(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物であって、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含んでいる、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ウイルス感染防御作用を有する、ことを特徴とする高分子糖蛋白質混合物。
【請求項２】
抗ヒトロタウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物であって、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含んでいる、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ヒトロタウイルス感染防御作用を有する、ことを特徴とする高分子糖蛋白質混合物。
【請求項３】
抗ウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有するウイルス感染防御組成物であって、上記高分子糖蛋白質混合物が、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含んでいる、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ウイルス感染防御作用を有する、ことを特徴とするウイルス感染防御組成物。
【請求項４】
抗ヒトロタウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有するウイルス感染防御組成物であって、上記高分子糖蛋白質混合物が、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含んでいる、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ヒトロタウイルス感染防御作用を有する、ことを特徴とするヒトロタウイルス感染防御組成物。
【請求項５】
抗ウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を製造する方法であって、ウシ乳清タンパク質濃縮物をアガロースの重合体からなり球状蛋白質の分画分子量が１０５〜２×１０７ダルトンであるゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより分離し、１０６〜１０７ダルトンなる分画を採取し、採取した分画をアガロースの重合体からなり球状蛋白質の分画分子量が１０４〜４×１０６ダルトンであるゲル濾過カラムクロマトグラフィーで、界面活性剤を添加した溶離液にて、分離し、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含む、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ウイルス感染防御作用を有する、高分子糖蛋白質混合物を含む分画を採取することを特徴とする高分子糖蛋白質混合物の製造法。
【請求項６】
抗ヒトロタウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を製造する方法であって、ウシ乳清タンパク質濃縮物をセファロースＣＬ−２Ｂを充填したゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより分離し、１０６〜１０７ダルトンなる分画を採取し、採取した分画をセファロース６Ｂを充填したゲル濾過カラムクロマトグラフィーで、０．１％ＳＤＳを添加した緩衝液にて、分離し、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含む、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ヒトロタウイルス感染防御作用を有する、高分子糖蛋白質混合物を含む分画を採取することを特徴とする高分子糖蛋白質混合物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ウイルス感染防御作用を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物、その用途及びその製造法に関する。詳しくは、本発明は、特定の理化学的性状を有し、かつ抗ウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物、該高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有するウイルス感染防御組成物、及び特定の理化学的性状を有し、かつ抗ウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物の製造法に関する。
本明細書において百分率の表示は、特に断りのない限り重量による値である。
【０００２】
【従来の技術】
乳児期、特に新生児は免疫機能が未熟であるため、感染症罹患率が高く、細菌、ウイルス等の感染による下痢発症率が高いといわれている。例えば、ロタウイルス下痢症は、冬季に流行を反復する乳幼児嘔吐下痢症であり、患者は激しい水様性の下痢、発熱、嘔吐の症状を呈する。特に衛生状態の劣悪な地域においては、これらの感染症による乳幼児の死亡率が高く、発展途上地域でのロタウイルス下痢症による死者数は年間８７万人にのぼる等社会的にも大きな問題となっており、その対策が急務となっている〔アドバンシイズ  イン  エクスペリメンタルメディシン  アンド  バイオロジ−（Adv.Exp.Med.Biol. ）第３１０巻、第２５５〜２６４頁、１９９１年〕。しかしながら、この疾病に罹患した乳幼児に対する有効な能動ワクチンは、未だに開発されていないのが現状である。
【０００３】
そこで、最近では、受動免疫による予防が検討され、その一例として、ヒトロタウイルスで過免疫したウシの初乳（ロタミルク）が乳児の下痢症に予防効果を示すことが報告されている〔ジャ−ナル  オブ  メディカル  ウィオロジ−（Journal of Medical Virology ）第３８巻、第１１７〜１２３頁、１９９２年〕。しかしながら、このロタミルクも、正常なウシをヒトロタウイルスを用いて免疫する必要があり、ヒトロタウイルスに対する抗体（IgG ）を取得するまでに数週間を必要とする等、操作が繁雑で長期間を要し、さらには、ヒトロタウイルスを用いることに伴う環境汚染等の危険性をも伴うというのが現状である。
【０００４】
一方、哺乳動物の乳には、種々の微量成分が含まれており、それらの成分の生理学的作用が、次第に解明されている。近年、糖蛋白質、糖脂質等の複合糖質が生体に重要な役割を演ずることが明らかにされてきた〔アクタ  ペディアトリカスカンジナビカ（Acta Paediatr.Scand.）第７５巻、第６８９〜６９５頁、１９８６年、及びイムノロジカル  アスペクツ  オブ  インフェクション  インザ  フィ−タス  アンド  ニュ−ボ−ン（Immunological aspects of infection in the fetus and newborn ）第１５５〜１９２頁、アカデミック  プレス社（Academic Press）、１９８１年〕。
【０００５】
例えば、一般にムチンと称される糖蛋白質又はムコ多糖蛋白質の高分子混合物は、多様な分子種を含有し、呼吸器官、胃、腸管等の粘膜に多く存在し、管腔内面の潤滑性の保持、腸管細胞への細菌の付着阻害、腸内でのビフィズス菌増殖促進等の多様な機能を有する物質であることが知られている〔ニュ−  パ−スペクティブス  イン  インファント  ニュ−トリション（New Perspectives in Infant Nutrition）第３２〜３８頁、シ−ム  メディカル  出版社（Thieme Medical Publishers ）、１９９２年、及びザ  ジャ−ナル  オブ  バイオケミストリ−（J.Biol.Chem.）第１８１巻、第８７９頁、１９４９年〕。
【０００６】
従来、ムチンは、ブタ等の動物由来のものが多く利用されているが、同様の高分子糖蛋白質が乳の脂肪球皮膜及び乳清にも含まれているにもかかわらず、これら乳由来のものは、今まで充分有効に利用されていなかった。副作用が少なく、安全、かつ安価な生理活性物質が求められている中で、工業的に利用可能なこれら乳由来の有用成分を、機能性食品などの食品及び医薬品素材として利用することが望まれるようになってきた。
【０００７】
一般に、母乳中には免疫グロブリン、ラクトフェリン、リゾチ−ム等の感染防御物質が含まれており、これらが乳児の感染防御に有効に作用することは広く知られている（乳技協資料、第４２巻、第１頁、１９９２年）。その他にも、乳中に含まれる感染防御作用を有する成分として、カゼイン又はグリコマクロペプチド（特開昭６３−２８４１３３号公報）、ガングリオシド（特開平５−２７６８９４号公報）、脂肪球皮膜又はグリコマクロペプチド（特開平５−３３９１６１号公報）、霊長類の乳由来の高分子糖蛋白質（特公平６−５３７６０号公報）が開示されている。
【０００８】
さらに、本願発明者の一部による報告（日本農芸化学会誌、第６８巻、第３号、第３４０頁、１９９４年３月）には、最小阻害濃度約４０μｇ／ｍｌという比較的弱い抗ヒトロタウイルス活性を有する人乳の乳清中のミルクムチンを含む画分Ｆ１、及び画分Ｆ１の抗ヒトロタウイルス活性に匹敵する活性をもつ牛乳の乳清タンパク質由来の高分子量画分が開示されている。
しかしながら、カゼイン、糖脂質、乳糖等を除去した、牛乳の乳清に含まれる残余の高分子成分について、前記ロタミルクに匹敵する強い抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有する高分子成分に関する報告は皆無であり、その生理学的作用が充分検討されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、乳に含まれている高分子成分の生理作用について研究を行った結果、牛乳の乳清から分離、精製し、特定の理化学的性状を有する乳分画が、ウイルス（ヒトロタウイルス）の増殖阻害活性を持つことを発見し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明の目的は、抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有し、かつ特定の理化学的性状を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有し、かつ特定の理化学的性状を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有するウイルス感染防御組成物を提供することにある。
【００１２】
更に本発明の他の目的は、抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有し、かつ特定の理化学的性状を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を製造する方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明の第一の発明は、抗ウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物であって、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含んでいる、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ウイルス感染防御作用を有する、ことを特徴とする高分子糖蛋白質混合物、である。
【００１４】
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、抗ヒトロタウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物であって、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含んでいる、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ヒトロタウイルス感染防御作用を有する、ことを特徴とする高分子糖蛋白質混合物、である。
【００１５】
前記課題を解決する本発明の第三の発明は、抗ウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有するウイルス感染防御組成物であって、上記高分子糖蛋白質混合物が、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含んでいる、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ウイルス感染防御作用を有する、ことを特徴とするウイルス感染防御組成物、である。
【００１６】
前記課題を解決する本発明の第四の発明は、抗ヒトロタウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有するウイルス感染防御組成物であって、上記高分子糖蛋白質混合物が、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含んでいる、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ヒトロタウイルス感染防御作用を有する、ことを特徴とするヒトロタウイルス感染防御組成物、である。
【００１７】
前記課題を解決する本発明の第五の発明は、抗ウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を製造する方法であって、ウシ乳清タンパク質濃縮物をアガロースの重合体からなり球状蛋白質の分画分子量が１０５〜２×１０７ダルトンであるゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより分離し、１０６〜１０７ダルトンなる分画を採取し、採取した分画をアガロースの重合体からなり球状蛋白質の分画分子量が１０４〜４×１０６ダルトンであるゲル濾過カラムクロマトグラフィーで、界面活性剤を添加した溶離液にて、分離し、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含む、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ウイルス感染防御作用を有する、高分子糖蛋白質混合物を含む分画を採取することを特徴とする高分子糖蛋白質混合物の製造法、である。
【００１８】
更に、前記課題を解決する本発明の第六の発明は、抗ヒトロタウイルス活性を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を製造する方法であって、ウシ乳清タンパク質濃縮物をセファロースＣＬ−２Ｂを充填したゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより分離し、１０６〜１０７ダルトンなる分画を採取し、採取した分画をセファロース６Ｂを充填したゲル濾過カラムクロマトグラフィーで、０．１％ＳＤＳを添加した緩衝液にて、分離し、（１）還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析で、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の２種類の糖蛋白質を含む、（２）７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなる、（３）ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、（４）ヒトロタウイルス感染防御作用を有する、高分子糖蛋白質混合物を含む分画を採取することを特徴とする高分子糖蛋白質混合物の製造法、である。
【００１９】
次に本発明について詳述する。
本発明の抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有する高分子糖蛋白質混合物の製造法の出発原料となるウシ乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）は、ウシの各泌乳期の乳、若しくはこれらの濃縮物又は乾燥物（以下これらをまとめて乳と記載することがある）を原料として、常法により得られる。濃縮物又は乾燥物を原料として使用する場合は、脱脂乳と同濃度に水で希釈して使用することができる。
【００２０】
一般に、乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）は、乳清を、乳を遠心分離等により脱脂し、この脱脂乳のｐＨを４．６に調節してカゼインを沈殿させ濾別し、乳清画分を採取することにより得た後、該乳清のｐＨを６．０に調整し、限外濾過膜を用いて脱塩濃縮を行い、分子量１０，０００ダルトン以上の分画を採取するか又は、ダイアフィルトレ−ションで濃縮分画することにより得られる。限外濾過は、市販の限外濾過膜〔例えば、ＳＬＰ−００５３（旭化成社製）等〕を用いて常法により実施できる。
【００２１】
次いで、採取された乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）をアガロ−スの重合体からなり球状蛋白質の分画分子量が１０5 〜２×１０7 ダルトンであるゲル濾過カラムクロマトグラフィ−〔例えばセファロ−スＣＬ−２Ｂ（商標。ファルマシア社製）等を吸着剤として用いる〕により分画し、１０6 〜１０7 ダルトンなる分画を採取する。溶離液は、例えばリン酸塩やトリス塩酸塩などｐＨ７〜８の公知の緩衝液を使用できる。またこれに、生理的濃度のＮａＣｌ、ＥＤＴＡ及び防腐剤などを添加しても良い。
【００２２】
更に、採取された１０6 〜１０7 ダルトンなる分画をアガロ−スの重合体からなり球状蛋白質の分画分子量が１０4 〜４×１０6 ダルトンであるゲル濾過カラムクロマトグラフィ−〔例えばセファロ−ス６Ｂ（商標。ファルマシア社製）等を吸着剤として用いる〕により分画し、２０〜５０万ダルトンなる分画を採取する。溶離液には、０．１〜０．５％の界面活性剤を添加したものを用いる。界面活性剤としては、ＳＤＳ、デオキシコ−ル酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などが使用できる。
【００２３】
採取された分画を、蒸留水に対して充分に透析して界面活性剤を除去した後、常法により凍結乾燥し、粉末状の高分子糖蛋白質混合物を得ることができる。後記する試験例及び実施例から明らかなように、牛乳を用いた場合、通常１ｌから約７ｍｇの抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有する高分子糖蛋白質混合物が得られる。
【００２４】
以上、本発明のウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物の製造法において、最も特徴的な点は、溶離液としてｐＨ７前後の緩衝液にＮａＣｌを添加したものを用いる従来のゲル濾過カラムクロマトグラフィ−を用いたウシ乳清蛋白質の分画法〔ジャ−ナル  オブ  デイリ−  サイエンス（J.Dairy Sci.）第７３巻、第２２９２〜２２９８頁、１９９０年等に記載の方法〕では分画できなかった、ウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有する高分子の糖蛋白質の分画法の問題点を、溶離液に界面活性剤を添加することにより、解決した点にある。
【００２５】
次に、本発明のウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物は、次のような理化学的性状を有している。
本発明の抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有する高分子糖蛋白質混合物は、ＢＣＡ法〔アナリティカル  バイオケミストリ−（Anal.Biochem. ）第１５０巻、第７６〜８５頁、１９８５年〕により測定した結果、７８〜８２％（重量）の蛋白質成分から成り、及び、中性糖、アミノ糖、シアル酸のそれぞれについて、高速液体クロマトグラフィ−法〔分析化学(Bunseki Kagaku ) 第３２巻、第E207頁、１９８３年等〕により測定した結果、１８〜２２％（重量）の糖成分とから成っている。
【００２６】
またゲル濾過法により測定した本発明の抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有する高分子糖蛋白質混合物の分子量は、２０〜５０万ダルトンである。還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析したところ、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の少なくとも２種類の糖蛋白質を含んでいた。これは、ゲル濾過クロマトグラフィ−法のような温和な条件のもとで分離される天然型の本発明高分子糖蛋白質混合物が、いくつかの低分子糖蛋白質の会合体であることを示している。
【００２７】
本発明の抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有する高分子糖蛋白質混合物は、乳成分であることから、一般に毒性は極めて低く、マウスについて測定した経口投与における急性毒性（ＬＤ50）の値は、体重１ｋｇ当り３０００ｍｇ以上であり、ラットに対して、体重１ｋｇ当て、１日に、５０ｍｇ、１００ｍｇ及び２５０ｍｇの投与量で３か月間経口投与したが、何らの異常も、副作用も認められなかった。
【００２８】
次に、本発明のウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有するウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御組成物とは、次のようなものである。各種のヒト及び動物用飲食品、例えば、加工乳、育児用ミルク、治療用ミルク、飼料用ミルク、経腸又は経管栄養剤等、及び各種のヒト及び動物用医薬品、例えば、ウイルス感染防御剤等である。
【００２９】
前記本発明の抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有する高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有する医薬品は、薬学的に許容される他の成分又は賦形剤等とともに、シロップ剤等に常法により加工することにより得ることができる。
【００３０】
前記本発明の抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有する高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有する医薬品は、ヒトロタウイルス等の感染による下痢症の予防に使用することができる。
【００３１】
本発明のウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を有効成分として含有するウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御組成物、特に医薬品は、経口的にヒト及び動物に投与することができる。有効投与量は、予防、治療の目的、対象となるウイルスの種類等によって異なるが、経口投与の場合、望ましい投与量は、投与対象体重１ｋｇ当て、１日に有効成分１０〜１００ｍｇである。
【００３２】
以上のごとく、本発明のウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物は、安全性において優れており、比較的高い抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有していることから、組成物として、各種の飲食品及び医薬に利用できる。
【００３３】
次に試験例を示して本発明を詳述する。
（試験例１）
この試験は、本発明のウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物の理化学的性状を調べるために行った。
後記する実施例１を反復し、本発明のウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物を製造した。ここで、セファロ−スＣＬ−２Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラム（５×８０ｃｍ）に通液し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．０２％  ＮａＮ3 を含む、５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。後記する（２）と同様の方法により各画分の分子量を測定し、また、後記する試験例２と同一の方法によりヒトロタウイルス増殖阻害活性を測定した結果、１０6 〜１０7 ダルトンの画分（Ｆ２画分）に抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）が認められた。従って、この分画を次の分離工程に用いた。
【００３４】
前記分画をセファロ−ス６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラム（２．５×３５ｃｍ）に通液し、０．１％ＳＤＳを含む１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を溶離液として溶出した。後記する（２）と同様の方法により各画分の分子量を測定し、また、後記する試験例２と同一の方法によりヒトロタウイルス増殖阻害活性を測定した結果、２０〜５０万ダルトンの画分（Ｆ６Ｂ−２画分）に抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）が認められた。従って、この分画が、本発明のウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物である。
【００３５】
次に、この分画を、透析した後、常法により凍結乾燥し、粉末状の高分子糖蛋白質混合物を得て、これを試料として以下の試験を行った。
（１）蛋白質成分及びの糖成分の比率を求める試験
試料の蛋白質成分を、ＢＣＡ法〔アナリティカル  バイオケミストリ−（Anal.Biochem. ）第１５０巻、第７６〜８５頁、１９８５年〕に従って、マイクロＢＣＡ  プロテイン  アッセイ  リ−ジェント〔（Micro BCA Protein Assay Reagent ）ピアス社製〕を用いて測定することにより、求めた。
その結果、試料の蛋白質成分は、試料の全固形分の７９．９％（重量）であった。
【００３６】
試料の糖成分を、下記の方法により、それぞれ測定することにより、求めた。中性糖については、２．５Ｍ  トリフルオロ酢酸中で１００℃、４時間加水分解後、三上及び石田（H.Mikami and Y.Ishida ）の方法〔分析化学(Bunseki Kagaku ) 第３２巻、第E207頁、１９８３年〕に準じて、高速液体クロマトグラフィ−〔島津高速液体クロマトグラフＬＣ−４Ａ型（島津製作所社製）〕により、日立 3013Nカラム（日立製作所社製）を使用して、アルギニンによるポストラベルを行う蛍光検出法で分析した。
その結果、試料中の中性糖の含量は、試料の全固形分の７．０％（重量）であった。
【００３７】
なお、アミノ糖については、４Ｎ  ＨＣｌで１００℃、４時間加水分解後、５０℃にて、高速液体クロマトグラフィ−〔島津高速液体クロマトグラフＬＣ−４Ａ型（島津製作所社製）〕により、TSK-GEL SCX(Na+)カラム（東ソ−社製）を使用して、０．１６Ｍホウ酸バッファ−(pH7.5)を溶離液として、アルギニンによるポストラベルを行う蛍光検出法で分析した。
その結果、試料中のアミノ糖の含量は、試料の全固形分の６．８％（重量）であった。
【００３８】
また、シアル酸については、０．０５Ｎ  Ｈ2 ＳＯ4 で８０℃、１時間加水分解後、本田らの方法〔日本薬学会第１０６年会講演要旨集１、第１１１頁（１９８６）〕に基づいて、６０℃にて、高速液体クロマトグラフィ−〔島津高速液体クロマトグラフＬＣ−４Ａ型（島津製作所社製）〕により、Gelpak C-620-10-カラム（日立化成社製）を使用して、０．３％リン酸を溶離液としてマロノニトリルによるポストラベルを行う蛍光検出法で分析した。
その結果、試料中のシアル酸の含量は、試料の全固形分の６．３％（重量）であった。
従って、各糖成分の合計値である試料の糖成分は、試料の全固形分の２０．１％（重量）であった。
以上より、試料は、試料の全固形分の７９．９％（重量）の蛋白質成分及び試料の全固形分の２０．１％（重量）の糖成分とからなる。
【００３９】
（２）分子量を求める試験
ゲル濾過法〔セファロ−ス６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラム（２．５×３５ｃｍ〕を使用し、０．１％ＳＤＳを含む１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を溶離液として用いた。）により、アルドラ−ゼ（分子量158000ダルトン、ナカライテスク社製）、フェリチン（分子量440000ダルトン、ナカライテスク社製）、チログロブリン（分子量669000ダルトン、ナカライテスク社製）、ブル−デキストラン〔分子量200 万ダルトン、シグマ(Sigma) 社製〕の４種を分子量標品として用い、該カラムにおける溶出容量と分子量との相関を表す検量線を作成し、該検量線を用いて、試料の分子量を測定した。
その結果、試料は、分子量２０〜５０万ダルトンの物質であった。
【００４０】
（３）試料の構成を求める試験
試料を０．２Ｍ  ２−メルカプトエタノ−ルによる還元条件で、レムリ（Laemmli ）の方法〔ネイチャ−(Nature ）第２２７巻、第６８０〜６８５頁、１９７０年) 〕に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行うことにより、分析した。
なお、オボアルブミン〔分子量45000ダルトン、バイオラド(Bio-Rad) 社製〕、ウシ血清アルブミン〔分子量66200ダルトン、バイオラド(Bio-Rad) 社製〕、ホスホリラ−ゼｂ〔分子量97400ダルトン、バイオラド(Bio-Rad) 社製〕、β−ガラクトシダ−ゼ〔分子量116250ダルトン、バイオラド(Bio-Rad) 社製〕、ミオシン〔分子量200000ダルトン、バイオラド(Bio-Rad) 社製〕の５種を分子量標品として用い、試料に平行して電気泳動させることにより、試料中の糖蛋白質の分子量を求めた。電気泳動後の試料中の糖蛋白質の検出は、電気泳動ゲルをＰＡＳ染色法〔アナリティカル  ケミストリ−（Anal.Chem.）第３０巻、第１４８頁、１９６９年〕で染色することにより検出した。この電気泳動の結果を図１に示す。
【００４１】
この結果から、試料は、１８〜２０万ダルトン（ＰＡＳ−Ｉ）と８万ダルトン（８０Ｋ）の少なくとも２種類の糖蛋白質を含んでいることが確認された。
なお、これらの低分子糖蛋白質が、ゲル濾過クロマトグラフィ−法のような温和な条件のもとでは、分離されないことから、天然型の本発明高分子糖蛋白質混合物は、これらの低分子糖蛋白質がサブユニットとして強固に結合してできた糖蛋白質会合体であるものと考えられる。
【００４２】
（試験例２）
この試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける本発明のウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物の抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を調べるために行った。
牛乳を用いて後記する実施例１と同一の方法により製造した高分子糖蛋白質混合物を試料として、ヒトロタウイルスＭＯ株の増殖阻害活性を以下のように測定した。
１０6 FCFU(Fluorescent Cell Focus Forming Unit)/mlのヒトロタウイルスＭＯ株［ジャ−ナル  オブ  クリニカル  マイクロバイオロジ−（J.Clin.Microbiol. ）第１６巻、第７２７〜７３０頁、１９８２年］ 0.3mlと20μg/mlのトリプシン 0.3mlを３０分間混合後、１０％ウシ胎児血清を含むイ−グル培地（極東製薬社製）で２５倍に希釈し、これを９６穴マイクロプレ−トに、１穴（ウェル）当り１００μｌずつ分注した。ここに予め無菌蒸留水にて各種濃度に希釈調製された試料１００μｌを加えて３０℃で１時間培養した。
【００４３】
なお、空試験用としては、前記試料１００μｌに代えて、無菌蒸留水１００μｌを用いた。この培養液を別の９６穴マイクロプレ−トに、対応する各穴に１００μｌずつ移し、ここにそれぞれ２×１０5 /ml のアカゲザル腎臓由来ＭＡ−１０４細胞を１穴当り１００μｌ添加し、混合後、各混合液の２０μｌをそれぞれ対応するスライドグラスに移し、３７℃で２日間培養した。これをアセトンで固定し、ヒトロタウイルス感染細胞数を、一次抗体としてウサギ抗ヒトロタウイルス抗体、及び二次抗体として蛍光標識したヤギ抗ウサギＩｇＧを用いた間接蛍光抗体法で検出した。
【００４４】
なお、増殖阻害活性の評価は、下記の式から求められる値（阻害率）が５０％以上の時、増殖阻害活性ありと判断した。
１００×〔１−（試料添加時の感染細胞数）／（空試験の感染細胞数）〕
また、増殖阻害活性がある最も高い希釈率で、試料原液の蛋白質濃度を除した値を最小阻害濃度とした。なお、試料原液の蛋白質濃度は、予めロ−リ−法〔Lowry 法：ザ  ジャ−ナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリ−（J.Biol.Chem.）第１９３巻、第２６５頁、１９５１年〕によって求めた。
【００４５】
その結果、本高分子糖蛋白質混合物の最小阻害濃度は、５μｇ／ｍｌであった。この結果から、本高分子糖蛋白質混合物は、充分に強い抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を持っていることが判明した。なお、他の出発原料及び方法により製造した本発明の高分子糖蛋白質混合物についても、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４６】
（試験例３）
この試験は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（経口投与）における本発明のウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有するウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物の抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を調べるために行った。
牛乳を用いて後記する実施例１と同一の方法により製造した高分子糖蛋白質混合物を試料として、抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を次のように試験した。
【００４７】
ＢＡＬＢ／Ｃ系雌５日齢マウス（一群９匹）に、試料１ｍｇまたは２ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解した液とヒトロタウイルスＭＯ株（１０6 FCFU）とを予め混合し、３７℃、３０分間インキュベ−トしたものの０．１ｍｌを経口投与して、３日後の下痢症の程度を評価した。なお、試料無添加を対照群とした。
この試験の結果を、表１に示す。
【００４８】
【表１】
0003794722.tif 000002
【００４９】
表１から明らかなように、対照群では、ほとんどのマウスに下痢が認められたのに対して、両試験群では下痢が顕著に抑制されることが認められた。従って、経口投与された本発明の高分子糖蛋白質混合物が、生体内において優れた抗ウイルス活性（抗ヒトロタウイルス活性）を有することが判明した。なお、他の出発原料及び方法により製造した本発明の高分子糖蛋白質混合物についても、ほぼ同様の結果が得られた。
【００５０】
次に実施例を示して本発明を更に詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
実施例１
精製当日に搾乳した牛乳１０００ｍｌを４℃に冷却し、遠心分離処理（１５４００×ｇ，２０分）することによって乳脂肪を除去し、脱脂牛乳８５０ｍｌを調製した。この画分のｐＨを４．６に調整し、カゼインを沈殿、濾別して乳清画分を得た。得られた乳清のｐＨを６．０に調整し、ダイアフィルトレ−ション〔ダイアフィルトレ−ションに使用した膜：アミコンＹＭ−１０（商標。アミコン社製）〕で濃縮分画し、分子量１０，０００以上の乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）約７０ｍｌを採取し、常法により凍結乾燥し、約０．８ｇの粉末を得た。
【００５１】
この粉末を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．０２％  ＮａＮ3 を含む、５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３２ｍｌに溶解し、その２０ｍｌをセファロ−スＣＬ−２Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラム（５×８０ｃｍ）に通液し、上記トリス塩酸緩衝液で溶出し、前記する試験例２と同一の方法によりヒトロタウイルス増殖阻害活性が認められた１０6 〜１０7 ダルトンの分画を回収し、常法により凍結乾燥し、約６３ｍｇの粉末を得た。
【００５２】
続いてこの粉末の５０ｍｇを０．１％ＳＤＳを含む１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）５ｍｌに溶解し、これをセファロ−ス６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラム（２．５×３５ｃｍ）に通液し、上記リン酸緩衝液で溶出して更に分離し、前記する試験例２と同一の方法によりヒトロタウイルス増殖阻害活性が認められた２０〜５０万ダルトンの分画を回収した。これを蒸留水に対して充分に透析後、常法により凍結乾燥し、高分子糖蛋白質混合物約３ｍｇを得た。
【００５３】
得られた高分子糖蛋白質混合物は、前記試験例１〜３に記載されるとおりの７８〜８２％（重量）の蛋白質成分及び１８〜２２％（重量）の糖成分とからなり、ゲル濾過法により測定した分子量が２０〜５０万ダルトンである、少なくとも２種類の糖蛋白質からなるウイルス（ヒトロタウイルス）感染防御作用を有する高分子糖蛋白質混合物であった。
【００５４】
実施例２
常法により次の組成の抗ヒトロタウイルス剤（錠剤）を製造した。
乳糖                                            １８．８  （％）
トウモロコシ澱粉                                ２３．５
ステアリン酸マグネシウム                          １．４
カルボキシメチルセルロ−スカルシウム              ９．４
実施例１の高分子糖蛋白質混合物                  ４６．９
上記組成物を打錠機により打錠し、錠剤とする。
【００５５】
実施例３
常法により次の組成の抗ヒトロタウイルスシロップを製造した。
パラオキシ安息香酸メチル                          ０．０３（％）
パラオキシ安息香酸エチル                          ０．０１
カルボキシメチルセルロ−スカルシウム              ０．２０
クエン酸ナトリウム                                ０．１８
クエン酸                                          ０．２２
果糖ブドウ糖液糖                                １９．８３
精製水                                          ７９．３３
実施例１の高分子糖蛋白質混合物                    ０．２０
【００５６】
実施例４
常法により次の組成の抗ヒトロタウイルス活性果汁飲料を製造した。
果糖ブドウ糖液糖                                １１．６０（％）
濃縮オレンジ果汁                                  ５．２５
クエン酸                                          ０．２０
香料                                              ０．１０
精製水                                          ８２．７５
実施例１の高分子糖蛋白質混合物                    ０．１０
【００５７】
【発明の効果】
本発明の高分子糖蛋白質混合物は、ウイルス（ヒトロタウイルス）の増殖を阻害する活性を有するので、ウイルス（ヒトロタウイルス）の感染を防御する目的で、飲食品及び医薬品の素材として用いることができる。また、ウイルス（ヒトロタウイルス）の感染によって生じる下痢症を抑制する飲食品及び医薬品の素材として利用することができる。また、本発明の高分子糖蛋白質混合物は牛乳由来のものであるため、安全性に問題がなく、人乳に比較して、産業上、大量に原料牛乳を入手し、高分子糖蛋白質混合物を大量生産することが容易であることから、低価格で提供できる。さらに、あまり利用されていない牛乳の高分子画分から比較的多量に調製できるので、資源の有効利用の点でも貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の高分子糖蛋白質混合物の還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示す。
【図１】
0003794722.tif 000003