(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアニオン及び両性界面活性剤の存在下、生体由来試料に(1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ、又は(2)コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）を作用させて、該試料中の低比重リポタンパク中のコレステロールの反応を阻害、遅延ないしは一時的に停止させ、低比重リポタンパク以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を消去（消費）した後、低比重リポタンパク中のコレステロールの反応によって生成する過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに基づいて生体由来試料中のコレステロールを測定する、ことを特徴とする、低比重リポタンパク中のコレステロールの測定法。
【請求項２】
ポリアニオン及び両性界面活性剤の存在下、生体由来試料に(1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ、又は(2)コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）を作用させた後、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中の低比重リポタンパク中のコレステロール量を算出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体由来試料とポリアニオン及び両性界面活性剤を接触させ、低比重リポタンパク以外のリポタンパク中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ低比重リポタンパク中のコレステロールの反応が開始される前に反応系の吸光度を測定し、更に低比重リポタンパク中のコレステロールの反応が実質的に終了した後に再度反応系の吸光度を測定し、これらの結果に基づいて生体由来試料中の低比重リポタンパク中のコレステロール量を算出する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
２試液法で測定を行う、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
第一試液にカタラーゼが含まれ、第二試液にカタラーゼ阻害剤が含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
更に、非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤の共存下に測定を行う、請求項１〜５の何れかに記載の測定法。
【請求項７】
更に、低比重リポタンパク以外のリポタンパクに結合する抗体の共存下に測定を行う、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
生体由来試料中の低比重リポタンパク中のコレステロールの反応を阻害、遅延ないしは一時的に停止させ、低比重リポタンパク以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を消去（消費）した後、低比重リポタンパク中のコレステロールの反応によって生成される過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定するための、下記(a)〜(c)の何れかの低比重リポタンパク中のコレステロールの測定用キット。
(a)(1)ポリアニオン及び両性界面活性剤、(2)コレステロールエステラーゼ、(3)コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及びカップラー又は／及びデベロッパー、及び(4)水性媒体を含んでなる第一試液と、水性媒体及び要すればデベロッパー又はカップラーを含んでなる第二試液とからなる、低比重リポタンパク中のコレステロール測定用キット。
(b)(1)ポリアニオン及び両性界面活性剤、(2)コレステロールエステラーゼ、(3)コレステロールオキシダーゼ、(4)カタラーゼ、及び(5)水性媒体を含んでなる第一試液と、カタラーゼ阻害剤と水性媒体とを含んでなる第二試液とからなるものであって、ペルオキシダーゼ、カップラー、デベロッパーが夫々第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、低比重リポタンパク中のコレステロール測定用キット。
(c)(1)ポリアニオン、(2)両性界面活性剤、(3)コレステロールエステラーゼ、(4)コレステロールデヒドロゲナーゼ、(5)ＮＡＤ（Ｐ）、及び(6)水性媒体を含んでなる第一試液と、(1)水性媒体を含んでなる第二試液とからなる、低比重リポタンパク中のコレステロール測定用キット。
【請求項９】
(1)ポリアニオン及び両性界面活性剤、(2)コレステロールエステラーゼ、(3)コレステロールオキシダーゼ、(4)カタラーゼ、及び(5)水性媒体を含んでなる第一試液と、カタラーゼ阻害剤と水性媒体とを含んでなる第二試液とからなるものであって、ペルオキシダーゼ、カップラー、デベロッパーが夫々第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、請求項８に記載の低比重リポタンパク中のコレステロール測定用キット。
【請求項１０】
更に、非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤が夫々第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１１】
第一試液が、更に低比重リポタンパク以外のリポタンパクに結合する抗体を含むものである、請求項８〜１０の何れかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、血清、血漿などの生体試料中に存在する低比重リポタンパク（以下、ＬＤＬと略記する。）中のコレステロールの測定法及びそのための試薬並びにキットに関する。
【０００２】
【発明の背景】
血清中の脂質の主な成分はコレステロール、トリグリセライド、リン脂質等であり、これら血清脂質はアポタンパクと結合してリポタンパクを形成し血中を循環する。該リポタンパクは比重の差により高比重リポタンパク（ＨＤＬ）、ＬＤＬ、超低比重リポタンパク(ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）等に分類される。これらリポタンパクのうち、ＨＤＬは組織に沈着した過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、抗動脈硬化作用を有し、一方、ＬＤＬは肝臓から各組織へのコレステロールの主たる運搬体であり、ＬＤＬの増加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられる。
従って、ＬＤＬ中のコレステロール（以下、ＬＤＬ−コレステロールと略記する。）は、動脈硬化症、虚血性心疾患（冠動脈疾患）の危険因子と考えられ、ＬＤＬ−コレステロール量は、これら疾患の診断・治療及び予防の重要な指標となる。
【０００３】
従来、ＬＤＬ−コレステロールの測定法としては、沈殿法、超遠心法、電気泳動法、算出式による算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法は、沈殿・遠心分離処理、超遠心分離処理或いは電気泳動処理により、ＬＤＬとＬＤＬ以外の不要のリポタンパクとを分離する前処理工程が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査の分野で広く普及している自動分析装置だけで直接測定を実施することができないという問題点を有している。
また、フリーデワルド（Friedewald）の式で知られている総コレステロール値、ＨＤＬ−コレステロール値及びトリグリセライド値から算出する算出法も、トリグリセライドを400mg／dl以上含有する試料を用いた場合には、正確なＬＤＬ−コレステロール量を測定することができないという問題を有している。
【０００４】
近年、従来法に於ける上記の如き問題点を解消するために、種々の方法が開発されており、例えば特開平７−２８０８１２号公報に開示された方法もその一つである。
即ち、ＬＤＬを凝集剤又は／及び抗体を使用して凝集させた後に、ＬＤＬ以外のリポタンパクに含まれるコレステロールを定量反応に関与しない別の反応系に導いて消去（消費）させた後、界面活性剤又は／及び無機塩類を使用して、凝集させたＬＤＬを定量反応ができる程度に溶解させ、ＬＤＬ−コレステロールを定量反応に付し該溶液の吸光度を測定するという方法がそれである。
【０００５】
しかしながら、この方法は、測定に３又は４種の試液が必要であるため、３又は４種の試液を用いて測定が可能なごく一部の自動分析装置にしか適用できず、通常の臨床検査に於いて用いられている２種の試液までしか使用できない自動分析装置を用いては測定を実施することができないという問題点がある。また、この方法には、３又は４種の試液を用いて測定を行うため、測定値の再現性が低下するという問題点もあった。
【０００６】
更に、煩雑な前処理操作なしでＬＤＬ−コレステロールを測定する方法として特開昭５８−１６５８００号公報に開示されている方法がある。しかしながら、この方法は、試薬中の例えば界面活性剤やコレステロールエステラーゼ（以下、ＣＨＥと略記する。）の使用濃度が限定されるため試薬の調製が煩雑であり、更に測定時のｐＨや、測定時間間隔等測定条件を厳密に設定しなくてはならず、しかもＨＤＬ中のコレステロールもある程度反応することから、動力学的測定、すなわち、レイト・アッセイでしかＬＤＬ−コレステロールの測定を行うことができないため、実用的な測定方法とは言い難い方法であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記した如き状況に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールを、従来法に於いて必要であった、ＬＤＬとＬＤＬ以外の不要のリポタンパクとを分離するための煩雑な前処理操作なしに直接自動分析装置等を用いて測定することを可能とする方法及びそれに用いられる試薬の提供にある。
【０００８】
【発明を解決するための手段】
本発明は、ポリアニオン及び両性界面活性剤の存在下、生体由来試料に(1)ＣＨＥ及びコレステロールオキシダーゼ（以下、ＣＯと略記する。）、又は(2)ＣＨＥ、コレステロールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＨＤと略記する。）及びＮＡＤ（Ｐ）を作用させて、該試料中の低比重リポタンパク中のコレステロールの反応を阻害、遅延ないしは一時的に停止させ、低比重リポタンパク以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を消去（消費）した後、低比重リポタンパク中のコレステロールの反応によって生成する過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに基づいて生体由来試料中のコレステロールを測定する、ことを特徴とする、低比重リポタンパク中のコレステロールの測定法の発明である。
【０００９】
また、本発明は、生体由来試料中の低比重リポタンパク中のコレステロールの反応を阻害、遅延ないしは一時的に停止させ、低比重リポタンパク以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を消去（消費）した後、低比重リポタンパク中のコレステロールの反応によって生成される過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定するための、下記(a)〜(c)の何れかの低比重リポタンパク中のコレステロールの測定用キットの発明である。 (a)(1)ポリアニオン及び両性界面活性剤、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する。）、及びカップラー又は／及びデベロッパー、及び(4)水性媒体を含んでなる第一試液と、水性媒体及び要すればデベロッパー又はカップラーを含んでなる第二試液とからなる、低比重リポタンパク中のコレステロール測定用キット。
(b)(1)ポリアニオン及び両性界面活性剤、(2)ＣＨＥ、(3)ＣＯ、(4)カタラーゼ（以下、ＣＡＴと略記する。）、及び(5)水性媒体を含んでなる第一試液と、ＣＡＴ阻害剤と水性媒体とを含んでなる第二試液とからなるものであって、ＰＯＤ、カップラー、デベロッパーが夫々第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、低比重リポタンパク中のコレステロール測定用キット。
(c)(1)ポリアニオン、(2)両性界面活性剤、(3)ＣＨＥ、(4)ＣＨＤ、(5)ＮＡＤ（Ｐ）、及び(6)水性媒体を含んでなる第一試液と、(1)水性媒体を含んでなる第二試液とからなる、低比重リポタンパク中のコレステロール測定用キット。
【００１３】
即ち、本発明者らは、ＬＤＬ−コレステロールを、ＬＤＬ以外の不要なリポタンパクを分離分別するための前処理操作なしに直接自動分析装置で測定し得る方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、生体試料中のコレステロールの測定を、ポリアニオン及び両性界面活性剤の存在下で行えば、ＬＤＬ−コレステロールの反応のみを阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させて、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を先行させて、これを消去することができ、かくしてＬＤＬ以外の不要なリポタンパクを分離分別することなくＬＤＬ中のコレステロールを特異的に測定することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
生体由来試料中のコレステロールを測定する方法としては、原理的には、生体由来試料中のコレステロールをＣＨＥと反応させて遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、次いで▲１▼ＣＯを反応させて生成する過酸化水素を測定するか、或いは▲２▼ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）を反応させて生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法が挙げられ、より具体的には、酵素反応を利用する、（１）例えば生体由来試料中のコレステロールエステルをＣＨＥによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレステロールと共に、ＣＯによって酸化して、コレステ−４−エン−３−オンと過酸化水素とにし、ＰＯＤの存在下、生成した過酸化水素で被酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を酸化発色させて、生じた酸化色素を比色定量する酸化呈色法、（２）例えば生体由来試料中のコレステロールをＣＨＥによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレステロールと共にＣＨＤの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）と反応させて、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを340nmで測定する紫外部測定法等が挙げられる。
【００１５】
本発明は、これらの方法の何れにも適用することができる。即ち、本発明は、これらの方法を行うに際して、反応系に、ポリアニオン及び両性界面活性剤を存在させればよい。より具体的には、先ず、生体由来試料とポリアニオン及び両性界面活性剤とを接触させて、該試料中のＬＤＬ−コレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させ、その結果としてＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を先行させてこれらを消去（消費）し、しかる後、ＬＤＬ−コレステロールの反応によって生成される前記生成物のみを測定する。
【００１６】
本発明方法の具体的な測定手段としては、以下の如き方法が挙げられる。
【００１７】
〔方法１〕
ポリアニオン及び両性界面活性剤の存在下、生体由来試料にＣＨＥとＣＯを作用させて過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素にＰＯＤと被酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を作用させて酸化色素を生じさせ、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出する。
【００１８】
〔方法２〕
ポリアニオン及び両性界面活性剤の存在下、生体由来試料にＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）を作用させてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じさせ、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出する。
【００１９】
〔方法３〕
ポリアニオン及び両性界面活性剤の存在下、生体由来試料にＣＨＥとＣＯを作用させて過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素にＰＯＤとカップラー（又はデベロッパー）、又はＣＡＴを作用させ、次いでデベロッパー（又はカップラー）、又はＣＡＴ阻害剤及び被酸化性呈色試薬を作用させて酸化色素を生じさせ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出する。
【００２０】
〔方法４〕
ポリアニオン及び両性界面活性剤の存在下、生体由来試料にＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）（或いはＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤ及びカップラー又は／及びデベロッパー）を作用させてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（或いは過酸化水素）を生じさせる反応系に導いた後、次いで、ＣＯ、ＰＯＤ、被酸化性呈色試薬及びＣＨＤ阻害剤（或いはＣＨＤ、ＮＡＤ（Ｐ）及びＣＯ阻害剤）を作用させて酸化色素（或いはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を生じさせ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出する。
【００２１】
上記方法１及び２に於いて、相異なる二つの時点とは、具体的には、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つＬＤＬ−コレステロールの反応が開始される前の時点と、ＬＤＬ−コレステロールの反応が実質的に終了した時点の二つの時点のことである。
尚、上記方法３及び４に於いては、一つの時点、即ち、ＬＤＬ−コレステロールの反応が実質的に終了した時点のみの吸光度の測定によっても生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を測定し得るが、より測定精度を上げるために、上記方法１及び２と同様の相異なる二つの時点での吸光度を測定するのが好ましい。
また、これら相異なる二つの時点は、測定方法の違いや、使用するポリアニオン、両性界面活性剤の種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポタンパク分画に対する反応性（反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。
【００２２】
本発明方法は、１液法でも２液法でも又それ以上の試液を用いる方法の何れでもよい。但し、上記方法３及び４は、２液法又はそれ以上の試液を用いる方法が実用的である。
尚、２液以上の試液を用いる方法に於いては、ポリアニオンと両性界面活性剤とを、生体由来試料と直接混合させる試液中に含有させればよい。また、上記方法１、２及び４に於いては、ＰＯＤとカップラー又は／及びデベロッパー、又はＮＡＤ（Ｐ）を、ＬＤＬ−コレステロールの反応が開始するより前の時点で添加する試液中に含有させればよく、また、上記方法３に於いては、ＰＯＤとカップラー、ＰＯＤとデベロッパー、又はＣＡＴを、ＬＤＬ−コレステロールの反応が開始するより前の時点で添加する試液中に含有させればよい。
【００２３】
本発明方法を２液法で行う場合の具体例は、例えば以下の如である。
例えば上記方法１又は２を実施する場合には、生体由来試料と、▲１▼ポリアニオン及び両性界面活性剤、▲２▼ＣＨＥ、▲３▼ＣＯ、ＰＯＤ及び被酸化性呈色試薬、（又はＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ））及び▲４▼水性媒体を含んでなる第一試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ1）を測定し、次いで、該混合液と、水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ2）を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出すればよい。
【００２４】
また、例えば上記方法３を実施する場合には、生体由来試料と、▲１▼ポリアニオン及び両性界面活性剤、▲２▼ＣＨＥ、▲３▼ＣＯ、▲４▼ＰＯＤとカップラー（又はデベロッパー）（或いは▲４▼ＣＡＴ）、及び▲５▼水性媒体を含んでなる第一試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ1）を測定し、次いで、該混合液と、▲１▼デベロッパー（又はカップラー）（或いは▲１▼ＣＡＴ阻害剤）と▲２▼水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ2）を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出すればよい。尚、第一試液にＣＡＴを含有させる場合には、ＰＯＤ、カップラー、デベロッパーは、夫々第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。
【００２５】
更に、例えば上記方法４を実施する場合には、生体由来試料と、▲１▼ポリアニオン及び両性界面活性剤、▲２▼ＣＨＥ、▲３▼ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）（又は▲３▼ＣＯ、ＰＯＤ、及びカップラー又は／及びデベロッパー）、及び▲４▼水性媒体を含んでなる第一試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ1）を測定し、次いで、▲１▼水性媒体、▲２▼ＣＯ、ＰＯＤ、被酸化性呈色試薬、及びＣＨＤ阻害剤（或いは▲２▼ＣＨＤ、ＮＡＤ（Ｐ）、及びＣＯ阻害剤）を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ2）を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出すればよい。
【００２６】
尚、上記方法に於いて、ＯＤ1とＯＤ2を測定する時点は、測定方法の違いや、使用するポリアニオン、両性界面活性剤の種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポタンパク分画に対する反応性（反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。
【００２７】
また、本発明方法を１液法（上記方法１又は２）で行う場合、より具体的には、以下の如く行えばよい。
即ち、例えば生体由来試料と、▲１▼ポリアニオン及び両性界面活性剤、▲２▼ＣＨＥ、▲３▼ＣＯ、ＰＯＤ及び被酸化性呈色試薬（又はＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ））、及び▲４▼水性媒体を含有する試液とを混合し、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つＬＤＬ−コレステロールの反応が開始される前の時点で吸光度（ＯＤ1）を測定し、次いで、ＬＤＬ−コレステロールの反応が実質的に終了した時点で吸光度（ＯＤ2）を再度測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出すればよい。
【００２８】
尚、上記の方法に於いて、ＯＤ1及びＯＤ2に基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出するには、ＯＤ2からＯＤ1〔又はＯＤ1に由来する値（例えばＯＤ1に液量補正係数を掛けて求めた値）〕を差し引いた吸光度（ＯＤ3）を求め、得られたＯＤ3を、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度既知の標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ3との関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロールの値を算出すればよい。
【００２９】
本発明に於いては、コレステロール反応を促進させるために、非イオン性界面活性剤や陰イオン性界面活性剤等を共存させてもよく、また、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を促進させる目的で、ＬＤＬ以外のリポタンパクに結合する抗体を共存させてもよい。
【００３０】
以下に、本発明に於ける構成要件の好ましい態様及びその使用濃度等について説明する。
【００３１】
本発明に於いて用いられる、ポリアニオンとしては、両性界面活性剤と共存させることによりＬＤＬ−コレステロールの反応を阻害させてＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を先行させ得るものであればよい。
尚、阻害とは、ＬＤＬ−コレステロールの反応をＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応に比べて遅延或いはＬＤＬ−コレステロールの反応を一時的に停止させることをいい、これ以降もこの意味で用いる。
これらポリアニオンの具体例としては例えば、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、又はこれらの塩等が挙げられる。塩としては、Ｎａ塩、Ｋ塩等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
上記した如きポリアニオンのうち、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸、又はこれらの塩が好ましい。また、これらポリアニオンの使用濃度としては、両性界面活性剤と共存させることによりＬＤＬ−コレステロールの反応を阻害させて、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を先行させ得る濃度であればよく、生体由来試料と直接混合させる試液中の濃度として、通常0.0001％〜10％（W/V）、好ましくは0.001％〜1％（W/V）である。尚、これらポリアニオンは単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせて用いてもよい。
【００３２】
本発明に於いて用いられる両性界面活性剤としては、ポリアニオンと共存させることによりＬＤＬ−コレステロールの反応を阻害させて、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を先行させ得るものであればよく、例えばアルキルベタイン誘導体（例えばラウリルベタイン、ステアリルベタイン、ラウリルジメチルアンモニウムベタイン、ココナットベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミドプロピルベタイン等）、イミダゾリニウムベタイン誘導体（例えば２−ラウリル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、２−ウンデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、例えば２−アルキル−Ｎ−カルボキシエチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等）、スルホベタイン誘導体（例えばＮ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸等）等のベタイン誘導体、例えばアルキルグリシン、アルキルビス（アミノエチル）グリシン、ジオクチルポリアミノエチルグリシン、Ｎ−アルキルポリアミノエチルグリシン、β−アラニン誘導体等のアミノカルボン酸誘導体、例えばビス（２−ウンデシル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリン）クロル酢酸錯体、アルキルイミダゾリン誘導体等のイミダゾリン誘導体、例えばラウリルジメチルアミンオキサイド等のアミンオキサイド誘導体等が挙げられる。
上記した如き両性界面活性剤のうち、ラウリルベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン及び２−アルキル−Ｎ−カルボキシエチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、アルキルグリシン、アルキルビス（アミノエチル）グリシン、ジオクチルポリアミノエチルグリシン、Ｎ−アルキルポリアミノエチルグリシン、β−アラニン誘導体が好ましい。
また、これら両性界面活性剤の使用濃度としては、ポリアニオンと共存させることによりＬＤＬ−コレステロールの反応を阻害させて、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を先行させ得る濃度であればよく、生体由来試料と直接混合させる試液中の濃度として、通常0.0001％〜10％（W／V）、好ましくは0.001％〜１％（W／V）である。尚、これら両性界面活性剤は単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
本発明に於いて用いられるＣＯとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来するもの等が挙げられる。ＣＯの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.03〜330u／ml、好ましくは0.07〜130u／ml、より好ましくは0.13〜65u／mlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常0.02〜250u／ml、好ましくは0.05〜100u／ml、より好ましくは0.1〜50u／mlである。
尚、一液法の場合は、上記最終の反応液中の濃度範囲から適宜選択される。（以下、同様。）
本発明に於いて用いられるＣＨＥとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、キャンディダ属、シュードモナス属等の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来するもの等が挙げられる。ＣＨＥの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.03〜330u／ml、好ましくは0.07〜130u／ml、より好ましくは0.13〜65u／mlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常0.02〜250u／ml、好ましくは0.05〜100u／ml、より好ましくは0.1〜50u／mlである。
【００３４】
本発明に於いて用いられるＰＯＤとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、西洋ワサビ、大根等の植物に由来するもの、カビ、酵母等の微生物に由来するもの、動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が挙げられる。ＰＯＤの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.1〜1000u／ml、好ましくは0.25〜400u／ml、より好ましくは0.5〜200u／mlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常0.1〜250u／ml、好ましくは0.25〜100u／ml、より好ましくは0.5〜50u／mlである。
【００３５】
本発明に於いて用いられる被酸化性呈色試薬としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して呈色するものであればよく、例えば４−アミノアンチピリン（以下、４−ＡＡと略記する。）等のカップラー及び、該カップラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合せ、即ち、例えば４−ＡＡとフェノール系化合物，ナフトール系化合物若しくはアニリン系化合物の組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物の組合せ等や、例えば２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェニレンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する発色剤等が挙げられる。
デベロッパーとしてのフェノール系化合物の具体例としては、例えばフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール等が挙げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば１−ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、１−ナフトール−２−カルボン酸等が挙げられ、また、アニリン系化合物の具体例としては、例えばＮ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニル−エチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等が挙げられる。
カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場合、カップラーの使用量としては、用いるカップラーの種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なるが、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.01〜400mM、好ましくは0.1〜40mM、より好ましくは0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.01〜100mM、好ましくは0.1〜10mMの範囲である。また、カップラーとして４−ＡＡを使用する場合の使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.01〜200mM、好ましくは0.1〜40mM、より好ましくは0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜５mMである。
また、デベロッパーの使用量としては、用いるデベロッパーの種類や組み合わせるカップラーの種類等により異なるため一概には言えないが、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.01〜200mM、好ましくは0.1〜40mM、より好ましくは0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜５mMである。
トリフェニルメタン系ロイコ色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリーン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホフェニルメタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナトリウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体例としては、例えばビス〔４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ−２−メチルフェニル〕アミン、Ｎ，Ｎ−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば10−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩、10−〔３−（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルアミノカルボニル〕−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等が挙げられる。更に、ベンジジン誘導体の具体例としては、例えばベンジジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラアミノベンジジン等が挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例としては、例えば２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（４ージエチルアミノフェニル）イミダゾール、２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール等が挙げられる。
これら発色剤の使用量としては、通常この分野で用いられる濃度範囲である。
【００３６】
本発明に於いて用いられるＣＡＴとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、牛肝臓等の動物臓器に由来するもの、クロロプラスト等の植物に由来するもの、ミクロコッカス属、ロドシュードモナス属等の微生物に由来するもの等が挙げられる。ＣＡＴの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常10〜50000u／ml、好ましくは100〜5000u／ml、より好ましくは0.5〜50u／mlである。
【００３７】
本発明に於いて用いられるＣＨＤは、通常この分野で使用されているもの、例えば、ノカルディア属に由来するもの等が挙げられる。ＣＨＤの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.1〜150u／ml、好ましくは0.3〜100u／ml、より好ましくは0.5〜60u／mlであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.1〜100u／ml、好ましくは0.5〜50u／mlである。
【００３８】
本発明に於いて用いられるＮＡＤ（Ｐ）は、通常この分野で使用されているもの、例えば、酵母に由来するもの等が挙げられる。ＮＡＤ（Ｐ）の使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.2〜70mM、好ましくは0.5〜50mM、より好ましくは１〜20mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常0.2〜50mM、好ましくは１〜10mMである。
【００３９】
本発明に於いて用いられるＣＡＴ阻害剤としては、通常この分野で使用されているもの、例えばＮａＮ3、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール等が挙げられる。これらＣＡＴ阻害剤の使用量としては、用いるＣＡＴ阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例えば２液法に於ける第二試液中の濃度として、通常0.01〜10％（W/V）、好ましくは0.02〜５％（W/V）、より好ましくは0.03〜３％（W/V）である。
【００４０】
本発明に於いて用いられるＣＯ阻害剤としては、通常この分野で使用されているもの、例えばＡｇ＋イオン、Ｚｎ２＋イオン、グルタチオン等が挙げられる。これらＣＯ阻害剤の使用量としては、用いるＣＯ阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例えば２液法に於ける第二試液中の濃度として、通常0.00002〜40％（W/V）、好ましくは0.0002〜４％（W/V）、より好ましくは0.002〜0.4％（W/V）である。
【００４１】
本発明に於いて用いられるＣＨＤ阻害剤としては、通常この分野で使用されているもの、例えばＡｇ＋イオン、Ｚｎ２＋イオン等が挙げられる。これらＣＨＤ阻害剤の使用量としては、用いるＣＨＤ阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例えば２液法に於ける第二試液中の濃度として、通常0.00001〜70％（W/V）、好ましくは0.0001〜７％（W/V）、より好ましくは0.001〜0.7％（W/V）である。
【００４２】
本発明に於いて用いられる非イオン性界面活性剤及び陰イオン性界面活性剤としては、コレステロール反応を促進させ得る性質を有するものであればよく、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられ、陰イオン性界面活性剤としてはコール酸およびその誘導体等が挙げられる。さらに、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例としては、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等が挙げられ、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルの具体例としては、ポリエチレングリコールモノラウレート、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールジステアレート、ポリエチレングリコールモノオレエート等が挙げられ、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられ、ソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げられ、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルの具体例としては、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルアミンの具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられ、グリセリン脂肪酸エステルの具体例としては、ステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等が挙げられる。
また、陰イオン性界面活性剤の具体例としては、コール酸、デオキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルサルコシン等が挙げられる。
【００４３】
上記した如き非イオン性界面活性剤の使用濃度としては、一液法で用いる場合、試液中の濃度として、通常0.0001％〜10％、好ましくは0.001％〜１％であり、２液法で用いる場合、第一試液と第二試液の液量比等により異なるが、第一試液中の濃度としては、通常0.0001〜５％（W/V）、好ましくは0.001〜0.5％（W/V）であり、第二試液中の濃度としては、通常0.01〜20％（W/V）、好ましくは0.05〜５％（W/V）である。
【００４４】
上記した如き陰イオン性界面活性剤の使用濃度としては、一液法で用いる場合、試液中の濃度として、通常0.0001％〜10％、好ましくは0.001％〜１％であり、２液法で用いる場合、第一試液と第二試液の液量比等により異なるが、第一試液中の濃度としては、通常0.0001〜５％（W/V）、好ましくは0.001〜0.5％（W/V）であり、第二試液中の濃度としては、通常0.01〜20％（W/V）、好ましくは0.05〜５％（W/V）である。
【００４５】
また、上記した如き非イオン性界面活性剤と陰イオン性界面活性剤とを併用した場合の使用濃度としては、一液法で用いる場合、試液中の界面活性剤の総濃度として、通常0.0001％〜20％、好ましくは0.001％〜２％であり、２液法で用いる場合、第一試液と第二試液の液量比等により異なるが、第一試液中の界面活性剤の総濃度としては、通常0.0001〜10％（W/V）、好ましくは0.001〜１％（W/V）であり、第二試液中の界面活性剤の総濃度としては、通常0.01〜40％（W/V）、好ましくは0.05〜10％（W/V）である。
尚、上記した如き界面活性剤は単独または二種以上併用してもよい。
【００４６】
本発明に於いて用いられるＬＤＬ以外のリポタンパクに結合する抗体としては、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を促進させ得る性質を有するものであればよく例えば抗ＨＤＬ抗体、抗アポリポタンパクＡ抗体、抗アポリポタンパクＣ抗体、抗アポリポタンパクＥ抗体、抗αリポタンパク抗体、抗ＶＬＤＬ抗体、抗プレβリポタンパク抗体等が挙げられる。尚、これら抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、一種でも或いは２種以上組み合わせて用いてもよい。
また、これらを酵素的或いは化学的に分解した例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2等や、酵素により標識された酵素標識抗体等も、ＬＤＬ以外のリポタンパクに結合する抗体に包含される。
また、本発明に於いては、上記した如き抗体に適当な化合物を結合させてＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を促進させ得る性質を付加或いは増強させた、修飾抗体を用いるのが好ましい。
このような化合物としては天然化合物でも化学合成化合物でも良く、例えば糖類、脂肪酸類、各種配糖体（アルカロイド配糖体、ステロイド配糖体、テルペノイド配糖体）、水溶性の合成高分子等が挙げられる。尚、これら化合物は、自体公知の方法により、抗体のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基と当該化合物中のアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基又は２，３−エポキシプロピル基とを共有結合させるか、或いは修飾のための活性基がない場合には、これら化合物を活性化して修飾する方法、架橋剤を介して修飾する方法により容易に抗体に結合させ得る。
【００４７】
これら化合物の具体例としては、デキストラン、プルラン、フィコール、デキストリン、シクロデキストリン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ペクチン酸、プロスベリン酸、アルギン酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリリジン、アルブミン、ラミナン、リケナン、レクチン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、グルコース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、ラクトース、マルトース、パラチノース、トレハロース、マンノース、フコース、グルクロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、イノシトール、シアル酸、ムラミン酸、グリチルリチン酸、アルブチン、ダイズイン、ポリビニールアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
上記化合物のうち、例えばアミノ基、カルボキシル基、イミノ基、アルデヒド基、スルフヒドリル基等の抗体のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基に対する活性基を有しているものはそのまま抗体との結合反応に供してもよく、また、活性基を有さないものは、次に挙げる活性基を導入する方法により活性化して用いればよい。尚、活性基は、適当な分子長を有する、例えば炭素数１〜６のアルキレン基等のスペーサーを介して導入されてもよい。
上記化合物に活性基を導入するための方法としては、例えば塩化シアヌルを用いるシアヌリル基の導入法（例えば、Ｊ．Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．，４巻，２１２８頁，１９７６年等）、メタ過沃素酸を用いるアルデヒド基の導入方法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７３巻，２１２８頁，１９７６年等）、ブロムシアンを用いるイミノ基の導入方法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２１４巻，１３０２頁，１９６７年等）、エピクロルヒドリンを用いる２，３−エポキシプロピル基の導入方法（例えば、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，５１巻，４７９頁，１９７０年等）、カルボン酸無水物を用いるカルボキシル基の導入方法（例えば、特開平５−２６８９５０号公報等）モノブロモカルボン酸を用いるカルボキシル基の導入方法（例えば、Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１４７巻，７８８頁，１９７１年等）等の自体公知の導入方法が挙げられる。
活性基を有する化合物と、抗体とを共有結合させる方法としては、自体公知の結合方法は全て挙げられ、例えば、反応に関与する反応基が、アミノ基とカルボキシル基の場合には、例えば、カリボジイミド法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５巻，３０５９頁，１９７０年等）、活性化エステル法（例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７巻、１７５頁、１９８４年等）、酸無水物法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３７巻，１８２５頁，１９６２年等）、アジド法（例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５巻，１２９頁，１９７２年等）、カルボシキクロリド法（例えば、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ，６７巻，６６１頁，１９５５年等）、イソシアナート法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２１０巻，３６７頁，１９６６年等）、ウッドワード試薬法（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７８巻，６２６頁，１９６９年等）、ウギ（Ｕｇｉ）反応（例えば、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，７４巻，９頁，１９６２年等）等が挙げられる。また、該反応基がアミノ基同士の場合には、例えば、グルタルアルデヒド法（例えば、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，２８巻，９５８頁，１９７３年等）、アルキル化法（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８巻，２７６頁，１９７０年等）等が挙げられ、該反応基が水酸基とアミノ基の場合には、例えば、アルキル化法（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８巻、２７６頁，１９７０年等）等が挙げられる。また、該反応基がアミノ基とアルデヒド基の場合には、例えば過沃素酸酸化法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３巻，２１２８頁，１９７８年等）等が挙げられ、該反応基がアミノ基とイミノ基の場合には、例えばブロムシアン法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２１４巻，１３０２頁，１９６７年等）等が挙げられる。
【００４８】
上記の如き抗体の使用濃度としては、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を促進し得る濃度以上であればよく、生体由来試料と直接混合させる試薬中の濃度として、通常0.001〜10mgAb/ml、好ましくは0.01〜１mgAb/mlである。
【００４９】
本発明に於いて用いられる水性媒体としては、水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液を構成する緩衝剤としては、pH５〜11の範囲で緩衝作用を有し、コレステロール測定反応を阻害しないものであればよく、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩衝剤、リン酸塩、ホウ酸塩等、通常この分野で用いられるものが挙げられ、その使用濃度としては、通常１mM〜２Ｍ、好ましくは10mM〜１Ｍの範囲であり、また、pHは、通常５〜11、好ましくは６〜８、より好ましくは７付近である。
【００５０】
本発明のＬＤＬ−コレステロール測定用試液及びキットは、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロ−ルを測定するために使用されるもので、ポリアニオンと両性界面活性剤とを使用する以外は、上記した如き生体由来試料中のコレステロールを測定する方法に使用される試薬類、例えばＣＯ、ＣＨＥ、ＣＨＤ、ＰＯＤ、ＮＡＤ（Ｐ）、被酸化性呈色試薬、ＣＡＴ、ＣＡＴ阻害剤、ＣＯ阻害剤、ＣＨＤ阻害剤、水性媒体、要すれば非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、抗体等を、この分野で通常使用される濃度範囲で含有するように調製されたものでよく、構成要件の好ましい態様や使用濃度等は、上で述べた通りである。また、当該キットには、必要に応じて、ＬＤＬ−コレステロール標準品等が組み合わされていてもよい。尚、該標準品は、例えばヒトや動物等の血清を用いて調製された標準血清やこれらに由来するＬＤＬ分画を含有するもの等を標準品として使用することができる。
【００５１】
本発明のＬＤＬ−コレステロール測定法及び測定用試液並びに測定用キットは、ポリアニオン及び両性界面活性剤を共存させることにより、ＬＤＬ−コレステロールの反応を阻害させてＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を先行させた後に、ＬＤＬ−コレステロールの反応を進行させて、ＬＤＬ−コレステロールの反応で生じる過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈのみを特異的に測定するため、従来法では困難であった通常の自動分析装置を用いるエンドポイント・アッセイでのＬＤＬ−コレステロール測定を可能ならしめるものである。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様としては、例えば以下の如きものが挙げられる。
即ち、例えば血清、血漿等の生体試料と、▲１▼ポリアニオン及び両性界面活性剤、▲２▼ＣＨＥ、▲３▼ＣＯ、デベロッパー、カップラー及びＰＯＤ（又はＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ））及び▲４▼緩衝剤、要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤、抗体等を含有する第一試液とを混合し、２〜40℃で１〜30分間反応させた後に吸光度（ＯＤ1）を測定する。次いで該反応液と、緩衝剤要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤を含有する第二試液とを混合し、２〜40℃で１〜60分間反応させた後に吸光度（ＯＤ2）を測定する。上記のＯＤ2からＯＤ1に由来する値（例えば、ＯＤ1に液量補正係数を掛けて求めた値）を差し引いた吸光度（ＯＤ3）を求め、得られたＯＤ3を、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度既知の標準液等の標準品を試料として上記と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ3との関係を示す検量線に当てはめることにより、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの値を求める。
【００５３】
また、例えば血清、血漿等の生体試料と、▲１▼ポリアニオン及び両性界面活性剤、▲２▼ＣＨＥ、▲３▼ＣＯ、デベロッパー（又はカップラー）及びＰＯＤ、及び▲４▼緩衝剤、要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤、抗体等を含有する第一試液とを混合し、２〜40℃で１〜30分間反応させた後に吸光度（ＯＤ1）を測定する。次いで該反応液と、デベロッパー（又はカップラー）及び緩衝剤、要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤を含有する第二試液とを混合し、２〜40℃で１〜60分間反応させた後に吸光度（ＯＤ2）を測定する。上記のＯＤ2からＯＤ1に由来する値（例えば、ＯＤ1に液量補正係数を掛けて求めた値）を差し引いた吸光度（ＯＤ3）を求め、得られたＯＤ3を、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度既知の標準液等の標準品を試料として上記と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ3との関係を示す検量線に当てはめることにより、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの値を求める。
【００５４】
更に、例えば血清、血漿等の生体試料と、▲１▼ポリアニオン及び両性界面活性剤、▲２▼ＣＨＥ、▲３▼ＣＯ、デベロッパー（又はカップラー）、▲４▼ＣＡＴ及び▲５▼緩衝剤、要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤、抗体等を含有する第一試液とを混合し、２〜40℃で１〜30分間反応させた後に吸光度（ＯＤ1）を測定する。次いで該反応液と、カップラー（又はデベロッパー）、ＰＯＤ、ＣＡＴ阻害剤及び緩衝剤、要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤を含有する第二試液とを混合し、２〜40℃で１〜60分間反応させた後に吸光度（ＯＤ2）を測定する。上記のＯＤ2からＯＤ1に由来する値（例えば、ＯＤ1に補正係数を掛けて求めた値）を差し引いた吸光度（ＯＤ3）を求め、得られたＯＤ3を、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度既知の標準液等の標準品を試料として上記と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ3との関係を示す検量線に当てはめることにより、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの値を求める。
また、１液法の場合は、例えば血清、血漿等の生体試料と、▲１▼ポリアニオン及び両性界面活性剤、▲２▼ＣＨＥ、▲３▼ＣＯ、ＰＯＤ及び被酸化性呈色試薬（又はＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ））、及び▲４▼緩衝剤、要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤、抗体等を含有する試液とを混合し、２〜40℃で１〜30分間反応させた後に吸光度（ＯＤ1’）を測定する。更に、２〜40℃で１〜60分間反応させた後に吸光度（ＯＤ2’）を測定する。上記のＯＤ2’からＯＤ1’を差し引いた吸光度（ＯＤ3’）を求め、得られたＯＤ3’を、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度既知の標準液等の標準品を試料として上記と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ3’との関係を示す検量線に当てはめることにより、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの値を求める。
【００５５】
上記の実施態様に於いて、ＯＤ1（又はＯＤ1’）とＯＤ2（又はＯＤ2’）を測定する時点は、例えば各リポタンパク分画に対する反応性（反応曲線等）を検討し、上記範囲から最適な時点を適宜設定すればよい。
【００５６】
以下に、実施例及び参考例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００５７】
【実施例】
実施例１
日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を使用して、本発明の測定用試薬と、超遠心法で分画した各種リポタンパクとの反応曲線を測定した。
〔試料〕
自体公知の超遠心法で血清より分画して得たＨＤＬ画分（84mg／dl）、ＬＤＬ画分（95mg／dl）及びＶＬＤＬ画分（33mg／dl）を試料とした。
〔試薬〕
（試液１〜１３）
ＣＯ（コード番号：C00-321、東洋紡績(株)製）１U／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成工業（株）製）１U／ml、N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン（HDAOS）0.5mM、４−ＡＡ  １mM、ＰＯＤ（コード番号：PEO-302、東洋紡（株）製）1.5U／ml、所定のポリアニオン 0.04％（W/V）及び所定の両性界面活性剤0.008％（W/V）を含有する25mM 2-ヒドロキシ-N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPSO）−NaOH緩衝液（pH7.0）を試液とした。
尚、表１に各試液で用いたポリアニオン及び両性界面活性剤の具体名を夫々示す。
【００５８】
【表１】
表１
0003767232.tif 000002
【００５９】
〔測定条件〕
測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。
測定方法；１ポイント  エンド[３４]−[０]
試料量  ；２．５μｌ
試液量  ；３００μｌ
測定波長；７００／６００ｎｍ
測定温度；３７℃
〔結果〕
試液１〜１３を使用して得られた測定結果を、図１〜１３に夫々示す。
尚、図１〜13に於いて、−□−はＬＤＬ画分試料について得られた結果を、−○−はＨＤＬ画分試料について得られた結果を、−△−はＶＬＤＬ画分試料について得られた結果を、また、−●−は生理食塩水を試料として得られた結果を夫々示す。
図１の結果から明らかな如く、ポリアニオン及び両性界面活性剤を添加していない試液（試液１）では、試液と混合後すぐにＬＤＬ、ＨＤＬ及びＶＬＤＬとの反応が開始され、２〜５分以内で反応はほぼプラトーに達することが判る。
これに対して、図２〜１３から明らかなように、ポリアニオン及び両性界面活性剤の共存下でリポタンパク中のコレステロールの測定を行うと（試液２〜13）、ＬＤＬとの反応が阻害されること、即ち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬとの反応が殆ど終了しているにも係わらずＬＤＬとの反応はいまだ進行中であったり（試液２及び３）、或いはＨＤＬ、ＶＬＤＬとの反応が実質的に終了した後に、ＬＤＬとの反応が始まる（試液４〜13）ことが判る。
以上のことから、ポリアニオンおよび両性界面活性剤を共存させることによりＬＤＬ−コレステロールの反応を遅延或いは一時的に停止させてＬＤＬ以外のリポタンパク中コレステロールの反応を先行させた後に、ＬＤＬ中コレステロールの反応を進行させることができること、即ち、ＬＤＬ−コレステロールを特異的に測定し得ることが判る。
【００６０】
実施例２
日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を使用して、本発明の測定法により、血清中のＬＤＬ−コレステロール量を測定した。
〔試料〕
新鮮血清10検体
〔試薬〕
0003767232.tif 000003
〔測定条件〕
測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。
測定方法；２ポイント  エンド[１６]−[３４]
試料量  ；３μｌ
Ｒ−１量；２７０μｌ
Ｒ−２量；９０μｌ
測定波長；７００／６００ｎｍ
測定温度；３７℃
〔結果〕
結果を表２に示す。
【００６１】
参考例１
実施例２で用いた血清検体について、従来法のＦｒｉｅｄｅｗａｌｄ式によりＬＤＬ−コレステロール値を算出した。
尚、測定操作は、CLINICAL CHEMISTRY, Vol.18, No.6, p499-502,(1972)に従 って行った。
〔結果〕
測定結果を表２に併せて示す。
【００６２】
【表２】
表２
0003767232.tif 000004
【００６３】
表２の結果から明らかな如く、本発明のポリアニオン及び両性界面活性剤を含有する試薬（試液１４）を用いて得られたＬＤＬ−コレステロール値は、従来法であるFriedewald式で算出したＬＤＬ−コレステロール値と良好な相関関係を示すこと、即ち、特異的にＬＤＬ−コレステロールを測定し得ることが判る。
【００６４】
実施例３
日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を使用して、本発明の測定法により、ＢＱ法（Beta quantification method）による測定値既知のコントロール血清〔ＰＢＩ（Pacific Biometrics，Inc．）社製）中のＬＤＬ−コレステロール量を測定した。
〔試料〕
コントロール血清５検体
〔試薬〕
0003767232.tif 000005
〔測定条件〕
実施例２同じ。
〔結果〕
結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】
表３
0003767232.tif 000006
【００６６】
表３の結果から明らかな如く、本発明のポリアニオン及び両性界面活性剤を含有する試薬（試液１５及び試液１６）を用いて得られたＬＤＬ−コレステロール値は、ＢＱ法（Beta quantification method）による測定値が付されたコントロール血清の表示値と殆ど同等であることが判る。
【００６７】
実施例４
日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を使用して、本発明の測定法により、ＢＱ法（Beta quantification method）による測定値既知のコントロール血清〔ＰＢＩ（Pacific Biometrics，Inc．）社製）中のＬＤＬ−コレステロール量を測定した。
〔試料〕
実施例３と同じ。
〔試薬〕
0003767232.tif 000007
0003767232.tif 000008
〔測定条件〕
実施例２と同じ。
〔結果〕
結果を表４に示す。
【００６８】
【表４】
表４
0003767232.tif 000009
【００６９】
表４の結果から明らかな如く、本発明のポリアニオン及び両性界面活性剤を含有する試薬（試液１７〜１９）を用いて得られたＬＤＬ−コレステロール値は、ＢＱ法（Beta quantification method）による測定値が付されたコントロール血清の表示値と殆ど同等であることが判る。
【００７０】
参考例２
自体公知の方法により修飾抗体の作成を行った。
（１）デキストラン修飾抗体の作製
羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg protein Ab／ml）15mlとジアルデヒドデキストラン300mgとを混合し、50mM リン酸緩衝液（pH6.0）中、30℃で反応させた後、更に200mgのボランピリジンを加えて５時間反応させた。この反応液をセロハンチューブに詰めて脱塩後、限外濾過濃縮処理し、デキストラン修飾抗体（10mg protein Ab／ml×12.6ml）を得た。
【００７１】
（２）ヘパリン修飾抗体の作製
過ヨウ素酸酸化処理したヘパリン 100mgに、6-アミノカプロン酸 500mgを加えて透析した。これに羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg protein Ab／ml）5mlと1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド 300mgを加え、５℃で一晩反応させた。この反応液をセロハンチューブに詰めて脱塩後、限外濾過濃縮処理し、ヘパリン修飾抗体（10mg protein Ab／ml×3.6ml）を得た。
【００７２】
（３）アルギン酸修飾抗体の作製
アルギン酸 50mgを20mlの20mM リン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、これに羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg protein Ab／ml）5mlと1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド 500mgを加え、５℃で一晩反応させた。この反応液をセロハンチューブに詰めて脱塩後、限外濾過濃縮処理し、アルギン酸修飾抗体（10mg protein Ab／ml×3.4ml）を得た。
【００７３】
（４）グルクロン酸修飾抗体の作製
羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg protein Ab／ml）10mlと400mgのグルクロン酸を0.1M リン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、250mgのシアンボロハイドライドを加えて37℃で５時間反応させた。この反応液をセロハンチューブに詰めて脱塩後、限外濾過濃縮処理し、グルクロン酸修飾抗体（10mg protein Ab／ml×7.6ml）を得た。
【００７４】
（５）ポリグルタミン酸修飾抗体の作製
ポリグルタミン酸 20mgを20mM リン酸緩衝液（pH6.5）４mlに溶解し、該溶解液に羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg protein Ab／ml）１mlと1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド40mgとを加え、５℃で一晩反応させた。この反応液をセロハンチューブに詰めて脱塩後、限外濾過濃縮処理し、ポリグルタミン酸修飾抗体を（10mg protein Ab／ml×0.72ml）を得た。
【００７５】
（６）グリチルリチン酸修飾抗体の作製
グリチルリチン酸 100mgを50mM リン酸緩衝液（pH6.5）２mlに溶解し、該溶解液にメタ過ヨウ素酸ナトリウム 100mgを加えて５℃で24時間反応させた後、セファデックスG-25のカラムで脱塩した。これと羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg protein Ab ／ml）10mlを混合して30℃で48時間反応させた。この反応液をセロハンチューブに詰めて脱塩後、限外濾過濃縮処理し、グリチルリシン酸修飾抗体を（10mg protein Ab／ml×7.3ml）を得た。
【００７６】
実施例５
日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を使用して、本発明の測定法によりＬＤＬ−コレステロール測定値を求め、基準法であるＢＱ法でのＬＤＬ−コレステロール測定値との比較を行った。
〔試料〕
ＰＢＩ社（Pacific Biometrics，Inc．）より入手した、ＢＱ法（Beta quantification method）による測定値既知の人血清（トリグリセライド400mg／dl以下）15検体及び人血清（トリグリセライド400mg／dl以上）８検体を試料とした。
尚、血清中のトリグリセライド量は、該人血清に付された表示値による。
〔試薬〕
0003767232.tif 000010
〔測定条件〕
実施例２と同じ。
〔結果〕
トリグリセライド400mg／dl以下の血清についての結果を表５に、また、トリグリセライド400mg／dl以上の血清についての結果を表６に夫々示す。
【００７７】
【表５】
表５
0003767232.tif 000011
【００７８】
【表６】
表６
0003767232.tif 000012
【００７９】
表５の結果から、トリグリセライドの値が400mg／dl以下の血清を検体とした場合は、試液２０及び試液２１の何れもそのＬＤＬ−コレステロール値は、ＢＱ法（Beta quantification method）により測定された表示値と殆ど同等であることが判る。また、表６の結果から、トリグリセライドの値が400mg／dl以上の血清を検体とした場合は、試液２１、即ち、ポリアニオン及び両性界面活性剤に、更にＬＤＬ以外のリポタンパクに結合する抗体を共存させて測定を行う方が、より表示値に近いこと、即ち、よりＬＤＬ−コレステロールを特異的に測定し得ることが判る。
【００８０】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロ−ルを特異的に且つ精度良く測定し得る方法並びにそれに用いられる試薬を提供するものであり、本発明を利用することにより、従来の方法では不可能であったＬＤＬ−コレステロ−ルを直接、しかも汎用の自動分析装置を用いて測定し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に於いて、試液１を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図２】実施例１に於いて、試液２を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図３】実施例１に於いて、試液３を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図４】実施例１に於いて、試液４を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図５】実施例１に於いて、試液５を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図６】実施例１に於いて、試液６を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図７】実施例１に於いて、試液７を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図８】実施例１に於いて、試液８を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図９】実施例１に於いて、試液９を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図１０】実施例１に於いて、試液１０を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図１１】実施例１に於いて、試液１１を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図１２】実施例１に於いて、試液１２を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【図１３】実施例１に於いて、試液１３を用いて得られた、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。
【符号の説明】
図１〜１３に於いて、−□−は低比重リポタンパク（ＬＤＬ）画分試料について得られた結果を、−○−は高比重リポタンパク（ＨＤＬ）画分試料について得られた結果を、−△−は超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）画分試料について得られた結果を、また、−●−は生理食塩水を試料として得られた結果を夫々示す。
【図１】
0003767232.tif 000013
【図２】
0003767232.tif 000014
【図３】
0003767232.tif 000015
【図４】
0003767232.tif 000016
【図５】
0003767232.tif 000017
【図６】
0003767232.tif 000018
【図７】
0003767232.tif 000019
【図８】
0003767232.tif 000020
【図９】
0003767232.tif 000021
【図１０】
0003767232.tif 000022
【図１１】
0003767232.tif 000023
【図１２】
0003767232.tif 000024
【図１３】
0003767232.tif 000025