(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
澱粉、蛋白質および脂質の少なくとも一種の成分を含有する食品を蛍光色素で染色した後、蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmより低波長領域で観察することを特徴とする、多成分分散系食品の組織構造を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、澱粉、蛋白質、脂質等を含有する多成分分散系食品の組織構造を解析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
澱粉、蛋白質および脂質は食品の三大栄養素と云われている。パン類、麺類、米飯、菓子類、天ぷらなどの二次加工食品は小麦粉、米を主原料としており、これらに含まれる三大栄養素成分が食品中にどのような形態で存在しているかによって味覚、食感が大きく変るものと考えられている。従来これらの味覚、食感の評価はもっぱら官能検査によって行われていたが、近年機器類を用いて食品の組織構造を解明し、その組織構造から食感等を判別することが試みられている。しかしながら、これらの機器類によって組織構造を観察しても各構成成分の境界部が不鮮明であったり、得られる画像が平面的であるため満足し得る評価が行えないのが現状である。
【０００３】
例えば電子顕微鏡による場合は標本に電子を飛ばして反射してきた電子を検出して標本の形を観察（走査型電子顕微鏡）するが、この方法は非常に高い分解能で標本を観察することができる反面、染色ができないために特定成分の判別が困難であり、その境界部分の構造解析をすることができない。
光学顕微鏡による場合は、標本の特定成分の染色を行い観察するが、やはり境界部分が不鮮明であり、さらに多重染色によりある程度の色分けはできるが、染色による特異性が小さく、かつ染色剤のオーバーラップによって組織構造の判別が実質的にできなかった。
また、レーザー共焦点顕微鏡による場合は、レーザー光を採用することで、直進性に優れた強い光を一点に集中させることができる。そのレーザー光を利用し、合焦点のみの像を表示でき、また、焦点深度の深い断面像が得られるため、コントラストの高い画像が得られる利準がある。しかしながらその反面、染色ができないため得られた画像から特定成分の判別が難しく、その境界部分の構造解析をすることが困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は澱粉、蛋白質および脂質を含有する多成分分散系食品の複雑な組織構造を立体的に視覚化が可能な画像解析方法について種々研究を重ねた結果本発明を完成するに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、澱粉、蛋白質および脂質の少なくとも一種の成分を含有する食品を蛍光色素で染色した後、蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmより低波長領域、好ましくは−５０nmより低波長領域、さらに好ましくは−７０nmより低波長領域で観察する、多成分分散系食品の組織構造を解析する方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、澱粉、蛋白質および脂質の少なくとも一種の成分を含有する食品を蛍光色素で染色する。
染色剤として使用する蛍光色素としてはフルオレセイン−イソチオシアネート(Fluorecein-isothiocyanate)、エオシン−イソチオシアネート(Eosin-isothiocyanate)、ルシファー  イエローＣＨ(Lucifer Yellow CH)、レゾルフィン(Resorufin)、テトラメチルローダミン−イソチオシアネート(Tetramethylrhodamin-isothiocyanate)、クマリン  マレイン酸イミド(Coumarin maleimide)、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸(7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid)、フルオレスカミン(Fluorescamine)、塩化ダンシル(Dansyl chroride)、ダンシルヒドラジン(Dansyl hydrazine)、アシッド  グリーン(Acid Green)、アクリジン  オレンジ(Acridine Orange)、アクリジン  イエロー(Acridine Yellow)、コンゴ  レッド(Congo Red)、酸性フクシン(Acid Fuchsin)、ナイル  ブルー(Nile Blue)、ファース  グリーンFCF(Fast Green FCF)、カルセイン(Calcein)、カルセイン  ブルー(Calcein Blue)、アクリフラビン(塩基性)(Acriflavine(base))、エバンス  ブルー(Evans blue)、ローダミン１２３(Rhodamine 123)、ズダン  ブラックＢ(Sudan Black B)等が挙げられる。
【０００７】
本発明は、目的とする食品の成分を特異的に染色する蛍光色素を用いて染色する。例えば澱粉を染色する蛍光色素としてはコンゴレッド、過ヨウ素酸シッフ等が挙げられる。蛋白質を染色する蛍光色素としてはフルオレスカスミン、酸性フクシン、塩基性パラローズアニリン、パラローズアニリンアセテート、ベーシックルビン、アゼンタIII、アニリンブルー、アルファズリンＡ、アルファズリンＦＧ、パテントブルーＶＦ、トリ−（ｐ−アミノフェニル）アミン、トリ−（ｐ−インチアネートフェニル）アミン等が挙げられる。脂質を染色する蛍光色素としてはナイルブルー、ズダンブラックＢ等が挙げられる。
【０００８】
本発明における食品の染色方法としては、一種の蛍光色素を用いて染色する方法あるいは二種以上の蛍光色素を用いて多重染色する方法のいずれも採用できる。
また前記蛍光色素に非蛍光色素を併用することができる。
前記非蛍光色素としてはヨード等が挙げられる。
【０００９】
次に蛍光染色された食品は使用した蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmより低波長領域で観察する。
前記観察を蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmより、高波長領域で観察すると蛍光強度が強くなること等、反対に判別がしずらくなり本発明の目的は達成されない。
【００１０】
本発明方法における「観察」手段としては使用する蛍光色素の種類によって肉眼による観測方法、赤外波長または紫外波長の領域で観測する方法により行われる。赤外または紫外波長の領域で観察する場合は特定の観測機器を用い、観測データを電気信号に変換し、コンピュータ処理することによって観測することが可能である。
【００１１】
本発明の蛍光観察に使用する光源としては、水銀ランプ（１００Ｖ，２００Ｖ）、キセノンランプ（７５Ｖ，１５０Ｖ）、ハロゲンランプ（１２Ｖ１００Ｗ）、タングステンランプ（６Ｖ３０Ｗ）等が挙げられ、これ以外にもキセノンランプ（２５０〜１，０００nm）、タングステンランプ（２５０〜１，０００nm）、Ｃｒ：ＬｉＳＡＦランプ（４３０nm）、ヘリウム−カドミニウムレーザー（３２５nm，４４２nm）、アルゴンイオンレーザー（４８８nm，５１４nm）、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（５３２nm）、ヘリウムネオンレーザー（５４３nm，５９４nm，６３３nm）、クリプトンイオンレーザー（５６８nm，６４７nm）等の励起光源を用いることができる。
【００１２】
本発明において多成分分散系食品の組織構造を解析する場合通常蛍光観察により行われるが、位相差と併用することによって、より立体的な組織構造として観察できる。この位相差手段としては明視野観察、位相差観察、微分干渉観察等が挙げられるが特に位相差観察および微分干渉観察との併用が好ましい。
【００１３】
前記の蛍光観察に用いられるフィルターとしては励起フィルター、ダイクロイックフィルター、吸収フィルターあるいはこれらがセットになったミラーユニットが用いられる。これらのミラーユニットとしてはＵ−ＭＷＵ［励起フィルター（３３０〜３８５nm）、吸収フィルター（４２０nm）、吸収フィルター（４００nm）］、Ｕ−ＭＷＩＢ［励起フィルター（４６０〜４９０nm）、吸収フィルター（５１５nm）、吸収フィルター（５０５nm）］（オリンパス光学工業株式会社製商品名）、Ｕ−ＭＷＩＧ［励起フィルター（５２０〜５５０nm）、吸収フィルター（５８nm）、吸収フィルター（５６５nm）］（オリンパス光学工業株式会社製商品名）、Ｕ−ＭＷＩＧ［励起フィルター（５４５〜５８０nm）、吸収フィルター（６１０nm）、吸収フィルター（６００nm）］（オリンパス光学工業株式会社製商品名）等が挙げられる。
【００１４】
明視野観察を併用する場合は照明ランプの明るさの透過率を全体の６％以下に抑えることが好ましい。この明視野観察に用いられるＮＤフィルターとしてはＬＢＤフィルター（オリンパス光学工業株式会社製商品名）、ＮＤ２５フィルター（オリンパス光学工業株式会社製商品名）、ＮＤ６フィルター（オリンパス光学工業株式会社製商品名）等が挙げられる。
【００１５】
本発明の多成分分散系食品の組織標本の作製方法としては、凍結固定法あるいは浸漬固定法等が挙げられる。
次に凍結固形法について説明する。試料をミクロトームの冷却ステージ上に凍結固定する。次いで凍結固定した試料を一定の厚みで切り出す。切り出した切片をプレパラート上に載せてヒーターで乾固させ固定する。別に染色剤溶液を調製し、この染色剤溶液と試料切片とを一定時間（例えば１〜３０分間、長い場合で１〜３時間）反応させた後乾燥する。乾燥した試料切片を軟質のカナダバルサムで封入することによって、組織標本を得ることができる。
【００１６】
また浸漬固定法について説明する。試料をホルマリン溶液、グルタルアルデヒド溶液に１２時間浸漬する。次いで試料を流水中で数時間（例えば１〜１２時間）洗浄する。洗浄した試料は脱水した後８０％、９５％、９９．５％および１００％濃度のエタノール溶液に順次各２〜４時間浸漬する。次に試料をキシレン−軟質パラフィン液に１２時間浸漬し包埋する。包埋したパラフィンを台木の上に固定する。固定した試料をミクロトームを使用し、一定の厚みで連続的に切り出す。切り出した切片を湯浴（３５〜４０℃）上に浮かせてしわをのばした後スライド上に切片をすくい上げ乾燥させる。別に染色剤溶液を調製し、この染色剤溶液と試料切片とを一定時間（例えば１〜３０分間、長い場合で１〜３時間）反応させた後乾燥する。次にこの切片を軟質のカナダバルサムで封入することによって組織標本を得ることができる。
【００１７】
【実施例】
次に本発明をさらに具体的に説明するために実施例を掲げるが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
ビスケット生地を冷却ステージ上で急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に蛋白質染色色素である酸性フクシン（λmax＝５４５nm）を用いて切片を染色する。光学顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製ＢＸ５０）に下記表１に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察と明視野観察（透過率１．５％）を併用して行った。
評価は１０名のパネラーにより表２に示す評価基準に従って評価を行った。その試験結果を示せば表１のとおりである。
【００１９】
【表１】
0003762308.tif 000002
【００２０】
【表２】
0003762308.tif 000003
【００２１】
実施例２
ビスケット生地を冷却ステージ上で急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に脂質染色色素であるナイルブルー（λmax＝６２５nm）を用いて切片を染色する。光学顕微鏡（オリンパス工業株式会社製ＢＸ５０）に下記表３に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察と明視野観察（透過率６％）を併用して行った。
なお評価は実施例１と同様に行った。その評価結果を示せば表３のとおりである。
【００２２】
【表３】
0003762308.tif 000004
【００２３】
実施例３
ビスケット生地を冷却ステージ上で急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に澱粉染色色素であるコンゴレッド（λmax＝４９７nm）を用いて切片を染色する。光学顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製ＢＸ５０）に下記表４に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察と明視野観察（透過率１．５％）を併用して行った。
なお評価は実施例１と同様に行った。次のその評価結果を示せば表４のとおりである。
【００２４】
【表４】
0003762308.tif 000005
【００２５】
実施例４
ビスケット生地を冷却ステージ上で急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に澱粉非染色色素であるファーストグリーンＦＣＦ（λmax＝６２２nm）を用いて切片を染色する。光学顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製ＢＸ５０）に下記表５に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察と明視野観察（透過率１．５％）を併用して行った。
なお評価は実施例１と同様に行った。次にその評価結果を示せば表５のとおりである。
【００２６】
【表５】
0003762308.tif 000006
【００２７】
実施例５
ビスケット生地を冷却ステージ上で急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に蛋白質染色色素である酸性フクシン（λmax＝５４５nm）を用いて切片を染色する。蛍光顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製ＢＸ５０）に下記表６に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察を行った。また蛍光観察と位相差観察、微分干渉観察を併用して行った。
なお評価は実施例１と同様に行った。その試験結果を示せば表６のとおりである。
【００２８】
【表６】
0003762308.tif 000007
【００２９】
実施例６
ビスケット生地を冷却ステージ上で急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に脂質染色色素であるナイルブルー（λmax＝６２５nm）を用いて切片を染色する。蛍光顕微鏡（オリンパス工業株式会社製ＢＸ５０）に下記表７に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察を行った。また蛍光観察と位相差観察、微分干渉観察を併用して行った。
評価は実施例１と同様に行った。その評価結果を示せば表７のとおりである。なお蛍光観察において励起フィルターとしてＵ−ＭＷＵを用い、４２０nmの蛍光波長フィルターを用いた場合の組織観察写真を示せば図１のとおりであり、Ａ＝澱粉（白色）、Ｂ＝蛋白質（赤色）およびＣ＝脂質（青色）の各粒子が鮮明に判別できる。
【００３０】
【表７】
0003762308.tif 000008
【００３１】
実施例７
ビスケット生地を冷却ステージ上で急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に澱粉染色色素であるコンゴレッド（λmax＝４９７nm）を用いて切片を染色する。蛍光顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製ＢＸ５０）に下記表８に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察を行った。また蛍光観察と位相差観察、微分干渉観察を併用して行った。
なお評価は実施例１と同様に行った。次のその評価結果を示せば表８のとおりである。
【００３２】
【表８】
0003762308.tif 000009
【００３３】
実施例８
ビスケット生地を冷却ステージ上で急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に澱粉非染色色素であるファーストグリーンＦＣＦ（λmax＝６２２nm）を用いて切片を染色する。蛍光顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製ＢＸ５０）に下記表９に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察を行った。また蛍光観察と位相差観察、微分干渉観察を併用して行った。
なお評価は実施例１と同様に行った。次にその評価結果を示せば表９のとおりである。
【００３４】
【表９】
0003762308.tif 000010
【００３５】
【発明の効果】
本発明は澱粉、蛋白質、脂質等を含有する多成分分散系食品を蛍光色素で染色した後蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmより低波長領域で観察することによって澱粉、蛋白質および脂質の組織構造を立体的画像として解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】写真は蛍光顕微鏡でビスケット生地を観察したときの組織写真である。
【図１】
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