(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスを含むことが疑われる試料を、下記の式（ＩＩ）の化合物に暴露させる工程を含む、インフルエンザウイルスの検出方法。
0003753740.tif 000010
｛式中、Ｒはアジド基、非置換もしくは置換グアニジノ基、または非置換もしくは置換アミノ基を示し；
ここでグアニジノ基もしくはアミノ基上に置換基が存在する場合には、その置換基は置換もしくは非置換Ｃ1-6アルキル基、またはアミノ、ヒドロキシ、シアノもしくはアルコキシカルボニル基であり；
Ｒ2はＣＯＣＨ3、ＣＯＣＦ3またはＳＯ2ＣＨ3を示し；
ＸはＯまたはＮＨを示し；
Ｗは全長が４原子から１００原子の原子鎖からなり、かつ任意に置換炭素および／または窒素原子も含み、かつ酸素および／または硫黄原子を任意に含む原子鎖からなるスペーサー基を示し；
ＹはＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2、ＣＨ＝Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ2、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＮＨＮＨ2もしくはＮＨ−ビオチニル、またはこれら末端官能性の１つの保護された形態を示す。｝
【請求項２】
支持材料の上または支持材料を通して試料を通過させる際にウイルス粒子が選択的に捕捉かつ濃縮されるように式（ＩＩ）の化合物を支持材料に結合させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
スペーサー基Ｗを介して式（ＩＩ）の化合物を表面に結合する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
スペーサー基Ｗが、表面に結合し得る官能性基で終止し、該末端官能性基がビオチニル基であり、かつ上記表面をアビジン、ストレプトアビジンまたはビオチンに対する抗体を用いて被覆し、または、末端官能性基がアミノ基であり、上記表面がカルボキシ基を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
式（ＩＩ）の化合物を、ビオチン−ストレプトアビジン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コロイド金、エピトープ、酵素システム、凝集反応システム、蛍光システム、化学発光システム、および放射性ラベルからなる群から選択される検出可能ラベルに連結する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
式（ＩＩ）の化合物に検出可能ラベルを共有結合させる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ウイルス粒子表面のウイルスノイラミニダーゼにバインダーが選択的に結合するような条件下に、検出可能ラベルに結合した式（ＩＩ）の化合物に試料中のウイルス粒子を暴露する、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
ウイルスの選択的捕捉および濃縮の工程を含む、請求項５または６記載の方法。
【請求項９】
インフルエンザウイルスの選択的捕捉および選択的検出の工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ａ）支持体に結合したノイラミニダーゼバインダーに試料を暴露する工程、および
ｂ）検出可能ラベルに連結したノイラミニダーゼバインダーに支持体上に保持したインフルエンザウイルス粒子を暴露する工程を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
式（ＩＩ）の化合物が１０-6Ｍ未満の、結合に対するＩＣ50を有する、請求項１から１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ノイラミン酸類似体が、式（ＩＩ）：
0003753740.tif 000011
｛式中、Ｒはアジド基、非置換もしくは置換グアニジノ基、または非置換もしくは置換アミノ基を示し；
ここでアミノ基もしくはグアニジノ基上に置換基が存在する場合には、その置換基は置換もしくは非置換Ｃ1-6アルキル基、またはアミノ、ヒドロキシ、シアノもしくはアルコキシカルボニル基であり；
Ｒ2はＣＯＣＨ3、ＣＯＣＦ3またはＳＯ2ＣＨ3を示し；
ＸはＯまたはＮＨを示し；
Ｗは全長が４原子から１００原子の原子鎖からなり、かつ任意に置換炭素および／または窒素原子も含み、かつ酸素および／または硫黄原子を任意に含む原子鎖からなるスペーサー基を示し；
ＹはＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2、ＣＨ＝Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ2、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＮＨＮＨ2もしくはＮＨ−ビオチニル、またはこれら末端官能性の１つの保護された形態を示し；
ただし、Ｘ−Ｗ−Ｙは、ＯＣ（＝Ｚ）ＮＲ5Ｒ6基［式中、ＺはＯもしくはＳ、およびＲ5およびＲ6は独立にＨ、または任意にＮＨ2、ＯＨもしくはＳＨにより置換された炭化水素基を示すが、Ｒ5およびＲ6は両者共にＨであることはない］を含まない｝の化合物である、ノイラミニダーゼバインダー。
【請求項１３】
７−位で結合したＸ−Ｗ−Ｙ基が末端官能化Ｎ−置換アルキルカルバメートである、請求項１２記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項１４】
ノイラミン酸の類似体が、式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）
0003753740.tif 000012
｛式中、Ｒはアジド基、非置換もしくは置換グアニジノ基、または非置換もしくは置換アミノ基を示し；
ここでアミノ基もしくはグアニジノ基上に置換基が存在する場合には、その置換基は置換もしくは非置換Ｃ1-6アルキル基、またはアミノ、ヒドロキシ、シアノもしくはアルコキシカルボニル基であり；
Ｒ2はＣＯＣＨ3、ＣＯＣＦ3またはＳＯ2ＣＨ3を示し；
Ｗは全長が４原子から１００原子の原子鎖からなり、かつ任意に置換炭素および／または窒素原子も含み、かつ酸素および／または硫黄原子を任意に含む原子鎖からなるスペーサー基を示し；
ＹはＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2、ＣＨ＝Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ2、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＮＨＮＨ2もしくはＮＨ−ビオチニル、またはこれら末端官能性の１つの保護された形態を示し；
ＡおよびＢは酸素もしくはＣＨ2であるか、または単一結合を示してもよく、
Ｒ1は１種以上のハロゲン原子、シクロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシまたは任意に置換されたアリール基により任意に置換された親油性Ｃ1〜Ｃ12アルキル基である｝の化合物である、ノイラミニダーゼバインダー。
【請求項１５】
スペーサー基Ｗが、線状ペプチド；オリゴサッカライド；ポリオール；ポリエチレングリコール基；および酸素もしくは硫黄原子と一緒に、またはカルボニル、アミド、尿素もしくはヒドラジド官能性と一緒に連結した炭化水素基；またはこれらの基の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項１６】
末端官能性Ｙに対する保護基が、ＯＨ、ＳＨおよびＣＯ2Ｈ基のエステル、ＮＨ2およびＣＯＮＨＮＨ2基のカルバメート、およびＣＨ＝Ｏ基のアセタールからなる基から選択される、請求項１２から１５いずれか１項記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項１７】
Ｒがグアニジノであり、Ｒ2がアセチルである、請求項１２記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項１８】
ＸがＯであり、かつＹがＮＨ2もしくはＮＨ−ビオチニルである、請求項１２または請求項１７記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項１９】
Ｗが、ＣＯＮＨ(ＣＨ2)n、ＣＯＮＨ(ＣＨ2)nＮＨＣＯＮＨ(ＣＨ2)m、
ＣＯＮＨ(ＣＨ2)n[ＮＨＣＯ(ＣＨ2)5]m、ＣＯ(ＣＨ2)n、
ＣＯ(ＣＨ2)nＮＨＣＯＮＨ(ＣＨ2)m、ＣＯ(ＣＨ2)nＮＨＣＯ(ＣＨ2)q、
ＣＯＮＨ(ＣＨ2)nＮＨ(ＣＯＣＨ2ＮＨ)qＣＯＣＨ2；
ＣＯＮＨ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯ(ＣＨ2)qおよび
ＣＯＮＨ(ＣＨ2)nＮＨＣＯ(ＣＨ2)q［式中、ｎおよびｍは２から１２の整数、およびｑは０または１から１２の整数］
からなる群から選択されるスペーサー基である、請求項１２、１７および１８のいずれか１項記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項２０】
１０-6Ｍ未満のＩＣ50を有する、請求項１２から１５いずれか１項記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項２１】
１０-8Ｍ未満のＩＣ50を有する、請求項２０記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項２２】
下記の化合物８、１３、１７、１９〜２３および２５〜３１から選択される、請求項１２から１４いずれか１項記載のノイラミニダーゼバインダー。
0003753740.tif 000013
（ここで、Ｘは酸素であり、Ｂｏｃはブトキシカルボニルであり、Biotinはビオチンである。）
【請求項２３】
５−アセトアミド−７−（６'−ビオチニルアミノ−トリグリシンアミド−ヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸(２１)。
【請求項２４】
５−アセトアミド−７−（６'−（６"−（６"'−アミノカプロイル）−トリアミノカプロイル）−アミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（２５）。
【請求項２５】
５−アセトアミド−７−｛６'−［６"−（６"'−ビオチニルアミノカプロイル）−トリ−アミノカプロイル］−アミノヘキシル｝−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（２６）。
【請求項２６】
５−アセトアミド７−｛６'−［６"−（６"'−ヒドラジドスクシニルアミノカプロイル）−トリアミノカプロイル］−アミノヘキシル｝−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（３０）。
【請求項２７】
ビオチン−ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コロイド金、エピトープ、酵素システム、凝集反応システム、蛍光システム、化学発光システム、および放射性ラベルからなる群から選択される検知可能ラベルに連結する、請求項１２から２６いずれか１項記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項２８】
連結が共有である、請求項２７記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項２９】
検知可能ラベルが、活性受容面を有する光学アッセイ手段における、または凝集反応検知システムにおける、抗体検知キットに使用するのに好適なエピトープである、請求項２７または２８記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項３０】
ノイラミニダーゼバインダーが検知可能ラベルに連結しており、このノイラミニダーゼバインダーが（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−アミノ−３−（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボキシル酸である、請求項１２記載のノイラミニダーゼバインダー。
【請求項３１】
診断用に適する担体と一緒に、請求項１２から３０いずれか１項記載の化合物を含む、診断用組成物。
【請求項３２】
ａ）式（ＩＩＩ）のシアリン酸誘導体を、式（ＩＶ）
0003753740.tif 000014
［式中、ＲおよびＲ2は式(ＩＩ)で定義したと同じであり、Ｒ′はアルキル基、およびＡは保護基を示す］
の８，９−保護化合物に転化し；
ｂ）７−ヒドロキシ基をアシル化し；
ｃ）任意にスペーサー基Ｗを伸長または官能化し；
ｄ）保護基を除く
工程を含む、請求項１２記載の式（ＩＩ）［ここではＸは酸素を示す］のノイラミニダーゼバインダーの合成方法。
【請求項３３】
ａ）請求項３２に定義した化合物（ＩＶ）をミツノブ反応の条件下に反応させて、Ｃ７において反転した立体化学を有する脱離基エステルを生成させ；
ｂ）このＣ７エステルを求核試薬で置換する
工程を含む、請求項１２記載の式（ＩＩ）［式中、ＸはＮＨ］のノイラミニダーゼバインダーの合成方法。
【請求項３４】
一般式（Ｖ）または（ＶＩ）
0003753740.tif 000015
［式中、Ａは保護基であり；
ＷおよびＷ′は請求項１２または請求項１５のＷに対して定義したスペーサー基であり；
Ｒは請求項１２で定義したと同じであり；
Ｒ2は請求項１２で定義したと同じであり；
Ｒ′はアルキル基であり；
Ｙは請求項１２または請求項１６で定義したと同じである］
の化合物。
【請求項３５】
ＡがＣ＝ＯまたはＣＭｅ2である、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
式（ＩＶ）から（ＶＩ）のＡがＣ＝ＯまたはＣＭｅ2である、請求項３４記載の化合物。
【請求項３７】
７−ヒドロキシ基がイソシアネート基ＯＣＮ−Ｗ'−Ｙによりアシル化され、ここでＷ'は請求項１２または請求項１５のＷに対して定義したスペーサー基であり、Ｙは請求項１２または請求項１６で定義したと同じである、請求項３２または請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
７−ヒドロキシ基が式ＣｌＣＯＬのアシルクロライドによりアシル化され、ここでＬは脱離基であり、Ｌはその後式Ｈ2Ｎ−Ｗ'−Ｙ［式中、Ｗ'は請求項１２または請求項１５のＷに対して定義したと同じであり，Ｙは請求項１２または請求項１６で定義したと同じである］のアミンにより置換される、請求項３２または請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は診断方法に関し、特に本発明はインフルエンザウイルス感染の診断方法に関するものである。本発明は、インフルエンザウイルスTypeＡおよびTypeＢの全ての株の検出に使用できる新規診断方法を提供する。この方法は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの活性部位に特異的に結合し得る化合物、またはかかる化合物の官能化誘導体を、臨床用試料中のインフルエンザウイルスの同定のための結合剤および／または検出剤として使用することに基ずく。ここで用いる”ノイラミニダーゼバインダー”なる用語は、これらの化合物およびこれらの官能化された誘導体を呼称する。本発明の方法および化合物は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼに非特異的に結合する化合物の存在下、または不在下のいずれかで機能できる。
本発明は特に、肉視による、または機器によりインフルエンザＡおよびＢを検出するための診断剤としての、新規クラスの化合物およびそれらの使用に関する。一層詳しくは本発明は、インフルエンザＡおよびＢノイラミニダーゼに結合し、その上、化合物を表面または検出可能ラベルにも結合させ得る官能性（functionality）を有する新規ノイラミン酸（シアリン酸（sialic acid））誘導体の一群に関する。
発明の背景
インフルエンザＡおよびＢは米国だけで年間推定３０−５０（百万）の感染を伴う急性呼吸器疾患の主たる原因である。インフルエンザＡは、数百万人を死亡させた1919年の”スペインカゼ”等の大流行に責任がある。多くのウイルスおよび細菌性感染はインフルエンザ感染類似の症状を呈することがある。呼吸器ウイルスの迅速な同定は医者をして最も適切な治療方法の採用を病気初期に可能ならしめるはずである。例えば正確な早期診断は、抗菌剤治療の採用の決定ならびに小人や年輩者の入院についての決定を可能ならしめるはずである。
臨床材料中のウイルスの同定のための実験室的試験法は広く採用され、かつ多数の異なった検出方法が利用できる。教材”Laboratory Diagnosis of Viral Infections”Marcel Dekker 1992,Ed E.H.Lennette中ではインフルエンザウイルスを包含する広範なウイルスに使用される方法を一般的に論議している。
インフルエンザＡおよびＢの診断用には多数の試験法が入手できる。インフルエンザウイルスの従来からの同定方法は細胞培養の使用であり、この方法は高度に鋭敏で特異的である。不幸にしてインフルエンザウイルスの培養、単離および同定に要する時間は２日から１０日の範囲に及び、かくして医者を適切な治療に先導する方法としては事実上役立たない。通常はインフルエンザウイルス感染は自己限定的であるから、もし治療を有効ならしめるのであれば診断は迅速であるべきである。換言すれば、かかる細胞培養法は通常は過去の疫学情報の提供に価値があるだけである。
インフルエンザ検出のための細胞培養法以外にも、最近では迅速で直接的な試験法が少しは入手できるようになり、この試験法はインフルエンザＡに対して特異的である。このように、モノクロナール免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）が報告されており（Spada,B.らのJ,Virol.Methds,1991 33 305）、かつ少なくとも１種の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）が利用できる（Ryan-Poirier,K.A.らJ.Clin.Microbiol.,1992 30 1072）。インフルエンザＡに対するこれら迅速検出法についての比較は多数報告されており（例えばLeonardi,G.P.らのJ.Clin.Microbiol.,1994 32 70参照）、著者らは治療手段および感染抑制手段を適時に設定し、かつ地域社会に流行しているインフルエンザ株の抗原性構成を疫学目的でモニターするためには、試料の直接試験と同時に培養単離法を併用して、両試験でウイルスの同定を可能ならしめるよう推奨している。ＩＦＡ法は労働集約的であり、かつかなり技術的熟練を要し、解釈が困難な結果をしばしば伴うことが報告されいる。一方、ＥＩＡ法（directigen FLU-A；Becton Dickinson Microbiology Systems）は高レベルの偽陽性結果を与えるので、このアッセイは直接免疫蛍光試験（Waner,J.L.らJ.Clin.Microbiol.,1991 29 479）に追加して、またはその代わりとして実験室的にのみ使用されるべきであることを推奨されている。
インフルエンザの場合に入手可能な迅速アッセイに伴う上記問題点と同時に、これらの方法の或る種のものには他の基本的欠陥を伴う。先ず、利用し得るいずれのアッセイもインフルエンザＢを検出できず、このことは陰性試験結果でさえも、採用されるべき治療タイプについて医者に確信を持たせないであろうことを意味する。第２に、仮に迅速免疫アッセイ法がインフルエンザＡタンパク質の１種に対する抗体の使用に依存するのであれば、抗原タンパク質構造がドリフトまたはシフトを受けた新規ウイルス株の検出には重要な問題が生ずる可能性がある。インフルエンザＡはかかる変化を受け易い性癖で悪名高い。
インフルエンザウイルスの迅速アッセイの他のタイプが一連の特許明細書に記載されている（例えばLiav,A.らの国際特許出願第ＷＯ92／12256号参照）。この方法には、インフルエンザノイラミニダーゼ酵素に対する発色性基質の使用が包含される。換言するとこのアッセイは、インフルエンザノイラミニダーゼが特殊シアリン酸−色素結合分子を開裂する際に形成される色素を可視化することに依存している。この技術はウイルスノイラミニダーゼの存在と、酵素特にバクテリアノイラミニダーゼの他の形態の存在との間を容易に識別できないために、限定された特異性を提供するようにみえる。またウイルスノイラミニダーゼの活性が比較的緩慢なので、感度が低い可能性がある。
ノイラミニダーゼはインフルエンザウイルス表面に存在する鍵タンパク質の１つであり、ヒト細胞へのウイルスの感染能に重要な役割を演ずる。このノイラミニダーゼ酵素に結合する薬剤はインフルエンザ感染を阻止する可能性があるかもしれないと長年考えられ、かかるバインダーを探索することに多くの努力が注がれてきた。in vitroでは多くの化合物がインフルエンザノイラミニダーゼに対して活性を示すのに対して、この酵素の活性部位に結合する強力なノイラミニダーゼバインダーの使用によりin vivoでインフルエンザ感染からの防御を達成し得ることが確立されたのは極く最近のことである（von Itzstein,M.らNature 1993 363 418および本発明者らの国際特許出願第ＷＯ／92／06691号および同第ＷＯ／91／16320号参照、これら全ての開示をここに引用によって包含する）。特に、２，３−ジデヒドロ−２，４−ジデオキシ−４−グアニジニル−Ｎ−アセチルノイラミン酸（化合物Ｉ、ＧＧ１６７と呼称）はインフルエンザノイラミニダーゼの強いバインダーであり、また動物（Ryan,D.M.らAntimicrobial Agents and Chemotherapy,1994 38 2270）およびヒトのボランテイア（Hayden,F.G.らJ.American Medical Assoc.,1996 275 295）において強い抗ウイルス活性をin vivoで示すことが判った。
0003753740.tif 000002
一層最近に至り、シアリン酸のある種の置換シクロヘキセン誘導体、および具体的に化合物（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−アミノ−３−（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボキシル酸（ＧＳ4071）もインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの強いバインダー（Kim,C.U.らJ.Amer.Chem.Soc.,1997 119 681）であることが判った。
本発明目的は、従来の方法に固有の諸問題点のいくつかを克服し、インフルエンザウイルス検出の単純で鋭敏な手段を提供することにある。
そこで、この度び本発明者らは上記von Itzsteinらの刊行物中に開示されたように、結合に対するＩＣ50が１０-6Mまたはそれ未満であって、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの活性部位に立体化学的相補性を有する生物学的活性物質および特に化合物Ｉのある種誘導体が、インフルエンザウイルスに選択的に結合する能力と表面または検出可能連結基に同時に結合する能力との両面を通じてインフルエンザウイルスの検出に使用できることを見いだした。
発明の概要
したがって本発明は、インフルエンザウイルスを含むことが疑われる試料を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの活性部位に特異的に結合し得るが、ノイラミニダーゼによって開裂されない化合物（ノイラミニダーゼバインダー）に暴露する工程を含む、インフルエンザウイルスの検出法を最初の局面において提供する。
本発明方法はインフルエンザＡおよびインフルエンザＢのすべての既知株に適用可能である。
本明細書の目的の場合、”含む”なる用語は”含んでいるが、それに限定はされない”と理解されるべきである。「含んでいる」および「包含する」の用語とは同じように理解されるべきである。
このノイラミニダーゼバインダーは、スペーサー基を介して表面または検出可能ラベルに連結されるのが好ましい。このスペーサー基は、検出可能ラベルがウイルス粒子の表面に暴露されるように充分に長くあるべきである。
本発明方法はウイルスの選択的捕捉および濃縮を利用し、次いで便利な在来法のいずれかを利用してウイルスを検出する；この検出法は固有の選択性を有する必要はない。例えば、このノイラミニダーゼバインダーを膜またはポリマー等の支持材料に結び付けて、この支持体の上方にまたは支持体を通じて試料を通過させる際にウイルス粒子が選択的に捕捉かつ濃縮されるようにしてもよい。したがって本発明の好ましい態様では、このスペーサー基は表面に結合し得る官能性において終止する。多くの適切な官能性が知られている。例えばこの末端官能性は、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンに対する抗体で被覆された表面にバインダーを結び付けるのに使用できるビオチニル基であってもよい。
別法としてこの末端官能性は、カルボキシ含有表面にノイラミニダーゼバインダーを結合させのに使用され得る例えばアミノ基であってもよい。
別法として選択的検出法も使用できる；例えばバインダーがウイルス粒子表面のウイルスノイラミニダーゼに選択的に結合するような条件下に、試料中のウイルス粒子を、検出可能ラベルに結合したノイラミニダーゼバインダーに暴露してもよい。検出可能ラベルはノイラミニダーゼバインダーに共有結合されるのが好ましい。次いでいずれかの便利な方法を用いて検出可能ラベルを検知する。ある種検出システムの場合、例えば表面上のスポットまたは線等の制限された領域中に試料を集中すると便利である。この目的は各種方法で達成できる；例えばフイルターまたは他の支持材料上に試料を懸垂（suspend）したり、または非選択的に捕捉してもよく、次いで上記のようにラベル化ノイラミニダーゼバインダーに試料を暴露してもよい。インフルエンザウイルスの非選択的捕捉には例えばfetuin-被覆表面上（J.Virological Methods,1992 39 111）または適当な膜上（J. Virological Methods,1992 40 77）等、いくつかの方法が知られている。他の好適な検出システムはMiller,B.J.らの米国特許出願第5,418,136号に記載のような光学的アッセイ装置であってもよい。
あるいは他の局面によれば、本発明では選択的捕捉と選択的検出との組み合わせを採用して、インフルエンザウイルス検出のための簡単で鋭敏な２段法を提供する。これは、インフルエンザウイルスの各粒子がその球状面の上に広がる約１００個のノイラミニダーゼ分子を典型的に保有し（White,D.O.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,1974 63 1-48）、したがつて１つを上回るノイラミニダーゼバインダー分子に同時に結合し得るという事実を利用するものである。
このようにノイラミニダーゼバインダー化合物は、例えば多孔性膜の長さに沿って狭いバンド状の支持体に結合する。次いで試験サンプルを膜の他端に施し、結合化合物のバンドを渡って流す。試験サンプル中のいずれのインフルエンザウイルス粒子も膜に結合した化合物によりトラップされ、かくして狭いバンド中に保持される。第２試験段階では、ノイラミニダーゼバインダーに結び付いた検出可能ラベルを、結合インフルエンザウイルス粒子のバンドを渡って膜を通して流す。次いで、インフルエンザウイルスの存在が結合化合物部位における膜の観察可能な変化により判る。クロマトグラフィーによる好適なアッセイ手段（device）は例えばChandler,H.M.による国際特許出願第ＷＯ92／21977号に記載されている。
適当な検出システムは、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスフアターゼ、蛍光システム、化学発光システム、コロイド金、放射性ラベルおよび凝集反応システム等極めて多数が知られている。スペーサー基を介してノイラミニダーゼバインダーに連結したコロイド金は特に便利な検出可能ラベルになり得る。他の便利な検出システムはセイヨウワサビペルオキシダーゼに共有結合したノイラミニダーゼバインダーを利用する。通常のトライ・アンド・エラー実験を利用すれば、適切な検出システムの選択、および検出条件の最適化は、当業者であれば容易に可能なはずである。
ノイラミニダーゼにより開裂される検出可能ラベルまたはスペーサー基は含まないことを前提にすれば、ノイラミニダーゼバインダーとしてはインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの活性部位に結合する薬剤のいずれでもかまわない。この結合は非可逆的である必要はない。結合に対するＩＣ50は１０-6Ｍまたはそれより良好なことが適当である。
好ましい薬剤の例中には、本発明者らの先の国際特許出願第ＷＯ／92／06691号およびＷＯ／91／16320号、およびまた米国特許第5,453,533号（Luoらの）、米国特許第5,512,596号（Gilead Sciences,Inc）、および国際特許出願第ＷＯ／96／26933号（Gilead Sciences,Inc）に開示された適切なＩＣ50の化合物が包含されるが、それらのみには限定されない。これらの明細書では開示する化合物の使用をインフルエンザウイルス感染の治療または予防のために開示してはいるが、本発明で記載するタイプのアッセイを用いる診断目的に対してこれらの化合物が有用であることを暗示してはいない。
第２の局面によれば本発明は、そのＣ7位置が、または上記類似体の環状系に結合した分岐側鎖上の同等位置が、検出可能ラベルまたは表面に結合するのに適したスペーサー基により置換されたノイラミン酸（シアリン酸）の類似体を含む、本発明方法での使用に適するノイラミニダーゼバインダーを提供する。
好ましい態様でこの局面は、式（ＩＩ）：
0003753740.tif 000003
｛式中、Ｒはアジド基、非置換もしくは置換グアニジノ基、または非置換もしくは置換アミノ基を示し；
Ｒ2はＣＯＣＨ3、ＣＯＣＦ3またはＳＯ2ＣＨ3を示し；
ＸはＯまたはＮＨを示し；
Ｗは全長が４原子から１００原子の原子鎖からなり、かつ任意に置換炭素および／または窒素原子も含み、かつ酸素および／または硫黄原子を任意に含む原子鎖からなるスペーサー基を示し；
ＹはＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2、ＣＨ＝Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ2、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＮＨＮＨ2もしくはＮＨ−ビオチニル、またはこれら末端官能性の１つが保護された形態を示し；
ここでアミノ基もしくはグアニジノ基上に置換基が存在する場合には、その置換基はメチルもしくはエチル基等の置換もしくは非置換Ｃ1-6アルキルまたはフエニル等の置換もしくは非置換アリール基；またはアミノ、ヒドロキシ、シアノもしくはアルコキシカルボニル基であり；
ただし、Ｘ−Ｗ−ＹはＯＣ（＝Ｚ）ＮＲ5Ｒ6基［式中、ＺはＯもしくはＳ、およびＲ5およびＲ6は独立にＨ、または任意にＮＨ2、ＯＨもしくはＳＨにより置換された炭化水素基を示すが、Ｒ5およびＲ6は両者共にＨであることはない］を含まない｝
の化合物を提供する。
他の好ましい態様で本発明は、式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）
0003753740.tif 000004
［式中、Ｒ、Ｒ2、ＷおよびＹは式（ＩＩ）に対する上記定義と同じであり、ＡおよびＢは酸素もしくはＣＨ2であり、または単一結合を示してもよく、Ｒ1は１種もしくは２種以上のハロゲン原子、シクロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシまたは任意に置換されたアリール基により任意に置換された親油性Ｃ1-Ｃ12アルキル基である］
のノイラミニダーゼバインダーを提供する。
好適なスペーサー基Ｗの例中には、線状ペプチド、オリゴサッカライド、ポリオール、ポリエチレングリコール基、炭化水素基、および酸素もしくは硫黄原子と一緒にまたはカルボニル、アミド、尿素もしくはヒドラジド官能基と一緒に連結した炭化水素基が包含されるが、これらのみに限定されない。スペーサー基Ｗはこれら各種基の組み合わせを包含してもよい。
末端官能性Ｙに対する好適な保護基の例中には、ＯＨ、ＳＨおよびＣＯ2Ｈ基のエステル、ＮＨ2およびＣＯＮＨＮＨ2基のカルバメート、およびＣＨ＝Ｏ基のアセタールが包含されるが、これらのみに限定されない。
ここで使用する用語”炭化水素基”中には、アリール基を包含する飽和および不飽和直鎖もしくは分岐型炭化水素基およびかかる基の組み合わせが包含される。
本発明の好ましい化合物の例中には、式（ＩＩ）［式中、Ｒはグアニジノを示し、Ｒ2はアセチルを示す］の化合物が包含される。
本発明の好ましい化合物式（ＩＩ）の他の群は、ＸがＯであり、かつＹがＮＨ2またはＮＨ−ビオチニルの場合の群である。
本発明化合物の三番目の好ましい群の例中には、式（ＩＩＡ）のノイラミニダーゼバインダー［式中、Ｒはアミノ、Ｒ2はアセチル、Ｂは酸素およびＲ1はアルキル基を示す］が包含される。
さらなる好ましい化合物の例は、式（ＩＩ）｛式中、ＷはＣＯＮＨ（ＣＨ2）n、ＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2）m、ＣＯＮＨ（ＣＨ2）n［ＮＨＣＯ（ＣＨ2）5］m、ＣＯ（ＣＨ2）n、ＣＯ（ＣＨ2）nＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2）m、ＣＯ（ＣＨ2）nＮＨＣＯ（ＣＨ2）q、ＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ（ＣＯＣＨ2ＮＨ）qＣＯＣＨ2；ＣＯＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯ（ＣＨ2）qおよびＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＮＨＣＯ（ＣＨ2）q［式中、ｎおよびｍは２から１２の整数、およびｑは０または１から１２の整数］からなる群から選択されるスペーサー基である｝の化合物である。
好適な検出可能ラベルおよび検出システムを選択し、かつルーチン方法を用いて上記化合物の適性を試験することは、当業者にとり可能なはずである。したがって上記のような選択的捕捉または選択的検出等、好ましい検出システムの選定は当業者であれば可能になろう。選択的捕捉システムの場合、このスペーサ基は固形支持体に結合し得る官能性において終結する。多くの適切な官能性が当分野で知られている。
基Ｗ−ＹによるＣ7位置（または同等部位）の置換によって、ノイラミニダーゼに結合する親化合物の能力が有意な程度に低減すべきではない；この結合は１００倍を超えて低減しないのが好ましい。ノイラミニダーゼに結合する能力は、いずれかの簡便な方法で評価できる；１つの適当な方法はWarnerおよびO'BrienのBiochemistry,1979 18 2783-2787に記載のin vitroでのノイラミニダーゼ活性のバイオアッセイである。In vitroでのバイオアッセイは本発明者らの出願第ＷＯ91／16320号に記載されている。この代わりに、ノイラミニダーゼへの放射性ラベル化バインダー化合物の結合は当分野での既知方法によっても評価できる。
本発明方法に使用するための臨床用試料の好ましいタイプの例中には、のど綿棒、はな綿棒、鼻咽頭洗浄物、鼻洗浄物およびうがい試料、またはこれらいずれかの組み合わせが包含され；うがい試料は必要に応じて例えば超遠心分離により任意に濃縮可能ではあるが、これはウイルス粒子数が少ない場合にのみ期待される。
スペーサー基に連結されるラベルは、米国特許第4943522号（Eisingerら）（Quidelに譲渡）記載のような抗体検出キット；米国特許第5,418,136号（Millerら）（Biostar,Inc.に譲渡）記載のような活性受容体面を有する光学アッセイ装置（device）；または米国特許第4,894,347号および国際特許出願第ＷＯ91／04492号（共にAgen limited.による）記載のような凝集反応検出システムに使用するのに適したエピトープであってもよいことは明瞭に理解できるはずである。本発明方法にはバイオセンサーシステムの使用が適することも考慮される。例えば、バクテリア検出用の炭水化物バイオセンサー面はNilsson,K.G.I.およびC.F.MandeniusによるBioTechnology,1994 12 1376-1378に記載されている。
本発明の幾つかの化合物はインフルエンザウイルスノイラミニダーゼに特に強く結合し、ＩＣ50は１０-8Ｍまたはそれより良好であり、これらの化合物は治療的にも有用であり得る。
本発明化合物は多様な方法で調製でき、したがって本発明のさらなる局面では、化合物式（ＩＩ）を調製するための方法を提供する。１つのタイプのアプローチでは、本発明化合物［ＸがＯの場合］の調製は下記の反応図表に示すように実施できる［式中、Ｒ、Ｒ2およびＹは式（ＩＩ）の場合の定義と同じであり、Ｒ’はアルキル基であり、Ｗ’はスペーサー基である］。このように、シアリン酸誘導体式（ＩＩＩ）は８，９−で保護された形態の式（ＩＶ）［このものは例えば環状カーボネート（Ａ＝Ｃ＝Ｏ）またはアセトニド（acetonide）（Ａ＝ＣＭｅ2）であってもよい］へと転化される。残りの遊離の７−ヒドロキシ基はイソシアネート基ＯＣＮ−Ｗ’−Ｙまたはアシルクロライド（ＣｌＣＯＬ）（これは第２の脱離基Ｌを有し）のいずれかでアシル化されるが、この基Ｌは次いでアミンＨ2Ｎ−Ｗ’−Ｙにより置き換えられる。基Ｗ’は一般的にはＷの定義以内の、一般に４から１０原子長のスペーサー基であり、ＷはＣＯＮＨＷ’と同等であってもよい。このスペーサー基Ｗ’は例えば（ＶＩ）におけるように鎖端部にビオチンを加えることによりさらに伸長または官能化ができる。
最後に、保護基Ａ、Ｒ’、および置換基ＲおよびＹ上に存在するいずれも、化合物式（ＩＩ）を与える標準条件下に除去可能である。ヒドロキシ基およびカルボニル基を保護するのに適する保護基は当分野で多数知られている［例えばT.H.Greeneによる”Protecting Groups in Organic Synthesis”(Wiley & Sons,1981)参照］。
0003753740.tif 000005
化合物式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）は知られており、これらの調製は例えば国際特許出願第ＷＯ91／16320号中に記載されている。
本発明化合物［ＸがＮＨの場合］を調製するための他のタイプのアプローチには、シアリン酸誘導体から出発してＣ7位置で２重反転（double inversion）を与える反応の実施が包含される。例えば一般式（ＩＶ）の中間体をミツノブ（Mitsunobu）反応条件下に反応させるとＣ7で反転した立体化学を有する好適な脱離基エステルを与える（Anderson,N.G.等のJ.Org.Chem.,1996 61 7955）。このＣ7エステルをアジド等の求核試薬で置き換えると、正しい立体化学を有するＣ7窒素置換誘導体を与える。シアリン酸誘導体のＣ7位置に窒素を導入するための別法はKongおよびvonItzsteinのTetrahedron Letters,1995 36 957中に記載されている。
殆どの中間体式（Ｖ）おび（ＶＩ）は新規化合物であり、これらは本発明のさらなる局面を構成する。
発明の具体的な説明
本発明を、制限無しの次の実施例を参照しながら詳しく述べる。
式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｏ）の本発明化合物の例を表１に示す。ビオチン（biotin）を含む置換基Ｙのこれら実施例は、アミド結合を介してそのカルボキシル基に結び付いたビオチンを有している。
0003753740.tif 000006
0003753740.tif 000007
および式（Ｖ）および（ＶＩ）の中間体の例を表２に示す。再度Ｂｏｃはブトキシカルボニルを示す。
0003753740.tif 000008
実施例  １ ５−アセトアミド−７−［６’−（６”−アミノヘキシルウレイド）−ヘキシル］−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（enopyranosonic acid）（８）の調製
（Ａ）        メチル  ５−アセトアミド−４−アジド−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（２）の調製
アルゴン下に氷浴中、メチル  ５−アセトアミド−４−アジド−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（１）（１．３２ｇ、４．０３ｍｍｏｌ）の懸濁液［Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（１．６ｍｌ、１２．４６ｍｍｏｌ）を含む乾燥ジクロロメタン（３２ｍｌ）およびアセトニトリル（１６ｍｌ）中の］にトルエン（３ｍｌ、６．０６ｍｍｏｌ）中のホスゲン２０％溶液を２０分間に亙って滴下した。この透明反応混合物を氷浴温度で２時間撹拌し、次いで室温に１６時間放置し、蒸発乾固させた。残渣を酢酸エチル（３００ｍｌ）と水（５０ｍｌ）間に分配した。５−１０℃で有機相を０．５Ｍ  ＨＣｌ溶液（３２ｍｌ）で、引き続いて飽和食塩水（３×３０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、さらに蒸発乾固させた。この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフイー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝８／１）にかけると、化合物（２）（１．０３５ｇ、７１％）を白色泡沫（foam）として与えた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：３５７  （Ｍ＋１）+
ｉ．ｒ．（ＣＨＣｌ3）ｃｍ-1：3314,2101,1774,1734,1654.
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤＤｌ3）  δ（ｐｐｍ）：2.13(s,3H),3.81(s,3H),3.82(d,1H),3.90(d,1H),4.08(dd,1H),4.21(dd,1H),4.72(d,2H),4.97(ddd,1H),5.95(d,1H),6.55(d,1H).
（Ｂ）        メチル  ５−アセトアミド−４−アジド−７−（６’−tert−ブトキシカルボニルアミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（３）の調製
アルゴン雰囲気下の化合物（２）（５７７ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（８ｍｌ）溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２７５ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）および４−ニトロフエニルクロロホルメート（４２４ｍｇ、２．１１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を３０−３５℃で３．５時間撹拌した。この混合物に６−tert−ブトキシカルボニルアミノヘキシルアミン（５６７ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４０５ｍｇ、３．３２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物をアルゴン下に室温で２４時間撹拌し、次いで酢酸エチル（４００ｍｌ）で希釈した。この酢酸エチル溶液を、水（３×４０ｍｌ）、引き続いて２Ｍ  ＨＣｌ（４０ｍｌ）を用いて５−１０℃で洗浄し、さらに水（３×２０ｍｌ）で洗浄した。有機相を蒸発乾固すると粗生成物（１．１０３ｇ）を与え、次いでこれをフラッシュクロマトグラフイー（シリカゲル、先ず酢酸エチル／ヘキサン＝２／１、次に酢酸エチル）にかけると表題化合物（３）（７２６ｍｇ、７５％）を白色泡沫として与えた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：599(M+1)+,607(m+9)+,(M+1+2H2O-N2)
ｉ．ｒ．（ＣＨＣｌ3）ｃｍ-1：3328,2734,2099,1799,1732,1682.
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤＣｌ3）  δ（ｐｐｍ）：1.20-1.40(m,4H),1.40-1.60(m,13H),2.07(s,3H),3.01-3.42(m,5H),3.84(s,3H),4.50-4.85(m,4H),4.93(m,2H),5.03(m,1H),5.41(m,1H),5.95(d,1H),6.48(d,1H).
（Ｃ）        メチル  ５−アセトアミド−７−［６’−（６”−tert−ブトキシカルボニルアミノヘキシルウレイド）−ヘキシル］−カルバモイルオキシ−４−アジド−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（５）の調製
化合物（３）（２００ｍｇ、０．３３４ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）溶液をアルゴン下に室温で１時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固した。残渣をメタノール（５ｍｌ）中に溶解し、再度蒸発乾固すると化合物（４）を白色泡沫として与えた。
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤＣｌ3）  δ（ｐｐｍ）：1.25-1.70(m,8H),2.08(s,3H),3.0-3.5(m,4H),3.81(s,3H),3.88(dd,1H),4.4-4.8(m,4H),5.01(ddd,1H),5.30(dd,1H),5.51(dd,1H),5.86(d,1H),6.73(d,1H),7.34(d,1H).
次いで化合物（４）を、ＤＭＡＰ（３０ｍｇ、０．２４６ｍｍｏｌ）と６−tert−ブトキシカルボニルアミノヘキシルイソシアネート（０．１５ｍｌ、０．４３４ｍｍｏｌ）との混合物を含むピチジン（２ｍｌ）中に溶解した。この反応混合物をアルゴン雰囲気下に１８−２０℃で７２時間撹拌し、次いでメタノール（０．２ｍｌ）と共に室温で３時間撹拌した。生成した反応混合物を蒸発乾固し、酢酸エチル（２００ｍｌ）と１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4溶液（５０ｍｌ）間で分配した。有機相を１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4（２×５０ｍｌ）、次いで水（３×２５ｍｌ）を用いて洗浄し、減圧蒸発乾固させた。残渣をフラッシュクロマトグラフイー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝８／１、次いで酢酸エチル／メタノール＝１０／１を使用）にかけると、題記化合物（５）（１８０ｍｇ、７２％）を白色泡沫として与えた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：741(m+1)+,749(m+9)+
ｉ．ｒ．（ＣＨＣｌ3）ｃｍ-1：3356,2934,2098,1801,1732,1654.
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤＣｌ3＋ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：1.12-1.42(m,25H),1.80(s,3H),2.90-3.18(m,9H),3.70(s,3H),3.90(dd,1H),4.18(dd,1H),4.32(dd,1H),4.55(d,2H),4.91(m,1H),5.21(br,1H),5.35(dd,1H),5.45(br d,1H),5.82(d,1H),6.05(dd,1H),7.82(d,1H).
（Ｄ）        メチル  ５−アセトアミド−４−アミノ−７−［６’−（６”−tert−ブトキシカルボニル  アミノヘキシルウレイド）−ヘキシル］−カルバモイルオキシ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（６）の調製
化合物（５）（１８０ｍｇ、０．２４６ｍｍｏｌ）、酢酸（３５ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）およびＰｄ／Ｃ（１０％）（３０ｍｇ）の混合物を、メタノール（１０ｍｌ）とトルエン（６ｍｌ）との混合物中で、室温、水素下に１時間撹拌した。この反応混合物をセライト（Celite）を通して濾過し、フイルターケーキをメタノール（３０ｍｌ）で洗浄し、濾液および洗浄液を併合し減圧蒸発乾固した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフイー（シリカゲル、酢酸エチル／２−プロパノール／水＝５／２／１）にかけると、化合物（６）（４６ｍｇ、４７．５％）を白色泡沫として与え、同時に出発材料（８０ｍｇ、４４％）が回収された。
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：1.15-1.55(m,25H),1.87(s,3H AcOH),1.92(s,3H),2.90-3.10(m,8H),3.56(dd,1H),3.69(s,3H),3.91(dd,1H),4.20(dd,1H),4.62(d,2H),5.05(dd,1H),5.46(dd,1H),5.85(dd,1H).
（Ｅ）        メチル  ５−アセトアミド−７−［６’−（６”−tert−ブトキシカルボニルアミノヘキシルウレイド）−ヘキシル］−カルバモイルオキシ−４−［２，３−ビス（tert−ブトキシカルボニル］−グアニジノ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリコ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（７）の調製
化合物（６）（４６ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍｌ）溶液をAmberlite IRA-400（OH）樹脂（１００ｍｇ）で３０秒間処理し、濾過した。樹脂をメタノール（２０ｍｌ）で洗浄した。濾液と洗浄液を併合し、蒸発乾固すると固形物質４１ｍｇを与え、これをメタノール（５ｍｌ）中のＮ，Ｎ’−ビス−tert−ブトキシカルボニル−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミジン（arboxamidine）（１０３ｍｇ、０．３３２ｍｍｏｌ）と混合した。この混合物をアルゴン下に３０−３５℃で５日間撹拌し、次いで蒸発乾固した。残渣をフラッシュクロマトグラフイー（シリカゲル、先ず酢酸エチル／ヘキサン＝８／１、次いで酢酸エチル）にかけると、化合物（７）（４７ｍｇ、８８．８％）を白色泡沫として与えた。
ｉ．ｒ．（ＣＨＣｌ3）ｃｍ-1：3312,2933,1802,1728,1643,1564.
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：1.20-1.60(m,43H),1.87(s,3H),2.19(s,1H),2.90-3.20(m,8H),3.73(s,3H),4.17(dd,1H),4.33(br d,1H),4.53-5.20(m,8H),5.51(br,1H),5.88(d,1H),6.66(br,1H),8.38(d,1H).
（Ｆ）        ５−アセトアミド−７−［６’−（６”−アミノヘキシルウレイド）−ヘキシル］−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（８）の調製
トリエチルアミン（０．８ｍｌ）を含むメタノール（５ｍｌ）と水（５ｍｌ）との混合物中の化合物（７）（４７ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン雰囲気下、室温で６時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固した。メタノール（５ｍｌ）と水（５ｍｌ）との混合物中にこの残渣を溶解し、Dowex 50WX8(H+)樹脂（１ｇ）と共に室温で１時間撹拌した。この樹脂を濾過し、メタノールおよび水（１：１）混合物で洗浄し、次いで２Ｍ  ＮＨ4ＯＨ溶液（２０ｍｌ）を用いて室温で２時間撹拌し、濾過した。濾液を蒸発乾固した。残渣を水（５ｍｌ）に再溶解し、再度蒸発乾固した。生成固体を水（２ｍｌ）中に溶解し、凍結乾燥するとグアニジン（Sakaguchi）反応陽性を示す化合物（８）（１６ｍｇ、４５．７％）を白色固体として与えた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：617(M+1)+
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：1.10-1.17(m,18H),2.07(s,3H);2.85-3.20(m,6H),3.50(dd,1H),3.70(dd,1H),4.10(m,2H),4.45(dd,1H),4.52(dd,1H),4.95(dd,1H),5.65(d,1H).
実施例  ２ ５−アセトアミド−７−［６’−アミノヘキシル）カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸〔トリフルオロ酢酸塩としての〕（１１）の調製
（Ａ）        メチル  ５−アセトアミド−４−アミノ−７−（６’−tert−ブトキシカルボニルアミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（９）の調製
実施例１（Ｄ）記載の手順に従って化合物（３）［実施例１（Ｂ）（５００ｍｇ、０．８３６ｍｍｏｌ）］を水素化したところ、化合物（９）（２８５ｍｇ、５９．６％）を白色泡沫として与えた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：573(M+1)+
ｉ．ｒ．（ＣＨＣｌ3）ｃｍ-1：3385,2935,1794,1725,1670,1542.
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：1.15-1.48(m,17H),1.91(s,3H),2.96(m,4H),3.51(dd,1H),3.70(s,3H),3.88(dd,1H),4.21(dd,1H),4.62(d,2H),5.05(ddd,1H),5.45(dd,1H),5.87(d,1H).
（Ｂ）        メチル  ５−アセトアミド−７−（６’−tert−ブトキシカルボニルアミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−［２’，３”−ビス（tert−ブトキシカルボニル）］グアニジノ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（１０）の調製
実施例１（Ｅ）記載の手順に従って化合物（９）（１２５ｍｇ、０．２１９ｍｍｏｌ）から題記化合物（１０）（１４９ｍｇ、８３．４％）を白色泡沫として得た。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：815(M+1)+
ｉ．ｒ．（ＣＨＣｌ3）ｃｍ-1：3313,2978,1805,1727,1643,1610,1558.
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：1.11-1.82(m,35H),1.91(s,3H),2.98-3.21(m,4H),4.13(dd,1H),4.32(dd,1H),4.50-4.80(m,3H),4.91-5.22(m,3H),5.45(dd,1H),5.89(d,1H),6.69(br d,1H),7.63(d,1H),8.48(d,1H).
（Ｃ）        ５−アセトアミド−７−（６’−アミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸〔トリフルオロ酢酸塩としての〕（１１）の調製
トリエチルアミン（５ｍｌ）を含むメタノール（２５ｍｌ）と水（２５ｍｌ）との混合物中で化合物（１０）（５４ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を、アルゴン下、室温で６時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固した。残渣をクロマトグラフイー（シリカゲル、酢酸エチル／２−プロパノール／水＝５／２／１）にかけ、Ｒf値０．４の画分を併合し蒸発乾固した。この残渣をトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）中で、アルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌し、次いで蒸発乾固させた。残渣を水（３ｍｌ）に溶解し、凍結乾燥させると題記化合物（１１）（２７ｍｇ、６９％）を与えた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：475(M+1)+,589(M+1+TFA)+.
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：1.27-1.81(m,8H),1.98(s,3H),2.89-3.21(m,4H),3.51(dd,1H),3.69(dd,1H),4.04(m,1H),4.18(dd,1H),4.46(dd,1H),4.57(dd,1H),4.96(dd,1H),6.01(d,1H).
実施例  ３ ５−アセトアミド−７−（６’−tert−ブトキシカルボニルアミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（１３）の調製
化合物（９）（２４ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の水（５ｍｌ）溶液に１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミジン（４４ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（４３ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を室温で加えた。生成混合物をアルゴン雰囲気下に９０−９５℃で２２時間撹拌し、次いで蒸発乾固すると、強い陽性のSakaguchi反応を与える粗化合物（１２）を与え、グアニジン基の存在を示した。この残渣をトリエチルアミン（０．５ｍｌ）を含む水（５ｍｌ）中で、アルゴン下に室温で１６時間撹拌し、次いで蒸発乾固させた。残渣をクロマトグラフイー（シリカゲル、２−プロパノール／水＝３／１）にかけた。Ｒf値０．２の画分を併合し蒸発乾固させ、次いで凍結乾燥させると題記化合物（１３）（９ｍｇ、３７％）を白色固体として与えた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：575(M+1)+
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：1.25-1.83(m,17H),1.95(s,3H),2.95-3.25(m,4H),3.52(dd,1H),3.63(dd,1H),3.72(dd,1H),3.98(dd,1H),4.10(m,1H),4.46(dd,1H),4.52(dd,1H),5.62(d,1H).
実施例  ４ ５−アセトアミド−７−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（１７）の調製
（Ａ）            メチル  ５−アセトアミド−４−アジド−７−｛２’−［２”−（２’”−tert−ブトキシカルボニルアミノエトキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバモイルオキシ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（１４）の調製
実施例１（Ｂ）記載と同様の手法に従って化合物（２）（３５６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）および２−［２’−（２”−tert−ブトキシカルボニルアミノ−エトキシ）エトキシ｝−エチルアミンから化合物（１４）（４２０ｍｇ、６７％）が白色泡沫として得られた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：631(M+1)+,639(M+9)+
ｉ．ｒ．（ＣＨＣｌ3）ｃｍ-1：3328,2934,2099,1802,1734,1658,1537.
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：1.41(s,9H),1.97(s,3H),3.12-3.64(m,12H),3.78(s,3H),4.41-4.71(m,4H),5.01(d,2H),5.12(m,1H),5.43(dd,1H),5.67(br,1H),5.91(d,1H),6.83(br d,1H).
（Ｂ）        メチル  ５−アセトアミド−４−アミノ−７−｛２’−［２”−（２’”−tert−ブトキシカルボニルアミノエトキシ）−エトキシ］−エチル｝カルバモイルオキシ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（１５）の調製
実施例Ｉ（Ｄ）記載のように化合物（１４）（４００ｍｇ、０．６３４ｍｍｏｌ）を接触水素化すると、クロマトグラフイー（シリカゲル、酢酸エチル／２−プロパノール／水＝５／２／１）後に、化合物（１５）（１４４ｍｇ、３７．５％）を白色泡沫として与えた。
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：1.32(s,9H),1.82(s,3H),1.89(s,3H,AcOH),3.04-3.22(m,4H),3.36-3.53(m,8H),3.68(s,3H),3.72(br d,1H),3.98(dd,1H),4.25(dd,1H),4.62(d,2H),5.03(ddd,1H),5.43(dd,1H),5.84(d,1H).
（Ｃ）        メチル  ５−アセトアミド−７−｛２’−［２”−（２’”−tert−ブトキシカルボニルアミノエトキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバモイルオキシ−４−［２’，３”−ビス（tert−ブトキシカルボニル）］−グアニジノ−８，９−モノ−カルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（１６）の調製
実施例１の（Ｅ）記載の手法に従って化合物（１５）（１０１ｍｇ）、０．１６７ｍｍｏｌ）をグアジニネート化すると化合物（１６）（７２ｍｇ、５１％）を白色泡沫として与えた。
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：1.42(s,9H),1.49(br s,18H),1.89(s,3H),3.12-3.65(m,12H),3.78(s,3H),4.07(m,1H),4.32(br d,1H),4.55-4.75(m,2H),4.90-5.35(m,3H),5.40-5.68(m,2H),5.91(d,1H),6.38(d,1H),8.42(d,1H).
（Ｄ）        ５−アセトアミド−７−｛２’−［２”−（２’”−アミノエトキシ）−エトキシ］−エチル｝カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（１７）の調製
実施例Ｉ（Ｆ）記載の手順に従って化合物（１６）（７０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）の保護基を除くと題記化合物（１７）（２５ｍｇ、６０％）が、Sakaguchi反応陽性を示す白色固体として得られた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：507(M+1)+
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：1.96(s,3H),3.14-3.78(m,14H),4.12(m,2H),4.41(dd,1H),4.52(dd,1H),4.93(dd,1H),5.68(d,1H).
実施例  ５ ５−アセトアミド−７−（６’−ビオチニルアミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（１９）の調製
化合物（１０）（１７６ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（５ｍｌ）中でアルゴン下、室温で１時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固すると化合物（１８）を与え、次いでこれをＮａＨＣＯ3（２７ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）とＮａ2ＣＯ3（３４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）との混合物を含む水性アセトン（水７．５ｍｌおよびアセトン１５ｍｌ）中でビオチン（１１０ｍｇ、０．３２４ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと室温で３時間反応させた。生成混合物を蒸発乾固させた。トリエチルアミン（４ｍｌ）を含むメタノール（２５ｍｌ）と水（２５ｍｌ）との混合物中で、残渣をアルゴン雰囲気下に室温で１６時間撹拌した。この混合物を減圧蒸発乾固させ、残渣をクロマトグラフイー（先ず、酢酸エチル／２−プロパノール／水＝５／２／１、次いで２−プロパノール／水＝３／１）にかけた。第２溶媒系におけるＲf値０．２５の画分を捕集し蒸発乾固させた。
この残渣を水に溶解し、Dowex 50X8（H+）樹脂（０．５ｇ）を用いて室温で０．５時間処理した。樹脂を水（５０ｍｌ）、メタノール（２０ｍｌ）、および引き続いて水（１０ｍｌ）で洗浄し、次いで２Ｍ  ＮＨ4ＯＨを用いて溶離した。溶離液を蒸発乾固させ、かつ凍結乾燥すると題記化合物（１９）（６０ｍｇ、３９．７％）を白色泡沫として与え、このものはSakaguchi反応陽性を示した。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：701(M+1)+
ｉ．ｒ．ｃｍ-1：3330,2934,1674,1616,1429.
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：1.25-1.80(m,14H),2.01(s,3H),2.23(dd,2H),2.78(d,1H),2.98(dd,1H),3.08-3.26(m,4H),3.35(m,1H),3.51(dd,1H),3.68(dd,1H),4.02-4.28(m,2H),4.32-4.08(m,4H),4.92(dd,1H),5.76(d,1H).
実施例  ６ ５−アセトアミド−４−アミノ−７−［６’−（６”−tert−ブトキシカルボニル−アミノヘキシルウレイド）−ヘキシル］−カルバモイルオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（２０）の調製
トリエチルアミン（４ｍｌ）を含む水（１５ｍｌ）とメタノール（３０ｍｌ）との混合物中で化合物（６）（５０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、室温で１６時間撹拌した。生成混合物を減圧乾固させた。残渣をクロマトグラフー（シリカゲル、２−プロパノール／水＝３／１）にかけて、題記化合物（２０）（３０ｍｇ、６３．５％）を白色フオームとして得た。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：675(M+1)+
ｉ．ｒ．ｃｍ-1：3333,2932,1710,1633,1557.
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：1.22-1.57(m,25H),1.98(s,3H),2.98-3.18(m,8H),3.49(dd,1H),3.64(dd,1H),4.02-4.28(m,3H),4.53(br d,1H),4.92(dd,1H),5.72(d,1H).
実施例  ７ ５−アセトアミド−７−（６’−ビオチニルアミノ−トリグリシンアミド−ヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−グアノジノ−２，３，４−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（２１）の調製
水（０．４ｍｌ）とアセトン（４ｍｌ）との混合物中の６−ビオチニルアミノトリグリシン（１０１．２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）溶液に、トリエチルアミン（２４．６ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）および引き続いてイソブチルクロロホルメート（３５ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ）を−１０℃で順次添加した。全混合物をアルゴン下に−１０℃で１２分間撹拌し、次いでこれをトリエチルアミン（２４．６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を含む水（１ｍｌ）とアセトン（１ｍｌ）との混合物中の化合物（１８）（９２ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）溶液と０−５℃で併合した。生成反応混合物を１５−２０℃で４時間撹拌し、減圧蒸発乾固した。残渣をアセトン（２×２５ｍｌ）中に溶解させ、濾過すると固形物（６９ｍｇ）が得られ、この固形物をトリエチルアミン（５ｍｌ）を含むメタノール（１０ｍｌ）と水（１０ｍｌ）との混合物中でアルゴン下室温で１６時間撹拌した。この溶液を蒸発乾固し、水（２０ｍｌ）に再溶解し、再び蒸発乾固させた。この手順を５回繰り返すと粗化合物（２１）（６０ｍｇ）が生じ、次いでこれをフラッシュカラムクロマトグラフイー（シリカゲル、先ず２−プロパノール／水＝５／１、次いで２−プロパノール／水＝３／１）にかけると表題化合物（２１）（１７ｍｇ、１２．５％）を白色固体として与え、この化合物はSakaguchi陽性反応（グアニジン呈色反応）およびビオチン呈色反応陽性を示した。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：872(M+1)+,871(M+)
ｉ．ｒ．ｃｍ-1：3287(br),1651(br).
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：1.22-1.81(m,14H),1.98(s,3H),2.37(m,2H),2.78(d,1H),2.95-3.55(m,7H),3.61-4.16(m,9H),4.39-4.67(m,4H),4.92(dd,1H),5.67(d,1H).
実施例  ８ ５−アセトアミド−７−（６’−ビオチニルアミノ−ドデカノイルアミノヘキシル）−カルバモイル−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−エノピラノソン酸（２２）
Methods in Enzymology,1990 184 664記載のように、カルボニルジイミダゾールを用いビオチニルアミノドデカン酸と化合物（１８）との結合によりこの化合物を調製した。
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：1.28-1.85(m,33H),1.98(s,3H),2.22(m,4H),2.75(d,1H),2.97(dd,1H),3.03-3.28(m,6H),3.49(dd,1H),3.64(dd,1H),4.07(m,1H),4.20(m,1H),4.34(m,2H),4.50(m,2H),5.57(d,1H).
実施例  ９ ５−アセトアミド−７−（６’−ビオチニルアミノ−カプロイル−アミノヘキシル）−カルバモイル−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（２３）
実施例８の記載と同様な条件を用いて、ビオチニルアミノカプロン酸と化合物（１８）との結合によりこの化合物を調製した。
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：1.30-1.85(m,21H),1.99(s,3H),2.24(m,4H),2.76(d,1H),2.98(dd,1H),3.05-3.3(m,7H),3.50(dd,1H),3.66(m,1H),4.07(m,1H),4.21(m,1H),4.37(m,2H),4.52(m,2H),5.58(d,1H).
実施例  １０ ５−アセトアミド−７−（６’−（６”−（６’”−アミノカプロイル）−トリアミノカプロイル）−アミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（２５）の調製
（Ａ）            メチル  ５−アセトアミド−７−｛６’−［６”−（６’”−tert−ブトキシカルボニルアミノカプロイル）−トリ−アミノ−カプロイル］−アミノヘキシル｝−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（２４）の調製
６−［６’−（６”−tert−ブトキシカルボニル−アミノカプロイル）−ジ−アミノカプロイル］−アミノカプロン酸（１５０ｍｇ、０．２６３ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍｌ）溶液中に、カリウムｔ−ブトキシド（３０ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（１５ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）、および引き続いてイソブチルクロロホルメート（４０ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）を順次加えた。全混合物を−１５〜−２０℃で２０分間、アルゴン下に撹拌し、次いでトリエチルアミン（３８ｍｇ，０．３７２ｍｍｏｌ）を含むメタノール（１．５ｍｌ）と水（１．５ｍｌ）との混合物中の化合物（１８）（１４０ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ）溶液と０〜５℃で併合した。生成反応混合物を１５〜２０℃で４時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固した。残渣をアセトン（５０ｍｌ×２）中に溶解し、濾過すると白色固体（空気乾燥後２２４ｍｇ）を与え、これをシリカゲル上でのクロマトグラフイー（酢酸エチル／２−プロパノール／水＝５／２／１）にかけると化合物（２４）（８０ｍｇ、３１．５％）を与えた。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：1068(M+1)+,1067(M+)
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤ3ＯＤ）ｄ1.21-1.72(m,41H),1.99(s,3H),2.18(t,8H),2.92-3.24(m,12H),3.79(s,3H),4.14(dd,1H),4.51-4.78(m,4H),5.19(ddd,1H),5.59(dd,1H),5.92(d,1H).
（Ｂ）  化合物（２５）の調製
化合物（２４）（２９．５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）中に溶解した。この混合物を室温で１時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固した。残渣を水（５ｍｌ）に再溶解し、再度減圧蒸発乾固し、水（２ｍｌ）に再溶解し、凍結乾燥させて白色固形物を形成させた。この固形物をメタノール（１０ｍｌ）、水（１０ｍｌ）およびトリエチルアミン（５ｍｌ）の混合物中に溶解した。生成溶液をアルゴン下に室温で１６時間撹拌し、次いで蒸発乾固した。これを水（１０ｍｌ）に再溶解し、再度蒸発乾固させた。残渣をアセトン（２０ｍｌ×３）、引き続いてエタノール（２０ｍｌ）中で粉砕し、さらに凍結乾燥すると化合物（２５）（１４ｍｇ、５６％）が白色固体として得られ、この固体はSakaguchi反応陽性およびニンヒドリン反応陽性を示した。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：927(M+1)+
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）ｄ1.15-1.69(m,32H),1.90(s,3H),2.11-2.23(m,8H),2.91-3.21(m,12H),3.41-3.70(m,2H),3.85-4.12(m,2H),4.48-4.52(m,2H),4.92(dd,1H),5.58(d,1H).
実施例  １１ ５−アセトアミド−７−｛６’−［６”−（６’”−ビオチニルアミノラプロイル）−トリ−アミノカプロイル］−アミノヘキシル｝−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（２６）の調製
化合物（２４）（７１．４ｍｇ、０．０６６７ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）溶液をアルゴン下、室温で１時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固させた。残渣を水（５ｍｌ）に溶解し、減圧蒸発乾固させた。生成残渣をビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３６ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌ）を含むピリジン（６ｍｌ）中に溶解した。この反応混合物をアルゴン下に、４０〜５０℃で４８時間撹拌し、減圧蒸発乾固した。生成残渣をアセトン（３０ｍｌ）中、室温で４時間撹拌し、次いで濾過した。沈殿をアセトン（１０ｍｌ×２）で洗浄し、空気乾燥すると白色固体（７２ｍｇ）が得られた。この固体をトリエチルアミン（５ｍｌ）を含むメタノール（２５ｍｌ）と水（２５ｍｌ）との混合物中で、アルゴン下に室温で１６時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固した。残渣をクロマトグラフイー（シリカゲル、先ず酢酸エチル／２−プロパノール／水＝５／２／１、次いで２−プロパノール／水＝３／１で行う）にかけると、題記化合物（２６）（３０．４ｍｇ、３９．５％）が白色固体として得られ、このものはSakaguchi反応陽性およびビオチン呈色反応陽性を示した。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：1153(M+1)+
赤外スペクトル：3292,2931,1638,1541cm-1.
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）ｄ（ｐｐｍ）：1.12-1.62(m,38H),1.91(s,3H),2.12(m,10H),2.65(d,1H),2.82-3.15(m,13H),3.30-3.62(m,3H),3.81-4.18(m,3H),4.25-4.56(m,4H),5.51(d,1H).
実施例  １２ ５−アセトアミド−７−｛６’−［６”−（６’”−ヒドラジドスクシニルアミノカプロイル）−トリアンオカプロイル］−アミノヘキシル｝−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸（３０）の調製
無水メタノール（４ｍｌ）中の６−｛６’−［６”−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジド−スクシニル）−アミノプロイル］−ジアミノカプロイル｝−アミノ−カプロン酸（１００ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）溶液中に、カリウムtert−ブトキシド（１６．４ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（１４．７ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）、および引き続いてイソブチルクロロホルメート（２４ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）を順次添加した。全混合物を−１５℃で１２分間撹拌し、次いでこれをトリエチルアミン（１６ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）を含むメタノール（１．５ｍｌ）を水（１．５ｍｌ）との混合物中の５−アセトアミド−７−（６’−アミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソン酸トリフルオ酢酸塩（１１）（７６．６ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）溶液と５℃で併合させた。生成反応混合液を室温で２時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固させた。残渣をアセトン（５０ｍｌ）中に溶解し、濾過した。固形物をアセトン（１０ｍｌ）で洗浄し、次いで空気乾燥した。このものをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、先ず酢酸エチル／２−プロパノール／水＝５／２／１、次いで２−プロパノール／水＝３／１）にかけ、化合物（２９）（６３ｍｇ，４２．５％）を白色固体として得た。
1Ｈ−ｎｍｒ（ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）
1-21〜1.72(m,41H),1.95(s,3H),2.17(m,8H),2.48(AB,4H),3.0〜3.28(m,12H),3.51(dd,1H),3.62(dd,1H),4.13(m,1H),4.17(dd,1H),4.35(dd,1H),4.46(dd,1H),4.98(dd,1H),5.56(d,1H).
化合物（２９）（６０ｍｇ、０．０５２６ｍｍｏｌ）をアルゴン下にトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）中で室温１時間撹拌し、次いで減圧蒸発乾固した。残渣を水（５ｍＬ）に溶解し、次いで減圧蒸発乾固し、次いで凍結乾燥させると化合物（３４）トリフルオロ酢酸塩を白色固体として与えた。これを水（１０ｍＬ）に溶解し、Amberlite IRA-400（OH-）樹脂を用いて処理してトリフルオロ酢酸を除き、濾過した。濾液を蒸発乾固させた。残渣をアセトン（１５ｍｌ）中で粉砕し、次いで冷凍乾燥させたところ題記化合物（３０）（４０ｍｇ、７３％）が白色固体として得られ、これをアルゴン下に保存した。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：1041(M+1)+1042(M+2)+
1Ｈ−ｎｍｒ  （Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）（トリフルオロ酢酸塩）
1.15〜1.68(m,32H),1.93(s,3H),2.18(m,8H),2.52(AB,4H),2.98-3.23(m,12H),3.40〜4.20(m,4H),4.42(dd,1H),4.52(dd,1H),4.92(dd,1H),5.88(d,1H).
実施例  １３ メチル  ５−アセトアミド−７−［６’−（３”−ヒドロキシカルボニルプロピオニル）−アミノヘキシル］−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネート（３２）の調製
無水ピリジン（２．５ｍｌ）中のメチル  ５−アセトアミド−７−［６’−アミノヘキシル）−カルバモイルオキシ−４−グアニジノ−８，９−モノカルボニルジオキシ−２，３，４，５−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノン−２−エノピラノソネートトリフルオロアセテート（１８）（１００ｍｇ、ｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）溶液中に、ジメチルアミノピリジン（２４ｍｇ、０．１９５ｍｍｏｌ）および無水琥珀酸（１９．５ｍｇ、０．１９５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物をアルゴン下に４５℃で２０時間撹拌し、次いで減圧下に蒸発してピリジンを除去した。残渣をメタノール（１０ｍｌ）に溶解し、２Ｎ  ＨＣｌで酸性化してｐＨ２とし、この酸性溶液を蒸発乾固した。生成残渣をフラッシュクロマトグラフイー（先ず酢酸エチル／メタノール＝１０／１、次いで酢酸エチル／２−プロパノール／水＝５／２／１、シリカゲル）にかけ、化合物（３２）（４０ｍｇ、４０％）を得た。
ＭＳ  （ＦＡＢ）：615(M+1)+
1Ｈ−ｎｍｒ  （ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）
1.25〜1.62(m,8H),1.93(s,3H),2.48(AB,4H),2.95〜3.21(m,4H),3.80(s,3H),4.10〜4.30(m,1H),4.50〜4.80(m,3H),5.0〜5.25(m,2H),5.59(dd,1H),5.92(dd,1H).
実施例  １４ インフルエンザウイルスに対する本発明化合物の結合の測定
インフルエンザ  Ａ  ウイルス２種およびインフルエンザ  Ｂ  ウイルス１種を、全ウイルスインフルエンザノイラミニダーゼに結合するこれら化合物の能力を試験するのに用いた。インフルエンザ  Ａ  株はＮＷＳ／Ｇ７０ＣおよびＮＷＳ／Ｔｏｋｙｏであり、かつインフルエンザ  Ｂ  株はＢ／Ｖｉｃ／０２／８７であった。ノイラミニダーゼアッセイは公表された方法（Potier,M.らのAnal.Biochem.,1979 94 287）に従って実施し、かつ測定阻害定数（ＩＣ50）を表３に要約する。
0003753740.tif 000009
実施例  １５ 化合物Ｎｏ．２１を用いた、アビジン被覆ＥＬＩＳＡウエル上へのインフルエンザウイルスの捕捉
９６ウエルELISA  プレートをアビジン（Sigma）溶液（１０μｇ／ｍｌ）を用いて一夜被覆した。次いでプレートウエルをＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩水）−Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液を用いてブロックした。プレートの下２列のそれぞれ全てのウエル中に１および１０μＭで化合物Ｎｏ．２１を加えた。他列の全てのウエル中には化合物Ｎｏ．８（コントロール）を１０μＭで加えた。室温で１時間保温（incubation）後、未結合コンジュゲートを除き、かつプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄した。ＮＷＳ／Ｇ７０Ｃインフルエンザ  Ａ  ウイルス（Ｈ１Ｎ９サブタイプ）を、最初のウエル中で２．５×１０6ウイルス粒子（５×１０7ｐｆｕ／ｍｌに相当）から始め、かつプレートの端から端まで連続２倍希釈で稀釈した。ウイルスを約３０分間保温し、洗浄により未結合ウイルスを除いた。結合ウイルスをポリクロナールウサギ抗血球凝集素抗体と反応させ、結合した抗血球凝集素抗体をヒツジ抗ウサギ抗体−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ａｂ−ＨＲＰＯ）コンジュゲートを用いて各段階で洗浄しながら検出した。ウイルス結合Ａｂ−ＨＲＰＯはＨＲＰＯ基質としてＡＢＴＳ（Sigma）を添加し、約３０分間保温することにより検出した。
化合物Ｎｏ．２１の両濃度（１および１０μＭ）では類似の結果が得られた：すなわち最高ウイルス濃度で強い吸収シグナル、および次いでウイルス希釈につれて減少するシグナルを与え、かくして明瞭にウイルスが捕捉され、かつ試験当たり少なくとも１．６×１０5ｐｆｕまでの検出を可能にした。これに反して、非ビオチニル化コントロール化合物Ｎｏ．８は全てのウイルス濃度で弱く、変化のない吸収のみを示した。
実施例  １６ 化合物Ｎｏ．２１を用いた、ＥＬＩＳＡプレート上のインフルエンザウイルスの検出
約１×１０8ｐｆｕ／ｍｌのウイルス溶液を用いて開始し、ＰＢＳ中のＮＷＳ／Ｇ７０Ｃインフルエンザ  Ａ  ウイルスの連続２倍希釈物をＥＬＩＳＡ（Dynatech）プレート上に直接加え、一夜放置して結合させた（全てのＥＬＩＳＡウエルは５０μｌを含有した）。洗浄後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０でブロックし、次いで化合物２１を別個の２列に１および１０μＭで加え、他の１列には１０μＭでコントロール化合物Ｎｏ．８を加えた。１時間保温後、このプレートを洗浄して未結合化合物を除去し、次いで発色性基質としてのＡＢＴＳを再度使用し、約３０分間保温してストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（Boehringer-Mannheim）を用いてこのウイルスを検出した。
化合物Ｎｏ．２１の両濃度はこのウイルスの検出を可能にし、ウイルス濃度の増加に平行して強さが増加する吸収を与える。ウエル当たり最少約１０5ウイルス粒子が化合物Ｎｏ．２１を用いて容易に検出できた。これに反して、非ビオチンコントロール化合物Ｎｏ．８では、いずれのウイルス濃度でも少しのシグナルも与えなかった。
実施例  １７ インフルエンザウイルスと化合物化合物Ｎｏ．２１との間の複合体の捕捉および検出
ウイルス粒子をＧＧ１６７−ビオチン誘導体を用いて被覆するために、ＮＷＳ／Ｇ７０Ｃインフルエンザ  Ａ  ウイルス溶液（１×１０8ｐｆｕ／ｍｌ）の１０、２．５および０．６２５μｌをＥＬＩＳＡプレートの別々の列の各ウエル中で１時間予備保温した。１μＭから開始して０．００００１μＭへと低減するように化合物２１の半ｌｏｇ10希釈物を加えた。次いでこのウイルス−化合物複合体を、アビジン（実施例１５におけるように）で予備被覆したＥＬＩＳＡプレートに移し、１時間保温して捕捉させた。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ウイルス血球凝集素に対するポリクローナルウサギ抗体を用いて（実施例１５におけるように）捕捉ウイルスを検出した。
最良の結果は化合物Ｎｏ．２１の０．０１μＭ濃度を用いた場合に見いだされ、これにより下が０．６２５×１０5ｐｆｕまでのウイルスの検出が明らかに可能であった。化合物濃度が一層高い場合、遊離の化合物Ｎｏ．２１により、たぶんいくつかのアビジン部位がブロックされるためにシグナルもより弱まるが、一層低濃度（＜０．０００１μＭ）では恐らく全てのウイルス粒子に完全に結合するのには化合物が不充分であることに起因して検出シグナルは同様に弱くなった。
ストレプトアビジン−ＨＲＰＯを用いた結合ウイルスの直接検出も、この場合シグナルのレベルはより低いものの、可能であることが判明した。
実施例  １８ インフルエンザウイルスと化合物Ｎｏ．２６との間の複合体の捕捉と検出
ＧＧ１６７−誘導体化合物Ｎｏ．２６を用いた以外は、実施例１７に記載したと同じ手法に従ったところ、インフルエンザＡの２種のサブタイプであるＮＷＳ／Ｇ７０ＣおよびＮＷＳ／Ｔｏｋｙｏ（Ｈ１Ｎ２）の両方は、２．５×１０5ｐｆｕ／ウエルで存在する場合に容易に検出できることが判った。試験した化合物Ｎｏ．２６の濃度は０．００１ｎＭから１０μＭであり；最良の結果はウイルスの両サブタイプの場合、０．１μＭで得られた。
明瞭化と理解の目的で、本発明を詳細に記載してきたが、この明細書に開示の発明概念の範囲から逸脱する事なしに、ここに記載の態様および方法についての種々の修飾および変更がなし得るであろうことは、当業者にとり明らかであろう。