(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化１式で表わされる化学発光性基含有カルボジイミド化合物。
【化１】
0003807781.tif 000017
［化１式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキル基、Ｘはハロゲン原子、ｐは１〜１２の整数を表す。Ｍｅはメチル基を表す。Ｂは下記化２式で表されるカルボジイミド基に結合する一価の有機基を表す。］
【化２】
0003807781.tif 000018
［化２式中、ｋは１〜１２の整数を表す。Ｍｅはメチル基を表す。］
【請求項２】
下記化３式で表される化合物又はそのモルホリノ基が四級アンモニウム塩である請求項１に記載の化学発光性基含有カルボジイミド化合物。
【化３】
0003807781.tif 000019
［化３式中、Ｍｅはメチル基を表す。］
【請求項３】
下記化４式で表されるカルボジイミド基含有化合物と、下記化５式で表されるハロゲン含有化学発光性化合物とを反応させる工程を含む、請求項１又は２に記載の化学発光性基含有カルボジイミド化合物の製造方法。
【化４】
0003807781.tif 000020
［化４式中、Ｂは前記化１式におけるのと同義である。Ｒ’は炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキル基、ｐは１〜１２の整数を表す。］
【化５】
0003807781.tif 000021
［化５式中、Ｘはハロゲン原子を表す。Ｍｅはメチル基を表す。］
【請求項４】
標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法において、前記標識物質として、請求項１又は２に記載の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法。
【請求項５】
標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、前記標識物質として、請求項１又は２に記載の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な化学発光性基含有カルボジイミド化合物に関する。詳しくは、本発明は、高感度で且つ標識が容易な検出試薬である新規な化学発光性基含有カルボジイミド化合物及びその製造方法、並びにそれを使用した核酸検出法又はイムノアッセイ法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、種々の生物学的分析においては、検出可能な特定の標識物質を利用して目的物質を検出する分析方法が開発されている。例えば、標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸検出法では、先ず、プローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を標識し、これをハイブリッド形成条件下で、調べるべき核酸を含む試料と接触させる。試料中に、プローブとして用いた核酸に相補的な塩基配列を有する核酸が存在すれば、これとプローブが結合（ハイブリダイズ）し、核酸−核酸ハイブリッドが形成される。このハイブリッドの標識物質を検出することにより目的の核酸を検出することができる。また、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法においては、例えば測定対象が抗原であるときは、その抗原に特異的に結合する抗体を標識し、次いで抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体に含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の抗原を検出することができる。
【０００３】
このような核酸検出法やイムノアッセイ法における標識物質としては、放射性物質、ビオチンやジゴキシゲニン化合物等の非放射性の標識物質、蛍光物質、化学発光物質等が挙げられる。これらのうち、化学発光物質は、検出感度が高い等の理由から、標識物質として有望である。
【０００４】
化学発光物質の標識方法としては、例えば、アミノリンカーが結合した核酸とアミノ基反応性基含有化学発光物質とを反応させて核酸に化学発光物質を標識する方法が知られている（Clinical Chemistry, Vol.35, No.8, p1588-1594, 1989）。
【０００５】
しかしながら、このような方法においては、アミノリンカーが結合した核酸を調製する必要があり、操作が煩雑となるばかりでなく、天然に存在する核酸に化学発光物質を直接結合させて標識することができないという欠点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核酸検出法又はイムノアッセイ法における測定用標識として、短時間で効率よく標識することができ、また天然由来の核酸にも標識可能であり、且つ高感度な標識物質である新規化学発光性基含有カルボジイミド化合物を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
カルボジイミド化合物が核酸と反応することは知られている。例えば、カルボジイミド化合物は核酸中の水素結合を形成していないグアニン及びチミンと反応して付加体を形成することが報告されている［P. T. Gilham, J. Amer. Chem. Soc., 84, 688(1962)］。
【０００８】
本発明者らは、簡便で効率的な核酸及び蛋白質への化学発光性基導入法に関して鋭意研究を重ねた結果、カルボジイミド基の核酸、蛋白質等への高い反応性を利用して、カルボジイミド化合物に化学発光性基を導入することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表される化学発光性基含有カルボジイミド化合物に関する。
【００１０】
【化６】
Ｂ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｌ−ＣＬ        ・・・（Ｉ）
【００１１】
［式（Ｉ）中、Ｂはカルボジイミド基に結合する一価の有機基を表し、ＣＬは化学発光性基を表し、Ｌはカルボジイミド基と前記化学発光性基とを連結するリンカーを表す。］
【００１２】
また、本発明は、下記一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含有化合物と、下記一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学発光性化合物とを反応させる工程を含む、前記化学発光性基含有カルボジイミド化合物の製造方法に関する。
【００１３】
【化７】
0003807781.tif 000002
【００１４】
［式（ＩＶ）中、Ｂは前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。Ｒ’は炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキル基、ｐは１〜１２の整数を表す。］
【００１５】
【化８】
ＣＬ−Ｘ      ・・・（Ｖ）
【００１６】
［式（Ｖ）中、ＣＬは前記一般式（Ｉ）におけるのと同義であり、Ｘはハロゲン原子を表す。］
【００１７】
また、本発明は、標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法において、前記標識物質として、前記化学発光性基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法に関する。
【００１８】
更に、本発明は、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、前記標識物質として、前記化学発光性基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法に関する。
【００１９】
一般式（Ｉ）で表される本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、核酸塩基に対して高い反応性を示すカルボジイミド基と、高感度な検出反応性を示す化学発光性基とを同時に有する化合物であり、核酸検出法やイムノアッセイ法等における標識物質として有用である。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
【００２１】
（１）本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物
本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。すなわち、化学発光性基（ＣＬ）が、リンカー（Ｌ）を介してカルボジイミド基に結合した構造を有するものであればよい。このようなカルボジイミド化合物のうち、好ましいものとして以下に示す一般式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００２２】
【化９】
0003807781.tif 000003
【００２３】
［式（ＩＩ）中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキル基、Ｘはハロゲン原子、ｐは１〜１２の整数を表す。Ｂ及びＣＬは各々前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。］
【００２４】
ここで、前記式（ＩＩ）中、化学発光性基ＣＬは化学発光性を示す物質から誘導されるものであれば特に限定されず、かかる化学発光性を示す物質としては、例えばアクリジニウム誘導体、ルミノール誘導体、イソルミノール誘導体、ジオキセタン誘導体等の、公知の方法により検出可能な種々の化学発光物質から選ぶことができる。また、それ自体は必ずしも化学発光性を示すものではないが、化学発光物質へ容易に変換できる化合物を用いてもよい。
【００２５】
これらのうち特に好ましいものは、下記式（ＣＬ）で表される化学発光性基群から選ばれる基である。尚、式中、Ｍｅはメチル基を表し、ＦＳＯ3-はフルオロスルホネートイオンを表す（以下、同様）。
【００２６】
【化１０】
0003807781.tif 000004
【００２７】
前記式（ＩＩ）中、Ｂは一価の有機基であれば特に限定されないが、好ましくは下記一般式（Ｂ）で示した有機基群から選ばれる有機基、又はジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等の３級アミノ基若しくはそれらの４級アンモニウム基である。式（Ｂ）中、ｋは、１〜１２の整数であり、好ましくは３〜６である。
【００２８】
【化１１】
0003807781.tif 000005
【００２９】
［式（Ｂ）中、ｋは１〜１２の整数を表す。Ｒ0は有機基を表す。］
【００３０】
このような本発明のカルボジイミド化合物としては、具体的には下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００３１】
【化１２】
0003807781.tif 000006
【００３２】
前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物の四級アンモニウム塩としては、下記一般式（ＩＩＩ’）で表される化合物が挙げられる。式（ＩＩＩ’）中ＴｓＯ-は、トルエンスルホン酸イオンを表す。
【００３３】
【化１３】
0003807781.tif 000007
【００３４】
（２）本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物の製造方法
本発明の前記一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミドは、前記一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含有化合物と、前記一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学発光性化合物とを反応させる工程を含む方法により製造される。すなわち、一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含有化合物は、末端にアルキルアミノ基を有するものであり、一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学発光性化合物の末端ハロゲン原子（Ｘ）と反応し、リンカー（一般式（Ｉ）中のＬ）が形成される。この反応を以下の反応式に示す。
【００３５】
【化１４】
0003807781.tif 000008
【００３６】
一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含有化合物及び一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学発光性化合物は、各々所望する化学発光性基含有カルボジイミド化合物の構造に応じて適宜選択することができる。例えば、一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含有化合物の具体例としては、Ｎ−（３−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルカルボジイミド、１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、ビス−（３，３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等が挙げられる。このようなカルボジイミド基含有化合物は、下記反応式で示すように、先ず、ジアルキルアミノ基含有イソチオシアネート化合物（反応式中、ａ）をアルキルアミン（ｂ）と反応させてチオ尿素化合物（ｃ）を合成した後、得られたチオ尿素化合物について、酸化水銀、酸化鉛等を触媒として脱硫反応を行うことにより得られる。
【００３７】
【化１５】
0003807781.tif 000009
【００３８】
ここで用いるジアルキルアミノ基含有イソチオシアネート化合物及びアルキルアミンは、所望するカルボジイミド基含有化合物の構造に応じて適宜選択することができる。例えば、ジアルキルアミノ基含有イソチオシアネート化合物としては、３−ジメチルアミノプロピルイソチオシアネート、３−（４−モルホリノ）プロピルイソチオシアネート等が挙げられる。また、アルキルアミンとしては、Ｎ−（３−アミノプロピル）モルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミン等が挙げられる。
【００３９】
次に、一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学発光性化合物としては、下記式（Ｖ’）で表されるアクリジニウムエステルの臭素体、ヨウ素体、塩化物等が挙げられる。
【００４０】
【化１６】
0003807781.tif 000010
【００４１】
これらのハロゲン含有化学発光性化合物は、公知の方法により検出可能な種々の化学発光物質を２−ブロモエチルアミン、２−イオドエチルアミン、２−クロロエチルアミン等のハロゲン化試薬と反応させることにより得ることができる。このような化学発光物質としては、下記式（Ｖ’’）に示したアクリジニウムのコハク酸イミドエステル誘導体、ｐ−ニトロフェノール誘導体等の化学発光物質エステル誘導体等が挙げられる。
【００４２】
【化１７】
0003807781.tif 000011
【００４３】
これらの個々の反応工程は、例えば通常用いられるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、塩化メチレン等の溶媒を用いて、公知の方法により行われる。
【００４４】
本発明においては、このようにして得られる前記一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含有化合物と前記一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学発光性化合物とを、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン等の通常用いられる溶媒を用いて反応させることにより所望の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を得ることができる。
【００４５】
更に、得られる化学発光性基カルボジイミド化合物を、ジメチルホルムアミド等の溶媒中でｐ−トルエンスルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ジメチル硫酸等と反応させることにより、所望の四級アンモニウム塩とすることができる。
【００４６】
以上述べた方法により得られる本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、核酸検定法やイムノアッセイ法において標識物質として好適に使用することができる。その場合は、標識しようとするＤＮＡ等の核酸又は抗原もしくは抗体等のタンパク質とともに、本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を、溶媒中で混合させる等の方法で接触させることにより、前記核酸又はタンパク質に結合させることができる。すなわち、本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を、核酸塩基と高い反応性を示すカルボジイミド基において核酸又はタンパク質と結合させることにより、高感度な検出試薬として働く化学発光性物質をこれらに付加し、標識とすることができるのである。よって、本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物と核酸又はタンパク質と結合させる場合には、カルボジイミド基が反応しやすい条件下、例えばｐＨ７．５〜８．５程度のアルカリ性の条件下で両者を接触させるのが好ましい。
【００４７】
（３）本発明の核酸検定法
本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法において、標識物質として用いることができる。すなわち、化学発光性基含有カルボジイミド化合物で標識された核酸は、ハイブリダイゼーション用のプローブとして用いることができる。測定対象である核酸にプローブをハイブリダイズさせて、核酸−核酸ハイブリッドを形成させ、系から遊離のプローブを除去した後にハイブリッドに含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の核酸を検出することができる。本発明においては、標識物質である化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、化学発光測定装置、フォトカウンター等を用いて化学発光強度等を測定することにより検知することができる。測定対象である核酸は、通常、ナイロンメンブレン、ニトロセルロース等の膜に固定化されて用いられる。
【００４８】
本発明の核酸の検出法におけるハイブリダイゼーションは、核酸プローブの標識に化学発光性基含有カルボジイミド化合物を用いる以外は、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション等の、通常の核酸のハイブリダイゼーションと特に変わるところはない。測定対象である核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、プローブに用いる核酸もまたＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００４９】
プローブに用いる核酸の標識は、上記の方法によってポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを標識することによって行うことが好ましいが、標識されたヌクレオチドをポリメラーゼ反応によってポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに取り込ませることによって行うこともできる。
【００５０】
（４）本発明のイムノアッセイ法
本発明の前記化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、前記標識物質として用いることができる。
【００５１】
測定対象が抗原であるときは、その抗原に特異的に結合する抗体を標識し、抗原−抗体複合体を形成させ、系から遊離の抗体を除去した後に複合体に含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の抗原を検出することができる。本発明においては、標識物質である化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、化学発光測定装置、フォトカウンター等を用いて化学発光強度等を測定することにより検知することができる。また、抗原に特異的に結合する第１の抗体を固相化しておき、これに抗原を結合させ、抗原に特異的に結合する第２の抗体を標識したものを結合させてもよい。この場合、第１の抗体と第２の抗体は、同一のポリクローナル抗体を用いてもよく、異なるモノクローナル抗体を用いてもよい。さらに、一方をポリクローナル抗体とし、他方をモノクローナル抗体としてもよい。各々の方法において、標識した抗体の代わりに未標識の抗体を用い、これを抗原に結合させた後に、前記抗体に結合する二次抗体を標識したものをさらに結合させてもよい。二次抗体は、抗体の調製に用いた動物のイムノグロブリンで前記動物と異なる動物を免疫することによって得られる。
【００５２】
測定対象が抗体であるときは、その抗原に特異的に結合する抗原を標識し、抗原−抗体複合体を形成させ、系から遊離の抗原を除去した後に複合体に含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の抗体を検出することができる。また、測定対象である抗体に特異的に結合する抗体が得られる場合には、その抗体を標識したものを用い、抗体−抗体複合体を形成させてもよい。
【００５３】
本発明のイムノアッセイ法は、抗原又は抗体の標識に化学発光性基含有カルボジイミド化合物を用いる以外は、通常のイムノアッセイ法と特に変わるところはなく、抗原又は抗体の固相化、抗原抗体反応、洗浄操作等は、通常行われているのと同様にして行えばよい。また、イムノアッセイ法の態様も、直接法、間接法、競合法等、いずれの態様も適用され得る。
【００５４】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を説明する。
【００５５】
【実施例１】
以下に示す方法で、本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。尚、各々の反応について、各項において反応式を示す。
【００５６】
（１）チオ尿素化合物の合成（反応式（１））
３−（ジメチルアミノプロピル）イソチオシアネート１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン１５ｍｌに溶解し、氷浴で冷却した。これにＮ−（３−アミノプロピル）モルホリン１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に水を加えた後、塩化メチレンで抽出し（５ｍｌ×３回）、無水炭酸カリウムで乾燥した後、濃縮してＮ−（３−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルチオ尿素（下記反応式（１）中、化合物−１。以下同様。）２．７ｇを得た（収率９８％）。
【００５７】
【化１８】
0003807781.tif 000012
【００５８】
（２）カルボジイミド基含有化合物の合成（反応式（２））
Ｎ−（３−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルチオ尿素（化合物−１）２．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）をアセトン３５ｍｌに溶解し、酸化水銀４．２ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加えて、還流下、２時間撹拌した。放冷後、反応混合物をろ過した後、溶媒を留去して粗生成物を得た。減圧蒸留により、Ｎ−（３−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルカルボジイミド（化合物−２）１．５ｇを得た（収率６０％）。このものの沸点（ｂ．ｐ．）は１２５〜１２８℃／０．２ｍｍＨｇであった。
【００５９】
【化１９】
0003807781.tif 000013
【００６０】
（３）化学発光物質の臭素体の合成（反応式（３））
アクリジニウムのコハク酸イミドエステル誘導体（化合物−３）４０ｍｇ（０．０８５ｍｍｏｌ）を１Ｎホウ酸ナトリウム緩衝液とメタノールの１：１混合液１ｍｌに溶解させた。この溶解液に２−ブロモエチルアミン塩酸塩１８ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を加え、１８時間反応させた。反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけた。カラムは商品名Puracil C-18（ウォータース社製）を用い、水：メタノールの６０：４０〜４０：６０の勾配をかけ、紫外吸収３８０ｎｍを追跡した。１２分のピークを分取し、分取分を凍結乾燥し、アクリジニウムエステルの臭素体（化合物−４）を２７ｍｇ得た。
【００６１】
【化２０】
0003807781.tif 000014
【００６２】
（４）化学発光性基含有カルボジイミド化合物の合成（反応式（４））
アクリジニウムエステルの臭素体（化合物−４）２７ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３ｍｌ中に溶解し、これにＮ−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルカルボジイミド（化合物−２）１２ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）が溶解しているジメチルホルムアミド溶液２ｍｌを加え、１８時間室温で撹拌した。反応溶媒を減圧留去し、残った反応混合物を少量のジメチルホルムアミドに溶解させ、これをジメチルエーテル中に滴下した。析出した黄色結晶を濾別後、乾燥させ、アクリジニウムエステル基を含有するカルボジイミド化合物（化合物−５）を２０ｍｇ得た。
【００６３】
【化２１】
0003807781.tif 000015
【００６４】
（５）化学発光性基含有カルボジイミド化合物の四級アンモニウム塩の合成（反応式（５））
アクリジニウムエステル基を含有するカルボジイミド化合物（化合物−５）２０ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３ｍｌに溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）５ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）が溶解しているジメチルホルムアミド溶液２ｍｌを加え、１８時間室温で撹拌した。反応溶媒を減圧留去し、残った反応混合物を少量のジメチルホルムアミドに溶解させ、これをジメチルエーテル中に滴下した。析出した白色結晶を濾別後、乾燥させ、アクリジニウムエステル基を含有するカルボジイミド化合物の四級アンモニウム塩（化合物−６）を１３ｍｇ得た。
【００６５】
【化２２】
0003807781.tif 000016
【００６６】
【実施例２】
前記実施例１において合成された化合物−６を用いて、以下に示す方法により、ＤＮＡに化学発光性基を導入して化学発光物質標識ＤＮＡを作製した。
【００６７】
反応溶液［ファージＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８複製型：宝酒造株式会社）１μｇ；０．１Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）；０．２５％ＳＤＳ；０．１Ｍのアクリジニウムエステル基含有カルボジイミド化合物の四級アンモニウム塩（化合物−６）］を８５℃で１分間インキュベートした。次に、未反応の化学発光性基含有カルボジイミド化合物（化合物−６）を除去するために、試料の１／９倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で４５分間静置した。遠心機（国産社製、Ｈ−１５００ＦＲ）により、４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心して上層を除去し、７０％エタノール５００μｌを加えて更に４℃、１２０００ｒｐｍで１分３０秒間遠心した。上層を除去した後、１００μｌの滅菌水に沈殿を溶解し、ＤＮＡ濃度をＵＶ測定器（UV-VISIBLE RECORDING SPECTROPHOTOMETER UV-2100：島津製作所）によって調べ、−２０℃で保存した。
【００６８】
【実施例３】
実施例２で得られた化学発光標識ＤＮＡを用いて、以下に述べるようにしてＤＮＡの検出を行った。
【００６９】
ファージＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８複製型ＤＮＡ：宝酒造（株）製）を１００ｐｇ／ｍｌから０．１ｐｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００℃で１０分間熱変性させ、９６ウェルマイクロタイタープレートに吸着固定した。洗浄後、１００μｌのプレハイブリダイゼーション溶液［５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５×デンハーツ（Denhardt's）溶液（０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ）、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、５０％ホルムアミド、０．５ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ］を加え、６０℃で２時間インキュベートした。
【００７０】
次いで１００μｌのハイブリダイゼーション溶液［５×ＳＳＣ、１×デンハーツ溶液、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、４５％ホルムアミド、０．２ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ、実施例２で作製した化学発光物質標識ＤＮＡプローブ １０ｎ／ｍｌ］を加え、４２℃で一晩インキュベートした。反応混合物から上清を除去後、５０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを加え、５分間インキュベート（洗浄）した。この操作を５回繰り返した。
【００７１】
マイクロタイタープレートを個々のウェルに切り離し、化学発光測定装置（ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−３０１：アロカ（株）製）に設置し、０．５％過酸化水素／０．１規定硝酸溶液１２０μｌを加え、次いで０．１２５％セチルトリメチルアンモニウムクロライド／０．２５規定水酸化ナトリウム溶液１２０μｌを加え、生じる化学発光を２秒間測定したところ、０．１ｐｇ／ｍｌの未標識ＤＮＡを検出することができた。
【００７２】
【実施例４】
本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を標識物質として、以下に示す方法で、化学発光物質標識タンパク質を作製した。
【００７３】
反応溶液［抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）（Anti-RABBIT-IgG(goat)、VECTER LABORATORIES社製）１００μｇ；０．１Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）；０．１Ｍの化学発光性基含有カルボジイミド化合物（実施例１で得られた化合物−６）］を氷上で１０分間静置した。全量の０．３％になるように１０％ＳＤＳを加え、マイクロ遠心チューブ（商品名ウルトラフリーＣ３ＬＧＣ；ミリポア(MILLIPORE)社製）を用いて、５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、未反応のカルボジイミド化合物を取り除いた。さらに、フィルターカップに１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）及び５０ｍＭのＮａＣｌを各々５０μｌ加え、５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。同様の操作を再度行い、残渣をエッペンドルフチューブに移し、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）及び５０ｍＭのＮａＣｌで０．１Ｍの溶液に調整した後、４℃で保存した。
【００７４】
【実施例５】
実施例４で作製した化学発光物質標識タンパク質の希釈系列を作り、化学発光測定装置（ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−３０１：アロカ（株）製）専用のバイアルに１０μｌずつ分注した。このバイアルを前記化学発光装置に設置し、０．５％過酸化水素／０．１規定硝酸溶液３００μｌを加え、次いで０．１２５％セチルトリメチルアンモニウムクロライド／０．２５規定水酸化ナトリウム溶液３００μｌを加え、生じる化学発光を２秒間測定したところ、０．１ｐｇ／ｍｌの化学発光物質標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）を検出することができた。
【００７５】
【発明の効果】
本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を用いれば、簡便な操作で高感度な核酸検出及びイムノアッセイ法を行うことができる。