(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モヅクの極性溶媒抽出物を二酸化炭素ガスを溶媒とする超臨界抽出法により低極性画分を除去して得られる精製モヅク抽出物。
【請求項２】
モヅクを二酸化炭素ガスを溶媒とする超臨界抽出法により低極性画分を除去した後、極性溶媒で抽出して得られる精製モヅク抽出物。
【請求項３】
モヅクを極性溶媒を用いて抽出した後、二酸化炭素ガスを溶媒とする超臨界抽出法により低極性画分を除去することにより精製する、精製モヅク抽出物の製造方法。
【請求項４】
モヅクを二酸化炭素ガスを溶媒とする超臨界抽出法により低極性画分を除去した後、極性溶媒で抽出することにより得られる、精製モヅク抽出物の製造方法。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載の精製モヅク抽出物を含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安全性が高く、しかも高い細胞賦活作用及び美白作用を有する精製モヅク抽出物、及びその製造方法、さらには、かかる精製モヅク抽出物を含有する、安全性が高く、皮膚の老化及び肌荒れ症状を有効に防止及び改善でき、高い美白効果を発揮する皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、加齢，紫外線曝露によるしわの形成や弾性の低下といった皮膚の老化や肌荒れ症状の進行を防止或いは改善するため、多くの皮膚外用剤が提案されてきた。最近では自然志向及び植物志向を反映してか、植物抽出成分において、真皮マトリックスの構成成分であるコラーゲンやエラスチン，ヒアルロン酸等の分解を抑制したり、これらの産生を促進したりする成分、線維芽細胞を賦活化する成分の検索が盛んに行われている。
【０００３】
しかしながら、従来用いられてきた植物抽出成分は、皮膚の老化及び肌荒れ症状の防止，改善効果が十分ではなく、皮膚外用剤に配合する場合、多量を用いなければならなく、そのため細胞毒性を示すなど、安全性に問題のあるものも存在していた。また、安定かつ一定の品質を有する抽出物が得られないものも存在していた。
【０００４】
またモヅク抽出物について、本発明者等は、すでにイシモヅク属植物抽出物のメラニン生成抑制効果及びこれを含有する美白剤（特開平１０−３３０２１９）、モヅク抽出物の表皮細胞及び真皮線維芽細胞に対する賦活効果（特願２００２−７００５０）を見いだし、特許出願を行っている。その他、モヅク抽出物のヒアルロニダーゼ阻害効果（特開平９−６７２６６）、モヅク抽出物に含まれるフコイダンの抗炎症効果（特開平９−３２８４３１），抗アレルギー作用（特開平１０−７２３６２）等も開示されており、皮膚外用剤への応用が期待されている。しかしながら、モヅクの極性溶媒抽出物においては、多量に配合すると細胞毒性を示し、有効量を配合すると皮膚刺激や肌荒れ等の原因となることがあった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明においては、皮膚刺激や肌荒れを生じず、安全性が高く、しかも高い細胞賦活作用及びメラニン生成抑制作用を有するモヅク抽出物を得ること、及びかかるモヅク抽出物を含有する安全性が高く皮膚の老化及び肌荒れ症状を有効に防止及び改善でき、高い美白効果を発揮する皮膚外用剤を得ることを目的とした。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するべく、モヅク抽出物の精製方法について検討を行ったところ、モヅクの極性溶媒抽出物をさらに炭酸ガスを溶媒とした超臨界抽出法により低極性画分を除去することにより、若しくは、モヅクを超臨界抽出法により低極性画分を除去した後極性溶媒で抽出することにより、細胞毒性を示すことなく表皮細胞及び真皮線維芽細胞を賦活化し、高いメラニン生成抑制作用を有することを見いだした。更に、これを皮膚に適用することにより、安全性が高く、しかも皮膚の老化及び肌荒れ症状を有効に防止及び改善でき、高い美白効果を発揮することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【発明の実施の形態】
モヅク抽出物を得る際に用いられるモヅクとしては、褐藻類（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）ナガマツモ目に属し、通常食用とされるモヅクであれば特に種類は問わず、例えばモヅク科モヅク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｎｓ  (Ｓｕｒｉｎｇａｒ)  Ｋｕｃｋｕｃｋ），ナガマツモ科オキナワモヅク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ  Ｔｏｋｉｄａ），ナガマツモ科フトモヅク（Ｔｉｎｏｃｌａｄｉａ ｃｒａｓｓａ  (Ｓｕｒｉｎｇａｒ)  Ｋｙｌｉｎ），ナガマツモ科イシモヅク（Ｓｐｈａｅｒｏｔｒｉｃｈｉａ ｄｉｖａｒｉｃａｔａ  (Ａｇａｒｄｈ)  Ｋｙｌｉｎ）等が挙げられる。精製モヅク抽出物を得る際の抽出部位は特に問わないが、全藻を用いることが好ましい。
【０００８】
本発明における精製モヅク抽出物は、かかるモヅクを生のまま、若しくは細切，乾燥，粉砕等の処理を行った後に抽出を行う。抽出は、▲１▼極性溶媒を用いた抽出、及び▲２▼二酸化炭素ガスを溶媒とする超臨界抽出法により低極性画分の除去の２段階で行う。この、▲１▼及び▲２▼の抽出は、順序を問わない。
【０００９】
▲１▼極性溶媒を用いた抽出法
極性溶媒としては、水、メタノール，エタノール，プロパノール，イソプロパノール等の低級アルコール、１，３−ブチレングリコール，プロピレングリコール，１，２−ペンタンジオール，ジプロピレングリコール，グリセリン等の多価アルコール等、生理食塩水，リン酸緩衝液，リン酸緩衝生理食塩水等を用いる。これらの極性溶媒の中でも、特に５０容量％エタノール水溶液を用いることが、細胞賦活作用の点から特に好ましい。抽出は、極性溶媒に浸漬して行う。抽出効率を上げるため撹拌を行ったり、抽出溶媒中でホモジナイズしても良い。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は極性溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、４時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１０】
▲２▼二酸化炭素ガスを溶媒とする超臨界抽出法により低極性画分の除去
超臨界抽出には、モヅクの極性溶媒抽出物若しくはモヅクを乾固させて用いる。超臨界流体又は亜臨界流体としては、二酸化炭素を用いる。抽出圧力は、使用する抽出剤の臨界圧力に応じて適宜選定することができるが、通常は３〜７０ＭＰａであることが好ましく、特４〜６０ＭＰａ、好ましくは５〜４０ＭＰａ、最も好ましくは６〜２０ＭＰａである。抽出温度は、１５〜２００℃、好ましくは２０〜１５０℃、最も好ましくは２５〜１００℃である。
【００１１】
抽出の際のモヅクの極性溶媒抽出物若しくはモヅクと抽出剤との比率は特に限定されないが、モヅクの極性溶媒抽出物若しくはモヅク１に対して溶媒０．１〜１０００重量倍、特に抽出操作、効率の点で、０．５〜１００重量倍が好ましい。また、抽出時間は抽出条件などにより異なるが２時間〜２週間の範囲とするのが好ましい。
【００１２】
また、抽出剤の溶解度を向上させるためにエントレーナを用いることもできる。エントレーナとしては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエンから選択される１種又は２種以上の溶媒を用いる。エントレーナの濃度として好ましくは、０．０００００１〜３０．０％、より好ましくは、０．００００１〜１０．０％、最も好ましくは、０．０００１〜１．０％である。これらのエントレーナを用いることで炭酸ガス中への低極性成分の溶解度を向上させる効果が高くなる。
【００１３】
なお、本発明においては、二酸化炭素ガス中に抽出されなかった抽出残さを用いる。
【００１４】
本発明は、▲１▼及び▲２▼の操作を行うことにより、精製モヅク抽出物を得る。また、かかる精製モヅク抽出物をそのまま、あるいは水，アルコール等の水性担体、乳剤，ゲル，クリーム，軟膏等の基剤に含有させて，皮膚外用剤として提供する。
【００１５】
本発明に係る皮膚外用剤は、ローション剤，乳剤，ゲル剤，クリーム剤，軟膏等の剤型で提供することができる。また、化粧水，乳液，クリーム，パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション，メイクアップベースクリーム，乳液状又はクリーム状あるいは軟膏型のファンデーション，アイカラー，チークカラー等のメイクアップ化粧料、ハンドクリーム，レッグクリーム，ボディローション等の身体用化粧料、毛髪洗浄料，身体用洗浄料，顔用洗浄料，石けん等の洗浄剤、トリートメント剤，セット剤等の毛髪用化粧料等としても提供することができる。
【００１６】
なお本発明に係る皮膚外用剤には、本発明に係る抽出物のほか、油類，界面活性剤，保湿剤，紫外線吸収剤，顔料，香料，防腐剤等の一般的な医薬品及び化粧料用原料や、活性酸素消去剤，抗炎症剤等の生理活性成分も含有させることができる。また、本発明に係る抽出物の皮膚外用剤への配合量としては、その剤型により異なるが、０．０００１〜１０．０重量％程度とするのが適当である。
【００１７】
【実施例】
更に本発明について、実施例により詳細に説明する。
【００１８】
［実施例１，実施例２］  精製モヅク抽出物
表１に示したモヅクの全藻を乾燥，粉砕した後、５０ｇを５０容量％エタノール水溶液１０００ｍＬに浸漬し、２５℃で７日間静置した。その後不溶物をろ別除去した後、減圧濃縮後乾固させたものを、モヅク抽出物とする。このモヅク抽出物を超臨界装置の抽出槽に充填し、抽出槽圧力１５ＭＰａ、抽出槽温度４０℃の条件下で、超臨界状態の二酸化炭素を用いて、超臨界抽出法による精製操作を行った。なお、エントレーナーとしてエタノールを使用した。約４時間二酸化炭素を流通した後、抽出槽において、精製モヅク抽出物を得た。
【００１９】
［実施例３，実施例４］  精製モヅク抽出物
表１に示したモヅクの全藻を乾燥，粉砕した後、超臨界装置の抽出槽に充填し、抽出槽圧力１５ＭＰａ、抽出槽温度４０℃の条件下で、超臨界状態の二酸化炭素を用いて、超臨界抽出法による低極性画分の除去操作を行った。なお、エントレーナーとしてエタノールを使用した。約４時間二酸化炭素を流通した後、抽出槽において、低極性画分を除去したモヅクを得た。これを５０容量％エタノール水溶液１０００ｍＬに浸漬し、２５℃で７日間静置した。その後不溶物をろ別除去した後、減圧濃縮後乾固させたものを、精製モヅク抽出物とする。このモヅク抽出物を超臨界装置の抽出槽に充填し、抽出槽圧力１５ＭＰａ、抽出槽温度４０℃の条件下で、超臨界状態の二酸化炭素を用いて、超臨界抽出法による精製操作を行った。なお、エントレーナーとしてエタノールを使用した。約４時間二酸化炭素を流通した後、抽出槽において、精製モヅク抽出物を得た。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
本発明の実施例１〜実施例４にあたる精製モヅク抽出物を用いて、真皮線維芽細胞賦活作用，表皮細胞賦活作用、及びメラニン生成抑制作用の確認を行った。これらの作用については、超臨界抽出を行っていない各モヅク抽出物を比較例１〜比較例４として同様に確認を行った。まず、実施例１及び比較例１に示した精製イシモヅク抽出物及びイシモヅク抽出物の真皮線維芽細胞賦活作用についてコールターカウンター及びＭＴＴアッセイによる結果を示す。
【００２２】
コールターカウンターによる真皮線維芽細胞賦活作用の評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り５．０×１０３個となるように２４ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５重量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、０．５％重量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整したモヅク抽出物を添加したサンプル液に交換しさらに２４、４８、７２時間培養した。培養終了後、各ウェル中の細胞数をベックマン（BECKMAN）社製コールターカウンター（Coulter Counter）にて計測した。計測は培地交換直後及び２４、４８、７２時間培養後の計４回実施した。評価は０．５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地のみにて培養したコントロールの値を１００とした時の相対値を求めて行った。結果を表２に示す。
【００２３】
ＭＴＴアッセイによる評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり２．０×１０４個となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１％のウシ胎児血清を添加したものを用いた。２４時間培養後、モヅク抽出物を添加した試験培地に交換し、さらに２４時間培養した。次いで３−(４,５−ジメチル−２−チアゾリル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍL含有する培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価結果を、細胞賦活剤が無添加の場合の細胞賦活作用を１００とした相対値にて表２に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
表２より明らかなように、比較例１のイシモヅク抽出物を添加した場合、５００μg/mL、若しくは１０００μg/mLで細胞毒性を示したが、実施例１の精製イシモヅク抽出物を添加した場合には、同濃度で細胞毒性を示さず、特にコールターカウンターでは、５００μg/mLの添加で最も高い真皮線維芽細胞賦活作用を示した。
【００２６】
次に、実施例１及び比較例１に示したイシモヅク抽出物の表皮細胞の賦活作用について示す。
【００２７】
評価は、以下の手順で行った。正常ヒト表皮細胞を１ウェル当たり２．０×１０４個となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、市販のクラボウ社製Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２を用いた。２４時間培養後、イシモヅク抽出物を添加した試験培地に交換し、さらに２４時間培養した。次いで３−(４,５−ジメチル−２−チアゾリル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を１００μｇ／ｍL含有する培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価結果を、細胞賦活剤が無添加の場合の細胞賦活作用を１００とした場合の相対値にて表３に示す。なお実施例１又は比較例１の添加濃度はｍｇ／ｍＬにて示した。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
表３より明らかなように、低極性画分の除去を行っていない比較例１のイシモヅク抽出物を添加した場合０．５ｍｇ／ｍＬの添加で細胞毒性が認められたが、実施例１の精製イシモヅク抽出物を添加した場合には、同濃度の添加でも細胞毒性は認められず、高い表皮細胞賦活作用を示した。
【００３０】
さらに、精製モヅク抽出物である実施例１〜実施例４、及び超臨界法により低極性画分の除去を行っていないモヅク抽出物，比較例１〜比較例４のメラニン生成抑制作用について示す。
【００３１】
評価は、以下の手順で行った。まず、Ｂ１６Ｆ０メラノーマ細胞を直径３５mmの培養ディッシュに、５０００細胞/ディッシュの密度で５容量％牛胎仔血清含有ダルベッコ最小必須培地を用いて播種し、３７℃で２４時間培養した。次いで、実施例若しくは比較例に示したモヅク抽出物を０．２重量％含有する培地に交換し、さらに６日間培養した。次にトリプシン処理によって細胞を剥離し、１．５mLマイクロチューブに移した後、遠心分離により細胞ペレットを作成した。同時に５容量％牛胎仔血清含有ダルベッコ最小必須培地のみ、及びこれに５０ｍＭの乳酸ナトリウムを添加した系に交換後培養し、対照及びスタンダードとした。メラニン生成抑制効果は、目視によりメラニン産生量が「スタンダードよりかなり少ない；５点」，「スタンダードより少し少ない：４点」，「スタンダードと同程度である：３点」，「スタンダードよりは多いが対照より少ない：２点」，「対照と同程度若しくは対照よりメラニン産生量が多い：１点」の５段階で判定し点数化した。同時にコールターカウンターを用いて、細胞数を測定し細胞毒性を確認した。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
表４より明らかなように、本発明の実施例を添加して培養することにより、細胞毒性を示すことなく、メラニン生成を抑制することが示された。しかしながら、精製していないモヅク抽出物を添加して培養することにより、Ｂ１６メラノーマ細胞に対して細胞毒性を示した。
【００３４】
つづいて、本発明に係る皮膚外用剤についての実施例の処方を示す。また、特に断らない限り、量目は重量％で示した。
【００３５】
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製法：(１)〜(７)の油相成分を混合，溶解して７５℃とする。一方、(８)〜(１１)の水相成分を混合，溶解して７５℃に加熱する。次いで、この水相成分に前記油相成分を添加して予備乳化した後ホモミキサーにて均一に乳化し、冷却する。
【００３６】
【表５】
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【００３７】
つぎに、本発明の実施例５〜実施例８、及び比較例５〜比較例８について、安全性試験を行った。安全性は、皮膚刺激性及び使用時の不快感により評価した。
【００３８】
［皮膚刺激性の評価］
男性パネラー２０名を用いて、４８時間閉塞貼付試験を行い、表６に示す判定基準により評価し、２０名の皮膚刺激指数の平均値を求めた。
【００３９】
【表６】
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【００４０】
［使用時の不快感の評価］
女性パネラー２０名を１群とし、各群に各実施例をそれぞれ使用させ、塗布後３０秒から１分間の間に感じる刺すような痛み，ヒリヒリ感，チクチク感といった不快感について評価させた。評価結果は、「非常に強く感じる；５点」，「やや強く感じる；４点」，「感じる；３点」，「少し感じる；２点」，「微妙に感じる；１点」，「感じない；０点」として評価し、２０名の平均値にて示した。以上の結果を表７にまとめて示した。
【００４１】
【表７】
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【００４２】
表７において、本発明の実施例については、いずれにおいても皮膚刺激性は認められておらず、使用時の不快感も微妙に感じられる程度であり、精製していないモヅク抽出物を含有する比較例より有意に高い安全性を有することが示された。
【００４３】
続いて本発明の実施例５〜実施例８について使用試験を行い、肌荒れ，シワ，タルミ，及び肌のハリの改善，美白効果を評価した。各試実施例ついて、肌荒れ，シワ，タルミ，肌のハリの低下，及び日焼けによる色素沈着といった症状が顕著に認められる３０〜５０才代の女性パネラー各２０名にブラインドにて１カ月間使用させ、使用前後の皮膚状態の変化を観察して評価した。皮膚の症状の指標として、肌荒れ，シワ，タルミ，肌のハリの低下，及び色素沈着について、「改善」，「やや改善」，「変化なし」の三段階で評価し、表８に各評価を得たパネラー数にて示した。
【００４４】
【表８】
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【００４５】
表８より明らかなように、本発明の実施例５〜実施例８の皮膚用クリームは、肌荒れや、シワ，たるみ，ハリといった老化症状、及び日焼けによる色素沈着を改善し、肌荒れ，老化症状の改善及び美白効果を発揮することが示された。
【００４６】
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製法：(１)〜(４)を順次(５)に添加し、均一に溶解する。
【００４７】
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製法：(１)〜(６)の油相成分を混合，加熱して均一に溶解し、７０℃とする。一方、(７)〜(１０)の水相成分を混合，加熱して均一とし、７０℃とする。この水相成分に前記油相成分を撹拌しながら徐々に添加して乳化し、冷却した後４０℃にて(１１)を添加，混合する。
【００４８】
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製法：(１)〜(４)の油相成分を混合，加熱して均一に溶解し、７５℃とする。一方、(５)〜(７)の水相成分を混合，加熱して均一とし、７５℃とする。この水相成分に前記油相成分を撹拌しながら徐々に添加して乳化し、冷却する。
【００４９】
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製法：(５)，(６)を(１０)の一部に溶解して５０℃とし、あらかじめ５０℃に加温した(４)に撹拌しながら徐々に添加する。これをあらかじめ混合し、７０℃に加熱溶解した(１)〜(３)に均一に分散し、次いで(７)〜(９)を(１０)の残部に溶解して７０℃に加熱したものを撹拌しながら添加し、ホモミキサーにて乳化する。冷却後、５０℃にて(１１)を添加，混合する。
【００５０】
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製法：(１)〜(４)の油相成分を混合，溶解して７５℃とする。一方、(５)〜(９)の水相成分を混合，加熱溶解し、これに(１０)〜(１２)の顔料成分を添加してホモミキサーにて均一に分散して７５℃とする。次いで、この水相成分に前記油相成分を添加してホモミキサーにて均一に乳化し、冷却後４０℃にて(１３)を添加，混合する。
【００５１】
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製法：(１)〜(５)の油相成分を混合，溶解して７５℃とする。一方、(６)〜(１０)の水相成分を混合，加熱溶解し、これに(１１)〜(１５)の顔料成分を添加してホモミキサーにて均一に分散して７５℃とする。次いで、この水相成分に前記油相成分を添加してホモミキサーにて均一に乳化し、冷却後４０℃にて(１６)を添加，混合する。
【００５２】
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製法：（１）〜（４）、（５）〜（７）をそれぞれ混合溶解し、エタノール相，水相とする。次いで、水相をエタノール相に加え、混合する。
【００５３】
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製造方法：（１）〜（５）を７５〜８５℃にて加熱溶解し、これに対し、予め混合均一化し７５〜８５℃に調整した（６）〜（１０）を加えて完全にケン化する。つぎに冷却を開始し、４５〜５０℃にて（１１）〜（１３）を加えた後、室温まで更に冷却を行う。
【００５４】
本発明の実施例５〜実施例１６について、４０℃恒温槽にて６ヶ月間静置し、保存安定性の観察を行った。その結果全ての実施例において、内容成分の析出など、状態に変化は認められなかった。
【００５５】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明により、安全性が高く、しかも高い細胞賦活作用及び美白作用を有する精製モヅク抽出物、及びその製造方法、さらには、かかる精製モヅク抽出物を含有する、安全性が高く、皮膚の老化及び肌荒れ症状を有効に防止及び改善でき、高い美白効果を発揮する皮膚外用剤を得ることができた。