(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物根共生性の糸状菌を内包する高分子ゲルからなる層を外側に有し、多糖類又はオリゴ糖類、及び、これらの多糖類又はオリゴ糖類の分解酵素であって、これらを分解して上記植物根共生性の糸状菌が資化可能な炭素源を生成する酵素を内包する高分子ゲルからなる層を内側に有する、多層構造をなす植物への接種剤。
【請求項２】
多糖類としてセルロース、及び、この多糖類の分解酵素であって、これを分解して植物根共生性の糸状菌が資化可能な炭素源を生成する酵素としてセルラーゼを内包する高分子ゲルからなる層を内側に有する、請求項１に記載の多層構造をなす植物への接種剤。
【請求項３】
植物根共生性の糸状菌として菌根菌を内包する高分子ゲルからなる層を外側に有する、請求項１又は２に記載の多層構造をなす植物への接種剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物根共生微生物を利用した新規な植物への接種剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌中には、植物根と共生し、その植物の生育を助ける種々の微生物が存在している。例えば、そのような微生物の一つである根粒菌は、植物根に感染し、空気中の窒素を固定して植物体に供給することにより、また菌根菌は、やはり植物根に感染し、リン酸等のミネラルや水の吸収を助けることにより、それらが感染している植物の増殖を促進したり、耐病性や耐乾燥性を高めることが知られている。
【０００３】
かかる根粒菌、菌根菌は、有用な植物根共生微生物として代表的なものであり、研究も進み、農業、林業等への利用に多大な期待が寄せられている。しかし、細菌である根粒菌に対し、糸状菌である菌根菌は、その増殖が遅く、植物への感染に長い期間を要する。そしてこのため、菌根菌は、植物への感染が成立するまでに、他の土壌微生物からの悪影響を受け易く、ただ単に土壌中に加えただけで、これを植物に感染させることは困難であった。
【０００４】
そこで、菌根菌の実際の使用にあたっては、これを他の土壌微生物から保護し、かつ、これに適当な増殖の場を与えて、植物への感染が起こりやすいようにするために、寒天、アルギン酸、κ−カラギーナン等の高分子ゲルよりなる担体材料にこれを内包させて接種剤を作成し、この接種剤を土壌に加える等の試みが行なわれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、高分子ゲルにより内包しただけでは、菌の増殖自体に大幅な向上は望めない。そのため、上記の試みによっても、菌根菌の植物への感染には、やはり、一定以上の期間が必要とされた。これは、細菌に対して増殖の劣る、植物根共生性の糸状菌を利用しようとした場合に共通する問題と考えられる。
【０００６】
本願発明は、かかる問題を踏まえてなされたものであり、高分子ゲルに、植物根共生性の糸状菌を内包した植物への接種剤であって、内包された糸状菌が活発に増殖し、その植物への感染期間を大幅に短縮することのできる、植物への接種剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討を行ない、かかる接種剤を多層構造とし、その外側の層に植物根共生性の糸状菌、その内側の層に炭素源を内包させると、外側の層に内包された糸状菌は、その菌糸を内側の層に伸ばしてこの炭素源を利用することで、極めて活発に増殖することを見出し、本願発明を完成した。
【０００９】
本願発明は、植物根共生性の糸状菌を内包する高分子ゲルからなる層を外側に有し、多糖類又はオリゴ糖類、及び、これらの多糖類又はオリゴ糖類の分解酵素であって、これらを分解して植物根共生性の糸状菌が資化可能な炭素源を生成する酵素を内包する高分子ゲルからなる層を内側に有する、多層構造をなす植物への接種剤をも提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本願発明を詳細に説明する。
【００１１】
本願発明の接種剤は、多層構造であって、まず、その外側に植物根共生性の糸状菌を内包する高分子ゲルからなる層を有する。
【００１２】
植物根共生性の糸状菌とは、植物根と共生可能な糸状菌を意味し、本願発明においては、かかる糸状菌であれば、どのような種類のものでも使用することができる。しかし、植物の生育を助けるものとして特に有用であり、その研究も進んでいる菌根菌は、本願発明の糸状菌としての適用が容易であり、その効果も大きいため好ましい。例えば、菌根菌のうち、内生菌根菌としてはArbuscular菌根菌に属するGigaspora属、Scutellispora属、Glomus属、Acaulospora属、Sclerocystis属、Entrophospora属等、ラン科菌根菌に属するRhizoctonia属等、ツツジ科菌根菌に属するPezizella属等が、外生菌根菌としてはAmanita属、Tricholoma属、Rhizopogon属、Scleroderma属、Pisolitus属等が本願発明に好適に使用できる。
【００１３】
本願発明においては、植物根共生性の糸状菌のいずれの部位を使用するかということも、問題とならない。即ち、本願発明の接種剤の外側の高分子ゲル層中に内包させるのは、上記糸状菌の胞子、菌糸又は子実体のいずれであってもよく、また、これらが混ざり合っていてもよい。なお、その量は、糸状菌の性質（土壌微生物に対する耐性の強弱等）と、こうした糸状菌を内包した接種剤が使用される土壌の性質（存在する土壌微生物の種類や数等）などを考慮し、その糸状菌の植物への感染率が最大になるように決定する。この場合、高分子ゲルに内包される糸状菌の量が多ければ多いほど、その植物への感染率も高くなるとは限らない。菌体を高分子ゲルで十分にガードできなければ、これらの糸状菌は土壌微生物からの悪影響を受け、植物根への感染が阻害されるからである。
【００１７】
さらに、本願発明の接種剤は、その内側の高分子ゲル層が、多糖類又はオリゴ糖類、及び、これらの多糖類又はオリゴ糖類を分解して、植物根共生性の糸状菌が資化可能な炭素源、即ち、単糖類、低分子糖類、糖アルコール等を生成する酵素を内包するものであってもよい。かかる多糖類としてはセルロース、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、デンプン等を、オリゴ糖類としてはセロビオース、セロトリオースなどのセロオリゴ糖、マルトース、シュークロース、ラクトース、キシロオリゴ糖等を使用することができる。従って、かかる多糖類又はオリゴ糖類を分解して、植物根共生性の糸状菌が資化可能な炭素源を生成する酵素としては、セルラーゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、キシラーゼ等を使用することができる。これらの酵素は精製酵素であっても粗酵素であっても構わない。加えて、本願発明においては、これらの酵素を分泌する微生物そのものを高分子ゲル層に内包させて使用しても構わない。但し、この場合には、かかる微生物が、外側の高分子ゲル層に内包される植物根共生性の糸状菌に悪影響を与えないものであることを要する。
【００１８】
多糖類又はオリゴ糖類と分解酵素又はこれを分泌する微生物（以下、分解酵素等ともいう。）との量比は、多糖類又はオリゴ糖類の種類、分解酵素等の性能やこれにより生成する炭素源の種類、そして、この炭素源を利用することとなる植物根共生性の糸状菌の特性を勘案して、適宜決定することができる。即ち、本願発明の接種剤において、内側の高分子ゲル層に内包させる多糖類又はオリゴ糖類と分解酵素等との量比は、これらの要素を考慮することにより、その植物根共生性の糸状菌の増殖に最も適するよう、決定することができる。また、本願発明の接種剤においては、必要に応じ、植物根共生性の糸状菌の増殖を制御するため、これらの要素を考慮した上で、敢えて炭素源の生成速度を抑制するよう、内側の高分子ゲル層に内包させる多糖類又はオリゴ糖類と分解酵素等との量比を決定することもできる。
【００１９】
なお、本願発明で使用する高分子ゲルは、それが糸状菌や炭素源等、本願発明の接種剤において内包すべき成分を内包することができ、土壌中に置かれた場合でも、一定期間その内包された成分を保持するという機能を果たすものであれば、使用できる種類に制限はない。例えば、寒天、アルギン酸、κ−カラギーナン等は、入手が容易で、ある程度の強度を有するゲルが比較的容易に作成できるので、このような高分子ゲルの材料として好ましい。ちなみに、植物根共生性の糸状菌を内包する外側の層と炭素源等を内包する内側の層とは、同一種類の高分子ゲルで構成しても、異なる種類の高分子ゲルで構成しても構わない。
【００２０】
本願発明の接種剤は、植物根共生性の糸状菌を内包する外側の高分子ゲル層と、炭素源等を内包する内側の高分子ゲル層以外に、他の層を有していてもよい。かかる他の層の存在は接種剤の強度向上に寄与する他、例えば、外側の高分子ゲル層と内側の高分子ゲル層との間に１層以上の他の層を配置し、この層の強度等を工夫することで、外側の高分子ゲル層に内包される植物根共生性の糸状菌の菌糸が、炭素源等を内包する内側の高分子ゲル層に到達する速度を調整し、この糸状菌の増殖を制御することもできる。但し、植物根共生性の糸状菌を内包する高分子ゲル層は、常に、炭素源等を内包する高分子ゲル層の外側に位置すること、そして、これらの高分子ゲル層以外の他の層の存在により、本願発明の目的が損ねられないことを要する。なお、外側の高分子ゲル層、内側の高分子ゲル層、及びこれら以外の他の層には、やはり本願発明の目的を損ねない範囲で、抗生物質、植物用肥料等の添加剤を添加することもできる。
【００２１】
本願発明の接種剤は、例えば、これに内包させた植物根共生性の糸状菌の宿主となる植物周辺の土壌や培養土・培地の表面に散布し、又はその土壌や培養土・培地中に混合したり埋め込んで使用する。宿主となる植物は種類を問わない。また、その由来も実生苗、挿し木苗、組織培養により得られたクローン苗のいずれであっても構わない。実生苗の場合には播種、発芽、発根、植え替え、植栽等の各過程において本願発明の接種剤を使用でき、また、挿し木苗の場合には挿し木、発根、植え替え、植栽等の各過程において、クローン苗の場合には発根、順化、育苗、植え替え、植栽等の各過程において、本願発明の接種剤を使用することができる。
【００２２】
【作用】
植物根共生微生物は、多くの場合、宿主となる植物から炭素源の供給を受けて増殖する。従って、高分子ゲルに植物根共生性の糸状菌を内包させた接種剤においても、そのゲル中に適当な炭素源を供給してやることで、糸状菌はこの炭素源を利用して活発に増殖し、植物へのその感染期間を大きく短縮することができる筈である。
【００２３】
しかし、実際に、植物根共生性の糸状菌とこれが資化可能な炭素源とを混合状態で高分子ゲルに内包させた接種剤を作成し、これを土壌に加えて植物を栽培しても、土壌中の微生物が接種剤に内包される炭素源を利用して活発に増殖し、植物根共生性糸状菌の増殖、そして植物へのその感染を阻害するため、糸状菌感染期間短縮の効果は全くない。それどころか、このような土壌中の雑菌の繁殖は、植物の生育にも悪影響を与えるため、かかる接種剤を用土に加えて栽培された植物は、生育不良を起こすこととなる。
【００２４】
そこで、本願発明の接種剤は多層構造とし、外側に植物根共生性の糸状菌を内包する高分子ゲルからなる層、その内側に、多糖類もしくはオリゴ糖類と、これを分解して上記植物根共生性の糸状菌が資化可能な炭素源を生成する酵素等とを内包する高分子ゲルからなる層を配置した。この接種剤においては、植物根共生性の糸状菌を内包する層は、この糸状菌を土壌中の微生物から保護して増殖の場を与えると同時に、その内側の層に内包される炭素源等をも土壌中の微生物の攻撃から保護する機能を果たすこととなる。従って、この接種剤においては、接種剤の炭素源を利用した土壌微生物の増殖を防止することができ、また、植物根共生性の糸状菌は、土壌微生物と競合することなく、その菌糸を伸長させて内側の層に内包される炭素源を容易に利用し、活発に増殖することができるので、植物へのその感染期間の大幅な短縮が可能となる。
【００２５】
【実施例】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。
【００２６】
［参考例］
Ｉ．接種剤の作成
グルコース２ｇを、０．５ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）５０ｍｌに溶解し、これを直径約０．７ｍｍのノズルから、３０℃に保った０．０５Ｍ塩化カルシウム溶液（ｐＨ６．０）中に一定速度で滴下し、ゆっくりと攪拌することにより、ほぼ球形で粒径約２ｍｍ、グルコース４ｗ／ｖ％を内包するゲルビーズを得た。得られたビーズは、塩化カルシウム溶液ごと２０℃に冷却して硬化させた後、水で洗浄し、再び０．０５Ｍ塩化カルシウム溶液中に浸漬して、４℃で一夜保持することにより平衡化し、そのゲル強度を強化した。
【００２７】
一方、Ｈａｇｅｍ培地にて速度１２０ｒｐｍで４週間振とう培養したコツブタケ（Pisolithus tinctorius)の培養液をホモジナイザーにかけ、菌糸を均一に分散させた懸濁液とし、この懸濁液５０ｍｌに４ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（同上）５０ｍｌを加えて混合し、更に、上記のグルコース内包ゲルビーズを加え、よく攪拌した。次いで、３０℃に保った０．０５Ｍ塩化カルシウム溶液（同上）中に、このビーズ添加−菌糸懸濁液を、グルコース内包ゲルビーズが液滴の核となるようにして、直径約２．３ｍｍのノズルから一定速度で滴下し、ゆっくりと攪拌することにより、ほぼ球形で粒径約４ｍｍ、外側にコツブタケを内包する高分子ゲル層、内側にグルコース４ｗ／ｖ％を内包する高分子ゲル層を有するゲルビーズを得、上記と同様にしてゲル強度を強化し、これを植物への接種剤とした。
【００２８】
ＩＩ．コツブタケ増殖能の検討
Ｉで得られた接種剤について、これを滅菌水中に放置し、内包したコツブタケの増殖を観察した。すると、３日後にはコツブタケの黄褐色の菌糸の伸長が観察され、また、２週間後には伸長した菌糸が接種剤の全表面を覆って、この植物根共生性の糸状菌が極めて活発に増殖していることが確認された。
【００２９】
ＩＩＩ．コツブタケ感染能、及び、苗の生育性に与えるその影響の検討
バーミキュライトとピートモスの等量混合用土にＩで得られた接種剤を１ｌ当り２０個混合し、これに、発根が確認されて２週間経過後のユーカリプタス・グロブラス（Eucalyptus globulus（以下、Ｅ．グロブラスと略記する。））組織培養苗５０本を移植して順化した。
【００３０】
移植から２週間経過後、順化を終えた苗の根を定法に従って０．０５％トリパンブルーで処理することにより、コツブタケの菌糸を染色してその感染を観察したところ、旺盛な感染が確認された。また、このとき、コツブタケ菌糸は、接種剤の周辺の用土にもその伸長が観察された。
【００３１】
表１に、このときのＥ．グロブラス苗の移植後１、２、３及び４ヶ月の平均苗高と、移植後１ヶ月の枯死率を示す。この表より明らかなように、こうして順化・育苗されたＥ．グロブラス苗は極めて順調な生育を示した。
【００３２】
［実施例１］
グルコースに代え、ろ紙粉末（東洋濾紙製）２ｇとセルラーゼ「ＯＮＯＺＵＫＡ−Ｒ１０」（（株）近畿ヤクルト製）０．２ｇを加えて内側の高分子ゲル層を作成した他は、参考例と同様にして、植物への接種剤を作成し、また、これを加えた用土を用いてＥ．グロブラス苗の順化・育苗を行なって、この接種剤が参考例で作成した接種剤に匹敵する性能を有することを確認した。
【００３３】
即ち、こうして得られた接種剤を滅菌水中に放置すると、３日後にはコツブタケの黄褐色の菌糸の伸長が観察され、２週間後には伸長した菌糸が接種剤の全表面を覆って、この植物根共生性の糸状菌が極めて活発に増殖していることが確認された。さらに、接種剤混合用土にて順化を行なったＥ．グロブラス組織培養苗の根には、順化開始から２週間でコツブタケ菌糸の旺盛な感染が確認され、また、このとき接種剤の周辺の用土にもその菌糸の伸長は確認された。そして、この接種剤を加えた用土を用いて順化・育苗されたＥ．グロブラス苗は、表１に示すように、極めて順調な生育を示した。
【００３４】
［比較例１］
参考例と同様の条件で４週間振とう培養を行なったコツブタケの培養液をホモジナイザーにかけ、菌糸を均一に分散させた懸濁液とし、この懸濁液５０ｍｌに４ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）５０ｍｌを加えて混合し、これを直径約２．２ｍｍのノズルから、３０℃に保った０．０５Ｍ塩化カルシウム溶液（ｐＨ６．０）中に一定速度で滴下してゆっくりと攪拌することにより、ほぼ球形で粒径約４ｍｍのコツブダケを内包するゲルビーズを得、参考例と同様にしてそのゲル強度を強化し、これを植物の接種剤とした。
【００３５】
こうして得られた接種剤について、やはり参考例と同様にして、その性能を検討した。しかし、この接種剤におけるコツブタケの増殖能は低く、これを滅菌水中に放置した場合、３日後では菌糸の伸長は全く観察されず、２週間後にようやくわずかにその伸長が観察されるだけであった。また、この接種剤を用土に加えてＥ．グロブラス苗の順化を行なっても、順化開始から２週間を経た時点では、その根へのコツブタケ菌糸の感染も用土への菌糸の伸長も全く観察されず、このため、この苗の生育性は、実施例１で同じＥ．グロブラス苗が示した生育性と比べ、劣ったものとなった。
表１に、このときのＥ．グロブラス苗の生育性を示す。
【００３６】
［比較例２］
コツブタケ菌糸の懸濁液５０ｍｌに、グルコース２ｇ及び４ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）５０ｍｌを加えてゲルビーズを作成した他は、比較例１と同様にして、植物への接種剤を作成した。
【００３７】
こうして得られた接種剤について、やはり参考例と同様にしてその性能を検討したところ、この接種剤は、コツブタケ増殖能に関しては、実施例１で得られた接種剤に匹敵する性能を示し、これを滅菌水中に放置した場合には、３日後にその菌糸の伸長が、２週間後には伸長した菌糸が接種剤の全表面を覆うのが観察された。しかし、これを用土に加えてＥ．グロブラス苗の順化を行なうと、接種剤の周辺の用土には、コツブタケ菌糸の伸長も観察されるものの、雑菌による汚染の拡大も同時に観察され、結局、Ｅ．グロブラス苗の根へのコツブタケ菌糸の感染は観察されなかった。しかも、かかる雑菌汚染のため、この苗の生育は著しく劣り、その枯死率も１ヶ月後で４０％を示した。
表１に、このときのＥ．グロブラス苗の生育性を示す。
【００３８】
［比較例３］
コツブタケ菌糸の懸濁液５０ｍｌに、ろ紙粉末２ｇ、セルラーゼ「ＯＮＯＺＵＫＡ−Ｒ１０」０．２ｇ及び４ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）５０ｍｌを加えてゲルビーズを作成した他は、比較例１と同様にして、植物への接種剤を作成した。
【００３９】
こうして得られた接種剤について、やはり参考例と同様にしてその性能を検討したところ、この接種剤は、比較例２で作成した接種剤と全く同様の性能を示した。
表１に、このときのＥ．グロブラス苗の生育性を示す。
【００４０】
【表１】
0003760696.tif 000002
【００４１】
【発明の効果】
本願発明の接種剤においては、高分子ゲルに内包した植物根共生性の糸状菌に、これが資化可能な炭素源を供給することで、単にこの糸状菌を他の土壌微生物から保護するばかりではなく、その増殖を積極的に促進させる。
【００４２】
しかも、本願発明の接種剤は多層構造とし、その外側に植物根共生性の糸状菌を内包する高分子ゲルからなる層、その内側に、多糖類もしくはオリゴ糖類と、これを分解して植物根共生性の糸状菌が資化可能な炭素源を生成する酵素等とを内包する高分子ゲルからなる層を配置することで、炭素源等を土壌微生物の攻撃から保護する。従って、土壌微生物がこの炭素源等を利用して増殖し、植物根共生性の微生物や、宿主となる植物に悪影響を与えることはない。
【００４３】
そして、本願発明の接種剤においては、その内包する植物根共生性の微生物が極めて活発な増殖を示すため、植物へのその感染期間を大幅に短縮することができる。
【００４４】
それ故、本願発明の接種剤は、有用な植物根共生性の糸状菌の農業や林業への実用的な適用を可能とする。