(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ｌｏｎｇｕｍから得られる酵素グルコースイソメラーゼを含有することを特徴とするグルコース測定用キット。
【請求項２】
システイン・カルバゾール試薬を含有することを特徴とする請求項１に記載のグルコース測定用キット。
【請求項３】
酵素安定剤、酵素活性化剤及び緩衝剤から選ばれる一種または二種以上を含有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載のグルコース測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ｌｏｎｇｕｍから得られる酵素グルコースイソメラーゼを含有することを特徴とし、他の共役酵素を使用することなく、また、保存不安定な試薬を使用することなく、試料に含有されるグルコースを効率よく、かつ正確に測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、グルコースの測定は血液、尿などの体液を対象とする臨床診断薬および食品中の糖成分の測定する方法として広く利用されている。特に成人病として発症率の高い糖尿病の鑑別診断においては必須の測定項目となっており、また、食品においても甘味度の評価基準、品質管理の手段などとして活用されている。このグルコースの測定方法として、従来よりグルコースの還元力を利用した各種の化学的方法や酵素を利用した方法が知られているが、化学的測定法は反応試薬に発ガン性物質を含むことなどから、近年、測定前の処理が簡単で、しかも短時間で測定が可能な酵素法が測定方法として広く活用されている。酵素法としては、グルコースオキシダーゼを使用した方法やヘキソキナーゼを使用した方法が知られている。
【０００３】
しかしながら、従来の酵素法では測定のために各種の共役系の酵素が必要であり、ヘキソキナーゼ法ではヘキソキナーゼとグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼの２種が必要であり、グルコースオキシダーゼ法はグルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼの２種の酵素が必要となる。そのため各酵素液の調整が繁雑であり、酵素液の安定保存にも留意しなければならない。さらに、ヘキソキナーゼ法は反応試薬としてＡＴＰおよびＮＡＤＰＨなど不安定で高価な薬品を使用する必要があり、グルコースオキシダーゼ法においてもフェノールやアミノアンチピリンなどの保存不安定な薬品を必要とする。以上のように、従来の酵素法によるグルコースの測定法は、２種類の酵素および数種類の発色試薬による複雑な連続反応であり、各反応を統一させ、最適化することは、使用する各構成成分の安定化を含めて調整が難しいという欠点がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来のグルコースの測定用キットおよびそれを用いる測定方法が有する欠点を克服し、グルコースを効率よく、かつ正確に測定しうる試薬およびその測定方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前述の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、Bifidobacterium属から得られた酵素グルコースイソメラーゼを使用することにより、他の共役酵素を使用することなく、また、反応試薬としてＡＴＰやＮＡＤＰＨなどの保存不安定な薬品を使用せずに、正確に、かつ効率よく簡単にグルコースが測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、Bifidobacterium属から得られた酵素グルコースイソメラーゼを使用し、酵素反応によって生成したフルクトースをシステイン・カルバゾール法、アンスロン法およびレゾルシン塩酸法などのケトヘキソース定量法を利用して試料中に含まれるグルコースを測定することを特徴とする、その測定方法とその測定キットに関するものである。
【０００７】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明においてグルコース測定用の酵素としてはBifidobacterium属の生産するグルコースイソメラーゼを用いることができる。本酵素は、従来よりグルコースをフルクトースに異性化する際に利用されるキシロースイソメラーゼとは異なり、キシロースよりグルコースに対する基質特異性が高い酵素である。そのため、グルコースから効率よくフルクトースを生産できる酵素として特許出願（特願昭第１９４４５３号）を行った。その後、さらに研究を重ねた結果、本酵素はグルコースに対する親和性が高く、１ｍＭなどの低濃度のグルコースにおいても酵素反応が可能であり、さらに、その酵素反応の再現性も高く、生成したフルクトース量から反応液中のグルコース量を換算定量することが可能であることが判明した。
【０００８】
Bifidobacterium属の微生物は理化学研究所、アメリカンタイプカルチャーコレクションおよび醗酵研究所からだれもが購入できる菌株で利用可能であり、例えば、Bifidobacterium adolescentis、B. animalis、B. bifidum、B. breve、B. coryneforme、B. globosum、B. infantis、B. longum、B. magnum、B. minimum、B. pseudolongum、B. subtile、B. thermophilumなどである。これらの微生物を培養する培地としてはグルコースの他にペプトン、酵母エキスなどを含む通常Bifidobacterium属を培養する培地を使用することが可能であり、30〜40℃で10〜30時間、静置もしくは嫌気培養を行い、遠心分離などにより菌体を得ることができる。得られた菌体から該酵素を採取する方法として以下のような方法が挙げられる。例えば、菌体の破砕方法は超音波または海砂、アルミナなどを使用した磨砕法、有機溶媒を使用した自己消化法などが利用できる。このようにして得られた酵素液をそのまま使用したり、凍結保存して使用時解凍するなどして使用してもかまわないが、好ましくは、それらの酵素を凍結乾燥して用いた方が良い。さらにイオン交換樹脂などを使用して得られる部分精製酵素や純品酵素を利用することも可能である。
【０００９】
該グルコースイソメラーゼを使用してグルコースを測定する反応条件としては、通常ｐＨ6.5〜7.5、温度30〜40℃において、1〜120分ほど反応が行われる。従って、酵素反応を支障なく行うためにはｐＨ5.0〜8.5、好ましくはｐＨ6.5〜7.5の範囲を保持する緩衝剤を使用することができ、通常の方法で製造することができる。緩衝剤としてはトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、リン酸塩などｐＨ6.5〜7.5の範囲で緩衝作用を示す緩衝剤であれば良く、溶液の状態でも粉末化しても良い。ただし、粉末化した緩衝剤の場合は、使用時に水を加えて溶液の状態で使用する。酵素の使用量としては特に制限はないが、反応時間内に生成物が最大になるように、適宜必要量を添加すればよく、通常0.1〜10,000ユニットの範囲で使用される。この場合１ユニットは37℃で１分間に１マイクロモルのフルクトースを産出するのに必要な酵素量を示す。使用する酵素は純品を用いても粗精製品を使用してもかまわないが、夾雑する糖成分の種類が多い場合にはグルコース測定値をより正確にするために精製酵素を利用することが好ましい。
【００１０】
また、本酵素はエデト酸、フィチン酸などのキレート作用を有する成分が含まれた試料を測定する場合、酵素活性が低下する可能性があるため、酵素活性化剤としてマグネシウム、マンガン、コバルトおよびカルシウムなどをそれぞれ塩化物、硫酸化物などの塩の形で添加することもできる。添加量としては通常0.0001〜10％、好ましくは0.01〜1％である。また、酵素の安定化剤として必要に応じてグリセリン、糖アルコールなどの多価アルコールやアルブミンなどのタンパク質を添加することも可能であり、特に精製した酵素や凍結乾燥処理した酵素を利用する場合には、酵素の活性が低下する可能性があるため、アルブミンなどのタンパク質を添加することが好ましい。添加量は多いほど効果が高いが、通常酵素量の１〜1000倍量で、好ましくは２〜100倍量である。尚、本酵素反応は必要に応じてトリクロル酢酸などの酸処理および加熱処理などにより停止することができる。
【００１１】
次に、得られた反応液中のフルクトースをシステインとカルバゾールを反応試薬として使用するケトヘキソースの定量方法であるシステイン・カルバゾール法などを利用して測定を行い、予め作成した検量線から試料中のグルコース量を知ることができる。本発明で用いるシステイン・カルバゾール試薬はシステインとカルバゾールを混合したものおよびそれぞれ単独に用いたものでもかまわない。システインは１回の測定において酵素反応溶液１mlに対して通常0.1〜30mg、好ましくは0.5〜10mgを添加することができる。カルバゾールは１回の測定において酵素反応溶液１mlに対して通常0.01〜3mg、好ましくは0.05〜1mgを添加することができる。緩衝剤、酵素活性化剤、酵素安定化剤およびシステイン・カルバゾール試薬に用いる薬品等は市販品を利用できる。
【００１２】
本発明に用いられるグルコース測定用試料は、グルコースを含有するものであればよく、特に制限はないが、具体的にはヒトおよび動物などの体液や組織およびそれらの抽出液、あるいは微生物の培養液、植物の抽出液の他に、ジュース、パン等の食品類などを用いることができる。また、グルコース含有試料が個体の場合、いったん水または緩衝液に溶解または懸濁させてから測定を行うとよく、必要に応じて不溶物を濾過することもできる。
【００１３】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１  グルコースイソメラーゼの調製方法
ポリペプトン1.5g、グルコース2.0g、食塩0.5g、酵母エキス0.5g、システイン0.04gを精製水100gに溶解後、ＮａＯＨにてpHを7.0に調整し、121℃、15分間、高圧滅菌を行い37℃に冷却後、Bifidobacterium longumを植菌し、37℃、20時間静置培養を行い前培養液を作製する。別にポリペプトン15g、グルコース20g、食塩5g、酵母エキス5g、システイン0.4gを精製水1kgに溶解し、ＮａＯＨにてpHを7.0に調整後、121℃、20分間、高圧滅菌を行った後、37℃に冷却し、予め作製した前培養液60mlを添加し37℃、20時間静置培養を行う。得られた本培養液を遠心分離にて集菌し、得られた菌体10gに10mMリン酸緩衝液（pH7.0）10mlを加え、４℃に冷却しながら、超音波破砕器にて２分間処理を５回行って菌体を破砕し、酵素液を得る。得られた酵素液を凍結乾燥処理して酵素の粉末品0.2gを得る。
【００１４】
実施例２  グルコースイソメラーゼの調製方法
ポリペプトン13g、グルコース20g、食塩5g、酵母エキス5g、システイン0.3g、リン酸二カリウム2g、酢酸ナトリウム5g、硫酸マグネシウム0.1gを精製水1000gに溶解後、ＮａＯＨにてpHを7.0に調整し、121℃、15分間、高圧滅菌を行い37℃に冷却後、Bifidobacterium adolescentisを植菌し、37℃、20時間静置培養を行い前培養液を作製する。別にポリペプトン130g、グルコース200g、食塩50g、酵母エキス50g、システイン3g、リン酸二カリウム20g、酢酸ナトリウム50g、硫酸マグネシウム1gを精製水10kgに溶解し、ＮａＯＨにてpHを7.0に調整後、121℃、30分間、高圧滅菌を行った後、37℃に冷却し、予め作製した前培養液500mlを添加し37℃、20時間静置培養を行う。得られた本培養液を遠心分離にて集菌し、得られた菌体100gに20mMリン酸緩衝液（pH7.0）100mlを加え、４℃に冷却しながら、超音波破砕器にて２分間処理を５回行って菌体を破砕し、酵素液を得る。得られた酵素液120mlを予め20mMリン酸緩衝液（pH7.0）にて平衡化したDEAEセルロース200ｃｍ3カラムに供し、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）800mlで洗浄後、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）400mlおよび0.8M塩化カリウムを含む同緩衝液400mlにてグラディエント溶出を行い酵素を精製する。得られた酵素液を20mMリン酸緩衝液（pH7.0）1000mlで２回透析を行い脱塩した後、凍結乾燥処理して酵素の粉末品2gを得る。
【００１５】
実施例３  血清中のグルコース量の測定
実施例１の方法で得られたグルコースイソメラーゼ凍結乾燥粉末を使用したグルコース測定方法について説明する。ウサギ血清0.01mlに20mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩溶液（pH7.0）0.89mlを加えた後、グルコースイソメラーゼ凍結乾燥粉末100ユニットを20mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩溶液（pH7.0）2mlに溶かした溶液0.1mlを添加し、37℃にて10分間反応を行う。反応終了後、直ちに氷水中で冷し、1.5％システイン溶液0.2ml、70％硫酸６ml、0.12％カルバゾール溶液0.2mlを添加して攪はん後、30℃、30分間反応を行う。得られた反応液の560nmにおける吸光度を測定し、予め作成したフラクトースの検量線からグルコース含有量を算出する。
【００１６】
実施例４  清涼飲料中のグルコースの測定
実施例２で調製したビフィズス菌由来グルコースイソメラーゼ10,000ユニットを含む小ビンＡ、システイン60mgを含む小ビンＢおよびカルバゾール4.8mgを含む小ビンＣからなるグルコース測定用キット。
清涼飲料１mlを精密に計り採り、精製水にて100倍に希釈した後、正確に0.05ml採り試料とする。試料に0.05Mリン酸緩衝液（pH7.2）0.4mlを加えた後、小ビンＡに0.05Mリン酸緩衝液（pH7.2）２mlを加えて溶かした溶液を0.05ml加え、37℃、10分間反応を行う。反応終了後、氷水中にて冷却し、小ビンＢに精製水４mlを加えて溶かした溶液0.1mlおよび70％硫酸３ml、小ビンＣにエタノール４mlを加えてとかした溶液0.1mlを加えて攪はん後、30℃、30分間反応を行う。得られた反応液の560nmにおける吸光度を測定し、予め作成したフルクトースの検量線からグルコース含有量を算出する。
【００１７】
実施例５  血清中のグルコースの測定
実施例２で調製したビフィズス菌由来グルコースイソメラーゼ5,000ユニット、酵素安定化剤であるアルブミン２mgおよび酵素活性化剤である塩化マグネシウム２mgを含む小ビンＡからなるグルコース測定用キット。
マウス血清0.01mlに0.05Mリン酸緩衝液（pH7.2）0.39mlを加えた後、小ビンＡに0.05Mリン酸緩衝液（pH7.2）２mlを加えて溶かした溶液を0.1ml添加して37℃、10分間反応を行う。反応終了後、氷水中に冷やし、1.5％システイン溶液0.1ml、70％硫酸３ml、0.12％カルバゾール溶液0.1mlを加えて攪はん後、30℃、30分間反応を行う。得られた反応液の560nmにおける吸光度を測定し、予め作成したフルクトースの検量線からグルコース含有量を算出する。
【００１８】
実施例６  みかん中のグルコースの測定
実施例２で調製したビフィズス菌由来グルコースイソメラーゼ10,000ユニット、リン酸水素二ナトリウム73mgおよびリン酸二水素カリウム35mgを含む小ビンＡからなるグルコース測定用キット。
みかん一房採集し、乳鉢でよくすりつぶした後、不溶分を遠心除去し、得られた上清から0.1mlを正確に採り、精製水を9.9mlを加え試料とする。小ビンＡに精製水10mlを加えて溶解させた溶液0.4mlに試料0.1mlを加え、37℃、10分間反応を行う。反応終了後、氷水中に冷やし、1.5％システイン溶液0.1ml、70％硫酸３ml、0.12％カルバゾール溶液0.1mlを加えて攪はん後、30℃、30分間反応を行う。得られた反応液の560nmにおける吸光度を測定し、予め作成したフルクトースの検量線からグルコース含有量を算出する。
【００１９】
実施例７  マウス血清中のグルコースの測定
実施例１で調製したビフィズス菌由来グルコースイソメラーゼ10,000ユニット、リン酸水素二ナトリウム73mgおよびリン酸二水素カリウム35mgを含む小ビンＡ、システイン60mgを含む小ビンＢ、カルバゾール4.8mgを含む小ビンＣからなるグルコース測定用キット。
小ビンＡに精製水10mlを加えて溶かした溶液0.49mlを採り、マウス血清0.01mlを加え、37℃、10分間反応を行う。反応終了後、氷水中に冷やし、小ビンＢに精製水４mlを加えて溶かした溶液0.1ml、70％硫酸３ml、小ビンＣにエタノール４mlを加えて溶かした溶液0.1mlを加えて攪はん後、30℃、30分間反応を行う。得られた反応液の560nmにおける吸光度を測定し、予め作成したフルクトースの検量線からグルコース含有量を算出する。
【００２０】
【発明の効果】
本発明は、上記のごとく新規なグルコースイソメラーゼ酵素を使用することにより、使用する酵素が１種類で良く、また、経時不安定なＡＴＰやＮＡＤＰＨなどの薬品を使用することなく、グルコース量を精度よく、容易に測定することができる利点がある。グルコース測定用キットとして市販されているグルコースオキシダーゼ法によるグルコースＢ-テストワコー（和光純薬工業株式会社製）およびヘキソキナーゼ法によるＦ−キット  グルコース／フルクトース（ベーリンガー・マンハイム株式会社製）についてウサギ血清を使用してグルコースの測定値の比較を行った。実施例１の方法に従って得た測定値は1.13mg／mlであり、グルコースＢ-テストワコーの測定値は1.11mg／ml、Ｆ−キット  グルコース／フルクトースの測定値は1.16mg／mlであった。これより、今回、開発したグルコースイソメラーゼを使用したグルコース測定方法は従来の測定方法と同等の測定結果を得ており、実用に対してなんら問題はない。