(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｈｃｉ６−Ｎｌｅ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２を有する化合物並びにその製薬的に認容性の酸との塩。
【請求項２】
塩が酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩又はエンボン酸塩である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の化合物を含有する医薬品組成物。
【請求項４】
適当な保護基を備えた構成成分からなるフラグメントを固相上又は液体中で、慣用の方法によって合成し、引き続き該フラグメントを固相上でセグメントカップリングによって結合させ、カップリングの完了後に化合物を慣用の方法でアミド化を行い固相から分離する、請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の化合物の、ホルモン依存性腫瘍、前立腺癌又は乳癌の治療のため、並びに治療がＬＨ−ＲＨホルモン抑制を必要とする非悪性適応症のための薬剤の製造のための使用。
【請求項６】
請求項１又は２記載の化合物を慣用の賦形剤及び助剤と混合し、かつ薬剤として調製する、薬剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は改善された溶解特性を有するＬＨＲＨ−アンタゴニスト、該化合物の製造方法、前記化合物を含有している薬剤並びにホルモン依存性腫瘍及びホルモンに影響される非悪性の疾患、例えば良性の前立腺肥大症（ＢＰＨ）及び子宮内膜症の治療のための薬剤の使用に関する。
【０００２】
ペプチドの定義のために使用される命名法は、生化学命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによって解説される命名法で調和され（European J. Biochem. 1984, 138, 9-37）、そこでは従来の表現による調和においてＮ−末端のアミノ基は左方に見られ、かつＣ−末端のカルボキシル基は右方に見られる。本発明によるペプチドのようなＬＨ−ＲＨ−アンタゴニストは、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸を含有し、その際、前者はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ及びＨｉｓを含む。個々のアミノ酸残基のための略号は、アミノ酸の慣用名に基づき、かつＡｌａ＝アラニン、Ａｒｇ＝アルギニン、Ｇｌｙ＝グリシン、Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｌｙｓ＝リジン、Ｐａｌ（３）＝３−（３−ピリジル）アラニン、Ｎａｌ（２）＝３−（２−ナフチル）アラニン、Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｃｐａ＝４−クロロフェニルアラニン、Ｐｒｏ＝プロリン、Ｓｅｒ＝セリン、Ｔｈｒ＝トレオニン、Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｔｙｒ＝チロシン及びＳａｒ＝サルコシンである。本願に記載される全てのアミノ酸は特に記載がない場合にはＬ−型のものである。例えばＤ−Ｎａｌ（２）は３−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニンのための略号であり、かつＳｅｒはＬ−セリンのための略号である。リジンの側鎖のε−アミノ基での置換はリジン以降の括弧に入れられた表現（場合により略号の形で）によって表される。
【０００３】
使用される別の略号は：
Ａｃ                                                          アセチル
Ａｔｚ            ３−アミノ−１，２，４−トリアゾール−５−カルボニル
Ｂ    ４−（４−アミジノ−フェニル）−アミノ−１，４−ジオキソ−ブチル
Ｂｏｃ                                      ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｂｏｐ
ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート
ＤＣＣ                                  ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ                                                  ジクロロメタン
Ｄｄｚ
ジメトキシフェニル−ジメチルメチレンオキシ−カルボニル（ジメトキシジメチル−Ｚ）
ＤＩＣ                                    ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ                          Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ                                            ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ                            フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＦ                                                      フッ化水素酸
ＨＯＢｔ                              １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ                                    高圧液体クロマトグラフィー
Ｍｅ                                                            メチル
ＴＦＡ                                                トリフルオロ酢酸
Ｚ                                            ベンジルオキシカルボニル
Ｈｃｉ                                                  ホモシトルリン
Ｃｐａ                                      ４−クロロフェニルアラニン
本発明によるペプチドは、黄体形成ホルモンを遊離するホルモン（ＬＨ−ＲＨ）であり、これは以下の構造を有する：
ｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２、［ＬＨ−ＲＨ、ゴナドレリン］
２０年以上の間、研究者はＬＨ−ＲＨ−デカペプチドの選択的に有効なアンタゴニスト［M.Karten und J.E.Rivier, Endocrine Reviews 7, 44-66(1986)］を調査してきた。かかるアンタゴニストへの高い関心は、内分泌学、婦人科学、避妊及び癌の分野におけるその有用性に理由づけられる。多数の化合物は、有効なＬＨ−ＲＨ−アンタゴニストとして製造されている。今日まで入手されていた関心の持たれた化合物は、構造がＬＨ−ＲＨ−構造の改変を表す化合物である。
【０００４】
有効なアンタゴニストの第一の系列は、芳香族アミノ酸残基を１位、２位、３位及び６位又は２位、３位及び６位に導入することによって得られた。該化合物の慣用の表記法は、以下のような形である：先ず、ＬＨ−ＲＨのペプチド鎖中で最初に存在するアミノ酸の部位に明らかにされているアミノ酸が挙げられ、その際、交換が行われた部位は高い位置の数字で特徴付けられる。更に、後置される名称“ＬＨ−ＲＨ”によって、交換が行われたＬＨ−ＲＨ−類似体であることを表現している。
【０００５】
公知のアンタゴニストは：
［Ａｃ−Ｄ−Ｃｐａ１，２、Ｄ−Ｔｒｐ３，６］ＬＨ−ＲＨ（D, H.Coy et al., In: Gross, E. and Meienhofer, J. (Eds) Peptides; Proceedings of the 6th American Peptid Symposium, S.775-779, Pierce Chem. Co., Rockville III. (1979)：
［Ａｃ−Ｐｒｏ１、Ｄ−Ｃｐａ２、Ｄ−Ｎａｌ（２）３，６］ＬＨ−ＲＨ（米国特許第４４１９３４７号）及び
［Ａｃ−Ｐｒｏ１、Ｄ−Ｃｐａ２、Ｄ−Ｔｒｐ３，６］ＬＨ−ＲＨ（J.L.Pineda, et al., J.Clin. Endocrinol. Metab. 56, 420, 1983）
である。
【０００６】
アンタゴニストの作用を改善するために、後に塩基性アミノ酸、例えばＤ−Ａｒｇを６位に導入した。例えば
［Ａｃ−Ｄ−Ｃｐａ１，２、Ｄ−Ｔｒｐ３、Ｄ−Ａｒｇ６、Ｄ−Ａｌａ１０］ＬＨ−ＲＨ（ＯＲＧ−３０２７６）（D. H. Coy, et al., Endocrinology 100, 1445, 1982）；及び
［Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１、Ｄ−Ｐｈｅ（４−Ｆ）２、Ｄ−Ｔｒｐ３、Ｄ−Ａｒｇ６］ＬＨ−ＲＨ（ＯＲＦ  １８２６０）（J.E. Rivier et al., in: Vickery B. H. Nestor, Jr. J. J., Hafez, E. S. E(Eds). LHRH and its Analogs, S.11-22 MTP Press, Lancaster, UK 1984）
である。
【０００７】
他の有効なＬＨ−ＲＨ−アンタゴニストは、ＷＯ９２／１９６５１号、ＷＯ９４／１９３７０号、ＷＯ９２／１７０２５号、ＷＯ９４／１４８４１号、ＷＯ９４／１３３１３号、ＵＳ−Ａ５３００４９２号、ＵＳ−Ａ５１４０００９号、ＥＰ０４１３２０９Ａ１号及びＤＥ１９５４４２１２Ａ１号に記載されている。
【０００８】
後者は６位に改変されたオルニチン構成要素又はリジン構成要素を有する化合物を開示しており、これは以下の式に相当する：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｘｘｘ６−Ｌｅｕ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２
［式中、Ｄ−Ｘｘｘは一般式（ＶＩ）：
【０００９】
【化４】
0003801867.tif 000002
【００１０】
のアミノ酸基を表す］。
更にＬＨ−ＲＨアンタゴニストは、ＷＯ９７／１１９９５３号及びＥＰ−Ａ２０３２８０９０号に記載されている。
【００１１】
他の公知のＬＨ−ＲＨ−アンタゴニストはアンタレリックス（Antarelix）、ガニレリックス（Ganirelix）及びセトロレリックス（Centrorelix）である。
【００１２】
アンタレリックス：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｈｃｉ６−Ｌｅｕ７−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２
ガニレリックス：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｔｙｒ５−Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２６−Ｌｅｕ７−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２
セトロレリックス：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｃｉｔ６−Ｌｅｕ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２
本発明の目的は、高められた酵素安定性及び大きく改善された水溶性を有する新規のＬＨ−ＲＨ−アンタゴニストを提供することである。
【００１３】
本発明の課題は、以下の一般式（Ｉ）：
Ａ−Ｘｘｘ１−Ｘｘｘ２−Ｘｘｘ３−Ｘｘｘ４−Ｘｘｘ５−Ｘｘｘ６−Ｘｘｘ７−Ｘｘｘ８−Ｘｘｘ９−Ｘｘｘ１０−ＮＨ２                          （Ｉ）
［式中、
Ａはアセチル基又は３−（４−フルオロフェニル）−プロピオニル基を表し、
Ｘｘｘ１はＤ−Ｎａｌ（１）又はＤ−Ｎａｌ（２）を表し、
Ｘｘｘ２−Ｘｘｘ３はＤ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ（３）又は単結合を表し、
Ｘｘｘ４はＳｅｒを表し、
Ｘｘｘ５はＮ−Ｍｅ−Ｔｙｒを表し、
Ｘｘｘ６はＤ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｈｃｉ又は一般式（ＩＩ）：
【００１４】
【化５】
0003801867.tif 000003
【００１５】
（式中、ｎは３又は４の数を意味し、その際、Ｒ１は一般式ＩＩＩ：
【００１６】
【化６】
0003801867.tif 000004
【００１７】
（式中、ｐは１〜４の整数を意味し、Ｒ２は水素又はアルキル基を意味し、Ｒ３は非置換又は置換のアリール基又はヘテロアリール基を意味する）の基を有する基を意味するか、又はＲ１は３−アミノ−１，２，４−トリアゾール−５−カルボニル基を意味するか、又はＲ１は一般式（ＩＶ）：
【００１８】
【化７】
0003801867.tif 000005
【００１９】
（式中、ｑは１又は２の数を意味し、Ｒ４は水素原子又はアルキル基を意味し、Ｒ５は水素原子又はアルキル基を意味し、かつＸは酸素原子又は硫黄原子を意味する）の環を表す）のＤ−アミノ酸基を表し、
Ｘｘｘ７はＬｅｕ又はＮｌｅを表し、
Ｘｘｘ８はＡｒｇ又はＬｙｓ（ｉＰｒ）を表し、
Ｘｘｘ９はＰｒｏを表し、かつ
Ｘｘｘ１０はＡｌａ又はＳａｒを表す］の化合物並びにその製薬的に認容性の酸との塩、特に酢酸塩、エンボン酸塩（Embonate）及びトリフルオロ酢酸塩によって解決される。
【００２０】
本発明による化合物とは、Ｘｘｘ６がＤ−［ε−Ｎ′−（イミダゾリジン−２−オン−４−イル）−ホルミル］−Ｌｙｓ、Ｄ−（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボニル）−Ｌｙｓ、略してＤ−Ｌｙｓ（Ａｔｚ）又はＤ−［ε−Ｎ′−４−（４−アミジノフェニル）−アミノ−１，４−ジオキソ−ブチル］−Ｌｙｓ、略してＤ−Ｌｙｓ（Ｂ）を意味するのようなものが特に有利である。
【００２１】
本発明による他の特に有利な化合物は：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｈｃｉ６−Ｎｌｅ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２、
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｔｚ）６−Ｌｅｕ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２、
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂ）６−Ｌｅｕ７−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２、
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂ）６−Ｌｅｕ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２、
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｈｃｉ６−Ｎｌｅ７−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）８−Ｐｒｏ９−Ａｌａ１０−ＮＨ２、
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｈｃｉ６−Ｎｌｅ７−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）８−Ｐｒｏ９−Ｓａｒ１０−ＮＨ２、
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｈｃｉ６−Ｎｌｅ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｓａｒ１０−ＮＨ２、
３−（４−フルオロフェニル）−プロピオニル−Ｄ−Ｎａｌ（１）１−Ｓｅｒ−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｔｚ）６−Ｌｅｕ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２、
並びに前記の製薬的に認容性の酸とのその塩である。
【００２２】
本発明による化合物は、ホルモン依存性腫瘍、特に前立腺癌又は乳癌の治療のため、並びに治療がＬＨ−ＲＨ−ホルモン抑制を必要とする非悪性の適応症のために使用できる。このために、これらを慣用の賦形剤及び助剤と混合し、薬剤として調製する。
【００２３】
式（Ｉ）による化合物の合成は、古典的なフラグメント縮合又は、相互の連続した合成により側鎖中で既に一般式：Ｒ１−ＣＯＯＨのカルボン酸でアシル化されたＤ−リジンの使用下にメリフィールドによる固相合成によっても、又はデカペプチド構成成分と相応のカルボン酸との反応によりＤ−リジン６の側鎖でのアミドカップリングによっても実施できる。それに応じて、プロセスの３つの異なる場所でＲ１−ＣＯ基の導入を実施してよい：単一の構成成分を縮合してペプチドにする前、ペプチド鎖にリジン又はオルニチンを挿入した後であるが、すぐ後の構成成分を縮合する前又は全ての構成成分の縮合の後。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物を、公知の方法で、例えば純粋な固相技術、部分的な固相技術（いわゆるフラグメント縮合）又は古典的な溶液カップリング（M. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984参照）によって合成する。
【００２５】
例えば、固相合成のための方法は、マニュアル“固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）”（J. M. Stewart and J. D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford III, 1984, und in G. Barany and R.B. Merrifield "The Peptides", Ch. 1, S. 1-285, 1979, Academic Press Inc.）に記載されている。古典的な溶液合成は論述“有機化学の方法（ホウベン−ヴェイル）、ペプチドの合成（Methoden der Organischen Chemie(Houben-Weyl), Synthese von Peptide）”（E. Wuensch(Herausgeber)1974, Georg Thieme Verlag Stuttgart, BRD）に詳細に説明されている。
【００２６】
段階的合成は、例えばまずα−位のアミノ基が保護されているカルボキシ末端のアミノ酸をこのために慣用の不溶性の担持体に共有結合させ、該アミノ酸のα−アミノ保護基を離脱させ、こうして得られた遊離アミノ基にすぐ次の保護されたアミノ酸をそのカルボキシ基を介して結合させ、かつ前記のように順次に合成されるべきペプチドの残りのアミノ酸を正しい順序でカップリングさせ、かつ全てのアミノ酸のカップリングの後に完成したペプチドを担持体から切り離し、場合により他の存在する側鎖官能保護基を離脱させる。段階的な縮合を、相応の従来のように保護されたアミノ酸から従来のように合成することによって実施する。
【００２７】
個々のアミノ酸を互いにカップリングさせることは、このために慣例の方法によって実施し、特に：
・  ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミド（ＤＣＣ、ＤＩＣ）の存在下での対称無水物の方法。
【００２８】
・  一般的なカルボジイミド法
・  カルボジイミド−ヒドロキシベンゾトリアゾール法（The Peptides, Volume 2, Ed. E. Gross and J. Meienhofer参照）
が該当する。
【００２９】
フラグメント縮合の場合には、有利にはラセミ化せずに進行するアジドカップリング又はＤＣＣ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール法もしくはＤＣＣ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン法を使用する。またフラグメントからの活性化されたエステルを使用してもよい。
【００３０】
アミノ酸の段階的縮合のために、Ｎ−保護されたアミノ酸の特に良好に活性化されたエステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又は２，４，５−トリクロロフェニルエステルが適当である。アミノ分解は、ほぼ酢酸の酸性度を有するＮ−ヒドロキシ化合物、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾールによって非常に良好に触媒することができる。
【００３１】
中間アミノ保護基として、脱水素基、例えばベンジルオキシカルボニル基（＝Ｚ−基）又は弱酸性の離脱可能な基が適当である。α−位のアミノ基のための保護基としては、例えば：
第３級ブチルオキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、カルボベンゾキシ基もしくはカルボベンズチオ基（場合によりそれぞれｐ−ブロモ又はｐ−ニトロ−ベンジル基を有する）、トリフルオロアセチル基、フタリル基、ｏ−ニトロフェノキシアセチル基、トリチル基、ｐ−トルエンスルホニル基、ベンジル基、ベンゼン核において置換されたベンジル基（ｐ−ブロモ又はｐ−ニトロ−ベンジル基）及びα−フェニルエチル基が該当する。そのためには、Ｊｅｓｓｅ  Ｐ．Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ及びＭｉｌｔｏｎ  Ｗｉｎｉｔｚ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９６１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，例えば８８３ページ以降，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  １９８４，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ及びＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ，１９８４，Ｇ．Ｂａｒａｎｙ及びＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｃｈ．１，Ｓ．１−２８５，１９７９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ並びにＴｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｅｄ．Ｅ．Ｇｒｏｓｓ及びＪ．Ｍａｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。これらの保護基は根本的に相応のアミノ酸の他の官能性側基（ＯＨ−基、ＮＨ２−基）の保護のためにも考慮される。
【００３２】
存在するヒドロキシ基（セリン、トレオニン）は、有利にはベンジル基及び類似の基によって保護される。他のα位にないアミノ基（たとえばω位のアミノ基、アルギニンのグアニジノ基）は有利には直角に保護される。
【００３３】
個々のアミノ酸構成成分は、Ｒ１−ＣＯ基によって改変されたリジン又はオルニチンを除いて、商業的に入手できる。後者の化合物の製造方法の可能な経過は以下のようである：
１．  α−カルボン酸基をアミド化し、
２．  ε−アミノ基をＺ−基で保護し、
３．  α−アミノ基を、後のアミノ保護基の分離に関する選択性が生じるようにＢｏｃ−保護基で保護し、
４．  ε−アミノ基のＺ−基を分離し、
５．  ε−アミノ基に所望の基：Ｒ４−ＣＯ−を挿入し、
６．  α−アミノ基のＢｏｃ−基を分離し、
７．  α−アミノ基にＺ−基を付与する。
【００３４】
Ｒ１−ＣＯ−基を、リジンのアミノ基と相応のカルボン酸との反応によって導入するために、根本的に前記にアミノ酸のカップリングのために記載したものと同じ方法が該当する。しかしながらカルボジイミド、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの使用が特に有利である。
【００３５】
アミノ酸のカップリングのための反応はこのために慣例の無作用の溶剤又は懸濁液（例えばジクロロメタン）中で実施し、その際、場合により溶解性の改善のためにジメチルホルムアミドを使用してよい。
【００３６】
合成担持材料としては、不溶性のポリマー、例えば有機溶剤中で膨潤可能なパール形のポリスチレン樹脂（例えばポリスチレン及び１％のジビニルベンゼンからなる共重合体）が該当する。ペプチドの所望のＣ−末端アミド官能性を担持体からのＨＦ−分解の後に生ずる、メチル−ベンズヒドリルアミド樹脂（ＭＢＨＡ樹脂、すなわちメチル−ベンズヒドリルアミド−基を備えたポリスチレン樹脂）上での保護されたデカペプチドアミドの合成は以下の作業工程表によって実施できる：
【００３７】
【表１】
0003801867.tif 000006
【００３８】
Ｎα−Ｂｏｃ保護されたアミノ酸は通常３倍のモル過剰中でＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ中のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の存在下に９０分以内でカップリングさせ、Ｂｏｃ保護基をＣＨ２Ｃｌ２中の５０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の半時間の作用によって分離する。完全な反応の制御のために、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ及びＫａｉｓｅｒのニンヒドリン試験後にクロロアニル試験（Chloraniltest）を使用する。遊離アミノ官能性残基をＣＨ２Ｃｌ２中のアセチルイミダゾールの５倍過剰中でアセチル化によって遮断する。樹脂上でのペプチド合成の反応工程の順序は、作業工程表から判明する。樹脂に結合するペプチドの切り離しのために固相合成のそれぞれの最終生成物を真空中でＰ２Ｏ５上で乾燥させ、５００倍過剰のＨＦ／アニソール（１０：１／Ｖ：Ｖ）中で０℃において６０分間処理する。
【００３９】
真空中でのＨＦ及びアニソールの留去の後に無水のエチルエーテルと一緒の攪拌によってペプチドアミドが白色の固体として生じ、生じたポリマーの担持体の分離は５０％の水性酢酸での洗浄によって実施する。真空中での酢酸溶液の慎重な濃縮によってそれぞれのペプチドが高粘度の油として得られ、冷却して無水のエーテルの添加後に白色の固体に変換することができる。
【００４０】
更なる精製を、分取高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の通常の方法によって実施する。
【００４１】
ペプチドの酸付加塩への変換は、それ自体と酸とを自体公知の方法で反応させることによって達成できる。反対に遊離ペプチドをその酸付加塩と塩基との反応によって得ることができる。ペプチドエンボン酸塩は、ペプチドのトリフルオロ酢酸塩（ＴＦＡ塩）と遊離のエンボン酸（パモア酸（Pamoasaeure））または相応のエンボン酸の二ナトリウム塩との反応によって作成できる。そのために水性溶液中のペプチド−ＴＦＡ−塩を極性の非プロトン性溶剤、有利にはジメチルアセトアミド中のエンボン酸二ナトリウムの溶液と混合し、形成する淡黄色の残渣が単離される。
【００４２】
以下の実施例は本発明を説明するものであり、それを制限するものではない。
【００４３】
例１
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｈｃｉ６−Ｎｌｅ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２
合成を、固相作業工程表（ペプチド合成プロトコール、１３頁）に従って、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ−カップリングを使用して、３．３ｇのＭＢＨＡ−樹脂（負荷密度（Beladungsdicht）  １．０８ミリモル／ｇ）から出発して実施した。ポリマー担持体のＨＦ−分解の後に３．４ｇの粗製ペプチドが生じ、これを分取ＨＰＣＩの標準的な方法によって精製した。引き続いての凍結乾燥後に、合計式Ｃ７２，Ｈ９６，Ｎ１７，Ｏ１４，Ｃｌの１．４３ｇのＨＰＬＣ純粋生成物が得られ、これは正確なＦＡＢ−ＭＳ：１４５８．７（Ｍ＋Ｈ＋）（計算値：１４５７．７）及び相応の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有した。
【００４４】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍでのδ）：
８．７ないし７．２，複数の（mehrere）ｍ，芳香族．Ｈ及び不完全に交換されたＮＨ；６．９２及び６．５８，２ｄ，２×２Ｈ，芳香族．Ｈ  ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ；５．２ないし３．５，複数のｍ，Ｃα−Ｈ及び脂肪族．Ｈ；３．２ないし２．６，複数のｍ，芳香族．Ｃβ−Ｈ，２．１ないし０．７，複数のｍ，残留．（restl）脂肪族．Ｈ；１．７０，ｓ，３Ｈ，アセチル；１．２０，ｄ，３Ｈ，Ｃβ―Ｈ  Ａｌａ；０．８，ｍ，Ｃδ−Ｈ  Ｌｅｕ
例２
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂ）６−Ｌｅｕ７−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２
合成を、作業工程表（ペプチド合成プロトコール、１３頁）によってＤＩＣ／ＨＯＢｔカップリングを使用して、４．０ｇのＭＢＨＡ樹脂（負荷密度  １．１１ミリモル／ｇ）から出発して実施した。ポリマーの担持体からのＨＦ−分解の後に、４．８７ｇの粗製ペプチドが生じ、これを分取ＨＰＣＩの標準的方法によって精製した。引き続いての凍結乾燥の後に、０．９３ｇのＨＰＬＣ純粋生成物が得られ、これを４−アミジノフェニルアミノ−４−オキソ酪酸と、カップリング試薬としてのＢＯＰの存在下に反応させて、所望の化合物にした。再度のＨＰＬＣ精製の後に、合計式Ｃ８５，Ｈ１１２，Ｎ１７，Ｏ１５，Ｃｌの１４８ｍｇの標的化合物が得られ、これは正確なＥＳＩ−ＭＳ：１６４７．６（Ｍ＋Ｈ＋），（計算値：１６４５．８）及び相応の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有した。
【００４５】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍでのδ）：
１０．４，ｓ，１Ｈ及び９．１３，ｓ，２Ｈ及び８．９４，ｓ，２Ｈ，４−アミジノアニリンからのＮＨ；８．６ないし７．３５，複数のｍ，芳香族．Ｈ及びＮＨ；７．２２及び７．１８，２ｄ，４Ｈ，芳香族．Ｈ（ｐＣＩ）Ｐｈｅ；６．９５及び６．５８，２ｄ，４Ｈ，芳香族．Ｈ  Ｔｙｒ；５．２ないし３．５，複数のｍ，Ｃα−Ｈ及び脂肪族．Ｈ；３．３ないし２．４，複数のｍ，Ｃβ−Ｈ及びＮ−ＣＨ３，２．１ないし１．１，複数のｍ，残留．脂肪族．Ｈ，１．６８，ｓ，３Ｈ，アセチル；１．２０，ｄ，３Ｈ，Ｃβ−Ｈ  Ａｌａ；０．８３，ｄｄ，６Ｈ，Ｃδ−Ｈ  Ｌｅｕ
例３
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂ）６−Ｌｅｕ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２
合成を、固相作業工程表（ペプチド合成プロトコール、１３頁）に従ってＤＩＣ／ＨＯＢｔカップリングによって、４．０ｇのＭＢＨＡ樹脂（負荷密度  ０．９７ミリモル／ｇ）から出発して実施した。ポリマーの担持体からのＨＦ−分解の後に、４．０ｇの粗製ペプチドが生じ、これを分取ＨＰＣＩの標準的方法によって精製した。引き続いての凍結乾燥の後に、１．３９ｇのＨＰＬＣ純粋生成物が得られ、これを４−アミジノフェニルアミノ−４−オキソ酪酸と、カップリング試薬としてのＢＯＰの存在下に反応させて、所望の化合物にした。再度のＨＰＬＣ精製の後に、Ｃ８２，Ｈ１０６，Ｎ１９，Ｏ１５，Ｃｌの４４０ｍｇの標的化合物が得られ、これは正確なＥＳＩ−ＭＳ：１６３２．７（Ｍ＋Ｈ＋）（計算値：１６３１．７）及び相応の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有した。
【００４６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍでのδ）：
１．０．４，ｓ，１Ｈ及び９．１５，ｓ，２Ｈ及び９．０，ｓ，２Ｈ，４−アミジノアニリンからのＮＨ；８．６０，ｍ，２Ｈ，芳香族．Ｈ；８．３ないし７．２，複数のｍ，芳香族．Ｈ及びＮＨ；７．２７及び７．２０，２ｄ，４Ｈ，芳香族．Ｈ（ｐＣＩ）Ｐｈｅ；６．９６及び６．６０，２ｄ，４Ｈ，芳香族．Ｈ  Ｔｙｒ；５．２ないし３．５，複数のｍ，Ｃα−Ｈ及び脂肪族．Ｈ；３．２ないし２．４，複数のｍ，Ｃβ−Ｈ及びＮ−ＣＨ３，２．１ないし１．１，複数のｍ，残留．脂肪族．Ｈ，１．７０，ｓ，３Ｈ，アセチル；１．２０，ｄ，３Ｈ，Ｃβ−Ｈ  Ａｌａ；０．８５，ｄｄ，６Ｈ，Ｃδ−Ｈ  Ｌｅｕ
例４
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｈｃｉ６−Ｎｌｅ７−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）８−Ｐｒｏ９−Ａｌａ１０−ＮＨ２
合成を、固相作業工程表（ペプチド合成プロトコール、１３頁）に従ってＤＩＣ／ＨＯＢｔカップリングによって、２．５ｇのＭＢＨＡ−樹脂（負荷密度  １．０８ミリモル／ｇ）から出発して実施した。ポリマーの担持体からのＨＦ分解の後に、２．７８ｇの粗製ペプチドが生じ、これを分取ＨＰＣＩの標準的方法によって精製した。引き続いての凍結乾燥の後に、合計式Ｃ７５，Ｈ１０２，Ｎ１５，Ｏ１４，Ｃｌの４００ｍｇのＨＰＬＣ純粋生成物が得られ、これは正確なＥＳＩ−ＭＳ：１４７２．６（Ｍ＋Ｈ＋）（計算値：１４７１．７）及び相応の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有した。
【００４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍでのδ）：
８．６２，ｍ，２Ｈ，８．３０，ｍ，２Ｈ，７．８０，ｍ，４Ｈ，７．６６，ｓ，１Ｈ，７．４７，ｍ，２Ｈ，７．３６，ｄ，１Ｈ，芳香族．Ｈ；７．２５及び７．２０，２ｄ，４Ｈ，芳香族．Ｈ（ｐＣＩ）Ｐｈｅ；６．９６及び６．６３，２ｄ，４Ｈ，芳香族．Ｈ  Ｔｙｒ；５．１０ないし４．０，複数のｍ，Ｃα−Ｈ及び脂肪族．Ｈ；３．７５ないし２．６５，複数のｍ，Ｃβ―Ｈ及びＮ−ＣＨ３；２．１ないし１．０５，複数のｍ，残留．脂肪族．Ｈ；１．７４，ｓ，３Ｈ，アセチル；１．２３，ｄ，３Ｈ，Ｃβ−Ｈ  Ａｌａ；１．２０，ｍ，ＣＨ３  イソプロピル．；０．８，ｍ，３Ｈ，Ｃδ−Ｈ  Ｎｌｅ
例５
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）１−Ｄ−Ｃｐａ２−Ｄ−Ｐａｌ（３）３−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｈｃｉ６−Ｎｌｅ７−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）８−Ｐｒｏ９−Ｓａｒ１０−ＮＨ２
合成を、固相作業工程表（ペプチド合成プロトコール、１３頁）に従ってＤＩＣ／ＨＯＢｔカップリングによって、２．５ｇのＭＢＨＡ樹脂（負荷密度  １．０８ミリモル／ｇ）から出発して実施した。ポリマーの担持体からのＨＦ分解の後に、２．７４ｇの粗製ペプチドが生じ、これを分取ＨＰＣＩの標準的方法によって精製した。引き続いての凍結乾燥の後に、合計式Ｃ７５，Ｈ１０２，Ｎ１５，Ｏ１４，Ｃｌの８４０ｍｇのＨＰＬＣ純粋生成物が得られ、これは正確なＥＳＩ−ＭＳ：１４７２．６（Ｍ＋Ｈ＋）（計算値：１４７１．７）及び相応の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有した。
【００４８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍでのδ）：
８．６，ｍ，２Ｈ，８．３，ｍ，２Ｈ，７．８５，ｍ，２Ｈ，７．８，ｍ，７．６５，ｓ，１Ｈ，７．４６，ｍ，２Ｈ，７．３５，ｄ，１Ｈ，芳香族．Ｈ；７．２３及び７．１７，２ｄ，４Ｈ，芳香族．Ｈ（ｐＣＩ）Ｐｈｅ；７．０及び６．６，２ｄ，４Ｈ，芳香族．Ｈ  Ｔｙｒ；５．１０ないし３．８，複数のｍ，Ｃα−Ｈ及び脂肪族．Ｈ；３．７５ないし２．６，複数のｍ，Ｃβ−Ｈ及びＮ−ＣＨ３；２．２ないし１．０５，複数のｍ，残留．脂肪族．Ｈ；１．７０，ｓ，３Ｈ，アセチル；１．２３，ｄ，３Ｈ，Ｃβ  Ａｌａ；１．２０，ｍ，ＣＨ３  イソプロピル．；０．８，ｍ，３Ｈ，Ｃδ  Ｎｌｅ
例６
３−（4−フルオロフェニル）−プロピオニル−Ｄ−Ｎａｌ（１）１−Ｓｅｒ４−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ５−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｔｚ）６−Ｌｅｕ７−Ａｒｇ８−Ｐｒｏ９−Ｄ−Ａｌａ１０−ＮＨ２
合成を、固相作業工程表（ペプチド合成プロトコール、１３頁）に従ってＤＩＣ／ＨＯＢｔカップリングによって、９．２ｇのＭＢＨＡ樹脂（負荷密度  １．０８ミリモル／ｇ）から出発して実施した。ポリマーの担持体からのＨＦ分解の後に、５．８ｇの粗製ペプチドが生じ、これを分取ＨＰＣＩの標準的方法によって精製した。引き続いての凍結乾燥の後に、２．０ｇのＨＰＬＣ均一の非置換のオクタペプチドが得られ、そのうち０．４ミリモルを０．５ミリモルの３−アミノ−１，２，４−トリアゾール−５−カルボン酸とカップリング試薬としてのＰｙＢＯＰの存在下に反応させて、所望の化合物の７９０ｍｇの粗生成物にした。再度のＨＰＬＣ精製の後に、合計式Ｃ６４，Ｈ８６，Ｎ１７，Ｏ１２，Ｆの２００ｍｇの標的化合物が得られ、これは正確なＦＡＢ−ＭＳ：１３０４．６（Ｍ＋Ｈ＋），（計算値：１３０３．６）を有した。
【００４９】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍでのδ）：
８．１４，ｍ，１Ｈ，７．９０，ｍ，１Ｈ，７．８０，ｍ，１Ｈ，７．５０，ｍ，２Ｈ，７．３５，ｍ，２Ｈ，７．０，ｍ，６Ｈ，７．６３，ｍ，２Ｈ，芳香族．Ｈ；５．０，ｍ，１Ｈ，４．８３，ｍ，２Ｈ，４．４１，ｍ，１Ｈ，４．３０−４．０５，複数のｍ，４Ｈ，Ｃα−Ｈ；３．６６ないし２．２５，複数のｍ、脂肪族．及び芳香族．側鎖−Ｈ；２．９５，ｓ及び２．７５，ｓ，Ｎ−Ｍｅ；２．０５ないし１．１，複数のｍ，残留．脂肪族．Ｈ；１．２０，ｄ，Ｃβ−Ｈ  Ａｌａ；０．７５，ｍ，６Ｈ，Ｃδ−Ｈ  Ｌｅｕ
式Ｉの本発明による化合物をその受容体結合に関して試験した。該方法はＢｅｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１，５３５−５４３（１９９５）に記載される方法に密接に依存した。前記に開示した合成によって得られるセトロレリックスを［１２５Ｉ］（Amersham; 比活性８０．５Ｂｑ／フェムトモル）によってＩｏｄｏＧｅｎ試薬（Pierce）を使用してヨウ化した。該反応混合物を、逆相高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、その際、一ヨウ化されたセトロレリックスが未標識ペプチドを伴わずに得られた。それぞれ約８０％の［１２５Ｉ］−セトロレリックス及び未標識の本発明による化合物は特異的受容体会合のために適当であった。
【００５０】
本発明による化合物を、以下の方法１及び２を使用してそのインビトロ作用に関して試験し、その際、結合親和性を［１２５Ｉ］−セトロレリックス（方法１）との結合アッセイにおいて、かつ機能的活性をアンタゴニスト刺激としてのトリプトレリン（Triptorelin）（方法２）を使用して測定した。
【００５１】
方法１
Ｂｅｃｋｅｒｓ，Ｔ．，Ｍａｒｈｅｉｎｅｋｅ，Ｋ．，Ｒｅｉｌａｅｎｄｅｒ，Ｈ．，Ｈｉｌｇａｒｄ  Ｐ．（１９９５）“Selection and characterization of mammalian cell lines with stable overexpression of human pituitary receptors for gonadoliberin(GnRH)”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１，５３５−５４３による受容体結合アッセイ
受容体結合の調査のために、セトロレリックスを［１２５Ｉ］を有するＩｏｄｏＧｅｎ−試薬（Pierce）（Amersham;８０．５Ｂｑ／フェムトモルの比活性）を使用してヨウ化した。該反応混合物を交換相（Vertauschten Phase）を有する高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、その際、一ヨウ化されたセトロレリックスが未標識ペプチドを伴わずに得られた。約８０％の［１２５Ｉ］セトロレリックスは特異的受容体会合のために有用であった。
【００５２】
受容体結合アッセイを、インタクトな細胞を使用して記載（Beckers et al.1995）のような生理学的条件下に実施した。安定にトランスフェクションされたＬＴＫ-−細胞（ヒトのＬＨＲＨ受容体を発現する）の集密的になる前（Subkonfluent）の培養をＮａＣｌ／Ｐｉ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）／１ｍＭのＥＤＴＡ中でのインキュベーションによって分離し、遠心分離によって回収した。細胞ペレットを結合バッファー（Ｈ２ＣＯ３不含のＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌのグルコース、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．５，０．５％（質量／容量）のＢＳＡ、１ｇ／ｌのバシトラシン、０．１ｇ／ｌのＳＢＴＩ、０．１％（質量／容量）のＮａＮ３を有する）中に再懸濁した。置き換えアッセイ（Verdraengung-Assay）のために、０．２５×１０６細胞／１００μｌを約２２５ｐＭの［１２５Ｉ］−セトロレリックス（比活性５−１０×１０５ｄｐｍ／ピコモル）および競合物としての種々の濃度の本発明による未標識化合物と一緒にインキュベートした。１００μｌの結合媒体中の細胞懸濁液を４００μｌのアッセイ試験管中で２００μｌの８４容量％のシリコーン油（Merck Typ 550）／１６容量％のパラフィン油によって成層した。緩慢に連続的に振盪して３７℃で１時間インキュベートした後に、細胞を９０００ｒｐｍ（Rotortyp HTA13.8; Heraeus Sepatec, Osterode/Germany）での２分間の遠心分離によってインキュベーション媒体から分離した。細胞ペレットを含有する試験管の先端を切断した。細胞ペレット及び上清を引き続きγ−線のカウントによって分析した。非特異的な結合量を１μＭの最終濃度での未標識セトロレリックスによる遮断によって測定し、全結合は典型的には≦１０％であった。結合データの分析をＥＢＤＡ／リガンド−分析プログラム（Biosoft V3.0）を使用して実施した。
【００５３】
方法２
アンタゴニスト作用の測定のための機能的アッセイ
該アッセイは幾つかの変更を加えてＢｅｃｋｅｒｓ，Ｔ．，Ｒｅｉｌａｅｎｄｅｒ，Ｈ．，Ｈｉｌｇａｒｄ，Ｐ．（１９９７）“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎａｌｏｇｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ”，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１，１７−２３（Beckers et al.1997）に記載のように実施した。１ウェルあたり、ヒトのＬＨＲＨ受容体及びルシフェラーゼ−リポーター遺伝子を発現する１００００細胞をマイクロタイタープレート中で２４時間、添加物及び１％（v:v）ＦＣＳｉと一緒にＤＭＥＭを使用して培養した。これらの細胞を引き続き１ｎＭの［Ｄ−Ｔｒｐ６］ＬＨＲＨで６時間刺激した。本発明による拮抗性化合物を刺激の前に添加し、これらの細胞を細胞性Ｌｕｃ−活性の定量のために最後に溶解した。用量−作用−曲線からのＩＣ５０値の計算を非線形回帰分析によってＨｉｌｌモデル（Programm EDX 2.0 von C.Grundwald, Arzneimittelwerk Dresden）を使用して実施した。
【００５４】
Ｌｕｃ−活性の定量を、実質的に記載（Promega Technical Bulletins #101/161）のように、その都度ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega E4030）を使用して全く同一に実施した。補酵素Ａ（ＣｏＡ）の添加によって、ルシフェリル−ＣｏＡの酸化が有利なキネティックを伴って行われた。マイクロタイタープレートからの培養培地の除去の後に、細胞を１００μｌのリシスバッファー（２５ｍＭのトリス−リン酸塩ｐＨ７．８，２ｍＭのジチオトレイトール、２ｍＭの１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＣＤＴＡ）、１０％（v:v）のグリセリン、１％（v:v）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の添加によって溶解した。室温で１５分間インキュベートした後に、１０μｌの細胞溶解物を蛍光測定的分析のために適当な白色のマイクロタイタープレート（Dynatech）に移した。酵素反応を５０μｌのアッセイバッファー（２０ｍＭのトリシンｐＨ７．８、１．０７ｍＭ（ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２、２．６７ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、３３．３ｍＭのジチオトレイトール、２７０μＭの補酵素Ａ、４７０μＭのホタル（Photinus pyralis）−ルシフェリン、５３０μＭのｒＡＴＰＮａ２）の添加によって開始させた。１分後に、１秒間の全時間の間、蛍光は５分間のシグナル半減期でＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ ＬＢ ９６ Ｐの使用下に測定された。
【００５５】
前記のように以下のインビトロデータが得られ、その際、ＫＤは結合親和性を表し、かつＩＣ５０は機能的活性を表し、かつｐＭは１リットルあたりのピコモルを意味する：
【００５６】
【表２】
0003801867.tif 000007