(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター。
【請求項２】
配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター。
【請求項３】
XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター。
【請求項４】
配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモーターを含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項５】
配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターを含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項６】
XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーターを含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項７】
配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモーター及び目的の構造遺伝子を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項８】
配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター及び目的の構造遺伝子を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項９】
XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター及び目的の構造遺伝子を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項１０】
配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモーター、目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項１１】
配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター、目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項１２】
XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター、目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項１３】
請求項４、請求項５又は請求項６記載のプラスミドを含有することを特徴とする微生物。
【請求項１４】
請求項７、請求項８又は請求項９記載のキメラ遺伝子を含有することを特徴とする微生物。
【請求項１５】
請求項１、請求項２又は請求項３記載のプロモーターの制御下で目的の構造遺伝子がコードするタンパク質を発現することを特徴とする植物細胞。
【請求項１６】
請求項７、請求項８又は請求項９記載のキメラ遺伝子を含有することを特徴とする植物細胞。
【請求項１７】
請求項１、請求項２又は請求項３記載のプロモーターの制御下で目的の構造遺伝子がコードするタンパク質を発現することを特徴とする植物体。
【請求項１８】
請求項７、請求項８又は請求項９記載のキメラ遺伝子を含有することを特徴とする植物体。
【請求項１９】
請求項１、請求項２又は請求項３記載のプロモーターの下流に、目的とする構造遺伝子を連結することを特徴とするキメラ遺伝子の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物プロモーターおよびその利用等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、植物を遺伝子工学的技術を用いて改良する場合、ある種のプロモーターの下流に、該植物内で発現させたいタンパク質の構造遺伝子（以下、目的とする構造遺伝子と記す。）を連結させたキメラ遺伝子を植物細胞に導入し、得られた植物細胞を通常の植物組織培養技術により再生させ、目的とするタンパク質を発現する形質転換植物体を作製する方法が知られている。
上記の方法で用いられる代表的なプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35S プロモーター（以下、35S プロモーターと記す。）があり、該プロモーターは、植物細胞内で目的とするタンパク質を組織非特異的に発現させることが知られ、比較的汎用性の高いプロモーターとして、特に試験研究において広く使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、植物を改良する場合、例えば、目的とするタンパク質を局所的に発現させることにより効果的な改良が行えることがあり、このような改良により新しいタイプの高機能性植物を開発する一環として、組織特異的な発現をもたらす各種の植物プロモーターの探索が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは鋭意検討を行った結果、根部において特異的に高発現している新規なタンパク質をコードする遺伝子を見い出し、その遺伝子の上流に存在する、特定の塩基配列である領域を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターの単離に成功し、そして該プロモーターを使用することにより、植物の維管束（特に根部における維管束）において目的とするタンパク質を高発現させることができることを突き止め、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
1 ）配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター（以下、本発明プロモーターと記す。）、
２）配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター、
３）XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター、
４）配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモーターを有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明プラスミドと記す。）、
５）配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターを有することを特徴とするプラスミド、
６）XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーターを有することを特徴とするプラスミド、
７）配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモーター及び目的の構造遺伝子を有することを特徴とするキメラ遺伝子（以下、本発明キメラ遺伝子と記す。）、
８）配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター及び目的の構造遺伝子を有することを特徴とするキメラ遺伝子、
９）XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター及び目的の構造遺伝子を有することを特徴とするキメラ遺伝子、
１０）配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモーター、目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明発現プラスミドと記す。）、
１１）配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター、目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを有することを特徴とするプラスミド、
１２）XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター、目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを有することを特徴とするプラスミド、
１３）図１で示されることを特徴とするプラスミド、
１４）前項４、前項５又は前項６記載のプラスミドを含有することを特徴とする微生物（以下、本発明微生物と記す。）、
１５）前項７、前項８又は前項９記載のキメラ遺伝子を含有することを特徴とする微生物、
１６）前項１、前項２又は前項３記載のプロモーターの制御下で目的の構造遺伝子がコードするタンパク質を発現することを特徴とする植物細胞（以下、本発明植物細胞と記す。）、
１７）前項７、前項８又は前項９記載のキメラ遺伝子を含有することを特徴とする植物細胞、
１８）前項１、前項２又は前項３記載のプロモーターの制御下で目的の構造遺伝子がコードするタンパク質を発現することを特徴とする植物体（以下、本発明植物体と記す。）、
１９）前項７、前項８又は前項９記載のキメラ遺伝子を含有することを特徴とする植物体、
２０）前項１、前項２又は前項３記載のプロモーターの下流に、目的とする構造遺伝子を連結することを特徴とするキメラ遺伝子の作製方法（以下、本発明キメラ遺伝子作製方法と記す。）、
２１）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する分子量16kDのタンパク質（以下、本発明タンパク質と記す。）、
２２）配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する分子量16kDのタンパク質遺伝子（以下、本発明タンパク質遺伝子と記す。）、
２３）配列番号４で示される塩基配列を有する分子量16kDのタンパク質遺伝子、
２４）前項２３記載の遺伝子を含有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明タンパク質遺伝子プラスミドと記す。）。
２５）配列番号５で示される塩基配列である領域を含む植物細胞内で機能可能なターミネーター（以下、本発明ターミネーターと記す。）、
を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
本発明で用いられる遺伝子工学的技術は、たとえば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch,T.,Maniatis 著、モレキュラークローニング第 2版（Molecular Cloning 2nd edition ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press ）、1989年及び D.,M.,Glover 著、DNA クローニング（DNA Cloning ）、IRL 発行、1985年などに記載されている通常の方法である。
【０００６】
本発明プロモーターは、配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターである。配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む他の具体的な領域としては、例えば、配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む領域やXhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）であって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示される領域を含む領域等をあげることができる。尚、特に強い発現を必要とする場合には、例えば、XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーターを用いることが好ましい。
ここで「植物細胞内で機能可能なプロモーター」とは、該プロモーターの下流に目的とするタンパク質の構造遺伝子を連結した場合、該タンパク質の植物細胞内における発現を制御する能力を有するようなプロモーターを意味し、上記の配列番号１又は２で示される塩基配列である領域からのみなるプロモーターやXhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）からのみなるプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーターであってもよく、また、例えば、アグロバクテリウムのオクトピン合成遺伝子の-333〜-116の領域とマンノピン合成酵素遺伝子の-318〜-138の領域を連結した転写翻訳活性化配列、またはマンノピン合成酵素遺伝子の-318〜-213の領域とオクトピン合成遺伝子の-333〜-116の領域を連結した転写翻訳活性化配列（The Plant Journal 7(4):661-676（1995））、カリフラワーモザイクウイルス35S プロモーターの-343〜-91 を含む領域（Nature 313:810-812（1985））、トマトのリブロース-1,5- 二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子（rbc-3A）の-1099 〜-205を含む領域（Plant Cell 1:217-227（1990））、タバコのPR1a遺伝子の-902〜-287を含む領域（Plant Cell 2:357-366（1990））、ジャガイモのプロテアーゼインヒビター遺伝子（PI-II ）の-1300-195 を含む領域（Plant Cell 2:61-70（1990））等を上記の配列番号１又は２で示される塩基配列である領域やXhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）であって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示される領域と連結してなるプロモーターであってもよい。
【０００７】
このような本発明プロモーターを有するプラスミド、即ち、本発明プラスミドは、通常、目的の構造遺伝子を挿入、切除できるように本発明プロモーターの下流に１つ以上のクローニング部位を有するように作製することが好ましい。さらに、複数個のクローニング部位を有するように作製するとより好ましい。ここでのクローニング部位とは、遺伝子工学的技術で用いられる制限酵素によって認識切断可能な部位のことを意味する。
【０００８】
本発明プロモーターは、目的とするタンパク質を植物細胞内で発現させるために、通常、該プロモーターの下流に目的とするタンパク質の構造遺伝子を連結することにより作製されたキメラ遺伝子（プロモーターに対して構造遺伝子はヘテロローガスな関係である）の形で使用される。このようなキメラ遺伝子、即ち、本発明キメラ遺伝子には、例えば、１）本発明プロモーター及び目的の構造遺伝子のみを有する組換えＤＮＡ遺伝子、２）該組換えＤＮＡ遺伝子を含有し、宿主染色体とは物理的に独立して自律複製し、安定に遺伝することができる染色体外性遺伝体のようなプラスミド、等が含まれる。
【０００９】
目的とするタンパク質の発現効率を高めるには、例えば、本発明プロモーター、目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを有するプラスミド、即ち、本発明発現プラスミドを用いて植物細胞を形質転換させる方法が適している。
ここで「植物細胞内で機能可能なターミネーター」とは、植物細胞内で目的の構造遺伝子を効率的に転写終結させる能力を有するようなターミネーターを意味し、これは各種のタンパク質の構造遺伝子における終止コドンの下流の３′末端非翻訳領域に存在するpoly（Ａ）付加シグナル（AATAAAとコンセンサス配列とする）のさらに下流に通常存在するpoly  Ａ配列下流に相当するゲノムＤＮＡ領域に存在している。例えば、配列番号６で示される塩基配列である領域を含む植物細胞内で機能可能なターミネーター（即ち、本発明ターミネーター）、植物遺伝子由来のノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター（NOS ）、ニンニクウイルスGV1 、GV2 遺伝子のターミネーター等があげれられる。
このような本発明発現プロモーターは、通常、目的の構造遺伝子を挿入、切除できるように本発明プロモーターの下流で、かつ植物細胞内で機能可能なターミネーターの上流に１つ以上のクローニング部位を有するように作製することが好ましい。さらに、複数個のクローニング部位を有するように作製するとより好ましい。ここでのクローニング部位とは、遺伝子工学的技術で用いられる制限酵素によって認識切断可能な部位のことを意味する。
このようなクローニング部位を有する具体的な本発明発現プラスミドとしては、例えば、図１で示されるプラスミド、pCR16G1/250-GUS 、pCR16G1/EV-GUS、pCR16G1/H-GUS をあげることができる。
【００１０】
本発明発現プラスミドは、例えば、以下の方法により作製することができる。配列番号１で示される塩基配列である領域を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター、すなわち、本発明プロモーターを、植物細胞内で機能可能なターミネーターを含むプラスミド、例えば、pBI101（CLONTECH社製）（Jefferson et al.EMBO J. 6:3901-39 07(1987)）のマルチクローニング部位に挿入する。つぎに、あらかじめ存在するマーカー遺伝子等の外来遺伝子、例えばβ- グルクロニダーゼ遺伝子（以下、GUS 遺伝子と記す。）を切り出し、該外来遺伝子を目的の構造遺伝子で置換することによって作製することができる。また、別な方法として、バイナリーベクター、例えば、pBIN19（Nuc.Acid.Res.12:8711-8721(1984) ）のマルチクローニング部位に本発明プロモーター、目的の構造遺伝子、植物細胞内で機能可能なターミネーター、の順に挿入する方法等もあげることができる。
【００１１】
本発明キメラ遺伝子に含まれる目的の構造遺伝子として、例えば、フェニールアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子（PAL ）、カルコンシンターゼ遺伝子（CHS ）、キチナーゼ遺伝子（CHT ）、リゾチーム遺伝子、PRタンパク質遺伝子等の植物防御遺伝子、Pto 遺伝子等の病害抵抗性遺伝子、ウイルスコートタンパク質遺伝子等、病虫害に対する抵抗性を増強することができる有用遺伝子を好ましくあげることができる。このような遺伝子によってコードされるタンパク質を本発明プロモーターを利用することにより植物の維管束において高発現させ、植物の維管束に局在する病原菌や、維管束領域から養分を吸収する害虫等を効率良く防除することができる。
また、本発明プロモーターは、目的とするタンパク質を特に根部における維管束において発現させるので、１）薬剤による防除が難しい土壌病虫害に有効であり、羅病虫性根に病虫免疫又は抵抗性を付与した機能性作物をつくること、２）根部を食用とする作物ではタンパク質などの栄養素の含量を効率的に高めた機能性作物をつくること等に有益である。このような目的で使用される目的の構造遺伝子として、例えば、ＢＴ（Bacillus thuringiensis) 毒素タンパク質遺伝子や上記のような病虫害に対する抵抗性を増強することができる有用遺伝子の他に、ダイズのグリシニン遺伝子、β- コングリシニン遺伝子等の貯蔵タンパク質遺伝子をはじめ、飼料作物における種々のタンパク質含量を増加させることができる有用遺伝子、ブラジルナッツの2Sアルブミン遺伝子、トウモロコシやイネの10kDa 及び15kDa タンパク質遺伝子等、飼料作物のメチオニン含量あるいはリジン含量を増加さることができる有用遺伝子、大腸菌等の微生物のbioA、bioB、bioC、bioD、bioF、bioH酵素遺伝子等、ビオチン生合成関連遺伝子であり飼料作物におけるビオチン含量を増加させることができる有用遺伝子、さらにステアロイル-ACP- デサチュレース、アシル-ACP- チオエステラーゼ、3-ホスフェートアシルトランスフェラーゼ遺伝子等、脂質の酸化安定性の増大とリン脂質の減少及びオレイン酸とリノレン酸の増加による脂質の改良をすることができる有用遺伝子、あるいはアシルトランスフェラーゼ遺伝子等、不飽和脂肪酸の割合を増加させ低温に対する抵抗性を増大させることができる有用遺伝子が挙げられる。さらに、L-ホスフォノスリシンアセチル化酵素や(EPSP)合成酵素、PPO 遺伝子等、除草剤抵抗性に関与する遺伝子であり除草剤抵抗性作物を作出することができる有用遺伝子をあげることができる。
【００１２】
本発明プラスミド、本発明キメラ遺伝子、又は本発明発現プラスミドを植物細胞に導入する方法としては、たとえば、アグロバクテリウム菌法（土壌菌であるアグロバクテリウム菌を植物組織に感染させる方法）、電気的導入法（プロトプラストへの電気的導入法：エレクトロポーレーション）、あるいはパーティクルガンによる直接導入法（植物組織及び培養細胞への直接導入法：パーティクルガン法）等の公知な方法が挙げられる。本発明プラスミド、本発明キメラ遺伝子、又は本発明発現プラスミドを含有する植物細胞は、たとえば、S.B.Gelvin,R.A.Schilperoot and D.P.S.Verma著：プラント・モレキュラー・バイオロジー/ マニュアル（Plant Molecular Biology/Manual,Kluwer Academic Publishers press,1988）、Valvekens et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,85:5536 -5540 （1988）に記載される通常の植物組織培養技術において用いられる方法に準じて再生することによって該植物細胞由来の植物体またはその一部を得ることができる。
【００１３】
尚、本発明に用いることが可能な植物種としては、例えば、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、タマネギ等の単子葉植物、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ等のマメ科植物、タバコ、トマト、ジャガイモ等のナス科植物、キャベツ、ナタネ、カラシナ等のアブラナ科植物、メロン、カボチャ、キュウリ等のウリ科植物、ニンジン、セロリ等のセリ科植物、レタス等のキク科植物等の双子葉植物等を挙げることができる。
以上のようにして、本発明プロモーターの制御下に目的の構造遺伝子がコードするタンパク質を発現する植物細胞及び植物体を得ることができる。
【００１４】
本発明タンパク質は、例えば黒田五寸などのニンジン（Daucus carota L.）に存在しており、しかもその根部に最も多く存在している。分子量16kDで、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、例えば配列番号４で示される塩基配列（本願では、イントロンを含んだゲノムＤＮＡの塩基配列及びそれに対応するｃＤＮＡの塩基配列の両者ともに意味している）を有している。例えば、このようなアミノ酸をコードする遺伝子を、例えば、本発明プロモーターを利用する前記方法に準じて根部で高発現させることにより、栄養素を高めたニンジンの作出が可能になる。また同様に他の根菜作物、例えばダイコン、カブ、サトウダイコン、ゴボウ等の根部にこのようなアミノ酸をコードする遺伝子を高発現させることにより、根部の栄養価を高めることが可能になる。さらに本発明タンパク質をコードする塩基配列およびアミノ酸配列と相同性の高い遺伝子およびアミノ酸配列を、EMBL、NBRF等のデータベースで検索することにより、例えば、1 ）病害抵抗性に関与するタンパク質の遺伝子およびアミノ酸配列と相同性が高い場合には、本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領域を含む遺伝子を用いた通常の遺伝子工学的手法により、植物自体に病害抵抗性を付与したり、病害抵抗性機構の解明を行うことができる、2 ）外界のストレス等によって、植物ホルモンの含有量が変化して発現、誘導されるタンパク質の遺伝子およびアミノ酸配列と相同性が高い場合には、本発明タンパク質をコードする領域を含む遺伝子を用いた通常の遺伝子工学的手法により、ストレス応答、ホルモン応答を利用した種々の品種改良ができる、3 ）花粉アレルギータンパク質の遺伝子およびアミノ酸配列と相同性が高い場合には、本発明タンパク質をコードする領域を含む遺伝子を用いた通常の遺伝子工学的手法により、花粉の改良、発現量を抑制した非アレルギー、または低アレルギー性の品種改良ができる、4 ）ヒートショックタンパク質の遺伝子およびアミノ酸配列と相同性が高い場合には、本発明タンパク質をコードする領域を含む遺伝子を用いた通常の遺伝子工学的手法により、有用タンパク質のホールディングを補助して保存性を向上させたり、有用タンパク質の輸送を改良させることができる。
【００１５】
つぎに本発明プロモーター、本発明ターミネーター、及び本発明タンパク質遺伝子を単離する方法について説明する。
まず、葉部からゲノムDNA を調製し、適当な酵素で部分分解後λファージ由来のベクターアームに連結する。これをin vitroパッケージングしてファージ粒子をつくらせ、さらに大腸菌に感染させて寒天培地上にプラークを形成させる。これを回収し、ゲノミックライブラリーとして遺伝子のスクリーニングに用いる。ゲノムDNA の調製法には例えば、M.Shure et al , Cell .35:225(1983)に記載されているCTAB法、S.O.Rogers and A.J.Bendich , Plant.Mol.Biol.5:69(1985)に記載されている尿素−フェノール法等が挙げられる。λベクターには例えば、STRATAGENE社のλ FIX II 、λEMBL3 、λ EMBL4、λ DASH II等を用いることができる。in vitroパッケージングには例えば、STRATAGENE社のGigapack packaging Extracts を用いることができる。
ゲノミックライブラリーから本発明プロモーター、本発明ターミネーター、及び本発明タンパク質遺伝子の塩基配列を含むゲノミッククローンを選抜するには例えば、目的とする遺伝子に相当するcDNA、または目的とする遺伝子に似たcDNAを、RIや蛍光試薬でラベルしたプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション等が有効である。RIラベルには例えば、ベーリンガー社、宝酒造のRandom Labelling Kit等を用いることができる。
また蛍光ラベルには例えば、アマシャム社のECL Direct Nucleic Acid Labelling and Ditection Systemを用いることができる。
スクリーニングで得られた本発明プロモーター、本発明ターミネーター、及び本発明タンパク質遺伝子の塩基配列を含むゲノミッククローンは、DNA 調製や解析が容易なプラスミドベクター、例えば市販のpUC18 、pUC19 、pBLUESCRIPT KS+ 、pBLUESCRIPT KS- 等にサブクローニングして、プラスミドDNA を調製し、Sanger et a l, J.Mol.Biol. ,94:441（1975）、Sanger et al , Proc.Natl.Acad.Sci. , 74:5463（1977）に記載されているSanger法、Saiki et al.,Science,230:1350(1985) に記載されているPCR 法を組み合わせたサイクルシークエンス法を用いてその塩基配列を決定することができる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明する。尚、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１  （本発明タンパク質遺伝子の単離）
ニンジン葉部より調製したゲノムDNA を用いて、ゲノミックライブラリーを作製した。既に取得しているcDNA断片をプローブにしてこのゲノミックライブラリーをスクリーニングし、2 つのポジティブクローンを取得した。以下にそのスクリーニング方法について説明する。
【００１８】
ステップ１  ニンジンゲノミックライブラリーの作製
（１）ニンジンゲノムDNA の調製
播種後６週目のニンジン葉部10g を液体窒素中で磨砕し、5ml の2xCTAB液（2% Cetylt rimetyl ammonium bromide、100mM トリス- 塩酸緩衝液 pH8.0、20mM EDTA pH8.0 、1.4M NaCl 、1% Polyvinylpyrrolidone ）に懸濁後、55℃で10分間保温した。これに等量のクロロホルム/ イソアミルアルコール（24:1）を加え、室温で30分穏やかに混合した後、遠心分離し、上層、下層を分離した。ａ）上層には等量のクロロホルム/ イソアミルアルコール（24:1）、ｂ）下層には等量の1xCTAB液（2xCTAB液を滅菌蒸留水で2 倍に希釈したもの）を加え、室温で10分間穏やかに混合、再度遠心分離し、ａ）、ｂ）両方より上層を分取して混合した。これに1/10量の10％CTAB液（10% Cetyltrimetyl ammonium bromide、0.7M NaCl ）、等量の沈澱バッファー（2% Cetyltrimetyl ammonium bromide 、50mMトリス- 塩酸緩衝液 pH8.0、10mM EDTA pH8.0 ）を加え、穏やかに混合した後遠心分離した。得られた沈殿物を1MNaCl-TE （1M NaCl 、10mMトリス- 塩酸緩衝液 pH8.0、1mM EDTA pH8.0）に懸濁、さらに等量のイソプロパノールを加えて穏やかに混合し、遠心分離し、得られた沈殿物を70% エタノールでリンスして軽く乾かし、TEに懸濁した。最終濃度10μg/mlになるようにRNase を加え、37℃で30分反応させた後、1/4 量の4M酢酸アンモニウムと2 倍量の100 ％エタノールを加え混合し、DNA を析出させた。このDNA を70% エタノールでリンスして軽く乾かし、TE（10mMトリス- 塩酸緩衝液 pH8.0、1mM EDTA pH8.0）に懸濁した。このDNA 溶液を適当に希釈し、吸光度測定、アガロースゲル電気泳動を行い、約 350μg のゲノムDNA が得られたことを確認した。
（２）ゲノムDNA の部分分解とλベクターへの挿入
上記のようにして得られたゲノムDNA50 μg 分と終濃度0.08U/μl のSau3AIを混合して37℃で50分間保温し、DNA を部分分解した。溶液の一部を0.5%アガロースゲル電気泳動により分画し、20-50kb のDNA 断片が多く含まれることを確認した。このDNA 溶液に等量のフェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコール（25:24:1 ）を加えてよく混合し、遠心分離後上層を分取した。このフェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコール（25:24:1 ）処理をもう一度繰り返した後、得られた溶液に1/10量の3M酢酸ナトリウムと2 倍量の100 ％エタノールを加えよく混合し、-80 ℃で10分冷却して遠心分離した。沈澱物を70％エタノールでリンスし、軽く乾かして、TEに懸濁した。このDNA 溶液に167 μMdATP 、167 μMdGTP を加え、終濃度0.05U/μl のKlenon（宝酒造）を添加して室温で15分反応させた。これに1/10量の10xSTE、等量の1xSTE を加え混合した。等量のフェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコール（25:24:1 ）を加えよく混合し、遠心分離して上層を分取した。このフェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコール（25:24:1 ）処理をもう一度繰り返し、得られた溶液に1/10量の3M酢酸ナトリウムと2 倍量の100 ％エタノールを加え、ー80℃で10分冷却した後遠心分離した。得られた沈澱を70％エタノールでリンスして軽く乾かし、TEに懸濁した。この溶液の1 部とλ/FIXIIベクター（STRATAGENE）1 μg とを加えた反応液（50mMトリスー塩酸緩衝液 pH7.5、70mM  MgCl2 、10mM DTT）を調製し、Ｔ4 DNA リガーゼ（宝酒造）を添加して、16℃で1 晩反応させた。
（４）パッケージングとライブラリーの増幅
（３）の反応液を、GigapackII Gold packaging extract （STARATAGENE ）を用いてパッケージングし、バンクサイズ6x104 のゲノミックライブラリーを得た。37℃で1 晩振とう培養した宿主大腸菌XL1-Blue MRA（P2）を、菌体濃度がOD600 =0.5になるように10mM硫酸マグネシウムに懸濁した。この菌液200 μl に10000pfuのファージを添加して、予め50℃に温めたトップアガーと共にNZY プレートに蒔き、37℃で8 時間保温し、増殖してきたファージをSMバッファー（50mMトリス- 塩酸緩衝液  pH7.5 、0.1 NaCl、7mM MgSO4 、0.01% ゼラチン）中に懸濁させた。ファージの懸濁液を回収し、以下のスクリーニングに用いた。
【００１９】
ステップ２  ニンジンゲノミックライブラリーのスクリーニング
（１）スクリーニング用フィルターの作製
NZY プレートに50000pfuのファージを蒔き、37℃で8 時間培養した。このプレート上にナイロンフィルター Hybond-N （アマシャム）を置き、1 分間静置してファージを吸着させた。次にフィルターをアルカリ処理（1.5NNaCl、0.5NNaOH、7 分）してファージを溶解させ、フィルターにDNA を結合させた後、中和処理（1.5NNaCl、0.5MTris-HCl pH8.0、3 分x2回）を行った。2xSSC （300mM NaCl、30mMクエン酸）で5 分洗った後、風乾し、2 分間UV照射することによりDNA をフィルターに固定した。このように作製したフィルター12枚を用いて、以下のハイブリダイゼーション反応を行った。
（２）プラークハイブリダイゼーション
上記のようにして作製したフィルターをハイブリバックに入れ、ハイブリダイゼーション液（6xSSC/1% SDS/100μg/ml Calfthymus DNA ）を入れて、45℃で2 時間保温し、プレハイブリダイゼーションを行った。本発明タンパク質cDNA断片20-50ng を、ランダムラベリングキット（ベーリンガーマンハイム）を用いて〔αー32P 〕dCTA（0.74MBq 、アマシャム）でラベルし、プローブを調製した。このプローブ300 万cpm 分、10mlのハイブリダイゼーション液、フィルターをハイブリバックに封入し、45℃で1 晩保温した。ハイブリダイゼーション反応後、2xSSC/1%SDS 中、45℃で10分洗浄した。この洗浄を2 回繰り返し、さらに2xSSC で軽くすすぎ、イメージングプレートに4 時間露光後、BAS2000 （富士フィルム）を用いて解析した。シグナルが検出された位置に相当するプレートを5mm 角にくり抜き、500 μl のSMバッファーに浸して、ファージを溶出させた。このファージ懸濁液から1 プレート当たり数百pfu のファージを蒔き、37℃で8 時間培養した。1 シグナルにつき2 プレートから上記と同様にフィルターを作製し、〔αー32P 〕dCTAでラベルした本発明タンパク質cDNA断片をプローブにしてハイブリダイゼーションを行った。イメージアナライザーで検出されたシグナルの領域からファージを回収し、3 度目のスクリーニングを上記の方法と同様に行い、本発明タンパク質遺伝子を含むと予想されるファージクローン2 つを単離した。このうち1 つのクローンについて、以下の解析を行った。
【００２０】
ステップ３  本発明タンパク質遺伝子のサブクローニングとシークエンス
（１）ファージDNA の調製
1L三角コルベンにNZYM液体培地（NZY 液体培地に0.2%マルトースを添加）を入れ、1 晩37℃で振とう培養した宿主大腸菌XL-1 Blue MRA(P2) （STRAGENE製）を加え、37℃、275rpmで振とう培養した。OD600 ＝0.1 になったら、5x1010pfu のファージを添加し、さらに培養を続けた。1 時間おきにOD600 の値を測定し、宿主大腸菌が溶菌したことを確認し、1.7ml のクロロホルムを加えて10分撹拌した。このように調製したファージ液360ml から、Lambda-trap （CLONTECH）を用いてファージDNA を調製し、約21mgのファージDNA を取得した。
（２）サザンハイブリダイゼーションによる本発明タンパク質遺伝子断片の同定
（１）で得られたファージDNA50ng 分を制限酵素NotI、XbaI、SalI、それぞれ0.5Uで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動を行い、DNA 断片を分画した。エチジウムブロマイド染色によりゲル中のDNA の移動度を確認後、軽く水でゆすぎ、0.25NHCl中で15分間振とうした。再び軽く水でゆすぎ、1.5NNaCl/0.5NNaOH 中で30分間振とうした。このゲルをVacugene（ファルマシア）を用いて、ナイロンフィルターHybond-N（アマシャム）にブロッティングした（1.5N NaCl/0.5NNaOH中、55気圧、1 時間）。ブロッティングしたフィルターを2xSSC で5 分洗い、風乾し、2 分間UV照射してDNA をフィルターに固定した。このフィルターをプレハイブリダイゼーション液と共にハイブリバックに封入し、45℃で2 時間保温した。ステップ２（２）のように調製した本発明タンパク質cDNAプローブ300 万cpm 分を10ml  のハイブリダイゼーション液、フィルターをハイブリバックに封入し、45℃で1 晩保温した。ハイブリダイゼーション反応後、2xSSC/1%SDS 中、45℃ 10 分の洗浄を2 回繰り返し、2xSSC で軽くすすぎ、イメージングプレートに2 時間露光後、BAS2000 （富士フィルム）を用いて解析した。その結果、XbaIで得られる1.5kb のDNA 断片に本発明タンパク質遺伝子が含まれていることが明らかになった。
（３）本発明タンパク質遺伝子を含むDNA 断片のクローニング
pBluescript KS- ベクター（STRATAGENE製）を2 μg をXbaI10U で完全消化した後、CIAP（宝酒造）で末端を脱リン酸化させ、反応液と等量のフェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコール（25:24:1 ）を加えよく混合し、遠心分離した。上清を分取し、1/10量の3M酢酸ナトリウム、2 倍量の100%エタノールを加えて、よく混合した。-80 ℃で10分冷却後、遠心分離し、得られた沈澱を軽く乾かしてTEに懸濁した。（１）で得られたファージDNA1μg 分をXbaI100Uで完全消化し、これと上記のように調製したpBluescript KS- ベクター50ng分をライゲーションキット（宝酒造）で連結した。この反応液の一部を大腸菌JM109 コンピテントセル（東洋紡）に添加し、トランスフォーメーションを行い、アンピシリン50μg/mlを含むLBプレートに蒔いた。37℃で1 晩培養後、コロニーハイブリダイゼーションを行った。フィルターの作製、プローブの調製、ハイブリダイゼーション、および洗浄の方法はステップ２（１）（２）と同様である。ただし、ハイブリダイゼーション、洗浄は65℃で行った。イメージアナライザーで解析した結果、多数のポジティブクローンが得られ、そのうちの18個のクローンから、QIA-prep spin カラム（QIAGEN）を用いてプラスミドDNA を調製した。このプラスミドDNA を、クローニングされたＤＮＡ断片を切り出すのに適する制限酵素XbaIで消化した後、0.8%アガロースゲルで分画、解析し、本発明タンパク質遺伝子断片（1.5kb ）を含むクローン1 つ、pCR16G1/Xb（図２参照）を選抜した。この選抜したクローンについて、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit （ABI ）、蛍光シークエンサー（ABI ）を用いて全塩基配列を決定した（配列番号１、４、５参照）。その結果、このクローン中には、プロモーター領域247bp （本発明プロモーター）、コーディング領域592bp （本発明タンパク質遺伝子）、およびターミネーター領域836bp （本発明ターミネーター）が含まれていることが明らかとなった。
【００２１】
実施例２  （本発明タンパク質の相同性）
実施例１で決定された本発明タンパク質遺伝子の塩基配列（配列番号４参照）およびこれにコードされている本発明タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３参照）を、データベースEMBLおよびNBRFで検索した。その結果、本発明タンパク質遺伝子およびこれにコードされているアミノ酸配列は、セロリ、シラカバなどの花粉アレルゲンタンパク質、パセリ、ジャガイモなどの病害抵抗性に関与するPRタンパク質、エンドウ、ダイズなどの、外界からのストレスによって誘導されるタンパク質と高い相同性を示した（図３参照）。最も相同性が高かったのは、ニンジンと同じセリ科である、セロリのAPIg1 、パセリのPRタンパク質であるPR1-3 、PR1-1 、であった。また、マウスのヒートショックタンパク質、HSP60 のmRNAとも比較的高い相同性が認められた。
【００２２】
実施例３  （ノザンハイブリダイゼーションよる本発明タンパク質遺伝子の発現パターンの解析）
ニンジンの花部、葉部、根部それぞれ2gからISOGEN（日本ジーン）を用いて全RNA を抽出し、さらにOligotex-dT30 （宝酒造）を用いて、約40μg のmRNAを調製した。このmRNA5 μg 分を1.2%変性アガロースゲル電気泳動で分画し、10xSSC中、キャピラリーブロッティング法でナイロンフィルターHybond-N（アマシャム）にブロッティングした。ブロッティング後、フィルターを風乾し、80℃で2 時間ベーキングすることによってDNA を固定した。このフィルターをプレハイブリダイゼーション液に浸して、45℃で2 時間保温した。pCR16G1/Xbを鋳型にして、3'ノンコーディング領域を増幅するプライマー
（プライマー配列）
0003791059.tif 000002
を用いてPCR 反応（９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３０サイクル）を行なった。この際、〔αー32P 〕dCTPを添加することによってラベルを入れ、これをプローブに用い、ステップ３（２）と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。イメージアナライザーで解析し、本発明タンパク質遺伝子が根部で高転写されていることを確認した。
【００２３】
実施例４  （本発明プロモーターの取得）
XhoIで完全消化し末端を脱リン酸化したpBluescript KS- ベクター50ngと、XhoIで完全消化したファージゲノミッククローンDNA1μg を、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結した。この反応液の一部を大腸菌JM109 コンピテントセル（東洋紡）100 μl に添加し、トランスフォーメーションを行い、アンピシリン100 μg/mlを含むLBプレートに蒔いた。37℃で1 晩培養後、生育してきたクローンから、QIA-prep spin （QIAGEN）を用いてプラスミドDNA を調製し、含まれているインサートDNA の端、数百bpの領域をシークエンスした。その結果、本発明タンパク質遺伝子のコーディング領域の一部とその上流域約13kbを含むクローン、pCR16G1/Xh（図４参照）を取得した。この中に含まれる本発明タンパク質遺伝子のプロモーター領域（2kb ）について、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit （ABI ）、蛍光シークエンサー（ABI ）を用いてシークエンスを行った（配列番号１参照）。
【００２４】
実施例５  （本発明（発現）プラスミドの構築）
（１）本発明プロモーター（247bp ）の調製
プライマーにベクターの内部と本発明タンパク質遺伝子ATG の上流数十bp
（プライマー配列）
0003791059.tif 000003
を用い、pCR16G1/Xbを鋳型にしてPCR 反応（94℃ 1分、40℃ 2分、72℃ 3分を１サイクルとして40サイクル）を行い、本発明プロモーター（247bp ）を含むDNA 断片を増幅させた。尚、本発明タンパク質遺伝子ATG の上流プライマーには、5 ’末端に予め制限酵素NheIの認識部位をつけて合成したものを使用した。この反応産物に、等量のクロロフォルム/ イソアミルアルコール（24：1 ）を加えよく撹拌し、遠心分離して上清を分取した。1/10量の3M酢酸アンモニウム、２倍量の100%エタノールを混合し、遠心して得られた沈澱を、制限酵素XbaI、NheIで完全消化した後、4%ポリアクリルアミド電気泳動により分画した。目的の長さのDNA 断片を含むようにゲルを切り出し、Molecular Cloning 記載の方法に従ってDNA 断片を回収した。まずゲルを細かく刻み、抽出バッファーに浸して37℃で5 時間保温後、遠心分離によりゲルの破片を取り除いた。その溶液に2 倍量の100%エタノールを加え、氷上で30分冷却後、遠心分離して得られた沈澱をさらにTEに懸濁した。これに1/10量の3M酢酸アンモニウム、2 倍量の100%エタノールを混合し、前記のようにエタノール沈澱を行った。得られた沈澱を再びTEに懸濁し、4%ポリアクリルアミド電気泳動を行ってDNA 断片の濃度を確認した。これを以下の本発明（発現）プラスミドの構築に用いた。
【００２５】
（２）本発明（発現）プラスミド（pCR16G1/250-GUS ）の構築
バイナリーベクターpBI101（CLONTECH製）をXbaIで切断してCIAP処理したものに、実施例により調製された本発明プロモーター（247bp ）を連結し、大腸菌JM109 コンピテントセルにトランスフォームした。カナマイシン50μg/mlを添加したLBプレート上で選抜し、生育してきたクローンからプラスミドDNA を調製し、制限酵素で切断することにより、本発明プロモーター（247bp ）を含有するクローンの候補を取得した。このクローンについて、GUS 遺伝子コーディング領域内部の合成プライマー
（プライマー配列）
0003791059.tif 000004
を用いてシークエンスを行い、プロモーター領域である247bp 内にTaq ポリメラーゼによる塩基置換が起こっていないことを確認した（図５参照）。
【００２６】
（３）本発明（発現）プラスミド（pCR16G1/EV-GUS）の構築
pCR16G1/XhoIをEcoRV で切断し、0.8%アガロースゲル電気泳動により分画した。本発明プロモーター（247bp ）を含むDNA 断片に相当するバンドを切りだし、ガラスビーズ（バイオラッド）を用いてDNA 断片を回収した。回収したDNA 断片について、そのDNA 濃度を0.8%アガロースゲル電気泳動により確認し、制限酵素SmaIで消化したバイナリーベクターpBI101に連結した。これを大腸菌JM109 コンピテントセルにトランスフォームし、カナマイシン50μg/mlを添加したLBプレート上で選抜した。生育してきたクローンについてプラスミドDNA を調製し、制限酵素切断でインサートの方向を調べ、順方向に挿入されているクローンを取得した。このクローンを大量培養し、QIAGEN tip-500カラム（QIAGEN）を用いて、プラスミドDNA を大量調製した。このプラスミドDNA をさらにXbaIで消化して0.8%アガロースゲル電気泳動により分画し、上記と同様にして1.75kb（前記247bp の上流域を含む）のDNA 断片を回収した。これをCIAP処理し、制限酵素XbaIで消化したpCR16G1 /250-GUS（NheIとXbaIの連結部位は切断されなくなっている）と連結した。大腸菌JM109 コンピテントセルにトランスフォームし、カナマイシン耐性クローンからプラスミドを調製し、制限酵素切断により目的とする本発明プロモーター（2kb ）を含むクローンを確認した。また、GUS コーディング領域内部の合成プライマー
（プライマー配列）
0003791059.tif 000005
を用いてプロモーター領域のシークエンスを行い、GUS 遺伝子のATG 上流約500bp についての構造を確認した（配列番号２、図６参照）。
【００２７】
（４）本発明（発現）プラスミド（pCR16G1/H-GUS ）の構築
pCR16G1/XhoIをXbaIで切断し、本発明タンパク質遺伝子のATG 上流域5kb を含むDNA 断片を上記（３）と同様に回収した。これを制限酵素XbaIで消化したバイナリーベクターpBI101に連結し、コンピテントセルにトランスフォームし、順方向にインサートが挿入されているクローンを得た。このクローンをさらにHindIII で消化し、セルフライゲーションさせ、トランスフォーメーションを行い、得られたクローンについてHindIII 切断部位が1 つになっていることを確認した。このプラスミドDNA をXbaIで消化し、前記のようにして調製した本発明プロモーター（247bp ）を連結した。この本発明プロモーター（247bp ）が順方向に挿入されているクローンについて、プラスミドを調製し、上記と同様に、GUS コーディング領域内部の合成プライマー
（プライマー配列）
0003791059.tif 000006
を用いてシークエンスを行い、GUS 遺伝子のATG 上流約500bp についての構造を確認した（図７及び８参照）。これにより、連結部とその周辺部の構造が変化していないことが確認できた。
【００２８】
実施例５  （本発明植物細胞及び植物体の作製）
トランスジェニック植物の作製は、S.B.Gelvin、R.A.Schilperoort and D.P.S.Verma著；Plant Molecular Biology/Manual（1988）（Kliwer Academic Publishers発行、Valvekens et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,85:5536-5540（1988）に記載してある方法に準じて行った。
YEB 培地中、30℃で一晩振とう培養したアグロバクテリウム菌LBA4404 を、新たなYEB 培地に植え継ぎ、OD600 =0.6になるまで培養した。以下の操作は、低温室にて行った。この培養液から、遠心して菌体を集め、冷やしておいた滅菌蒸留水で懸濁後、再度遠心して集菌した。この洗いを2 回繰り返し、さらに滅菌蒸留水を10% グリセロール溶液に変えて同様の操作を行った。こうして得られた菌体を最終的に400 倍濃縮になるように10% グリセロール溶液に懸濁した。このコンピテントセルに、上記のようにして構築した3 種のTiプラスミド発現ベクター（以下、pCR16G1/250-GUS 、pCR16G1/EV-GUS、pCR16G1/H-GUS と記す。）を、エレクトロポレーション法を用いて導入し、カナマイシン50μg/mlを含むYEB プレート上で選抜した。生育してきたカナマイシン耐性クローンからアルカリ-SDS法によりプラスミドDNA を調製し、0.8%アガロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色により、Tiプラスミド発現ベクターが導入されていることを確認した。このアグロバクテリウム菌（pCR16G1/250-GUS/LBA4404 、pCR16G1/EV-GUS/LBA4404、pCR16G1/H-GUS/LBA4404 ）をカナマイシン50μg/m を含むYEB 液体培地中、30℃で2 晩振とう培養した。
無菌播種後、23℃で2-3 週間生育させたアラビドプシスの根を1cm 程度に切断し、CIM プレートで2 日間培養したものを、30℃で2 晩振とう培養したアグロバクテリウム培養液（pCR16G1/250-GUS/LBA4404 、pCR16G1/EV-GUS/LBA4404、pCR16G1/H-GUS/LBA4404 ）に浸し、再びCIM プレート上で培養した。2 日後、根部切片をSIMC培地に移し、さらに2 日後、SIMCK 培地に植え継いだ。約１カ月経って再生してきたシュートを切断してRIM 培地に植え替え、発根させた。発根した個体を土壌、またはロックウールに植え、人工気象器で育てて自殖種子を得た。
無菌培養したタバコの葉部切片をＭＳ液体培地に浸し、その中に30℃でで1 晩培養したアグロバクテリウム菌（pCR16G1/250-GUS/LBA4404 、pCR16G1/EV-GUS/LBA4404、pCR16G1/H-GUS/LBA4404 ）を添加して、暗所、25℃で２日間共存培養した。培養後、MS液体培地で葉部切片を洗浄し、MS-NBCK 培地上に置いた。これを明所、25℃で約１カ月程度静置培養し、再生してきたシュートを葉部切片本体より切断し、MS-CK 培地に植え継いだ。約１カ月後、発根してきた個体について土壌に植え替え、温室で育てて自殖種子を得た。
【００２９】
実施例６  （本発明植物体における導入遺伝子の確認）
実施例５で得られたトランスジェニックアラビドプシスの種子を1%次亜塩素酸で５分間滅菌し、滅菌蒸留水で3-5 回洗浄した後、カナマイシン20μg/mlを含むMS培地で無菌発芽させた。カナマイシン耐性を示した個体からロゼット葉を4-5 枚をとって、CTAB法によりゲノムDNA を調製した。
このDNA50ng を鋳型にし、プライマーとしてレポーター遺伝子であるGUS 遺伝子の内部とGUS 遺伝子のATG から250bp 上流付近（本発明プロモーター内部）の組合せ、
（プライマー配列）
0003791059.tif 000007
さらにＧＵＳ遺伝子内部とＮＯＳターミネーター内部の組合せ
（プライマー配列）
0003791059.tif 000008
を用いてPCR 反応（94℃1 分、55℃2 分、72℃3 分を1 サイクルとして40サイクル）を行い、PCR 産物の一部を0.8%アガロースゲル電気泳動で分画し、目的とするDNA 断片（導入遺伝子）の増幅を確認した。
トランスジェニックタバコについても種子を2.5%次亜塩素酸/0.002%Triton X-100 で5 分間滅菌し、滅菌水で4-5 回洗浄した。これをカナマイシン100 μg/mlを含むMS培地で無菌発芽させた。カナマイシン耐性を示した中から1 個体を用いて、CTAB法によりゲノムDNA を調製し、アラビドプシスの方法と同様な方法、即ち、カナマシン耐性を示した中から１個体を用いて、CTAB法によりゲノムDNA を調製した。このDNA50ng を鋳型にし、プライマーとして、ＧＵＳ遺伝子内部とＧＵＳ遺伝子ＡＴＧから２５０ｂｐ上流付近（本発明プロモーター内部）の組合せ、
（プライマー配列）
0003791059.tif 000009
さらに、ＧＵＳ遺伝子内部とＮＯＳターミネーター内部の組合せ
（プライマー配列）
0003791059.tif 000010
を用いてPCR 反応（94℃１分、55℃2 分、72℃3 分を1 サイクルとして40サイクル）を行い、PCR 産物の一部を0.8 ％アガロースゲル電気泳動で分画し、目的とするDNA 断片（
導入遺伝子）の増幅を確認した。
【００３０】
実施例７  （導入遺伝子の発現パターンの確認）
実験例５で得られた本発明植物体（本発明発現プラスミド：pCR16G1/250-GUS 、pCR16G1/EV-GUS、pCR16G1/H-GUS 、及び対照としてpBI121（CLONTECH製）、pBI101を含む。）の実生の葉と根におけるGUS 染色及びGUS 活性の測定をPlant Mol.Biol.Rep.5:387-405(1987)記載の方法に準じて行った。
尚、 GUSの活性測定は、4-メチルウンベリフェリルグルクロン酸を基質とした蛍光法で、活性染色は 5- ブロモ-4- クロロ-3- インドリル- β-D- グルクロン酸（X-Gluc）を基質として青色色素（インジゴチン）の沈着量を測定した。
（1 ）GUS 染色
トランスジェニックアラビドプシスの種子を、カナマイシン20μg/mlを含むMS培地で無菌発芽させ、カナマイシン耐性を示した個体を３週間生育させた。根を傷つけないように植物体を抜き、GUS 染色液（1 mM X-Gluc 、0.5 mM K3 Fe(CN)6 、0.5 mM  Fe4 Fe(CN)6 、0.3% Triton X-100 ）に浸して37℃で１晩反応させた。反応後、100%エタノールで数回洗浄して脱色し、染色パターンを観察した。その結果、いずれの本発明植物体においても導入遺伝子の産物が維管束、中でも根部における維管束において高発現していることを確認した（図９、１０参照）。またその発現の強さにおいて、pCR16G1/H-GUS を導入した本発明植物体が最も強い発現を示した（表１参照）。
トランスジェニックタバコの種子をカナマイシン100 μg/mlを含むMS培地で無菌発芽させ、１週間後、３週間後、１カ月後にカナマイシン耐性の植物体を引き抜き、GUS 染色液に浸して37℃で１晩反応させた。これを100%エタノールを用いて脱色し、その染色パターンを観察した。その結果、トランスジェニックアラビドプシスでの発現と同様な傾向を示すことが確認できた。また成長段階が進むにつれて、その染色が強くなる傾向も認められた。
（2 ）GUS 活性測定
トランスジェニックタバコ種子をカナマイシン100 μg/mlを含む培地で無菌発芽させ、25℃で1 カ月培養した。根部0.8g、葉部0.5gを乳鉢にとり、それぞれ1ml 、0.5ml の抽出バッファー（50mMリン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA 、0.1% Triton X-100 、0.1 % Sarcosyl、10mMメルカプトエタノール）を添加し、海砂を適当量加え摩砕した。この摩砕液をエッペンドルフチューブに移して遠心分離し、上清を分取した。この液10-70 μl 分を500 μl の反応基質液（50mMリン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA 、0.1% Triton X-100 、0.1% Sarcosyl 、10mMメルカプトエタノール、1mM 4-methylumberlifer- β-D-glucuronide）に添加し、37℃で反応させた。反応後、一定時間おきに100 μl をサンプリングし、直ちに900 μl の反応停止液（0.2M炭酸ナトリウム溶液）と混合した。このように調製したサンプルを分光蛍光光度計（日立製作所 F-2000 ）で測定した。この測定値と葉部、根部の抽出液のタンパク質濃度からGUS 活性を算出した。タンパク質濃度の定量はBIO-RAD 社のProtein assay reagent を用いた方法で行った。その結果、本発明植物体では根部において高いGUS 活性が検出された（表２参照）。
【００３１】
【表１】
0003791059.tif 000011
【００３２】
【表２】
0003791059.tif 000012
【００３３】
実施例において用いられた培地の組成を以下に示す。
（１）タバコ用培地
ａ）MS寒天培地
MURASHIGE AND SKOOG(Flow Laboratories)4.4g、ショ糖30g を蒸留水 1 Lに溶かし、1M KOHで pH 5.8 に調製し、ジェランガム（和光純薬）を3g添加した後、オートクレーブ滅菌した。
ｂ）MS-NBCK 寒天培地
MS寒天培地に、1-ナフタリン酢酸（NAA ）0.1 μg/ml、6-ベンジルアミノプリン（BA）1.0 μg/ml、カナマイシン20μg/ml、クラフォラン300 μg/mlを添加した培地である。
ｃ）MS-CK 寒天培地
MS寒天培地にカナマイシン100 μg/ml、クラフォラン300 μg/mlを添加した培地である。
（２）アラビドプシス用培地
ａ）MS寒天培地
MURASHIGE AND SKOOG(Flow Laboratories)4.4g、ショ糖20g を蒸留水 1 Lに溶かし、1M KOHで pH 6.3 に調製し、ジェランガム（和光純薬）を2g添加した後、オートクレーブ滅菌した。
ｂ）CIM 寒天培地
MS寒天培地に、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D ）0.5 μg/ml、カイネチン0.05μg/mlを添加した培地である。
ｃ）SIMC寒天培地
MS寒天培地にN6- ［２- イソペンテニル］アデニン（2-Pi）5 μg/ml、インドール酢酸（IAA ）0.15μg/ml、クラフォラン300 μg/mlを添加した培地である。
ｄ）SIMCK 寒天培地
SIMC培地にカナマイシン20μg/mlを添加した培地である。
（３）細菌、ファージ用培地
ａ）L-培地
バクトトリプトン（Difco ）10g 、バクトイーストエキストラクト（Difco ）5g、NaC l 10g を蒸留水 1 Lに溶かし、5M NaOH で pH 7.0 に調整し、オートクレーブ滅菌する。プレートの場合はこれに15g の寒天を添加する。
ｂ）YEB 培地
バクトビーフエキストラクト（Difco ）5g、バクトイーストエキストラクト（Difco ）1g、ポリペプトン5g、ショ糖5g、10M NaOH 0.2mlを蒸留水 1 Lに溶かし、オートクレーブ滅菌する。オートクレーブ後、フィルター滅菌した1M MgSO4を0.2ml 添加して用いる。プレートの場合はこれに15g の寒天を添加する。
ｃ）NZY 培地
イーストエキストラクト5g、NZアミン10g 、NaCl 5g 、MgSO4 ・7H2O2gを蒸留水1Lに溶かし、5M NaOH で pH 7.5 に調整し、オートクレーブ滅菌する。プレートの場合はこれに15g の寒天（Difco ）を添加しておく。
ｄ）トップアガー
NZY 培地100ml にのAgarose-II（Dojin ）0.7gを添加したものである。
【００３４】
【発明の効果】
本発明プロモーターを利用することにより、植物の維管束（特に根部における維管束）において目的とするタンパク質を高発現させることが可能になった。
【００３５】
【配列表】
0003791059.tif 000013
【００３６】
0003791059.tif 000014
0003791059.tif 000015
【００３７】
0003791059.tif 000016
0003791059.tif 000017
【００３８】
0003791059.tif 000018
0003791059.tif 000019
【００３９】
0003791059.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明（発現）プラスミドであるpCR16G1/250-GUS 、pCR16G1/EV-GUS、pCR16G1/H-GUS を示す図である。
【図２】図２は、本発明タンパク質遺伝子プラスミドであるpCR16G1/Xbを示す図である。
【図３】図３は、本発明タンパク質のアミノ酸配列と種々のタンパク質のアミノ酸配列との比較を示す図である。
【図４】図４は、本発明プラスミド（本発明タンパク質遺伝子の一部と本発明プロモーターを含有するプラスミド）であるpCR16G1/Xhを示す図である。
【図５】図５は、pBI101から本発明（発現）プラスミドであるpCR16G1/250-GUS を構築する工程を示す図である。
【図６】図６は、pBI101、pCR16G1/250-GUS から本発明（発現）プラスミドであるpCR16G1/EV-GUSを構築する工程を示す図である。
【図７】図７は、pBI101から本発明（発現）プラスミドであるpCR16G1/H-GUS を構築する工程を示す図である。
【図８】図８は、本発明プロモーターであり、XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有する領域（約４Ｋｂｐ）を示す図である。
【図９】図９は、本発明プロモーターにより植物の維管束において目的とするタンパク質が高発現していることを染色により視覚化した（生物の形態を示す）図である。維管束部が染色された結果、図では白抜き表示されている。尚、図では黒表示が非染色域であり、白抜き表示が染色域である。
【図１０】図１０は、本発明プロモーターにより植物の維管束において目的とするタンパク質が高発現していることを染色により視覚化した（生物の形態を示す）図である。維管束部が染色された結果、図では白抜き表示されている。尚、図では黒表示が非染色域であり、白抜き表示が染色域である。
【図１】
0003791059.tif 000021
【図２】
0003791059.tif 000022
【図３】
0003791059.tif 000023
【図４】
0003791059.tif 000024
【図５】
0003791059.tif 000025
【図６】
0003791059.tif 000026
【図７】
0003791059.tif 000027
【図８】
0003791059.tif 000028
【図９】
0003791059.tif 000029
【図１０】
0003791059.tif 000030