(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性ウイルス性Ｂ型肝炎治療用医薬組成物であって、この医薬組成物は、
（ａ）抗原性Ｔ細胞活性化エピトープを含む、Ｂ型肝炎ウイルスのプレ−S1ポリペプチド配列と、
（ｂ）前記エピトープを提示することができる担体としての、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ抗原配列と、
を有するポリペプチドを含んでなり、
上記ポリペプチド中で、前記プレ−S1ポリペプチド配列（ａ）と前記Ｓ抗原配列（ｂ）とはペプチド結合により連結されており、それらのモル比は50：50である、
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが組換えDNA分子の発現により生産される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記配列（ｂ）が、分泌時に少なくとも10nmの直径を有する粒子を形成する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、慢性ウイルス性肝臓病に対する治療薬を提供するためのポリペプチド配列と担体とを含んで成る組成物に関する。本発明は、前記ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列および前記ＤＮＡ配列の発現のためのトランスフェクトされた細胞に関する。
少なくとも５種のウイルス、即ちＡ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥ型肝炎ウイルスが急性肝炎の臨床的局面を開始させることができる。腸内的に感染するＡ型肝炎とＥ型肝炎は患者の死をもたらすのとは異り、Ｂ型、Ｃ型（以前は非経口性非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれた）およびＤ型肝炎は炎症の慢性段階に進行することがあり、これが次いで肝硬変や一次性肝細胞癌を引き起こし得る。
Ｃ型とＤ型肝炎、それらの診断および治療方法並びに各ウイルスに関して入手できるデータは比較的少ない。Ｄ型肝炎ウイルスは、不完全であることが知られているＲＮＡウイルスである。従って、それは患者中で発達するためにヘルパーウイルスを必要とし、ＨＢＶに感染した個体においてのみ見つかる。ごく最近になってようやくＣ型肝炎ウイルスが検出され、慢性Ｃ型肝炎感染の診断を容易にする抗体試験（抗ＨＣＶ）が開始された。しかしながら、この病気を直す治療法に対する緊急な要望がますます高まっている。
免疫学的方法による認識、原因となるウイルス並びにウイルスの生活環およびＤＮＡ配列に関してより詳しく研究された病気である慢性Ｂ型肝炎にも同じことが当てはまる。ウイルスＤＮＡが10週間よりも長く存続している場合、またはＢ型肝炎表面抗原（HBsAg）が６か月より長く存続している場合、患者はＢ型肝炎ウイルスの慢性保有者であると言われる。
ほぼ30000万の人が慢性Ｂ型肝炎にかかっていると思われ、その大部分が極東に住む人々である。それらの人が感染する主な危険性は、慢性的に感染した母親がウイルスを新生児に伝達するため、出産中または出産直後であると思われる。こうして感染した子供の90％は、その後の人生の間に同じように慢性感染状態になるだろう。西欧諸国では、より頻繁には人生の後期、幼児期または成人になってさえも、主に非経口的または性的伝染によって、感染が起こる。誕生後のＢ型感染の場合には、感染者の５〜10％のみが慢性保有者になる。しかしながら、転移されたウイルスは、感染者がウイルスを排除するのかまたはそれを体内に終生保持するのかのいずれかを示す明確な反応を招かない。従って、それは将来の身体状態を決定する免疫学的状態の問題であると思われる。
ＨＢウイルス粒子（デーン粒子）は、異なる構造タンパク質であるコアタンパク質と表面（Ｓ）タンパク質とから構成される。後者は、３つのＳ型領域のコード配列（その各々は生体内で翻訳を開始することができるＡＴＧトリプレットで始まる）を包含する転写解読枠の翻訳産物である。それらの領域は、該分子の５′から３′末端の順序でプレＳ１、プレＳ２およびＳと呼ばれる。このＯＲＦから６つのタンパク質産物：Ｓ領域のみから翻訳される主要タンパク質のグリコシル化形と非グリコシル化形（gp27とp24）（226アミノ酸）（以下、HBV Ｓペプチドと称する）、１本または２本の多糖類鎖（それぞれgp33及びgp36）を有しプレＳ２とＳ領域によりコードされる中央タンパク質（281アミノ酸）（以下、HBV ２Ｓペプチドと称する）、そして最後に、プレＳ１、プレＳ２およびＳの翻訳により形成される大型タンパク質のグリコシル化形（gp24）と非グリコシル化形（p39）（ウイルスの抗原型に依存して389〜400アミノ酸）（以下、HBV Ｓ１ペプチドと称する）が誘導される。コアタンパク質はHBcAgとHBeAgであり、後者のタンパク質はおそらくHBcAgのプロセシング産物であろう。コアタンパク質はプレ−コアペプチドを有することができる。
感染性ウイルス粒子であるデーン粒子は、コアタンパク質と表面タンパク質の両方を含んで成り、一方フィラメントは６種の表面抗原の混合物から成る。HBV Ｓ，Ｓ１及びＳ２ペプチド（本明細書に定義する）は単独で凝集すると、完全に非感染性であるいわゆる20nm粒子を形成する。
ＨＢウイルスにより感染された患者は、慢性的ＨＢＶ感染状態であると見なされる前に幾つかの肝炎病期を通過する。感染直後は、血清中のHBeAgの存在により特徴づけられる感染期がくるだろう。ＨＢＶ複製の抑制にもかかわらず連続したＨＢs抗原血は、患者の細胞性ゲノム中に組み込まれたウイルスＤＮＡ配列の存在を指摘する。組み込まれたウイルス配列では、宿主細胞が完全なウイルスを合成することはできない。しかしながら、組み込まれたＨＢＶ配列を有する肝細胞はHBsAgのみを生産することができ、これが患者の血清中に検出可能であり、慢性Ｂ型肝炎の指標である。おそらく、形質転換された肝細胞は細胞毒性Ｔ細胞により溶解されず、増殖して慢性持続性肝炎（ＣＰＨ）か慢性活動性肝炎（ＣＡＨ）のいずれかを誘発し、これが次いで肝硬変または一次性肝細胞癌に進行して患者の早熟死を引き起こし得る。
最近、慢性的にＨＢＶ感染している患者が内因性インターフェロン生産に欠損を示すことが確立された（Abbら., 1985：J. Med. Virol. 16, 171-176）。これは、血清中のHBeAgとHBV-DNAの存在により指摘されるような慢性Ｂ型肝炎を有する患者をインターフェロンα（IFN α）で治療することの理論的根拠であった。多数の患者の管理試行は、インターフェロンαの投与が対照と比較すると有意に増加されたＢ型肝炎ウイルス排除をもたらすことを示した。しかしながら、誕生時またはその近辺に感染した患者は、この治療に応答してセロコンバーションしないと思われる。この現象は、不運にも保有者の75％をIFNα療法できなくする。
現在も慢性Ｂ型肝炎に対するインターフェロンαの正確な作用形態は不明瞭なままである。それの抗ウイルス活性が感染細胞を感染から保護するかまたはＨＢＶ感染細胞におけるウイルスの転写、翻訳および複製を減少させるのかもしれない。インターフェロンは更に、Ｔ細胞、マクロファージおよびＮＫ細胞を活性化させそしてＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を誘導することにより免疫調節機能を有する。
慢性Ｂ型肝炎を治療する別のアプローチは、ウイルスの複製を抑制し、それによって宿主免疫系をウイルスを排除できるようにするのに十分な防御を付与する考えである。これは、慢性的にＨＢＶに感染した個体の治療に向けて抗ウイルス薬、例えばアデニンアラビノシドおよびアデニンアラビノシドモノリン酸を試験することに至る。しかしながら、患者の半数未満が、持続的または一時的セロコンバーション（HBeAg+から抗HBe+に）のいずれかにより、この治療法に応答した。それらの抗ウイルス薬の更に不利な面は免疫抑制性質である。
慢性保有者の治療用に試験されている他の薬剤としては、インターフェロンβ、アシクログアノシン（アシクロビル）、インターロイキン２、ステロイド、例えばプレドニソロン、およびそれらの組合せが挙げられる。しかし、それらのいずれもインターフェロンαでの治療よりも優れた結果を提供することができなかった。ステロイドの初期投与の後のＩＦＮαの投与を含む組合せ療法のみが、特定の患者において応答速度を増加させることができる。
従来技術から、慢性的にＨＢＶに感染したチンパンジーはHBsAg（破傷風毒素に結合させたもの）での治療でも抗HBsでの治療でも直すことができないことが知られている。更に、慢性的にＨＢＶ感染した患者をHBV Ｓ２及びＳ１ペプチド（本明細書に定義する）の投与により免疫処置することが試みられている。この処置はそれらの人において抗HBs抗体形成さえも引き起こさなかった。
その上、定義によれば、Ｂ型肝炎ウイルスの慢性保有者は、血清中にHBsAgが検出可能であることにより特徴づけられる。従って、本発明に係るMBVゲノムのプレＳ１−プレＳ２−Ｓ領域によりコードされるＴ細胞活性化エピトープを含んで成る組合せがＢ型肝炎ウイルスの慢性保有者において免疫化と最終的治癒を誘導できることは全く予想外であった。
上述した技術の現状を考慮すれば、本発明の目的は、完全な応答（即ち、ＨＢＶ複製の持続的阻害、ＨＢＶ  ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼの喪失、および患者の血清中のHBeAgとHBsAgの減少そして最終的にはそれらの消失）をもたらすウイルス性慢性肝臓病の治療のための有効な治療薬を提供することである。
本発明によれば、この目的は、
ａ）１または複数のＴ−細胞活性化エピトープを有する少なくとも１つのポリペプチド配列と、
ｂ）エピトープ配列ａ）を提示することができる担体との組合せであって、ここで前記ポリペプチド配列ａ）は共有結合又は疎水結合により担体ｂ）に結合することができる
組合せにより達成される。
本発明は、慢性ウイルス性肝炎の治療用医薬組成物に向けられ、この組成物は、上記ａ）及びｂ）の組合せを含んで成る。
すなわち、本発明の医薬組成物は、ａ）１又は複数のｔ−細胞活性化エピトープを有する少なくとも１つのポリペプチド配列と、ｂ）該エピトープ配列を提示することができる担体の組合せであって、該ペプチド配列ａ）は共有結合又は疎水結合により担体ｂ）に結合しているものを患者に投与することにより慢性ウイルス性肝炎の治療を行うための医薬組成物に向けられる。
１または複数の異なるポリペプチドであることができるポリペプチド配列a）が直接的または間接的方法でＴ細胞活性化エピトープの抗原性を媒介することが重要である。本発明によれば、ポリペプチド配列a）は、任意のサブタイプ、特にadw，ayw，adrおよびadyのＢ型肝炎ウイルスの１つのポリペプチドであるかまたは２つ以上のポリペプチドの組み合わせであることができる。Ｂ型肝炎ウイルスに由来するそれらのペプチドは、ＨＢＶペプチドプレＳ１、プレＳ２もしくはＳ（本明細書に定義する）、またはＨＢＶコア抗原であることができる。
ポリペプチド配列ａ）として有用なものはさらに、（ｉ）少なくとも６個の連続するアミノ酸残基を含んで成るエピトープが保存される任意の除去により、（ii）１又は少数のアミノ酸の置換を有することにより、又は（iii）そのＮ−末端に、そのＣ−末端に、又は前記ポリペプチド配列への挿入として追加のアミノ酸配列を有することにより、変更されている前記のポリペプチド又は２以上の該ポリペプチドの組合せのいずれかである。しかしながら、これらの場合のそれぞれにおいて、生物学的活性が維持されていることが必須である。
疎水性結合又は付着を助けるため、ポリペプチド配列ａ）はミリスチル化されているのが好ましい。
適当な薬理活性を示すためには、本発明の組合せにおいてポリペプチド配列a）が担体b）上に提示されることが必要である。この担体は、例えば疎水性ポリマー粒子、無機粒子または多糖粒子から成ることができる特定の物質から成る。好ましくは、担体b）は、分泌時に粒子を形成する第二のポリペプチド配列であり、前記粒子は好ましくは少なくとも10nmの直径を有する。
粒子を形成するポリペプチド配列b）は、ＨＢＶ  Ｓペプチド（本明細書に定義する）、ＨＢＶコア抗原、ＨＡＶコア抗原、ＨＡＶ表面抗原、ＨＩＶ表面抗原およびＨＩＶコア抗原並びにポリオウイルスの表面抗原から成る群から選ぶことができるポリペプチドの実質的部分または完全なアミノ酸配列であることが好ましい。粒子形成担体b）として好ましいのは、ＨＢＶのＳペプチドおよび／またはコアペプチドである。
担体ｂ）として使用するとき、上述のポリペプチドは、（ｉ）任意の除去を有することにより、（ii）１又は少数のアミノ酸の置換を有することにより、又は（iii）そのＮ−末端に、そのＣ−末端に、又は該ペプチド配列ｂ）への挿入として、変更されていてもよい。但し、粒子形成能が維持されていることを前提とする。疎水結合の形成を助けるため、ポリペプチド配列ｂ）はミリスチル化される。
担体b）がポリペプチド配列であるならば、両配列a）とb）を次の相互作用：疎水的固定（ミリスチン酸により媒介される）、ジスルフィド結合形成、のうちの１つまたは複数によって結合することができ、または両配列をペプチド結合により連結して融合ペプチドを形成せしめることができる。後者の場合、所望によりポリペプチド配列a）とポリペプチド配列b）との間にスペーサー配列を挿入することができ、このスペーサー配列はペプチド結合によって両ポリペプチドに結合される。
本発明は更に、慢性ウイルス性肝臓病の治療用医薬の製造に有用である、或る組合せをコードする組換えＤＮＡ分子を提供する。この組換えＤＮＡ分子は、少なくとも１つの第一のＤＮＡ配列、所望により第二、第三および／または第四のＤＮＡ配列を含んで成り、ここで
ｉ）前記少なくとも１つの第一のＤＮＡ配列は、上記で定義した少なくとも１つのポリペプチド配列a）をコードし、
ii）前記第二のＤＮＡ配列は、粒子形成ペプチドの上記定義に従ったポリペプチド配列b）をコードし、
iii）前記第三のＤＮＡ配列はスペーサー配列をコードし、そして
iv）前記第四のＤＮＡ配列は選択マーカーをコードし、
そして前記ＤＮＡ配列は発現に不可欠なＤＮＡ要素により調節され、所望により共通の読み枠を有する。
多くのアミノ酸が複数のトリプレットによって指定されるという事実を鑑みれば、上記で定義したペプチド配列a）およびb）をコードする、本発明に包含される幾つかのＤＮＡ配列が存在する。
この他に、本発明は、ヌクレオチドの30％までが置換され得るという事実により上記で定義した組換えＤＮＡ分子とは異なる組換えＤＮＡ分子も更に包含する。
本出願の更なる目的は、上記組合せをコードする組換えＤＮＡ分子によりトランスフェクトされた宿主細胞を提供することであり、該宿主細胞は慢性的ＨＢＶ感染患者の治療に有用である。この宿主細胞は哺乳動物、酵母または細菌細胞であることができる。本発明の目的上、この宿主細胞が上記組合せ中に含まれるポリペプチド以外のいずれの霊長類血清タンパク質やヒト血清タンパク質も生産しないことが好ましい。
本明細書中で使用する用語「ＨＢＶ  Ｓペプチド」は、HBVゲノムの全Ｓ領域（すなわちプレ−Ｓ１及びプレ−Ｓ２領域を除く）によりコードされるペプチドを言う。本明細書中で使用する用語「ＨＢＶ  プレＳ２ペプチド」は、ＨＢＶゲノムの完全なプレＳ２とＳ領域によりコードされるペプチドを言う。本明細書中で使用する用語「ＨＢＶ  プレＳ１ペプチド」は、ＨＢＶゲノムの完全なプレＳ１、プレＳ２およびＳ領域によりコードされるポリペプチドを言う。本明細書中で使用する用語「エピトープ」は、指定のゲノム領域によりコードされる少なくとも６つの連続アミノ酸の配列を言う（例えば、「ＨＢＶプレＳ２エピトープ」とはＨＢＶゲノムのプレＳ２領域によりコードされる少なくとも６つの連続アミノ酸の配列を言う）。本明細書中で使用する用語「Ｔ細胞エピトープ」は、Ｔ細胞の表面上のレセプターと相互作用して免疫応答を増強するかあるいは免疫応答をもたらすエピトープを言う。本明細書中で使用する「抗原性」は、免疫応答を惹起せしめる能力（例えば抗原として作用する）、抗体産生を引き起こす能力（例えば抗原として作用する）および／または表面細胞レセプターと相互作用して免疫応答もしくは抗体産生を増強するような能力を意味する。
用語「ＨＢＶ」は、文献〔P. Valenzuela, Nature第280巻, 815頁（1979）；Gerlich, EP-A-85 111 361；Neurath, EP-A-85 102 250〕中に記載されたウイルスの任意のサブタイプ、特にadw，ayw，adrおよびayrを意味する。１または複数のエピトープの抗原性を媒介するポリペプチド配列a）を構成するそのペプチド配列の例を、配列表（配列番号17〜20，22）に示す。
本発明の好ましい態様は、次の組合せである：
−HBVゲノムのプレ−Ｓ１、及び／又はプレ−Ｓ２領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ（決定基）を有するHBV Ｓ−抗原粒子；
−HBVゲノムのプレ−Ｓ１、プレ−Ｓ２、及び／又はＳ領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ（決定基）を有するHBVコア−抗原粒子；
−HBVゲノムのＳ、プレ−Ｓ１及び／又はプレ−Ｓ２領域によりコードされるペプチドの特異的エピトープ（決定基）を有する肝炎Ａ−抗原粒子。
本発明にとって好ましい組換えＤＮＡ分子は、１または複数のＴ細胞エピトープの抗原性を媒介するポリペプチド配列a）をコードする配列、および分泌時に10nm以上の直径を有する粒子を形成するポリペプチドb）をコードする配列（両配列とも適当なプロモーターの調節下にある）の存在により特徴づけられる。a）をコードする配列の例としては、配列表の配列番号１〜24又は28〜34のもとに記載した配列を挙げることができる。ポリペプチド配列b）をコードするＤＮＡ配列の例は、配列表の配列番号25〜27又は35の配列のいずれかにより表される。
24種の配列（配列番号１〜24）のいずれかを配列表中の配列番号25〜27のもとに開示される配列と組み合わせることができ、この場合ａ−ｂとｂ−ａの両方の順序が包含される。
特に好ましい本発明の態様は、粒子形成物としての配列番号26および／または27の配列と組み合わせた配列番号28のエピトープ（ＨＢＶのＳ１配列のアミノ酸９〜28を含む配列に相当する）の組合せを含んで成る。
本発明の組換えＤＮＡ構成物において使用する肝炎ウイルス配列は、制限断片の単離と連結、合成装置（Cyclon, Bio-Search）を使ったオリゴヌクレオチドの化学合成、およびＰＣＲ法による合成〔T.J. White, N. Arnleim, H.E. Erlich, 1989, The Polymerase Chain Reaction, Technical Focus 5(6)〕を包含する任意の手段により作製または単離することができる。
好ましい組換えＤＮＡ分子は、合成オリゴヌクレオチドをＨＢＶゲノムのＳ領域からの5′XbaＩ−BglII3′断片（配列番号27）（これは完全なプレＳ１−プレＳ２−Ｓ領域を含むBglII−BglIIＨＢＶ断片から誘導される）に、または完全なＳ領域に連結せしめることにより作製した。そのような構成物の作製に用いるオリゴヌクレオチドを下の表Ｉに要約する。
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他の好ましいＤＮＡ分子は、ＰＣＲ法により調製されそしてＴ細胞エピトープをコードするコア配列を、ポリペプチド配列b）として機能するＨＢＶのコア配列（配列番号25）に連結せしめることにより作製した。それらの構成物の作製に用いるオリゴヌクレオチドを表II−１に与える。
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表II−２は、ＨＢＶゲノムの制限切断によりＴ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列を単離し、そして上記に定義したポリペプチド配列b）をコードする配列に連結せしめた幾つかの例を示す。
0003857305.tif 000004
表II−３に特定の組換えＤＮＡ分子を列挙する。それらの作製方法は実施例の中でより詳細に記載する。
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本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子は、ポリペプチドa)およびb)をコードする領域に加えて、選択マーカーをコードする追加のＤＮＡ配列を含んで成る。更に、それらは発現に不可欠な全ての有用な要素、例えばプロモーター配列、開始コドンおよびポリアデニル化配列を含んで成る。
適当なプロモーターの例は、宿主細胞として哺乳動物細胞を使った場合、メタロチオネイン（MT）、U2およびH2Kプロモーターである。酵母または細菌細胞を使う予定ならば、それぞれ適当な酵母および細菌プロモーター、例えばGCN4およびGAL 1/10プロモーター、または原核性trpおよびtacプロモーターをそれぞれ使うことができる。
本発明に係るポリペプチドa）とポリペプチドb）の組合せを生産するためには、組換えＤＮＡ分子をトランスフェクションにより（哺乳動物細胞の場合）、形質転換により（酵母および細菌細胞の場合）または他の手段により、宿主細胞中に挿入する。組換えＤＮＡ分子を転写および翻訳することのできる任意の生物の細胞、例えば哺乳動物、細菌および酵母細胞を宿主として使用することができる。
本発明に係る適当な哺乳動物細胞は、例えば、VERO細胞（サル腎臓細胞系）、3T3、C127およびＬ細胞（マウス繊維芽細胞系）、並びにCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞であり、それらはデヒドロ葉酸レダクターゼが陽性または陰性のいずれかである。
本発明の特定態様によれば、それぞれポリペプチド配列a）とポリペプチド配列b）をコードする上記に定義した第一のＤＮＡ配列と上記に定義した第二のＤＮＡ配列が、異なる組換えＤＮＡ分子中に存在することも更に可能であり、その場合、それらの組換えＤＮＡ分子の両者により宿主細胞が同時トランスフェクトされる。
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表IIIは、本発明のＤＮＡ構成物を与えるための適当なＤＮＡ配列の組合せ方法についての大要を示す。この表に示されるいずれの構成物も、組み合わせて、宿主細胞中にトランスフェクトされると取り込まれて慢性ウイルス性肝炎の治療用医薬としての組合せ〔ポリペプチドa）とb）を含んで成る〕を生産することのできるＤＮＡ配列を提供することができることに注意すべきである。Ｔ細胞エピトープ配列をコードするＤＮＡ配列は、Biosearch Cyclon合成装置を用いて合成的に（SYN）、ＰＣＲ法により（PCR）、またはウイルスゲノムの制限酵素切断により（GENE）、調製した。
慢性ウイルス性肝炎を有する患者の治療のために、ポリペプチド配列a）と担体b）の組合せを、任意の種類の医薬組成物中に製剤することができる。該医薬組成物は、適当な希釈剤または医薬担体材料、例えば緩衝液を更に含んで成る。
投与は、任意の方法、即ち非経口（例えば静脈内または筋肉内）または経口（例えば活性物質を被包する細菌細胞を使うことによって）により行うことができる。
医薬組成物は、投与によって応答を惹起せしめるのに十分な濃度において上記の組合せを含んで成る。
【図面の簡単な説明】
図Ｉは、プロモーター、粒子形成物配列および選択遺伝子をコードするＤＮＡ構成物を示す（実施例３／４に記載）。
図IIは、プロモーター、完全なHB-S-Agを有するエピトープおよび選択遺伝子をコードするＤＮＡ遺伝子構成物を示す（実施例３／18に記載）。
図IIIは、プロモーター、粒子形成物残基を有するエピトープおよび選択遺伝子をコードするＤＮＡ構成物を示す（実施例３／21に記載）。
図IVは、Hepa-Care処置中のチンパンジー１のAST値を示す（実施例10／１に記載）。
図Ｖは、Hepa−Care処置中のチンパンジー１の抗原値を示す（実施例10／１に記載）。
図VIは、Hepa-Careで３回追加免疫処置したチンパンジー１の肝酵素ATLとGGT値を示す（実施例10／２に記載）。
図VIIは、Hepa-Care処置中のチンパンジー２の肝酵素ALT，ASTおよびGGT値並びに抗原値を示す（実施例10／３に記載）。
図VIIIは、未処置の対照チンパンジーについて測定された肝酵素を示す（実施例10／３に記載）。
図IXおよびＸは、それぞれHepa-Care処置中の患者１の抗原価および抗体価を示す（実施例11に記載）。
図ＸＩおよびＸIIは、それぞれHepa-Care処置中の患者２の抗原価および抗体価を示す（実施例11に記載）。
図ＸIIIおよびＸIVは、それぞれHepa-Care処置中の患者３の抗原価および抗体価を示す（実施例11に記載）。
本発明を次の実施例により更に詳細に説明する。
実施例１
1.  ポリエチレングリコール（PEG）を用いた分別沈澱
ＨＢＶタンパク質を生産する培養物の上清を収集し、2,400ml部分に分けた。各部分に144gのPEG 6000（Serva）を添加し、室温で20分間攪拌しながら溶解させ、更に４℃で６時間攪拌した。500ml容器中でGS 3ローター中で10℃にて9,000rpm（15,000×g）で30分間遠心することにより沈澱を分離した。上清を収集し、144gのPEG6000を添加し、上記と同様に溶解させた。その溶液を４℃で３時間攪拌した。遠心を60分間続けたこと以外は上記と同様にしてこの溶液から沈澱を回収した。
2.  ゲルクロマトグラフィー
PEG沈澱後に得られた物質を20mlのPBSに再溶解し、A-5m（BioRad）上でのゲルクロマトグラフィーにかけた。カラム寸法は25×1000mmおよび480mlのベッド容積であった。典型的な分画操作では、PEG沈澱したＨＢＶタンパク質1,000μgを10〜15mlにおいて負荷し、そして６滴／分（18ml／時）の速度でPBSを使って溶出せしめた。３mlの画分を収集した。ＨＢＶタンパク質は最初のピークに溶出した。収集した画分をCsCl勾配にかけた。
3.  CsCl勾配中での沈降
A-5m上でのカラムクロマトグラフィーでの最初のピークを包含し且つ予備精製されたＨＢＶタンパク質を含む約30画分を約100mlに集めた。この溶液をCsClで1.30g/ccの密度に調整し、次いでSW  27/28ローター（Beckman）に合ったポリアロマー試験管に移した。1.35g/ccのCsCl溶液4mlを下層しそしてその上に1.25g/ccの密度の溶液4mlを、次いで1.20g/ccの密度の溶液4mlを重層することにより、勾配を設定した。この勾配を10℃にて28,000rpmにおいて50時間実施し続けた。その後、勾配を分別し、1.20g/cc密度の層中に浮いている精製ＨＢＶタンパク質を収集した。透析袋中での水に対する３回の透析により、この溶液を脱塩した。
実施例２
ＨＢＶタンパク質の定量
1.  ラジオイムノアッセイによる定量
AUSRIA II-125「サンドイッチ」ラジオイムノアッセイ（Abbotから市販されている）において、Ｂ型肝炎表面抗原に対するモルモット抗体（抗HBs）がコーティングされたビーズを、血清、血漿または精製タンパク質および適当な対照と共にインキュベートした。存在し得るHBsAgを固相抗体に結合させた。未結合物質を吸引しそしてビーズを洗浄した後、ヒト125Ｉ−抗HBsをビーズ上の抗体−抗原複合体と反応せしめた。次いでビーズを洗浄して未結合の125Ｉ−抗HBsを除去した。
）−抗HBs  HBsAg
）−抗HBs・HBsAg  125Ｉ−抗HBs
）−抗HBs・HBsAg・125Ｉ−抗HBs
ビーズ上に残っている放射能をガンマシンチレーションカウンター中でカウントした。
2.  ELISAによる定量
Enzygnost HBsAg微量「サンドイッチ」アッセイ（Behringから市販されている）において、ウエルを抗HBsでコーティングした。血清、血漿または精製タンパク質と適当な対照をウエルに添加し、インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識HBSAg抗体を残余の抗原決定基と反応せしめた。未結合の酵素接合抗体を洗浄により取り除き、そして固相上の酵素活性を測定した。過酸化水素と色素原との酵素触媒反応を希硫酸の添加により停止させた。色の強度は試料のHBsAg濃度に比例し、HBsAg濃度は、未知試料の色の強度と付随の正および負の対照血清の色の強度との分光学的比較により得られた。
実施例３
プロモーター、所望の抗原配列および選択遺伝子を含む本発明の遺伝子構成物の調製。
1.  MTプロモーターの単離
プラスミドpBPV-342-12（ATCC 37224）をエンドヌクレアーゼBglIIとBamHIで消化した。３つのＤＮＡ分子が生成した。着目の断片は、4.5kbを有しメタロチオネインプロモーターとpBR322配列を含み、他の断片（2.0kbおよび7.6kb）から容易に識別可能である。
反応緩衝液200μlの総容量で各制限酵素100単位を含む0.5μg/μl  ＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。消化の完結は、37℃で３時間のインキュベーション後に0.8％アガロースゲル上でのアガロースゲル電気泳動により確認した。反応は４μｌの0.5M EDTAの添加により停止させた。
調製用1.2％アガロースゲル電気泳動により4.5kb断片を他の断片から分離した。ＤＮＡをアガロースゲルからDE-81 Whatman濾紙上に溶出せしめ、その濾紙から高塩緩衝液中でＤＮＡを取り出した。フェノール−クロロホルム抽出と２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。
2.  ＨＢＶコア抗原をコードする1.8kb断片の連結
ＨＢＶ含有ＤＮＡからＨＢＶコアコード領域を含む1.8kbのBamHI-BamHI断片を単離した。この断片を、MTプロモーターとpBR残基を含む4.5kb断片（１に記載）と一緒に連結せしめた。
２μｌの1.8kb断片を３μｌの4.5kb断片と混合し、２単位のＤＮＡリガーゼと2mMのATPを含む総容量10μｌの連結緩衝液中で14℃にて一晩連結せしめた。
この連結混合物をＤＮＡ取り込みのためコンピテント細菌細胞懸濁液150μｌに添加した。ＤＮＡ取り込み後、50μｌ／mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液50〜300μｌの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレートを37℃で一晩インキュベートした。１つの単離した細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。
3.  所望のプラスミドを含む細菌コロニーのスクリーニング
単一コロニーを爪楊枝で取り、LB−アンピシリン培地の入った試験管（５ml）に移した。この試験管を迅速振盪環境下で37℃にて一晩インキュベートした。各増殖細菌懸濁液のミニプラスミド調製物を作製した。種々の生成したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼBglIIでの消化により確かめた。２つの分子、400bp断片と5.9kb断片が期待された。消化物をアガロースゲル電気泳動により分析した。細菌細胞からプラスミドＤＮＡを単離した。
4.  ネオマイシン選択マーカーの挿入
上記の３から得られたプラスミドを制限酵素EcoRIでの消化により直鎖状にした。50μｌの総容量および1μg/μｌプラスミドＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。50単位のEcoRIを添加し、37℃で３時間インキュベーションした後でアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。１μｌの0.5M EDTAの添加により反応を停止させ、そして最終濃度0.3Ｍの酢酸ナトリウムと３〜４容のエタノールを用いて−80℃にて30分間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを50μｌの蒸留水に溶かした。
直鎖状プラスミド2μｌを、メタロチオネインプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むＤＮＡ断片〔プラスミドpMT-neo-E（ATCC/Exogeneから入手可能）からエンドヌクレアーゼEcoRIでの消化により3.9kb断片として単離したもの〕３μｌと混合し、一緒に連結せしめた。単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。
5.  U2プロモーター配列を含む断片の単離
プラスミドpUC-8-42（Exogeneから入手可能）を制限エンドヌクレアーゼEcoRIとApaIで消化した。２つのＤＮＡ分子が生成した。着目の断片は、340bpを有するU2プロモーターを含み、他方の断片（3160bp）から容易に検出可能である。
反応緩衝液200μｌの総容量で各制限酵素100単位を含む0.5μg/μｌでＤＮＡ最終濃度において反応を実施した。消化の完結は、37℃で３時間のインキュベーション後に0.7％アガロースゲル中でのアガロースゲル電気泳動により確認した。４μｌの0.5M EDTAの添加により反応を停止させた。調製用1.2％アガロースゲル電気泳動により340bp断片をプラスミドＤＮＡから分離した。ＤＮＡをアガロースゲルからED-81 Whatman濾紙上に溶出せしめ、その濾紙から高塩緩衝液中でＤＮＡを取り出した。フェノール／クロロホルム抽出と２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。
6.  ポリリンカープラスミド中へのプロモーター配列含有断片の挿入
ポリリンカー配列（次の制限部位を含む：EcoRI, SacI, SmaI, AvaI, BamHI, BglII, SalI, PstI, HindIII）を含むプラスミドpSP165（Promega Biotecから入手可能）を制限酵素EcoRIにより直鎖状にした。50μｌの総容量において１μg/μｌプラスミドＤＮＡの最終濃度で反応を実施した。50単位のEcoRIを添加し、そして37℃にて３時間のインキュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。１μｌの0.5M EDTAの添加により反応を停止させ、最終濃度0.3Mの酢酸ナトリウムと３〜４容のエタノールを用いて−80℃にて30分間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを50μｌの蒸留水に溶かした。
プラスミドＤＮＡ  ２μｌをU2プロモーター配列を含むＤＮＡ断片10μｌと混合し、２単位のT4-DNAリガーゼと2mMのATPを含有する総容量25μｌの連結緩衝液中で14℃にて一晩連結せしめた。その後、フェノール／クロロホルム抽出に次いで２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製し、そして10μｌの蒸留水に溶解させた。生成したEcoRIとApaI粘着末端を平滑末端に変換して連結させなければならなかった。次のようにしてマングビーンヌクレアーゼとの反応により粘着末端を平滑末端に変換した：反応緩衝液中のＤＮＡ（１μg/μｌ濃度）25μｌに20単位の酵素を添加し、１％グリセロールの最終濃度と35μｌの最終反応容量を与えた。30℃にて30分間のインキュベーション後、フェノール−クロロホルム抽出に続く２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。このＤＮＡを再度５μｌの蒸留水に溶かした。生じた平滑末端を、上記で使用したものより10倍高いＴ４リカーゼと２mMのATPを含む15μｌの反応液中で14℃にて一晩一緒に連結せしめた。
この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため150μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。ＤＮＡ取り込み後、50μｌ／mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液50〜300μｌの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレートを37℃で一晩インキュベートした。単一の単離した細菌コロニーを、所望のU2プロモーター断片を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。得られたプラスミドを細菌細胞から単離し、制限酵素分析により特徴づけた。
7.  合成オリゴＤＮＡヌクレオチド89（配列番号：30）とMTプロモーター断片（4.5kb）との連結
MTプロモーターとpBR残基を含む4.5kb断片（１に記載）を合成オリゴヌクレオチド89（配列番号：30）と一緒に連結せしめた。この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため150μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単一の単離した細菌コロニーを、所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌクレアーゼEcoRIとXbaIでの消化により確かめた。１つは2.0kbで１つは2.6kbの２つの分子が期待された。
8.  合成オリゴヌクレオチド101（配列番号：32）とプラスミド（７に記載）との連結
プラスミド（７に記載）をBglIIとBamHIで消化し、13ヌクレオチドの断片を取り出した（１に記載）。第一のオリゴヌクレオチド89（配列番号：30）を含む生成断片を、BglII−BamHI断片であるオリゴヌクレオチド101（配列番号：32）と連結せしめた。ＤＮＡ取り込み後、単細胞を所望のプラスミドについてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌクレアーゼEcoRIとXbaI、またはEcoRIとBglIIでの消化により確かめた。
9.  合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド99（配列番号：31）と4.5kb断片（１に記載）との連結
4.5kb断片（BglII−BamHI）をＤＮＡオリゴヌクレオチド99（配列番号：31）と連結せしめた。様々なＤＮＡを含む単一細胞コロニーのスクリーニング後、所望のプラスミドをEcoRIでの消化（1.9kbと2.7kbの２断片を生じる）とBglIIまたはBamHIでの陽性の線状化により特徴づけた。
次いでこの新規プラスミドをPstIとBamHIで消化した。pBR残基、MTプロモーターおよびオリゴヌクレオチドを含む2.6kb断片と、2.0kbのpBR残基の２つの分子が期待された。2.6kb断片を単離した。
10. ９に記載のプラスミドの2.6kb断片とプラスミド（８に記載）から単離した断片との連結
ＤＮＡオリゴヌクレオチド89と101（それぞれ配列番号30と32）を含むプラスミド（８に記載）をPstIとBglIIで消化した。２断片が期待された。１つはpBR残基とMTプロモーターを含む2.5kb断片で、もう１つはpBR残基と両方のオリゴを含む2.2kb断片であった。
この2.2kb断片を、８に記載のpBR残基、MTプロモーターおよびオリゴ99（配列番号：31）を含む2.6kb断片と連結せしめた。
所望のプラスミドについてスクリーニングした後、それをBglII-XbaIを使った制限エンドヌクレアーゼ消化により特徴づけた。オリゴＤＮＡヌクレオチドの270bp断片およびMTプロモーターとpBRの4.5kb断片の２断片が期待された。
11. 2.3kb HBV BglII-BglII断片の連結
ＨＢＶ含有ＤＮＡから、ＨＢＶ  プレＳ１、プレＳ２およびＳコード領域を含む2.3kbのBglII-BglII断片を単離した。この2.3kb断片を、メタロチオネインプロモーターを含む4.5kb断片（１に記載した通りに得た）と連結せしめた。
２μｌの2.3kb断片を３μｌの4.5kb断片と混合し、そして２単位のT4-DNAリガーゼと2mMのATPを含む総容量10μｌの連結緩衝液中で14℃にて一晩連結せしめた。
この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため150μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。ＤＮＡ取り込み後、50μｌ／mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に、プレートあたり細胞懸濁液50〜300μｌの容量で細菌細胞を塗抹した。この寒天プレートを37℃で一晩インキュベートした。単離した単一の細菌コロニーを、所望の断片を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。
12. ＨＢＶコアエピトープによるＨＢＶ遺伝子配列の一部分の変換
上記の11から得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼBglIIとXbaIで消化した。１つが550bp断片で１つが6.25kb断片である２つの分子が期待され、アガロースゲル電気泳動後に6.25kb断片を単離した。
6.25kb断片を、ＨＢＶコア遺伝子のエピトープ部分をコードする10に記載のプラスミドの270bp断片（上記と同様なBglIIとXbaIでの消化および断片の単離後）と連結せしめた。
この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため150μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単離した単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラスミドをBamHIでの消化により確かめた。950bp，450bpおよび5,150bp断片の３分子が期待された。
13. 「ビヒクル」プラスミドの調製
プラスミド（11に記載）をEcoRIとXbaIで消化した。2,450bp断片と4,350bp断片の２分子が期待され、ゲル電気泳動4,350bp断片を単離した。
この4,350bp断片を、ATGからXbaI部位までのＨＢＶ−Ｓ遺伝子の全ＤＮＡ配列をコードし、ATGがATAに変更されているＤＮＡオリゴヌクレオチド39（配列番号：29）と連結せしめた。
14. 完全なＨＢＶ−Ｓ遺伝子の上流のコアエピトープ
次いでこの「ビヒクル」プラスミドをPstIとXbaIで消化すると、600bpプラスミド残基と3,850bp断片の２分子が期待され、後者の断片を単離し、10に記載のプラスミドの消化後に単離された2,800bp（2,700bp）のPstI-XbaI断片と連結せしめた。
所望のプラスミドについてスクリーニングした後、それをEcoRIとXbaI、EcoRIとBglIIとBamHIを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化により特徴づけた。
15. 選択マーカーの挿入
前記プラスミド（14に記載）をEcoRIにより直鎖状にした。50μｌの総容量および１μg/μｌのプラスミドＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。50単位のEcoRIを添加し、37℃で３時間インキュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。
１μｌの0.5M EDTAの添加により反応を停止させ、そして最終濃度0.3Ｍの酢酸ナトリウムと３〜４容のエタノールを用いて−80℃にて30分間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを50μｌの蒸留水に溶かした。
直鎖状プラスミド２μｌを、メタロチオネインプロモーターとネオマイシン選択遺伝子を含むＤＮＡ断片（４に記載）３μｌと混合し、一緒に連結せしめた。単一の細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングし、プラスミドを単離しそして特徴づけた。
上述した各遺伝子構成物は、EcoRIとBglIIでの消化後、MTプロモーター含有DNA断片を、EcoRIとBglIIによる消化後に単離されたU2プロモーター含有ＤＮＡ断片によって置き換えることにより、U2プロモーターを使って作製することもできる。
16. 大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（egpt）選択遺伝子の単離
プラスミドpMSGをBamHIとBglIIで消化した後、egpt選択遺伝子を含む断片（1.8kb）を単離し、そしてMTプロモーターを含む4.5kb断片（BglII-BamHI、１に記載）と連結せしめた。
所望のプラスミドについてスクリーニングした後、プラスミドを単離し、精製し、そしてBamHI部位からEcoRI部位への変換により完成させた。
17. ＰＣＲ法による所望のＤＮＡ配列の単離
１つのＤＮＡ断片（400bp）をゲル電気泳動後に単離した。その断片は、プライマーとして特定のオリゴヌクレオチド131と132（配列番号：33と34）を使ってＰＣＲ法（実施例５に記載）により作製された。
このＤＮＡ断片をエンドヌクレアーゼBamHIとXbaIで消化し、次いでゲル電気泳動により精製した。単離したＰＣＲ断片を、プラスミド（13に記載）からBglIIとXbaIでの消化後に単離された6.25kb断片と連結せしめた。ＤＮＡの取り込みと細菌の形質転換後、単一の細菌コロニーを所望のプラスミドについてスクリーニングした。
18. 選択マーカーの挿入
プラスミド（17に記載）に選択遺伝子（15に記載）を付加することによりプラスミドを完成させた。
19. H2Kプロモーターの単離
pSP65H2（Exogeneから入手可能）からEcoRI-BglII断片（２kb）としてH2Kプロモーターを単離した。
上述の全ての構成物において、どのプロモーターもEcoRI／BglII断片として交換することができる。
20. ＨＢＶ遺伝子配列の一部の変換
上記の11から得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼBglIIとXbaIで消化した。２分子が期待され、その１つが6.250kb断片であり、その断片をアガロースゲル電気泳動後に単離した。
6.250kb断片をオリゴＤＮＡヌクレオチド23（配列番号：28）と連結せしめた。この連結混合物をＤＮＡ取り込みのため150μｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。単一の単離した細菌コロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。新規プラスミドをエンドヌクレアーゼEcoRIとBglIIでの消化により確かめた。１つが1.9kbで１つが4,450kbの２分子が期待された。
21. egpt選択マーカーの挿入
前記プラスミド（20に記載）をEcoRIにより直鎖状にした。100μｌの総容量および0.6μg/μｌプラスミドＤＮＡの最終濃度において反応を実施した。60単位のEcoRIを添加し、37℃で３時間インキュベーション後にアガロースゲル電気泳動により消化を確かめた。２μｌの0.5M EDTAの添加により反応を停止させ、そして最終濃度0.3Ｍの酢酸ナトリウムと４容のエタノールを用いて−80℃にて１時間ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを50μｌの蒸留水に溶かした。
直鎖状プラスミド２μｌを、メタロチオネインプロモーターとegpt選択遺伝子を含むＤＮＡ断片（3.7kb）（16に記載）３μｌと混合し、一緒に連結せしめた。単一のコロニーを所望のプラスミドの存在についてスクリーニングした。上記と同じ方法で表IIIに記載の各遺伝子構成物を調製することができる。
実施例４
本発明の構成物を用いた哺乳動物細胞のトランスフェクション
本発明の構成物によりコードされるＨＢＶペプチドの相当量の分泌を獲得するためには、本発明のＤＮＡ構成物を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトせしめなければならない。二段階で（即ち、各構成物について別々のトランスフェクション）または一段階で（即ち、両構成物の調製物を使った１回のトランスフェクション）同時トランスフェクションを実施した。２つの構成物上での異なる選択マーカーの使用により、またはイムノアッセイによる両構成物の発現産物の分泌の検出により、同時トランスフェクションを確かめた。
あるいは、本発明のＨＢＶペプチド配列をコードする配列と、完全なＳまたはコアまたはＨＡＶタンパク質をコードする別の配列とを、単一構成物中に組み合わせることができる。
実施例５
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ポリメラーゼ連鎖反応は、既知ゲノム配列の選択した領域の特定のＤＮＡヌクレオチド配列を試験管内で百万倍以上に増幅することが可能である（Thomas J. White, Norman Arnleim, Henry A. Erlich 1989: The polymerase chain reaction. Technical Focus, 第５巻，第６号；S. KwokおよびR. Higuchi 1989: Avoiding false positives with PCR. Nature, 第339巻，237-238頁）。
細胞から単離したＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを処理してそれの相補的鎖を分離する。次いでそれらの鎖を、Ｘヌクレオチド（ここでＸは通常50〜2,000塩基対である）により隔てられた配列とマッチするように化学的に合成された過剰の２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド（各々長さ20〜25塩基対）とアニールせしめる。
この２つのオリゴヌクレオチドは、２つのオリゴヌクレオチドと一致する配列の間でＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼにより触媒される試験管内ＤＮＡ合成のための特異的プライマーとして働く。２つのプライマーオリゴヌクレオチドが正しい配列を含むならば、５′と３′に新たな消化部位を造成することが可能である。
複数回の反応サイクル後、所望の長さの多量のＤＮＡ断片が得られ、それをゲル電気泳動により精製し、そして制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動により特徴づけた。増幅された精製ＤＮＡ断片を他の断片、即ちプラスミドと連結せしめるために使った。
ＰＣＲ−ＤＮＡ断片は平滑末端で増幅された。粘着末端を与えるために（連結操作のため）、該断片を所望のエンドヌクレアーゼで消化し、再度精製しなければならない。
ＰＣＲ反応は20〜30サイクル間回転するだろう。１サイクルは、異なる反応時間と異なる反応温度（ＰＣＲ熱循環器により制御される）により３段階に分けられる。第一段階は鋳型ＤＮＡの「変性」（１分／95℃）であり、第二段階は鋳型ＤＮＡとプライマーの「ハイブリダイゼーション」（１分／55℃）であり、第三段階は「重合」（２分／72℃）である。
１回のアッセイ用の最終容量は例えば30μｌであり、これは次の最終濃度を含む：ＰＣＲ緩衝液（１×）、４種のヌクレオチド各200μＭを有するヌクレオチド混合物、２つのプライマー各々を30μｌあたり200ng、aqua bidest 30μｌあたり0.5単位のTaqポリメラーゼ。
実施例６
タンパク質を分泌するトランスフェクト細胞の培養
受容細胞（ATCCから入手可能なC127またはCHO細胞）を、第１日にペトリ皿中の標準増殖培地（DMEM＋10％ウシ胎児血清、グルコースおよびグルタミン）中に接種した（1-2×106細胞／皿、φ10cm）。翌日、培地を除去し（ＤＮＡ沈澱を細胞上に添加する４時間前）、細胞を１×PBSで２回洗浄した。次いでFCSを含まないDMEM8mlを添加し、４時間後にＤＮＡ沈澱（下記の如く調製したもの）を細胞に添加した。再び４時間後、培地を除去し、３mlのグリセロール混合物（２×TBS緩衝液50ml、グリセロール30ml、蒸留水120ml）を添加した。37℃で３分間のインキュベーション後にグリセロール混合物を即座に除去し、そして細胞を１×PBSで洗浄した。10％FCSを含むDMEM8ml中で細胞を一晩培養した。
48時間後、トリプシン−EDTA溶液（0.025％トリプシン＋1mM  EDTA）で処理することにより細胞を皿から回収した。その後、トリプシン−EDTAを除去するために細胞を１×PBSで洗浄し、10％FCSを含むDMEM中に懸濁し、そして24コスターウエルプレートに分配した（１つの皿からの細胞を４枚の24ウエルプレートに）。
細胞が十分に増殖した時、選択培地を添加した〔例えば、濃度0.5〜１mg／mlのネオマイシンまたは、キサンチン（250μg/ml）、ヒポキサンチン（15μg/ml）もしくはアデニン（25μg/ml）、チミジン（10μg/ml）、アミノプテリン（２μg/ml）、ミコフェノール酸（25μg/ml）〕。最初の増殖中の細胞コロニーは２週間後に認められた。
10μgのプラスミドＤＮＡと20μgの担体ＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡ、子ウシ胸腺ＤＮＡ）に、TE緩衝液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.05）を440μｌの最終容量になるように添加し、そして60μｌの2M CaCl2と混合した。次いで等量の２×TBS（Hepes 50mM, NaCl 280mM, Na2HPO4 1.5mM, pH 7.05）を添加し、よく混合した。沈澱溶液を37℃で30分間インキュベートし、そしてトランスフェクトせしめる予定の細胞に直接添加した。
実施例７
精製粒子のアジュバントの調製
無菌の食塩溶液中に懸濁した所望の濃度の抗原に、１：10,000容のチメロゾール、1/10容の濾過滅菌済0.2M KAl(SO4)2・12 H2Oを添加した。無菌の1N NaOHでpHを5.0に調整し、そして懸濁液を室温で３時間攪拌した。ミョウバン沈澱した抗原を2,000rpmで10分間の遠心により回収し、１：10,000チメロゾールを含む無菌の標準食塩溶液中に再懸濁し、そして無菌条件下でアリコートに分けた。
実施例８
Ｂ型肝炎コア抗原の精製
ＨＢコア抗原分泌細胞の細胞上清を収集し、限外濾過により濃縮した。この濃縮物をBeckman SW28ローター中で４℃にて20,000rpmで15分間の遠心により清澄化した。
Beckman SW28ローター中４℃にて28,000rpmで24時間のショ糖密度勾配遠心（0〜45％ショ糖）により粒子形成を試験した。勾配を分画し、１画分ずつをELISAにより分析した。
実施例９
下表は、本発明の免疫原性粒子の後述のELISA分析の幾つかの結果を与える。
表IVは、抗プレＳ１モノクローナル抗体MA 18/7と抗HBsモノクローナル抗体G022を用いた、プレＳ１エピトープとＳ領域を含む本発明のＨＢＶ配列構成物から生産された精製HBs抗原粒子のELISAデータを示す。
表IVは、CsCl密度勾配後に収集した画分（21）を示す。
0003857305.tif 000008
0003857305.tif 000009
表Ｖは、ＨＢコアに対するポリクローナル抗体とHB-S-Agに対するモノクローナル抗体G022を用いた、本発明の任意のＨＢコア配列構成物から生産された精製ＨＢコア抗原粒子のELISAデータを示す。
0003857305.tif 000010
0003857305.tif 000011
実施例10
チンパンジーにおけるHepa-Careの投与実験
Hepa-Careは、特定の配合比（50:50）においてＢ型肝炎表面抗原（Ｓ１およびＳ）を提示する粒子であり、肝炎ウイルスの慢性保有者の治療に使われる。
実験１
Ｂ型肝炎保有チンパンジー１を、第０，４および８週に注射１回あたり18μgの用量においてHepa-Careで処置（筋肉内）した。
肝酵素（図IV）並びにＢ型肝炎抗原レベル（図Ｖ）をモニタリングした。
実験２
上記処置後のチンパンジー１を第30，34および38週に追加免疫処置した。その結果を図VIに示す。
実験３
チンパンジー２をHepa-Careで処置した。ただし、チンパンジー１とは異なり、静脈内に与えた。用量は２mgであった。結果を図VIIに示す。
対照チンパンジー３からも肝酵素をモニタリングし、その結果を図VIIIに示す。
実施例11
Hepa-Careでの処置：
（定義については実施例10を参照のこと）
患者１（男性、年齢65才、病歴２年）：
0003857305.tif 000012
を、第０，１，６および７か月にHepa-Careで処置（i.m.）した。抗原および抗体測定の結果を図IXとＸに与える。
患者２（女性、年齢48才、病歴12年）：
0003857305.tif 000013
を、第０，１および６か月にHepa-Careで処置（i.m.）した。抗原および抗体測定の結果を図ＸＩとＸIIに与える。
患者３（女性、年齢41才、病歴５年）：
0003857305.tif 000014
を、第０，１，２および５か月にHepa-Careで処置（i.m.）した。HBs抗原および抗HBs抗体の測定値を図ＸIIIとＸIVに示す。
配列表
配列番号：１
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：558bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：ＰＣＲ増幅
0003857305.tif 000015
配列番号：２
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：504bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：ＰＣＲ増幅
0003857305.tif 000016
配列番号：３
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：504bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：ＰＣＲ増幅
0003857305.tif 000017
配列番号：４
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：534bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：ＰＣＲ増幅
0003857305.tif 000018
配列番号：５
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：534bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：ＰＣＲ増幅
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配列番号：６
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：87bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000020
配列番号：７
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：81bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000021
配列番号：８
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：114bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000022
配列番号：９
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：90bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000023
配列番号：10
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：261bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000024
配列番号：11
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：291bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000025
配列番号：12
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：123bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000026
配列番号：13
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：138bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
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配列番号：14
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：294bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ２  ayw/adw
直接の起源：ＨＢＶ  ＤＮＡ
0003857305.tif 000028
配列番号：15
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：99bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000029
配列番号：16
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：390bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：ＰＣＲ増幅
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配列番号：17
配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ：60bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ１  ay
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000031
配列番号：18
配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ：63bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ１  ay
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000032
配列番号：19
配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ：63bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ１  ay
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000033
配列番号：20
配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ：108bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ１  ay
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000034
配列番号：21
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：63bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ１  ad
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000035
配列番号：22
配列の型：ヌクレオチドと対応するタンパク質
配列の長さ：108bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ１  ad
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000036
配列番号：23
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：60bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ２  ay
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000037
配列番号：24
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：60bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ２  ay
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000038
配列番号：25
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：558bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア  adw
直接の起源：ＰＣＲ増幅
0003857305.tif 000039
配列番号：26
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：678bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ  adw/ayw
直接の起源：ＨＢＶ  ＤＮＡ
0003857305.tif 000040
配列番号：27
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：585bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ  adw/ayw
直接の起源：ＨＢＶ  ＤＮＡ
0003857305.tif 000041
配列番号：28
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：106bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ１
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000042
配列番号：29
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：115bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶ  Ｓ
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000043
配列番号：30
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：108bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000044
配列番号：31
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：106bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000045
配列番号：32
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：89bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000046
配列番号：33
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：25bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000047
配列番号：34
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：25bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：化学合成
0003857305.tif 000048
配列番号：35
配列の型：ヌクレオチド
配列の長さ：588bp
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
起源：ＨＢＶコア
直接の起源：ＰＣＲ増幅
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【図１】
0003857305.tif 000050
【図２】
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【図３】
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【図４】
0003857305.tif 000053
【図５】
0003857305.tif 000054
【図６】
0003857305.tif 000055
【図７】
0003857305.tif 000056
【図８】
0003857305.tif 000057
【図９】
0003857305.tif 000058
【図１０】
0003857305.tif 000059
【図１１】
0003857305.tif 000060
【図１２】
0003857305.tif 000061
【図１３】
0003857305.tif 000062
【図１４】
0003857305.tif 000063