(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミエローマ細胞と抗サイモシンα１抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマからサイモシンα１の構造のアセチル化されたＮ端Ｓｅｒ〔１〕を含む部分を認識し、かつ、Ｃ端側〔１６−２８〕を認識しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項２】
ハイブリドーマが、ＭＴＨ３３Ｇ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４６１）である請求項１記載のハイブリドーマ。
【請求項３】
ミエローマ細胞が、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損またはチミジンキナーゼ欠損細胞である、請求項２記載のハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【請求項５】
サイモシンα１と、請求項４記載のモノクローナル抗体（Ａ）と、該モノクローナル抗体と異なる認識部位を持つ抗サイモシンα１ポリクローナル抗体（Ｂ）との３元複合体を形成し、該複合体を形成するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と特異的に結合する標識化された物質（Ｃ）との４元複合体を形成し、該４元複合体の標識物質を定量することを特徴とするサイモシンα１の測定法。
【請求項６】
モノクローナル抗体が固相上に結合されたモノクローナル抗体である、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗サイモシンα１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマおよびそれが産生する抗体ならびに該抗体を用いる免疫学的サンドイッチ法によるサイモシンα１の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイモシンα１（Thymosin  α1)は、胸腺組織で産生される胸腺因子の一つで、免疫機能の維持に重要な役割を果たしているＴ細胞の分化誘導作用を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドはヒトのみならずウシにおいても見出されており、ヒトサイモシンα１と全く同じアミノ酸配列である。サイモシンα１は２８アミノ酸残基からなり、Ｎ末端の１番目のＳｅｒ〔１〕がアセチル化されている。
【０００３】
サイモシンα１の測定法としては、既に抗血清を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が確立されている（特開昭５５−１６０８５６; 特開昭５７−１６８５０; International Journal of Immunopharmacology 14, 1267-1278, 1992; Journal of Immunological Methods 110, 261-265, 1988; Molecular Immunology 23, 701-707, 1986; Journal of Immunological Methods 89, 9-17, 1986; Journal of Immunological Methods 80, 45-53, 1985)。これらの、サイモシンα１を認識するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を利用した免疫学的測定法は、すべて標識抗原を用いた競合法ＲＩＡもしくは競合法エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）であった。これらのサイモシンα１の免疫学的測定法においては、放射性もしくは非放射性の標識体で標識されたサイモシンα１と生体中のサイモシンα１とでは、抗サイモシンα１抗体に対する免疫反応性が全く同等とはいえない。また、競合法の免疫学的測定法の場合はサイモシンα１だけではなくサイモシンα１の分解断片やその他アミノ酸配列が類似したペプチドも一緒に測り込む危険性があるので、サイモシンα１に対して特異性が高いとは言えない。また感度の点からも満足できるものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の測定法に用いられている抗サイモシンα１モノクローナル抗体や抗サイモシンα１ポリクローナル抗体は、サイモシンα１の一部分しか認識しない。そこでサイモシンα１のＮ端側、特に生理学的に重要なアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を特異的に認識する抗体とＣ端側を特異的に認識する抗体が得られれば、そのような２種の抗体を用いたサンドイッチ法による免疫学的測定が可能になる。サンドイッチ法は、競合法に比べ感度の点からも特異性の点からも有利である。従って本発明はサイモシンα１のＮ端側を特異的に認識する抗体とＣ端側を認識する抗体を用いたサンドイッチ法を特徴とする高感度で特異性の高い免疫学的測定法およびその試薬を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはサイモシンα１のＮ端断片を特異的に認識する親和性の高いモノクローナル抗体を創製すべく鋭意研究を行った結果、サイモシンα１のアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を含むＮ端を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得て、そのモノクローナル抗体を利用するサイモシンα１の高感度測定法を完成するに至った。
【０００６】
（１）免疫原の調製
サイモシンα１は２８アミノ酸残基からなるポリペプチドであり、比較的低分子であるため抗体の産生を誘起する能力（免疫原性）が低いハプテンと呼ばれるものである。そのため、抗原として用いるためには牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、牛チログロブリンなどのキャリヤータンパク質と結合させる。一般に、ハプテンをキャリヤータンパク質と結合させる公知な方法としては、グルタルアルデヒド架橋法、カルボジイミド法、ホモ２価性架橋試薬である１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いたＤＦＤＮＢ法〔Marfey, S.P. and Tsai, K.H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 65, 31 (1975)〕が従来からよく用いられているが、過重合体や不均一なハプテン複合体ができやすいので免疫原として望ましくない場合が多い。特にサイモシンα１では２８アミノ酸配列内にＬｙｓが４残基、Ａｓｐが３残基、Ｇｌｕが６残基も存在するので、サイモシンα１分子の分子内架橋や分子間架橋、さらにはキャリヤータンパク質との過剰な架橋が形成されてしまう。事実、我々はサイモシンα１とＢＳＡ、サイモシンα１と牛チログロブリンのハプテン複合体を作成すべく、グルタルアルデヒド法、カルボジイミド法、ＤＦＤＮＢ法を用いて免疫原を調製し、それをアジュバントと混合したものをマウスやウサギに繰り返し免疫を試みたが、抗体力価・感度に関して満足できるものではなかった。
【０００７】
このため我々は、ヘテロ２価性架橋剤であるスルホサクシイミジル４−〔Ｎ−マレイミドメチル〕シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Sulfo-SMCC）を利用したマレイミド法〔Yositake, S., et al., J. Biochem. 92, 1413, (1982 ）〕を用いてハプテン−タンパク質複合体を調製し、それを動物に免疫すると良好な結果を得ることができることを見出した。
【０００８】
（２）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
マレイミド法で得られた免疫原は、フロイントの完全アジュバント等の適当なアジュバントに乳濁させ、マウスの免疫に用いる。免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔に数回繰り返し接種することにより行う。最終免疫後３日後に脾臓を取り出し、抗体産生細胞として使用する。この時同時に抗体産生細胞と融合させてハイブリドーマを得るための親細胞として、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ-)あるいはチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ-)のような適切なマーカーを持つミエローマ細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。
【０００９】
ハイブリドーマ作製における培地としては、ＲＰＭＩ−１６４０などの通常良く使用されているものに、適宜約１０％の牛血清（ＣＳ、calf serum）を加えて用いることができる。例えば、親細胞であるミエローマと脾細胞を約４：１０の割合で用意する。融合剤としては５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いるのが融合率が高いとされている。融合細胞はＨＡＴ選択法により選択しうる。生じるハイブリドーマのスクリーニングは、培養上清を用いてＲＩＡ法など既知の方法により行い、目的の免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、スクリーニングは二段階で行い、アセチル化されたＳｅｒ〔１〕を持つサイモシンα１〔１−２８〕を認識する免疫ブロブリンを分泌しているハイブリドーマを１段階目で選抜し、１段階目で選抜されたハイブリドーマの中から、アセチル化されていないＳｅｒ〔１〕をＮ末端に持つデスアセチル−サイモシンα１〔１−２８〕を認識しない免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマだけを選抜する。
【００１０】
ハイブリドーマの単一性を吟味するため、例えば９６穴のマイクロウエルにハイブリドーマを１穴に１個より多くならないように蒔き、生育してくるクローンについて再びスクリーニングを行う。このようなサブクローニングを繰り返すことにより、単一性のハイブリドーマを得る。このようにして後記実施例で得られたハイブリドーマは、ＭＴＨ３３Ｇ２と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成６（１９９４）年８月５日に、ＭＴＨ３３Ｇ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４４６１）として寄託されている。
【００１１】
（３）モノクローナル抗体の産生
次に、本発明のモノクローナル抗体を製造するために、上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（in vitro）または動物体内（in vivo)で培養する。in vitro系で培養する場合、培地は先に述べた通常培地にＣＳを添加したものでよく、この培地で３〜５日培養の後、培養上清からモノクローナル抗体を得ることができる。in vivo 系の培養では、ハイブリドーマをマウスの腹腔に接種し、７〜１４日後に腹水を採取し、これよりモノクローナル抗体を得ることができる。in vivo 系での培養の場合、in vitro系での培養に比べて遥かに大量の抗体を効率的に取得しうるので好ましい。
【００１２】
こうして得られた培養上清または腹水からのモノクローナル抗体の精製は、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、プロテインＡセファロースカラムクロマトグラフィー等の既知の方法を適宜組み合わせて、例えば後記実施例に記載したようにして行うことができる。
【００１３】
本発明で得られたハイブリドーマ細胞ＭＴＨ３３Ｇ２の産生するモノクローナル抗体ＭＴＨ３３Ｇ２は、後記実施例に示すとおり、アセチル化されたＮ末端Ｓｅｒ〔１〕を含むサイモシンα１〔１−２８〕を特異的に認識し、アセチル化されていないＮ末端Ｓｅｒ〔１〕を持つデスアセチル−サイモシンα１〔１−２８〕やＣ端側半分のサイモシンα１〔１６−２８〕とは反応しないことから、そのエピトープはサイモシンα１のＮ端、詳細にはエピトープ解析の結果からアセチルＳｅｒ〔１〕からＶａｌ〔５〕に含まれる部分を認識しているものと推定した。
【００１４】
（４）ウサギ抗サイモシンα１〔１６−２８〕血清
公知の方法で化学合成したサイモシンα１〔１６−２８〕をマレイミド法によってサイモシンα１〔１６−２８〕−牛チログロブリン複合体を作成する。そのサイモシンα１〔１６−２８〕−牛チログロブリン複合体とフロイントの完全アジュバントを乳濁させ、それをウサギに投与して数回免疫し、最終免疫から１０〜１４日後に採血してウサギ抗サイモシンα１〔１６−２８〕血清を調製する。こうして得られたウサギ抗サイモシンα１血清をＭＣＲ０５７７と命名した。
【００１５】
上記のポリクローナル抗体はウサギ由来のものであるが、これに限定されるものではなく、例えば馬、ヤギ、ニワトリなどの動物に免疫して得られる特異抗血清でもよい。
【００１６】
（５）抗体の固相化法
抗体（Ａ）を固相化する固相としては、通常の免疫測定法に使用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボール）、チューブ、プレートなどを用いることができる。これらの担体に、サイモシンα１のＮ端側またはＣ端側を認識する抗体を吸着させる。吸着は通常リン酸緩衝液中pH６〜１０、好ましくは中性付近で室温下に一夜放置することにより行う。抗体を吸着した抗体は、アジ化ナトリウムの存在下のリン酸緩衝液中または乾燥して冷所に保存する。
【００１７】
（６）標識化物質（Ｃ）の調製
本発明における抗体（Ｂ）を認識する標識化された物質とは、１つは標識物質を結合した特異抗体であり、該特異抗体とは、上記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を得る動物種の抗体を、それ自体既知の通常用いられる方法で他種の動物に免疫して得られる特異抗血清もしくはこれを精製して得られる抗体あるいはモノクローナル抗体である。該特異抗体としては、抗体（Ａ）に使用される上記モノクローナル抗体を得る動物種の正常血清に結合する抗体を除去したものであってもよい。
【００１８】
抗体の標識物質としては、非放射性物質または放射性物質のいずれでもよい。非放射性物質としてはホースラディッシュパーオキシターゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシターゼなどが挙げられる。放射性物質としては、α線、β線、γ線などの放射線を出す放射性同位元素が挙げられるが、通常、免疫学的測定法においてはヨウ素１２５(125Ｉ）で標識化したものがよく用いられる。本発明の実施例においてもヨウ化ナトリウム（Ｎａ 125Ｉ）とクロラミンＴで 125Ｉ標識した抗体を用いた。
【００１９】
サイモシンα１を測定する免疫学的測定試薬の調製における抗体の組合わせとしては、サイモシンα１のＮ端側を認識する抗体（Ａ）を固相化した場合にはＣ端側を認識する抗体（Ｂ）に対する特異抗体を標識抗体（Ｃ）とし、Ｃ端側を認識する抗体（Ａ）を固相化した場合にはＮ端側を認識する抗体（Ｂ）に対する特異抗体を標識抗体（Ｃ）とすればよい。一般には、固相化には比較的大量の抗体（Ａ）が必要であるため、安定的に大量の抗体が得られるモノクローナル抗体（例えば、本発明のＭＴＨ３３Ｇ２）が固相化に適している。液相の抗体（Ｂ）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、固相化した抗体（Ａ）が認識するのとは異なる部位を認識するものであればよい。例えば、固相化抗体として本発明のＭＴＨ３３Ｇ２を用いた場合には、液相抗体として上述の抗血清ＭＣＲ０５７７が適用できる。当然、固相化する抗体としてサイモシンα１のＣ端側を認識するモノクローナル抗体が、液相抗体としてＮ端を認識するモノクローナル抗体および抗血清も本発明に適用できる。
【００２０】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
免疫原の調製
（１）サイモシンα１〔１−２８〕へのマレイミド基の導入
合成サイモシンα１〔１−２８〕（５．３mg）を２８０μl の０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）に溶解し、これにスルホサクシイミジル４−〔Ｎ−マレイミドメチル〕シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Sulfo-SMCC; ピアス社製）５．９mgを加え、３０℃で３０分間撹拌した。次いで、反応混合物を０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（ＮＡＰ−５カラム；ファルマシア製）に通すことによって、過剰の試薬を除去した。
【００２１】
（２）ＢＳＡへのチオール基の導入（メルカプトサクシニルＢＳＡ）
ＢＳＡ２００mgとＳ−アセチルメルカプトサクシニックアンヒドリド５０mgを、０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）５ml中で、ときどきかき混ぜながら３０℃で３０分間保温した。この間、１N ＮａＯＨを加えて反応液のpHを７．０に保つようにする。反応液を０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）で透析することによって、未反応の試薬を除去し、アセチルメルカプトサクシニルＢＳＡを得た。
【００２２】
次に上記で得られたアセチルメルカプトサクシニルＢＳＡ  １０mgを０．１M ヒドロキシルアミンを含む０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）０．２mlに溶かし、室温で３０分間処理して脱アセチル化し、５mMＥＤＴＡを含む０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（ＮＡＰ−５カラム；ファルマシア製）に通して、過剰の試薬を除去することによってメルカプトサクシニルＢＳＡを得た〔北川ら、「免疫実験操作法IX」、日本免疫学会編、p.３５２９（１９８２）〕。
【００２３】
（３）サイモシンα１〔１−２８〕−ＢＳＡ複合体の作製
（１）で得たマレイミド化したサイモシンα１〔１−２８〕５．３mgを、（２）で得られたメルカプトサクシニルＢＳＡ  ４．５mgを含む０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）０．７mlにかき混ぜながら滴下し、さらに２時間室温に保温した。この溶液を、生理食塩水３L に対して５回、２４時間透析した。この透析物を分注して−２０℃で保存した。
【００２４】
（４）免疫エマルジョンの調製
上記の分注保存した溶液（サイモシンα１〔１−２８〕−ＢＳＡ複合体２mgを含む）に生理食塩水を加えて１mlとし、これをフロイントの完全アジュバント１mlに乳濁した。
【００２５】
ハイブリドーマの調製
上記の免疫エマルジョンをＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの腹腔に注射し（１匹当り１００μl)、さらに２週間後に同じ方法で追加免疫した。２週間おきに追加免疫を繰り返し、１０週間後の、血液中の抗体を測定し、最も強く免疫応答を示した１匹のマウスの尾静脈にサイモシンα１〔１−２８〕を含む生理食塩水（１００μl)をさらに追加免疫した。その３日後、マウスから細胞融合のために脾臓細胞を採集した。
【００２６】
採集した脾臓細胞（１．０×１０8 個）とミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １９５７）（４×１０7 個）をＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製）中で混合し、１，１５０rpm 、４℃で５分間遠沈した。得られたペレットを３７℃に加温した後、５０％ＰＥＧ４０００（ＰＥＧ  １g ／ＲＰＭＩ−１６４０  １ml）１mlを３７℃で１分間かけて滴下し、続けて１分間撹拌した。さらに３７℃のＲＰＭＩ−１６４０  １mlを１分間かけて滴下し、続けて１分間撹拌した後、３７℃のＲＰＭＩ−１６４０  ７mlを３分間かけて加え希釈し、４℃で１０％ＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０で遠心洗浄した。
【００２７】
得られた細胞を９６穴プレートに蒔き、ＨＡＴ培地（シグマ社製）中で２週間培養した。後述のスクリーニング法によってハイブリドーマを選抜し、最も高い抗体価を示したウエルの細胞を限界希釈法等によりクローン化した。このクローニングによって、安定に大量の抗体を産生するクローンを選抜し、ＭＴＨ３３Ｇ２と命名した。
【００２８】
上記の、免疫マウスの抗血清およびハイブリドーマ培養上清中の抗体価は下記のようにして測定した。免疫マウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清をサンプルとし、該サンプル希釈液１００μl 、アッセイバッファー〔０．１M リン酸ナトリウム（pH７．４）、０．１５M ＮａＣｌ、１．０mg/ml ＢＳＡ、０．５mg/ml Tween ２０、０．２mg/ml アジ化ナトリウム〕１００μl 、 125Ｉ−〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα１〔１−２８〕（１０，０００cpm)５０μl の混合液を４℃で２４時間反応させた。これをウサギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＰＥＧ６０００、アビセルを含む第２抗体溶液２５０μl と混合し、４℃で３０分間反応させた。その後、４℃で２０分間、３，０００rpm にて遠心し、その沈澱の放射活性をγ−カウンター（アロカ  ＡＲＣ−６００）で測定することにより、サンプル希釈液中の抗体価を求めた。
【００２９】
上記 125Ｉ−〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα１〔１−２８〕はクロラミンＴ法によって調製した。即ち、〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα１〔１−２８〕（４．８μg)とＮａ 125Ｉ（０．５mCi)を混合し、３μl のクロラミンＴ（１．０mg/ml)を加え、３０秒後に２５μl のアスコルビン酸（０．７mg/ml)を加えた。さらに、０．２g/mlヨウ化カリウム溶液１００μl を加え、ＯＤＳ−１２０Ｔカラム（TOSO社製）で精製した。
【００３０】
モノクローナル抗体の調製
０．５mlのプリスタンを腹腔注射後、２週間経たＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に、ＲＰＭＩ−１６４０に懸濁したハイブリドーマＭＴＨ３３Ｇ２を注射した。得られた腹水をプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア社製）で精製し、モノクローナル抗体ＭＴＨ３３Ｇ２を得た。
【００３１】
ＭＴＨ３３Ｇ２の諸性状
本モノクローナル抗体のアイソタイプの決定は、マウスモノクローナル抗体サブタイピングキット（BioRad社製）に従って行い、ＩｇＧ1 サブクラスに属するものと決定した。親和性はスキャッチャードプロットを作成することにより求め、その結果はＫａ＝４．０×１０7M-1であった。
【００３２】
エピトープは、種々のサイモシンα１関連ペプチドに対する交差反応性をＲＩＡで調べることにより決定した。すなわちハイブリドーマＭＴＨ３３Ｇ２を注射したマウスから得られた腹水をアッセイバッファー〔０．１M リン酸ナトリウム（pH７．４）、０．１５M ＮａＣｌ、１．０mg/ml ＢＳＡ、０．５mg/ml Tween ２０、０．２mg/ml アジ化ナトリウム〕で１，０００倍希釈した。その腹水希釈液１００μｌとアッセイバッファーで希釈したサイモシンαｌ標準溶液（４種類のペプチド）１００μｌ、125 Ｉ−〔Ｔｙｒ29〕−サイモシンα１〔１−２８〕（１０，０００cpm ）５０μｌの混合液を４℃で２４時間反応させた。これをウサギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＰＥＧ６０００、アビセルを含む第２抗体溶液２５０μｌと混合し、４℃で３０分間反応させた。その後、４℃で２０分間、３，０００rpm にて遠心し、その沈殿の放射活性をγ−カウンター（アロカ  ＡＲＣ−６００）で測定した。
標準曲線の作製には、既知量のサイモシンα１存在下における結合放射活性をサイモシンα１の非存在下における結合放射活性で割った値（Ｂ／Ｂ０）を計算した。その結果を図１に示す。Ｎ端がアセチル化されていないデスアセチル−サイモシンα１〔１−２８〕とサイモシンα１〔１６−２８〕には殆ど反応しないことから、エピトープはサイモシンα１〔１−１５〕に含まれると推定した。またサイモシンα１のＮ端アセチル基を認識し、逆にＮ端がアセチル化されていないサイモシンα１は認識しなかった。
【００３３】
モノクローナル抗サイモシンα１被覆ポリスチレンボールの調製
ポリスチレンボール（直径６．３５mm、イムノケミカル社製）５００個を０．０５M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２）１５０mlに入れ、これにモノクローナル抗サイモシンα１−ＩｇＧ1 （ＭＴＨ３３Ｇ２）７５０μg を加え、室温で一夜放置した。このポリスチレンボールを０．０５M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２）で洗浄し、乾燥してから、冷蔵庫中で保存した。
【００３４】
サイモシンα１〔１６−２８〕−牛チログロブリンの作製
サイモシンα１〔１６−２８〕ペプチドのＮ末端にＣｙｓを付加した〔Ｃｙｓ〕−サイモシンα１〔１６−２８〕をマレイミド基を導入した牛チログロブリンと結合させた。
【００３５】
牛チログロブリンへのマレイミド基の導入は以下にように行った。牛チログロブリン（５０mg）を０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）５mlに溶解し、これにスルホサクシイミジル４−〔Ｎ−マレイミドメチル〕シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Sulfo-SMCC; ピアス社製）１０mgを加え、３０℃で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を５mM  ＥＤＴＡを含む０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに通すことによって、過剰の試薬を除去した。
【００３６】
マレイミド基が導入された牛チログロブリン５０mgが溶解している５mM  ＥＤＴＡを含む０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）７mlに〔Ｃｙｓ〕−サイモシンα１〔１６−２８〕を加え、３０℃で１時間撹拌した。この反応液を生理食塩水１５L に対して４℃で３回透析したのち、分注して−２０℃で保存した。
【００３７】
免疫ならびに採血
上記サイモシンα１〔１６−２８〕−牛チログロブリン複合体をフロイントの完全アジュバンドに懸濁して家兎の背部２０ケ所以上に皮下注射した。これを２週間毎に１０回繰り返し、耳静脈から採血して抗血清ＭＣＲ０５７７を得た。
【００３８】
抗サイモシンα１ウサギＩｇＧの調製
抗サイモシンα１血清（ＭＣＲ０５７７）は、サイモシンα１〔１−２８〕をセファロースに固相化したイムノアフィニティカラムで精製した。
【００３９】
サイモシンα１〔１−２８〕セファロースカラムの作成は次のように行った。まず活性化ＣＨセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）１g を氷冷した１mMＨＣｌ  １５ml中で１５分間静置させてゲルを膨潤させた。膨潤したゲルを１mMＨＣｌ  １００mlで素早く洗浄した。洗浄したゲルを０．５M ＮａＣｌ  ４．５mlを含む０．１M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）に懸濁し、サイモシンα１〔１−２８〕３０μg を加えて、室温で２時間緩やかに撹拌した。ゲルと結合していないサイモシンα１〔１−２８〕を洗い流すため、０．５M ＮａＣｌを含む０．１M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）９０mlでゲルを洗浄した。さらに０．５M ＮａＣｌを含む０．１M 酢酸ナトリウム（pH４．０）１５mlで洗浄し、続いて０．５M ＮａＣｌを含む０．１M トリス塩酸（pH８．０）１５mlで洗浄した。洗浄したゲルはアジ化ナトリウムを含むダルベッコＰＢＳ緩衝液中で保存した。
【００４０】
抗サイモシンα１抗血清（ＭＣＲ０５７７）を上記で作成したサイモシンα１〔１−２８〕セファロースカラムに通した後、ダルベッコＰＢＳ緩衝液でカラムを洗浄し、カラムに残っている非特異的吸着物を洗い流した。カラムからの溶出は０．２M グリシン塩酸緩衝液（pH２．５）で行い、溶出液に１M トリス塩酸（pH８．０）を加えて中和した。
【００４１】
〔 125Ｉ〕−抗ウサギＩｇＧヤギ抗体標識体の調製
抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ（DAKO社製）２５μg を含んだ０．５M リン酸緩衝液５０μl に１mCi のＮａ 125Ｉを加えて、クロラミンＴ（２．０mg/ml)５μl を加え、５分後にアスコルビン酸（２．０mg/ml)２０μl を加えた。さらに、０．２g/mlヨウ化カリウム溶液２０μl を加え、Superose１２カラム（ファルマシア社製）で精製した。
【００４２】
血漿の前処理
被験者の肘前静脈より採血する。血液はテルモ社製のＥＤＴＡ採血管で採血し、遠心分離機で血漿を分離した。分離した血漿はＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８（Waters社製）で２５％アセトニトリルで抽出した。
【００４３】
サンドイッチ法（ＩＲＭＡ： Immuno Radiometric Assay ）によるサイモシンα１の測定法
モノクローナル抗サイモシンα１−ＩｇＧ1(ＭＴＨ３３Ｇ２）被覆ポリスチレンボール１個と、アフィニティクロマトグラフィーにより精製したウサギ抗サイモシンα１〔１６−２８〕５ngと、０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；１．０mg/ml ＢＳＡ、１．０mg/ml Tween ２０、０．５mg/ml アジ化ナトリウムを含む）５０μl とを混合し、サイモシンα１〔１−２８〕標準溶液または血漿のＳｅｐ−Ｐａｋ抽出物（総容量２００μl)に加え、室温で４時間振盪した。サイモシンα１標準溶液は０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；１．０mg/ml ＢＳＡ、１．０mg/ml Tween ２０、０．５mg/ml アジ化ナトリウムを含む）で最終容量が２００μl となるように希釈した。また、血漿をＳｅｐ−Ｐａｋで抽出し、０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；１．０mg/ml ＢＳＡ，１．０mg/ml Tween ２０、０．５mg/ml アジ化ナトリウムを含む）で溶解した。
【００４４】
反応混合物から溶液部分を除き、ポリスチレンボールは精製水３mlで３回洗浄後、〔 125Ｉ〕−抗ウサギＩｇＧヤギ抗体標識体（２００，０００cpm)と０．１M リン酸カリウム緩衝液（pH７．２；２０mg/ml ＢＳＡ、０．５mg/ml 牛−γグロブリン、１．０mg/ml Tween ２０、０．５mg/ml アジ化ナトリウムを含む）２００μl とを混合し、４℃で１８時間静置した。溶液部分を除去し、ポリスチレンボールを上記と同様３回洗浄した後、γ−カウンター（アロカＡＲＣ−６００）で放射能を測定した。
【００４５】
特異性
この方法によるサンドイッチ法におけるサイモシンα１の標準希釈曲線を図２に示す。サイモシンα１のＮ端認識のモノクローナル抗体とＣ端側認識のポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ法なので、末端のサイモシンα１〔１−１５〕フラグメントおよびサイモシンα１〔１６−２８〕フラグメントとは反応しない。またＮ末端側アセチル基が欠如しているデスアセチル−サイモシンα１〔１−２８〕も全く反応しない。これらの結果は、使用した抗体の特異性と一致する。ポリスチレンボールに固相化したマウス・モノクローナルＩｇＧ1 は、サイモシンα１のアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を含むＮ末端側に特異性を示し、ウサギ抗サイモシンα１−ＩｇＧは、サイモシンα１〔１６−２８〕に特異性を示す。
【００４６】
サンドイッチ法の感度
サイモシンα１の測定限界は１チューブ当たり１．０pgであるので、測定サンプル２００μl を用いたときのサイモシンα１の感度は５．０pg/ml(１．６fm）である。この感度は、既存のＲＩＡ（特開昭５７−１６８５０; International Journal of Immunopharmacology 14, 1267-1278, 1992; Journal of Immunological Methods 110, 261-265, 1988; Molecular Immunology 23, 701-707, 1986; Journal of Immunological Methods 89, 9-17, 1986; Journal of Immunological Methods 80, 45-53, 1985)と比較して、１桁以上感度が高い。
【００４７】
健常人および胸腺腫患者の血漿中サイモシンα１値
本発明サイモシンα１測定試薬により測定した健常人および胸腺腫患者の血漿中サイモシンα１値は、下記表１のとおりであった。
【００４８】
【表１】
0003853384.tif 000002
【００４９】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体を用いたサイモシンα１の免疫学的測定試薬を用いれば、Ｎ端のアセチル化されたＳｅｒ〔１〕を含むインタクトなサイモシンα１を測定できる。このサイモシンα１の測定法の確立により、胸腺腫、免疫欠損疾患、自己免疫疾患に対する有用な診断試験法を提供し、またこのホルモンの血中濃度を追跡することにより薬物療法におけるサイモシンα１のモニタリングが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】サイモシンα１〔１−２８〕（○）、デスアセチル−サイモシンα１〔１−２８〕（サイモシンα１〔de１−２８〕）（△）、およびサイモシンα１断片（サイモシンα１〔１−１５〕（□）、サイモシンα１〔１６−２８〕（●））と本発明のモノクローナル抗体ＭＴＨ３３Ｇ２との交差反応性を示す。
【図２】ＩＲＭＡによるサイモシンα１〔１−２８〕の標準曲線（○）と、デスアセチル−サイモシンα１〔１−２８〕〔サイモシンα１（de１−２８）（△）〕およびサイモシンα１断片（サイモシンα１〔１−１５〕（□）、サイモシンα１〔１６−２８〕（●））の交差反応性を示す。
【図１】
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【図２】
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