(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノンを含有する溶液に、アンモニアおよびホルムアルデヒドを添加し、該溶液中のピロロキノリンキノンよりイミダゾピロロキノリンを生成するイミダゾピロロキノリンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イミダゾピロロキノリンの製造方法に関し、さらに詳細には、ピロロキノリンキノンからイミダゾピロロキノリンの製造法に係わる。
イミダゾピロロキノリン（以下ＩＰＱと略す）は、別名７，１０−ジヒドロ−７−オキソ−イミダゾ［４，５，１−ｉｊ］ピロロ［２，３−ｆ］キノリン−１，３，９−トリカルボン酸であり、化学構造式は、化１のごとくである。
【０００２】
【化１】
0003791554.tif 000002
ＩＰＱは、ピロロキノリンキノン（以下ＰＱＱと記す）の誘導体であり、今後、医薬品として、開発しうる重要な物質である。なお、ＰＱＱは、１９７９年にメタノ−ル資化性細菌のメタノ−ル脱水素酵素の補酵素として見い出された。
【０００３】
【従来の技術】
ＰＱＱは、細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母、さらには、哺乳動物にも存在し、補酵素として重要な働きをになっている。また、さらに、近年までに細胞の増殖促進作用（特開昭６１−５８５８４号公報，同６３−２３３７８３号公報）、抗白内障作用（特開昭６３−４１４２１号公報，同６３−４８２１５号公報，同６４−２９３１３号公報）、肝臓疾患予防治療作用（特開昭６３−１９２７１７号公報）、創傷治癒作用（特開昭６３−１５２３０９号公報）、抗アレルギ−作用（特開昭６３−１７４９３号公報）、逆転写酵素阻害作用（特開昭６３−１５６７２４号公報，特開平１−２９３１３号公報）およびグリオキサラ−ゼＩ阻害作用−制癌作用（特開昭６３−２１５６２８号公報，特開平１−２９３１３号公報）など多くの生理活性が明らかにされている。しかしながら、ＰＱＱは、腎毒性を有することが近年明らかにされ（渡辺ら、Hiroshima J.Med.Sci.，第３８巻，１号，頁４９〜５１( １９８９年) ）、毒性および腎毒性が低く安全なＰＱＱ誘導体の開発が望まれている。
【０００４】
本発明者らは、種々のＰＱＱ誘導体について、腎毒性および急性毒性試験を行なったところ、イミダゾピロロキノリン（ＩＰＱ）がこれらの毒性を大幅に軽減していることを見出した。しかして、ＩＰＱは、ＰＱＱとグリシンを反応させて得られる方法が知られているが、反応の収率を向上させるためには、ＰＱＱに対して過剰となる量のグリシンを添加する必要があり、より安価な原料による製造法が期待されていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＩＰＱのより安価な製造法について種々検討した結果、ＰＱＱを含有する溶液中に、アンモニアおよびホルムアルデヒドを添加し酸素存在下で反応させることにより、効率よくＩＰＱに転換されることを見いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、ピロロキノリンキノンを含有する溶液に、アンモニアおよびホルムアルデヒドを添加し、該溶液中のピロロキノリンキノンよりイミダゾピロロキノリンを生成するイミダゾピロロキノリンの製造法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において使用されるＰＱＱを含有する溶液としては、
１．メタノ−ルの資化性を有し、かつ、ＰＱＱを菌体外に生産する能力を有する細菌をメタノ−ルを炭素源とする培地中に培養して得られるＰＱＱを含有する培養液、
２．メタノ−ルの資化性を有し、かつ、ＰＱＱを菌体外に生産する能力を有する細菌をメタノ−ルを炭素源とする培地中に培養して得られるＰＱＱを含有する培養液から酸性処理、塩析処理などの方法により回収して得られた、ＰＱＱを含有する粉体を、水または緩衝液に溶解して得られる溶液、
３．高純度のＰＱＱを、水または、緩衝液に溶解して得られる溶液などがある。
【０００７】
このようにして得られたＰＱＱを含有する溶液に、アンモニアおよびホルムアルデヒドを添加し、該溶液中に含まれるＰＱＱと好気的条件下で反応させる。但し、該溶液がＰＱＱを含有する培養液で、十分量のアンモニアをすでに含有している場合は、ホルムアルデヒドのみの添加でも良い。このとき添加されるアンモニアとしては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩類、アンモニア水、アンモニアガスなどがあげられるが、実用上は、アンモニア水、アンモニウム塩類が用いられる。ホルムアルデヒドとしては、ホルムアルデヒド水溶液、ホルムアルデヒドガスなどがあげられるが、実用上は、ホルムアルデヒド水溶液（ホルマリン）が用いられる。
【０００８】
これらの化合物の添加量は、化学理論量以上であればよく、特に制限はないが、実用上は、アンモニアとしては該溶液中に含有されているＰＱＱに対して１〜１０００モル倍が好ましく、特に５〜１００モル倍が好ましい。ホルムアルデヒドとしては、該溶液中に含有されているＰＱＱに対して１〜３０００モル倍が好ましく、特に３０〜１０００モル倍が好ましい。反応液のｐＨは、３〜１０の範囲が好ましく、ｐＨ４〜８が特に好ましい。また、反応の進行とともに、ｐＨが低下するので、該反応液のｐＨを保つため、アンモニア、苛性カリ、苛性ソーダ等を添加して、該反応液のｐＨを調節する必要がある。温度は、１５℃から８０℃が好ましく、実用上特に２５〜５０℃が好ましい。また、該反応液中の溶存酸素濃度には特に制限はないが、反応を短時間で終了させるためには、０．５〜１ｐｐｍ以上が好ましい。そのために空気あるいは酸素またはその混合ガスなどを通気し、撹拌したり、さらに、反応槽の圧力を高めるなどの手段が使用される。このような条件で反応させることによりＰＱＱからＩＰＱが生成する。
【０００９】
このようにして得られた反応生成液は、ＰＱＱを含有する溶液としてＰＱＱを含有する培養液などを用いた場合、菌体、ホルムアルデヒドにより変性されたタンパク質などの固形物が含まれているので、濾過もしくは遠心分離などの通常の固液分離手段によって、固形分を除去し、上澄液を得る。ｐＨ３〜５などの低ｐＨでＩＰＱを生成させた場合、生成したＩＰＱが反応液中で沈澱物として存在している場合もあるので、反応液のｐＨを中性以上にし、生成したＩＰＱを一旦溶解した後、上澄液を得る必要がある。得られた上澄液からＩＰＱが分離・回収される。上澄液からのＩＰＱの分離、精製には種々の方法が用いられる。例えば沈澱法、洗浄法、限外濾過法、抽出法およびＩＰＱを吸着する樹脂担体を用いる方法等が挙げられる。これらの方法を単独あるいは組み合わせてＩＰＱを分離、精製することができる。
【００１０】
ＩＰＱを分離精製する方法についてさらに具体的に説明する。沈澱法としては、たとえば、塩酸、硫酸および硝酸などの無機酸ならびにトリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロメタンスルホン酸などの有機酸などにより反応生成液を酸性としてＩＰＱを沈澱させる酸性沈澱法、反応生成液に塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどのアルカリ金属塩、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩を添加してＩＰＱを沈澱させる塩析法または反応生成液と、たとえば、アセトンなどのＩＰＱの溶解度の低い溶媒とを混合し沈澱させる溶媒沈澱法などがある。これらの沈澱法においては、液温を低くする程、ＩＰＱの回収率は向上する。前記の沈澱法によって得られたＩＰＱの粉体、または、ＩＰＱを含む沈澱物を、たとえば、アセトン、ジエチルエーテルおよび酸性の水のようなＩＰＱを溶かしにくい溶剤で洗浄する洗浄法を適用することにより、ＩＰＱの純度をさらに向上させることができる。
【００１１】
ＰＱＱを含有する溶液として発酵法により得られた培養液を用いる場合には、培養液中の高分子の夾雑物を除くため限外濾過法を利用することができる。限外濾過法として、セファデックスＧ−１０（商品名、ファルマシア株式会社製）およびトヨパールＨＷシリーズ（商品名、東ソー株式会社製）などのゲル濾過用樹脂担体を用いる方法あるいは各種限外濾過膜や限外濾過中空糸を用いる方法などを適用することができる。抽出法に用いる抽出剤として、水および有機溶媒等が使用される。有機溶剤としては、水との相溶性が小さい有機溶剤が好ましく、たとえば、ｎ−ブタノールのような炭素数４個以上の脂肪族アルコールが好適に使用される。
【００１２】
ＩＰＱを吸着する樹脂担体を用いた方法では、ＩＰＱを吸着・脱離することのできる樹脂担体であれば特に制限なく利用できる。この樹脂担体の代表例として、陰イオン交換樹脂担体では、多糖系担体のＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（商品名、ファルマシア株式会社製）、親水性ポリマー系樹脂のＤＥＡＥ−トヨパール６５０（商品名、東ソー株式会社製）およびアンバーリストＡ−２１（商品名、ローム・アンド・ハース株式会社製）などがある。また、吸着・分離型樹脂担体では、疎水性ポリマー系樹脂のダイヤイオンＨＰシリーズ（商品名、三菱化学株式会社製）およびアンバーライトＸＡＤシリーズ（商品名、ローム・アンド・ハース株式会社製）などの他にシリカ、オクタデシルシリカおよびアルミナなどがある。疎水性クロマトグラフィ用樹脂担体では、ブチル−トヨパール６５０およびフェニル−トヨパール６５０（東ソー株式会社製）などがある。ＩＰＱの同定には、元素分析、核磁気共鳴スペクトル、赤外吸収スペクトルおよび質量分析などの手段が用いられる。また、ＩＰＱの定量には、高速液体クロマトグラフィーにより行うことが出来る。
【００１３】
［ＰＱＱおよびＩＰＱの急性毒性および腎毒性試験］
（１）マウスに対する急性毒性試験
１）ＳＰＦ−ＩＣＲマウス  雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱをマウス１ｋｇ当り２０、４０、８０、１６０および２００ｍｇのそれぞれを腹腔投与し、１４日間、２５℃で飼育した。なお、一群は８匹とした。その結果、ＰＱＱ・Ｎａ2 ２０ｍｇ／ｋｇ投与および４０ｍｇ／ｋｇ投与ではマウスは死亡しなかったが、８０ｍｇ投与で５匹、１６０ｍｇ投与および２００ｍｇ投与で８匹全部死亡した。ＰＱＱ・Ｎａ2 のＬＤ50は約７０ｍｇ／ｋｇマウスであった。一方、ＩＰＱ投与の場合は全てのマウスが死亡しなかった。
２）ＳＰＦ−ＩＣＲマウス  雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＩＰＱをマウス１ｋｇ当り０．１ｇ、０．２ｇ、０．４ｇ、０．８ｇあるいは１．２ｇのそれぞれを腹腔投与し、１４日間、２５℃で飼育した。なお、一群は８匹とした。ＩＰＱ０．１〜０．４ｇ投与ではすべてのマウスが死亡せず、０．８ｇでは２匹、１．２ｇでは６匹が死亡した。ＬＤ50は約１．０ｇ／ｋｇマウスであった。
３）ＳＰＦ−ＩＣＲマウス  雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＩＰＱをマウス１ｋｇ当り１．０ｇ、１．５ｇあるいは２．０ｇをそれぞれ経口投与し、１４日間、２５℃で飼育した。一群は８匹とした。すべてのマウスは死亡しなかった。
１）〜３）の結果より、ＩＰＱはＰＱＱに比べて毒性が著しく低下していた。
【００１４】
（２）マウスに対する腎毒性
１）尿検査による腎毒性
急性毒性試験と同様にして、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱを腹腔投与し、マウスを飼育した。毎日、マウスの尿を採取し、臨床検査試薬（商品名：ウリステックスＩＩ、マイルス・三共株式会社製）を用いてグルコ−ス濃度を調べた。表１に示すように、ＰＱＱ・Ｎａ2 を投与したマウスの尿からは糖が検出されたが、ＩＰＱを投与したマウスの尿からは糖が検出されなかった。すなわち、ＰＱＱは腎毒性が認められたが、ＩＰＱでは腎毒性が認められなかった。
【００１５】
【表１】
表１
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【００１６】
２）血液検査による腎毒性
イ．急性毒性試験と同様にして、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱを腹腔投与し、マウスを飼育した。投与１日後に絶食（水は与える）し、さらに18時間後に採血して血清を得た。血清中のグルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニン（Creatinine）を臨床検査試薬（商品名：富士ドライケムスライド、富士写真フィルム株式会社製）を用いて調べた。なお、各々の値は８匹の平均値で示した。結果を表２に示す。
【００１７】
ＰＱＱ・Ｎａ2 投与では、グルコ−スの大幅な減少、尿素態窒素およびクレアチニンの大幅な増加がみられ、腎毒性が認められた。これに対してＩＰＱの投与では、グルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニンのそれぞれの含有量は「無投与」の場合と大差なかった。
【００１８】
【表２】
表２
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【００１９】
ロ．急性毒性試験と同様にして、ＩＰＱを１５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇあるいは６００ｍｇ／ｋｇ腹腔投与し、マウスを１日飼育した。その後、絶食（水は与える）し、さらに18時間後に採血して血清を得た。血清中のグルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニン（Creatinine）を臨床検査試薬（商品名：富士ドライケムスライド、富士写真フィルム株式会社製）を用いて調べた。なお、各々の値は８匹の平均値で示した。
結果を表３に示す。ＩＰＱのいずれの投与量でも、グルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニンのそれぞれの蓄積量は「無投与」の場合と大差はなかった。
【００２０】
【表３】
表３
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１）〜２）の結果より、ＰＱＱは腎毒性が認められたが、ＩＰＱは腎毒性が認められなかった。
【００２１】
（３）ラットに対する腎毒性
Wistarラット  雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱをラット１ｋｇ当り４０ｍｇそれぞれ腹腔投与し、７日間、２５℃で飼育した。なお、一群は５匹とした。その結果ＰＱＱ・Ｎａ2 では３日目に１匹、５日目に２匹死亡したが、ＩＰＱ投与では死亡ラットはみられなかった。ＰＱＱ・Ｎａ2 のラットに対する急性毒性は約４０ｍｇ／ｋｇラットであった。投与前（０日目）、投与後１日目、３日目、５日目および７日目に血液（血清）および尿を採取した。血清中の尿素対窒素、クレアチニン、グルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸ピリビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を、富士ドライケムスライトを用いて測定した。また、尿中のグルコース濃度をウリステックスＩＩを用いて測定した。
結果を表４に示す。ＰＱＱ投与により、血清中の尿素態窒素、クレアチニン、およびＧＯＴまた尿中のグルコース濃度が増加した。その量は、特に投与１〜３日目が高く、その後低下する傾向が見られた。一方、ＩＰＱ投与では全期間を通じて、何ら変化はみられなかった。つまり、ラットに対してＰＱＱは腎毒性を示したがＩＰＱは毒性を示さなかった。
【００２２】
【表４】
表４
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【００２３】
【実施例】
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
２００ｍｌ容のビーカーにＰＱＱ１００ｍｇおよび蒸留水８０ｍｌを入れ、溶液のｐＨを水酸化ナトリウムを加えｐＨ７．０とし、ＰＱＱを溶解した。このビーカーに、３７％ホルムアルデヒド水溶液１０ｍｌおよび塩化アンモニウム５００ｍｇを加え溶解し、溶液のpHを水酸化ナトリウムを加えｐＨ７．０とし、さらに蒸留水を加え全量を１００ｍｌとした。この溶液を撹拌子を用いて撹拌しながら、室温で２４時間反応させたところ、溶液中にＩＰＱが３０．９ｍｇ生成した。この溶液のｐＨを１．０としＩＰＱを沈殿させ、沈殿したＩＰＱを濾別し、更にこの濾別したＩＰＱをｐＨ１．０の塩酸酸性の水で２回洗浄した後、乾燥重量で２７．５ｍｇのＩＰＱを得た。
次にこのＩＰＱの元素分析値、ＩＲスペクトル、 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび可視・紫外部スペクトルを示す。
【００２４】
１）元素分析値：Ｃ15Ｈ7 Ｎ3 Ｏ7 
（ＭＷ  ３４１．２４）
理論値（％）：Ｃ５２．８０  Ｈ２．０７  Ｎ１２．３１
実測値（％）：Ｃ５２．５１  Ｈ２．３２  Ｎ１２．１０
２）ＩＲスペクトル（νmax 値, ｃｍ-1）：（ＫＢｒ）
２９５０br,s，２４００br,s，１５８５s ，１２００s ，
１１７０vs，８７５m ，７３５m 
３） 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル (δ値，ｐｐｍ）:
（ＤＭＳＯ−ｄ6 内部標準：ＴＭＳ）
７．２２（d,1H,pyrrole ring C-H ,J=2.2Hz），
８．２７（s,1H,pyridine ring  C-H ），
９．２１（s,1H,imidazole ring C-H ）
１３．１６（brs,1H,pyrrole ring N-H ）
４）可視・紫外部スペクトル（λmax 値，ｎｍ）：
（１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ７．０）
２５１，２７６，４２３
【００２５】
実施例２
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３．０ｇ、KH2PO4  １．４ｇ、Na2HPO4 ２．１ｇ、MgSO4 ・7H2O  ０．２ｇ、CaCl2 ・2H2O  ３０ｍｇ、FeC6H5O7・XH2O３０ｍｇ、MnCl2 ・4H2O  ５ｍｇ、ZnSO4 ・7H2O  ５ｍｇ、CuSO4 ・5H2O  ０．５ｍｇおよびメタノ−ル８ｍｌを溶解し、ｐＨが７．１に調整された液２００ｍｌを１ｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌し、これを培地とした。これにハイホミクロビウム  デニトロフィカンス  DSM 1869を接種し、３０℃でロ−タリ−シェ−カ−で回転数２２０回／分の回転振盪培養を行った。この培養液を種母液とした。
【００２６】
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 １．０ｇ、MgSO4 ・7H2O  １．０ｇ、KH2PO4１．４ｇを添加した培地１５ｌを３０ｌ容培養槽に入れ、殺菌した。純水１０ｍｌあたりに、FeSO4 ・7H2O  ７５ｍｇ、ZnSO4 ・7H2O  １５０ｍｇ、CaCl2 ・2H2O１５０ｍｇ、NaCl  １５０ｍｇ、MnSO4 ・4 〜5H2O  ４５ｍｇ、H3BO3 ３ｍｇ、CuSO4 ・5H2O  １．５ｍｇ、CoCl2 ・2H2O  １．５ｍｇ、KI  １．５ｍｇ、(NH4)6Mo7O24・4H2O  １．５ｍｇを含むミネラル溶液を殺菌した。３０ｌ容培養槽の温度が３０℃に低下した後、槽内の培地に、このミネラル溶液１０ｍｌを無菌的に加え、さらにアンモニア水を無菌的に添加して、培養液のｐＨを６．８に調整した。この培養槽に、メタノ−ルを１５０ｍｌおよび前記の種母液２００ｍｌを無菌的に加え、通気量１０ｌ／min 、攪拌数３００rpm で温度３０℃、培養ｐＨを６．８になるようにアンモニア水を添加しながら培養した。細菌が増殖するに従って、培養液中のメタノ−ル濃度が低下したが、それを排気ガス中のメタノ−ルをガスクロマトグラフィ−で分析することにより検出し、培養液中のメタノ−ル濃度が０．１〜０．５重量％になるようにメタノ−ルを供給した。
【００２７】
このような方法により、３０ｌ培養槽で１０日間培養し、ＰＱＱを３６１ｍｇ／ｌ含有する培養液１５ｌを得た。このＰＱＱを含有する培養液に、３７％ホルムアルデヒド水溶液１５０ｍｌを添加し、４５ｍｌの２５％アンモニア水を添加し、ｐＨ７．０とし、撹拌数２５０rpm 、通気量５ｌ／min で反応を行ったところ、反応液のｐＨが低下したので、２５％アンモニア水を添加し、反応液中のｐＨを７．０にコントロールしながら２時間反応を行ったところ、反応液中のＩＰＱ濃度は１８５ｍｇ／ｌとなった。なお、添加した25％アンモニア水量は合計で７１ｍｌであった。
【００２８】
実施例３
実施例２と同様にして、ハイホミクロビウム  デニトロフィカンス  DSM 1869の培養を３０ｌ容培養槽で１０日間行なった。その後、培養液を遠心分離し、得られた培養上清液に７６０ｇの塩化ナトリウムを添加し、塩酸を用いて、ｐＨ３．０とし、５℃で一晩静置し、遠心分離によって沈澱物を集め、それを乾燥することにより、粉体１６．２ｇを得た。この粉体１ｇにはＰＱＱを０．２７ｇ含有していた。この粉体１２ｇを３００ｍｌの蒸留水に溶解し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７とし、１００ｍｌずつ３本の２００ｍｌ容三角フラスコに分注した。この溶液は、１０７０ｍｇ／ｌのＰＱＱを含有していた。各々の三角フラスコに、（１）０．３７％、（２）１％、（３）２％のホルムアルデヒド濃度となるように３７％ホルムアルデヒド水溶液を添加し、各々の三角フラスコに、塩化アンモニウム０．５ｇずつを添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７とし、２５℃で２４時間反応させた。反応生成液中のＩＰＱの含有量を表５に示す。
【００２９】
【表５】
0003791554.tif 000007
【００３０】
【発明の効果】
本発明によりＰＱＱからのイミダゾピロロキノリンの製造をより安価な方法で行うことが可能である。