(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
0003789134.tif 000014
（式中、Ｒ1およびＲ2は同一又は異なってSO3H又はＨを表し、Ｘはグルタミン又は単結合を表し、Ｚ1はバリン又はイソロイシンを表し、Ｚ2はセリン又はトレオニンを表し、ＹはOH又はNH2を表す）で表されるペプチド。
【請求項２】
下記の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれる請求項１記載のペプチド。
（ａ）Ｒ1およびＲ2がSO3Hであり、Ｘがグルタミンであり、Ｚ1がイソロイシンであり、Ｚ2がトレオニンであり、ＹがOHであるペプチド
（ｂ）Ｒ1およびＲ2がSO3Hであり、Ｘが単結合であり、Ｚ1がイソロイシンであり、Ｚ2がトレオニンであり、ＹがOHであるペプチド
（ｃ）Ｒ1およびＲ2がSO3Hであり、Ｘがグルタミンであり、Ｚ1がイソロイシンであり、Ｚ2がトレオニンであり、ＹがNH2であるペプチド
（ｄ）Ｒ1およびＲ2がSO3Hであり、Ｘがグルタミンであり、Ｚ1がバリンであり、Ｚ2がトレオニンであり、ＹがOHであるペプチド
（ｅ）Ｒ1およびＲ2がSO3Hであり、Ｘがグルタミンであり、Ｚ1がイソロイシンであり、Ｚ2がセリンであり、ＹがOHであるペプチド
（ｆ）Ｒ1がSO3Hであり、Ｒ2がＨであり、Ｘがグルタミンであり、Ｚ1がイソロイシンであり、Ｚ2がトレオニンであり、ＹがOHであるペプチド
（ｇ）Ｒ1がＨであり、Ｒ2がSO3Hであり、Ｘがグルタミンであり、Ｚ1がイソロイシンであり、Ｚ2がトレオニンであり、ＹがOHであるペプチド
（ｈ）Ｒ1およびＲ2がＨであり、Ｘがグルタミンであり、Ｚ1がイソロイシンであり、Ｚ2がトレオニンであり、ＹがOHであるペプチド
【請求項３】
請求項１又は２記載のペプチドを含有することを特徴とする植物成長剤。
【請求項４】
式
H-Tyr-Z1-Tyr-Z2-X-Y
（式中、Ｘはグルタミン又は単結合を表し、Ｚ1はバリン又はイソロイシンを表し、Ｚ2はセリン又はトレオニンを表し、ＹはOH又はNH2を表す）で表されるペプチド骨格を合成した後、スルホン酸基をチロシン残基の側鎖に結合させうる酵素によるスルホン酸化を行うことを特徴とする、請求項１記載のペプチド（ただし、Ｒ1およびＲ2がＨで表されるペプチドを除く）の製造方法。
【請求項５】
植物から細胞を採取し、採取した細胞を培地に移植して培養し、培養終了後に細胞と培養液を分離して調製培養液を得ることを特徴とする、式
0003789134.tif 000015
（式中、Ｘはグルタミン又は単結合を表す）で表されるペプチドを含有する調製培養液の製造方法。
【請求項６】
植物が単子葉植物である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
単子葉植物がアスパラガス、イネ又はトウモロコシである請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法により得られる、式
0003789134.tif 000016
式中、Ｘはグルタミン又は単結合を表す）で表されるペプチドを含有する調製培養液。
【請求項９】
請求項８記載の調製培養液中のペプチドを陰イオン交換樹脂に吸着させ、該樹脂から塩濃度を増加させて該ペプチドの溶出を行うことにより、該ペプチドを回収することを特徴とする、式
0003789134.tif 000017
（式中、Ｘはグルタミン又は単結合を表す）で表されるペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物細胞増殖因子としての性質を有するペプチド類に関する。
背景技術
植物由来の細胞増殖因子としては、オオムギ由来の分子量６００以下の脂溶性脂肪酸〔ジャーナル  オブ  プラント  フィジオロジー、１２１巻、１８１〜１９１頁、１９８５年〕、松由来の分子量１０００以下のオリゴ糖からなる増殖因子〔プラント  セル、ティッシュ  アンド  オルガン  カルチャー、２６巻、５３〜５９頁、１９９１年〕、ニンジン由来の分子量約７００の耐熱性の増殖因子（プラント  サイエンス、５１巻、８３〜９１頁、１９８７年〕、黒メキシコトウモロコシ由来で、分子量１３５０以下、オリゴ糖様の特徴を持ち、ｐＨ5の緩衝液中で陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂に非吸着である増殖因子〔ジャーナル  オブ  プラント  フィジオロジー、１３２巻、３１６〜３２１頁、１９８８年〕が知られている。
公知の植物由来の細胞増殖因子は単離精製が困難であり、該因子を大量に製造する技術も知られていない。植物細胞増殖因子を植物細胞成長剤として使用するためには、大量生産しやすい植物細胞増殖因子を探査する必要がある。
発明の開示
本発明は、式（Ｉ）
0003789134.tif 000002
（式中、Ｒ1又はＲ2は同一又は異なってSO3H又はＨを表し、Ｘはα−アミノ酸又は単結合を表し、Ｚ1およびＺ2は同一又は異なったα−アミノ酸を表し、ＹはOH又はNH2を表す）で表されるペプチドに関する。
以下、式（Ｉ）で表される化合物を化合物（Ｉ）と称す。
式（Ｉ）の各基の定義において、α−アミノ酸とは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等の脂肪族アミノ酸類、セリン、トレオニン等のオキシアミノ酸類、システイン、シスチン、メチオニン等の含イオウアミノ酸類、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸類、アスパラギン、グルタミン等のアミドアミノ酸類、リジン、アルギニン、オルニチン等の塩基性アミノ酸類、フェニルアラニン、チロシン等の芳香族アミノ酸類、ヒスチジン、トリプトファン、プロリン、オキシプロリン等の複素環アミノ酸類があげられる。Ｘにおいては前記α−アミノ酸の中でもアミドアミノ酸類が好ましく、とりわけグルタミンが好ましい。Ｚ1においては前記α−アミノ酸の中でも脂肪族アミノ酸が好ましく、なかでもバリン、イソロイシンがとりわけ好ましい。Ｚ2においては前記α−アミノ酸の中でもオキシアミノ酸類が好ましい。
化合物（Ｉ）は、高等植物からの抽出あるいは通常のペプチド合成法で得ることができる植物細胞増殖因子である。
本発明における細胞増殖因子を抽出する植物としては、アスパラガス、イネ、トウモロコシ等の単子葉植物であればどのようなものでもよく、抽出は、植物体からの水性媒体による抽出法（植物細胞組織培養、原田および駒嶺編、１９７９年、理工学社刊、３８２頁）、培養細胞の培養液からの回収法（植物細胞組織培養、原田および駒嶺編、１９７９年、理工学社刊、２７頁）により行なうことができる。
本発明における植物細胞増殖因子は、すべての植物の細胞増殖を促進するが、とくにアスパラガス、イネ、トウモロコシ等の単子葉植物の細胞増殖促進に優れている。
高等植物からの抽出法は、例えば常法により培養する細胞を採取し（植物細胞組織培養、原田および駒嶺編、１９７９年、理工学社刊、２７頁）、採取した細胞を通常の植物細胞培養に用いる培地（プラントサイエンス、６５巻、１１１〜１７１頁、１９８９年）に移植して、２０〜３０℃、好ましくは２４〜２８℃の温度で８〜１６日間、好ましくは９〜１１日間振盪培養する。振盪培養終了後に細胞と培養液を遠心分離等の操作で分離し、調製培養液（Conditioned Medium、以下にＣＭという）を得る。
DEAE Sephadex A-25、DEAEセルロース、DEAE Sepharose等陰イオン交換樹脂を１０〜１００mMのトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸ナトリウム-炭酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ6.5〜8.0）を用いて膨潤させた後、カラム法又はバッチ法によりＣＭ中の植物細胞増殖因子を吸着させる。次に塩化カリウム、炭酸ナトリウム等の塩濃度を順次１０〜２０００mMまで増加させて溶出を行なうことにより植物細胞増殖因子を回収することができる。植物細胞増殖因子は上記の溶出画分のうち８００〜２０００mMの塩濃度好ましくは１０００〜１２５０mMの塩濃度の領域に溶出される。
得られた画分を、更に透析等により脱塩した後、好ましくはBio-Gel P2、Bio-Gel P4（以上、バイオラド社製）、セファデックスG25（以上、ファルマシア社製）等のゲル浸透カラムにかける。
透析、ゲル浸透画分等で脱塩した活性画分をヌクレオシル-100-C18（ナーゲル社製）、ミクロゾルブPR18（メルク社製）等を担体とする逆層高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）で分離し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有した水−アセトニトリル、水−メタノール、水−エタノール等の溶媒を用いて、保持時間８〜１２分の間に溶出した画分から精製した植物細胞増殖因子を得る。
また、化合物（Ｉ）は“ペプチド合成”泉屋信夫ら著、昭和５０年丸善刊等に記載されたペプチド合成法によりペプチド骨格を合成した後、次いでアリルスルフォトランスフェラーゼ等、スルホン酸基をチロシン残基の側鎖に結合させうる酵素によるスルホン酸化を行い所望のペプチドを製造することができる。
化合物（１）は、植物成長剤として以下のような形態で使用できる。
▲１▼液剤
防腐剤、ｐＨ調整剤を含む水溶液に、化合物（Ｉ）を０．０００１〜１％溶解して植物細胞成長促進剤を製造する。防腐剤としては、ホウ酸、さらし粉、安息香酸、サリチル酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸、プロピオン酸、イソシアヌル酸、亜塩素酸、次亜塩素酸、パラオキシ安息香酸およびそのエステル、ラウリルトリメチルアンモニウム−２，４，５−トリクロロカルボニライト、トリブロモサリチルアニライド，３，４，４′−トリクロロカルボニライド、ヘキサクロロフェン、ビチオノール、クロラミン−Ｔ、クロラミンＢハラゾーン等好ましくはソルビン酸があげられる。ｐＨ調整剤としてはクエン酸塩、リン酸塩等一般に用いられているものを、単独あるいは組み合わせて使用できる。
前記のように製造した液剤を水に１００−１００００倍、好ましくは１０００倍に希釈したものに植物の種子あるいは差し穂等の種苗を浸漬するか、または水耕培の培養液に当該ペプタイドの最終濃度が０．００１から１０ＰＰＭになるよう添加することにより、植物成長剤として用いることができる。
▲２▼ペースト製剤
当該ペプチドを０．０１〜１０ＰＰＭペースト材料に練りこみ植物成長促進剤を製造する。ペースト材料としては脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、ろう、樹脂、プラスチック、グリコール、高級アルコール類、グリセリン等、好ましくはワセリン、ラノリンがあげられる。
前記のように製造したペースト製剤を接ぎ木された植物の接ぎ木部分、あるいは果実の果柄部分、あるいは切断時の切断面等に塗布することにより植物成長剤として用いることができる。
化合物（１）の具体例として
0003789134.tif 000003
等が例示される。
【図面の簡単な説明】
図１はアスパラガス由来の培養細胞のコロニー形成率に対するＣＭ濃度の影響を示す。
図中の符号は、--□--  ＣＭ  25.０％、−◇−  ＣＭ  12.５％、−○−  ＣＭ  6.３％、−△−  ＣＭ  3.１％、−■−  ＣＭ  1.６％、−◆−  コントロールを表す。
図２はアスパラガス由来の培養細胞のコロニー形成率に対する化合物（Ｉ−１）、化合物（Ｉ−２）、化合物（Ｉ−３）、化合物（Ｉ−６）、化合物（Ｉ−７）、化合物（Ｉ−８）の各種濃度の影響を示す。
図中の符号は、−□−  化合物（Ｉ−１）、−◇−  化合物（Ｉ−２）、−○−  化合物（Ｉ−３）、−△−  化合物（Ｉ−６）、−■−  化合物（Ｉ−７）、−◆−  化合物（Ｉ−８）、
図３は（ａ）DEAE Sephadex A-25イオン交換クロマトグラフィー、（ｂ）Bio-Gel P-2 extra fineクロマトグラフィー、（ｃ）Devlosil ODS-HG-5逆層ＨＰＬＣにおける植物細胞増殖因子の溶出挙動を示す。
図中の符号は、□  コロニー形成率、−吸光度（２２０nm）を表す。
発明を実施するための最良の形態
以下に本願発明の植物細胞増殖因子の植物細胞増殖活性を試験例で示す。
試験例1.
実施例（２）の方法により得られたアスパラガスの遊離細胞を実施例（３）の方法により調製した培地に移植し、本発明の植物細胞増殖因子を添加して培養し、培養アスパラガス細胞の増殖に対する植物細胞増殖因子の影響をコロニー形成率の変化を測定することにより調べた。
（ｉ）細胞の培養
細胞培養には24穴のマイクロプレート（IWAKI 3820-024）を用いた。マイクロプレートの１穴あたり、あらかじめ目的とする細胞密度の２倍密度となるように調製したアスパラガスの遊離単離細胞懸濁液250μl、４倍濃度の液体培地125μl、滅菌蒸留水125μl、または濾過滅菌(ADVANTEC DISMIC-13cp 0.20μm)後希釈した実施例（４）で得られたＣＭ 125μlを加えよく攪拌し、蒸散防止のためビニルテープでシールドした後、暗黒下、２８℃、120rpmの条件で振盪培養(TAITEC BR-300L)した。
（ｉｉ）細胞の観察
１穴ごとに１００倍の倒立顕微鏡(OLYMPUS CK2)下で、視野内に存在する生存細胞数（コロニー形成細胞を含む）、死細胞数、およびコロニー形成細胞数をカウントし、３穴以上の観察結果をもとにして、以下の計算式に従いコロニー形成率(colony formation frequency)、および細胞生存率を算出した。
Ｃ（％）＝ａ／ｂＸ１００
Ｃ：コロニー形成率    ａ：コロニー形成細胞数    ｂ：生存細胞数
Ｌ（％）＝〔ｂ／（ｂ＋ｄ）〕×１００
Ｌ：細胞生存率      ｂ：生存細胞数      ｄ：死細胞数
（iii）ＣＭがコロニー形成に及ぼす効果
5.０×１０4cells/mlおよび2.5×１０4cells/mlのアスパラガスの遊離細胞培養液中に、ＣＭを最終濃度２5.０％、１2.５％、6.３％、3.１％、1.６％となるように添加し培養した。各ＣＭ添加濃度におけるアスパラガス培養細胞のコロニー形成率を測定した。結果を図１に示す。
以下、上記方法を植物細胞増殖因子の生物検定として示す。
その結果図１によれば、ＣＭの濃度依存的に著しいコロニー形成の増加がみられ、ＣＭが植物細胞増殖活性を持つことがわかる。
試験例2.
実施例（７）で得た化合物（Ｉ−１）、化合物（Ｉ−２）、化合物（Ｉ−３）、化合物（Ｉ−６）、化合物（Ｉ−７）または化合物（Ｉ−８）（１０-5Ｍ〜１０-9Ｍ）を用いる以外は試験例１と同様の方法により細胞増殖活性を測定した。結果を図２に示した。
実施例
Ａ．〔ＣＭの抽出とその理化学的性質〕
（１）植物材料
アスパラガス（Asparagus officinalis L. cv. Mary Washington 500W、タキイ種苗）の種子を、クレハ培養土（クレハ化学工業）を入れた育苗用ポット（直径９cm）に播種後、人工気象室（小糸工業）内で育成した。人工気象室内の照度は葉面で２０,９９９Lux、日長は１日１６時間明期８時間暗期、温度は昼間２２℃夜間１８℃、湿度は約８０％とした。種子は通常播種後約３週間で発芽し、播種後６週目までに３本程度の芽条を生じるので、随時直径２１cmの植木鉢に移植した。実験には、播種後９週間以降の株から採集した葉状茎を用いた。
（２）葉肉細胞由来細胞の調製
長さ約１０cmのアスパラガス葉状茎を、生物検定には１本、調製培養液（ＣＭ）の調製には２００mlあたり４本使用した。採集した葉状茎は、７０％エタノールに３０秒間浸漬後、１０倍希釈アンチホルミンに１００mlあたり２滴のTween 20を加えた溶液中で１０分間滅菌し、さらに滅菌蒸留水で３回洗浄した。次に、クリーンベンチ内にてガラス製ホモジェナイザー（22×167mm、岩城硝子）を用い、滅菌蒸留水中で葉状茎を破砕後、破砕液を３７μmのステンレス製メッシュ（飯田製作所）で濾過し、濾液を遠心分離（100×g、3min、Kubota KS-5000)することにより遊離単細胞を沈殿させた。沈殿した遊離単細胞は再度滅菌蒸留水に懸濁させ、遠心分離後に上清を除去する操作を３回繰り返し、完全に夾雑物を除いた。
（３）培地の調製
培地組成を第１表に示す。
0003789134.tif 000004
第１表に示した液体培地を、使用直前に保存液を目的濃度の４倍濃度となるように蒸留水で希釈して調製し、1.０N KOHでｐＨ5.８とした後、滅菌フィルター(ADV ANTEC DISMIC-25cs 0.２０μm）を用いて濾過滅菌した。
（４）ＣＭの採取
遊離単細胞懸濁液を、ビュケルチュルク血球計算盤（日本臨床器械工業）を用いて、約5.０×１０5cells/mlとなるように調製し、その５０mlと２倍濃度の液体培地５０mlの合計１００mlを３００mlの三角フラスコに加え、シリコン栓をかぶせて、暗黒下、２８℃、１２０rpmの条件で振盪培養(高崎科学器械 TB-25R)した。細胞増殖が最大となる培養開始１０日目に、吸引濾過(ADVANTEC No.2）によりＣＭを回収し、−３０℃で凍結保存した。
以下に、得られたＣＭの理化学的性質について詳述する。
（ａ）熱安定性
培養１０日目に採取したＣＭ（以下同じＣＭを使用する）1.５mlを蒸留水で2倍希釈し、沸騰水浴中で１０分間加熱後直ちに氷冷した。同様に、ＣＭ 1.５mlを蒸留水で２倍希釈し、１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理を行なった。以上の２サンプルについて生物検定を行なった。
ＣＭを沸騰水浴中で１０分間加熱した場合には、細胞増殖活性の７０％は保持されたが、１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理では、完全に失活した。
（ｂ）ｐＨ安定性
ＣＭ 1.０mlを蒸留水で4.０mlに希釈後、0.１N HNO3または0.１N KOHを用いｐＨ3.０、ｐＨ5.０、ｐＨ7.０、ｐＨ9.０、ｐＨ11.０とし、４℃にて２４時間放置した。次に0.１N KOHまたは0.１N HNO3でｐＨ5.８とした後、2.０mlに濃縮し、それぞれのサンプルについて生物検定を行なった。なお、ＣＭ自体のｐＨは約5.０であった。
本発明の植物細胞増殖因子はｐＨ3.０、ｐＨ5.０、ｐＨ7.０、ｐＨ9.０においては概ね安定であったが、ｐＨ11.０では６０％程度活性が低下した。
（ｃ）ＣＭの溶媒分画
ＣＭ2.０mlを蒸留水で１０mlに希釈し、0.１N HNO3を用いてｐＨ3.０にした後、5.０mlの酢酸エチルで３回抽出した。得られた水層は、0.１N KOHでｐＨ5.８とした後4.０mlに濃縮した。酢酸エチル層は硫酸ナトリウムで乾燥させた後、蒸留乾固し、4.０mlの蒸留水で溶解した。同様に、ＣＭ2.０mlを蒸留水で１０mlに希釈し、0.１N KOHでｐＨ11.０にした後、5.０mlのジエチルエーテルで３回抽出した。得られた水層は、0.１N HNO3でｐＨ5.８とした後4.０mlに濃縮した。エーテル層は硫酸ナトリウムで乾燥させた後、蒸発乾固し、4.０mlの蒸留水に溶解した。以上の４サンプルについて生物検定を行なった。
酸性条件、塩基性条件のいずれにおいても、細胞増殖促進活性は水層に残った。
（ｄ）逆相担体に対する吸脱着実験
Cosmosil 75C18-OPN(Nacalai tesque)１０ｇをメタノールに懸濁し、真空下で脱気後カラム（1.７×８cm、１８ml）に充填した。担体が完全に充填された後に溶出液を蒸留水に置換し、１００mlの蒸留水でカラムを洗浄した。次に、ＣＭ5.０mlをカラムに添加し、蒸留水１００ml、３０％ＣＨ3ＣＮ  １００ml、６０％  ＣＨ3ＣＮ  １００mlにて順次溶出（流速６０ml/h）し、各画分をエバポレーターで蒸発乾固後、１０mlの蒸留水に溶解して生物検定を行なった。同様に、Diaion HP-20（三菱化成）１０ｇをメタノールに懸濁し、真空下で脱気後カラムに充填した後に、海砂Ｂを５mm厚い重層し、担体の浮き上がりを防いだ上で、溶出液を蒸留水に置換し、１００mlの蒸留水でカラムを洗浄した。次に、ＣＭ5.０mlをカラムに添加し、蒸留水１００ml、３０％ＣＨ3ＣＮ  １００ml、６０％ＣＨ3ＣＮ  １００mlにて順次溶出（流速６０ml/h）し、各画分をエバポレーターで蒸発乾固後、１０mlの蒸留水に溶解して生物検定を行なった。
Cosmosil 75C18-OPNおよびDiaion HP-20のいずれの担体に対しても細胞増殖因子は保持されず、蒸留水によって溶出された。したがって、本発明の植物細胞増殖因子は比較的極性が高いことがわかる。
（ｅ）活性炭に対する吸脱着実験
活性炭（和光純薬工業）5.０ｇを、１５％酢酸１００ml中で１００℃、３０分間加熱して不純物を除き、さらに蒸留水５００mlで洗浄後、蒸留水に懸濁してカラム（1.７×１１cm、２５ml）に充填した。次にＣＭ5.０mlをカラムに添加し、蒸留水１００ml、１５％エタノール１００ml、３０％エタノール１００ml、アセトン１００mlにて順次溶出（流速６０ml/h）し、各画分をエバポレーターで蒸発乾固後、１０mlの蒸留水に溶解して生物検定を行なった。
本発明の植物細胞増殖因子は活性炭に極めて強く吸着され、１５％エタノール、３０％エタノールおよびアセトンによっても全く溶出されなかった。この条件では、中性のオリゴ糖や一部の酸性糖が溶出されることが知られている。
（ｆ）イオン交換樹脂に対する吸脱着実験
DEAE Sephadex A-25(Pharmacia LKB Biotechnology）0.８ｇを５００mM Tris-HCl緩衝液（ｐＨ7.４）５０ml中、室温で膨潤（２４時間）させた後、２０mMの同緩衝液に懸濁しカラム（1.２×3.５cm、4.０ml）に充填した。ＣＭ  １０mlを凍結乾燥し、１０mlの同緩衝液に溶解した後、カラム上に添加し、同緩衝液２０ml、２５０mM  ＫＣｌを含む同緩衝液２０ml、５００mM  ＫＣｌを含む同緩衝液２０ml、１０００mM  ＫＣｌを含む同緩衝液２０mlで順次溶出（流速１５ml/h）した。次に、各溶出画分を１０mlに濃縮し、透析チューブ(Spectra/Por 7 MWCO:1000)に注入し、両端をクローサーで閉じた後、３０００mlの蒸留水中で４℃において２４時間透析することにより脱塩を行なった。透析内液を濃縮して１０mlとし、各画分について生物検定を行なった。
同様に、ＣＭ  Sephadex C-25 0.８ｇを５００mM KH2PO4-KOH緩衝液ｐＨ6.０ ５０ml中で、室温で膨潤（２４時間）させた後、２０mMの同緩衝液に懸濁しカラム（1.２×3.５cm、4.０ml）に充填した。ＣＭ  １０mlを凍結乾燥し、１０mlの同緩衝液に溶解した後、カラム上に添加し、同緩衝液２０ml、２５０mM  ＫＣｌを含む同緩衝液２０mlで溶出（流速１５ml/h）した。透析により脱塩後、各画分について生物検定を行なった。
本発明の細胞増殖因子はDEAE Sephadex A-25に極めて強く吸着され、１０００mMのＫＣｌによって溶出された。一方、ＣＭ  Sephadex C-25には該細胞増殖因子は全く吸着されず、２０mM KH2PO4-KOH緩衝液によって溶出された。この結果から、該細胞増殖因子は酸性物質であることがわかる。
（ｇ）各種加水分解酵素による活性物質の失活試験
非特異的ペプチド分解酵素であるPronase E(Sigma)3.０mgを、２０mM KH2PO4-KOH緩衝液(pH7.5)3.０mlに溶解し、セルロースアセテートフィルター(ADVANTEC DISMIC-13cp 0.２０μm)で不溶物を濾過して酵素溶液とした。酵素溶液のうち1.０mlは、沸騰水浴中で１０分間加熱することにより失活酵素液とした。試験管に同緩衝液を0.９ml、ＣＭまたは蒸留水を1.０ml、酵素溶液または失活酵素液または同緩衝液を１００μl、それぞれ加え、恒温振盪器(TAITEC, Personal-11)を用い３７℃、１７０rpmにおいて３時間振盪した。酵素反応後、反応液を0.１N HNO3でpH5.８とし、沸騰水浴中で１０分間加熱後直ちに氷冷することにより酵素を失活させた後、生物検定を行なった。
同様に、数種類の糖鎖の加水分解酵素混合物であるGlycosidases “Mixed”（生化学工業）3.０mgを、２０mM Glutamic acid-KOH緩衝液（pH4.０）3.０mlに溶解し、セルロースナイトレートフィルターで不溶物を濾過して酵素溶液とした。酵素溶液のうち1.０mlは、沸騰水浴中で１０分間加熱することにより失活させ、失活酵素液とした。試験管に同緩衝液を0.９ml、ＣＭまたは蒸留水を1.０ml、酵素溶液または失活酵素液または同緩衝液を１００μl、それぞれ加え、恒温振盪器を用い３７℃、１７０rpmにおいて３時間振盪した。酵素反応後、反応液を0.１N KOHでpH5.８とし、沸騰水浴中で１０分間加熱後直ちに氷冷することにより酵素を失活させた後、生物検定を行なった。
本発明の植物細胞増殖因子は、ペプチド分解酵素であるPronase Eを作用させることにより、完全に失活した。したがって、該細胞増殖因子は分子内にペプチド構造を持っており、この部分が活性の発現に重要であることがわかる。
一方、糖鎖の加水分解酵素混合物であるGlycosidases “Mixed”を作用させても、細胞増殖因子の活性は保持された。
以上のＣＭの理化学的性質をまとめると以下のようになる。
0003789134.tif 000005
Ｂ．〔化合物（Ｉ）の抽出、合成、構造決定〕
（１）DEAE Sephadex A-25 3.０ｇを５００mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)５０ml中、室温で膨潤（２４時間）させた後、２０mMの同緩衝液に懸濁しカラム(1.7×8.０cm、１８ml）に充填した。次に、ＣＭ  １００mlをエバポレーターにより５０mlに濃縮後、Trisを最終濃度２０mMとなるように加え、6N HClでpH7.４としてカラム上に添加し、同緩衝液３０ml、２５０mM  ＫＣｌを含む同緩衝液３０ml、５００mM  ＫＣｌを含む同緩衝液３０ml、７５０mM  ＫＣｌを含む同緩衝液３０ml、１０００mM  ＫＣｌを含む同緩衝液３０ml、１２５０mM  ＫＣｌを含む同緩衝液３０ml、１５００mM  ＫＣｌを含む同緩衝液３０mlで順次溶出した。この際、ＵＶ２２０nmにおける吸収により活性分画を推定した。
植物細胞増殖活性を示す分画が、１０００mMおよび１２５０mMのＫＣｌによって溶出された（図３−ａ）。１２５０mM  ＫＣｌ溶出画分のみを凍結乾燥し秤量したところ、9.０２mgであった。
各溶出フラクションを透析（スペクトラ／Por MWCO:1000)により脱塩化した後、５０mlまで濃縮した。
（２）ゲル浸透カラム
DEAE Sephadexカラムからの脱塩化溶出液(1000mM KCl、1250mM KCl溶出フラクション）を凍結乾燥した後、1.０mlの２０mM、KH2PO4-KOH-緩衝液(pH5.8)に溶解した。つづいて得られた溶液を、あらかじめ上記の溶解液に用いた緩衝液で平衡化したBio-Gel P-2 extra fineカラム(1.7×37cm)に注入した。ＵＶ２２０nmにおける吸収を測定しながら該緩衝液を流速１５mh-1で溶出させた（図3-b）。
５mlずつにフラクションを採取し、各々のフラクションの活性をバイオアッセイで測定した。
（３）逆相ＨＰＬＣカラム
Bio-Gelカラムからの溶出活性画分を凍結乾燥させた後、１０μｌの１０％アセトニトリル含有0.１％ＴＦＡに溶解した。得られた溶液をDevelosil ODS-HG-5カラムに注入した（4.６×２５０nm、野村化学社製）た後、0.１％ＴＦＡを含んだ１０％アセトニトリルのイソクラチィック溶出（isocratic elution）により分離した（流速1.０ml/m、モニターＵＶ２２０nm）。フラクション（各２ml）を採取し、各フラクションの活性をバイオアッセイで検討した（図３−ｃ）。活性を持つ２本のフラクションを採取した。６００mlのＣＭからの収量は化合物（Ｉ−１）で２μg、化合物（Ｉ−２）で１０μｇであった。ＣＭから１０7倍の精製が行われ、活性の回収％は１０％であった。
以下に上記の溶出フラクションのアミノ酸組成を検討した。
（４）アミノ酸組成
ガス層アミノ酸シークエンサーによるアミノ酸の解析は化合物（Ｉ−１）の場合はTyr-Ile-Tyr-Thr-Glnであった。しかしＦＡＢ−質量分析法による分子量は８４６でありTyr-Ile-Tyr-Thr-Glnの分子量よりも分子量が160大きかった。
更に、〔Ｍ−２Ｈ＋Ｋ〕-に相当する疑似分子イオンm/z883で観測され、〔Ｍ−Ｈ＋８０〕-に相当するフラグメントイオンがm/z765で観測された。
上記の結果から化合物（Ｉ−１）のアミノ酸は化学的に修飾されており、その修飾は、アミノ酸構造分析等の条件下では容易に離脱することが示された。
ＦＡＢ−質量分析実験における〔Ｍ−Ｈ＋８０〕-フラグメントイオンから化合物（Ｉ−１）は硫酸化合物であり〔ロジカースら、カルボハイドロ  リサーチ、179巻、７−19頁（1988）〕、アミノ酸構造を元に算出した推定分子量より多い化合物（Ｉ−１）の１６０マスユニットは、２つのチロシン残基のＯＨ基にスルフォン酸が置換されているためであると推定された。スルフォン酸の置換したチロシンはDEAE Sephadexに吸着されること、アミノ酸構造決定条件下ではスルフォン酸が離脱すること等により化合物（Ｉ）の構造が決定された。
上記構造を確認するため、上記化合物（Ｉ−１）の合成を行った。スルフォン酸を持たないペプチドをペプチド合成機により合成し、得られたペプチドにアリルスルフォトランスペプチダーゼによりスルフォン酸基を置換した〔村松ら、ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー、223巻、243-248頁（1994）〕。得られたペプチドは、逆相ＨＰＬＣにおいて化合物（Ｉ−１）と同じ保持時間で溶出され、化合物（Ｉ−１）に特有のマススペクトルをFAB-MSによる分析で示した。更に生物活性を示す濃度も同一であった。
よって化合物（Ｉ−１）の構造がH-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gln-OHであることが合成法によっても確認された。さらに、化合物（Ｉ−１）のＣ末端カルボン酸をアミド化したアミド化体も合成した〔化合物（Ｉ−３）〕。
上記と同様の試験により化合物（Ｉ−２）の構造もH-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gln-OHであると決定された。
さらに、上記のペプチド合成法に従い、化合物（Ｉ−１）のイソロイシンの代わりにバリンを置換した構造〔H-Tyr(SO3H)-Val-Tyr(SO3H)-Thr-Gln-OH〕を持つ化合物（Ｉ−４）〔配列番号：４〕(FAB-MS m/z 831(M-H)-）、化合物（Ｉ−１）のスレオニンの代わりにセリンを置換した構造〔H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Ser-Gln-OH〕を持つ化合物（Ｉ−５）〔配列番号：５〕(FAB-MS m/z 831(M-H)-)、また、化合物（Ｉ−１）のスルフォチロシンのひとつをチロシンに置換した構造〔H-Tyr(SO3H)-Ile-Try-Thr-Gln-OH〕を持つ化合物（Ｉ−６）〔配列番号：６〕(FAB-MS 765(M-H)-）および〔H-Tyr-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gln-OH〕を持つ化合物（Ｉ−７）〔配列番号：７〕(FAB-MS 765(M-H)-）も合成した。また、化合物（Ｉ−１）の二つのスルフォチロシンを共にチロシンに置換した〔H-Tyr-Ile-Tyr-Thr-Gln-OH〕化合物（Ｉ−８）〔配列番号：８〕も合成した。
産業上の利用分野
本発明は、植物細胞成長促進剤として用いることができる植物細胞増殖因子に関する。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸(amino acid)
鎖の数：一本鎖(single)
配列の種類：ペプチド(peptide)
起源：
生物名：アスパラガス
細胞の種類：葉肉細胞
配列の特徴
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：１
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：３
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
配  列
0003789134.tif 000006
配列番号：２
配列の長さ：４
配列の型：アミノ酸(amino acid)
鎖の数：一本鎖(single)
配列の種類：ペプチド(peptide)
起源：
生物名：アスパラガス
細胞の種類：葉肉細胞
配列の特徴
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：１
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：３
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
配  列
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配列番号：３
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸(amino acid)
鎖の数：一本鎖(single)
配列の種類：ペプチド(peptide)
配列の特徴
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：１
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：３
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：５
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：Xaaはグルタミンアミドを表す。
配  列
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配列番号：４
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸(amino acid)
鎖の数：一本鎖(single)
配列の種類：ペプチド(peptide)
配列の特徴
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：１
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：３
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
配  列
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配列番号：５
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸(amino acid)
鎖の数：一本鎖(single)
配列の種類：ペプチド(peptide)
配列の特徴
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：１
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：３
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
配  列
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配列番号：６
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸(amino acid)
鎖の数：一本鎖(single)
配列の種類：ペプチド(peptide)
配列の特徴
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：１
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
配  列
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配列番号：７
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸(amino acid)
鎖の数：一本鎖(single)
配列の種類：ペプチド(peptide)
配列の特徴
特徴を表す記号：Modified-site
存在位置：３
特徴を決定した方法：Ｅ
他の情報：XaaはＯ−スルフォチロシンを表す。
特徴を表す記号：Modified-site
配  列
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配列番号：８
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸(amino acid)
鎖の数：一本鎖(single)
配列の種類：ペプチド(peptide)
配列の特徴
配  列
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【図１】
0003789134.tif 000018
【図２】
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【図３】
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