(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィラメントの収束方向に平行に設けられた複数の培養液仕切板を有する平板状培養容器中に、バクテリアセルロース生産菌を培養し、培養液上層に集積した複数のゲル状バクテリアセルロース薄層を、ピックアップロールを介してドデシル硫酸ナトリウム水溶液で処理後、巻き取りロールにより緊張下で連続的にフィラメント状に収束することを特徴とするバクテリアセルロースフィラメントの製造方法。
【請求項２】
フィラメントを収束させる方向に平行に設けられる複数の培養液仕切板を有する平板状培養容器、培養液上層に集積した複数のゲル状バクテリアセルロースをフィラメント状に収束するためのピックアップロール、および巻き取りロールを有することを特徴とする、バクテリアセルロースフィラメントの製造装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物により生産されたバクテリアセルロースを培養液から分離回収する方法に関し、特に培養液上層に生成したゲル状バクテリアセルロース薄層を培養層から直接、収束することにより、バクテリアセルロースフイラメントとして分離回収するバクテリアセルロースフイラメントの製造方法及びそれに用いる培養装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルロースは植物細胞壁の主成分であり、紙・パルプの原料としては高等植物である木材のセルロースが天然セルロースとして広く利用されている。
【０００３】
しかし、セルロースを作るのは高等植物が生産するセルロース以外にもセルロース源としてバクテリア、海藻、ホヤが知られているが、特に、ある種の酢酸菌(Acetobacter) が炭水化物を含む培地にセルロース膜を形成することを報告して以来、この系は生合成モデルとして注目され、研究されてきた。
【０００４】
ところで、酢酸菌が生産するバクテリアセルロースは、純粋なセルロースとして菌体外に排出されるが、微細な構造を有すること、セルロースとして純度が高いこと、ヤング率が高いこと、生分解性が高いこと等から、人工皮膚等の医療用用途の他、音響振動板（スピーカーコーン）等の電気用用とへの利用が知られているが、形態的に機能を付与できる形状でないために限定された用途しかみられなかった。
【０００５】
他方、微生物が生産するバクテリアセルロースの分離回収方法としては、微生物の産生するゲル様セルロース性物質を分散性の優れた離解物として回収する方法（特開昭61-113601 号）、微生物産製セルロース性物質の懸濁液の濾過物を乾燥することによりシート状セルロース性物質を得る方法（特開昭62-175190 号）、セルロース生産菌の菌体及びセルロース含有混合物をアルカリ処理後、超音波処理により分離回収する方法（特開昭63-68093号）等が知られているが、培養容器から生成したバクテリアセルロースを直接バクテリアセルロースフイラメントとして分離回収する方法は、これまで全く知られていなかった。
【０００６】
従って、微生物が生産するバクテリアセルロースを懸濁液の濾過物あるいはシート状物以外の形状、例えば繊維状で分離回収することができれば、新たな用途が期待されるところである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者等は、バクテリアセルロースの分離回収方法について種々検討した結果、フイラメント収束方向に対して平行に設けられた複数の培養液仕切板を有する平板状の培養液容器中の培養液上層に集積した複数のゲル状バクテリアセルロース薄層を、ピックアップロールを介してドデシル硫酸ナトリウム（以下『ＳＤＳ』と略記）水溶液で処理後、巻き取りロールにより緊張下で連続的にフイラメント状に収束することを特徴とするバクテリアセルロースフイラメントの製造が可能であることを見い出し、本発明に到達した。
【０００８】
従って、本発明の第一の目的は、酢酸菌等の静置培養により得られるバクテリアセルロースを菌体培養液から直接、バクテリアセルロースフイラメントとして分離回収するバクテリアセルロースフイラメントの製造方法を提供することにある。さらに、本発明の第二の目的は、上記バクテリアセルロースフイラメントの製造方法に直接使用する平板状培養容器を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の上記した第一の課題は、フイラメント収束方向に対して平行に設けられた複数の培養液仕切板を有する平板状培養容器中の培養液上層に集積した複数のゲル状バクテリアセルロース薄層を、ピックアップロールを介してＳＤＳ水溶液で処理後、巻き取りロールにより緊張下で連続的にフイラメント状に収束することを特徴とするバクテリアセルロースフイラメントの製造方法により解決された。
【００１０】
また、上記した第二の課題は、フイラメント収束方向に対して平行に設けられた複数の培養液仕切板を有する平板状培養容器を用いることを特徴とするバクテリアセルロースの培養装置により解決された。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において使用するセルロース生産菌としては、従来、公知のアセトバクターキシリナム（Acetobacter xylinum ）等を用いることができる。
【００１３】
また、培地としては、同様に炭素源としてグルコースを用いたヘストリンーシュラム（Hestrin-schrum）培地を用いることができるが、例えば、グルコース2.0 ％，ペプトン0.5 ％，イースト抽出物0.5 ％，リン酸２ナトリウム塩0.15％，クエン酸0.27％，カルボキシメチルセルロース0.2 〜2.0 重量％からなる培地を例示することができる。
【００１４】
培養温度としては、セルロースの生産速度が最も大きい温度28℃前後で静置培養を行う。所定期間培養終了後は、常法により得られたバクテリアセルロースフイラメントを緊張下でＳＤＳ水溶液により処理後、セルロースフイラメントとして収束することにより、本発明のバクテリアセルロースフイラメントを得ることができる。
【００１５】
次に、本発明のバクテリアセルロースフイラメントの具体的製造方法をその培養装置の概要と共に説明する。
【００１６】
本発明に使用する静置培養装置を図１に示した通りであるが、その主要部は、培養液供給槽(6) 、静置培養容器(8) 、ＳＤＳ水溶液槽(3) 、及び巻き取りロール(1) より構成されるが、これらの装置は雑菌混入防止のためフイルターを有する無菌チャンバー(4) 中に収納される。
【００１７】
酢酸菌等によるバクテリアセルロースの培養に用いる静置培養容器としては、幅10〜20cm、長さ40cm、深さ 7mm程度のステンレス製あるいはプラスチック製の長方形状の平板状静置培養容器(8) を用いることができる。
【００１８】
なお、平板状静置培養容器(8) は、フイラメント収束方向に対して平行に設けられた複数の培養液仕切板(10)を有している。
【００１９】
培養液仕切板(10)の間隔は、目的とするバクテリアセルロースフイラメントの太さにより、適宜、決定する。
【００２０】
また、培養容器の一端の上部には、培養液供給チューブ(11)を介して培養液供給槽(6) が設けられ、他の一端にはピックアップロール(5) 、ＳＤＳ水溶液通過ロール(2) を有するＳＤＳ水溶液槽(3) 及び毎時間 1〜15mmの速度で収束可能なワインダーが付属した巻き取りロール(1) が設けられている。
【００２１】
培養液(7) は、静置培養容器の上部に設けられた培養液供給槽(6) から培養容器(8) における培養液量が常時3 〜4mm 程度の深さとなるように連続的に添加しつつ静置培養を行い、複数の培養液仕切り板に分割された各培養液の上層にバクテリアセルロースを集積させる。
【００２２】
ここで、平板状の培養容器(8) のフイラメント収束方向に対して平行に設けられた培養液仕切板(10)は、培養液上層に生成したゲル状バクテリアセルロース薄層をフイラメント状に収束することにより、分離回収するためのバクテリアセルロースフイラメントの太さ調節のためのものである。
【００２３】
次いで、培養液上層に集積した複数のゲル状バクテリアセルロース薄層(9) をピックアップロール(5) 及びＳＤＳ水溶液通過ロール(2) を介して巻き取りロール(1) によりフイラメントとして収束する。
【００２４】
その際、ゲル状バクテリアセルロース薄層のピックアップロール(5) による収束速度としては、当初は毎時間16mm程度の速度で、次いで毎時間3 〜5mm の速度で成長速度に同調させることが重要である。
【００２５】
なお、ＳＤＳ水溶液槽(3) は、分離回収されたバクテリアセルロース中のタンパク質の変性、バクテリアの殺菌及び添加した培養物除去を行うためのものであり、通常、２％ＳＤＳ水溶液が用いられる。
【００２６】
通常、バクテリアセルロースは、二次元的に面状にネット状に形成され配向性は期待できないが、適度の緊張下で培養することにより、ある程度の配向性及び引張強度に優れたバクテリアセルロースフイラメントを得ることができる。
【００２７】
本発明において、配向性のある引張強度の優れたバクテリアセルロースフィラメントが得られる理由は、走査型電子顕微鏡写真による観察結果より明らかであるが、培養液から培養しながら適度の緊張下で培養液上層に生成したセルロース層を連続的に巻き取ることにより、分子配向性及び引張強度の優れたフィラメントが得られるものと考えられる。
【００２８】
本発明に用いた上記平板状培養容器においては、分離回収されたバクテリアセルロースフィラメントの平均太さが約100 デニールであったので、バクテリアセルロースを収束し、太さ10デニールのフィラメントとして分離回収するためには、平板状培養容器における培養液仕切板(10)の間隔は、培養液を少なくとも約10mm幅程度に分割する必要がある。
【００２９】
以上のごとく、本願発明においては培養液が、フイラメント収束方向に対して平行に設けられた複数の培養液仕切板により分割され、分割された各培養液上層に生成したゲル状バクテリアセルロース薄層を集めてウエット状態において連続的に巻き取りロールにより収束することにより、酢酸菌等の培養生成物をフイラメントとして、直接、分離回収することができる。
【００３０】
なお、得られたバクテリアセルロースフィラメントは、常法により精製処理、伸延処理、緊張乾燥を行うことによりバクテリアセルロース繊維とすることができる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００３２】
【実施例】
１．菌体の培養液組成と培養
ヘストリンーシュラムの改良培地（グルコース2.0 ％，ペプトン0.5 ％，イースト抽出物0.5 ％，リン酸２ナトリウム塩0.15％，クエン酸0.27％，カルボキシメチルセルロース0.2 〜2.0 重量％からなる培地）を用いて、温度28℃でアセトバクター・キシリナム（菌体番号：ATCC10245)を、上記した本発明の平板状静地培養容器に植菌した。
【００３３】
静地培養容器としては、培養液量として150ml 〜300ml の範囲の長方形状の培養装置（長さ38cm、幅20cmの大型培養容器、及び長さ38cm、幅10cmの小型培養容器）を使用し、常時培養液量の深さが３〜４mmとなるように培養液供給槽より培養液を供給するとともに連続培養のための空気を期間中（２週間）は無菌的に補給し連続的に培養を行った。
【００３４】
なお、使用した培地量は、大型培養容器では最初300ml 、途中滴下により最終375ml 、小型培養容器では最初150ml 、途中滴下みより最終200ml であった。
【００３５】
２．生成したバクテリアセルロースの分離回収
各培養液上層に生成した薄いゲル状のバクテリアセルロース層の巻き取り速度としては、最初はゆっくりとした速度（16mm/1時間）で巻き取りロールにより収束を開始し、その後、成長速度に合わせてに安定した早い速度（4mm/1 時間）で巻き取りロールにより収束した。
【００３６】
次いで、タンパク質の変性、バクテリアの殺菌及び添加した培養物の除去のために２％( 重量/ 容量) のＳＤＳ水溶液中を、細いゲル状のバクテリアセルロースフイラメントを通過させて巻き取りロールにより収束した。
【００３７】
３．分離回収したバクテリアセルロースフイラメントの精製
以上のようにして巻き取りロールにより収束されたバクテリアセルロースフイラメントは、人力により延伸処理し２時間煮沸後、さらに４％苛性ソーダ水溶液中で1.5 時間再び煮沸後、アルカリ除去のために蒸留水にて十分洗浄を行うか（試料１〜５）、又は、10(v/v) ％エチレングリコール水溶液にて十分洗浄を行った（試料６〜８）。また蒸留水により十分洗浄を行った試料は、さらに常温下で10％エチレングリコール水溶液による処理を行った（試料９〜１２）。
【００３８】
なお、いずれの試料も上記処理後、室温緊張下で乾燥を行ないセルロースフイラメント繊維を得た。
【００３９】
以上の実施例により生成したバクテリアセルロースの繊維収量（２日の誘導期を加えた６日後の収量）は、大型培養容容器（長さ38cm、幅20cm）では 7.5ｇ、小型培養容容器（長さ38cm、幅10cm）では 3.2ｇであった。
【００４０】
また、２日の誘導期を加えた１４日間精置培養を行った場合は、大型培養容器では同様に 9.0ｇ（培地量は300ml で開始し最終500ml ）、小型培養容器では同様に 5.1ｇ（培地量は150ml で培養を開始し最終300ml ）のバクテリアセルロースの繊維収量であった。
【００４１】
従来の精置培養法においては、培地容量が 500mlの場合でもバクテリアセルロースの繊維収量は 0.8〜1.0g程度に過ぎないので、本発明の方法による場合はかなり高いバクテリアセルロースの繊維収量ということができる。
【００４２】
４．バクテリアセルロースフィラメントの性状
本発明の方法により得られたバクテリアセルロースフイラメントの性状を表１に示した。表１から明らかなように、本発明のバクテリアセルロースフイラメントから得られた繊維は、通常洗浄試料（試料１〜５）における平均引張強度は2.55g/デニール、10％エチレングリコール水溶液による洗浄試料（試料６〜８）では 1.50g/ デニール、水洗後10％エチレングリコール水溶液処理試料では 1.48g/ デニールであった。なお、エチレングリコール処理試料では、得られたフイラメントのデニール値が水洗試料に対して約２倍に増加しているにも拘わらず、セルロースマトリックス中における残存エチレングリコールによりフイラメント中の分子配列は、若干乱れていることが推測された。
【００４３】
また、フイラメントのヤング率も、平均引張強度と同様の傾向を示した。
【００４４】
【表１】
0003803443.tif 000002
【００４５】
本発明におけるバクテリアセルロース繊維の引張強度は、レーヨン繊維及びアセテート繊維の同様の試験方法における引張強度が、それぞれ1.7 〜5.2g/ デニール及び1.2 〜1.4g/ デニール程度であることから、アセテート繊維の引張強度よりは優れ、レーヨン繊維の引張強度と同等であった。
【００４６】
なお、上記表１における引張強度測定における引張試験は、インストロン試験機（東洋測容器株式会社製ＵＴＭ−１）を用い、初期荷重： 2.5ｇ、引張速度： 2mm/min、試験長：25mmの条件下で、含水率３％に調整した試験片を用いて行った。
【００４７】
【発明の効果】
本発明の方法では、従来、フイルム状又は懸濁液状としてのみ分離回収されていた微生物の生産するバクテリアセルースを、バクテリアセルロースフイラメントとして分離回収すること初めて可能となった。
【００４８】
しかも、本発明の方法により得られたバクテリアセルロースフイラメントは、適度の緊張下で培養されるため、優れた分子配向性及び引張強度を有するとことから、さらに新たな機能の付与が可能できることも大きな特徴である。
【００４９】
また、本発明はセルロース源を含む各種の食品廃棄物から機能性セルロースフィラメントをバイオ的手法で直接に培養育成に合わせて連続的に再構築するために応用可能と考えられることから、その工業的意義は極めて大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】バクテリアセルロースフイラメントの製造に用いる培養装置を説明する模式図である。
【符号の説明】
１．巻き取りロール
２．ＳＤＳ水溶液通過ロール
３．ＳＤＳ水溶液槽
４．無菌チャンバー
５．ピックアップロール
６．培養液供給槽
７．培養液
８．平板状培養容器
９．ピックアップされているバクテリアセルロース
10．培養液仕切板
11．培養液供給チューブ
【図１】
0003803443.tif 000003