(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル基供与体である脂肪酸又はその低級アルコールエステル及びアシル基受容体であるグリセリン又はモノグリセリドを、固定化リパーゼ製剤を充填した酵素充填塔に送液し、反応流体を酵素充填塔から流出させ、次いで反応流体中の水分又は低級アルコール分を脱水槽で低減させ酵素充填塔へ循環を行うエステル化反応において、アシル基供与体とアシル基受容体の混合比を、アシル基受容体のグリセリル基１モルに対してアシル基供与体のアシル基が1.6〜2.8モルとなる範囲とし、反応流体の酵素充填塔への供給を、滞留時間10〜80秒となる条件で行うことを特徴とするジグリセリドの製造法。
【請求項２】
反応流体の脱水又は脱アルコールを、物質移動容量係数ｋLａ〔ｋLは物質移動係数、ａは気液接触面積を示す〕が0.0005（s-1）以上となる条件で行うものである請求項１記載のジグリセリドの製造法。
【請求項３】
反応流体の脱水槽への供給を、スプレーノズルを用いて行う請求項１又は２記載のジグリセリドの製造法。
【請求項４】
反応流体の脱水槽への供給を、平均液滴径が５mm以下となるように調整して行う請求項３記載のジグリセリドの製造法。
【請求項５】
固定化リパーゼ製剤として、エステル化活性が100（unit/g-酵素）以上である固定化1,3位選択性リパーゼを用いる請求項１〜４のいずれかに記載のジグリセリドの製造法。
【請求項６】
酵素充填塔内の流れ方向の充填厚みをＬ（ｍ）、酵素製剤の平均粒子径をｄ（mm）とした場合、α＝Ｌ／ｄ2で定義されるαが25以下となる条件で操作する請求項１〜５のいずれかに記載のジグリセリドの製造法。
【請求項７】
酵素製剤の平均粒子径が0.2〜0.8mmである請求項１〜６のいずれかに記載のジグリセリドの製造法。
【請求項８】
酵素充填塔内の流れ方向の充填厚みが0.05〜0.6ｍである請求項１〜７のいずれかに記載のジグリセリドの製造法。
【請求項９】
酵素充填塔の圧力損失が20kg/cm2以下となる条件で操作する請求項１〜８のいずれかに記載のジグリセリドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高純度のジグリセリドを短時間かつ高収率で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジグリセリド類は、化粧品、医薬品等の分野において基剤として、また食品分野において油脂の可塑性改良用添加剤や食用油として用いられている。
【０００３】
かかるジグリセリド類は、通常グリセリンと脂肪酸とのエステル化反応、グリセリンと油脂とのアルコール交換反応等の方法により製造されている。これらの製造法は、アルカリ触媒等を用いた化学反応法と、リパーゼ等の油脂加水分解酵素等を用いた生化学反応法に大別されるが、合成されるジグリセリド類の収率・純度、省エネルギーの点から生化学反応法がより一般的である。
【０００４】
生化学反応法の例として、例えば、脂肪酸等とグリセリンとを、1,3位選択性リパーゼの存在下、反応生成水等を系外に除去しながら反応させることにより、ジグリセリドを高収率、高純度で得る方法（特開昭64-71495号公報）、グリセリンを脂肪酸の等モル以上加えて反応させ、ジグリセリド濃度を高めた状態で反応を停止させ、不溶グリセリンを分離した後、脱水しながら更に反応を行うことにより、脱水効率を向上させ高いエステル化反応速度でジグリセリドを合成する方法（特開平4-330289号公報）、脂肪酸等とグリセリン等の混合液を、リパーゼを充填した流通管式反応器中で反応させるに際し、当該反応器中の混合液の空塔速度を0.05cm/s以上とする方法（特開平10-234391号公報）などが知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記方法のうち、特開昭64-71495号公報の技術では、工業レベルの製造条件は検討されておらず、特開平4-330289号公報の技術では、ジグリセリド濃度がピークに達した時点で反応を停止させる必要があるなど、技術的に困難を伴い、また特開平10-234391号公報の技術では、操作も容易であり反応速度もある程度改善されるが、得られるジグリセリドの純度や工業的なスケールアップ技術においては不十分であった。
【０００６】
従って本発明は、工業的レベルで高純度のジグリセリドを短時間かつ高収率で製造する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、同一酵素充填量で充填厚みと断面積の異なる酵素充填塔を種々作製し、同一流量で反応流体を循環させ、空塔速度が反応速度・ジグリセリド純度に与える影響を調べたが、これらに変化はなかった。一方、酵素充填塔内部での反応流体の流れ方向の組成変化を分析したところ、塔入口付近では1,3-ジグリセリド濃度が上昇するが、塔中間以降ではあまり上昇せず、逆にトリグリセリド濃度が増加することが判明した。これらのことから、本発明者らは、たとえ反応流体の酵素充填塔での空塔速度が高くても、滞留時間が長いと反応生成水による影響で1,3位エステル化反応が平衡に達し目的のジグリセリドの生成が抑制される一方で、水分の影響を受けない1,3-ジグリセリドから1,2-ジグリセリドへの転位反応の進行、更にそのエステル化によりトリグリセリド濃度が上昇し、ジグリセリドの純度の低下を招いてしまうこと、そしてこの滞留時間を一定以下に制御して反応操作を行えば、工業的レベルで高純度のジグリセリドが効率良く得られることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、アシル基供与体である脂肪酸又はその低級アルコールエステル及びアシル基受容体であるグリセリン又はモノグリセリドを、固定化リパーゼ製剤を充填した酵素充填塔に送液し、反応流体を酵素充填塔から流出させ、次いで反応流体中の水分又は低級アルコール分を脱水槽で低減させ酵素充填塔へ循環を行うエステル化反応において、反応流体の酵素充填塔への供給を、滞留時間10〜80秒となる条件で行うことを特徴とするジグリセリドの製造法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
ここでの滞留時間の定義は、反応流体が酵素充填塔内の酵素充填部分を通過するのに要する時間をいい、酵素充填容量、すなわち酵素製剤により充填占有されている嵩容量（酵素製剤の間隙である空隙容量ではない）を循環流量で除することにより算出している。本発明においては、反応流体の酵素充填塔への供給を、滞留時間が120秒以内となる条件、好ましくは滞留時間が10〜80秒となる条件で操作を行うことにより、高純度のジグリセリドを工業的レベルで高い生産速度で製造することを可能にするものである。滞留時間が120秒を超えるような条件では、トリグリセリド濃度の上昇のためにジグリセリド純度は低下してしまう。
【００１０】
本反応は、反応により生成する水又は低級アルコールを脱水槽で低減させながら行うが、本発明においては、ジグリセリドの純度と生産速度をより向上させる上で、前記酵素充填塔における滞留時間の条件に加え、この反応流体の脱水又は脱アルコールを、物質移動容量係数ｋLａ〔ｋLは物質移動係数、ａは気液接触面積を示す〕が0.0005（s-1）以上、特に0.0008〜0.01（s-1）となる条件で行うのが好ましい。
【００１１】
グラムレベルのバッチサイズの反応器では、脱水容量も小さくてよく、脱水槽内の反応液全体が高真空の状態になり、攪拌のみでも反応液全域で脱水可能である。しかし、数十kgからトンレベルのバッチサイズの反応器では、脱水槽空間部がいくら高真空でも槽内の反応液の自重のため液内部では高真空が得られず、液内部からの脱水が起こらないために脱水速度が不足する。そこで、本発明者らは、このような工業的レベルの反応器では、上記物質移動容量係数ｋLａを一定値以上とすれば、脱水が効率化される結果、前述の水分による1,3位エステル化反応の抑制を回避でき、高純度のジグリセリドを高い生産速度で製造する上で好ましいことを見出したものである。このような観点より、反応流体の脱水槽への供給は、スプレーノズルを用いて行い、平均液滴径が５mm以下、特に２mm以下となるように調整することが好ましい。
【００１２】
ここで、ｋLａの算出は、反応中の脱水速度の解析によってもよく、また反応の有無とは無関係に脱水条件を同一にし脱水速度のみを定量化することによってもよい。例えば、脱水槽中の反応流体中の水分[H2O]を経時的に測定し、十分な時間の経過後の水分を平衡水分[H2O]*、時間をｔとすると、脱水速度式はd[H2O]/dt＝−ｋLａ([H2O]−[H2O]*)となり、これを積分すると、ln([H2O]−[H2O]*)＝−ｋLａ・ｔ＋定数となる。従って、ln([H2O]−[H2O]*)は時間に対し直線性を有することから、この直線の傾き（ｋLａ）を最小二乗近似法により求めればよい。
【００１３】
反応流体の脱水又は脱アルコールの方法としては、例えば減圧による方法のほか、乾燥した不活性ガスの通気や、モレキュラーシーブス等の吸水剤の使用による方法が挙げられる。なかでも、低温で実施可能であり、不活性ガスや脱水剤の回収も不要であることから減圧による方法が好ましく、減圧度は70hPa以下、特に15hPa以下が好ましい。なお脱水槽の形状、大きさ及び数には特に制限はない。
【００１４】
また、酵素充填塔内の条件として、塔内の流れ方向の充填厚みをＬ（ｍ）、酵素製剤の平均粒子径をｄ（mm）とした場合、α＝Ｌ／ｄ2で定義されるαが25以下、特に３以下となるようにするのが好ましい。このαは、酵素充填塔の圧力損失を算出するKozeny-Carmanの式：
ΔＰ＝定数×ｕ×Ｌ／ｄ2
〔ΔＰ：酵素充填塔の圧力損失，ｕ：空塔速度，Ｌ：酵素充填塔内の流れ方向の充填厚み，ｄ：酵素製剤の平均粒子径〕
に基づいて導出される「Ｌ／ｄ2」を意味するものである。
【００１５】
上記の条件を満たすようにするため、固定化リパーゼ製剤として、平均粒子径ｄが、0.1mm以上、特に0.2〜0.8mmであるものを用いるのが好ましく、また酵素充填厚みＬは１ｍ以下、特に0.05〜0.6ｍとなるように設定するのが好ましい。これらは、実験室レベルの小規模の反応器では重要ではないが、工業的レベルの大規模な反応器においては重要な因子となる。
【００１６】
また、酵素充填塔の圧力損失が、20kg/cm2以下、特に10kg/cm2以下となる条件で操作を行うことが、酵素充填塔の設計強度、循環ポンプに対する負荷の観点から、設備費用の低減になり、好ましい。また、高圧で繰り返し反応を行うと、固定化酵素が圧密化し、圧力損失が上昇したり、活性が低下し反応時間が長期化するおそれがある。
【００１７】
反応原料であるアシル基供与体、すなわち脂肪酸又はその低級アルコールエステルとしては、炭素数２〜24個の飽和又は不飽和の脂肪酸、例えば酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ゾーマリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、アラキドン酸、ガドレン酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸等のほか、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、α-リノレン酸、γ-リノレン酸等の高度不飽和脂肪酸；菜種油、大豆油、綿実油、オリーブ油、コーン油、ヤシ油、パーム油、シソ油、ボラージ油、牛脂、豚脂、魚油等の動植物油由来の脂肪酸；これらを硬化、蒸留、分別等の手段により加工した脂肪酸、及びこれらの低級アルコールエステルが挙げられる。低級アルコールエステルとしては炭素数１〜３の低級アルコール、すなわちメタノール、エタノール、1-プロパノール又は2-プロパノールとのエステルが挙げられる。これらのアシル基供与体は、いずれかを単独で又は２種以上組合わせて用いることができる。
【００１８】
もう一方の反応原料であるアシル基受容体、すなわちグリセリンとしては、市販のものを用いることができる。アシル基供与体とアシル基受容体との混合比としては、特に制限はないが、アシル基受容体のグリセリル基１モルに対して、アシル基供与体のアシル基が１モル以上、特に1.6〜2.8モルの範囲が好ましい。
【００１９】
なお原料混合液にモノグリセリドを添加してもよい。グリセリンと脂肪酸等とを混合しても相互溶解性が低いため脂肪酸相とグリセリン相の存在する不均一反応となるが、モノグリセリドを添加することにより反応初期から脂肪酸相へのグリセリンの溶解度が高くなり、反応速度が向上する。
【００２０】
本発明に用いる固定化リパーゼ製剤としては、グリセリンの1,3位に特異的に作用するもの（以下「固定化1,3位選択性リパーゼ」という）が好ましい。かかる1,3位選択性リパーゼとしては、リゾプス（Rhizopus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ムコール（Mucor）属等の微生物由来のリパーゼや、脾臓リパーゼなど、より具体的には、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）、リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、ムコール・ミーハイ（Mucor miehei）等を起源とするリパーゼが挙げられる。固定化リパーゼ製剤は、リパーゼを公知の酵素固定化方法、例えば「固定化酵素」千畑一郎編，講談社刊，第９〜85頁、「固定化生体触媒」千畑一郎編，講談社刊，第12〜101頁等に記載の方法に従って固定化することにより得られる。固定化リパーゼ製剤は、減圧条件でもその特性を維持するため、保水力を示すものである必要がある。このためには、特にイオン交換樹脂で固定したリパーゼが好ましい。また、固定化リパーゼ製剤のエステル化活性は、100（unit/g-酵素）以上、特に200（unit/g-酵素）以上であるのが好ましい。市販の固定化1,3位選択性リパーゼとしては、ノボ・ノルディスクバイオインダストリー社製の商品名「Lipozyme IM」がある。
【００２１】
本発明におけるアシル基供給体とアシル基受容体との反応には、ヘキサン、オクタン、石油エーテル等の溶剤を用いてもよいが、その除去・精製を考慮すると、溶剤を加えない方が好ましい。また、加水分解を抑制するため、この反応系には、リパーゼ製剤及び反応原料に溶解している水分以外に水を添加しない方が好ましい。本反応の反応温度は、20〜100℃、特に35〜70℃が好ましい。
【００２２】
反応終了物中に含まれる未反応のグリセリン、脂肪酸及び脂肪酸の低級アルコールエステル並びにモノグリセリドは、分子蒸留等、従来周知の分離・精製手段により、容易に除去することができる。従って、得られるジグリセリドの純度は式Ｄ／(Ｄ＋Ｔ)で、反応率は式Ｄ＋Ｔで表現することができる〔Ｄ：反応生成物中のジグリセリド濃度，Ｔ：反応生成物中のトリグリセリド濃度〕。
【００２３】
本発明におけるジグリセリドの製造工程を例示すると、例えば図１に示すとおりである。脱水槽１に原料混合液２を入れ、撹拌器３で適宜撹拌しながら混合液２をポンプ５を用いライン11により酵素充填塔６に送液する（ここでの混合液の酵素充填塔への供給は、滞留時間120秒以内となるような条件で行う）。酵素充填塔６内で反応により生成したジグリセリド、副生成物及び未反応原料４はライン12から脱水槽１に入る（混合液の脱水は、物質移動容量係数ｋLａが0.0005（s-1）以上となる条件で行うのが好ましいが、図１ではポンプ14を用いライン13から脱水槽１への反応流体の供給にスプレーノズルを用いることによりこれを実現している。）。上記操作を繰り返すことにより、ジグリセリドの濃度が増大する。この間脱水槽１は減圧状態となっており、ジグリセリドの生成反応により生じた水等が除去される。
【００２４】
【実施例】
以下において、物質移動容量係数ｋLａは、バッチサイズと同量の反応終了油を水分が約0.5％になるように調整して脱水槽に仕込み、酵素塔への循環を行わず、各実施例又は比較例における流量と同一の流量でスプレー側の循環を行い減圧下で経時的に水分[H2O]を測定し、10時間後の水分を平衡水分[H2O]*として、前述の方法に従い最小二乗近似法により算出した。
【００２５】
また、酵素活性は、オレイン酸86ｇ、グリセリン14ｇ及び固定化酵素５ｇを４つ口フラスコに添加し、300rpmの回転数で攪拌し、40℃、6.7hPaで反応を行い、反応開始時と15分後のオレイン酸濃度より求めた脂肪酸消費速度及び固定化酵素使用量から、１分間に１μmolのオレイン酸を消費した活性単位を１unitとして算出した。
【００２６】
実施例１
使用した反応器は1,3位選択性固定化リパーゼLipozyme IM（ノボ・ノルディスクバイオインダストリー社製，300unit/g-酵素）を５kg充填した酵素充填塔（酵素充填容量0.0132m3，製剤の嵩比重0.38g/cc）と減圧により脱水を行う脱水槽から構成され、オレイン酸86kgとグリセリン14kgを脱水槽に仕込み、攪拌しながら温度を40℃に設定した。その後、反応流体の酵素充填塔への供給と脱水槽のスプレーノズルへの供給を開始し、脱水槽内は真空ポンプにより6.7hPaの真空度になるように調整した。酵素充填塔への反応流体の供給流量は1.2m3/hrとし、酵素充填容量を流量で除した値（滞留時間）が40秒となるようにした。また、スプレーノズルへの循環流量は1.2m3/hrとした。
反応流体の供給を開始してから3.5時間後に反応油を一部取り、アルカリ滴定することにより脂肪酸量を測定した後、トリメチルシリル化してガスクロマトグラフィーによりトリグリセリド、ジグリセリド及びモノグリセリドの組成を求めた。この結果を表１及び２に示す。
なお、圧力損失は酵素塔入口の圧力計と出口の圧力計の数値の差分、酵素充填厚みは酵素塔内の反応流体の流れ方向に酵素製剤が充填されている距離、空塔速度は酵素充填塔への流量を流れ方向に垂直の充填塔断面積で割った数値である。
【００２７】
実施例２
実施例１において、反応流体の酵素充填塔への流量を0.6m3/hrとした以外は同様に操作を行い、組成を求めた結果を表１に示す。
【００２８】
実施例３
実施例１において、スプレー側循環流量を0.3m3/hrとした以外は同様に操作を行い、組成を求めた結果を表１に示す。
【００２９】
比較例１
実施例１において、反応流体の酵素充填塔への流量を0.3m3/hrとした以外は同様に操作を行い、組成を求めた結果を表１に示す。
【００３０】
比較例２
実施例１において、酵素充填量を４倍にし、また酵素充填塔の圧力損失が増大したため反応流体の酵素充填塔への流量を１m3/hrとした以外は同様に操作を行い、組成を求めた結果を表１に示す。
【００３１】
比較例３
実施例１において、1,3位選択性固定化リパーゼLipozyme IMを乳鉢で粉砕して粒子径を微細化し、反応流体の酵素充填塔への流量を0.14m3/hrとした以外は同様に操作を行い、組成を求めた結果を表１に示す。
【００３２】
比較例４
実験室レベルの反応器を用いて、スプレー側の循環を行わず、1,3位選択性固定化リパーゼLipozyme IMの充填量を100g、バッチサイズを１kg、96ml/minの循環流量で酵素充填塔に送液して反応を行い、組成を求めた結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
0003853552.tif 000002
【００３４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、短時間かつ高収率で高純度のジグリセリドを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における製造工程を示す概略図である。
【符号の説明】
１：脱水槽
２：混合液
３：撹拌器
４：ジグリセリド類、副生成物及び未反応原料
５，14：ポンプ
６：酵素充填塔
11，12：酵素充填塔循環ライン
13：脱水槽循環ライン
15，16：圧力計
【図１】
0003853552.tif 000003