(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の大きさが径３０μｍ以上であり、酸性及び塩基性染料の組合せのうち酸性成分を保持し、かつ１または２個の核を有し、それぞれの核が２または３個の顕著な核小体を含んでいる、単離した肝予備細胞。
【請求項２】
単層培養においてプラスチックに強く付着する、請求項１に記載の肝予備細胞。
【請求項３】
より小さな他の肝実質細胞に付着する、請求項１または２に記載の肝予備細胞。
【請求項４】
トリチウム標識チミジンの取り込みにより測定したとき、in vitro培養の開始時に他の肝細胞よりも実質的に高い分裂指数を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の肝予備細胞。
【請求項５】
分化することにより、アルブミン産生およびシトクロムＰ−４５０酵素活性の能力がある細胞を生じさせる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の肝予備細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の肝予備細胞の実質的に均質な集団を含む細胞組成物。
【請求項７】
約９０％以上の上記細胞が、酸性及び塩基性染料の組合せのうち酸性成分を保持する肝予備細胞である、請求項６に記載の細胞組成物。
【請求項８】
肝細胞の混合集団を７０％パーコール密度勾配遠心にかけることにより、下方の２ゾーンが肝予備細胞を含んでいる４つのゾーンを得ること；および上記２つの下方ゾーンに含まれる細胞をプールし、２５％〜５０％パーコール不連続勾配に対して遠心することにより1.0381g/mlの浮遊密度を有する細胞を含む界面ゾーンを得ることを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の肝予備細胞を単離する方法。
【請求項９】
上記界面ゾーンの上部から細胞を回収し、少なくとも８０％の肝予備細胞の集団を得ることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物の肝臓を再生するための組成物の製造における、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離した肝予備細胞の使用方法。
【請求項１１】
哺乳動物の遺伝子欠損を正すための組成物の製造における、外因性遺伝子を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の肝予備細胞の使用方法。
【請求項１２】
上記遺伝子は細胞表面タンパク質をコードするものである、請求項１１に記載の使用方法。
【請求項１３】
上記遺伝子は分泌タンパク質をコードするものである、請求項１１に記載の使用方法。
【請求項１４】
非ヒト哺乳動物の肝臓を再生するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の肝予備細胞の使用方法。
【請求項１５】
非ヒト哺乳動物の遺伝子欠損を正すための、外因性遺伝子を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の肝予備細胞の使用方法。
【請求項１６】
上記遺伝子は細胞表面タンパク質をコードするものである、請求項１５に記載の使用方法。
【請求項１７】
上記遺伝子は分泌タンパク質をコードするものである、請求項１５に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
１．序論
本発明は肝臓の予備細胞（reserve cell）または幹細胞（stem cell）に関するものである。特に、本発明は、肝予備細胞の単離、特性付け、培養および使用に関する。密度勾配遠心により単離された肝予備細胞は、その形態、染色特性、高増殖活性およびin vitroでの分化能の点で他の肝実質細胞と区別することができる。ここに記載する長期培養において、これらの細胞は数を増やし、そして肝特異的機能を仲介し得る形態的に成熟した肝実質細胞へと分化する。かくして、単離した肝予備細胞は、遺伝子治療における外因性遺伝子の運搬体として、および／または破壊や感染を受けた、あるいは遺伝子的に欠損のある哺乳動物の肝臓を移植によって置き換えて再生させることを含むが、これらに限らない、多様な用途を有するだろう。
２．発明の背景
肝臓は様々な生理学的過程において重要な役割を担っている精力的な臓器である。肝臓の複雑な機能として、代謝、貯蔵、排泄、アルブミンのような血漿タンパク質の分泌、それにシトクロムｐ−４５０系の酵素による有害物質の解毒を挙げることができる。さらに、通常は休止している肝臓が、ある情況のもとでは、著しい有糸分裂活性の能力をもち得る。
2.1.  肝細胞
肝臓の主要な細胞集団は、肝細胞（hepatocyte）としても知られる実質細胞（parenchymal cell：ＰＣ）である。肝臓はこの他にも、内皮細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、クッパー細胞（Kupffer cell）のような、総称的に間質（沿岸）細胞と呼ばれるいくつかの細胞型を含んでいる。肝臓が損傷を受けたり、部分的に切除されたときに、肝細胞が速やかに再生され得るということは、自己再生および分化能を有する幹細胞または予備細胞の集団が存在することを推測させた。しかしながら、本発明以前には、こうした肝予備細胞が確認されたことはなかったし、その特性も記載されたことがなかった。
成体の哺乳動物肝臓には「卵形（oval）」細胞が記載されている。これらの細胞は高い核：細胞質の比を有し、新たに単離したＰＣの直径の約４０％にあたり、胎児肝細胞の酵素活性と一致する活性を発現し、そして比較的高い増殖速度を有する（Tsaoら, 1984, Exp. Cell Res. 154:38-52; Farberら, 1956, Cancer Res. 196:142-149）。しかし、通常、これらの細胞を生じさせるためには、動物をエチオニン、２−アセチルアミノフルオレンまたは他の発癌性物質でin vivoにて処理しなければならない。一部の研究者達は、卵形細胞がＰＣの後方分化（retrodifferentiation）の証拠でありうると仮定した（Grisham, 1980, Ann. N.Y. Acid. Sci. 349:128-137; Firminger, 1955, J. Nat. Cancer Instit. 15:1427-1441）。しかし、それらは内皮細胞にもっとよく似ているようである（Faustoら, 1987, Cell Separation: Methods and selected applications, 第４巻, T.G. Pretlow IIおよびT.P. Pretlow編集, Academic Press, ロンドン, 45-78頁）。推定上の幹細胞または予備細胞としての卵形細胞の役割は少しも知られておらず、多くの研究の対象となっている（Faustoら, 1987, Cell Separation: Methods and selected applications, 第４巻, T.G. Pretlow IIおよびT.P. Pretlow編集, Academic Press, ロンドン, 45-78頁）。
2.2.  肝臓培養物
さまざまな肝機能とそれに関与する細胞型を研究する試みにおいて、実験動物からばかりでなくヒトからも肝細胞のin vitro培養物が調製されている。酵素の漏出、代謝および細胞膜に対する潜在的毒素の影響を研究するために、ラット肝細胞の一次培養物が広く用いられている（Grisham, 1979, Int. Rev. Exp. Pathol. 20:123-210; AcostaおよびMitchell, 1981, Biochem. Pharmacol. 30:3225-3230）。しかし、このような培養物系は多くの欠点を有し、どれも肝ＰＣの増殖または肝予備細胞の同定を提供しなかった。
in vitroにおいて、成体の肝細胞はほんの短期間しか増殖しないが、それらを肝臓由来の他の細胞外マトリックス物質またはこれらの組合せと共培養する場合には、アルブミンを産生したり、シトクロムＰ−４５０酵素活性を示すそれらの能力が長引くことがある。液体培養では、肝細胞の生存能および誘導性シトクロムＰ−４５０酵素活性を現すこれら細胞の能力が時間の関数として低下する（SiricaおよびPitot, 1980, Pharmacol. Rev. 31:205-228）。さらに、細胞分裂が培養の最初の２４〜４８時間に限られる（ClaytonおよびDarnell, 1983, Mol. Cell Biol. 3:1552-1561; Chapmanら, 1973, J. Cell Biol. 59:735-747）。単層培養における付着肝細胞の生存能はやや長い期間持続するものの、特定の活性が急速に失われる（Deschenesら, 1980, In Vitro 16:722-730）。
肝細胞の増殖を促進し、in vitroで肝特異的機能を引き延ばすという目的のために、種々のマトリックス上で肝細胞が培養されてきた。例えば、これらにはＩ型コラーゲンプレートおよび膜（MichalopoulosおよびPitot, 1975, Exp. Cell Res. 94:70-78）、ホモジナイズした肝バイオマトリックス（Reidら, 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 349:70-76）、IV型コラーゲンまたはラミニンが豊富なゲル（Bissellら, 1987, J. Clin. Invest. 79:801-812）、２層のＩ型コラーゲンの間に挟み込むもの（Dunnら, 1989, FASEB J. 3:174-177）、およびフィブロネクチンまたは他の細胞外マトリックスタンパク質を被覆したプレート（Desohenesら, 1980, In Vitro 16:722-730）を用いる方法がある。これらの方法の全てがin vitroにおいて肝細胞の機能的寿命を長引かせたと報告されている。
これに関しての大きな改善が、ＰＣを種々の型の非実質間質もしくは沿岸肝細胞または非肝間質細胞とともに培養することによって得られた。同じ種の肝内皮細胞と共培養したヒトおよびラットの両方の肝細胞は培養下で特定の機能を数週間維持したが、それらは数の点で有意な増加を示さなかった（Guguen-Guilluozoら, 1983, Exp. Cell Res. 143:47-54; Begueら, 1983, Biochem. Pharmacol. 32:1643-1646）。ヒトの繊維芽細胞（Kuri-HarcuchおよびMendoza-Figueroa, 1989, Differentiation 41:148-157）および内皮細胞（Begueら, 1983, Biochem. Pharmacol. 32:1643-1646）と共培養したラット肝細胞は、シトクロムＰ−４５０活性を１０日間以上維持したと報告されている。従って、これらの混合肝細胞共培養系は、細胞間の相互作用を最適化することによってin vivoの状態に類似したミクロの環境を提供するのかもしれない。さらに、さまざまなＰＣ機能を他の肝細胞によって調節および／または最適化することができる。例えば、クッパー細胞の分泌産物はＰＣのシトロクロムＰ−４５０酵素活性を変調することが報じられている（PetersonおよびRenton, 1984, J. Pharmacol. Exp. Ther. 229:299-304）。繊維芽細胞へのＰＣの付着は、明らかに、クッパー細胞による特別の細胞外マトリックス物質の分泌によって決まる（Michalopoulosら, 1979, In Vitro 15:769-806）。肝内皮細胞も細胞外マトリックスの重要な成分を産生し（Guguen-Guilluozoら, 1983, Exp. Cell Res. 143:47-54）、また、脂肪細胞は代謝活性肝細胞における細胞膜の自己再生にとって不可欠な原料を産生することができる。
培養下の肝ＰＣの生存能および機能活性は、これらの細胞を非実質肝間質細胞、他の組織由来の支持細胞、またはそれらの分泌産物と共培養するとき、in vitroで引き延ばすことができるが、ＰＣの増殖は限られたものであるか、またはこれらの系には存在しない。肝細胞の共培養物における有糸分裂はおもに非実質細胞に起因している（Guguen-Guilluozoら, 1983, Exp. Cell Res. 143:47-54）。いくつかの報告は、非実質肝細胞が肝細胞と類似した機能を発現することを示している（Grisham, 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 349:128-137）が、これら非ＰＣの本性についてはあまり知られていない。
ラット肝細胞の増殖は、ナイロン濾過スクリーンに付着させた肝由来の間質細胞から成る三次元テンプレートの上で培養したとき、特に促進された（NaughtonおよびNaughton, 1991, 米国特許第5,032,508号）。間質区画は肝組織に存在する付着細胞（クッパー細胞、血管および胆管の内皮細胞、繊維芽細胞、およびいくつかの脂肪細胞に似た細胞を含む）のすべてを含んでいる。これらの細胞はin vivoで肝臓において観察されたマトリックスといくつかの点で似ているマトリックスを精巧に作り上げ、そしてin vitroでのＰＣの長期増殖およびそれらの肝特異的機能を支持する。しかしながら、本発明以前には、こうした培養物中に肝予備細胞が存在することは全く知られていなかった。
３．発明の概要
本発明は、肝予備細胞、肝予備細胞の単離および培養方法、ならびに特定の肝障害を有する個体への移植における外因性遺伝物質を含むまたは含まない肝予備細胞の使用方法に関するものである。
本発明は、部分的に、ラット肝ＰＣが培養系で生育させたとき肝特異的機能を６０日間以上維持することができ、この培養系がin vivoで肝臓に存在する全ての細胞型を含んでいるという本発明者らの発見に基づいている。ナイロンスクリーンに付着させてある肝間質細胞上で生育させた肝ＰＣから成る生培養物は、液体培地に入れると、フラスコ底面と培地表面の間に浮遊するようになり、三次元の生育効果を高めることとなる。in vitroで７週間以上も続く肝細胞のＤＮＡ合成は、培地に飽和トランスフェリンを補給するか、および／または部分的肝切除ラットの肝静脈から得られた血清で培地を調整することにより増強される。アルブミン合成やシトクロムＰ−４５０酵素活性のような肝特異的機能が培養下で６０日間もの長期にわたり観察される。さらに、培養した肝実質細胞上でのＭＨＣクラスＩ抗原の発現およびクッパー細胞上でのＭＨＣクラスII抗原の発現はin vitroにおいて時間の関数として低下した。付着ゾーン細胞のペレットからの切片は正常な実質細胞の構造を示した。
肝ＰＣを単離して培養する過程で、他の肝細胞よりも高い増殖速度を有する、以前には知られていなかった大きな好酸性肝細胞の集団が密度勾配遠心により単離された。培養したこれら好酸性肝細胞は上記の培養系において細胞分裂を行い、細胞周期の分析によると、それらはその総ＤＮＡ含量ゆえに間質細胞というよりもむしろＰＣであることが示唆された。鉄（III）イオンで飽和したトランスフェリンを含有しかつ硫酸鉄（II）とクエン酸鉄（III）を補給した、および／または肝切除ラット由来の血清で調整した培地は、浮遊ナイロンスクリーン培養物上の好酸性細胞単独または好酸性細胞と成熟ＰＣの混合細胞の接種物の分裂指数を高める。最も重要なこととして、これらの好酸性細胞は培養下で肝細胞へと発達する能力があり、肝特異的機能を果たすことができる。従って、これらの好酸性細胞は肝臓の予備細胞であると考えられる。
本発明は、ラット肝臓の予備細胞を単離し、それらの細胞学的および生物学的性質を特徴付ける実施例によって説明される。肝予備細胞の比較的均一な（＞９０％）集団を培養下で維持することができ、これらは増殖能と分化能を保持することが分かった。ここに記載する本発明は肝予備細胞の多岐にわたる用途を包含するものである。中でも、これらの細胞の高増殖速度は、該細胞が各種肝障害の遺伝子治療において外因性遺伝子を安定して挿入するための理想的な宿主となることを可能にするものである。
【図面の簡単な説明】
図１．７０％パーコール（Percoll）密度遠心のペレットの細胞塗抹標本の顕微鏡写真。成熟実質細胞は暗黒色に染まる。より大きな、うすく染まる好酸性細胞を視覚化するために、染料を比較的長い時間適用する必要があった。
図２．不連続“ニートなパーコール（neat Percoll）”法からの好酸性細胞の塗抹標本の顕微鏡写真。Diff-Quik染色。原倍率＝１０００倍。これらの細胞は標本中の他の細胞より２５〜３０％大きく、空胞化されて、かすかに染色され、多数の大きな核小体（仁）を含み、そして単離物の他の肝細胞より低い核：細胞質の寸法比を有する。
図３．好酸性細胞（１０日培養物）を用いて着手した単層培養の非付着ゾーン中の形態的に成熟した実質細胞の塗抹標本。
図４．単層培養における好酸性細胞の付着ゾーンにくっついている、そして恐らくは付着ゾーンから放出される成熟実質細胞。
図５．Ａ．７０％パーコール密度勾配からの細胞を、ナイロンスクリーン上の肝間質細胞の亜集密層に接種することによって樹立した肝臓共培養物の倒立位相差顕微鏡写真。
Ｂ．不連続パーコール密度勾配法を用いて単離した好酸性肝予備細胞を接種することによって樹立した肝臓共培養物の倒立位相差顕微鏡写真。
図６．フローサイトメトリーによりヨウ化プロピジウムで染色した単離核において測定した、異なる条件下での肝臓共培養物の細胞周期分析。
図７．種々の培養条件下での肝細胞へのトリチウム標識チミジンの取り込み。
図８．接種の８５日後のナイロンスクリーン肝細胞培養物の酵素解離付着ゾーン細胞のペレットからの切片の透過型電子顕微鏡写真。開放ミトコンドリア超微細構造および代謝的に活動している粗面小胞体の膜が見られる。原倍率＝２８００倍。
図９．Ａ．浮遊ナイロンスクリーン肝培養物の付着ゾーンから得られた種々の日齢の細胞による培地への平均アルブミン分泌（±平均標準誤差）。
Ｂ．４０日肝臓共培養物におけるアルブミンの免疫ペルオキシダーゼ染色。
図10．シトクロムＰ−４５０酵素活性を有する細胞によるエトキシフルオレセインエチルエステル（ＥＦＥＥ）のフルオレセイン（Ｆ）への代謝的変換の概略図。種々の日齢の肝培養物におけるシトクロムＰ−４５０酵素活性は、フローサイトメトリーにより測定されるＥＦＥＥからＦへの変換により決定した。
図11．Ａ．浮遊ナイロンスクリーン培養物の付着ゾーン中の各種肝細胞の相対的パーセンテージを示す面積プロット。
Ｂ．間質細胞を含む培養物中に実在する好酸性細胞の持続性を示す４０日目の肝臓共培養物の付着ゾーンの細胞塗抹標本。
図12．ナイロンスクリーン共培養物のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。
図13．毒性測定用の培養物。
Ａ．次第に増加する濃度のアルコールと共培養した肝細胞の低下した生存能を示す中性生存能アッセイ。
Ｂ．５−フルオロウラシルの用量に関連した培養肝細胞のＤＮＡへの減少したトリチウム標識チミジン取り込み。
Ｃ．骨髄細胞と共培養した肝細胞によるシクロホスファミドおよびベンゼンの活性化。これらの条件下で、骨髄の生存能（ＭＴＴアッセイ）はシクロホスファミドおよびベンゼンの用量を増すにつれて低下する。
５．発明の詳細な説明
本発明は、肝予備細胞、これらの細胞の単離および培養方法、ならびにこれらの細胞の使用方法に関する。
肝予備細胞は分別勾配遠心により他のラット肝ＰＣから分離されるもので、次のようなユニークな表現型特性を示す。予備細胞はすべての典型的なＰＣよりも大きく、核：細胞質の寸法比が低く、１個の核につき２〜３個の目立った核小体をもっている。これらの細胞は酸性／塩基性染料の組合せのうち主に酸性成分を取り込むのに対し、他のＰＣは強い好塩基性である。肝予備細胞は単層培養において高い増殖速度（２４〜２８時間の倍加時間）を有し、間質細胞を有するナイロンスクリーン共培養ではさらに長期間残存する。培養下で、それらは他の“成熟”ＰＣへ、そしてプラスチックへ速やかにかつ強固に付着する。さらに、それらは典型的なＰＣの形態と機能を有する細胞へと分化する能力がある。単層培養での速やかな増殖期間ののち、細胞が付着性の好酸性予備細胞培養物から明らかに誘導され、他の細胞から脱着するようになる。これらは核：細胞質の寸法比が比較的高く、染料の塩基性成分を蓄積する。これらの細胞の肝特異的機能活性として、アルブミンの分泌および誘導性シトクロムＰ−４５０酵素の発現がある。
本発明は、以下の分節において、限定としてではなく単なる説明としてより詳細に論じられる。論議を分かりやすくするために、ここに記載する手順および方法はラット肝標本を用いて例示されるが、それらは本発明の実施の単なる例示にすぎない。類似の手順および技法を、ヒトを含めた全ての哺乳動物種に等しく応用することができるだろう。事実、ヒトの肝予備細胞がヒト肝調製物から同様の手順によって単離され、ここに示したラット好酸性肝予備細胞と合致する表現型を現すことが分かった。
5.1.  肝予備細胞の単離
本発明は、正常な肝臓中に少ない数（全肝ＰＣ集団の２〜５％を占める）で存在する肝予備細胞に関する。これらの細胞の比較的大きいサイズは他の肝細胞からそれらを分離するのに都合がよい。こうして、これらの細胞は下記の第6.1.1.節に記載するような分別密度勾配遠心により肝臓から分離することができる。パーコール不連続勾配遠心後の界面ゾーンの上方部分に得られた大型の細胞は、９０％以上が大きな好酸性肝予備細胞から成っている。このレベルの濃縮は一般に、下記の第5.4.節に記載するようなこれら細胞の種々の用途において許容されるものである。
これとは別に、肝予備細胞は、肝細胞調製物をレクチンクロマトグラフィー、陽性および陰性選択を含むアフィニティークロマトグラフィー、反復密度勾配遠心、またはこれらの組合せに付すことによっても単離することができる。例えば、下記の第6.1.1.節で得られた肝予備細胞は、繊維芽細胞、内皮細胞、クッパー細胞および脂肪細胞を除くための抗体を用いてパンニングすることによって陰性選択され得る。こうした抗体の例として、クッパー細胞と内皮細胞に対してそれぞれ特異的な抗ＭＨＣクラスII抗原および抗ｖＷ因子VIIIがある。これらの抗体は任意の組合せで繰り返しまたは逐次適用される。細胞が抗体に結合したら、第二ステップ抗体（すなわち、第一抗体がマウス由来のものであれば、抗マウス抗体）を被覆した固体表面またはカラムに吸着させることによって細胞を分離できる。抗体がビオチンに結合されている場合は、アビジン被覆カラムによって抗体結合細胞を分離することができる。また、抗体が磁性ビーズに結合されているのであれば、抗体によって認識される抗原を発現する細胞は磁界において分離することができる。陽性選択においても同様の手順に従うが、この場合は肝予備細胞に特異的な表面マーカーに対する抗体を利用して目的の細胞集団を選別する。
5.2.  肝予備細胞および他の実質細胞の長期培養
肝臓は、分裂を休止している臓器であるが、全体的な肝切除または部分的な化学破壊の後には再生する能力がある（Bucher, 1963, Int. Rev. Cytol. 15:245-300; Naughtonら, 1977, Science 196:301-302）。この現象には肝予備細胞が係わっているということは、肝臓再生と肝臓発癌の両方の誘導を理解する上で重要となる。下記の実施例６に示した特定の態様において、肝ＰＣまたは好酸性肝予備細胞は間質細胞をまいたナイロンスクリーン上で増殖し、培養下で長期間にわたって残存することが示された。さらに、肝細胞のシトクロムＰ−４５０酵素機能にとっては、間質細胞またはこれらの細胞によって分泌されるマトリックスタンパク質の存在が重要である（Deschenesら, 1980, In Vitro 16:722-730; MichalopoulosおよびPitot, 1975, Exp. Cell Res. 94:70-78; Reidら, 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 349:70-76; Bissellら, 1987, J. Clin. Invest. 79:801-812; Dunnら, 1989, FASEB J. 3:174-177; Guguen-Guilluozoら, 1983, Exp. Cell Res. 143:47-54; Begueら, 1983, Biochem. Pharmacol. 32:1643-1646; Kuri-HarcuchおよびMendoza-Figueroa, 1989, Differentiation 41:148-157）。フィブロネクチン、ラミニン、およびコラーゲンは肝間質細胞（これらの細胞の上にＰＣまたは肝予備細胞がまかれる）によって産生される。これらの物質のレベルは、第一抗体による標識化後に蛍光色素結合第二抗体を用いて蛍光強度により測定したところ、肝臓切片において観測されたレベルより高くなっている。これらの細胞外マトリックスタンパク質の増大した合成は胎児組織におけるそれらの発現パターンによく似ている。
肝臓共培養において間質細胞によって産生される細胞外マトリックス物質は、ＰＣと肝予備細胞の細胞分裂および遺伝子発現に影響を及ぼし得る（Tonomuraら, 1987, J. Cell Physiol. 130:221-227; Sudhakaranら, 1986, Exp. Cell Res. 167:505-516）。in vitroでの肝細胞のＤＮＡ合成速度は、フィブロネクチンやラミニンに富む基質上で比較的高く（Tonomuraら, 1987, J. Cell Physiol. 130:221-227）、そして培養肝細胞によるα−胎児性タンパク質およびアルブミンの合成はIV型コラーゲンのもとで最大となる（Sudhakaranら, 1986, Exp. Cell Res. 167:505-516）。in vivoの肝臓と同様に、本発明の肝細胞共培養物の細胞外マトリックスはフィブロネクチン、ラミニン、およびIV型コラーゲンを含んでいる。培養肝細胞によるＴＧＦβ、フィブリノーゲン、その他の肝特異的タンパク質の生産も観察される。
大きな好酸性肝予備細胞を、間質細胞を含む長期共培養物中に置くと、培養期間中に３つの細胞集団が現れる。大半の培養細胞は典型的なＰＣの形態を示す。残りの細胞の大部分は間質細胞であるが、好酸性予備細胞の小さいが検出できる集団が数週間にわたって必ず存在する。これらの肝細胞を、たとえ休止状態であっても、長期間維持できるということは、これらの細胞に対する種々の毒物の作用を評価する上で重要となる（MichalopoulosおよびPitot, 1975, Exp. Cell Res. 94:70-78; Bissellら, 1987, J. Clin. Invest. 79:801-812; Guguen-Guilluozoら, 1983, Exp. Cell Res. 143:47-54）。共培養系において、シトクロムＰ−４５０酵素活性は６０日間以上持続することがラット肝細胞において明らかである。この活性はＦＬＳやＳＳの特性に基づく細胞の異なる集団すべてに観察される。低度から中度の顆粒性を示す、これらの混合培養物中の比較的小さな細胞は内皮細胞とクッパー細胞であるらしい。内皮細胞もクッパー細胞もin vivoおよびin vitroでＰＣのシトクロムＰ−４５０活性を変調させると報告されている（Begueら, 1983, Biochem. Pharmacol. 32:1643-1646; Ratanasavahnら, 1988, Xenobiotica 18:765）。また、マクロファージもそれら自身の解毒活性を示すことが報じられている（Wichramasinghe, 1987, Clin. Lab. Hematol. 9:271-280）。これに関して、最近、骨髄間質のマクロファージ成分がＥＦＥＥをフルオレセインに代謝し得ると報告された（Naughtonら, 1992, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 201:481-490）。しかし、共培養系中のクッパー細胞は大きさが大部分のＰＣよりもかなり小さく、ＥＦＥＥをフルオレセインへ代謝する能力によって証明される最大シトクロムＰ−４５０活性を示すのは主としてもっと大きな細胞である。
長期培養される肝ＰＣまたは肝予備細胞の増殖は、培地に各種の補充物質を加えることによって高められる。通常低レベルの鉄を含有する組織はそれより高レベルの鉄に対して毒性反応を示すが、肝細胞は鉄が豊富な環境でも残存しており、それらの細胞内鉄の蓄えがin vitroで急速に減少する。従って、たいていの培養下の肝細胞が増殖できないのは、鉄欠乏が原因の一部であるのかもしれない。培地に鉄塩と飽和トランスフェリンを補充すると、アルブミンの生産が抑制されるものの、肝細胞への放射性チミジンの取り込みが促進される。哺乳動物の鉄貯蔵物はおもに肝臓と脾臓に存在している。このミネラルは、例えばＤＮＡ合成に必要とされるリボヌクレオチドレダクターゼの活性化の際の補因子としてのその役割のために、細胞増殖には必要である（ReichardおよびEhrenbergen, 1983, Science 221:514-519）。さらに、トランスフェリン受容体の数も増殖活性と関係しており（Sutherlandら, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:4515-4519）、これらは最大発現がＳ期で起こるように細胞周期において変化する（Yehら, 1982, Exp. Cell Res. 138:429-434）。トランスフェリン受容体を認識するモノクローナル抗体４２／６はトランスフェリンの結合をブロックし、in vitroで数種のセルラインの増殖を抑制する（Trowbridgeら, 1984, Biochem. Pharmacol. 33:925-932; Mendelsohnら, 1983, Blood 62:821-826）。
肝赤血球造血因子（ＨＥＦ）は、部分的肝切除後に肝臓が再生されている動物の血清中に見いだせる因子があるが（Naughtonら, 1980, Amer. J. Physiol. 238:E245-E252）、ここに記載した培養系において肝細胞のＤＮＡ合成をやはり促進する。肝切除動物由来の血清が正常動物の肝臓や他の組織ならびに培養肝細胞に及ぼす栄養効果についての報告がある（Bucher, 1963, Int. Rev. Cytol. 15:245-300）。肝臓の再生をコントロールする正確な機構は十分には解明されていないが、ex situで灌流させた再生肝の流出液中には肝栄養活性が見いだされており（Dornfestら, 1981, Ann. Clin. Lab. Sci. 11:27-46）、肝臓がそれ自身の調節に寄与しうることを示唆する。現在のところ、これらの因子は十分な特性付けがなされていないが、肝予備細胞とＰＣの長期増殖を支持するのにすべてが有用でありうる。
5.3.  肝予備細胞の特性付け
下記の実施例６に示すように、いろいろな手順によって肝予備細胞を単離し、濃縮することができる。肝予備細胞はそれらと卵形細胞（oval cell）またはこれまでに報告された他の肝細胞とを区別する、明確に異なった物理的特性を有する。例えば、それらは、一般に径２２〜２６μｍの範囲にある典型的な肝ＰＣよりも大きく（径３０μｍ以上）、低い核：細胞質比を有し、そして１個または２個の核を有し、それぞれの核が２〜３個の顕著な核小体をもっている。Diff-Ouickのような酸性および塩基性染料の組合せで染色すると、それらは主に染料の酸性成分を保持する。実際に、すべての肝ＰＣは高度に好塩基性であるから、最初は肝予備細胞を“細胞ゴースト”または死細胞とみなすほど、それらはかすかにしか染色されない。これらの細胞をもっとはっきり見えるようにするため、通常は、細胞塗抹標本を長期間かけて染色し、それらの染料の取り込みを高める。従って、「好酸性（acidophilic）」という用語は、高度に好塩基性である他の肝細胞集団との比較において用いられる。さらに、卵形細胞と違って、それらは正常な肝臓に存在し、化学発癌物質によって前もって誘導する必要がなく、そしてアルブミンの分泌およびシトクロムＰ−４５０酵素活性のＰＣ関連機能を示す細胞へと表現および／または発達する。培養下では、それらはプラスチックに強く付着し、他の肝ＰＣにも付着することができる。それらは比較的高い分裂指数を有し、単層培養において１０日から２週間にわたり規則正しく２４〜２８時間ごとに分裂することができ、この期間後には非付着性となる。この時期の脱着細胞は典型的な肝ＰＣと形態学的に区別がつかない。
肝予備細胞は、さまざまな既知の細胞表面マーカー特異的モノクローナル抗体との反応性によってさらに特性付けられる。例えば、それらは低レベルのＭＨＣクラスＩ抗原を発現するが、検出可能なＭＨＣクラスII抗原は発現しない。さらに、肝予備細胞はまだ同定されていない他のマーカーを発現するかもしれない。それゆえ、これらの細胞の更なる特性付けのために、該細胞を利用してその細胞表面分子に対する抗体をつくることができる。
肝予備細胞によって発現される新規な抗原マーカーを認識するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生もまた本発明の範囲内にある。このような抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによる肝予備細胞の単離、等の種々の用途を持ちうる。当分野の技術で公知の種々の手順が、肝予備細胞に対する抗体の産生に使用できる。種々の宿主動物を、生育力のある肝予備細胞、固定化細胞（fixed cell）または膜調製物の注射により免疫感作することが可能である。これらの宿主動物は、ウサギ、ハムスター、マウス、ラットを含むが、これらだけに限定されない。免疫応答を高めるために、宿主の種によって種々のアジュバントを使用できる。これらのアジュバントは、（完全および不完全）フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等の無機ゲル、リゾレシチン等の界面活性剤、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）やコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）等の潜在的に有用なヒトのアジュバントを含むが、これらだけに限定されない。
肝予備細胞上の新規抗原に対するモノクローナル抗体は、培養下の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて調製することができる。これらの技法は、以下のものを含むが、それらだけに限定されない。すなわち、KohlerおよびMilstein（1975, Nature 256, 495-497）によって最初に記述されたハイブリドーマ法、およびより最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosborら、1983, Immunology Today 4:72; Coteら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）である。適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を、ヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによって「キメラ抗体」を産生するために開発された技法を使用することができる（例えば、Morrisonら、1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neudergerら、1984, Nature, 312:604-608; Takedaら、1985,Nature 314:452-454参照）。さらに、１本鎖抗体の産生のために記述された技法（米国特許第4,946,778号）が、１本鎖抗体の産生に適用可能である。
同系、同種および異種の宿主が、生育可能な形に、または固定された形に、またはそれらの抽出された膜調製物として調製された肝予備細胞の注射に用いうる。モノクローナル抗体は、肝予備細胞と選択的に結合するが、他の肝ＰＣおよび間質細胞とは結合しないことによって示差的にスクリーニングされうる。
抗体分子の結合部位を含有する抗体断片は、公知の技法によって作成できる。例えば、これらの断片は以下のものを含むが、それらだけに限定されない。すなわち、抗体分子のペプシン消化によって産生可能なF(ab')2断片、およびF(ab')2断片のジスルフィド橋を還元することによって作成可能なFab断片である。
５．４．肝予備細胞の用途
大きい好酸性細胞が培養中に増殖し、成熟した生物学的に活性な肝細胞に分化する能力は、これらの細胞が肝臓の予備細胞であることを示す。そのため、これらの細胞は遺伝子的に欠陥のある、病原菌に感染した、および／または部分的に破壊された肝臓を置換および／または再生する移植治療に特に有用でありうる。
外来遺伝子の、異なる臓器の宿主真核細胞への安定した組込みを達成するための現在の試みにおける主要な障害は、これらの細胞の殆どがin vitroで増殖できないことである。これは外因性遺伝子を肝細胞に挿入する試みにおいて特に問題となる。なぜなら、肝細胞は普通in vitroでの細胞分裂をしないからである。最近、ヒトにおける家族性高コレステロール血症の動物モデルとして広く使われているWatanabe遺伝性高脂血症ウサギから単離した肝細胞を用いて、遺伝子導入の研究が実施された。Watanabeウサギ細胞は、それらのヒト対応物と同様、循環系における高レベルのコレステロール、および若年での冠状動脈疾患の発病率の上昇をもたらす、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体における遺伝子欠陥を有する（Wilsonら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8437参照）。ウサギ肝細胞を、機能性ＬＤＬ受容体遺伝子を持つ組換えウイルスに感染させたところ、これらの細胞は、移植後、遺伝子欠陥のあるウサギに高脂血症の一時的緩和を引き起こすことを示した。この形の治療の成功率は、対象の遺伝子が実質的細胞分裂の可能なレシピエント細胞集団へのより安定した組込みを達成できるならば、さらに高めることができると思われる。肝予備細胞はin vitroで増殖するので、また特に本明細書に記述する共培養系ではより長期間にわたって増殖するので、培養における外因性遺伝子の導入のためのレシピエント（宿主）として理想的な候補でありうる。
種々の先天性代謝異常が肝細胞の遺伝的遺伝子欠陥により引き起こされる。これらの疾患は正しい遺伝子の機能性コピーを持つ肝予備細胞の移植によって治療することができる。簡単に述べると、この処置は特定の欠陥を持つ患者からの肝予備細胞の単離、その遺伝子欠陥を正すための、従来の遺伝子導入技術によるこれら肝予備細胞への機能性遺伝子の導入、安定した組込み、ならびに所望の遺伝子産物の発現の確認、および再構成のための患者自身の肝臓へのこれらの細胞の移植、を含む。このアプローチは、単一の遺伝子欠陥が疾病の原因であって、その欠陥遺伝子が同定され、分子としてクローン化されている場合、特に適用できる。しかし、このアプローチの適用は、これらの条件にのみ限定されるものではない。自己のために設定された遺伝子治療に加え、機能性遺伝子を持つ肝予備細胞は同種の、ＨＬＡが適合する個体へも移植することができる。標的遺伝子、およびこの形の治療を受けることのできるそれらの関連肝疾患の例は、以下のものを含むが、それらだけに限定されない。すなわち、家族性高コレステロール血症におけるＬＤＬ受容体遺伝子、血友病における凝固第VIIIおよび第IX因子の遺伝子、気腫におけるα１−アンチトリプシン遺伝子、フェニルケトン尿症におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子、高アンモニア血症におけるオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子、および種々の形の補体欠陥における補体タンパク質遺伝子である。
肝臓は、多数の分泌タンパク質の産生の中心である。肝臓は、種々のタンパク質の血流への効率的な放出を可能とするように、解剖学的に循環系とつながっている。それゆえ、全身性効果を有するタンパク質をコードする遺伝子は、通常それらの効果を生ずる特定の細胞型にではなく、肝予備細胞に挿入することができる。これらの特定細胞に遺伝子を組み込むことが困難な場合は、特にそうである。例えば、種々のホルモン遺伝子または特定の抗体遺伝子を、それらの遺伝子産物の循環系への分泌のため、肝予備細胞に挿入することができる。
本発明の実施にあたっては、後に述べる実施例６に記載の方法によって単離された肝予備細胞を、遺伝子導入実験のレシピエントとして使用する。これらの細胞は、外因性遺伝子の導入の前、導入中、および導入後に、間質細胞との共培養系で最適に増殖させることができる。これらの細胞の増殖活性は、後に述べる第5.2.節に記載の種々の鉄補充物によって増強することが可能であり、そして、これらの細胞のin vitroでの分化は、造血幹細胞培養物における白血病阻止因子の使用と同様の方法で、サイトカイン類を添加することにより最小限にできる。
培養した肝予備細胞への外因性遺伝子の導入のためには、任意のクローン化遺伝子を従来の技術（マイクロインジェクション、トランスフェクションおよび形質導入を含むが、これらだけに限定されない）を使用して導入できる。さらに、肝予備細胞がアシアログリコプロテインの受容体を発現する場合は、対象遺伝子を含有するプラスミドをアシアログリコプロテインに結合して細胞に添加し、取り込みと発現を誘導することが可能である（Wuら、1991, J. Biol. Chem. 266:14338参照）。この処置は、レシピエント細胞に対してより穏やかである。
遺伝子導入の好ましい方法は、レトロウイルスおよびアデノウイルス等の組換えウイルスを活用する。例えば、アデノウイスル発現ベクターを用いる場合は、コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（control complex）、例えば、後期プロモーターおよび３分節のリーダー配列等に連結することができる。このキメラ遺伝子を次にin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への導入は、生育力があり、かつ感染した肝予備細胞中に遺伝子産物を発現できる組換えウイルスをもたらすであろう（例えば、LoganおよびShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659参照）。または、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーターを使用することもできる（例えば、Mackettら、1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419; Mackettら、1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicaliら、1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931参照）。特に興味深いのは、ウシ乳頭腫ウイルスに基づく、染色体外因子として複製する能力を有するベクターである（Sarverら、1981, Mol. Cell. Biol. 1: 486参照）。このＤＮＡを細胞に導入した少し後に、そのプラスミドは細胞あたり約１００から２００コピーにまで複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写は、プラスミドの宿主染色体への組込みを必要とせず、したがって、高レベルの発現が生じる。これらのベクターは、プラスミド中に選択マーカー、例えばｎｅｏ遺伝子等を含むことによって安定した発現のために使用することができる。または、肝予備細胞に任意の対象遺伝子を導入し、その発現を引き出すことのできるベクターとして使用するために、レトロウイルスゲノムを修飾することができる（ConeおよびMulligan, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6349-6353）。高レベルの発現は、メタロチオネインIIAプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含むがこれらだけに限定されない誘導性プロモーターを使用しても達成することができる。
組換えタンパク質の長期間にわたる高収率の産生のためには、安定した発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、むしろ肝予備細胞は適切な発現制御因子（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）によって制御されるｃＤＮＡおよび選択マーカーを用いて形質転換することができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そして細胞がその染色体中にプラスミドを安定に組込み、増殖してフォーカス（細胞増殖巣）を形成するのを可能とする。次にフォーカスはクローン化し細胞系へと発展させることができる。例えば、外来ＤＮＡの導入に続いて、遺伝子操作した肝予備細胞を１〜２日間、富化した培地で増殖させてもよく、次に選択培地に切り換える。多数の選択系が使用できる。これらの選択系は以下のものを含むが、それらだけに限定されない。すなわち、単純ペルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977, Cell 11: 223）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskaおよびSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980, Cell 22: 817）遺伝子である。また、代謝拮抗物質耐性もまた、メトトレキセートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Wiglerら、1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hareら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527）；マイコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（MulliganおよびBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Coleberre-Garapinら、1981, J. Mol. Biol. 150: 1）；ハイグロマイシンへの耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Santerreら、1984, Gene 30:147）遺伝子の選択の基礎として用いることができる。最近、別の選択遺伝子が記載された。すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤ（HartmanおよびMulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047）；およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯへの耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）［Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory（編）中のMcConlogue L., 1987］である。
ノーザンブロットおよびＥＬＩＳＡ等の技法を用いて、遺伝子産物の発現によりある特定の遺伝子を組み込んだと判断された肝予備細胞は、その細胞をそもそもそこから誘導した患者、またはＨＬＡが適合する個体に移植することができる。ＨＬＡが適合する同種移植のためには、肝予備細胞は必ずしも移植に先立つ遺伝子導入を必要としない。例えば、凝固第VIII因子をコードする機能性遺伝子を有するドナーから得た肝予備細胞は、ＨＬＡが適合する血友病患者への移植に直接使用できる。移植された細胞は、たぶん増殖し、凝固第VIII因子の産生を含む正常な肝機能を遂行する成熟したＰＣをもたらすであろう。
肝臓遺伝子の欠陥を正すために肝予備細胞を使用するのに加えて、これらの細胞は肝硬変の場合、肝実質細胞を補充するために使用でき、またそれらは肝臓特異的伝染性疾患に対して遺伝子操作することが可能である。例えば、非感染肝予備細胞を初期段階の肝炎患者より得て、肝炎ウイルスの重要な複製関連遺伝子要素に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子のレシピエントとして使用することができる。次に、ウイルスの拡散をコントロールし、正常な肝機能を回復するために、肝予備細胞を患者に移植することができる。
６．実施例：長期肝臓培養物における肝予備細胞の同定、単離および特徴付け
６．１．材料及び方法
６．１．１．細胞単離
週齢６〜９の雄ロングエバンズ（Long-Evans）ラットにナトリウムペントバルビタール麻酔を施した後、これらから細胞を採取した。２０ゲージのアンギオカテ（angiocath）（Terumo Corp., Japan）を肝臓門静脈に挿入し、２本の４−０結紮糸で固定した。肝臓を５００ｍＬのＣａ++を含まない緩衝液（Cell Preparation: Methods and selected Applicatkons, Vol. 4, T.G. Pretlow IIおよびT.P. Pretlow,編, Academic Press, New York, pp. 1-24中のPertoftおよびSmedsrod, 1987）で灌流した。この緩衝液は、Harvard Instrument(MA)製の蠕動性ポンプによって50mL/minの速度で供給した。肝臓を、均一に色抜きされるまで穏やかにマッサージした。肝臓を修正ブフナー漏斗に入れ、Ｃａ++および0.05g/dLのIV型コラゲナーゼ（Sigma Chemical Co, MO）を含有する緩衝液を用いて、循環システムで１５〜２０分間灌流した。次に、肝臓を１．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したコラゲナーゼ緩衝液を含有するペトリ皿に移し、グリソン鞘の穿孔後、肝細胞を懸濁液中に遊離させ、１８５μｍのナイロンシーブで濾過し、遠心によってペレット化し、完全培地ＤＭＥＭ〔６％ＦＢＳおよび１０％ウマ血清によって調整し、培地５００ｍＬあたり３５μＬグルゴカン（Sigma #G9261）、１０μｇインスリン（Sigma #G14011）、０．２５ｇグルコースおよび２５０μＬ半コハク酸ヒドロコルチゾンを補充したもの〕に再懸濁した。
肝細胞は、パーコール（Percoll）勾配遠心法を用いて、以下のサブ集団に分離した：
実質細胞
細胞懸濁液を、２５％パーコール（Pharmacia Inc., NJ）を１０Ｘダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶かした溶液の上に重層し、８００ｘｇ（１０℃）で１０分間回転して細胞下破砕物を除去した。細胞を洗浄し、培地に再懸濁し、７０％パーコール勾配で遠心した。この調製物のペレットは、肝ＰＣの相対的に純粋な集団（≧９０％）を含有する。この懸濁液の重量オスモル濃度は、TimonenおよびSakselaの方法（TimonenおよびSaksela, 1980, J. Immunol. Methods 36: 285）を用いて、２９０ｍＯｓと計算された。
肝予備細胞
培養下で増殖し、成熟肝細胞に似た細胞に分化する大きな（径≧３０μｍ）好酸性細胞の集団を、以下のように分離した：新しく単離した肝細胞の単細胞懸濁液を遠心（500 x g/5 min）にかけ、ペレットを培地に再懸濁した。この細胞懸濁液を、「ニートな（neat）」パーコールおよび１ｘＰＢＳ（Sigma Chemical Co., MO）の７０％ｖ／ｖ溶液２５ｍＬの上に重層し、８００ｘｇで１０分間遠心した。（４つのゾーンのうち）下部の２ゾーンをプールし、洗浄し、明確な界面領域とペレットを生ずる25%/50%（v/v、ニートなパーコール／1x PBS）不連続勾配で遠心した。界面（密度＝1.0381g/mL）は約９０％の、複数の顕著な核小体をもつ大きく、軽度に好酸性の、単核または二核細胞からなる。
間質細胞
肝臓の繊維芽細胞、内皮細胞、およびクッパー細胞を以下の方法で濃縮した。新しく単離した肝細胞を、１０ｘＰＢＳ中の７０％パーコール（Pharmacia）勾配（密度＝1.09g/mL）で１０分間遠心し、ペレットおよび中心ゾーンを形成した。中心ゾーン由来の細胞を洗浄し、25%/50%パーコールカラムで遠心した。界面ゾーン（密度＝1.03625g/mL）は、繊維芽細胞、マクロファージ、内皮細胞、および時おり末梢血白血球を含有した。
６．１．２．ナイロンスクリーン培養
210μmの空間を有する15mm x 60mmのナイロン濾過スクリーン（Tetko, NY）を1.0M酢酸で処理し、蒸留水中で洗浄し、細胞の付着を高めるためウシ胎児血清（ＦＢＳ）に浸した。これらのナイロンスクリーンをティシューテック（Tissue Tek）スライドチェンバー（Nunc, Inc., IL）に入れ、単層培養物から酵素的に引き上げた１０7個の肝間質細胞を接種した。１８〜２４時間後にスクリーンを２５ｃｍ2のフラスコに移した。２週間以内に、発育する間質細胞の突出部が、５個のメッシュ開口部あたり３〜４個を横切って広がった。スクリーン培養物をスライドチェンバーに入れ、２〜５ｘ１０6個の肝ＰＣまたは好酸性肝予備細胞を接種し、１８〜２４時間後に２５ｃｍ2のフラスコに移した。細胞を完全培地で培養した（５％ＣＯ2／３５〜３７℃／湿度＞９０％）。完全培地の取り替えは、週に６回実施した。培地への実験的補充物は、飽和トランスフェリン、硫酸鉄（II）、クエン酸鉄（III）、および再生しつつある肝臓を有するラット由来の血清を含んでいた。後者（ラット由来の血清）は、肝細胞増殖を誘導する因子を含有することが判明している（Bucher, 1963, Int. Rev. Cytol. 15:245-300; Naughtonら、1980, Amer. J. Physiol. 238:E245-E252）。
６．１．３．アルブミンアッセイ
各栄養補給（feeding）の間に培地を回収し、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Bissellら、1987, J. Clin. Invest. 79:801-812）を用いてラットアルブミンの存在を試験した。クロマトグラフィー的に純粋なラットアルブミンおよびペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗ラットアルブミン抗体をCappel Inc.（PA）より購入し、４９０ｎｍの吸光度を動的マイクロプレート読み取り装置（kinetic microplate reader）（Molecular Devices Inc, CA）を用いて測定した。１００μＬの使用済培地を９６ウエルのプレートに加え、０℃で１２〜１４時間保存した。ウエルをＰＢＳに溶かした０．５％トゥイーン(Tween)−２０を用いて洗浄し、非特異的結合部位をＰＢＳに溶かした５．０％ＢＳＡを用いてブロックした。０．５％トゥイーン−２０で洗浄の後、１００μＬのヒツジ抗ラットアルブミン−ペルオキシダーゼ結合体を各ウエルに加え、２２℃で１時間インキュベートした。ウエルを０．５％トゥイーン−２０で洗浄し、１５分間ο−フェニレンジアミン基質（Cappel Inc., PA）と共にインキュベートした。反応を停止させ、吸光度をＥＩＡ読み取り装置で測定した。結果を標準曲線から読み取った。
６．１．４．細胞数
合計の非付着および付着ゾーン細胞数を、インピーダンス原理細胞計測器（Counter Electronics, FL）を用いて測定した。示差的細胞数は、ディフ−クイック（Diff-Quick）（Baxter SP, IL）を用いて染色した細胞の形態に厳密に基づいた。細胞は実質細胞対間質細胞として記録された。コロイドカーボンの食作用、およびｖＷ因子VIIIに対するＦＩＴＣ結合抗体との反応を、それぞれクッパー細胞および内皮細胞の同定のために使用した。
６．１．５．フローサイトメトリー
表現型分析  肝臓培養物から誘導された細胞を、氷の上で、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Serotec Inc, UK）と結合している、ラットMHC IまたはMHC II抗原に対するマウスモノクローナルＩｇＧ1多型性抗体１００μＬと反応させた。対照細胞は、マウスＩｇＧ1−ＦＩＴＣのみで処理した。試料は、波長４８８ｎｍに合わせ、対照細胞の≧９８％を排除するように調節された蛍光ゲイン（gain）を有するＥＰＩＣＳ  Ｃフローサイトメーター（Couler Electronics, Hialeah, FL）を用いて分析した。前方光散乱（ＦＬＳ）対側面散乱（ＳＳ）の２パラメーターヒストグラムを用いて、種々の細胞集団の回りにウインドウ（window）を設けた。そして、陽性蛍光結果の百分率を決定した。
シトクロムＰ−４５０アッセイ  新しく単離した肝細胞、単離後２４時間の肝細胞、および様々な存続期間の、浮遊ナイロンスクリーン培養物から誘導した肝細胞を、フローサイトメトリーによって、シトクロムＰ−４５０モノオキシゲナーゼ活性についてアッセイした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Sigma Chem. Co.）に溶かした２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ρ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）（Chemical Carcinogen Repository, National Cancer Institute, Kansas City, MO）の１μＭストック溶液の１ｎＭを、細胞培養物に１８時間添加し、酵素活性を誘導した（Miller, 1983, Anal. Chem. 133:46-57）。この非蛍光化合物は、このアッセイのための理想的誘導物質であることが判明した。浮遊ナイロンスクリーン培養物中の細胞を、トリプシン−コラゲナーゼ混合物（NaughtonおよびNaughton, 1989, Ann. N.Y. Acad. Sci. 554:125-140）を用いて引き上げ、ペレット化し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に約５ｘ１０5個／ｍＬの密度で再懸濁し、氷上に１時間保存し、徐々に３７℃まで温めた。細胞は、シトクロムＰ−４５０酵素活性の証拠について、エトキシフルオレセインエチルエステル（ＥＦＥＥ）を蓄積している細胞において、次第に増加するフルオレセイン蛍光を定量することにより分析した（Miller, 1983, Anal. Chem. 133:46-57; Whiteら、1987, Biochem. J. 247:23-28）。細胞をＰＢＳに溶かした５０ｎＭ  ＥＦＥＥ（Molecular Probes, Eugene, OR）と共に５分間３７℃でインキュベートし、５１５ｎｍのロングパスフィルターを備え、４８８ｎｍバンドに合わせてあるフローサイトメーターを使用して、緑色蛍光を検査した。蛍光を、ＦＬＳ対ＳＳ特性の相違に基づいて、種々の細胞集団についてゲート（gate）し、３７℃に維持した試料を用いて１分につき１回、１５分まで測定した。細胞における経時的フルオレセインの蓄積は、シトクロムＰ−４５０活性を示すものであった（Miller, 1983, Anal. Chem. 13:46-57; Whiteら、1987, Biochem. J. 247:23-28）。
細胞周期分析  浮遊ナイロンスクリーン肝細胞培養物の付着ゾーンから分離した細胞は、細胞周期の異なる時期における細胞の相対百分率をつきとめるため、外形測定分析に付した。Friedら（Friedら、1978, J. Histochem. Cytochem. 26:921-933）およびTaylor（Taylor, 1980, J. Histochem. Cytochem. 28:1021-1024）の方法の変法を用いて、細胞のＤＮＡ内容物を染色した。1.5%トリトン-X-100を１：５（v/v）の比で完全培地と共に含む、蒸留水に溶かした0.05mg/mLのヨウ化プロピジウム（Sigma Chem. Co., St. Louis, MO）からなる染色溶液を加え、軌道振とう機を用いて試験管を２〜３分間穏やかに攪拌した。ＲＮアーゼ（1mg/mL, 50〜75Kunitz単位／mL）（Sigma Chem. Co.）を各試験管に３分間加えた。懸濁液を５０μｍのナイロンスクリーンで濾過した。ヒストグラムから破砕物を除くため前方光散乱でゲートした後、細胞フルオログラフを用いて、ｌｏｇスケールで赤色蛍光を測定した。ヒストグラムをリストモード（List Mode）にセーブし、PARA Iプログラム（Coulter Electronics, Hialeah, FL）を用いて分析した。すべての試料のＧ1／Ｇ0ピークの変動係数（ＣＶ）は、≦３．０であった。
統計学的分析  フローサイトメトリー測定は、試料サイズ５，０００（表現型分析）から１０，０００（細胞周期分析）イベントについて３回反復して行なった。ＥＦＥＥからフルオレセインへの変換を、時間の関数として、１分あたり３，０００から５，０００イベントをサンプリングして測定した。すべての結果は、平均±１平均標準誤差（ｓｅｍ）で表されている。データは、５％レベルで有意とみなされた。
６．１．６．免疫蛍光
標本を９５％エタノールで固定し（２４ｈｒ／４℃）、同一条件下で無水エタノールにより脱水させ、そして５６℃でパラフィンに包埋する前に、キシレンで澄明化した（８ｈｒ／４℃）。７μｍの切片をキシレンで澄明化し、等級付けられた一連のエタノールで脱水させ、０．１Ｎ  酢酸ナトリウム酢酸緩衝液ｐＨ６．０中に濃度０．５ｍｇ／ｍＬであるウシ精巣ヒアルロニダーゼ（Sigma Chem. Co., MO）溶液で５分間、前消化した。スライドを、一次抗血清の添加の前に、４％ヤギ血清、０．１％ＢＳＡ、および０．１％トゥイーン−２０を０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に含有する溶液でブロックした。フィブロネクチンまたはラミニンに対するポリクローナルウサギ一次抗体（Telios Pharmaceuticals, CA）を、１．０％ヤギ血清を含有する０．０１ＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）で１：１００に希釈し、上記の切片と１〜３時間２２℃で反応させた。スライドを５回、０．１Ｍ  ＮａＣｌに溶かしたトゥイーン−２０の０．１％溶液で洗浄し、Ｒ−フィコエリトリンと結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Sigma Chem. Co., MO）で標識する前に、Ｔｒｉｓ緩衝液に１０分間入れた。切片をヨウ化プロピジウムで３０分間対比染色し、ゲルマウント（Gelmount）で固定し、ニコンエピフルオレスセンス（Nikon Epifluorescence）顕微鏡で調べた。
６．１．７．電子顕微鏡検査
付着ゾーン細胞をコラゲナーゼを用いて分離し、洗浄し、完全培地に４〜６時間入れた。次に、細胞を遠心によってペレット化し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中の２．５％グルタルアルデヒドで１時間固定し、緩衝液で洗浄し、四酸化オスミウムで後固定し、漸増する濃度のエタノールおよび酸化プロピレンで脱水させ、Epon 812に包埋した。切片をＬＫＢウルトラマイクロトム（Ultramicrotome）（LKB Instruments, MD）で切り出し、５％酢酸ウラニルで染色し、０．４％クエン酸鉛で後染色した。切片をJOEL 100C透過型電子顕微鏡で検査した。
６．２．結果
本節に記述する結果は、上記の第６．１．節に概要を述べた肝予備細胞の単離、特徴付け、培養および機能に関する手順および技法を利用した実験から得られたデータである。灌流およびパーコール密度勾配分離の後に肝細胞を単離すると、４つの異なる形態学的カテゴリーの細胞が観察された。すなわち、（１）少なくとも２つの核、顕著な核小体、および時おり膜性「ブレブ（bleb）」を示した中〜大細胞。これらの細胞はプラスチックの皿および肝間質細胞に付着し、７０％パーコールペレットに局在した（図１参照）；（２）プラスチックに付着しなかったが、間質細胞に付着する若干の能力を示した小〜中細胞。付着しなかったこのグループの細胞は死滅し、培養の２〜３日以内に自己溶解した。これらの細胞はすべての分離ゾーンに見いだされたが、25%/50%勾配のオーバーレイ（overlay）培地において最も顕著であった；（３）７０％パーコールスピンの上清に濃縮されていた種々のサイズの死滅細胞、および（４）１〜２個の核および複数の顕著な核小体をもつ、大きい（≧３０μｍ）、微かに染色される好酸性細胞（図２参照）。これらは、２５％／５０％（ニートなパーコール／１Ｘ  ＰＢＳ）遠心分離の界面に現れ、プラスチック皿、ナイロンスクリーン、または間質細胞に付着する。さらに、いったんこれらの細胞が固着されると、他のＰＣはこれらに付着する。これらの大きい好酸性細胞は、単層培養において２週間まで増殖し、脱着し、そして非付着ゾーンに浮遊するようになる。このゾーンでは、これらの細胞は、新たにペレット化された肝細胞と形態学上見分けがつかない（図３参照）。これらの大きい好酸性細胞は、肝予備細胞であると考えられる。これらの細胞は、間質とともに共培養すると、全実験期間にわたって生き続けた。７０％パーコールペレットに単離されたＰＣと、肝間質細胞との結合（association）が、図４に見られる。
肝間質細胞は、２５％：５０％不連続パーコール勾配の界面の下部バンドに局在した。この集団に含まれたのは、クッパー細胞（コロイドカーボンを貧食し、またMHC II抗原を発現する能力によって同定された）、内皮細胞（vW因子VIIIに対する抗体と結合した）、繊維芽細胞、および脂肪細胞に似た細胞であった。これらの間質細胞は、ナイロンスクリーンテンプレート上にマトリックスを形成し、これはいくつかの点で肝臓の切片に見られるものと類似していた。フィブロネクチンおよびラミニンの沈着が、間接免疫蛍光により同定された。抗フィブロネクチン抗体で標識された培養マトリックスの蛍光強度は、肝臓切片に見られるものより大きいように思われ、この事はこの細胞外マトリックス物質の増強された合成を示唆した。
ナイロンスクリーン上の半集密的に増殖している間質細胞に接種されたＰＣは、培養物中で２〜３日間増殖し、６〜２０個の細胞からなるクラスターを、以前には１個または２個の細胞しか含有していなかった領域に形成した（図５参照）。細胞は生育力を持ち続けたが、この時点で増殖は終わったようであった。浮遊ナイロンスクリーン／間質のテンプレート上で培養された肝臓の好酸性細胞は、同様の初期増殖パターンを示した（図５Ｂ参照）。しかし、この過程は、強固に付着した実質細胞クラスターの密集ゾーンが現れるまで、継続するように見えた。
ある培地補充物は培養中の肝細胞に対し活性であった。この点では、ヨウ化プロピジウム細胞フルオログラフ分析によって実証されるように（図６参照）、鉄補充物がＳ期における肝細胞の百分率を高めた。不完全肝切除の後、再生しつつある肝臓を有するラットの肝静脈血清に見出される因子もまた、この混合培養系において肝細胞のＤＮＡ合成を増強した（図７参照）。
また、好酸性細胞は肝間質に付着したが、他のＰＣより高速度でクラスター形成を行なった。これらの細胞による3Ｈ−チミジンの取り込みは、培養中の他の肝細胞集団のそれよりも有意に高かった。また、浮遊ナイロンスクリーン共培養における細胞は、この放射性核種を２か月以上にわたって取り込み続けた。酵素によって分離された付着ゾーン細胞の示差的カウントは、有系分裂像を有する実質細胞に似た細胞の数の増加を示した。透過型電子顕微鏡による検査は、ペレット化された付着ゾーン細胞が、新しく調製された肝細胞に見られるのと同様の、超微細構造的特性を示すことを明らかにした（図８参照）。浮遊ナイロンスクリーン／間質のテンプレート上で培養したＰＣは、生育力を持ち続け、培養を開始するのに使用したＰＣよりも有意に大量のアルブミンを合成した（図９参照）。
浮遊ナイロンスクリーン共培養における細胞は、ＥＦＥＥをフルオレセインに変換するその能力によって示されるように、誘導性のシトクロムＰ−４５０酵素活性を６０日間まで維持した（図１０参照）。この変換は細胞内のものであった。なぜなら、蛍光測定値は、ＦＬＳ対ＳＳ特性によって同定された個別的細胞集団についてゲートされたからである。３つの主要な肝細胞集団がこの活性を示したが、最も高い蛍光は大きい方のＰＣに観察された。任意の変換単位を、陽性蛍光パーセントとピークチャンネル数の積として、Millerらが記述するように計算した（Millerら、1983, Anal. Chem. 133:46-57）。ＥＦＥＥからフルオレセインへの変換ピークは、種々の共培養物において、新たに単離した肝細胞、または単離した肝細胞の１日齢の液体培養物よりも高かった。このパラメーターは共培養物の日齢に依存しないように思われたが、ＥＦＥＥ変換の示差的速度および持続期間を、種々の日齢の培養物において観察した。培養されたＰＣは、新しく単離された肝ＰＣ（４．９％）と比較すると，ＭＨＣクラスＩ抗原の減少した発現（２．６％）を示した。対照的に、間質細胞については、いかなるＭＨＣクラスＩ抗原の発現も検出されなかった。また、マクロファージのＭＨＣクラスＩＩエピトープは、非培養細胞のそれよりも実質的に低かった（それぞれ、３．５％対９．６％）。図１１および１２は、高度に富化された大きい好酸性肝予備細胞を用いて開始し、間質細胞を塗布したナイロンスクリーン上で増殖させた長期共培養物の付着ゾーンにおける、３つの主要肝細胞型の相対的百分率を示す。
上記の肝細胞培養物のin vitro使用の例は、図１３に示される。異なる作用剤の毒性効果が、共培養した肝細胞を使って測定されている。
本発明は、例示した態様の範囲に限定されるものではない。例示した態様は、本発明の個々の側面の説明として意図されている。実際、当業者には先行の記述および添付の図面より、ここに示し、また記述したものに加えて、様々な変更が明らかとなろう。そのような変更は、添付の請求の範囲に入るものとする。
本明細書に引用した刊行物はすべて、参考としてその全体をここに組み入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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