(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のビタミンＤ結合蛋白の多型について測定し、それとビタミンＤ類による治療効果とを結びつけることを特徴とする薬剤感受性の予測方法。
【請求項２】
患者のビタミンＤ結合蛋白の遺伝子多型について測定し、それとビタミンＤ類による治療効果とを結びつけることを特徴とする薬剤感受性の予測方法。
【請求項３】
遺伝子多型が、ＧＣ１Ｓ、ＧＣ１ＦおよびＧＣ２の組み合わせによる６種の型である、請求項２に記載の薬剤感受性の予測方法。
【請求項４】
薬剤投与対象疾患がビタミンＤ内分泌系の関与する疾患である請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤感受性の予測方法。
【請求項５】
薬剤投与対象疾患が骨・軟骨疾患、皮膚疾患、免疫疾患、またはガンである請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤感受性の予測方法。
【請求項６】
薬剤投与対象疾患が骨粗鬆症である請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤感受性の予測方法。
【請求項７】
ビタミンＤ結合蛋白遺伝子型のＧＣ２―２を薬剤高感受性型と分類する、請求項３〜６のいずれかに記載の薬剤感受性の予測方法。
【請求項８】
患者がモンゴロイド系人種である請求項１〜７のいずれかに記載の薬剤感受性の予測方法。
【請求項９】
患者が日本人である請求項１〜７のいずれかに記載の薬剤感受性の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、蛋白又はその遺伝子の多型を測定することにより、薬剤に対する感受性を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、西洋医学においては、疾患や患者の症状に応じて薬の投与がなされていたが、患者個人個人における薬に対する反応性の違いに関しては“体質”として片付けられ、個人個人の薬剤感受性（薬剤反応性）に応じた薬剤投与をすることは困難であった。
【０００３】
疾患やその治療法がますます複雑になっている現在、治療による薬剤感受性の判定と患者個人個人の体質に応じた適切な薬の投与は、治療を有効に行うためにもますます必要になってきている。
【０００４】
近年、遺伝子解析の進歩に伴い、薬剤に対する個人個人の反応性の違いが、ある遺伝子型によって分類されるという報告がいくつかなされた。
【０００５】
Carmena R.らは、家族性高コレステロール血症患者におけるlovastatin（ＨＭＧ―ＣｏＡ還元酵素阻害剤）の治療効果がアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）の遺伝子型によって異なることを報告した（Metabolism Vol. ４２，No. ７，ｐ８９５（１９９３））。
【０００６】
また、Watanabe J. らは、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の高コレステロール血症患者に対するプラバスタチン（ＨＭＧ―ＣｏＡ還元酵素阻害剤）の効果がアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）の遺伝子型によって異なることを報告した（Diabetes Res Clin Pract Vol.２０，No. １，ｐ２１（１９９３））。
【０００７】
さらに、Okuguchi F. らも、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の高脂血症患者に対するプラバスタチン（ＨＭＧ―ＣｏＡ還元酵素阻害剤）の効果がアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）の遺伝子型によって異なることを報告した（J Jpn Atheroscler Soc Col.２２，No. ３，ｐ１２４（１９９４））。
【０００８】
しかし、ビタミンＤ類薬剤のビタミンＤ内分泌系関与疾患患者に対する治療における薬剤感受性に関する報告はこれまでになされていない。
【０００９】
ビタミンＤ製剤は、現在多くの疾患の治療に用いられている。その作用は大きく２つに分類され、１つはＣａ代謝の調節、そしてもう１つは免疫調節である。
【００１０】
前者に関連する疾患として、骨軟化症、クル症、腎性骨異栄養症、骨粗鬆症等がある。また、後者に関する疾患として乾癬、アトピー、癌、自己免疫疾患等が挙げられる。
【００１１】
しかしながら、現在のところビタミンＤの薬剤を用いて前述の各疾患を治療する際に事前に薬剤感受性を判定する手段は報告されていない。ビタミンＤの治療は長期を要するため、高感受性の患者と低感受性の患者を分類できれば、無用の治療を避けることができるので、治療前の効果判定は非常に有用である。
【００１２】
一方、近年高齢者、特に女性の高齢者において、骨粗鬆症の発生が問題とされており、高齢者の骨密度について大きな関心が寄せられている。かかる骨密度低下については、その治療方法、治療薬の研究も盛んであるが、その原因の研究および遺伝的要因の検討も進められている。骨に関係する要因としては、ビタミンＤおよびそれに関連する物質が取り上げられて研究されており、それらには例えばビタミンＤ受容体（Vitamin-D Receptor：ＶＤＲ）、オステオカルシン並びにビタミンＤ結合蛋白（Vitamin-D Binding Protein ：ＤＢＰ）が挙げられる。
【００１３】
骨形成過程に組み込まれる群特異的成分（Group Specific Component：ＧＣ、これはＤＢＰと同じである）については、例えばAndress Braun, et al, Hum Genet （１９９２）８９：４０１〜４０６において、ＤＢＰの遺伝子多型について述べられており、そこではゲノムＤＮＡを制限酵素ＨａｅIII またはＳｔｙＩで切断した制限断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism：ＲＦＬＰ）が開示されており、ＧＣフェノタイプについて６種の分類を行っている。しかしながら、これらの遺伝子型と薬剤感受性との関係については何も述べられていない。
【００１４】
さらに、J.E.Eichner, et al, Genetic Epidemiology９：１７７〜１８９（１９９２）には、閉経女性についてＤＢＰと骨密度または骨格寸法との関係に関する研究が記載されているが、「ＧＣまたはＡＨＳＧフェノタイプのいずれも、どの部分においてもＢＭＤとの統計的に意味のある相関は示さなかった。」と結論している。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
かかる状況下、本発明者らは、ビタミンＤ内分泌系関連疾患に対するビタミンＤ類薬剤投与における個人個人の反応性の違いには、必ずＤＢＰが関連しているはずであるとの確信のもとに、骨粗鬆症患者に対してビタミンＤ類薬剤を投与した場合の骨密度の変化と、ＤＢＰ遺伝子型の関係について検討したところ、驚くべきことにＤＢＰ遺伝子型が、ビタミンＤ類薬剤を投与した場合の骨密度の変化に関係していることを見い出し、本発明に到達した。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
しかして本発明は、
項１：ビタミンＤ結合蛋白の多型について測定し、それと薬剤に対する反応性、治療効果とを結びつけることを特徴とする薬剤感受性の予測方法、
項２：ビタミンＤ結合蛋白の遺伝子多型について測定し、それと薬剤に対する反応性、治療効果とを結びつけることを特徴とする薬剤感受性の予測方法、
項３：上記遺伝子多型が、ＧＣ１Ｓ、ＧＣ１ＦおよびＧＣ２の組み合わせで形成される６種の型である、項２記載の薬剤感受性の予測方法、
項４：薬剤がビタミンＤ類である、項１〜３記載の薬剤感受性の予測方法、
項５：薬剤投与対象疾患がビタミンＤ内分泌系の関与する疾患である項１〜４記載の薬剤感受性の予測方法、
項６：薬剤投与対象疾患が骨・軟骨疾患、皮膚疾患、免疫疾患、ガンである項１〜４記載の薬剤感受性の予測方法、
項７：薬剤投与対象疾患が骨粗鬆症である項１〜４記載の薬剤感受性の予測方法、
項８：ビタミンＤ結合蛋白遺伝子型のＧＣ２―２を薬剤高感受性型と分類する、項３〜７記載の薬剤感受性の予測方法、
項９：予測対象者がモンゴロイド系人種である項１〜８のいずれか１項記載の薬剤感受性の予測方法、及び
項１０：予測対象者が日本人である項１〜８のいずれか１項記載の薬剤感受性の予測方法
である。
【００１７】
ビタミンＤ結合蛋白の採取源は、該蛋白が産生されている生体試料なら特に限定しないが、採取の容易性から血清が好ましい。
【００１８】
ゲノムＤＮＡの多型分析を行う生体試料の採取源には特に限定はないが、血球成分が採取しやすく、これで十分である。
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２０】
（１）ゲノムＤＮＡを用いた多型分析
（ａ）標準的ＤＮＡ抽出操作
１．全血０．５ｍｌ（２Ｎａ―ＥＤＴＡ抗凝固剤使用）を１．５ｍｌ容のマイクロ遠心管に入れる。
２．溶解液を０．５ｍｌ加えて、チューブを数回軽く、逆さにして液を混ぜる。（下記の混合操作はこれに従う）
溶解液例：１×ＳＳＣ（１リットル中にＮａＣｌ  １７５．３ｇ、クエン酸ナトリウム８８．２ｇを含む１０Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調製した２０×ＳＳＣを１０倍に希釈したもの）
３．遠心（１０，０００ｇ、２０秒、４℃）した後、黒っぽいペレットが流出しないように上清を除く。
４．溶解液を１ｍｌ加えて、マイクロチューブミキサーにて攪拌する（ＭＴ―３６０では、スピード７、３０秒）。
５．遠心（１０，０００ｇ、２０秒、４℃）した後、上清を除く。
６．ステップ４〜５を１回繰り返す。
７．酵素反応液２００μｌと蛋白分解酵素１０μｌを加えて混合する。
【００２１】
酵素反応液例：０．０４Ｍ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム）および０．４％ＳＤＳの混合液
蛋白分解酵素液例：１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Proteinase K）
８．３７℃で１時間保温する（途中２〜３回軽く振り混ぜる）。
９．ヨウ化ナトリウム溶液を３００μｌ加えて混合する。
１０．イソプロピルアルコールを０．５ｍｌ加えて、白い線状のＤＮＡが完全に見えてくるまで、混合する。
１１．遠心（１０，０００ｇ、１０分、室温）した後、上清をゆっくり除く。容器を濾紙の上に逆さに置く等の方法で、器壁に残った溶液を十分に除く。
１２．洗浄液（Ａ）を１ｍｌ加えて混合する。沈澱が器壁から剥がれる程度に十分混合する。
【００２２】
洗浄液（Ａ）例：７０％ＥｔＯＨ
１３．遠心（１０，０００ｇ、５分間、室温）後上清を除く。
１４．洗浄液（Ｂ）を１ｍｌ加えて、混合する。沈澱が器壁から剥がれる程度に十分混合する。
【００２３】
洗浄液（Ｂ）例：８０％ＥｔＯＨ
１５．遠心（１０，０００ｇ、５分間、室温）後上清を除く。
１６．ＤＮＡ沈澱を軽く減圧乾燥する。（乾燥しすぎると、ＤＮＡが溶けにくいので、乾燥時間は３分間以内にする。）
（ｂ）標準的遺伝子増幅操作
遺伝子増幅法についてはいくつかの原理が知られているが、ここではポリメレース・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）を標準的なものとして記載する。
【００２４】
反応液組成：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ９．０、２５℃）、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ―１００、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１５μＭフォワードプライマー（Forward Primer）、１５μＭリバースプライマー（Riverse Primer）、１ｍｇ／ＬゲノムＤＮＡ、１ユニット  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、全容積５０μｌ
反応サイクル：９４℃、１分；６４℃、１分；７２℃、１分を１サイクルとし、４０サイクル実施。
【００２５】
プライマー：制限酵素ＨａｅIII 用、ＳｔｙＩ用とも下記のものを用いた。
【００２６】
【化１】
ＤＢ―１  ５′―ＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＴＡＴＧ―３′
ＤＢ―２  ５′―ＡＡＴＣＡＣＡＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴ―３′
［A. Braun et al, Hum Genet （１９９２）８９：４０１〜４０６］
【００２７】
（ｃ）標準的制限酵素切断操作
ＨａｅIII 用反応液組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ
ＨａｅIII を１ユニット／２０μｌ反応液の濃度で加え、３７℃、３時間インキュベートする。
【００２８】
ＳｔｙＩ用反応液組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ
ＳｔｙＩを１０ユニット／２０μｌ反応液の濃度で加え、３７℃、２時間インキュベートする。
【００２９】
（ｄ）標準的電気泳動操作
電気泳動用緩衝液は、０．５×ＴＢＥである。但し、５×ＴＢＥは１リットル中Ｔｒｉｓベース５４ｇ、ホウ酸２７．５ｇおよびＥＤＴＡ  １ｍＭを含有し、ｐＨ８．０に調整してある。上記緩衝液を用いて、１％アガロースゲル［Seakem GTA Agarose (FMC Bio Products）使用］（０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド含有）を使用して、電圧１００Ｖで３０分間泳動する。その後ＵＶランプでＤＮＡのバンドを観察する。
【００３０】
ＨａｅIII で切断した場合、アレル（ａｌｌｅｌｅ）と切断フラグメントは下記のとおりである。
【００３１】
［切断されたフラグメントの長さ（ｂｐ）］
ＧＣ２      ３８０／５００／１１２０
ＧＣ１Ｓ    ３８０／５００／１０２０／１００
ＧＣ１Ｆ    ３８０／５００／１１２０
ＳｔｙＩで切断した場合は、下記のとおりである。
【００３２】
［切断されたフラグメントの長さ（ｂｐ）］
ＧＣ２      １９１０／９０
ＧＣ１Ｓ    ２０００（切断されない）
ＧＣ１Ｆ    ２０００（切断されない）
すなわち、それぞれのビタミンＤ結合蛋白の遺伝子型におけるバンドのパターンは下記表１のとおりである（多型はＧＣのサフィックスで表示）。
【００３３】
【表１】
0003786442.tif 000002
【００３４】
（２）免疫固定等電点電気泳動を用いた多型解析
本解析は、J. Constans, Science, Vol.１９８，ｐｐ１０７０〜１０７１（１９７７）に記載された方法に準じて実施することができる。すなわち、被検者の血清を採取し、これを下記ゲルにアプライし、等電点電気泳動（Isoelectrofocusing）を行った後、市販のＧＣを免疫して常法により得られた抗ＧＣウサギ抗血清を反応させる。その後、生じた免疫沈降物のバンドをクマシーブルー染色する。等電点電気泳動（Isoelectrofocusing）は、ＬＫＢ  Multiphor （登録商標）Electrofocusing 装置（ファルマシア・ＬＫＢ社）を用いて行う。ゲルとしてはリボフラビンの存在下で光重合したポリアクリルアミドゲル（２ｍｍ厚）を使用する。ｐＨ４〜６の両性担体Ampholine （ファルマシア・ＬＫＢ社）を使用する。
【００３５】
この操作により、図３に示すようなバンドが得られ、６種のフェノタイプに分類することができる。
【００３６】
（３）骨密度の測定方法
骨密度の測定は、ＤＥＸＡ法に基づいて行う。ＤＥＸＡ法に用いる装置として、例えばＤＰＸ―Ｌ［Lunar Rad. Co. (Madison, WI ）］を用いて行う。測定部位は腰椎Ｌ２―４を測定することができる。
【００３７】
なおビタミンＤ類としては、以下のものが挙げられる。
カルシポトリオール（Calcipotriol）
２２―オキサカルシトリオール（oxacalcitriol ）
１，２３，２５（ＯＨ）3 ―２４―オキソＤ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―２４―エピ―Ｄ2 
１α，２５Ｒ，２６（ＯＨ）3 ―２２―エンＤ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―２０―エピ―２２―オキサ―２４，２６，２７―トリホモ（trihomo ）Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―２２，２４―ジエン―２４，２６，２７―トリホモ（trihomo ）Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―１６―エン―２３―インＤ3 
２β―（３―ヒドロキシプロポキシ）―１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―２２―エン―Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―２６，２７―Ｆ6 ―Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ2 
１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 ―２４，２４，２４，２６，２６，２６，２７，２７，２７―ｄ8 
１α，２５Ｓ，２６（ＯＨ）3 Ｄ2 
１α，２５Ｓ，２６（ＯＨ）3 Ｄ3 
１α，２５，２８（ＯＨ）3 Ｄ2 
１α，２４Ｒ，２５（ＯＨ）3 Ｄ3 
２５（ＯＨ）―２３―インＤ3 
２５（ＯＨ）―２６，２７―Ｆ6 ―２３―イン―Ｄ3 
２４Ｒ，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
２５（ＯＨ）―１６―エン―２３―イン―Ｄ3 
２４―ノル―１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
１α，１１β，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
ビタミンＤ3 
２５（ＯＨ）Ｄ3 
１α（ＯＨ）Ｄ3 
１α，２４Ｓ（ＯＨ）2 ―２２―エン―２６，２７―デヒドロ―Ｄ3 
９（１１）―デヒドロ―１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
１１β―メトキシ―１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
１α（ＯＨ）２５―オキソ―２６，２７―ジメチル―２５―ホスファ―２６，２７―ジオキサ―Ｄ3 
２２（ｍ―ヒドロキシフェニル）―２３，２４，２５，２６，２７―ペンタノル―１α（ＯＨ）Ｄ3 
２２（ｐ―ヒドロキシフェニル）―２３，２４，２５，２６，２７―ペンタノル―１α（ＯＨ）Ｄ3 
２５Ｓ，２６（ＯＨ）2 Ｄ3 
１α，２５Ｓ，２６（ＯＨ）3 Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―１６―エン―２３―イン―２６，２７―Ｆ6 ―Ｄ3 
２５（ＯＨ）―１６―エン―２３―イン―２６，２７―Ｆ6 ―Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―２４ａ―ホモ―Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―２４ａ―ジホモ―Ｄ3 
２２―オキサ―１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
２２［ｍ（ジメチルヒドロキシメチル）フェニル］―ペンタノル―１α（ＯＨ）2 Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―２３―エン―Ｄ3 
２５（ＯＨ）―２３―エン―Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―１６，２３―ジエン―Ｄ3 
１４―エピ―１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
１４―エピ―１α，２５（ＯＨ）2 プレ―Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―プレ―Ｄ3 ―９，１４，１９，１９，１９―ｄ5 
１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 ―９，１４，１９，１９，１９―ｄ5 
１β，２５（ＯＨ）2 ―３―エピ―Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―３―エピ―Ｄ3 
１β，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―１６―エン―Ｄ3 
２５（ＯＨ）―１６―エン―Ｄ3 
２５（ＯＨ）―１６，２３―ジエン―Ｄ3 
（２２Ｓ）―１α，２５（ＯＨ）2 ―２２，２３―ジエン―Ｄ3 
（２２Ｒ）―１α，２５（ＯＨ）2 ―２２，２３―ジエン―Ｄ3 
１４―エピ―２５（ＯＨ）Ｄ3 
１４―エピ―２５（ＯＨ）―プレ―Ｄ3 
α―Ｆｅ（ＣＯ）3 ―２５（ＯＨ）―５，６―トランス―Ｄ3 
α―Ｆｅ（ＣＯ）3 ―２５（ＯＨ）Ｄ3 
β―Ｆｅ（ＣＯ）3 ―２５（ＯＨ）Ｄ3 
β―Ｆｅ（ＣＯ）3 ―２５（ＯＨ）―５，６―トランス―Ｄ3 
Ｃｏ2 （ＣＯ）6 ―１α，２５（ＯＨ）2 ―６，７―デヒドロ―プレ―Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―トランス―タキステロール（tachysterol ）
１α，２４Ｓ（ＯＨ）2 Ｄ3 
１α，２４Ｒ（ＯＨ）2 Ｄ3 
１α，２５Ｓ，２６（ＯＨ）3 ―２２―エン―Ｄ3 
１α，２５（ＯＨ）2 ―２３―イン―Ｄ3 
１α―Ｆ―２５（ＯＨ）―１６―エン―２３―イン―２６―２７―Ｆ6 ―Ｄ3 
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３９】
［実施例１］
無作為に選んだ日本人骨粗鬆症患者２０名を対象として、ビタミンＤ3 （１α（ＯＨ）2 Ｄ3 ）製剤を経口投与（０．５〜１．０μｇ／日）し、３〜６ケ月後の骨密度（ＢＭＤ）を初期の骨密度と比較し、骨密度の変化率（ＢＭＤ（治療後）／ＢＭＤ（治療前））を求めた。また、同時に採血を行い各人のＤＢＰ遺伝子型を判定した。結果を表２および図１に示す。
【００４０】
【表２】
0003786442.tif 000003
【００４１】
また２―２型と他の型全体との比較を図２に示す。ｔ検定はｐ＝０．０４１５であり、ＧＣ２―２型は他の群と比較し、有意に骨密度上昇率が高い。
【００４２】
上記結果は、ＤＢＰ遺伝子型分類により、薬剤感受性を判定するに際し、ビタミンＤ類の経口投与による骨粗鬆症治療において、ＧＣ２―２型が高感受性であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】各遺伝子型と骨密度変化率の関係を示すものである。
【図２】２―２型とその他の型全体との比較を示すものである。
【図３】免疫固定等電点電気泳動によるＶＢＰ多型分析を示すものである。
【図１】
0003786442.tif 000004
【図２】
0003786442.tif 000005
【図３】
0003786442.tif 000006