(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オタネニンジン、トチバニンジン、アメリカニンジン、三七ニンジンを含めたパナックス属の薬用ニンジンの組織を、炭素源としての単糖類および／または２糖類を５０〜１５０ｇ／Ｌに調製したムラシゲ・スクーグ培地で培養することにより不定胚を増殖させ、増殖した不定胚を発芽させて苗を得ることを特徴とするパナックス属薬用ニンジン苗の大量生産方法。
【請求項２】
増殖した不定胚を、炭素源としての単糖類および／または２糖類を５〜２５ｇ／Ｌに調製したムラシゲ・スクーグ培地で発芽させる請求項１に記載のパナックス属薬用ニンジン苗の大量生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は組織培養によって、薬用ニンジンの苗を大量に得るための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
オタネニンジン（Panax ginseng C. A. Meyer ）、トチバニンジン（Panax japonicum C. A. Meyer ）、アメリカニンジン（Panax quinquefolium L.）、三七ニンジン（Panax notoginseng F. H. Chen）を含むパナックス属薬用ニンジンは、重要な薬用植物として栽培され、通常は種子により繁殖されている。特にオタネニンジンは古くから漢方薬、民間薬として広く用いられてきた生薬の一種で、最近では健康食品にも利用されるようになり、需要はますます伸びている。
【０００３】
しかし、生薬原料として用いられる薬用ニンジンは、通常収穫までに４年〜７年を要し、天候によっても生育が左右されやすく、また病害（ネグサレ病、タチガレ病、ハンテン病など）や害虫（ウドコブゾウムシ、ズイムシなど）による被害も多いため栽培には多大な労力を要している。従って、優良な品種の安定な保存と供給が望まれていたが、これらパナックス属植物は自殖性であり種子の採取までに３年を要するため、優良品種の苗を大量に得ることは困難なものとされていた。
【０００４】
そこで上記の問題を解決するために、オタネニンジンの根、茎、葉などの組織からオーキシン類及びサイトカイニン類を含有するカルス誘導培地を用いてカルスを誘導し、該カルスを増殖し、次いで該カルスを光照射下で再分化させる方法（特開昭６１−２１６６１９号公報）が提案されたが、地上部を誘導した後に根を誘導する過程が必要であるため手間がかかり、また発根の効率や幼苗の圃場での活着にも問題がある。さらに、再分化して得られる幼苗の数がカルスの量に依存し、またカルスは継代を繰り返すとかなりの割合で変異するので、１個体の植物から得られる正常なクローン苗の量に限界があるという欠点がある。
【０００５】
一方、これまでに食用ニンジンなど多くの植物において、種子と同様の形態変化の過程をとって成長する不定胚を誘導して幼苗を得る技術が多数報告されているが、薬用ニンジンにおいては既に根や子葉などからカルスを誘導し、さらに不定胚を誘導してこれを再分化させ幼苗を得る方法（W.C.Chang, Y. I. Hsing; THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, 57, 133,(1980)、特開昭６２−１５１１１７号公報、特開昭６３−２４８３２１号公報）が提案されている。
【０００６】
しかしこの方法では不定胚の誘導効率に問題があり、また培養開始から幼苗を得るまでに長期間を要するという欠点がある。さらに前述のカルスから光照射で再分化させる方法と同様カルスを経由するために、継代培養を繰り返すうちに不定胚形成能や再分化能が失われ、加えて変異も多発するために１個体から得られる正常なクローン苗の量に限界があるという欠点がある。そこでこれらの問題点を解決するために、花芽を材料に不定胚を誘導する方法（特公平２−５１５７３号公報）、及び不定胚からシュートを誘導し、これをマルチプルシュート化して増殖させる方法（特公平３−４４７２５号公報）などが提案されている。
【０００７】
ところで、通常不定胚は雑多な組織中において徐々に分化してくるため、他の組織から成熟不定胚だけを分離しなければ効率よく苗を生産することはできない。したがって、不定胚からの苗の大量生産を行うためには、１培養周期内でできるかぎり大量に、かつ同調的に成熟胚を得ることが必要である。既に食用ニンジンにおいては細胞塊の大きさをメッシュによって揃える方法（鎌田  博，原田  宏，「植物細胞組織培養」，理工学社，ｐ．９４，（１９７９））や、細胞塊の培地中の密度を調整する方法（第１２回植物組織培養学会  講演要旨集，ｐ．５３，（１９９１））などが同調的に不定胚を誘導する方法として提案されているが、薬用ニンジンに関してはそのような同調化の方法はまだ確立されていない。
【０００８】
また食用ニンジンなどでは、芽生えの茎頂を高濃度のサッカロースやマンニトールを含む培地で一時的に高浸透圧処理することにより、不定胚が誘導できるとの報告があるが（KAMADA H., KOBAYASHI K., KIYOSUE T., AND HARADA H., In Vitro Cell. Dev. Biol.,25,1163,(1989)）、薬用ニンジンにおいてはそのような方法、および条件は未だに確立されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、前述の問題点を解決しようとするものであり、同一の形質を持つ薬用ニンジンの苗を短期間に大量に提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前述の課題を解決すべくなされたものであり、オタネニンジン、トチバニンジン、アメリカニンジン、三七ニンジンを含めたパナックス属の薬用ニンジンの組織を水１リットルに炭素源４０〜２００ｇの割合で溶解したムラシゲ・スクーグ培地で培養することにより不定胚を増殖させ、増殖した不定胚を発芽させて苗を得ることを特徴とするパナックス属薬用ニンジン苗の大量生産方法を提供する。
【００１１】
本発明でいうパナックス属の薬用ニンジンとは、種子植物門、セリ目、ウコギ科、パナックス属に属する植物のうち薬用に供されるニンジンをいい、具体的にはオタネニンジン（Panax ginseng C. A. Meyer ）、トチバニンジン（Panax japonicum C. A. Meyer ）、アメリカニンジン（Panax quinquefolium L.) 、三七ニンジン（Panax notoginseng F. H. Chen）などがある。
【００１２】
本発明でいう不定胚とは、受精卵と同様な形態変化の過程をとって植物の体細胞から生ずる一種の胚で、胚様体（embryoid）ともいい、完全な植物体にまで発育しうる能力を有するものである（岩波書店刊「生物学辞典」第３版、１１２３頁（１９８３年）参照）。
【００１３】
本発明でいう炭素源とは、植物細胞に吸収利用される炭素化合物をいい、培養細胞においては通常糖類が用いられる。
【００１４】
本発明においては、不定胚は水１リットルに炭素源４０〜２００ｇの割合で溶解した培地で培養され増殖される。炭素源４０ｇ未満、２００ｇを超える培地では不定胚の増殖の効率が低下する。不定胚の増殖の効率と、不定胚形成組織の生育の面から水１リットルに炭素源５０〜１５０ｇの割合で溶解した培地がより好ましい。
【００１５】
本発明で用いる炭素源の種類は、糖類が好ましく、栄養源として利用されやすい単糖類および／または２糖類が好ましい。単糖類としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノースが例示され、２糖類としては、サッカロース、ラクトースが例示される。なお、マンニトールは栄養源として利用されにくいためこれを用いることは好ましくない。
【００１６】
本発明で用いる培地の支持材は、実施例３から明らかなようにゲランガムや寒天のようなゲル性の支持材と、セラミックファイバー、ロックウールなどの無機性ファイバーのいずれを使用しても有効である。
【００１７】
本発明で増殖された不定胚は、水１リットルに炭素源５〜３０ｇの割合で溶解した培地で培養し発芽させることが、発芽効率に優れるので好ましい。かかる培地で増殖した不定胚を６週間程度培養を続けることで地上部約３ｃｍ、地下部約３ｃｍの幼苗を得ることができる。
【００１８】
【作用】
本発明での不定胚増殖に対する詳細な作用は明らかではないが、組織の観察によれば従来用いていた炭素源濃度で培養した場合はマルチプルシュートが多量に形成され、また非常に低い頻度で不定胚が形成されても順次マルチプルシュート化するのに対して、本発明によれば、マルチプルシュートの形成がほとんどみられない。このことから推測すると、本発明の条件では従来の条件よりも不定胚形成の頻度が向上するばかりでなく、成熟胚の以後のステージへ分化が進行しにくいため、順次分化してくる不定胚が蓄積され結果的に大量の成熟胚が得られるものと考えられる。また、この効果は、サッカロースが低濃度域でほとんど不定胚増殖効果が認められないことと、マンニトールを用いた場合ではほとんど不定胚増殖効果が認められないことなどから、前述の高浸透圧による効果とは別の原理によるものと考えられる。
【００１９】
【実施例】
実施例１
水１リットルにサッカロースを３０ｇの割合で溶解し、これにカイネチンを１ｐｐｍ添加したムラシゲ・スクーグ培地（以下Ｋ１培地と略す）を準備した。Ｋ１培地を用いオタネニンジンの５年根を２０℃、5,000 ルクス、１４時間の光照射下で培養し、マルチプルシュートを誘導した。次いでセラミックファイバーを支持材とし、植物ホルモンを添加しないサッカロース濃度の異なるムラシゲ・スクーグ培地を準備した。この培地に上記マルチプルシュートを置床し、移植重量を測定後２０℃、5,000 ルクス、１４時間の光照射下で６週間培養を続けた。培養終了後不定胚数を計数し、移植重量１ｇあたりの不定胚形成数を算出した。この時の結果を表１に示した。表１から明らかなように本発明によるものは不定胚の形成数が極めて多い。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
実施例２
実施例１と同様のマルチプルシュートを、炭素源の種類および濃度を変えたほかは実施例１と同様にした培地に置床し、実施例１と同様の条件で５週間培養を続けた。培養終了後不定胚数を計数し、移植重量１ｇあたりの不定胚形成数を算出した。この時の結果を表２に示した。表２から、サッカロースと同様炭素源として利用されやすいグルコースでも高濃度にすると不定胚増量の効果がみられるが、炭素源として利用されにくいマンニトールでは、その効果がほとんどみられないことがわかった。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
実施例３
実施例１と同様のマルチプルシュートを、培地支持材をゲランガムに代えサッカロースの濃度を変えたほかは実施例１と同様にした培地に置床し、実施例１と同様の条件で５週間培養を続けた。培養終了後各サッカロース濃度について不定胚数を計数し、移植重量１ｇあたりの不定胚形成数を算出した。このときの結果を表３に示した。表３から、支持材をゲル状のものに変更しても、炭素源を高濃度にすることにより不定胚増量の効果がみられることがわかった。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
実施例４
実施例１と同様のマルチプルシュートを、サッカロースの濃度を変えほかは実施例１と同様にした培地に置床し、実施例１と同様の条件で６週間培養を続けて不定胚を得た。次いで、サッカロースの濃度を変えた培地に移植後、さらに６週間培養を続けた。培養終了後各サッカロース濃度で発芽した胚の数を計数し表４に示した。なお、表４から明らかなように、不含有の培地を除き不定胚の発芽が認められた。但し、観察の結果では、サッカロースの重量３０ｇの培地のものはマルチプルシュート化する苗が多く好ましくない。
なお、同表におけるＡ，Ｂは、水１リットルに対し、それぞれサッカロース６０ｇ、１００ｇの割合で溶解した培地で増殖した不定胚を用いた場合の発芽数である。
【００２６】
【表４】
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【００２７】
【発明の効果】
本発明はパナックス属薬用ニンジンの不定胚を大量増殖させることにより、効率よく苗を大量生産できるという優れた効果を有する他、材料としてマルチプルシュートを用いることにより、優良形質を遺伝的に安定に維持することができ、長期に渡って優良苗を供給できるという効果も認められる。