(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式  化１
【化１】
0003855329.tif 000013
（式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）
で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の一般式  化１で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼをコードし、かつ、下記の（１）〜（３）のいずれかの塩基配列を含むことを特徴とするエステラーゼ遺伝子。
（１）配列番号１で示される塩基配列とのホモロジーが９０％以上である塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
【請求項２】
エステラーゼ遺伝子が、E.coli JM109/pAL612株（FERM-BP 5740として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された形質転換体微生物）に含有されるプラスミドに組み込まれたＤＮＡの塩基配列を含むことを特徴とする請求項１記載のエステラーゼ遺伝子。
【請求項３】
配列番号１で示される塩基配列とのホモロジーが９０％以上である塩基配列を含むことを特徴とする請求項１記載のエステラーゼ遺伝子。
【請求項４】
配列番号１で示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項１記載のエステラーゼ遺伝子。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を含有することを特徴とするプラスミド。
【請求項６】
請求項５記載のプラスミドにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
形質転換体が微生物であることを特徴とする請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むことを特徴とするエステラーゼ。
【請求項９】
請求項３記載のエステラーゼ遺伝子の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項８記載のエステラーゼ。
【請求項１０】
請求項６記載の形質転換体を培養することにより、一般式  化２
【化２】
0003855329.tif 000014
（式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）
で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の一般式  化２で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼを産生することを特徴とするエステラーゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項８記載のエステラーゼを一般式  化３
【化３】
0003855329.tif 000015
（式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）
で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用させて、該エステルを不斉加水分解して、（Ｒ）−体の一般式  化３で示されるシクロペンテノロン類とその対掌体のエステルとに分割することを特徴とする一般式 化３で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法。
【請求項１２】
一般式  化３で示されるシクロペンテノロン類が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンであることを特徴とする請求項１１記載の光学分割方法。
【請求項１３】
一般式  化３で示されるシクロペンテノロン類が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オンであることを特徴とする請求項１１記載の光学分割方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エステラーゼ遺伝子及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般式  化４
【０００３】
【化４】
0003855329.tif 000002
【０００４】
（式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）
で示されるシクロペンテノロン類は、医薬や農薬等の中間体として重要である。
このシクロペンテノン類は、優れた殺虫活性を有するいわゆる合成ピレスロイドと呼ばれる一群のエステル系化合物の重要なアルコール成分として有用であり、また医薬であるプロスタグランジン誘導体の中間体としても有用である。
例えば、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オンの２、２、３、３−テトラメチルシクロプロパンカルボン酸とのエステルである下記式  化５で示される化合物は極めて強いノックダウン効力及び致死効力を有する優れた殺虫剤である（例えば、特公昭５０−１５８４３）。
【０００５】
【化５】
0003855329.tif 000003
【０００６】
一般式  化４で示されるシクロペンテノロン類は、その４位に不斉炭素を有するために２種の光学異性体が存在する。該光学異性体をアルコール成分として有する合成ピレスロイドにおいては、そのアルコール成分における光学異性の差によって殺虫効果に大きな差を生じることが知られており、例えば、上記一般式  化５で示される化合物において、（Ｓ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オンからなるエステルは、対応する（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オンからなるエステルに比し、その殺虫効力が数倍優れていることが明らかになっている。
また、同様に光学活性な４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノン、４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニルヘキシル）−２−シクロペンテノン及び４−ヒドロキシ−２−（２−プロペニル）−２−シクロペンテノン等は、医薬であるプロスタグランジン誘導体の中間体として有用である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このため、医薬や農薬等の中間体である一般式  化４で示されるシクロペンテノロン類の光学異性体を工業的にも有利に分離取得する方法の開発が望まれており、また、そのために、例えば、該シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用して、これを不斉加水分解する能力を有する優れたエステラーゼを産生する微生物を遺伝子工学的手法により作製するために、上記のようなエステラーゼをコードする遺伝子の探索も強く望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは、シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用して、これを不斉加水分解し、高い光学純度の（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼ遺伝子を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１）一般式  化６
【０００９】
【化６】
0003855329.tif 000004
【００１０】
（式中、Ｒ1は水素又はメチル基、Ｒ2は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個のアルキニル基、炭素原子１〜４個のハロアルキル基、末端のヒドロキシ基が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素基、又は、末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基を表す）
で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼをコードし、かつ、配列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズすることを特徴とするエステラーゼ遺伝子（以下、本発明遺伝子と記す。）、
２）配列番号１で示される塩基配列とのホモロジーが９０％以上であることを特徴とする前項１記載のエステラーゼ遺伝子。
３）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とする前項１記載のエステラーゼ遺伝子、
４）配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴とする前項１記載のエステラーゼ遺伝子、
５）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を含有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明プラスミドと記す。）、
６）前項５記載のプラスミドにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記す。）、
７）形質転換体が微生物であることを特徴とする前項６記載の形質転換体、
８）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を有する微生物が産生することを特徴とするエステラーゼ（以下、本発明エステラーゼと記す。）、
９）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を有する微生物が前項６記載の形質転換体であることを特徴とする前項８記載のエステラーゼ、
１０）前項６記載の形質転換体を培養することにより、一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼを産生することを特徴とするエステラーゼの製造方法（以下、本発明製造方法と記す。）、
１１）前項８記載のエステラーゼを一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用させて、該エステルを不斉加水分解して、（Ｒ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類とその対掌体のエステルとに分割することを特徴とする一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法（以下、本発明光学分割方法と記す。）、
１２）一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載の光学分割方法、
１３）一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載の光学分割方法、
を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明遺伝子は、一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼをコードし、かつ、配列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズするエステラーゼ遺伝子である。尚、本発明でいうエステラーゼとは、リパーゼを含む広義のエステラーゼを意味している。
ここで一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力とは、例えば、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−メチルシクロペントー２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−エチル−２−シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）−２−シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２、４−ペンタジエニル）−２−シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（１−メチル−２−プロピニル）−２−シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（１−メチル−２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２，２，２−トリフルオロエチル）シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−２−（７−アセトキシヘプチル）−２−シクロペンテノン、４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノン、４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニルヘキシル）−２−シクロペンテノン、４−ヒドロキシ−２−（２−プロペニル）−２−シクロペンテノン等のシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、対応する（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類を産生する能力を意味する。
一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類において、
Ｒ2で示される炭素原子１〜１０個のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、ペンチル基、ヘプチル基、デシル基等をあげることができ、
炭素原子２〜１０個のアルケニル基としては、例えば、２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２，４−ペンタジエニル基、２−ヘプテニル基、２−デセニル基等をあげることができ、
炭素原子２〜１０個のアルキニル基としては、例えば、２−プロピニル基、１−メチル−２−プロピニル基、２ーヘプチニル基、２ーデシニル基等をあげることができ、
炭素原子１〜４個のハロアルキル基としては、例えば、２，２，２，−トリフルオロエチル基、４，４，４−トリフルオロブチル基等をあげることができ、
末端のヒドロキシ基が保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素基としては、末端のヒドロキシ基が、例えば、アルキル基、アルコキシアルキル基等により保護されてもよい炭素原子５〜９個のヒドロキシ脂肪族炭化水素基であり、なかでもその脂肪族炭化水素が直鎖飽和脂肪族炭化水素である置換基を好ましくあげることができる。例えば、７−アセトキシペンチル基、７−ヒドロキシペンチル基、７−アセトキシヘプチル基、７−ヒドロキシヘプチル基、１０−ヒドロキシノニル基等をあげることができる。
末端のカルボキシル基が保護されてもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基としては、末端のカルボキシル基が、例えば、アルキル基等により保護されてもよい炭素原子５〜９個の脂肪酸基であり、なかでもその脂肪酸が直鎖飽和脂肪酸である置換基を好ましくあげることができる。例えば、６−メトキシカルボニルヘキシル基、８−メトキシカルボニルオクチル基等をあげることができる。
尚、前記有機カルボン酸エステルに於いて、有機カルボン酸としては、例えば、炭素原子１〜１８個の飽和又は不飽和の脂肪酸、ピレスロイド酸等をあげることができる。
【００１２】
また、「配列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズする」遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、例えば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９、農村文化社発行）等に記載されるサザンハイブリダイゼーション方法によって視覚的に検出可能であるような遺伝子を意味し、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ又はそのＤＮＡにおける１若しくは複数の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列からなるＤＮＡ等である。例えば、95℃、1分という条件の熱処理や、0．5M NaOH、1．5M NaClという条件のアルカリ処理により、二本鎖からなるDNAを相補的な一本鎖DNAに解離させた後、例えば、氷上に1分放置するという条件の放熱や0．5M Tris・HCl（pH7．0）、3．0M NaClという条件の中和処理により前記一本鎖DNAに対して相補性を有する一本鎖DNAや一本鎖RNAを会合させ、再び二本鎖状態（ハイブリダイズした状態）になり、このようなＤＮＡは、通常、配列番号１で示される塩基配列と高いホモロジー（活性部位や構造等に強く関与する領域か否かによっても異なるが、例えば、全体として９０％程度以上のホモロジー）を有するような塩基配列を有する遺伝子である。
ホモロジーは、PearsonとLipmanが開発したホモロジー検索プログラムを用いて計算することができる（Pearson and Lipman, (1988), Proc.Natl.Academic.Sci USA, 85, 2444）。また、Genetyx-Mac（ソフトウエア開発（株）製）に含まれているこのプログラムを用いても計算することができる。また、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のWorldWideWebサービスにあるホモロジーサーチ・プログラム(fasta)を用いることもできる。
このような本発明遺伝子のより具体的な例としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するエステラーゼ遺伝子をあげることができる。もちろん、配列番号１で示される塩基配列を有するエステラーゼ遺伝子も本発明遺伝子としてあげることができる。
【００１３】
本発明遺伝子は、例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法（例えば、「新  細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記載される方法）によって調製された染色体DNAを鋳型とし、かつ配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡの一部（例えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと配列番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合わせ、または、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合わせ）をプライマーとして用いるＰＣＲ法により取得することができる。
また、例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法（例えば、「新  細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記載される方法）によって調製された染色体DNAをラムダファージやプラスミドなどに挿入して作成された遺伝子ライブラリーを、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは配列番号１に示される塩基配列に含まれる15塩基以上のDNA断片をプローブとして、コロニーハイブリダーゼーションや、プラークハイブリダイゼーションなどの方法によっても取得することができる。
本発明遺伝子が調製される微生物としては、上記の微生物の中でもバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）を特に好ましくあげることができ、さらに具体的にはBurkholderia cepacia SC-20株があげられる。
尚、上記にあるBurkholderia cepacia SC-20株は、本発明者が自然界から見出した微生物であり、下記の菌学的性質を有する（表１及び２）。
【００１４】
【表１】
0003855329.tif 000005
【００１５】
【表２】
0003855329.tif 000006
【００１６】
以上の菌学的性質を、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第１巻（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984))、バージェイズ・マニュアル・オブ・デタミネティブ・バクテリオロジー第９版（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,Ninth edition(1994))、ZhaoらのInt. J. Syst. Bacteriol. 45,p.600,(1995)及びYabuuchiらのMicrobiol. Immunol.,36,p.1251,(1992)の記載と対比すると、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）と一致している。
【００１７】
また、鋳型としてE.coli JM109/pAL612株の菌体から調製したDNAを用い、かつプライマーとして配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡの一部（例えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと配列番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合わせ、または、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合わせ）を用いるＰＣＲ法により取得することができる。
尚、上記にあるE.coli JM109/pAL612株は、本発明遺伝子を含有するプラスミドpAL612（本発明プラスミド）をエシェリヒア・コリ(Escherchia coli）JM109株に導入した形質転換体微生物（本発明形質転換体）は、FERM-BP 5740として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託（受理日：平成８年１１月７日）されている。
【００１８】
取得された本発明遺伝子を、例えば、形質転換させる宿主細胞において通常用いられるベクタ−に通常の遺伝子工学的手法を用いて組み込むことにより本発明プラスミドを容易に構築できる。具体的には、例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、用いるベクターとしては、pUC119（宝酒造（株）製）、pBluescriptII （ストラタジーン クローニング システム製）等をあげることができる。
構築された本発明プラスミドにより宿主細胞を形質転換させる方法は、形質転換させる宿主細胞に応じて通常用いられる方法であればよく、例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される通常の方法をあげることができる。
尚、形質転換体を選抜するには、例えば、まず本発明プラスミドにより形質転換させた宿主細胞をトリブチリン含有ＬＢプレートで培養し、クリアゾーンを形成するものを選択する。次に選択された形質転換体を培養して得られた培養物を、一般式  化６に示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用させ、反応生成物を分析することにより、（Ｒ）−体の一般式  化６に示されるシクロペンテノロン類を高い光学純度で生成する形質転換体を選抜すればよい。
より具体的には、例えば、（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステル0.5gと50mMリン酸緩衝液(pH7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に入れ、撹拌子で撹拌させながら40℃、10分間予熱する。これに1.0mlの上記培養物を加え、撹拌子で撹拌させながら40℃で反応を行う。30分間後、該反応液を50μlを回収し、1mlのエタノールを添加することにより反応を停止する。ブランクは、培養物の代わりに精製水を用いて同様な方法で試験する。分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測する。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度150℃、インジェクション温度170℃、ディテクション温度170℃、検出器はFIDの条件で、GC-14A（（株）島津製作所製）を用いて分析する。酵素力価は、1分間に、1μmolの（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンを遊離する酵素量を1unitとする。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により，（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンの光学純度を測定する。分析には、（株）住化分析センター製OA-4100 (4.0mmI.D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用する。溶出液は、Hexane と1,2-dichloroethane とethanol を100:20:1の割合で混合したものを用いることができる。流速は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光学異性体比を分析すればよい。
さらに詳細に、選抜された形質転換体から該形質転換体が保有するプラスミドを調製した後、調製されたプラスミドについて、例えば「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される通常の方法によリ制限酵素地図を作製し、目的とする本発明遺伝子が含まれているか否かを、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等の方法で確認することもできる。
【００１９】
このようにして本発明形質転換体を得て、該形質転換体を培養することにより本発明エステラーゼを産生させることができる（本発明製造方法）。
形質転換体が微生物である場合、該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養される。炭素源としては、グルコース、グリセロール、デキストリン、シュークロース、有機酸、動植物油、糖蜜等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、硝酸ナトリウム、尿素などの有機または無機窒素源等が挙げられる。有機ないし無機塩としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸物、酢酸塩、炭酸塩類およびリン酸塩類、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素一カリウム、リン酸水素二カリウム等を挙げることができる。
さらに、オリーブ油等のトリグリセライドを培地に添加することが好ましい。添加量としては、例えば、培地100ml に対して、約10mg〜約10g程度をあげることができる。
培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter ）培養、培養タンク等）いずれも可能である。特に、ジャーファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液量の約0.1 〜約2 倍/ 分の通気条件を用いる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、約15℃〜約40℃の範囲の培養温度、約6.0〜約8.0の培地pHで培養することが好ましい。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約1〜約5日間が望ましい。
【００２０】
本発明エステラーゼは、
１）分子量（SDS-PAGE）約３．８万ダルトンであり、
２）等電点（pI）６．０であり、
３）至適温度は約６０℃で、少なくとも約２０℃〜約７０℃程度、好ましくは約３０℃〜約４０℃程度の範囲において反応可能であり、
４）ｐＨ約４〜約９程度、好ましくはｐＨ約５〜約７程度の範囲において反応可能であり、
５）一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力を有し、
６）例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する微生物（特に好ましい微生物としては、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、さらに具体的にはBurkholderia cepacia SC-20株等の非形質転換体を培養することにより得ることもできる。もちろん、前記の如く本発明遺伝子を含有するプラスミドにより形質転換された形質転換体を培養することによっても得ることができる。
本発明エステラーゼは、それ自体を含有する培養物の形で酵素反応に利用してもよいが、該培養物から分離して粗酵素や精製酵素等の形で酵素反応に利用してもよい。このような分離の方法としては、例えば、超音波処理、ガラスビーズやアルミナを用いる磨砕処理、フレンチプレス処理、リゾチーム等の酵素処理等により菌体を破砕し、得られた破砕物から硫安などを用いる塩析、有機溶媒やポリエチレングリコール等の有機ポリマーによる沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、電気泳動等により分画する通常の方法をあげることができる。必要に応じて、これらの方法を組み合わせて用いることができる。
さらにまた、本発明エステラーゼを共有結合、イオン結合、吸着などにより担体に結合させる担体結合法、高分子の網目構造のなかに閉じ込める包括法等の固定化の方法によって不溶化し、容易に分離可能な状態に加工した固定化物の形で酵素反応に利用することもできる。
【００２１】
本発明エステラーゼは、例えば、一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法に利用できる。即ち、本発明エステラーゼを、一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用させて、該エステルを不斉加水分解して、（Ｒ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類とその対掌体である（Ｓ）−体のエステルとに分割する方法に利用でき、かかる分割方法に於いて、通常は、ラセミのエステルが原料として用いられる。
具体的には、例えば、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノン、４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニルヘキシル）−２−シクロペンテノン又は４−ヒドロキシ−２−（２−プロペニル）−２−シクロペンテノンをあげることができる。
反応温度は、例えば、約20℃〜約70℃、好ましくは、約30℃〜約40℃を、反応pHは、例えば約4〜約9、好ましくは、約5〜約7を、反応時間は、例えば、約5分間〜約96時間を挙げることができる。
反応液からの（Ｒ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類とその対掌体のエステルの回収は、一般に知られている任意の方法で行うことができる。例えば、溶媒抽出、分別蒸留、カラムクロマトグラフィーなどの操作を、適宜採用することができる。具体的には、反応液をエーテル、酢酸エチル、ベンゼンなどの有機溶媒で抽出し、この抽出物を分別蒸留し、（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類とその対掌体のエステルを分離取得するか、抽出物をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、分離し、抽出することによっても得ることができる。このようにして、所望の合成ピレスロイドやプロスタグランジン誘導体を取得することができる。
また、このようにして、回収した上記の（Ｒ）−体のシクロペンテノロン類は、目的に応じて、そのままで、または、これを、例えば、特開昭５２−１５６８４０号公報、特公平４−５０１９号公報、特公平５−３６４２９号公報等に記載の方法に準じて、一旦トシル化又はメシル化した後、加水分解することにより光学的に反転させ、対応する対掌体に変換し、合成ピレスロイドのアルコール中間体やプロスタグランジン誘導体の中間体として重要である（Ｓ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類に容易に導くことができる。そしてここで得られたシクロペンテノロン類を例えばエステル化することにより、所望の合成ピレスロイドやプロスタグランジン誘導体を製造することができる。
一方、不斉水解反応に於いて残存する（Ｓ）−体のエステルは、そのまま、もしくは、これを一旦加水分解するか、または特公平５−７９６５６号公報の記載に準じて、不斉水解反応後の反応生成物のまま、トシル化またはメシル化反応に付した後、加水分解することにより、（Ｓ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類に導くことができ、これを前記と同様に例えばエステル化することにより、所望の合成ピレスロイドやプロスタグランジン誘導体を製造することができる。
このように本発明により、一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類からなる有機カルボン酸エステルを最終的にはすべて（Ｓ）−体の一般式  化６で示されるシクロペンテノロン類からなる有機カルボン酸エステルに変換することも可能になり、本発明は工業的にもきわめて有効な方法である。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  （染色体DNA の調製）
バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia) SC-20株 を、LB培地（Bacto tryptone(Difco Laboratories Incorporated製） 10g、Bacto yeast extract(Difco Laboratories Incorporated 社製） 5g、NaCl 5g/ L、以下LB培地と略)で、30℃、12時間培養した後、遠心分離（6000rpm 、10min ）により集菌し、菌体を回収した。
回収された菌体を1mg/mlの塩化リゾチーム（生化学工業（株）製）、25μg/mlのRNaseA（シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）製）を含むTEN溶液（10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA-NaOH(pH8.0) 、10mM NaCl 、以下TENと略）に懸濁し、３７℃、20分間インキュベートした。その後、終濃度が1%(w/v）になるようにドデシル硫酸ナトリウム を加え、55℃、10分間インキュベートした。次に、等量のTE［10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA(pH8.0)］飽和フェノールを加え、ゆっくりとかき混ぜた後、遠心分離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収した。回収された上層に、等量のTE飽和フェノール・クロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混ぜた後、遠心分離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収した。回収された上層に、1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム溶液を加えた後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるDNAをガラス棒で巻き取った。このDNA を70% (v/v）エタノールでリンスし、次に80% (v/v）エタノール、100%エタノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA を、25μg/mlのRNaseA（シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）製）、20μg/mlのPrteinase K （ベーリンガー・マンハイム（株）製）を含むTEN溶液に懸濁し、37℃、12時間インキュベートした。これに、等量のTE飽和フェノール・クロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混ぜた後、遠心分離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収した。1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム液を加えた後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるＤＮＡをガラス棒で巻き取った。このＤＮＡを70% (v/v）エタノールでリンスし、次に80% (v/v）エタノール、100%エタノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA を、25μg/mlのRNaseAを加えた10mlTE溶液に溶解した後、2LのTE溶液に対して２回透析を行った。このようにして100ml の培養液から約1.6mg の染色体DNA を得た。
【００２４】
実施例２  （染色体DNA ライブラリの作製）
得られた染色体50μg を制限酵素EcoRIで37℃、1 時間分解し、アガロース電気泳動（0.7%濃度）を行った。9.4kb から6.6kb までの大きさのDNA画分と 7.5bから5.5kb までの大きさのDNA画分をアガロースゲルから切り出し、GeneClean（BIO101社製）で精製した。
精製されたDNA画分とλZAPII DNA （スタラタジーン  クローニング  システム製）を、キット付属の説明書に従い、DNA リガーゼを用い結合した。結合したDNA は、ギガパックゴールドパッケージングキット（スタラタジーン  クローニング  システム製）を用いて、キット付属の説明書に従い、λ粒子中にインビトロ・パッケージングをした。
【００２５】
実施例３  （プローブDNA の作製）
（１）エステラーゼ酵素の精製
土壌から単離したバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)SC-20株を培地（大豆粉抽出液100ml、、コーンスチープリカー 1g、ダイズ油 5g）で、30℃、48時間培養した。尚、大豆粉抽出液は、大豆粉10gに0.3% NaOHを250ml加え、70℃で１時間加熱し、ろ紙でろ過することにより調製された。培養終了後、遠心分離(14,000 rpm 、20min ）により上清を回収した。回収された上清液にエタノールを濃度が80%になるまで加えた後、再び遠心分離(14,000 rpm 、20min）により沈殿を回収した。
沈殿を乾燥後、５０mMリン酸緩衝液（pH7.0)で懸濁し、硫安濃度が20%から60%において沈殿する画分を回収した。
回収した画分を20mM Tris-HCl(pH8.0)溶液 5mlに懸濁し、該懸濁を20mM Tris-HCl (pH8.0)溶液で平衡化したDEAE-Sepharose FastFlowカラム（2.6 x 5cm、ファルマシバイオテク（株）製）にチャージした後、20mM Tris-HCl(pH8.0)溶液で十分に洗浄した。洗浄後、0Mから0.5MのNaClの濃度勾配溶出により目的とする蛋白質を溶出し、活性画分を得た。得られた活性画分を10mM Tris-HCl(pH7.5)溶液で平衡化したDEAE-Sepharose FastFlowカラム（2.6 x 5cm、ファルマシバイオテク（株）製）を用いた上記同様の操作により精製を行い、再び活性画分を得た。得られた活性画分は、150mM NaClを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.5)とで平衡化したSuperose12 HR10/30カラム（ファルマシア社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。
得られた活性画分（メインピーク）は、（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンを産生する能力を有した。また、（ＲＳ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オンを産生する能力を有した。尚、該活性画分を、SDS 電気泳動［PhastGel Gradient 10-15 とPhastGel SDS buffer stripを用いた自動電気泳動装置ファストシステム（ファルマシバイオテク（株）製）による］で解析したところ、蛋白質としては単一な状態であり、該蛋白質は単一のサブユニットから構成され、その分子量は約３．８万ダルトンであることが明らかになった。
（２）プローブDNAの作製
このようにして得られた蛋白質を、分子量１万ダルトン以下の蛋白質をカットする限外濾過（グレースジャパン（株）製）で濃縮し、水で平衡化した脱塩カラム（FastDesalting Colum、ファルマシバイオテク（株）製）で脱塩した後、減圧濃縮した。減圧濃縮された蛋白質をプロテインシークエンサー470A（（株）パーキンエルマージャパン製）を用いてＮ末端側から切断した後、PTH-Analyzer120A（（株）パーキンエルマージャパン製）で分析し、そのＮ末端側のアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列を配列番号３に示す。
上記のようにして決定されたＮ末端側のアミノ配列をもとに配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドを合成した。尚、オリゴヌクレオチドの合成には、DNA 自動合成装置モデル380A（（株）パーキンエルマージャパン製）が用いられた。合成されたDNAをMEGALABEL キット（宝酒造（株）製）を用いて放射性同位元素で標識した。
【００２６】
実施例４  （本発明遺伝子含有ファージの単離）
実施例２で調製された染色体DNA ライブラリからの本発明遺伝子のスクリーニングは、Colony/Plaque Screen（NEN Research Products製）を用いて添付の説明書に従って行われた。具体的には、大腸菌XL1-BlueをLB培地で培養した後、遠心分離(8000 rpm、15min）により集菌した。集菌された菌体を10mM MgSO4溶液に懸濁した後、該菌懸濁液に実施例２で調製された染色体DNA ライブラリを含むλファージを感染させた。感染後、50℃に加温した0.7%アガロースを含むNZY培地（NaCl 5g/L、MgSO4-H2O 2g/L、Bacto yeast extract(Difco Laboratories Incorporated製） 5g/L、NZアミン 10g/L、以下NZY培地と略）と混合し、これを直径150mm のNZY寒天プレートの上に重層した。１枚のプレートに約２万個程度のファージをまき、37℃でプラークが出現するまでインキュベートした。インキュベート後、プレート上に発生したプラークをプレート当たり２枚の割合でColony/Plaque Screenメンブレンに移し取った後、0.5M NaOHを含む溶液で５分間、２回処理し、1.0M Tris-HCl(pH8.0)溶液で5分間、２回中和した後、2xSSC溶液でColony/Plaque Screenメンブレンをリンスし、濾紙上で風乾した。（但し、ｎxSSC溶液とは、20xSSC溶液をn/20倍希釈したものを指し、20xSSC溶液は、175.3g NaCl、88.2gクエン酸３ナトリウム／Ｌ(pH7.0)である。以下、n x SSCと略。）
得られたColony/Plaque Screenメンブレンを2xSSCに浸した後、68℃に加温した6xSSC、0.5%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム（以下、SDSと略）、5XDenhart's液（0.1g Ficoll、0.1g polyvinylpyrrolidone, 0.1g bovine serum albumin / 100ml）、100μg/mlのdenatured sonicated sermon sperm DNAのプレハイブリダイゼーション溶液に３時間浸した。このように前処理されたメンブレンを6xSSC、0.5%(w/v)SDS、100μg/mlのdenatured sonicated sermon sperm DNAのハイブリダイゼーション溶液に浸し、これに実施例３で作製されたプローブDNAを加え、さらに６３℃で、18時間振とうしながら放置した。その後、メンブレンを2XSSC、0.5%SDS液で５分間室温にて洗浄した。さらに、（１）2XSSC、0.1%SDS液で１５分間室温で振盪しながら洗浄し、（２）0.1XSSC、0.5%SDS液で６０分間３７℃で振盪しながら洗浄し、（３）0.1XSSC、0.5%SDS液で６０分間６８℃で振盪しながら洗浄することにより余分なプローブDNAを除去した。メンブレン上に吸着したプローブDNAに相当する位置からファージをパスツールピペットで吸い取り、単一のプラークとして分離できるまで上記の作業を繰り返し、目的とするDNA断片（本発明遺伝子）が含まれるファージを単離した。このようにして約４万個のプラークをスクリーニングし、３株のファージを単離した。
【００２７】
実施例５  （形質転換体の取得と塩基配列の解析）
実施例４により得られたファージをλZAPIIのマニュアル（ストラタジーン  クローニング  システム製）に従ってプラスミドに組み換えた。得られたプラスミドをpAL601と命名した。pAL601を制限酵素により解析した結果、約7.0kbpのEcoRI断片が挿入されていた（図１参照）。
pAL601のうち約2kbpのSmaI断片（エステラーゼ遺伝子の領域）についてPRISM kit （（株）パーキンエルマージャパン製）と自動塩基配列解析装置373A（（株）パーキンエルマージャパン製）を用いてその塩基配列を決定した。尚、解析はGenetyx-Mac/ATSQ（ソフトウエア開発（株）製）と、Genetyx-Mac（ソフトウエア開発（株）製）により行い、そのエステラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号２に示した。
決定された塩基配列から予想されるアミノ酸配列の中に、配列番号3に示したアミノ酸配列と完全に一致する領域が存在し、上記DNA断片上に目的とするエステラーゼ遺伝子が存在することが確認できた。
【００２８】
実施例６  （エステラーゼの光学選択性１）
pAL601を制限酵素SmaIで切断しサブクローニングすることによりpAL612を得た。得られたpAL612を大腸菌JM109株に形質転換した。
このようにして得られた得られた形質転換体E.coli JM109/pAL612株を、各々50mg/Lのアンピシリンと1mMのisopropyl thio-β-D-galactoside（以下IPTGと略）を含む100mlのＬＢ培地で、37℃、16時間培養した後、遠心分離（6000rpm、10min）により集菌し、菌体を回収した。
得られた菌体を20mlの200mMリン酸緩衝液に懸濁した。（RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンのメチルエステル0.5gと50mMリン酸緩衝液(pH7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に入れ、撹拌子で撹拌させながら40℃、10分間予熱した。これに1.0mlの上記懸濁液を加え、撹拌子で撹拌させながら40℃で反応を行った。30分間後、該反応液を50μlを回収し、1mlのエタノールを添加することにより反応を停止させた。ブランクは、培養物の代わりに精製水を用いて同様な方法で試験した。分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測した。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度150℃、インジェクション温度170℃、ディテクション温度170℃、検出器はFIDの条件で、GC-14A（（株）島津製作所製）を用いて分析した。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により光学純度を測定した。分析には、（株）住化分析センター製OA-4100 (4.0mmI.D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用した。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジクロロエタンとエタノールを100:20:1の割合で混合したものを用いることができる。流速は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光学異性体比を分析した。
上記の分析結果に基づき、加水分解率、光学選択性を算出し、表３に示した。表３から明らかなように、2kb SmaI断片が挿入された形質転換体である大腸菌JM109/pAL612株が（RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステルを不斉加水分解し、（Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−２−エン−１−オンを産生する能力を有するエステラーゼを産生することを確認できた。
【００２９】
実施例７  （エステラーゼの光学選択性２）
（RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステルを基質として、実施例４と同様な検討を行った結果を、表４に示す。
【００３０】
実施例８  （エステラーゼの光学選択性３）
（RS）−４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノンのジ酢酸エステルを基質として、実施例４と同様な検討を行った結果を表５に示す。尚、緩衝液には100mMリン酸緩衝液(pH6.0)を用いた。
４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノンのジ酢酸エステルの分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測した。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度240℃、インジェクション温度260℃で分析した。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により光学純度を測定した。４−ヒドロキシ−２−（７−ヒドロキシヘプチル）−２−シクロペンテノンの分析には、（株）住化分析センター製OA-4500 光学異性体分析カラムを２本連結して使用した。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジクロロエタンとエタノールを100:4:4の割合で混合したものを用いることができる。流速は1.5ml/minで、235nmの吸光度を指標にして光学異性体比を分析した。
【００３１】
実施例９  （エステラーゼの光学選択性４）
（RS）−４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニルヘキシル）−２−シクロペンテノンの酢酸エステルを基質として、実施例４と同様な検討を行った結果を表６に示す。
分解率は、ガスクロマトグラフィーで計測した。分析用のカラムは、10% シリコン DC-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度240℃、インジェクション温度260℃で分析した。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで抽出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により光学純度を測定した。４−ヒドロキシ−２−（６−メトキシカルボニルヘキシル）−２−シクロペンテノンの分析には、（株）住化分析センター製OA-4500 光学異性体分析カラムを使用した。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジクロロエタンとエタノールを100:20:1の割合で混合したものを用いることができる。流速は1ml/minで、235nmの吸光度を指標にして光学異性体比を分析した。
【００３２】
【表３】
0003855329.tif 000007
【００３３】
【表４】
0003855329.tif 000008
【００３４】
【表５】
0003855329.tif 000009
【００３５】
【表６】
0003855329.tif 000010
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、一般式 化6で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用して、不斉加水分解し、高い光学純度の(R)-体の一般式 化6で示される(R)-シクロペンテノロン類を産生する能力を有するエステラーゼをコードする遺伝子を提供することが可能になった。
【００３７】
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:1089
配列の型:直鎖状
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
生物名：Burkholderia cepacia
株名：SC-20
配列
ATG AGC AGA TCG ATA CGA GCG AAG GCA GTG GCG ACC GTG GTG GCG ATC    48
AAC GCG GCC CCG GCC GCG AGT GTT GGA ACC GTT CTG GCC ATG TCG CTG    96
GCC GGC GCA CAG GCC GCT TCC GCC GCG ACG ACC GCC GTT GAC GAC TAC   144
GCG GCG ACC CGG TAC CCG ATC ATT CTC GTG CAC GGG CTG ACC GGC ACC   192
GAC AAG TAC GGT GGC GTC GTC GAG TAC TGG TAT CGC ATT CCG GAG GAC   240
CTG CGG GCG CAC GGC GCG GCG GTA TAC GTT GCC AAC CTG TCC GGC TTC   288
CAG AGC GAC GAT GGC CCG AAC GGG CGT GGC GAG CAA TTG CTT GCA TTC   336
GTG AAG CAG GTG CTC GCG GCG ACG GGC GCG CAG AAG GTG AAT CTG ATC   384
GGC CAT AGC CAG GGC GGC CTG ACA TCG CGT TAT GTT GCG TCC GTT GCA   432
CCG GAA CTG GTC GCA TCG GTG ACG ACG ATC AGT ACG CCG CAC TGG GGC   480
TCG CAA TTC GCG GAC TTC GTC CAG CAA CTG TTG CAG ACG GAC CCG ACC   528
GGC CTG TCG TCG ACC GTG CTC GGC GCA TTC GCG AAT GCG CTC GGC ACG   576
TTG ACG AGC AGC AAC TTC AAT ACG AAC CAG AAT GCG ATT CAG GCG TTG   624
TCG GTG CTG ACG ACG GCA AAG GCC GCC GCA TAC AAC CAG AAA TTC CCG   672
AGC GCC GGT CTC GGT GCG CCG GGC TCG TGT CAA ACC GGC GCG CCA ACG   720
GAG ACT GTC GGC GGC AAT ACG CAT CTG CTT TAT TCG TGG GGC GGC ACG   768
GCG ATC CAG CCG ACA GCG ACG GTG GCC GGC GTG ACA GGG GCC GTC GAT   816
ACG AGC GTG AGC GGG GTC ACC GAT CCG GCG AAC GCG CTC GAT CCG TCA   864
ACG CTG GCA CTC CTC GGC AGC GGC ACG GTG ATG ATC AAT CGC AGC GCC   912
GGT CCG AAC GAT GGC GTC GTG TCG CAA TGC AGC GCG CGG TTT GGC CAG   960
GTG CTC GGC ACG TAT CAC TGG AAT CAC ACC GAT GCG ATC AAC CAG ATC  1008
CTC GGC GTG CTC GGC GCG AAT GTG GAG GAT CCG GTT GCG GTA ATC CGC  1056
ACG GAC GCG AAC CGG TTG AAG CTC GCA GGC GTG                      1089
【００３８】
配列番号：２
配列の長さ：３６３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
起源：
生物名：Burkholderia cepacia
株名：SC-20
配列
1               5                  10                  15
Met Ser Arg Ser Ile Arg Ala Lys Ala Val Ala Thr Val Val Ala Ile
20                  25                  30
Ala Met Asn Ala Ala Pro Ala Ala Ser Val Gly Thr Val Leu Ser Leu
35                  40                  45
Ala Gly Ala Gln Ala Ala Ser Ala Ala Thr Thr Ala Val Asp Asp Tyr
50                  55                  60
Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His Gly Leu Thr Gly Thr
65                  70                  75                  80
Asp Lys Tyr Gly Gly Val Val Glu Tyr Trp Tyr Arg Ile Pro Glu Asp
85                  90                  95
Leu Arg Ala His Gly Ala Ala Val Tyr Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe
100                 105                 110
Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Phe
115                 120                 125
Val Lys Gln Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Gln Lys Val Asn Leu Ile
130                 135                 140
Gly His Ser Gln Gly Gly Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ser Val Ala
145                 150                 155                 160
Pro Glu Leu Val Ala Ser Val Thr Thr Ile Ser Thr Pro His Trp Gly
165                 170                 175
Ser Gln Phe Ala Asp Phe Val Gln Gln Leu Leu Gln Thr Asp Pro Thr
180                 185                 190
Gly Leu Ser Ser Thr Val Leu Gly Ala Phe Ala Asn Ala Leu Gly Thr
195                 200                 205
Leu Thr Ser Ser Asn Phe Asn Thr Asn Gln Asn Ala Ile Gln Ala Leu
210                 215                 220
Ser Val Leu Thr Thr Ala Lys Ala Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Pro
225                 230                 235                 240
Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro Thr
245                 250                 255
Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Gly Gly Thr
260                 265                 270
Ala Ile Gln Pro Thr Ala Thr Val Ala Gly Val Thr Gly Ala Val Asp
275                 280                 285
Thr Ser Val Ser Gly Val Thr Asp Pro Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ser
290                 295                 300
Thr Leu Ala Leu Leu Gly Ser Gly Thr Val Met Ile Asn Arg Ser Ala
305                 310                 315                 320
Gly Pro Asn Asp Gly Val Val Ser Gln Cys Ser Ala Arg Phe Gly Gln
325                 330                 335
Val Leu Gly Thr Tyr His Trp Asn His Thr Asp Ala Ile Asn Gln Ile
340                 345                 350
Leu Gly Val Leu Gly Ala Asn Val Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg
355                 360         363
Thr Asp Ala Asn Arg Leu Lys Leu Ala Gly Val
【００３９】
0003855329.tif 000011
【００４０】
0003855329.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明プラスミドであるpAL601,pAL612の制限酵素地図を表す図である。
【図１】
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