(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸粘膜の懸濁液を、ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースカラム及びアシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより処理し、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する画分を精製・分離することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸に特異的に作用するβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する精製酵素画分の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸に特異的に作用するβ１，４−ガラクトース転移酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸を含むオリゴ糖鎖は生体内に広く存在しているが、その生理的機能については不明点が多い。しかしながら、近年炎症反応の際に生じる白血球の炎症部位への集合現象において、白血球と血管内皮細胞との結合に６−硫酸化シアリルルイスＸ構造［Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃ］を有する糖タンパク質が深く関与していることが報告されている（光岡ら J.Biol.Chem.,273,11225-11233,1998）。この糖鎖構造を有する化合物は、炎症反応部位への投与により炎症を軽減する効果を示すことが考えられ、医薬品としての応用が期待されている。しかしながら、６−硫酸化シアリルルイスＸの合成は現在のところ高度な技術を要する化学合成法に依存している。
【０００３】
一方、化学合成以外の手段として、酵素を用いる６−硫酸化シアリルルイスＸの合成法については、α２，３−シアル酸転移酵素、α１，３−フコース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン：→６硫酸転移酵素を用いる方法が報告されており、これら転移酵素はそれぞれｃＤＮＡのクローニングが行われ、現在入手が可能となっている。また、これらの転移酵素の基質特異性から、６−硫酸化シアリルルイスＸの酸素合成は、Ｎ−アセチルグルコサミンの６−硫酸化、ガラクトースの導入、シアル酸の導入、フコースの導入という順序で合成する必要があるが、既存のミルク由来β１，４−ガラクトース転移酵素などではＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸への反応効率が極めて悪く、このガラクトースの導入ステップが６−硫酸化シアリルルイスＸの酵素合成法を確立する上での障害となっていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸へ選択特異的にガラクトースをβ１，４−結合で結合することができる新規なβ１，４−ガラクトース転移酵素の製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ブタ大腸粘膜についてＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸に効率良く作用するガラクトース転移酵素を検索する過程において、アシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いることにより、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸に特異的に作用する新規なβ１，４−ガラクトース転移酵素（精製酵素画分）が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、大腸粘膜の懸濁液を、ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースカラム及びアシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより処理し、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する画分を精製・分離することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸に特異的に作用するβ１，４−ガラクトース転移酵素（精製酵素画分）の製造方法からなる。
【０００７】
また本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸又は非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸残基を有するオリゴ糖に、上記のＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸に特異的に作用するβ１，４−ガラクトース転移酵素（精製酵素画分）を作用させることを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸又は非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸残基を有するオリゴ糖にガラクトースがβ１，４結合により結合したオリゴ糖を製造する方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
（酵素源）
本発明のＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸（以下「６Ｓ−ＧＮ」と略することがある）に特異的に作用するβ１，４−ガラクトース転移酵素（以下「β４ＧａｌＴ」と略することがある）の酵素源としては、ブタ大腸、ヒト大腸等種々の動物の大腸を挙げることができるが、入手の容易さ、安価さからブタ大腸が酵素源として適している。
【０００９】
（分離精製）
本発明のＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸に特異的に作用するβ１，４−ガラクトース転移酵素は、例えば、屠殺場にて得たブタ大腸から粘膜層をかき取り、得られる懸濁液をホモジナイズ後遠心により細胞膜画分をまず調製し、この画分から界面活性剤により酵素を可溶化した後、ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースカラム及びアシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースカラムの２つのアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行うことにより得ることができる。
【００１０】
本発明のβ１，４−ガラクトース転移酵素は膜結合酵素であることから、まず粘膜層から膜画分を調製することが好ましい。酵素の可溶化については界面活性剤を用いるが、タンパク質変性作用の少ないものが好ましく、好ましい界面活性剤としては、トリトン（Triton）Ｘ−１００、トリトンＣＦ−５４、ノニデット（Nonidet）Ｐ−４０、オクチルグルコシドなどを例示することができる。
【００１１】
精製に用いられるＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースカラムについては、市販の試薬が存在するが酵素を結合する能力が低く、市販のＵＤＰ−ヘキサノールアミンと活性化セファロース樹脂から調製することが望ましい。
【００１２】
アシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースカラムの調製は、常法により鶏卵卵白よりオボムチンを調製し、これをプロナーゼ消化し糖ペプチドを得る。この糖ペプチドをシアリダーゼ及びガラクトシダーゼ消化した後、活性化セファロースゲルへ結合させ調製する。アシアロ−アガラクト−オボムチン糖ペプチドは非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸残基を多数有するため、本発明のＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸に特異的に作用するβ１，４−ガラクトース転移酵素を結合することができる。
【００１３】
（アフィニティークロマトグラフィー）
次に、ヒト大腸を酵素源とした場合の、ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースカラムとアシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製効果について説明する。なお、ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースカラムとアシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースカラムで使用するＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースレジン及びアシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースレジンの調製は次のようにして行った。
【００１４】
（ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースレジンの調製）
ＵＤＰ−ヘキサノールアミン（シグマ社製）を、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム−０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．３）中、臭化シアンで活性化されたセファロース４Ｂ（スウェーデンのファーマシア・バイオテク社製）と、４℃で１６時間穏やかな攪拌下結合させた。未反応の臭化シアン活性化残基は、０．２Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ８．０）で処理することによりブロックした。ゲル１ｍｌ当たりのＵＤＰ−ヘキサノールアミンの結合量は７μｍｏｌであった。
【００１５】
（アシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースレジンの調製）
オボムチンは、ブルックとヘイルの方法（Biochim.Biophys.Acta.46,289-301,1961）により卵白から調製した。卵５０個から調製された粗オボムチンを、プロナーゼＥ（科研製薬株式会社製）で消化し、水に対して透析した。次に、消化物をセファデックスＡ−２５カラム「２．３×４４ｃｍ、塩素イオン型、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）平衡化」にかけた。０．４Ｍ塩化ナトリウムでこのカラムを洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。得られた画分を水に対し透析し、凍結乾燥した（１０６ｍｇ）。グリコペプチドの２０ｍｇを、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）ＬＴ２株から得られるα２，３−シアリダーゼ（宝酒造社製）０．２Ｕ及びストレプトコッカス（Streptococcus）６６４６Ｋ株から得られるβ−ガラクトシダーゼ３５ｍＵを用いて３７℃で１６時間消化した。１００℃で３分間加熱した後、消化物を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム−０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．３）に対し透析し、臭化シアンで活性化されたセファロース４Ｂに結合させた。結合量は、ゲル１ｍｌ当たり６．７ｍｇであった。
【００１６】
（６Ｓ−ＧＮに特異的に作用するβ４ＧａｌＴの単離）
ヒト大腸粘膜から酵素を含む懸濁液を分離した（ステップ１）。次いで、この懸濁液からミクロソームを分離し、１％トリトンＸ−１００で３回処理し、ミクロソーム可溶化液を得た（ステップ２）。次にこのミクロソーム可溶化液に対し、ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースアフィニティークロマトグラフィーを行った（ステップ３）。１Ｍ塩化ナトリウムで溶出したところ、Ｎ−アセチルグルコサミン−（β１，３）−ガラクトース−（β１，４）−グルコース（以下「ＧＬ」といい、ＧＬも含めてオリゴ糖を「ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ」のように記載することがある）に対してガラクトース転移酵素活性を示すβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３ＧａｌＴ）に富むフラクションＩが得られた（図１Ａ参照）。次いで、１ｍＭＵＤＰ−１Ｍ塩化ナトリウムで溶出したところ、ＧＬに対してガラクトース転移酵素活性を示すβ１，４−ガラクトース転移酵素（β４ＧａｌＴ）のみを含むフラクションIIが得られた（図１Ａ参照）が、このフラクションIIに含まれる酵素β４ＧａｌＴは、ＧＬを基質とすることから、目的とする６Ｓ−ＧＮに特異的に作用するβ４ＧａｌＴではない。
【００１７】
そこで、ＧＬに代えて６Ｓ−ＧＮをアクセプターとして上記フラクションＩのガラクトース転移酵素活性を調べてみたところ、単一のピ−クが現れ、フラクションＩには、β３ＧａｌＴばかりでなく、６Ｓ−ＧＮに特異的に作用するβ４ＧａｌＴが存在することが見い出された（図１Ｂ参照）。このフラクションＩに対して再度ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースアフィニティークロマトグラフィーを行った（ステップ４）後、アシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースアフィニティークロマトグラフィーを行った（ステップ５）ところ、図２に示されるように、本発明の６Ｓ−ＧＮに特異的に作用するβ４ＧａｌＴ（図２中の△−△）とＧＬに作用するβ３ＧａｌＴ（図２中の●−●）を分離することができることがわかった。上記ステップ１〜５の各段階における総タンパク、６Ｓ−ＧＮ特異的β４ＧａｌＴの総酵素活性、比活性、収率、精製度合いを表１にまとめて示す。
【００１８】
【表１】
0003862430.tif 000002
【００１９】
（６Ｓ−ＧＮに特異的に作用するβ４ＧａｌＴの生化学的性質）
次にヒト大腸から得られた本発明の酵素の生化学的性質を調べた。図３に各種ｐＨにおける酵素活性を示す。各種ｐＨにおける酵素活性は、カコジル酸ナトリウム緩衝液（図３中の●−●）及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−水酸化ナトリウム緩衝液（図３中の○−○）中で測定した。図３から至適ｐＨがｐＨ６〜８、特にｐＨ６．５〜７．５であることがわかる。このように、本発明の６Ｓ−ＧＮに特異的に作用するβ４ＧａｌＴの至適ｐＨは６〜８、特に６．５〜７．５である。
【００２０】
次に、種々の化合物の存在下における比活性を図４に示す。図４からもわかるように、本発明の酵素は、塩化マンガン（●）、塩化マグネシウム（○）及び塩化カルシウム（▲）により比活性が増大することから、２価カチオンに依存すると考えられる。他方、本発明の酵素活性は、５ｍＭのＥＤＴＡ（△）によって阻害され、また１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）（■）によって阻害され、その比活性はコントロールレベル（１０ｍＭ塩化マンガン）の１８％まで低下する。これらのことから、本発明の酵素は、活性の発現に重要なチオール残基を有すると考えられる。このように、本酵素の酵素活性は２価カチオンに依存し、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｃａ2+等の２価カチオン存在下で活性が２〜３倍に増大する。２価カチオンの種類はいずれでもよいが、例えば１０ｍＭ  Ｍｎ2+が活性を高める点で好ましい。
【００２１】
本発明の６Ｓ−ＧＮ特異的β４ＧａｌＴの基質特異性を種々のアクセプターを用いて調べた。表２は、本発明の６Ｓ−ＧＮに特異的に作用するβ４ＧａｌＴ（図２中の△−△）の他、β３ＧａｌＴ（図２中の●−●）、β４ＧａｌＴ（図１ＡのフラクションII）及び牛ミルクβ４ＧａｌＴの各種基質１ｍＭに対する認識度合いを示している。
【００２２】
【表２】
0003862430.tif 000003
【００２３】
表２より、本発明のβ１，４−ガラクトース転移酵素が、他のβ１，４−ガラクトース転移酵素等に比較して、６Ｓ−ＧＮや６Ｓ−ＧＰ｛ＳＯ3-→６ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３（Ｍａｎα１→６）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ｝に特異的に作用し、アクセプターとしてのＧＬやＧＰ｛ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ｝、又はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）には弱い活性を示すにすぎないことがわかる。また、本発明の酵素は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃをよいアクセプターとして認識していない。これらの結果は、この酵素が６Ｓ−ＧＮや非還元末端に６Ｓ−ＧＮ残基を有するオリゴ糖に対して厳密な基質特異性を有することを示している。このように、本発明の酵素は非還元末端の６Ｓ−ＧＮをよい基質とするが、非還元末端のＮ−アセチルグルコサミンを有する糖脂質型・Ｎ−結合型糖鎖にはほとんど作用しないという新規な活性を有している。
【００２４】
これに対して、β３ＧａｌＴ（図２中の●−●）、β４ＧａｌＴｓ（図１ＡのフラクションII）及び牛ミルクβ４ＧａｌＴ等の他のガラクトース転移酵素は、基質特異性において、本発明の酵素と大きく異なっている。β３ＧａｌＴは基質としてＧＬをよく認識し、β４ＧａｌＴｓはＧＬ、ＧＰ及びＧｌｃＮＡｃを幅広く認識するが、これらは６Ｓ−ＧＮ又は６Ｓ−ＧＰを殆ど認識しない。β４ＧａｌＴｓ（図１ＡのフラクションII）の基質特異性は、β４ＧａｌＴＩとして分類される牛ミルクにおける基質特異性とよく似ている。
【００２５】
また、本発明の酵素は、β４ＧａｌＴｓ（図１ＡのフラクションII）及び上記牛ミルクβＧａｌＴと異なり、α−ラクトアルブミンが存在しても基質特異性に影響を受けない。α−ラクトアルブミンの存在下、基質として６Ｓ−ＧＮを用いた場合の結果が図５に示されている（図５の●−●）。また、本発明の酵素は基質としてグルコースを用いた場合、α−ラクトアルブミン存在下でも何ら活性を示さなかった（図５の△−△）。  他方、β４ＧａｌＴｓ（図１ＡのフラクションII）及び牛ミルクのβＧａｌＴの活性は、基質としてグルコースを用いた場合、α−ラクトアルブミン濃度の増大に伴い著しく上昇した（それぞれ図５の○−○及び▲−▲）。また、本発明の６Ｓ−ＧＮ特異的β４ＧａｌＴは、１Ｍ塩化ナトリウムの存在下でα−ラクトアルブミンアガロースカラムに結合しない。
【００２６】
また、本酵素の６Ｓ−ＧＮとＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）を基質として用いた場合の反応速度は、標準状態でタンパク濃度（少なくとも１ｍｌ当たり１ｍｇのタンパク）に比例し、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸の各種濃度における反応速度を図６に、ＵＤＰ−ガラクトースの各種濃度における反応速度を図７に示す。これらのデータから計算すると、６Ｓ−ＧＮに対するＫｍ値及びＶｍａｘ値はそれぞれ０．４３ｍＭ及び４５０ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパクであり、また、ＵＤＰ−ガラクトースに対するＫｍ値及びＶｍａｘ値はそれぞれ１６μＭ及び４５０ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパクであった。
【００２７】
（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸にガラクトースがβ１，４結合により結合したオリゴ糖の製造）
本発明のβ１，４−ガラクトース転移酵素を用いて、６Ｓ−ＧＮ又は６Ｓ−ＧＰ等の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸残基を有するオリゴ糖にガラクトースがβ１，４結合により結合したオリゴ糖を製造することができる。本酵素を用いた６Ｓ−ＧＮへのガラクトース転移反応は、ｐＨ６〜８、特にｐＨ６．５〜７．５で効率良く進行する。基質濃度は本酵素の６Ｓ−ＧＮ、ＵＤＰ−ガラクトースに対するミカエリス定数がそれぞれ０．４３ｍＭ、１６μＭであることから、６Ｓ−ＧＮは１ｍＭ以上、ＵＤＰ−ガラクトースは３０μＭ以上であることが望ましい。また、β１，４−結合に特異的に作用するβ−ガラクトシダーゼを用いることにより、本発明のβ１，４−ガラクトース転移酵素によりガラクトースがβ１，４−結合により結合したことを確かめることができる。
【００２８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ブタ由来Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸特異的β１，４−ガラクトース転移酵素の調製）
ブタ大腸１ｋｇをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に浸し粘膜層をかき取る。得られた懸濁液を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、沈殿に５００ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）−０．２５Ｍシュークロースを加え、ホモジナイズした後遠心する。上清を回収し、沈殿にさらに４００ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）−０．２５Ｍシュークロースを加えホモジナイズした後遠心して上清を回収する。得られた上清を合わせ、さらに３０，０００ｒｐｍ、６０分の超遠心を行う。沈殿に１５０ｍｌの１Ｍ塩化カリウムを加え、ホモジナイズした後超遠心して上清を捨てる。
【００２９】
得られた沈殿に６５ｍｌの１％ジギトニン−１Ｍ塩化ナトリウム−２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）−１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）−１０％グリセロール−１０ｍＭ塩化マンガンを加え、ホモジナイズした後超遠心する。この操作をもう一度繰り返した後、沈殿に６５ｍｌの１％トリトン（Triton）Ｘ−１００−１Ｍ塩化ナトリウム−２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）−１ｍＭ  ＤＴＴ−１０％グリセロール−１０ｍＭ塩化マンガンを加えホモジナイズした後超遠心する。上清を回収した後、沈殿に対し同様の操作を繰り返し、上清を回収する。
【００３０】
得られた２つの上清画分を合わせ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）−１ｍＭ  ＤＴＴ−１０％グリセロール−１０ｍＭ塩化マンガン（以下「緩衝液Ａ」という）に対し透析した後、ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースカラムにかけた［１．６×３ｃｍ、７μｍｏｌウリジン５′−ジフォスフォ（ＵＤＰ）−ヘキサノールアミン／ｍｌゲル、０．１％トリトンＸ−１００−２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）−１ｍＭ  ＤＴＴ−１０％グリセロール−１０ｍＭ塩化マンガン（以下「緩衝液Ｂ」という）で平衡化］。０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂでカラムを洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで酵素画分を溶出した。溶出した酵素画分を緩衝液Ａに対し透析した後、１ｍｌのＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースカラムを用いて再度クロマトグラフィーを行い、同様に酵素画分を溶出した後、透析を行った。
【００３１】
次に、酵素画分を１ｍｌのアシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースカラム［６．７ｍｇ糖ペプチド／ｍｌゲル、緩衝液Ｂで平衡化］にかけ、緩衝液Ｂの存在下、塩化ナトリウムの直線濃度勾配法により酵素画分を溶出した。塩化ナトリウム濃度が０．０６〜０．１０Ｍのときに溶出される酵素画分を集め、濃縮した後緩衝液Ａに対し透析を行った。最終的に得られた酵素量は５６２ｍＵであり、収率は２５％であった。ここで、１Ｕは１分あたり１μｍｏｌのガラクトースをＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸に転移する酵素量とする。
【００３２】
実施例２
（ヒト由来Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸特異的β１，４−ガラクトース転移酵素の調製）
すべての操作は４℃で行った。ヒト大腸粘膜（１７．３ｇ）由来の粗ミクロソームに、１Ｍ塩化カリウム溶液１０ｍｌを加え、３０分間緩やかに攪拌した。この懸濁液を超遠心した後、沈殿に０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び１％トリトンＸ−１００を含む緩衝液Ａ８ｍｌを加え懸濁し、緩やかに１時間攪拌した。再び超遠心した後、沈殿に対しさらに２回抽出処理し、３回分の洗浄抽出フラクションを集めた。フラクションを緩衝液Ａに対し透析した後、ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースカラムにかけた［１．６×３ｃｍ、緩衝液Ｂで平衡化、流速１０ｍｌ／ｈｒ］。緩衝液Ｂでこのカラムを洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで酵素活性画分を溶出し、フラクションＩを得た。次に１Ｍ塩化ナトリウムと１ｍＭＵＤＰとを含む緩衝液Ｂで酵素活性画分を溶出し、フラクションIIを得た。各々のフラクションを緩衝液Ａに対し透析した後、再度クロマトグラフィー処理を行った。フラクションＩは、さらにアシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースカラム［０．７×２．６ｃｍ、緩衝液Ｂで平衡化、流速１０ｍｌ／ｈｒ］にかけた。緩衝液Ｂでこのカラムを洗浄した後、緩衝液Ｂの存在下、塩化ナトリウム濃度０〜０．２Ｍの直線濃度勾配法及び０．５Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液Ｂにより酵素画分を溶出した後濃縮した。
【００３３】
実施例３（Ｇａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃ構造のオリゴ糖鎖の合成）
３ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸、２５０μＭ  ＵＤＰ−ガラクトース、実施例１で得られたガラクトース転移酵素７５ｍＵ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ塩化マンガン  、０．０５％トリトンＸ−１００を含む２５ｍｌの溶液を、３７℃で１時間インキュベートした後、凍結乾燥した。これを少量の水に溶かし、ワットマン３ＭＭろ紙にスポットし、３０００Ｖ、１時間ろ紙電気泳動を行った。［3Ｈ］Ｇａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃと同一の泳動箇所を切り出し、水によりＧａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃを抽出し、最終的に２．４ｍｇのＧａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃを得た。収率はＵＤＰ−ガラクトースに対して８２％であった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明のＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸特異的β１，４−ガラクトース転移酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸へ選択的にガラクトースをβ１，４−結合で結合するガラクトース転移酵素であることから、これにより容易に６−硫酸化シアリルルイスＸの大量調製が可能となるばかりか、他の様々なＧａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃ構造を持つ糖鎖の調製が容易になる。また、本酵素活性は大腸の癌化に伴い約１／２に有意に減少することから、糖鎖構造の癌性変化に関与していると考えられ、この点も含め、硫酸化糖鎖の研究における有用な試薬となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＵＤＰ−ヘキサノールアミンセファロースアフィニティークロマトグラフィーによるガラクトース転移酵素の溶出フラクションを示す図である。
【図２】アシアロ−アガラクト−オボムチンセファロースアフィニティークロマトグラフィーによるガラクトース転移酵素の溶出フラクションを示す図である。
【図３】本発明のβ１，４−ガラクトース転移酵素の至適ｐＨ範囲を示す図である。
【図４】種々の化合物の存在下における本発明のβ１，４−ガラクトース転移酵素の活性を示す図である。
【図５】α−ラクトアルブミンの存在下におけるβ１，４−ガラクトース転移酵素の活性の比較を示す図である。
【図６】Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸の各種濃度における本発明のβ１，４−ガラクトース転移酵素の反応速度を示す図である。
【図７】ＵＤＰ−ガラクトースの各種濃度における本発明のβ１，４−ガラクトース転移酵素の反応速度を示す図である。
【図１】
0003862430.tif 000004
【図２】
0003862430.tif 000005
【図３】
0003862430.tif 000006
【図４】
0003862430.tif 000007
【図５】
0003862430.tif 000008
【図６】
0003862430.tif 000009
【図７】
0003862430.tif 000010