(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾イムノグロブリン分子、あるいは抗原結合部位を有するそのフラグメントまたは一部分（以下、修飾Ｉｇとする）であって、１以上の非−ＣＤＲループであるループに導入されたＩｇに対して外来の抗原性ペプチドを有し、定常ドメイン骨格輪郭が維持されている修飾Ｉｇ。
【請求項２】
Ｉｇの抗原結合ドメインが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面分子を認識する請求項１記載の修飾Ｉｇ。
【請求項３】
修飾イムノグロブリン、あるいは抗原結合部位を有するそのフラグメントまたは一部分（以下、修飾Ｉｇとする）であって、ＣＤＲループ以外のＩｇのループに対応する位置でその構造中に導入されたＩｇに対して外来の抗原性ペプチド、及び樹状抗原提示細胞（以下、樹状ＡＰＣとする）に対する認識部位を有する修飾Ｉｇ。
【請求項４】
前記樹状ＡＰＣに対する認識部位が、Ｉｇの抗原結合部位によって与えられる請求項３記載の修飾Ｉｇ。
【請求項５】
前記抗原性ペプチドが、重鎖または軽鎖の定常領域の１以上のループに導入される請求項１から４のいずれかに記載の修飾Ｉｇ。
【請求項６】
前記抗原性ペプチドが、細胞性タンパク質において腫瘍原突然変異を発現する請求項１から５のいずれかに記載の修飾Ｉｇ。
【請求項７】
前記抗原性ペプチドが、ウイルスまたは他の感染性生物のエピトープを発現する請求項１から５のいずれかに記載の修飾Ｉｇ。
【請求項８】
治療または予防用に用いられる請求項１から７のいずれかに記載の修飾Ｉｇ。
【請求項９】
感染または前記抗原性ペプチドによって発現されるエピトープを含む細胞性突然変異に罹患した、または罹患する危険のある患者の、免疫化用薬剤または治療用薬剤の調製における請求項１から７のいずれかに記載の修飾Ｉｇの使用。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれかに記載の修飾ＩｇをエンコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
適当な宿主を請求項１０記載のＤＮＡで形質転換し、該ＤＮＡを発現させて前記修飾Ｉｇを製造することからなる請求項１０記載のＤＮＡの発現方法。
【請求項１２】
請求項１０記載のＤＮＡによってエンコードされる修飾Ｉｇの製造方法であって、前記ＤＮＡで形質転換した適当な宿主生物細胞を培養して修飾Ｉｇを製造し、次いで、該宿主細胞から前記修飾Ｉｇを回収することからなる修飾Ｉｇの製造方法。
【請求項１３】
イムノグロブリン、あるいは抗原結合部位を有するフラグメントまたは一部分であるＩｇを準備し、前記Ｉｇに対して外来の抗原性ペプチドを、前記Ｉｇの一つ以上の非−ＣＤＲループに導入することを含む、修飾Ｉｇの製造方法。
【請求項１４】
可変領域の抗原結合特異性を改変することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法によって取得可能な修飾Ｉｇ。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞の活性化、特に、感染または細胞における癌性突然変異を治療するための体細胞媒介免疫システムの刺激のためのＴ細胞の活性化に関する。
背景
身体の免疫システムが作用するメカニズムを１つは、外来タンパク質の抗原表現細胞による包み込みを含み、タンパク質はプロテアーゼによって、ペプチド負荷(loading)部分内の細胞ＭＨＣ  ＩＩタンパク質を伴うペプチドフラグメントに切断され、次いでＡＰＣ表面に輸送され、ＭＨＣ  ＩＩを伴うペプチドは、Ｔ−ヘルパー細胞（ＣＤ４+Ｔ細胞）のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に表現される。ＣＤ４  Ｔ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ  ＩＩを持つ抗原性ペプチドのみを認識し、ＴＣＲは、認識部位のレパートリーを持つので、適当なＴＣＲを持つようなヘルパー細胞のみが与えられた抗原ペプチドを認識する。これは、ヘルパーＴ細胞を活性化し、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８+またはＴｃ細胞）及びＢ細胞を、対応する抗原特異性で刺激し、次いで、直接ＣＤ４+Ｔ細胞自身によるか、あるいは抗体の生成によるか、またはＴｃ細胞によって、外来タンパク質の起源への攻撃を増加させる。後者の場合、Ｔｃ細胞の認識部位は、細胞表面にＭＨＣ  Ｉを伴って表現された最初の抗原を認識し、それらは内因的、例えば、感染の結果として、または細胞内の突然変異タンパク質の生成によって生成される。
感染性疾患に対する保護においては、ワクチン化が非常に重要であった。より安全でより有効なワクチンの開発の要求が未だにある。また、そのような予防的手段が無かった疾患に対するワクチンの開発も必要である。効果的なワクチン化のためには、ＣＤ４+細胞が細胞毒性Ｔ細胞及びＢ細胞を直接活性化するので、ＣＤ４タイプのＴ細胞の活性化が必要である。
多くの癌細胞は、例えばｐ２１ｒａｓ領域の突然変異、それに続く突然変異を持つ抗原性ペプチドフラグメントの細胞表面での発現といった突然変異の結果である。身体の免疫システムは、通常はそのような潜在的癌細胞に、ＭＨＣ  ＩＩの明らかな「外来」抗原を認識し、腫瘍細胞を殺すことのできる特異的細胞毒性Ｔ細胞に対して「シグナル２」を与えるＣＤ４+Ｔ細胞のレセプターによって対処する。このように、我々は、癌細胞を、それらが外来生物に感染したように処理することにより潜在的癌細胞と闘うことができるだろう。しかしながら、腫瘍が確立されてしまう場合があるので、そのときは、Ｔ細胞と腫瘍細胞とのバランスを、特異的Ｔ細胞活性を誘発または増進することによりＴ細胞に味方して変化させるのが有利である。
ＭＨＣ  ＩＩ分子に位置する抗原ペプチドは、典型的には約１１−２０アミノ酸長であり、感染試薬に対して有効にワクチン化するまたは腫瘍特異的抗原に特異的な細胞を活性化する一つの方法は、人工的にペプチドを与えることである。しかし、ペプチドは容易に分解するので、、その可能性を成功裡に証明されたことはない。
ある研究グループ(Zaghouani,等, Science(1993), 259: 224-227、及び、Brumeanu,等, J. Exp. Med.,(1993)178: 1795-1799)は、ウイルス性エピトープペプチドをエンコードするＤＮＡを、イムノグロブリン分子の重鎖のＣＤＲ３ループをエンコードするＤＮＡに置換することを開示している。この遺伝子は、軽鎖と共発現し、分子の完全Ｉｇタイプを生成し、それはＡＰＣのＦｃレセプター（ＦｃＲ）によって取り込まれ、ウイルス性エピトープはイン・ビトロでＡＰＣの表面にＭＨＣ  ＩＩを伴って発現される。著者は、抗原化された自己Ｉｇ分子は、ワクチン化（または寛容）プロトコールのように、ペプチドのＭＨＣ  ＩＩ分子への輸送用の有効なキャリアを表現し、キャリアは長寿命で自己効果を全く持たないことを示唆している。
我々は、Ｍ３１５抗体のλ２軽鎖からの９１−１０１アミノ酸フラグメントの抗原発現を研究した(Bogen,等, Eur. J. Immunol.,(1986)16: 1373)。更に我々は、そのエピトープをヒトＩｇＧ３重鎖のループに移動させるイン・ビトロ突然変異を用いた。３つの異なる突然変異体が生成され、各々は、９１−１０１ペプチドで置換されたＣＨ１ドメインのループの１つを有している。突然変異遺伝子は、既にＥαkＥβdＭＨＣ  ＩＩをエンコードする遺伝子でトランスフェクションされた維線維芽細胞列にトランスフェクションされる。その結果得られるクローンは、λ２315特異的Ｔ細胞クローンの刺激可能性を検定した。突然変異した重鎖は、トランスフェクションされた線維芽細胞に細胞内的に保持されるが、ペプチドは、プロセシングされずＭＨＣ  ＩＩに表現されない。
発明の要旨
我々は、ペプチド抗原を抗体の非ＣＤＲループに組み込むことができ、その結果得られるＡｂがＡＰＣに取り込まれ、前記ペプチド抗原がＭＨＣ  ＩＩの前後のＡＰＣの表面に発現され、それによって免疫反応が生ずるような変性抗原を製造できることを見出した。
本発明は、感染性疾患のワクチン化に用いられ、その場合は、Ｉｇ分子に挿入されたペプチド抗原が、感染性試薬のタンパク質から誘導されたものでなければならない。ワクチン化の目的のためには、修飾されたＩｇは、特に無垢のＴ細胞刺激において有効な樹状細胞を標的とする。
また本発明は、ある種の治療に関しても用いられ、その目的は、明らかに特定の抗原に寛容となり始めている免疫システムを刺激することである。例えば、通常細胞タンパク質の突然変異から誘導される多くの癌は、身体の免疫システムが、その突然変異タンパク質によって活性化されないことから生ずることもある。さらに、癌細胞は、共刺激分子を持たないのでＡＰＣが乏しい。従って、治療戦略は、身体の免疫システムを突然変異タンパク質に表現することによって刺激することである。好ましくは、抗原は、Ｔ細胞刺激に特に有効な樹状細胞に表現される。この試みの他の態様では、ＡＰＣ表面にＭＨＣ  ＩＩを伴って表現されたペプチド抗原が、各々Ｔｈ１及びＴｈ２と呼ばれるＴヘルパー細胞の２つのタイプのいずれかまたは両方を刺激する。Ｔｈ１刺激の結果、シトキンＩＮＦ−ガンマ及びＩＬ−２の生成と、細胞毒性Ｔ細胞（Ｔｃ）の刺激が起こる。一方、Ｔｈ２刺激は、シトキンＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０の生成をもたらし、Ｂリンパ球の活性化及び抗原に対する抗体の生成を促す。２つのうちで、Ｔｃ細胞が強力な抗ウイルス薬であるため、この試みにおいてはＴｈ１経路が好ましい。また、突然変異ｒａｓペプチドに対する特異性を持つＴｃ細胞（ＣＤ８+Ｔ細胞）が、癌患者に検出されており、そのような癌細胞は向上したＴｃ免疫反応を受けやすい。
Ｔｈ１またはＴｈ２のいずれが好ましいかは、投与量及び投与される抗原の性質に依存する。安定な抗原は、より長い半減期を有する。Ｉｇ分子はＡＰＣ内で安定と見られるので、そのペプチドは、ＡＰＣの表面において遅い速度で生成され、表面において遅い定常状態エピトープ濃度が与えられるが、抗原はＡＰＣ内に長時間生き残ると予想される。さらに、Ｉｇ分子は、その生物自身の内部で安定であり、従って、ＡＰＣは抗原に長時間曝される。よって、我々の試みの全有効性は、長期間に渡る、免疫システムのＩｇに担持された抗原への低レベルの暴露であり、有効なＴ細胞反応を顕現させるのに重要である。
我々は、イムノグロブリン（Ｉｇ）分子が、樹状細胞に包み込まれたとき、特定の無垢のＴ細胞を刺激してＩＬ−２生成させることを見出した。さらに、我々は、抗原ペプチドを組み込んだ変性Ｉｇが同様に作用することも見出した。
我々は、Ｉｇ軽鎖のＣＤＲループからのペプチドが重鎖定常領域のループに移動でき、かつＩｇは発現されることを示した。
折りたたみ、集合、保持、及び減成は、小胞体での出来事に強く関係しているので、ペプチドの導入後に定常ドメイン骨格輪郭が維持されることは重要である。ペプチドループは、通常隣接するベータ鎖とともに正しい折りたたみを促進するので、他のループ位置に移動されたときに正しく折りたたまれた分子を分泌させるのは重要と考えられる。
しかし我々は、ｒａｓペプチドがＩｇの（非−ＣＤＲ）ループに位置することができ、なおかつＩｇを分泌することを示した。これは更に驚くべきことであり。たぜなら、細胞において厳正な「品質制御」が存在し、それがＩｇが正しく折りたたまれないで分泌されるのを予防し、ループのアミノ酸配列の変更は、タンパク質の不正であると検知される構造への折りたたみを生じ、従って、それを退化させると考えられるからである。
重要な外来ペプチドがＩｇの非ＣＤＲループに導入され得ることを示した。これが免疫システムの刺激に用いられ、特にＴｃ細胞媒介アーム(arm)が、そのようなペプチドを含む表現タンパク質、特に癌細胞及び種々の感染細胞の攻撃に用いられ得る。
クラスＩＩ分子上の特定のフラグメントを得るために、これらのペプチドフラグメントをＡＰＣ類、より詳しくは樹状細胞の標的にすることを望む。樹状細胞の膜タンパク質に結合する可変領域を持ち、その定常領域に外来抗原性ペプチドフラグメントが加えられた抗体分子を構成することによってなすことができる。このような変性抗体は、樹状細胞上で集積され、エンドサイトーシスされ、退化する。この過程は、クラスＩＩ分子と結合しうる抗原性ペプチドフラグメントを遊離させる。ペプチドフラグメント／クラスＩＩ分子複合体は、次いで、細胞膜外に移動し、ＣＤ４+Ｔ細胞を活性化（「ワクチン化」）する。
従って本発明は、抗原性ペプチドを樹状細胞あＰＣのペプチド担持分画に向けさせて、ＭＨＣ  ＩＩ分子を持つ細胞表面において効率的に発現されるようにする。この試みは、抗原性ペプチドをエンコードするＤＮＡを、ＣＤＲループ以外のＩｇ分子のループ、特にＩｇ分子の定常領域に見られるループに対応する位置におけるイムノグロブリン（Ｉｇ）鎖の遺伝子に置換するか挿入することである。
Ｉｇ分子のポリペプチド鎖は、ループによって結合した平行に連続するベータ鎖に折りたたまれる。可変領域では、３つのループが、抗体のエピトープ結合特異性を決定する「相補的決定領域（ＣＤＲ）」を構成している。定常領域のループは、抗原結合特異性を持たないが、Ｉｇ分子の折りたたみ及び／またはそのエフェクターまたは他の機能に重大な影響を有する。
我々の発明では、抗原ペプチドをエンコードするＤＮＡが、存在する非−ＣＤＲループＤＮＡと置換でき、あるいは、それに挿入できる。その結果得られる変性したポリペプチド鎖は、完全なＩｇタイプ分子またはそのフラグメントの一部を、その分子の他の鎖と結合させることによって開始することができる。
挿入される抗原ペプチドのサイズは、ＡＰＣのＭＨＣ  ＩＩと結合するのに十分である限りは、おそらく臨界的ではない。一般的に、１１アミノ酸ペプチドで十分であるが、更に長く、例えば１７または２０アミノ酸であってもよい。
抗原ペプチドは、ただ１つの非−ＣＤＲループに挿入することができるが、１以上のそのようなループに抗原ペプチドを組み込むのが好ましい。これは同じペプチドでもよく、ＡＰＣに担持される抗原ペプチドの量が増加する；あるいは、異なる抗原性ペプチドを組み込んで、例えば、１以上の抗原に同時に対応する患者の免疫システムを刺激し、あるいは、感染性生物の１以上の株に特有の単一分子抗原性ペプチドまたは異なるＭＨＣ  ＩＩに結合する同じ抗原からの抗原性ペプチドに与えてもよい。Ｉｇ分子の担持能力は、それらに導入される抗原性ペプチドを持つことができるＣＤＲループの数による。
よって、特に示さない限り、イムノグロブリン即ちＩｇ分子は、一般的に、ペプチド抗原を導入する修飾がされていない無傷の重鎖及び軽鎖を含む完全なＩｇタイプ分子、そのような完全分子のフラグメント、重鎖または軽鎖を除くことによる、あるいは、鎖の末端同士を共有結合することによる一本鎖、及び、通常のＩｇ分子に他の必要な変形を施したものを含むと解釈される。Ｉｇは、任意のクラスまたはサブクラスを含む（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、等）。
用いられる非−ＣＤＲループは、ヒンジ領域と可変領域の間のＣＨ１即ちＣk領域である。これは、ＩｇがＦａｂフラグメントのときに特に当てはまる。さもなくば、または更に、Ｆｃ領域のループも使用できる。
本発明の好ましい特徴は、Ｉｇ分子の可変領域の結合特異性が変化せずに維持されることである。従って、抗原ペプチドを担持するＩｇは、ＡＰＣの関係する表面分子に特異的な抗体を選択することにより、ＡＰＣの適当な部位を標的とすることができる。例えば、黄体の可変領域は、ＭＨＣ分子、樹状細胞のマーカー、またはＦｃＲ分子に特異的である。後者の場合、修飾されたＩｇは、Ｉｇ分子のＦｃ領域を認識するのではなく、（または、おそらくそれに加えて、）可変領域を認識することによりＦｃＲに結合する。この方法でＡＰＣに導入される修飾したＩｇは、「ヘッド・ファースト(head first)」として認識され、Ｆｃ認識における「サイドウェイ(sideway)」とは区別される。ＦＣγＩを介するサイドウェイ導入は、必ずしも可変領域における抗原特異性を必要としないが、この場合においても、保持された抗原特異性を持つ可変領域を有するのは有利である。特に好ましい方法は、樹状細胞マーカーに対する抗原結合領域を用いることである。このようなマーカーはＣＤ１１ｃであり、このマーカーに対する抗体も知られている（Ｎ４１６、ＡＴＣＣ  ＨＢ２２４）。
よって、このような抗体、またはその可変領域は、ここで述べる種類の修飾抗体構造に用いることができる。樹状細胞表面における抗体の架橋が必要なとき、これは、本発明の二特異的(bispecific)抗体を用い、可変領域の１つを架橋導入に特異的とするか、または、本発明の変性抗体の（例えばＦｃ領域）に対する抗体をももちいることにより与えられる。一方、Ｉｇの可変領域がＡＰＣ表面エピトープに特異的ではなく、変性抗体のＦｃ領域がＡＰＣのＦｃＲを標的とするために用いられるとき、可変領域は、架橋導入の結合に用いられ、それによって抗体は、ＦｃＲを介して容易に取り込まれる免疫複合体を形成する。
従って、一般的には、ＡＰＣ（好ましくは樹状細胞）に対する保持された抗原結合特異性の利点は、下記を含む。
Ｆｃ−ＦｃＲ結合より大きなＡＰＣに対する親和性を潜在的に与える可能性があること。
ＡＰＣに取り込まれかつＡＰＣ内に退化される可能性を増大させることのできる２価の結合を与える可能性があること。
Ｉｇ分子が、それらの定常領域によって架橋する可能性を与え、それによってＡＰＣによる取り込みの可能性を増大させること。
（二特異的抗体の場合、）Ｉｇ分子が、その可変領域で架橋する可能性を与え、免疫複合体の取り込みにはＦｃＲが主に採用されるので、それによって、ＡＰＣによる取り込み及び正当なプロセシングの可能性をぞうだいさせること。
Ｉｇが誤った部位を標的とするのを実質的に阻害すること。
原理的に、ＡＰＣの任意の表面エピトープ、特に樹状細胞に特異的なエピトープを標的とできること。
従って本発明は、中でも、下記を提供する。
１以上の非−ＣＤＲループに抗原性ペプチドを有する修飾Ｉｇ分子；
そのような修飾Ｉｇ分子の、患者、特に感染またはこの抗原性ペプチドを含む細胞性突然変異に罹患した、あるいは罹患する危険のある患者における免疫化または治療用の医薬の提供のための使用。
そのようなＩｇ分子をエンコードするＤＮＡ、及び修飾Ｉｇを提供するための、そのＤＮＡの宿主細胞での発現。
本発明の修飾Ｉｇの製造
組み換えＤＮＡ発現による抗体及び抗体フラグメントの製造方法は、今日ではよく知られ利用されている。これらの方法は、本発明の実施にも同様に使用できる。典型的には、本発明のＦａｂフラグメントの製造のために、Ｖ遺伝子が、完全抗体の製造用として周知の方法によって、同じベクターのＣk（軽鎖）及びＣＨ１（重鎖）遺伝子と融合される。
詳細な説明
以下の例によって、組み換えＤＮＡ法をさらに説明する。
添付図面において：
図１は以下を示す：
（Ａ）ヒトＣγ３遺伝子の制限マップ。エクソンをボックスとして示した。h=HindIII、bg=BGIII、p=PstI、s=SphI、b=BamHI。PstI及びBamHI部位は、ｐＵＣポリリンカーに属する２．６ｋｂ遺伝子構造の外側である。
（Ｂ）ヒトＩｇＧ3ＣH１ドメインのアミノ酸配列。各突然変異誘発反応に対して、セグメントの１つが、９１−１０１（λ２315）エピトープ（下線）で置換された。
（Ｃ）イン・ビトロ突然変異誘発反応に用いたプライマーのヌクレオチド配列。挿入された９１−１０１エピトープをエンコードするヌクレオチドは、中心区にあり、両側に２１フランキングヌクレオチドを持つ。
図２は挿入された抗体遺伝子配列の発現のためのヒトＣＭＶプロモーターを用いた２つの発現ベクターを示す：
（Ａ）任意のＣ−遺伝子と組み合わせた任意の重鎖Ｖ−遺伝子発現のためのｐＬＮＯＨ２。
（Ｂ）カッパＣ−遺伝子と組み合わせたカッパ重鎖Ｖ−遺伝子発現のためのｐＬＮＯＫ。
（Ｃ）ｐＬＮＯＨ２／ｐＬＮＯＫ配置。
図３は、Ｌ３突然変異株Ａｂまたは天然のＭ３１５Ａｂを抗原として用いた抗原ペプチドを持つリンパ節細胞の刺激後に生成されたＩＬ−２を示すグラフである。
図４は以下を示す：
（Ａ）ｐＵＣ１９にクローニングされたγ３定常領域。エクソンをボックスとして示した。h=HindIII、bg=BGIII、p=PstI、s=SphI、b=BamHI。PstI及びBamHI部位は、ｐＵＣポリリンカーに属する２．６ｋｂ遺伝子構造の外側である。
（Ｂ）ヒトＩｇＧ3ＣH１ドメインのアミノ酸配列（１文字コード）。ＣＤＲ３−対応ループを構成する４つのアミノ酸を太字で示した。１−２５ｒａｓまたは５−２１ｒａｓエピトープをエンコードするアミノ酸で置換された。
（Ｃ）イン・ビトロ突然変異誘発反応に用いたプライマーのヌクレオチド配列。挿入された１−２５または５−２１ｒａｓエピトープをエンコードするヌクレオチドは太字で示し、２０ヌクレオチドのフランキング領域は細字で示した。
図５は、異なるｒａｓエピトープを持つＩｇＧ３の定常領域遺伝子の名称及び構造を示す。エクソンはボックスで示した。ＣＤＲ３−対応ループを構成するアミノ酸は、１文字ａａ符号で示した。下線を施したａａは、ｒａｓ  ｗ.ｔ．配列から変化したところである。
ＣＤＲ３ループペプチド挿入を有する突然変異株ＩｇＧ３重鎖の構成と発現
図１は、
Ｍ３１５  Ｉｇ骨髄腫タンパク質のＣＤＲ３領域からの、ヒトγ３鎖ポリペプチドのＣH１の３つの異なる位置での、９１−１０１（λ２315）抗原性ペプチドをエンコードするＤＮＡの挿入を示す。従来のイン・ビトロ突然変異を用い、挿入された１１アミノ酸ペプチドエピトープをエンコードするＤＮＡは、各々ＣH１のＬ１、Ｌ２、及びＬ３ループに、７、７、及び４アミノ酸で置換され、エピトープの新たな位置は、二次構造について全ての変異体に類似するように選択された。
得られたＣＨ１エンコードフラグメントは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇＩＩＩ部位を用いた完全Ｃγ３遺伝子の野生種ＣH１ドメインの置換に用いられ、Ｃγ３遺伝子はｈｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして発現ベクターにサブクローニングすることができる。
図２を参照すると、これらの発現ベクターは、ゲノムＣ−遺伝子構造を伴うＰＣＲ−増幅Ｖ−遺伝子からのＩｇの発現を指向する。ベクターは、以下の特徴を有する。
無垢のＶ−遺伝子を発現できる。全部の、無垢のＶ−遺伝子は、各々読み取り領域及び定常領域で、ＰＣＲ−プライマーを用いて増幅される。
Ｖ−遺伝しの簡単なサブクローニングができる。Ｖ−遺伝子に隣接する非−豊富な制限部位が、ＰＣＲ−再増幅反応に導入される。Ｖ−遺伝子のコンピュータ分析が、Ｖ−遺伝子コード領域内にしばしば見られる制限部位を除くために行われる。
任意のＣ−遺伝子を持つＩｇを発現できる。このベクターは、ＣＨγ３及びＣk定常領域遺伝子で構成され、これらの遺伝子は、他の定常遺伝子配列と交換してもよい。
ｈＣＭＶ−プロモータを含む。ｈＣＭＶプロモータは、数種の哺乳類セルラインで高い発現を与える。
安定な発現のためのネオマイシン選択マーカー。
一過性発現のためのＳＶ４０  ｏｒｉ。一過性発現は遺伝子生成物の速い分析の可能性を与える。
一本鎖ベクターＤＮＡの単離を可能にする。ベクター内の複製のｆ１−起源は、イムノグロブリン遺伝子の直接配列及びインビトロ突然変異のための一本鎖ＤＮＡの単離を可能にする。
重鎖及び軽鎖ベクターの共トランスフェクションが無い。単一クローニング工程は、コンビネーションベクター：ｐＬＮＯＨ２Ｋを作る。これは、２つのベクターの共トランスフェクションを回避する簡単な方法である。
ベクターｐＬＮＯＨ２では、クローニング部位の上流側で、ベクターはｈＣＭＶプロモータ及びマウスＶH遺伝子、ＶNP、をも含み、よって完全キメラ重鎖遺伝子を形成する。ＶNP遺伝子セグメントは、ハプテン４ヒドロキシ−３ニトロフェナセチル（ＮＰ）及びそのヨウ化誘導体５−ヨード−４ヒドロキシ−３−ニトロフェナセチル（ＮＩＰ）に対する特異性を有するλ１軽鎖含有マウス抗体に特徴的なＶH鎖をコードする。またｐＬＮＯＨ２ベクターは、Ｇ−４１８に対する耐性により安全にトランスフェクトされた細胞を選択することができるネオマイシン選択マーカーも含んでいる。
Ｆａｂフラグメントは、ｐＬＮＯＨ２の変形であり以下のように作ることのできるハツゲンベクター（ｐＬＮＯＨ２／Ｆｄ）を用いて製造することができる。ＰＣＲプライマーは、ヒトＣγ３遺伝子のＣＨ１エクソンの５’イントロン及び超３’末端においてハイブリダイズされて構成される。プライマーは、制限酵素タグで構成され、下記のセンスプライマー
0003786695.tif 000002
がＢｓｉＷＩ部位（下線）に導入され、下記の非−センスプライマー
0003786695.tif 000003
がＢａｍＨＩ部位（下線）及び停止コドン（太字）に導入される。ＰＣＲ生成物は、Ｃγ３遺伝子を置換するために、ＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨ１部位のｐＬＮＯＨ２に挿入され、ｐＬＮＯＨ２／Ｆｄを作る。ｐＬＮＯＨ２／Ｆｄにおいて、Ｉｇ転写産物は、ベクターのＢＧＨ  ｐＡ部位によってポリアデニル化される。Ｖ−遺伝子のＰＣＲ増幅及び再増幅
ヒトまたはマウスの重鎖及び軽鎖（カッパ）Ｖ−遺伝子は、完全Ｖ−遺伝子が保存されているならば、読み取り及び定常領域内の適当なプライマーで増幅される（Larrick等, BioTechnology, 7, 1989, 934-938; Bendig等, biTechnology, 9, 1991, 88-89）。
ＰＣＲ−増幅されたＶ−遺伝子をベクターにクローニングするために、Ｖ−遺伝子は、Ｖ−遺伝子でハイブリダイズされたプライマーで配列され再増幅される。プライマーは、下記を組み込んだタグを含まなければならない（図２参照）。
５’プライマーについて：制限部位ＢｓｍＩを持つ読み取り配列の一部。
３’プライマーについて：スプライス／ドナー部位及び制限部位ＨｐａＩまたはＢｓｉＷＩ。
Ｃ−遺伝子のクローニング
ベクター中のＣ遺伝子は、抗原ペプチドを有し、図１で示したように製造されたＣ遺伝子に交換される。
ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限部位の、ヒト定常γ３遺伝子（ｐＬＮＯＨ２について）、及びヒト定常カッパ遺伝子（ｐＬＮＯＫについて）を組込まれている。これらのＨ／Ｂフラグメントは、分岐点シグナル及びスプライスアクセプターシグナル並びに３’末端のポリ−Ａシグナルを持つイントロンを含有する。Ｈ／Ｂ制限部位にクローニングされたＣ−遺伝子は、これらのシグナルを持たなければならない。
再増幅用プライマー
ＶＨ−遺伝子用の再増幅プライマーを構成するときに、スプライスドナー部位ａｇｇｔｇａｇｔが含まれなければならない（上記参照）。
ＶＫ−遺伝子用のプライマーを構成するときに、ヒトのカッパＪ１セグメントからのスプライスドナー部位ｔｇａｇｔａｇａａを用いることができる。
３’ＶＫプライマー２２１４７：
0003786695.tif 000004
５’ＶＫプライマー２２１４６：
0003786695.tif 000005
３’ＶＨプライマーＶＨＴＰ３Ｆ：
0003786695.tif 000006
５’ＶＨプライマーＶＨＴＰ３Ｂ：
0003786695.tif 000007
斜体字で示した配列は、Ｖ−配列の例である。構成されたプライマーは、各々の場合で、増幅されるべき実際のＶ−遺伝子に相補的でなければならない。
２つのベクターの１つでの組み合わせ
ｐＬＮＯＫは、ＢｇＩＩＩ及びＢａｍＨＩで切断される。これは、ｈＣＭＶプロモータ、Ｖ−遺伝子及びカッパ遺伝子を含むフラグメントを作る。このフラグメントは、ｐＬＮＯＨ２ベクターの、ＢａｍＨＩぶいにおいて、両方向に挿入される。
上記２つのベクターは、繊維芽宿主細胞などの非−β細胞において、ｈＣＭＶプロモーターの下でＩｇ鎖を高いレベルで発現するために用いられる。プラズマ宿主細胞を用いる場合、ｈＣＭＶプロモータを持つこれらのベクターも用いることができるが、天然Ｉｇプロモータも、低い発現レベルではあるが機能する。
Ｉｇプロモータを用いたＪ５５８Ｌ細胞での突然変異重鎖の発現
突然変異Ｃ３遺伝子は、ＨｉｎｄＩＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして（図１参照）、ベクターｐＳＶ２ｇｐｔＶNP［Neuberger等, 1985, Nature 314: 268-271］にサブクローニングされる。これらの構造体は、Ｊ５５８Ｌセルライトにトランスフェクトされる。８００ｌのＰＢＳ中の２×１０7細胞及び２０ｇＤＮＡが、３．５ｋＶ／ｃｍ及び２５Ｆの電気泳動条件下を用いてトランスフェクトされた。Ｊ５５８Ｌセルラインは、決して重鎖を生成しない形質細胞腫である。しかし、重鎖遺伝子でトランスフェクトされたとき、完全Ａｂが生成され分泌される。
Ｌ３突然変異重鎖（図１参照）を含有するＡｂは、トランスフェクトされた細胞の成長培地から、各々プロテインＡ及びプロテインＧで被覆された２つの連続したカラムを用いて単離された。プロテインＡカラムは、ＦＣＳから混合するあｂの幾分を取り除くために用いられるが、ヒトＩｇＧ３は関知しない。突然変異Ｌ３Ａｂは、プロテインＧカラムから、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶離した。
樹状細胞豊富な脾臓細胞の単離
脾臓に、０．５ｍｌの１００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ・タイプＩＶを注入し、５分間インキュベートし、次いで、脾臓細胞を単離した。赤血球細胞は、ＡＣＴに溶解し、残りの細胞をペトリ皿において、３７℃で２時間インキュベートした。非接着細胞を新たにし、新鮮な媒質を加え、皿を３７℃で終夜インキュベートした。皿を渦巻きにした後、非接着細胞を回収し、Ｔ細胞活性化実験に用いた。
外的に添加した抗原性Ｌ３ＡｂについてのＴ細胞活性化アッセイ
Ｔ細胞レセプタートランスジェニックマウス［Bogen等, Eur. J. Immunol（1992）22: 703-709］からのリンパ節（ＬＮ）細胞をＴ細胞として用い、ＡＰＣとして、樹状細胞豊富なＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞を採用した。ＬＮ細胞（１０5／ウェル）及び照射（２０００ｒａｄ）した脾臓細胞（１０4／ウェル）を、３組、種々の抗原性Ｌ３Ａｂとともに共培養した。２日後、培地を、１μＣｉ［3Ｈ］ｄＴｈｄでパルスし、［3Ｈ］ｄＴｈｄ取り込みを数えた。これらのＩＬ−２含有量は、ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬセルラインを用いて前述したように測定した［Lauritzen, G.F.及びBogen, B., 1991, Scand. J. Immunol., 33, 647-656］。
外的添加抗原性Ｌ３ＡｂでのＴ細胞アッセイからの結果
我々は、抗原性ペプチドがＬ３突然変異重鎖から励起され、ＡＰＣへの外的添加によっても発現するか否かを確認したかった。ＡＰＣ（脾臓細胞）及びＴ細胞（ＬＮ細胞）は、種々の量のＬ３Ａｂを含有する媒質中で３組培養した。抗原として１０μｇ／ｍｌの合成９１−１０１（λ２315）を用いた正の対照も含む。Ｔ細胞増幅は、［3Ｈ］ｄＴｈｄの導入、及び培養上澄みへのＩＬ−２分泌の両方によって測定した。ＩＬ−２測定の結果を図３に与えた。最大のＩＬ−２（［3ＨｄＴｈｄ］のＣＴＬＬ細胞への導入、ｃｐｍ）は、合成ペプチドを抗原として用いた対照（図示せず）において測定された。これらの対照からの平均ｃｐｍは、４２，２７６であり、１０μｇ／ｍｌのＬ３抗原の約３倍大きかった。しかし、抗原性Ｍ３１５またはＬ３Ａｂの量の増加に伴い、かなりのレベルのＩＬ−２が培養上澄みに分泌された。特に、ペプチドは、Ｌ３変異体に位置する方が、Ｍ３１５の元の位置にあるときよりも効率的に発現された。Ｔ細胞増殖の測定でも極めて類似した結果が得られた。
種々の突然変異ｒａｓペプチド挿入物を有する変性ＩｇＧ３重鎖の構成
免疫学的試薬
ＥＬＩＳＡに用いた抗体及び複合体は、我々の研究室で製造した。ビオチニル化は、文献［Goding J.W.（1986）Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Sc. ed. Academic Press, London］に記載されているように行った。ビオチン−Ｘ−ＮＨＳは、Calbiochem Corporation（La Jolla, CA）から入手した。ＢＳＡまたはセファロースをラベルするハプテンＮＩＰ／ＮＰは、以下の文献に記載されている［Michaelsen, T.E., Aase, A., Westby, C.,及びSandlie, I.（1990）Enhancement of complement activation and cytolysis of human IgG3 by deletion of hinge exons. Scand. J. Immunol. 32, 517-528;及び、Sandlie, I., Aase, A., Westby, C.,及びMichaelsen, T.E.（1989）Clq binding to chimeric monoclonal IgG3 antibodies consisting of mouse variable regions and human constant region with shortened hinge containing 15-47 amino acids. Eur. J. Immunol. 19, 1599-1603］。ＮＩＰ及びＮＩＰ／ＮＩＰ−Ｃａｐ−ｏ−Ｓｕは、Chambridge Research Biochemicals Ltd., Cambridge, UKから購入した。
変異体ＩｇＧ３重鎖遺伝子にイン・ビトロ突然変異及び構成
（１）ＩｇＧ３  １−２５ｒａｓ及びＩｇＧ３  ５−２１ｒａｓをエンコードする構成
（Ｇ３ｍｂ°アロタイプ）ヒトγ３定常領域遺伝子は、ｐＵＣ１９（M.-P. Lefranc, Laboratoire d' Immunogenetique, Universite des Sciences et Techniques du Languedoc, Montpellier, Franceからの贈与物）（ｐＵＣγ、図４Ａ）のポリリンカーにクローニングした２．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩフラグメントに含有せしめた。ＣH１ドメインをエンコードする０．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントは、Ｍ１３ｍｐ１８のポリリンカーにサブクローニングした。イン・ビトロ突然変異形成は、［Kunkel, T.A., Roberts, J.D.及びZakour, R.A.（1987）Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Meth. Enzymol., 154, 367-382;及び、Sanger, F., Nicklen, S.及びCoulson, A.R.（1977）DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467］に記載されているように行った。大きなヘテロ二本鎖の生成ではなく効率的なアニーリングを確実にするために、突然変異中心ヌクレオチドの両側に２０ヌクレオチドの隣接領域を選択した。図４Ｂ及びＣは、変化したアミノ酸及び用いたプライマーを示す。
突然変異形成に用いた試薬及びE.coli株は、BIO RAD laboratories（Richmond, CA, USA）から購入し、合成オリゴヌクレオチドは、DNA Synthesis Laboratory, University of OsloまたはMedProbe AS（Oslo, Norway）から購入した。変異体のスクリーニングは、独特のＳｐｅＩ制限部位の導入によって促進した。突然変異は、サンガー（Sanger）のジデオキシ鎖停止法（５）を用いた配列法によって照合した。用いた試薬は、United States Biochemicals（Cleveland, Ohio, USA）からのシークエナーゼ２．０商業キットで供給された。
（２）ｒａｓペプチドに単一のアミノ酸置換を持つＩｇＧ３  １−２５ｒａｓ及びＩｇＧ３  ５−２１ｒａｓをエンコードする遺伝子の構成
ＩｇＧ３  １−２５ｒａｓ及びＩｇＧ３  ５−２１ｒａｓのｒａｓエピトープに単一のアミノ酸置換を導入するために、これらの遺伝子構造物をＭ１３ｍｐ１８にクローニングした。これらの構造を、イン・ビトロ突然変異形成反応のためのテンプレートとして提供した。導入した突然変異は以下の通りである。
プライマー5'-tgggcgcggtgggcgtgggc-3'は、12Gly→Val変異（IgG3 1-25rasG12V及びIgG3 5-21rasG12V）の製造に用い、プライマー5'-gtgggcgcgcggggcgtgggc-3'は、12Gly→Arg変異（IgG3 1-25rasG12R及びIgG3 5-21rasG12R）の製造に用い、そして、プライマー5'-gcgcgggcgacgtgggcaagt-3'は、12Gly→Asp変異（IgG3 1-25rasG12D及びIgG3 5-21rasG12D）の製造に用いた。太字のヌクレオチドは変異部位を表す。図５は、得られた突然変異ＩｇＧ３重鎖遺伝子を示す。
変異下ＣH１フラグメントは、ｐＵＣγのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩＩ部位の対応する野生種（ｗ.ｔ．）配列と置換した。変異体ＩｇＧ３重鎖遺伝子並びにｗ．ｔ．遺伝子は、ベクターｐＬＮＯＨ２にＨｉｎｇＩＩＩ−ＢａｍＨＩとしてクローニングした（図２参照）。クローニング部位より上流側で、このベクターはｈＣＭＶプロモータ及びマウスＶH遺伝子ＶNPも有し、よって、完全なキメラ重鎖遺伝子を形成する。ＶNP遺伝子セグメントは、ハプテン４ヒドロキシ−３ニトロフェナセチル（ＮＰ）及びヨウ化誘導体５ヨード−４ヒドロキシ−３ニトロフェナセチル（ＮＩＰ）に特異性を有するλ１軽鎖含有マウス抗体の特徴を持つＶH鎖をコードする。また、ｐＬＮＯＨ２ベクターは、Ｇ−４１８に対する耐性によって安定なトランスフェクションを選択できるネオマイシン選択マーカーも有する。
細胞培養及び遺伝子輸送
突然変異重鎖遺伝子は、マウス骨髄腫セルラインＪ５５８Ｌ（Dr. S.L. Morrison, Dept. of Microbiology, Molecular Biology Institute, UCLAからの贈与物）またはＮＳＯ（ATCCから入手）に、電気穿孔によって導入された。Ｊ５５８Ｌは、λ１軽鎖を生成したが、それ自身の重鎖は発現しなかった。内在性軽鎖のＶλは、トランスフェクトされた重鎖のＶNPと相補し、ＮＰ−特異的抗体を生成した。ＮＳＯは、イムノグロブリンポリペプチドを全く生成せず、従って、ＩｇＧ３重鎖遺伝子を含有するｐＬＮＯＨ２及び無関係なマウス可変遺伝子の下流側に挿入されたヒトκ軽鎖遺伝子を含有するベクターｐＬＮＯＫ（図２参照）からなる混合ベクターでトランスフェクトした。
Ｊ５５８Ｌ細胞は、ＲＰＭＩ１６４０中に、ＮＳＯは、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てGibco BRC, Paisley, Scotlandからのもの）を添加したＤＭＥＭ中に、３７℃及び５％ＣＯ2で保持した。
トランスフェクションは、２×１０7細胞及び０．８ｍｌ氷冷ＰＢＳ中の２０μｇプラスミドに、２５Ｆの容量セッティングを用いて３．５ｋＶ／ｃｍの電場をかけることにより行った。細胞は、次いで標準媒質で希釈し、２４ウェルの組織培養皿に播種した。２４時間インキュベートした後、トランスフェクタントは、８００μｇ／ｍｌＧ−４１８を追加した媒質中で選択した。安定にトランスフェクトされた細胞のコロニーが、約２週間後に見られた。トランスフェクション効率は約５×１０-5であった。
キメラ抗体の定量
トランスフェクタントに分泌されたＩｇＧ３の量をＥＬＩＳＡで測定した。マイクロタイタープレートを、４℃において、１μｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＮＩＰまたはＰＢＳ／０．０２％アジド中のポリクローナルヒツジ抗−ヒトＩｇＧ３（Ｆａｂ特異的）で終夜被覆した。０．０５％Tween20を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔ）で数回洗浄した後、各ウェルにに１００μｌの細胞上澄み液を添加して、３７℃で１．５時間インキュベートした。上記のように洗浄した後、ＰＢＳ／Ｔ中のビオチンラベルしたポリクローナルヒツジ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）（１：８０００）とストレプトアビディン及びビオチンラベルしたアルカリホスファターゼ（１：６０００）からなる第２の層を添加した。３７℃でさらに１．５時間インキュベートした後、ＰＢＳ／Ｔで繰り返し洗浄し、基質ｐ−ニトロフェニルホスファート（Sigma）を添加して結合した抗体を顕現させた。Dynatech MR 700 Microplate Readerで４０５ｎｍの吸収を測定する前に、反応を３７℃で２０−６０分間行った。抗体の標準曲線は、ＥＬＩＳＡ及び２８０ｎｍの吸収測定によって定量化された親和性精製されたヒトＩｇＧの逐次希釈液の吸収を測定することによって構成した。
Ｊ５５８Ｌ及びＮＳＯ細胞からの突然変異抗体の分泌
Ｊ５５８Ｌは、図５に示した重鎖遺伝子構造でトランスフェクションした。ＮＳＯは、ＩｇＧ３  w.t.、ＩｇＧ３  １−２５ｒａｓ及びＩｇＧ３  ５−２１重鎖遺伝子構造体並びにκ軽鎖でトランスフェクションした。分泌された抗体の量は、ハプテン抗原（ＮＩＰ−ＢＳＡ）が被覆として用いられたＥＬＩＳＡ反応によって決定した。抗体の通常レベルが検知されたので、ＣＨ１へのペプチドの導入後でも、抗原特異性が維持されていることが示された。
Ｊ５５８Ｌトランスフェクタントによって分泌された抗体の量を、表１にまとめた。
ＮＳＯトランスフェクタントから分泌された抗体の量は、Ｊ５５８Ｌトランスフェクタントとはかなり異なる（図２参照）。しかし、我々は、５−１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ３  １−２５ｒａｓ及びＩｇＧ３  ５−２１ｒａｓ抗体を分泌するＮＳＯトランスフェクタントの個々のクローンを最近得ている。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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