(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルの調製方法であって、式Ｉ
0003794702.tif 000023
［式中、
Ｒ1およびＲ2は、それらが結合している炭素と一緒になって基
0003794702.tif 000024
（ここで、Ｘは、Ｃ＝Ｏであり；
Ｒ3は、ＯＨであり；Ｒ4は、Ｃ1−Ｃ3アルキルであり；そしてＲ5は、ハロゲンである）を形成し、式中、キラル炭素は星印によって示されている］
のエステルの鏡像異性体の混合物と、
ムコール・ミエヘイ由来リパーゼＡ；カンジダ・アンタルキチカ由来リパーゼＢ；カンジダ・アンタルキチカ由来リパーゼＡ；ブタの膵臓由来リパーゼ；ムコール・ミエヘイ由来リパーゼＢ；カンジダ・アンタルキチカ由来リパーゼＣ；カンジダ・アンタルキチカ由来リパーゼＤ；フミコーラ・ラヌギノーサ由来リパーゼ；リパーゼ触媒；またはコリネバクテリウム・ホアギイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏａｇｉｉ）ＡＴＣＣ７００５；フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２７５５１；シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−３４２９；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ２３９７３；ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）ＡＴＣＣ１４８８７；ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ４２７７；ロドコッカス・コプロフィラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３６；ロドコッカス・ロドニイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３５；ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＡＴＣＣ６８５５；キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ２１８１８；カンジダ・ギリエルモンディイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＡＴＣＣ６２６０；カンジダ・ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）ＡＴＣＣ４１３５；カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ４６４９１；ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ）ＡＴＣＣ４５５７；ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ９７７３；アスペルギルス・アリアクルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｒｕｓ）ＡＴＣＣ１００６０；ボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）ＡＴＣＣ２６０３７；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ７４２９２；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ２６８５１；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ３８６５７；ボーベリア・ニベア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｎｉｖｅａ）ＡＴＣＣ７４２９４；ロホトリカス・マルチニイ（Ｌｏｐｈｏｔｒｉｃｈｕｓ  ｍａｒｔｉｎｉｉ）ＡＴＣＣ１１２２１；ペシロミセス・マルクヮンヂ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｑｕａｎｄｉ）ＡＴＣＣ１０５２５；ペスタロチア・ミクロスポラ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）ＡＴＣＣ１１８１６；リゾープス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ１０４０４；リゾープス・オリゼＡＴＣＣ２２５８０；スポロボロミセス種（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２０２９０；バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１４５９１；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ１７４５３；アスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ）ＮＲＲＬ−３１５；ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉ��ｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ１０００２；ペニシリウム・ノタータム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）ＡＴＣＣ３６７４０；アミコラトプシス・ルゴサ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｒｕｇｏｓａ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２２９５；ロドコッカス・エクイＡＴＣＣ１３５５６；ストレプトミセス・エンダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｎｄｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２３３９；およびアスペルギルス・カンヂダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ）ＡＴＣＣ２００２２からなる群より選ばれる微生物由来の生体触媒とを接触させることを含む方法。
【請求項２】
５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−１−オキソ−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸メチルの鏡像異性体エステル混合物と生体触媒とを接触させることを含む、鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルの調製方法であって、鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルが（＋）鏡像異性体であり、そして生体触媒が、α−キモトリプシン、β−キモトリプシン、γ−キモトリプシンおよびδ−キモトリプシンから選ばれることを特徴とする調製方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
多数の農業化学品および医薬品は、近年、ラセミまたはジアステレオマー混合物として市販されている。多くの場合、所望の生理的効果は、唯一の鏡像異性体／ジアステレオマーに由来するのに対して、他の鏡像異性体／ジアステレオマーは、不活性であるか、有害もしくは阻害的ですらある。鏡像異性体を分離する化学的および酵素的技術は、高い鏡像異性体純度の化学品製造の益々重要な武器になりつつある。
米国特許第4,898,822号は、立体選択性エステラーゼ活性をもつ酵素または微生物を利用して対応するラセミエステルを加水分解することによって、光学活性なインドリン−２−カルボン酸の調製を記述している。その特許に開示された基質は、次の一般式：
0003794702.tif 000002
［式中、星印で示されるキラル中心は、第２級置換されたα−炭素原子である］
の化合物である。
米国特許第5,202,260号およびYee et al.，J．Org．Chem．(1992)57:3525-3527は、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の酵素を用いるα−第３級カルボン酸エステルの部分酵素的加水分解によって、光学活性な酸およびそれらの対応するエステルの調製を開示している。利用される酵素は、ただ一種類の酵母からのみに由来し、そしてラセミ混合体のＳ−エステルのみをその対応するＳ−酸に変換し、Ｒ−エステルはそのまま残す。
Feichterらは、J．Chem．Soc．Perkin Trans.(1991)1;653-654において、中でもα−キモトリプシンの作用を通して、ラセミ体アトロラクチン酸メチルを立体特異的に加水分解し、対応するＲ−酸およびＳ−エステルを生成することを開示している。
Petersらは、Appl．Microbiol．Biotechnol.(1992)38;334-340において、ケト酸もしくはエステルを立体特異的に還元して、それらの対応するキラルヒドロキシ酸もしくはエステルを生成することを開示している。特に、これらの著者は、カンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）およびロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）の立体特異的なケトエステル・レダクターゼ活性を例証しており、そこでは、ラセミ体、非環式、β−ケト酸エステルが、その対応するキラルヒドロキシ酸エステルに立体特異的に変換される。
発明の概要
本発明は、α−第３級カルボン酸もしくはエステルの鏡像異性体を、それらの対応するエステルの混合物から、該エステルの混合物と全細胞または部分的もしくは高度に精製された酵素標品を含む生体触媒との接触によって増強する方法を提供する。鏡像異性エステル化合物は、薬物学的および農学的に活性な化合物の調製のための中間体として有用である。例えば、ＷＯ92/11249は、ある種の殺節足動物性カルボキサニリド類の調製のための中間体として、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−１−オキソ−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸メチルを開示している。
本発明は、特に、鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルの調製方法であって、式Ｉ
0003794702.tif 000003
［式中、
Ｒ1およびＲ2は、独立して、フェニルおよびＣ1−Ｃ6アルキルからなる群より選ばれ、各基は、場合によって、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ3アルコキシおよびフェノキシからなる群の３個までにより置換されてもよいが；但し、Ｒ1およびＲ2は互いに異なる；あるいは、
Ｒ1、Ｒ2およびそれらが結合される炭素は、一緒になって基
0003794702.tif 000004
［式中、Ｘは、Ｃ＝Ｏ，Ｏ，ＳおよびＮＨからなる基より選ばれ；Ｒ3は、ＯＨおよびＮＨ2からなる基より選ばれ；Ｒ4は、Ｃ1−Ｃ6アルキルであり；そしてＲ5は、ハロゲンおよびＣ1−Ｃ3フルオロアルコキシからなる基より選ばれるが、この場合、キラル炭素は星印によって示される］を形成する］
のエステルの鏡像異性体の混合物と、
ＩＭ６０Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社より販売されているムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ、本明細書では、ムコール・ミエヘイ由来リパーゼＡとも言う。）；ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−２リパーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌｓ社より販売されているカンジダ・アンタルキチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ、本明細書では、カンジダ・アンタルキチカ由来リパーゼＢとも言う。）；ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−５リパーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌｓ社より販売されているカンジダ・アンタルキチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ、本明細書では、カンジダ・アンタルキチカ由来リパーゼＡとも言う。）；ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−７リパーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌｓ社より販売されているブタの膵臓由来のリパーゼ、本明細書では、ブタの膵臓由来リパーゼとも言う。）；ＳＰ５２４リパーゼ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社より販売されているムコール・ミエヘイの（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ、本明細書では、ムコール・ミエヘイ由来リパーゼＢとも言う。）；ＳＰ５２６リパーゼ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社より販売されているカンジダ・アンタルキチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ、本明細書では、カンジダ・アンタルキチカ由来リパーゼＣとも言う。）；ＳＰ５３９リパーゼ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社より販売されているカンジダ・アンタルキチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼ、本明細書では、カンジダ・アンタルキチカ由来リパーゼＤとも言う。）；ＬｉｐｏｌａｓｅＬｉｐａｓｅ（市販のフミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）由来のリパーゼ、本明細書では、フミコーラ・ラヌギノーサ由来リパーゼとも言う。）；ＣＲＬｉｐａｓｅ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社より販売されているリパーセ触媒、本明細書では、リパーゼ触媒とも言う。）；コリネバクテリウム・ホアギイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏａｇｉｉ）ＡＴＣＣ７００５；フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２７５５１；シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−３４２９；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ２３９７３；シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ−Ｂ−１１３３０；ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）ＡＴＣＣ１４８８７；ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ４２７７；ロドコッカス・コプロフィラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３６；ロドコッカス・ロドニイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３５；ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ５５６０２；ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３１��ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３４；ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＡＴＣＣ６８５５；キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ２１８１８；カンジダ・ギリエルモンディイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＡＴＣＣ６２６０；カンジダ・ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）ＡＴＣＣ４１３５；カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ４６４９１；ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ）ＡＴＣＣ４５５７；ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ９７７３；アスペルギルス・アリアクルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｒｕｓ）ＡＴＣＣ１００６０；ボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）ＡＴＣＣ２６０３７；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ７４２９２；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ２６８５１；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ３８６５７；ボーベリア・ニベア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｎｉｖｅａ）ＡＴＣＣ７４２９４；クニンガメラ・エチヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）ＡＴＣＣ８６８８；ロホトリカス・マルチニイ（Ｌｏｐｈｏｔｒｉｃｈｕｓ  ｍａｒｔｉｎｉｉ）ＡＴＣＣ１１２２１；ペシロミセス・マルクヮンヂ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｑｕａｎｄｉ）ＡＴＣＣ１０５２５；ペスタロチア・ミクロスポラ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）ＡＴＣＣ１１８１６；リゾープス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ１０４０４；リゾープス・オリゼＡＴＣＣ２２５８０；スポロボロミセス種（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２０２９０；トリコフィトン・コンセントリカム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ７４２９３；バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１４５９１；ノカルヂア種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ−Ｂ−５６４６；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ１７４５３；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＲＲＬ−Ｙ−２０３４；シゾサッカロミセス・オストスポラス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｓｔｏｓｐｏｒｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｙ−８５４；アスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ）ＮＲＲＬ−３１５；ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ１０００２；ペニシリウム・ノタータム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）ＡＴＣＣ３６７４０；アミコラトプシス・ルゴサ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｒｕｇｏｓａ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２２９５；ロドコッカス・エクイＡＴＣＣ１３５５６；ストレプトミセス・エンダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｎｄｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２３３９；アスペルギルス・カンヂダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ）ＡＴＣＣ２００２２；およびミコフィータ・���クロスポラ（Ｍｙｃｏｐｈｙｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）ＡＴＣＣ８９８２１からなる群より選ばれる生体触媒とを接触させることを含む方法を提供する。
本発明者らは、本発明のある種の好適な生体触媒が、２種の特に好適なエステル：α−ヒドロキシ−α−メチル−４−フェノキシベンゼン酢酸エチル：
0003794702.tif 000005
および５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−１−オキソ−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸メチル：
0003794702.tif 000006
の鏡像異性体混合物の（＋）または（−）鏡像異性体いずれかの増強に有用であることを発見した。
鏡像特異的生物変換のための本発明の仮定されるメカニズムは、α−第３級エステル混合物の１種の鏡像異性体の鏡像特異的加水分解によって、対応するカルボン酸を生成すること、およびケト酸エステルの鏡像異性体混合物の場合には、ケト基の鏡像特異的還元により、対応するα−第３級ヒドロキシ酸エステルの生成をもたらすことからなる。
発明の詳細
本発明は、鏡像異性的に増強されたα−第３級カルボン酸もしくはエステルを、それらの対応するエステルの鏡像異性体混合物からなる出発基質から調製する方法に関する。
出発化合物は、α−第３級炭素をもつエステルの鏡像異性体混合物であり、式Ｉ
0003794702.tif 000007
［式中、
Ｒ1およびＲ2は、独立して、フェニルおよびＣ1−Ｃ6アルキルからなる群より選ばれ、各群は、場合によって、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ3アルコキシおよびフェノキシからなる群の３個までにより置換されてもよいが；但し、Ｒ1およびＲ2は互いに異なる；あるいは、
Ｒ1、Ｒ2およびそれらが結合される炭素は、一緒になって基
0003794702.tif 000008
（式中、Ｘは、Ｃ＝Ｏ，Ｏ，ＳおよびＮＨからなる群より選ばれ；Ｒ3は、ＯＨおよびＮＨ2からなる群より選ばれ；Ｒ4は、Ｃ1−Ｃ6アルキルであり；そしてＲ5は、ハロゲンおよびＣ1−Ｃ3フルオロアルコキシからなる群より選ばれるが、この場合、キラル炭素は星印によって示される）を形成する］
によって示される。
好適な基質は、式中、Ｒ1が、場合によって、フェノキシにより置換されているフェニルであり；Ｒ2がＣ1−Ｃ3アルキルであるか；あるいは、Ｒ1、Ｒ2およびそれらが結合される炭素が、一緒になって基
0003794702.tif 000009
を形成し；Ｘは、Ｃ（＝Ｏ）であり；Ｒ3は、ＯＨであり；Ｒ4は、Ｃ1−Ｃ3アルキルであり；そしてＲ5は、ハロゲンである、式Ｉの化合物である。
特に、好適な基質は：
α−ヒドロキシ−α−メチル−４−フェノキシベンゼン酢酸エチル；および
５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−１−オキソ−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸メチルである。
本発明の基質は、当業者に既知の技術によって容易に調製される。例えば、α−ヒドロキシ−α−メチル−４−フェノキシベンゼン酢酸エチルは、下記のように調製できる。マグネチックスターラー、水凝縮器、１２５ｍＬ滴下ロート、温度計および窒素導入口を備えた２５０−ｍＬフラスコに、マグネシウム金属２．７ｇ（１１０ｍｍｏｌ）を添加し、そして強力な窒素パージ下でヒートガンにより乾燥した。冷却後、ロートに、乾燥ＴＨＦ６７ｍＬ中４−ブロモジフェニルエーテル１７．５ｍＬ（２４．９ｇ，１００ｍｍｏｌ）溶液を入れ、そして１０ｍＬをフラスコに流入した。撹拌しつつ、グリニャール反応が自然に始まり、そしてフッ化物溶液の残りが１５分間かけて添加され、内部温度６７−６８℃に維持された。添加が完了した時、５分間６８℃に保たれた温度は、次いで低下し始め、４５分後に３０℃になった。その間、２５０ｍＬフラスコ、マグネチックスターラーおよびオーブン乾燥された１２５ｍＬ滴下ロートを、窒素下で熱時組み立て、そして放冷した。次いで、低温温度計を付着し、フラスコに、乾燥ＴＨＦ６６ｍＬ中ピルビン酸エチル１１．５ｍＬ（１２．２ｇ，１０５ｍｍｏｌ）溶液を入れ、そしてグリニャール試薬の溶液を、注射器を用いて滴下ロートに移した。ピルビン酸エステル溶液を、−１０℃まで冷却し、そしてグリニャール溶液を、内部温度−５〜−１０℃に維持するように、十分撹拌、冷却しながら１５分かけて滴下した。得られた溶液を、水５０ｍＬ、続いて飽和塩化アンモニウム水溶液５０ｍＬによって撹拌、処理して、２つの澄明相を得た。これらを分離し、そして上相をロータリーエバポレーターにかけて、ほとんどのＴＨＦを除去した。水および塩化メチレン５０ｍＬづつを添加して、２つの澄明相を得た。これらを分離し、その水相を、別な塩化メチレン２５ｍＬで洗浄し、そして合体した有機相を水および塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして蒸発させると黄橙色オイル２３．８ｇが残った。１４０℃／０．１〜０．２ｍＭで６０分間のＫｕｇｅｌｒｏｈｒ蒸留により、揮発性不純物を除去して、澄明な橙色オイルとしての生成物１７．１ｇ（６０％）を得た。
同様に、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−１−オキソ−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸メチルは、次の方法で調製できる。水素化ナトリウム（オイル中６０％溶液の２４ｇ，０．６ｍｏｌ）をヘキサンで洗浄してそのオイルを除去した。得られた洗浄ＮａＨを、ＤＭＦ２００ｍＬ中に懸濁し、次いで、反応温度を３５℃以下に維持するような速度で、５−クロロ−１−インダノン５０ｇ（０．３ｍｏｌ）とＤＭＦ１５０ｍＬの溶液によって処理した。得られた混合物を、３０分間撹拌し、次いで、１５分かけて添加した炭酸ジメチル３８ｍＬ（０．４５ｍｏｌ）で処理した。得られた混合液を、室温で１．５時間撹拌し、次いで、一夜放置した。その反応混合液を、濃ＨＣｌ  １００ｍＬと氷約１０００ｍＬの混合液中に注意深く注いだ。次に、エーテル５００ｍＬを添加し、その水層を、エーテルで２回抽出した。その合体した有機層を、Ｈ2Ｏで３回洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、そして濃縮して、褐色オイル６４．６ｇを得た。前記生成物５．０ｇ（０．０２２ｍｏｌ）と塩化メチレン７０ｍＬの溶液を、室温で５０〜６０％ｍ−クロロ過安息香酸（Aldrich）１０ｇ（約０．０３２ｍｏｌ）で処理した。１時間後、その反応を０℃に冷却し、飽和炭酸ナトリウム水溶液を注意深く添加して止めた。その層を、飽和炭酸ナトリウム水溶液で２回、飽和重亜硫酸ナトリウムで１回洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、そして濃縮して、黄色固体４．０ｇを得た。
本発明の１つの実施態様では、開示された酵素および生物材料の生体触媒作用は、変化を受けなかった鏡像異性体から容易に分離される生成物への、望ましくない鏡像異性体の転化をもたらす。本開示に関し、本調製法の効率は、１）回収率および２）目的の生成物の鏡像異性純度を定量化することによって測定された。回収率は、生体触媒処理の後、残存している出発基質のパーセントである。目的の生成物の鏡像異性純度は、生体触媒処理に続いて回収された基質に残存している不要の鏡像異性体に対する目的の鏡像異性体の過剰量の算出によって決定される。この鏡像異性体過剰量（％ｅ．ｅ．）は、次の式の１つを用いて個々の鏡像異性体濃度から算出される：
(＋)型の％ｅ.ｅ.＝([(＋)]−[(−)])／([(＋)]＋[(−)])×１００
(−)型の％ｅ.ｅ.＝([(−)]−[(＋)])／([(−)]＋[(＋)])×１００
［式中、［（＋）］および［（−）］は、それぞれ、（＋）および（−）型の濃度である］。
それは、本方法の必須の態様ではないけれども、必要によっては、鏡像異性的に増強されたエステル生成物（≧５０％ｅ．ｅ．として定義される）は、数種の技術上周知の手段のいずれかによって、生体触媒反応混合物から分離されてもよい。本発明の目的のために、開示された方法の基質として働く鏡像異性体混合物は、％ｅ．ｅ．が５０未満である鏡像異性体エステルの混合物である。これは、必然的に、両鏡像異性体が、等しい割合で存在するラセミ混合物、ならびに１種の鏡像異性体が、その相補的鏡像異性体に対して過剰に存在するが、鏡像異性体過剰量が５０％未満である光学活性混合物を包含する。いずれの場合でも、本発明の方法は、目的の鏡像異性体が、少なくとも５０の％ｅ．ｅ．までで得られた鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルの調製をもたらす。
本開示の目的では、本発明者らは、次の用語が、以下に述べられる意味をもつことを意図している。
用語「鏡像異性的に増強された」は、目的の鏡像異性体が、少なくとも５０の％ｅ．ｅ．までで得られたことを意味する。
用語「生体触媒」は、細菌、酵母もしくは真菌の全細胞、または細胞抽出物もしくは生成物によって供される酵素活性；あるいは細菌、酵母、真菌もしくは哺乳動物細胞から精製もしくは部分精製された形状での酵素活性であって、本発明の反応工程を酵素的に触媒する活性を包含する。
５０％を超える鏡像異性体過剰量（残存する他の鏡像異性体種に対して目的の鏡像異性体の３倍過剰量を超える量を表す）を得るそのような生体触媒が好適である。より好適には約９０％以上、さらに好適には約９５％以上、もっとも好適には約９９％以上の増強である。
実験過程において、本発明者は、４００以上の強力な生体触媒源を評価した。驚くべきことに、本明細書に開示されるものは、本発明者らによって探求されたその活性を保持した。したがって、本発明は、特に、鏡像特異的反応を実施できる生体触媒（微生物もしくはその変異株、または酵素）を特徴とする。好適な生体触媒は、次の微生物由来のものを含む：コリネバクテリウム・ホアギイＡＴＣＣ７００５；フラボバクテリウム種ＡＴＣＣ２７５５１；シュードモナス・オレオボランスＮＲＲＬ−Ｂ−３４２９；シュードモナス・プチダＡＴＣＣ２３９７３；シュードモナス種ＮＲＲＬ−Ｂ−１１３３０；ロドコッカス・エクイＡＴＣＣ１４８８７；ロドコッカス・エリスロポリスＡＴＣＣ４２７７；ロドコッカス・コプロフィラスＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３６；ロドコッカス・ロドニイＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３５；ロドコッカス・ロドクラスＡＴＣＣ５５６０２；ロドコッカス種ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３１；ロドコッカス種ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３４；ストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ６８５５；キサントモナス・カンペストリスＡＴＣＣ２１８１８；カンジダ・ギリエルモンディイＡＴＣＣ６２６０；カンジダ・ケフィルＡＴＣＣ４１３５；カンジダ・トロピカリスＡＴＣＣ４６４９１；ロドトルラ・ルブラＡＴＣＣ４５５７；ヤロウィア・リポリチカＡＴＣＣ９７７３；アスペルギルス・アリアクルスＡＴＣＣ１００６０；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ２６０３７；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ７４２９２；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ２６８５１；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ３８６５７；ボーベリア・ニベアＡＴＣＣ７４２９４；クニンガメラ・エチヌラタＡＴＣＣ８６８８；ロホトリカス・マルチニイＡＴＣＣ１１２２１；ペシロミセス・マルクヮンヂＡＴＣＣ１０５２５；ペスタロチア・ミクロスポラＡＴＣＣ１１８１６；リゾープス・オリゼＡＴＣＣ１０４０４；リゾープス・オリゼＡＴＣＣ２２５８０；スポロボロミセス種ＡＴＣＣ２０２９０；トリコフィトン・コンセントリカムＡＴＣＣ７４２９３；バチルス・セレウスＮＲＲＬ−Ｂ−１４５９１；ノカルヂア種ＮＲＲＬ−Ｂ−５６４６；シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１７４５３；サッカロミセス・セレビシエＮＲＲＬ−Ｙ−２０３４；シゾサッカロミセス・オストスポラスＮＲＲＬ−Ｙ−８５４；アスペルギルス・アリアセウスＮＲＲＬ−３１５；ペニシリウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１０００２；ペニシリウム・ノタータムＡＴＣＣ３６７４０；アミコラトプシス・ルゴサＮＲＲＬ−Ｂ−２２９５；ロドコッカス・エクイＡＴＣＣ１３５５６；ストレプトミセス・エンダスＮＲＲＬ−Ｂ−２３３９；アスペルギルス・カンヂダスＡＴＣＣ２００２２；およびミコフィータ・ミクロスポラＡＴＣＣ８９８２１。本発明の方法を実施できる鏡像特異的酵素を含む生物材料は、単離または生合成でき、そしてそれだけで使用できるが、適当な微生物を直接使用することが、通常は、より便利である。
また、好適なものは、次の給源からの加水分解酵素の精製標品である：α−キモトリプシン（ウシ膵臓由来、Sigma Chemical Co.）；β−キモトリプシン（ウシ膵臓由来、Sigma Chemical Co.）；γ−キモトリプシン（ウシ膵臓由来、Sigma Chemical Co.）；δ−キモトリプシン（ウシ膵臓由来、Sigma Chemical Co.）；ＩＭ６０Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（Novo Nordisk）；ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−２リパーゼ（Boehringer Mannheim）；ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−５リパーゼ（Boehringer Mannheim）；ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−７リパーゼ（Boehringer Mannheim）；ＳＰ５２４リパーゼ（Novo Nordisk）；ＳＰ５２６リパーゼ（Novo Nordisk）；ＳＰ５３９プロテアーゼ（Novo Nordisk）；Ｌｉｐｏｌａｓｅリパーゼ（Novo Nordisk）；およびＣＲＬｉｐａｓｅ（Altus Biologics,Inc.）。
もっとも好適なものは、次の微生物において発見されるものを含む生体触媒である：ロドコッカス・ロドクラスＡＴＣＣ５５６０２；トリコフィトン・コンセントリカムＡＴＣＣ７４２９３；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ７４２９２；およびボーベリア・ニベアＡＴＣＣ７４２９４。
（＋）−または（−）−鏡像異性体のいずれかについて、α−第３級カルボン酸エステルの鏡像異性体混合物を増強するこの方法では、生体触媒作用は、鏡像特異的酵素の生産に適した培地中で微生物を培養することによって都合よく得られる１種以上の鏡像特異的酵素の作用によって達成される。このようにして得られた酵素は、混合物の（＋）−または（−）−α−第３級カルボン酸エステルのいずれかに選択的に作用するように添加され、残存する（＋）−または（−）−カルボン酸エステルの増強をもたらす。次いで、目的の生成物（増強されたカルボン酸エステル）が、酸からカルボン酸エステルを、ヒドロキシ酸エステルからケト酸エステルを分離するため、そして個々の鏡像異性体を分離するために、当業者に既知の方法によって、不要な生成物（（＋）−または（−）カルボン酸、または（＋）−または（−）−ヒドロキシ酸エステル）から分離できる。明らかに、本発明者らは、本発明の方法がまた、α−第３級カルボン酸エステルの鏡像異性体の対応する混合物の選択的生体触媒作用を通しての、（＋）または（−）α−第３級カルボン酸、または（＋）または（−）ヒドロキシ酸エステルの鏡像異性的増強法としても、同様に良好に述べることができると認識している。
本発明の生体触媒は、細菌、酵母、真菌および哺乳動物細胞から由来されるか、またはそれらの中に位置される生物材料を含む。これらの生体触媒のいくつかは、ブダペスト条約の約定の下に、ＡＴＣＣ（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション、12301  パークローン  ドライブ、ロックビル、ＭＤ  20852（American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852））に寄託され、そして次の受託番号を有する：
0003794702.tif 000010
次の略語が、本明細書で使用される：
ＭＣＩＣ  −  ５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−１−オキソ−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸メチル
ＥＨＰＡ  −  α−ヒドロキシ−α−メチル−４−フェノキシベンゼン酢酸エチル
ＨＰＬＣ  −  高速液体クロマトグラフィー
ＤＭＦ    −  ジメチルホルムアミド
ＡＣＮ    −  アセトニトリル
ｅ．ｅ．  −  鏡像異性体過剰量
ＳＭ      −  サブロー・マルトースブロス
ＳＢＧ    −  ソイビーングリセロール
ＮＢ      −  ヌートリエントブロス
ＰＤ      −  ポテトデキストロースブロス
生体触媒活性の測定では、適当な生長培地２５ｍＬに、標準微生物学技術を用いて、試験生物体の凍結または凍結乾燥保存株の少量部分を接種した。本明細書に開示される生物体の生長のために利用される培地は、次のものから選ばれた：
ＳＭ（サブロー・マルトースブロス；BBL Inc.，Cockeysville，MD）；
ＰＤ（ポテトデキストロースブロス；Difco Laboratories,Inc.，Detroit,MI）
ＮＢ（ヌートリエントブロス；Difco Laboratories,Inc.，Detroit，MI）；
0003794702.tif 000011
各開示微生物に使用された生長培地は、表１〜６に示される。接種された培養菌は、定常的に振盪しながら２８〜３０℃で７２時間増殖された（２５０ｒｐｍ；段階Ｉ増殖）。この種菌培養液の１０〜２０％を、新鮮培地（２５ｍＬ）に移植し、培養をさらに２４時間継続した（段階ＩＩ増殖）。細胞を収穫し、そして適切なバッファー（ｐＨ４．５〜８．５）に再懸濁したが、この場合、生体触媒の最終濃度は、バッファー１ｍＬ当たり触媒約１０〜２５０ｍｇ（乾燥重量）であり、基質の最終濃度は、約２〜２００ｍＭであった。生物変換を達成すべきインキュベーションは、定常的に振盪（２５０ｒｐｍ）しながら２５〜５０℃で４〜７２時間継続された。次いで、反応液を酸性にし、塩化メチレンで抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2の蒸発に続いて、その残渣をＡＣＮに再懸濁した。ＡＣＮ溶液中の基質の回収％を、逆相ＨＰＬＣによって測定し、そして鏡像異性純度をキラルＨＰＬＣによって測定した。
分析操作
第３級α−置換カルボン酸エステルおよび加水分解産物を、逆相ＨＰＬＣによって測定した。検出は、紫外線吸収によった。ＭＣＩＣについては、４０％アセトニトリルおよび６０％Ｈ2Ｏ＋０．１％トリエチルアミンの移動相（ｐＨ６.５に調整）を用いるＺｏｒｂａｘ▲Ｒ▼ＲＸ−Ｃ8カラム（４．６ｘ２５０ｍＭ）を使用した。ＥＨＰＡについては、０．１％Ｈ3ＰＯ4で酸性にした５０％アセトニトリルおよび５０％Ｈ2Ｏの移動相を用いるＺｏｒｂａｘ▲Ｒ▼Ｃ18カラム（４．６ｘ２５０ｍＭ）を使用した。エステルのクロマトグラフィーによる同定および定量は、純標準品との比較によって決定した。
鏡像異性体分離のためのキラルＨＰＬＣは、Chromatech(Sweden)から入手されるα−酸糖タンパク質カラムを用いて実施される。エステル鏡像異性体の分離用移動相は、以下にまとめられる。
0003794702.tif 000012
実施例１０におけるＥＨＰＡ鏡像異性体の分離のためのキラルＨＰＬＣは、J.T.Bakerから入手されるＢａｋｅｒｂｏｎｄ▲Ｒ▼キラルＯＤカラムを用いて実施された。ＥＨＰＡ鏡像異性体の分離用移動相は、９０％ヘキサン：１０％プロパノールであった。
鏡像異性体組成、純度および前記エステルのクロマトグラフィーによる同定は、鏡像異性体もしくはラセミ混合物の純標準品との比較によって決定された。
（実施例１）
表１に挙げられる微生物菌株では、細胞を、段階ＩＩ増殖から遠心分離によって回収し、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．０の５ｍＬに再懸濁した（細胞湿重量５０〜１００ｍｇ／バッファー１ｍＬ）。次いで、ＤＭＦ５０μＬ中ラセミＭＣＩＣ  １０μｍｏｌを添加した。３０℃で２４時間インキュベーション後、反応を終結するか（２ｍＭ生物変換）、またはＤＭＦ５０μＬ中ラセミＭＣＩＣ１０μｍｏｌをさらに添加し、インキュベーションをさらに２４時間継続した（４ｍＭ生物変換）。２ｍＭと４ｍＭの両ＭＣＩＣ生物変換を、３ＭＨ2ＳＯ4でｐＨ３に酸性化することによって終結した。塩化メチレン２倍量を、各サンプルに添加し、その懸濁液を１５分間撹拌した。塩化メチレン層を採取し、窒素通気下で蒸発乾固し、そして残渣をアセトニトリル１０ｍＬに再懸濁した。回収された両ＭＣＩＣの％および（＋）−ＭＣＩＣｅ．ｅ．を、それぞれ、逆相ＨＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣによって測定し、そしてその結果を表１に示す。
（実施例２）
各キモトリプシン酵素（表１）のサンプル１０ｍｇを、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０の２ｍＬに添加した。次いで、ＤＭＦ２０μＬ中ラセミＭＣＩＣ４μｍｏｌを添加した。同様に、ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−７リパーゼのサンプル２０ｍｇを、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０に添加し、そしてＤＭＦ２０μＬ中ラセミＭＣＩＣ４０μｍｏｌを添加した。３０℃（キモトリプシン）または２５℃（Ｌ−７）で２４時間インキュベーション、そして続いて実施例１と同様な抽出および分析操作の後、回収されたＭＣＩＣの％および（＋）−ＭＣＩＣｅ．ｅ．を測定した。その結果を表１に示す。
0003794702.tif 000013
（実施例３）
表２に挙げられる微生物菌株では、細胞を、段階ＩＩ増殖から遠心分離によって回収し、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０の５ｍＬに再懸濁した（細胞湿重量５０〜１００ｍｇ／バッファー１ｍＬ）。実施例１と同様の方法で、ラセミＭＣＩＣ  １０μｍｏｌを添加した。実施例１と同様のインキュベーション（４ｍＭ生物変換）、抽出および分析操作に続いて、回収されたＭＣＩＣ％および（−）−ＭＣＩＣｅ．ｅ．を、測定した。その結果を表２に示す。
（実施例４）
ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−２リパーゼ５ｍｇ、ＳＰ５２４リパーゼ、ＳＰ５２６リパーゼ、ＳＰ５３９プロテアーゼ１０ｍｇまたはＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−５リパーゼ２０ｍｇ（表２）を、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０の２ｍＬに添加した。次いで、ＤＭＦ２０μＬ中ラセミＭＣＩＣ４０μｍｏｌ（ＳＰ５２６では２０μｍｏｌ）を添加した。２５℃で２４時間インキュベーション、そして続く実施例１と同様な抽出および分析操作の後、回収されたＭＣＩＣ％および（−）−ＭＣＩＣｅ．ｅ．を測定した。その結果を表２に示す。
0003794702.tif 000014
（実施例５）
表３に挙げられる微生物菌株では、各２４時間の段階ＩＩ培養液（２５ｍＬＳＢＧ培地）に、ＤＭＦ１００μｌ中ラセミＭＣＩＣ４２μｍｏｌを添加した。ＭＣＩＣ添加に続いて、２７℃で８時間もしくは２９時間インキュベーション後の培養液から４ｍＬづつを採取した。各サンプルに、酢酸エチル１ｍＬを添加し、その懸濁液を１０秒間撹拌した。酢酸エチル層の２／１０ｍＬを、各サンプルから採取し、窒素通気下で蒸発乾固し、そして残渣をアセトニトリル３ｍＬに再懸濁した。回収されたＭＣＩＣの％および（−）−ＭＣＩＣｅ．ｅ．を、それぞれ、逆相ＨＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣによって測定し、そしてその結果を表３に示す。
0003794702.tif 000015
（実施例６）
表４に挙げられる微生物菌株では、細胞を、段階ＩＩ増殖から遠心分離によって回収し、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０の５ｍＬに再懸濁した（細胞湿重量５０〜１００ｍｇ／バッファー１ｍＬ）。次いで、ＤＭＦ５０μＬ中ラセミＥＨＰＡ  １０μｍｏｌを添加した。３０℃で２４時間インキュベーション後、反応を終結するか（２ｍＭ生物変換）、またはＤＭＦ５０μＬ中ラセミＥＨＰＡ  １０μｍｏｌをさらに添加し、インキュベーションをさらに２４時間継続した（４ｍＭ生物変換）。２ｍＭと４ｍＭの両ＥＨＰＡ生物変換を、３ＭＨ2ＳＯ4でｐＨ３に酸性化することによって停止した。塩化メチレン２倍量を、各サンプルに添加し、その懸濁液を１５分間撹拌した。塩化メチレン層を採取し、窒素通気下で蒸発乾固し、そして残渣をアセトニトリル１０ｍＬに再懸濁した。回収された両ＥＨＰＡの％および（＋）−ＥＨＰＡｅ．ｅ．を、それぞれ、逆相ＨＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣによって測定し、そしてその結果を表４に示す。
（実施例７）
ＩＭ６０Ｌｉｐｏｚｙｍｅ、ＳＰ５２４リパーゼ、ＳＰ５２６リパーゼのサンプル２０ｍｇ、またはＬｉｐｏｌａｓｅリパーゼ１ｍＬを、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０の２ｍＬ（Ｌｉｐｏｌａｓｅでは１ｍＬ）に添加した。次いで、ＤＭＦ２０μＬ中ラセミＥＨＰＡ２０μｍｏｌを添加した。３０℃で４８時間（ＩＭ６０Ｌｉｐｏｚｙｍｅ）または２５℃で２４時間（ＳＰ５２５、ＳＰ５２６、Ｌｉｐｏｌａｓｅ）インキュベーション後、反応を３ＭＨ2ＳＯ4でｐＨ３に酸性化することによって停止した。実施例６と同様の抽出および分析操作の後、ＥＨＰＡ％および（＋）−ＥＨＰＡｅ．ｅ．を測定した。その結果を表４に示す。
0003794702.tif 000016
（実施例８）
表５に挙げられる微生物菌株では、細胞を、段階ＩＩ増殖から遠心分離によって回収し、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０の５ｍＬに再懸濁した（細胞湿重量５０〜１００ｍｇ／バッファー１ｍＬ）。実施例５と同様の方法で、ラセミＥＨＰＡ  １０μｍｏｌを添加した。実施例５と同様のインキュベーション（２ｍＭ生物変換）、抽出および分析操作に続いて、回収されたＥＨＰＡ％および（−）−ＥＨＰＡｅ．ｅ．を、測定した。その結果を表５に示す。
0003794702.tif 000017
（実施例９）
表６に挙げられる微生物菌株では、段階ＩＩ増殖から遠心分離によって回収され、−８０℃で凍結保存された細胞を、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０の２ｍＬに再懸濁した（細胞湿重量１５０〜３００ｍｇ／バッファー１ｍＬ）。その細胞懸濁液を、５０％ｅ．ｅ．（＋）−ＭＣＩＣ  １００μｍｏｌを含む反応バイアルに添加した。３０℃で２４時間インキュベーション後、反応を３ＭＨ2ＳＯ4でｐＨ３に酸性化することによって停止した。塩化メチレン５倍量を、各サンプルに添加し、その懸濁液を１５分間撹拌した。各塩化メチレン層の１／２を採取し、窒素通気下で蒸発乾固し、そして残渣をアセトニトリル１０ｍＬに再懸濁した。回収された両ＭＣＩＣの％および（＋）−ＭＣＩＣｅ．ｅ．を、それぞれ、逆相ＨＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣによって測定し、そしてその結果を表６に示す。
0003794702.tif 000018
（実施例１０）
ＣＲＬｉｐａｚｅ（Altus Biologics Inc.，Cambridge，MA）１０ｍｇを、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０の２ｍＬに添加した。次いで、ＤＭＦ２０μｍｏｌ中ラセミＥＨＰＡ１０μｍｏｌを添加した。３０℃で２４時間インキュベーション後、反応を３ＭＨ2ＳＯ4でｐＨ３に酸性化することによって停止した。塩化メチレン５倍量を、各サンプルに添加し、その懸濁液を１５分間撹拌した。各塩化メチレン層の１／２を採取し、窒素通気下で蒸発乾固し、そして残渣をアセトニトリル１０ｍＬに再懸濁した。回収された両ＥＨＰＡの％および（＋）−ＥＨＰＡを、それぞれ、逆相ＨＰＬＣおよびキラルＨＰＬＣによって測定し、そしてその結果を表７に示す。
0003794702.tif 000019
本発明の主な態様は次のとおりである。
１．鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルの調製方法であって、式Ｉ
0003794702.tif 000020
［式中、
Ｒ1およびＲ2は、独立して、フェニルおよびＣ1−Ｃ6アルキルからなる群より選ばれ、各基はハロゲン、Ｃ1−Ｃ3アルコキシおよびフェノキシからなる群の３個までにより、場合によって、置換されてもよく；但し、Ｒ1およびＲ2は互いに異なることを前提とする；あるいは、
Ｒ1、Ｒ2およびそれらが結合される炭素は、一緒になって基
0003794702.tif 000021
（ここで、Ｘは、Ｃ＝Ｏ，Ｏ，ＳおよびＮＨからなる群より選ばれ；Ｒ3は、ＯＨおよびＮＨ2からなる群より選ばれ；Ｒ4は、Ｃ1−Ｃ6アルキルであり；そしてＲ5は、ハロゲンおよびＣ1−Ｃ3フルオロアルコキシからなる群より選ばれる）を形成し、式中、キラル炭素は星印によって示されている）］
のエステルの鏡像異性体の混合物と、
ＩＭ６０  Ｌｉｐｏｚｙｍｅ；Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｌ−２リパーゼ；Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｌ−５リパーゼ；Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｌ−７リパーゼ；ＳＰ５２４リパーゼ；ＳＰ５２６リパーゼ；ＳＰ５３９プロテアーゼ；Ｌｉｐｏｌａｓｅ  Ｌｉｐａｓｅ；ＣＲ  Ｌｉｐａｓｅ；コリネバクテリウム・ホアギイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏａｇｉｉ）ＡＴＣＣ７００５；フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２７５５１；シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−３４２９；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ２３９７３；シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ−Ｂ−１１３３０；ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）ＡＴＣＣ１４８８７；ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ４２７７；ロドコッカス・コプロフィラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３６；ロドコッカス・ロドニイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３５；ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ５５６０２；ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３１；ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３４；ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＡＴＣＣ６８５５；キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ２１８１８；カンジダ・ギリエルモンディイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＡＴＣＣ６２６０；カンジダ・ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）ＡＴＣＣ４１３５；カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ４６４９１；ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ）ＡＴＣＣ４５５７；ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ９７７３；アスペルギルス・アリアクルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｒｕｓ）ＡＴＣＣ１００６０；ボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）ＡＴＣＣ２６０３７；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ７４２９２；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ２６８５１；ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ３８６５７；ボーベリア・ニベア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｎｉｖｅａ）ＡＴＣＣ７４２９４；クニンガメラ・エチヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）ＡＴＣＣ８６８８；ロホトリカス・マルチニイ（Ｌｏｐｈｏｔｒｉｃｈｕｓ  ｍａｒｔｉｎｉｉ）ＡＴＣＣ１１２２１；ペシロミセス・マルクヮンヂ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｑｕａｎｄｉ）ＡＴＣＣ１０５２５；ペスタロチア・ミクロスポラ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）ＡＴＣＣ１１８１６；リゾープス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ１０４０４；リゾープス・オリゼＡＴＣＣ２２５８０；スポロボロミセス種（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２０２９０；トリコフィトン・コンセントリカム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ７４２９３；バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１４５９１；ノカルヂア種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ−Ｂ−５６４６；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ１７４５３；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＲＲＬ−Ｙ−２０３４；シゾサッカロミセス・オストスポラス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｓｔｏｓｐｏｒｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｙ−８５４；アスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ）ＮＲＲＬ−３１５；ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ１０００２；ペニシリウム・ノタータム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）ＡＴＣＣ３６７４０；アミコラトプシス・ルゴサ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｒｕｇｏｓａ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２２９５；ロドコッカス・エクイＡＴＣＣ１３５５６；ストレプトミセス・エンダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｎｄｕｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２３３９；アスペルギルス・カンヂダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ）ＡＴＣＣ２００２２；およびミコフィータ・ミクロスポラ（Ｍｙｃｏｐｈｙｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）ＡＴＣＣ８９８２１からなる群より選ばれる生体触媒とを接触させることを含む方法。
２．式Ｉにおいて、Ｒ1が、場合によって、フェノキシにより置換されたフェニルであり；Ｒ2がＣ1−Ｃ3アルキルであるか；あるいは、Ｒ1、Ｒ2およびそれらが結合される炭素が、一緒になって基
0003794702.tif 000022
［式中、Ｘは、Ｃ（＝Ｏ）であり；Ｒ3は、ＯＨであり；Ｒ4は、Ｃ1−Ｃ3アルキルであり；そしてＲ5は、ハロゲンである］を形成する、上記の１記載の方法。
３．式Ｉの鏡像異性体エステル混合物が、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−１−オキソ−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸メチルであり、鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルが（＋）鏡像異性体であり、そして生体触媒が、コリネバクテリウム・ホアギイＡＴＣＣ７００５、フラボバクテリウム種ＡＴＣＣ２７５５１、シュードモナス・オレオボランスＮＲＲＬ−Ｂ−３４２９、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ２３９７３、シュードモナス種ＮＲＲＬ−Ｂ−１１３３０、ロドコッカス・エクイＡＴＣＣ１４８８７、ロドコッカス・エリスロポリスＡＴＣＣ４２７７、ロドコッカス・コプロフィラスＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３６、ロドコッカス・ロドニイＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３５、ロドコッカス・ロドクラスＡＴＣＣ５５６０２、ロドコッカス種ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３１、ロドコッカス種ＮＲＲＬ−Ｂ−１６５３４、ストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ６８５５、キサントモナス・カンペストリスＡＴＣＣ２１８１８、ロドトルラ・ルブラＡＴＣＣ４５５７、ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ２６０３７、ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ７４２９２、ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ２６８５１、クニンガメラ・エチヌラタＡＴＣＣ８６８８、ペシロミセス・マルクヮンヂＡＴＣＣ１０５２５、ペスタロチア・ミクロスポラＡＴＣＣ１１８１６、リゾープス・オリゼＡＴＣＣ１０４０４、リゾープス・オリゼＡＴＣＣ２２５８０、トリコフィトン・コンセントリカムＡＴＣＣ７４２９３およびＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−７リパーゼから選ばれる、上記の２の方法。
４．式Ｉの鏡像異性体エステル混合物が、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−１−オキソ−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸メチルであり、鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルが（−）鏡像異性体であり、そして生体触媒が、カンジダ・ギリエルモンディイＡＴＣＣ６２６０、カンジダ・ケフィルＡＴＣＣ４１３５、カンジダ・トロピカリスＡＴＣＣ４６４９１、ヤロウィア・リポリチカＡＴＣＣ９７７３、アスペルギルス・アリアクルスＡＴＣＣ１００６０、ボーベリア・ニベアＡＴＣＣ７４２９４、ロホトリカス・マルチニイＡＴＣＣ１１２２１、スポロボロミセス種ＡＴＣＣ２０２９０、バチルス・セレウスＮＲＲＬ−Ｂ−１４５９１、ノカルヂア種ＮＲＲＬ−Ｂ−５６４６、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１７４５３、サッカロミセス・セレビシエＮＲＲＬ−Ｙ−２０３４、シゾサッカロミセス・オストスポラスＮＲＲＬ−Ｙ−８５４、アスペルギルス・アリアセウスＮＲＲＬ−３１５、ペニシリウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１０００２、ペニシリウム・ノタータムＡＴＣＣ３６７４０、ＳＰ５２４リパーゼ、ＳＰ５２６リパーゼ、ＳＰ５３９プロテアーゼ、ＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−２リパーゼおよびＣｈｉｒａｚｙｍｅＬ−５リパーゼから選ばれる、上記の２の方法。
５．式Ｉの鏡像異性体エステル混合物が、α−ヒドロキシ−α−メチル−４−フェノキシベンゼン酢酸エチルであり、鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルが（＋）鏡像異性体であり、そして生体触媒が、シュードモナス種ＮＲＲＬ−Ｂ−１１３３０、ロドコッカス・エクイＡＴＣＣ１３５５６、カンジダ・トロピカリスＡＴＣＣ４６４９１、アスペルギルス・カンヂダスＡＴＣＣ２００２２、ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ２６８５１、ボーベリア・バッシアナＡＴＣＣ３８６５７、ミコフィータ・ミクロスポラＡＴＣＣ８９８２１、トリコフィトン・コンセントリカムＡＴＣＣ７４２９３、ＩＭ６０Ｌｉｐｏｚｙｍｅ、ＳＰ５２４リパーゼ、ＳＰ５２６リパーゼ、ＬｉｐｏｌａｓｅリパーゼおよびＣＲＬｉｐａｓｅから選ばれる、上記の２の方法。
６．式Ｉの鏡像異性体エステル混合物が、α−ヒドロキシ−α−メチル−４−フェノキシベンゼン酢酸エチルであり、鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルが（−）鏡像異性体であり、そして生体触媒が、アミコラトプシス・ルゴサＮＲＲＬ−Ｂ−２２９５およびストレプトミセス・エンダスＮＲＲＬ−Ｂ−２３３９から選ばれる、上記の２の方法。
７．さらに、生体触媒反応混合物から鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルを分離する付加的段階を含む、上記の１の方法。
８．該分離が、抽出または相分離によって達成される、上記の７の方法。
９．５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−１−オキソ−１Ｈ−インデン−２−カルボン酸メチルの鏡像異性体エステル混合物と生体触媒とを接触させることを含む、鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルの調製方法であって、鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルが（＋）鏡像異性体であり、そして生体触媒が、α−キモトリプシン、β−キモトリプシン、γ−キモトリプシンおよびδ−キモトリプシンから選ばれることを特徴とする調製方法。
１０．さらに、生体触媒反応混合物から鏡像異性的に増強されたカルボン酸エステルを分離する付加的段階を含む、上記の９の方法。
１１．該分離が、抽出または相分離によって達成される、上記の１０の方法。