(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト間葉前駆細胞の試験管内軟骨形成およびそれからのヒト軟骨細胞の試験管内形成のための一つの組成物であって、この組成物が充填細胞ペレットとして近接して濃縮された単離ヒト間葉幹細胞、およびそれと接触する少くとも１個の軟骨誘導剤を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が単離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が既知組成無血清環境にあることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１記載の組成物であって、ここで軟骨誘導剤が（ｉ）グルココルチコイド；（ii）トランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの一員；および（iii）コラーゲン性細胞外マトリックスの成分より成るグループから選択されることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項４記載の組成物であって、ここでグルココルチコイドがデキサメタゾンであることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項４記載の組成物であって、ここでトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの一員が骨形態形成タンパク質、ＴＧＦ−β１、インヒビンＡおよび軟骨形成刺激活性因子より成るグループから選択されることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項６記載の組成物であって、ここで骨形態形成タンパク質がＢＭＰ−４であることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項４記載の組成物であって、ここでコラーゲン性細胞外マトリックスの成分がコラーゲンＩであることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項８記載の組成物であって、ここでコラーゲンＩがゲルの形態にあることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１記載の組成物であって、ここで軟骨誘導剤がデキサメタゾンおよびＴＧＦ−β１を組合せたものであることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
間葉幹細胞を試験管内で軟骨誘導剤と接触させることにより間葉幹細胞から軟骨細胞を生産する一つの方法であって、ここで幹細胞が充填細胞ペレットとして近接して濃縮されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が単離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が既知組成無血清環境にあることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１記載の方法であって、ここで軟骨誘導剤が（ｉ）グルココルチコイド；（ii）トランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの一員；および（iii）コラーゲン性細胞外マトリックスの成分より成るグループから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１記載の方法であって、ここで軟骨誘導剤がデキサメタゾンおよびＴＧＦ−β１を組合せたものであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１１記載の方法であって、ここで接触の段階がヒト間葉幹細胞のペレットを既知組成無血清培地で培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法であって、ここで既知組成無血清培地が（１）既知組成最少必須培地；（２）アスコルビン酸塩あるいはその類似体；（３）鉄源；（４）インスリンあるいはインスリン状増殖因子；および（５）少くとも１個の軟骨誘導剤あるいは因子を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１１記載の方法であって、ここで細胞が軟骨誘導組成物と共に培養され、その後硬質多孔性容器に置かれることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法であって、ここで硬質多孔性容器がセラミックキューブであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
間葉幹細胞を試験管内で軟骨誘導剤に接触させることにより間葉幹細胞に軟骨形成を誘導する一つの方法であって、ここで幹細胞が充填細胞ペレットとして近接して濃縮されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が単離され培養拡張されるヒト間葉幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２０記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が既知組成無血清環境にあることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２０記載の方法であって、ここで軟骨誘導剤が（ｉ）グルココルチコイド；（ii）トランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの一員；および（iii）コラーゲン性細胞外マトリックスの成分より成るグループから選択されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２０記載の方法であって、ここで軟骨誘導剤がデキサメタゾンおよびＴＧＦ−β１を組合せたものであることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２０記載の方法であって、ここで接触の段階がヒト間葉幹細胞のペレットを既知組成無血清培地で培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法であって、ここで既知組成無血清培地が（１）既知組成最少必須培地；（２）アスコルビン酸塩あるいはその類似体；（３）鉄源；（４）インスリンあるいはインスリン状増殖因子；および（５）少くとも１個の軟骨誘導剤あるいは因子を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２０記載の方法であって、ここで細胞が軟骨誘導組成物で培養され、その後硬質多孔性容器に置かれることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法であって、ここで硬質多孔性容器がセラミックキューブであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
この発明は試験管内で培養された間葉始原細胞を特異的な細胞系列経路に分化するよう仕向ける方法および組成物の分野に関し、とりわけヒトおよび他の種の病理条件の治療処置のために受容体あるいは宿主への移植の前あるいはその時点でのこのように仕向けられた系列誘導に関する。
間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）は骨髄、血液、真皮、および骨膜に見出される形態形成多能芽細胞あるいは胚状細胞であり、それは脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋組織、線維結合組織を含む間葉あるいは結合組織の特異的な型に分化することができる。これらの細胞が入り込む特異的分化経路は機械的影響およびもしくは成長因子、サイトカインなどの内因性生物活性因子およびもしくは宿主組織により確立された局所微環境条件からの各種影響に依存する。これらの細胞は通常骨髄で非常に低い頻度で存在するけれども、組織培養でこれらの細胞母集団を分離し、精製し、かつ有糸分裂拡張する製法はキャプラン他、合衆国特許番号５，１９７，９８５号および５，２２６，９１４号で報告されている。
出生前生物においては、特殊化結合組織細胞へのＭＳＣｓの分化は十分に確立されている。例えば胚ひな、マウスあるいはヒト肢芽間葉細胞は軟骨、骨および他の結合組織に分化する（キャプランＡＩ，発展生物学協会３９回年次報告、Ｓ．サブテルニーおよびＵアボット編、３７６８ページ。ニューヨーク、アラン・アール・リス・インコーポレイテッド，１９８１；エルマー他、奇形学、２４：２１５−２２３，１９８１；ホーシュカＳＤ，発展生物学、３７：３４５−３６８、１９７４；ソラーシュ他、発展生物学、８３：９−１９、１９８１；スウォラ他、発展生物学、１１６：３１−３８，１９８６）。加えて、クローン化ラット胎仔頭蓋冠細胞系も筋、脂肪、軟骨および骨に分化することが示されてきている（五島他、臨床整形外科関係研究、２６９：２１４−２８３、１９９１）。生後生物におけるＭＳＣｓの存在はいくつかの中胚葉表現型への胚後細胞の分化を示す目的について広範に研究されてこなかった。行われた数少ない研究は拡散チャンバーへの入れこおよび生体内移植に続く骨髄細胞による骨および軟骨の形成を伴っている（アシュトン他、臨床整形外科関係研究、１５１：２９４−３０７，１９８０；ブルーダー他、骨無機質、１１：１４１−１５１，１９９０）。最近、ひな骨膜からの細胞が分離され、培養拡張され、また試験管内高密度条件の下で軟骨および骨に分化することが示された（中原他、実験細胞研究、１９５：４９２−５０３、１９９１）。ラット骨髄誘導間葉細胞が生体内移植された時に骨芽細胞および軟骨細胞に分化する能力を持つことが示された（デニス他、細胞移植、１：２３３２、１９９１；五島他、臨床整形外科関係研究、２６９：２７４−２８３、１９９１）。これらの軟骨形成能力の間接的証拠は移植研究から得られたけれども、これらの細胞が軟骨細胞に分化する試験管内システムは展開されなかった。
この発明に従って、ヒト間葉幹細胞が三次元形態に結合されると、細胞はある種の軟骨誘導剤あるいは因子と試験管内で接触した時軟骨形成経路に沿って委ねられ分化するように誘導することができるということが発明者により観察された。三次元形態はこの発明が試験管内軟骨形成にとっては重要であり、細胞は例えば充填されあるいはペレット化された細胞塊として望ましくは一緒に濃縮される。この試験管内製法は生体内で起こることを反復するものと考えられ、軟骨形成の製法で重要である分子事象を定義するのに使用することができる。
かくして、一つの見地において、この発明はヒト間葉前駆体細胞の試験管内軟骨形成のためおよびそのヒト軟骨細胞の試験管内形成のための一つの組成物を提供し、この組成物は三次元形態での分離ヒト間葉幹細胞およびそこで接触する少くとも１個の軟骨誘導剤を含む。間葉幹細胞は望ましくは合成無血清環境にある分離された培養拡張ヒト間葉幹細胞であり、三次元細胞塊、例えば充填細胞あるいは遠心分離細胞ペレットなどの形態にあるなどのようにごく近接して濃縮される。
軟骨誘導剤は望ましくは（ｉ）デキサメタゾンなどのグルココルチコイド；（ii）骨形態発生タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、ＴＧＦ−β１、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子などのトランスフォーミング成長因子−β上科の一員；（iii）コラーゲンＩ（特にゲル形態のもの）などのコラーゲン性細胞外基質の成分；および（iv）レチノイン酸などのビタミンＡ類似体、よりなるグループから個別にあるいは組合せて選択される。とりわけ望ましいものはデキサメタゾンおよびＴＧＦ−β１の組合せである。
この発明はまたそこで幹細胞が三次元形態に結合される軟骨誘導剤に試験管内で間葉幹細胞を接触させることにより間葉幹細胞から軟骨細胞を生産する製法を提供する。
この発明は更にそこで幹細胞が三次元形態に結合される軟骨誘導剤に試験管内で間葉幹細胞を接触させることにより間葉幹細胞内に軟骨形成を誘導する製法を提供する。
前記の方法において、間葉幹細胞は望ましくは合成無血清環境において分離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であり、三次元細胞塊、例えば充填細胞あるいは遠心分離細胞ペレットの形態にあるなどのようにごく近接して濃縮される。更に接触は望ましくはヒト間葉前駆体細胞のペレットを合成無血清培地で培養することを含み、この合成無血清培地は（１）合成最少必須培地；（２）アルコルビン酸塩あるいはその類似体；（３）鉄源；（４）インスリンあるいはインスリン状成長因子；および（５）少くとも１個の軟骨誘導剤あるいは因子、を含む。前記の方法は更に望ましくは、細胞が軟骨誘導組成物で培養されその後セラミックキューブなどの硬い多孔性容器に置かれる段階を含む。
分離された非培養非相同ヒト間葉幹細胞製剤をこの発明の組成物および方法に使用することも可能である。ＭＳＣｓは密度勾配分画などにより、骨髄、（末梢血を含む）血液、骨膜および真皮、ならびに中胚葉起点を持つ他の組織などの組織から非培養非相同製剤として分離することができる。これに関連して、これらの間葉幹細胞は通常骨髄に例えば非常に微量で存在し、またその量は年齢と共に（すなわち比較的若い患者で約１／１０，０００細胞から高年齢の患者で１／２，０００，０００と同じ位まで少なく）大きく減少するけれども、ヒト間葉幹細胞製剤は骨髄の他の型の細胞が事実上ないように組織、とりわけ骨髄から分離することができる。分離された分画製剤がその内少くとも約９０％、また望ましくは少くとも約９５％でヒト間葉幹細胞である細胞を含むことが考えられる。
前記の試験管内方法で軟骨形成の誘導および軟骨細胞生産で起こる事象の配列は胚肢形成における軟骨形成のそれと類似する。このシステムのすべての成分が定義されているため、システムは軟骨形成進行に関する成長因子等の作用の研究に対し貴重な研究手段として使用することができる。それはまた始原細胞からの哺乳類軟骨形成の分子制御についての研究にも適用できる。
この研究はこれから各図面の簡単な説明を引用して更に説明されるが、それは発明の範囲を決して制限するものではない。
図１．ヌードマウスへの皮下移植３週後に採取された間葉始原細胞積み込みコラーゲンスポンジを経由する切片のトルイジンブルー染色。ラビット骨髄誘導細胞はスポンジへの積み込み前に単層培養で１４日間成長した。
図２Ａ−２Ｃ．７日（図２Ａ）、１４日（図２Ｂ）および２１日（図２Ｃ）の＋ＤＥＸ培養からのペレット化ラビット骨髄誘導の切片のトルイジンブルー染色。
図３Ａ−３Ｇ．ペレット培養骨髄誘導始原細胞の免疫組織化学。７日（図３Ａ）、１４日（図３Ｂ）、および２１日（図３Ｃ）でのII型コラーゲンの免疫染色。図３ＤはＸ型コラーゲンを免疫染色した２１日目のペレットの切片である。免疫染色はまたグリコサミノグリカン：コンドロイチン硫酸（図３Ｅの７−Ｄ−４；図３Ｆの３−Ｂ−３（＋））およびケラタン硫酸（図３Ｇの５−Ｄ−４）で示される。
図４．基質分子プローブを用いるラビット間葉始原細胞ＲＮＡのノーザンハイブリッド形成。ラビット骨髄誘導間葉始原細胞（レーン１、３）およびラビット皮膚線維芽細胞（レーン２、４）からの全細胞ＲＮＡがヒトコラーゲンα１（Ｉ）プローブ（レーン１、２）およびコラーゲンα２（Ｉ）に対するラビット特異的プローブ（レーン３、４）でハイブリッド形成された。同じブロットがヒトα１（II）およびラビット特異的アグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）ならびに化学結合タンパク質プローブで再プローブされた時にはｍＲＮＡ帯は検出できなかった。
この発明はこれからそれを支持する数多くの実施例および例と関連してより詳細に説明されるであろう。
この発明は数多くの用途および利点を有する。その利点の一つは自己由来宿主に戻す移植の前にＭＳＣ分化に指向し促進する能力にある。例えば、軟骨形成細胞になるように試験管内で指向されるＭＳＣｓは、まず系列内に補充され次いで主要分化段階を通じて進行する筈であるＭＳＣｓよりもより速く均一に移植部位で軟骨基質を合成するであろう。このような生体外処置は更に精製ＭＳＣｓに対する生物活性因子の均一で制御された適用を提供し、均一の系列委託および分化に導く。内因性生物活性因子の生体内有用性は容易に保証あるいは制御することができない。ここで開示されているような前処理段階はこれを回避する。加えて、移植の前にＭＳＣｓを前処理することにより、外因性生物活性因子の全身あるいは局所投与に関連する潜在的に有害な副作用は回避される。この技術のも一つの用途は細胞が移植の時点にある分化の段階に基づく組織再生に向ける能力にある。それはつまり軟骨細胞に関して、移植における細胞の状態が形成される最終組織の型を制御するということである。
ここで使用されるように、「軟骨誘導剤」あるいは「軟骨誘導因子」という用語は、試験管内軟骨形成誘導あるいは軟骨細胞生産を実施するように三次元形態にあるヒト間葉幹細胞に適用できるいずれかの天然あるいは合成、有機あるいは無機化合物もしくは生化学化合物もしくは化合物の組合せあるいは混合物、もしくは機械的あるいは他の物理的装置、コンテナー、影響あるいは力を引用する。軟骨誘導剤は望ましくは（ｉ）デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、（ii）骨形態発生タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、ＴＧＦ−β１、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子（ＣＳＡ）などのトランスフォーミング成長因子−β上科の一員；（iii）コラーゲンＩ（特にゲル形態のもの）などのコラーゲン性細胞外基質の成分；および（iv）レチノイン酸などのビタミンＡ類似体、よりなるグループから個別にあるいは組合せて選択される。
ここで使用されるように、「合成培地」という用語は、この発明の組成物が特にこの発明の方法に従って試験管内軟骨形成を受けることのできる維持、成長あるいは培養培地を引用し、また最少必須培地、アスコルビン酸塩あるいはその類似体、鉄源およびインスリンもしくはインスリン状成長因子を含む。
ここで使用されるように、「最少必須培地」という用語は、試験管内でヒト間葉幹細胞の生存可能性を支持するいずれかの無血清動物細胞培養製剤あるいは既知の組成物の培地を引用する。その例はいずれかのイーグル基本培地、すなわちダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）；イスコーブ修飾イーグル培地、アルファ修飾イーグル培地、および更にマッコイ５Ａ、ならびにＢＧＪb（フィットン−ジャクソン修飾）などである。
ここで使用されるように、「鉄源」という用語は還元された第二鉄の鉄の形態を培地に放出するいずれかの化学種を引用し、必ずしもそれに限定されないがトランスフェリン、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ4）、あるいはフェリチンを含む。
ここで使用されるように、「インスリン」という用語は既知の各種インスリンのいずれかを引用する。インスリンは皮下注射後に作用の速効性、継続および強度に従って３種のカテゴリー、すなわち前記の通り速やかな、中間の、あるいは長期作用性に分割される。結晶性標準インスリンは塩化亜鉛の存在下で沈殿により調製され修飾形態が活性のパターンを変更するために開発された。プロタミン亜鉛インスリン（ＰＺＩ）はタンパク質複合体を形成するためのインスリンおよび亜鉛と塩基性タンパク質プロタミンの反応の成果であり、この複合体は結晶性標準インスリンよりもよりゆるやかに溶解し吸収されしかもより着実な割合での吸収に高度に信頼できる。イソフェンは修飾結晶性プロタミン亜鉛インスリンであり、その作用は量の多い標準インスリンと量の少ないプロタミン亜鉛インスリンとの混合物に匹敵する。持続されかつ敏速なインスリン亜鉛懸濁液もこの発明での使用が考えられている。インスリンは例えばヒト、ウシ、めん羊あるいは他の動物源のものであり、あるいは組換え産物であることができる。
ヒトインスリンは今ではその組換えＤＮＡによる生産の結果として広く利用できる。理論上それは精製ブタインスリンよりも免疫原性が少し少なく、代ってブタインスリンはウシインスリンよりも免疫原性が少ない。ウシインスリンは３個のアミノ酸残基でヒトインスリンとは異なり、一方ブタはβ鎖のカルボキシル末端にある１個のアミノ酸のみでヒトインスリンと異なる。しかし高度に精製された場合、３種のインスリンすべては免疫応答を刺激する比較的低いしかし測定可能な能力を持つ。
短期あるいは急速作用性インスリンは中性ｐＨで緩衝液に溶解された標準の結晶性亜鉛インスリン（インスリン注射剤）の単なる溶液である。これらは作用の最速の開始としかし最短の継続期間を有し、すなわちグルコース水準は２０−３０分以内に最低の状態に達し、また約２−３時間で基線に戻る。
中間作用性インスリンはそれが皮下に投与された時によりゆるやかに溶解するように処方されており、その作用の継続期間は従ってより長い。もっともよく使用される２種の製剤は中性プロタミンハーゲドルン（ＮＰＨ）インスリン（イソフェンインスリン懸濁液）およびレンテインスリン（インスリン亜鉛懸濁液）である。ＮＰＨインスリンは亜鉛とプロタミンをリン酸緩衝液で持つ複合体のインスリン懸濁液である。レンテインスリンは結晶性（ウルトラレンテ）インスリンおよびインスリンの溶解度を最小化する酢酸緩衝液内の無晶性（セミレンテ）インスリンの混合物である。製剤は類似の薬学動態プロファイルを持つ。
ウルトラレンテインスリン（持続型インスリン亜鉛懸濁液）およびプロタミン亜鉛インスリン懸濁液は長期作用性インスリンである。これらは非常にゆっくりとした開始および作用の延長された（「水平の」）最盛期を持つ。これらのインスリンは１日を通じてインスリンの低い基礎濃度を提供することが主張される。
ここで使用されるように、インスリンという用語はインスリン類似体を包含することも考慮される。吸収の割合を変化させた最近のインスリンの展開は関心を高めた。Ｂ９およびＢ２７のそれぞれの位置で置換されたアスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩を持つインスリンは不十分に結晶化し、また「単量体インスリン」と名付けられた。このインスリンは皮下の貯蔵所からより急速に吸収され、かくして食後の需要に合致するのに有用となる。それに反して、他のインスリン類似体は注射部位で結晶化する傾向があり、よりゆるやかに吸収される。効力の向上したインスリンはＢ１０の位置でアスパラギン酸塩をヒスチジンに置換することにより、またβ鎖のカルボキシル末端残基の修飾により生産されている。
ヒト間葉幹細胞の分離、精製および培養拡張
ここで記載の通り分離され精製されたヒト間葉幹細胞は、例えば骨髄、血液、真皮あるいは骨膜から誘導される。骨髄から得られた時、これは股関節部あるいは膝置換手術の間に変形性関節症の患者から得られた大腿頭海綿質片の栓子、あるいは正常な供与体および将来の骨髄移植のために骨髄を採取された腫瘍患者から得られた吸引骨髄の栓子を含む数多くの異なった源からの骨髄であり得る。採取された骨髄は次いで細胞培養を準備される。分離製法は、分化なしで間葉幹細胞の成長を可能にするだけでなく、培養容器のプラスチックあるいはガラス表面への間葉幹細胞のみの直接付着を可能にする作用薬を含む特別に用意された培地の使用を伴う。非常に微量の間葉組織サンプルに存在する望ましい間葉幹細胞の選択的付着を可能にする培地を創出するために、次いで源の間葉組織に存在する他の細胞（すなわち赤血球および白血球、他の分化間葉細胞等）から間葉幹細胞を分離することが可能となった。
骨髄は長骨の骨髄腔、いくつかのハヴァース管、および海綿質骨の小柱の間の空間を占める軟組織である。骨髄は２種の型：初期のすべての骨および成人の制限位置（すなわち海綿質）で見出され、また血球の生産（すなわち造血）およびヘモグロビン（かくして赤色）の生産に関連する赤；および主として脂肪細胞（かくして黄色）ならびに結合組織よりなる黄である。
全体として、骨髄は複組織であり、造血幹細胞を含む造血細胞、および赤血球ならびに白血球およびその前駆体；また「支質」と呼ばれる結合組織網様構造に貢献する間葉幹細胞、線維芽細胞、網状赤血球、脂肪細胞および内皮細胞を含む細胞のグループよりなる。支質より得た細胞は細胞表面タンパク質を経る直接の相互作用を通じる造血細胞の分化および成長因子の分泌を調節し、骨格構造の基礎および支持に従事する。動物モデルを使用する研究は、骨髄が軟骨、骨および他の結合組織細胞に分化する能力を持つ「前支質」細胞を含むことを示唆した（ベレスフォード、Ｊ、Ｎ．：骨形成幹細胞および骨と骨髄の支質システム、臨床整形外科、２４０：２７０、１９８９）。最近の証拠は、多能性支質幹細胞あるいは間葉幹細胞と呼ばれるこれらの細胞が数多くの生物活性因子の影響に依存する活性化に際して、いくつかの異なった型の細胞系（すなわち骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等）に生成する能力を持つことを示す。しかし間葉幹細胞は広範な種類の他の細胞（すなわち赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞等）と共にごく微量で組織に依存する。
その結果、分化の前に組織からヒト間葉幹細胞を分離し精製し次いで筋骨格治療のための貴重な道具を生産する間葉幹細胞を培養拡張する製法が開発されてきた。このような操作の目的は間葉幹細胞の数を大きく増加しこれらの細胞を身体の正常な回復能力に再指向およびもしくは強化するのに利用することである。間葉幹細胞は数多く拡張され、かつ再生およびもしくは修復のための生体内成長を高めあるいは刺激し、続く活性化および分化を通じて各種の人工装置への移植片付着を改善し、あるいは造血細胞生産を高める等のため結合組織損傷の領域に適用される。
望ましい選択的付着に特によく適しており、下記の通り血清を補充された時「完全培地」としてここで引用されるいくつかの培地が準備されてきた。このような培地の一つはよく知られており容易に商業的に利用できるダルベッコ修飾イーグル培地−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）の増強版である。
商業的処方は重炭酸ナトリウム３７００ｍｇ／ｌおよびペニシリン（塩基）の１０，０００単位、ストレプトマイシン（塩基）の１０，０００μｇ、ペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン、および食塩水０．８５％内でのファンジゾン▲Ｒ▼としてのアンホテリシンを利用するアンホテリシンＢ／ｍｌの２５μｇを含む１００×抗生物質−抗真菌剤１０ｍｌ／ｌが補充される。
前に記載の培地は形成され使用に供するまで１００ｍｌ当り９０ｍｌあるいは５００ｍｌ当り４５０ｍｌのボトルに４℃で貯蔵される。使用には、（選択されたロットからの）胎仔ウシ血清１０ｍｌあるいは５０ｍｌが培地のボトルに加えられ血清量１０％の最終量となる。培地は使用の前に３７℃まで温められる。
この点について、ウシ胎仔血清１０％の試験され選択されたロット（カリフォルニア、ウッドランド、Ｊ．Ｒ．サイエンティフィックあるいは他の供給業者）と共にＢＧＪb培地（ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ）がこの発明の用途に充分に適していた。同じく「完全培地」であるこの培地は、更に分化なしで間葉幹細胞成長を刺激し、特異的タンパク質結合部位等を通じて間葉幹細胞のみのペトリ皿のプラスチック表面への選択的付着を可能にした因子を含んでいた。
加えて、培地Ｆ−１２単養混合物（ハム）（ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ）は選択的間葉幹細胞分離に対する望ましい物性を示したことが同じく発見された。
前に示したように、完全培地は細胞培養分離用の採取骨髄を用意するために使用される当初の採取工程の特異的な型に依存する数多くの異なった分離工程を利用することができる。これに関して、海綿質骨髄の栓子が利用された時、骨髄は完全培地に加えられ分散を形成するために渦動され、それは次いで骨片等から骨髄細胞を分離するために遠心分離された。骨髄細胞（主として赤血球および白血球、また微量の間葉幹細胞、等よりなる）は次いで一連の１６、１８、および２０ゲージ針に適した注射器を通じて骨髄細胞を含む完全培地を連続的に通過させることにより単一細胞に解離された。いずれかの酵素分離工程とは逆に、機械的分離工程の利用を通じて生産された利点は、機械的工程が殆ど細胞変化をもたらさなかったが一方酵素工程は細胞付着および選択的分離に必要なタンパク質結合部位、およびもしくは前記間葉幹細胞に特異的なモノクローナル抗体の生産に必要なタンパク質部位に特に細胞損傷をもたらし得ると考えられている。単一細胞懸濁液（約５０−１００×１０6有核細胞で構成されているもの）は次いで懸濁液で見出される残存細胞から間葉幹細胞を選択的に隔離およびもしくは分離する目的で１００mm皿に連続して平板培養された。
吸引骨髄がヒト間葉幹細胞の源として利用された時、（骨片は殆どあるいは全然なく大量の血液を含んでいた）骨髄幹細胞は完全培地に加えられ、パーコル（ミズーリ、セントルイス、シグマ）勾配で分画された。パーコル勾配は骨髄誘導間葉幹細胞を含む低密度血小板分画から大きな割合の赤血球および単核造血細胞を分離した。これに関して、約３０−５０×１０6細胞を含む血小板分画は確定されない量の血小板、３０−５０×１０6有核細胞、および骨髄供給体の年齢に依存する約５０−５００個のみの間葉幹細胞で構成されていた。低密度の血小板分画は次いで細胞付着に基づく選択的分離のためにペトリ皿で平板培養された。
これに関して、海綿質あるいは腸骨吸引液（すなわち一次培養）のいずれかから得られた骨髄は完全培地で成育され下記の実施例１で設定された条件に従って１乃至７日間ペトリ皿の表面に付着された。最小細胞付着が３日後に観察されたので、非付着細胞がもとの完全培地を新鮮完全培地で置換することにより培養から除去される時間の標準の長さとして３日が選ばれた。続く培地変更は培養皿が通常は１４−２１日を要する密集になるまで４日毎に実施された。これは未分化ヒト間葉幹細胞の数で１０3−１０4倍の増加を示した。
細胞は次いでＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を持つトリプシン（トリプシン０．２５％、ＥＤＴＡ（１Ｘ）１ｍＭ、ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ）などの除去剤を利用して培養皿から分離された。除去剤は次いで不活性化され、分離培養未分化間葉幹細胞は次の使用のために完全培地で洗浄された。
非培養ヒト間葉幹細胞の分離
この発明の組成物および方法で分離された非培養非均質ヒト間葉幹細胞製剤を使用することも可能である。ＭＳＣｓは非培養非均質製剤として、密度勾配分画化などにより、骨髄、血液（末梢血を含む）、骨膜および真皮、ならびに中胚葉起源を持つ他の組織などの組織から分離することができる。これに関して、これらの間葉幹細胞は例えば非常に微量で骨髄に通常存在しかつこれらの量は年齢で（すなわち比較的若い患者の約１／１０，０００細胞から高年齢の１／２，０００，０００までと同じ位）大幅に減少するけれども、ヒト間葉幹細胞製剤は骨髄の他の型の細胞を事実上欠いているように組織、とりわけ骨髄から分離できることが発見された。分離された分画化製剤が少くとも約９０％、また望ましくは少くとも約９５％がヒト間葉幹細胞である細胞を含むであろうということも熟考される。
大腿頭海綿質片の骨髄は股関節部あるいは膝置換手術の間に変形性関節症の患者から得られる。加えて骨髄は更に正常な供与体および将来の骨髄移植のために採取される骨髄を持つ腫瘍患者からの腸骨吸引液により得られる。腫瘍患者のすべては支質細胞には無関係の悪性腫瘍を持ちその支質細胞は正常な核型を発現する。
骨髄は無菌作業条件の下で胸骨、肋骨および腸骨稜からのいくつかの部位から吸引される。吸引は注射器での凝固を避けるためにゆるやかである。１乃至２個の皮膚貫通部位を持つ骨からの多重吸引部位は比較的低い量の希釈末梢血で汚染された高い有核細胞総数を提供する。注射器は従来の胸骨吸引針、１２ゲージ骨髄吸引套管針、あるいは骨髄採取に用いられる管錐針を備える。２５ｍｌの骨髄が無菌食塩水のヘパリン化注射器９１０００単位／リットルに採取される。
ヒト骨髄は次いで５０ｍｌ遠心分離管に移され細胞ペレットを産出するために低速で遠心分離される。脂肪および血漿は吸引で遠心分離管から除去される。細胞ペレットはトリス塩基２０ｍＭおよび塩化アンモニウム０．７％を含む無菌溶液で再懸濁される。ｐＨは７．２に調節され懸濁液は次いで細胞ペレットを産出するために低速で遠心分離される。トリスＮＨ4Ｃｌ溶液が細胞ペレットから吸引され、ペレットはＤＭＥＭ培地１０ｍｌに再懸濁される。再懸濁ペレットは７０％パーコルTM３５ｍｌを含む５０ｍｌ管に注意深く層状に挿入される。管は４６０×ｇで１５分遠心分離される。間葉幹細胞、血小板およびその他細胞を含む勾配の上部２５％あるいはパーコル勾配の１２．５ｍｌはピペットで採取される。この分画はそれに２５ｍｌの培地が加えられていた５０ｍｌ遠心分離管に移される。この管は細胞を懸濁するために数回逆転され次いで細胞ペレットを産出するために低速で再遠心分離される。この工程は新鮮培地で２回反復される。
ヒト骨髄サンプルは次いで血漿を除去するために濃縮されまた前に記載されたＮＨ4Ｃｌ処理によりあるいは脂肪、赤血球および血漿を除去するために注射器カートリッジフィルターに含まれるルーコソーブTMフィルター上でのサンプルの継代接種によるいずれかで赤血球を除去される。フィルターで保持される細胞分画はクエン酸ナトリウムを含む緩衝液を用いてフィルターから溶離される。フィルターから溶離するＭＳＣ富化細胞は次いでＭＳＣと優先的に結合するヒドロキシアパタイトカラムの継代接種により更に富化される。赤血球枯渇骨髄を含む注射器フィルター溶離液はヒドロキシアパタイトで充たされた注射器を通過させられる。この実施例で使用されるヒドロキシアパタイトはインターポア・コーポレイション（ＩＰ２００）から得られる。２００マイクロメートルの最小孔サイズおよび５００マイクロメートルまでの最大孔サイズを持つ多孔性ヒドロキシアパタイト顆粒が使用される。細胞は無菌移転段階にヒドロキシアパタイトを含む注射器に負荷される。細胞は１５分間結合を許され細胞内に存在する緩衝液は流出が可能となる。注射器は次いで培地（ＤＭＥＭ）１５ｍｌで１回洗浄される。ねじ山を切られた注射器の底部はねじを抜かれ、移植物質は更なる処理のためあるいは移植部位への直接の手術時適用のためにプランジャで注射器から押し出される。
モノクローナル抗体分離は次いで以下の通り実施される。ダイナビーズＭ−４５０（ニューヨーク、レーク・サクセス、ダイナル（アール）インコーポレイテッド）はＡＴＣＣアクセス番号ＨＢ１０７４３、ＨＢ１０７４４およびＨＢ１０７４５を持つ抗ＭＳＣモノクローナル抗体と結合され、この結合は抗体をダイナビーズで被覆された二次抗体（２．０μｇ抗ＭＳＣ抗体／ｍｇダイナビーズ）をＰＢＳ内で３０分間４℃で保温することで行われる。１×１０7ダイナビーズ／ｍｌを含むビード溶液が使用される。抗体は保温される。ダイナビーズはビーズおよび抗体を含む溶液をマグネティック・パーティクル・コンセントレーター（磁性粒子濃縮器）（ダイナルＭＰＣ）に置くことにより収集される。上澄みは除去され、一方ダイナビーズは磁石により試験管壁に保持される。ダイナビーズは５回ＰＢＳで洗浄することにより遊離抗体を除去される。最後の洗浄の後、ダイナビーズは収集され上澄みは除去される。ダイナビーズ８０ｍｌに３５ｍｌのヘパリン化骨髄が加えられる。細胞はダイナビーズト共に１５分振動させながら保温される。添加ＭＳＣｓを持つダイナビーズは次いでダイナルＭＰＣを用いて収集される。上澄みは除去され磁性粒子はＰＢＳで濃縮洗浄される。約２００×１０6細胞がダイナビーズで収集される。細胞は１％ＥＤＴＡを含む溶液５０ｍｌでビーズを保温することによりビーズから除去される。ＥＤＴＡ溶液は低速での遠心分離により細胞から除去され、この発明の使用に適した細胞が得られる。
実施例１
デキサメタゾンを使用する試験管内軟骨形成
我々の予備研究において、１４日間で培養され次いでセラミックキューブあるいはコラーゲンスポンジのいずれかに播種されまたヌードマウスに皮下移植されたラビット骨髄誘導間葉始原細胞は骨および軟骨を３週以内に産出するということを我々は発見した（図１）。
この発明は、試験管内で前軟骨凝縮の創出が生後骨髄から誘導される間葉始原細胞での軟骨形成を促進し、ここでそのような母集団が軟骨細胞のための幹細胞あるいは始原細胞を含むということを考える。これは分離成長平板培養細胞で使用するために開発されたペレット培養システムを使用して達成され、（加藤他、全米科学アカデミー紀要、８５：９５５２−９５５６、１９８８；バロックおよびレッディ、細胞生物学ジャーナル、１２６：１３１１−１３１８、１９９４）また、培養内に置かれた軟骨細胞の軟骨表現型の発現を維持するためにも使用されてきた。
ラビットおよびヒト骨髄誘導細胞の両方が使用された。骨髄誘導間葉始原細胞がニュージーランド白ラビット頸骨あるいは腸骨稜から３０００Ｕヘパリンを含む注射器に吸引により採取された。これらの細胞は胎仔ウシ血清１０％を含むＤＭＥＭで２０，０００，０００／１００mm皿で平板培養され、１４日間３７℃、炭酸ガス５％内で４日毎に培地変更により成育された。血清スクリーンは、これらの細胞の増殖を支持し前に引用した生体内セラミックキューブ検定で最初の継代接種細胞の大抵の骨および軟骨を生産する沢山の血清を同定するためにまず行われた。付着細胞のコロニーが（約１０−１４日で）培養皿に形成された後、細胞は皿全体をトリプシン消化され計数された。２００，０００細胞のアリコートが血清１０％、アスコルビン酸−２−リン酸５０ｎｇ／ｍｌ＋／−１０-7Ｍデキサメタゾン（ＤＥＸ）を持つＤＭＥＭで無菌１５ｍｌ円錐形ポリプロピレン管で１０分間５００×ｇで遠心分離され、次いで３７℃で５％炭酸ガス恒温器で３週間まで保温された。２４時間後細胞のいくつかの部分は管内でペレットを形成し、一方いくつかの細胞は管の側壁に単層として残った。３週後ペレットの大部分は分解した。残存するペレットの内、軟骨細胞の外観を持つ細胞は全然含まれずまたII型コラーゲン染色のものは見出されなかった。血清に対する一つの選択肢として、定義された培地補充剤（ＩＴＳ＋プレミックスTM、コラボレイティブ・バイオメディカル・プロダクツ）が試験された。この補充剤は成長平板培養軟骨細胞のペレット培養にこれまで使用されていた（バロックおよびレッディ、細胞生物学ジャーナル、１２６：１３１１−１３１８、１９９４）。補充剤はインスリン（６．２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（６．２５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸（６．２５μｇ／ｍｌ）、リノール酸（１．２５μｇ／ｍｌ）およびウシ血清アルブミン（５．３５μｇ／ｍｌ）を有するＤＭＥＭよりなる（与えられた濃度は最終のものである）。これに対しデキサメタゾン（ＤＥＸ）１０-7Ｍありもしくはなしでピルビン酸塩（１ｍＭ）、アスコルビン酸−２−リン酸（５０μｇ／ｍｌ）が加えられた。いくつかの実験に関しＦＢＳ１０％含有培地は置換されなかった。スパン細胞は３７℃で炭酸ガス５％で保温された。ヒト骨髄細胞は健全な供与体から腸骨稜の吸引により得られた。培養条件はラビット細胞に用いられたものと同一であった。保温の２４時間内に、細胞はペレットを形成した。培地交換は２日毎に行われた。２１日の時点でペレットが採取された時、各ペレットのアルカリ性ホスファターゼ活性がリン酸Ｐ−ニトロフェニルでの保温および４０５ｎｍでの吸光度測定により決定された。＋／−ＤＥＸで保温されたペレットの典型的な実験で得られた吸光度は培養の最初の１４日の間に３−５倍増加し、２１日まで上昇した水準に留まった。組織学および免疫組織化学的分析のためにペレットはＯＣＴ（オルチニン・カルバミル・トランスフェラーゼ）内で氷結され、５μｍの部分が切断された。トルイジンブルー染色および免疫組織化学が行われ、後者は抗コラーゲンＩ、IIおよびＸ、および３−Ｂ−３、７−Ｄ−４（コンドロイチン硫酸）、および５−Ｄ−４（ケラタン硫酸）を含む細胞外基質成分��対する抗体と共に行われた（図２および３）。反応性はＦＩＴＣ結合二次抗体および蛍光顕微鏡検査あるいはアルカリ性ホスファターゼ結合抗体ならびに基質のいずれかで検出された。ペレットは更にグアニジン４Ｍ、酢酸ナトリウム２０ｍＭ含有プロテアーゼインヒビター２０ｍＭに抽出されＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングによる分離の後免疫局在性を受けた。
培養７日までに＋ＤＥＸ規定培地ペレットの部分のいくつかの異染染色がトルイジンブルーで見ることができた。１４日までに、＋ＤＥＸペレットは内部局在細胞の領域の周りに明らかな異染染色を含み、それは肥厚性軟骨細胞の外観を有していた。ペレットの周辺にあるこれらの細胞は平坦なままであり異染性を示さなかった。２１日までに、＋ＤＥＸペレットは肥厚性軟骨細胞の球体に類似していた。それに反して、−ＤＥＸ規定培地ペレットはすべてそのサイズを収縮し多くの場合２１日までに培養で分解した。明らかな肥厚性細胞はいずれの−ＤＥＸペレットでも明白ではなかった。
II型コラーゲンに対する抗体を使用する免疫組織化学はいくつかのサンプルで７日と同じ位初期に＋ＤＥＸ規定培地ペレットで正であった（図３Ａ）。１４日までに肥厚状細胞の領域の基質はII型コラーゲンを正に染色した（図３Ｂ）。いくつかの実験で、全ペレットは２１日に分析された時II型コラーゲンを正に染色した（図３Ｃ）。他では、薄い外部領域はまだII型コラーゲンに負であった。Ｘ型コラーゲンの正の染色は同じく１４日までに見られた（図３Ｄ）。肥厚性細胞の基質は更に染色分布にいくらか差はあるもののコンドロイチン硫酸（図３Ｅの７−Ｄ−４；図３Ｆの３−Ｂ−３（＋））およびケラタン硫酸（図３Ｇの５−Ｄ−４）を正に染色した。ＤＥＸ不在で成長したペレットはいずれもII型コラーゲンの正の染色がなかった。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の免疫染色が分離し、抗II型抗体を持つウエスタンブロットペレット抽出物はα（II）鎖の移動で正の帯を与えた（図４）。続く実験において、この同じ規定培地、＋ＤＥＸが単層あるいは微小塊培養のいずれにも軟骨形成を生産しなかったことを我々は発見した。これらの観察は重要であり、初期細胞−細胞相互作用が軟骨形成に必要であることを示している。かくして試験管内細胞濃縮を創り出しまた適切な許容因子を加えることの組合せを通じて、我々は生後哺乳類骨髄源からの細胞に軟骨形成を生産することができた。
前記のことはラビットおよびヒト骨髄誘導間葉始原細胞が肥厚性軟骨細胞に分化する培養システムを実証する。事象の配列は胚肢形成における軟骨形成のそれと類似する。すべての成分が定義されるので、このシステムは軟骨形成の進行に関する成長因子等の作用についての研究に使用することができる。それは更に始原細胞からの哺乳類軟骨形成の分子制御についての研究にも適用できる。
このシステムは生後源を利用し、また骨髄誘導始原細胞に関するデータを増大させる。これらの細胞母集団が骨形成および脂肪細胞能を持つことを示すために試験管内システムが他で使用されてきた。我々はここで少くともその母集団の一つのサブセットが軟骨形成能を持つことを実証する。このシステムは軟骨形成の制御の探索を促進するであろうし、またこの生体内工程を促進するためにはいかなる因子が必要とされるかについての理解に導くことができる。これは軟骨修復のための臨床適用可能性を有する。
実施例２
デキサメタゾンおよびＴＧＦ−β１を使用する試験管内軟骨形成
ラビットおよびヒト骨髄誘導間葉細胞が入手され実施例１に記載の通りペレット化された。培養培地は下記の通り修飾された。
ラビット骨髄誘導間葉細胞は（ｉ）ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）の追加あるいは（ii）ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）の追加およびデキサメタゾンの削除、のいずれかと共に実施例１に記載の通り培養された。ヒト骨髄誘導間葉細胞は（ｉ）ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）の追加あるいは（ii）ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）の追加およびデキサメタゾンの削除、のいずれかと共に実施例１に記載の通り培養された。
ラビット細胞培養において、ＭＳＣｓの軟骨細胞への分化がデキサメタゾンありおよび無しで、ＴＧＦ−β１の存在下で観察された。ヒト細胞培養において、ＭＳＣｓの軟骨細胞への分化がデキサメタゾンありのＴＧＦ−β１の存在下で観察されたが、デキサメタゾン無しの場合には観察されなかった。
実施例２
デキサメタゾンおよびＢＭＰ−２を使用する試験管内軟骨形成
ラット骨髄誘導間葉細胞が入手され実施例１に記載の通りペレット化された。培養培地は下記の通り修飾された。ラット骨髄誘導間葉細胞はデキサメタゾン（１０-7Ｍ）の存在あるいは不在下で１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌでのＢＭＰ−２の追加と共に実施例１に記載の通り培養された。ＭＳＣｓの軟骨形成への分化はデキサメタゾンと共にＴＧＦ−β１の存在下で観察されたが、デキサメタゾン不在下では観察されなかった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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