(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞又は組織を、一般式（Ｉ）（化１）
【化１】
0003815919.tif 000012
［式中、ＸはＯ、Ｓ、またはＮＨを表し、Ｒは、式ＩＩ又は式ＩＩＩ（化２）
【化２】
0003815919.tif 000013
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立にＨ、ＯＨ、または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ3及びＲ6は、それぞれ独立にＨ、炭素数１〜６のアルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアリールアルキル基を表し、ｎは１〜５の整数を表し、ｙは１〜５の整数を表す。）を表す。］で示されるジャスモン酸誘導体の存在下に培養し、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項２】
ジャスモン酸誘導体が式ＩＶ（化３）で表される化合物Ａであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【化３】
0003815919.tif 000014
【請求項３】
ジャスモン酸誘導体が式Ｖ（化４）で表される化合物Ｂであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【化４】
0003815919.tif 000015
【請求項４】
タキサン型ジテルペンが、タキソール、バッカチンIII、セファロマニン、バッカチンVIから選ばれる少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項５】
タキサン型ジテルペンを産生する植物がイチイ属植物であることを特徴とする請求項１〜請求項３記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項６】
一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体の培地中濃度が１〜１０００μＭであることを特徴とする請求項１〜請求項３記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項７】
一般式（Ｉａ）（化５）
【化５】
0003815919.tif 000016
［式中、ＸはＯ又はＳを表し、Ｒは、式ＩＩ（化６）
【化６】
0003815919.tif 000017
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ3は独立にＨ、炭素数１〜６のアルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアリールアルキル基を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）を表す。］で示されるジャスモン酸誘導体。
【請求項８】
式ＩＩにおいて、Ｒ1及びＲ2は共にＨであり、ｎは１であり、Ｒ3は炭素数１〜６のアルキル基であり、一般式（Ｉ）においてＸがＯである請求項７に記載のジャスモン酸誘導体。
【請求項９】
式ＩＩにおいて、Ｒ3はメチル基である、請求項８に記載のジャスモン酸誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型ジテルペンの製造方法並びに新規なジャスモン酸誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソール(Taxol)は、イチイ科イチイ属植物であるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia NUTT)より単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、前記薬理活性と関連する複雑なエステルグループを有している。タキソールはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在し、その含有量は樹皮において最も高いことが報告されている。現在、タキソールは植物体中からの採取、あるいは、植物体中に存在する前駆体の１０−デアセチルバッカチンIIIを原料とする半合成により得られている。とはいえ、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高さに成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植物であり、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうため、大量のタキソールを得ることは容易でない。もし、タキソールおよびタキソールの前駆物質であるバッカチンIII等のタキサン型ジテルペンの合成が組織培養を利用して行なうことができれば、樹木を伐採する事なく、大量のタキソールを容易に得ることができるので有利である。
【０００３】
現在までの植物の培養細胞を利用したタキサン型ジテルペンの生産方法については、ジャスモン酸メチルの存在下、イチイ細胞を培養することにより、タキソールやバッカチンIIIなどのタキサン型ジテルペンの生産性が向上することが報告されている（特開平８−３３４９０号公報）。
【０００４】
しかし、当該公報には本発明に使用されるジャスモン酸誘導体は開示されておらず、それら化合物がタキサン型ジテルペンの生産方法に与える影響は未知であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞または組織を培養することにより、タキサン型ジテルペンをより簡便且つ効率的に製造する方法並びに新規なジャスモン酸誘導体を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、新しく種々のジャスモン酸誘導体を合成し、合成した該誘導体をタキサン型ジテルペンを産生する植物の培養細胞または培養組織の培地中に添加して培養を行なうと、従来知られていたジャスモン酸メチルを添加した場合に比べて培養物中のタキサン型ジテルペンの生産性がより向上することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞又は組織を、一般式（Ｉ）（化７）
【０００８】
【化７】
0003815919.tif 000002
［式中、ＸはＯ、Ｓ、またはＮＨを表し、Ｒは、式ＩＩ又は式ＩＩＩ（化８）
【０００９】
【化８】
0003815919.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立にＨ、ＯＨ、または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ3及びＲ6は、それぞれ独立にＨ、炭素数１〜６のアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいアリールアルキル基を表し、ｎは１〜５の整数を表し、ｙは１〜５の整数を表す。）を表す。］で示されるジャスモン酸誘導体の存在下に培養し、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法、および一般式（Ｉａ）（化９）
【００１０】
【化９】
0003815919.tif 000004
［式中、ＸはＯ又はＳを表し、Ｒは、式ＩＩ（化１０）
【００１１】
【化１０】
0003815919.tif 000005
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立にＨ、ＯＨ、または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ3は独立にＨ、炭素数１〜６のアルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアリールアルキル基を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）を表す。］で示されるジャスモン酸誘導体である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の製造方法の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はなく、具体的には、タキソール、バッカチンIII、セファロマニン、バッカチンVI等を例示できる。
【００１３】
本発明の製造方法に用いられるタキサン型ジテルペンを産生する植物としては、例えば、セイヨウイチイ(Taxus baccata LINN)、イチイ(T. cuspidata SIEB.et   ZUCC)、キャラボク(T. cuspidata SIEB.et ZUCC var. nana REHDER)、タイヘイヨウイチイ(T. brevifolia NUTT)、カナダイチイ(T. canadiensis MARSH)、中国イチイ(T. chinensis)、メディアイチイ（T.media）等のイチイ属植物が挙げられる。これらの中でもメディアイチイ（T.media）が特に好ましい。
前記植物の組織培養は、本発明により一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体を添加する以外は、従来から知られている方法によって行なうことができる。
【００１４】
一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5又はＲ6で表される炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられる。
一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体において、Ｒ3及びＲ6で表される炭素数１〜６の置換されていてもよいアリール基としては、フェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体において、Ｒ3及びＲ6で表される炭素数１〜６の置換されていてもよいアリールアルキル基としては、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基等が挙げられる。
一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体の具体例としては、以下に示す化合物Ａ（式ＩＶ，化１１）、化合物Ｂ（式Ｖ，化１２）、化合物Ｃ（式ＶＩ，化１３）、化合物Ｄ（式ＶＩＩ，化１４）が挙げられる。
【００１５】
【化１１】
0003815919.tif 000006
【００１６】
【化１２】
0003815919.tif 000007
【００１７】
【化１３】
0003815919.tif 000008
【００１８】
【化１４】
0003815919.tif 000009
【００１９】
一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体の合成方法を化合物Ｂを例として述べる。
まず、市販のジャスモン酸メチルをアルカリ加水分解し、ジャスモン酸（ＪＡ）を得る。ＪＡ（１００ｍｇ、０．４８ ｍｍｏｌ）、グリコール酸メチル（１１０μｌ、１．４４ｍｍｏｌ)、４-ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（４．７ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を添加したジクロロメタン（６ｍｌ）溶液に窒素気流下、０℃にてジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１０８ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を加える。０℃にて１時間、室温にて３時間撹拌後、溶媒を留去し、残さに酢酸エチルを加えて不溶物をろ別する。ろ液を２Ｎ ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、飽和食塩水の順に順次洗浄後、Ｎａ2ＳＯ4にて乾燥する。溶媒留去後、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、化合物Ｂを無色油状物として得る。
【００２０】
上記と同様の反応条件および後処理操作に従い、ＪＡとメチルグリシン塩酸塩より化合物Ａ、ＪＡとエチレングリコール  モノメチルエーテルより化合物Ｃ、ＪＡとジメチレングリコール  モノメチルエーテルより化合物Ｄを得ることができる。
【００２１】
本発明において、ジャスモン酸誘導体は、培養細胞が増殖期ないし定常期に添加することがもっとも効果的であり、この中でも特に増殖期から定常期に移行する時期にジャスモン酸誘導体を添加することが本発明の方法にとって好ましい。たとえば、１４日おきに細胞を移植している場合には、７〜１４日目がジャスモン酸誘導体の添加の適期にあたる。また、添加方法としては、一度に行ってもよいし、複数回に分けて行ってもよい。
一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体を含む組織培養培地中で組織培養し、得られる組織培養物および／または培地からタキサン型ジテルペンを回収することができる。
【００２２】
一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体は、培地における濃度が１〜１０００μＭとすることが必要であり、この中でも特に誘導体の濃度を１０〜３００μＭの範囲に調整することが本発明の方法にとって好ましい。
【００２３】
本発明における組織培養に使用される培地としては、従来から知られている植物の組織培養に用いられる培地、例えばムラシゲ・スクーグ（Murashige & Skoog）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（Linsmaier Skoog）の培地、ウッディー・プラント・メディウム（Woody Plant Medium）の培地、ガンボルグ（Gamborg）のＢ−５培地、三井のＭ−９培地等が挙げられる。
【００２４】
これら培地に植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸等を添加することもできる。
炭素源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。
無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物として添加できる。
【００２５】
植物ホルモンとしては、例えばインドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用いられる。
ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ1）、ピリドキシン（ビタミンＢ6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられる。
アミノ酸類としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等を添加できる。
【００２６】
一般に前記の各成分は、無機成分が約０．１μＭ、ないし１００ｍＭ、炭素源が約１〜約３０ｇ／ｌ、植物ホルモン類が約０．０１〜約１０μＭ、ビタミン類およびアミノ酸類がそれぞれ約０．１〜約１００ｍｇ／ｌの濃度で用いられる。
尚、本発明には液体培地および寒天やゲランガム等を通常０．１〜１％含有する固形培地のいずれも使用できるが、通常は液体培地が好ましい。
本発明における組織培養においては、前記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片または細胞、あるいはこれらを上記培地あるいは他の従来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用することができる。
【００２７】
これらの組織または細胞を前記一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体の存在下に組織培養すると、無添加または無処理の場合と比較して、タキサン型ジテルペンの高生産性培養組織または培養細胞が得られる。
【００２８】
以上のようにして得られた培養組織または培養細胞および／または培地から、メタノール、ジクロロメタン等の有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分離することができる。また、培地中に適当な吸着剤や有機溶媒を共存させ、連続的にタキサン型ジテルペンを回収することもできる。
【００２９】
本発明における組織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。
先ずイチイ属に属する植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッディー・プラント・メディウムの固体培地上に置床し、１０〜３５℃で１４〜６０日程度経過させて組織片の一部をカルス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカルスの一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをいう。
この安定化したカルスを増殖に適した液体培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速度が高められる。本発明では、この安定化したカルスまたは該カルスを構成する細胞は、一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体を含有する固体培地または液体培地で培養される。
【００３０】
一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸誘導体を用いて２段培養を行う場合、１段目の培養では、ジャスモン酸誘導体を含まない培地で細胞を増殖後、次に２段目の培養でジャスモン酸を添加して培養することができる。その際、２段目に移行する細胞の状態は増殖期ないし定常期であることが好ましい。
本発明における組織培養の培養温度としては、通常は約１０〜約３５℃、特に約２３〜２８℃が増殖速度が大きいので好適である。また、培養期間としては、１４〜４２日間が好適である。
【００３１】
本発明における培養方法において液体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーションまたは濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞および／または培地から目的とするタキサン型ジテルペンをメタノール、ジクロロメタン等の有機溶媒による抽出等の方法によって分離することができる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
ナフタレン酢酸を１０-5Ｍの濃度になるように添加したウッディー・プラント・メディウムの固体培地（ゲランガム０．２５重量％）に、前もって２％アンチホルミン溶液または70％エタノール溶液等で滅菌処理したメディアイチイ(Taxus media)の胚の一部を置床し、２５℃で暗所にて静置培養してメディアイチイカルスを得た。次にこのカルス１ｇ（新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウムの液体培地２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、１００ｒｐｍ）し、１４日毎に植え継ぎ、該カルスの生育速度を速めた。
このようにして得られた培養細胞２ｇ（新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウム２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ジャスモン酸の誘導体として化合物Ａ（式（ＩＶ））をその終濃度が１〜１０００μＭになるように添加し、さらに１４日間培養した。
培養終了後、メディアイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後その乾燥重量を測定し、液体培地１Ｌ当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得られた乾燥カルス及び培地からメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、バッカチンＩＩＩ、バッカチンＶＩと比較定量することによってタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表１に示す。
【００３３】
〔比較例１〕
実施例１において、ジャスモン酸の誘導体を添加しない以外は実施例１と同様に操作した。その結果を表１（表１）に示す。
【００３４】
〔比較例２〕
実施例１において、ジャスモン酸の誘導体としてジャスモン酸メチル（特開平８−３３４９０号公報の実施例１で使用されている化合物に相当する）を添加する以外は実施例１と同様に操作した。その結果を表１（表１）に示す。
【００３５】
〔実施例２〕
実施例１において、ジャスモン酸の誘導体として化合物Ｂ（式（Ｖ））を添加する以外は実施例１と同様に操作した。その結果を表１（表１）に示す。
【００３６】
〔実施例３〕
実施例１おいて、ジャスモン酸の誘導体として化合物Ｃ（式（ＶＩ））を１００μＭ添加する以外は実施例１と同様に操作した。その結果を表１（表１）に示す。
【００３７】
〔実施例４〕
実施例１において、ジャスモン酸の誘導体として化合物Ｄ（式（ＶＩＩ））を１００μＭ添加する以外は実施例１と同様に操作した。その結果を表１（表１）に示す。
【００３８】
【表１】
0003815919.tif 000010
【００３９】
〔実施例５〕  化合物Ｂの合成
市販のジャスモン酸メチルをアルカリ加水分解し、ジャスモン酸（ＪＡ）を得る。ＪＡ（１００ｍｇ、０．４８  ｍｍｏｌ）、グリコール酸メチル（１１０μｌ、１．４４ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（４．７ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を添加したジクロロメタン（６ｍｌ）溶液に窒素気流下、０℃にてジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１０８ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を加え他。０℃にて１時間、室温にて３時間撹拌後、溶媒を留去し、残さに酢酸エチルを加えて不溶物をろ別した。ろ液を２Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、飽和食塩水の順に順次洗浄後、Ｎａ2ＳＯ4にて乾燥した。溶媒留去後、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、化合物Ｂを無色油状物として得た。得られた化合物のＮＭＲデータを表２に示す。
【００４０】
【表２】
0003815919.tif 000011
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞又は組織の培養培地にジャスモン酸誘導体を添加して培養することによって、大量のタキサン型ジテルペンを簡便且つ効率的に生産することが可能になる。本発明において使用されるジャスモン酸誘導体は従来知られていたジャスモン酸メチルをはじめとするジャスモン酸誘導体に比べ、タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞又は組織のタキサン型ジテルペンの生産を促進する作用が高いため、本発明の方法は従来知られている方法よりもより簡便且つ効率的である。