(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子を含む溶液の液滴を保持部材上に保持し、その液滴からの溶媒の蒸発により溶液を過飽和状態にして、溶液中で生体高分子の結晶を生成させる、生体高分子の結晶成長方法において、
前記保持部材に細長い形状を有する晶析推進部材を、保持部材上に保持される前記溶液の液滴中に晶析推進部材の少なくとも一部が浸漬されるように取り付け、前記晶析推進部材の浸漬部分の表面上であって、前記溶液の液滴からの溶媒の蒸発によって次第に低下していく液滴の表面付近に、順次生体高分子の結晶を析出させていき、生体高分子の結晶が得られた後に、前記晶析推進部材を生体高分子の結晶と一緒に前記保持部材から取り外して、前記溶液の液滴中から生体高分子の結晶を取り出すことを特徴とする、生体高分子の結晶成長方法。
【請求項２】
生体高分子を含む溶液の液滴からの溶媒の蒸発により溶液を過飽和状態にして、溶液中で生体高分子の結晶を生成させる、生体高分子の結晶成長用装置において、
生体高分子を含む溶液の液滴を保持する溶液保持部材と、
細長い形状を有し、前記溶液保持部材に、その溶液保持部材上に保持される前記溶液の液滴中に少なくとも一部が浸漬されるように着脱自在に取り付けられて、液滴中に浸漬された部分の表面上であって、前記溶液の液滴からの溶媒の蒸発によって次第に低下していく液滴の表面付近に、順次生体高分子の結晶を析出させていく晶析推進部材とを備えたことを特徴とする、生体高分子の結晶成長用装置。
【請求項３】
前記晶析推進部材の表面が、縦方向のステップと横方向のテラスとが連接して規則的に繰り返される階段状に形成されており、前記各ステップの縦方向の幅が生体高分子の分子サイズと同等の寸法にそれぞれ形成された請求項２記載の、生体高分子の結晶成長用装置。
【請求項４】
前記晶析推進部材のステップおよび／またはテラスの表面に、ステップとテラスとが同一の化学的性質または互いに異なる化学的性質を有するように化学的および／または物理的修飾が施された請求項３記載の、生体高分子の結晶成長用装置。
【請求項５】
前記溶液保持部材が、前記晶析推進部材を複数取り付けることができる取付部を有し透孔が形成された複数の溶液保持部と開口部とを有する板状チップで構成された請求項２ないし請求項４のいずれかに記載の、生体高分子の結晶成長用装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、蛋白質に代表される生体高分子の結晶を生成させる結晶成長方法、ならびに、その方法を実施するために使用される結晶成長用装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質に代表される生体高分子の三次元立体構造を明らかにすることは、その生体高分子の、生体中における生理機能を解明することができるばかりでなく、合理的な医薬品の開発（ドラッグデザイン）を進める上でも極めて有用である。この生体高分子の三次元立体構造を解析する実用的な手法としては、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法とＸ線結晶構造解析法とがあるが、解析上、生体高分子の分子量に制限の無いＸ線結晶構造解析法が、今後は特に有効であると考えられている。ところが、このＸ線結晶構造解析法では、解析に供するための生体高分子の単結晶を作製しなければならない。しかも、構造解析の分解能を向上させるためには、結晶性の良い単結晶を作製する必要がある。
【０００３】
生体高分子、例えば蛋白質の単結晶を作製する方法としては、現在、蒸気拡散法とバッチ法とが一般に採用されている。これらの方法のうち、蒸気拡散法では、図１７の（ａ）に示すように、少量の蛋白質を含む水溶液１ａを、カバーガラス３ａの下面側となる面に滴下して付着させ、あるいは、図１７の（ｂ）に示すように、少量の蛋白質を含む水溶液１ｂを、容器２ｂの内部に設置された支持台４の上面に滴下し、また、容器２ａ、２ｂの内底部に沈殿剤５を収容しておき、カバーガラス３ａ、３ｂによって容器２ａ、２ｂの上部開口を密閉する。これにより、蛋白質を含む水溶液１ａ、１ｂは、水分の蒸発によってやがて過飽和状態となり、その水溶液１ａ、１ｂ中で蛋白質の結晶が析出することになる。
【０００４】
また、バッチ法では、図１７の（ｃ）に示すように、少量の蛋白質を含む水溶液１ｃを小形容器６内に充填し、容器２ｃ内に緩衝溶液または沈殿剤７を収容して、蛋白質を含む水溶液１ｃと緩衝溶液または沈殿剤７とを透析膜または半透膜８で隔てておく。そして、蛋白質を含む水溶液１ｃのｐＨあるいは塩濃度が緩衝溶液または沈殿剤７のｐＨあるいは塩濃度に徐々に近付くように、透析膜または半透膜８を通して水分子だけを移動させることにより、蛋白質を含む水溶液１ｃを過飽和状態にして、その水溶液１ｃ中で蛋白質の結晶を析出させる。
【０００５】
これらの方法では、蛋白質を含む溶液中で偶発的に結晶核の形成と結晶の成長とが引き起こされ（この反応は、均一核形成反応と呼ばれている）、蛋白質結晶化の成否は、数多くの溶液作製条件、すなわち、蛋白質を溶解させる緩衝溶液の種類、ｐＨ、イオン強度、初期の蛋白質濃度、さらには沈殿剤の種類、濃度などによって左右されることになる。また、現状では、生化学的特性の異なる個々の蛋白質に対してそれぞれ有効な結晶化条件をあらかじめ予測した上で結晶化の実験を進める、といった手法は、未だ確立されていない。このため、結晶化の初期に大量のスクリーニングを行う、といった方法が一般的に採られている。
【０００６】
以上のような均一核形成法に比べ、固体基板の表面上で結晶核の形成を行わせる不均一核形成法は、熱力学的な理由から、低過飽和度の溶液条件下での結晶化に適しており、この方法によると、結晶核形成が容易に起こることが知られている。これに関しては、ダブル．ティラー、「ザ・サイエンス・オブ・クリスタリゼーション：マイクロスコピック・インターフェイシャル・フェノミナ」（ケンブリッジ・ユニバーシティ・プレス）（Ｗ．Ｔｉｌｌｅｒ“Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ”（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ））に詳細な報告が掲載されている。したがって、蛋白質の結晶成長方法にも、この方法を適用することができると考えられる。
【０００７】
また、上記した固体表面での不均一核形成法と原理は異なるが、固体表面の場を利用した蛋白質等の微小粒子の二次元的な結晶成長法が、例えば、特開平９−９２６１７号公報（発明の名称「ナノスケール微粒子の２次薄膜集積法」）に開示されており、また、エヌ．ディー．デンコフ他、ラングミール、第８巻、第１２号（１９９２）、３１８３ページ、「メカニズム・オブ・フォーメーション・オブ・ツー−ディメンジョナル・クリスタルズ・フロム・ラテックス・パーティクルズ・オン・サブスツイティズ」（Ｎ．Ｄ．Ｄｅｎｃｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１２（１９９２），ｐ３１８３，“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ  Ｌａｔｅｘ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ”に報告されている。この方法は、シリコン等の原子レベルで平滑な固体基板の表面に蛋白質等の微粒子を、液膜の乾燥時の、溶液に対する駆動力を利用して、溶液端部から二次元薄膜として集積化するというものである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
蛋白質に代表される生体高分子の結晶核形成および結晶成長には、上述したような方法が、従来は一般的に用いられている。しかしながら、均一核形成法では、結晶化条件の探索のために膨大な数のスクリーニングテストを行う必要があり、作業効率が悪く、また多くの労力を要する、といった問題点がある。しかも、スクリーニングによって結晶化条件を見出せない場合には、目的とする蛋白質の結晶化を断念せざるを得ないのが実状である。また、均一核形成法では、溶液中で結晶が得られるが、得られた結晶をＸ線結晶構造解析に供するためには、成長した個々の結晶を溶液中から取り出して専用のジグに装填する必要がある。この操作は、通常、手作業で行われるため、大量に蛋白質の結晶構造解析を行おうとするときは、極めて非能率的である、といった問題点がある。
【０００９】
また、不均一核形成反応を利用して固体基板の表面上に蛋白質の結晶成長を行わせる方法では、結晶は、固体基板の表面上に吸着された状態で成長する。したがって、大形の結晶にまで成長させた場合には、結晶の下面全体が基板と接着しているため、結晶を取り出す際に、結晶が壊れてしまったり結晶内にクラックが入ってしまったりして、結晶構造解析に使用できなくなる、といった問題点がある。
【００１０】
また、固体基板の表面に蛋白質分子の二次元結晶を成長させる方法では、二次元結晶の領域（ドメインサイズ）を大きくすることができず、しかも、引き続き乾燥させずに三次元結晶にまで成長させることは不可能であり、このため、結晶構造解析に供することのできる結晶を得ることができない。
【００１１】
この発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、生体高分子の結晶化の成功率を高め作業効率を向上させることができ、また、成長した結晶を簡便かつ迅速に結晶構造解析に供することを可能にする生体高分子の結晶成長方法を提供すること、ならびに、その方法を好適に実施することができる結晶成長用装置を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
請求項１に係る発明は、生体高分子を含む溶液の液滴を保持部材上に保持し、その液滴からの溶媒の蒸発により溶液を過飽和状態にして、溶液中で生体高分子の結晶を生成させる、生体高分子の結晶成長方法において、前記保持部材に細長い形状を有する晶析推進部材を、保持部材上に保持される前記溶液の液滴中に晶析推進部材の少なくとも一部が浸漬されるように取り付け、前記晶析推進部材の浸漬部分の表面上であって、前記溶液の液滴からの溶媒の蒸発によって次第に低下していく液滴の表面付近に、順次生体高分子の結晶を析出させていき、生体高分子の結晶が得られた後に、前記晶析推進部材を生体高分子の結晶と一緒に前記保持部材から取り外して、前記溶液の液滴中から生体高分子の結晶を取り出すことを特徴とする。
【００１３】
請求項２に係る発明は、生体高分子を含む溶液の液滴からの溶媒の蒸発により溶液を過飽和状態にして、溶液中で生体高分子の結晶を生成させる、生体高分子の結晶成長用装置において、生体高分子を含む溶液の液滴を保持する溶液保持部材と、細長い形状を有し、前記溶液保持部材に、その溶液保持部材上に保持される前記溶液の液滴中に少なくとも一部が浸漬されるように着脱自在に取り付けられて、液滴中に浸漬された部分の表面上であって、前記溶液の液滴からの溶媒の蒸発によって次第に低下していく液滴の表面付近に、順次生体高分子の結晶を析出させていく晶析推進部材とを備えたことを特徴とする。
【００１４】
請求項３に係る発明は、請求項２記載の結晶成長用装置において、晶析推進部材の表面を、縦方向のステップと横方向のテラスとが連接して規則的に繰り返される階段状に形成し、前記各ステップの縦方向の幅を生体高分子の分子サイズと同等の寸法にそれぞれ形成したことを特徴とする。
【００１５】
請求項４に係る発明は、請求項３記載の結晶成長用装置において、晶析推進部材のステップおよび／またはテラスの表面に、ステップとテラスとが同一の化学的性質または互いに異なる化学的性質を有するように化学的および／または物理的修飾を施したことを特徴とする。
【００１６】
請求項５に係る発明は、請求項２ないし請求項４のいずれかに記載の結晶成長用装置において、溶液保持部材を、前記晶析推進部材を複数取り付けることができる取付部を有し透孔が形成された複数の溶液保持部と開口部とを有する板状チップで構成したことを特徴とする。
【００１７】
請求項１に係る発明の結晶成長方法によると、保持部材上に保持された溶液の液滴からの溶媒の蒸発により、生体高分子を含む溶液の過飽和度が増大するとともに、溶液の液滴の表面（液面）が低下していく。このとき、液滴の表面付近であって液滴中に浸漬されている晶析推進部材の表面と接する溶液部分は、溶液中の溶媒分子の蒸発によって溶液の過飽和度が最も高い状態にある。このため、液滴の表面付近における晶析推進部材の浸漬部分の表面上で生体高分子の二次元的な結晶核形成が最も早く開始され、晶析推進部材の表面上に生体高分子の結晶が優先的に成長することになる。そして、晶析推進部材の表面上に保持された状態で、生体高分子の結晶が得られる。生体高分子の結晶が得られると、その結晶共々、細長い形状の晶析推進部材を保持部材から取り外すことにより、溶液の液滴中から結晶を取り出し、その結晶は、そのまま結晶構造解析等に供される。
【００１８】
請求項２に係る発明の結晶成長用装置においては、溶液保持部材に晶析推進部材を取り付け、生体高分子を含む溶液を溶液保持部材上に滴下して保持させ、その溶液保持部材上に保持された溶液の液滴中に晶析推進部材が浸漬されるようにする。この状態で、溶液保持部材上に保持された溶液の液滴から溶媒が蒸発すると、生体高分子を含む溶液の過飽和度が増大するとともに、溶液の液滴の表面（液面）が低下していく。このとき、液滴の表面付近であって液滴中に浸漬されている晶析推進部材の表面と接する溶液部分は、溶液中の溶媒分子の蒸発によって溶液の過飽和度が最も高い状態にある。このため、液滴の表面付近における晶析推進部材の浸漬部分の表面上で生体高分子の二次元的な結晶核の形成が最も早く開始され、晶析推進部材の表面上で生体高分子の結晶が優先的に成長することになる。そして、晶析推進部材の表面上に保持された状態で、生体高分子の結晶が得られる。生体高分子の結晶が得られると、その結晶共々、細長い形状の晶析推進部材を溶液保持部材から取り外すことにより、溶液の液滴中から結晶を取り出し、その結晶は、そのまま結晶構造解析等に供される。
【００１９】
請求項３に係る発明の結晶成長用装置では、上記したように溶液保持部材上に保持された溶液の液滴の表面（液面）が低下する際に、生体高分子の二次元的な核形成が、ステップ面を起点として行われ、かつ、テラスの表面上ではテラスの幅程度しか進行しない。そして、次の二次元的な核形成は、再び次段のステップ面から開始されることになる。このように、常にステップ面が核形成の起点となって二次元的な結晶成長が進行し、しかも、ステップ面は常に生体高分子に対して同一環境の親和性を有する核形成場として機能するため、極めて良好な配向性をもつ二次元的核形成が進行することになる。
【００２０】
請求項４に係る発明の結晶成長用装置では、晶析推進部材の表面上への生体高分子の無秩序な吸着が防止される。
【００２１】
請求項５に係る発明の結晶成長用装置では、スクリーニングテストにおいて、例えば、それぞれの溶解保持部には、それぞれ異なる表面修飾が施された複数の晶析推進部材を取り付け、各溶液保持部間では、生体高分子を含む溶液の液滴中に晶析推進部材を浸漬させるときの角度を変える、といったことが可能になる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の好適な実施形態について図１ないし図１６を参照しながら説明する。
【００２３】
図１は、この発明の実施形態の１例を示し、生体高分子、例えば蛋白質の結晶を生成させるために使用される結晶成長用装置の要部を構成する結晶成長用チップの構成を示す図であって、（ａ）が拡大平面図で、（ｂ）が（ａ）のＢ−Ｂ矢視縦断面図である。この結晶成長用チップ１０は、板状をなし蛋白質を含む溶液を保持するチップ本体１２と、細長い形状を有し結晶核の形成を促進するとともに成長した結晶を保持する晶析推進部材１４とから構成されている。
【００２４】
チップ本体１２には、複数、図示例では３つの溶液保持セル１６と開口部１８とが形設されている。溶液保持セル１６は、蛋白質を含む溶液の液滴を保持することができるように、凹状に形成され、かつ、平面視で十字形の保持フレーム２０を有し、それ以外の部分が貫通して透孔２２となっている。溶液保持セル１６に透孔２２が形成されていることにより、セル１６に保持された溶液の液滴からの水分の蒸発が促進させられて、蛋白質を含む溶液が速やかに過飽和状態に到達し過飽和度の増大が可能になる。開口部１８は、後述するようにウエル内底部への沈殿剤の注入を容易にし、また、その面積を適当に設定することにより蛋白質を含む溶液の過飽和度を調整するために設けられる。
【００２５】
図２に示す結晶成長用チップ２４は、図１に示した結晶成長用チップ１０に比べて開口部を多くした構成例である。図２中において、図１に示した部材と同一機能を有する各部材には、図１で使用した符号と同一符号をそれぞれ付している。図２に示すように、チップ本体２６における開口部２８ａ、２８ｂ、２８ｃ、２８ｄの総面積をより大きくすることにより、溶液保持セル１６に保持された蛋白質を含む溶液が過飽和状態に到達する速度をより速めることができる。
【００２６】
チップ本体１２、２６の材質は、酸、アルカリおよび塩に対する耐性があればどのようなものでもよい。但し、溶液保持セル１６に溶液を保持する必要があるため、撥水性を有し、また複雑な形状に加工することが可能である安価な材料のものが好ましい。これらの要求を満たす最も好ましい材質として、結晶シリコンあるいは多結晶シリコンが挙げられる。
【００２７】
チップ本体１２、２６のサイズについては、厚みは、例えば０．１ｍｍ〜１ｍｍ前後であるのが好ましい。また、全体の大きさは、使用する形態によって異なるが、結晶成長用チップ１０、２４が個別に用いられる場合には、例えば５ｍｍ〜１０ｍｍ角程度であり、集積化したチップとして用いられる場合には、例えば１００ｍｍ角程度である。また、図１に示した結晶成長用チップ１０におけるように、典型的な開口部１８の大きさは、例えば０．５ｍｍ角程度であり、溶液保持セル１６の大きさは、直径が例えば０．１ｍｍ〜０．５ｍｍ程度で、その凹部の深さが０．０１ｍｍ〜０．５ｍｍ程度である。さらに、溶液保持セル１６に設けられた十字形の保持フレーム２０の幅は、例えば０．１ｍｍ前後であることが好ましい。このようなチップ本体１２、２６は、例えば半導体製造技術を応用して、シリコン基板を微細加工することにより製造することができる。
【００２８】
晶析推進部材１４は、蛋白質を含む溶液中での初期結晶核形成を容易にし、さらには、成長後の結晶の取出しを簡便にするとともに、取り出された結晶を結晶構造解析へ迅速に供することができるようにする目的で備えられる。この晶析推進部材１４は、細長い形状、例えば短冊状（部分拡大斜視図を示す図７参照）に形成されており、その一端部が溶液保持セル１６の保持フレーム２０の十字交叉部に固定され他端部が斜め上方に突き出すようにして、溶液保持セル１６に着脱自在に取り付けられている。そして、各溶液保持セル１６に４本ずつの晶析推進部材１４が円周方向に等配されて取着されている。この晶析推進部材１４は、溶液保持セル１６に溶液を滴下して液滴を保持させたときに、その一部または全体が液滴中に浸漬される。
【００２９】
チップ本体の溶液保持セルへの晶析推進部材１４の取付け方法および取付け角度は、図１および図２に示した以外にも、各種の態様を採り得る。
【００３０】
図３の（ａ）に拡大平面図を、（ｂ）に（ａ）のＢ−Ｂ矢視縦断面図を示す結晶成長用チップ３０では、チップ本体３２の溶液保持セル３４の外周縁の外側に、その外周縁から半径方向に延びる固定用溝４２が形成されている。固定用溝４２は、各溶液保持セル３４に円周方向に等配されて４本ずつ設けられている。そして、各固定用溝４２に各晶析推進部材１４の一端部がそれぞれ固定され、各晶析推進部材１４の他端部が固定用溝４２から溶液保持セル３４の中心に向かって水平方向にそれぞれ突き出すように、各溶液保持セル３４に４本ずつの晶析推進部材１４が円周方向に等配されて取着されている。図３中において、符号３６が開口部、３８が十字形の保持フレーム、４０が透孔である。
【００３１】
次に、図４の（ａ）に拡大平面図を、（ｂ）に（ａ）のＢ−Ｂ矢視縦断面図を示す結晶成長用チップ４４では、チップ本体４６の溶液保持セル４８の外周縁の外側に、その外周縁から半径方向に少し離間して有底の固定用小孔５６が形成されている。固定用小孔５６は、各溶液保持セル４８に円周方向に等配されて４個ずつ設けられている。そして、各固定用小孔５６内に各晶析推進部材１４の一端部がそれぞれ固定され、各晶析推進部材１４の他端部が溶液保持セル４８の中心に向かって斜め上方にそれぞれ突き出すように、各溶液保持セル４８に４本ずつの晶析推進部材１４が円周方向に等配されて取着されている。図４中において、符号５０が開口部、５２が十字形の保持フレーム、５４が透孔である。
【００３２】
また、図５の（ａ）に拡大平面図を、（ｂ）に（ａ）のＢ−Ｂ矢視縦断面図を示す結晶成長用チップ５８では、チップ本体６０の溶液保持セル６２に、上面側および下面側からそれぞれ四角錐状に穿孔されて上下に貫通する固定用孔６６が形成されている。固定用孔６６は、各溶液保持セル６２に円周方向に等配されて４個ずつ設けられている。各晶析推進部材１４は、それぞれガラスキャピラリー６８内に挿入され、晶析推進部材１４が内挿された各ガラスキャピラリー６８の一端部が、各固定用孔６６内に差し入れられてそれぞれ保持されている。各ガラスキャピラリー６８の他端部は、固定用孔６６のテーパー面に沿って斜め上方にそれぞれ突き出している。そして、各溶液保持セル６２に４本ずつの、晶析推進部材１４が内挿されたガラスキャピラリー６８が、それぞれ同一角度で同一方向を向くように取着されている。図５中において、符号６４が開口部である。
【００３３】
晶析推進部材１４は、図６に拡大模式図を、図７に部分拡大斜視図をそれぞれ示すように、蛋白質を含む溶液と接する少なくとも１つの面側を、縦方向のステップ７０と横方向のテラス７２とが連接して規則的に繰り返される階段状に形成することが好適であり、その場合には、各ステップ７０の縦方向の幅ａを蛋白質の分子サイズと同等の寸法にそれぞれ形成する。ステップ７０のサイズは、縦方向の幅ａが例えば１Å〜１０Å程度が良く、テラス７２のサイズは、幅ｂが例えば１Å〜５００Å程度が良い。図６中のθは、後述するように結晶面を切り出す際の角度であり、θ＝０のときには、晶析推進部材１４がステップ・テラス表面構造とならない。
【００３４】
このような晶析推進部材１４のステップ・テラス表面構造は、微細加工技術を用いて加工形成することができるが、次に説明するような方法によっても形成することが可能である。すなわち、ある種の無機結晶、例えばペロブスカイト構造の結晶では、結晶軸と僅かにずれた角度（オフ角）で結晶面を切り出すと、その切出し面には階段状の結晶面が現れる。この切り出す際の結晶軸と角度とを変えることにより、任意の寸法のステップとテラスとを有する表面構造が得られる。このような目的で使用可能である無機結晶としては、例えばＴｉＯ２、ＭｇＯ、Ａｌ２Ｏ３、ＮｄＧａＯ３、ＭｇＡｌ２Ｏ４、ＬａＡｌＯ３、ＳｒＴｉＯ３などが挙げられる。
【００３５】
また、晶析推進部材１４の階段状の面側には、あるいは、ステップ・テラス表面構造を有しない晶析推進部材の、蛋白質を含む溶液と接する面側には、その表面への蛋白質分子の化学吸着能を制御することを可能にするために、図８および図９に示すように、種々の化学的および／または物理的修飾を施すことができる。
【００３６】
図８の（ａ）は、晶析推進部材１４のステップ７０およびテラス７２のいずれにも表面修飾を施していない例であり、（ｂ）は、晶析推進部材１４のステップ７０とテラス７２の両方に表面修飾膜７４を被着形成した例、（ｃ）は、晶析推進部材１４のステップ７０だけに表面修飾膜７４を被着形成し、テラス７２には表面修飾を施していない例、（ｄ）は、晶析推進部材１４のテラス７２だけに表面修飾膜７４を被着形成し、ステップ７０には表面修飾を施していない例である。また、図９の（ｅ）は、晶析推進部材１４のステップ７０に表面修飾膜７４を被着形成し、テラス７２には別の表面修飾膜７６を被着形成した例であり、（ｆ）は、晶析推進部材１４のステップ７０とテラス７２の両方に表面修飾膜７４を被着形成し、さらにテラス７２には表面修飾膜７４の表面に別の表面修飾膜７６を被着形成した例である。また、図９の（ｇ）は、ステップ・テラス表面構造を有しない晶析推進部材１４ａの、蛋白質を含む溶液と接する面に、表面修飾を施していない例であり、（ｈ）は、ステップ・テラス表面構造を有しない晶析推進部材１４ａの１つの面に表面修飾膜７４を被着形成した例である。
【００３７】
図８の（ｂ）〜（ｄ）ならびに図９の（ｅ）および（ｆ）に示したように、晶析推進部材１４のステップ７０および／またはテラス７２に表面修飾膜７４、７６を被着形成することにより、ステップ７０またはテラス７２への蛋白質分子の無秩序な吸着を防止することができる。この表面修飾膜７４、７６は、耐酸性、耐アルカリ性および耐塩性を有するものが好ましく、無機・金属物質としては、例えばＳｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、Ｓｉ、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ａｕ、Ｐｔ、Ｔｉなどが使用可能である。また、有機系物質としては、例えば、シリコンまたはフッ素を含有するポリマー樹脂を用いることができる。表面修飾膜７４、７６の厚みは、例えば１０Å程度が良い。
【００３８】
図８および図９に示した集積推進部材１４、１４ａの表面への表面修飾膜７４、７６の形成には、例えば一般的な物理蒸着法、スピンコーティング法、スプレー法、ディッピング法などを用いることができる。また、晶析推進部材１４のステップ７０またはテラス７２への選択的な表面修飾膜７４、７６の形成には、斜め物理蒸着法、あるいは、斜め物理蒸着法により特定の面のみに犠牲膜を形成した後、全面にスプレー法等により表面修飾膜を形成し、その後に最初の犠牲膜を除去する方法などを用いることができる。
【００３９】
次に、上記した結晶成長用チップにおける結晶生成の動作について、図１に示した結晶成長用チップ１０を用いた場合で説明する。
【００４０】
チップ本体１２の溶液保持セル１６に晶析推進部材１４を取り付け、図１０に拡大縦断面図を示すように、蛋白質を含む溶液を溶液保持セル１６上に滴下して溶液の液滴７８を保持させ、その溶液保持セル１６上に保持された溶液の液滴７８中に晶析推進部材１４の大部分が浸漬されるようにする。この状態で、溶液保持セル１６上に保持された溶液の液滴７８から水分が蒸発すると、蛋白質を含む溶液の過飽和度が増大するとともに、図１１の（ａ）に部分拡大模式図を示すように、溶液の液滴７８の表面（液面）が、液面８０ａから液面８０ｂ、液面８０ｃへと低下していく。
【００４１】
このとき、液滴７８の表面付近であって液滴７８中に浸漬された晶析推進部材１４の表面と接する溶液部分は、溶液中の水分子の蒸発によって溶液の過飽和度が最も高い状態にある。このため、液滴７８の表面付近における晶析推進部材１４の浸漬部分の表面上で、蛋白質分子の凝集あるいは二次元的な結晶核形成が最も早く開始される。一般に、この二次元的核形成は、水分子の蒸発に伴う液面付近への蛋白質分子の供給が駆動力となって進行するため、規則的な核形成部分と不規則でランダムに蛋白質分子が凝集した部分とが混在した状態となることが予想される。また、蛋白質分子が晶析推進部材１４の表面上に静電的な相互作用によって吸着・結合してしまうと、蛋白質分子は、再配向することができないため、ランダムに配向した集合体となって凝集してしまうと予想される。
【００４２】
ところが、図１１の（ａ）の一部をさらに拡大した模式図を（ｂ）に示すように、晶析推進部材１４の表面に、蛋白質分子８２と同等のサイズのステップ７０とテラス７２とが形成されていると、溶液の液滴７８の表面（液面）８０が低下する際に、二次元的核形成は、ステップ７０面を起点としてテラス７２の表面上ではテラス７２の幅程度しか進行しない。そして、次の二次元的な核形成は、再び次段のステップ７０面から開始されることになる。このように、常にステップ７０面が核形成の起点となって二次元的な結晶成長が進行し、しかも、ステップ７０面は常に、結合異方性のある蛋白質分子に対して同一環境の親和性を有する核形成場として機能するため、極めて良好な配向性をもつ二次元的核形成が進行することになる。
【００４３】
この結晶成長用チップ１０を用いて蛋白質の結晶化を行うと、以上のような動作により、図１１に示すように、蛋白質の結晶８４が、常に、蛋白質を含む溶液の液滴７８の表面（液面）８０の直下での晶析促進部材１４上で優先的に成長することになる。そして、晶析推進部材１４の表面上に保持された状態で、蛋白質の結晶８４が得られる。蛋白質の結晶８４が得られると、その結晶８４共々、晶析推進部材１４をチップ本体１２の溶液保持セル１６から取り外すことにより、溶液の液滴７８中から結晶８４を取り出し、その結晶８４は、そのまま結晶構造解析等に供される。
【００４４】
図１２に拡大縦断面図を示した結晶成長用チップ８６では、チップ本体８８の溶液保持セル９０の外周縁の外側に形設された有底の固定用小孔９４内に各晶析推進部材１４の一端部をそれぞれ固定し、各晶析推進部材１４の他端部を溶液保持セル４８の中心に向かって斜め上方にそれぞれ突き出させ、晶析推進部材１４同士の上端部を互いに交差させるようにして、溶液保持セル９０に晶析推進部材１４を取着している。そして、溶液保持セル９０に、蛋白質を含む溶液の液滴７８が、その液滴７８の表面（液面）８０が晶析推進部材１４上端部の交差部分に位置するように保持されている。この結晶成長用チップ８６においても、蛋白質の結晶８４は、常に、蛋白質を含む溶液の液滴７８の表面（液面）８０の直下での晶析促進部材１４上で優先的に成長する。図１２中における符号９２は、開口部である。
【００４５】
図１０および図１２に示した結晶成長用チップ１０、８６のいずれにおいても、晶析推進部材１４の上端部を、溶液保持セル１６、９０に保持された溶液の液滴７８の表面（液面）８０から外部へ突き出させるようにしている。晶析推進部材１４の全体を溶液の液滴７８中に浸漬させるようにしても、結晶成長は勿論可能であるが、晶析推進部材１４の上端部を溶液の液滴７８から外部へ突出させると、溶液が低（塩）濃度である場合に、より早く結晶の成長を行うことができ、また、成長させた結晶を晶析推進部材１４と一緒にＸ線結晶構造解析に供することができるなど、迅速な結晶化と解析を行いたい場合に特に有効である。すなわち、成長した結晶を溶液中から取り出し、Ｘ線結晶構造解析用のジグに結晶をマウントする操作は、手作業で行われ、ある程度の熟練を要するため、成長した結晶を晶析推進部材１４と一緒に溶液中から取り出してジグにマウントすれば、その作業時間を短縮化することができる。
【００４６】
上記したように構成された結晶成長用チップ１０を使用する場合において、どのような化学的性質を有する蛋白質の結晶化にも対応することができるようにするために、１つの溶液保持セル１６内には、それぞれ異なった表面修飾膜７４、７６を有する複数の晶析推進部材１４を同時にセットすることが有効である。また、蛋白質分子の、晶析推進部材１４の表面との相互作用の程度や流動性が、蛋白質の種類によって異なることを想定して、チップ本体１２の各溶液保持セル１６間で、蛋白質を含む溶液の液滴７８中に晶析推進部材１４を浸漬させるときの角度を変える、といったことも有効である。例えば、それぞれの溶解保持部には、それぞれ異なる表面修飾が施された複数の晶析推進部材を取り付け、各溶液保持部間では、生体高分子を含む溶液の液滴中に晶析推進部材を浸漬させるときの角度を変える、といったことが可能になる。
【００４７】
例えば、１つ目の溶液保持セル１６内には、表面構造の異なる４種類の晶析推進部材１４を、それぞれ同じ角度で蛋白質を含む溶液の液滴７８中に浸漬させるようにセットし、２つ目の溶液保持セル１６については、表面構造の異なる４種類の晶析推進部材１６は１つ目の溶液保持セル１６のものと同一であるが、１つ目の溶液保持セル１６のものとは角度を変えて晶析推進部材１６をセットした結晶成長用チップ１０を使用して、蛋白質の結晶化操作を行う方法が考えられる。このような方法は、スクリーニングテストでは特に有効となる。
【００４８】
次に、上記構成の結晶成長用チップの使用形態について説明する。結晶成長用チップは、密閉可能で内底部に沈殿剤が注入される容器に内装して個別に使用することも勿論可能であるが、図１３に示した例では、多数の結晶成長用チップを１つのウエルプレートに装填して使用するようにしている。すなわち、図１３の（ａ）に模式的平面図を、（ｂ）に部分拡大縦断面図をそれぞれ示すように、多数の容器状凹部（ウエル）９８が形設されたウエルプレート９６を使用し、ウエルプレート９６の各容器状凹部９８内に結晶成長用チップ１０を、容器状凹部９８の内部に設置された支持台１００で支持してそれぞれ装填する。そして、図示していないが、各容器状凹部９８の内底部に沈殿剤をそれぞれ注入し、結晶成長用チップ１０の溶液保持セル１６に蛋白質を含む溶液を滴下して液滴を保持させた後、全ての容器状凹部９８の上部開口をガラス板等によって密閉し、蛋白質の結晶化を行わせる。このような使用形態は、スクリーニングテストを行う場合に適している。
【００４９】
また、図１４は、多数の結晶成長用ユニットセルをワンチップ化した例を示す。すなわち、図１４の（ａ）に平面図を、（ｂ）に部分拡大縦断面図をそれぞれ示すように、結晶成長用ユニットセル１０２は、複数、例えば３つの溶液保持セル１０４と、開口部１０６と、各溶液保持セル１０４にそれぞれ取り付けられる晶析推進部材（図示せず）と、内底部に沈殿剤が注入される容器セル１０８とから構成され、多数の結晶成長用ユニットセル１０２が１つのチップ１１０に設けられている。そして、チップ１１０は、多数の容器セル１０８が形成されたガラス等からなるプレート１１２と、３つの溶液保持セル１０４と開口部１０６との組合せが多数形成された溶液保持基板１１４と、容器セル１０８および一組の溶液保持セル１０４と開口部１０６との形成部に対応して多数の透孔１１８が形成されたガラス板等からなる側壁形成板１１６と、図示しないガラス板等からなる最上部の密閉板とを一体的に接合して構成されている。このような構成のチップ１１０を使用すると、例えばスクリーニングテストは、この小形のチップ１１０を１枚用意するだけで行うことが可能になり、このため省スペース化が図れることになる。
【００５０】
図１４に示したように多数の結晶成長用ユニットセルをワンチップ化した場合、溶液の供給および排出機能を設けることにより、例えば宇宙空間のように微少重力下等の極限条件下における結晶化実験にも対応することが可能になる。この例を図１５および図１６に示す。
【００５１】
図１５に模式的平面図を、図１６に部分拡大縦断面図をそれぞれ示すように、１枚のチップ１２０に多数の結晶成長用ユニットセル１２２が形設されている。結晶成長用ユニットセル１２２は、溶液保持セル１２４と開口部（図示せず）と晶析推進部材１２６と容器セル１２８とから構成され、チップ１２０は、多数の容器セル１２８が形成されたガラスプレート１３０と、溶液保持セル１２４と開口部との組合せが多数形成された溶液保持基板１３２と、容器セル１２８および一組の溶液保持セル１２４と開口部との形成部に対応して多数の透孔１３６が形成された側壁形成板１３４と、最上部の密閉ガラス板１３８と、最下部の下面ガラス板１４０とを一体的に接合して構成されている。そして、密閉ガラス板１３８には、蛋白質を含む溶液の供給管（図示せず）が接続されるジョイント１４２の通路に一端が連通し、他端が溶液保持セル１２４の上方位置で開口する溶液供給用流路１４４が形成されており、また、下面ガラス板１４０には、沈殿剤の供給管（図示せず）が接続されるジョイント１４６の通路に一端が連通し、他端が容器セル１２８の内底面で開口する沈殿剤供給用流路１４８が形成されている。
【００５２】
図１５および図１６に示したチップ１２０を使用すると、溶液保持セル１２４への蛋白質溶液の滴下および容器セル１２８の内底部への沈殿剤の注入動作を自動制御することができ、極限条件下における結晶化実験に適したものとなる。
【００５３】
【実施例】
以下、この発明のより具体的な実施例について、実験例を示して説明する。
【００５４】
〔結晶成長用チップのチップ本体の作製〕
厚みが０．５ｍｍで６インチ径の多結晶シリコン基板を材料にし、ドライエッチング装置を使用して多結晶シリコン基板を図１に示したパターンにエッチングした。１チップに相当するサイズは、０．７５ｍｍ角であり、開口部１８は０．３５ｍｍ角で、溶液保持セル１６は、外周部の直径が０．２ｍｍで、内周部の直径が０．１８ｍｍであった。また、溶液保持セル１６内の十字形の保持フレーム２２の幅は０．１ｍｍであった。さらに、溶液保持セル１６の凹状の深さは０．１５ｍｍであった。得られた基板を所定のチップサイズにダイシング（カット）することにより、図１に示した結晶成長用チップ１０のチップ本体１２を得た。
【００５５】
〔晶析推進部材の作製〕
次に、晶析推進部材１４を作製した。材料として、厚みが０．４ｍｍで１００ｍｍ角のサファイア基板を用いた。図６に示したステップ７０およびテラス７２を有する表面構造は、まず、サファイア結晶のＲ面に対し角度を２度ずらして（２度オフ）サファイア基板を切り出し、切出し面を研磨して形成した。このようにして得られた基板（以下、「ＳＴ基板」と呼ぶ）は、表面のステップ７０の縦方向の幅が約５Åで、テラス７２の幅が約１００Åであった。また、ステップ・テラス構造を持たないサファイア基板（以下、「フラット基板」と呼ぶ）も作製した。これは、サファイア結晶のＲ面をそのまま切り出し研磨して作製した。
【００５６】
その後、ＳＴ基板およびフラット基板に対し、以下のような表面修飾を施した。
【００５７】
（Ａ）：ＳＴ基板
サンプル（Ａ）−１：サファイア表面をそのまま使用した（表面修飾を施さない）。
サンプル（Ａ）−２：サファイア表面全体にシリコン系樹脂膜を１０Åの厚みに浸漬法により形成して疎水性表面とした。
サンプル（Ａ）−３：サファイア表面全体にＳｉＯ２膜をスパッタリング法により１０Åの厚みに形成して親水性表面とした。
サンプル（Ａ）−４：テラス面のみにシリコン系樹脂膜を犠牲層除去法により１０Åの厚みに形成して部分的に疎水性表面とした。
サンプル（Ａ）−５：サファイア表面全体にＡｕを１０Åの厚みに蒸着した。
（Ｂ）：フラット基板
サンプル（Ｂ）−１：サファイア表面をそのまま使用した（表面修飾を施さない）。
サンプル（Ｂ）−２：サファイア表面全体にシリコン系樹脂膜を１０Åの厚みに浸漬法により形成して疎水性表面とした。
サンプル（Ｂ）−３：サファイア表面全体にＳｉＯ２膜をスパッタリング法により１０Åの厚みに形成して親水性表面とした。
サンプル（Ｂ）−５：サファイア表面全体にＡｕを１０Åの厚みに蒸着した。
【００５８】
続いて、得られたＳＴ基板およびフラット基板の全てをダイシング装置により０．１ｍｍ×２．５ｍｍのサイズにカットすることにより、晶析推進部材１４を得た。
【００５９】
〔結晶成長用チップの作製〕
以上のようにして作製された晶析推進部材１４（サンプル（Ａ）−１〜（Ａ）−５）の５本を１セットとして、図１に示したような構造となるようチップ本体１２の溶液保持セル１６の中心部にマウントとすることにより、結晶成長用チップ１０を作製した。晶析推進部材１４のマウントに際しては、表面修飾膜が形成された面を上側にして、紫外線硬化樹脂を用いて晶析推進部材１４の一端部を溶液保持セル１６に固定した。また、フラット基板から作製した晶析推進部材（サンプル（Ｂ）−１〜（Ｂ）−３、（Ｂ）−５）も４本を１セットとして、図１に示したような構造となるようチップ本体１２の溶液保持セル１６の中心部にマウントとすることにより、結晶成長用チップを作製した。
【００６０】
以上のようにして作製された各結晶成長用チップは、図１３に示したウエルプレート９６に組み込まれて実験に供された。
【００６１】
〔結晶化テスト〕
ウシ肝臓製カタラーゼ（分子サイズ：約４０Å）を１０ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにそれぞれ、濃度が０．１ＭでｐＨ８．０のＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ緩衝溶液に溶解させて、蛋白質溶液を調製した。また同時に、蛋白質溶液に、１．０Ｍの濃度となるように塩としてＮａＣｌを添加した。
【００６２】
このようにして調製された蛋白質溶液を５μｌずつ、チップ本体の各溶液保持セル上にそれぞれ滴下した。また、ウエルプレート９６の容器状凹部（ウエル）９８の内底部には、沈殿剤として濃度２．０ＭのＮａＣｌ溶液を０．５ｍｌ、それぞれ滴下して注入した。結晶化テストは、２０℃の温度下で、７日間行った。結晶化テストの結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
0003803538.tif 000002
【００６４】
〔比較例〕
図１７の（ａ）に示した従来法（ハンギングドロップ蒸気拡散法）を用いて、上記した実施例の場合と同一の蛋白質溶液を使用し同一の結晶化条件で、蛋白質の結晶化テストを行った。その結果、１０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度では、結晶成長は起こらず、また、５０ｍｇ／ｍｌの濃度では、多数の微結晶と凝集体（沈殿物）の析出が認められた。
【００６５】
以上の結晶化テストの結果から、本発明の実施例中では、サンプル（Ａ）−２および（Ａ）−４、特にサンプル（Ａ）−４が、良好な結晶を得るのに特に有効であることが分かった。
【００６６】
【発明の効果】
請求項１に係る発明の結晶成長方法によると、通常の条件下での結晶化が困難な場合、あるいは良質の結晶が得られない場合でも、生体高分子の良好な結晶を得ることができる。そして、生体高分子の結晶化の成功率を高め作業効率を向上させることができる。また、晶析推進部材の表面上に保持された状態で生体高分子の結晶が得られるので、成長した結晶を晶析推進部材と一緒に溶液中から取り出すことにより、生成された結晶を簡便かつ迅速に結晶構造解析等に供することが可能になる。これらのことにより、本発明は、今後、大量の蛋白質を迅速に結晶化させ結晶構造解析を行う必要がある場合などに、大いに貢献し得るものである。
【００６７】
請求項２に係る発明の結晶成長用装置を使用すると、請求項１に係る発明の方法を好適に実施することができ、請求項１に係る発明の上記効果が確実に得られる。
【００６８】
請求項３に係る発明の結晶成長用装置では、極めて良好な配向性をもつ二次元的核形成が進行することになり、結晶性の良い生体高分子の結晶が得られる。
【００６９】
請求項４に係る発明の結晶成長用装置では、晶析推進部材の表面上への生体高分子の無秩序な吸着が防止されるので、より良好な結晶が得られる。
【００７０】
請求項５に係る発明の結晶成長用装置は、スクリーニングテストを行う場合などに特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施形態の１例を示し、蛋白質の結晶を生成させるために使用される結晶成長用装置の要部を構成する結晶成長用チップの構成を示す図であって、（ａ）が拡大平面図で、（ｂ）が（ａ）のＢ−Ｂ矢視縦断面図である。
【図２】結晶成長用チップの別の構成例を示す拡大平面図である。
【図３】結晶成長用チップのさらに別の構成例を示し、（ａ）が拡大平面図で、（ｂ）が（ａ）のＢ−Ｂ矢視縦断面図である。
【図４】結晶成長用チップのさらに別の構成例を示し、（ａ）が拡大平面図で、（ｂ）が（ａ）のＢ−Ｂ矢視縦断面図である。
【図５】結晶成長用チップのさらに別の構成例を示し、（ａ）が拡大平面図で、（ｂ）が（ａ）のＢ−Ｂ矢視縦断面図である。
【図６】結晶成長用チップの構成要素の１つである晶析推進部材の構成例を示す拡大模式図である。
【図７】図６に示した晶析推進部材の部分拡大斜視図である。
【図８】晶析推進部材に施される表面修飾の種々の例を模式的に示す図である。
【図９】同じく、晶析推進部材に施される表面修飾の種々の例を模式的に示す図である。
【図１０】図１に示した結晶成長用チップにおける結晶生成の動作について説明するための拡大縦断面図である。
【図１１】同じく、結晶生成の動作について説明するための図であって、（ａ）が部分拡大模式図で、（ｂ）が（ａ）の一部をさらに拡大した模式図である。
【図１２】図１に示した結晶成長用チップとは異なる構成の結晶成長用チップにおける結晶生成の動作について説明するための拡大縦断面図である。
【図１３】図１に示した結晶成長用チップの使用形態の１例を示し、（ａ）は、多数の結晶成長用チップを装填したウエルプレートの模式的平面図で、（ｂ）は、その一部を拡大して示す縦断面図である。
【図１４】多数の結晶成長用ユニットセルをワンチップ化した例を示し、（ａ）は、多数の結晶成長用ユニットセルが形設されたチップの平面図で、（ｂ）は、その一部を拡大して結晶成長用ユニットセルを示す縦断面図である。
【図１５】多数の結晶成長用ユニットセルをワンチップ化した変形例を示すチップの模式的平面図である。
【図１６】図１５に示したチップの部分拡大縦断面図である。
【図１７】蛋白質の単結晶を作製する従来の方法について説明するための模式図である。
【符号の説明】
１０、２４、３０、４４、５８、８６  結晶成長用チップ
１２、２６、３２、４６、６０、８８  チップ本体
１４、１４ａ、１２６  晶析推進部材
１６、３４、４８、６２、９０、１０４、１２４  溶液保持セル
１８、２８ａ、２８ｂ、２８ｃ、２８ｄ、５０、６４、９２、１０６  開口部
２０、５２  保持フレーム
２２、５４  透孔
４２  固定用溝
５６、９４  固定用小孔
６６  固定用孔
６８  ガラスキャピラリー
７０  晶析推進部材のステップ
７２  晶析推進部材のテラス
７４、７６  表面修飾膜
７８  蛋白質を含む溶液の液滴
８０、８０ａ、８０ｂ、８０ｃ  溶液の液滴の表面（液面）
８２  蛋白質分子
８４  蛋白質の結晶
９６  ウエルプレート
９８  容器状凹部（ウエル）
１００  支持台
１０２、１２２  結晶成長用ユニットセル
１０８、１２８  容器セル
１１０、１２０  チップ
１１２、１３０  プレート
１１４、１３２  溶液保持基板
１１６、１３４  側壁形成板
１１８、１３６  側壁形成板の透孔
１３８  密閉ガラス板
１４０  下面ガラス板
１４２  蛋白質を含む溶液の供給管とのジョイント
１４４  溶液供給用流路
１４６  沈殿剤の供給管とのジョイント
【図１】
0003803538.tif 000003
【図２】
0003803538.tif 000004
【図３】
0003803538.tif 000005
【図４】
0003803538.tif 000006
【図５】
0003803538.tif 000007
【図６】
0003803538.tif 000008
【図７】
0003803538.tif 000009
【図８】
0003803538.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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