(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖DNAに特異性でありそして９４℃で２分後に不可逆的に不活性化される、Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓから誘導されたネイティブ酵素である熱不安定性のＤＮアーゼを使用することを特徴とする、増幅反応における核酸混入を除去する方法。
【請求項２】
二本鎖DNAに実質的に特異性でありそして９４℃で２分後に不可逆的に不活性化される、Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓから誘導されたネイティブ酵素である熱不安定性のＤＮアーゼの、増幅反応混合物における核酸混入の除去への使用。
【請求項３】
上記の核酸混入が二本鎖ＤＮＡである、請求項１又は２に記載の方法又は使用。
【請求項４】
上記増幅反応混合物が熱不安定性のＤＮアーゼと、該混合物中のあらゆる二本鎖ＤＮＡを消化させる条件下で接触させ、該反応混合物を加熱して該ＤＮアーゼを不活性化し、そしてその後、該混合物を、増幅しようとする標的核酸と接触させることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法又は使用。
【請求項５】
核酸増幅反応におけるキャリーオーバーによる偽の正反応結果を防止又は減少させる方法であって、二本鎖DNAに特異性でありそして９４℃で２分後に不可逆的に不活性化される、Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓから誘導されたネイティブ酵素である熱不安定性のＤＮアーゼを、増幅反応混合物中に存在するキャリーオーバーされた非標的二本鎖ＤＮＡを分解するのに使用することを特徴とする、上記の方法。
【請求項６】
反応混合物５０μｌ当たり約０．１単位の熱不安定性ＤＮアーゼを使用する、請求項３又は４に記載の方法又は使用。
【請求項７】
上記の増幅反応が複製連鎖反応（ＰＣＲ）である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法又は使用。
【請求項８】
上記の核酸サンプルが、ＤＮアーゼの不活性化前に反応混合物中に存在する、請求項２又は３に記載の方法又は使用。
【請求項９】
二本鎖DNAに特異性でありそして９４℃で２分後に不可逆的に不活性化される、Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓから誘導されたネイティブ酵素である熱不安定性のＤＮアーゼ。
【請求項１０】
ＤＮアーゼを含むＰａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓからの抽出物を得、引き続き該ＤＮアーゼを分離することを特徴とする、請求項９に記載のＤＮアーゼの単離および精製方法。
【請求項１１】
上記抽出物源が小えび加工水である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
標的核酸のイン  ビトロ増幅方法において、反応混合物又はその個々の成分を、実際の増幅反応の開始前に、二本鎖DNAに特異性でありそして９４℃で２分後に不可逆的に不活性化される、Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓから誘導されたネイティブ酵素である熱不安定性ＤＮアーゼで処理する段階を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１３】
二本鎖DNAに特異性でありそして９４℃で２分後に不可逆的に不活性化される、Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓから誘導されたネイティブ酵素である熱不安定性ＤＮアーゼ、および任意に、ヌクレオチド三リン酸、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼおよび核酸増幅反応を実施するのに必要な緩衝液を含む、上記請求項記載の方法のいずれか一つを実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸の増幅反応における偽の正（ポジティブ）の結果を防止する方法、特にＤＮアーゼを使用した防止方法に関する。本発明はまた、かかる方法に使用するのに適した熱不安定性（ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ）ＤＮアーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
複製連鎖反応（ＰＣＲ’ｓ）のような核酸増幅技術は生体技術に利用可能な最も強力な手段の一つであり、少量の核酸しか含んでいないサンプルから標的配列の多くのコピー（複製物）を調製することができる。ＰＣＲの場合、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、標的配列および遊離のヌクレオチドを含む反応混合物に添加する。ＤＮＡポリメラーゼの存在下での熱的環化は、プライマーの間に配列の増幅を生じる結果となる。ＰＣＲ過程により生じた増幅フラグメントが、ＰＣＲ環の鋳型として作用する能力を有するため、かなりの量の標的配列が急速に生成する。標的配列の単一のコピーでさえも、例えば標識したプルーブとのハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）又は３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅セグメントへの汚染（混入）により、検出するのに充分な核酸を生じる。
【０００３】
リガーゼ連鎖反応としても知られるリガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）は、ＰＣＲと同様に、反復サイクルと交番温度とを使用して、標的配列の多くのコピーを指数的に増加させる。この方法において、ＤＮＡリガーゼは、標的ＤＮＡ鎖の一方の隣接領域に相補的な二つのオリゴヌクレオチドを結合する触媒作用をする。他方の鎖に相補的な他方の二つのオリゴヌクレオチドもまた連結することができる。変性の後、元の鋳型鎖および二つの連結された対は、さらなるハイブリダイゼーションおよび連結のための鋳型として作用することができる。
【０００４】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）鋳型が、相補的な一本鎖ＤＮＡに逆転写される増幅方法であり、この相補的な一本鎖ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を形成するのに使用され、次にこのｄｓＤＮＡは引き続き通常の方法でＤＮＡ  ＰＣＲ生産物として増幅される。いくつかの酵素は、第１のＤＮＡ鎖を生成しそして第２の鎖を合成して、ｄｓＤＮＡを形成することができ、そして他の酵素はこの二ステップの丁度一つだけに特異的である。
【０００５】
微量の標的配列を増幅するためのこれらの技術の能力は、試薬、ピペット装置、実験室の表面、手袋又はエーロゾル化における前の増幅反応から持ち越される（キャリーオーバーされる）標的配列の混入（汚染）に対して非常に感じ易くする。エーロゾルは、溶液を流す時のような溶液の撹乱により、又は容器の表面上の少量の材料、例えばプラスチック管のキャップの内側表面上の残渣を撹乱しても、該管を開けた時に生じ得る。サンプルの核酸が医学的診断又は裁判上の理由で検査される場合、標的配列を含み得る核酸の反応混合物への偶然の導入（キャリーオーバーとして知られている）により引き起こされる偽の正の結果の影響は、広範囲にわたる。
【０００６】
キャリーオーバーの影響を防止又は制限するための多くの技術が開発された。これらには、ネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー、即ち、ＰＣＲを開始するのに使用される二つのプライマーのアニーリング境界の内側で標的配列にアニールするプライマー、が含まれる（Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ外。Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ、第ＬＩ巻、２６３−２７３頁、１９８６年）。ネスト化プライマーの短いＰＣＲ増幅生産物は出発プライマーとアニールすることができないので、キャリーオーバーされる（持ち越される）のがこの生産物であれば、出発プライマーの使用はこのキャリーオーバーを増幅しないであろう。しかしながら、このキャリーオーバーは取り除かれてなく、そして同じネスト化プライマーが引き続くＰＣＲに使用されるならば、ネスト化プライマーの以前に増幅された生産物は増幅されるであろう。
【０００７】
最近、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）の代わりにヌクレオチドデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を、増幅された核酸配列に導入することを含む方法が開発された。デオキシウリジン（ｄＵ）は通常、天然のＤＮＡに見いだされないので、このヌクレオチドは新たな標的配列から前に生産されたアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）から識別される。さらなる増幅反応を開始する前に、増幅反応混合物は、酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を用いて処理することができる。該酵素はウラシル塩基を除去して糖−ホスホジエステル（リン酸ジエステル）骨格を残し、一本鎖（ｓｓ）および二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ中のアバシック（ａｂａｓｉｃ）部位を完全に生成する（ＵＳ−Ａ−５，４１８，１４９）。増幅反応混合物の温度を上昇させてＤＮＡをアバシック部位で引き裂くと、キャリーオーバーを分解する結果となる。増幅生産物中でのｄＵＴＰの導入は引き続く該生産物の分析、例えば制限酵素開裂による分析、を妨害し得るので、この方法も問題がないわけでない。また、ＵＤＧは高温で不可逆的に不活性化されない。増幅反応に用いられる温度ステップは５４℃より高くしそして反応容器は高温に保持するか凍結直前に保持して、ウラシルをも含むであろう新たに生じる増幅物が分解するのを防止しなければならない。
【０００８】
個々の反応混合物を、標的ＤＮＡおよびＴａｇＤＮＡポリメラーゼの添加前に、増幅プライマーの対を内部で切断するＤＮアーゼＩ又は制限エンドヌクレアーゼで処理することも示唆された（Ｆｕｒｒｅｒ外、Ｎａｔｕｒｅ、３４６巻、３２４頁、１９９０年）。この方法は３０分の脱汚染時間を必要とし、ＤＮアーゼＩ又は制限エンドヌクレアーゼを脱汚染の後に不活性化するために、反応混合物を煮沸する。この煮沸工程のために、脱汚染の後にＴａｇ  ＤＮＡポリメラーゼを添加することが必要であり、これは予備増幅混合物にキャリーオーバーを導入するという別の危険を呈する。１μＭのプライマー濃度がこの方法で用いられる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、核酸増幅反応におけるキャリーオーバーによる偽の正の反応結果を簡単に且つ効率的に防止すことができる方法がまだ要請される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
新しいＤＮアーゼ、即ちＤＮＡ分解酵素、が単離されそして精製された。この新しいＤＮアーゼは本発明者等によって発見され、キャリーオーバーの除去又は低減に使用するのに適した特性を示す。特に、該ＤＮアーゼは、高温で不可逆的に不活性化されて、熱的に不安定である。全てのＤＮアーゼと同じように、本発明の熱不安定性のＤＮアーゼは、糖リン酸核酸骨格のホスホジエステル結合を裂くことによりｄｓＤＮＡを消化（ｄｉｇｅｓｔ）する。
【００１１】
従って本発明によって、熱不安定性のＤＮアーゼを使用することを特徴とする、増幅反応における核酸汚染（混入）を除去する方法が提供される。
【００１２】
このように、熱不安定性ＤＮアーゼは、増幅反応混合物に存在する二本鎖の非標的ＤＮＡを分解するのに使用される。これにより、非特異的増幅が減少又は回避され得る。
【００１３】
特に上記方法は、増幅反応混合物を熱不安定性のＤＮアーゼと、該混合物中のあらゆる二本鎖ＤＮＡを消化させる条件下で接触させ；該反応混合物を加熱して該ＤＮアーゼを不活性化し、その後、該混合物を、増幅しようとする上記標的核酸と接触させることを含む。標的核酸（即ち、増幅用の鋳型）は単に該混合物に、又は取り出された増幅反応の残部から該鋳型を分離するバリヤーに、添加すればよい。
【００１４】
あるいは、本発明のこの側面は、熱不安定性ＤＮアーゼの、増幅反応混合物中の核酸汚染を除くための使用を提供する。
【００１５】
上記のように、本発明は、キャリーオーバーを防止又は制限するのに特に有用であり、そして特にキャリーオーバーによる偽の正反応を防止又は減少させるのに有用である。
【００１６】
本発明の別の側面において、核酸増幅反応におけるキャリーオーバーによる偽の正反応を防止又は減少させる方法が提供され、該方法は、熱不安定性のＤＮアーゼを、増幅反応混合物中に存在するキャリーオーバーされた非標的二本鎖ＤＮＡを分解するのに使用することを特徴とする。
【００１７】
“増幅反応”の用語は、核酸の標的配列のコピー（複製物）の数を増加させるためのあらゆるイン  ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）手段を云う。好ましくは該方法は、高温環化を含めた“熱的環化”を含むであろう。該方法はＰＣＲおよびそれへの修飾、ＬＡＲ又はＬＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを含むが、それらに限定されない。該方法は、標的配列のコピーの数を直線的に又は指数的に増加させ得る。  標的核酸は、選択した増幅方法に依存して、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。例えば、ＰＣＲについては、標的ＲＮＡをまず、逆転写酵素（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してＤＮＡに転写し得る。
【００１８】
“増幅反応混合物”の用語は、標的核酸を増幅するのに使用されるいろいろな試薬を含むあらゆる溶液、一般には水性溶液、を云う。これらには、酵素、水性緩衝液（バッファ）、塩およびヌクレオシド三リン酸が含まれる。該用語は、首尾よく増幅反応を実施するのに必要な全ての成分を含む混合物、および不完全であり、それゆえに必要な成分の幾つかだけしか含まない混合物を云う。
【００１９】
“ＤＮアーゼ”の用語は、ＤＮＡ骨格中のホスホジエステル結合を加水分解する酵素を云い、特定のヌクレオチド配列ではない。
【００２０】
“核酸汚染の除去”とは、核酸汚染（又は混入）（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）の防止および低減の両方を含むことを意図する。
【００２１】
“キャリーオーバー”の用語は、偶然に又は意図的でなく反応混合物に導入されたあらゆる核酸、特に前の増幅反応から持ち越された標的配列、を記述するのに使用される。
【００２２】
“偽の正反応”の用語は、検査中の核酸サンプルが標的配列を含むことを示すように見える結果を示すが、ここで増幅された生産物がキャリーオーバーから誘導されたものである結果を云う。明確には、本発明が提供する偽の正反応の低減は、裁判上および診断の分野で特に有益である。本発明の方法は、核酸増幅の特異性を増大させることができる。
【００２３】
“熱不安定性のＤＮアーゼ”の用語は、増幅反応に適した高温で少なくとも実質的に不可逆的に不活性化されるＤＮアーゼを示す。従って、該ＤＮアーゼは９４℃で５分後に、好ましくは９４℃で２分後に、効果的に実質的に不可逆的に不活性化される。
【００２４】
“実質的に不活性化される”とは、加熱により、酵素が少なくとも９５％、好ましくは９８％、不活性化されることを意味する。好ましくは、酵素は３分の加熱により１００％不活性化される。反応混合物の温度が室温に戻っても、ＤＮアーゼはその活性を回復せず、実質的に残留活性がない。詳しくは、活性が５％未満、好ましくは２％未満であり、最も好ましくは検出可能なＤＮアーゼ活性が残っていない。かかる熱不安定性のＤＮアーゼ酵素自体は、本発明の別の側面を構成する。
【００２５】
本発明のこの側面は、二本鎖ＤＮＡに実質的に特異性でありそして９４℃で５分間の加熱により実質的に不可逆的に不活性化される熱的不安定性のＤＮアーゼ酵素を提供する。
【００２６】
本発明による熱不安定性のＤＮアーゼは、高温ＤＮＡポリメラーゼが活性でない温度（例えば室温）で活性であるので、低温に適すると考えられる。線状二本鎖ＤＮＡおよび超螺旋状（スーパーコイルド）環状ＤＮＡの両者は本発明による酵素の基質である。該酵素は、増幅プライマーのような一本鎖ＤＮＡに対して僅かしか又は全く活性がない。詳しくは、酵素（０．１Ｕ／μｌ（酵素調製物））を一本鎖生産物と室温で３０分間培養した後、一本鎖ＤＮＡに対する検出可能な活性は観察されなかった。
【００２７】
上記の酵素は、増幅範囲における通常の環化に使用されるような高温で実質的に不可逆的に不活性化される。これらの特性により、プライマー、ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液を含む反応混合物に上記ＤＮアーゼを含ませることができ、そして室温で全てのキャリーオーバー物質を急速に分解することができる。有利なことには、本発明による熱不安定性のＤＮアーゼは全増幅反応混合物中で充分に機能性であり、標準的なイン  ビトロ増幅反応体および条件と両立性である。好ましくは、該ＤＮアーゼは室温で５分以内、最も好ましくは２．５分以内で全てのキャリーオーバーを分解することができる。
【００２８】
反応混合物の温度を次に短時間、有利には９４℃に１−２分間上昇させることができ、それにより熱不安定性のＤＮアーゼを不可逆的に不活性化させる。増幅しそして分析すべき核酸サンプル（即ち標的核酸）を次に加えそして増幅を開始させることができる。反応混合物の温度が熱環化中におよび増幅後に下がっても、標的配列のコピー（複製物）は分解しないであろう。何故なら、ＤＮアーゼは不可逆的に不活性化されたからである。ＤＮＡポリメラーゼを反応混合物に含ませることができ、一方脱汚染および引き続き不活性化段階を行うことができることとは、本発明の特別の利点である。これは、ＤＮアーゼを不活性化させる条件がかなり穏やかな条件（例えば９４℃で１−２分）である結果であり、従ってさらに可能な汚染源が除去される。
【００２９】
上述した特性を有するあらゆる熱的不安定性ＤＮアーゼは本発明による方法に使用するのに適当であろうことは明瞭であるが、小えび（ｓｈｒｉｍｐ）（Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）から誘導された特定のＤＮアーゼは本発明の別の側面を形成し、その単離方法は実施例１に記載される。
【００３０】
さらに本発明の範囲に含まれるのは、ネイティブ（生の）熱不安定性ＤＮアーゼと機能的に同等であるが遺伝子操作又は化学的操作によって修飾された酵素変形体である。活性フラグメントもまた使用できる。例えば、Ｐａｎｄａｌｕｓｂｏｒｅａｌｉｓ酵素の配列修飾は本発明内に含まれる。ポリペプチド又はヌクレオチド配列の修飾の技術は当業界でよく知られそして標準的であり、そして例えばかかる修飾された変形体を、アミノ酸置換、付加又は除去により得ることが知られている。
【００３１】
本願で記載された脱汚染法にＰａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓからのＤＮアーゼを使用することは、本発明の特に好ましい態様を表す。
【００３２】
脱汚染法に使用するのに適した酵素は、意図する増幅を著しく阻止したり、目的の増幅生産物の性質に、例えばその後の分析を妨害することにより、影響を及ぼすものであってはならない。本発明の特定の熱不安定性ＤＮアーゼは意図する増幅を阻止しない。何故なら、該ＤＮアーゼは増幅反応における高温で不活性化されるか、又は増幅の開始前に別個の工程で不活性化することができるからである。また、該ＤＮアーゼは修飾ヌクレオチドを必要としないので、増幅生産物は慣用の増幅生産物と同じであり、同じようにして分析できる。言い換えると、本発明の方法では、ＵＤＧ脱汚染方法と違って、脱汚染酵素は目的の増幅生産物の性質に影響を及ぼさない。
【００３３】
（上記の）Ｆｕｒｒｅｒ外により記述された脱汚染システムと違って、本発明による方法は、低濃度のプライマー、典型的には０．０５−０．２μＭ、の使用が可能であるというさらなる利点がある。
【００３４】
上記酵素は反応混合物からのキャリーオーバーのかなりの量を除去できなければならず、通常ｆｇ−又はｐｇ−レベルの量、しかし好ましくは１ｎｇまでの量を除去できなければならない。本発明のＤＮアーゼの１単位（Ｕ）は、５０７ｂｐ  ｄｓＤＮＡを１ｎｇ、即ちＴａｇポリメラーゼの１ｘＰＣＲ緩衝液中で室温にて２．５分間に２×１０９ 個の分子を除去できる（例えば、実施例に記載したクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）アッセイによる）。このように、本発明による方法で使用される酵素は、理想的には酵素１単位当たり少なくとも１×１０９ 個の分子、好ましくは酵素１単位当たり少なくとも２×１０９ 個の分子の脱汚染効率を有し得る。キャリーオーバーの除去は核酸の全体的分解である必要はない。（上記の）Ｆｕｒｒｅｒ外により記述された脱汚染システムは、２×１０３ 分子／Ｕの脱汚染効率を有するにすぎない。実際のＰＣＲ反応混合物中での両方の脱汚染システムの効率は、上記の最適値よりも幾分低いようである。
【００３５】
１０２ 個の標的分子は首尾よくＰＣＲ増幅を行うのに充分である。例えば実施例２を参照されたい。そして２×１０９ 個の分子が本発明のＤＮアーゼによって増幅が防止された。従って、本発明による方法に使用される酵素は、少なくとも２×１０７ のファクターで増幅される可能性があるキャリーオーバーの量を減少させ得る。
【００３６】
Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓからの熱不安定性ＤＮアーゼの単離および精製する方法は、本発明の別の側面を表す。この側面で、本発明は、ＤＮアーゼを含むＰａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓからの抽出物を得、引き続きＤＮアーゼを該抽出物から分離することを含む上記の方法を提供する。
【００３７】
ＤＮアーゼは抽出物から、当業界で知られそして文献で広く記載された、タンパク質の精製技術、又はそれらの組み合わせを用いて分離又は単離し得る。かかる技術には、例えば、沈殿、限外濾過、透析、いろいろなクロマトグラフィー技術、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＥＰＬＣ、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離等が含まれる。
【００３８】
同様にしてＰａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓの抽出物は、当業界で良く知られた技術、例えば均質化、凍結−解凍等を用いて調製できる。Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓのＤＮアーゼは、小えびの消化腺（肝膵臓）に見られ、これは所望により分離／抽出して、精製用の酵素源として使用し得る。低温環境で生存する他の類も適当な熱不安定性ＤＮアーゼの源となり得る。
【００３９】
イオン交換クロマトグラフィーおよびレッドーセファロースカラム（ファーマシア  ビオテク、スエーデン）のクロマトグラフィーの組み合わせに基づく精製プロトコルが、該酵素を容易に単離するのに使用し得ることが見いだされた。
【００４０】
更に詳しくは、抽出物はイオン交換クロマトグラフィーに付しそしてタンパク質はＮａＣｌ勾配で溶出し得る。ＤＮアーゼを含むフラクションを透析し、そして次にＮａＣｌで最終的に溶出する前にアフィニティカラムに適用することができる。
【００４１】
Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓＤＮアーゼの特に便利な源は、いわゆる“小えび加工水”である。小えび加工水は、小えびの殻をはがしそして食するための大規模な小えびの加工の“副生物”として生じる。小えび捕獲物をまず冷凍し、次に引き続く加工のために低温の新たな水を加えて解凍する。冷凍小えびが解凍されたとき冷凍した消化腺は破裂し、そしてその酵素含有物を解凍工程中に使用した水に放出する。この解凍水は便利に再循環できそしてその同じ水を多量の小えびの解凍に使用できるので、放出された酵素を蓄積しそして濃縮することができることになる。従って、この小えび加工水は熱不安定性ＤＮアーゼおよび放出された酵素を含み、便利な抽出物を与え、それは精製してＤＮアーゼを与えることができる。
【００４２】
理想的には、反応容器は増幅の開始前にできるだけ短時間しか開けないようにして、汚染の機会を少なくしなければならない。増幅すべき核酸サンプルが脱汚染工程中に反応容器内に存在し、従ってＤＮアーゼの不活性化の後に添加する必要がなければ、非常に有利であろう。慣例的な増幅プロトコルを下記のように変更すること、即ち核酸サンプルをＤＮアーゼの不活性化の後に添加する必要がないことは、本発明の別の側面を構成する。例えば二本鎖ＤＮＡサンプルを、ＤＮアーゼ含有反応混合物に添加する前に、例えば煮沸して一本鎖にし、従ってＤＮアーゼで分解されないようにすることにより、変性することができる。一本鎖ＤＮＡサンプルは反応混合物に添加する前に、氷の上に保存するのが好ましい。
【００４３】
別の態様において、標的核酸、例えば二本鎖ＤＮＡサンプルは、主反応混合物から、ＤＮアーゼが不活性化する高温で融解するワックスのような材料（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって分離される。一旦ワックス部分が融解すると、ＤＮＡサンプルは反応混合物の残余と接触するようになり、標的配列の増幅が始まる。かかる方法は“ホットースタート（熱開始）”として知られ、多くの“ホットースタート”工程が当業界で知られている。
【００４４】
本発明はまた、少なくとも本発明による熱不安定性ＤＮアーゼを含むキットを提供する。該キットは核酸増幅反応を実施するのに必要な試薬、緩衝液、酵素等の全てを含み得る。更に詳しくは、該キットはヌクレオチド三リン酸、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは熱安定性ポリメラーゼ、例えばＴａｇポリメラーゼ、又はＬＡＲの場合はＤＮＡリガーゼ、を含み得る。ＤＮアーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ又はＬＣＲリガーゼと一緒に一つの区画に与えることができる。
【００４５】
本発明はまた、標的核酸のイン  ビトロ増幅方法を提供し、該方法は、反応混合物又はその個々の成分を、実際の増幅反応の開始前に熱不安定性ＤＮアーゼで処理する段階を含むことを特徴とする。
【００４６】
かかる方法はＰＣＲを含むか、又はＰＣＲに基づくのが便利であろう。ＰＣＲ法は勿論、当業界において現在標準的であり、公知の又は標準的な試薬および技術を用いて実施し得る。
【００４７】
典型的ＰＣＲ反応プロトコルにおいて、脱汚染段階は単に、ＤＮアーゼを含む増幅反応混合物を室温で短時間、例えば１ないし１０分間、便利には２ないし５分間培養することを含む。この培養時間は厳密でなく、使用した正確なＤＮアーゼおよび量、および反応系のその他の成分によって変化し得る。温度は酵素が活性である温度、即ち不活性化温度より低い温度、であるが、室温が便利である。  かかる反応混合物は、上記の通り、鋳型、即ち増幅すべき標的核酸、のほかに、増幅反応に必要な全ての反応体を含み得る。
【００４８】
典型的な代表的ＰＣＲ増幅反応混合物は例えば下記を含み得る：
0003801865.tif 000002
上記の代表的例において、反応体（緩衝液、ｄＮＴＰｓ、プライマー、酵素およびＭｇＣｌ２ 溶液を含む）が５０−１００μｌに等しい限り、殺菌蒸留水容量および実験用鋳型容量のあらゆる組み合わせが使用できる。しかしながら、別の最終容量を好みにより使用して、例えば類似の又は他の所望の最終反応体濃度を達成してもよい。あらゆる便利な又は市販のＰＣＲ緩衝液を使用できる。適した１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液は１００ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、および５００ｍＭのＫＣｌであろう。ＰＣＲ緩衝液はペルキンーエルマーセタス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）から購買できる。
【００４９】
潜在的汚染のレベルに依存して、必要なＤＮアーゼの量は変わるであろう。短い培養時間で（室温で０−１０分）、５０μｌの反応混合物当たり０．１単位は一般に十分である。０．０５から０．２単位／５０μｌ（反応混合物）が適当であり、約０．１単位／５０μｌ（反応混合物）の活性、例えば０．０８から０．１２単位／５０μｌ（反応混合物）が好ましい。１単位／５０μｌ（反応混合物）の濃度で、いくらかのｓｓＤＮアーゼ活性が観察され、従って上記に掲げた活性が好ましく、特に汚染物が二本鎖核酸および標的一本鎖核酸である場合、好ましい。酵素の１単位はクニッツアッセイ（Ｋｕｎｉｔｚ  Ｍ．、１９５０年、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩ．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｙｍｕｓ  ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ．Ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３  ３６３−３７７頁）において、２６０ｎｍでの吸収が０．００１／分だけ増加する量として定義される。
実施例１
小エビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）ＮＡアーゼの単離
熱不安定性ＤＮアーゼを、小エビ漁業工業の副生物である小エビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）加工水から得る。捕獲物の殆どは漁船の船上で冷凍する。陸上の工場で加工する場合、冷凍ブロックを、温度を調整した新たな水（１５℃未満）を振りかけながらコンベヤー上を通過させることにより解凍する。小エビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）の冷凍消化腺は破裂し、そしていろいろな酵素を水中に放出する。この水を再循環させて、その同じ水を約１０−１２トン／日の小えびの解凍に使用できる；水中の酵素の濃度はその日中に増大するであろう。この加工水が小エビＤＮアーゼの源である。
【００５０】
小エビ加工水を４℃にて２０分間、１０，０００×ｇの遠心分離を２回行って透明にし、次いで公称分子量カットオフ膜１０ｋＤａを用いた超濃縮に付した。濃縮物を次に、５ｍＭのＭｇＣｌ２ を含むｐＨ８．０の０．０５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液に平衡させたＱ−セファロースイオン交換クロマトグラフィーカラムを通した。該カラムを０．３ＭのＮａＣｌで洗い、タンパク質を０．３−１．５ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。ＤＮアーゼ活性を有するフラクションを０．７−１．１ＭのＮａＣｌを用いて集めた。溜められたＤＮアーゼ活性を有するフラクションを、５ｍＭのＭｇＣｌ２ を含む０．０１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ８．０、で透析した。透析した材料にレッドーセファロースカラム（ファーマシア  ビオテク、スエーデン）を適用し、次いで０．３ＭのＮａＣｌで広範囲に洗浄した。最後に、結合されたＤＮアーゼを１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。
【００５１】
塩化ナトリウムを検定前にＤＮアーゼから除去した。ＤＮアーゼ活性を、クニッツの手順（Ｋｕｎｉｔｚ  Ｍ．、１９５０年、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩ．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｙｍｕｓ  ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ．Ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３３  ３６３−３７７頁）に従って検定する。５０μｌの酵素調製物を、５ｍＭのＭｇＣｌ２ を含むｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中の２００μｇの子牛胸腺ＤＮＡに加えて、最終容量を１ｍｌにする。混合物を３７℃で培養する。２０分の培養の後に、０．５ｍｌの氷冷１２％ＨＣｌＯ４ を加え、十分に混合し、そして氷上で２０分間放置する。チューブをエッペンドルフ遠心分離器でフルスピードで５分間遠心分離する。２６０ｎｍでの吸収を測定し、それからクニッツ単位を計算する。１Ｕ＝０．００１  ＯＤ２６０ 増加／分。
実施例２
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  ＧＣＡＴのＰＣＲ増幅
遺伝子：ＧＣＡＴ（グリセローホスフォリピドーコレステロールアセチルトランスフェラーゼ）、１１７６ｂｐ
遺伝子銀行加入番号Ｘ７０６８６
前進プライマーＧＣＡＴ−１：５’−ＴＴＧＧＧＧＴＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＧＡ−３’、遺伝子位置６５−８３と同じ
逆プライマーＧＣＡＴ−２：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＧＴＴＧＡ−３’、位置５５２−５７１と逆相補的
鋳型：Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａゲノムＤＮＡ
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実施例３
ＰＣＲ  ＤＮＡ生産物に対する小エビＤＮアーゼ活性
この実施例および次の実施例で使用される材料：
Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓからの小エビＤＮアーゼ（５０μｌの反応混合物当たり約０．１単位）、実施例１参照、
Ｔａｇ緩衝液およびＴａｇ−ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）１２３ｂｐＭＷマーカー（Ｇｉｂｃｏ）
ＧＣＡＴ１および２プライマーを使用して生成したＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａからのＧＣＡＴのＰＣＲ生産物、実施例２参照、
熱サイクル（２４００  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）。
【００５２】
３００ｎｇのＧＣＡＴの  ＰＣＲ−生産物（５０７ｂｐ）を小エビから濃縮し、部分的に精製したＤＮアーゼ２μｌと、２ｍＭのＭｇＣｌ２ 、１ｘＴａｇ−緩衝液中で混合して最終容量を５０μｌにした。サンプルを直ちに３７℃で熱サイクル機械に入れた。１５μｌのサンプルを２分、７分および１５分後に取り出し、１．３％アガロースゲル上に充填した。
【００５３】
濃縮し、部分的に精製した小エビＤＮアーゼ１μｌを、合計１５μｌの２ｍＭのＭｇＣｌ２ 、１ｘＴａｇ−緩衝液中で混合した。サンプルを９４℃に２分間付し、引き続き熱サイクル機械を用いて３７℃に移した。１５μｌのサンプルを１５分後に取り出し、１．３％アガロースゲル上に充填した。
【００５４】
サンプルを、ＵＶ−トランスイルミネータ上で写真をとる前に、ＥｔＢｒの存在下で１ｘＴＢＥ中で３０分間操作した。図１参照。図１で、
レーン：
１−Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  からのＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物
２−１２３ｂｐ  ＭＷマーカー
３−３７℃で２分間、ＤＮアーゼを用いて培養したＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物
４−３７℃で７分間、ＤＮアーゼを用いて培養したＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物
５−３７℃で１５分間、ＤＮアーゼを用いて培養したＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物
６−ＤＮアーゼの熱処理後、３７℃で１５分間ＤＮアーゼを用いて培養したＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物
ＤＮアーゼの特異性ＰＣＲ生産物（ＧＣＡＴ、５０７ｂｐが約１００ｎｇ）に対する活性をテストし、そして、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２ を含む１ｘＴａｇーポリメラーゼ検定緩衝液中で、即ち全ての実施例で使用した緩衝液系中で、３７℃で１５分後、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをかなり分解する能力を有することが示された。９４℃で２分間の予備培養はＤＮアーゼを不活性化することが示された。
実施例４
ＰＣＲ反応のキャリーオーバー生成物の脱汚染における熱不安定性小エビＤＮアーゼのテスト
Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａからのＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物
Ｔａｇーポリメラーゼ
濃縮し、部分的に精製した小エビからのＤＮアーゼ
プライマー（オリゴヌクレオチド  ＧＣＡＴ１および２）、ｄＮＴＰミックス、ＭｇＣｌ２ 、Ｔａｇ−緩衝液およびＴａｇ−ポリメラーゼ（これらの濃度は前と同じ）を、全容量２１８μｌにして混合し、そして６本のＰＣＲチューブに分配した。Ｈ２ Ｏを加えて、最終容量を１本のチューブ当たり５０μｌとした。１ｎｇのＧＣＡＴ  ＰＣＲ生成物をチューブ３、４および６に加えて、キャリーオーバーをまねた。２μｌのＤＮアーゼをチューブ２、４、５および６に加えた。これらのチューブを熱サイクル器に３７℃で１５分間入れた。熱サイクル器を下記のＰＣＲプログラムに従って活性化した；
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９４℃での初期の加熱段階の２分後に、１ｎｇのＧＣＡＴ  ＰＣＲ生成物鋳型をチューブ１、５および６に加えた。ＰＣＲサイクルの完了後に、各チューブからの１５μｌのサンプルを１．３％アガロースゲル（１ｘＴＢＥ）中で電気泳動に付し、そしてＥｔＢｒで染色した。図２参照。図２において、
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１ｎｇのＰＣＲ生成物およびＤＮアーゼを含む混合物のＰＣＲ反応は、ＤＮアーゼ処理が汚染（混入）したＰＣＲ生成物の増幅を阻止したことを示した。初期の加熱段階の２分後にＰＣＲ生成物を加えると、増幅を生じる結果となり、下記を例証する：ａ）ＤＮアーゼは一本鎖オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを分解しなかった；ｂ）ＤＮアーゼ処理はキャリーオーバー生成物の増幅を首尾よく阻止した；およびｃ）ＤＮアーゼ活性は、９４℃で２分間の加熱により十分に破壊されて、その後に添加されるＤＮＡ（１ｎｇのＰＣＲ生産物）の増幅を阻止しない。
実施例５
ＰＣＲキャリーオーバー対温度についての小エビＤＮアーゼ活性のテスト
１ｎｇのＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物を含むＰＣＲ反応混合物を前の実施例に記載したように設定し、４本のチューブに分配した。２μｌの精製ＤＮアーゼ（実施例３および４のＤＮアーゼを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、５ｍＭのＭｇＣｌ２ および１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡させたサイズ除外クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、更に精製したもの）を、チューブ２、３および４に加えた。これらのチューブを１２℃で（熱サイクル器）、２２℃（室温）および３７℃（水浴）でそれぞれ１５分間培養した。４本の全てのチューブを熱サイクル器のホットースタートに移し、そしてＰＣＲ反応を前のように実施した。最終ＰＣＲ反応物からの１０μｌのサンプルを１．３％アガロースゲル上で操作し、そして目に見えるようにした。図３参照。図３において：
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分解テストは、ＤＮアーゼが１２℃では活性でないこと、およびＤＮアーゼ活性は２２℃においての方が３７℃よりも高いことを示した。
実施例６
ＰＣＲキャリーオーバー対時間についての小エビＤＮアーゼ活性のテスト
６ｎｇのＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物を含むＰＣＲ反応混合物を設定し、６本のチューブに分配した。２μｌのＤＮアーゼを、チューブ２、３、４および５に加え、これらのチューブを２２℃で培養した。該チューブを熱サイクル器のホットースタートのために、２．５分、５分、７．５分、１０分および１５分後（それぞれチューブ２、３、４、５および６）に移した。ＰＣＲ反応を前の実施例のように実施した。各チューブからの１０μｌのＰＣＲ生産物サンプルをアガロースゲル電気泳動に付した。図４参照。図４において：
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機能的ＰＣＲ反応についての時間対活性テストは、２２℃で２．５分の処理が、ＤＮアーゼの存在下で培養した１ｎｇのＰＣＲ生産物の増幅を阻止するのに十分であることを示す。
実施例７
ＰＣＲ反応の開始中の小エビＤＮアーゼ不活性化のテスト
１ｎｇのＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物を含むＰＣＲ反応混合物を設定し、５本のチューブに分配した。２μｌの部分的に精製したＤＮアーゼを、４本のチューブ（チューブ２−５）のそれぞれに加え、該チューブを２２℃で５分間培養した。該チューブを熱サイクル器に移し、ＰＣＲサイクルプロフィールを開始させた。３本のチューブに、初期の加熱段階で温度が７０℃に達した時（チューブ３）、９４℃に達した時（チューブ４）、又は９４℃に達してから１分後（チューブ５）に、１ｎｇのＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物を加えた。ＰＣＲサイクルの完了後、１０μｌのサンプルをアガロースゲル上で分析した。図５参照。図５において：
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脱汚染テストは、ＤＮアーゼを含むＰＣＲミックスを、ＰＣＲ増幅を実質的に回避するために、鋳型ＤＮＡ（１ｎｇのＰＣＲ生産物）の添加前に９４℃に少なくとも１分間おかなければならないことを示した。
実施例８
ＰＣＲ反応におけるキャリーオーバーの脱汚染に対する、Ｍｇ２＋および小エビＤＮアーゼの酵素濃度の要件についてのテスト
８ｎｇのＧＣＡＴ  ＰＣＲ生産物を含む元になるＰＣＲミックスを８本のチューブ（それぞれ１００μｌ）に分配した。各チューブ中のＭｇ２＋を調整した（０ｍＭ；チューブ１および２、１ｍＭ；チューブ３、２ｍＭ；チューブ４、５および６、５ｍＭ；チューブ７および８）。２μｌの部分的に精製したＤＮアーゼを、チューブ（２、３、６および８）に加え、そして０．５μｌをチューブ４および５に加えた。これらのチューブを、熱サイクル器に入れる前に、室温（ほぼ２２℃）で５分間培養し、そしてＰＣＲサイクリング段階に付した。１０μｌのサンプルをアガロースゲル上で分析した。図６参照。図６において：
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１ｎｇのキャリーオーバーＰＣＲ生産物を含む１００μｌの最終溶液中の２μｌのＤＮアーゼの脱汚染活性に対して、１ｍＭのＭｇ２＋は５ｍＭのＭｇ２＋と同じように十分である。０．１μｌ又は０．５μｌのＤＮアーゼ（１０倍に希釈した酵素を１μｌおよび５μｌ）は活性が十分でない；これは不安定性によるであろう。
実施例９
ｓｓ−およびｄｓＤＮＡに対する熱不安定性小エビＤＮアーゼ活性
６００ｎｇのＰＣＲ生産物、２ｍＭのＭｇ２＋、および１ｘＴａｇ緩衝液からマスター（元になる）ミックスを作って最終容量を９０μｌにし、そして３本のチューブに分配した。チューブ２および３を６分間煮沸した。チューブ２を６０℃で５分間、そして次に２５℃で５分間置いた。チューブ３は煮沸後に直接氷の上に１０分間置いた。３本のチューブ全てから１０μｌを取り出し、氷上に保持した。チューブ２および３中の残りの２０μｌ（ほぼ２００ｎｇのＤＮＡ）に、２μｌの部分的に精製したＤＮアーゼを加え、該チューブを室温で３０分間培養し、その間、５分後に各サンプルから１０μｌを取り出した（それらは氷の上に保持した）。１０μｌのサンプルを氷の上に保持し、次にアガロースゲル上で分析した。図７参照。図７において：
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ＰＣＲ生産物のｓｓ−（熱変性）およびｄｓ−ＤＮＡを用いたテストは、ＤＮアーゼが使用した検定系−ＰＣＲ緩衝液条件−にてｄｓＤＮＡに優先的であること、そしてｓｓＤＮＡに対して活性があったとしても低いことを示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  熱不安定性ＤＮアーゼのＰＣＲ  ＤＮＡ生産物に対する活性を示すアガロースゲルの写真である。
【図２】  ＤＮアーゼがキャリーオーバー混入物（汚染）の増幅を阻止すること、およびＤＮアーゼの高温での不活性化を示す写真である。
【図３】  いろいろな温度でのＤＮアーゼ活性をアガロースゲルの写真である。
【図４】  ＤＮアーゼがＰＣＲ生産物キャリーオーバーを、引き続くＰＣＲで分解するのに必要な時間を示す写真である。
【図５】  ＤＮアーゼを不活性化するのに必要な温度および時間を示すアガロースゲルの写真である。
【図６】  キャリーオーバーの脱汚染に必要なＤＮアーゼの濃度および反応混合物中のＭｇ２＋への依存性を示す、アガロースゲルの写真である。
【図７】  ＤＮアーゼのｄｓＤＮＡ特異性を示す、アガロースゲルの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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