(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体表面を塩素化し、次いでアミノ化して該固体支持体表面に第１級アミノ基を形成させ、該第１級アミノ基に、ジカルボン酸にカルボジイミドあるいはジシクロヘキシルカルボジイミド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドあるいはｐ−ニトロフェノールを反応させて得られるものであるＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル化したジカルボン酸あるいはｐ−ニトロフェノール活性化エステル化したジカルボン酸を反応させることを特徴とする一方の末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基あるいはｐ−ニトロフェノールエステル基からなる活性化エステル基が結合した炭化水素基の他方の末端を、固体支持体表面にアミド結合を介して固定化させたことを特徴とする化学修飾を施した基体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分子生物学分野、生化学関連分野において有用な、核酸又は蛋白を固定化可能な化学修飾を施した基体に関するものである。例えば、ＤＮＡを固体支持体表面に固定化して保存し、必要なときに取り出してポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction;ＰＣＲ)によりＤＮＡのセグメントを増幅して、ＤＮＡを解析するという全く新しい発想の基で成し遂げられたものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子解析は分子生物学、生化学の分野で有用であり、近年では病気の発見等医療分野でも利用されている。
【０００３】
遺伝子解析において、近年ＤＮＡチップが開発され解析速度が著しく速くなった。しかし従来のＤＮＡチップはスライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にＤＮＡを固定する方法である。また、フォトリソグラフ等の半導体技術を用いてガラス基板上にオリゴヌクレオチドを合成する方法が用いられている。
【０００４】
しかし、スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布してＤＮＡを固定する方法では、ＤＮＡの固定化状態が不安定であり、ハイブリッド形成工程や洗浄工程において、ＤＮＡが剥離するといった問題が生じる。また、半導体技術を用いたＤＮＡチップは、製造工程の煩雑さから非常に高価であるという問題がある。
このような問題点を解決するためには、固体支持体表面にＤＮＡを高密度で且つ強固に固定化する必要がある。
【０００５】
また、従来、固体支持体の表面を化学修飾した基体が知られている。しかし、カルボン酸等にＤＮＡを結合させるには、カルボン酸の活性化が必要となるため、基板の化学修飾だけでは不十分である。
【０００６】
本発明は、ＤＮＡの解明やＤＮＡ保存を効率的に行うことができ、分子生物学分野、生化学分野等において有用な化学修飾を施した基体を提供しようとすることを目的とするものである。また、本発明は、ＤＮＡ或いは蛋白を安定に固定化するための基体を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討の結果、固体支持体表面を化学修飾してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル或いはｐ−ニトロフェノールエステル等の活性化エステル基を含む炭化水素基を有する基体が、ＤＮＡ等を安定して固定可能なことを見いだし、本発明に到達した。
すなわち、
請求項１に記載の化学修飾を施した基体の製造方法は、固体支持体表面を塩素化し、次いでアミノ化して該固体支持体表面に第１級アミノ基を形成させ、該第１級アミノ基に、ジカルボン酸にカルボジイミドあるいはジシクロヘキシルカルボジイミド、およびｐ−ニトロフェノールを反応させて得られるものであるｐ−ニトロフェノール活性化エステル化したジカルボン酸を反応させることを特徴とする一方の末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基あるいはｐ−ニトロフェノールエステル基からなる活性化エステル基が結合した炭化水素基の他方の末端を、固体支持体表面にアミド結合を介して固定化させたことを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の基体は、固体支持体の表面に特定の化学修飾を施したことを特徴とするものである。本発明における化学修飾とは、炭化水素基の末端に活性エステル基が結合した基を、固体支持体表面にアミド結合を介して固定化することをいう。このような化学修飾によって、ＤＮＡ等或いは蛋白を基体の表面に固定しやすくなる。
【０００９】
炭化水素基は、炭素数０〜１２、中でも０〜６のものが好ましい。
例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸などのモノカルボン酸；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などのジカルボン酸；トリメリット酸等の多価カルボン酸等があげられる。中でもシュウ酸、コハク酸が好ましい。
【００１０】
炭化水素基の末端に結合する活性エステル基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル或いはｐ−ニトロフェノールエステルが好ましい。
【００１１】
このような化学修飾は、固体支持体にアミド結合を介して炭化水素基の末端に活性エステル基が結合した基を固定化することである。
例えば活性エステル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基の場合には、塩素ガス中で固体支持体に紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、適当な酸クロリドを用いてカルボキシル化し、末端のカルボキシル基をカルボジイミド或いはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することにより行うことができる。
この方法を採用する場合の脱水縮合について一例を挙げて説明すると、表面を化学修飾し、カルボキシル基を有する状態の固体支持体をカルボジイミドあるいはジシクロヘキシルカルボジイミド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド或いはｐ−ニトロフェノールを溶解した１，４−ジオキサン溶液中に浸漬させ、洗浄後乾燥する。このようにして、Ｎ−スクシンイミドエステル基やｐ−ニトロフェノールエステル基を末端に有する炭化水素基が結合した基体が得られる。
【００１２】
また、上記の方法より好ましい方法として、特に、あらかじめダイヤモンド等の固定支持体（基板）上に形成された第１級アミノ基に、活性化ジエステルの一方のエステル基を脱水縮合させることにより形成されることが望ましい。
【００１３】
活性化ジエステルとは、上記した活性エステル基を２つ有しているものをいう。エステル基は活性化ジエステル中の両端に位置していることが好ましく、炭素数０〜１２、好ましくは０〜６のものが好ましい。エステル基を除いた骨格部分は直鎖状飽和脂肪酸が好ましい。
【００１４】
活性化ジエステルを用いた方法として、同様に塩素化し、次いでアミノ化後、このアミノ基に対し、予めシュウ酸（ジカルボン酸）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル化して得られる活性化エステルを反応させ、所望の基体を得る方法が挙げられる。
【００１５】
この方法におけるＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル化とは、ジカルボン酸をカルボジイミド２．５ｍｇ/ｍｌおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．５ｍｇ/ｍｌを溶解した１，４−ジオキサン溶液(３ｍｍ角ダイヤモンド１枚に対し１００μｌとなる量)に溶解して１５分間反応させ、活性化ジエステルを得るものである。この活性化エステルをアミノ基を付しておいて固体支持体に結合させ、化学修飾を完了する。
この方法は、本発明者らがはじめて開発したものである。固体支持体表面を活性化エステル基で化学修飾した状態の商品とすることにより、ユーザーはそれを用いて容易にＤＮＡを直に固体支持体表面にアミド結合により固定化することができる。
【００１６】
シュウ酸ジクロリドは入手困難であるが、シュウ酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルにすることで容易に固体支持体表面を化学修飾できる。
【００１７】
本発明において上記のような化学修飾を行う固体支持体としては、ダイヤモンド、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；上記金属とセラミックスとの積層体；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック等が挙げられる。
その他の材料でも、化学的に安定な材料であれば使用でき、例えば、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボンが挙げられる。また、プラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体でもよい。
【００１８】
これらのうち、熱伝導性の点からダイヤモンドが好ましい。ダイヤモンドは熱伝導性に優れており、急速な冷却が可能であるため、ＰＣＲ等の加熱冷却を繰り返すヒートサイクル時間を効果的に短縮できる。
本発明の基体の熱伝導率は、０．１Ｗ/ｃｍ・Ｋ以上、好ましくは０．５Ｗ/ｃｍ・Ｋ以上、特好ましくは１．０Ｗ/ｃｍ・Ｋ以上であることが好ましい。１．０Ｗ/ｃｍ・Ｋ以上とすることにより、ＤＮＡを本発明の基体の化学修飾部分に固定化させてＰＣＲ等を行う場合、加熱・冷却の追随性に優れているからである。
【００１９】
ダイヤモンド基板の素材として、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、或いは天然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。また、それらの構造が単結晶体或いは多結晶体のいずれでも差し支えない。生産性の観点よりマイクロ波プラズマＣＶＤ法などの気相合成法を用いて製造されたダイヤモンドを用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の基体の形成方法は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ法、ＥＣＲＣＶＤ法、ＩＰＣ法、直流スパッタリング法、ＥＣＲスパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。また、金属粉末やセラミック粉末等に樹脂をバインダーとして混合して結合形成したものが挙げられる。また、金属粉末やセラミック粉末等の原料をプレス成形機を用いて圧粉したものを高温で焼結したものもあげられる。
【００２１】
本発明の基体の基板表面は意図的に粗面化されていることが望ましい。このような粗面化表面は基体の表面積が増えて多量のＤＮＡ等を固定させることに好都合であるからである。基体の形状は平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。
さらに、このダイヤモンド基板は、ダイヤモンドと他の物質との複合体（例えば、２層からなる基板）であってもよい。
【００２２】
【実施例】
以下実施例により本発明を説明する。
実施例１
塩素ガス中で３ｍｍ角のＣＶＤダイヤモンドに紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、酸クロリドを用いてクロロホルム中で還流してカルボキシル化した。
この表面が修飾された固体支持体を、カルボジイミド２．５ｍｇ/ｍｌおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．５ｍｇ/ｍｌを溶解した１，４−ジオキサン溶液（３ｍｍ角ダイヤモンド１枚に対し１００μｌとなる量）中に１５分間浸漬させ、末端カルボキシル基を脱水縮合した。反応終了後水洗し、さらに、１，４−ジオキサン溶液で洗浄後乾燥し、化学修飾された基体を得た。
【００２３】
実施例２
塩素ガス中で３ｍｍ角のシリコン基板に紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化後、このアミノ基に対し、予めシュウ酸（ジカルボン酸）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル化して得られる活性化ジエステルを反応させた。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル化は、以下のようにして行った。シュウ酸をカルボジイミド２．５ｍｇ/ｍｌおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．５ｍｇ/ｍｌを溶解した１，４−ジオキサン溶液（３ｍｍ角ダイヤモンド１枚に対し１００μｌとなる量）に溶解して１５分間反応させ、活性化ジエステルを得た。この活性化ジエステルを予めアミノ基を付しておいた固体支持体に結合させ、化学修飾を施した基体を得た。
【００２４】
上記に示す実施例１と実施例２で作成した基体を用いて、２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを固定した後、相補的な配列を持つ蛍光標識プローブとハイブリッド形成し、蛍光光度計を用いてオリゴヌクレオチド固定化量を見積もった。その結果、実施例１では３ｍｍ角の基板１枚あたり３８ｐｍｏｌ、実施例２では３ｍｍ角の基板１枚あたり３５ｐｍｏｌであり、いずれもオリゴヌクレオチドが高密度に固定していることが明らかになった。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の化学修飾を施した基体は、化学修飾がされ活性化エステル基を有しているため、ＤＮＡ等核酸を安定して固定化できるので、ＰＣＲを行うにあたり有利である。また、本発明の製造方法により、ＤＮＡ等を安定して固定化できる基体を効率よく生産できる。特にカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化して得られるジエステルを用いることにより、酸クロリドの存在化クロロホルム中で還流操作をすることなく、固体支持体表面に活性化エステル基を化学修飾することができる。また、この状態で商品とすることで、ユーザーは容易にＤＮＡを固定化することができる。