該多糖類が、定量分析により98.5%よりも多い炭水化物ならびに1.0%未満の量のタンパク質を含んでおり、
該多糖類組成物が造血性の、骨髄保護の、抗腫瘍免疫細胞発生の、および放射線感作の活性を有することを特徴とする多糖類組成物。
【請求項２】
造血剤、骨髄保護剤、危険を誘導する放射線および／または抗がん剤の阻害剤、化学予防剤および放射線増感剤用の請求項１の多糖類組成物を有効量（100〜1000mg/日/60kg人）含むことを特徴とする医薬製剤用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、チョウセンニンジンから単離され、造血性の、骨髄保護の、抗腫瘍免疫細胞発生のおよび放射線増感の活性を有する新規多糖類に関する。本発明はまたチョウセンニンジンからの多糖類ならびに造血性の、骨髄保護の、抗腫瘍免疫細胞発生のおよび放射線増感の活性を増強する製剤用組成物の調製方法に関する。
【０００２】
詳しくは、本発明のチョウセンニンジンから単離される多糖類は、
下記の工程：
i)  メタノールを用いて残渣を得ること、
ii)  蒸留水を使用して水可溶性画分を抽出し、得ること、
iii)  ４０％エタノールを用いて沈殿物を得ること；および
iv）  透析膜を使用して多糖類を得ること、
v)   セファクリルS-500ゲルクロマトグラフィーにより６画分を得ること、
vi)  ＤＥＡＥ−セファデックスA-50クロマトグラフィーにより多糖類を精製すること、
の工程を含む調製方法により得られ、該多糖類は、
６種類の多糖類であって、それらの分子量が1,800,000〜2,200,000、1,350,000〜1,650,000、620,000〜780,000、105,000〜130,000、23,000〜27,000、5,000〜6,000ダルトンであり、11.4〜13.4：3.6〜4.2：4.5〜5.1：0.7〜0.9：40.1〜48.1：31.0〜37.0の比で存在する多糖類が、α（１→６）連結のＤ−グルコピラノース単位を主として含み、部分的にＣ-３位置で連結した分岐を持つ。
【０００３】
【発明の技術的背景】
本発明の完成以前に、チョウセンニンジン（Panax ginsen）から抽出された多くの多糖類が報告されてきた。以下はこのことにおける周知の報告である。
Ｄ−グルコースからなるグリカンの一つであるパナキサン（Panaxan）は、血糖レベルを低下させる活性成分として開示された〔Konno C. et al., チョウセンニンジン根のパナキサンA.B.C.D.およびEグリカンの単離と血糖低下活性、 Planta Medica 50 pp434-436,1984〕。その多糖類は、ガラクツロン酸、グルコース、アラビノース、マンノース、およびガラクトースからなり、抗補体効果を有する物質として開示された〔Gao Q., Kiyohara H. et al., チョウセンニンジンの根および葉からの多糖類画分の化学的性質および抗補体活性、Planta Medica 55 pp9〜12,  1989〕。さらにチョウセンニンジンからの当該多糖類は、抗腫瘍もしくは抗菌（bacterial resistance）活性を有することが報告された〔日本国特許公開公報1986-18722A1号〕。
【０００４】
上記多糖類は、すべてチョウセンニンジンから抽出されたものであるけれども、それらの多糖類の成分は、本発明に係る多糖類の成分とは異なっている。さらにチョウセンニンジンから抽出された多糖類が、造血性の、骨髄保護の、抗腫瘍免疫細胞発生の、および放射線増感の活性を増強する物質としては決して開示されたことはない。
【０００５】
他方、チョウセンニンジンからの効能ある物質はサポニン誘導体に属し、それは本発明の多糖類に比べて異なる分子構造を有する。
酵母細胞壁から分離されたβ-グルカンは、造血活性を持つことが知られているが、本発明の多糖類とは異なる分子構造を有する。さらに、ストレプトコッカス  ピロジェンス（Streptococcus pyrogenes Su）細胞系を、Lentinus edodesから抽出された椎茸抽出物（Lentinan）とともに加熱処理することにより調製されるＯＫ−４３２粉末は、生物応答調節剤（biological response modifiers, BRMs）として開示されているが、β-グルカン構造もまた有する。
【０００６】
本発明は、チョウセンニンジン根から造血性細胞、骨髄保護性の発生しつつある抗腫瘍免疫細胞および放射線増感腫瘍細胞の成長を促進する活性をもつ多糖類を精製単離することにより完成された。
【０００７】
【発明の開示】
本発明の目的は、チョウセンニンジン（Panax  ginseng）の根から調製され、下記の工程：
i)  １重量部のチョウセンニンジン根を２〜４重量部のメタノールで抽出することにより残渣を得ること；
ii)  工程i)の残渣から３〜５重量部の蒸留水を使用して水可溶性画分を抽出し、得ること；
iii) 工程ii)で得られた水可溶性画分を凍結乾燥すること；
iv)  工程iii)での凍結乾燥画分から４０％エタノールに対し不溶性画分を得てから透析膜を使用して内画分を得ること；
v)   セファクリルS-500ゲルクロマトグラフィーにより６画分を得ること；および
vi)  ＤＥＡＥ−セファデックスA-50クロマトグラフィーにより多糖類を精製すること；
により精製された造血性の、骨髄保護の、抗腫瘍免疫細胞発生のおよび放射線増感の活性を有する多糖類組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、分子量が1,800,000〜2,200,000、1,350,000〜1,650,000、620,000〜780,000、105,000〜130,000、23,000〜27,000、5,000〜6,000ダルトンであり、11.4〜13.4：3.6〜4.2：4.5〜5.1：0.7〜0.9：40.1〜48.1：31.0〜37.0の比で存在する６種類の多糖類であって、部分的にα（１→３）連結した分岐とともにα（１→６）連結のＤ−グルコピラノース単位を含む多糖類を提供することにある。
【０００９】
さらに定量分析により98.5%よりも多い炭水化物ならびに1.0%未満の量のタンパク質を含む多糖類を提供することにある。
本発明の更なる目的は、造血性の、骨髄保護性の、抗腫瘍免疫細胞発生の、および放射線増感の活性を増強する多糖類を有する製剤用組成物を与えることである。
【００１０】
【発明の最良の実施態様】
本発明の単離方法は図１に模式化されている。以下は、その詳細な抽出方法である。
１重量部のチョウセンニンジンを３重量部のメタノールで抽出した。抽出後、残渣を得て暗所で乾燥した。次いでその残渣から４重量部の蒸留水を使用して４℃、24時間で３回、抽出して水可溶性画分を得て凍結乾燥した。得られた水可溶性画分は、少量の蒸留水に溶解し、次に４０％エタノールにより沈殿させて、不溶画分を得た。次いでセルロース膜を使用して蒸留水に対して透析することにより多糖類画分を得て凍結乾燥した。結局、セファクリルS-500ゲルクロマトグラフィーにより６画分の多糖類を得て、ＤＥＡＥ−セファデックスA-50クロマトグラフィーにより多糖類を精製した（図1〜３）。
１）本発明に係る多糖類の炭水化物含量の定量
本発明の多糖類の総炭水化物は、Ｄ−グルコースを標準としてフェノール硫酸法により定量した。多糖類を蒸留水に0.1mg／mlの濃度で溶解した。次いで、５％フェノール溶液30μlおよび硫酸0.2mlの試薬を、20μlの多糖類溶液に加えて撹拌し、60℃で20分間反応させた。490nmで吸光度を測定し、多糖類の炭水化物含量は、グルコース標準に対比して98.5%である。
２）本発明に係る多糖類のタンパク質含量の定量
本発明の多糖類に含まれる総タンパク質は、バイオラッド社（Bio-Rad, Co）のタンパク質アッセイキットを使用して製造業者の指示に従い、ブラッドフォード（Bradford）法により定量した。多糖類のタンパク質含量は、ウシ血清アルブミンを標準に対比して1.0%よりも少なかった。
３）薄層クロマトグラフィーによる本発明に係る多糖類の糖成分の同定
本発明の多糖類20mgを1Ｍ硫酸２mlとともに100℃で4時間反応させ、水酸化バリウムで中和した。本発明の多糖類は、n-プロパノールおよび水（85:15,v/v）の混合溶媒系を使用し、硫酸で検出する薄層クロマトグラフィーによって主にグルコースで構成されていた。図４は、多糖類がグルコースを含んでいたことを示す。
４）本発明に係る多糖類の成分を調べるため、ガスクロマトグラフィーにより糖分析の定量をおこなった。
【００１１】
本発明の多糖類20mgをＤＭＳＯ（2ml）に溶解し、窒素ガスのもと、60℃で５分間反応させた。多糖類溶液にメチルスルフィニルカルバニオン（0.5ml）を加え、25℃で1.5時間反応させた。反応混合液は水で透析しクロロホルムで抽出し、かかるメチル化は、水酸基のＩＲ吸収バンドがなくなるまで反復した。メチル化された多糖類は、最初90%蟻酸（0.5ml）で100℃で8時間、次いで２Ｍトリフルオロ酢酸（0.5ml）で３時間100℃で、加水分解した。水素化ホウ素ナトリウムで還元後、アルディトール (alditols)は、酢酸-ピリジン(1:1,v/v)0.2mlとともに100℃で2時間加熱することによりアセチル化した。生成物は、ＧＣ-マスにかけ、このＧＣ−マスはＨＰ−５毛細管カラムを使用し280℃の条件下で行った。インジェクターの温度条件は280℃であり、炎イオン化検出器の温度は300℃であった。これらの結果に基づき、該多糖類は、α（１→６）連結のＤ−グルコピラノース単位からなり、３位を通じて、10:1の比で部分的に連結した分岐を持つ（表１）。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
５）本発明の多糖類の分子量決定
本発明に係る多糖類のゲル浸透クロマトグラフィーをHewrette-Packard HP-600Sで行った。移動層は、1.5 ml/minの流速で0.1Ｍ炭酸ナトリウム溶液であり、糖は、屈折率検出器で追跡した。分子量は、アマーシャム・ファーマシア・バイオテック社（Amersham Pharmacia Biotech.）から購入したデキストランＴ２０００（分子量2,000,000ダルトン）、Ｔ５００（分子量500,000ダルトン）、Ｔ７０（分子量70,000ダルトン）、Ｔ４０（分子量40,000ダルトン）、Ｔ１０（分子量10,000ダルトン）といった標準多糖類との溶出時間および面積の比較により決定した。表２は、本発明の多糖類が、11.4〜13.4：3.6〜4.2：4.5〜5.1：0.7〜0.9：40.1〜48.1：31.0〜37.0の比で存在する分子量が、1.8〜2.2×106、1.35〜1.65×106、6.2〜7.8×105、1.05〜1.3×105、2.3〜2.7×104、5.0〜6.0×103ダルトンからなることを示す。
【００１４】
【表２】
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【００１５】
６）本発明の多糖類の確認のためのフーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）分光法の適用
本発明に係る多糖類のＩＲスペクトルを、ＫＢｒを使いフーリエ変換赤外分光器、Bomen DA8.12, Hartman and Braun, Co.,カナダ国 により測定した。ＩＲスペクトル（図５）は、ヒドロキシル基（-ＯＨ）を示す3400cm-1の幅広い吸収；エステル基（Ｃ-Ｏ）を示す1000〜1100 cm-1の吸収バンドおよび炭化水素を示す2800〜2900 cm-1の吸収バンドを表している。
７）本発明の多糖類の構造解明のためのＮＭＲ分光法の適用
本発明の多糖類のＮＭＲスペクトルが、重水溶媒について500ＭＨｚで核磁気共鳴分光法、Bruker AMX 500,ドイツ国により得られた。プロトン核磁気共鳴（1Ｈ-ＮＭＲ）スペクトルは、ヒドロキシル化されたメチンおよびメチレンプロトンに基づくδ3.5〜4.2、アノマーの水素プロトンシグナルに基づくδ4.76（二重線、J=2.6Ｈz）δ4.98（二重線、J=3.0Ｈz）を示しているグルコースの典型的なスペクトルを示した（図６）。相互作用の比は10:1であった。これらの結果は、Ｄ−グルコース単位がα-連結していることを示唆した。13Ｃ-ＮＭＲスペクトル（図７）は、6個の主要炭素シグナル（δ62.6, 66.0, 77.8, 78.9, 82.8および106.7）ならびに12個の小さい炭素シグナル（δ63.0, 64.8, 63.6, 65.1, 72.3, 76.9, 77.3, 79.2, 82.1, 83.6, 83.8, 106.1, 106.2および106.7）を示した。これらのシグナルのなかで、Ｃ-６炭素シグナルは、δ62.6, 64.8 および65.1で吸収し、Ｃ-3炭素シグナルはδ82.9, 83.6および83.8で吸収した。Ｃ-1炭素シグナルは、δ106.7, 106.1および106.2で現われた。本発明に係る多糖類のこれらのスペクトル性質は、α-Ｄ-グルコース単位が１、３および６位で連結していることを示した。この結果は、この多糖類が主要な骨格および小さい分岐から構成されていることを示唆した。
【００１６】
炭素およびプロトンのすべてを異核多重量子相関（ＨＭＱＣ）実験によりマッチさせた。プロトンとプロトンとの相関は、1Ｈ-1Ｈ-ＣＯＳＹ実験により決定した（図８）。δ3.89でのプロトンシグナルはδ3.56とスピンカップリングしており、δ4.10はδ4.19とスピンカップリングしており、δ3.67はδ3.79およびδ4.10とスピンカップリングしており、δ3.69はδ3.79とスピンカップリングしている。したがって、本多糖類は、α（１→６）グルコピラノース連結を有することが同定された。長域Ｃ-Ｈカップリングは、図９に示すように異核多重結合コヒーレンス（ＨＭＢＣ）実験により観測された。δ66.0での炭素シグナルはδ4.10のメチンプロトンと相関しており、δ82.8の炭素シグナルはδ3.56および4.10のプロトンと相関し、δ71.8での炭素シグナルはδ4.19のプロトンと相関し、δ78.9での炭素シグナルはδ3.79および4.10のプロトンと相関し、δ62.6での炭素シグナルはδ4.19のプロトンと相関し、δ106.7での炭素シグナルはδ3.79のプロトンとそれぞれ相関していた。これらの結果から、α（１→６）グルコピラノース連結が同定された。
【００１７】
本発明の物理化学的および分光学的な諸性質を精査すると、その構造はα（１→６）連結Ｄ−グルコピラノース単位であると同定され、３位を通じて部分的に連結した分岐を10:1の比率で有する（図２）。
チョウセンニンジンから単離された多糖類は、様々な薬剤に使用することができ、たとえば造血細胞の発育を促進する薬剤、骨髄細胞を保護する薬剤、放射線−化学治療法により誘発された造血細胞の抑圧を阻害する薬剤、抗腫瘍免疫治療剤、がん予防剤および放射線治療の治療効果を高める薬剤などである。
【００１８】
本発明は、さらに具体的に以下の実施例により説明される。しかしながら、実施例は本発明の説明を意図したものであり、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではないことは理解されねばならない。
【００１９】
【実施例】
【００２０】
【実施例１】
造血細胞の成長促進に関する試験
１）  顆粒球マクロファージコロニー形成単位（GM-CFU, granulocyte macrophage-colony forming unit）の発生
骨髄細胞（1×105/皿）を、0.3%の寒天、20%の馬血清および10%の組換GM-CSFを加えたIscove's変法ダルベッコ培地(IMDM, Iscove's modified Dulbecco's medium)が入っている35mmの組織培養皿（2mmのグリッドを有する、Nalge Nunc. International, Corning, NY, USA）にプレートした（植え付けた）。本発明の多糖類を、濃度に従って処置し、37℃、空気中5%のCO2中で、7日間培養物を維持した。50細胞より多いコロニーを評価した。表３は、GM-CFUの数が、コントロールにおける40.67から、チョウセンニンジンの多糖類を50μg/mlの割合で用いて培養されたものでは、64.67コロニーにまで増大されたことを示している。
【００２１】
【表３】
0003797930.tif 000004
【００２２】
【実施例２】
骨髄保護（myeloprotecting）活性に関する試験
１）  照射により誘導される造血細胞の抑制阻害に関する特性
18〜22gの重さのメスのBALB/cマウスをアクリル製の箱に入れ、97.1 cGy/分の線量率で、60Co γ−照射にさらした。本発明の多糖類を、リン酸バッファー溶液（PBS, pH 7.4）に溶かし、0.45μmのミリポア（Millipore）膜（Corning, NY）を用いてろ過し、マウスに投与するまで、4℃で保管した。適当な濃度の多糖類を0.2ml容積で、腹膜内注射により正常なマウスに投与した。コントロールの動物は、同時に、0.2mlのPBSを受けた。ヘパリン化キャピラリーチューブ（Chase instruments corp., Norcross, GA）を用いてマウスの眼瞼から血液を得た。自動血球（blood cell）分析装置、cell-DYN 4000を用いて、血球分析を行った。
【００２３】
▲１▼照射後の骨髄および脾臓細胞充実性（cellularity）に及ぼす効果
4.5 Gy照射の5日後に、マウスの骨髄および脾臓細胞の数を計測した。それぞれの細胞の数を、トリパンブルー排除法（trypan blue exclusion method）により評価した。
PBSのみを投与した、照射されたコントロールマウス中の脾臓細胞および骨髄細胞の数は、それぞれ、非照射の正常マウスの10％未満、および62％未満であった。これらの値は、照射の24時間前に、多糖類を100mg/kg注射したマウス由来の脾臓細胞充実性においては1.8倍、骨髄細胞充実性においては1.3倍増加した。図10は、この結果を示す。
【００２４】
▲２▼致死下（亜致死）の照射後の顆粒球マクロファージコロニー形成単位（GM-CFU）の早期回復
本発明の多糖類をPBS中に溶かし、照射の24時間前に、腹膜内注射により100mg/kgまたは200mg/kgで投与した。その後、マウスを4.5 Gy致死下の線量で照射した。GM-CFUの数を、照射後5日目に測定した。
【００２５】
表4は、GM-CFUの数が、照射されたPBS-コントロールマウスでは非常に低く、非照射の正常値の約17％であったことを示しており、他方、照射前に多糖類を投与したグループでは、注目されたGM-CFUの増加（エンハンスメント）が正常のものの63〜80％にまでになったことを示している。そのことは、多糖類を投与されたグループは、コントロールのグループと比較して、3.7〜4.7倍早く回復されることを示している。
【００２６】
【表４】
0003797930.tif 000005
【００２７】
▲３▼末梢血球の改善効果
4.5 Gy致死下照射の5日後に、白血球の数が3.463±0.236から0.476±0.034×103/μLに減少した。血小板の数は、585.0±39.0から354.5±26.0×103/μLに減少し、好中球およびリンパ球の数もまた有意に減少した。表5に見られるように、多糖類処置マウスにおける造血の回復は、照射コントロールグループのものよりも2倍早く、特に好中球の数に対するものが早かった。
【００２８】
【表５】
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【００２９】
▲４▼コロニー形成単位−脾臓の増大効果
照射前24時間にてPBSまたは多糖類を100mg/kg投与され、致死下照射された5日目のマウス（5匹のマウス/各グループ）から、骨髄細胞を回収した。受容体マウス（10匹のマウス/各グループ）は、９Gｙの致命的照射線量を受けた。骨髄細胞（105）を受容体マウスの尾の静脈に静脈（intraveineously）注射した。脾臓中のコロニーの数を、Bouin's溶液で固定させた後8日後に顕微鏡により数えた。
【００３０】
照射PBSコントロールマウスでは、コロニーは検出されないが、100mg/kgの量で多糖類を用いて処置したマウスでは、17.47±2.33 CFU-Sを生じた。表6は、この結果を示す。
【００３１】
【表６】
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【００３２】
２）  抗がん剤によって誘導される造血特性の抑制に及ぼす阻害効果
▲１▼シクロホスファミドで処置した後の骨髄、脾臓細胞充実性およびGM-CFUの数の早期回復
250mg/kgのシクロホスファミドの投与後24時間後にて、50mg/kgの多糖類を投与した。骨髄および脾臓細胞を9日目のマウスから回収し、それぞれの細胞の生存能力をトリパンブルー排除法により評価した。
【００３３】
シクロホスファミドで処置したグループに対しては、骨髄細胞の数は、正常レベルの76％だけ減少したが、統計的には有意ではなかった。シクロホスファミドと一緒に多糖類が投与されたグループでは、骨髄細胞の数には有意な変化はなかった。
他方、脾臓の細胞充実性では、シクロホスファミドの処置に対してより感受性であった。シクロホスファミドを併用して多糖類（100mg/kg）が投与されたマウスでは、脾臓細胞の数が、正常値の68％を示すシクロホスファミド処置されたコントロールマウスに比べ、2.1倍増加した。
【００３４】
さらに、シクロホスファミド処置されたマウスのGM-CFUの数は、正常レベルの40％まで有意に減少したが、他方で、シクロホスファミドを併用して多糖類を投与したマウスのGM-CFUの数は、シクロホスファミド処置コントロールマウスよりも1.94倍増加した。表７にこの結果を示す。
【００３５】
【表７】
0003797930.tif 000008
【００３６】
【実施例３】
抗腫瘍免疫細胞の活性化に関する試験
１）  ナチュラルキラー（NK）細胞の活性化に関する試験
C3H/HeNマウスを5匹ケースに入れ、PBSまたは多糖類を腹膜内注射により10,50,100,200mg/kg投与した。4時間［51Cr］放出アッセイを用いてナチュラルキラー細胞の発生を決定した。すなわち、多糖類投与後24時間にて脾臓細胞（1.5×106細胞/ml）を準備し、［51Cr］標識標的細胞、YAC-1を用いて（エフェクター細胞：標的細胞＝100:1）、96 well-U-bottomマイクロプレート中で4時間培養した。このプレートを採取し、上澄み液に放出された放射能を、γ−カウンター（Beckmann Inst., Palo Alto., CA, USA）を用いて決定した。特定の放出の割合は、次のように計算された：
特定の放出の％＝（ER-SR）/(MR-SR)×100
（式中、ERは実験グループからの平均カウントであり、SRは単独で培地中でインキュベートされた標的細胞からの平均カウントであり、MRは0.5％ triton X-100で処置した標的細胞からの平均カウントである）。100mg/kgで多糖類処置されたグループは、YAC-1腫瘍細胞に対し42.4%の細胞毒性を示し、これは、コントロールの12.1%より、3.5倍高い。表8は、この結果を示す。
【００３７】
【表８】
0003797930.tif 000009
【００３８】
２）  細胞毒性Tリンパ球の活性化に関する試験
MOPC 315プラズマ細胞腫細胞系（American Type Culture Collection, Rockville, MD）を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび10%の牛胎児血清（FCS）を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM, Dulbecco's modified Eagles medium）中で培養した。MOPC 315細胞を1×106で、Balb/cマウスに皮下(s.c.)注射した。3日後に、多糖類を50,10,2mg/kgの濃度で一日おきに4回、マウスに腹膜内注射により投与することにより、マウスに投与した。14日後、脾臓細胞を採取し、CTL活性を51Cr標識標的細胞に対して評価した。種々の数のエフェクター細胞を3倍量で104の51Cr標識MOPC315腫瘍細胞とともに混合し、96-well U-bottom組織培養皿で培養した。4時間後、プレートを400gで5分間遠心分離し、0.1mlの上澄み液を回収し、ガンマカウンターでカウントした。2,10,50mg/kgで多糖類を投与したグループは、それぞれ、MOPC 315細胞に対し、18.6, 22.4, 17.8%の細胞毒性を示した。表9は、この結果を示す。
【００３９】
【表９】
0003797930.tif 000010
【００４０】
３）  多糖類を用いて培養された腹膜のマクロファージの殺腫瘍活性に関する試験
C3H/HeNマウスの腹膜のマクロファージを、単離して、37℃、5% CO2インキュベーターで24時間、多糖類を入れたまたは入れていない96well-U-Bottomマイクロプレートに2×105細胞/ウェルを接種した。腹膜のマクロファージを、PBSで洗浄し、多糖類を除き、2μCi/ウェルの3H-チミジンの存在下、1×104細胞/ウェルでYAC-1細胞と共にインキュベートした。24時間後、細胞を自動多重ウェル採取機（automatic multiwell harvester）を用いて採取し、標的細胞に取り込まれた放射能の量を液体シンチレーションカウンター中でカウントした。10, 50, 100μg/mlの多糖類を用いて培養した腹膜のマクロファージは、YAC-1がん細胞の成長をそれぞれ52.6, 69.2, 59.8％阻害した。表10は、その結果を示す。
【００４１】
【表１０】
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【００４２】
４）  インビボにおける抗腫瘍形成に関する試験
MOPC 315腫瘍細胞（１×106細胞/マウス）を、Balb/cマウスにs.c.注射した。10, 2, 0.5mg/kgの多糖類およびPBSを、腫瘍の接種後3日目から1日おきに8回腹膜内注射した。図11は、10, 2, 0.5mg/kgの多糖類を投与したマウスでは、30日目のコントロールマウスと比較して、腫瘍の大きさが22%、46%、16%減少したことを示している。
５）  がん予防効果に関する試験
Balb/cマウスを4つのグループに分けた。それぞれのグループは50匹のマウスを含んだ。1% ゼラチン水溶液中の0.5mgのベンゾ［α］ピレンを、誕生後24時間以内に肩甲骨領域に皮下注射し、0.5, 2, 10mg/mlの割合で飲み水に溶かした多糖類を、離乳後9週間無制限に与えた。マウスを殺し、肺を取り除いた後、Bouin's溶液で固定した。肺中の小結節の数を顕微鏡下で数えた。表１１に見られるように、BP単独グループ中の肺腫瘍の発生率は62%であり、それは、多糖類を用いた処置によってそれぞれ、31%、23%、および45%まで有意に減少した。
【００４３】
【表１１】
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【００４４】
６）  サイトカインmRNAの発現に関する試験
C3H/HeNマウスの脾臓細胞（２×106細胞/ml）を種々の濃度の多糖類（5μg/ml、50μg/ml、200μg/ml）を入れた6ウェルプレートに接種し、1、3、6、24時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、全RNAを単離した。全RNAの1μgを37℃で60分間逆転写した。逆転写酵素を95℃で5分間不活化し、2.5UのTaqポリメラーゼ、10μMの各dNTPs、40pmolのサイトカインプライマーおよび1.5mMの塩化マグネシウム条件下で、cDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。PCR生成物をエチジウムブロミドで染色した2%アガロースゲル上で電気泳動し、DNAサイズマーカー、λDNA-BstEII Digestと比較した。それぞれのサイトカインmRNA発現を、β−アクチンと比較するMCIDソフトウェアプログラムを有するイメージアナライザーを使用して定量した。Th1細胞由来のIL-2、IFNγ、IL-12 mRNA；Th2細胞由来のIL-4、IL-5、IL-10およびマクロファージ由来のTNFα、GM-CSF、IL-1βの発現が誘導された。図12は、この結果を示している。
【００４５】
【実施例４】
腫瘍細胞の放射線感受性に及ぼす増大効果に関する試験
１）  酸化窒素の発生に関する試験
NOの放射性感受性にする効果は、よく証明されているので、われわれは、NO生成物およびLine 1細胞系中の多糖類の放射線感受性効果を評価した。腫瘍細胞培養上澄み液中の、NO形成の安定な最終生成物である、NO2-の集積を、NO生成物の相対測定として利用した。細胞を96ウェルプレート上に、5×104細胞/ウェルの割合で、多糖類（100μg/ml）またはIFN-γ（50U/ml）とともに接種した。24時間のインキュベーション後、100μlの細胞のない上澄み液を100μlのGriess試薬（H2O中の0.1％ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩：5%H3PO4中の1%スルファニルアミド＝１：１）とともに室温で10分間インキュベートし、550nmにおける吸収を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。NO2-の濃度を、それぞれの実験で発生した亜硝酸ナトリウム標準の最小二乗線形回帰解析により決定した。図13に示したように、多糖類（100μg/ml）で処置した細胞は、21.6μMのNO2-を生成し、またIFNγでは、16.7μMのNO2-を生成した。細胞を、IFNγ（50U/ml）を併用した多糖類（100μg/ml）により処置したときは、相乗作用的効果があった。
２）  放射線感受性効果の評価
対数期発育におけるLine 1細胞を採取し、多糖類、IFN-γまたはIFN-γを併用した多糖類を入れた6mm2の培養皿に16時間接種し、照射した。皿あたりの細胞数を処理したところ、各条件で、50-200コロニーが生き残った。7日のインキュベーションの後、コロニーを無水メタノール中の1%メチレンブルーで染色し、カウントした。＞50細胞を含むコロニーを評価した。増大割合（ER）は、コントロール条件についての放射線量を1%生存フラクションレベルで種々の試薬処置された条件についての放射線量で割ることにより算出した。図14は、多糖類（100μg/ml）およびIFN-γ（50U/ml）を用いて処置されたLine 1細胞に関する放射線生存曲線を示している。多糖類に関するERsは、1.28であり、IFN-γに関しては1.14であった。多糖類とIFN-γとの併用効果のERは、1.66であった。
３）  インビボにおける放射線感受性効果に関する試験
インビボにおける多糖類の放射線感受性効果を調査するために、Line 1細胞をBalb/cメスのマウスに移植した。腫瘍が、平均容積1000mm3になると同時に、処置を開始した。腫瘍体積は、カリパスを用いた直接計測により決定し、式（長さ×幅×厚さ／２）により計算し、平均容積±S.E.として報告した。マウスにPBSまたは多糖類（200mg/kg）を、一日おきに3回腹膜内注射した。処置後、マウスを線量率65.8cGy/分で20Gy放射線にさらした。多糖類の投与および放射線を組合わせた場合、腫瘍は、同じ時点では、実際にコントロールマウスの45%だけ退行した（図15）。
【００４６】
【実施例５】
急性毒性に関する試験
多糖類の急性毒性を測定するために、2g/kg、1g/kg、200mg/kgまたは40mg/kgの多糖類を腹膜内注射した。30日の期間の間に生じた死亡数を計測した。表12は、この結果を示している。
【００４７】
【表１２】
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【００４８】
本発明の多糖類は、従来の担体を用いた製薬調製物に調製されてもよい。この処方は、種々の方法、たとえば、経口または非経口投薬型の、タブレット剤、分散剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液剤または注射剤に用いることができる。
多糖類の投薬量は、患者の状態、体重、年齢および性別に従って変えることができる。一般に、100〜1,000mg/日/60kgが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、チョウセンニンジンから本発明の多糖類を得る単離工程を示す。
【図２】図２は、チョウセンニンジンからの本発明の多糖類の部分構造を示す。
【図３】図３は、セファクリルＳ-500ゲルクロマトグラフィーによる本発明の多糖類、６種の単離工程を示す。
【図４】図４は、本発明に係る多糖類の酸加水分解後のＴＬＣパターンを示す。
【図５】図５は、本発明の多糖類のＩＲスペクトルを示す。
【図６】図６は、本発明の多糖類の1Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】図７は、本発明の多糖類の13Ｃ-ＮＭＲスペクトルを示す。
【図８】図８は、本発明の多糖類のＤＱＦ-ＣＯＳＹスペクトル示す。
【図９】図９は、本発明の多糖類のＨＭＢＣスペクトル示す。
【図１０】図１０は、本発明の多糖類による60Ｃｏγ線照射後の骨髄細胞への保護効果を示す。
【図１１】図１１は、本発明の多糖類によるインビボでの抗腫瘍効果を示す。
【図１２】図１２は、本発明の多糖類によるサイトカイン発現ｍＲＮＡの増強効果を示す。
【図１３】図１３は、本発明の多糖類によるがん細胞系における酸化窒素の生成効果を示す。
【図１４】図１４は、本発明の多糖類によるがん細胞系における放射線増感活性を示す。
【図１５】図１５は、本発明の多糖類による放射線治療効果の増強作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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