(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む反応溶液を表面に親水性を示す材料と該親水性を示す材料の周囲を囲む疎水性を示す材料とを被覆した発熱抵抗体の上に滴下し、
前記発熱抵抗体へ電力を供給して滴下された反応溶液を加熱することと前記発熱抵抗体への電力供給を停止して滴下された反応溶液を冷却することとを繰り返し、
滴下された反応溶液に含まれる核酸の塩基配列を複製する
核酸の塩基配列複製方法。
【請求項２】
反応溶液が滴下された発熱抵抗体及び反応溶液より比重が軽い油性材を共に容器に入れて前記滴下された反応溶液の加熱及び冷却を繰り返す請求項１記載の核酸の塩基配列複製方法。
【請求項３】
表面に親水性を示す材料と該親水性を示す材料の周囲を囲む疎水性を示す材料とを被覆した反応溶液を滴下するための発熱抵抗体及び前記発熱抵抗体を支持する基板を備えた反応器と、
前記反応器の発熱抵抗体へ電力を供給する電力供給装置と、
前記発熱抵抗体への電力の供給と前記発熱抵抗体への電力供給の停止とを繰り返し制御する制御装置と、
を含む核酸の塩基配列複製装置。
【請求項４】
反応溶液が滴下された発熱抵抗体及び反応溶液より比重が軽い油性材を共に入れる容器を更に含む請求項３項記載の核酸の塩基配列複製装置。
【請求項５】
前記反応溶液の温度を測定する温度センサを更に備え、前記制御装置は前記温度センサ出力に基づいて前記反応溶液の温度を予め定められた温度に制御する請求項３または４記載の核酸の塩基配列複製装置。
【請求項６】
発熱抵抗体が温度センサを兼ねるようにした請求項５記載の核酸の塩基配列複製装置。
【請求項７】
核酸を含む反応溶液を発熱抵抗体の上に滴下し、
反応溶液が滴下された発熱抵抗体及びワックスを共に容器に入れ、
前記発熱抵抗体へ電力を供給して滴下された反応溶液を加熱することと前記発熱抵抗体への電力供給を停止して滴下された反応溶液を冷却することとを繰り返して滴下された反応溶液に含まれる核酸の塩基配列を複製し、
ワックスを固形化させて反応溶液、発熱抵抗体及びワックスを一体にして容器から取り出し、
反応生成物である核酸の塩基配列を分析するための反応溶液、発熱抵抗体及びワックスを一体にした分析試料を製造する核酸の塩基配列分析試料の製造方法。
【請求項８】
請求項７の核酸の塩基配列分析試料の製造方法によって製造された分析試料を電気泳動槽のゲル内に入れ、
前記発熱抵抗体へ電力を供給して加熱することにより、前記ワックスを発熱抵抗体から剥離して反応溶液をゲル内に放出し、
放出した反応溶液中に含まれる反応生成物である核酸の塩基配列を電気泳動法により分析する
核酸の塩基配列分析方法。
【請求項９】
前記ワックスを前記発熱抵抗体から剥離する際、前記発熱抵抗体の電位を周囲の電位より低い電位に保持する請求項８記載の核酸の塩基配列分析方法。
【請求項１０】
請求項７の核酸の塩基配列分析試料の製造方法によって製造された分析試料中の反応溶液に含まれる核酸の塩基配列を電気泳動法により分析する電気泳動槽と、
前記発熱抵抗体へ電力を供給して加熱することにより、前記ワックスを発熱抵抗体から剥離して反応溶液をゲル内に放出する剥離装置と、
発熱抵抗体の周囲の電位を測定するための測定装置と、
前記発熱抵抗体の電位を周囲の電位より低い電位に保持する保持装置と、
を含む核酸の塩基配列分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の塩基配列複製方法、複製装置、核酸の塩基配列分析試料の製造方法、核酸の塩基配列分析方法、及び分析装置に係り、より詳しくは、反応溶液の加熱及び冷却を連続して所定回数繰り返すポリミラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＤＮＡあるいはＲＮＡである核酸分子の塩基配列を複製する核酸の塩基配列複製方法及び複製装置、この複製方法または複製装置で複製された反応生成物である核酸の塩基配列を電気泳動法により分析するための分析方法及び分析装置、及び分析のための分析試料を製造するための核酸の塩基配列分析試料の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
特定の核酸配列を持つＤＮＡあるいはＲＮＡを指数関数的に増幅する方法として、ポリミラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が知られている（特開昭６２−２８１号公報）。この方法によれば、プライマと熱安定酵素とからなる核酸鎖の合成試薬により微量の試料から目的とする核酸配列を効果的に増幅できることが実証されていて、広く標準的な方法として確立している。
【０００３】
この方法では、鋳型となる核酸、４種類のヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプライマ、及び熱安定性酵素を含む反応溶液を生成する。そして、この反応溶液を加熱することにより、鋳型となる核酸を熱により変性して一本鎖分子とする。その後、オリゴヌクレオチドプライマが、変性した核酸の相補配列部分に結合するのに適した温度まで冷却し、この温度で所定時間保持した後、熱安定性酵素が有効に働く温度に設定する。これにより、結合したオリゴヌクレオチドプライマを出発点に熱安定性酵素が４種類のヌクレオシドトリホスフェートと鋳型となる核酸とを基質として新しい核酸分子を合成する。この一連の温度操作により鋳型となった核酸分子と同じ配列を持った核酸分子を倍に複製することができ、このような加熱及び冷却の繰り返しを行うことで塩基核酸配列と同様な塩基配列を持った核酸分子を指数関数的に複製することができる。
【０００４】
また、この方法により合成される核酸分子はオリゴヌクレオチドプライマと相補的な配列を持つ部分に限定されるため、核酸分子の特定の塩基配列を決定する（シーケンス）際に使用される。
【０００５】
上記の複製方法においては、反応段階における温度設定及び温度保持時間を厳密に制御することが必要である。このため、反応溶液の加熱及び冷却の繰り返しを自動的に制御する装置が特開昭６２−２４０８６２号公報に記載されている。この装置は、金属ブロックを加熱及び冷却するためのヒートポンプと、このヒートポンプの温度を制御するためのコンピュータとから構成され、反応に必要な温度サイクルを実現する。
【０００６】
この装置による反応では、プラスチック容器を囲むような形に形成された金属ブロックに反応溶液が入れられたプラスチックの容器を挿入し、この金属ブロックを加熱及び冷却することにより、プラスチック容器内部の反応溶液の加熱及び冷却を行う。
【０００７】
加熱に際しては、プラスチック容器内部の反応溶液の蒸発を防ぐため、ミネラルオイルがよく使用されるが、反応後にフェノール等によりサンプル溶液からミネラルオイルを除去する必要が生じる場合がある。そのため、ミネラルオイルの代わりに使用可能な反応溶液の蒸発を防止するワックスが米国Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒｓ社よりＡｍｐｌｉＷＡＸ（商品名）として販売されている。
【０００８】
上記の装置により生成した核酸分子は、水溶液としてピペット等を用いて反応容器から取り出される。このようにして取り出した核酸分子は、電気泳動法により分子量が測定され、生成した核酸分子が決定されることが多い。その際、サンプルの損失や他のサンプルとのコンタミネーションを防止するため、実験作業者は溶液の移し替えや電気泳動用のゲルへの滴下等に注意を払う必要がある。また、溶液を電気泳動用のゲルへ滴下する時、溶液の比重を増加して電気泳動槽に滴下し易くするために、溶液にグリセリンやサッカロース等を混入させることも必要である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ＰＣＲ等のように溶液の加熱及び冷却を必要とする核酸の塩基配列の複製方法では、反応溶液の温度上昇及び下降を速くすることで、反応に必要な時間を短縮することができる。そのためには、反応溶液と加熱器及び反応溶液と冷却器との間の熱伝導率を高くし、反応溶液及び周辺部分を含めた部分の熱容量を小さくすることが望ましい。
【００１０】
しかしながら、上記従来の方式では、反応溶液はプラスチックまたはガラスの容器に入れられ、この容器を金属ブロックで囲む構造であるため、この金属ブロック等の熱容量の影響で反応時間が長く必要になる、という問題がある。
【００１１】
本発明は上記問題点を解消するために成されたもので、反応に必要な時間を短縮した核酸の塩基配列複製方法及び複製装置を提供することを第１の目的とする。
【００１２】
また、反応中に反応溶液は９０°Ｃ以上に加熱されることがあるため、ミネラルオイル、ワックス、密閉容器または加湿空気等を用いて反応中の溶液の蒸発を防止する必要があるが、上記の従来技術では、反応後の溶液はピペット等を用いて反応容器から取り出しているため、この反応後の溶液の回収に手間を要し、その回収効率も低下することがある、という問題がある。また、回収操作の時に他のサンプルとのコンタミネーションを起こす危険がある、という問題がある。
【００１３】
本発明は、反応後の溶液の回収を簡単にし、回収効率が高く、コンタミネーションをなくした核酸の塩基配列分析試料の製造方法を提供することを第２の目的とする。
【００１４】
そして、反応後の生成物は電気泳動によりその分子量を測定することが多いが、その場合、電気泳動用ゲルに反応後の溶液を滴下するのに手間がかかる、という問題がある。また、この操作中、溶液の損失も生じる、という問題がある。
【００１５】
本発明は、上記問題点を解消するためになされたもので、生成物を簡単に全量、電気泳動によりその分子量を測定することができる核酸の塩基配列分析方法及び分析装置を提供することを第３の目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記第１の目的を達成するために本発明の核酸の塩基配列複製方法は、核酸を含む反応溶液を表面に親水性を示す材料と該親水性を示す材料の周囲を囲む疎水性を示す材料とを被覆した発熱抵抗体の上に滴下し、前記発熱抵抗体へ電力を供給して滴下された反応溶液を加熱することと前記発熱抵抗体への電力供給を停止して滴下された反応溶液を冷却することとを繰り返し、滴下された反応溶液に含まれる核酸の塩基配列を複製するものである。
【００１７】
また、本発明の核酸の塩基配列複製装置は、表面に親水性を示す材料と該親水性を示す材料の周囲を囲む疎水性を示す材料とを被覆した反応溶液を滴下するための発熱抵抗体及び前記発熱抵抗体を支持する基板を備えた反応器と、前記反応器の発熱抵抗体へ電力を供給する電力供給装置と、前記発熱抵抗体への電力の供給と前記発熱抵抗体への電力供給の停止とを繰り返し制御する制御装置と、を含んで構成したものである。
【００１８】
上記核酸の塩基配列複製方法及び複製装置において、ＰＣＲ等のように反応溶液の加熱及び冷却を繰り返すことにより核酸の塩基配列の複製を行う場合には、まず、テンプレートＤＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマ、複数のｄＮＴＰ、耐熱性ＤＮＡポリミラーゼ及び反応に適したイオン濃度に調製されたバッファ溶液からなる反応溶液を生成する。そして、この反応溶液を表面に親水性を示す材料と該親水性を示す材料の周囲を囲む疎水性を示す材料とを被覆した発熱抵抗体、好ましくは平面状の発熱抵抗体上に滴下し、発熱抵抗体へ電力を供給したときの発熱により反応溶液を加熱し、発熱抵抗体への電力供給を停止したときの発熱停止による発熱抵抗体からの放熱により冷却し、反応溶液を反応させる。
【００１９】
本発明の核酸の塩基配列複製方法及び複製装置によれば、反応溶液が発熱抵抗体の面で直接接している状態で反応が行われるため、反応溶液と発熱抵抗体との間の熱抵抗は低く、反応溶液の温度上昇及び下降を速やかに行い、反応速度を短縮することができる。
【００２０】
反応時に反応溶液の蒸発を防止するためには、反応溶液が滴下された発熱抵抗体及び反応溶液より比重が軽い油性材を共に容器に入れて滴下された反応溶液の加熱及び冷却を繰り返せばよい。反応溶液より比重が軽い油性材としては、ミネラルオイルや米国Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒｓ社の商品名ＡｍｐｌｉＷＡＸのワックスを使用することができる。
【００２１】
上記発熱抵抗体は、電気抵抗を有する物質であり電力を供給することで発熱するものである。例えば、板状のセラミック基板の上に、抵抗体となるべき金属粒等を混入したペーストを印刷した後、焼成し抵抗体とする厚膜抵抗体を平面状の発熱抵抗体として用いることができる。このような厚膜抵抗体では、ペースト印刷時のパターンにより、基板上に任意の形で、発熱抵抗体を作製することができる。
【００２２】
平面状の発熱抵抗体の他の例としては、ガラス基板あるいはシリコンウェファの上に真空蒸着またはスパッタリングにより金属あるいは金属化合物を着膜したものがある。この例では、特に微量の反応溶液を扱う場合に好適な、微小な発熱抵抗体を作製することができる。これらの平面状の発熱抵抗体によれば、同一の基板上に、配線も含めて複数個の発熱抵抗体を作製することができる。そのため、一度に複数の独立した反応を一つの基板上に形成された発熱抵抗体の上で行うことができる。また、基板を長方形にし、その長辺の部分から発熱抵抗体の部分が突出するような形にすると、反応溶液が滴下された発熱抵抗体及び反応溶液より比重が軽い油性材を共に入れる容器（反応容器）への出し入れ、及び核酸の塩基配列を分析するときの電気泳動ゲルへの挿入に際して、複数の発熱抵抗体を一度に操作できるので操作の効率が向上する。
【００２３】
発熱抵抗体の表面には、親水性を示す材料と該親水性を示す材料の周囲を囲む疎水性を示す材料とを被覆することができる。
【００２４】
親水性を示す材料を被覆するには、前述の厚膜抵抗体による発熱抵抗体の作製方法を使用する場合には、抵抗体となるペーストを印刷した上から、ガラス粒を含むぺーストを印刷し、焼成することで、発熱抵抗体表面にガラス層を形成する方法を用いることができる。ガラスは親水性表面となることが知られているため、発熱抵抗体及び親水性を示す材料を被覆するための表面加工が一度の焼成により作成できる。また、親水性表面を作る材料として樹脂を使うことができ、樹脂としてはポリイミド樹脂が親水性、加工性及び耐熱性に優れているため最も適した樹脂である。
【００２５】
発熱抵抗体の反応溶液が滴下される部分の表面に親水性を示す加工を施し、親水性を示す加工がされた表面以外の部分に疎水性を示す加工を施しているので、反応溶液を水滴状にして平面状の発熱抵抗体の親水性を示す表面加工を施した部分に限定的に保持することでき、反応溶液の飛散や他の反応溶液とのコンタミネーションを防止することができる。
【００２６】
反応容器は反応溶液の冷却時に発熱抵抗体の放熱を良好にするために、発熱抵抗体の裏面と反応容器の内面とが面で接触する構造にし、反応容器の発熱抵抗体の裏面と接触する部分を熱伝導率のよい金属等で構成すると効果的である。このような反応容器と発熱抵抗体とで構成することにより、冷却時の反応溶液の温度の下降時間を速くすることができる。
【００２７】
本発明の複製装置には、反応中の反応溶液の温度を測定するための温度センサを設け、制御装置によって温度センサ出力に基づいて反応溶液の温度を予め定められた温度に制御するようにすることができる。温度制御としては、反応のための温度プロファイルと温度測定結果とに基づいたフィードバック制御を使用することができる。
【００２８】
温度センサとしては、熱電対、金属皮膜または半導体温度センサ等公知の温度センサを用いることができる。また、発熱抵抗体として、電気抵抗に熱勾配があるものを用い、その抵抗値から発熱抵抗体の温度を測定する方法を採用することができる。この方法によれば、発熱抵抗体が温度センサを兼ねることになるので、温度センサ及び配線を省略することができる。
【００２９】
上記第２の目的を達成するために、本発明の核酸の塩基配列分析試料の製造方法は、核酸を含む反応溶液を発熱抵抗体の上に滴下し、反応溶液が滴下された発熱抵抗体及びワックスを共に容器に入れ、前記発熱抵抗体へ電力を供給して滴下された反応溶液を加熱することと前記発熱抵抗体への電力供給を停止して滴下された反応溶液を冷却することとを繰り返して滴下された反応溶液に含まれる核酸の塩基配列を複製し、ワックスを固形化させて反応溶液、発熱抵抗体及びワックスを一体にして容器から取り出し、反応生成物である核酸の塩基配列を分析するための反応溶液、発熱抵抗体及びワックスを一体にした分析試料を製造するものである。
【００３０】
この核酸の塩基配列分析試料の製造方法では、反応溶液が滴下された発熱抵抗体は、反応溶液が滴下された状態で反応溶液ごと、ワックスと共に反応容器内で加熱及び冷却が行われる。ワックスは、室温で硬化することと、反応中は融解していることが好ましいことから、融解温度が３０°Ｃ〜５０°Ｃの範囲のものを用いることができる。最も扱いやすいワックスは、融解温度が３５°Ｃ〜４５°Ｃのものである。
【００３１】
反応溶液が滴下された発熱抵抗体及びワックスを共に容器に入れて加熱及び冷却を繰り返して反応させているため、反応時に発熱抵抗体の熱によりワックスが融解し、反応溶液の表面を覆うので、反応時の反応溶液の蒸発を防止することができる。
【００３２】
この核酸の塩基配列分析試料の製造方法では、核酸の塩基配列を複製する場合と同様に、反応溶液が発熱抵抗体の面で直接接しているため、反応溶液と発熱抵抗体との間の熱抵抗は低く、反応溶液の温度上昇及び下降を速やかに行い、反応速度を短縮して速やかに分析試料を製造することができる。
【００３３】
また、ワックスを固形化させているので、ワックスは発熱抵抗体を取り囲むように固形化し、反応溶液、発熱抵抗体及び固形化したワックスを一体にした分析試料を製造しているので、反応溶液が固形化したワックスと発熱抵抗体との間に封入され、飛散したり他の反応溶液と混ざることがなく、これにより反応後の溶液の回収を簡単に行うことができ、回収操作時に他のサンプルとのコンタミネーションを起こすこともない。
【００３４】
上記第３の目的を達成するために、本発明の核酸の塩基配列分析方法は、上記の核酸の塩基配列分析試料の製造方法によって製造された分析試料を電気泳動槽のゲル内に入れ、前記発熱抵抗体へ電力を供給して加熱することにより、前記ワックスを発熱抵抗体から剥離して反応溶液をゲル内に放出し、放出した反応溶液中に含まれる反応生成物である核酸の塩基配列を電気泳動法により分析するものである。
【００３５】
また、本発明の核酸の塩基配列分析装置は、上記の核酸の塩基配列分析試料の製造方法によって製造された分析試料中の反応溶液に含まれる核酸の塩基配列を電気泳動法により分析する電気泳動槽と、前記発熱抵抗体へ電力を供給して加熱することにより、前記ワックスを発熱抵抗体から剥離して反応溶液をゲル内に放出する剥離装置と、発熱抵抗体の周囲の電位を測定するための測定装置と、前記発熱抵抗体の電位を周囲の電位より低い電位に保持する保持装置と、を含んで構成したものである。
【００３６】
電気泳動法により分析する場合には、電気泳動槽の両端に設けられている電極に核酸の泳動方向と逆方向に電界が加わるように電圧を印加する。この時の電圧は、測定対象の核酸の長さ、電気泳動槽の大きさ、ゲルの濃度によって決定される。その時、測定装置により、例えば電気泳動槽の陰極を基準として、発熱抵抗体の周囲の電位Ｅｗを測定する。
【００３７】
そして、保持装置により発熱抵抗体の電位を周囲の電位Ｅｗより低い電位、すなわち負の電位になるように保持しながら、発熱抵抗体を加熱し反応溶液を取り囲むワックスを発熱体から剥離させ、反応溶液をゲル内に放出する。この時、放出された反応溶液中に含まれる生成物である核酸は電気泳動槽内の電界により、電気泳動用ゲルの内部に導かれる。例えば、電気泳動槽の陰極を基準として電位Ｅｗを測定した場合には、電気泳動槽の陰極に対し電圧Ｅｈとなる電圧を印加する。このときの電圧Ｅｈは発熱抵抗体の電位を周囲の電位より低くなるように印加するものであり、その電圧ＥｈはＥｗ〜Ｅｗ−１００［Ｖ］範囲（例えば、Ｅｗ＝２０Ｖのとき、２０Ｖ〜−８０Ｖの範囲）で設定することができる。この電圧の印加により、核酸分子の発熱抵抗体からの分離を促進させることができる。また、電圧Ｅｈは電位Ｅｗより大きく負の電圧とすると、電気泳動槽全体の電界分布が不均一になり、ゲル中での電界分布を乱して核酸の電気泳動方向を湾曲させることがあるため、電圧ＥｈはＥｗ〜Ｅｗ−２０［Ｖ］の範囲（例えば、Ｅｗ＝２０Ｖのとき、２０Ｖ〜０Ｖの範囲）が適当である。
【００３８】
電気泳動が進み、反応生成物である核酸が十分にゲル内で所定の距離まで泳動したところで、電気泳動槽電極への電圧印加、発熱抵抗体へ電力供給及び電圧印加をすべて停止する。
【００３９】
上記の核酸の塩基配列分析方法では、反応溶液、発熱抵抗体及び固形化したワックスを一体にした分析試料を用いており、反応後の溶液をピペット等を用いて回収したり、電気泳動用のゲルに反応溶液液を滴下したりする必要がないので、反応後の溶液の回収を簡単に行うことができ、溶液の損失も生じることもない。
【００４０】
このようにして電気泳動ゲルに導かれた反応生成物である核酸の分子については、電気泳動法により長さの測定ができる。また、所定の泳動距離のゲルを切り出すことにより、特定の長さをもった核酸分子のみを分離し回収するとができる。また、ワックスが剥離し反応溶液が電気泳動槽に放出された直後に電気泳動槽への印加電界をゼロにして、発熱抵抗体近傍のゲルを回収することで全ての長さのＤＮＡを回収することもできる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本実施の形態における反応器を示すものである。反応器１は、略長方形状の基板１２Ｇの一方の長辺から複数（本実施の形態では６個）の略長方形の支持部１２Ａ〜１２Ｆを所定間隔で突出して形成したアルミナからなる支持基板１２と、支持基板１２の支持部１２Ａ〜１２Ｆの各々の表面上に形成された平面状の複数の発熱抵抗体１１Ａ〜１１Ｆとを備えている。
【００４２】
発熱抵抗体１１Ａ〜１１Ｆは、支持部１２Ａ〜１２Ｆの各々の表面上に銀、鉛及びガラス各々の粉末を主成分とする抵抗体ペーストを印刷により付着させ、その後焼成することで形成されている。抵抗体ペーストに混入する金属粉末の成分は、銀及び鉛の他に、金、銅、タングステン、ニッケル等のいずれか一種またはこれらを組み合わせて用いることができる。
【００４３】
また、支持基板１２は、アルミナの他にシリコンカーバイト、窒化アルミからなるセラミックス等の材料を用いることができる。特に、シリコンカーバイトを用いると熱伝導率が良いので、反応の際、反応溶液の冷却を速やかに行うことができ、反応時間の短縮が図れるので好適である。
【００４４】
発熱抵抗体１１Ａ〜１１Ｆへ電力を供給するための電力供給用配線２１Ａ〜２１Ｆ，２２Ａ〜２２Ｆは、支持基板１２上にプリントしたパターン配線によって構成されている。この電力供給用配線２１Ａ〜２１Ｆ，２２Ａ〜２２Ｆは、コネクタ１４に接続され、コネクタ１４は後述するコントローラ装置５１に接続される。
【００４５】
次に、発熱抵抗体部分を詳細に説明する。発熱抵抗体部分はいずれも同一の構造であるので、１つの発熱抵抗体部分について説明し、他の発熱抵抗体部分についての説明は省略する。図２は図１に示した発熱抵抗体１１Ａ部分を拡大した図であり、図３は図２のＡ−Ａ’線断面図である。
【００４６】
発熱抵抗体１１Ａは、電力供給用配線２１Ａ、２２Ａに接続されるように支持部１２Ａ上に平面状に形成されている。発熱抵抗体１１Ａの表面には、ガラスからなる親水性表面材２３が被覆されている。親水性表面材２３は、発熱抵抗体を形成する抵抗体ペーストを印刷した上から、ガラス粒を含むぺーストを印刷し、焼成することで、発熱抵抗体表面に形成されたガラス層によって構成されている。
【００４７】
親水性表面材２３としては、ガラスの他に親水性を示す樹脂を用いることができる。このような樹脂としては、発熱抵抗体の発熱に対し耐性があるポリイミドが適している。親水性表面材２３は発熱抵抗体１１Ａの表面に位置し、滴下した反応溶液３１を保持する。
【００４８】
親水性表面材２３の周囲には、疎水性表面材２４が、親水性表面材２３の反応溶液３１を滴下する部分を除いて発熱抵抗体１１Ａ、及び支持部１２Ａの全体を被覆するように形成されている。このように疎水性表面材２４を被覆することにより、反応溶液３１を親水性表面材２３の露出部分に限定した部分に保持することができる。疎水性表面材２４としては、硬化後に疎水性を示す樹脂を用いることができ、このような樹脂としてはシリコーン系のコーティング剤がその加工性、耐熱性及び疎水性において優れた最適な材料である。
【００４９】
発熱抵抗体１１Ａは、支持基板１２上の電力供給用配線２１Ａ、２２Ａを介して電力が供給され発熱する。その時に滴下されている反応溶液３１の温度を測定しフィードバック制御をするための、温度センサ２７Ａが親水性表面材２３の表面に配置されている。温度センサ２７Ａからのリード線は、支持基板上の配線２８Ａ、２９Ａに接続されている。
【００５０】
本実施の形態において、発熱抵抗体１１Ａの表面は、親水性表面材２３が疎水性表面材２４によって囲まれた構造であれば、形状や加工方法はどのようなものを使用してもよい。図４はそのような形状の例を示したものである。
【００５１】
図４の（ａ）は、疎水性表面材２４として、粘性のあるシリコーン系のコーティング剤を適量、発熱抵抗体１１Ａの周辺に点線Ｂに沿って滴下し形成した場合における、親水性表面材２３の露出している部分の形状を示したものである。発熱抵抗体１１Ａの表面の粗さや傾斜によって、露出部分の形状は不均等で歪んだ形状になっているが、機能上大きな問題はない。
【００５２】
図４の（ｂ）は、円形状の親水性表面材２３が疎水性表面材２４の中に複数個点在する形状を示すものである。この形状では、個々の親水性表面が占有する面積が小さくなり、親水性表面材２３に溜まる反応溶液の量が少なくなることから、反応溶液の温度の上昇及び下降を速やかにできるため、反応時間を短縮することができる。
【００５３】
なお、親水性表面材２３が点在するときの形状は、図４の（ｃ）に示すような矩形状であっても同様の効果が得られる。
【００５４】
図４の（ａ）及び（ｂ）の形状は、フォトレジスト等により親水性表面材２３の露出させたい部分をマスクし、疎水性表面材２４となる材料をコートする方法で形成することができる。また、疎水性表面材２４としてフッ素樹脂によるシールを用い、親水性表面材２３を露出させる部分に対応した部分に穴を穿設してシールを貼着けることで形成することもできる。
【００５５】
図５は反応器１とコントローラ装置５１との接続を示す図である。なお、図において、符号１３Ａ〜１３Ｆは図１の電力供給用配線２１Ａ〜２１Ｆ，２２Ａ〜２２Ｆを示し、符号５２Ａ〜５２Ｆは温度センサ２７Ａ〜２７Ｆからのリード線が接続される配線（図２には配線２８Ａ、２９Ａのみ示す）を示すものである。
【００５６】
６個の発熱抵抗体１１Ａ〜１１Ｆは、それぞれ発熱のために電力を供給する支持基板１２の上の電力供給用配線１３Ａ〜１３Ｆの一端に接続されている。また、各々の発熱抵抗体に設けられている温度センサ２７Ａ〜２７Ｆの信号は、支持基板１２上のセンサ用配線５２Ａ〜５２Ｆの一端に接続されている。電力供給用配線１３Ａ〜１３Ｆ及びセンサ用配線５２Ａ〜５２Ｆの他端は、支持基板１２のコネクタ１４に接続され、このコネクタ１４はコントローラ装置５１へ接続するためのコネクタ５３に接続されている。
【００５７】
コントローラ装置５１は、図６のブロック図に示すように、発熱抵抗体１１Ａ〜１１Ｆの各々に接続されて発熱用の電力を供給するためのアンプ５２Ａ〜５２Ｆを備えている。各アンプ５２Ａ〜５２Ｆは、インターフェイス回路５４Ａ〜５４Ｆ及びバスラインを介してＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭを含んで構成されたコンピュータ５８に接続されている。
【００５８】
各温度センサ２７Ａ〜２７Ｆは、アナログ信号をディジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータ５６Ａ〜５６Ｆ、及びバスラインを介してコンピュータ５８に接続されている。
【００５９】
図７は、発熱抵抗体の持つ電気抵抗の温度勾配を利用し、発熱抵抗体が温度センサを兼ねる場合のコントローラ装置のインターフェイス部分の回路図である。各回路は同一構成であるため、図７では、発熱抵抗体１１Ｆに接続されている部分のみ示した。図に示すように、発熱抵抗体１１Ｆは、アンプ５２Ｆ、インターフェイス回路５４Ｆ及びバスラインを介してコンピュータ５８に接続されている。また、発熱抵抗体１１Ｆは、抵抗器６１、Ａ／Ｄコンバータ６２Ｆ、６３Ｆ、及びバスラインを介してコンピュータ５８に接続されている。
【００６０】
抵抗器６１は、発熱抵抗体１１Ｆの抵抗値に対して十分低い抵抗値のものを用いる。これにより、抵抗器６１の両端の電圧は発熱抵抗体１１Ｆに流れる電流Ｉｒを示すことになる。この値をＡ／Ｄコンバータ６２Ｆによりディジタルデータに変換し、バスラインを通じてコンピュータに入力する。Ａ／Ｄコンバータ６３Ｆは、発熱抵抗体１１Ｆに印加する電圧Ｅｒをディジタルデータに変換し、バスラインを通じてコンピュータに入力する。コンピュータはＲｒ＝Ｅｒ／Ｉｒを計算し、Ｒｒの値から発熱抵抗体１１Ｆの温度を演算する。
【００６１】
発熱抵抗体１１Ｆの材料が金属を主成分とするものであれば、温度上昇に対して電気抵抗が低下することが知られているので、Ｒｒの値より発熱抵抗体１１Ｆの温度を求めることができる。この場合、発熱抵抗体の主成分として、白金、ニッケル、銅等を用いると温度測定の感度を向上することができる。特に、白金は、温度測定の安定性に優れた材料である。
【００６２】
この回路によれば、発熱抵抗体が温度センサを兼ねているため、温度センサを省略することができる。
【００６３】
次に、反応溶液を反応させる反応容器について説明する。図９及び図１０に示すように、反応容器７２は、ポリプロピレン等の１００°Ｃ以上の耐熱性を持つプラスチックで形成され、かつ上面及び側面に開口する略直方体状の複数の穴が独立に穿設された本体７４を備えている。本体７４の開口を備えた側面、すなわち裏面には、アルミニューム、銅、銀等の熱伝導性のよい材料で形成された板状の放熱部材７５が取付けられており、本体７４と放熱部材７５とにより、上面のみに開口した複数の反応室７１が形成されている。放熱部材７５は、反応器を冷却をする場合に放熱機構となるものであり、更に効率よく冷却するために放熱部材７５の外側面に冷却装置を取り付けるようにしてもよい。
【００６４】
次に、図１２及び図１３を参照して、電気泳動法によって反応生成物であるＤＮＡ等の核酸分子を分析する分析装置について説明する。図に示すように、この分析装置は電気泳動槽１０１を備えており、電気泳動槽１０１の内部の両端の側壁近傍の位置には、各々陰極１２１及び陽極１２２が対向するように配置されている。陰極１２１及び陽極１２２には、核酸の泳動方向と逆方向に電界が印加されるように電源６４が接続されている。電気泳動槽１０１内には、ゲル１０２が収納される。電気泳動時の電源６４の電圧は、測定したい核酸の長さ、電気泳動槽の大きさ、ゲルの濃度によって決定されるので、コンピュータによって電圧が制御可能な可変電源が好ましい。
【００６５】
また、電気泳動槽１０１の分析時に反応器が挿入される部位の下側には、電位測定電極１０４が配置されている。この電位測定電極１０４と陰極１２１との間には、電圧計６８が接続されており、この電圧計６８により挿入された反応器の発熱抵抗体の周囲の電位Ｅｗが測定される。また、陰極１２１と反応器１との間には、陰極１２１の電位を基準とした電圧Ｅｈを印加するための電源６６が接続されている。電圧Ｅｈは、発熱抵抗体の電位を周囲の電位Ｅｗに対して負になるように印加するものであり、Ｅｗ〜Ｅｗ−１００［Ｖ］の範囲（例えば、２０〜−８０［Ｖ］の範囲）で設定される。発熱抵抗体の電位を周囲の電位Ｅｗより大きく負の値に設定すると、電気泳動槽全体の電界分布が不均一になり、核酸の電気泳動方向を湾曲させることがあるため、ＥｈはＥｗ〜Ｅｗ−２０［Ｖ］の範囲（例えば、２０〜０［Ｖ］の範囲）が好ましい範囲である。
【００６６】
この分析装置では、電気泳動が進み、反応生成物である核酸が充分にゲル内で所定の距離まで泳動されたところで、電源からの電圧印加及び発熱抵抗体への電力供給をすべて停止する。
【００６７】
図１の反応器は、発熱抵抗体を支持基板上に６組形成しており、形状は図１のように支持基板の形を全体として長方形にして、その長辺部分から複数の発熱抵抗体を支持する支持部分を突出した形状にしてある。このような形状にすることで、反応器１の発熱抵抗体の部分のみを反応容器７２の反応室７１に挿入したり、反応容器７２から電気泳動槽１０１へ移送したりする場合に適した形状となる。また、同一の反応器に複数組の発熱抵抗体を設けることで、一度に同一または異なった複数の反応を行うことができる。さらに、発熱抵抗体の温度を独立に制御することができることから、それぞれ異なった条件の反応を行うことができる。
【００６８】
次に、上記の反応器を用いて、反応溶液に含まれる核酸の塩基配列を複製する方法、及び複製された核酸の塩基配列を電気泳動法により分析する方法について説明する。まず、使用する発熱抵抗体の表面の親水性表面材２３が露出した部分に、テンプレートＤＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマ、ｄＮＴＰｓ、耐熱性ＤＮＡポリミラーゼ及び反応に適したイオン濃度に調製されたバッファ溶液からなる反応溶液３１をピペット等により反応をさせる発熱抵抗体上に滴下する。反応溶液３１は、図９に示すように、水滴状に親水性表面材２３に付着する。
【００６９】
反応溶液が付着している状態で、反応器１の発熱抵抗体が設けられている部分の各々を反応容器７２の反応室７１の各々に挿入する。この場合、反応器１の発熱抵抗体が設けられている面と反対側の面が放熱部材７５に接触するように、すなわち、反応器１の反応溶液が付着している面が図９の矢印Ｄ方向を向くように挿入する。また、この時、反応室７１の内壁面に反応溶液３１が接触しないように注意しながら挿入する。
【００７０】
その後、各反応室７１の内部に融解温度が４５°Ｃの小粒状のワックスあるいは５０°Ｃに熱して融解したワックス７３を反応溶液が付着している部分が挿入されている反応室７１の内部に挿入する。
【００７１】
次に、発熱抵抗体へ電力を供給して滴下された反応溶液を加熱することと発熱抵抗体への電力供給を停止して滴下された反応溶液を冷却することとを繰り返す温度制御をコントローラ装置５１によって行い反応溶液を反応させる。
【００７２】
図８を参照してコントローラ装置５１による温度制御について説明する。まず、予め図示しないキーボードから温度制御すべき発熱抵抗体を指定しておく。この場合、全ての発熱抵抗体を使用して反応を行わせる場合には全ての発熱抵抗体を指定し、温度制御すべき発熱抵抗体の各々で温度制御条件が異なるようであれば、温度制御条件も同時に指定する。
【００７３】
ステップ１００では、温度制御すべき発熱抵抗体に設けられている各温度センサで測定された測定値を取り込み、ステップ１０２で温度制御条件に応じた加熱制御時の第１の設定温度（例えば、９４°Ｃ）、加熱制御時の第２の設定温度（例えば、７２°Ｃ）、冷却制御時の設定温度（例えば、５５°Ｃ）、及び温度保持制御時の設定温度（例えば、６８°Ｃ）を読み込む。
【００７４】
なお、上記の設定温度及び加熱及び冷却の繰り返しサイクルは、予めコンピュータ５８のＲＯＭやＲＡＭ等の記憶装置に記憶され、指定された温度条件に応じて読み出されるが、制御する度にキーボードから入力してもよい。
【００７５】
次のステップ１０４では、各温度センサで測定された測定値と加熱制御時の第１の設定温度とに基づいて、電力を供給し反応溶液の温度が所定時間の間（例えば、１分）加熱制御時の第２の設定温度に一致するようにフィードバック制御する。所定時間加熱制御を行った後、次のステップ１０６では、各温度センサで測定された測定値と冷却制御時の設定温度とに基づいて、電力の供給を停止し反応溶液の温度が所定時間の間（例えば、４分）冷却制御時の設定温度に一致するようにフィードバック制御する。この場合、反応器１の発熱抵抗体が設けられている面と反対側の面が放熱部材７５に接触しているので、速やかに冷却することができる。なお、放熱部材７５の外面に冷却装置を取り付けた場合には、冷却制御時に冷却装置の制御を同時に行うことにより、冷却制御の時間を更に短縮することができる。そして、ステップ１０７において、各温度センサで測定された測定値と加熱制御時の第２の設定温度とに基づいて、電力を供給し反応溶液の温度が所定時間の間（例えば、１分）加熱制御時の第２の設定温度に一致するようにフィードバック制御する。
すなわち、コンピュータは、予め記憶装置に記憶されている反応を行うための設定温度と時間とのプロファイルに従って、設定温度に対応する発熱量に見合った電気信号をインターフェイス回路を介してアンプに送り、アンプはこの電気信号を電力に変換して、発熱抵抗体を発熱させ、反応溶液を加熱する。アンプに与えられる電気信号としては、発生電力の量が電圧あるいは電流として現されたアナログ信号、または発生電力の量がパルス数やパルス幅などで現されたディジタル信号を用いることができる。なお、冷却制御の場合は電力の供給を停止する。この動作は、各発熱抵抗体について独立に設定された温度対時間のプロファイルによって独立に制御されるようにプログラミングされている。
【００７６】
次のステップ１０８では、予め定められたサイクルだけ加熱制御及び冷却制御が繰り返されたか否かを判断し、繰り返されていない場合は上記の加熱制御及び冷却制御を繰り返えし、予め定められたサイクル加熱制御及び冷却制御が繰り返された場合には、ステップ１１０においてフィードバック制御により反応溶液の温度を所定時間（例えば、７分）設定温度に保持されるように温度保持制御を行い、温度保持制御が終了した時にこのルーチンを終了する。
【００７７】
図１０に示すように、反応中は、反応室７１内部に挿入したワックス７３が溶解し、反応器１の親水性表面材２３に付着した反応溶液３１を取り囲むような状態になり、反応溶液３１の蒸発を防止する。この状態で、コントローラ装置５１は上記で説明したように温度対時間のプロファイルに従って反応溶液３１の温度制御を行う。反応後は発熱体への電力供給を停止し、反応室７１内部の温度を低下する。
【００７８】
図１１は、ＰＣＲ反応後に反応器１を反応容器から取り出した状態を示す図である。反応室７１内部の温度を低下することにより反応室７１内部のワックス７３が固形化するので、反応器１の各発熱抵抗体の部分に反応溶液３１を取り囲んだ状態で、反応溶液、発熱抵抗体及びワックスを一体にした分析試料を反応容器から取り出すことができる。そして、一体として取り出した分析試料を用いて、核酸の塩基配列が分析される。
【００７９】
本実施の形態によれば、ワックスは発熱抵抗体を取り囲むように固形化し、反応溶液、発熱抵抗体及び固形化したワックスを一体にして分析されるので、反応溶液が固形化したワックスと発熱抵抗体との間に封入され、飛散したり他の反応溶液と混ざることがなく、これにより反応後の溶液の回収を簡単に行うことができ、回収操作時に他のサンプルとのコンタミネーションを起こすこともない。
【００８０】
図１２は、反応器１を反応容器７２取り出し、水平タイプの電気泳動槽１０１に移しかえる様子を示す図である。図１１の状態のまま、反応器１の発熱抵抗体の部分を電気泳動槽１０１の中に移送し、反応溶液３１の電気泳動による反応生成物の電気泳動分析を行う。
【００８１】
図１３は、電気泳動槽１０１の内部の様子を示した図である。反応器１の発熱抵抗体が設けられている部分を各々ゲル１０２に設けられている角穴１０３に挿入する。この状態で、発熱抵抗体の電位を周囲の電位より低い負の電位に保持した状態で各発熱抵抗体に電力を供給する。これにより、付着していたワックス７３が熱により融解して剥離し、角穴１０３の上部に浮上する。ワックスの浮上と同時に、反応溶液３１は角穴１０３の中に溶け出す。
【００８２】
図１４は、反応器１の発熱抵抗体に印加する電圧と、電気泳動槽の電極に印加する電圧との関係を示す図である。電気泳動ではＤＮＡ等の核酸分子は、陰極１２１から陽極１２２に向かって、すなわち、反応器１の背面に対応する方向に負電極１２１が置かれているため、矢印Ｍの方向に核酸分子が移動する。この時、反応器１を電気泳動槽１０１に挿入しない状態で、電気泳動槽内で反応器１が挿入される位置の陰極１２１を基準とした電位Ｅｗを、電位測定電極１０４により測定する。
【００８３】
反応器１と陰極１２１との間に、電圧Ｅｈを印加することにより、各発熱抵抗体には、ワックスを融解し剥離するための電力の供給に加えて、陰極１２１の電位を基準にしてＥｗ〜Ｅｗ−２０［Ｖ］の範囲で設定された電圧Ｅｈが印加される。このような発熱抵抗体への電圧印加によって核酸分子を泳動させる電界の強さが強くなるため、反応溶液３１の中に含まれる核酸分子のゲル１０２への溶解を促進することができ、核酸分子が浮上する前に核酸分子をゲル１０２内へ溶解させることができる。このため、従来のように、反応溶液にグリセリンやサッカロース等を混入させて反応溶液の比重を増加させて核酸分子が浮上するのを防止する必要がなくなる。
【００８４】
その後の操作は通常の電気泳動と同様であり、核酸であるＤＮＡ長を測定したり、所望の長さのＤＮＡをゲルから切り出し分離回収したりする。
【００８５】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の核酸の塩基配列複製方法及び核酸の塩基配列複製装置によれば、反応溶液が発熱抵抗体の面で直接接している状態で反応が行われるため、反応溶液と発熱抵抗体との間の熱抵抗は低く、反応溶液の温度上昇及び下降を速やかに行い、反応速度を短縮することができる、という効果が得られる。
【００８６】
また、反応溶液が滴下された発熱抵抗体及び反応溶液より比重が軽い油性材を共に容器に入れて反応させれば、反応溶液の蒸発を防止することができる、という効果が得られる。
【００８７】
発熱抵抗体の表面に親水性を示す材料と該親水性を示す材料の周囲を囲む疎水性を示す材料とを被覆することにより、反応溶液を水滴状にして発熱抵抗体の親水性を示す表面加工を施した部分に限定的に保持することができ、反応溶液の飛散や他の反応溶液とのコンタミネーションを防止することができる、という効果が得られる。
【００８８】
本発明の核酸の塩基配列分析試料の製造方法によれば、反応溶液、発熱抵抗体及び固形化したワックスを一体にした分析試料を製造しているので、反応溶液が固形化したワックスと発熱抵抗体との間に封入され、飛散したり他の反応溶液と混ざることがなく、これにより反応後の溶液の回収を簡単に行うことができ、回収操作時に他のサンプルとのコンタミネーションを起こさないようにすることができる、という効果が得られる。
【００８９】
そして、本発明の核酸の塩基配列分析方法及び分析装置によれば、反応溶液、発熱抵抗体及び固形化したワックスを一体にした分析試料を用いており、反応後の溶液をピペット等を用いて回収したり、電気泳動用のゲルに反応溶液液を滴下したりする必要がないので、反応後の溶液の回収を簡単に行うことができ、溶液の損失も生じることもない、という効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態の反応器を示す斜視図である。
【図２】上記反応器の発熱抵抗体の部分の拡大図である。
【図３】図２のＡ−Ａ’線断面図である。
【図４】発熱抵抗体の表面での親水性表面材と疎水性表面材の形状の他の例を示す平面図である。
【図５】反応器とコントローラ装置との接続を状態を示す図である。
【図６】コントローラ装置の詳細を示すブロック図である。
【図７】発熱抵抗体が温度センサを兼ねる場合の、コントローラ装置のインターフェイス部分の回路図である。
【図８】発熱抵抗体を加熱及び冷却する温度制御ルーチンを示す流れ図である。
【図９】  反応容器及び反応液滴下された反応器を示す斜視図である。
【図１０】反応器が反応容器の内部に挿入して反応を行わせる状態を示す図である。
【図１１】  反応後に反応器を反応容器から取り出したときの図である。
【図１２】反応器を反応容器から水平タイプの電気泳動槽に移しかえる様子を示す図である。
【図１３】  電気泳動槽の内部で反応器から反応溶液を回収するときの図である。
【図１４】発熱抵抗体に印加する電圧と電気泳動槽の電極との電圧の関係を示す図である。
【符号の説明】
１      反応器
１１Ａ〜１１Ｆ    発熱抵抗体
１２    支持基板
１４    反応器のコネクタ
２３    親水性表面材
２４    疎水性表面材
２７Ａ〜２７Ｆ    温度センサ
５１    コントローラ装置
５２Ａ〜５２Ｆ  温度センサ用配線
５３    コントローラ装置のコネクタ
７２    反応容器
１０１  電気泳動槽
１０２  電気泳動に用いるゲル
１０３  ゲルに開けた角穴
１０４  電位測定電極
１２１  電気泳動槽の陰極
１２２  電気泳動槽の陽極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0003743090.tif 000014
【図１４】
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