(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
pH3.5〜9.6の範囲及び／又は温度15〜50℃の範囲で生育し、かつ、好気性細菌及び酪酸菌の増殖を抑制することができるペディオコッカス属に属する微生物であって、ペディオコッカス・エスピーLA3（受託番号FERM P-16549）菌株又はペディオコッカス・エスピーLA35（受託番号FERM P-16548）菌株である、前記微生物。
【請求項２】
請求項１記載の微生物を生草材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はサイレージ調製用乳酸菌及びサイレージの調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイレージとは、水分の多い生草を用い、サイロ内で制御された乳酸発酵を経て調製された貯蔵飼料である。乳酸菌の種類とその生理的性質は、サイレージの発酵品質ばかりでなく、栄養価値及び反すう家畜の生理代謝に及ぼす重要な要因となる。一方、サイレージ材料草に共存する好気性細菌又は酪酸菌等の微生物は、乳酸菌の活動を競合的に阻害し、サイレージ品質の劣化及び発酵損失を招く原因となる。従って、高品質のサイレージを調製するには、これら好気性細菌又は酪酸菌等の微生物の生活環境を制御して（即ちこれら微生物の増殖を抑制して）乳酸の生成量を高めるという優れた機能を有する乳酸菌の選抜及び育種が必要である。
【０００３】
近年、サイレージ用微生物添加剤が開発されているが、その構成菌の主流はラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)及びエンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis) 等である。
しかし、これらの菌は耐熱性又は耐酸性に欠けるため、サイレージ発酵過程において生ずるｐＨの低下又はサイロ内の高温化によって乳酸発酵が完全に阻害される。従って、得られるサイレージは品質の低いものが多い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はサイレージ調製用乳酸菌及びサイレージ調製方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、飼料作物及びルーメンから優れた機能を有する発酵乳酸菌を分離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ｐＨ3.5〜4.5の範囲及び／又は温度45〜50℃の範囲で生育することができるペディオコッカス属に属する微生物である。
【０００６】
さらに、本発明は、ｐＨ3.5〜9.6の範囲及び／又は温度15〜50℃の範囲で生育し、かつ、好気性細菌及び酪酸菌の増殖を抑制することができるペディオコッカス属に属する微生物である。
上記微生物としては、例えばペディオコッカス・エスピー LA3 FERM P-16549菌株又はペディオコッカス・エスピーLA35 FERM P-16548菌株が挙げられる。
さらに、本発明は、前記微生物を生草材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
（１）微生物の取得
本発明者は、栃木県那須郡西那須野町の酪農家で採集したサイレージ10gとルーメン液10mlを無菌的に取り出してストマッカ用ビニール袋に入れ、滅菌した生理食塩水90mlを加えてから激しく振とうして10倍〜100000倍の希釈液を作製した。各希釈液をMRS寒天培地、又はBCP(Bromocresol Purple)を加えたプレートカウント寒天培地にまき、嫌気培養装置で30℃で２〜３日間の培養を行った。
【０００８】
なお、MRS寒天培地(Lactobacilli MRS寒天培地(Difco社製))の組成は以下の通りである。
【０００９】
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【００１０】
これらの培地から出現した各形状の異なるコロニーを単離して分離株とした。
分離した菌株について、乳酸生成能、耐酸性、高温耐性及びサイレージ発酵環境の適応性等を検索した。
【００１１】
その結果、目的とする乳酸菌を２株分離し、これらをバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergeys Manual of Systematic Bacteriology）に従って同定すると、得られた乳酸菌はグラム染色陽性、カタラーゼ陰性、グルコースから多量に乳酸を生成する四連球菌であることから、２株ともにペディオコッカス（Pediococcus）属に属することは明らかであり、また、pH3.5〜4.5及び45℃〜50℃の範囲で生育できることから、公知のペディオコッカッス属に属する微生物とは異なる新規な微生物であると判定された。
【００１２】
そして、サイレージ発酵過程において、不良微生物である好気性微生物及び酪酸菌の増殖を効果的に抑えることから、上記２株はペディオコッカス属に属する新菌株であると判断し、ペディオコッカス・エスピー(Pediococcus sp.) LA3及びペディオコッカス・エスピーLA35と命名した。
これらの微生物の菌学的性質は表１に示す通りである。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
さらに、本発明の菌株の上記以外の菌学的性質（温度及びｐＨについては表１に記載した内容の詳細）を表２に示す。
【００１５】
【表２】
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【００１６】
これらの微生物は、工業技術院生命工学工業技術研究所(茨城県つくば市東１丁目１番３号)に、平成９年12月11日に、ペディオコッカス・エスピーLA3株（Pediococcus sp. LA3）についてはFERM P-16549、ペディオコッカス・エスピーLA35株（Pediococcus sp. LA35）についてはFERM P-16548としてそれぞれ寄託されている。
【００１７】
表１及び２に示す通り、本発明のペディオコッカス属に属する微生物は、公知のペディオコッカス属に属する微生物のうち何れの菌株とも異なっている。特に、温度45〜50℃及びｐＨ3.5〜4.5の範囲において耐熱性及び耐酸性を兼ね備えており、従来のペディオコッカス属に属する微生物にない優れた特性を有している。そして、本発明の微生物は、サイレージ発酵に対する不良微生物、すなわち大腸菌（Escherichia coli）などの好気性細菌、及びクロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)などの酪酸菌の増殖を抑制することができる。
従って、本発明の微生物は、サイレージ調製用微生物添加剤として適している。
【００１８】
（２）サイレージの調製
本発明においては、上記微生物を生草材料草に添加し、所定期間培養（貯蔵）すると、高品質のサイレージ、すなわち乳酸含量が高く、酪酸及びアンモニア態窒素含量が低く、そして乾物損失率が少ないサイレージが調製される。
本発明においてサイレージ材料草は、トウモロコシ、ソルガムなどの飼料作物はもちろん、アルファルファ、イタリアンライグラス、エンバク、ギニアグラスなどの牧草も含まれ、何ら限定されるものではない。
【００１９】
まず、これらのサイレージ材料草を10mm程度に細切した。
一方、サイレージ材料草に微生物を添加するため、本発明の微生物の培養は、MRS液体培地に接種し、好気又は嫌気培養装置を用いて、30℃〜37℃で１〜２日行う。
次に、培養後の微生物を生理食塩水で希釈し、適量を上記材料草に散布添加してサイロに固く詰め込んだ。
【００２０】
飼料単位量あたり本発明の微生物を添加する量は、材料草1gあたり103〜105菌数レベル、好ましくは105菌数レベルである。また、本発明の微生物の菌株の種類は限定されず、1種類の菌株（LA3株又はLA35株）を単独で添加してもよく、両者を混合して添加してもよく、さらに本発明の微生物に他の乳酸菌（例えばラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)等）を混合して添加してもよい。
【００２１】
本発明の微生物（例えばLA3株及びLA35株）を複数混合する場合は、それぞれの微生物の混合比を任意に設定することができ、全体で103〜105菌数レベルとなるようにする。また、他の乳酸菌を添加する場合は、微生物全体のうち本発明の微生物が103〜105菌数レベルとなるようにする。
散布添加後、サイロ内で14日以上、好ましくは30日〜60日貯蔵すると、品質に優れたサイレージが調製される。ここで、本発明の微生物はpＨ3.5〜4.5の範囲及び／又は温度45〜50℃の範囲で生育することができるため、高温又は常温条件でも高品質サイレージの調整ができる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。但し、本発明は以下の実施例によってその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕サイレージの調製及び微生物環境の検討
サイレージの調製は、小規模サイレージ発酵試験法（Cai.Y. et al., J. Appl. Microbiol. 83, 307-313(1997)）によって行った。
まず、アルファルファ及びイタリアンライグラス材料草をそれぞれカッターで約10mmに切断した。一方、本発明の乳酸菌（LA3又はLA35株）をMRS液体培地に接種し、好気又は嫌気条件下で30℃〜37℃で１〜２日培養した。
【００２３】
次に、材料草1gあたり105菌数レベルのLA3又はLA35株を添加し、１L実験用ガラス瓶サイロに固く詰め込み、ビニールフィルムで密封してサイレージを調製した。材料草の処理区は、無処理区、LA3添加区及びLA35添加区の３つの試験区をそれぞれ設定した。これらのサイロを25℃及び45℃のインキュベーターで所定期間それぞれ培養した。
サイレージ発酵過程における微生物の変遷は、貯蔵後２、５、10、及び30日目にサイロをそれぞれ開封して調査した。
【００２４】
まず、サイレージ10gを無菌的に取り出してストマッカ用ビニール袋に入れ、滅菌した生理食塩水90mlを加えた後激しく振とうして10倍希釈液とし、次にこの液の一定量をさらに適当に希釈してから微生物の数を平板培養法で計測した。
【００２５】
乳酸菌はBCP加プレートカウント寒天培地及びMRS寒天培地、酪酸菌はEG寒天培地及びBL寒天培地を使用して嫌気培養装置で37℃で２〜５日間培養した。好気性細菌は、普通寒天培地を使用して30℃で２日間培養した。なお、各細菌の菌数は、新鮮試料1g当たりのコロニー形成数(cfu/g)で表示した。
結果を表３に示す。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
表３において、常温（25℃）における本発明の菌株を添加したサイレージでは、無処理のサイレージ（本発明の菌株無添加）と比較して、発酵初期に添加菌が旺盛に増殖し、そして培養日数とともに好気性細菌が減少し、酪酸菌においては検出できないほど増殖が抑えられた。この結果は、アルファルファサイレージにおいてもイタリアンライグラスサイレージにおいても同様の傾向であった。
また、高温（45℃）における本発明の菌株を添加したサイレージについても、25℃におけるサイレージと同様、本発明の菌株を添加することにより好気性細菌及び酪酸菌の増殖が抑えられた。
従って、本発明の菌株は、サイレージでの発酵環境に適し、そしてサイレージ発酵品質を改善する点で有用である。
【００２８】
〔実施例２〕サイレージ発酵品質の検討
サイレージの乾物率は、70℃通風乾燥法により定量した。サイレージのpHと有機酸含量は以下の通り測定した。
サイレージ試料50gを採取し、これに蒸留水200mlを加えてよく攪拌した後、４℃冷蔵庫で12時間放置した。この浸漬液を濾過し、ガラス電極pHメーターでpH値を測定した。
一方、残りの浸漬液をイオン交換樹脂（Amberlite IR120H+）で処理し、続いて高速遠心分離(12,000rpm×３分)を行った。遠心分離後の上澄液を口径0.45μmフィルターに通し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって有機酸を分析した。
【００２９】
サイレージのアンモニア態窒素含量は、F-キット酵素法（ベーリンガー・マンハイム山之内）を用いてそれぞれ分析した。この場合、サイレージ抽出液を80℃で15分間加熱処理して酵素活性を失活させた後に含量の分析を行った。なお、サイレージの発酵品質はMultiple range testを用いて有意差を検定した。
結果を表４に示す。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
表４において、本発明の菌株を添加した場合は、無処理と比較して乳酸含量が顕著に増加した。また、サイレージの品質を低下させる酪酸発酵及びアンモニア態窒素の生成力が顕著に抑えられた。このことは、25℃の試験区及び45℃の試験区ともに同様の結果であった。
従って、本発明の菌株の添加によって、常温のみならず、高温条件下でも高品質サイレージが調製されることが分かった。
【００３２】
〔実施例３〕サイレージ乾物損失率及びガス生成量の検討
サイレージのガス生成量は、小規模サイレージ発酵試験法で測定した。すなわち、精密に秤量した材料草100gをガスバリヤー性の高い（ガスを透過しにくい）ポリエチレン、ナイロン及びビニリデンの積層フィルム（旭化成、飛竜KNタイプ、180×260mm）袋内に入れ、真空包装機（松下電器BH-950）で脱気・密封した。恒温水槽(30℃)を用いて詰込み時のサイロ体積を測定した。
【００３３】
貯蔵60日目に同様に体積を測定して、詰込時の体積との差から膨張したガス体積を求め、材料草１kg当たりに換算してガス生成量とした。また、乾物損失率は材料草とサイレージの乾物重量から求めた。サイレージのガス生成量と乾物損失率はMultiple range testを用いて有意差を検定した。
結果を図１に示す。
図１より、本発明の菌株を添加したサイレージでは、乾物の損失及びガスの生成が抑えられ、サイレージの発酵損失を有意に減少させることが明らかになった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、サイレージ調製用高機能発酵乳酸菌及びサイレージの調製方法が提供される。本発明の菌株は、耐酸性及び耐熱性を有し、乳酸生成能が高く、サイレージ調製の際の発酵環境を悪化させる好気性細菌及び酪酸菌等の増殖を抑制することができるため、サイレージ調製用微生物添加剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】サイレージの乾物損失及びガスの生成を示す図である。
【図１】
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