(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１．〜６．の工程を含み、該工程１．〜６．までの間は制限酵素を用いないことを特徴とする微量ｍＲＮＡの増幅方法。
１．試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させる工程；
２．担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；
３．得られる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加する工程；
４．２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程；
５．解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；
６．２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；
【請求項２】
以下の１．〜７．の工程を含み、該工程１．〜６．までの間は制限酵素を用いないことを特徴とする微量ｍＲＮＡの増幅方法。
１．試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させる工程；
２．担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；
３．得られる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加する工程；
４．２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程；
５．解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；
６．２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；
７．前記第１のプロモーター配列及び／又は第２のプロモーター配列を利用して、インビトロ転写系によりセンス鎖ｃＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成する工程；
【請求項３】
担体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項１又は２記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項４】
第１のプロモーター配列を有するリンカーとして、その５′末端が非対合末端、３′末端が平滑末端であるリンカーを使用することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項５】
第１のプロモーター配列を有するリンカー及び／又は第２のプロモーター配列を有するリンカーとして、該プロモーター配列の５′側及び／又は３′側に制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項６】
第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が異なることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項７】
第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターが、該プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーターであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項８】
プロモーター特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターから選ばれることを特徴とする請求項７記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項９】
第１のプロモーター配列を有するリンカーが、配列番号１及び２で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項１０】
第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーが、配列番号３で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法を用いることを特徴とする遺伝子のクローニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮＡ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡの少なくとも１つを標識化して用いることを特徴とするサブトラクションクローニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に存在する微量のｍＲＮＡの増幅方法、より詳しくは、ｃＤＮＡライブラリーの作製、サブトラクションクローニング、マイクロアレイへの適用が可能である、ＰＣＲ法を組み合わせた、生体内で発現している超微量のｍＲＮＡを感度よく増幅する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マウス、ヒトなどの哺乳類のゲノムの全遺伝子数は従来約１０万個程度と予想されており、これに対応するｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを網羅的にクローン化することは、遺伝子のコードするタンパク質の配列予測、遺伝子の構造予測、ＤＮＡマイクロアレイの構築等の観点から、実用的にも基礎研究の上でも極めて重要であり、現在、米国、日本をはじめ世界的な取り組みがなされている。例えば、マウスでは既に３万種類程度のｃＤＮＡがクローン化されているが、これらは主に、成体あるいは胚に適当量以上存在するｍＲＮＡに由来するものであると考えられ、残されたｃＤＮＡの単離が今後の課題であるといわれている。多細胞高等生物においては、相当部分の遺伝子は、特化された一部の細胞に限局して発現している可能性が考えられており、例えば、脳視床下部における下垂体ホルモン放出因子遺伝子や、膵島細胞における糖調節ホルモン遺伝子等は、極めて限られた少数の細胞においてのみ、その発現が見られる。ある一群の遺伝子は特定の発生段階の限局された領域でのみ発現している可能性があり、また、他の一群の遺伝子は各種ストレスや病原体の感染など環境要因の変動にさらされた細胞でのみ誘導される可能性がある。そして、一般に、より多くのｃＤＮＡ種をクローン化するためには、種々の発生段階にあるより多くの組織、細胞種について環境条件を多様化させて調べることの有用性が指摘されている。
【０００３】
産業上有用な遺伝子は、その産物であるｍＲＮＡあるいはタンパク質の解析や調製が容易なｃＤＮＡの形で単離されることが望ましく、ｃＤＮＡの単離はｍＲＮＡを出発材料とするが、上記のようにｍＲＮＡ種の多くは生体の極く限られた組織、細胞にのみ発現しており、得られるｍＲＮＡが微量なため、ｃＤＮＡの調製が困難な場合が多々あり、現在までに多くの微量ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡの増幅法が提案されている（Dulac,C.&Axel,R. (1995)A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.Cell Vol.83,pp.195-206、Mackler S.A.,Brooks,B.P.&Eberwine,J.H. (1992)Stimulus-induced coordinate changes in mRNA abundance in single postsynaptic hippocampal CA1 nuerons. Neuron Vol.9,pp.539-548等）が、それぞれｃＤＮＡライブラリーの調製、ハイブリダイゼーションプローブの調製に特化したものであり、汎用性を有しないものがほとんどである。
【０００４】
その他、迅速かつ簡便に被検試料中の特定の核酸配列を検出する方法として、検出すべき配列に操作可能に結合したプロモーターを含む２本鎖核酸の製造方法であって、（a）オリゴヌクレオチドプロモーター−プライマーを得；（b）プロモーター−プライマーと検出すべき核酸配列とがハイブリダイズする条件下で、該プロモーター−プライマーと該検出すべき配列を含有する核酸とを接触させ、（c）プロモーター−プライマーの３′末端から、検出すべき核酸配列に相補的な伸長産物を製造させ；（d）工程(c)の産物を３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を有する物質と接触させ；（e)プロモーター−プライマーのプロモーターと相補的な伸長産物を、検出すべき配列の３′末端から合成することからなる方法（特開平１１−８９６００号公報）や、センス及びアンチセンスｍＲＮＡや一本鎖ｃＤＮＡの合成を含む遺伝子の保存等種々の方法に有用なポリヌクレオチド固定化担体、そのポリヌクレオチド固定化担体を用いる遺伝子の保存方法、並びに、ｓｓ−ｃＤＮＡ、ｄｓ−ｃＤＮＡ、センスｍＲＮＡもしくはアンチセンスｍＲＮＡの製造方法（ＷＯ９３／１５２２８）に関する技術が知られている。上記ＷＯ９３／１５２２８に記載された方法は、ポリヌクレオチド固定化担体を用いているものの、アダプターの付着や固定化担体からのｃＤＮＡの切出しに制限酵素を用いており、また固定化担体上でのセンス鎖ｃＲＮＡの合成効率が不明であり、かかる方法では微量のｍＲＮＡから大量のセンス鎖ｃＲＮＡやｃＤＮＡを遺失なく合成することができない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
神経科学が対象とする神経組織は限局された領域であることが多く、また発生生物学が対象とする初期胚は細胞数が少なく、そこから得られるｍＲＮＡ等は極微量であり、分子生物学的解析を困難にしている。現在、ｃＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ法が最も広く使われているが、各ｃＤＮＡの含有率の代表性に問題があり、ＰＣＲサイクル数は極力少なくするべきである。一方、ｃＤＮＡ合成による線型増幅は、代表性に優れているが、極微量の試料への適用には問題があった。本発明の課題は、ｃＤＮＡライブリーの作製、サブトラクションクローニング、マイクロアレイへの適用が可能で、かつ汎用性のある、生体内で発現している超微量のｍＲＮＡを増幅する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、今回、微量全ｍＲＮＡを増幅し、特定のｍＲＮＡの変動を定量化すると共に、ｃＤＮＡライブラリーを容易に構築できる実験手技の開発を試みた。そして、オリゴ(ｄＴ)を結合させた磁気ビーズに試料中のｍＲＮＡを吸着させた後、磁気ビーズ上で２重鎖ｃＤＮＡを合成し、５′末端にＴ７プロモーター配列を有するリンカーを付加した後、アンチセンス鎖ｃＤＮＡが結合した磁気ビーズを除去し、上清中のセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６プロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを再度合成し、この２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列をプライマーとしてＰＣＲを行ってｃＤＮＡ混成物を増幅し、次いでＴ７ポリメラーゼやＳＰ６ポリメラーゼを用いることにより、試料中のｍＲＮＡを１０8倍程度増幅しうることを見い出し、かかる微量ｍＲＮＡの増幅法を用いて、ｍＲＮＡのレベルの定量、及びｃＤＮＡライブラリーの構築が可能であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、以下の１．〜６．の工程を含み、該工程１．〜６．までの間は制限酵素を用いないことを特徴とする微量ｍＲＮＡの増幅方法１．試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させる工程；２．担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；３．得られる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加する工程；４．２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程；５．解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；６．２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；（請求項１）や、以下の１．〜７．の工程を含み、該工程１．〜６．までの間は制限酵素を用いないことを特徴とする微量ｍＲＮＡの増幅方法１．試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させる工程；２．担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；３．得られる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加する工程；４．２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程；５．解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；６．２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；７．前記第１のプロモーター配列及び／又は第２のプロモーター配列を利用して、インビトロ転写系によりセンス鎖ｃＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成する工程；（請求項２）や、担体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項１又は２記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項３）や、第１のプロモーター配列を有するリンカーとして、その５′末端が非対合末端、３′末端が平滑末端であるリンカーを使用することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項４）や、第１のプロモーター配列を有するリンカー及び／又は第２のプロモーター配列を有するリンカーとして、該プロモーター配列の５′側及び／又は３′側に制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項５）や、第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が異なることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項６）や、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモーターが、該プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーターであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項７）や、プロモーター特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターから選ばれることを特徴とする請求項７記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項���）や、第１のプロモーター配列を有するリンカーが、配列番号１及び２で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項９）や、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーが、配列番号３で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項１０）に関する。
【０００８】
また本発明は、請求項１〜１０のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法を用いることを特徴とする遺伝子のクローニング方法（請求項１１）や、請求項１〜１０のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮＡ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡの少なくとも１つを標識化して用いることを特徴とするサブトラクションクローニング方法（請求項１２）に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法としては、１．試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させる工程；２．担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；３．得られる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加する工程；４．２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程；５．解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；６．２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；を含むことを特徴とする方法や、上記１．〜６．の工程に加えて、７．前記第１のプロモーター配列及び／又は第２のプロモーター配列を利用して、インビトロ転写系によりセンス鎖ｃＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成する工程；をも含むことを特徴とする方法であれば特に制限されるものではなく、その一例が図１に示されている。
【００１０】
上記工程１．における試料としては、動物、植物、微生物等の細胞・組織等のｍＲＮＡを含むものであれば特に制限されるものではなく、これら細胞溶解液等のｍＲＮＡを含む液体サンプルの調製は常法により行うことができるが、グアニジンチオシアネートの存在下等のＲＮａｓｅ活性が阻害された緩衝液中で行うことが好ましい。本発明によると、例えば、細胞をグアニジンチオシアネートを用いて溶解した後、細胞１個程度に含まれる全ＲＮＡ量０．１ｎｇ程度以上を単離すればよく、その中に増幅しようとする標的ｍＲＮＡが５ｐｇ以上程度含まれていればよい。また、工程１．において用いられる担体としては、水不溶性の担体で、加熱変性時に溶融しないものであればどのようなものでもよいが、ポリエチレンビーズ、プラスチックプレート、磁気ビーズ等を好適に例示することができるが、これらの中でも工程４．における担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する操作を簡便に実施することができる磁気ビーズが特に好ましい。また、工程１．〜３．を磁気ビーズ等の担体上で行うことにより、反応液の交換等が容易となり、試料の逸失が少ない。
【００１１】
工程１．におけるオリゴ(ｄＴ)は常法により合成されたものであればどのようなものでもよく、オリゴ(ｄＴ)の重合度としてはｍＲＮＡのポリ(Ａ)とハイブリダイズして、ｍＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着させうる重合度であれば特に制限されないが、５〜２００、特に１０〜３０程度が好ましい。また、オリゴ(ｄＴ)に代えてポリＵ等のｍＲＮＡのポリ(Ａ)に相補的な配列を含んでいるものも使用することができ、これらの使用も本発明に含まれる。かかるオリゴ(ｄＴ)と上記磁気ビーズ等の担体とを結合させる方法としては特に制限されるものではなく、例えば、共有結合法、イオン結合法、物理吸着法、ビオチン−アビジン系を用いる方法等を例示することができる。
【００１２】
工程１．のオリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に試料中のｍＲＮＡを吸着させる反応は、オリゴ(ｄＴ)結合担体とポリ(Ａ)+ＲＮＡ含有試料とを緩衝液中でインキュベーションし、担体に結合しているオリゴ(ｄＴ)とｍＲＮＡのポリ(Ａ)とをハイブリダイズすることにより行うことができる。かかるハイブリダイゼーションのためのインキュベーションは、温度２０〜２５℃で５分程度穏やかな攪拌下で行うことが好ましい。上記緩衝液としては、ＲＮａｓｅ活性が極力除去された緩衝液が好ましい。また、インキュベーション後、上記緩衝液等を用いて、試料中の担体非結合成分を不溶性担体から洗浄・除去することが好ましい。
【００１３】
上記工程１．で調製された担体結合オリゴ(ｄＴ)−ポリ(Ａ)+ＲＮＡ複合体は、工程２．の磁気ビーズ等の担体上でのアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡの合成に用いられる。アンチセンス鎖ｃＤＮＡの合成は、オリゴ(ｄＴ)をプライマーとし、ｍＲＮＡを鋳型として、デオキシヌクレオチドの存在下、逆転写酵素を用いて反応させ、ポリ(Ａ)+ＲＮＡ−担体結合ｃＤＮＡ複合体を担体上で調製することにより行うことができる。センス鎖ｃＤＮＡの合成は、ポリ(Ａ)+ＲＮＡ−担体結合ｃＤＮＡ複合体を、ＲＮａｓｅ含有液で処理してポリ(Ａ)+ＲＮＡを消化・除去するか、希ＮａＯＨ溶液を用いてポリ(Ａ)+ＲＮＡを解離・除去し、次いであるいは並行して、担体結合アンチセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、デオキシヌクレオチドの存在下、ＤＮＡポリメラーゼを反応させ、センス鎖ｃＤＮＡ−担体結合アンチセンス鎖ｃＤＮＡ複合体を担体上で調製することにより行うことができるが、センス鎖ｃＤＮＡ断片の連結を促進するため、ＤＮＡリガーゼを存在させておくことが好ましい。また、得られる２重鎖ｃＤＮＡの５′末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより平滑化しておくことが好ましい。
【００１４】
次いで、上記工程２．で得られた担体結合２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーが工程３．において付加される。かかる第１のプロモーター配列を有するリンカーとしては、ＤＮＡリガーゼ等により担体結合２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に結合しうるものであれば、単鎖あるいは２重鎖のどちらでもよいが、操作の簡便性からして２重鎖が好ましく、例えば、その５′末端が非対合末端、３′末端が平滑末端であるリンカーを使用することもできる。また、上記第１のプロモーター配列を有するリンカーとして、該プロモーター配列の５′側及び／又は３′側に制限酵素認識部位（配列）を有するリンカーを使用することが、ｃＤＮＡを解析するときなど好ましい場合が多いが、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程６．までの間に、上記認識部位に相当する制限酵素を使用することは、試料に由来するｃＤＮＡを消化・分解する可能性があるので好ましくない。そして、この工程３．においては、担体結合２重鎖ｃＤＮＡのアンチセンス鎖のオリゴ(ｄＴ)からなる５′末端は磁気ビーズ等の担体上に固定されているため、この断端が遮蔽されており、まずセンス鎖ｃＤＮＡの５′末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーを確実に結合させることができ、後の工程５．においてセンス鎖ｃＤＮＡの３′末端に第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを特異的に連結できるよう工夫されている。さらに、上記第１のプロモーター配列を有するリンカー構造を、事前にｍＲＮＡのキャップ部位に直接連結するリンカーの構造に組み込むと、完全長ｃＤＮＡの増幅が容易となる。
【００１５】
上記第１のプロモーター配列としては、該プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーター配列であることが好ましく、特に第１のプロモーター配列と後述する第２のプロモーター配列とが異なる場合、例えば、第１のプロモーター配列としてＴ７プロモーター配列を、第２のプロモーター配列としてＳＰ６プロモーター配列を用いる場合、工程７．において、Ｔ７プロモーター配列を特異的に転写することができるＴ７ポリメラーゼを用いることにより、工程７．においてアンチセンス鎖ｃＲＮＡを特異的に増幅することができる。上記プロモーター特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列（５′−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３′；配列番号６）、ＳＰ６プロモーター配列（５′−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ−３′；配列番号７）、Ｔ３プロモーター配列（５′−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３′；配列番号８）等を具体的に例示することができる。そして、これら第１のプロモーター配列を有するリンカーは、ＤＮＡ合成装置を用いて常法により調製することができる。
【００１６】
上記５′末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーが付加された担体結合２重鎖ｃＤＮＡは、次の工程４．において、２重鎖が解離させられ、アンチセンス鎖ｃＤＮＡが担体と共に除去される。２重鎖ｃＤＮＡを解離する方法としては特に制限されるものではなく、例えば低塩濃度溶液中で９０〜１００℃にて約１〜１０分間加熱して２重鎖ｃＤＮＡを熱変性することにより行われる。かかる２重鎖ｃＤＮＡを解離させた後のアンチセンス鎖ｃＤＮＡ結合担体の除去は常法により行うことができ、例えば、担体が磁気ビーズの場合は磁石等の磁性体を用いて、また担体がポリエチレンビーズの場合は遠心分離若しくは濾過等により除去することができるが、溶液中に遊離状態で残存するセンス鎖ｃＤＮＡの逸失を最少限度に留めることができる点で、担体として磁気ビーズを用いることが好ましい。
【００１７】
次の工程５．において、工程４．で解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡが再び合成される。上記工程４．により得られる遊離状態のセンス鎖ｃＤＮＡを含む溶液に、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーが加えられ、センス鎖ｃＤＮＡの３′端のポリ(Ａ)部分に上記プライマーのオリゴ(ｄＴ)をハイブリダイズさせ、センス鎖ｃＤＮＡと前記オリゴ(ｄＴ)プライマーとの複合体を作製する。上記第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーにおける第２のプロモーター配列を有するリンカーとしては、該プロモーター配列の５′側及び／又は３′側に制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することが、ｃＤＮＡを解析するときなど好ましい場合が多いが、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程６．までの間に、制限酵素認識部位に相当する制限酵素を使用することは試料に由来するｃＤＮＡを消化・分解する可能性があるので好ましくない。上記第２のプロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列等の特異的に転写することができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーター配列であることが好ましく、特に第２のプロモーター配列と前述の第１のプロモーター配列とが異なる場合、例えば、第２のプロモーター配列としてＳＰ６プロモーター配列を、第１のプロモーター配列としてＴ７プロモーター配列を用いる場合、工程７．において、ＳＰ６プロモーター配列を特異的に転写することができるＳＰ６ポリメラーゼを用いることにより、アンチセンスｃＲＮＡを特異的に増幅することができる。そして、これら第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーは、ＤＮＡ合成装置を用いて常法により合成することができる。
【００１８】
センス鎖ｃＤＮＡと前記オリゴ(ｄＴ)プライマーとの複合体を用い、センス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、デオキシヌクレオチドの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を反応させることにより、両５′端にプロモーター配列を有するリンカー部分が付加された２重鎖ｃＤＮＡを合成することができる。工程６．では、この２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、全ｃＤＮＡ混成物を増幅する。ＰＣＲはサーマルサイクラー（Perkin-Elmer社製）等を用いて常法により行うことができる。工程６．までの過程により１０μｇ程度のｃＤＮＡ混成物を得ることができる。このｃＤＮＡ混成物を用いると、ｃＤＮＡライブラリーの構築が可能となる。また、全ｃＤＮＡ混成物を数十分子種程度に希釈し、ＰＣＲを行い、このＰＣＲ産物を電気泳動等により分離し、ゲルから切り出したｃＤＮＡバンドから塩基配列を直接決定することもできる。
【００１９】
工程６．により大量に増幅された、両端にプロモーター配列を有するリンカー部分が付加された２重鎖ｃＤＮＡにおける前記第１のプロモーター配列及び／又は第２のプロモーター配列を利用して、ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写系により、センス鎖ｃＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを大量に合成することができる。前記のように、第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列が異なる場合、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを個別に合成することができる。この工程７．により、工程６．までの過程により得られた１０μｇ程度のｃＤＮＡ混成物を用いて、１００μｇ程度のセンス鎖及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を容易に調製することができる。この１００μｇ程度のＲＮＡ量は、通常の分子生物学的実験には十分な量であり、例えば、センス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を用いてサブトラクションクローニングが可能となる。
【００２０】
上記のように、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法を用いると、生体内で一過性に発現する超微量のｍＲＮＡであっても、通常の分子生物学的実験に十分な量まで増幅することができることから、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法は、遺伝子の検出やクローニング、ｃＤＮＡライブラリーの作製、マイクロアレイの作製・解析等に幅広く利用することができる。本発明の遺伝子のクローニング方法としては、上記本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法を用いる方法であれば特に制限されるものではなく、かかる遺伝子のクローニング方法により、遺伝子のクローニングの他、遺伝子の検出や遺伝子のスクリーニングを行うことができる。より具体的には、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により増幅されたｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを標識化し、これら標識化されたｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを用いて、リバース−ノーザンハイブリダイゼーション、サブトラクションクローニング、ＤＮＡアレイ等の解析を行うことができる。また、本発明により増幅されたｃＤＮＡ又はｃＲＮＡに対して、通常のサザンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションを行うことも可能である。さらに、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により調製した完全長ｃＤＮＡを用いる場合には、インビトロ転写・翻訳によりタンパク質を合成し、２次元電気泳動法等により解析することにより、発現量の変動する遺伝子数や発現産物の同定が可能となる。
【００２１】
上記リバース−ノーザンハイブリダイゼーション方法としては、その一例が図７に示されているように、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られる増幅された混成２重鎖ｃＤＮＡから、まずジゴキシゲニン（Digoxigenin；ＤＩＧ）等で標識された基質リボヌクレオチドの存在下にセンス鎖ｃＲＮＡ混成物をインビトロで合成する。他方、特定の遺伝子のクローン化ｃＤＮＡからアンチセンス鎖ｃＲＮＡをインビトロで合成し、これを変性アガロースゲル等を用いて電気泳動後、ナイロンメンブランやニトロセルロース膜に写しとって膜上に固定し、この膜上に固定されたアンチセンス鎖ｃＲＮＡに、前記ＤＩＧ等で標識化されたセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を反応させ、次いでハイブリダイズしたｃＲＮＡを、例えばアルカリフォスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体と化学発光基質等を用いて検出することにより行うことができる。かかるリバース−ノーザンハイブリダイゼーションを、特定条件下の細胞由来のｍＲＮＡと対照細胞由来のｍＲＮＡとに個別に行い、それらの結果を比較することにより、発生過程において生体内で発現量の変動する遺伝子や特定の薬剤の存在下で発現量の変動する遺伝子等のｍＲＮＡレベルの変化を検出することができる。
【００２２】
本発明のサブトラクションクローニング方法としては、上記本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮＡ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡのうちの少なくとも１つを標識化して用いる方法であれば、どのようなサブトラクションクローニング方法であっても特に制限されるものではないが、以下に示すサブトラクションによるクローニングを例示することができる。特定条件下の細胞由来のｍＲＮＡを、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により増幅し、大量のセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を調製する。一方、対照細胞由来のｍＲＮＡを、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により増幅し、大量のアンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を調製する。かかるアンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物の調製に際して、ビオチン化リボヌクレオチドを基質に用いて標識する。次に、前記センス鎖ｃＲＮＡ混成物とビオチン標識アンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物をハイブリダイゼーションさせ、続いてアビジン結合磁気ビーズを反応せしめた後、磁性体等を用いてハイブリダイズしていないアンチセンス鎖ｃＲＮＡや、センス鎖ｃＲＮＡ−アンチセンス鎖ｃＲＮＡ複合体を系外に除去し、特定条件下の細胞のみに発現しているｍＲＮＡに由来するハイブリダイズしていないセンス鎖ｃＲＮＡを得て、これを鋳型とし、アンチセンス鎖ｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅し、次いで、このｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、以後、常法によりディファレンシャル・ハイブリダイゼーションを行う。かかるサブトラクションクローニング方法においては、例えば、１個のマウスの初期胚、１匹のマウスの微小な脳神経核・組織領域から出発することが可能である。
【００２３】
本発明のマイクロアレイとしては、上記本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮＡ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡのうちの少なくとも１つを用いて作製されるマイクロアレイであればどのようなものでもよく、マイクロアレイの作製は、「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社２０００年３月１６日発行）の２６〜３４頁に記載された方法など、従来公知の方法により行うことができる。また、かかるマイクロアレイを用いたゲノム解析も、文献（Nature Vol.407, September 7 (2000) Appendix 9-19）に記載された方法など、従来公知の方法により行うことができる。
【００２４】
本発明のｃＤＮＡライブラリーとしては、上記本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるｃＤＮＡ混成物がベクターに導入されているものであればどのようなものでもよく、上記ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなど従来公知のライブラリー作製用のベクターを例示することができる。本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法によると、工程１．〜６．により増幅ｃＤＮＡ混成物を調製するまで制限酵素を使用する必要がないことから、一部のｃＤＮＡの欠失を招くことがない。かかるｃＤＮＡライブラリーの作製は、例えば、１個のマウスの初期胚、１匹のマウスの微小な脳神経核・組織領域から出発することが可能である。また、ｃＤＮＡライブラリー作製に用いられるｃＤＮＡ混成物として、工程７．で得られたｃＲＮＡ混成物から、さらに逆転写酵素を用いて合成したｃＤＮＡ混成物を用いることもできる。
【００２５】
また、先行技術（ＷＯ９３／１５２２８）では、ｃＤＮＡをプラスミドベクターに一方向性に挿入するため、制限酵素消化による断端配列を利用しており、これにより一部のｃＤＮＡが失われることになるが、本発明においては、制限酵素消化を用いることなく、ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を利用して調製した、その両端に特異的な制限酵素切断端配列を有するｃＤＮＡ断片を利用してプラスミドベクターに一方向性かつ１コピーの挿入を行うことが可能となる。後述する実施例において詳しく説明されているように、例えば、ｄＡＴＰとｄＴＴＰのみ含有し、ｄＣＴＰとｄＧＴＰを含まない反応液中で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを作用させると、その３′→５′エキソヌクレアーゼ活性により、３′端側からＣ及び／又はＧからなるヌクレオチド部分がＡ又はＴが現出するところまで除去されて５′突出末端が形成され、制限酵素ＡｖａＩ及びＡｃｃＩ断端を有するｃＤＮＡ断片等を調製することができ、かかるｃＤＮＡ断片を利用するとプラスミドベクターに一方向性かつ１コピーの挿入を行うことができる。
【００２６】
本発明の微量ｍＲＮＡ増幅用キットとしては、オリゴ(ｄＴ)を結合させた磁気ビーズ等の担体、第１のプロモーター配列を有するリンカー、前記第１のプロモーター配列とは異なる第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを含むものであれば特に制限されるものではないが、前記工程１．〜７．で使用する各種緩衝液等を含むものが好ましい。本発明の微量ｍＲＮＡ増幅用キットを用いると、前記サブトラクションクローニングや、マイクロアレイの作製・解析や、ｃＤＮＡライブラリーの構築を簡便に行うことができる。
【００２７】
【実施例】
以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［微量ｍＲＮＡ増幅法（ＭＳＭＡＰ）；図１参照］
［ＲＮＡサンプル液の調製］
ラット初代培養肝細胞から酸・グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホルム抽出法（ＡＧＰＣ法）により全ＲＮＡを抽出し、１μｇの全ＲＮＡを含む１０μｌの水溶液を出発材料とした。これを滅菌水を用いて段階希釈し、ＲＮＡ量（ｎｇ）が１０2、１０、１、１０-1、１０-2、１０-3を含む各サンプル液及びネガティブコントロールとしてＲＮＡ量（ｎｇ）が０のサンプル液それぞれ１０μｌを調製した。
【００２８】
［オリゴ(ｄＴ)磁気ビーズへのポリ(Ａ)+ＲＮＡの吸着（図１ステップ１）］
上記ＲＮＡ１μｇを含む水溶液１０μｌを６５℃にて５分間保温後氷上で急冷し、２５μｇのオリゴ(ｄＴ)磁気ビーズ（Dynal社製Dynabeads Oligo(dT)25）を懸濁した１０μｌの２×結合緩衝液［１×結合緩衝液の組成：１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に加え、室温で５分間インキュベートし、ポリ(Ａ)+ＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)にアニールさせた。ポリ(Ａ)ＲＮＡ吸着オリゴ(ｄＴ)ビーズを磁石（Dynal社製MPC-E/E1）による吸引と分散を繰り返すことにより、５０μｌの０．３×結合緩衝液にて２回洗滌した。
【００２９】
［磁気ビーズ上での２重鎖ｃＤＮＡの合成（図１ステップ２）］
上記ポリ(Ａ)+ＲＮＡ吸着オリゴ(ｄＴ)磁気ビーズを、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Gibco BRL社製SuperScriptII）２００ユニットを含む２０μｌの反応混合液に懸濁し、４２℃にて５０分間（１０分ごとに攪拌しビーズを浮遊させながら）インキュベートして、アンチセンス鎖ｃＤＮＡを合成した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡビーズを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ（以下、ＴＥ溶液という）５０μｌにて３回洗滌した。続いて、同ビーズを１９ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、９１ｍＭ塩化カリウム、４．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、３．８ｍＭ ＤＴＴ、０．１５ｍＭ ＮＡＤ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Gibco BRL社製）５ユニット、大腸菌ＤＮＡリガーゼ（Gibco BRL社製）５ユニット、大腸菌ＲＮａｓｅＨ（Gibco BRL社製）１ユニットを含む２０μｌの反応混合液に懸濁し、１６℃にて１時間インキュベートして、センス鎖ｃＤＮＡを合成し、磁気ビーズ固定２重鎖ｃＤＮＡを得た。さらに、１ユニット／μｌ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）０．５μｌを追加し、１６℃にて１０分間インキュベートして、５′末端の平滑化を徹底した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止し、２重鎖ｃＤＮＡビーズをＴＥ溶液５０μｌにて３回洗滌した。
【００３０】
［ｃＤＮＡ５′末端へのプロモーター配列の付加とセンス鎖ｃＤＮＡの分取（図１ステップ３および４）］
配列番号１で表される５２ｍｅｒの塩基配列からなるupper strandと、配列番号２で表される５０ｍｅｒの塩基配列からなるlower strandのオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡシンセサイザーを用いて常法により合成した。lower strandの５′末端はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を用いてリン酸化した。両鎖を常法によりアニールし、２重鎖とし、図２に示したＭＳＭＡＰ−５′−Ｔ７リンカーを得た。上記の２重鎖ｃＤＮＡビーズを６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、ＭＳＭＡＰ−５′−Ｔ７リンカー１μｇ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）３５０ユニットを含む２０μｌの反応混合液に懸濁し（最後に酵素液１μｌを加えて反応開始）、４℃にて１晩インキュベートし（ローテーターにて持続的に撹拌）、ＭＳＭＡＰ−５′−Ｔ７リンカーを２重鎖ｃＤＮＡの５′末端に連結した（図１ステップ３）。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止し、リンカー連結２重鎖ｃＤＮＡビーズをＴＥ溶液５０μｌにて３回洗滌した。続いて、同ビーズをＴＥ溶液２０μｌに懸濁し、９５℃にて５分間インキュベートして、熱融解によりセンス鎖ｃＤＮＡを解離させた。アンチセンス鎖ｃＤＮＡビーズを磁石に吸引し、センス鎖ｃＤＮＡを含む上清を分取した（図１ステップ４）。
【００３１】
［ｃＤＮＡ３′末端へのプロモーター配列の付加とアンチセンス鎖ｃＤＮＡの再合成（図１ステップ５）］
センス鎖ｃＤＮＡ溶液４μｌに、配列番号３で表される６８ｍｅｒの塩基配列からなる、ＳＰ６プロモーター配列を付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーＭＳＭＡＰ−３′−ＳＰ６プライマー５０ｎｇを加え、合計５μｌとした。９０℃にて３分間加熱した後、氷上にて急冷し、これに各終濃度２０ｍＭトリス塩酸（ＰＨ８．４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを加え、４２℃にて５分間プレインキュベートした後、さらにＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Gibco BRL社製SuperScriptII）２００ユニット（１μｌ）を加え２０μｌの反応混合液とした。４２℃にて１時間インキュベートして、アンチセンス鎖ｃＤＮＡを合成し、２重鎖ｃＤＮＡとした。反応終了後、ドライアイス上にて凍結させ、−２５℃に保管した。この状態で少なくとも１年間保存することができた。
【００３２】
［ｃＤＮＡ混成物の増幅（図１ステップ６）］
２段階のＰＣＲにより、ｃＤＮＡ混成物の増幅を行なった。プライマーとしては、２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列、すなわち配列番号４で表される２０ｍｅｒの塩基配列からなる５′ＰＣＲプライマー（図２）と、配列番号５で表される２０ｍｅｒの塩基配列からなる３′ＰＣＲプライマー（図２）を用いた。第１段階のＰＣＲは、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．２）、１０ｍＭ塩化カリウム、６ｍＭ硫酸アンモニウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ Triton X-100、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、上記２重鎖ｃＤＮＡ溶液２μｌ、５′ＰＣＲプライマー０．１ｎｍｏｌ、３′ＰＣＲプライマー０．１ｎｍｏｌ、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製Pfu DNAポリメラーゼ）３ユニットを含む１００μｌの反応混合液中で行なった。なお、ＰＣＲの条件は、９４℃にて１分間熱変性、５７℃にて２分間アニーリング、７２℃にて２分間伸長反応させるというサイクルを１５回繰り返すという条件で行なった。第２段階のＰＣＲは、第１段階のＰＣＲ産物混合液５μｌずつを５本のチューブに分注し、各チューブの他の組成は第１段階と同様の１００μｌの反応混合液中で行なった。なお、ＰＣＲの条件は、上記第１段階と同様の条件で行なった。５本の産物混合液（全ＲＮＡ１μｇの１／２００に相当）を１本に集め、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μｌと１０％ ＳＤＳ１０μｌとを加えて反応を停止した。ＴＥ飽和フェノール５００μｌによる抽出２回、ＴＥ飽和フェノール／クロロフォルム（５０：５０）５００μｌによる抽出２回、クロロフォルム５００μｌによる抽出２回の後、残された約４５０μｌの産物混合液に、キャリアーとしてグリコーゲン（Roche Diagnostics社製）２０μｇ（１μｌ）を加え、さらに５Ｍ酢酸アンモニウム２／３容（３００μｌ）、エタノール２容（１．５ｍｌ）を加え、氷上に１時間保管後、遠心により産物を回収した。沈殿を７０％エタノール１ｍｌにて洗滌した後、風乾し、ＴＥ溶液２０μｌに溶解した。以上の方法により、全ＲＮＡ１μｇの１／２００相当量を第２段階のＰＣＲに適用した場合、通常、約１０μｇの増幅ｃＤＮＡ混成物が得られることがわかった。図３に示すように、第２段階のＰＣＲの各サイクルにおける増幅ｃＤＮＡ混成物を１％アガロースゲルにて電気泳動後、エチジウムブロマイドにて蛍光染色すると、１２サイクル以上で約４０００ｂｐの長さに及ぶｃＤＮＡの増幅が認められた。上記のように、通常、第２段階のＰＣＲのサイクル数としては、合成量が飽和していない１５サイクル程度を用いた。また、図４に示すように、出発材料の全ＲＮＡは０．１ｎｇまで少量化が可能であった。これに含まれるｍＲＮＡを２ｐｇと仮定し、この全量を増幅した場合、理論上２ｍｇの増幅ｃＤＮＡが得られることになり、この段階までで１０9倍の増幅が可能であることが明らかになった。
【００３３】
［ｃＲＮＡ混成物の合成（図１ステップ７）］
上記増幅ｃＤＮＡ混成物を鋳型として、センス鎖およびアンチセンス鎖ｃＲＮＡをそれぞれＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて以下のように特異的に合成した。４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、１ｍＭ ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）、ＲＮａｓｅインヒビター（Roche Diagnostics社製）４ユニット、増幅ｃＤＮＡ混成物０．３μｇ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）４０ユニットを含む２０μｌの反応混合液を３７℃にて２時間インキュベートして、ｃＲＮＡを合成した。続いて、ＲＮａｓｅ活性を含まないＤＮａｓｅＩ（１０ユニット／μｌ Roche Diagnostics社製）２μｌを加え、さらに３７℃にて１５分間インキュベートすることにより鋳型ｃＤＮＡを分解し、最後に０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止した。続いて５Ｍ酢酸アンモニウム２／３容（１５．２μｌ）、エタノール２容（７６μｌ）を加え、氷上に１０分間保管後、遠心により産物を回収した。回収した産物（沈殿物）を７０％エタノール０．１ｍｌにて洗滌した後、風乾し、滅菌水１０μｌに溶解した。なお、上記の結果、増幅ｃＤＮＡ混成物０．３μｇから、通常、約１０μｇの増幅ｃＲＮＡ混成物が得られることがわかった。以上のことから、出発材料の１μｇの全ＲＮＡ（約２０ｎｇ ｍＲＮＡ）から起算してルーチンに１０8倍、０．１ｎｇの全ＲＮＡから出発した場合理論上最大で１０12倍の増幅が可能であると計算された。図５に示すように、増幅ｃＲＮＡ混成物を１％アガロース／ＭＯＰＳ酢酸／ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動後、エチジウムブロマイドにて蛍光染色すると、約２０００ｂの長さに及ぶｃＲＮＡの合成が認められた。
【００３４】
［増幅ｃＲＮＡ混成物のノーザンハイブリダイゼーション解析（図６）］
ラット初代培養肝細胞に由来する全ＲＮＡ２μｇ、およびその増幅センス鎖ｃＲＮＡ混成物０．３μｇを１％アガロース／ＭＯＰＳ酢酸／ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動後、ＲＮＡ蛍光バンドを検出し、さらに常法によりナイロンメンブレンにブロットした。アルギナーゼｃＤＮＡを鋳型にしてRoche Diagnostics社製のキットを用いてＤＩＧ標識したアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成し、これをプローブに用いてハイブリダイゼーションを行なった。同社のプロトコルに従い、アルカリフォスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体と化学発光基質CDP-Starを用い、発光シグナルをＸ線フィルムに検出した。約１．６ｋｂのアルギナーゼｍＲＮＡおよびセンス鎖ｃＲＮＡが検出された。
【００３５】
［標識ｃＲＮＡ混成物を用いたリバース−ノーザンハイブリダイゼーション解析（図７，８）］
クローン化遺伝子由来のｃＲＮＡをフィルターに固定し、これに、検体試料に由来する標識反対鎖ｃＲＮＡ混成物をハイブリダイズさせ、特定のｍＲＮＡのレベルを測定することを可能にする方法の原理を図７に、実験例を図８に示した。β−アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、およびアルギナーゼのｃＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写系によりアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成した。各ｃＲＮＡ０．５μｇを１％アガロース／ＭＯＰＳ酢酸／ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動後、常法によりナイロンメンブレンにブロットした。一方、１０-6Ｍデキサメサゾンおよび３×１０-8Ｍグルカゴンにて２時間処理あるいは無処理のラット初代培養肝細胞の全ＲＮＡに由来する増幅ｃＤＮＡ混成物を鋳型として、Roche Diagnostics社製のキットを用いてＤＩＧ標識したセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を合成した。同社のプロトコルに従い、アンチセンス鎖ｃＲＮＡブロットに対して、０．５μｇ／ｍｌのＤＩＧ標識センス鎖ｃＲＮＡ混成物を６８℃にて１晩反応させ、ハイブリダイズしたＲＮＡに由来するシグナルを化学発光としてＸ線フィルムに検出した。その結果、β−アクチン、Ｇ３ＰＤＨのｍＲＮＡレベルに変化が認められないのに対し、デキサメサゾンおよびグルカゴン処理によりアルギナーゼｍＲＮＡレベルが上昇するのが確認できた。
【００３６】
［ｃＤＮＡ混成物よりのｃＤＮＡライブラリーの作製（図９）］
ＰＣＲによる増幅前あるいは増幅後のｃＤＮＡ混成物は、その両端に構築された特殊な配列を利用して、pUC18/19、pGEM-3Zf(+)/(-)等のプラスミドベクターに一方向性に、かつ１コピーのみ挿入することが可能である。ｃＤＮＡ混成物の５′末端の配列
５′−ＣＣＧＧＡ・・・・・−３′
３′−ＧＧＣＣＴ・・・・・−５′
に対して、ｄＡＴＰとｄＴＴＰのみが存在し、ｄＣＴＰとｄＧＴＰが存在しない反応液中で、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを作用させると、その３′→５′エキソヌクレアーゼ活性により、
５′−ＣＣＧＧＡ・・・・・−３′
３′−Ｔ・・・・・−５′
の５′突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、pGEM-3Zf(+)/(-)等のポリリンカー部位をＡｖａＩにて消化した際形成される５′突出末端と相補的である。同様にして、ｃＤＮＡ混成物の３′末端の配列
５′−ＣＧＡ・・・・・−３′
３′−ＧＣＴ・・・・・−５′
に対して、
５′−ＣＧＡ・・・・・−３′
３′−Ｔ・・・・・−５′
の５′突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、pGEM-3Zf(+)/(-)等のポリリンカー部位をＡｃｃＩにて消化した際形成される５′突出末端と相補的である。この特質を利用して、各ｃＤＮＡを一方向性にプラスミドのＡｖａＩ−ＡｃｃＩ部位に挿入できる。また、各ｃＤＮＡの両端はリン酸化されていないため、ｃＤＮＡ同士の連結がおこらず、１コピーのみ挿入される。
【００３７】
以下に、前記増幅ｃＤＮＡ混成物をpUC19に挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した実験例を示す。５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．８）、７ｍＭ塩化マグネシウム、１５ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭメルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１ｍＭ ｄＴＴＰ、増幅ｃＤＮＡ混成物１．２μｇ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）２．５ユニットを含む１００μｌの反応混合液を３７℃にて５分間インキュベートして、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性によりｃＤＮＡの両３′端よりＣおよびＧヌクレオチド残基を除去した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４μｌを加えて反応を停止した。キャリアーとしてグリコーゲン（Roche Diagnostics社製）２０μｇ（１μｌ）を加え、ＴＥ飽和フェノール１００μｌによる抽出２回、ＴＥ飽和フェノール／クロロフォルム（５０：５０）１００μｌによる抽出２回、クロロフォルム１００μｌによる抽出２回の後、産物混合液に５Ｍ酢酸アンモニウム２／３容（６７ｍｌ）、エタノール２容（３３４ｍｌ）を加え、氷上に１０分間保管後、遠心により産物を回収した。回収した産物（沈殿物）を７０％エタノール０．５ｍｌにて洗滌した後、風乾し、ＴＥ溶液２０μｌに溶解した。一方、pUC19をＡｖａＩおよびＡｃｃＩにより消化し、アガロース電気泳動後、ベクター部分のバンドを含むゲルを切り出し、ＤＮＡをGlassmilk（Bio 101社製）を用いて精製した。ＡｖａＩ／ＡｃｃＩ末端構成ｃＤＮＡ混成物約５ｎｇとＡｖａＩ／ＡｃｃＩ消化pUC19約５ｎｇを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、常法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルをトランスフォームした。約２００コロニーのトランスフォーマントが得られ、そのうち無作為に選んだ１２クローンについて液体培養後プラスミドを抽出した。これをＣｌａＩおよびＨｉｎｄIIIにて消化し、１％アガロース電気泳動にて解析した。その結果を図９に示す。このことから、１１クローンにｃＤＮＡ由来と考えられるインサートが確認され、その長さは約２００〜１０００ｂｐであることがわかった。以上のことから、ｃＤＮＡ混成物１μｇを用いると、約４万クローンからなるｃＤＮＡライブラリーを、プラスミドをベクターに用いて容易に構築することが可能であることが明らかになった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法は、ヒトなど高等生物の限局された細胞、組織に由来する微量のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを増幅することが可能な汎用性を有する方法であり、本発明によると、磁気ビーズ上でのｃＤＮＡ合成、ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅と、それに続くインビトロＲＮＡ合成を組み合わせることにより、ｍＲＮＡの一億倍程度の増幅が容易にでき、ｃＤＮＡの増幅のみでも、単一細胞からのライブラリー調製が十分可能となり、限局された細胞からの各種ｃＤＮＡの単離にきわめて有用である。また、ｃＤＮＡの両端に連結したＴ７及びＳＰ６のプロモーター配列を利用し、センス鎖及びアンチセンス鎖両方のｃＲＮＡを特異的に合成することができ、サブトラクションクローニングや各鎖特異的標識プローブを調製することができる。かかる各鎖特異的標識プローブは、ＤＮＡマイクロアレイ等の高感度解析に極めて有用である。さらに、特異的に合成されたセンス鎖ｃＲＮＡを用いてタンパク質のインビトロ合成も可能となる。そして、ｃＤＮＡ各端の潜在的制限酵素認識部位構成配列により、プラスミドへの一方向かつ１コピーの挿入が可能であり、クローン化後の解析が容易となる。このように本発明は、微量試料に由来するｃＤＮＡの単離とその遺伝子発現解析に汎用性が高く、遺伝子資源の発見、開発に極めて有用である。
【００３９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微量ｍＲＮＡ増幅法により、ｃＤＮＡ混成物やｃＲＮＡ混成物を合成する、各工程別の概略を示す図である。
【図２】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法に用いられるリンカーやプライマーの構造を示す図である。
【図３】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により、全ＲＮＡからｃＤＮＡ混成物を増幅した結果を示す図である。第１段階のＰＣＲ産物混合液５μｌを用いて、第２段階のＰＣＲを１００μｌの反応混合液中で行った。各サイクル数の反応の後１０μｌを抜取り、アガロース電気泳動を行なってｃＤＮＡ混成物の増幅を解析した。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーを泳動した。
【図４】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により、段階希釈した全ＲＮＡからｃＤＮＡ混成物を増幅した結果を示す図である。用いた全ＲＮＡ量に相当する細胞の概数も示した。ＰＣＲは１段階のみで、４０サイクル行なった。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーを泳動した。
【図５】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により増幅したｃＤＮＡ混成物から、センス鎖およびアンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を合成した結果を示す図である。レーンＭは分子量マーカーとして全ＲＮＡを泳動した。
【図６】全ＲＮＡおよび増幅ｃＲＮＡ混成物のノーザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。レーン１および２は、ラット初代培養肝細胞由来の全ＲＮＡおよびその増幅センス鎖ｃＲＮＡ混成物を電気泳動後、蛍光染色した結果を示す。これらをブロット後、アルギナーゼｍＲＮＡおよびｃＲＮＡを検出した（レーン３および４）。
【図７】本発明におけるリバース−ノーザンハイブリダイゼーション解析の概要を示す図である。
【図８】リバース−ノーザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図９】増幅ｃＤＮＡ混成物を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、各クローンのインサートの長さを検定した結果である。レーン１２を除く全てのクローンにインサートが認められた。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーを泳動した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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