(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜８に示すアミノ酸配列のいずれかからなり、かつ骨形成作用を有するペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号９〜11に示すアミノ酸配列のいずれかからなる請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドを有効成分として含有することからなる骨形成促進剤。
【請求項４】
ペプチドが担体に固定化されてなる請求項３に記載の骨形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨形成作用を有する新規なペプチド及びこれを有効成分として含有することからなる骨形成促進剤に関する。
本発明のペプチドは骨形成作用を有し、骨折の治療、骨欠損部位への充填剤、骨粗鬆症や歯周病疾患における骨量減少の抑制、骨粗鬆症やリウマチ性関節炎における骨折の予防等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ＢＭＰ（Bone morphogenetic protein）はＴＧＦ（トランスフォーミング成長因子）βファミリーに属する蛋白質で（Wozney, J.M.ら、Science,242, 1528(1988) ）、活性型は分子量が約18kDのホモダイマ−として存在する。ＢＭＰは未分化な間葉系細胞に作用して、軟骨芽細胞と骨芽細胞を分化誘導し、軟骨および骨形成を引き起こす作用を有する（Wang, E. A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2220(1990)）。
このため、ＢＭＰは、骨折の治療、骨粗鬆症や歯周病疾患における骨量減少の抑制、骨粗鬆症やリウマチ性関節炎における骨折の予防等に有効であると期待されている（例えば、特開平6-298800号、特開平10-70989号公報参照）。
また、ＢＭＰと各種のマトリクスとを組み合わせた移植体及び組成物に関する発明が多数知られている（例えば、特開平6-296677号、特開平7-246235号、特開平7-116240号、特開平 7-88174号、特開平 10-151188号公報参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のＢＭＰは、生体内に投与しても数分内に血中から消失し、有効性が失われる。この点を補うために大量に投与すると、肝臓および腎臓に対する毒性など、種々の副作用が発現するおそれがある。また、上記のＢＭＰは、分子量が大きいことから免疫原性があり、反復投与によりアナフィラキシーショックを引き起こす恐れがある。さらに、ＢＭＰを脱灰骨やコラーゲンのマトリクスに含浸させて用いると、骨形成作用は発現されるが、これらのマトリクスに由来する抗原性や感染性の問題が新たに生じるおそれがある。
本発明の目的は、これらの副作用を軽減した、骨形成作用を有するペプチド及びこれを含有する骨形成促進剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、上記の目的は、配列表の配列番号１〜８に示すアミノ酸配列のいずれかを有するペプチドにより達成される。
また、本発明の目的は、上記ペプチドを含有することからなる骨形成促進剤により達成される。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、骨形成作用を有するかぎり、配列表の配列番号１〜８に示すアミノ酸配列と全く同一の配列を有する必要はない。すなわち、ペプチドが骨形成作用を有する範囲内で、これらの配列中の１もしくは数個のアミノ酸は、通常の遺伝子工学的な手法により欠失、置換もしくは付加されていてもよい。欠失、置換もしくは付加されていてもよいアミノ酸は、アミノ酸の種類、部位等により適宜選択することができる。
なお、この発明において「骨形成作用を有する」とは、骨芽細胞のアルカリホスファターゼの活性化を促し（山口朗、Molecular Medicine, Vol.30, N0.10, 1232 (1993)）、新生骨を形成するか、または既存の骨の成長を誘発する作用等としてとらえることができる。
【０００６】
本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
Ala ：L-アラニン残基
Asn ：L-アスパラギン残基
Cys ：L-システイン残基
Gln ：L-グルタミン残基
Glu ：L-グルタミン酸残基
Ile ：L-イソロイシン残基
Leu ：L-ロイシン残基
Lys ：L-リジン残基
Pro ：L-プロリン残基
Ser ：L-セリン残基
Thr ：L-トレオニン残基
Val ：L-バリン残基
Glx ：L-グルタミン残基またはL-グルタミン酸残基
Xaa ：各配列で定義するアミノ酸
また、本明細書においては、常法に従ってペプチドのアミノ酸配列を、そのＮ末端のアミノ基が左側に位置し、Ｃ末端のカルボキシル基が右側に位置するように記述する。
【０００７】
配列表の配列番号１〜８で示されるアミノ酸配列は、配列：−Ｙ１−Asn−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Pro−Lys−Ｙ５−Cys−Cys−Ｙ６−Pro−Thr−Ｙ７−Leu−Ｙ８−Ala−Ｙ９−
（式中、Ｙ１は Asn−Ser−Val および Ileよりなる群から選ばれるペプチド残基又はアミノ酸残基を表し；Ｙ２は Serおよび Pro−Glu よりなる群から選ばれるアミノ酸残基又はペプチド残基を表し；Ｙ３は Lys、Ser および Thrよりなる群から選ばれるアミノ酸残基を表し；Ｙ４は Ileおよび Valよりなる群から選ばれるアミノ酸残基を表し；Ｙ５は AlaおよびPro よりなる群から選ばれるアミノ酸残基を表し；Ｙ６は AlaおよびVal よりなる群から選ばれるアミノ酸残基を表し；Ｙ７は GluおよびGln よりなる群から選ばれるアミノ酸残基を表し；Ｙ８は Serおよび Asnよりなる群から選ばれるアミノ酸残基を表し；Ｙ９は Ileおよび Ile−Ser よりなる群から選ばれるアミノ酸残基又はペプチド残基を表す）によっても示すことができる。
【０００８】
本発明のペプチドは、ペプチドの合成において通常用いられる方法、例えば固相合成法または液相合成法によって製造されるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学（下）」（昭和62年５月20日  株式会社東京化学同人発行）、第 641-694頁、及び Atherton,E.ら、「固相ペプチド合成 -実用的な方法」 (1989年 IRLプレス、オックスフォード発行）、第 152-154頁参照〕。固相合成は、通常アミノ基を適当な保護基、例えば Boc(tert-ブトキシカルボニル）又は Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）のどちらか、またはそれらの組合せで保護して行うことができる。
【０００９】
本発明のペプチドの製造は、例えば、1)反応溶媒に不溶性の固相材料に、目的とするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸をそれが有するα-COOH基を介して結合させ、2)次いで該アミノ酸に目的とするペプチドのＮ末端の方向に向かって、対応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸またはペプチド断片が有するα-COOH基以外のα-アミノ基などの官能基を保護した上で縮合させて結合させ、3)該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけるα-アミノ基などのペプチド結合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作を順次繰り返すことによって、ペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成することができる。
このようにして形成したペプチド鎖は、固相材料から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去し、次いでこれを精製することによって、目的とするペプチドとして得ることができる。
【００１０】
ここで、固相材料としては、例えばスチレン-ジビニルベンゼン共重合体、メリーフィールド樹脂、クロロメチル樹脂、ウォン樹脂、シーバー樹脂、リンクアミド樹脂、リンクアシッド樹脂、2-クロロトリチルクロライド樹脂、 HMBA-MBHA樹脂、MBHA樹脂、オキシム樹脂等を用いることができる。これらのうち、好ましいのはスチレン-ジビニルベンゼン共重合体である。
また、固相材料からのペプチド鎖の脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸またはフッ化水素を用いて同時に行うのが、副反応を抑制する観点から好ましい。
ペプチド合成における溶媒及び縮合剤等は、当該分野で一般的に知られているものを適宜用いることができ、例えば溶媒としては DMF（ジメチルホルムアミド）、トリクロロエタノール、N-メチルピロリドン等を、縮合剤としては DCC、HATU（O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、HOBt（1-ヒドロキシベンゾトリアゾール）、HBTU（O-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、 PyBOP（ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、CF3-NO2-PyBOP 等を挙げることができる。
得られたペプチドの精製は、逆相液体クロマトグラフィ−で行うのが効果的である。
【００１１】
上記のように製造された本発明のペプチドのＮ末端あるいはＣ末端、またはそれらの両方は、化学的に適宜修飾されていてもよく、具体的には、例えばＮ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化されていてもよい。
また、本発明のペプチドは、通常の塩生成反応により、生理学的に許容される塩を形成していてもよい。そのような塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸などの無機酸、または乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマ−ル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、t-ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどのアミンとの塩などが挙げられる。
【００１２】
本発明により提供されるペプチドの代表例は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の具体例である配列番号９ならびに10に示すアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号８のアミノ酸配列の具体例である配列番号11に示すアミノ酸配列を有するペプチドであり、特に配列番号９〜11のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端がアミノ基、Ｃ末端がカルボキシル基であるペプチド及び配列番号９のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端がアセチル基、Ｃ末端がカルボキシル基のペプチドである。
これらのペプチドが、骨形成作用を有する範囲内で、欠失、置換もしくは付加されていてもよいことは上述のとおりである。
【００１３】
本発明のペプチドは、骨形成作用を有し、かつ細胞毒性及び全身急性毒性等の毒性の低いことが確認されている。また、本発明のペプチドを含有することからなる骨形成促進剤では、製造工程においてγ線や湿熱蒸気滅菌等の滅菌操作を施したり、抗原性の少ない多糖類からなる担体を選択したりすれば、マトリクスに由来する感染性や抗原性の問題が軽減される。
本発明のペプチドは、骨折の予防及び治療目的にそれ自体を単独で用いることができ、さらに薬理学的に許容される安定化剤、保存剤、増粘剤、可溶化剤等の種々の添加剤を含み得る適当な担体又は水溶性賦形剤に固定化、混合、溶解もしくは懸濁させて得られる骨形成促進剤として用いることができる。この発明の骨形成促進剤は、ペプチドを担体に固定化してなるものが、特に好ましい。
【００１４】
本発明のペプチドを固定化する担体は、生体との適合性を有するものであればよく、例えば各種のセラミックス、人工骨等のほか、アルギン酸の共有結合架橋ゲル（Suzuki, Y.ら、J. Biomed. Mater. Res., 39, 317(1998) ）、コラーゲンなどの蛋白質からなるゲル、ヒアルロン酸、硫酸カルシウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロキシアパタイト、リン酸トリカルシウム等のような生体内で分解、吸収され得る担体を１種又は組み合わせて用いることできる。これらの担体のうち、アルギン酸の共有結合架橋ゲル、ヒアルロン酸ゲルのような多糖類からなるゲルが、非炎症性と非免疫原性の観点から好ましい。
固定化方法は、特に制限されないが、共有結合、イオン結合、疎水結合、水素結合、ＳＳ結合等を形成するような固定化方法、例えば、ペプチド含有溶液を用いる浸漬、含浸、噴霧、塗布、滴下等の方法を採用することができる。これらの固定化方法のうち、安定性と作用の持続性の観点から、共有結合による固定化が好ましく、そのような固定化は、通常、酵素などの生理活性蛋白質の固定化に用いられる方法によって行うことができる（例えば、Scouten, W. H., Methods in Enzymol., 135, Mosbach, K. Ed., 1987, Academic Press, NY, pp30-65参照）。
固定化されるペプチドは、乾燥担体 100重量部に対して0.01〜50重量部程度が好ましい。このようにしてなる固定化されたペプチドは、通常、骨欠損部位等に埋植して、骨折の治療等に用いられる。
【００１５】
水溶性賦形剤としては、生理食塩水、マンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース等の生理学的に許容し得る溶液、好ましくは５％ブドウ糖液や生理食塩水を挙げることができる。
これらの製剤は、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、関節内投与、経皮投与または骨欠損部位への充填等により用いることができる。さらに、常法によりカプセル化またはリポソ−ム化すれば、経口投与も可能である。
【００１６】
したがって、本発明のペプチド及び骨形成促進剤は、リウマチ性関節炎や骨粗鬆症における骨折などの患者に投与するか、骨欠損部位に充填あるいは埋植して、骨折の治療を促進することができる。また、リウマチ性関節炎や骨粗鬆症、歯周病疾患の患者に投与することにより、骨量減少を抑制し、骨折を予防することができる。
有効成分としてのペプチドは、形成が望まれる骨の重量、骨損傷の部位、骨の状態、患者の年齢、性別、体重等によって適宜増減されるが、通常0.01μg/kg〜33mg/kg （成人）、好ましくは0.01μg/kg〜3.3mg/kg（成人）の量を一日一回投与することにより、有効性が発現される。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１
ペプチド自動合成装置を用いる固相合成法により、配列表の配列番号９のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端がアミノ基、Ｃ末端がカルボキシル基であるペプチドを合成した。
すなわち、4-(N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-L-イソロイシル）−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65mmol/g（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：99対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、HMP イソロイシン〕 0.1mmolを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。
結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製の N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-N↑β-トリチル-L-アスパラギン〔Fmocアスパラギン〕、 N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-O-t-ブチル-L-セリン〔Fmocセリン〕、 N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-バリン〔Fmocバリン〕、 N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-N↑ε-t-ブチルオキシカルボニル-L-リジン〔Fmocリジン〕、 N↑α-(フルオレニルメトキシカルボニル)-L-イソロイシン〔Fmocイソロイシン〕、 N↑α-(フルオレニルメトキシカルボニル)-L-プロリン〔Fmocプロリン〕、 n↑α-(フルオレニルメトキシカルボニル)-L-アラニン〔Fmocアラニン〕、 N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-S-トリチル-L-システイン〔Fmocシステイン〕、 N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-O-t-ブチル-L-トレオニン〔Fmocトレオニン〕、 N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-γ-ブチル-L-グルタミン酸〔Fmocグルタミン酸〕、 N↑α-(フルオレニルメトキシカルボニル)-L-ロイシン〔Fmocロイシン〕を、各結合ステップについてそれぞれ１mmolずつ用いた。
ペプチド合成の縮合剤及び添加剤には、HBTU及びHOBtを用いた。
【００１８】
得られたペプチド樹脂を、 2.5％の水と 2.5％のエタンジチオールを含むトリフルオロ酢酸10mlで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加え、生じた沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。トリフルオロ酢酸を0.05％の割合で含む水-アセトニトリル混合溶媒（アセトニトリル濃度を30分間で５容量％から50容量％に変化させた）を用い、粗生成物を逆相分取用高速液体クロマトグラフ〔カラム：日本ウォーターズ株式会社製ノバパック HR C18 25x100mm、RCM 25x10 加圧モジュ−ル付〕で精製した。
得られた精製ペプチドをファルマシアバイオテク株式会社製 AKTA explorer 10XT 〔カラム：ファルマシアバイオテク株式会社製μRPC C2/C18 ST4.6/100、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒（アセトニトリル濃度を30分間で５容量％から50容量％に変化させた）、流速0.5ml/分〕に付したところ、24.5分に単一のピ−クが示された。
FAB法マススペクトルによれば、精製ペプチドの分子量は2075であった（理論値：2074.45)。これにより、所望のペプチドが精製されたことが確認された。
【００１９】
実施例２〜４
配列表の配列番号９のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端がアセチル基、Ｃ末端がカルボキシル基であるペプチド（実施例２）、配列番号10の配列を有し、Ｎ末端がアミノ基、Ｃ末端がカルボキシル基であるペプチド（実施例３）、および配列番号11の配列を有し、Ｎ末端がアミノ基、Ｃ末端がカルボキシル基であるペプチド（実施例４）を、それぞれ実施例１と同様の方法で合成した。
【００２０】
実施例２においては、ペプチド自動合成装置で得られたペプチド樹脂を、20mlのジメチルホルムアミドに懸濁撹拌し、無水酢酸２mlとジイソプロピルエチルアミン26μlを加えて、さらに室温で４時間撹拌した。アセチル化されたペプチド樹脂をグラスフィルター上でメタノールでよく洗浄した後、減圧乾燥した。
【００２１】
実施例４では、4-(N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-O-t-ブチル-L-セリン)-オキシメチル-フェノキシ-メチル基を 0.65mmol/g （樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：99対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、HMP セリン〕 0.1mmolを用いた。
また、アミノ酸としては、実施例１で用いたものに加えて米国アプライド・バイオシステムズ社製の N↑α-9-(フルオレニルメトキシカルボニル)-N↑γ-トリチル-L-グルタミン〔Fmocグルタミン〕を使用した。
【００２２】
得られたそれぞれのペプチド樹脂について実施例１と同様にして脱保護と固相からの脱離を行い、粗生成物を精製した。それぞれの精製ペプチドについて、分析用高速液体クロマトグラフにおける溶出時間および FAB法マススペクトルによる分子量測定結果を表１にまとめて示す。
【００２３】
【表１】
0003786533.tif 000002
【００２４】
試験例１：ラット骨髄細胞のアルカリフォスファターゼ活性測定試験
−インビトロ
６週齢の雌性ラット(Lewis、日本 SLCにより購入）の大腿骨を無菌的に摘出した。大腿骨の両端を切断した後、21Ｇの注射針を付けた注射器を用いて、10％の牛胎児血清を含むイーグルの MEMで骨髄を遠心管の中に押し出した。骨髄をピペットでよく分散した後、40μｍのフィルターでろ過し、凝集塊を除去した。10％の牛胎児血清を含むイーグルの MEMで３回遠心洗浄(1200rpm、５分）した後、細胞数をカウントした。比較的大きな骨髄細胞が106/mlになるように、10％の牛胎児血清を含むアルファの MEMで希釈し、希釈液を10mlずつ培養面積が25cm2の培養用フラスコに分注し、５％CO2存在下、37℃で培養した。
培養開始から24時間後に、実施例１で得られたペプチドを含有する10％の牛胎児血清を含むアルファの MEMに培地交換した。その後、３日ごとに同様の培地交換を行った。
培養開始から１週間後に、増殖した細胞をアルカリフォスファターゼ染色キット（シグマ社製）を用いて染色した。
結果は、実施例１で得られたペプチドの代わりに、ヒトIL-1を 10ng/mlになるように加えた場合、および何も加えなかった場合と比較して、顕著なアルカリフォスファターゼ活性の増大を認めた。
実施例２〜４で得られたペプチドについて同様の試験を行った結果、実施例１で得られたペプチドと同様、顕著なアルカリフォスファターゼ活性の増大を認めた。
【００２５】
試験例２：ラット骨髄細胞のアルカリフォスファターゼ活性測定試験
−インビボ
６週齢の雌性ラット(Lewis、日本 SLCより購入）の腹腔内に、実施例１で得られたペプチド 500μgのリン酸塩緩衝溶液（PBS:10mM、 0.15Mの食塩を含む、pH 7.4）を１週間に３回投与した。一週間後、ラットの大腿骨を無菌的に摘出した。大腿骨の両端を切断した後、21Ｇの注射針を付けた注射器を用いて、10％の牛胎児血清を含むイーグルの MEMで骨髄を遠心管の中に押し出した。骨髄をピペットでよく分散した後、40μｍのフィルターでろ過し、凝集塊を除去した。10％の牛胎児血清を含むイーグルの MEMで３回遠心洗浄(1200rpm、５分）した後、細胞数をカウントした。比較的大きな骨髄細胞が106/mlになるように、10％の牛胎児血清を含むアルファの MEMで希釈し、希釈液を１mlずつ培養用の24穴プレートに分注し、５％CO2存在下、37℃で培養した。
培養開始から24時間後に、10％の牛胎児血清を含むアルファの MEMに培地交換した。その後、３日ごとに同様の培地交換を行った。
培養開始から１週間後に培養上清を除去し、PBS で１回洗浄した。24穴プレートの各ウェルに、１mlの１％トリトン X-100を含むトリス緩衝溶液（20mM、pH 8.5）を加えて、30分間静置して細胞を溶解した。
細胞溶解液 100μlに対し、7.5mM のp-ニトロフェニルフォスフェイトを含むトリス緩衝溶液（1.5M、１mMのZnCl2と１mMのMgCl2を含む、pH 8.5)100μl を加えて、 405nmの吸光度の増加を測定し、細胞溶解液中のアルカリフォスファターゼ活性をもとめた。また、細胞溶解液の蛋白質濃度を、 BCAアッセイキット（ピアス社製）を用いて求めた。
この結果、実施例１で得られたペプチドを投与したラットのアルカリフォスファターゼ活性は、 6.3±1.4μmol/分・mg蛋白であった。これに対して、実施例１で得られたペプチドの代わりに PBSのみを投与したラットでは 3.2±1.1 μmol/分・mg蛋白であり、実施例１に示すペプチドは顕著なアルカリフォスファターゼ活性の増大をもたらした。
【００２６】
実施例５
10mlのメタノールに溶解した0.6g(10mmol)のエチレンジアミン(EDA、和光純薬工業株式会社）を、2.3g(20mmol)のN-ヒドロキシコハク酸イミド（HOSu、（株）ペプチド研究所）を溶解した 150mlのメタノールに室温で撹拌しながら滴下した。滴下終了後、さらに１時間撹拌を続けた。析出した結晶を濾取し、減圧下に乾燥して2.6g（収率約90％）のエチレンジアミン 2N-ヒドロキシコハク酸イミド塩(EDA・2HOSu)を得た。
アルギン酸ナトリウム（フナコシ株式会社、粘度 550cp、M/G 比 1.0）の１重量％水溶液30mlに、66mgの EDA・2HOSu と 0.48gの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（WSCD・HCl、（株）ペプチド研究所）を溶解して、10cm×10cmのテフロン被覆アルミ製トレイに流延し、25℃で48時間静置して、アルギン酸の共有結合架橋ゲルを得た。
これを、2.5mM のCaCl2と 143mMのNaClを溶解した注射用精製水（大塚製薬）で十分に洗浄し、その後注射用精製水のみで洗浄した。洗浄後のアルギン酸ゲルを凍結乾燥して、白色のスポンジ状ゲルを得た。
得られたスポンジ状ゲルの0.1gをジメチルホルムアミド20mlに浸漬し、12mgのN-ヒドロキシコハク酸イミドと19mgのWSCD・HClを加えて、室温で一晩振盪した。スポンジ状ゲルをメタノールとジメチルホルムアミドでよく洗浄した後、実施例１で得られたペプチド20mgを含むジメチルホルムアミド溶液10mlを加えて、室温で一晩振盪した。メタノールとエタノールでよく洗浄して、実施例１で得られたペプチドが固定化された骨形成促進剤を得た。
【００２７】
試験例３：ラット筋肉内埋植試験
実施例５で得られた骨形成促進剤の 0.01gを、６週齢の雌性SDラット（日本SLC)の大腿部筋肉内に埋植した。３週間後に埋植部を含む周辺組織を取り出して、組織染色（「臨床検査技術学」菅野剛史、松田信義編、▲５▼病理学・病理組織細胞学、医学書院、1991年）を行った。
その結果、von Kossa 染色において埋植部位にCaの沈着が認められた。比較として、同ラットの反対側にペプチドを固定化しないスポンジ状ゲルを埋植した部位には、von Kossa 染色においてCaの沈着は全く認められなかった。
【００２８】
試験例４：イヌ骨欠損部位埋植試験
実施例５で得られた骨形成促進剤の0.07g を、６カ月齢の雌性ビーグル犬（日本SLC)の下顎骨に人為的に作製した直径７mmの骨欠損部位に埋植した。埋植後２週間目に、埋植部位を含む組織を取り出して組織染色を行った結果、明らかに新生骨の形成を認めた。比較として、同ビーグル犬の反対側にペプチドを固定化しないスポンジ状ゲルを埋植した部位には、新生骨は全く認められなかった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、骨形成作用を有し、かつ細胞毒性など、種々の副作用が軽減されたペプチド及びこれを有効成分として含有する骨形成促進剤が提供される。これらのペプチド及び骨形成促進剤は、骨折の治療、骨欠損部位への充填、骨粗鬆症や歯周病疾患における骨量減少の抑制、骨粗鬆症やリウマチ性関節炎における骨折の予防等に有用である。
【００３０】
【配列表フリーテキスト】
以下の配列表の配列番号１〜８に記載する「Xaa」は、各配列で定義されるアミノ酸を意味する。
配列番号１及び２において、存在位置６の Xaaは Lys、Ser 又はThr のいずれかであり、存在位置７の Xaaは Ile又は Val、存在位置10の Xaaは Ala又は Pro、存在位置13の Xaaは Ala又は Val、存在位置18の Xaaは Ser又は Asnのアミノ酸を示す。
配列番号３及び４において、存在位置７の Xaaは Lys、Ser 又はThr のいずれかであり、存在位置８の Xaaは Ile又は Val、存在位置11の Xaaは Ala又は Pro、存在位置14の Xaaは Ala又は Val、存在位置19の Xaaは Ser又は Asnのアミノ酸を示す。
配列番号５及び６において、存在位置４の Xaaは Lys、Ser 又はThr のいずれかであり、存在位置５の Xaaは Ile又は Val、存在位置８の Xaaは Ala又は Pro、存在位置11の Xaaは Ala又は Val、存在位置16の Xaaは Ser又は Asnのアミノ酸を示す。
配列番号７及び８において、存在位置５の Xaaは Lys、Ser 又はThr のいずれかであり、存在位置６の Xaaは Ile又は Val、存在位置９の Xaaは Ala又は Pro、存在位置12の Xaaは Ala又は Val、存在位置17の Xaaは Ser又は Asnのアミノ酸を示す。
【００３１】
【配列表】
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