(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸抱合型胆汁酸を胆汁酸硫酸スルファターゼ及び還元系発色試薬を用いて定量する方法において、還元系発色試薬が２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である硫酸抱合型胆汁酸の定量法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
（１）検体に胆汁酸硫酸スルファターゼを作用させ、
（２）次いで、得られた３β−ヒドロキシ胆汁酸にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下、β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を作用させ、
（３）３−オキソ胆汁酸と共に生じるＮＡＤＨに、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を作用させることによって生成するホルマザン類を定量する
ことを特徴とする定量法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
（１）検体に胆汁酸硫酸スルファターゼを作用させ、
（２）次いで、得られた３β−ヒドロキシ胆汁酸にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下、β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を作用させ、
（３）(i)３−オキソ胆汁酸と共に生じるＮＡＤＨに、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を作用させることによって生成するホルマザン類及び
(ii)３−オキソ胆汁酸に、３−オキソ−５β−ステロイド−Δ4−脱水素酵素及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を作用させることによって生成するホルマザン類
の合計量を定量する
ことを特徴とする定量法。
【請求項４】
電子キャリアーが、ジアホラーゼ、１−メトキシフェナジニウムメチルサルフェート及び９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライドからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の定量法。
【請求項５】
第１試薬及び第２試薬を含む硫酸抱合型胆汁酸定量キットであって、
（Ｉ）第１試薬が、β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を含み、
（II）第２試薬が胆汁酸硫酸スルファターゼを含む
硫酸抱合型胆汁酸定量キット。
【請求項６】
請求項５に記載のキットであって、第１試薬が、更に３−オキソ−５β−ステロイド−Δ4−脱水素酵素を含むことを特徴とするキット。
【請求項７】
電子キャリアーが、ジアホラーゼ、１−メトキシフェナジニウムメチルサルフェート及び９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライドからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項５又は６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、硫酸抱合型胆汁酸の定量法および硫酸抱合型胆汁酸定量キットに関するものであり、特に、このキットは、肝胆道系疾患診断に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
肝胆道系疾患によって、血液中の胆汁酸が著しく増加することは、よく知られており、血液中の胆汁酸の定量は、臨床検査において肝機能を調べる上で重要な項目となっている。尿中にあっても胆汁酸は血液中と類似した動態を示すことが明らかにされているが、尿中では胆汁酸の多くが水溶性の高い硫酸抱合型（胆汁酸の３位の水酸基の硫酸エステル型）として存在するようになるため、その測定が容易でなかった。
【０００３】
本発明者等は、先にこの硫酸抱合型胆汁酸の３α位の硫酸エステルを効率良く加水分解する酵素：胆汁酸硫酸スルファターゼ（ＢＳＳ）を開発し、この酵素を主剤として生体試料中の硫酸抱合型胆汁酸を酵素法により簡便に測定する方法を確立した（特開平２−１４５１８３）。
【０００４】
続いて、この方法による尿中硫酸抱合型胆汁酸の測定が肝胆道系疾患の検査法として、ＧＯＴ、ＧＰＴ、γ−ＧＴＰ、ＴＢＡ等の血液化学検査と同等の診断効率を示し、この方法が尿による非侵襲的肝機能検査法として有用であることが明らかにされた（肝胆膵、第３１巻（１９９５年）、第２号、３１５−３２６頁  ）。
【０００５】
この方法（従来法）の測定原理は、硫酸抱合型胆汁酸を、まずＢＳＳによって３β−ヒドロキシ胆汁酸に変換させ、この胆汁酸へβ−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（β−ＨＳＤ）を該脱水素酵素の補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下に反応させることにより、３−オキソ胆汁酸と共に生じるＮＡＤＨを、ＮＡＤＨの高感度発色試薬として汎用されている還元系発色試薬、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）で比色定量する方法に基づいている。しかし、臨床検査法として、多数の検体を人手をかけずに、迅速に測定するという点では、以下の点で未だ充分ではなかった。
【０００６】
即ち、尿を検体とするこの方法では、血清に比べて個体差が大きく、尿検体の内因性の発色物質によるブランク値の継続的な増加があって、その程度が尿検体によって変動するため、測定値からそのブランク値を消去するためにＢＳＳを省いたブランク試薬による測定も行なわなければならず、１検体の測定に、２種類の測定を並行して行う必要があり、操作が煩雑である。また、還元系発色試薬のニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）およびそのホルマザンは、水に溶解しにくく、比色定量に用いるセルを１度使用すると試薬に汚染され、再利用するには、非常に綿密な洗浄が必要となり、自動分析装置への適用が困難になっている。従って、現状では測定は用手法とならざるを得ず、そのため、処理検体数、時間等で制約を受けている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は人手をかけず、より簡便に測定できるようにすべく、汎用されている自動分析装置に適した硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びキットを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
自動分析装置用分析試薬の条件として、（１）１つの測定反応系で検体ブランクの消去を可能とする、（２）全反応を短時間で完了する、（３）装置の汚染の心配がなく、高感度の測定を可能とする、を挙げて鋭意検討を重ねた。
【０００９】
本発明者らは、研究段階において、ＮＴＢ（以下、比較試薬ａとする。）
【００１０】
【化１】
0003760250.tif 000002
【００１１】
に代えて試薬として種々の水溶性の還元系発色試薬の使用、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（以下、比較試薬ｂとする。）
【００１２】
【化２】
0003760250.tif 000003
【００１３】
や２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩（以下、比較試薬ｃとする。）
【００１４】
【化３】
0003760250.tif 000004
【００１５】
等の試薬を試みた。しかし、これら試薬を使用しても、尿中の発色物質の影響を強く受け、ブランク値が安定せず、自動化には適しておらず、本目的を達成するものではなかった。
【００１６】
しかしながら、更なる研究において、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（以下、本還元系発色試薬という。）
【００１７】
【化４】
0003760250.tif 000005
【００１８】
(但し、Ｍ+は、アルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンを示す。)
を使用することにより、初めて上記目的を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
即ち、本発明者等は還元系発色試薬であるテトラゾリウム塩の中で、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩が尿又は血液中の発色物質の影響を受ける程度が極く軽微で、許容範囲内に納まることを見い出した。即ち、本発明では、この試薬を用いることにより、同一セルで第１反応として、第１試薬に含まれる発色試薬を作用させることによって検体中の内因性発色物質によるブランク発色反応を行なわせ、ブランク値として測定後、第２試薬に含まれるＢＳＳを作用させ、検体中の硫酸抱合型胆汁酸の脱硫酸生成物による発色反応を測定、両反応の差から硫酸抱合型胆汁酸を測定することが可能となった。
【００２０】
また、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩およびそのホルマザンは、水溶性であることから、セルの洗浄が容易で、装置の汚染の心配が無く、且つ、そのホルマザンの分子吸光係数が ε＝ 3.7×104 (λ＝ 438nm) と高いことから、高感度測定が可能であった。
【００２１】
即ち、本発明は、硫酸抱合型胆汁酸を胆汁酸硫酸スルファターゼ（ＢＳＳ）及び還元系発色試薬を用いて定量する方法において、該還元系発色試薬が２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である硫酸抱合型胆汁酸の定量法及び定量キットを提供する。
【００２２】
詳しくは、（１）検体にＢＳＳを作用させ、（２）次いで、得られた３β−ヒドロキシ胆汁酸にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下、β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（β−ＨＳＤ）を作用させ、（３）３−オキソ胆汁酸と共に生じるＮＡＤＨに、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を作用させることによって生成するホルマザン類を定量することを特徴とする定量法を提供するものである。
【００２３】
キットとして、本発明は、β−ＨＳＤ、ＮＡＤ、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を含む第１試薬、及びＢＳＳを含む第２試薬を含む硫酸抱合型胆汁酸定量キットを提供する。
【００２４】
更に、β−ＨＳＤの反応生成物である３−オキソ胆汁酸に作用する脱水素酵素、３−オキソ−５β−ステロイド−Δ4−脱水素酵素(Δ4−ＤＨ)を共役させることにより、脱水素反応の結果生じるＨ+の受容体として２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩が反応し、更に１分子のホルマザンが生成することから、吸光度値が約２倍になり、この酵素を共役させることにより測定感度は、従来の約２倍にアップすることも見出した。
【００２５】
即ち、本発明は、上記定量法の（３）の工程において、(i)３−オキソ胆汁酸と共に生じるＮＡＤＨに、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を作用させることによって生成するホルマザン類及び(ii)３−オキソ胆汁酸にΔ4−ＤＨ及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を作用させることによって生成するホルマザン類の合計量を定量することを特徴とする定量法、及び、上記キットの第１試薬が、β−ＨＳＤ、ＮＡＤ、電子キャリアー、Δ4−ＤＨ及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を含むキットも提供する。
【００２６】
この感度の上昇により、検体量が少なくてすむようになり、検体中の夾雑物の影響も減り、より精密な値が得られるようになった。
【００２７】
これら上記定量法は、尿又は血液中の硫酸抱合型胆汁酸を定量することが可能である。
【００２８】
上記定量法及びキットに使用される電子キャリアーとは、電子供与体から電子受容体へ電子を移動させる反応を触媒する物質である。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本還元系発色試薬である２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩は、公知物質である。例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。例えば、モノナトリウム塩として、株式会社同仁化学研究所から、ＷＳＴ−１の名称で販売されているものが使用できる。
【００３０】
本発明に使用する各種酵素、ＢＳＳ、β−ＨＳＤ及びΔ4−ＤＨは、公知物質であり、いずれの生物由来のものでも用いられ、例えば、いずれも Pseudomonas testosteroni 由来のものが好適に用いられる。また、遺伝子工学的に製造されたものを使用することもできる。
【００３１】
ＢＳＳは、例えば、Y. Tazuke, K. Matsuda, K. Adachi, & Y. Tsukada; Biosci.Biotech. Biochem., 58, 889-894 (1994) の文献の記載に従って精製し得ることができる。
【００３２】
β−ＨＳＤは、例えば、Richard M, Schultz, Ernest V. Groman and Lewis L. Engel ; J. Biol. Chem 252, 3775-3783 (1977)の文献の記載に従って精製し得ることができる。あるいは、市販されている例えばSigma Chemical Co. から購入したものを使用することも可能である。
【００３３】
Δ4−ＤＨは S. J. Davidson & P. Talalay;  J. Biol. Chem.,241, 906-915 (1966) の文献の記載に従って精製し得ることができる。
【００３４】
本発明に使用するＮＡＤも例えば、市販されているものを使用することができる。
【００３５】
本発明に使用される電子キャリアーとしては、例えば、ジアホラーゼやＮＡＤＨオキシダーゼなどの酵素、及びフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジニウムメチルサルフェート（１−メトキシＰＭＳ）、９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライド（メルドラブルー）等の物質から選ばれ、１種又は２種以上使用することができる。好ましくは、ジアホラーゼ、１−メトキシフェナジニウムメチルサルフェート及び９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライドからなる群から選ばれる少なくとも１種である。これら、電子キャリアーは、市販されているものを使用することができ、例えば、ジアホラーゼはオリエンタル酵母工業株式会社、１−メトキシＰＭＳ、メルドラブルーは株式会社同仁化学研究所のものが使用できる。
【００３６】
本発明の方法を以下に図１及び図２を用いて説明する。
【００３７】
図１において、自動分析装置のセル内で、まず、検体、例えば尿又は血液に、ＮＡＤ、β−ＨＳＤ、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を含む第１試薬を作用させる反応を第１反応として、検体中の内因性発色物質を所定時間内で反応、発色させ、ブランク値（図１における測定値Ａ）として測定する。所要時間としては、約５分程度である。
【００３８】
続いて、第２反応として同一セル内へＢＳＳを含む第２試薬を添加し、検体中に含まれる硫酸抱合型胆汁酸を３β−ヒドロキシ胆汁酸に変換し、該３β−ヒドロキシ胆汁酸を、所定時間内にセル内に存在しているβ−ＨＳＤで酸化し、同時に生成するＮＡＤＨを発色させて吸光度を測定する（測定値Ｂ）。その所要時間は、約２分から５分程度である。得られた測定値Ｂからブランク値（測定値Ａ）を差引いた値から、目的の検体、例えば尿又は血液中の硫酸抱合型胆汁酸値を算出する。
【００３９】
また、図２に示すように、β−ＨＳＤの反応生成物である３−オキソ胆汁酸に作用する脱水素酵素、Δ4−ＤＨを共役させることにより、脱水素反応の結果生じるＨ+の受容体として２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩が反応し、更に１分子のホルマザンが生成することから、吸光度値が約２倍になり、この酵素を共役させることにより測定感度は従来法の約２倍にアップすることも可能となった。
【００４０】
即ち、自動分析装置のセル内で、まず、検体、例えば尿又は血液に、ＮＡＤ、β−ＨＳＤ、Δ4−ＤＨ、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を含む第１試薬を作用させる反応を第１反応として、検体中の内因性発色物質を所定時間内で、反応、発色させ、ブランク値（図１における測定値Ａ）として測定する。所要時間としては、約５分程度である。
【００４１】
続いて、第２反応として同一セル内へＢＳＳを含む第２試薬を添加し、検体中に含まれる硫酸抱合型胆汁酸を３β−ヒドロキシ胆汁酸に変換し、該３β−ヒドロキシ胆汁酸を、所定時間内にセル内に存在しているβ−ＨＳＤで酸化し、同時に生成するＮＡＤＨ及び３−オキソ胆汁酸を、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、及び、Δ4−ＤＨ及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩で発色させて吸光度を測定する（測定値Ｂ）。その所要時間は、約２分から５分程度である。得られた測定値Ｂからブランク値（測定値Ａ）を差引いた値から、目的の検体、例えば尿又は血液中の硫酸抱合型胆汁酸値を算出する。
【００４２】
本発明の検体、例えば尿又は血液中の硫酸抱合型胆汁酸の測定原理は上記の通りであるが、本発明は、生成するＮＡＤＨ（及び３−オキソ胆汁酸）の比色測定法の発色試薬として、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩を特定し、この試薬を使用した時、始めて目的とする１つの測定反応系で検体ブランクの消去が可能となることを見出した。
【００４３】
検体量としては、適宜選択できる。
【００４４】
特に、検体が尿の場合に、その効果が顕著であった。
【００４５】
キットとしては、以下の通りである。第１試薬としては、基本的にはβ−ＨＳＤ、ＮＡＤ、電子キャリアー及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（本還元系発色試薬）を含んでいる。更に、感度を倍増させるために、第１試薬にΔ4−ＤＨを含有させることもできる。第２試薬としては、ＢＳＳを含んでいる。
【００４６】
また、上記成分に加えて、反応促進のため及び干渉物質の影響を除くため、第１試薬及び第２試薬に、界面活性剤やアスコルビン酸酸化酵素(ＡＳＯＤ)、及び緩衝剤を含有させることができる。
【００４７】
また、上記各酵素の安定化のために、第１試薬及び第２試薬中に、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、サッカロース、トレハロースなどの糖類、血清アルブミン等を配合しても良い。また、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、アジ化ナトリウム、オキサミド酸を配合していても良い。
【００４８】
第１試薬及び第２試薬は、粉末（凍結乾燥品）の状態で、使用時に緩衝液や水を加えることによって調製しても良いし、溶液の状態であっても良い。添加する水又は緩衝液を、キット中に、試薬として含んでいても良い。
【００４９】
また、標準物質となる硫酸抱合型胆汁酸（好ましくはグリコリトコール酸−３−硫酸等）を含む試薬を、キット中の試薬としても良い。濃度としては、特に限定されないが、例えば、標準液中の濃度として１０μＭ〜１００μＭ程度になるような濃度がよい。この試薬は粉末（凍結乾燥品）の状態で、使用時に上記に記載の緩衝液や水を加えることによって調製しても良いし、溶液の状態であっても良い。添加する水又は緩衝液を、キット中に、試薬として含んでいても良い。
【００５０】
その他、キット中に一般的に使用されている試薬を、本発明のキットに含んでいても良い。
【００５１】
これら試薬中の各成分は、キット中有効量含まれ、当業者であればその各成分の有効量を設定することができる。具体例として、以下のように例示する。
【００５２】
検体に、第１試薬及び第２試薬が加えられた最終的な反応液中での各成分の濃度としては、以下の範囲で使用できる：
β−ＨＳＤ      ：100〜1,000 U／l
ＮＡＤ          ：0.3〜5g／l
本還元系発色試薬：0.1〜 2g／l。
【００５３】
Δ4−ＤＨ       ：100 〜 3,000 U／l。
【００５４】
第１試薬に含まれる電子キャリアーの濃度としては、反応液中のＮＡＤＨから電子を移動するのに十分な濃度であれば、特に限定されない。例えば、ジアホラーゼの場合、1,000〜20,000 U／l、１−メトキシＰＭＳ及びメルドラブルーの場合、0.01〜0.5mMの範囲で使用できる。他の電子キャリアーについては、これらの値を参考して濃度を設定することができる。
【００５５】
第２試薬に含まれるＢＳＳの濃度としては、上記反応液中100〜3,000U／l程度である。
【００５６】
上記各成分の好ましい範囲としては、以下の通りである。
【００５７】
β−ＨＳＤ          ：200〜500 U／l
ＮＡＤ              ：0.4〜1g／l
本還元系発色試薬    ：0.2〜 0.5g／l
電子キャリアー
ジアホラーゼ      ：2,000〜10,000 U／l
１−メトキシＰＭＳ
又はメルドラブルー：0.03〜0.05mM。
【００５８】
Δ4−ＤＨ           ：300 〜 1,000 U／l。
【００５９】
ＢＳＳ              ：200〜500U／l。
【００６０】
また、緩衝剤としては、グッドの緩衝剤、具体的には、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＰＩＰＥＳ等が使用できる。反応液中での濃度としては、pH 7 〜 8 の 50〜200 mM グッド緩衝液になるような量配合されているのがよく、これらは、緩衝剤として第１試薬及び／又は第２試薬に配合し、調製時に水を添加して、上記濃度になるように調製しても良いし、調製時に上記濃度の反応液になるように緩衝液を添加しても良い。この添加する水又は緩衝液も、キット中の試薬として、含まれていても良い。
【００６１】
ＡＳＯＤは、反応液中で50〜500U／lの濃度で含有されていてもよく、好ましい濃度としては50 〜 200U／lである。
【００６２】
含有してもよい界面活性剤としては、Tween系界面活性剤が挙げられ、具体的にはTween 20が反応液中に0.2〜1.5重量％含まれていてもよい。
【００６３】
その他、配合しても良い上記各成分も、適当な濃度で配合することができる。
【００６４】
本発明の方法は、具体的には以下の通りである。例えば、尿検体の場合、検体10〜20μlに対し、第１試薬を添加、混合して 37℃下所定時間（例えば約５分間）反応した時点の吸光度を読み取り、この値をブランク値とし、続いて第２試薬を添加、混合して更に所定時間（例えば２〜５分間）反応を継続した時点の吸光度を読み取って、この値からブランク値を差し引き、得られる吸光度の増加値を求めることにより行われる。尿検体中の硫酸抱合型胆汁酸値は、同様の操作から得た標準物質を含む標準液での吸光度増加値を標準値として比例計算により求めることができる。
【００６５】
血液の場合も、上記の方法と同様に行うことができる。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によれば、汎用されている臨床検査用自動分析装置を用いて硫酸抱合型胆汁酸の定量が１反応系でできるようになり、測定の操作性が大幅に改善され、人手を要さない自動分析装置での測定が可能となり、検体の測定処理性能の改善も可能となった。
【００６７】
【実施例】
以下、実施例を用いて、より詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。本明細書において、特に記載がない限り、％は、重量％を示す。
【００６８】
比較例１  還元系発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）（比較試薬ａ）を使用した時の吸光度の経時的変化
還元系発色試薬としてＮＴＢを使用して、下記組成の第１試薬及び第２試薬を用いて、自動分析装置ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡにより１０種類の尿を検体として測定を行い、吸光度の経時的変化を観測した。反応温度は37℃で、検体20μl、精製水30μl及び第１試薬 160μl添加し５分間反応後、同一セルに第２試薬40μl及び精製水10μl添加し、２５秒ごとに５５０ｎｍの吸光度を測定した。第１試薬及び第２試薬中の各成分濃度は以下の通りである。
【００６９】
第１試薬（ｐＨ７．５）
ジアホラーゼ（オリエンタル酵母工業株式会社）：5,000 U/l
β−ＨＳＤ（J. Biol. Chem 252, 3775-3783 (1977)の記載に従って精製）：500 U/l
β−ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業株式会社）：1 g/l
ＮＴＢ（ナカライテスク株式会社）：0.5g/l
ＡＳＯＤ（オリエンタル酵母工業株式会社）：200 U/l
Tween20（ナカライテスク株式会社）：0.5 重量%
ソルビトール（ナカライテスク株式会社）：20 重量%
HEPES（ナカライテスク株式会社）：100 mM
第２試薬 （ｐＨ７．５）
ＢＳＳ（Biosci.Biotech. Biochem., 58, 889-894 (1994) の記載に従って精製）：2,000 U/l
Tween20     ：0.5 重量%
ソルビトール：20 重量%
HEPES       ：100 mM
結果を図３に示した。第１反応のブランク値が直線的に増加し、所定時間の５分間で完結せず、第２反応に移行しても同様の傾向が継続した。また、尿検体によってブランク値の増加傾向に差があった。
【００７０】
従って、還元系発色試薬としてＮＴＢを用いた場合、前述のブランク反応を別のセルで並行して行なう方法を取らざるを得ない状況にあった。
【００７１】
実施例１  各種テトラゾリウム塩を還元系発色試薬として使用したときの吸光度の経時的変化
以下の各種テトラゾリウム塩を還元系発色試薬として使用したときの吸光度の経時的変化を観測した。
【００７２】
還元系発色試薬：
（比較試薬ａ）ＮＴＢ（ナカライテスク株式会社）
（比較試薬ｄ）３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ  テトラゾリウムブロミド（Sigma chemical Co.）
【００７３】
【化５】
0003760250.tif 000006
【００７４】
（比較試薬ｂ）２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（株式会社同仁化学研究所、ＷＳＴ−３）
（比較試薬ｃ）２−ベンゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩（株式会社同仁化学研究所、ＷＳＴ−４）
（本還元系発色試薬）２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（株式会社同仁化学研究所、ＷＳＴ−１）
下記組成の第１試薬及び第２試薬を用いて、自動分析装置ＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡにより尿を検体として測定を行い、吸光度の経時的変化を観測した。反応温度は37℃で、検体20μl、精製水30μl及び第１試薬 160μl添加し５分間反応後、同一セルに第２試薬40μl及び精製水10μl添加し、２５秒ごとに吸光度を測定した。比較試薬ａ、比較試薬ｃ及び比較試薬ｄを用いた場合は５５０ｎｍの吸光度、比較試薬ｂ及び本還元系発色試薬を用いた場合は４５０ｎｍの吸光度を測定した。第１試薬及び第２試薬中の各成分濃度は以下の通りである。
【００７５】
第１試薬 (pH7.5)
ジアホラーゼ        ：5,000 U/l
β−ＨＳＤ          ：500 U/l
β−ＮＡＤ          ：1 g/l
各種還元系発色試薬  ：0.5 g/l
ＡＳＯＤ            ：200 U/l
Tween20             ：0.5 重量%
ソルビトール        ：20 重量%
HEPES               ：100 mM
第２試薬 (pH7.5)
ＢＳＳ              ：2,000 U/l
Tween20             ：0.5 重量%
ソルビトール        ：20 重量%
HEPES               ：100 mM
結果を図４に示した。比較試薬ａ、比較試薬ｂ、比較試薬ｃ及び比較試薬ｄではブランク値の継続的増加があるのに反して、本還元系発色試薬では反応が速やかに進行し、且つ、尿の内因性発色物質の影響を受けにくいため、ブランク値が許容範囲内で安定していた。
【００７６】
実施例２  還元系発色試薬として２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（本還元系発色試薬）を使用したときの吸光度の経時的変化
還元系発色試薬として２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（株式会社同仁化学研究所、ＷＳＴ−１）を使用して、１０種類の尿検体での吸光度の経時的変化を実施例１と同様の方法によって観測した。結果を図５に示した。
【００７７】
何れの尿検体でもブランク値は５分以内にほぼ安定化し、反応は速やかに進行して、第２試薬添加後、２〜３分の測定で、ブランク値の変動の影響を殆ど受けることなく、硫酸抱合型胆汁酸の測定が可能であった。
【００７８】
実施例３  従来の方法と本発明の方法との相関
還元系発色試薬としてＮＴＢ（比較試薬ａ）及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（本還元系発色試薬）を使用した本発明の方法での測定値と従来の方法の測定値との相関関係を、尿を検体として調べた。
【００７９】
従来の方法として、「ユーバステック」（マルキン醤油株式会社製）を用いて測定した。具体的には以下の通りである。
【００８０】
測定用及び検体盲検用の試験管を用意し、各試験管に尿を200μｌを加えた。測定用試験管に以下に記載の第１’試薬酵素液を400μｌ、検体盲検用試験管に第１’試薬ブランク液を400μｌ加え混和し、３７℃で１０分間加温した。各試験管に第２’試薬発色液を500μｌ加え混和し、更に３７℃で１０分間加温した。その後各試験管に２Ｍクエン酸水溶液を100μｌ加え反応を停止し、それぞれを水を対照として波長５４０ｎｍで、第１’試薬酵素液を加えた反応液の吸光度（Ａ’）、第１’試薬ブランク液を加えた反応液の吸光度（Ｂ’）を測定し、（Ａ’−Ｂ’）を求め、標準液（グリコリトコール酸−３−硫酸、５０μｍｏｌ／l）での測定値から各尿中の硫酸抱合型胆汁酸の濃度を定量した。
【００８１】
第１’試薬酵素液
ＢＳＳ        ：2.5Ｕ／ｍｌ
ＡＳＯＤ      ：2.5Ｕ／ｍｌ
Tris-HCl緩衝液：0.1Ｍ（ｐＨ７．５）
第１’試薬ブランク液
ＡＳＯＤ      ：2.5Ｕ／ｍｌ
Tris-HCl緩衝液：0.1Ｍ（ｐＨ７．５）
第２’試薬発色液
ジアホラーゼ    ：4.0 Ｕ/ｍｌ
β−ＨＳＤ      ：0.7 Ｕ/ｍｌ
β−ＮＡＤ      ：1.3 ｍｇ／ｍｌ
ＮＴＢ          ：0.4 ｍｇ／ｍｌ
リン酸緩衝液    ：０．２Ｍ（ｐＨ７．０）
本発明の方法については、以下の通りである。
【００８２】
下記組成の第１試薬及び第２試薬を用いて、日立7070型自動分析装置により各種尿を検体として測定を行った。反応温度は37℃で、検体 20μl及び第１試薬 240μl添加し５分間反応後第２試薬50μl添加、第２試薬添加２分後の450nmの吸光度から第２試薬添加前の450nmの吸光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値とした。標準液（グリコリトコール酸−３−硫酸、５０μｍｏｌ／l、（Sigma chemical Co.））での測定値から各尿中の硫酸抱合型胆汁酸の濃度を定量した。
【００８３】
第１試薬 (pH7.5)
ジアホラーゼ          ：5,000 U/l
β−ＨＳＤ             ：500 U/l
β−ＮＡＤ             ：1 g/l
比較試薬ａ又は本還元系発色試薬  ：0.5 g/l
ＡＳＯＤ              ：200 U/l
Tween20               ：0.5 重量%
ソルビトール          ：20 重量%
HEPES                 ：100 mM
第２試薬 (pH7.5)
ＢＳＳ          ：2,000 U/l
Tween20         ：0.5 重量%
ソルビトール    ：20 重量%
HEPES           ：100 mM
結果を図６および図７に示した。ＮＴＢでは、ブランク値の増加が加算されるため、その分従来法に比べ高値(1.3 倍程度)になり、相関係数も悪くなる傾向にあった。
【００８４】
他方、本還元系発色試薬では、従来法との相関係数は r＝0.995 と極めて良好で、測定値もほぼ１対１の関係にあって、従来法と同等の正確度の測定法であることが示された。
実施例４ ジアホラーゼを含む第１試薬を用いての本発明の効果
下記組成の第１試薬及び第２試薬を用いて、日立7070型自動分析装置により各濃度（20〜200μmol/l）に調製したグリコリトコール酸−３−硫酸（GLCA-S）溶液及び、５段階に希釈した３種類の尿を検体として測定を行った。還元系発色試薬として、実施例１に記載の２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（本還元系発色試薬）を使用した。反応温度は37℃で、検体 20μl及び第１試薬 240μl添加し５分間反応後第２試薬50μl添加、第２試薬添加２分後の450nmの吸光度から第２試薬添加前の450nmの吸光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値とした。
【００８５】
第１試薬 (pH7.5)
ジアホラーゼ     ：5,000 U/l
β−ＨＳＤ       ：500 U/l
β−ＮＡＤ       ：1 g/l
本還元系発色試薬 ：0.5 g/l
ＡＳＯＤ        ：200 U/l
Tween20         ：0.5 重量%
ソルビトール    ：20 重量%
HEPES           ：100 mM
第２試薬 (pH7.5)
ＢＳＳ          ：2,000 U/l
Tween20         ：0.5 重量%
ソルビトール    ：20 重量%
HEPES           ：100 mM
結果を図８及び図９に示す。図８に示す様に、GLCA-S濃度と測定値の間には、原点を通る良好な直線性が得られた。図９に示す様に、５段階に希釈した３種類の尿についても直線性が得られた。
【００８６】
実施例５ ジアホラーゼ及びΔ4−ＤＨを含む第１試薬を用いての本発明の効果下記組成の第１試薬及び第２試薬を用いて、日立7070型自動分析装置により各濃度（20〜200μmol/l）に調製したグリコリトコール酸−3−硫酸（GLCA-S）溶液及び、５段階に希釈した３種類の尿を検体として測定を行った。還元系発色試薬として、実施例１に記載の２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（本還元系発色試薬）を使用した。反応温度は37℃で、検体 20μl及び第１試薬 240μl添加し５分間反応後第２試薬50μl添加、第２試薬添加２分後の450nmの吸光度から第２試薬添加前の450nmの吸光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値とした。
【００８７】
第１試薬 (pH7.5)
ジアホラーゼ    ：5,000 U/l
β−ＨＳＤ       ：500 U/l
Δ4−ＤＨ        ：1,000 U/l（J. Biol. Chem.,241, 906-915 (1966) の記載に従って精製）
β−ＮＡＤ       ：1 g/l
本還元系発色試薬 ：0.5 g/l
ＡＳＯＤ        ：200 U/l
Tween20         ：0.5 重量%
ソルビトール    ：20 重量%
HEPES           ：100 mM
第２試薬 (pH7.5)
ＢＳＳ          ：2,000 U/l
Tween20         ：0.5 重量%
ソルビトール    ：20 重量%
HEPES           ：100 mM
結果を図１０及び図１１に示す。図１０に示す様に、GLCA-S濃度と測定値の間には、原点を通る良好な直線性が得られた。図１１に示す様に、５段階に希釈した３種類の尿についても直線性が得られた。
【００８８】
実施例６ １−メトキシＰＭＳを含有する第１試薬を用いての本発明の効果
下記組成の第１試薬及び第２試薬を用いて、日立7070型自動分析装置により各濃度（20〜200μmol/l）に調製したグリコリトコール酸−3−硫酸（GLCA-S）溶液を検体として測定を行った。還元系発色試薬として、実施例１に記載の２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（本還元系発色試薬）を使用した。反応温度は37℃で、検体 20μl及び第１試薬 240μl添加し５分間反応後第２試薬50μl添加、第２試薬添加２分後の450nmの吸光度から第２試薬添加前の450nmの吸光度をブランクとして差し引き、その吸光度差を測定値とした。
【００８９】
第１試薬 (pH7.5)
1−メトキシＰＭＳ：0.05 mM(株式会社同仁化学研究所)
β−ＨＳＤ       ：500 U/l
β−ＮＡＤ       ：1 g/l
本還元系発色試薬 ：0.5 g/l
ＡＳＯＤ        ：200 U/l
Tween20         ：0.5 重量%
ソルビトール    ：20 重量%
HEPES           ：100 mM
第２試薬 (pH7.5)
ＢＳＳ          ：2,000 U/l
Tween20         ：0.5 重量%
ソルビトール    ：20 重量%
HEPES           ：100 mM
結果を図１２に示す。図１２に示す様に、GLCA-S濃度と測定値の間には、原点を通る良好な直線性が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法及び従来の方法を示す図である。
【図２】本発明の方法を示す図である。
【図３】自動分析装置を使用して、ＮＴＢを還元系発色試薬として各種尿検体(No.1〜10)を測定した時の吸光度の経時的変化(１ポイント： 25秒)を示す図である。
【図４】自動分析装置を使用する尿検体の測定において還元系発色試薬の種類による吸光度の経時的変化(１ポイント： 25秒)を示す図である。
【図５】自動分析装置を使用して、本還元系発色試薬を用いて、各種尿検体(No.1〜10)を測定した時の吸光度の経時的変化(１ポイント： 25秒)を示す図である。
【図６】自動分析装置を使用して、ＮＴＢを還元系発色試薬として測定した値と従来法(用手法)の測定値との相関性を示す図である。
【図７】本発明の方法(本還元系発色試薬を用いた自動分析)と従来法 (用手法)の測定値間の相関性を示す図である。
【図８】実施例４における、GLCA-S濃度に対する450nmにおける吸光度変化量の結果を示す図である。
【図９】実施例４における、尿濃度に対する450nmにおける吸光度変化量の結果を示す図である。
【図１０】実施例５における、GLCA-S濃度に対する450nmにおける吸光度変化量の結果を示す図である。
【図１１】実施例５における、尿濃度に対する450nmにおける吸光度変化量の結果を示す図である。
【図１２】実施例６における、GLCA-S濃度に対する450nmにおける吸光度変化量の結果を示す図である。
【図１】
0003760250.tif 000007
【図２】
0003760250.tif 000008
【図３】
0003760250.tif 000009
【図４】
0003760250.tif 000010
【図５】
0003760250.tif 000011
【図６】
0003760250.tif 000012
【図７】
0003760250.tif 000013
【図８】
0003760250.tif 000014
【図９】
0003760250.tif 000015
【図１０】
0003760250.tif 000016
【図１１】
0003760250.tif 000017
【図１２】
0003760250.tif 000018