(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの一本鎖標的核酸配列とのハイブリッド形成能のアッセイ方法であって、
ａ）標的核酸配列を含有する試験試料を該オリゴヌクレオチド接触させ、
ｂ）標的核酸配列およびオリゴヌクレオチドを含有する該試験試料を二本鎖切断・分解剤で処理し、
ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、処理された試験試料をアクリジニウムエステル標識プローブと接触させ（ここで、プローブは切断または分解されていない核酸配列とハイブリダイズすることができて、その結果、該プローブの標識は次なる化学的不活性化から保護されるが、該プローブは切断または分解された核酸配列とはハイブリダイズすることができず、その結果、該プローブの標識は次なる化学的不活性化から保護されないままである）、
ｄ）プローブと接触した試験試料を、該試料中の該プローブの保護されない標識を不活性化する薬剤で処理し、
ｅ）該プローブの保護された標識の量を測定することによって、プローブの切断または分解されていない核酸とのハイブリダイゼーションを測定すること
を含む方法。
【請求項２】
さらに、工程ｂ）の後であって工程ｃ）の前に、処理された試料中に存在するオリゴヌクレオチドをＤＮａｓｅで分解する工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドの一本鎖標的核酸配列とのハイブリッド形成能のアッセイ方法であって、
ａ）標的核酸配列を含有する試料をオリゴヌクレオチドと接触させ、
ｂ）標的核酸配列およびオリゴヌクレオチドを含有する試料を処理される試験試料および対照試料に分け、
ｃ）該試験試料を二本鎖切断・分解剤で処理し、
ｄ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、処理された試験試料および対照試料をアクリジニウムエステル標識プローブと接触させ（ここで、プローブは切断または分解されていない核酸配列とハイブリダイズすることができて、その結果、該プローブの標識は次なる化学的不活性化から保護されるが、該プローブは切断または分解された核酸配列とはハイブリダイズすることができず、その結果、該プローブの標識は次なる化学的不活性化から保護されないままである）、
ｅ）プローブと接触した試験試料を、該試料中の保護されない標識を不活性化する薬剤で処理し、
ｆ）該プローブの保護された標識の量を測定することによって、対照試料および処理された試験試料中でプローブの切断または分解されていない核酸とのハイブリダイゼーションを測定すること
を含む方法。
【請求項４】
標的核酸配列がＲＮＡであり、オリゴヌクレオチドがＤＮＡまたは修飾ＤＮＡである請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが１個以上のホスホロチオエート連結基を含む請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
二本鎖切断・分解剤がＲＮＡseＨである請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
リボザイムの一本鎖標的核酸配列切断能のアッセイ方法であって、
ａ）標的核酸配列を含有する試料をリボザイムと接触させ、
ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、標的核酸配列およびリボザイムを含有する試料をアクリジニウムエステル標識プローブと接触させ（ここで、プローブは、リボザイムの切断部位を含有する標的核酸配列の領域とハイブリダイズすることができ、かつ、該プローブは切断または分解されていない核酸配列とハイブリダイズすることができて、その結果、該プローブの標識は次なる化学的不活性化から保護されるが、該プローブは切断または分解された核酸配列とはハイブリダイズすることができず、その結果、該プローブの標的は次なる化学的不活性化から保護されないままである）、
ｃ）プローブと接触した試験試料を、該試料中の該プローブの保護されない標識を不活性化する薬剤で処理し、
ｄ）該プローブの保護された標識の量を測定することによって、プローブの切断または分解されていない核酸とのハイブリダイゼーションを測定すること
を含む方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーションの測定が、ハイブリダイズされたプローブをハイブリダイズされなかったプローブと物理的に分離せずに、ホモジーニアスアッセイで行われる請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
試験試料を接触させることが生理的条件下で行われる請求項１〜８いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
核酸を切断または分解する第１の薬剤の、標的核酸を切断または分解する能力をアッセイするホモジーニアス方法であって、
ａ）標的核酸を含有する試験試料を第１の薬剤と接触させて、処理された試験試料を形成し、
ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、処理された試験試料をアクリジニウムエステル標識プローブと接触させ（ここで、該プローブは切断または分解部位とハイブリダイズすることができ、かつ、該プローブは切断または分解されていない核酸配列とハイブリダイズすることができて、その結果、該プローブの標識は次なる化学的不活性化から保護されるが、該プローブは切断または分解された核酸配列とはハイブリダイズすることができず、その結果、該プローブの標識は次なる化学的不活性化から保護されないままである）、
ｃ）プローブと接触した試験試料を、該試料中の該プローブの保護されない標識を不活性化する第２の薬剤で処理し、
ｄ）該プローブの保護された標識の量を測定することによって、プローブの切断または分解されていない核酸とのハイブリダイゼーションを測定すること
を含む方法。
【請求項１１】
第１の薬剤がヌクレアーゼまたは制限酵素である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ａ）標的核酸配列およびそれと完全に相補的なオリゴヌクレオチドを含む領域において二本鎖核酸を切断または分解する二本鎖切断・分解剤、および
ｂ）標的核酸配列とハイブリダイズし、かつ、該二本鎖切断・分解剤によって切断または分解することができないアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチド配列を含むプローブ
を含む、オリゴヌクレオチドの一本鎖標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの測定用キット。
【請求項１３】
標的核酸配列がＲＮＡである請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
二本鎖切断・分解剤がＲＮＡｓｅＨである請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
標的核酸配列とハイブリダイズするが、リボザイムによって切断または分解され得ないアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチド配列を含むプローブを含む、リボザイムの標的核酸配列切断能をアッセイするためのキット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーション能および薬物の核酸配列変性能を測定するためのアッセイに関する。これらのアッセイは、実質的な生理学的条件下、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーション能またはリボザイムの標的配列ハイブリダイゼーションおよび切断能を測定するのに特に有用である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡからのタンパクの産生を阻害することができる。リボザイムは、その標的部位にハイブリダイズし、ｍＲＮＡを切断することによって、ｍＲＮＡからのタンパクの産生を阻害することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を説明するために多くのメカニズムが提案された。例えば、ヘレン（Ｈelene）およびトウルム（Ｔoulme）、ビオシミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（Ｂiochimica et Ｂiophysica Ａcta）１０４９：９９（１９９０）；ならびにウールマン（Ｕhlmann）およびペイマン（Ｐeyman）、ケミカル・リビューズ（Ｃhemical Ｒeviews）９０：５４３（１９９０）を参照。これらのメカニズムは、二本鎖に含まれるＲＮＡ鎖を分解する細胞様ＲＮＡseＨに対するＤＮＡ：ＲＮＡ基質を形成すること；アンチセンスオリゴヌクレオチドの、未熟な転写終末に導く未完成ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション；プレ−ｍＲＮＡイントロン／エキソン接合部にハイブリダイズすることによるｍＲＮＡプロセッシングを妨害することを含む。これらのメカニズムは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的核酸配列へのハイブリダイゼーション能に基づく。
オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列に存在する相補的ヌクレオチド間の水素結合によって生じると思われる。標的核酸配列上の個々のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドにアクセシブル（accessible）ではない場合は、ハイブリダイゼーションは、妨げられるであろう。標的核酸配列のインアクセシビリティ（inaccessibility）は、標的核酸配列またはオリゴヌクレオチドの二次構造およびこれらの核酸と関連するタンパクを含む種々の因子によるものであってもよい。
インアクセシビリティ以外の因子は、オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことができる。さらなる因子としては、オリゴヌクレオチドと標的核酸配列との間の相補性の程度およびハイブリダイゼーション条件が挙げられる。
オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーション能を測定するために種々の方法が利用可能である。これらの方法のいくつかは、標識オリゴヌクレオチドを標的部位にハイブリダイゼーションさせ、次いで、形成された二本鎖をハイブリダイズされない標識オリゴヌクレオチドと物理的に分離することを含む。ハイブリダイゼーションは、ゲル電気泳動［サザン（Ｓouthern）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ.Ｍol.Ｂiol.）９８：５０３（１９７５）］；ビオチニル化ＤＮＡプローブおよび酵素標識抗体の使用［イール（Ｙehle）ら、モレキュラー・アンド・セルーラー・プローブズ（Ｍolecular and Ｃellular Ｐrobes）１：１７７（１９８７）］；ならびに蛍光、化学発光および酵素標識合成核酸プローブの使用［アーディア（Ｕrdea）ら、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ（Ｎucleic Ａcids Ｒesearch）１６：４９３７（１９８８）］などの種々の技術を使用して検出することができる。
リンゲルバッハ（Ｌingelbach）らのニュークリイック・アシッズ・リサーチ（Ｎucleic Ａcid Ｒes.）１６：３４０５（１９８８）には、ｍＲＮＡ配列のアクセシビリティ（accessibility）についてチェックするための小麦胚芽溶解物中のｍＲＮＡ配列に対する相補的オリゴヌクレオチドの使用が開示されている。小麦胚芽溶解物は、内因性ＲＮＡseＨを含有する。ｍＲＮＡのアクセシビリティは、相補的オリゴヌクレオチドの存在および不在下、ｍＲＮＡの安定性を測定することによってポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使用して測定された。
マクスウィッゲン（ＭcＳwiggen）らのアブストラクト（Ａbstract）、１９９１には、ＲＮＡ標的部位へのリボザイムアクセシビリティについてのアッセイのための方法が開示されている。該方法は、ＲＮＡ標的をＤＮＡフラグメントとハイブリダイズさせるためのＲＮＡseＨの使用を含む。
発明の概要
本発明は、オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーション能を測定するためのホモジーニアスアッセイを特徴する。これらのアッセイは、標識核酸ベースプローブを使用して、標的核酸配列の変性を検出する。標的核酸配列の変性は、オリゴヌクレオチド：標的二本鎖の形成、および二本鎖変性剤の添加またはオリゴヌクレオチド（例えば、リボザイムなどのエンドヌクレアーゼ活性を有するもの）の固有の二本鎖変性能によって行われる。標識プローブは、プローブ標識を次なる化学的分解から保護するように、非変性核酸にハイブリダイズする。次いで、変性は、プローブ標識シグナルの不在によって測定することができる。薬物の核酸変性能をアッセイするための方法も記載される。
プローブ標識を化学的不活性化から保護するようなプローブのハイブリダイゼーション能を第１図に説明する。第１図は、保護されたプローブ標識、あまり保護されないプローブ標識および保護されないプローブ標識を示す。説明したプローブ標識は、共有結合したアクリジニウムエステル（ＡＥ）である。該プローブを標的核酸とハイブリダイズさせて二本鎖が形成されると、ＡＥは、アルカリ性加水分解から保護される。ＡＥがハイブリダイズされたプローブの末端から離れて位置するほど（すなわち、より中心に位置するほど）、ＡＥは、よりよく保護される。ＡＥが二本鎖領域の末端に位置する場合（第１図Ｂ）、ＡＥは、あまり保護されない。ＡＥが一本鎖プローブに存在する場合、ＡＥは、保護されない。
本発明の当該アッセイは、オリゴヌクレオチドの特定の核酸配列へのハイブリダイゼーション能を測定するために使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムなどのオリゴヌクレオチドの１つの使用は、標的核酸配列にハイブリダイズし、標的核酸がタンパクを合成するために使用されることを防止することである。オリゴヌクレオチドは、核酸、例えば、細菌、植物、ヒトおよびウイルス中に存在する核酸に対する標的とすることができる。
オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションは、標的核酸配列のアクセシビリティ、オリゴヌクレオチドの構造およびハイブリダイゼーション条件を含む多くの因子によって影響を及ぼされる。本発明のアッセイは、１個以上のプローブを使用して、オリゴヌクレオチドフラグメントを物理的に分離することを必要とせずに、種々のハイブリダイゼーション条件下、非標識オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーション能を検出する。温度、ハイブリダイゼーション緩衝液、ハイブリダイゼーション時間および標的に対するオリゴヌクレオチドの濃度比などのハイブリダイゼーション条件は、細胞内条件または生理的条件に近づくように設定することができるか、または、他の適用のために必要とされるものとは無関係に変化させることができる。かくして、該アッセイは、オリゴヌクレオチドがそれらの効果を発揮すると予想される条件下、標的核酸配列へのハイブリダイゼーション能についてオリゴヌクレオチドをスクリーンするために使用されてもよい。
かくして、第１の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドの標的核酸配列とのハイブリッド形成能を測定するホモジーニアスアッセイ法を特徴とする。該アッセイは、以下の工程：（ａ）標的核酸配列を含有する試験試料をオリゴヌクレオチドと接触させ；（ｂ）該試験試料を二本鎖変性剤で処理し；（ｃ）プローブが非変性一本鎖標的核酸配列にハイブリダイズできるストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、処理した試験試料を標的プローブと接触させる工程を含む。該プローブ標識は、標識オリゴヌクレオチドが非変性標的核酸にハイブリダイズされる場合にのみ次なる化学的不活性化から保護されるように選択される。該プローブは、プローブ標識を次なる化学的不活性化から保護するように、変性標識核酸配列にハイブリダイズすることができない。該方法は、さらに、試料の化学的処理から残った保護された標識の量を測定することによって、プローブの非変性標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを測定する工程（ｄ）を含む。化学的処理は、保護されない標識を不活性化できる化学物質を用いて行われる。かかる標識の一例は、ネルソン（Ｎelson）ら（後出の文献）によって開示されているが、ＡＥである。
試験試料は、標的核酸配列を含有する核酸を含む。試験試料の環境は、種々の条件下でハイブリダイゼーションを試験するために変化させることができる。好ましくは、試験試料の環境は、標的核酸が自然に見られる生理的条件に近い。
「実質的に生理的な」なる用語は、生理的環境または細胞環境によく似るように設計された条件を表す。最小限、実質的な生理的条件は、生理的pＨに緩衝化され、生理的温度を有する溶液を含む。好ましくは、生理的条件は、生理的タンパク濃度および組成、核酸濃度、ならびに塩濃度および組成に近い。
本発明のアッセイに使用されるべきオリゴヌクレオチドは、典型的には、標的核酸配列と相補的であるように設計される。相補性の程度およびオリゴヌクレオチドのサイズは、変えることができる。該アッセイの１つの使用は、オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーション能を測定することである。
本発明のアッセイの特徴は、プローブ標識を次なる化学的不活性化から保護するような標識プローブの非変性標的配列へのハイブリダイゼーション能である。標的配列の変性は、核酸を切断、分解または化学的に変性できる二本鎖変性試薬を用いて行うことができる。二本鎖変性試薬の例としては、ＤＮＡse、ＲＮＡse、制限酵素、化学試薬、および核酸を切断できる化学試薬を装備した三本鎖が挙げられる。
好ましい二本鎖変性試薬は、オリゴヌクレオチド：標的二本鎖の標的配列を選択的に分解するか、または、該二本鎖の標的鎖における共有結合を破壊し、一本鎖標的配列を分解または変性しないであろう物質である。一本鎖標的配列が二本鎖変性剤の作用によりもはや存在しない場合、該プローブは、全くハイブリダイズすることができず、結果として、プローブ標識は、化学的不活性化から保護されないであろう。この場合、該アッセイは、オリゴヌクレオチド：標的二本鎖が形成されても形成されなくても、標的配列の除去が標的配列の変性を示すので、変性された標的核酸の検出に基づいてオリゴヌクレオチド：標的二本鎖の形成を測定することができない。好ましくは、標的核酸は、ＲＮＡであり、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドがホスホジエステルまたはホスホロチオエート基によって結合されるＤＮＡであり、二本鎖変性剤は、ＲＮＡseＨである。
該標識プローブは、非変性標的配列の存在を検出するために使用される。プローブは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、非変性標的核酸配列にハイブリダイズするために充分な、標的核酸配列と相補的な隣接塩基を有する標識オリゴヌクレオチドである。好適な標識は、適切なストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ハイブリダイゼーションを妨げないが、結合状態（プローブ：標的）対非結合状態で異なる特徴を示し、容易に検出することができる。標識のために有用な特徴の例は、結合状態においてアルカリ性加水分解に対する高い耐性であるが、非結合状態の場合は、そうではない。プローブは、好ましくは、８〜１００ヌクレオチド長さ、さらに好ましくは、１４〜５０ヌクレオチド長さである。
アクリジニウムエステルは、好ましい標識である。ＡＥによるケミルミネッセンスは、「ホモジーニアス・プロテクション・アッセイ」（Ｈomogeneous Ｐrotection Ａssay）と題されるアーノルド（Ａrnold）らのＥＰＯ出願番号８８３０８７６７.８、公開番号３０９２３０（出典明示により本明細書の一部とする）およびネルソン（Ｎelson）らのノンイソトピック・ディエヌエイ・プローブ・テクニクス（Ｎonisotopic ＤＮＡ Ｐrobe Ｔechniques）、第２７５頁、アカデミック・プレス、サンディエゴ（クリッカ（Ｋricka）編、１９９２）（出典明示により本明細書の一部とする）（ＡＥについての全ての化学式を含む）によって開示されている。アーノルドら（前出の文献）は、ホモジーニアス保護アッセイにおいて使用することができるアクリジニウムエステルの多くの例を開示している。これらのアクリジニウムエステルは、本明細書に記載の方法についてのプローブ標識として使用することもできる。第２図は、保護されたＡＥ−標識または保護されないＡＥ−標識の示差加水分解（differential hydrolysis）を説明する。ケミルミネッセンスは、Ｈ2Ｏ2およびアルカリ溶液の添加によって、ＡＥ基について引き起こされ得る。
ＡＥ標識プローブ中のＡＥ基は、好ましくは、ＡＥ−プローブの末端から３ヌクレオチド以上に位置する。さらに好ましくは、ＡＥ基は、ＡＥ−プローブの末端から７ヌクレオチドに位置する。最も好ましくは、ＡＥ基は、ＡＥ−プローブの末端から少なくとも１０ヌクレオチドに位置する。前記のとおり、ＡＥ基は、ＡＥ−プローブの末端に近いほど、化学的不活性化からあまり保護されない。
第３図は、好ましいアッセイを説明する。３７℃で、ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドをＲＮＡ標的配列と接触させる。次いで、ＲＮＡseＨを添加して、試験試料を形成する（「＋」と記す）。対照試料は、ＲＮＡseＨを欠いている（「−」と記す）。次いで、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ＡＥ−標識プローブを使用して、残存する標的配列の存在を検出する。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが試験試料中の該標的とハイブリダイズすると、標的核酸は、ＲＮＡseＨによって分解され、該試料は、もはや、プローブとの次なるハイブリダイゼーションのための標的配列を有しなくなる。かくして、試験試料中、ＡＥ標識は、一本鎖核酸として、優勢的に、または、それだけで、存在する。次いで、化学的不活性化剤を添加して、保護されない標識エステル基を加水分解する。化学的不活性化の結果、ＡＥシグナルの欠失が生じる。このシグナルをＲＮＡseＨで処理されない対照と比較する。対照試料は、プローブと二本鎖を形成することができる非変性標的配列を有しており、これにより、プローブＡＥ標識を保護する。
該アッセイは、標的核酸配列の一部のみが分解または変性される場合にも行うことができる。標的核酸配列の部分変性は、標識プローブを使用して検出される。ここで、該プローブ標識は、プローブが切断標的部位の一部のみにハイブリダイズする場合、次なる化学的不活性化から保護されないように配置される。該プローブ標識は、切断標的部位と相補的な位置でプローブ上に配置されるか（第１図を参照）、または、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で切断標的部位にあまりハイブリダイズしない短いプローブ領域上に位置する。
切断標的部位検出するためのＡＥ−標識プローブの使用の例を第４図に示す。第４図に示されるプローブは、切断標的部位へのハイブリダイゼーションに含まれない短い領域上で標識される。この短いプローブ領域は、適切なストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で切断標的部位にハイブリダイズできるほど充分には多くの相補的な核酸配列を有しない。
好ましくは、短いプローブ領域は、切断標的部位の一部と相補的な３〜１０個のヌクレオチドを有し、残りのヌクレオチドは、切断標的部位の他の部位と相補的である。プローブ標識は、短いプローブ領域の末端から３〜７ヌクレオチドに位置するのが好ましい。さらに好ましくは、標識は、プローブの末端から７ヌクレオチドに位置する。
関連する態様において、該アッセイは、処理された試験試料および対照試料を使用して行われる。処理された試験試料は、二本鎖変性剤で処理され、一方、対照試料は、二本鎖変性剤で処理されない。次いで、両方の試料を非変性標的核酸配列の存在についてプローブする。対照試料の使用は、標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを測定し、検出可能なプローブハイブリダイゼーションの欠如が実験の欠点によるものではないことを確認する手段として好ましい。他の適正な対照は、相補的オリゴヌクレオチドの不在下での二本鎖変性剤の使用を含む。
別の関連する態様において、リボザイムの標的核酸配列切断能をアッセイするための方法が記載される。標的核酸配列を含有する試料中にリボザイムを導入する。次いで、プローブを使用して、切断されたＲＮＡの存在を測定する。リボザイムの存在下でのケミルミネッセンスの量を、試験試料にリボザイムを添加しない対照と比較することができる。
リボザイム切断アッセイは、実質的には、第５図に示されるように行われる。標的部位のリボザイム切断を測定するために使用されるプローブは、切断標的部位の部分変性を測定することについて前記したと同様に設計される（すなわち、切断標的部位と反対の位置または短いプローブ領域上に標識を置く）。
別の態様では、薬物の核酸配列変性能を測定するためのアッセイが記載される。該アッセイは、標的核酸を薬物と接触させ、次いで、標識プローブを使用して、変性の程度を測定することによって行われる。標識プローブを使用して、前記に従って、プローブ標識を次なる化学的不活性化から保護するように非変性核酸に優勢的にハイブリダイズすることによって非変性核酸の存在を検出する。
このアッセイは、プリンまたはピリミジン環の、もはや水素結合することができない形態への、ヌクレアーゼ分解、制限酵素切断および化学的変性などの種々のタイプの変性を測定することができる。このアッセイのための適正なプローブ設計は、アッセイされる薬物のタイプに依存する。薬物が２、３の部位でのみ切断するかまたは化学的に変性させる場合、プローブ標識は、前記のとおり、切断部位または変性部位の向かい側のプローブ上に置かれるのが好ましい（第１図を参照）。別法としては、切断部位は、前記のとおり、切断核酸標的にハイブリダイズしない短い標識領域を有するプローブを使用してアッセイすることができる（第４図）。
このアッセイは、変性核酸を非変性核酸と物理的に分離することを必要とせずに、標識プローブを用いて、ホモジーニアスアッセイにおいて、薬物の核酸配列変性能を測定することができる。かくして、ヌクレアーゼなどの種々の薬物の核酸変性能を容易に測定することができる。
別の態様では、本発明の方法を行うためのキットが記載される。該キットは、分離容器中のプローブ標識および二本鎖変性剤からなる。好ましくは、該キットに含有されるプローブ標識は、結合状態の場合、化学的不活性化から保護され得る。さらに好ましくは、該プローブ標識は、アクリジニウムエステルであり、二本鎖変性剤は、ＲＮＡseＨである。
本発明の他の特徴および長所は、以下の好ましい具体例の説明および請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、保護されたアクリジニウムエステルまたは保護されないアクリジニウムエステルを示す。「ｐ」は、ホスホジエステル基を表す。
第２図は、アクリジニウムエステルの検出を示す。示差加水分解により、ハイブリダイズされないプローブ中に存在する保護されないアクリジニウムエステルの切断を生じる。次いで、保護されたアクリジニウムエステルからのケミルミネッセンスを測定する（明るい）。
第３図は、アクリジニウムエステル標識プローブを用いて、オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションについての好ましいアッセイ方法を示す。「＋」は、ＲＮＡseＨの存在を表す。「−」は、ＲＮＡseＨの不在を表す。
第４図は、切断核酸標的にハイブリダイズしない短い標識プローブ領域を有するプローブを用いて切断核酸を測定するアッセイを説明する。
第５図は、リボザイムによる標的部位切断を測定するためのアッセイを説明する。変性された核酸は、短いプローブ領域を有するプローブを用いて検出される。
好ましい具体例の説明
当該特徴的な方法は、オリゴヌクレオチドの特定の核酸配列へのハイブリダイゼーションをアッセイするために使用することができる。これらの方法は、特に、実質的な細胞内条件または生理的条件下、アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれらの標的ＲＮＡ核酸配列へのハイブリダイゼーションをアッセイするのに有用である。記載された方法を使用して、迅速かつ定量的に、所定の標的についてアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーンおよびランク付けすることができ、一般的に、オリゴヌクレオチド：標的系に適用可能である。リボザイムの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションおよび切断能をアッセイするための方法および薬物の核酸変性能をアッセイするための方法も記載される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムなどのオリゴヌクレオチドを使用して、イン・ビボで遺伝子発現を変性することができる。かかる変性は、種々の微生物において行われて、種々の目的を達成することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、所望の植物特性を得るために使用され得るか、または、治療薬としてヒトにおいて使用され得る。
生物中で好結果に使用されるべきオリゴヌクレオチドについて、それは、生理条件下、その標的核酸配列にハイブリダイズすることができなければならない。多くの因子は、オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーション能に影響及ぼすことができる。これらの因子としては、標的核酸のアクセシビリティ、オリゴヌクレオチドの構造、およびハイブリダイゼーションが生じる条件が挙げられる。
標的領域は、二次構造および標的核酸に関連するタンパクなどの種々の因子のためにインアクセシブルであり得る。これらの因子は、オリゴヌクレオチドが標的配列に水素結合およびハイブリダイズすることを防ぐことができる。
オリゴヌクレオチドの構造は、ヌクレオチド基を連結する連結基のタイプ、標識の存在または不在、オリゴヌクレオチドと標的核酸配列との相補性の程度、糖およびプリンまたはピリミジン塩基の修飾およびオリゴヌクレオチドの二次構造を含む。相補性の程度は、オリゴヌクレオチドと標的配列との間のミスマッチの数、および相補的ヌクレオチドの総数を含む。隣接する相補的ヌクレオチドの数が少ないほど、およびミスマッチの数が多いほど、適当なハイブリダイゼーションが生じることは予想されなくなる。
ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、pＨ、塩濃度、およびタンパク濃度）および温度を含む。オリゴヌクレオチドが治療薬として使用されるべきである場合、ハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドが使用されるであろう条件に近いように設計されるべきである。
ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす前記因子は、相互に関係付けられる。例えば、ハイブリダイゼーション温度が上昇すると、オリゴヌクレオチドと標的核酸配列との間の相補性の程度は、ハイブリダイゼーションが生じるために増加する必要がある。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション温度よりも高い融点を有する二本鎖を得るのに充分な相補性がない場合に阻害されるであろう。
前記アッセイを使用して、所定の条件セット下で二本鎖を形成するのに充分な程度の相補性が存在するか、および標的領域のアクセシビリティなどの他の因子がハイブリダイゼーションを妨げるかを決定することができる。オリゴヌクレオチドのその標的配列へのハイブリダイゼーションは、好ましくは、まず、標的核酸配列を含有する試験試料をオリゴヌクレオチドと接触させることによって行われる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボース部分を含有するヌクレオチドからなり、１個以上のホスホロチオエートまたはホスホジエステル連結基によって連結されており、標的核酸配列は、ＲＮＡまたはｍＲＮＡであり、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を分解する酵素が使用される。オリゴヌクレオチドを試験試料と接触させた後、該反応を分け、イー・コリ（Ｅ.coli）ＲＮＡseＨまたはウシ胸腺ＲＮＡseＨなどのＲＮＡseＨの存在および不在下でさらにインキュベートするのが好ましい。次いで、これらの反応を希釈し、ネルソンら（前出の文献）によって開示されたように、ＡＥ−標識プローブを用いて、ホモジーニアス・プロテクションアッセイ（ＨＰＡ）によって、非変性標的ＲＮＡの相対量を測定する。種々の実験的設計を用いて、本発明を展開させて、ハイブリダイゼーションの程度およびハイブリダイゼーション速度を測定することができる。
本発明は、本明細書に記載の好ましいアッセイまたは特定の実施例に限定されるものではない。好ましいアッセイのバリエーションは、本明細書に記載される。さらなるバリエーションは、本発明の説明に基づいて、当業者によって行われ得る。前記アッセイおよび特定の実施例の種々の成分を以下に詳述する。
標的オリゴヌクレオチド
「標的オリゴヌクレオチド」は、特定の核酸配列にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドを表す。標的オリゴヌクレオチドの長さおよびその標的配列との相補性の程度は、可変である。前記アッセイの使用の１つは、標的オリゴヌクレオチドが特定の標的配列にハイブリダイズすることができるかを決定することである。
標的オリゴヌクレオチドの糖基は、リボース、デオキシリボースであるか、または、修飾された糖基を有する。さらに、複素環塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミン）は、修飾されてもよい。ヌクレオチドは、ホスホジエステル連結基またはホスホロチオエートおよびメチルホスホネートなどの修飾された連結基によって連結され得る。修飾ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、それらの標的配列とハイブリダイズすることができるべきであり、二本鎖変性剤による標的配列の変性を防止すべきでない。
好ましい二本鎖変性剤は、ＲＮＡseＨである。かくして、好ましい標的オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ核酸を切断するように選択されるべきである。ＲＮＡ標的鎖は、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドが１個以上のホスホロチオエートまたはホスホジエステル連結基を含有するＤＮＡである場合、ＲＮＡseＨで切断することができる。ＲＮＡ鎖は、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドがメチルホスホネートおよびホスホロアミデートなどの連結基だけを有する場合、ＲＮＡseＨで切断されないであろう。
二本鎖の変性
オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションは、試験されたハイブリダイゼーション条件下で形成されたオリゴヌクレオチド：標的二本鎖を変性する薬物を添加し、次いで、残存する非変性二本鎖の量を使用してアッセイするためのプローブを使用することによって測定される。好適な二本鎖変性剤は、オリゴヌクレオチド：標的二本鎖の標的核酸配列を分解または切断する。好適な変性剤の例としては、二本鎖ＤＮＡを分解するＤＮＡse、二本鎖ＲＮＡを分解するＲＮＡseＩＩＩのようなＲＮＡse、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を分解するＲＮＡseＨのようなＲＮＡse、および制限酵素が挙げられる。特定の核酸配列に作用する変性剤は、特定の配列を有する標的核酸についてのみ使用されるべきである。例えば、制限酵素は、特定の核酸配列に作用し、ＲＮＡseＩＩＩは、かなりの配列特異性を有する。有用な二本鎖変性剤は、二本鎖核酸に対してのみ活性であり、一本鎖核酸に対しては活性ではないものである。好ましくは、かかる薬物は、標的およびオリゴヌクレオチドプローブの存在下で生じる二本鎖、例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対してのみ作用する。かかる薬物は、当該技術分野でよく知られており、それらの能力は、標準的な方法を使用して容易に評価される。
好適な二本鎖変性剤の選択は、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列の糖基にある程度依存する。好ましくは、ＲＮＡseＨが使用されて、オリゴヌクレオチド：標的二本鎖が変性され、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボース糖基を含有し、標的核酸配列は、リボース部分を含有する。
リボザイムは、一本鎖ＲＮＡ（および、しばしば、ＤＮＡ）に対して作用し、詳述された標的配列でＲＮＡを切断することができる。「リボザイム」なる用語は、分子間核酸切断活性を有する核酸部分を表す。例えば、リボザイムは、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ分子における共有結合を切断することができる。かくして、該アッセイを使用してリボザイムのその標的配列切断能を測定する場合、分離二本鎖変性工程は、必要ではない。実際、リボザイムおよびその標的核酸によって形成された二本鎖は、リボザイム自体によって変性され、標的核酸を切断する。
非変性標的配列の検出
非変性標的核酸配列は、プローブを使用し、プローブ標識を保護するプローブ：標的の形成を測定して検出することができる。プローブは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でプローブ：標的二本鎖を形成するのに充分な、その標的核酸配列と相補的な隣接ヌクレオチドを有する標識オリゴヌクレオチドである。プローブは、好ましくは、８〜１００ヌクレオチド長さ、さらに好ましくは、１４〜５０ヌクレオチド長さである。
プローブの糖基は、リボース、デオキシリボースであるか、または、修飾された糖基を有する。さらに、複素環塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはチミン）は、修飾されていてもよい。ヌクレオチドは、ホスホジエステル連結基またはホスホロチオエートおよびメチルホスホネートなどの修飾された連結基によって連結され得る。修飾されたヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、それらの標的配列とハイブリダイズすることができるべきである。
好適な標識は、適切なストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ハイブリダイゼーションを妨げないものであり、結合状態（プローブ：標的）対非結合状態において異なる特徴を示し、容易に検出される。異なる特徴は、結合状態でアルカリ性加水分解に対する増加した耐性を含む。二本鎖形成を測定するための標識プローブの使用は、アーノルドら（前出の文献）［題名「ホモジーニアス・プロテクション・アッセイ」］およびネルソンら（前出の文献）によって開示されている。これらの文献は、ホモジーニアス・プロテクション・アッセイで標的核酸配列を検出するためのＡＥ標識プローブの使用を説明する。アーノルドら（前出の文献）は、プローブ標識として使用され得るアクリジニウムエステルの実施例も提供する。
ＨＰＡの必須の工程は、（１）ハイブリダイゼーション、（２）示差加水分解（不活性化）、および（３）検出である。これらの工程に加えて、核酸は、プローブを使用する前に変性されて、標的核酸をプローブにさらにアクセシブルにする。標的核酸は、同一理由のためにプローブにインアクセシブルであり、標的オリゴヌクレオチドにインアクセシブルである。標的核酸の変性は、ネルソンら（前出の文献）によって開示されているような二本鎖核酸の変性と同一の方法で行われる。ホーガン（Ｈogan）ら、Ｕ.Ｓ.Ｐ５,０３０,５５７（出典明示により本明細書の一部とする）によって開示されているようなヘルパープローブの使用は、インアクセシブル領域を利用可能にするためもう１つの方法である。
分離変性工程および／またはヘルパープローブの使用は、該プローブがストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でその標的配列にハイブリダイズすることができる場合には必要ではない。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、標的配列をアクセシブルにする。
該プローブは、次なる化学的不活性化からプローブ−標識を保護するように、非変性標的核酸配列にハイブリダイズすることによって、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する。次なる化学的不活性化は、もはや検出不可能であるように、保護されない標識を選択的に不活性化するための薬物の使用に関する。ＡＥ標識プローブは、ネルソンら（前出の文献）およびアーノルドら（前出の文献）に開示されているように、化学的に不活性化される。
プローブ標識は、結合状態の場合、最大保護を達成するようにプローブ上に置かれるべきである。最大保護は、プローブの末端から離れてプローブ標識を置くことによって達成される。プローブの末端から３ヌクレオチドの範囲内にあるプローブ標識は、結合状態の場合でさえ、次なる化学的不活性化からあまり保護されない。好ましくは、該標識は、プローブの末端から３ヌクレオチド以上に位置する。さらに好ましくは、該標識は、プローブの末端から７ヌクレオチド以上に位置する。最も好ましくは、標識は、プローブの末端から１０ヌクレオチド以上に位置する。結合されたプローブ−標識が保護される程度は、ＨＰＡを使用して測定することができる。
プローブの標的へのハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で行われる。ストリンジェント条件は、プローブがその標的核酸配列にハイブリダイズすることができるが、試験試料中に存在する他の核酸配列にはハイブリダイズすることができないものである。好適なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で知られている方法によって決定される。例えば、ネルソンらには、０.１Ｍコハク酸リチウム緩衝液、pＨ５.０、２mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ ＥＧＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウムからなるＡＥ標識ホスホジエステルプローブと一緒に使用するためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件、および６０℃で５〜６０分間のインキュベーションが開示されている。
プローブのハイブリダイゼーションは、標的オリゴヌクレオチドの標的へのハイブリダイゼーションに対してプローブの標的へのハイブリダイゼーションに有利である条件下で行われるべきである。プローブのハイブリダイゼーションは、プローブ：標的がオリゴヌクレオチド：標的よりも高い融点（Ｔm）を有するようにプローブを設計することによって有利にすることができる。該アッセイの標識不活性化工程は、プローブおよびオリゴヌクレオチドのＴmの間の温度で操作することができた。例えば、標的オリゴヌクレオチドのＴmが５０℃であり、プローブのＴmが６０℃であった場合、不活性化工程は、５５℃で、または５８℃でさえ行うことができる（５８℃は、より良好な識別を与えるが、プローブからのシグナルを低下させる）。
高いＴmを有するプローブは、標的とするプローブの隣接した相補的ヌクレオチドの数を標的とする標的オリゴヌクレオチドのものと比較して増加させるか、または、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびホスホジエステルプローブを使用することによるなどの当該技術分野で知られている技術に基づいて設計することができる。プローブとオリゴヌクレオチドとの間のＴm差は、ほぼ３℃、さらに好ましくは、７℃、最も好ましくは、１０℃以上である。
標的オリゴヌクレオチドに対するプローブの比を増加させることは、プローブ：標的ハイブリダイゼーションも有利にする。２倍過剰は、特に、使用される標識が非常に感受性である（例えば、ＡＥを使用する）場合、ハイブリダイゼーションにおける若干の差異を示すのに適している。１０倍の差異は、ハイブリダイゼーションにおいて非常に明瞭で明かに識別できる差異を与え、１００倍の差異の場合、オリゴヌクレオチド：標的の量は、非常に僅かであるべきである。
プローブ標的ハイブリダイゼーションを有利にする別の方法は、標的オリゴヌクレオチドを除去するためのＤＮＡseの使用を介するものである。この方法は、標的オリゴヌクレオチドがＤＮＡであり、標的核酸がＲＮＡである場合に使用される。この方法に適しているＤＮＡseは、一本鎖ＤＮＡを分解することができるが、ＲＮＡを分解することはできない。選択されたＤＮＡseが、標的核酸配列を分解するＲＮＡse活性を汚染しないことが重要である。好ましくは、標的オリゴヌクレオチドおよび標的核酸の両方がホスホジエステル連結基によって連結される場合、ＤＮＡse工程を使用して、標的オリゴヌクレオチドを除去する。
示差加水分解を行って、非結合標識を優先的に加水分解する。ネルソンら（前出の文献）には、ＡＥ標識プローブと一緒に使用するための示差加水分解条件を決定することが開示されている。これらの条件は、保護されないＡＥのアルカリ加水分解を含む。無傷のＡＥは、アルカリ条件下で過酸化水素などの当該技術分野で知られている技術を使用してケミルミネッセントにされ得る。ケミルミネッセンスは、ルミノメーター［例えば、ゲン−プローブ・インコーポレイテッド（Ｇen−Ｐrobe Ｉncorporated）から入手可能なＬＥＡＤＥＲ Ｉ▲Ｒ▼、ＬＥＡＤＥＲ ５０▲Ｒ▼、ＬＥＡＤＥＲ ２５０▲Ｒ▼およびＬＥＡＤＥＲ ４５０▲Ｒ▼］で測定することができる。
薬物の核酸変性能のアッセイ
薬物の核酸変性能は、標的核酸を薬物と接触させ、次いで、標識プローブを使用して変性の程度を測定することによってアッセイすることができる。これらの方法は、リボザイムを１個以上の核酸変性剤に代えて、リボザイムの標的部位ハイブリダイゼーションおよび切断能をアッセイすることについてと実質的に同様に行われる。
核酸の変性を検出するプローブの適正な設計は、試験される薬物のタイプを考慮すべきである。ヌクレアーゼなどの該薬物が核酸を分解する場合、プローブ標識は、ハイブリダイゼーションに対する最大保護を得るためにプローブの末端から離れて位置すべきである。制限酵素などの該薬物が核酸を切断する場合、プローブ標識は、切断標的部位の向かい側または短いプローブ領域上に置かれるべきである。別法としては、該薬物が複素環式プリンまたはピリミジン環を変性することによるなど水素結合形成を分解することによって核酸を変性させる場合、プローブ標識は、変性されたヌクレオチドの向かい側に位置すべきである。
オリゴヌクレオチド合成
ホスホジエステルまたは修飾連結基を含有するオリゴヌクレオチドは、標準的な方法で合成することができる。これらの方法としては、ホスホジエステル連結基を含有するオリゴヌクレオチドの合成法［カルサーズ（Ｃaruthers）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍethods Ｉn Ｅnzymology）１５４：２８７（１９８７）］、ホスホロチオエート連結基を含有するオリゴヌクレオチドの合成法［本願の譲受人であるゲン−プローブ・インコーポレイテッド（Ｇen−Ｐrobe Ｉncorporated）に譲渡された１９８９年３月６日に出願されたバット（Ｂhatt）のＵ.Ｓ出願番号０７／３１９,５７０、発明の名称：「メソッド・アンド・リージェント・フォー・スルフリゼーション・オブ・オルガノホスホラス・コンパウンズ」（Ｍethod and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds）、出典明示により本明細書の一部とする］およびメチルホスホネート連結基を含有するオリゴヌクレオチドの合成法［クレン（Ｋlem）ら、発明の名称：インプルーブド・プロセス・フォー・ザ・シンセシス・オブ・オリゴマーズ（Ｉmproved process for the synthesis of oligomers）、ＰＣＴ ＷＯ９２／０７８６４］が挙げられる。
ＡＥによるプローブ標識は、ネルソンら（前出の文献）またはアーノルドら（ＰＣＴ／ＵＳ８８／０３３６１）［発明の名称：アクリジニウム・エステル・レベリング・アンド・ピューリフィケーション・オブ・ニユークリアタイド・プローブズ（Ａcridinium Ｅster Ｌabelling and Ｐurification of Ｎucleotide Ｐrobes）、出典明示により本明細書の一部とする］による開示に従って行われるのが好ましい。
以下の実施例により、本発明の種々の態様および具体例を説明する。これらの実施例は、如何なる場合も本発明を限定するものではない。
実施例１
オリゴヌクレオチドのウサギグロビンｍＲＮＡ中に存在する標的配列へのハイブリダイゼーションを測定するための本発明の使用を以下に記載する。この実施例で使用される標的オリゴヌクレオチドＢglＲ３８−ＰＳは、ホスホロチオエート連結基を含有し、以下のヌクレオチド配列（５'から３'に記載する）を有する：GCACCATTCTGTCTGTTTTGGGG。
この実施例で使用されるプローブの核酸配列ＡＥ−ＢglＲ３８−ＰＯは、プローブのヌクレオチドがホスホジエステル連結基を含有しており、ＡＥがヌクレオチド１１と１２との間に結合されている以外は、ＢglＲ３８−ＰＳと同一の核酸配列を有する。
標準的なホスホルアミダイト（phosphoramidite）固相化学［カルサーズら（前出の文献）］を使用して、ホスホジエステル連結基を含有するオリゴヌクレオチドを合成した。標準的なホスホルアミダイト固相化学を使用してヌクレオチドを結合させ、バット（前出の文献）の方法に従って鎖を成長させる各工程で硫化を行うことによって、ホスホロチオエート連結基を含有するオリゴヌクレオチドを合成した。ネルソンら（前出の文献）による開示に従って、ＢglＲ３８−ＰＯをアクリジニウムエステルで標識化し、精製した。
ＡＥ−ＢglＲ３８−ＰＯの標的配列検出能は、ＢglＲ３８−ＰＳのその標的配列へのハイブリダイゼーション能を測定する前に特徴付けられた。この目的のために、ネルソンらによって開示された一般的なＨＰＡプロトコールを使用した。ＡＥ−ＢglＲ３８−ＰＯのウサギグロビンｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション緩衝液（０.１Ｍコハク酸リチウム緩衝液、pＨ５.０、２mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ ＥＧＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）１００μＬ中でウサギグロビンｍＲＮＡ ０.９ピコモル、ＡＥ−ＢglＲ３８−ＰＯ.１ピコモルを使用して行った。
ハイブリダイズされないプローブおよびハイブリダイズされたプローブの半減期を、時間に対するケミルミネッセンスの消失を測定することによって、ネルソンら（前出の文献）による開示に従って測定した。所定時間後に残存するケミルミネッセンスのパーセントの対数を所定時間に対してプロットした。次いで、直線回帰分析法によって半減期を決定した。加水分解曲線の直線部分のｙ切片からハイブリダイゼーションのパーセンテージを決定した。
コハク酸リチウム緩衝化溶液（０.１Ｍコハク酸リチウム緩衝液、pＨ５.０、２mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ ＥＧＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中、過剰の標的をプローブと混合して、プローブ：標的ハイブリッドを形成させることによって、Ｔmを測定した。ハイブリッドのアリコットをハイブリダイゼーション緩衝液中で希釈し、予想されるＴm（５５℃）未満から始まり２〜５度ずつ上昇する種々の温度で５分間インキュベートした。次いで、この溶液を緩アルカリホウ酸緩衝液（０.１５Ｍテトラホウ酸ナトリウム、pＨ７.６、５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００）で希釈し、低温（５０℃）で１０分間インキュベートした。これらの条件下、一本鎖プローブに結合したＡＥは、加水分解されるが、一方、ハイブリダイズしたプローブに結合したＡＥは、相対的に、加水分解から保護される。残存するＡＥの量は、ハイブリッドの量に比例し、過酸化水素およびアルカリ溶液の添加によりＡＥから生成されたケミルミネッセンスによって測定することができる。得られたデータを温度に対する最大シグナルのパーセント（通常、最低温度から）としてプロットした。Ｔmは、最大シグナルの５０％が残存する温度と定義される。
0003789471.tif 000002
ハイブリダイズされたプローブの増加した半減期によって示されるように、ＡＥ−ＢglＲ３８−ＰＯは、ＡＥ標識をアルカリ加水分解から保護するように標的配列にハイブリダイズする。この結果は、ＡＥ−ＢglＲ３８−ＰＯを使用して、用いられた条件下でその標的配列を検出することができることを示す。
他のプローブの適合性、および、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションのための所望の条件は、本明細書に記載した技術を使用して、および、例えば、マクドナフ（ＭcＤonough）ら［本発明の譲受人であるゲン−プローブ・インコーポレイテッド（Ｇen−Ｐrobe Ｉncorporated）に譲渡された、１９９３年３月２６日に出願されたＵ.Ｓ出願番号８／０４０,７４５、発明の名称：ディテクション・オブ・ヒューマン・イムノデフィシェンシー・バイラス・タイプ・１（Ｄetection Ｏf Ｈuman Ｉmmunodeficiency Ｖirus Ｔype １）、出典明示により本明細書の一部とする］におけるような当該技術分野における開示に従って決定することができる。
３７℃で２時間、１：１または１：３（ｍＲＮＡ：オリゴヌクレオチド）のモル比で標的オリゴヌクレオチドとウサギグロビンｍＲＮＡとを混合することによって、標的オリゴヌクレオチドのその標的核酸へのハイブリダイゼーション能を測定した。標的オリゴヌクレオチドを有しない対照も含まれた。ハイブリダイゼーションは、２ｘ イー・コリ（Ｅ.coli）ＲＮＡseＨ緩衝液（４０mＭトリス−ＨＣl（pＨ７.５）、２０mＭ ＭgＣl2、２００mＭ ＫＣl、０.２mＭ ＤＴＴおよび１０％（ｗ／ｖ）シュークロース）中で行った。
次いで、該反応を分け、等量の水を添加して、最適なＲＮＡseＨ酵素活性のための１ｘ最終緩衝液濃度のデュプリケートを調製した。２つのデュプリケート反応のうち一方にイー・コリ（Ｅ.coli）ＲＮＡseＨ（ＢＲＬ、０.４Ｕ／反応）を添加した（試験試料）。ＲＮＡseＨを欠いている他方のデュプリケート反応は、(−)ＲＮＡseＨ対照として供された。これらの反応を３７℃で１時間インキュベートし、９５℃で５分間変性させることによって停止させ、氷上に直接置いた。
次いで、ネルソンら（前出の文献）によって開示された一般的なプロトコールに従って、ＡＥ−ＢglＲ３８−ＰＯを用いて反応のアリコットをアッセイした。結果を第２表に示す（データは、デュプリケート分析の平均を示す）。
0003789471.tif 000003
第２表に示したデータは、オリゴヌクレオチドに対するｍＲＮＡの比率１：１および１：３の両方で、該プローブが標的にハイブリダイズし、次いで、ＲＮＡseＨがオリゴヌクレオチド：ｍＲＮＡハイブリッドのｍＲＮＡ鎖を消化したことを示す。ＢglＲ３８−ＰＳの不在下であるが、ｍＲＮＡおよびＲＮＡseＨの存在下でのシグナルの維持（実験誤差の範囲内）は、１：１および１：３（オリゴヌクレオチドに対するｍＲＮＡ）でのシグナルの消失が非特異的ＲＮＡseＨ効果ではないことを示す。これらの結果は、記載されたアッセイが、問題のオリゴヌクレオチドが特定の標的核酸配列とハイブリダイズするかを迅速に測定することができることを示す。
実施例２
実施例１に記載の方法およびオリゴヌクレオチドを使用して、２ｘ ＲＮＡseＨ緩衝液（第３表、「２ｘ」）および生理的緩衝液（１０mＭ Ｎa+、１３mＭ Ｍg++、１６０mＭ Ｋ+、トリス−ＨＣl pＨ７.２、１mＭ Ｃa++、１００μg／ml ＢＳＡ）（第３表、「Ｐhy」）中、標的オリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを測定した。
実施例１に記載のプロトコールに従って、ｍＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドの比率１：０（対照）および１：３での生理的緩衝液中におけるハイブリダイゼーションを実施例１からの２ｘイー・コリ（Ｅ.coli）ＲＮＡseＨ緩衝液中でのハイブリダイゼーションと直接比較した。結果を第３表に示す（データは、デュプリケート分析の平均を示す）。
0003789471.tif 000004
これらの結果により、記載したアッセイが、実質的に生理的条件下、問題のオリゴヌクレオチドが特定の標的核酸配列とハイブリダイズするかを迅速に測定できることが判明する。試験されたオリゴヌクレオチドについて、２ｘ ＲＮＡseＨ緩衝液中でのハイブリダイゼーションは、生理的緩衝液中でのハイブリダイゼーションと同等である。
実施例３
この実施例は、本明細書に記載の方法の、標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを測定するための使用をさらに詳述し、ＲＮＡseＨを含む好ましいアッセイにおいて、分解がアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡseＨの両方に依存することを示す。ウサギグロビンｍＲＮＡに標的化された種々のホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを実施例１の記載に従って合成した。合成したオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、以下のとおりである（５'から３'へ記載した）：
0003789471.tif 000005
括弧内の数字は、存在する場合のＡＥの位置を表す。例えば、（９／１０）は、９番目と１０番目のヌクレオチドの間にＡＥ基が位置することを表す。
ハイブリダイゼーション特徴およびＴmを、実施例１の記載に従って、各オリゴヌクレオチドに結合したアクリジニウムエステル標識を使用して種々の条件下で測定した。
オリゴヌクレオチドは、実施例１の記載に従って、過剰のｍＲＮＡ標的の存在下、種々の温度でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、試料を、０.１５Ｍテトラホウ酸ナトリウム、pＨ７.６、５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００と一緒に６０℃で、または、０.６Ｍホウ酸pＨ８.５、１％トリトンＸ−１００と一緒に３７℃でインキュベートして、ＡＥ標識を化学的に不活性化した。ＡＥ加水分解速度、Ｔmおよびハイブリダイゼーションの程度を実施例１の記載に従って測定した。
ｍＲＮＡ標的にハイブリダイズした種々のホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのＡＥ加水分解速度、パーセントハイブリダイゼーションおよびＴmを第４表に示す。
0003789471.tif 000006
４つのホスホジエステル−ＡＥ（ＰＯ−ＡＥ）プローブは、全て、６０℃でよくハイブリダイズした。ＢglＲ３８−ＰＯおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、３７℃で、最高のハイブリダイゼーション度（各々、９７.１％および８５.３％）を示した。残りのＰＯ−ＡＥプローブは、単に平均５０％ハイブリダイゼーションを示したが、一方、対応するホスホロチオエート−ＡＥ（ＰＳ−ＡＥ）プローブは、これらの条件下、平均１６.１％ハイブリダイゼーションであった。
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについて得られたＴmは、それらのホスホジエステルカウンターパートよりも有意に低かった。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドとホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとの間のＴm差は、プローブ検出方法の研究において活用された。オリゴヌクレオチドとプローブとの間の競争を減少させるために、その対応するＰＯ−ＡＥプローブと一緒にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを使用した。
２ｘ イー・コリ（Ｅ.coli）ＲＮＡseＨ緩衝液または生理的緩衝液を使用して、実施例１における記載に従って、オリゴヌクレオチドのそれらの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを行った。種々の濃度のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびホスホロジエステルオリゴヌクレオチドを３７℃で２時間ｍＲＮＡとハイブリダイズさせた。次いで、該反応を分けて、最適なＲＮＡseＨ酵素活性についての１ｘ最終緩衝液濃度でデュプリケートを調製した。２つのデュプリケート反応のうち一方にイー・コリ（Ｅ.coli）ＲＮＡseＨ（ＢＲＬ、０.４Ｕ／反応）を添加した；ＲＮＡseＨを欠いている他方のデュプリケート反応は、(−)ＲＮＡseＨ対照として供した。該反応を３７℃で１時間インキュベートし、９５℃で５分間変性させることによって停止させ、氷上に直接置いた。
次いで、該反応のアリコットを適切なホスホジエステルＡＥ−プローブとハイブリダイズした。実施例１の記載に従って、ＡＥ−プローブを６０℃で１時間ハイブリダイズした。標的核酸配列以外の領域とハイブリダイズすることが予想されるＡＥ−プローブを使用して、対照ハイブリダイゼーションを行った。これらの対照ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドによって標識されない配列がＲＮＡseＨによって分解されるかを測定することによって、ｍＲＮＡ標的の非特異的ＲＮＡseＨ分解を測定する。次いで、ハイブリダイゼーション緩衝液中でアリコットを希釈し、ハイブリダイズされないＰＯ−ＡＥ対照が完全に加水分解されるまで（通常、６〜８分間）、６０℃で、レプリケート５０μＬを、３００μＬの０.１５Ｍテトラホウ酸ナトリウム、pＨ７.６、５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を有する１２×７５mmルミノメーター管中でハイブリダイズさせた。１.５Ｎ ＮaＯＨ、０.１％Ｈ2Ｏ2の単回注入を使用して、ケミルミネッセンスを引き起こさせ、ルミノメーターで測定した。
標的ｍＲＮＡにハイブリダイズした種々のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション特性およびＲＮＡseＨ感受性の差異を観察した（実施例１の第２表および下記第５表を参照）。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを有する標的部位は、変性標的核酸配列を生成するＲＮＡseＨについての良好な基質として供した。結果として、変性核酸配列は、次なる示差加水分解の間、ＡＥをあまり保護せず、低いＨＰＡシグナルを得た。対照反応は、ＨＰＡシグナルの欠失がアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびＲＮＡseＨに依存することを示した。
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第５表で使用したオリゴヌクレオチドおよびプローブは、ＡglＲ７２−ＰＳおよびＡＥ−ＡglＲ７２−ＰＯであった。
細胞内条件をまねるため、およびスクリーニングアッセイの最終的な予想値を増強するために、２ｘイー・コリ（Ｅ.coli）ＲＮＡseＨ緩衝液および生理的緩衝液におけるハイブリダイゼーションを比較した。２種類のオリゴヌクレオチドについての結果を、ＢglＲ３８−ＰＳを使用して第１表に（実施例１を参照）、ＡglＲ７２−ＰＳを使用して第６表に示す。ＡＥ−プローブは、オリゴヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を有したが、ＡＥ基で標識され、ホスホジエステル連結基を含有した。試験されたオリゴヌクレオチドについて、ハイブリダイゼーションは、これらの２つの緩衝液条件下で同様に出現した。検出工程の間、６０℃で、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびＰＯ−ＡＥ検出プローブ間で競争は観察されなかった。
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プライマー伸長分析法によって、標的ｍＲＮＡのＲＮＡseＨ消化の特異性および程度をアッセイした。プライマー伸長分析は、コテヴィクツ（Ｋotewicz）ら、ニユークリイック・アシッズ・リサーチ（Ｎuc.Ａcids Ｒes.）１６：２６５（１９８８）によって開示された同様に、プローブと接触されなかった各反応からのアリコットについて行った。グロビンｍＲＮＡ（０.２５μg）を種々の濃度のアンチセンスホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。各反応を１ｘプライマー伸長緩衝液（５０mＭトリス−ＨＣl、pＨ８.３、７５mＭ ＫＣl、３mＭ ＭgＣl2、１０mＭ ＤＴＴ）に調節し、３７℃で、適切な伸長プライマー（２０倍モル過剰）にハイブリダイズさせた。ＲＮＡを、３７℃で１時間、32Ｐ ｄＣＴＰの存在下、２００ Ｕ スーパースクリプト（Ｓuperscript）リバーストランクリプターゼ（ＢＲＬ）で伸長させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）によって分析した。
ＢglＲ３８オリゴヌクレオチドを欠いているか、または、ＢglＲ３８オリゴヌクレオチドを含有するが、ＲＮＡseＨを欠いている試料において、ＢglＲ１７９プライマーからの完全な２０１塩基伸長産生物の生成を観察した。ＢglＲ３８のホスホジエステルおよびホスホロチオエートの両方のバージョンで処理したＲＮＡseＨ消化標的ｍＲＮＡの伸長は、オリゴヌクレオチド：標的比１：１および５：１で、ほぼ完全な特異的消化を示した。ＲＮＡseＨ消化標的の伸長により得られた産生物に及ぶ全長産生物（２０１塩基）および強い１４０塩基は、少ししかまたは全く観察されなかった。
２ｘイー・コリ（Ｅ.coli）ＲＮＡseＨ緩衝液を使用する実験において、ＢglＲ３８−ＰＳは、最も安定なハイブリッドおよびＲＮＡseＨ消化についての最良の基質を形成するが、一方、他のオリゴヌクレオチド、最も顕著なＡglＲ７２−ＰＳは、相対的には、充分に作動しなかった。これらの結果は、予め得られたハイブリダイゼーションデータと一致する。ＢglＲ３８−ＰＳは、ＨＰＡシグナルにおいて平均３５倍ドロップを用いる１：１比および１：３比の両方でのアッセイにおいてよく作動した。対照的に、ＡglＲ７２−ＰＳは、シグナルにおいて２〜３倍ドロップだけを用いて、両方の比率で不充分に作動した。
ハイブリダイゼーション速度の測定
ｍＲＮＡへのＢglＲ３８−ＰＳおよびＡglＲ７２−ＰＳハイブリダイゼーションの速度を測定して、これらのオリゴヌクレオチドのそれらの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを評価した。オリゴヌクレオチドを前記に従ってハイブリダイズし、０、１０、２０、３０、６０、９０および１２０分でアリコット１５μＬを取り出し、氷上に置いた。全ての反応を標準(＋)および(−)ＲＮＡseＨ消化反応に分けた。(＋)反応を高濃度のＲＮＡseＨ（１.５ユニット）で２０分間処理して、オリゴヌクレオチドサイクリング（すなわち、オリゴヌクレオチドの遊離、次いで、標的の消化、他の標的分子に次なるハイブリダイゼーション）を最小にした。９５℃で５分間加熱することによって、ＲＮＡseＨ消化を停止させた。次いで、前記に従って、標準的なＨＰＡ分析を行った。
ＢglＲ３８−ＰＳおよびＡglＲ７２−ＰＳのハイブリダイゼーション速度を比較した。ＢglＲ３８−ＰＳのその標的へのハイブリダイゼーションは、１０分以内でほぼ完全であったが、ＡglＲ７２−ＰＳは、２時間のハイブリダイゼーション反応の間、その標的にゆっくりとおよび不完全にハイブリダイズした。これらの結果は、前記に従って、これらのオリゴヌクレオチドについてのハイブリダイゼーション特性を確証し、前記アッセイがオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを測定することを示した。非標的領域の正のＨＰＡ対照は、シグナル欠失がＲＮＡseＨ媒介標的分解のため特異的であったことを示した。
実施例５
この実施例は、ＲＮＡseＡの活性を測定するためのアッセイを説明する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、鋳型ＲＮＡ鎖を増幅することによって、ＲＮＡseＡについての基質を調製した。以下の２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成することによって、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼについての鋳型鎖を調製した：
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以下の成分：緩衝液（４０mＭトリス−ＨＣl（pＨ８.３）、２５mＭ ＮaＣl、１２.８mＭ ＭgＣl2、５mＭジチオトレイトール、２mＭスペルミジン）１０μＬ、オリゴヌクレオチド１（４５ピコモル／μＬ）０.３μＬ、オリゴヌクレオチド２（０.５ピコモル／μＬ）２μＬ、各々４０mＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ ６.２５μＬ、水８１.４５μＬ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（２００ユニット／μＬ）０.５μＬを含有する反応混合物において、これらのオリゴヌクレオチドからのＲＮＡ転写物を産生した。該反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
種々の量のＲＮＡ転写物をＡＥ標識プローブと混合し、ＨＰＡを使用してケミルミネッセンスを測定することによって、ＡＥ標識プローブにハイブリダイズした場合に約２５−３０,０００ＲＬＵを生じる転写物の量を測定した。ＡＥ−プローブ（プローブ母液５０μＬと９５０μＬの２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、２０mＭ ＥＧＴＡ、２０mＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍコハク酸リチウム、１.１Ｍ塩化リチウム、pＨ４.７を含有する溶液とを混合することによって調製した）５０μＬを使用してＨＰＡを行った。ＡＥ−プローブは、以下の配列：5'GAGGCATAGCAGCAGGATGAAGAGG3'を有した。ネルソンら（前出の文献）における開示に従って、塩基７と８との間にＡＥ基を含有するＡＥ−プローブを調製した。該プローダの比活性は、２×１０7ＲＬＵ／ピコモルであった。プローブ母液を１ピコモル／mＬの濃度に調製した。
ＲＮＡ ５０μＬおよびプローブ５０μＬを含有する反応を６０℃で１０分間インキュベートした。次いで、３００μＬの０.６Ｍホウ酸ナトリウム、pＨ８.５、１.０％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を反応に添加し、６０℃で７分間インキュベートすることによって、ＡＥの化学的不活性化を行った。次いで、反応を氷上で簡単に冷却し、リーダー（Ｌeader）ルミノメーターにおいて、ハイブリッド関連アクリジニウムエステル標識の量を測定した。
約２５−３０,０００ＲＬＵを生じる転写物の量は、反応の１０００ｘ希釈３μＬと一致した。ＲＮＡseＡをアッセイする次なる実験において、ＳＴＥ緩衝液（０.１Ｍ ＮaＣl、１０mＭトリス−ＨＣl（pＨ８.０）、１mＭ ＥＤＴＡ）中での１０００ｘ希釈から転写物を直接使用した。
次いで、ＲＮＡseＡのＲＮＡ分解能を測定した。使用直前に、ＲＮＡseＡの水中母液（０.１ユニット／μＬ）の水における１０倍連続希釈物を調製した。反応は、以下の成分：ＳＴＥ緩衝液中のＲＮＡ転写物（前記転写物の１００ｘ希釈物）３μＬ、水６μＬ、ＲＮＡseＡ １μＬを含有した。対照は、ＲＮＡseＡの代わりに水１μＬを含有した。
反応を室温で１時間インキュベートし、水４０μＬの添加によって希釈し、次いで、９５℃で５分間加熱することによって変性させた。次いで、該反応を氷上で１分間冷却した。前記のＡＥ−プローブ母液５０μＬを使用して、残存するＲＮＡ転写の量を測定した。結果を第７表に示す。
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ＲＮＡseＡを含まない対照をデュプリケートで操作した。「標的を含まない」反応は、ＲＮＡ転写物を欠いていた。該アッセイは、ＲＮＡseＡ １０-5〜１０-6を検出することができた。
他の具体例は、以下の請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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