(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸を検出または定量するための方法であって、
（ａ）標的核酸の所定の位置に特異的に対合する少なくとも１種のプライマーを準備する工程と、
（ｂ）（ａ）からの少なくとも１種のプライマーを標的核酸とアニーリングさせて、標的核酸の所定の位置でプライマー−核酸二本鎖を得る工程と、
（ｃ）非ターミネーターヌクレオチド混合物を、（ｂ）からのプライマー−核酸二本鎖と混合する工程であって、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣから選ばれる非ターミネーターヌクレオチドの少なくとも１種が前記非ターミネーターヌクレオチド混合物から除かれており、前記非ターミネーターヌクレオチド混合物から除かれていない少なくとも１種の非ターミネーターヌクレオチドが検出可能なマーカーで標識されている、前記混合する工程と、
（ｄ）適当な緩衝液中で酵素または化学反応により等長プライマー伸長を行うことにより、等長プライマー伸長産物を得る工程であって、前記プライマー伸長は（ｃ）の前記除かれた非ターミネーターヌクレオチドに相補的な標的核酸ヌクレオチドの位置で停止する、前記等長プライマー伸長産物を得る工程と、および
（ｅ）前記等長プライマー伸長産物の標的シグナルの量を検出または定量する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
プライマーが、核酸プライマー、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、またはデオキシリボ核酸とリボ核酸の共重合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象とする核酸が、デオキシリボ核酸、リボ核酸、またはデオキシリボ核酸とリボ核酸の共重合体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
非ターミネーターヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ターミネーターヌクレオチドがジデオキシリボヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記非ターミネーターヌクレオチド混合物が、
（ａ）dATP，dCTP，dGTP，
（ｂ）dATP，dCTP，dTTPもしくはdUTP，
（ｃ）dATP，dGTP，dTTPもしくはdUTP，または
（ｄ）dCTP，dGTP，dTTPもしくはdUTP
である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能なマーカーは、酵素、タンパク質の部分、放射性同位体、蛍光性の部分、または化学基からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマー伸長産物は、テンプレート依存性酵素を用いて得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
テンプレート依存性の酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
テンプレート依存性の酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、そのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、好熱菌のＤＮＡポリメラーゼ、レトロウイルスの逆転写酵素、またはそれらの組み合わせである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸は、インビボまたはインビトロで酵素により合成されたものであるか、酵素によらずに合成されたものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
標的核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応により合成されたものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸は、天然由来でないヌクレオチド類似体を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
天然由来でないヌクレオチド類似体は、デオキシイノシンまたは７−デアザ−２’−デオキシグアノシンを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
標的核酸は、生物からのゲノムＤＮＡ、そのＲＮＡ転写物、またはそのＲＮＡ転写物から調製されたｃＤＮＡを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
生物は、植物、微生物、細菌、またはウイルスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生物は、脊椎動物または無脊椎動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
生物は哺乳動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
生物はヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸について増幅工程を行う、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
増幅工程は、クローニング、転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（strand displacement amplification）（ＳＤＡ）、またはループ媒介等温増幅（loop mediated isothermal amplification）（ＬＡＭＰ）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
プライマーは、組込まれなかった試薬および／または対象とする核酸から該プライマーをアフィニティ分離することを可能にする１つまたは複数の部分を有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
プライマーは、固体支持体へのプライマーの固定化を可能にし、固定化されたプライマー配列の提供を可能にする１つまたは複数の部分を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
当該部分は、ビオチンまたはジギトニンを含む特定の化学基からなる、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
当該部分は、固体支持体中に存在する相補的配列への塩基対合を介して該固体支持体に当該プライマーを結合させることができるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列からなる、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
プライマーは、固定化されたプライマーの配列を提供させるように固体支持体上で直接合成されたものである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
当該合成は、酵素による方法、化学的方法、または物理的方法によりなされている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
プライマーは、固定化された等長プライマーの伸長産物を提供させるように固体支持体上に固定化されている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
プライマーは、可逆的に固体支持体上に固定化されている、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
プライマーは、化学的方法、酵素による方法、または物理的方法によって固体支持体から切り離すことができる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
標的核酸は、固定化された等長プライマー伸長産物を提供させるように固体支持体上に固定化されている、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
標的核酸は、可逆的に固体支持体上に固定されている、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
標的核酸は、化学的方法、酵素による方法、または物理的方法によって固体支持体から切り離すことができる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
固定化は、光によって開裂させることができる結合を介してなされている、請求項２８、２９、３１または３２に記載の方法。
【請求項３５】
固体支持体は、ビーズ、平坦な表面、チップ、キャピラリー、ピンまたはウエハからなる群より選ばれる、請求項２３、２５、２６、２８、２９、３１または３２に記載の方法。
【請求項３６】
固体支持体に予め固定化された相補的な捕獲用核酸分子と、標的核酸配列とは異なる核酸分子の部分との間で起こるハイブリダイゼーションによって、固定化がなされる、請求項２８、２９、３１または３２に記載の方法。
【請求項３７】
固体支持体と、標的核酸配列とは異なる核酸分子との間での直接的な結合を介して、固定化がなされる、請求項２８、２９、３１または３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、等長プライマー伸長（isometric primer extension）（iPE）法を使用することによって特定のＤＮＡまたはＲＮＡを検出かつ定量するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の特定の配列を検出かつ定量するための方法には、サザンブロット法、ノーザン分析法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などがある。しかし、試料中に存在する特定のＲＮＡ種を検出しようとする場合、ノーザンブロット法やＲＮアーゼプロテクションアッセイには、効率に限界があり、手間がかかり、精度がそれほど高くなく、コストがかかり、感受性がそれほど高くなく、比較的多量のＲＮＡ試料を必要とし、特殊な装置が必要になり、大量の生体に有害な物質と放射性同位体の廃棄物が生じるといった問題がある。特に、ノーザンブロット法とＲＮアーゼプロテクションアッセイはともに、分析が終了するまで２〜３日を要する。また、ノーザンブロット法には、ＲＮＡゲルでの泳動、ＲＮＡの固体支持体への転写、プローブの調製、およびハイブリダイゼーション反応の実施が必要である。そのため十分な感度を得るには、たとえば５μｇの試料が必要である。ノーザンブロット法は、標的とプローブの核酸との間でハイブリダイゼーションが起こるという原理に基くものである。また、大量の生体に有害な物質と放射性同位体の廃棄物が生じ、その一反応あたりのコストは、かなり高くなる。
【０００３】
同様に、ＲＮアーゼプロテクションアッセイも、適当な結果を得るのに２〜３日かかる。その実験の手順では、テンプレートＤＮＡの調製、ＲＮＡプローブの調製、ハイブリダイゼーション反応の実施、酵素による消化反応、およびゲルでの泳動が必要になる。そして、よい結果を得るのに、たとえば１μｇの標的ＲＮＡ試料が必要になる。ＲＮアーゼプロテクションアッセイが基いている原理は、ハイブリダイゼーション反応と酵素による消化反応との組合わせである。ノーザンブロット法と同様、この反応を行うのに費用がかかる。さらに、この方法では、生体に有害な物質と放射性同位体の廃棄物が多く生じる。なお、後に示す表１には、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイおよび本発明による複数プライマー伸長法に関係するファクターを比較して示している。
【０００４】
米国特許明細書第５，８４６，７１０号は、変異ＤＮＡ分子をスクリーニングするためプライマー伸長法を使用することを開示する。しかし、この公報は、試料中の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを検出することを開示しない。
【０００５】
米国特許明細書第５，９９４，０７９号は、ＤＮＡプライマーを特定のＲＮＡにアニールすることによってＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成し、逆転写酵素を使用することによってプライマーを伸長させることを開示する。このハイブリッドは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的な抗体によって検出される。しかし、この公報は、本発明のような試料中に存在する標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを検出する方法を開示しない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
簡便であり、時間がかからず、感度が高く、費用に対して効果が高く、環境への悪影響が少ない核酸検出法が、当該技術分野において必要であることがわかる。本発明は、これらの必要性をすべて満たし得る方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上述した必要性を満たすため、本発明により、試料中の標的核酸を検出または定量する方法が提供される。この方法は、
（ａ）標的核酸の所定の位置に特異的に対合する１つまたは複数のプライマーを準備すること、
（ｂ）高ストリンジェンシーの条件下で（ａ）からの１つまたは複数のプライマーを標的核酸とアニーニリングさせて、標的核酸の所定の位置でプライマー−核酸二本鎖を得ること、
（ｃ）（１）１種、２種または３種の遊離の非ターミネーターヌクレオチドと、必要に応じて検出可能なマーカーで標識された少なくとも１種の非ターミネーターヌクレオチドを含み、かつ
（２）（１）の１種、２種または３種の非ターミネーターヌクレオチドとは異なる種類のターミネータヌクレオチドを含むか含まない
混合物を、（ｂ）からのプライマー−核酸二本鎖と混合すること、および
（ｄ）適当な緩衝液中で酵素または化学反応によりプライマー伸長を行うことを含み、さらに
（ｅ）プライマー伸長したヌクレオチド上の標識シグナルを検出または定量すること、もしくは
（ｆ）伸長したプライマーを質量分析によって検出または定量すること
のいずれかを含む。
【０００８】
上記方法において、プライマーは、核酸プライマー、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、あるいは、デオキシリボ核酸とリボ核酸との共重合体とすることができる。標的となる核酸は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、あるいは、デオキシリボ核酸とリボ核酸との共重合体とすることができる。
【０００９】
好ましい態様において、本発明による方法は、以下に示すような非ターミネーターヌクレオチド（ターミネーターでないヌクレオチド）とターミネーターヌクレオチド（ターミネーターであるヌクレオチド）との組合わせからなる混合物を含み得る。
【００１０】
(a) dATP, dCTP, dGTP, ddTTP もしくは ddUTP,
(b) dATP, dCTP, dTTP もしくは dUTP, ddGTP,
(c) dATP, dGTP, dTTP もしくは dUTP, ddCTP,
(d) dCTP, dGTP, dTTP もしくは dUTP, ddATP,
(e) dATP, dCTP, dGTP,
(f) dATP, dCTP, dTTP もしくは dUTP,
(g) dATP, dGTP, dTTP もしくは dUTP, または
(h) dCTP, dGTP, dTTP もしくは dUTP。
【００１１】
本発明による方法は、検出可能なマーカーで標識された少なくとも１つの非ターミネーターヌクレオチドを使用することができる。検出可能なマーカーは、酵素、タンパク質成分、放射性同位体、蛍光成分、あるいは、ビオチンなどの化学基からなり得る。また、検出または定量する方法の工程は、質量分析によって行ってもよい。
【００１２】
本発明のプライマー伸長反応に使用される酵素には、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩもしくはその「クレノウフラグメント」などのテンプレート（鋳型）依存性酵素、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、T. aquaticus ＤＮＡポリメラーゼ、レトロウイルスの逆転写酵素、または、それらの組合わせがある。
【００１３】
添付の図面を参照し、以下に本発明の構成および目的をさらに詳細に説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明により、等長プライマー伸長（iPE）法を使用することによって特定のヌクレオチド配列を検出かつ定量する方法が提供される。本発明の重要な点は、試料中の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡが、単数または複数のオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイゼーションされることである。次いで、１種、２種または３種の予め標識された遊離のヌクレオチドの存在下において、該プライマーは伸長される。伸長をとぎれさせないために必要な４種のヌクレオチドのうち少なくとも１種を、反応に入れないでおくか、あるいは、ジデオキシヌクレオチドのようなそれに対応するタイプのターミネーターヌクレオチドで置き換える。その後、伸長した単数または複数のプライマー上の標識により生成されるシグナルが存在するか否かを測定することによって、特定の標的核酸を検出かつ定量することができる。伸長したプライマーを遊離のヌクレオチドから分離し、伸長したプライマーの標識の組込みについて分析する。
【００１５】
標的核酸の位置に相当するプライマーが伸長され、一群の長さの等しいプライマー伸長した核酸（等長プライマー伸長核酸）が生成する。というのも、一定の数のヌクレオチドが、配列に依存して取り込まれるからである。これらの等しく伸長したプライマーを定量することによって、標的核酸の量または数を定量することができる。試料中に標的ＤＮＡまたはＲＮＡの多数の複製物が存在する場合、標識ヌクレオチドが組込まれたプライマー伸長物の複製物の数はそれに対応して増え、全体のシグナルはより強くなる。かくして、未知の試料において観測されたシグナルの強度を、標準化された既知量のＤＮＡまたはＲＮＡと比較することによって、試料中の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを検出および／または定量することができる。他の態様では、これらの等長プライマー伸長核酸種を質量分析を用いて測定することにより、特定の標的核酸を検出または定量することができる。
【００１６】
反応緩衝液中にある遊離のヌクレオチドが存在しないと、そのヌクレオチドが入るべき場所でプライマー伸長は停止する。かくして、別個の長さのプライマー伸長物が得られる。
【００１７】
本発明の範囲において、種々の明らかな変形が可能である。たとえば、１種のヌクレオチドではなく、２種または３種のヌクレオチドをプライマー伸長反応から除いてもよい。さらに、種々の標識を使用することができ、それらは、放射性ヌクレオチドに限定されず、蛍光体や酵素でもよい。
【００１８】
ここで使用する「核酸」または「ヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、あるいはデオキシリボ核酸とリボ核酸の共重合体とすることができる。核酸の試料は、天然のものでも合成のものでもよい。核酸の試料は、天然に存在する核酸でもよいし、任意の生物から得られるものでもよい。本発明が適用される生物には、たとえば、植物、微生物、ウイルス、鳥、脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ウマ、イヌ、ウシ、ネコ、ブタ、ヒツジがある。標的核酸は、天然由来のものでもよいし、インビボで酵素により合成されたもの、インビトロで酵素により合成されたもの、あるいは非酵素的に合成されたものでもよい。
【００１９】
対象とする１つまたは複数の核酸を含有する試料は、生物からのゲノムＤＮＡ、そのＲＮＡ転写物、またはそのＲＮＡ転写物から調製されるｃＤＮＡを含み得る。対象とする１つまたは複数の核酸を含有する試料はさらに、生物からのゲノム外のＤＮＡ、そのＲＮＡ転写物、またはそのＲＮＡ転写物から調製されるｃＤＮＡを含み得る。さらに、対象とする１つまたは複数の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成され得る。
【００２０】
対象とする核酸は、デオキシイノシンまたは７−デアザ−２−デオキシグアノシンなどの天然にないヌクレオチド類似体を含み得る。これらの類似体は、ＤＮＡ二本鎖を不安定にし、鎖を完全に分離することなく、二本鎖試料においてプライマーのアニーリングおよび伸長反応が起こることを可能にし得る。
【００２１】
対象とする核酸は、組込まれていない試薬および／またはプライマーからの対象とする核酸のアフィニティ分離を可能にする１つまたは複数の部分を含み得る。たとえば、対象とする核酸はビオチンを含むことができ、それは、固体支持体へ付着されたアビジン族化合物へのビオチンの結合を介して、組込まれていない試薬および／またはプライマーからの対象とする核酸のアフィニティ分離を可能にする。対象とする核酸の配列は、固体支持体に付着された核酸中に存在する相補的配列への塩基対合を介して、組込まれていない試薬および／またはプライマーからの対象とする核酸のアフィニティ分離を可能にする、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含み得る。対象とする核酸は検出可能なマーカーで標識することができ、この検出可能マーカーは、試薬に存在する検出可能なマーカーあるいはプライマーに付着された検出可能マーカーと異なるものとすることができる。
【００２２】
本発明に関し、「正常なヌクレオチド」または「正常な塩基」という用語は、野生型塩基または既知の標準的ヌクレオチド塩基を意味し、それに対して、当該塩基部位における突然変異を同定することができる。「標準的ヌクレオチド塩基」は、任意の既知の塩基を含むものであり、それは、野生型の塩基を含んでもよいし、その塩基が既知でありその変異体を知り得る場合には、既知の突然変異塩基を含んでもよい。したがって、正常な塩基は、たとえば既知の野生型塩基であり得、それに対して該当する位置での突然変異を調べることができる。一方、既知の塩基は、既知の突然変異体であり得、それに対して、該当する位置での野生型塩基の存在を調べることができる。あるいは、既知の正常な塩基は、既知の突然変異体であり得、それに対して、他の突然変異体塩基を調べることができる。このように本発明の方法は、該当する部位において任意の他の塩基変異体が存在するかどうかを決定するのに用いることができる任意の既知の配列に適用することができる。
【００２３】
ここで使用する「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、たとえばヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの酵素、ならびに適当な温度およびｐＨなどのさまざまな要因の存在下で、核酸（テンプレート）鎖に相補的なプライマー伸長物の合成を可能にする条件下におかれたとき、合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。
【００２４】
一方、用語「プライマー」は、任意の材料から得られる任意の核酸フラグメントを含む。たとえばプライマーは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＰＣＲにより得られたＤＮＡのようなより大きな核酸フラグメントを断片化することにより調製することができる。プライマーの性質は、プライマーを得る方法、たとえば、それが、天然由来の核酸あるいは合成された核酸を断片化することによるものなのか、あるいは核酸プライマー自体を合成することによるものなのかによって、限定されるものではない。またプライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド類の共重合体、オリゴリボヌクレオチド、リボヌクレオチド類の共重合体、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの共重合体とすることができる。プライマーは、天然のものでもよいし合成のものでもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは、インビボでの酵素による合成、インビトロでの酵素による合成、あるいはインビトロでの酵素によらない合成のいずれでも合成することができる。プライマーは、検出可能なマーカーで標識することができ、この検出可能なマーカーは、試薬に存在するかあるいは対象とする核酸に付着されるいずれの検出可能マーカーとも異なり得る。さらに、プライマーは、同定すべきヌクレオチド塩基の上流に隣接した対象とする特定の位置にあるフランキング配列に対応する配列を有している必要がある。
【００２５】
また、プライマーは、対象とする核酸に存在するヌクレオチドと、ハイブリダイゼーションまたはアニーリングできる必要がある。必要なハイブリダイゼーションを達成する方策の１つは、テンプレート依存性プライマーを、既知の塩基配列に対し実質的に相補的または完全に相補的にすることである。
【００２６】
オリゴヌクレオチドプライマーは、組込まれていない試薬および／または対象とする核酸からのプライマーのアフィニティ分離のため、固体支持体に当該プライマーを結合させる１つまたは複数の部分を含み得る。そのようなアフィニティ部分は、限定されることなく、たとえば、ジギトニン、磁気ビーズ、リガンド類、たとえば抗体を含むタンパク質リガンド類を含む。好ましくは当該部分はビオチンである。ビオチンを用いる場合、ビオチンを含むプライマーは、固体支持体に付着されたストレプトアビジンへのビオチンの結合を介して、組込まれていない試薬および／または対象とする核酸からのプライマーのアフィニティ分離を可能にする。オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、固体支持体に付着された核酸中に存在する相補的配列への塩基対合を介して、組込まれていない試薬および／または対象とする核酸からの当該プライマーのアフィニティ分離を可能にするＤＮＡ配列を含み得る。
【００２７】
ここで使用する「プライマー伸長反応」という用語は、テンプレート依存性の核酸合成反応が行なわれる反応状態を指す。テンプレート依存性のプライマー伸長反応を起こすための条件は、部分的に、適当なテンプレート依存性酵素を存在させることにより作り出すことができる。適当なテンプレート依存性酵素にはＤＮＡポリメラーゼがある。ＤＮＡポリメラーゼには、いくつかの種類のものが有り得る。しかし、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー依存性でありかつテンプレート依存性でなければならない。たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはその「クレノウフラグメント」、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ）、サーマス・アクアチカス（T. aquaticus） ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはレトロウイルス逆転写酵素を使用することができる。Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ類も、いくつかのプロトコルで使用できる。ポリメラーゼに応じて、異なった条件を使用する必要があり、また、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応のために異なった温度範囲が必要となり得る。
【００２８】
ここで使用する「プライマー伸長鎖」という用語は、プライマーが添加された後、二本鎖においてテンプレートに対向して形成される鎖を含む。好ましくは、プライマーの伸長は、プライマー伸長鎖へのターミネーターの組込みによって停止される。
【００２９】
ここで使用する「テンプレート」という用語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ、あるいはその任意の修飾物を含む核酸を指し、任意の長さまたは配列であり得る。
【００３０】
ここで使用する「ターミネーター」または「チェーンターミネーター」という用語は、テンプレート鎖に対向するプライマー伸長鎖に組込まれたとき、効果的にプライマー伸長反応を終わらせる、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴもしくはＵ、またはその類似体などの核酸塩基を指す。好ましくは、ターミネーターはジデオキシヌクレオチドである。また好ましくは、ターミネーターは、非ターミネーター上の標識と区別できるように、標識されないかまたは標識される。ここで、「ターミネーター」または「チェーンターミネーター」という用語が単数形で使用されるとき、それは、ヌクレオチド一分子を使用することを意味するものではない。むしろ「ターミネーター」という用語の単数形は、アッセイに用いられるヌクレオチド、核酸塩基あるいは核酸類似体の種類を表している。たとえば、ターミネーターがｄｄＡであるとき、単数形のｄｄＡは集合名詞であり、ｄｄＡのたった一分子を指しているのではない。一方、「ターミネーター」は、特定の種類のヌクレオチドが存在しないことでもあり得る。その場合、プライマー伸長は、該当する位置に特定のヌクレオチドがないことによって停止される。たとえば、テンプレート鎖上の「Ｃ」に対向する位置でプライマー伸長反応を停止させたい場合、非終結塩基であるＡ、ＴおよびＣをプライマー伸長反応混合物に含有させる一方、「Ｇ」（「Ｃ」の相補塩基）を含有させないようにすることができる。このようにすれば、相補的塩基が存在しないことにより、プライマー伸長反応を停止させることができ、たとえばジデオキシターミネーターヌクレオチドを添加する場合と同様の結果を得ることができる。
【００３１】
ここで使用される「非ターミネーター」または「非チェーンターミネーター」という用語は、プライマー伸長鎖に組込まれたときに伸長反応を終わらせないヌクレオチド塩基をいう。好ましくは、プライマー伸長反応における少なくとも１つの非ターミネーターが標識される。ここで、「非ターミネーター」または「非チェーンターミネーター」という用語を単数形でいうとき、それは、ヌクレオチド一分子を使用することを意味するものではない。むしろ「非ターミネーター」という用語の単数形は、アッセイに用いられるヌクレオチド、核酸塩基あるいは核酸類似体の種類を表している。たとえば、ターミネーターがＧであるとき、単数形のＧは集合名詞であり、Ｇのたった一分子を指しているのではない。
【００３２】
ここで使用する「突然変異体」または「突然変異」という用語は、野生型の塩基または正常な塩基と異なる、テンプレート鎖上の任意の塩基を示している。本発明の方法を使用して検出され得る突然変異は、アニーリングされたプライマーのすぐ３′側の塩基に直接対向するテンプレート上の塩基に変異がある場合、単一塩基の突然変異、挿入変異、欠失変異または遺伝子の転座を含むあらゆるタイプの突然変異であり得る。
【００３３】
ここで使用する「標識」という用語は、検出可能なシグナルを与えるため、ターミネーターヌクレオチドまたは非ターミネーターヌクレオチドに結合される任意の分子を指す。標識は、放射性のもの、化学蛍光性のもの、抗体などのタンパク質リガンドとすることができ、もし蛍光基が使用されるのであれば、非ターミネーターヌクレオチド塩基の各タイプについて異なった蛍光基を使用してもよい。これらの蛍光性標識は、分光測定によって識別可能な発光スペクトルを有する。
【００３４】
一方、プライマー伸長物へのヌクレオチド塩基の組込みのレベルは、米国特許明細書第５，８８５，７７５号に例示される質量分析法によっても測定することができる。同公報に記載された内容はすべて本明細書中に引用により援用する。
【００３５】
ここで使用する「高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件」という用語は、核酸のハイブリダイゼーション条件を指し、限定されるものではないが、たとえば４２℃で０．１×ＳＳＣの洗浄条件などがある。ハイブリダイゼーション条件は一般的な分子生物学のプロトコル書に見ることができ、たとえば、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, Pub.（1994）に記載されている。同書籍の内容すべてをここに引用により援用する。
【００３６】
ここで使用する「薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）」は、セルロース材料をベースとする紙媒体において行なうことができるが、それに限定されることなく、複数種の分子を細かく分離し均一な層を形成させることのできる任意の物質で調製することができる。そのような材料は、シリカゲル、酸化アルミニウム、ケイソウ土またはケイ酸マグネシウムなどの無機物質を含むがこれらに限定されるものではない。ＴＬＣのための有機物質には、セルロース、ポリアミドまたはポリエチレン粉末があるがこれらに限定されるものではない。薄層クロマトグラフィ法は、化学プロトコル書に一般的に記述されており、たとえば、Freeman and Co.出版のFreifelder, Physical Biochemistry-Applications to Biochemistry and Molecular Biology, second ed.（1982）、特にクロマトグラフィの技法について述べる第８章、とりわけ、薄層クロマトグラフィについて述べる第２２９頁から２３２頁に記載されている。同書籍の内容すべてをここに引用により援用する。
【００３７】
対象とする核酸を同定および／または定量するための方法において、伸長反応の後、適当な変性条件を使用し、対象とする核酸からプライマー伸長鎖を分離することができる。この変性条件は、熱、アルカリ、ホルムアミド、尿素、グリオキサール、酵素、およびそれらの組合わせを含み得る。変性条件には、２．０ＮのＮａＯＨによる処理を使用してもよい。
【００３８】
当業者には明らかなように、ターミネーターを非ターミネーターと異なる標識で標識することができ、それを、プライマー伸長鎖におけるターミネーターと非ターミネーターの組込みを区別するのに用いることができる。ターミネーターの例には、特定の種類のヌクレオチドが存在しないことも含まれる。そのようなターミネーターも一例であり、それにより特許請求の範囲が限定されるものではない。ターミネーター上の標識が非ターミネーター上の標識と異なる限り、示差的に標識されたあるいは示差的に標識されていないターミネーターも本発明に含まれる。
【００３９】
当業者には明らかなように、テンプレートの配列の少なくとも一部が既知であれば、テンプレート鎖に結合するプライマーを設計することができ、そして、そのようなプライマーをテンプレート鎖に結合させることができる。また当業者に明らかなように、本発明の方法は、１またはそれ以上のアッセイチューブにおいて、数種類のプライマーを用いて行うことができる。
【００４０】
本発明の方法の特徴は、非ターミネーターが均一に標識されていれば、強いシグナルを発生させることができる点にある。というのも、プライマー伸長鎖にいくつかの標識された非ターミネーターが組込まれ、それにより加成的なシグナル効果が得られるからである。種々のターミネーターまたは非ターミネーターに特異的な種々の標識を使用してシグナルを検出すれば、精度が向上する。
【００４１】
また、本発明により、必要に応じて定量的にあるいは非定量的に試料中の標的核酸の有無を迅速かつ正確に測定するためのキットおよび試薬が提供される。当該キットの各構成要素は、該キットに含まれる適当な容器に、それぞれ収容することができる。個々の容器には、その内容物を明らかにするようにラベルをつけることができる。さらに、個々に収容される構成要素は、必要なすべての構成要素を収容することができるより大きな容器に入れてもよい。また、当該キットの使用方法を示す説明をキットに付属させることができる。そのような説明は、説明書として入れてもよいし、キット自体に付与してもよい。
【００４２】
以下の例は、本発明の例示として提供されるものであり本発明を限定するものではない。
【００４３】
例
全ＲＮＡをラットの脳からＲＮＡｚｏｌＢ（Tels-tel, TX）法により抽出した。全ＲＮＡの濃度をＯＤ２６０ｎｍの吸光度により測定した。全ＲＮＡをＲＮアーゼフリーのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理された水で希釈した。表２に示すように異なる量のＲＮＡを含む希釈したＲＮＡ溶液５μｌを各チューブに入れ、次いで、１μｌの合成オリゴヌクレオチドプライマー5'-GTGGGAACCGTGTCA-3'（SEQ ID No.1）を混合した。このプライマーは、ラットの脳の特定のｃＤＮＡ（非公開データ）と対合する配列である。このＲＮＡ−プライマー混合物を７０℃で３分間加熱し、そして氷上で３分間インキュベートした。チューブをすばやくスピナーにかけた後、最終濃度が２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１５単位のＲＮアーゼ阻害剤、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、１μｌのｄＣＴＰα32Ｐおよび１００単位のＭＭＶＬ逆転写酵素を含む１４μｌの反応混合物を添加して、プライマー伸長反応を開始させた。この反応を３７℃で２０分間行った後、１００℃で２分間反応チューブを加熱することにより反応を停止させた。１μｌの反応混合物を薄層クロマトグラフィー（TRIM USA, メリーランド）にかけ、遊離のｄＣＴＰα32Ｐを分離した。次いで、標識されたプライマーの放射能をシンチレーションカウンター（Beckman LS 5000）により計測した。その結果を表２に示す。
【００４４】
上述の工程はすべて、すでに自動化されているかまたは自動化できる、化学反応、操作およびプロトコルを含む。したがって、本発明の好ましい実施の態様を、適当にプログラムされた自動化装置のワークステーション操作に組入れることで、生物試料から得られる核酸中の特定のヌクレオチド配列または配列の違いの検出に応じて、実質的にあらゆる診断法について顕著にコストを節約でき、生産性を高めることができる。
【００４５】
なお、本明細書中で引用するすべての文献の内容は、そっくりそのまま、本明細書による開示とする。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
【表２】
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【００４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  特定のＤＮＡ配列を検出かつ定量するための複数プライマー伸長反応を示す模式図である。
【図２】  ＲＮＡを検出かつ定量するための複数プライマー伸長法を使用するための模式図である。
【図１】
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【図２】
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