(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスゲノムのＥ１領域が欠失した複製不能のアデノウイルスベクターであって、タンパク質ＩＸ遺伝子がアデノウイルスゲノム中で該タンパク質ＩＸ遺伝子が通常存在する位置以外の位置へ再配置されており、複製能のあるアデノウイルスの発生が最小限又は皆無となる、前記ベクター。
【請求項２】
Ｅ４領域の一つ以上のオープンリーディングフレームが欠失している、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
タンパク質ＩＸ遺伝子がＥ４領域へ再配置されている、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
Ｅ４領域のＯＲＦ６は保持されている、請求項２に記載のベクター。
【請求項５】
タンパク質ＩＸ遺伝子がＯＲＦ６遺伝子に隣接して挿入されている、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
アデノウイルスゲノムのＥ１領域が欠失した組換アデノウイルスベクターであって、異種遺伝子が挿入されており、且つタンパク質ＩＸ遺伝子がアデノウイルスゲノム中で該タンパク質ＩＸ遺伝子が通常存在する位置以外の位置へ再配置されており、複製能のあるアデノウイルスの発生が最小限又は皆無となる、前記ベクター。
【請求項７】
Ｅ４領域の一つ以上のオープンリーディングフレームが欠失している、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
タンパク質ＩＸ遺伝子がＥ４領域へ再配置されている、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
Ｅ４領域のＯＲＦ６は保持されている、請求項７に記載のベクター。
【請求項１０】
タンパク質ＩＸ遺伝子がＯＲＦ６遺伝子に隣接して挿入されている、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
異種遺伝子がＣＦＴＲをコードする遺伝子である、請求項６に記載のベクター。
【請求項１２】
異種遺伝子が真核性プロモーターに作動可能に連結されて、該遺伝子を発現させることができる、請求項６に記載のベクター。
【請求項１３】
アデノウイルスが、アデノウイルス血清型２、４、５、及び７から選択される、請求項１又は６に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、in vitro増殖および臨床使用の際に複製能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）の発生を妨げるように設計されている、遺伝子療法において用いるための新規なアデノウイルスベクターに関する。本発明は、更に、新規なウイルスベクターの生産法を提供する。これらベクターは、遺伝子療法のために遺伝子を受容細胞中に導入するのにアデノウイルスベクターが用いられる臨床用途の安全性を最大限にする。
発明の背景
遺伝病を治療するまたは治療的分子を供給する遺伝子療法の可能性は、受容細胞に対して外因性核酸を安全に供給する遺伝子輸送ビヒクルの開発に依る。これまで、大部分の研究は、標的細胞に対してゲノム内容を送るウイルスの自然の能力を利用するために、異種遺伝子（トランスジーン）を有するウイルス由来ベクターの使用に集中してきた。
遺伝子療法にウイルスベクターを用いる大部分の試みは、レトロウイルスベクターに頼ってきたが、それは主として、細胞ゲノム中に組込まれるそれらの能力のためであった。しかしながら、分裂細胞のみに対する指向性、細胞ゲノム中への組込みの際の挿入突然変異誘発の可能性、トランスジーン発現の経時的な減少、血清中補体による急激な失活、および複製能のあるレトロウイルスの発生の可能性を含めたレトロウイルスベクターの欠点が次第に明らかになっている（ジョリー（Jolly），Ｄ．，Cancer Gene Therapy 1:51-64,1994；ホジソン（Hodgson），C.P., Bio Technology 13:222-225,1995）。
アデノウイルスは、約３６ｋｂのゲノムを有する核ＤＮＡウイルスであり、古典的遺伝学および分子生物学における研究によって充分に特性決定されてきた（ホルウィッツ（Horwitz），M.S.,“Adenoviridae and Their Replication”，Virology，第２版，フィールズ（Fields），B.N.ら監修，ラベン・プレス（Raven Press），ニューヨーク，1990年中）。そのゲノムは、ウイルスタンパク質の二つの一過性種類の発生に関して、初期（Ｅ１〜Ｅ４として知られる）および後期（Ｌ１〜Ｌ５として知られる）転写単位に分類される。これらの現象間の区別は、ウイルスＤＮＡ複製である。
アデノウイルスを基礎とするベクターは、分裂および非分裂細胞の両方への指向性、最小の病原潜在性、ベクター原料の調製用に高力価まで複製する能力、および大形のインサートを有する可能性を含めたいくつかの独特の利点を与える（バークナー（Berkner），K.L., Curr.Top.Micro.Immunol.158:39-66,1992；ジョリー，Ｄ．，Cancer Gene Therapy 1:51-64,1994）。アデノウイルスベクターのクローニング容量は、ウイルス増殖に重要でないウイルスゲノムのある部分、例えば、Ｅ３の欠失、パッケージング細胞系からトランスで機能が復元される部分、例えば、Ｅ１の欠失、および２９３細胞によるその相補性（グラハム（Graham），F.L., J.Gen.Virol.36:59-72,1977）、並びに野生型長さの約１０５％〜１０８％である最適パッケージングの最大寸法に起因して、約８ｋｂである。
アデノウイルスベクターによってこれまでに発現された遺伝子としては、ｐ５３（ウィルス（Wills）ら，Human Gene Therapy 5:1079-188,1994）；ジストロフィン（ビンセント（Vincent）ら，Nature Genetics 5:130-134,1993）；エリトロポエチン（デスカンプス（Descamps）ら，Human Gene Therapy 5:979-985,1994）；オルニチントランスカルバミラーゼ（ストラトフォード・ペリコーデト（Stratford-Perricaudet）ら，Human Gene Therapy 1:241-256,1990）；アデノシンデアミナーゼ（ミタニ（Mitani）ら，Human Gene Therapy 5:941-948,1994）：インターロイキン−２（ハッダダ（Haddada）ら，Human Gene Therapy 4:703-711,1993）；およびα１−アンチトリプシン（ジェフェ（Jaffe）ら，Nature Genetics 1:372-378,1992）がある。
気道の細胞に関するアデノウイルスの向性は、白人において最も一般的な常染色体劣性疾患である、気道上皮においてｃＡＭＰ調節Ｃｌ-チャンネルを妨害する貫膜コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子中の突然変異のために肺機能不全を引き起こす嚢胞性線維症（ＣＦ）の遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用に特に関係している（ザブナー（Zabner），Ｊ．ら，Nature Genetics 6:75-83,1994）。ＣＦＴＲ遺伝子を有するように処理されたアデノウイルスベクターが開発され（リッチ（Rich），Ｄ．ら，Human Gene Therapy 4:461-476,1993）、そして研究は、ＣＦ患者の鼻腔上皮（ザブナー，Ｊ．ら，Cell 75:207-216,1993）、コットンラットおよび霊長類の気道上皮（ザブナー，Ｊ．ら，Nature Genetics 6:75-83,1994）並びにＣＦ患者の気道上皮（クリスタル（Crystal），R.G.ら，Nature Genetics 8:42-51,1994）に対してＣＦＴＲを供給するこれらベクターの能力を示した。
安全なウイルスベクターの開発において残された重大な問題の一つは、パッケージング細胞系でのベクター生産の際にまたは個体の遺伝子療法処置の際に複製能のあるウイルスの発生を妨げることである。これら複製能のあるウイルスの発生は、患者への病理学的結果を伴った、目的とされていないウイルス感染の脅威をもたらす。
遺伝子療法のヒト候補者の受容細胞における野生型アデノウイルスの存在は、そのベクターおよび受容細胞中に存在する同種ＤＮＡ配列のために、複製能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）を発生させる可能性をもたらす（ジョリー，Ｄ．，Cancer Gene Therapy 1:51-64,1994）。更に、トランスジーンを有する新規なウイルスの発生は、そのトランスジーンを有する新規なウイルスによってその遺伝子の余分なコピーが生産されることがあるので、最適な遺伝子療法の投薬必要条件の妨げになることがある。したがって、複製欠損であるのみならず、自己分解による組換え現象の有害な作用を制限するように組換えを促進する可能性を最小限にするよう設計されているベクターを開発することが重要である。
発明の概要
本発明は、患者に対して有用な遺伝子を供給するのに有効である遺伝子療法ベクターであって、患者に対する毒性または免疫学的結果を最小限にするように構築されている上記遺伝子療法ベクターを提供する。
本発明は、パッケージング細胞または受容細胞内での組換え現象の発生によって失活し、したがって、複製能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）の発生を妨げる新規なアデノウイルスベクターに関する。失活は、必須遺伝子の欠損によって、またはパッケージングされることができないベクターゲノムの発生によって起こりうる。
本発明は、更に、ＲＣＡの発生を妨げるために、パッケージング細胞または受容細胞中に存在しうるウイルス配列との相同性を減少させるベクターゲノム再配列によって、パッケージング細胞または受容細胞での組換え現象の発生を最小限にしたベクターに関する。
これらのベクター設計は、遺伝子療法用途において遺伝子輸送ビヒクルとして用いるための組換えアデノウイルスベクターの安全性を増加させる。
したがって、一つの態様において、本発明は、アデノウイルスゲノムの要素、更には、真核性転写プロモーターの制御下にある哺乳動物起原の異種遺伝子を含むヌクレオチド配列を提供する。このヌクレオチド配列は、前述の異種遺伝子を発現させるベクターとして、個体の細胞中にそのベクターが入れられた場合に働くことができる。該ヌクレオチド配列は、更に、宿主哺乳動物細胞中のアデノウイルスの複製またはパッケージングに不可欠であるアデノウイルスゲノムの第一要素が該配列中に存在しないこと、および、ヌクレオチド配列中の通常であれば該第一要素で占有される位置のまたは直ぐ隣の位置へ、宿主哺乳動物細胞中のアデノウイルスの複製またはパッケージングにそれ自体不可欠であるアデノウイルスゲノムの第二要素が配置されていることを特徴とする。
本発明の更に別の態様は、第一要素がアデノウイルスゲノムのＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域であり且つ第二要素がアデノウイルスのＥ４領域、Ｅ２Ａ部分、末端タンパク質をコードしている遺伝子またはファイバーＬ５などのアデノウイルス構造タンパク質のいずれか一つであってよいヌクレオチド配列である。
更にもう一つの態様は、アデノウイルスゲノムおよび真核性転写プロモーターの制御下にある哺乳動物起原の異種遺伝子を含有するヌクレオチド配列であって、アデノウイルスゲノムのＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域が不存在であり、そして哺乳動物起原の異種遺伝子の場所以外の位置のヌクレオチド配列中にスタッファー（stuffer）配列が挿入されている上記ヌクレオチド配列を提供する。この配列を含有するベクターは、更に、該配列を複製するまたはパッケージングするのに用いられるヘルパー細胞中または個体の細胞中に存在し且つＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域と相同である要素と該配列との正当な組換えが、ヘルパー細胞中または該個体の細胞中でのパッケージングされ易さの点で未修飾のヌクレオチド配列よりも実質的に効率的でない伸長されたヌクレオチド配列の生産をもたらすことを特徴とする。
本発明は、更に、アデノウイルスタンパク質ＩＸの遺伝子および真核性転写プロモーターの制御下にある哺乳動物起原の異種遺伝子を包含する上記のようなヌクレオチド配列を提供する。このヌクレオチド配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域が不存在であり且つタンパク質ＩＸをコードする遺伝子が、野生型アデノウイルスゲノム中のその正常な位置からはずれた位置に再配置されていることを特徴とする。
本発明は、更に、アデノウイルスタンパク質ＩＸの遺伝子を欠失し且つ真核性転写プロモーターの制御下にある哺乳動物起原の異種遺伝子を包含する上記のようなヌクレオチド配列を提供する。このヌクレオチド配列は、更に、アデノウイルスゲノムのＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域が不存在であること、およびその配列がアデノウイルスゲノムの長さの約９０％以下であることを特徴とする。
本発明は、更に、ウイルスベクターを用いて異種遺伝子を供給する遺伝子療法を受ける個体の、複製能のあるウイルスに対する暴露を最小限にする方法であって、薬学的に許容しうる担体および上記のヌクレオチド配列を有するベクターの内の一つまたは別のものをそれ自体が含む遺伝子療法組成物で該個体を処置する工程を含む上記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１  現行ベクター構築物の略図および２９３細胞中での組換え現象の図面。組換え後の必須遺伝子の欠失によって複製能のないベクターを生じる新規な構築物を示す。
図２  野生型ウイルスを用いる組換えの際に、必須遺伝子またはセグメントを欠失した複製能のないベクターを生じる本発明の新規なベクターを示す。
図３  ベクターと２９３細胞との間の組換えを最小限にするようにタンパク質ＩＸがＥ４欠失部分に再配置されている新規なベクターの３′末端を示す。
図４Ａ〜Ｄ  アデノウイルス血清型２および５の、ヌクレオチド１〜６００（アデノウイルス２型：配列番号：１およびアデノウイルス５型：配列番号：３）および３０４１〜４８４７（アデノウイルス２型：配列番号：２およびアデノウイルス５型：配列番号：４）からのＤＮＡ配列の比較。アデノウイルス２の配列は上の列で示され且つアデノウイルス５の配列は下の列で示される。
図５  Ｅ１領域を欠失し且つアデノウイルスゲノム中のＥ１部位にクローン化されたＣＦＴＲ遺伝子を含有する各種アデノウイルスベクターの略図。ＣＦＴＲ遺伝子は、各ベクター中に図示されている特定の真核性転写プロモーターおよびポリＡ部位の制御下にある。各ベクター中のアデノウイルスゲノムの更に別の変更を示す。
図６  図５で示されたアデノウイルスベクターの野生型アデノウイルス血清型２および５のＢｃｌＩ制限酵素分析。２９３細胞でのベクター生産中に生じたＲＣＡの制限酵素パターンを各ベクターの下に示す。
図７  ２９３細胞でのベクター生産中に生じたＲＣＡの略図。ＲＣＡの構造は、組換え部位の特定のヌクレオチド境界並びにＥ１領域およびタンパク質ＩＸ遺伝子の血清型の起原に関して示される。
図８Ａ〜Ｂ  ｐＡｄ２／Ｅ１ＡＣＦＴＲｓｖｄｒａ−の構築の略図。
図９  ｐＡｄＥ４ＯＲＦ６ΔＥ３Ｂの構築の略図。
図１０  Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７を生じるのに用いられたin vivo組換え工程の略図。
図１１  ２９３細胞でのアデノウイルスベクターの多重継代中にＲＣＡ発生を検定する実験の略図。継代計画は、３、６、９および１２継代後に行われたＲＣＡ生物検定と一緒に示される。ＨＡは、検定において逐次的に用いられたヒーラおよびＡ５４９細胞を意味し、次に続く二つの数はそれぞれ、各細胞系での感染の日数を示す。ＲＣＡ検定で用いられた感染用量は、Ｅ＝べき指数である場合に示され、感染単位（ＩＵ）で表わされる。
発明の詳細な説明
本発明は、パッケージング細胞または受容細胞内での正当な組換え現象の発生によって失活し、したがって、複製能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）の発生を妨げるアデノウイルスベクターに関する。正当な組換えとは、互いに相同であると認められる配列での特異的、且つ正常な塩基対合に依るものである。失活は、必須遺伝子の欠損によって、またはパッケージングされることができないベクターゲノムの発生によって起こりうる。
本発明は、更に、ＲＣＡの発生を妨げるために、パッケージング細胞または受容細胞中に存在しうるウイルス配列との相同性を減少させるベクターゲノム再配列によって、パッケージング細胞または受容細胞での組換え現象の発生を最小限にするベクターに関する。
遺伝子療法の的にされる受容細胞は、アデノウイルスベクターを用いて組換えしうる野生型アデノウイルスＤＮＡ配列を含む可能性がある（ジョリー，Ｄ．，Cancer Gene Therapy 1:51-64,1994）。これらのベクター設計は、したがって、遺伝子療法用途において遺伝子輸送ビヒクルとして用いるための組換えアデノウイルスベクターの安全性を増加させる。したがって、一つの態様において、本発明は、アデノウイルスゲノムの要素、更には、真核性転写プロモーターの制御下にある哺乳動物起原の異種遺伝子を含むヌクレオチド配列を提供する。このヌクレオチド配列は、前述の異種遺伝子を発現させるベクターとして、個体の細胞中にそのベクターが入れられた場合に働くことができる。該ヌクレオチド配列は、更に、宿主哺乳動物細胞中でのアデノウイルスの複製またはパッケージングに不可欠であるアデノウイルスゲノムの第一要素が該配列中に存在しないこと、および、通常であればヌクレオチド配列中において該第一要素で占有される位置またはその直ぐ隣接する位置に、宿主哺乳動物細胞中でのアデノウイルスの複製またはパッケージングにそれ自体不可欠なアデノウイルスゲノムの第二要素が配置されていることを特徴とする。
本発明の実施の観点では、不可欠と定義されるウイルスゲノムの要素（本明細書中において言及される第一および第二要素など）には、複製またはパッケージングを促進するが、このような過程に必ずしも絶対的に不可欠ではない要素もまた含まれることが理解されよう。
本発明のこの態様に関して、異種遺伝子は、有用と認められる全ての遺伝子である。典型的な例として、例えば、哺乳動物起原のタンパク質または有用なＲＮＡ；ヘルペスチミジンキナーゼなどのウイルスタンパク質および細胞障害療法のための細菌コレラ毒素をコードする遺伝子が含まれる。
本発明の更に別の態様は、第一要素がアデノウイルスゲノムのＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域であり且つ第二要素がアデノウイルスのＥ４領域、Ｅ２Ａ部分、末端タンパク質をコードしている遺伝子またはファイバーＬ５などのアデノウイルス構造タンパク質のいずれか一つであってよいヌクレオチド配列である。
更にもう一つの態様は、アデノウイルスゲノムの要素および真核性転写プロモーターの制御下にある哺乳動物起原の異種遺伝子を含有するヌクレオチド配列であって、アデノウイルスゲノムのＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域が不存在であり、そして哺乳動物起原の異種遺伝子の場所以外の位置のヌクレオチド配列中にスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列が挿入されている上記ヌクレオチド配列を提供する。この配列を含有するベクターは、更に、該配列を複製する若しくはパッケージングするのに用いられるヘルパー細胞中に存在する要素または個体の細胞中に存在する要素であって且つＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域と相同である要素と、該配列との正当な組換えが、ヘルパー細胞中または該個体の細胞中でのパッケージングされ易さの点で、未修飾のヌクレオチド配列よりも実質的に有効でない伸長されたヌクレオチド配列の生産をもたらすことを特徴とする。
追加の配列とは、ベクターの機能に悪影響を及ぼさない不活性な配列を意味する。追加の配列の長さは、欠失した配列の長さに基づいて選択される。例えば、欠失がＥ１領域から成る場合、許容しうるインサートは、当業者に知られている理論に基づき、最適パッケージングのためのベクター長さを考慮すると、約３ｋｂである。
本発明は、更に、アデノウイルスタンパク質ＩＸの遺伝子および真核性転写プロモーターの制御下にある哺乳動物起原の異種遺伝子を包含する上記のようなヌクレオチド配列を提供する。このヌクレオチド配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域が不存在であり且つタンパク質ＩＸをコードする遺伝子が、野生型アデノウイルスゲノム中のその正常な位置からはずれた位置に再配置されていることを特徴とする。
好ましくは、それは、概して、除去された少なくとも約１００ヌクレオチド、好ましくは、除去された約５００ヌクレオチド、そして最も好ましくは、除去された約１００ヌクレオチドの位置に再配置される。
本発明は、更に、アデノウイルスタンパク質ＩＸの遺伝子を欠失し且つ真核性転写プロモーターの制御下にある哺乳動物起原の異種遺伝子を包含する上記のようなヌクレオチド配列を提供する。このヌクレオチド配列は、更に、アデノウイルスゲノムのＥ１ａ−Ｅ１ｂ領域が不存在であること、およびその配列がアデノウイルスゲノムの長さの約９０％以下であることを特徴とする。
本発明は、更に、ウイルスベクターを用いて異種遺伝子を供給する遺伝子療法を受ける個体の、複製能のあるウイルスに対する暴露を最小限にする方法であって、薬学的に許容しうる担体および上記のヌクレオチド配列を有するベクターをそれ自体が含む遺伝子療法組成物で該個体を処置する工程を含む上記方法を提供する。
組換え依存性標的配列欠失ベクター
本発明のこの態様は，パッケージング細胞または受容細胞が相同のウイルス配列を有するために潜在的に組換えが行われる部分に、必須の遺伝子またはゲノムセグメント（欠失標的）が入れられているアデノウイルスベクター設計によってＲＣＡの発生を妨げるベクターに関する。細胞性配列とベクターとの間の潜在的組換え現象の結果は、この必須の遺伝子またはゲノムセグメントが組換えの際に欠失し、それによってウイルスベクターを複製不能にさせることである。これは、欠失標的をその元のゲノム位置から移動させて、潜在的に組換えが行われる部分内に位置するようにゲノムを再配列することによって達成される。組換えは、失われたウイルス配列を復元するかもしれないが、そのようなウイルスは、組換え現象の結果、必須遺伝子の欠損という欠陥を含むであろう。
本発明の一つの実施態様において、このベクター設計は、２９３細胞のようなパッケジング細胞系での組換え現象を妨げるのに適用できる（グラハム（Graham），F.L., J.Gen.Virol.36:59-72,1977）。これらの細胞は、ゲノム中に組込まれた５′ＩＴＲから約４３００ヌクレオチド（番号付けに関する参考文献は、ロバーツ（Roberts），R.J., Adenovirus DNA，オーバーフラー（Oberfler），Ｗ．監修，マティナス・ナイホフト・パブリッシング（Matinus Nihoft Publishing），ボストン，1986年中）のアデノウイルス５に由来する自然のままの隣接したウイルスＥ１  ＤＮＡ配列を含有し、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターに対してＥ１遺伝子産物をトランスで供給することができる。ＲＣＡの発生は、充分な隣接した相同配列が正当な組換え現象を促進するように与えられるならば、細胞中のＥ１配列と、タンパク質ＩＸなどのベクター中のＥ１の境界にある残りの配列との間の組換えから可能である。
具体的な実施態様において、Ｅ１領域およびＯＲＦ６遺伝子を除いたＥ４領域を欠失したアデノウイルスベクターは、Ｅ４欠失部分に発現カセットを挿入することによって構築される。（図１）。ＯＲＦ６遺伝子は、Ｅ１欠失領域へ移動させる。アデノウイルスベクターのＥ４領域は、ＤＮＡ複製、後期ｍＲＮＡ蓄積、および宿主タンパク質合成の停止におけるその役割のために、ＯＲＦ６を除いて欠失させることができる（ブリッジ（Bridge），Ｅ．ら，J.Virol.63:631-638,1989；ワン（Huang），Ｍ．ら，J.Virol.63:2605-2615,1989）。組換え現象がウイルス配列と２９３細胞との間に生じる場合、ベクターがなお複製不能であるように、Ｅ１配列が得られ且つＯＲＦ６遺伝子を欠失する。
本発明のもう一つの態様において、ベクターは、いずれのパッケージング細胞系からもＲＣＡの発生を妨げるようにあつらえることができる。欠失標的の遺伝子またはセグメントは、パッケージング細胞系に含まれるＤＮＡと相同であるベクターの領域中に処理されるであろう。したがって、この領域内での組換えは、標的遺伝子またはセグメントを欠失させて、複製不能のウイルスベクターの発生を引き起こすであろう。欠失標的が、例えば、Ｅ２またはＥ４領域に挿入されているベクターは、Ｅ２またはＥ４遺伝子産物を供給するパッケージング細胞系での組換え現象を回避するように設計することができる（クレシク（Klessig），Ｄ．ら，Mol.Cell.Biol.4:1354-1362,1984；ワインバーグ（Weinberg），Ｄ．ら，PNAS 80:5383-5386,1983）。類似したパッケージング細胞系での組換えを回避するように設計された類似の構築物は、本発明の範囲内である。
本発明のもう一つの実施態様において、このベクター設計は、患者の細胞中に存在しうる野生型アデノウイルスとの組換えからのＲＣＡの生成を妨げるのに用いることができる。アデノウイルスに基づく遺伝子療法のヒト候補者における野生型アデノウイルスの存在は、複製不能のアデノウイルスベクターからＲＣＡを生じる組換え現象の関するウイルスＤＮＡ配列の起原を説明することができる（ジョリー，Ｄ．，Cancer Gene Therapy 1:51-64,1994）。ＲＣＡ生産の防止は、野生型アデノウイルスによって組換えが行われる潜在的おそれを有するベクター中の１か所またはそれ以上の部分中に必須遺伝子またはセグメントを入れることによって達成されうる。潜在的組換え部位に必須の標的を入れることにより、一つまたはそれ以上の組換え現象は、必須ウイルス遺伝子を欠失するのに役立つであろうし、それによってウイルスベクターを複製不能にするであろう。
図２で示されたもう一つの実施態様において、野生型ウイルスとの組換えで複製不能にされるベクターを構築する。該ベクターは、欠失したＥ１領域に配置されたＯＲＦ６遺伝子、および欠失したＥ４領域に挿入された発現カセットを含有する。ベクターゲノムの中心部分は野生型アデノウイルスに対して相同であり、そして組換え現象が生じると、そのように生じたベクターゲノムは、図２で示されたように複製不能であろう。
組換え現象の際に欠失させる標的として役立つように配置されることができる必須アデノウイルス遺伝子またはゲノムセグメントとしては、ＯＲＦ６、Ｌ５（ファイバータンパク質）、Ｅ４領域全体、Ｅ２Ａ部分、末端タンパク質、または任意の他の必須ウイルス遺伝子若しくはセグメントがある。
組換え依存性パッケージング欠損ベクター
本発明のこの態様は、パッケージング細胞または受容細胞での組換え現象の発生の際にパッケージング欠損にされて、ＲＣＡの発生を妨げるベクターに関する。この設計は、アデノウイルスビリオン中にパッケージングされうるゲノム長さ上に存在する制限を利用している。新しいビリオン中に最適にパッケージングされうるアデノウイルスゲノムの寸法は、その野生型長さを最大約１０５％〜１０８％まで越えることができ、そしてなお新しいビリオン中にパッケージングされうる（バークナー（Berkner），K.L., Curr.Top.Micro.Immunol.158:39-66,1992）。組換え現象が、パッケージング限界を越えるウイルスゲノムを生じる場合、それはパッケージングされないであろうし、そしてＲＣＡは生じない。
組換え後にパッケージング欠損であるベクターは、その長さが野生型長さの少なくとも１０１％であるようにベクターＤＮＡを処理することによって作ることができる。これは、欠失を補い且つ野生型に近い長さでゲノムを維持する異種ＤＮＡ配列の挿入のために、野生型アデノウイルスゲノムの欠失を含むベクターを用いたとしても達成されうる。
異種ＤＮＡ配列は、目的の遺伝子を単独でコードすることができるし、或いは、異種遺伝子が小さい寸法である場合、ベクターゲノムを野生型長さの少なくとも１０１％の寸法にするように、追加の異種スタッファーＤＮＡ配列を加えることができる。スタッファーとは、バクテリオファージλのいくつかの部分のような、配列の長さを伸長するための機能的に不活性な配列を定義するための用語として当該技術分野において一般的に認められた用語である。
本発明のこの態様のもう一つの実施態様において、Ｅ１領域更にはＯＲＦ６遺伝子を除くＥ４領域が全部で５ｋｂ欠失し、およびＣＦＴＲ遺伝子がＥ４欠失部分に挿入されたベクターを設計する。このベクター寸法は、野生型長さの１０１．３％である。２９３細胞での、例えば、Ｅ１領域がベクター中に挿入されるＥ１媒介性の組換え現象の後、そのゲノムは、野生型長さの約１０８％まで増加して、パッケージング不能になり且つＲＣＡの発生を妨げるであろう。
組換え依存性パッケージング欠損アデノウイルスベクターの概念は、組換えの際に最適パッケージング長さを越えるベクター寸法を維持する全体としての目的をもって、ベクター中の幾つもの部位中に処理される幾つものウイルスまたは非ウイルスＤＮＡフラグメントを用いることによって実践することができるということは当業者に理解されるであろう。
組換えおよび組換えによるＲＣＡの発生を最小限にする攪乱ゲノムベクター
本発明のこの態様において、野生型アデノウイルスに由来するベクターゲノムを、ウイルスコーディング部分の直鎖状配列を乱すように再配列する。一つの実施態様において、このゲノムの「スクランブリング（攪乱）」は、遺伝子療法のヒト候補者において見出されうる野生型アデノウイルスとアデノウイルスベクターとの間の組換えの可能性を減少させる。この減少は、細胞とベクターとの間の相同ＤＮＡ配列の長い伸長部分が、ベクター中のウイルス配列が再配列される時に排除されるという事実による。組換えの可能性は、相同部分の長さが減少すにつれて減少する。この方式で、ＲＣＡの発生は最小限にされる。スクランブリングされうるアデノウイルスゲノムの領域としては、例えば、Ｅ２Ａ領域、Ｅ４領域、ＯＲＦ６、Ｌ５（ファイバータンパク質）、末端タンパク質、または直鎖状配列が野生型とはかけ離れたスクランブルゲノムを生じるウイルスゲノムのこれらおよび他の領域の任意の組合わせでありうる。
この概念は、複製能の回復に数回の組換え現象を必要とするような、アデノウイルスの二つ以上の部分が欠失しているベクターとして応用することができ、それぞれの部分は、おそらくは、ベクターと細胞との間の直鎖相同性がスクランブリングによって減少するにつれて少なくなる。
この概念は、同じように、アデノウイルスベクターとパッケージング細胞系との間の組換えを最小限にするために、該細胞系と相同の伸長部分が再配列によって乱されてそれらの有効な長さおよび組換えの可能性が減少しているベクターを設計することによって適用することができる。本発明のこの実施態様の一つの例において、アデノウイルスベクターと２９３細胞との間の組換えの可能性は、そのベクター中のタンパク質ＩＸ配列を再配列することによって減少する。タンパク質ＩＸ配列は、しばしば、ベクター中の欠失したＥ１領域の右側境界で見出される。タンパク質ＩＸ配列はまた、Ｅ１アデノウイルスインサートの境界で２９３細胞中に含まれ、そしてベクターと細胞性配列との間の組換えを促進することができる。その結果は、ベクターに対するＥ１配列の復元が、タンパク質ＩＸに媒介された組換え現象によって起こりうるということである。ベクター中のＥ１欠失領域からのタンパク質ＩＸ境界の再配置または突然変異誘発は、このような現象およびＲＣＡの発生の可能性を減少させるであろう。このようなベクターは、以下の実施例１および図３で記載されている。
Ａｄ２／ＣＦＴＲ−８は、本発明のこの態様の具体的な実施態様であり、図５で示されている。
パッケージング細胞系との相同性を欠失したベクターによるＲＣＡの防止
本発明のこの態様は、組換えを促進するＤＮＡ配列の欠失によってベクター生産中のＲＣＡの発生を妨げるベクター設計に関する。ＲＣＡ発生は、複製不能な欠失ベクター中のウイルスＤＮＡ配列と、ウイルスタンパク質をトランスで供給するパッケージング細胞系中のウイルスＤＮＡ配列との間に相同の部分がある場合、ベクター生産中に起こりうる。本発明のこの実施態様でのベクターは、ウイルスゲノムとパッケージング細胞系との間の相同の部分が、非必須ウイルスＤＮＡの欠失によって更に最小限にされるように設計されている。これらのベクターは、目的の遺伝子を標的細胞中に輸送し且つその遺伝子を発現のために細胞に与えるという目的を達成するのに必要な最小限のウイルス配列まで削減され、ＲＣＡ生成を妨げることによって最大限の安全性が得られるように設計される。
これまでのベクター設計において欠失されてきたアデノウイルスＤＮＡ配列としては、ウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３およびＥ４領域からの配列がある（バークナー，K.L., Curr.Top.Micro.Immunol.158:39-66,1992）。本発明は、アデノウイルス配列を含有するパッケージング細胞系との相同性を更に減少させるように、ウイルスゲノムのタンパク質ＩＸ領域を欠失したベクターを提供する。この欠失は、細胞ゲノム中のウイルスインサート中にタンパク質ＩＸ配列を包含する細胞系にベクターをパッケージングする場合に特に有用である。例えば、アデノウイルスベクター生産において広く用いられる２９３細胞系は、アデノウイルス血清型５に由来するＥ１領域およびタンパク質ＩＸ配列を含み（グラハム，F.L., J.Gen.Virol.36:59-72,19771）、そしてＥ１欠失ベクターの増殖を許容する場合がある。
本発明の具体的なベクターＡｄ２／ＣＦＴＲ−７は、たんぱく質ＩＸをコードするウイルス遺伝子を欠失するように構築された。この遺伝子は、Ｅ１Ｂ部分の右側境界で見出され、しかもビリオン集合の際に完全な長さゲノムのパッケージングに関与するタンパク質をコードする（ゴーシュ・チョウダリー（Ghosh-Choudhury），Ｇ．ら，J.EMBO 6:1733-1739,1987）。ベクター中のタンパク質ＩＸ  ＤＮＡ配列は、２９３細胞系中のアデノウイルスＥ１インサート内に含まれるタンパク質ＩＸ配列との組換えの可能性を有する。このような組換え現象は、ベクター生産の経過中にＲＣＡを発生することがあるので、ここで記載されたベクターは、タンパク質ＩＸ組換え促進性配列の除去によってこの可能性を避ける手段を提供する。
タンパク質ＩＸは、野生型長さの少なくとも９０％のゲノムをパッケージングするのに必要とされるので、タンパク質ＩＸ遺伝子の除去は、パッケージングされるＤＮＡの量を減少させるベクター設計にとって許容される（ゴーシュ・チョウダリー，Ｇ．ら，J.EMBO 6:1733-1938,1987）。これは、非必須配列の欠失によって、またはシスで必要とされない配列であって、しかもその遺伝子産物がトランスで供給されうる配列の欠失によって達成されうる。このような配列としては、ゲノムのアデノウイルスＥ１、Ｅ３およびＥ４領域に由来するものがある。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７において、Ｅ３領域は、ゲノム長さを減少させるために削減された。アデノウイルスタンパク質に対する宿主免疫応答を最小限にする場合にＥ３タンパク質が関与しているという事実のために、Ｅ３欠失によってウイルスゲノム寸法を減少させるが、若干のＥ３配列を依然として保持するようにすることは望ましいことがある（ホルウィッツ，M.S., Adenoviridae and their Replication, Virology，第２版，フィールズ，B.N.ら監修，ラベン・プレス，ニューヨーク，1990年中）。この方式において、患者へのウイルスベクター導入の不都合な結果を妨げることができる。
ＲＣＡ発生の可能性を最小限にするアデノウイルスベクター設計の能力は、バイオアッセイを用いてベクター生産サイクルにおけるＲＣＡ量を測定することによって評価することができる。検定は、複製不能な欠失ベクターを許容せず且つ野生型アデノウイルスのみの増殖を支持する細胞系を用いることによって、ベクター生産中に生じたＲＣＡについて評点する。これらの細胞系をベクター原料で感染させ、そして観察しうる細胞変性作用（ＣＰＥ）の存在または不存在を用いてＲＣＡ発生を評点する。
複製不能であるアデノウイルス欠失ベクターが、必須ウイルスタンパク質をトランスで供給するアデノウイルス配列を含む細胞系中にパッケージングされた場合、組換え現象から生じたＲＣＡは、両方の起原からのウイルスＤＮＡ配列の混合物を含む。ＲＣＡ中のこのようなハイブリッドゲノムは、細胞系およびベクター中のウイルス配列が異なったウイルス血清型に由来する場合に同定可能である。このようにして、ウイルス血清型間での配列不均一性を用いて、制限酵素分析または直接ＤＮＡ配列決定などの当業者に知られている任意の技法によって組換え現象を調べることができる。ＲＣＡ中の配列決定された部分を、アデノウイルス血清型の既知の配列と比較すると、試験された配列の起原の識別が可能である。したがって、ＲＣＡを生じる組換え現象は、配列分析によって分析することができる。
ＲＣＡゲノム分析を用いて組換え現象の性質を調べる具体的な例は、Ｅ１領域を欠失したアデノウイルスベクターを用いて示すことができる。そのようなベクターにおいて、目的の遺伝子をそのＥ１部位中にクローン化する。これらのベクターを、２９３細胞中で生産させる。ベクターが、２９３細胞系を構築するのに用いられたのとは異なるアデノウイルス血清型、例えば、アデノウイルス２から生産される場合、細胞中のアデノウイルス５配列とベクター中のアデノウイルス２配列との間の組換えによって生じるＲＣＡはいずれも、二つの血清型間の異なった制限酵素パターンによって特徴付けることができる。更に、ＤＮＡ配列決定は、具体的な配列変異を識別するのに用いることができる。Ｅ１欠失ベクターを用いる場合、組換え現象から生じたＲＣＡはいずれも、２９３細胞におけるアデノウイルス５インサートからのＥ１領域を包含するであろうし、そしてＲＣＡ中のこれらの配列の存在は、Ｅ１領域の特性決定によって確認することができる。ＲＣＡのＥ１領域は、制限酵素分析によって地図を作成することができるしおよび／または直接的に配列決定してこの配列の起源を決定することができる。したがって、当業者は、ＲＣＡがアデノウイルス２およびアデノウイルス５配列の混合物を含むことを確認することができ、組換え現象は細胞とベクターウイルスＤＮＡ配列との間に起こったことが示される。
タンパク質ＩＸを欠失したベクターは、タンパク質ＩＸ配列を含有するパッケージング細胞系、すなわち、２９３細胞におけるベクター生産中のＲＣＡの防止に特に関係しているので、遺伝子または配列欠失を用いる懸念を、相同のウイルス配列を含み、したがってＲＣＡを発生する可能性を有する細胞系で用いられる場合にウイルス配列のいずれかの部分を最小限にするまたは欠失するベクターの設計まで同じように拡大させることができることは当業者に理解されうる。
ベクターのパラメーター
本発明のアデノウイルスベクターは、限定されるものではないが、アデノウイルス２、４、５および７を含めた種々のアデノウイルス血清型、そして概して、非発癌性血清型のゲノムに由来しうる。
本発明のアデノウイルスベクターは、供給および発現のためのいずれの異種遺伝子も標的細胞に対して運搬するように処理されることができる。その遺伝子は、当業者に周知である技法を用いて、限定されるものではないが、Ｅ１領域、Ｅ２領域、Ｅ３領域およびＥ４領域を含めたベクター内の様々な部位中に処理されることができる（Current Protocols in Molecular Biology，オースベル（Ausubel），Ｆ．ら監修，ウィリー・アンド・サンズ（Wiley and Sons），ニューヨーク，1995）。アデノウイルスベクター中にクローン化された異種遺伝子は、適当なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた完全な転写単位として処理されることができる。この種のプロモーターは、例えば、アデノウイルスＥ１プロモーターまたはＥ４プロモーターを含み、更には、限定されるものではないが、ＣＭＶプロモーターおよびＰＧＫプロモーターや他のものも含む。異種遺伝子の３′末端にある適当なポリアデニル化シグナルとしては、限定されるものではないが、ＢＧＨおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルがある。アデノウイルスゲノムのＥ３領域は、ベクターのクローニング容量を増加させるために欠失してよいし、またはそれを、本発明の実施に際して遭遇する条件にしたがって、そのベクター構築物中に残してもよい。現在のところ、いくつかの態様において、ベクター構築物に対する患者による重症の炎症症状を含めた免疫応答を最小限にするように、ベクター中のＥ３領域の少なくとも実質的な部分を残すことが好ましい。
本発明のアデノウイルスベクター中に処理されることができる遺伝子としては、限定されるものではないが、ＣＦのためのＣＦＴＲ、気腫のためのα１ーアンチトリプシン、エイズのための可溶性ＣＤ４、アデノシンデアミナーゼ欠損症のためのＡＤＡおよび当該技術分野において遺伝子療法に有用であると認められる何等かの他の遺伝子がある。
本発明のベクターは、失われた若しくは欠損した遺伝子を訂正する目的で、または臨床症状の処置のために治療的分子を与える目的で受容細胞に対して遺伝子を輸送する必要がある疾患の治療のための遺伝子療法に適用することができる。
本発明のベクターは、ex vivoおよびin vitro遺伝子療法用途に適応することができる。
前の段落に含まれたベクター設計の概念を、限定されるものではないが、レトロウイルス、ヘルペス、アデノ関連ウイルス、パポバウイルス、ワクシニア並びに他のＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含めた他のウイルスベクターに対しても同じように適用することができることは理解されるであろう。
実施例１：タンパク質ＩＸ依存性組換えを妨げるスクランブルアデノウイルスベクターの構築
Ｅ１を欠失し且つＥ４配列を３４０７７位のＣｌａＩ部位から３５５９７位のＴａｑＩ部位まで欠失している新規なアデノウイルスベクターを、プラスミドＡｄ２Ｅ４ＯＲＦ６（ＰＣＴ公報第WO 94/12649号）から出発することによって構築する。３３１７８〜３４０８２のＯＲＦ６配列をＥ４領域に挿入する。ＳＶ４０初期ポリＡ配列を、ＯＲＦ６に隣接して挿入し、これはＯＲＦ６遺伝子からＬ５（ファイバー）配列への読み越しを防止するのにも役立つ。タンパク質ＩＸは、ウイルスゲノムその元の位置からＥ４欠失部分へＢａｍＨＩフラグメントとして再配置される。タンパク質ＩＸフラグメントはそれ自体のプロモーターを含み、しかもベクター中にどちらの方向へもクローン化することができる。構築物を図３で示す。標準的な技法を用いてプラスミドを２９３パッケージング細胞中に転移させて、ベクターの原料（ストック）を生じさせる（Current Protocolsin Molecular Biology，オースベル，Ｆ．ら監修，ウィリー・アンド・サンズ，1995）。得られたベクターは、ベクターと２９３細胞との間の相同性を減少させるタンパク質ＩＸ遺伝子の再配置のために、２９３細胞中でのウイルス配列との組換え現象の可能性が低下している。
Ａｄ２／ＣＦＴＲ−８は、タンパク質ＩＸがウイルスゲノムのＥ４領域に再配置されたアデノウイルスベクターの一例であり、図５で示される。
実施例２：血清型配列不均一性によるＲＣＡの分析
アデノウイルスベクターと２９３細胞との間の組換えに起因するＲＣＡの発生を、ベクター生産中に生じた複製能のあるウイルスの配列分析によって分析した。ベクターはアデノウイルス血清型２に由来し且つＥ１領域を欠失していたが、タンパク質ＩＸ配列は含んでいた。２９３細胞は、アデノウイルス血清型５からのＥ１領域およびタンパク質ＩＸ配列を含む。アデノウイルス血清型２および５間の配列不均一性を用いて、ＲＣＡ中に含まれたＥ１およびタンパク質ＩＸ配列の起原を同定した。ＲＣＡ中のタンパク質ＩＸ配列がアデノウイルス５に由来する場合、ベクターと２９３細胞との間の相同的組換え現象を評点することができる。ヌクレオチド１〜６００（アデノウイルス２型：配列番号：１およびアデノウイルス５型：配列番号：３）および３０４１〜４８４７（アデノウイルス２型：配列番号：２およびアデノウイルス５型：配列番号：４）のこれらアデノウイルス血清型間の配列不均一性を図４Ａ〜Ｄで示す。
ＲＣＡ発生について分析された生産中のベクターを図５で示す。図６は、それぞれのベクターおよび２９３細胞中でのベクター生産中に生じたＲＣＡのＢｃｌＩ制限酵素分析の結果を示す。野生型アデノウイルス２および５血清型における制限部位を参考にして、ＲＣＡをその配列の起原に関して特性決定することができる。このような方式で、ベクターとＲＣＡを生じるパッケージング細胞系との間の組換え現象を確認することができる。図７は、２９３細胞中でのそれぞれのベクターの生産中に生じたＲＣＡの配列分析の略図を提供する。２９３細胞中に含まれたアデノウイルス５配列はそれぞれの図の上部に見られ、ベクター中のタンパク質ＩＸ配列との組換え現象に利用可能である。この図は、試験された各ベクターに関するＲＣＡ中のＥ１インサートの５′および３′末端の組換え部位を示す。ベクターＡｄ２／ＣＦＴＲ−２、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−５およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−６の生産中に生じたＲＣＡにおいて、ＲＣＡ中のＥ１フラグメントの３′境界のタンパク質ＩＸ配列はアデノウイルス５に由来しており、組換え現象がベクターと２９３細胞との間で起こり、タンパク質ＩＸ配列によって媒介されたことが示される。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−３およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−１からの結果は可変的であり、タンパク質ＩＸによって媒介されない組換えが検出された。
ＲＣＡの組換え分析の結果は、アデノウイルスベクター中のタンパク質ＩＸ配列が、相同タンパク質ＩＸ配列を含む細胞系でのＲＣＡの発生の組換え部位として役立ちうることを実証する。
実施例３：Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７の構築および分析
一連のクローニング工程は、ベクターＡｄ２／ＣＦＴＲ−７の最終構築までのプラスミド中間体を構築するのに必要とされた。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７を誘導するin vivo組換え工程を以下に詳述する。ＲＣＡ検定を用いて、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７ベクター設計が２９３細胞での継代中にＲＣＡ発生を減少させたかどうかを確認した。
ｐＡｄ２／Ｅ１ａＣＦＴＲｓｖｄｒａ−の構築
中間体プラスミドｐＡｄ２／Ｅ１ａＣＦＴＲｓｖｄｒａ−を構築する場合に用いられたクローニング工程およびプラスミドを以下に記載し且つ図８Ａおよび８Ｂで図示する。出発プラスミドｐＡｄ２／ＣＭＶ−２は、ヌクレオチド３５７および３４９８間の配列の欠失を除いてＡｄ２の最初の１０，６８０ヌクレオチドを含む、ｐＢＲ３２２のＣｌａＩおよびＢａｍＨＩ部位中にクローン化された約７．５ｋｂのインサートを含有する。上記ヌクレオチド３５７〜３４９８間の欠失により、Ｅ１プロモーター、Ｅ１ａおよび大部分のＥ１ｂコーディング領域が除かれている。プラスミドｐＡｄ２／ＣＭＶ−２はまた、Ｅ１欠失の部位のＣｌａＩおよびＳｐｅｌ部位中に挿入されたＣＭＶプロモーターおよびＢａｍＨＩ部位中にクローン化された下流のＳＶ４０ポリアデニル化（ポリＡ）配列（元は、１９７ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩフラグメント）を含有する。
クローニング工程の最初の手順では、先ずＳＶ４０ポリＡの一部分およびタンパク質ＩＸ遺伝子の一部分を、そして次に、タンパク質ＩＸ遺伝子の残部を除去した。プラスミドｐＡｄ２／ＣＭＶ−２をＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＳＶ４０ポリＡおよびＡｄ２配列を含有する３１４６ｂｐフラグメントをpBluescript SK-（ストラタジーン（Stratagene））の同じ部位に連結して、プラスミドｐＢＳＳＫ／ｓ／ｈを生じた。ＳＶ４０ポリＡの６０ヌクレオチドおよびＡｄ２のタンパク質ＩＸ配列の大部分を含有する６５６ｂｐのＭｕｎＩフラグメントをこのプラスミドから切除して、プラスミドＰＢＳ−ＳＨ  ｍｕｎ−を生じた。このプラスミドをＤｒａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして２２１０ｂｐフラグメントをpBluescript SKII-（ストラタジーン）のＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化してプラスミドｐＢＳＤｒａ−ＨｉｎｄＩＩＩを生じた。この工程において、タンパク質ＩＸ遺伝子の残部を除去した。次に、このプラスミドのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（２２１４ｂｐ）を、プラスミドｐＢＳ−ＳＨｍｕｎ−のＭｕｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化してｐＢＳ−ＳＨ．ｄｒａ−を生じた。この工程において、タンパク質ＩＸ欠失を含むＡｄ２ゲノムのセグメントは、切断されたＳＶ４０ポリＡセグメントと再結合される。このようにして、プラスミドｐＢＳ−ＳＨ．ｄｒａ−は、ＳＶ４０ポリＡの６０ｂｐ欠失、タンパク質ＩＸ遺伝子の欠失、およびｂｐ４０２０〜１０６８０までのＡｄ２配列を有する。このインサートはまた、ポリリンカー部位（複数）で取囲まれている。
クローニング工程の次の手順において、ＳＶ４０ポリＡおよびタンパク質ＩＸ欠失を含有する上で生産されたＤＮＡセグメントを、Ａｄ２ゲノムの左末端を完成するのに必要な配列と結合した。ｐＢＳ−ＳＨ．ｄｒａ−を、ＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして２３６８ｂｐフラグメントをプラスミドｐＡｄＥ１ａＢＧＨのＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化し、このプラスミドからのＢＧＨポリＡ、タンパク質ＩＸおよびＡｄ２配列を有効に置換し、そしてそれによってプラスミドｐＡｄ２／Ｅ１ａｓｖｄｒａ−を生じた。
クローニング工程の次の手順において、ＣＦＴＲ  ＣＤＮＡを、ｐＡｄ２／Ｅｌａｓｖｄｒａ−中のＥ１Ａプロモーターより下流に導入した。これを達成するために、ＣＦＴＲ  ＣＤＮＡを含有するＳｗａＩおよびＡｖｒＩＩフラグメントをプラスミドｐＡｄＰＧＫＣＦＴＲｓｖから脱離させ且つｐＡｄ２／Ｅ１ａｓｖｄｒａ−のＳｗａＩおよびＡｖｒＩＩ部位に挿入して、プラスミドｐＡｄ２／Ｅ１ａＣＦＴＲｓｖｄｒａ−を生じた。このプラスミドを、以下に記載のin vivo組換えにおいて用いた。
ｐＡｄ２／ＯＲＦ６Ｅ３Δ１．６の構築
ｐＡＤ２／ＯＲＦ６Ｅ３Δ１．６を製造するためのクローニング工程およびプラスミドを図９で詳述する。出発プラスミドｐＡｄＥ４ＯＲＦ６は、ＰＣＴ公報第WO 94/12649号に記載されている。このプラスミドのＥ３領域内の１．６ｋｂ欠失は、ＭｌｕＩおよびＥａｇＩ切断ｐＡｄＥ４ＯＲＦ６中への二つのＰＣＲフラグメントの三方連結によって構築された。これらのＰＣＲフラグメントは両方とも、ｐＡｄＥ４ＯＲＦ６  ＤＮＡを用いて製造され、そして第一ＰＣＲフラグメントは、Ａｄ２ヌクレオチドの２７１２３〜２９２９２に該当し（２１６９ｂｐ）且つＥａｇＩおよびＲｓｒＩＩ部位がそれぞれ隣接していた。第二ＰＣＲフラグメントは、Ａｄ２ヌクレオチドの３０８４１〜３１１７６に該当し（３３９ｂｐ）且つＲｓｒＩＩおよびＭｌｕＩ部位がそれぞれ隣接していた。ＭｌｕＩおよびＥａｇＩ切断ｐＡｄＥ４ＯＲＦ６  ＤＮＡと連結されて得られたプラスミドｐＡｄＯＲＦ６Δ１．６は、Ａｄ２のヌクレオチド２９２９３〜３０８４０（１５４７ｂｐ）またはポリＡ部位を除くＥ３ｂ全体の欠失を含んでいた。そして、２７１２３〜３５９３７までのＡｄ２配列の残部を保持しており、またこの段階で独特のＲｓｒＩＩ部位も含んでいた。
Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７を誘導するのに用いられたin vivo組換え工程
Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７のＤＮＡ構築物を誘導するのに用いられた組換え工程を図１０に図示する。
ＣｌａＩで線状化されたプラスミドｐＡｄ２Ｅ４ＯＲＦ６Δ１．６（Ａｄ２  ｂｐ３５９３７を越えたプラスミドのポリリンカー部分）並びにｐａｃＩ（Ａｄ２のｂｐ２８６２２）およびＡｓｅＩ（ＰａｃＩの多カット３′）で消化されたＡｄ２  ＤＮＡを、ＣａＰＯ4トランスフェクションを用いて２９３細胞中に導入した。この工程から得られた所望の組換えウイルスＡｄＯＲＦ６Δ１．６をプラーク精製し且つ種原料（シードストック）を製造するのに用いた。次に、ｐＡｄ２／Ｅ１ａＣＦＴＲｓｖｄｒａ−を、Ａｄ２中の１０６７０位の独特のＢｓｔＢＩ部位に対応する部位のところでＢｓｔＢＩで切断した。Ａｄ２／ＯＲＦ６Ｅ３Δ１．６からのゲノムＤＮＡを、ウイルスの５′部分で２回切断するＰｓｈＡＩで消化した。次に、プラスミドおよびゲノムＤＮＡを、ＣａＰＯ4（プロメガ（Promega））を用いて２９３細胞中にトランスフェクションした。この工程から得られた所望の組換えベクターＡｄ２／ＣＦＴＲ−７をプラーク精製し、そして種原料を製造するのに用いた。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７を図５に示す。
実施例４：２９３細胞で継代されたベクターのＲＣＡ検定
Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７ベクターを試験して、タンパク質ＩＸ部分が保持されている他のベクターと比較した場合に、盲目継代中にＲＣＡ発生が起きたかどうかを確認した。ＲＣＡバイアッセイを用いてＲＣＡを評点した。ＲＣＡ検定計画の略図を図１１に示す。
試験されたベクターの略図を図５で示す。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−７と比較して試験されたベクターとしては、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−２およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−６がある。これら対照ベクターは全て、タンパク質ＩＸ遺伝子を含有する。
各ベクターの種原料は２９３細胞中でのウイルスの増殖によって調製されたが、２９３細胞は、アデノウイルスＥ１領域を含み且つＥ１欠失ベクターの複製を許容する。種原料は、２９３細胞で力価検定した。
種原料の連続継代は２９３細胞で行われた。Ｍ．Ｏ．Ｉ．（感染多重度）５〜１０のウイルス接種材料を用いて細胞を感染させた。細胞変性効果（ＣＰＥ）が１００％と観察された時点でそれぞれの継代物を採取し、そして標準的な技法にしたがって細胞溶解液を調製した。
２９３細胞でのＲＣＡ発生の検定は、ヒーラ細胞およびＡ５４９細胞を用いて行われた複製能のあるウイルスのバイオアッセイによって試験された。これら細胞系は、アデノウイルスＥ１配列を全く含まないので、設計によってＥ１領域を含ウイルスまたは組換え現象によってＥ１領域を獲得したウイルスに対してのみ増殖を許容する。したがって、この検定は、Ｅ１欠失ベクターと２９３細胞との間の組換え現象から生じた全てのＲＣＡを評点する。
２９３細胞により継代された各ベクターから選んだ継代物を、ＲＣＡ検定によって分析した。その検定は、ヒーラ細胞に試験されるベクター継代物をＭＯＩ２０で感染させることによって行われた。この感染処理を４日間進行させた後、細胞を採取し、そして標準的な技法によって細胞溶解液を調製した。次に、その溶解液を用いてＡ５４９細胞に感染させ、そしてこの感染処理を１０日間進行させた。細胞をＣＰＥの存在または不存在について評点した。表１は、試験された各ベクターの選択された継代物で行われたＲＣＡ検定の結果を示す。継代物は、ＣＰＥの観察に基づく判定によって、ＲＣＡが観察されなかった場合は合格（PASS）と評点し、そしてＲＣＡが観察された場合は不合格（FAIL）と評点した。ＲＣＡ検定で試験されたベクターの投与量は、表に示されたように何通りかで行った。
ＲＣＡ検定による結果は、ベクターＡｄ２／ＣＦＴＲ−２およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−６からの継代１２回で、およびベクターＡｄ２／ＣＦＴＲ−１からの継代３回でＲＣＡを観察できたことを示す。対照的に、ベクターＡｄ２／ＣＦＴＲ−７からの継代１２回では、最高の投与量で試験された場合でもＲＣＡは観察されなかった。このベクターは、試験されたベクターの内で最低量のＲＣＡを有する。結果は、タンパク質ＩＸ配列の除去が、２９３細胞中でのＲＣＡ発生を有意に減少させたことを示している。
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実施例５：最小限のＥ４配列を含むアデノウイルスベクター
プラスミドｐＡｄＥ４ＯＲＦ６は、ＰＣＴ公報第WO 04/12649号に記載されており、同じく同公報に記載されているＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲを構築するのに用いられた。後者は、ＰＧＫプロモーターの制御下にあるＣＦＴＲ遺伝子を含有する。図５で示されたＡｄ２／ＣＦＴＲ−８は、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲと同等のアデノウイルスベクターである。
このベクター設計のさらなる変更は本発明の態様である。言い換えると、ＣＦＴＲ遺伝子は、図５のＡｄ２／ＣＦＴＲ−５で示されるＣＭＶプロモーターの制御下に置くことができる。用いることができる他のプロモーターとしては、ベクターＡｄ２／ＣＦＴＲ−４で図示されたようなアデノウイルス主後期プロモーター（ＭＬＰ）がある。ＢＧＨおよびＳＶ４０ポリＡ要素およびその他の要素は、ベクター構築並びに当業者に知られているように用いることができる。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：アルメンタノ・ドナ（ARMENTANO,DONNA）
ロマンツク・ヘレン（ROMANCZUK,HELEN）
ワズワース・サムエル（WADSWORTH,SAMUEL）Ｃ．
（ｉｉ）発明の名称：遺伝子療法用の新規なアデノウイルスベクター
（ｉｉｉ）配列の数：４
（ｉｖ）宛先：
（Ａ）住所：ジェンザイム・コーポレーション（Genzyme Corporation）
（Ｂ）地区：ワン・マウンテン・ロード（One Mountain Road）
（Ｃ）市名：フレーミンハム
（Ｄ）州名：マサチューセッツ
（Ｅ）国名：米国
（Ｆ）郵便番号：０１７０１−９３２２
（ｖ）コンピューター読取り形式：
（Ａ）中型：ディスケット
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ適合性
（Ｃ）操作システム：ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ファストセク・バージョン（FastSEQ Version）１．５
（ｖｉ）現行出願資料：
（Ａ）出願番号：０８／５４０，０７７
（Ｂ）出願日：１９９５年１０月６日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先行出願資料：
（Ａ）出願番号：０８／４０９，８７４
（Ｂ）出願日：１９９５年３月２４日
（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ドナヒュー，Ｅ．ビクター（Donahue,E.Victor）
（Ｂ）登録番号：３５，４９２
（Ｃ）照会／事件整理番号：ＧＥＮ５−１．１  ＰＣＴ
（ｉｘ）通信情報：
（Ａ）電話：５０８−８７２−８４００
（Ｂ）ファクシミリ：５０８−８７２−５４１５
（Ｃ）テレックス：
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６００塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮説：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｖ）フラグメント種類：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列種類：配列番号：１：
0003827163.tif 000003
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７９６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮説：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｖ）フラグメント種類：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列種類：配列番号：２：
0003827163.tif 000004
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６００塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮説：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｖ）フラグメント種類：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列種類：配列番号：３：
0003827163.tif 000005
（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８００塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮説：なし
（ｉｖ）アンチセンス：なし
（ｖ）フラグメント種類：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列種類：配列番号：４：
0003827163.tif 000006
0003827163.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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