(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を固体支持体に固定する工程、
該固体支持体を、該固定された抗原と結合する第１抗体を含む第１溶液と接触させる工程、
該固体支持体を免疫デンドリマを含む第２溶液と接触させる工程；ならびに
該標識化免疫デンドリマを検出することによって直接該抗原の存在または量を検出する工程；
を含む抗原検出方法であって、
上記免疫デンドリマは、オリゴヌクレオチドに複合体化された抗第１抗体および該オリゴヌクレオチドにハイブリッド化された標識化樹状ポリヌクレオチド（labeled dendritic polynucleotide）を含み、ここで、抗第１抗体は第１抗体に結合するものであり、かつ、該標識化樹状ポリヌクレオチドはハイブリッド化および架橋によって共に結合した複数のマトリックスポリヌクレオチドモノマを含んでなり、各マトリックスポリヌクレオチドモノマは、ハイブリッド化結合の前に第１の端部および第２の端部を有する線状２本鎖くびれ部（waist region）を有し、該第１の端部は各々くびれ部の鎖に由来する２つの一本鎖ハイブリッド化領域で終わり、そして該第２の端部は各々くびれ部の鎖に由来する１つまたは２つの一本鎖ハイブリッド化領域で終わり、そして、該樹状ポリヌクレオチドにおいて各マトリックスポリヌクレオチドモノマは少なくとも１つの他のマトリックスポリヌクレオチドモノマに少なくとも１つのかかるハイブリッド化領域でハイブリッド化結合および架橋しており、そして、同じマトリックスポリヌクレオチドモノマのかかるハイブリッド化領域の２つ以上にハイブリッド化結合および架橋しているとき、２つのモノマがハイブリッド化結合または架橋していない中間領域が存在し、そして、存在する複数のマトリックスポリヌクレオチドモノマは標識化樹状ポリヌクレオチドの飽和度を越えないものである、方法。
【請求項２】
該オリゴヌクレオチドが該標識化樹状ポリヌクレオチドの第１の一本鎖ハイブリッド化アームにハイブリッド化され、そして第２の標識化オリゴヌクレオチドが該標識化樹状ポリヌクレオチドの第２の一本鎖ハイブリッド化アームにハイブリッド化結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該オリゴヌクレオチドが３’および５’端部を有し、該オリゴヌクレオチドが５’端部で抗第１抗体に複合体化され、かつ、該オリゴヌクレオチドの３’端部が32Ｐで標識化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該オリゴヌクレオチドが該標識化樹状ポリヌクレオチドの第１の一本鎖ハイブリッド化アームにハイブリッド化され、かつ、第２の標識化オリゴヌクレオチドが該標識化樹状ポリヌクレオチドの第２の一本鎖ハイブリッド化アームにハイブリッド化されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該標識化樹状ポリヌクレオチドが第１の２次リポータで標識化されており、かつ、該抗原の量が、第１の２次リポータと相補的でありそして蛍光色素、酵素、重金属キレートおよび放射性同位体からなる群から選択される分子に結合する第２の２次リポータの添加によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該第１の２次リポータがビオチンであり、かつ、該第２の２次リポータがアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体からなる群から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該標識化樹状ポリヌクレオチドが蛍光色素、酵素、重金属キレートおよび放射性同位体からなる群から選択される分子で標識化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該第１抗体が単クローン性であり、かつ、該抗第１抗体が多クローン性である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗原を固体支持体に固定する工程；
該固体支持体を免疫デンドリマを含む溶液と接触させる工程；および
該標識化免疫デンドリマを検出することによって、直接該抗原の存在または量を検出する工程；
を含む抗原検出方法であって、
上記免疫デンドリマは、固定化された抗原に結合する抗体を含み、ここで、該抗体はそれに複合体化されたオリゴヌクレオチドを有し、該オリゴヌクレオチドはそれにハイブリッド化された標識化樹状ポリヌクレオチドを有し、そして該標識化樹状ポリヌクレオチドはハイブリッド化および架橋によって共に結合した複数のマトリックスポリヌクレオチドモノマを含み、ここで、各マトリックスポリヌクレオチドモノマは、ハイブリッド化結合の前に第１の端部および第２の端部を有する線状２本鎖くびれ部を有し、該第１の端部は各々くびれ部の鎖に由来する２つの一本鎖ハイブリッド化領域で終わり、そして該第２の端部は各々くびれ部の鎖に由来する１つまたは２つの一本鎖ハイブリッド化領域で終わり、そして、該樹状ポリヌクレオチドにおいて各マトリックスポリヌクレオチドモノマは少なくとも１つの他のマトリックスポリヌクレオチドモノマに少なくとも１つのかかるハイブリッド化領域でハイブリッド化結合および架橋しており、そして、同じマトリックスポリヌクレオチドモノマのかかるハイブリッド化領域の２つ以上にハイブリッド化結合および架橋しているとき、２つのモノマがハイブリッド化結合または架橋していない中間領域が存在し、そして、存在する複数のマトリックスポリヌクレオチドモノマは標識化樹状ポリヌクレオチドの飽和度を越えないものである、方法。
【請求項１０】
該オリゴヌクレオチドが３’および５’端部を有し、該オリゴヌクレオチドが５’端部で該抗体に複合体化され、かつ、該オリゴヌクレオチドの３’端部が32Ｐで標識化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該標識化樹状ポリヌクレオチドが第１の２次リポータで標識化されており、かつ、該抗原の量が、第１の２次リポータと相補的でありそして蛍光色素、酵素、重金属キレートおよび放射性同位体からなる群から選択される分子と結合する第２の２次リポータの添加によって検出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該第１の２次リポータがビオチンであり、かつ、該第２の２次リポータがアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該標識化樹状ポリヌクレオチドが蛍光色素、酵素、重金属キレートおよび放射性同位体よりなる群から選ばれる分子で標識化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
該抗体が単クローン性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
該オリゴヌクレオチドが該樹状ポリヌクレオチドの第１の一本鎖ハイブリッド化アームにハイブリッド化されており、かつ、標識化オリゴヌクレオチドが該樹状ポリヌクレオチドの第２の一本鎖ハイブリッド化アームにハイブリッド化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
抗原を固体支持体に固定化する工程；
該固体支持体を該固定化された抗原と結合する第１抗体を含む第１溶液と接触させる工程；
該固体支持体を免疫デンドリマを含む第２溶液と接触させる工程；
該固体支持体を標識化３次抗樹状ポリヌクレオチド抗体を含む第３溶液と接触させる工程；ならびに
該標識化免疫デンドリマを検出することによって直接該抗原の存在または量を検出する工程；
を含む抗原検出方法であって、
上記免疫デンドリマは該第１抗体に結合する抗第１抗体を含み、該抗第１抗体はオリゴヌクレオチドに複合体化されており、そして、樹状ポリヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドにハイブリッド化し、該樹状ポリヌクレオチドはハイブリッド化および架橋によって共に結合した複数のマトリックスポリヌクレオチドモノマを含み、ここで、各マトリックスポリヌクレオチドモノマは、ハイブリッド化結合の前に第１の端部および第２の端部を有する線状２本鎖くびれ部を有し、該第１の端部は各々くびれ部の鎖に由来する２つの一本鎖ハイブリッド化領域で終わり、そして該第２の端部は各々くびれ部の鎖に由来する１または２つの一本鎖ハイブリッド化領域で終わり、そして該樹状ポリヌクレオチドにおいて各マトリックスポリヌクレオチドモノマは少なくとも１つの他のマトリックスポリヌクレオチドモノマに少なくとも１つのかかるハイブリッド化領域でハイブリッド化結合および架橋しており、そして、同じマトリックスポリヌクレオチドモノマのかかるハイブリッド化領域の２つ以上にハイブリッド化結合および架橋しているとき、２つのモノマがハイブリッド化結合または架橋していない中間領域が存在し、そして、存在する複数のマトリックスポリヌクレオチドモノマは標識化樹状ポリヌクレオチドの飽和度を越えないものであり、上記標識化３次抗樹状ポリヌクレオチド抗体は該免疫デンドリマと結合するものである、方法。
【請求項１７】
該標識化３次抗体が蛍光色素、酵素、重金属キレート、２次リポータおよび放射性同位体からなる群から選択される分子で標識化されている、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、免疫デンドリマ(immunodendrimer)、即ち、標識処理された即ち標識処理の(labeled)デンドリマにハイブリッド化された(hybridized)オリゴヌクレオチド−抗体複合体(conjugate)の形成による抗原−抗体複合体(complex)を検出する方法に関する。免疫デンドリマは、複数の標識分子(label molecule)を１つの抗原−抗体複合体に配給することにより従来の方法において観察される信号を増幅させることができる。
明細書における以下の説明においては、幾つかの刊行物が引用されている。これらの引用文献には、本技術分野の技術状況が記載されているが、本明細書においては、これらの文献を引用してその説明に代える。
発明の背景
抗原−抗体の相互作用は、酵素−基質の相互作用と同様の２分子会合であるが、可逆プロセスである点で重要な違いがある。抗体と抗原との相互作用は、抗原決定基即ち抗原のエピトープと抗体分子の可変領域ドメインとの種々の非共有相互作用により支配される。抗原に関する抗体の特異性により、抗体または抗原の存在を検出するのに使用することができる種々の免疫検定を開発することができる。これらの検定は、疾病を診断し、体液免疫応答のレベルを監視し、かつ、生物学上重要な分子を識別する手段となっている。
抗原は、膜（ウエスターン法）において及びインシトゥ(in situ)（免疫組織化学、免疫蛍光、免疫染色など）において日常的に検出される。使用される抗体の数と種類、標識及び基質により抗原を検出する利用可能な方法に関して数多くの変更が行われている。かかる変更の如何に拘わらず、抗原の検出は、抗体−抗原複合体を形成する特定の抗体−抗原反応反応に実質上依存する。
抗原−抗体結合からなる非共有相互作用には、水素結合、並びに、イオン、疎水及びファンデルワールス相互作用が含まれるが、これらはいずれも共有結合と比較して相対的に弱いものであるため、著しく短い距離に対しては有効な相互作用となる。従って、強い抗原−抗体相互作用のためには、極めて多数のかかる会合と、抗原−抗体相互作用の特性を示す高度の特異性による抗原−抗体間の極めて緊密な適合性とが必要となる。
１次(primary)抗体−抗原複合体の検出は、数多くの態様で行われている。検出方法には、直接標識処理の単クローン性抗体が含まれ、標識は酵素、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及びホースラディッシュ(Horseradish)ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と;蛍光色素（蛍光化合物）、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ−３及びＣｙ−５；ユーロピウム、ランタン、イットリウム及び金のような重金属のキレートと；125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ及び35Ｓとからなり、あるいは標識は２次(secondary)リポータ、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ジゴキシゲニンまたはジニトロフェニルとすることができる。あるいは、検出方法はまた、直接標識処理の多クローン性抗体を含むことができ、標識は単クローン性抗体に関して上記した素子からなることができる。更に、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−複合体のような、多クローン性抗−第１抗体である標識処理の２次抗体を、検出の方法として使用することができる。別の検出方法には、ＡＰ−ストレプトアビジンのような、必ずしも抗体である必要がない標識処理の２次試薬；ＨＲＰ−ヤギ−抗フルオレスセイン及びＡＰ−ウサギ−抗−ＤＮＰのような、抗−複合エピトープである標識処理の２次抗体、並びに、標識処理の３次(tertiary)抗体即ち標識処理の３次成分を用いて検出される未標識処理の２次抗体が含まれる。
抗原タンパク質が全タンパク質のごく小さなフラクションを示す抽出物においては、特定のエピトープを有するタンパク質の数とサイズは、ウエスターン法(Western blotting)により迅速に測定することができる。ウエスターン法は、抗原タンパク質即ちドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）からのタンパク質の、ゲルの一方の面に配置されたニトロセルロースフィルタ上への電気泳動移行からなるものであり、タンパク質が移されるにつれて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質の位置は保存される。移されたタンパク質は、ニトロセルロースにしっかりとかつ非共有的に結合し、これに結合する１次抗体に曝露される。この結合された１次抗体には、次に、視認可能な共有結合により取着されたマーカを含む２次抗体が結合することができる。標識処理の特異的抗体を利用することができない場合には、抗原−抗体複合物は、放射線標識のまたは酵素標識の２次抗−同位体抗体を添加することにより検出することができ、バンドはオートラジオグラフィまたは基質添加により視認される。エピトープを有するこれらのタンパク質だけがこのようにして視認されるとともに、異なる分子量を有する幾つかのタンパク質がエピトープを有する場合には、各タンパク質はニトロセルロースにおいて別々のバンドとして見られる（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)が１９９３年発行の「抗体と拡散プローブの選択された方法(Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probe)」第２９３−３１６頁に掲載のエス・ホックフィールド(S. Hockfield)等の論文）。
ウエスターン法によれば、所定のタンパク質抗原または特異性抗体を識別することができる。例えば、ウエスターン法は、ＨＩＶのエンベロープ及びコアタンパク質と、ＨＩＶ感染個体の血清におけるこれらの成分に対する抗体を識別するのに使用されている。
免疫−ＰＣＲ、即ち、ＰＣＲと免疫検定系のハイブリッドは、抗体の可動分子認識をＤＮＡ複製の増幅電位と組み合わせるものである。この技術は、検定の際に標識処理のＤＮＡ−抗体複合体のインシトゥアセンブリを必要とし、ＤＮＡ標識の取着と成分のアセンブリとの双方において可変の化学量論性を形成する。
免疫−ＰＣＲの処理上の複雑さは、被分析体の抗体に対するＤＮＡの直接的な化学取着により低減されているので、固定された捕捉抗体と、非共有的に取着されたＤＮＡ標識を担持するリポータ抗体が使用され、検定応答がＤＮＡ標識のＰＣＲと増幅生成物の検出とにより得られる。この技術は修正されて、複数の被分析体に関する免疫−ＰＣＲサンドイッチ検定が開発された(Clinical Chemistry、１９９５年、第４１（９）巻、第１３７１−１３７７頁に掲載のジョーガー(Joerger)等の論文、Nucl. Acids Res.、１９９５年、第２３（３）巻、第５２２−５２９頁に掲載のイー・アール・ヘンドリクソン(E.R.Hendrickson)等の論文及びScience、１９９２年、第２５８巻、第１２０−１２２頁に掲載のティー・サノ(T.Sato)等の論文参照）。
しかしながら、免疫−ＰＣＲは、従来の方法に比べて高い感度を示すにも拘わらず、時間を要し、複雑であり、しかも自動化に役立つことができない。
特異性の核酸シーケンス(sequence)を検出するために、（測定されるべきシーケンスの全てまたは一部に対して相補性のある）極めて特異的なプローブＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスが単離され、クローニングにより増幅され、均質になるまで精製され、適宜のマーカを用いて標識処理に供される。精製され、標識処理されたＤＮＡは、試験されるべきサンプルから変性された核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含むハイブリッド形成溶液に加えられる。ハイブリッド形成溶液の水性状態は、核酸ハイブリッド形成または再アニーリングを許容することにより、標識処理の分子が未標識処理の相補性のシーケンス相対物とハイブリッド化を行うことができるように調整される。複体の形成は、（Ｓ１ヌクレアーゼのような）１重鎖特異ヌクレアーゼによる消化により監視することができる。抵抗性のある、即ち、２重鎖の再アニーリングされた物質の回収及び定量により、試験される核酸シーケンスを測定することができる。ハイブリッド化の量は、ＤＮＡの当初の濃度と再アニーリングに許容される時間の関数である。従って、初期ＤＮＡ濃度が高いと、ハイブリッド形成時間を短くすることができる。
オリゴヌクレオチドのシーケンスを検出するのに特異ハイブリッド形成を使用する例が、J. Mol. Bio.、第９８巻、第５０３頁、１９７５年に掲載のサザーン・イー(Southern, E.)の論文に記載されている。この検定においては、検出されるべきＤＮＡシーケンスを含むサンプルを精製し、適宜の制限エンドヌクレアーゼで消化させ、フラグメントをゲル電気泳動により分離する。次に、フラグメントをニトロセルロースのような適宜の固体支持体に結合させる。この結合には、比較的高濃度の塩化ナトリウムを含む溶液の存在下で最小で１２乃至１６時間がかかる。次に、測定されるべきシーケンスに対して相補性のある標識処理されたプローブをニトロセルロースに加え、１２乃至４８時間ハイブリッド形成に供する。この時間の経過した後に、ニトロセルロースを適宜の塩及び温度条件の下で洗浄しなければならない。洗浄を行わない場合には、標識処理のプローブは、膜と他の非相同ＤＮＡシーケンスの双方に非特異的に結合し、「ノイズ」または「間違った正(false positive)」の背景となる。
上記したサザーンのハイブリッド化検定の簡素化された方法においては、分析されるべき核酸サンプルは、分別されていない状態にある固体の支持体にドット形成される(dotted)。次に、固体の支持体は、サザーンハイブリッド化検定の場合と同様にプローブ処理され(probed)、洗浄され、結合されたプローブの定量が行われる。
しかしながら、ＤＮＡ標識のＰＣＲ及び増幅生成物の検出に関する追加の要件なしに、ウエスターン検定法において問題の抗原の存在を監視する手段として上記技術を使用する記載は、先行技術には存在しない。
ニルセン(Nilsen)等の米国特許第５，１７５，２７０号及び第５，４８７，９７３号には、デンドリマと、アームを隣接する分子アームにハイブリッド化することにより形成される、分子の隣接するアームに２重鎖ウエストと１重鎖フリーアームをもったポリヌクレオチドの連続層からなる核酸シーケンスを検定するための一群の試薬が記載されている。外層のポリヌクレオチドは、アニーリングされていない自由な１重鎖アームを介して識別されるべきシーケンス関して特異的である。
抗原−抗体複合物を検出するために、オリゴヌクレオチド標識のＰＣＲを行う必要性のない、オリゴヌクレオチド−抗体複合体と、ＤＮＡデンドリマの感度とを用いたウエスターン技術を使用する抗体検出方法を開発することが待望されている。
発明の目的と概要
本発明の目的は、抗原を固体の支持体に固定する工程と、固体の支持体を、免疫デンドリマを抗原に取着する手段と接触させる工程と、免疫デンドリマに取着された標識の存在または抗原−免疫デンドリマ複合体に複合体化された(complexed)抗体の存在を検出することにより存在する抗原を定量する工程とを備え、抗原−抗体複合体１つにつき複数の標識分子を取着することにより複合体に関して観察される信号を高めることができることを特徴とする抗原の検出の感度を向上させる方法が提供されている。
本発明の方法は、固定された抗原を、デンドリマに取着された１次または２次抗体と該抗体に取着されたオリゴヌクレオチドを介して接触させることにより免疫デンドリマを形成する手段を提供するものであり、免疫デンドリマはデンドリマに取着された標識によりまたは固体支持体を抗−デンドリマ抗体と接触させることにより検出することができる。
更に、本発明の目的は、オリゴヌクレオチドが32Ｐで標識処理されているオリゴヌクレオチド−抗体複合体を提供することにある。
本発明の別の実施の形態においては、デンドリマの第１および第２のシーケンスにハイブリッド化されたオリゴヌクレオチドが、抗原−抗体複合体の検出のために存在する標識の量を拡大することにより抗原検出の標準的な技術と比較して複合体の観察される信号を高めるために提供されている。
本発明の別の目的は、標識が蛍光色素、酵素、重金属キレート、２次リポータまたは放射性同位体である標識処理の免疫デンドリマを検出する方法が提供されている。これらのおよび他の実施の形態が、以下の詳細な説明に開示されており、あるいはかかる説明から自明となるものである。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、抗原−抗体複合体の検出を行う32Ｐ検定を概略示するもので、Ｃ（−）オリゴヌクレオチド結合２次抗体は32Ｐ標識処理のＣ（＋）オリゴヌクレオチドにより標識処理されている。
図１Ｂは、32Ｐ免疫デンドリマ検定を概略示するもので、デンドリマのＣ（＋）アームがＣ（−）オリゴヌクレオチドを介して２次抗体に結合され、デンドリマはデンドリマのＡ（＋）アームにハイブリッド化された32Ｐ標識処理のＡ（−）オリゴヌクレオチドにより検出されている。
発明の詳細な説明
抗原の検出は、デンドリマにハイブリッド化されて免疫デンドリマを形成するオリゴヌクレオチド−抗体複合体を介して有意に高めることができる。オリゴヌクレオチド−抗体複合体の重要な利点の１つとして、放射性リン、ビオチン、ジゴキシゲニン及び他の多くの標識を用いてオリゴヌクレオチドを容易に標識処理することができることがある。免疫デンドリマは、複数の標識分子を１つの抗原−抗体複合体に配給することにより従来のウエスターン法及び免疫組織化学において信号を増幅することができる。
従来のウエスターン法による検定においては、抗原は１次抗体で標識処理され、１次抗体はリポータ分子に結合された２次抗体により検出される。抗原−抗体複合体は、各リポータ分子の存在を分析することにより検出され、これは抗原−抗体複合体当たり１つのリポータ分子に制限される。抗原−抗体複合体が極めて低濃度で存在する場合には、リポータ分子の検出は困難となり、非特異的な相互作用により影が薄くされる。
問題の抗原と抗原−抗体複合体を形成することができ、標識処理のＤＮＡデンドリマにハイブリッド化されるオリゴヌクレオチドと複合体化される１次または２次抗体を使用することにより、抗原−抗体複合体の検出の感度を大きく高めることができるという驚くべき事実が判明した。リポータとして機能する標識処理のＤＮＡデンドリマにより、複数の標識分子を１つの抗体−抗原複合体と会合させることができるので、オリゴヌクレオチドに結合された標識処理のデンドリマの数と等しい因子により検出信号を拡大させることができる。
本発明の好ましい実施の形態においては、抗原は、固体の支持体に固定されかつ第１の抗体と接触されて、抗原−抗体複合体を形成する。次に、固体の支持体は、オリゴヌクレオチドが複合体化されている抗−第１抗体（即ち２次抗体）からなる免疫デンドリマと標識処理のデンドリマとを含む溶液と接触される。標識処理デンドリマは、デンドリマの最外層の１つ以上即ちデンドリマの１重鎖（「アーム」）シーケンスを介してオリゴヌクレオチドにハイブリッド化される。免疫デンドリマの抗−第１抗体は第１の抗体と複合体を形成し、抗原は免疫デンドリマの存在を検出することにより定量される。
あるいは、抗原は、抗原を固体支持体に固定し、かつ、固定された抗原と抗原−抗体複合体を形成することができる、オリゴヌクレオチドが複合体化された抗体からなる免疫デンドリマを含む溶液とこの固体支持体を接触させることにより、本発明の方法により検出することができ、標識処理のデンドリマはオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド化される。抗原は、免疫デンドリマの存在を検出することにより定量される。
本発明の別の実施の形態においては、抗原は、抗原を固体支持体に固定し、固体支持体を第１の抗体を含む溶液と接触させて抗原−抗体複合体を形成することにより検出することができる。次に、固体支持体を、オリゴヌクレオチドが複合体化されかつデンドリマがオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド化された抗−第１抗体（即ち、２次抗体）からなる免疫デンドリマを含む溶液と接触され、抗−第１抗体は第１の抗体と複合体を形成する。次いで、固体支持体は、標識処理の３次抗−デンドリマ抗体を含む溶液と接触され、３次抗体はオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド化されたデンドリマと複合体を形成し、抗原の量は標識処理３次抗体の存在を検出することにより定量される。
本発明の一の実施の形態においては、デンドリマは標準的な技術により、即ち、蛍光色素（即ち、蛍光化合物）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼ）、重金属キレート、２次リポータまたは放射性同位体を使用することにより標識処理することができる。
あるいは、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、放射性リンにより放射性標識処理することができる。好ましい実施の形態においては、オリゴヌクレオチドは、５’端部が抗体に対し複合体化され、３’端部が32Ｐで標識処理される。32Ｐ標識処理のオリゴヌクレオチド−抗体複合体は、当業者に周知の従来の方法により、例えば、抗体に対するオリゴヌクレオチドの直接的な共有結合により形成することができ、抗体と、５’アミノ改質オリゴヌクレオチドは別個の異質２価架橋剤により別々に活性化することができる（Nucl. Acids Res.、１９９５年、第２３（３）巻、第５２２−５２９頁に掲載のイー・ヘンドリクソン、(E. Hendrickson)、ティー・ハットフィールド・トルビ(T. Hatfield Truby)、アール・ジョーガー(R. Joerger)ダブリュ・マジャリアン(W. Majarian)及びアール・エバーソウル(R. Ebersole)の論文を参照されたい）。かかるオリゴヌクレオチド−抗体複合体は、放射性リンの高エネルギと比較的短い半減期とにより極めて魅力的な標識である。更に、放射性リンを使用することにより、抗原−抗体複合体中の同位体の量を検出するのにホスホリメージャ(phosphorimager)を使用することができる。ホスホリメージャによれば、膜の同位体の量に関する量的な情報を得ることができるので、ウエスターン法による検定において信号の定量を改善することができる。
本発明において使用されるＤＮＡデンドリマは、ＤＮＡの層からなる構成体である。所定のＤＮＡデンドリマの最外層は、抗体に対して複合体化される所定の核酸シーケンスとハイブリッド化する表面に露出された１重鎖のシーケンス（「アーム」）を有している。
更に、オリゴヌクレオチドは、デンドリマの第１のシーケンスに対してハイブリッド化することができると同時に、デンドリマの第２のシーケンスに対してもハイブリッド化することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドアームの異なるシーケンスと相補するシーケンスをそれぞれ有する複数の標識処理デンドリマは、抗体に対して複合体化される１つのオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド化されることにより、複数の標識処理分子を抗原−抗体複合物に対して複合体化させることができるとともに、各抗原−抗体複合体に関する信号の検出を増進させることができる。
デンドリマ分子の各層は、特定の部類のマトリックスモノマからなる。マトリックスモノマは、モノマの連続添加により３次元ＤＮＡデンドリママトリックスを形成することができる特性を有している。デンドリマは、特定の物質、例えば、抗体に対して複合体化される相補ＤＮＡシーケンスに対して選択的に透過性があるという点で、生物学的な膜と類似する。
本発明の検定において使用されるＤＮＡデンドリマを形成する方法及び使用する方法は、米国特許第５，１７５，２７０号及び第５，４８７，９７３号に開示されており、本明細書においては、これらの米国特許を引用してその説明に代える。
更に、デンドリマに対してハイブリッド化することができるオリゴヌクレオチドに結合される単クローン性または他クローン性の直接標識処理の１次抗体は、本発明の方法において使用することができる。デンドリマは、ビオチン蛍光色素、重金属キレートまたは放射性同位体のような２次リポータにより標識処理し、標準的な方法により検出することができる。あるいは、デンドリマ（即ち、免疫デンドリマ）は、固体支持体を標識処理の抗−デンドリマ抗体と接触させ、かつ、従来の方法を使用して存在する標識の量を測定することにより検出することができる。
本発明の方法において使用される抗体は、単クローン性または多クローン性とすることができる。簡単に説明すると、単クローン抗体はハイブリドーマにより分泌され、ハイブリドーマは、不滅細胞（骨髄腫細胞）を免疫感作された動物から取り入れた抗体分泌細胞（リンパ球）と融合させることにより得られる。これにより、抗原またはその混合物に対する動物の多クローン性の応答は、ハイブリドーマの形成に関する単細胞クローニング処理を介して、個々の成分に分解される。
更に、抗結合(anti-conjugated)ハプテンである抗体もまた、本発明の方法において使用することができる。この種の抗体は典型的には単クローン性であり、多くの場合、ヤギ抗−マウスのような２次抗体に結合されると、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）のような特殊なハプテンを認識する。
更に、多クローン性抗−第１抗体である標識処理の２次抗体を使用することができる。あるいは、（結合された２次抗体に取着されたオリゴヌクレオチドに対して複合体化されたデンドリマが使用される場合には）標識処理の３次抗−第２抗体または３次抗−デンドリマ抗体により検出される未標識処理の１次抗体を、本発明において使用することができる。
多クローン性と単クローン性の双方の抗体を形成する方法が、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版（１９８９年）、第３巻、第１８．２−１８．１８に掲載のジェイ・サムブルック(J. Sambrook)、イー・エフ・フリッチュ(E. F. Fritsch)及びティー・マニアティス(T. Maniatis)の論文、並びに、Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes、（１９９３年）、第５９−１０９頁に掲載のエス・ホックフィールド(S. Hockfield)の論文にみることができる。
本発明の方法において使用するのに利用することができる抗体に関する種々の順列(permutation)が、免疫学の分野における当業者に自明である。当業者であれば、利用される抗体の組み合わせに関係なく、本発明の方法を、抗原の検出のためにデンドリマを抗体に対して複合体化するのに広く使用することができる。
更に、本発明において使用するデンドリマ（即ち、オリゴヌクレオチド）を標識処理する従来の方法を使用することができる。これらの方法には、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素、アビジン、ストレプトアビジン及び抗−ビオチン抗体のような相補性のある２次リポータ分子を有する、ビオチンのような２次リポータ、金のような重金属キレート、放射性同位体、即ち、125Ｉ、3Ｈ、35Ｓ及び32Ｐ、並びに、蛍光染料（蛍光化合物）、即ち、フルオレセイン及びローダミンの使用が含まれる。
同様に、オートラジオグラフィ、フルオログラフィ、ホスホリメージャ及び蛍光定量法のような、上記した標識の検出に利用することができる方法を本発明の方法において使用することができる。当業者であれば、上記した順列のそれぞれを、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、かつ、過度の実験の負担を受けることなく、本発明の方法において使用することができる。
本発明を、以下の実施例により更に説明する。本発明の更なる目的は、かかる目的に寄与する別の特徴及び利点とともに、本発明の以下の実施例から明らかになるものである。本発明の製品及び方法の変更と修正を、請求の範囲に記載の本発明の精神または範囲から逸脱することなく、当業者が行うことができるものである。
実施例
実施例１−ウエスターン法における信号の増幅
ベータ−ガラクトシダーゼ(Sigma)を連続して１：１０希釈し、４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル(Novex)に施用した。単クローン性マウス抗−ｂｇａｌ（クローンｇａｌ−１３）を１次抗体として使用した。多クローン性ウサギ抗−マウス−ＡＰを従来のウエスターン法による検出モードにおいて標識処理の２次抗体として使用した。多クローン性ヤギ抗−マウス抗体を、シンセティック・ジェネティックス(Synthetic Genetics)により５’ＮＨ3−オリゴヌクレオチドに結合させた。ＤＮＡデンドリマをPolyprobe Inc.から入手し、Rad-Free（商標）標識処理系を用い、ビオチンで標識処理した。
標準的なウエスターン法による検定においては、ベータ−ガラクトシダーゼ抗原の連続希釈サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質バンドを、半乾燥装置(Novex)を使用して、ニトロセルロースフィルタに移した。
ニトロセルロースにタンパク質を移し終わったときに、ニトロセルロースをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから分離し、濃厚非抗原タンパク質溶液、即ち、阻止溶液、例えば、５％ｗ／ｖ非脂肪乾燥牛乳に浸漬した。溶液中のタンパク質は、抗体がニトロセルロースに非特異的に結合するのを防止するとともに、抗体が固定された抗原タンパク質にだけ結合する可能性が大きくなるのを防止しようとした場合に、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから未だ吸収していないニトロセルロースの全ての領域に非特異的に結合した。抗体がニトロセルロースまたはニトロセルロースの無関係なタンパク質に非特異的に結合しないことを更に確保するため、抗体を、ニトロセルロースに施用する前に非抗原タンパク質溶液において希釈した。
ニトロセルロースを希釈された単クローン性マウス抗−ベータ−ガラクトシダーゼでプローブ処理を行い、膜を室温の緩衝液（ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳはトリス緩衝生理的食塩水であり、Ｔｗｅｅｎ２０はＰＥＧ（２０）モノラウリン酸ソルビタンであり、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０からなる）において逐次洗浄した。洗浄液を捨て、膜をウサギ抗−マウス−ＡＰでプローブ処理した。抗体溶液を除去し、膜をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０において逐次洗浄した。ルミンホス−５３０(Luminphos-530)を加え、ニトロセルロースをＸ線フィルムに曝露した（図示せず）。
本発明の検定においては、（上記した従来のウエスターン検定において使用されるのと同じ希釈率を使用した）ベータガラクトシダーゼ抗原の連続希釈サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質バンドをニトロセルロースフィルタの上に移した。
ニトロセルロースにタンパク質を移し終わったときに、ニトロセルロースをＳＤＳ−ＰＡＧＥから分離し、濃厚非抗原タンパク質溶液、即ち、阻止溶液、例えば、５％ｗ／ｖ非脂肪乾燥牛乳に浸した。
ニトロセルロースを、希釈した単クローン性マウス抗−ベータ−ガラクトシダーゼでプローブ処理し、膜をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０において逐次洗浄した。洗浄液を捨て、膜をヤギ抗−マウスデンドリマでプローブ処理した。膜をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で逐次洗浄し、膜をストレプトアビジン−ＡＰでプローブ処理した。抗体溶液を除去し、膜をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０において逐次洗浄した。ルミンホス−５３０を加え、ニトロセルロースをＸ線フィルムに曝露した。
データ（図示せず）を検討した結果は、ＤＮＡデンドリマでプローブ処理したブロットに関する感度は優れていた。
実施例２−32Ｐウエスターン検定
ベータ−ガラクトシダーゼ(Sigma)を連続して１：１０希釈し、４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル(Novex)に施用した。単クローン性マウス抗−ｂｇａｌ（クローンｇａｌ−１３）を１次抗体とし、シンセティック・ジェネティックスにより５’オリゴヌクレオチドに結合された多クローン性ヤギ抗−マウス抗体（Ｃ（−）オリゴヌクレオチド）を２次抗体とし、５’−32Ｐ標識処理Ｃ（＋）オリゴヌクレオチドをプローブとした。免疫デンドリマを、Ｃ（−）抗体複合体（シンセティック・ジェネティックス）の約１００ｎｇのＣ（−）オリゴヌクレオチドと、１００μｌのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０に入れた１μｇの全４層デンドリマとを組み合わせることにより形成した。このオリゴヌクレオチドを少なくとも１時間３７℃でハイブリッド化に供した。
32Ｐウエスターン検定においては、ベータ−ガラクトシダーゼの連続希釈サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質バンドをニトロセルロースフィルタに移した。
ニトロセルロースにタンパク質を移し終わったときに、ニトロセルロースをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから分離し、濃厚非抗原タンパク質溶液、即ち、阻止溶液、例えば、５％ｗ／ｖ非脂肪乾燥牛乳に浸漬した。
ニトロセルロースを、希釈した単クローン性マウス抗−ベータ−ガラクトシダーゼでプローブ処理し、膜をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０において逐次洗浄し、洗浄液を廃棄した。32Ｐ−Ｃ（＋）−オリゴヌクレオチドをＣ（−）−２次抗体複合体にハイブリッド化させた。膜を32Ｐ−Ｃ（＋）−オリゴヌクレオチド−Ｃ（−）−抗体複合体でプローブ処理し、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０において逐次洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露した。結果は図示していないが、検定は図１Ａに概略示されている。
比較のため、本発明の方法により、即ち、免疫デンドリマ及び32Ｐ標識処理オリゴヌクレオチドプローブを使用した抗原検出の結果（図示せず）の概略が図１Ｂに示されている。簡単に説明すると、32Ｐウエスターン検定においては、ベータ−ガラクトシダーゼの連続希釈サンプルは、上記したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロースに移した。
ニトロセルロースを、希釈した単クローン性マウス抗−ベータ−ガラクトシダーゼでプローブ処理し、膜をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０において逐次洗浄した。
２次抗体に対して複合体化されたＣ（−）オリゴヌクレオチドと相補するＣ（＋）オリゴヌクレオチドアームと、Ａ（＋）オリゴヌクレオチドアームとを有する（オリゴヌクレオチドアームの表示Ａ（＋）とＣ（＋）は異なる）４層のデンドリマをプローブとして使用した。32Ｐ−Ａ（−）−オリゴヌクレオチドとＣ（−）−抗体複合体とを４層デンドリマにハイブリッド化させ、５’−32Ｐ標識処理Ａ（−）オリゴヌクレオチドは免疫デンドリマのＡ（＋）アームと相補するものであった。膜を、予めアニーリングし、標識処理した複合体−デンドリマアセンブリでプローブ処理し、膜をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０において洗浄した。膜をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０において逐次洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露した。
これらの結果から、免疫デンドリマの使用に関連して信号が高められていることがわかる。32Ｐ標識処理オリゴヌクレオチド−抗体複合体は、32Ｐの高エネルギと短い半減期とから、極めて魅力的な標識である。更に、ホスホリメージャをＸ線検出の代替物として使用することができ、これはウエスターン法の同位体の量に関する量情報を提供するので、ウエスターン法による検定の定量を改善することができる。
本発明の好ましい実施例を詳細に説明したが、多くの変更を請求の範囲に記載の本発明の精神と範囲とから逸脱することなく行うことができるので、本発明は上記説明に記載の特定の構成により限定されるものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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