(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドに結合し得る３〜２４個の塩基を含む第１結合ドメイン、および第２カップリング部分に結合し得る第１カップリング部分を含む第１オリゴヌクレオチド・アナローグ；
標的ポリヌクレオチドに結合し得る３〜２４個の塩基を含む第２結合ドメイン、および該第１カップリング部分に結合し得る第２カップリング部分を含む第２オリゴヌクレオチド・アナローグ；
を含み、該第１および第２カップリング部分はオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナローグ、金属イオン結合部分、金属イオンからなる群から選択される非共有結合対部分を含み、該第１及び第２カップリング部分は、標的ポリヌクレオチドの非存在下に連結して、アンチセンス分子を形成する、組成物。
【請求項２】
前記第１オリゴヌクレオチド・アナローグ及び前記第２オリゴヌクレオチド・アナローグがそれぞれ独立して、リボ核酸、デオキシリボ核酸、DNAホスホロチオエート、RNAホスホロチオエート、2'-O-ヒドロカルビルリボ核酸、2;-O-ヒドロカルビルDNA、2'-O-ヒドロカルビルRNAホスホロチオエート、2'-O-ヒドロカルビルDNAホスホロチオエート、2'-F-ホスホロチオエート、2'-F-ホスホジエステル、2'-メトキシエチルホスホロチオエート、2-メトキシエチルホスホジエステル、デオキシMMI、2'-O-ヒドロカルビルMMI、デオキシ-メチルホスホネート、2'-O-ヒドロカルビルメチルホスホネート、モルホリノ、4'-チオDNA、4'-チオRNA、ペプチド核酸、リボピラノシル、3'-アミデート、デオキシ3'-アミデート、および2'-O-ヒドロカルビル3'-アミデートからなる群から選択される骨格部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１オリゴヌクレオチド・アナローグおよび前記第２オリゴヌクレオチド・アナローグがそれぞれ独立して、天然のヌクレオシド塩基、ジアミノプリン、２−アミノプリン、プロピニル−Ｃ、プロピニル−Ｕ、イノシン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、４−ニトロベンズイミダゾール、ネブラリン、Ｐ及びＫからなる群から選択される複数の塩基を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アンチセンス分子がヌクレアーゼ認識領域を含み、ヌクレアーゼがRNase H、RNase PおよびRNase Lからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
１以上の結合ドメイン及びカップリング部分が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド及びポリエステルからなる群から選択されるフレキシブルリンカーによって結合される、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
フレキシブルリンカーが１〜１２炭素原子（および／又は他の骨格原子）の長さである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１及び第２カップリング部分が互いにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナローグを含んでいる、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記第１および第２カップリング部分がヒスチジン・オリゴマーおよび金属イオン結合部分を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
標的RNA分子を開裂する方法であって、
標的RNA分子を提供すること；
標的RNA分子を請求項１〜８のいずれかに記載の組成物に接触させること；及びRNA標的物を開裂し得るRNaseの存在下に該標的RNA分子及び前記組成物をインキュベートすること、を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、有機化学および生物学的アッセイの分野に関する。より詳細には、本発明は、最適なアンチセンス配列、およびオリゴヌクレオチド・アナローグの最適化されたライブラリーを決定する方法および組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
アンチセンス技術は、DNAおよび／またはRNAの転写または翻訳が、標的核酸に結合するオリゴヌクレオチドを用いて調節され得るという知見に基づく。ワトソン-クリック塩基対を利用することにより、標的核酸に非常に高度の特異性を有するアンチセンス分子をデザインすることができる。標準的(「天然の」)塩基および骨格のみを有するオリゴヌクレオチドは、RNaseHを活性化することによる遺伝子発現を有効にダウンレギュレーションするのに充分なエネルギーで結合するために、一般に少なくとも17個の塩基を含まなければならない。
【０００３】
しかしながら、公知の配列のDNAまたはRNAが与えられても、最適に有効なアンチセンス分子をデザインすることは今だに困難である。これは、核酸が、インビボで様々な二次および三次構造の形成に従い、そしてしばしばコイル状になり、スーパーコイル状になり、折り畳まれ、および／またはタンパク質によって覆い隠されてしまうからである。標的配列の幾つかの部分は、アンチセンス分子による結合およびハイブリダイゼーションを非常に受けやすく、一方、標的配列の他の部分は本質的に隠れているか又は利用し得ない。代表的には、20〜50個のオリゴヌクレオチドが、遺伝子当り１以上の活性なアンチセンス部位を見つけるためにテストされる。
【０００４】
プレmRNAまたはmRNA配列内でアンチセンス部位を選択する標準的方法は、大規模な標的物確認プログラムへのアンチセンスの迅速で高い処理量用途には不充分である。オリゴヌクレオチドは、それぞれの標的遺伝子内でそれぞれの標的部位について、「カスタム合成」されなければならない。約100,000個のヒト遺伝子のそれぞれを首尾良く標的化するのに、何百万または何十億という慣用されているオリゴヌクレオチドの常備のライブラリーが必要とされる。何百万というアンチセンス・オリゴヌクレオチドの指定されたライブラリーは、現在利用可能な化学的、物理的、および組織化されたツールを超えている。
【０００５】
（発明の概要）
アンチセンスおよびリボザイム配列を調製しテストする新しい方法が、現在、発明された。
【０００６】
本発明の１つの局面は、２つのオリゴヌクレオチド・アナローグを含む組成物であり、それぞれは、結合ドメインおよびカップリング部分を有し、ここで、結合ドメインは標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、カップリング部分は標的分子の非存在下に互いにカップリングし得る。
【０００７】
本発明の他の局面は、式R1-L1-X-A-Y-L2-R2を有する化合物であり、式中、R1は、RNAに結合し得るオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド・アナローグであり；R2は、RNAに結合し得るオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド・アナローグであり；L1およびL2は、それぞれ独立して連結部分または結合であり；XおよびYはそれぞれ独立してカップリング部分であり；およびAは、共有結合、金属イオン、および非共有結合からなる群から選択される連結を含み、ここで、該化合物は、標的ポリヌクレオチドに結合するときヌクレアーゼを活性化または開裂を触媒し得る。
【０００８】
本発明の他の局面は、標的ポリヌクレオチドを開裂する方法であり、該方法は、標的RNA分子を提供すること；標的RNA分子を第１オリゴヌクレオチド・アナローグ（標的ポリヌクレオチドの第１領域に結合し得る第１結合ドメイン、および第２カップリング部分に結合し得る第１カップリング部分を含む）、および第２オリゴヌクレオチド・アナローグ（該標的ポリヌクレオチドの第２領域に結合し得る第２結合ドメイン、および該第１カップリング部分に結合し得る第２カップリング部分を含む）と接触させること、ここで、該第１および第２結合ドメインは該標的RNA分子に同時に結合し得る；およびRNA標的物を開裂し得るRNaseの存在下に該標的RNA分子、第１アナローグおよび第２アナローグをインキュベートすること、を包含する。
【０００９】
本発明の他の局面は、標的RNA分子を開裂する方法であり、該方法は、標的RNA分子を提供すること；標的RNA分子を第１オリゴヌクレオチド・アナローグ（標的ポリヌクレオチドの第１領域に結合し得る第１結合ドメイン、および第２カップリング部分に結合し得る第１カップリング部分を含む）、および第２オリゴヌクレオチド・アナローグ（該標的ポリヌクレオチドの第２領域に結合し得る第２結合ドメイン、および該第１カップリング部分に結合し得る第２カップリング部分を含む）と接触させること、ここで、該第１および第２結合ドメインは該標的RNA分子に同時に結合し得る；およびRNA標的物を開裂し得るRNaseの存在下に該標的RNA分子、第１アナローグおよび第２アナローグをインキュベートすること、を包含する。
【００１０】
本発明の他の局面は、アンチセンス・ライブラリーであり、該ライブラリーは、１セットの第１オリゴヌクレオチド・アナローグ（それぞれの第１アナローグは第１カップリング部分および第１結合ドメインを含み、該第１結合ドメインは第１骨格および標的核酸と塩基対を形成し得る複数の第１塩基を含む）；および１セットの第２オリゴヌクレオチド・アナローグ（それぞれの第２アナローグは該第１カップリング部分に特異的に結合し得る第２カップリング部分および第２結合部分を含み、該第２結合ドメインは第２骨格および標的核酸と塩基対を形成し得る複数の第２塩基を含む）を含む；ここで、第２アナローグにカップリングされた第１アナローグからなるアンチセンス・アナローグは標的核酸に結合してヌクレアーゼ基質として機能し得る。
【００１１】
本発明の他の局面は、アンチセンス前駆体化合物、式2(R1-L1-X)を有する複数の化合物および、式3(Y-L2-R2)を有する複数の化合物であり、ここで、R1およびR2は、それぞれ独立してmRNAに結合し得るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナローグである；L1およびL2は、それぞれ独立して連結部分または結合である；XおよびYは、それぞれ独立してカップリング部分である；ここで、式２および式３の該化合物は、標的ポリヌクレオチドに結合するとき、カップリングしてヌクレアーゼを補給または活性化し得る化合物を形成し得る。
【００１２】
本発明の他の局面は、リボザイム前駆体化合物のライブラリーであり、式４(GG-R1-CUGAUGA-L1-X)を有する複数の化合物および式5(Y-L2-GAA-R2)を有する複数の化合物を含み、ここで、R1およびR2は、それぞれ独立してRNAに結合し得るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナローグである；L1およびL2は、それぞれ独立して連結部分または結合である；XおよびYは、それぞれ独立してカップリング部分である；ここで、式４および式５の該化合物は、カップリングしてリボザイムを形成し得る。
【００１３】
本発明の他の局面は、所与のmRNAに関する最適なアンチセンス部位を決定する方法であり、複数の第１オリゴヌクレオチド・アナローグを選択すること、該第１アナローグは第１カップリング部分および該mRNAに相補性である第１結合ドメインを含む；それぞれの第１オリゴヌクレオチド・アナローグのための第２オリゴヌクレオチド・アナローグを選択すること、該第２アナローグは該第１カップリング部分を結合し得る第２カップリング部分、および該第１結合ドメインが相補性である部位に対して近位の位置で該RNAに相補性である第２結合ドメインを含む；該第１カップリング部分と該第２部分をカップリングして複数のアンチセンス・プローブを提供すること；RNaseの存在下に該mRNAを該アンチセンス・プローブと接触させて開裂産物を形成すること；およびどのアンチセンス・プローブが該開裂産物に対応するかを決定すること、を包含する。
【００１４】
本発明の他の局面は、所与の標的RNAに関する最適なリボザイム開裂部位を決定する方法であり、複数の第１オリゴヌクレオチド・アナローグを選択すること、該第１アナローグは、第１カップリング部分および該標的RNAに相補的である第１結合ドメインを含む；それぞれの第１オリゴヌクレオチド・アナローグのための第２オリゴヌクレオチド・アナローグを選択すること、該第２アナローグは該第１カップリング部分に結合し得る第２カップリング部分、および該第１結合ドメインが相補的である部位に対して近位の位置で該RNAに相補的である第２結合ドメインを含む；該第１カップリング部分と該第２部分をカップリングして複数のリボザイムを提供すること；該標的RNAを該リボザイムと接触させて開裂産物を形成すること；およびどのリボザイムが該開裂産物に対応するか決定すること、を包含する。
【００１５】
本発明の１つの目的は、実行可能な数の予め合成されたコンポネントを用いて、アンチセンスまたはリボザイム分子を迅速に調製する方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の目的は、要求があり次第、アンチセンスまたはリボザイム分子を形成するために好適なコンポネントのライブラリーを提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、所与の標的のための最適なアンチセンスまたはリボザイム配列を決定する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、標的ポリヌクレオチド配列が知られていないアンチセンスまたはリボザイム配列を決定する方法を提供することである。
【００１９】
（詳細な説明）
定義
本明細書中で使用される用語「アンチセンス」は、遺伝子発現を干渉するようデザインされ、特定の所望の標的ポリヌクレオチド配列を認識またはそれに結合し得る分子を指す。アンチセンス分子は、代表的には(必須ではない)、RNA分子上に存在する標的配列に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナローグを含む。そのような結合は、ポリメラーゼの作用、RNAプロセッシングおよびヌクレアーゼの補給および／または活性化を妨害することを含む、様々な手段によって翻訳を干渉する。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「リボザイム」は、ポリヌクレオチドを触媒的に開裂し得るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナローグを指す。
【００２１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、DNA、RNA、またはDNA／RNAハイブリッドからなる分子を指す。
【００２２】
用語「オリゴヌクレオチド・アナローグ」は、例えば、骨格および一連の塩基を有するオリゴヌクレオチド様の構造を含む分子を指し、ここで、骨格および／または１以上の塩基は、天然に生じるDNAおよびRNAに見い出される以外の構造であり得る。「非天然の」オリゴヌクレオチド・アナローグは、天然のDNAまたはRNAで見い出されない少なくとも１つの塩基または骨格構造を含む。例示的なオリゴヌクレオチド・アナローグは、DNA、RNA、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸("PNA"s)、メトキシエチルホスホロチオエート、デオキシイノシンまたはデオキシ5-ニトロインドールを含むオリゴヌクレオチド、などを限定なしに含む。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「オリゴマー」は、結合ドメインおよび少なくとも１つのカップリング部分を含む、本発明のコンポネントを指す。オリゴマーは、必要に応じてフレキシブルリンカーにより、カップリング部分に結合され得る。オリゴマーは、式Y-L1-R-L2-Xによって包括的に示され得、ここで、Rは結合ドメインであり、L1およびL2はそれぞれ独立して任意のフレキシブルリンカーであり、Xはカップリング部分であり、およびYは任意の第２カップリング部分である。オリゴマーは、さらに、検出可能な標識を含み得る。個々のオリゴマーは、短すぎて活性を発揮し得ないが、カップリングされたときには活性を発揮し得る。
【００２４】
用語「ライブラリー」は、連結されて様々な異なるアンチセンス分子を形成し得るコンポネントの集合を指す。本発明の実施では、ライブラリーは、第１セットのオリゴマーが、好ましくは付加により自然に、第２セットのオリゴマーにカップリングし得るようにデザインされた少なくとも２セットのオリゴマーを含む。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「骨格」は、一般に、定められた間隔で結合された複数の塩基を支持し得る直線的分子を指す。好ましくは、骨格は、支持塩基と標的ポリヌクレオチドの塩基との間のハイブリダイゼーションを促す幾何学的形状における塩基を支持する。
【００２６】
用語「非天然の塩基」は、A、C、G、T、およびU以外の塩基を指し、同義性および普遍性塩基ならびに天然塩基または他の非天然塩基に特異的に結合し得る部分を含む。
【００２７】
用語「普遍的塩基」は、任意の塩基を置換し得る部分を指す。普遍的塩基は、ハイブリダイゼーションに寄与する必要はなく、ハイブリダイゼーションを著しく減じるべきでない。例示的な普遍的塩基は、イノシン、5-ニトロインドールおよび4-ニトロベンズイミダゾールを限定なしに含む。
【００２８】
用語「同義性塩基」は、任意のプリン、または任意のピリミジンと塩基対を形成し得るが、プリンおよびピリミジン両方ではない部分を指す。例示的な同義性塩基は、6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2]オキサジン-7-オン("P"、ピリミジン模倣体)および2-アミノ-6-メトキシアミノプリン("K"、プリン模倣体)を限定なしに含む。
【００２９】
用語「標的ポリヌクレオチド」は、例えば、生細胞で見い出されるもののような、アンチセンス分子がそれと結合または反応することが意図されるDNAまたはRNAを指す。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「極性」は、ストランドまたは直線的分子の配向を指す。例えば、5'→3'は一方の極性を構成し、3'→5'は反対の極性を構成する。全ての直線的分子が、固有の定められた極性を有するわけではない。
【００３１】
用語「フレキシブルリンカー」は、結合ドメインをカップリング部分に共有結合的に付着させ得る部分を指す。好適なフレキシブルリンカーは、代表的には、少なくとも１種または２種の原子の鎖での直線的分子であり、より代表的には、１〜１２炭素原子(および／または他の骨格原子)の長さの有機ポリマー鎖である。例示的なフレキシブルリンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステルなどを含む。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「カップリング部分」は、他のカップリング部分と反応して２つの分子を結合し得る反応性の化学的基を指す。本発明で使用されるカップリング部分は、任意の標的分子の非存在下に結合し得るべきであり、好ましくは(ライブラリーが調製され使用される条件下で)、第１カップリング部分が第２カップリング部分とのみ反応し、任意の他の分子の部分または他の第１カップリング部分とは反応しないように選択される。同様に、第２カップリング部分は、第１カップリング部分とのみ反応するが、任意の他の第２カップリング部分(または任意の他の分子の部分)と反応すべきではない。例示的なカップリング部分は、相補性オリゴヌクレオチド(好ましくは、それらが標的ポリヌクレオチドのいずれの部分ともハイブリダイズしないように選択される)、相補性オリゴヌクレオチド・アナローグ(特に、天然塩基とハイブリダイズしない塩基を使用する)、および求電子または求核性部分、例えば、アルキルハライド、アルキルスルホネート、活性化エステル、ケトン、アルデヒド、アミン、ヒドラジン、スルフヒドリル、アルコール、ホスフェート、チオホスフェート、Michael付加受容体、ジエノフィル、ジエン、ジポラロフィル、ニトリル、チオセミカルバジド、イミデート、イソシアネート、イソチシアネート、アルキンおよびアルケンを含む。アンチセンス構築物が２超のコンポネント部分を含む場合(例えば、３または４分子がカップリングされて最終構築物を産生する場合)、カップリング部分は、好ましくは、第１および第２のカップリング部分が、互いとのみ反応し、第３および第４カップリング部分が互いとのみ反応するなどのように選択される。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「ステム(stem)」は、２つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナローグのカップリング部分をカップリングすることによって形成される構造を指す。
【００３４】
用語「活性」は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされたときに、標的ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を干渉する本発明のアンチセンス分子の能力を指す。好ましくは、干渉が生じるのは、アンチセンス分子が、ハイブリダイズされたときヌクレアーゼを補給するよう機能し、および／またはヌクレアーゼ基質として機能するからである。「干渉」は、任意の検出可能な程度の阻害を含む。
【００３５】
用語「ヒドロカルビル(hydrocarbyl)」は、炭素および水素からなり、１〜約12個の炭素原子を含む部分を指す。例示的なヒドロカルビル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、2-ブチル、t-ブチル、ヘキシルなどを限定なしに含む。
【００３６】
一般的方法
オリゴヌクレオチド・アナローグの予め形成されたライブラリーが提供され、該ライブラリーは、１セットの第１オリゴヌクレオチド・アナローグおよび１セットの第２オリゴヌクレオチド・アナローグを含み、それらアナローグは、それぞれの第１オリゴヌクレオチド・アナローグを第２オリゴヌクレオチド・アナローグにカップリングさせてアンチセンス分子を形成することを提供するカップリング部分を有する。オリゴヌクレオチド・アナローグは、カップリングされたときに、標的核酸にハイブリダイズされたときデュプレックス(ds)RNAまたはRNA／DNAハイブリッドを認識するエンドヌクレアーゼのための基質として作用するように、選択される。結合ドメインは、アンチセンス分子が標的ポリヌクレオチドに結合し、ヌクレアーゼを補給および／または活性化し得ることを確実にするよう充分に長い必要がある。しかしながら、完全なライブラリーに必要とされる分子の数は、示された配列の長さに指数関数的に増加する。
【００３７】
アンチセンス分子を２以上の断片に概念的に分離することによって、必要とされる複数の候補的アンチセンス分子を合成するよりも、包括的アンチセンス・ライブラリーが前もって調製され得る。全ての可能な17量体のオリゴヌクレオチドの完全なライブラリーは、４個の天然塩基を用いると、417(または約1.7×1010)分子からなるであろう。少なくとも２つのコンポネントとしてアンチセンス分子を提供することにより、例えば、８量体のライブラリーおよび９量体のライブラリーが必要に応じて迅速に組立てられ、必要とされるライブラリーのサイズは48+49つまり327,650分子に減少される。ライブラリーの要求された複雑さは、１以上の普遍的または同義性塩基を幾つかの天然塩基で置き換えることによってさらに減少される。従って、例えば、９量体ライブラリーが５個の普遍的塩基その後に４個の天然塩基からなる場合は、コンポネントの数は44(256)に減少し、トータルのライブラリー・サイズは、48+44、約66,000分子に減少する。ライブラリーの複雑さは、アンチセンス分子を３以上のセグメントに分割することによっても、減少され得る。例えば、全長の18量体のライブラリーは、418分子つまり約6.9×1011分子を要求するであろう。しかしながら、18量体を形成するために組立てられる第１、第２および第３の６量体からなるライブラリーは、現在の並行合成技術で達成され得るサイズである44+46+46、つまり12,288分子を含むことのみを必要とする。もし、例えば、中間の６量体のセットが普遍的塩基の６量体で置き換えられるなら、ライブラリーの複雑さは、３分の１だけ減少する。このサイズのライブラリーを合成し維持し、長いオリゴマーのカスタムで新規な合成の必要性なしに、任意の所望のアンチセンス分子を迅速に組立てることが可能である。従って、本発明の１つの実施態様は、少なくとも２セットのオリゴマーを含むライブラリーであり、ここで、オリゴマーは各セットから選択され、必要に応じてカップリングされる。
【００３８】
ライブラリー・サイズは、乏しい結合能力により、乏しいアンチセンス分子として機能すると予測される特定の配列、例えば、AT-リッチな分子；または人工的構成物、例えば、AGリッチな領域、ポリC、(GGN)n、(GGGN)n、およびTATモチーフを回避することによって、さらに減少され得る。
【００３９】
図１は、オリゴヌクレオチド・アナローグにハイブリダイズしたRNA 101を有するRNA-アナローグ・コンプレックス100の図式的図解であり、該オリゴヌクレオチド・アナローグは、第１「アンカー」ドメイン102、およびRNAの隣接領域110および111にハイブリダイズする第２「クリーバー(cleaver)」ドメイン103を含む。「クリーバー」ドメインは、ヌクレアーゼ基質としても機能し得る。第１および第２ドメインは、第１および第２カップリング部分106および107を介して互いに連結し、該部分は、フレキシブルリンカー104および105それぞれによって、第１および第２の結合ドメイン102および103に連結している。
【００４０】
図２は、複数のオリゴマーを有するRNAアンチセンス分子コンプレックス200を表している。結合ドメイン205、206、207は、カップリング部分、ここでは相補性オリゴヌクレオチド208、209、210、211によって互いにカップリングされ、該相補性オリゴヌクレオチドは、フレキシブルリンカー212によって結合ドメインに連結されている。標的領域202、203、204は、隣接し、連続し、または僅かにスペースを有して離れ得る。結合ドメインは、等しい長さである必要はない。
【００４１】
少なくとも１つの結合ドメインは、約３〜約24塩基、好ましくは約6〜約8塩基を含む。所望されるならば、１ドメインは、殆どの標的特異性を提供し得、他方、他のドメインは、主として、ヌクレアーゼ基質を提供する。例えば、ドメインのそれぞれは、単一の６量体配列とのみ結合する１セットの６量体結合ドメイン、および４個の塩基のみが配列特異的であり残りの塩基は同義性または普遍性である１セットの８量体結合ドメインを有するライブラリーが構築され得る。第１セットは、可能な46(4096)個の配列(望ましくない配列を除去する前に)を含み、他方で、第２セットは44(256)個の配列(望ましくない配列を除去する前、４個の「特定の」塩基および４個の普遍的塩基と仮定する)を含む。必要に応じて、第１および第２セットから選択されるオリゴマーを結合することにより、4,352分子のみを用いて、410(106)個の異なる配列を生じ得る。対照的に、14量体の完全なライブラリーは、414(2.7×108)個の分子を要求するであろう。
【００４２】
オリゴマーは、標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いて、合成され得る。例えば、AccuTag反応器(Irori、ラホヤ(La Jolla)、カリフォルニア州(CA))により、プールおよびスプリット方法を用いて、組合せ合成技術を使用し得る。オリゴヌクレオチドは、固体支持体上で合成され、貯蔵され、溶液中に開裂され、必要なときまで貯蔵され得る。オリゴヌクレオチドは、合成され、開裂可能なリンカーによって固体支持体に結合され得る。所望されるならば、細胞培養条件下で(即ち、リンカーは、細胞を傷害することなしに、細胞の存在下に開裂され得る)開裂され得るリンカーを使用し得る。好適なリンカーは、光に不安定リンカー(Glen Research)、β脱離、酸化的開裂、および酵素活性(例えば、RNAases、エステラーゼ、プロテアーゼなど)によって開裂されるリンカーを含む。このことにより、乾燥状態で、オリゴマーを貯蔵および分配し、それらをin situでカップリングすることが可能になる。
【００４３】
オリゴマー合成は、或るライブラリー・コンポネントに対しては3'から5'方向であり、他のコンポネントに対しては5'から3'方向で為され得る。カップリング部分がオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナローグである場合、カップリング部分を最後に合成して、その結果、合成失敗は、不完全ステムを有する分子をもたらす(従って、カップリングし得ない)ことが好ましい。
【００４４】
結合ドメインに使用されるオリゴマーは、天然の核酸(DNAおよび／またはRNA)にハイブリダイズする分子を生じ得る任意の骨格を使用し得る。好適な骨格の例は、ホスホジエステルおよびデオキシホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびデオキシホスホロチオエート、2'-O-置換ホスホジエステルおよびデオキシ・アナローグ、 2'-O-置換ホスホロチオエートおよびデオキシ・アナローグ、モルホリノ、ペプチド核酸(Nielsenら、US5,539,082)、2'-O-アルキルメチルホスホネート、3'-アミデート、MMI、アルキルエーテル(Cookら、US5,223,618)およびCookら、US5,378,825、Sanghviら、US5,489,677、Cookら、US5,541,307に記載される他のものなどを含む。RNase活性が所望される場合、RNase基質として機能し得る骨格が、オリゴマーの少なくとも一部に使用される。
【００４５】
好適な塩基は、制限なしに、下記のものを含む：
0003855117.tif 000002
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0003855117.tif 000004
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カップリング部分は、共有結合または非共有結合的な相互作用のいずれか、例えば非共有結合対によって、異なるセットからの２つのオリゴマーを連結するように選択される。カップリング部分は、好ましくは、ライブラリー中の１セットのオリゴマー上に存在するカップリング部分が、互いにはカップリングしないが、他のセットのオリゴマー上のカップリング部分とは容易に結合するように選択され、オリゴマーが意図される配向でカップリングすることを確実にする。１つの実施態様では、カップリング部分は、相補性オリゴヌクレオチドである。相補性領域は、幾つかの非相補性塩基によって分離され、固有のフレキシブルリンカーを提供し得る。相補性オリゴヌクレオチドは、結合ドメインに、同じ極性または配向で結合し得、或いは、逆の極性または配向で提供され得る。例えば、結合ドメインが5'-3'配向である場合、相補性オリゴヌクレオチド・カップリング部分は、3'-5'配向に結合し得、こうして、カップリング部分が、標的ポリヌクレオチドへの結合に不注意に関与する(または干渉する)機会を減らす。他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、天然塩基とハイブリダイズしない非天然塩基を含む。
【００４６】
カップリング部分は、例えば、縮合、付加環化、または求核求電子付加によって、共有結合的な化学的相互作用の結果としても連結し得る。１つの実施態様では、１つのカップリング部分は、スルフヒドリル基であり得、他方、相補性カップリング部分は、スクシニミジル基である。他の実施態様では、１つのカップリング部分は、アミンまたはヒドラジン部分であり、他方、相補性カップリング部分は、カルボニル基(アルデヒド、ケトン、または活性化エステル)である。他の実施態様では、１つのカップリング部分は、マレイミジル基であり、他方、相補性カップリング部分は、スルフヒドリル基である。他の実施態様では、１つのカップリング部分は、アリール-ジヒドロキシボロン基であり、該基は、リボース上の隣接するOH基に結合する。
【００４７】
【化１】
0003855117.tif 000008
【００４８】
他の実施態様では、オキサゾール誘導体は、１つのカップリング部分を形成し、他方、その相補体は、T. Ibataら、Bull Chem Soc Japan (1992)65:2998-3007に記載されるように、ジケトトリアゾールを含む。
【００４９】
【化２】
0003855117.tif 000009
【００５０】
２超のセットのオリゴマーを有するライブラリー(即ち、アンチセンス分子が、互いにカップリングされた３以上のオリゴマーを含む場合)では、カップリング部分は、互いに直行するように選択され、オリゴマーが意図された順序で組立てられることを確実にする。例えば、第１および第２オリゴマー間のカップリング部分は、スルフヒドリル基およびマレイミド基であり得、他方、第２および第３オリゴマー間のカップリング部分は、ジエン基およびジエノフィル基であり得る。好適なカップリング部分は、アルキルハライド、アルキルスルホネート、活性化エステル、ケトン、アルデヒド、アミン、ヒドラジン、スルフヒドリル、アルコール、ホスフェート、チオホスフェート、Michael付加受容体、ジエノフィル、ジエン、ジポラロフィル、ニトリル、アルキン、チオセミカルバジド、イソチオシアネート、イソシアネート、イミデート、およびアルケンを限定なしに含む。
【００５１】
フレキシブルリンカーは、必要に応じて、標的核酸の隣接領域に結合する２つの結合ドメイン間へのカップリング部分の挿入から生じるかもしれないストレスを解放するように使用される。フレキシブルリンカーは、好ましくは、カップリング部分のバルクが、コンプレックス上のハイブリダイゼーション、RNase認識、および／またはRNase活性を干渉しないように、柔軟で、親水性で、充分な長さであるように選択される。それぞれの結合ドメインおよびそのカップリング部分の間でフレキシブルリンカーを用いることが好ましいが、必須ではない。少なくとも結合ドメインとRNase基質として機能するカップリング部分との間でリンカーを使用することが好ましく、それぞれのオリゴマー中でフレキシブルリンカーを使用することが、より好ましい。リンカーは、結合ドメインの末端塩基に連結され得、或いは、末端から１以上の塩基に連結され得る。好適なフレキシブルリンカーは、代表的には、少なくとも１または２個の原子の鎖の直線分子であり、より代表的には、長さとして１〜12炭素原子(および／または他の骨格原子)の有機ポリマー鎖である。フレキシブルリンカーは、標的配列に相補性ではない更なる塩基も含む。例示的なフレキシブルリンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステルなどを含む。
【００５２】
個々のオリゴマーは、インビトロでまたはインビボで組立てられ得る。カップリング部分は、好ましくは、自然に、細胞内環境の条件下で連結するように選択される。従って、別々のオリゴマーを個々に、インビボでの薬剤形成のために投与し得る。或いは、投与する前に、オリゴマーをインビトロで結合し得る。さらに、取込み速度を増加するために、トランスフェクション助剤、例えば、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクターセなどを使用し得る。
【００５３】
本発明の様々な構築物の活性は、例えば、下記の実施例に記載される標準的アッセイ法によって、測定され得る。一般に、公知の配列を有する標的ポリヌクレオチドを調製し、該標的を、コンプレックスを形成するように標的配列と結合するように選択された本発明のオリゴマーと接触させ、該コンプレックスを所望の標的ヌクレアーゼを用いて開裂させ、産物を分析して開裂が起きたかどうか決定し得る。
【００５４】
本発明のライブラリーは、前もって調製され得る。標的ポリヌクレオチドに関する配列が供給されるなら、該配列に対応するオリゴマーは、ライブラリーから選択され、混合されて複数のアンチセンス剤を形成させ、該剤は、標的を発現する複数のテスト細胞に適用される。該剤は、個々に又は混合して、適用され得る。活性は、開裂された標的ポリヌクレオチドを直接的に検出することによって(例えば、標識プローブへのハイブリダイゼーション、PCRによる増幅、ゲル上での可視化など)、または宿主細胞表現型上での効果(例えば、選択されたタンパク質の発現または発現の欠如)によって測定され得る。
【００５５】
或いは、標的配列が知られていない場合、複数の薬剤を組立て、どの配列が活性剤を生じるか経験的に決定し得る。例えば、公知の細胞によって発現される未知の配列のタンパク質を仮定してみる。例えば、ライブラリー中のそれぞれのセット中のオリゴマーの全ての組合せからなる、本発明の複数のアンチセンス分子を提供し得る、
0003855117.tif 000010
アンチセンス分子があまりにも多すぎて、それぞれの組合せを個々に調べられない場合、テストのためにアンチセンス分子をプールすることが好ましいかもしれない。例えば、第１セットが、約4,000個の６量体配列を含み(全塩基は非同義性であり、非普遍性である)、第２セットが約250の８量体配列(４個の普遍性塩基および４個の特異的塩基を有する)を含む場合、完全なライブラリーは、約106個の個々の組合せを含むであろう。これらの分子は、例えば、それぞれ個々の８量体配列を、全６量体配列の混合物にカップリングさせることによって、容易にプールされ得、4,000組合せの250プールを生じる。それぞれのプールは、続いて、非同定タンパク質を発現することが公知の細胞に対してテストされ、タンパク質発現の調節をもたらすプールが同定される。活性なプールは、さらに、亜分類され(例えば、「活性な」８量体を200個の６量体の個々の混合物とカップリングさせて、200組合せの200プールを形成する)、活性なアンチセンス分子が同定され、他の手段で検査されるまで、反復してテストされる。
【００５６】
本発明のオリゴマーおよび方法は、リボザイム、およびリボザイムのライブラリーを生じるためにも適用され得る。リボザイム活性に関する最小配列要件は、F. Benselerら、J Am Chem Soc(1993)115:8483-84に記載され、本明細書中に参考として援用される。ハンマーヘッド・リボザイム分子は、基質ポリヌクレオチドにハイブリダイズする末端ドメイン("I"および"III")、触媒部分、およびステムループ構造("II")を含み、ステムループ構造は、分子を互いに保持し得る様々な他の構造によって置き換えられ得る。これらの分子は、本発明のオリゴマーから組立てられ、IIドメインステムループを、上記のようなカップリング部分と置き換え得る。従って、例えば、第１セットとして、配列5'-GGNNNNNCUGAUGA-cp1(配列番号：１)を有する複数のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナローグ(ドメインI、触媒性部分の第１部分、および第１カップリング部分)、 および第２セットとして、配列5'-cp2-GAANNNNN(配列番号：２)を有する複数のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド・アナローグ(第２カップリング部分、触媒性部分の第２部分、およびドメインIII)のライブラリーを調製し得、ここで、塩基"N"は標的基質にハイブリダイズするように選択される。これらのリボザイムは、公知配列の標的ポリヌクレオチドの最適な開裂部位を決定するために前もって組立てられ得、或いは、非公知配列の標的を阻害する有効な分子を決定するために上記の混合様式で組立てられ得る。
【００５７】
実施例
下記の実施例は、当業者の指針として提供され、本発明をいかなる方法でも限定することは意味しない。全ての産物は、製造業者の指示によって使用され、実験は、他に記載がなければ、標準的条件下で行われる。
【００５８】
全ての試薬は、乾燥している(<30ppm水)。DNA合成試薬(酸化剤、テトラゾール、キャッピング試薬、プロピルリンカー支持体、2'-デオキシ、2'-OMe、およびスペーサー9アミダイト)は、Glen Research(スターリング, バージニア州)から購入した。溶液中アミダイトは、Perseptive BiosystemsからのTrap-paks上で乾燥する。保護されたアミノ酸、PyBOP、およびクロロトリチルクロリド樹脂は、NovaBiochemから得た。
【００５９】
実施例１
(クリーバー合成-ハイブリダイゼーション・モチーフ)
(A)ジメトキシトリチル基(DMT)保護されたプロピル・リンカーで予め誘導体化された固体支持体を、Perseptive Expediteシンセサイザーと適合性のDNAシンセサイザー・カラムに置いた(１μモルの出発プロピル・リンカー)。DMT基を、脱ブロック試薬(ジクロロメタン(DCM)中2.5%ジクロロ酢酸)を用いて除去した。RNA合成用の標準的プロトコールを、2'-OMeβ-シアノエチルアミダイト(乾燥アセトニトリル中0.1M)に適用した。アミダイトを、テトラゾール(乾燥アセトニトリル中0.45M)で活性化した。カップリング時間は、代表的には、2'-OMeアミダイトに関して15分間までであった。クリーバー・オリゴヌクレオチドのステム部分を合成するために、2'-OMeホスホナイト中間体を、酸化剤(THF/ピリジン/水 68/20/2中0.02Mヨウ素)で処理した。それぞれの酸化工程の後、任意の残りの非カップリング5'-OH基上にアセチル基を置くキャッピング工程を、２つのキャッピング試薬の混合物(CAP A=THF中無水酢酸、およびCAP B=THF中N-メチルイミダゾール)処理によって導入した。様々なアミダイトを用いてサイクルを15回繰返して、所望の配列を得た。スペーサー９(Glen Research, カタログ番号10-1909-90)は、手動カップリング・プロトコールを用いて、導入した。スペーサー９を、２回カップリングさせて、適切なカップリングを確実にした。手動カップリングは、オリゴヌクレオチドの第１部分を有する支持体を含むカラムを、脱ブロック溶液を含むシリンジに結合することによって、行なった。全てのオレンジ色が消失するまで、溶液を通過させた。カラムを、乾燥アセトニトリル(3x10ml)で洗浄した。100μlのアクチベーターを含む１つのシリンジを、カラムの一端に結合し、100μlのアミダイト(0.1M溶液)を含む他のシリンジを、カラムの他端に結合した。シリンジを二者択一的に突入して、アクチベーターおよびアミダイトの混合物を、支持体上で前後に駆動した。アミダイトをカップリングする手順を、繰返した。次に、支持体をアセトニトリル(10ml)で洗浄し、支持体を酸化剤溶液(3ml)で処理した。続いて、支持体を再びアセトニトリル(10ml)で洗浄し、キャッピング溶液(新しく混合された、cap Aおよびcap Bの等量混合物)を支持体上を通過させた。支持体を、乾燥アセトニトリル(10ml)で洗浄した。スペーサー９のトリチル基を、脱ブロック溶液で除去し、カラムをシンセサイザー上に置く前に、支持体をアセトニトリル(10ml)で洗浄した。続いて、デオキシホスホロチオエートのセグメントを合成した。これは、2'-デオキシ-β-シアノエチルホスホルアミダイトを、スペーサー９リンカーにカップリングすることによって為された。Expediteの標準的カップリング・サイクルを使用した。2'-OMeに関する上記のサイクルへの例外は、カップリング時間が典型的により短く、Beaucage硫化試薬(Glen Research, カタログ番号40-4036-10)を、ヨウ素酸化剤の代わりに使用してホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合を生じたことであった。トリチル基を、最後の塩基上に残留させた。支持体を、55℃で濃NH4OH中で16時間、処理した。溶液を、スピードヴァック上で濃縮し、残渣を、100μlの0.1Mトリチルアンモニウムアセテート("TEAA")水溶液中に溶解した。これを、HPLCカラム(C-18、Kromasil、5μm、直径4.3mm、長さ250mm)に適用し、CH3CN勾配(溶媒A:0.1M TEAA，溶媒Ｂ:0.1M  TEAAおよび50%アセトニトリル)で、30分かけて1 ml/分流速で溶出した。80%超純粋な産物の分画を、プールし濃縮した。得られた残渣を、水中80%酢酸中に溶解してトリチル基を除去し、逆相カラムに再度適用し、上記のように精製した。90%超の純度を含む分画をプールし、濃縮した。
【００６０】
(B)RNaseLを補給するのに有用なオリゴヌクレオチドを、上記(A)に記載されるように、スペーサー９後で使用されるデオキシアミダイトを2'-OMeホスホルアミダイトで置換して調製した。得られたオリゴは、スペーサーの3'側で2'-OMeジエステル部分を、スペーサーの5'側上で2'-OMeホスホロチオエートを有する。オリゴ2'-5'アデノシンに結合したリンカーを、Torrenceら、US5,583,032およびUS5,677,289に記載されるように、オリゴの5'末端に結合し、両方の文献とも本明細書中に参考として援用される。産物を、Torrenceらに記載されるように精製する。
【００６１】
(C)ローダミン標識したクリーバー：トリチル基を最後の塩基から除去し、その塩基に保護されたアミンリンカー(Perkin-Elmerカタログ番号402872)をカップリングしたことを除いて、上記(A)のように、ローダミン標識したクリーバーを合成した。オリゴヌクレオチドの脱保護は、上記(A)に記載のように行なった。オリゴヌクレオチドを、10M NH4OAc中に溶解し、EtOHを加えて70%エタノール溶液とし、オリゴヌクレオチドを沈殿させた。オリゴヌクレオチドをペレット化し、ペレットを100mM NaHCO3中に溶解した。ローダミンのイソチオシアネート誘導体(Molecular Probesカタログ番号X-491)を加え、混合物を４時間攪拌した。混合物を、上記(A)のように精製した。
【００６２】
実施例２
(アンカー合成-ハイブリダイゼーション・モチーフ)
(A)スペーサー("9")(3'-5'を合成する)の前に加えられる2'-OMeアミダイトを、Beaucage試薬で酸化してホスホロチオエート結合を形成することを除いて、上記の実施例1(A)に記載されるように、オリゴヌクレオチドを調製した。2'-OMeアミダイトは、スペーサー９結合の後で使用し、ヨウ素酸化剤で酸化して、ホスホジエステル結合を生じる。得られたオリゴヌクレオチドを、実施例１でのように精製した。
【００６３】
(B)フルオレセイン標識したアンカー：トリチル基を最後の塩基から除去し、その塩基に保護されたアミンリンカー(Perkin-Elmerカタログ番号402872)をカップリングしたことを除いて、上記(A)のように、フルオレセイン標識したアンカーを合成した。オリゴヌクレオチドの脱保護は、上記(A)のように行なった。オリゴヌクレオチドを、10M NH4OAc中に溶解し、EtOHを加えて70%エタノール溶液とし、オリゴヌクレオチドを沈殿させた。オリゴヌクレオチドをペレット化し、100mM NaHCO3中に溶解した。フルオレセインのイソチオシアネート誘導体(Molecular Probesカタログ番号F-1907)を加え、混合物を４時間攪拌した。混合物を、(A)に記載のように精製した。
【００６４】
実施例３
(ピラノシルRNAステムを有するクリーバー)
2'-OMeβ-シアノエチルアミダイトをピラノシルRNAモノマーで置き換えることを除いて、上記の実施例１に記載のように、クリーバー・オリゴヌクレオチドを調製した。合成および脱保護条件は、Pitschら、Helv Chimica Acta(1993)76:2161-2183に記載されるように使用した。
【００６５】
実施例４
(ピラノシルRNAステムを有するアンカー)
2'-OMeモノマーおよびホスホジエステル合成条件をピラノシルRNAモノマーおよびスペーサー９リンカー後の合成条件で置き換えることを除いて、上記の実施例２に記載のように、アンカー・オリゴヌクレオチドを調製した。精製を、実施例２に記載されるように行なった。
【００６６】
実施例５
(クリーバー合成-ハイブリダイゼーション・モチーフ)
ヒスチジン６合成：乾燥CH2Cl2(DCM)中2-クロロトリチルクロリド樹脂の懸濁液に、充分なジメチルアセトアミドとともにN-α-Fmoc-N-π-t-ブトキシメチル-L-ヒスチジン(0.6当量、Fmoc-His(Bum)-OH)を加え、溶解性を与えた。ジイソプロピルアミン(４当量)を加え、混合物を強く30分間攪拌した。産物を、濾過して、樹脂を、3X DCM/MeOH/DIPEA(17:2:1)で洗浄し、３回のDCM洗浄、２回のDMF洗浄、さらに２回のDCM洗浄、最後に２回のMeOH洗浄をした。樹脂を、KOH上で真空で乾燥し、過剰のMeOHを除去した。ヒスチジンのローディングを、DMF中20%ピペリジンを用いてFmocを放出することによって、分光光度的に測定した。最初のFmocを、DCM/DMA中5%ピペリジン(1:1)で10分間、その後、DMA中20%ピペリジンで15分間Fmoc-ヒスチジン樹脂を処理して、除去した。遊離アミンを、DMA中Fmoc-His(Bum)-OH(2.5当量)、PyBOＰ(2.5当量)、およびDIPEA(5当量)で処理した。カップリングを30分間続けて、その後、樹脂を濾過しDMAで洗浄した。Fmocを、再びDMA中20%ピペリジンを用いて除去し、カップリングサイクルをさらに３回繰返し、樹脂結合His６量体を生じた。６量体を、樹脂から除去し、Bum保護基を95%水性トリフルオロ酢酸を用いて除去した。産物を、RP-HPLC(Kromasil C18, 5μm, 直径4.3mm, 250mm長)により、50分間の溶媒Aから溶媒Bへの勾配(A:0.1% TFA/H2O; B:CH3CN/H2O/TFA 90/10/0.1)を用いて、精製した。純度>90%の分画をプールし、スピードバックによって濃縮した。構造を、陽イオン質量分析[M+H]802によって確認した。
【００６７】
Z-ACPIDの合成：Z-(アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸(Z-ACPID)を、Hochuliら、J Chromatog(1987)411:177-84の手順に従って合成した。
【００６８】
ACPIDの合成：1:3 H2O:EtOH中Z-保護NTA(2.0g)の懸濁液を、混合物が透明になるまで、加熱した。これに、10% Pd/C(2.0g)および20mlのシクロヘキセンを加えた。混合物を、還流下に２時間加熱した。Pd/Cを濾過し、濾過物を真空で濃縮し、固体フォームを生じた。構造を、陰イオン質量分析[M-H]261によって確認した。収量は、900mgであった。
【００６９】
ACPID誘導体化されたクリーバー：ジメトキシトリチル基(DMT)保護されたプロピル・リンカーで予め誘導体化されていた固体支持体を、Perseptive Expediteシンセサイザー(１μモルの出発プロピル・リンカー)と適合性であるDNAシンセサイザー・カラムに置く。DMT基を、脱ブロック試薬(ジクロロメタン中2.5%ジクロロ酢酸)を用いて、除去する。DNA合成に関する標準的プロトコールを、3'O-DMT-5'-O-β-シアノエチルアミダイト(乾燥アセトニトリル中0.1M、<30ppm H2O)に適用する。アミダイトを、テトラゾール(乾燥アセトニトリル中0.45M、<30ppm H2O)を用いて、活性化する。ホスホナイト中間体を、Beaucage試薬を用いて処理し、ホスホロチオエート結合を形成する。それぞれの酸化工程の後、任意の残りの非カップリング3'-OH基上にアセチル基を置くキャッピング工程を、２つのキャッピング試薬の混合物(CAP A：THF中無水酢酸およびCAP B：THF中N-メチルイミダゾール)を用いて処理することによって、導入する。サイクルを、様々な塩基を用いて12回繰返し、所望の配列を得る。最後の3'-OHを、チオール・モディファイアー(チオール・モディファイアーC6 S-S、Glen Research 10-1936)にカップリングし、該モディファイアーは、オリゴヌクレオチド上に保護ジスルフィドを置く。DMTを、DCAを用いて除去する。支持体を、過剰のトリス-カルボキシエチルホスフィン(TCEP、Pierceカタログ番号20490)を用いて処理し、洗浄して、過剰のTCEPを除去する。得られたスルフヒドリルを、過剰のスクシニミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB、Pierceカタログ番号22315)を用いて処理する。支持体を洗浄して、過剰のSMPBを除去する。得られたNHSエステルを、過剰のACPID((アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸)を用いて処理する。次に、得られた金属キレート化オリゴヌクレオチド複合体を洗浄して、過剰のACPIDを除去する。支持体を、55℃で16時間、濃水酸化アンモニウム中で処理する。溶液を、スピードバック上で濃縮し、残渣を、100μl水性0.1 Mトリエチルアンモニウムアセテートに溶解する。これを、HPLCカラム(C-18、Kromasil、5μm、直径4.3mm、250mm長)に適用し、アセトニトリル勾配(溶媒A：0.1M TEAA；溶媒B：0.1M TEAAおよび50%アセトニトリル)で、30分間 1ml／分の流速で溶出する。純度90％超の分画を、プールし濃縮する。
【００７０】
His6誘導体化アンカー：ジメトキシトリチル基(DMT)保護されたプロピル・リンカーで予め誘導体化されていた固体支持体を、Perseptive Expediteシンセサイザー(１μモルの出発プロピル・リンカー)と適合性であるDNAシンセサイザー・カラム中に置く。DMT基を、脱ブロック試薬(ジクロロメタン中2.5%ジクロロ酢酸)を用いて、除去する。RNA合成に関する標準的プロトコールを、5-O-DMT-2'-OMe-3'-O-β-シアノエチルアミダイト(乾燥アセトニトリル中0.1M濃度、<30ppm H2O)に適用する。アミダイトを、テトラゾール(乾燥アセトニトリル中0.45M、<30ppm H2O)を用いて、活性化する。カップリング時間は、代表的には、2'-OMeアミダイトに関しては、15分間までである。ホスホナイト中間体を、Beaucage試薬を用いて処理し、ホスホロチオエート結合を形成する。それぞれの酸化工程の後、任意の残りの非カップリング5'-OH基上にアセチル基を置くキャッピング工程を、２つのキャッピング試薬(CAP A：THF中無水酢酸およびCAP B：THF中n-メチルイミダゾール)を用いて処理することによって、導入する。サイクルを、様々な塩基を用いて８回繰返し、所望の配列を得る。最後の3'-OHに、チオール・モディファイアー(チオール・モディファイアーC6 S-S、Glen Research 10-1936)にカップリングし、該モディファイアーは、オリゴヌクレオチド上に保護ジスルフィドを置く。DMTを、DCAを用いて除去する。支持体を、過剰のトリス-カルボキシエチルホスフィン(TCEP、Pierceカタログ番号20490)を用いて処理し、洗浄して、過剰のTCEPを除去する。得られたスルフヒドリルを、過剰のスクシニミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB、Pierceカタログ番号22315)を用いて処理する。支持体を洗浄して、過剰のSMPBを除去する。得られたNHSエステルを、過剰のヒスチジン６量体と反応する。次に、得られたオリゴヒスチジン・オリゴヌクレオチド複合体を、洗浄して、過剰のヒスチジン６量体を除去する。支持体を、55℃で16時間、濃水酸化アンモニウム中で処理する。溶液を、スピードバック上で濃縮し、残渣を、100μl水性0.1M  トリエチルアンモニウムアセテートに溶解する。これを、HPLCカラム(C-18、Kromasil、5μm、直径4.3mm、250mm長)に適用し、アセトニトリル勾配(溶媒A：0.1M TEAA；溶媒B：0.1M TEAAおよび50%アセトニトリル)で、30分間 1ml／分の流速で溶出する。純度90％超の分画を、プールし濃縮する。
【００７１】
His６誘導体化クリーバー：ヒスチジン６量体を使用してAPCIDの代わりにNHSエステルに複合体化することを除いて、上記のACPIDクリーバーと同じ様式でオリゴヌクレオチドを合成する。
【００７２】
ACPID誘導体化アンカー：APCID分子を使用してヒスチジン６量体の代わりにNHSエステルに複合体化することを除いて、上記のヒスチジン６アンカーと同じ様式でオリゴヌクレオチドを合成する。
【００７３】
His６クリーバー・オリゴヌクレオチドへのACPIDアンカー・オリゴヌクレオチドの連結：ACPIDアンカー・オリゴヌクレオチドを、10当量のNiSO4の0.1N溶液で処理する。混合物を、G-25ゲル濾過スピン・カラムに通して、過剰のニッケルを除去する。His６クリーバーの溶液を、ニッケル付加ACPIDアンカー・オリゴヌクレオチドに加える。His６ニッケル・キレートを介するアンカーとクリーバーとの連結は、ポリアクリルアミドゲル(19%)で確認する。
【００７４】
His６アンカー・オリゴヌクレオチドへのACPIDクリーバー・オリゴヌクレオチドの連結：ACPIDクリーバー・オリゴヌクレオチドを、10当量のNiSO4の0.1N溶液で処理する。混合物を、G-25ゲル濾過スピン・カラムに通して、過剰のニッケルを除去する。His６アンカーの溶液を、ニッケル付加ACPIDアンカー・オリゴヌクレオチドに加える。His６ニッケル・キレートを介するアンカーとクリーバーとの連結は、ポリアクリルアミドゲル(19%)で確認する。
【００７５】
普遍的塩基を含むクリーバーの合成：天然塩基を修飾されたモノマーで置き換え、上記の実施例１に記載されるように、普遍的塩基(5-ニトロインドール、イノシン)を含むオリゴヌクレオチドを、合成した。
【００７６】
実施例６
(アッセイ)
材料：分泌されるアルカリ性ホスファターゼ(SEAP)の一部をコードするdsDNAフラグメントを調製するために、下記のプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用した：
P3(配列番号：３)        5'-cgaaattaaatcgactcactat-3'
P3.1(配列番号：４)       3'-gctttaattatgctgagtgatatcccgaagcttagcgcttaagcgggtggtacgacgacgacgacgacgacgacccggac-5'
P4(配列番号：５)        3'-tagggtcaactcctcctcttgg-5'
P5(配列番号：６)              3'-tacgacgacgacgacgacgacgacccggactccgatgtcgagagggacccgtagtagggtcaactcctcctcttgg-5'
これらのプライマーは、配列(配列番号：７)5'-gggcttcgaatcgcgaattcgcccaccatgctgctgctgctgctgctgctgctgctgaggctacagctctccctgggcatcatcccagttgaggaggagaaccを有するSEAP RNAフラグメント(1〜102)に基づいている。
【００７７】
PCR増幅は、製造業者(Life Technologies、カタログ番号10198-018)に推奨される反応条件下で行なった。プライマーp3.1およびP5を10nMで使用し、他方、プライマーP3およびP4を0.50μMで使用した。PCRプログラムは、94℃で5分間、35サイクルの52℃で30秒間、72℃で1分間、94℃で45秒間、その後72℃で10分間であった。
【００７８】
続いて、SEAP dsDNAを、RiboMaxTMラージスケール(large Scale)RNAキット(Promega、カタログ番号P1300)を用いて、ssRNAに転写した。SEAP DNA濃度は、30μg/mLであった。転写反応は、DNase Iを加えて、37℃で15分間インキュベートし、停止した。DNAフラグメントおよび遊離ヌクレオチドを、EtOH/NaOAc中で沈降して除去し、70%EtOHで洗浄した。RNAを、RNase H活性アッセイ中で用いるために、再懸濁して約２μMに希釈した。
【００７９】
アッセイ：テスト・オリゴヌクレオチド(それぞれ20μM)、SEAP RNA(2μMの溶液10μl)、およびTris/EDTA緩衝液(10mM Tris-HCl, pH7.4, 1 mM EDTA, "TE", 2μlに等しい)を、500μlの薄壁反応試験管に加え、３〜５分間40℃でインキュベートし、熱的平衡に到達させた。RNase H緩衝液(10X: 200mM Tris-HCl, pH7.4-7.5, 1000mM KCl, 100mM MgCl2.6H2O, 0.5mM DTT, 25% w/v スクロース)、RNase H(0.4〜0.6U, Promegaカタログ番号M4281)、および水(20μLに等しい)を混合し、カクテルを形成し、３〜５分間40℃でインキュベートした。続いて、８μlのカクテルを各反応試験管に加え、できるだけ速く混合して冷却を防いだ。反応は、MJ Research PCT-100温度コントローラー中で40℃で30分間インキュベートした。反応は、20μl FDEサンプル緩衝液(90% v/vホルムアミド, 10% v/v 10X TBE緩衝液, 0.5% w/vブロモフェノールブルー, 25mM EDTA)(1X TBE: 89mM Tris塩基, 89mMホウ酸, 2mM EDTA, pH8.0)を、各反応に加え、90℃で3〜5分間加熱することによって停止した。
【００８０】
検出：それぞれのサンプル(8〜10μl)を、変性15%ポリアクリルアミドゲル上に200ボルトで約１時間、或いは、色素フロントがゲルの底に達するまで、ランした。ゲルを、電気泳動カセット、8cm x 8cm x 1mm(Novex、カタログ番号NC2010)にランした。使用の直前に、ゲルを注いだ。簡単に述べると、非ポリマー性変性ゲルミックス(10ml)を、真空で完全に脱気し、10%過硫酸アンモニウム(35μl, BioRad)およびTEMED(12μl, BioRad)と混合し、各カセットに注いだ。ポリメリゼーション後、ゲルを、電流がゲル当り4〜5mAで安定化するまで、250-300ボルトでプレ電気泳動した。
【００８１】
ゲル中の核酸バンドを、1X TBE中にCyberGoldTM(Molecular Probes, カタログ番号S-11494)の1:10,000希釈物に5〜10分間ゲルを浸漬し、さらに5〜10分間1X TBE中に浸漬し、短波長UVトランシルルミネーター上で照射することによって、可視化した。結果は、CyberGREENTMフィルターおよびPolaroid Type 667 3000 ASA白黒フィルムを装填したPolaroid MP-4カメラを用いて、CyberGoldTMフルオレセンスを写真に撮ることにより、記録した。
【００８２】
デュプレックスDNAラダー(20bpおよび100bp、GenSura、サンディエゴ)を、サイズ標準として用いた。標準ラダーは、ゲル上にロードする前には加熱せず、変性されず、変性および非変性ゲルの両方中にデュプレックスDNAフラグメントとしてランした。
【００８３】
バント・シフト：ゲルバンド・シフトを、アンカー／クリーバー・ペアを用いて行ない、RNA標的の非存在下に、オリゴヌクレオチドの互いの高い親和性を実証した。
【００８４】
様々なアンカーおよびクリーバー・オリゴヌクレオチドを、1X RNase H緩衝液、15%グリセロール、および6% FDE中で混合し、60℃で30秒間加熱した。それぞれのオリゴヌクレオチドの最終濃度は、6.6μMであった。室温に冷却後、サンプルを、1M尿素および1X TBEを含む非変性15%(19:1)アクリルアミドゲル上で直接的にランした。バンド・シフト実験に関する非変性ゲルを、非変性ゲルミックスを変性ゲルミックスに換えて、変性ゲルと同じように調製し、ランし、可視化した。
【００８５】
蛍光的にタッグされたオリゴヌクレオチド1015および1016(1015=ローダミン, 1016=フルオレセイン、およびペア1000/1016, 1015/1010, 1015/1012, 1015/1013, 1015/1014, および1015/1016)を含む相補性クリーバー／アンカーデュプレックスは、非変性のストリンジェントな条件下で、ゲルシフト分析により、標的RNAの非存在下に互いに効率的にハイブリダイズすることを実証した。コンポネントを、表１に示す。デュプレックス形成は、サイズ標準と比較した、ゲルの強い移動性シフトによって確認した。
【００８６】
【表１】
0003855117.tif 000011
【００８７】
ここで、"ACGT"はPS DNAを示し、"ACGT"は2'-OMe RNAを示し、"acgt"は2'-OMe PS RNAを示し、"9"はGlen Researchリンカー#9を示す。
【００８８】
【表２】
0003855117.tif 000012
【００８９】
ゲルを、CyberGold染色の前後に写真撮影し、蛍光標識したオリゴヌクレオチド(1015および1016)のみ、および非標識オリゴヌクレオチドとのコンプレックスにして可視化した。両方の写真は、CyberGoldフルオレセンスによって明らかにされたDNA標準ラダーを例外として、同一であった。
【００９０】
融点測定：クリーバーおよびアンカーを結合するために使用された15塩基の2'-O-メチルRNAデュプレックスステムの融点は、UV分光光度計によって測定された。熱コントローラーを装備したCarey 3E(Varian)分光光度計を使用して、MP緩衝液(150mM NaCl, 10mM Na2HPO4, 0.1mM EDTA, pH7.4)中のアンカー／クリーバー・ペア1000/1000および1000/1013の吸光度をモニターした。
【００９１】
260 nmで75℃での0.1 AUの吸光度の増加は、デュプレックスステムの融点が75℃であることを示した。融点がこのように高いことは、コンプレックスが非常に長くて、幾日かのオフ・レートを有することを示す。
【００９２】
15塩基の2'-OMe RNAステムがGeneLeadアンカーおよびクリーバーを安定で機能的なアンチセンス分子に結合し、および会合が、標的RNAの非存在下および1M尿素の存在下に起こることを実証した。75℃の融点を用いると、デュプレックスステムは、細胞トランスフェクションの間、および特異的標的RNA分子に対するアンチセンス効果の生起の間に、溶液中でGeneLeadライブラリー・メンバー分子を結合し得る。
【００９３】
実施例７
(活性)
クリーバーおよびアンカー・オリゴヌクレオチドを、減少した長さで合成し、SEAP上でRNase H活性化に関してテストした。下記のオリゴヌクレオチドを調製した：
オリゴ#     配列番号：                配列
1000+         15        5'-CAGCAGCAGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1006+         16           5'-GCAGCAGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1007+         17             5'-AGCAGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1008+         18              5'-CAGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1009+         19                5'-GCAT9GAGUACUCAACCAGC
1034+         20              5'-CAGCAT-GAGUACUCAACCAGC
1001**        21        5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaauucgc
1010**        22        5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaauu
1011**        23        5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaa
1012**        24        5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcg
1013**        25        5'-GCUGGUUGAGUACUC9gguggg
1014**        26        5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggug
1035*+        27        5'-GCUGGUUGAGUACUC-ggugggcg
1045**        28        5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaauucgc1
ここで、"ACGT"はホスホロチオエートデオキシリボ核酸を示し、"ACGT"は2'-O-メチルリボ核酸を示し、"9"はGlen Researchリンカー#9を示し、"1"はCPG上のGlen Researchプロピルリンカーを示し、+はクリーバー・オリゴを示し、**はアンカー・オリゴを示す。
【００９４】
【表３】
0003855117.tif 000013
【００９５】
全てのクリーバー・オリゴヌクレオチドは、1001アンカーと組合せられたとき、より効果的な開裂を生じた。クリーバー1008は、アンカーと組合せたときのみ、活性であった。クリーバー1009は、1001アンカー分子の存在下および非存在下に、不活性であった。1000/1001コンプレックスを、図３に示す。
【００９６】
【表４】
0003855117.tif 000014
【００９７】
このデータは、長さ８のクリーバーが、任意の付随するアンカーの長さに関係なく、開裂を刺激し得るが、開裂は、長さ６のアンカーによって最大にされることを明示する。
【００９８】
クリーバー(６塩基)およびアンカー(８塩基)を、９原子リンカーを使用して又は使用せずに調製し、RNase H活性についてテストした。
オリゴ#     配列番号：                配列
1019         29        5'-AGCABBBB9GAGUACUCAACCAGC
1020         30        5'-AGCAGCBB9GAGUACUCAACCAGC
1021         31        5'-BBBBGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1022         32        5'-KKPKKPKP9GAGUACUCAACCAGC
1023         33        5'-KKPKGCAT9GAGUACUCAACCAGC
ここで、"ACGTBK"はPS DNAを示し、"ACGT"は2'-OMe RNAを示し、"9"はGlen Researchリンカー#9を示す。結果を、以下の表５に示す。
【００９９】
【表５】
0003855117.tif 000015
【０１００】
結果は、フレキシブルリンカーが使用されるとき、活性が増大することを示した。最大活性は、クリーバーおよびアンカーが共にリンカーを含むときに得られた。１つのみのリンカーを有するコンプレックスでは、リンカーは、アンカー部分に存在するとき、最大の効果を有した。
【０１０１】
修飾された塩基を組込んだクリーバーおよびアンカーを調製した。「普遍的塩基"B"」は、任意の天然塩基に有意に水素結合しないが、デュプレックス構造では耐性である。「同義性塩基」は、水素結合する、またはプリンもしくはピリミジン("K"および"P"それぞれ)とデュプレックスの形態で適合するものであって、両方と適合しないものである。クリーバーおよび／またはアンカー中で、天然塩基を多くの普遍的または同義的塩基で置換することによって、より多くの標的mRNA配列に結合する能力を有するオリゴを調製し得る。
【０１０２】
【表６】
0003855117.tif 000016
【０１０３】
この実験からの結果は、８塩基の長さを有するクリーバーが６塩基のクリーバーよりも開裂を得るのにより有効であり、６塩基の長さを有するアンカーが４塩基または12塩基のアンカーよりもより有効であることを明示した。
【０１０４】
【表７】
0003855117.tif 000017
【０１０５】
上記の表７において、全てのクリーバーは、８塩基を有し、アンカーは６塩基を有する。"N"は、天然塩基の数を示し、"B"は、普遍的塩基の数を示し、"P-K"は同義性プリン／ピリミジン塩基の数を示す。"ライブラリー・サイズ"は、上記のサイズおよび組成物の全ての可能なオリゴを構成するであろう分子の数である。
【０１０６】
結果は、２個の普遍的塩基を有するクリーバー1020が、アンカー・オリゴの存在下または非存在下に、クリーバー1007(天然塩基のみ有する)と同じくらい有効に結合したことを示す。対応するライブラリーのサイズは、２個の普遍的塩基を組込むことにより、16倍減少することに注目。
【０１０７】
表８に示される配列を有する普遍的塩基"B"を含むクリーバー・オリゴヌクレオチドを合成し、RNase H活性についてテストした。結果を表９に示す。
【０１０８】
【表８】
0003855117.tif 000018
【０１０９】
*C、G、A、T=ホスホロチオエートDNA：c、g、u、a=2'-O-MeホスホロチオエートRNA；"9"=Glen Researchリンカー#9、"1"=Glen Researchプロピルリンカー
【０１１０】
【表９】
0003855117.tif 000019
【０１１１】
RNase H認識領域と1033の2'-OMe RNA結合領域との間のフレキシブルリンカーの存在は、アンチセンス活性を排除しない。このリンカーは、標的開裂領域および標的領域を連結して、一本鎖で活性なアンチセンス分子を形成する他の方法のモデルとして耐性であり機能するように見える。クリーバーおよびアンカー、２つの短いクリーバー、および他のライブラリーに基づくオリゴヌクレオチド構造を結合する他の方法(例えば、キレート化および合成後共有結合相互作用)は、置き換えられ得る。
【０１１２】
1033のRNase H活性は(1025と比較して)、RNase H認識に対する長さの依存性を明らかに明示する。1025に関する分子の全長は、より長いことを考慮しても、それは、1033よりも活性でない。重要な差異は、短い全ホスホロチオエート(PS)領域の長さにあるように見える。分子の一端での４塩基のPS領域は、充分な開裂のためには短すぎるように見える。従って、1027は、RNase H基質PS領域が、２個の普遍的塩基によるではなく、４塩基の長さしかないという事実により、最も不活性であるらしい。
【０１１３】
1033のRNase H活性(一本鎖の直線性アンチセンス分子)の1020/1013ペアとの比較は、RNase H基質領域の長さに対する依存性を実証する。1020/1013ペアは、２個の普遍的塩基および構造を保持するデュプレックスステムを含み、1033よりも有意により活性であり、1033は、普遍的塩基もステム構造も含まず、SEAP標的mRNAに対して同じフットプリント長を正確に有する。
【０１１４】
1020中に含まれる２つの普遍的塩基は、全PS RNase H認識領域を丁度充分なトータル８塩基に長くするように見え、標的RNAは、1033の６塩基基質領域にハイブリダイズするRNAよりもより効果的に開裂される。アンチセンス・ライブラリーの数的な複雑さの増大を回避するために普遍的塩基を含める決定的工程は、これらの結果によって図解的に実証される。1033の６塩基PS領域は、この直線的なリンカーを含むオリゴヌクレオチドに基づく任意のライブラリーに対して、4,096のファクターを寄与する。そのRNase H基質活性を改善するためにPS領域に２個の天然塩基を付加すると、42倍増加し、トータルで65,536に増加するであろう。２個の普遍的塩基およびバルキーな2'-OMeデュプレックスステム・カップラーを含む1020/1013ペアが直線的分子よりも活性であるという事実は、驚くべきことである。
【０１１５】
実施例８
(細胞内活性)
ヒト細胞内での活性を明示するための遺伝子標的として、プロテインキナーゼCアルファ(PKCα)が選ばれた。PKCαは、大部分のヒト癌タイプで過剰に発現され、全てのアンチセンス標的遺伝子の中で最も高く公開されているものの中の１つである、正常なヒト遺伝子である。
【０１１６】
この実施例のために調製されたオリゴヌクレオチドを、表１０に示す。
【０１１７】
【表１０】
0003855117.tif 000020
【０１１８】
*C、G、A、T=ホスホロチオエートDNA：c、g、u、a=2'-O-MeホスホロチオエートRNA；C、G、A、T=2'-OMe RNA；"9"=Glen Researchリンカー#9、"1"=Glen Researchプロピルリンカー
オリゴ1040(12量体、RNase H基質クリーバー)は、1041(８量体、非RNase H基質アンカー)にハイブリダイズして、PKCαに対する活性なアンチセンス構造を形成した。オリゴ1042および1043は、それぞれコントロールのクリーバーおよびアンカーであり、それらはハイブリダイズして、公知の遺伝子にはマッチしないが、1059(ISIS4189)と同じ塩基組成であるコントロールの全ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド20量体を有する構築物を形成した。オリゴ1058(ISIS3551)は、慣用されている20量体の全ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴヌクレオチドであり、それは、PKCα発現をダウンレギュレーションするアンチセンス・メカニズムを介して作用することが充分に確立されている。オリゴ1061は、慣用されている全ホスホロチオエート18量体であり、BCL2遺伝子に対する４塩基ミスマッチ・コントロールであった。
【０１１９】
ヒト膀胱癌系(T-24, ATCC HTB-4)は、PKCαを過剰発現することが公知の細胞系であり、実験で使用した。T-24を、標準的方法：75cm2フラスコ(Falcon, 3084)中、37℃、5% CO2、10%血清(Gemini Bio-Products、カタログ番号100-107)およびペニシリン-ストレプトマイシン(50IU/ml, 50μg/ml, Mediatech #30-001-L1 )を有する、McCoy's 5A培地(Mediatech, #10-050-CV)培地中で維持した。アンチセンス実験のために、T-24細胞を、12ウェルプレート(Falcon, #3043)に75,000細胞/ウェルでプレートし、トランスフェクション前に終夜、接着させて回収した。
【０１２０】
オリゴヌクレオチドを、カチオン性脂質含有サイトフェクション剤(LipofectACETM, GibcoBRL, #18301-010)とともにT-24細胞にトランスフェクトし、該剤は、T-24中に本発明の蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの充分な核運搬を提供する。
【０１２１】
本発明のオリゴヌクレオチドおよび慣用されている全ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを、1.5mLの減少した血清培地Opti-MEM(登録商標)I(Gibco-BRL, #11058-021)に、それぞれ400nMの濃度に希釈した。続いて、オリゴヌクレオチド含有溶液を、重量で５対１の最終脂質対オリゴヌクレオチド比を与えるのに充分な等しい体積のLipofectACE含有Opti-MEM Iと、混合した。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、200nMであった。オリゴヌクレオチド／脂質コンプレックスを、組織培養細胞に添加する前に、20分間室温でインキュベートした。
【０１２２】
細胞を一回、リン酸緩衝生理食塩水(PBS, Mediatech, #21-030-LV)中で洗浄し、血清含有培地を洗い流し、続いて、トランスフェクション・ミックス(1 ml)を12ウェルプレートの各ウェルに入れた。全てのトランスフェクションは、３重で行なわれた。細胞を、トータルの細胞性RNAを回収する前に、22時間、オリゴヌクレオチド／脂質コンプレックスを取込むようにさせた。モック・トランスフェクションは、Opti-MEM Iのみで処理した細胞からなっていた。
【０１２３】
トータルの細胞質RNA単離：アンチセンス処理の22時間後、トータルRNAを、細胞から回収した。細胞を、標準的方法に従い、トリプシン処理によって(トリプシン/EDTA, Mediatech #25-052-LI)プレートから解放した。細胞の３重グループをプールし、トータルの細胞質RNAを、製造業者のプロトコールに従い、RNeasy Kit(QIAGEN, #74104)を用いて単離した。RNAを、標準的方法に従いDNase I処理し、UV定量した。
【０１２４】
PKCαRNAを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応：逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を、GibcoBRLからのSuperScript One-Step RT-PCR Kit(カタログ番号10928-026)からの方法および材料を用いて行なった。PKCαを検出するためのRT-PCRは、Oxford Biomedical ResearchからのPKCα特異的プライマー(#EZ-60AおよびEZ-60B)および100ngのインプット・トータルRNAを用いて、２回の独立ランで行なった。
【０１２５】
コントロールのMultiplex RT-PCRs(MP RT-PCRs)を、それぞれのPKCαRT-PCRへの等量のインプットRNAを確認するために、行なった。プライマー、試薬、およびプロトコールは、Maxim Biotech(#APO-M052-G)から得た。コントロールのMP RT-PCRsは、BAXおよびLICE遺伝子を全てのサンプル中で等しく増幅し、等量の無傷のRNAがPKCαRT-PCRsに付加されたことを確認した。
【０１２６】
全てのRT-PCR反応は、PTC-100サーモサイクラー(MJResearch)中で、下記のプログラムに従い行なった：工程１、50℃で35分間；工程２、94℃で2分間；工程３、55℃で30秒間；工程４、72℃で1分間；工程５、94℃で30秒間；工程６、工程３に進み、さらに33回；工程７、72℃で10分間；工程８、終わり。全てのRT-PCR産物は、製造業者の指示に従い、4% Super Resolution Agarose TBEゲル(Apex, #20-105)上で分離し、CyberGold(Molecular Probes, #S-11494)により染色した。ゲルを、Polaroid Type 667フィルム上で写真撮影した。結果を、表11に示す。
【０１２７】
【表１１】
0003855117.tif 000021
【０１２８】
本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、上記のアンカー＋クリーバー対慣用されているアンチセンスによって実証されるように、慣用されている20量体のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドと同じほど活性であることが証明された。クリーバー(1040)もアンカー(1041)も、単独で投与されたときには活性を示さず、組立てられたとき、完全な活性を示したことに注目のこと。コントロールのGeneLead構築物(1042+1043)は、PKCα、BAXまたはLICEに対して非特異的活性を示さず、他のコントロールのオリゴヌクレオチドのいずれも示さなかった。
【０１２９】
結果は、GeneLead構築物が、慣用されているアンチセンス分子と同じほど活性であることを実証する。さらに、GeneLead構築物は、コンポネントの常備の予め合成されたライブラリーから組立てられ得、それは慣用されているアンチセンス分子を用いては実行可能でない。
【０１３０】
実施例９
(組織培養細胞中のヒトBcl2遺伝子に対する活性)
B細胞リンパ腫関連遺伝子２(BCL2)を、ヒト細胞内部のGeneLeadTM活性を実証するために選択した。BCL2は、大部分のヒト癌タイプで過剰発現される、別の「正常な」ヒト遺伝子である。BCL2タンパク質は、細胞死を調節する大きなファミリーのタンパク質の１つである。BCL2の過剰発現は、細胞を、化学療法および放射線療法に耐性にさせることが公知である。
【０１３１】
オリゴマー：下記のBCL2標的化アンチセンス分子を合成した：
【０１３２】
【化３】
0003855117.tif 000022
【０１３３】
1062(12量体、RNase H基質クリーバー)および1063(12量体、RNase H基質領域の5'末端で６塩基C-5プロピニル修飾された"tack"を有するRNase H基質クリーバー)は、1066(６量体、非RNase H基質アンカー)にハイブリダイズして、BCL2に対する活性なGeneLeadアンチセンス構築物を創出した。
【０１３４】
1060(G3139として臨床的に公知である公開されたオリゴヌクレオチドに基づく)は、慣用されている18量体の全ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴヌクレオチドである。1060は、オープンリーディングフレームの最初の６コドンの全域でBCL2プレmRNAにハイブリダイズする。
【０１３５】
1061は、BCL2遺伝子に対する慣用されている全ホスホロチオエート18量体、４塩基ミスマッチコントロールである。
【０１３６】
組織培養：このデモンストレーションに使用された細胞系は、BCL2を過剰発現することが公知であるT-24(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション#HTB-4)、ヒト膀胱カルチノーマ系であった。
【０１３７】
T-24は、75-cm2フラスコ(Falcon, カタログ番号3084)中で、10%血清(Gemini Bio-Products, カタログ番号100-107)およびペニシリン-ストレプトマイシン(50 IU/mL, 50mcg/mL, Mediatech, カタログ番号30-001-LI)を有するMcCoy's 5A培地(Mediatech, カタログ番号10-050-CV)中で、37℃、5% CO2で、標準的方法を用いて、培地中で維持した。
【０１３８】
アンチセンス実験のために、T-24を12ウェルプレート(Falcon,  カタログ番号3043)に、75,000細胞／ウェルでプレートし、オリゴヌクレオチドのトランスフェクションが始まる前に終夜、接着させ回収可能とした。
【０１３９】
T-24細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクション：オリゴヌクレオチドを、T-24細胞に、カチオン性脂質含有サイトフェクチン剤LipofectACETM(GibcoBRL, カタログ番号18301-010)とともにトランスフェクトした。LipofectACEは、T-24中で蛍光標識したGeneLead構築物の充分な核デリバリーを与えることが示された。
【０１４０】
GeneLeadおよび慣用されている全ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドは、1.5mLの減少した血清培地Opti-MEM(c)I(GibcoBRL, カタログ番号11058-021)に、それぞれ400nMの濃度に希釈された。続いて、オリゴヌクレオチド含有溶液を、重量で５対１の最終脂質対オリゴヌクレオチド比を与えるのに充分な等量のOpti-MEMI含有LipofectACEと混合した。
【０１４１】
オリゴヌクレオチドの最終濃度は、200nMであった。オリゴヌクレオチド／脂質コンプレックスを、組織培養細胞に加える前に、室温で20分間インキュベートした。
【０１４２】
細胞を一回、リン酸緩衝生理食塩水(PBS, Mediatech, カタログ番号21-030-LV)中で洗浄し、血清含有培地を洗い流し、続いて、1 mLのトランスフェクション・ミックスを12ウェルプレートの各ウェルに入れた。全てのトランスフェクションは、３重で行なった。
【０１４３】
細胞を、トータル細胞性RNAを回収する前に、24時間、オリゴヌクレオチド／脂質コンプレックスを取込むようにさせた。モック・トランスフェクションは、Opti-MEM Iのみで処理した細胞からなっていた。
【０１４４】
トータルの細胞質RNA単離：アンチセンス処理の22時間後、トータルRNAを、細胞から回収した。細胞を、標準的方法に従い、トリプシン処理(トリプシン/EDTA, Mediatech カタログ番号25-052-L1)によってプレートから解放した。細胞の３重グループをプールし、トータルの細胞質RNAを、RNeasy Kit(QIAGEN, カタログ番号74104)からのプロトコールおよびスピンカラムに従い、単離した。
【０１４５】
RNAを、標準的方法に従いDNase I処理し、UV定量した。
【０１４６】
BCL2 RNAを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応：逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を、GibcoBRLからのSuperScript One-Step RT-PCR Kit(カタログ番号10928-026)からの方法および材料を用いて行なった。BCL2を検出するためのRT-PCR反応は、文献からのBCL2特異的プライマー：上流5'ggtgccacctgtggtccacctgおよび下流5'cttcacttgtggcccagatagg(両方のプライマーとも、正常のDNAであった)および1μgのインプット・トータルRNAを用いて、行なった。β-アクチンに対するコントロールのRT-PCR反応も、文献からのプライマー：上流5'gagctgcgtgtggctcccgaggおよび下流5'cgcaggatggcatggggggcatacccc(両方のプライマーとも、正常のDNAであった)および0.1gのインプット・トータルRNAを用いて、行なった。
【０１４７】
全てのBCL2およびβ-アクチンRT-PCR反応は、PTC-100サーモサイクラー(MJResearch)上で、下記のプログラムに従い行なった：工程１、50℃で35分間；工程２、94℃で2分間；工程３、60℃で30秒間；工程４、72℃で1分間；工程５、94℃で30秒間；工程６、工程３に進み、さらに35回；工程７、72℃で10分間；工程８、終わり。
【０１４８】
全てのRT-PCR産物は、製造業者の指示に従い、4% Super Resolution Agarose TBEゲル(Apex, カタログ番号20-105)上で分離し、SyberGold(Molecular Probes, カタログ番号S-11494)により染色した。ゲルを、Polaroid Type 667フィルム上で写真撮影した。
【０１４９】
【表１２】
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【０１５０】
結果
GeneLead抗BCL2構築物は、コントロール処理と比較して、BCL2 RNAレベルを有意に減少した。レーン５(オリゴ1062＋1066)および７(1063＋1066)を、レーン１(モック処理)および３(慣用されているアンチセンス・コントロール)と比較せよ。
【０１５１】
オリゴヌクレオチドもGeneLead構築物も、コントロール遺伝子β-アクチンに対する活性を示さなかった。
【０１５２】
これは、それがGeneLead活性を、(a)僅か６塩基アンカー(1066、レーン５および７)と、(b)クリーバー配列中の天然塩基を代替する２個のニトロインドール普遍的塩基"B"(1063単独で、および1063+1066、レーン６および７)とともに明らかに実証するので、および(c)GeneLead活性が一般的であり、他のヒト標的遺伝子に対して容易に観察され得るので、重要である。
【０１５３】
普遍的塩基としてニトロインドールを含むクリーバーと組合せた僅か６塩基長のアンカー(1063+1066)が、細胞内で有効なアンチセンス活性を有するGeneLead構築物を形成し得たという実験的結果は、SEAP標的化GeneLeadオリゴヌクレオチドを用いた、我々の細胞を含まない仕事の有効性を確認した。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドを、２以上の機能的単位に分離し、普遍的塩基を組込んで、アンチセンス・オリゴヌクレオチドのライブラリーを数的に単純化するという原理は、生きたヒト細胞中で実施化された。
【０１５５】
これらの概念は、診断薬、リボザイム適用、および免疫刺激(CpGオリゴヌクレオチド)におけるオリゴヌクレオチドの現在の使用を改善するために、容易に適用され得る。
【０１５６】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のオリゴヌクレオチド構築物を、図解的に示す。
【図２】  複数のオリゴマーを有するアンチセンス構築物を、図解的に示す。
【図３】  アンカー・オリゴヌクレオチド、クリーバー・オリゴヌクレオチド、および標的RNAからなるコンプレックスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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