(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変換したい塩基としてシトシンを有する核酸類を、
次式Ｉ：
【化１】
0003753938.tif 000012
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有する光連結性ヌクレオシドを末端に含有するＤＮＡの存在下で、光照射して変換したい塩基と前記光連結性ヌクレオシドとを結合させ、変換したい塩基を化学的に変性させた後、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌクレオシドとを開裂させることからなる、核酸類中の塩基が点変異した核酸類を製造する方法。
【請求項２】
電子吸引性基が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＺがＯで、Ｘが水素原子で、Ｙがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
化学的に変性させる方法が、脱アミノ化である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
核酸類の一部を固定化させるためのテンプレートを用いる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
核酸類が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸類中の特定の位置の塩基を、他の塩基に点変異させる方法、及びその方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸類中の特定の位置の塩基を、光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡの存在下で、光化学反応を利用して酵素の不存在下で他の塩基に変換することからなる核酸類中の特定の位置の塩基を点変異させる方法、及びその方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＰＮＡ（ペプチド核酸）などの核酸類中の特定の位置の塩基を他の塩基に変換する方法は、点変異（ポイントミューテーション）として変異した核酸類を調製したり、核酸類の機能解析のための技術として重要視されてきている。
しかし、従来の点変異の技術は酵素反応を用いるために特異性や確実性の点において充分ではなく、その効率も必ずしも充分ではなかった。また、酵素反応を用いた方法では、後処理の必要な化学活性化剤を使用しなければならず、コストがかかり、かつ反応条件の至適化や制御が難しく、実用化が困難であった。
また、任意の位置のシトシンのみをウラシルへと点変異させることは従来はできなかった。シトシンからウラシルへの変換は、任意の位置ではないが、同じ鎖内でピリミジンダイマー生成、デアミネーション、及びフォトリアーゼによる光解裂によりシトシンをウラシルへと変異させた例があるが、この方法では酵素を用いる点、他のサイトとの競争反応がある点、及び効率が低い点等において改良の余地があった。
【０００３】
一方、本発明者らは、先に光化学反応により光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡと、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類（ＤＮＡやＰＮＡなど）を光化学反応により連結と開裂を特異的に行うことができることを見出してきた（特願２０００−６７５１９号参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便で確実でかつ特異的であって、さらに低コストで無公害の点変異法を提供するものであり、低コスト、無公害、簡便性、正解性を併せ持った新技術を用いた実用化可能な遺伝子操作法の開発を目指している。
すなわち、本発明は、光化学反応を利用した新規な点変異技術を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために光化学反応により光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡと、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類（ＤＮＡやＰＮＡなど）を光化学反応により連結と開裂を特異的に行うことができることに着目し、これを利用して酵素反応を利用すること無く光化学反応により特異的な点変異を行うことができることを見出した。より詳細には、５位にビニル誘導体置換基を導入したピリジミンを有する核酸に対して光照射を行い、対象ＤＮＡ、及びＲＮＡ上の任意のシトシンに対し光連結を行い枝分かれ核酸構造を形成させることで、他のシトシンとの分別化を行い、加熱処理を用いてデアミネーションを促進させ、最終的には短波長光照射による解裂によってウラシルへと特異的、高効率で点変異させることに成功した。
【０００６】
すなわち、本発明は、変換したい塩基を有する核酸類を、光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡの存在下で、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌクレオシドとを結合させ、変換したい塩基を化学的に変性させた後、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌクレオシドとを解裂させることからなる核酸類中の特定の塩基を点変異させる方法、及びその方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。
また、本発明は、核酸類中の特定の位置の塩基を、光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡの存在下で、光化学反応を利用して酵素の不存在下で他の塩基に変換することからなる核酸類中の特定の位置の塩基を点変異させる方法、及びその方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。
【０００７】
より詳細には、本発明は、前記した本発明の方法において、光連結性ヌクレオシドとして、ビニル基を導入したピリジミンを有する核酸、好ましくは５位にビニル誘導体置換基を導入したピリジミンを有する核酸を含有するものを用いる方法に関する。さらに詳細には、本発明は前記した本発明の方法において、光連結性ヌクレオシドとして、
【０００８】
【化２】
0003753938.tif 000002
【０００９】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有するヌクレオシドを用いる方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、前記した本発明の方法において、核酸類中の変換したい塩基として炭素−炭素二重結合、好ましくは非縮合環系の炭素−炭素二重結合を有する塩基、例えばシトシンを点変異させる方法に関する。
本発明の方法を核酸類中の変換したい塩基としてシトシンを例にして具体的に説明する。図１は本発明の方法によりシトシンをウラシルに変換する方法を例示したものである。
まず、ステップ１においてシトシンを含有する核酸類のシトシンの直前までをテンプレートにハイブリダイズさせて固定し、ビニル基含有の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡを同様にテンプレートに固定する。ステップ２においてこれに光（例えば、波長３６６ｎｍの光）を照射してシトシンと光連結性ヌクレオシドのビニル基とでシクロブタン環を形成させる。ステップ３において、水などの酸素を含有する物質の存在下に加熱処理してシトシンの脱アミノ化を行う。脱アミノ化が終了したら、ステップ４においてシクロブタン環を解裂させるための光（例えば、波長３０２ｎｍの光）を照射して両者を切り放すとシトシンがウラシルに変換された核酸類を得ることができる。
【００１１】
本発明の方法をシトシンからウラシルへの変異を例としてさらに具体的に説明する。
シトシンを含有するＴＧＴＧＣの部分配列を有する核酸（ＯＤＮ  １）を、その相補配列であるＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡＣの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ  ２）に配置する。次にビニル基含有の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡとして５−カルボキシビニルウラシルを塩基（下記化学式中ではＸで示されている。）を有するＸＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有するＤＮＡ（ＯＤＮ３）を配置する（ステップ１）。このときの各ＤＮＡの配置を次の化学式、
【００１２】
【化３】
0003753938.tif 000003
【００１３】
に示す。式中のＯＤＮ１、ＯＤＮ２及びＯＤＮ３は前記したＤＮＡである。
このようにして、対象遺伝子のシトシン（Ｃ）の塩基までをテンプレート（ＯＤＮ  ２）に固定化し、当該シトシンに隣接して光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡ（ＯＤＮ３）を配置して光を照射すると、対象遺伝子と本発明の核酸が連結する（ステップ２）。この連結した状態のときに、シトシンの４位のアミノ基を酸素又は水などの酸素含有物の存在下の水酸基に置換することができる。例えば、連結した状態で空気中で穏やかに温度を上げてゆくと空気酸化されて、シトシンのピリミジン環の４位のアミノ基が水酸基に置換される（ステップ３）。そして、再度光を照射して、連結を開裂させると、シトシンがウラシルに変換されることになる（ステップ４）。
【００１４】
図２はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図２の横軸はリテンション時間（分）であり、図２の最上段は光照射前のステップ１の段階のチャートであり、図２の最上段の左からＯＤＮ３、ＯＤＮ２、ＯＤＮ１の各ピークが示されている。図２の上から２段目は波長３６６ｎｍの光を１時間照射した後のチャートである。光を照射した後も図２の最上段の左から２番目のＯＤＮ２のピーク（テンプレートのピーク）は光照射前と後で変化は無い。しかし図２の最上段の左側のＯＤＮ３のピーク及び右側のＯＤＮ１のピークは消失して新たにより右側にピークが出現してきている。この新たに出現したピークはＯＤＮ１とＯＤＮ３が連結した１７量体のものであり、このピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳによる測定値が５２４８．７４（計算値５２４９．５５（Ｍ−Ｈ））であったことにより確認された。
【００１５】
得られた１７量体をテンプレートから分離し、９０℃で２時間加熱した後のチャートが図２の上から３段目のものである。最も左のピークは内部標準として用いたチミンのピークであり、右側のピークがデアミネーションされた１７量体のものである。このものはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳによる測定値が５２５２．１（計算値５２５０．５（Ｍ−Ｈ））であったことにより確認された。
得られたデアミネーションされた１７量体に波長３０２ｎｍの光を１時間照射し、ポリＡを含む断片を酵素処理した結果のＨＰＬＣのチャートが図２の最下段に示されている。左側にｄＵのピークを確認することができた。ｄＣのピークは消失し、ｄＵ：ｄＧ：ｄＴ：ｄＡ＝１：２：２：６であった。
【００１６】
シトシンがウラシルに変換されたＤＮＡを、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理すると、このウラシルの位置で特異的に切断することができる。したがって、ＤＮＡの任意のシトシンの位置を本発明の方法によりウラシル化することにより、ＤＮＡを任意の位置での特異的に切断することも可能となる。
前記の実験結果をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理により、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を図３に、図面に代わる写真で示す。
図３のＡの位置はウラシルの位置で切断された断片を示している。レーン１は反応前のものである。レーン２は３６６ｎｍの光照射を１時間行った後のものである。レーン３はレーン２の後に９０度加熱を２時間行ったものである。レーン４はレーン３の後に３０２ｎｍの光照射を１時間行ったものである。レーン５はレーン４の後にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものである。
レーン６はレーン２の後に９０度加熱を行わずに、３０２ｎｍの光照射を１時間行ったものであり、シトシンはウラシルに変換されていないものである。レーン７はレーン６の後にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものであり、ウラシルに変換されていないために切断された断片は得られていない。
レーン８は対照として５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものである。
【００１７】
この結果、コントロールのレーン８と、光反応実験で得られたレーン５のバンド（ウラシルでの切断）が一致した。レーン６、７のように９０度加熱を行わないと酵素で切断されないので、加熱によって、シトシンがウラシルに変換されていることがわかった。
このように９０℃での加熱を行わないとデアミネーションが進行せず、シトシンがウラシルに変換されないことがわかった。
【００１８】
そこで、デアミネーションの条件について検討した。
その結果のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析を図４に、図面に代わる写真で示す。レーン１は反応前のものである。レーン２は３６６ｎｍの光照射を１時間行った後のものである。
レーン３はレーン２の後に９０度加熱を行わず、３０２ｎｍ光照射１時間、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理（３７度・１時間）、ピペリジン処理（９０度加熱・３０分）を行ったものである。
レーン４はレーン２の後に９０度加熱を１５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン５はレーン２の後に９０度加熱を３０分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン６はレーン２の後に９０℃加熱を４５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン７はレーン２の後に９０度加熱を６０分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン８はレーン２の後に９０度加熱を７５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン９はレーン２の後に９０度加熱を９０分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン１０はレーン２の後に９０度加熱を１０５分行い、それ以外はレーン３と同じものである。レーン１１はレーン２の後に９０度加熱を１２０分行い、それ以外はレーン３と同じものである。
レーン１２は対照として５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７度・１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行ったものである。
【００１９】
この結果を定量化して示したものが図５である。図５の横軸は時間（分）であり、縦軸はデアミネーションされていないシトシンタイプの残量を％で示している。このデアミネーションされていないシトシンタイプの半減期は４０分（９０℃）であることがわかった。
このように、本発明の方法によれば、光連結性ヌクレオシド含有ＤＮＡの光照射により、対象シトシンに対するシクロブタン反応を行い枝分かれ核酸を形成させ、加熱処理、及び化学反応処理を行うことでシトシンの脱アミノ化を促進し、最終的に光解裂を行い、ＤＮＡ、及びＲＮＡ上の任意のシトシンをウラシルへと誘導が可能になる。この技術はフォトブランチング技術との組み合わせにより、ｉ）光転写制御、ii）光翻訳制御、iii）光誘導型変異蛋白の生産等への利用が期待される。
【００２０】
本発明の方法は、後処理の必要な化学活性化剤や使用条件に制限がかかる酵素を全く用いずに、光をトリガーとして用いるシトシンからウラシルへの点変異技術であり、環境にやさしい２１世紀型のバイオテクノロジー技術である。任意の位置のシトシンをウラシルへと点変異させる技術としても有用である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の光連結性ヌクレオシドは、塩基部分に次式、
【００２２】
【化４】
0003753938.tif 000004
【００２３】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有することが好ましい。
置換基Ｘ、Ｙにおける電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ニトロ基などが挙げられるがこれらの例示したものに限定されるものではなく、細胞系への適合を考慮して適宜電子吸引基を選択することができる。好ましい電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基などが挙げられる。アルコキシカルボニル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。
置換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一または異なる電子吸引基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。
【００２４】
本発明の核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれであってもよく、天然又は合成のＤＮＡやＲＮＡなどと塩基対を形成し得るものが好ましい。
また、本発明の核酸類は、変換させる塩基だけを有するモノヌクレオチドであってもよいが、他の核酸と共にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドになっているものが好ましい。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドにおける塩基数は特に制限はないが、好ましくは１から１００００、より好ましくは１から３０００、さらに好ましくは１から１０００程度である。
また、本発明の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、またＰＮＡであってもよいが、その鎖中に少なくとも１個の光連結性ヌクレオシドを含有するものである。光連結性ヌクレオシドを含有する位置としては反応性に影響が無ければ特に制限は無いが、通常は５’又は３’末端が好ましい。本発明の光連結性ヌクレオシドを含有するＤＮＡの長さも特に制限はないが、入手のし易さや取扱いの簡便さから、余り長くないのが好ましい。好ましい長さとしては、例えば、塩基数で１〜５０、１〜２５、５〜１５程度である。
【００２５】
本発明の光連結性ヌクレオシドは、通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。例えば、５−置換ビニルウリジンのＤＭＴｒ体にアミダイド化剤を作用させてアミダイド化し、次いで保護基を切断して、これを通常のＤＮＡ合成法によりオリゴヌクレオチドとすることができる。
５−置換ビニルシトシン誘導体又は５−置換ビニルウラシル誘導体は、以下に示す具体例の方法によってもよいが、他の通常の有機合成法によっても製造することができる。
【００２６】
本発明の方法における、変換させる塩基としては、炭素−炭素二重結合を有する塩基であるが、縮合環を形成している炭素−炭素二重結合は好ましくなく、単環式の炭素−炭素二重結合又は環に置換している炭素−炭素二重結合が好ましい。好ましい炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、天然のものではシトシン、チミン又はウラシルなどが挙げられる。
炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれのものであってもよい。
【００２７】
本発明の方法における光としては、反応に必要なエネルギーを有する波長のものであればよいが、紫外線が好ましい。一般に、連結させるときは、比較的長波長側でよく、開裂させる場合には比較的短波長側の光が好ましい。より具体的には、連結させるときの波長としては、３３０ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以上、より好ましくは３６０ｎｍ以上の波長が好ましい。また、開裂させるときの波長としては、３２０ｎｍ以下、好ましくは３１０ｎｍ以下の波長が好ましい。好ましい波長としては、連結させるときの波長が３６６ｎｍで、開裂させるときの波長が３０２ｎｍである場合が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法は、溶液中のように自由に流動できる状態で行うこともできるが、より選択性を挙げるためにはテンプレートに固定して反応させる方法が好ましい。テンプレートとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの塩基対を形成し得るものであればよい。テンプレートの長さは特に制限はないが、３塩基以上、好ましくは５塩基以上がテンプレート上で塩基対を形成できる長さのものが好ましい。
テンプレートは１本鎖のものであってよいが、前述してきたようにテンプレートとして二本鎖ＤＮＡを使用することもできる。
【００２９】
本発明の方法における、変換させる塩基を含有する核酸類としては、前記したテンプレートに固定化できるものであればどのようなものであってもよい。目的のシトシンの位置から上流又は下流側の３〜１０塩基程度の塩基配列を調べて、それの相補的な塩基配列を有するものをテンプレートとして使用することができる。
本発明の化学的に変性する方法としては、加水分解、酸化反応、還元反応、アミノ化反応などの各種の化学反応が挙げられる。例えば、シトシンのアミノ基を加水分解して水酸基にする方法などが挙げられる。
この方法における、酸素又は水などの酸素含有物としては、空気中の酸素や加水分解のための水などを使用することができる。
この方法によって得られたウラシル化されたＤＮＡは、常法によるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理をすることができる。
【００３０】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸の製造例の反応式を次に示す。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００３１】
【化５】
0003753938.tif 000005
【００３２】
実施例１  ５−シアノビニルデオキシウリジン（４）の製造
（１）  化合物（２）の製造
５−ヨード−デオキシウリジン（ＩＤＵ）（１）をピリジン５ｍＬと３回共沸し、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（１．７１７ｇ，１１．４０ｍｍｏｌ）と共に窒素置換し、ピリジン５ｍＬを加え均一溶液とした。これにイミダゾール（０．７７６ｇ，１１．３９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（５ｍＬ）を加え、室温で１２時間攪拌した。薄層クロマト（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、ピリジンを減圧で留去し、残留物を酢酸エチル（２０ｍＬｘ３）と水（２０ｍＬ）を用いて抽出した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒  ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（２）を白色固体（１．６６１ｇ，９６．５％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
0.04-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.93(s,9H,t-BuSi), 1.96 (m,1H,H-2β'), 2.28 (m,1H,H-2α'),
3.74 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.87 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.97 (m,1H,H-4'), 4.38 (m,1H,H-3'), 6.25 (t,1H,H-1'),
8.07 (s,1H,H-6), 8.09(br,1H,NH)
【００３３】
（２）  化合物（３）の製造
Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．０１９ｇ，０．０８５ｍｍｏｌ），ＰＰｈ３（０．０４５ｇ，０．１７０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に加えた後、さらにＮＥｔ３（０．９３ｍＬ，６．６７２ｍｍｏｌ）を加え、６０℃の水浴中で攪拌した。溶液が濃赤色になった後に、前記（１）で得た化合物（２）（０．４９８ｇ，０．８５４ｍｍｏｌ）、アクリルニトリル（０．７ｍＬ，１０．６３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶液として加え一晩攪拌した。減圧でＤＭＦを除去した後、酢酸エチル（１５ｍＬｘ３）、水（１５ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し再び溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒  ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（３）を黄色固体（０．４３４ｇ，５３．７％）として単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
0.03-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.91 (s,9H,t-BuSi), 2.00 (m,1H,H-2'β), 2.39 (m,1H,H-2'α),
3.76 (dd,1H,H-5'), 3.87 (dd,1H,H-5'), 4.00 (m,1H,H-4'),
4.37 (m,1H,H-3'), 6.23 (t,1H,H-1'),
6.67 (dd,J=16.4Hz,1H,vinylic H-1''),
6.85 (dd,J=16.2Hz,1H,vinylic H-2''), 7.96 (s,1H,H-6),
7.98 (br,1H,NH)
【００３４】
（３）  化合物（４）の製造
前記の（２）で得られた化合物（３）（０．２３３ｇ，０．４５９ｍｍｏｌ）にＴＢＡＦ（in  ＴＨＦ，１ｍｍｏｌ／ｌ）２．０ｍＬを加え室温で４５分攪拌した後、溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒  ５％ＭｅＯＨ  in  ＣＨＣｌ３）により目的の化合物（４）を淡黄色固体（０．１２８ｇ，７５％）として単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：
2.15 (m,2H,H-2'αβ), 3.57 (m,1H,H-5'), 3.65 (m,1H,H-5'),
3.80 (m,1H,H-4'), 4.23 (m,1H,H-3'), 5.10 (t,1H,OH-5'),
5.26 (d,1H,OH-3'), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
6.50 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-1''),
7.22 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-2''), 8.33 (s,1H,H-6),
11.72 (br,1H,NH)
【００３５】
実施例２  ５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸（７）の製造
（１）  化合物（５）の製造
前記した実施例１で得られた化合物（４）（０．０９６ｇ，０．３４４ｍｍｏｌ）をピリジン２ｍＬとの供沸操作を３回行った後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（０．１３３ｇ，０．３９２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０２５ｇ，０．２０３ｍｍｏｌ）と共に窒素雰囲気下とした。ピリジン（１ｍＬ）を加え攪拌し、均一溶液とした。さらにここへＮＥｔ３（０．０５ｍＬ，０．３５９ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌した。減圧でピリジンを除去した後、クロロホルム（１０ｍＬｘ３）と水（１０ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去した。残留物に対しカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒３％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）により目的の化合物（５）を黄色固体（０．０９６ｇ，４７．９％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
2.38 (m,1H,H-2'β), 2.49 (m,1H,H-2'α),
3.43 (dd,J=10.4Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.52 (dd,J=2.4Hz,J=10.4Hz,1H,H-5'), 3.80 (s,6H,OCH3x2),
4.11 (m,1H,H-4'), 4.68 (m,1H,H-3'),
6.50 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-1''), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
7.22 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-2''),
6.84-6.87 (m,4H,H-β to OCH3x4), 7.20-7.33 (m,9H,phenyl),
7.98 (br,1H,NH), 8.00 (s,1H,H-6)
【００３６】
（２）  化合物（７）の製造
前記の（１）で得られた化合物（５）をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移した後、減圧し溶媒を除去し、アルゴン雰囲気下とした。アセトニトリル（１ｍＬ）を加え固体を溶解させた後、アミダイト化剤（５０ｕＬ）、テトラゾール（０．５Ｍ，３６０ｕＬ）を順に加え９０分攪拌した。あらかじめＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した酢酸エチルと、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いて抽出操作を行い、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を除去した。得られた固体をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移し、減圧し溶媒を除去した。さらにアセトニトリルとの供沸操作を２回行った。これ以上の精製はせず、このままＤＮＡ合成機へ取り付けオリゴマー合成を行った。
ＤＮＡ合成機を用いてオリゴマー（５’−ＣＮＵＧＣ  ＧＴＧ）を合成し、ＨＰＬＣを用いて精製を行った。
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【００３７】
前記した実施例２と同様の方法により、次の反応式に示される化合物（９）〜化合物（１１）を製造した。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００３８】
【化６】
0003753938.tif 000007
【００３９】
実施例３  化合物（９）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着しフォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を６５℃、４時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＣＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
0003753938.tif 000008
【００４０】
実施例４  化合物（１０）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、緩和条件で脱保護可能なアミダイトを用いて、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を３７℃、１時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＭＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
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【００４１】
実施例５  化合物（１１）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体より２Ｎのトリメリレンジアミンのメタノール溶液で密封条件下６５℃、４時間加熱することで、ＤＮＡを修飾、切り出しそして脱保護を行った。１Ｎ酢酸で中和後、メタノール及び水を留去し、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＡＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
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【００４２】
実施例６  枝分かれ構造の調製
２０μＭの５’−ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ−３’（ＯＤＮ  １）及び、２０μＭの５’−ＶＣＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ  ３）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ  ２）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を０℃で１時間行い、目的の枝分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。ＨＰＬＣによって単離した枝分かれＤＮＡを測定することで同定を行った。
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【００４３】
実施例７  ＤＮＡ鎖内部のシトシンをウラシルに変換（ＨＰＬＣ）
２０μＭ ＯＤＮ−１、２０μＭ ＯＤＮ−２、２０μＭ ＯＤＮ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石英チューブに加え、氷上で３６６ｎｍの光照射を１時間行った後、ＨＰＬＣで、新しく現れた連結体のピークを分離精製した（６−１４％ acetonitrile、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８ ＭＳ column）。次に、この連結体８μＭ、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む水溶液５０μＬを９０℃で２時間加熱し、新しく現れた、デアミネーション生成物を分離精製した（６−１４％ acetonitrile、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８−ＭＳ column）。このデアミネーションした連結体７μＭ、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む水溶液２０μＬを石英チューブを用いて、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行った後、ＨＰＬＣでウラシルを含んだピークを分離精製した（６−１４％ acetonitrile、６０min、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー）。単離したウラシルを含むＤＮＡ ７μＭを５μＬとって、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（snake venom phosphodiesterase）とアルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）をそれぞれ１μＬ（１unit）加えて、３７℃で１時間加温し、ＨＰＬＣで分析した（３−２０％ アセトニトリル、２０分、５０ｍＭ ギ酸アンモニウムバッファー、５Ｃ１８−ＭＳ column）。
【００４４】
結果を図２に示す。図２の最上段は反応前のチャートであり、上から２段目は波長３６６ｎｍの光を１時間照射した後のチャートであり、上から３段目は連結した１７量体を分離して９０℃で２時間加熱した後のものであり、最下段は波長３０２ｎｍの光を１時間照射し酵素分解した後のチャートである。
【００４５】
実施例８  ＤＮＡ鎖内部のシトシンをウラシルに変換（ゲル電気泳動）
１μＭ ＯＤＮ−１、７μＭ ＯＤＮ−２、７μＭ ＯＤＮ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石英チューブに加え、氷上で、３６６ｎｍの光照射を１時間行った。次に、この反応液をエッペンドルフチューブに移し、９０℃で２時間加熱した後、再度、石英チューブを用いて、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行った。さらに、反応液にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを１μＬ（１unit）加えて、３７℃で１時間加温した後、ピペリジンを５μＬ加えて９０℃で３０分加熱した。反応溶液をスピードバックで留去し、ローディングバッファーを加えて、７Ｍ 尿素（urea）を含んだ１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。泳動結果をＸ線フィルムで視覚化するため、−８０℃で一晩保存した。
【００４６】
結果を図３に示す。図３中の各レーンは次のとおりである。
レーン１：反応前
レーン２：３６６ｎｍの光照射を１時間行った。
レーン３：レーン２の後に９０度加熱を２時間行った。
レーン４：レーン３の後に３０２ｎｍの光照射を１時間行った。
レーン５：レーン４の後にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行った。
レーン６：レーン２の後に９０度加熱を行わずに、３０２ｎｍの光照射を１時間行った。
レーン７：レーン６の後にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分間行った。
レーン８：５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラー          ゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３０分          間行った。
この結果、コントロールのレーン８と、光反応実験で得られたレーン５のバンド（ウラシルでの切断）が一致した。レーン６、７のように９０度加熱を行わないと酵素で切断されないので、加熱によって、シトシンがウラシルに変換されていることがわかる。
【００４７】
実施例９  デアミネーションの時間変化の実験
１μＭ ＯＤＮ−１、７μＭ ＯＤＮ−２、７μＭ ＯＤＮ−３、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液５０μＬを石英チューブに加え、氷上で、３６６ｎｍの光照射を１時間行った。次に、この反応液をエッペンドルフチューブに移し、９０℃で１５分間隔で２時間まで加熱した後、それぞれの時間の反応液を、石英チューブを用いて、室温で３０２ｎｍの光照射を１時間行い、反応液にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを１μＬ（１unit）加えて、３７℃で１時間加温し、ピペリジンを５μＬ加えて９０℃で３０分加熱した。反応溶液をスピードバックで留去し、ローディングバッファーを加えて、７Ｍ ureaを含んだ１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。泳動結果をＸ線フィルムで視覚化するため、−８０℃で一晩保存し、デンシトメーターを用いてバンドを定量化した。
結果を図４及び図５に示す。図４の各レーンは次のとおりである。
レーン１：反応前
レーン２：３６６ｎｍの光照射を１時間行った。
レーン３：レーン２の後に９０度加熱を行わず、３０２ｎｍ光照射１時間、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理（３７℃で１時間）、ピペリジン処理（９０度加熱・３０分）を行った。
レーン４：レーン２の後に９０度加熱を１５分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン５：レーン２の後に９０度加熱を３０分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン６：レーン２の後に９０℃加熱を４５分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン７：レーン２の後に９０度加熱を６０分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン８：レーン２の後に９０度加熱を７５分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン９：レーン２の後に９０度加熱を９０分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン１０：レーン２の後に９０度加熱を１０５分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン１１：レーン２の後に９０度加熱を１２０分行った。それ以外はレーン３と同じ。
レーン１２：５'−３２Ｐ−ＴＧＴＧＵＡＡＡＡＡＡをウラシルＤＮＡグリコシラ            ーゼで処理（３７℃で１時間）して、ピペリジンで９０度加熱を３            ０分間行った。
【００４８】
【発明の効果】
本発明は、光による可逆的な核酸類の連結・解裂を利用した新規な点変異法を提供するものであり、本発明の方法は特定の位置の塩基を簡便な方法により特異的に点変異させることができる。本発明の方法は、酵素反応を使用する必要が無く、光を用いたユニークな構造を持つ核酸を合成するため、環境にもやさしい方法である。
また、本発明の方法によれば、光連結性ヌクレオシド含有ＤＮＡの光照射により、対象シトシンに対するシクロブタン反応を行い枝分かれ核酸を形成させ、加熱処理、及び化学反応処理を行うことでシトシンの脱アミノ化を促進し、最終的に光解裂を行い、ＤＮＡ、及びＲＮＡ上の任意のシトシンをウラシルへと誘導することが可能になる。本発明の方法により得られたウラシル体は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理を行うことで任意の位置で特異的に切断することができる。このような変換はＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルへ特異的に変換し、ｍＲＮＡの遺伝情報を特異的に変更することができる。さらに、本発明の方法は、フォトブランチング技術との組み合わせにより、ｉ）光転写制御、ii）光翻訳制御、iii）光誘導型変異蛋白の生産等への利用が期待される。
このように本発明の方法は、後処理の必要な化学活性化剤や使用条件に制限がかかる酵素を全く用いずに、光をトリガーとして用いるシトシンからウラシルへの点変異技術であり、環境にやさしい２１世紀型のバイオテクノロジー技術である。任意の位置のシトシンをウラシルへと点変異させる技術としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法によりシトシンをウラシルに変換する方法を化学反応式により具体的に説明するものである。
【図２】図２は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換したときの各ステップにおけるＨＰＬＣのチャートを示したものである。図２の上から、反応前のチャート、波長３６６ｎｍの光を１時間照射した後のチャート、連結した１７量体を分離して９０℃で２時間加熱した後のチャート、最下段は波長３０２ｎｍの光を１時間照射し酵素分解した後のチャートである。
【図３】図３は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換したときの各ステップにおける電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図４】図４は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換する際の、デアミネーション反応を種々の反応時間で行った場合の電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。レーン３は０分、レーン４からレーン１１はそれぞれ反応時間を１５分ずつ長くしたものである。
【図５】図５は、本発明の方法によりＤＮＡ中のシトシンをウラシルに変換する際の、デアミネーション反応におけるシトシン体の減少率（％）とウラシル体の生成率（％）を時間（分）に対してプロットしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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