(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反復配列を含んで成る標的配列を分析する方法であって、当該反復配列は式ＡpＣyＧaＴzを有し、ここで、ＴはＵで置換することができ、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは塩基を表し、ｐ、ｙ、ａおよびｚは０から５であり、ｐ＋ｙ＋ａ＋ｚの合計は少なくとも２であり、反復配列は当該標的配列内で前後して少なくとも２回繰り返し、そしてＡ、Ｃ、ＧおよびＴまたはＵはいずれの順序であっても良く、当該方法は、
ａ）標的配列を含んで成る試験試料と標的配列捕獲試薬とを接触させて標的配列／捕獲オリゴヌクレオチドのハイブリッドを形成させる工程、ここで、当該標的配列捕獲試薬は、固形支持体に固定した少なくとも第一および第二の捕獲オリゴヌクレオチドを含んで成り、ここで、
（ｉ）当該第一捕獲オリゴヌクレオチドは、当該反復配列に相補的な第一の多重度の配列を含んで成り、
（ｉｉ）当該第二捕獲オリゴヌクレオチドは、当該反復配列に相補的な第二の多重度の配列を含んで成り、そして
（ｉｉｉ）当該第一の多重度は、当該第二の多重度と異なり、
ｂ）当該ハイブリッドの環境のストリンジェンシーを増大して当該ハイブリッドの漸進的解離を引き起こす工程、
ｃ）当該ハイブリッドの漸進的解離を検出する工程、および
ｄ）当該標的配列内の当該反復配列の多重度を測定する（ここで、当該反復配列の測定された多重度は、当該捕獲オリゴヌクレオチドに比例する）工程を含んで成ることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
当該漸進的解離の検出が、当該ハイブリッド漸進的解離中の検出可能なシグナルの変化を監視することにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該第一および当該第二捕獲オリゴヌクレオチドが、当該固形支持体に配置されて固定される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
当該標的配列／捕獲オリゴヌクレオチドのハイブリッドを形成した後、そして当該ハイブリッドの環境のストリンジェンシーを増大する前に洗浄工程を更に含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項５】
当該漸進的解離を、光学的導波管装置を用いて検出する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
当該試験試料と当該リピート捕獲試薬とを接触させる前に、試験試料前処理工程を更に含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項７】
当該ハイブリッドの環境のストリンジェンシーの当該増大を、当該ハイブリッドの環境の温度を上昇させることにより達成する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
標的配列を捕獲するための標的配列捕獲試薬であって、
ａ）少なくとも２種のオリゴヌクレオチド、ここで、
（ｉ）第一オリゴヌクレオチドは、反復配列に相補的な第一の多重度の配列を含んで成り、
（ｉｉ）第二オリゴヌクレオチドは、当該反復配列に相補的な第二の多重度の配列を含んで成り、そして
（ｉｉｉ）当該標的配列は、当該反復配列を含んで成り、当該反復配列は、式ＡpＣyＧaＴzを有し、ここで、ＴはＵで置換することができ、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは塩基を表し、ｐ、ｙ、ａおよびｚは０から５であり、ｐ＋ｙ＋ａ＋ｚの合計は少なくとも２であり、反復配列は当該標的配列内で前後して少なくとも２回繰り返し、そしてＡ、Ｃ、ＧおよびＴまたはＵはいずれの順序であっても良い、および
ｂ）当該少なくとも２種のオリゴヌクレオチドが固定される固形支持体を含んで成る、前記捕獲試薬。
【請求項９】
当該少なくとも２種のオリゴヌクレオチドが、当該固形支持物質に配置されて固定される、請求項８記載の捕獲試薬。
【請求項１０】
当該捕獲試薬が、光学的導波管装置の一部を形成する、請求項８記載のリピート捕獲試薬。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、連続的に反復する核酸配列に関し、特に、反復配列が連続的に反復する回数を分析する方法に関する。
発明の背景
ヒトゲノムの特定の領域は、いろいろ呼び方はあるがタンデム・リピートと呼ばれる、連続的に反復する核酸配列を含有する。３個のヌクレオチドの反復配列は、普通、゛トリプレット・リピート゛と呼ばれ、一定の多重度の反復配列は正常であるが、遺伝的突然変異は、多重度が１世代毎に増加する傾向がある不安定な構造の原因となるリピートの多重度を増加させ得る。不幸にも、多重度が一定数を超えて増加する場合、反復領域は、精神遅滞、神経筋消耗性弛緩、運動失調、不随意運動、てんかん、痴呆および神経軽症麻庫のような重篤な肉体的形質を発現する疾患の原因となり得る。
例えば、健康な個体は、ＣＧＧ配列が、５０回未満繰り返すＣＧＧトリプレット・リピートを有する。この長さを超える場合、不安定に帰する。リピートの数が、２００を超える場合、脆弱Ｘ症候群と呼ばれる遺伝的疾患が起こる。不安定な長さの範囲（即ち、ＣＧＧリピートが５０から２００重複）は、゛前突然変異゛と呼ばれ、将来の世代が、完全に突然変異を起こした配列を受け継ぎがちである上述の遺伝的現象に帰する。筋緊張性ジストロフィと呼ばれる同様の遺伝的疾患は、約１００回を超えて反復するＣＴＧ配列を有するヒトに特徴的である。ＣＴＧが、約５２から約９０回の範囲で反復する個体は、前突然変異段階にあり、ＣＴＧが、約５から約３７回反復する個体は、正常である。歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症は、トリプレット・リピート増大が特徴的である遺伝的疾患の更なる例である。
例えば、ウィルスに起因するもののような他の疾患は、ゲノム中のユニークな核酸配列の存在により特徴づけることができ、その特定の標的配列の検出は、比較的簡単である。しかしながら、増大したリピート配列が特徴的である遺伝的疾患の検出は、配列が重複していること、及び疾患を示すのは配列それ自体の存在ではなくこの重複の程度であることから困難である。従って、例えば、リピート配列に相補的である配列を被覆した固形支持物質は、配列の長さに関係無くリピート配列とハイブリダイズする。それ故に、リピート配列の存在を検出することは可能であるが、配列の長さを測定することは、問題が残る。結果として、従来の捕獲試薬は、一般的に、反復配列が一定の多重度を超える場合に起こる遺伝的疾患を検出するのには用いられない。
従って、現在の研究の慣行では、タンデム・リピート配列は、典型的には配列決定反応に用いるゲルシステムを用いたゲル電気泳動により分析される。臨床的慣行では、リピート配列のサイズの相違を決定するのが困難であることから、制限酵素断片法およびサザン・ブロットが用いられる。
発明の概要
本発明は、反復配列に相補的な異なる多重度の配列を有する１セットのオリゴヌクレオチドに比例した標的配列内に見い出される反復配列の回数を測定するために標的配列を分析する方法を提供する。この方法は、迅速且つ容易に自動化され、従って技術者の最小限の関与しか要さない。反復配列は、式ＡpＣyＧaＴzに従い、ここで、Ｔは、Ｕで置換することができ；Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは、塩基を表し；ｐ、ｙ、ａおよびｚは、０から５であり；ｐ＋ｙ＋ａ＋ｚの合計は、少なくとも２であり；Ａ、Ｃ、ＧおよびＴまたはＵは、いずれの順序であっても良い。反復配列は、標的配列内で前後して少なくとも２回繰り返し、本発明によるこのような標的配列を分析する方法は、試験試料と標的配列捕獲試薬とを接触させて標的配列／捕獲オリゴヌクレオチドのハイブリッドを形成させることを含んで成る。標的配列捕獲試薬は、固形支持体に固定された少なくとも２種の捕獲オリゴヌクレオチドを含んで成り、これらの捕獲オリゴヌクレオチドは、反復配列に相補的な異なる多重度の配列を有する。標的配列捕獲試薬により形成したハイブリッドの環境のストリンジェンシーの増加により、ハイブリッドが漸進的に解離する。漸進的ハイブリッド解離パターンを検出して標的配列における反復配列の多重度を測定することができ、この多重度は、捕獲オリゴヌクレオチド内に見られる相補的配列の多重度に比例して測定される。
上述の式を有する反復配列を含んで成る、標的配列を捕獲するための標的配列捕獲試薬も提供される。捕獲試薬は、固形支持物質に固定した、反復配列に相補的な異なる多重度の配列を有する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含んで成る。
図の簡単な説明
図１は、標的配列捕獲試薬を模式図により示す。
図２および３ａ−３ｃは、ハイブリッド形成または解離を検出するための光学的導波管装置および光学的導波管装置使用の背景にある概念を模式図により具体的に説明する。
図４および５は、標的配列捕獲試薬の模式的具体的説明である。
図６および８は、反復配列の数の関数としてコンピューターが作成したハイブリッド融解温度のグラフによる表現である。図７ａ−７ｅ、９ａ−９ｅ、および１０（ａ）−１０（ｄ）は、本発明による標的配列の分析を模式図により示す。
発明の詳細な説明
本明細書で用いる゛反復配列゛とは、連続して又は前後して反復される塩基または核酸配列を意味する。また、本発明の目的に適うべく、゛標的配列゛とは、反復配列を含んで成る核酸配列を意味し、反復配列を含有する標的配列の領域を゛リピート領域゛と呼ぶ。例えば、連続する塩基ＣＴＧＣＴＧＣＴＧを含む標的配列において、反復配列は、ＣＴＧである。本明細書で用いる゛塩基゛とは、その通常の意味を有し、且つ変形した及び天然に存在する、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グナニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）のようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。反復配列は、式ＡpＣyＧaＴzにより表すことができ、ここで、Ｔは、Ｕで置換することができ；Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは、塩基を表し；ｐ、ｙ、ａおよびｚは、反復する一連の塩基内に各塩基が存在する回数を表し、０から５の範囲にあることができ；ｐ＋ｙ＋ａ＋ｚの合計は、典型的には２以上、好ましくは３であり；Ａ、Ｃ、ＧおよびＴまたはＵは、反復配列内でいずれの順序でもあることができ；そして、反復配列は、典型的には、標的配列内で２回以上、更に典型的には５から２００回繰り返す。反復配列を特徴付けるのに用いた゛いずれの順序゛とは、反復配列内の塩基がいずれの配列であってもよいこと、同じ塩基の多重出現が、隣接するシリーズ内で相互に隣り合っていても又は、少なくとも１個の異なる介在塩基により分かれていても良いことを意味することを意図している。例えば、ｐが２に等しく；ｙが１に等しく；ａおよびｚが、０に等しく；そして反復配列が２回繰り返す場合；以下の配列：ＡＡＣＡＡＣ；ＡＣＡＡＣＡ；またはＣＡＡＣＡＡが可能である。
リピート領域を有する相補的配列を含む相補的二重鎖核酸配列は、種々のストリンジェントな条件下で解離することが公知である。通常、異なる長さを有する、ハイブリダイズした核酸配列即ち゛ハイブリッド゛は、やはり異なるハイブリダイゼーション強度を有し、より長い配列は、より短い配列と比較してより強固なハイブリッドを形成する。従って、より長鎖のハイブリッドを解離するには、よりストリンジェントな条件が必要とされる。本発明の方法は、標的配列内の反復配列の多重度を示すために、異なる鎖長のハイブリッドを解離するのに必要とするストリンジェンシーの相違を利用する。
本発明は、標的配列内の反復配列の多重度を捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度と比較して測定することにより、遺伝的疾患又はそれに対する感受性を検出するのに特に適している。表１は、反復配列増大により特徴付けられる例示的遺伝的疾患、反復配列、ならびに正常な個体、前突然変異の個体および疾患のある個体を特徴付ける反復配列の多重度の範囲のリストを提供する。
0003853845.tif 000002
反復配列を含む可変の鎖長のハイブリッドを解離するのに要するストリンジェンシーの相違を利用することにより、このような遺伝的異常を、本発明により検出することができる。例えば、試験試料、及びその中に含まれるいずれかの標的配列を、種々の多重度の反復配列に相補的な配列を有する少なくとも２種の捕獲オリゴヌクレオチドを含む標的配列捕獲試薬と接触させることができる。それにより標的配列／捕獲オリゴヌクレオチドのハイブリッドを形成させ、ストリンジェンシーを次第に増大させる。次第に増大するストリンジェンシーは、相補的配列間のハイブリダイゼーションの量に基づいて、ハイブリッドを漸進的に解離させ、最も多くの塩基対を介して形成されたハイブリッドは、最後に解離する。その結果生じた漸進的ハイブリッド解離パターンの検出は、捕獲オリゴヌクレオチド内の反復配列の相補的配列の数に相関して、標的配列内に見い出される反復配列の回数の測定を可能にする。
゛試験試料゛とは、標的配列を含有すると考えられる材料を指す。供試試料は、血液、唾液、眼の水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水、粘液、滑液、腹腔液、羊水等を含む生理学的液体、または発酵ブロス、細胞培養物、化学反応混合物等のようないずれの生物学的源からも得ることができる。試験試料は、（ｉ）源から得られたまま直接または（ｉｉ）試料の特性を改変する前処理後、用いることができる。従って、試験試料は、例えば、血液から血漿を調製、固形物質から液体を調製、粘稠な液体を希釈、液体を濾過、液体を蒸留、液体を濃縮、干渉成分を不活性化、試薬を添加すること等により、使用前に前処理することができる。また、試験試料は、消化、制限または二重鎖核酸配列を一本鎖にするよう前処理することができる。更には、試験試料は、その中に含まれているかもしれない標的配列を集め、精製し、増幅又はさもなければ濃縮するよう前処理することができる。
上述のように、標的配列は、増幅することができ、例えば、米国特許４，６８３，１９５および４，６８３，２０２に記載されているポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）のような当業界で周知の増幅反応を、この目的に用いることができる。適切な増幅プライマーは、リピート配列を含有する領域をフランクすることが公知である（または測定することができる）配列に基づいて選択することができる。反復配列はＧＣ含量に富み、ＰＣＲ法を用いたこのような領域の増幅は、二次構造を有する増幅生成物を生じさせることは、特筆すべきである。ＧＣに富む領域の増幅中の二次構造を回避する方法には、７−デアザ−２′−デオキシグアノシン−５′−三燐酸、即ち国際特許出願第ＷＯ  ９０／０３４４３に記載の改変Ｇヌクレオチドの使用が含まれる。よって、ＰＣＲ法を用いてＧＣに富むリピート配列を増幅する場合、７−デアザ−２′−デオキシグアノシン−５′−三燐酸を用いるのが好ましい。また、シャーリングＭ．（Schalling M.）等，Nature Genetics, 4巻，135-139ページ（1993）は、標的配列のリピート領域とハイブリダイズする多重度プローブの多重ライゲーションを通じてより効率的に標的配列を増幅するのに適した好ましい且つ改変したＬＣＲ法について述べている。
前処理していようとなかろうと、試験試料は、捕獲オリゴヌクレオチドと接触するものであり、同様にポリヌクレオチドを包含するものとする゛捕獲オリゴヌクレオチド゛とは、例えば、核酸、リボ核酸および、それらに限定される訳ではないが国際特許出願ＷＯ  ９２／２０７０２に開示されたペプチド核酸（ＰＮＡｓ）または米国特許第５，１８５，４４４、５，０３４，５０６および５，１４２，０４７に説明されているモルホリノ類似体を含む未荷電の核酸類似体のような核酸類似体を含んで成ることができる。
捕獲オリゴヌクレオチドは、標的配列のリピート領域に少なくとも部分的に相補的であり、従って、反復配列に相補的である少なくとも１配列の塩基を有する。しかしながら、この相補的配列が特定の捕獲オリゴヌクレオチド内で反復する回数は、反復配列が標的配列内で反復する回数より多くても、同じでも又は少なくても良い。このように、捕獲オリゴヌクレオチドは、反復配列により決定される一連の塩基を有するが、捕獲オリゴヌクレオチドは、標的配列に部分的に相補的である必要しかないことから、特定の捕獲オリゴヌクレオチドは、標的配列より長い、短い又は同じ鎖長であってもよい。故に、Ｐが２に等しく、ｙが１に等しく、ａおよびｚが、０に等しく、反復配列が２回繰り返し、そして反復配列の順序がＡＡＣである上記で提供した反復配列の例を用い、この配列とハイブリダイズするように設計された捕獲オリゴヌクレオチドは、以下の配列：ＴＴＧ、ＴＴＧＴＴＧまたはＴＴＧＴＴＧＴＴＧを有することができる。
捕獲オリゴヌクレオチド配列の一部分は、標的配列のリピート領域に相補的であるが、捕獲オリゴヌクレオチドは、通常、標的配列に完全には相補的ではない。これはいくつかの理由で事実である。第一に、前述のように、捕獲オリゴヌクレオチドは、反復配列に相補的である種々の多重度の配列を有することができる。例えば、標的配列捕獲試薬上の捕獲オリゴヌクレオチドの１つは、反復配列が実際に標的配列中に見い出される正確な多重度で反復配列の相補体であり、故にその捕獲オリゴヌクレオチドを標的配列のリピート領域に正確に相補的にする配列から成ることができる。他方、標的配列捕獲試薬を形成する他の捕獲オリゴヌクレオチドは、標的配列内に存在する反復配列の実際の多重度より多いか又は少ない多重度の反復配列の相補体を含むことができる。更には、標的配列内の反復配列の多重度が、捕獲オリゴヌクレオチド内のリピートの数と合っていたとしても、捕獲オリゴヌクレオチドは、例えば、下記に更に詳細に説明するように、固形支持物質に捕獲オリゴヌクレオチドを固定するために用いることのできる核酸尾部のような更なる塩基対を含んで成ることができる。あるいは、試験試料は、例えば、反復領域に隣接する（またはフランクする）領域とハイブリダイズする増幅プライマーまたはプローブを用いることにより得られた増幅した標的配列を含有することができる。従って、その結果生じた増幅生成物は、反復配列以外の配列を含むことができる。更に、試験試料が、例えば、消化または制限により前処理される場合、標的配列は、反復領域に隣接する領域を含んで成ることもできる。故に、捕獲オリゴヌクレオチドの配列は、常に、リピート領域の完全な相補体であるとは限らない。
前述のように、捕獲オリゴヌクレオチドは、固形支持物質に固定して標的配列捕獲試薬を形成することができる。本明細書で用いた゛固形支持物質゛とは、不溶性であるか又は引き続く反応により不溶性にすることのできる、この目的にとって周知のいずれの物質も意味する。従って、固形支持物質は、例えば、ラテックス、プラスチック、誘導プラスチック、磁気または非磁気性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロタイター  ウェル、シート、チップおよび当業者等に公知の他の形状物であってもよい。固形支持物質が、必要な場合、標的配列による接近を可能にするのに十分な多孔性を有するいかなる適切な多孔性物質も含んで成ることができることが考えられ、且つそれも本発明の範囲内にある。
捕獲オリゴヌクレオチドは、例えば、吸着、共有結合、チオール酸金相互作用または、前述のようなポリヌクレオチド尾部のようないずれの周知の方法論を用いても支持物質に結合することができる。
捕獲オリゴヌクレオチドは、任意に支持物質に固定することができるが、好ましくは、捕獲オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個所の離れたオリゴヌクレオチド捕獲部位を支持物質上に形成するパターンを意味する゛配置゛で固形支持物質に固定する。個々の捕獲部位は、反復配列に相補的な同じ多重度の配列を有する捕獲オリグヌクレオチドを含んで成る。故に、一方の部位は、５回反復する反復配列の相補体を有する捕獲オリグヌクレオチドを含むことができ、他の捕獲部位は、１０回反復する反復配列の相補体を有する捕獲オリグヌクレオチドを含むことができる。捕獲オリグヌクレオチド部位の配置は、反復配列が、特定の部位にハイブリダイズするかどうかに関して為される区別を可能にする。典型的には、捕獲オリゴヌクレオチドの配置は、捕獲オリゴヌクレオチド部位を相互に物理的に離すことにより作る。結果として、同じ多重度の所定の配列を含む捕獲オリゴヌクレオチドは、異なる多重度の配列を有する捕獲オリゴヌクレオチドから分けられる。
配置内の捕獲オリゴヌクレオチド間の距離は、主として、選択した検出システムの分解能に基づく当業者の選択の問題である。同様に、オリゴヌクレオチドを固定する部位のサイズ、及びこれらの部位に固定するオリゴヌクレオチドの濃度は、やはり用いる検出システムに基づくことができる当業者の選択の問題である。詳しくは、敏感な検出システムは、反復配列が、高い表面密度の詰まった間隔の捕獲オリゴヌクレオチドを有する捕獲試薬にハイブリダイズするかどうかを検出することができる。従って、ＣＣＤカメラを用いて特定の部位のハイブリッドの存在または非存在を観察するとしたなら、配置の単純な機械的に補助されていない観察を行う場合よりも、小さい部位、低いオリゴヌクレオチド濃度、およびオリゴヌクレオチド間の短い間隔を用いることができる。
捕獲オリゴヌクレオチドの配置としては、例えば、支持物質上の少なくとも２個所の捕獲オリゴヌクレオチド  スポットのような単純なパターンを挙げることができ、これらの捕獲オリゴヌクレオチド  スポットは、反復配列に相補的である異なる多重度の配列を含んで成る。更に複雑なパターンは、米国特許第５，４０５，７８３、米国特許第５，４１２，０８７、サザンＥ．Ｍ．（Southern E. M.）等，Nucleic Acids Research, 22巻，8号，1368-1373ページ（1994）およびマスコス  Ｕ．（Maskos U.）等，Nucleic Acids Research, 21巻，20号，4663-4669ページ（1993）に記載の方法論を用いて作ることができる。
オリゴヌクレオチドの好ましいパターンを、リピート捕獲試薬１０を具体的に説明する図１に示す。図１により示されるように、固形支持体２０は、捕獲部位３０、４０および５０を形成するようその上に固定された捕獲オリゴヌクレオチドを有する。本発明によれば、捕獲部位３０は、反復配列の４倍の相補体を有する捕獲オリゴヌクレオチドを有することができ；捕獲部位４０は、反復配列の７倍の相補体を有する捕獲オリゴヌクレオチドを有することができ；そして捕獲部位５０は、反復配列の１０倍の相補体を有する捕獲オリゴヌクレオチドを有することができる。
標的配列の反復領域の相補的領域とリピート捕獲試薬の捕獲オリゴヌクレオチドとの接触は、捕獲オリゴヌクレオチドが、標的配列のリピート領域に種々の度合いで相補的であることから、種々の度合いのハイブリダイゼーション強度を有する標的配列／捕獲オリゴヌクレオチドのハイブリッドの形成に帰する。更に、標的配列のリピート領域と特定の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの度合い（または塩基ペアリングの量）は、通常、より多くの塩基ペアリングを有するハイブリッドが、より少ない塩基ペアリングを有するハイブリッドよりも安定であることから、最大の度合いまで可能である。従って、可能性のある最大の程度まで塩基ペアリングを通じて形成したハイブリッドは、好ましいハイブリッドであり、主たる標的配列／捕獲オリゴヌクレオチド  ハイブリッドであろう。しかしながら、前述したように、最大の度合いのハイブリダイゼーションを有する配列は、最も安定であり、従って、解離が最も困難である。
ハイブリッド環境における次第に増大するストリンジェンシーは、ハイブリッドを漸進的に解離させる。本明細書で用いた゛漸進的に解離゛とは、相補的一本鎖配列間に起きる塩基ペアリング相互作用の量に基づく解離を意味する。従って、漸進的解離は、本発明により、標的配列／捕獲オリゴヌクレオチド配列ハイブリッドを取り巻く環境においてストリンジェンシーが次第に増大するにつれて起きる。次第に増大するストリンジェンシーは塩基ペアリングの量に基づいて、段階に応じた解離パターンを生じさせ、その解離パターンは標的配列内の反復配列の多重度を示すべく検出することができる。詳しくは、条件のストリンジェンシーの増大に応答して、最も弱いハイブリッド、即ち、最も少ない量の塩基ペアリングで形成されたものは、初めに解離し、最も多い量の塩基ペアリングを通じて形成されたものは、最後に解離する。したがって、種々の標的配列／捕獲オリゴヌクレオチド  ハイブリッドの解離を検出することにより、反復配列の多重度を、捕獲オリゴヌクレオチドに比例して測定することができる。漸進的解離は、全てのハイブリッドが直ちに解離する１回の解離事象を含む解離パターンまたは、複数の解離事象が異なるストリンジェンシーで起こる解離パターンを含むことができるのは当然のことである。
本発明によれば、捕獲オリゴヌクレオチド内の反復配列の相補体に比例した反復配列の多重度を測定することができる。本明細書で用いた゛捕獲オリゴヌクレオチドに比例゛とは、反復配列が標的配列内に存在する回数の評価を、その相補体が捕獲オリゴヌクレオチド内で見い出される回数に関して為すことができるという意味である。よって、標的配列内の反復配列の多重度の特徴付けを、それが特定の捕獲オリゴヌクレオチドに関係することから、為すことができる。捕獲オリゴヌクレオチドに比例した、特定の標的配列内の反復配列の多重度は、例えば、捕獲オリゴヌクレオチド内の反復配列相補体の多重度゛より小さい゛、゛より大きい゛、または゛より小さい若しくはそれに等しい゛のような特徴付けを含むことができる。
例えば、反復配列の溶液と、それぞれが反復配列に相補的な異なる多重度の配列を有する３種の捕獲オリゴヌクレオチドを含んで成るリピート捕獲試薬とのハイブリダイゼーションは、（ｉ）標的配列内の反復配列の多重度が、全ての捕獲オリゴヌクレオチド内に見い出されるその相補体の多重度より小さい、（ｉｉ）標的配列内の反復配列の多重度が、中サイズの捕獲オリゴヌクレオチド内に見い出されるその相補体の多重度と同じ、又は（ｉｉｉ）標的配列内の反復配列の多重度が、いずれの捕獲オリゴヌクレオチド内に見い出されるその相補体の多重度よりも大きい状況を含むことができる。リピート捕獲試薬に関する考察の目的のため、最も小さい多重度の反復配列相補体を有する捕獲オリゴヌクレオチドを、最も短い捕獲オリゴヌクレオチドと呼び、最も大きい多重度の反復配列相補体を有する捕獲オリゴヌクレオチドを、最も長い捕獲オリゴヌクレオチドと呼び、そして、最も短い捕獲オリゴヌクレオチドと最も長い捕獲オリゴヌクレオチドの間の多重度の反復配列相補体を有する捕獲オリゴヌクレオチドを、中サイズの捕獲オリゴヌクレオチドと呼ぶ。
前述の３通りの可能性のシナリオに関して、第一の場合、標的配列の相補的部分と全ての捕獲オリゴヌクレオチドとの完全な塩基ペアリングが起こり、従って、その結果生じた全ハイブリッドは、同じハイブリダイゼーション強度を有する。故に、全ての標的が、共通のストリンジェンシーで捕獲オリゴヌクレオチドから解離する。この漸進的解離パターンの検出により、標的配列が、最も短い捕獲オリゴヌクレオチド内の反復配列相補体の多重度より小さい又はそれに等しい多重度の反復配列を含有することを測定することができる。
第二の場合、標的配列の相補的部分と最も短い捕獲オリゴヌクレオチドとの不完全な塩基ペアリングが起こり、標的配列の相補的部分と中サイズおよび最も長い捕獲オリゴヌクレオチドとの完全な塩基ペアリングが起こる。故に、最も短い捕獲オリゴヌクレオチドで形成されたハイブリッドは、初めに解離し、その他は、より強い共通のストリンジェンシーで解離する。この漸進的解離を検出することにより、反復配列の多重度が、最も短い捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より大きい、中サイズの捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より大きい若しくはそれに等しい、そして最も長い捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より小さいことを測定することができる。
第三の場合、ハイブリッドは、再度、すべての捕獲オリゴヌクレオチドで形成されるが、反復配列の多重度が、いずれの捕獲オリゴヌクレオチド内に見い出されるその相補体の多重度よりも大きいことから、標的配列は、全ての捕獲オリゴヌクレオチドの上に張り出る。それにもかかわらず、最も長い捕獲オリゴヌクレオチドは、標的配列のリピート領域との最も多量の塩基ペアリングを有することから、最も強力なハイブリッドを形成する。従って、次第に増大するストリンジェントな条件下では、ハイブリッドは、最も短い捕獲オリゴヌクレオチドから初めに解離し；続いて標的配列と中サイズの捕獲オリゴヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドが解離し；引き続き順番に、リピート配列と最も長い捕獲オリゴヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッドが解離する。この漸進的解離の検出は、反復配列の多重度が、最も長い捕獲オリゴヌクレオチド内で見い出されるその相補体の多重度より大きいか又はそれに等しいことを示す。
次第に増大するストリンジェンシーは、ハイブリッド配列を解離し且つ相補的核酸配列間の塩基ペアリングの量に基づく有効性を有するいずれかの化学的または物理的現象によって、もたらすことができる。例えば、ｐＨの変化およびイオン強度の変化は、塩基ペアリングの量に基づき種々の度合いでハイブリッド配列を解離する。詳しくは、より長いハイブリッドを解離するには、より短いハイブリッドを解離するのに要するものより低いｐＨおよびイオン強度が要求される。同様に、より長い配列を相互に解離するには、より短い配列を相互に解離するのに要するものより高い融点（Ｔｍ）が要求される。従って、温度、ｐＨおよびイオン強度の変化を、ハイブリッドを取り巻く環境のストリンジェンシーを変える手段として用いることができる。
例えば、ｐＨまたはイオン強度を用いてストリンジェンシーを増大しハイブリッドを解離する場合、種々のｐＨまたはイオン強度を有するバッファーとハイブリッドとを連続して接触させ、それにより次第にストリンジェンシーを増大し、漸進的ハイブリッド解離を引き起こす。あるいは、例えば、温度を用いてストリンジェンシーを増大する場合、ハイブリッドの環境温度を、次第に増大させ、それによりストリンジェンシーを増大し、漸進的様式で解離を引き起こす。ストリンジェンシーの増大は、潜在的に複数の液体移動の必要性を排除することから、好ましくは、連続的温度上昇により達成する。
゛ハイブリッドの環境゛は、次第に増大するストリンジェンシーが、上記で考察した様式で解離を引き起こす、ハイブリッドを取り巻く領域である。
ハイブリッド解離の検出は、標的配列、捕獲オリゴヌクレオチド、またはリピート配列と捕獲オリゴヌクレオチドの両方に検出可能な標識を組み込むことにより補助することができる。標識とは、検出することのできる性質または特徴を有するいずれの部分も指す。標識は、例えば、ラジオアイソトープ、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子、挿入染料等によるように直接的に検出可能であってもよいし；または標識は、例えば、特異的結合構成員によるように間接的に検出可能であっても良い。直接的標識は、標識の検出を可能にする、例えば、基質、トリガー試薬、光等のような更なる成分を必要としてもよいことは、当然のことである。
間接的標識を用いる場合、それらは、代表的には、゛共役物（conjugate）゛と組み合わせて用いる。共役物は、代表的には、特異的結合構成員に結合した又はカップリングした直接検出可能な標識である。本明細書で用いる゛特異的結合構成員゛とは、結合対の構成員、即ち、分子の一方が、例えば、化学的または物理的手段を介して他方の分子に特異的に結合する２種の異なる分子を意味する。抗原および抗体の特異的結合対に加え、他の特異的結合対としては、それらに限定される訳ではないが、アビジンおよびビオチン；それぞれ１９９３年７月１日に出願された米国特許第５，４２４，４１４および米国特許出願番号０８／０８４，４９５に説明されているアダマンタンおよびカルバゾールのようなハプテンに特異的な抗体およびハプテン；相補的ヌクレオチド配列；酵素補因子または基質および酵素等が挙げられる。共役物を合成するカップリング化学は、当業界で周知であり、例えば、特異的結合構成員の特異的結合特性または標識の検出可能な特性を破壊しない化学的手段および／または物理的手段を挙げることができる。
他の検出態様によれば、上述のような標識の組み合わせを用いてハイブリッドの解離を検出することができる。例えば、標識の抑制または増強を生じさせる相補的配列とのハイブリダイゼーションにより抑制または増強される標識は、捕獲オリゴヌクレオチドまたは標的配列に組み込むことができる。例えば、一本鎖捕獲オリゴヌクレオチド上の標識は、蛍光シグナルを発することができるが、標識の抑制または増強を生じさせる標的配列とハイブリダイズした場合、シグナルを抑制することができるか又は、蛍光シグナルの波長は、もっぱら一本鎖捕獲オリゴヌクレオチドと会合した場合と異なるものとすることができる。結果として、一本鎖配列またはハイブリダイズした配列の存在を検出することができる。
例えば、ヌクレオチド、プライマーまたはプローブのような増幅試薬または合成試薬に標識を組み込むことにより、標識を、リピート配列または捕獲オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。このような試薬を標識する方法は、当業界で周知であり、例えば、米国特許第４，９４８，８８２に説明されている。
本発明の他の態様によれば、その中に組み込まれた検出可能な標識を有する標的配列を、例えばガラスチップ上の２種の捕獲オリゴヌクレオチド部位の配置を含んで成るリピート捕獲試薬と接触させることができる。第一の部位は、第二の部位のオリゴヌクレオチドに比し小さい多重度の、反復配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含んで成ることができる。２種の捕獲オリゴヌクレオチド部位でのハイブリッドの形成により、任意に洗浄工程を用いてハイブリダイズしていない標的配列を配置から分離することができ、両方の部位でのシグナルを、前述の方法論を用いて検出することができる。ストリンジェンシーは、例えば、温度増加を用いて増大させることができ、部位での解離は、これらの部位でのシグナルの損失を観察することにより検出することができる。反復配列が、いずれかの部位の捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より小さい多重度で標的配列に存在する場合は、部位で生じたシグナルは、共通のＴｍで減少する。この解離パターンの検出は、反復配列の多重度が、第一の部位の捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より小さいか又はそれに等しいことを示す。しかしながら、反復配列が、第一の部位の捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より大きい多重度で標的配列内に存在するが、第二の部位の捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より小さいか又はそれに等しい場合、標的配列は、第一の捕獲部位から初めに離れ、続いて第二の捕獲部位から離れる。従って、リピート配列内の反復配列の多重度は、捕獲部位からのシグナルの漸進的損失を観察することにより温度計のような様式で測定することができる（即ち、第一の部位のその相補体の多重度より大きい）。
別の態様によれば、捕獲オリゴヌクレオチドは、任意に、例えば、単一の部位で固形支持物質に固定することができる。この態様によれば、漸進的解離事象をカウントして標的配列内の反復配列の多重度を測定することができる。例えば、種々の多重度の反復配列相補体を有する３種の捕獲オリゴヌクレオチドを、固形支持物質上の単一のスポットに任意に固定し、標的配列と接触させることができる。標的配列と種々の捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成後、ストリンジェンシーを増大することができ、検出される解離事象の数に基づいて、標的配列内の反復配列の多重度を測定することができる。従って、全てのハイブリッドが、共通のストリンジェンシーで捕獲部位から解離する場合、１回の解離事象が検出され、反復配列の多重度は、最も短い捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より小さいか又はそれに等しい。あるいは、２回の解離事象が検出された場合、これは、標的配列が、初めに最も短い捕獲オリゴヌクレオチドから解離し、続いて中サイズおよび最も長い捕獲オリゴヌクレオチドから解離することを示し；従って、反復配列の多重度が、中サイズのオリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より大きいか又はそれに等しいが、最も長い捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の数より小さいことを示す。同様に、３回の解離事象が検出された場合、反復配列の多重度は、最も長い捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の多重度より大きいか又はそれに等しいことを測定することができる。
配置された捕獲オリゴヌクレオチド部位でのシグナルを検出する好ましい方法は、光学的導波管装置を用いて固体の基質上の結合事象又はそれがないことを検出する検出法を説明する、１９９４年９月２２日に出願された米国特許出願番号０８／３１１，４６２に見い出される。ハイブリダイゼーションの型のフォーマットに用いる導波管装置の能力は、当業界で公知である全内部反射（ＴＩＲ）と呼ばれる現象に基づく。図２に具体的に説明するように、ＴＩＲは、より密な媒体６２（即ち、より高い屈折率を有する、Ｎ1）に進入してより密な媒体とより疎の媒体６６（即ち、より低い屈折率を有する、Ｎ2）との間の境界面６４にぶつかる光６０が、臨界角が等式：
θC＝ａｒｃｓｉｎ（Ｎ2／Ｎ1）
により定義される臨界角θCより大きい角度θRで境界面にぶつかるならば、より密な媒体６２以内で完全に反射するという原理で作用する。これらの条件下で、゛減衰波゛として知られる電磁波が生じる。図２に示すように、より密な媒体中で光と会合した電場は、境界面に対して直交する定在正弦波６８を形成する。減衰波は、疎の媒体６６の中へと透過するが、そのエネルギーＥは、７０で示すように境界面からの距離Ｚの関数として指数的に減衰する。゛透過深度゛（図２の７２で示すｄp）として知られるパラメーターは、減衰波エネルギーが、境界面でのエネルギー値の０．３６８倍に落ちた、境界面からの距離として定義される。Ｅ＝（ｅ-1）・Ｅ0である深度としてｄpを定義する［サザーランド（Sutherland）等，J. Immunol. Meth., 74:253-265（1984）参照］。透過深度は、以下の通りに算定する：
0003853845.tif 000003
透過深度を増加させる傾向のある因子は：入射角θRの角度の増加；２つの媒体の非常に近い屈折率（即ちＮ2／Ｎ1−−＞１）；および波長の増加λである。例えば、石英ＴＩＲ要素（Ｎ1＝１．４６）を水性媒体（Ｎ2＝１．３４）中に置いた場合、臨界角θCは６６°（＝ａｒｃｓｉｎ０．９１７８）である。５００ｎｍの光がθR＝７０°（即ち、臨界角より大きい）で境界面に衝突する場合、ｄpは、約２７０ｎｍである。
また、ＴＩＲは、散乱全内部反射（゛ＳＴＩＲ゛）と呼ばれる技法に光散乱検出と連結して用いられてきた。例えば、シュット（Schutt）等の米国特許４，９７９，８２１および５，０１７，００９ならびにＷＯ  ９４／００７６３（Akzo N. V.）参照。この技法によれば、光線は、適切な角度でＴＩＲ要素の表面を斜めに走査し、光エネルギーは、減衰波を除き完全に反射する。透過深部内で特異的に結合した、赤血球、コロイド金またはラテックスのような粒子は、光を散乱させ、散乱光は、光検出手段により検出される。
図３Ａ−３Ｃは、平面導波管要素８２および平行な平面プレート８４を含んで成る導波管装置８０を具体的に説明する。このように、導波管要素は、平行な表面８６および８８ならびに光受領端９０を有する。同様に、プレート８４は、平行な表面９２および９４を有する。導波管要素８２およびプレート８４は、要素表面８８およびプレート表面９２が、狭い溝９６の境界を定めるような、空間を空けた平行な様式で共に保たれる。要素およびプレートは、要素およびプレートの端に沿って配置された両面テープから成る接着手段９８を含むいずれかの都合の良い手段により共に保つことができる。溝９６は、そこを通過する液体試料の毛細管移動を可能にするように、好ましくは、小さいほうがよい。例えば、高さは、約１ｍｍ未満、好ましくは約０．１ｍｍ未満であるべきである。
要素８２は、例えば、ガラス、石英または、ポリカーボネート、アクリル樹脂もしくはポリスチレンのようなプラスチックのような光学的に透明な物質で作成すべきである。導波管の屈折率は、当業界で公知であるように、全内部反射をもたらすため試料液の屈折率より大きい必要がある。水性試料溶液の屈折率ｎは、約１．３３であることから、導波管は、代表的には、１．３５を超える、通常約１．５以上の屈折率を有する。導波管は、プラスチックまたはガラスの１片であってもよく、例えば、顕微鏡の標準的ガラス  スライドまたはカバースリップを用いることができる。
プレート８４は、同様の物質で作製することができる。図３Ａおよび３Ｂに見るように、導波管要素８２の光受領端９０は、光源１０４から発する迷光の影響を最小にするため、マスク１０２の狭いスリット１００の中に配置される。迷光の最小化は、光吸収物質の使用によっても改善される。
入射光線を発生する光源１０４は、可視、紫外線、および近赤外線スペクトルのエネルギーを含む、電磁エネルギー源であってもよい。従って、゛光゛とは、かなり広く解釈され、検出が可視的に為される場合を除いて可視範囲に限定されない。非可視波長は、当業界で周知であるような、特定の波長に最適化した検出器により検出する。光は、単色または多色、平行または非平行、偏光または非偏光であってもよい。好ましい光源としては、レーザー、発光ダイオード、フラッシュ電球、アーク灯、白熱灯および蛍光燈が挙げられる。従って、導波管要素を照射するのに用いる光源は、低ワット量のヘリウム−ネオンレーザーであっても、または、ポケット懐中電灯に使うような、電池によって電力を供給する小さい白熱電球であってもよい。好ましくは、光源は、光源の強度を変化させるポテンシオメーター装置を含む。あるいは、フィルターおよび／またはレンズを用いて強度を適切な水準に調整することができる。
検出手段を用いて、光を散乱する標識（ＬＳＬ）により生じた光の散乱を測定することができる。図３Ｂで最も良く分かるように、ＬＳＬは、例えば、固定した捕獲オリゴヌクレオチドと同種のＤＮＡ配列との間のような特異的結合構成員間の相互作用を介し、導波管要素８２の表面８８に固定することができる。ＬＳＬは、入射光を弾力的に、即ち実質的に光のエネルギーを吸収することなく散乱させる、分子または物質、しばしば粒子である。例示的ＬＳＬｓとしては、金コロイドまたはセレンのような金属コロイドおよび非金属標識；赤血球；およびラテックス、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネートまたは類似の物質でできている染色したプラスチック粒子が挙げられる。このような粒状の標識のサイズは、１０ｎｍから１０μｍ、代表的には５０から５００ｎｍ、そして好ましくは７０から２００ｎｍの範囲である。粒子が大きいほど光の散乱作用が大きく、このシステムのユニークな特徴は、粒子の自己吸光力による溶液相から散乱を消滅させる能力である。粒子のサイズの上限は、完全には分かっていないが、自己凝集および沈殿する、より大きい粒子の増加傾向と関係づけることができる。適切な粒子ＬＳＬｓは、バングス  ラボラトリー（Bangs Laboratories）社，Camel, IN, USAから入手可能である。
器械の使用および可視検出手段を用いてＬＳＬにより生じた光の散乱の度合いを測定することができる。全導波管を横切る光散乱事象は、人間の観察者の裸眼によろうと、またはデジタル化されコンピューターを用いて処理される画像を形成するＣＣＤカメラを含む光検出装置によろうと、実質的に同時に監視することができる。
以下の実施例は、本発明を更に具体的に説明するものであり、本発明は、これにより制限されるものではない。
実施例１
リピート捕獲試薬の作製
この実施例において、ＣＴＧおよびＣＧＧリピートを有する配列を捕獲するよう設計されたリピート捕獲試薬を作製する。
捕獲オリゴヌクレオチド部位１１０、１１２、１１４、１１６および１１８が、ガラスチップ１２０に固定されている、模式的ＣＴＧリピート捕獲試薬を、図４に示す。配列ＧＡＣ（即ち、ＣＴＧの相補体）の１０回（配列番号１）、２０回（配列番号２）、３０回（配列番号３）、４０回（配列番号４）および５０回（配列番号５）のリピートを含んで成る捕獲オリゴヌクレオチドが、図４に示した方法でチップに固定されている重複ＣＴＧ捕獲試薬を作成する。図４において、バンド１１０が１０回のＧＡＣリピートの位置を図解し、バンド１１２が２０回のＧＡＣリピートの位置を図解し、バンド１１４が３０回のＧＡＣリピートの位置を図解し、バンド１１６が４０回のＧＡＣリピートの位置を図解し、そしてバンド１１８が５０回のＧＡＣリピートの位置を図解する。
捕獲オリゴヌクレオチド部位１３０、１３２、１３４および１３６が、ガラスチップ１３８に固定されている、模式的ＣＧＧリピート捕獲試薬を、図５に示す。ＧＣＣ配列（即ち、ＣＧＧの相補体）の２０回（配列番号６）、４０回（配列番号７）、６０回（配列番号８）および８０回（配列番号９）のリピートを有する捕獲オリゴヌクレオチドが、図５に示した方法でチップに固定されている重複ＣＧＧ捕獲試薬を作成する。図５において、バンド１３０が２０回のＧＣＣリピートの位置を図解し、バンド１３２が４０回のＧＣＣリピートの位置を図解し、バンド１３４が６０回のＧＣＣリピートの位置を図解し、そしてバンド１３６が８０回のＧＣＣリピートの位置を図解する。
実施例２
ＣＴＧリピート配列の鎖長の測定
この実施例において、５０回のＣＴＧリピートを有する核酸配列（配列番号１０）を、増幅し、実施例１で作成した重複ＣＴＧリピート捕獲試薬と接触させ、温度を漸進的に増大させる。
ＣＴＧリピート配列を、リピート領域のフランキング配列とハイブリダイズする５′ビオチン標識ＰＣＲプライマーを用いて増幅する。配列および対応する配列番号を、下記の表２に示す。
0003853845.tif 000004
試料を、サンペイ（Sanpei）等；Biochemical Biophysical Research Communications, 212巻，341-346ページ（１９９５年７月１７日）に説明された方法に従い、ＰＣＲ法により３０サイクル増幅する。増幅した試料を、１９９４年９月２２日に出願された米国特許出願０８／３１１，４６２に述べられているように、抗ビオチンと共役したセレンコロイドと混合する。共役した混合物を、次いで、全体のストリンジェンシーに影響を及ぼす１０ｍＭまたは１ｍＭの定められた塩濃度に希釈し、ハイブリダイゼーション条件下で２つのＣＴＧ捕獲試薬に供する。ハイブリダイゼーションがオリゴヌクレオチドと増幅した標的配列との間に起こるのに十分な時間が経過した後、未結合の物質を、定められた塩濃度を有するバッファーで試薬から洗い流し、一方、バッファーにおいては、２℃の増分で温度を上げ、各上昇温度で約１分間保持することにより、ハイブリッドの環境の温度を次第に増大させる。各増加温度で、種々の捕獲部位における増幅配列の存在または非存在を、標識により観察して解離パターンを測定する。
図６は、種々のハイブリッドが、２種の塩濃度で２つの捕獲試薬から解離する温度をグラフにより図解する。これらの溶解温度は、ナショナル  バイオサイエンス（National Biosciences）；Plymouth,ミネソタから入手可能であるソフトウェアプログラム゛オリゴ（Oligo）゛バージョン４．０３を用いて算定した。図６により示されるように、温度が増大するにつれ、増幅した配列は、捕獲オリゴヌクレオチドから漸進的に解離するが、どちらの塩濃度でも、１０回のリピートを有する捕獲オリゴヌクレオチドは、初めに解離し、５０回のリピートを有する捕獲オリゴヌクレオチドは、最後に解離する。しかしながら、より高い塩条件下で形成したハイブリッドを有する捕獲試薬は、一貫して、より低い塩条件下で形成したハイブリッドよりも高い温度で解離する。
１０ｍＭの塩濃度のこの実施例で述べた漸進的解離を、図７（ａ）−（ｅ）に模式的に示す。図７（ａ）は、標的配列とのハイブリダイゼーション前の、図４と連結して説明したＧＡＣ捕獲試薬の上から見た図である。図７（ｂ）は、増幅した標的配列とのハイブリダイゼーション後の捕獲試薬の上から見た図および側面図を示す。図７（ｂ）に示すように、ハイブリッド１４０は、種々の度合いのハイブリダイゼーションで全ての捕獲オリゴヌクレオチドと共に形成される。温度が６０℃に増大すると、塩基ペアリングの量が最も少ないバンド１１０で解離が起こり、バンド１１０からの解離は、図７（ｃ）に図解するように、そのバンドにおけるハイブリダイゼーションの非存在により検出される。温度が約６８℃に上昇すると、バンド１１２および１１４でのハイブリッドが、図７（ｄ）に示すように解離する。最後に、温度が７５℃を超えて上昇すると、最後のハイブリッドが、図７（ｅ）に示すように捕獲試薬から放出される。従って、試験試料は、少なくとも５０回の多重度の反復配列を含んで成る標的配列を含有していた。
実施例３
ＣＧＧリピート配列の鎖長測定
この実施例において、８０回のＣＧＧリピートを有する標的配列（配列番号１３）を、実施例２におけるように増幅し、実施例１で作製したような重複ＣＧＧリピート捕獲試薬と接触させ、温度を漸進的に増大させる。
ＣＧＧリピート配列を、リピート領域のフランキング配列とハイブリダイズする５′ビオチン標識ＰＣＲプライマーを用いて増幅する。配列および対応する配列番号を、下記の表３に示す。
0003853845.tif 000005
試料をＰＣＲ法により増幅し、最終反応混合物は、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリスｐＨ８．３、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％ＤＭＳＯ、ｄＧＴＰの７５％が７−デアザ−ｄＧＴＰ（ファルマシア）であったことを除けば２００ｐＭの各ｄＮＴＰ、０  ７５ｕＭの各プライマーおよび２−５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ酵素（パーキン  エルマー社）を含有する。システム９６００サーマル  サイクラー（パーキン  エルマー社）に用いた熱サイクル条件は：９５℃での５分の開始融解、４０サイクルの（９５℃で２０秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で９０秒間）、７２℃で５分の最終的伸長である。増幅した試料を、実施例２で説明したような抗ビオチンと共役したセレンコロイドと混合する。共役した混合物を、次いで、全体のストリンジェンシーに影響を及ぼす１０ｍＭまたは１ｍＭの定められた塩濃度に希釈し、ハイブリダイゼーション条件下で２つのＣＧＧ捕獲試薬に加える。ハイブリダイゼーションがオリゴヌクレオチドと増幅した標的配列との間に起こるのに十分な時間が経過した後、未結合の物質を、定められた塩濃度を有するバッファーで試薬から洗い流し、一方、バッファーにおいては、２℃の増分で温度を上げ、各上昇温度で約１分間保持することにより、ハイブリッドの環境の温度を次第に増大する。各増加温度で、種々の捕獲部位における増幅配列の存在または非存在を、標識により観察して解離パターンを測定する。
図８は、種々のハイブリッドが、２種の塩濃度で２つの捕獲試薬から解離する温度をグラフにより図解する。温度は、ナショナル  バイオサイエンス；Plymouth,ミネソタから入手可能であるソフトウェアプログラム゛オリゴ゛バージョン４．０３を用いて調節した。図８により示されるように、温度が増大するにつれ、増幅した配列は、捕獲オリゴヌクレオチドから漸進的に溶解または融解するが、どちらの塩濃度でも、２０回のリピートを有する捕獲オリゴヌクレオチドは、初めに解離し、８０回のリピートを有する捕獲オリゴヌクレオチドは、最後に解離する。しかしながら、より高い塩条件下で形成したハイブリッドを有する捕獲試薬は、一貫して、より低い塩条件下で形成したハイブリッドよりも高い温度で解離する。
図９（ａ）−（ｅ）は、１０ｍＭの塩濃度の場合の、温度が増大するにつれ、それにより、捕獲試薬上で形成されたハイブリッドを解離する捕獲試薬のシグナルを模式的に示す。部位でのハイブリダイゼーションを斜線として表す。図９（ａ）は、全ての捕獲オリゴヌクレオチド部位１３０、１３２、１３４、および１３６でハイブリッドを形成した際の、図５に示すようなＣＧＧ捕獲試薬を示す。図９（ｂ）は、温度が、部位１３０における捕獲オリゴヌクレオチドのＴｍである約７７℃以上に上昇した後、この部位でのハイブリッドが解離した後の捕獲試薬を示す。図９（ｃ）は、温度が、部位１３２における捕獲オリゴヌクレオチドのＴｍである約８３℃以上に上昇した後、この部位でのハイブリッドが解離した後の捕獲試薬を示す。図９（ｄ）は、温度が、部位１３４における捕獲オリゴヌクレオチドのＴｍである約８５℃以上に上昇した後、この部位でのハイブリッドが解離した後の捕獲試薬を示す。最後に、図９（ｅ）は、温度が、部位１３６における捕獲オリゴヌクレオチドのＴｍである約８７℃以上に上昇した後、この部位でのハイブリッドが解離した後の捕獲試薬を示す。この漸進的解離パターンに基づき、リピート配列内の反復ＣＧＧ配列の多重度は、少なくとも８０、すなわち部位１３６の捕獲オリゴヌクレオチドに見られるその相補体の数であると結論付けられる。
実施例４
正常、前突然変異および完全突然変異トリプレット配列検出用三部位捕獲試薬
この案施例において、３個の捕獲部位を用いてトリプレットリピート配列の相対的長さを検出するよう設計された捕獲試薬を作製する。この捕獲試薬は、図１に示した捕獲試薬と同様である。５回のＧＡＣリピート（配列番号１６）、５２回のＧＡＣリピート（配列番号１７）および１００回のＧＡＣ（配列番号１８）リピートを含んで成る捕獲オリゴヌクレオチドを、それぞれ、部位３０、４０および５０に、図１に示すように固定した。
実施例５
三部位捕獲試薬を用いた、正常、前突然変異筋緊張性ジストロフィーおよび完全突然変異筋緊張性ジストロフィーの検出
この実施例において、三人の患者由来の試料を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、その結果できたアンプリコンを、実施例４で合成した個々の捕獲試薬と接触させる。患者の試料は、５から３７回のＣＴＧリピートを有する正常な患者；５２から９０回のＣＴＧリピートを有する前突然変異個体；および１００回を超えるＣＴＧリピートを有する完全突然変異個体由来である。
配列を、ハプテン  アダマンタンで標識したＰＣＲプライマーを用いて増幅する。各試料を増幅してＣＴＧを含有する標的配列の多数のコピーを生じさせた後、増幅した配列を、セレンコロイドで標識した抗−アダマンタン抗体を含んで成るセレンコロイド共役物と接触させる。共役物が配列に結合した後、標識された配列が、実施例４の捕獲試薬が平面プレート８４を含んで成る、前述し図３ａに示したような光学的導波管装置中に流れていく。標識した配列を、三部位捕獲試薬上の種々の捕獲部位にハイブリダイズさせ、温度を、約２８℃から約１１５℃へ急速に増大する。
図１０（ａ）−１０（ｄ）はそのような実験の結果を表わし、１０（ａ）の列の捕獲試薬が、第一の温度（Ｔ１）でのハイブリダイゼーションパターンを表し、１０（ｂ）の列の捕獲試薬が、より高い第二の温度（Ｔ２）でのハイブリダイゼーションパターンを表し、１０（ｃ）の列の捕獲試薬が、更に高い第三の温度（Ｔ３）でのハイブリダイゼーションパターンを表し、そして１０（ｄ）の列の捕獲試薬が、なお更に高い第四の温度（Ｔ４）でのハイブリダイゼーションパターンを表す。試料を、上部の各カラムの三部位捕獲試薬で同定し、ここでローマ数字Ｉが、正常な患者由来の試料を表し、ローマ数字ＩＩが、前突然変異の患者由来の試料を表し、そしてローマ数字ＩＩＩが、完全な突然変異の患者由来の試料を表す。より暗い影をつけた捕獲部位は、増幅した標的配列が結合している区画を表す。
図１０（ａ）−１０（ｄ）により示されるように、反復配列の多重度が、上昇した温度Ｔ２−Ｔ４でハイブリダイズしたままであるほど十分大きくないことから、それらは全ての捕獲部位から解離するので、正常な患者のＴ２での捕獲部位は、標的配列を含まない。前突然変異患者由来の増幅した配列は、Ｔ１−Ｔ３では存在するのに対し、温度がＴ４に達した場合、それらはハイブリダイズしたままでいるほど十分長くはない。しかしながら、１００ＣＴＧリピートを超える配列を有する患者試料ＩＩＩは、反復相補的領域が、Ｔ４でハイブリダイズしたままでいるのに十分大きいことから、Ｔ４でのハイブリダイゼーションを示す。従って、試料ＩＩＩの漸進的解離は、反復配列の多重度が、部位５０の捕獲オリゴヌクレオチド内のその相補体の数１００より大きいか等しいことを示している。
本発明を、詳細に特定の態様に言及して説明してきたが、本発明の精神および範囲から離れることなく、このような態様に種々の変化および改変を為すことができることは、当業者に明白である。更に、上述の全ての特許および公開物を、参照により本明細書に含めるものとする。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２
配列の長さ：６０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：３
配列の長さ：９０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：４
配列の長さ：１２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：５
配列の長さ：１５０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：６
配列の長さ：６０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：７
配列の長さ：１２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：８
配列の長さ：１８０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：９
配列の長さ：２４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：１０
配列の長さ：１５０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノミックＤＮＡ
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：５′ビオチン
存在位置：１
配列
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配列番号：１２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：５′ビオチン
存在位置：１
配列
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配列番号：１３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノミックＤＮＡ
配列
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配列番号：１４
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：５′ビオチン
存在位置：１
配列
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配列番号：１５
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：５′ビオチン
存在位置：１
配列
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配列番号：１６
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：１７
配列の長さ：１５６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：１８
配列の長さ：３００
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０】
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