(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンの異なる複数のCDRに、それぞれRIQRPGRAFVTIGKおよびSIHIGPGRAFYTTGEからなるペプチドを含む２種のエピトープを移植し、エピトープ分子移植抗体を作製する工程を有するヒト免疫不全ウイルスに対するワクチンの製造方法。
【請求項２】
前記エピトープ分子移植抗体を化学架橋する工程をさらに含む請求項１に記載のワクチンの製造方法。
【請求項３】
免疫グロブリンの異なる複数のCDRに、それぞれRIQRPGRAFVTIGKおよびSIHIGPGRAFYTTGEからなるペプチドを含む２種のエピトープが移植された、ヒト免疫不全ウイルスに特異的に反応するエピトープ分子移植抗体。
【請求項４】
化学架橋された請求項３に記載のエピトープ分子移植抗体からなるエピトープ分子移植抗体オリゴマー。
【請求項５】
請求項３に記載のエピトープ分子移植抗体および／または請求項４に記載のエピトープ分子移植抗体オリゴマーを含むヒト免疫不全ウイルス用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エピトープ分子移植抗体、ワクチンおよびその製造方法に関する。より詳細には、ヒト免疫不全ウイルス（エイズウイルス、ＨＩＶ）に対するエピトープ分子移植抗体、上記エピトープ分子移植抗体を含むワクチンおよびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
予防接種は、古くから多くの菌による感染症の予防のためにワクチンの投与といった形で行われており、ある程度の効果を上げている。こうした予防接種の効果は、免疫適格細胞（immunocompetent cell）、すなわち、Ｂ細胞、Ｔ細胞および抗原提示細胞（APCs）に対する刺激の強さに依存する。
【０００３】
近年、ウイルスによる感染症や疾病が社会的にも問題となっており、ワクチンを使用することによって菌に起因する感染症の予防に効果があったことから、ウイルスによる疾病に関しても同様の予防策を講じるために、様々な試みがなされてきた。
【０００４】
こうした試みとしては、エイズウイルスのワクチンペプチドを有機合成により作成する方法（Berzofsky ら、Vaccines 94, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 147 頁(1994 年) ）、免疫グロブリンとＣＤ４分子のキメラ分子をエイズウイルス防御に利用する方法（Capon 、Nature、337 巻、 525頁（1989年））、免疫グロブリン軽鎖第３超可変部にエピトープを移植をし、これを抗原として用いる方法（Zanetti ら、Nature、355 巻、476 頁（1992年））、免疫グロブリン軽鎖第３超可変部にインフルエンザウイルスの部分構造を移植をし、これを抗原として用いる方法（Zaghouriら、Science 、259 巻、 224頁（1993年））、免疫グロブリン軽鎖第１および第３超可変部と免疫グロブリン重鎖第２および第３超可変部にエピトープを移植するという方法（Kumagai 、Vaccines 94, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 9 頁, 1994年）などがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の体内動態は複雑巧妙であること、さらに、ウイルスの排除に有効な機能的免疫を誘導するための適切な免疫原がデザインされていないこと、あるいはＨＩＶは突然変異率が高いこと（多変異性）などのために、ＨＩＶ感染に対するワクチン開発が困難であった。
【０００６】
一方、ＨＩＶの研究が進むにつれて、ＨＩＶエピトープ地図が作成され、また、エピトープそれぞれの免疫学的活性に関して膨大な情報が蓄積された。こうした情報から、ＨＩＶのエンベロープタンパク質（gp120）の第３可変部であるＶ３ループ領域に存在するエピトープ（ＰＮＤ，Principally Neutralizing Determinant）がＨＩＶの中和抗体、Ｔ細胞、さらに抗体依存性細胞傷害機序（ＡＤＣＣ）のターゲットとなっていることが判明した。このことに基づき、第３可変ループ領域から得られる短いペプチド（Ｖ３合成ペプチド）を作成し、これを用いた免疫法が試みられている。
【０００７】
しかし、Ｖ３合成ペプチドの免疫原性が低く、ペプチドの体内寿命が短いこと、あるいはフロイントの完全アジュバントのような強力なアジュバントを用いてもＶ３特異的な免疫を強く誘導することは容易でないといった問題点がある。
本発明の発明者らは、上記のような問題点を解決すべく鋭意研究を重ね、抗体超可変部に複数のＨＩＶ−１  ＭＮ株のＰＮＤを蛋白質工学的に分子移植し、抗体のＦｃ部の生物活性を有効に利用して、免疫誘導効率のよい、副作用のないワクチン（Ig-PND8 ）を分子設計し、抗体応答が効果的に誘導できるIg-PND8を作成した。
【０００８】
Ig-PND8は抗体応答を効果的に誘導するが、Ｖ３に対する細胞性免疫、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T cell, CTL ）の誘導が充分でなかったため、さらに研究を重ねて、異なるＨＩＶのサブタイプのＶ３配列を同一免疫グロブリン分子超可変部に分子移植した複合型エピトープ移植抗体を作製し、Ｖ３株特異的免疫応答の誘導機能を付与して本発明を完成したものである。
【０００９】
さらに、これらに加えて、上記抗体をワクチンとして使用したときにこのワクチン分子とＦｃレセプターとの相互作用を増強するために、上記抗体を化学架橋して多価免疫グロブリンを作製する方法をも開発した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルスに対するワクチンの製造方法、上記ヒト免疫不全ウイルスに特異的に反応するエピトープ分子移植抗体、化学架橋された上記エピトープ移植抗体からなるエピトープ分子移植抗体オリゴマー、および上記エピトープ分子移植抗体および／または上記オリゴマーを含むヒト免疫不全ウイルス用ワクチンを提供することを目的とする。
【００１１】
すなわち、本発明は、免疫グロブリンの超可変部の複数箇所にヒト免疫不全ウイルスのエピトープを移植し、エピトープ分子移植抗体を作製する工程を有するヒト免疫不全ウイルスに対するワクチンの製造方法である。
【００１２】
上記ワクチンの製造方法では、上記エピトープ分子移植抗体の作製にあたり、前記移植されるエピトープが、少なくとも１種のヒト免疫不全ウイルスのＶ３塩基配列から得られたペプチドであることを特徴とする。
また、上記エピトープ分子移植抗体を化学架橋する工程をさらに含むことを特徴とする。
【００１３】
加えて、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスに特異的に反応するエピトープ分子移植抗体である。
さらに、上記エピトープ分子移植抗体は、少なくとも１種のヒト免疫不全ウイルスのＶ３塩基配列から得られたペプチドからなるエピトープが移植されたことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明は、化学架橋された上記エピトープ分子移植抗体からなるエピトープ分子移植抗体オリゴマーである。
さらにまた、本発明は、上記エピトープ分子移植抗体および／または上記エピトープ分子移植抗体オリゴマーを含むヒト免疫不全ウイルス用ワクチンである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明においては、免疫グロブリンの超可変部の複数箇所にヒト免疫不全ウイルスのエピトープを移植し、エピトープ分子移植抗体を作製してヒト免疫不全ウイルスに対するワクチンを製造する。
【００１６】
本発明で使用する免疫グロブリンは、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる免疫グロブリンＧ（IgG ）を意味する。この免疫グロブリンは、いかなる動物種から得られるものであってもよく、特に限定されないが、マウス、ヒト、ラットなどから得られるものが遺伝子構造や生物活性についての情報が豊富であることから好ましい。特に、ワクチン活性を容易に検定できることから、マウスIgG を好適に使用することができる。
【００１７】
上記IgG のサブクラスは特に限定されないが、マウスIgG2b 、マウスIgG2a を好適に使用することができる。
免疫グロブリンのＬ鎖およびＨ鎖には、それぞれ３つの超可変部（相補性決定部ともいい、ＣＤＲ１〜３と略される）が存在する。本発明においては、後述するヒト免疫不全ウイルスのエピトープを、これらのＣＤＲのうちの複数の箇所に移植する。免疫グロブリンのＣＤＲの複数箇所に後述するＨＩＶのエピトープを移植すると、免疫原性が増強することによる。
【００１８】
エピトープを移植する複数箇所のＣＤＲとしては、Ｌ鎖のＣＤＲ１とＣＤＲ３、あるいはＨ鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３などの組み合わせを挙げることができ、特に限定されない。しかし、Ｌ鎖のＣＤＲ１とＣＤＲ３、あるいはＨ鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３といったように異なるＣＤＲに移植することが、複数のエピトープを同一免疫グロブリン分子上に提示できる点から好ましい。
【００１９】
上記移植するエピトープは、少なくとも１種のヒト免疫不全ウイルスのＶ３塩基配列から得られたペプチドである。ＨＩＶはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に大別されるが、このように分けられた種類のＨＩＶには、さらにＨＩＶ−１ IIIB 、ＨＩＶ−１  ＭＮ、ＨＩＶ−１  ＳＦ２、ＨＩＶ−１  ＪＲＣＳ、およびＨＩＶ−１  ＪＹ１などといった幾つかの系統（株）があることが知られている。本発明においては、ＨＩＶ−１ IIIB 株およびＨＩＶ−１  ＭＮ株を使用することが、液性免疫、細胞性免疫の両者を誘導する目的から好ましい。
【００２０】
本発明で使用する移植用エピトープとしては、上記のウイルス株より得られる主要抗原のＶ３配列から得られたペプチドを好適に使用することができる。これらのペプチドは、上記の超可変部の複数箇所に同一のものを移植してもよく、異なるものを移植してもよい。しかし、液性免疫および細胞性免疫の双方を効率的に誘導するためには、上記Ｖ３配列の異なる上記エピトープを上記超可変部の複数箇所に移植することが好ましい。
【００２１】
上記エピトープは、配列表の配列番号１または２に示されるアミノ酸配列、または配列表の配列番号１または２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有する。ここで、「配列表の配列番号１または２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列」とは、配列表の配列番号１または２に示されるアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸残基について、欠失、置換、付加などの変化が生じた配列であって、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と同様の機能を有するエピトープをいう。１もしくは数個のアミノ酸残基についての欠失、置換、付加などの変化は、本願の出願時において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acid Research, vol.10, No.20, p6487-6500）により生じさせることができる。
【００２２】
特に、ＨＩＶ−１ＭＮ株のＶ３コアセンス配列であり配列表の配列番号１に示されるSIHIGPGRAFYTTGE、またはＨＩＶ−１ IIIB 株のＶ３コア配列であり、配列表の配列番号２に示されるRIQRPGRAFVTIGK（いずれもgp120 のposition 315-329）を移植すると、良好な抗体応答を得ることができる。
【００２３】
上記エピトープ分子移植抗体の作製にあたっては、ＨＩＶのＶ３領域のＤＮＡ塩基配列から想定されるアミノ酸配列と対応した遺伝子断片を、IgG Ｈ鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３、およびＬ鎖（λ鎖）のＣＤＲ１とＣＤＲ３の遺伝子断片と、それぞれ遺伝子増幅法を用いて入れ換える。ついで、常用される遺伝子導入法を用いて、免疫グロブリン産生能を欠落した形質細胞腫（たとえばＳＰ２／０細胞）で発現させる。
【００２４】
こうして作成されたエピトープ分子移植抗体は、ヒト免疫不全ウイルスに特異的に反応する抗体やＣＴＬを誘導する。
ウイルスは一般的に突然変異を起こし易く、ＨＩＶも高い突然変異性を有するためにワクチンの製造が難しい。しかし、上述のようにして、ＨＩＶのＶ３の配列を免疫グロブリンのＣＤＲの複数箇所に移植してライブラリー化を行うと、このようなＨＩＶにおける高いウイルスの突然変異性に対応することが可能となる。
【００２５】
本発明では、さらに、モノマーである上記エピトープ分子移植抗体をジチオビス（スクシミジルプロピオネート）、ジサクシミジルスベレートなどの化学架橋剤を用いて、弱アルカリ性条件下で化学架橋させる。特に、ジチオビス（スクシミジルプロピオネート）を用いて架橋することが架橋度の制御が容易な点から好ましい。
【００２６】
上記エピトープ分子移植抗体は、モノマーのまま後述するワクチンに使用することもできる。また、こうしたモノマーを化学架橋してオリゴマー、すなわち、多価免疫グロブリンとしてもよい。上記モノマーをオリゴマーとすると、これらの抗体をワクチンとして使用したときに抗原提示細胞上のＦｃレセプターとの相互作用が増強されてin vivoにおける免疫原性を高めることができ、また、細胞性免疫の誘導性、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導性を高めることができる。
【００２７】
一般的には、ハプテンの免疫原性を高めるためには、アジュバントなどの免疫増強剤とハプテンとを結合させるという方法が採用されるが、このような免疫増強剤は、細胞性免疫の誘導を抑制することがある。本発明においては、このような細胞性免疫の誘導抑制を回避するために、免疫増強剤を使用せず、上記のエピトープ分子移植抗体オリゴマーを使用する。
【００２８】
上記化学架橋された上記エピトープ分子移植抗体からなるエピトープ分子移植抗体オリゴマーは、２〜３量体程度であることが、抗原提示細胞上のＦｃレセプターとの結合とプロセッスィングの効率が高いことから好ましい。
さらにまた、本発明は、上記エピトープ分子移植抗体および／または上記エピトープ分子移植抗体オリゴマーを含むヒト免疫不全ウイルス用ワクチンである。
【００２９】
上記ワクチンは、これらのエピトープ分子移植抗体オリゴマーの他に、防腐剤、安定化剤などを含んでもよい。
上記エピトープ分子移植抗体は、他の生物製剤で使用される適当な賦形剤、吸着防止剤などとともに処理して、組換え沈降ワクチンあるいは凍結乾燥ワクチンとすることができる。
【００３０】
例えば、所望量の上記エピトープ分子移植抗体モノマーおよび／またはオリゴマーと上記成分とを混合して、組換え沈降ワクチン溶液を製造し、一定量ずつアンプルに充填・封入し、組換え沈降ワクチン製剤とすることができる。あるいは、所望量の上記エピトープ分子移植抗体モノマーおよび／またはオリゴマーを抗原性を有しないタンパク成分と水溶液の状態で混合し、一定量ずつバイアルに分注して凍結乾燥し、凍結乾燥ワクチン製剤としてもよい。このようなワクチンの製造は、通常のタンパク製剤を製造する工程と同様に行うことができる。
【００３１】
以上のようにして製造したＨＩＶに対するワクチンをＨＩＶの予防のために投与する場合には、例えば、所定量を４週間間隔で２回皮下ないし筋肉内に投与し、20〜24週経過後にさらに１回、皮下ないし筋肉内に投与する。投与量は、上記エピトープ分子移植抗体モノマーおよび／またはオリゴマーとして、１〜500 μｇ程度を投与することができ、0.1 〜100 μｇを投与することが好ましい。
【００３２】
投与量については、投与を受ける者の体重、年齢、健康状態などによって適宜調整する。また、投与期間についても、血中抗体価の上昇をモニターしながら調整する。
【００３３】
（製剤例）
（１）組換え沈降ワクチン製剤
下記の処方により、ワクチン溶液を調製してガラスアンプルに0.50 mL ずつ分注し、封入して組換え沈降ワクチン製剤とした。
【００３４】
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【００３５】
（２）凍結乾燥製剤
下記の処方により、ワクチン溶液を調製してガラスバイアルに0.50 mL ずつ分注し、−２０℃で終夜凍結乾燥して凍結乾燥ワクチン製剤とした。
【００３６】
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【００３７】
【実施例】
（実施例１）エピトープ分子移植抗体
（１）遺伝子のコンストラクトの構築
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞のｃＤＮＡライブラリーをLamda Zap II(Stratagene 社製）で作製し、γ2bのＨ鎖の定常部およびλ1 のL 鎖の定常部のＤＮＡ配列をプローブとして、可変部全体を含むγ2bのＨ鎖およびλ1 のL 鎖のｃＤＮＡを遺伝子クローニングした。これらを鋳型として使用し、プライマーとしてオーバーラッピングプライマーを用いて遺伝子増幅を行った。遺伝子増幅の条件は、常法に従い20サイクル行った。
【００３８】
得られた上記抗体の超可変部を、ＣＤＲの５’側20〜30ＤＮＡの塩基配列あるいはＣＤＲの３’側20〜30ＤＮＡの塩基配列と化学合成し、連続したＨＩＶ−１のＶ３コア配列をプライマーとして用いたリコンビナント遺伝子増幅法（Nucleic Acid Res., vol.17, 723-733(1989)）により、ＨＩＶ−１  ＭＮ株のＶ３コアセンス配列であるSIHIGPGRAFYTTGE（ gp120の position 315-329 ）と入れ替えた。また、上記抗体の超可変部をＨＩＶ−１  IIIB株のＶ３コアセンス配列であるRIQRGPGRAFVTIGKで入れ替えた遺伝子コンストラクトを同様にして作製した。
【００３９】
（２）ＨＩＶ−１のgp120 のＶ３エピトープの分子移植
上記（１）で得た遺伝子コンストラクトを、常法として用いられている免疫グロブリン遺伝子発現法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 2495 ）により組み込んだ。
【００４０】
その後、この組換えベクターを、マウス由来の骨髄種細胞であるＳＰ２／０細胞へエレクトロポレーションにより導入し、10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640 培地（５Ｌ）中、37℃にて、５％ＣＯ2 インキュベーター中で72時間までの適当な時間培養し、発現させた。
得られたエピトープ分子移植抗体（700 μｇ）を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア社製）により、培養産物から回収、精製した。
【００４１】
（実施例２）エピトープ分子移植抗体オリゴマーの調製
上記のようにキメラ遺伝子産物として発現したエピトープ分子移植抗体（500 μｇ）を、１ｍＭのジチオビスサクシミジルプロピオネート（dithiobis(succimidyl propionate)）を含む0.1 Ｍのカーボネートバッファー（pH 8.0）中で30分間37℃で保温して化学架橋した。その後、Sephacryl S-300 HR（ファルマシア社製）およびSephacryl S-400 HR（ファルマシア社製）を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（１mMリン酸バッファー、pH 7.2、0.15Ｍ NaCl 、以下ＰＢＳと略す）を溶出液としてゲルクロマトグラフィーを行い、後述する画分を調製した。
【００４２】
（実施例３）エピトープ分子移植抗体画分の調製と命名
上述のようにして、エピトープ分子移植抗体を精製し、得られた画分からモノマー、ダイマー、トライマーとして調製した。
これらの画分の分子量を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量を検定した。その後、Ｖ３ペプチドで免疫したマウス血清を用いた酵素抗体法により、これらの抗体のＣＤＲの複数箇所に移植されたエピトープの発現を調べた。
【００４３】
その結果、上記Ｖ３配列からなるエピトープが抗体分子Ｈ鎖の第二超可変部（ＣＤＲ２）と第三超可変部（ＣＤＲ３）に移植されている抗体と、そのエピトープ分子移植抗体がＬ鎖の第一超可変部（ＣＤＲ１）と第三超可変部（ＣＤＲ３）とに移植されている抗体とが産生されていることを確認した。
【００４４】
また、上述の方法で、上記ＣＤＲに移植されているＶ３配列がＨＩＶ−１  ＭＮ株のＶ３配列のみである抗体（ホモエピトープ移植抗体）と、ＨＩＶ−１  ＭＮ株のＶ３配列とＨＩＶ−１  IIIB株のＶ３コア配列の両方を抗体１分子の超可変部に有するヘテロエピトープ移植抗体とを作製した（図１）。
得られた抗体を、それらの超可変部に含まれるＨＩＶ−１  ＭＮ株またはＨＩＶ−１  IIIB株のＶ３配列によって以下のように命名した（図１参照）。
【００４５】
（１）ホモエピトープ移植抗体（homologous graft）：ＨＩＶ−１  ＭＮ株のＶ３配列またはＨＩＶ−１  IIIB株のＶ３コア配列のいずれかのみを抗体超可変
部に分子移植したもの
ＨＩＶ−１  ＭＮ株のＶ３配列のみを有する抗体；Ig-PNDMN8
ＨＩＶ−１  IIIB株のＶ３コア配列のみを有する抗体；Ig-PNDIIIB8
【００４６】
（２）ヘテロエピトープ移植抗体（heterologous graft）：ＨＩＶ−１  ＭＮ株のＶ３配列とＨＩＶ−１  IIIB株のＶ３コア配列の両方を抗体１分子の超可変部に有するもの；Ig-PNDMN4IIIB4
【００４７】
（実施例４）エピトープ分子移植抗体による動物の免疫と抗体応答の測定
（１）エピトープ分子移植抗体による動物の免疫
免疫する動物として、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週令、雌、日本チャールズリバー社より購入）した。このマウスを、アラム５mgとともに上記モノマー、ダイマーおよびトライマー抗体10μｇ／300 μL ／マウスで投与するＡ群(1群５匹）、アラムなしで上記各抗体（ＰＢＳ(pH7.2））に溶解したもの)10 μｇ／300 μL ／マウスで投与するＢ群、ＰＢＳ 300μL のみを投与する陰性対照群、およびアラム 300μL のみを投与するアラム対照群とした。
初回免疫として、実施例２および３で調製したエピトープ移植抗体のモノマーあるいはオリゴマーを、Ａ群及びＢ群に腹腔内投与した。
【００４８】
（２）免疫応答の測定
（２−１）抗体価およびウイルス中和活性の測定
免疫応答の測定を行うために、初回免疫刺激後、４週目に初回免疫に使用したと同じ上記エピトープ移植抗体のモノマーあるいはオリゴマーを、アラム非存在下で腹腔内投与した。この２度目の免疫の２週後に、各群５匹のマウスの尾静脈から血液を採取してプールし、血清を調製した。
【００４９】
産生された抗体の配列表の配列番号１に示す SIHIGPGRAFYTTGE（ＭＮ）と配列表の配列番号2 に示すRIQRGPGRAFVTIGK（IIIB）とに対する力価、およびＨＩＶ−１のＭＮ株とＨＩＶ−１のIIIB株とに対するウイルス中和活性とを表１に示す。
【００５０】
【表１】
0003780421.tif 000004
【００５１】
上記ペプチドを高原としたときの抗体価は、ＥＬＩＳＡを用いてＡ405nm で測定した。ウイルス中和活性は、７日間アッセイでＨＩＶ−１感受性細胞であるＭＴ−４細胞へのＨＩＶ−１感染阻止をｐ２４産生阻害により測定した。
【００５２】
表１に示したように、上記抗体価は、アラムの存在下、非存在下に関わらず、モノマー抗体＜ダイマー抗体＜トライマー抗体の順で高くなっていた。アラム存在下では、ダイマー抗体およびトライマー抗体を用いると、モノマー抗体を使用した場合に比べて、40倍以上抗体価が上昇した。また、アラムの非存在下でも、ダイマー抗体とトライマー抗体を使用すると、モノマー抗体を使用した場合に比して、70倍以上抗体価が上昇していた。
【００５３】
ウイルス中和活性もまら、抗体価と同様の傾向を示した。
以上より、エピトープ分子移植抗体を化学架橋させてオリゴマーを形成させると、モノマーより高いin vivo での免疫原性を賦与することができることが示された。
【００５４】
（２−２）ＣＴＬ誘導能の測定
ついで、ＣＴＬの誘導能を測定した。ＣＴＬの誘導能の測定には、上記（１）と同様に初回免疫を行い、その後４週目に各群のマウスから腹膜切開により脾臓を摘出し、各マウスから脾細胞を採取して効果細胞（エフェクター）としてプールした。こうして得た脾細胞を通常のマウス細胞培養条件下で、試験管内で１週間、１μｇ／mLの上述したhomologous graftまたはheterologous graftを用いて再刺激した。
【００５５】
その後、51Ｃｒ遊離試験のために、P815細胞（DBA/2 マウス由来、５×107 個／mL）を20μＬの51Ｃｒ（比活性５mCi/mL）とともに、RPMI1640培地中にて１時間インキュベートし、51Ｃｒを細胞内に取り込ませた。ついで、このようにラベルしたP815細胞をＰＢＳで調製した10μｇ／mLの上記２種類のペプチド、ＭＮＶ３またはIIIBＶ３ペプチドで37℃で１時間保温することによりパルスした。
【００５６】
上述のように刺激した脾細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、上記のように
51Ｃｒでラベルし、ＭＮＶ３またはIIIBＶ３ペプチドでパルスしたP815細胞を標的細胞（Ｔ）として、Ｅ／Ｔ比＝50：１または100 ：１で混合し、51Ｃｒ遊離試験を行った。結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
表２に示したように、ＰＢＳ中のダイマーおよびトライマーで、いずれのパルスの場合においても、ＣＴＬ活性が誘導された。また、SIHIGPGRAFYTTGE （ＭＮ）およびＭＮでパルスし、アラムとともに抗体を投与した場合には、ＣＴＬの誘導は観察されなかったが、RIQRGPGRAFVTIGK（IIIB）およびIIIBでパルスした場合には、ＣＴＬの誘導が観察された。
【００５９】
homologous graftとして調製したIg-PNDMN8 は、モノマー、オリゴマーともにＭＮＶ３特異的免疫応答は誘導できるが、ＣＴＬの誘導は不十分であることが示された。また、別のhomologous graftとして調製したIg-PNDIIIB8 は、モノマー、オリゴマーともにIIIBＶ３特異的免疫応答並びにＣＴＬを誘導することも観察された。
【００６０】
さらに、heterologous graftであるIg-PNDNM4IIIB4は、モノマー、オリゴマーともにＭＮＶ３並びにIIIBＶ３特異的免疫応答とＣＴＬを誘導することが示された（表１および２）。
【００６１】
さらにまた、ホモエピトープ移植抗体とヘテロエピトープ移植抗体は化学架橋によりオリゴマーを形成すると、アラムの非存在下でも、有意な免疫応答を誘導できること、およびアラムを初回免疫刺激に用いると、ＣＴＬ誘導に対しては抑制的に働くことが判明した。
【００６２】
本発明のエピトープ移植抗体は、合成ペプチドに比べて500 倍から1,000 倍高い抗原提示能を有するが、この抗原提示活性はオリゴマー形成によりさらに増強された。また、オリゴマーの抗原提示活性は、低親和性Ｆｃγレセプターに対する単クローン抗体のＦabフラグメント、アンモニウムクロリドやクロロキン処理、抗Ｉ−Ａd 抗体で阻害されることも示された。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫学的性質の異なるＨＩＶ中和主要エピトープ（ＰＮＤ）を、抗体分子Ｈ鎖の第二超可変部（ＣＲＤ２）と第三超可変部（ＣＲＤ３）、またはＬ鎖の第一超可変部（ＣＲＤ１）と第三超可変部（ＣＲＤ３）とに分子移植をし、ＨＩＶのＶ３エピトープに対する免疫応答反応を誘導するＨＩＶに対するワクチンを製造することができる。また、このようにして作製されたエピトープ分子移植抗体をさらに化学架橋してＨＩＶに対するワクチンとして製造することができる。
【００６４】
さらに、本発明は、上記のようにしてエピトープ分子移植抗体を作製することができ、また、これらを化学的に架橋させてオリゴマーとし、複合型多価エピトープ分子移植抗体を作製することができる。この複合型多価エピトープ移植抗体では。その免疫原性がオリゴマー形成により増強されるのでアジュバントなどの免疫誘導抑制を生じることがある免疫増強剤を利用しないという利点を有する。さらにまた、免疫学的特性の異なる主要エピトープを共有結合的に複合型エピトープとして移植抗体において表現提示することにより、液性免疫および細胞性免疫機能におけるリンパ球スペクトラムを抑制できる。
【００６５】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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【００６６】
配列番号：２
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源：
配列：
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【図面の簡単な説明】
【図１】超可変部の複数の箇所に２種類のＨＩＶエピトープが移植されたエピトープ移植抗体を示す図である。
【図１】
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