(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）が産生するザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番号１）の第１４番目のアラニンが他の中性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号２）を有するザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼ。
【請求項２】
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）が産生するザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番号１）の第１４番目のアラニンがイソロイシン、ロイシン、チロシンまたはトリプトファンに置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号２）を有するザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼ。
【請求項３】
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）が産生するザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番号１）の第１６番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号３）を有するザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼ。
【請求項４】
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）が産生するザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番号１）の第１７番目のメチオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号４）を有するザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼ。
【請求項５】
ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物から、活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする改変ザルコシンオキシダーゼの製造法であって、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）が産生するザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番号１）の第１４番目のアラニンが他の中性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号２）、第１６番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号３）または第１７番目のメチオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号４）を有する改変ザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子である改変ザルコシンオキシダーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は改変ザルコシンオキシダーゼ、すなわちザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である新規なザルコシンオキシダーゼおよび該酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、ザルコシンオキシダーゼ（EC 1.5.3.1）は、臨床的に筋疾患、腎疾患の診断の指標となっている体液中のクレアチン、クレアチニンの測定用酵素として、例えばクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびペルオキシダーゼと組み合わせて使用されている。すなわち、試料中のクレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼを作用させ、生成するクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼを作用させ、さらに生成するザルコシンにザルコシンオキシダーゼを作用させ、かつ、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼおよび発色剤（例えば４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体）により発色させ、その発色強度を吸光度測定して、試料中のクレアチニン量を測定する。
【０００３】
ザルコシンオキシダーゼは、基質であるザルコシンに水および酸素の存在下で作用して、グリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。このようなザルコシンオキシダーゼは、バチルス属（特開昭54-52789号公報）、コリネバクテリウム属（J. Biochem., 89, 599,1981 ）、シリンドロカルボン属（特開昭56-92790号公報）、シュードモナス属（特開昭60-43379号公報）等の細菌が生産することが知られている。とりわけ、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６３７）の生産するザルコシンオキシダーゼは、従来のザルコシンオキシダーゼよりも熱安定性に優れ、かつミカエリス定数、Ｋｍ値の小さい実用的な酵素であることが既に知られている（特開平2-265478号公報）。これらのザルコシンオキシダーゼは活性発現に関して塩素イオンや種々の金属イオン等を要求しない。
【０００４】
本発明者らは、既に、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６より抽出した染色体ＤＮＡよりザルコシンオキシダーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全構造を決定し(Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244,1993) 、また、該ザルコシンオキシダーゼを遺伝子工学的手法によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純度なザルコシンオキシダーゼを安価に大量供給することを可能にしている（特開平6-113840号公報）。
このザルコシンオキシダーゼは塩素イオンや金属イオンを要求しない。
【０００５】
さらに、ザルコシンオキシダーゼはフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD)を補酵素とすることが既に知られており、他のＦＡＤ酵素との比較により、ザルコシンオキシダーゼの補酵素結合に関与する部位が同定されている(Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244,1993) 。
【０００６】
一方、塩素イオンは生体内にあって、ナトリウムイオンと共に塩化ナトリウムとして大部分が細胞外液中に存在し、血漿中の総陰イオンの７０％を占め、他の電解質との相互関係のもとに、水分平衡、浸透圧の調節、酸塩基平衡の調節などに重要な役割を演じている。
塩素イオンの定量法としては、塩素イオン測定用電極の利用が主流である。しかし、電極では生化学自動分析装置への組み込みが困難である。また、イオン特異性の点でも問題があり、生体中に存在するレベルの重炭酸イオン等の他イオンも計測してしまうことはよく知られている。
そこで、哺乳類由来のアミラーゼを用いた酵素法が開発された（特開昭63-126497号公報など）。これは、アミラーゼとカルシウムイオンとの親和性が塩素イオンにより変化する性質を利用した方法であって、イオン特異性の点で電極利用の場合より優れている。しかしながら、その測定原理よりカルシウムイオンの影響を受けることは避けられない。ヒト検体中に存在する唾液及び膵液由来アミラーゼの影響も当然、受けることとなる。
また、哺乳類由来の酵素を用いるため、細菌の系での遺伝子操作技術による大量生産することも困難である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、塩素イオン定量に用いることができる酵素、すなわち塩素イオンに活性発現が依存する酵素であって、細菌の系での遺伝子操作技術による大量生産を実施することができ、検体中の夾雑物質の影響が少ない酵素が望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために、種々検討した結果、補酵素結合に関与する部位のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを造成し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち本発明はザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼである。
【００１０】
また、本発明はザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物から、活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする改変ザルコシンオキシダーゼの製造法である。
【００１１】
【発明の実施態様】
本発明に使用する改変される前のザルコシンオキシダーゼとしては、特に限定されないが、例えばバチルス属由来のザルコシンオキシダーゼ、シュードモナス属由来のザルコシンオキシダーゼなどの細菌由来のザルコシンオキシダーゼが好ましい。
本発明の一具体例としては、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを用いた。アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６由来のザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列を配列表・配列番号１に示す。また、これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を配列表・配列番号５に示す。
【００１２】
上記ザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列中、第１３番目のグリシンから第１８番目のグリシンに至るアミノ酸が補酵素結合に関与する部位として同定されている。このうち、第１３番目、第１５番目、および第１８番目のグリシンはすべてのＦＡＤ酵素で高度に保存されているため、第１４番目、第１６番目および第１７番目のアミノ酸を改変のターゲットとした。
【００１３】
本発明の一実施態様は、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭＰ−１０６３７）が産生するザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番号１）の第１４番目のアラニン、第１６番目のセリンおよび／または第１７番目のメチオニンが他の中性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼである。また該改変ザルコシンオキシダーゼは、配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列の第１４番目のアラニン、第１６番目のセリンおよび／または第１７番目のメチオニンが他の中性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼである。
【００１４】
本発明の具体例としては、配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列の第１４番目のアラニンがイソロイシン、ロイシン、チロシンまたはトリプトファンに置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号２）を有する改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｙ、Ａ１４Ｗがある。
【００１５】
また、別な具体例としては、配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列の第１６番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号３）を有する改変ザルコシンオキシダーゼＳ１６Ｐがある。
さらに別な具体例としては、配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列の第１７番目のメチオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列表・配列番号４）を有する改変ザルコシンオキシダーゼＭ１７Ｇがある。
【００１６】
本発明の改変ザルコシンオキシダーゼは、以下に示す手順で製造することが可能である。
ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常、行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(TransformerTM；Clonetech 製、EXOIII/Mung Bean Deletion Kit; Stratagene 製）の使用、或いはＰＣＲ法の利用が挙げられる。
【００１７】
作成された改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変蛋白質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には pBluescript、ｐＵＣ１８などが使用できる。
【００１８】
宿主微生物としては、例えばエシェリヒア・コリー W3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーJM109 、エシェリヒア・コリー DH5αなどが利用できる。
【００１９】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。
【００２０】
このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変蛋白質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００２１】
培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変蛋白質が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜48時間程度である。培地pHは菌が発育し改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ 6.0〜9.0 程度である。
【００２２】
培養物中の改変蛋白質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般的には常法に従って改変蛋白質が培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、改変蛋白質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変蛋白質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変蛋白質を可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２３】
このようにして得られた改変蛋白質含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過，吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを得ることができる。
【００２４】
本発明の改変ザルコシンオキシダーゼを用いた塩素イオンの測定法としては、該ザルコシンオキシダーゼの酵素反応により生じる物質を直接或いは間接的に測定する方法であれば、如何なる方法も利用することができる。例えば、ザルコシンオキシダーゼの酵素反応により生じる過酸化水素に対し、ペルオキシダーゼの作用によりキノン色素を生成させ、その発色量より定量する方法、酵素反応により生じるホルムアルデヒドにホルムアルデヒド脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤＨを紫外部の吸光度により測定する方法などがある。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例中、酵素特性を示す指標であるミハエル数Ｋｍ、kcatを求める際のオキシダーゼ活性の測定は以下のように行なった。
すなわち、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）または０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）または１０ｍＭ塩化カリウム含有０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、任意の濃度の基質（ザルコシン）、０．４７ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、２．０ｍＭフェノール、４．５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ中で酵素を３７℃，１０分反応させ、５００ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００２６】
実施例１  ザルコシンオキシダーゼの改変
ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有する組換え体プラスミドｐＳＡＯＥＰ３（図１参照）を Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993)に記載の方法に従い、以下に示すようにして調製した。
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０６３７）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を１００ｍｌの２×ＹＴ培地（１．６％ポリペプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム（ｐＨ７．２））で３７℃一晩振盪培養後、遠心(8000rpm, 10分) により集菌した。１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含んだ溶液で菌体を洗浄した後、２０％シュークロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）を含んだ溶液５ｍｌに懸濁させ、０．５ｍｌのリゾチーム溶液(100mg/ml)を加えて、３７℃、３０分間保温した。次いで１１ｍｌの１％ラウロイルサルコシン酸、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９．６）を含む溶液を加えた。この懸濁液に臭化エチジウム溶液を０．５％、塩化セシウムを約１００％加え、撹拌混合し、５５，０００ｒｐｍ、２０時間の超遠心でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡは、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ溶液（ＴＥ）で透析し、精製ＤＮＡ標品とした。
【００２７】
精製ＤＮＡ標品１μｇを制限酵素 Sau3AI （東洋紡製）で部分分解反応させ、３ｋｂｐ以上の断片に分解した後、SalIII（東洋紡製）で切断したｐＵＣ１８  ０．５μｇと M.G.Loftus らのＢＡＣＫＦＩＬＬＩＮＧ法（Biotechniques Vol12,No.2(1992)) に従い、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１ユニットで１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡは Hanahanの方法により作成したエシェリヒア・コリーJM109のコンピテントセルを用いて形質転換した。使用したＤＮＡ１μg 当たり約 1×106 個の形質転換体のコロニーが得られた。得られたコロニーは５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５％ザルコシン、０．００５％パラロースアニリンおよび０．０２５％ソディウムハイドロジェンサルファイト入りＬ培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム）で３７℃、１８時間培養し、赤色コロニーを指標にザルコシンオキシダーゼ遺伝子の入った組換えＤＮＡをスクリーニングした。
【００２８】
その結果、約１，０００個のコロニーのうち１株の割合で赤色を示すコロニーを得た。この中の１株が保有するプラスミドには、約８．７ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＳＡＯ１とした。次いでｐＳＡＯ１より挿入ＤＮＡ断片を種々の制限酵素により切断してｐＵＣ１８にサブクローニングし、約１．７ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を有するｐＳＡ０ＥＰ３を得た。
配列表の配列番号５にｐＳＡＯＥＰ３の挿入ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を、配列表の配列番号１にｐＳＡＯＥＰ３の挿入ＤＮＡ断片中にコードされているザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列をそれぞれ記載している。
【００２９】
該組換えプラスミドｐＳＡＯＥＰ３を基に、配列表の配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５の１０種のオリゴヌクレオチドとＤＮＡ中の塩基を変換するキットである TransformerTM（Clonetech 製）を用い、TransformerTM のプロトコールに従い変異処理操作を行った。その結果、配列表の配列番号１記載の第１４番目のアラニンがバリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸、リジンにそれぞれ置換された改変蛋白質Ａ１４Ｖ、Ａ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｙ、Ａ１４Ｗ、Ａ１４Ｄ、Ａ１４Ｋ（配列表の配列番号２記載）、第１６番目のセリンがプロリンに置換された改変蛋白質Ｓ１６Ｐ（配列表の配列番号３記載）、第１７番目のメチオニンがグリシンに置換された改変蛋白質Ｍ１７Ｇ（配列表の配列番号４記載）、およびＳ１６ＰとＭ１７Ｇの二重変異である改変蛋白質Ｓ１６Ｐ＋Ｍ１７Ｇの合計１０種の改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを保持するプラスミドをそれぞれ作成した。
【００３０】
それぞれの改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを種々の制限酵素で切断してサブクローンを調製し、常法に従い、SEQUENING PRO 7-deaza-dGTP kit（東洋紡製）を用いて塩基配列を決定し、改変されていることを確認した。
【００３１】
それぞれの改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを保持する組換え体プラスミドでエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換し、形質転換体をそれぞれ得た。
【００３２】
実施例２  形質転換体の培養と改変蛋白質の精製
２×ＹＴ培地（１．６％ポリペプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム（ｐＨ７．２））５０ｍｌを５００ｍｌフラスコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い放冷後、別途無菌濾過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）を０．１％添加した。この培地に上記と同一組成の培地で予め３７℃で１８時間振盪培養した形質転換体の培養液１ｍｌを接種し、３７℃で通気撹拌培養した。
培養液より改変蛋白質を、Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993) 記載のザルコシンオキシダーゼの精製法に従い、超音波破砕、除核酸処理、硫酸アンモニウム塩析、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈｄｅｘカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの工程を順次、実施し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて単一のバンドを形成するまで精製した。
【００３３】
実施例３  改変蛋白質の評価
精製された各改変ザルコシンオキシダーゼと野生型ザルコシンオキシダーゼの、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）または１０ｍＭ塩化カリウム含有0.1Mリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）におけるミハエル数Ｋｍ、ｋｃａｔ測定値を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0003743535.tif 000002
【００３５】
表１から明らかなように、Ａ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｙ、Ａ１４Ｗ、Ｓ１６Ｐ、Ｍ１７Ｇの特性は、該酵素の活性発現が塩素イオン濃度に依存的であることを示している。
酵素の反応性を示す指標であるＫｍ、ｋｃａｔを見ると、野生型ザルコシンオキシダーゼは活性測定系中の塩素イオンの有無にかかわらず、同等の値を示すが、Ａ１４Ｖは塩素イオン存在下で非存在下の約１．３倍、Ａ１４Ｉは塩素イオン存在下で非存在下の約３．７倍、Ａ１４Ｌは塩素イオン存在下で非存在下の約１３０倍、Ａ１４Ｙは塩素イオン存在下で非存在下の約１８０倍、Ａ１４Ｗは塩素イオン存在下で非存在下の約３４倍、Ｓ１６Ｐは塩素イオン存在下で非存在下の約８８倍、Ｍ１７Ｇは塩素イオン存在下で非存在下の約４６００倍であった。
すなわち、改変蛋白質はザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であることが明らかとなった。
【００３６】
参考例１  改変ザルコシンオキシダーゼを用いた塩素イオンの測定
検体中の塩素イオン濃度を、下記試薬を用いて下記測定法により測定した。
試薬
第１試薬（Ｒ１）
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）            ０．１Ｍ
４−アミノアンチピリン                        ０．０１２％
フェノール                                    ０．０２３％
ペルオキシダーゼ                              ６．３Ｕ／ｍｌ
ザルコシン                                    ０．１Ｍ
第２試薬（Ｒ２）
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）            ２０ｍＭ
改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｌ            １Ｕ／ｍｌ
【００３７】
測定方法
ＫＣｌ水溶液３００ｍＭまたはＮａＣｌ水溶液３００ｍＭの１０段階希釈液を試料として、各試料を５μｌ採取し、これに上記第１試薬（Ｒ１）３１０μｌを加えて、３７℃で２分間加温後、上記第２試薬（Ｒ２）８５μｌを加えて、３７℃で３分間反応させて、５００ｎｍにおける吸光度変化を求めた。なお、ブランクは塩素イオン含有被検液の代わりに蒸留水を用いた。
塩濃度と吸光度との関係（希釈直線性）を図２，３に示す。図２はＫＣｌ、図３はＮａＣｌの場合を示す。
図２，３から明らかなように、活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを用いる塩素イオンの定量法により、短時間に正確かつ簡単に塩素イオンを測定することが可能となる。
【００３８】
参考例２  他イオンの影響
実施例１の塩素イオンの測定系における他イオンの影響を調査した。表１に示すように、検体（ＫＣｌ，１００ｍＭ水溶液）に種々のイオンを含有させ、塩素イオン濃度を測定したところ、カルシウムイオンを含めて、他のイオンの測定値への影響は見られなかった。
【００３９】
【表２】
0003743535.tif 000003
【００４０】
【発明の効果】
本発明によって、ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を蛋白工学的手法を用いて改変し、活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを供給することが可能となった。本発明の改変ザルコシンオキシダーゼは、細菌の系での遺伝子操作技術による大量生産を実施することができる。また、該ザルコシンオキシダーゼでは他のイオンに対する依存性が少なく、検体中に存在するものではない。したがって、検体中の塩素イオン量を正確、迅速に測定するために使用することができる。
【００４１】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：389 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter SP.)株名：ＴＥ１８２６配列Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser   1               5                  10                  15     Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr              20                  25                  30         Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His          35                  40                  45             Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr      50                  55                  60                 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys  65                  70                  75                  80 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly                  85                  90                  95     Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys             100                 105                 110         Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys         115                 120                 125             Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu     130                 135                 140                 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145                 150                 155                 160 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val                 165                 170                 175     Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr             180                 185                 190         Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn         195                 200                 205             Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr     210                 215                 220                 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225                 230                 235                 240 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr                 245                 250                 255     Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His             260                 265                 270         Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly         275                 280                 285             Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr     290                 295                 300                 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305                 310                 315                 320 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe                 325                 330                 335     Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe             340                 345                 350         Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys         355                 360                 365             Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys     370                 375                 380                 Gln Lys Glu Thr Ile 385
【００４２】
配列番号：２配列の長さ：389 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列の特徴他の情報：Xaaはアラニン以外のアミノ酸配列Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Xaa Gly Ser   1               5                  10                  15     Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr              20                  25                  30         Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His          35                  40                  45             Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr      50                  55                  60                 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys  65                  70                  75                  80 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly                  85                  90                  95     Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys             100                 105                 110         Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys         115                 120                 125             Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu     130                 135                 140                 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145                 150                 155                 160 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val                 165                 170                 175     Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr             180                 185                 190         Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn         195                 200                 205             Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr     210                 215                 220                 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225                 230                 235                 240 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr                 245                 250                 255     Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His             260                 265                 270         Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly         275                 280                 285             Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr     290                 295                 300                 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305                 310                 315                 320 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe                 325                 330                 335     Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe             340                 345                 350         Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys         355                 360                 365             Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys     370                 375                 380                 Gln Lys Glu Thr Ile 385
【００４３】
配列番号：３配列の長さ：389 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列の特徴他の情報：Xaaはセリン以外のアミノ酸配列Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Xaa   1               5                  10                  15     Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr              20                  25                  30         Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His          35                  40                  45             Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr      50                  55                  60                 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys  65                  70                  75                  80 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly                  85                  90                  95     Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys             100                 105                 110         Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys         115                 120                 125             Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu     130                 135                 140                 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145                 150                 155                 160 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val                 165                 170                 175     Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr             180                 185                 190         Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn         195                 200                 205             Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr     210                 215                 220                 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225                 230                 235                 240 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr                 245                 250                 255     Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His             260                 265                 270         Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly         275                 280                 285             Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr     290                 295                 300                 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305                 310                 315                 320 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe                 325                 330                 335     Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe             340                 345                 350         Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys         355                 360                 365             Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys     370                 375                 380                 Gln Lys Glu Thr Ile 385
【００４４】
配列番号：４配列の長さ：389 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列の特徴他の情報：Xaaはメチオニン以外のアミノ酸配列Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser   1               5                  10                  15     Xaa Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr              20                  25                  30         Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His          35                  40                  45             Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr      50                  55                  60                 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys  65                  70                  75                  80 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly                  85                  90                  95     Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys             100                 105                 110         Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys         115                 120                 125             Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu     130                 135                 140                 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145                 150                 155                 160 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val                 165                 170                 175     Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr             180                 185                 190         Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn         195                 200                 205             Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr     210                 215                 220                 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225                 230                 235                 240 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr                 245                 250                 255     Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His             260                 265                 270         Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly         275                 280                 285             Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr     290                 295                 300                 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305                 310                 315                 320 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe                 325                 330                 335     Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe             340                 345                 350         Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys         355                 360                 365             Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys     370                 375                 380                 Gln Lys Glu Thr Ile 385
【００４５】
配列番号：５配列の長さ：1670配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic cDNA起源生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter SP.)株名：ＴＥ１８２６配列CTGCAGTTCT TCCTCCAGCT TTTGAATCCT CACGGTAACA TAAGATTGAA CATAATTTAA   60ACTTTTGGCC GCCTTTGAAA CGCTGCCATA TTCAACTACC TTTTGAAAAA TCTGCAAATC  120TTTAATTTCC AAGTATAATC ACTCCCAAAA CGTTCTTTTA CTACTAGCAC TAGAATATTT  180CTAAAAGTGA TAGCTGCTAT CACTTTTAAG CATTTTACAT GATGGCCAAT AGGCCGTATG  240ATGTAAATAG ATAATTAAGA AAATTCAAAT TACCTGTTTG AAAAAGGAGA GGAAACA     297ATG AGT ATT AAA AAA GAT TAT GAT GTA ATT GTG GTT GGC GCT GGT TCC    345Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser  1               5                  10                  15 ATG GGA ATG GCA GCT GGG TAC TAT CTG TCT AAA CAA GGT GTT AAA ACA    393Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr             20                  25                  30 CTA TTG GTA GAT TCA TTT CAT CCT CCC CAT ACA AAT GGC AGC CAT CAT    441Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His         35                  40                  45 GGC GAT ACA CGG ATC ATT CGT CAC GCA TAT GGC GAA GGA AGA GAG TAT    489Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr     50                  55                  60 GTA CCG TTT GCC TTG AGA GCA CAA GAG TTA TGG TAT GAA TTA GAA AAG    537Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65                  70                  75                  80 GAG ACT CAT CAT AAA ATA TTT ACA AAA ACA GGT GTA CTC GTT TTT GGT    585Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly                 85                  90                  95 CCT AAA GGA GAA GCT CCT TTC GTT GCC GAA ACA ATG GAA GCC GCA AAG    633Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys            100                 105                 110 GAA CAT TCA TTA GAT GTT GAT TTA CTA GAA GGA AGT GAA ATA AAT AAG    681Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys        115                 120                 125 CGT TGG CCA GGT GTA ACG GTT CCT GAG AAT TAT AAT GCT ATT TTT GAA    729Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu    130                 135                 140 AAA AAT TCT GGT GTC TTA TTT AGT GAA AAT TGT ATT CGC GCT TAC CGT    777Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg145                 150                 155                 160 GAA TTG GCG GAA GCA AAT GGT GCG AAA GTT CTA ACG TAC ACA CCC GTT    825Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val                165                 170                 175 GAA GAT TTC GAG ATT GCC GAG GAC TTC GTC AAA ATC CAA ACC GCC TAT    873Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr            180                 185                 190 GGC TCC TTT ACA GCC AGT AAA TTA ATT GTT AGC ATG GGC GCT TGG AAT    921Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn        195                 200                 205 AGC AAA CTG CTA TCA AAA TTA AAT ATT GAA ATC CCA TTG CAG CCA TAC    969Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr    210                 215                 220 CGT CAA GTT GTC GGA TTC TTC GAA TGT GAT GAA AAA AAA TAT AGC AAT   1017Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn225                 230                 235                 240 ACA CAT GGT TAT CCG GCG TTC ATG GTC GAA GTC CCA ACT GGC ATC TAT   1065Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr                245                 250                 255 TAC GGA TTT CCA AGC TTC GGC GGC TGC GGC TTG AAA ATA GGC TAT CAT   1113Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His            260                 265                 270 ACG TAT GGT CAA AAA ATC GAT CCA GAT ACG ATT AAT CGT GAA TTT GGT   1161Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly        275                 280                 285 ATT TAC CCG GAG GAT GAA GGG AAT ATT CGC AAA TTC CTG GAA ACA TAT   1209Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr    290                 295                 300 ATG CCG GGA GCA ACC GGC GAA TTA AAA AGT GGG GCA GTT TGC ATG TAC   1257Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr305                 310                 315                 320 ACA AAA ACA CCT GAT GAG CAT TTC GTG ATT GAT TTA CAT CCT CAA TTC   1305Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe                325                 330                 335 TCG AAT GTC GCG ATT GCA GCC GGA TTC TCC GGA CAT GGG TTT AAA TTC   1353Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe            340                 345                 350 TCA AGC GTA GTT GGT GAA ACA TTA AGT CAA TTA GCT GTA ACC GGT AAA   1401Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys        355                 360                 365 ACA GAA CAC GAT ATT TCC ATC TTT TCA ATC AAT CGC CCT GCT TTA AAA   1449Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys    370                 375                 380 CAA AAA GAA ACG ATT TAAAAACGCA AGCAAGCCGT ACATAAATTT CGATAGATAT   1504Gln Lys Glu Thr Ile385TATGTACGGC TTACTTTATT TACAACTTAA AAATCTGCAT ATCAATCCTG TCCCTCTACT 1564GATTGAAGCA CAAACTGTAC TTGAACGGCT TTTTTATTAA CTTGTAACGA TAACAGGAAC 1624GCTAAAATAA GAAGACCGCT GCATAAGAAT AGTACGGGAG GAATTC                1670
【００４６】
配列番号：６配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列AAAAGATTAT GATGTAATTG TGGTTGGCGT TGGTTCCATG GGAATGGCAG CTGGGTACT   59
【００４７】
配列番号：７配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列AAAAGATTAT GATGTAATTG TGGTTGGCAT TGGTTCCATG GGAATGGCAG CTGGGTACT   59
【００４８】
配列番号：８配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列AAAAGATTAT GATGTAATTG TGGTTGGCCT TGGTTCCATG GGAATGGCAG CTGGGTACT   59
【００４９】
配列番号：９配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列AAAAGATTAT GATGTAATTG TGGTTGGCTA TGGTTCCATG GGAATGGCAG CTGGGTACT   59
【００５０】
配列番号：１０配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列AAAAGATTAT GATGTAATTG TGGTTGGCTG GGGTTCCATG GGAATGGCAG CTGGGTACT   59
【００５１】
配列番号：１１配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列AAAAGATTAT GATGTAATTG TGGTTGGCGA TGGTTCCATG GGAATGGCAG CTGGGTACT   59
【００５２】
配列番号：１２配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列AAAAGATTAT GATGTAATTG TGGTTGGCAA AGGTTCCATG GGAATGGCAG CTGGGTACT   59
【００５３】
配列番号：１３配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ATTATGATGT AATTGTGGTT GGCGCTGGTC CCATGGGAAT GGCAGCTGGG TACTATCTG   59
【００５４】
配列番号：１４配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列GATGTAATTG TGGTTGGCGC TGGTTCCGGA GGAATGGCAG CTGGGTACTA TCTGTCTAA   59
【００５５】
配列番号：１５配列の長さ：59配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列GATGTAATTG TGGTTGGCGC TGGTCCCGGA GGAATGGCAG CTGGGTACTA TCTGTCTAA   59
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミド pSAOEP3の制限酵素地図を示す。
【図２】塩素イオン（ＫＣｌ）測定の希釈直線性を示す。
【図３】塩素イオン（ＮａＣｌ）測定の希釈直線性を示す。
【図１】
0003743535.tif 000004
【図２】
0003743535.tif 000005
【図３】
0003743535.tif 000006