(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に凝集原１を含まない、ボルデテラ（Bordetella）属菌株由来の線毛性凝集原２（Agg 2）ならびに線毛性凝集原３（Agg 3）を含んでなる凝集原製剤の製造方法であって、
（ａ）細胞膜表面上に凝集原１、線毛性凝集原２（Agg 2）ならびに線毛性凝集原３（Agg 3）を有する、ボルデテラ（Bordetella）属菌株の菌体ペーストを調製する工程；
（ｂ）該菌体ペーストを１Ｍ〜６Ｍの尿素を含有する緩衝液中に分散させ、前記凝集原２及び３を含む第１の上清ならびに第１の残渣沈澱物を形成する、菌体ペーストから凝集原２及び３を選択的に抽出する工程；
（ｃ）第１の残渣沈澱物から第１の上清を分離する工程；
（ｄ）第１の上清を７５℃〜８５℃の温度において、１０分間〜６０分間の時間インキュベーションして、線毛性凝集原２および３を含む純化された上清、ならびに非線毛性凝集原不純物を含む第２の沈澱物を形成し、次いで、第２の沈澱物から、該純化された上清を分離する工程；
（ｅ）純化された上清を濃縮し、この純化された上清にポリエチレングリコールを加えることで、純化された上清から線毛性凝集原２および３を沈澱させ、沈澱させた線毛性凝集原２および３を得られた上清から分離し、分離された線毛性凝集原２および３を可溶化することにより、粗線毛性凝集原溶液を調製する工程；ならびに
（ｆ）粗線毛性凝集原溶液から線毛性凝集原２および３を精製して、線毛性凝集原２および３を含んでなる凝集原製剤を調製する工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記インキュベーション工程（ｄ）において、前記温度を８０℃とすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベーション工程（ｄ）において、前記時間を３０分間とすることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベーション工程（ｄ）に先立ち、第１の上清を濃縮することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｅ）における、前記沈澱形成は、純化された上清に分子量８０００のポリエチレングリコールを３重量％〜５重量％の濃度まで加え、純化された上清から前記線毛性凝集原の沈澱を起こさせることでなされることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ポリエチレングリコールの濃度が、４．３重量％〜４．７重量％であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記精製工程（ｆ）において、線毛性凝集原２および３は、カラムクロマトグラフィーにより粗線毛性凝集原溶液から精製されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記カラムクロマトグラフィーは、セファデックス６Ｂカラム・クロマトグラフィーおよび／またはＰＥＩシリカカラム・クロマトグラフィーを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記精製工程（ｆ）は、無菌の線毛性凝集原製剤を調製するため、前記カラムクロマトグラフィー精製の溶出液の滅菌を含むことを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記無菌線毛性凝集原製剤は、無機塩アジュバント上に吸着されていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記無機塩アジュバントが水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム（通常、アルム（Alum）と総称される）であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ボルデテラ（Bordetella）属菌株が、百日咳菌（Bordetella pertussis）菌株であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
実質的に凝集原１を含まず、線毛性凝集原２（Agg 2）ならびに線毛性凝集原３（Agg 3）を含有し、
線毛性凝集原２（Agg 2）の線毛性凝集原３（Agg 3）に対する重量比が、１．５：１〜２：１である
ことを特徴とするボルデテラ（Bordetella）属菌株由来の線毛性凝集原製剤。
【請求項１４】
請求項１４に記載の凝集原製剤を含んでなる免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、非細胞性百日咳ワクチンにおける、成分として利用可能な、ボルデテラ（Bordetella）属菌由来の凝集原製剤およびその製造方法に関するものである。
関連出願についての参照
本出願は、１９９５年５月４日出願の同時係属中の米国特許出願０８／４３３６４６号の一部継続出願である。
発明の背景
百日咳は、百日咳菌（Bordetella pertussis）によって引き起こされる重度の非常に伝染性が強い上気道感染である。世界保健機構は、年間６０００万人の百日咳患者があり、０．５／１００万の割合でそれに関連する死者が出ていると推算している（参考文献１。本明細書を通じて、本発明が関係する最新技術についてより詳細に説明することを目的として、各種参考文献が括弧を施して引用される。各引用についての完全な文献情報が明細書末尾の、請求の範囲の直前にある。それにより、これらの参考文献の開示内容は、引用によって本開示に含まれる）。非予防接種群では、百日咳の発生率は５歳以下の小児において８０％という高率である（参考文献２）。百日咳は一般に子供の病気と考えられているが、青少年および成人において臨床的および無症候性の疾患であることを示す証拠が多くなっている（参考文献３、４および５）。
１９４０年代における化学的および熱的に不活化した百日咳菌（B. pertussis）微生物からなる全細胞ワクチンの導入によって、百日咳菌（B. pertussis）が原因の百日咳の発生率は大幅に低下した。全細胞ワクチンについての効力は、患者の定義によって決まるが、９５％以下であると推定されている（参考文献６）。百日咳菌（B. pertussis）に感染すると、一生続く免疫が得られるが、全細胞ワクチンによる免疫感作後に保護効果の低下を示す証拠が増えている（参考文献３）。全細胞百日咳ワクチン接種、反応原性（reactogenicity）および重篤な副作用との間の関係について言及する報告がいくつか行われたことから、ワクチン接種が低下し、結果的に新たな流行が起こった（参考文献７）。さらに最近では、所定成分百日咳ワクチンが開発されている。
所定成分百日咳ワクチン用の抗原
各種の非細胞性百日咳ワクチンが開発されており、それにはボルデテラ属（Bordetella）百日咳抗原、百日咳毒（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（haemagglutinin）（ＦＨＡ）、６９ｋＤＡ外膜蛋白（ペルタクチン（pertactin））および線毛性凝集原などがある（後述の表１参照。表は明細書の末尾にある。）。
百日咳毒
百日咳毒は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有する細菌毒素のＡ／Ｂ類の一種である外毒素である（参考文献８）。これら毒素のＡ部分は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示し、Ｂ部分は毒素の宿主細胞受容体への結合とその作用部位へのＡの転位に介在する。ＰＴはさらに、百日咳菌（B. pertussis）の線毛上皮細胞への付着を促進し（参考文献９）、百日咳菌（B. pertussis）による巨食細胞の侵襲においてある役割を果たす（参考文献１０）。
非細胞性百日咳ワクチンはいずれも、主要な毒性因子であり保護抗原として提案されているＰＴを含むものであった（参考文献１１および１２）。百日咳菌（B. pertussis）による自然感染により、ＰＴへの体液媒介性および細胞媒介性の両方の応答が生じる（参考文献１３および１７）。乳児は胎盤由来の抗ＰＴ抗体を持ち（参考文献１６および１８）、抗ＰＴ抗体を有するヒト初乳は、エアロゾル感染に対するマウスの受動保護において有効であった（参考文献１９）。非細胞性ワクチンによる免疫感作後には、ＰＴサブユニットに対する細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答が明らかになっており（参考文献２０）、全細胞ワクチン接触後にはＰＴに対するＣＭＩが応答が生じている（参考文献１３）。全細胞ワクチンまたは成分ワクチン中の化学的に不活化されたＰＴは動物モデルおよびヒトにおいて保護効果を有する（参考文献２１）。さらに、サブユニットＳ１に特異的なモノクローナル抗体は、百日咳菌（B. pertussis）に対する保護を行う（参考文献２２および２３）。
ＰＴの主要な病態生理学的効果は、それのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性によるものである。ＰＴはＮＡＤからＧiグアニンヌクレオチド結合蛋白へのＡＤＰ−リボースの転移を触媒し、それによって細胞のアデニル酸シクラーゼ調節系を障害する（参考文献２４）。ＰＴはさらに、大食細胞およびリンパ球の炎症部位への移動を防止し、好中球介在の食作用および殺細菌を妨害する（文献２５）。多くのin vitroおよびin vivoのアッセイを用いて、ウシトランスジューシンのＡＤＰ−リボシル化（文献２６）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の群形成アッセイ（参考文献２７）、ヒスタミン感作（文献２８）、白血球増加症およびＮＡＤグリコヒドロラーゼなどのＳ１および／またはＰＴの酵素活性が評価されている。ＰＴ曝露を受けると、ＣＨＯ細胞は特徴的な群形成形態を取る。この現象は、ＰＴの結合とその後の転位およびＳ１のＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性に対して依存性であり、ＣＨＯ細胞群形成アッセイはＰＴ完全毒素の完全性および毒性を調べるのに広範囲に使用されている。
線維状ヘマグルチニン（haemagglutinin）
線維状ヘマグルチニン（haemagglutinin）は、大きい（２２０ｋＤａ）無毒性ポリペプチドであり、細菌のコロニー形成時における百日咳菌（B. pertussis）の上気道線毛細胞への付着を媒介する（参考文献９、２９）。自然感染により、抗ＦＨＡ抗体および細胞媒介性免疫が誘発される（参考文献１３、１５、１７、３０および３１）。抗ＦＨＡ抗体は、ヒト初乳において認められ、やはり胎盤を通じて伝達される（参考文献１７、１８および１９）。全細胞性または非細胞性の百日咳ワクチンによる予防接種により抗ＦＨＡ抗体が生じ、ＦＨＡを含む非細胞性ワクチンによってはさらに、ＦＨＡに対するＣＭＩ応答が誘発される（参考文献２０および３２）。ＦＨＡは、能動免疫または受動免疫後でのマウスの呼吸系攻撃モデルにおける保護抗原である（参考文献３３および３４）。しかしながら、ＦＨＡ単独では、マウスの脳内攻撃力アッセイにおいて保護を示さない（参考文献２８）。
６９ｋＤａ外膜蛋白（ペルタクチン）
６９ｋＤａ蛋白は、最初はボルデテラ・ブロンキセプチカから確認された外膜蛋白である（参考文献３５）。それはボルデテラ・ブロンキセプチカに対する保護抗原であることが明らかになっており、その後、百日咳菌（B. pertussis）およびパラ百日咳菌（B. parapertussis）の両方で確認されている。６９ｋＤａ蛋白は、真核細胞に直接結合し（参考文献３６）、百日咳菌（B. pertussis）による自然感染によって、抗Ｐ．６９体液応答を誘発し（参考文献１４）、Ｐ．６９も細胞介在性免疫応答を誘発する（参考文献１７、３７および３８）。全細胞ワクチンまたは非細胞性ワクチンによる予防接種によって抗Ｐ．６９抗体が誘発され（参考文献３２および３９）、非細胞性ワクチンによってＰ．６９ＣＭＩが誘発される（参考文献３９）。ペルタクチンは、百日咳菌（B. pertussis）によるエアロゾル攻撃に対してマウスを保護し（参考文献４０）、ＦＨＡとの併用によって、百日咳菌（B. pertussis）に対する脳内攻撃試験において保護を示す（参考文献４１）。ポリクローナルまたはモノクローナルの抗Ｐ．６９抗体の受動的転移によっても、エアロゾル攻撃に対してマウスが保護される（参考文献４２）。
凝集原
百日咳菌（B. pertussis）の血清型は、その凝集性線毛によって決まる。ＷＨＯは、１型、２型および３型の凝集原（Ａｇｇ）が交差保護性ではないことから、全細胞ワクチンにこれらの凝集原を含ませることを推奨している（参考文献４３）。Ａｇｇ１は非線毛性であって全ての百日咳菌（B. pertussis）菌株で認められるのに対して、血清型２型および３型Ａｇｇは線毛性である。自然感染または全細胞性もしくは非細胞性のワクチンによる免疫感作によって、抗Ａｇｇ抗体が誘発される（参考文献１５および３２）。マウスにおいて、エアロゾル感染後に、Ａｇｇ２およＡｇｇ３によって、特異的な細胞介在性免疫応答を生じさせることができる（参考文献１７）。Ａｇｇ２およびＡｇｇ３は、マウスにおいて呼吸系攻撃に対する保護効果を持ち、抗凝集原を含むヒト初乳も、このアッセイで保護を示す（参考文献１９、４４、４５）。
非細胞性ワクチン
最初に開発された非細胞性ワクチンは、サトウ（Sato）らの２成分ＰＴ＋ＦＨＡワクチン（ＪＮＩＨ６）であった（参考文献４６）。このワクチンは、百日咳菌（B. pertussis）tohama株の培養上清からのＰＴ抗原およびＦＨＡ抗原の同時精製と、それに続くホルマリントキソイド化によって製造された。１９８１年以降、各種製造業者からの各種成分の非細胞性ワクチンを用いて、日本の小児の百日咳に対する免疫感作が奏功して、結果的に疾患の発生率が大幅に低下している（参考文献４７）。ＪＮＩＨ６ワクチンおよび単一成分ＰＴトキソイドワクチン（ＪＮＩＨ７）について１９８６年にスウェーデンで大規模な治験での試験が行われている。最初の結果は、全細胞ワクチンについて報告されている効力より低い効力を示していたが、追跡調査試験では、血清学的方法によって診断される比較的軽い疾患に対しては、より有効であることが明らかになっている（参考文献４８、４９、５０、５１）。しかしながら、これらのワクチンにおいては、ホルマリン不活化ＰＴの毒性への復帰の現象を示す証拠があった。これらのワクチンはさらに、感染に対してではなく、疾患に対して保護作用があることが認められている。
現在、多くの新たな非細胞性百日咳ワクチンが評価を受けており、それにはＰＴ、ＦＨＡ、Ｐ．６９および／または凝集原の併用が含まれており、これらは表１に挙げてある。化学的解毒のいくつかの方法が、ＰＴに対して行われており、それにはホルマリン（参考文献４６）、グルタルアルデヒド（参考文献５２）、過酸化水素（参考文献５３）およびテトラニトロメタン（参考文献５４）による不活化などがある。
そのように、現在市販されている非細胞性百日咳ワクチンは、適切な免疫原型の適切な抗原の適切な製剤が含まれていて、百日咳に対して感受性のヒトの群において所望のレベルの効力を得ることができていない。
そこで、特定の抗原を特定の相対量で含む有効な非細胞性百日咳ワクチンならびにその製造方法を提供することが望ましいものと考えられる。
発明の概要
本発明は、非細胞性百日咳ワクチン製剤、その成分、そのようなワクチンおよびその成分の製造方法、ならびにその使用方法に関するものである。
本発明の１態様によれば、ボルデテラ属（Bordetella）菌株からの凝集原製剤の製造方法において、
（ａ）ボルデテラ属（Bordetella）菌株の細胞ペーストを得る段階
（ｂ）該細胞ペーストから線毛性凝集原を選択的に抽出して、凝集原を含む第１の上清と第１の残渣沈殿物を得る段階
（ｃ）第１の残渣沈殿から第１の上清を分離する段階；
（ｄ）第１の上清を、線毛性凝集原を含む透明上清と非凝集原汚染物を含む第２の沈殿物を得るだけの温度および時間でインキュベーションする段階；
（ｅ）透明上清を濃縮して、粗線毛性凝集原を含有する溶液を得る段階；
（ｆ）粗線毛溶液から凝集原を精製して、凝集原製剤を得る段階
を有してなる方法が提供される。
ボルデテラ属（Bordetella）菌株は、百日咳菌（B. pertussis）であることができる。第１の上清は、約５０℃〜約１００℃、さらには約７５℃〜約８５℃、好ましくは約８０℃の温度でインキュベーションすることができる。インキュベーション時間は、約１０分間〜約６０分間、好ましくは約３０分間とすることができる。線毛性凝集原の細胞ペーストからの選択的抽出は、細胞ペーストを約１Ｍ〜約６Ｍの尿素を含む緩衝液に分散させることで行うことができる。特定の実施態様においては、第１の上清を濃縮してから、透明上清を得るような時間および温度でインキュベーションを行う。
透明上清の濃縮は、透明上清からの線毛凝集原の沈殿と、得られた上清からの線毛性凝集原の沈殿の分離と、沈殿した線毛性凝集原の可溶化などの簡便な手段によって行うことができる。沈殿形成は、透明上清に、分子量約８０００のポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコールを加えることで行うことができる。そのような沈殿形成で使用されるポリエチレングリコールの濃度は、約３％〜約５％、好ましくは約４．３％〜約４．７％として、透明上清からの前記線毛性凝集原の沈殿を行うことができる。
線毛性凝集原は、カラムクロマトグラフィーによって粗線毛溶液から精製することができ、カラムクロマトグラフィーでは、セファデックス（Sephadex）６Ｂなどのゲル濾過および／またはＰＥＩシリカカラムクロマトグラフィー等をも含め得る。本発明の特定の態様において凝集原は、例えばカラムクロマトグラフィーからの溶出液（run-through）の無菌濾過によって滅菌された無菌凝集原製剤として提供される。特定の実施態様においては、無菌線毛性凝集原製剤は、アルム（Ａｌｕｍ）などの無機塩アジュバントに吸着される。
本発明の特定の態様においては、実質的に凝集原１を含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含むボルデテラ属（Bordetella）菌株から得られる線毛性凝集原製剤が提供される。凝集原１は反応原性である百日咳菌（B. pertussis）のリポオリゴ糖（ＬＯＳ）であることが報告されていることから、実質的にＬＯＳを含まない線毛性凝集原の提供はそれによる反応原性を低下させるものである。Ａｇｇ２のＡｇｇ３に対する重量比は、そのような線毛性凝集原製剤では約１．５：１〜約２：１とすることができる。本発明の特定の実施態様においては、本発明で提供される方法によって製造される線毛性凝集原製剤が提供される。
本発明のさらに別の態様では、本発明で提供される線毛性凝集原製剤を有してなる免疫原性組成物が提供される。その免疫原性組成物は、ボルデテラ属（Bordetella）によって生じる疾患からワクチンによって免疫感作された宿主を保護するためにin vivoで使用されるワクチンとして製剤することができ、１以上の他のボルデテラ属菌（Bordetella）抗原を含むことができる。その１以上の他のボルデテラ属菌（Bordetella）抗原は、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ外膜蛋白、アデニル酸シクラーゼ、Bordetellaリポオリゴ糖、外膜蛋白ならびに百日咳毒もしくはそのトキソイドであることができ、それらの遺伝的に解毒された類縁体も含まれる。
本発明のさらに別の態様においては、本発明で提供される免疫原性組成物は、１以上の非ボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原を有することができる。そのような非ボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ヘモフィルス菌属（Haemophilus）の莢膜多糖類、ヘモフィルス属菌（Haemophilus）の外膜蛋白、Ｂ型肝炎表面抗原、小児麻痺、おたふくかぜ、はしか、および／または風疹などがあり得る。
本発明で提供される免疫原性組成物はさらにアジュバントを含有することができ、そのようなアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、クイル（Quil）Ａ、ＱＳ２１、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステルまたはリポ蛋白などがあり得る。
本発明の具体的な態様によれば、百日咳菌（B. pertussis）による感染によって生じる疾患の場合に対して危険性のあるヒト群を保護するためのワクチン組成物であって、その危険群の構成員の７０％以上の範囲まで保護を提供するべく選択された相対量で、精製された形態での百日咳トキソイド、線維状ヘマグルチニン、ペルタクチンおよび凝集原を有してなるワクチン組成物が提供される。
そのようなワクチン組成物は、約５〜約３０μｇの百日咳トキソイド窒素、約５〜約３０μｇの線維状ヘマグルチニン窒素、約３〜約１５μｇのペルタクチン窒素、ならびに約１〜約１０μｇの凝集原窒素を含有することができる。
ある具体的な実施態様においてワクチンは、ボルデテラ属菌（Bordetella）の百日咳トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を、約１０：５：５：３の重量比で含むことができ、その場合、ヒトへの１回用量に、百日咳トキソイド約１０μｇ、線維状ヘマグルチニン約５μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μｇを含有させることができる。さらに別の特定の実施態様においてワクチンは、百日咳トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を、約２０：２０：５：３の重量比で含むことができ、その場合、ヒトへの１回用量に、百日咳トキソイド約２０μｇ、線維状ヘマグルチニン約２０μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μｇを含有させることができる。さらに別の特定の実施態様においてワクチンは、百日咳トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を、約２０：１０：１０：６の重量比で含むことができ、その場合、ヒトへの１回用量に、百日咳トキソイド約２０μｇ、線維状ヘマグルチニン約１０μｇ、６９ｋＤａ蛋白約１０μｇおよび線毛性凝集原約６μｇを含有させることができる。
２１日以上の期間にわたる痙攣性の咳があって培養で確認された細菌感染のある患者に関しては、本発明のワクチン組成物が提供する危険性のあるヒト群に対する保護の程度は、約８０％以上、好ましくは約８５％以上であり得る。１日以上の期間の咳を有する軽度の百日咳患者に関しては、危険性のあるヒト群に対する保護の程度は、約７０％以上である。
ワクチンの凝集原成分は、凝集原１を実質的に含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含有するものである。Ａｇｇ２のＡｇｇ３に対する重量比は約１．５：１〜約２：１とすることができる。
本発明において提供されるワクチンには、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドを併用して、ＤＴＰワクチンを提供することができる。１実施態様においては、ワクチンは約１５Ｌｆのジフテリアトキソイドと約５Ｌｆの破傷風トキソイドを含む。
さらに、ワクチンは、アジュバント、特には、アルム（Ａｌｕｍ）を含むこともできる。
そのような特定の実施態様において、免疫原性組成物は、それに含まれる各抗原に対してある免疫応答特性（profile）を与え、その応答特性は、全細胞百日咳ワクチンによって得られるものと実質的に等価である。
本発明のさらに別の態様においては、ボルデテラ属菌（Bordetella）によって生じる疾患に対して宿主を免疫感作する方法であって、ヒトなどの宿主に対して、本発明で提供される免疫原性組成物もしくはワクチンを免疫的に有効な量で投与する段階を有してなる方法が提供される。
本発明のさらに別の態様においては、百日咳菌（B. pertussis）による感染によって生じる疾患に対して、危険性のあるヒト群を免疫感作する方法であって、危険性のあるヒト群の構成員に対して、本発明で提供されるワクチン組成物を免疫的に有効な量で投与して、危険群の構成員の約７０％以上に保護を与える方法が提供される。
本発明の利点には、非細胞性百日咳ワクチンに含有させるのに好適な免疫原性凝集原製剤を簡単な方法で製造して、そのようなワクチンの効力を高めることができるというものがある。
本発明によって提供される凝集原製剤は、ワクチンによって免疫感作される宿主を百日咳菌（B. pertussis）などのボルデテラ属菌（Bordetella）によって生じる疾患から保護するための非細胞性の多成分ワクチン製剤において用途を有するものである。特に、本発明で提供される凝集原製剤を含む免疫原性組成物は、二重盲検ヒト効力治験での評価向けに、米国政府の国立アレルギー・感染症研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases: NIAID）によって選択されており、それにより、特定の当業者に対して、その組成物が対象疾患（百日咳）の予防にある程度有効であることを示すだけの根拠が確立された。この治験は、本米国特許出願の出願日現在で継続中である。その治験の対象（本発明で提供されるワクチン）は、有用性がかなり予測できるものであるという要求を満足するものであった。
【図面の簡単な説明】
本発明は、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明および実施例からさらに詳細に理解される。
図１は、本発明の１態様によるボルデテラ属（Bordetella）菌株からの凝集原製剤の単離手順の図式的フローシートである。
発明の詳細な説明
１態様において本発明は、ボルデテラ属（Bordetella）菌株からの凝集原製剤を製造するために用いることができる新規な方法を提供する。図１について説明すると、ボルデテラ属（Bordetella）菌株からの凝集原製剤の製造方法のフローシートが示してある。図１からわかるように、百日咳菌（B. pertussis）細胞ペーストなどの凝集原を含むボルデテラ属菌（Bordetella）細胞ペーストを、１０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび４Ｍ尿素などの尿素含有緩衝液で抽出して、細胞ペーストから凝集原を選択的に抽出することで、凝集原を含む第１の上清（ｓｐ１）と第１の残渣沈殿物（ｐｐｔ１）を得る。第１の上清（ｓｐ１）を、遠心分離などによって、第１の残渣沈殿物（ｐｐｔ１）から分離する。その残渣沈殿物（ｐｐｔ１）は廃棄する。次に、透明上清（ｓｐ１）を、例えば１００〜３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フィルターを用いて、例えば１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％トリトンＸ−１００に対して濃縮・ダイアフィルトレーションを行うことができる。
次に、第１の上清を、凝集原を含む透明上清（ｓｐ２）と非凝集原汚染物を含む第２の廃棄沈殿物（ｐｐｔ２）を得るだけの温度および時間でインキュベーションする。適切な温度としては、約５０℃〜約１００℃、さらには約７５℃〜約８５℃などがあり、適切なインキュベーション時間としては、約１分間〜約６０分間などがある。次に、透明上清を、例えば分子量約８０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を最終濃度約４．５±０．２％となるまで加え、約３０分間以上ゆっくり撹拌することで濃縮して、第３の沈殿物（ｐｐｔ３）を得て、それを遠心にて回収することができる。残った上清ｓｐ３は廃棄する。
この第３の沈殿物（ｐｐｔ３）を、例えば１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液で抽出して、粗線毛性凝集原含有溶液を得る。その粗線毛溶液に１Ｍリン酸カリウムを加えて、それをリン酸カリウムに関して約１００ｍＭとすることができる。別法として、熱処理した線毛性凝集原の透明上清を、セファロースＣＬ６Ｂなどのゲルを用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって沈殿形成を行わずに精製することができる。次に、粗溶液中の線毛性凝集原を、ＰＥＩシリカカラムを通過させる等のカラムクロマトグラフィーによって精製して、溶出液中の線毛性凝集原製剤を得る。
この線毛性凝集原含有溶出液をさらに、１００〜３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜を使用する１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液に対して濃縮・ダイアフィルトレーションすることができる。凝集原製剤は、≦０．２２μＭ膜フィルターによる濾過によって滅菌して、線毛性凝集原２および３を含む最終精製線毛性凝集原製剤を得ることができる。
本発明は、凝集原１を実質的に含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含むボルデテラ属（Bordetella）菌株からの凝集原製剤を含むものである。Ａｇｇ２のＡｇｇ３に対する重量比は、約１．５：１〜約２：１とすることができる。そのような線毛性凝集原製剤は、本発明で提供され上記で詳細に説明した方法によって製造することができる。本発明はさらに、本発明で提供される線毛性凝集原製剤を含む免疫原性組成物（ワクチンを含む）も含むものである。そのようなワクチンには、線維状ヘマグルトニン、６９ｋＤａ外膜蛋白および百日咳毒もしくはそれのトキソイド（文献６８に記載のＰＴの遺伝的に解毒した類縁体を含む）ような他のボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原、ならびにジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ヘモフィルス属菌（Haemophilus）の莢膜多糖類、ヘモフィルス属菌（Haemophilus）の外膜蛋白、Ｂ型肝炎表面抗原、小児麻痺、おたふくかぜ、はしか、および／または風疹のような非ボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原などがあり得る。各ボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原をそれぞれアジュバント（例：ミョウバン）に吸収させて、本発明で提供されるワクチン中に特定の相対量で抗原を含有するワクチンを簡便かつ迅速に得る。
特定の実施態様において本発明は、以下の特性を有するワクチンを提供するものであり（ここで使用されるμｇ蛋白は、精製濃縮物について実施されるケルダール試験の結果に基づくものであり、蛋白窒素のμｇ数として表現されたものである）、そのいずれも筋肉注射によって投与することができる。
（ａ）ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの一つの製剤を、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴと称した。ＣＰ１０／５／５／３ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
１０μｇ  百日咳トキソイド（ＰＴ）
５μｇ  線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
３μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白
１５Ｌｆ  ジフテリアトキソイド
５Ｌｆ  破傷風トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
（ｂ）ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴ
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの別の製剤を、ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴと称した。ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
２０μｇ  百日咳トキソイド（ＰＴ）
２０μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
３μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白
１５Ｌｆ  ジフテリアトキソイド
５Ｌｆ  破傷風トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
（ｃ）ＣＰ１０／５／５ＤＴ
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンのある製剤を、ＣＰ１０／５／５ＤＴと称した。ＣＰ１０／５／５ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
１０μｇ  百日咳トキソイド（ＰＴ）
５μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
１５Ｌｆ  ジフテリアトキソイド
５Ｌｆ  破傷風トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
（ｄ）ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴ
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンのさらに別の製剤を、ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴと称した。ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
２０μｇ  百日咳トキソイド（ＰＴ）
１０μｇ  線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）
１０μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
６μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白（６９ｋＤＡ）
１５Ｌｆ  ジフテリアトキソイド
５Ｌｆ  破傷風トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
他のボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原、百日咳毒（例えば、本発明の譲受人に譲渡され引用によって本明細書に含まれるクラインら（Klein et al.）の米国特許５０８５８６２号に記載のような、それの遺伝的に解毒された類縁体を含む）、ＦＨＡおよび６９ｋＤａ蛋白は、以下に記載のような各種方法によって製造することができる。
ＰＴの精製
ＰＴは、従来の方法を用いて、百日咳菌（B. pertusis）菌株の培養上清から単離することができる。例えば、セクラ（Sekura）らの方法（参考文献５５）を用いることができる。ＰＴの単離は、最初に培養上清を色素リガンドゲル充填剤（Affi-Gel Blue；Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA）を充填したカラムに吸収させることで行う。このカラムから、０．７５Ｍ塩化マグネシウムなどの高濃度の塩によってＰＴを溶離させ、塩を除去した後に、臭化シアンで不活化したセファロースにフェチュインを結合させた構成のフェチュイン−セファロースアフィニティ充填剤のカラムに通す。ＰＴは、４Ｍマグネシウム塩を用いて、フェチュインカラムから溶離させる。
別法として、アイロンズら（Irons et al、参考文献５６）の方法を用いることができる。培養上清を、予めヘパトグロビンが共有結合的に結合したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラムに吸収させる。ＰＴをｐＨ６．５で吸収剤に結合させ、段階的にｐＨを１０まで変化させながら、０．１Ｍトリス／０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を用いて、カラムから溶離させる。
別法として、１９８７年１１月１０日にスコット（Scott）らに与えられ、引用によって本明細書に含まれる米国特許４７０５６８６号に記載の方法を用いることができる。この方法では、百日咳菌（B. pertussis）の培養上清もしくは細胞抽出物を、内毒素は吸着するがボルデテラ属菌（Bordetella）抗原は通過させるかあるいは内毒素から分離させるだけの能力を有するアニオン系イオン交換樹脂のカラムに通す。
別法としてＰＴは、本願の譲受人に譲渡され、引用によって本明細書に含まれる欧州特許３３６７３６号に記載のような、パーライトクロマトグラフィーを用いて精製することができる。
ＰＴの解毒
ＰＴの解毒して、最終ワクチンの副作用を起こし得る望ましくない活性を除去する。各種の従来の化学的解毒法を使用することができ、それにはホルムアルデヒド、過酸化水素、テトラニトロメタンまたはグルタルアルデヒドによる処理などがある。
例えば、ムノズ（Munoz）らの報告（参考文献５７）に記載の手順の変法を用いて、グルタルアルデヒドによってＰＴを解毒することができる。この解毒方法では、精製ＰＴを、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水を含む溶液中でインキュベーションする。溶液をグルタルアルデヒド０．０５％とし、混合物を室温で２時間インキュベーションし、Ｌ−リジンで０．０２Ｍとする。混合物をさらに室温で２時間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳに対して２日間透析する。特定の実施態様では、欧州特許３３６７３６号の解毒方法を用いることができる。すなわち、ＰＴを以下のようにしてグルタルアルデヒドで解毒することができる。０．２２Ｍで塩化ナトリウムを含む精製ＰＴの７５ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ８．０）を等量のグリセリンで希釈して、蛋白濃度を約５０〜４００μｇ／ｍＬとする。溶液を加熱して３７℃とし、グルタルアルデヒドを最終濃度０．５％（容量基準）となるように加えて解毒を行う。混合物を３７℃で４時間経過させ、アスパラギン酸（１．５Ｍ）を加えて、最終濃度０．２５Ｍとする。混合物を室温で１時間インキュベーションし、０．１５Ｍで塩化ナトリウムと５％でグリセリンを含むｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウム１０倍容量でダイアフィルトレーションを行って、グリセリン量を低下させ、グルタルアルデヒドを除去する。０．２μＭ膜を通して、ＰＴトキソイドを無菌濾過する。
組換え法を用いてトキソイド化分子として使用するのに無毒かまたはほとんど毒性を示さないＰＴ突然変異体分子を製造する場合、化学的解毒は必要ない。
ＦＨＡの精製
ＦＨＡの精製は、コーウェル（Cowell）らの報告（参考文献５８）に記載の方法にほぼ従って、培養上清から精製することができる。メチル化β−シクロデキストリンなどの成長促進剤を用いて、培養上清中のＦＨＡの収量を上昇させることができる。その培養上清を、ヒドロキシルアパタイトカラムに投入する。ＦＨＡはカラムに吸着されるが、ＰＴは吸着されない。カラムをトリトンＸ−１００でかなり洗浄して内毒素を除去する。次に、０．５ＭでＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液を用いてＦＨＡを溶離し、必要に応じてフェチュイン−セファロースカラムに通して、残っているＰＴを除去する。セファロースＣＬ−６Ｂカラムを通して、さらに精製を行うことができる。
別法として、ＦＨＡの精製を、その抗原に対するモノクローナル抗体を用いて行うことができ、その場合、抗体をＣＮＢｒ活性化アフィニティカラムに付着させておく（参考文献５９）。
別法として、ＦＨＡの精製を、上記の欧州特許３３６７３６号に記載の方法に従ってパーライトクロマトグラフィーによって行うことができる。
６９ｋＤａ外膜蛋白（ペルタクチン）の精製
最初に、引用によって本明細書に含まれる公開欧州特許出願４８４６２１号に記載された方法に従って、チメロサールなどの静菌剤を用いて細胞を不活化することで、細菌細胞から６９ｋＤａ外膜蛋白（６９Ｋまたはペルタクチン）を回収することができる。その不活化細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７〜８）などの水系媒体中に懸濁させ、高温（４５〜６０℃）で繰り返し抽出し、その後室温もしくは４℃まで冷却する。抽出によって、細胞から６９Ｋ蛋白が放出される。６９Ｋ蛋白含有物を沈殿によって回収し、アフィゲルブルー（Affi-gel Blue）カラムに通す。６９Ｋ蛋白を、０．５Ｍ塩化マグネシウムなどの高濃度の塩で溶離させる。透析後、それをクロマトフォーカシング担体に通す。
別法として、本願の譲受人の名称で出願され、引用によって本明細書に含まれる公開ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１５５０５号に記載の方法に従って、百日咳菌（B. pertussis）培地の培養上清から、６９ｋＤａ蛋白を精製することができる。
百日咳菌（B. pertussis）からの６９ｋＤａ外膜蛋白の他の適切な精製方法は、ゴット（Gotto）らに１９８４年１月４日に与えられた米国特許５２７６１４２号およびバーンズ（Burns）ら１９９２年３月３１日に与えられた米国特許５１０１０１４号に記載されている。
本明細書に記載のような多くの治験がヒトにおいて行われて、百日咳に対する保護向けに、本発明の方法に従って製造される線毛性凝集原を含む成分ワクチンの安全性、非反応原性および有用性が確認されている。特に、ワクチンに含まれる各抗原に対する免疫応答（例えば、後述の表３に示したもの）が得られている。ある特定の非細胞性百日咳ワクチンＣＰ１０／５／５／３ＤＴについて、危険性のあるヒト群における大規模なプラシーボ対照多施設二重無作為化治験で解析が行われ、代表的な百日咳に対するそのワクチンの効力が推算されている。
代表的百日咳疾患患者は以下のように定義された。
２１日以上の痙攣性の咳
および
培養で確認された百日咳菌（B. pertussis）
または
対合血清でのＦＨＡもしくはＰＴに対するＥＬＩＳＡにおける１００％のＩｇＧもしくはＩｇＡ抗体上昇によって示されるボルデテラ属菌（Bordetella）特異的感染の血清学的証拠
あるいは
血清学的データがない場合、治験参加小児における咳発症の前後２８日以内に咳を発症したその家庭内の培養で確認された百日咳菌（B. pertussis）保菌患者とその治験参加小児との間に接触があったこと
この治験の結果から、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴが上記のような代表的百日咳疾患についての患者定義で定義されたような百日咳の予防に約８５％の効力を持つことが明らかになった。同じ治験で、ＰＴおよびＦＨＡのみを含む２成分系百日咳非細胞性ワクチンは約５８％の効力であり、全細胞百日咳ワクチンは約４８％の効力であった（後述の表４参照）。さらに、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴワクチンは、１日以上の期間の咳として定義される軽度の百日咳を、約７７％の効力で予防した。特に、得られた免疫応答特性は、百日咳に対して非常に有効であると報告されている全細胞百日咳ワクチンによる免疫感作後に得られたものと実質的に同等であった。
ワクチン製造および使用
そこで、ワクチンとしての使用に好適な免疫原性組成物を、本願に開示の方法に従ってボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原から製造することができる。このワクチンは、オプソニン作用性または殺細菌性となり得る抗体を産生する患者において免疫応答を誘発する。予防接種患者を百日咳菌（B. pertussis）が攻撃したとしても、そのような抗体が細菌に結合し、不活化する。さらに、オプソニン作用性または殺細菌性の抗体は、別の機序によって保護を与える可能性もある。
ワクチンなどの免疫原性組成物は、液剤や乳剤などの注射剤として製剤することができる。ボルデテラ属菌（Bordetella）免疫原は、その免疫原と適合性である医薬的に許容される賦形剤と混合することができる。そのような賦形剤としては、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールおよびそれらの組み合わせたものなどがあり得る。免疫原性組成物およびワクチンは、湿展剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤またはアジュバントなどの補助物質をさらに含有して、その有効性を高めることができる。免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射もしくは筋肉注射によって、非経口的に投与することができる。免疫原性製剤およびワクチンは、その製剤に適合する方法にて、治療上有効で、免疫原性があり、保護効果のあるような量で投与される。投与量は、治療を受ける患者によって決まるものであり、例えば、抗体を合成し、必要に応じて細胞介在性免疫応答を生じるその個人における免疫系の能力によって決まる。投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断によって決まる。しかしながら、好適な用量範囲は、当業者であれば容易に決定し得るものであり、免疫原をμｇ単位とすることになると考えられる。初期投与および追加免疫投与における好適な投与法も変動し得るものであるが、初期投与とそれに続く投与を行うものと考えられる。用量は投与経路によっても決まるものであり、宿主の大きさに応じて変動する。
本発明による免疫原性組成物中の免疫原の濃度は通常、約１〜約９５％である。１個の病原体のみの抗原材料を含むワクチンは単価ワクチンである。数種類の病原体の抗原材料を含むワクチンは、混合ワクチンであって、これも本発明に含まれる。そのような混合ワクチンは、例えば各種病原体からまたは同一病原体の各種菌株から、あるいは各種病原体の組み合わせからの材料を含むものである。
抗原をアジュバントと同時に（アジュバントは通常、リン酸緩衝生理食塩水の０．００５〜０．５％溶液として使用）抗原を投与すると、免疫原性を大幅に上昇させることができる。アジュバントは、抗原の免疫原性を高めるが、必ずしもそれ自体が免疫原性とは限らない。アジュバントは、抗原を投与部位付近に局所的に保持することで、免疫系の細胞への抗原の緩やかな徐放を促進する貯蔵効果を生じることで作用し得るものである。アジュバントはさらに、免疫系の細胞を抗原貯蔵部まで引き寄せ、そのような細胞を刺激して免疫応答を誘発することができる。
免疫刺激剤またはアジュバントは、例えばワクチンに対する宿主の免疫応答を改善するために、長年にわたって使用されている。リポ多糖類などの内在性アジュバントは通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒化細菌の成分である。外因性アジュバントは、代表的には共有結合的に抗原に結合する免疫調節剤であり、宿主の免疫応答を促進するよう製剤されている。そうして、非経口的に搬送される抗原に対する免疫応答を促進するアジュバントが確認されている。しかしながら、そのようなアジュバントの一部は有毒であり、望ましくない副作用を起こし得るものであることから、ヒトや多くの動物で使用するには不適なものとなっている。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（通常、アルム（Ａｌｕｍ）と総称される）のみがヒトワクチンおよび動物ワクチンにおけるアジュバントとして常用される。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答上昇におけるアルム（Ａｌｕｍ）の効果は明らかになっており、より最近では、ＨＢｓＡｇワクチンにアルム（Ａｌｕｍ）がアジュバントとして使用されている。アルム（Ａｌｕｍ）の有用性は一部の利用分野で明らかになっているが、それには制限がある。例えば、アルム（Ａｌｕｍ）はインフルエンザ予防接種には無効であり、必ずしも細胞介在性免疫応答を誘発するとは限らない。アルム（Ａｌｕｍ）をアジュバントとする抗原によって誘発される抗体は、マウスにおいては主としてＩｇＧ1アイソタイプであり、一部のワクチン剤による保護には最適ではない可能性がある。
広範囲の外因性アジュバントが抗原に対して強力な免疫応答を起こし得る。それには、膜蛋白抗原と錯形成したサポニン（免疫刺激錯体）、鉱油とのプルロニック（pluronic）ポリマー、鉱油中の死ミコバクテリウム、完全フロイントアジュバント、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）などの細菌産生物、ならびにリピドＡおよびリポソームなどがある。
体液性免疫応答（ＨＩＲ）および細胞介在性免疫（ＣＭＩ）を効果的に誘発するためには、多くの場合、免疫原をアジュバント中で乳化させる。多くのアジュバントが有毒であり、症状としては、肉芽腫、急性および慢性の炎症（完全フロイントアジュバント、ＦＣＡ）、細胞崩壊（サポニンおよびプルロニックポリマー）および発熱性、関節炎および前部ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）などがある。ＦＣＡは優れたアジュバントであり、研究で広範囲に使用されているが、その毒性のために、ヒトワクチンや動物ワクチンでの使用には許容可されていない。
理想的なアジュバントの望ましい特性には次のものがある。
（１）毒性がないこと
（２）長期間の免疫応答を刺激する能力
（３）製造が簡単で、長期保存において安定であること
（４）各種経路で投与される抗原に対してＣＭＩとＨＩＲの両方を誘発できること
（５）他のアジュバントとの相乗作用
（６）抗原提供細胞（ＡＰＣ）の群との選択的相互作用を行う能力
（７）適切なＴN２またはＴN１細胞特異的免疫応答を特異的に誘発する能力
（８）抗原に対して適切な抗体アイソタイプ濃度（例：ＩｇＡ）を選択的に上昇させる能力
ロックホッフ（Lockhoff）らに対して１９８９年８月８日に与えられた米国特許４８５５２８３号（引用によって本明細書に含まれる）には、Ｎ−グリシルアミド、Ｎ−グリコシル尿素およびＮ−グリコシルカーバメート（これらはそれぞれ、免疫調節剤またはアジュバントとしてのアミノ酸によって糖残基が置換されている）などの糖脂質類縁体が開示されている。そこで、ロックホッフらは（米国特許４８５５２８３号および参考文献６０）、糖スフィンゴ脂質およびグリセロ糖脂質などの天然糖脂質と構造的に類似しているＮ−糖脂質類縁体が単純疱疹ウィルスワクチンおよび偽性狂犬病ウィルスワクチンの両方において強力な免疫応答を誘発できることを報告している。糖脂質の中には、アノマー炭素原子を介して糖と直接結合する長鎖のアルキルアミンおよび脂肪酸から合成されて、天然脂質残基の機能を模倣するものもある。
モロニー（Moloney）に対して与えられ、本願の譲受人に対して譲渡され、引用によって本明細書に含まれる米国特許４２５８０２９号には、オクタデシルチロシン塩酸塩（ＯＴＨ）が、破傷風トキソイドならびにホリマリンで不活化したＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型小児麻痺ウィルスワクチンと錯形成した場合に、アジュバントとして機能することが開示されている。さらに、ニクソン−ジョージら（Nixon-George et al、参考文献６１）は、組換えＢ型肝炎表面抗原と錯形成した芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルがＢ型肝炎ウィルスに対する宿主の免疫応答を促進したと報告している。
実施例
上記の開示内容は、本発明の全般を説明するものであるので、以下の具体的な実施例を参照することで、より完全な理解を得ることができる。これら実施例は単に説明を目的として記載されているものであって、本発明の範囲を限定するものではない。状況から見て示唆されるかあるいは好都合なものとなる可能性がある場合、等価なものの形態および置換に対して変更を加えることは想到されるものである。本明細書においては具体的な用語を用いているが、そのような用語は説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。
本開示およびこれらの実施例において使用されているが明瞭には説明されていない蛋白生化学、発酵および免疫学の方法は、科学文献に広く報告されているものであり、十分に当業者の能力の範囲内のものである。
実施例１
本実施例は、百日咳菌（Bordetella pertussis）の成長について説明するものである。
原シード
百日咳菌（Bordetella pertussis）菌株の原シード培地を、凍結乾燥シードロットとして、２℃〜８℃で保存した。
作業シード
凍結乾燥培地をホルニブロック（Hornibrook）培地に回収し、それを用いてボルデー-ジャングー寒天（ＢＧＡ）平板に接種した。ホルニブロック培地は以下の組成である。
成分 １リットル当たり量
カゼイン加水分解物（活性炭処理）      10.0g
ニコチン酸                            0.001g
塩化カルシウム                        0.002g
塩化ナトリウム                        5.0g
塩化マグネシウム・６水和物            0.025g
塩化カリウム                          0.200g
リン酸２カリウム                      0.250g
デンプン                              1.0g
蒸留水                            1.0リットルまで  １％炭酸ナトリウム溶液でｐＨを６．９±０．１に調節する。培地を試験管中に分散させ、オートクレーブ中で２０分間水蒸気処理し、１２１℃〜１２４℃で２０分間オートクレーブ処理することで滅菌する。シードを、最初にＢＧＡ平板で、次に成分百日咳寒天（ＣＰＡ）で２回継代培養した。成分百日咳寒天（ＣＰＡ）は以下の組成を有する。
ＮａＣｌ  2.5 g/L
ＫＨ2ＰＯ4  0.5 g/L
ＫＣｌ  0.2 g/L
ＭｇＣｌ2（Ｈ2Ｏ）6  0.1 g/L
トリス塩基  1.5 g/L
カザミノ酸  10.0 g/L
ＮａＨグルタミン酸  10.0 g/L
濃ＨＣｌ  pH 7.2まで
寒天  15.0 g/L
成長因子（ＣＰＧＦ）  10.0 mL/L
成分百日咳成長因子（ＣＰＧＦ）−１００Ｘは以下の組成を有する。
Ｌ−システインＨＣｌ  4.0 g/L
ナイアシン  0.4 g/L
アスコルビン酸  40.0 g/L
還元グルタチオン  15.0 g/L
Ｆｅ2ＳＯ4（Ｈ2Ｏ）7  1.0 g/L
ジメチル-β-シクロデキストリン  100 g/L
ＣａＣｌ2（Ｈ2Ｏ）2  2.0 g/L
最終培地を百日咳シード懸濁緩衝液（ＣＰＳＢ）に懸濁し、２〜４ｍＬに小分けし、−６０℃〜−８５℃で冷凍保存した。百日咳シード懸濁緩衝液（ＰＳＳＢ）は以下の組成を有する。
カザミノ酸  10.0 g/L
トリス塩基  1.5 g/L
無水グリセリン  100 mL/L
濃ＨＣｌ  pH 7.2まで
これらのグリセリン懸濁液を、作業シード取得の原料として用いた。
培養方法
作業シードの増殖を、成分百日咳寒天ルー瓶中、３４℃〜３８℃で４〜７日間行った。その培養後、細胞を、成分百日咳培地（ＣＰＢ）によって寒天から洗い出した。サンプルについて、グラム染色により、培地の純度および不透明度を観察した。
ＣＰＢを含む４リットル三角フラスコに細胞を移し、振盪しながら、３４℃〜３８℃で２０〜２６時間インキュベーションした。サンプルをグラム染色で観察し、培地の純度を調べた。フラスコの内容物を合わせ、その懸濁液を用いて、ＣＰＢを含む２個の発酵槽に接種した（容量１０リットルで、初期ＯＤ６００は０．１〜０．４）。シードは成長して、採取ＯＤ６００は５．０〜１０．０となった。サンプルについて、グラム染色によって培地の純度と、抗原特異的ＥＬＩＳＡによって無菌性を調べた。
実施例２
この実施例では、百日咳菌（Bordetella pertussis）細胞培地からの抗原の精製について説明する。
培養液および細胞濃縮物の製造
細菌懸濁液を、２個の生産発酵槽で、３４℃〜３７℃で３５〜５０時間成長させた。発酵槽のサンプリングを行って、培地滅菌性試験を行った。この懸濁液を連続流円板積層型遠心機（１２０００×ｇ）に送って、肉汁から細胞を分離した。細胞を回収して、線毛成分の抽出用に待機した。透明液体を≦０．２２μｍ膜フィルターに通した。濾過した液体を、１０〜３０ｋＤａを公称分子量限界（ＮＭＷＬ）とする膜を用いる限外濾過によって濃縮した。濃縮液を保存して、百日咳毒素（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）および６９ｋＤａ（ペルタクチン）成分の分離・精製用に待機した。
培養液成分の分離
上述の欧州特許３３６７３６号および出願人の公開ＰＣＴ出願ＷＯ  ９１／１５５０５号に記載の方法にほぼ従って、肉汁成分（６９ｋＤａ、ＰＴおよびＦＨＡ）を、パーライトクロマトグラフィーおよび選択的溶離の段階によって分離・精製した。行った具体的精製操作について以下に説明する。
百日咳毒素（ＰＴ）
パーライトカラムを、５０ｍＭトリス緩衝液、５０ｍＭトリス／０．５％トリトンＸ−１００緩衝液および５０ｍＭトリス緩衝液で洗浄した。５０ｍＭトリス／０．１２Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を用いて、パーライトカラムからＰＴの分画を溶離させた。
パーライトクロマトグラフィーからのＰＴ分画をヒドロキシルアパタイトカラムに負荷し、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で洗浄した。ＰＴを７５ｍＭリン酸カリウム／２２５ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で溶離した。カラムを２００ｍＭリン酸カリウム／０．６Ｍ ＮａＣｌで洗浄して、ＦＨＡ分画を得て、それを廃棄した。精製ＰＴにグリセリンを５０％まで加え、混合物を２℃〜８℃で保存し、１週間以内に解毒を行った。
線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）
ＦＨＡ分画を５０ｍＭトリス／０．６Ｍ ＮａＣｌでパーライトカラムから溶離した。線維状ヘマグルチニンをヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィーによって精製した。パーライトカラムからのＦＨＡ分画をヒドロキシルアパタイトカラムに負荷し、０．５％トリトンＸ−１００を含む３０ｍＭリン酸カリウムと次に３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で洗浄した。ＰＴ分画を８５ｍＭリン酸カリウム緩衝液で溶離し、廃棄した。次に、２００ｍＭリン酸カリウム／０．６Ｍ ＮａＣｌによってＦＨＡ分画を溶離し、２℃〜８℃で保存し、１週間以内に解毒した。
６９ｋＤａ（ペルタクチン）
肉汁濃縮液を注射用水（ＷＦＩ）で希釈して、導電率を３〜４ｍＳ／ｃｍとし、パーライトカラムに、パーライト１ｍＬ当たり蛋白０．５〜３．５ｍｇの負荷量で負荷した。溶出液（６９ｋＤａ成分分画）を、１０〜３９ｋＤａ ＮＭＷＬ膜を用いる限外濾過によって濃縮した。濃縮溶出液に硫酸アンモニウムを３５±３％（重量／容量）まで加え、得られた混合物を２℃〜８℃で４±２日間保存するか、直ちに遠心した（７０００×ｇ）。過剰の上清を傾斜法にて除去し、沈殿物を遠心（７０００×ｇ）によって回収した。得られた６９ｋＤａペレットを−２０℃〜−３０℃で冷凍保存するか、あるいはトリスもしくはリン酸緩衝液に溶かして、直ちに使用した。
濃縮パーライト溶出液の３５％（重量／容量）硫酸アンモニウムによる沈殿形成によって得られた６９ｋＤａ外膜蛋白を用いて精製を行った。硫酸アンモニウム（１リットル当たり１００±５ｇ）を６９ｋＤａ分画に加え、混合物を２℃〜８℃で２時間以上撹拌した。混合物を遠心して（７０００×ｇ）、上清を回収した。上清に硫酸アンモニウム（１リットル当たり１００〜１５０ｇ）を加え、混合物を２℃〜８℃で２時間以上撹拌した。混合物を遠心して（７０００×ｇ）、ペレットを回収し、それを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）に溶かした。溶液のイオン強度を、１５ｍＭ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）と同等に調節した。
６９ｋＤａ蛋白を、Ｑ−セファロースカラムと直列に連結したヒドロキシルアパタイトカラムに負荷した。６９ｋＤａ蛋白を溶出液に回収し、１５ｍＭ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）でカラムから洗い出し、溶出液中の６９ｋＤａと一緒に蓄積した。６９ｋＤａ蛋白蓄積液を、１００〜３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜で、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む６〜１０倍容量の１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８）でダイアフィルトレーションした。限外濾過液を回収し、限外濾過液中の６９ｋＤａ蛋白を濃縮した。
６９ｋＤａ蛋白について、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）による溶媒交換を行い、Ｑ−セファロースに吸着させ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）／５ｍＭ硫酸アンモニウムで洗浄した。６９ｋＤａ蛋白を、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８）で溶離した。６９ｋＤａ蛋白を、１０〜３０ｋＤａ ＮＭＷＬ膜で、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む６〜１０倍容量の１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８）でダイアフィルトレーションした。６９ｋＤａ蛋白を、≦０．２２μｍフィルターで無菌濾過した。この無菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ヶ月以内に吸着を行った。
線毛性凝集原
培養液からの分離後の細胞ペーストから、凝集原を精製した。細胞ペーストを、１０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび４Ｍ尿素を含む緩衝液中で細胞が０．０５容量部となるまで希釈し、３０分間混和した。細胞溶解物を遠心（１２０００×ｇ）によって透明とし、１００〜３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フィルターを用い、１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１トリトンＸ−１００に対して濃縮・ダイアフィルトレーションを行った。
濃縮液を８０℃で３０分間加熱処理し、遠心（９０００×ｇ）によって再度透明とした。透明上清に、最終濃度が４．５％±０．２％となるようにＰＥＧ８０００を加え、３０分間以上ゆっくり撹拌した。得られた沈殿を遠心（１７０００×ｇ）によって回収し、ペレットを１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で抽出して、粗線毛性凝集原溶液を得た。線毛性凝集原をＰＥＩシリカに通して精製した。粗溶液を、１Ｍリン酸カリウム緩衝液を用いてリン酸カリウムに関して１００ｍＭとし、ＰＥＩシリカカラムに通した。
カラムからの溶出液を、１００〜３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フィルターを用い１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液に対して濃縮・ダイアフィルトレーションした。この無菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ヶ月以内に吸着を行った。線毛性凝集原製剤は、線毛性Ａｇｇ２および線毛性Ａｇｇ３を重量比約１．５〜約２：１で含有し、実質的にＡｇｇ１を含まないことが認められた。
実施例３
本実施例は、精製百日咳菌（Bordetella pertussis）抗原、ＰＴおよびＦＨＡのトキソイド化について説明するものである。
実施例２に記載の方法に従って純粋な形で得られたＰＴについて、ＰＴ溶液中のグルタルアルデヒド濃度を０．５％±０．１％に調節し、３７℃±３℃で４時間撹拌することでトキソイド化した。Ｌ−アスパラギン酸塩を０．２１±０．０２Ｍまで加えることで、反応を停止した。混合物をさらに１±０．１時間にわたり室温に維持し、次に２℃〜８℃に１〜７日保持した。
得られた混合物を、３０ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フィルターで、１０ｍＭリン酸カリウム／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／５％グリセリン緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、次に≦０．２２μｍ膜フィルターに通すことで滅菌した。この滅菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ヶ月以内に吸着を実施した。
実施例２に記載の方法に従って純粋な形で得られたＦＨＡ分画については、Ｌ−リジンとホルムアルデヒド濃度をそれぞれ４７±５ｍＭおよび０．２４±０．０５％に調節し、３５℃〜３８℃で６週間インキュベーションすることでトキソイド化した。次に、混合物を、３０ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フィルターで、１０ｍＭリン酸カリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌに対してダイアフィルトレーションし、次に膜フィルターに通すことで滅菌した。この滅菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ヶ月以内に吸着を実施した。
実施例４
本実施例は精製百日咳菌（Bordetella pertussis）抗原の吸着について説明するものである。
ＰＴ、ＦＨＡ、Ａｇｇおよび６９ｋＤａのそれぞれのリン酸アルミニウム（ミョウバン）への吸着用に、リン酸アルミニウムのストック液の濃度を１８．７５±１ｍｇ／ｍＬとした。好適な容器を準備し、いずれかの抗原を無菌的に容器中に懸濁させた。２−フェノキシエタノールを無菌的に加えて、最終濃度０．６％±０．１％（容量基準）とし、均一になるまで撹拌した。適切な量のリン酸アルミニウムを容器に無菌的に加えた。適切な容量の無菌蒸留水を加えて、リン酸アルミニウムの最終濃度を３ｍｇ／ｍＬとした。容器を密閉し、ラベルを施し、室温で４日間撹拌した。それから容器を保管して、最終製剤用に待機した。
実施例５
本実施例は、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの製剤について説明するものである。
これ以前の実施例に記載の方法に従って得た百日咳菌（B. pertussis）抗原を、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドとともに製剤して、いくつかの成分百日咳（ＣＰ）ワクチンを得た。
百日咳成分は、上記の実施例１〜４に詳細に記載した方法に従って深部培養で成長させた百日咳菌（Bordetella pertussis）から得た。成長終了後、培養肉汁と細菌細胞を遠心によって分離した。各抗原をそれぞれ精製した。百日咳毒（ＰＴ）および線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）を、パーライトおよびヒドロキシルアパタイトでの連続クロマトグラフィーによって肉汁から精製した。ＰＴは、グルタルアルデヒドによって解毒し、ＦＨＡ分画中に存在する残留ＰＴ（約１％）はホルムアルデヒドによって解毒した。線毛性凝集原（２＋３）（ＡＧＧ）は、細菌細胞から得た。細胞を尿素で破壊して加熱処理し、線毛性凝集原をポリエチレングリコールによる沈殿形成およびポリエチレンイミンシリカでのクロマトグラフィーによって精製した。６９ｋＤａ蛋白（ペルタクチン）成分を、パーライトクロマトグラフィー段階（実施例２）からの溶出液から硫酸アンモニウム沈殿形成によって単離し、ヒドロキシルアパタイトおよびＱ−セファロースでの連続クロマトグラフィーによって精製した。全ての成分を、０．２２μｍ膜フィルターによる濾過によって滅菌した。
ジフテリアトキソイドは、標準法によって深部培養で成長させたジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）から得た。ジフテリアトキソイドの製造は5段階に分けることができる。すなわち、作業用シードの維持、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）の成長、ジフテリア毒の回収、ジフテリア毒の解毒およびジフテリアトキソイドの濃縮である。
ジフテリアトキソイドの製造
（Ｉ）作業用シード
ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）を凍結乾燥シードロットとして維持した。再生シードを３５℃±２℃で１８〜２４時間にわたり、レフラースロープ（Loeffler slope）で成長させ、ジフテリア培地のフラスコに移した。次に、培地について純度とＬｆ含有量を調べた。残りのシードを用いて、発酵槽に接種した。
（ＩＩ）ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）の成長
培地を、発酵槽中で３５℃±２℃でインキュベーション・撹拌した。培地に、所定量の硫酸第一鉄、塩化カルシウムおよびリン酸溶液を加えた。各溶液（リン酸塩、硫酸第一鉄、塩化カルシウム）の実際の量は、各培地ロットについて実験的に求めた。選択した濃度は、Ｌｆ含有量が最大となったものである。成長周期（３０〜５０時間）終了後、培地についてサンプリングを行って、純度およびＬｆ含有量を調べた。
重炭酸ナトリウムによってｐＨを調節し、温度を３５℃±２℃に維持しながら０．４％トルエンで１時間処理することで培地を不活化した。次に、無菌性試験を行って、生存ジフテリア菌（C. diphtheriae）が存在しないことを確認した。
（ＩＩＩ）ジフテリア毒の回収
１個または数個の発酵槽からのトルエン処理した培地を大きい槽に蓄積した。約０．１２％重炭酸ナトリウム、０．２５％活性炭および２３％硫酸アンモニウムを加え、ｐＨを調べた。
混合物を約３０分間撹拌した。珪藻土を加え、混合物をデプスフィルターにポンプで送った。濾液を透明になるまで循環させ、回収し、サンプリングによってＬｆ含有量を調べた。追加の硫酸アンモニウムを濾液に加えて、濃度を４０％とした。さらに珪藻土も加えた。この混合物を２℃〜８℃で３〜４日間維持して、沈殿を形成させた。沈殿した毒素を回収し、０．９％生理食塩水に溶かした。珪藻土を濾過によって除去し、毒素を０．９％生理食塩水に対して透析して、硫酸アルミニウムを除去した。透析した毒素を蓄積し、サンプリングを行ってＬｆ含有量および純度を調べた。
（ＩＶ）ジフテリア毒の解毒
解毒は透析直後に行う。解毒を行うには、毒素を希釈して、最終溶液に以下のものが含有されるようにする。
ａ）ジフテリア毒１０００±１０％Ｌｆ／ｍＬ
ｂ）０．５％重炭酸ナトリウム
ｃ）０．５％ホルマリン
ｄ）０．９％（重量／容量）Ｌ−リジン・モノ塩酸塩
この溶液を生理食塩水で規定量とし、ｐＨを７．６±０．１に調節した。
セルロース珪藻土フィルターパッドおよび/または膜前置フィルターおよび０．２μｍ膜フィルターでトキソイドを濾過して回収容器に取り、３４℃で５〜７週間インキュベーションした。サンプリングを行って、毒性を調べた。
（Ｖ）精製トキソイドの濃縮
トキソイドを蓄積し、限外濾過によって濃縮し、好適な容器に回収した。サンプリングを行って、Ｌｆ含有量および純度を調べた。保存剤（２−フェノキシエタノール）を加えて、最終濃度０．３７５％とし、ｐＨを６．６〜７．６に調節した。
トキソイドを前置フィルターおよび０．２μｍ膜フィルター（または相当品）によって濾過することで滅菌し、回収した。無菌トキソイドをサンプリングして、トキソイドＬｆ含有量、保存剤含有量、純度（窒素含有量）、無菌性および毒性の不可逆性を調べた。無菌濃縮トキソイドを２℃〜８℃で保存して、最終製剤に備えた。
破傷風トキソイドの製造
破傷風トキソイド（Ｔ）は、深部培養で成長させた破傷風菌（Clostridium tetani）から得た。
破傷風トキソイドの製造は、５段階に分けることができる。すなわち、作業用シードの維持、破傷風菌（Clostridium tetani）の成長、破傷風毒素の回収、破傷風毒素の解毒および破傷風トキソイドの精製である。
（Ｉ）作業用シード
破傷風トキソイドへの変換向けの破傷風毒素の生産に使用した破傷風菌（Clostridium tetani）の菌株を、シードロットで凍結乾燥品として維持した。シードをチオグリコレート培地に接種し、３５℃±２℃で２４時間成長させた。サンプリングを行って、培地の純度を調べた。
（ＩＩ）破傷風菌（Clostridium tetani）の成長
破傷風培地を発酵槽中に分散させ、熱処理し、冷却した。次に、発酵槽に接種を行い、培地を３４℃±２℃で４〜９日間成長させた。サンプリングを行って、培地の純度およびＬｆ含有量を調べた。
（ＩＩＩ）破傷風毒素の回収
セルロース珪藻土パッドによる濾過によって、毒素を分離し、透明毒素を膜フィルターを用いて濾過滅菌した。サンプリングを行って、Ｌｆ含有量と滅菌性を調べた。毒素を、３００００ダルトンの孔径を用いて限外濾過で濃縮した。
（ＩＶ）破傷風毒素の解毒
毒素をサンプリングして、Ｌｆ含有量を調べてから解毒を行った。０．５％（重量／容量）重炭酸ナトリウム、０．３％（容量基準）ホルマリンおよび０．９％（重量／容量）Ｌ−リジン・モノ塩酸塩を加えて、濃縮毒素（４７５〜５２５Ｌｆ／ｍＬ）を解毒し、生理食塩水で規定量とした。ｐＨを７．５±０．１に調節し、混合物を３７℃で２０〜３０日間インキュベーションした。サンプリングを行って、無菌性と毒性を調べた。
（Ｖ）トキソイドの精製
濃縮トキソイドを、前フィルターと次に０．２μｍ膜フィルターによって滅菌した。サンプリングを行って、無菌性およびＬｆ含有量を調べた。
硫酸アンモニウムの至適濃度は、トキソイドサンプルから求めた分別「Ｓ」字曲線に基づいたものである。第１の濃縮液をトキソイドに加えた（１９００〜２１００Ｌｆ／ｍＬまで希釈）。混合物を２０℃〜２５℃で１時間以上維持し、上清を回収し、高分子量分画を含む沈殿物は廃棄した。
硫酸アンモニウムの第２の濃縮液を第２の分別用の上清に加えて、低分子量不純物を除去した。混合物を２０〜２５℃で２時間以上維持し、その後最長で３日間、２℃〜８℃で保管することができた。純粋トキソイドである沈殿物を遠心および濾過によって回収した。
ＰＢＳによるアミコン（Amicon）（または相当品）限外濾過膜を用いたダイアフィルトレーションを行ってトキソイド溶液で硫酸アンモニウムが検出できなくなるようにすることで、精製トキソイドから硫酸アンモニウムを除去した。ｐＨを６．６〜７．６に調節し、２−フェノキシエタノールを加えて、最終濃度０．３７５％とした。トキソイドを膜濾過によって滅菌し、サンプリングを行って試験を行った（トキソイド、Ｌｆ含有量、ｐＨ、保存剤含有量、純度、無菌性および毒性の不可逆性）。
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの一つの製剤を、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴと称した。ＣＰ１０／５／５／３ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
１０μｇ  百日咳トキソイド（ＰＴ）
５μｇ  線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
３μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白
１５Ｌｆ  ジフテリアトキソイド
５Ｌｆ  破傷風トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンの別の製剤を、ＣＰ１０／５／５ＤＴと称した。ＣＰ１０／５／５ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
１０μｇ  百日咳トキソイド（ＰＴ）
５μｇ  線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
１５Ｌｆ  ジフテリアトキソイド
５Ｌｆ  破傷風トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンのさらに別の製剤を、ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴと称した。ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
２０μｇ  百日咳トキソイド（ＰＴ）
２０μｇ  線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）
５μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
３μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白
１５Ｌｆ  ジフテリアトキソイド
５Ｌｆ  破傷風トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチンのさらに別の製剤を、ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴと称した。ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。
２０μｇ  百日咳トキソイド（ＰＴ）
１０μｇ  線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）
１０μｇ  線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ）
６μｇ  ６９ｋＤａ外膜蛋白（６９ｋＤＡ）
１５Ｌｆ  ジフテリアトキソイド
５Ｌｆ  破傷風トキソイド
１．５ｍｇ  リン酸アルミニウム
０．６％  ２−フェノキシエタノール（保存剤）
実施例６
本実施例は、本発明によって製造される成分非細胞性百日咳ワクチンの臨床評価について説明するものである。
（ａ）成人での試験
成人および１６〜２０ヶ月齢の小児における試験から、線毛性凝集原を含む多成分ワクチンが安全かつ免疫原性であることが示された（表２）。
Ｉ相治験を、５成分百日咳ワクチン（ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ）を用いてアルバータ州カルガリーで１７〜１８月齢の小児で行ったところ、副作用が報告された。３３名の小児にワクチンを投与し、さらに別の３５名に６９ｋＤａ蛋白成分を含まない同じワクチンを投与した。
局所反応は希であった。主として過敏性である全身性の副作用が治験参加者の約半数において認められ、それはどのワクチンを投与したかとは無関係であった。酵素イムノアッセイによる抗ＰＴ、抗ＦＨＡ、抗線毛性凝集原および抗６９ｋＤａ ＩｇＧ抗体ならびにＣＨＯ細胞中和試験での抗ＰＴ抗体において有意な抗体上昇が測定された。抗６９ｋＤａ抗体の場合を除き、４成分（ＣＰ１０／５／５ＤＴ）または５成分（ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ）を投与された小児において、抗体応答における差は検出されなかった。６９ｋＤａ蛋白を含む５成分ワクチンの投与を受けた小児は、有意に高い免疫感作後抗６９ｋＤａ抗体レベルを有していた。
用量−応答試験がカナダのマニトバ州ウィニペグで４成分ワクチンを用いて行なわれた。２種類のワクチン製剤、すなわちＣＰ１０／５／５／３ＤＴおよびＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴを用いた。全細胞ＤＰＴワクチンも対照として含めた。
この治験は、追加免疫百日咳投与の時点で１７〜１８ヶ月齢の幼児９１名における二重盲検試験であった。これらの小児は、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴおよびＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴのいずれも良好に耐容した。いずれの成分ワクチン投与後においても、局所反応や全身反応を起こした小児の数に差は示されなかった。それとは対照的に、全細胞ワクチン投与を受けた小児では、ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴ成分ワクチン投与を受けた小児より局所および全身の反応を起こした小児数に有意な増加があった。
幼児での治験
ＩＩ相
カナダのアルバータ州カルガリーおよびブリティッシュコロンビアで、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴワクチンを用いた治験が行われた。この治験では、幼児４３２名に成分百日咳ワクチンまたは全細胞対照ワクチンＤＰＴを２ヶ月齢、４ヶ月齢および６ヶ月齢で投与した。これらの小児は、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴワクチンを良好に耐容した。局所反応は、各投与後において、全細胞ワクチンより成分ワクチンによる方が少なかった。
成分百日咳ワクチンによる予防接種後に、全ての抗原に対する有意な抗体応答が示された。全細胞ワクチンの投与を受けた幼児は、線毛性凝集原ＤおよびＴに対して激しい抗体応答を示した。数ヶ月後、成分ワクチン投与被験者の８２％〜８９％および全細胞ワクチン投与被験者の９２％で、線毛性凝集原に対する抗体力価に４倍以上の上昇があった。それとは対照的に、ＦＨＡに対する抗体応答は、成分ワクチン投与群で７５％〜７８％であったのに対して、全細胞投与群では３１％であった。成分ワクチン投与群の９０％〜９３％および全細胞投与群の７５％で、抗６９ｋＤａ抗体の４倍上昇が認められた。成分ワクチン投与群の４０％〜４９％および全細胞投与群の３２％で、酵素イムノアッセイによるＰＴに対する抗体に４倍上昇が認められた。成分ワクチン投与群の５５％〜６９％および全細胞投与群の６％で、ＣＨＯ中和によるＰＴ抗体に４倍上昇が認められた（表２）。
ＩＩＢ相
２ヶ月齢、４ヶ月齢および６ヶ月齢の幼児１００名において、ジフテリア含有量が１５Ｌｆと比較的低い製剤とそれに対して２５Ｌｆの製剤を用いて、Ｄ１５ＰＴを対照とする無作為盲検試験で、ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴワクチンおよびＣＰ１０／５／５／３ＤＴワクチンの評価を行った。２種類の成分製剤間で、副作用の率に差は検出されず、いずれも全細胞対照より反応原性が有意に低かった。抗原含有量が高いＣＰ２０／２０／５／３ＤＴワクチンの投与を受けた群では、酵素イムノアッセイおよびＣＨＯ中和によるＰＴとＦＨＡに対する抗体力価が相対的に高かった。７ヶ月後には、抗ＦＨＡ幾何平均力価はＣＰ２０／２０／５／３ＤＴ投与群では９５．０、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ投与群では４５．２であったのに対して、ＣＰ１５ＤＴ投与群では８．９に過ぎなかった。抗ＰＴ力価はそれぞれ、イムノアッセイによって１３３．３、５８．４および１０．４であり、ＣＨＯ中和によって８２．４、３２．７および４．０であった（表２）。
本治験により、抗原含有量の高い、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを吸着によって併用した成分百日咳ワクチンが幼児において安全かつ免疫原性であり、抗原含有量が高いことで、反応原性の上昇を起こさずに、製造された抗原（ＰＴおよびＦＨＡ）に対する免疫応答が大きくなることが明らかになった。
ＮＩＡＩＤのＩＩ相米国比較試験
非細胞性百日咳ワクチンについての大規模効力試験の予備試験として、国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）による支援下に、米国でＩＩ相治験が行われた。ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドを吸着させて併用した本発明の一つの成分百日咳ワクチン（ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ）が、他の１２種類の非細胞性ワクチンおよび２種類の全細胞ワクチンとともにその治験に含まれていた。安全性の結果が、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ成分ワクチンによって２ヶ月齢、４ヶ月齢および６ヶ月齢で免疫感作された小児１３７名について報告されている。
前述の治験からわかる通り、成分ワクチンは安全であり、低反応原性であり、しかもワクチンに対する耐容は良好であった。
７ヶ月後において、抗ＰＴ抗体、抗ＦＨＡ抗体、抗６９ｋＤａ抗体および抗線毛性凝集原抗体はいずれも、全細胞ワクチン投与後に得られたレベル以上であった（参考文献７１および表２）。小児を無作為にＣＰ２０／２０／５／３ＤＴまたはＣＰ１０／５／５／３ＤＴワクチン製剤のいずれかの投与に割り付けた二重盲検試験が行われた。計２０５０名の幼児を米国およびカナダで登録し、幼児１９６１名が治験を完了した。いずれのワクチンも、これらの幼児において安全で、低反応原性であり、免疫原性であった。免疫原性は、２９２名の小群で評価された。両方のワクチン製剤により、ワクチン中に含有される全ての抗原に対して抗体上昇が誘発された。ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴ製剤の方がＦＨＡに対する抗体力価誘発が大きかったが、ＰＴについてはそうではなかった。ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ製剤は、線毛に対して相対的に高い力価および相対的に高い凝集原力価を誘発した。
さらに別の安全性および免疫原性についての試験が、フランスで行われた。試験計画は、ワクチンの投与を２ヶ月齢、３ヶ月齢および４ヶ月齢で行った以外、上記の北米での試験と同様であった。局所反応および全身反応は全般に軽度であった。全体的に、この投与方法を用いたフランスでの治験参加者では、ワクチンの許容度は良好であった。
幼児１００００名での、２種類の非細胞性百日咳ワクチンおよび１種類の全細胞ワクチンについてのプラシーボ対照効力試験
ＮＩＡＩＤ ＩＩ相米国比較試験の結果を受けて、２成分および５成分の非細胞性ワクチンが、多施設、対照、二重無作為化、プラシーボ対照効力試験向けに選択された。治験は、百日咳の発生率が高いスウェーデンで行なわれた。２成分ワクチンには、グリセロアルデヒドおよびホルマリン不活化ＰＴ（２５μｇ）、ホルマリン処理ＦＨＡ（２５μｇ）およびジフテリアトキソイド１７Ｌｆおよび破傷風トキソイド１０Ｌｆを含有させた。５成分百日咳ワクチンは、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴとした。治験に向けて、スウェーデンにおけるこの年齢群の幼児のほぼ１／２に相当する幼児１００００名を、生誕登録を利用して、１４の地理的に決定された治験実施施設で募集した。
１９９２年の１月および２月に生まれた小児を３薬剤（armed）試験に無作為に割り付けた。親の同意を得た後、２ヶ月齢、４ヶ月齢および６ヶ月齢で、幼児の２／３に対して、２種類のジフテリア−破傷風−非細胞性百日咳製剤のうちの１種類を投与した。対照群には、ＤＴのみを投与した。１９９２年５月に、米国で特許取得された市販の全細胞ＤＴＰワクチンが導入され、１９９２年の３月から１２月に生まれた小児を４薬剤試験に無作為に割り付けた。親の同意を得た後、２ヶ月齢、４ヶ月齢および６ヶ月齢で、幼児の３／４に対して、３種類のＤＴＰ製剤のうちの１種類を投与した。対照群には、ＤＴのみを投与した。
各ワクチンを約２５００名の小児に投与した。ワクチンは３回投与した。第１回投与は、２ヶ月齢であって３ヶ月齢未満の時点で行った。その後の投与は、８週間ずつの期間を設けて行った。ワクチンは筋肉注射にて投与した。
小児および家族について、３０ヶ月間の追跡調査を行った。百日咳が疑われる場合は、臨床データを収集し、鼻腔吸引液に対する細菌学的培養およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）診断を行うことで臨床検査的に確認した。急性期および回復期に採血を行って、血清学的診断を行った。
この治験以前では、危険性のあるヒト群（特に、新生児）における本発明の成分百日咳ワクチンが提供するペルタクチンの程度は不明であった。特に、各種ボルデテラ属菌（Bordetella）成分および選択された相対量での百日咳ワクチン中での存在のワクチンの効力に対する寄与は不明であった。
この治験の主目的は、非細胞性百日咳ワクチンと全細胞ワクチンがプラシーボと比較して代表的な百日咳に対する保護を与える能力を推算することにあった。
第２のエンドポイントは、重度の異なる確定した百日咳感染に対するワクチンの効力を解明することにあった。
ワクチンの効力は、非予防接種小児と比較した予防接種被験者における百日咳罹患確率のパーセント低下と定義される。
２つのワクチン群における百日咳の相対的危険度は、その２群における疾患の確率の比で表現される。
侵襲率とも称される百日咳罹患の確率は、各種方法によって推算することができる。標本数の計算においては、所定の試験群における百日咳罹患確率は、百日咳患者の小児と治験追跡調査終了後に試験群に残っていた小児との間の率によって計算される。
代表的百日咳の予防における本治験での成分ワクチンＣＰ１０／５／５／３ＤＴの効力を表４に示してあり、約８５％であった。同じ治験で、ＰＴおよびＦＨＡのみを含む２成分百日咳比細胞性ワクチンは約５８％の効力であり、全細胞ワクチンは約４８％の効力であった。ＣＰ１０／５／５／３ＤＴはさらに、軽度の百日咳予防においても有効で、推定効力は約７７％であった。
発明の要旨
本開示をまとめると、本発明は百日咳菌（Bordetella pertussis）の線毛性凝集原の新規な製剤とその製造方法を提供するものである。線毛性凝集原は、他のボルデテラ属菌（Bordetella）抗原および非ボルデテラ属菌（Bordetella）抗原とともに製剤して、多くの多成分百日咳ワクチンを得ることができる。そのようなワクチンは、ヒトにおいて安全、非反応原性、免疫原性であって、保護効果を持つ。本発明の範囲内においては変更が可能である。
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【図１】
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