(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非システイン残基がシステイン残基（Cys）に置換されており、亜鉛およびカドミウムとの結合能が野生型よりも増強された改変型メタロチオネイン。
【請求項２】
メタロチオネインが配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトメタロチオネインである請求項１の改変型メタロチオネイン。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列における第11番のアスパラギン酸残基（Asp）および第28番セリン残基（Ser）がシステイン残基（Cys）に置換されている請求項２の改変型メタロチオネイン。
【請求項４】
メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非システイン残基がシステイン残基（Cys）に置換されており、亜鉛およびカドミウムとの結合能が野生型よりも増強された改変型メタロチオネインをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
メタロチオネインが配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトメタロチオネインである請求項４のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列における第11番のアスパラギン酸残基（Asp）および第28番セリン残基（Ser）がシステイン残基（Cys）に置換されている改変型メタロチオネインをコードする請求項５のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４から６のいずれかのポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７の組換えベクターによる形質転換細胞。
【請求項９】
請求項７の組換えベクターの発現産物または請求項８の形質転換細胞の産生物である改変型メタロチオネイン。
【請求項１０】
金属結合能が増強された改変型メタロチオネインをスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(a)メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非システイン残基がシステイン残基（Cys）に置換されているメタロチオネイン変異体を、置換アミノ酸残基の種類を変えて複数個調製し；
(b)各々のメタロチオネイン変異体を、カドミウム、亜鉛、銅、水銀、銀からなる群より選択される１種以上の金属と接触させ；
(c)野生型メタロチオネインよりも多くの金属原子を結合したメタロチオネイン変異体および／または野生型メタロチオネインよりもpH変化に対して安定なメタロチオネイン変異体を選択する、
を含むことを特徴とする改変型メタロチオネインのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、改変型メタロチオネインに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、野生型メタロチオネインが有する金属結合能をさらに増強されており、医薬品や診断剤等の開発や、あるいは環境汚染重金属の回収等に有用な改変型メタロチオネインに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
メタロチオネイン（metallothionein：MT）は、酵母、カビ、植物、無脊椎動物、脊椎動物等の細胞内に存在するタンパク質であり、例えば以下の性質等によって特徴付けられている。
(1) 種々の重金属（Cd, Zn, Cu, Hg, Ag等）と結合し、一分子当たりの金属含有量が高い。
(2) 低分子量タンパク質である。金属を含まない状態で、N.crassaでは約3000、脊椎動物の多くで6000-7000である。
(3) アミノ酸残基Cysを多く含む。哺乳類のメタロチオネインでは全アミノ酸残基の1/3がCysである（例えば、ヒトメタロチオネイン-IIの場合、61アミノ酸のうち20がCysである）。重金属はCysのチオール基を介してメタロチオネインと結合している。
(4) 芳香族アミノ酸を含まないので280 nmでの吸光がない。ただし、カドミウムを結合した場合には、カドミウムとチオール基間のメルカプチド結合により254 nm付近に吸光がある。低pHでカドミウムをメタロチオネインから分離させるとこの吸光はなくなる。
【０００３】
またMTは、13Cd NMRによる分析結果から、2つのクラスターを形成していることが知られている。Aクラスターは11個のCysが4原子のカドミウムまたは亜鉛に結合していて、メタロチオネインのC末端の第31-61番アミノ酸領域にあたり、αドメインとも言われる。一方、Bクラスターは9個のCysが3原子のカドミウムまたは亜鉛に結合していて、メタロチオネインのＮ末端の第1-30番アミノ酸領域に相当し、βドメインとも言われている。X線解析によって、αおよびβドメインは直径1.5〜2.0nmの球形であることが知られている。
【０００４】
生物体の器官や組織から単離精製されたメタロチオネインには様々な金属が結合している。例えば、ヒトの検死体の肝臓より精製されたメタロチオネインは亜鉛を多く含み、一方、腎臓ではカドミウムを多く含むことが知られている。また、実験的にカドミウムや亜鉛を投与した動物や肝臓や腎臓からは、その金属を多く含むメタロチオネインが得られることが知られている。
【０００５】
なお、メタロチオネインは、インビボおよびインビトロにおいて金属を結合した状態を言い、金属を結合していないものは「アポメタロチオネイン」と定義される。ただし、以下の説明においては、金属を結合している状態と金属を結合していない状態を併せて「メタロチオネイン」と記載し、特に金属を結合していない精製タンパク質等をアポメタロチオネインと記載する。
【０００６】
現在のところ、メタロチオネインの生物学的な機能として以下が挙げられている。すなわち、重金属との結合能があり、また重金属、発癌遺伝子産物やストレス刺激によって遺伝子転写レベルでの発現の制御が行われていることから、重金属（CdやHg等）の毒性低減、生体内での必須金属（CuやZn等）の代謝調節が考えられている。あるいは、Cysを多く含むことから、酸化還元電位の調節、硫黄代謝への関与が想定されている。さらに、アルツハイマー病患者の脳で不足している神経成長阻害因子とメタロチオネイン量に高い相関があることや、癌患者における抗癌剤耐性にもメタロチオネインが関与するが知られている。
【０００７】
従って、メタロチオネインは、生体の恒常性維持のための薬剤やアルツハイマー病、癌等の治療用薬剤成分の一部、あるいはそれらの薬剤成分を探索するための標的タンパク質としての役割が期待されている。
【０００８】
一方、メタロチオネインの生物学的な機能とは別に、その優れた重金属結合能に着目し、例えば環境汚染物質の原因となる重金属のモニタや除去を目的としたメタロチオネインの利用についても検討されている。例えば、特開平5-180747号公報には、水中の重金属を検出することを目的としたメタロチオネイン含有の重金属モニタが開示されている。
【０００９】
以上のとおり、メタロチオネインは医療や医薬製造分野、あるいは環境浄化の分野等においてその有用性が指摘されているが、生体組織からメタロチオネインを大量に単離精製することは困難であるため、遺伝子工学的手法によるメタロチオネイン生産について様々な試みがなされている。例えば、この出願の発明者らは、サルメタロチオネイン-II cDNAをPRプロモーターおよびSD配列下流に結合し、大腸菌における直接発現で14mg/g(total protein)のMTの発現を既に報告している（Appl. Environ. Microbiol. 53:204-207, 1987）。また、同じくこの出願の発明者らは、ヒトメタロチオネイン-IIのアミノ酸配列、DNA配列、並びに大腸菌発現のための合成DNAのデザイン法を参考にしてヒトメタロチオネイン-II遺伝子の全合成を行い、大腸菌でβ−ガタクトシダーゼと融合発現し、全タンパク質の約24％にあたる量を発現させることに成功し、しかも得られたメタロチオネインが有為な金属結合活性を示すことをも見出している（J. Ferment. Bioeng. 77(2):113-118, 1994）。その他にも、大腸菌によるメタロチオネイン発現の例が幾つか知られている（例えば、J. Biochem. 104:924-926, 1988; Biochem. Biophys. Acta. 951:230-234, 1988; J. Biotechnol. 8:207-220, 1988; Gene 83:95-103, 1989; Biochem. Biophys. Acta. 1048:178-186, 1990）。
【００１０】
さらにこの出願の発明者らは、組換えメタロチオネインを安定した状態で、かつ大量に発現させることを目的として、複数個のメタロチオネイン分子が連結したメタロチオネイン多量体とその製造方法を発明し、すでに特許出願している（特開2000-60561号公報）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、遺伝子工学的手法を用いることによりメタロチオネインを大量生産することについては一定の目途が立っている。しかしながら、メタロチオネインがその金属結合能によって医薬品や診断剤の成分として、あるいは重金属汚染環境の浄化のめたの材料としての有用性を発揮していることを考慮すれば、メタロチオネインの金属結合能のさらなる増強もまた、その有用性をさらに向上させるために重要な要素となる。そのような金属結合能を増強させたメタロチオネインは、より少量で医療的な機能を発揮し、また環境浄化のための使用量、使用適用範囲を拡大することが期待されるからである。
【００１２】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、野生型メタロチオネインに比して、その金属結合能をさらに増強させた改変型メタロチオネインを提供することを課題としている。
【００１３】
またもの出願の発明は、そのような改変型メタロチオネインの遺伝子工学的製造を可能とするための材料を提供することを課題としている。
【００１４】
さらにこの出願の発明は、金属結合能を増強させた改変型メタロチオネインをスクリーニングする方法を提供することを課題としている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非システイン残基がシステイン残基（Cys）に置換されている改変型メタロチオネインを提供する。
【００１６】
この第１発明の改変型メタロチオネインにおいては、メタロチオネインが配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトメタロチオネインであること、そして配列番号１のアミノ酸配列における第11番のアスパラギン酸残基（Asp）および第28番セリン残基（Ser）がシステイン残基（Cys）に置換されていることを好ましい態様としている。
【００１７】
この出願は、第２の発明として、メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非システイン残基がシステイン残基（Cys）に置換されている改変型メタロチオネインをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
この第２発明のポリヌクレオチドにおいては、メタロチオネインが配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトメタロチオネインであること、そして配列番号１のアミノ酸配列における第11番のアスパラギン酸残基（Asp）および第28番セリン残基（Ser）がシステイン残基（Cys）に置換されている改変型メタロチオネインをコードすることを好ましい態様としている。
【００１９】
この出願は、第３の発明として、前記第２発明のポリヌクレオチドを保有する組換えベクターを提供する。
【００２０】
この出願は、第４の発明として、前記第３発明の組換えベクターによる形質転換細胞を提供する。
【００２１】
この出願は、第５の発明として、前記第３発明の組換えベクターの発現産物または前記第４発明の形質転換細胞の産生物である改変型メタロチオネインを提供する。
【００２２】
さらにこの出願は、第６の発明として、金属結合能が増強された改変型メタロチオネインをスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(a)  メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非システイン残基がシステイン残基（Cys）に置換されているメタロチオネイン変異体を、置換アミノ酸残基の種類を変えて複数個調製し；
(b)  各々のメタロチオネイン変異体を１種以上の金属と接触させ；
(c)  野生型メタロチオネインよりも多くの金属原子を結合したメタロチオネイン変異体および／または野生型メタロチオネインよりもpH変化に対して安定なメタロチオネイン変異体を選択する、
を含むことを特徴とする改変型メタロチオネインのスクリーニングを提供する。
【００２３】
以下、実施形態を示し、この出願の各発明について詳しく説明する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
第１発明の改変型メタロチオネインは、野生型メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非システイン残基がシステイン残基（Cys）に置換されているポリペプチドである。
【００２５】
「野生型メタロチオネイン」は、様々な種由来の天然型メタロチオネインを意味し、特にその遺伝子（cDNA）およびアミノ酸配列が既知のものが好ましい。例えば、メタロチオネイン遺伝子はN. crassa、酵母、ニジマス、サル、ヒト等において公知であり、そのcDNA配列やアミノ酸配列は既存の配列データベース（GenBank等）から当業者であれば容易に知ることができる。例えば、ヒトメタロチオネインに４種類のアイソタンパク質が知られており、メタロチオネイン-IはGenBank Accession No. X97261、メタロチオネイン-IIはGenBank Accession No. X97260、メタロチオネイン-IIIはGenBank Accession No. XM#008111等が知られている。
【００２６】
「改変型メタロチオネイン」とは、前記の野生型メタロチオネインを構成するアミノ酸配列のうち、１以上の非Cys残基をCys残基に置換することによってその金属結合能を増強させたポリペプチドである。この改変型メタロチオネインは、野生型メタロチオネインと同一のサイズであってもよく、あるいはその金属結合能が野生型よりも増強されていることを条件として、野生型メタロチオネインの一部（例えば、βドメインまたはαドメイン、若しくは両者を部分的に含む10アミノ酸残基以上のペプチド）であってもよい。
【００２７】
さらに、非Cys残基と置換するCys残基は、天然型のCys残基であってもよく、あるいは金属との結合能が良好であることを条件として、何らかのCys残基誘導体であってもよい。そのようなCys残基誘導体は、例えばシステイニル基を、例えばブロモートリフルオロ酢酸、α-ブロモ-β-（5-イミダゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルホスファート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；メチル2-ピリジルスルフィド；p-クロロメルクリ安息香酸；2-クロロメルクリ-4ニトロフェノール；またはクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾール等と反応させることにより生成することができる。
【００２８】
野生型メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非Cys残基をCys残基に置換するための一つの方法は、特定の塩基置換を含むポリペプチドを、公知のペプチド合成法によって作製する方法である。ペプチド合成は種々の固相法を用いて行うことができ（例えば、Science 269:202, 1995; Methods Enzymol. 289:3-13, 1997参照）、また例えばABI431Aペプチド・シンセサイザー（Perkin Elmer）等を用いることによって自動的に行うこともできる。
【００２９】
野生型メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非Cys残基をCys残基に置換するための別の方法は、塩基置換を伴ったアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（第２発明）を調製し、このポリヌクレオチドを発現ベクターに組換えて（第３発明）、この発現ベクターによる形質転換細胞（第４発明）の培養物として改変型メタロチオネインを作製する方法である。
【００３０】
第２発明のポリヌクレオチドは、公知の野生型メタロチオネインをコードする核酸配列（ゲノムDNA、mRNA、およびmRNAから合成されるcDNA）のうち、非Cys残基をコードする３塩基（トリプレット）を、Cys残基をコードするトリプレット（aga、agc）に置換することによって作製することができる。トリプレットの置換は、ミューテーション・キット等を使用する方法、あるいは変異導入型のPCR法など、公知の方法により行うことができる。また、公知のポリヌクレオチド合成法（例えば、Nucleic Acid Res. 25:3440-3444, 1997等）によって化学合成することもできる。
【００３１】
この第２発明のポリヌクレオチドを用いることによって、第３発明の組換えベクターおよび／または第４発明の形質転換細胞から改変型メタロチオネイン（第５発明）を作製することができる。例えば、RNAポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組換え、この組換えベクターをプロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、改変型メタロチオネインをインビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T7、T3、SP6などが例示できる。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pBluescript IIなどが例示できる。また、ポリヌクレオチドを適当な宿主−ベクター系において発現させれば、改変型メタロチオネインを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の真核細胞などで生産することができる。例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的の改変型メタロチオネインを大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescript II、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。さらに、ポリペプチドを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドをプロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクターをトランスフェクトした真核細胞から目的の改変型メタロチオネインを得ることができる。発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYES2などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞HEK293、サル腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３２】
以上のとおり、この発明の改変型メタロチオネインは、野生型メタロチオネインを構成するアミノ酸配列における１以上の非Cys残基がCys残基に置換されていることを特徴とするものである。野生型メタロチオネインよりも金属結合能が増強されていることを条件として、いずれの非Cys残基がCys残基に置換されていてもよい。例えば、ヒトメタロチオネイン-IIは61残基のアミノ酸によって構成されているが、そのうち20残基がCysである。従って、残り41個の非Cys残基のいずれか１以上をCys残基に置換した結果、その置換後の金属結合能が野生型メタロチオネインよりも増強したポリペプチドがこの発明の改変型メタロチオネインの範囲に含まれる。
【００３３】
このような改変型メタロチオネインは、第６発明のスクリーニング方法によって特定することができる。
【００３４】
この第６発明の方法では、先ずステップ(a)として、メタロチオネインのアミノ酸配列における１以上の非Cys残基がCys残基に置換されているメタロチオネイン変異体を、置換対象となるアミノ酸残基の種類を変えて複数個調製する。この場合のメタロチオネイン変異体は、先に説明したようなペプチド合成、あるいは遺伝子工学的方法によって調製することができる。また、調製するメタロチオネイン変異体の個数は、例えば野生型ヒトメタロチオネイン-IIを鋳型とする場合には、非Cys残基の1-41個をあらゆる組み合わせでCys残基に置換したものから選択される２以上とすることができる。
【００３５】
次いで、ステップ(b)として、各々のメタロチオネイン変異体を１種以上の金属と接触させる。金属は、野生型メタロチオネインが結合するカドミウム、亜鉛、銅、水銀、銀等から選択することができる。
【００３６】
そして、ステップ(c)において、各々のメタロチオネイン変異体から、野生型メタロチオネインよりも金属結合能が増強されたものを選択する。その際の基準の一つは、各々のメタロチオネイン変異体に結合した金属原子を測定し、野生型メタロチオネインよりも多くの金属原子を結合したメタロチオネイン変異体を選択することである。金属原子の結合数は、実施例に示したような原子吸光光度の測定等の方法によって行うことができる。選択のための別の基準は、pH変化（pHの上昇変化）に対するメタロチオネインの安定性である。すなわち、メタロチオネインに結合した金属は低pH（pH2.5〜3.0）で解離する。金属と結合していないメタロチオネイン（アポメタロチオネイン）は中性およびアルカリ条件下では酸化されやすく不安定となる。従って、pHの上昇変化に対して野生型メタロチオネインよりも安定なメタロチオネイン変異体は、より強固に金属を結合していると判定することができる。
【００３７】
この出願は、以上のとおりのスクリーニング方法によって選択された改変型メタロチオネインとして、ヒトメタロチオネインのアミノ酸配列を示した配列番号１における第11番のアスパラギン酸残基（Asp）および第28番セリン残基（Ser）がシステイン残基（Cys）に置換されている改変型メタロチオネインを好適な具体例として提供する。
【００３８】
以下、実施例および試験例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３９】
【実施例】
実施例１：メタロチオネイン変異体をコードするポリヌクレオチドと、その発現ベクターの構築
ヒトメタロチオネイン-IIの全長cDNA（配列番号１）およびβドメインcDNA（配列番号１の第1-30番アミノ酸配列）をそれぞれInteinとの融合タンパク質として発現するプラスミドpTIMTIおよびpTIMTII（Protein Expr. Purif. 21(1):243-250, 2001）にMutant-Super Express Km kit（タカラ酒造社製）を用い、そのプロトコールに従って部位特異的変異（第11番のAspおよび第28番SerをCysに置換するための塩基置換）を導入した。各クローンのDNA塩基配列を決定して目的の塩基変異を確認し、プラスミドベクターpTIMTID11C/S28CおよびpTIMTIID11C/S28Cを構築した。
実施例２：メタロチオネイン変異体の発現および精製
実施例１で構築したプラスミドベクターpTIMTID11C/S28CおよびpTIMTIID11C/S28Cを用いて大腸菌ER2566株を形質転換した。IMPACT System（New England Biolabs社製）を用いて形質転換菌にヒトメタロチオネイン-IIの全長またはβドメインとInteinとの融合タンパク質を発現させ、アファニティーカラムを用いて精製後、ジチオスレイトール（DDT）によりInteinとメタロチオネインとを切断した。発現、精製の各段階において、SDS-PAGEにより高発現バンドの存在を確認した。カラム精製後の溶出画分に1N塩酸を添加してpH1.0とし、10,000 rpm 5分 4℃で遠心分離し、上清をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Sephadex G-50 column、10 ml/hr、20 mM Tris-HCl溶液）により分画を行い、各フラクションを220 nmの吸光度で測定し、精製アポメタロチオネインを回収した。
【００４０】
また、コントロールとして、プラスミドpTIMTIおよびpTIMTIIを用い、前記と同様にして野生型ヒトメタロチオネイン-IIおよびそのβドメインペプチドを発現させ、精製した。
実施例３：金属結合メタロチオネインの作製
実施例２で作製した野生型および変異型のアポメタロチオネインまたはそれそれのβドメインペプチドに塩化カドミウムおよび硫酸亜鉛を加え、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Sephadex G-50 column、10 ml/hr、20 mM Tris-HCl溶液）により分画を行い、塩化カドミウムを加えた場合は250 nm、硫酸亜鉛を加えた場合は220 nmの吸光度で各フラクションを測定し、カドミウム結合メタロチオネインおよび亜鉛結合メタロチオネイン、並びにそれぞれのβドメインペプチドを作製した。
試験例１：金属結合数の測定
0.1N硝酸により希釈した原子吸光光度測定用標準溶液（Wako社製）を用いてカドミウムおよび亜鉛の希釈系列（0.01-2.00μg/ml）を作製し、実施例３で作製した金属結合メタロチオネインおよびβドメインペプチドを約1.00μg/mlに希釈し、原子吸光光度測定装置（model SAS7500A:Seiko社製）を用いて金属濃度を測定した。測定波長はカドミウムの場合は229nm、亜鉛の場合は241nmとした。
【００４１】
結果は表１に示したとおりである。野生型の全長メタロチオネインおよびそのβドメインペプチドに比較し、２箇所のアミノ酸置換を有するメタロチオネイン変異体およびβドメインペプチド変異体は、約１個多いカドミウムおよび亜鉛を結合することが確認された。
【００４２】
【表１】
0003801937.tif 000002
【００４３】
試験例２：pH変化に対する安定性の測定
実施例３で作製した金属結合メタロチオネインおよびβドメインペプチドを20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）で3 nmol/mlに希釈した後、HClでpH 2.5に調製して金属を解離させた。次いで、Tris溶液を添加してpHを徐々に上昇させ、メタロチオネインおよびβドメインペプチドの安定性をUV吸収の変化として測定した。なお、カドミウム結合のものについては250nm、亜鉛結合のものは220nmの吸光度を測定した。
【００４４】
結果は図１および図２に示したとおりである。図１は、野生型および変異型のカドミウム結合メタロチオネインおよびβドメインペプチドのpH滴定曲線であり、図２は亜鉛結合メタロチオネインおよびβドメインペプチドのpH滴定曲線である。いずれの金属を結合した場合も、野生型の全長メタロチオネインおよびそのβドメインペプチドに比較し、２箇所のアミノ酸置換を有するメタロチオネイン変異体およびβドメインペプチド変異体は低pHで立ち上がり、その勾配も急であることから、pH安定性が向上し、金属結合能が増強されていることが確認された。
【００４５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、野生型メタロチオネインに比べて金属結合能がさらに増強された改変型メタロチオネインが提供される。
【００４６】
【配列表】
<110> Japan Science and Technology Corporation
<120> A modified metallothionein
<130> NP02127-YS
<140>
<141>
<160> 1
<210> 1
<211> 61
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala
1               5                  10                  15
Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser
20              25                  30
Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys
35              40                  45
Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala
50              55                  60
【図面の簡単な説明】
【図１】野生型および変異型のカドミウム結合メタロチオネインおよびβドメインペプチドのpH滴定曲線である。pTIMTIは完全長野生型、pTIMTID11C/S28Cは完全長変異型、pTIMTIIはβドメイン野生型、pTIMTIID11C/S28Cはβドメイン変異型を示す。
【図２】野生型および変異型の亜鉛結合メタロチオネインおよびβドメインペプチドのpH滴定曲線である。pTIMTIは完全長野生型、pTIMTID11C/S28Cは完全長変異型、pTIMTIIはβドメイン野生型、pTIMTIID11C/S28Cはβドメイン変異型を示す。
【図１】
0003801937.tif 000003
【図２】
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