(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−末端がVal-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-であり且つ糖鎖を有するペプチド分子種から成る、均一なＮ末端を有する組換え型ヒトインターロイキン６。
【請求項２】
請求項１に記載の組換え型ヒトインターロイキン６の製造方法であって、Ｎ末端がValであるヒトインターロイキン６と、ヒトインターロイキン６の本来のシグナルペプチド以外のシグナルペプチドとから成る融合蛋白質をコードするＤＮＡにより形質転換された動物細胞を培養し、得られた培養物から該ヒトインターロイキン６を採取することを特徴とする、Ｎ末端が均一なヒトインターロイキン６の製造方法。
【請求項３】
前記シグナルペプチドがヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナルペプチドである、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｎ−末端がバリン(Val) から始まり、糖鎖により修飾されている均一なペプチド分子種から成る組換え型ヒトインターロイキン６及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン6 は、造血細胞の成育支持などの生物学的活性のゆえに医薬として、特に血小板増多因子としての用途が期待されている生理活性物質である。天然型としてヒト細胞を培養することにより得られたインターロイキン６は、糖鎖による修飾を受けた糖蛋白質であり、そのＮ末端アミノ酸配列は表１に示すように異なる数種のものが含まれる。
【０００３】
組換えＤＮＡ技術により、インターロイキン６遺伝子をクローン化し、動物細胞たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞に導入して、その細胞を培養することによりインターロイキン６を生産する方法が開発された。精製されたインターロイキン６は、天然型と同様に糖鎖による修飾を受けていたが、Ｎ末端アミノ酸配列は不均一であった。
【０００４】
【表１】
0003786433.tif 000002
【０００５】
このＮ末端配列の不均一性は、精製蛋白の純度検定に支障をきたす。また、それぞれの成分の単離は困難であり、個々の成分の安定性評価、薬効評価、吸収、代謝、排泄の評価および毒性評価等は不可能であった。そして、これらの理由により、ヒトインターロイキン６を医薬として使用することは実質的に不可能であった。
【０００６】
なお、微生物、たとえば大腸菌により産生する方法で、均一なＮ末端を有する組換え型ヒトインターロイキン６の製造は可能である Tonouchi,N.,et al., J.Biochem.,104,30(1988)  が、糖鎖が付加しておらず、本来糖鎖でおおわれているポリペチド部分が露出することにより抗体が産生されるため抗原性等の点で問題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明はＮ末端が均一なヒトインターロイキン６及びその製造方法を提供しようとするものである。
本発明者らは、インターロイキン６のＮ末端の均一化について種々研究を重ねた結果、ヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナルペプチドを用い、かつインターロイキン６のＮ末端として Valを選択することにより、チャイニーズハムスター卵巣細胞の産生する、均一なＮ末端を有し、かつ糖鎖の修飾を受けたインターロイキン６が得られることを見出し、本発明を完成した。従来の培養および精製の系を変更すること無く、均一なＮ末端を有し、かつ糖鎖の修飾を受けたインターロイキン６が得られるという優れた利点を有している。
【０００８】
従って本発明は、Ｎ末端が Valから始まり且つ糖鎖を有するペプチド分子種から成る、均一なＮ末端を有する組換え型インターロイキン６を提供する。
本発明はさらに、前記のヒトインターロイキン６製造方法であって、Ｎ末端が Valから始まるヒトインターロイキン６と、ヒトインターロイキン６の本来のシグナルペプチド以外のシグナルペプチドとから成る融合蛋白質をコードするＤＮＡにより形質転換された動物細胞を培養し、得られた培養物から該インターロイキン６を採取することを特徴とするＮ末端が均一なヒトインターロイキン６の製造方法を提供する。
【０００９】
【具体的な説明】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、シグナルペプチドを置換することにより、動物細胞を宿主とした、均一なＮ末端を有する組換え型ヒトインターロイキン６（以下ヒトIL-6と略記する）を得る方法、及びこの方法により製造される組換型ヒトIL-6を提供する。
【００１０】
シグナルペプチドとしては、例えばヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下ヒトG-CSF と略記する）のものなどが含まれる。ヒトIL-6のシグナルペプチドは、統計学的にシグナルペプチド中にはあまり見かけられないPro に富み、かつ細胞膜に埋れていると思われる疎水性コアから切断点までの距離が短い。ヒトG-CSF のシグナルペプチドは切断点近傍にPro を含まず、疎水性コアからの距離も十分であり、かつ−２位に負の電荷を持つGlu を有するためリン脂質二重膜の表面電荷と反発し、切断点近傍を確実に細胞膜外へ露出させ得る特徴を持つ。
【００１１】
従って、ヒトIL-6の本来のシグナルペプチドの上記性質に対比してヒトG-CSF のシグナルペプチドのような性質を有するシグナルペプチドを本発明において使用することができる。このようなシグナルペプチドとして、例えば、マウスIL-6、マウス顆粒球コロニー刺激因子、ヒトエリスロポエチン、マウスエリスロポエチン、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトIL-2、マウスIL-2、ヒトIL-3、マウスIL-3、ヒトIL-4、マウスIL-4、ヒトIL-5、マウスIL-5、ヒトIL-7、マウスIL-7、ヒトインターフェロン(IFN) α、マウス IFNβ、ヒト IFNγ、マウス IFNγ、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、マウスマクロファジコロニー刺激因子等のシグナルペプチドが挙げられる。
【００１２】
また、ヒトIL-6の本来のシグナルペプチドのＣ末端を改変したものであってもよい。
宿主とする動物細胞としては、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下CHO 細胞と略記する）などが含まれる。 CHO細胞は組換え型ヒトG-CSF など数多くの実績があり、これにより付加される糖鎖の構造は最も天然型のものに近い。しかしながら、宿主としての動物細胞にCHO に限られるのではなく、例えばNIH3T3，C127，BHK ，Namalva 等種々の細胞系を用いることもできる。
【００１３】
ヒトIL-6のＮ末端配列としては、 Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp- が選ばれる。単純にシグナルペプチドを置換し、Ｎ末端配列としてAla-Pro-Val-Pro-Pro-Gly-を選んだ場合、均一なＮ末端を有するものは得られず、 Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp- を選んだ場合にのみ均一なＮ末端を有するものが得られた。これらのことはヒトIL-6の構造からは容易に考えつくものではないことは明らかである。またこの配列は、天然型でも見られるものであり、人為的改変を加えたものに見られるような抗原性などの心配は全くない。
【００１４】
本発明の方法においては、宿主により生産されたヒトIL-6は主として細胞外に分泌される。従って、培養後、培養上清を得、これに硫安分画、エタノール分画、アセトン分画、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、調製用電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー等の常用の精製手段を適用することにより、本発明の組換え型ヒトIL-6を得ることができる。
【００１５】
【実施例】
以下本発明の実施例を示す。特に記さない限り遺伝子操作はMolecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory(1989) に従って行ない、酵素類は宝酒造より購入した。また、オリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成機( アプライド・バイオシステム社製）を用いて合成し、ＤＮＡ断片は低融点アガロース電気泳動法により調製した。
参考1. 組換え型ヒトIL-6の発現
プラスミドpAdD26SVpA Kaufman.R.J.,and Sharp,P.A.,Mol.Cell.Biol.,2.1304(1982)  のジヒドロ葉酸還元酵素（以下DHFRと略記する) 発現ユニットを含む2.０kbのEcoR I／BamH I断片を、Klenow酵素により平滑末端化した。プラスミドpdKCR O'Fukunaga.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,5086(1984)  のHind III部位を同様に平滑末端化し、前記の断片とライゲーションさせ、得られたプラスミドをpdR とした（図１参照）。
【００１６】
プラスミドpdR のSV40初期プロモーター制御下にあるBamH I部位に、ヒトIL-6遺伝子 Hirano,T.,et al.,Nature,324,73(1986) に記載される19番目から 678番目までを含み、両端にBamH Iリンカーを付加したもの  を挿入し、得られたプラスミドをprIL-6とした（図１参照）。
DHFR遺伝子の欠損変異株である CHO細胞 DXB-11 Graf,L.H and Chasin,L.A.,Mol.Cell.Biol.,2,93(1982)  を、前記のプラスミドprIL-6を用いてリン酸カルシウム法により形質転換した。
【００１７】
核酸を含まないアルファMEM(GIBCO)でDHFR陽性細胞を選択し、葉酸アナログであるメトトレキセート（以下MTX と略記する) を添加した培地で選択を繰返すことにより、導入された遺伝子の増幅を行なった。 100nMもしくは50nM MTX耐性株を１％牛胎児血清を含むイスコフ培地(GIBCO) で３日間培養し、その培養上清を集め、これを原材料とした。
【００１８】
精製はゲル濾過および逆相クロマトグラフィーを用いて行なった。即ち培養上清をAmicon PM-10膜（アミコン社製）を用いた限外濾過法で約８倍に濃縮した後、150mM NaClおよび0.05％ Tween 20 を含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.４）溶液で平衡化したTSK-G3000SW(21.5mm×60cm, 東ソー製）に添加し、同緩衝液中、流速3.75ml／分で展開した。
【００１９】
分取した画分を抗IL-6抗体(Genzyme) で検出した結果、IL-6は保持時間42分〜50分で溶出された。IL-6を含む画分を集め、再度PM-10 膜で濃縮後、逆相−HPLCにかけた。0.１％トリフルオロ酢酸を含む35％アセトニトリルで平衡化したVydac protein C4カラム（バイダック社製)(4.６mm×25cm) に試料を注入後、流速１ml／分でアセトニトリル濃度を35％から80％まで0.５％／min の直線勾配で上げていき吸着蛋白質を溶出させた。
【００２０】
分取した画分を前述の抗体で検出した結果、IL-6はアセトニトリル濃度43％〜48％のところに溶出された。IL-6を含む画分に蒸留水を加え２倍に希釈した後、再度逆相−HPLCにかけ同一条件で溶出させ、精製IL-6を得た。
IL-6のＮ末端近傍のアミノ酸配列は、気相式プロテイン・シークエンサー470A型及びPTH アナライザー120 型のオンラインシステム（アブライド・バイオシステム社製）を用いて分析した。
【００２１】
その結果、組換え型ヒトIL-6のＮ末端アミノ酸配列は、天然型と同様Ala-Pro-Val-Pro-Pro-Gly-およびVal-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-の混合物であった（表２参照）。この不均一性は細胞のクローニングでは解消されず、ひとつの細胞が異なるＮ末端を持った混合物を産生していることがわかった。
参考例2. シグナルペプチドの置換(Alaで接続したもの) 
ヒトIL-6のＮ末端近傍をコードする遺伝子配列上にポリメレースチェインリアクション法により変異を導入し、新たにKpn I 部位を構築した（図２参照）。
【００２２】
即ち、以下に示す配列を持った合成プライマー(GGATCCATATGGTACCCCCAGGAGAAGATTCC,CGTCGACGGATCCGGTGCCCATGCTAC)および参考例１で述べたヒトIL-6遺伝子を含むプラスミドprIL-6を鋳型にして、GeneAmp kit 及びThermal Cycler( 宝酒造) を用いて変異を導入した断片を増幅した。
この断片をBamH I処理し、参考例１で述べたプラスミドpdR のBamH I部位にサブクローニングしたものを、プラスミドpTOMとした（図２参照）。
【００２３】
以下に示す配列を持った２本の合成オリゴヌクレオチドからなるものをリンカーＡとした(TGCACTCTGGACAGTGCAGGAAGCCGCCCCAGTAC, TGGGGCGGCTTCCTGCACTGTCCAGAG)。
プラスミドpTOMの Kpn I／Xho I 断片(6.0kb) 、ヒトG-CSF 遺伝子を含むプラスミドpV2DR1（特公平１−5395に記載されるもの。prIL-6とほぼ同じ構造) のXho I ／ApaL I断片(0.9Kb) および前記の合成リンカーＡをライゲーションさせ、得られたプラスミドをprIL-6GAとした（図２参照）。これはヒトG-CSF のシグナルペプチドにヒトIL-6のAla-Pro-Val-Pro-Pro-Gly-以降を接続したものである。
【００２４】
プラスミドprIL-6の代りにprIL-6GAを用いること以外は、参考例１の記載と同様の方法で解析を行なった。その結果、Ｎ末端アミノ酸配列は、依然Ala-Pro-Val-Pro-Pro-Gly-，Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-の混合物であった（表２参照）。
実施例1. シグナルペプチドの置換(Valで接続したもの) 
以下に示す配列を持った２本のオリゴヌクレオチドからなるものをリンカーＶとした(TGCACTCTGGACAGTGCAGGAAGCCGTAC. GGCTTCCTGCACTGTCCAGAG)。
【００２５】
前記の合成リンカーＶを用いること以外は、参考例２の記載と同様の方法でプラスミドprIL-6GVを得た（図２参照）。これはヒトG-CSF のシグナルペプチドにヒトIL-6のVal-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-以降を接続したものである。
プラスミドprIL-6の代りにprIL-6GVを用いること以外は、参考例１の記載と同様の方法で解析を行なった。その結果、Ｎ末端アミノ酸配列はVal-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-の単一物であった（表２参照）。また参考例１で得られたものと、糖鎖による修飾、生物活性において差は認められず、人為的改変による影響は全く無かった。
【００２６】
以上の結果を次の表２にまとめる。
【００２７】
【表２】
0003786433.tif 000003
【００２８】
実施例2.  ValをＮ末端とする組換型ヒトIL-6の糖鎖構造の解析
実施例１で得られた ValをＮ末端とする組換型ヒトIL-6を SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下SDS-PAGEと略す）と抗rhIL-6抗体を使用したWestern Blottingを行なったところ分子量24kDと28kDに相当する位置にバンドが検出され（図３、レーン２）、大腸菌由来の組換型ヒトIL-6(Amercham)（図３、レーン５；22kD）よりも分子量が大きいことがわかった。これは、天然型ヒトIL-6〔 Van Dammc J.,et.al,,J.Immunol.,140,1534(1988)〕と同様に糖鎖が結合しているためと考えられた。
【００２９】
そこで、結合している糖鎖を解析するため組換型ヒトIL-6をノイラミニダーゼ（生化学工業）、エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ(Boehringer Mannheim) 及びグリコペプチダーゼ−Ｆ(Boehringer Mannheim) で消化し、それぞれの処理による分子量の変化をSDS-PAGE及びWestern Blottingで調べた。結果は図３に示したように、ノイラミニダーゼとエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼで消化するとレーン３のように分子量の減少がみられ、これをさらにグリコペプチダーゼ−Ｆで消化するとレーン４にみられるように大腸菌由来の組換型ヒトIL-6と同一の分子量22kDに相当する単一のバンドとして検出された。
【００３０】
以上の結果をまとめると、１）エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの基質特異性(Galβ1-3GalNAc をSer またはThr から切断する）から、組換型ヒトIL-6には天然型ヒトIL-6と同様にGal β1-3GalNAc のコアにシアル酸が結合した形の糖鎖が結合している。２）一部の分子には天然型ヒトIL-6と同様にＮ−グリコシド型糖鎖も結合している。ということが明かとなった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によればＮ末端を Valとする均一な、糖鎖で修飾された組換え型ヒトIL-6が得られる。
【００３２】
【配列表】
0003786433.tif 000004
0003786433.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は天然型インターロイキン６のための発現プラスミドprIL-6の作製過程を示す。
【図２】図２はＮ末端が AlaであるヒトIL-6のための発現プラスミドprIL-6GA及びＮ末端が Valである本発明のヒトIL-6のための発現プラスミドprIL-6GVの作製過程を示す。
【図３】図３は本発明のヒトIL-6が糖鎖を有することを示す電気泳動図である。
【図１】
0003786433.tif 000006
【図２】
0003786433.tif 000007
【図３】
0003786433.tif 000008