(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０６０ＩＵ／ｍｌの組み換え凝固因子ＶＩＩＩＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）からなる皮下投与用の医薬製剤。
【請求項２】
ｉ）少なくとも１０６０ＩＵ／ｍｌの組み換え凝固因子ＶＩＩＩＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）と、
ｉｉ）少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルと、
ｉｉｉ）０．１Ｍ以上の量の塩化ナトリウムと、
ｉｖ）０．５ｍＭ以上の量の塩化カルシウムまたはグルコン酸カルシウムと、
ｖ）１ｍＭ以上の量のＬ−ヒスチジンと、
からなることを特徴とする請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
血友病を治療するための皮下投与用の薬剤を製造するために請求項１または２に記載の組み換え凝固因子ＶＩＩＩＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）を使用する組み換え凝固因子ＶＩＩＩの使用方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は組み換え凝固因子ＶＩＩＩからなる皮下、筋肉内または皮内投与用の医薬製剤と、血友病を治療するための薬剤を製造するために組み換え凝固因子ＶＩＩＩを使用する凝固因子ＶＩＩＩの使用方法とに関するものである。その製剤は少なくとも１０００ＩＵ／ｍｌの濃度において非常に純化された組み換え凝固因子ＶＩＩＩからなり、それは意外にも皮下、筋肉内または皮内投与後の血流中に高いレベルの活性因子ＶＩＩＩを付与する。調合剤は皮下、筋肉内または皮内投与により血友病の治療に向けられる。組み換え凝固因子ＶＩＩＩは好ましくはその欠失誘導体であり、それは皮下投与用の薬剤を製造するために使用され得る。
発明の背景
血友病は数世紀前に知られた遺伝子によつて受け継がれる病気であり、それが種々の形態、すなわち血友病Ａ、血友病Ｂおよび血友病Ｃ間を区別することが可能となつたのは、ここ３０年内である。血友病Ａは最も頻繁な形態である。それは生きて生まれた１００００人の男性当たり１人または２人の発生率で男性にのみ生じる。この病気は血漿中に通常存在するたんぱく質である生物活性凝固因子ＶＩＩＩ（抗血友病因子）が存在しない場合または存在しても非常に減少されたレベルの場合に発生する。血友病Ａの臨床的兆候は激しい出血傾向があり、因子ＶＩＩＩの濃縮物による治療が採用される以前には、それらの患者の平均年齢は２０年以下であつた。血漿から得られた因子ＶＩＩＩの濃縮物は約３０年間のあいだ有効であつた。これは血友病患者の治療の状況をかなり改善し、かれらに正常な生活を送る可能性を付与した。
治療因子ＶＩＩＩ濃縮物は現在までは血漿の分別により製造されていた。しかしながら、現在では、例えば、ジエイ・ギツチエ氏等著、ネイチヤー第３１２巻、第３３０頁乃至第３３７頁、１９８４年（Ｊ  Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，ｐ．３３０−３７，１９８４）およびヨーロツパ特許出願第ＥＰ−Ａ−１６０４５７号明細書において報告されたような組み換えＤＮＡ技術を使用する細胞培養中で因子ＶＩＩＩを製造するための有効な方法がある。
ヒト血漿から誘導された因子ＶＩＩＩ濃縮物は幾つかに分裂された完全に活性の因子ＶＩＩＩ形態を含有している（アンデルツソン氏等著、米国国立大学化学学会会報、第８３巻、第２９７９乃至２９８３頁、１９８６年５月「Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ  ８３，ｐ．２９７９−８３，Ｍａｙ  １９８６」）。最小の活性形態は１７０ｋＤａの分子質量を有し、そして金属イオン架橋によりともに保持される９０ｋＤａおよび８０ｋＤａの２つの鎖からなっている。ここではヨーロツパ特許出願第ＥＰ−Ａ−１９７９０１号明細書を引用する。カビ  フアーマシア社は治療因子ＶＩＩＩ濃縮物中において１７０ｋＤＡ血漿因子ＶＩＩＩ形態に対応する組み換え因子ＶＩＩＩ製品を開発した。切截された組み換え因子ＶＩＩＩの分子はｒ−ＶＩＩＩＳＱと呼ばれ、そして漿液のない媒体中において細胞培養方法でのチヤイニーズ  ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞により製造される。
組み換え因子ＶＩＩＩ製品の一般的な構造および生化学はテイブテツク、第９巻、１９９１年および血液学、第６３巻、１９９１年、第１５５頁乃至第１６５頁（Ｔｉｂｔｅｃｈ，Ｖｏｌ  ９，１９９１  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，６３，ｐ．１５５−６５，１９９１）においてカウフマンにより説明された。ｒ−ＶＩＩＩＳＱの構造および生化学は国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ−９１／０９１２２号公報に記載されている。
大きなたんぱく質は血流で直接有効となる薬剤のように静脈内に通常付与される。しかし、薬剤が皮下、筋肉内または皮内に付与され得る場合にこれらの投与形態は患者にとって非常に取り扱い易いので、それは有利となる。とくに薬剤を生存中に規則的に取られねばならない場合、その治療は患者が子供のときからすでに、容易に開始することができる。
しかしながら、１７０〜３００ｋＤａの凝固因子ＶＩＩＩのような非常に大きくかつ不安定な分子を有する薬剤は摂取が十分でなくかつ劣化が激しいので、皮下、筋肉内または皮内に付与される場合に通常非常に低い生体活性を有する。我々の知識では、皮下注射により投与され得る唯一の凝固因子たんぱく質は因子ＩＸ（９０ｋＤａ）である。
市場で現在入手し得るすべての因子ＶＩＩＩ製剤は静脈内投与用調合剤として作られかつヒト血清アルブミンにより安定化されている。
発明の概要
驚いたことに、非常に敏感なたんぱく質である因子ＶＩＩＩは皮下に付与させることができ、そして以前のあらゆる経験に対比して、血液中に高い吸収性と高いレベルの活性因子ＶＩＩＩのたんぱく質が得られることが判明した。
かくして、皮下、筋肉内または皮内に因子ＶＩＩＩを投与することが可能であり、因子ＶＩＩＩを必要とするすべての患者に大きな利点を付与する医薬製剤を開発した。
組み換え因子ＶＩＩＩＳＱは代表的な血友病の治療に必要とされる。ｒ−ＶＩＩＩＳＱの半減期は静脈内に注入されるとき人間に関しておよそ１２時間である。予防治療に関して１５〜２５ＩＵ／ｋｇ体重が因子ＶＩＩＩについて１週間に３回付与される。静脈注射は通常５〜１０ｍｌである。皮下に付与される注入は０．０５〜１ｍｌの間であり、そして因子ＶＩＩＩの濃度はそのような調合剤においては非常に高くなければならない。これは例えば非常に純化された組み換え因子ＶＩＩＩにより得ることができる。
本発明はしたがつて因子ＶＩＩＩを皮下、筋肉内または皮内の医薬製剤として付与させるとき、血流中に吸収させることが可能であることと、このために所望の高い濃度の因子ＶＩＩＩからなる医薬製剤を製造することが可能であるという認識の組み合わせにより想着されたものである。
本発明は少なくとも１０００ＩＵ／ｍｌの濃度において非常に純化された組み換え凝固因子ＶＩＩＩからなる皮下、筋肉内または皮内投与用の医薬製剤に関し、該医薬製剤は投与後血液中に因子ＶＩＩＩ活性の治療的レベルを付与する。
組成物は好ましくは皮下で付与される。医薬製剤中の因子ＶＩＩＩ活性は少なくとも１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１５００ＩＵ／ｍｌ以上そして最も好ましくは５０００〜１０００００ＩＵ／ｍｌである。付与される量は適切には０．１〜２ｍｌ、好ましくは０．２５〜１．５ｍｌ、そしてより好ましくは０．５〜１ｍｌである。その量はまた０．１〜１ｍｌにすることもできる。
因子ＶＩＩＩは組み換え型でありそしてその全長形態または好ましくはその欠失誘導体にすることができる。より好ましくは欠失誘導体は組み換え因子ＶＩＩＩＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）である。欠失誘導体はここではＢ−ドメインの全部または１部分が失われている凝固因子ＶＩＩＩを意味する。加えて、ｒ−ＶＩＩＩＳＱ分子は例えば、生体内の分子の安定性を改善するために、ペギユレイシヨン、共有結合された炭水化物またはポリペプチドにより化学的に変性させることができる。
使用した因子ＶＩＩＩは非常に純化され、すなわち５０００ＩＵ／ｍｇたんぱく質以上の比活性、更に１２０００ＩＵ／ｍｇたんぱく質以上の比活性を有しそして好ましくはアルブミンの添加なしに安定化している。
医薬製剤はまた好ましくは０．１Ｍ以上の量において塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むことができる。
因子ＶＩＩＩの重い鎖および軽い鎖の集合状態の維持のためにカルシウム（または他の二価の金属イオン）が必要である。カルシウムはここでは塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）として添加されるが、グルコン酸カルシウム、カルシウムグルビオネートまたはカルシウムグルセプタートのような他の塩も使用され得る。組成物は好ましくは０．５Ｍ以上の量において塩化カルシウムまたはグルコン酸カルシウムを含む。
アミノ酸は好ましくは系を緩衝するのに使用され、そしてそれはまた医薬製剤が凍結乾燥される場合に無定形相のたんぱく質を保護する。適切な緩衝剤はＬ−ヒスチジン、リジンおよび／またはアルギニンである。およそｐＨ７のＬ−ヒスチジンの良好な緩衝剤能力のためＬ−ヒスチジンが主として選ばれた。
医薬製剤は、
ｉ）少なくとも１０５０ＩＵ／ｍｌの組み換え凝固因子ＶＩＩＩの欠失誘導体と、
ｉｉ）少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルと、
ｉｉｉ）好ましくは０．１Ｍ以上の量における塩化ナトリウムと、
ｉｖ）好ましくは０．５Ｍ以上の量における塩化カルシウムまたはグルコン酸カルシウムのごときカルシウム塩と、
ｖ）１ｍＭ以上の量におけるＬ−ヒスチジンのごときアミノ酸と
から構成することができる。
非イオン表面活性剤も医薬製剤中に存在させることができ、そして好ましくはポロキサマーのようなブロツク共重合体、またはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノラウラートまたはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノオレアートのようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選ばれる。非イオン表面活性剤が使用される場合には好ましくは臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上の量において存在すべきである。ウアンおよびリー氏著、薬物化学ジャーナル、第６３巻、第１３６頁、１９７４年（Ｗａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６３，ｐ．１３６，１９７４）参照。
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌの量で使用される。
この医薬製剤には単糖類、または二糖類、または糖アルコール、好ましくはスクロースが添加され得る。またグルタチオン、アセチルシステイン、トコフエノール、ＥＤＴＡ、クエン酸、ブチルヒドロキシトルエン、および／またはブチルヒドロキシアニゾールのような酸化防止剤が添加され得る。そのうえ、ベンジルアルコール、フエノール、ソルビン酸、パラベンおよびクロロクレゾールのような保存料が添加され得る。
医薬製剤は好ましくはＬ−ヒスチジンおよびスクロースを含有している。凍結乾燥のための組成物中の塩化ナトリウム対Ｌ−ヒスチジンおよびスクロースの比率は適切には１：１（ｗ：ｗ）以上、好ましくは２：１（ｗ：ｗ）以上である。
医薬製剤は乾燥された形態、好ましくは凍結乾燥され得る。乾燥された製品は注入用殺菌水または薬学的に許容し得る緩衝剤溶液で再溶解させるか、または投与前に吸収増加剤またはプロテアーゼ抑制剤を含有する水溶液と混合させるかまたは再溶解させる。
本発明の医薬製剤はまた投与に備える安定した水溶液であつても良い。それは散布液、例えば懸濁液、リポゾーム調合剤またはエマルジヨンであつても良い。
医薬製剤は国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＥ９４／００２６５号明細書に開示されたような酸素減少環境中に貯蔵され得る。
吸収増加剤またはプロテアーゼ抑止剤が添加され得る。適切な吸収増加剤の例はリン脂質、脂肪酸、胆汁酸塩、サルチル酸およびＥＤＴＡである。適切なプロテアーゼ抑止剤の例はアプロチニンおよびＥＤＴＡである。
本発明の医薬製剤は因子ＶＩＩＩを、好ましくはＬ−ヒスチジン、のようなアミノ酸、ナトリウム塩、スクロースおよびカルシウム塩とともに、水溶液中で非イオン表面活性剤と混合するかまたは因子ＶＩＩＩを、好ましくはナトリウム塩、スクロース、カルシウム塩およびＬ−ヒスチジンのごときアミノ酸とともに、水溶液中に非イオン表面活性剤を含有する緩衝剤により最後の純化工程から溶出することにより製造され得る。
本発明はまた血友病を治療するための皮下、筋肉内または皮内投与用の薬剤を製造するために本発明の医薬製剤を使用する使用方法、好ましくは皮下投与用の薬剤を製造するために組み換え因子ＶＩＩＩの欠失誘導体を使用する使用方法に関するものである。薬剤は安定した水溶液または散布液、または凍結乾燥され得る。本発明はまたその医薬製剤の皮下、筋肉内または皮内投与による血友病の治療方法に関する。
実施例に示したデータはｒ−ＶＩＩＩＳＱが皮下で注入されかつ生体内の静脈において活性形態で回収され得ることを示す。これは医薬製剤が以前には知られていなかつたので、非常に驚くべき認識である。
保護範囲はこれらの例による組成物に限定されない。
実験
材料および方法
組み換え凝固因子ＶＩＩＩＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）の製造は基本的には国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ−９１／０９１２２号公報に記載されたように行われた。ＤＨＦＲ遺伝子欠失ＣＨＯ細胞系（ＤＧ４４Ｎ．Ｙ．）がｒ−ＶＩＩＩＳＱ遺伝子を含有する発現ベクターおよびジヒドロフロレート還元酸素遺伝子を含有する発現ベクターにより電気泳動された。選択的な媒体についての選択に続いて生き残っている群体が段階的に増加するメトトレキセートの量において成長により増殖された。結果として生じる群体からの上清が因子ＶＩＩＩ活性に関して個々にふるい分けされた。生産クローンが選ばれ、これはその後特定された媒体中で漿液無し懸濁液成長に適合され、そして最後に大規模発酵過程が展開された。上清は一定の時間後集められかつさらに以下に記載されたごとく純化された。
浄化され調節された媒体はｐＨ調整されそしてＳ−セフアローズＦＦコラムに加えられた。洗浄後、因子ＶＩＩＩが５ｍＭＣａＣｌ2を含有する塩緩衝剤により溶出された。
免疫吸着が免疫親和樹脂について実施され、リガンドが因子ＶＩＩＩの重い鎖に向けられたモノクローン抗体（８Ａ４）であつた。コラムに負荷する前にＳ−溶出物は０．３％ＴＮＢＰおよび１％オクトキシノール９で処理された。コラムは平衡させ、洗浄され、そして因子ＶＩＩＩは０．０５ＭＣａＣｌ2および５０％エチレングリコールを含有する緩衝材により溶出された。
ｍＡｂ−溶出物はＱ−セフアローズＦＦコラムに負荷され、免疫親和工程において溶出緩衝剤により平衡された。洗浄後、因子ＶＩＩＩは０．０５ＭＬ−ヒスチジン、０．６Ｍ塩化ナトリウム、４ｍＭ塩化カルシウムおよびｐＨ６．８により溶出された。
Ｑ−溶出物がゲル濾過コラム（スーパーデツクス２００ｐ．ｇ．）に付加された。Ｌ−ヒスチジン、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムを含有する緩衝剤で平衡化および溶出が行なわれた。たんぱく質ピークが集められ、そして溶液が凍結乾燥前に調合された。
ｒ−ＶＩＩＩＳＱからなるこの材料は最終純化工程から収容された。因子ＶＩＩＩ活性および不活性成分の濃度がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する適切な緩衝剤で希釈することにより調整された。溶液は次いで殺菌濾過（０．２２μｍ）され、分配されかつ凍結乾燥された。
例１
組み換え因子ＶＩＩＩが実験に記載した方法によつて製造された。
ｒ−ＶＩＩＩＳＱを含有する凍結乾燥された組成物はガラス瓶当たり下記の通りであり、それは注射用の４ｍｌ殺菌水で再溶解された。
ガラス瓶当たりの組成
Ｌ−ヒスチジン、ｍｇ                                ３１．０
塩化ナトリウム、ｍｇ                                ７０．１
塩化カルシウム・（２Ｈ2Ｏ）、ｍｇ                       ２．３５
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）、ｍｇ        ４．０
ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタン
モノオレアート（トウイーン８０（登録商標））、ｍｇ    １
充填されたＶＩＩＩ：Ｃ，ＩＵ／ガラス瓶          ４４００
再溶解された溶液中のＶＩＩＩ：Ｃ、ＩＵ／ｍｌ    １０６０
約３０ｇの体重でかつ菌株ＮＭＲＩ，ＳＰＦの雄のアルビノマウスは再溶解されたｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液を首に皮下注射された。
１００００ＩＵ／ｋｇの投与レベルで注射された量は９．４ｍｌ／ｋｇでそして高い投与レベル５００００ＩＵ／ｋｇで、５倍大きい、４７ｍｌ／ｋｇであつた。プラシーボ治療において、塩水９．４ｍｌ／ｋｇが使用された。血液サンプリング前３〜５分で、マウスはメブマル（登録商標）（ペントバルビタル）ｖｅｔ．６０ｍｇ／ｍｌで腹膜内に麻酔がかけられた。注射された量は９．４ｍｌ／ｋｇ、すなわち０．３ｍｌ／マウスであつた。麻酔下で０．４５ｍｌの血液が０．０５ｍｌ０．１３Ｍクエン酸ナトリウムを含有するプラスチツク注射器で大静脈から集められた。血漿はその後遠心分離（８８００ｇ７分間）により集められた血液から製造され、そして因子ＶＩＩＩ活性の測定の時まで−７０℃でプラスチツククリオフレツクス管内で凍結保持された。
結果
0003827713.tif 000002
0003827713.tif 000003
結果
１．ｒ−ＶＩＩＩＳＱ１００００ＩＵ／ｋｇの皮下投与後の時間による血漿中のＶＩＩＩ：Ｃの変化は皮下の貯蔵所から吸収されている薬物の代表的なパターンを示す（表１参照）。血漿中のＶＩＩＩ：Ｃの最大レベルが投与後１．５時間で見られる（表１参照）。
２．皮下の貯蔵所からのｒ−ＶＩＩＩＳＱの吸収は投与量が５倍増加されたときに見られる最大濃度の増加により確かめられる。ｒ−ＶＩＩＩＳＱの投与を一定のままにしながら皮下の注入量が９．４から４７ｍｌ／ｋｇに変化させたとき得られたＶＩＩＩ；Ｃの血漿レベルに関して顕著な作用は観察されなかつた。そのうえ、血漿中に得られたＶＩＩＩ：Ｃは本質的に投与溶液の浸透性に依存しなかつた。
３．マウスの皮下投与後のｒ−ＶＩＩＩＳＱの生体有効性は静脈投与後の生体有効性の約１０％であつた。生体有効性は活性（ＶＩＩＩ：Ｃ）−時間曲線による区域から計算された。
例２
血漿誘導因子ＶＩＩＩが使用された。
血漿誘導因子ＶＩＩＩを含有する凍結乾燥された溶液は下記の通りであつた。
ｍｌ当たりの組成物：
Ｌ−ヒスチジン、ｍｇ                                  ７．８
塩化ナトリウム、ｍｇ                                ３５．１
塩化カルシウム・（２Ｈ2Ｏ）、ｍｇ                     ０．５９
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）、ｍｇ        １．０
ヒトアルブミン、ｍｇ                                １０．０
ＶＩＩＩ：Ｃ，ＩＵ／ｍｌ                          ２５０
約３０ｇの体重でかつ菌株ＮＭＲＩ，ＳＰＦの雄のアルビノマウスは再溶解されたｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液を首に皮下注射された。
１００００ＩＵ／ｋｇの投与レベルで注射された量は４０ｍｌ／ｋｇであつた。プラシーボ治療において９％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウムを含有する溶液が使用された。血液サンプリング前３〜５分でマウスはメブマル（登録商標）（ペントバルビタル）ｖｅｔ．６０ｍｇ／ｍｌで腹膜内に麻酔がかけられた。投与量は約１．２ｍｌ／マウスであつた。麻酔下で０．４５ｍｌの血液が０．０５ｍクエン酸ナトリウム（０．１３Ｍ）を含有するプラスチツク注射器中に大静脈から集められた。血漿は遠心分離（８８００ｇ７分間）により集められた血液から製造されかつその後ＶＩＩＩ：Ｃの測定の時まで−７０℃でプラスチツククリオフレツクス管内で貯蔵された。
結果
0003827713.tif 000004
結果：
１．血漿誘導因子ＶＩＩＩの生体有効性はマウスの生体内研究の結果によればかなり低い（表３）。血漿誘導因子ＶＩＩＩの生体有効性はｒ−ＶＩＩＩＳＱの生体有効性の約１／１０である。それゆえ、ｒ−ＶＩＩＩＳＱの生体有効性は実質上ヒト血漿から誘導された因子ＶＩＩＩの生体有効性より高い。ＶＩＩＩ：Ｃの最大血漿レベルは皮下投与後約１．５時間で見られる。
例３
組み換え因子ＶＩＩＩが以下の例外、すなわちｉ）最終純化工程から収容されたｒ−ＶＩＩＩＳＱの材料がＰＥＧを含有しない緩衝剤により希釈され、ｉｉ）ｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液が凍結乾燥されず、−７０℃で貯蔵されたことを有して実験で記載した方法によつて製造された。
ｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液が以下の組成物を有した。
ガラス瓶当たりの組成：
Ｌ−ヒスチジン、ｍｇ                                  ７．５
スクロース、ｍｇ                                  １５８
塩化ナトリウム、ｍｇ                                ４５
塩化カルシウム・（２Ｈ2Ｏ）、ｍｇ                     １．２５
ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタン
モノオレアート（トウイーン８０（登録商標））、ｍｇ    ０．５０
充填されたＶＩＩＩ：Ｃ，ＩＵ／ガラス瓶          ６０７０
ＶＩＩＩ：Ｃ，ＩＵ／ｍｌ★                      １１３０
★希釈されたｒ−ＶＩＩＩＳＱ−溶液（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ−溶液の１部＋水の１部、ｖ：ｖ）
ｒ−ＶＩＩＩＳＱ−溶液はＶＩＩＩ：Ｃの投与が３０００ＩＵ／ｋｇ体重以下であるとき投与前に注入用殺菌水により希釈された（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ−溶液の１部＋水の１部、ｖ：ｖ）。約３〜３．５ｋｇの体重の雌のカニクイザルは投与領域に皮下でｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液を注射された。投与に依存して、注入の量は０．２〜２．０ｍｌ／ｋｇ体重間で変化させた。２５０，２５００および５０００ＩＵ／ｋｇの単一投与による皮下注射が投与された。各サンプリングの場合に１．８ｍｌの血液が抗凝固剤としてクエン酸（０．２ｍｌ）を含有する管に集められた。遠心分離後血漿が分離されかつ一定部分凍結された（＜−６０℃）。
結果
0003827713.tif 000005
0003827713.tif 000006
0003827713.tif 000007
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結果
１．結果（表４〜６）によれば時間の関数としての血漿濃度は皮下注射後吸収されている薬物の代表的なパターンに追随する。ＶＩＩＩ：Ｃの最大濃度が投与後約９時間で見られる。
２．得られた投与−応答関係（表７）は皮下注射に続いて血流中にＶＩＩＩ：Ｃの吸収があることのさらに他の確認を付与する。
３．サルの皮下投与後のｒ−ＶＩＩＩＳＱの生体有効性は約５〜１０％であつた。生体有効性は活性（ＶＩＩＩ：Ｃ）−時間曲線による区域から計算された。生体有効性は本質的にｒ−ＶＩＩＩＳＱの投与から独立していた。