(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼ含有検体中に、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（１）、４−（シアノメチルチオ）フェノールおよび４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールから選ばれる一種以上の化学発光増強剤（２）及び酸化剤（３）からなる試薬成分を配合し、（１）の酸化反応に伴う化学発光の強さにより検体中のペルオキシダーゼを測定する方法に用いられる（１）、（２）及び（３）の組み合わせからなる化学発光試薬において、下記第１液及び第２液からなることを特徴とする化学発光試薬。
第１液：（１）、（２）がｐＨ８．０〜９．５の緩衝液に溶解され、該緩衝液が、カルボキシル基を持つグッド緩衝剤、又はスルホン酸基と２個以上のヒドロキシル基を持つグッド緩衝剤で調製された緩衝液である、試薬溶液。
第２液：（３）の水溶液。
【請求項２】
該緩衝液が、ｐＨ８．５〜９．５のＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液またはｐＨ８．０〜９．０の２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸緩衝液である、請求項１記載の化学発光試薬。
【請求項３】
（１）が、ルミノールまたはルミノールの塩であり、（２）が化学発光増強作用を有するフェノール誘導体である請求項１又は２記載の化学発光試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査薬などに応用可能な、化学発光法と化学発光試薬およびそれらを用いた酵素免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼ含有検体中に、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、化学発光増強剤及び酸化剤からなる試薬成分を配合し、上記フタラジンジオン化合物の酸化反応に伴う化学発光の強さにより検体中のペルオキシダーゼを測定する方法が知られており、この測定法には、上記試薬成分を含有する緩衝溶液状態の化学発光試薬が配合使用されている。この緩衝溶液状態の試薬の保存の困難さを改善して、保存安定性を向上するため、従来、下記▲１▼〜▲３▼などの方法が提案されている。
▲１▼上記フタラジンジオン化合物を含む試薬を酸性溶液とする方法（公開特許公報昭６２−２２８９３６号）
▲２▼安定化のため環状多糖誘導体を添加する方法（公開特許公報７−３１３１９５号）
▲３▼ｐＨ９〜１３に調製されたを含有する試薬１と、ｐＨ４〜８に調製された酸化剤を含有する試薬２を用いる方法（公開特許公報平７−３２７６９４号）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、▲１▼の方法は、測定直前に試薬ｐＨを発光反応の至適なｐＨ８〜１０に調製することが必要であり、簡便に測定できない。▲２▼の方法は安定化の効果が小さい。▲３▼の方法は用いる緩衝液、化学発光増強剤および上記フタラジンジオン化合物の種類により効果を示さない場合がある。また、１液と２液を配合する際のｐＨの制御が困難である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定の添加剤を用いることにより、保存安定性が高く、簡便に調製、使用できる発光試薬を得て本発明に到達した。
【０００５】
すなわち本発明は、ペルオキシダーゼ含有検体中に、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（１）、４−（シアノメチルチオ）フェノールおよび４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールから選ばれる一種以上の化学発光増強剤（２）及び酸化剤（３）からなる試薬成分を配合し、（１）の酸化反応に伴う化学発光の強さにより検体中のペルオキシダーゼを測定する方法に用いられる（１）、（２）及び（３）の組み合わせからなる化学発光試薬において、下記第１液及び第２液からなることを特徴とする化学発光試薬。
第１液：（１）、（２）がｐＨ８．０〜９．５の緩衝液に溶解され、該緩衝液が、カルボキシル基を持つグッド緩衝剤、又はスルホン酸基と２個以上のヒドロキシル基を持つグッド緩衝剤で調製された緩衝液である、試薬溶液。
第２液：（３）の水溶液。
【０００６】
本発明において測定可能なペルオキシダーゼとしては、西洋ワサビ、微生物、牛乳、白血球などから抽出したペルオキシダーゼが挙げられる。これらのうち好ましいのは西洋ワサビのペルオキシダーゼである。また、ペルオキシダーゼは、遊離の状態であっても、免疫測定において用いられるような配位子（例えば、抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン、ビオチンなど）と結合した複合体の状態であってもよい。
【０００７】
本発明において、該フタラジンジオン化合物（１）としては、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）およびＮ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）が挙げられる。これらのうち好ましいものはルミノールおよびルミノールの塩である。ルミノールのナトリウム塩は、特に好ましい。
【０００８】
本発明において、酸化剤（３）としては、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウムなどが挙げられる。これらのうち好ましいのは過酸化水素である。
【０００９】
本発明において、化学発光増強剤（２）は従来公知のものが使用できる。例えば、特開昭５９−５００２５２号公報記載の化合物、特開昭５９−１７１８３９号公報記載、特開平７−１４３８９９号公報記載の化合物、特開平４−２９３４９８号公報記載の化合物などが使用できる。このうち特に好ましいのは、Ｐ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールである。
【００１０】
本発明の第１液に用いられる緩衝液は、ｐＨが８．０〜９．５の範囲であり、カルボキシル基を持つグッド緩衝剤、又はスルホン酸基と２個以上のヒドロキシル基を持つグッド緩衝剤で調製された緩衝液である。
カルボキシル基を持つグッド緩衝剤、又はスルホン酸基と２個以上のヒドロキシル基を持つグッド緩衝剤としては、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、２−ヒドロキシ−３−［４−（ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物、Ｎ−（２−アセタミド）イミノジ酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸），２水和物、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン等があげられる。特に好ましいものは、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、２−ヒドロキシ−３−［４−（ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物である。Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシンを緩衝剤として用いる場合、緩衝液（以下ビシン緩衝液と記載）のｐＨは８．５〜９．５の範囲が特に好ましい。またはｐＨ８．０〜９．０の２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物を緩衝剤として用いる場合、緩衝液（以下ＨＥＰＰＳＯ緩衝液と記載する）のｐＨは８．０〜９．０の範囲が特に好ましい。同様なｐＨを示す他のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン／ＮａＯＨ緩衝液、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、バルビタール緩衝液、ホウ酸緩衝液などは、保存安定性が低下し本発明には使用できない。
【００１１】
該緩衝液中の緩衝剤のモル濃度は、０．０２〜０．２の範囲が好ましい。この範囲より小さいと緩衝能力が小さく発光量が不安定となり、大きいと発光反応を抑制し、発光量が低下する。
【００１２】
本発明においては、該化合物（１）及び化学発光増強剤（２）は該緩衝液に溶解され、第１液として保存される。酸化剤（３）は、第１液とは別に、第１液のｐＨを変化させない溶媒（通常は水）に溶解された第２液として保存される。通常、発光反応は、ペルオキシダーゼを含む検体に第１液および第２液を加えることで行われる。あらかじめ、第１液と第２液を混和した後、測定に用いることも可能であるが、混和後の保存安定性は低下する。
【００１３】
第１液には、安定性及びＳ／Ｎ比をさらに改善するため、キレート剤、抗酸化剤、界面活性剤、タンパク質等を添加することもできる。
【００１４】
本発明に用いられる、（１）、（２）、（３）の各濃度は、用いる化合物の種類、測定方法、条件によって最適濃度を設定することができる。通常、（１）は０．１ミリモル／リットル〜１モル／リットル、（２）は１０-4〜１．０（Ｗ／Ｖ％）、（３）は０．１ミリモル／リットル〜１モル／リットルの範囲で設定できる。
【００１５】
一般に化学発光に用いられる、試薬および水は、高純度であることが要求され、再結晶などの精製を行う場合が多い。特に化合物（１）の精製度は、Ｓ／Ｎ比に影響することが知られている。本発明の方法でも、精製度の高い化合物（１）を用いればよりＳ／Ｎ比は改善する。
【００１６】
本発明の化学発光試薬は、従来公知のペルオキシダーゼを利用した測定法および測定用キット、特に免疫測定法および免疫測定用キットに使用することができる。ペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法については広く知られている。試料中の測定対象物質の量は、ペルオキシダーゼ標識された配位子（例えば、抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン、ビオチンなど）の量に対応させて、そのペルオキシダーゼ活性を定量することで定量できる。本発明は、従来のペルオキシダーゼを用いる全ての酵素免疫測定法に適応可能なものである。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
本実施例は、本発明による化学発光試薬の保存安定性が高くなることを示すものである。
【００１９】
１）発光試薬第１液の調製
市販ルミノールナトリウム（和光純薬）０．１８ｇおよび４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを、表１に示したｐＨ８．５の緩衝液に溶解し、発光試薬第１液とした。これらの溶液は、使用するまで冷蔵保存した。
【００２０】
【表１】
0003839133.tif 000002
【００２１】
２）発光試薬第２液の調製
酸化剤としては、過酸化水素を用いた。２００μｌの３５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解し、発光試薬第２液とした。使用するまで冷蔵保存した。
【００２２】
３）免疫反応用試薬と免疫反応操作
ペルオキシダーゼを標識に用いた市販の酵素免疫測定試薬「グラザイムＡＦＰ−ＥＩＡ  ＴＥＳＴ」（三洋化成工業（株）製）を用いて、添付の説明書に準じて免疫反応を行った。すなわち、試験管中で、ＡＦＰを含むサンプル２０μｌと免疫反応用緩衝液３００μｌおよび抗体ビーズ１個を３７℃、１時間反応した。
反応液を廃棄した後、緩衝液を加え、ビーズを緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗体液３００μｌを加え、３７℃、１時間反応した。緩衝液で洗浄後下記の方法で、酵素活性の測定を行った。
【００２３】
４）発光測定操作
酵素活性の測定は、次のように行った。上記のビーズの入った試験管（１２×７５ｍｍ）をアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーにセットし、発光試薬第１液２００μｌおよび発光試薬第２液２００μｌを加え、発光反応を開始した。発光量は、発光反応開始４０秒後から１０秒間の平均値として示した。試薬盲検（ブランク測定）も、上記ビーズの無い条件で同様に測定した。
【００２４】
５）保存安定性の比較結果
上記１）で作成した第１液を、４℃及び２５℃で保存し、４週間後に上記３）、４）の方法でＡＦＰ２ｎｇ／ｍｌ測定時の発光量を比較した。結果を表２に示した。本発明の緩衝剤、特に、ビシン緩衝液とＨＥＰＰＳＯ緩衝液の場合安定性が高いことが判る。
【００２５】
【表２】
0003839133.tif 000003
【００２６】
実施例２
本実施例は、ビシン緩衝液及びＨＥＰＰＳＯ緩衝液のｐＨの範囲を示すものである。
【００２７】
ｐＨ８．０〜１０．０のビシン緩衝液およびＨＥＰＰＳＯ緩衝液を用いて、実施例１と同様に第１液を調製し、４℃及び２５℃保存、４週間後のＡＦＰ２ｎｇ／ｍｌ測定時の発光量を比較した。結果を表３に示した。ｐＨにより安定性が異なることが判る。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、これまで溶液状態の保存が困難であった化学発光試薬を、溶液状態で保存することが可能となる。従って、本発明を適用することで、より安定で試薬の調製などの不必要な臨床検査薬などが開発できる。