(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物を含む物質が付着した黒鉛ナノチューブであって、該物質は
（ｉ）追加された問題の分析物又は該分析物の追加された類似体、
（ｉｉ）該分析物の結合相手又は該類似体の結合相手、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合することができる反応成分、
からなる群から選ばれる、上記黒鉛ナノチューブ。
【請求項２】
前記ルミネセンスが電気化学ルミネセンスである、請求項１記載の黒鉛ナノチューブ。
【請求項３】
前記成分が酵素バイオセンサーである、請求項１記載の黒鉛ナノチューブ。
【請求項４】
サンプル中に存在する問題の分析物を検出するための組成物であって、
（ｉ）官能基を含有する黒鉛ナノチューブと、
（ii）前記官能基に結合した物質であって、分析物に結合することができるか、又は分析物の結合相手に結合することに関して分析物と競合することができる該物質とを含み、該物質は
（ｉ）追加された問題の分析物又は該分析物の追加された類似体、及び
（ｉｉ）該分析物の結合相手又は該類似体の結合相手、
からなる群から選ばれる、上記組成物。
【請求項５】
更に、分析物に結合したアッセイ実行物質を含み、前記アッセイ実行物質が、ルミネセントラベル化合物を含む、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
サンプル中に存在する問題の分析物に関して結合アッセイを実施する方法であって、該工程は下記工程：
（ａ）（ｉ）前記サンプルと、
（ii）ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物を含むアッセイ実行物質と、
（iii）第２の物質に結合した複数個の官能化黒鉛ナノチューブであって、該第２の物質は前記分析物に直接的又は間接的に結合することができるか、又は前記分析物と競合することができるものである、上記複数個の官能化黒鉛ナノチューブ、
とを含有する組成物を形成する工程と；
（ｂ）前記組成物をインキュベートして、前記複数個の黒鉛ナノチューブの少なくとも１つと前記ラベル化合物とを包含する複合体を形成する工程と；
（ｃ）前記複合体を測定帯に収集する工程と；
（ｄ）前記複合体中のラベル化合物をルミネセンスを発生するように誘導する工程と；
（ｅ）発生したルミネセンスを測定して、サンプル中の問題の分析物の存在を測定する工程と
を含み、前記第２の物質は
（ｉ）追加された問題の分析物又は該分析物の追加された類似体、
（ｉｉ）該分析物の結合相手又は該類似体の結合相手、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合することができる反応成分
からなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項７】
サンプル中に存在する問題の分析物に関して結合アッセイを実施する方法であって、該方法は下記工程：
（ａ）（ｉ）前記サンプルと、
（ii）ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物を含むアッセイ実行物質であって、前記分析物に直接的又は間接的に結合することができるか、又は前記分析物と競合することができるものである上記アッセイ実行物質、と
（iii）第２の物質に結合した複数個の官能化ナノチューブであって、該第２の物質は前記分析物に直接的又は間接的に結合することができるか、又は前記分析物と競合することができるものである、上記複数個の官能化黒鉛ナノチューブ、
とを含有する組成物を形成する工程と；
（ｂ）前記組成物をインキュベートして、前記複数個の官能化黒鉛ナノチューブの少なくとも１つと前記ラベル化合物とを包含する複合体を形成する工程と；
（ｃ）前記複合体中の前記ラベル化合物をルミネセンスを発生するように誘導する工程と；
（ｄ）発生したルミネセンスを測定して、前記サンプル中の前記問題の分析物を測定又は検出する工程と
を含み、該第２の物質は
（ｉ）追加された問題の分析物又は該分析物の追加された類似体、
（ｉｉ）該分析物の結合相手又は該類似体の結合相手、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合することができる反応成分
からなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項８】
前記複合体が電極表面に収集される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
電極表面での電気化学ルミネセンスの測定に基づいて、サンプル中に存在する問題の分析物に関する結合アッセイを実施する方法であって、該方法は下記工程：
（ａ）（ｉ）前記サンプルと、
（ii）電気化学ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物を含むアッセイ実行物質であって、前記分析物に直接的又は間接的に結合することができるか、又は前記分析物と競合することができる上記アッセイ実行物質、と
（iii）第２の物質に結合した複数個の官能化黒鉛ナノチューブであって、該第２の物質は前記分析物に直接的又は間接的に結合することができるか、又は前記分析物と競合することができるものである上記複数個の官能化黒鉛ナノチューブ、と
を含有する組成物を形成する工程と；
（ｂ）前記組成物をインキュベートして、前記複数個の黒鉛ナノチューブの少なくとも１つと前記ラベル化合物とを包含する複合体を形成する工程と；
（ｃ）前記複合体を収集する工程と；
（ｄ）前記収集された複合体を電極表面と接触させ、前記電極に電圧を印加することによって、前記複合体中のラベル化合物をルミネセンスを発生するように誘導する工程と；
（ｅ）電極表面において発生したルミネセンスを測定して、サンプル中の問題の分析物の存在を測定する工程と
を含み、該第2の物質は
（ｉ）追加された問題の分析物又は該分析物の追加された類似体、
（ｉｉ）該分析物の結合相手又は該類似体の結合相手、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合することができる反応成分
からなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項１０】
電極表面での電気化学ルミネセンスの測定に基づいて、サンプル中に存在する問題の分析物に関する結合アッセイを実施する方法であって、該方法は下記工程：
（ａ）（ｉ）前記サンプルと、
（ii）電気化学ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物を含むアッセイ実行物質であって、前記分析物に直接的又は間接的に結合することができるか、又は前記分析物と競合することができる上記アッセイ実行物質と、
（iii）第２の物質に結合した複数個の磁気反応性の懸濁黒鉛ナノチューブであって、該第2の物質は前記分析物に直接的又は間接的に結合することができるか、又は前記分析物と競合することができるものである上記複数個の磁気反応性の懸濁黒鉛ナノチューブと
を含有する組成物を形成する工程と；
（ｂ）前記組成物をインキュベートして、前記複数個の黒鉛ナノチューブの少なくとも１つと前記ラベル化合物とを包含する複合体を形成する工程と；
（ｃ）前記黒鉛ナノチューブ上に磁界を印加することによって、前記複合体を収集する工程と；
（ｄ）前記収集された複合体を電極表面と接触させ、前記電極に電圧を印加することによって、前記複合体中のラベル化合物をルミネセンスを発生するように誘導する工程と；
（ｅ）電極表面において発生したルミネセンスを測定して、サンプル中の問題の分析物の存在を測定する工程と
を含み、該第２の物質は
（ｉ）追加された問題の分析物又は該分析物の追加された類似体、
（ｉｉ）該分析物の結合相手又は該類似体の結合相手、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合することができる反応成分
からなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項１１】
前記磁界の印加が前記複合体を前記電極の表面に収集させる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
物質に結合した官能化黒鉛ナノチューブと、
下記成分：
（ａ）電解質；
（ｂ）ＥＣＬ部分を含有するラベル化合物；
（ｃ）問題の分析物又は問題の分析物の類似体；
（ｄ）問題の分析物の結合相手又はその類似体の結合相手；
（ｅ）（ｃ）又は（ｄ）と反応することができる反応性成分；
（ｆ）還元体；及び
（ｇ）電気化学ルミネセンス発生反応強化剤、但し任意の試薬組成物中に含有される２種類の成分が、予定のアッセイにおけるそれらの機能を損なわないように、貯蔵中に相互に反応性でない、
から成る群から選択される少なくとも１種類の他の成分とを含む、微粒子に基づく結合アッセイに試薬として用いるための組成物であって、前記物質は
（ｉ）追加された問題の分析物又は該分析物の追加された類似体、
（ｉｉ）該分析物の結合相手又は該類似体の結合相手、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合することができる反応成分
からなる群から選ばれる、上記組成物。
【請求項１３】
磁気反応性黒鉛ナノチューブを含有する、請求項１２記載の試薬。
【請求項１４】
結合反応と電気化学ルミネセンス現象の測定とに基づくアッセイのためのアッセイ試薬であって、該試薬は下記成分：
（ａ）電解質；
（ｂ）第１の物質に結合した複数個の磁気反応性官能化黒鉛ナノチューブであって、該第１の物質は前記分析物に直接的又は間接的に結合することができるか、又は前記分析物と競合することができるものである上記複数個の磁気反応性官能性黒鉛ナノチューブ；及び
（ｃ）電気化学ルミネセンス特性を有する化学的部分を含むアッセイ実行物質であって、前記分析物に直接的又は間接的に結合することができるか、又は前記分析物と競合することができる上記アッセイ実行物質を含み、前記第１の物質は
（ｉ）追加された問題の分析物又は該分析物の追加された類似体、
（ｉｉ）該分析物の結合相手又は該類似体の結合相手、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合することができる反応成分
からなる群から選ばれる、上記アッセイ試薬。
【請求項１５】
サンプル中に存在する問題の分析物に関してアッセイを実施する方法であって、下記工程：
（ａ）（ｉ）前記サンプルと、
（ii）ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物に結合する成分に結合した官能化黒鉛ナノチューブであって、前記成分が問題の分析物の基質である前記ナノチューブと
を含有する組成物を形成する工程と；
（ｂ）前記分析物に前記成分を切断させる条件下で、前記組成物をインキュベートする工程と；
（ｃ）前記黒鉛ナノチューブを前記組成物から分離する工程と；
（ｄ）ラベル化合物をルミネセンスを発生するように誘導する工程と；
（ｅ）発生したルミネセンスを測定して、サンプル中の問題の分析物の存在を測定する工程
とを含む上記方法。
【請求項１６】
前記ラベル化合物が電気化学ルミネセンスラベルである請求項１記載の黒鉛ナノチューブ。
【請求項１７】
前記電気化学ルミネセンスラベルが希土類金属又は遷移金属を含む請求項１６記載の黒鉛ナノチューブ。
【請求項１８】
前記電気化学ルミネセンスラベルが、ルテニウム、オスミウム及びレニウムからなる群から選択される金属原子を含む請求項１６記載の黒鉛ナノチューブ。
【請求項１９】
前記ラベル化合物が
（ａ）ルテニウム、オスミウム及びレニウムからなる群から選択される金属原子、及び
（ｂ）窒素含有の、複素環状、芳香族多座金属リガンド
を含む請求項１記載の黒鉛ナノチューブ。
【請求項２０】
前記物質が、抗体、タンパク質レセプター、アビジン、ストレプタビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン又は核酸を含む請求項１記載の黒鉛ナノチューブ。
【請求項２１】
前記ナノチューブが磁気反応性である請求項１記載のナノチューブ。
【請求項２２】
ラベル化合物を含むアッセイ実行物質を更に含む請求項５記載の組成物。
【請求項２３】
前記ラベル化合物が電気化学ルミネセンスラベルである請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
前記電気化学ルミネセンスラベルが希土類金属又は遷移金属を含む請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
前記ラベル化合物が、ルテニウム、オスミウム及びレニウムからなる群から選択される金属原子を含む請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
前記ラベル化合物が
（ａ）ルテニウム、オスミウム及びレニウムからなる群から選択される金属原子、及び
（ｂ）窒素含有の、複素環状、芳香族多座金属リガンド
を含む請求項２２記載の組成物。
【請求項２７】
前記物質が、抗体、タンパク質レセプター、アビジン、ストレプタビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン又は核酸を含む請求項４記載の組成物。
【請求項２８】
前記アッセイ実行物質が
（ｉ）前記問題の分析物の特定の結合相手；及び
（ｉｉ）追加された問題の分析物又は前記問題の分析物の結合相手に結合することに関して前記問題の分析物と競合する前記問題の分析物の追加された類似体
からなる群から選択される請求項２２記載の組成物。
【請求項２９】
前記物質が前記官能基に共有結合的に結合している請求項４記載の組成物。
【請求項３０】
前記物質がビオチン−ストレプタビジン相互作用を含む結合を介して前記ナノチューブに結合している請求項４記載の組成物。
【請求項３１】
電気化学ルミネセンス結合アッセイを実施するためのアッセイ試薬であって、該アッセイ試薬は一つ又は複数の容器中に、
（ａ）第１の物質に結合した黒鉛ナノチューブ；及び
（ｂ）ラベル化合物を含むアッセイ実行物質
を含み、前記第１の物質は
（ｉ）追加された問題の分析物又は該分析物の追加された類似体、
（ｉｉ）該分析物の結合相手又は該類似体の結合相手、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合することができる反応成分
からなる群から選ばれるものである、上記アッセイ試薬。
【請求項３２】
前記ラベル化合物が電気化学ルミネセンスラベルである請求項３１記載のアッセイ試薬。
【請求項３３】
前記ラベル化合物が希土類金属原子又は遷移金属原子を含む請求項３１記載のアッセイ試薬。
【請求項３４】
前記ラベル化合物が、ルテニウム、オスミウム及びレニウムからなる群から選択される金属原子を含む請求項３１記載のアッセイ試薬。
【請求項３５】
前記ラベル化合物が
（ａ）ルテニウム、オスミウム及びレニウムからなる群から選択される金属原子、及び
（ｂ）窒素含有の、複素環状、芳香族多座金属リガンド
を含む請求項３１記載のアッセイ試薬。
【請求項３６】
前記第１の物質及び／又は前記アッセイ実行物質が、抗体、タンパク質レセプター、アビジン、ストレプタビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン又は核酸を含む請求項３１記載のアッセイ試薬。
【請求項３７】
前記第１の物質が前記ナノチューブに結合している、及び／又は前記アッセイ実行物質がビオチン−ストレプタビジン相互作用を含む結合を介して前記ラベル化合物に結合している請求項３１記載のアッセイ試薬。
【請求項３８】
前記ナノチューブが磁気反応性である請求項３１記載のアッセイ試薬。
【請求項３９】
前記アッセイ実行物質及び／又は前記第２の物質が
（ｉ）前記問題の分析物の特定の結合相手；及び
（ｉｉ）追加された問題の分析物又は前記問題の分析物の結合相手に結合することに関して前記問題の分析物と競合する前記問題の分析物の追加された類似体
からなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項４０】
前記ラベル化合物が電気化学ルミネセンスラベルである請求項６記載の方法。
【請求項４１】
前記ラベル化合物が希土類金属原子又は遷移金属原子を含む請求項６記載の方法。
【請求項４２】
前記ラベル化合物が、ルテニウム、オスミウム及びレニウムからなる群から選択される金属原子を含む請求項６記載の方法。
【請求項４３】
前記ラベル化合物が
（ａ）ルテニウム、オスミウム及びレニウムからなる群から選択される金属原子、及び
（ｂ）窒素含有の、複素環状、芳香族多座金属リガンド
を含む請求項６記載の方法。
【請求項４４】
前記複合体を収集する工程を更に含む請求項６記載の方法。
【請求項４５】
前記アッセイ実行物質及び／又は前記第２の物質が、抗体、タンパク質レセプター、アビジン、ストレプタビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン又は核酸を含む請求項６記載の方法。
【請求項４６】
前記アッセイ実行物質が前記ラベル化合物に結合している、及び／又は前記第２の物質がビオチン−ストレプタビジン相互作用を含む結合を介して前記ナノチューブに結合している請求項６記載の方法。
【請求項４７】
電極表面で前記ナノチューブを収集する工程を更に含む請求項６記載の方法。
【請求項４８】
前記問題の分析物が酵素であり、前記アッセイ実行物質及び／又は前記第２の物質が前記酵素の基質を含む請求項６記載の方法。
【請求項４９】
前記酵素は前記ナノチューブから前記ラベル化合物を放出し、及び／又は前記ナノチューブから前記物質を放出するように前記基質を切断する請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記ナノチューブが磁気反応性である請求項６記載の方法。
【請求項５１】
（ｉ）電気化学ルミネセンスラベル；（ｉｉ）酵素；及び（ｉｉｉ）酵素コファクターからなる群から選択される少なくとも２種類の成分に結合した黒鉛ナノチューブ。
【請求項５２】
酵素バイオセンサーに結合した黒鉛ナノチューブであって、前記酵素バイオセンサーが電気化学ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物を含む上記黒鉛ナノチューブ。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９４年１１月３０日に出願されたＭａｓｓｅｙ等の同時係属出願第０８／３４６，８３２号の一部継続であり、これは１９９３年１１月２４日に出願された出願第０８／１５８，１９３号の継続であり、これは１９９１年２月６日に出願された出願第０７／６５２，４２７号の継続かつ、１９８８年１１月３日に出願され、現在放棄されている「電気化学ルミネセンスアッセイ」なる名称の出願第７／２６６，８８２号の継続である、１９９０年６月１８日に出願された出願第０７／５３９，３８９号の一部継続である。本出願はまた、１９９４年１２月８日に出願されたＦｉｓｃｈｅｒ等の「官能化ナノチューブ」なる名称の同時係属出願第０８／３５２，４００号の一部継続でもある。これらの出願の内容は本明細書に援用される。
発明の分野
本出願は一般に、結合アッセイをおこなうための方法と装置、より詳しくは、アッセイ系の１つ以上の標識成分によって放出されるルミネセンスを測定することによって問題の分析物の存在を測定する結合アッセイに関する。さらに詳しくは、本発明は、ルミネセンス成分がアッセイ組成物中で濃縮され、検出系に集積されてから、電気化学ルミネセンスを生じる、改良された感度を有する、精密で、再現可能であり、正確な、均質又は不均質な特異的結合アッセイに関する。
発明の背景
生化学的及び生物学的物質中の問題の分析物を検出し、定量するために、非常に多くの方法と装置が開発されている。微量の微生物、薬剤、ホルモン、ウイルス、抗体、核酸及び他のタンパク質を測定することができる方法と装置は、研究者と臨床医にとって非常に貴重である。
当該技術分野の大部分は周知の結合反応、例えば、抗原−抗体反応、核酸ハイブリダイゼーション方法、及びタンパク質−リガンド系に基づいて開発されている。多くの生化学的及び生物学的結合系における高度な特異性は、研究及び診断において重要なアッセイ方法とアッセイ系をもたらしている。典型的に、問題の分析物の存在は、１種類以上の結合物質に付着した観察可能な“ラベル”の有無によって実証される。生化学的、化学的及び電気化学的手段を通してルミネセンスを発するように形成することができるラベルが特に重要である。“フォトルミネセンス”は、物質が電磁線を吸収したときにルミネセンスを発するように物質を誘導するプロセスである。蛍光と燐光とはフォトルミネセンスの種類である。“化学ルミネセンス”プロセスはエネルギーの化学的転移によるルミネセンス発生種の形成を必然的に伴う。“電気化学ルミネセンス”はルミネセンス発生種の電気化学的形成を必然的に伴う。
問題の分析物を含有するサンプルに化学ルミネセンスラベルで標識した反応物を混合する化学ルミネセンスアッセイ方法が開発されている。反応混合物をインキュベートすると、標識反応物の一部が分析物に結合する。インキュベーション後に、混合物の結合部分と非結合部分とを分離し、いずれかの部分又は両方の部分中のラベルの濃度を化学ルミネセンス方法によって測定することができる。一方の部分又は両方の部分で測定された化学ルミネセンスレベルは、生物学的サンプル中の問題の分析物の量を表示する。
電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）アッセイ方法は、化学ルミネセンス方法の改良である。電気化学ルミネセンスアッセイ方法は問題の分析物の存在と濃度の鋭敏で正確な測定を可能にする。このような方法では、ルミネセンスを誘発するためにボルタメトリック(voltametric)作用電極に、インキュベートしたサンプルを暴露させる。適当な化学的環境において、特定の時間に特定の方法で作用電極に印加された電圧によって、このような電気化学ルミネセンスが誘発される。ラベルによって発生された光は測定され、分析物の存在又は量を表示する。このようなＥＣＬ方法についてのさらに詳細な説明に関しては、ＰＣＴ公開出願ＵＳ８５／０１２５３（ＷＯ８５／０２７３４）、ＰＣＴ公開出願ＵＳ８７／００９８７、及びＰＣＴ公開出願Ｕ．Ｓ．８８／０３９４７が参照される。上記出願の開示は参照することにより本明細書中に取り込まれる。
アッセイ操作中に分離工程を必要としないで電気化学ルミネセンスアッセイをおこない、正確で鋭敏な測定がなされうるように、分析物の種々な濃度におけるシグナル調節(signal modification)を最大にすることが望ましい。非分離アッセイの先行技術方法のなかに、アッセイサンプル中に懸濁した微粒状物質を用いて、アッセイの１種類以上の結合成分に結合させる方法がある。
米国出願第５３９，３８９号（ＰＣＴ公開出願Ｕ．Ｓ．８９／０４９１９）は、不活性な微粒状物質がアッセイ系の結合性反応物質の１種類に特異的に結合する、ルミネセンス現象に基づく、鋭敏で、特異的な結合アッセイ方法を教示する。このアッセイ方法は不均質な（１つ以上の分離工程）アッセイフォーマットでおこなうことができるが、均質な（分離なし）アッセイフォーマットで最も有利におこなうことができる。
Ｕ．Ｓ．８９／０４９１９は、ルミネセンス発生現象の測定のための結合反応に基づくアッセイ用組成物であって、アッセイ混合物の成分に結合することができる表面を有する複数個の懸濁粒子を包含する組成物に関する。他の態様では、これはこの発明のアッセイ組成物を用いてアッセイ方法をおこなうことができる、サンプル中の問題の分析物の検出及び定量系に関する。この系はアッセイ媒質中のラベル化合物を誘導してルミネセンスを発生させる手段と、このルミネセンスを測定して、サンプル中の分析物の存在を検出する手段とを包含する。
電気化学ルミネセンス発生部分が結合したアッセイ系の成分が懸濁した微粒状物質に結合することが、その成分に結合した電気化学ルミネセンス発生部分によって発生されるルミネセンスシグナルの強度を非常に調節し、それによってアッセイ系の特異的結合反応をモニターする手段を提供することが判明している。懸濁粒子は、これらの懸濁微粒状物質に結合しない状態で留まる系成分に結合した電気化学ルミネセンス発生部分によって発生されるルミネセンスシグナルの強度に殆ど又は全く影響しないことが発見されている。
したがって、Ｕ．Ｓ．８９／０４９１９はサンプル中の問題の分析物の検出方法であって、（１）（ａ）問題の分析物を含有すると疑われるサンプルと、（ｂ）（ｉ）問題の分析物又は問題の分析物の類似体と、（ii）問題の分析物又はその前記類似体の結合対と、（iii）（ｉ）又は（ii）と結合可能な反応成分とから成る群から選択されるアッセイ実行物質(assay-performance-substance)であって、その１種類が、ルミネセンスを発生するように誘導されることができる化学的部分を有するラベル化合物に結合するアッセイ実行物質と、（ｃ）（ｂ）の（ｉ）、（ii）及び（iii）において定義された分析物及び／又は物質と特異的に結合することができる複数個の懸濁粒子とを含む組成物を形成する工程と；（２）該組成物をインキュベートして、粒子と前記ラベル化合物とを含む複合体(complex)を形成する工程と；（３）ラベル化合物を誘導してルミネセンスを発生させる工程と；（４）該組成物によって発生されるルミネセンスを測定して、サンプル中の問題の分析物の存在を検出する工程とを包含する。同じ方法を用いて、アッセイ組成物のルミネセンスを、既知量の分析物を含有する組成物のルミネセンスと比較することによって、サンプル中の分析物の量を定量することができる。
天然物又は合成物のいずれでもよい、問題の分析物の類似体は、分析物に匹敵する結合性を有する化合物であるが、より高い又はより低い結合能力を有する化合物をも包含する。この発明に用いるために適した結合対は周知である。例は抗体、酵素、核酸、レクチン、補因子及び受容体である。分析物若しくはその類似体及び／又はそれらの結合対と結合可能な反応性成分は、二次抗体又は例えばプロテインＡ若しくはプロテインＢのようなタンパク質でありうるか又はアビジン若しくはビオチン若しくは、結合反応に入ることが当該技術分野で知られた他の成分であることができる。
特異的結合対に結合しているか結合していないかに拘わらず、ラベル化合物をボルタメトリック作用電極に暴露させることによって誘導される電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）から、ルミネセンスが生じることが有利である。ＥＣＬ反応性混合物は、特定の時間に、特定の方法で作用電極に印加される電圧によって発光するように制御可能に誘発されて、光を発生する。可視光の発生が有利な特徴であるが、組成物又は系は他の種類の電磁線、Ｘ線、マイクロウェーブ等を発生することもできる。“電気化学ルミネセンス”、“電気化学ルミネセンスの”、“電気化学ルミネセンスを発生する(electrochemiluminescence)”、“ルミネセンス”、“ルミネセンスの”及び“ルミネセンスを発生する(luminesce)”なる用語の使用は、光及び他の形式の電磁線の発生を包含する。
Ｕ．Ｓ．８９／０４９１９に教示される方法は、研究及び臨床的設定においておこなわれる多様なアッセイにおける極度に少量の分析物の検出と定量を可能にする。しかし、研究者及び臨床医の要求は、これらの方法によっておこなわれるアッセイの検出限界を下げて、これらのアッセイの感度を高めること及びアッセイをおこなうことができる速度を高めることを絶対必要にする。標識種に測定工程を受けさせる前に、標識種を濃縮することによって標識種からのシグナルを高めるための種々な方法が当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第４，６５２，３３３号では、蛍光ラベル、燐光ラベル又は原子蛍光ラベルで標識した粒子をミクロ濾過によって濃縮する。
測定前の標識免疫化学種を例えば磁気反応性標識粒子を測定器の表面に引き出すことによって濃縮することも、当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第４，７３１，３３７号、第４，７７７，１４５号及び第４，１１５，５３５号では、このような粒子は器壁に引き寄せられてから、照射されて、蛍光の発光を刺激する。
米国特許第４，９４５，０４５号では、粒子は磁気電極上に濃縮される。電気化学的反応が電極でおこなわれ、この反応は標識化学メディエーターによって促進される。免疫化学的結合反応は、結合がおこなわれるときに、調節されたシグナルを生じるメディエーターの効率を変化させる。
表面励起、例えば電気化学ルミネセンスの如何なる機構的説明にも縛られる訳ではないが、固相複合体上のラベルが電極において酸化されなければならないと考えられる。これは、電子がラベルから電極に移動することを必要とする。電子がこの“ジャンプ”を、電子が空隙（そのポテンシャルエネルギーが非常に高い領域、例えば溶液）を、ポテンシャルエネルギーバリヤーを飛び“越える”必要なく、通過するトンネリングとして知られる現象によっておこなうと考えられる。電子はエネルギーバリヤーを通り抜けることができるので、１つの分子から他の分子へ又は１つの分子から電極へ、付加的なエネルギー供給なしに、移動することができる。しかし、このトンネリング現象は非常に短い距離に対して作用することができるに過ぎない。２つの種の間の距離が増加するにつれて、トンネリング現象の見込みは指数関数的に減衰する。この距離が２５Å（２．５ｎｍ）未満であるならば、２つの種の間で生ずるトンネリング現象の確率はかなり高いが、この距離がこれより大きいならば、この確率はかなり低い。２５Åの距離は当業者によって用いられる経験によって割り出されるが、絶対的な限定ではない。
したがって、電極表面から２５ÅであるようなＥＣＬラベルのみがＥＣＬプロセスに関与すると期待されることができる。電極表面から２５Åの範囲内である粒子の面積は通常、極度に小さい。
したがって、粒子表面からのＥＣＬが如何なる有意な程度にも測定可能であるとは予想されない。さらに、ＥＣＬプロセスによって発生される光は光電子増倍管に達するために粒子を通過しなければならない。粒子は本質的に不透明性である（それらの濃縮懸濁液は黒色である）ので、ＥＣＬによってかなりの量の光が発生されることができたとしても、その光が粒子を通過して、光電子増倍管によって測定されることができるとは期待することができない。
１９７０年代以降、黒鉛ナノチューブ(graphitic nanotube)とフィブリルは多様な用途のための重要な物質であると特定されている。１ミクロンより小さい黒鉛フィブリルは時には気相成長(vapor grown)炭素繊維と呼ばれる。炭素フィブリルは直径１．０μ未満、好ましくは０．５μ未満、さらにより好ましくは０．２μ未満を有する蠕虫状炭素析出物(vermicular carbon deposit)である。これらは多様な形態で存在し、金属表面における種々な炭素含有ガスの触媒分解によって製造されている。このような蠕虫状炭素析出物は、ほぼ電子顕微鏡検査法の出現以来、観察されている。良好な以前の概観と参考は、ＢａｋｅｒとＨａｒｒｉｓのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ，ＷａｌｋｅｒとＴｈｒｏｗｅｒ編集，１４巻，１９７８，８３頁に見い出され、これは参照することにより本明細書に取り込まれる。
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｎ．のＪ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８巻，３２３３頁（１９９３）も参照のこと、これは参照することにより本明細書に取り込まれる。
１９７６年に、Ｅｎｄｏ等（Ｏｂｅｌｉｎ，Ａ．とＥｎｄｏ，Ｍ．，Ｊ．ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，３２巻（１９７６），３３５〜３４９頁，参照することにより本明細書に取り込まれる）は、このような炭素フィブリルが成長する基本的機構を解明している。これらは炭化水素含有ガスの存在下で炭素中に過飽和状態になる金属触媒粒子から生じるのが観察されている。円筒状の規則的な黒鉛コアが押し出されて、これはＥｎｄｏ等によると、直ちに熱分解析出黒鉛(pyrolytically deposited graphite)の外層によって被覆された状態になる。熱分解によるオーバーコートを有する、これらのフィブリルは典型的に０．１μを超える直径、より典型的には０．２〜０．５μの直径を有する。
１９８３年に、Ｔｅｎｎｅｎｔの米国特許第４，６６３，２３０号は、熱分解炭素によって汚染されない円筒状の規則的な黒鉛コアを成長させることに成功している。したがって、Ｔｅｎｎｅｎｔの発明はさらに小さい直径、典型的に３５〜７００Å（０．００３５〜０．０７０μ）のフィブリルと、“成長した状態で”規則的な黒鉛表面へのアクセスを提供する。より不完全な構造であり、熱分解炭素の外層も有さないフィブリル状炭素も成長されている。
フィブリル、バッキーチューブ(buckytube)及びナノファイバー(nanofiber)は、補強剤として商業的に入手可能な連続炭素繊維とは区別される。大きいアスペクト比が望ましいが、不可避に限定されたアスペクト比を有するフィブリルとは対照的に、連続炭素繊維は少なくとも１０4、しばしば１０6又はそれ以上のアスペクト比（Ｌ／Ｄ）を有する。連続繊維の直径はフィブリルの直径よりもはるかに大きく、常に＞１．０μ、典型的に５〜７μである。
連続炭素繊維は有機先駆体繊維、通常はレーヨン、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）及びピッチの熱分解によって製造される。したがって、連続炭素繊維はそれらの構造内にヘテロ原子を包含する。“製造された状態で（ａｓ  ｍａｄｅ）”連続炭素繊維の黒鉛的性質は変化するが、次の黒鉛化工程を受けることができる。黒鉛面の黒鉛化度、配向及び結晶化度の差と、存在する場合の、ヘテロ原子の可能な存在及び基材直径の絶対差とのために、連続繊維による経験からナノファイバー化学を良好に予測することができない。
Ｔｅｎｎｅｎｔの米国特許第４，６６３，２３０号は、連続した熱炭素(thermal carbon)オーバーコートを有さず、フィブリル軸に実質的に平行である多重黒鉛外層を有する炭素フィブリルを述べている。このようなものとして、これらのフィブリルはそれらのＣ−軸、すなわちそれらの円筒軸に実質的に垂直な、黒鉛の弯曲層の接線に垂直である軸を有するものとして特徴付けられることができる。これらのフィブリルは一般に０．１μ以下の直径と、少なくとも５の長さ対直径比とを有する。これらのフィブリルは連続した熱分解炭素オーバーコート、即ち、それらを製造するために用いられたガス供給材料の熱クラッキングから生ずる熱分解による析出炭素を実質的に有さないことが望ましい。
Ｔｅｎｎｅｎｔ等の米国特許第５，１７１，５６０号（参照することにより本明細書に取り込まれる）は熱オーバーコート(thermal overcoat)を有さず、フィブリル軸に実質的に平行な黒鉛層を有し、前記フィブリル軸上の前記層の突出が少なくともフィブリル直径の２倍の距離にわたって伸びるような炭素フィブリルを述べている。典型的に、このようなフィブリルは、実質的に一定直径を有する、実質的に円筒状のナノチューブであり、円筒状黒鉛シートを含み、この円筒状黒鉛シートのＣ−軸はそれらの円筒軸に実質的に垂直である。これらのフィブリルは熱分解による析出炭素を実質的に含まず、０．１μ未満の直径と、５より大きい長さ対直径比とを有する。これらのフィブリルはこの発明において最も重要である。
炭素フィブリル凝集体の形成に関するさらなる詳細は、Ｓｎｙｄｅｒ等，米国特許出願第１４９，５７３号（１９８８年１月２８日出願）とＰＣＴ出願第ＵＳ８９／００３２２号（１９８９年１月２８日出願）（“炭素フィブリル”）ＷＯ８９／０７１６３と、Ｍｏｙ等，米国特許出願第４１３，８３７号（１９８９年９月２８日出願）とＰＣＴ出願第ＵＳ９０／０５４９８号（１９９０年９月２７日出願）（“フィブリル凝集体とその製造方法”）ＷＯ９１／０５０８９との開示に見い出すことができる、これらの全ては本明細書の発明と同じ譲受人に譲渡され、参照することにより本明細書に取り込まれる。
Ｍｏｙ等のＵＳＳＮ０７／８８７，３０７（１９９２年５月２２日出願）（参照することにより本明細書に取り込まれる）は、種々な巨視的形態（走査電子顕微鏡検査法によって測定）を有する凝集体として製造されたフィブリルを述べている、これらの凝集体においてフィブリルは相互にランダムにからみあって、鳥の巣に類似したフィブリルのからみあったボール（“ＢＮ”）を形成している；又は実質的に同じ相対配向を有する、直鎖状からやや曲がった若しくはよじれたまでの炭素フィブリルの束から成る、例えばコーム状ヤーン(combed yarn)（“ＣＹ”）の外観を有する凝集体として、各フィブリル（個々の曲がり又はよじれに拘らず）の長軸は束の周囲フィブリルの方向と同じ方向に伸びている；又は相互にゆるくからみあった、直線状からやや曲がった若しくはよじれたまでのフィブリルの束から成る凝集体として、“目の粗いネット(open net)”（“ＯＮ”）構造を形成している。目の粗いネット構造では、フィブリルのからみあい度は、コーム状ヤーン凝集体（個々のフィブリルが実質的に同じ相対配向を有する）において観察されるからみあい度よりも大きいが、鳥の巣のからみあい度よりも小さい。ＣＹ凝集体とＯＮ凝集体はＢＮよりも分散されやすく、このことがこれらの凝集体を、構造を通しての均質な性質が望ましい複合体の製造により有用なものにしている。
フィブリル軸上の黒鉛層の突出がフィブリル直径の２倍未満の距離にわたって伸びる場合には、黒鉛ナノファイバーの炭素面は、断面において、ヘリンボン外観を呈する。これらはフィッシュボーン(fishbone)フィブリルと名付けられる。Ｇｅｕｓの米国特許第４，８５５，０９１号（参照することにより本明細書に取り込まれる）は、実質的に熱分解オーバーコートを実質的に有さないフィッシュボーンフィブリルの製造方法を提供する。これらの繊維は本発明の実施にも有用である。
上述した触媒的に成長したフィブリルと同様な形態の炭素ナノチューブが、高温炭素アーク中で成長されている（Ｉｉｊｉｍａ，Ｎａｔｕｒｅ，３５４，５６，１９９１）。これらのアーク成長ナノファイバーはＴｅｎｎｅｎｔの以前に触媒的に成長したフィブリルと同じ形態を有する。アーク成長した炭素ナノファイバーも本発明に有用である。
発明の目的
それ故、有利に高度な発光を得るために、アッセイ実行物質を固定するための大きい表面積を有する粒子を用いるルミネセンスアッセイを提供することが、本発明の目的である。
ルミネセンスを発生するように誘導することができる化合物で標識することができる黒鉛ナノチューブ（フィブリル）を用いる組成物とアッセイを提供することも、本発明の目的である。
このようなアッセイに用いるための官能化フィブリルを提供することが、さらなる目的である。
発明の説明
用語の定義
“ＥＣＬ部分”、“金属含有ＥＣＬ部分”、“ラベル”、“ラベル化合物”及び“ラベル物質”なる用語は、互換可能に用いられる。“ＥＣＬ部分”、“金属ＥＣＬ部分”、“有機金属の”、“金属キレート”、“遷移金属キレート”、“稀土類金属キレート”、“ラベル化合物”、“ラベル物質”及び“ラベル”と呼ばれる種を、例えば分析物若しくはその類似体、及びこのような結合対のさらなる結合対又は、分析物、その類似体若しくは上述したような結合対と結合することができる反応性成分のような分子に結合させることが、本発明の範囲に含まれる。上記種を１種以上の結合対及び／又は１種以上の反応性成分の組合せに結合させることもできる。さらに、結合対、反応性成分、又は１種以上の結合対及び／又は１種以上の反応性成分の組合せに結合した分析物若しくはその類似体に、上記種を結合させることもできる。また、複数種類の上記種を直接又は上述したような他の分子を介して、分析物若しくはその類似体に結合させることも、本発明の範囲内である。簡潔さのために、これらのリガンドをアッセイ実行物質と呼ぶ。
検出及び定量なる用語は“測定”と呼ばれ、定量は基準組成物の調製とキャリブレーションとを必要としうることが理解される。
複合体の収集及び濃縮なる用語は、アッセイ組成物中の複合体の濃縮と、例えば電極表面における複合体の収集とを表すために互換可能に用いられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の微粒子に基づく非分離及び分離分析をおこなうためのセルの概略図である。
図２は、図１のセルによって用いるための電圧制御装置の簡略線図である。
図３は、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識ペプチドフィブリル上の特異的酵素加水分解部位を示す概略図である。
図４は、アビジン−フィブリルを用いるＤＮＡプローブ分析の概略図である。
図５は、Ｎε−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシンの添加による二官能性フィブリルの製造の反応スキームの概略図である。
図６は、ＥＣＬに基づく二官能性バイオセンサーフィブリルを合成するための反応スキームの概略図である。
図７は、ＥＣＬに基づく二官能性バイオセンサーフィブリルの概略図である。
図８は、Ｄ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼによって触媒される反応の概略図である。
図９は、フィブリルに担持されるＥＣＬに基づくバイオセンサーを用いる、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼのＥＣＬ検出を示すグラフである。
図１０は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）に基づくＥＣＬバイオセンサーの概略図である。
図１１は、Ｄｙｎａｌ  Ｍ４５０ビーズに固定された（左）及びアルキルフィブリルに固定された（右）、ＡＤＨに基づくバイオセンサーの概略図である。
図１２は、ビーズ及びフィブリルに固定された酵素バイオセンサーを用いるエタノールのＥＣＬ検出を示すグラフである。
図１３は、カルボキシフィブリルと、２種類の異なる方法によって製造されたＰＥＧ−修飾フィブリルとに結合するＲｕ（ｂｐｙ）32+の分析のグラフ表示である。
発明の簡単な説明
本発明は、その最も広い実施態様において、ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物に結合した成分が付着したナノチューブにある。特に、前記ナノチューブは黒鉛ナノチューブであり、前記ルミネセンスは電気化学ルミネセンスである。１実施態様において、前記成分は酵素バイオセンサーである。
本発明はまた、サンプル中に存在する問題の分析物を検出するための組成物であって、
（ｉ）官能基を有する黒鉛ナノチューブと、
（ii）前記官能基に結合したアッセイ実行物質であって、該分析物に直接的又は間接的に結合することができる上記アッセイ実行物質と
を含む上記組成物にある。
１実施態様では、前記官能基に結合するアッセイ実行物質は、次に分析物に結合する。組成物はさらに、分析物に結合する第２アッセイ実行物質であって、ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物に結合する前記第２アッセイ実行物質を含む。
アッセイ実行物質は、
（ｉ）添加された問題の分析物又は添加された前記分析物の類似体；
（ii）前記分析物の結合対又は前記類似体の結合対；及び
（iii）（ｉ）又は（ii）と結合することができる反応性成分
から成る群から選択される少なくとも１種類の物質を含有する。
前記物質（ｉ）、（ii）又は（iii）のうちの１つは、ルミネセンスを発生するように誘導されることができる化学部分を有するラベル化合物に結合する。
おおざっぱにいうと、粒子は官能化フィブリル、即ち、その表面が１種類以上の物質と反応又は接触して、その表面上に異なる化学種を化学的置換又は物理的吸着するための活性部位を生じているフィブリルである。
ＭｃＣａｒｔｈｙ等の米国特許出願第３５１，９６７号（１９８９年５月１５日出願）（参照することにより本明細書に取り込まれる）は、フィブリルの表面を酸化するために充分な反応条件（例えば、時間、温度及び圧力）下で、硫酸（Ｈ2ＳＯ4）及び塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ3）を包含する酸化剤と、フィブリルを接触させることを含む、炭素フィブリルの表面の酸化方法を述べている。ＭｃＣａｒｔｈｙ等の方法によって酸化されたフィブリルは不均一に酸化されている、即ち、炭素原子がカルボキシル基、アルデヒド基、ケトン基、フェノール基、及び他のカルボニル基によって置換されている。
フィブリルは硝酸による処理によっても不均一に酸化されている。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０１６８は、官能基の混合物を含有する、酸化されたフィブリルの形成を開示している。Ｈｏｏｇｅｎｖａａｄ，Ｍ．Ｓ．等（“新規な炭素担体に担持された金属触媒”、１９９４年９月、Ｂｅｌｇｉｕｍ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓでの不均質触媒の製造の化学的基礎に関する第６回国際会議で発表）も、フィブリル担持貴金属の製造において、フィブリル表面を硝酸によって最初に酸化することが有利であると発見している。酸によるこのような前処理は炭素担持貴金属触媒の製造における標準的工程であり、この場合に、このような炭素の通常の供給源を想定すると、この前処理は表面を官能化するためと同程度に、表面から望ましくない物質を除去するためにも役立つ。
発表された研究において、ＭｃＣａｒｔｈｙとＢｅｎｉｎｇ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ＡＣＳ  Ｄｉｖ．ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍ．３０（１）４２０（１９９０））は、表面が多様な酸化された基を含むことを実証するために、酸化されたフィブリルの誘導体を製造した。かれらが製造した化合物、フェニルヒドラゾン、ハロ芳香族エステル、タリウム（Ｉ）塩等は、それらの分析的有用性、例えば、光輝を放って着色される、又は他の何らかの強くかつ容易に同定され、識別されるシグナルを有するために選択された。
粒子は好ましくは、おおざっぱに、式：
［ＣnＨL］−Ｒm
を有する官能化フィブリルであり、
上記式中、ｎは整数であり、Ｌは０．１ｎ未満の数であり、ｍは０．５ｎ未満の数であり、
各Ｒは同じであり、ＳＯ3Ｈ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＮ、ＣＯＣｌ，ハライド、ＣＯＳＨ、ＳＨ、ＣＯＯＲ’、ＳＲ’、ＳｉＲ’3、Ｓｉ−（ＯＲ’）y−Ｒ’3-y、Ｓｉ−（ＯＳｉＲ’2）−ＯＲ’、Ｒ”、Ｌｉ、ＡｌＲ’2、Ｈｇ−Ｘ、ＴｉＺ2及びＭｇ−Ｘから選択され、
ｙは３に等しいか又は３未満の整数であり、
Ｒ’はアルキル、アリール、シクロアルキル又はアラルキルであり、
Ｒ”はフルオロアルキル、フルオロアリール、フルオロシクロアルキル、フルオロアラルキル又はシクロアリールであり、
Ｘはハライドであり、
Ｚはカルボキシレート又はトリフルオロアセテートである。
炭素原子、Ｃnは実質的に一定直径の、実質的に円筒状の、黒鉛ナノチューブの表面炭素である。これらのナノチューブは、５より大きい長さ対直径比と、０．５μ未満、好ましくは０．１μ未満の直径とを有するナノチューブを包含する。これらのナノチューブは、熱分解による析出炭素を実質的に含まない、実質的に円筒状の黒鉛ナノチューブ、より好ましくは、フィブリル直径の少なくとも２倍の距離にわたって伸びるフィブリル軸上の黒鉛層の突出を有することを特徴とするナノチューブ及び／又はそれらのＣ−軸がそれらの円筒軸に対して実質的に垂直である円筒状黒鉛シートを有するナノチューブであることもできる。これらの組成物は、各Ｒが同一であることで、均一である。
粒子は不均一に置換されたナノチューブをも包含する。これらは式：
［ＣnＨL］−Ｒm
［式中、ｎ、Ｌ、ｍ、Ｒ及びナノチューブ自体は上記で定義した通りである、但し、各Ｒは酸素を含有しない、又は各Ｒが酸素含有基である場合に、ＣＯＯＨは存在しない］
で表される組成物を包含する。
式：［ＣnＨL］−Ｒm
［式中、ｎ、Ｌ、ｍ、Ｒ及びＲ’は上記と同じ意味を有し、炭素原子は、５より大きい長さ対直径比を有するフィッシュボーンフィブリルの表面炭素原子である］で表される組成物も、本発明の範囲内の粒子として包含される。これらは均一に又は不均一に置換されることができる。好ましくは、ナノチューブは熱分解オーバーコートを含有せず、０．５μ未満の直径を有する。
式：［ＣnＨL］−Ｒm
［式中、ｎ、Ｌ、ｍ、Ｒ’及びＲは上記と同じ意味を有する］
で示される官能化ナノチューブも、本発明の粒子として含まれる。炭素原子、Ｃnは実質的に一定直径の、実質的に円筒状の、黒鉛ナノチューブの表面炭素である。これらのナノチューブは、５より大きい長さ対直径比と、０．５μ未満、好ましくは０．１μ未満の直径とを有する。これらのナノチューブは、熱分解による析出炭素を実質的に含まないナノチューブでありうる。より好ましくは、ナノチューブは、フィブリル軸上の黒鉛層の突出がフィブリル直径の少なくとも２倍の距離にわたって伸びるようなナノチューブ及び／又はそれらのＣ−軸がそれらの円筒軸に対して実質的に垂直である円筒状黒鉛シートを有するナノチューブである。
均一に置換されたナノチューブと不均一に置換されたナノチューブの両方において、表面原子Ｃnは反応する。黒鉛フィブリルの表面層における大抵の炭素原子は、黒鉛におけると同様に、底面炭素である。底面炭素は化学的アタックに対して比較的不活性である。例えば、黒鉛面がフィブリルの周囲に完全に及ぶことができない欠陥部位には、黒鉛面のエッジ炭素原子に類似した炭素原子が存在する（エッジ及び底面炭素の考察に関しては、Ｕｒｒｙ，Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）。
欠陥部位では、ナノチューブの下方の内部層のエッジ又は底面炭素が露出されることができる。表面炭素なる用語は、ナノチューブの最外部層の全ての炭素、底面及びエッジ炭素と、最外部層の欠陥部位において露出されうる下層の炭素、底面及び／又はエッジの両方の炭素を包含する。エッジ炭素は反応性であり、炭素の原子価を満たすために幾らかのヘテロ原子又は基を含有しなければならない。
上記置換ナノチューブは有利にはさらに官能化されることができる。このような組成物は式：
［ＣnＨL］−Ａm
で示される組成物を包含する、
式中、炭素はナノチューブの表面炭素であり、ｎ、Ｌ及びｍは上記で定義した通りであり、
Ａは下記：
0003791930.tif 000002
から選択され、
Ｙはタンパク質、ペプチド、酵素、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、抗原、若しくは酵素基質、酵素阻害剤或いは酵素基質の遷移状態類似体の適当な官能基であるか、又はＲ’−ＯＨ、Ｒ’−ＮＨ2、Ｒ’ＳＨ、Ｒ’ＣＨＯ、Ｒ’ＣＮ、Ｒ’Ｘ、Ｒ’ＳｉＲ’3、Ｒ’Ｓｉ−（ＯＲ’）y−Ｒ’3-y、Ｒ’Ｓｉ−（ＯＳｉＲ’2）−ＯＲ’、Ｒ’−Ｒ”、Ｒ’−Ｎ−ＣＯ、（Ｃ2Ｈ4Ｏ）w−Ｈ、−（Ｃ3Ｈ6Ｏ）w−Ｈ、（Ｃ2Ｈ4Ｏ）w−Ｒ’、−（Ｃ3Ｈ6Ｏ）w−Ｒ’及びＲ’から選択される、及び
ｗは１より大きく、２００より小さい整数である。
炭素原子、Ｃnは実質的に一定直径の、実質的に円筒状の、黒鉛ナノチューブの表面炭素である。これらのナノチューブは、５より大きい長さ対直径比と、０．１μ未満、好ましくは０．０５μ未満の直径とを有するナノチューブを包含する。これらのナノチューブは、熱分解析出炭素を実質的に含まない、実質的に円筒状の黒鉛ナノチューブでありうる。より好ましくは、これらのナノチューブは、フィブリル直径の少なくとも２倍の距離にわたって伸びる、フィブリル軸上の黒鉛層の突出を有することを特徴とする及び／又はこれらのナノチューブは、それらのＣ−軸がそれらの円筒軸に対して実質的に垂直である円筒状黒鉛シートから構成される。好ましくは、これらのナノチューブは熱オーバーコートを有さず、０．５μ未満の直径を有する。
構造：
［ＣnＨL］−［Ｒ’−Ｒ］m
を有する官能性ナノチューブは、式：
［ＣnＨL］−［Ｒ’−Ａ］m
［式中、ｎ、Ｌ、ｍ、Ｒ’及びＡは上記で定義した通りである］
で示される組成物を製造するように官能化されることもできる。炭素原子、Ｃnは実質的に一定直径の、実質的に円筒状の、黒鉛ナノチューブの表面炭素である。これらのナノチューブは、５より大きい長さ対直径比と、０．５μ未満、好ましくは０．１μ未満の直径とを有するナノチューブを包含する。これらのナノチューブは、熱分解析出炭素を実質的に含まない、実質的に円筒状の黒鉛ナノチューブでもありうる。より好ましくは、これらのナノチューブは、フィブリル直径の少なくとも２倍の距離にわたって伸びる、フィブリル軸上の黒鉛層の突出を有すること及び／又は、それらのＣ−軸がそれらの円筒軸に対して実質的に垂直である円筒状黒鉛シートを有することを特徴とする。好ましくは、これらのナノチューブは熱オーバーコートを有さず、０．５μ未満の直径を有する。
本発明の粒子は、その上部にある一定の環状化合物が吸着されるナノチューブも包含する。これらは式：
［ＣnＨL］−［Ｘ−Ｒa］m
で示される物質の組成物を含有する、
式中、ｎは整数であり、Ｌは０．１ｎ未満の数であり、ｍは０．５ｎ未満であり、ａは０又は１０未満の数であり、Ｘは多核芳香族部分、多複素核(polyheteronuclear)芳香族部分又は金属多複素核(metallopolyheteronuclear)芳香族部分であり、Ｒは上記で定義した通りである。炭素原子、Ｃnは実質的に一定直径の、実質的に円筒状の、黒鉛ナノチューブの表面炭素である。これらのナノチューブは、５より大きい長さ対直径比と、０．５μ未満、好ましくは０．１μ未満の直径とを有するナノチューブを包含する。これらのナノチューブは、熱分解析出炭素を実質的に含まない、実質的に円筒状の黒鉛ナノチューブ、より好ましくは、フィブリル直径の少なくとも２倍の距離にわたって伸びる、フィブリル軸上の黒鉛層の突出を有することを特徴とするナノチューブ及び／又は、それらのＣ−軸がそれらの円筒軸に対して実質的に垂直である円筒状黒鉛シートを有するナノチューブであることができる。好ましくは、これらのナノチューブは熱オーバーコートを有さず、０．５μ未満の直径を有する。
好ましい環状化合物は、ＣｏｔｔｏｎとＷｉｌｋｉｎｓｏｎのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの７６頁に述べられている平面的な大環状化合物である。吸着のためにより好ましい環状化合物はポルフィリンとフタロシアニンである。
吸着された環状化合物は官能化されることができる。このような組成物は式：
［ＣnＨL］−［Ｘ−Ａa］m
［式中、ｍ、ｎ、Ｌ、ａ、Ｘ及びＡは上記で定義した通りであり、炭素は上記で定義したような、実質的に円筒状の黒鉛ナノチューブの表面炭素である］
で示される成分を包含する。
上述したように官能化された炭素フィブリルをマトリックスに組み入れることができる。好ましくは、マトリックスは有機ポリマー（例えば、エポキシ、ビスマレイミド、ポリアミド若しくはポリエステル樹脂のような熱硬化性樹脂；反応射出成形樹脂；熱可塑性樹脂；又は例えば天然ゴム、スチレン−ブタジエンゴム又はシス−１，４−ポリブタジエンのようなエラストマー）；無機ポリマー（例えば、ガラスのようなポリマー無機酸化物）；金属（例えば、鉛若しくは銅）；又はセラミック物質（例えば、ポルトランドセメント）である。
特定の理論に縛られる訳ではないが、官能化フィブリルは、修飾された表面特性がポリマーとより大きく相容性であるため、又は修飾された官能基（特に、ヒドロキシル基若しくはアミン基）がポリマーに末端基として直接結合するために、ポリマー系中に良好に分散される。このようにして、例えばポリカーボネート、ポリウレタン、ポリエステル又はポリアミド／イミドのようなポリマー系はフィブリルに直接結合し、改良された付着性で、フィブリルを分散されやすくする。
炭素フィブリルを強い酸化剤と、前記フィブリルの表面を酸化させるために充分な時間接触させることによって、さらに、酸化された表面に官能基を加えるために適した反応物と前記フィブリルを接触させることによって、官能基が炭素フィブリルの表面に導入される。好ましくは、酸化剤は強酸中のアルカリ金属塩素酸塩の溶液から構成される。他の実施態様では、アルカリ金属塩素酸塩は塩素酸ナトリウム又は塩素酸カリウムである。好ましい実施態様では、用いる強酸は硫酸である。酸化のために充分な時間は約０．５時間から約２４時間までである。
炭素フィブリルの表面を酸化させるために充分な時間、炭素フィブリルを酸化剤と接触させ、表面酸化された炭素フィブリルを、炭素フィブリルの表面に官能基を加えるために適した反応物と接触させ、表面官能化フィブリルを、炭素フィブリルの網状構造を製造するために有効な架橋剤とさらに接触させることによって、炭素フィブリルの網状構造が製造される。好ましい架橋剤はポリオール、ポリアミン又はポリカルボン酸である。
官能化フィブリルは、フィブリルの硬質網状構造の形状でもありうる。酸−官能化フィブリルの良好に分散した、例えば、酸基（フィブリル間）をポリオール又はポリアミンによって架橋させて、硬質網状構造を形成することによって、三次元網状構造を安定化することができる。
フィブリル粒子は、本発明の官能化フィブリルを結合させることによって形成された三次元網状構造をも包含する。これらの複合体は、直接結合又は化学部分を含む１種類以上のリンカーによって結合した少なくとも２本の官能化フィブリルを包含する。これらの網状構造は、非常に均一な、等しい孔度の多孔質媒質を含む。
これらのフィブリル間の空隙は孔度と形状の両方において不規則であるが、これらの空隙は孔と見なされることができ、多孔質媒質を特徴付けるために用いる方法によって特徴付けることができる。このような網状構造における空隙のサイズは、フィブリルの分散系の濃度とレベル及び架橋剤の濃度と鎖長さによって制御することができる。
粒子を含む複合体は例えば電極表面に収集されて、そこで電極への電圧印加によって、励起され、ルミネセンスを発生するように誘導される。複合体を測定帯に、即ち、複合体にルミネセンスを発生させることができる表面に収集することによって、本発明を好ましく実施することができるが、本発明は複合体を測定帯に回収して、その後にその帯にルミネセンスを誘導し、測定するための手段をもたらすか又は他の工程を行う方法をも含む。
複合体の回収は、重力沈降、濾過、延伸分離、又は複合体の一部を形成する磁気反応性粒子の磁気吸引(magnetic attraction)を含めた、幾つかの異なる方法によっておこなうことができる。幾つかの実施態様を以下でさらに詳しく説明する。
本発明はまた、サンプル中に存在する問題の分析物に関して結合アッセイを実施する方法であって、下記工程：
（ａ）（ｉ）前記サンプルと、
（ii）ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物に結合した成分を含有するアッセイ実行物質と、
（iii）アッセイ実行物質に結合した複数個の官能化黒鉛ナノチューブと
を含有する組成物を形成する工程と；
（ｂ）前記組成物をインキュベートして、前記官能化黒鉛ナノチューブと前記ラベル化合物とを包含する複合体を形成する工程と；
（ｃ）前記複合体を測定帯に収集する工程と；
（ｄ）表面選択的励起によって、前記複合体中のラベル化合物をルミネセンスを発生するように誘導する工程と；
（ｅ）発生されたルミネセンスを測定して、サンプル中の問題の分析物の存在を測定する工程と
を含む上記方法にある。
特に、前記複合体は、ルミネセンスを誘導し、前記ルミネセンスを測定するための手段の表面に収集される。
この方法は有利には、前記複合体が電極表面に収集される、電気化学ルミネセンスの測定に基づく。
本発明はまた、電極表面での電気化学ルミネセンスの測定に基づいて、サンプル中に存在する問題の分析物に関する結合アッセイを実施する方法であって、下記工程：
（ａ）（ｉ）前記サンプルと、
（ii）電気化学ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物に結合した成分を含有するアッセイ実行物質と、
（iii）アッセイ実行物質に結合した複数個の官能化黒鉛ナノチューブと
を含有する組成物を形成する工程と；
（ｂ）前記組成物をインキュベートして、前記官能化黒鉛ナノチューブと前記ラベル化合物とを包含する複合体を形成する工程と；
（ｃ）前記複合体を収集する工程と；
（ｄ）前記収集された複合体を電極表面と接触させ、前記電極に電圧を印加することによって、前記複合体中のラベル化合物をルミネセンスを発生するように誘導する工程と；
（ｅ）電極表面において発生されたルミネセンスを測定して、サンプル中の問題の分析物の存在を測定する工程と
を含む上記方法にある。
本発明はさらに、電極表面での電気化学ルミネセンスの測定に基づいて、サンプル中に存在する問題の分析物に関する結合アッセイを実施する方法であって、下記工程：
（ａ）（ｉ）前記サンプルと、
（ii）電気化学ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物に結合した成分を含有するアッセイ実行物質と、
（iii）アッセイ実行物質に結合した複数個の磁気反応性の懸濁(suspended)官能化黒鉛ナノチューブと
を含有する組成物を形成する工程と；
（ｂ）前記組成物をインキュベートして、黒鉛ナノチューブと前記ラベル化合物とを包含する複合体を形成する工程と；
（ｃ）前記黒鉛ナノチューブ上に磁界を印加することによって、前記複合体を収集する工程と；
（ｄ）前記収集された複合体を電極表面と接触させ、前記電極に電圧を印加することによって、前記複合体中のラベル化合物をルミネセンスを発生するように誘導する工程と；
（ｅ）電極表面において発生されたルミネセンスを測定して、サンプル中の問題の分析物の存在を測定する工程と
を含む上記方法にある。
前記磁界の印加が前記電極の表面に前記複合体を収集させる。
さらに、本発明は、官能化黒鉛ナノチューブと、下記成分：
（ａ）電解質；
（ｂ）ＥＣＬ部分を含有するラベル化合物；
（ｃ）問題の分析物又は問題の分析物の類似体；
（ｄ）問題の分析物の結合対又はその類似体の結合対；
（ｅ）（ｃ）又は（ｄ）と反応することができる反応性成分；
（ｆ）還元体；及び
（ｇ）電気化学ルミネセンス発生反応強化剤
から成る群から選択される少なくとも１種類の他の成分とを含む、微粒子に基づく結合アッセイに試薬として用いるための、物質の組成物であって、任意の試薬組成物中に含有される２種類の成分が、予定のアッセイにおけるそれらの機能を損なわないように、貯蔵中に相互と反応性でないという条件の組成物にある。
本発明はまた、結合反応と電気化学ルミネセンス現象とに基づくアッセイのためのアッセイ試薬であって、下記成分：
（ａ）電解質；
（ｂ）アッセイ実行物質に結合した表面を有する、複数個の磁気反応化官能性黒鉛ナノチューブ；及び
（ｃ）結合特性を有するラベル物質
を含み、前記ラベル物質が電気化学ルミネセンス特性を有する化学的部分を包含する上記分析試薬にある。
本発明はさらに、サンプル中に存在する問題の分析物に関してアッセイを実施する方法であって、下記工程：
（ａ）（ｉ）前記サンプルと、
（ii）電気化学ルミネセンスを発生するように誘導されることができるラベル化合物に結合したアッセイ成分に結合した官能化黒鉛ナノチューブであって、前記成分が問題の分析物の基質である前記ナノチューブと
を含有する組成物を形成する工程と；
（ｂ）前記分析物に前記成分を切断させる条件下で、前記組成物をインキュベートする工程と；
（ｃ）前記官能化黒鉛ナノチューブを前記組成物から分離する工程と；
（ｄ）前記ラベル化合物をルミネセンスを発生するように誘導する工程と；
（ｅ）発生されたルミネセンスを測定して、サンプル中の問題の分析物の存在を測定する工程と
を含む上記方法にある。
バッチ式アッセイをおこなうことができるが、連続又は半連続分析をフローセルでおこなうことができる。フローセルでは、固相は測定セル中に留まるが、溶液は流動して、セルを出る。固相（例えば、粒子）が水よりも高密度である、即ち、水の密度よりも大きい密度（１．０ｇ／ｍｌより大きい）を有する場合には、粒子上の重力が粒子をセルの底部に落下させる。流体がセルを通って流れるにつれて、粒子が底部に沈降するように、セルを構成することができる、又はサンプルの大部分がＥＣＬ系の作用電極上の円柱状区画内でセル中に含まれるようにセルを構成することができる。ＥＣＬを誘導する前に、電極の表面上に粒子を沈降させるために、セル中の充分な滞留時間を与えなければならない。
本発明の他の実施態様では、粒子を測定帯に取り出して、そこで次に粒子を例えば電極と接触させて、電気化学ルミネセンスを誘導させるために、又は粒子を遠心分離工程において直接電極と接触させるために、アッセイ組成物の残部よりも大きい密度を有する懸濁フィブリルを含むアッセイ組成物に遠心分離を受けさせることができる。
この実施態様では、測定セルにはサンプルを迅速に回転させる手段とサンプル密閉容器(enclosure)とを備える。遠心力はサンプル中のフィブリルをサンプル密閉容器の回転軸から外方に移動させ、サンプル密閉容器の外面に収集させる。
このようなサンプル密閉容器の外面はＥＣＬ測定系の作用電極を構成することができる。
第３実施態様では、フィブリルを濾過によってアッセイ組成物から取り出すことができる。この実施態様では、粒子はアッセイ組成物の残部よりも大きい密度を有する必要はない。フィブリルを溶液から分離して、溶液をフィルターに通すことによって、例えばポンピングして、フィルターの表面に粒子を収集することによって濃縮する。フィルターのこの表面を例えば、ＥＣＬ検出系において作用電極として役立つことができる薄い金属フィルムで被覆する。
他の実施態様では、懸濁フィブリルは磁気反応性であり、例えば、これらは常磁性又は強磁性であり、粒子上の電界の印加によって、測定帯において、好ましくは電極表面に直接収集される。測定セルは磁石を備える。磁石の磁界は、粒子がバッチ式セルに存在するときに又は粒子がフローセルを通って流れるときに粒子に力を及ぼし、粒子を溶液の本体から磁石に最も接近したセルの表面上に分離させる。磁石を適当な配向で、ＥＣＬ検出系の作用電極に密接に接近させて配置するならば、粒子は作用電極の表面に濃縮される。
結合アッセイのための数種類の異なる不均質及び均質なフォーマットを上記方法を用いて実施して、複合体を電極表面に複合体を収集し、濃縮することができる。不均質な結合アッセイでは、複合体を組成物から分離してから、ラベルからのルミネセンスを測定する。均質なアッセイでは、（固相に）結合した標識試薬と結合しない標識試薬との分離をおこなわない。
均質なアッセイでは、複合体が作用電極の表面上で濃縮されるときに、ラベルからの測定シグナルは収集工程が存在しない場合よりも非常に大きい。これに反して、非複合体化標識試薬からのシグナルは変化しない。このため、測定セルに非複合体化標識試薬が存在するにも拘わらず、収集された複合体からのシグナルは、複合体を収集しないアッセイにおけるよりも強い。結合アッセイの検出限界は収集操作の結果として非常に改良される。
本発明の好ましい実施態様では、均質な結合アッセイ操作にその場での(in-situ)分離工程が含まれる。アッセイ組成物、即ち、サンプル、アッセイ実行物質及び粒子を測定セルに注入して、複合体が作用電極上に捕捉された後に、ラベル又は標識試薬を含まない第２流体をセルに通して注入することによって、アッセイ組成物の非結合成分からの複合体のin-situ洗浄又は分離をおこなう。このアッセイ方法は技術的に不均質結合アッセイである。しかし、測定セル内で分離を実施できることは、付加的な分離装置を必要としない点で有利であり、この方法は一般に外部分離方法よりも非常に迅速である。
本発明を用いて、アッセイ組成物の成分を混合し、予め定められた長さの時間にわたってそれらを反応させることによって、不均質な結合アッセイを実施する。次に、アッセイ組成物に分離工程を受けさせ、溶液を粒子から分離する。次に、電気化学ルミネセンスを複合体から又は溶液から測定する。濃縮工程後の複合体からのＥＣＬの測定は、濃縮なしで可能であるよりも良好な精度かつより低い検出限界での分析物の測定を可能にする。
典型的な実施例
本発明の１つの代表的な実施態様では、官能化フィブリルをアビジン（アッセイ実行物質）とさらに反応させて、それをＥＣＬ分析に用いるために用意する。このように修飾したフィブリルを次にビオチニル化オリゴヌクレオチド（アッセイ実行物質）と反応させて、ＤＮＡプローブアッセイに用いるためのフィブリル−アビジン−ビオチン−オリゴヌクレオチド複合体を形成する。この複合体は問題のオリゴヌクレオチド分析物のプローブとして使用可能であり、この分析物は、ＥＣＬ部分によって標識された前記問題の分析物に対して相補的である第２オリゴヌクレオチドの存在下でのサンドイッチアッセイにおいて前記プローブに相補的である。
発明の詳細な説明
本発明並びにそれの他の目的と特徴は、ある一定の好ましい実施態様の下記説明からより明白にかつ完全に理解されるであろう。
本発明は、結合反応に関与することができる問題の分析物に広範囲に適用可能である。これらの反応は例えば抗原−抗体、リガンド受容体、ＤＮＡとＲＮＡの相互作用、及び他の公知反応を包含する。本発明は、多成分サンプル中のこのような問題の分析物の存在を定性的かつ定量的に検出するための種々な方法とアッセイに関する。
サンプル
問題の分析物を含有することができ、固体、エマルジョン、懸濁液、液体、又はゲル形状であることができるサンプルは、例えば、細胞、細胞由来産物、水、食物、血液、血清、ヘア、汗、尿、糞便、組織、唾液、油、有機溶媒又は空気から得られることができる。サンプルはさらに、例えば、水、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチル−ピロリドン又はアルコール又はこれらの混合物を含むことができる。
分析物
典型的な問題の分析物は、サンプル中に存在する、全細胞若しくは表面抗原、細胞内(subcellular)粒子、ウイルス、プリオン、ウイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、タンパク質、リポタンパク質、多糖、リポ多糖、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬理学的作用剤、合成有機分子、有機金属分子、トランキライザー、バルビツレート、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、組換えタンパク質若しくは誘導タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又は無機分子である。典型的に、問題の分析物は１０-3モル又はそれ以下の濃度、例えば、１０-12モル又はそれ以下程度の低い濃度で存在する。
アッセイ実行物質
問題の分析物を含有するサンプルと結合するアッセイ実行物質は、（ｉ）上記で定義したような、添加された問題の分析物又はその類似体、（ii）問題の分析物又はその前記類似体の結合対、及び（iii）（ｉ）又は（ii）と結合することができる、上記で定義したような反応性成分から成る群から選択された、少なくとも１種類の物質を含し、前記物質の１種類は化合物又は部分、例えば、ルミネセンスを発生するように誘導されることができるＥＣＬ部分に結合する。標識物質は、全細胞若しくは表面抗原、細胞内粒子、ウイルス、プリオン、ウイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂質、脂肪酸、核酸、多糖、タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、薬理学的作用剤、合成有機分子、トランキライザー、バルビツレート、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的ポリマー（好ましくは、溶解性）、レクチン、組換えタンパク質若しくは誘導タンパク質、合成有機分子、有機金属分子、無機分子、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジンであることができる。１実施態様では、試薬は抗体、抗原、核酸、ハプテン、小ヌクレオチド配列、オリゴマー、リガンド、酵素、又はビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、又はこれらの複合体、又はタンパク質相互作用を通して第１結合対に結合することができる他の第２結合対である。
天然物又は合成物のいずれでもよい、問題の分析物の類似体は、典型的に、分析物に匹敵する結合特性を有する化合物であるが、これより高い若しくは低い結合能力を有する化合物であることもできる。分析物若しくはその類似体と及び／又はそれらの結合対と結合することができ、それらを介してＥＣＬ部分が分析物に結合することができる反応性成分は、適当には、第２抗体、又は例えばプロテインＡ若しくはプロテインＧのようなタンパク質、又はアビジン若しくはビオチン若しくは結合反応に関与することが当該技術分野で知られた他の成分である。
ラベル
有利には、ＥＣＬ部分は金属キレートである。このキレートの金属は適当には、金属キレートが問題の反応系に課せられる電気化学的条件下でルミネセンスを発生するような、任意の金属である。このような金属キレートの金属は、例えば、遷移金属（例えば、α−ブロック遷移金属）又は稀土類金属である。金属は好ましくはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロム又はタングステンである。ルテニウムとオスミウムが特に好ましい。
このようなキレートにおいて金属と結合するリガンドは、通常、性質において複素環状又は有機であり、金属キレートが水性環境又は有機環境又は他の非水性環境に可溶性であるか否かの決定に役割を果たしている。リガンドは多座(polydentate)リガンドであることができ、置換されることができる。多座リガンドは芳香族リガンドと脂肪族リガントを包含する。適当な芳香族多座リガンドは、芳香族複素環状リガンドを包含する。好ましい芳香族複素環状リガンドは、例えば、ビピリジル、ビピラジル、ターピリジル、及びフェナントロリルのような、窒素含有リガンドである。適当な置換基は、例えば、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジウム、ウレイド、硫黄含有基、リン含有基、及びＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドのカルボキシレートエステルを包含する。キレートは１つ以上の単座リガンドを有することができ、多様な多座リガンドが当該技術分野に公知である。適当な単座リガンドは、例えば、一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド並びに脂肪族、芳香族及び複素環状ホスフィン、アミン、スチルベン及びアルシンを包含する。
適当なキレートの例は、ビス［（４，４’−カルボメトキシ）−２，２’−ビピリジン］  ２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）プロピル］−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’−ビピリジン）  ［４−（ブタン−１−アール）−４’−メチル−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’−ビピリジン）  ［４−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）−酪酸］ルテニウム（ＩＩ）；トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）；（２，２’−ビピリジン）［ビス−ビス（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン］２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）プロピル］−１，３−ジオキソランオスミウム（ＩＩ）；ビス（２，２’−ビピリジン）［４−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン）−ブチルアミン］ルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’−ビピリジン）［１−ブロモ−４（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）ブタン］ルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸，４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−ブチルアミドルテニウム（ＩＩ）である。他のＥＣＬ部分は共通に譲渡されたＰＣＴ公開出願ＵＳ８７／００９８７とＰＣＴ公開出願８８／０３９４とに述べられている。
ＥＣＬ部分の機能は、反応系に電気化学的エネルギーを導入する結果として電磁線を発生することである。これをするために、これらのＥＣＬ部分は励起エネルギー状態にまで刺激されることができ、その励起状態からの下降時に、例えば光のフォトンのような電磁線を発生することもできなければならない。電気化学ルミネセンス発生反応にＥＣＬ部分が関与する機構の理論的分析によって縛られることを望む訳ではないが、ＥＣＬ部分は反応系への電気化学的エネルギーの導入によって酸化され、次に、系中に存在する還元体との相互作用によって、励起状態に転化されると考えられる。この状態は比較的不安定であり、金属キレートは迅速に、より安定な状態に下降する。このようにするときに、キレートは例えば、検出可能である、光のフォトンのような電磁線を放出する。
本発明によって組み入れられる、金属キレート又は金属含有ＥＣＬ部分の量は、系毎に変化する。一般に、このような部分の使用量は、系の上記組成物から電磁エネルギーの検出可能な発生、必要な場合には、定量可能な発生を生じるために有効である量である。問題の分析物の検出及び／又は定量は、典型的に、問題の分析物とＥＣＬ部分とを含有するサンプルからのルミネセンスを、既知量の問題の分析物とＥＣＬ部分とによって作成されたキャリブレーション基準によって発生されるルミネセンスと比較することによっておこなわれる。これは均質なフォーマットを前提とする。不均質モードでは、既述したような分離をＥＣＬ分析の前におこなう。
当業者によって理解されうるように、金属含有ＥＣＬ部分は優勢な条件に依存して系毎に変化する。適当な金属含有ＥＣＬ部分と、望ましい結果を得るために充分なその量は、本明細書の教示をひと度与えられるならば、必要以上の実験なしに、当業者によって経験的に決定されることができる。
黒鉛ナノチューブ
ナノチューブは、分散状態、凝集体、マット又はフィルムとしてを含めた、種種な形状で分析用途に固体担体として、ビーズを含めたより大きい担体に取り付けて用いられるか、又は他の物質と混合して、複合体として例えば多孔質カラムに入れて用いられることができる。ナノチューブは主として、化学的に修飾可能な黒鉛炭素から成る。これらは一般に０．１μｍ以下の直径と少なくとも５の長さ対直径比とを有する。典型的に、これらのナノチューブは０．０１μｍの直径と１〜１０μｍの長さとを有する。
官能化ナノチューブ
有利には、フィブリルは官能化フィブリル、即ち、その表面がそれと結合した官能性化学部分を有するように均一に又は不均一に修飾されているフィブリルである。フィブリル表面は酸化性媒質又は他の化学媒質との反応によって官能化されることができる。フィブリル表面は化学反応によって、又はそれら自体が化学反応性を有する種を物理的に吸着することによって均一に修飾されることができる。フィブリル表面は例えば酸化によって修飾されることができ、他の官能基との反応によってさらに修飾されることができる。フィブリルが電気化学ルミネセンスアッセイにおける結合成分を含めた、多様な基質中の化学基に化学的に反応するか又は物理的に結合することができるように、フィブリル表面を多様な官能基によって修飾することができる。フィブリル上の官能基をある範囲のリンカー化学によって相互に結合させることによって、フィブリルの複雑な構造を得ることができる。
フィブリル表面を化学的に修飾する方法と、フィブリル表面に種を物理的に吸着させる方法は、各場合に、フィブリル表面と結合した官能性部分を生ずるように述べられている。
アッセイ実行物質に結合した官能化ナノチューブ
官能化フィブリルを種々なバイオ分子と反応させて、それらをＥＣＬ分析に用いるために用意することができる。種々なアッセイ実行物質、例えば抗体、受容体又は他の結合性部分は官能化フィブリルと反応して、それらをＥＣＬ分析に用いるために用意することができる。
粒子
黒鉛ナノチューブは、例えば粒子のような、より大きい固相に共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。
粒子は有利には、０．０５μｍ〜２００μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１００μｍ、最も好ましくは０．５μｍ〜１０μｍの直径を有する超微粒状物質と、分析物及び／又は、上記サブパラグラフ（ｂ）（ｉ），ｂ（ii）又はｂ（iii）で定義した１種類以上の他の物質に結合することができる表面成分とを含む。例えば、超微粒状物質は架橋した澱粉、デキストラン、セルロース、タンパク質、有機ポリマー、スチレンポリマー、例えばスチレン／ブタジエンコポリマー、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレンコポリマー、ビニルアセチルアクリレート、又は塩化ビニル／アクリレートコポリマー、不活性無機粒子、二酸化クロム、鉄の酸化物、シリカ、シリカ混合物、及びタンパク質に似た物質、又はこれらの混合物であることができる。粒子をＥＣＬ系に懸濁させることが望ましい。
アッセイ媒質
電極が電気化学エネルギーを導入する系を操作するために、電極を浸漬するための、ＥＣＬ部分を含有する電解質を用意することが必要である。電解質は、それを通して電荷がイオンによって運ばれる相である。一般に、電解質は液相に存在し、水中、有機液体中若しくは有機液体混合物中、又は水と１種類以上の有機液体との混合物中の１種類以上の塩の溶液である。しかし、他の形態の電解質も本発明のある一定の実施態様において有用である。例えば、電解質は流体−−例えば、液体、蒸気若しくは超臨界流体−−中の１種類以上の物質の分散系であることができる、又は固体、蒸気若しくは超臨界流体中の１種類以上の物質の溶液であることができる。
電解質は適当には水中の塩の溶液である。塩は好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩であるが、他のカチオンの導入も、このカチオンが一連の電気化学ルミネセンス発生相互作用を妨害しない限り、ある一定の実施態様に適切である。塩のアニオンは例えばホスフェートであることができるが、他のアニオンの使用も、−−この場合にも、選択されたアニオンが一連の電気化学ルミネセンス発生相互作用を妨害しない限り−−、ある一定の実施態様に適切である。
組成物は非水性でもありうる。超臨界流体も場合によっては有利に用いることができるが、非水性組成物に有機液体を含む電解質を用いることがより一般的である。水性電解質と同様に、非水性電解質もそれを通して電荷がイオンによって運ばれる相である。通常は、これは、塩が有機液体媒質中に溶解していることを意味する。適当な有機液体の例は、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、エタノール、及びこれらの２種類又はそれ以上の混合物である。実例として、有機液体に可溶性である、例えばテトラフルオロホウ酸テトラブチルアンモニウムのような、テトラアルキルアンモニウム塩を有機液体と共に用いて、非水性電解質を形成することができる。
電解質は、本発明のある一定の実施態様では、緩衝系である。リン酸塩緩衝剤がしばしば有利である。例はリン酸ナトリウム／塩化ナトリウムの水溶液と、リン酸ナトリウム／フッ化ナトリウムの水溶液である。
他の分析成分
「アミン由来還元体を用いる電気化学ルミネセンス発生反応」なる名称の、共通に譲渡されたＰＣＴ公開出願Ｕ．Ｓ．８９／０４８５９（この開示は参照することにより本明細書に取り込まれる）が述べているように、酸化されて、自然に分解して、高度に還元性の種に転化する還元体、典型的には、アミン又はアミン部分（大きい分子の）を含めることが望ましい。反応系に導入される電気化学的エネルギーによって、アミン又はアミン部分も酸化されると考えられる。アミン又はアミン部分は１個の電子を失って、脱プロトン化し、又はそれ自体で転位して、強力な還元剤になる。この還元剤は酸化された金属含有ＥＣＬ部分と相互作用して、これに上記励起状態を負わせる。この役割を果たすために、アミン又はアミン部分が、炭素中心ラジカルであって、このような炭素から与えられることができる電子と、還元体を形成するための脱プロトン化中にプロトンドナーとして作用することができるα炭素とを有する上記炭素中心ラジカルを有することが好ましい。アミン由来還元体は金属含有ＥＣＬ部分をその励起状態に転化させるために必要な刺激を与え、この励起状態から検出可能な電磁線が放出される。
広範囲なアミンと対応アミン部分とを本発明の実施に用いることができる。一般に、アミン又はアミン部分は、電気化学ルミネセンスアッセイされる予定である系のｐＨに適合するように選択される。他の関連要素は、アミン又はアミン部分が、分析中にその中で機能しなければならない環境に適合する必要がある、即ち、場合によって、水性環境又は非水性環境に適合する必要があることである。さらに他の考察は、選択されたアミン又はアミン部分が、系の酸化された金属含有ＥＣＬ部分を還元させるほど強い、優勢な条件下でアミン由来還元体を形成すべきであるということである。
本発明に有利に用いられるアミン（及びそれから誘導される対応部分）は、例えば第１級アミン、第２級アミン及び第３級アミンであり、各アミンのアルキル基は炭素数１〜３である脂肪族アミン、並びに置換脂肪族アミンである。トリプロピルアミンが、比較していえば、特に高い強度の電磁線放出を生じて、それを用いる実施態様の検出及び定量の感度と精度を高めるので、特に好ましいアミンである。例えばヒドラジンのようなジアミンと、例えばポリ（エチレンイミン）のようなポリアミンも適切である。本発明の実施に適切な、他のアミンの例はトリエタノールアミン、トリエチルアミン、１，４−ジアザビシクロ−（２．２．２）−オクタン、１−ピペリジンエタノール、１，４−ピペラジン−ビスー（エタン−スルホン酸）、トリイソプロピルアミン及びポリ（エチレンイミン）である。
典型的に、本発明に用いられる金属含有ＥＣＬ部分は反応限定要素である。したがって、アミン又はアミン部分がそれを基準にして化学量論的過剰で供給されることも通常おこなわれる。実例として、アミン又はアミン部分は５０〜１５０ｍＭの濃度で用いられる。約７のｐＨで用いるためには、１００ｍＭの濃度がしばしば有利である。ある一定の実施態様では、アミン又はアミン部分の濃度の上限は、それが用いられる環境中、例えば水中のアミン又はアミン部分の最大溶解度によって決定される。一般に、アミン又はアミン部分の使用量は、酸化された金属含有ＥＣＬ部分をルミネセンスが発生するようなその励起状態に変換させるために充分である量である。当業者は、本明細書の教示を与えられたならば、分析される特定の系に有利に用いられるアミン又はアミン部分の量を、必要以上の実験なしに、経験によって判定することができる。
「強化された電気化学ルミネセンス発生反応」なる名称の、共通に譲渡されたＰＣＴ公開出願Ｕ．Ｓ．８９／０４９１５（この内容は参照することにより本明細書に取り込まれる）が述べているように、本発明の分析は強化剤(enhancer)、典型的に、式：
0003791930.tif 000003
［式中、Ｒは水素又はＣnＨ2n+1であり、Ｒ’はＣnＨ2nであり、ｘは０〜７０であり、ｎは１〜２０である］
で示される化合物の存在下でおこなわれることが望ましい。特に、ｎは１〜４である。特定の例は、式：
0003791930.tif 000004
［式中、ｘは９〜１０である］
で示される、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００なる名称で商業的に入手可能な物質と、式：
0003791930.tif 000005
［式中、ｘは４０である］
で示される、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−４０１（ＮＰＥ−４０）なる名称で商業的に入手可能な物質である。強化剤は一般に、その存在下で、電磁線の放出の望ましい増加が生ずるほどの充分な量で用いられる。典型的に、この量は０．０１％〜５．０％、特に０．１％〜１．０％（ｖ／ｖ）である。この出願の内容は本明細書に援用される。
本発明によって組み入れられるＥＣＬ部分は、それを励起状態に刺激することによって電磁線を放出するように誘導される。これは、ＥＣＬ部分が組み入れられた系を電気化学的エネルギーに暴露させることによって達成される。ＥＣＬ部分と強い還元体を形成する種との酸化が生ずる電位はそれらの正確な化学構造と、例えば系のｐＨ及び電気化学的エネルギーの導入に用いられる電極の性質のような要素とに依存する。最適電位と電気化学ルミネセンス系の発光波長とを如何にして決定するかは、当業者に周知である。ＥＣＬ系を刺激するある一定の好ましい方法は、共通に譲渡されたＰＣＴ公開出願Ｕ．Ｓ．８９／０１８１４（この内容は参照することにより本明細書に取込まれる）に開示されている。
電気化学ルミネセンスの測定装置
本発明の分析を実施するための装置は図１と２に示す。図１は有利なＥＣＬ装置を開示するが、本発明の方法は装置１０における適用に限定されず、ＥＣＬ部分を電気化学ルミネセンスを発生するように誘発するために電気化学エネルギーを供給する作用電極又は他のトリガー面を含む他の型のＥＣＬ装置にも適用可能である。本発明の方法は静止モード又はフロースルー(flow-through)モードで実施することができるが、装置１０はフロースルーセルを含む、これは結合アッセイサンプルを含めた、多くの種類のサンプルに対して明らかな利点を生じる。本発明のＥＣＬ分析を実施するための装置に関するさらなる詳細は、共通に譲渡されたＰＣＴ公開出願Ｕ．Ｓ．８９／０４８５４とＵ．Ｓ．９０／０１３７０に開示されている。
装置１０は電気化学セル１２、有利には光電子増倍管（ＰＭＴ）でありうる光検出／測定デバイス１４、光ダイオード、荷電結合素子、写真フィルム若しくは乳剤等と、セル１２へ、セル１２を通して、セル１２からの流体輸送を生じるための、有利には蠕動ポンプであるポンプ１６とを包含する。或いは、容積移送式ポンプを用いることができる。セル１２とＰＭＴ１４との間にはシャッター機構１８を備えて、ＥＣＬ測定期間中にＰＭＴ１４をセル１２に暴露させるためにだけ開放するように制御可能に操作する。このシャッター機構は例えばメインテナンス中は閉鎖することができる。図１に示されていないが、種々な成分をその中に入れるためと、ＥＣＬ測定中に外部光からＰＭＴ１４を遮蔽するための光線遮断ハウジングも装置１０に含まれる。
セル１２自体は、有利にはステンレス鋼から構成されることができる、入口管２２と出口管２４とが貫通している第１マウンティングブロック２０を含む。マウンティングブロック２０はセル１２のサンプル保持容積３０の片側を画定する第１外面２６と第２内面２８を有し、セル１２はこの中に装置１０の対応操作中に洗浄溶液及び／又はコンディショニング(conditioning)溶液及び／又は測定溶液を保持する。入口管２２と出口管２４とはマウンティングブロック２０を外面２６から内面２８まで貫通し、サンプル保持容積３０中に開口する。有利には同様にステンレス鋼から構成される第２マウンティングブロック３２は第１外面３４と第２内面３６を有する。第２マウンティングブロック３２は第１マウンティングブロック２０から、有利にはテフロン又は他の非汚染性材料から構成された、環状スペーサー３８によって分離される。したがって、マウンティングブロック３２の外面３４は、サンプル保持容積３０の第２側の一部を画定する。スペーサー３８は外側部分４０と中央開口部４２を有し、中央開口部の内側縁４４はサンプル保持容積３０の側壁を画定する。外側部分４０は第１マウンティングブロック２０の内面２８を第２マウンティングブロック３２の外面３４に対してシールして、溶液がサンプル保持容積３０から２つの面２８、３４の間に漏出するのを防止する。マウンティングブロック３２はさらに、中央開口部４６を有し、ここにおいてウィンドー４８はシールフィットされ(seal-fitted)、サンプル保持容積３０の第２側の残部を外面３４の続きとして画定する。ウインドー４８は、ＥＣＬ部分によって放出される電気化学ルミネセンス光の波長において実質的に透明である。それ故、ウインドー４８はガラス、プラスチック、石英等から有利に形成される。
入口管２２はサンプル保持容積３０と、スペーサー３８に隣接したその第１端部５０において交差し、出口管２４はサンプル保持容積３０と、スペーサー３８に隣接したその第２端部５２において交差する。それによって、入口管２２とサンプル保持容積３０と出口管２４との組合せは、セル１２へ、セル１２を通して、セル１２からの溶液の狭い、実質的に層流の連続流路を形成する。
第１マウンティングブロック２０の内面２８には、作用電極系５４が取り付けられ、これは図示した実施態様では第１電極と第２電極５６、５８を含む。他の実施態様では、単一作用電極が有利に備えられることができる、又は電極５６のみが作用電極でありうる。問題の電気化学的及びＥＣＬ反応がおこなわれうる場合には、作用電極５６、５８が存在する。作用電極５６、５８は固体ボルタメトリック電極であるので、白金、金、炭素又はこの目的のために有効である他の物質から構成されることができる。作用電極５６、５８にそれぞれ、結合したワイヤーコネクター６０、６２は第１マウンティングブロック２０を通って出る。
コネクター６０、６２は両方とも、図２に示した電圧制御装置６６の第１“作用電極”端子６４に接続する。電圧制御装置６６は作用電極５６、５８に電圧シグナルを供給し、任意にＥＣＬ測定中のそれらから流出する電流を測定するためのポテンシオスタットと同様に作動することが有利である。或いは、コネクター６０、６２は個別の操作のために電圧制御装置６６の別々の端子に接続することができる。
電圧制御装置６６のポテンシオスタット操作はさらに対極（カウンター電極）６８と、任意に、但し有利には、基準電極７０とによっておこなわれる。図示した実施態様では、マウンティングブロック３２はステンレス鋼製であり、対極６８はマウンティングブロック３２の露出面７２、７４に存在する。対極７２、７４と作用電極５６、５８はサンプル保持容積３０内の溶液に電位を与えるためのインターフェースを形成し、この電位が化学反応にエネルギーを与え、サンプル中の電気化学ルミネセンスを誘発し、及び／又はセル１２の表面を洗浄し、コンディショニングするためのエネルギーを与える。カウンター電極７２、７４はワイヤーコネクター７６によって、電圧制御装置６６の第２“対極”端子７８に接続される。
基準電極７０は基準電圧を与え、作用電極５６、５８によって与えられる電圧は、例えば基準に対して＋１．２ボルトのように、これを基準にする。基準電極７０は有利には出口管２４内にセル１２から間隔をおいた位置８０に配置され、ワイヤーコネクター８２によって、電圧制御装置６６の第３“基準電極”端子８４に接続される。３電極モードでは、電流は基準電極７０を通って流れない。基準電極７０は３電極操作モードで用いられて、平衡した(poised)既知の安定な電圧を与えることができるので、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）から有利に構成されるか又は飽和カロメル電極（ＳＣＥ）である。電圧制御装置６６は２電極操作モードで、作用電極５６のみと、カウンター／基準電極としての電極５８とを用いて操作可能である。この２電極操作モードでは、カウンター／基準電極５８は電圧制御装置６６の電圧制御端子７８と８４に電気的に接続する。この場合に、電圧制御装置６６は本質的にバッテリーとして作動する。電圧制御装置６６は作用電極とカウンター電極５６と５８に電圧シグナルを与えて、それぞれの電極から流れる電流を任意に測定する。或いは、基準電極７０は白金、金、ステンレス鋼又は他の材料から構成された、いわゆる“準−基準(quasi-reference)”電極である可能性があり、あまり安定でない電圧であるが、接触する溶液を基準にしてまだ測定可能である電圧を与える。２電極操作モードと３電極操作モードの両方において、基準電極７０又は５８は、作用電極５６に印加される電圧を測定する基準を与える目的に役立つ。平衡した電圧基準(poised voltage reference)は現在、より有利であると考えられている。電圧制御装置６６はそのポテンシオスタット操作において、作用電極５６、５８に基準電極７０を基準にして既知電圧を与え、作用電極５６、５８とカウンター電極７２、７４の間の電流を測定することによって、種々な電圧を制御する。この目的のためのポテンシオスタットは周知であるので、電圧制御装置６６の内部構造は、上記機能を生じ、本発明自体に関与しない、慣用的で、商業的に入手可能な、任意のポテンシオスタットに相当することができる。実際に、装置１０は代替え的に内部電圧制御装置６６なしに構成して、電極５６、５８、７２、７４及び７０に必要な電圧シグナルを与えるために別に制御される外部ポテンシオスタットに接続するように適応させることもできる。以下で説明するように、特異的な方法で供給される、これらの電圧シグナルは作用電極５６、５８の表面に、有利には全体としてのセル１２の表面に反復可能な初期条件を与え、これはＥＣＬ測定の正確さの改良に顕著に寄与する特徴である。
ポンプ１６は出口管２４に有利に配置され、サンプル量から溶液を矢印Ａの方向に入口管２２中に“引き出す”。この溶液は入口管２２、サンプル保持容積３０及び出口管２４を通って流れ、基準電極７０を通って矢印Ｂ方向に出る。或いは、ポンプ１６は入口管２２に配置され、装置１０を通して溶液を“プッシュ”する。有利には、入口管２２、サンプル保持容積３０及び出口管２４を通るこの同じ流路がセル１２を通過する全ての溶液と流体に用いられるので、各流体はセル１２からそれまでの流体を押し出すことで流体力学的な洗浄作用を果たす。ポンプ１６は、セル１２に特定の溶液を任意の時間保持させるために、その操作を中断するように制御されることができる。
装置１０のフロースルー構造は、作用電極に可変な電圧を印加する、又は作用電極５６、５８（又はカウンター及び基準電極７２、７４、７０）を空気に暴露させずに、１種類以上の溶液に連続的に暴露させながら、操作前の電位に連続的に維持することを可能にする。基準電極７０への回路を開くことになる空気への暴露は、未知のランダムな電圧変動を生じさせ、作用電極５６、５８の表面条件の再現性を破壊する。このフロースルー構造は、電極系５４を洗浄し、コンディショニングする初期工程と、１つ以上の測定波形又はスイープ(sweep)がＥＣＬを誘発する測定工程との間の迅速な変更を可能にする。本発明はまた、試薬組成物にも関する。おおざっぱにいうと、この試薬組成物は本発明のアッセイ系の任意のいずれかの成分、即ち、（ａ）電解質、（ｂ）ＥＣＬ部分含有ラベル化合物、（ｃ）アッセイ実行物質が結合する官能化フィブリル、磁気反応性粒子を含めた、粒子に任意に結合する、（ｄ）問題の分析物、又は問題の分析物の類似体、（ｅ）問題の分析物又はその類似体の結合対、（ｆ）（ｄ）又は（ｅ）と反応可能な反応性成分、（ｇ）還元体、又は（ｈ）電気化学ルミネセンス反応強化剤であることができる。これらの試薬は、使用の便利さのために、相互に組合せることができる、即ち、２成分、３成分又はそれ以上の多成分混合物を、成分が貯蔵中に相互に反応して、予定のアッセイにおけるそれらの機能を損なうことがないかぎり、調製することができる。試薬が、粒子と１種類以上の他の成分とを含有する２成分又は多成分混合物であることが望ましい。
本発明はまた、キットにも関する。キットは上記成分（ａ）〜（ｈ）の１種類以上を含有する容器を包含することができる、又はキットは、全て、本発明のアッセイ方法と系に用いるためのこれらの成分の混合物を含めて、上記１種類以上の試薬組成物を含有する容器を含むことができる。
フィブリルの官能化方法
本発明の官能化フィブリルは、スルホン化、脱酸素化したフィブリル表面への求電子性付加または金属化によって直接に製造することができる。アーク成長ナノファイバーを使用する場合、これらは官能化させる前に、過度の精製を必要とすることがある。Ｅｂｂｅｓｅｎ等は、このような精製方法を開示している（Ｎａｔｕｒｅ，３６７，５１９（１９９４））。
好適には、カーボンフィブリルを官能化剤と接触させる前に、これらを処理する。このような処理は、フィブリルを溶媒中に分散させる処理を包含することができる。或る場合には、カーボンフィブリルを次いで、濾過し、次いで乾燥させた後にさらに触媒させる。
１．スルホン化
基礎技術は、Ｍａｒｃｈ，Ｊ．Ｐ．によるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３版、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５；Ｈｏｕｓｅ，Ｈ．によるＭｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，２版，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，１９７２に記載されている。
活性化したＣ−Ｈ結合（芳香族Ｃ−Ｈ結合を包含する）は、２０％までのＳＯ3を含有する濃硫酸の溶液である発煙硫酸［オレウム（ｏｌｅｕｍ）］を用いてスルホン化することができる。慣用の方法は、オレウムを用いてＴ〜８０℃で液相による方法である；しかしながら、活性化したＣ−Ｈ結合はまた、不活性非プロトン溶剤中でＳＯ3を用いて、あるいは気相でＳＯ3を用いてスルホン化することもできる。この反応は下記のとおりである：
0003791930.tif 000006
過剰反応は、下記反応に従いスルホンの生成をもたらす：
0003791930.tif 000007
製造例Ａ
硫酸を使用するＣ−Ｈ結合の活性化
反応は結果に格別の差異を伴わずに、気相および溶液中で行われた。気相反応はリンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）炉により加熱されている横式石英管反応器内で行った。濃Ｈ2ＳＯ4中２０％ＳＯ3を含有し、気体導入管／排出管を備えた多頸フラスコをＳＯ3供給源として使用した。
磁器ボート（舟型容器）内の重量計量したフィブリル試料（ＢＮまたはＣＣ）を、気体導入口を備えた１″管に入れた；その排出口は濃Ｈ2ＳＯ4吹き込みトラップに接続した。この反応器に２０分間、アルゴンを吹き込み、全部の空気を除去し、次いでこの試料を３００℃に１時間加熱し、残留水分を除去した。乾燥後、温度をアルゴン雰囲気下に反応温度に調整した。
所望の温度に安定化された時点で、ＳＯ3供給源を反応管に接続し、次いでアルゴン流を用いて、ＳＯ3上記を石英管反応器に導入した。反応は、所望の温度で所望の時間かけて行い、その後、この反応器を流動アルゴン下に冷却させた。このフィブリルを次いで、５″Ｈｇ減圧で９０℃において乾燥させ、乾燥重量利得を得た。０．１００Ｎ  ＮａＯＨとの反応および最終点としてｐＨ６．０を用いる０．１００Ｎ  ＨＣｌによる逆滴定によって、スルホン酸（−ＳＯ3Ｈ）含有量を測定した。
液相反応は、温度計／温度制御機および磁気撹拌機を備えた多頸１００ｃｃフラスコで行った。このフラスコに、濃Ｈ2ＳＯ4（５０）中のフィブリルスラリーを入れた。オレイム溶液（２０ｃｃ）は、反応器に添加する前に、〜６０℃に予備加熱した。反応後、その酸スラリーを粉砕した氷上に注ぎいれ、次いで直ちに、１リットルのＤＩ水で稀釈した。固形物を濾別し、次いで洗浄流出液のｐＨが変化しなくなるまで、ＤＩ水で徹底的に洗浄した。フィブリルを５″Ｈｇ減圧で１００℃において乾燥させた。濾過の際の移送損失により、正確な重量利得を得ることはできなかった。結果を表Ｉに示す。
0003791930.tif 000008
気相または液相における反応によるスルホン酸含有量に格別の差異はなかった。温度作用があった。反応温度が高いほど（気相）、スルホンの量は多くなった。１１８−６１Ｂにおいて、４．２重量％の重量利得はスルホン酸含有量と一致した（理論値は０．５１ｍｅｑ／ｇであった）。実験６０Ａおよび６１Ａは単にスルホン酸含有量によるものと説明できる、多すぎる重量利得を有した。従って、認識できる量のスルホンがまた生成されたものと推定された。
２．オキシドを含有していないフィブリル表面への付加
基礎技術は、Ｕｒｒｙ，Ｇ．によるＥｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されている。
フィブリルの表面炭素は、グラファイトに類似して挙動する。すなわち、これらは底面炭素およびエッジ炭素の両方を含む六角形シートに配列されている。底面炭素は化学的衝撃に対して比較的不活性であり、一方エッジ炭素は反応性であり、かつまた或る種のヘテロ原子または基を含有して、炭素原子価を満たしていなければならない。フィブリルはまた、基本的にエッジ炭素であり、ヘテロ原子または基を含有する表面欠落部位を有する。
フィブリルの表面炭素に結合している最も普通のヘテロ原子は水素（これは製造中の主要気体状成分である）；酸素（これはその高い反応性により、およびその痕跡量は排除が非常に困難であることから存在する）；およびＨ2Ｏ（これは触媒により常時存在する）である。減圧で〜１０００℃で熱分解させると、未知メカニズムに従うが、公知の化学理論に従い、複合した反応により表面は脱酸素化される。この生成物は２：１比のＣＯおよびＣＯ2である。生成するフィブリル表面は、活性化オレフィンに対して非常に反応性であるＣ1〜Ｃ4配列で基を含有する。この表面は減圧下に、あるいは不活性気体の存在下に安定であるが、反応性気体にさらされるまで、その高い反応性を保有する。従って、フィブリルは減圧下に、あるいは不活性雰囲気中で、〜１０００℃で熱分解させることができ、これらと同一条件下に冷却させることができ、かつまたさらに低温で相当する分子と反応させて、安定な官能性基を付与することができる。代表例には下記の反応がある：
0003791930.tif 000009
この反応に引き続き、下記の反応が生じる：
0003791930.tif 000010
上記式中、Ｒ′は炭化水素基（アルキル、シクロアルキル等）である。
製造例Ｂ
アクリル酸とオキシドを含有しないフィブリル表面との反応により官能化したフィブリルの製造
磁器ボート中のＢＮフィブリル  １グラムを、熱電対を備えた横式１″石英管に入れ、リンドバーグ管炉内に配置する。その末端に気体導入口／排出口を用意する。この管を乾燥した脱酸素化アルゴンにより１０分間浄化する。その後炉温度を３００℃に高め、３０分間維持する。その後、アルゴンの連続流下に、温度を１００℃づつ１０００℃まで高め、１６時間維持する。この時間の終了時点で、この管をアルゴン流下に、室温（ＲＴ）まで冷却させる。アルゴン流を次いで、迂回させ、５０℃で純粋にまで精製したアクリル酸を含有し、気体導入口／排出口を備えた多頸フラスコに通す。このアクリル酸／アルゴン蒸気流入は室温で６時間継続する。この時間の終了時点で、先ずアルゴンで浄化し、次いで＜５″減圧で１００℃において減圧乾燥させることにより、残留する未反応アクリル酸を除去する。過剰の０．１００Ｎ  ＮａＯＨとの反応およびｐＨ７．５の最終点までの０．１００Ｎ  ＨＣｌによる逆滴定によって、カルボン酸含有量を測定する。
製造例Ｃ
アクリル酸とオキシドを含有しないフィブリル表面との反応により官能化したフィブリルの製造
熱分解および冷却を１０-4トールの減圧で行う以外は、上記と同様の方法を反復する。精製したアクリル酸蒸気を、前記方法と同様にアルゴンで稀釈する。
製造例Ｄ
マレイン酸とオキシドを含有しないフィブリル表面との反応により官能化したフィブリルの製造
室温における反応剤が精製無水マレイン酸（ＭＡＮ）である以外は、上記と同様の方法を反復する。ＭＡＮは、８０℃において融解ＭＡＮ浴にアルゴン気体を通すことによって反応器に供給する。
製造例Ｅ
アクリロイルクロリドとオキシドを含有しないフィブリル表面との反応により官能化したフィブリルの製造
室温における反応剤が精製アクリロイルクロリドである以外は、製造例Ｂと同様の方法を反復する。アクリロイルクロリドは、２５℃において純粋アクリロイルクロリド上にアルゴンを通すことによって反応器に供給する。過剰の０．１００Ｎ  ＮａＯＨとの反応および０．１００Ｎ  ＨＣｌによる逆滴定によって、酸クロリド含有量を測定する。
減圧におけるフィブリルの熱分解は、フィブリル表面を脱酸素化させる。ＴＧＡ装置において、減圧下にまたは精製Ａｒ流下に１０００℃で熱分解させると、ＢＮフィブリルの３試料について、３％の平均重量損失が生じる。気体クロマトグラフイ分析では、ＣＯおよびＣＯ2のみが〜２：１比で検出された。生成する表面は非常に反応性であり、アクリル酸、アクリロイルクロリド、アクリルアミド、アクロレイン、無水マレイン酸、アリルアミン、アリルアルコールまたはアリルハライドなどの活性化オレフィンは室温においてさえも反応し、活性化オレフィンに官能的に結合したもののみを含有するクリーンな生成物が生成される。従って、カルボン酸のみを含有する表面は、アクリル酸または無水マレイン酸との反応に利用することができる；この表面はアクリロイルクロリドとの反応によって酸クロリドのみを；アクロレインからはアルデヒドのみを；アリルアルコールからはヒドロキシルのみを；アリルアミンからはアミンのみを；そしてアリルハライドからはハライドのみを；含有する。
３．金属化
基礎技術は、ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ，３版，５４５頁に記載されている。
芳香族Ｃ−Ｈ結合は、種々の有機金属反応剤を用いて金属化させ、炭素−金属結合（Ｃ−Ｍ）を生成させることができる。Ｍは通常、Ｌｉ、Ｂｅ、Ｍｇ、ＡｌまたはＴｌである。しかしながら、その他の金属もまた使用することができる。最も単純な反応は、活性化芳香族化合物における水素の直接置換によるものである：
0003791930.tif 000011
この反応には、強塩基、例えばカリウムｔ−ブトキシドまたはキレート形成性ジアミンがさらに必要であることもある。非プロトン溶剤が必要である（パラフィン類、ベンゼン）。
0003791930.tif 000012
この金属化誘導体は基本的一官能化フィブリルの例である。しかしながら、これらはさらに反応させて、他の基本的一官能化フィブリルを得ることもできる。中間体を単離することなく同一装置で、いくつかの反応を引き続いて行うことができる。
0003791930.tif 000013
製造例Ｆ
フィブリル−Ｌｉの製造
ＣＣフィブリル  １グラムを磁器ボートに入れ、１″石英管反応器に挿入し、この反応器をリンドバーグ管炉内に入れる。この管の末端に気体導入口／排出口を用意する。Ｈ2連続流下に、このフィブリルを７００℃に２時間加熱し、全部の表面オキシゲネートをＣ−Ｈ結合に変換する。この反応器を次いで、流動Ｈ2下に室温まで冷却させる。
この水素添加したフィブリルを、乾燥した脱酸素化ヘプタンとともに（ＬｉＡｌＨ4とともに）、全部の空気を除去し、不活性雰囲気を維持するための精製アルゴン浄化装置、コンデンサー、磁気撹拌機および注射器により液体を添加することができるゴム栓を備えた１リットル多頸丸底フラスコに移す。アルゴン雰囲気下に、ヘプタン中のブチルリチウム５ミリモルを含有する２％溶液を注射器により添加し、次いでこのスラリーを穏やかな還流下に４時間撹拌する。この時間の終了時点で、フィブリルをアルゴン雰囲気グローブボックスで重力濾過により分離し、次いでこのフィルター上で乾燥した脱酸素化ヘプタンにより数回洗浄する。止めコックを備えた５０ｃｃ丸底フラスコにフィブリルを移し、１０-4トールの減圧下に５０℃で乾燥させる。フィブリル試料とＤＩ水中の過剰の０．１００Ｎ  ＨＣｌとの反応およびｐＨ５．０の最終点までの０．１００Ｎ  ＮａＯＨを用いる逆滴定により、リチウム濃度を測定する。
製造例Ｇ
フィブリル−Ｔｌ（ＴＦＡ）2の製造
ＣＣフィブリル  １グラムを製造例Ｅと同様に水素添加し、乾燥アルゴンによる反復浄化により脱気されているＨＴＦＡとともに、多頸フラスコに添加する。ＨＴＦＡ中のＴｌ（ＴＦＡ）3５ミリモルの５％溶液を、ゴム栓を通してフラスコに添加し、このスラリーを穏やかな還流下に６時間撹拌する。反応後、フィブリルを採取し、次いで製造例Ａと同様に乾燥させる。
製造例Ｈ
フィブリル−ＯＨ（ＯＨ官能基のみを有する酸素化誘導体）の製造
製造例Ｆで製造されたリチウム化フィブリル  １／２グラムを乾燥した脱酸素化ヘプタンとともに、アルゴン雰囲気グローブボックス内で止め栓および磁気撹拌棒を備えた５０ｃｃ一頸フラスコに移す。このフラスコをグローブボックスから取り出し、次いで磁気撹拌棒で撹拌する。止め栓を次いで空気に対して開け、このスラリーを２４時間撹拌する。この時間の終了時点で、フィブリルを濾過により分離し、水性ＭｅＯＨで洗浄し、次いで５″減圧で５０℃において乾燥させる。８０℃でジオキサン中無水酢酸の標準化溶液（０．２５２Ｍ）と反応させることによりＯＨ基をアセテートエステルに変換し、このようにして、反応させた無水酢酸１モルあたり１当量の酢酸を放出させることにより、ＯＨ基濃度を測定する。総酸含有量、遊離酢酸および未反応無水酢酸を、ｐＨ７．５の最終点まで０．１００Ｎ  ＮａＯＨを用いて滴定することにより測定する。
製造例Ｉ
フィブリル−ＮＨ2の製造
タリウム化フィブリル  １グラムを製造例Ｇと同様に製造する。このフィブリルをジオキサン中でスラリー化し、次いでジオキサン中に溶解したトリフェニルホスフィン０．５ｇを添加する。このスラリーを５０℃で数分間撹拌し、次いで５０℃で２０分間、気体状アンモニアを添加する。このフィブリルを次いで、濾過により分離し、ジオキサンで、次いでＤＩ水で洗浄し、次いで５″減圧で８０℃において乾燥させる。過剰の無水酢酸との反応および０．１００Ｎ  ＮａＯＨを用いる遊離酢酸および未反応無水酢酸の逆滴定により、アミン濃度を測定する。
４．誘導体化多核芳香族化合物、多ヘテロ核芳香族化合物および平面状巨大環状化合物
フィブリルのグラファイト状（ｇｒａｐｈｉｔｉｃ）表面は、芳香族化合物の物理的吸着を可能にする。この吸引はファンデルワールスの力学によるものである。これらの吸引力は多環状ヘテロ核芳香族化合物とグラファイト状表面の基底面炭素との間で際立っている。競合的表面吸着が可能である場合、または吸着物が高い溶解性を有する場合のような条件下では、脱着が生じることがある。
製造例Ｊ
ポルフィリン化合物およびフタロシアニン化合物のフィブリル上への吸着
フィブリル上への物理的吸着に好適な化合物は、グラファイトまたはカーボンブラックに強力に吸着することが知られている誘導体化したポリフィリン化合物およびフタロシアニン化合物である。数種の化合物、例えばテトラカルボン酸ポルフィリン、コバルト（ＩＩ）フタロシアニンまたはジリチウムフタロシアニンを利用することができる。後者の２種の化合物はカルボン酸形態に誘導体化することができる。
ポルフィリン化合物およびフタロシアニン化合物の積載能力は、これらを増量しながら添加した場合の溶液の脱色によって測定することができる。この溶液の深い色（ＭｅＯＨ中のテトラカルボン酸ポルフィリンの場合の深桃色、アセトンまたはピリジン中のジリチウムフタロシアニンまたはコバルト（ＩＩ）の場合の暗青色）は、この分子がフィブリルの黒色表面に吸着されることによって分離されることから消失する。
積載能力はこの方法により推定し、またこれらの誘導体のフットプリントはそれらの大体の測定値から計算した（〜１４０ｓｑ．オングストローム）。２５０ｍ2／ｇのフィブリルの平均表面積の場合の最大積載量は〜０．３ミリモル／ｇであるものと見做される。
テトラカルボン酸ポルフィリンは滴定により分析した。この吸着の完全性は、室温および高められた温度における水性系中での色放出により試験した。
フィブリルスラリーを先ず、混合し［ワーリング（Ｗａｒｉｎｇ）ブレンダー］、次いで装填中は撹拌した。色はもはや消失しないが、効果が無くなった後に、スラリーの一部を超音波処理に付した。
装填後に、実験１６９−１１、−１２、−１４および−１９−１（表ＩＩ参照）では、同一溶剤中で洗浄し、吸蔵されている染料を分離した。洗浄流出液は全部が連続する淡い色合いを示し、従って正確な飽和点の測定は困難であった。実験１６８−１８および−１９−２は添加顔料の量の計算に使用し、添加後に、非常に軽くのみ洗浄した。
さらに特徴を確認するために、テトラカルボン酸ポルフィリン（アセトンから）およびＣｏフタロシアニン（ピリジンから）を、フィブリル上に積載した（それぞれ実験１６９−１８および−１９−２）。
テトラカルボン酸ポルフィリンの分析
過剰の塩基（ｐＨ１１〜１２）を添加すると、滴定用スラリーは直ちにピンク色に発色した。これは滴定を干渉しなかったが、高ｐＨではポルフィリンの脱着を示した。カルボン酸濃度は、ｐＨ７．５の終末点を使用して過剰のＮａＯＨの逆滴定により測定した。この滴定により、１．１０ｍｅｇ／酸ｇの装填量が得られた。これは０．２７５ｍｅｑ／ポルフィリンｇに等しい。
コバルトまたはジリチウムフタロシアニンの分析
これらの吸着物の濃度は脱色実験のみから推定した。３０分後に青−緑色が薄れなかった点を飽和点とした。
多くの置換多核芳香族化合物または多ヘテロ核芳香族化合物をフィブリル表面上に吸着させた。付着の場合、芳香族環の数は環／側鎖官能性基あたりで２個よりも多くなければならない。すなわち、３個の縮合環を有する置換アントラキノン化合物、フェナントレン化合物など、あるいは４個または５個以上の縮合環を有する多官能性誘導体を、ポルフィリンまたはフタロシアニン誘導体の代わりに使用することができる。同様に、キノリンなどの置換芳香族ヘテロ環状化合物または４個または５個以上の環を有する多置換ヘテロ芳香族化合物を使用することもできる。
表ＩＩに、３種のポルフィリン／フタロシアニン誘導体にかかわる積載実験の結果をまとめて示す。
0003791930.tif 000014
５．塩素酸塩または硝酸酸化
濃硫酸中の塩素酸カリウムまたは硝酸などの強酸化剤によるグラファイトの酸化にかかわる刊行物には、Ｒ．Ｎ．ＳｍｉｔｈによるＱｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ  １３，２８７（１９５９）；Ｍ．Ｊ．Ｄ．ＬｏｗによるＣｈｅｍ．Ｒｅｖ．，６０，２６７（１９６０）が包含される。一般に、エッジ炭素（欠落部位を包含する）は攻撃されて、カルボン酸、フェノールおよびその他の酸化基の混合物を生成する。このメカニズムはラディカル反応を包含して複雑である。
製造例Ｋ
塩素酸塩を用いるカルボン酸官能化フィブリルの製造
ＣＣフィブリルの試料を濃Ｈ2ＳＯ4中で、スパチュラを用いて混合することによってスラリー化し、次いで気体導入口／排出口およびオーバーヘッド撹拌機を備えた反応フラスコに移した。撹拌しながら、かつまたアルゴンの穏やかな流通下に、実験の継続時間の全体にわたり室温で、ＮａＣｌＯ3添加物を少しづつ添加した。この実験の全体を通して、塩素蒸気が発生し、この塩素蒸気は水性ＮａＯＨトラップ中に反応器から排除した。この実験の終了時点で、このフィブリルスラリーを粉砕した氷上に注ぎ入れ、次いで減圧濾過した。このフィルターケーキを次いで、ソックスレー  チンブルに移し、次いでソックスレー抽出器でＤＩ水により洗浄し、この際に数時間毎に新鮮な水と交換した。洗浄は、新鮮なＤＩ水に添加した場合、フィブリル試料がこの水のｐＨを変えなくなるまで継続した。このフィブリルを次いで、濾過により分離し、次いで５″減圧で１００℃において一夜かけて乾燥させた。
カルボン酸含有量は、試料を過剰の０．１００Ｎ  ＮａＯＨと反応させ、次いでｐＨ７．５の終末点まで０．１００ｎ  ＨＣｌで逆滴定することによって測定した。この結果を表ＩＩＩにまとめて示す。
0003791930.tif 000015
製造例Ｌ
硝酸を用いるカルボン酸官能化フィブリルの製造
重量計量したフィブリルの試料を、オーバーヘッド撹拌機および水コンデンサーを備えた丸底多頸の刻み目付き反応フラスコ中で相当する濃度の硝酸を用いてスラリー化した。絶えず撹拌しながら、温度を調節し、反応を特定の時間行った。酸強度に関係なく、温度が７０℃を超えた後に、茶色の煙が短時間放出された。反応後、このスラリーを粉砕した氷上に注ぎ入れ、次いでＤＩ水で稀釈した。このスラリーを濾過し、次いでスラリー化した試料がＤＩ水からｐＨに変化を与えなくなるまで、ソックスレー抽出器中で洗浄することによって、過剰の酸を除去し、この際に貯蔵槽は数時間毎に新鮮な水で置き換えた。このフィブリルを５″の減圧で１００℃において一夜かけて乾燥させた。一定重量のフィブリルのカルボン酸含有量を、標準０．１００Ｎ  ＮａＯＨとの反応および０．１００Ｎ  ＨＣｌによる逆滴定により測定した。表面酸素含有量はＸＰＳにより測定した。水中分散性を０．１重量％において、ワーリングブレンダーで２分間高速混合することによって試験した。結果を表ＩＶにまとめて示す。
0003791930.tif 000016
６．官能化フィブリルの二次誘導体
カルボン酸−官能化フィブリル
カルボン酸そのものから製造することができる二次誘導体の数は基本的に制限される。アルコール類またはアミン類は酸に容易に結合して、安定なエステルまたはアミドを生成する。アルコールまたはアミンが二官能性または多官能性分子の一部である場合、Ｏ−またはＮＨ−を経る結合は側鎖基として別の官能性をもたらす。二次反応剤の代表例を下記に示す：
0003791930.tif 000017
これらの反応は、カルボン酸のアルコールまたはアミンによるエステル化またはアミン化用に開発された方法のいずれかを用いて行うことができる。これらの中で、エステルまたはアミド用のアシル化剤としてＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールを使用するＨ．Ａ．ＳｔａａｂによるＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔ，Ｅｄｉｔ．，（ｉ），３５１（１９６２）の方法およびアミド化用カルボン酸の活性化にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用するＧ．Ｗ．ＡｍｄｅｒｓｏｎによるＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８６，１８３９（１６９４）の方法を使用した。
製造例Ｍ
官能化フィブリルの二次誘導体の製造
Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール
この方法には、清明な乾燥した非プロトン溶剤（例えば、トルエンまたはジオキサン）が必要である。化学量論的量の反応剤で充分である。エステルの場合、カルボン酸化合物は不活性雰囲気（アルゴン）下にトルエン中で、室温において２時間、トルエンに溶解した化学量論量のＣＤＩと反応させる。この時間中に、ＣＯ2が発生する。２時間後に、触媒量のＮａエトキシドとともにアルコールを添加し、反応を８０℃で４時間継続する。規定アルコールの場合、収率は定量的である。この反応は下記のとおりである。
0003791930.tif 000018
アミンのアミド化は室温で触媒なしで生じる。この方法の第一段階は同一である。ＣＯ2の発生後に、化学量論量のアミンを室温で添加し、１〜２時間反応させる。この反応は定量的である。この反応は下記のとおりである：
0003791930.tif 000019
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
一級アミンによるアミノ化のためのカルボン酸の活性化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミルエステルを経て生じる；置換尿素として放出される水を結合させるためにカルボジイミドを使用する。このＮＨＳエステルを次いで、室温で一級アミンとの反応によって、アミドに変換する。この反応は下記のとおりである：
0003791930.tif 000020
シリル化
トリアルキルシリルクロリドまたはトリアルキルシラノールは、下記式に従い酸Ｈと直ちに反応する：
0003791930.tif 000021
少量のジアザ−１，１，１−ビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）を触媒として使用する。適当な溶媒はジオキサンまたはトルエンである。
製造例Ｎ
カルボン酸−官能化フィブリルからのエステル／アルコール誘導体の製造
カルボン酸−官能化フィブリルは、製造例Ｋと同様に製造した。カルボン酸含有量は０．７５ｍｅｑ／ｇであった。フィブリルは、不活性雰囲気下で溶媒としてトルエンを用い室温において、ＣＯ2の発生が止むまで、化学量論量のＣＤＩと反応させた。その後に、このスラリーを、８０℃で１０倍モル過剰のポリエチレングリコール（分子量６００）および触媒として少量のＮａＯＥｔと反応させた。２時間の反応後に、このフィブリルを濾過により分離し、トルエンで洗浄し、次いで１００℃で乾燥させた。
製造例Ｏ
カルボン酸−官能化フィブリルからのアミド／アミン誘導体の製造
（１７７−０４１−１）
塩素演算−酸化フィブリル０．２４２ｇ（０．６２ｍｅｑ／ｇ）を、セラム（ｓｅｒｕｍ）ストッパーを備えた１００ｍｌ丸底フラスコ中で撹拌しながら、無水ジオキサン２０ｍｌ中に懸濁した。２０倍モル過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２９９ｇ）を添加し、次いで溶解させた。ここに引き続いて、２０倍モル過剰の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（０．５１０ｇ）を添加し、撹拌を室温で２時間継続した。この時間の終了時点で、撹拌を止め、上清を吸引除去し、固形物を無水ジオキサンおよびＭｅＯＨにより洗浄し、次いで０．４５ミクロンのポリスルホン膜上で濾過した。この固形物をフィルター膜上で追加のＭｅＯＨにより洗浄し、次いで重量の減少がもはや見られなくなるまで減圧乾燥させた。ＮＨＳ−活性化した酸化フィブリルの収率は、見出された６％の重量利得に基づき１００％であった。
エチレンジアミン（ｅｎ）１００μｌを、０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3緩衝液１０ｍｌに添加した。当量の酢酸（ＨＯＡｃ）を添加し、ｐＨを８付近に維持した。ＮＨＳ−活性化した酸化フィブリル（０．３１０ｇ）を、激しく撹拌しながら添加し、次いで１時間反応させた。追加の３００μｌのｅｎおよび３００μｌのＨＯＡｃをさらに１０分間かけて添加した。この溶液を０．４５ミクロンのポリスルホン膜上で濾過し、次いでＮａＨＣＯ3緩衝液、１％ＨＣｌ、ＤＩ水およびＥｔＯＨにより順次洗浄した。この固形物を一夜かけて減圧乾燥させた。引き続く分析および反応用に、このＨＣｌ塩をＮａＯＨとの反応により遊離アミノに逆変換した（１７７−０４６−１）。
ＥＳＣＡを行い、このアミン化フィブリル上に存在するＮの量を定量した（ＧＦ／ＮＨ2）。１７７−０４６−１のＥＳＣＡ分析は、０．９０ａｔ％Ｎを示した（１７７−０５９）。このＮのうちのどのくらいが、利用できるアミン基および反応性アミン基の両方として存在するかをさらに分析するため、相当する利用できる一級アミン基とのシッフ塩基結合を生成させるためにペンタフルオロベンズアルデヒドと気相反応させることにより誘導体を製造した。ＥＳＣＡ分析は依然として、予想されたとおりに０．９１ａｔ％Ｎおよび１．６８ａｔ％Ｆを示した。これは、アミノ化フィブリル上の反応性一級アミンとして存在するＮの０．３４ａｔ％に相当する（５Ｆ／ペンタフルオロベンズアルデヒド分子）。０．４５ａｔ％Ｎのレベルは各Ｎの遊離末端との推定される完全反応を予想させた。見出されたレベルは、ＮとＮＨＳ−活性化フィブリルとの反応からの非常に高い収率を示し、利用できる遊離アミン基の反応性を確認させる。
ＥＳＣＡデータから計算された遊離アミンとして存在する０．３４ａｔ％のＮレベルにおいて、フィブリルは遊離アミン基によりほとんど完全に覆われ、これにより別種の物質のカプリングが可能にされる。
製造例Ｐ
カルボン酸−官能化フィブリルからのシリル誘導体の製造
製造例Ｋと同様に製造された酸−官能化フィブリルを不活性雰囲気下にジオキサン中でスラリー化した。撹拌しながら、化学量論量のクロロトリエチルシランを添加し、０．５時間反応させ、次いで数滴のジオキサン中ＤＡＢＣＯ５％溶液を添加した。この反応系をさらに１時間反応させ、その後、このフィブリルを濾過により採取し、ジオキサン中で洗浄した。このフィブリルをＶ″減圧で１００℃において一夜かけて乾燥させた。
表Ｖは二次誘導体製造例をまとめて示すものである。これらの生成物は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、ＳＩおよびＦ表面含有量について、ＥＳＣＡにより分析した。
0003791930.tif 000022
製造例Ｑ
カルボン酸−官能化フィブリルからのシリル誘導体の製造
製造例Ｋと同様に製造された酸官能化フィブリルを、不活性雰囲気下にジオキサン中でスラリー化する。撹拌しながら、化学量論量のクロロトリエチルシランを添加し、０．５時間反応させ、次いで数滴のジオキサン中ＤＡＢＣＯ５％溶液を添加する。この反応系をさらに１時間反応させ、その後、フィブリルを濾過により採取し、次いでジオキサン中で洗浄する。このフィブリルを５″減圧で１００℃において一夜かけて乾燥させる。
表ＶＩに、この二次誘導体製造をまとめて示す。生成物はＥＳＣＡにより分析する。この分析により所望の側鎖基の導入が確認される。この生成物を、ＥＳＣＡによりＣ、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＦ表面含有量について分析する。
0003791930.tif 000023
スルホン酸−官能化フィブリル
製造例Ａと同様に製造されたアリールスルホン酸をさらに反応させて、二次誘導体を生成させることができる。スルホン酸は、ＬｉＡｌＨ4またはトリフェニルホスフィンとヨウ素との組合せによりメルカプタンに還元することができる（Ｍａｒｃｈ，Ｊ．Ｆ．，１１０７頁）。これらの化合物はまた、ジアルキルエーテル化合物との反応によってスルホネートエステルに変換することができる、すなわち、
0003791930.tif 000024
酸素を含有しないフィブリル表面への求電子性付加によりまたは金属化により官能化されたフィブリル
酸素を含有していないフィブリル表面への活性化求電子性基の付加により得られる一次生成物は、側鎖基−ＣＯＯＨ、−ＣＯＣｌ、−ＣＮ、−ＣＨ2ＮＨ2、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ハロゲン、またはＨＣ＝Ｏを有する。これらは下記のとおりに二次誘導体に変換することができる：
0003791930.tif 000025
多核芳香族化合物または多ヘテロ核芳香族化合物または平面状巨大環状化合物の吸着により官能化されたフィブリル
ジリチウムフタロシアニン：  一般に、２個のＬｉ+イオンは、大部分の金属（特に多価）錯体によりフタロシアニン（Ｐｃ）基から置き換えられる。従って、非移動性リガンドと結合した金属イオンによるＬｉ+イオンの置換は、フィブリル表面上に安定な官能性基を配置する方法である。ほとんど全部の遷移金属錯体は、ＰｃからＬｉ+を置き換え、安定で非移動性のキレートを形成する。この金属は、この部位で適当なリガンドとカプリングする。
コバルト（ＩＩ）フタロシアニン
コバルト（ＩＩ）錯体はこの目的に特に適している。Ｃｏ++イオンは２個のＬｉ+イオンと置き換えることができ、これにより非常に安定なキレートが生成される。Ｃｏ++イオンは次いで、ニコチン酸などのリガンドに配位結合する。ニコチン酸は側鎖カルボン酸基を有するピリジン環を含有し、かつまたピリジン基に優先的に結合することが知られている。過剰のニコチン酸の存在下に、Ｃｏ（ＩＩ）ＰｃはＣｏ（ＩＩＩ）Ｐｃに電気化学的に酸化させることができ、ニコチン酸のピリジン分子と非移動性の錯体を形成する。従って、ニコチン酸リガンドの遊離カルボン酸基はフィブリル表面に堅古に結合する。
別種の適当なリガンドは、一末端にアミノ−またはピリジル−分子のどちらかを有し、もう一方の末端にいずれか所望の官能性基を有するアミノピリジン類またはエチレンジアミン（側鎖ＮＨ2）、メルカプトピリジン（ＳＨ）またはその他の多官能性リガンドである。
７．３−次元構造体
酸化フィブリルは未酸化フィブリルに比較して、水性媒質中に容易に分散する。メソ−およびマクロ孔を有する（＞２ｎｍ孔）、安定な有孔３次元構造体は、触媒またはクロマトグラフイ支持体として非常に有用である。フィブリルは個別化して分散させることができることから、架橋結合により安定化される良好に分散されている試料は、このような支持体の構築を可能にする。官能化フィブリルは水性媒質および極性媒質中に容易に分散し、その官能性基が架橋結合部位を提供することから、これらはこの用途にとって理想的である。さらにまた、この官能性基は触媒部位またはクロマトグラフイ用部位を支持する場所を提供する。この結果として、その総表面積を、その上に活性剤を支持するための官能性部位として利用できる、堅古な３次元構造体が得られる。
触媒における、これらの支持体の代表的用途には浸漬により配置される金属触媒用の、例えば貴金属水素添加触媒用の多有孔質支持体としてのそれらの使用が包含される。さらにまた、この構造体の非常に高い有孔性と組み合わされている官能性基を介する支持体への結合により分子状触媒を固定する能力は、均質反応を不均質様相で実施することを可能にする。結合した分子状触媒は基本的に、均質反応器に対するものと同様の連続液相における懸垂（ダングリング（ｄａｎｇｌｉｎｇ））であり、これは均質反応に付随する選択性および速度における利点を利用することを可能にする。しかしながら、固体支持体への結合は活性成分およびかなりの場合に非常に高価な触媒の容易な分離および採取を可能にする。
これらの安定で堅固な構造体はまた、従来非常に困難であった反応、例えば不斉合成または適当なエナンチオマー触媒または選択性基質を支持体に結合させることによるアフィニティクロマトグラフイの実施を可能にする。メタロ（Ｍｅｔａｌｌｏ）−Ｐｃまたはメタロ−ポルフィリン錯体を経る誘導体化はまた、金属イオンに結合したリガンドの回復を可能にし、さらにまたこの二次誘導体を経て、全部の分子をリガンドに結合させることを可能にする。一例として、官能化フィブリルの３次元構造体が電極である場合、あるいは電極の一部である場合、およびまたこの官能化がＣｏ（ＩＩ）Ｐｃの吸着の結果である場合、ニコチン酸の存在におけるＣｏ（ＩＩ）からＣｏ（ＩＩＩ）への酸化が、側鎖基としてカルボン酸を有する非移動性のＣｏ（ＩＩＩ）−ピリジル錯体を生成させる。適当な抗原、抗体、触媒性抗体、またはその他の部位−特異性捕獲剤の結合は、別段では達成が非常に困難である分子の選択的分離（アフィニティクロマトグラフイ）を可能にする。この電極を洗浄して、封入されている物質を除去した後に、標的分子を含有するＣｏ（ＩＩＩ）錯体を電気的に還元し、移動性Ｃｏ（ＩＩ）錯体を採取することができる。標的分子を含有するＣｏ（ＩＩ）上のリカンドは次いで、移動性Ｃｏ（ＩＩ）リカンドの質量作用置換により採取することができ、これにより別段では実施が非常に困難であるか、または高価である分子（例えば、キラル医薬）の分離および採取を行うことができる。
３次元構造体のもう一つの例にはフィブリル−セラミック複合体がある。
製造例Ｒ
アルミナ−フィブリル複合体の製造（１８５−０２−０１）
硝酸酸化したフィブリル１ｇ（１８５−０１−０２）をＤＩ水１００ｃｃ中にＵ／Ｓ崩壊剤を用いて、高度に分散させた。このフィブリルスラリーを９０℃に加熱し、次いでプロパノール２０ｃｃに溶解したアルミニウムトリブトキシド０，０４モルの溶液をゆっくり添加した。還流を４時間継続し、その後コンデンサーを取り除き、アルコールを追い出した。３０分後に、コンデンサーを再度取り付け、このスラリーを１００℃で一夜かけて還流させた。均一な外観を有する黒色溶液が得られた。この溶液を室温で冷却させ、１週間後に、滑らかな表面を有する黒色ゲルを生成した。このゲルを空気中で３００℃に１２時間加熱した。
このアルミナ−フィブリル複合体を、ＳＥＭにより試験した。砕いた表面の顕微鏡写真はゲル中のフィブリルの均一な分散を示した。
製造例Ｓ
シリカ−フィブリル複合体の製造（１７３−８５−０３）
硝酸酸化したフィブリル２ｇ（１７３−８３−０３）をエタノール２００ｃｃ中に超音波処理を用いて高度に分散させた。このスラリーに室温において、エタノール５０ｃｃに溶解したテトラエトキシシラン０．１モルの溶液をゆっくり添加し、次いで濃ＨＣｌ  ３ｃｃを添加した。この混合物を８５℃に加熱し、容積が１００ｃｃに減少するまで、この温度に維持した。この混合物を冷却させ、黒色固形ゲルが生成されるまで放置した。
このシリカ−フィブリル複合体をＳＥＭにより試験した。砕いた表面の顕微鏡写真はゲル中のフィブリルの均一な分散を示した。
ジルコニア、チタニア、稀土類オキシドおよびまたターナリーオキシドなどのその他のセラミックを用いて類似の調製物を製造することができる。
前記説明および例により例示されているように、本発明は広く種々の官能化ナノチューブの形成に用途を有する。
使用されている用語および表現は、説明の用語として使用されており、制限しようとするものではない。これらの用語または表現の使用は、その一部として示され、説明されている特徴に均等なものの全部を排除しようとするものではない。種々の修正が本発明の範囲内で可能であるものと認識される。
発明の好適態様の説明
本発明の分析法には、広く種々のナノチューブを使用することができるが、一般にナノチューブは１．０〜５．０ｇ／ｍｌの密度を有し、好ましくは１．１〜３ｇ／ｍｌの密度を有する。最適密度は当業者の範囲内にあり、重力−駆動分析法における沈降速度は、本分析の速度と電極表面上の錯体の均一層を生成させたいという希望との間の駆け引きである。
広範囲の平均径を有するナノチューブをまた採用することができる。０．００１〜１００μｍの平均径を有する粒子を使用することができ、好ましくは、この粒子は０．０１〜１０μｍの平均径を有する。このナノチューブの長さは、この径の少なくとも５倍である。
アッセイ組成物中の粒子の濃度は広範囲にわたり使用することができる。一例として、この濃度は、１×１０-9〜１×１０-2ｇ／ｍｌ、好ましくは１×１０-8〜１×１０-3ｇ／ｍｌの範囲であることができる。好ましくは、この粒子の密度、それらのサイズおよびそれらの濃度は、粒子が少なくとも０．５ｍｍ／分の速度で、好ましくはさらに早い速度で沈降するように選択する。
本発明の実施における濾過方式において、濾過手段は好ましくは、平均径として測定して、広くは粒子の平均径の０．０１〜９０％、好ましくは粒子の平均径の１０〜９０％である孔サイズを有する。
ナノチューブは、常磁性または強磁性であることができ、かつまた当該磁性粒子を分析に使用できるように、結合性化合物がカッブリングする種々の物質で被覆することもできる。好ましくは、本発明で使用される磁性ナノチューブは、少なくとも０．００１ｃｑｓ単位の感受性、好ましくは少なくとも０．００１ｃｑｓ単位の感受性を有する。磁性ナノチューブは、広範囲の密度を有することができる。すなわち、水の比重よりも実質的に小さい比重、０．０１〜５ｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２ｇ／ｍｌの比重を有する。これらの粒子サイズは０．００１〜１００μｍ、好ましくは０．０１〜１０μｍの範囲であることができる。粒子の濃度は、広くは１×１０-9〜１×１０-2ｇ／ｍｌ、好ましくは１×１０-8〜１×１０-3ｇ／ｍｌの範囲であることができる。
好ましくは、使用される磁性ナノチューブは、例えばＥＰ０，１８０，３８４に記載されているように、低い磁気共鳴性を備え、従って、磁場が電極表面から取り除かれた後に、このナノチューブは脱磁性化し、分析セルから排除することができる。好ましくは、磁性ナノチューブの比重、濃度およびサイズは、沈降時間が少なくとも０．５ｍｍ／分であり、好ましくはこの速度以上であるように選択する。磁性セルの操作では、光電子増倍管の動作を干渉させないために、電気化学的発光を誘発させる前に、電極表面から磁気手段を取り除くことがしばしば望ましい。
分析
本発明の方法を使用して、種々の分析を行うことができる。分析は、官能化カーボンナノチューブを用いて行うことができる。分析には、カーボンナノチューブを使用する加水分解性酵素のＥＣＬ分析が包含される。カーボンナノチューブ（フィブリル）は加水分解性酵素の基質により化学的に修飾される。フィブリルから最も遠い基質の末端をＲｕ（ｂｐｙ）32+の誘導体に結合させた。この固体相の一般構造は、次のとおりである：フィブリル−基質（分裂し易い結合）−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+。分裂し易い結合を分裂させる酵素が存在する場合、この基質のＲｕ（ｂｐｙ）32+末端が酵素の作用により溶液中に放出される。引き続く混合および酵素とのフィブリルのインキュベート後に、このフィブリルを溶液から取り出す（濾過または遠心分離による）。残留する溶液のＥＣＬを測定する。酵素が存在する場合、基質のＲｕ（ｂｐｙ）32+末端は溶液中に存在し、光を発生する。従って、特定の酵素の存在は、この混合物の溶液相からの発光をもたらす。この分析は、抗体を包含しないことからプロテアーゼ用の新規ＥＣＬ分析法である（イムノアッセイではない）。従って、この方法は酵素の存在による分析法というよりはむしろ、酵素活性による分析法であるという利点を有する。さらにまた、この分析法は、固体支持体としてフィブリルを使用する。フィブリルは、それらの広い表面積を有し、かつ酵素基質などの生体分子の結合に対する従順性を有することから、魅力的である。さらにまた、官能化フィブリルは流動性膜（ｍａｔ）に形成することができる。酵素混合物を急速に流動させ、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+を放出させることができ、これにより分析は迅速にかつまた容易にされる。
フィブリルおよびＥＣＬを用いるＤＮＡプローブ分析を行った。カーボンナノチューブ（フィブリル）は、生物学的液体および添加試薬を含有することができる複合混合物からアナライトを分離するための分離手段としてのＤＮＡプローブ分析において固体支持体として使用した。フィブリルは共有結合により（ＮＨＳエステルを介する）、またはアルキルフィブリルへの吸着により、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）［またはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）］により修飾した。このアビジンフィブリルにビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ｓｓＤＮＡ（これはアナライトである）を結合させ、次いでＲｕ（ｂｐｙ）32+で標識した補足一重鎖オリゴヌクレオチドのＥＣＬによって検出した。
天然（非ビオチニル化）ＤＮＡ断片を検出するための方式の一つに、競合方式があり、この方式では、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識したオリゴを天然ＤＮＡまたは導入されたビオチニル化ＤＮＡのどちらかに結合させることができる。従って、存在するアナライトが多いほど、ビオチニル化ＤＮＡに結合するために残留する標識したオリゴは少なくなる。ビオチニル化ＤＮＡはアビジンフィブリル上に捕獲されると、ＥＣＬシグナルを発する。
これはＤＮＡ分析に使用された最初のカーボンナノチューブである。その利点には、（１）カーボンナノチューブは非常に大きい表面積を有し、これは必要な固体支持体の量が別種の固体支持体よりも少ないことを意味する。（２）フィブリルは電導性であり。これはＥＣＬ用途における固体支持体として魅力的な性質であり、この場合、固体支持体は電極に支持される。電導性である場合、電導性ではない別種の支持体に比較して、表面積が大きいほど、電気化学的容量は大きくなる。
カーボンナノチューブ（フィブリル）に不動化した抗体を使用するＥＣＬに基づくイムノアッセイは有利である。抗体フィブリルは競合性イムノアッセイ方式（この場合、アナライトとＲｕ（ｂｐｙ）32+−標識したアナライトとの間に、抗体フィブリルへの結合にかかわり競合が生じる）、あるいはサンドイッチ方式（この場合、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識した二次抗体は抗体フィブリル−アナライト複合体に結合する）において、ＥＣＬ用途に使用することができる。両方の場合に、ＥＣＬ発光は対象のアナライトの存在または不存在にかかわる信号を発生する。抗体は数種の相違する方法によって、共有手段または非共有手段によって、フィブリル上に不動化することができる。非共有不動化の場合、抗体は未修飾フィブリル上に、または吸着特性を増大させるために修飾されているフィブリル上に吸着させる。このような修飾フィブリルは疎水性の付加基（アルキル鎖またはフェニル−アルキル鎖）を有する。フィブリル上への抗体の共有不動化は、３種の相違する方法により達成することができる：すなわちカルボキシル化フィブリルのＮＨＳエステル活性化により、抗体炭水化物基の還元的アミノ化により、および還元された抗体またはマレイミド−修飾された抗体と反応するスルフヒドリル／マレイミドフィブリルにより達成することができる。カーボンフィブリル上への抗体の不動化は有利である。抗体フィブリルは抗体用の別種の固体支持体に比較して、多くの特異な性質を有する。これらの利点には、大きい表面積／重量、電導性（特にＥＣＬ用途において）、ならびに化学的および物理的安定性が包含される。
カーボンナノチューブをＥＣＬに基づくバイオセンサーとして使用した。二官能性フィブリルを製造した。この場合、酵素補因子ＮＡＤ+の誘導体を一方の官能性基に結合させ、かつまたＲｕ（ｂｐｙ）32+の誘導体をもう一方の官能性基（ＣＯＯＨ）に結合させた。このバイオセンサーフィブリルを、アナライト（この場合、デヒドロゲナーゼ、Ｇ６ＰＤＨ）含有溶液と混合し、次いでこのデヒドロゲナーゼの基質（この場合、グルコース−６−ホスフェート）を添加した。その基質との反応およびフィブリル上のＮＡＤ+のＮＡＤＨへの変換に適する時間の後に、このフィブリルのＥＣＬをＥＣＬ装置で測定した。バイオセンサーフィブリルのＥＣＬ性質における変化は、酵素、Ｇ６ＰＤＨ、の存在を示した。次の利点が見出された：（１）共反応剤であるＮＡＤ+とＲｕ（ｂｐｙ）32+との密接な近似関係は分子外ＥＣＬ反応をもたらし、これは分子内ＥＣＬ反応に比較して効果的である。（２）ＥＣＬ活性試薬（ＮＡＤ+およびＲｕ（ｂｐｙ）32+共反応剤）はフィブリル上に不動化され、これによりＥＣＬ電極に磁性により引きつけられるか、または沈降することが可能になり、際立った発光が得られる。（３）フィブリルは格別に大きい表面積を有しており、従って大量の共反応剤（ＮＡＤ+およびＲｕ（ｂｐｙ）32+）を不動化させることができ、これにより理論的には、デヒドロゲナーゼ検出中の光発生量が増加される。（４）フィブリルは電気的に伝導性であり、バイオセンサーが電極に達すると、電極と実際には接触していないそれらの表面積のより広い部分が電圧を受けることができ、特にＥＣＬ反応においてそうである。（５）バイオセンサーを、補因子としてＮＡＤ+またはＲｕ（ｂｐｙ）32+のどちらかを用いるデヒドロゲナーゼ検出用にデザインすることができる。これらの酵素のかなりが存在し、本発明を用いて検出できた。
カーボンフィブリルを酵素バイオセンサー用の固体支持体として使用した。この酵素バイオセンサーは溶解性であることから、不動化しない限り１回でのみ使用することができる（不動化はアナライト溶液からの回収を可能にする）。米国出願ＳｅｒｉａｌＮｏ．０８／４６７，７１２は、固体支持体への、および（固体）電極への不動化を開示し、特許請求している。この出願は、固体支持体としてのカーボンフィブリルの使用を示している。この酵素バイオセンサーは、吸着によりフィブリルに結合させることができる。このフィブリルは未修飾フィブリルであるか、あるいは好ましくは化学的に修飾されたフィブリルである。このフィブリルの化学的修飾は好ましくは、アルキル化である。バイオセンサーの吸着は、酵素バイオセンサーとアルキル化フィブリルとを混合しながらインキュベートすることによって行われる。固体支持体としてのフィブリルは新規であり、かつまた次の利点を有する：（１）これらは強力な多大な発光をもたらす不動化された大きい表面積を有する；（２）バイオセンサーなどの蛋白質は、共有化学性によることなく、共有的に吸着される；（３）フィブリルは電導性であり、電極と接触させると、ＥＣＬを際立たせることができる；（４）フィブリルそれら自体を電極に形成することができ、この場合、電極それ自体がバイオセンサー支持体になる。
磁気感受性粒子は、分離用デバイスとして有用である。例えば、複合混合物からの特定のアナライトの分離は、血液などのようにアナライトが複合した混合物中に存在する診断分野で有用である。この複合混合物はアナライトの分析を干渉することがあることから、固体表面にアナライトを結合させ、これにより複合混合物をアナライトから洗出することができ、その測定が可能にされることは望ましいことである。所望のアナライトを磁気感受性粒子に特異的に結合させることができる場合、この粒子は磁気により保持することができ、従って複合混合物からのアナライトの洗出が可能になり、このアナライトを次いで、検出することができる。フィブリルは生体分子を特異的に、かつまた効果的に結合することができる粒子であることから、磁気感受性フィブリルは、特にＥＣＬ分析における固体相分離デバイスとして有利に使用される。フィブリルは予備処理により、例えば化学反応またはこれらを懸濁する溶媒の変更により（例えば、水からＤＭＦに）、磁気感受性にすることができる。）このような操作は多数のフィブリルの物理的凝集における変化を生じさせるものと考えられる。フィブリルはそれらの中に、若干（約０．５重量％）の鉄を含有し、一旦凝集すると、実質的に磁気感受性になる。フィブリルの磁気感受性を増大させる数種の処理を行った。これらの処理は、フィブリルの凝集性に変化を生じさせ、この変化は次いで、磁気への効果的な吸引を生じさせるものと推定される。磁気感受性フィブリルは、少なくとも二つの特異な利点を有する。すなわち、少ない必要量りフィブリルを使用して、同一結果が得られる［例えば、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）ビーズに比較して］。第二に、これらは磁気感受性粒子を電極に保持するＥＣＬなどの用途において利点を有する。すなわち、電導性であることから、これらは実際に、電極の一部になり、これにより光発生量が増大される。
例
（１）装置
図１および２に記載されているような３個の電極を使用する一貫生産装置（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用した。
作用電極  −−Ａｕディスク、３ｍｍ径
対極      −−Ａｕディスク、３ｍｍ径
基準電極  −−Ａｇ／ＡｇＣｌ
テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）ガスケット（０．１５″厚さ）
ブレキシガラス  フェースプレート
導入管＝０．０４２″ｉｄ  ポリプロピレン
吸引速度：０．０１ｍｌ／分から５ｍｌ／分まで可変性
ポテンショスタット：マイクロプロセッサー制御
ハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）Ｒ３７４ＰＭＴ（低ゲイン赤色感受性管）を使用する輝度測定計；ＰＷＴ電圧：０〜１４００Ｖで可変性
（２）ＥＣＬ測定回路（３電極セル操作）
ＥＣＬ測定回路は３段階からなる：
（１）予備コンディショニング；（２）測定；および（３）クリーニング。
予備コンディショニング工程は２．０Ｖ／秒において、０．０Ｖ  −  ＋２．２Ｖ  −  −１．０Ｖ  −  ＋０．６Ｖの電圧三点波形（ｖｏｌｔａｇｅ  ｔｒｉａｎｇｌｅ  ｗａｖｅ）の印加を包含する。測定工程は、１．０Ｖ／秒において、＋０．６Ｖ  −  ＋２．８Ｖ  −  ＋２．０Ｖの三点波形の印加を包含する。クリーニング工程は、＋０．０Ｖから＋３．０Ｖ  −  −０．５Ｖ  −  ０．０Ｖの電圧四点波形（ｖｏｌｔａｇｅ  ｓｑｕａｒｅ  ｗａｖｅ）の印加を包含する。全部の電圧は、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対するものである。
例１
ルテニウムタグペプチドフィブリルの合成
本例は、ＥＣＬアナライザーにおける酵素検出試薬の合成を示している。
ルテニウムペプチドフィブリルの合成：
ＦｍｏｃＮＨ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｎε−ＣＢＺ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨのテトラペプチドを慣用の溶液相方法により合成し、このペプチド（７１ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）を、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（７３ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）の一級アミン誘導体化合物と反応させ、ＥＤＣ（１７．８ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）を活性化試薬として使用し、そしてＨＯＢＴ（１２．５８ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）を触媒として使用した。生成物、ＦｍｏｃＮＨ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｎε−ＣＢＺ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＣＯ−ＮＨタグ（１７０ｍｇ、０．２２３ｍｍｏｌ）をピペリジン（９６ｍｌ）およびメチレンクロリド（１．１ｍｌ）により脱保護化した。このテトラペプチド−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+化合物の構造は、１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。このテトラペプチド−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+（５ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）のメチレンクロリド（２ｍｌ）溶液に、カルボキシルフィブリル（５４ｍｇ）を添加した。次いで、ＥＤＣ（５．８ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を一夜にわたり撹拌した。このフィブリルを水、メタノール、アセトニトリルおよびメチレンクロリドにより徹底的に洗浄した。生成したフィブリルを４０℃で３時間、アセトニトリル（４ｍｌ）中のトリメチルシリルヨウダイド（ＴＭＳＩ、１ｍｌ）で処理した。この最終生成フィブリルを水、メタノール、アセトニトリル、ＩＧＥＮ標準ＥＣＬ分析用緩衝液（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）およびメチレンクロリドにより徹底的に洗浄した。
例２
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識したペプチドフィブリルを用いるトリプシンおよびキモトリプシン活性のＥＣＬ分析
Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識したテトラペプチド（ＮＨ2−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+）を、例１に記載のとおりにカルボキシル化フィブリルに結合させた。このＲｕ（ｂｐｙ）32+−標識したペプチドフィブリル（ＲＰＦ）を使用して、加水分解性酵素トリプシンおよびキモトリプシンの活性を検出した。簡単に説明すると、これらの酵素のどちらか、または両方を含有する水性溶液にＲＰＦを添加した。このペプチドはトリプシンおよびキモトリプシンの両方に対する特異的分裂部位を含有するようにデザインされていることから（図３）、およびまたこのフィブリルは固体であることから、酵素の作用は、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+（トリプシン）またはＧｌｙ−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+（キモトリプシン）のどちらかを溶液中に遊離させる。この固体相ペプチドを酵素が分裂させるのに適するインキュベーション時間の後に、遠心分離、濾過または磁気によるフィブリルの分離などの標準的手段により、フィブリルから水性溶液を分離した。この水性溶液中に遊離したＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+またはＧｌｙ−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+を次いで、ＥＣＬにより検出した。
トリプシンおよびキモトリプシンの分析をここで説明したが、その他の加水分解性酵素を、相当するＲｕ（ｂｐｙ）32+−標識した酵素基質に結合させたフィブリルを用いて検出することができた。このような酵素（および修飾フィブリル）には下記のものが包含される：ヌクレアーゼ（Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識したＲＮＡ、一重鎖ＤＮＡ、または二重鎖ＤＮＡに結合させたフィブリルを使用する）、グリコシダーゼ（Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識した糖、オリゴサッカライド、またはポリサッカライドに結合させたフィブリルを使用する）、あるいはリパーゼ（Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識した脂質に結合させたフィブリルを使用する）。
例３
フィブリルを使用するトリプシンのＥＣＬ検出
標準ＥＣＬ分析用緩衝液（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中のＲＰＦ（フィブリル−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+）の懸濁液（２．２ｍｇ／ｍｌ）２．９７ｍｌに、１ｍＭ  ＨＣｌ中の５８．９μＭトリブシン（最終濃度＝０．５９μＭ）３０μＬまたは１ｍＭ  ＨＣｌ  ３０μＬのどちらかを添加した。これら２つの懸濁液を次いで、室温で回転させた。定期的に回転を止め、懸濁液を迅速に遠心分離し、次いでこの水性上清のＥＣＬを測定した。３０分のインキュベーション後のＥＣＬ結果は、試料のＥＣＬ比（トリプシン含有ＥＣＬ／トリプシン非含有ＥＣＬ）は１．２９であったことを示した。４４時間後、このＥＣＬ比は２．０５であった。これらの結果は、フィブリルからの電気化学ルミネセンスのルテニウム標識の加水分解的遊離に対するその能力によって、トリプシンを検出できたことを証明している。
例４
フィブリルを使用するキモトリプシンのＥＣＬ検出
標準ＥＣＬ分析用緩衝液（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中のＲＰＦ（フィブリル−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｒｕ（ｂｐｙ）32+）の懸濁液（０．１５ｍｇ／ｍｌ）２．９７ｍｌに、１ｍＭ  ＨＣｌ中の３４．２μＭキモトリプシン（最終濃度＝０．３４μＭ）３０μｌまたは１ｍＭ  ＨＣｌ  ３０μｌのどちらかを添加した。これら２つの懸濁液を室温で回転させた。定期的に回転を止め、懸濁液を迅速に遠心分離し、次いでこの水性上清のＥＣＬを測定した。試料の初期（時間＝０）ＥＣＬ比（キモトリプシン含有ＥＣＬ／キモトリプシン非含有ＥＣＬ）は１．０６であったことを示した。３０分のインキュベーション後に、この比は１．２５に上昇し、そして２３時間のインキュベーション後に、この比は１．８５に上昇した。これらのデータは、フィブリル固体支持体から電気化学ルミネセンスの標識、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+、を遊離させるこの酵素の能力によって、キモトリプシン活性を検出できたことを示している。
例５
ＮＨＳエステルを経るフィブリルへの蛋白質の共有結合
蛋白質がＮＨＳエステルを介してフィブリルに共有結合することができることを証明するために、フィブリルに、ストレプトアビジン、アビジンおよびトリプシンを結合させた。
ＮＨＳ−エステルフィブリル０．５ｍｇを、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．１）で５回洗浄し、その上清は廃棄した。このフィブリルに、２００μｌストレプトアビジン溶液（同一緩衝液中の１．５ｍｇ）を添加し、この混合物を室温で５．５時間回転させた。このフィブリルを次いで、下記緩衝液１ｍｌにより順次洗浄した：５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．１）、ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）、ＯＲＩＧＥＮ分析用緩衝液（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）およびＰＢＳ。このストレプトアビジンフィブリルは、さらに使用するためにＰＢＳ緩衝液中で保存した。
ＮＨＳ−エステルフィブリル２．２５ｍｇを、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．１）５００μｌ中で４０分間、音波処理し、その上清は廃棄した。このフィブリルを、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．１）５００μｌ中に懸濁し、次いで同一緩衝液中にアビジン２ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，Ａ−９３９０）を含有するアビジン溶液３００μｌを添加した。この混合物を室温で２時間回転させ、４℃で一夜保存し、次いで室温でさらに１時間回転させた。このフィブリルを、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．１）１ｍｌで４回およびＰＢＳ緩衝液１ｍｌで２回、洗浄した。このアビジンフィブリルをＰＢＳ緩衝液２００μｌ中に懸濁し、保存した。
トリプシンフィブリルは、ＮＨＳ−エステルフィブリル１．１ｍｇ（アビジンフィブリルの場合と同様に処理した）および５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．１）中の１．０６ｍＭトリブシン溶液２００μｌを混合し、次いで室温で６．５時間回転させることによって製造した。このトリプシンフィブリルを次いで、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．１）１ｍｌで３回洗浄し、同一緩衝液４００μｌ中に懸濁して保存した。
例６
ＥＣＬアナライザーを用いるＤＮＡプローブ分析
ＥＣＬ分析法において、ストレプトアビジン（またはアビジン）結合フィブリルに対するアナライトの非特異的結合を排除するために、これらのフィブリルを４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液により室温で６時間、次いで４℃で一夜かけてブロックした。
ＤＮＡプローブ分析法は図４に示されている。この実験はＢＳＡブロックしたアビジン−フィブリルおよびストレプトアビジン−フィブリル（例５から）１１５μｌを５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．１）で２回洗浄することから開始した。各フィブリルを同一緩衝液１００μｌ中の〜５７μｇで、２本の管に適量分割した。（ストレプト）アビジンフィブリルの１本の管は、ルテニウムタグで標識したオリゴマーに結合させた４ｎＭビオチニル化ＤＮＡ（７０ヌクレオチド）４μｌと混合した。もう１本の管には、対照分析用に、ルテニウムタグで標識したオリゴマー（ビオチニル化ＤＮＡ試料と同一濃度）４μｌを添加した。これらの反応混合物を室温で１５分間インキュベートし、次いでＯＲＩＧＥＮ分析用緩衝液（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）３００μｌで７回洗浄した。このフィブリルを次いで、ＯＲＩＧＥＮ分析用緩衝液６００μｌ中に懸濁し、フィブリルの重力捕獲を用いて２本の管に等量分割し、デュプリケートＥＣＬ計測した。ＥＣＬ分析結果を下記にまとめて示す：
0003791930.tif 000026
アビジンフィブリルの同一分析をまた、フィブリルの磁気捕獲を用いて行った。この実験方法は、ＤＮＡをフィブリルに結合させた後に洗浄しないことを除いて、上記と同一であった。この試料をプログラムされた工程に従いＥＣＬアナライザーで洗浄した。ＥＣＬ計測値は、アビジンフィブリルＤＮＡプローブについて、３８３５であったのに対して、対照では２０５であった。
Ｃ８−フィブリル上に吸着したアビジンをまた、上記フィブリルの磁気捕獲を用いるＤＮＡプローブ分析法により試験した。ＥＣＬ計測値は、アビジンフィブリルＤＮＡプローブについて、１５，７９２であったのに対して、対照では２０５であった。
例７
カーボンナノチューブ上への抗体の共有不動化
本例の目的は、カーボンナノチューブの表面上に抗体を不動化することにある。このような抗体−修飾したナノチューブは特定のアナライトのイムノアッセイ検出および生体特異性アフィニテイ分離を包含する種々の用途で使用することができる。イムノアッセイは、抗体−修飾したナノチューブを固体支持体として使用して行うことができる。固体支持体が固定されているか、あるいは別の手段で溶液相から分離されている（例えば、濾過、遠心分離または磁化による）場合、固体支持体の使用は洗浄工程を可能にする。洗浄工程の使用は、かなりの型式の電気化学的発光に基づくイムノアッセイにおける抗体−修飾ナノチューブの使用を可能にする。この抗体−修飾ナノチューブは常用されている磁性ビーズの代わりに使用することができ、あるいは濾過により捕獲することができる感受性支持体としてまたは永久固定支持体イオンの廃棄できるカートリッジとして使用することができる。
一級アミン基とカルボキシル基との間のフィブリル−抗体カプリング
ＮＨＳエステルフィブリルの生成
ＣＨ2Ｃｌ2／ジオキサン混合物中のカーボンフィブリル（Ｈｙｐｅｒｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）１４８．４ｍｇの懸濁液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）２３９ｍｇおよびＥＤＣ３９９ｍｇと混合し、反応を４時間進行させた。生成するＮＨＳエステル−修飾フィブリル（ＮＨＳ−フィブリル）の収量は２１４．７ｍｇであった。
抗体−修飾フィブリルの生成
ＮＨＳエステルフィブリル（８４．５ｍｇ）を、カプリング用懸濁液（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．１）１．０ｍｌで予備処理し、次いで追加の１．０ｍｌのカプリング用懸濁液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に懸濁した。このフィブリルに、モノクローナル抗体（抗−グルコースオキシダーゼ）（カプリング用懸濁液２ｍｌ中の１．５ｍｇ）を添加し、この懸濁液を１時間回転させ、ＮＨＳフィブリルを抗体と（主として、抗体のリジン側鎖基と）反応させた。生成するフィブリルを濾過し、次いでカプリング用懸濁液で反復洗浄した。
抗体−修飾フィブリルへのグルコースオキシダーゼの結合
抗体−修飾フィブリルの未抗体被覆部位を、リン酸塩緩衝塩類溶液（ｐＨ６．０）中に溶解した１％ＢＳＡとともに１０分間回転させることによってブロックした。グルコースオキシダーゼはＢＳＡ溶液に溶解し、この溶液を１．５時間、フィブリルと混合した。最後に、このフィブリルを、２８０ｎｍにおける流出液の電気化学的追跡によって蛋白質の流出が見られなくなるまで、中性ｐＨリン酸塩緩衝液により洗浄した。
抗体−修飾フィブリル上の抗体の検出
フィブリル上の官能性抗体分子は、結合した抗原、グルコースオキシダーゼの触媒的活性により量的に測定した。グルコースオキシダーゼ活性は、酵素試料（遊離の酵素または抗体−修飾フィブリルに特異的に結合した酵素）を、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、２０μＭグルコース、１８３ｎＭホースラディッシュペルオキシダーゼ、および３０μＭ  ２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を含有するキュベットに添加することによって分光光度を測定した。グルコースオキシダーゼ活性は、２５℃で４１４ｎｍにおける吸光率の増加（緑色の発現）を分光光度測定によって測定した。結合酵素の定量は、フィブリル１グラムあたり１．５２μｍｏｌｅの官能性抗体の存在を示した。
一級アミン基と炭化水素基との間のフィブリル−抗体カプリング
アミノフィブリルの生成
新しく調製した０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．１）中のＮＨＳ−フィブリル（２１４．７ｍｇ）の懸濁液を、室温で１，２−ジアミノエタン（１００μＬ）と混合した。この懸濁液を、約５時間撹拌した。この混合物を次いで、ブックナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）ロトで吸引濾過し、次いで水（３×１０ｍｌ）およびメタノール（３×１０ｍｌ）で洗浄し、次いで減圧で一夜かけて乾燥させた。アミノフィブリルの収量は１４４ｍｇであった。ニンヒドリン試験は、ジアミノエタン（未結合）が依然としてフィブリルに吸着されていることを示した。フィブリルを水中に再懸濁し、９０分間音波処理した。ニンヒドリン試験は、フィブリルが未−共有結合アミンを実質的に含有していないことを示した。
抗体−修飾フィブリルの生成
ＮＡＰ−５カラムを１００ｍＭアセテート（ｐＨ５．５）で平衡化し、次いでモノクローナル抗体（抗−グルコースオキシダーゼ、緩衝液３００μｌ中の１．５ｍｇ）を添加し、次いで緩衝液で溶離した。この溶液を室温で２時間、２０ｍＭ  ＮａＩＯ4  ５０μｌと反応させた（最終ＮａＩＯ4濃度＝１ｍＭ）。予め平衡化したＮＡＰ−１０（０．１５Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．０）に添加することによって反応を中断させ、次いで同一緩衝液で溶離した。この溶離液をアミノフィブリル含有１０−ｍｌ管内に採取し、この懸濁液を２〜３時間反応させた。このフィブリルを次いで、反応緩衝液で洗浄し、次いで５ｍｌ  ＫＨ2ＰＯ4、（ｐＨ５．５）中で保存した。
抗体−修飾フィブリル上の抗体の検出
フィブリル上の官能性抗体分子を、上記のとおりに、結合した抗原、グルコースオキシダーゼの触媒活性により定量した。結合した酵素の定量は、フィブリル１グラムあたり０．３６μｍｏｌｅの官能性抗体の存在を示した。
マレイミド基とスルフヒドリル基との間のフィブリル−抗体カプリング
0003791930.tif 000027
マウスモノクローナル抗体の還元
抗体溶液（２．８ｍｌ中の２４．７ｍｇ）に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、２５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、次いでこの混合物を室温で１時間インキュベートした。この還元された抗体を、ＰＤ−１０廃棄性ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製した。
抗体とマレイミドフィブリルとの共有カプリング
マレイミドフィブリル（０．１８ｍｇ）および生のフィブリル（０．１５ｍｇ）を室温で１５分間、音波処理し、次いで４０℃で３０分間インキュベートした。このフィブリルを次いで、遠心分離し、この上清は除去した。このフィブリルを次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＭ７．２、１．１ｍｌ）中の還元抗体（１２．４ｍｇ）とともに室温で４時間インキュベートした。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識したヤギ抗−マウス抗体を用いる抗体フィブリル上の抗体の定量
マウス抗体フィブリルは、リン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５、１ｍｌ）中の０．１％ＰＥＧとともに４０℃で３０分間、予備インキュベートした。これらを次いで、遠心分離し、上清は除去した。マウス抗体フィブリル（０．０１ｍｇ）を、０．１％ＰＥＧを含有するリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５、５００ｍｌ）中のＨＲＰ−標識したヤギ抗−マウス抗体（０．０１ｍｇ）とともに、室温で２時間インキュベートした。このフィブリルを次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５、１ｍｌ）中の０．１％ＰＥＧで５回洗浄した。結合したＨＲＰの量は、結合した酵素の触媒活性を分光光度測定により測定した。この酵素反応を下記に示す：
0003791930.tif 000028
この結果は、フィブリル上のマウス抗体の密度が１．８４ｍｇ抗体／１ｇフィブリルであり、そして生の（対照）フィブリル上のマウス抗体の密度が０．４８ｍｇ抗体／１ｇフィブリルであることを示した（非特異性結合の程度は約２６％であった）。
例８
リジンの付加による二官能性フィブリルの製造
Ｎα−ＣＢＺ−Ｌ−リジンベンジルエステルの合成
この反応順序は、図５に示されている。Ｎε−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジン（２ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）を、メタノール（４０ｍｌ）および水（４０ｍｌ）に溶解し、次いでトリエチルアミンによりｐＨ８に調整した。上記混合物に、ジオキサン中のＮ−（ベンジルオキシカルボニル−オキシ）スクシンイミドの溶液（２．４ｇ、２０ｍｌ中の９．７ｍｍｏｌ）を添加し、次いでトリエチルアミンによりｐＨを８〜９に維持した。この反応混合物を一夜にわたり撹拌した。溶媒をロータリエバポレーターにより除去し、粗製Ｎα−ＣＢＺ−Ｎε−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジンを得た。このＮα−ＣＢＺ−Ｎε−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジンを、０．２Ｍ炭酸カルシウム（４ｍｌ）で処理し、次いでその水性層を除去し、白色固形物を得た。この固形物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍｌ）およびベンジルブロマイド（１．１６ｍｌ）中に再懸濁した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。この反応混合物を酢酸エチルおよび水を用いて仕上げ処理し、その有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を分離し、粗製Ｎα−ＣＢＺ−Ｎε−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジンベンジルエステルを得た。この生成物はシリカゲルクロマトグラフイにより、酢酸エチル中２５％ヘキサンを溶剤として使用して精製した。メチレンクロリド（１０ｍｌ）中のＮα−ＣＢＺ−Ｎε−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジンベンジルエステル（１ｇ、２．２ｍｍｏｌ）に、０℃で三フッ素化酢酸を添加した。この反応混合物を０℃で１０分間撹拌し、次いで室温でさらに２．５時間撹拌した。溶剤を除去し、粗製生成物を得た。純粋なＮα−ＣＢＺ−Ｌ−リジンベンジルエステルを、シリカゲルクロマトグラフイにより得た。
Ｎα−ＣＢＺ−Ｌ−リジンベンジルエステルフィブリルの合成
メチレンクロリド（１８ｍｌ）中のカルボキシルフィブリル（３００ｍｇ）の懸濁液に、Ｎα−ＣＢＺ−Ｌ−リジンベンジルエステルの溶液（メチレンクロリド２０ｍｌおよびトリエチルアミン１７６μｌ中の１４８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ＨＯＢＴ（４３．３ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（６１．３ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌し、粗製生成物を得た。生成フィブリルを、メタノール、メチレンクロリドおよび水により徹底的に洗浄し、次いで減圧乾燥させた。
二官能性フィブリルＦｉｂ−Ｌｙｓ（ＣＯＯＨ）ＮＨ2の合成
メタノール（４ｍｌ）中のＮα−ＣＢＺ−Ｌ−リジンベンジルエステルフィブリル（１１３ｍｇ）に、水酸化ナトリウム（１Ｎ、４ｍｌ）を添加し、この反応混合物を一夜にわたり撹拌した。生成物Ｎα−ＣＢＺ−Ｌ−リジンフィブリルを、水およびメタノールで徹底的に洗浄し、このフィブリルを減圧乾燥させた。アセトニトリル（４ｍｌ）中のＮα−ＣＢＺ−Ｌ−リジンフィブリル（５０ｍｇ）の懸濁液に、トリメチルシリルヨウダイド（１ｍｌ）を添加した。この混合物を４０℃で３時間撹拌した。最終二官能性フィブリルを水、メタノール、０．５Ｎ水酸化ナトリウム、アセトニトリルおよびメチレンクロリドで徹底的に洗浄した。アミノ酸分析は、フィブリル１グラムあたりリジン０．３μｍｏｌを示した。
本明細書に記載の方法と同様の方法により、セリン、スレオニンまたはチロシンを使用して、ヒドロキシルおよびカルボキシル（またはアミノ）二官能性フィブリルを製造することができる。チオール化したカルボキシル（またはアミノ）二官能性フィブリルは、システインを用いて製造することができる。カルボキシルおよびアミノ二官能性フィブリルは、アスパラギン酸またはグルタミン酸を使用して製造することができる。
例９
ＥＣＬに基づくバイオセンサーとしてのカーボンナノチューブ
メチレンクロリド（８ｍｌ）中の二官能性フィブリル（１１３ｍｇ）の懸濁液に、４−（ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１９．５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、３３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加した（図６）。この混合物を５分間撹拌し、次いで４−メチル−４′−（８−ヒドロキシオクチル）−２，２′−ビピリジン（４７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。生成する生成物フィブリルを、ＤＭＦ、５０％水中ジオキサン、メタノールおよび水で徹底的に順次洗浄した。このフィブリルを、エタノール（４ｍｌ）と水（４ｍｌ）との混合物中に懸濁し、次いでシス−ジクロロビス（２，２′−ピピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ジハイドレート（４５．２ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を１１０℃で５．５時間還流させた。このルテニウム錯体−修飾したフィブリルを、水、飽和ＥＣＬ分析用緩衝液（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、トルエン、５０％水中ジオキサンにより徹底的に洗浄し、次いでアセトニトリル、エチレングリコールおよびメタノール中で順次還流させた。このルテニウム錯体−修飾フィブリルを、４０℃で４時間、アセトニトリル（４ｍｌ）中のＴＭＳＩ（４ｍｌ）と反応させ、ＣＢＺ基を脱保護化し、次いでメタノール、水および水酸化ナトリウム（１Ｎ）により洗浄した。最終生成物は減圧乾燥させた。このフィブリルを次いで、メチレンクロリド（５ｍｌ）中に懸濁し、次いでトリエチルアミン（５滴）を添加した。この懸濁液に、無水コハク酸（４０ｍｇ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌し、次いで生成物をメチレンクロリド、メタノールおよび水で洗浄し、次いで減圧乾燥させた。このカルボン酸／ルテニウム錯体−修飾フィブリルをジオキサン（５ｍｌ）中に再懸濁し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍｇ）およびＥＤＣ（１６７ｍｇ）を添加した。この反応混合物を、室温で４時間撹拌した。生成するＮＨＳエステル／ルテニウム錯体−修飾フィブリルを、ジオキサンおよびメタノールで洗浄した。このＮＨＳエステル／ルテニウム錯体−修飾フィブリルを、ジオキサン（２ｍｌ）中に再懸濁し、次いで重炭酸ナトリウム中のＮＡＤアナログの溶液（０．２Ｍ、ｐＨ８．６  ＮａＨＣＯ3  ２ｍｌ中の７５ｍｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。このフィブリルを次いで、水、重炭酸ナトリウム（０．２Ｍ）およびメタノールにより徹底的に洗浄し、次いで減圧乾燥させ、バイオセンサーフィブリルを得た。
例１０
ＥＣＬに基づくバイオセンサーとしてのカーボンナノチューブの使用
ＥＣＬに基づくバイオセンサーは、フィブリルの化学的修飾によって製造した。
この修飾フィブリルは、ＮＨ2／ＣＯＯＨ二官能性フィブリル（例８）を用いて製造した。１個の官能性基（ＮＨ2）に、ＮＡＤ+アナログを付加し、そしてもう１個の官能性基（ＣＯＯＨ）に、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+の誘導体を付加した。このバイオセンサーフィブリルの構造を図７に示す。
このバイオセンサーは、補因子としてＮＡＤ（Ｐ）+／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを受け入れるデヒドロゲナーゼ酵素および補因子としてＮＡＤ（Ｐ）+／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを受け入れるデヒドロゲナーゼ酵素の基質の検出を際立たせるようにデザインした。ＮＡＤ（Ｐ）+およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+ＥＣＬを促進させる能力について劇的に相違する能力を有することは知られている（Ｅ．Ｊａｍｅｉｓｏｎ等によるＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，印刷中）。すなわち、デヒドロゲナーゼの活性は、そのＮＡＤ（Ｐ）+／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを還元／酸化する能力により検出することができ、この検出はＲｕ（ｂｐｙ）32+電気化学ルミネセンスを生じさせるＮＡＤ（Ｐ）+およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの能力の差異によって見出すことができる（図８）。同様に、デヒドロゲナーゼのそれらの基質に対する作用は、ＮＡＤ（Ｐ）+のＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの変換またはＮＡＤ（Ｐ）ＨのＮＡＤ（Ｐ）+への変換によって化学量論的に行われることから、それらの基質の存在がまた、電気化学的発光によって検出できる。
フィブリル支持されているＥＣＬに基づくバイオセンサーを使用するためには、このバイオセンサーを、デヒドロゲナーゼおよび未知量のデヒドロゲナーゼ基質（この基質はアナライトである）を含有する水性溶液、またはデヒドロゲナーゼ基質および未知量のデヒドロゲナーゼ（このデヒドロゲナーゼはアナライトである）を含有する水性溶液と混合する。酵素反応を進行させ、フィブリル上に不動化されているＮＡＤ（Ｐ）+またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを還元または酸化させるのに適当なインキュベーション時間の後に、このフィブリルをＥＣＬ装置に採取し、次いでフィブリルのＥＣＬを測定する。ＥＣＬ測定は、相当する濃度のトリプロピルアミンを含有していない緩衝液中で行う（これは、ＮＡＤ（Ｐ）+／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが本発明においてトリプロピルアミン置換体であることによる）。
このＥＣＬに基づくバイオセンサーは次の利点を有する：電気化学的ＥＣＬメカニズムにおける電子移動効率を増大させるフィブリル上の同一二官能性基上のＮＡＤ（Ｐ）+／ＮＡＤ（Ｐ）ＨとＲｕ（ｂｐｙ）32+とは密接した近似性を有する（分子外電子移動は分子内電子移動に比較して、効率が高い）；ＥＣＬ活性試薬、ＮＡＤ（Ｐ）+／ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＲｕ（ｂｐｙ）32+は両方ともに、ＥＣＬ装置の電極上に磁気的に保持することができるフィブリル上に支持されており、これにより発光する光量が増加される）；フィブリルは格別に大きい表面積を有しており、これにより高密度（重量あたり）のＮＡＤ（Ｐ）+／ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＲｕ（ｂｐｙ）32+を不動化させることが可能になり、これは発光させる光を増加させる；このバイオセンサーは、多くの種々のアナライト（補因子としてのＮＡＤ（Ｐ）+／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、またはこれらの基質を受け入れる全部のデヒドロゲナーゼ）の検出を可能にする。
例１１
フィブリル支持されたＥＣＬに基づくバイオセンサーを用いるグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の検出
二官能性付加物（ＥＣＬバイオセンサーフィブリル）に共有結合されているＮＡＤ+アナログおよびＲｕ（ｂｐｙ）32+アナログの両方で修飾されたフィブリルを、酵素グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼの検出に使用した。ＥＣＬバイオセンサーフィブリル（８６０μｇ／ｍｌ）を、約５０μＭグルコース−６−ホスフェートを含有する中性ｐＨ緩衝溶液と混合した。１本の管には、Ｇ６ＰＤＨを３．６μＭの濃度まで添加した。第二の対照管には、脱イオン水を添加した。直ちに、このフィブリルのＥＣＬを測定した。図９には、時間ゼロにおけるＧ６ＰＤＨを有する（ＤＨ＋）または有していない（ＤＨ−）フィブリルのＥＣＬが類似レベルであったことを示している。分析用緩衝液（フィブリルは存在しない）から得られるバックグラウンドＥＣＬがまた示されている（Ａ．Ｂ．）。４２時間のインキュベーション後（室温で回転させる）、より多くのフィブリルが採取され、そのＥＣＬを再測定した。図９に示されているように、分析用緩衝液のＥＣＬ（Ａ．Ｂ．）およびＧ６ＰＤＨを含有していないフィブリル（ＤＨ−）は、ゼロ時間で類似のＥＣＬを示した。しかしながら、Ｇ６ＰＤＨを含有する試料（ＤＨ＋）のＥＣＬは、ゼロ時間で実質的に低かった。これらの結果は、Ｇ６ＰＤＨ活性をフィブリル支持ＥＣＬバイオセンサーを用いて検出することができることを示している。ここで使用された特定のＮＡＤ+アナログ（非不動化）およびＲｕ（ｂｐｙ）32+アナログ（非不動化）を、フィブリルの不存在において用いた別の実験により、ＮＡＤ+アナログの還元体（ＮＡＤＨ）が酸化体（ＮＡＤ+）に比較して、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+の電気化学ルミネセンスに関して、効率が低いことが確認された。
例１２
ＥＣＬに基づくバイオセンサー用支持体としてのカーボンナノチューブの使用
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）酵素補因子のアナログおよびルテニウム（ＩＩ）トリスビピリジン（Ｒｕ（ｂｐｙ）32+）のアナログの両方を結合させたデヒドロゲナーゼ酵素含有酵素バイオセンサーを製造した。このＮＡＤ+アナログは、結合すると自然に挙動するように酵素の補因子結合部位に結合させることができる（すなわち、酵素の天然基質の存在下に、正常な化学メカニズムにより酵素により還元されることができるように結合させる）。さらにまた、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+アナログは、ＮＡＤ+と物理的に接触することができるように結合させる（図１０）。ＩＧＥＮオリジン（Ｏｒｉｇｅｎｅ）（登録商品名）アナライザー（ＩＧＥＮ、Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのＥＣＬ装置において、ＮＡＤ+およびその還元体であるＮＡＤＨは、Ｒｕ（ｎｐｙ）32+の電気化学的ルミネセンスを相違する程度で促進させる。従って、光発現量に基づいて、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨまたはこれら２種の或る種の混合物が溶液中に存在するか否かを測定することができる（Ｆ．Ｊａｍｅｉｓｏｎ等によるＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，印刷中）。すなわち、このバイオセンサーは、ＮＡＤ+の還元程度の検出にかかわるＲｕ（ｂｐｙ）32+のＥＣＬ反応の効率と酵素の基質の存在との間の差異を使用するものである。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼは下記の反応を触媒する：
0003791930.tif 000029
アルコールデヒドロゲナーゼに基づくＥＣＬバイオセンサーは、エタノールをアセトアルデヒドに変換することができ、付随的にＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する。バイオセンサー上に不動化されたＲｕ（ｂｐｙ）32+のＥＣＬ性質は、ＮＡＤ+が不動化されているか、またはＮＡＤＨが不動化されているかに依存することから、酵素バイオセンサーのＥＣＬはエタノールの存在下に報告することができる。このバイオセンサーの魅力的特徴は、ＥＣＬ反応中に、補因子のＮＡＤＨ形態がＮＡＤ+形態に再−酸化されることによって、このバイオセンサー分子の一つを、アナライトの複数の分子の検出に反復使用することができることにある。
このバイオセンサーは可溶性酵素（デヒドロゲナーゼ）に由来するものであり、かつまたアナライト（例えば、エタノール）はまた可溶性であることから、消費されたアナライト含有溶液を洗出することなく、相違するアナライトを含有する試料の分析に反復使用できるようにバイオセンサーを不動化することは有利なことである。このような不動化を、アルコールデヒドロゲナーゼに由来するＥＣＬバイオセンサーを用いて行った（図１０に図解式に示されている）。図１１には、ＡＤＨ由来バイオセンサーのダイナル（Ｄｙｎａｌ）Ｍ４５０ビーズ（Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）上への不動化（左側）およびアルキルフィブリル上への不動化（右側）が示されている。どちらの図解図も、バイオセンサー分子が固体支持体の大きさに対して実際に小さいような大きさでは描かれていない。アルキルフィブリルは、酸化フィブリル（ＣＯＯＨ基を有する）と１−アミノオクタンとの反応により製造した。両方の場合（フィダリルおよびビーズ）、酵素バイオセンサーは、緩衝水性溶液中における非共有吸着によって不動化させた。
エタノールは、ビーズ−およびフィブリル−不動化ＥＣＬ  ＡＤＨ由来バイオセンサーの両方を用いて検出した。ビーズ−またはフィブリルに吸着された酵素バイオセンサーの量は、溶液中に残留する（非吸着）蛋白質の量を２８０ｎｍにおける紫外線吸収により測定することによって決定した（この２８０ｎｍにおける吸収は溶液中の蛋白質の量を示す）。この結果は、フィブリル１ｍｇあたりの結合ＡＤＨバイオセンサーの量が０．３０８ｍｇであるのに対して、ビーズ１ｍｇあたりの結合ＡＤＨバイオセンサーの量は０．０１５ｍｇであることを示している。すなわち、固体支持体の単位重量あたりのフィブリルの吸着能力は、ダイナルビーズの吸着能力の２０．５倍を越えた。
エタノールのＥＣＬ検出は、ＡＤＨバイオセンサー吸着ビーズ（０．５０〜１．２５ｍｇ）またはＡＤＨバイオセンサー吸着フィブリル（０．０４〜０．１０ｍｇ）を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１２ｍＭセミカルバジドを含有する溶液と混合することによって行った。若干の試料にはまた、アナライトであるエタノール０．５ｍＭを含有させた。このバイオセンサーを被覆した固体支持体を、ＩＧＥＮオリジン（Ｏｒｉｇｅｎｅ）（登録商品名）アナライザー（ＩＧＥＮ、Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に導入し、ＥＣＬを測定した。このような実験の一つの結果を図１２に示す。ビーズおよびフィブリルは両方ともに、酵素バイオセンサーのＥＣＬ信号をエタノールの存在下に減少した。この結果は、Ｒｕ（ｂｐｙ）32+電気化学ルミネセンスについての、この酸化／還元状態のＮＡＤ+アナログの効果にかかわる溶液試験（非不動化ＮＡＤ+／ＮＡＤＨおよび非不動化Ｒｕ（ｂｐｙ）32+を使用する）で得られた結果と一致する。これらの結果は、フィブリルを、例えばＥＣＬにおける支持体として、特に酵素に基づくＥＣＬバイオセンサー用の支持体として使用できることを示している。これらの結果がフィブリルを２０倍少ない量で使用した場合でも、ダイナルビーズを用いて見出された結果と同様であることにもまた留意されるべきである。
例１３
ビオチニル化フィブリルおよび二官能性ビオチニル化アルキルフィブリル
フィブリル表面はビオチニル化することができ、あるいはアルキル化およびビオチニル化の両方をすることができることが見出された。このような修飾を含むフィブリは次いで、全てのストレプトアビジン結合材料、例えばストレプトアビジンビーズおよびストレプトアビジン酵素を結合することができる。
フィブリルは、それらの大きい表面積から、固体担体として格別の利益を提供する。強磁性にすることができるビーズは、分離分析に格別に有用である。本明細書に記載されているビオチニル化フィブリルは、フィブリルとビーズとの両方の利点を組合わせて有する。ビオチニル化アルキルフィブリルは、同一概念を拡大するものであるが、アルキルフィブリルの追加の蛋白質吸着物性を示す。
ストレプトアビジン−およびビオチン−被覆したフィブリルは、診断に使用することができ、そしてまた電気化学的ルミネセンスアッセイ用の捕獲剤として使用することができる。
本発明の新規特徴は、一つのフィブリル上に二つの固体担体を組合せ、二官能性フィブリルを創造したことにある。さらにまた、開示されている方法はビーズの表面積を拡大し、かつまたフィブリルの磁化性を倍増させる。
ビオチニル化フィブリルの製造
ビオチニル化フィブリルは、基本的に製造例Ｏに記載されているとおりに製造されたアミノフィブリル２．４ｍｇを、ｐＨ８．１５で緩衝液０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3中で、ＮＨＳエステル長鎖状ビオチン９ｍｇと混合することによって製造した。この混合物を室温で４時間回転させ、次いで同一緩衝液で２回洗浄した。ビオチニル化アルキルフィブリルの製造
ビオチニル化アルキルフィブリルは、二段階反応によって製造した。最初に、二官能性フィブリル４．２５ｍｇ（これはアミノおよびカルボキシルの両方を含有する）およびＮＨＳエステル長鎖状ビオチン２５ｍｇを混合した。このフィブリルを洗浄し、次いで減圧で乾燥させた。
第二反応は、このビオチニル化二官能性フィブリル４ｍｇを、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１１ｍｇ、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）７．５ｍｇおよびＤＭＦ０．５ｍｌ中のＮＨ2（ＣＨ2）7ＣＨ3  １０μｌと混合することによって行った。この混合物を室温で一夜かけて撹拌した。最終ビオチニル化アルキルフィブリルをＣＨ2Ｃｌ2、ＭｅＯＨ、およびｄＨ2Ｏにより洗浄した。
例１４
ＥＣＬ分析における固体支持体としてのビオチニル化フィブリル
ビオチニル化フィブリルは、ストレプトアビジン−ビオチンまたはアビジン−ビオチン相互反応を必要とする方式を包含するＥＣＬ分析で使用することができる。例えば、ビオチニル化フィブリルは、ストレプトアビジンによりさらに誘導体化することができる。フィブリルに共有結合したビオチン（例１３参照）は、ストレプトアビジンと強力な非共有結合性相互反応を行うことができた。ストレプトアビジンは、４つの均等な結合性部位を有するテトラマー蛋白質であるから、ビオチニル化フィブリルに結合したストレプトアビジンは、ほとんど確実に未占領結合部位を有し、この部位に追加のビオチニル化試薬を結合させることができた。このようにして、ビオチニル化フィブリルをストレプトアビジン被覆フィブリルに変換することができる。
このようなフィブリル−ビオチン−ストレプトアビジン（ＦＢＳ）支持体を用いて、多くの分析試験法を実施することができる。一例として、ビオチニル化抗−アナライト抗体を、ＦＢＳ支持体上に捕獲することができた（抗体がアナライトに複合する前または後に）。ビオチニル化抗−アナライト抗体を用いるアッセイは充分に確立されている。このようなアッセイには、対象アナライトが導入されたＲｕ（ｂｐｙ）32+−標識したアナライトと、抗−アナライト抗体への結合に関して競合する競合性アッセイが包含される。遊離の（未結合）アナライトおよび遊離の（未結合）Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識したアナライトは、フィブリル不動化抗体から洗出することができる。この洗浄工程は、フィブリルが遠心分離、濾過を包含する慣用の実施方法により溶液相から物理的に分離されるか、または磁気による吸引により溶液相から物理的に分離されるかに依存する。
競合性アッセイ以外に、サンドイッチ方式イムノアッセイをＦＢＳ支持体上で行うことができる。サンドイッチ方式イムノアッセイは診断の分野で一般に、およびまた特にＥＣＬ検出において周知である。このような分析法は、２種の抗体によるアナライトの同時的結合を包含する；すなわち、例えばビオチンで標識することによって固体表面上に捕獲される最初の「第一」抗体および固体表面によって捕獲されないが、ＥＣＬ用途におけるＲｕ（ｂｐｙ）32+のようなリポーター基で標識されている「第二」抗体。このようなサンドイッチ方式アッセイを、固体捕獲性支持体としてフィブリルを用いて行うことができる。この場合、フィブリルは前項に記載されているように捕獲される。一方、このようなアッセイでは、フィブリルはそこに共有結合したビオチンを有する。このビオチンはストレプトアビジンに結合し、次いで順に、ビオチニル化第一抗体に結合し、次いでアナライトに結合し（アナライトが存在する場合）、次いでＲｕ（ｂｐｙ）32+−標識した第二抗体に結合する。
同様に、ＤＮＡプローブアッセイは、ＦＢＳ支持体を用いて行うことができた。ビオチニル化一重鎖ＤＮＡはＦＢＳ支持体に結合させることができ、競合性ハイブリッド形成を、補足一重鎖アナライトＤＮＡ分子と補足Ｒｕ（ｂｐｙ）32+−標識したオリゴヌクレオチドとの間で生じさせることができる。
もう一つの種類のビオチニル化フィブリル、すなわちビオチニル化アルキル化フィブリルは、イムノアッセイおよびＤＮＡプローブアッセイで使用することができる。例１３に記載されているように、二官能性フィブリルは、１種の官能性基に対するビオチンの共有結合および他の１種の官能性基に対するアルキル鎖の共有結合によって修飾することができる。生成したアルキル化され、ビオチニル化されたフィブリルは、ストレプトアビジンまたはアビジンとの特異的結合（ビオチンを介する）および蛋白質の吸着（アルキル鎖を介する）の両方を用いることができる。
アルキルフィブリルは別の固体支持体、例えばダイナル磁性ビーズを包含するストレプトアビジン被覆した磁性ビーズとの結合に使用することができた。このようなビーズに優るフィブリルの利点は、これらがより広い表面積（単位重量あたり）を有する点にある。従って、フィブリルを磁性ビーズの外側表面に付着させることができた場合には、これは表面積を劇的に改善し、従ってビーズの結合能力を劇的に改善する。アルキル化され、ビオチニル化されたフィブリルは、ストレプトアビジン被覆ビーズと混合することができ、これにより高親和性のストレプトアビジン（ビーズ）−ビオチン（フィブリル）相互反応が得られ、従って格別に広い表面積を有するフィブリル被覆ビーズが得られる。アルキルフィブリルは吸着により蛋白質を結合させることができるから、フィブリル被覆ビーズは、ストレプトアビジンおよび抗体を包含する吸着蛋白質によりさらに誘導体化させることができる。前記したように、ストレプトアビジンまたは抗体被覆したフィブリルは、イムノアッセイおよびＤＮＡプローブ分析法で使用することができる。すなわち、フィブリル被覆ビーズは、それらの表面積を劇的に増大させることによってビーズの物性を改良することができ、同一の結果を得るために指定の分析法で要求されるビーズの数を減少させる。
例１５
磁気感受性カーボンナノチューブ
フィブリルは磁性物性を有することができる。フィブリルを磁性または非磁性にすることができる程度は、フィブリル製造方法の結果としてフィブリル中に存在する触媒の量により制御される。このような方法は、米国特許４，６６３，２３０、５，１６５，９０９および５，１７１，５６０に記載されている。
フィブリルの磁性物性は、フィブリルを官能化した後に、すなわちアルキルフィブリル、蛋白質結合フィブリルなどに見出される。或る反応（例えば、アルキル化）の後のフィブリルは、その反応の前よりも顕著に早く磁石に移動する。この現象の仮説の一つは、或る種の凝集または溶媒和現象が反応プロセス中に生じることがあるというものである。しかしながら、真のメカニズムは現在、未決定である。
例１６
ＰＥＧ修飾したフィブリルとＲｕ（Ｂｐｙ）3との非特異的結合の還元
塩素酸塩酸化フィブリル、ベンゾイルペルオキシドを用いてＰＥＧで修飾されたフィブリルおよびＮＨＳエステルカプリングによりＰＥＧで修飾されたフィブリルの原料分散液を、音波処理を用いて、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の１．０ｍｇ／ｍｌとして製造した。それぞれの一連の１０倍稀釈液２ｍｌを５本のポリプロピレン管にそれぞれ入れた。同一緩衝液中のＲｕ（Ｂｐｙ）3の原料溶液（約１０μＭ）５０μｌを各管におよび３本の緩衝液ブランクに添加した。３本のＲｕ（Ｂｐｙ）3を含有していない緩衝液管をまた調製した。全部の管をボーテックスミキサーで混合し、次いで一夜かけてインキュベートした。全部の管を遠心分離に付し、フィブリルを分離し、上清各０．１ｍｌを新しい管に移し、オリジン（Ｏｒｉｇｅｎ）（登録商品名）分析用緩衝液（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）１．０ｍｌにより稀釈し、次いでマグナライザー（Ｍａｇｎａｌｙｚｅｒ）（登録商品名）（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてＥＣＬによりＲｕ（Ｂｐｙ）3について分析した。上清中に残留するＲｕ（Ｂｐｙ）3のレベルは、フィブリルに非特異的に結合した量の間接的尺度であった（図１３）。両方のＰＥＧ修飾フィブリル物質について、０．１ｍｇ／ｍｌまでのフィブリルレベルで、実質的に全部のＲｕ（Ｂｐｙ）3が上清中に残留していた。これらのフィブリル１．０ｍｇ／ｍｌにおいて、上清中のＲｕ（Ｂｐｙ）3の２０〜３０％の減少が見られた。これに対して、塩素塩酸化したフィブリルの場合、１．０ｍｇ／ｍｌにおいてＲｕ（Ｂｐｙ）3は上清中にほとんど存在しておらず、かつまたＰＥＧ修飾されていないこれらのフィブリルの０．１ｍｇ／ｍｌにおいて、上清中のＲｕ（Ｂｐｙ）3に２０〜３０％の減少が見られた。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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