(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチンを含むリポソームにおいて、該リポソームの小胞壁を形成する脂質が、天然レシチン、合成レシチン、ケファリンおよびスフィンゴミエリンから成る群から選択される１または２以上のリン脂質であり、更に上記小胞壁を形成する脂質がステロールグリコシドを含有することを特徴とする、上記エリスロポエチンを含むリポソーム。
【請求項２】
上記ステロールグリコシドが、β−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラジカステロールおよびコレステロールから成る群から選択される１または２以上のステロールのモノグリコシドであることを特徴とする請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
上記リン脂質がジパルミトイルホスファチジルコリンである請求項１または２記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、エリスロポエチンを含むリポソームに関する。
【０００２】
【従来の技術】
エリスロポエチン（以下、Ｅｐｏと略称する）は、主として腎臓で、およびこれより少量が肝臓で産生される糖タンパクである。Ｅｐｏは約３０ＫＤの分子量を有する単鎖ポリペプチドであり、その分子量の約４０％は炭水化物である。Ｅｐｏの生理学的作用は、赤血球前駆細胞の増殖および分化を調整することである。最近では、遺伝子工学により大量生産され上市されており、貧血の治療に用いられている。
【０００３】
今日では、Ｅｐｏのヒトへの投与は、静脈および皮下注射に限定されている。リポソームの放出系を使用することにより、Ｅｐｏについての治療可能性、例えば非経口的および経口的投与、を拡げることができる。しかしながら、Ｅｐｏが溶液中で機械的応力、特に振盪および超音波処理に対して弱く、通常のリポソーム調製の条件に適合しないと考えられたため、これまで研究が行われてこなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題及びその解決手段】
本発明は、Ｅｐｏを高い封入効率で封入し、しかもＥｐｏの活性を保護するリポソームおよびその製法を提供することを目的とするものである。
【０００５】
本発明者らは、リポソームの製造に際して、リポソーム小胞壁の形成に用いるリン脂質にステロール類（以下ＳＡと略称する）および／またはそのグリコシド（以下ＳＡＧと略称する）を配合し、このリン脂質を用いる逆相蒸発法によってＥｐｏを封入することにより、所期の目的を達成することに成功した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明によって提供されるＥｐｏを含有するリポソームは、天然レシチン、合成レシチン、ケファリンおよびスフィンゴミエリン等のリン脂質を用いることによって製造できる。本発明では、特にジパルミトイルホスファチジルコリン（以下ＤＰＰＣと略称する）が好ましい。また、リン脂質にＳＡまたはＳＡＧを配合することによって、よりＥｐｏの活性が保持される。本発明で使用できるＳＡとしては、β−シトスデロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラジカステロールまたはコレステロール（Ｃｈ）を単独でまたは２つ以上の混合物で用いることが好ましい。また、ＳＡＧは上記ステロール類（ＳＡ）のグリコシド、特にモノグリコシドであることが好ましい。
上記のＳＡは次式で表される。
【０００７】
【化１】
0003850468.tif 000002
式中Ｒ＝ＣＨ3 （カンペステロール）；Ｒ＝Ｃ2 Ｈ5 （シトステロール）；Ｒ＝Ｃ2 Ｈ5 および△22（スチグマステロール）；Ｒ＝ＣＨ3 および△22（ブラジカステロール）；Ｒ＝Ｈ（コレステロール）である。
本発明におけるリン脂質とＳＡまたはＳＡＧとの好ましいモル配合比率は、７：１から７：４の範囲である。
【０００８】
本発明のＥｐｏ含有リポソームは、上記のリン脂質とＳＡおよび／またはＳＡＧとの混合物を使用し、逆相蒸発（以下ＲＥＶと略称する）法によってＥｐｏをリポソーム内に封入した。リポソームをラットのへ皮下投与または経口投与し、血中の循環性網状赤血球数を測定することによって、リポソーム内のＥｐｏの活性を評価し、また高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるリポソーム中のＥｐｏ濃度の測定値と比較した。
【０００９】
以下に、本発明を実験例および実施例により、さらに詳細に説明する。
【００１０】
【実施例】
（材料：以下の実施例において次の材料を使用した。）
リン脂質としてはＤＰＰＣはシグマ・ケミカル社製（米国）、大豆ステロール（ＳＳ）および大豆ステロールのグリコシド（ＳＧ）は龍角散製、コレステロール（Ｃｈ）はシグマ・ケミカル社製、Ｅｐｏは中外製薬製、カルセインは東京化成工業製を使用した。その他の化学物質はすべて試薬級のものを用いた。尚、ここで使用したＳＳおよびＳＧは、それぞれ、β−シトステロール（約４９．９％）、カンペステロール（約２９．１％）、スチグマステロール（約１３．８％）およびブラジカステロール（約７．２％）の混合物、およびそのモノグリコシド類の混合物であった。Ｃｈは実質上単一の成分からなる市販品であった。
【００１１】
実施例１
（１）ＳＳおよびＳＧ−リポソーム封入Ｅｐｏの製造
リポソームは逆相蒸発法に従って製造した。ＤＰＰＣ（１０５μモル）およびＳＳおよびＳＧ（３０μモル）（ＤＰＰＣ：ＳＳまたはＳＧ＝７：２、モル比）のクロロホルム溶液を５０ｍｌのナス形フラスコ中に入れ、そしてこの有機溶媒を室温でロータリーエバポレーターによって減圧除去した。脂質の薄膜をクロロホルム３ｍｌおよびイソプロピルエーテル３ｍｌ中に再溶解させた。得られる有機相に、１ｍｌのＥｐｏ溶液（１８０，０００ＩＵ／ｍｌ）および１ｍｌのリン酸生理食塩水緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／２．６ｍＭ  ＫＣｌ／６．４ｍＭＮａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ／１．４ｍＭ  ＫＨ2 ＰＯ4 ；ｐＨ７．３１；以下ＰＢＳと略す）を含む水相を添加した。この混合物を、水浴型超音波処理機（ホンダ・エレクトロニクス社製、Ｗ２２０Ｒ、２００Ｗ、４０ＫＨｚ）中で５０℃で、この混合物が均質なＷ／Ｏエマルジョンになるまで４分または１分間超音波処理した。次にこのエマルジョン中の有機溶媒をロータリーエバポレーター、アスピレーターを用いて減圧（４００ｍｍＨｇ）下で除去し、５０−５５℃で３０分間穏やかな窒素流（５００ｍｌ／分）でフラッシュした。残った水相をＰＢＳで２倍希釈し、約６０℃で０．４および０．２μｍの孔径のポリカーボネート膜〔ヌクレポア（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）社、米国〕を通して連続的に押出し調整した。リポソームのサイズ分布は、ナイコンプ３７０・サブミクロン・パーティクル・アナライザー（Ｎｉｃｏｍｐ  ３７０  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）〔パシフィック  サイエンティフィック（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国カリフォルニア州〕によって測定した。ＳＳおよびＳＧ−リポソームについて推定されたサイズは、サイズ分布において完全に均質であり、平均直径は各々１３４〜１６６ｎｍであった。押出し調整後に０．５ｍｌの製剤をＰＢＳを用いてセファデクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０カラム〔１．８×３５ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン〕を通過させて、未封入のＥｐｏを除去した。各分画は４．５ｍｌを含有していた。ゲル濾過後のリポソーム懸濁液の希釈倍率は９であった。ＳＳ−リポソームおよびＳＧ−リポソーム中に封入されているＥｐｏは、各々Ｅｐｏ／ＳＳ−リポソームおよびＥｐｏ／ＳＧ−リポソームとして表わされる。
【００１２】
製剤は以下の実験に供するため次のように表示した。
【００１３】
0003850468.tif 000003
（２）封入されたリポソームの体積の測定
封入体積は、与えられた量の脂質によって囲まれた体積として、そして総脂質１モルあたりの閉じこめられた体積（リットル数）という単位（Ｌ／モル）で、定義される。封入された体積を測定するためのマーカーとしてカルセインを使用した。リポソーム（ＤＰＰＣ  １０５μモルおよびＳＳまたはＳＧ３０μモル）の製法においては、乾燥させた脂質薄膜が、２０ｍＭのカルセインを含有する、クロロホルム３ｍｌ、イソプロピルエーテル３ｍｌおよびＰＢＳ２ｍｌ中に溶解させた。Ｅｐｏ含有リポソームを製造するために同じＲＥＶ法および押出し法を適用した。ゲル濾過を通過した後のカルセインを封入している製剤をＰＢＳで１０００倍に希釈して、蛍光強度（Ｆｂ）を蛍光スペクトロメーター〔４９０ｎｍで励起、５２０ｎｍで発光；日立  Ｆ−４０１０〕で測定した。そして次に１ｍｌの試料に１０％トリトン（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）溶液３０μｌを加えることによってリポソームを完全に崩壊させた後、蛍光強度（Ｆａ）を測定した。リポソーム中に封入しているカルセインの蛍光強度（Ｆｌｉｐｏ）は、式（Ｆｌｉｐｏ＝Ｆａ−Ｆｂ）に従って計算した。リポソーム中に封入しているカルセインの量（Ｃｌｉｐｏ）は、Ｆｌｉｐｏおよび、既知濃度のカルセインによって用意された検量線から計算された。ＳＳまたはＳＧ−リポソームの封入体積は、Ｃｌｉｐｏおよび、リン脂質Ｂ−テスト：ワコー（和光純薬工業株式会社）を用いることによって決定したリポソーム中のＤＰＰＣの濃度から計算したとき、各々７．０８または４．７４Ｌ／モル脂質であった。
【００１４】
実施例２
下記の条件以外は上記実施例１（１）記載の方法に従ってＳＳ、ＳＧおよびＣｈ−リポソーム封入Ｅｐｏを製造した。
【００１５】
ＤＰＰＣとの配合比率は、実施例１と同様に７：２（モル比）であった。超音波処理は２分とした。また、リポソームを整粒するために用いるポリカーボネート膜の孔径は０．１μｍおよび０．２μｍであった。ポリカーボネート膜を通過させた後、実施例１の方法で製剤をゲル濾過し、未封入のＥｐｏを除去した。
【００１６】
このようにして得られたリポソームは実施例１（２）の方法により、封入されたリポソームの体積を測定した。なお、Ｅｐｏを封入するＳＳ、ＳＧおよびＣｈ−リポソームを各々Ｅｐｏ／ＳＳ−リポソーム、Ｅｐｏ／ＳＧ−リポソームおよびＥｐｏ／Ｃｈ−リポソームとして表す場合がある。
結果を次の表に示す。
【００１７】
0003850468.tif 000004
実験例１  動物実験による皮下投与後の循環性網状赤血球数
すべての実験で、生後９週（約３００ｇ）の雄のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（埼玉実験動物供給所）を使用した。ラット（１グループ３匹）はジエチルエーテルで軽く麻酔をかけてから、遊離のＥｐｏ溶液または実施例１で製造したＥｐｏを封入しているリポソームの懸濁液を首の背側に皮下投与した。投与前、投与後２日、４日および７日目に背中足の静脈から２０μｌの血液試料を採取し、この試料を直ちに１０ｍｌのセルパック（自動血球計数装置用希釈液、東亜医用電子株式会社〕で希釈して希釈された血液溶液を作った。この希釈された血液溶液を計数の約１５分前に約１００μｌの溶血試薬、クイックライザー（東亜医用電子株式会社）で処理した。溶血させた血液をマイクロセルカウンター（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｆ−５００、東亜医用電子株式会社）およびセルモニター（Ｓｙｓｍｅｘ  ＣＭ−５、東亜医用電子株式会社）を用いて計数した。セルモニターの感度は４にセットし、ディスクリミネーターは１または５にセットした。ディスクリミネーターのレベル１および５で計数した数の差を、循環性網状赤血球数として計算した。ゲル濾過後のＥｐｏ／ＳＳおよびＥｐｏ／ＳＧ−リポソーム懸濁液を、０．３、０．１および０．０３ｍｌ／３００ｇラット、で投与し、一方ゲル濾過前のこれらを０．０３３、０．０１１および０．００３ｍｌ／３００ｇラットで、各々投与した。ゲル濾過の前後の間の用量の差は、ゲル濾過後のリポソーム懸濁液の希釈倍率（９）に等しかった。
【００１８】
試験結果
Ｅｐｏ溶液を皮下に投与したとき、血中の循環性網状赤血球数は、図１に示すように有意に増大し、２日目にピークに達し、その後、７日目に投与前の水準まで減少した。
【００１９】
Ｅｐｏ溶液の皮下投与の後、２日目の血中の循環性網状赤血球数はＥｐｏの対数用量と直線関係を示す。Ｅｐｏ溶液の皮下投与後の、２日目の血中の循環性網状赤血球数（ｙ、×１００／μｌ）対Ｅｐｏの用量（ｘ、ＩＵ／ｋｇ）の直線回帰式は
ｙ＝−７６１＋４２９×（ｌｏｇｘ）（ｒ＝０．９９９）    （１）
であった。
【００２０】
製剤１−ａおよび製剤２−ａを皮下投与したとき、循環性網状赤血球数は図２に示すようにＥｐｏ溶液のように増加した。
【００２１】
このためＥｐｏ／ＳＳおよびＥｐｏ／ＳＧ−リポソーム懸濁液の投与は、上記のような３つの用量のかわりに、１つの用量、すなわちゲル濾過の後または前では各々０．１０または０．０１１ｍｌ／３００ｇラットの体重、の用量を用いて実施した。
【００２２】
ゲル濾過前にはＥｐｏはリポソーム中に未封入および封入の懸濁液として存在した。循環性網状赤血球数は未封入および封入Ｅｐｏの投与によって増加した。製剤１−ｂの皮下投与の２日後の循環性網状赤血球数は、図３に示されるようにｔ−検定（ｐ＜０．０５）により、どんな投与体積の製剤１−ａのそれよりも有意には高くなかった。
【００２３】
表１は、一連のリポソーム懸濁液製剤の皮下投与の２日後の循環性網状赤血球数を表わす。
【００２４】
【表１】
0003850468.tif 000005
製剤２−ｂおよび製剤２−ａの循環性網状赤血球数もまた、ｔ−検定（ｐ＜０．０５）により有意の差は示さなかった。しかし製剤４−ｂおよび製剤４−ａと同様に製剤３−ｂおよび製剤３−ａについては、循環性網状赤血球数はｔ−検定（ｐ＜０．０５）により有意の差異を示した。これらの結果は、Ｅｐｏ／ＳＳおよびＥｐｏ／ＳＧ−リポソーム懸濁液中のリポソームに封入していないＥｐｏは、４分の超音波処理によって製造したものでは、顕著な作用を示さず、一方、１分の超音波処理によって製造したものでは循環性網状赤血球数において顕著な作用を示した。
【００２５】
実験例２  ＨＰＬＣによるＥｐｏ濃度の測定
リポソームの製造後のＥｐｏ濃度をＨＰＬＣによって測定した。Ｅｐｏを含有するリポソーム懸濁液０．３ｍｌを、リポソームを崩壊させるために０．０９ｍｌのクロロホルムとともに振盪した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、Ｅｐｏを含有する水相またはＥｐｏの標準溶液の０．２ｍｌをＨＰＬＣにインジェクトした。Ｅｐｏの分析用のＨＰＬＣ系は、ブチルシリルシリカゲルカラム（Ｖｙｄａｃ  Ｃ4 、２５０×４ｍｍ、５μｍ）、ウォーターズ６００マルチソルベント送液システム、およびウォーターズ４８６チューナブルＵＶ／ＶＩＳ検出器（日本ウォーターズリミテッド）より成っていた。移動相Ａは水：アセトニトリル：トリフルオロ酢酸（４００：１００：１）より成り、Ｂは水：アセトニトリル：トリフルオロ酢酸（１００：４００：１）より成っていた。カラムは３５％のＢおよび６５％のＡより成る移動相で平衡させた。Ｂの百分率は、インジェクション後５分間は３５％に保持し、１５分かけて直線的に１００％まで変化させた。Ｂの百分率を２分間１００％に保持した。流量は１ｍｌ／分であった。Ｅｐｏは波長２１４ｎｍで検出され、室温で保持時間約２０分で溶出した。結果は下記の表２に示す。
【００２６】
実験例３  Ｅｐｏの活性と、ＨＰＬＣ法によって測定されたＥｐｏ濃度との比較
ＨＰＬＣ法によって評価したゲル濾過前および後のＥｐｏ／ＳＳおよびＥｐｏ／ＳＧ−リポソームのＥｐｏ濃度を表２に要約した。
【００２７】
【表２】
0003850468.tif 000006
リポソーム懸濁液の皮下投与の２日後の循環性網状赤血球数から、直線回帰式（Ｉ）および投与体積（表１）を用いることにより、Ｅｐｏの活性を計算する。
【００２８】
Ｅｐｏ／ＳＳ−リポソーム（製剤１−ａ、３−ａ）は、ＨＰＬＣによって評価されたＥｐｏ濃度が循環性網状赤血球数によって評価されたＥｐｏの活性に匹敵することを示し、一方、Ｅｐｏ／ＳＧ−リポソーム（製剤２−ａ、４−ａ）はＥｐｏ濃度がＥｐｏの活性と比較できないことを示した。
【００２９】
実験例４  封入された体積により評価したＥｐｏ濃度
封入された体積は当然のことながら与えられた技術によって生成されるリポソームの半径に依存し、各小胞の脂質組成および媒質のイオン組成によって影響をうける。Ｅｐｏ／ＳＳおよびＥｐｏ／ＳＧ−リポソームの封入体積は、各々７．０８および４．７４Ｌ／モル脂質であった。
【００３０】
封入効率は、二重層によって分離された水相区画率として定義された。Ｅｐｏ／ＳＳまたはＥｐｏ／ＳＧ−リポソームの封入効率（各々７４．３％または４９．８％）は、封入体積に総脂質の量（１０５μモル）をかけてＥｐｏ溶液のもとの体積（１ｍｌ）で割った値として計算された。
【００３１】
押出し調整およびゲル濾過後に残った脂質の量を、押出し調整前の最初の製剤中の量で割って、脂質回収率を得た。脂質回収率は、押出し調整およびゲル濾過後に残留するＥｐｏの収率を示す。リポソーム中のＥｐｏの収率は脂質回収率と封入効率とをかけて計算した。そしてリポソーム中のＥｐｏの収率およびゲル濾過後の希釈倍率（９）は、ゲル濾過後のリポソーム懸濁液中の総Ｅｐｏの活性が求められ、これを表３に要約した。
【００３２】
【表３】
0003850468.tif 000007
活性の保持率は、総Ｅｐｏの活性（表３）およびＥｐｏの活性（表２）から評価され、次の式によって表わされた。
【００３３】
活性の保持率（％）＝Ｅｐｏの活性／総Ｅｐｏの活性×１００      （２）
製剤１−ｂを製剤１−ａと比較してＥｐｏの活性の保持率から、未封入または封入の、Ｅｐｏのどちらの部分が不活性化されるかを調べた。製剤１−ｂは未封入および封入のＥｐｏの総活性として７２９３ＩＵ／ｍｌを示した。４５０００ＩＵ／ｍｌ  Ｅｐｏの封入効率７４．３％（＝リポソーム中のＥｐｏ３３４３５ＩＵ／ｍｌ）およびＥｐｏの活性の保持率２５．３％をもつ製剤１−ａは、封入しているＥｐｏの活性として８４５９ＩＵ／ｍｌを示した。このため、４分の超音波処理によって製造したＥｐｏ／ＳＳ−リポソーム懸濁液中の製剤１−ｂには、未封入のＥｐｏには活性は存在しないであろう。
【００３４】
製剤２−ｂは１５４９４ＩＵ／ｍｌを示し、製剤２−ａは１１９４５ＩＵ／ｍｌを示した。４分の超音波処理によって製造したＳＧ−リポソーム懸濁液中の未封入のＥｐｏの活性は、７．９％であった。
【００３５】
これらの結果は、４分の超音波処理を用いるリポソーム製法によって、Ｅｐｏ／ＳＳおよびＥｐｏ／ＳＧ−リポソーム中に封入されていないＥｐｏの活性の約１００％および９２％、そしてＥｐｏ／ＳＳおよびＥｐｏ／ＳＧ−リポソーム中に封入されているＥｐｏの活性の約７５％および４７％が各々損傷をうけたことを示している。このことは、リポソームの二重層がＥｐｏの活性を保護する効果を有することを示した。
【００３６】
表３の結果は、押出し調整後、ゲル濾過したＥｐｏ／ＳＳおよびＥｐｏ／ＳＧリポソームは、それぞれ２５．３％（超音波処理時間４分）、３３．６％（超音波処理時間１分）および、５３．３％（超音波処理時間４分）、５８．３％（超音波処理時間１分）の活性を保持していることを示している。
【００３７】
実験例５  動物実験による経口投与後の循環性網状赤血球数
生後９〜１０週令（体重２５０〜３５０ｇ）の雄ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（埼玉実験動物供給所）を使用した。ラット（１グループ３匹）を、ラット固定盤に仰向けに固定し、ゾンデを用いて実施例２で調製したＥｐｏを封入しているリポソームを所定量経口投与した。投与前（０日目）及び投与後２日および４日目のほぼ一定時刻に、ラットの背中足静脈を注射針（２５Ｇ）で窄刺して出血させ、マイクロピペットにて２０μｌを採血してサンプルとした。Ｅｐｏの薬理効果の指標として、Ｅｐｏの投与後の網状赤血球数の変化を実験例１と同様の方法で測定した。
【００３８】
結果を図４（Ｅｐｏ／Ｃｈ（０．１μｍ）−リポソーム）、図５（Ｅｐｏ／ＳＳ（０．１μｍ）−リポソーム）および図６（Ｅｐｏ／ＳＧ（０．２μｍ）−リポソーム）に示す。
【００３９】
図４に見られるように、低用量（３６，０００ＩＵ／ｋｇ）の投与群（３匹）では２日目に増加が見られ、中用量（１０８，０００ＩＵ／ｋｇ）の投与群では３日目および９日目に増加が見られた。
【００４０】
図５では、低用量（３６，０００ＩＵ／ｋｇ）投与群では投与後２日目に増加が見られ、中用量（１０８，０００ＩＵ／ｋｇ）の投与群では４日目、７日目に増加のピークがあるものが見られ、高用量（１８０，０００ＩＵ／ｋｇ）の投与群では４日目に増加のピークがあるものが見られた。
【００４１】
図６では、１８，０００ＩＵ／ｋｇ投与群で投与後２日目にわずかながら増加のピークが見られた。
【００４２】
実験例６  ＨＰＬＣによるリポソーム中のＥｐｏ活性保持率
実施例２で調製した製剤番号５ないし１０のＥｐｏ封入リポソームについて、ＨＰＬＣによりＥｐｏ活性を測定し、活性保持率を算出した。測定方法は、前記実験例２記載の方法に従った。
結果を次に示す。
【００４３】
0003850468.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】循環性網状赤血球数への、遊離Ｅｐｏ溶液の１回の皮下投与の効果を示す。投与量は各々１００（四角）、３００（丸）および１０００（黒四角）ＩＵ／ｋｇラットである。値は平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図２】循環性網状赤血球数への、ゲル濾過後のＥｐｏ／ＳＳおよびＥｐｏ／ＳＧ−リポソーム懸濁液の１回の皮下投与の効果を示す。点線および中空の印はＥｐｏ／ＳＳ−リポソーム（製剤１−ａ）を表わす。実線および中実の（ｓｏｌｉｄ）印はＥｐｏ／ＳＧ−リポソーム（製剤２−ａ）を表わす。投与体積は各々０．３（丸）、０．１（四角）および０．０３（三角）ｍｌ／３００ｇである。値は平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図３】１回の皮下投与の２日後の循環性網状赤血球数に関しての、ゲル濾過前のＥｐｏ／ＳＳ−リポソーム（製剤１−ｂ、灰色）のゲル濾過後のＥｐｏ／ＳＳ−リポソーム（製剤１−ａ、黒）との比較を示す。ゲル濾過前のリポソームの投与体積は、リポソーム懸濁液の濃度がゲル濾過後に１／９まで希釈されるので、ゲル濾過後の投与体積の１／９である。値は平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図４】実施例２でＤＰＰＣとＣｈとを用いて調製したリポソーム（製剤７）の経口投与による、循環網状赤血球数の変化を示す。図中の２つのグラフはそれぞれ投与量が３６，０００ＩＵ／ｋｇ、１０８、０００ＩＵ／ｋｇの群についての結果であり、各グラフとも３匹のラットについて得られた測定値を示す。
【図５】実施例２でＤＰＰＣとＳＳとを用いて調製したリポソーム（製剤５）の経口投与による、循環網状赤血球数の変化を示す。図中の３つのグラフはそれぞれ投与量が３６，０００ＩＵ／ｋｇ、１０８，０００ＩＵ／ｋｇ、１８０，０００ＩＵ／ｋｇの群についての結果であり、各グラフとも３匹のラットについて得られた測定値を示す。
【図６】実施例２でＤＰＰＣとＳＧとを用いて調製したリポソーム（製剤９）の経口投与による、循環網状赤血球数の変化を示す。投与量が１８，０００ＩＵ／ｋｇの群についての結果であり、４匹のラットについて得られた測定値を示す。
【図１】
0003850468.tif 000009
【図２】
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【図３】
0003850468.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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