(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロプロジギオシン塩酸塩を産生することのできるシュードアルテロモナス・デニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans)を培地に培養してシクロプロジギオシン塩酸塩を産生せしめ、これを採取することを特徴とするシクロプロジギオシン塩酸塩の製造法。
【請求項２】
請求項１記載のシクロプロジギオシン塩酸塩をシクロプロジギオシン又はその他の塩類に変換することを特徴とするシクロプロジギオシン及びその塩類の製造法。
【請求項３】
シクロプロジギオシン塩酸塩を産生することのできるシュードアルテロモナス・デニトリフィカンスがシュードアルテロモナス・デニトリフィカンスAK-1(FERM P-15771)である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
シュードアルテロモナス・デニトリフィカンスAK-1(FERM P-15771)。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、海洋細菌を用いて微生物学的方法によりシクロプロジギオシン及びその塩類を製造する方法に関する。
また、さらにこのようなシクロプロジギオシン塩酸塩を産生することのできる海洋細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、海洋細菌に関する種々の研究が行なわれ、その産生する生理活性物質についてもいくつかの報告がなされている。
例えば、シクロプロジギオシンについてみてみると、この化合物は、好気性海洋細菌、アルテロモナス  ルブラ(Alteromonas rubra)から産生され単離されている(Tetrahedron  Letters 24(26), 2701-2704(1983))。また、ベネッケア  ガゾゲネス(Benekea gazogenes)からも単離されている (同上誌  24(27), 2797-2798(1983))。そして、このシクロプロジギオシンが抗菌活性や抗真菌活性であることが報告されている (同上誌  30(13) 1725 (1989)) 。
しかし、これらの海洋細菌から得られるシクロプロジギオシンは、多種のプロジギオシン類の爽雑物の形で産生抽出され、そのなかからシクロプロジギオシン単体を単離するには煩雑な単離操作を必要とした。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、海洋細菌が産生する生理活性物質の単離を目的として海洋細菌の産生する低分子化合物の検索を行なったところ、海洋細菌のシュードアルテロモナス (Pseudoalteromonas)属の産生する赤色色素がマウスリンパ球に対して強い増殖抑制効果があることを見出した。そしてこの物質を同定したところシクロプロジギオシン塩酸塩であり、しかもこの海洋細菌の産生物は、他のプロジギオシン類の爽雑物を含むことなくシクロプロジギオシン塩酸塩のみが産生されることを見出して本発明をなすに至った。
すなわち、本発明の課題は、海洋細菌を用いて生理活性物質、特にシクロプロジギオシン塩酸塩を効率よく製造する方法を提供することにある。
また、本発明の課題は、このようなシクロプロジギオシン塩酸塩を産生することのできる海洋細菌を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。
すなわち、本発明は、シクロプロジギオシン塩酸塩を産生することのできるシュードアルテロモナス・デニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans)を培地に培養してシクロプロジギオシン塩酸塩を菌体内及び菌体外に産生せしめ、これを採取することよりなるシクロプロジギオシン塩酸塩の製造法に関する。
本発明で得られたシクロプロジギオシン塩酸塩は、これを遊離の形に変換して生理活性を高めたりあるいは他の塩類の形に変換してもよい。
本発明におけるシクロプロジギオシン塩酸塩を産生することのできるシュードアルテロモナス・デニトリフィカンスとして、本発明者らによって日本近海から単離され、シュードアルテロモナス・デニトリフィカンスAK-1と命名され工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM P-15771 として寄託されている海洋細菌を用いることが望ましい。
また、本発明は、このような工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM P-15771 として寄託されているシュードアルテロモナス・デニトリフィカンスAK-1に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明におけるシクロプロジギオシン塩酸塩を産生することのできるシュードアルテロモナス・デニトリフィカンスは、日本近海の海水中から単離される。
この海洋細菌の単離は、昭和61年１月15日 (株) Ｒ＆Ｄプランニング発行  山本正和著「微生物の分離法」第 123〜124 頁に記載されるフィルター法によって行なうことができる。すなわち、汲み上げた海水をミリポアーフィルターHA型を通して吸引濾過し、菌の付着しているフィルター面を ZoBell 2216 E  改変培地（培地組成; バクトペプトン(Difco) 2.5g、バクトイースト抽出物(Difco) 0.5g、リン酸鉄(III)n水和物 (和光純薬) 0.1g、バクトアガー (和光純薬) 15.0g 、天然海水1000.0g よりなり、pH7.6 に調整した培地) 上に張りつけ、菌を培地に移行させ、20℃で数日間培養を行なう。菌の赤色色素の産生を目途に、赤色産生細菌を採取し、このなかから後述のシクロプロジギオシン塩酸塩産生菌株を選択する。
なお、天然海水に代えて人工海水を用いてもよい。人工海水としては、アクアオーシャン (登録商標)(新扶桑製薬 (製造) 、日本動物薬品 (株)(販売))を例示できる。
【０００６】
本発明でこのようにして得られたシクロプロジギオシン塩酸塩産生能を有する菌株は、海洋性の非発酵性グラム陰性桿菌で、一本の極鞭毛により運動する。また、脱窒能を有し、赤色の色素を生産することが特徴である。この菌株の性状試験結果を、次の表１に示す。
この結果を基に、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 1(1984), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 第９版(1994), Int. J.Syst.Bacteriol., 37,416-421(1987)及び同誌34,145-149(1984)に基づいてシュードアルテロモナス  デニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans)と同定した。
本発明のシュードアルテロモナス・デニトリフィカンス(Pseudoalteromonasdenitrificans) AK-1 株(FERM P-15771)は、従来知られているシュードアルテロモナス・デニトリフィカンス ATCC 43337 株 (Int. J. Syst. Bacteriol., 37,416-421(1987)) にくらべてマルトース及びL-チロシンを資化しない点で特異的であり、新規な菌株ということができる。
なお、シュードアルテロモナス属は、1995年に Gauthier ら(Int. J.Syst. Bacteriol., 45, 755-761(1995))によって提唱された新属で、シュードアルテロモナス  デニトリフィカンスは、アルテロモナス(Alteromonas) 属から移行された種である。
本発明においてこのようにして得られたシュードアルテロモナス  デニトリフィカンスは AK-1 として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号 FERM  P-15771を得ている。
【０００７】
【表１】
0003826202.tif 000002
【０００８】
本発明においては、前記したシュードアルテロモナス属に属するシクロプロジギオシン塩酸塩産生能を有する菌株を各種の栄養成分を添加し, pH6.5 〜7.8 に調整した人工海水または天然海水を培地として用い、15〜20℃において好気的条件下で１〜５日間培養する。このようにして培養するとシクロプロジギオシン塩酸塩の単体だけが菌体内及び培地中に生成蓄積されるので、これを簡単な精製法により大量かつ高い精製度で精製することができる。
培地中からシクロプロジギオシン塩酸塩を精製するには、培養後集菌し、あるいは培養液を濃縮し、これをシクロプロジギオシン可溶性有機溶媒で抽出し、再結晶を行なうことによって容易に単離精製することができる。このような有機溶媒としては、ジエチルエーテルアセトン混液、エタノールアセトン混液等が、また再結晶は、塩化メチレンを用いて行なうことが好ましい。
【０００９】
このようにして単離されたシクロプロジギオシン塩酸塩をカラムクロマトグラフィー処理することによって容易に塩化水素をはずし塩酸塩のない遊離のシクロプロジギオシン（以下、遊離シクロプロジギオシンという）を得ることができる。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲルをカラムとし、塩化メチレン、エーテル等を溶媒として用いて行なうことが望ましい。
遊離シクロプロジギオシンはリン酸、硫酸等の酸で処理することによってこれらの酸塩に変換することができる。
このようにして得られる塩類としては、リン酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、カルボン酸塩 (例えば酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩等) 、ヨウ素酸塩、臭素酸塩、ピクリン酸塩、スルホン酸塩、テトラフルオロボレート塩等を例示することができる。
【００１０】
このようにして得られたシクロプロジギオシン塩酸塩は、元素分析、融点、Massスペクトル、IRスペクトル、H-NMR, UV スペクトル等で解析したところ、Tetrahedron  Letters, 24 (26) 2701-2704(1983) 記載のシクロプロジギオシン塩酸塩のこれらと一致し、また遊離シクロプロジギオシンについてもH-NMR で解析したところ同様に文献記載のシクロプロジギオシンのそれと一致し、これらの化合物であることが確認された。
【００１１】
本発明のこれらの化合物は、従来から知られているように抗菌活性や抗真菌活性を利用して抗菌剤として用いることができる。また、本発明者らは、これらの化合物が免疫抑制作用、あるいは V-ATPase 脱共役 H+ ポンプ阻害作用があることを見出した。従って、免疫抑制剤、骨粗鬆症治療剤、動脈硬化治療剤あるいはその他の医薬として用いることもできる。
【００１２】
次に本発明の実施例を示して本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
汲み上げた海水 50ml を直ちにミリポアーフィルター-HA 型 (孔径 0.45 μm,フィルター径 47mm)で吸引濾過し、このフィルターを菌の付着している面を上にしてZoBell 2216 E 改変培地と接触させ、菌を培地表面に移行させ、20℃の恒温培養装置中で２日間培養した。このなかで赤色の色素を産生する菌を採取し、シクロプロジギオシン塩酸塩の生成を確認した。この菌を同定したところ表１に示されるような菌学的性質が得られ、シュードアルテロモナス・デニトリフィカンス(Pseudoalteromonas denitrificans)と同定された。この菌株は、Pseudoalteromonas  denitrificans AK-1 と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM P-15771 として寄託されている。
【００１３】
【実施例２】
バクトペプトン(Difco)2.5g 、バクトイーストエクストラクト(Difco)0.5g 及びリン酸鉄(III)n水和物 (和光純薬)0.1g を天然海水１L 中に溶解した後、滅菌し、その3ml 中で、実施例１で得られたシュードアルテロモナス・デニトリフィカンスAK-1株を15〜20℃で１日間振盪培養を行なった。得られた培養物を上記組成の培地600ml に移し、１日間培養を行なった。
このようにして培養された培地を22,000 rpmで20分間遠心分離し、菌体を回収した。菌体は５〜10g が回収された。シクロプロジギオシン塩酸塩は水溶性であるので培地中にも産生され、培養液からも回収可能である。また、天然海水に代えて前記アクアオーシャン (登録商標) (pH7.6±0.2)を用いることもできる。
この菌体にアセトン- ジエチルエーテル(4:1) 混液を加え200 振盪/minで色素 (シクロプロジギオシン塩酸塩) を抽出した。抽出液を12,000 rpmで10分間遠心分離して上澄み液を得た。この上澄み液に無水硫酸マグネシウムを加えて水分を吸着除去し、この硫酸マグネシウムを濾過して除去した。濾液を乾固するまで濃縮し、これを薄層クロマトグラフィーによって分析した(Kieselgel 60F254; 展開溶媒ベンゼン: エーテル＝1:1)。この結果を図１に示す。図１に示すようにRf 0.20 に単一のスポットが得られた。この濃縮物を塩化メチレン5ml に溶解し、この溶液から温度差を利用して再結晶した。生成した結晶をペンタンで洗浄し、吸引濾過して結晶 5mgを採取した。
この結晶は、赤色の金属光沢をもった針状結晶であって、融点はなく、約 230℃で分解した。
元素分析値を表２に示す。
【００１４】
【表２】
0003826202.tif 000003
【００１５】
この解析の結果、上記結晶の物性値はシクロプロジギオシン塩酸塩(C20H23ON3・HCl)の物性値と一致し、シクロプロジギオシン塩酸塩（化１) であると同定された。
菌体抽出物中にはシクロプロジギオシン塩酸塩以外のプロジギオシン類は見出されなかった。
【００１６】
【化１】
0003826202.tif 000004
【００１７】
【実施例３】
実施例２で得られたシクロプロジギオシン塩酸塩5mg を塩化メチレン 10ml に溶解し、シリカゲルカラム（口径 1.5cm、長さ12cm、流速1.2ml/min)を通過させ、溶媒を留去して遊離シクロプロジギオシン 4mgを得た。この物質が遊離シクロプロジギオシンであることは H-NMR等のデータによって確認された。 H-NMRのスペクトルを図４に示す。
【００１８】
【発明の効果】
従来のシクロプロジギオシンには、抗菌活性、抗真菌活性があることが知られており、本発明のシクロプロジギオシンも同様に抗菌活性、抗真菌活性を有し、抗菌剤あるいは抗真菌剤として用いることができる。
さらに、本発明者らは、マウス脾臓細胞からリンパ球を調製し、シクロプロジギオシン及びその塩酸塩がＴ細胞のレクチンである ConA の濃度に依存してチミジンの取り込みを抑制することができることを見出した( IC50＝５〜10ng/ml)。
また、 V-ATPase 脱共役 H+ ポンプを濃度10nMで完全に阻害できることを見出した。従って、本発明により得られるシクロプロジギオシンは免疫抑制剤、骨粗鬆症治療剤、動脈硬化治療剤その他の医薬として有用に利用される。
しかも、本発明のシクロプロジギオシン塩酸塩を産生することのできるシュードアルテロモナス・デニトリフィカンスを用いて培養すると数日の短時間のうちにシクロプロジギオシン塩酸塩のみを菌体又は菌体外に産生し、その他のプロジギオシン類を産生せしめないので、シクロプロジギオシン塩酸塩の精製を簡単にかつ容易に行なうことができる。さらに、シクロプロジギオシン塩酸塩の形で得ることができるので結晶化を容易に行なうことができる。またさらに、シクロプロジギオシン塩酸塩から遊離シクロプロジギオシンを簡単な操作で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２のシュードアルテロモナス・デニトリフィカンスAK-1株の培養菌体をアセトン- ジエチルエーテル混液で抽出した抽出物のシリカゲルクロマトグラフィー。
【図２】実施例２の抽出物から再結晶されたシクロプロジギオシン塩酸塩のIRスペクトル。
【図３】実施例２の抽出物から再結晶されたシクロプロジギオシン塩酸塩の H-NMRスペクトル。
【図４】実施例３のシクロプロシギオシンの H-NMRスペクトル。
【図１】
0003826202.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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