(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されたアミノ酸配列を含む単離されたＤＮＡポリメラーゼλ（Ｐｏｌ λ）ポリペプチド。
【請求項２】
４３８位のアルギニン残基がトリプトファンに置換されている、請求項１記載のＰｏｌ λポリペプチド。
【請求項３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されたアミノ酸配列を含む単離されたＤＮＡポリメラーゼλ（Ｐｏｌ λ）ポリペプチド。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、９または１１のいずれか一つに記載されたアミノ酸配列を含む単離されたＤＮＡポリメラーゼλポリペプチドアイソフォーム。
【請求項５】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつ、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項６】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつ、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドをコードする核酸配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項７】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつ、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドの配列変異体またはアレルであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５または２に記載されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項８】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドの単離されたフラグメントまたは活性部分。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に記載されたＰｏｌ λコード配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基４３８（Ａｒｇ）からトリプトファン（Ｔｒｐ）への変化をもたらす、Ｐｏｌ λ ｃＤＮＡの１６８３位において一塩基多型（ＣからＴ）を有する、請求項１０記載の核酸分子。
【請求項１２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、８または１０に記載された配列を有する核酸を含む単離された核酸分子。
【請求項１３】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に記載されたＰｏｌ λコード配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項１４】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、６、８または１０に記載された核酸配列に、明細書中に記載されたストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる単離された核酸分子。
【請求項１５】
その発現を指示する調節配列に機能的に結合した請求項９ないし１４のいずれか一項に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１６】
ベクターが、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターである、請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の発現ベクターでトランスフォームされた宿主細胞。
【請求項１８】
Ｐｏｌ λポリペプチド、またはそのアイソフォーム、フラグメントまたは活性部分を産生する方法であって、請求項１７に記載の宿主細胞を培養し、かくして産生されたＰｏｌ λポリペプチドを単離することを含む方法。
【請求項１９】
遺伝子治療法に使用するための請求項１０ないし１４のいずれか一項に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１０ないし１４のいずれか一項に記載のＰｏｌ λ核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２２】
医学的治療方法における使用のための請求項１ないし８のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドに特異的に結合できる抗体。
【請求項２４】
（ａ）アッセイにおけるＰｏｌ λポリペプチドの存在または量を検出または定量するため、または（ｂ）Ｐｏｌ λポリペプチドを精製するための、請求項２３記載の抗体の使用。
【請求項２５】
Ｐｏｌ λに特異的に結合することができる抗体を産生する方法であって、免疫原として請求項１ないし８のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いることを含む方法。
【請求項２６】
（ａ）Ｐｏｌ λ生物学的活性を有する、または（ｂ）Ｐｏｌ λポリペプチドに結合する、または（ｃ）Ｐｏｌ λポリペプチドの生物学的活性を阻害する候補化合物をスクリーニングするための、請求項１ないし８のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドの使用。
【請求項２７】
ＤＮＡ分子を修復または再構成するための医薬を調製するための、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する請求項１ないし８のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドの使用。
【請求項２８】
Ｐｏｌ λ核酸配列を増幅するプライマーを設計するための、請求項１０ないし１４のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項２９】
試験サンプルにおけるＰｏｌ λ核酸またはその変異形態の存在および／または核酸配列内の変異を調べる方法であって、
（ａ）核酸の試験サンプルと、請求項１０ないし１４のいずれか一項に記載の核酸配列にハイブリダイズし得るプローブとを接触させる工程；および
（ｂ）核酸プローブが試験サンプルに存在する核酸に結合するか否かを調べる工程を含む方法。
【請求項３０】
試験サンプルにおけるＰｏｌ λ核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）請求項１０ないし１４のいずれか一項に記載の核酸配列に基づくプライマーを用いて、Ｐｏｌ λ核酸配列を増幅する工程；および
（ｂ）かくして産生された増幅されたＰｏｌ λ核酸を分離する工程を含む方法。
【請求項３１】
試験サンプルにおけるＰｏｌ λ核酸もしくはその変異形態、またはＰｏｌ λポリペプチドもしくはそのアイソフォームの存在を調べる方法であって、
（ａ）サンプル内の核酸の配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されたＰｏｌ λ核酸配列の全てまたは一部と比較して、患者に由来するサンプルが一以上の変異を含むか否かを調べる工程；または
（ｂ）患者に由来するサンプルにおける請求項１ないし８のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドの存在を調べ、存在する場合には、そのポリペプチドが、全長であるか、および／または野生型であるか、および／または野生型ポリペプチドのアイソフォームであるか、および／または正常レベルで発現されているかを調べる工程；または、
（ｃ）ＤＮＡフィンガープリンティングを用いて、患者に由来する核酸のサンプルを制限酵素で切断した場合に得られる制限パターンを、請求項９ないし１４のいずれか一項に記載の核酸から得られた制限パターンと比較する工程；または、
（ｄ）請求項９ないし１４のいずれか一項に記載のＰｏｌ λ核酸配列に結合できる特異的結合メンバを用いる工程であって、前記特異的結合メンバが、Ｐｏｌ λ核酸配列とハイブリダイズし得る核酸を含むか、天然もしくは変異したＰｏｌ λ核酸配列またはそれにコードされたポリペプチドに対する特異性を備えた抗体ドメインを含む物質を含み、特異的結合メンバが、その結合パートナーに対する特異的結合メンバの結合が検出可能であるようにラベルされている工程；または
（ｅ）請求項９ないし１４のいずれか一項に記載の配列に基づく一以上のプライマーを用いたＰＣＲを使用して、患者に由来するサンプルにおける正常または変異Ｐｏｌ λ遺伝子をスクリーニングする工程、
の一以上を含む方法。
【請求項３２】
変異Ｐｏｌ λ核酸配列が、２５７６位においてシトシンをチミジンに置換する変異、および２５７９位においてチミジンをグアニジンに置換する変異を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
Ｐｏｌ λまたはそのアイソフォームに関連した腫瘍の予後の診断のためである、請求項３１または３２記載の方法。
【請求項３４】
ＤＮＡ修復を調節することができる化合物を同定する方法であって、
（ａ）請求項１ないし８のいずれか一項に記載のＰｏｌ λポリペプチドと候補化合物とを接触させる工程、および
（ｂ）候補化合物が、Ｐｏｌ λポリペプチドのＤＮＡポリメラーゼ活性を調節および／または結合するか否かを調べる工程
を含む方法。
【請求項３５】
Ｐｏｌ λポリペプチドを発現する細胞系統で実施される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
化合物により引き起こされる調節が、ＤＮＡポリメラーゼ活性のアッセイにおいて調べられる、請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
（ｃ）Ｐｏｌ λのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害することができる候補化合物を選択する工程
をさらに含む、請求項３４ないし３６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡポリメラーゼの同定および単離、並びにこのポリメラーゼの使用に関する。特に本発明は、ＤＮＡポリメラーゼラムダ（Ｐｏｌ λ）のヒト遺伝子のヌクレオチド配列、Ｐｏｌ λのアミノ酸配列、およびそのｍＲＮＡの選択的スプライシングから誘導されたいくつかのアイソフォーム(isoform)のアミノ酸配列を記載する。これらのアイソフォームの一部と腫瘍サンプルとの結合から、Ｐｏｌ λは、腫瘍プロセスの診断、予後および進展のマーカーとなる。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ修復メカニズムの存在に対する第一の仮説の一つは、多細胞生物の胚細胞に存在するＤＮＡが、減数分裂に関連した効率的なＤＮＡ修復により、損傷、そして結果的には老化から保護されるということを提案するものであった。一方、体細胞は、より低いＤＮＡ修復力しか備えていないので、ＤＮＡの損傷をはるかに受けやすい。しかしながら、ゲノムで起こる損傷および変更の殆どを消失する、体性レベルでも作用するいくつかのＤＮＡ修復機構が存在すること、そして、これらの保護メカニズムの過剰な損傷または機能不全が早発性の老化および細胞死を引き起こし、あるいは、腫瘍プロセスを特徴付ける増殖を促すことが知られている。
【０００３】
哺乳動物では、種々の種の寿命とそのＤＮＡ修復実行力との間に明確な相関関係が存在する。さらに、老化は、ＤＮＡに損傷を与える処理またはＤＮＡ修復に関係する遺伝子における遺伝的欠陥により加速されうる。ヒトでは、老化のキーポイントの一つは、中枢神経系（ＣＮＳ）の変性であり、これは、遺伝子毒性剤に対するその極度の敏感性に関連する。時にＣＮＳの早期老化の症状を示すほとんどの変性疾患は、ＤＮＡの損傷の蓄積によるものであると、広く受け入れられている。
【０００４】
さらに、ＤＮＡ修復の欠陥による変異の固定（体性変異）は、細胞のトランスフォーメーションを引き起こしうる。発癌は、ＤＮＡにおける損傷により始まり、次いで、ＤＮＡセグメントの変異または転座が起こり、最後は細胞の表現型のトランスフォーメーションが起こる、複雑なプロセスである。一部の正常な遺伝子（プロトオンコジーン）が、ＤＮＡ鎖を破壊するいくつかの薬剤の作用により腫瘍性（オンコジーン）になりうることが広く刊行物に記載されている。しばしば、これらの変化は、直接的にプロトオンコジーンの配列に影響し、これは、異なる染色体における別の破壊ポイントに転座される。当該技術分野で知られているように、殆どの細胞は、このゲノムの損傷を認識および消失するＤＮＡ修復メカニズムを付与されている。これらのシステムの不在または機能不全は、細胞トランスフォーメーションの可能性を増加する。ポリＡＤＰ-リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、ＤＮＡ鎖破壊のＤＮＡ修復に関与する第一の酵素の一つである。その活性は、コントロールと比べて、ＳＶ４０でトランスフォームした繊維芽細胞の核においてより高いことが示された。同様に、ＰＡＲＰの酵素活性は、正常細胞と比べて、白血病においてより高いことが示され、これと同様の増加が、健常者と比較して結腸直腸ガン患者の粘膜において観察されていうる（Miwaら, Arch.Biochem.Biophys.181:313-321 (1977); Burzioら, Proc.Soc.Exp.Biol.Med.149:933-938(1975); Hiraiら,Cancer Res.43:3441-3446 (1983)）。この研究は、ＰＡＲＰのＤＮＡポリメラーゼ活性がＤＮＡの損傷後に増加するということを結論付けさせるものである。さらに、特定の薬剤の添加によるＰＡＲＰのポリメライゼーション活性の増加は、ゲノムＤＮＡ損傷および腫瘍形成トランスフォーメーションの危険性の増加を引き起こした［Harris,Int.J.Radiat.Biol.48:675-690 (1985)］。これらのデータは、腫瘍マーカーとして、およびガン進展の傾向の指標としてＰＡＲＰを用いることを示唆した。米国特許第5449605号参照。
【０００５】
一方、近年、非遺伝的結腸ガン、および約１５％の散発性胃ガンが、ＤＮＡの反復性配列の不安定性により特徴付けされることが示された（ミクロサテライト(microsatellite)）。ミューテーター表現型と呼ばれるこの表現型は、自発的変異の数百倍の増加を伴う[Eshlemanら, (1995), Oncogene 10, 33-37; Eshlemanら, (1996), Oncogene 12, 1425-1432]。これは、ＤＮＡミスマッチ修復のプロセスに関与する遺伝子の機能不全による［Hofman & Cazaux, (1998), Int.J.Oncol.12, 377-382; Umar & Kunkel,(1996),Eur.J.Biochem.238,297-307］。かくして、結腸ガンの疾病素質（素因）の基準は、複製後ミスマッチ修復に必要とされる遺伝子の一部（hMSH2、hMLH1、PMS1、 PMS2、hMSH3およびhMSH6）における生殖細胞系変異（遺伝）の存在に基づくとすることができ[Prollaら,(1998),Nature Genetics 18,276-279]；欠陥ＤＮＡ修復の結果として現れうる第二の散発性変異が、同一の遺伝子の他のアレルを標的化、またはＤＮＡ修復に関与する別の遺伝子を標的化した場合に、ミューテーター表現型を増加させ、増殖性変異体のさらなる選別を可能にし、かつ、腫瘍形成を引き起こす。いくつかの変異は、遺伝的結腸ガン患者における、しばしば、連続的なアデニン残基とシトシン残基のシリーズに発生するフレームシフトである、ミスマッチ修復に関与する二つのヒトの遺伝子（hMSH3とhMSH6）に記載されていた。
【０００６】
これまでに、Ｐｏｌ βが“ミスマッチ修復”のプロセスに関係するという証拠は無い。しかしながら、Ｐｏｌβのアレルの一つにおける、活性部位に近い、特異的欠失（アミノ酸２０８から２３６）は、一部の乳ガンおよび結腸ガンに関係して見出されている[Battacharyya & Banerjee, (1997), P.N.A.S. USA 94, 10324-10329]。さらに、８３％のヒト大腸ガンは、Ｐｏｌβ遺伝子の変異の存在を示す[Wangら(1992), Cancer Res.52,4824-4827; Dobashiら,(1995),Hum.Genet.95,389-390]。また、膀胱ガンに関与するＰｏｌβ変異の存在についても証拠が報告されている。しかし、この場合には、ｐ１６およびＲＢのような腫瘍サプレッサー遺伝子に関連したさらなる変異も存在する[Matsuzakiら(1996),Mol.Carcinog.15,38-43]。腫瘍形成(tumourogenesis)におけるＰｏｌβの重要性を証明する試みは成功しなかった。これは、Ｐｏｌβの生殖細胞系(germline)欠失が致死的表現型をもたらすからである[Guら (1994), Science 265, 103-106]。
【０００７】
これまで、１０の真核細胞性ＤＮＡポリメラーゼが記載されている（ＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、およびκ）。ＤＮＡポリメラーゼα、β、およびεは、ＤＮＡ複製に関する[Wood & Shivji (1997), Carcinogenesis 18, 605-610]。ほとんどのＤＮＡ修復メカニズムが、損傷したヌクレオチドを置換あたは破壊されたＤＮＡの末端を架橋するためにＤＮＡ合成工程に関与する。細胞内でしばしば用いられるメカニズムの一つは、僅かに修飾された塩基または無塩基のヌクレオチドを消失させる“塩基排除修復”である。このプロセスに関与するＤＮＡ合成酵素は、ＸＲＣＣ１およびＤＮＡリガーゼIIIと共同して作用するＰｏｌβであることが示された[Dianov & Lindahl, (1994), Nature 362, 709-715; Sobolら,(1996),Nature 379, 183-186; Nichollら(1997), Biochemistry 36, 7557-7566]。プロセッシビティーファクターＰＣＮＡとＤＮＡポリメラーゼδおよびεに関与する、選択的な、より大きなスケールのプロセスの存在について考察されていた。“ヌクレオチド排除修復”と称されるプロセスにおいて実施される、ＤＮＡにおけるチミジンダイマーの消失およびバルク付加は、ＤＮＡポリメラーゼδまたはεも関与することを示す。これと同じ意味で、ＤＮＡポリメラーゼδまたはεは、挿入エラーの複製後修復（ミスマッチ修復）を触媒する際に引き出される。これは、この処理がＰｏｌβに欠陥のある細胞で通常行われるからである。ハウスキーピング遺伝子であるＰｏｌβの発現は一定であり、かつ、調節された細胞増殖または細胞周期のいずれによっても刺激されない[Zmudzkaら,(1988), Nucleic Acids Res. 16,9587-9596]。明らかに、ミスマッチ修復はＤＮＡ複製と対であるべきであり、両方のプロセスが共制御されるべきである。ＤＮＡポリメラーゼζ、ηおよびθは、複製エラーを修正するのに適していない。一方、その生化学的特性は、これらの酵素がＤＮＡレション(lession)のバイパス、ＤＮＡ修復の別法に関与することを支持する[Lawrence & Hinkle, (1996), Cancer Surv. 28, 21-31; Masutaniら(1991), Nature 399, 700-704; Shariefら(1991), Genomics 1, 90-96]。
【０００８】
さらに、ミューテーター表現型の取得に関与するさらなるＤＮＡポリメラーゼを同定するという技術課題が残っている。これらのポリメラーゼは、ガン発達の疾病素質を有する患者を同定するためのツールを提供するために臨床的に極めて重要であり、早期検出の臨床的検視および早期段階での介入の効率を改善し[de la Chapelle & Peltomaki, (1995), Annual Rev.Genet.29,329-348]、これらのターゲットに基づいた治療の新規手法を開発する。また、これらのＤＮＡポリメラーゼの一部は、中枢神経系の神経変性疾患に関与しうる。これは、これらのプロセスが、おそらくは、不完全な、または誤りの傾向のあるＤＮＡ修復と関連しているからである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
概して、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼラムダ（Ｐｏｌ λ）のヒトおよびマウス遺伝子の核酸配列、Ｐｏｌ λのアミノ酸配列、およびそのｍＲＮＡの選択的スプライシングから得られたいくつかのアイソフォームのアミノ酸配列を記載する。これらのアイソフォームの一部と腫瘍サンプルとの結合は、Ｐｏｌ λを、一部の腫瘍プロセスの予後、診断および進展の潜在的マーカーとする。活性部位の近くに位置づけられた一塩基多型に相当するアレル変異体、および腫瘍形成に関連するポリＡの近くのダブルミューテーションについても開示する。さらに、Ｐｏｌ λが非常に低い挿入適合度を有するＤＮＡポリメラーゼであるという事実から、胚細胞および体細胞の両方で、この酵素の制御不全がゲノムの変異頻度を増大させるという可能性が開かれる。さらに、Ｐｏｌ λの発現の変更は、ミューテーター表現型の出現を導く、ＤＮＡ修復欠如と関連した病理学的プロセスに関連する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
従って、第一の態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を含む単離されたＤＮＡポリメラーゼλ（Ｐｏｌ λ）ポリペプチドを提供する。これは、ヒトＰｏｌ λの野生型アミノ酸配列である。他の関連する態様では、本発明は、ヒトのＰｏｌ λのアイソフォームである単離されたポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、９および１１に記載されたアミノ酸配列を有する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されたアミノ酸配列を含む単離されたＤＮＡポリメラーゼλ（Ｐｏｌ λ）ポリペプチドを提供する。これは、マウスのＰｏｌ λの野生型アミノ酸配列である。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、上記Ｐｏｌ λアミノ酸配列のいずれか一つと、４０％より大きいアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチドを提供する。さらなる態様では、本発明は、ストリンジェントな条件下で、ヒトまたはマウスのＰｏｌ λまたはそのアイソフォームをコードする核酸配列の一つにハイブリダイズすることができる核酸によってコードされた単離されたポリペプチドを提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、上記ポリペプチドのいずれか一つの配列変異体またはアレルであるポリペプチドである物質を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、上記ポリペプチドのいずれか一つのフラグメントまたは活性部位である物質を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、上記ポリペプチドのいずれか一つをコードする単離された核酸分子を提供する。全長ヒトＰｏｌ λのｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されている。全長マウスＰｏｌ λのｃＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されており、対応するゲノム配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されている。ヒトアイソフォームの核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、８および１０に記載されている。
【００１６】
また本発明は、上記核酸配列のいずれか一つと９０％より高い配列同一性を有する核酸分子を含む。他の実施態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、５、６、８または１０に記載した配列に、例えば以下に記載するストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸配列に関する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、その発現を指示するコントロール配列に機能的に結合した上記核酸のいずれか一つを含む発現ベクター、およびこのベクターでトランスフォームされた宿主細胞を提供する。また、本発明は、宿主細胞を培養し、かつかくして産生されたポリペプチドを単離することを含む、Ｐｏｌ λポリペプチド、もしくはそのアイソフォーム、フラグメントまたは活性部位を産生する方法も含む。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、遺伝子治療法に使用するためのＰｏｌ λ核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、ここに定義するＰｏｌ λ核酸分子を含む組成物を提供する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、上記一以上のＰｏｌ λポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、医学的治療方法に使用するための上記Ｐｏｌ λポリペプチドまたは核酸分子を提供する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、例えば、薬学的研究におけるリード化合物として発展する、Ｐｏｌ λポリペプチドのペプチドまたは非ペプチド模擬物を見出すための、（ａ）Ｐｏｌ λ生物学的活性を備えるか、（ｂ）Ｐｏｌ λポリペプチドに結合するか、（ｃ）Ｐｏｌ λポリペプチドの生物学的活性を阻害する候補化合物をスクリーニングするためのＰｏｌ λポリペプチドの使用を提供する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、上記Ｐｏｌ λポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。これらの抗体は、Ｐｏｌ λポリペプチドの存在を検出および定量するアッセイにおいて、Ｐｏｌ λポリペプチドを精製する方法において、およびＰｏｌ λ生物学的活性のインヒビターとして、使用することができる。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、ここに提供されたＰｏｌ λ核酸配列に基づく核酸プローブに対する試験サンプル核酸のハイブリダイゼーションを検出することを含む、試験サンプルにおけるＰｏｌ λ核酸の存在および／または核酸配列内の変異を調べる方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、上記Ｐｏｌ λポリペプチドをコードする核酸を用いて核酸ポリメラーゼ反応を開始することを含む、核酸試験サンプルを増幅する方法を提供する。また、本発明は、例えば一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）のような技術を用いる、Ｐｏｌ λ遺伝子における変異の調査における上記核酸の使用も提供する。
【００２６】
本発明のこれらのおよびその他の態様を、以下により詳細に記載する。例示的に、本発明の実施態様を、添付図面を参照しながらより詳細に記載する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
Ｐｏｌ λのクローニング、発現、および特徴決定
先の出願では、Ｐｏｌ λが“Ｐｏｌ ｋ”と呼ばれていたこと、および優先日から採用されてきた学名と一致させるために、本発明のポリメラーゼは、当該技術分野およびここにおいては“Ｐｏｌ λ”と称し、また、それをコードする遺伝子について“ＰＯＬＬ”と称することに注意すべきである。本発明では、“Ｐｏｌ λの生物学的活性”とは、ＤＮＡポリメラーゼとしてのこれらのポリペプチドの活性を指す。
【００２８】
本発明の新規のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ λ）は、豚コレラウイルス(ASFV) Ｐｏｌ Ｘのアミノ酸配列をプローブとして用いて同一性を調べることにより同定された[Oliverosら, (1997),J.Biol.Chem.272,30899-30911]。このウイルス性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰｏｌＸファミリーと呼ばれるＰｏｌβ様ＤＮＡポリメラーゼのファミリーに属する。このＤＮＡポリメラーゼが存在することに対する第一の指標は、ゲノムＤＮＡフラグメントを見出したことから得られ、その翻訳は低かったものの、ＰｏｌＸファミリーメンバと、特に、触媒中心の最も保存された領域において、顕著な同一性があった。このＤＮＡフラグメント（クローンCIT282B21：gb AC003694）は、マウスの１９番染色体に位置づけられ（Mus musculus）、ＨＴＧＳ(High Throughput Genome Sequences)データベースから得られ、Ｐｏｌ λが同定されたとき、さらに１８４９ＤＮＡフラグメントを含んでいた。ＥＳＴ(dbEST/GenBank)データベースでさらに同一性を調べた後、この潜在的なＤＮＡポリメラーゼの発現の第一の証拠が得られた。マウスＰｏｌ λに対応するＥＳＴの中で、その完全なｃＤＮＡを潜在的にコードするものが同定された。このＥＳＴ（クローン1162340;AA692052）を、ＬＬＮＬ(Lawrence Livermore National Laboratory)のＩＭＡＧＥ協会(IMAGE Consortium)から入手し、配列決定した。
【００２９】
得られた配列は、５７３アミノ酸タンパクをコードする、２２７７ヌクレオチドのオープンリーディングに相当するものであった。ｃＤＮＡの５’末端に対応するさらなる配列（５９ヌクレオチド）は、ＲＡＣＥ５’により、マウス精巣のｍＲＮＡをもとに得られた。
【００３０】
かくして、Ｐｏｌ λ遺伝子（ＰＯＬＬ）に対応するｃＤＮＡは、全部で２３３６ｂｐからなり（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、８３ｂｐの５'-非翻訳領域（ヌクレオチド１から８３）、１７２２ｂｐのコード領域（ヌクレオチド８４から１８０５）、および５３１ｂｐの３'-非翻訳領域（ヌクレオチド１８０６−２３３６）を有する。誘導されたタンパクであるマウスＰｏｌ λは、５７３アミノ酸を有する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２）。
【００３１】
ｃＤＮＡ配列とゲノムクローンAC003694との比較により、マウスＰＯＬＬ遺伝子のエキソン−イントロン機構が定義された（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３参照）。この遺伝子は、約８キロベースにわたり、マウスの第１９染色体に位置づけられる。このゲノム配列は、いくつかのイントロンに位置づけられるいくつかのマイクロサテライトを含む：位置１０７９．．１１５６ｙ３０８８．．３１３８の（Ａ）１２；位置３７７９．．３８２３ｙ４９１４．．４９８２の（ＣＡ）３２；位置４０１７．．４２７２の（ＧＣＣＴＣＴ）４０；位置１５６５．．１５８９の“ＡＴリッチ”；および位置３８７４．．３９０１の（ＴＧＧ）ｎ。ｍＲＮＡ転写物は、９のエキソンからなる。アミノ酸残基２４７から５７３を含むＣ末端セグメントは、ＤＮＡポリメラーゼＸファミリーのメンバと高い同一性を示す[Ito & Braithwaite, (1991), Nucleic Acids Res.19, 4045-4057]。このファミリーのメンバは、ＤＮＡ修復に選択的に関与してきた唯一の真核ＤＮＡポリメラーゼであるＰｏｌβ；ウイルス性ＤＮＡ修復に関与するＡＦＳＶ、ＰｏｌＸ；抗原レセプター変異性の生成に関与する末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である。マウスＰｏｌ λは、整列されうる部位（アミノ酸残基２４０から５７３）に、Ｐｏｌβと３２％のアミノ酸配列同一性を有する。この比較的低い値にも関わらず、鋳型としてＰｏｌβの構造を用いてこのＤＮＡポリメラーゼの構造を作製することができ、、かつ、全ての構造化された要素（αヘリックス、ターン、およびβ鎖）、およびＰｏｌβに記載されている４つの異なるサブドメインの三次折り畳み：“８ｋＤａ”、“フィンガー”、“パーム”、および“サム”を保存していた。一次配列および構造予測は、新たに同定されたタンパクが、Ｐｏｌ λと呼ばれ、そして、本発明の一部を形成する、新規のＤＮＡポリメラーゼであるという仮説を支持した。
【００３２】
一方、Ｐｏｌ λの最初の２３９アミノ酸（Ｐｏｌβには対応部分がない）は、ＢＲＣＴドメインを含む（アミノ酸残基３４−１２５）。このＢＲＣＴドメインは、ＤＮＡ修復に直接関連する、あるいは、ＤＮＡ損傷に反応した細胞周期調節チェックポイントに関連するタンパクのＮ末端またはＣ末端の多重コピーの一つに存在することが最近報告されている。ＢＲＣＡ１タンパクに最初に同定されたＢＲＣＴドメインは、ＥＣＴ２オンコジーン、タンパクｐ５３ＢＰ、およびヒトＲＢのような腫瘍形成に関与する他のタンパクにも存在する。ＢＲＣＴドメインを触媒ドメイン（Ｐｏｌβ様）と関連させる、アミノ酸残基ＳｅｒとＰｒｏに富んだ領域（残基１２６−２３９）が存在し、これは、公知のタンパクとは同一性を有さず、柔軟なヒンジを提供してＤＮＡポリメラーゼ活性を、ＤＮＡ修復プロセスに必要な種々の相互作用、タンパク：タンパク、およびタンパク：ＤＮＡに結びつける。
【００３３】
次の工程では、マウスｃＤＮＡの完全配列を含むベクターを用いて、形質転換したE.coli細胞においてＰｏｌ λを発現させた。これにより、高い量の精製された組み換えＰｏｌ λを得ることができ、かつ、特異的ポリクローナル抗体を得ることができた。タンパクの発現と、Ｐｏｌ λタンパクに特異的に結合できる抗体の生成は、本発明の一部である（さらに以下を参照）。本発明は、かくして、Ｐｏｌ λの遺伝子配列；Ｐｏｌ λのｃＤＮＡ配列；Ｐｏｌ λのアミノ酸配列；Ｐｏｌ λ核酸を含むベクター、Ｐｏｌ λを発現するトランスフォームされた細胞；およびＰｏｌ λに特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。
【００３４】
Ｐｏｌ λに関連した本来的なＤＮＡポリメラーゼ活性は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル［Blanco & Salas, (1984), P.N.A.S.USA 81,5325-5329］およびＰｏｌ λの発現が誘導された粗製のE.coli抽出物におけるin situ ＤＮＡポリメラーゼ分析を用いて行うことができる。分子生物学におけるツールとしてのこの新規ＤＮＡポリメラーゼの適用の基盤である、この新規酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性は、本発明の一部を形成する。
【００３５】
８キロベースのＰｏｌ λゲノム配列の入手可能性が、Ｐｏｌ λのヒトｃＤＮＡの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、並びにそのコードされているタンパクのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の同定および決定を可能にし、これらの両方が本発明の一部を形成する。Ｐｏｌ λのマウスおよびヒトのホモローグは、８０％以上のアミノ酸同一性を有し、最も保存された領域では９０％に達し、Ｓｅｒ／Ｐｒｏ-リッチの柔軟なヒンジでは５７％である。Ｐｏｌ λのヒトホモローグの同定は、最初は、dbEST/GeneBankデータベースの同一性調査に基づくものであった。全部で１３２３０７３の非重複配列のうち、１１がマウスＰｏｌ λと顕著な同一性を有していた。これらの１１のＤＮＡフラグメントは、胎児組織（心臓、肝臓および脾臓；５ケース）、幼児脳（２ケース）、胚中心Ｂ細胞（１ケース）、および、残りの３つのケースが一部の腫瘍サンプル（結腸、乳房および生殖細胞）に対応する。Ｐｏｌ λに対応する全てのＥＳＴが高い増殖の程度を有する組織（正常または病的）に由来し、それゆえ、これに対応してＤＮＡ修復に関連した酵素の高い量を必要とすることが重要であろう。
【００３６】
Ｐｏｌ λのｍＲＮＡの発現は、精巣において高度に富んでいる（ヒトおよびマウスの両方において）が、殆どの組織において基礎的な発現がある。それゆえ、発現データは、このＤＮＡポリメラーゼの正常または優勢な機能が、体細胞に起こったＤＮＡ破壊を修復すること、および胚細胞のＤＮＡのプログラムされた二本鎖破壊により開始されるプロセスである減数分裂に関係することであると示唆する。in vitroＤＮＡポリメライゼーションアッセイ中に観察されたエラー傾向の上昇から誘導される興味深い可能性は、Ｐｏｌ λにより触媒されたＤＮＡ合成が、突然変異誘発性であり、ゲノム進化に必要な変異性の背景となりうる変異をＤＮＡに導入し得るということである。
【００３７】
この新規ＤＮＡポリメラーゼの生化学的特性は、分子生物学における新規ＤＮＡ修飾酵素としての潜在的使用の基盤であり、本発明のさらなる態様を構成する。
【００３８】
そのマウスホモローグとは異なって、ヒトＰｏｌ λは、正常組織、腫瘍組織、および細胞系統に検出できる顕著な数のスプライシング変異体を示す。幼児脳から得られたヒトＰｏｌ λ(H11886)に対応するＥＳＴの一つは、Ｐｏｌ λプレｍＲＮＡに起こる選択的スプライシングの結果であると考えられ、エキソン５と８の融合をもたらし、その結果、エキソン６と７を欠失する（エキソンスキッピング）。これらのエキソンに対応するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅は、胎児ｃＤＮＡに存在するが、成人のｃＤＮＡには存在しない二つの主なスプライシング変異体の存在を示した。その一方はエキソン６の欠損に対応し（Ｄ６）、他方はエキソン６および７の同時欠損に対応する（Ｄ６＋７）（図２ａ）。さらに、これと同じスプライシング変異体とより大きなサイズの別のものが、腫瘍細胞系統および卵巣ガン、結腸腺癌および乳ガンのようなヒト腫瘍から誘導された生物学的サンプルから誘導されたｃＤＮＡの増幅により観察された（図２ｂ）。５つのスプライス変異体の全てを特徴決定した。そのうちの３つは、元のリーディングフレームを維持しており、それゆえ、得られたタンパクは切り詰められていない。Ｐｏｌ λのマウス遺伝子のエキソン−イントロン機構によれば、切り詰められていない変異体の一つはエキソン６の欠失に対応し、他のものはエキソン６および７の同時的欠失に対応する。第三の切り詰められていない変異体は、ヒト配列のエキソン５内に存在する隠れたスプライシング部位の使用により生成される。最も豊富に発現されるこれらの変異体は、以下に命名および詳説する。
【００３９】
hPOLλデルタ5（クローンタイプ a60b4）：ｃＤＮＡのヌクレオチド９８７−１２６２の欠失を有する；エキソン５の８７％を欠失し、位置６０７から２７７塩基を欠失する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；得られたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されている。
【００４０】
hPOLλデルタ６（クローンタイプ a31m）：ｃＤＮＡのヌクレオチド１２６３−１４３６の欠失を有する；エキソン６、位置２６から１７５ベースを完全に欠失し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；得られたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されている。
【００４１】
hPOLλデルタ６＋７（クローンタイプ a31c）：ヌクレオチド１２６３−１５６５の欠失を有する；エキソン６および７（位置２６から３０４ベース（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０））を完全に欠失し；その得られたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されている。
【００４２】
他の二つのスプライシング変異体は、より興味の薄い“プライオリ(priori)”である。これは、これらがオープンリーディングフレームの早期切りつめを生じるからである。正常−腫瘍組織におけるＰｏｌ λの各スプライシング変異体の選択的発現分析を実施するために、ＰＣＲ-プライマーのスプライシング特異的対を設計した。これらのプライマーは、各変異体を選択的に増幅することができ（実施例２参照）、その存在および異なる生物学的サンプルにおける相対量を調べることができる。変異体の相対的な量を評価する方法は、本発明の一部を形成する。
【００４３】
かくして、成体の脳には存在しないが幼児の脳に存在する変異体Ｄ６が、分析した正常組織の殆ど（膵臓を除く）に存在しないが、対応する組織の一次腫瘍に検出されることが観察された（図３）。
【００４４】
変異体Ｄ６＋７の選択的増幅は、胎児脳に起こるが、成人脳に起こらないことから、この変異体が正常組織の殆どに存在し、かつ、その対応する腫瘍において同様にまたは僅かに多く存在することを示した（図４）。興味深いことに、イントロン８のさらなる保持に対応する新たな変異体が成人脳に観察された。この新たなアイソフォームは、正常な膵臓においてのみ検出可能であり、かつ、通常は存在しない組織に対応する腫瘍サンプルにも見られる。最も顕著な例は結腸であり、そこでは正常−腫瘍組織を比較した場合、アイソフォームの完全な置換がある。
【００４５】
アミノ酸レベルにおいて、欠失Ｄ６＋７はサブドメイン８ｋＤａの一部、および“フィンガー”サブドメインの完全な欠失を生じ、結果的に“ヘリックス−ヘアピン−ヘリックスモチーフ”と呼ばれる、酵素の二つの重要なＤＮＡ結合ドメインを欠失する［Dohertyら,(1996), Nucleic Acids Res.24, 2488-2497］。３つの変異体Ｄ５、Ｄ６およびＤ６＋７は、タンパクの切りつめを生じず、触媒部位を形成するサブドメインを維持する。それゆえ、ポリメラーゼの機能的なバージョンを示すと考えられる。これは、最小コアに限定されたそのポリメライゼーションドメインが、ＤＮＡ修復におけるその機能が最近報告されているＡＳＦＶ ＰｏｌＸのそれと非常に類似しているからである［Oliverosら,(1997), J.Biol.Chem.272,30899-30911］。先に記載されているように、腫瘍トランスフォーメーションを引き起こすミューテーター表現型の取得は、最初は、ＤＮＡ修復メカニズムにおける変更による。本発明では、ＤＮＡ損傷蓄積を妨げることにより、腫瘍のサプレッサーとして作用し得る、あるいは、エラー傾向のあるＤＮＡ修復メカニズムへの関与という副作用としてＤＮＡに変異を導入することによる腫瘍形成に直接寄与する、新規のヒトＤＮＡポリメラーゼが記載されている。後者の説は、未損傷ＤＮＡ鋳型にin vitroでアッセイした場合の、Ｐｏｌ λの低い挿入忠実度によって支持されている。さらに、Ｐｏｌ λの特定のアイソフォームが、機能的であり、腫瘍形成に寄与しうるミューテーター表現型を示した。このアイデアは、腫瘍サンプルにおけるこれらの変異体の一部の、選択的ＰＣＲ増幅により同定された、特異的な存在によって支持されている。それゆえ、Ｐｏｌ λとそのアイソフォームは、これらの悪性腫瘍の予後および診断の両方に結果的な利点を有する、ヒトにおける潜在的腫瘍マーカーと考えることができる。一方、これらの各アイソフォームの発現は、同定および診断のより特異的な方法を開発することを可能にする特異的抗体を生じるための精製されたポリペプチドを得ることを可能にし、これは本発明の一部を成す。さらに、各アイソフォームに対応するｃＤＮＡ配列の知識は、同定および診断のための特異的プローブを生成することを可能にし、これも本発明の一部を成す。
【００４６】
ここに提案された魅力的な仮説は、選択的スプライシングにより産生されたＤＮＡポリメラーゼ変異体が、優勢なエラー傾向のあるバージョンとして作用し、正常レベルのＤＮＡ修復を妨げかつ／または変更し得る“ミューテーター(mutator)”ＤＮＡポリメラーゼを示すことであり、これは、これらの変異体が発現される細胞の細胞性トランスフォーメーションを誘導するか、あるいは、神経変性疾患および老化に起こるような、不十分なＤＮＡ修復力に関連した別のプロセスを促す。
【００４７】
ＰＯＬＬ遺伝子（Ｐｏｌ λをコードする）およびその発現変異体に関する我々の知識は、正常細胞生理機能のメンテナンスまたは細胞トランスフォーメーションの促進において、これらの酵素の機能を調べるための戦略を開発することを可能にする。これらの戦略は、Ｐｏｌ λの特異的変異体を過剰発現するプラスミドの種々の組合せで正常細胞をトランスフォーメーションし、細胞表現型に対する発現されたアイソフォームの効果を調べることに基づいている。
【００４８】
病理的表現型を誘導できる特定のＰｏｌ λアイソフォーム（またはアイソフォームの組合せ）の同定は、ＤＮＡ修復の欠陥に関連したプロセス（神経変性疾患、ガン）を妨げる新規ターゲットを提供し、本発明のさらなる態様を形成する。一方、腫瘍表現型を示すＰｏｌ λ形質転換細胞の入手可能性は、治療化合物を提供する特異的インヒビターの開発を可能にする。
【００４９】
さらに、Ｐｏｌ λに関する本発明の開示により、マウスにおけるＰｏｌ λ欠陥モデル（ノックアウト）が生成され、そこではこの遺伝子が選択的に欠失され［Schawartzbergら(1989),Science 246,799-803］、病理の誘導の研究、および新規治療化合物の同定に非常に有益である。
【００５０】
ｍＲＮＡの３'-末端に対応する情報を含むヒトＰｏｌ λに対応するＥＳＴを探すために、dbEST/GeneBankで行った同様の調査では、多数のＥＳＴが見出された。存在するＥＳＴは以下の同定番号を有していた：AI970471; AA576526; AI199486; AI123218; AA989195; AI091150; AA922738; W69567; AI560660; AI612820; AA927738; AA742404; R16877; H11524; T81488; R71372; AI538103; AA807380; AA991853; AA468875。これらの２０の配列の内、９は正常組織に対応するが、残りの１１の配列は種々の起源の腫瘍に対応する。
【００５１】
これら２０のＥＳＴのヌクレオチド配列アライメントは、７つのケースにダブルミューテーションの存在を示した。このダブルミューテーションは、全てのケースで、二つのヌクレオチドのみによって分けられた、ヌクレオチドＴ２５７６およびＧ２５７９において生じた（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。全てのケースで、これら二つのヌクレオチドは、同様に置換された：Ｔ２５７６−＞Ｃ  ｙ  Ｇ２５７９−＞Ｔ。７つの変異した配列はいずれも、正常組織から得られたＥＳＴには対応しないが（全部で９のＥＳＴ）、これら全てが腫瘍から得られたＥＳＴに対応する（１１サンプルの内の７つの変異配列）。この変異したＥＳＴは、以下の同定番号を有する：AI970471; AA576526; AA922738; AI612820; AA927738; AI538103; AA468875。これらの３つは、生殖細胞腫瘍から得られ、１つは卵巣ガン、１つは子宮腺癌、そして残りの２つは乳ガンおよび結腸ガンから得られる。本発明の一部の核酸の態様では、これらのＥＳＴは本発明から排除される。
【００５２】
それゆえ、より徹底的かつ有意味な統計的分析の不在下では、異なる性質の腫瘍サンプルにおけるこのダブル変異の発生は、６４％という顕著に高い値に達する。最も妥当な解釈は、腫瘍発達の高い結合または可能性を有する、このダブル変異がアレル変異体に対応するということである。この相互関係は、アレル変異体を有する患者のＰｏｌ λ ｍＲＮＡの変更された安定性の結果である。これは、Ｐｏｌ λ機能、そしてそれゆえ、ＤＮＡ修復の特異的プロセスを実施する細胞の能力に不全を含む。in situハイブリダイゼーションまたはＰＣＲのような、分子生物学の種々の技術による、ヒト生物学的サンプルにおけるこのダブル変異の同定は、この変異を有する患者の早期診断を可能にし、危険性のある集団の適切な監視およびコントロールを明確にすることを助ける。
【００５３】
体細胞ハイブリッドのパネルを用いて（マウス／ヒト）、ヒトＰｏｌ λ遺伝子を第１０染色体に最初に位置づけた。放射線ハイブリッドを用いて、マッピングを、１０ｑ２４位へとしぼった。この領域は、非常に高い頻度の分子変異、主に欠失および再配列を示す。
【００５４】
９キロベースだけの領域に７以上の破壊点が存在することは、その活性化が選択的な利点を与える隣接する遺伝子の存在を示唆する。同じ領域である１０ｑ２４は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病における転座に関与し[Parkら,(1992),Genes Chromosomes Cancer 4,32-40]、高い割合の前立腺ガン[Fordら,(1998),Cancer Genet.Cytogenet.102,6-11]およびヒトグリオーム(glyoma)[Chernovaら,(1998), Cancer Genet.Cytogenet.105-60-68]でしばしば欠失される。最後に、Ｐｏｌ λが、顕著なレベルの発現をヒトの脳、特にニューロンにおいて有することに注意すべきである。さらに、アイソフォームのパターンは、種々の発生段階を比較した場合に異なる（胎児−成体）（図２ａ）。ＤＮＡ修復におけるＰｏｌ λの役割、およびＤＮＡ修復不全が神経変性疾患の基盤であることを仮定すると、本発明に記載された新規ポリメラーゼの散発的または遺伝的変性がこれらの疾患の出現および発達に重要であると推測される。それゆえ、Ｐｏｌ λの機能および制御に関する広い知識は、これらの病理の診断および治療に新たな道を開く。
【００５５】
Ｐｏｌ λ核酸
“Ｐｏｌ λ核酸”とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子を含む。Ｐｏｌ λコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に記載された全長配列、相補的核酸配列であり、あるいはこれらの配列のミュータント、誘導体またはアレルであってもよい。配列は、示された配列の一以上のヌクレオチドの一以上が付加、挿入、欠失、および置換により、示された配列から異なるものであってもよい。ヌクレオチド配列に対する変化は、タンパクレベルでアミノ酸の変化をもたらしても、そうでなくてもよく、これは遺伝コードによって決定される。かくして、本発明にかかる核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に示された配列とは異なる配列を含むが、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【００５６】
一方、コードされたポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に示されたアミノ酸配列とは、一以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含んでもよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に示された配列のアミノ酸配列ミュータント、変異体、誘導体またはアレルであるポリペプチドをコードする核酸が、本発明によりさらに提供される。かかるポリペプチドは以下に記載されている。かかるポリペプチドをコードする核酸は、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に示されたコード配列と少なくとも４０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【００５７】
また本発明は、ここに記載したＰｏｌ λ核酸配列のフラグメントを含む。フラグメントは好ましくは、少なくとも６０、１２０、１８０、２４０または４８０ヌクレオチドの長さである。
【００５８】
一般的に、本発明にかかる核酸は、単離物として、単離されたおよび／または精製された形態で、あるいは、一以上の発現制御配列を除く、ヒトゲノムの遺伝子に隣接する遊離または実質的に遊離の核酸のような、自然に結合する遊離または実質的に遊離の物質として提供される。核酸は、全体的または部分的に合成されてもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡを含んでもよい。本発明にかかる核酸はＲＮＡを含むが、示された配列の参照は、ＵをＴに置換したＲＮＡ等価物の参照として解釈されるべきである。
【００５９】
ＰＯＬＬ遺伝子の全てまたは一部、および／またはその制御エレメントをコードする核酸配列は、ここに含まれる情報および参考文献並びに技術常識を用いて、当業者であれば容易に調製できる（例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis,"Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,およびAusubelら,Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992参照）。これらの技術は、(i)例えば、ゲノム源から、かかる核酸のサンプルを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、(ii)化学合成、または(iii)E.coliでの増幅を含む。修飾されたＰｏｌ λポリペプチドを発現させたり、核酸を発現させるために用いられる宿主細胞におけるコドン選択を考慮するために、例えば、部位特異的変異導入を用いて、Ｐｏｌ λ配列の修飾を行うことができる。
【００６０】
Ｐｏｌ λ核酸配列の発現を得るために、この配列を、Ｐｏｌ λ核酸に機能的に結合されたコントロール配列を有するベクターに取り込み、その発現をコントロールすることができる。このベクターは、挿入された核酸の発現を誘導するプロモーターまたはエンハンサー、Ｐｏｌ λポリペプチドが融合物として産生されるような核酸配列、および／または宿主細胞で産生されたポリペプチドが細胞から分泌されるように分泌シグナルをコードする核酸配列のような、他の配列を含むことができる。Ｐｏｌ λポリペプチドは、ベクターを、そのベクターが機能する宿主細胞にトランスフォーミングし、Ｐｏｌ λポリペプチドが産生されるようにその宿主細胞を培養し、かつ、宿主細胞または周りの培地からＰｏｌ λポリペプチドを回収することにより得ることができる。E.coli、酵母、およびＣＯＳまたはＣＨＯ細胞のような真核細胞の株を含む、原核および真核細胞は、当該技術においてこの目的のために用いられる。宿主細胞の選択は、例えば、ポリペプチドが宿主細胞に蓄積されることを制御する、またはそのグリコシレーションおよびホスホリレーションのような特性に影響を与えるといった、これらの細胞において発現されたＰｏｌ λポリペプチドの特性をコントロールするために用いられる。
【００６１】
核酸の増幅のためのＰＣＲ技術は、米国特許第４６８３１９５号に記載されている。一般に、かかる技術は、標的配列の末端からの配列情報が知られていて、適切なフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーが増幅の標的であるポリヌクレオチド配列に同一または類似するように設計できることが必要である。ＰＣＲは、鋳型核酸の変性（二本鎖の場合）、プライマーをターゲットにアニーリング、およびポリメライゼーションの工程を含む。この増幅反応の鋳型としてプローブされまたは用いられる核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡであってもよい。ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡから特定配列、特定のＲＮＡ配列、およびｍＲＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミドから転写されたｃＤＮＡを増幅するために用いることができる。ここに示されたＰｏｌ λ核酸配列は、当業者であれば容易にＰＣＲプライマーを設計することができる。ＰＣＲ技術の一般的使用の参考文献は、Mullisら,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,51:263,(1987), Ehrlich(ed), PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989, Ehrlichら, Science, 252:1643-1650, (1991), "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds.Innisら, Academic Press, New York, (1990)を含む。
【００６２】
ここに示された核酸配列は、試験サンプルにおいて、興味のある核酸（および、本発明にかかり得るもの）を同定するのに有益である。本発明は、興味のある核酸を得る方法、ここに記載された配列または相補配列の全てまたは一部を有するプローブをターゲット核酸にハイブリダイズさせることを含む方法を与える。
【００６３】
ハイブリダイゼーションは、一般に、後で、成功したハイブリダイゼーションの同定、およびプローブにハイブリダイズした核酸の単離を行い、これらは、ＰＣＲの一以上の工程を含んでもよい。
【００６４】
本発明にかかる核酸は、ここに記載した核酸配列の一以上のフラグメント、特に、コドン使用または統計的分析に基づいて、比較的稀な配列のフラグメントとハイブリダイズするように設計された一以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて得られる。添付図に記載した核酸配列のフラグメントとハイブリダイズするように設計されたプライマーは、ターゲットの核酸がクローン化されたクローニングベクター内の配列にハイブリダイズするように設計された一以上のオリゴヌクレオチドと関連して用いられるか、あるいはいわゆる“ＲＡＣＥ”(rapid amplification of ｃＤＮＡ ends)、すなわち、ライブラリーのｃＤＮＡがオリゴヌクレオチドリンカーにライゲートされ、ＰＣＲがここに記載された配列とハイブリダイズするプライマーとオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするプライマーとを用いて行われる方法において用いられる。
【００６５】
かかるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、および全長配列（および、ミュータント、アレル、変異体、および誘導体）も、アレル、ミュータント、および変異体、特に、Ｐｏｌ λタンパクの不活性または機能不全形態の産生を導くものの存在に関して、核酸を含む試験サンプルをスクリーニングすることにおいて有益であり、このプローブは、試験される患者から得られたサンプルに由来するターゲット配列とハイブリダイズさせられる。ハイブリダイゼーションの条件は、非特異的結合を最小限にするように調節される。好ましくは、ストリンジェントから適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。当業者であれば、Sambrookら(1989)およびAusubelら(1992)のような教科書に従って、容易に、かかるプローブを設計し、それらをラベルし、ハイブリダイゼーション反応に適した条件を工夫することができる。
【００６６】
Ｐｏｌ λ配列における多型または変異の存在を調べるのと同様に、このプローブを、Ｐｏｌ λをコードするｍＲＮＡが細胞または組織に存在するか否かを調べるためにも使用することができる。多型の例は、実施例５に詳細に記載されている１３８９位の一塩基多型である。
【００６７】
一以上の細胞（例えばヒト）から単離および／または精製された核酸、または細胞から単離および／または精製された核酸から誘導された核酸ライブラリー（例えば、細胞から単離されたｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリー）は、選択的ハイブリダイゼーションの条件下でプローブされ、かつ／または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような特異的核酸増幅反応が行われてもよい。
【００６８】
クローニングに関連して、一以上の遺伝子フラグメントが、全長コード配列を生成するためにライゲートされる必要があるかもしれない。また、全長コード化核酸分子が得られなかった場合は、全長分子の一部を示すより小さい分子が、全長クローンを得るために用いられてもよい。インサートは、部分的ｃＤＮＡクローンから調製され、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられてもよい。単離された全長クローンを発現ベクターにサブクローニングすることができ、例えばレポータープラスミドを有する適切な宿主細胞に、トランスフェクションすることによって活性をアッセイしてもよい。
【００６９】
一以上の（例えば２の）プローブまたはプライマーのターゲット核酸へのハイブリダイゼーションを含んでもよい。核酸が二本鎖ＤＮＡである場合には、ハイブリダイゼーションは、一般に、変性させて一本鎖ＤＮＡを最初に生じさせる。ハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ法の一部、またはＰＣＲに関連しないプロービング方法の一部である。例示的方法は、ＰＣＲと低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションとの組合せである。当業者に利用される多くの方法から選択されたスクリーニング方法は、成功したハイブリダイゼーションを同定し、かつ、単離されたハイブリダイズした核酸を同定するために用いられる。
【００７０】
標的核酸（例えばＤＮＡ）に対するプローブの結合は、当業者の自由で、種々の技術のいずれかを用いて測定することができる。例えば、プローブは、放射能、蛍光、または酵素ラベルされてもよい。プローブのラベル化を用いない別の方法は、制限フラグメント長さ多型の調査、ＰＣＲを用いた増幅、ＲＮＡアーゼ切断、および、アレル特異的オリゴヌクレオチドプロービングを含む。
【００７１】
プロービングは、標準的なサザンブロッティング技術を用いてもよい。例えば、ＤＮＡは、細胞から抽出されて、種々の制限酵素で切断されてもよい。制限フラグメントは、アガロースゲルでの電気泳動により分離され、変性し、ニトロセルロースフィルターに移されてもよい。ラベル化されたプローブは、フィルターのＤＮＡフラグメントにハイブリダイズされ、結合が調べられてもよい。プロービングのＤＮＡは、細胞からのＲＮＡ調製物から調製されてもよい。
【００７２】
予備的実験は、制限酵素で切断したＤＮＡのサザンブロットに種々のプローブをストリンジェンシーの低い条件下でハイブリダイズさせて行ってもよい。適切な条件は、多数のハイブリダイジングフラグメントが得られるが、バックグラウンドハイブリダイゼーションが低い場合に達成される。これらの条件を用いて、核酸ライブラリー、例えば発現された配列を表すｃＤＮＡライブラリーを、調査してもよい。
【００７３】
当業者であれば、オリゴヌクレオチドの長さや塩基の組成、温度などのファクターを考慮して、選択的ハイブリダイゼーションに適した所望のストリンジェンシーの条件を用いることができる。
【００７４】
アミノ酸配列情報に基づいて、遺伝コードの縮重、および、適切であれば、候補の核酸が誘導される生物のコドン使用を考慮して、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを設計することができる。核酸増幅に使用されるオリゴヌクレオチドは、約１０以下のコドン（例えば、６、７または８）、すなわち、約３０以下の長さのヌクレオチド（例えば、１８、２１または２４）を有する。一般的に、特異的プライマーは、１４ヌクレオチド以上の長さであるが、１８−２０以下である。当業者であれば、ＰＣＲのような使用プロセスのためのプライマーの設計に精通している。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、特に、核酸を得るおよび／またはスクリーニングする方法において使用される、ここに記載されたヌクレオチド配列の一つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドフラグメント、または相補的配列を提供する。上記配列は、一以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入、または欠失によって修飾されてもよいが、好ましくは、ここに記載された配列を有する核酸と選択的にハイブリダイズできる能力を損なわないものである。すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、記載された配列の一つとの配列同一性の程度が、顕著に高いものとされる。
【００７６】
一部の好ましい実施態様では、ここに開示された核酸配列のいずれかのフラグメントである、本発明にかかるオリゴヌクレオチド、またはその相補配列は、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。かかるフラグメントは、それぞれ、本発明の態様を示す。フラグメントおよび他のオリゴヌクレオチドは、上記のようにプライマーまたはプローブとして用いられてもよいが、試験サンプルにおけるＰｏｌ λ核酸の存在を調べることに関連した方法で生成（例えば、ＰＣＲによる）されてもよい。
【００７７】
本発明にかかる核酸は、遺伝子治療法、例えば、上記状態を予防または治癒（全体的または部分的）する目的の患者の治療法において、用いることができる。このツールは以下に記載する。
【００７８】
本発明にかかるポリペプチドを産生する簡便な方法は、それをコードする核酸を、発現系においてその核酸を使用することにより発現させることである。発現系の使用は、高度に洗練されている。
【００７９】
従って、本発明は、ポリペプチド（開示）を調製する方法を含み、当該方法はそのポリペプチドをコードする核酸（一般的には、本発明にかかる核酸）からの発現を含む。これは、都合のよいことには、ポリペプチドの発現を引き起こし、あるいは可能にする適切な条件下で、かかるベクターを含む、培養における宿主細胞の増殖によって達成される。ポリペプチドは、網赤血球溶解物のような、in vitro系で発現されてもよい。
【００８０】
種々の宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムが周知である。適切な宿主細胞は、細菌、哺乳動物および酵母のような真核細胞、およびバキュロウイルス系を含む。異種ポリペプチドの発現に関する技術において利用できる哺乳動物細胞系統は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞およびその他多くを含む。一般的な、好ましい細菌宿主はE.coliである。
【００８１】
安定なベクターは、適切な制御配列、適当に、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニレーション配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、およびその他の配列を含むように選択または構成される。ベクターは、適当に、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドとすることができる。さらに詳しくは、例えば、Molecular Cloning: a laboratory Manual:2nd edition, Sambrookら,1989, Cold Spring harbor Laboratory Pressを参照。核酸を操作するための多くの公知技術およびプロトコール、例えば核酸構成物の調製、変異、シークエンシング、細胞へのＤＮＡの挿入および遺伝子発現、およびタンパク分析は、詳細に、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら, eds., John Wiley & Sons, 1992に記載されている。
【００８２】
かくして、本発明のさらなる態様は、ここに開示された核酸を含む宿主細胞を提供する。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組み込まれてもよい。組み込みは、標準的な技術に従って、ゲノムと組み換えを促進する配列の封入により促進されてもよい。核酸は、細胞内の染色体外ベクターにあってもよい。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、宿主細胞に核酸を組み込むことを含む方法を提供する。（特にin vitro組み込みで）制限することなく、一般的に“トランスフォーメーション”として称される組み込みは、あらゆる利用可能な技術を用いることができる。真核細胞では、適切な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニア、または昆虫細胞用のバキュロウイルスを用いた形質導入を含むことができる。細菌細胞では、適切な技術は、塩化カルシウムトランスフォーメーション、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを用いたトランスフェクションを含むことができる。別法として、直接的核酸注入を用いることができる。
【００８４】
抗生物質耐性または敏感性遺伝子のようなマーカー遺伝子を、当該技術分野で周知のように、興味のある核酸を含むクローンを同定することにおいて用いることができる。
【００８５】
導入後、その核酸から、例えば、コードされたポリペプチドが産生されるような、遺伝子の発現の条件下で、宿主細胞（実際にトランスフォームされた細胞を含むが、好ましくはトランスフォームした細胞の子孫）を培養することにより、発現を引き起こすまたは可能にする。適切なシグナルリーダーペプチドに結合したポリペプチドが発現される場合には、培養培地に細胞から分泌され得る。発現による産生後、ポリペプチドは、宿主細胞および／または培養培地から単離および／または精製されてもよく、次いで、所望の通りに、例えば、一以上のさらなる成分を含む組成物、例えば一以上の薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクル、またはキャリアーを含む薬学的組成物の製造に用いられてもよい（例えば、以下参照）。
【００８６】
例えば、細胞またはその細胞の祖先核酸を導入した結果、および／または細胞または祖先に内因的な配列の遺伝的変更の結果（導入または変更はin vivoまたはex vivoで起こる）として本発明にかかる核酸を含む宿主細胞は、動物、特に哺乳動物である生命体内に含まれてもよい（例えば体幹）。この動物は、ヒトであってもよく、ヒト以外、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、またはウマであってもよく、またニワトリのようなトリであってもよい。かかる細胞を含む遺伝的に修飾されたまたはトランスジェニック動物またはトリは、本発明のさらなる態様をもたらす。
【００８７】
これは、治療目的を有してもよい。（遺伝子治療は以下に記載する）。特に同族内因性配列の代わりに、生物体の細胞におけるミュータント、アレルまたは変異体配列の存在は、前記生物体を、in vitroでＰｏｌ λ遺伝子またはコードされたポリペプチドの活性を調節する物質の役割を試験および／または研究するモデルとして用いることを可能にする。
【００８８】
トランスジーンによりコードされたポリペプチドの産生に用いられることに加えて、宿主細胞は、大量に生成するために、関心の向けられた核酸を複製するための核酸製造所として用いられてもよい。関心の向けられた核酸の多重コピーが、ＤＨＦＲのような増幅可能な遺伝子に結合されて、細胞内で形成されてもよい。関心の核酸で形質転換された宿主細胞、または、核酸が導入された宿主細胞の子孫は、適切な条件下で、例えば、発酵槽において培養されて、その培養物から回収され、かつ、核酸を精製するための処理を受けてもよい。精製後、核酸またはその一以上のフラグメントを、所望の通りに、例えば、以下に記載する診断または予後アッセイにおいて用いることができる。
【００８９】
Ｐｏｌ λポリペプチド
当業者であれば、ここに記載された技術または当該技術分野で周知の他の技術を用いて、医薬としての使用のため、薬剤の開発、およびその特性およびin vivoでの役割に関するさらなる研究のために、大量のＰｏｌ λポリペプチド、そのフラグメントまたは活性部分を、生成することができる。
【００９０】
かくして、本発明のさらなる態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。これは、単離および／または精製された形態であってもよく、天然で結合している物質、例えば他のポリペプチドまたはＰｏｌ λポリペプチド以外のヒトポリペプチドから遊離または実質的に遊離した、または（例えば原核細胞における発現により産生された場合）天然グリコシレーションを欠く、例えば非グリコシル化された形態であってもよい。
【００９１】
アミノ酸配列変異体、アレル、誘導体またはアイソフォームであるポリペプチドも、本発明により提供される。変異体、アレル、誘導体またはアイソフォームであるポリペプチドは、一以上のアミノ酸の一以上の付加、置換、欠失および挿入により、ここに開示された配列から異なるアミノ酸配列を有してもよい。好ましいポリペプチドは、上記のように、Ｐｏｌ λポリメラーゼ機能を有する。
【００９２】
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に記載されたアミノ酸配列のアミノ酸配列変異体、アレル、誘導体またはミュータントであるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４の配列に対して、少なくとも４０％の配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも５０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも６０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００９３】
当業者であれば、当該技術分野で周知の技術、例えば、Genetics Computer Group, Oxford Molecular Group, Madison, Wisconsin, USA, Version 9.1から入手できるＧＣＧプログラムを用いて、容易に配列比較を行い、かつ、同一性を調べることができる。特定のアミノ酸配列変異体は、１のアミノ酸、２、３、４、５−１０、１０−２０、２０−３０、３０−５０、５０−１００、１００−１５０または１５０以上のアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に記載された配列から異なってもよい。
【００９４】
ハイブリダイゼーション反応の“ストリンジェンシー”は、当業者により容易に決定され、一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存して経験的に予測される。一般的に、より長いプローブは適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、相補的な鎖がそれらの溶解温度以下の環境に存在する場合に再アニールする変性ＤＮＡの能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望のホモロジーの程度が高くなればなるほど、使用できる相対温度がより高くなる。結果として、より高い相対温度が、反応条件をよりストリンジェントにし、より低い温度がよりストリンジェンシーを低下させる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの詳細および説明については、Ausubelら, Current Protocoles in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照。
【００９５】
“ストリンジェントな条件”または“高ストリンジェンシー条件”とは、以下のように同定される：（１）洗浄に低イオン強度および高温を用いる、例えば、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムで、５０℃；（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤、例えばホルムアミドを用いる、例えば、５０％(v/v)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５、（７６０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）、４２℃；あるいは、（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘDenhardt's溶液、超音波処理したサーモンスパームＤＮＡ(salmon sperm DNA)（５０ｌｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストランスルファート、４２℃を用い、４２℃で０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミドで５５℃で洗浄し、次いで、ＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる、５５℃での高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【００９６】
ここに記載したＰｏｌ λポリペプチド配列に関して“パーセント（％）アミノ酸配列同一性”とは、必要であれば、最大の配列同一性のパーセントを達成するために、配列をアライメントしギャップを導入した後で、そして、配列同一性の部分としてあらゆる保存的置換も考慮せずに、Ｐｏｌ λ配列のアミノ酸残基と同一の候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。ここで用いられる％同一性の値は、［Altschulら, Methods in Enzymology,266:460-480 (1996): http://blast.wustl/edu/blast/README.html］から入手したWU-BLAST-2により得られたものである。WU-BLAST-2は、いくつかのサーチパラメーターを用いる。その殆どはデフォルト値に設定されている。調節可能なパラメーターは、以下の値にセットされている：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰＳ２パラメーターは、動的値であり、特定の配列の組成と、興味の配列について調べられる特定のデータベースの組成に基づいてそのプログラムにより確立される。しかしながら、この値は、感度を増大させるために調節されてもよい。アミノ酸配列同一性値は、一致した同一の残基の総数を、整列された領域の“より長い”配列の残基の総数で割ることにより決定される。“より長い”配列とは、整列された領域における最大の実際の残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにWU-BLAST-2により導入されたギャップは無視される）。
【００９７】
同様に、ここに記載されたＰｏｌ λポリペプチドのコード配列に関する“パーセント（％）核酸配列同一性”とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および４に記載されたＰｏｌ λコード配列の核酸残基と同一の候補配列における核酸残基のパーセントである。ここで用いられる同一性の値は、デフォルトのパラメーターにセットされたWU BL AST-2のBLASTNモジュールにより、オーバーラップスパンとオーバーラップフラクションをそれぞれ１と０．１２５にセットして得られた。
【００９８】
本発明は、本発明のＰｏｌ λポリペプチドの活性部分及びフラグメントも含む。
【００９９】
Ｐｏｌ λポリペプチドの“活性部分”は、前記全長Ｐｏｌ λポリペプチドよりも短いが、例えばＤＮＡポリメラーゼとしての本質的な生物学的活性の少なくとも一部を維持するペプチドを意味する。例えば、Ｐｏｌ λのより小さいフラグメントは、他のタンパクと相互作用することにより封鎖剤または競合アンタゴニストとして作用することができる。
【０１００】
Ｐｏｌ λポリペプチドの“フラグメント”は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、７、９または１１に記載された配列の少なくとも５つ連続するアミノ酸のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも７つ連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも１０連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも４０連続するアミノ酸を意味する。Ｐｏｌ λポリペプチド配列のフラグメントは、Ｐｏｌ λアミノ酸配列の一部に対する抗体を生じるエピトープまたは抗原決定基として使用することができる。
【０１０１】
Ｐｏｌ λポリペプチドの“誘導体”またはそのフラグメントは、タンパクのアミノ酸配列を変更することによって、例えば、タンパクをコードする核酸の操作、またはタンパクそのものを変更することによって、修飾されたポリペプチドを意味する。天然アミノ酸配列のかかる誘導体は、Ｐｏｌ λポリペプチドの本質的な活性を基本的に変更することなく、１、２、３、５またはそれ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失、または置換を含むことができる。
【０１０２】
本発明にかかるポリペプチドは、例えば、コード化核酸から発現により産生した後に、（例えば、抗体を用いて）単離および／または精製されてもよい（以下を参照）。本発明にかかるポリペプチドは、化学合成により全体的または部分的に生成されてもよい。この単離および／または精製されたポリペプチドは、少なくとも一つのさらなる成分を含む組成物、例えば、薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクル、またはキャリアーを含む製薬学的組成物の製剤に用いることができる。本発明にかかるポリペプチドを含む組成物は、以下に記載する予防および／または治療処置に使用することができる。
【０１０３】
本発明にかかるポリペプチド、ペプチドフラグメント、アレル、ミュータントまたは変異体は、特異的抗体を得るための免疫原等として用いられる。抗体は、ポリペプチドおよびペプチドの精製およびその他の操作、診断的スクリーニング、および治療において有益である。これについては、以下にさらに記載する。
【０１０４】
本発明にかかるポリペプチドは、その活性または機能に影響するまたは調節する分子をスクリーニングすることに使用できる。かかる分子は、治療（予防も含む）に有益である。
【０１０５】
Ｐｏｌ λポリペプチドは、結合パートナー、例えば、エフェクター分子、ラベル、試薬、毒素および／またはキャリアーまたは輸送分子に結合されてもよい。本発明のペプチドをペプチジルおよび非ペプチジル結合パートナーの両方に結合させるための技術は、当該技術分野において周知である。
【０１０６】
Ｐｏｌ λポリペプチドに結合できる抗体
Ｐｏｌ λポリペプチドのさらなる重要な用途は、Ｐｏｌ λポリペプチド、またはそのフラグメントまたは活性部分に特異的に結合する特性を有する抗体を生じることである。
【０１０７】
Ｐｏｌ λタンパクに対するモノクローナル抗体を産生することが可能であり、これを行う技術は当該技術分野でよく確立されている。モノクローナル抗体は、元の抗体の特異性を維持する別の抗体またはキメラ分子を生じる組み換えＤＮＡ技術に処理されてもよい。かかる技術は、抗体のイムノグロブリン可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、別のイムノグロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含んでもよい。例えば、EP-A-184187、GB-A-2188638またはEP-A-239400を参照。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、産生された抗体の結合特性を変更しうる、または変更しない、遺伝的変異または別の変化を受けてもよい。
【０１０８】
新規Ｐｏｌ λポリペプチドの供給が、それと特異的に結合することができる抗体の産生を初めて可能にする。従って、本発明のさらなる態様は、抗Ｐｏｌ λ抗体を提供する。かかる抗体は、それが結合できるポリペプチドと、それが全くまたは実質的に全く結合親和性を持たない（例えば結合親和性が約１０００ｘ以下）別のヒトポリペプチドとの間を識別することができるという意味で、特異的である。特異的な抗体は、他の分子には存在しないまたはアクセスできない分子上のエピトープに結合する。本発明にかかる抗体は、野生型のポリペプチドに特異的である。本発明にかかる抗体は、以下に記載される診断および予防的方法に有益であるように、野生型Ｐｏｌ λポリペプチドとの間で、特定のミュータント、変異体、アレルまたは誘導体ポリペプチドに特異的である。また抗体は、例えば、コードする核酸からの組み換え発現による産生後に、それらの抗体が結合するポリペプチドを精製することにも有益である。
【０１０９】
本発明にかかる好ましい抗体は、他のポリペプチドに結合できる抗体のような不純物を含まない、および／または血清成分を含まないという意味で、単離されている。モノクローナル抗体は、一部の目的にとって好ましいが、ポリクローナル抗体は本発明の範囲内にある。
【０１１０】
抗体は、当該技術分野で標準的な技術を用いて得られる。抗体産生方法は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、またはサル）をそのタンパクまたはそのフラグメントで免疫することを含む。抗体は、当該技術分野で公知の種々の技術を用いて免疫化された動物から得られ、好ましくは興味の抗原に対する抗体の結合を用いてスクリーニングされる。例えば、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降法を用いることができる(Armitageら, Nature, 357:80-82, 1992)。抗体および／または動物からの抗体産生細胞の単離は、動物を殺す工程を伴ってもよい。
【０１１１】
ペプチドで哺乳動物を免疫化することに代えて、あるいはこれに加えて、タンパクに特異的な抗体が、例えば、その表面に機能的なイムノグロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを用いて、発現されたイムノグロブリン可変ドメインの組み換え産生ライブラリーから得られてもよい。例えば、WO92/01047参照。ライブラリーは、タンパク（またはフラグメント）で免疫されていない生物から得られた配列から構成されたナイーブであってもよく、また、興味の抗原に曝された生物から得られた配列を用いて構築されたものであってもよい。
【０１１２】
本発明にかかる抗体は、多数の方法で修飾されてもよい。用語“抗体”とは、必要な特異性を備えた結合ドメインを有する結合物質をカバーするように構成されるべきである。かくして、本発明は、抗体フラグメント、誘導体、機能的等価物およびホモローグをカバーし、合成分子および抗原またはエピトープに結合可能にする抗体の形状に類似する形状を備えた分子を含む。
【０１１３】
抗原または他の結合パートナーに結合できる抗体フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣｌおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；単離されたＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド結合により結合した二つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである。一本鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。
【０１１４】
非ヒト源のＣＤＲがヒトフレームワーク領域にグラフトしており、通常は、フレームワークアミノ酸残基の一部の変更を伴い、親の非ヒト抗体よりも低い免疫原性を有する抗体を生じるヒト化抗体も、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１５】
本発明にかかるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、遺伝的変異または他の変化を受けてもよい。さらに、当業者であれば、モノクローナル抗体は、元の抗体の特異性を維持した別の抗体またはキメラ分子を生じる組み換えＤＮＡ技術で処理されてもよいことを理解できるであろう。かかる技術は、抗体のイムノグロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、別のイムノグロブリンの定常領域または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含んでもよい。例えば、EP-A-184187、GB-A-2188638またはEP-A-0239400を参照。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP-A-0120694およびEP-A-0125023に開示されている。
【０１１６】
抗体（抗体フラグメントを含む）をコードする核酸を含み、かつ、その発現をすることができる、真核または原核性の宿主細胞である、所望の結合特性を備えた抗体を産生することができるハイブリドーマは、本発明の範囲内である。本発明は、抗体が産生される、好ましくは分泌される条件下で、抗体を産生することができる細胞を培養することを含む抗体の産生方法も提供する。
【０１１７】
サンプルに対する抗体の反応性は、あらゆる適切な手段によって調べることができる。個々のレポーター分子でタグを付すこともできる。レポーター分子は、直接または間接的に、検出可能、かつ、好ましくは測定可能なシグナルを生じる。レポーター分子の結合は、直接または間接的に、例えばペプチド結合を介して共有的、あるいは非共有的とすることができる。ペプチド結合を介した結合は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合物の組み換え発現の結果であってもよい。
【０１１８】
好ましい方法の一つは、各抗体を、個々の螢光色素、螢光体、または分光学的に単離された吸収または放射特性を備えたレーザー励起染料と共有結合させる。適切な螢光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッド(Texas Red)を含む。適切な発色染料は、ジアミノベンジジンを含む。
【０１１９】
別のレポーターは、視覚的に観察、電気的に検出、またはその他により記録されるような、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じる、高分子コロイド状粒子または微粒子状物質、例えば、着色されたラテックスビーズ、磁性物質または常磁性物質、および生物学的または化学的活性剤を含む。これらの分子は、例えば、発色または変色する、あるいは電気特性に変化を生じる反応を触媒する酵素であってもよい。これらは、エネルギー状態間の電子項遷移が特徴的な分光学的吸収または放射を生じるような、分子的に励起可能なものであってもよい。これらは、バイオセンサーに関連して用いられる化学的物質を含んでもよい。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアミジンおよびアルカリホスファターゼ検出システムを用いることができる。
【０１２０】
結合を調べる方法は、本発明の特徴ではなく、当業者であれば、好みと一般的知識に従って適切な方法を選択することができる。
【０１２１】
本発明にかかる抗体は、例えば細胞または細胞溶解物を含む試験サンプルにおいて、ポリペプチドの存在をスクリーニングすることに使用でき、かつ、例えば、それをコードする核酸の発現によるポリペプチドの産生の後に、本発明のポリペプチドを精製および／または単離することに使用できる。抗体は、それが結合するポリペプチドの活性を変更することができ、そのため、そのポリペプチドが患者において有害な影響を与える場合には、治療に有益である（予防を含む）。
【０１２２】
抗体は、キットとして提供されてもよく、キットは、抗体の使用に関する説明、例えば、試験サンプルにおける特定の物質の存在を調べることの説明を含んでもよい。一以上のその他の試薬、例えばラベル化分子、バッファー溶液、溶出剤などを含んでもよい。試薬は、それを外部環境から保護する容器、例えば密封バイアル内に提供されてもよい。
【０１２３】
診断方法
患者が野生型の、または多型を含むＰｏｌ λアレルを有することを調べるために、患者の生物学的サンプルを分析する多数の方法が、当該技術分野で知られている。かかる分析の目的は、症状の深刻さまたはその後の経過を決定することにおいて医師を助ける、および／またはその治療を最適化するために、診断または予後、特に腫瘍または腫瘍の悪性度の診断または予後のために用いられる。
【０１２４】
概して、この方法は、Ｐｏｌ λ核酸配列の存在をスクリーニングする方法と、Ｐｏｌ λポリペプチドまたはそのアイソフォームの存在または不在を検出する方法とに分けられる。この方法は、かかる核酸配列またはポリペプチドを含むことが疑われる患者の生物学的サンプルを利用する。生物学的サンプルの例は、血液、血漿、血清、組織サンプル、腫瘍サンプル、唾液および尿を含む。
【０１２５】
Ｐｏｌ λ核酸またはポリペプチドを検出するための例示的アプローチは、以下を含む。
（ａ）サンプル内の核酸の配列を、Ｐｏｌ λ核酸配列と比較して、患者に由来するサンプルが一以上の変異を含むか否かを調べる工程；または
（ｂ）患者に由来するサンプルにおけるＰＯＬＬ遺伝子によりコードされるポリペプチドの存在を調べ、存在する場合には、そのポリペプチドが、全長であるか、および／または野生型であるか、および／または野生型ポリペプチドのアイソフォームであるか、および／または正常レベルで発現されているかを調べる工程；または、
（ｃ）ＤＮＡフィンガープリンティングを用いて、患者に由来する核酸のサンプルを制限酵素で切断した場合に得られる制限パターンを、正常ＰＯＬＬ遺伝子またはその変異形態から得られた制限パターンと比較する工程；または、
（ｄ）Ｐｏｌ λ核酸配列に結合できる特異的結合メンバ（正常配列または公知の変異配列）を用いる工程であって、前記特異的結合メンバが、Ｐｏｌ λ核酸配列とハイブリダイズし得る核酸を含むか、天然もしくは変異したＰｏｌ λ核酸配列またはそれにコードされたポリペプチドに対する特異性を備えた抗体ドメインを含む物質を含み、特異的結合メンバが、その結合パートナーに対する特異的結合メンバの結合が検出可能であるようにラベルされている工程；または
（ｅ）正常または変異したＰＯＬＬ遺伝子配列に基づく一以上のプライマーを用いたＰＣＲを使用して、患者に由来するサンプルにおける正常または変異ＰＯＬＬ遺伝子をスクリーニングする工程、
【０１２６】
“特異的結合対”は、特異的結合メンバ（ｓｂｍ）と結合パートナー（ｂｐ）を含み、これらは、互いに特別な特異性を有し、かつ、通常の条件で、他方の分子に選択的に互いに結合する。特異的結合対の例は、抗原と抗体、分子とレセプター、および相補的ヌクレオチド配列である。当業者であれば他の多くの例を考えることができ、ここに列挙するまでもないであろう。さらに、用語“特異的結合対”は、特異的結合メンバと結合パートナーの両方またはいずれかが、巨大分子の一部を含む場合にも適用できる。特異的結合対が核酸配列である実施態様では、アッセイの条件下で互いにハイブリダイズする長さ、好ましくは１０ヌクレオチドの長さ以上、より好ましくは１５または２０ヌクレオチドの長さ以上とされる。
【０１２７】
Ｐｏｌ λ核酸のスクリーニングに関係する本発明の殆どの実施態様では、サンプルは、最初に、ＰＣＲ等を用いて増幅されて、サンプルに存在する別の配列と比較してアナライトの量を増大させる。これは、サンプルに存在するのであれば、高い感度でターゲット配列を検出可能にする。この最初の工程は、当該技術分野で重要性の増しつつある高感度アレー技術を用いることによって、回避されてもよい。
【０１２８】
ＰＯＬＬ遺伝子の変異形態は、遺伝子の機能を妨げうる、または妨げることのない、野生型配列と比較して一以上のヌクレオチドの一以上の挿入、欠失、置換および／または付加を含んでもよい。核酸レベルでの差異は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列の差異に必ずしも反映されるものではないが、公知の機能不全に関連しうる。しかしながら、遺伝子の変異または他の差異が、（たとえあるとしても）産生されたポリペプチドの性質に深刻に影響するフレームシフトまたは停止コドンをもたらす場合があり、あるいは、ポリペプチドの一以上のアミノ酸または領域の挿入、欠失、置換および／または付加を含む、コードされたポリペプチドにポイントミューテーションまたは顕著な変異的変化をもたらす場合がある。プロモーター配列または他の制御配列における変異は、遺伝子からの発現を妨げ、または低減し、あるいは、ｍＲＮＡ転写のプロセッシングまたは安定性に影響する。腫瘍形成に関連した一塩基多型の例は、Ｐｏｌ λ ｃＤＮＡの１６８３位の一塩基対変化トランジション（ＣからＴ）であり、これは、Ｐｏｌ λのコード領域においてアミノ酸残基４３８（Ａｒｇ）からトリプトファン（Ｔｒｐ）への変化をもたらす。
【０１２９】
試験サンプル中に、特定の核酸配列またはそのミュータント、変異体、またはアレルの存在または不在を調べる種々の方法がある。例示的試験は、ヌクレオチドシークエンシング、チップ上に固定された核酸を用いたハイブリダイゼーション、分子表現型試験、タンパク切りつめ試験（ＰＴＴ）、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）試験、ミスマッチ切断検出、および変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を含む。これらの技術およびその利点および欠点は、Nature Biotechnology, 15:422-426,1997に記載されている。
【０１３０】
試験は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡを含む調製物に対して行ってもよい。ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを試験することは、核酸の複雑さがイントロン配列の不在により低減されるという利点を有するが、その調製物の作製に余計な時間と努力が必要であるという欠点もある。ＲＮＡは、ＲＮＡアーゼが広範囲に存在することから、ＤＮＡよりも操作が困難である。
【０１３１】
試験サンプル中の核酸を配列決定し、その配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の配列と比較して、差異が存在するか否かを調べてもよい。もしそうであれば、その差異を、公知の罹病性アレルと比較し、その試験核酸が記載された一以上のバリエーションを含むか否かを調べることができる。
【０１３２】
一般には、試験サンプル中の全ての核酸または全ＰＯＬＬ遺伝子さえ配列決定することは時間または労力の面から効率的ではないので、一以上の対のプライマーを用いたＰＣＲのような特異的な増幅反応を用いて、その核酸の興味のある領域、例えば、ＰＯＬＬ遺伝子、または、上記症状の一つに対する罹病性と関連した変異の特定の領域を増幅する。次いで、この増幅された核酸を、上述したように配列決定し、および／または他の方法で試験して、特定の特徴の存在または不在を調べる。試験用の核酸は、細胞から取り出された、あるいはライブラリーの核酸から、制限酵素切断および電気泳動のような種々の別の技術を用いて調製することができる。
【０１３３】
核酸は、変異体−またはアレル−特異的プローブを用いてスクリーニングされてもよい。かかるプローブは、上記状態に対する罹病性と関連することが知られている配列変化を有するＰＯＬＬ遺伝子の領域またはその相補鎖に対応する。適切にストリンジェントな条件下における、テスト核酸に対するかかるプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、試験核酸の配列変化の存在を示す指標である。効率的なスクリーニングのために、一以上のプローブを同一の試験サンプルに用いる。
【０１３４】
アレル−または変異体−特異的オリゴヌクレオチドは、試験サンプルに存在するのであれば、同様に、特定の配列を特異的に増幅するためにＰＣＲで用いることができる。ＰＣＲバンドが遺伝子変異体を含んでいるかどうかの評価は、当業者になじみの深い多くの方法で実施できる。ＰＣＲ産物は、例えば、遺伝子変異体が選択されたことに関連する特異的バンドを用いて、変性ポリアクリルアミドＤＮＡシークエンシングゲルで変異または多型を示すことを可能にするように処理されてもよい。
【０１３５】
試験サンプルにおける変異配列の存在を探すことに代えて、あるいはこれに加えて、例えば、適度に特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて、正常配列の存在を探す。
【０１３６】
プローブと試験核酸との間のハイブリダイゼーションを用いたアプローチおよびミスマッチの検出を用いることができる。適切な条件下では（温度、ｐＨ等）、オリゴヌクレオチドプローブは、完全には相補的でない配列とハイブリダイズする。二つの分子間の塩基対形成の程度は、ミスマッチであるにも関わらずアニールするのに十分なのであろう。二つのアニーリング核酸分子間のミスマッチの存在を検出するための種々のアプローチが当該技術分野で知られている。
【０１３７】
例えば、ＲＮＡアーゼＡは、ミスマッチの部位を切断する。切断は、関連するプローブがアニールした試験核酸を電気泳動し、全長プローブ／試験ハイブリッドよりも短い分子（すなわち、より高い電気泳動移動度を有する分子）を探すことによって検出することができる。他のアプローチは、レソルバーゼまたはエンドヌクレアーゼのような酵素を使用する。
【０１３８】
かくして、正常ＰＯＬＬ遺伝子の一部の領域の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ（センスまたはアンチセンス鎖）（そこで変異が生じることが知られている）を、試験核酸にアニールさせてもよく、ミスマッチの存在または不在が調べられる。ミスマッチの存在の検出は、試験核酸に変異の存在を示唆する。一方、変異を含むＰＯＬＬ遺伝子の領域の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを、試験核酸にアニールさせて、ミスマッチの存在または不在が調べられてもよい。ミスマッチの不在は、試験サンプル中の核酸が正常な配列を有することを示唆しうる。いずれの場合でも、一連の遺伝子の種々の領域に対するプローブを用いることができる。
【０１３９】
核酸分子の配列における差異の存在は、制限酵素切断により検出することができる。例えば、一以上の制限酵素を用いて核酸サンプルを切断した場合に得られた制限パターンと、正常遺伝子または変異体またはアレルを含むサンプルを前記と同一の酵素を用いて切断した場合に得られるパターンとを比較する、ＤＮＡフィンガープリンティングの方法である。
【０１４０】
プロモーターまたはイントロンに位置する別の制御配列における重要な制御エレメントの存在または不在は、転写によるｍＲＮＡ産生レベルまたはｍＲＮＡからの翻訳によるポリペプチド産生レベルを調べることにより評価してもよい。
【０１４１】
核酸の試験サンプルは、例えば、唾液または好ましくは血液における細胞から核酸を抽出することによって提供されてもよく、あるいは、羊膜、胎盤または胎児自身から出生前試験であってもよい。
【０１４２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのアミノ酸配列ミュータント、変異体、アレルまたはアイソフォームのような、試験サンプルにおける特定のポリペプチドの存在または不在を調べるための種々の方法が存在する。
【０１４３】
サンプルは、例えば、Ｐｏｌ λポリペプチドの一以上の特定の変異体に特異的な抗体（または抗体の混合物）のような、特異的結合メンバに対する結合パートナーの存在について試験されてもよい。
【０１４４】
サンプルは、ポリペプチドに特異的な抗体（または抗体の混合物）のような特異的結合メンバに対する結合パートナーの存在について試験されてもよい。
【０１４５】
この場合、サンプルは、特異的結合に適切な条件下で、抗体のような特異的結合メンバと接触させ、次いで、例えば、上記レポーターシステムを用いて、結合が調べることによって試験されてもよい。抗体のパネルが用いられる場合には、それぞれの結合が調べられるように、種々のレポーティングラベルが、各抗体に用いられてもよい。
【０１４６】
抗体のような特異的結合メンバを用いて、試験サンプルからその結合パートナーポリペプチドを単離および／または精製し、ポリペプチドの配列決定および／または生化学分析により、それがＰｏｌ λポリペプチドの配列および／または特性を有するか否か、あるいはそれがミュータントまたは変異形態であるかを調べることを可能にする。アミノ酸配列決定は、自動化配列決定装置を用い、当該技術分野では機械的な手段である。
【０１４７】
医薬およびペプチド治療
Ｐｏｌ λポリペプチド並びにアンタゴニストおよびアゴニストは、広範囲の疾患の治療に有益である。特に、Ｐｏｌ λ酵素のインヒビターは、ガンを治療するために用いることができ、特に、ＤＮＡ損傷を引き起こして例えば細胞にアポトーシスを誘導する試薬と組み合わせることにより、それによって、疾患を有する細胞が、前記試薬処理によって引き起こされた損傷を修復できないようにする。さらに、エラー傾向のあるＤＮＡ修復プロセスにおけるＰｏｌ λの役割は、クラススウィッチ組み換えおよび体性のハイパーミューテーションのような、二次免疫応答を生じうる。かくして、Ｐｏｌ λインヒビターは、免疫抑制、乾癬、関節炎、および移植拒絶の治療に使用される。
【０１４８】
本発明にかかるＰｏｌ λポリペプチド、インヒビター、アンタゴニスト（例えば、抗体）、ペプチドおよび核酸は、薬学的組成物に製剤化され得る。これらの組成物は、上記物質に加えて、薬学的に許容できる賦形剤、キャリアー、バッファー、安定剤、または当業者に周知の他の物質を含んでもよい。かかる物質は、非毒性かつ活性成分の効力を妨げないものとすべきである。キャリアーまたは他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔、筋肉内、腹腔内経路による。
【０１４９】
経口投与用の薬学的組成物は、錠剤、カプセル、粉末、または液状とすることができる。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントのような固形キャリアーを含んでもよい。液状の薬学的組成物は、一般に、水、ペトロレウム、動物または植物油、鉱物油または合成油のような液状キャリアを含む。生理食塩水、ブドウ糖または他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールを含んでもよい。
【０１５０】
静脈内、皮膚または皮下注射、または、罹患部位での注射では、活性成分は、発熱物質を含まない、適切なｐＨ、等張性および安定性を備えた経口的に許容できる水溶液の形態とされる。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム液、リンガー液、乳酸加リンガー液のような、等張ビヒクルを用いて適切な溶液を調製することができる。必要であれば、防腐剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤および／または他の添加剤を含むことができる。
【０１５１】
患者に与えられるものが本発明にかかるポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小さい分子、または他の薬学的に使用できる化合物であろうと、投与は、好ましくは“予防的に有効な量”または“治療的に有効な量”（場合により、予防は治療と考えられる）とされる。これは、患者に利益を示すのに十分なものである。投与の実際の量、および速度およびタイムコースは、治療されるものの性質および深刻度に依存する。治療の処方、例えば、投与量等の決定は、医師およびその他の医療ドクターの責務の範囲内であり、通常は、治療すべき疾患、患者の状態、輸送部位、投与方法、および医師の知るその他のファクターを考慮する。上記技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.(ed), 1980に記載されている。
【０１５２】
あるいは、ターゲッティング療法を、抗体または細胞特異性リガンドのようなターゲッティングシステムの使用により、あるタイプの細胞に対してより特異的に活性剤を輸送するために用いることができる。ターゲッティングは、種々の理由から望ましい。例えば、薬剤が許容不可能な毒性である場合、あるいは、あまりにも高い投与量を必要とする場合、あるいは、ターゲット細胞に侵入できない場合である。
【０１５３】
これらの薬剤を直接投与する代わりに、例えばウイルスベクターの、細胞内に導入されたコード遺伝子から発現させることによってターゲット細胞において産生させてもよい（ＶＤＥＰＴ技術の変形−以下参照）。ベクターは、治療される特異的細胞にターゲット化されるか、あるいは、多かれ少なかれ選択的にターゲット細胞によりスウィッチされる制御エレメントを含むことができる。
【０１５４】
あるいは、薬剤は、治療されるべき細胞において産生、またはその細胞にターゲット化された活性化剤により活性形態に変換される前駆体形態で投与されてもよい。この種のアプローチは、ＡＤＥＰＴまたはＶＤＥＰＴとして知られる。前者は、細胞特異的抗体に結合することによって細胞に活性化剤をターゲット化することを含み、後者は、ウイルスベクターのコードＤＮＡから発言させることによりベクターの活性化剤、例えば酵素を産生することを含む（例えば、EP-A-415731およびWO90/07936参照）。
【０１５５】
組成物は、単独で投与されてもよく、また、治療すべき症状に依存して、同時または連続的に、他の治療剤と組み合わせて投与されてもよい。
【０１５６】
Ｐｏｌ λインヒビターおよび試薬のスクリーニング方法
本発明にかかるポリペプチドは、その活性または機能に影響または変更する分子をスクリーニングすることに用いることができる。かかる分子は、治療に有益である（予防を含む）。
【０１５７】
新たな薬剤の同定を導く薬学的調査は、リード化合物が見出される前およびその後で、非常に大量の候補物質のスクリーニングを含むことが周知である。これは、薬学的研究を、非常に高価かつ時間のかかるものとする要因の一つである。スクリーニングプロセスにおける補助手段は、顕著な商業的重要性および有用性を有する。
【０１５８】
ポリペプチドの活性を変更する物質のスクリーニング方法は、一以上の試験物質を、適切な反応媒体でポリペプチドと接触させること、処理されたポリペプチドの活性を試験すること、およびその活性を、試験物質で処理していない比較反応媒体中のポリペプチドの活性と比較することを含む。処理および未処理ポリペプチドの間の活性の差異は、関連する試験物質の変更効果の指標である。
【０１５９】
コンビナトリアルライブラリー技術は、多数の種々の物質を、ポリペプチドの活性を変更する能力について調べるのに効率的な方法を与える。かかるライブラリーおよびその使用は、当該技術分野で公知である。ペプチドライブラリーの使用が好ましい。
【０１６０】
活性の変更についてスクリーニングする前またはこれと同時に、例えば、酵母２ハイブリッドシステム(ポリペプチドと試験物質の両方がコード核酸から酵母において発現されうることを必要とする)において、試験物質をポリペプチドと相互作用する能力についてスクリーニングしてもよい。これは、物質を、ポリペプチドの活性を変更する実際の能力について試験する前の、粗いスクリーニングとして用いることができる。あるいは、スクリーニングを用いて、例えば、治療剤として試験するための、Ｐｏｌ λポリペプチドの類似物を見出すべく、Ｐｏｌ λ特異的結合パートナーに対する結合について試験物質をスクリーニングすることができる。
【０１６１】
ポリペプチド活性を変更または影響する物質の同定後、この物質をさらに調査してもよい。さらに、製剤、医薬のような組成物、薬学的組成物または薬剤のような、調製物において使用および／または製造されてもよい。これらは、患者に投与することができる。
【０１６２】
かくして、本発明は、ここの開示に従って、ポリペプチド活性のモジュレーターとして核酸分子を用いて同定された物質だけでなく、薬学的組成物、医薬、薬剤、またはかかる物質を含む別の組成物、かかる物質を患者に投与することを含む方法、投与用組成物の製造におけるかかる物質の使用、およびかかる物質と薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクルまたはキャリアー、および任意に他の成分とを混合することを含む薬学的組成物の調製方法という種々の態様にもわたる。
【０１６３】
【実施例】
実施例１：ヒトＰｏｌ λに対応するｃＤＮＡのクローニング
ヒトＰＯＬＬ遺伝子のクローニングを、我々の先の研究により得られていたマウスＰＯＬＬ遺伝子のｃＤＮＡ配列と高い同一性を示したＥＳＴ群の、公共のデータベースdbEST/GeneBankにおける同定により開始した。これらのＥＳＴは、以下の同定番号を有する：AA742404、AA922738、AI091150、AA989195、W69567、AI123218、AI199486、AA576526、W69888、T81701 ｙ H11886。Ｐｏｌ λのコード流域の一部を含むと思われる、ＥＳＴH11886を除く、前記の全てが３'-未翻訳領域に対応していた。ヒト胎盤から得られた全ｃＤＮＡから出発して、Ｐｏｌ λに対応するｃＤＮＡが、ＰＣＲ増幅により、一連の重複フラグメントとして得られた（図１）。第一フラグメント（a136-20、図１）は、上記ＥＳＴから誘導されたプライマーを用いて特異的ＰＣＲにより得られた。このフラグメントは、ＥＳＴH11886の配列と重複し、かつ、３'-末端に対応するＥＳＴ群と重複する。このフラグメントは、1419ｂｐの長さを有し、ここに記載した完全なｃＤＮＡの1107から2525位にわたる。2526から2678位にわたる3'末端セグメントは、ＥＳＴのコンセンサスから推定された。
【０１６４】
第２フラグメント(a60-a、図１)は、開始コドンに近いマウス配列から誘導されたセンスプライマーと、ヒトＰＣＲフラグメントa136-20から誘導されたアンチセンスプライマーとを用いて、半特異的ＰＣＲにより得られた。この第２フラグメントは、９９６ｂｐの長さを有し、ヒトＰｏｌ λｃＤＮＡの３８０から１５７５位に対応するコード配列を含む。このｃＤＮＡ配列は、フラグメントa91で完成する（図１）。このフラグメントは、５'ＲＡＣＥにより得られ、未翻訳５'領域を含む５０４ｂｐ長のフラグメントであり、コード領域の最初の部分である。それゆえ、ヒトＰｏｌ λの完全なｃＤＮＡは、全部で２６７８ｂｐを含み、３７１ｂｐの５'未翻訳領域（1-371）、１７２８ｂｐにわたるコード配列（372-2099）、および５７９ｂｐの３'未翻訳領域(2100-2678）を有する。対応するタンパクであるＰｏｌ λは、５７５アミノ酸残基を有する。Ｐｏｌ λのマウスおよびヒトホモローグに対応するコード配列は、ＤＮＡレベルで８４％の同一性を有する。タンパクレベルでは、マウスおよびヒトＰｏｌ λは、全体的に８０％の同一性を有し、最も保存されたドメインでは９０％に至り、ＢＲＣＴドメインとＰｏｌ βコアを連結する領域では５７％に減少する。
【０１６５】
実施例２：正常および腫瘍性の種々の起源に由来するｃＤＮＡにおけるＰｏｌ λ変異体のＰＣＲ分析
種々の組織におけるスプライシング変異体hPOLLデルタ6およびhPOLLデルタ(6+7)の発現を調べるために、ｃＤＮＡレベルでこれらの変異体を検出するアッセイを開発した。このアッセイは、Ｐｏｌ λの各変異体に対応するｃＤＮＡフラグメントを増幅することを可能にする特異的プライマーを用いる。種々の変異体の中から識別することができる特異的プライマーとして、スプライシング特異的センスプライマーを用い、その一方で、全てのケースにおいて、共通のアンチセンスプライマーを用いた。
【０１６６】
２Ｂ２と称する両方の変異体のアンチセンスプライマーは、エキソン９に位置づけられた共通領域に対応する。
２Ｂ２  ５'-GGAGCGGTTGAAGTGTGC-３'
【０１６７】
２Ｂ３と称される、変異体hPOLLデルタ6に特異的なセンスプライマーは、その最初の１１の５’−ヌクレオチドがエキソン５の最後に対応するが、残りのプライマーがエキソン７の最初の配列に対応するように設計された。
２Ｂ３  ５'-CCTCGTACCAGGGCTTCC-３'
【０１６８】
一方、２Ｂ４と称される、変異体hPOLLデルタ(6+7)に対応する特異的プライマーは、その最初の５'-ヌクレオチドがエキソン５の最後に対応し、残りのヌクレオチドがエキソン８の最初の配列に対応するように設計された。
２Ｂ４  ５'-CACCTCGTACCAGGTCCAGA-３'
【０１６９】
アッセイを行うために、別個の反応チューブに、種々の起源に由来するｃＤＮＡサンプル、および以下の組み合わせのプライマー：１）２Ｂ３と２Ｂ２（図２および３）、２Ｂ４と２Ｂ２（図４）とを、１μＭの濃度で含めた。反応混合物は、Tris-HCl 10mM pH 9、KCl 50mM、MgCl2 1.5mM、0.2mMの各ヌクレオチド(dATP、dCTP、dGTP y dTTP)、および0.025U/mlのTaq DNA polを含む。反応は４０サイクルのＰＣＲで行われた。各サイクルは、９４℃で１０秒、６０℃２０秒であった。フラグメントの同定を、クローニングおよびシークエンシングにより確かめた。
【０１７０】
実施例３：マウスＰｏｌ λの発現および精製、並びに特異的抗体の生成
Ｐｏｌ λをコードするｃＤＮＡ領域を、ベクターｐＴ７のEcoRIおよびNdeI部位、または発現プラスミドpRSET-A(Invitrogen)のEcoRIおよびBamHI部位にさらにクローニングするように設計されたプラスミドを用いて、ＬＬＮＬにより提供されたプラスミドからＰＣＲ増幅した。後者の場合、６ｘヒスチジンタグが、組み換えタンパクのＮ末端に添加される。
【０１７１】
トランスフォーメーションのために、E.coli株TOP10F'を用いた。シークエンシングにより全ての構成物をチェックした後に、トランスフォーメーションをE.coli株BL21(DE3)pLysSに実施した。これは、IPTGにより誘導可能な、lacUV5プロモーターの調節下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する。Ｐｏｌ λ発現の誘導を、３０、３２および３７℃で、０．６（A600）の光学密度で行った。IPTG(Sigma)を、０．５ｍＭの濃度で添加した。Rifampicine(Sigma)を誘導の２０分後に、１２０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。誘導の最適な時間が２時間であることが示された。また、２．５ｍＭのBetaina(Sigma)および１Ｍのソルビトール(BDH)の存在下で行った。いずれの条件でも、マウスＰｏｌ λは不溶性であった。対照的に、同じ方法による、ヒトＰｏｌ λのE.coliにおける発現は、可溶性かつ活性なタンパクを生じた。
【０１７２】
E.coliにおいて発現されたマウスＰｏｌ λに対応する不溶性フラクションを用いて、ポリクローナル抗体を産生した。ＳＤＳの存在下で電気泳動により分離した後に、Ｐｏｌ λに対応するバンドを、ゲルから切り出し、“フレンチプレス”を用いて粉砕した。Ｐｏｌ λの１００μｇに相当する分注物を、抗原として用いて、多重皮内接種によりウサギを免役した。標準的な免疫化プロトコールの後に得られた血清は、ウェスタンブロット分析により特異的にＰｏｌ λを認識することができた。
【０１７３】
実施例５：ヒトＰｏｌ λの全コード領域のＰＣＲ／ＳＳＣＰスクリーニング
正常−腫瘍ヒト組織のｃＤＮＡライブラリーのパネル(Clontech)を、ヒトＰｏｌ λ遺伝子における潜在的遺伝変異の調査のためのテンプレートとして用いた。ヒトＰｏｌ λ遺伝子の全コード配列をカバーするためにプライマーセットを選択した。得られたアンプリマーを、ＳＳＣＰにより別個にスクリーニングした。プライマー：センス５'GGCATGTGGTTCATACCGACとアンチセンス５'GGAGCGGTTGAAGTGTGCを用いて、Ｐｏｌ λの触媒ドメインの一部（〜320bp）を増幅した。この領域のＰＣＲ産物は多型変異を含む。
【０１７４】
テンプレートの分注物を５倍希釈し、得られた分注物をＰＣＲの５倍ストックとして用いた。全てのＰＣＲ反応は、標準的な条件下で、10pmolの各プライマー、0.25mM dNTP、1xTaqバッファー(10mM Tris, 50mM, KCl, ゼラチン, 0.2mg/ml BSA, pH8.5)、0.25UのTaqポリメラーゼを用い、ＰＣＲ混合物の全体量１０ｍｌで行った。ＰＣＲパラメーターは以下の通りであった：３５サイクル：変性に９４℃／１５秒；プライマーアニーリングに６０℃／３０秒、および伸長に７２℃／１５秒。ＰＣＲ産物を、ＳＳＣＰ分析した。
【０１７５】
１２人の無関係の患者に由来するゲノムＤＮＡを、記載したように抹消血液リンパ球から調製した。ＰＣＲを、約２０−５０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、標準的な条件下で行った：10pmolの各プライマー、0.25mM dNTP、1xTaqバッファー(10mM Tris, 50mM, KCl, ゼラチン, 0.2mg/ml BSA, pH8.5)、0.25UのTaqポリメラーゼ。ＰＣＲ混合物の全体量を１０ｍｌとした。ヒトＰｏｌ λの触媒ドメインの部分（全エキソン８）を増幅するためのプライマーの配列は、センス５'GGCATGTGGTTCATACCGAC；アンチセンス５'TTCCTGCCGAAGACTGTCAであった。ＰＣＲパラメーターは以下の通りであった：３５サイクル：変性に９４℃／１５秒；プライマーアニーリングに６０℃／３０秒、および伸長に７２℃／１５秒。ＰＣＲ産物を、TAクローニングベクターpCRII(Invitrogen)にクローニングし、ABI373(Applied Biosystems)自動シークエンサーで自動化ジデオキシターミネーションダイ法により配列決定した。
【０１７６】
一本鎖コンホメーション多型分析（ＳＳＣＰ）を記載の通りに実施した(Oritaら,1989)。ＰＣＲ産物を１ｘホルムアミドローディング染料に希釈し、９５℃で３分間変性した。サンプルを、１５％のグリセロールを含む８％ポリアクリルアミドゲルに適用した。流した後で、ゲルを記載されているように銀染色した：１０％エタノールで１５分固定、１％ＨＮＯ3で１０分間インキュベーションし、０．１％ホルムアルデヒドを含む０．２％ＡｇＮＯ3で３０分間インキュベーションし、かつ、バンドが見えるまで０．０５％ホルムアルデヒドを含む３％Ｎａ2ＣＯ3で発色させ、１０％酢酸で１０分間固定化した。
【０１７７】
一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）とＤＮＡシークエンシングを用いて、ヒトＰｏｌ λの全ｃＤＮＡをカバーする重複ＰＣＲ産物を分析し、ガンに関する変異の存在を調査した。最初に、正常−腫瘍ヒト組織のパネル(Clontech)を用いた。図５に示されているように、ＳＳＣＰは、ＳＳＣＰ分析における移動度の変化が、触媒部位に近いヒトＰｏｌ λの部分において卵巣ガンｃＤＮＡライブラリーのケースに観察されたことを示した。これらのフラグメントのクローニングおよび配列決定が、卵巣ガンｃＤＮＡにおいてホモ接合形態で存在する一塩基対置換を同定したが、ヘテロ接合構成物が、正常卵巣組織ｃＤＮＡライブラリーに対応するＳＣＣＰプロフィールにおいて検出された。Ｐｏｌ λｃＤＮＡの１６８３位における一塩基対変化トランジション（ＣからＴ）は、Ｐｏｌ λコード領域のアミノ酸残基４３８（Arg）からトリプトファン（Trp）への変化をもたらす。我々は、１２人の無関係の患者のゲノムＤＮＡをスクリーニングすることにより、集団におけるこの特定の多型の発生率を分析した。結果は、この多型のメンデル学的隔離を示した。Argのバージョンをコードするアレルがやや優性であった。次に、各特定のアレル変異体に対するヒトＰｏｌ λの活性アッセイを研究した。
【０１７８】
実施例６：in situハイブリダイゼーション
非放射活性in situハイブリダイゼーションを、ポリＬ-リシン被覆ガラススライドに載せた１２−１４μｍ厚の組織切片に対して行った。出生後２０日および成体の試験片を切り出し、直ちにＤＥＰＣ処理ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩固定した。アガーに固定された切片を０．１μｇ／ｍｌのセンスまたはアンチセンスのジゴキシゲニンラベル化リボプローブ(Boehringer Mannheim)とハイブリダイズさせた。最後に、このスライドをHoechst 33258で染色し、蛍光および明視野顕微鏡で観察し、CCDカメラで記録した。次いで、カバースリップを取り出し、スライドを脱水し、DePex(Serva)を載せた。
【０１７９】
これらの実験は、Ｐｏｌ λ ｍＲＮＡが増殖性精原細胞には検出されないものの、減数分裂の組み換えが起こるステージであるパキテン期精母細胞の細胞質に豊富に存在することを示した。
【０１８０】
実施例７：ヒトＰｏｌ λの生化学的特徴決定
ＤＮＡポリメラーゼの機能的バージョンを示すヒトＰｏｌ λのスプライシング変異体（切り詰められていない）の検出をすることは、この形態の一部が腫瘍サンプルに特異的に発現されると思われることから、非常に興味深い。それゆえ、これらの形態が、腫瘍形成に必要なポリメラーゼの変異した（ミューテーター）変異体を示すのか否かを調べた。
【０１８１】
また、ヒトＰｏｌ λをE.coliにおいて、可溶性かつ活性な形態で発現させることにも成功した。予備的データは、Ｐｏｌ λが高度にエラー傾向であることを示し、これは、Ｐｏｌ λ機能が、減数分裂中のＤＮＡ修復に関与しうると言う事実が再考されなくてはならないということを支持する。Ｐｏｌ λは、配偶子を産生するプロセスに関連して、胚細胞において選択的に発現される。この酵素が、損傷を受けていない鋳型について合成する際に、変異を導入しうるということを考慮すると、Ｐｏｌ λの機能は、我々の胚細胞にある程度の変異性を生じることであり、かかる変異誘発のバックグラウンドが、ゲノム進化にとっては重要となりうる。
【０１８２】
かかる推定される機能の証拠は、ヒトＰｏｌ λにより触媒されたＤＮＡポリメライゼーションのin vitro分析から誘導される。Ｐｏｌ λがムターゼとして挙動していることを示すために、鋳型鎖がホモポリメリック（ポリｄＴ）であり、それゆえプライマー鎖（オリゴｄＡ）が単独の正確なもの（相補的ヌクレオチド）としてｄＡＴＰを用いて伸長される、明白なin vitroアッセイを用いた。顕著な挿入忠実性を有する対照の酵素（Klenow）とは異なって、ヒトＰｏｌ λによるラベル化ｄＡＴＰの取り込みは、相対的に低い濃度（１μＭ）の各非相補的デオキシヌクレオチドの添加により強く阻害された。阻害のレベルは、Ｐｏｌ ｍｕ（ムターゼ）について先に報告されたものよりも高かった、図７参照。
【０１８３】
また、図８は、Ｐｏｌ λの阻害が、アッセイで用いられた活性化マグネシウムまたはマンガンイオンの性質とは無関係であることを示す。
【０１８４】
かくして、Ｐｏｌ λのエラー傾向は、この酵素を、変異性を生じさせるプロセスにおいて、すなわち、体性ハイパーミューテーションとして、および／または、ことによると、優勢的に、配偶子形成中に起こる特異的プロセスとして、ＤＮＡ情報を生成／変更する良い候補にすると考えられる。後者の考えは、パキテン期精母細胞および精子細胞におけるＰｏｌ λの卓越した発現により支持される。
【０１８５】
上記参考文献の全てを、特別に参考としてここに含める。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトＰＯＬＬ遺伝子をクローニングする方法のスキーム。異なるクローニング工程が、得られた異なるｃＤＮＡフラグメントのアライメントにより示されている。フラグメント１−３は、胎盤から得られた。フラグメント４から１４は、dbEST/GenBankデータベースから得られた配列を示し、その受理番号を用いて示されている。H11886と同定されたＥＳＴは内部欠失を示した。アステリスクは、開始および終結コドンの相対的な位置を示す。
【図２】  ヒトＰＯＬＬ遺伝子に対応するｍＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲ増幅。特異的プライマーを用いて、スプライシングに差異を示すｍＲＮＡの部位を選択的に増幅するした。Ｍはサイズマーカーである。ａ）胎児および成体の脳からのサンプルの増幅。ｂ）細胞系統およびヒト腫瘍から得られたサンプルの増幅。ｃ）ＲＴ-ＰＣＲ増幅により同定されたＰｏｌ λｍＲＮＡのスプライシング変異体の図示。
【図３】  Ｐｏｌ λｍＲＮＡに対応するスプライシング変異体Ｄ６のＲＴ-ＰＣＲ増幅。この反応は、正常および腫瘍組織の両方において、スプライシング変異体Ｄ６を選択的に増幅するために、スプライシング特異的プライマー（明細書中に記載）を用いて実施した。Ｍはサイズマーカー；Ｎは正常組織；Ｔは腫瘍組織；？は特徴決定されていない増幅産物である。
【図４】  Ｐｏｌ λｍＲＮＡに対応するスプライシング変異体Ｄ６＋７のＲＴ-ＰＣＲ増幅。この反応は、正常および腫瘍組織の両方において、スプライシング変異体Ｄ６＋７を選択的に増幅するために、スプライシング特異的プライマー（明細書中に記載）を用いて実施した。Ｍはサイズマーカー；Ｎは正常組織；Ｔは腫瘍組織；？は特徴決定されていない増幅産物である。
【図５】  Ａ．ヒトＰｏｌ λのコード配列における潜在的アレル変異体の発生を示す一本鎖コンホメーショナル多型（ＳＳＣＰ）分析。この変異体は、CLONTECHの卵巣ガン細胞系統に最初に見出された（レーン３および４）。レーン１および２は、正常卵巣組織を示す。Ｂ．クローニングおよび配列決定後に、ヒトＰｏｌ λｃＤＮＡの１６８３位に位置する、一塩基多型（ＣからＴ）が観察された。スペイン人の集団に確認されたこの多型は、活性部位に非常に近いところに位置する酵素の部位に一つのアミノ酸残基の変化を生じる（Ａｒｇ４３８からＴｒｐへ）。
【図６】  腫瘍形成と関連したヒトＰｏｌ λの推定上のアレル変異体。
【図７】  Ｐｏｌ λポリメライゼーションが非相補的ｄＮＴＰにより強く阻害されることを示す（ポリｄＴ／ポリｄＡ、１ｍＭＭｎＣｌ２、Ｐｏｌ λ(ＰＣ０．５Ｍ)、３０℃で１０分）。
【図８】  Ｐｏｌ λポリメライゼーションが、マンガンまたはマグネシウムイオンの存在下でポリｄＡ／ポリｄＴ鋳型を用いて、非相補的ｄＮＴＰにより強く阻害されることを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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