(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
0003753734.tif 000011
（式中、
Ｘは、直鎖又は分岐の、飽和又は不飽和の、Ｃ1-4アルキル鎖（これは、場合により、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個の複素原子により中断されていてもよく、かつ場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1-4アルキル、アリール及びＣ（Ｏ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）であり；
Ｙは、Ｘと同義の置換基又はＨであり；
Ｘ及びＹは、一緒になって、５員〜８員の、飽和又は不飽和複素環（これらは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、オキソ、Ｃ1-4アルキル、アリール及びＣ（Ｏ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）を形成してもよく；
Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、Ｈ；カルボキシル；Ｃ1-4アルキル；ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ1-4アルコキシカルボニル及びアミノカルボニルから選択される基により置換されているＣ1-4アルキル；プロリン以外のＤ又はＬアミノ酸のα炭素側鎖；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ；カルボキシル；アミノ；Ｃ1-4アルキル；ヒドロキシル、カルボキシル又はアミノにより置換されているＣ1-4アルキル；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｒ7は、Ｈ及び硫黄保護基から選択され；そして
Ｚは、ヒドロキシル、Ｃ1-4アルコキシ、及び、３個以上のアミノ酸残基を含むペプチドである標的分子から選択される）
で示される化合物を含む、哺乳動物における部位の放射線造影または放射線を用いた治療のための薬剤。
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が、水素である、請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
Ｘ及びＹが、独立して、Ｃ1-4アルキル及びアリール置換Ｃ1-4アルキルから選択される、請求項１記載の薬剤。
【請求項４】
Ｒ3が、ヒドロキシメチル及び１−ヒドロキシエチルから選択される、請求項１記載の薬剤。
【請求項５】
Ｘ及びＹが、メチル、エチル及びベンジルから選択される同一の基である、請求項１又は４記載の薬剤。
【請求項６】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が、水素であり、Ｒ3が、ヒドロキシメチル及び１−ヒドロキシエチルから選択され、Ｘ及びＹが、メチルであり、Ｚが、標的分子である、請求項５記載の薬剤。
【請求項７】
Ｚが、標的分子である、請求項１記載の薬剤。
【請求項８】
該ペプチドが、配列ＴＫＰＰＲを含む、請求項７記載の薬剤。
【請求項９】
該ペプチドが、配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨを含む、請求項８記載の薬剤。
【請求項１０】
金属放射性核種又はそのオキシド若しくはニトリドとの錯体形態である、請求項１〜９いずれか１項記載の薬剤。
【請求項１１】
該金属放射性核種が、99mＴｃである、請求項１０記載の薬剤。
【請求項１２】
一般式（II）：
【化２】
0003753734.tif 000012
（式中、
Ｘは、直鎖又は分岐の、飽和又は不飽和の、Ｃ1-4アルキル鎖（これは、場合により、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個の複素原子により中断されていてもよく、かつ場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1-4アルキル、アリール及びＣ（Ｏ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）であり；
Ｙは、Ｘと同義の置換基又はＨであり；
Ｘ及びＹは、一緒になって、５員〜８員の、飽和又は不飽和複素環（これらは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、オキソ、Ｃ1-4アルキル、アリール及びＣ（Ｏ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）を形成してもよく；
Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、Ｈ；カルボキシル；Ｃ1-4アルキル；ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ1-4アルコキシカルボニル及びアミノカルボニルから選択される基により置換されているＣ1-4アルキル；プロリン以外のＤ又はＬアミノ酸のα炭素側鎖；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ；カルボキシル；アミノ；Ｃ1-4アルキル；ヒドロキシル、カルボキシル又はアミノにより置換されているＣ1-4アルキル；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｚは、ヒドロキシル、Ｃ1-4アルコキシ及び標的分子から選択され；
そして
Ｍは、金属放射性核種又はそのオキシド若しくはそのニトリドである）
で示される化合物。
【請求項１３】
Ｍが、99mＴｃ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、97Ｒｕ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、198Ａｕ、199Ａｕ、203Ｐｂ、212Ｐｂ及び212Ｂｉ、並びにそのオキシド又はニトリドから選択される、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
Ｍが、99mＴｃ又はそのオキシド若しくはニトリドである、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｚ；
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｚ；
Ｎ，Ｎ−ジエチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｚ；及び
Ｎ，Ｎ−ジベンジルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｚから選択され、Ｚが標的分子である、請求項１記載の薬剤。
【請求項１６】
金属放射性核種又はそのオキシド若しくはニトリドとの錯体の形態である、請求項１５記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、診断用造影の分野に属し、診断部位の組織を標的とする放射性標識剤として有用な化学キレート化剤に関する。
発明の背景
診断用造影の技術は、体内で部位選択的に結合又は局在して、診断部位の画像の解像を促進するコントラスト剤（contrast agent）を利用するものである。67ガリウム塩は、例えば腫瘍及び感染組織への親和性を有し、スキャニングトモグラフィ（Scanning tomographyt）を用いて、身体の病変領域を医者に示すことができる。他のコントラスト剤は、99mテクネチウム及び186/188レニウムのような金属放射性核種を含み、それらは、タンパク、ペプチド及び人体の所望の領域に局在している抗体のような標的分子を標識するために用いられている。標的剤として、タンパク及び他の高分子は、診断の正確さのために必要である組織特性を提供することができるが、金属放射性核種でのそれらの試剤の標識化は、それらの物理構造により困難である。特に、タンパク及びペプチド標的剤は、放射性核種と結合しうる数多くの部位が存在し、その結果不均一に標識された生成物を生成させる。また、それらの大きな寸法にもかかわらず、タンパクには、高い親和性の放射性核種の結合のための最も適切な構造的配置、即ち５員環を形成する４個又はそれ以上の供与性原子を組み込む領域がほとんど存在していない。結果として、放射性核種は、典型的にはより豊富な低親和性部位で結合し、不安定な錯体を形成する。
低親和性結合の問題を取り扱うために、Paikら（Nucl Med Biol 1985, 12:3）は、低親和性結合部位を遮蔽するために過剰のＤＰＴＡ（ジアミントリメチレンペンタ酢酸）の存在下に抗体の標識を行う方法を提案した。低親和性結合の問題は、この方法で軽減されるけれども、放射性核種の実際の結合は、このテクネチウムの場合に、結果として非常に低い。システィン残基を高い割合で有するタンパクの直接標識が、また、示されている（Dean et al; WO92/13,572)。この方法は、放射性核種の結合のための高親和性部位としてシスティン残基のチオール基を利用し、その適用は、必然的に必要なチオール構造を有するそれらの標的剤に限定される。
標的剤の直接標識の有望な別の方法は、間接的方法であり、そこでは標的剤及び放射性核種は、キレート化剤の使用により結合される。キレート化剤として用いるための候補は、選択された金属放射性核種に強固に結合し、また標的化合物と結合するための反応性官能基を有するそれらの化合物である。ペプチドの標識及びタンパクに基づく標的剤での用途のために、このキレート化剤は、理想的にはペプチドに基づき、そのためにキレート化剤−標的分子の結合体は、ペプチド合成の技術を用いて全体として合成することができる。診断造影の用途のために、キレート化剤は、望ましくは血液並びに腎臓クリアランス及び脈管外拡散のような生体内での使用に適切な特性を有する。
本発明の要約
本発明は、診断的に有用な金属放射性核種に結合し、診断及び治療的に興味のある身体部位に局在しうる標的剤に結合することができるキレート化剤を提供する。本発明のキレート化剤は、99mテクネチウム及び186/188レニウムのオキソ、ジオキソ及びニトリドイオンを結合しうるＮ3Ｓ配置を与えるように構造的に設計されたペプチド類似体である。
更に詳細、かつ本発明の特徴の一つにより、下記式（Ｉ）：
0003753734.tif 000002
（式中、
Ｘは、直鎖又は分岐の、飽和又は不飽和のＣ1-4アルキル鎖（これは、場合により、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個の複素原子により中断されていてもよく、かつ場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1-4アルキル、アリール及び（ＣＯ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）であり；
Ｙは、Ｈ又はＸと同義の置換基であり；
Ｘ及びＹは、一緒になって、５−員〜８−員の、飽和又は不飽和複素環（これらは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、オキソ、Ｃ1-4アルキル、アリール及び（ＣＯ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）を形成してもよく；
Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、Ｈ；カルボキシル；Ｃ1-4アルキル；Ｃ1-4アルキル（これは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ1-4アルコキシカルボニル及びアミノカルボニルから選択される基により置換されている）；プロリン以外のＤ−又はＬ−アミノ酸のα炭素側鎖；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ；カルボキシル；アミノ；Ｃ1-4アルキル；Ｃ1-4アルキル（これは、ヒドロキシル、カルボキシル又はアミノにより置換されている）；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｒ7は、Ｈ及び硫黄保護基から選択され；そして
Ｚは、ヒドロキシル、Ｃ1-4アルコキシ及び標的分子から選択される）
で示される金属放射性核種キレート化剤を提供する。
本発明の別の特徴により、本発明のキレート化剤は、一般式（II）：
0003753734.tif 000003
（式中、
Ｘは、直鎖又は分岐の、飽和又は不飽和の、Ｃ1-4アルキル鎖（これは、場合により、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個の複素原子により中断されていてもよく、かつ場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1-4アルキル、アリール及び（ＣＯ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）であり；
Ｙは、Ｈ又はＸと同義の置換基であり；
Ｘ及びＹは、一緒になって、５−員〜８−員の、飽和又は不飽和複素環（これらは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、オキソ、Ｃ1-4アルキル、アリール及び（ＣＯ）Ｚから選択される少なくとも一つの基により置換されていてもよい）を形成してもよく；
Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、Ｈ；カルボキシル；Ｃ1-4アルキル；Ｃ1-4アルキル（これは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ1-4アルコキシカルボニル及びアミノカルボニルから選択される基により置換されている）；プロリン以外のＤ−又はＬ−アミノ酸のα炭素側鎖；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ；カルボキシル；アミノ；Ｃ1-4アルキル；Ｃ1-4アルキル（これは、ヒドロキシル、カルボキシル又はアミノにより置換されている）；及びＣ（Ｏ）Ｚから選択され；
Ｚは、ヒドロキシル、Ｃ1-4アルコキシ及び標的分子から選択され；そして
Ｍは、金属放射性核種又はオキシド若しくはそのニトリドである）で示される錯体化した金属放射性核種を有する形態で提供される。
本発明の別の特徴において、キレート化剤は診断的に有用な標的分子に結合した形態、及び場合により造影のために錯体化された金属放射性核種との組み合わせの結合体で提供される。
本発明の別の特徴として、本発明の結合体が先ず患者へ放射性核種錯体として投与され、次いで放射性核種の位置が画像化の手段を用いて検出される診断部位の造影の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、99mＴcで標識された結合体Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨのＨＰＬＣ分析である。
本発明の詳細な説明
本発明は、標的分子に結合したとき、治療又は診断的興味の身体部位に放射性核種を送達するために有用である金属放射性核種キレート化剤を提供する。上記の式で示したように、このキレート化剤は、放射性核種が錯体化されているＮ3Ｓ配置で存在するペプチド化合物である。
上記で用いたように記号Ｒ1〜Ｒ7、Ｘ、Ｙ及びＺで定義した用語は、以下の意味を有する：
「アルキル」は、直鎖又は分岐のＣ1-4鎖を意味する；
「アリール」は、芳香族及び複素芳香族環を意味する；
「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃ１及びＢｒを意味する；
「硫黄保護基」は、チオール基の酸化を阻害する化学基を意味し、それは金属のキレート化で切断されるそれらを含む。適切な硫黄保護基は、既知のアルキル、アリール、アシル、アルカノイル、アリーロイル、メルカプトアシル及び有機硫黄基を含む。
本発明の好適な実施態様において、このキレート化剤は、上記の式に適合し、そこでは、
Ｒ1〜Ｒ4は、独立して、Ｈ；並びにヒドロキシメチル及び１−ヒドロキシエチルのようなヒドロキシル−置換Ｃ1-4アルキルから選択され；
Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ及びＣ1-4アルキルから選択され、好適には両方Ｈであり；
Ｒ7は、水素原子若しくは硫黄保護基であり、最も好適にはアセトアミドメチルであり；
Ｘは、Ｃ1-4アルキル鎖又は好適にはメチル、エチルであるか、又はＣ1-4アルキル鎖（これは、アリール基で置換されている）、好適にはベンジル基を形成し；
Ｙは、Ｈ又はＸと同義の置換基であり、好適にはメチル、エチル又はベンジル、最も好適にはＸと同義であり；
Ｚは、ＯＨ、Ｃ1-4アルコキシ又は標的分子であり、好適にはペプチド標的分子である。
本発明の特定のキレート化剤は：
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ；
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ；
Ｎ，Ｎ−ジエチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ；
Ｎ，Ｎ−ジベンジルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ；及び
サルコシン−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ。
Ｘ及びＹにより表される置換基が隣接する窒素原子と一緒になって複素環を形成する場合に、そのような環は、５−員〜８−員の、飽和環、例えばピロリジン、ピペリジン、１−アザシクロヘプタン及び１−アザシクロオクタンであってよい。Ｘ及びＹにより形成される不飽和環は、その環の同等の窒素が必然的に３価であり、隣接原子と二重結合を形成できないことが理解されるけれども、ピロール及び４Ｈ−ピリジンを含む。Ｘ及びＹにより形成される複素環は、またＮ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個の更なる複素原子を組み入れてもよい。更なる複素原子を有する環は、１−イミダゾール、ピラゾール、ピペラジン、モルホリン及びチオモルホリンを含むが、それらに限定されない。Ｘ及びＹにより形成される環は、またハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、オキソ、Ｃ1-4アルキル及びアリールからの１個又はそれ以上、好適には３個より少ない基で置換されていてもよく、例えば４−オキソ−１−ピペリジン、４−オキソ−１−ピロリジン及び４−ヒドロキシ−１−ピペリジンを形成することができる。
診断用造影の目的のために、このキレート化剤それ自体は、金属放射性核種との錯体の形態で用いることができる。適切な放射性核種は、それらの種々のオキシド又はニトリド形態での、99mＴｃ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、97Ｒｕ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、198Ａｕ、199Ａｕ、203Ｐｂ、212Ｐｂ及び212Ｂｉを含む。好適な金属放射性核種は、それらの種々のオキシド形態のテクネチウム(99mＴｃ）及びレニウム(186,188Ｒｅ）、例えばＲｅＯ3+、ＲｅＯ2+、99mＴｃＯ2+であり、最も好適には99mＴｃＯ3+である。望ましい、かつ本発明の好適な特徴により、このキレート化剤は、上記の式でＺで表される標的分子に結合し、キレート化された放射性核種を哺乳動物の所望の位置へ送達するように結合を形成する。このキレート化剤に結合するために適切な標的分子の例は、ステロイド、タンパク、ペプチド、抗体、ヌクレオチド及び糖類を含むが、これらに限定されない。好適な標的分子は、タンパク及びペプチドを含み、特に特有の病理の特性的な細胞表面受容体に特定的に結合しうるそれらである。例えば、特定のタンパク受容体の過剰発現に結びつく病態は、本発明のキレート化剤にそれらのタンパク又は受容体断片を標識することにより造影することができる。最も好適な標的分子は、標的部位に特定的に結合しうるペプチドであり、３個又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。ある医学状態及び組織を造影するに有用な標的ペプチドは、下記に示した：
アテローム性プラクに対して
0003753734.tif 000004
感染及びアテローム性プラクに対して
0003753734.tif 000005
血栓に対して
0003753734.tif 000006
血小板に対して
0003753734.tif 000007
アミロイドプラク（アルツハイマー疾患）に対して
0003753734.tif 000008
このキレート化剤に関連して、標的分子は、キレート化剤と標的分子の間の物理的分離をもたらす「スペーサー」を含んでいてもよい。スペーサーは、キレート化剤に結合するために誘導体化されたアルキル鎖であってよい。標的分子がペプチドである場合に、このスペーサーは、適切には１個又はそれ以上のアミノ酸残基であってよい。好適には、ペプチド標的分子は、グリシン又はβ−アラニン残基のような化学的に不活性なα−炭素側鎖を有するような１〜５個のアミノ酸からのスペーサーを組み込んでいる。
標的分子は、Ｒ1〜Ｒ6、Ｘ、Ｙ及びＺ、並びにＸ及びＹで形成された環を含む種々の部位で本発明のキレート化剤に結合することができる。結合は、反応性である標的分子に存在する基をキレート化剤の置換基と反応させ結合を形成させることにより達成することができる。例えば、Ｎ−末端又はε−アミノ−リシンのような遊離のアミノ基を有するペプチド標的分子は、キレート化剤のカルボキシル基と反応しアミド結合を形成することができる。別の方法として、ペプチド標的分子のＣ末端は、キレート化剤のアミノ置換基と反応することができる。好適な実施態様において、標的分子は、式（Ｉ）のキレート化剤と置換基Ｚでペプチド結合のようなアミド結合により結合する。例えば、ペプチド標的分子のＮ−末端アミノ基は、Ｚのカルボキシル基と反応する。ペプチド以外の標的分子は、キレート化剤に結合する適切な基が存在するならば、本発明のキレート化剤と同様な方法で反応する。適切な基が存在しない場合には、標的分子は、そのような基を存在させるように化学的に誘導体化されてよい。１個以上の反応性基がキレート化剤又は標的分子に存在する場合、単一の結合種を得るために適切な保護試剤で、結合のための特定の基以外のすべての基を保護するのが望ましい。例えば、遊離のカルボキシル基は、ｔ−ブチルエステル（これは、ＴＦＡで除くことができる）のようなエステルを形成することにより保護することができる。遊離のアミノ基は、ＦＭＯＣ（これは、続いてピペリジンで除くことができる）のような保護基で保護することができる。
本発明の特定の実施態様において、病巣炎症部位の生体内での造影は、標的分子がアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ＴＫＰＰＲ）を含む化学戦略ペプチドである結合物を用いて達成される。このペプチドは、白血球受容体に特によく結合することが見い出された。標的ペプチドは、その局在化活性を保持するならば、キレート化剤から更なるアミノ酸残基、好適にはグリシンにより隔離されることができる。特定の実施態様において、このペプチドＴＫＰＰＲは、Ｇｌｙ残基による式（Ｉ）のキレート化剤のＺ置換基に結合される。
ペプチドに基づく標的分子は、それ自体としてか、又はキレート化剤との結合体として、種々の確立された方法を用いて製造することができる。それは固相合成により容易であるので、別のＦＭＯＣ保護及び脱保護を実施することが短いペプチドを合成するについて好適な方法である。組み換えＤＮＡの技術は、タンパク及びその長い断片を製造するのに好適である。特定の実施態様において、ペプチド−キレート化剤結合体は、固相ペプチド合成法により合成され、それはポリスチレンのような不溶性の（固体）支持体又はマトリックスに結合している成長ペプチド鎖にアミノ酸残基の逐次付加を含む。標的ペプチドのＣ末端残基は、まず、フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基のようなＮ−保護試剤で保護されたそのアミノ基で、商業的に入手しうる支持体につなぎ止める。典型的には、この支持体は、保護された形態で予め結合されたＣ−末端残基として得られる。アミノ保護基は、適切な脱保護剤、例えばピペリジンで除くことができ、次のアミノ酸残基（Ｎ−保護形態での）は、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）のような結合剤と共に加えられる。ペプチド結合の生成後、この試薬は支持体から洗い出される。標的ペプチド鎖が合成された後、キレート化剤の最初の残基、即ちＳ−アセトアミドメチル保護システィンが、Ｎ−末端に加えられる。キレート化剤の最後の残基は、式（Ｘ）（Ｙ）Ｎ−Ｃ（Ｒ1）（Ｒ2）−ＣＯ（ここで、Ｘ、Ｙ、Ｒ1及びＲ2は上記と同義である）に適合する誘導体化されたアミノ酸残基である。最後の残基、例えばジメチル−グリシン、ジエチル−グリシン、ジベンジル−グリシン又はサルコシンは、商業的に得ることができるか、又は合成することができる。完了した結合体は、支持体からトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような適切な試薬で開裂される。
本発明のＲ1〜Ｒ4の置換基は、Ｄ−アミノ酸を含む天然由来又は誘導体化されたアミノ酸の側鎖であり、商業的に入手可能であり、固相合成技術に適合すると考えられる。商業的に入手できない誘導体化アミノ酸残基は、確立された有機化学の技術によりそれらを合成し、上述した固相合成の適切な段階で本発明のキレート化剤に挿入して組み込むことができる。同様に、置換基Ｒ5及びＲ6が、Ｈ以外である場合、誘導体化されたシスティンアミノ酸残基は、ペプチド合成に用いられる。例えば、商業的に入手可能な残基、ペネシラミンは、Ｒ5及びＲ6が両方メチルである場合に組み込まれる。
Ｘ及びＹの種々の置換基は、固相合成の最後の残基として式（Ｘ）（Ｙ）Ｎ−Ｃ（Ｒ1)(Ｒ2)−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ（ここで、Ｘ、Ｙ、Ｒ1及びＲ2は上記と同義である）の誘導体化アミノ酸を、本発明のキレート化剤に組み込むことにより導入することができる。Ｘ及びＹのＮ−末端アミノ置換基を有するアミノ酸は、確立された有機化学の手法及び技術により合成することができる。例えば、Ｘ及びＹが両方ジベンジル置換基である場合、相当するジベンジルグリシン残基は、ジクロロメタンのような適切な溶媒中で商業的に入手可能な試薬、ブロモ酢酸及びジベンジルアミンを反応させ、次いで加熱することにより合成することができる。他のアミンは、ジベンジルアミンの代わりに、例えばジイソプロピルアミンで、相当するジイソプロピルグリシンを得る反応で実施することができる。同様に、ジベンジルアミンに代えて、ピペリジン及びモルホリンは、相当するピペリジン−グリシン及びモルホリン−グリシンを与える。
本発明の最も好適な実施態様において、ペプチド−キレート化剤結合体は、固相支持体上で調製され、式（Ｉ）（ここで、標的分子は、配列、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨであり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6は、Ｈであり；Ｒ4は、ヒドロキシメチル又は１−ヒドロキシメチルであり；そしてＲ7は、アセトアミドメチルである）の構造を有する。
キレート化剤中に選択された放射性核種の組み込みは、種々の確立された方法で行うことができる。例えば、以下の一般的方法を用いることができる。水性アルコール、例えばエタノール−水１：１中にキレート化剤を溶解することにより、まずキレート化剤溶液を形成させる。例えば、Ｎ2で脱ガスすることにより酸素を除き、次いで水酸化ナトリウムを加えて、チオール保護基を除く。この溶液の酸素を再度除き、水浴で加熱してチオール保護基を加水分解し、次いでこの溶液を酢酸のような有機酸（pH６．０〜６．５）で中和する。標識化工程で、テクネチウムナトリウムを、テクネチウム酸を還元するに十分な量の塩化第一スズを有するキレート化剤溶液に加える。この溶液を混合し、室温に放置して反応させ、次いで水浴で加熱する。別の方法として、標識化は、pH８に調整したキレート化剤溶液で行うことができる。この高いｐＨで、ペルテクネチウム塩は、所望のキレート化剤と配位子交換反応のための適切な遊離しうる配位子との錯体化したテクネチウムを含む溶液で置き換えることができる。適切な配位子は、酒石酸塩、クエン酸塩及び７糖類塩である。塩化第一スズは、キレート化剤溶液が、別の方法で標識化工程のために高いpH１２〜１３に調整されているならば、還元試薬としてナトリウムジチオナイトで置き換えることができる。本発明のキレート化剤は、放射性核種での標識の前に標的分子に結合させることができ、この方法は「二官能性キレート」法である。別の方法は、「予め標識された配位子」法であり、キレート化剤は、まず放射性核種で標識され、次いで標的分子に結合される。
標識されたキレート化剤は、汚染物質99mＴｃＯ4及びコロイドの99mＴｃＯ2からクロマトグラフィ的に、例えばエタノールで活性化し、続いて希釈ＨＣｌでのＣ−１８Sep Pakカラムで分離することができる。希釈ＨＣｌでの溶出は、99mＴｃＯ4を分離し、ＥｔＯＨ−食塩水１：１での溶出は、キレート化剤を除くが、コロイドの99mＴｃＯ2をカラムに残す。
標的分子に結合し、診断的に有用な金属で標識された場合に、本発明のキレート化剤は、診断用造影の技術での通常の技術で病態を検出するために用いることができる。テクネチウムのような放射性核種で標識されたキレート化剤−標的分子結合物は、哺乳動物にリンパ管内、腹膜内及び静脈内的に、食塩水又は血清媒体のような製薬学的に許容しうる溶液で投与することができる。投与される標識された結合物の量は、選択された標的分子の毒性特性及び金属特性に依存し、典型的にはホスト７０kgあたり約０．０１〜１００、好適には１０〜５０mCiの範囲である。生体内での金属の局在化は、投与に続く適当な時間に標準のシンチグラフィーの手法で追跡される。画像が得られる時間は、標的分子の特性に依存し、例えば大抵のペプチドは急速に局在化し、画像が３時間以内、しばしば１時間以内に得られる。特定の実施態様では、食塩水中でペプチド標的分子ＧＴＫＰＰＲに結合する本発明のキレート化剤は、静脈内注射で病巣炎症の画像部位に投与される。
以下の実施例で更に本発明の実施態様を説明するために与えられる。
実施例１：ペプチド−キレート化剤結合体の調製
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ及び
サルコシン−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
表題の結合体は、Applied Biosystems 433Aペプチドシンセサイザー（Foster City, CA)を用いて、ＦＭＯＣ−アルギニンを予め結合させた２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Sasrin樹脂、Bachem Biosciences Inc., Philadelphia, PA)上で、ＦＭＯＣ化学を用いて、固相ペプチド合成により単一のペプチド鎖として合成した。誘導体化アミノ酸残基、Ｓ−アセトアミドメチルシスティン（Bachem）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（sigma Chemical Company, St.Louis, Mo）及びサルコシンは、鎖延長の適切な段階で組み入れた。
最後の残基、Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ又はサルコシンの付加において、ペプチド樹脂を真空下に一晩乾燥し、樹脂からペプチドの開裂は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９．５ml、水０．５ml、チオアニソール０．５ml及び２−エタンジチオール０．２５mlの冷却溶液（ペプチド−樹脂１００mg当り１ml）をペプチド−樹脂と室温で１．５〜２時間混合して行った。濾過により樹脂を除去し、ＴＦＡ１〜３mlで洗浄し、透明な黄色溶液６〜８mlを得た。この溶液を５０ml円錐形ポリプロピレン遠心分離管中のｔ−ブチルメチルエーテル３０〜３５ml中にゆっくり滴下し、白色沈殿を形成させた。この沈殿物を０℃で５分間、７，０００rpmで遠心分離（Sorval RT600, Dupont）し、傾斜し、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回以上洗浄した。真空下に乾燥した後、この沈殿物を水に溶解した。この溶液をアセトン−ドライアイスで凍結し、一晩凍結乾燥した。得られた白色粉末を水に溶解し、０．４５μmシリンジフィルター（Gelman Acrodic 3 CR PTFE)を通して濾過し、緩衝液Ａとして水中の０．１％ＴＦＡ及び緩衝液Ｂとしてアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いて、Ｃ１８カラム（Waters RCM 25 x 10）を用いた逆相ＨＰＬＣ（Beckman System Gold)により精製した。カラムを１００：０の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂで平衡化させ、１ml／分で２５分間かけて、５０％緩衝液Ｂまで直線勾配で溶離した。分画をＨＰＬＣ上で再分析し、適合プロフィールにしたがって集めた。純粋な分画を、アセトン−ドライアイス中で凍結し、１２時間凍結乾燥して、白色粉末を得た。
実施例２：ペプチド−キレート化剤結合体の調製
Ｎ，Ｎ−ジベンジルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
Ｎ，Ｎ−ジエチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
表題の結合体は、Applied Biosystems 433Aペプチドシンセサイザー（Foster City, CA)を用いて、ＦＭＯＣ−アルギニンを予め結合させた２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Sasrin樹脂、Bachem BiosciencesInc., Philadelphia, PA）上で、ＦＭＯＣ化学を用いて、固相ペプチド合成により単一のペプチド鎖として合成した。誘導体化アミノ酸残基、Ｓ−アセトアミドメチルシスティン（Bachem）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン及びＮ，Ｎ−ジベンジルグリシンは、鎖延長の適切な段階で組み入れた。
誘導体化アミノ酸残基、Ｎ，Ｎ−ジベンジルグリシンは、以下の方法で合成した：電磁攪拌装置を備えたフラスコ中で、ブロモ酢酸（５．００ｇ、３５．９９mmol）をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、０℃に冷却し、ジベンジルアミン（８．３１ml、４３．７９mmol）を添加した。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、室温に暖まるまで放置し、次いで３０〜４０℃に１２時間加熱した。この混合物を室温ま冷却し、溶媒を減圧下に蒸発させ、熱エタノールで洗浄し、真空下に乾燥して白色固体残渣（収率７１．２％）を得た。
誘導体化アミノ酸残基Ｎ，Ｎ−ジエチルグリシンは、以下方法で合成した。
フラスコ中で、クロロ酢酸（５．００ｇ、５２．９１mmol）を、ジエチルアミン（３５ml）に加え、室温で１２時間攪拌し、次いで還流下に７２時間加熱した。この反応混合物を室温に冷却し、ＨＣｌで中和し、減圧下に濃縮した。次いで、酢酸エチル及びＥｔＯＨを加え、得られた白色沈殿を濾過し、真空下に乾燥して生成物１．７４ｇ（収率２５％）を得た。
実施例３：ペプチド−キレート化剤結合体の標識
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ
Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ
Ｎ，Ｎ−ジエチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ
Ｎ，Ｎ−ジベンジルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ及び
サルコシン−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲ
実施例１と２の結合体を、再構成（２００μl、１mg/ml食塩水）し、次いでペルテクネチウム塩１００μl（１０mCi)及びグルコン酸スズ（５０μg塩化第一スズ及び１mgグルコン酸ナトリウム）を有する３mlバクテイナー（vacutainer）中に注入した。この管を沸騰水浴中に１２分間置き、次いでワットマンＰＶＤＦシリンジ濾過器を通して濾過し、標識された結合体溶液を得、更に食塩水で希釈し注射しうる溶液（２Mbq/ml）を調製した。この結合体は試料（２０μl)（蒸留前）からＨＰＬＣ（Beckman)により単離し、放射活性を測定して標識化収率を決定した。
0003753734.tif 000009
サルコシン−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＴＫＰＰＲを除いて、それぞれの結合体は、単一ピークであり、標識収率８５％以上である。標識化２４時間後に、Ｎ，Ｎ−ジメチルＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを、ＨＰＬＣで再分析し、分解又は放射性分解生成物を観察しなかった。
実施例４：生体内での結合物の画像化及び生物分布
ラット炎症試験を以下のように実施した。２匹の雄性ウィスター系ラット（Charles River、１５０〜２００ｇ）に、酵母細胞壁懸濁液であるザイモサン（２５mg）を、造影の２４時間前にその左後脚に筋注した。脚の病巣炎症は１日後に視覚的に検出可能となった。キレート化剤−ペプチド結合体１mg（約０．７μmol)をジメチルスルホキシド５０μｌ中に溶解し、エタノール−水混合物（１：１、２０μl)に加えた。Ｔｃ−９９ｍ酒石酸塩（約４００MBq)を加え、１００℃、２０分でキレート交換を進行させた。このＴｃ−９９ｍ標識結合体をSep Pakカートリッジを通す溶離により精製し、次いで約１００μCi（３．７MBq)の活性を有する注射しうる製剤（２００μl)を調製するために食塩水で希釈した。
ラットを、ソムニトール(somnitol)（４０〜５０mg/kg)で麻酔し、標識結合体溶液（２００μl)を尾静脈に静注した。３０分で、連続全身シンチグラムを得た。次いでラットを麻酔して屠殺し、器官、尿、血液、炎症筋（左脚）、非炎症筋（右脚）及び炎症滲出液の標本の重量を測定し、器官に従いウェル形ガンマ計数器又はガンマ線量測定器のいずれかで計数した。血液容積は体重の８％であるという仮定に基づいて、線量計算を行った。下表に示した結合体の結果は、２匹のラットの平均であり、尾中残留線量について補正した。
二つの結合体は、他の既知の炎症造影剤、例えばＧａ−６７、99mＴｃ−ＩｇＧ、111Ｉｎ−ＷＢＣ及び99mＴｃ−ナノコール（これは観察された高い標的対バックグラウンド比（炎症筋対比炎症筋）で示されている）に比べて、優れたシンチグラム画像を与えた。これらの結合体は、既知の試剤よりかなり迅速に画像化し、優れた生体分布を示した。また、肝臓及び胃腸管のような非標的器官は、低い蓄積を示した。
0003753734.tif 000010
【図１】
0003753734.tif 000013