(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生産する能力を有するミクロバクテリウム（Microbacterium）属またはステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属に属する微生物の菌体および／または該菌体処理物の存在下、Ｌ−リブロースからＬ−リボースを生成蓄積させてＬ−リボースを採取することを特徴とするＬ−リボースの製造方法。
【請求項２】
ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物がミクロバクテリウム  ラティクム（Microbacterium laticum）であり、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属に属する微生物がステノトロフォモナス  マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ミクロバクテリウム属に属する微生物が、ミクロバクテリウム  ラティクム（Microbacterium laticum）ＩＡＭ１６４０であり、ステノトロフォモナスに属する微生物が、ステノトロフォモナス  マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＩＡＭ１２４２３であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−リボースの製造方法に関し、より詳細には微生物を用いてＬ−リブロースを異性化して、Ｌ−リボースを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、非天然型の糖類が、立体異性体の制御が必要な医薬及び農薬を合成する際の中間原料として注目されている。非天然型の糖類であるＬ−リボースの主な生産方法としては、Ｌ−アラビノースを原料としたコバルト触媒による化学合成法と、微生物を用いてＬ−リボースを生産する方法としてアシネトバクター  カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus ）ＬＲ７Ｃ株又はその突然変異株であるＤＬ−２８株を用いる方法（特開平１０−１５５４８０）等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし実際に工業的規模でＬ−リボースの生産を行う場合、従来の方法では種々の問題が生じる。上記した合成法では原料のＬ−アラビノースも、触媒であるコバルトも非常に高価であると同時に、この反応により合成されるＬ−リボースの収率も決して満足のいくものではなかった。また、微生物を用いてＬ−リボースを製造する方法では、上記したアシネトバクター属の微生物を利用することが報告されているのみであり、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生産する能力のより高い微生物が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の問題を解決すべく鋭意検討した結果、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属またはステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属に属する微生物がＬ−リブロースを異性化して、Ｌ−リボースを生産する能力を有しており、これらの微生物を用いてＬ−リブロースからＬ−リボースを生成させることによりＬ−リボースが工業的に有利に製造可能なことを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生産する能力を有するミクロバクテリウム（Microbacterium）属またはステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属に属する微生物の菌体および／または該菌体処理物の存在下、Ｌ−リブロースからＬ−リボースを生成蓄積させてＬ−リボースを採取することを特徴とするＬ−リボースの製造方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の製造方法で用いるミクロバクテリウム（Microbacterium）属またはステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属に属する微生物としては、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されない。本発明に用いられるミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物としては、例えばミクロバクテリウム  ラティクム（Microbacterium laticum）種等、具体的菌株としては、例えばミクロバクテリウム  ラティクム（Microbacterium laticum）ＩＡＭ１６４０が挙げられる。また、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属に属する微生物としては、例えばステノトロフォモナス  マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）種等、具体的な菌株としては、例えばステノトロフォモナス  マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ＩＡＭ１２４２３が挙げられる。これらの菌株はＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｃａｔｅｄ  Ｍｉｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＡＭ）に保管されており、容易に入手することができる。
【０００６】
なお上記微生物は、野生株以外に変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝的手法により誘導される組換え株などいずれの株であってもよい。また本微生物は、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生産する時にＬ−アラビノースを副生する場合があるが、この性質に対して、例えば紫外線照射などの物理的処理やＮ−メチル−Ｎ'-ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理などの化学処理などにより取得した、Ｌ−リボースの生産比率がよく、さらにＬ−アラビノースの生産性の低い変異株であってもよい。また同様の変異処理により取得される、培養時にＬ−リブロースあるいはＬ−リボースによる酵素の誘導を行わなくとも十分な活性を生じる変異株を用いることもできる。これらの変異株を用いればＬ−リボースの生産性をより向上させることができ、工業的にＬ−リボースを生産する場合特に有効である。
【０００７】
本発明の方法において上記微生物は、１種あるいは２種以上を同時に用いることができる。
本発明で用いる微生物の培養に用いられる培地は、上記微生物が生育でき、かつＬ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成する能力を誘導できるものであればいかなるものでもよいし、通常用いられる炭素源、窒素源、無機イオン、また必要に応じてビタミン類を含有するそれ自体既知の培地が用いられる。それらの培地成分は１種類あるいは複数種類を適宜用いることができ、また培養中必要に応じて追補添加することもできる。
【０００８】
炭素源としては、上記微生物が資化しうるものなら特に制限はなく、例えばグルコース、スクロースなどの炭水化物、グリセロールなどのアルコール類、有機酸などが挙げられる。これらの中でグルコース、グリセロール、スクロースを用いるのが好ましく、特にスクロースを用いるのが好ましい。また窒素源としては、本微生物が資化しうるものなら特に制限はなく、例えば、アミノ酸類、酵母エキス、大豆ペプチド、大豆粉末、コーンスティープリカー、ＮＺアミン、トリプトース、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚肉エキスその他の有機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源が挙げられる。これらの中で、酵母エキスや大豆ペプチド、ポリペプトンを用いるのが好ましい。無機イオンとしては、例えばリン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンなどが用いられる。またビタミン類としては、例えばチアミン、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられる。
【０００９】
培養は、温度が２０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で、１２時間から４８時間、好気的条件下で行う。Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成させる能力を高く発現させるには、十分な通気を行いながら培養することが重要である。通気は通常０．１〜３．０ｖｖｍ、好ましくは０．５〜２．０ｖｖｍが適当である。
得られた培養物はそのままで、あるいは培養液から遠心分離等の公知の方法で菌体を回収して、Ｌ−リブロースの異性化反応に用いられる。また回収した菌体は、そのままでも、あるいは公知の手法で化学的、物理的、酵素的に処理して用いてもよい。微生物菌体の処理方法としては、トルエン処理、アセトン処理、リゾチーム処理、凍結乾燥処理、超音波破砕等が挙げられる。この内、トルエン処理は、異性化反応液中に、菌体と共にトルエンを加える方法で行うこともできる。また、これらの菌体または菌体処理物から、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生産する能力を有する酵素を、粗製物あるいは精製物として取り出して用いることもできる。上記菌体の処理方法の中では、培養物から菌体を回収し、トルエン処理を行うのが望ましい。
【００１０】
上述のようにして得られた菌体、菌体処理物および酵素画分等は、そのままで、あるいはポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化して用いてもよい。ここで本明細書において「菌体および／または該菌体処理物」とは、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、およびそれらの固定化物等の全てを意味するものである
本発明の方法においては、上記微生物菌体および／または該菌体処理物の存在下、Ｌ−リブロースを異性化させて、Ｌ−リボースを生成蓄積させてＬ−リボースが採取される。
【００１１】
上記Ｌ−リブロースの異性化は、通常、酢酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等の適当な緩衝液あるいは水等の水性反応液中で行われる。反応液に用いる緩衝液の濃度は、通常１〜１０００ｍＭ、好ましくは、１０〜２００ｍＭ程度であり、また反応液のｐＨは通常４．０〜９．５、好ましくは８．５〜９．０Ｍ程度である。
原料として用いられるＬ−リブロースは、分離、精製されたものでもよく、微生物を用いて製造されたＬ−リブロースを含有する未精製の反応液または該反応液を部分精製したものでもよい。反応液の部分精製は、Ｌ−リブロースを含有する反応液を遠心分離など公知の方法で除菌した後、必要により濃縮し、Ｌーリブロースを、晶析やカラムクロマトグラフィーなどにより分離精製する方法で行えばよい。また発酵液を未精製のまま用いる場合は、上記した適当な緩衝液、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、あるいは水等を用いて希釈して用いることもできる。
【００１２】
かくして得られるＬ−リブロース含有液に、上記した微生物の菌体および／または該菌体処理物を添加し、Ｌ−リブロースの異性化反応が行われる。反応液中のＬ−リブロースの初期濃度は、通常０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１５重量％である。反応液にＬ−リブロースを逐次添加して反応を行ってもよい。反応は、温度２０℃〜４０℃、好ましくは２７℃〜３２℃で、攪拌しつつ行う。反応が進行するにつれ、反応液のｐＨが低下するため、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液を用いて発酵液のｐＨを上記した範囲に制御することが好ましい。Ｌ−リブロースからＬ−リボースへの異性化反応は可逆反応あるため、通常Ｌ−リブロースの異性化反応はＬ−リブロースとＬ−リボースが平衡に達して終了する。
【００１３】
かくして得られた反応液中には、生成したＬ−リボース以外にＬ−リブロースや、微生物の菌体および／または該菌体処理物、微生物由来のタンパク質などの高分子物質、塩類、副反応により生成する有機塩類、ジヒドロキシアセトン、Ｌ−アラビノースなどの糖類、着色成分などの夾雑物が多く含まれる。従って生成したＬ−リボースをこの反応液中から分離精製する必要がある。Ｌ−リボースの分離精製は、それ自体既知の方法である遠心分離、濾過、濃縮、カラムクロマトグラフィー、脱色、脱塩、晶析などを適当な順序や条件にしたがって組み合わせることにより行うことができる。
反応終了後、まず遠心分離などの既存の方法で微生物の菌体等を反応液から除去する。反応液に熱を加え、酵素失活および澱下げを行ってからこの除菌を行ってもよい。さらに除菌前または除菌後に炭酸飽充を行うと、その後の精製に有効である。
【００１４】
除菌された反応液は、Ｌ−リボース以外に未だ上述の夾雑物が多く含まれる。これらは、通常、カラムクロマトグラフィーや晶析等により除去できる。特に夾雑物が多い場合は、晶析に先立ってゲル型濾過材を担体として用いるクロマトグラフィーで精製するのが好ましい。ゲル型濾過材としては、Ｌ−リボースと他の夾雑物とを効率よく分離することができるものであれば特に限定されないが、好ましくはカチオン系イオン交換体が挙げられ、さらに好ましくは架橋度４〜８％のアルカリ金属またはアルカリ土類金属型のカチオン系イオン交換体が挙げられる。かかるイオン交換体の具体例としては、ＵＢＫ−５３０、ＵＢＫ−５３５、ＵＢＫ−５５０、ＵＢＫ−５５５（いずれも三菱化学社製）等が挙げられる。具体的には、予め脱塩水にてスラリー化し、十分に気泡を除去したゲル型濾過材を分離カラムに充填する。該カラムに充填した濾過材容量の１／２〜１／１００、好ましくは１／５〜１／２０量の除菌後の発酵液を送入し、次いで水で溶出させてＬ−リボース画分を分画する。
【００１５】
このＬ−リボース画分は、必要であれば、通常知られた方法により脱塩脱色後、晶析をを行うことにより高純度のＬ−リボースを得ることができる。
晶析の方法としては、Ｌ−リボースのみが析出する方法であれば特に制限はないが、上記Ｌ−リボース画分には未反応のＬ−リブロースが残存しており、この混合液からＬ−リボース結晶を得るには、このＬ−リボース分画液に有機溶媒を添加し、反応液中に残存するＬ−リブロースを析出させずにＬ−リボースを単独で析出させる方法が好ましい。具体的には、Ｌ−リボース分画液について充分に濃縮を行った後、この濃縮シロップに有機溶剤を加え充分に攪拌する。さらにここに微量のＬ−リボース結晶を加え、４℃で２４時間放置する。Ｌ−リボース分画液の濃縮は６０ブリックス以上、好ましくは８５ブリックス以上、さらに好ましくは９０ブリックス以上まで行う。また、添加する有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール等の低級アルコール類、アセトン、ヘキサン、アセトニトリル、トルエンなどが挙げられ、好ましくはエタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、さらに好ましくはエタノールが用いられる。これら有機溶媒の添加量は、Ｌーリボース分画濃縮液に対し、１／２〜１０倍量、好ましくは１〜３倍量である。この晶析に先だって、上述したクロマトグラフィーによる精製を再度行い、Ｌ−リボース分画中からＬ−リブロースをより完全に除いておくと、Ｌ−リボースの晶析率がさらに上昇するため、より精製度の高いＬ−リボースを採取することができる。
【００１６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１および２
（ａ）使用微生物
Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｃｕｍ  ＩＡＭ１６４０（菌株Ａ）およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ  ＩＡＭ１２４２３（菌株Ｂ）を用いて以下の実験を行った。
【００１７】
（ｂ）微生物培養方法
スクロース  ２．０ｇ／Ｌ、酵母エキス（アサヒビール食品社製：ミーストＰ１Ｇ）５．０ｇ／Ｌ、大豆ペプチド（不二製油社製）５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ３ｇ／Ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 １ｇ／Ｌ、Ｌ−リボース（シグマ社製）１５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）よりなる培地を２０ｍＬずつ２００ｍＬ容量のバッフルフラスコに分注し、上記（ａ）記載の菌株Ａ及びＢをそれぞれ接種した。これらのバッフル付きフラスコを１６０ｒｐｍで回転する振とう培養機にセットし、３０℃で１８時間培養をを行った。
【００１８】
（ｃ）異性化反応方法
上記（ｂ）記載の培養にて得られた培養終了液を各々遠心分離し、集菌した。各菌体ペレットにグリシン−塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．０）を２ｍＬずつ加え均一に懸濁した後、トルエンを６０μＬずつ加え、１５分間激しく混合した。このように調整したトルエン処理菌体を１０ｇ／ＬのＬ−リブロース（アルドリッチ社製）含有液５ｍＬに加え、均一になるよう緩やかに撹拌しつつ３０℃で１５時間反応を行った。途中、１Ｎ  ＮａＯＨによってｐＨ９．０に制御した。
【００１９】
（ｄ）Ｌ−リボースの生成の確認
上記（ｃ）記載の反応終了液を各々遠心分離し、微生物菌体を除去した。得られた上清に含まれるＬ−リボースの含量を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で測定した。Ｌ−リボースの保持時間は下記分析条件において、２４．０分である。
【００２０】
【表１】
0003815137.tif 000002
【００２１】
その結果、上清中のＬ−リボース含有量は、菌株Ａで６．５ｇ／Ｌ、菌株Ｂで４．０ｇ／Ｌであった。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来入手困難であったＬ−リボースを効率的に製造することができる。