(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ成分、ボロン酸基含有不飽和単量体、
ｂ成分、重合体に下部臨界共溶温度を付与する不飽和単量体、
を重合してなる重合体からなるボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の分離剤を水系の媒体中で用いて
（１）分離剤およびボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の混合
（２）均一化
（３）液−液相分離を示す温度以上に加温して相分離
の工程を行うこと特徴とするボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物を液−液相分離によって分離する分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の分離剤およびそれを用いた分離方法に関する。更に詳しくは、ボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物を特定のボロン酸基含有重合体を用いて分離する分離剤およびそれを用いた分離方法に関する。
本発明は、液−液相分離、さらには、カラム分離に応用可能な分離剤およびその分離方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
低分子化合物を分離する方法としては蒸留、昇華、抽出、結晶化、各種充填剤を用いたカラム分離、液−液相分離を利用した方法等が挙げられる。
液−液相分離は、特定の１種または２種の重合体を同一の液体に溶解し混合することによって形成され、通常、液体と重合体濃厚溶液、または２種の重合体溶液の２層に分離した状態になる（見かけ上、２層に分離した重合体溶液が懸濁状態（コアセルベート）になることもある）。液−液相分離を利用した化合物の分離を達成するためには、使用する相分離の系に用いた溶媒と同じ溶媒に溶解した化合物に相分離を起こす重合体溶液を加えることによって達成され、化合物は層分離した２つの層に一定の分配係数で分配されるため、分配係数の高い層に濃縮され、混合物試料を用いた場合、結果として化合物の分離が可能となる。
【０００３】
これまでに液−液相分離を形成する重合体は各種知られている。例えば、Walter,H.,  Brooks,E.D.,and  Fisher,D.,"Partitioning  in  aqueous  two-phase  systems,  Academic  Press,  London,(1985)に参考文献も含め、詳細な報告がある。また、液−液相分離を温度によって制御する報告としては、ポリマー第３７巻第６８１頁〜６８５頁（１９９６年）（Hiroaki Miyazaki, and Kazunori Kataoka, Polymer, 37 (1996) 681-685 ）が挙げられる。
【０００４】
前記の系においては、目的とする分離したい低分子化合物の重合体溶液に対する受動的な分配係数を利用して低分子化合物の分離を行っていた。そのため、より十分な分離効率を得ることができなかった。
【０００５】
また、ボロン酸基を側鎖に有する重合体を用いた液−液相分離に関しては、宮崎浩明らによる、自律応答性材料シンポジウム予稿集、第９４頁〜９５頁（１９９５年）に記載されているが、化合物の分離への応用に関しては知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ボロン酸基含有重合体を用いて、ボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物を効率よく分離する分離剤を提供するものである。またさらに、該重合体を用いて  ボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物を効率よく分離する方法を提供するものである。
また、更に詳しくは、本発明の目的は、液−液相分離を起こすことができ、この相分離によって化合物を分配、分離することができ、この相分離状態を温度の制御、およびボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の添加によってコントロール可能な重合体を提供すること、およびその分離方法の提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の問題点を鋭意検討した結果、特定のボロン酸基含有単量体を重合した重合体が下部臨界共溶温度を有し、またボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物とボロン酸基がコンプレックスを形成して、分離効率を高めることを見いだした。換言すれば、化合物の分離においては、ボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物と特異的に結合可能なボロン酸基を使用する重合体の側鎖に導入することによって、ボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の分配係数を積極的に向上させているために、より高い分配係数となり、結果としてボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の効率の良い分離が可能となることがわかり、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
ａ成分、ボロン酸基含有不飽和単量体、
ｂ成分、重合体に下部臨界共溶温度を付与する不飽和単量体、
を重合してなる重合体からなるボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の分離剤を水系の媒体中で用いて
（１）分離剤およびボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の混合
（２）均一化
（３）液−液相分離を示す温度以上に加温して相分離
の工程を行うこと特徴とするボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物を液−液相分離によって分離する分離方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に使用する重合体は、ａ成分のボロン酸基含有不飽和単量体、ｂ成分の重合体に下部臨界共溶温度を付与する単量体、さらにはｃ成分のその他の不飽和単量体を重合してなる重合体である。
【０００９】
本発明で用いるａ成分のボロン酸基含有単量体とは、下記式（１）
【化１】
0003767011.tif 000002
（ただし、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は水素原子またはメチル基であり、Ｙは、
【化２】
0003767011.tif 000003
である。）
で示される重合性の二重結合とボロン酸基を含有する不飽和単量体である。具体例としては、例えば、３−アクリロイルアミノフェニルボロン酸、３−メタクリロイルアミノフェニルボロン酸、４−ビニルフェニルボロン酸、３−アクリルアミド−４−ヘプタフルオロプロピルフェニルボロン酸、３−アクリルアミド−２，５−ビス（ω−ヒドロペルフルオロブチル）フェニルボロン酸などが挙げられる。これらの１種または２種以上を用いることができる。
ａ成分のボロン酸基含有不飽和単量体は、全不飽和単量体中、０．１〜９０モル％の範囲で用いられるが、好ましくは０．５〜７０モル％の範囲で用いるのが良い。
【００１０】
ｂ成分の重合体に下部臨界共溶温度を付与する不飽和単量体とは、重合して得られる重合体が下部臨界共溶温度（以下、ＬＣＳＴをと略す）を有する性質を示すもので、このｂ成分の不飽和単量体のみを重合してなる重合体が必ずしも水に対して０℃から１００℃の間でＬＣＳＴを有していなくてもよい。具体例としては、たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリドンなどが挙げられる。それらの１種または２種以上を用いることができる。該単量体は、全不飽和単量体中、０．１〜９０モル％の範囲で用いられるが、好ましくは３０〜８０モル％の範囲で用いるのが良い。
【００１１】
また本発明に使用する重合体は、ａ成分のボロン酸基を有する不飽和単量体、ｂ成分の重合体に下部臨界共溶温度を付与する不飽和単量体の他に、ｃ成分の他の不飽和単量体を共重合することが可能である。
この場合、重合性の不飽和単量体であればどのようなものでもよい。具体例としては、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、アクリル酸、メタクリル酸、各種アルキルアクリレート、各種アルキルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ-ビニルピロリドン、メタクリル酸モノグリセロール、アクリロニトリル、スチレン、各種マクロモノマー、ビニルベンジルアミン、アミノスチレン、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、２−ビニルイミダゾール、Ｎ−メチル−２−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルイミダゾール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド各種四級塩、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド各種四級塩、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート各種四級塩、ジメチルアミノエチルメタクリレート各種四級塩、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート各種四級塩、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート各種四級塩、酢酸ビニル、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクルアミド、イタコン酸、メタコン酸、フマル酸、無水マレイン酸、アミノスチレン、ビニルベンジルアミン等が挙げられる。
これらの１種以上を用いることができる。
ｃ成分のその他の単量体は、全不飽和単量体中、０〜６０モル％の範囲で用いられるが、好ましくは０〜３０モル％の範囲で用いるのが良い。
【００１２】
本発明に使用する重合体は、ａ成分およびｂ成分、必要に応じてｃ成分の不飽和単量体からなる単量体組成物を、公知の溶液、塊状、乳化、懸濁重合法などを用いて、重合温度０〜１００℃、重合時間１０分〜４８時間の条件で重合することによって得ることが出来る。
重合に用いる重合開始剤としては、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス〔２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン〕二塩酸塩、２，２’−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン〕二塩酸塩、２，２’−アゾビスイソブチルアミド二水和物、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ターシャリブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ターシャリブチルペルオキシピバレート、ターシャリブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等があげられる。これらを単独で用いてもよく、あるいは各種レドックス開始剤系などを併用して用いても良い。また、これらの重合開始剤を１種または２種以上を用いてもよい。
重合開始剤の使用量は、全不飽和単量体に対して０．０１〜５重量％が好ましく使用される。
【００１３】
本発明に使用する共重合体の重合度は、１０から５万であることが好ましい。ボロン酸基含有量と重合体を含む溶液の粘度の関係から１００から５千であることがより好ましい。また、共重合体一分子中のボロン酸濃度は２個以上であることが望まれるが、生理的ｐＨ＝７．４でボロン酸の結合力を保持するためには２０個以上であることが好ましい。
【００１４】
前記重合体は水系の媒体中、あるいは、５０％以下の有機溶媒を含む水系の媒体中で使用されるが、緩衝液を用いて使うのが好ましい。その緩衝液の具体例としては、リン酸緩衝液、リン酸生理緩衝液、グッド緩衝液（ヘペス緩衝液，モプス緩衝液など）などが挙げられる。また、この際のｐＨ値は２〜１０で用いることができるが、ボロン酸基のコンプレックス形成可能な化合物に対するコンプレックス形成能力を積極的に利用する場合はｐＨ値が６．５〜１０が好ましい。
【００１５】
なお、本発明の重合体を前記水系媒体中で化合物分離に用いるに際には、その最終濃度が、０．５〜３００ｍｇ／ｇの濃度で使用する事ができるが、粘度の関係、及び分離効率の関係上５〜１００ｍｇ／ｇで使用することが好ましい。
【００１６】
本発明で用いるボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物とは、具体的には、ドーパ、ドーパミン、エピネフリン等の各種カテコール類；アデノシン、グアノシン、イノシン等の各種ヌクレオシド；ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｃ−ＡＭＰ、ＧＭＰウリジン、チミジン、ＦＡＤ、ＮＡＤＰ等の各種ヌクレオチド；ｒ−ＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡをはじめとする各種ＲＮＡ；フルクトース、グルコース、リボース、グルシトール、マンニトール、ソルビトール、アデノシン等の各種糖類；及びそれらの修飾物、膜糖蛋白、ＩｇＧ等の糖蛋白；乳酸、ドキソルビシン、チロシン等が挙げられる。
【００１７】
前記の重合体の分離剤を用いて分離する方法は、次の工程を行う。すなわちａ成分、ボロン酸基含有不飽和単量体、
ｂ成分、重合体に下部臨界共溶温度を付与する不飽和単量体、
を重合してなる重合体からなるボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の分離剤を水系の媒体中で用いて
（１）分離剤およびボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の混合
（２）均一化
（３）液−液相分離を示す温度以上に加温して相分離
の工程を行うこと特徴とするボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物を液−液相分離によって分離する分離方法である。
【００１８】
本発明のボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の分離の具体的な方法は、前記重合体溶液に分離を行う試料を溶解し、温度を上昇させる。上昇させる温度としては、使用する重合体及び使用する緩衝液によって異なるが、系が液−液相分離を示す温度以上に上昇させる事が必要である。そうすることによって、均一であった分離剤、ボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物の水溶液が液−液相分離状態となる。
このとき各層は、即座に２層に分離することもあるが、懸濁状態（コアセルベート）になる場合もある。その場合は相分離を起こしている温度における遠心操作によって、速やかに２層に分離することができる。
【００１９】
液−液相分離形成後の最終的な目的の化合物の分離においては、分離操作によって単離したい化合物が多価水酸基化合物に代表されるボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物である場合と、分離操作によって除きたい化合物が多価水酸基化合物に代表されるボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物である場合が考えられるが、前者の場合、目的化合物は前記重合体溶液の層にあり、重合体溶液の層を分離後、温度をＬＣＳＴより低い温度に低下させ、さらに媒体の溶液のｐＨを低下させることによってコンプレックスを解離させるか、あるいは他の多価水酸基化合物に代表されるボロン酸基とコンプレックスを形成する化合物を加えることによって、コンプレックスを解離させ、引き続いて、通常高分子の分離に用いられる方法であるゲルろ過法や再沈殿法などによって分離することが出来る。後者の場合、目的物は前記重合体溶液ではない層にあることから、その層を取り出すことによって分離は完了する。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の化合物の分離剤は、ａ成分のボロン基含有不飽和単量体およびｂ成分の重合体に下部臨界共溶温度を付与する不飽和単量体、必要に応じてｃ成分のその他の不飽和単量体を重合してなる重合体で、ボロン酸基を重合体に導入することによって、ボロン酸基とコンプレックス形成可能な化合物とボロン酸基がコンプレックス形成可能となり、より高い分配係数で分離することが可能である。
また、本発明の分離方法は、水を５０％以上含む溶媒に溶解する化合物を液−液相分離によって効率よく分離することが可能になる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
合成例１
エタノール中にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（以下ＤＭＡＡと略記）と３−アクリロイルアミノフェニルボロン酸（以下ＡＡＰＢＡと略記）を０．５モル／リットルの濃度となるように溶解し、また重合開始剤としての２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）を２．５ミリモル／リットルの濃度となるように溶解し、４５度で重合時間０．５ｈにおいて溶液重合を行った。
反応終了後、反応液をエーテルに滴下して重合体を沈殿させ濾別し、一晩減圧乾燥し、重量測定により重合体の収率を求めた。それぞれの結果を合成例１〜３として表１に示す。得られた共重合体中のボロン酸モノマーの含有量（mol％）は共重合体７mgをＤＭＳＯ−ｄ6  １ｍｌに溶かし、４００ＭＨｚ1Ｈ−ＮＭＲ（ＪＮＭ−ＥＸ４００，ＪＥＯＬ，ＬＴＤ）測定により行った。結果を表１に示した。
【００２２】
【表１】
0003767011.tif 000004
【００２３】
合成例２、３
合成例１と同様にして表１に示した単量体のモル％で合成した。結果を表１に示した。
【００２４】
合成例４
表１に示した組成でＡＡＰＢＡを３−メタクリロイルアミノフェニルボロン酸（以下ＭＡＰＢＡと略記）に代えた以外は合成例１と同様にして溶液重合を行い、共重合体を得た。その結果を表１に示した。
【００２５】
合成例５
表１に示した組成でＤＭＡＡをＮ−エチルアクリルアミド（以下ＥＡＡと略記）に代え、 ＡＡＰＢＡを３−メタクリロイルアミノフェニルボロン酸（以下ＭＡＰＢＡと略記）に代えた以外は合成例１と同様にして溶液重合を行い、共重合体を得た。その結果を表１に示した。
【００２６】
合成例６
表１に示したようにＤＭＡＡ、ＡＡＰＢＡおよびメチルメタクリレート（ＭＭＡと略記）の組成を代えた以外は合成例１と同様にして溶液重合を行い、共重合体を得た。その結果を表１に示した。
【００２７】
合成例７
表１に示したようにＤＭＡＡ、ＡＡＰＢＡおよびイソプロピルメタクリレート（ＩＰＰＡＡｍと略記）の組成を代えた以外は合成例１と同様にして溶液重合を行い、共重合体を得た。その結果を表１に示した。
【００２８】
［共重合体の分子量の測定］
得られた共重合体の重量度（ｎ）は、ゲルパーミェーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）装置にカラム（ＴＯＳＯＨ製ＧＭＨＨＲ−ＭＸ２）を接続し、ＤＭＦ系でポリスチレンを標準物質として測定した。結果を表１に示した。
【００２９】
比較合成例１
ＡＡＰＢＡを加えずにＮ−エチルアクリルアミド（以下ＥＡＡと略記）単独で合成例１と同様にして溶液重合を行い、重合体を得た。その結果を表２に示した。
【００３０】
【表２】
0003767011.tif 000005
【００３１】
比較合成例２
ＡＡＰＢＡをフェニルアクリルアミド（以下ＰＡと略記）に代えた以外は合成例１と同様にして溶液重合を行い、２５．２％の収率で共重合体を得た。得られた共重合体の構造解析は、共重合体７ｍｇをＤＭＳＯ−ｄ6  １ｍｌに溶かし、1Ｈ−ＮＭＲにより行った。得られた共重合体中のフェニルアクリルアミドの含有率は１８．３モル％であった。その結果を表２に示した。
【００３２】
なお、下部臨界共溶温度の測定は次の方法に従った。
［下部臨界共溶温度（lower critical solution temperature:ＬＣＳＴ）の測定］
共重合体を０．１重量％でｐＨ７．４の０．０５Ｍリン酸緩衝生理食塩水（Ｎａ２ＨＰＯ４；５．２６５ｇ／リットル，ＮａＨ２ＰＯ４；０．８２６９ｇ／リットル，ＮａＣｌ；８．０ｇ／リットル，ＫＣｌ；０．２ｇ／リットル）に溶かし、この溶液の入った測定セルをペルチェ式恒温セルホルダー中に装着し、温度を５分間保持しながら１度ずつ上昇させ、セル内の温度を測定しながら５００ｎｍにおける透過率を分光光度計（ＪＡＳＣＯ社製、Ｕｂｅｓｔ−５０）により測定した。濁度が生じる温度をＬＣＳＴとした。
【００３３】
実施例１
合成例１の共重合体を０．１重量％でＮａＣｌ；８．０ｇ／リットル，ＫＣｌ；０．２ｇ／リットルを含むｐＨ７．８の０．０５Ｍリン酸緩衝生理食塩水５ｍｌに溶かし、さらにそこに多価水酸基化合物としてドキソルビシン（以下ＤＯＸと略記する）を１０，４０，８０，１００μｇ／ｍｌになるように溶かした。その後に、 ＬＣＳＴ＋１０℃で２４時間インキュベートすることによってコアセルベートを形成させ、この溶液を４００Ｇで１０分間遠心分離を行うことによってコアセルベート相を分離した。この上澄み液の４８５ｎｍにおける吸光度を測定することによって、コアセルベート相へのＤＯＸの分配量を算出した。分配量の決定においては、あらかじめ４８５ｎｍの吸光度から作製しておいたＤＯＸの検量線を用いた。
また、ＦＩＴＣ−アルブミンについてもＤＯＸと同様にして蛍光分析（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）により定量し、分配量を算出した。その結果を表３に示した。
【００３４】
実施例２〜５
実施例１と同様にして、表１に示した合成例２〜５の共重合体を用いて分配量を求めた。その結果を表３に示した。
【００３５】
比較例１
比較合成例１で得られた重合体を実施例１と同様にしてＤＯＸとＦＩＴＣ−アルブミンのコアセルベート相への分配量を測定した。その結果を表３に示した。
【００３６】
比較例２
比較合成例２で得られた共重合体を実施例１と同様にしてＤＯＸとＦＩＴＣ−アルブミンのコアセルベート相への分配量を測定した。その結果を表３に示した。
【００３７】
【表３】
0003767011.tif 000006
【００３８】
実施例６
合成例３の共重合体を用いて、また、実施例１におけるドキソルビシンの代わりにカテコールを用いて、２８０ｎｍの吸光度で測定して実施例１と同様の方法で評価した。結果を表４に示した。
【００３９】
実施例７
実施例６における合成例３の共重合体の代わりに合成例６の共重合体を用いて、実施例６と同様の方法で評価した。結果を表４に示した。
【００４０】
実施例８
実施例６の合成例３の共重合体の代わりに合成例７の共重合体を用いて、実施例６と同様の方法で評価した。結果を表４に示した。
【００４１】
【表４】
0003767011.tif 000007
【００４２】
以上の結果から、実施例は、比較例に比べ分配係数が高いことがわかる。