(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタピロカテカーゼを用いる酸素添加酵素反応において、ポジトロン核種15Ｏを添加酸素としてピロカテコールに導入することを特徴とする酸素添加酵素反応の放射検出方法。
【請求項２】
安定同位体の17Ｏおよび／または18Ｏを併用する請求項１の放射検出方法。
【請求項３】
14Ｎ（ｄ，ｎ）15Ｏ反応により作製した15Ｏを酸素−窒素混合ガスにより導入する請求項１ないし２のいずれかの放射検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、酸素添加反応の放射検出方法に関するものである。さらに詳しくは、粗物質系においても微量代謝産物の検出を容易とし、酸素添加反応の機序の解明や生化学的応用等を可能とする新しい放射検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
酸素は、生体にとって不可欠の分子であるが、最近になり老化のメカニズムの一つとして、酸化的ストレスの結果がもたらす多くの生化学的変化がクローズアップされ、酸素の生体分子への関与が、大きな問題となってきている。従来、酸素から見た代謝を語る場合、細胞呼吸によりエネルギー（ＡＴＰ）を生じること、また、酸素添加酵素の働きによりステロイド、プロスタグランジン、カテコールアミン、セロトニン等の多くの生理活性物質の生合成に重要なこと、酸素から生じるラジカルのこと、等が語られてきたが、酸素分子そのものから、これらの代謝を見た研究は、殆ど皆無であった。これは、後にも述べるように、酸素に使い易い放射性同位元素がなかったことによる。
【０００３】
一方、酵素は、生化学的反応に重要な役割を果しているが、その反応過程の解析はそれほど容易でない。たとえば酵素による反応として酸素添加反応が知られており、細胞や生体組織における酸素を用いての反応としてその反応過程が注目されているが、現実的にはその解析手段はほとんど現実的なものとなっていない。これは反応の過程で生じる微量の不安定代謝物の検出が極めて難しいことにその理由がある。
【０００４】
もちろん、これまでにも、酸素添加酵素反応についてその反応過程の検討が行われてきている。酸素添加酵素反応の証明のために、安定同位体である18Ｏや17Ｏを用いる方法である（たとえばO.Hayaishi、１９５７）。
しかしながら、これまでに知られている安定同位体18Ｏや17Ｏを用いる方法は、精製酵素に適用するのにはよいが、細胞や組織などの複合系には適用しがたいという問題がある。つまり、より複雑な系において、微量の不安定物質を検知することができないのである。このことは、従来においては酸素原子に利用しやすい放射性同位元素を用いる方法がなかったからである。
【０００５】
このような事情は、酵素反応に限られることなく、酸素が関与する生合成、あるいは一般の化学合成等の反応において、たとえば、金属やその錯体、酸化物等を触媒として用いる場合にもその反応機序の解明が難しく、これら反応技術の発展を大きく制約していたことにも見てとれる。
そこで、この発明は、以上のような従来技術の限界を克服し、より複雑な系においても、酵素反応における微量不安定物質の検出、触媒反応における微量中間体化合物の検出をも可能とする新しい酸素添加反応の検出方法を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、メタピロカテカーゼを用いる酸素添加酵素反応において、ポジトロン核種15Ｏを添加酸素としてピロカテコールに導入することを特徴とする酸素添加酵素反応の放射検出方法を提供する。
そしてまた、この発明は、上記の方法において、安定同位体の17Ｏおよび／または18Ｏを併用することや、14Ｎ（ｄ，ｎ）15Ｏ反応により作製した15Ｏを酸素−窒素ガスにより導入すること等をその一つの態様として提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
この発明は、上記の構成によって、様々な基質を対象とする酸素添加反応において、これまでは検出が困難であった微量の不安定代謝物質や反応中間体等の検出を可能とする。このため、反応機序の解明をはじめ、生物細胞やその組織における作用の検討と、様々な医学、生化学的応用、さらには化学合成への応用を可能とする。
【０００８】
15Ｏは、物理学的半減期は２．０７分と比較的短いが、比放射能が高い（理論的には３．３６×１０21Ｂｑ／ｍｏｌ）ことから、微量の不安定代謝物の探索には非常に有利である。
この15Ｏによる標識では、ポジトロン核種であり、たとえばポジトロンエミッショントモグラフィーに用いられているものを利用することができ、酸素添加反応においてこれを導入すればよい。
【０００９】
酵素反応での反応基質、酵素の種類、触媒反応における原料物質や触媒の種類、さらには生成物の同定手段について特に限定はなく、様々な態様が可能であるが、特にメタピロカテカーゼを用いた酸素添加酵素反応において、基質としてピロカテコールを用いることを対象としている。
また、15Ｏとともに、17Ｏや18Ｏの安定同位体を併用する場合、つまり２重標識法による場合には、15Ｏで未知代謝物（酸素添加物）等の存在をモニターし、その部分をさらに17Ｏや18Ｏの存在によってゆっくりと時間をかけて構造決定できる等の利点がある。このような併用も様々な態様として可能である。
【００１０】
以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明の実施の形態を説明する。
【００１１】
【実施例】
酸素添加酵素反応のモデルとして、
基質：ピロカテコール
酵素：メタピロカテカーゼ
を用いた。
【００１２】
図１は、このモデル反応のための実験系を例示したものである。ベビーサイクロトロンにより定常的に14Ｎ（ｄ，ｎ）15Ｏ反応によって15Ｏを作製し、酵素−窒素混合ガスのフローにより１％Ｏ2 ／９９％Ｎ2 として２５０ｍｌ／ｍｉｎの速度により実験に供給した。
この反応において、基質のカテコールは、次式のとおり、経時的に放射活性のある単一の産物に変換されたことが確認された。
【００１３】
【化１】
0003789972.tif 000002
【００１４】
なお、産物はＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳによって同定した。
図２は、15Ｏ2 の反応への関与を示した反応時間と放射能との関係を示したものである。また、図３はＨＰＬＣの同定結果を示したものである。なお、ＨＰＬＣの同定の条件は次のとおりとした。
【００１５】
【表１】
0003789972.tif 000003
【００１６】
また、図４はＬＣ−ＭＳのスペクトルを示したもので、最下段は、基質カテコールを示している。また、最上段の最初の放射ピークは、酵素に結合した15Ｏである。カテコールおよび産物のスペクトルについては、いずれも５０〜１０００Ｄａでスキャンニングしている。ＬＣ−ＭＳの同定条件は次のとおりとした。
【００１７】
【表２】
0003789972.tif 000004
【００１８】
15Ｏは、次式のとおりの部位にあるものとして確認された。
【００１９】
【化２】
0003789972.tif 000005
【００２０】
もちろん、この発明は以上の例によって何ら限定されるものではない。様々な反応において15Ｏによる標識化が有効である。
【００２１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、酸素が介在する酵素反応や触媒反応等の化学反応について、酸素添加活性の評価、反応により生成する中間体や産物としての微量の不安定物質の検出、これによる反応機序の解明、さらには18Ｏ、17Ｏという安定同位体による検討との併用等によって、合成化学、生化学、そして細胞、標識における代謝過程、その医学への応用等が可能とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験系を例示した構成図である。
【図２】実施例としての反応時間と検出放射能との関係を示した図である。
【図３】ＨＰＬＣスペクトル図である。
【図４】ＬＣ−ＭＳのスペクトル図である。
【図１】
0003789972.tif 000006
【図２】
0003789972.tif 000007
【図３】
0003789972.tif 000008
【図４】
0003789972.tif 000009