(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フザリウム・サブグルチナンス（Fusarium  subglutinans）に属し、シンビジウム黄斑病の発病抑制機能を有する弱病原性フザリウム菌の懸濁液に、シンビジウムの幼苗の地上部を浸漬することを特徴とする弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法。
【請求項２】
弱病原性フザリウム菌がフザリウム・サブグルチナンス（Fusarium  subglutinans）ＨＰＦ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６６）であることを特徴とする請求項１に記載の弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法。
【請求項３】
シンビジウムの幼苗が、フラスコ苗もしくは寄せ植え（ＣＰ）苗であることを特徴とする請求項１または２に記載の弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、シンビジウムに発生するシンビジウム黄斑病の発病抑制機能を有するフザリウム菌の効率的接種方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
シンビジウムに発生する病害に対する防除法としては、株の廃棄などによる耕種的防除が従来の対策である。化学農薬の使用は、シンビジウムに対して農薬登録がないために使用できない。
しかしながら、生産農家では、シンビジウム黄斑病等の防除に病原菌がフザリウム菌という理由などから、ベノミル剤や銅剤を使用している。ところが、ベノミル剤は高率にベノミル剤耐性菌が発生しており、ほとんど防除効果がない。また銅剤は薬害が発生し、シンビジウムの商品価値を極端に低下させる。したがって実用上防除の決め手がないのが現状である。
【０００３】
第２に、近年、無農薬栽培が望まれている中において、農薬に代わる安全で有効な病害防除として有望視されている生物防除方法がある。これは植物に有用で無害な、自然界に存在する微生物を利用するものである。
【０００４】
実際には、バチルス属菌、シュ−ドモナス属菌、トリコデルマ属菌等が知られ、土壌伝染性病原菌に対する拮抗微生物として土壌病害を防除することがわかっている。また非病原性フザリウム（Fusarium）菌が病害に対して抵抗性を植物に付与する作用で、病害防除作用があることが知られている。それらの一部は、実際に微生物製剤として販売されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、フザリウム菌については、非病原性フザリウム菌が交差防御作用により、一般的に植物に病害抵抗性を付与することは知られている。そして種々の土壌病害について、どの非病原性フザリウム菌に防除、抑制作用が存在するか否かを確認する作業が行なわれている。
しかしながら、いまだかつて弱病原性フザリウム菌によるシンビジウム黄斑病の発病抑制については、何ら試みられていないのが現状である。
【０００６】
そこで、本発明者は下記の方法により、シンビジウム黄斑病を防除、抑制する弱病原性フザリウム菌の検索をした。
ａ）シンビジウム黄斑病が多発していたハウスの感受性品種の中から病徴が認められない外観上健全な株を選び、この菌について組織内分離を行ない、フザリウム菌を得た。
ｂ）上記のようにして得たフザリウム菌の菌体をシンビジウムの株全体に噴霧し、３日間放置した。
ｃ）その後シンビジウム黄斑病菌の菌体を噴霧接種し、シンビジウム黄斑病の発病を抑制するフザリウム菌を得た。
【０００７】
得た弱病原性フザリウム菌は、シンビジウム黄斑病（黄斑系統菌、黒斑系統菌）に対する高い発病抑制作用を備えていた。そしてこのように菌体の茎葉への感染によって、茎葉病害(黄斑病)が防除できる弱病原性フザリウム菌は、いままで存在しなかったのである。
また、上記菌体は極めて長期間（デ−タでは７ヶ月間、実際には生育終了時までと考えられる）の発病抑制作用を発揮することができるものであった。したがって、１回の菌体の接種のみでほぼ生育終了まで発病抑制作用が有効であり、接種を複数回繰り返す必要がないため、非常に効率的な病害の防除を図ることができる。
【０００８】
ところで、上記弱病原性フザリウム菌の菌体はシンビジウムの株全体に噴霧する方法で行なっていたが、シンビジウムの株の茎葉への噴霧では接種の手間がかかりすぎて非効率である上、菌体の使用量が多くなってコスト的にも問題があり、その改善が臨まれていた。
この発明は従来例の上記欠点を解消しようとするもので、シンビジウム黄斑病の発病抑制機能を有する弱病原性フザリウム菌の懸濁液に、シンビジウムの幼苗の地上部を浸漬することにより、非常に迅速かつ効率的に接種することができ、しかも大量に処理することができて大幅なコスト削減を達成することができる、弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法を提供しようとするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
すなわちこの発明の弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法は、フザリウム・サブグルチナンス（Fusarium  subglutinans）に属し、シンビジウム黄斑病の発病抑制機能を有する弱病原性フザリウム菌の懸濁液に、シンビジウムの幼苗の地上部を浸漬することを特徴とするものである。
【００１０】
この発明の弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法は、上記弱病原性フザリウム菌がフザリウム・サブグルチナンス（Fusarium  subglutinans）ＨＰＦ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６６）であることをも特徴とするものである。
【００１１】
この発明の弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法は、上記シンビジウムの幼苗が、フラスコ苗もしくは寄せ植え（ＣＰ）苗であることをも特徴とするものである。
【００１２】
上記菌株は、後述するように、ＰＤＡ平板培地（グルコ−ス添加ジャガイモ煎汁寒天培地，Potato−dextrose−agar）で２５℃、２週間培養後にコロニー形状を観察したところ、紫色の色素を産出していた。またＢＬＢ照射下において、ＳＮＡ培地（Spezielle−Nahstoffarmer−agar）で２５℃、５８日間培養後に形態的特徴を光学顕微鏡下で観察したところ、大型分生子がやや鎌型からほぼ直線で、小型分生子は卵形から長円形で、常に分生子柄上に擬頭を形成した。フィアライドは、モノフィアライドが主体で、ポリフィアライドがしばしば見られ、フザリウム・サブグルチナンス（Fusarium subglutinans （Nelsonら、1983））と同定された。
【００１３】
ここで分離した菌株は、フザリウム・サブグルチナンス ＨＰＦ−１と命名し、これを産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に平成１３年３月１９日付けで寄託したところ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６６として受託された。
【００１４】
この発明は、フザリウム・サブグルチナンスのこのような優れたシンビジウム黄斑病の発病抑制作用を利用した弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法を提供するものである。
【００１５】
すなわち、このフザリウム・サブグルチナンスの生菌を植物に施用する方法としてはメリクロン苗の茎葉や根部に直接することが好ましい。接種する方法としては、浸漬がもっとも望ましい方法である。
そしてメリクロン苗には、フラスコ苗もしくはＣＰ苗の状態でフザリウム・サブグルチナンスの生菌が施用される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下この発明の弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明する。ただし、この発明はこれらに限定されるものではない。
【００１７】
【実施例１】
［弱病原性フザリウム菌の接種］
弱病原性フザリウム菌のnit変異株を用い、接種効率を調べた。弱病原性フザリウム菌の接種は、次のように行った。
フラスコ内で培養しているメリクロン苗(品種：ラブリー エンジェル‘ザ ツー バージンズ’)をフラスコから出し、ＨＰＦ−１ nit変異株の懸濁液に地上部を浸漬して接種を行った。nit変異株の懸濁液の濃度は、1×107、1×106、1×105、1×104cell/mlの4段階とした。浸漬接種後、nit変異株を感染させるため、２５℃湿度１００％の条件下に３日間置いた。感染処理後、苗を寄せ植えにしてハウス内で栽培を行った。
【００１８】
【比較例１】
弱病原性フザリウム菌のnit変異株を用い、接種効率を調べた。弱病原性フザリウム菌の接種は、次のように行った。
フラスコ内で培養しているメリクロン苗(品種：ラブリー エンジェル ‘ザ ツーバージンズ)をフラスコから出し、ＨＰＦ−１ nit変異株の懸濁液に根を浸漬して接種を行ったｎit変異株の懸濁液の濃度は、1×107、1×106、1×105、1×104cell/mlの4段階とした。浸漬接種後、nit変異株を感染させるため、２５℃、湿度100％の条件下に３日間置いた。感染処理後、苗を寄せ植えにしてハウス内で栽培を行った。
【００１９】
【比較例２】
弱病原性フザリウム菌のnit変異株を用い、接種効率を調べた。弱病原性フザリウム菌の接種は、次のように行った。
フラスコ内で培養しているメリクロン苗(品種：ラブリー エンジェル ‘ザ ツーバージンズ’)  にＨＰＦ−１ nit変異株を噴霧接種した。ｎit変異株の接種濃度は、1×107、1×106、1×105、1×104cell/mlの4段階とした。噴霧接種後、nit変異株を感染させるため、フラスコの蓋を閉じ、２５℃の条件下に３日間置いた。その後、苗をフラスコから出し寄せ植えにして、ハウス内で栽培を行った。
【００２０】
【比較例３】
弱病原性フザリウム菌のnit変異株を用い、接種効率を調べた。弱病原性フザリウム菌の接種は、次のように行った。
フラスコ内で培養しているメリクロン苗(品種：ラブリー エンジェル ‘ザ ツーバージンズ’)を寄せ植え（ＣＰ植え）したところに、ＨＰＦ−１ nit変異株を噴霧接種した。ｎit変異株の接種濃度は、1×107、1×106、1×105、1×104cell/mlの4段階とした。噴霧接種後、nit変異株を感染させるため、２５℃、湿度100％の条件下に３日間置いた。その後、ハウス内で栽培を行った。
【００２１】
［感染効率の調査］
実施例１、並びに比較例１〜３で弱病原性フザリウム菌を接種したメリクロン苗から、同菌を再抽出し、感染率を調査した。その結果を表１に示す。
［傷害発生の調査］
実施例１、並びに比較例１〜３で弱病原性フザリウム菌を接種したメリクロン苗の黄斑病の発病を調査した。その結果を表1に示す。
（以下余白）
【００２２】
【表１】
［弱病原性フザリウム菌nit変異株を用いた感染効率の比較］
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結果）感染効率としては、フラスコ内で噴霧処理したものが最も良好であったが、弱病原性フザリウム菌の影響により、黄斑病の病斑が見られ、実用上問題がある。地上部の浸漬処理で接種した場合は、８０％以上の感染率が見られた場合でも、黄斑病の病斑は見られず、他の方法より優れていることがうかがえる。
【００２３】
［黄斑病の防除効果］
上記で示された効率的な２種の接種法で弱病原性フザリウム菌の接種を行い、後から接種した病原性菌の防除効果について検討した。
【実施例２】
弱病原性フザリウム菌体液へ地上部を浸漬し、接種した際の黄斑病の防除効果を調べた。
フラスコ内で培養しているメリクロン苗(品種：ラブリー エンジェル‘ザ ツー バージンズ’、ラブリーバニー‘ロミオ’)をフラスコから出し、弱病原性フザリウム菌（ＨＰＦ−１)の懸濁液に地上部を浸漬して接種を行った。弱病原性フザリウム菌の懸濁液の濃度は、1×107、1×106、1×105、1×104cell/mlの４段階とした。浸漬接種後、弱病原性フザリウム菌を感染させるため、温度２５℃、湿度１００％の条件下に３日間置いた。感染処理後、苗を寄せ植えにし、ハウス内で1週間栽培を行った。この苗に病原菌を噴霧接種し、２５℃、湿度100％の条件下に３日間置き、病原菌の感染を行った。用いた病原菌は、ラブリー エンジェル‘ザ ツー バージンズ’には黄斑病菌Fusarium proliferatum race Ｂ、また‘ロミオ’には黄斑病菌Fusarium proliferatum race Ｙをそれぞれ107cell/mlで噴霧した。病原菌の感染処理後、更にハウス内で栽培を行った。
２ヵ月後、病株率、病葉率、および発病度の調査を行った。
【００２４】
【比較例４】
弱病原性フザリウム菌の懸濁液をＣＰ植え苗へ噴霧で接種した際の黄斑病防除効果を調べた。
フラスコ内で培養しているメリクロン苗(品種：ラブリー エンジェル ‘ザ ツーバージンズ’、ラブリー バニー‘ロミオ’)を寄せ植えしたところに、弱病原性フザリウム菌(ＨＰＦ−１)を噴霧接種した。弱病原性フザリウム菌の接種濃度は、1×107、1×106、1×105、1×104cell/mlの4段階とした。噴霧接種後、弱病原性フザリウム菌を感染させるため、２５℃、湿度100％の条件下に３日間置いた。感染処理後、ハウス内で１週間栽培を行った。このメリクロン苗に病原菌を噴霧接種し、２５℃、湿度100％の条件下に３日間置き、病原菌の感染を行った。用いた病原菌は、‘ザ ツー バージンズ’には黄斑病菌Fusarium proliferatum race Ｂ、また‘ロミオ’には黄斑病菌Fusarium proliferatum race Ｙをそれぞれ107cell/mlで噴霧した。病原菌の感染処理後、更にハウス内で栽培を行った。
2ヵ月後、病株率、病葉率、および発病度の調査を行った。また、弱病原性フザリウム菌の宿主に対する影響を見るために、病原菌の接種を行わなかった株も同様の栽培、および調査を行った。
表２に、発病抑制についての調査結果を示す。
【００２５】
【表２】
弱病原性フザリウム菌ＨＰＦ-1処理による黄斑病発病抑制効果
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品種：ＹＴ５７の場合、地上部の浸漬よる接種で、発病葉率、発病度ともに抑制される傾向が見られた。しかし、ＣＰ植えへの噴霧接種では、発病葉率、発病度ともに対照区と差が見られなかった。
品種：ＺＹ０３では、対照区においても、発病率が低かったものの、地上部の浸漬接種、CP植え苗への噴霧接種いずれも、発病葉率、発病度ともに抑制される傾向が見られた。しかし、地上部の浸漬処理の方が、低濃度の弱病原性フザリウム菌の処理でも、発病抑制を示していた。
【００２６】
なお、表３にシンビジウム黄斑病および腐敗病に対する発病抑制菌の形態的特徴を示す。
【表３】
シンビジウム黄斑病および腐敗病に対する発病抑制
菌の形態的特徴
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コロニー形状は、ＰＤＡ平板培地で２５℃、２週間培養後に観察した。形態的特徴は、ＢＬＢ照射下においてＳＮＡ培地で２５℃、５８日で培養したものを光学顕微鏡下で観察した。その結果、本菌は、コロニー形態および菌の形態的特徴からFusarium subglutinans（Nelsonら、1983）と同定された。
【００２７】
【発明の効果】
この発明によれば、シンビジウム黄斑病の発病抑制機能を有する弱病原性フザリウム菌の懸濁液に、シンビジウムの幼苗の地上部を浸漬することにより、非常に迅速かつ効率的に接種することができ、しかも大量に処理することができて大幅なコスト削減を達成することができる、非常に有用な弱病原性フザリウム菌のシンビジウムへの効率的接種方法を提供することが可能となった。
またシンビジウムに弱病原性フザリウム菌を効率的に接種することができるばかりか、その結果として長期間（データでは７ヶ月間、実際には生育終了時まで）黄斑病に発病抑制効果がある。