(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコノバクター属またはアセトバクター属に属し、D-アラビトールをキシリトールに変換する能力を持つ微生物をD-アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法。
【請求項２】
グルコノバクター属またはアセトバクター属に属する微生物がグルコノバクター・サブオキシダンス、グルコノバクター・オキシダンスまたはアセトバクター・キシリナムである請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キシリトールの製造法に関する。キシリトールは、食品、医薬分野等で有用である。
【０００２】
【従来の技術】
天然に存在する糖アルコールであるキシリトールの需要は今後増加することが予想される。キシリトールは、蔗糖よりもカロリーが低いが蔗糖に匹敵する甘味を呈し、低カロリー甘味料として将来有望である。加えて、抗う蝕性を有しており、虫歯予防甘味料となりうる。さらに、キシリトールは血糖値を上昇させないため、糖尿病治療の際の輸液として利用されている。
【０００３】
現在、キシリトールは主として米国特許第4,008,825に記載されるようなD-キシロースの水素添加により工業生産されている。原料となるD-キシロースは、硬木、藁、とうもろこしの穂軸、オート麦の外皮、その他キシランに富んだ植物材料を出発材料とし、これを加水分解することによって得られる。
【０００４】
しかし、植物材料を加水分解して得られるD-キシロースは価格が高いという問題点がある。これは、生産コストが高いことによる。例えば、植物材料の加水分解処理の収率が低いため、生成するD-キシリトールの純度は低くなる。このため、加水分解処理後に、イオン交換処理をして加水分解に用いた酸および色素を除去する。さらに、D-キシロースを結晶化して他のヘミセルロース性糖類を除去する。食品に適するD-キシロースを得るためにはさらなる精製が必要となる。これらイオン交換処理および結晶化処理が生産コストの上昇につながる。
【０００５】
この問題点を解決するため、出発材料が容易に手に入り、かつ生じる廃棄物の量が少ないキシリトールの製造法が望まれている。例えば、他のペンチトールを出発原料としてキシリトールを生産する方法が開発されてきた。容易に手に入るペンチトールのひとつがD-アラビトールであり、D-アラビトールは酵母を用いて製造できる（Can.J.Microbiol.,31,1985,467-471、J.Gen.Microbiol.,139,1993,1047-1054）。
【０００６】
そこで、D-アラビトールを原料とするキシリトール生産法がいくつか開発されている。Applied Microbiology., 18, 1969, 1031-1035には、デバリオミセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii） ATCC20121を用いて、発酵によりグルコースからD-アラビトールを生産し、次に、アセトバクター・サブオキシダンス（Acetobacter suboxydans）を用いて同D-アラビトールをD-キシルロースに変換し、さらにキャンディダ・ギリエルモンディ・ヴァリ．ソヤ（Candida guilliermondii var. soya）を同D-キシルロースに作用させキシリトールに変換する方法が報告されている。
【０００７】
また、ヨーロッパ特許出願公開第403392号（出願人ロケッテ・フレレス(Roquette Freres)）および同第421882号（出願人ロケッテ・フレレス(Roquette Freres)）には、耐浸透圧酵母を用いてD-アラビトールを発酵生産し、次にアセトバクター属細菌、グルコノバクター属細菌またはクレブジエラ属細菌を用いて同D-アラビトールをD-キシルロースに変換し、次いで同キシルロースにグルコース（キシロース）イソメラーゼを作用させてキシロースおよびキシルロース混合物を生成し、さらに生成したキシロース／キシルロースに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている。また、同キシロース／キシルロース混合物中のキシロースを予備濃縮し、これに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている。
【０００８】
しかし、上記D-アラビトールを原料とするキシリトール生産法は、高収率でキシリトールを生成することができるが、多段階の反応ステップを必要とするためにプロセスが煩雑なものとなるという欠点があり、そのため経済的にも満足のいくものではなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、D-アラビトールを原料としてキシリトールを製造する方法であって、かつ、プロセスが単純な同製造法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
鋭意検討の結果、本発明者らはD-アラビトールをキシリトールに直接変換する活性を持つ菌を見出し、本発明を完成させ、前記課題を解決した。
【００１１】
すなわち本発明は、グルコノバクター属またはアセトバクター属に属し、D-アラビトールをキシリトールに変換する能力を持つ微生物をD-アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法である。
【００１２】
さらに本発明は、グルコノバクター・サブオキシダンス、グルコノバクター・オキシダンスまたはアセトバクター・キシリナムに属し、D-アラビトールをキシリトールに変換する能力を持つ微生物をD-アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法である。
【００１３】
また本発明は、アクロモバクター属、アグロバクテリウム属、アルスロバクター属、アゾトバクター属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エルビニア属、フラボバクテリウム属、ミクロコッカス属、ノカルディア属、プラノコッカス属、シュードモナス属またはロドコッカス属に属し、D-アラビトールをキシリトールに変換する能力を持つ微生物をD-アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法である。
【００１４】
さらに本発明は、アクロモバクター・ビスコーサス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アルスロバクター・パラフィネウス、アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス、アゾトバクター・インディカス、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム、コリネバクテリウム・ファシエンス、エルビニア・アミロボーラ、フラボバクテリウム・ペレグリナム、フラボバクテリウム・フカタム、ミクロコッカス・ｓｐ．  ＣＣＭ８２５、ノカルディア・オパカ、プラノコッカス・ユーシナタス、シュードモナス・シンキサンタまたはロドコッカス・エリスロポリスに属し、D-アラビトールをキシリトールに変換する能力を持つ微生物をD-アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法である。
【００１５】
また本発明は、モルガネラ属、アクチノマドゥラ属、アクチノマイセス属またはストレプトマイセス属に属し、D-アラビトールをキシリトールに変換する能力を持つ微生物をD-アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法である。
【００１６】
さらに本発明は、モルガネラ・モルガニ、アクチノマドゥラ・マドゥラ、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・アンチビオティカス、ストレプトマイセス・カカオイまたはストレプトマイセス・ラベンデュレに属し、D-アラビトールをキシリトールに変換する能力を持つ微生物をD-アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられる微生物は、グルコノバクター属、アセトバクター属、アクロモバクター属、アグロバクテリウム属、アルスロバクター属、アゾトバクター属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エルビニア属、フラボバクテリウム属、ミクロコッカス属、ノカルディア属、プラノコッカス属、シュードモナス属、ロドコッカス属、モルガネラ属、アクチノマドゥラ属、アクチノマイセス属またはストレプトマイセス属に属し、D-アラビトールをキシリトールに変換する能力を持つ微生物である。
【００１８】
上記微生物として具体的には、グルコノバクター・サブオキシダンス、グルコノバクター・オキシダンス、
アセトバクター・キシリナム、
アクロモバクター・ビスコーサス、
アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アルスロバクター・パラフィネウス、
アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス、
アゾトバクター・インディカス、
ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム、
コリネバクテリウム・ファシエンス、
エルビニア・アミロボーラ、
フラボバクテリウム・ペレグリナム、フラボバクテリウム・フカタム、
ミクロコッカス・ｓｐ．  ＣＣＭ８２５、
ノカルディア・オパカ、
プラノコッカス・ユーシナタス、
シュードモナス・シンキサンタ、
ロドコッカス・エリスロポリス、
モルガネラ・モルガニ、
アクチノマドゥラ・マドゥラ、
アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス、
ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・アンチビオティカス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・ラベンデュレ等が挙げられる。
【００１９】
さらに、本発明に用いられる微生物の具体的な菌株としては、以下のような菌株が挙げられる。
【００２０】
グルコノバクター・サブオキシダンス(Gluconobacter suboxydans) NRRLB-755
グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans) ATCC621
グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans) IAM 1842
グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans) IAM 1839
アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum) ATCC14851
【００２１】
アクロモバクター・ビスコーサス(Achromobacter viscosus)  ATCC12448
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) ATCC2778
アグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter) ATCC4718
アルスロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus) ATCC15590
アルスロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus) ATCC15591
アルスロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus) ATCC19064
アルスロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus) ATCC19065
アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス(Arthrobacter hydrocarboglutamicus) ATCC15583
アゾトバクター・インディカス(Azotobacter indicus) ATCC9037
ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム(Brevibacterium ketoglutamicum) ATCC15587
ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム(Brevibacterium ketoglutamicum) ATCC15588
コリネバクテリウム・ファシエンス(Corynebacterium fasciens) IAM1079
エルビニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora) IFO12687
フラボバクテリウム・ペレグリナム(Flavobacterium peregrinum) CCM1080-A
フラボバクテリウム・フカタム(Flavobacterium fucatum) AJ2478
ミクロコッカス・ｓｐ．(Micrococcus sp.) CCM825
ノカルディア・オパカ(Nocardia opaca) NCIB9409
プラノコッカス・ユーシナタス(Planococcus eucinatus) AJ1656
シュードモナス・シンキサンタ(Pseudomonas synxantha) ATCC796
ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis) ATCC11048
【００２２】
モルガネラ・モルガニ (Morganella morganii) AJ2771
アクチノマドゥラ・マドゥラ (Actinomadura madurae) ATCC19425
アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス (Actinomyces violaceochromogenes) IFO13100
ストレプトマイセス・セリカラー (Streptomyces coelicolor) ATCC10147
ストレプトマイセス・フラベラス (Streptomyces flaveolus) AJ9012
ストレプトマイセス・グリセオラス (Streptomyces griseolus) NRRL B-1062
ストレプトマイセス・リビダンス (Streptomyces lividans) IFO13385
ストレプトマイセス・オリバセウス (Streptomyces olivaceus) ATCC21379
ストレプトマイセス・タナシエンシス(Streptomyces tanashiensis) ATCC15238
ストレプトマイセス・バージニエ (Streptomyces virginiae) AJ9053
ストレプトマイセス・アンチビオティカス (Streptomyces antibioticus) NRRL3238
ストレプトマイセス・カカオイ (Streptomyces cacaoi) ATCC19093
ストレプトマイセス・ラベンデュレ (Streptomyces lavendulae) ATCC8664
【００２３】
フラボバクテリウム・ペレグリナム(Flavobacterium peregrinum) CCM1080-A およびミクロコッカス・ｓｐ．(Micrococcus sp.) CCM825は、チェコスロバック・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムズ(Czechoslovak Collection of Microorganisms、住所 Tvrdeho 14， Brno CS-602 00, Czechoslovakia)から入手可能である。
【００２４】
フラボバクテリウム・フカタム(Flavobacterium fucatum) AJ2478は、1983年4月25日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）（住所 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan）に寄託され、受託番号FERM P-7053が付与され、1998年９月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6492が付与されている。
【００２５】
プラノコッカス・ユーシナタス(Planococcus eucinatus) AJ1656は、1987年1月19日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に寄託され、受託番号FERM P-9133が付与され、1998年９月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6493が付与されている。
【００２６】
モルガネラ・モルガニ (Morganella morganii) AJ2771は、1998年1月16日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に寄託され、受託番号FERM P-16594が付与され、1998年９月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6496が付与されている。
【００２７】
ストレプトマイセス・フラベラス (Streptomyces flaveolus) AJ9012は、1998年1月16日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に寄託され、受託番号FERM P-16585が付与され、1998年９月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6494が付与されている。
【００２８】
ストレプトマイセス・バージニエ (Streptomyces virginiae) AJ9053は、1998年1月16日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に寄託され、受託番号FERM P-16587が付与され、1998年９月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6495が付与されている。
【００２９】
ノカルディア・オパカ(Nocardia opaca) NCIB9409は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（ National Collections of Industrial and Marine Bacteria.、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station  135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。
【００３０】
エルビニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora) IFO12687、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス (Actinomyces violaceochromogenes) IFO13100 およびストレプトマイセス・リビダンス (Streptomyces lividans) IFO13385 は、インシュティチュート・フォア・ファーメンテーション・オオサカ（Institute for Fermentation, Osaka.、住所 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan）から入手可能である。
【００３１】
コリネバクテリウム・ファシエンス(Corynebacterium fasciens) IAM1079、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans) IAM1842およびグルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans) IAM1839は、インシュティチュート・オブ・モレキュラー・アンド・セルラー・バイオサイエンス（旧インシュティチュート・オブ・アプライド・マイクロバイオロジー）（Institute of Molecular and Cellular Biosciences. (Formerly, Institute of Applied Microbiology)、住所：日本国東京都文京区弥生一丁目東京大学（The university of Tokyo, Yayoi 1-chome, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan）から入手可能である。
【００３２】
これらの微生物を培養する培地は格別の制限はなく、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要ならば有機栄養源を含む通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、その他が適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩その他が用いられる。リン源としてはリン酸のカリウム塩、ナトリウム塩等が使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、硫酸イオンその他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有するレバーエキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜用いられる。
【００３３】
また、D-アラビトールからキシリトールを生成する反応を触媒する酵素群の誘導剤としてD-キシロース、D-キシルロース、D-アラビトール、キシリトールなどの糖類や糖アルコールを培地に添加することによって、D-アラビトールをキシリトールに変換する活性が向上する場合がある。
【００３４】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下pH5〜8及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度を適当に制限しつつ12〜72時間程度培養を行なえばよい。
【００３５】
かくして培養された微生物を、D-アラビトールに接触反応させることにより、反応液中にキシリトールを生成することができる。本発明の方法において前記「微生物」は、菌体そのものであってもよいし、D-アラビトールをキシリトールに変換する能力を有する限り菌体の処理物であってもよい。具体的には、菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、該菌体固定化処理物、アセトン処理または凍結乾燥等した菌体、菌体破砕液、菌体破砕液の分画物もしくは精製酵素画分、又はこれらの処理物の固定化物等が挙げられる。
【００３６】
反応は通常、温度20〜60℃、望ましくは30〜40℃で、pH4.0〜9.0望ましくはpH6.5〜7.5で好結果を与える。尚、反応液に炭酸カルシウムを例えば2%(w/v)となるように添加するなどして、反応時のpHの低下を防ぐと、キシリトールの収率を高めることができる場合がある。反応には、静置反応あるいは撹はん反応のいずれの方法も採用し得る。反応時間は、使用する菌体の活性、D-アラビトール濃度などの条件によって異なるが、1〜100時間が望ましい。
【００３７】
反応の際に炭素源を添加して反応を行うと、キシリトールの生成量が向上する場合がある。特に、アセトバクター属細菌又はグルコノバクター属細菌を用いる場合は、反応液に炭素源を添加することが好ましい。添加する炭素源としては糖、糖の誘導体、アルコール類、アルデヒド類、および有機酸類等が挙げられる。糖としてはグルコース、フルクトース、スクロース、ラクトースが挙げられる。糖の誘導体としてはソルビトール、マンニトール、グリセロール等の糖アルコール、グルコン酸等のアルドン酸等が挙げられる。また、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、1,4−ブタンジオール、2,3−ブタンジオールなどが、アルデヒド類としてはホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、イソブチルアルデヒド、グリセロアルデヒドなどが、また有機酸類としてはギ酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸などが挙げられる。これらの炭素源は、単独で使用してもよく、任意の２種または３種以上の炭素源を混合物として使用してもよい。これら炭素源の添加量は、使用する菌体の活性、D-アラビトール濃度などの条件によって異なるが、合計で0.5〜30%(w/v)、好ましくは0.5〜10%(w/v)が好ましい結果を与える。
【００３８】
また、微生物として、菌体破砕液などの菌体処理物を用いる場合には、前記反応系にNADまたはNADHを直接添加することによっても、D-キシルロースの還元反応を効率的に進行させることができる。尚、この場合、微生物としてグルコノバクター属またはアセトバクター属に属する細菌を用いる場合はNADHを、アクロモバクター属、アグロバクテリウム属、アルスロバクター属、アゾトバクター属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エルビニア属、フラボバクテリウム属、ミクロコッカス属、ノカルディア属、プラノコッカス属、シュードモナス属、ロドコッカス属、モルガネラ属、アクチノマドゥラ属、アクチノマイセス属またはストレプトマイセス属に属する細菌を用いる場合はNADを添加することが好ましい。
【００３９】
上記のようにして培養液中に生成したキシリトールは、常法に従って反応液より採取分離される。具体的には、遠心分離、ろ過等により固形物を除去した後、活性炭、イオン交換樹脂により脱色、脱塩し、その溶液から結晶化する方法が採用できる。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例にて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本実施例において、原料のD-アラビトールおよび生成したキシリトールは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。
【００４１】
カラム：Shodex SC1211〔昭和電工社製品〕
移動層：50% アセトニトリル／50% 50ppm Ca-EDTA水溶液
流  速：0.8 ml/分
温  度：60℃
検  出：RI検出器
【００４２】
【実施例１】
普通ブイヨン(栄研化学社製品)1.8％ (w/v)を含む培地（pH 7.0）4mlを試験管に分注し、120℃、20分間加熱滅菌した。この培地に、別滅菌したD-アラビトール、キシリトール、D-キシロースをそれぞれ１％となるように添加した。この培地に表１に示す菌体をそれぞれ接種し、30℃で2日間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1回洗浄した。
【００４３】
それぞれの培養菌体を0.1Mリン酸緩衝溶液 (pH 7.0)に湿重量で５％(w/v)となるように懸濁した。ガラスビーズ（Biospec products社製、直径0.1mm)を菌体懸濁液の約半分量加えて、マルチビーズショッカー MB-200（安井器械社製）を使用して菌体を破砕した。破砕は3000rpmで3分間行い、得られた菌体懸濁液を粗酵素液として以下の変換反応に使用した。
【００４４】
0.1Mトリス塩酸緩衝溶液 (pH 8.0)に終濃度でそれぞれD-アラビトール 5％(w/v)、NAD 10mMとなるように溶解し、試験管に0.9mlずつ分注した。この反応液にそれぞれの粗酵素液を0.1ml添加し、pH 8.0、30℃にて22時間反応を行った。反応後、遠心分離により沈殿を除いた後、HPLCにて生成したキシリトールを定量した。この結果を表１に示した。表１に示したようにいずれの菌体を用いた反応によってもD-アラビトールよりキシリトールが効率よく生成蓄積した。
【００４５】
【表１】
0003855486.tif 000002
【００４６】
【実施例２】
酵母エキス（Yeast Extract）0.2％ (w/v)、肉エキス（Meat Extract）0.2％、ペプトン（Peptone）0.4％、NaCl 0.5％、硫酸マグネシウム7水和物 0.2％を含む培地（pH 7.2）50mlを500ml容フラスコに分注し、120℃、20分間加熱滅菌した。この培地に、別滅菌したD-アラビトール、キシリトール、D-キシロースをそれぞれ１％となるように添加した。この培地に表２に示す菌体をそれぞれ接種し、30℃で2日間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1回洗浄した。
【００４７】
それぞれの培養菌体を0.1Mリン酸緩衝溶液 (pH 7.0)に湿重量で５％(w/v)となるように懸濁した。ガラスビーズ（Biospec products社製、直径0.1mm)を菌体懸濁液の約半分量加えて、マルチビーズショッカー MB-200（安井器械社製）を使用して菌体を破砕した。破砕は3000rpmで3分間行い、得られた菌体懸濁液を粗酵素液として以下の変換反応に使用した。
【００４８】
0.1Mトリス塩酸緩衝溶液 (pH 8.0)に終濃度でそれぞれD-アラビトール 5％(w/v)、NAD 10mMとなるように溶解し、試験管に0.9mlずつ分注した。この反応液にそれぞれの粗酵素液を0.1ml添加し、pH 8.0、30℃にて22時間反応を行った。反応後、遠心分離により沈殿を除いた後、HPLCにて生成したキシリトールを定量した。この結果を表２に示した。表２に示したようにいずれの菌体を用いた反応によってもD-アラビトールよりキシリトールが効率よく生成蓄積した。
【００４９】
【表２】
表２  反応により生成したキシリトール濃度及び収率
────────────────────────────────────
菌株                        生成キシリトール(g/l)  反応収率(%)
────────────────────────────────────
Actinomadura madurae ATCC19425                   0.5           1.0
Actinomyces violaceochromogenes IFO13100         0.1           0.2
Streptomyces coelicolor ATCC10147                0.5           1.0
Streptomyces flaveolus AJ9012                    0.3           0.6
Streptomyces griseolus NRRL B-1062               0.4           0.8
Streptomyces lividans IFO13385                   0.4           0.8
Streptomyces olivaceus ATCC21379                 0.3           0.6
Streptomyces tanashiensis ATCC15238              0.9           1.8
Streptomyces virginiae AJ9053                    0.5           1.0
Streptomyces antibioticus NRRL3238               0.1           0.2
Streptomyces cacaoi ATCC19093                    0.1           0.2
Streptomyces lavendulae ATCC8664                 0.1           0.2
────────────────────────────────────
【００５０】
【実施例３】
ポテトデキストロース(Difco社製品)2.4％ (w/v)、酵母エキス(Difco)3％、バクト・レバー・インフュージョン（Bacto liver infusion）(Difco)2.5％、肉エキス(Difco)0.5％、グリセロール1.5％を含む培地（pH 7.0）50mlを500ml坂口フラスコに分注し、120℃、20分間加熱滅菌した。この培地に、別に滅菌したD-アラビトール、キシリトール、D-キシロースをそれぞれ0.5％となるように、および炭酸カルシウムを2.5%となるように添加した。この培地にグルコノバクター・オキシダンスATCC621、グルコノバクター・サブオキシダンス NRRLB-755およびアセトバクター・キシリナム ATCC14851をそれぞれ接種し、30℃で3日間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1回洗浄した。
【００５１】
D-アラビトール 5％ (w/v)、D-グルコース 1％を0.1Mリン酸緩衝溶液 (pH 7.5)に溶解し、試験管に10mlずつ分注した。この反応液にそれぞれの培養菌体を湿重量で５％(w/v)となるように添加し、pH 7.5、30℃にて22時間振とう反応を行った。反応後、遠心分離により菌体を除いた後、HPLCにて生成したキシリトールを定量した。この結果を表３に示した。表３に示したようにいずれの菌体を用いた反応によってもD-アラビトールよりキシリトールが効率よく生成蓄積した。
【００５２】
【表３】
0003855486.tif 000003
【００５３】
【実施例４】
ポテトデキストロース(Difco社製品)2.4％ (w/v)、酵母エキス(Difco)3％、肉エキス(Difco)0.5％、グリセロール1.5％を含む培地（pH 7.0）40mlを500ml坂口フラスコに分注し、120℃、15分間加熱滅菌した。この培地に、別滅菌したD-アラビトール、キシリトール、D-キシロースをそれぞれ１％となるように、および炭酸カルシウムを2.0%となるように添加した。この培地にグルコノバクター・オキシダンスATCC621を接種し、30℃で3日間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1回洗浄した。
【００５４】
D-アラビトール 5％ (w/v)、D-グルコース 1％を0.1Mリン酸緩衝溶液 (pH 6.0)に溶解し、試験管に10mlずつ分注した。この反応液に菌体を湿重量で10％(w/v)、炭酸カルシウムを2％(w/v)となるように添加し、30℃にて振とう反応を行った。反応６時間目にエタノールまたはグルコースを表４に示すように加えた場合についても行った。27時間反応後、遠心分離により菌体を除いた後、HPLCにて生成したキシリトールを定量した。この結果を表４に示した。表４に示したように炭素源の添加により、D-アラビトールよりのキシリトールの生成量が増大した。
【００５５】
【表４】
0003855486.tif 000004
【００５６】
【実施例５】
ポテトデキストロース(Difco社製品)2.4％ (w/v)、酵母エキス(Difco)3％、肉エキス(Difco)0.5％、グリセロール1.5％を含む培地（pH 7.0）40mlを500ml坂口フラスコに分注し、120℃、15分間加熱滅菌した。この培地に、別滅菌したD-アラビトール、キシリトール、D-キシロースをそれぞれ１％となるように、および炭酸カルシウムを2.0%となるように添加した。この培地にグルコノバクター・サブオキシダンス NRRLB-755およびアセトバクター・キシリナム ATCC14851をそれぞれ接種し、30℃で3日間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1回洗浄した。
【００５７】
D-アラビトール 5％ (w/v)、D-グルコース 1％を0.1Mリン酸緩衝溶液 (pH 6.0)に溶解し、試験管に10mlずつ分注した。この反応液に菌体を湿重量で10％(w/v)、炭酸カルシウムを2％(w/v)となるように添加し、30℃にて振とう反応を行った。反応６時間目にエタノール5%およびグルコース0.5%を添加した。27時間反応後、遠心分離により菌体を除いた後、HPLCにて生成したキシリトールを定量した。この結果を表５に示した。表５に示したようにD-アラビトールよりキシリトールが効率よく生成蓄積した。
【００５８】
【表５】
0003855486.tif 000005
【００５９】
【実施例６】
ポテトデキストロース（Difco社製品）2.4%(w/v)、酵母エキス（Difco）3%、肉エキス（Difco）0.5%、グリセロール1.5%を含む培地（pH 7.0）50mlを500ml坂口フラスコに分注し、120℃、15分間加熱殺菌した。D-アラビトール溶液を120℃、15分間殺菌した後、上記培地に3.0%となるように添加した。さらに炭酸カルシウム1gを200℃、120分間乾熱滅菌して上記培地に添加した。この培地にグルコノバクター・オキシダンスATCC621を接種し、30℃で３日間振とう培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。
【００６０】
D-アラビトールを0.1Mリン酸緩衝溶液（pH 6.0）に5%(w/v)となる様に溶解し、これに上記の洗浄菌体を湿重量で約10%(w/v)となるように添加した。この反応液10mlを試験管に入れ、30℃にて振とう反応を行った。24時間反応後、遠心分離により菌体を除いた後、HPLCにて生成したキシリトールを定量した。この結果を表７に示した。表６に示したようにD-アラビトールよりキシリトールが生成蓄積した。
【表６】
0003855486.tif 000006
【００６１】
【発明の効果】
本発明により、D-アラビトールを原料として、単純なプロセスでキシリトールを製造することができる。