(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロスマリン酸、ロスマリン酸のイソプロピルエステル、ロスマリン酸のエチルエステル、または（ｓ）−ロスマリン酸のビス−（第３ブチルジメチルシリル)エーテルを有効成分とする、臓器または組織の移植拒否反応、慢性移植拒否反応または移植片-対-宿主疾患、自家免疫疾患の治療、診断または予防用薬剤。
【請求項２】
移植される臓器または組織が腎臓、心臓、肺、肝腸、骨髄、膵臓、角膜、小腸、皮膚または心臓弁膜である請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
自家免疫疾患が狼瘡、リューマチ性関節炎、胆嚢病、重傷筋無力症、または多発性硬化症である請求項１記載の薬剤。
【請求項４】
さらに一つ以上の他の免疫抑制剤を含む請求項１記載の薬剤。
【請求項５】
該免疫抑制剤がシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸およびその２−（Ｎ−モルフォリノ)エチルエステル、ミコフェノール酸モフェチィル、アザチオプリン、コルチコステロイド、レフルノミド、シクロホスファミド、ラパマイシン、ＯＫＴ３、ＡＴＧ、１５−デオキシスペルグアリン、ミゾリビン、ミソプロストール、アメトプテリン(ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ)、インターロイキン−２受溶体に対する抗体およびリンパ球／胸腺細胞に関する血清からなる群から選択される第４項記載の薬剤。
【請求項６】
ロスマリン酸、ロスマリン酸のイソプロピルエステル、ロスマリン酸のエチルエステル、または（Ｓ）−ロスマリン酸のビス−（第３ブチルジメチルシルリル）エーテルを有効成分とする、Ｔリンパ球細胞キナーゼ（Ｌｃｋ）のＳＨ２ドメインの活性抑制薬剤。
【請求項７】
該ＳＨ２ドメインがリンパ球細胞キナーゼ（Ｌｃｋ）の一部分である請求項６記載の薬剤。
【請求項８】
該ＳＨ２ドメインの活性抑制薬剤が臓器または組織の移植拒否反応、慢性移植拒否反応、または移植片−対−宿主疾患の治療、診断または予防用薬剤である請求項６記載の薬剤。
【請求項９】
移植される臓器または組織が腎臓、心臓、肺、肝腸、骨髄、膵臓、角膜、小腸、皮膚または心臓弁膜である請求項８記載の薬剤。
【請求項１０】
さらに一つ以上の他の免疫抑制剤を含んでもよい請求項６記載の薬剤。
【請求項１１】
該免疫抑制剤がシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸およびその２−（Ｎ−モルフォリノ）エチルエステル、ミコフェノール酸モフェチィル、アザチオプリン、コルチコステロイド、レフルノミド、シクロホスファミド、ラパマイシン、ＯＫＴ３、ＡＴＧ、１５−デオキシスペルグアリン、ミゾリビン、ミソプロストール、アメトプテリン(ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ)、インターロイキン−２受溶体に対する抗体およびリンパ球／胸腺細胞に関する血清からなる群から選択される第１０項記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はロスマリン酸（rosmarinic acid)及びその誘導体をＴリンパ球細胞キナーゼ（Lymphocytecell kinase 、以下「Ｌｃｋ」とする）のＳＨ２（Src homology region 2)ドメインの活性抑制剤又は免疫抑制剤として使用する方法に関し、上記化合物又はそれを有効成分とする薬学的組成物を臓器または組織移植時に起こる拒否反応自家免疫疾患、炎症性疾患等の治療、診断または予防に有効に利用できる。
【０００２】
【発明の背景、従来の技術】
臓器移植は腎不全症、心不全症、肝不全症および肺不全症の末期患者によく行われており、特に腎臓、心臓、肺、肝臓、骨髄、膵臓（島細胞）、角膜、小腸および皮膚の同種移植片が、広く行われているだけではなく、豚の心臓弁膜を利用した異種移植も行われている。しかし、このような臓器移植は移植された患者に多様な免疫反応を起させ、移植拒否や移植片対宿主疾患（agaft-versus-host disease 、以下「ＧＶＨＤ」とする）を惹起したりする。
【０００３】
免疫反応は、主にＴ細胞が同種異系抗原を認識することにより勃発し、移植拒否反応として起きる免疫反応の主な攻撃対象は自己と異なった形態のＭＨＣ（主要組織適合抗原系）ＩとＭＨＣＩＩ抗原である。急性移植拒否反応が起こる時、臓器提供者の樹脂状細胞又は単球などと同じ抗原保有細胞が移植部から周辺のリンパ節に移動し、被移植者のＣＤ４+ ＴH 細胞によって外部物質として認識され、その結果被移植者のＴH 細胞の増殖を刺激することになる。ＴH 細胞が増殖すれば細胞毒性ＣＤ８+ Ｔ細胞及びＣＤ４+ Ｔ細胞などの細胞群が生成され移植部位に移動および浸透し移植拒否反応を媒介する（Noelle, R. J.et al., FASEB 5(13): 2770, 1991) 。
【０００４】
急性移植拒否反応がＴ細胞の依存的反応である反面、その後に起きる移植組織破壊現象は、広範囲な反応の一連の過程としてサイトカインが分泌され細胞間の相互作用を通してＣＤ４+ Ｔ細胞、ＣＤ８+ Ｔ細胞毒性Ｔ細胞、抗体を形成するＢ細胞、その他初期炎症白血球(proinflammatory  Leukocyte)を含む多様な組み合わせのリンパ球が、抗同種移植片応答に関与する。具体的には、抗原を保有する移植された細胞は、細胞毒性ＣＤ８+ Ｔ細胞によって直接破壊され、活性化したＣＤ４+ Ｔ細胞が産生するインターロイキン−２（ＩＬ−２：以下インターロイキンを「ＩＬ」とする）がＣＤ８+ ＴとＢ細胞を活性化させる。またＣＤ４+Ｔ細胞はインターフェロンガンマ（以下、「ＩＦＮ−γとする）又はインターロイキン−４（ＩＬ−４）のような移植細胞破壊に関与するサイトカインを産生する。ＩＦＮ−γは移植組織のＭＨＣＩ分子とＭＨＣＩＩ分子の発現を誘発し、移植組織がさらに攻撃されやすくするばかりではなく、大食細胞（マクロファージ）活性を増加させ、炎症反応に関連した細胞に影響を与え遅延型過敏反応（以下「ＤＴＨ」とする）と炎症を誘起し移植組織に対し非特異的な損傷を与える。このような反能が移植後数週間以内に起こる初期急性拒否反応の主原因として知られており、このような急性拒否反応を放置すれば、数日以内に移植組織の破壊が急速に起こる。
【０００５】
骨髄移植の場合、特にＧＶＨＤが移植手術を受けた患者の生存率を左右する。ＧＶＨＤは移植された細胞が被移植者の細胞を攻撃するものであり（Storb, “Pathophysiology and prevention of graft-versus-host disease." IN Advances in immunobiology: Blood cell antigens and bone marrow transplantation, McCullogh and Sandler, editors, Alan, R., Liss, Inc., NewYork, p337, 1984),ＧＶＨＤに罹った殆どの患者は死亡することになる。（Weiden et al., "graft-versus-host disease in allogeneic marrow transplantation" IN Biology of Bone-Marrow Transplantation, Gale and fox, editors, Academic Press,NewYork, p37, 1980).
【０００６】
上記のような致命的な移植拒否反応を防ぐために、多様な免疫抑制剤が使用される。現在同種移植片拒絶反応の調節に使用される免疫抑制剤としては、シクロスポリンＡ、アザチオプリン、プレドニソン、又はメチルプレドニソン等のコルチコステロイド及びシクロホスファミド等がある。この中で、シクロホスファミドＡは、最も強力でよく使われる免疫抑制剤として臓器移植外科手術分野で認められており、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、１５−デオキシスペルグアリン、ミゾリビン、ミソプロストール、ＯＫＴ３、ＩＬ−２受溶体に対する抗体など、その他の免疫抑制剤も臓器移植拒絶反応の治療または予防に使われてきた（Briggs，Immunology letters Jul.29 (1-2): 89-94, 1991; FASEB 3: 3411, 1989 ）。その結果、このような免疫抑制剤は患者の生存に相当な寄与をしたけれども、これら抑制剤は免疫組織以外の組織にも抑制作用を示すため腎臓や肝臓に対する毒性等の副作用が多いという問題点を持っている。
【０００７】
移植拒絶反応で起きる免疫反応は主にＴ細胞に依存するために、Ｔ細胞の機能を抑制する医薬がより高い効能を示すことになる。シクロスポリンＡ及びＦＫ５０６はサイトカイン遺伝子の転写を抑制しＴ細胞の活性化を抑制するものであり、その作用過程は次のように要約できる。
【０００８】
シクロスポリンＡ及びＦＫ５０６は、サイクロフィリンとＦＫ５０６結合タンパク質（イムノフィリン）と同じ、免疫ピリンに結合し薬品−免疫ピリン複合体（drug-immunophilin complex ）を形成する。この複合体はカルシューム及びカルモジュリン（calmodulin）依存性セリン／スレオニン  ホスファターゼであるカルシニュ−リンに結合して、その酵素活性を阻害する。この酵素の不活性化が起きれば、細胞質にあった転写因子ＮＦ−ＡＴが核内部に転位（トランスロケーション）できなくてインターロイキン−２等のサイトカイン遺伝子が発現しない。しかし、シクロスポリンＡは有効容量で使用した時に毒性及び副作用を誘起する。ＦＫ５０６は、試験管内インターロイキン−２転写抑制と生体内移植拒絶反応の抑制において、シクロスポリンＡより１０倍ないし１００倍以上強力だが、やはり神経毒性及び腎臓毒性のような副作用を示す。
【０００９】
また別の免疫抑制剤であるラパマイシンは、インターロイキン−２に依存的なリンパ球増殖を抑制し、パラマイシン−ＦＫＢＰ複合体の細胞内標的であるｍＴＯＲは、ホスホイノシティドキナーゼ活性を持っており、サイトカインに反応するｍＴＯＲ信号伝達過程の結果で細胞周期が進行する。
【００１０】
このような上記の免疫抑制剤はすべてＴ細胞の機能に影響を与える。シクロスポリンＡとＦＫ５０６がＴ細胞の活性化段階を妨害する反面、ラパマイシンはＴ細胞の増殖段階を抑制する。しかし、これらの抑制剤の標的は、免疫組織以外の組織にも発現する。したがって、免疫細胞、特にＴ細胞から特異的に発現される標的分子を選択的に妨害する物質が理想的で、より効果的な免疫抑制剤と言えるので、現在その開発が切実に待ち望まれている。
【００１１】
移植拒絶反応だけではなく、自家免疫疾患のようなＴ細胞が媒介する免疫病理現象においても、Ｔ細胞活性化とその作用機能に対する阻害作用は、その治療剤を開発するための目的になる。抗原特異的Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞受容体（以下「ＴＣＲ」とする）が媒介する信号伝達過程によって開始されるが、上記信号伝達過程では、いろんなチロシンキナーゼまたは燐酸化タンパク質が関連しており、活性化されたＴ細胞が細胞増殖される過程は、インターロイキン−２とインターロイキン−２受容体との相互作用によって調節される。
【００１２】
一方、Ｌｃｋは、Ｔ細胞に特異的なＳｒｃ系チロシンキナーゼとして、ＴＣＲが媒介する信号伝達とＴ細胞活性化、増殖および分化において革新的役割を果たす。このようなＬｃｋの必須的な役割を遂行させるためには、Ｌｃｋのキナーゼ活性を持ったドメインだけではなく、信号伝達の標的物質とＬｃｋに存在するＳＨ２又はＳＨ３ドメインの相互作用が重要である。
【００１３】
ＳＨ２ドメインは、１００アミノ酸程度のタンパク質部位として、ホスホタイロシンを含むタンパク質の結合を通して細胞内の任意のタンパク質から他のタンパク質に信号を伝達する重要な役目をする。ＳＨ２ドメインを含むタンパク質の多くは、細胞内信号伝達体系（signal transduction system）に関与しているものと知られており、特定タンパク質のＳＨ２ドメインとその結合するタンパク質間の結合特異性は、結合部位に位置する燐酸化タイロシン、その周辺のアミノ酸の序列および構造によって決定する（Pawson，Nature，373：573-580,1995）。
【００１４】
ＳＨ２ドメインは、ＳＨ３ドメインと共にＬｃｋ調節部位の一つで、酵素が不活性化した状態ではＬｃｋタンパク質のカルボキシル基末端部位に存在する燐酸化タイロシン（ｐＹ５０５）と分子内結合を起こすことによって自家調節を受けているが、活性化した状態ではＳＨ２ドメインが露出し、露出したドメインがＴリンパ球細胞の他のタンパク質と結合し、外部刺激に対する信号を伝達する（Peri et al., Oncogene Res., 8: 2765-2772, 1993）。Ｔリンパ球の細胞の活性化において、ＬｃｋのＳＨ２ドメインの重要性に対しては、ＳＨ２ドメインと燐酸化タイロシン間との結合できない突然変異Ｌｃｋを利用したいろいろな試験を通して報告された。
【００１５】
この突然変異Ｌｃｋを持った細胞は、Ｔリンパ球細胞活性化信号によって誘導される細胞内カルシューム信号伝達、Ｔリンパ球細胞増殖に必要なインターロイキン−２合成および分泌信号伝達等が阻害されることが確認された。（Xu and Littman, Cell 74: 633-643, 1993； Straus et al., J. Biol. Chem., 2: 9976-9981, 1996； lewis et al., J. Immunol., 159: 2292-2300, 1997）。これと同じくＬｃｋのＳＨ２ドメインは、評価的なζ鎖燐酸化；Ｔ細胞活性化に誘導する細胞内部カルシュームの移動；およびＴ細胞におけるインターロイキン−２遺伝子発現などに必須的である。
【００１６】
細胞信号伝達系において、ＨＳ２ドメインが重要であるにもかかわらず、個別的なＳＨ２ドメインに対する詳しい研究はほとんどなかった。ＴＣＲの機能においてＬｃｋのようなタイロシンキナーゼの機能を明らかにし難くかった理由は、特異的な薬理学的な阻害体がなかったからである。
ハービマイシン（herbimycin）およびＰＰ１／ＰＰ２と同じような幾つかの低分子タイロシンキナーゼの阻害剤が開発されたが、これらはタイロシンキナーゼを抑制するがＴ細胞に対する特異性がなく、他の細胞にも作用するという門題点がある。
【００１７】
本発明者は、ＬｃｋがＴ細胞で特異的に発現し、ＬｃｋのＳＨ２ドメインがＴ細胞の活性化、増殖および分化に重要な役割をするという事実に着目し、そしてＬｃｋのＳＨ２ドメインの活性を選択的に阻害することによってＴ細胞に特異的に作用する免疫抑制効果を発揮する物質を開発しようと努力した結果、ロスマリン酸およびその誘導体がＬｃｋのドメインを選択的に抑制することを発見し、動物実験を通して臓器移植時免疫抑制剤として性能が優秀であることを確認して本発明を完成した。
【００１８】
このようにロスマリン酸およびその誘導体は、ＳＨ２ドメインを選択的に抑制することによって、ＳＨ２ドメインまたはその天然配位子を含んだタンパク質が信号伝達複合体として媒介する疾患、またはその病理学的症状を治療または予防するのに有用に使用でき、同時に既存の免疫抑制剤と同じ用途、つまり移植拒絶反応、自家免疫疾患、炎症性疾患等の治療または予防に効果的に使用できる。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はロスマリン酸（ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）及びロスマリン酸のイソプロピルエステル、ロスマリン酸のエチルエステル、または（Ｓ）−ロスマリン酸のビス−（第３ブチルジメチルシリル)エーテル（以下、ロスマリン酸の誘導体とする）を免疫抑制剤として使用する新規な用途及びそれらを有効成分とする医薬組成物を提供する。免疫抑制剤としての用途の他に、本発明はロスマリン酸及びその誘導体をＳＨドメインの抑制剤として使用する新規な用途及びそれらを有効成分とする医薬組成物を提供する。
【００２０】
本発明において、ロスマリン酸の誘導体は、ロスマリン酸イソプロピルエステル、ロスマリン酸エチルエステル、及び（Ｓ）−ロスマリンビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル等を含む。
【００２１】
また、本発明は夏枯草（Prunella vulbaris)抽出物を免疫抑制剤として使用するその用途を提供する。また、本発明は夏枯草抽出物をＳＨ２ドメインの阻害剤として使用するその用途を提供する。
【００２２】
本発明の免疫抑制剤は、移植された器官または組織の拒絶反応、慢性的な拒絶反応、又はＧＶＨＤの診断、予防又は治療に有用である。
【００２３】
本発明は、ロスマリン酸及びその誘導体、また夏枯草抽出物を自家免疫疾患の診断、予防または治療に使用するその用途を提供する。
【００２４】
本発明はまた、ロスマリン酸及びその誘導体又は夏枯草抽出物を亢進したＩＬ−１β、ＩＬ−４又はＩＬ−６の発現によって特徴づけられる状態を治療するその用途を提供する。
【００２５】
本発明はロスマリン酸およびその誘導体又は夏枯草抽出物を少なくても一つ以上の確立された免疫抑制剤と組み合わせて使用するその用途を提供する。
【００２６】
また、本発明は夏枯草からロスマリン酸を下記の工程によって分離する方法を提供する。
【００２７】
１）メタノールに浸漬させた夏枯草から活性物質を抽出する工程、
２）上記工程１の抽出物からエチルアセテートを用いて活性留分を抽出する工程、
３）上記工程２の抽出物をカラムクロマトグラフィーを使って、精製する工程、ここで、非活性留分をクロロホルムとメタノールとの混合溶媒で洗い、活性留分を、クロロホルム、メタノール及び水の混合溶媒で抽出する、
４）上記工程３で得られた生成物をクロマトグラフィーで精製する工程、ここで展開溶媒にはメタノールを使う、
５）上記工程４で得られた生成物をクロマトグラフィーで精製する工程、ここで、メタノールと燐酸との混合溶媒を展開溶媒として使う、
６）上記工程５で得られた生成物を高性能液状クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製する工程、ここでメタノールと燐酸との混合溶媒を展開溶媒に使う。
【００２８】
本発明の目的は、ロスマリン酸及びその誘導体を免疫抑制剤として、又はＬｃｋ  ＳＨ２ドメインの抑制剤として使用するその新規な用途を提供する。
【００２９】
本発明の他の目的は、Ｔリンパ球細胞の活性、分裂、及び分化を特異的に阻害する免疫抑制剤を提供する。
【００３０】
本発明はまたＴリンパ球細胞の活性に必要な細胞内信号伝達を抑制できるＳＨ２ドメインの抑制剤を提供する。
【００３１】
本発明はまた夏枯草からロスマリン酸を産生する効果的な方法を提供する。
【００３２】
本発明はロスマリン酸及びその誘導体を免疫抑制剤として、又はＬｃｋ  ＳＨ２ドメインの特異的な抑制剤として使用するその用途を提供する。特に、本発明は、ロスマリン酸及びその誘導体を有効成分とする、臓器または組織の移植拒否反応、慢性移植拒否反応または移植片−対−宿主疾患、または自家免疫疾患の治療、診断または予防用薬剤を提供する。
【００３３】
また、本発明は溶媒抽出法とクロマトグラフィーを使って、夏枯草からロスマリン酸を分離する方法を提供する。
【００３４】
また、本発明はロスマリン酸の誘導体を免疫抑制剤として又はＬｃｋ  ＳＨ２ドメインに対する特異的な抑制剤として使用するその用途を提供する。
【００３５】
ロスマリン酸の誘導体は、ロスマリン酸イソプロピルエステル、ロスマリン酸エチルエステル、及び（Ｓ）−ロスマリンビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル等を含む。
【００３６】
また、本発明はロスマリン酸、ロスマリン酸の誘導体又は夏枯草抽出物を有効成分として含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、免疫抑制剤又はＬｃｋＳＨ２ドメインの抑制剤、及び特に移植された組織の拒絶現象、自家免疫疾患、炎症疾患等の診断、予防及び治療に使用される。
【００３７】
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明はロスマリン酸、ロスマリン酸誘導体及び夏枯草抽出物をＬｃｋ  ＳＨ２ドメイン抑制剤及び免疫抑制剤として使用する方法を提供する。
【００３８】
本発明が提供するロスマリン酸誘導体の用途は周知の用途とは区別される。すなわち、ロスマリン酸は生体内で多様な活性を持つものとして知られており、特に、抗ウイルス活性（国際公開第９２１３５２３号公報）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）の合成に対する阻害活性（特開平７−２１５８４号公報）、５−リポキシケナーゼ活性（特開平１−１２１２１７号公報）、抗生殖線刺激ホルモン活性（ドイツ特許第３２４７６１０号公報、ドイツ特許第２９５１１４号公報、ヨーロッパ特許第３４２１４号公報、米国特許第４３２９３６１号明細書）を持つとして知られて、その他に抗酸化活性および抗細菌活性を持つとして知られている。
【００３９】
本発明で使用されるロスマリン酸及びロスマリン酸誘導体には、（Ｒ）−ロスマリン酸、（Ｓ）−ロスマリン酸、ロスマリン酸のイソプロピルエステル、ロスマリン酸のエチルエステル、ロスマリン酸のビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル等が含まれる。
【００４０】
本発明のロスマリン酸は、多年生の草本である夏枯草(Prunella  vulgaris)を含む植物の抽出物から得られる。上記ロスマリン酸は、ＬｃｋのＳＨ２のドメインとそれに特異的に結合するペプチドを利用してこれらの相互作用を阻害する物質をスクリーニングすることによって探索された。
【００４１】
望ましい実施態様として、夏枯草からロスマリン酸を精製する方法は下記の工程から成る。
１）メタノールに浸漬させ、夏枯草から活性物質を抽出する工程、
２）上記工程１の抽出物からエチルアセテートを用いて活性部分を抽出する工程、
３）上記工程２の抽出物をカラムクロマトグラフィーを使って、溶出する工程、ここで、非活性部分をクロロホルムとメタノールから成る溶媒で洗い、活性部分をクロロホルム、メタノール及び水から成る溶媒で抽出する工程、
４）上記工程３から得られた生成物をクロマトグラフィーで溶出する工程、ここで、展開溶媒にはメタノールを使う、
５）上記工程４から得られた生成物をクロマトグラフィーで溶出する工程、ここで、メタノールと燐酸からなる溶媒を展開溶媒として使う、
６）上記過程５から得られた生成物を高性能液状クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で溶出する工程、ここで、メタノールと燐酸から成る溶媒を展開溶媒として使う。
【００４２】
さらにまた、本発明では多様なロスマリン酸の誘導体を提供するが、ロスマリン酸のイソプロピルエステル、ロスマリン酸のエチルエステルおよび（Ｓ）−ロスマリン酸のビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル等を含み、上記誘導体はロスマリン酸又はタイロシン及びカフェイン酸等から合成することができ、さらに多くの誘導体が上記の誘導体から容易に合成することができる。
【００４３】
本発明のロスマリン酸およびその誘導体は、Ｌｃｋ  ＳＨ２ドメインとそれに特異的に結合するペプチド間の試験管内結合を阻害する（図１参照）。より詳しくは、ロスマリン酸およびその誘導体は、ＧＳＴと融合したＬｃｋ  ＳＨ２ドメインを選択的に阻害し、一つ以上のＳＨ２ドメインと自然的配位子を含む蛋白質の信号伝達複合体の形成を妨げたり不安定にするために、上記の信号伝達複合体が媒介する疾患の予防又は治療のためにロスマリン酸およびその誘導体が有用に使用できる。
【００４４】
本発明の係わるロスマリン酸およびその誘導体は、免疫反応で惹起されるＴ細胞内部のカルシウム伝達過程に影響を与える（図２参照）。Ｔリンパ球の表面抗原（ｓＩｇ）であるＣＤ３とＣＤ４に対する抗体を処理すれば、細胞内カルシュームイオンの増加とＴリンパ球の活性化が起き、こような一連の過程中にＬｃｋが関連していることが知られている。ＣＤ３とＣＤ４に対する抗体処理による細胞内カルシウムイオンの増加は、ロスマリン酸およびその誘導体により阻害され、ロスマリン酸およびその誘導体は、ＳＨ２ドメインの結合を阻害し、その結果起こるＴリンパ球の活性化を抑制できる。
【００４５】
本発明のロスマリン酸およびその誘導体は、細胞内ＩＬ−２遺伝子発現を抑制する。本発明では、ＩＬ−２遺伝子発現水準に関するロスマリン酸およびその誘導体の効果を知るためにＩＬ−２／ルシペラーゼ  リポートシステムを利用する。ＩＬ−２合成および分離はＴ細胞増殖を惹起し、ＩＬ−２合成および分離を抑制するロスマリン酸及びその誘導体はＴ細胞増殖を抑制できる。
【００４６】
上記の結果を根拠として、ロスマリン酸およびその誘導体は、Ｌｃｋ  ＳＨ２ドメイン、Ｓｒｃ系蛋白質タイロシンキナーゼのＳＨ２ドメイン又は多様なサイトカインの合成を阻害するだけではなく、これらを媒介とする免疫反応および疾患等を抑制するのに有意義に用いられる。
【００４７】
また、本発明のロスマリン酸およびその誘導体は、試験管内免疫反応および生体内免疫反応を阻害する（図５および図６参照）。本発明では、混合リンパ球反応試験およびＤＮＦＢ（２，４−ジニトロフルオロベンゼン）接触に対する過敏反応を遂行し、ロスマリン酸およびその誘導体がＴ細胞増殖および免疫反応を抑制する能力があることを立証する。
【００４８】
本発明のロスマリン酸およびその誘導体は、動物における同種移植拒絶反応を制御する（図１参照）。本発明では、上記抑制効果は、移植皮膚の生存時間を測定する生体内標準薬理テスト過程で確認した。
【００４９】
本発明のロスマリン酸は、移植組織においてのサイトカイン遺伝子の発現を抑制する。移植組織においては、高い水準でサイトカイン遺伝子が発現するために、本発明では、サイトカイン遺伝子発現に対するロスマリン酸の制御効果をＲＴ−ＰＣＲ法で調査して、ロスマリン酸およびその誘導体が免疫抑制治療に使用でき、上記サイトカインが増加することにより誘発されるその他の疾患にも使用できることを確認した。
【００５０】
上記の結果を総合してみると、ロスマリン酸およびその誘導体は、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、および皮膚移植等の移植拒絶症状；狼瘡、リューマチ性関節炎，胆嚢病、重傷筋無力症、多発性硬化症、乾癬のような自家免疫疾患；皮膚炎、湿疹、脂漏、炎症性腸疾患のような炎症性疾患；及び真菌感染等の治療に有用である。
【００５１】
また、本発明では、上記ロスマリン酸、ロスマリン酸誘導体および夏枯草抽出物を有効成分とする医薬組成物を提供する。
本発明が提供する医薬組成物は、免疫制御療法に利用され、特に、移植拒絶症状、自家免疫疾患および、炎症性疾患のための治療法に利用され得る。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、臓器移植拒絶反応、慢性移植拒絶反応、自家免疫疾患及び慢性炎症性疾患の治療または予防に使用でき、具体的には、哺乳類のＧＶＨＤ、狼瘡、リューマチ性関節炎，胆嚢病、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏、炎症性腸疾患、クローン病、元発性胆汁性肝硬変（primary bikiarycirrhosis）等の診断、予防および治療に利用できる。
【００５３】
その他にも、Ｓｒｃ系蛋白質タイロシンキナーゼのＳＨ２ドメインが媒介する細胞機能を阻害する用途にも、本発明の医薬組成物を使用できる。上記Ｓｒｃ系蛋白質タイロシンキナーゼは、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｌｙｎ及びＢｌｋを含む。
【００５４】
上記の医薬組成物は、ロスマリン酸またはその誘導体以外に製薬的に許容し得る担体を含むことができ、必要に応じて多様な免疫抑制剤と組み合わせて調剤できる。本発明の医薬組成物と組み合わせて使用できる免疫抑制剤としては、シクロスポリンＡ，ＦＫ５０６、コルチコステロイド、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ラパマイシン、１５−デオキシスペルグアリン、ミゾリビン、レフルノミド、ＯＫＴ３，ＩＬ−２受容体に対する抗体、ミソプロストール、メトツレッセイト、シクロホスフェミド及び抗リンパ球／胸腺細胞血清、ブレニソン又はメチルブレニソンのようなコルチコステロイドからなる群から選択される一つ以上の物質を利用できる。このような二つ以上の免疫抑制剤を利用して調剤された組成物は、ロスマリン酸又はその他の免疫抑制剤を各々単独で投与した時の薬理的効果の組合せよりもさらに高い免疫抑制活性を相乗的に持つだけでなく、毒性や副作用を低く誘発しつつその免疫抑制活性を持つ。
【００５５】
移植拒絶反応に対する治療に使用される場合、本発明の医薬組成物は、同種移植または異種移植の拒絶反応を治療したり，ＧＶＨＤが惹起する合併症を治療するのに使用されるが、上記移植拒絶反応の治療に使用される医薬組成物はロスマリン酸及びシクロスポリンＡを含む。
【００５６】
また、上記医薬組成物はビステロイド抗炎症剤を含むことができるが、ビステロイド抗炎症剤は、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、ジクロフェナク、スリンダク、ピロキシカム、エトドラク、ケトプロフェン、メクロフェナメイト、スプロフェン及びテルメチンからなる群から選択され、哺乳類の器官移植拒絶反応、ＧＶＨＤ，乾癬、自家免疫疾患および慢性炎症疾患を治療したり、予防したりするために、上記ロスマリン酸および誘導体と上記ビステロイド抗炎症剤を組合わせて投与できる。
【００５７】
ロスマリン酸、ロスマリン酸誘導体および夏枯草抽出物は、経口、静脈内、皮下、鼻腔内、気管支内又は直腸に投与するために医薬賦形剤又は稀釈剤で調剤できる。医薬組成物は希望する投与形態によって、適当な固体や液体状の賦形剤、稀釈剤、又は添加剤を用いる典型的な方法で調剤できる。
【００５８】
経口用には、本発明に係わる化合物は錠剤、カプセル、顆粒、粉末の形態で投与できる。また、本発明に係わる化合物は、口腔での生物学的利用能を向上させるために、ナトリウムラウリルサルフェート又は他の製薬的に許容可能な洗浄剤と共に使用できる。
【００５９】
ロスマリン酸およびその誘導体は約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇの容量で投与でき、望ましくは０．１〜５００ｍｇ／ｋｇであり、１日に０．５〜３回投与できる。
【００６０】
以下、ロスマリン酸およびロスマリン酸誘導体の製造方法を実施例に基づいて説明する。
ただし、下記の実施例は本発明の例示をするだけであり、本発明の範囲が実施例によって限定されるものではない。
【００６１】
【実施例】
〈実施例１〉Ｌｃｋ  ＳＨ２ドメインに対する結合阻害物質の探索。
本発明では、ＬｃｋのＳＨ２ドメインと特異的結合を制御する物質をスクリーニングするためのシステムを開発した。上記スクリーニングシステムでＬｃｋＳＨ２ドメインは、ＧＳＴと融合して発現し、この時ＧＳＴは、アミド結合を通して９６−ウェル  マイクロタイトプレートに共有的に固定された。Ｌｃｋ  ＳＨ２ドメインに非常に高い親和力がある配位子として知られているビオチン化ホスホタイロシン（biotinylated  pY）を含有した合成ペプチド（biotin−SGSGEEPQpYEEIPI)（Kim, J. et al., Journal of Biochemistry and Molecular Biology 31: 370-376, 1998)を９６−ウェル  マイクロタイトプレートに加えると合成ペプチドは、上記固定された融合蛋白質と連続的に結合した。
【００６２】
精製された１μＭ濃度のグルタチオン−Ｓ−転移酵素（以下、ＧＳＴとする）−Ｌｃｋ  ＳＨ２部位の蛋白質を常温で２時間反応させ９６−ウェル  マイクロタイトプレートに付着させた。そこに１μＭのビオチン-SGSGEEPQpYEEIPIペプチド及び各種のストレプトマイセス属の微生物、真菌及び薬草を含む数千に及ぶ天然物質中の一つを混合して反応させ、試料がペプチドとＧＳＴ−Ｌｃｋ  ＳＨ２との結合を競争的に阻害できるように常温でさらに２時間放置した。その次に過酸化酵素が付着したストレプトアビディン（Streptavidin, Pierce社  製品、米国）を添加して反応させた後，洗浄して、ビオチン−ペプチドと結合して残っている過酸化酵素の活性を発色反応を利用して測定した。換言すると、３，３，５，５−テトラメチルベンジジンを基質に添加し３０分間反応させた後、０．８Ｎ硫酸で酵素活性を停止させ４５０ｎｍで吸光度を測定することにより、ＳＨ２ドメインとホスホタイロシンを含むペプチドの結合を定量した。
【００６３】
発色反応が阻害された試料中、各天然物抽出液内の阻害物質の存在を探索した結果、最も阻害活性が高く再現性を見せた夏枯草（Prunella vulgaris)抽出物を選定した。
【００６４】
〈実施例２〉夏枯草抽出液からロスマリン酸の分離及び精製。
市販の乾燥させた夏枯草６００ｇを購入し、メタノール１０〜２０Ｌに浸漬させて、常温で３〜５日間放置して活性物質を抽出した。メタノール抽出物を減圧乾燥して蒸留水に懸濁した後、エチルアセテートで溶媒抽出してＬｃｋのＳＨ２ドメインに対する結合阻害活性が最も高いエチルアセテート部分を得た。
得られたエチルアセテート部分を減圧濃縮後、クロロホルムとメタノール２０：１混合液の少量に溶かしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。クロロホルムとメタノールの２０：１混合液でＬｃｋのＳＨ２ドメインに対する結合阻害活性が無い部分を溶出除去後、クロロホルム、メタノール及び蒸留水の２０：１０：１〜１０：５：１混合液を展開溶媒として使用してＬｃｋのｓｈ２ドメインに対する結合阻害物質を溶出した。
【００６５】
得られた活性部分を減圧濃縮し少量のメタノールに溶かして、メタノール展開溶媒にしてセファデックスＬＨ−２０（シグマ社製品）カラムクロマトグラフィーを実施した。
【００６６】
ここで得られたＳＨ２ドメインに対する結合阻害活性を示す部分は、２０％メタノールと１％燐酸混合液を展開溶媒とし、逆相低圧（Ｌｏｂａｒ，マーク社製品）クロマトグラフィーに付し、得られた活性留分を集め、ダイアイオン（Diaion）ＨＰ−２０に吸着させ１００％メタノールで活性物質を溶出した。
【００６７】
溶出された活性留分を４５％メタノール：０．５％燐酸混合液を展開溶媒にして、カラムでＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８（内径２ｃｍ×外形１５ｃｍ）を使用して流速４ｍｌ／分、ＵＶ  ２５４ｎｍの分離条件で高性能液状クロマトグラフィー（ＨＰＬＡＣ）に付し、結合阻害活性を示す溶出時間２２分のピークだけを集め、集めた活性留分をダイアイオンＨＰ−２０に吸着させ１００％メタノールで溶出し、ＬｃｋのＳＨ２ドメイン結合阻害物質を５０ｍｇ得た。
【００６８】
得られた物質の物理化学的特性を次に示す。
１）外観：薄い黄緑色液状
２）紫外線（UV）−分光光度スペクトル、λmax （nm）： 210, 220, 230(s),250(s), 285, 340（中性または酸性メタノール), 208, 225, 250-260, 300-310,370 （塩基性メタノール）
３）紫外線(IR)−分光光度  スペクトルνmax  (cm -1, KBr) ：3300（ヒドロキシル) 、1700（カボニル), 1600, 1500, 1450 （芳香族）
４）質量スペクトル： m/z 361 [M+H]
【００６９】
【表１】
0003827948.tif 000002
【００７０】
【化１】
0003827948.tif 000003
【００７１】
結果的に確認された純粋分離精製物質は、ロスマリン酸であることが分かった。
【００７２】
〈実施例３〉ロスマリン酸のイソプロピルエステル。
ロスマリン酸（75mg, 0.21mmol) をＤＭＦ４ｍＬに溶かして、イソプロピルアルコール（33mg, 0.26mmol) Ｏ−ベンゾトリアゾール−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU,  75mg,  0.23mmol）を添加し、窒素気流下、室温で攪拌した後、メチルベンゼンアミン（34mg、0.28mmol）を添加して室温で２４時間攪拌した。この反応液をエチルアセテート５０ｍｌで稀釈後、炭酸水素ナトリウム溶液（3  x  20ml）、１０％塩酸で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し減圧濃縮後、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（溶離システム、n-ヘキサン：酢酸エチル８５：１５〜６：４）に付して、黄色い固体を得た（79mg、82%)。
【００７３】
【化２】
0003827948.tif 000004
【００７４】
〈実施例４〉ロスマリン酸のエチルエステル。
ロスマリン酸（75mg、0.21mmol）をエタノールに溶かして、２４時間加熱還流した。この溶液をエチルアセテート５０ｍｌで稀釈後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（3  x  20ml）、１０％塩酸で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮後、残渣をフラシュクロマトグラフィー（溶離システム、n-ヘキサン：酢酸エチル８５：１５〜６：４）に付して、白色固体を得た（79mg、82%)。
【００７５】
【化３】
0003827948.tif 000005
【００７６】
〈実施例５〉（Ｓ）−ロスマリン酸のビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル。
（工程１）ヒドロキシフェニル  アラニン塩酸塩のアセチル化
Ｓ−タイロシン（１．４５ｇ、８ｍｍｏｌ)を前もって蒸留したニトログリセリンに溶かして、次に塩化アルミニウム（４．２４ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下して攪拌し、それにアセチルクロライド（０．７８ｍｌ、１１ｍｍｏｌ) を添加し、６時間加熱還流した。反応液に氷を含んだ濃塩酸を加えて、８０ｍｌの酢酸エチルを添加後、有機層を分離して、減圧濃縮した。固体の表題化合物を５Ｍ塩酸溶液で再結晶させた。
【００７７】
【表２】
0003827948.tif 000006
【００７８】
【式１】
0003827948.tif 000007
【００７９】
（工程２）アセチル  ヒドロキシフェニール  乳酸
上記（工程１）で合成された化合物（1.0g、3.5mmol)を２０ｍｌの水に溶かし、氷の水槽で冷却した。これをアジル酸ナトリウム（0.4g、5.8mmol)を１２ｍｌの水に溶かした溶液にゆっくり滴下して攪拌した。その溶液を２０時間室温で攪拌し、硫酸アンモニウム（204mgl, 1.54mmol）を添加し、１時間攪拌した。これを酢酸エチルで抽出し、有機層を分離後硫酸マグネシウムで乾燥させて減圧濃縮し、過剰溶媒を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（溶離システム、n-ヘキサン：酢酸エチル８５：１５〜６：４）に付して、表題の化合物である黄色オイルを得た（0.7mg 、81% ) 。
【００８０】
【表３】
0003827948.tif 000008
【００８１】
【式２】
0003827948.tif 000009
【００８２】
（工程３）３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−（Ｓ）−乳酸
上記（工程２）で合成した化合物（1.0g、4.5mmol ) を水酸化ナトリウム溶液（0.64g 、16 mmol ）を含んだ３０％過酸化水素溶液に添加し１２時間攪拌した。その反応液を濃塩酸１ｍｌで酸性化し、酢酸エチルで抽出し、分離した有機層を硫酸マグネシウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をフラシュクロマトグラフィーに付して、黄色固体を得た（0.55mg、61%)。
【００８３】
【表４】
0003827948.tif 000010
【００８４】
【式３】
0003827948.tif 000011
【００８５】
（工程４）３−（３’，４’−ジヒドロキシフェニル）−（Ｓ）−乳酸のジアリルエーテル  アリルエステルの合成
上記（工程３）で合成された化合物（940mg 、4.7mmol)をアセトン１４ｍｌに溶解後、アリルブロマイド（7ml 、80mmol）と炭酸カルシウム（1.97g 、14.3mmol）を添加し、シリコン−油浴下で２２時間加熱還流した。濾過して得た不溶性塩を塩化メチルで溶かして水（10ml）で洗浄後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィーにふして、無色固体を得た（640mg 、42%)。
【００８６】
【表５】
0003827948.tif 000012
【００８７】
【式４】
0003827948.tif 000013
【００８８】
（工程５）カフェー酸のビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテルの合成
カフェー酸（4g,  22.2mmol)を塩化メチルに溶かし、テトラブチルジメチルシリルトリフレート（24ml, 100mmol ）とトリエチルアミン（20.5ml, 147mmol ）を添加し、１７時間攪拌した。この反応液を１０％塩酸溶液（2 x 20ml) 、水（2 x 20ml）で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラシュクロマトグラフィーに付して、精製した無色の固体を得た（2.15mg、86%)。この無色の固体をメタノール、水１：１の２００ｍｌの溶液に溶かした後、炭酸カルシウム（1.8g、11mmol）を添加し、常温で６時間攪拌した。反応物を濾過後、溶媒を除去し、少量の塩酸を加えて酸性化させた後、酢酸エチル（100ml)に溶かした後、水（20ml X 3）で洗浄後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥して濃縮した。残渣をフラシュクロマトグラフィーに付して、無色固体を得た。
【００８９】
【式５】
0003827948.tif 000014
【００９０】
（工程６）カフェー酸のビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテルと３−（３’，４’−ジヒドロキシフェニル）−（Ｓ）−乳酸の反応
【００９１】
上記（工程５）で得ら精製されたカフェー酸のビス（第三ブチルジメチルシリルトリフレート）エーテル（４．３１ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を塩化チオニル（２．４ｍｌ、３３ｍｍｏｌ）と四塩化炭素を溶媒にして反応させて過剰な溶媒を除去した後、上記（工程４）で合成された化合物（２．４ｍｌ、６．０ｍｍｏｌ)を添加し、塩化メチルを溶媒にして攪拌して、トリエチルアミン（５．９ｍｌ、４２ｍｍｏｌ）を加えて、窒素気流下で、４時間攪拌した。この反応溶液を１０％塩酸溶液と飽和−塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、有機層を分離し硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）に付して、明るい黄色の固体（４．６ｇ，９０％)を得た。
【００９２】
【式６】
0003827948.tif 000015
【００９３】
（工程７）（Ｓ）−ロスマリニルビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル。
上記（工程６）で合成された固体（600mg, 1.2mmol) を３０ｍｌのエタノール：ベンゼン：水（7:3:1, v/v) の混合溶液に溶かして、トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）クロライド（700ml, 0.757mmol）を添加し、加熱還流した。過剰の溶媒を除去して４０ｍｌの酢酸エチルに溶解した。有機層を４０ｍｌの飽和−塩化ナトリウム溶液（3 ｘ 20ml ）、１０％塩酸で洗浄後、有機層を分離し硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラシュクロマトグラフィー（溶離システム、n-ヘキサン：酢酸エチル８５：１５〜６：４）して、無色の固体（120mg、29%)を得た。
【００９４】
【式７】
0003827948.tif 000016
【００９５】
【表６】
0003827948.tif 000017
【００９６】
〈実施例６〉（Ｓ）−ロズマリン酸の合成
上記実施例５で得られた精製された固体（4.23g 、5.97mmol）を、窒素気流下で、テトラヒドロフラン(THF）に溶かして、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド(THF中で 1.0 M、12ml, 12mmol）を添加して、１５分間攪拌した。この反応溶液を水で洗浄後、酢酸エチルで抽出し、有機層を分離し硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラシュクロマトグラフィーに付して、表題の化合物として黄色オイルを得た（1.47g 、51% ）。
【００９７】
【式８】
0003827948.tif 000018
【００９８】
【表７】
0003827948.tif 000019
【００９９】
以下、ロスマリン酸及びロスマリン酸誘導体のＬｃｋ  ＳＨ２ドメイン活性抑制剤又は、免疫抑制剤としての効果を実施例によって詳しく説明する。
ただし、下記の実施例は本発明の例示をするだけであり、本発明を限定するものではない。
【０１００】
〈実施例７〉Ｌｃｋ  ＳＨ２ドメインと特異的ホスホチロシルペプチドとの間の試験管内結合対する阻害効果
本発明は、ロスマリン酸及びその誘導体がＬｃｋの  ｓｈ２ドメインに結合する活性を持っているかどうかを調査するために、実施例１の試験管内結合分析システムを利用した。
【０１０１】
ロスマリン酸及びその誘導体の阻害効果を知るために多様な濃度のロスマリン酸及びその誘導体をホスホペプチド溶液と混合し、蛋白質でコーティングしたミクロ−ウェルに加えた。ビオチン化ｐＹペプチドの結合を確認するために、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼを使用した。つまり、ロスマリン酸及びその誘導体を０．０３〜３００μｇ／ｍｌ濃度範囲で上記実施例１の方法によってＬｃｋのＳＨ２ドメインとビオチン−ペプチドとの結合に対する阻害活性を測定した。
【０１０２】
図１の結果から本発明の夏枯草から分離したロスマリン酸を処理することによって、ＬｃｋのＳＨ２ドメインとビオチン−ペプチドとの結合が濃度依存的に阻害され、５０％阻害濃度（ＩＣ50）値は、３μg/mlであることが分かった。
【０１０３】
一方、ロスマリン酸のイソプロピルエステル、エチルエステル、ビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル等のロスマリン酸の誘導体と（Ｓ）−ロスマリン酸を利用して、同一の方法で試験したときにも、上記誘導体と（Ｓ）−ロスマリン酸は、ＬｃｋのＳＨ２ドメインとその特異的ペプチド間の結合を阻害する効果を示し、５０％阻害濃度は、それぞれ１、４、１３、１０μｇ／ｍｌであった。
【０１０４】
したがって、ロスマリン酸及びその誘導体は、生物学的研究に有用な物質である。例えば、これらは当業者が関心をもつ特異的な信号伝達経路を遮断したり、分離できる。ロスマリン酸及びその誘導体は、一つまたはそれ以上のＳＨ２ドメインがそれらの自然の配位子を含む蛋白質によって形成される信号伝達複合体が安定化したり又は形成されるのを阻害し、したがって、このような複合体によって媒介される病理学的疾病を防止したり治療したりするのに使用できる。
【０１０５】
〈実施例８〉Ｔ細胞増殖を起こす信号伝達系に対する抑制効果
夏枯草から分離されたロスマリン酸及びその誘導体がＬｃｋ  ＳＨ２ドメインに対する結合を阻害することによって、上記阻害効果がＴ細胞内のカルシウムイオンの流れに対して与える影響を調べてみた。
【０１０６】
抗原特異的Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が媒介する信号伝達過程によって開始されるが、上記信号伝達過程では、種々のチロシンキナーゼ又は燐酸化タンパク質が関連しており、活性化されたＴ細胞が細胞増殖に至る過程は、ＩＬ−２とＩＬ−２受容体の相互作用によって調節される。すなわち、Ｔリンパ球の表面抗原（ｓＩｇ）であるＣＤ３とＣＤ４に対する抗体を処理すれば、活性化刺激に適用され、Ｔリンパ球が活性化され、この時、細胞内のカルシウムイオンが増加することが知られている。
【０１０７】
また、このような一連の過程中にＬｃｋが関連していることが知られていて、ロスマリン酸及びその誘導体が、Ｔリンパ球活性化による細胞内のカルシウムイオン量の増加を阻害するかどうかを調べてみた。
【０１０８】
細胞内のカルシウイオンと結合して、蛍光を出す物質であるＦｕｒａ−２／ＡＭ（Calbiochem, San , Diego, CA, USA）を処理したＪＵＲＫＡＴ細胞に上記の実施例８にしたがって、夏枯草から分離したロスマリン酸を１０分処理した後、そこにＣＤ３とＣＤ４抗体を処理しながら細胞内カルシウイオンの増加を、放出された蛍光量から探知した。その時ロスマリン酸を処理しなかったものを対照群として、ロスマリン酸の処理量を各々０．５μｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇにして細胞内カルシウムイオンの増加を測定し、その結果を図２に示した。
【０１０９】
図２から本発明にしたがって、夏枯草から分離したロスマリン酸を処理した場合、濃度依存的に細胞内カルシウムイオンの流れに対する阻害活性を示すことが分かった。
【０１１０】
〈実施例９〉ＴＣＲが誘導するＩＬ−２遺伝子発現に対する抑制効果
上記のようにロスマリン酸及びその誘導体が選択的にＬｃｋ機能を阻害することによって、本発明の化合物がＴ細胞増殖を進行させるＩＬ−２合成を抑制するかどうか調べることになった。本発明では、ＩＬ−２遺伝子発現水準に関するロスマリン酸及びその誘導体の評価を知るために、ＩＬ−２／ルシフェラーゼリポターシステムを利用した。
【０１１１】
ＩＬ−２のプロモーター範囲とルシフェラーゼの構成遺伝子範囲を融合したプラスミドに１０6 ＪＵＲＫＡＴ  Ｔ細胞を、スパーフェクト（Superfect TM)(Qiagen Inc.)を利用したリポータープラスミドにトランスペクションさせた。２４時間培養後Ｔ細胞を活性化させる前、多様な試薬（ロスマリン酸、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＬＹ２９４００２；各々８μＭずつ処理）で３０分間処理した。５μｇ／ｍｌ抗−ＣＤ３抗体(UCHT1、Pharmingen）及び／又は抗−ＣＤ４抗体(RPA-T4 、Pharmingen）を塗布した３５ｍｍ皿で１４時間培養し収穫するためにｔ細胞を活性化させた。ＰＭＡとイオノマイシン刺激のために、ＰＭＡ５ｎｇ／ｍｌと５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンを培養細胞に添加し、１４時間培養した。ルシフェラーゼ活性は、ベルソルド発光測定器（luminometer)ＬＢ９５３で測定し、各試験を重複して３回行って決定した。
【０１１２】
ロスマリン酸はシクロスポリンＡやＦＫ５０６よりＩＬ−２合成に対する抑制活性が優秀だった（図３参照）。一方、ロスマリン酸のイソプロピルエステル、エチルエステル、ビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル等のロスマリン酸の誘導体と（Ｓ）−ロスマリン酸を利用して、同一の方法でルシフェラーゼ活性を調査した結果、ロスマリン酸と比較する時、全部が類似の阻害活性を示した（図４参照）。このように、ロスマリン酸およびその誘導体がＴ細胞活性を効果的に抑制することによって、移植拒絶症状とＧＶＨＤだけでなく、自家免疫疾患や慢性炎症性疾患のようなＴ細胞媒介性反応に関連した病気を予防したり治療するのにロスマリン酸及びその誘導体が利用できる。
【０１１３】
〈実施例１０〉Ｔ細胞増殖に対する抑制効果
Ｌｃｋは、Ｔ細胞活性化及び増殖を起こすＴ細胞特異的チロシンキナーゼであるため、本発明ではロスマリン酸及びその誘導体のＴ細胞増殖に対する抑制活性を試験してみた。下記に説明する混合リンパ球反応（以下「ＭＬＲ」とする）試験により本発明の化合物免疫細胞反応を抑制する能力があることが分かる。ＭＬＲは移植者と被移植者間の移植適合性を検定する時に利用される反応で（Park and  Good, 71頁，移植組織適合検査と器官移植，1973，アカデミックプレス Inc., NY ) 、お互いに異なった二種または系列の生体から分離したリンパ球を混合し免疫反応を惹起させた後、これらの細胞成長速度を測定し免疫反応の活性程度を示す。
【０１１４】
Ｂａｌｂ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスから分離した脾臓細胞(1×105 splenocytes/well）を混合し、加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。五日目に、［メチル− 3Ｈ］−チミジン(0.5μCi／ウェル) を培養細胞に添加し、次の日培養細胞中への混合量を測定した。上記した工程の間、シクロスポリンＡ、ロスマリン酸、（Ｓ）−ロスマリン酸又はロスマリン酸の誘導体で処理した。
【０１１５】
本発明で利用するロスマリン酸は、投与量に比例してＴ細胞増殖を１０-1〜１０００ｎＭ範囲で抑制した（図５参照）。
【０１１６】
ロスマリン酸のイソプロピルエステル、エチルエステル、ビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル等のロスマリン酸の誘導体と（Ｓ）−ロスマリン酸の場合にも１ｎＭからＴ細胞増殖を抑制した。
【０１１７】
ＭＬＲは、試験管内（インビトロ）免疫反応であり、ロスマリン酸及びその誘導体によりＭＬＲ免疫反応が抑制されたということは、ロスマリン酸及びその誘導体が生体内（インビボ）でも免疫抑制活性があることを暗示するものであるので、本発明の化合物は、臓器移植拒絶症状とＧＶＨＤを防止するのに効果的である。したがって、ロスマリン酸及びその誘導体は上記疾患を治療するのに効能がある。
【０１１８】
〈実施例１１〉生体内免疫反応に対する抑制効果
ロスマリン酸及びその誘導体が、生体内免疫抑制活性を持っているという事実を明らかにするために、ＤＮＦＢ（２，４−ジニトロフルオロベンゼン）接触に対する過敏反応を実施した。動物を利用した接触敏感反応モデルは、抗炎症剤の薬学的スクリーニングや自家免疫疾患の治療のためにいくつかの実験室で日常的に行われている。
【０１１９】
接触感受性反応の感作および誘導は、スキーニアス（Scheynius)等の方法で行われる（Scheynius et al., 1804, JI）。その手順を下記に示す。８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マウスの腹部皮膚から毛を除いた後、４：１アセトン：オリーブ油（シグマ化学）に溶かした２０μＬ０．５％ＤＮＦＢ（シグマ化学）を２日間にかけて皮膚に塗って、４日後、同じ賦形剤に溶かした１０μＬ０．２％ＤＮＦＢをマウスの両方の耳の両面に投与した。シクロスポリンＡとロスマリン酸を５日間表示された量、筋肉に投与して、２４時間後に耳の厚みを工学用マイクロメータ（ミツトヨ Co. Mfg. Ltd., 東京）で測定した。耳のむくれあがりの抑制度で、ロスマリン酸とシクロスポリンＡの免疫抑制活性を推定した。
【０１２０】
誘導段階６日間連続的にロスマリン酸（５−５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を処理すると、ＤＮＦＢによる接触敏感性が抑制された。シクロスポリンＡもまた反応の抑制効果を示した（図６参照）。ロスマリン酸のイソプロピルエステル、エチルエステル、ビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル等のロスマリン酸の誘導体と（Ｓ）−ロスマリン酸で接続敏感性の抑制反応を実施した場合にも、その投与量に比例して抑制効果が見られた。結果的にロスマリン酸及びその誘導体は、生体内でヘルパーＴ細胞の機能と記憶Ｔ細胞形成を抑制できる。
【０１２１】
上記標準薬理学試験の結果をもとに、本発明の化合物は、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、及び皮膚移植等の移植拒絶症状；狼瘡、リューマチ性関節炎，胆嚢病、重傷筋無力症、多発性硬化症、乾癬のような自家免疫疾患；皮膚炎、湿疹、脂漏、炎症性腸疾患のような炎症性疾患；及び真菌感染等の治療に有用である。
【０１２２】
〈実施例１２〉移植拒否反応に対する抑制効果
免疫抑制を惹起するロスマリン酸及びその誘導体の効能は、移植皮膚の生存時間を測定する生体内標準薬理テスト過程で確認できる。
【０１２３】
同種移植拒絶反応は、同種異系Ｃ５７ＢＬ／６（２Ｈ−２ｂ）マウスの尾をＢａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）に移植して行った。ロスマリン酸及びその誘導体は、移植した日から拒絶する日まで筋肉内(i.m) 投薬し、シクロスポリンＡは、試験対照群に利用し、処理しなかった鼠は、拒絶対照群に用いた。尾の皮膚を、２．０×２．０ｃｍの大きさに切断し被移植マウスの胸側面に移植し殺菌した殺菌用ガーゼで覆った。その後胸全体を柔らかい包帯で巻いておいた。ロスマリン酸、その誘導体(15mg/kg/day) 又はシクロスポリンＡ(50mg/kg/day) をリポソマール剤の形態で筋肉内に投与し、毎日被移植マウスに拒絶前まで投与した。６日目に包帯を除去後、皮膚移植組織を毎日観察した。拒絶反応の定義は、移植された上皮組織の９０％以上が壊死したものとした。
【０１２４】
図１から分かるように賦形剤処理だけした対照群からは、同種移植拒絶反応が７日目に始まり９日目には同種移植組織の約５０％が拒絶した。１５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ量のロスマリン酸及びその誘導体は、皮膚移植生存を相当に延長させる効果を示した。平均生存期間は、対照群は９．６日だったが、１５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ量のロスマリン酸を処理した試験群は、１４．０日であった（ｐ〈０．０１）。このシステムで５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ量のシクロスポリンＡもまた上記した結果と類似して効果的だった（平均生存期間１３．４日）。
【０１２５】
上記、生体内標準薬学的テストの結果によれば、ロスマリン酸及びその誘導体処理は、免疫抑制を惹起し皮膚移植拒絶を防止する。
【０１２６】
また、本発明で利用するロスマリン酸は、シクロスポリンＡと一緒に使用すれば、生体内皮膚移植拒絶を防止するのにさらに効果的であった。このように、ロスマリン酸をシクロスポリンＡと一緒に使用し投与量を減らせば、免疫抑制療法において副作用を防ぐことができる。
【０１２７】
【表８】
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【０１２８】
〈実施例１３〉移植された組織におけるサイトカイン遺伝子発現抑制
本発明の一つ重要な観点によれば、ロスマリン酸は同種移植された組織で多く発現するサイトカイン遺伝子を抑制する能力を持っているいうことが明らかにされた。免疫抑制治療またはサイトカインの増加によって生じる他の疾病を治療する用途のために、この発見の及ぼす影響をこの実施例で論議する。
【０１２９】
ロスマリン酸がサイトカインの生産を抑制する能力は、ＲＴ−ＰＣＲを利用して調査した。Ｃ５７ＢＬ／６種のドナーから移植されたＢａｌｂ／ｃ被移植マウス（レシピエント）は、下被膜腎臓(subcapsular kidney)移植後７日目に犠牲にした。同種移植された腎臓を取り出して細胞全体のＲＮＡを抽出して、多様なサイトカインｍＲＮＡの発現を分析した。半定量的なＰＣＲ法を使って、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現程度を分析した。
【０１３０】
発明者は７日間筋肉内注射で注入したロスマリン酸（１日容量；25mg/kg/day)とシクロスポリンＡ（１日容量；50mg/kg/day)の効果を決定した。サイトカイン測定に使用したＲＴ−ＰＣＲ結果からロスマリン酸は、同種移植された組織で、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６及びＩＬ−１βのｍＲＮＡの転写を顕著に阻害した反面、シクロスポリンＡは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１βの発現を阻害した。ＰＣＲ生成物のサイトカイン数値は、対照群に使用したβ−アクチンｍＲＮＡで標準化した。ＩＬ−４とＩＬ−６は、ロスマリン酸によっては有意義な減少を示したが、シクロスポリンＡによっては減少しなかった。これは、ロスマリン酸は、Ｔｈ１とＴｈ２サイトカインの発現を両方抑制し、シクロスポリンＡよりさらに強力なＩＬ−２とＩＬ−１βに対する抑制活性が見られる。このような結果は、ロスマリン酸が、移植拒絶又はＴリンパ球細胞に対する免疫病理（T cell-mediated immunopathology)のような多様な免疫反応にさらに強力に影響を与える免疫抑制剤である可能性を意味する。
【０１３１】
１）マウス下被膜腎臓移植(mouse subcapsular kidney transplantation)
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腎臓組織を同種のマウスであるＢａｌｂ／ｃに下被膜腎臓移植技術を利用して移植した。移植後オリーブ油(Sigma社) に調剤したロスマリン酸（25mg/kg/day)又はシクロスポリンＡ（50mg/kg/day)を７日間毎日移植されたマウスに筋肉内注射した。
【０１３２】
２）半定量的ＲＴ−ＰＣＲを利用したサイトカインｍＲＮＡ
７日間ロスマリン酸（25mg/kg/day)を処理した移植された腎臓をマウスから除去後、すぐ液体窒素で凍結させた。全体ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ  ＬＳ試薬(Life Technologies)を使用して分離し、クロロホルムを添加後常温で15分間放置した。フェノール／クロロホルムでＲＮＡを抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、分離された全ＲＮＡを分光光度計で定量した。全ＲＮＡ１μｇを製造社の指針に従ってチタン  オン  チューブ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Titan One Tubu RT-PCR System）でＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは５０μＬの体積で実施した。反応液の組成は、Ｍｇ2+を含む１×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、０．２１ｍＭの各々のｄＮＴＰ（dATP, dGTP, dCTP  及び dTTP)、１０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤、酵素混合液（AMV 及び  ExpandTMHigh Fidelity PCR-System) 、５ｍＭＤＴＴ溶液及び０．４ｕＭの適当なプライマー対でできていた。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γＩＬ−６、ＩＬ−１βそしてβーアクチンのプライマー配列は、以前の報告から得た。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γＩＬ−６、ＩＬ−１βそしてβーアクチンのＰＣＲ生成物の大きさは、２２６、２２２、３３６、２２９、３２０そして５６８ｂｐであり、増幅周期は２５回だった。当量の(15 μl)のＰＣＲ生成物の２％のアガロースゲルから電気泳動し、増幅されたＤＮＡ切片をＥｔＢｒで染色した。
【０１３３】
３）プライマー
ＰＣＲのプライマー配列は、配列番号１から配列番号１２で表される。プライマーは相応する遺伝子に従って命名した。ｍはマウスを示す；後ろに遺伝子の名前がつく；Ｆは前方(forward orientation) を示し, Ｒは後方(reverse orientation) を示す。例えば、ｍＩＬ−２Ｆは、ＩＬ−２のＰＣＲに使用された前方プライマーを示す。アニーリング温度は全ての場合に５２℃であり、例外にβ−アクチンの場合には６５℃だった。
【０１３４】
〈実施例１４〉ラットを利用した非経口投薬の急性毒性試験
ロスマリン酸及びその誘導体の急性毒性を確認するために下記の試験を行った。
【０１３５】
急性毒性は、６週齢の特定病原不在(SPF) ＳＤラットを使って検査した。リポソーム剤の形態の１ｇ／ｋｇのロスマリン酸、ロスマリン酸のイソプロピルエステル、ロスマリン酸のエチルエステル、（Ｓ）−ロスマリンビス−（第三ブチルジメチルシリル）エーテル又は（Ｓ）−ロスマリン酸を各試験群当たり２匹の動物に筋肉内注射した。注射後に動物の臨床症状、体重変化を観察し血液検査を実施した。胸腔臓器と腹腔臓器の異常を調査するために剖検を実施した。試験結果は、試験に使用された全ての動物が生存し、目立った異常症状や体重変化又は異なる毒性を観察できなかった。全ての化合物は１ｇ／ｋｇの範囲でラットに注射投与された時いかなる毒性も示さず、したがって、非経口投与でも安全な化合物であると判明した。
【０１３６】
【発明の効果】
以上、詳しく述べたように本発明にしたがって、夏枯草から分離されたロスマリン酸およびその誘導体は、ＬｃｋのＳＨ２ドメインを阻害する。その結果、ロスマリン酸及びその誘導体は免疫反応として惹起されるＴ細胞内部のカルシウム信号伝達過程に影響を与え、細胞内ＩＬ−２遺伝子の発現を抑制し、試験管内および生体内免疫反応を阻害し、動物における同種移植拒絶反応及び移植組織におけるサイトカイン遺伝子発現を抑制する。したがって、本発明のロスマリン酸およびその誘導体は、ＬｃｋのＳＨ２ドメイン又はＳｒｃ系蛋白質チロシンキナーゼのＳＨ２ドメインを抑制したり多様なサイトカインの合成が媒介する免疫反応等を抑制するのに有用に使用できるだけでなく、臓器移植拒絶症状、自家免疫症状、炎症等を緩和するのに使用でき、Ｔリンパ球に特異的な蛋白質であるＬｃｋの機能を阻害することによって投与時の副作用が少ない。
【０１３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＬｃｋのＳＨ２ドメインとこれに特異的なホスホチロシルペプチドとの間の結合をロスマリン酸が阻害することを示した図である。
【図２】  ＪＵＲＫＥＴ  Ｔ細胞からＣＤ３とＣＤ４抗体によって誘発される細胞内カルシウ濃度の増加がロスマリン酸の処理濃度によって抑制されることを示した図である。
【図３】  ＪＵＲＫＥＴ  Ｔ細胞からからＣＤ３とＣＤ４抗体によるインターロイキン−２プロモーター部位の活性をロスマリン酸又は既存の免疫抑制剤が抑制することを示した図である。
【図４】  ＪＵＲＫＥＴ  Ｔ細胞からからＣＤ３とＣＤ４抗体によるインターロイキン−２プロモーター部位の活性をロスマリン酸、ロスマリン酸の誘導体又は、（Ｓ）−ロスマリン酸が抑制することを示した図である。
【図５】  ＭＬＲ（mixed lymphocyte reaction)からＴ細胞の増殖をロスマリン酸が阻害することを示した図である。
【図６】  マウスにおいて、ＤＮＦＢの接触によって起きる敏感反応を、ロスマリン酸が抑制することを示した図である。
【図７】  同種移植された腎臓組織において、サイトカインの合成をロスマリン酸が阻害することを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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