(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシドおよび／または２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド、反応時の濃度として５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩、ならびに小麦由来のアミラーゼ活性阻害剤を反応時の濃度として０．０１−１０ｍｇ／ｌ含むことを特徴とするアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬。
【請求項２】
２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシドおよび／または２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド、反応時の濃度として５０〜４００ｍＭのチオシアン酸塩、ならびに小麦由来のアミラーゼ活性阻害剤を反応時の濃度として０．０１−１０ｍｇ／ｌ用いることを特徴とするアミラーゼアイソザイム活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬及びアミラーゼアイソザイム活性の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
膵液や尿等の体液に含有されるα−アミラーゼは，主として膵臓由来のＰ型アミラーゼと唾液腺由来のＳ型アミラーゼ（以下、それぞれＰ型、Ｓ型とも示す）の２種類のアイソザイムに大別され、これらを測定することにより各種疾患の診断が行われる。なかでも、Ｐ型は臓器特異性が高く急性膵炎のマーカーとして有用であると言われている。
【０００３】
従来、アミラーゼアイソザイム測定においては、電気泳動法や阻害剤を使用する方法などが用いられてきた。これらの方法のうち、電気泳動法には操作が煩雑で時間がかかることや結果の判定に熟練を要することなどの問題があるため、阻害剤を使用する方法が汎用されている。
阻害剤を使用する方法は、任意の総アミラーゼ活性測定法と、Ｐ型アミラーゼとＳ型アミラーゼの２種のアイソザイムを異なる比率で阻害する物質としての阻害剤を組み合せることにより、Ｐ型とＳ型で反応性の差が生じることを利用して、アミラーゼアイソザイムを測定する方法である。
【０００４】
例えば、Clin. Chem. 第３７巻、第１３４５−１３４９頁 (1991)には、小麦由来の阻害剤を用いる方法が開示されており、その概略は次の通りである。
▲１▼試料の総アミラーゼ活性を適当な手段で測定する。
▲２▼活性測定試薬に阻害剤を加えて同様の操作を行い、残存アミラーゼ活性を測定する。
▲３▼次の式によりアミラーゼアイソザイム活性を計算する。この計算式から明らかなように、本方法を適用する場合、Ｐ型とＳ型とで反応性に差があることが前提となる。
【０００５】
【数１】
0003862058.tif 000002
【０００６】
また、特公平４−３７３８０号公報、特公昭６３−２６００号公報などには、阻害剤としてモノクローナル抗体を用いる方法が開示されている。複数のモノクローナル抗体をうまく利用すると、Ｐ型をほとんど阻害することなくＳ型をほぼ完全に阻害することができるので、計算を行わず近似的に直接Ｐ型の値を求めることができる利点がある。しかしながら、モノクローナル抗体は非常に高価であるため、コストを考えた場合、現状では近年の社会的な要請である医療費の抑制に応えきれていないという問題がある。
【０００７】
一方、上記方法と組み合わせるべき総アミラーゼ活性測定法としては、種々のマルトオリゴ糖あるいはその誘導体を用いる方法がよく用いられている（Clin. Chim. Acta. 第２３４巻、第１７７−１７９頁 (1995), Clin. Chim. Acta.  第１９９巻、第２３−３２頁 (1999), Clin. Chim. Acta.  第１７４巻、第３１５−３２４頁 (1988), J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 第２７巻、第２号、第１０３−１１３頁 (1989), Anal.Biochem.  第２０２巻、第６１−６７頁 (1992)など）。しかしながら、これらの総アミラーゼ活性測定法には、通常アミラーゼ反応によって生成する水解物をさらに検出可能な物質へ導くためにα−グルコシダーゼなどの追随酵素が添加されているため、高コストになるという問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述したような従来からの問題点を解決し、安価で、簡便かつ正確にアミラーゼアイソザイム活性を測定することのできる試薬を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するための手段について調査した結果、総アミラーゼ活性測定法として、追随酵素が不要な２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシドを基質とする方法（特許第２８０７９４９号公報）や、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシドを基質とする方法（Clin.Chim.Acta. 第２８１巻、Ｓ５−Ｓ３９頁 (1999)）を、またＰ型とＳ型の反応性の差をつける方法として、安価な小麦や微生物由来の阻害剤を選択し、これらを組み合わせることがその要請に最も近いものと考えた。測定の都度標準品を測定しなければならないデータ処理上の煩雑さについては、近年の計算機やコンピュータの普及により実用上問題ではなくなってきている。
【００１０】
しかし、小麦等に由来する阻害剤がこれらに適用できるかどうかについては、これまで全く検討されていなかった。そこで、本発明者らは上記目的を達成するために鋭意検討を行い、上記組み合せにチオシアン酸塩を共存させ、さらにその反応液中の濃度を適切に選択することにより、安価で、簡便かつ正確性に優れたアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬を提供することができることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシドおよび／または２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド、チオシアン酸塩、ならびに植物および／または微生物由来のアミラーゼ活性阻害剤を含むことを特徴とするアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬。
（２）アミラーゼ活性阻害剤が小麦由来である（１）のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬。
（３）２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシドおよび／または２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド、チオシアン酸塩、ならびに植物および／または微生物由来のアミラーゼ活性阻害剤を用いることを特徴とするアミラーゼアイソザイム活性の測定方法。
（４）アミラーゼ活性阻害剤が小麦由来である（３）のアミラーゼアイソザイム活性の測定方法。
（５）反応時におけるチオシアン酸塩の濃度が５０〜４００ｍＭである（３）または（４）のアミラーゼアイソザイム活性の測定方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬に用いられる基質は、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド（ＧａｌＧ２ＣＮＰ；式（１））および／または２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド（Ｇ３ＣＮＰ；式（２））であり、構造、製造法などは公知である（特開平６−３１５３９９号公報、特開昭６３−１８３５９５号公報など）。本発明においては、どちらの基質を用いることも可能であるが、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシドには、副反応として糖転移反応があることが指摘されており（Carbohydr.Res. 第３０３０巻、第２１９−２２７頁 (1997)）、原理上は２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシドを用いる方がより好ましい。
【００１３】
式（１）の骨格となるマルトオリゴ糖はマルトースである。非還元末端のグルコースの修飾基であるガラクトピラノシル基は非還元末端の４位の水酸基にβ型で結合している。還元末端にはアグリコンとして、１位水酸基にα型のグルコシド結合を介して２−クロロ−４−ニトロフェニル基が結合している。この結合はα−アミラーゼによって切断され、該結合が切断された際に生じる２−クロロ−４−ニトロフェノールが測定可能な物質となる。
【００１４】
【化１】
0003862058.tif 000003
【００１５】
一方、式（２）の骨格となるマルトオリゴ糖はマルトトリオースである。非還元末端には修飾基は結合していない。還元末端にはアグリコンとして、１位水酸基にα型のグルコシド結合を介して２−クロロ−４−ニトロフェニル基が結合している。この結合はα−アミラーゼによって切断され、該結合が切断された際に生じる２−クロロ−４−ニトロフェノールが測定可能な物質となる。
【００１６】
【化２】
0003862058.tif 000004
【００１７】
本発明におけるアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬に用いられる植物および／または微生物由来のアミラーゼ活性阻害剤は、Ｐ型とＳ型に対する阻害能力が異なるものであれば特に限定されない。ここで、微生物由来の阻害剤としてはストレプトマイセス（Streptomyces）属、キャンディダ（Candida）属など、植物由来の阻害剤としては、小麦、大麦、大豆、そら豆、金時などに由来するものが挙げられる。なかでも、Ｐ型とＳ型に対する阻害能力の差が明確であり、容易に入手できる点から、小麦由来のもの（Biochim.Biophys.Acta 第４２２巻、第１５９−１６９頁(1976)）が特に好ましい。
例えば、市販の小麦由来のアミラーゼ活性阻害剤として、「Ｓアミラーゼ阻害剤」（東洋紡績株式会社製）などが挙げられる（Clin.Chem. 第３７巻、第８号、第１３４５−１３４９頁(1991)）。またそれらの濃度についても、Ｐ型とＳ型に対する阻害能力が異なる設定であれば特に限定されないが、例えば、小麦由来のアミラーゼ活性阻害剤を用いる場合、反応時の濃度として０．０１〜１０mg/L、さらに好ましくは０．２〜０．６mg/L程度存在させるのが好ましい。
【００１８】
本発明のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬には、アミラーゼの反応活性化剤としてチオシアン酸塩が使用される。それらの濃度は特に限定されないが、実用上はチオシアン酸イオンの反応時における濃度としては５０〜４００ｍＭであることが好ましい。更に好ましくは１００〜２００ｍＭである。また、チオシアン酸塩の種類も特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩が好適に用いられる。
【００１９】
本発明のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬においては、必要に応じて、上述したものに加えてさらにその他の添加剤を含有せしめても良い。該添加剤としてはポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のようなのような界面活性剤カルシウムイオン給原（塩化カルシウムなど）、塩素イオン給原（塩化ナトリウムなど）等のような活性化剤、アルブミンやポリエチレングリコールなどの高分子化合物、アミノ酸類、糖類、シクロデキストリン類等のような安定化剤、抗生物質、アジ化ナトリウム等のような防腐剤、ＥＤＴＡ（又はその塩）等のようなキレート剤などが挙げられる。また、本発明のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬は基質を溶解した緩衝液を包含しても良い。該緩衝液としてはＭＥＳ緩衝液などのグッド緩衝液をはじめ、酸性側から中性付近（ｐＨ４〜７付近）に緩衝能を有する各種緩衝液を用いることができるが、特に限定されるものではない。
【００２０】
一方、本発明のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬においては、追随酵素を添加する必要はないことを特徴とする。ここで、追随酵素とは非還元末端からグルコシド結合を加水分解するエキソグルコシダーゼのことであり、例えば、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどがこれに該当する。
【００２１】
本発明のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬を用いたアミラーゼアイソザイム活性の測定は、具体的には次のように行うのが好ましい。
（１）上記マルトオリゴ糖誘導体を、チオシアン酸塩の存在下でＰ型アミラーゼとＳ型アミラーゼを含有する試料と接触させて、遊離した２−クロロ−４−ニトロフェニノ−ルの量を適当な手段により測定することにより総アミラーゼ活性を測定する。例えば、２−クロロ−４−ニトロフェノールがそれ自体４００ｎｍ付近に吸収があることから、遊離後４００ｎｍ付近の吸光度の変化を測定する。２−クロロ−４−ニトロフェノールの測定方法としては、アミラーゼの反応を連続的に追跡するレート法、一定時間反応させた後に反応を止めて測定するエンドポイント法のいずれもが使用されうる。
【００２２】
（２）さらに、上述したような小麦等に由来するアミラーゼ活性阻害剤を加えて同様の操作を行い、残存アミラーゼ活性を測定する。該アミラーゼ活性阻害剤適用時の反応は、そのマルトオリゴ糖誘導体を基質とする総アミラーゼ活性を測定する場合と同様の条件下で行えばよい。例えば、反応温度２５〜４０℃、ｐＨ５〜８にて約１〜２０分反応を行うのが好ましい。
【００２３】
（３）次の式によりアミラーゼアイソザイム活性を測定する。
【００２４】
【数２】
0003862058.tif 000005
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれら実施例により特に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００２６】
実施例１および実施例２
下記組成１および組成２からなる総アミラーゼ活性測定試薬をそれぞれ調製し、市販のアミラーゼ管理試料「キャリブザイムＡＭＹ  Ｐ」、「キャリブザイムＡＭＹ  Ｓ」（国際試薬株式会社製）をそれぞれ測定した。
同様に、下記組成１（実施例１）および組成２（実施例２）のそれぞれに小麦由来のアミラーゼ阻害剤を添加した試薬を調製し、「キャリブザイムＡＭＹ  Ｐ」、「キャリブザイムＡＭＹ  Ｓ」（国際試薬株式会社製）をそれぞれ測定した。アミラーゼ阻害剤としては、「Ｓアミラーゼ阻害剤」（東洋紡績株式会社製）を添付文書に準拠してＲ１に使用した。調製試薬を用いた測定は次のように行った。Ｒ１を２．２５ｍＬに試料（ヒト血清）をそれぞれ０．０５ｍＬ添加し、３７℃にて５分間静置した。その後、Ｒ２を０．７５ｍＬ添加し、３分間静置した後４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
【００２７】
組成１（実施例１）
Ｒ１（濃度は反応液中最終濃度）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）
ＮａＣｌ  ３００ｍＭ
ＣａＣｌ2   ５ｍＭ
チオシアン酸カリウム  ０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７００及び９００ｍＭ
Ｒ２（濃度は反応液中最終濃度）
基質（２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド）  ２．６ｍＭ
【００２８】
組成２（実施例２）
Ｒ１（濃度は反応液中最終濃度）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  ３００ｍＭ
ＣａＣｌ2  ５ｍＭ
チオシアン酸カリウム  ０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７００及び９００ｍＭ
Ｒ２（濃度は反応液中最終濃度）
基質（２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド）  ２．６ｍＭ
【００２９】
実施例１の結果を図１左側に、実施例２の結果を図１右側にそれぞれ示す。上段は総アミラーゼ活性測定試薬および阻害剤を含む試薬でＰ型、Ｓ型をそれぞれ測定した結果を示す。下段は総アミラーゼ活性測定試薬での測定感度を１００％とした時の阻害剤を含む試薬での測定感度を％で示す。
図１下段の結果より、チオシアン酸カリウム濃度が高くなると（図では７００ｍＭ以上）、Ｐ型とＳ型のどちらにもほとんど阻害がかからないことが示される。両者の反応性の差が大きくなるのは、チオシアン酸カリウム濃度が４００ｍＭ以下であり、さらに濃度を下げると反応性の差もさらに大きくなる。しかし一方、図１上段より、チオシアン酸カリウム濃度を下げすぎると感度が小さくなることがわかる。５０ｍＭ未満では実用に供しにくいレベルまで小さくなる。これらの結果より総合的に判断して、１００ｍＭ以上２００ｍＭ以下が最も好ましいことがわかる。
【００３０】
実施例３および比較例
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製し、それぞれに小麦由来のアミラーゼ阻害剤として「Ｓアミラーゼ阻害剤」（東洋紡績株式会社製）を添付文書に準拠して添加した試薬を調製し、市販試薬「ダイヤカラー・リキッドＰ−ＡＭＹ」（東洋紡績株式会社製）との相関を求めた。調製試薬を用いた測定は次のように行った。Ｒ１を２．２５ｍＬに試料（ヒト血清）をそれぞれ０．０５ｍＬ添加し、３７℃にて５分間静置した。その後、Ｒ２を０．７５ｍＬ添加し、３分間静置した後４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定することによりアミラーゼ活性を算出した。市販試薬「ダイヤカラー・リキッドＰ−ＡＭＹ」を用いた測定は添付文書に準拠して行った。
【００３１】
試薬組成
（１）実施例３
Ｒ１（濃度は反応液中最終濃度）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  ３００ｍＭ
ＣａＣｌ2  ５ｍＭ
チオシアン酸カリウム  １４０ｍＭ
Ｒ２（濃度は反応液中最終濃度）
基質（２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトシド）  ２．６ｍＭ
【００３２】
（２）比較例
Ｒ１（濃度は反応液中最終濃度）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  ３００ｍＭ
ＣａＣｌ2  ５ｍＭ
チオシアン酸カリウム  ９００ｍＭ
Ｒ２（濃度は反応液中最終濃度）
基質（２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド）  ２．６ｍＭ
【００３３】
その結果を図１に示す。比較例においてはチオシアン酸カリウム濃度が高いために正確な測定が出来ていないため、良好な相関性が得られていないことがわかる。
【００３４】
【発明の効果】
上述したように、本発明のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬を用いることにより、安価で、簡便かつ正確にアミラーゼアイソザイム活性を測定できる方法およびアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】上段の２つの図は、それぞれＧａｌＧ２ＣＮＰとＧ３ＣＮＰを基質として用いた総アミラーゼ活性測定試薬と、さらにそれらにそれぞれ阻害剤を添加した試薬で、Ｐ型、Ｓ型を測定した結果を１分あたりの吸光度変化量で示す。横軸はチオシアン酸カリウム濃度を示す。
下段の２つの図は、それぞれＧａｌＧ２ＣＮＰとを基質として用いた総アミラーゼ活性測定試薬でＰ型、Ｓ型を測定した感度を１００％とした時の、さらにそれらにそれぞれ阻害剤を添加した試薬でＰ型、Ｓ型を測定した感度を％で示す。すなわち、阻害剤が入っている時の活性残存率を示す。横軸はチオシアン酸カリウム濃度を示す。
【図２】（ａ）実施例３、及び（ｂ）比較例における測定結果を縦軸に、「ダイヤカラー・リキッドＰ−ＡＭＹ」の測定結果を横軸にそれぞれプロットした相関関係を示す図である。
【図１】
0003862058.tif 000006
【図２】
0003862058.tif 000007