(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル乳に対してフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤を用いて抽出したＲＮＡ試料を−２０℃〜−８０℃の冷凍保存することを特徴とするＲＮＡの長期保存方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤を用いることを特徴とする、乳からのＲＮＡの抽出及び長期保存方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳房炎とは、乳房内に侵入してきた病原性微生物により発症する乳房組織の炎症を指し、乳量の減少や罹患牛の淘汰など酪農、乳業にとって乳房炎によってもたらされる経済的損失は非常に大きい。乳房炎対策は早期発見、早期治療が原則であり、乳汁による診断法としては体細胞数の計測法、ＰＬテストなどが一般的に用いられている。これらは乳房炎に罹患すると乳中の体細胞数が増加する現象や、乳汁のｐＨがアルカリ側に傾く現象を利用した測定法であるが、ともに個体間や泌乳期による変動が大きい因子であり、乳房炎の早期発見法としては不十分と考えられる。一般に、乳房炎乳は成分の変動が見られるが、特にカゼインについては減少が特徴的である。このことを利用し、過去に乳成分のカゼイン窒素量／総窒素量の値で乳房炎乳を判定する試みがなされたこともあるが、測定値のバラツキが大きく、正確な判定が困難であった。
【０００３】
乳成分の変動は、様々な要因により発生するが、その一つとして乳房炎原因菌が乳管より乳房内に侵入して乳腺上皮細胞に付着することにより、乳腺上皮細胞における乳成分の合成が阻害されるという機構が考えられる。つまり、何らかの方法によって乳腺上皮細胞の乳成分合成能力の変化を測定することにより、乳房炎の早期発見が可能と考えられる。
近年、ポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ法：米国特許第４，６８３，１９５号及び４，６８３，２０２号）を利用した逆転写−ポリメレース連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法が、ｍＲＮＡの転写量を高感度に検出する方法として用いられるようになり、この方法により細胞における発現タンパク質を高感度に定性的、定量的に測定することが可能となった。しかし、診断のために乳腺組織を切除してＲＮＡを抽出することは産業動物である乳牛においては実質上不可能であり、生体を傷つけること無く乳腺上皮細胞のＲＮＡを抽出する方法は過去に報告が無かった。このため、乳からＲＮＡを抽出して検査に用いようとする試みがなされている。乳汁からＲＮＡを抽出するためには、ＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解を最小限度に抑える必要があり、さらに細胞由来のＲＮＡを抽出する場合は、乳汁中の乳腺上皮細胞数が他の細胞と比較して非常に少ないため、乳を遠心分離して細胞の沈殿を得た上でＲＮＡ抽出を行う必要がある。又、ケラチン遺伝子は上皮系の細胞でのみ特異的に発現する細胞骨格遺伝子であるが、様々な種類があり、種及び部位により発現するケラチン遺伝子の種類が異なるため、ウシ乳腺上皮細胞量の指標として用いるプライマーはウシ乳腺上皮細胞で発現するケラチンとハイブリダイズする必要があり、又、ケラチンの発現量は上皮細胞数と相関する必要がある。又、αS1−カゼインは４つの遺伝的変異体の存在が知られており、汎用性のある検出法のためには、何れのαS1−カゼイン変異体ともハイブリダイズするプライマーを用いる必要がある。
【０００４】
このような状況に鑑み、本発明者らは乳汁からＲＮＡを調製する方法、及び得られたＲＮＡを用いた乳房炎の精度の高い検出法を鋭意研究した結果、乳汁を速やかに氷温まで冷却し、緩衝液にて希釈し遠心分離を行い、必要に応じこれを繰り返し、得られた細胞ペレットからＲＮＡを抽出するという、乳汁中から乳腺上皮細胞由来のＲＮＡを調製する方法を見出した。さらに、この方法により調製されたＲＮＡを、細胞数と相関して発現するケラチン遺伝子の一部及びαS1−カゼイン遺伝子の一部を増幅するようにデザインされたそれぞれのプライマーを用いて、逆転写−ポリメレース連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ；Wang et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, pp9717-9721(1989) ）法を行うという、乳から簡便、迅速、且つ高精度に乳房炎の検出を行う方法を見出した。
【０００５】
このような方法を用いて乳房炎を検査する場合、乳からのＤＮＡ、あるいはＲＮＡなどの分離操作が必要になる。従来、乳から核酸を分離するには、乳を遠心分離し上清を捨て、残った体細胞ペレットに核酸抽出試薬を加え、核酸を抽出している。しかし、この方法では生乳の遠心処理が必要であるため、遠心分離装置などの設備の無い場所において搾乳した場合、遠心分離装置などの設備のある場所に輸送する必要が生じる。又、乳中には核酸分解酵素が多量に存在するため、生乳の状態で長時間保持すると、体細胞中のＤＮＡあるいはＲＮＡが分解作用を受け、その後の試験結果を左右する可能性が生じる。さらに、核酸分解酵素の作用を抑制するために乳を凍結させると、体細胞が凍結融解によって破壊されるため、解凍後の核酸分解が懸念される。そこで、搾乳後の生乳を検査に用いるためには、搾乳後５時間以内のものでなければならなかった。又、細胞を得るために乳の希釈、あるいは遠心分離など操作が多く、それに伴い細胞に対する損傷なども起こるとともに、操作の煩雑性が問題であった。
【０００６】
また、乳中の体細胞には乳腺上皮細胞以外に白血球などの血球細胞が多数含まれており、それらの細胞における炎症性因子の遺伝子発現を簡便に検出するための手段があれば、その発現レベルを測定することによって乳房炎などの疾病の診断に用いることも可能となる。さらに、近年体細胞クローン作出技術の急速な発展が見られ、良い形質の雌ウシの選別のために、遺伝子レベルでの判定を行なう必要性が増加すると考えられる。その際、乳中の体細胞から簡便にＲＮＡを抽出し、カゼインなどの乳タンパク質の遺伝子発現レベルを検出することができれば、選別の判断基準を迅速、簡便に効率良く行うことも可能になる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況に鑑み、本発明者らは乳からＲＮＡを抽出する方法及び長期保存するための方法を鋭意研究した結果、フェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤を用いて乳からＲＮＡを抽出することにより、乳から簡便且つ効率良くＲＮＡを抽出し、さらに抽出されたＲＮＡの長期保存を可能とすることを見出した。従って本発明は、フェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出薬剤を用いることを特徴とする、乳からのＲＮＡの抽出及び長期保存方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、フェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤を用いることを特徴とする、乳からのＲＮＡの抽出及び長期保存方法に関する。この方法を用いることにより、乳から迅速、簡便に効率良くＲＮＡを抽出し、さらに抽出されたＲＮＡの長期保存を可能とする方法が提供される。本発明の方法は、特に乳の高感度検査のために用いるＲＮＡを迅速、簡便に効率良く抽出し、さらに抽出されたＲＮＡを長期保存できる方法として有用である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、フェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤を用いることを特徴とする、乳からのＲＮＡの抽出及び長期保存方法に関する。本発明の乳からのＲＮＡの抽出及び長期保存する方法は、サンプル乳にフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤を添加して乳を処理するのみである。この時、サンプル乳に対するフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤の量は、１：１〜１：５、特に１：３にするのが好ましい。この割合より低いとＲＮＡを抽出することができなく、又高いとＲＮＡが変性を受けてしまう。用いるフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤としては、特に限定されないが、特に好ましくはＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（ニッポンジーン社）あるいはＲＮＡｓｏｌ（テル・テスト社）が用いられる。このような薬剤で乳を処理することにより、迅速、簡便且つ効率良くＲＮＡを抽出することができる。さらに、得られたＲＮＡサンプルを速やかに−８０℃に冷凍することにより、３日以上の長期保存が可能となる。この時、冷凍する方法としては特に限定されないが、例えばエタノールにドライアイスを加えて得られる冷エタノールを用いれば、サンプル乳を搾乳後、その場でフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤で処理しＲＮＡを抽出し、すぐにその場で簡便に冷凍することができる。尚、ＲＮＡ抽出用薬剤として本発明で示す組成以外にも様々なものが知られているが、これらを用いて乳からＲＮＡを抽出及び冷凍保存すると、ＲＮＡが分解されてしまい試験用サンプルとして用いることができない。
得られたサンプルからＲＮＡを調製するときは、有機溶媒を用いて遠心分離をするなど、常法により行うことができる。例えば、サンプル乳にクロロホルムを適量添加し、超遠心分離を行う。この時の遠心分離の条件は、通常行われるＲＮＡ抽出における超遠心分離の条件であれば特に限定されないが、４℃、回転数１５，０００ＲＰＭ程度が好ましい。次に、遠心分離されたサンプルの上層を取り、その上層へ等量のイソプロピルアルコールを加え、混合後冷凍庫で保持し、ＲＮＡを析出させる。このサンプルを上記と同様の条件で超遠心分離（３０分間）することにより、サンプル乳のＲＮＡ沈殿を得ることができる。この沈殿へ７０％エタノールを適量添加し、再遠心してＲＮＡ純度を高めることにより、高純度のＲＮＡを得ることができる。
このようにして得られたＲＮＡは、例えば乳牛におけるタンパク質の発現レベルを確認するのに用いられ、これを利用して乳房炎などの診断、あるいはクローン動物を作成する際の選別に用いることができる。
【００１０】
【実施例】
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明する。
【００１１】
【実施例１】
乳からのＲＮＡの抽出
泌乳ホルスタインより清潔なサンプリング容器に乳を２ml程度搾乳した。ピペットを用いてマイクロチューブに２５０μｌ量りとり、サンプル乳とした。このサンプル乳にＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（ニッポンジーン社）を７５０μｌ加え、良く混合した。混合液の状態で４℃、−２０℃、及び−８０℃で保存し、最大３日間保存した。毎日各々のサンプルにクロロホルムを１００μｌ添加して激しく攪拌後室温で１０分間保持し、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心してＲＮＡ層である上層を採取した。採取した上層に等量のイソプロピルアルコールを加え、上下に反転して混合し、冷凍庫にて３０分間保持してＲＮＡを析出させた。その後、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心してＲＮＡの沈殿を得た。ＲＮＡ沈殿に７０％エタノールを１ml添加して１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ＲＮＡ沈殿の純度を高めた。得られたＲＮＡ沈殿を軽く風乾し、蒸留水を５０μｌ添加して溶解し、ＲＮＡ溶液とした。得られたＲＮＡ溶液について、分光光度計を用いて収量、純度の測定を行ない、保存せずにＲＮＡを抽出した無保存区（コントロール）と比較した。その結果を表１に示す。
また、ケラチンとカゼインについてＲＴ−ＰＣＲを行い、サンプルの評価も行なった。その結果を表２に示す。
【００１２】
【表１】
0003781577.tif 000002
【００１３】
【表２】
0003781577.tif 000003
【００１４】
これらの結果より、ＲＮＡの収量にはバラツキが見られ、４℃保存区ではＲＮＡ分解によると思われる収量低下と純度低下が見られた。しかし、冷凍保存区では純度のバラツキはほとんど見られず、サンプル間の有意差は無かった。ＲＴ−ＰＣＲは、４℃保存区では反応が起こらず、ＲＮＡが分解されていることが示唆された。しかし、冷凍保存区では全てのサンプルについてＲＴ−ＰＣＲを行なうことができ、カゼイン発現量／ケラチン発現量の値は全ての保存条件でコントロールである無保存のサンプルとほぼ同じ数値となった。ただし、−２０℃で凍結保存した場合はＲＮＡの部分的な分解に起因すると思われるＲＴ−ＰＣＲ結果の変化が生じ、サンプルとしての使用は−８０℃保存が最も適切と考えられた。即ち、凍結時に−８０℃にて急速に凍結させることにより、少なくとも３日間以上の長期保存が可能であることが明らかとなった。
【００１５】
【発明の効果】
本発明により、フェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＲＮＡ抽出用薬剤を用いることを特徴とする、乳からのＲＮＡの抽出及び長期保存方法が提供される。本発明の方法は、特に乳の高感度検査のために用いるＲＮＡを迅速、簡便に効率良く抽出し、さらに抽出されたＲＮＡを長期保存できる方法として有用である。