(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む部位特異的変異導入方法であって、
（１）部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿入した２本鎖ＤＮＡベクターを熱変性することにより１本鎖ＤＮＡを形成させる工程、
（２）上記（１）工程で得られた１本鎖ＤＮＡに変異プライマー及び選択プライマーをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により前記プライマーの間を埋め、前記１本鎖ＤＮＡから２本鎖ＤＮＡを調製する工程、ここで前記選択プライマーは、薬剤耐性遺伝子の中に１箇所以上のアンバーコドンを含む配列（選択配列）に相補的な配列を有し、かつアンバー変異を復帰させる変異を持つプライマーであり、
（３）上記（２）で得られたＤＮＡで、ｍｕｔＳの宿主大腸菌を形質転換し、クローンを得る工程及び
（４）上記（３）のクローンから得られたＤＮＡで、ｓｕｐ。の宿主大腸菌を形質転換し、目的の変異ＤＮＡを持つクローンを選択する、
ことを特徴とする部位特異的変異導入方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法に用いるためのベクターであって、下記（１）に示される構造を有するｐＫＦ３９６、ｐＫＦ３９７、ｐＫＦ３９８、ｐＫＦ３９９、及び下記（２）、（３）に示される構造を有するベクターであって、マルチクローニングサイトがそれぞれｐＫＦ３９６、ｐＫＦ３９７、ｐＫＦ３９８、ｐＫＦ３９９と同じものであるｐＫＦ２９６、ｐＫＦ２９７、ｐＫＦ２９８、ｐＫＦ２９９から選択されるベクター〔なお、（２）及び（３）中で、「ａｇｐ−３」はカナマイシン耐性遺伝子を意味し、「ａｍ」で示される２つのアンバーコドンは、当該カナマイシン耐性遺伝子中に存在する。〕。
（１）
0003743525.tif 000015
（２）
0003743525.tif 000016
（３）
0003743525.tif 000017
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、遺伝子工学において使用される部位特異的変異導入（Site-Specific Mutagenesis)を、より一層簡素化するための方法及びそれに使用するベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子工学の分野においては、遺伝子をクローニングし、発現するだけの技術では、有用な物質を単にそのまま大量に取得するための方法としても成功する例は少ない。部位特異的変異導入法によって、最大の発現量を得るためにフレームを合わせ、またアミノ酸配列を変えることなく開始コドン付近のＤＮＡ配列を変える操作は、最低限必要な技術である。また、クローニング発現させた蛋白質をより有用なものにするため、部位特異的変異導入法を用いて、アミノ酸を削除、変換し、その物質の特異性を変化させ、その物質が酵素である場合なら、最適ｐＨ、安定性、基質特異性、Ｋｍ値等を操作する技術は必須である。更に、蛋白質工学研究分野の手法としても、部位特異的変異導入法を用いてＤＮＡレベルでの変異導入、削除は、研究をより迅速、正確に行う技術として重要である。
【０００３】
部位特異的変異導入の典型的な操作（ギャップトデュプレックス法）は次の項目から成っている。
（１）まず、ファージ由来の１本鎖と２本鎖で存在できるベクターであってアンバーコドンを含むベクターに目的の変異を導入したいＤＮＡをクローニングする。
（２）クローンの一本鎖ＤＮＡをファージ感染により調製する。
（３）この１本鎖ＤＮＡと、外来ＤＮＡの挿入されていない２本鎖ベクターを直鎖状にしたものとを、変性後ハイブリダイズさせて、目標ＤＮＡの部分が一本鎖でベクターの部分が２本鎖になっているＤＮＡ（ギャップトデュプレックスＤＮＡ）を形成させる。
（４）次に導入したい変異のとおりに化学合成したオリゴヌクレオチド（変異プライマー）をハイブリダイズさせて、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応によりギャップを埋め、目的の変異点以外は完全に相補的な２本鎖ＤＮＡを調製する。
（５）このＤＮＡを、mutSの宿主大腸菌（ＤＮＡの修復能力を欠損している株）にトランスフェクションし、親ＤＮＡを持つファージクローンと変異ＤＮＡを持つファージクローンを成育させる。
（６）更に、 sup°の宿主大腸菌にトランスフェクションし、目的の変異ＤＮＡを持つファージクローンを選択する。
しかしながら、この方法はファージ感染による１本鎖ＤＮＡの調製や、外来ＤＮＡの挿入されていない２本鎖ベクターの調製が必要であり、操作が煩雑である。更に、ファージベクターを使用するので、大きなＤＮＡ断片、例えば５kb以上の長さのＤＮＡは挿入されにくく、また、ファージ特有の複製過程で変異が起こりやすい欠点が指摘されている。
特開平１−２５２２９１号公報には、これらの課題を解決するためのベクターとして、プラスミド／ファージ融合ベクターが記載されている。これは、アンバーコドンを含むアンピシリン耐性遺伝子とバクテリオファージＭ１３由来のインタージェニックリージョンを含んだ約３．２kbの融合ベクターである。このベクターは、比較的大きなサイズの遺伝子が挿入できる利点があり、更に、複製時に変異が生じる不安定性が認められない。しかし、このベクターを用いて部位特異的変異導入を行う場合でもやはりヘルパーファージを感染させて１本鎖ＤＮＡを調製しなければならず、また、外来ＤＮＡの挿入されていない直鎖状２本鎖ＤＮＡの調製も必要であり、操作が煩雑である。更に、このベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含むので以下のような問題も有している。すなわち、アンピシリン耐性は該遺伝子がコードするβ−ラクタマーゼによるアンピシリンの不活化によってもたらされるが、この酵素は分泌性タンパク質であるので、過剰量の菌体をプレートにまくと、分泌されて漏れだしたβ−ラクタマーゼのためにその部分のアンピシリンが不活化され、アンピシリン感受性の菌も生育してしまう。したがって、１枚のプレートにまくことができる菌体量が限られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、操作がより簡便な部位特異的変異導入方法、及びそれに用いるためのベクターを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は部位特異的変異導入方法に関し、下記工程を含む部位特異的変異導入方法であって、
（１）部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿入した２本鎖ＤＮＡベクターを熱変性することにより１本鎖ＤＮＡを形成させる工程、
（２）上記（１）工程で得られた１本鎖ＤＮＡに変異プライマー及び選択プライマーをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により前記プライマーの間を埋め、前記１本鎖ＤＮＡから２本鎖ＤＮＡを調製する工程、ここで前記選択プライマーは、薬剤耐性遺伝子の中に１箇所以上のアンバーコドンを含む配列（選択配列）に相補的な配列を有し、かつアンバー変異を復帰させる変異を持つプライマーであり、
（３）上記（２）で得られたＤＮＡで、ｍｕｔＳの宿主大腸菌を形質転換し、クローンを得る工程及び
（４）上記（３）のクローンから得られたＤＮＡで、ｓｕｐ。の宿主大腸菌を形質転換し、目的の変異ＤＮＡを持つクローンを選択する、
ことを特徴とする。
本発明の第２の発明は上記第１の発明の部位特異的変異導入方法に用いるためのベクターに関し、上記第１の発明の方法に用いるためのベクターであって、図３に示される構造を有するｐＫＦ３９６、ｐＫＦ３９７、ｐＫＦ３９８、ｐＫＦ３９９及び図４中に示される構造を有するベクターであって、マルチクローニングサイトがそれぞれｐＫＦ３９６、ｐＫＦ３９７、ｐＫＦ３９８、ｐＫＦ３９９と同じものであるｐＫＦ２９６、ｐＫＦ２９７、ｐＫＦ２９８、ｐＫＦ２９９から選択されるベクターであることを特徴とする。
なお、上記引用した図４中で、「ａｇｐ−３」はカナマイシン耐性遺伝子を意味し、「ａｍ」で示される２つのアンバーコドンは、当該カナマイシン耐性遺伝子中に存在する。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のベクターは、１箇所以上のアンバーコドンを含むクロラムフェニコール耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子を含む。クロラムフェニコール耐性は、該遺伝子がコードするクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼによるクロラムフェニコールの不活化によってもたらされる。また、カナマイシン耐性は、該遺伝子がコードするアミノグリコシド３′−ホスホトランスフェラーゼによるカナマイシンの不活化によってもたらされる。これらの酵素は菌体内酵素なので、従来のアンピシリン耐性のような問題はなく１枚のプレートにより多くの菌体をまくことができる。特に、カナマイシン耐性遺伝子をもつベクターは、他の薬剤耐性遺伝子を持つベクターに比べて各薬剤存在下で培養した菌体からのベクターの収率が高いので、特に好ましい。本発明のベクターは、その他の配列、例えば適当なクローニングサイトを含んでいてもよい。
なお、本発明のベクターは部位特異的変異導入に好適であるが、一般的なクローニングベクターとしても効果的な使い方がある。すなわち、一般に、あるクローニングベクターにクローニングされているＤＮＡ断片を別のベクターに移しかえる際には、元のベクター由来のバックグラウンドを除くために、ＤＮＡ断片を精製するか、別のベクターとして薬剤耐性が元のベクターとは異なるベクターを選択して、元のベクター由来のクローンを除去する。しかし、本発明のベクターの適当なクローニングサイトにＤＮＡ断片をクローニングしておけば、このベクターと同じ薬剤耐性（クロラムフェニコール耐性又はカナマイシン耐性）をもつ他のベクターに再クローニングする場合でも、supE宿主菌から sup°宿主菌へと菌株を変えるだけで元のベクター由来のバックグラウンドを容易に除去することができる。
【０００７】
本発明の方法による部位特異的変異導入は、例えば以下の工程によって行うことができる。
（１）本発明のベクターに標的となるＤＮＡを挿入する。
（２）（１）で調製したＤＮＡ挿入ベクター、変異プライマー、及び選択プライマーを、選択プライマーが過剰の状態で混合して熱変性を行いこれらをハイブリダイズさせる。
（３）ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により、変異プライマーと選択プライマーとの間を埋め、目的の変異点及び選択配列中の変異点以外は完全に相補的な二本鎖ＤＮＡを調製する。
（４）このＤＮＡで、mutSの宿主大腸菌を形質転換し、親ＤＮＡを持つクローンと変異ＤＮＡを持つクローンを成育させる。
（５）更に、 sup°の宿主大腸菌を形質転換し、クロラムフェニコール又はカナマイシン存在下で培養を行い、アンバー変異が復帰してクロラムフェニコール耐性又はカナマイシン耐性を獲得した、すなわち目的の変異ＤＮＡを持つクローンを選択する。
【０００８】
なお、本明細書中において、選択配列とは、薬剤耐性遺伝子の中に１箇所以上のアンバーコドンを含む配列をいう。また、選択プライマーとは、選択配列に相補的な配列を有し、かつアンバー変異を復帰させる変異を持つプライマーをいう。
【０００９】
本発明においては１本鎖ＤＮＡを熱変性によって形成させるので、従来のようなファージ感染による１本鎖ＤＮＡの調製といった複雑な操作を必要としない。その結果、操作が簡略化され、かかる日数も１日少なくてすむ。熱変性の結果生じた１本鎖ＤＮＡは、従来のようにギャップトデュプレックスＤＮＡを形成させるのに用いてもよく、前述の例のように選択プライマーと変異プライマーをハイブリダイズさせて用いてもよい。熱変性の方法としては、１本鎖ＤＮＡが形成される方法であれば何でもよいが、例えば、９０〜１００℃で数分間処理したのち、氷上で急冷すればよい。
【００１０】
本発明は、熱変性の結果生じた１本鎖ＤＮＡから選択プライマーを用いて２本鎖ＤＮＡを調製する工程も含む。この工程は、従来のようにギャップトデュプレックスＤＮＡを形成させる工程を経ないので、クローンされていない直鎖状２本鎖ＤＮＡを調製する必要がなく、選択プライマーとなるオリゴヌクレオチドを準備するだけでよい。選択プライマーの長さは特に限定されないが、２０mer 程度が一般的である。選択プライマーを選ぶ位置としては、選択配列中のアンバーコドンとのミスマッチが選択プライマーの配列の真ん中から５′個になるように選ぶ方がよい。
（５）の工程においては、クロラムフェニコール又はカナマイシン存在下で培養した菌体からいったんＤＮＡを抽出して、再度 sup°の宿主大腸菌に形質転換すれば、更に高い効率で部位特異的変異導入を行うことができる。
【００１１】
図１に、本発明による部位特異的変異導入の典型的な流れを示す。図中、CmR 、CmS はそれぞれクロラムフェニコール耐性、クロラムフェニコール感受性を、KmR 、KmS はそれぞれカナマイシン耐性、カナマイシン感受性を表す。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１３】
実施例１  部位特異的変異導入用ベクターの構築
（１）クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むベクターの構築
pHSG1337〔ジーン（Gene) 、第６１巻、第６３〜７４頁（１９８７）に記載〕のクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat-1)内にあるPvuII サイトを消失させ、かつその部分にアンバー変異を２箇所導入するために、配列表の配列番号１に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドプライマーを作製した。このプライマーは、本来はＣである４番目と１３番目の塩基をＴに変えてあり、その結果、グルタミンコドン（ＣＡＧ）に代わってアンバーコドン（ＴＡＧ）が出現するようになっている。
０．５μｇのpHSG1337（約０．６pmol) と６０pmolの上記プライマーを４０μｌのＢＡ緩衝液（２０mM  トリス−塩酸  ｐＨ  ７．５、１０mM  ＭｇＣｌ2 、５０mM  ＮａＣｌ）に溶解し、９５℃で３分間インキュベートした後氷中で急冷した。次に、６μｌの１０×Ｔ４ＰＬ緩衝液（１００mM  トリス−塩酸  ｐＨ７．５、５mM  ｄＮＴＰ、１０mM  ＡＴＰ、２０mM  ジチオスレイトール）、２０単位のＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、１５００単位のＴ４  ＤＮＡ  リガーゼを加え、蒸留水で６０μｌにした後２５℃で２時間インキュベートした。反応液を、エタノール沈殿したのち乾燥し５０μｌのPvuII 緩衝液（１０mM  トリス−塩酸  ｐＨ  ７．５、７mM  ＭｇＣｌ2 、７mM  ２−メルカプトエタノール、６０mM  ＮａＣｌ）に溶解して、１０単位のPvuII を加え、３７℃で２時間反応させた。反応液１０μｌを大腸菌ＢＭＨ７１−１８株（supE、mutS) にトランスフォームし、１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３mlを加え、３７℃で一晩培養した。
培養液１mlからプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法で回収し、エタノール沈殿、乾燥し、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０mM  トリス−塩酸  ｐＨ  ７．５、１mMＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液４μｌをPvuII 緩衝液５０μｌに溶解したのち１０単位のPvuII を加えて、３７℃で２時間反応させた。反応液１０μｌを、大腸菌ＢＭＨ７１−１８株にトランスフォームし、１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＳ寒天培地に適当量プレーティングし、３７℃で一晩培養した。
生育したコロニーを適当量個別に拾い培養し、それぞれプラスミドを回収、PvuII で処理し、切断されないプラスミドpHSG1337am2 が得られた。
【００１４】
一方、pHSG396 、pHSG397 、pHSG398 、pHSG399 （いずれも宝酒造社製）それぞれ０．５μｇを、AccIII、ApaLI 、NcoIで処理し、1133bp（pHSG398 及びpHSG399 から）、1144bp（pHSG396 及びpHSG397 から）の ApaLI−NcoIフラグメントを回収した。次に、２μｇのpHSG1337am2 をApaLI 、NcoIで処理し、1095bpのフラグメントを回収し、４等分し、上記 pHSG396〜399 由来のフラグメントとライゲーションし、pKF396、pKF397、pKF398、pKF399を得た。図２にこれらのプラスミドの構築図を示す。更に図３にpKF396〜399 の構造を示す。図中、各プライマーの小文字は変異部位を、（Δａ）はアデニン残基欠失を、（PvuII)は２箇所のアンバーコドンがいずれもグルタミンコドンに復帰した場合に出現するPvuII サイトを示す。すなわち、これらのベクターは２箇所のアンバーコドンを含むクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat-１am2)を持ち、lacZ′領域にマルチクローニングサイトを持つためsupE宿主菌を用いればIPTGとX-gal を含むプレートで、外来ＤＮＡの挿入の有無が容易に判別できる。また、pUC ベクターと同じ複製開始点を持つため、コピー数が多く、更に、これらのベクターはサイズが小さく（２２２８bp又は２２３９bp）、大きなサイズ（５kb以上）の遺伝子が挿入できる利点がある。これらのベクターは、互いに異なるマルチクローニングサイトを持つので、目的に応じて使い分けることができる。
【００１５】
（２）カナマイシン耐性遺伝子を含むベクターの構築
プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造社）をHindIII 、SmaIで部分消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした後Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行い、カナマイシン耐性遺伝子を保持し、かつマルチクローニングサイト内のHindIII −SmaI領域（３０ｂｐ）を欠失させたプラスミドｐ１５１４を構築した。
次に、配列表の配列番号２、３、４に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製し、実施例１−（１）と同様にしてｐ１５１４のカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ）内にあるHindIII 、SmaI、ClaIの各サイトを消失させた。更にカナマイシン耐性遺伝子にアンバー変異を２箇所導入するために、配列表の配列番号５に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製し、ジーン、第１５２巻、第２７１〜２７５頁（１９９５）に記載の方法に従いプラスミドＤＮＡにニックを入れ、アンバー変異が導入されたカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ−３）をもつプラスミドｐ２９９−５を構築した。
次に、前出のジーンに記載のプラスミドｐＫＦ１６ｃをAseIで処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、更にBglIで処理してマルチクローニングサイトを含む３３８ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐ２９９−５をNspIで処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、更にBglIで処理し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１９３１ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、上記ｐＫＦ１６ｃ由来の３３８ｂｐのＤＮＡ断片と連結してプラスミドｐ１５２９を構築した。次に、ｐ１５２９をDsaIで処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした後に連結反応を行い６１ｂｐのDsaI−DsaI領域を欠失させて、プラスミドｐＫＦ２９６を構築した。
一方、前出のジーンに記載のプラスミドｐＫＦ１７ｃ、ｐＫＦ１８ｃ、ｐＫＦ１９ｃをNdeIとBglIで処理し、マルチクローニングサイトを含む２２９ｂｐ（ｐＫＦ１７ｃ）、２１７ｂｐ（ｐＫＦ１８ｃ、ｐＫＦ１９ｃ）のＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＫＦ２９６をNdeIとBglIで処理し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１９８３ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、上記２２９ｂｐ又は２１７ｂｐのｐＫＦ１７ｃ〜ｐＫＦ１９ｃ由来のＤＮＡ断片とライゲーションし、プラスミドｐＫＦ２９７、ｐＫＦ２９８、ｐＫＦ２９９をそれぞれ構築した。図４にｐＫＦ２９６〜２９９の構築図を示す。図中のＭＣＳはマルチクローニングサイトを表す。なお、ｐＫＦ２９６〜２９９はそれぞれ実施例１−（１）のｐＫＦ３９６〜３９９と同じマルチクローニングサイトをもっている。
すなわち、これらのベクターは２箇所のアンバーコドンを含むカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ−３）を持ち、lacZ′領域にマルチクローニングサイトを持つためsupE宿主菌を用いればIPTGとX-gal を含むプレートで、外来ＤＮＡの挿入の有無が容易に判別できる。また、pUC ベクターと同じ複製開始点を持つため、コピー数が多く、更に、これらのベクターはサイズが小さく（２２１６bp又は２２０４bp）、大きなサイズ（５kb以上）の遺伝子が挿入できる利点がある。これらのベクターは、互いに異なるマルチクローニングサイトを持つので、目的に応じて使い分けることができる。
【００１６】
実施例２
実施例１−（１）で作製したベクターpKF399のlacZ′遺伝子のディレーションミューテーションの導入を行い、その効率を数値化した。lacZ′遺伝子はlacZα−ペプチドをコードしており、この遺伝子をlacZΔＭ１５の遺伝子型を持つ宿主菌に導入するとβ−ガラクトシダーゼ活性を生ずる。したがって、lacZ′遺伝子がそのままであればIPTGとX-gal の存在下で生育コロニーは青くなり、ミューテーションが入ると生育コロニーは白くなり、これらの青コロニーと白コロニーの数を比較することにより部位特異的変異導入の効率を数値化できる。
クロラムフェニコール耐性遺伝子内のダブルアンバー変異を復帰させる選択プライマー（CQ2)として、配列表の配列番号６に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製した。すなわち、pKF399ではCQ2 の４番目と１３番目のＣに対応する塩基がＴであるのでストップコドンになる（図３参照）。
lacZ′遺伝子にディレーションミューテーションを導入する変異プライマー（dZ) として、配列表の配列番号７に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製した。すなわち、dZは１０番目のＣと１１番目のＴの間にあるＡを欠落するように合成した（図３参照）。
次に、下記の表１に示すサンプルを調製した。
【００１７】
【表１】
0003743525.tif 000002
【００１８】
それぞれ蒸留滅菌水で全量２０μｌにした。次に、それぞれの溶液を１００℃で３分間インキュベートし、氷中にて急冷した。次に、それぞれの溶液に７μｌの滅菌蒸留水、３μｌの１０×Ｔ４ＰＬ緩衝液、０．５μｌのＴ４  ＤＮＡ  リガーゼ（１７５単位）、０．５μｌのＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（２単位）を加え、２５℃で２時間インキュベートした。
反応終了した各溶液それぞれ５μｌに大腸菌ＢＭＨ７１−１８株コンピテントセル５０μｌを加え、０℃で３０分間、４２℃で２分間、次いで０℃で２分間インキュベートした後、ＬＳ培地１mlを加え、３７℃で１時間インキュベートした。更にＬＳ培地２mlと１．５mg／mlのクロラムフェニコール溶液３０μｌを加え３７℃で一晩振とう培養した。
培養後、培養液１mlより煮沸法（ただしフェノール処理、クロロホルム処理、及びRNase 処理は行わない）にて粗プラスミドＤＮＡを調製し、１００μｌの滅菌蒸留水に溶解した。このＤＮＡ溶液５μｌを５０μｌの大腸菌ＴＨ３α株（supE、lacZΔＭ１５）又は大腸菌ＯＭ２７９株（ sup°、lacZΔＭ１５）コンピテントセルにトランスフォームしてＬＳ培地１ml加え、３７℃で１時間インキュベートした。この溶液に１５μｇ／mlのクロラムフェニコールとX-gal を含む寒天培地に適当量プレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
それぞれのコロニー数をカウントし、部位特異的変異導入の効率を計算した。なお、大腸菌ＴＨ３α株はsupEなので、アンバーコドン（ＴＡＧ）がグルタミンコドン（ＣＡＧ）に復帰してもしなくても菌は生育する。一方、大腸菌ＯＭ２７９株は sup°なので、アンバーコドンがグルタミンコドンに復帰したもののみが、生育する。また、lacZ′部分にディレーションが入るとコロニーは白く、入らないとコロニーは青くなる。結果を以下の表２及び表３に示す。
【００１９】
【表２】
0003743525.tif 000003
【００２０】
【表３】
0003743525.tif 000004
【００２１】
すなわち、No. ４の条件で約７９％の効率で、部位特異的変異ミュータントが得られた。
このように、従来のギャップトデュプレックス法だとファージプラスミド若しくはヘルパーファージの感染により１本鎖ＤＮＡの調製を必要とするため、全工程に少なくとも３日を必要としたが、本方法では２日で高い効率で部位特異的変異ミュータントを得ることができた。
【００２２】
実施例３
１９９２年、エルセビア  サイエンス（Elsevier Science) 出版発行、T.O.ヨシダ（Yoshida)ら、モレキュラー  アプローチズ  トゥ  ザ  スタディ  アンドトリートメント  オブ  ヒューマン  ディズィーズ（Molecular Approaches to the Study and Treatment of Human Disease) 、第８章、第５１〜５５頁に記載のヒトATIII cDNA（約１．５kbp)をpKF396のHindIII/XbaIサイトに挿入したプラスミドp396ATを作製し、ヒトATIII 遺伝子に部位特異的変異を導入しヒトATIII 分子異常症のＤＮＡを作製することを試みた。図５にプラスミドp396ATの構造を示す。図中、各プライマーの小文字は変異部位を、（PvuII)は２箇所のアンバーコドンがいずれもグルタミンコドンに復帰した場合に出現するPvuII サイトを示す。ヒトATIII 分子異常症は、野生型のArg406がMet に変わり、コドンＡＧＧがＡＴＧになっているため、制限酵素StuIの認識配列ＡＧＧＣＣＴが消失する。よって、部位特異的変異が導入されているかの確認は、StuIで切断されるかされないかで行える。
ポイントミューテーションを導入する変異プライマー（Kyt)として、配列表の配列番号８に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製した。すなわち、１０番目のＧがＴに変わるように合成した。次に下記の表４に示すサンプルを調製した。
【００２３】
【表４】
0003743525.tif 000005
【００２４】
それぞれ蒸留滅菌水で全量２０μｌにしたのち、実施例２と同様の手順で変異導入を行った。ＴＨ３α株とＯＭ２７９株のコロニー数を下記表５に示す。
【００２５】
【表５】
0003743525.tif 000006
【００２６】
サンプルNo. ６のＯＭ２７９株のコロニーを無作為に７個拾い、１５μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むＬＳ培地２mlで、３７℃一晩振とう培養した。培養後、培養液１mlより、アルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドＤＮＡを抽出し、適当量を制限酵素StuI、HindIII 、StuI／HindIII 、PvuII で切断処理を行い、部位特異的変異導入の有無を確認した。その結果、6 個のプラスミドについて部位特異的変異が導入されていた。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によって、遺伝子工学の分野で有用なより簡便な部位特異的変異導入方法、及びそれに用いるためのベクターが提供された。
【００２８】
【配列表】
【００２９】
配列番号：１
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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【００３０】
配列番号：２
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0003743525.tif 000008
【００３１】
配列番号：３
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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【００３２】
配列番号：４
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0003743525.tif 000010
【００３３】
配列番号：５
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0003743525.tif 000011
【００３４】
配列番号：６
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0003743525.tif 000012
【００３５】
配列番号：７
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
0003743525.tif 000013
【００３６】
配列番号：８
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による部位特異的変異導入の典型的な流れを示す図である。
【図２】pKF396〜pKF399の構築過程を示す図である。
【図３】pKF396〜pKF399の構造を示す図である。
【図４】pKF296〜pKF299の構築過程を示す図である。
【図５】p396AT6 の構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
0003743525.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
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