(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鞘翅目昆虫の防除のためのバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）Cry6A毒素由来の毒素をコードしたポリヌクレオチドであって、配列番号２における１２アミノ酸から４４３アミノ酸の領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項1に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換え宿主。
【請求項３】
形質転換された宿主が微生物である、請求項２記載の組換え宿主。
【請求項４】
微生物が大腸菌およびシュードモナスからなる群より選択される、請求項３記載の組換え宿主。
【請求項５】
形質転換された宿主が植物である、請求項２記載の組換え宿主。
【請求項６】
請求項1記載のポリヌクレオチドを含む組換えDNAトランスファーベクター。
【請求項７】
請求項1記載のポリヌクレオチドによってコードされるバチルス・チューリンギエンシスCry6A切断型毒素。
【請求項８】
切断型毒素が約40〜50kDaである、請求項７記載の毒素。
【請求項９】
配列番号２に記載の１２アミノ酸から４４３アミノ酸からなるバチルス・チューリンギエンシスCry6A切断型毒素。
【請求項１０】
配列番号２に記載の１２アミノ酸から４４３アミノ酸からなるバチルス・チューリンギエンシスCry6A切断型毒素の製造方法であって、請求項２から４のいずれかの宿主を培養する工程を含む、方法。
【請求項１１】
配列番号２に記載の12アミノ酸から４４３アミノ酸からなるバチルス・チューリンギエンシスCry6A切断型毒素の製造方法であって、配列番号２に記載の完全長バチルス・チューリンギエンシスCry6A毒素をトリプシン消化させる工程を含む、方法。
【請求項１２】
細胞内毒素を含む処理された実質的に無傷の細胞であって、毒素が鞘翅目害虫に対して有効な毒素をコードするバチルス・チューリンギエンシス遺伝子の発現の結果であり、該毒素が請求項1記載のDNA分子によってコードされ、該細胞が標的昆虫の環境に対して適用された際に殺虫活性を延長させるような条件下で処理された細胞。
【請求項１３】
環境中での殺虫活性を延長するような化学的または物理的手段によって処理された請求項１２記載の細胞。
【請求項１４】
鞘翅目昆虫を請求項1記載のDNAによってコードされる毒素と接触させることを含む、鞘翅目昆虫の防除のための方法。
【請求項１５】
毒素が約40〜50kDaである、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
昆虫およびその他の害虫は、農作物の損害およびこれらの害虫を制御された状態に保つ費用として農場経営者に年間何十億ドルもの出費を強いている。農業生産環境において害虫によって引き起こされる損害には、農作物の収穫量の減少、農作物の品質の低下、および収穫コストの増加が含まれる。
【０００２】
鞘翅目昆虫は、毎年莫大な損害をもたらす農業害虫の重要な一群である。鞘翅目の害虫の例には、アルファルファゾウムシ（alfalfa weevil）およびハムシモドキ幼虫（corn rootworm）が含まれる。
【０００３】
アルファルファゾウムシ、ヒペラ・ポスティカ（Hypera postica）およびその近縁種であるエジプトアルファルファゾウムシ（Egyptian alfalfa weevil）、ヒペラ・ブルンネイペニス（Hypera brunneipennis）は、米国で栽培されるアルファルファの最も重大な害虫であり、1984年には290万エーカーが感染している。これらの害虫の駆除には年間合計2000万ドルが費やされている。エジプトアルファルファゾウムシは米国南西部で主要な種であり、夏の暑い数カ月の間は夏眠（すなわち、ハイバネーション）を行う。これはそれ以外の点では、米国の残る全域で優勢なアルファルファゾウムシと全く同一である。
【０００４】
ゾウムシの生活環では幼虫期が最も有害である。幼虫はアルファルファ植物の成長中の先端を摂食することにより、葉の葉脈化（skeletonization）、発育阻害、植物成長低下を引き起こし、最終的には収穫量の減少をもたらす。激しい蔓延のために刈り取った乾草がすべて駄目になることもある。成虫も葉を食べるが、それによる損害は幼虫ほど重大ではない。
【０００５】
米国ではほぼ930万エーカーのトウモロコシがハムシモドキ幼虫複合種に毎年感染している。ハムシモドキ幼虫複合種には、北部ハムシモドキ幼虫（northern corn rootworm）ディアブロチカ・バーベリ（Diabrotica barberi）、南部ハムシモドキ幼虫（southern corn rootworm）D.ウンデシムパンクタタ・ハワーディ（D. undecimpunctata howardi）および西部ハムシモドキ幼虫（western rootworm）D.ヴィルジフェラ・ヴィルジフェラ（D. virgifera virgifera）が含まれる。これらのハムシ科（Diabrotica）の種の土壌生息幼虫はトウモロコシの根を食べ、倒伏を引き起こす。倒伏は最終的にはトウモロコシの収穫量を減少させ、しばしば植物の死をもたらす。その成虫である甲虫はトウモロコシの毛を食べることにより授粉を減少させ、このために植物体1本当たりのトウモロコシの収穫量に有害な影響を及ぼす。さらに、ハムシ科の昆虫は、ウリ科の農作物（キュウリ、メロン、カボチャなど）ならびに商業的に生産される多くの野菜および農作物、さらには家庭菜園で育てられるそうしたものも攻撃対象とする。
【０００６】
ハムシモドキ幼虫の防除は、一部には、輪作および不定根系の成長を促すための高リン酸レベルの適用などの栽培法によって対策が講じられてきた。さらに、一部の地域では、新たに出現した2年休眠性（または越冬性）の北部ハムシモドキ幼虫が輪作に混乱をもたらしている。しかし、望ましいレベルの防除を確保する目的では、化学殺虫剤に最も大きく依存している。殺虫剤は土壌の上に集積するか、またはその中に取り込まれる。化学殺虫剤の使用に伴う大きな問題は、処理を受けた昆虫集団における耐性の発生である。
【０００７】
米国だけでも年間2億5千万ドル以上もの殺虫剤がハムシモドキ幼虫の防除のために使用されている。殺虫剤を用いた場合でさえ、この幼虫は毎年7億5千万ドル以上に相当する農作物の損害を引き起こしており、米国中西部では最も深刻なトウモロコシ害虫となっている。
【０００８】
線虫によって引き起こされる植物の損害も、蔓延している深刻な経済的問題である。線虫は多くの植物種において広範にわたる深刻な損害を引き起こす。多くの線虫属がこのような損害を引き起こすことが知られている。植物に寄生する線虫には、線虫（Nematoda）門、クキセンチュウ（Tylenchida）目およびドリライムス（Dorylaimide）目に属するものが含まれる。クキセンチュウ目において、植物に寄生する線虫はチレンクス上科（Tylenchoidea）およびワセンチュウ上科（Criconematoidea）という2つの上科にて見いだされている。線虫には100,000種を上回る種が記載されている。
【０００９】
化学殺虫剤は害虫防除の有効な方法を提供してきたが、食物、地下水および環境中に認められる可能性のある残留化学物質の量に対して一般社会の懸念が増している。殺虫剤の使用に対する厳しい新たな規制および一部の有効な殺虫剤の市場からの排除は、損害の大きい害虫の防除のための経済的および有効な選択肢を制限してしまう恐れがある。このため、環境に対して有害でない害虫防除の方法および組成物を同定することには緊急的な需要がある。
【００１０】
植物に寄生する線虫の防除に日常的に用いられてきた殺線虫薬は、環境安全に関する懸念が増すに伴い、市場から急速に排除されつつある。2001年にはこのような寄生虫の防除の主力であった臭化メチルが米国では販売されなくなると思われる。このため、より有害でない防除剤が明らかに必要となっている。
【００１１】
ハムシモドキ幼虫およびその他の鞘翅目害虫ならびに線虫の防除のための化学殺虫剤の使用にはいくつか欠点がある。殺虫剤の使用はしばしば、土壌ならびに上水道および下水道の汚染といった環境面での懸念を生じる。殺虫剤を用いる作業は、それを使用する人々に危険をもたらす恐れもある。
【００１２】
望ましくない生物体の防除のために化学殺虫剤を日常的に用いることは、化学物質耐性種の選択につながる可能性がある。化学物質耐性は経済的に重大な昆虫の多くの種で生じており、ヒツジ、ヤギおよびウマの線虫でも生じている。望ましくない生物体を防除するための化学毒素の日常的使用は、薬剤耐性種の選択につながる可能性がある。これは経済的に重大な昆虫の多くの種で生じており、ヒツジ、ヤギおよびウマの線虫でも生じている。例えば、線虫の防除のための一般に認められた方法では、ベンズイミダゾールという薬物およびその同種物（congener）が中心となっている。これらの薬物の大規模な使用は、線虫集団における耐性獲得の事例を数多く引き起こしてきた（Prichard, R.K.ら［1980］「線虫における駆虫薬耐性の問題（The problem of anthelmintic resistance in nematodes）」、Austr. Vet. J. 56：239〜251、Coles, G.C.［1986］「ヒツジにおける駆虫薬耐性（Anthelmintic resistance in sheep）」、Veterinary Clinics of North America：Food Animal Practice、Vol 2：423〜432［Herd, R.P.編］W.B. Saunders、New York）。線虫には100,000種を上回る種が記載されている。殺虫剤耐性の発生のために、異なる作用様式をもつ新たな防除薬を探索し続けることが必要となっている。
【００１３】
現時点では、感受性のある宿主および農作物に対してかなりの損害をもたらす多くの鞘翅目昆虫および線虫を防除するためのより有効な手段を手にする必要がある。このような有効な手段には特異的な生物的因子を用いることが有利と考えられる。
【００１４】
土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.）は、パラ胞子結晶蛋白質封入体を特徴とするグラム陽性の胞子形成性細菌である。これらの封入体は顕微鏡下ではしばしば明瞭な形状を示す結晶として認められる。これらの蛋白質は害虫に対して非常に有毒であってその毒素活性の点で特異的でありうる。ある種のB.t.毒素遺伝子は単離および配列決定がなされており、組換えDNAに基づくB.t.産物が産生され、その使用が承認されている。さらに、遺伝子工学の技法を用いて、これらのB.t.内毒素を農業環境に供給するための新たな手法が開発中であり、これには昆虫耐性に対する内毒素遺伝子により遺伝子操作がなされた植物の使用、およびB.t.内毒素送達媒体としての安定化されたインタクトな微生物細胞の使用が含まれる（Gaertner, F.H.、L. Kim［1988］TIBTECH 6：S4〜S7）。このため、単離されたB.t.内毒素遺伝子の商業的な価値は高まりつつある。
【００１５】
ごく最近まで、B.t.農薬の商業的使用は狭い範囲の鱗翅目（毛虫）害虫にほとんど限定されていた。鱗翅目害虫に対する市販の殺虫剤としては、B.チューリンギエンシス亜種クルスタキ（B. thuringiensis subsp. kurstaki）の胞子および結晶の調製品が長年用いられてきた。例えば、B.チューリンギエンシス変種クルスタキ（B. thuringiensis var. kurstaki）HD-lは、多数の鱗翅目昆虫の幼虫に対して有毒である結晶性δ-内毒素を産生する。
【００１６】
しかし近年、はるかに広い範囲の害虫に対して特異性のあるB.t.殺虫剤が研究者らによって発見された。例えば、B.t.のその他の種、すなわちイスラエレンシス（israelensis）およびモリソニ（morrisoni）（別名テネブリオニス（tenebrionis）、別名B.t.M-7、別名B.t.サンディエゴ（san diego））が、それぞれ双翅目および鞘翅目の昆虫の防除に商業的に用いられている（Gaertner, F.H.［1989］「殺虫性蛋白質用の細胞送達システム：生きたおよび生きていない微生物（Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins：Living and Non-Living Microorganisms」、農作物保護剤の制御放出（Controlled Delivery of Crop Protection Agents）、R.M. Wilkins編、Taylor and Francis、New York and London、1990、pp.245〜255）。クーチ（Couch, T.L.）（1980）「バチルス・チューリンギエンシス変種イスラエレンシスの蚊病原性（Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. israelensis）」、Developments in Industrial Microbiology 22：61〜76、およびビーグル（Beegle, C.C.）（1978）「農業生態系における昆虫寄生菌の使用（Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems）」、Developments in Industrial Microbiology 20：97〜104も参照されたい。クリーグ（Krieg, A.）、フガー（A.M. Huger）、ランゲンブルーフ（G.A. Langenbruch）、シュネッター（W. Schnetter）（1983）Z.ang.Ent. 96：500〜508は、鞘翅目の2種類の甲虫に対して有効なことが報告されているバチルス・チューリンギエンシス変種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis var. tenebrionis）を記載している。これらの甲虫はコロラドハムシである、レプチノターサ・デセムリネアータ（Leptinotarsa decemlineata）およびアゲラスティカ・アルニ（Agelastica alni）である。
【００１７】
さらに最近では、B.t.の新たな亜種が同定され、活性のあるδ内毒素蛋白質に関与する遺伝子が単離されている（Hofte, H.、H.R. Whiteley［1989］ Microbiological Reviews 52（2）：242〜255）。ヘフテ（Hofte）およびホワイトリー（Whiteley）はB.t.結晶蛋白質遺伝子を4つの主要なクラスに分類した。このクラスとは、CryI（鱗翅目特異的）、CryII（鱗翅目および双翅目特異的）、CryIII（鞘翅目特異的）およびCryIV（双翅目特異的）である。その他の害虫に対して特異的に毒性である系統が発見されたことも報告されている（Feitelson、J.S.、J. Payne、L. Kim［1992］ Bio／Technology 10：271〜275）。CryVは線虫特異的な毒素遺伝子のクラスを命名するために提唱されたものである。今日ではB.t.遺伝子のその他のクラスも同定されている。
【００１８】
結晶性蛋白質に関するヘフテおよびホワイトニーの1989年の命名および分類法は、毒素の推定アミノ酸配列および宿主範囲の双方に基づくものであった。この体系は、5つの主要なクラスに分けられる14の異なる種類の毒素遺伝子をカバーするように改変された。より多くの毒素遺伝子が多く発見されるに伴い、同様の配列をもつ遺伝子が著しく異なる殺虫特異性を有することが明らかになったため、この体系は役立たないようになり始めた。配列決定がなされたバチルス・チューリンギエンシス結晶蛋白質遺伝子の数は、現在のところ約50種である。アミノ酸の同一性のみに基づく改訂された命名法が提唱されている（Crickmoreら［1996］、無脊椎動物病理学会（Society for Invertebrate Pathology）、第29回年次会合（29th Annual Meeting）、バチルス・チューリンギエンシスに関する第3回国際会議（IIIrd International Colloquium on Bacillus thuringiensis）、University of Cordoba、Cordoba、Spain、9月1〜6日、要旨）。依然として別のクラスであるcytAおよびcytBを除き、毒素遺伝子にはすべて「cry」という呼び名が残された。第1序列のローマ数字はアラビア数字に換えられ、第3序列の括弧は除去された。上記の例外を除いて、番号は再分類されたが、最初の名称の多くは残された。
【００１９】
大腸菌におけるB.t.結晶蛋白質遺伝子のクローニングおよび発現が、発表文献中に記載されている（Schnepf, H.E.、H.R. Whiteley（1981）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：2893〜2897）。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号はいずれも大腸菌におけるB.t.結晶性蛋白質の発現を開示している。鱗翅目に対する活性を有するB.t.毒素を開示しているものの中には、米国特許第4,990,332号、第5,039,523号、第5,126,133号、第5,164,180号、第5,169,629号および第5,286,485号がある。米国特許第4,797,276号および第4,853,331号は、種々の環境で鞘翅目害虫の防除に用いうるB.チューリンギエンシスのテネブリオニス（tenebrionis）系統を開示している。米国特許第4,918,006号は双翅目に対する活性を有するB.t.毒素を開示している。
【００２０】
線虫卵の生存性に対するB.チューリンギエンシス種由来のδ内毒素の効果に関して発表されている研究論文の数は少ない。ボットチェル（Bottjer）、ボーン（Bone）およびギル（Gill）（［1985］Experimental Parasitology 60：239〜244）は、B.t.クルスタキ（B.t.kurstaki）およびB.t.イスラエレンシス（B.t.israelensis）が線虫トリコストロンギルス・コルブリフォルミス（Trichostrongylus colubriformis）の卵に対してインビトロで有毒であったことを報告した。さらに、種々の程度の毒性を有する他の28種のB.t.系統も検討されている。イグノフォ（Ignoffo）およびドロップキン（Dropkin）（［1977］J. Kans. Entomol. Soc. 50：394〜398）は、バチルス・チューリンギエンシス由来の耐熱性毒素（β外毒素）が、自由生活性線虫パナグレラス・レディビバス（Panagrellus redivivus）（Goodey）、植物寄生性線虫メロイドジャイン・インコグニタ（Meloidogyne incognita）（Chitwood）および真菌摂食性線虫アフェレンカス・アヴェナ（Aphelenchus avena）（Bastien）に対して活性であったことを報告している。β外毒素は特異性がほとんどまたは全くない普遍的な細胞毒性物質である。また、シオルディア（Ciordia）およびビッツェル（Bizzell）（［1961］Jour. of Parasitology 47：41［要旨］）は、いくつかのウシ線虫に対するB.チューリンギエンシスの効果に対して予備的な報告を行っている。
【００２１】
米国特許第5,151,363号および米国特許第4,948,734号は、線虫に対する活性を有する特定のB.t.単離物を開示している。線虫に対する活性を開示しているその他の米国特許には、第5,093,120号、第5,236,843号、第5,262,399号、第5,270,448号、第5,281,530号、第5,322,932号、第5,350,577号、第5,426,049号および第5,439,881号が含まれる。資源に関する広範な研究および取り組みの結果として、新たなB.t.単離物およびB.t.単離物の新たな用途に関するその他の特許も発行されている。総説についてはファイテルソン（Feitelson）ら、前記を参照されたい。しかし、新たなB.t.単離物および既知のB.t.単離物の新規用途の発見は、現在も経験的で予測不能な技術のままである。
【００２２】
今日ではハムシモドキ幼虫およびその他の鞘翅目に対して有効なバチルス・チューリンギエンシス毒素がいくつか知られている。例えば、米国特許第4,849,217号はアルファルファゾウムシに対する活性を有するものとして、PS52A1およびPS86A1を含む種々の単離物を開示している。米国特許第5,208,017号は、西部ハムシモドキ幼虫に対する活性を有するものとしてPS86A1を開示している。米国特許第5,427,786号および第5,186,934号はそれぞれ鞘翅目に対して有効なB.t.単離物および毒素を開示している。これらの特許において具体的に開示されているのは、PS86A1として知られる単離物、およびそれから得られる86A1として知られる鞘翅目に有効な毒素である。毒素86A1は今日ではCry6A（CryVIA）としても知られる。野生型Cry6A毒素は約54〜58kDaである。
【００２３】
また、Cry6B毒素も知られている。この毒素はPS69D1単離物から得ることができる。完全長のCry6AおよびCry6B毒素は線虫に対する活性を有することが知られている。以下の米国特許は、その一部で、線虫に対する活性を有するものとしてPS69D1単離物を開示している： 第4,948,734号、第5,093,120号、第5,262,399号および第5,439,881号。
【００２４】
CryVI毒素のアミノ酸配列に関する一般式は国際公開公報第92／19739号に開示されており、これは線虫に対する活性を有する完全長毒素も開示している。そこにはPS52A1およびPS69D1単離物が開示されている。米国特許第5,262,159号および第5,468,636号も、アブラムシに対する活性を有する毒素の一般式を開示している。
【００２５】
Cry6A毒素はある種の鞘翅目昆虫の成長を阻害することが知られているが、この毒素が切断により、西部ハムシモドキ幼虫などの鞘翅目昆虫に対して致死的な毒素を生じうるかについてはこれまで知られていない。さらに、切断型Cry6Aが線虫に対して有効であるとの示唆も得られていない。
【００２６】
当技術分野では、その他のB.t.毒素に対する切断の例がこれまでにいくつか知られている。例えば、P2（Cry2）毒素（Nicholles,E.N.、W. Ahmad、D.J. Ellar［1989］J. Bact. 171：5141〜5147）は61〜63kDaの蛋白質として存在する。蛋白質分解を行うと約5kDaが切り取られ、56〜58kDaの蛋白質が残る。しかし、毒性は不変のまま維持されるか、10分の1に低下するかのいずれかであった。さらに、これらの蛋白質にはCry6毒素との有意な相同性はみられない。B.t.毒素の一部の活性および／または機能のある特定の面を検討したその他の論文には、アダング（Adang, M.J.）、ステイヤー（M.J. Stayer）、ロシェリュー（T.A. Rocheleau）ら（1985）Gene 36：289〜300、ワビコ（Wabiko, H.）、レイモンド（K.C. Raymond）、ブラ（L.A. Bulla, Jr.）（1986）DNA 5：305〜314（Medline 863000920）、シュネフ（Schnepf,H.E.）、ホワイトリー（H.R. Whiteley）（1985）J. Biol. Chem. 260：6273〜6280、米国特許第5,468,636号、米国特許第5,236,843号および欧州特許第0462721号が含まれる。
【００２７】
以下に説明する活性化されたCry6A毒素を得るための切断の使用は、B.t.の技術分野にとって完全に新規である。
【００２８】
発明の簡単な概要
本発明は害虫、特に植物害虫の防除に有用な材料および方法に関する。具体的には、本発明は、ハムシモドキ幼虫を含む鞘翅目害虫の防除に有用な新たな切断型B.t.毒素を提供する。本発明はさらに、線虫の防除に有用な毒素を提供する。本発明はさらに、これらの毒素をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００２９】
本発明の1つの好ましい態様において、切断型のcry6A B.t.毒素がハムシモドキ幼虫に対して特に有効であることが明らかになった。本明細書に記載される切断型毒素を線虫の防除のために用いることもできる。本明細書に具体例として示されているものは、N末端およびC末端が除去されたアミノ酸を有する約40〜50kDaの切断型cry6A毒素である。1つの好ましい態様において、本発明の毒素は高い活性をもつ切断型蛋白質をコードする遺伝子によって産生される。本明細書で説明される通り、B.t.培養上清の処理および／または適切な条件下でB.t.培養物を増殖させてプロテアーゼの有利な効果の結果として活性毒素を産生させることにより、本発明の切断型毒素を入手することも可能である。同様に、組換え宿主によって発現された蛋白質の処理によっても切断型毒素を入手しうる。
【００３０】
1つの好ましい態様では、前記植物に害虫抵抗性を付与するために、殺虫性毒素をコードする本明細書に記載される遺伝子が植物の形質転換に用いられる。植物のこのような形質転換は当業者に周知の技法を用いて達成することができ、典型的には、植物における切断型毒素の発現を最適化するような遺伝子の改変が含まれる。
【００３１】
また、本発明は、融合蛋白質および融合遺伝子の産生における切断型毒素および遺伝子の全体または一部の使用にも関する。
【００３２】
発明の詳細な開示
本発明は害虫の防除のための材料および方法に関する。特定の態様において、本発明は鞘翅目害虫に対する活性を有する切断型B.t.毒素に関する。また、本発明は線虫の防除に有用な毒素も提供する。本発明はさらに、これらの殺虫性毒素をコードする新規遺伝子に関する。1つの特に好ましい態様において、本明細書に記載される材料および方法はハムシモドキ幼虫の防除に用いることができる。
【００３３】
本発明に係る有用な単離物は、米国特許第5,427,786号、第5,186,934号および第5,273,746号を含む種々の米国特許に記載された寄託物の恩恵により当業者に入手可能である。PCT国際出願・国際公開公報第93／04587号も参照されたい。PS86A1（NRRL B-18400、1988年8月16日に寄託）およびMR506菌はこれらの特許において開示されている。PS69D1単離物（NRRL B-18247、1987年7月28日に寄託）は、米国特許第4,948,734号、第5,093,120号、第5,262,399号および第5,439,881号を含む種々の米国特許において開示されている。
【００３４】
B.t.PS86A1単離物は、86A1または86A1(a)毒素と呼ばれる約55kDaの毒素を産生する。この毒素はCry6A毒素である。この毒素をコードする遺伝子はバチルス・チューリンギエンシス単離物MR506中にクローニングされており、これもCry6A毒素を発現する。
【００３５】
本発明の1つの好ましい態様においては、B.t.単離物PS86A1およびMR506によって発現される約55kDaのCry6A毒素が切断され、鞘翅目に対する高い生物活性を有する約45kDaの毒素が得られる。この種の切断型毒素は本明細書において切断型Cry6A毒素と呼ばれる。有利なことに、この切断型毒素はハムシモドキ幼虫に対して特に有効なことが明らかになっている。この切断型毒素は、好ましくはN末端およびC末端が除去されたアミノ酸を有することによって活性をもつ切断型形態を生じる。しかし、本発明に係る切断型の活性化毒素は、N末端のみまたはC末端のみのいずれかからアミノ酸を除去することによっても得ることができる。
【００３６】
本明細書に記載される通り、アミノ酸の除去によって切断された活性型を得ることは、種々の技法を用いて達成しうる。1つの好ましい態様において、切断型の活性な形態の毒素をコードするように遺伝子が改変される。または、内因性プロテアーゼが蛋白質を切断して高活性型にするような適切な条件下におけるB.t.培養物の処理または培養物の増殖によって本発明の切断型毒素を得ることができる。
【００３７】
86A1 55kDa毒素のN末端およびC末端の部分の除去により、活性の強さが増すという有利な活性化がこの毒素に生じることが見いだされた。アミノ酸の除去は、好ましくはトリプシン処理により、またはプロナーゼ、キモトリプシンもしくはB.t.培養液中の内因性プロテアーゼといった別の適した酵素または酵素混合物による処理によって達成しうる。トリプシン濃度、インキュベーション時間および温度は相互依存的な条件であり、望ましい最終消化産物を得るために当業者によって変更しうると考えられる。本明細書に提供される開示を用いて当業者がその他の生理活性断片を得ることも可能である。上記で同定されたものと類似するアミノおよび／またはカルボキシ末端を有する断片も、改良された殺虫活性を示すと考えられる。
【００３８】
この開示の恩恵を受ける当業者は容易に理解すると思われるが、B.t.培養物の増殖に用いられる特定の培地を、B.t.毒素の最適な活性化が達成されるように改変することができる。例えば、培地の調整または変更によって細胞密度を調節することができる。また、B.t.毒素の活性化を増強するために、内部にプロテアーゼを有する培地を用いることもできる。
【００３９】
約55kDaの完全長B.t.毒素を発現させ、続いて適切な試薬の添加および／または内因性プロテアーゼの偶発的作用による蛋白質の切断が生じる条件下で培養物を増殖させることによって高活性型に変換することができる。1つの代替的な態様においては、完全長毒素に他の改変を施すことによって活性型の毒素を得ることもできる。完全長毒素に望ましい改変を生じさせて活性型を得るために、毒素の可溶化の調整のほか、pH、イオン強度または酸化還元電位などのその他の反応条件を用いることもできる。
【００４０】
本発明の切断型毒素を得るために用いうる組換え宿主の一つがMR506である。本発明の切断型毒素は、バチルス・チューリンギエンシスMR506株の結晶性δ内毒素をウシトリプシンなどのセリンプロテアーゼによりアルカリ性pHで、好ましくはβ-メルカプトエタノールの非存在下において処理することによって得ることができる。
【００４１】
また、本発明は、融合蛋白質および融合遺伝子の産生における切断型毒素および遺伝子の全体または一部の使用にも関する。
【００４２】
遺伝子および毒素  本発明に係る有用な遺伝子および毒素には、具体的に例示される配列のみならず、本明細書に具体的に例示される毒素の特徴的な殺虫活性を保持するより短い配列ならびに変種、変異体および融合蛋白質も含まれる。本明細書で用いられる遺伝子の「変種（variant）」または「変化物（variation）」という用語は、同一の毒素をコードする、または殺虫作用を有する等価な毒素をコードする、ヌクレオチド配列を意味する。本明細書で用いられる「等価な毒素」という用語は、標的害虫に対して例示される毒素と同一または本質的に同一な生物活性を有する毒素を意味する。
【００４３】
活性のある毒素をコードする遺伝子をいくつかの手段によって同定および入手しうることは当業者には明らかであると思われる。本明細書に例示される具体的な遺伝子は、上記の培養物の受託所に寄託された単離物から入手しうる。これらの遺伝子またはその部分もしくは変種を、例えば遺伝子合成装置を用いて合成的に構築することもできる。遺伝子の変化物は、点変異を作るための標準的な技法を用いて容易に構築しうる。また、標準的な手順に従って市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いてこれらの遺伝子の断片を作製することもできる。例えば、Bal3Iなどの酵素または部位特異的変異誘発法を用いて、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを計画的に切除することができる。また、種々の制限酵素を用いて活性断片をコードする遺伝子を得ることも可能である。これらの毒素の活性断片を直接入手するためにプロテアーゼを用いてもよい。
【００４４】
等価な毒素および／またはこれらの等価な毒素をコードする遺伝子は、本明細書で提供される技法を用いてB.t.単離物および／またはDNAライブラリーから得ることができる。本発明の殺虫性毒素を入手するための方法は数多くある。例えば、本明細書で開示および請求される殺虫性毒素に対する抗体を用いて、蛋白質の混合物から他の毒素を同定および単離することができる。具体的には、最も定常的であって他のB.t.毒素と最も異なる毒素の部分に対する抗体を産生させることができる。続いてこれらの抗体を用いて、免疫沈降法、固相酵素免疫測定法（ELISA）またはウエスタンブロット法により、特徴的活性を有する等価な毒素を特異的に同定することができる。本明細書に開示される毒素もしくは等価な毒素またはこれらの毒素の断片に対する抗体は、当技術分野における標準的な手順を用いて容易に調製できる。続いて、これらの毒素をコードする遺伝子を微生物から得ることができる。
【００４５】
例示される毒素の殺虫活性を保持する断片および等価物は本発明の範囲に含まれると考えられる。また、遺伝暗号の重複（redundancy）のために、種々の異なるDNA配列が本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードすることができる。同一または本質的に同一な毒素をコードするこれらの代替的なDNA配列を作製することは、十分に当業者の技能の範囲に含まれる。これらの変種DNA配列は本発明の範囲に含まれる。本明細書で用いられる「本質的に同一な」配列という言及は、殺虫活性に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を有する配列を意味する。殺虫活性を保持する断片もこの定義に含まれる。
【００４６】
本発明の毒素および遺伝子を同定するための1つのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用によるものである。これらのプローブは検出可能なヌクレオチド配列である。プローブは、毒素をコードする本発明の遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、DNAまたはRNA合成装置および標準的な手順を用いて合成することができる。プローブが合成的に作製される場合、プローブは通常は少なくとも約10塩基、より一般的には少なくとも約18塩基であり、最大で約50塩基またはそれ以上であって、通常は約200塩基を上回ることはないと考えられる。しかし、さらに長いプローブも容易に利用することができ、このようなプローブの長さは例えば数キロベースでありうる。プローブの配列は、関心対象の毒素をコードする遺伝子に対して少なくとも実質的には相補的であるように設計される。プローブは、それがハイブリダイズする配列に対して完全な相補性を有する必要はない。当業者に周知の技法を用いてプローブを標識してもよい。このようなプローブ分析により、B.t.の多種多様な亜種に含まれる、商業的に価値のある可能性のある殺虫性内毒素遺伝子を同定するための迅速な方法が提供される。
【００４７】
種々の程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを用いることができる。条件がストリンジェントであるほど、2重鎖の形成に要する相補性は高くなる。厳密性は、温度、プローブ濃度、プローブ長、イオン強度、時間などによって制御できる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばケラー（Keller, G.H.）、マナック（M.M. Manak）（1987）、DNAプローブ（DNA Probes）、Stockton Press、New York、NY.、pp.169〜170に記載された通りの、当業者に周知の技法により、ストリンジェントな条件下で実施される。比較的長い遺伝子断片を用いる場合には、低ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションが好ましい方法である。
【００４８】
本明細書で用いられるハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな」条件とは、本出願者によって採用される条件と同じ、または実質的に同じ程度の特異性のハイブリダイゼーションが達成される条件を意味する。具体的には、サザンブロット上に固定されたDNAと32Pで標識した遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションを標準的な方法によって行った（Maniatis, T.、E.F. Fritsch、J. Sambrook［1982］、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY）。一般に、ハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄は、例示される毒素遺伝子に対する相同性を有する標的遺伝子の検出が可能となるようなストリンジェントな条件下で行った。2本鎖DNA遺伝子プローブについては、ハイブリダイゼーションを6×SSPE、5×デンハート溶液、0.1％SDS、0.1mg／ml変性DNA中にてDNAハイブリッド体の融解温度（Tm）未満の20〜25℃で一晩行った。融解温度は以下の式によって記載される（Beltz, G.A.、K.A. Jacobs、T.H. Eickbush、P.T. CherbasおよびF.C. Kafatos［1983］Methods of Enzymology、R.Wu、L. GrossmanおよびK. Moldave［編］、Academic Press、New York 100：266〜285）。
【００４９】
Tm＝81.5℃＋16.6 Log［Na+］＋0.41（％G＋C）−0.61（％ホルムアミド）−600／2重鎖の塩基対の長さ。
【００５０】
洗浄は典型的には以下の通りに行われる：
【００５１】
（1）室温で1×SSPE、0.1％SDS中にて15分間を2回（低ストリンジェンシーでの洗浄）。
（2）Tm-20℃で0.2×SSPE、0.1％SDS中にて15分間を1回（中程度のストリンジェンシーでの洗浄）。
【００５２】
オリゴヌクレオチドプローブについては、ハイブリダイゼーションは6×SSPE、5×デンハート溶液、0.1％SDS、0.1mg／ml変性DNA中にて、ハイブリッド体の融解温度（Tm）未満の10〜20℃で一晩行った。オリゴヌクレオチドプローブに関するTmは「隣接個体」法によって決定しうる。ブレスラウアー（Breslauer）ら、「塩基配列からのDNA2重鎖の安定性の予測（Predicting DNA duplex stability from the base sequence」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、83（11）：3746〜3750（June 1986）、リィクリク（Rychlik）およびローズ（Rhoads）「DNAのフィルターハイブリダイゼーション、シークエンシングおよびインビトロ増幅用の最適なオリゴヌクレオチドを選択するためのコンピュータプログラム（A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA）」Nucleic Acids Res.、17（21）：8543〜8551（Nov.11、1989）、サンタルチア（SantaLucia）ら、「DNA2重鎖の安定性を予測するための改良された隣接パラメーター（Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability）」Biochemistry 35（11）：3555〜3562（March 19、1996）、ドクチズ（Doktycz）ら、「128の八量体DNA2重鎖の光学的融解。塩基対の位置および隣接塩基の熱安定性に対する影響（Optical melting of 128 octamer DNA duplexes. Effects of base pair location and nearest neighbors on thermal stability）」、J. Biol. Chem.、270（15）：8439〜8445（1995年4月14日）。または、Tmを以下の式によって決定することもできる：
Tm（℃）＝2（T／A塩基対の数）＋4（G／C塩基対の数）（Suggs, S.V.、T. Miyake、E.H. Kawashime、M.J. Johnson、K. ItakuraおよびR.B. Wallace［1981］ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes、D.D. Brown［編］、Academic Press、New York、23：683〜693）。
【００５３】
洗浄は典型的には以下の通りに行われる：
（1）室温で1×SSPE、0.1％SDS中にて15分間を2回（低ストリンジェンシーでの洗浄）。
（2）ハイブリダイゼーション温度で1×SSPE、0.1％SDS中にて15分間を1回（中程度のストリンジェンシーでの洗浄）。
【００５４】
本発明のDNA配列をPCR増幅用のプライマーとして用いることもできる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、核酸配列の反復性で酵素的なプライマーによる合成である。この手順は当業者に周知であり、広く用いられている（Mullis、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号、Saiki、Randall K.、Stephen Scharf、Fred Faloona、Kary B. Mullis、Glenn T. Horn、Henry A. Erlich、Norman Arnheim［1985］「βグロビンゲノム配列の酵素的増幅および鎌状赤血球貧血の診断のための制限部位分析（Enzymatic Amplification of β-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia）」Science 230：1350〜1354を参照されたい）。PCRは、標的配列の対側鎖とハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドプライマーが隣接する関心対象のDNA断片の酵素的増幅に基づく。プライマーは3'端が互いに向かい合うように配向される。テンプレートの熱変性、プライマーの相補配列とのアニーリング、およびアニーリングしたプライマーのDNAポリメラーゼによる伸長というサイクルを繰り返すことにより、PCRプライマーの5'端によって規定されるセグメントが増幅される。各プライマーの伸長産物は他方のプライマーに対するテンプレートとしての役割を果たしうるため、各サイクルにより、前のサイクルで生じたDNA断片の量は本質的には2倍となる。これは特定の標的断片の指数的蓄積をもたらし、2〜3時間で数百万倍にもなる。好熱菌サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）から単離されるTaqポリメラーゼなどの耐熱性DNAポリメラーゼを用いることにより、この増幅工程は完全に自動化できる。
【００５５】
本発明のある種の毒素は本明細書に具体的に例示されている。これらの毒素は本発明の毒素の単なる例に過ぎないため、例示される毒素と同じまたは同様の殺虫活性を有する変種または等価な毒素（および等価な毒素をコードするヌクレオチド配列）が本発明に含まれることは容易に明らかになると思われる。等価な毒素は例示される毒素との高いアミノ酸相同性を有すると思われる。このアミノ酸同一性は典型的には60％を上回り、好ましくは75％を上回り、より好ましくは80％を上回り、より好ましくは90％を上回り、95％を上回ることも可能である。これらの同一性は標準的な整列化法を用いて決定される。アミノ酸相同性は、生物活性の原因となる、または最終的に生物活性の原因となる三次元構造の決定に関与する毒素の決定的な領域において最も高いと考えられる。この点に関して、ある種のアミノ酸置換は許容可能であり、これらの置換が活性に決定的でない領域にあるか、または分子の三次元構造に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換であるか否かを予想しうる。例えば、アミノ酸は以下のクラスに分けられる：非極性、非荷電極性、塩基性および酸性。1つのクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸によって置換される保存的置換は、その置換が化合物の生物活性を実質的に変化させない限り、本発明の範囲に含まれる。各クラスに属するアミノ酸の例の一覧を表１に提示する。
【００５６】
【表１】
0003794548.tif 000002
【００５７】
場合によっては、非保存的置換がなされることも可能である。決定的な要因は、これらの置換が毒素の生物活性を著しく低下させないことである。
【００５８】
本明細書で用いられる「単離された」ポリヌクレオチドおよび／または「精製された」毒素という語句は、これらの分子が、それらが自然な状態にある際に付随して認められるその他の分子を伴っていないことを意味する。このため、「単離および精製された」という語句は、本明細書で説明するような「人の手」が加わっていることを意味する。
【００５９】
組換え宿主  本発明の毒素コード遺伝子は、極めて多岐にわたる微生物または植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子の発現は、直接的であれ間接的であれ、殺虫剤の細胞内での産生および維持をもたらす。シュードモナスなどの適した微生物宿主を用いることにより、微生物を害虫のいる位置に適用し、そこでそれを増殖させ、摂取させることができる。その結果、害虫の制御がなされる。または、毒素遺伝子の宿主である微生物を、毒素の活性を延長させて細胞を安定化するような条件下で処理することもできる。毒性活性を保持する処理された細胞は、続いて標的害虫の環境に対して適用しうる。
【００６０】
B.t.毒素遺伝子が適したベクターを介して微生物宿主に導入され、前記宿主が生きた状態で環境に適用される場合には、ある種の宿主微生物を用いることが必須である。微生物宿主は、関心対象の1つまたは複数の農作物の「フィトスフェア（phytosphere）」（葉面（phylloplane）、葉圏（phyllosphere）、根圏（rhizosphere）および／または根面（rhizoplane））を占めることが知られているものが選択される。これらの微生物は、特定の環境（農作物およびその他の昆虫居住環境）において野生型微生物と首尾よく競合することができて、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定的な維持および発現を提供し、望ましくは環境性分解および不活性化からの殺虫剤の保護における改良が提供されるように選択される。
【００６１】
多数の微生物が、非常に多岐にわたる重要な農作物の葉面（植物の葉の表面）および／または根圏（植物の根の周囲の土壌）に生息することが知られている。これらの微生物には細菌、藻類および真菌が含まれる。特に関心がもたれるのは、シュードモナス属、エルウィニア属、セラチア属、クレブシエラ属、キサントモナス属、ストレプトマイセス属、根粒菌属、ロドシュードモナス属、メチロフィルス属、アグロバクテリウム属、アセトバクター属、乳酸桿菌属、アルスロバクター属、アゾトバクター属、ロイコノストック属およびアルカリゲネス属などの細菌；真菌、特に酵母菌属、クリプトコッカス属、クリュイベロマイセス（Kluyveromyces）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、ロドトルラ属およびオーレオバシジウム属などの酵母といった微生物である。特に関心がもたれるのは、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）、アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）およびアゾトバクター・ヴィンランディ（Azotobacter vinlandii）などのフィトスフェア細菌種；ならびにロードトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、R.グルティニス（R. glutinis）、R.マリナ（R. marina）、R.オーランティアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、C.ディフルエンス（C. diffluens）、C.ローレンティ（C. laurentii）、サッカロマイセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、S.プレトリエンシス（S. pretoriensis）、S.セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、S.オドラス（S. odorus）、クリュイベロマイセス・ヴェロネ（Kluyveromyces veronae）およびオーレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）などのフィトスフェア酵母種である。特に関心がもたれるのは色素性細菌である。
【００６２】
遺伝子の安定的な維持および発現を可能とする条件下で毒素をコードするB.t.遺伝子を微生物宿主に導入するためには、かなりの数の方法を用いうる。これらの方法は当業者には周知であり、例えば米国特許第5,135,867号に記載されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【００６３】
本発明の単離物、毒素および遺伝子を用いてのハムシモドキ幼虫を含む鞘翅目昆虫ならびに線虫の防除は、当業者に知られた種々の方法によって達成しうる。これらの方法には、例えば、B.t.単離物の害虫（またはその居場所）に対する適用、組換え微生物の害虫（またはその居場所）に対する適用、および本発明の殺虫性毒素をコードする遺伝子による植物の形質転換が含まれる。組換え微生物は、例えばB.t.、大腸菌またはシュードモナスでありうる。形質転換は当業者により、標準的な技法を用いて行いうる。これらの形質転換に必要な材料は本明細書に開示されており、または当業者が別の方法によって容易に入手しうる。
【００６４】
宿主の形質転換のために、本明細書に例示される遺伝子と機能的に等価な合成遺伝子を用いることも可能である。合成遺伝子の作製のための方法は、例えば、米国特許第5,380,831号に見いだすことができる。
【００６５】
細胞の処理  上記の通り、毒性活性の延長および細胞の安定化のために、B.t.毒素を発現するB.t.または組換え細胞を処理することができる。形成される殺虫剤マイクロカプセルは、安定化されていてマイクロカプセルを標的害虫の環境に適用した際に毒素を保護すると思われる細胞構造内にB.t.毒素を含む。適した宿主細胞には原核細胞または真核細胞のいずれも含まれるが、通常は哺乳動物などの高等生物に対して有害な物質を産生しないような細胞に限定される。しかし、毒性物質が不安定であるか、哺乳動物宿主に対する毒性の可能性がすべて回避される程度に適用レベルが低い場合には、高等生物に対して有害な物質を産生する生物体を用いることも可能と思われる。宿主として特に関心がもたれるのは、原核生物および真菌などの下等な真核生物である。
【００６６】
細胞は通常は無傷であって処理される際には、場合によっては胞子を用いることもできるが、胞子型ではなく実質的に増殖型にあるものである。
【００６７】
その技法が毒素の特性に有害な影響を及ぼさず、しかも細胞による毒素の保護能を低下させない限り、B.t.毒素遺伝子を含む微生物などの微生物細胞の処理を、化学的もしくは物理的手段、または化学的および／もしくは物理的手段の組み合わせによって行うこともできる。化学試薬の例には、ハロゲン化剤、特に原子番号17〜80番のハロゲンがある。より特別には、ヨウ素を穏やかな条件下で望ましい結果が達成されるのに十分な時間にわたって用いることができる。その他の適した技法には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド；塩化ゼフィランおよび塩化セチルピリジニウムなどの抗感染薬；イソプロピルアルコールおよびエタノールなどのアルコール；ルゴールヨウ素（Lugol iodine）、ブワン固定液などの種々の組織固定液；種々の酸ならびにヘリー固定液（Humason、Gretchen L.、動物組織の技法（Animal Tissue Techniques）、W.H. Freeman and Company、1967を参照のこと）、または細胞が宿主環境に対して投与された際に細胞内で産生される毒素の活性を保持および延長させる物理的（熱）および化学的因子の組み合わせによる処理が含まれる。物理的手段の例には、γ線照射およびX線照射などの短波長照射、凍結、UV照射、凍結乾燥などがある。微生物細胞の処理のための方法は米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されており、これらは参照として本明細書に組み入れられる。
【００６８】
細胞は一般に、環境条件に対する抵抗性が増すように構造的安定性が高められていると考えられる。殺虫剤が前駆形態（proform）にある場合には、細胞処理の方法は、標的害虫病原体による殺虫剤の前駆形態から成熟形態へのプロセシングを阻害しないように選択される必要がある。例えば、ホルムアルデヒドは蛋白質を架橋し、ポリペプチド殺虫剤の前駆形態のプロセシングを阻害しうると考えられる。処理の方法は、毒素の生物学的利用能または生理活性の少なくとも実質的部分を保持させる必要がある。
【００６９】
産生のための宿主細胞の選択において特に関心がもたれる特性には、宿主へのB.t.遺伝子の導入しやすさ、発現系の利用可能性、発現効率、宿主内での殺虫剤の安定性、および補助的な遺伝的能力の存在が含まれる。殺虫性マイクロカプセルとしての使用に関して関心がもたれる特徴には、厚い細胞壁、色素沈着および細胞内パッケージングまたは封入体形成などの殺虫剤に対する保護特性、水性環境における生存性、哺乳動物毒性がないこと、害虫が摂取するような誘引性、毒素に障害を及ぼさずに殺菌および固定を行える容易さなどが含まれる。考慮すべきその他の事項には、製剤化および取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性などが含まれる。
【００７０】
細胞の増殖  B.t.殺虫性遺伝子を含む細胞宿主は、実質的にすべてまたはすべての細胞がB.t.遺伝子を保持するような選択的培地であるような、そのDNA構築物が選択的な利益を提供する任意の好都合な栄養培地中で増殖させることができる。続いてこれらの細胞を従来の方式に従って回収してもよい。または、回収の前に細胞を処理することもできる。
【００７１】
本発明のB.t.細胞は、標準的な技術である培地および発酵法を用いて培養することができる。発酵サイクルが完了した時点で、当技術分野で周知の手段により、まずB.t.胞子および結晶を発酵培地から分離することによって細菌を回収することができる。回収したB.t.胞子および結晶は、界面活性剤、分散剤、不活性担体ならびに特定の標的害虫に対する取り扱いおよび適用を容易にするためのその他の成分を添加することにより、水和剤、原液、顆粒またはその他の製剤として製剤化することができる。これらの製剤および適用手順は当技術分野で周知である。
【００７２】
害虫防除のための方法および製剤  本発明の毒素および遺伝子を用いての鞘翅目昆虫の防除は、当業者に知られた種々の方法によって達成しうる。これらの方法には、例えば、B.t.単離物の害虫（またはその居場所）に対する適用、組換え微生物の害虫（またはその居場所）に対する適用、および本発明の殺虫性毒素をコードする遺伝子による植物の形質転換が含まれる。組換え微生物は、例えばB.t.、大腸菌またはシュードモナスでありうる。形質転換は当業者により、標準的な技法を用いて行いうる。これらの形質転換に必要な材料は本明細書に開示されており、または当業者が別の方法によって容易に入手しうる。
【００７３】
誘引物質ならびにB.t.単離物の胞子および結晶を含む製剤化された餌用顆粒、または本明細書に開示されるB.t.単離物から入手しうる遺伝子を含む組換え微生物は土壌に適用することができる。製剤化された産物を、種子コート剤、または農作物サイクルの後期における根処理剤もしくは全植物処理剤として適用することもできる。B.t.細胞の植物および土壌への処理には、無機塩類（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）または植物性物質（粉末トウモロコシ穂軸、籾殻、クルミ殻など）の種々の不活性物質と混合することにより、水和剤、顆粒または粉剤として用いうる。本製剤は、乳化-展着補助剤、安定剤、その他の殺虫性添加剤または界面活性剤などを含みうる。液体製剤は水性でも非水性でもよく、泡剤、ゲル剤、懸濁液、乳剤などとして用いてもよい。成分には流体力学的  製剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤またはポリマーを含めうる。
【００７４】
当業者には理解されると思われる通り、殺虫剤の濃度は、個々の製剤の性質に応じて、特にそれが濃縮物であるか、または直接用いられるかによって大きく異なると考えられる。殺虫剤は重量にして少なくとも1％で存在し、重量にして100％でもありうると考えられる。乾燥製剤は殺虫剤を重量にして約1〜95％含むと考えられ、液体製剤は一般に液相中に個体を重量にして約1〜60％含むと考えられる。製剤は一般に約102から約104個／mgの細胞を有すると考えられる。これらの製剤は、1ヘクタール当たり約50mg（液状または乾燥）から1kgまたはそれ以上で投与されると考えられる。
【００７５】
本製剤は、噴霧、散布、散水などにより、土壌および葉などの害虫環境に対して適用することができる。
【００７６】
本明細書で言及される米国特許はすべて参照として本明細書に組み入れられる。
【００７７】
以下は、本発明の実践のための手順を例示した実施例である。これらの実施例は制限的なものと解釈されるべきではない。別に特記する場合を除き、比率はすべて重量比であり、溶媒混合比率はすべて容積比である。
【００７８】
実施例1―B.t.単離物の培養
以下の培地、ペプトン、グルコース、塩類培地の播種にB.t.単離物の継代培養物を用いることができる。
バクトペプトン（Bacto Peptone）      7.5g／l
グルコース                           1.0g／l
KH2PO4                               3.4g／l
K2HPO4                               4.35g／l
塩類溶液                             5.0ml／l
CaCl2溶液                            5.0ml／l
塩類溶液（100ml）
MgSO4・7H2O                          2.46g
MnSO4・H2O                          0.04g
ZnSO4・7H2O                         0.28g
FeSO4・7H2O                         0.40g
CaCl2溶液（100ml）
CaCl2・2H2O                         3.66g
pH7.2
【００７９】
塩類溶液およびCaCl2溶液を濾過滅菌し、接種の時点でオートクレーブおよび加熱された培地に添加する。フラスコを回転振盪器上にて30℃、200rpmで64時間インキュベートする。
【００８０】
上記の手順は、当技術分野で周知の手順により、大きな発酵槽にまで容易にスケールアップすることができる。
【００８１】
上記の発酵において得られたB.t.胞子および結晶は、当技術分野で周知の手順によって単離しうる。頻用される手順は、回収された発酵培地を遠心などの分離法にかけることである。
【００８２】
実施例2―PS86A1株からの組換えCry6A毒素の発現および精製
250mlのバッフル付き培養フラスコにオートクレーブ済みの50mlのLB培地を含み、50μlのPS86A1が接種されたものからなる出発培養物を調製した。フラスコを閉鎖し、回転振盪器にて30℃、225rpmで4〜6時間インキュベートした。5mlの出発物を、2リットルのバッフル付き培養フラスコに入れたオートクレーブ済みの300mlの増殖培地への播種に用い、発泡栓をした。増殖培地はNYS-CAAと命名され、以下のものからなる：
栄養ブイヨン（Difco）                3.75g
トリプトン                           3.75g
カザミノ酸                           6.00g
酵母抽出物                           1.50g
B.t.塩                               30ml
【００８３】
B.t.塩の原液は以下のものからなる：
CaCl2・2H2O                           10.30g
MgCl2・6H2O                           20.35g
MnCl2・4H2O                            1.00g
FeSO4・7H2O                            0.02g
ZnSO4・7H2O                            0.02g
(NH4)2SO4                              0.02g
HCl(7N)                                1.00ml
【００８４】
播種した培養物を大型の回転振盪器上にて30℃で65時間またはそれ以上にわたり増殖させた（溶解が実質的に完了するまで）。ソーバル（Sorvall）GS-3ローター中での4℃および8,000rpmでの遠心処理によって粒子状物質を回収した。ペレット化した物質を再懸濁して上記の通りに遠心することにより、この結果得られたペレットを約5倍量の蒸留水で3回洗浄した。毒素結晶は、50％ 15ml 、45％ 7mlおよび40％ 7mlのNaBrからなる臭化ナトリウムの段階的勾配に対する遠心処理（ソーバルHS-4ローター中にて6,500rpmで100分、4℃）を用いて精製した。結晶を勾配から採取して、蒸留水で約50％に希釈し、ソーバルSS-34ローター中での14,000rpm、4℃の遠心処理によって濃縮した。結晶性蛋白質のペレットを最小量の蒸留水中に懸濁して、ドライアイス／イソプロパノール浴中で急速凍結し、-80℃で保存した。この工程の産物のSDS-PAGE分析により、54kDaを主とするクーマシー染色バンドが明らかになる。蛋白質の質量分析（マトリックス介助レーザーデソープション-タイムオブフライト法（matrix-assisted laser desorbtion-time of flight）、MALDI-TOF）では54,080ダルトンに主ピークが検出された。完全な86A1毒素のアミノ酸配列から算出される分子量は54,080ダルトンである。
【００８５】
実施例3―Cry6A毒素の蛋白質分解性消化
上記の通りに得た結晶性蛋白質をウシトリプシンを用いて蛋白質分解的に消化した。消化混合物には2.0mlの最終容積中に133mMトリス塩基、1M尿素、5mgの86A1毒素蛋白質、50μgのトリプシン（例えばSigma XIIIタイプまたはBoerhinger-Mannheimシークエンシング用グレード）が含まれていた。上記の混合物からトリプシンを除いたものを37℃で15分間インキュベートした。続いてトリプシンを10mM酢酸ナトリウム、pH4.5中の1mg／ml溶液として添加し、37℃でさらに2時間インキュベートした。インキュベーション終了後、反応混合物をエッペンドルフ（Eppendorf）遠心管に入れて4℃で15分間遠心した。上清を除去して2mlのセントリコン30（Centricon 30）（Amicon）に移し、蒸留水2mlで3回洗った。洗浄した試料は4℃で保存するか、ドライアイス／イソプロパノール浴中で急速凍結して-80℃で保存した。
【００８６】
洗浄した消化混合物のSDS-PAGE分析では、45,000ダルトンに主要なクーマシーブルー染色バンドが認められ、46,000ダルトンおよび約34,000ダルトンに弱いバンドが検出可能であった。MALDI-TOFでは、46,500ダルトンの単一のバンドが認められる。PVDFメンブレンにブロットされたSDS-PAGEバンドの自動（ABI）エドマン分解を用いたアミノ末端配列解析により、完全長86A1毒素（配列番号：2）のうちアミノ酸第１２残基に始まる既知の配列に対応する11アミノ酸配列が明らかである。ジテックス（Zitex）メンブレンにブロットされた主要なSDS-PAGEバンドの自動化カルボキシ末端シークエンシング（HP）では、配列番号：2のアミノ酸残基441に始まってアミノ酸443で終わる86A1毒素の既知の配列に対応する配列が認められた。配列決定がなされた断片（残基12〜443）に関して算出された質量は48,725ダルトンである。
【００８７】
上記断片に基づく切断型毒素を本明細書ではR443、切断型86A1毒素または切断型Cry6A毒と呼ぶ。R443（配列番号：６）は配列番号：２の12位−443位のアミノ酸残基に基づくが、配列番号：２の１２位及び１３位の（His−Ser）は配列番号：６のN末端では「Met-Gly」に置換されている。よって、配列番号６の3位-432位のアミノ酸残基は配列番号：２の14位−443位のアミノ酸残基に対応している。配列番号：５は配列番号：６をコードするDNA配列である。
【００８８】
上記の好ましい方法のほかに、1M尿素の非存在下においても同様の結果を得ることができる。1M尿素の存在下または非存在下において140mMのβ-メルカプトエタノールを添加すると、産物の収量は大きく減少する。これは尿素が存在しない場合には、トリプシンの量を10倍に増やすことにより、ある程度克服可能である。pHがpH9〜11の間にある緩衝液ならいずれも同様の能力を有する可能性が高い。
【００８９】
実施例4―西部ハムシモドキ幼虫のバイオアッセイ
上記の実施例3の通りに入手した切断型蛋白質調製物を西部ハムシモドキ幼虫に対するバイオアッセイに用いたところ、有意な毒性活性を有することが明らかになった。
【００９０】
表2に示した通り、切断型86A1蛋白質を用いて得られた活性のレベルは、予想外のことに、完全長86A1蛋白質を用いて得られた対照レベルを上回った。
【００９１】
【表２】
0003794548.tif 000003
【００９２】
本来の長さ（58kDa）の86A1蛋白質および切断型（45kDa）の86A1蛋白質に関してLC50（μg／cm2）を求めた。結果は表3に提示している。
【００９３】
【表３】
0003794548.tif 000004
【００９４】
実施例5―融合蛋白質および遺伝子の構築
西部ハムシモドキ幼虫に対する活性を有する、Cry6BおよびCry6Aからなる融合蛋白質を構築することができる。Cry6B／69D1蛋白質がこれまでハムシモドキ幼虫の防除に有用なことは知られていなかった点に留意すべきである。PS69D1から入手しうる完全長Cry6B毒素の配列は配列番号：10に相当する。配列番号：9も参照されたい。
【００９５】
融合物は、Cry6Bからの遺伝子セグメントがCry6Aからのものと、オープンリーディングフレームが維持されるような形で連結されたものからなる。 1つの態様は、Cry6Bのアミノ酸1から394までをCry6Aのアミノ酸386から443までと連結したものからなる。実質的な相同性からみて同様の三次元構造が推測され、三次元構造における有害な擾乱の可能性も低いことから、実質的な相同性がある箇所で2つの遺伝子の間の交差を行うことが好ましいと考えられる。図1はCry6AとCry6Bを整列化したものであり、交差のための相同領域を示している。遺伝子融合のための交差点のその他の可能例を以下の表４に示す。この表は制限的なものと解釈されるべきではない。
【００９６】
【表４】
0003794548.tif 000005
【００９７】
さらに、最初の約10〜25個のアミノ酸がなくなるように構築物のアミノ末端を切断することも可能である。
【００９８】
実施例6―植物への毒素遺伝子の挿入
本発明の1つの局面は、殺虫性毒素をコードする本遺伝子による植物の形質転換である。形質転換を受けた植物は、標的害虫による攻撃に対して抵抗性である。好ましい態様において、本発明の切断型遺伝子は植物での使用のために最適化される。配列番号：3および4は、完全長cry6A遺伝子および毒素が植物に最適化されたものに関する配列情報を提供している。切断遺伝子を植物での使用のために最適化することもできる。例えば、R390とも称される配列番号：7および8の遺伝子および毒素の配列は植物での使用のために最適化されている。
【００９９】
本明細書に開示される通りの殺虫性毒素をコードする遺伝子は、当技術分野で周知の種々の技法を用いて植物細胞に導入することができる。外来遺伝子を高等植物に挿入する調製のためには、例えば、大腸菌における複製系および形質転換細胞の選択を可能とするマーカーを含む数多くのクローニングベクターが利用できる。ベクターには、例えば、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184などが含まれる。したがって、B.t.毒素をコードする配列をベクターの適切な制限部位に挿入することができる。この結果得られたプラスミドを形質転換のために大腸菌に用いる。大腸菌細胞を適した栄養培地中で培養し、続いて回収および可溶化する。プラスミドは回収する。配列解析、制限分析、電気泳動およびその他の生化学的-分子生物学的方法が、分析方法として一般に行われる。各操作の後には、用いるDNA配列を切断し、次のDNA配列と連結することができる。各プラスミド配列は同一または他のプラスミド中にクローニングしうる。所望の遺伝子を挿入する方法によっては、その他のDNA配列が必要になることもある。例えば、植物細胞の形質転換にTiまたはRiプラスミドを用いる場合には、挿入しようとする遺伝子の隣接領域として、TiまたはRiプラスミドT-DNAの少なくとも右境界部、しかししばしば右および左境界部の両方を連結する必要がある。
【０１００】
植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用には詳細な研究がなされており、欧州特許第120 516号、ヘーケマ（Hoekema）（1985）、バイナリーベクター系（The Binary Plant Vector System）、Offset-durkkerij Kanters B.V.、Alblasserdam、第5章、フレイリー（Fraley）ら、Crit. Rev. Plant Sci. 4：1〜46、およびアンら（An）（1985）EMBO J. 4：277〜287に十分な記載がある。
【０１０１】
挿入されたDNAがゲノムに組み込まれると、それはそこで比較的安定となり、原則として再び遊離されることはない。それは通常、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシンもしくは特にクロラムフェニコールなどの、殺生剤または抗生物質に対する抵抗性を形質転換植物細胞に付与する選択マーカーを含む。このため、個々に用いられるマーカーは、挿入DNAを含まない細胞ではなく、形質転換細胞の選択を可能とすべきである。
【０１０２】
植物宿主細胞へのDNAの挿入には多数の技法を用いうる。それらの方法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換因子として用いてのT-DNAによる形質転換、融合、注入、遺伝子銃（微粒子照射）または電気穿孔ならびにその他の可能な方法が含まれる。形質転換のためにアグロバクテリウム属を用いる場合には、挿入しようとするDNAは特定のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングする必要がある。中間ベクターは、T-DNAにおける配列と相同な配列があることによる相同組換えにより、TiまたはRiプラスミドに組み込まれうる。TiまたはRiプラスミドは、T-DNAのトランスファーに必要なvir領域も含んでいる。中間ベクターはそれ自体ではアグロバクテリウム内で複製を行えない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスにトランスファーされる（接合）。バイナリーベクターはそれ自体で大腸菌およびアグロバクテリウム内の両方で複製しうる。それらは右および左のT-DNA境界領域による枠組みの内部に選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。それらは直接的にアグロバクテリウムに形質転換されうる（Holstersら［1978］ Mol. Gen. Genet. 163：181〜187）。宿主細胞として用いるアグロバクテリウムはvir領域を有するプラスミドを含む必要がある。vir領域は植物細胞へのT-DNAのトランスファーに必要である。付加的なT-DNAを含んでもよい。このような形質転換を受けた細菌を植物細胞の形質転換に用いる。植物細胞へのDNAのトランスファーのために、植物エクスプラントをアグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスとともに有利に培養することも可能である。続いて、選択のための抗生物質または殺生剤を含みうる適した培地中にて感染した植物材料（例えば、葉の小片、茎の断片、根、さらにはプロトプラストまたは懸濁培養細胞）から植物全体を再生させることができる。このようにして得られた植物を、続いて、挿入されたDNAの存在に関して検査できる。注入および電気穿孔の場合にはプラスミドに関して特定の条件はない。例えば、pUC誘導体などの通常のプラスミドを用いることが可能である。
【０１０３】
形質転換細胞は通常の様式で植物内部で増殖する。それらは生殖細胞を形成し、形質転換された形質を子孫植物に伝えることができる。このような植物は通常の様式で成長させ、同じ形質転換がなされた遺伝因子または他の遺伝因子を有する植物と交配させることができる。この結果得られた雑種個体は対応する表現型特性をもつ。
【０１０４】
本発明の1つの好ましい態様において、植物は、コドンの用法が植物に対して最適化された遺伝子による形質転換を受けると考えられる。例えば、米国特許第5,380,831号を参照されたい。また、切断型毒素をコードする植物も有利に用いうると考えられる。この切断型毒素は典型的には完全長毒素の約55％から約80％をコードすると考えられる。植物で用いるための合成B.t.遺伝子を作製するための方法は当技術分野で知られている。
【０１０５】
本明細書に記載された実施例および態様は例示のみを目的としたものであり、当業者にはそれらを鑑みて種々の改変または変更が示唆されると思われ、それらも本出願の精神および範囲ならびに添付の請求の範囲に含まれることが理解される必要がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、86A1および69D1のアミノ酸を比較して示したアミノ酸である。
配列の簡単な説明
配列番号：1は、完全長cry6A遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号：2は、完全長Cry6A毒素のアミノ酸配列である。
配列番号：3は、cry6A／86A1遺伝子の植物に最適化された完全長遺伝子配列である。
配列番号：4は、配列番号：3によってコードされる完全長アミノ酸配列である。
配列番号：5は、R443切断型遺伝子配列である。
配列番号：6は、配列番号：5によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：7は、 植物に最適化された切断型のR390遺伝子配列である。
配列番号：8は、配列番号：7によってコードされる切断型蛋白質配列である。
配列番号：9は、完全長cry6B／69D1遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号：10は、完全長Cry6B／69D1毒素のアミノ酸配列である。
【配列表】
0003794548.tif 000006
0003794548.tif 000007
0003794548.tif 000008
0003794548.tif 000009
0003794548.tif 000010
0003794548.tif 000011
0003794548.tif 000012
0003794548.tif 000013
0003794548.tif 000014
0003794548.tif 000015
0003794548.tif 000016
0003794548.tif 000017
0003794548.tif 000018
0003794548.tif 000019
0003794548.tif 000020
0003794548.tif 000021
【図１】
0003794548.tif 000022