(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー同士またはポリマーと細胞表面との間に架橋を生じさせる性質を有する水溶性ポリマーと、触媒活性を有する細胞とを混合し、得られた混合物を水不溶性固体担体上にコーティングおよび乾燥して固定化生体触媒を製造する方法において、前記乾燥において乾燥温度と乾燥時間との関係が図１に示す囲いの範囲内にあることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記温度と乾燥時間との関係が図２の囲い内にあることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度と乾燥時間との関係が図３の囲い内にあることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記コーティング前の水不溶性固体担体の水分含量が３０％以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマーが、次の一般式：
【化１】
0003753607.tif 000011
（式中、Ｙは直接結合であるか、又は次の式：
【化２】
0003753607.tif 000012
により表わされる２価基であり、Ｒ1 及びＲ2 は相互に独立に水素原子又は有機残基であり、
【化３】
0003753607.tif 000013
は陰イオンを表わし、そしてｎは１００〜５０００の数である）
により表わされる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞がアスパルターゼを含有する菌体細胞である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固定化生体触媒の新規な製造方法、及び該固定化生体触媒の使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリマー同士またはポリマーと細胞表面との間に架橋を生じさせる性質を有する水溶性ポリマーと、触媒活性を有する細胞とを混合し、得られた混合物を水不溶性固体担体上にコーティングして固定化生体触媒を製造する方法において、ポリアゼチジン系ポリマーを使用する方法（特開平５−３４４８９８）、ポリアリルアミン系ポリマーを使用する方法（特開平１０−２８６０８７）などが開示されている。これらの方法では、水溶性のポリマーに細胞を懸濁し、これをイオン交換樹脂に混合して、ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下で乾燥させる方法が開示されている。
【０００３】
大量に固定化生体触媒を調製した場合、これらの方法では、乾燥のスケールや乾燥時間によって、得られる固定化生体触媒の活性が異なり、また固定床の触媒として使用した場合に短時間で活性が低下してしまうなどの問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は上記の欠点を解消した固定化生体触媒の大量製造方法を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく種々検討した結果、水不溶性固定化担体を水溶性ポリマーでコーティングする際の乾燥工程で、好ましくは該水不溶性固定化担体の水分量を３０％以下とした後、固定化生体触媒の水分含量を所定の温度と乾燥時間により乾燥することにより、固定化生体触媒が再現性良く調製でき、またその活性が長期間にわたって、安定に保たれることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
従って本発明は、ポリマー同士またはポリマーと細胞表面との間に架橋を生じさせる性質を有する水溶性ポリマーと、触媒活性を有する細胞とを混合し、得られた混合物を水不溶性固体担体上にコーティングおよび乾燥して固定化生体触媒を製造する方法において、前記乾燥を、乾燥温度と乾燥時間の関係が図１に示す囲いの範囲内にあることを特徴とする固定化生体触媒の製造方法を提供する。
本発明はまた、上記細胞としてアスパルターゼを含有する細胞を用いる固定化生体触媒にフマル酸とアンモニア、もしくはフマル酸アンモニウムを接触せしめることを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の固定化生体触媒において使用する担体としては、粒状物又はシート状物のいずれでもよく、例えば、粒状物としてはイオン交換樹脂、例えばアニオン交換樹脂である（オルガノ（株）製）アンバーライトＩＲＡ−９０４，ＩＲＡ−９４Ｓ、アンバーリストＡ−２６，Ａ−２７、カチオン交換樹脂である（オルガノ（株）製）アンバーライト２００Ｃ，２０１Ｂ，ＩＲＣ−５０，ＩＲＣ−７６等が使用される；無機担体、例えばモレキュラーシーブ、アルミナ、シリカ、シリカゲル等が使用される。粒状物の粒径は、０．１mm〜１０mmが好ましく、さらに好ましくは０．３mm〜３mmである。またシート状物としてはイオン交換膜やアルミナやシリカのシート等が使用される。シート状物の厚さは、０．０１mm〜１０mmが好ましくさらに好ましくは０．１mm〜５mmである。
【０００８】
本発明において細胞を固定化するために使用する樹脂としては、次の一般式：
【化４】
0003753607.tif 000002
（式中、Ｙは直接結合であるか、又は次の式：
【０００９】
【化５】
0003753607.tif 000003
により表わされる２価基であり、Ｒ1 及びＲ2 は相互に独立に水素又は有機残基であり、
【００１０】
【化６】
0003753607.tif 000004
は陰イオンを表わし、そしてｎは１００〜５０００の数である）
により表わされるポリマーが使用される。
【００１１】
式中、Ｒ1 及びＲ2 の有機残基としては、炭素数１０個以下のアルキル基が挙げられ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒ−ブチル基等であり、メチル基が特に好ましい。さらに、ハロゲンやヒドロキシルの置換した有機残基を使用することができ４−クロロ−２−ジメチルペンチル基、３−エチル−２，５−ジクロロヘプチル基、２−ヒドロキシ−３，５−ジメチルノニル基などであり、特に、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル基が好ましい。
【００１２】
Ｘ- としてはハロゲンイオン、例えばＦ- 、Ｃｌ- 、Ｂｒ- 、Ｉ- が挙げられ特にＣｌ- が好ましい。さらに、他の一価の陰イオン、例えばＮＯ3 - などを使用することもできる。ｎは好ましくは１００〜５０００である。具体的なポリマーとしては、次の構造式により示されるものが挙げられる。
【００１３】
【化７】
0003753607.tif 000005
【００１４】
式（Ａ）のポリマーは、例えば商品名ＰＡＳ４１０として、式（Ｂ）のポリマーは例えば商品名ＰＡＳ９２として、式（Ｃ）のポリマーは例えば商品名ＰＡＳ−Ｍ−１として、式（Ｄ）のポリマーは例えば商品名ＰＡＳ−８８０として、式（Ｅ）のポリマーは例えば商品名ＰＡＳ−Ｈ−５Ｌとして、日東紡績株式会社から入手することができる。また、例えば式（Ａ）のポリマーは、ジアリルアミン塩（例えば塩酸塩）とマレイン酸の１：１共重合により製造することができ、式（Ｂ）のポリマーはジアリルアミン塩（例えば塩酸塩）と亜硫酸ガスとの共重合又はラジカル重合により、式（Ｃ）のポリマーはジアリルモノアルキルアミンの共重合又はラジカル重合により、製造することができる。
【００１５】
さらに、本発明の固定化に使用する水溶性架橋性ポリマーとして、下記の式：
【化８】
0003753607.tif 000006
により示されるポリキャップ（ハーキュレス社製ポリキャップ１７２等）を使用することもできる。
【００１６】
本発明で使用する細胞としては、所望の酵素を含有する任意の細胞を使用することができ、例えば細菌、酵母、藻類、糸状菌等の微生物細胞、植物細胞等が使用できる。酵素としては、特に限定されないが、例えばフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換するアスパルターゼ、マレイン酸をフマル酸に転換するマレイン酸イソメラーゼ、フマル酸をＬ−リンゴ酸に転換するフマラーゼ、マレイン酸をＤ−リンゴ酸に転換するマレアーゼ、シスエポキシコハク酸をＬ−酒石酸に転換するヒドラターゼ等、種々の酵素が挙げられる。より具体的な細胞の例として、アスパルターゼを含有する細菌細胞、マレイン酸イソメラーゼを含有する細菌細胞、アスパルターゼとマレイン酸イソメラーゼの両方を含有する細菌細胞等が使用される。
【００１７】
本発明において使用する細胞はさらに、上記のごとき酵素をコードする遺伝子を遺伝子工学的に導入した宿主細胞であってもよい。
さらに、具体的には、例えば次のような微生物の細胞を使用することができる。
【００１８】
【表１】
0003753607.tif 000007
【００１９】
これら微生物の細胞を培養した培養液に先の一般式（化４）で示されるポリマーを低濃度で添加すると、培養菌体を凝縮沈降させることができ、大量の培養液を遠心分離にかける必要がなくなるため操作が簡易となる。具体的には、固定化する微生物を培養した培養液に、先の一般式（化４）で示されるポリマーを固型分濃度として１０〜１００００ppm になるように、好ましくは１００〜１０００ppm になるように添加し、静置すると微生物菌体が凝集し、沈降する。この時、あらかじめ培養液を冷却しておけば、目的の酵素活性の低下を防ぐのに有効である。
【００２０】
このようにして、微生物菌体を沈降させた後、上澄みを抜き出すことによって液量を数分の１に減らすことが出来る。例えば、１Ｌの培養液にＰＡＳ−８８０を５００ppm 添加して、３０分静置すると、約８００mlが上澄みとして分離される。残りの菌体凝集液を３０００rpm の低速遠心分離器にかけると、菌体をケーキとして回収することが出来る。このように凝集した菌体は低速遠心機でも十分に遠心分離できるため、簡易な装置で菌体が回収出来るようになる。
【００２１】
回収した菌体はそのまま、あるいは水を追加して、pH調節したポリマー溶液と混合することによって固定化の材料として使用することができる。また、菌体を回収後、凍結保存していたものを解凍後または凍結ブロック状の菌体を粗く砕いた後に、ミキサーでポリマーと混合して使用することもできる。この凍結菌体とポリマーの混合物は、やわらかいシャーベット状で非常に冷えているために、室温でも特別な冷却操作をせずに固定化作業を行うことができ、酵素の活性を維持する点でも好ましい。
【００２２】
細胞の固定に当っては１種類の細胞を固定することもでき、又は複数種類の細胞を固定することもできる。例えば、マレイン酸イソメラーゼを含有する細菌細胞とアスパルターゼを含有する細菌細胞とを組合せて固定することができる。
細胞の固定化方法は、まず弱酸性にした液状のポリマーを水と混合し、pHを中性〜塩基性にした後、細胞を混合する。この細胞とポリマーの混合物を固体担体にまぶしたものを乾燥させればよい。まぶす方法としては、適当な大きさの容器中で棒、へら等による攪拌及び手で直接かき混ぜることによって、細胞とポリマーの混合物を担体と均一に混合する。
【００２３】
固定化すべき細胞とポリマーの比率は細胞（ウェット）１kgに対してポリマー固形分０．２〜１０kg、好ましくは０．５〜５kgの範囲である。ポリマーと細胞との混合物を調製する場合に添加する水の量は、乾燥を早く行うためにはできるだけ少ないほうが好ましく、細胞が懸濁できる量であればよい。通常、細胞１kg（ウェット）あたり０．１〜２kg、好ましくは０．３〜１kgである。
【００２４】
固定化の担体をあらかじめ乾燥させておくと、乾燥時間が短くなるので好ましい。担体の乾燥は、ロータリーエバポレーター、流動床乾燥機、温風乾燥機、棚段乾燥機、噴霧乾燥機、トンネル乾燥機、ナウタミキサー、流動層乾燥機、真空乾燥機、気流乾燥機など常用の乾燥機で、担体の変質が起こらない温度範囲であればよく、担体の重量に対して、３０重量％以下、好ましくは２０％以下、さらにこのましくは１０％以下にまで乾燥することが好ましい。
【００２５】
このように、担体を事前に乾燥させておくと、水溶性のポリマーと菌体の混合物を担体と混合したときに、担体内部に混合物中の水が吸い込まれることによって、担体表面に水溶性ポリマーと菌体混合物がはりつき、一次コーティングを行うことができる。このときの固定化混合物の状態は粘質性が比較的低い状態となるため、その後の乾燥を短時間に行うことができ、結果として得られる固定化生体触媒の活性を高くすることができる。
【００２６】
固定化担体に細胞とポリマーとの混合物をまぶす方法としては、適当な大きさの容器のなかで棒、へら等による攪拌、及び手で直接かき混ぜることによって、細胞とポリマーの混合物を均一に混合する。またこの混合の操作を通常の混合に用いられる装置を用いて行うこともできる。混合の装置としては、リボンミキサー、ニーダーなどのミキサー、特にプラネタリー型ミキサーなど、パン生地を練るのに用いられるような、粘質物を混合できるミキサーであればいずれも好適にもちいることができる。装置としてはたとえば愛工舎製作所製の実験用卓上ミキサーＫＭ−６００にフック型あるいはビーター型の攪拌子をつけたものなどが例示することができる。
【００２７】
固定化の際の乾燥は固定化生体触媒中の水分が２０重量％以下、より好ましくは１０％以下になるまで、例えばロータリーエバポレーター、流動床乾燥機、温風乾燥機、棚段乾燥機、噴霧乾燥機、トンネル乾燥機、ナウタミキサー、流動層乾燥機、真空乾燥機、気流乾燥機などを使用して行う。この範囲より水分が多いと、固定化生体触媒を固定床で使用した場合、短期間で活性が低下してしまう。
【００２８】
ポリマーでの被覆層はゲル状態であるが、乾燥が不十分な場合、このゲル層が厚くなり、ポリマー同士、ポリマーと細胞表面の架橋が緩くなるため、固定化後、固定床の触媒として使用した場合に細胞内の酵素が菌体とポリマーからなっているゲル状の被覆層から漏れ出し、固定化生体触媒の活性が短期間で低下してしまう。このゲル状の被覆層を酵素が漏れ出ない状態まで架橋させるために先の範囲になるまで乾燥を行う。
【００２９】
本発明の方法における乾燥温度と乾燥時間と固定化酵素の活性との関係を図３に示す。図中、黒丸印は本発明の範囲内の乾燥温度と乾燥時間との組合せであり、×段は本発明の範囲外の乾燥温度と乾燥時間との組合せである。この図において、囲で示す範囲内の乾燥温度と乾燥時間の組合せの範囲内で有用な固定化酵素が得られることが実証された。
【００３０】
しかしながら図１に示す囲いの高温及び長時間側において固定化酵素が２１００Ｕ〜３２００Ｕという実用性のある酵素活性を示すことから、図３における高温及び長時間側の折線よりもさらに高温及び長時間側においても有用な固定化酵素が得られることが明らかである。また、低温及び短時間側においては、酵素の失活はより少ないのであるから、図３の低温及び短時間側の折線よりもさらに低温及び短時間において、有用な酵素が得られることは明らかである。従って、本願発明における乾燥温度と乾燥時間の範囲は図１又は図２により示される。
このようにして固定した後の細胞を含むポリマー層の厚さは、０．００１〜０．３mm、好ましくは０．００５〜０．２mmである。
【００３１】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
参考例１．アスパルターゼ遺伝子を導入した組換え宿主細胞の調製
（１）Eschelichia coliアスパルターゼ組み換え体の作成
財団法人醗酵研究所から購入した大腸菌（Eschelichia coli）ＩＦＯ３３０１株を表１に示すＬＢ培地に接種して、３７℃で８時間培養した。この培養液１mlから菌体を回収し、蒸留水１mlに懸濁した。この菌体懸濁液１μｌをアスパルターゼ遺伝子を増幅するための鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００３２】
【表２】
0003753607.tif 000008
【００３３】
（２）ＰＣＲでのアスパルターゼ遺伝子の増幅と挿入断片の作成公知の大腸菌（Eschelichia coli）Ｋ−１２株のアスパルターゼ遺伝子（該遺伝子の塩基配列及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列は、特開平１１−３１３６９４号に記載されている）（Biochem.J.237(2), 547-557)をもとに大腸菌（Eschelichia coli）のアスパルターゼ遺伝子を増幅するために以下の２つのプライマーを作成した。
プライマーＦ１：ＧＧＡＴＡＡＴＣＧＴＣＧＧＴＣＧＡＡＡＡ
プライマーＲ１：ＣＧＴＣＡＴＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＴＴ
【００３４】
ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、下記の組成の反応液を調製し、ＰＣＲでのアスパルターゼ遺伝子の増幅を行った。
【表３】
0003753607.tif 000009
【００３５】
ＰＣＲ条件：９８℃  ５分；９８℃  ３０秒；５３℃  ３０秒；６８℃  １分；からのサイクルを３０回繰り返す。ＰＣＲの反応終了後、増幅されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで電気泳動、エチジウムブロマイド染色したところ、予想された約１６００bpの断片が増幅されていた。この断片をアガロースゲルから切り出して、Prep-A-Gene (Bio Rad）でＤＮＡを回収した。
【００３６】
（３）ベクターへの挿入断片の結合pCR-ScriptAmpSK （＋）クローニングベクターに制限酵素ＳｒｆとＤＮＡリガーゼの存在下、先に回収したＤＮＡ断片を結合させた。この挿入ＤＮＡ断片を入れた形質転換体の一つをPUaspE1 株と命名した。このPUaspE1 株をアンピシリン１００ppm を添加したＬＢ培地３mlに接種し、３７℃で一夜振とう培養し、その培養液１．５mlから菌体を回収した。この菌体から、アルカリＳＤＳ法によってプラスミドを回収した。このプラスミドをpUaspE1 と命名した。
【００３７】
このプラスミドの挿入断片の配列を解析したところベクターのプロモーターに対して逆向きにアスパルターゼ遺伝子が挿入されていることがわかった。プロモーターに対して、順向きにつなぎ直すために、プラスミドpUaspE1 から制限酵素SacIとBamHI で挿入断片を切り出し、pUC19 に導入することにした。プラスミドpUaspE1 を制限酵素BamHI で切断した後エタノール沈殿によってＤＮＡを回収し、次いで制限酵素SacIで切断した。切断したＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで電気泳動することによって分離し、ゲルから切り出してprep-A-Gene (bio rad) でＤＮＡを回収した。
【００３８】
（４）ベクターの作成プラスミドpUC19 （ニッポンジーン製）１μｇを制限酵素BamHI で切断後、エタノール沈殿によってＤＮＡを回収し、次いで制限酵素SacIで切断した。切断したＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで電気泳動することによって分離し、ゲルから切り出してprep-A-Gene (bio rad) でＤＮＡを回収してベクターとした。
【００３９】
（５）ベクターへの挿入断片の結合制限酵素で切断したベクターと挿入断片をライゲーションハイ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて１６℃、３０分結合させた。
【００４０】
（６）大腸菌の形質転換ベクターと挿入断片を結合させた反応液２μｌを大腸菌コンピテントセル（XL 2-Blue MRF' Ultracompitent cells STRATAGENE社製）２００μｌに入れ、大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリン１００ppm を含有するＬＢ寒天培地に広げて３７℃、一夜培養した。コントロールとして、挿入断片を挿入していないプラスミドpUC18 で形質転換し、同様にアンピシリン１００ppm を含有するＬＢ寒天培地に広げて３７℃で一夜培養した。
【００４１】
出現したコロニーを２０個釣り上げ、アンピシリン１００ppm を含有するＬＢ培地に接種して、３７℃で振とう培養した。８時間後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を１mMの濃度に添加して、さらに一夜３０℃で振とう培養し、培養液１mlから菌体を回収した。同様に、挿入断片をもたないコントロールの形質転換体１株を培養し、菌体を回収した。この回収した菌体に表２に示すフマル酸アンモニウム基質液１mlを添加して、菌体を懸濁させ、３０℃で１時間反応させた。
【００４２】
【表４】
0003753607.tif 000010
【００４３】
反応液を分析したところ、挿入断片を入れた大腸菌形質転換体は、Ｌ−アスパラギン酸への転化率９９．５％であった。一方挿入断片を入れていないコントロールの形質転換体は転化率５％であった。この挿入断片を入れた形質転換体の一つをPUaspE2 と命名した。
【００４４】
PUaspE2 をアンピシリン１００ppm を添加したＬＢ培地３mlに接種し３７℃で８時間培養した。この培養液１．５mlからアルカリＳＤＳ法によってプラスミドを回収した。このプラスミドをpUaspE2 と命名した。プラスミドpUaspE2 を制限酵素SmaI、ついで制限酵素HindIII で切断後、１％アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡ断片の大きさを計算したところ、約２９６０bpと１６００bpの２本の断片が存在していた。
【００４５】
PUaspE2 株をアンピシリン１００ppm を添加したＬＢ培地３mlに接種し、３７℃で振とう培養し、８時間後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を１mMの濃度に添加して、さらに一夜３０℃で振とう培養した。この培養液１mlから菌体を回収するとともに菌体濃度ＯＤ６６０nmを測定したところ８．０であった。この菌体を２０％フマル酸アンモニウム基質液１０mlに懸濁し、３０℃で１時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣ分析した。生成したＬ−アスパラギン酸と菌体濃度から、アスパルターゼ活性を計算したところ、２，０００，０００μＭ−Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ＯＤ６６０nm菌体濃度であった。
【００４６】
同様に、挿入断片をもたないコントロールの形質転換体１株を培養し、菌体を回収するとともに菌体濃度ＯＤ６６０nmを測定したところ８．５であった。この菌体を２０％フマル酸アンモニウム基質液１０mlに懸濁し、３０℃で１時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣ分析した。生成したＬ−アスパラギン酸と菌体濃度から、アスパルターゼ活性を計算したところ、１０，０００μＭ−Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ＯＤ６６０nm菌体濃度であった。このように取得したPUaspE2 株は挿入アスパルターゼ遺伝子を持たない株の２００倍のアスパルターゼ活性を有していた。
【００４７】
（７）組み換え体の培養大腸菌（Eschelichia coli）のアスパルターゼの組換え大腸菌PUaspE2 株を表１に示す培地にアンピシリン１００ppm を含む培地３mlを入れた試験管１０本に接種して３７℃で８時間培養後、同組成の培地にＩＰＴＧを１mMを添加した培地１００mlを入れた坂口フラスコ１０本にそれぞれ１本ずつ接種し、３０℃で一夜振盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ１．８５moles Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ｇ菌体であった。
【００４８】
実施例１．
大腸菌（Eschelichia coli）アスパルターゼ組み換え大腸菌pUasp-E2株を表１に示す培地にアンピシリン１００ppm を含む培地３mlを入れた試験管１０本に接種して３７℃で８時間培養後、表３の培地にＩＰＴＧ１mMとアンピシリン１００ppm を添加した培地１００mlを入れた坂口フラスコ１０本にそれぞれ１本ずつ接種し、３０℃で一夜振盪培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ１．９moles Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ｇ菌体であった。
【００４９】
ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリでpH７．０付近にしたもの１２０ｇ及び脱イオン水２４０ｇをよく混合し、先に回収した菌体２７０ｇを均一に分散させた。これをあらかじめ乾燥させておいたイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９６ＳＢＣｌ型オルガノ社製、平均粒径０．５mm  水分含量６％）２Ｌに混合してコーティングし、ステンレス製のバットに広げた。
【００５０】
このバットを４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２８％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は１５％であった。この固定化生体触媒の活性値は４５００Ｕであった。なお、本発明において、固定化生体触媒の活性値は、「１Ｕ＝１μmol Ｌ−アスパラギン酸生成／１分／ml固定化生体触媒」と定義する。
【００５１】
この固定化生体触媒を、２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．３）に４℃で一晩浸漬したのち、その１０mlを直径１cmのカラムに充填した。固定化アスパルターゼの充填層長さは約１２．７cmであった。このカラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の基質液（１Ｌ中に２００ｇのフマル酸、２００ｇの２５％アンモニア水、０．２５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びアンモニアでpH８．３に調製）を断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時３００mlの速度（ＬＨＳＶ＝３０）で流通させ連続反応を行った。
【００５２】
反応開始後３時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．７７％であった。このとき流出液の温度は３３℃であった。また反応開始後７日目、１ヶ月後の変換率も９９．７％を維持していた。
【００５３】
実施例２．
実施例１と同様にして菌体培養し５０℃の温風乾燥機を用いて１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１７％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は９％であった。
【００５４】
この固定化アスパルターゼの活性は５０００Ｕであった。調製した固定化アスパルターゼを、２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．３）に４℃で一晩浸漬したのち、その１０mlを直径１cmのカラムに充填した。固定化アスパルターゼの充填層長さは約１２．７cmであった。このカラムを使用して実施例１と同様にして連続反応を行った。基質液の温度は２０℃で、またその流通速度は毎時３００ml（ＬＨＳＶ＝３０．０）で行った。反応開始後３時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．６％であった。このとき流出液の温度は３３℃であった。また反応開始後７日目、１ヶ月後の変換率も９９．５％を維持していた。
【００５５】
実施例３．
実施例１と同様にして菌体培養し５５℃の温風乾燥機を用いて１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１０％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は６％であった。
【００５６】
この固定化アスパルターゼの活性は４７００Ｕであった。調製した固定化アスパルターゼを、２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．３）に４℃で一晩浸漬したのち、その１０mlを直径１cmのカラムに充填した。固定化アスパルターゼの充填層長さは約１２．７cmであった。このカラムを使用して実施例１と同様にして連続反応を行った。
【００５７】
基質液の温度は２０℃で、またその流通速度は毎時３００ml（ＬＨＳＶ＝３０．０）で行った。反応開始後３時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．６％であった。このとき流出液の温度は３３℃であった。また反応開始後７日目、１ヶ月後の変換率も９９．５％を維持していた。
【００５８】
実施例４．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを８０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１７％であり、その活性は５２００Ｕであった。
【００５９】
実施例５．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１００℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１０％であり、その活性は５５００Ｕであった。
【００６０】
実施例６．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１２０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は５３００Ｕであった。
【００６１】
実施例７．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１４０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は４４００Ｕであった。
【００６２】
実施例８．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１６０℃の温風で２分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は３２００Ｕであった。
【００６３】
実施例９．
実施例１と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１８０℃の温風で１分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は５％であり、その活性は２６００Ｕであった。
【００６４】
実施例１０．
実施例１と同様にしてEschelichia coliアスパルターゼ組み換え大腸菌pUasp-E2株を培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ２．０moles Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ｇ菌体であった。
【００６５】
ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリでpH７．０付近にしたもの１２０ｇ及び脱イオン水１２０ｇをよく混合し、先に回収した菌体２７０ｇを均一に分散させた。これをあらかじめ乾燥させておいたイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９６ＳＢＣｌ型オルガノ社製、平均粒径０．５mm  水分含量６％）２Ｌに混合してコーティングし、ステンレス製のバットに広げた。このバットを４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２１％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は１０％であった。この固定化生体触媒の活性値は４８００Ｕであった。
【００６６】
実施例１１．
実施例１と同様にしてEschelichia coliアスパルターゼ組み換え大腸菌pUasp-E2株を培養した。この培養液から、菌体を遠心分離によって回収した。この菌体のアスパルターゼ活性を測定したところ２．０moles Ｌ−アスパラギン酸生成／ｈｒ／ｇ菌体であった。
【００６７】
ＰＡＳ−８８０（日東紡績製）をアルカリでpH７．０付近にしたもの１２０ｇ及び脱イオン水６０ｇをよく混合し、先に回収した菌体２７０ｇを均一に分散させた。これをあらかじめ乾燥させておいたイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９６ＳＢＣｌ型オルガノ社製、平均粒径０．５mm  水分含量６％）２Ｌに混合してコーティングし、ステンレス製のバットに広げた。このバットを４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。１時間後、固定化混合物の粘性がなくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２０％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は１０％であった。この固定化生体触媒の活性値は５０００Ｕであった。
【００６８】
実施例１２．
実施例１０と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを８０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は１７％であり、その活性は５４００Ｕであった。
【００６９】
実施例１３．
実施例１０と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１００℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は９％であり、その活性は５６００Ｕであった。
【００７０】
実施例１４．
実施例１０と同様にして菌体培養し、固定化混合物を調製した。この固定化混合物約１０mlを１２０℃の温風で３分処理して乾燥を行った。この処理によって固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は５３００Ｕであった。
【００７１】
実施例１５．
乾燥時間を１０分にした以外は実施例４と同様にして固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は２６００Ｕであった。
【００７２】
実施例１６．
乾燥時間を７分にした以外は実施例５と同様にして１００℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は２１００Ｕであった。
【００７３】
実施例１７．
乾燥時間を５分にした以外は実施例６と同様にして１２０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は２８００Ｕであった。
【００７４】
実施例１８．
乾燥時間を５分にした以外は実施例７と同様にして１４０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は３２００Ｕであった。
【００７５】
実施例１９．
乾燥時間を３分にした以外は実施例８と同様にして１６０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は２９００Ｕであった。
【００７６】
実施例２０．
乾燥時間を２分にした以外は実施例８と同様にして１８０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は２５００Ｕであった。
【００７７】
実施例２１．（４５℃乾燥、短時間）
実施例１０と同様にして培養した菌体と水溶性ポリマー、イオン交換樹脂を混合したものを調製した。このうちの１０mlをとり、全体をかき混ぜながらドライヤーの温風を当てて４５℃で１０分間、送風加熱乾燥を行った。５分後、全体が粘性の無いさらさらの状態となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２７％であった。乾燥１０分後の固定化生体触媒の水分含量は１６％であり、その活性は５５００Ｕであった。
【００７８】
実施例２２．（４５℃乾燥、長時間）
実施例１０と同様にして培養した菌体と水溶性ポリマー、イオン交換樹脂を混合したものを調製した。ステンレス製のバットに広げ、４５℃の恒温器に入れて１時間に１回切り返しながら、送風無しで８時間乾燥を行った。５時間目に全体が粘性の無いさらさらの状態となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２５％であった。乾燥７時間後の固定化生体触媒の水分含量は１９％であり、その活性は１９００Ｕであった。
【００７９】
実施例２３．
未乾燥のイオン交換樹脂を用いた以外は実施例１と同様にして菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂の混合を行った。用いたイオン交換樹脂の水分含量は６０重量％であった。
【００８０】
菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂を混合したもの（固定化混合物）は、調製直後はペースト状であり若干の流動性を有していた。この固定化混合物の１／１０をステンレス製のバットに薄く広げ、４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を４時間行った。この処理によって１時間後に固定化混合物の粘性が少なくなり、さらさらの粒状となった。この時の固定化生体触媒の水分含量は２３％であった。乾燥４時間後の固定化生体触媒の水分含量は１３％であり、その活性は３４００Ｕであった。
【００８１】
参考例２．（未乾燥のイオン交換樹脂を用いた例）
未乾燥のイオン交換樹脂を用いた以外は実施例１と同様にして菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂の混合を行った。用いたイオン交換樹脂の水分含量は６０重量％であった。
【００８２】
菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂を混合したもの（固定化混合物）は、調製直後はペースト状であり若干の流動性を有していた。これをステンレス製のバットに広げ、４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を１０時間行った。１時間後は、固定化混合物の粘性が高く、乾燥が十分に進行せず、その水分含量は６１％であった。さらに乾燥を継続し乾燥７時間でさらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２８％であった。乾燥６時間後の固定化生体触媒の水分含量は１５％であった。この固定化生体触媒の活性値は９００Ｕであった。
【００８３】
参考例３．（未乾燥のイオン交換樹脂を用いた例、菌体懸濁時の水の量半分）菌体を均一に分散させるのに使用する脱イオン水の量を１２０ｇにした以外は比較例１と同様にして菌体、水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂の混合を行った。
【００８４】
菌体及び水溶性ポリマーの混合物とイオン交換樹脂とを混合したもの（固定化混合物）は、調製直後は柔らかいペースト状であった。これをステンレス製のバットに広げ、４５℃の温風乾燥機に入れて、１時間に１回かき混ぜながら固定化生体触媒の乾燥を６時間行った。１時間後は、固定化混合物の粘性が高く、乾燥が十分に進行せず、その水分含量は５１％であった。さらに乾燥を継続し乾燥３時間でさらさらの粒状となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２３％であった。乾燥６時間後の固定化生体触媒の水分含量は１３％であった。この固定化生体触媒の活性値は５００Ｕであった。
【００８５】
比較例１．
乾燥時間を３０分にした以外は実施例４と同様にして８０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は９００Ｕであった。
【００８６】
比較例２．
乾燥時間を２０分にした以外は実施例５と同様にして１００℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は８％であり、その活性は６５０Ｕであった。
【００８７】
比較例３．
乾燥時間を１５分にした以外は実施例６と同様にして１２０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は３００Ｕであった。
【００８８】
比較例４．
乾燥時間を１５分にした以外は実施例７と同様にして１４０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は８００Ｕであった。
【００８９】
比較例５．
乾燥時間を１０分にした以外は実施例８と同様にして１６０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は５００Ｕであった。
【００９０】
比較例６．
乾燥時間を６分にした以外は実施例８と同様にして１８０℃の温風で固定化生体触媒の調製を行った。この固定化生体触媒の水分含量は６％であり、その活性は検出されなかった。
【００９１】
比較例７．（４５℃乾燥、長時間）
実施例１０と同様にして培養した菌体と水溶性ポリマー、イオン交換樹脂を混合したものを調製した。ステンレス製のバットに広げ、４５℃の恒温器に入れて２時間に１回切り返しながら、送風無しで１０時間乾燥を行った。６時間目に全体が粘性の無いさらさらの状態となった。このときの固定化生体触媒の水分含量は２５％であった。乾燥１０時間後の固定化生体触媒の水分含量は１９％であり、その活性は２００Ｕであった。
【００９２】
比較例８．（４５℃乾燥、短時間）
実施例１０と同様にして培養した菌体と水溶性ポリマー、イオン交換樹脂を混合したものを調製した。このうちの１０mlをとり、全体をかき混ぜながらドライヤーの温風を当てて４５℃で５分間、送風加熱乾燥を行った。５分後、全体が粘性の無いさらさらの状態となった。この固定化生体触媒の水分含量は２７％であり、その活性は５５００Ｕであった。この乾燥が不充分な固定化生体触媒を、２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．３）に４℃で一晩浸漬したのち、その１０mlを直径１cmのカラムに充填した。
【００９３】
固定化アスパルターゼの充填層長さは約１２．７cmであった。このカラムの外部を発泡ポリスチレンの保温材で保温することによって反応器を断熱した。このカラムに、２０℃の恒温水槽で保温した２０℃の基質液（１Ｌ中に２００ｇのフマル酸、２００ｇの２５％アンモニア水、０．２５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ及びアンモニアでpH８．３に調製）を断熱材を巻いたテフロンチューブを通して、毎時３００mlの速度（ＬＨＳＶ＝３０）で流通させ連続反応を行った。
【００９４】
反応開始後３時間目に反応液の分析を行ったところ、反応生成物として、消費されたフマル酸とほぼ等モルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９９．７７％であった。このとき流出液の温度は３３℃であった。反応開始後１ヶ月目の転化率は８７％、４ヶ月目には６５％まで低下した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法における乾燥温度と乾燥時間との許容される組合せの範囲を示す。
【図２】図２は、本発明の方法における乾燥温度と乾燥時間との好ましい組合せの範囲を示す。
【図３】図３は、本発明の方法における乾燥温度と乾燥時間との最も好ましい範囲を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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