(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸依存性アニオンチャンネルとして機能するショウジョウバエアベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合タンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子であって、前記タンパク質が配列番号６に示したアミノ酸配列からなる精製ＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号５に示したヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の精製ＤＮＡ分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡ分子を含む、組み換え宿主細胞におけるショウジョウバエアベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合タンパク質を発現する発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを保有し、組み換えショウジョウバエアベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合タンパク質を発現させる宿主細胞。
【請求項５】
ゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項１または２に記載の精製ＤＮＡ分子。
【請求項６】
ショウジョウバエアベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合タンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項３に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトするステップ、及び
（ｂ）宿主細胞を前記発現ベクターからのショウジョウバエアベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合タンパク質の発現に適する条件下に培養するステップを含む方法。
【請求項７】
ショウジョウバエアベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合タンパク質として、及びグルタミン酸依存性アニオンチャンネルとして機能し、かつ配列番号６に示したアミノ酸配列からなる実質的に純粋な形態のタンパク質。
【請求項８】
グルタミン酸依存性アニオンチャンネルとして機能し、かつ配列番号６に示したアミノ酸配列からなるショウジョウバエアベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合タンパク質と免疫反応する単一特異性抗体。
【請求項９】
アベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合タンパク質活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ショウジョウバエアベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合タンパク質活性の調節因子を、請求項６の方法により発現されたアベルメクチン及び／またはグルタミン酸結合組換えタンパク質と組み合わせるステップ、及び
（ｂ）調節因子がタンパク質に及ぼす作用を測定するステップ
を含む方法。
【請求項１０】
調節因子がタンパク質に及ぼす作用が、グルタミン酸依存性アニオンチャンネルのリガンドの結合の抑制または促進であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
調節因子がタンパク質に及ぼす作用が、グルタミン酸依存性アニオンチャンネルを介してのアニオン流動の刺激または抑制であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
アニオン流動が膜塩素イオン流動であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
グルタミン酸依存性塩素イオンチャンネル（glutamate-gated chloride channel）もしくはＨ受容体は節足動物の神経及び筋肉において同定され（Ｃ．  Ｌｉｎｇｌｅ及びＥ．  Ｍａｒｄｅｒ，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ２１２，  ｐｐ．４８１−４８８，  １９８１；  Ｂ．  Ｇ．  Ｈｏｒｓｅｍａｎ，  Ｃ．  Ｓｅｙｍｏｕｒ，  Ｉ．  Ｂｅｒｍｕｄｅｚ及びＤ．  Ｊ．  Ｂｅａｄｌｅ，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．  ８５，  ｐｐ．６５−７０，  １９８８；  Ｋ．  Ａ．  Ｗａｆｆｏｒｄ及びＤ．  Ｂ．  Ｓａｔｔｅｌｌｅ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏ．  １４４，  ｐｐ．４４９−４６２，  １９８９；  Ｔ．  Ｊ．  Ｌｅａ及びＰ．  Ｎ．  Ｒ．  Ｕｓｈｅｒｗｏｏｄ，  Ｃｏｍｐ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４，  ｐｐ．３３３−３５０，  ９７３；  Ｓ．  Ｇ．  Ｃｕｌ−Ｃａｎｄｙ，  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２５５，  ｐｐ．４４９−４６４，  １９７６）、土壌線虫のＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓからクローン化されている（Ｄ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ，  Ｄ．  Ｋ．  Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ，  Ｌ．  Ｈ．  Ｔ．  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ及びＪ．  Ｐ．  Ａｒｅｎａ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７１，  ｐｐ．７０７−７１１，  １９９４）。このチャンネルは、広く用いられているアベルメクチンクラスの駆虫薬及び殺虫薬化合物の重要な標的である。アベルメクチンは、元来放線菌のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓから単離された大環状ラクトン類である。半合成アベルメクチン誘導体のイベルメクチン（２２，２３−ジヒドロ−アベルメクチンＢ1a）は世界中で、ヒト及び動物の寄生蠕虫及び有害昆虫の処理に用いられている。およそ１５年前に発見されたアベルメクチンは今でも、受容者に対して僅かな毒性しか示さない最も強力な広スペクトルエンデクトサイド（ｅｎｄｅｃｔｏｃｉｄｅｓ）である。アベルメクチンは線虫（Ｊ．  Ｍ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ及びＨ．  Ｗ．  Ｈａｉｎｅｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  ３８，  ｐｐ．２３２９−２３３８，  １９８９；  Ｄ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ及びＰ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍ．  ４０，  ｐｐ．３２６−３３２，  １９９１）及び昆虫（Ｓ．  Ｐ．  Ｒｏｈｒｅｒ，  Ｐ．  Ｔ．  Ｍｅｉｎｋｅ，  Ｅ．  Ｃ．  Ｈａｙｅｓ，  Ｈ．  Ｍｒｏｚｉｋ及びＪ．  Ｍ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８９，  ｐｐ．４１６８−４１７２，  １９９２）の膜の高親和性部位と実質的に不可逆的に相互作用し、線虫（Ｒ．  Ｊ．  Ｍａｒｔｉｎ及びＡ．  Ｊ．  Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ９８，  ｐｐ．７４７−７５６，  １９８９）、節足動物（Ｒ．  Ｈ．  Ｓｃｏｔｔ及びＩ．  Ｒ．  Ｄｕｃｅ，  Ｐｅｓｔｉｃ．  Ｓｃｉ．  １６，  ｐｐ．５９９−６０４，  １９８５；  Ｉ．  Ｒ．  Ｄｕｃｅ及びＲ．  Ｈ．  Ｓｃｏｔｔ，  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ８５，  ｐｐ．３９５−４０１，  １９８５）及び甲殻類（Ｆ．  Ｚｕｆａｌｌ，  Ｃ．  Ｆｒａｎｋｅ及びＨ．  Ｈａｔｔ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  １４２，  ｐｐ．１９１−２０５，  １９８９）に���いて膜塩素イオン透過性の上昇を惹起する。アベルメクチンはＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ由来のグルタミン酸依存性塩素イオンチャンネルを直接活性化し（Ｊ．  Ｐ．  Ａｒｅｎａ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ及びＤ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４０，  ｐｐ．３６８−３７４，  １９９１；  Ｊ．  Ｐ．  Ａｒｅｎａ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ及びＤ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  １５，  ｐｐ．３３９−３４８，  １９９２；  Ｄ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ，  Ｄ．  Ｋ．  Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ，  Ｌ．  Ｈ．  Ｔ．  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ及びＪ．  Ｐ．  Ａｒｅｎａ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７１，  ｐｐ．７０７−７１１，  １９９４）、またイナゴの筋肉においてグルタミン酸依存性塩素イオンチャンネルの電流を直接活性化または増強する（Ｒ．  Ｈ．  Ｓｃｏｔｔ及びＩ．  Ｒ．  Ｄｕｃｅ，  Ｐｅｓｔｉｃ．  Ｓｃｉ．  １６，  ｐｐ．５９９−６０４，  １９８５；  Ｅ．  Ａｙｄａｒ，  Ｌ．  Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｂｅａｄｌｅ及びＩ．  Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，  “Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，”  ｐ．２４，  １９９３）ことが判明している。
発明の概要
節足動物におけるアベルメクチン作用の標的をクローン化し、かつ特性解明したが、これはリガンド依存性チャンネルのうちのグルタミン酸依存性塩素イオンチャンネル類の新規な一員である。逆転写ＰＣＲ法を用いて、ショウジョウバエグルタミン酸及びアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネルをコードする機能性ＤＮＡ分子を単離した。このＤＮＡ分子から得られるタンパク質の電気生理学的特性及び構造特性を、アミノ酸及びヌクレオチド配列同様開示する。本発明の組み換えタンパク質はチャンネルの調節因子の同定に有用である。本発明の方法で同定した調節因子は、殺虫薬、外部寄生虫駆除薬、内部寄生虫駆除薬、ダニ駆除薬及び駆虫薬を含めた治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１はＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌのヌクレオチド配列を示す説明図である。
図２はＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌのアミノ酸配列を示す説明図である。
図３はアフリカツメガエル卵母細胞において発現されたＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌの電気生理学的特性の説明図である。
図４は化合物１の構造を示す説明図である。
図５はＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌの系統発生学的分類分析の説明図である。
詳細な説明
本発明は、節足動物のグルタミン酸及びアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネル（ＧｌｕＣｌ）産生細胞から単離した、ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡに係わる。本明細書中に用いた記号ＧｌｕＣｌは、グルタミン酸またはアベルメクチンによってゲート（ｇａｔｅ）されるアニオンチャンネルとして特異的に機能し得るタンパク質を意味する。
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌのアミノ酸配列はこれまで知られておらず、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌをコードするヌクレオチド配列も未知であった。本発明は、グルタミン酸依存性塩素イオンチャンネルの節足動物からのクローニングを初めて報告するものである。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌは、以前にクローン化されたＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβ（Ｄ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ，  Ｄ．  Ｋ．  Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ，  Ｌ．  Ｈ．  Ｔ．  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ及びＪ．  Ｐ．  Ａｒｅｎａ，  上掲誌）と関連付けられる。Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓチャンネルとは異なり、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌはアベルメクチンまたはグルタミン酸による直接活性化のためにただ１種のポリペプチドしか要しない。加えて、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌは、米国特許第５，３９９，５８２号に詳述された該特許の主題である殺虫薬の化合物１（図５）によって直接活性化される。アベルメクチンに対して感受性であるショウジョウバエ関連生物はいずれも上述のグルタミン酸及びアベルメクチン感受性チャンネルを有すると予測される。ＧｌｕＣｌを産生し得るショウジョウバエ細胞には、アベルメクチンに対して感受性である生物から単離した筋肉または神経細胞が非限定的に含まれる。アベルメクチン感受性動物は多様であり、節足動物門及び線形動物門に属する無脊椎動物が含まれる。
ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの単離に用いるのに他の細胞及び細胞系が適当である場合も有る。適当な細胞は、細胞抽出物においてＧｌｕＣｌ活性に関しスクリーニングを行なうことにより選択し得る。ＧｌｕＣｌ活性は、放射性標識したイベルメクチンもしくは放射性標識した化合物１、またはその誘導体を用いる結合アッセイを行なう（Ｃｕｌｌｙ及びＰａｒｅｓｓ，上掲誌；  Ｒｏｈｒｅｒ等，上掲誌）か、またはグルタミン酸、化合物１もしくはアベルメクチン感受性である塩素イオンチャンネルを直接電気生理学的に測定する（Ｒ．  Ｊ．  Ｍａｒｔｉｎ及びＡ．  Ｊ．  Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ９８，  ｐｐ．７４７−７５６，  １９８９；  Ｒ．  Ｈ．  Ｓｃｏｔｔ及びＩ．  Ｒ．  Ｄｕｃｅ，  Ｐｅｓｔｉｃ．  Ｓｃｉ．  １６，  ｐｐ．５９９−６０４，  １９８５；  Ｉ．  Ｒ．  Ｄｕｃｅ及びＲ．  Ｈ．  Ｓｃｏｔｔ，  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ８５，  ｐｐ．３９５−４０１，  １９８５；  Ｆ．  Ｚｕｆａｌｌ，  Ｃ．  Ｆｒａｎｋｅ及びＨ．  Ｈａｔｔ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  １４２，  ｐｐ．１９１−２０５，  １９８９）ことによってモニターし得る。このアッセイにおいてＧｌｕＣｌ活性を示す細胞はＧｌｕＣｌ  ＤＮＡまたはＲＮＡの単離に適し得る。
ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡの分子クローン化には、当業者に公知である様々な操作のうちの任意のものを用い得る。前記操作には、適当な発現ベクター系においてＧｌｕＣｌ含有ＤＮＡライブラリーを構築した後にＧｌｕＣｌ遺伝子を直接機能性発現させることが非限定的に含まれる。バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＧｌｕＣｌ含有ＤＮＡライブラリーを、ＧｌｕＣｌタンパク質のアミノ酸配列から設計して標識したオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングするのも一法である。更に、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＧｌｕＣｌ含有ＤＮＡライブラリーを、ＧｌｕＣｌタンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡでスクリーニングすることから成る方法も有る。前記部分的ｃＤＮＡは、精製したＧｌｕＣｌタンパク質のアミノ酸配列から設計した縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行なうＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ断片の特異的ＰＣＲ増幅によって得られる。
更に別の方法では、ＧｌｕＣｌ産生細胞からＲＮＡを単離し、このＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系を介してタンパク質に翻訳する。前記ＲＮＡをペプチドまたはタンパク質に翻訳することによって、例えば抗ＧｌｕＣｌ抗体との免疫反応性やＧｌｕＣｌタンパク質の生物活性によって同定し得るＧｌｕＣｌタンパク質の少なくとも一部を調製できる。この方法ではＧｌｕＣｌ産生細胞から単離したＲＮＡのプールを、ＧｌｕＣｌタンパク質の少なくとも一部をコードするＲＮＡの存在について分析する。更に、ＲＮＡプールを分画して、非ＧｌｕＣｌ  ＲＮＡからＧｌｕＣｌ  ＲＮＡを精製し得る。この方法で調製したペプチドまたはタンパク質を分析してアミノ酸配列を求め、得られた配列を用いてＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ調製のためのプライマーを得ることができ、または翻訳に用いるＲＮＡを分析してＧｌｕＣｌをコードするヌクレオチド配列を得、ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ調製のためのプローブを作製し得る。この方法は当業者に公知であり、例えばＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９中に見出され得る。
他の種類のライブラリー、並びに他の細胞または細胞種から構築したライブラリーもＧｌｕＣｌコーディングＤＮＡの単離に有用であり得ることは、当業者にはただちに明らかである。他の種類のライブラリーには、他の細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー、並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）を含有するゲノムＤＮＡライブラリー、及びコスミドライブラリーが非限定的に含まれる。
ＧｌｕＣｌ活性を有する細胞または細胞系から適当なｃＤＮＡライブラリーを調製し得ることは、当業者にはただちに明らかである。ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを単離するべくｃＤＮＡライブラリーを調製するのに用いる細胞または細胞系は、最初にアベルメクチン及びグルタミン酸感受性塩素イオンチャンネルの電気生理学的測定かまたはグルタミン酸もしくはアベルメクチンリガンド結合アッセイを用いて細胞に関連するＧｌｕＣｌ活性を測定することによって選択し得る。
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当業者に良く知られた標準的な技術で可能である。良く知られたｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えばＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９中に見出され得る。
ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡが適当なゲノムＤＮＡライブラリーからも単離できることも、当業者にはただちに明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当業者に良く知られた標準的な技術で可能である。良く知られたゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９中に見出され得る。
ＧｌｕＣｌ遺伝子を上述の方法でクローン化するのにＧｌｕＣｌのアミノ酸配列が必要な場合が有る。このアミノ酸配列を得るには、ＧｌｕＣｌタンパク質を精製してその部分アミノ酸配列を自動配列決定装置で決定し得る。全アミノ酸配列を決定する必要は無く、ＧｌｕＣｌタンパク質の、６〜８個のアミノ酸から成る二つの領域の直線状配列を決定して、これを部分ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマー作製に用いる。
適当なアミノ酸配列を同定したら、該配列をコードし得るＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重するので、或る特定のアミノ酸をコードするのに２種以上のコドンが用いられる場合が有り、従ってアミノ酸配列は一組の類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドのうちのいずれかによってコードされ得る。ＧｌｕＣｌ配列と同等であるのは一組のＤＮＡオリゴヌクレオチドのうちのただ一つのみであるが、このＤＮＡオリゴヌクレオチドは適当な条件下であれば、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドが存在してもＧｌｕＣｌ  ＤＮＡとハイブリダイズし得る。ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドでもなお十分にＧｌｕＣｌ  ＤＮＡとハイブリダイズして、ＧｌｕＣｌコーディングＤＮＡの同定及び単離を可能にし得る。このような方法で単離したＤＮＡを用いて、無脊椎動物及び脊椎動物ソースから得た様々な細胞種に由来するＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、相同遺伝子を単離することができる。
精製された生物活性ＧｌｕＣｌは幾つかの異なる物理的形態を有し得る。ＧｌｕＣｌは完全長の新生（ｎａｓｃｅｎｔ）ポリペプチドもしくはプロセシングを受けていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングを受けたポリペプチドか、もしくはプロセシングを受けたポリペプチド同士の組み合わせとして存在し得る。完全長新生ＧｌｕＣｌポリペプチドは特異的なタンパク質分解性切断事象によって翻訳後修飾され得、前記事象は完全長新生ポリペプチドのフラグメントを生成させる。フラグメント、またはフラグメント同士の物理的会合体はＧｌｕＣｌに関連する完全な生物活性を有し得る（グルタミン酸、アベルメクチンまたは化合物１感受性チャンネル）。しかし、ＧｌｕＣｌ活性の程度は個々のＧｌｕＣｌフラグメント及び物理的に会合したＧｌｕＣｌポリペプチドフラグメント間で様々となり得る。
本明細書に開示した方法で得られるクローン化ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡは、適当なプロモーター及び他の適当な転写調節要素を有する発現ベクター中への分子クローニングし、組み換えＧｌｕＣｌを産生させるために原核または真核宿主細胞内に移入することにより発現させ得る。このような操作に用いられる技術はＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，上掲書に詳述されており、かつ当業者に良く知られている。
本明細書では「発現ベクター」を、適当な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写及びそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義する。このようなベクターは、大腸菌を含めた細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を含めた真菌細胞、及び動物細胞などの様々な宿主において真核生物遺伝子を発現させるのに用い得る。
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母、細菌−動物細胞、細菌−真菌細胞、または細菌−無脊椎動物細胞などの宿主間でのＤＮＡのシャトル化を可能にする。適当に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製開始点と、選択マーカーと、限られた数の有用な制限酵素部位と、潜在的高コピー数領域と、活性なプロモーターとを有する。プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼを、ＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するように導くＤＮＡ配列のことである。強いプロモーターは、ｍＲＮＡの合成開始を高い頻度で惹起するプロモーターである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスが非限定的に含まれ得る。
哺乳動物細胞における組み換えＧｌｕＣｌの発現には様々な哺乳動物発現ベクターを用い得る。組み換えＧｌｕＣｌ発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）及びｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）が非限定的に含まれる。
細菌細胞における組み換えＧｌｕＣｌの発現には様々な細菌発現ベクターを用い得る。組み換えＧｌｕＣｌ発現に適し得る市販の細菌発現ベクターにはｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が非限定的に含まれる。
酵母などの真菌細胞における組み換えＧｌｕＣｌの発現には様々な真菌細胞発現ベクターを用い得る。組み換えＧｌｕＣｌ発現に適し得る市販の真菌細胞発現ベクターにはｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が非限定的に含まれる。
昆虫細胞における組み換えＧｌｕＣｌの発現には様々な昆虫細胞発現ベクターを用い得る。組み換えＧｌｕＣｌ発現に適し得る市販の昆虫細胞発現ベクターにはｐＢｌｕｅＢａｃII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が非限定的に含まれる。
ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡを、組み換え宿主細胞における発現のための発現ベクター中へクローン化することも可能である。組み換え宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起源の細胞系を非限定的に含む哺乳動物細胞、並びにショウジョウバエ及びカイコ由来の細胞系を非限定的に含む昆虫細胞が非限定的に含まれる。適当であり得る市販の哺乳動物種由来細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ細胞及びＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）が非限定的に含まれる。
発現ベクターの宿主細胞内への導入は、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リボフェクション及びエレクトロポレーションを非限定的に含む幾つかの技術のうちのいずれかによって行ない得る。発現ベクター保有細胞をクローン化により増殖させ、個々の細胞を分析してＧｌｕＣｌタンパク質を産生するかどうか確認する。ＧｌｕＣｌを発現させる宿主細胞クローンは、抗ＧｌｕＣｌ抗体との免疫反応性、及び宿主細胞関連のＧｌｕＣｌ活性の存在を非限定的に含む幾つかの手段によって同定し得る。
ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡの発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製した合成ｍＲＮＡを用いても実現可能である。合成ｍＲＮＡ、またはＧｌｕＣｌ産生細胞から単離したｍＲＮＡは、小麦胚抽出物及び網状赤血球抽出物を非限定的に含む様々な無細胞系において効率的に翻訳され得、またカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションを非限定的に含む細胞ベースの系においても効率的に翻訳され得るが、好ましいのはカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションである。
最適レベルのＧｌｕＣｌ活性及び／またはＧｌｕＣｌタンパク質をもたらす（一つ以上の）ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ配列を確認するべく、ＧｌｕＣｌタンパク質をコードするＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの完全長読み取り枠（最初のメチオニンの最初のヌクレオチドから最初の終結コドンの前に位置する最後のヌクレオチドまでに対応）を非限定的に含むＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ分子を構築し得、構築物はＧｌｕＣｌタンパク質をコードするｃＤＮＡの一部を含む。いずれの構築物も、ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの５′または３′非翻訳領域を含まないかまたはその全部もしくは一部を含むように設計可能である。このような構築物を適当な宿主細胞内に単独で導入し、かつ組み合わせても導入することによってＧｌｕＣｌ活性及びタンパク質発現レベルの測定が可能となる。経過的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）アッセイにおいて最適発現をもたらすＧｌｕＣｌ  ＤＮＡカセットを確認したらそのＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ構築物を、哺乳動物細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、大腸菌及び酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを非限定的に含む宿主細胞における発現のための様々な発現ベクターに移入する。
次の方法によって、宿主細胞トランスフェクト体及びマイクロインジェクションを行なった卵母細胞をＧｌｕＣｌチャンネル活性のレベルとＧｌｕＣｌタンパク質のレベルとの両方についてアッセイし得る。組み換え宿主細胞の場合、アッセイはＧｌｕＣｌ  ＤＮＡを含む１種の、または場合によっては２種以上のプラスミドでの同時トランスフェクションを含む。卵母細胞の場合は、アッセイは１種以上のＧｌｕＣｌタンパク質をコードする合成ＲＮＡまたはＤＮＡの注入を含む。発現を可能にする適当な時間の経過後、細胞タンパク質を例えば35Ｓ−メチオニンで２４時間代謝標識し、その後細胞溶解物及び細胞培養上清を回収し、これらにおいてＧｌｕＣｌタンパク質に対するポリクローナル抗体で免疫沈降を生起させる。
ＧｌｕＣｌ活性を検出する他の方法の一つに、ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡでトランスフェクトした全細胞またはＧｌｕＣｌ  ｍＲＮＡを注入した卵母細胞において直接ＧｌｕＣｌ活性を測定することが有る。ＧｌｕＣｌ活性は、ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡを発現させる宿主細胞の特異的リガンド結合特性及び電気生理学的特性によって測定する。ＧｌｕＣｌが発現される組み換え宿主細胞では、パッチ電圧固定技術を用いて塩素イオンチャンネル活性を測定し、かつＧｌｕＣｌタンパク質を定量し得る。卵母細胞では、パッチクランプ技術並びに二電極電圧固定技術を用いて塩素イオンチャンネル活性を測定し、かつＧｌｕＣｌタンパク質を定量し得る。
宿主細胞のＧｌｕＣｌタンパク質レベルは、免疫アフィニティー及び／またはリガンドアフィニティー技術で測定する。細胞膜への放射性グルタミン酸またはイベルメクチン結合の量を測定することにより、ＧｌｕＣｌ発現細胞を発現されたＧｌｕＣｌ分子の数についてアッセイし得る。ＧｌｕＣｌ特異的なアフィニティービーズまたはＧｌｕＣｌ特異的な抗体を用いれば、例えば35Ｓ−メチオニンで標識したかまたは標識していないＧｌｕＣｌタンパク質が単離できる。標識したＧｌｕＣｌタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。標識していないＧｌｕＣｌタンパク質は、ＧｌｕＣｌ特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイによって検出する。
遺伝暗号は縮重するので、或る特定のアミノ酸をコードするのに２種以上のコドンが用いられる場合が有り、従ってアミノ酸配列は一組の類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドのうちのいずれかによってコードされ得る。ＧｌｕＣｌ配列と同等であるのは一組のＤＮＡオリゴヌクレオチドのうちのただ一つのみであるが、このＤＮＡオリゴヌクレオチドは適当な条件下であれば、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドが存在してもＧｌｕＣｌ  ＤＮＡとハイブリダイズし得る。別の条件下ではミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドでもＧｌｕＣｌ  ＤＮＡとハイブリダイズして、ＧｌｕＣｌコーディングＤＮＡの同定及び単離を可能にし得る。
特定の生物に由来するＧｌｕＣｌコーディングＤＮＡを用いて他の生物に由来するＧｌｕＣｌの相同体を単離及び精製することが可能である。そのためには、第一のＧｌｕＣｌ  ＤＮＡを適当なハイブリダイゼーション条件下に、ＧｌｕＣｌの相同体をコードするＤＮＡを含有する試料と混合する。ハイブリダイズさせたＤＮＡ複合体を単離し、この複合体から相同体ＤＮＡをコードするＤＮＡを精製する。
特定のアミノ酸をコードする様々なコドンに相当量の重複が存在することが知られている。従って本発明は、同じアミノ酸の究極的な翻訳をコードする代替コドンを含むＤＮＡ配列にも係わる。本明細書の趣旨に副って、１個以上の置換コドンを含む配列を縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）と定義する。ＤＮＡ配列または翻訳されたタンパク質において生起する、発現されたタンパク質の最終的な物理特性を実質的に変更しない突然変異も本発明の範囲内に含まれる。例えば、ロイシンがバリンに、リシンがアルギニンに、またはグルタミンがアスパラギンに置換されてもポリペプチドの機能に変化は生じない。
或るペプチドをコードするＤＮＡ配列が天然ペプチドのものとは異なる特性を有するペプチドをコードするように改変され得ることが知られている。ＤＮＡ配列を改変する方法には、位置特異的突然変異誘発が非限定的に含まれる。変更される特性の例には、酵素の基質に対する親和性や受容体のリガンドに対する親和性の変化が非限定的に含まれる。
本明細書中、ＧｌｕＣｌの「機能性誘導体」とは、ＧｌｕＣｌの生物活性と実質的に同様の（機能上または構造上の）生物活性を有する化合物のことである。「機能性誘導体」という語は、ＧｌｕＣｌの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「相同体」、または「化学誘導体」を包含するものとする。「フラグメント」という語は、ＧｌｕＣｌの任意のポリペプチドサブセットを意味する。「変異体」という語は、完全なＧｌｕＣｌ分子またはそのフラグメントと実質的に同様の構造及び機能を有する分子を意味する。ＧｌｕＣｌ分子と実質的に同様の構造を有するか、または同様の生物活性を有する分子をＧｌｕＣｌと「実質的に同様」とする。従って、実質的に同様の活性を有する二つの分子は、一方の分子の構造が他方において見出されなくても、あるいはまた両者のアミノ酸配列が同等でなくても変異体であると看做される。「類似体」という語は、完全なＧｌｕＣｌ分子またはそのフラグメントと実質的に同様の機能を有する分子を意味する。
組み換え宿主細胞におけるＧｌｕＣｌ発現後、ＧｌｕＣｌタンパク質を回収してその活性形態とし得る。幾つかのＧｌｕＣｌ精製操作が利用可能で、かつ使用に適する。天然ソースからのＧｌｕＣｌ精製に関して先に述べたように、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを様々に組み合わせてかまたは単独で適用することにより、組み換えＧｌｕＣｌを細胞溶解物及び抽出物または馴らし培地から精製し得る。
加えて、完全長新生ＧｌｕＣｌまたはＧｌｕＣｌもしくはＧｌｕＣｌタンパク質のポリペプチドフラグメントに対して特異的であるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて製造した免疫アフィニティーカラムを用いれば、組み換えＧｌｕＣｌを他の細胞タンパク質から分離することができる。
ＧｌｕＣｌに対する単一特異性抗体を、ＧｌｕＣｌに対して反応性である抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製するか、またはＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ｐｐ．４９５−４９７，  １９７５の技術を用いてＧｌｕＣｌに対して反応性であるモノクローナル抗体として調製する。本明細書中に用いた「単一特異性抗体」という語は、ＧｌｕＣｌに対して均一の（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）結合特性を有する単抗体種または多抗体種を意味する。本明細書中に用いた「均一の結合」という語は抗体種の、先に述べたＧｌｕＣｌに関連する能力のような、特定の抗原またはエピトープと結合する能力を意味する。ＧｌｕＣｌ特異的な抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物、好ましくはウサギを、免疫アジュバントを伴ったかまたは伴わない適当な濃度のＧｌｕＣｌで免疫すると産生される。
初回免疫の前に免疫前（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）血清を採集する。各動物に約０．１〜約１０００ｍｇのＧｌｕＣｌを、許容可能な免疫アジュバントと共に与える。前記許容可能なアジュバントには、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ含有油中水型乳濁液及びｔＲＮＡが非限定的に含まれる。初回免疫は、好ましくはフロイントの完全アジュバント中に存在させたＧｌｕＣｌを多数の部位において皮下（ＳＣ）投与するか、腹腔内（ＩＰ）投与するか、またはこれらの経路の両方から投与することにより行なう。各動物から規則的な間隔で、好ましくは週１回採血（ｂｌｅｅｄ）して抗体力価を測定する。初回免疫後、動物に追加免疫注射を行なってもよく、また行なわなくてもよい。追加免疫注射を行なう動物には通常、フロイントの不完全アジュバント中に存在させた等量の抗原を同じ経路で投与する。追加免疫注射は最大力価が得られるまで約３週間置きに行なう。各追加免疫の約７日後に、またはただ１回の免疫後約１週間置きに動物から採血し、血清を採集し、アリコートを約−２０℃で貯蔵する。
ＧｌｕＣｌと反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＧｌｕＣｌで免疫することによって調製する。等量の先に述べた許容可能なアジュバント中に存在させた約０．５ｍｌの緩衝液または食塩液中の約０．１〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＧｌｕＣｌでマウスをＩＰまたはＳＣ経路で免疫する。アジュバントはフロイントの完全アジュバントが好ましい。第０日にマウスに初回免疫を施し、このマウスを約３〜約３０週間放置する。このように免疫したマウスに、リン酸緩衝食塩液どの緩衝液中の約０．１〜約１０ｍｇのＧｌｕＣｌを用いる追加免疫を１回以上、静脈内（ＩＶ）経路から施す。抗体陽性マウス由来のリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、免疫したマウスから脾臓を当業者に知られた標準的な操作で摘出することによって得る。安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下に脾臓リンパ球を適当な融合相手、好ましくはミエローマ細胞と混合することによってハイブリドーマ細胞を作製する。上記融合相手にはマウスミエローマのＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１、ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４及びＳｐ  ２／０が非限定的に含まれ得、なかでもＳｐ  ２／０が好ましい。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは分子量が約１０００のポリエチレングリコール中で約３０〜約５０％の濃度で融合させる。融合ハイブリドーマ細胞は当業者に知られた操作により、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での増殖によって選択する。第１４日、第１８日及び第２１日ごろに増殖陽性ウェルから上清を回収し、この上清を抗体産生に関して、抗原としてＧｌｕＣｌを用いる固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＩＲＡ）などのイムノアッセイによってスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降アッセイで試験し、ｍＡｂのイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  “Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９７３に記載された軟寒天技術などの技術によってクローン化する。
マウス１匹当たり約０．５ｍｌのプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）で感作したＢａｌｂ／ｃマウスに前記感作の約４日後に約２×１０6〜約６×１０6個のハイブリドーマ細胞を注射することにより、モノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を実現する。細胞伝達の約８〜１２日後に腹水を採集し、当業者に知られた技術でモノクローナル抗体を精製する。
抗ＧｌｕＣｌ  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生は、約２％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させ、それによって十分な量の特異的ｍＡｂを得ることにより行なう。ｍＡｂは当業者に知られた技術で精製する。
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価を、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）技術及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を非限定的に含む様々な血清学的または免疫学的アッセイによって測定する。体液または組織及び細胞抽出物においてＧｌｕＣｌの存在を検出するのにも同様のアッセイを用いる。
単一特異性抗体を産生させる上述の方法を、ＧｌｕＣｌポリペプチドフラグメントまたは完全長新生ＧｌｕＣｌポリペプチドに特異的な抗体の産生に用い得ることは当業者には直ちに明らかである。特に、ただ１種のＧｌｕＣｌタンパク質のみ、または完全に機能するグルタミン酸、化合物１もしくはアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネルのみに特異的である単一特異性抗体を産生させ得ることは当業者には直ちに明らかである。
抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化したゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を添加することにより、ＧｌｕＣｌ抗体アフィニティーカラムを作製する。次に、スペーサーアームが介在するアミド結合によって抗体とゲルとを結合させる。その後、残存する活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で反応停止させる。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、結合しなかった抗体や生体外タンパク質を除去する。次に、カラムをリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．３）中で平衡させ、このカラムにＧｌｕＣｌまたはＧｌｕＣｌタンパク質フラグメントを含有する細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくり通す。その後、カラムを光学密度（Ａ２８０）が低下してバックグラウンドに達するまでリン酸緩衝食塩液で洗浄してから、タンパク質を０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離する。このように精製したＧｌｕＣｌタンパク質をリン酸緩衝食塩液に対して透析する。
アフリカツメガエル卵母細胞において同価同義（ｈｏｍｏｍｅｒｉｃ）チャンネルとして、またはＧｌｕＣｌ類に属する他のチャンネルを伴った異価同義（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）チャンネルとして発現されるとグルタミン酸またはアベルメクチンによって直接活性化されるタンパク質をコードする、ｐＧｌｕＣｌと呼称するＤＮＡクローンを同定する。グルタミン酸依存性塩素イオンチャンネルは無脊椎動物においてのみ報告されていて、昆虫の筋肉及びニューロン体細胞並びに甲殻類の筋肉中に見出され、卵母細胞において昆虫の筋肉ポリ（Ａ）+ＲＮＡから発現され（Ｃ．  Ｌｉｎｇｌｅ及びＥ．  Ｍａｒｄｅｒ，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ２１２，  ｐｐ．４８１−４８８，  １９８１；  Ｂ．  Ｇ．  Ｈｏｒｓｅｍａｎ，  Ｃ．  Ｓｅｙｍｏｕｒ，  Ｉ．  Ｂｅｒｍｕｄｅｚ及びＤ．  Ｊ．  Ｂｅａｄｌｅ，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．  ８５，  ｐｐ．６５−７０，  １９８８；  Ｋ．  Ａ．  Ｗａｆｆｏｒｄ及びＤ．  Ｂ．  Ｓａｔｔｅｌｌｅ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  １４４，  ｐｐ．４４９−４６２，  １９８９；  Ｔ．  Ｊ．  Ｌｅａ及びＰ．  Ｎ．  Ｒ．  Ｕｓｈｅｒｗｏｏｄ，  Ｃｏｍｐ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４，  ｐｐ．３３３−３５０，  １９７３；  Ｓ．  Ｇ．  Ｃｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ，  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２５５，  ｐｐ．４４９−４６４，  １９７６；  Ｓ．  Ｐ．  Ｆｒａｓｅｒ等，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ８，  ｐｐ．３３１−３４１，  １９９０）、また土壌線虫のＣ．  ｅｌｅｇａｎｓからクローン化されている（Ｄ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ，  Ｄ．  Ｋ．  Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ，  Ｌ．  Ｈ．  Ｔ．  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ及びＪ．  Ｐ．  Ａｒｅｎａ）。「Ｈ（過分極）受容体」という語は、イナゴの筋肉のグルタミン酸依存性塩素イオンチャンネルを該筋肉の興奮性Ｄ（脱分極）グルタミン酸受容体と区別するのに用いてある（Ｔ．  Ｊ．  Ｌｅａ及びＰ．  Ｎ．  Ｒ．  Ｕｓｈｅｒｗｏｏｄ，  Ｃｏｍｐ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４，  ｐｐ．３３３−３５０，  １９７３；  Ｓ．  Ｇ．  Ｃｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ，  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２５５，  ｐｐ．４４９−４６４，  １９７６）。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ＲＮＡを注入された卵母細胞と同様に、節足動物のＨ受容体はイボテネートによって特徴的に活性化され、ピクロトキシンによって低い親和性でしか遮断されず、かつＧＡＢＡによっては活性化されない（Ｃ．  Ｌｉｎｇｌｅ及びＥ．  Ｍａｒｄｅｒ，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ２１２，  ｐｐ．４８１−４８８，  １９８１；  Ｋ．  Ａ．  Ｗａｆｆｏｒｄ及びＤ．  Ｂ．  Ｓａｔｔｅｌｌｅ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  １４４，  ｐｐ．４４９−４６２，  １９８９；  Ｓ．  Ｇ．  Ｃｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ，  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２５５，  ｐｐ．４４９−４６４，  １９７６；  Ｔ．  Ｊ．  Ｌｅａ及びＰ．  Ｎ．  Ｒ．  Ｕｓｈｅｒｗｏｏｄ，  Ｃｏｍｐ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４，  ｐｐ．３５１−３６３，  １９７３）。イナゴの筋肉のＨ受容体は、Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓポリ（Ａ）+ＲＮＡから発現されるグルタミン酸依存性塩素イオンチャンネルと同様���アベルメクチンによって直接活性化される（Ｒ．  Ｈ．  Ｓｃｏｔｔ及びＩ．  Ｒ．  Ｄｕｃｅ，  Ｐｅｓｔｉｃ．  Ｓｃｉ．  １６，  ｐｐ．５９９−６０４，  １９８５；  Ｊ．  Ｐ．  Ａｒｅｎａ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ及びＤ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  １５，  ｐｐ．３３９−３４８，  １９９２）。加えて、イナゴのニューロン体細胞に存在するグルタミン酸依存性塩素イオンチャンネルはアベルメクチンによって強化され、かつ直接活性化される（Ｅ．  Ａｙｄａｒ，  Ｌ．  Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｂｅａｄｌｅ及びＩ．  Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，  “Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，”  ｐ．２４，  １９９３）。従って、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌは節足動物のＨ受容体との間に関連性を有すると考えられる。このチャンネルはショウジョウバエにおいてアベルメクチン及び化合物１の標的である。
系統発生学的分析が示唆するところでは、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌはリガンドゲートを具えた塩素イオンチャンネルの、グリシンα及びβ、Ｌｙｍζ並びにＤｒｏｓ  ｒｄｌタンパク質と関連し得るユニークなサブクラスを成すＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβチャンネルとも関連付けられる。これらのタンパク質は系統発生学的には関連性を有するが、異なるリガンドに応答し、薬理学的に区別される（Ｖ．  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｎ，  Ｇ．  Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ，  Ｐ．  Ｒ．  Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ及びＨ．  Ｂｅｔｚ，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８，  ｐｐ．６９５−７００，  １９８９；  Ｒ．  Ｈ．  Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，  Ｔ．  Ａ．  Ｒｏｃｈｅｌｅａｕ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｓｔｅｉｃｈｅｎ及びＡ．  Ｅ．  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３，  ｐｐ．４４９−４５１，  １９９３；  Ｇ．  Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ等，  Ｎｅｕｒｏｎ  ４，  ｐｐ．９６３−９７０，  １９９０；  Ｍ．  Ｌ．  Ｈｕｔｔｏｎ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｈａｒｖｅｙ，  Ｆ．  Ｇ．  Ｐ．  Ｅａｒｌｅｙ，  Ｅ．  Ａ．  Ｂａｒｎａｒｄ及びＭ．  Ｇ．  Ｄａｒｌｉｓｏｎ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３２６，  ｐｐ．１１２−１１６，  １９９３）。アベルメクチンはリガンド依存性塩素イオンチャンネル類に属する他の塩素イオンチャンネルと相互作用することが報告されている。アベルメクチンは、線虫及び昆虫ではＧＡＢＡ感受性電流を遮断し、一方ザリガニでは多伝達物質（グルタミン酸、アセチルコリン、ＧＡＢＡ）依存性の塩素イオンチャンネルを直接活性化する（Ｒ．  Ｊ．  Ｍａｒｔｉｎ及びＡ．  Ｊ．  Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈｒａｍａｃｏｌ．  ９８，  ｐｐ．７４７−７５６，  １９８９；  Ｆ．  Ｚｕｆａｌｌ，  Ｃ．  Ｆｒａｎｋｅ及びＨ．  Ｈａｔｔ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  １４２，  ｐｐ．１９１−２０５，  １９８９；  Ｌ．  Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄｙｅ及びＲ．  Ｊ．  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １０１，  ｐｐ．２６５−２７１，  １９９０；  Ｉ．  Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，  Ｃ．  Ａ．  Ｈａｗｋｉｎｓ，  Ａ．  Ｍ．  Ｔａｙｌｏｒ及びＤ．  Ｊ．  Ｂｅａｄｌｅ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１，  ｐｐ．２２１−２３２，  １９９１）。ニワトリのヒナの脳ＧＡＢＡa受容体を発現させる卵母細胞では、アベルメクチンはＧＡＢＡ応答を増強する（Ｅ．  ｓｉｇｅｌ及びＲ．  Ｂａｕｒ，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３２，  ｐｐ．７４９−７５２，  １９８７）。加えて、アベルメクチンはストリキニーネが哺乳動物のグリシン受容体に結合するのを抑制する（Ｄ．  Ｇｒａｈａｍ，  Ｆ．  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ及びＨ．  Ｂｅｔｚ，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９，  ｐｐ．１７３−１７６，  １９８２）。しかし、ＧｌｕＣｌタンパク質はリガンド依存性塩素イオンチャンネル類に属する塩素イオンチャンネルのうちでグルタミン酸及びイボテネートに関しユニークな薬理特性を示す唯一のものであり、従ってリガンド依存性イオンチャンネル類の新規なサブクラスを成す。
本発明は、ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現及びＧｌｕＣｌタンパク質の機能をｉｎ  ｖｉｖｏで調節する化合物をスクリーニングする方法にも係わる。上記のような活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク性有機分子であり得る。これらの化合物は、ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、またはＧｌｕＣｌタンパク質の機能を促進または抑制して調節し得る。ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、またはＧｌｕＣｌタンパク質の機能を調節する化合物は様々なアッセイによって検出できる。前記アッセイは、発現または機能に変化が有るかどうかを確認する単純な「はい／いいえ」アッセイであり得る。試験試料の発現または機能を標準試料の発現または機能レベルと比較することによってアッセイを定量的に行なうことも可能である。本発明の方法で同定される調節因子は、治療薬、殺虫薬及び駆虫薬として有用である。
ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ、ＧｌｕＣｌに対する抗体、またはＧｌｕＣｌタンパク質を含むキットを作製し得る。このようなキットは、ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡの検出、または試料におけるＧｌｕＣｌタンパク質またはペプチドフラグメントの存在の検出に用いられる。このようなキットを用いての特性解明は、法医学的分析及び疫学研究を非限定的に含む様々な目的のために有用である。
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組み換えタンパク質及び抗体は、ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ、ＧｌｕＣｌ  ＲＮＡまたはＧｌｕＣｌタンパク質のレベルに関するスクリーニング及び測定に用い得る。本発明の組み換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、ＧｌｕＣｌの検出及び型分類に適したキットの作製に役立つ。前記キットは、少なくとも１個の容器を厳重に固定して保持するのに適した仕切り付きの支持器（ｃａｒｒｉｅｒ）を含む。この支持器はＧｌｕＣｌの検出に適した組み換えＧｌｕＣｌタンパク質または抗ＧｌｕＣｌ抗体などの試薬も保持する。支持器は、標識した抗原または酵素基質等といったものを検出する手段も具備し得る。
ＧｌｕＣｌコーディングＤＮＡ配列と相補的であるヌクレオチド配列をアンチセンス療法用に合成し得る。得られるアンチセンス分子はＤＮＡ、ホスホロチオエートやメチルホスホネートといった安定なＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、２′−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体、または他のＧｌｕＣｌアンチセンスオリゴヌクレオチド模擬体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）である。ＧｌｕＣｌアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム封入、またはアンチセンス配列を含むベクターからの発現によって細胞内に導入し得る。ＧｌｕＣｌアンチセンス療法は、ＧｌｕＣｌ活性の低下が有益である疾患の治療に特に有用であり得る。
ＧｌｕＣｌを標的臓器の細胞内に導入するのにＧｌｕＣｌ  ＤＮＡを用い得る。ＧｌｕＣｌ遺伝子はウイルスベクター中に連結することができ、前記ベクターは受容宿主細胞に感染することによってＧｌｕＣｌ  ＤＮＡの移入を媒介する。適当なウイルスベクターに、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が含まれる。あるいは他の場合には、リガンド−ＤＮＡ結合体またはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合体を用いる受容体媒介型標的指向性ＤＮＡ移入、リポフェクション、膜融合または直接マイクロインジェクションを含めた、ウイルスベクターを用いない（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ）技術によってＧｌｕＣｌ  ＤＮＡを細胞内に移入し得る。これらの操作とその改良型とは、ｅｘ  ｖｉｖｏ並びにｉｎ  ｖｉｖｏ  ＧｌｕＣｌ遺伝子療法に適している。ＧｌｕＣｌ遺伝子療法は、ＧｌｕＣｌ活性を高めることが有益である場合に特に有用であり得る。
ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ、ＧｌｕＣｌ  ＲＮＡもしくはＧｌｕＣｌタンパク質、またはＧｌｕＣｌ受容体活性調節因子を含有する、医薬に有用な組成物を、医薬に許容可能なキャリヤの混合によるような公知方法に従って調製し得る。前記キャリヤや調製方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中に見出され得る。有効な投与に適した、医薬に許容可能な組成物を調製するべく、組成物には有効量の上記タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは調節因子を含有させる。
本発明の治療または診断用組成物は、ＧｌｕＣｌ関連活性の調節が指示される障害の治療または診断に十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の状態、体重、性別及び年齢などの様々な要因に従って変化し得る。上記以外の要因に、投与モードが含まれる。本発明の医薬組成物は、皮下、局所的、経口及び筋肉内などの様々な経路で個体に投与し得る。
「化学誘導体」という語は、通常は基本分子の一部でない付加的な化学的部分を有する分子を意味する。前記部分によって、基本分子の溶解度、半減期、吸収性等を改善し得る。あるいは他の場合には、上記部分によって基本分子の望ましくない副作用を抑制したり、基本分子の毒性を低下させたりする。このような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓなどの様々な文献に記載されている。
本明細書に開示した方法によって同定した化合物は、潜在的な毒性を最小限に留めつつＧｌｕＣｌ受容体もしくはその活性を最適に抑制するべく常用試験によって規定した適当な用量で単独に用い得る。
本発明の方法は、本発明の新規な治療方法で用いるのに適した局所用、経口用、全身用及び非経口用医薬組成物の提供も目的とする。ＧｌｕＣｌ受容体の調節に用いる、活性成分として本発明により同定した化合物を含有する組成物は、通常の投与用賦形剤を用いてきわめて様々な治療投与形態として投与し得る。例えば、上記化合物は錠剤、カプセル剤（それぞれ時限放出製剤及び徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤及び乳濁液剤などの経口投与形態で、または注射によって投与し得る。上記化合物はまた、静脈内形態（ボーラスと注入との両方）、腹腔内形態、皮下形態、閉塞を伴うかもしくは伴わない局所形態、または筋肉内形態でも投与可能であり、用いられる形態はいずれも医薬の分野において当業者に良く知られている。有効であるが有毒でない量の所望化合物をＧｌｕＣｌ調節剤として用い得る。
化合物の１日当たりの用量は、患者１人につき０．００１ｍｇから１，０００ｍｇまでの広い範囲にわたって様々となり得る。経口投与用組成物は好ましくは、治療するべき患者への投与量を症状に応じて調節できるように、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０及び５０．  ０ｍｇの活性成分を含有する刻み目の入ったまたは刻み目のない錠剤の形態で提供する。通常、有効量の薬物を１日当たり体重１ｋｇにつき約０．０００１〜約１００ｍｇの投与レベルで供給する。所望の作用が得られるように配合する場合は、ＧｌｕＣｌ受容体調節因子の用量を調節する。他方、配合する様々な薬物の用量を独立に最適化して組み合わせ、それによっていずれの薬物を単独使用した場合よりも病因が減少する相乗的な成果を挙げることも可能である。
本発明の方法において活性である化合物は、１日分の用量をただ１回で投与するか、または１日２回、３回もしくは４回に分けて投与すると有利である。そのうえ、本発明の方法において活性である化合物は、適当な鼻腔内用賦形剤の局所使用を介して鼻腔内形態で投与したり、当業者に良く知られた経皮投与用皮膚パッチの形態を用いて経皮経路から投与したりできる。経皮送達系の形態での投与では当然ながら、用量は投与方式全体を通して断続的にではなく連続的に投与される。
２種以上の活性物質を別個の投与製剤中に存在させて用いる組み合わせ治療では前記活性物質を同時に投与し得、または各活性物質を別々にずらした時点に投与し得る。
本発明の方法において活性である化合物の投与方式は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別及び病状；  治療するべき状態の重篤度；  投与経路；  患者の腎及び肝機能；  並びに用いる特定の化合物を含めた様々な要因に従って選択する。通常の医師または獣医師であれば、状態の進行を予防し、打ち消し、または阻止するのに必要な薬物の有効量を容易に決定及び処方し得る。毒性を伴わない効力をもたらす範囲内の薬物濃度を達成するのに最適の精度の実現には、標的部位に対する薬物の有効性の動力学に基づく投与方式が必要である。このような方式では、薬物の分布、平衡及び排除が考慮される。
本発明の方法では該方法において活性である化合物が活性成分を構成し得、この化合物は典型的には、所期の投与形態、即ち経口用の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤等のために適宜選択された、通常の調剤法で実際に用いられる適当な医薬用稀釈剤、賦形剤またはキャリヤ（本明細書中ではまとめて「キャリヤ」物質と呼称）と混合して投与される。
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態で経口投与する場合は活性薬物成分をエタノール、グリセロール、水等といった、無毒で医薬に許容可能な経口用不活性キャリヤと組み合わせ得る。そのうえ、所望または必要であれば、適当な結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び着色剤も混合物に添加し得る。適当な結合剤には、澱粉、ゼラチン、グルコースまたはβ−ラクトースといった天然糖、コーン甘味剤、アラビアゴム、トラガカントゴムまたはアルギン酸ナトリウムといった天然及び合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋等が非限定的に含まれる。上記投与形態に用いられる滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が非限定的に含まれる。崩壊剤には、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴム等が非限定的に含まれる。
液体形態の場合は活性薬物成分を、適宜香味付けした合成及び天然ゴム、例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、メチルセルロース等といった懸濁化剤または分散剤中に加え得る。用い得る他の分散剤にグリセリン等が含まれる。非経口投与の場合は滅菌懸濁液剤及び溶液剤が望ましい。静脈内投与が望ましい場合には、通常適当な防腐剤を含有する等張製剤を用いる。
活性薬物成分を含有する局所用製剤は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、ＰＰＧ２プロピオン酸ミリスチル等の当業者に良く知られた様々なキャリヤ物質と混合して、例えばアルコール性溶液剤、局所用清浄剤、清浄化クリーム剤、皮膚用ゲル剤、皮膚用ローション剤、及びクリーム剤またはゲル剤状のシャンプー剤とし得る。
本発明の方法において活性である化合物は、小さな単ラメラ小胞、大きな単ラメラ小胞、及び多重ラメラ小胞などのリポソーム送達系の形態でも投与できる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンといった様々なリン脂質から形成可能である。
本発明の方法において活性である化合物は、化合物分子を結合させる個別キャリヤとしてモノクローナル抗体を用いることによっても送達し得る。本発明の方法において活性である化合物は標的指向性薬物キャリヤとしての可溶性ポリマーと結合させることもできる。前記ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシ−プロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルタミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンが含まれ得る。更に、本発明の方法において活性である化合物は薬物の制御放出に有用な生分解性ポリマー類、例えばポリ乳酸、ポリε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーに結合させることも可能である。
本発明の方法において活性である化合物は、ヒト、動物及び植物において多くの寄生虫症を引き起こす内部及び外部寄生虫、特に蠕虫及び節足動物に対する寄生虫駆除薬として有用である。
寄生虫症は内部寄生虫または外部寄生虫によって引き起こされ得る。内部寄生虫とは、宿主の体内で（胃、肺、心臓、腸等のような）臓器内にか、または単に皮下に棲息する寄生虫のことである。外部寄生虫とは、宿主の外表面上に棲息するが栄養は宿主から摂取する寄生虫のことである。
通常蠕虫病と呼称される内部寄生虫症は、宿主が蠕虫として知られている寄生虫に感染することによって引き起こされる。蠕虫病は、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、イヌ、ネコ及び家禽などの家畜の感染に起因して、普遍的でかつ重大な世界規模の経済問題である。上記感染の多くは、世界中の様々な動物種において疾患の原因となる、線虫と呼称される寄生虫群によって引き起こされる。線虫が原因の疾患はしばしば重症で、感染動物を死亡させかねない。先に挙げた動物に感染する線虫で最も一般的なものは、捻転胃虫、毛様線虫、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ属、Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ属、Ｃｏｏｐｅｒｉａ属、カイチュウ、Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ属、Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ属、Ｃｈａｂｅｒｔｉａ属、鞭虫、円虫、Ｔｒｉｃｈｏｎｅｍａ属、Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ属、毛細線虫、Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ属、犬回虫、Ａｓｃａｒｉｄｉａ属、ウマギョウチュウ、ズビニ鉤虫、極東鉤虫、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ属及び馬回虫である。多くの寄生虫が種特異的（ただ１種の宿主にのみ感染）であり、またほとんどの寄生虫は動物体内に好ましい感染部位を有する。即ち、捻転胃虫及びＯｓｔｅｒｔａｇｉａ属は主として胃に感染し、一方Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ属及びＣｏｏｐｅｒｉａ属は大抵腸を冒す。別の寄生虫は心臓、眼、肺、血管等に好んで棲息し、更に別の寄生虫は皮下寄生虫である。蠕虫病は、衰弱、体重減少、貧血、腸傷害、栄養不良、及び他の臓器の障害を招く恐れが有る。これらの疾患は、治療せずに放置すれば動物を死亡させかねない。
外部寄生虫であるマダニ類（ｔｉｃｋｓ）、その他のダニ類（ｍｉｔｅｓ）、シラミ、サシバエ、ツノサシバエ、クロバエ科及びニクバエ科のハエ（ｂｌｏｗ  ｆｌｉｅｓ）、ノミ、並びにＴｅｎｏｐｈａｌｉｄｅｓ属、Ｉｘｏｄｅｓ属、Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ属、Ｌｕｃｉｌｉａ属及びＨｅｍｏｔｏｂｉａ属のような他の吸血昆虫（ｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔｓ）などの節足動物が引き起こす疾患も重大な問題である。上記のような寄生虫による感染及び侵襲は血液の減少、皮膚病変をもたらし、また正常な摂食習慣を妨げ、即ち体重減少を惹起しかねない。上記のような寄生虫への感染によって、致命的となりかねない脳炎、アナプラズマ症、豚痘等の重症疾患が伝播する恐れも有る。本明細書に開示した方法において活性である化合物は上述の感染及び侵襲を予防及び治療するのに有用である。
動物は幾つかの寄生虫種に同時に感染する場合が有り、なぜなら１種の寄生虫への感染によって動物は衰弱し、第二の寄生虫種により感染しやすくなり得るからである。即ち、寄生虫症の治療では広範な活性を有する化合物が特に有利である。本発明の化合物は上述のような寄生虫に対する活性を有し、加えてイヌの犬糸状虫、齧歯類のＮｅｍａｔｏｓｐｉｒｏｉｄｅｓ属及びＳｙｐｈａｃｉａ属、吸血昆虫、並びにウシのＨｙｐｏｄｅｒｍａ属種及びウマのウマバエなどの体内移行性双翅類幼虫に対しても活性である。
本明細書に開示した方法において活性である化合物は、ヒトにおいて寄生虫症を引き起こす内部及び外部寄生虫に対しても有用である。ヒトが感染する内部寄生虫の例には、ズビニ鉤虫、アメリカ鉤虫、カイチュウ、糞線虫、旋毛虫、毛細線虫、鞭虫、ギョウチュウ等の胃腸寄生虫が含まれる。ヒトが感染する内部寄生虫は血中に、または他の臓器においても見出される。そのような寄生虫の例には、フィラリア寄生虫の糸状虫、Ｂｒｕｇｉａ属、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ属等、並びに腸外期の腸寄生虫のＳｔｒｏｎｇｙｌｉｄｅｓ属及び旋毛虫が有る。ヒトに寄生する外部寄生虫にはマダニ類、ノミ、マダニ類以外のダニ類、シラミ等の節足動物が含まれ、これらの寄生虫への感染は家畜の場合同様、重症で致命的ですらある疾患の伝播を招きかねない。本発明の活性化合物は上記のような内部及び外部寄生虫に対して活性であり、しかもヒトを悩ます吸血昆虫その他の双翅類害虫に対しても活性である。
本明細書に開示した方法において活性である化合物は、Ｂｌａｔｅｌｌａ属種（ゴキブリ）、Ｔｉｎｅｏｌａ属種（イガ）、Ａｔｔａｇｅｎｕｓ属種（ヒメマルカツオブシムシ）、Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）といった通常の家庭内害虫、及びＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  Ｉｎｖｉｃｔａ［トフシアリの一種（ｉｍｐｏｒｔｅｄ  ｆｉｒｅ  ａｎｔ）］に対しても有用である。
本明細書に開示した方法において活性である化合物は更に、アブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｉｏｓｉｐｈｏｎ属種）、イナゴ、ハダニ及びワタミハナゾウムシなどの農業害虫に対して、またＴｒｉｂｏｌｉｕｍ属種及びゴミムシダマシなどの貯蔵穀物を傷める有害昆虫、並びに植物組織上に棲息する未成熟期の昆虫に対しても有用である。本発明の化合物は、農業の分野で重要であり得る、土壌線虫及びＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ属種などの植物寄生虫の防除のための殺線虫剤としても有用である。
動物において寄生虫駆除薬として用いる場合は本発明の化合物を、経口でかもしくは注射によって体内に投与するか、またはドレンチ液剤（ｌｉｑｕｉｄ  ｄｒｅｎｃｈ）もしくはシャンプー剤として局所投与し得る。
経口投与の場合、本明細書に開示した方法において活性である化合物はカプセル剤、錠剤またはボーラスの形態で投与し得、あるいはまた飼料に混入し得る。カプセル剤、錠剤及びボーラスは、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたはリン酸二カルシウムといった適当なキャリヤ賦形剤と組み合わせられた活性成分から成る。これらの単位投与形態は、活性成分を稀釈剤、充填剤、崩壊剤及び／または結合剤を含めた適当な微粉状不活性成分と、均一混合物が得られるように十分混合することによって調製する。不活性成分とは、本発明の化合物と反応せず、かつ治療する動物に対して有毒でない成分のことである。適当な不活性成分に、澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性のゴム質及び油等が含まれる。上記製剤は、治療するべき動物種の大きさ及びタイプ並びに感染の種類及び重篤度などの多くの要因に応じて様々に変化し得る量の活性及び不活性成分を含有し得る。活性成分を飼料への添加物として投与することも、単に本発明の化合物を飼料と混合するか、または本発明の化合物を飼料の表面に適用することによって可能である。あるいはまた、活性成分を不活性キャリヤと混合してもよく、このようにして得られた組成物は飼料と混合し、または直接動物に与える。適当な不活性キャリヤに、コーンミール、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）ミール、発酵残留物、大豆粗粒（ｇｒｉｔｓ）、乾燥穀粒等が含まれる。活性成分を上記のような不活性キャリヤと、粉砕、攪拌、磨砕またはタンブリングによって十分に混合し、それによって０．００１〜５重量％の活性成分を含有する最終組成物を得る。
あるいは他の場合には、本明細書に開示した方法において活性である化合物を、不活性液体キャリヤに溶解した活性成分から成る製剤の注射によって非経口投与する。注射は、筋肉内、反芻胃内（ｉｎｔｒａｒｕｍｉｎａｌ）、気管内または皮下注射とし得る。注射用製剤は、適当な不活性液体キャリヤと混合された活性成分から成る。許容可能な液体キャリヤに、落花生油、綿実油、胡麻油等といった植物油及びソルケタール、グリセロール、ホルマール等といった有機溶媒が含まれる。代替物として、水性の非経口用製剤を用いることも可能である。液体キャリヤとして好ましいのは植物油である。注射用製剤は、最終製剤が０．００５〜１０重量％の活性成分を含有するようにして活性成分を液体キャリヤ中に溶解または懸濁させることによって調製する。
本明細書に開示した方法において活性である化合物の局所適用は、水性の溶液剤、分散液剤または懸濁液剤状の、本発明の化合物を含有するドレンチ液剤またはシャンプー剤を用いることによって可能となる。前記のような製剤は通常、ベントナイトなどの懸濁化剤、湿潤剤または類似の賦形剤を含有し、かつ普通は消泡剤も含有する。０．００１〜１重量％の活性成分を含有する製剤が許容可能である。好ましい製剤は、０．０１〜１重量％の活性化合物を含有するものである。
本明細書に開示した方法において活性である化合物は主として、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ及び家禽などの家畜の蠕虫病を治療及び／または予防するのに用いる寄生虫駆除薬として有用である。この化合物は、上記のような家畜のマダニ類、その他のダニ類、シラミ、ノミ等といった外部寄生虫への感染を予防及び治療するのにも有用である。この化合物はヒトの寄生虫感染の治療にも有効である。そのような感染の治療では上記化合物を個別に、または別の上記化合物とかもしくは関連性の無い他の寄生虫駆除薬と組み合わせて用い得る。最良の結果を得るのに必要な化合物用量は、動物の種及び大きさ、感染の種類及び重篤度、投与方法並びに用いる化合物などの幾つかの要因によって左右される。本発明の化合物は通常、動物の体重１ｋｇ当たり０．０００５〜１０ｍｇの投与レベルで一度に、または数日置きに数回に分けて経口投与すると良い結果をもたらす。普通、いずれか１種の本発明の化合物の一回投与によって優れた防除を達成できるが、再感染に対処したり、異例に耐性である寄生虫種を防除したりする場合は反復投与を行ない得る。上述のような化合物を動物に投与する技術は獣医学分野の当業者に公知である。
本明細書に開示した方法において活性である化合物は、作物を圃場において、または貯蔵中に傷める農業害虫への対処にも用い得る。この化合物は、成長中の植物、または収穫した作物に対して噴霧剤、散布剤、乳濁液剤等を用いる場合に適用する。本発明の化合物を前記のように適用する技術は農業分野の当業者に公知である。
本発明を、以下の実施例によって非限定的に詳述する。
実施例１
ショウジョウバエＲＮＡ単離
キイロショウジョウバエのＯｒｅｇｏｎ  Ｒ系統の頭部からポリ（Ａ）+ＲＮＡを調製した。上記頭部を液体Ｎ2中で急速冷凍し、液体Ｎ2中に沈めたままで乳鉢及び乳棒で粉砕した。粉末状の凍結ショウジョウバエ組織を、４Ｍチオシアン酸グアニジニウムと、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）と、０．１Ｍ  β−メルカプトエタノールとを含有する溶液に添加し（溶液１０ｍｌ当たり組織１ｇ）、これをポリトロンホモジナイザーで混合した。１分間ホモジナイズした後、０．５％ナトリウムサルコシルを添加して十分に混合し、溶液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を５．７Ｍ  ＣｓＣｌクッション上に重層させ、３３，０００ｒｐｍで１８時間遠心した。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、Ｈ2Ｏ中に再懸濁させ、４：１のクロロホルム：イソブタノールで抽出し、エタノールで沈澱させた。オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム上での精製ラウンドを２回行なってポリ（Ａ）+ＲＮＡを単離した。
実施例２
ショウジョウバエＧｌｕＣｌ  ＰＣＲ生成物のクローニング及び特性解明
ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー
5′TGGGT(AGCT)(TA)(CG)(AGCT)TT(CT)TGGTT-3′
（配列番号１；  プライマー１）及び
5′GC(TGCA)CC(TGA)ATCCA(TGCA)AC(GA)TC(TGA)AT-3′
（配列番号２；  プライマー２）を低ストリンジェンシーＰＣＲ反応に用いてショウジョウバエＧｌｕＣｌ遺伝子配列を増幅した。上記オリゴヌクレオチドは、Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧｌｕＣｌα遺伝子のＭ１及びＭ３ドメインに存在するアミノ酸配列をコードする（Ｃｕｌｌｙ等，上掲誌）。ショウジョウバエポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Ｈ2Ｏ  １７μｌ中に１μｇ）を６５℃で３分間加熱してから氷上に置いた。氷上に、３μｌのＲＮアシン（ＲＮａｓｉｎ）（４０単位／μｌ）、８μｌの５倍ＲＴ緩衝液（２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ＢＲＬ）、４μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、４μｌの２０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌの２０μＭプライマー２オリゴヌクレオチド、及び０．５μｌの２００単位／μｌのモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を添加した。反応混合物を４２℃で９０分間インキュベートし、その後６５℃で１０分間加熱することによって反応を停止させた。得られた第１鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡを次のようにしてポリメラーゼ連鎖反応に用いた。Ｔａｑ反応緩衝液（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、４００μＭ  ｄＮＴＰ）中の２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）を含有する反応混合物５０μｌ中で３μｌのｃＤＮＡを１．２μＭの各プライマー（ＤＮＡ配列１及び２）及び２０μＣｉの32Ｐ−ｄＣＴＰと共にインキュベートした。反応混合物のインキュベーションは、９４℃（１分間）、３７℃（２分間）、７２℃（３分間）のサイクルを２５回実施するようにプログラムしたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓサーモサイクラーで行なった。反応混合物を１μｇのｔＲＮＡ、１／１０体積部の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２体積部の１００％エタノールと混合し、−２０℃で１６時間インキュベートし、１１，０００×ｇで３０分間遠心し、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを脱水して３μｌのＨ2Ｏ及び３μｌの停止溶液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）中に再懸濁させ、７０℃で２分間加熱し、６％アクリルアミドゲル−尿素配列決定ゲル（Ｍａｎｉａｔｉｓ）上でキシレンシアノールマーカーがゲル（４０ｃｍ）の底部に達するまで電気泳動させた。対照ＤＮＡを配列決定し（ＵＳＢ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡ配列決定キット）、サイズマーカーとしてゲル上を移動させた。ゲルを取り出し、１０％メタノール、７％酢酸に１５分間浸漬し、Ｗｈａｔｍａｎ  ３ｍｍ濾紙に移し、乾燥し、Ｘ線フィルムに対して曝露した。１５２塩基の領域に対応するゲルを切り取り、４００μｌのＨ2Ｏに２２℃で２時間浸漬した。溶離したＤＮＡ（３０μｌ）を、Ｔａｑ反応緩衝液、１．０μＭの各プライマー（ＤＮＡ配列１及び２）及び５単位のＴａｑポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物１００μｌ中に鋳型として用いた。サーモサイクラーは先に述べたのと同様にプログラムした。このようにして得られたＰＣＲ反応生成物の３０μｌアリコートを、同等の第二のＰＣＲ反応のための鋳型として用いた。
反応混合物から１５２ｂｐのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、１／１０体積部の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２体積部の１００％エタノールを用いて−２０℃で１６時間沈澱させ、１１，０００×ｇで３０分間遠心し、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを脱水して１０μｌのＴＥ（ｐＨ８．０のトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、４％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＴＡＥ（４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）上で電気泳動させた。ＤＮＡ断片をゲルから切り取り、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片を、ＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いてｐＣＲベクター中に連結した。連結ＤＮＡを、先に述べたのと同様に１／１０体積部の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２体積部の１００％エタノールを用いて沈澱させ、−２０℃でインキュベートし、遠心し、洗浄し、２μｌの水中に再懸濁させた。ＤＮＡの１μｌアリコートで４０μｌのＩＮＶαＦ′エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を、２．５ｋＶ、キャパシタンス２５μＦ及び抵抗２００ΩのＧｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いるエレクトロポレーションによって形質転換し、その後１ｍｌのＳＯＣ培地（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含有するＬＢ寒天プレート上に播種し、３７℃で１８時間インキュベートした。白色のコロニーを取り出し、そのうちの、約１５２塩基対の挿入部分を有するベクターをそれぞれ保持する１０のコロニーにおいて、ＵＳＢ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡ配列決定キットを用いて配列決定を行なった。完全長ｃＤＮＡクローンを同定するプローブとしてクローンｐＰＣＲ−２を選択した。ｐＰＣＲ−２のＤＮＡ配列は配列番号４の配列であり、この配列は予測されるアミノ酸配列
WVTFWLDQGAVPARVSLGVTTLLTMATQTSGINASLPPVSYTKAIDVWIG
（配列番号３）を有するペプチドをコードする。
実施例３
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの単離及び同定
ショウジョウバエのＯｒｅｇｏｎ  Ｒ系統の頭部からｃＤＮＡライブラリーを、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）クローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に作製した。このライブラリーで大腸菌ＢＢ４細胞をトランスフェクトし、この細胞をＮＺＹ培地（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）上に播種し、３７℃で１８時間インキュベートした。得られたプラークをＤｕｒｕｌｏｓｅ膜（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に移した。膜をプレハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、２倍Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ試薬、５倍ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌニシン精子一本鎖ＤＮＡ）中で４２℃で１６時間プレハイブリダイズさせ、その後ランダムプライミング式ＤＮＡ標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてランダムプライミングにより32Ｐ−ｄＣＴＰで標識したクローンｐＰＣＲ−２のＥｃｏＲＩ挿入断片を２×１０7ｃｐｍ含有する５０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（１０％のデキストラン硫酸を含有するプレハイブリダイゼーション溶液）中で４２℃で６５時間ハイブリダイズさせた。膜をＸ線フィルムに対して曝露した。３６個の陽性ファージクローンを同定し、これらをＳｔｒａｔａｇｅｎｅプロトコルによるようなｉｎ  ｖｉｖｏ切り出しによってプラスミドに変換した。或るクローン即ちｐＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌは３９５８塩基の挿入部分を有することが判明した。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの配列を図１に示す。
実施例４
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌチャンネルの一次構造
ｐＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌはそのヌクレオチド配列から、約１５１８塩基対から成るただ一つの大型の読み取り枠を有することが判明した。このｃＤＮＡは約２５４ヌクレオチドから成る５′非翻訳延長部分と、約２１８６ヌクレオチドから成る３′非翻訳領域とを有する。最初の枠内メチオニン（塩基４０５）が、終結コドンＴＡＡ（塩基１７７３）において終わる読み取り枠の開始コドンとして指示された。予測されるＧｌｕＣｌタンパク質（図２）は約５２，３４４Ｄａの推定分子質量（Ｍr）を有する。このタンパク質は疎水性アミノ末端残基を、アミノ酸２３辺りで始まる成熟タンパク質をもたらすシグナル切断部位を強力に予兆する配列で有する。
予測されるＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質をヌクレオチド及びタンパク質データベースと突き合わせたところ、Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧｌｕＣｌα、ＧｌｕＣｌβ、並びにグリシン及びＧＡＢＡA受容体と関連することが判明した。前記チャンネル類において見出される大型ＮＨ2末端細胞外ドメイン及び四つの疎水性膜貫通ドメインＭ１〜Ｍ４などの保存モチーフがＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ配列中にも見出された。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質は、リガンドゲートを具えた塩素イオンチャンネル総ての細胞外ドメインに存在する保存システイン残基を有していた。更に２個のシステイン残基（アミノ酸３５６及び３６７）が存在したが、これらはグリシン依存性塩素イオンチャンネル並びにＣ．  ｅｌｅｇａｎｓのＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβにおいても見出される。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質は、推定膜貫通領域Ｍ３とＭ４との間に位置するプロテインキナーゼＣリン酸化部位に関して二つの強いコンセンサス配列を有していた。ＧＡＢＡA受容体タンパク質のＭ３とＭ４との間の細胞内ドメインにも類似のリン酸化部位が存在し、この部位はチャンネル調節に関与すると考えられる（Ｎ．  Ｊ．  Ｌｅｉｄｅｎｈｅｉｍｅｒ，  Ｓ．  Ｊ．  ＭｃＱｕｉｌｋｉｎ，  Ｌ．  Ｄ．  Ｈａｈｎｅｒ，  Ｐ．  Ｗｈｉｔｉｎｇ及びＲ．  Ａ．  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  ４１，  ｐｐ．１１１６−１１２３，  １９９２；  Ｓ．  Ｋｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｐ．  Ｍａｌｈｅｒｂｅ及びＥ．  ｓｉｇｅｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７，  ｐｐ．２４６６０−２５６６３，  １９９２）。上記ＧｌｕＣｌタンパク質は先に挙げた細胞外ドメイン内に、ＧＡＢＡA及びグリシン受容体配列中に見出される推定Ｎ連結グリコシル化部位を有していた。
完全なＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質配列、Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβタンパク質、ＧＡＢＡA及びグリシン受容体タンパク質、並びに関連する無脊椎動物タンパク質配列に関して系統発生学的分析を行なった（図５）。上記タンパク質類が進化によってそれぞれに分かれる様子を、ＧＡＢＡAα及びγタンパク質をその他のタンパク質から分かれさせた２本の大枝への分岐によって示した。前記大枝は更に小枝に分岐しており、これらの小枝によってタンパク質は、ＧＡＢＡAα、β、γ、δ、ρ、並びにグリシンα及びβなどの各サブクラスに分類される。
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質はＣ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβ、グリシンα及びβ、Ｌｙｍζ並びにＤｒｏｓ  ｒｄｌタンパク質と系統発生学的的に関連するが、これらのタンパク質は薬理学的にはＧｌｕＣｌタンパク質と区別される一つのグループを成す。アフリカツメガエル卵母細胞における発現研究によれば、機能性同価同義塩素イオンチャンネルはグリシンに対して感受性であるグリシンαタンパク質（Ｖ．  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｎ，  Ｇ．  Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ，  Ｐ．  Ｒ．  Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ及びＨ．  Ｂｅｔｚ，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８，  ｐｐ．６９５−７００，  １９８９）及びＧＡＢＡに対して感受性であるＤｒｏｓ  ｒｄｌタンパク質（Ｒ．  Ｈ．  Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，  Ｔ．  Ａ．  Ｒｏｃｈｅｌｅａｕ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｓｔｅｉｃｈｅｎ及びＡ．  Ｅ．  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３，  ｐｐ．４４９−４５１，  １９９３）によって形成される。同価同義グリシンβチャンネルは非常に低効率で形成され（Ｇ．  Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ等，  Ｎｅｕｒｏｎ  ４，  ｐｐ．９６３−９７０，  １９９０）、またＬｙｍζタンパク質は機能性同価同義チャンネルを形成しない（Ｍ．  Ｌ．  Ｈｕｔｔｏｎ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｈａｒｖｅｙ，  Ｆ．  Ｇ．  Ｐ．  Ｅａｒｌｅｙ，  Ｅ．  Ａ．  Ｂａｒｎａｒｄ及びＭ．  Ｇ．  Ｄａｒｌｉｓｏｎ，  ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ３２６，  ｐｐ．１１２−１１６，  １９９３）。
実施例５
アフリカツメガエル卵母細胞におけるＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質の発現
クローンｐＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌを制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩでの消化によって直鎖状にした。４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と、６ｍＭ  ＭｇＣｌ2と、２ｍＭスペルミジンと、１０ｍＭ  ＮａＣｌと、１０ｍＭ  ＤＴＴと、０．０５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンと、２単位／μｌ  ＲＮアシンと、各８００μＭのＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰと、２００μＭ  ＧＴＰと、８００μＭ  ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇと、５μＣｉ  32Ｐ−ＣＴＰと、５０単位のＴ３ＲＮＡポリメラーゼとを含有する最終体積５０μｌの反応混合物中で０．５μｇの上記プラスミドからｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡを合成した。反応混合物を３７℃で３時間インキュベートし、その後２０単位のＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼを加えて更に１５分間インキュベートし、フェノール、フェノール：クロロホルム、クロロホルムで抽出した。１／１０体積部の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５体積部の１００％エタノールを用いてＲＮＡを沈澱させ、これを−２０℃で１６時間貯蔵し、７０％エタノールで洗浄し、１ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に再懸濁させてアフリカツメガエル卵母細胞内に注入した。
アフリカツメガエル卵母細胞の調製と該細胞内へのＲＮＡ注入は、これまでに文献に記載されていて当業者に公知である標準的な方法を用いて行なった（Ｊ．  Ｐ．  Ａｒｅｎａ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ及びＤ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４０，  ｐｐ．３６８−３７４，  １９９１；  Ｊ．  Ｐ．  Ａｒｅｎａ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｒｅｓｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ及びＤ．  Ｆ．  Ｃｕｌｌｙ，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  １５，  ｐｐ．３３９−３４８，  １９９２）。成体の雌アフリカツメガエルに０．１７％トリカイン（ｔｒｉｃａｉｎｅ）メタンスルホネートで麻酔を掛け、外科手術により卵巣を取り出して、８２．５ｍＭ  ＮａＣｌと、２ｍＭ  ＫＣｌと、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2と、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2と、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳとから成る混合物（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調節；  ＯＲ−２）を収容した皿に入れた。卵巣葉を切開（ｂｒｅａｋ  ｏｐｅｎ）し、数回濯ぎ、０．２％のコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ；  １Ａ型）を含有するＯＲ−２中で２〜５時間穏やかに振盪した。約５０％の卵胞層を除去したところで第Ｖ期及び第VI期卵母細胞を選択し、注入前に２４〜４８時間、８６ｍＭ  ＮａＣｌと、２ｍＭ  ＫＣｌと、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2と、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2と、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳと、２．５ｍＭピルビン酸Ｎａと、０．５ｍＭテオフィリンと、０．１ｍＭゲンタマイシンとから成る培地（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調節；  ＮＤ−９６）中に置いた。卵母細胞に５０ｎｌのＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ＲＮＡ（０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ）を注入した。対照卵母細胞には５０ｎｌの水を注入した。卵母細胞をＮＤ−９６中で２〜１０日間インキュベートしてから記録を取った。インキュベーション及びコラゲナーゼ消化は１８℃で行なった。
記録は、１１５ｍＭ  ＮａＣｌと、２ｍＭ  ＫＣｌと、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2と、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2と、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳとから成る標準的なカエル食塩液（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調節）中で室温において取った。卵母細胞を、標準的な二微小電極増幅器（Ｄａｇａｎ  ８５００またはＴＥＶ−２００，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）を用いて電圧固定した。ピペットに３Ｍ  ＫＣｌを満たし、その抵抗を０．５〜３．０ＭΩとした。プレキシグラス製の記録室（容量２００μｌ）には常に１０ｍｌ／分での灌流を行なった。記録室をＡｇ／ＡｇＣｌ電極で接地した。ＴＬ−１インターフェースを具備したＰＣＬＡＭＰ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いてデータを取得及び解析した。固定（ｈｏｌｄｉｎｇ）電位−８０ｍＶにおける膜電流を記録した。薬物感受性電流の強さを、薬物存在下に得られるピーク電流から−８０ｍＶにおける固定電流を減算することによって測定した。データを３０Ｈｚにおいて濾波し、１６．６Ｈｚにおいて標本化した。電流／電圧関係（Ｉ／Ｖ）及び逆転電位（Ｅrev）を、−１１０〜＋８０ｍＶの電圧範囲にわたる１〜３秒電圧ランプを用いて測定した。前記ランプに関しては、データを０．３〜３ｋＨｚにおいてフィルターし、１６０Ｈｚにおいてサンプリングした。薬物無含有溶液中の電流を薬物存在下での電流から減算して、薬物感受性電流／電圧関係を求めた。
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質を発現させる卵母細胞は、急速に活性となり、かつ急速に脱感受性（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ）となるグルタミン酸感受性電流を示した（図３）。グルタミン酸に関するＥＣ50は３０μＭで、その際Ｈｉｌｌ係数は１．３であった。脱感受性となる速度はグルタミン酸の濃度によって左右され、グルタミン酸濃度が高いほど早く脱感受性となった。
ＩＶＭＰＯ4も、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ発現卵母細胞において直接電流を活性化した（図３）。ＩＶＭＰＯ4による電流の活性化は、浴からＩＶＭＰＯ4を洗浄した後１０分もの間不可逆的であった。電流は１μＭ  ＩＶＭＰＯ4によって最大限に活性化され、１０ｎＭでは最強電流の２０〜４０％まで活性化された。
米国特許第５，３９９，５８２号に詳述されている殺虫薬の化合物１（図４）も膜電流を直接活性化した（図３）。化合物１によって発生した電流はゆっくり変化する可逆性を有し、基線値まで完全に戻るのに１０分掛かった。
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌは、グルタミン酸類似体のイボテネート（１００μＭにおいて最大限に活性化）及び関連アミノ酸のアスパラギン酸（１ｍＭにおいて最大限の８％活性化）によっても可逆的に活性化された。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ＲＮＡを注入された卵母細胞は、１ｍＭ以上の濃度で試験したＧＡＢＡ、グリシン、カイネート、ヒスタミン及びＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸に対して非感受性であった。ＩＶＭＰＯ4によって発生した電流は、リガンド依存性塩素イオンチャンネルの遮断薬であるピクロトキシンによって弱く遮断された（５００μＭにおいて１３％遮断）。
実施例６
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの大腸菌発現ベクター中へのクローニング
ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を非限定的に含む大腸菌発現ベクター中にＧｌｕＣｌ発現カセットを移入し、その後大腸菌に組み換えＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質を産生させる。ｐＥＴベクターはＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ発現を、厳密に調節されたバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に置く。上述のように作製した構築物を、誘導性ｌａｃプロモーターによって駆動されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有する大腸菌宿主内に移入し、次に適当なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）を培養物に添加するとＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌの発現が誘導される。発現されたＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌのレベルを、先に述べたアッセイによって測定する。
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌに対応する読み取り枠全体をコードするｃＤＮＡをｐＥＴ［１６］１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。正の向きの構築物を配列解析により同定して、発現宿主株ＢＬ２１の形質転換に用いる。次に、形質転換体を、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質産生のための培養物への接種に用いる。培養物は、その組成が当業者に公知であるＭ９またはＺＢ培地中で増殖させ得る。ＯＤ600＝１．５まで増殖させた後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いてＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌの発現を３７℃で３時間誘導する。
実施例７
哺乳動物細胞系におけるＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌの発現
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＭＡＭｎｅｏ及びｐｃＤＮＡ３中へサブクローン化した。ｐＭＡＭｎｅｏを制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩで消化し、かつＫｌｅｎｏｗ酵素で処理して５′突出部分を満たした。次に、ＤＮＡをＳａｌＩで消化して、１個の平滑末端と１個のＳａｌＩ部位とを有する直鎖状ベクターを創出し、これを仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して自己連結を防止した。ベクターを０．７％アガロースゲル上でゲル精製した。ｐＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌをＳｍａＩ及びＳａｌＩで消化してベクターから挿入部分を取り出し、次いで０．７％アガロースゲル上を移動させて挿入部分を精製した。上記ｃＤＮＡを含む挿入部分を精製したｐＭＡＭｎｅｏベクターに連結し、組換え体を選択し、これを用いて哺乳動物Ｌ細胞をＣａＰＯ4沈澱によってトランスフェクトした。
ｐｃＤＮＡ３をＮｏｔＩで消化し、かつＫｌｅｎｏｗ酵素で処理して５′突出部分を満たした。次に、ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化して、１個の平滑末端と１個のＢａｍＨＩ部位とを有する直鎖状ベクターを創出し、これを仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して自己連結を防止した。ｐＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌをＳａｌＩで消化し、かつＫｌｅｎｏｗ酵素で処理して５′突出部分を満たした。次に、ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化して、ｐｃＤＮＡ３ベクターと相容性である、１個の平滑末端と１個のＢａｍＨＩ部位とを有するｃＤＮＡ断片を創出した。ベクターと挿入部分との両方を０．７％アガロースゲル上でゲル精製し、その後両者を連結した。組換え体を選択し、これを用いて哺乳動物Ｌ細胞をＣａＰＯ4沈澱によってトランスフェクトした。
安定な細胞クローンを、Ｇ４１８の存在下での増殖によって選択した。Ｇ４１８耐性の単一クローンを単離したところ、無傷のＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ遺伝子を有することが判明した。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを有するクローンを、ＧｌｕＣｌタンパク質に特異的な抗体を用いる免疫沈降法、ウェスタンブロッティング及び螢光抗体法などの免疫学的技術を用いて発現に関して分析する。抗体は、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ配列から予測したアミノ酸配列に基づき合成したペプチドを接種したウサギから得る。発現の分析は、パッチクランプ式の電気生理学的技術、アニオン流動アッセイ、並びに3Ｈ−イベルメクチン及び3Ｈ−グルタミン酸結合アッセイを用いても行なう。
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌを安定に、または一時的に発現させる細胞を用いて、アベルメクチン、グルタミン酸、化合物１感受性塩素イオンチャンネルの発現、及びリガンド結合活性について試験する。上記細胞を用いて上記以外の化合物を同定し、かつ当該化合物が有する、アベルメクチン、グルタミン酸、化合物１感受性塩素イオンチャンネルを調節し、阻害し、または活性化する能力、及び結合に関してアベルメクチン、グルタミン酸、化合物１と競合する能力を調べる。上記細胞を用いて、ＧｌｕＣｌ活性を調節する上記以外の化合物をアニオン流動アッセイで同定及び試験する。
プロモーターに対して正の向きを有するＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを含むカセットをプロモーターの３′に位置する適当な制限部位に連結し、制限部位マッピング及び／または配列決定によって同定する。このようにして得られたｃＤＮＡ発現ベクターを線維芽細胞である宿主細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ１６５１）、及びＣＶ−１  ｔａｔ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８，  ｐ．１５７５，  １９８７）、２９３，Ｌ（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ６３６２）内に、エレクトロポレーションや化学的操作（カチオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を非限定的に含む標準的な方法で導入する。トランスフェクトした細胞及び細胞培養上清を回収し、先に述べたようにしてＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ発現に関し分析し得る。
哺乳動物移行（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現に用いられるベクターは総て、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌを発現させる安定な細胞系の樹立に用いることができる。発現ベクター中へクローン化した、改変していないＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ構築物は宿主細胞を、ＤｒｏｓＧｌｕＣｌタンパク質を産生するようにプログラムすると予測される。加えて、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ構築物を分泌タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡに連結すれば、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌは分泌タンパク質として細胞外で発現される。トランスフェクション宿主細胞には、ＣＶ−１−Ｐ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８，  ｐ．１５７５，  １９８７）、ｔｋ−Ｌ（Ｗｉｇｌｅｒ等，  Ｃｅｌｌ  １１，  ｐ．２２３，  １９７７）、ＮＳ／０、及びｄＨＦｒ−ＣＨＯ（Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９，  ｐ．６０１，  １９８２）が非限定的に含まれる。
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを含む任意のベクターと、Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；  ヒグロマイシン、ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；  ＡＰＲＴ、キサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを非限定的に含む薬物選択プラスミドとで同時トランスフェクションを行なえば、安定にトランスフェクトされたクローンを選択することができる。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌのレベルは本明細書中に述べたアッセイで測定する。
ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ構築物を、可能な最高レベルのＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌを合成する哺乳動物細胞クローンの作製に用いられる、増幅可能な薬物耐性マーカーを有するベクター中にも連結する。このようにして得られた構築物を細胞内に導入した後、プラスミドを有するクローンを適当な物質を用いて選択し、前記物質の用量を徐々に増やしながら選択することによって高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローンを単離する。
組み換えＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌの発現は、哺乳動物宿主細胞を完全長Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡでトランスフェクトすることによって実現できる。
実施例８
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの、昆虫細胞における発現に用いられるバキュロウイルス発現ベクター中へのクローニング
ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルスベクターを、昆虫細胞のＳｆ９系（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ１７１１）においてｃＤＮＡの高レベル発現を実現するように設計する。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを発現させる組み換えバキュロウイルスを、次の標準的な方法（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｘｂａｃ  Ｍａｎｕａｌ）で作成する。Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０及びＢｌｕｅＢａｃベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を含めた様々なバキュロウイルス移入ベクター中のポリヘドリン遺伝子中に連結する。バキュロウイルス移入ベクターと直鎖状ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ（Ｐ．  Ａ．  Ｋｉｔｔｓ，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １８，  ｐ．５６６７，  １９９０）とでＳｆ９細胞を同時トランスフェクトした後に相同組み換えを行なうことによって組み換えバキュロウイルスを発生させる。組み換えｐＡＣ３６０ウイルスは感染細胞内に封入体が存在しないことによって同定し、組み換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に基づいて同定する（Ｍ．  ．Ｄ．  Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＧ．  Ｅ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐ．  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，  Ｎｏ．１５５５）。プラーク精製後、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ発現を本明細書中に述べたアッセイによって測定する。
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌに対応する読み取り枠全体をコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃIIのＢａｍＨＩ部位に挿入する。正の向きの構築物を配列解析により同定して、直鎖状ＡｃＮＰＶ野生型（ｍｉｌｄ  ｔｙｐｅ）ＤＮＡの存在下にＳｆ９細胞をトランスフェクトするのに用いる。
真正の活性Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌは感染細胞の細胞質中に見出される。感染細胞から活性Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌを、低張溶解または洗浄剤溶解によって抽出する。
実施例９
Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの酵母発現ベクター中へのクローニング
最適のＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡシストロンを、異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を導くように設計した発現ベクターに挿入し、その後酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに組み換えＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌを産生させる。細胞内発現のためには、ＥｍＢＬｙｅｘ４等のようなベクターをＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌシストロンに連結する（Ｕ．  Ｒｉｎａｓ等，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，  ｐｐ．５４３−５４５，  １９９０；  Ｂ．  Ｈｏｒｏｗｉｔｚ等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ｐｐ．４１８９−４１９２，  １９８９）。細胞外発現のためにはＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌシストロンを、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質のＮＨ2末端に分泌シグナル（酵母または哺乳動物ペプチド）を融合させる酵母発現ベクター中に連結する（Ｍ．  Ａ．  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｇｅｎｅ  ８５，  ｐｐ．５１１−５１６，  １９８９；  Ｌ．  Ｒｉｅｔｔ及びＮ．  Ｂｅｌｌｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２８，  ｐｐ．２９４１−２９４９，  １９８９）。
上記のようなベクターには、ヒト血清アルブミンシグナルをｃＤＮＡ発現物と融合させるｐＡＶＥ１＞６（Ｏ．  Ｓｔｅｅｐ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，  ｐｐ．４２−４６，  １９９０）、及びヒトリゾチームシグナルをｃＤＮＡ発現物と融合させるベクターｐＬ８ＰＬ（Ｙ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２８，  ｐｐ．２７２８−２７３２）が非限定的に含まれる。加えて、ベクターｐＶＥＰを用いてＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌを酵母において、ユビキチンと結合した融合タンパク質として発現させる（Ｄ．  Ｊ．  Ｅｃｋｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４，  ｐｐ．７７１５−７７１９，  １９８９；  Ｅ．  Ａ．  Ｓａｂｉｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，  ｐｐ．７０５−７０９，  １９８９；  Ｄ．  Ｐ．  ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ９，  ｐｐ．５５１７−５５２３，  １９８９）。発現されたＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌを本明細書中に述べたアッセイによって測定する。
実施例１０
組み換えＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌの精製
遺伝的組み換えによって産生されたＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌは、抗体アフィニティークロマトグラフィーによって精製可能である。
抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化したゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ抗体を添加することにより、Ｄｒｏｓ  ＧｌｕＣｌ抗体アフィニティーカラムを作製する。次に、スペーサーアームが介在するアミド結合によって抗体とゲルとを結合させる。その後、残存する活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で反応停止させる。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、結合しなかった抗体や生体外タンパク質を除去する。次に、カラムを洗浄剤などの適当な膜溶解剤と混合したリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．３）中で平衡させ、このカラムに、可溶化されたＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌを含有する細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくり通す。その後、カラムを洗浄剤と混合したリン酸緩衝食塩液で、光学密度（Ａ２８０）が低下してバックグラウンドに達するまで洗浄してからタンパク質を、洗浄剤と混合した０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離する。このように精製したＤｒｏｓ  ＧｌｕＣｌタンパク質をリン酸緩衝食塩液に対して透析する。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0003862278.tif 000002
配列番号：２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0003862278.tif 000003
配列番号：３
配列の長さ：５０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003862278.tif 000004
配列番号：４
配列の長さ：１５２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0003862278.tif 000005
配列番号：５
配列の長さ：３９５８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0003862278.tif 000006
0003862278.tif 000007
0003862278.tif 000008
配列番号：６
配列の長さ：４５６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
0003862278.tif 000009
0003862278.tif 000010
【図１Ａ】
0003862278.tif 000011
【図１Ｂ】
0003862278.tif 000012
【図２】
0003862278.tif 000013
【図３Ａ】
0003862278.tif 000014
【図３Ｂ】
0003862278.tif 000015
【図３Ｃ】
0003862278.tif 000016
【図４】
0003862278.tif 000017
【図５】
0003862278.tif 000018