(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１プロテイナーゼ阻害剤及び他のタンパク質類を含む水性溶液からα−１プロテイナーゼ阻害剤を精製する方法であって、
(A)  該水性溶液中の活性α−１プロテイナーゼ阻害剤は強陽イオン交換樹脂に結合しないが、他のタンパク質類は結合するように、該水性溶液中のｐＨを５．４５〜６．０に、イオン強度を１０ｍｍｈｏ／ｃｍ以下に、そしてタンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍＬ以下に調整する工程；及び
(B)  該水性溶液を、該強陽イオン交換樹脂を通過させ、そしてα−１プロテイナーゼ阻害剤を含有する通過液を回収する工程、
を含んでなる該方法。
【請求項２】
工程（Ａ）及び（Ｂ）が一回より多く実施される請求項1記載の方法。
【請求項３】
精製工程間に水性溶液にウイルス不活化工程が実施される請求項2記載の方法。
【請求項４】
ウイルス不活化工程が６０℃より高い温度に１０時間より長くα−１プロテイナーゼ阻害剤を加熱することを含んでなる請求項３記載の方法。
【請求項５】
ウイルス不活化工程が化学剤を添加することを含んでなる請求項４記載の方法。
【請求項６】
ウイルス不活化工程が水性溶液にリン酸トリ−ｎ−ブチル及び洗浄剤を添加することを含んでなる請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般にタンパク質の精製に関する。本発明は、詳細には、活性α−１ＰＩがカラムに結合しないが、汚染タンパク質は結合するような条件下で陽イオン交換によって血漿画分からα−１プロテイナーゼ阻害剤を精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
α−１プロテイナーゼ阻害剤（α−１  ＰＩ）は約５５，０００ダルトンの分子量を有する糖タンパク質である。α−１  ＰＩは、例えばトリプシン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼ、皮膚コラゲナーゼ、レニン、ウロキナーゼのようなプロテイナーゼ類の阻害剤であり、そして多形核リンパ球のプロテアーゼ類の阻害剤である。現在、α−１  ＰＩは肺中のリンパ球エラスターゼの阻害剤としての治療上の用途を有する。このプロテアーゼの機能は外来タンパク質を破壊することである。エラスターゼ活性を調節するのに十分な量のα−１  ＰＩが存在しない場合には、エラスターゼは肺組織を破壊する。やがて、このアンバランスは慢性の肺組織損傷及び気腫を生じさせる。α−１  ＰＩの補給はこのタイプの気腫の治療に成功裏に用いられてきている。
【０００３】
現在、α−１  ＰＩの需要は入手可能な供給を超えている。α−１  ＰＩ遺伝子は微生物、細胞系及びヒツジ中に移されて発現されてきた。しかしながら、満足できる組換え産物はいまだ生産されていない。ヒト血漿が治療用α−１  ＰＩのいまだ唯一の承認された給源である。α−１  ＰＩは代償療法に用いられ、そして長期間にわたって規則的に患者に与えられる。痕跡量の不純物が患者の免疫応答を刺激し得るので、治療を成功させるには高純度の産物が不可欠である。α−１  ＰＩの給源である血漿は限られているので、α−１  ＰＩを高純度に精製する方法が必要になる。高収率でかつ高純度でα−１  ＰＩを提供する実用的な方法は今日まで得られていない。
【０００４】
ヒト血漿からα−１  ＰＩを精製する種々の方法が記載されている。Ｂｏｌｌｅｎら、米国特許第４，６２９，５６７号明細書（１９８６）は、酵母、大腸菌及びヒト血漿からα−１  ＰＩを精製するために５つの異なるクロマトグラフィー工程を用いている。５つの工程は、ＤＥＡＥイオン交換、チオール−ジスルフィド交換、ヘパリンアフィニティー、亜鉛−キレートクロマトグラフィー及びアミノヘキシル・イオン交換を含む。純度と収率のデータは示されていない。
【０００５】
Ｎｏｖｉｋａら、Ｇｅｍａｔｏｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｚｉｏｌ．３４：４６−５０（１９８９）は、血液製品の製造の際の副生成物からの単離方法を報告している。彼らはアフィニティー、ＤＥＡＥセルロース、及びゲル瀘過クロマトグラフィーを用いている。純度と収率のデータは得られていない。
【０００６】
Ｐｏｄｉａｒｅｎｅら、Ｖｏｐｒ．Ｍｅｄ．Ｋｈｉｍ．３５：９６−９９（１９８９）は、モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを使用してヒト血漿からα−１  ＰＩを単離する、単一工程手法を報告している。２０％の収率でα−１  ＰＩ活性は６１．１倍増大した。
【０００７】
Ｂｕｒｎｏｕｆら、Ｖｏｘ．Ｓａｎｇ．５２，２９１−２９７（１９８７）は、血漿上清Ａ（コーン（Ｃｏｈｎ）の画分ＩＩ  ＋  ＩＩＩに等しい）から出発し、ＤＥＡＥクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、８０〜９０％の純度の（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）α−１  ＰＩを製造し、純度を３６倍増大させた。上清Ａからの回収率は６５〜７０％であった。
【０００８】
Ｈｅｉｎｆら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．９：１６Ｓ−２０Ｓ（１９９０）は、出発物質としてコーンの画分ＩＶ−１を用い、そしてポリエチレングリコールによる分別沈殿及び引き続いてＤＥＡＥセファロース（商標）上の陰イオンクロマトグラフィーを利用する方法を述べている。最終生成物は４５％の収率で得られ、約６０％の純度を有する。
【０００９】
Ｄｕｂｉｎら、Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：６３−７０（１９９０）は２工程クロマトグラフィー精製を示している。最初にα−１  ＰＩ、ＣＩ阻害剤、α−１  抗キモトリプシン及びインター−α−トリプシン阻害剤をブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）から溶離し、次にα−１
ＰＩをゲル瀘過で精製した。純度と収率のデータは得られていない。
【００１０】
Ｂａｌｌｉｅｕｘらは、４−フェニルブチルアミン・アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換そして最後に免疫アフィニティー工程を用いて、化膿啖からα−１  ＰＩとプロテイナーゼ−３の複合体を精製した（Ｂａｌｌｉｅｕｘ，Ｂ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５９：６３−７０（１９９３））。陽イオン交換工程で用いた緩衝液のｐＨは７．０であった。用いた条件下では、ほとんどの啖タンパク質は樹脂に結合したが、α−１  ＰＩ及びプロテイナーゼ−３は結合することなく通過した。
【００１１】
Ｊｏｒｄａｎら、米国特許第４，７４９，７８３号明細書（１９８８）は、ウイルス不活化工程の後に、製剤中の生物学的に不活性なタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーで除去する方法を記述している。タンパク質の天然型と変性型間の分離は、アフィニティー樹脂に対する天然タンパク質の生物学的活性に基づくのであって、天然タンパク質と変性タンパク質間の物理的相違に基づくものではなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
これらの方法のいずれも、精製工程として、低ｐＨ、低塩濃度及び中程度のタンパク質濃度での強陽イオン樹脂による通液型（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）クロマトグラフィーを用いていない。意外なことに、このような条件下で、活性α−１  ＰＩのみがカラムを流れる。クロマトグラフィーカラムにより９０％の収率を達成しそして陽イオンカラムに２回かけた後に約９５％の純度が達成するように、方法の手はずを決めることができる。本発明は、大規模で、高純度でかつ高収率でヒト血漿からα−１  ＰＩを精製する改良された方法を提供する。
【００１３】
用語の定義
「活性α−１  ＰＩ」又は「天然α−１  ＰＩ」は、試験管内でのエラスターゼアッセイでエラスターゼ活性の阻害を示すα−１  ＰＩを意味する。
【００１４】
「不活性α−１  ＰＩ」又は「変性α−１  ＰＩ」は、試験管内でのエラスターゼアッセイでエラスターゼ活性に対して効果を生じないα−１  ＰＩを意味する。
【００１５】
「高度に精製された」は２０％未満の汚染タンパク質を含むことを意味する。
「不活性α−１  ＰＩを実質的に含まない」は１０％未満の不活性α−１  ＰＩを含むことを意味する。
【００１６】
「不活性ウイルス類を実質的に含まない」は、認められているウイルス不活化工程（例えば、低温殺菌又は化学処理）に供されたために、低減された活性ウイルス含量を有することを意味する。一般に、このことは少なくとも対数約４のモデルウイルス力価の低減を意味する。
【００１７】
すべての伝導率測定は２５℃でなされた。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、タンパク質含有水性溶液からα−１  ＰＩを精製する方法であって、不活性（又は変性）α−１  ＰＩを含む他のタンパク質類が媒体（又はイオン交換樹脂）に結合するのに対して、活性α−１  ＰＩが該媒体（又は該イオン交換樹脂）に結合しないことを確保するのに十分なｐＨ、イオン強度及びタンパク質濃度の条件下で、陽イオン樹脂クロマトグラフィー媒体を用いる通液型クロマトグラフィーによる方法である。好適な実施態様において、方法は以下の工程を含む：
(1)  タンパク質溶液を約≦１０  ｍｍｈｏ／ｃｍのイオン強度に透析又は透析瀘過し；
(2)  溶液のｐＨを約≦６．０に調整し；
(3)  タンパク質溶液を約≦１０  ｍｇタンパク質／ｍＬに調整し；
(4)  溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過させ；そして
(5)  クロマトグラフィーの通過液画分を精製α−１  ＰＩとして回収する。
【００１９】
本発明はヒト血漿からα−１  ＰＩを精製する改良された方法である。この方法は、低イオン強度緩衝液によるｐＨ≦６．０での陽イオン交換クロマトグラフィーを含む。精製α−１  ＰＩを含む通過液画分を回収する。陽イオン交換クロマトグラフィーはα−１  ＰＩに特異的であり、そしてこれを、コーン（Ｃｏｈｎ）の画分ＩＶ−１懸濁液からの直接的な２工程精製方法（陽イオン交換カラム及び引き続く第２の陽イオン交換カラム）として、実際に用いることができる。
【００２０】
この手法は十分に多方面に適用できるので、陽イオンクロマトグラフィーは、コーンの画分流出液 II + III、コーンの画分ＩＶ−１ペースト（現在、好適な出発物質）及び精製α−１  ＰＩの範囲に及ぶ、どのような数の出発物質にも働くであろうし、そしてなお実質的に精製された生成物を生じさせる。
【００２１】
製薬学的製剤の大規模製造用のオプションとして、ウイルス不活化を含む多種の追加的工程を加えて、収率を最適化し、ウイルス安全性を改良しそして規制コンプライアンスを確保することができる。これらの工程を含むことができるが、これらに限定されるものではない：
(1)  弱イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ）による最初のクロマトグラフィー；
(2)  強陰イオン交換樹脂（ＱＡＥ）による最初のクロマトグラフィー；
(3)  風乾又は溶液中での低温殺菌のいずれかを利用するウイルス不活化；
(4)  あり得るウイルス汚染物を除去するためのウイルス除去瀘過；
(5)  ウイルス不活化のための、例えば溶剤洗浄剤処理のような化学処理；及び
(6)  陽イオンクロマトグラフィーに先立って、出発物質を部分的に精製するための沈殿工程。
【００２２】
タンパク質の荷電基を変えることにより、ｐＨはイオン交換クロマトグラフィーにおいて重要な役割を果たす。それはクロマトグラフィー樹脂に対するタンパク質の結合挙動を、非結合から結合に、或いはその逆に変える。本発明に用いられる強陽イオン交換樹脂リガンドは、樹脂ビーズに直接結合しているか或いは短い炭素を主とする鎖を介して結合しているスルホネート基（−ＳＯ3-）である。リガンドは１〜１４のｐＨ領域を通じて負電荷を有する。所定のｐＨでタンパク質の純有効表面電荷が負である場合には、タンパク質は遅滞なくカラムを流れる。一般に、溶液のｐＨがそのｐＩより高い場合にはタンパク質は負電荷を有する。
【００２３】
良好に特性決定されたヒト血漿中の２種類のタンパク質はα−１  ＰＩ及びアルブミンであり、これらはそれぞれ４．８及び５．３の平均ｐＩを有する。両タンパク質はｐＨ５．４５で負に荷電されてなければならず、かつ、陽イオン交換カラムを流れなければならない。意外なことに、低塩濃度及びｐＨ５．４５で、アルブミン及び変性（又は不活性）α−１  ＰＩは樹脂に結合し、そして天然（又は活性）α−１  ＰＩのみがカラムを流れることを、これらの実験は示している。α−１  ＰＩについてのこの観察は、タンパク質のｐＩのみならずその３次構造がイオン交換において重要であることを示唆している。α−１  ＰＩの天然型が明らかに負に荷電した表面を与えるのに対して、変性型の表面はより正に荷電され得る。したがって、変性タンパク質は幸運にも陽イオン樹脂に結合する。α−１  ＰＩの天然型は、より高いｐＨでより相当安定である。安定性と陽イオン交換クロマトグラフィーによるα−１  ＰＩの精製の両者を考慮した場合、ｐＨ５．４５が実際上最低のｐＨとなる。
【００２４】
イオン交換樹脂とタンパク質溶液の間の平衡は、溶液のイオン強度、タンパク質濃度、ｐＨ及び樹脂上の特異的なリガンドにより影響される。Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２５：１３７３−１３９１（１９８３）は、低タンパク質濃度で、溶液のイオン強度の関数としての分配係数に関連する半実験式を述べている。式は次のとおりである：
Ｋ  ＝  Ａ（Ｉ）B  ＋  Ｋcrt
式中、Ｋは分配係数を表し、Ａ及びＢは実験的定数を表し、Ｉは溶液のイオン強度を表し、そしてＫcrtは静電相互作用が無視できる高イオン強度におけるタンパク質の分配係数を表す。異なるタンパク質の分配係数は、所定のイオン強度で異なる。したがって、種々のタンパク質は、同一条件下で異なる速度で移動する。これを、このクロマトグラフィーにおけるタンパク質分離に適用する。低塩濃度では、添加工程中にほとんどのタンパク質の移動速度は樹脂に結合することにより遅れる。そのユニークな表面電荷特性により、天然α−１  ＰＩはカラムを通過する。通過液緩衝液のイオン強度が増大する場合には、他のタンパク質と樹脂との相互作用が変わり、そしてより高いパーセンテージのタンパク質がカラムを流れるであろう。したがって、溶液のイオン強度を増大させると、カラムを流れるα−１  ＰＩの純度が低減するであろう。
【００２５】
また、塩濃度は、例えばＮａ+のような陽イオンを樹脂上の水素イオンで逆に交換することにより、溶離液のｐＨを変える。塩濃度を上げると、樹脂から溶離液により多くのＨ+が移動し、その結果溶離液のｐＨが低下する。したがって、最初のタンパク質溶液を平衡緩衝液で限外瀘過する場合には、添加溶液のイオン強度は平衡緩衝液と等しいか或いはわずかに高くなるはずである。添加中に、ｐＨは同一のままに残るか或いはほんのわずか低下するはずである。添加後に、平衡緩衝液を洗浄液として使用すると、イオン強度が低下してｐＨが高くなり得る。したがって、ｐＨを維持するために、この洗浄液に、わずかに高いイオン強度の緩衝液を用いることができる。
【００２６】
上述したように、また、高タンパク質濃度は樹脂に結合したタンパク質の平衡に影響を及ぼす。タンパク質濃度が増大する場合には、吸着等温式は通常飽和曲線を示す（Ｙａｍａｍｏｔｏら、”Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，１９８８，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ）。したがって、結合の飽和レベルに近づくときに、結合した不純物の総量は最大値に達する。最大値に達した後には、試料のタンパク質濃度が増大するにつれて、カラムを通過する不純物の相対的パーセンテージは増大する。したがって、タンパク質濃度は、不純物の吸着曲線の直線領域に入るほど十分に低い場合に最適である。
【００２７】
タンパク質は溶液のｐＨを緩衝化する傾向があるので、タンパク質濃度はまた溶離液のｐＨに影響を及ぼす。クロマトグラフィー媒体に結合することによりタンパク質は溶液から選択的に除去されるので、溶液の緩衝能自体（すなわち、ｐＨ）が変わる。ｐＨ変動はカラムに吸着されているタンパク質の相対パーセンテージに依存するので、クロマトグラフィーに対する影響は複雑である。吸着は、カラムの流形、溶液の緩衝能、タンパク質混合物の変性した性質及び種々のタンパク質の競争的結合により、影響を受ける。
【００２８】
より高タンパク質濃度を添加すると、陽イオン交換カラムは、陽イオン交換カラムの充填が進行するにつれて溶離液中のｐＨの連続的な上昇をもたらすことが、我々の実験で示されている。増大したｐＨはα−１  ＰＩの純度を低下させる。一般にはより希釈されたタンパク質の溶液がα−１  ＰＩ精製クロマトグラフィーのためのより良い出発物質であるが、大規模に精製するために陽イオン交換カラムの充填を増大させるためには、不純物曲線及びｐＨ効果の許容し得る範囲内でより高い濃度を用いることができる。
【００２９】
【実施例】
実施例１
好適な実施の形態
我々の好適な実施態様では、強陽イオン交換カラムにかけるのに先立って、コーンの画分ＩＶ−１（Ｆｒ．ＩＶ−１）懸濁液からα−１  ＰＩを部分的に精製するために、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる。比活性によるとコーンの画分ＩＶ−１懸濁液は約１０％のα−１  ＰＩである。他の血漿画分と同様に、ＩＶ−１懸濁液は、種々のタンパク質、例えばリポタンパク質、免疫グロブリン、グロブリン、メタプロテイン等を含む。リポタンパク質は特別の問題を生じさせる。それらがクロマトグラフィー樹脂に結合する場合には、それらを除去するのが困難であり、そして樹脂の孔を塞ぎ、樹脂ベッドを加圧することができる。また、タンパク質残渣が樹脂上に蓄積するので結合能が低減する。Ｆｒ．ＩＶ−１懸濁液からリポタンパク質及び他の不純物を除去するために、強イオンクロマトグラフィーの代わりに、第１の工程としてＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを用いる。ＤＥＡＥ充填条件はリポタンパク質の主要部分がカラムに結合することなく、通過するような条件である。ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーのα−１  ＰＩ溶離条件はα−１  ＰＩについて９５〜１００％の回収率を得るように選択される。
【００３０】
ＩＶ−１懸濁液を≧５  ｍｍｈｏ／ｃｍの伝導率でかつｐＨ８．０に調整した。次にタンパク質溶液をＤＥＡＥ樹脂上にかける。α−１  ＰＩを、２０ｍＭ  第二リン酸ナトリウム及び９５ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で溶離した。ＤＥＡＥ溶離液を、２０  ｍＭ第一リン酸ナトリウム及び５ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で透析瀘過する。透析瀘過した溶離液をｐＨ５．４５に調整し、次に強陽イオン樹脂上にかける。α−１  ＰＩはカラムを流れる。通過液をｐＨ７．０に調整し、そして０．１５Ｍ  塩化ナトリウムを添加する。
【００３１】
この時点で所望であれば、α−１  ＰＩを凍結することができる。ウイルス不活化のために、必要であればα−１  ＰＩ溶液を解凍し、６０ｍＭ  ヒスチジン及び５ｍＭ  塩化カルシウムでｐＨ６．５に調整し、次に凍結乾燥する。次に凍結乾燥物を８０℃で７２時間加熱して、ウイルスを不活化する。次に凍結乾燥物を精製水に溶解し、そして３７％（ｗ／ｖ）スクロース及び０．３８Ｍ  シトレートを安定剤として添加する。エンベロープをもつウイルスに対する溶剤洗浄剤処理として、リン酸０．３％トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）及び０．２％コール酸ナトリウムを添加する。３０℃で３時間インキュベーションした後、ＴＮＢＰ及びコール酸塩を透析瀘過で除去する。
【００３２】
ウイルス不活化した溶液を２０ｍＭ  第一リン酸ナトリウム及び５ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で透析瀘過する。透析瀘過した溶液のｐＨを５．４５に調整し、そして第２の強陽イオン樹脂カラム上にかけて、残存するいずれの汚染物も除去しそしてウイルス不活化工程で変性したα−１  ＰＩも除去する。α−１  ＰＩの天然型はカラムを流れる。回収した通過液のｐＨを７．０に調整し、０．１５Ｍ  塩化ナトリウムを添加し、さらなるウイルス不活化工程として１５μＭフィルターを通過させる。他のタンパク質を実質的に含まない、高度に精製されたα−１  ＰＩ（〉９５％）を製造する。ＤＥＡＥクロマトグラフィーにより、リポタンパク質が除去され、そしてα−１  ＰＩ純度が２０％に増大する。第１の陽イオンカラム処理は約９０％の回収率で約６０〜７０％の純度のα−１
ＰＩを生じさせた。第２の陽イオンカラム処理は最終生成物としての９５％の純度を達成する。陰イオンカラムを１Ｍ  ＮａＣｌ及び１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄して、結合タンパク質を除去する。２つの陽イオンカラムに結合したタンパク質を、１Ｍ  塩化ナトリウム及び引き続いて１Ｍ  水酸化ナトリウムで除去する。
【００３３】
実施例２
本実施例では、コーンの画分流出液  II + IIIを出発物質とした。それを、５℃で２０ｍＭ  第１リン酸ナトリウム及び５ｍＭ  第１塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で透析瀘過し、アルコールを除去してイオン強度を低下させた。次に溶液のｐＨを５．４５に調整し、そして既に平衡化した強陽イオン交換カラムにかけた。α−１  ＰＩに有意に富む画分として通過液を回収した。出発物質中の汚染タンパク質は陽イオン交換カラム上に保持された。
【００３４】
陽イオン交換カラムを１回通過させた後、α−１  ＰＩを、コーンの画分流出液  II + III中の他のタンパク質から実質的に精製した。ＳＤＳ−ＰＧＡＥによると、通過液の純度は８２％α−１  ＰＩであった。比活性は、全タンパク質１ｍｇ当たり０．０３ｍｇのエラスターゼ阻害活性から全タンパク質１ｍｇ当たり０．５９ｍｇのエラスターゼ阻害活性へと、２０倍増大した。
【００３５】
実施例３
本実施例では、出発物質として市販の部分的に精製したα−１  ＰＩ（プロラスチン（Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ）（商標）、Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．社）を用いた。プロラスチン（商標）は０．１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０２Ｍ  リン酸ナトリウムでｐＨ７．０に緩衝化されている。α−１  ＰＩの濃度は約３０ｍｇ／ｍＬであり、そしてタンパク質濃度は約６０ｍｇ／ｍＬである。アルブミンは典型的には全タンパク質の１２％であり、そしてＩｇＡは典型的には約１ｍｇ／ｍＬ（全タンパク質の２．５％）で存在する。プロラスチン（商標）を５ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  第１リン酸ナトリウムで透析瀘過して、イオン強度を低下させた。溶液のｐＨを５．４５に下げ、タンパク質濃度を５．３ｍｇ／ｍＬに低減し、そして溶液を強陽イオン交換カラムにかけた。通過液を精製したα−１  ＰＩとして回収し、そしてこれは、ＳＤＳ−ＰＧＡＥによるとα−１  ＰＩの単量体及び二量体のみ（それぞれ９５．４％及び４．６％のタンパク質）を示した。次に溶液を０．１５Ｍ  ＮａＣｌでｐＨ７．０に安定化し、そして瀘過し又は濃縮した後、凍結乾燥して安定な最終生成物を得た。
【００３６】
結合タンパク質画分を溶離し、そしてＳＤＳ−ＰＧＡＥで電気泳動にかけた。クーマシーブルーで可視化された４４％のタンパク質はα−１  ＰＩ分子量領域内であった。この画分をエラスターゼ阻害活性アッセイしたところ、α−１  ＰＩ活性は示されなかった。このことは、このバンドのタンパク質が不活化α−１
ＰＩであることを示唆する。
【００３７】
上記実施例を次の表に要約する。
【００３８】
【表１】
0003770414.tif 000002
【００３９】
上記の説明により、タンパク質精製の当業者は変法に想到するであろうと考えられる。したがって、上記の実施例は具体例としてのみ解釈されるべきであり、本発明の範囲は上記の特許請求の範囲によってのみ制限されるものと意図される。
【００４０】
本発明の主な特徴及び態様は以下の通りである。
【００４１】
１．  α−１プロテイナーゼ阻害剤及び他のタンパク質類を含む水性溶液中の、該α−１プロテイナーゼ阻害剤を精製する方法であって、
(A)  該活性α−１プロテイナーゼ阻害剤はイオン交換樹脂に結合しないが該溶液中の他のタンパク質類は結合するように、該水性溶液中のｐＨ、イオ  ン強度及びタンパク質濃度を調整する工程；及び
(B)  該溶液を、該イオン交換樹脂を通過させ、そして通過液中のα−１プロテイナーゼ阻害剤を回収する工程、
を含んでなる該方法。
【００４２】
２．工程(A)の水性溶液のｐＨが約６．０未満であるか或いは等しい上記１記載の方法。
【００４３】
３．水性溶液のイオン強度が約１０ｍｍｈｏ／ｃｍ未満であるか或いは等しい上記１記載の方法。
【００４４】
４．水性溶液のタンパク質濃度が約１０ｍｇ／ｍＬ未満であるか或いは等しい上記１記載の方法。
【００４５】
５．工程が一回より多く実施される上記１記載の方法。
【００４６】
６．精製工程間に溶液に対してウイルス不活化工程が実施される上記５記載の方法。
【００４７】
７．該ウイルス不活化が約６０℃より高いか或いはそれと等しい温度で、約１０時間より多いか或いは等しい時間で、α−１プロテイナーゼ阻害剤を加熱することを含んでなる上記６記載の方法。
【００４８】
８．該ウイルス不活化が化学剤を添加することを含んでなる上記６記載の方法。
【００４９】
９．該ウイルス不活化が溶液にリン酸トリ−ｎ−ブチル及び洗浄剤を添加することを含んでなる上記８記載の方法。
【００５０】
１０．  活性ウイルス類を実質的に含有せず、不活性α−１プロテイナーゼ阻害剤を実質的に含有せず、そして全タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも約０．９ｍｇのエラスターゼ阻害活性を有する活性α−１プロテイナーゼ阻害剤を含んでなる、高度に精製したα−１プロテイナーゼ阻害剤調製物。
【００５１】
１１．α−１プロテイナーゼ阻害剤の純度が９０％より高い上記１０記載の調製物。
【００５２】
１２．製薬学的に許容できるキャリアー中の上記１０記載の産物。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従いα−１  ＰＩを精製するための、一般的なＣｏｈｎ（コーン）の分別法、画分から誘導されたタンパク質、並びに２つの出発物質［コーンの画分ＩＶ−１並びにコーンの流出液  II & III］を説明するフローチャートである。
【図２】我々のα−１  ＰＩ精製方法の好適な工程を示すフローチャートである。
【図３】従来技術と比べた場合の本発明の方法による純度及び比活性の改良を説明する棒グラフである。
【図１】
0003770414.tif 000003
【図２】
0003770414.tif 000004
【図３】
0003770414.tif 000005