(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子を有効成分として含有し、同種異系移植におけるグラフト（移植片）に対するレシピエント（宿主）の移植免疫反応を抑制するための移植免疫抑制剤。
【請求項２】
単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子が、ヒト尿、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子産生細胞の培養液、又は単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子遺伝子組換え細胞の培養液から得られるものである請求項１記載の移植免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、皮膚移植等の移植時に問題となるグラフト（移植片）に対する生体の拒絶反応を抑制する移植免疫抑制剤に関する。更に詳しくは、本発明は、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子を有効成分として含有することを特徴とする細胞、組織、臓器等の移植におけるグラフト（移植片）に対するレシピエント（宿主）の移植免疫反応の抑制に有効な新規な移植免疫抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、骨髄細胞に作用して顆粒球及びマクロファージへの分化・増殖を促進する因子であり、顆粒球の増殖を促進する顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球・マクロファージの増殖を促進する単球・マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球及び単球・マクロファージの双方の増殖を促進する顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等に分類されている。
【０００３】
これらのうち、Ｍ−ＣＳＦについては、本発明者及び共同研究者等により、癌免疫補助剤（特開平１−１９３２２７号公報）、血小板減少症治療剤（特開平１−２０７２４４号公報）、造血器疾患治療剤（特開平１−２２１３２２４号公報）、抗悪性腫瘍剤（特開平２−２２５４１８号公報）、悪性腫瘍治療補助剤（特開平２−２６４７２９号公報）、高脂血症治療剤（特開平２−２６４７２８号公報）、骨髄異形成症候群治療剤（特開平３−１７０２１号公報）、大理石骨病治療剤（特開平４−１７８３３４号公報）等の用途が、これまで開発されている。
【０００４】
ところで、細胞、組織、臓器等の移植は、医学上重要な手技である。移植においては、一般に、移し植えられる細胞、組織、臓器等をグラフト（移植片）、グラフトを提供する者をドナー、グラフトを移植される者をレシピエント（宿主）と呼んでいる。
【０００５】
移植は、ドナーとレシピエントとの関係から、
▲１▼一つの個体の一部の組織を、同じ個体の他の部分に移植する自家移植、
▲２▼一つの純系動物群の中でも雌雄も同じ２個体間、即ち、遺伝因子が全く同一と
考えられる２個体間の移植である同系移植、
▲３▼純系以外の同じ種属中の２個体間での移植である同種異系移植、
▲４▼種属の異なる２個体間の移植である異種移植、
の４種類に分類される。
【０００６】
自家移植及び同系移植の場合は、グラフトとレシピエントの遺伝因子が全く同一であり、いわゆる組織適合性抗原が完全に一致しているので、レシピエントはグラフトを異質物とは認めず、自己のものと認知する。従って、異質物の侵入によって生じる抗原抗体反応（即ち、移植免疫反応）は全く惹起せず、移植手技さえ万全であれば、グラフトはレシピエントに永久生着する。
【０００７】
同種異系移植の場合は、たとえ親子間又は兄弟間であっても、レシピエントはグラフトを抗原として認識し、抗体を産生するので、移植免疫反応に基づく拒絶反応により、グラフトは数日後に壞死する。
異種移植の場合は、レシピエントに対するグラフトの異質性は一般に強烈であり、移植後数時間以内にグラフトが壞死することも稀ではない。
【０００８】
一般に、皮膚、肺、腎臓等の臓器を移植する場合は、同種異系移植である。同種異系移植では可能な限り組織適合性のよいグラフトを選択することにより、生着率を向上させることができるが、組織適合性のみで拒絶反応を完全に防止するのは不可能であり、移植の際には細胞性免疫の抑制を主眼として免疫抑制剤が用いられる。
【０００９】
移植時に用いられる主な免疫抑制剤には、化学的免疫抑制剤及び副腎皮質ステロイド剤がある。前者は、更に、アルキル化剤、プリン同族体、葉酸代謝拮抗剤等に分類される。アルキル化剤は、放射線様物質ともいわれるように、Ｘ線照射に類似した細胞障害作用を有し、核酸をアルキル化してその転写及び複製の過程で誤反応を惹起する。プリン同族体は、核酸合成の過程で、リボ核酸の生合成を阻害することにより細胞毒性効果を発揮する。葉酸代謝拮抗剤は、ジヒドロ葉酸レダクターゼを阻害し、テトラヒドロ葉酸の合成を阻害することにより、ＤＮＡ合成を抑制する。このように、化学的免疫抑制剤は、主として免疫反応において重要な役割を演じるリンパ球の増殖過程を抑制するものである。
一方、副腎皮質ステロイドは、リンパ球の増殖過程のみならず、Ｂリンパ球の形質細胞化、抗体産生過程等の免疫応答のあらゆる過程に作用するといわれている。
【００１０】
化学的免疫抑制剤及び副腎皮質ステロイド剤は、非特異的免疫抑制剤であり、移植抗原に対する免疫抑制にとどまらず、骨髄抑制により一般的な免疫能も抑制し、感染に対する抵抗性が減少する。移植患者の死亡例で、その死因として感染症が４０％にも達するのはそのためである。このほか、プリン同族体には肝毒性及び骨髄毒性が、また副腎皮質ホルモンには消化管潰瘍の易発性、創癒合障害等の副作用があり、これらが致命的な合併症となることもある。
【００１１】
最近、新たな免疫抑制剤として、シリンドロカルポン・ルシダム(Cylindrocarpon lucidum)及びトリコデルマ・ポリスポラム(Trichodema polysporum) の代謝産物として得られ、ポリペプチドであるサイクロスポリンＡが知られている［アナレス・オブ・インターナル・メディシン(Annals of Internal Medicine) ，第１０１巻，第５号，第６６７〜６８２ページ，１９８４年］。このサイクロスポリンＡは、ヘルパーＴ細胞からのインターロイキン−２の分泌を、主に抑制することにより免疫抑制作用を示すものと考えられている。サイクロスポリンＡには、既存の骨髄抑制作用がないといわれているが、腎障害及び肝障害を惹起するという副作用が知られている［ジャーナル・オブ・リューマトロジー(Journal of Rheumatology) ，第１８巻，第１０号，第１４８５〜１４８９ページ，１９９１年］。
【００１２】
また、筑波山の土壌から発見されたマクロライド化合物であるＦＫ５０６が、免疫抑制剤として開発されたが［トランスプランテーション(Transplantation) ，第４４巻，第６号，第７３４〜７３８ページ，１９８７年］、その適応は極めて狭く、日本国内では肝移植にのみ認められているのが現状である。
このように、従来、免疫抑制剤が種々開発されているものの、いずれも前記のような問題点を有するものでり、かかる従来技術の状況において、副作用の少ない新たな移植免疫抑制剤の開発が待望されていた。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、従来、骨髄中の幹細胞に作用して特に単球及びマクロファージへの分化・誘導を促進する因子である単球・マクロファージコロニー刺激因子（以下Ｍ−ＣＳＦと記載することがある）が、自家骨髄移植において、その生着率、生存率を改善することは、既に、報告されている（特開平１−２２１３２２４号公報）。しかしながら、このような知見は、あくまで自家骨髄移植に限られたものであって、Ｍ−ＣＳＦが、同種異系移植においてグラフト（移植片）に対する生体の拒絶反応を抑制することは、これまで報告された例はなく、従来、知られていなかった。
【００１４】
本発明者らは、このような状況の中にあって、鋭意研究を行った結果、Ｍ−ＣＳＦが、同種異系移植片に対する移植免疫反応を抑制し、移植片の生着、生存率を改善することを見い出し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明の目的は、副作用の軽減された新規な移植免疫抑制剤を提供することにある。
【００１６】
また、本発明の目的は、同種異系移植におけるグラフト（移植片）に対するレシピエント（宿主）の移植免疫反応の抑制に有効な移植免疫抑制剤を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明は、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子を有効成分として含有し、同種異系移植におけるグラフト（移植片）に対するレシピエント（宿主）の移植免疫反応を抑制するための移植免疫抑制剤に係るものであり、また、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子が、ヒト尿、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子産生細胞の培養液、又は単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子遺伝子組換え細胞の培養液から得られるものである上記移植免疫抑制剤であること、を望ましい態様としてもいる。
【００１８】
次に本発明について詳述する。
本発明に使用するＭ−ＣＳＦの製造法としては、特に制限されるものではないが、例えば、ヒト尿から化学的方法により単離することもでき、また、遺伝子工学的に製造することもできる。具体的には、ヒト尿から化学的方法により単離する方法として、特開昭６３−１９８７００号公報、特開昭６３−２５０４００号公報、特開昭６４−２２８９９号公報、特表昭６２−５０１６０７号公報、遺伝子工学的に製造する方法として、特表平１−５０２３９７号公報等に開示された方法を例示することができる。
【００１９】
前記の方法により製造されたＭ−ＣＳＦは、軟寒天中で哺乳動物の骨髄細胞に作用し、単球・マクローファージ系細胞からなるコロニー形成を促進する活性（以下コロニー刺激活性と記載することがある）を有しており、本発明で使用するＭ−ＣＳＦとしては、これと同様のコロニー刺激活性を有する蛋白質因子であれば使用可能であり、その種類は特に限定されず、一例を示せば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、当該配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部が脱落又は置換したペプチド、当該配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部に他のアミノ酸が挿入又は付加したペプチド等、が好適なものとして例示されるが、これらに限らず、前記コロニー刺激活性を有するものであればよい。また、本発明においては、前記ペプチドの薬理学的に許容し得る誘導体も使用することもできる。
【００２０】
このようにして化学的方法又は遺伝子工学的方法により得られたＭ−ＣＳＦに、必要により、安定剤として、ヒト血清アルブミン、糖類等を含む緩衝液を添加し、Ｍ−ＣＳＦを溶解し、以下、常法により無菌瀘過し、凍結乾燥し、移植免疫抑制剤を製造することができる。尚、ヒト血清アルブミン及び糖類の他に、薬理学的に許容される成分、更には、従来から移植免疫の抑制に使用されている薬剤を添加することもできる。
【００２１】
本発明の移植免疫抑制剤は、例えば、注射用生理食塩水、注射用蒸留水等に溶解し、点滴、静注、皮下注等、適宜の形態において、症状に応じて適宜その有効量を投与することができる。通常、有効投与量は、多くの場合、臨床用量の数倍、数十倍のオーダーである［津田恭介及び野上寿編，「薬効の評価（２）前臨床試験および臨床薬理試験」，第２２２ページ，地人書館，昭和４８年］ことから、本発明の移植免疫抑制剤の投与量は、後記試験結果から、１日、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．０１ｍｇ程度である。
【００２２】
本発明の移植免疫抑制剤は、細胞毒性の極めて強い従来の免疫抑制剤と異なり、元来ヒトの体液中に自然に含まれている天然物であるＭ−ＣＳＦを有効成分としているので、副作用が極めて軽微であるという利点がある。尚、Ｍ−ＣＳＦの急性毒性については、例えば、既に特公平６−１１７０５号公報の実験例１に具体的試験データとして記載してあるとおり、Ｃ57ＢＬ系雄性マウスを用いた試験において、ＬＤ50が腹腔内投与では４ｇ／ｋｇ体重、静脈内投与では２ｇ／ｋｇ体重、皮下投与では４ｇ／ｋｇ体重であることが確認されている。
【００２３】
次に試験例を示して本発明を詳述する。
試験例１
この試験は、コロニー刺激活性を測定するために行った。
１）試料の調製
実施例１と同一の方法により得たＭ−ＣＳＦを用いた。
【００２４】
２）試験方法
Ｍ−ＣＳＦ０．１ｍｌを、０．３％（以下濃度の表示は、重量による値である）寒天、２０％牛胎児血清（フロー・ラボラトリー社製）及びマウス骨髄細胞［Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本チャールズ・リバー社から入手）の大腿骨骨髄から無菌的に採取］１×１０5 個を含むMcCoy's 5A培地（フロー・ラボラトリー社製）１ｍｌと滅菌シャーレ中で混合し、７．５％炭酸ガス通気下、３７℃で７日間培養した。培養終了後、５０個以上の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数を計測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、１単位は１コロニーを形成させるのに必要なＭ−ＣＳＦの量である。また、比活性は、Ｍ−ＣＳＦ蛋白質１ｍｇ当たり形成されるコロニー数（単位）である。
【００２５】
３）試験結果
この試験の結果、実施例１と同様な方法で得たＭ−ＣＳＦは、１×１０8 単位／ｍｇ蛋白質の比活性を有していた。また、形成されたコロニーをヘマトキシリン−エオジン染色して形態学的に分類した結果、９５％以上のコロニーが単球及びマクロファージからなっていた。
【００２６】
試験例２
この試験は、Ｍ−ＣＳＦの移植免疫抑制効果を調べるために行った。
１）試料の調製
実施例と同一の方法により得たＭ−ＣＳＦを用いた。
【００２７】
２）試験方法
８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６，（Ｂ６）マウス（日本チャールズ・リバー社から入手）をレシピエントとし、８週齢のオスＢ６．Ｃ−Ｈ−２bm1 （ｂｍ１２）マウス（日本チャールズ・リバー社から入手）をドナーとして、ｂｍ１２マウスの背部皮膚をＢ６マウスの側胸部に移植した。このような移植マウス１５匹を、１群５匹からなる３群にわけ、第１群には、移植免疫抑制剤としてＭ−ＣＳＦを１０ｍｇ／ｋｇ、第２群には、同１ｍｇ／ｋｇ、及び第３群には、生理食塩水を、移植後５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１日目にそれぞれそれぞれ静脈内投与し、移植後４０日目までグラフトの生着、生存率を観察した。
【００２８】
３）試験結果
この試験の結果は、図１に示すとおりである。図１において、縦軸及び横軸は、それぞれ移植片生着率及び移植後日数を示し、図中実線、破線、及び一点鎖線は、それぞれ第１群、第２群及び第３群を示す。
図１から明らかなように、第１群では、５例が１５日間移植片が生着し、４例が１９日間、３例が２８日間、２例が３２日間、１例が３８日間移植片が生着した。これに対して、第３群では、５例が１１日間移植片が生着し、４例が１２日間、３例が１４日間移植片が生着し、１７日で全例の移植片が脱落した。
一方、第２群では、拒絶反応による移植片脱落の進行に遅延が認められ、４例に１５日間の生着が認められた。
【００２９】
この結果から、Ｍ−ＣＳＦが移植免疫を抑制し、１日当たり少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で移植片の生着率の改善に有効であることが認められた。尚、Ｍ−ＣＳＦ及びマウスの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３０】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を更に詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（ヒト尿からの移植免疫抑制剤調製）
健康なヒトの尿（１，０００ｌ）をｐＨ８．５に調整し、沈殿物を瀘別し、分画分子量50,000ダルトンの限外瀘過膜 (アミコン社製。Ｈ１０×５０) で濃縮及び脱塩し、濃縮液のｐＨを７．０に調整し、密封容器中で６０℃、１０時間加熱殺菌し、のち遠心分離（５，０００×ｇで３０分間) して沈殿を除去した。次いで０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ファルマシア社製）と混合し、これに吸着させ、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）及び０．１５Ｍ食塩添加０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で順次洗浄し、のち０．２５Ｍ食塩添加０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出させ、該溶出液を限外瀘過膜 (アミコン社製。Ｈ１０Ｐ１０）で濃縮した。
【００３１】
セファクリールＳ−３００（登録商標。ファルマシア社製）を充填したカラム（直径２０ｃｍ、長さ８０ｃｍ）を用い、１Ｍ硫酸アンモニウム添加緩衝液（ｐＨ７．２）で該濃縮液をゲル瀘過し、分子量範囲７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を上記１Ｍ硫酸アンモニウム添加緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したフェニル・セファロース４Ｂ（登録商標。ファルマシア社製) カラム（直径１０ｃｍ、長さ２０ｃｍ）に吸着させ、次いで０．５Ｍ硫酸アンモニウム添加緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出させた。
【００３２】
溶出液を限外瀘過膜（アミコン社製。Ｈ１０Ｐ１０）で濃縮し、ＴＳＫＧ−３０００ＳＷ（東洋曹達社製）カラム（直径２．５ｃｍ、長さ６０ｃｍ）を用いて高速液体クロマトグラフィーにかけ、分子量範囲７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を得た。この画分を再度限外瀘過膜（アミコン社製。Ｈ１０Ｐ１０）で濃縮し、Ｈｉ−Ｐｏｒｅ２１４ＴＰ（登録商標。バイダック社製）逆相カラム（直径２．５ｃｍ、長さ６０ｃｍ）で０．１％トリフルオロ酢酸（和光純薬工業社製）を含むアセトニトリル１〜１００％（ｐＨ２．０）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、Ｍ−ＣＳＦを溶出させ、溶出液を凍結乾燥した。この方法を反復し、Ｍ−ＣＳＦ約５０ｍｇを得た。
得られたＭ−ＣＳＦの比活性を試験例１と同一の方法で測定した結果、１．０×１０8 単位／ｍｇ蛋白質であった。
【００３３】
得られたＭ−ＣＳＦを、１％マンニトール（和光純薬工業社製）を含む０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有リン緩衝液（ｐＨ７．２）に２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ニトロセルロース系無菌瀘過膜を装着した瀘過除菌装置（ミリポア社製）を用いて除菌し、予め１８０℃で２時間乾熱滅菌したガラス製バイアル瓶に１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥し、のちバイアル瓶を密封し、移植免疫抑制剤を調製した。
【００３４】
実施例２
（遺伝子組換え細胞培養液からの移植免疫抑制剤調製）
純化した遺伝子組換えＭ−ＣＳＦをウサギに免疫して得た抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で透析し、濃度を２０ｍｇ／ｍｌに調整し、該抗体溶液２００ｍｌを予め蒸留水及び０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した１００ｇのフォルミル−セルロファイン（生化学工業社製）に添加し、室温で２時間攪拌し、水素化シアノホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）７００ｍｇを加え、更に１６時間攪拌し、フォルミル−セルロファインと抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を結合させ、抗体結合支持体を調製した。０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液で洗浄し、更に、水素化シアノホウ素ナトリウム５００ｍｇを含むトリス緩衝液２００ｍｌを加え、室温で４時間攪拌し、未反応基を不活化し、抗体結合支持体を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液で十分洗浄した。この抗体結合支持体は、支持体１ｇ当り３２．６ｍｇの抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を結合していた。
【００３５】
特表平１−５０２３９７号公報に開示されたＭ−ＣＳＦを発現し得る遺伝子組換え細胞（ＣＨＯ細胞。ジェネティクス・インスティチュート社から入手)培養液１０ｌを限外瀘過濃縮機で濃縮し、脱塩し、ＤＥＡＥ−セルロースに吸着させ、非吸着の夾雑物質を除去し、０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出し、該溶出液に塩化ナトリウムを加えて０．５Ｍの濃度に調整し、Ｍ−ＣＳＦを含有する溶液を調製した。このＭ−ＣＳＦの比活性は、３×１０6 単位／ｍｇであった。
【００３６】
前記抗体結合支持体１００ｇに、このＭ−ＣＳＦ含有溶液（全量５００ｍｌ）を添加し、１０℃以下で、一夜攪拌し、バッチ式クロマトグラフィー処理を行った。攪拌後、ガラスフィルターで瀘過し、抗体結合支持体を集め、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液で該抗体結合支持体を十分に洗浄した。洗浄後、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２．５）５００ｍｌを加え、１０℃で１時間攪拌し、Ｍ−ＣＳＦを溶出した。溶出液のｐＨを７．０に調整し、限外瀘過膜で濃縮及び脱塩し、Ｍ−ＣＳＦ画分を得た。
【００３７】
この画分をＨｉ−Ｐｏｕｒ２１４ＴＰ（バイダック社。直径２．２、長さ２５ｃｍ）の逆相カラムで０．１％トリフルオロ酢酸（和光純薬工業社製）を含むアセトニトリル０〜１００％（ｐＨ２．０）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、Ｍ−ＣＳＦを集め、凍結乾燥し、Ｍ−ＣＳＦ約２０ｍｇを得た。
得られたＭ−ＣＳＦの比活性は、試験例１と同一の方法により測定した結果、１．９×１０8 単位／ｍｇ蛋白質であった。
【００３８】
得られたＭ−ＣＳＦを、１％マンニトールを含む０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有リン緩衝液（ｐＨ７．２）に、１ｍｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ濃度で添加し、ニトロセルロース系無菌瀘過膜を装着した瀘過除菌装置（ミリポア社製）を用いて除菌し、予め１８０℃で２時間乾熱滅菌したガラス製バイアル瓶に、１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥し、のちバイアル瓶を密封し、移植免疫抑制剤を調製した。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳記したように、本発明は、単球・マクロファ−ジコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を有効成分として含有することを特徴とする移植免疫抑制剤に係るものであり、本発明によって奏せられる主たる効果は次のとおりである。
１）本発明の移植免疫抑制剤は、グラフト（移植片）に対するレシピエント（宿主）の移植免疫反応の抑制に有効である。
２）本発明の移植免疫抑制剤は、移植免疫反応を抑制し、グラフト生着、生存率の向上に有効である。
３）本発明の移植免疫抑制剤は、従来の免疫抑制剤と比較して、副作用が少ないという利点がある。
４）本発明の移植免疫抑制剤は、細胞、組織、臓器等の同種異系移植におけるグラフト（移植片）に対する生体の移植免疫反応を抑制するのに有用である。
【配列表】
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0003760321.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｍ−ＣＳＦのグラフト（移植片）生着率に及ぼす影響に関する試験結果の一例を示す。
【図１】
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