(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性の担体に２個以上の酵素が共有結合し、その酵素の少なくとも１個以上に、抗体、抗体断片、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、ヒアルロン酸結合タンパク質から選ばれる１種類の他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が共有結合したこと、を特徴とする酵素−タンパク質複合体。
【請求項２】
水溶性の担体に２個以上の酵素が共有結合し、その酵素の少なくとも１個以上に、抗体、抗体断片、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、ヒアルロン酸結合タンパク質から選ばれる１種類の他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が共有結合し、かつ、この担体上にも直接、抗体、抗体断片、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、ヒアルロン酸結合タンパク質から選ばれる他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が共有結合したこと、を特徴とする酵素−タンパク質複合体。
【請求項３】
水溶性の担体が５０００〜５０００００の分子量を有するものであること、を特徴とする請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
水溶性の担体が２個以上のアミノ基を有すること、を特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
水溶性の担体が、塩基性アミノ基を２個以上有するペプチドポリマー、あるいは、アミノ基、アルデヒド基、ビニル基の少なくともひとつを導入した多糖類であること、を特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
水溶性の担体がポリリジンであること、を特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼから選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であること、を特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
抗体断片がＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂｃ’から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の複合体を含有すること、を特徴とする免疫測定用キット。
【請求項１１】
免疫測定が免疫組織染色又は酵素免疫測定であること、を特徴とする請求項１０に記載の免疫測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、担体を介して共有結合した酵素上に、他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質を結合させた酵素−タンパク質複合体に関するもので、その複合体は免疫組織化学、エンザイムイムノアッセイなどの免疫測定に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
近年の免疫化学の進歩により、抗原抗体反応を用いて微量の物質を感度良く検出する免疫測定が広く用いられるようになった。現在、免疫測定の中で一般的なものは免疫組織染色及び酵素免疫測定の２分野である。
【０００３】
免疫組織染色とは、組織上の特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する手法である。通常は、組織を固定後パラフィン包埋したブロックから薄切した切片上に特定の抗原を認識する抗体を反応させ、反応した抗体の有無から抗原の存在を判断する。最初に抗原と反応させる抗体を通常、第一抗体と呼ぶ。第一抗体に、視覚または機器により検出し得るシグナルを発する物質を結合させておけば、そのシグナルの強度から第一抗体の量がわかり、それは即ち切片上の抗原の量に対応する。この目的を達成するためのシグナルを発する物質として蛍光物質、酵素などが挙げられる。免疫組織染色が開発された当初はシグナルを発する物質として蛍光物質が用いられていた。その際には蛍光は検出するための蛍光顕微鏡が必要であった。
【０００４】
その後、Ｎａｋａｎｅらにより酵素抗体法が確立され、光学顕微鏡での染色像の解析が可能となった。現在では、シグナルを発する物質として酵素を用いるのが一般的である。免疫組織染色を行う際、第一抗体に酵素を結合させておけば、その酵素の発色性の基質を加えることにより酵素活性に対応した発色が得られ、それは抗体の量に対応、即ち組織上に存在する抗原の量に対応する。しかし、この方法では通常十分な感度が得られない。
【０００５】
現在最も広く用いられている方法は、ストレプトアビジンビオチン法（ＳＡＢ法）と呼ばれ、抗原に結合した第一抗体のシグナルを増幅させて検出する手法である。この方法ではまず、組織切片上の特定の物質を認識する第一抗体を反応させる。次に第一抗体に結合する第二抗体を反応させる。第二抗体は通常第一抗体を認識して結合するポリクロナール抗体で、第一抗体に複数の第二抗体が結合する。第二抗体には予め複数のビオチンを結合させてある。この第一抗体−ビチオン結合第二抗体複合体に酵素結合ストレプトアビジン（酵素試薬）を反応させる。ストレプトアビジンはビオチンと強固に結合することが知られている。したがって、第一抗体−ビオチン結合第二抗体−酵素結合ストレプトアビジンの複合体が形成される。この方法によると第一抗体に複数のビオチン結合第二抗体が結合、さらにビオチン結合第二抗体に複数の酵素結合ストレプトアビジンが結合するため、結果的に第一抗体に結合する酵素量は大幅に増加する。その結果、高い感度で組織切片上の抗原を検出できる。
【０００６】
このようにＳＡＢ法は抗原に結合した第一抗体に結果的に多数の酵素が結合し、より強いシグナルを得ることができる優れた方法である。しかしながら、その操作面に視点を向けると第一抗体の反応、第二抗体の反応、酵素試薬の反応という３段階の操作を行う必要がある。このようにＳＡＢ法は、工程が多く、正確性とともに迅速性、簡便性が要求される医療等の現場ではまだ充分なものとはいえず、改良がまたれている。
【０００７】
もう１つの一般的な免疫測定の手法としては、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）が知られている。ＥＩＡの代表的な原理及び操作は次のとおりである。まず、ポリスチレンビーズあるいはマイクロプレート等の担体に、測定したい物質を認識する抗体を固相化する。次いで、アルブミン等のタンパク質によって担体をブロッキングした後、次に測定目的の物質（抗原）が含まれる溶液（検体）を加える。その後、抗原を認識する抗体に酵素を結合させたもの（酵素標識抗体）を加える。即ち２つの抗体で抗原を挟み込む。次に余分な酵素標識抗体を洗い去った後、酵素の発色性の基質を加え発色させる。抗原の量は酵素活性に依存するため、あらかじめ既知の濃度の抗原を試料とした際の発色と比較することにより、検体中の抗原の濃度がわかる。エンザイムイムノアッセイにおいて感度に関わる要素はいくつかあるが、酵素標識抗体の質は重要な要素の一つである。即ち酵素標識抗体に酵素が多数結合していれば、強いシグナルが得られ、高い感度で抗原を定量できると考えられる。
【０００８】
このように免疫測定において、酵素標識抗体の質は大変重要であり、測定系の感度、あるいは操作の段階数に多大な影響を及ぼす。これまでに高感度の酵素標識抗体を得るために、下記に例示するように、数々の試みがなされてきた。その多くは担体に多数の酵素と抗体を結合させるものである。
【０００９】
特開昭６３−５０３１３８では、薬物、トキシン、キレーター、ホウ素付加体などの検出し得る標識の誘導体が結合した担体に抗体を結合させた。担体としてはアミノデキストランを使用し、まずアミノデキストランにメソトキセートなどの薬物を結合させる。その後、抗体の糖鎖を過よう素酸ナトリウムで酸化させて生じるアルデヒド基とアミノデキストランのアミノ基を反応させた後、水素化シアノホウ素ナトリウムにより還元し共有結合させ、薬物、抗体、アミノデキストランの複合体を作製した。
【００１０】
特開平３−１５８７５８ではデキストランを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、生じたアルデヒド基とアルカリ性フォスファターゼ及び抗体のアミノ基を反応させた後、水素化ホウ素ナトリウムにより還元し、酵素、抗体、デキストランの複合体を作製した。
【００１１】
また、特表平６−５０９１６７ではデキストランなどのポリマーにジビニルスルフォンを反応させビニル基を導入後、酵素及び抗体を反応させることにより酵素、抗体、デキストランの複合体を作製した。
【００１２】
これらの方法により調製された複合体はいずれもポリマーに直接、２種の物質が結合することにより形成される複合体であった。これらの方法で調製された複合体はいずれも、担体を介さずに直接２つの物質を結合させた場合と比較してその性能は向上したと言う。しかしながら、これらの方法には次のような欠点がある。即ち、一つの担体に２種の物質を結合させる場合、この担体に結合しうる物質の量には限りがあるため、一方の物質を多く結合させれば他方の物質の結合量は少なくなる点である。この問題点を解決できればさらに性能の良い複合体となる可能性がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、上記欠点を解消した高品質な酵素−タンパク質複合体を新たに提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高品質な酵素−タンパク質結合体を得るために酵素−タンパク質複合体の製造方法について検討を行った結果、担体に酵素を結合させ、さらに酵素上にタンパク質を結合させることでその目的が達成されることを見出し、さらに研究を行い、ついに本発明の完成に至ったものである。
【００１５】
即ち、本発明は、担体に２個以上の酵素が結合し、その酵素の少なくとも１個以上に他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が結合した酵素−タンパク質複合体に関するものである。さらには、このようにして得た酵素−タンパク質複合体の担体上にも、直接他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が結合した酵素−タンパク質複合体にも関するものである。したがって本発明に係る酵素−タンパク質複合体においては、酵素と他の物質に特異的に結合性を示すタンパク質が結合した酵素が担体に多数結合しているか、又は、酵素と他の物質に特異的に結合性を示すタンパク質が結合した酵素及び担体に直接結合した他の物質に特異的に結合性を示すタンパク質が、担体に多数結合していることとなる。
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、当初免疫組織化学、エンザイムイムノアッセイの分野において使用できる酵素−タンパク質複合体について検討する過程でなされたものであるが、他の分野に適用することに何ら制限はない。
【００１７】
本発明でいう担体とは、タンパク質、多糖類などで特に制限はない。しかし、免疫測定の感度を上げるには多数の酵素を担体に結合させることが望ましい。従って、ある程度の大きさの分子量であることと、酵素を結合させるための反応性官能基が存在することあるいは反応性官能基を導入できることが必要である。そのような目的を達成する担体の例としては、ペプチドポリマー及び／又は多糖類が挙げられ、さらにはそれらの分子量が５，０００〜５００，０００、さらに好ましくは１０，０００〜３００，０００の分子量のものが適している。ただし、上記の分子量の範囲は一応の目安を示したものであって、液中で沈澱や沈降を生じないものであれば上記範囲よりも大きな分子量のものであっても使用可能であり、また、本発明の目的が達成されるのであれば上記範囲よりも小さい分子量のものでも使用可能である。
【００１８】
本発明においては、例えば、結合性を有する２個以上の多数のアミノ基を含有するペプチドが担体として適宜使用される。その１例としては、リジン、アルギニン、オルニチン、グルタミン、各種塩基性アミノ酸等α−アミノ基、ε−アミノ基その他を有するアミノ基を有するペプチドが例示される。更にその具体例としては、ε−アミノ基を有するリジンのポリマーであるポリリジンのほか、リジンを有するとともに他のアミノ酸も有する各種ペプチドが挙げられる。そして後者のペプチドポリマーの例として、リジンとグリシンのランダムコポリマー、リジンとセリンのランダムコポリマー、リジンとグルタミン酸のランダムコポリマーなどが挙げられ、各種分子量のものが市販されている。
【００１９】
一方、アルデヒド基、アミノ基あるいはその他の活性基を導入した多糖類も、本発明における担体として使用することができる。多糖類としては、デキストラン、アガロース、デキストリン、可溶性澱粉等が例示される。アルデヒド基を有する多糖類は、多糖類に過よう素酸ナトリウムを反応させることにより容易に調製できる。また、アミノ基も公知の方法により多糖類に導入できる。例えばアミノ基を有するデキストランは、デキストランを過よう素酸ナトリウムで処理しアルデヒド基を生成させた後、ジアミンと反応させ水素化ホウ素ナトリウムにて還元することにより調製できる。また、多糖類への活性基の導入も公知の方法で行える。例えば、デキストランにジビニルスルホンを反応させることにより、ビニル基を有するデキストランが得られる。
【００２０】
本発明において使用する酵素としては、２個以上のアミノ基を有するものであればすべての酵素が使用可能であって、免疫測定において一般的に使用される酵素が適宜使用される。その例として限定はしないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。
【００２１】
本発明でいう他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質とは、特定の抗原と結合する抗体、特定のリガンドと結合するレセプター等である。例えば、特定の抗原と結合するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、ビオチンと特異的に結合するアビジン及びストレプトアビジン、抗体と特異的に結合するプロテインＡ及びプロテインＧ、糖鎖と特異的に結合するレクチン、ヒアルロン酸と特異的に結合するヒアルロン酸結合タンパク質等である。また、これらの他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質の分子中に存在する、特定の物質に特異的に結合するタンパク質断片をも含有する。例えば、抗体の断片であるF(ab')２、Fab'、Fabc'などである。
【００２２】
本発明においては、まず担体と酵素の複合体を調製する。その方法は、例えば担体のアミノ基をチオール化し、アミノ基をマレイミド化した酵素と混合する。チオール基とマレイミド基は速やかに反応し共有結合するので、酵素が結合した担体が得られる。
【００２３】
担体のアミノ基にチオール基を導入するには、Ｓ−アセチルメチルカプト無水コハク酸（S-acetylmercaptosuccinic anhydride）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate、SPDP)、Ｓ−アセチルチオグリコリックアシドＮ−ヒドロキシスクシンイミド（S-acetylthioglycolic acid N-hydroxysuccinimide、SATA)などを用いる方法が知られている。これらの試薬はアミノ基と反応し、ブロックされたチオール基が導入される。その後、S-acetylmercaptosuccinic anhydride、SATAを用いた場合はHydroxylamine、SPDPを用いた場合はジチオスレイトール(dithiothreitol、DTT)で処理することによりチオール基をブロックしている保護基を除去し、チオール基を生成する。
【００２４】
アミノ基にマレイミド基を導入するには、１分子中にマレイミド基とスクシンイミドエステル基を有する化合物を使用する。例えば、一端にマレイミド基を、他端にＮ−ハイドロキシスクシンイミド基を有する二価の架橋剤を用いればよい。例えば、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スクシンイミド（N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide（ＧＭＢＳ）などである。
【００２５】
１分子中にマレイミド基とスクシンイミド基を併有する化合物としては、上記したＥＭＣＳ、ＧＭＢＳのほか、次のものが非限定的に例示される：Ｎ−スクシンイミジル−Ｎ−マレイミドアセテート（N-Succinimidyl-N-maleimidoacetate）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（N-Succinimidyl-4-(N-maleimido) butyrate)、Ｎ−スクシミジル−６−（マレイミド）ヘキサノエート（N-Succimidyl-6-(N-maleimido) hexanoate、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート（N-succinimidyl-m-(N-maleimido) benzoate)、Ｎ−スクシミジル−ｐ−（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Succinimidyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate)、Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（N-Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート（N-Succinimidyl-m-(N-maleimido) benzoate)、Ｎ−スルホスクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Sulfosuccinimidyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate) など。
【００２６】
本発明においては担体にさらに別の物質を結合させる必要はないため、可能な限り酵素が多数結合した担体−酵素複合体を調製することが望ましい。その目的を達成する手法の一例を次に示す。前記の酵素−担体複合体にマレイミド化試薬を大過剰加えて反応させ、複合体上に残存したアミノ基のほとんどすべてにマレイミド基を導入する。そして、酵素に少なくとも１個以上のアミノ基が残存する条件で、酵素をチオール化する。これは後にこの酵素上に残存するアミノ基を利用して、他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質を結合させるためである。このチオール化した酵素と、マレイミド基を導入した酵素−担体複合体を反応させる。
【００２７】
その後、残存したマレイミド基をチオール基を有する物質でブロックする。ブロックに用いられるチオール基を有する物質の例としてはメルカプトエタノール、システアミン塩酸塩、システインなどが挙げられる。メルカプトエタノールでブロックした場合には、酵素−担体複合体にはチオール化した酵素上にのみアミノ基が存在する。システアミン塩酸塩、システインでブロックした場合、酵素−担体複合体にはチオール化した酵素上にアミノ基が存在し、さらに残存したマレイミド基をブロックした試薬に存在するアミノ基が加わる。
【００２８】
上記酵素−担体複合体に他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質を結合させるには、酵素−担体複合体を調製した際と同様にチオール基とマレイミド基の反応を利用すればよい。例えば、酵素−担体複合体に存在するアミノ基に上述したマレイミド基を導入する試薬を反応させる。次に他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質に同じく上述したチオール基を導入する試薬を反応させる。この両者を混合すれば酵素−他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質−担体の複合体が完成する。他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質に、他の物質との結合に関与しないＳ−Ｓ結合が存在するなら、チオール化する代わりにシステアミン塩酸塩、ＤＴＴなどで還元することによりチオール基を生成させることも可能である。
【００２９】
また、他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が糖鎖を有するならばそれを利用してもよい。例えば、他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質の糖鎖を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し生成したアルデヒド基と、酵素−担体複合体上のアミノ基を反応させた後、還元することにより両者を結合させることも可能である。
【００３０】
完成した複合体は、酵素−担体複合体の調製時の最後に担体上に残存するマレイミド基をメルカプトエタノールでブロックした場合は、酵素上にのみ他の物質に特異的に結合性を示すタンパク質が結合した複合体となる。また、酵素−担体複合体の調製時の最後に担体上に残存するマレイミド基をシステアミン塩酸塩、あるいはシステインでブロックした場合は、酵素上及び担体上のいずれにも他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が結合した複合体が形成される。
【００３１】
本発明の実施態様の一つとして、担体としてポリ−Ｌ−リジン、酵素としてペルオキシダーゼ、他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質として抗体断片であるF(ab')２を用いた場合の酵素−タンパク質−担体複合体の製造について、以下に概説する。
【００３２】
▲１▼  チオール基結合担体の作成
ポリ−Ｌ−リジン含有溶液にＳ−アセチルメルカプトスクシニックアンハイドライドを加え反応させた後、ヒドロキシルアミンを反応させ、担体にチオール基を導入する（担体−ＳＨの作成）。但し、担体はすべてチオール化するのではなく、いくつかのアミノ基は遊離のまま残しておく。
【００３３】
▲２▼  マレイミド基結合ペルオキシダーゼの作成
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）にＥＭＣＳを反応させ、マレイミド基結合ペルオキシダーゼ（Ｍ−ＰＯＤ）を作成する。
【００３４】
▲３▼  ＰＯＤ−ポリ−Ｌ−リジン複合体１の作成
チオール基結合担体とＭ−ＰＯＤとを混合、反応させることにより、複合体（担体−Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ）を作成する。反応後、メルカプトエタノールにより残存するマレイミド基をブロックする。この反応により、上記したＳ−Ｍ−ＰＯＤ及びＳＨ基が導入される他、遊離のアミノ基も有する担体（複合体）が得られる。
【００３５】
▲４▼  マレイミド基結合前記複合体の作成
前記複合体に大過剰のＥＭＣＳ溶液を加えて反応させ、前記複合体のすべてのアミノ基にマレイミド基を導入する。この反応により、Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、マレイミド基、ＳＨ基とＥＭＣＳが結合した後ＥＭＣＳのＮ−ハイドロキシスクシニックアンハイドライドが加水分解して生じるＣＯＯＨ基、が導入された担体（複合体）が得られる。
【００３６】
▲５▼  チオール基結合ペルオキシダーゼの作成
ＰＯＤにＳ−アセチルチオグリコリックアシド−Ｎ−ハイドロキシスクシニックアンハイドライドを反応させた後、ヒドロキシルアミンを反応させ、ＰＯＤにチオール基を導入する。その際、ＰＯＤに遊離のアミノ基が残るような条件で反応させる（ＳＨ−ＰＯＤ−ＮＨ２）。
【００３７】
▲６▼  ＰＯＤ−ポリ−Ｌ−リジン複合体２の作成
ＳＨ−ＰＯＤ−ＮＨ２と▲４▼で得た複合体を反応させることにより、担体に結合したマレイミド基にチオール化したペルオキシダーゼを導入する。その後、残存したマレイミド基をメルカプトエタノールで処理し、ＯＨ基に転換する。この反応により、Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基が導入された、担体（酵素複合体）が得られる。
【００３８】
▲７▼  マレイミド基結合ＰＯＤを有するＰＯＤ−ポリ−Ｌ−リジン複合体２の作成
上記酵素複合体にＥＭＣＳ溶液を反応させ、複合体のＰＯＤのアミノ基をマレイミド化する。Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−Ｍ、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基を有する複合体が形成される。
【００３９】
▲８▼  還元した抗体断片の作成
ヤギ抗マウスＩｇＧをペプシン処理してそのF(ab')２断片を得、これにシステアミン塩酸塩を反応させて還元した抗体断片（ＳＨ−Ｆａｂ'）を得る。
【００４０】
▲９▼  酵素抗体複合体の作成
還元した抗体断片と▲７▼で得た複合体を混合させることにより、ＰＯＤのマレイミド基に抗体断片が結合する。この反応により、Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−Ｍ−Ｓ−Ｆａｂ'、Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−Ｍ、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基が結合した担体（酵素抗体複合体）が得られる。必要あれば、更にメルカプトエタノールで処理して、Ｓ−ＰＯＤ−Ｍの未反応のマレイミド基をＯＨ基に転換して、マレイミド基をブロックしてもよい。
【００４１】
本発明に係わる酵素タンパク質複合体は、上記した構造を採ることに初めて成功したものであり、担体上の酵素が極めて多いためこれを発色させた場合、強い発色が得られる。また担体上は多数の酵素で占有されているにもかかわらず、他の物質に特異的に結合性を示すタンパク質が酵素上に結合することができるため、結果として多数の他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質を複合体に結合させることができ、従って他の物質との結合の確率は極めて高くなる。
【００４２】
したがって本発明に係る酵素−タンパク質複合体によれば、他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が多数存在するため、微量にしか存在しない測定対象物質であってもこれを補捉、結合することができる。そして該タンパク質のどれかひとつに測定対象物質が結合した場合、この酵素−タンパク質複合体には多数の酵素が結合しているため、非常に強い発色が得られる。すなわち本発明によれば、極く微量の物質であっても、これを高感度で検出、測定することができ、正確な測定が可能となる。したがって、本複合体を使用することにより、すぐれた測定キットを組むことができる。
【００４３】
また、本発明においては、酵素−タンパク質複合体を創製するに際して、既述したように、ポリリジンを最初からＥＭＣＳで処理するのではなく（沈殿が生じて使用できなくなる）、最初にＳ−アセチルメルカプトエチルサクシニック  アンハイドライドで処理して担体のアミノ基の一部をメルカプト化し、これにマレイミド化した酵素を結合せしめた後、大過剰のＥＭＣＳで処理することによりマレイミド化及びカルボキシル化し、次いでチオール基結合酵素を反応させれば、最初の酵素の結合数は少数であっても、最終的には多数の酵素を結合させることがはじめて可能となり、しかも、沈殿や沈降することなく、溶液状態で多数の酵素を結合させることができるという著効が奏される。
【００４４】
よって、本発明によれば、ごく微量の試料、非常に希釈された試料であっても、正確にその物質を分析することができるという著効が奏される。
【００４５】
【実施例】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４６】
【実施例１】
酵素担体複合体の製造
マレイミド基結合ペルオキシダーゼを次のように調製した。２．４ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した１００ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼに０．６ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した２０ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３０分反応させた。その後、セファデックスＧ２５（ファルマシア製）にてゲルろ過を行い４０３ｎｍの吸光度を測定し、そのピークを集め限外濾過にて濃縮した。
【００４７】
次に、チオール基結合ポリリジンを以下の通り調製した。１ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した５ｍｇのポリ−Ｌ−リジンハイドロブロマイド（シグマ社製、分子量３７６００）に２０μｌのＤＭＦに溶解した６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトスクシニックアンハイドライドを加え、３０℃、２０分間反応させた。その後、１００μｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）、１０μｌのＥＤＴＡ（ｐＨ７）、１００μｌの１Ｍハイドロキシルアミン（ｐＨ７）を加え、３０℃、５分間反応させた。次に反応液をセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２３０ｎｍの吸光度のピークを集め、限外ろ過にて濃縮した。この場合、全アミノ基をチオール化するものではない。
【００４８】
マレイミド基結合ペルオキシダーゼとチオール基結合ポリ−Ｌ−リジンを混合し４℃、１８時間反応させた。０．１Ｍメルカプトエタノールを１０分の１容加えて３０℃、２０分間反応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（バイオセプラ社製）にてゲルろ過し、各分画の４０３ｎｍの吸光度を測定した。西洋ワサビペルオキシダーゼとポリ−Ｌ−リジンの複合体は高分子画分に存在した。この画分を限外ろ過にて緩衝液を０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に交換した後、３ｍｌまで濃縮した。複合体の西洋ワサビペルオキシダーゼの量は２０ｍｇであった。これを酵素担体複合体１とした。
【００４９】
上記複合体に０．７５ｍｌのＤＭＦに溶解した５０ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３０分間反応させた。生成物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光度のピークを集め限外ろ過にて濃縮した。これをマレイミド基結合酵素担体複合体１とした。この場合、全アミノ基はマレイミド化し、チオール基はカルボキシル基に転換される。
【００５０】
次に、チオール基結合西洋ワサビペルオキシダーゼを以下のように調製した。２．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した１００ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼに０．５ｍｌのＤＭＦに溶解した２．５ｍｇのＳ−アセチルメルカプトチオグリコリックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＡＴＡ）を加え、室温で３０分間反応させた。その後、１００μｌのＥＤＴＡ（ｐＨ７）、０．５ｍｌの１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７）を加え室温で５分間反応させた。反応物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光度を持つ画分を濃縮した。チオール基結合西洋ワサビペルオキシダーゼのチオール基をジャーナル  オブ  イムノアッセイ（Journal of Immunoassay）, 4(3) p209〜327に記載された公知の方法で測定した。その結果、１分子の西洋ワサビペルオキシダーゼに存在するチオール基は１．３と計算された。西洋ワサビペルオキシダーゼには３以上のアミノ基が存在する。従って、上記条件で調製されたチオール基結合西洋ワサビペルオキシダーゼには少なくとも１以上のアミノ基が残存することが確認された。
【００５１】
マレイミド基結合酵素担体複合体とチオール基結合西洋ワサビペルオキシダーゼを混合し、４℃、１８時間反応させた。生成物に０．１Ｍメルカプトエタノールを１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４でゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光度を測定した。複合体は高分子画分に溶出された。これを酵素担体複合体２とした。
【００５２】
また、マレイミド基結合酵素担体複合体とチオール基結合西洋ワサビペルオキシダーゼを混合し、４℃、１８時間反応させたのち、０．１Ｍシステアミン塩酸塩を１０分の１容加え、上記と同様に精製して得られた複合体を酵素担体複合体３とした。酵素担体複合体２及び酵素担体複合体３に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼの量はいずれも４０ｍｇであった。
【００５３】
【実施例２】
酵素第二抗体複合体の製造１
ヤギ抗マウスＩｇＧは、公知の方法により、そのF(ab')２断片を調製した。ヤギ抗マウスＩｇＧ Fab'は以下の方法で得た。０．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した５ｍｇのヤギ抗マウスＩｇＧF(ab')２に５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した０．１Ｍシステアミン塩酸塩を５５μｌ加え３７℃、１．５時間反応させた。反応物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２８０ｎｍの吸光度のピークを集め限外ろ過にて濃縮した。
【００５４】
マレイミド基結合酵素担体複合体２の調製は以下の通り行った。１．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した５ｍｇの酵素担体複合体２に３７５μｌのＤＭＦに溶解した１０ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３０分反応させた。反応物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光度のピークを集め限外ろ過にて濃縮した。
【００５５】
マレイミド基結合酵素担体複合体２とヤギ抗マウスＩｇＧFab'を混合し、４℃、１８時間反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノールを反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有する高分子画分が酵素−Fab'−担体複合体であった。
【００５６】
【実施例３】
酵素第二抗体複合体の製造２
マレイミド基結合酵素担体複合体３の調製は以下の通り行った。１．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した５ｍｇの酵素担体複合体３に３７５μｌのＤＭＦに溶解した１０ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３０分反応させた。反応物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光度のピークを集め限外ろ過にて濃縮した。
【００５７】
上記と同様の方法で調製したヤギ抗マウスＩｇＧFab'とマレイミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、１８時間反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノールを反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有する高分子画分が酵素−Fab'−担体複合体であった。
【００５８】
【実施例４】
酵素第一抗体複合体の製造１
ウサギ抗ｐ５３遺伝子産物抗体（ニチレイ製）を公知の方法に従って、ペプシン消化し、ウサギ抗ｐ５３遺伝子産物F(ab')２断片を調製した。ウサギ抗ｐ５３遺伝子産物Fab'は以下の方法で得た。０．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した５ｍｇのウサギ抗ｐ５３遺伝子産物F(ab')２に５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した０．１Ｍシステアミン塩酸塩を５５μｌ加え３７℃、１．５時間反応させた。反応物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２８０ｎｍの吸光度のピークを集め限外ろ過にて濃縮した。このようにして得た、ウサギ抗ｐ５３遺伝子産物Fab'と実施例３と同様の方法で得たマレイミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、１８時間反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノールを反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有する高分子画分が酵素−Fab'−担体複合体であった。
【００５９】
【実施例５】
酵素第一抗体複合体の製造２
チオール基結合抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ニチレイ製）の調製を次のように行った。１ｍｌのＰＢＳに溶解した５ｍｇの抗ＣＤ３４モノクローナル抗体に５０μｌのＤＭＦに溶解した０．１ｍｇのＳＡＴＡを加え、室温で３０分間反応させた。その後、１０μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）、１００μｌの１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７）を加え、室温で５分間反応させた。生成物はセファデックスＧ２５によりゲルろ過にて精製した。このようにして得たチオール基結合抗ＣＤ３４モノクローナル抗体と、実施例３と同様の方法で得たマレイミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、１８時間反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノールを反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有する高分子画分が酵素−モノクローナル抗体−担体複合体であった。
【００６０】
【実施例６】
酵素ストレプトアビジン複合体の製造
チオール基結合ストレプトアビジンの調製を次のように行った。２．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した２５ｍｇのストレプトアビジンに２５０μｌのＤＭＦに溶解した０．２５ｍｇのＳＡＴＡを加え、室温で３０分間反応させた。その後、５０μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）、２００μｌの１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７）を加え、室温で５分間反応させた。生成物はセファデックスＧ２５によるゲルろ過にて精製した。このようにして得られたチオール基結合ストレプトアビジンと、実施例３と同様の方法で得たマレイミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、１８時間反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノールを反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有する高分子画分が酵素−ストレプトアビジン−担体複合体であった。
【００６１】
【実施例７】
免疫組織化学における実施例３で調製した酵素抗体複合体と従来法で調製した酵素標識抗体の比較及びＳＡＢ法との比較
第一抗体として抗ＬＣＡモノクローナル抗体（ニチレイ製）を用い、腸の組織切片の染色を行った。まず、パラフィン包埋された組織を薄切しスライドグラスに付着させた。その後、脱パラフィン処理及び脱ペルオキシダーゼ処理を行い上記第一抗体と室温で１時間反応させた。ＰＢＳでよくすすいだ後、第二抗体を滴下した。第二抗体は実施例３で作製したものを６μｇ／ｍｌの濃度で用いた。また、従来法でペルオキシダーゼを直接抗体に標識したものも同濃度で使用した。従来法の標識方法はジャーナル  オブ  イムノアッセイ（Journal of Immunoassay）, 4(3) p209〜327の方法に従い、用いた原料及び試薬はすべて実施例３と同様のものを用いた。これらの第二抗体とは室温で３０分間反応させた。
【００６２】
ＳＡＢ法においては、第二抗体としてビオチン標識抗マウスポリクローナル抗体（ニチレイ製）を使用した。その場合、第二抗体と１０分間反応させた後、洗浄しペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ製）を滴下、５分間反応させた。その後、いずれの場合もよく洗浄し、基質溶液（ジアミノベンジジン、過酸化水素）を滴下反応させ精製水で洗浄、封入を行い顕微鏡にて検鏡した。その結果を下記表１に示した。実施例３で作製した酵素第二抗体複合体は従来法で調製した酵素標識抗体と比較して、著しく優れていた。また、増幅操作を行うＳＡＢ法よりも優れていた。
【００６３】
0003781934.tif 000002
Ａ：従来法の酵素標識抗体  Ｂ：実施例３の酵素第二抗体複合体  Ｃ：ＳＡＢ法
【００６４】
【実施例８】
免疫組織化学における実施例４で調製した酵素第一抗体複合体とＳＡＢ法の比較
ＳＡＢ法の第一抗体は実施例４の原料であるウサギ抗ｐ５３ポリクローナル抗体（ニチレイ製）を用いた。まず、パラフィン包埋した胃癌の組織を薄切しスライドグラスに付着させた。その後、脱パラフィン処理及び脱ペルオキシダーゼ処理を行い上記第一抗体と室温で１時間反応させた。ＰＢＳでよくすすいだ後、ビオチン標識抗ウサギポリクローナル抗体（ニチレイ製）と室温で１０分間反応させた。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを滴下、５分間反応させた。
【００６５】
一方、実施例４で作製した酵素第一抗体複合体は脱ペルオキシダーゼ処理した後、室温で１時間反応させた。その際の酵素抗体複合体の濃度は２μｇ／ｍｌであった。その後、いずれの場合もよく洗浄し、基質溶液（ジアミノベンジジン、過酸化水素）を滴下し発色させ精製水で洗浄、封入を行い顕微鏡にて検鏡した。結果は、酵素第一抗体複合体を用いた場合、増幅操作を行うＳＡＢ法と同等の染色強度が得られた。
【００６６】
【実施例９】
エンザイムイムノアッセイにおける実施例３で調製した酵素第二抗体複合体と従来法で調製した酵素標識抗体の比較
９６穴マイクロタイタープレートにヤギ抗マウスＩｇＧを１０μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。生理食塩水で洗浄後、１％ウシ血清アルブミンを２００μｌ加え２時間インキュベートした。所定の濃度（０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）のマウスＩｇＧを１００μｌ加え２時間インキュベートし、生理食塩水で洗浄後、実施例３で調製した酵素第二抗体複合体を抗体量換算で０．５μｇ／ｍｌで、従来法で調製した酵素標識抗体を抗体量換算で２μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ加え３０分インキュベートした。さらに生理食塩水で洗浄し、基質溶液（テトラメチルベンジジン、過酸化水素）を１００μｌ加え１５分間反応させ、１Ｎ硫酸５０μｌ加えて反応を停止した。呈色の程度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果は図１の通りで実施例３で調製した酵素第二抗体複合体が従来法で調製した酵素標識抗体と比較して、より少ない抗体量で強い発色が得られた。
【００６７】
図１は上記の結果を示すものである。図中、横軸はマウスＩｇＧの濃度、縦軸は４５０ｎｍの吸光度を示すものである。●は実施例３で作製した酵素抗体複合体、○は従来法で作製した酵素標識抗体である。
【００６８】
【発明の効果】
本発明の酵素−タンパク質複合体は、特に免疫組織化学、エンザイムイムノアッセイにおける酵素標識抗体（第一抗体はもとより第二抗体としても）として有用であり、感度の高い免疫測定を可能にするものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例９の結果を示す図である。
【図１】
0003781934.tif 000003