(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式で表されるサイトキサゾン。
【化２】
0003753285.tif 000010
【請求項２】
ストレプトマイセス属に属する、サイトキサゾン生産菌を培地に培養し、サイトキサゾンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１記載のサイトキサゾンの製造方法。
【請求項３】
サイトキサゾン生産菌が、ストレプトマイセス sp.95-31 である請求項２記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載のサイトキサゾンを有効成分とする免疫調節剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規物質、その製造方法、それを有効成分とする、免疫調節剤および抗癌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種サイトカインによって、免疫反応やアレルギー反応が引き起こされ、その詳細なメカニズムも次第に明らかになりつつある。一方で、特定のサイトカインの産生異常が生体防御系の秩序を乱し、免疫疾患や癌の増殖環境の亢進に深く関わっていることが明らかになりつつある。そこで、サイトカイン産生を制御する物質は有効な癌・免疫系疾患の治療薬になると考えられている。免疫調節剤および抗癌剤として、既に多数の化合物が医薬品として実用化されているが、副作用など幾つかの問題を抱えている医薬品が多い。一般に化学物質の生物活性はその化学構造に依存するところが大きいため、免疫調節活性および抗癌活性を有し、副作用の少ない新規な化合物に対しては、不断の希求があるといえる。
近年の飛躍的な分子生物学の発展により、Ｔ細胞が産生するサイトカインはおのおの異なる免疫反応に関与することが判明し、サイトカインプロフィールを異にするＴ細胞の選択的活性化が、異なる免疫反応を引き起こすことなどが明らかになってきた。さらに、 CD4+ T 細胞は、Th1(T helper type 1)、Th2(T helper type 2)に分類され、Th1 は、遅延型過敏症や細胞傷害性Ｔ細胞などの細胞性免疫をヘルプし、Th2 は抗体産生応答などの液性免疫をヘルプするという概念が確立された。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上記の希求に応えるものであり、Th1, Th2がそれぞれに特異的に産生するサイトカインの産生調節を介した免疫調節活性および抗癌活性を有する新規物質、その製造方法、それを有効成分とする免疫調節剤、及び抗癌剤の提供を目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題の解決のために鋭意検討した結果、広島県福山市の土壌から分離された、ストレプトマイセス属に属する放線菌サイトキサゾン生産株がサイトカイン産生Ｔヘルパー細胞亜集団Th2 の産生するサイトカインIL-4、及びIL-10 の産生を抑制し、免疫調節物質および抗癌活性を有する物質を生産することを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の一般式（１）で表される新規化合物、サイトキサゾンを提供するものである。
【０００５】
【化３】
0003753285.tif 000002
式中Ｒ1 は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ2 は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、ベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。
本発明の好ましい化合物は、式（１）において、Ｒ1 が、ヒドロキシメチル基であり、Ｒ2 が、パラ−メトキシフェニル基である化合物である。
本発明の最も好ましい化合物は下記の式（２）で表される化合物である。
【０００６】
【化４】
0003753285.tif 000003
【０００７】
本発明の式（２）で表される化合物は、ストレプトマイセス属に属する、サイトキサゾン生産菌を培地に培養し、サイトキサゾンを生成蓄積せしめ、これを採取することにより製造することができる。本発明で使用するサイトキサゾン生産菌の好ましい例としては、ストレプトマイセス属(Streptomyces sp.) 95-31株が挙げられる。
本発明はさらに、新規物質サイトキサゾンを有効成分とする免疫調節物質および抗癌剤を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物である、サイトキサゾンの生産に有利に使用されるストレプトマイセス属 95-31株は以下の菌学的性質を有する。
【０００９】
【表１】
ストレプトマイセス属 95-31株の生理的性状
0003753285.tif 000004
【００１０】
【表２】
ストレプトマイセス属 95-31株の培養性状
0003753285.tif 000005
【００１１】
【表３】
ストレプトマイセス属 95-31株の炭素源の利用性
0003753285.tif 000006
上記表１、２、３の生物学的性質に基づき、本発明にかかわる菌株は、ストレプトマイセス属に属することが判明した。なお、当該菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研菌寄第P-16171 号 (FERM P-16171 )として寄託されている。
【００１２】
上記菌株、放線菌ストレプトマイセス属 95-31株を培養し、当該培養物から新規物質サイトキサゾン( 以下「本発明化合物」とも記載する) を採取する方法は、具体的には後述する製造例に記載するが、概ねストレプトマイセス属に属する菌の培養方法に従って実施することができる。培養終了後、培養液から本発明のサイトキサゾンを精製、単離するには、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、又は活性炭、アルミナ、シリカゲル等の吸着剤によるクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー、あるいは結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥の手段をそれぞれ単独又は適宜組み合わせて、あるいは反復して使用することが可能である。
【００１３】
以上のようにして製造される新規物質サイトキサゾンは、後述の試験例に示すように抗腫瘍活性を有する。
本発明のサイトキサゾンを有効成分とする免疫調節剤および抗癌剤は、その使用目的に合わせて、使用方法、剤型、投与量 (使用量) が適宜決定される。例えば、本発明のサイトキサゾンを有効成分とする免疫調節剤および抗癌剤の投与形態は、経口投与でも非経口投与でもよい。剤型としては、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤又は注射剤もしくは座剤等の非経口投与剤を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤、結合剤等の製薬上許容される添加剤を用いて既知の方法で製造される。また、上記のサイトキサゾンを有効成分として含有する免疫調節剤および抗癌剤の臨床的投与量は、患者の年齢、体重、感受性、症状の程度等により異なるが、通常効果的な量は、成人一日 0.1 mg 〜 1g 程度であり、一日一回又は数回にわけて投与することも可能である。また、必要により上記の範囲外の量を用いることができる。
【００１４】
また化学試験用試薬として使用する場合、有機溶剤または含水有機溶剤に溶解して各種培養細胞系へ直接投与すると、主としてIL-4およびIL-10 の産生抑制能を示す。使用可能な有機溶剤としては、例えば、メタノールやジメチルスルホキシド等を挙げることができる。剤型としては、例えば、粉末または顆粒等の固形剤もしくは有機溶剤または含水有機溶剤に溶解した液体剤等を挙げることができる。通常、上記サイトキサゾンを有効成分とするサイトカイン産生抑制の効果的な使用量範囲は 0.1〜 100μg/mLであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なる。また、必要により上記の範囲外の量を用いることができる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例等を記載して本発明を具体的に記載する。
【製造例１】
グルコース 2% 、大豆粉 2.5% 、可溶性澱粉 1% 、酵母 0.4% 、肉エキス 0.1% 、食塩0.2%、リン酸第二カリウム 0.005% 、炭酸カルシウム0.05% 、ポポン−Ｓ0.05% の組成の培地 (pH 7.2) に、前記菌株ストレプトマイセス属 95-31株を接種し、28℃で96時間振盪培養を行った。
培養液 1.4 Lを遠心分離し、菌体と上清に分離した。菌体を 80%アセトン 2 Lを用いて抽出した後、吸引濾過、減圧濃縮し、得られた水溶液をpH 7.0に調製し、500 mLの n- ブタノールで 3回抽出した。一方、上清をpH 7.0に調整し、500 mLの n- ブタノールで 3回抽出した。抽出後、全てのn-ブタノール層を合わせて減圧濃縮し、褐色のシロップ 1.18 g を得た。
【００１６】
このシロップ 1.18 g を少量のメタノールに溶解し、あらかじめクロロホルムで平衡化したシリカゲルカラム（直径６cm、長さ９０cmに浸潤させ、最初にクロロホルム 1.2 Lを流した後、クロロホルム−メタノール溶液を配合割合を順次変えて（100 ：1, 100：2, 100：5, 100：10, 100 ：20, 50：50）それぞれ１L づつ流し、最後にメタノール1.2 L を流した。免疫調節活性および抗癌活性は、クロロホルム−メタノール溶液 100：5 の画分に溶出した。これを減圧濃縮することによって100 ｍg の褐色粉末を得た。
さらに、逆相C18 カラム（直径２cm、長さ２５cm; PEGASIL ODS 、センシュー科学( 株) 製）を用いて高速液体クロマトグラフィーによる精製を行った。なお、用いた溶媒は30 %メタノールで、流速 9.9 mL ／分、検出波長 215 nm で行った。この結果、白色粉末として活性物質サイトキサゾンを約3.0mg 得た。
以下に当該精製標品サイトキサゾンの物理化学的性質を表４に、サイトキサゾンのNMR スペクトルデータを表５に示す。
【００１７】
【表４】
サイトキサゾンの物理化学的諸性質
0003753285.tif 000007
【００１８】
【表５】
サイトキサゾンの 600 MHz 1H NMR および150 MHz 13C NMR 化学シフト値 (δppm)1)
0003753285.tif 000008
【００１９】
本発明化合物の活性は以下の方法に従って測定した。
【試験例１】
サイトキサゾンのTh2細胞におけるIL-4、IL-10産生の抑制
S11-7 細胞は、Th2 タイプのクローン化された細胞であり、PWM （pokeweed mitogen）刺激によりIL-4、IL-10 を産生する。そこで、あらかじめ培養プレートにまいたS11-7 細胞(1x105 cells/ml)に各濃度のサイトキサゾンを添加した後、PWM (5μg/ml) により抗原刺激を行った。刺激72時間後に、培養上清に産生されたIL-4、IL-10 の量をELISA 法により測定し、サイトキサゾン処理時の産生量(T) ／無処理時の産生量(C) の比をT/C(%)で表した。結果を表６に示す。
【００２０】
【表６】
サイトキサゾンのTh2 細胞におけるIL-4、IL-10 産生の抑制
0003753285.tif 000009
表６の結果は、本発明の物質、サイトキサゾンのTh2 細胞における、IL-4、IL-10 産生抑制効果を示し、免疫調節物質としての有効性を示している。また、IL-4、IL-10 はある種の癌の増殖環境の亢進に深く関わっているためサイトキサゾンの抗癌剤としての有効性も示された。なお、サイトキサゾンは、IL-4、IL-10 産生抑制効果を示す１０倍の濃度においてもほとんど細胞毒性を示さなかった。
【００２１】
【製剤例１】
（注射・点滴剤）
サイトキサゾン10 mg を含有するように、粉末ブドウ糖 5g を加えてバイアルに無菌的に分配し密封し、窒素、ヘリウムなどの不活性ガスを封入して冷暗所に保存した。使用前にエタノールに溶解し、0.85 %生理的食塩水 100 mL を添加して静脈内注射剤とし、一日、10-100 mL を症状に応じて静脈内注射または点滴で投与する。
【００２２】
【製剤例２】
（顆粒剤）
サイトキサゾン 1g 、乳糖 98g  及びヒドロキシプロピルセルロース 1 gを各々取り、よく混合した後、常法に従って粒状に形成し、これをよく乾燥して瓶、ヒートシール包装などに適した顆粒剤を製造した。一日、100-1000 mg を症状に応じて経口投与できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】サイトキサゾンの赤外線吸収スペクトル (KBr)を示す。
【図２】サイトキサゾンの 1H NMR (DMSO-d6) スペクトルを示す。
【図３】サイトキサゾンの13C NMR (DMSO-d6) スペクトルを示す。
【図１】
0003753285.tif 000011
【図２】
0003753285.tif 000012
【図３】
0003753285.tif 000013