(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ No.１に示されているアミノ酸配列を有しており、腫瘍細胞に対する細胞毒性作用を示すバシラス・スリンジエンシス亜種スリンジエンシスから誘導、単離、精製された蛋白質。
【請求項２】
該蛋白質がプロテターゼおよび酸性状態に対して反応を示し、細胞毒性効果がジチオトレイトールによる措置あるいは100℃の温度への露出に対して抵抗性を有する請求項１の蛋白質。
【請求項３】
該蛋白質がＵ−937細胞、骨髄腫細胞、Ｂリンパ腫細胞、Ｔリンパ腫細胞、赤芽腫細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞及び肝臓癌に対して細胞毒性を示す請求項１の蛋白質。
【請求項４】
該細胞毒性作用が上記蛋白質に向けられた抗体によって阻止される請求項１の蛋白質。
【請求項５】
該蛋白質が正常なヒト抹消血液リンパ球及びヒト包皮線維芽細胞に対して細胞毒性を示さない請求項１の蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの蛋白質と薬学的に受け入れ可能な基剤を含む医薬品組成物。
【請求項７】
ヒト又は動物の疾病の措置のための薬剤の製造のための請求項１〜５のいずれかの蛋白質の使用。
【請求項８】
疾病が腫瘍状態である請求項７の使用。
【請求項９】
腫瘍状態が、骨髄腫細胞、Ｂリンパ腫細胞、Ｔリンパ腫細胞、赤芽腫細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、および肝臓癌細胞で構成されるグループから選択される腫瘍細胞に起因する請求項８の使用。
【請求項１０】
薬剤が腫瘍状態の再発を遅らせる請求項７の使用。
【請求項１１】
薬剤がヒト又は動物の生残時間を延長させる請求項７の使用。
【請求項１２】
請求項６記載の組成物を、治療的に有効な量投与することよりなる腫瘍性細胞を措置するためのイン・ビトロでの方法。
【請求項１３】
腫瘍細胞が、骨髄腫細胞、Ｂリンパ腫細胞、Ｔリンパ腫細胞、赤芽腫細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞及び肝臓癌細胞からなるグループから選択される請求項12の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的には免疫学および蛋白質化学に関するものである。より具体的には、バシラス・スリンジエンシス変異体スリンジエンシスからの新しい抗増殖性蛋白質の単離、精製および特徴付けに関するものである。
関連技術の説明
腫瘍細胞に対して選択的に抗増殖性特性を示す薬剤は抗癌剤としての可能性を秘めている。こうしたタイプの薬剤は合成および天然両方の供給源から求められてきている。抗増殖性を有するこうした化合物はその性質上蛋白質性、あるいは非蛋白質性の両方の場合がある。
グラム陰性およびグラム陽性両方のバクテリアが真核細胞に対して毒性を示す蛋白質を合成することが知られている。バシラス・スリンジエンシスは芽胞形成中、摂取されると昆虫を殺す場合がある蛋白質を大量に合成するグラム陽性バクテリアである（HofteおよびWhiteley, 1989）。この蛋白質は30年間以上にわたって微生物殺菌剤として用いられてきており、ヒトに対しては無害であると考えられている（Greenら、1990）。これらの殺虫性蛋白質はバクテリア内で結晶性副芽胞小体として組み立てられており、３つの異なったサイズ・クラス；133−145kDa, 65−67kDaおよび27kDaに分類される。バシラス・スリンジエンシスの種々の亜種がひとつ、あるいは複数の各サイズ・クラスを表現する。133−145kDa蛋白質は腸内プロテアーゼによって劣化されると毒素成分を含んでいる約67kDaのアミノ末端フラグメントを産出する発熱物質である（Ogiwaraら、1992）。この67kDa毒素はバシラス・スリンジエンシスの他の亜種からの毒素とかなり構造的に共通性を有している。しかしながら27kDa毒素は他のサイズ・クラスの毒素との共通性を示さないが、亜種とはかなりの共通性を示す（Luthyら、1982）。亜種イスラエリエンシス（バシラス・スリンジエンシス・イスラエリエンシス）、キュシュンシス（バシラス・スリンジエンシス・クルサタキ）、およびモルリソーニ（バシラス・スリンジエンシス・モルリソーニ）からの27kDa毒素の遺伝子はクローン化され、バシラス・スリンジエンシス・イスラエリエンシス毒素はバシラス・スリンジエンシス・モルリソーニ毒素と一つの塩基対だけが違っているのに対して、バシラス・スリンジエンシス・クルサタキ毒素に対しては39％しか同一性を示さないことが分かっている（Waalwijkら、1985；Ward及びElrar, 1986；Wardら、1986；Galjartら、1987；Koni及びEllar, 1993）。種々の亜種から得られた毒素が培養中の昆虫細胞に対して細胞溶解性を示すことが分かっている。
約20年ほど前に、バシラス・スリンジエンシス亜種スリンジエンシスがヨシダ腹水肉腫などの一定のマウス腫瘍に対してイン・ビボで抗腫瘍作用を示すことが報告されている。その後、バシラス・スリンジエンシス・イスラエリエンシスから得られた毒素もイン・ビトロで一定のネズミ腫瘍細胞に対して抗腫瘍性を示すことが示された。バシラス・スリンジエンシス・スリンジエンシス蛋白質はラットやモルモット内での体液免疫システムを強化し、そしてその後の腫瘍移植の拒絶反応で判定されるような持続的な固型腫瘍免疫性を誘発する。この抗腫瘍蛋白質の構造的特徴とそれが種々の他の悪性腫瘍から得られる上に述べたような殺虫毒素と機能的に関連しているのかどうかは未だ分かっていない。
先行技術は種々の腫瘍の成長を抑止する有効な手段を持っていない点で欠陥がある。本発明はこの分野で長い間待ち望まれていたこうした必要性と願望に応えるものである。
発明の要約
本発明はグラム陽性菌バシラス・スリンジエンシス変異体スリンジエンシスからオンコトキシンという名の蛋白質を単離し特徴付けを行うことについて述べている。オンコトキシンの識別は部分的にはヒト組織リンパ腫Ｕ−937細胞に対する抗増殖作用に基づいていた。このアッセイを用いることにより、オンコトキシンは差分臭化ナトリウム勾配超遠心分離、蛋白質分解消化、そしてそれに続いて行われるＤＥＡＥアフィゲル・ブルー親和性クロマトグラフィーによって単離されていた。ＤＥＡＥアフィゲル・ブルー樹脂に結合したオンコトキシンは0.05Ｍ  ＮａＣｌで溶離できた。それは変性状態下で約20kDaの分子量を有している。
この精製された蛋白質の生物学的活性はトリプシン、チモトリプシン及びプロナーゼを含む種々の蛋白質溶解酵素に対して反応を示し、酸性状態（pH４以下）に対して反応を示し、トルフルオロ酢酸（0.1％）およびアセトニトリル（50％）に対して反応を示した。しかしながらオンコトキシン活性は昇温（100℃で30分間）、および還元状態（１mlジチオトレイオトール）に対しては抵抗性を示した。この蛋白質のアミノ末端アミノ酸配列はＮＨ2−Ｐro−Ｓer−Ｔhr−Ｖal−Ｖal−Ａsn−Ｖal−Ｓer−Ａsn−Ｌeu−Ｌys−Ｐro−Ｇly−Ａsp−Ｔhr−Ｉle−Ｇlu−Ｌys−Ｇlu−Ｐhe−で構成されていた。この配列は他の蛋白質の公開されている配列と比較すると独特であった。この配列に基づく合成ペプチドがウサギの体内でポリクローナル抗体をつくるために用いられ、これらの抗体は抗血清を１：10,000に希釈してもオンコトキシンの生物学的な活性を完全に中性化した。これらの抗体を用いてのウェスターン・ブロット分析も20kDaでオンコトキシンの一定の帯を示した。
チミジン組込み法の他に、トリパン・ブルー排除およびＭＴＴ法も高度に生成されたオンコトキシンでＵ−937細胞の長期的な成長の完全な抑制を示した。後者は骨髄腫（Ｕ−937，ＴＨＰ−１，ＨＬ−60）、リンパ腫（Raji, Jurkat）、赤芽細胞腫（Ｋ−562）、乳癌（ＣＬＯ，ＭＣＦ−７）、子宮癌（ＯＶＣＡ429，ＯＶＣＡ432，ＯＶＣＡ433）、腎臓（Ａ−293）及び肝臓癌（Ｈep３Ｂ，ＨepＧ２）を含む種々の異なった腫瘍細胞に対して抗増殖性作用を示した。しかしながら、同様の条件で、ヒト・グリオブラストーマ（Ｕ−251）およびネズミ繊維肉腫（Ｌ−929）はオンコトキシンに対して抵抗性を示した。正常なヒト二倍体包皮線維芽細胞および正常なヒト抹消血液リンパ球も100μg/ml濃度まではオンコトキシンに対して抵抗性を示した。オンコトキシンでＵ−937細胞を24時間処理するとアガロース・ゲル電気泳動で見られるようなＤＮＡフラグメントがもたらされ、これはオンコトキシンによる細胞死の機序がアポプトシスを通じて行われている可能性が非常に高いことを示唆している。全体的に、本発明は幅広い種の腫瘍細胞に対して抗増殖性作用を示す新しいバクテリア性蛋白質の単離を実証している。
本発明の一つの実施の形態で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約20kDaの分子量を有するバシラス・スリンジエンシス亜種スリンジエンシスから誘導され、単離された蛋白質で構成される組成物が提供され、該組成物はＳＥＱ  ＩＤ  NO.１に示されているような部分的アミノ酸配列を有しており、該蛋白質は腫瘍細胞に対して細胞毒性的な効果を示す。
本発明の別の実施の形態で、本発明による新しい蛋白質と薬学的に受け入れ可能な基剤とで構成された医薬品組成物が提供される。
本発明のさらに別の実施の形態で、本発明による蛋白質の調製方法が提供される。
本発明のさらに別の実施の形態で、治療上有効な量の本発明による組成物を該細胞に投与するステップを含む腫瘍細胞を措置する方法が提供される。
本発明の他のそして更なる特徴及び利点は開示の目的で提供される本発明の現時点での好ましい実施の形態を参照することによって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
上に述べた本発明の特徴、利点、及び目的、そして今後明らかになるその他の点をより詳細に理解できるように、上に概要を述べた本発明のより具体的な説明を添付図面に示されているようないくつかの実施の形態を参照して行う。これらの図面は本明細書の一部を構成するものである。なお、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであり、従って本発明の範囲を限定するものではないとして考えられるべきである。
図１はオンコトキシンのソディウムドデシルスルフェート・ポリアクリルアミド・ゲル分析を示している。１μgのオンコトキシンが以下に述べるような15％アクリルアミド・ゲル上で認められた。
図２はオンコトキシンのアミノ末端アミノ酸配列の分析を示している。
図３Ａはウェスターン・ブロット分析によるオンコトキシンの検出を示している。図３Ｂは合成オンコトキシン・ペプチドに対する抗体によるオンコトキシンの生物学的活性の中性化を示している。
図４はオンコトキシンとそのアミノ酸配列上に合成ペプチドを置いた場合との効果の比較を示している。
図５はオンコトキシンの生物学的活性に対する種々のプロテアーゼの影響を示している。
図６はオンコトキシンの生物学的活性に対するpH（図６Ａ）および有機溶剤（図６Ｂ）の影響を示している。
図７はオンコトキシンに関するバイオアッセイを示している。５×103個の細胞（0.2ml）を96ウェル・プレートに入れオンコトキシンと共に37℃の温度で72時間培養して、細胞生存性が以下に述べるようなトリチウムを含むチミジン組込み法によって判定された。すべての判定は三重に行われた。
図８は種々の骨髄細胞株に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図９Ａは種々のリンパ腫細胞株に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図９Ｂは赤芽細胞腫瘍細胞株に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図10は種々の乳癌細胞株に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図11は種々の子宮癌細胞株に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図12は種々の肝臓癌細胞株に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図13は種々のヒト胎仔腎臓細胞株に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図14は種々のグリオブラストーマ細胞株に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図15はネズミの繊維肉腫に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図16はトリパン・ブルー排除法（図16Ａ）及びＭＴＴ法（図16Ｂ）によるヒト組織リンパ腫Ｕ−937細胞の成長に関するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図17は正常なヒト二倍体線維芽細胞（図17Ａ）及び正常なヒト抹消血液白血球（図17Ｂ）に対するオンコトキシンの投与量依存効果を示している。
図18はＵ−937細胞におけるＤＮＡ細分化に対するオンコトキシンの時間依存効果を示している。
図19はオンコトキシン活性とバシラス・スリンジエンシス・クルサタキから得られたＣryIIＡ毒素との比較を示している。
発明の詳細な説明
本発明はバシラス・スリンジエンシス亜種スリンジエンシスから誘導、単離、精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約20kDaの分子量を有する蛋白質で構成された組成物に関するものであり、該蛋白質はＳＥＱ  ＩＤ  NO.１に示すような部分的アミノ酸配列を有しており、そして該蛋白質は腫瘍細胞に対して細胞毒性を発揮する。以下に明確に述べるように、この新しい蛋白質はプロテアーゼおよび酸性状態に対して反応を示し、この細胞毒性作用はジチオスレイオトールによる措置、あるいは100℃の温度への露出に対して抵抗性を示す。
本発明によるこの新しい蛋白質は幅広いタイプの腫瘍細胞に対して細胞毒性を示すが、通常、Ｕ−937細胞、骨髄腫細胞、Ｂリンパ腫細胞、Ｔリンパ腫細胞、赤芽腫細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、及び肝臓癌細胞に対して細胞毒性を示す。この蛋白質は抹消血液リンパ球、およびヒト包皮線維芽細胞のような普通の人の細胞に対しては細胞毒性を示さない。この細胞毒性はその蛋白質に向けられた抗体によって阻止される。
本発明によるこの新しい蛋白質を用いることによって医薬品組成物をつくる可能性が考えられる。こうした場合、その医薬品組成物は本発明による新しい蛋白質と薬学的に受け入れられる基剤とで構成される。この分野の当業者なら、それ程の実験を行わなくても、本発明によるこの新しい蛋白質の投与量および投与経路を判断することができるであろう。
イン・ビボで治療に用いられる場合、本発明の蛋白質は患者や動物に対して治療的に効果のある量、つまり腫瘍負担を根絶、あるいは軽減させる量で投与される。通常は非経口投与、好ましくは静脈注射で投与されるが、他の投与経路を用いてもよい。投与および処方は癌の性質（初期あるいは転移性）およびその群、特定の免疫毒素の性質、例えば治療指数、患者、その患者の病歴やその他のファクターなどに依存する。投与される蛋白質の量は一般的には患者の体重１kgあたり0.1〜10mgの範囲である。投与スケジュールは措置の否定的な効果とのバランスを考慮しつつ、効果を最大限にするように継続される。本明細書に組み入れられるRemington's Pharmeceutical Science, 17版（1990）Mark Publishing Co., Easton, Penn；及びGoodman and Gilman's：The Pharmacological Basic of Therapeutice  第８版（1990）Pergamon Press参照。
蛋白質の非経口投与を行うためには、蛋白質は最も一般的には薬学的に受け入れ可能な非経口投与賦形剤との組み合わせでユニット投与注射可能形態（溶液、懸濁液、乳剤）に調製される。こうした賦形剤は非毒性で治療効果を持たないことが好ましい。こうした賦形剤の例としては水、食塩水、リンゲル液、デキストロース液、および５％ヒト血清アルブミンである。固定油およびエチルオレイン酸エステルなども用いてよい。リポゾームも基剤として用いることができる。この賦形剤は蒸気圧や化学的安定性を強化する物質などの添加剤、例えば緩衝液や保存剤を少量含んでいてもよい。免疫毒素は通常は0.1mg〜10mg  mlの濃度でそうした賦形剤内で調製される。
分子生物学の分野での平均的な科学者の通常の技術レベルは近年高まってきている。この分野での通常の技術を有する人であれば本明細書の教示を参照することにより、この新しい細胞毒性蛋白質の遺伝子をクローンすることは容易にできるであろう。
本発明はまた薬学的に有効な量の本発明による組成物を細胞に投与することを含め、腫瘍性細胞を措置するための方法に向けられたものである。好ましくは、この腫瘍細胞は骨髄腫細胞、Ｂリンパ腫細胞、Ｔリンパ腫細胞、赤芽腫細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、及び肝臓癌細胞によって構成されるグループから選択される。通常、この腫瘍細胞はヒト、又は動物のものである。特に、この新しい組成物が腫瘍状態の再生を遅らせ、該腫瘍細胞の宿主の生残期間を延長させるであろうことが考えられる。
本発明による蛋白質はイン・ビトロの方法でも用いることができる。例えば、この方法は骨髄からの腫瘍細胞を殺すのに用いることができる。この方法においては、骨髄は先ず腫瘍性疾患を有する個体から取り出される。次に、この骨髄を細胞レベルで有効な量の本発明による蛋白質を用いて処理し、残留腫瘍細胞を除去する。措置された骨髄細胞はすべての内発性腫瘍性血液毒性細胞を取り除くために集中化学治療及び／又は放射線治療を受けた後、免疫系の再確立を容易にするために再投与することができる。
以下の実例は本発明の種々の実施の形態を説明するために与えられるものであって、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することは意図していない。
実例１
素材
ＲＰＭＩ−1640はWittaker MA Bioproducts（Walkersvill, MD）から得られたものである。胎児仔ウシ血性（ＦＢＳ）およびジェンタミシンはＧＩＢＣＯ（Grand Island, NY）から入手した。他の薬剤および生化学物質はSigma Chemical Co.（St Louis, MO）から得た。Ｕ−937（組織リンパ腫、ＣＲＬ  1593）、骨髄炎促進性白血病ＨＬ−６０（ＣＣＬ  240）、急性骨髄性白血病ＫＧ−１ａ（ＣＣＬ  246.1）、乳腺癌ＭＣＦ−７（ＨＴＢ  22）、皮膚癌  H epＧ−２（ＣＣＬ  23）、乳癌ＢＴ−20（ＨＴＢ  19）、バーキットリンパ腫ラジ（ＣＣＬ  86）、及びジャーケット（急性Ｔ細胞白血病、ＴＩＢ  152）細胞株はAmerican Type Cell Culture Collection（Rockvill, MD）から得られたものである。細胞はグルタミン（２mM）、ジェンタミシン（50mg/ml）、及び胎児仔ウシ血性（10％）で補ったＲＰＭＩ1640培養液内で通常の方法で培養された。遺伝子組換えＤＮＡ法でつくられたバシラス・スリンジエンシス・クルスタキ毒素（Ｃry IIＡと呼ばれる）（Donovanら、1988）はEcogen Inc. （Langhorne, PA）のWilliam P. Donovan博士から与えられた。
実例２
オンコトキシン・バイオアッセイ
オンコトキシンの生物学的活性を、72時間の期間でヒト組織リンパ腫Ｕ−937細胞内でのチミジン組み込みを抑止するその能力によってモニターした。このアッセイはこれまでに述べられているように（Higuchi及びAggarwal, 1992）行われた。簡単に言えば、細胞（５×103/0.1ml）は96−ウェル・ファルコン・プレートに入れられた。標的細胞に対してオンコトキシンの連続希釈液を加えて37℃で72時間培養した。72時間培養期間の最後の６時間に、トリチウム含有チミジン（6.7Ci/mmole,New England Nuclear, Boston, MA）を各ウェル（0.5mCi/ウェル）に加えた。次にこの細胞懸濁液をPackard Filtermate196細胞ハーベスターの助けを借りてガラス・ファイバー・フィルター上に取り出し、そしてそのフィルターに結合した放射活性をPackard Matrix 9600ダイレクト・ベータ・カウンター（Packard CO., Meriden, CT）内で測定した。細胞の相対的生存可能性は措置された細胞に組み込まれた量を措置されなかった細胞内の量で割ってパーセンテージで示した。
Ｕ−937細胞の成長は修正テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）アッセイ（Hansenら、1989）によって測定された。要約的に言えば、細胞（5000細胞/ウェル）を最終濃度を0.1mlとして種々の濃度のオンコトキシンを加えた場合と加えない場合との条件下で37℃の温度下、いろいろな日数で培養した。その後、0.025mlのＭＴＴ液（ＰＢＳ内に５mg/ml）を各ウェルに加えた。37℃の温度下で２時間培養した後、0.1mlの抽出緩衝液（20％ナトリウムドデシルスルフェート、50％ジメチルフォルムアミド）を加えた。37℃で一昼夜培養した後、抽出緩衝液をブランクとして、96ウェル・マルチスキャナー（Dynatech MR5000）を用いて570nmでの最適濃度を測定した。
実例３
微生物および成長条件
バシラス・スリンジエンシス変種スリンジエンシスはNuevo LeonのAutonama大学の生物科学部、免疫ウィルス学研究所から入手した。そのバクテリアは栄養寒天斜面上で４℃の温度で保持され、これまでに述べられている方法（Cheung及びHammock,1985）で三か月毎に継代培養された。
実例４
結晶および胞子の生産
結晶および胞子の生産はこれまでに述べられた方法（Yamamoto及びMcLaughlin, 1981；Yamamoto及びIizuka, 1983）に従って行われた。簡単に言うと、バクテリアは寒天ブロス内で30℃の温度下で18時間、耐えず振動させながら培養した。この培養のサンプルを30℃の温度下で72時間、寒天培養フラスコで培養し、その後、ＩＭ  ＮａＣｌ内で４℃の温度下で30分間、10,000rpmで遠心分離（Beckman）で結晶を取り出した。ペレットを１Ｍ  ＮａＣｌで３回洗浄して、−20℃の温度下で保存した。
実例５
蛋白質結晶の単離
結晶は臭化ナトリウム勾配（30,31.5,33,34.5及び36％）を用いて25,000rpm（Beckman遠心分離器Ｌ５−50Ｅ、ロータＳＷ−２Ｔ）で４℃の温度下、90分間差分限外遠心分離によって胞子から結晶を得た。結晶を含んでいる帯をプールして、純水で３回洗浄して凍結乾燥してから−20℃の温度で保存した（Ang及びNickerson, 1978）。
実例６
結晶の可溶性化
このステップはPrasad及びShettaによって1974年に述べられた方法で行われた。簡単にいうと、100mgの結晶蛋白質を20mlの１Ｍ  ＮａＯＨを0.1Ｍグルシン内に室温で５時間懸濁させ、その後遠心分離（20,000rpmで４℃の温度下30分間）を行った。アルカリ可溶化結晶と呼ばれるこの上澄液を燐酸緩衝食塩水pH7.2で透析した。サンプルを凍結乾燥して、−20℃の温度で保存した。
実例７
トリプシンによるアルカリ可溶化結晶の活性化
このステップのためにChomaらの手順（1990）を採用した。要約して言うと、アルカリ可溶化画分（５mg/ml）はトリプシン（10％、Ｗ/Ｗ）を0.1Ｍグリシン緩衝液に加えたものpH7.2で37℃の温度下で30分間処理した。サンプルを20,000rpm（Beckman遠心分離器）で30分間、４℃の温度下で遠心分離し、次にその上澄液を燐酸緩衝食塩水pH7.2内で透析した。
実例８
ＤＥＡＥ−アフィゲル・ブルー親和性クロマトグラフィー
上のステップで得たオンコトキシン画分（約２mg/ml）を20mMトリス、pH８内で予備均衡させたＤＥＡＥ−アフィゲル・ブルー・カラム（１×6.5cm）に加えた。このカラムを均衡緩衝液で洗浄して、その後、0.05〜1.0Ｍ  ＮａＣｌのステップ・アップ勾配で溶離した。オンコトキシン画分をバイオアッセイで確認し、蛋白質濃度をバイオラッド法で測定した。
実例９
ＤＮＡ分裂分析
細胞（５×106/ml）をオンコトキシン（50μg/ml）で24時間あるいは72時間措置し、その後スパン・ダウンしてＰＢＳで洗浄し、10mMトリス−Ｃｌ、pH7.4及び１mM  ＥＤＴＡ、pH８内に再懸濁させた。その後、細胞を細胞溶解緩衝液（10mMトリス−Ｃｌ pH８, 100mM  ＮａＣｌ, 25mM  ＥＤＴＡ，及び0.5％ＳＤＳ）で溶解して、Ｒナーゼ（10mg/mlの１μｌ）でＲＮＡを除去した。50℃の温度下で30分間培養した後、１μｌのプロテイナーゼＫ（20mg/ml）をすべてのチューブに加えて、さらに培養を50℃の温度下で30分間継続した。0.4μｌの負荷染料（0.025％ブルモフェノール・ブルー、0.25％キシレン・シアノールＦＦ、及び30％グルコールを水に加えたもの）を加えてから、サンプルをＴＡＥ緩衝液（0.04Ｍトリス酢酸、0.001Ｍ  ＥＤＴＡ）に1.2％アガロース・ゲルを加えたもので溶解した。
実例10
アミノ酸配列分析
オンコトキシンのアミノ酸配列をBaylor医大（Houston, TX）の蛋白質配列決定施設で行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから、蛋白質をＰＶＤＦ薄膜に移して、その後マイクロシーケンサ473Ａ型（Applied Biosystems Inc., Foster City, CA）で配列決定を行った。配列相同性調査はＢＬＡＳＴネットワーク・サービスを用いて国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）で行われた。
実例11
ペプチド合成
オンコトキシンのアミノ酸配列に基づいて、18アミノ酸対ペプチドがBaylor医大（Houston, TX）の蛋白質化学コア施設で合成された。このオンコトキシン・ペプチドの合成のためのFmoc多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）樹脂が用いられた。この合成ペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製してアミノ酸組成の特徴付けを行った。
実例12
抗体生産
上のように合成したペプチドを用いて、100μgの抗原を完全フロイド・アジュバンドに加えたもので皮下投与してウサギを免疫化して抗体（Bethyl Laboratories,Montgomery, TX）をつくった。その後、それぞれ50μgを不完全フロイド・アジュバンド内に加えたものを14日目と21日目に筋肉内注射した。その後、この血清をオンコトキシン・バイオアッセイ内での中性化力価とウェスターン・ブロット分析で免疫反応性に関してテストした。
実例13
ウェスターン・ブロット分析
蛋白質サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル（15％）で電気泳動させた。電気泳動後、サンプルはトリス塩酸（25mM, pH8.3）、グリシン（192mM）、及びメタノール（20％，Ｖ/Ｖ）を含んだ緩衝液内でニトロセルロース・フィルター紙に移した。ＰＢＳ（ＰＢＳ−ツイーン緩衝液）内にＢＳＡ（５％）及びツイーン20（0.1％，Ｖ/Ｖ）を含んだブロッキング緩衝液で上記ニトロセルロース・フィルター紙上の特定されない結合をできるだけ減らした。ＰＢＳ−ツイーン緩衝液で３回洗浄した後、フィルター紙を抗オンコトキシン抗体（１：10,000希釈液）を用いて室温で１時間培養した。このフィルター紙を再度洗って、その後、ヤギ抗ウサギＩgＧ西洋ワサビ・ペロキシダーゼ接合体（１：10000希釈液）を用いて室温で１時間培養した。その後、フィルター紙を４回洗って、強化化学蛍光システム（Amersham）を用いて視覚化した。
実例14
オンコトキシンの単離及び物理化学的特徴付け
Ｕ−937細胞毒性バイオアッセイと勾配超遠心分離、蛋白質分解、及びＤＥＡＦアフィゲル・ブルー親和性クロマトグラフィーの手順で構成される精製手順とを用いて、0.05Ｍ  ＮａＣｌで溶離された蛋白質を単離した。この蛋白質をこの明細書ではオンコトキシンと呼ぶ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって変性状態下で分析を行ったところ、コマシー・ブルー及び銀染色の両方で、約20kDa程度の分子量のところでひとつの大きな帯が現れた（図１）。オンコトキシンをＰＶＤＦ薄膜上にエレクトロブロットして、アミノ酸配列分析を行った。得られたこのアミノ酸末端配列を図２に示す。ペプチドとヌクレオチド配列データベースの両方を用いて調べたところ、オンコトキシンの配列は新しいものであった。
この配列に基づいて、ペプチドを合成し、その後このペプチドを用いてウサギを免疫化した。このオンコトキシン・ペプチドに対して得られた抗体をウェスターン・ブロット分析でオンコトキシン蛋白質とクロス反応させた（図３Ａ）。この抗体は抗血清を１：10,000に希釈させてもオンコトキシンの生物学的活性を中性化させることができた（図３Ｂ）。全長蛋白質よりはずっと短かったが、この合成オンコトキシン・ペプチドはＵ−937細胞に対して一定の活性を示した（図４）。
種々のプロテアーゼ；トリプシン、キモトリプシン、及びプロナーゼ（10％，Ｗ/Ｗ）をオンコトキシンで24時間措置したところこの蛋白質の活性が消失した（図５）。これらの結果は、この生物学的な活性が全長蛋白質に存在していることを示している。プロテアーゼの他、オンコトキシンの活性は酸性状態に対しても反応を示すことが分かった。完全ではないが、その活性のかなりの量がオンコトキシンをpH２に露出した場合に破壊された（図６Ａ）。オンコトキシン活性はトリフルオロ酢酸（0.1％）あるいはアセトニトリル（50％）での措置にも反応を示すことが分かった（図６Ｂ）。しかしながら、この活性はジチオトレイオールでの措置（１mMで２時間）、あるいは100℃への温度への３０分間の露出に対して抵抗性を示した（データ図示せず）。
実例15
オンコトキシンの生物学的特徴付け
オンコトキシンで72時間Ｕ−937を措置したところ、チミジン組み込みで判定してこれらの細胞の成長が抑止された（図７）。15μg/ml濃度のオンコトキシンで50％の抑止が観察された。オンコトキシンのこの作用はいくつかの他のタイプの細胞株でも調べられた。オンコトキシンは他の骨髄腫細胞（図８）、リンパ腫（ＢおよびＴの両方）細胞（図９Ａ）、赤芽腫細胞（図９Ｂ）、乳房腫瘍細胞（図10）、子宮癌細胞（図11）、および肝臓癌（図12）に対しても抑制作用を発揮した。胎児腎臓細胞はオンコトキシンに対して比較的高い抵抗性を示した（図13）。ヒト・グリオブラストーマ細胞およびマウス・線維肉腫はオンコトキシンによってまったく影響を受けないことが分かった（図14および図15）。細胞成長を50％抑止するのに必要なオンコトキシンの量を分析したところ、それは腫瘍細胞タイプによって非常に差があった（表Ｉ）。
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96−ウェル・プレートに入れた細胞（５×103/0.1ml）を37℃の温度で72時間培養した。最後の６時間の間に、細胞にトリチウム含有チミジンで刺激を与えた。すべての判定は三重で行われた。
チミジン組み込みの他に、細胞成長はトリパン・ブルー排除法および細胞をＭＴＴで染色することによってモニターした。これら２つの方法による、オンコトキシンがある場合とない場合のＵ−937細胞の成長曲線を図16に示した。これらの結果はオンコトキシンにより細胞成長が完全に抑止されたことも示している。
腫瘍細胞の他に、いくつかの正常な細胞もオンコトキシンに対する感作性がテストされた（図17）。正常で新鮮な抹消血液リンパ球とヒト包皮線維芽細胞の両方とも100μg/mlの濃度でもオンコトキシンに対して抵抗性を示した。
形態学的にはＤＮＡ分裂、薄膜分解、クロモゾーム濃縮で特徴づけられるアポプトシスと糸粒体膨張を伴う壊死性細胞死の２つのタイプの細胞死がある。オンコトキシンによるＵ−937細胞の措置はＤＮＡ分裂をもたらし（図18）、従って細胞死がアポプトシスによるものであることを示している。
オンコトキシンの活性はバシラス・スリンジエンシスの別の亜種から単離された毒素とも比較された。バシラス・スリンジエンシス変種クルスタキからの毒素に対するｃＤＮＡもクローンされている。その予想されるアミノ酸配列はオンコトキシンとは異なっている。組換えＤＮＡ法でつくられたバシラス・スリンジエンシス・クルスタキ毒素は66kDaの分子量を有している（Ｃry IIＡと呼ばれる）（Donovanら、1988）。Ｃry IIＡ毒素はバイオアッセイでは何の作用も示さなかった（図19）。
ここに述べている発明はバシラス・スリンジエンシス亜種スリンジエンシスが分子量がほぼ20kDaの新しい蛋白質を表現することを示している。オンコトキシンといわれるこの蛋白質は独特のアミノ酸配列を有しており、種々の腫瘍細胞を殺すが正常な細胞は殺さず、その作用はアポプトシス性メカニズムによるものである可能性が高い。
バシラス・スリンジエンシス・スリンジエンシスから誘導されたオンコトキシンのアミノ酸配列はまったく独特である。バシラス・スリンジエンシス・スリンジエンシスからの結晶性蛋白質Ｃry Ａ４の遺伝子（分子量130kDa）がクローンされている（Bizzard及びWhiteley, 1988）。オンコトキシンの配列はこの蛋白質とはまったく異なっている。また、抗腫瘍および殺虫作用の両方を示す分子量が13kDaの酸性毒素もバシラス・スリンジエンシス・スリンジエンシスから得られることが報告されている。この抗腫瘍バシラス・スリンジエンシス・スリンジエンシス蛋白質は分子量が違うことと（13kDa：20kDa）、多数の酸性残基が存在している（42％及びＧlu）ことからオンコトキシンではない。その単離手順も、その活性画分がＤＥＡＥセルロース上で0.27Ｍ  ＮａＣｌで溶出され（オンコトキシンは0.05Ｍ  ＮａＣｌで溶出される）、さらにトリプシン消化ステップを含んでいないという点でここで用いられている手順とは異なっていた。この酸性毒素はまた硫黄含有アミノ酸残基を含んでおらず、結晶形態を有していた。13kDaのバシラス・スリンジエンシス・スリンジエンシスのアミノ酸配列は報告されていない。
バシラス・スリンジエンシス・スリンジエンシスから得られることが報告されている別の蛋白質はトリプシンによって蛋白質分解的に活性化されて分子量が55,000の第二の毒素に分解される分子量が70,000の毒素を放出するプロトキシンである（Huber-Lukacら、1983）。この毒素は熱およびアルキル化によって非活性化され、このことは特定の配座及びスルフィジル基の役割を示唆している。対照的に、オンコトキシンはサイズが20kDaで、熱（100℃で30分間）と還元状態の両方に対して安定である。バシラス・スリンジエンシス・クルスタキからの毒素は生物学的活性を表現するために高度のアルカリ性状態を必要とするが（Gringortonら、1992）、この特徴もオンコトキシンとは異なっている。さらに、バシラス・スリンジエンシス・クルスタキ蛋白質は抗腫瘍作用を発揮することは示されていない。これは組換えバシラス・スリンジエンシス・クルスタキ毒素を用いてここに報告されている観察事実と一致している。バシラス・スリンジエンシス・イスラエリエンシスから誘導された分子量が20kDaの別の蛋白質はＣytＡ Ｓ蛋白質（27.3kDa）の結晶形成を促進し、ＣytＡ毒性の抑止に導く（Wu及びFederici, 1993）。
バシラス・スリンジエンシスの異なった亜種からのほとんどの結晶性蛋白質は、二つの内部構造、半分が毒性を有するα−螺旋構造を有するアミノ酸末端及び半分が交互に繰り返されるβ−ストランドとコイル構造を有するカルボキシル末端を有し、結晶構造の組み立て及び安定性に重要な役割を果たしている（Conventsら、1990）。ｄ−エンドトキシン（Ｃry IIIＡ，60−70kDa）の結晶構造は３つの内部構造、つまり７つの螺旋状束、３つのシート状領域、そしてβサンドウィッチを有していることが分かっている（Liら、1991）。螺旋部は薄膜の孔形成に使えるようになっており、シート領域はリセプタ結合に関与している。
バシラス・スリンジエンシスから誘導される蛋白質の腫瘍細胞に対する細胞毒性についてはほとんど分かっていない。サイズが25kDaのバシラス・スリンジエンシス・イスラエリシス毒素はそれ自体がマウス腫瘍細胞に対して細胞毒性を示し、それはイン・ビトロおよびイン・ビボの両方で一定の抗腫瘍剤の細胞毒性作用を強化する（Thomas & Ellar, 1983；Yokoyamaら、1988；Yokoyamaら、1991）。種々の化学治療剤のうちで、最も高い相乗効果はブレオミシンとの間で見られる。バシラス・スリンジエンシス・スリンジエンシスから誘導された蛋白質はイン・ビボでマウス腫瘍細胞に対して細胞毒性を示すことも分かっている（Prasad及びShethna,1973,1974）。
バシラス・スリンジエンシス誘導蛋白質が腫瘍細胞を殺す機序は未だ分かっていないが、バシラス・スリンジエンシス・イスラエリシス誘導毒素が特定のプラズマ薄膜脂質と結合して、脂質を洗剤のように再構成して薄膜の一体性の崩壊と最終的な細胞溶解を引き起こすことは分かっている（Thomas及びEllar, 1983）。昆虫の細胞においては、この毒素は（Ｎａ，Ｋ）−ＡＴＰaseを抑止することが示されている（Englishら、1986）。オンコトキシンがこうした広い範囲の細胞を同様の機序で殺すのかどうかは明らかではない。オンコトキシンは細胞内でＤＮＡ分裂を誘発し、これは細胞死のアポプトシス性メカニズムの特徴のひとつである。さらに、オンコトキシンは正常な細胞に対しては毒性を示さないことが分かっている。しかしながら一部の腫瘍細胞はオンコトキシンに対して反応を示すことが分かった。
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この明細書で触れられているすべての特許あるいは刊行物は本発明が関連する技術分野の当業者のレベルを示している。これらの特許および刊行物は個々の刊行物を具体的、個別的に参照することによって本明細書に組み込まれるのと同じ程度に全体として本明細書に組み込まれている。
本発明が上に述べた目的を実施し、課題と利点、及びそれらに本質的に付随する課題と利点を達成するのによく適していることは容易に分かるであろう。これらの実例はここに述べられている方法、手順、措置、分子、および具体的な化合物と共に好ましい実施の形態の現段階における代表例であり、事例であって、本発明の範囲を限定するものではない。当業者なら特許請求の範囲に定義されている本発明の精神の範囲内で、その変更およびその他の利用法は容易に想起できるであろう。
配列のリスト
（１）一般情報
（ｉ）出  願  人：アガルワル，バハラト  ビー．及びパディラ，クリスティナ  ロドリゲス
（ii）発明の名称：バシラス・スリンジエンシス変異体スリンジエンシスからの新しい抗増殖性蛋白質
（iii）配  列  数：１
（iv）通信用住所
（Ａ）あて先：ジェイムス  エフ・ウエイラー  法  代理人
（Ｂ）街  路：スイート1560、ワン  リバーウエイ
（Ｃ）都  市：ヒューストン
（Ｄ）州：テキサス
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：77056
（ｖ）コンピュータ読み取り方式：
（Ａ）メディアタイプ：DS, HD1.44 Mb/1.44 Mo
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ互換型ＰＣ
（Ｃ）オペレーティングシステム：PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト6.0
（vi）現出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分  類：
（viii）弁理士／代理人に関する情報：
（Ａ）氏  名：ウエイラー，ジェイムス  エフ．
（Ｂ）登録番号：16,040
（Ｃ）参考／処理番号：D−5789
（ix）電信電話情報：
（Ａ）電話番号：713-626-8646
（Ｂ）テレファックス：713-963-5853
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長  さ：20
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）繊維状：
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）分子タイプ：
（Ａ）記  事：蛋白質
（iii）ヒポセチカル：なし
（iv）アンチセンス；なし
（vi）本来のソース：
（Ｂ）菌  株
（Ｃ）個体分離：
（Ｄ）開発段階：
（Ｆ）組織タイプ：
（Ｇ）細胞タイプ：
（Ｈ）細胞株：
（xi）配列説明：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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