(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基番号３２０〜２４６１記載のヌクレオチド配列からなることを特徴とする、ＦｒｐＢタンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２の塩基番号１６０〜２３０１記載のヌクレオチド配列からなることを特徴とする、ＦｒｐＢタンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
ＦｒｐＢタンパク質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＦｒｐＢである請求項１または２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された核酸分子でコードされたポリペプチドまたは当該ポリペプチドのアミノ酸配列と１つまたは数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列からなり、ＦｒｐＢタンパク質と同等の抗原性を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項２に記載の単離された核酸分子でコードされたポリペプチドまたは当該ポリペプチドのアミノ酸配列と１つまたは数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列からなり、ＦｒｐＢタンパク質と同等の抗原性を有するポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項７】
核酸分子がプラスミドにリンクされている請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
宿主中に請求項６に記載のベクターを包含し、ＦｒｐＢ抗原性ポリペプチドを産生するための宿主ベクターシステム。
【請求項９】
宿主がバクテリア細胞または動物細胞である請求項８に記載の宿主ベクターシステム。
【請求項１０】
請求項８に記載の宿主ベクターシステムをポリペプチドを産生させる好適な条件下で増殖させ、産生されたポリペプチドを回収することを特徴とする、ＦｒｐＢ抗原性ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
サンプル中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに特異的な抗体を検出する方法であって、
（ａ）サンプル中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに特異的な抗体と、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された核酸配列にコードされたＦｒｐＢタンパク質との間に複合体を形成するような条件下でサンプルと当該ＦｒｐＢタンパク質とを接触させ；そして
（ｂ）そのようにして形成されたすべての複合体を検出し；
それによってＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに特異的な抗体を検出する方法。
【請求項１２】
ＦｒｐＢタンパク質が検出可能マーカーで標識されている請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、米国公衆衛生総局の助成金Ｕ０１Ａ１３１４９６号、および米国国立衛生研究所の遺伝学カリキュラム・トレーニング助成金５Ｔ３２ＧＭ０７０９２号の支援による研究の一環としてなされたものである。ＵＣＬＡのタンパク質マイクロ配列決定施設において行われたタンパク質配列決定は米国国立衛生研究所のＢＲＳ設備共有助成金（ＢＲＳ  ＳｈａｒｅｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ＩＳ１０ＲＲ０５５５４−０１）の補助を受けて行なわれたものである。米国政府は本発明について一定の権利を有する。
発明の背景
ＦｒｐＢは淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ）に共通する７０ｋＤの鉄により調節される主要な外膜タンパク質であるとされている（１６、２１）。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの鉄摂取システムは同様である（３、１７）。
従来の研究において、ＦｒｐＢは表面露出性で、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて免疫原性であることが示されている（１、１６、４１）。ポリクローナルおよびいくつかのモノクローナル抗ＦｒｐＢ抗体は試験したほぼすべての淋菌および髄膜炎菌単離物のウエスタンブロットにおいて変性タンパク質を認識した（１６および本発明）。髄膜炎菌ＦｒｐＢに対するその他のモノクローナル抗体は殺菌性があり、かつ株特異的であった（４１）。しかしながら、ＦｒｐＢのサイズはよく保存されているようである。
ＦｒｐＢはワクチンとして有用であるが、これはその表面の露出（１、１６、４１）、部分的な抗原保存（８、１６）、ならびに殺菌性抗体による攻撃に対する感受性（４１）のためである。本発明のＦｒｐＢ遺伝子のクローニングおよび配列によって、哺乳類におけるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対するワクチンの生産が可能となった。
発明の概要
本発明は、ＦｒｐＢタンパク質を含むアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子を提供する。
本発明はまた、本発明の単離された核酸によってコードされるＦｒｐＢタンパク質と薬学的に許容される担体を含み、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる哺乳類の感染を防止するワクチン組成物の製造法も提供する。
本発明はさらに、本発明の単離された核酸によってコードされるＦｒｐＢタンパク質と薬学的に許容される担体を含み、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染から哺乳類を守ることができるワクチン組成物も提供する。
加えて、本発明は本発明の単離された核酸配列によってコードされるＦｒｐＢタンパク質のエピトープに対する抗体も提供する。
本発明はまた、サンプル中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに特異的な抗体を検出する方法であって、サンプルに本発明の単離された核酸配列によってコードされるＦｒｐＢタンパク質を、ポリペプチドと抗体との間に複合体を形成するような条件下で接触させ、そしてそのようにして形成された複合体を検出することを特徴とする方法も提供する。
さらに本発明は、本発明の抗体を哺乳類に投与してＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに感染した哺乳類を治療する方法であって、当該抗体がＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＦｒｐＢタンパク質のエピトープに対するものであることを特徴とするものである。
【図面の簡単な説明】
図１にはオリゴヌクレオチドＭＢ．３が３’から５’まで示されており、非コード鎖に対応する。本図に示したｆｒｐＢ配列は寄託番号Ｕ１３９３０としてＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
図２はｆｒｐＢクローンの制限地図である。ｆｒｐＢ ＯＲＦの位置は物理的マップの下に白枠ボックスで示している。関連クローニング部位だけをＣ：Ｃｌａ Ｉ；Ｄ：Ｄｒａ Ｉ；Ｅ：ＥｃｏＲ Ｉ；Ｍ：Ｍｌｕ Ｉで示した。成熟タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端由来のオリゴヌクレオチドＭＢ３の位置も示した。
図３は、菌株ＦＡ１９からの淋菌ｆｒｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。推定アミノ酸配列の一文字記号をこのヌクレオチド配列の下に示した。星＊印は終止コドンを示す。ヌクレオチド配列の下の棒線は推定Ｆｕｒ ｂｏｘを示す。推定の−１０および−３５配列は四角枠で囲んだ。ＲＢＳはリボソーム結合部位を示す。黒三角はΩ挿入のＢｇｌ Ｉ部位を示す。縦矢印はシグナル・ペプチダーゼＩ開列部位を示す。逆向きの水平矢印は逆方向反復配列を示す。
図４は、ＦＡ１９およびＦＡ６８０７ＤＮＡのサザンブロット分析を示す。パネルＡはｐＵＮＣＨ３１９特異性フラグメントでプローブしたもの。パネルＢはΩフラグメントでプローブしたもの。レーン１はＨｉｎｃ IIで消化したＦＡ１９ＤＮＡ、レーン２はＨｉｎｃ II消化したＦＡ６８０７ＤＮＡを含む。Ωフラグメントは２ｋｂである。分子量マーカーはキロベース（ｋＢ）で示されている。
図５は、ＦＡ１９およびＦＡ６８０７膜のウエスタンブロット分析を示す。ブロットを抗ＦｒｐＢモノクローナル抗体でプローブした。Ｗ．６レーンの１および２はＦＡ１９；レーン３および４はＦＡ６８０７である。レーン１および３は鉄を十分量含む培養物から調製した全膜を含み；レーン２および４は鉄欠乏培養物からの全膜を含む。分子量標準のおおよその位置を左側にキロダルトンで示した。
図６は種々の濃度のアエロバクチンの存在下のＣＤＭ中でのＦＡ１９およびＦＡ６８０７の増殖を示す。グラフＡはＦＡ１９；グラフＢはＦＡ６８０７である。（▲）１００ｕＭクエン酸塩；（■）２．５ｕＭ Ｔｆ；（△）３ｕＭアエロバクチン；（●）１ｕＭアエロバクチン；（□）０．３ｕＭアエロバクチン；ならびに（○）鉄源なし。
図７は55Ｆｅ−ヘムおよび55Ｆｅ−Ｔｆからの55Ｆｅ取り込みを示す。黒カラムはヘムからの平均取り込み量を示し、白カラムはＴｆからの平均取り込み量を示す。ＦＡ１９の平均取り込み実験から１００％の取り込みが測定された。標準偏差は誤差棒線で示されている。遺伝子型はＦＡ１９野生型、ＦＡ６８０７（ｆｒｐＢ）、およびＦＡ６７４７（ｔｐｂＡ）である。
図８はｐＡＣＹＣ１８４中へのｆｒｐＢの再構築を示す。関連部位は、Ｂ：ＢａｍＨ Ｉ；Ｃ：Ｃｌａ Ｉ；Ｄ：Ｄｒａ Ｉ；Ｍ：Ｍｌｕ Ｉ；およびＸ：Ｘｂａ Ｉである。黒太矢印はクロラムフェニフコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｍ）、分離された矢印はテトラサイクリン抵抗性遺伝子（Ｔｃ）、黒棒は複製のｐＡＣＹＣ１８４オリジン（Ｏｒｉ）を示し、白枠ボックスはｆｒｐＢコード配列を示し、白枠矢印は全ｆｒｐＢコード領域を示し、白箱はｆｒｐＢのＤＮＡ５’および３’を示し、ｆｒｐＢ’およびｆｒｐＢ″は部分的ｆｒｐＢコード配列を示す。
図９はヘム・プレート上でのＲＫ１０６５（ｐＡＣＹＣ１８４）およびＲＫ１０６５（ｐＵＮＣＨ３３１）の増殖を示す。プレート１はヘムだけを含む。プレート２はヘムとｄ−アミノレブリン酸を含む。ＡはＲＫ１０６５（ｐＡＣＹＣ１８４）であり、ＢはＲＫ１０６５（ｐＵＮＣＨ３３１）。抗菌ディスクはＥ：エリスロマイシン；Ｎ：ノボバイオシン；およびＲ：リファンピシンである。
図１０は菌株ＦＡ１０９０からの淋菌ｆｒｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。導き出したアミノ酸配列の３文字記号をヌクレオチド配列の下に示した。３つの星印は終止コドンを示す。
発明の詳細な説明
本発明はＦｒｐＢタンパク質の少なくとも一部分を包含するアミノ酸配列をコードする単離核酸分子を提供する。本発明の一実施態様においては、この単離核酸分子はＤＮＡである。本発明の別の実施態様においては、本単離核酸分子はｃＤＮＡまたはＲＮＡである。本発明の好ましい実施態様においては、単離核酸分子には図３に示した核酸配列の少なくとも一部分と同一または実質的に同一の配列を包含する。さらに好ましい実施態様においては、単離核酸分子には図３に示されたヌクレオチド配列と同一の配列を包含する。
本発明はまた、上記の単離核酸分子によりコードされたアミノ酸配列を包含するＦｒｐＢタンパク質も提供する。好ましくは、このアミノ酸配列は抗原性、さらに好ましくは免疫原性ＦｒｐＢをコードするものである。本明細書において抗原性とは、哺乳類中に特異性抗体を誘発するＦｒｐＢを意味し、また免疫原性とは哺乳類において免疫応答を誘発するＦｒｐＢを意味する。
本明細書において、“ＦｒｐＢ”という用語は鉄により調節されるタンパク質Ｂを意味し、天然ＦｒｐＢのアミノ酸配列ならびにそれらの抗原性フラグメントと同一または実質的に同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをすべて含む。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの様々な菌株中のＦｒｐＢ核酸およびアミノ酸配列は相同であるが、その配列にはわずかな差異が見られる。たとえば、図３および図１０にそれぞれ示した相同菌株ＦＡ１９およびＦＡ１０９０の間に核酸およびアミノ酸配列にわずかな差異がある。
さらに、ＦｒｐＢには天然のＦｒｐＢとＣＯＯＨ末端またはＮＨ2末端のいずれかまたは両方に点変異、または付加あるいは欠失などによって内部的に異なるアミノ酸配列を有する同等の抗原性ポリペプチド類も含む。アミノ酸配列が他の配列と実質的に同一であるが、１つまたはそれ以上の置換、付加および／または欠失によって配列が異なるものも同等の配列と見なされる。好ましくは、本発明のタンパク質から、２５％以下の、さらに好ましくは１０％以下の、そして最も好ましくは５％以下の数のアミノ酸残基が置換、付加、または欠失したものが望ましい。
たとえば、配列中のアミノ酸を同等のアミノ酸で置換したものが知られている。一般的に同等と見なされるアミノ酸のグループは：
（ａ）  Ａｌａ（Ａ）Ｓｅｒ（Ｓ）Ｔｈｒ（Ｔ）Ｐｒｏ（Ｐ）Ｇｌｙ（Ｇ）；
（ｂ）  Ａｓｎ（Ｎ）Ａｓｐ（Ｄ）Ｇｌｕ（Ｅ）Ｇｌｎ（Ｑ）；
（ｃ）  Ｈｉｓ（Ｈ）Ａｒｇ（Ｒ）Ｌｙｓ（Ｋ）；
（ｄ）  Ｍｅｔ（Ｍ）Ｌｅｕ（Ｌ）ＩＩｅ（Ｉ）Ｖａｌ（Ｖ）；及び
（ｅ）  Ｐｈｅ（Ｆ）Ｔｙｒ（Ｙ）Ｔｒｐ（Ｗ）である。
そのようなＦｒｐＢ同等物には、哺乳類において天然ＦｒｐＢに匹敵する免疫応答を誘発する類似物が含まれる。さらに、それら同等物はそれらに対応するＦｒｐＢタンパク質と免疫的に交差反応性がある。
ＦｒｐＢタンパク質フラグメントは好ましくは抗原エピトープを規定するのに十分なアミノ酸残基を含むものが望ましい。このフラグメントは、たとえばエピトープだけをコードするミニ遺伝子である。既知の免疫原性タンパク質から免疫原性フラグメントを単離および検知する方法はサルフェルド[Salfeld]ら（７２）およびイソーラ[Isola]ら（７３）に記述されている。
もしフラグメントが適当なエピトープを規定するものの、免疫原性が不十分な場合は、キャリヤー分子に結合することができる。好適なキャリヤー分子としては、カサガイ・ヘモシアニン、Ｉｇ配列、ＴｒｐＥならびにヒトまたはウシ血清アルブミンなどがある。結合は当分野で公知の方法により行われる。そのような方法の１つは、該当フラグメントのシステイン残基をキャリヤー分子のシステイン残基に結合させる方法である。
好ましい実施態様においては、ＦＡ１９のＦｒｐＢは、ＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの鉄レギュロンの一部分である約７３ｋＤ外膜ＦｒｐＢタンパク質またはそれと同等のものである。２つのアミノ酸配列が実質的に相同であるかどうかの決定は、ピアソン[Pearson]とリップマン[Lipman]（７４）によるＦＡＳＴＡサーチに基づいて行なわれる。
本発明のＦｒｐＢは当分野で公知の方法により調製される。そのような方法としては、たとえば（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから直接ＦｒｐＢを単離する方法；および（ｂ）リコンビナントＦｒｐＢを作るためにＦｒｐＢをコードする本発明の核酸分子を使用する方法がある。
（ａ）ＦｒｐＢの直接単離：
ＦｒｐＢは当分野で公知の方法によりＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから直接単離することができる。まず、淋菌または髄膜炎菌の外膜を公知の方法により単離して調製する。ウエスト[West]とスパーリング[Sparling]（７５）ならびにシュリバース[Schryvers]とモリス[Morris]（７６）により記述されている方法が好適である。
ＦｒｐＢタンパク質の単離膜またはフラグメントを、分散剤の添加などの公知の方法により溶解させる。一般に使用されている分散剤としてはオクチル−Ｂ−グルコシド、チャプス[Chaps]、ツビッタージェント[Zwittergent]３、１４またはトライトン[Triton]−Ｘなどがある。膜タンパク質の溶解性を増強するための分散剤の使用についてはジョーンズ[Jones]ら（７７）、ヘレニウス[Helenius]ら（７８）、ならびにエジェルメランド[Hjelmeland]とクランバック[Chrambach]（７９）に記述されている。
ＦｒｐＢタンパク質またはフラグメントは常法により可溶化した膜から単離する。好適な方法としては沈降法およびイオン交換、疎水性反応ならびにゲルろ過などの液体クロマトグラフ法などがある。たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（８０）およびＳｃｏｐｅｓ（８１）を参照。
精製物質はまた、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にタンパク質またはフラグメントを分離し、目的のバンドを切り取り、当分野で公知の方法によりポリアクリルアミドマトリックスからタンパク質を電離することにより得ることもできる。分散したＳＤＳは公知の方法、たとえばピアース[Pierce]社のＥｘｔｒａｃｔｉ−Ｇｅｌカラムなどの適切なカラムを使用した透析などの方法でタンパク質から分離することができる。
（ｂ）本発明の核酸分子を使用してＦｒｐＢを作る方法：
あるいは、ＦｒｐＢを調製するために当分野で公知のリコンビナント法を使用することができる。たとえば、ＦｒｐＢの少なくとも一部分をコードする本発明の単離または合成した核酸分子からＦｒｐＢを調製することができるが、この場合は好適な宿主にＤＮＡをクローニングし；宿主中にＤＮＡを発現させ；そしてＦｒｐＢを採取する（サンブルック[Sambrook]ら（８２）参照）。
さらに核酸単離の標準法を用いて、既に米国基準株保存機関（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）に寄託されている菌株からＤＮＡを得ることができる。ＦＡ１０９０（ＡＴＣＣ寄託番号）はブダペスト条約に基づいて１９９６年４月８日に寄託されている。菌株ＦＡ１９（ＡＴＣＣ寄託番号５５０７３）もその前に、ブダペスト条約に基づいて１９９６年７月１２日に寄託されている。
ＤＮＡはまた当分野で公知の方法により、４つのヌクレオチドから全体または一部を化学的に合成することもできる。それらの方法としては、カルーサーズ[Caruthers]、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，２８１−２８５（１９８５）に記述されているものなどがある。
必要ならば全長ＤＮＡもまた、重なりあった二重鎖オリゴヌクレオチドを調製し、ギャップを埋め、そして両端を結合させることにより産生することができる。このＤＮＡを適切な宿主細胞にクローン化し発現させる。ＤＮＡおよびタンパク質をこの宿主細胞から回収する。一般参考文献として、サンブルック[Sambrook]ら“分子クローニング”、２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリープレス（１９８７）参照。
本発明は上記のようにＦｒｐＢの少なくとも一部分を包含するアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。好適なベクターとしては、プラスミドまたはウイルス類が挙げられるがこれらに限定されない。このベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトし、ＦｒｐＢまたは抗原性ポリペプチドの少なくとも一部分の生物活性を有するポリペプチドを産生するための宿主ベクターシステムを形成させる。
クローニング・ベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含むものとすることができる。好適な原核ベクターとしてはｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびＲＰ４などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプラスミドがある。原核ベクターとしてはまた、Ｍ１３、ｆ１およびその他線状一本鎖ＤＮＡファージなどのファージＤＮＡの誘導物も含まれる。
バクテリア、特に大腸菌中でタンパク質を発現するベクターも公知である。そうしたベクターとしては、ｐＫ２３３（またはプラスミドのｔａｃファミリーのすべて）、Ｔ７、およびラムダＰLなどがある。融合タンパク質を発現するベクターの例としては、ディックマン[Dieckman]とツァゴロフ[Tzagoloff]（８３）により記述されているＰＡＴＨベクターがある。これらのベクターはアンスラニレート・シンセターゼ（ＴｒｐＥ）をコードし、カルボキシ末端にポリリンカーを有するＤＮＡ配列を含む。その他の発現ベクターシステムは、β−ガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）；マルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ）ならびにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）−Ｇｅｎｅ（８４）およびＰｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（８５）参照−をベースとするものである。
酵母中で有用なベクターも入手可能である。好適な例は２μプラスミドである。
哺乳類細胞に使用するのに好適なベクターについても公知となっている。それらベクターとしては周知のＳＶ−４０誘導物、アデノウイルス、レトロウイルス由来ＤＮＡ配列および、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから取り出されるベクター類がある。
さらに当分野では真核発現ベクター類も公知となっている（たとえば、Ｐ．Ｊ．サザン[Southern]とＰ．ベルグ[Berg]（８６）；Ｓ．スブラマニ[Subramani]ら（８７）；Ｒ．Ｊ．カウフマン[Kaufman]とＰ．Ａ．シャープ[Sharp]（８８）；Ｓ．Ｉ．スカヒル[Scahill]ら（８９）；Ｇ．ウルラウブ[Urlaub]とＬ．Ａ．チェイシン[Chasin]（９０）参照）。
発現ベクターは、好ましくは発現させようとするＤＮＡ配列またはフラグメントに機能的に効果のあるように結合させた少なくとも１つの発現コントロール配列を含むものとする。このコントロール配列は、クローンＤＮＡ配列の発現をコントロールおよび調節するためにベクター中に挿入される。有用な発現コントロール配列の例としては、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ｔａｃシステム、ｔｒｃシステム、ファージラムダの主要オペレータおよびプロモーター領域、ｆ１コートタンパク質のコントロール領域、３−ホスホグリセレート酸キナーゼのプロモーター、酵母酸ホスファターゼのプロモーター、たとえば酵母アルファ因子のプロモーターであるＰｈｏ５、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスおよびシミアンウイルス、たとえばＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ならびに原核およびまたは真核細胞やそれらのウイルス類の遺伝子の発現をコントロールすることが知られているその他の配列またはそれらの組み合わせなどである。
好適な発現宿主としては、公知の原核および真核細胞がある。好適な原核宿主としては、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧ−９３６、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ １０１、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ２２８２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ ＭＲＣＩなどの大腸菌類、シュードモナス属、枯草菌などのバチルス類およびストレプトマイセスなどが挙げられる。好適な真核細胞としては酵母およびその他の真菌、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞などの昆虫、動物細胞、組織培養のヒト細胞および植物細胞などがある。
ワクチン類
本発明の核酸分子によってコードされたＦｒｐＢは、哺乳類をＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる感染から防御するワクチンとして特に有用である。なぜならば、ＦｒｐＢはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染を防御または予防する免疫システムに与えた場合に予期せざる極めて有効な免疫応答を誘発するからである。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによる感染から防御するためには、ＦｒｐＢは好ましくは前に規定したようにＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＦｒｐＢの少なくとも一部分が実質的に同一であることが望ましい。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる感染から防御するためには、ＦｒｐＢは好ましくは前に規定したようにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＦｒｐＢの少なくとも一部分が実質的に同一であることが望ましい。この免疫応答は既に感染した哺乳類においても治療効果を発揮する。哺乳類は好ましくはヒトである。
本発明の核酸によりコードされたＦｒｐＢタンパク質と薬学的に許容される担体、たとえば生理食塩水、滅菌水、燐酸緩衝生理溶液、リポソームおよびエマルションなどを含むワクチン組成物を提供する。哺乳類に投与するために好適なその他の緩衝液および分散剤ならびに不活性の非毒性物質もこのワクチン組成物に配合することができ、これらは当分野の熟練技術者は周知である。これら組成物は通常の滅菌技術により滅菌される。
これらのワクチン組成物には宿主の免疫応答の刺激を促進するアジュバント類も使用することができる。それらアジュバントとしては、たとえばムラミルペプチド、インターフェロン、インターロイキン−１およびインターロイキン−６などのリンホカイン類、あるいはバクテリア系アジュバントなどがある。アジュバントには変異または野生型ＦｒｐＢタンパク質を吸着するような適切な粒子、たとえば酸化アルミニウム粒子などを含む。アジュバントを含むこれらワクチン組成物は当分野で周知の技術で調製される。
組成物中のＦｒｐＢの濃度は、たとえば液体の容量または抗原性、ならびに選択する特定の投与方法に応じて異なる。
本発明はさらに、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染から哺乳類を防御する方法も提供するが、同法は本発明のワクチン組成物を哺乳類に投与することを特徴とする。このワクチンは当分野で周知の方法により哺乳類に投与される。それらの方法としてはたとえば、経口、経静脈、腹腔内投与、皮下、筋肉内、局所、または皮内投与などがある。
本発明はまた、ＦｒｐＢに薬学的に許容される担体、ならびに好ましくは上記に規定したアジュバントも包含する前記ワクチン組成物の製造法も提供する。
ＦｒｐＢ抗体
本発明は、本発明の単離核酸配列の少なくとも一部分によりコードされたＦｒｐＢエピトープに対する抗体を提供する。これら抗体は好ましくはモノクローナルである。モノクローナル抗体は当分野で周知の方法により作られる。これらの方法としては、ケーラー[Kohler]とミルスタイン[Milstein]（９１）により記述されている免疫学的方法、ならびにヒューズ[Huse]ら（９２）により記述されているリコンビナントＤＮＡ法がある。
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに感染した哺乳類は本発明の抗体を投与して治療することができる。好ましくは、抗体はＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに存在するアミノ酸配列を含むポリペプチドに対するものである。
治療目的のためには、これら抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでバクテリア細胞の成長を著しく阻止するか、または殺すような中和抗体であることが望ましい。もし疾病に感染した哺乳類の疾患の症状を防止または緩和するための十分な阻止または中和能があるならば、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるバクテリアの繁殖は著しく抑制される。
中和抗体はまた、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに感染した哺乳類を免疫するのに有用なワクチンとして抗イディオタイプ抗体を作るためにも使用される。抗イディオタイプ抗体は当分野で周知の方法により調製される。
プローブを使用したＦｒｐＢの検出
本発明はまた、ＦｒｐＢポリペプチドに特異的なプローブを使用してサンプル中のＦｒｐＢを検出する方法も提供する。このプローブは前記の抗体でよい。抗体によりポリペプチドを検出する方法は公知である。たとえば、ポリペプチドを固相支持体に固定化する。ポリペプチドの固定化はこのポリペプチドに特異的な第１抗体を固定化することによって行なわれる。固定化された第１抗体をポリペプチドを含む疑いのあるサンプルとともにインキュベートする。もし存在する場合は、このポリペプチドは第１抗体に結合する。
同じくポリペプチドに特異的な第２抗体を固定化したポリペプチドに結合させる。この第２抗体は当分野で周知の方法により標識される。固定化されない物質は洗い流され、固定化標識が存在すればポリペプチドの存在を示すことになる。この方法およびその他の免疫検定法については、デビッド[David]らの米国特許第４，３７６，１１０号（ハイブリテック社[Hybritech Inc.]（カリフォルニア州ラフォーラ）に譲渡）に記述されている。
このプローブはまた、本発明のＦｒｐＢ核酸分子を認識する核酸分子とすることもできる。核酸分子プローブがサンプル中の特定の核酸分子を認識するか否かを判定する方法は当分野では周知である。一般的には、サンプル中に存在すると思われる核酸配列に相補的な標識プローブを調製する。標的核酸分子にハイブリダイズしたプローブの存在は標的核酸分子の存在を示すことになる。好適な方法は、シュナイダー[Schneider]ら、米国特許第４，８８２，２６９号（プリンストン大学に譲渡）ならびにセゲフ[Segev]によるＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０１０６９号（イムクローン・システムズ社[ImClone Systems Incorporated]に譲渡）に記述されている。
上記のプローブ類は当分野で周知の方法に基づいて標識される。抗体標識の方法については、たとえばハンター[Hunter]とグリーンウッド[Greenwood]（９３）ならびにデビッド[David]ら（９４）に記述されている。さらなる抗体標識法については米国特許第３，９４０，４７５号および第３，６４５，０９０号に記述されている。オリゴヌクレオチド・プローブの標識法については、たとえばレアリー[Leary]ら（９５）；レンツ[Renz]とクルツ[Kurz]（９６）；リチャードソン[Richardson]とガムポート[Gumport]（９７）；スミス[Smith]ら（９８）；ならびにメインコス[Meinkoth]とワール[Wahl]（９９）に記述されている。
標識は放射性のものとすることができる。有用な放射性標識の一例としては、32Ｐ、125Ｉ、131Ｉ、および3Ｈなどがある。放射性標識の使用については英国特許第２，０３４，３２３号、米国特許第４，３５８，５３５号および米国特許第４，３０２，２０４号に記述されている。
非放射性標識の一例としては、電子顕微鏡で検出できる酵素、発色団、原子および分子、ならびに磁性により検出可能な金属イオン類がある。
有用な酵素標識としては、基質中に検出可能な変化を起こさせる酵素類が挙げられる。有用な酵素類およびそれらの基質類としては、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ピロガロールおよびｏ−フェニレンジアミン）、ベータ−ガラクトシダーゼ（蛍光ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド）、およびアルカリ性ホスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）などがある。酵素標識の使用については英国特許第２，０１９，４０４号、欧州特許第６３，８７９号、およびロットマン[Rotman]（１００）に記述されている。
有用な発色団としては、たとえば蛍光、化学蛍光およびバイオ蛍光分子、ならびに染料類である。本発明に有用な具体的な発色団としては、たとえばフルオレセイン、ローダミン、テキサス・レッド、ヒコエリスリン、ウンベリフェロン、およびルミノールなどである。
標識は当分野で周知の方法により抗体またはヌクレオチド・プローブに接合することができる。これら標識はプローブ上の官能基を通して直接付着させることができる。プローブにはそうした官能基を含むか、含ませるようにすることができる。好適な官能基の例としては、たとえばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基などがある。
標識はまた、プローブに付着させたリガンドに上記の方法および標識に付着させるリガンド用のレセプターにより接合することもできる。公知のリガンド−レセプターの組み合わせはいずれも好適なものである。ビオチン−アビジン・コンビネーションが好ましい。
本発明のポリペプチドは、サンプル中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに特異的な抗体の存在を検出するために使用することができる。この方法は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する抗体を検出するためにはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからのＦｒｐＢ、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する抗体を検出するためにはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからのＦｒｐＢのいずれかと実質的に同一のアミノ酸配列を有するセグメントを含むポリペプチドを調製することを包含する。このポリペプチドは前述のように調製することができる。
サンプルは、たとえばＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに感染していることが疑わしい患者からのものである。好適な検定法は、たとえばＲ．Ｈ．ケネス[Kenneth]（１０１）に記述されている標準ＥＬＩＳＡプロトコルなど当分野では周知のものである。
要約すれば、抗体の検出可能量を結合させるのに十分な濃度の抗原性ポリペプチドでプレートを被覆する。プレートをポリペプチドとともにインキュベートした後、プレートを好適なブロッカー、たとえば１０％正常ヤギ血清などでブロックする。患者血清などのサンプルを添加し、終点を決定するために滴定する。未知のサンプル中に存在する関連抗体を定量するために、陽性および陰性の対照も同時に添加する。インキュベーションの後、サンプルを適当な酵素に結合したヤギ抗ヒトＩｇでプローブする。サンプル中の抗ポリペプチド抗体の存在は酵素の存在により示される。
以下の実施例の部分は本発明の理解を助けるために記述するものである。この部分はその後に続く請求項に示されている本発明をいかなる形でも限定するものではない。
実  施  例
菌株および成育条件：本実験で使用した細菌株を表１に示す。ケロッグ[Kellogg]の栄養剤ＩおよびII（２９）を含むＧＣＢ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上でＮｅｉｓｓｅｒｉａ株を通常の方法で培養し、５％ＣＯ2の雰囲気中３５℃で一晩生育した。抗生物質選択は、ｍＴｎ３（Ｃｍ）（５１）による突然変異株に対してはクロラムフェニコールを１μｇ／ｍｌで、またΩ（４４）による突然変異株に対してはストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌで使用した。
鉄を強化した淋菌の膜の全タンパクをウエスタンブロッティング分析するため、細胞を前記の（１３）のようにＣＤＭ中で生育した。１０００ｕＭのクエン酸第二鉄を加えることによって培養物が鉄分に富んでいるものであることが分かった。
大腸菌をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（４７）上で通常の方法で培養した。抗生物質選択は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４０μｇ／ｍｌのカナマイシン、および／または３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールであった。δ−アミノレブリン酸を３０μｇ／ｍｌ、ヘムを５０μｇ／ｍｌ使用した。大腸菌の培養物に２００μＭの２，２−ディリジル（diyridyl）（シグマケミカル社[Sigma Chemical Co.]、ミズリー州セントルイス）の添加によって鉄を強化した。デフェロキサミンメシレート（desferal）はチバガイギー社[Ciba-Geigy]（スイス国バーゼル）から入手した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）およびウエスタンブロッティング：ＳＤＳ−ＰＡＧＥを７．５％のポリアクリルアミドを溶解したゲル中、および４．５％のポリアクリルアミドを積んだゲル中で行った。Ｌａｅｍｍｌｉ（３２）の不連続バッファーシステム中で、各ゲルについて４０ｍＡすなわち二つのゲルに対して８０ｍＡの電流を流して電気泳動を行った。移入と生育については既に述べた（２３、６１）。
ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体の調製：ポリクローナル抗血清の調製については上記した（８）。抗ＦｒｐＢモノクローナル抗体は上記の方法（６０）によって発生した。
ＤＮＡの単離、消化およびサザンブロット分析：ステム[Stem]らの方法（５４）によるＣｓＣｌ勾配遠心分離によって染色体ＤＮＡを精製した。プラスミドはＣｓＣｌ遠心分離またはＭａｇｉｃ  ＭｉｎｉｐｒｅＰ（商標）ＤＮＡ精製キット（プロメガ[Promega]、ウイスコンシン州マジソン）に添付の指示に従い精製した。サザンブロット分析とＤＮＡのハイブリダイゼーションは上記したように行った（１３）。制限酵素であるＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片およびＴ４ＤＮＡリガーゼをニューイングランドバイオラボ[New England Biolabs]（マサチューセッツ州ビバリー）またはベセスダリサーチラボラトリー[Bethesda Research Laboratories]（メリーランド州ガイサスバーグ）から購入し、製造業者の仕様に従って使用した。λ−ＺａｐｌｌおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋はストラタジーン[Stratagene]（カルホルニア州La Jolla）から入手した。
ＤＮＡ配列決定および配列分析：ＣｓＣｌによって精製したｐＵＮＣＨ３１９およびｐＵＮＣＨ３２５を、米国バイオケミカルシーケンナーゼ[Biochemical Sequenase]およびサンガー[Sanger]らのチェーンターミネータ法（４８）を使用して二重鎖ＤＮＡ配列決定（３１）のためのテンプレートとして使用した。ｄＧおよびｄｌの標識反応の両方を全てのプライマーについて行った。ｐＵＮＣＨ３１９の両方の鎖をベクター特異性またはインサート特異性のプライマーを用いて配列決定した。Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ III／Ｅｘｏ VIIによってネスティングした遺伝子欠失をｐＵＮＣＨ３２５のＭｌｕ末端から生成し、個々の遺伝子欠失クローンの配列を決定するためにベクター特異性プライマーを使用した。クローン間のギャップおよび対向する鎖の配列を決定するために内部プライマーを用いた。ＤＮＡ配列はジェネティックスコンピューターグループのソフトウエアパッケージ（１５）（ウイスコンシン大学）にて分析した。
突然変異誘発および淋菌性形質転換：ｆｒｐＢを挿入により不活化するためにｐＨＰ４５Ω（４４）を用いた。ｐＵＮＣＨ３２５をＢｇｌＩにて消化し、末端をＫｌｅｎｏｗにて修復した。ｐＨＰ４５ΩをＳｍａＩにて消化し、ジーンクリーン[Geneclean]IIキット（Ｂｉｏ１０１、カルフォルニア州、La Jolla）に添付の指示書に従ってアガロースゲルから２．０ｋｂΩ断片を単離した。プラスミドＤＮＡのＦＡ１９への形質転換は上記（７）のようにして行った。
アミノ末端配列分析のためのＦｒｐＢの調製：Ｎ−ラウロイルサルコシン（シグマ社）不溶性膜の画分を鉄を強化した淋菌ＵＵ１００８から調製し、タンパク濃度をビシンコニニック酸アッセイ（ＢＣＡ）（ピアース[Pierce]、イリノイ州ロックホード）によって決定した。７．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルの調製ウェル内に２００μｇのタンパクを充填し、２４時間前に注いで、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）とＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）を蒸発させた。Ｌａｅｍｍｌｉの不連続バッファーシステム（３２）を用いて４０ｍＡの定電流で電気泳動を行った。移入の前に移入用バッファー（１３）に１５分間ゲルを浸した。ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリジン）膜を１００％メタノール中に２秒間置き、蒸留水（ｄｄＨ2Ｏ）に５分間移し、移入の前に１０分間移入バッファーに浸した。移入は浸したトランスブロット装置（バイオラッド[BioRad]、カルフォルニア州リッチモンド）中で９０ｍＡで３時間半行った。移入の後、タンパクを可視化するためにＰＶＤＦ膜０．１％クーマシーブリリリアントブルー[Coomassie Brilliant Blue]、２０％メタノールおよび１０％酢酸中に５分間浸けて染色し、一回交換してｄｄＨ2Ｏ中で１０分間脱色した。フィルターを一晩−２０℃で凍結させた。分子量によりＦｒｐＢを同定し、フィルター上のタンパクのアミノ末端アミノ酸配列をＵＣＬＡのプロテインマイクロシーケンシングファシリティー[Protein Microsequencing Facility]によって決定した。
55Ｆｅ取り込み分析：異なる日に３回行った個々の実験からのデータをまとめた。淋菌を実験の前に以前に報告されている方法（２）で鉄を強化した。完全な細胞の溶解産物を通常の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングを行い、培養物が一様でかつ均等に鉄が強化されていることを確認した。これは、抗ＦｒｐＢモノクローナル抗体および／または抗Ｔｂｐ１抗血清との反応性で分かる。以前に報告されている方法（９）に以下の変更を加えて鉄取り込みアッセイを行った。実験の直前に１×ＣＤＭ中の３０μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡにてフィルターをブロックした。５％ＣＯ2雰囲気中３５℃で、９６ウエルの濾過プレート（ＭＡＨＶ  ミリポア[Millipore]、マサチューセッツ州ベッドフォード）中の２００μｌの容量でアッセイを行った。１×ＣＤＭにシアン化カリウムを溶解した。真空マニホールドはミリポアのマルチスクリーンアッセイシステム[Multiscreen Assay System]を使用した。ヘムを０．５μＭ、トランスフェリンを６．２５μＭ、クエン酸塩を１００μＭ使用した。膜を一晩空気中で乾燥させ、計数の前に個々のフィルターを分離して回収するためにミリポアのパンチキットを使用した。データは、１μｇのタンパク１分当たりの計数で表した。
アエロバクチンおよびエンテロバクチンの調製：精製されたエアロバクチンおよびエンテロバクチンはＰ．Ｅ．クレッバ（Klebba）のご厚意によるものであった。アエロバクチンは下記のようにして鉄化した。１．５μｌのＨＣｌを含む５０ｍｌのｄｄＨ2Ｏ中に硫酸第二鉄を４ｍＭ溶解した。４００μ、４ｍＭのアエロバクチンを、４００μｌ、４ｍＭの硫酸第二鉄と８０μｌ、０．５ＭのＮａ2ＨＰＯ4中に加えた。フェリアエロバクチン（Ｆｅｒｒｉａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）を、０．５５ＭのＮａ2ＨＰＯ4によって平衡にしたＣＭセルロース（シグマ、ミズリー州セントルイス）のカラム上に流した。アエロバクチンの最終濃度は４００ｎＭの吸収度を読むことで測定した（２４）。
鉄源：ヒトのトランスフェリン、ヒトのラクトフェリン、ウシのヘム、ヒトのヘモグロビン、およびヒトのハプトグロビンはシグマケミカル（ミズリー州セントルイス）から入手した。55Ｆｅヘミンは、ＮＥＮプロダクトデュポン（デラウエア州ウイルミントン）のカスタム合成設備から購入した（ロット番号ＦＥ５５Ｚ１１９３ＲＳ）。トランスフェリン、ラクトフェリンおよびクエン酸塩は既に記載された方法（３６）によって55ＦｅＣｌを用いて鉄化した。
ＲＮａｓｅアッセイ：ＲＮａｓｅアッセイは、０．５ＮのＨＣｌの代わりに０．１ＮのＨＣｌを用いた点を除き、文献記載の方法（７１）で行った。
ヘミンアフィニティー精製：ヘミンアガロースはシグマケミカル（ミズリー州セントルイス）から購入した。アフィニティー精製の方法はリー[Lee]によって記載されている（３３）。
殺菌性アッセイ：殺菌性アッセイは以前に記載された方法（１８）で行った。
淋菌性ｆｒｐＢ遺伝子のクローニング：淋菌株ＵＵ１００８からのサルコシル〔Sarcosyl]不溶性の膜画分を使用してＦｒｐＢＮ末端アミノ酸配列を得た（上記説明参照）。イノシンを含有する変質オリゴヌクレオチド（図１のＭＢ．３）をこの配列から推定し、ＦＡ１９クロモゾーマルＤＮＡのザザンブロットを検出するために使用した。各制限消化物は単一のハイブリダイズバンドを含んでいた。５．８ｋｂのＤｒａＩ断片を更なる分析のために選択した。
大腸菌でリンカーしたＦＡ１９染色体ＤＮＡのＤｒａＩ断片（２）を含むλ−Ｚａｐ IIライブラリーをオリゴＭＢ．３にてスクリーニングした。スクリーニングを行ったプラーク１０，０００個当たり約一個の陽性のプラークが認められた。完全インサートを含むファージミドを切断することを試みたが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ+のみの場合に比べて遺伝子欠失生成物は常に小さかった。大きな染色体断片はｆｒｐＢプロモータとｆｒｐＢコード配列全体の両方を含んでいる可能性があり、またＦｒｐＢの発現は大腸菌にとって毒性となる可能性があったので、より小さい断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ+にサブクローニングした。
ハイブリダイズしたプラークの一つから調製したＤＮＡであるλｆｒｐＢ−４（図２）をＥｃｏＲＩにて消化して、インサートＤＮＡを遊離した。予定の５．８ｋｂの断片をアガロースゲルから単離し、ＣｌａＩにて更に消化させ５４０ｂｐのＭＢ．３ハイブリダイズ断片とＭＢ．３にハイブリダイズしなかった約５．３ｋｂの断片とを生成した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ+中に連結した小さい方の断片は大腸菌ＤＨ５αＭＣＲの中で安定であり、ｐＵＮＣＨ３１９と命名した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ+中に連結した大きい方の断片はｐＵＮＣＨ３２０と命名した。ｐＵＮＣＨ３２０は大腸菌ＤＨ５２ＭＣＲの成長を遅くし、複製数を制限した。これらのデータはｆｒｐＢの３’に位置する他の配列も大腸菌にとって有毒であり、また安定なクローンを得るためには更なるサブクローニングが必要であることを示唆した。ｐＵＮＣＨ３２０のＭｌｕＩとＥｃｏＲＩによるて消化により約１．０ｋｂと１．５ｋｂの断片を得、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ+に接合した２．８ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片が残った。この５．８ｋｂの断片（ベクターと２．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を有する）をその後単離し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、それ自身を再び連結してｐＵＮＣＨ３２５を生成した。ＤＨ５αＭＣＲ（ｐＵＮＣＨ３２５）形質転換株は安定であり、プラスミドの複写数は明らかに正常であった。
ヌクレオチド配列とｆｒｐＢの分析：クローンの配列分析の前に行った染色ＤＮＡのＰＣＲ増幅によりｐＵＮＣＨ３１９とｐＵＮＣＨ３２５との間のＣｌａ接合点を確認した。ｐＵＮＣＨ３１９からｐＵＮＣＨ３２５までの合成したヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を図３に示す。推定プロモータ配列がうまく保存されたＦｕｒ  ｂｏｘ（４）の上流に位置していた。９個のシトシン残基のストリングが推定の−１０と−３５のＲＮＡポリメラーゼ結合部位の間に見られた。ヌクレオチド３０７から始まりヌクレオチド３１０で終わるＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、１，９２５ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始点であるＡＴＧコドンから塩基６個分前側に位置していた。このＯＲＦはアミノ酸が７１３個のタンパクをコード化する。推定したタンパクは典型的な単一の配列と特徴的なＡｌａ−Ｘ−ＡｌａシグナルペプチダーゼＩ開裂部位を含んでいた。この開裂部位に隣接する最初の１０個のアミノ酸は、成熟ＦｒｐＢタンパクから得たペプチド配列と同一であった。古典的なＴｏｎＢｂｏｘが残基３２−３６において見られた。成熟タンパクは７６．６ｋＤの計算分子量と１０．３８の等電点を有していた。ＯＲＦの下流側の配列から反転リピートが明らかにされたが、ｒｈｏ独立の転写終点で特徴付けられるＴ残基の鎖は有しなかった。（６９）。タンパクは、交互に疎水性と親水性である９個のアミノ酸に続く芳香族残基によって終わる。この構造は、現在までに配列が明らかにされている多くのバクテリアの外膜タンパクにおいて典型的なものである。
ＧｅｎＢａｎｋの相同性：ＦｒｐＢとジーンバンク[GenBank]の他の配列との比較により、幾つかの興味深い相同性が明らかになった。推定ＦｒｐＢタンパクは、膜の局在化および／またはＴｏｎＢ相互作用に対して重要であるとされる他のタンパクで同定された領域に関して類似性がある。ＦｒｐＢと、大腸菌のＢｔｕＢ（２５）とＦｅｐＡ（３５）を含む、ＴｏｎＢ依存性外膜受容体タンパクのファミリーとの間、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ膜のＴｂｐ１（１３）とＩｒｏＡ（４２）との間に部分的な相同性が見出された。この類似性は、極めて保存度の高いドメインに限られ（１３）、これはＦｒｐＢもＴｏｎＢ依存性受容体であることができることを示唆した。より高い類似性が、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（５５）のヘミン受容体ＨｅｍＲとの間で見られた。ＨｅｍＲは、ＴｏｎＢ依存性受容体タンパク族の一つでもある鉄分の調整された外膜タンパクである。この２種類のタンパクは全体の２６％が同一で４８％が類似であった。最も顕著な類似性は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（２６）の主要な外膜タンパクであるＣｏｐＢとの間で見られた。ＦｒｐＢとＣｏｐＢは全体の５２％が同一で７１％が類似であった。
ｆｒｐＢのトランスポゾン突然変異：ＦｒｐＢの突然変異株を作るために、ｐＵＮＣＨ３１９中の淋菌インサートをｐｕＰ１（１９）に連結しｐＵＮＣＨ３２１を作った。ｐＨＰ４５ΩからのΩ断片をｐＵＮＣＨ３２１中の唯一のＢｇｌＩ部位（図３に示す挿入部位）に連結した。このＤＮＡを、形質転換と対立置換によって淋菌株ＦＡ１９の染色体内に再導入し、ＦＡ６８０７を作った。ＦＡ１９とＦＡ６８０７からの染色体ＤＮＡのサザンブロット分析の結果、親では存在していた４５０ｂｐのＭＢ．３ハイブリダイズ断片であるＨｉｎｃ II断片がＦＡ６８０７では消失し、約２．５ｋｂの新たな反応性バンドが存在していることが示された（図４のパネルＡ）。ＦＡ６８０７中の２．５ｋｂ断片のみにハイブリダイズされたΩにより同一のブロット（図４、パネルＢ）が検出された。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）と抗ＦｒｐＢモノクローナル抗体であるＷ．６を用いたウエスタンブロット分析を行い、この株にはＦｒｐＢが存在しないことが確認された（図５）。
ｆｒｐＢのΩ挿入を、形質転換と対立置換によりＦＡ６７４７（ｔｂｐＡ：：ｍＴｎ３（Ｃｍ））へ導入し、ＦＡ６８０８を作った。ＦＡ６８０８のＦｒｐＢ／Ｔｂｐ１”顕型（フェノタイプ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析により確認した。この株を下記に述べるＦｒｐＢ機能分析に用いた。
鉄源の利用：鉄の利用におけるＦｒｐＢが果たす機能を決定すべく、ＦＡ１９とＦＡ６８０７を化学的に定義された培地（ＣＤＭ）中で無鉄状態で生育させた。１０μＭのデスフェラル（Ｄｅｓｆｅｒａｌ）を含むＣＤＭアガロースと５０μＭのデスフェラル（Ｄｅｓｆｅｒａｌ）を含むＧＣベースのアガールの上に鉄を強化した培養物のアリコットを板状に置いた。クエン酸塩、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘム、ヘモグロビン、またはハプトグロビンに接合したヘモグロビンの何れかを含む３ｍｍの無菌ディスクを各プレートの周囲に置いた。鉄源を付加していない一枚のディスクをネガティブコントロールとして追加した。一晩のインキュベーションの後、両方の株が成長したことがネガティブコントロール以外の全てのディスクにおいて明らかであった。
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅはアエロバクチン（６７）およびエンテロバクチン（４５）を鉄源として利用できる。ＦｒｐＢがアエロバクチンまたはエンテロバクチン受容体として機能するか否かを判定するため、ＦＡ１９、ＦＡ６８０８、ＦＡ６７４７、ＫＤＦ５４１、ＫＤＦ５４１／ｐＡＢＮ６およびＢＮ１０７１（表１）に上記のようにしてＣＤＭ内で鉄を強化し、２．５μＭの３０％鉄飽和トランスフェリンを含有するＣＤＭアガロースに板状に置いた。ＦＡ６７４７とＦＡ６８０８はＴｂｐ１を欠いていたためＴｆを鉄源として使用できなかった。したがって、これらの株は、機能的に親和性が高いヘモジデリン貧食細胞受容体の存在下でのみ成長可能であった。３個の無菌ディスクをこれらのプレートの回りに置いた。３０％の飽和ラクトフェリン（淋菌の生存可能性の陽性コントロール）、もしくはＬＧ１３１５ｐＣｏｌＶ（アエロバクチンプロデューサー）またはＡＮ１０２（エンテロバクチンハイパープロデューサー）からの濾過によって無菌にされた鉄を含まない上清を各ディスクに加えた。一夜の培養の後、大腸菌のコントロールは予想通り成長し、両方のヘモジデリン貧食細胞が、培地中に提供された唯一の鉄源であるトランスフェリンから鉄を奪う上で効率的であることが示唆された。予想通り、トランスフェリンプレート全体でＦＡ１９が成長した。しかし、ＦＡ６８０８とＦＡ６７４７の成長はラクトフェリンディスクの回りにだけ見られ、細胞は生存可能であるがこれらの状態ではアエロバクチンまたはエンテロバクチンを使用できないことを示唆した。
ＦＡ１９とＦＡ６８０７によるアエロバクチンの利用を、種々の濃度の精製フェリ（ｆｅｒｒｉ）アエロバクチン（図６）を用いて化学的に定義された液体培地で更に評価した。アエロバクチン受容体陰性の大腸菌株ＫＤＦ５４１とアエロバクチン受容体陽性の大腸菌株ＫＤＦ５４１（ｐＡＢＮ６）をコントロールとして使用した。これらのデータは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＦＡ１９とＦＡ６８０７がアエロバクチン受容体陰性の大腸菌コントロールと同じように、かつ濃度に依存してフェリアエロバクチンを使用することを示唆した。フェリアエロバクチンによる淋菌成長促進には比較的高い濃度（３μＭ）を必要とし、Ｔｆまたはクエン酸塩のコントロールと同等の密度を得ることができなかった。これらの実験により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアエロバクチンを鉄源として利用する淋菌の能力は確認されたが、この能力は親和性の高い受容体を媒介とする事象に依存するものでないことを示した。
ヘミン、Ｔｆおよびクエン酸塩の55Ｆｅの取り込み：
Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ内の既知のヘミン受容体であるＨｅｍＲとＦｒｐＢとの間の類似性が高いため、ヘミンからの55Ｆｅ取り込みに関してＦＡ１９とＦＡ６８０７との間で量的な差異が検出できるか否かを解析した。ＦＡ１９、ＦＡ６８０７およびＴｂｐ１突然変異株ＦＡ６７４７によるトランスフェリンからの55Ｆｅ取り込みをコントロールとして使用した。結果は、トランスフェリンからの55Ｆｅ取り込み、ＦＡ６８０７ではほぼワイルドタイプであり（Ｐ＝０．８２６）であり、ヘミンからの55Ｆｅ取り込みは約６０％減少した（Ｐ＜０．００１）（図７）。驚くべきことに、ＦＡ６７４７においてもヘミンからの55Ｆｅ取り込みが大幅に減少した（Ｐ＜０．００１）。ヘミンからの55Ｆｅを利用する能力がＦＡ６８０７（ＦｒｐＢ）とＦＡ６７４７（Ｔｂｐ１）に特異的であるか否かを判定するために、ヘミンからの55Ｆｅ取り込みを、他の鉄抑制タンパクの発現において特異的に変更されるその他の充分特徴付けられた淋菌の突然変異種においてアッセイした。それぞれＴｂｐ２-とＬｂｐ-株であるＦＡ６８１９とＦＡ６７７５もヘミンからの55Ｆｅの内在化が減少した（Ｐ＜０．００１）。これらのデータは、ヘミン鉄の内在化に二個以上のタンパクが関与しているか、またはこれらの突然変異株でのヘミン鉄取り込みの著しい減少は、膜に結合した別のヘム鉄取り込みシステムに対してのこれらの突然変異株の各々の予期していなかった非特異的な効果から生じたことを示唆した。
ｐＡＣＹ１８４におけるｆｒｐＢの再構築およびＲＫ１０６５（ｈｅｍＡ）の機能的相補性：ＦｒｐＢがヘミン受容体として機能できるか否かを判定するために、大腸菌ｈｅｍＡ突然変異株をＦｒｐＢにて相補的にした。複写回数の多いベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ+からのＦｒｐＢの発現は大腸菌に有毒であるが、複写回数の少ないベクターｐＡＣＹＣ１８４は許容できた。ｆｒｐＢの再構築のストラテジーを概略的に図８に示す。簡単に述べると、ｐＵＮＣＨ３１９からのインサートをｐＡＣＹＣ１８４のＣｌａＩとＢａｍＨＩ部位に連結してｐＵＮＣＨ３３０を生成させた。ｐＵＮＣＨ３３０をＣｌａＩにて消化し、ゲル精製したｐＵＮＣＨ３２５からのＣｌａＩ−ＸｂａＩ断片をこの部位に下記のようにして連結した。４時間の連結処理の後、室温で３０分リゲーション混合物にＫｌｅｎｏｗを加え，連結されていないＣｌａＩおよびＸｂａＩ末端を修復した。この反応物の連結処理をさらに一晩行った。ｐＡＣＹＣ１８４中のｆｒｐＢクローンをｐＵＮＣＨ３３１と命名した。ｐＵＮＣＨ３３１からのＦｒｐＢの発現は鉄抑制であり、大腸菌Ｆｕｒによる調節を示唆した。
ＲＫ１０６５は、ヘムを合成または内在化することができない大腸菌ｈｅｍＡの突然変異型である（２７）。成長促進にはδ−アミノレブリン酸、またはヘムと機能性ヘム受容体が必要である。ｐＵＮＣＨ３３１のＲＫ１０６５への形質転換はヘム上での成長を支援するのに対し、ｐＡＣＹＣ１８４のみでは支援しなかった（図９）。ＦｒｐＢ発現が大腸菌の外膜を変化させてヘムが細胞内へ容易に分散できるようした（７１）か否かを判定するためにＲｎａｓｅ漏出アッセイを行った。ｐＥＢＨ２１を含有する大腸菌株Ｃ３８６とＨＢｌ０１をそれぞれ陽性および陰性のコトロールとして使用した。ＲＫ１０６５（ｐＡＣＹＣ１８４）とＲＫ１０６５（ｐＵＮＣＨ３３１）との間での漏出性の差は無く、ヘムプレート上でのＲＫ１０６５（ｐＵＮＣＨ３３１）の成長は、周辺質タンパクＲＮａｓｅＨが漏出できるのに充分大きな膜の混乱[perturbation]によるものでないことを示唆した。しかしながら、ＲＫ１０６５（ｐＵＮＣＨ３３１）は、ｐＡＣＹＣ１９４のみの同じ株に比べて幾つかの疎水性抗生物質に対してより敏感であることが示唆された（図９）。この実験は、大腸菌内におけるＦｒｐＢの存在により、小穴（ポア）の形成または外膜の一体性の混乱により非特異的にヘムが侵入できるようになったことを示唆した。ＲＫ１０６５（ｐＵＮＣＨ３３１）におけるヘミンからの55Ｆｅ取り込みはＫＣＮによって阻止されず、非特異的な受容体を媒介としない取り込みメカニズムと合致している。
殺菌性アッセイ：Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓにおいては、ＦｒｐＢに最も類似したタンパクであるＣｏｐＢが血清抵抗性において主要な役割を果たしているようである。ＣｏｐＢが消失した突然変異体は血清抵抗性が減少した。ＣｏｐＢが消失した突然変異体は血清抵抗性が減少し、マウスモデル（２６）において生存した。鉄を制限した状態で生育させたＦＡ１９とＦＡ６８０７上でヒト血清を使用して標準的な殺菌性アッセイを行ったが、生存性に関しては差異を検出できず、両方の株は何れも完全に血清抵抗性であった。
0003797490.tif 000002
0003797490.tif 000003
0003797490.tif 000004
0003797490.tif 000005
0003797490.tif 000006
0003797490.tif 000007
0003797490.tif 000008
0003797490.tif 000009
0003797490.tif 000010
0003797490.tif 000011
0003797490.tif 000012
0003797490.tif 000013
0003797490.tif 000014
0003797490.tif 000015
0003797490.tif 000016
0003797490.tif 000017
0003797490.tif 000018
0003797490.tif 000019
0003797490.tif 000020
0003797490.tif 000021
【図１】
0003797490.tif 000022
【図２】
0003797490.tif 000023
【図３−Ａ】
0003797490.tif 000024
【図３−Ｂ】
0003797490.tif 000025
【図３−Ｃ】
0003797490.tif 000026
【図４】
0003797490.tif 000027
【図５】
0003797490.tif 000028
【図６−Ａ】
0003797490.tif 000029
【図６−Ｂ】
0003797490.tif 000030
【図７】
0003797490.tif 000031
【図８】
0003797490.tif 000032
【図９】
0003797490.tif 000033
【図１０−Ａ】
0003797490.tif 000034
【図１０−Ｂ】
0003797490.tif 000035
【図１０−Ｃ】
0003797490.tif 000036
【図１０−Ｄ】
0003797490.tif 000037