(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記に示すタンパク質をローヤルゼリー全タンパク質当たり９重量％以上含有することを特徴とするローヤルゼリーと、リンゴ酸及び／又はその塩、クエン酸及び／又はその塩、コハク酸及び／又はその塩、リン酸及／び又はその塩から選ばれる一種乃至は二種以上とを含有する濃度が０．１〜２モルであり、ｐＨが３．５〜４．５である緩衝液とを含有することを特徴とする組成物。
１）ローヤルゼリー中のタンパク質が非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する。
２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンである。
３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ローヤルゼリーとその鮮度保持剤として緩衝液及び／又はその塩を含有する食品、化粧品又は医薬品などの組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ローヤルゼリーは、滋養強壮作用を有する素材として知られており、これを主成分とした健康食品などが広く販売されているが、その生理活性の本体全てが未だ決定されておらず、その為、その生理活性には、ロット差が大きく、活性値としてコントロールされていないのが現状であった。これは生理活性本体が未だ突き止め切れていないためである。この為、生理活性を維持する手段の開発が望まれていた。又、ローヤルゼリー中に、１）ローヤルゼリー中の蛋白質の非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する、２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンである、３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含むタンパク質を含有していることも知られておらず、該タンパク質がローヤルゼリー中の分子量５７キロダルトンタンパク質であり、且つ生理活性物質であることも全く知られていない。又、該分子量５７キロダルトンタンパク質は、熱に弱く分解し、それに伴い生理活性が低下することも知られていなかった。従って、分子量５７キロダルトンタンパク質を安定化させる手段も知られていなかった。
【０００３】
他方、緩衝液は、緩衝液は少量のＨ+あるいはＯＨ-イオンを加えたときに溶液のｐＨが大きく変化することに抵抗するような物質の混合物を言い、一般的に、緩衝溶液は共役酸と共役塩基で調製するものである。緩衝液の用途としては、ｐＨを安定に保ち生化学研究等の酵素活性を測定するときなどに用いられたり、微生物を培養するときの培地の希釈液、ゲル濾過やゲルクロマトグラフィーに用いるゲルの膨潤剤、電気泳動分析時のゲルの安定化剤等の目的に用いられている。
【０００４】
又、蛋白分解酵素であるプロテアーゼの中には、その活性発現の過程で金属イオンを必要とする様なプロテアーゼも存在し、その活性を抑えるには、エチレンジアミン４酢酸及び／又は塩等のキレート剤の添加が有効であり、更にｐＨを調整することにより、その活性を抑えることも知られている。しかし、ローヤルゼリーの活性本体がタンパク質であることは全く知られていないため、保存中のローヤルゼリータンパク質の分解を抑制し、ローヤルゼリーを安定化する試みは為されていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況をふまえて為されたものであり、ローヤルゼリー中の生理活性成分を安定化し、その生理活性を維持する手段を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題の解決手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは鋭意研究努力を重ねた結果、ローヤルゼリー中の５７キロダルトンタンパク質がローヤルゼリーの活性本体であり、これを安定化させることにより、かかる安定化が可能であることを見出した。この様な安定化手段を追求した結果、ローヤルゼリーにリンゴ酸及び／又はその塩、クエン酸及び／又はその塩、コハク酸及び／又はその塩、リン酸及／び又はその塩等から選ばれる一種乃至は二種以上の緩衝液を添加することにより、活性本体である５７キロダルトンタンパク質が分解せず安定化することを見出し、完成させるに至った。該タンパク質について、以後、単に「５７キロダルトンのタンパク質」或いは「分子量５７キロダルトンタンパク質」と表現することがある。即ち、本発明は、次に示す技術に関するものである。
（１）  ローヤルゼリーと緩衝液とを含有することを特徴とする組成物。
（２）  ローヤルゼリーが、下記に示すタンパク質をローヤルゼリー全タンパク質当たり９重量％以上含有するものであることを特徴とする、（１）に記載の組成物。
１）ローヤルゼリー中のタンパク質が非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する。
２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンである。
３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。
（３）  緩衝液が、リンゴ酸及び／又はその塩、クエン酸及び／又はその塩、コハク酸及び／又はその塩、リン酸及び／又はその塩から選ばれる一種乃至は二種以上とを含有することを特徴とする、（１）乃至（２）に記載の組成物。
（４）  緩衝液の濃度が０．１〜２モルであることを特徴とする、（１）〜（３）の何れか一に記載の組成物。
（５）  緩衝液のｐＨが３．５〜４．５であることを特徴とする、（１）〜（４）の何れか一に記載の組成物。
（６）  緩衝液がローヤルゼリー中のプロテアーゼ活性を阻害することを特徴とする、（１）〜（５）の何れか一に記載の組成物。
（７）  食品、化粧品又は医薬品であることを特徴とする、（１）〜（６）の何れか一に記載の組成物。
以下、本発明について、実施の形態を中心に説明を加える。
【０００７】
【発明の実施の形態】
（１）本発明の組成物の必須成分であるローヤルゼリー
本発明の組成物は、ローヤルゼリーを必須成分とすることを特徴とする。ローヤルゼリーの化学的組成は、生産地により、多少の差異はあるが、水分６５〜７０％、蛋白質１５〜２０％、炭水化物１０〜１５％、脂肪１．７〜６％、灰分０．７〜２％含むとされている。ローヤルゼリーの生物学的・薬理学的作用については、老化予防作用、酵素作用、抗菌作用、抗腫瘍作用、血液・循環器に対する作用などが知られている。本発明のローヤルゼリーは、分子量５７キロダルトンのタンパク質を含有することを特徴とする。このタンパク質は本発明者らによって、はじめてローヤルゼリーの活性本体であることが確認された成分であり、限界運動量増強作用、肝細胞増殖促進作用、血中アンモニア濃度抑制作用、血中乳酸蓄積抑制作用などの活性を発現することを見出している。ここで、この該タンパク質の含有量であるが、前記効果を十分に発揮する為には、少なくとも９重量％以上を含んでいることが好ましい。このタンパク質はＧＰＣカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによって定量する事ができ、該ローヤルゼリーの液体クロマトグラフィーにおいて、該タンパク質のピーク面積が、全ピーク面積の９重量％以上であることが、本発明の食品，化粧品、医薬品中の生理活性成分として充分作用するからである。該タンパク質のピーク面積が全ピーク面積の９重量％未満であれば、本発明の必須成分であるローヤルゼリーとして品質上好ましくない。本発明の組成物に於けるローヤルゼリーの好ましい含有量は、組成物全量に対して、１〜５０重量％であり、更に好ましくは５〜３０重量％が好ましい。これは、効果発現と処方自由度の兼ね合わせからである。
【０００８】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによるローヤルゼリー中の分子量５７キロダルトン蛋白質の定性方法
凍結乾燥したローヤルゼリーを０．７重量％で１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ＵＦ１０万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ１００；限外濾過）で６倍濃縮、７回脱塩を行い、その濾液をさらにＵＦ３万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ３０；限外濾過）で８倍濃縮、１回脱塩を行い、分子量１０万〜３万の分画を得た。上記の分子量１０万〜３万のサンプルは、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画することで、分子量５７キロダルトンタンパク質を分離できる。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、通常に知られている方法に従って行えば良く、例えば東ソー株式会社製ＤＥＡＥーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍをカラムとして用いて、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液Ａ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）と１ＭＮａＣｌを展開液Ｂとしてグラジェントにより、流速を５ｍｌ／ｍｉｎ、２８０ｎｍの吸光度で検出し、２．５ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮｏ．１１９〜１２７に分子量５７キロダルトンのタンパク質画分を検出することができる。さらにこの画分をゲル濾過クロマトグラフィーにより、これは通常に知られている方法に従って行えば良く、この様な好ましい例としては、例えば、ファルマシア株式会社製ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００をカラムとして用いて、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０を展開液とし、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出し、２．０ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮｏ．３５〜４３に分子量５７キロダルトンのタンパク質を検出することが出来る。（電気泳動にて同一タンパク質を確認）また、既知分子量のゲル濾過分析の結果より、上記タンパク質は、分子量５７キロダルトンモノマータンパク質であると確定された。又、このタンパク質は、Ｎ−グルコシダーゼＦによって消化され、消化後の分子量が４８キロダルトンになるため糖タンパク質であることを本発明者は見出している。
【０００９】
（３）電気泳動によるローヤルゼリー中の分子量５７キロダルトンのタンパク質の定性方法
本発明のローヤルゼリー中の分子量５７キロダルトンのタンパク質は、電気泳動によりタンパク質の構成を分析し、有効成分であるタンパク質の分子量を特定することを特徴とする。電気泳動の方法としては、該有効タンパク質が特定できれば特段の限定は受けないが、好ましい方法は、水溶性ローヤルゼリータンパク質（１０％ローヤルゼリー水溶液（Ｗ／Ｖ））をポリアクリルアミドゲル（１０％均一）にて、電流２０ｍＡで電気泳動し、クマシーブリリアントブルーにより染色して、タンパク質を特定する方法である。この様な電気泳動に於ける本発明の蛋白質の分子量はその精製タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、５７キロダルトンと決定された。
【００１０】
（４）本発明の組成物の必須成分である緩衝液
本発明の組成物は、緩衝液を含有することを特徴とする。緩衝液としては、通常知られているものであれば、特段の限定無く使用でき、本発明の組成物に用いられる緩衝液の種類として具体的には、ホウ酸及び／又はその塩、カコジル酸及び／又はその塩、酢酸及び／又はその塩、ベロナール酢酸及び／又はその塩、コリジン及び／又はその塩、塩酸及び／又はその塩、酢酸及び／又はその塩、グルタル酸及び／又はその塩、炭酸及び／又はその塩、リンゴ酸及び／又はその塩、クエン酸及び／又はその塩、コハク酸及び／又はその塩、リン酸及／び又はその塩、ＨＥＰＥＳ‐ＫＯＨ 緩衝液、Kellenberger緩衝液、PBS 緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸リチウム緩衝液から選ばれる一種乃至は二種以上とを含有することが好ましい。中でも、リンゴ酸及び／又はその塩、クエン酸及び／又はその塩、コハク酸及び／又はその塩、リン酸及び／又はその塩から選ばれる一種乃至は二種以上とを含有することが最も好ましい。また、その性状として、緩衝液の濃度が０．１〜２モルの濃度範囲であることが好ましく、緩衝液のｐＨが３．５〜４．５であることが好ましい。特殊な物として、両性電解質のアミノ酸、特に、N-置換タウリン類あるいはN-置換グリシン類等を用いるグッド緩衝液（Good's  buffer）等が挙げられ、この性状は、１）水に溶けやすく、非極性溶媒に比較的溶けにくい、２）生体膜を通過しにくい、３）イオン強度が低いと言う性質を有している。この緩衝液は、N.E.Goodら（1966）が開発した十数種の両性イオン緩衝液(zwitter-ionic buffer)であり、その多くは緩衝剤(buffer agent、緩衝液をつくるために用いられる試薬)としてを用いているが、中には脂肪族アミンや両性イオン緩衝液でないものも一部含まれている。この緩衝液はこれらの緩衝剤溶液を水酸化ナトリウムあるいは塩酸で希望のｐHまで中和することにより作製することができる。また、市販されている物として、キシダ化学株式会社製のMESA（MOPS-EDTA-酢酸ナトリウム緩衝液・10倍濃縮）TAE (トリス-酢酸-EDTA緩衝液・10倍濃縮）、TBE (トリス-ほう酸-EDTA緩衝液・、TPE (トリス-りん酸-EDTA緩衝液・10倍濃縮） 、TE (トリス-EDTA緩衝液・10倍濃縮）、TNE (トリス-塩化ナトリウム-EDTA緩衝液・10倍濃縮） 、SSC (クエン酸-生理食塩水・20倍濃縮）、SSPE (塩化ナトリウム-EDTA-りん酸緩衝液・20倍濃縮）、1M Tris HCl (pH 8.0)等を用いることもできる。
【００１１】
（５）本発明の組成物
本発明の組成物は、ローヤルゼリーと緩衝剤（液）、好ましくは、リンゴ酸及び／又はその塩、クエン酸及び／又はその塩、コハク酸及び／又はその塩、リン酸及び／又はその塩から選ばれる１種乃至は２種以上を含有することを特徴とする。本発明の組成物は、ローヤルゼリーにリンゴ酸及び／又はその塩、クエン酸及び／又はその塩、リン酸及び／又はその塩を添加することにより、ローヤルゼリーの生理活性成分である分子量５７キロダルトンタンパク質が、分解されず好適な含有量を維持することができる。ここで組成物としては、特段の限定無く適用でき、例えば、食品、化粧品、医薬品などの組成物が好ましく例示できる。これは、ローヤルゼリー製剤としての実績があるからである。又、ローヤルゼリーは、通常の疲労蓄積の改善に有効であり、これを人に投与することにより、疲労回復効果が得られる。本発明の組成物の適応症としては、肌荒れ、虚弱体質、病中・病後や産前・産後の体力の回復、慢性疲労症慣用候群の改善等が挙げられる。本発明のローヤルゼリーは、そのまま、あるいは慣用の製剤担体と共に動物及び人に投与することが出来る。１日の好ましい有効投与量は、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、更に好ましい投与量は５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。食品及び医薬品に於いては、投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じて適宜選択して使用され、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、座剤等の非経口剤が挙げられる。以上の製剤は、定法によって製造される。通常知られた任意成分を本発明のローヤルゼリーの生理活性が損なわれない程度に配合することが出来る。かかる任意成分として、白糖、乳糖等の賦形剤、デンプン、ゼラチン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤、タルク、ロウ類等の滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル等の流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料等が挙げられる。又、化粧品に於いては、上記必須成分以外に通常皮膚外用剤で使用される任意成分を含有することができる。かかる任意成分としては、例えば、ワセリンやマイクロクリスタリンワックス等の様な炭化水素類、ホホバ油やゲイロウ等のエステル類、牛脂やオリーブ油等のトリグリセライド類、セタノール及びオレイルアルコール等の高級アルコール、ステアリン酸、オレイン酸等の脂肪酸類、グリセリンや１、３ーブチレングリコール等の多価アルコール類、非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、エタノール、カーボポール等の増粘剤、紫外線吸収剤、防腐剤、抗酸化剤、色素、粉体類等が好ましく例示できる。本発明の組成物は、これらの必須成分及び任意成分を常法に従って処理することにより得られる。
【００１２】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定を受けないことは、言うまでもない。
【００１３】
＜実施例１〜３＞
生ローヤルゼリー５０ｇに各緩衝液が１Ｍになる様に添加し、４０℃へ、１，２，３、４日間放置した。尚コントロール実験として緩衝液無添加コントロール群も同様に処理した。これを５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清中の５７キロダルトンタンパク質含量をゲル濾過カラムにて測定した。測定としては、東ソー株式会社製TSK-GEL G3000SWカラムを用いて、０．３Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０を展開液とし、流速を０．３ ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出する方法を用いた。表１に示す様に緩衝液を添加した場合、分子量５７キロダルトンタンパク質は経時的に分解の程度が少なかったのに対し、緩衝液無添加のコントロール群は、経時的に分解していった（表１：実施例１〜３）。また、クエン酸―クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐH４．０）及びリンゴ酸―リンゴ酸ナトリウム緩衝液（ｐH４．０）は内因性のプロテアーゼ活性を阻害してした（表２：実施例４，５）。この様に，各緩衝液は、ローヤルゼリー中のプロテアーゼを阻害することにより分子量５７キロダルトンのタンパク質を安定化する事ができる。
【００１４】
【表１】
0003815726.tif 000002
【００１５】
【表２】
0003815726.tif 000003
【００１６】
＜実施例６〜８＞
以下に示す処方に従って、健康食品を作成した。即ち、処方成分を撹拌可溶化しドリンク製剤の健康食品を得た。これらのものは何れも分子量５７キロダルトンタンパク質の安定性に優れていた。表中の数値の単位は重量部を表す。
【００１７】
【表３】
0003815726.tif 000004
【００１８】
＜実施例９〜１１＞
以下に示す処方に従って、健康食品を作成した。即ち、処方成分を撹拌可溶化しドリンク製剤の健康食品を得た。これらのものは何れも分子量５７キロダルトンタンパク質の安定性に優れていた。表中の数値の単位は重量部を表す。
【００１９】
【表４】
0003815726.tif 000005
【００２０】
＜実施例１２〜１４＞
以下に示す処方に従って、健康食品を作成した。即ち、処方成分を撹拌可溶化しドリンク製剤の健康食品を得た。これらのものは何れも分子量５７キロダルトンタンパク質の安定性に優れていた。表中の数値の単位は重量部を表す。
【００２１】
【表５】
0003815726.tif 000006
【００２２】
＜実施例１５〜１７＞
以下に示す処方に従って、クリームを作成した。イ）、ロ）の成分を８０℃に加熱し、ロ）をイ）に徐々に加えることにより乳化し、冷却撹拌しクリームを得た。
これらのものは何れも分子量５７キロダルトンタンパク質の安定性に優れていた。尚、表中の数値の単位は重量部を表す。
【００２３】
【表６】
0003815726.tif 000007
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、ローヤルゼリー中の分子量５７キロダルトンタンパク質の分解を緩衝液を加えることにより内因性プロテアーゼによる分解を防ぎ、以てローヤルゼリーを製剤中に安定に含有させる手段を提供することができる。
【００２５】
【配列表】
0003815726.tif 000008
【００２６】
0003815726.tif 000009