(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料と、緩衝液を含む第１試薬とを混合し、次いで、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体と少なくとも結合するモノクローナル抗体を感作したラテックス試薬を含む第２試薬を、更に添加して反応させ、前記反応により生じる凝集を光学的に測定して被検試料中に含まれる前記Ｄダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体を免疫学的に分析する方法において、
前記第１試薬にヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるＤモノマーを共存させ、前記Ｄモノマーの濃度が、終濃度として０．１５〜２μｇ／ｍＬであることを特徴とする、前記Ｄダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的分析方法。
【請求項２】
（１）ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるＤモノマー、及び緩衝液を含む希釈用第１試薬と、
（２）ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体と少なくとも結合するモノクローナル抗体を感作したラテックス試薬を含む第２試薬と
を含み、前記Ｄモノマーの濃度が、終濃度として０．１５〜２μｇ／ｍＬであることを特徴とする、前記Ｄダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体（以下、前記Ｄダイマーと前記ＤＤ／Ｅ複合体とを併せて、「ＸＤＰ」と称することがある）の免疫学的分析方法及び免疫学的分析用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、血栓及び／又は塞栓により死亡する基礎疾患が増加する傾向にある。血栓形成の機序には未だに不明なことが多いけれども、血栓形成の臨床診断法は血栓症の増加につれて進歩している。
従来、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＸＤＰの定量的測定に抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナル抗体を感作したポリスチレンラテックス粒子を用いた凝集法が一般的に用いられてきた。しかし、この方法は、検体中にフィブリノーゲンが混在すると、疑似的にＸＤＰが陽性となる。このような疑似陽性反応をなくすため、検体は完全に脱フィブリノーゲン処理が行なわれることが要求される。けれども、このような操作は非常に煩雑であり、緊急性を要する臨床診断薬として適当でない。
【０００３】
そのような観点から、臨床的にはフィブリノーゲンの存在下でも前記のような干渉を受けず、ＸＤＰを特異的にかつ簡便に測定するため、モノクローナル抗体を用いた方法及びその試薬が開発され、現在に至っている。しかしながら、臨床の現場において、特にこのような特異的なモノクローナル抗体を感作したラテックス凝集試薬を用いた場合、多数の患者検体の中で、希に分析結果が低値になるケースが認められるようになった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、モノクローナル抗体を感作したラテックス凝集法を利用した免疫学的分析方法において、ＸＤＰを正確に測定することができる分析方法及び分析用キットを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、被検試料と、緩衝液を含む第１試薬とを混合し、次いで、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体と少なくとも結合するモノクローナル抗体を感作したラテックス試薬を含む第２試薬を、更に添加して反応させ、前記反応により生じる凝集を光学的に測定して被検試料中に含まれる前記Ｄダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体を免疫学的に分析する方法において、
前記第１試薬にヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるＤモノマーを共存させ、前記Ｄモノマーの濃度が、終濃度として０．１５〜２μｇ／ｍＬであることを特徴とする、前記Ｄダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的分析方法に関する。
【０００６】
また、本発明は、（１）ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるＤモノマー、及び緩衝液を含む希釈用第１試薬と、
（２）ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体と少なくとも結合するモノクローナル抗体を感作したラテックス試薬を含む第２試薬と
を含み、前記Ｄモノマーの濃度が、終濃度として０．１５〜２μｇ／ｍＬであることを特徴とする、前記Ｄダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的分析用キットにも関する。
【０００７】
本明細書において、単に「Ｄダイマー」と称する場合には、前記「Ｄダイマー」は、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤダイマーを意味する。また、単に「ＤＤ／Ｅ複合体」と称する場合には、前記「ＤＤ／Ｅ複合体」は、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤＤ／Ｅ複合体を意味する。
また、本明細書においては、前記Ｄダイマー（すなわち、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤダイマー）と、前記ＤＤ／Ｅ複合体（すなわち、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤＤ／Ｅ複合体）とを併せて、「ＸＤＰ」と称する。
更に、本明細書において、単に「Ｄモノマー」と称する場合には、前記「Ｄモノマー」は、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるＤモノマーを意味する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の原理は、少なくともヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるＤダイマー及びＤＤ／Ｅ複合体と反応するモノクローナル抗体を感作したラテックス粒子（以下、単に「抗体感作ラテックス粒子」ともいう）を用いて、被検試料中のＸＤＰを分析する逆受身凝集反応である。なお、本明細書において、前記「分析」には、ＸＤＰの量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、ＸＤＰの存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【０００９】
この抗体感作ラテックス粒子は、被検試料中に存在するＸＤＰと抗原抗体反応を起し、凝集を生ずる。従って、前記抗体感作ラテックスの一定量と被検試料の一定量とをスライド板やマイクロタイタープレート上で一定時間混和した後、凝集像の有無あるいは強弱を観察し、被検試料中のＸＤＰの量又は存在の有無を判定することができる。あるいは、抗体感作ラテックスの一定量と被検試料の一定量とを混合し、一定時間後の吸光度の増大を適当な波長で光学的に測定することにより検体中のＸＤＰ量を定量することができる。
【００１０】
本発明により分析可能な被検試料としては、例えば、液状生体試料、例えば、血液、血漿、血清、又は尿等を挙げることができる。
【００１１】
本発明に用いるモノクローナル抗体としては、少なくともＸＤＰと結合するモノクローナル抗体である限り、特に限定されるものではない。本発明においては、前記モノクローナル抗体として、ヒトフィブリノーゲン及び安定化フィブリン塊とは反応せず、ＸＤＰと結合するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００１２】
本発明に用いるモノクローナル抗体は、公知の手段により得ることができる。具体的には、例えば、以下に示すとおりである。
モノクローナル抗体は、所望のモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマを、例えば、培地又はマウスの腹腔内で培養することによって製造することができる。ここで用いるマウスハイブリドーマは、一般的には、Ｄダイマーで免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）参照］により細胞融合して得ることが可能である。
【００１３】
前記ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ；以下、ＤＭＥと称する）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸、及び抗生物質（ペニシリンＧ及びストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
前記ハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、５％ＣＯ2濃度且つ３７℃の条件下で約３日間で行なうことができる。また、マウスの腹腔内で培養する場合には、約１４日間で行なうことができる。
【００１４】
このようにして得られた培養液又はマウスの腹水から、タンパク質の単離及び精製に一般的に用いられる方法により、前記モノクローナル抗体を分離及び精製することが可能である。
そのような方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【００１５】
こうして得られたモノクローナル抗体をラテックス粒子（好ましくはポリスチレンラテックス粒子）に感作して用いる。本発明に使用するポリスチレンラテックス粒子は、市販のものを使用することができ、その粒径は、０．１〜０．８μｍであることが好ましい。
感作法は、従来公知の手段を用いることができ、例えば、物理的結合法、あるいは、共有結合させる化学結合法を用いることができる。こうして調製した抗体感作ラテックス粒子は、適当な溶液、例えば、緩衝液中に分散させて保存することができる。
【００１６】
本発明の趣旨は、以下の点にある。すなわち、被検試料をまず適当な溶液で希釈した後、抗体感作ラテックス粒子を混合して免疫反応を行なう。このとき用いる希釈液（すなわち、第１試薬）に、人為的に、ヒトフィブリノーゲン由来のＤ分画（Ｄモノマー）を共存させて用いることで本発明の目的が達成される。
ここで共存させる前記Ｄモノマーは、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるＤモノマーである限り、その調製方法又は入手方法は特に限定されない。例えば、前記Ｄモノマーとしては、市販品［例えば、ＦＤＰ−Ｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ（シグマ社）］を用いることもできるし、ヒトフィブリノーゲンをヒトプラスミンで分解し、特異抗体を固定化したカラムで分取及び精製することによっても得ることができる。
【００１７】
本発明においては、こうして得たＤモノマーを第１試薬に共存させる。その濃度としては、終濃度が好ましくは０．１５〜２μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．４〜１．５μｇ／ｍｌとなるように添加する。０．１５μｇ／ｍｌより少ないと、被検試料に含まれるＤモノマーの干渉を抑制することが不充分であることがあり、２μｇ／ｍｌより高いと、ラテックス凝集系自体を抑制してしまうことがある。
【００１８】
第１試薬自体は、検体希釈の目的のために用いるものであり、その組成としては、緩衝液をベースにする。また、前記緩衝液に、適宜、界面活性剤を添加することができる。前記界面活性剤としては、非イオン系の界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｒｉｔｏｎＸ１００等が好適に用いられる。緩衝液としては、化学的に安定で、金属イオンとの錯形成能が小さく、酸解離定数ｐＫａがｐＨ６〜９の間にある点で、グッドバッファーを用いることが好ましい。前記グッドバッファー以外にも、例えば、トリスバッファー又はリン酸バッファー等を用いることもできるが、前記理由によりグッドバッファーを用いることが好ましい。
【００１９】
本発明においては、このように予めＤモノマーを含む第１試薬で被検試料を希釈した後に、抗体感作ラテックス試薬を加えて所望の免疫反応を行なう。この反応で生じる凝集は、被検試料中に含まれるＸＤＰ濃度依存的に増加するので、凝集像を光学的に検出すれば、ＸＤＰを定量することができる。
本発明では、被検試料由来の不確定なＤモノマーの影響を、過剰量のＤモノマーを予め人為的に共存させておくことで打ち消すことを特徴とする。そのため、測定に使用するモノクローナル抗体の反応特異性によっては、本来の凝集自体が抑制される可能性がある。すなわち、本発明で用いるモノクローナル抗体の反応特異性としては、少なくともＸＤＰと結合する（好ましくはヒトフィブリノーゲン及び安定化フィブリン塊とは反応しない）抗体であれば充分であるが、前記抗体がＤモノマーとの反応性を更に有する場合には、反応系に存在するＤモノマー（被検試料中に含まれる可能性があるＤモノマーも含め）が抗体と反応する。この場合、見かけ上の凝集量は減少するものの、ＸＤＰの濃度依存的に凝集量は増加している。
【００２０】
本発明においては、第１試薬中に、更に、凝集促進剤、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、又はポリビニルピロリドン等を添加することができる。凝集促進剤を添加すると、低値での凝集が明瞭となるため、測定濃度範囲も低濃度側に拡大される。
【００２１】
【作用】
以下、本発明の作用機序について説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
先に、従来技術の説明において述べたように、モノクローナル抗体を感作したラテックス凝集試薬を用いた場合、臨床の現場において、多数の患者検体の中で、希に分析結果が低値になるケースが認められるようになった。種々の原因が考えられるが、その主たる要因としては、従来、体内では１次線溶でのＤモノマーの存在はほとんどないという考え方が一般的であったが、近年、医学の進歩、治療及び治療薬の進歩の影響等により、従来では予測し得なかったＤモノマーの存在が影響しているものと、本発明者は考えている。
【００２２】
この点を更に詳細に説明すれば以下のとおりである。
従来、このような場合に使用され得るモノクローナル抗体については、多くの報告がされており、例えば、Ｒｙｌａｔｔ等［ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ  ＲＥＳＥＲＣＨ，３１，７６７−７７８（１９８３）］、Ｓｏｒｉａ等［Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ；Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２２７−２３３（１９８３）］、又は特公平７−４６１０４号公報等に開示されている。基本的に、ＸＤＰを分析するためのモノクローナル抗体としては、少なくともヒトフィブリノーゲン及び安定化フィブリン塊とは反応せず、ＸＤＰと結合する抗体を用いる。
【００２３】
Ｍａｒｃ  Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ等［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５７，２９１２−２９１９（１９８２）］が述べているとおり、線溶酵素のプラスミンは、フィブリン上で効率よく生成されるので、生体内においては、局所のフィブリンのみを分解すると考えるのが一般的である。液相においては、プラスミンの生理的阻害剤であるα２−プラスミンインヒビターが高濃度に存在するので、プラスミンは瞬時に失活され、フィブリノーゲンの分解は起こらないものと考えられていた。従って、Ｄモノマーと反応するモノクローナル抗体を用いた場合であっても、ＸＤＰを測定することにおいては、重要視する必要はなかった。
【００２４】
しかしながら、近年、医学の進歩、治療及び治療薬の進歩により、例えば、血栓症患者等の治療に血栓溶解剤が使われるようになり、前記のごとく生理的環境では起こり得ないと考えられていた態様で１次線溶がおこり、Ｄモノマーを含むフィブリノーゲン分解産物の存在が無視できないようになってきたものと考えられる。すなわち、従来では予測し得なかったＤモノマーの存在がラテックス凝集系においてその測定値に影響していると考えられる。
このように、被検試料中にＤモノマーが存在した場合、使用するモノクローナル抗体の特性によっては、ラテックス凝集反応に対してＤモノマーが干渉し、本来の凝集が抑制されて、本来の値より低値の結果を与えてしまうものと思われる。本発明においては、被検試料由来の不確定なＤモノマーの影響を、過剰量のＤモノマーを予め人為的に共存させておくことで打ち消すものと、本発明者は考えている。
【００２５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《抗ＸＤＰモノクローナル抗体の製造》
（１）免疫用抗原（Ｄダイマー）の調製
Ｄダイマーの調製は、主に、Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  Ａ．Ｏｌｅｘａ及びＡｎｄｒｅｉ  Ｚ．Ｂｕｄｚｙｎｓｋｉの方法［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｓｕｐｐｌ．５８，１１９（１９７８）］並びにＯｌｅｘａらの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５７６，３９−５０（１９７９）］に準じて行なった。
【００２６】
すなわち、フィブリノーゲン（カビ社，スウェーデン）２０ｍｇ（１０ｍｇ／ｍｌ）に、ヒトトロンビン及び塩化カルシウムを、それぞれ終濃度が１０単位／ｍｌ及び１０ｍＭとなるように加え、３７℃で２時間反応させることにより、フィブリノーゲンをフィブリンに変換させた。続いて、１８０００×ｇで３０分間遠心し、フィブリンを非凝固性物質から分離した。得られたフィブリンを、０．１５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）−５ｍＭ塩化カルシウム−０．０２％ＮａＮ3液２０ｍｌに浮遊させた。浮遊液にヒトプラスミン（１単位／ｍｌ，ミドリ十字社）を１時間毎に０．５ｍｌずつ添加した。１０時間経過後に、アプロチニン（Ｍｏｂａｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）２００単位を加えて分解反応を停止させた。反応液を容量１０ｍｌのリジンセファロースカラムに通過させ、プラスミンを除去した。
【００２７】
次に、通過液を、前もって５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）−０．１５Ｍ塩化ナトリウム−５ｍＭ塩化カルシウム溶液で平衡化したセファロースＣＬ６Ｂ（ファルマシア社）のカラム（直径２．６ｃｍ，長さ９０ｃｍ）に充填した。平衡化に使用した前記溶液で展開する分子篩クロマトグラフィーを行ない、オクテロニー法によりＤＤ／Ｅ複合体の分画を同定及び分離した。
【００２８】
このようにして得られたＤＤ／Ｅ複合体を３Ｍ尿素−５０ｍＭクエン酸（ｐＨ５．５）溶液中で３７℃で４時間保温した。次に、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７．４）−２８ｍＭクエン酸ナトリウム−０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂのカラム（直径２．６ｃｍ，長さ９０ｃｍ）に充填し、平衡化に使用した前記溶液で展開し、オクテロニー法により、Ｄダイマー分画を同定及び分離し、Ａ２８０ｎｍ＝２．０のＤダイマー溶液１０ｍｌを得た。
このようにして調製したＤダイマー溶液は、以下、免疫原として、あるいは、抗ＸＤＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別するためのエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）用抗原として使用した。
【００２９】
（２）免疫化した脾臓細胞の調製
前記実施例１（１）で調製したＤダイマー免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝２．０）を、等量のフロインド氏完全アジュバントと乳化するまで混合し、その混合液１００μｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった（第１回免疫）。３０日経過後、前記マウスに第１回免疫と同様の方法でマウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過後、Ｄダイマー免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝２．０）を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液１００μｌを、前記マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
【００３０】
（３）細胞融合
無菌的に摘出した前記脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓を１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を５０ｍｌ遠心チューブに集めて５００×ｇで１０分間遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液［１５５ｍＭ−ＮＨ4Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3，１ｍＭ−ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．０］３〜５ｍｌを加え、懸濁させた。０℃で５〜１０分間放置することにより懸濁液中の赤血球を破壊した。１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地１０〜２０ｍｌを加えてから遠心分離した。このようにして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定した。
【００３１】
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４約２×１０7個に１×１０8個の前記脾細胞を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、遠心分離を行なった（５００×ｇ，１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保温しておいて４０％ポリエチレングリコール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを手で、１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットとを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒間に１ｍｌ加えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地２０〜３０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分間）を行なった。
【００３２】
上清を除去した後、細胞ペレットを１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１．６×１０-5Ｍ、及びヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄した後、前記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに２００μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器（３７℃）で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地を約１００μｌ除き、新たに前記ＨＡＴ培地を１００μｌ加えることにより、ＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ及びヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目に、後述のＥＬＩＳＡ法により、抗ＸＤＰ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００３３】
（４）ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無をＥＬＩＳＡ法により測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  II，日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、実施例１（１）で調製した精製Ｄダイマー溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．０５，生理食塩水で希釈した）を５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置した。次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で３回洗浄した後、各ウェルに培養上清を５０μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。
次にＴｗｅｅｎ２０−生理食塩水で２００倍希釈したペルオキシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社，デンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール及び０．００５％過酸化水素水を含む溶液２５０μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、抗体産生が認められたものをピックアップした。同様にして、ヒトフィブリノーゲン、安定化フィブリン塊、及びＤＤ／Ｅ複合体との反応性を確認した。
【００３４】
前記ＥＬＩＳＡ法によって認められた培養上清中の抗ＸＤＰ抗体中、ヒトフィブリノーゲン及び安定化フィブリン塊とは反応せず、ＸＤＰに特異的に反応する２ウェル中のハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって抗ＸＤＰ抗体の産生の有無を確認してから、限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウェルあたり２×１０4個分注してある９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注した。約１０日後、ＥＬＩＳＡ法によって抗ＸＤＰ抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、１０〜２０個の抗体産生クローンが得られた。
これらのクローンの中から、増殖性が高く、抗体分泌能が高く、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の方法で再クローン化を行ない、抗ＸＤＰ特異的抗体産生ハイブリドーマＸＤＰ−１及びＸＤＰ−２を樹立した。
【００３５】
（５）モノクローナル抗体の製造（インビトロ法）
マウスハイブリドーマＸＤＰ−１を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃且つ５％二酸化炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００×ｇ，１０分間）した後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下３０分間撹拌した後、６０分間放置し、遠心分離（１００００×ｇ，１０分）し、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。これを、１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）との間で濃度勾配法により行なった。
【００３６】
溶出されたモノクローナル抗体を限外ろ過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に、通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製した抗ＸＤＰ特異抗体ＸＤＰ−１を得た。
これと同様にして抗ＸＤＰ特異抗体ＸＤＰ−２も得て、以下の操作に付した。
【００３７】
（６）モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスの同定
抗ＸＤＰモノクローナル抗体ＸＤＰ−１及びＸＤＰ−２の免疫ブロブリン・クラスの同定をオクテロニー免疫拡散法により行なった。結果は表１に示すとおりである。
【００３８】
《表１》
ＸＤＰ−１          ＸＤＰ−２
ＩｇＧ１，κ        ＩｇＧ１，κ
【００３９】
（７）モノクローナル抗体の認識部位の同定
モノクローナル抗体ＸＤＰ−１及びＸＤＰ−２の認識部位の同定は、ウェスターンブロッティング法によって行なった。実験操作は主に、Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（バイオ・ラッド社，アメリカ）に添付の取り扱い説明書（Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｎｕａｌ）に従って、行なった。実験操作の概要は以下のようである。
フィブリノーゲンをＣａ2+の存在下でプラスミン処理し、３０分間、６０分間、及び２４時間反応後のそれぞれのフィブリノーゲン分解物を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）非存在下でＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動した。前記取り扱い説明書に記載の方法でブロッティング及びエンザイムイムノアッセイを行ない、この結果とＳＤＳポリアクリルアミドゲルのクマジー・ブリリアント・ブルーＧ−２５０によるタンパク質染色との結果から、各モノクローナル抗体ＸＤＰ−１及びＸＤＰ−２の認識部位の同定を行なった。フィブリノーゲン、精製Ｄダイマー、及びＤＤ／Ｅ複合体に対しても前記と同様の方法で認識部位の同定を行なった。結果は表２に示すとおりである。表２において、「＋」は、モノクローナル抗体が分解物を認識することを意味し、「−」は、モノクローナル抗体が分解物を認識しないことを意味する。
【００４０】
0003857468.tif 000002
【００４１】
【実施例２】
《感作ポリスチレンラテックス粒子の調製》
モノクローナル抗体ＸＤＰ−１及びＸＤＰ−２をそれぞれ０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．００）に溶解して調製した抗体液５ｍｌに、平均粒径０．３μｍのポリスチレンラテックス［積水化学工業（株），固形分５％（ｗ／ｖ）］５ｍｌを添加して室温にて６０分間撹拌した。
前記混合物に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．３％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．００）を添加し、室温で６０分間撹拌した後、前記混合物を２０，０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物に１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．００）−０．０５％ＮａＮ3１０ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁させて各抗ＸＤＰモノクローナル抗体感作ラテックス試薬を調製した。
【００４２】
【実施例３】
《第１試薬の調製（Ｄモノマー含有緩衝液の調製）》
０．２Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．００）−０．５％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ−０．１５Ｍ−ＮａＣｌ−０．１％ＥＤＴＡ−２Ｎａ−０．０５％ＮａＮ3に、Ｄモノマー（シグマ社）を１テストあたりの反応時濃度で、０．７６μｇ／ｍｌになるように添加し、第１試薬（すなわち、Ｄモノマー含有緩衝液）を調製した。
対照試験では、Ｄモノマーを添加する前の前記緩衝液を、従来法による第１試薬として使用した。
【００４３】
【実施例４】
《被検試料中のＸＤＰの測定》
ＸＤＰ標準品（入手先：ダイアヤトロン）を、０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、及び３２μｇ／ｍｌの濃度になるように、それぞれ蒸留水にて溶解し、ＸＤＰ抗原標準溶液として使用した。また、患者から採取した血漿検体を、検体試料とした。
【００４４】
測定は以下に示す手順で実施した。すなわち、検体押しだし液（生理食塩水）８０μｌで前記の各ＸＤＰ抗原標準溶液５μｌを反応チューブに分注し、そこに更に、前記実施例３で調製した第１試薬（Ｄモノマー含有緩衝液）１８０μｌを添加し、混合して３７℃で約５分間保持した。続いて、この混合液に、前記実施例２で調製した抗ＸＤＰ抗体感作ラテックス液４０μｌを添加して撹拌し、約１０分間経過するまでの間の吸光度変化を波長９５０ｎｍにて測定し、検量線を作成した。次に、前記標準溶液５μｌの代わりに、検体試料５μｌを用いること以外は、前記操作を繰り返し、先に作成した検量線を用いて測定値を求めた。前記吸光度測定は、全自動免疫血清検査システムＬＰＩＡ−２００を用いて行なった。
また、比較試験（従来法）として、前記第１試薬（Ｄモノマー含有緩衝液）の代わりに、前記実施例３で調製した従来法による第１試薬（Ｄモノマー不含緩衝液）を用いること以外は、前記操作を繰り返した。
結果を表３に示す。なお、表３に示す数値の単位は「μｇ／ｍｌ」である。表３から明らかなように、本発明方法と従来法とでは、本実施例に用いた検体の結果が異なっていた。
【００４５】
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【００４６】
本発明法と従来法とで結果が異なる前記検体１、２、及び３について、生理食塩水にて１／１０〜１０／１０の１０段階に希釈調製したものを検体として、希釈直線性を調べた。その結果を図１〜図３に示す。図１は、モノクローナル抗体ＸＤＰ−１を用いた場合の検体１に関する結果を示し、以下、同様に、図２は、モノクローナル抗体ＸＤＰ−１を用いた場合の検体２に関する結果を示し、図３は、モノクローナル抗体ＸＤＰ−２を用いた場合の検体３に関する結果を示す。図１〜図３において、「黒丸」は本発明方法による結果を表わし、「白丸」は従来法の結果を表わす。
いずれの検体においても、従来法では、正確に測定されていないのに対し、本発明方法では直線性を示し、正確にＸＤＰを測定していることが確認された。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によれば、被検試料中に存在する可能性のあるＤモノマーの影響を受けることなく、ＸＤＰを正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４で実施した本発明方法及び従来法による検体１の測定結果を示すグラフである。
【図２】実施例４で実施した本発明方法及び従来法による検体２の測定結果を示すグラフである。
【図３】実施例４で実施した本発明方法及び従来法による検体３の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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