(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離；
ｂ）ｂ１）単離された真菌細胞の分解；および
ｂ２）真菌ＤＮＡの単離
による、単離された真菌細胞からのＤＮＡの抽出；
の工程を含み、
工程ａ）が更に
ａ１）全血中に含有される血液細胞の分解；
ａ２）細胞ＤＮＡからのほぼ無傷の真菌細胞の単離
の工程を含み、
工程ｂ１）がｂ１．１）真菌細胞のアルカリ溶解および酵素処理の工程を含む、全血から真菌ＤＮＡの抽出による臨床物質中における真菌ＤＮＡの検出方法。
【請求項２】
工程ａ）が更に
ａ１．１）浸透溶血による赤血球の溶解；
ａ１．２）白血球の酵素消化；および
ａ２．１）この手法で処理された全血の遠心と、次の操作工程でペレットの使用
の工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ１．１）において赤血球の溶解が、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１０ｍＭ  ＮａＣｌの最終濃度で、低張液および界面活性剤を用いて行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ１．２）において白血球の酵素消化が、２００μg/mlプロテイナーゼＫ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．２％  ＳＤＳの最終濃度の溶液で行われる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
白血球の酵素消化に用いられる溶液が６０〜７０℃で１００〜１４０分間にわたりインキュベートされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ１．１）が
-５０ｍＭ  ＮａＯＨ含有溶液中において、９０〜９５℃で５〜１５分間にわたる、工程ａ２．１）からのペレット中に存在する真菌細胞のインキュベート
-１Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ７．０による中和
-３０〜４０℃で５０〜７０分間にわたるザイモリアーゼでの酵素処理
-６０〜７０℃で１０〜３０分間にわたるＴｒｉｓ／ＥＤＴＡとのインキュベートによるタンパク質変性
の工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ２）が
-５Ｍ酢酸カリウムによるタンパク質沈降、および
-氷冷イソプロパノール中で上澄のＤＮＡ沈降
の工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応による、検出される真菌ＤＮＡの少くとも１つのセグメントの増幅；および
ｄ）増幅産物の検出
の工程を含み、
工程ｃ）において、配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列がプライマーとして用いられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の試験溶液中における真菌細胞の検出方法。
【請求項９】
工程ｃ）において、ポリメラーゼ連鎖反応が下記サイクル：
ｃ１）９０〜９６℃で０．３〜１分間の変性；
ｃ２）５８〜６４℃で０．５〜１．５分間のハイブリッド形成；
ｃ３）６８〜７５℃で１．５〜２．５分間の伸長
で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
９０〜９６℃で３〜９分間の変性工程がサイクル工程の開始前に行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）において、増幅産物がゲル電気泳動を用いて検出されて、染色される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
下記追加工程：
ｅ）真菌種に特徴的である、試験溶液中に含有されたＤＮＡのヌクレオチド配列セグメントの決定
を含み、
工程ｅ）において、工程ｃ）により既に増幅された真菌ＤＮＡまたは真菌ＤＮＡセグメントを、ある真菌株および／または種に特異的なＤＮＡプローブとハイブリッド形成させ、成功したハイブリッド形成の試験により真菌種を同定し、配列番号３〜配列番号８の１以上のヌクレオチド配列がＤＮＡプローブとして用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の真菌種の同定方法。
【請求項１３】
プローブがジオキシゲニンで標識され、ハイブリッドが成功するハイブリッド形成の試験のために例えばサザンブロット法により検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡプローブが順番に用いられて、各ハイブリッド形成が試験される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡプローブが、下記順序：配列番号３、配列番号８、配列番号６、配列番号７、配列番号４および配列番号５で連続順に用いられて、各ハイブリッド形成が試験される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
-全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離
-単離された真菌細胞からＤＮＡの抽出
-配列番号１および２のヌクレオチド配列を用いる、抽出された真菌ＤＮＡの少くとも１つのセグメント（これは１８ｓｓｕ-ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子のセグメントである）の増幅
-ｙｅｓ／ｎｏ決定による増幅産物の検出、および
-ＤＮＡプローブとしてヌクレオチド配列配列番号３〜８の１以上とのハイブリッド形成による、単一真菌種についての増幅産物の分類
の工程を含む、全血中における真菌細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般的に、臨床物質中における真菌細胞の検出方法に関する。
このような方法は実務から知られており、適切な栄養培地で臨床物質からの真菌種の培養に通常基づいている。
同定の速度および感度は、特に真菌種の遅い増殖のために、例えばペトリ皿での培養と、増殖したりまたはしなかったりするコロニーに基づく検出により、かなり影響される。このため、侵襲性真菌感染は臓器の極端に複雑な生検により、または患者の死亡後に診断できるだけである。
真菌細胞の検出方法における関心は、特にここ数年にわたり、真菌病原体が重要な院内病原体として免疫抑制患者にとって非常に重要になってきた、という事実に関連させてみられるにちがいない。侵襲性真菌感染は、骨髄移植（ＢＭＴ）後に、肝臓、腎臓、膵臓と心臓または心-肺移植後でも、著しく増加した。１９９４年に、例えばFrench ＢＭＴセンターで感染、特にAspergillus感染が次第に増加して、数か月にわたりこれらのセンターの閉鎖を招いた。
臓器移植患者の他にも、特に化学療法または手術後のがん患者、火傷した患者、並びに外科および新生児集中治療室の患者は、侵襲性真菌病原体により次第に侵襲されていく。１つの臓器系または更にいくつかの臓器系がこれらの患者群で侵襲されると、これら感染合併症の死亡率は８０〜１００％に高まる。
治療の成功は、このような場合に、早期診断だけで改善されることがある。上記標準検出方法に伴う欠点のために、全身真菌感染の早期で安全な診断を行える集中的試みがあった。
分子生物学法に基づく新規技術が、いくつか他の病原体による感染症のより高感度の診断と、ひいてはある程度より早期の検出および治療とを既に実現させたが、これは真菌病原体についてはなお不可能であった。
しかしながら、文献″Detection of various fungal pathogens in blood samples″in: EBMT 1995,Vol.15,Suppl.2,March 1995,Abstract Book,Abstract 432,P.103では、血中でいくつかの真菌病原体を同定するためにＰＣＲ法を用いる真菌遺伝子のＤＮＡセグメントの増幅について既に記載している。種特異性オリゴヌクレオチドとの追加ハイブリッド形成によれば、様々な真菌株間の識別も可能であった。
分子生物学技術を用いた真菌感染の検出に際して最も重要な問題は、真菌細胞壁の非常に複雑な組成に起因しており、そのため時間のかかる高価な抽出方法が今までに必要であった。
別な問題は真菌種の数の増加が免疫抑制患者で危険な感染を引き起こしうるという事実であり、これらの患者において全範囲の異なる真菌種および株の記録および検出が必要となっている。治療法は様々な真菌種で異なるため、すべての真菌種を記録するだけでなく、これらの種を識別して同定することも必要である。
上記からみて、真菌感染の早期診断を行うために上記方法を改善することが本発明の目的である。
その方法はできるだけ迅速かつ容易であるべきであり、できるだけ多くの真菌種を記録すべきであり、しかも開発の別な段階でこれらを同定することができるべきである。
本発明に従って見い出された臨床物質で真菌病原体を検出するための方法は、下記工程を含む：
１）全血からの真菌ＤＮＡの抽出；および
２）抽出された真菌ＤＮＡの検出
臨床物質から真菌種の伝統的培養をやめて、真菌ＤＮＡ自体に向かうことにより、真菌特異性ＤＮＡの検出から高感度で真菌感染の非常に早期な検出を行える方法が開発された。検出はＤＮＡレベルで行えるため、少くとも部分的に高感度で確立された迅速な方法が使用でき、感度および速度に関して既知方法よりも大きな利点を生じる。真菌ＤＮＡの放出および精製は、高感度を保証して迅速な診断を行う上で、迅速なだけでなくほぼ完全にかつ比較的純粋にも行なえねばならないことが想起されるべきである。
更に、新規方法はいくつかの真菌種に感度があり、しかも真菌種は最少の可能な操作工程で同定されるべきである。
この追加目的は、操作工程２）に加えてまたはその代わりに行われる下記操作工程を介して、前記の新規方法で達成される：
３）抽出された真菌ＤＮＡからの真菌種の決定。
この方法は、例えば既知の配列決定方法が使用できるために、特定の真菌感染がＤＮＡレベルで非常に迅速に行われて、高い特異性を示せる、という別の利点を有している。
いくつかの問題が新規方法の個別工程で克服されなければならない。その一部は真菌細胞壁の組成と、多数の真菌細胞が全血中でフリーに溶解されずに、食作用後にいくつかの血液細胞群、特に顆粒球およびマクロファージに存在するという事実に基づく。
このため、本方法の独立した第一工程、即ち全血から真菌ＤＮＡの抽出も本出願の目的である。この方法は患者で真菌感染を検出する上で診断学上有利に使用できるが、真菌ＤＮＡが他の別な処理のために必要とされる場合はいつでも用いることができる。
例えば新規方法を用いると、真菌ＤＮＡは問題の真菌種で特に感染した動物の血液から抽出することができる。ＤＮＡプローブはこの手法で得られた真菌ＤＮＡから切り出されて、その後検出反応に用いられるかまたはプラスミドにクローニングされる。基本リサーチ、診断、治療、工業遺伝子テクノロジーなどの全分野にわたる適用が考えられる。
真菌ＤＮＡの抽出プロセスでは、全血中で非常に少量の真菌でさえも確実に真菌ＤＮＡを抽出することができるはずである。更に、本方法のこの工程では迅速かつ容易に行えるはずで、そのため熟練者により病院における日常の作業に用いることができる。
この目的は、全血から真菌ＤＮＡを抽出する工程が：
１）全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離；および
２）単離された真菌細胞からＤＮＡの抽出
の工程を含む本発明に従い達成される。
本発明の目的はこの手法で完全に達成される。新規方法は、第一工程で全血からの真菌細胞の単離と、第二工程でこれらの単離真菌細胞からＤＮＡの抽出からなる２段階から構成されていて、こうして抽出されたＤＮＡは真菌感染を検出して、必要であれば同定するために用いられる。この２段階プロセスではとりわけ特異性を改善するが、その理由は干渉する他のＤＮＡがその方法の第二工程にほんの少量でしか存在しないためである。
その方法が下記操作工程：
ａ１）全血中における血液細胞の分解；
ａ２）細胞ＤＮＡからのほぼ無傷の真菌細胞の単離
ｂ１）単離された真菌細胞の分解；および
ｂ２）真菌ＤＮＡの単離
を含むならば、好ましい。
これは細胞ＤＮＡから真菌ＤＮＡの非常に迅速で安全な分離を行える。細胞ＤＮＡは全血中で血液細胞の溶解によりこの初期溶液中に放出されるため、それまでに先の分解プロセスで分解されなかったかまたは少くとも完全には分解されなかった真菌細胞は、迅速で容易なプロセス、例えば遠心により遊離細胞ＤＮＡから分離できる。この手法で単離された真菌細胞のその後の溶解に際して、溶液中には細胞ＤＮＡが全く存在しないかまたはわずかな量で存在するだけであると仮定してもさしつかえない。工程ａ１）における血液細胞の分解は、真菌細胞までが溶解されないように行われねばならない。真菌細胞壁は血液細胞の細胞壁よりもかなり複雑であるため、これは適切で慎重な分解プロセスにより保証することができる。
操作工程ａ１）は別な利点、即ち非常に少量の真菌が特に診断目的のためになお全血から抽出できるように、全細胞に捕捉された真菌を放出させるという利点を有している。新規な方法では、少くともいくつかの真菌細胞が全血中でフリーに溶解される必要性はもはやなく、いくつかの真菌細胞が食作用後も例えば顆粒球またはマクロファージ中に存在していれば十分である。
下記工程が工程ａ）で行われるならば好ましい：
ａ１．１）浸透溶血による赤血球の溶解；
ａ１．２）白血球の酵素分解；および
ａ２．１）この手法で処理された全血の遠心と、次の操作工程でペレットの使用
ここの利点は、血液細胞が工程ａ１．１）およびａ１．２）で確実に溶解されていながら、真菌細胞自体はなお損傷をうけていないことである。その後の遠心では、一方で血液細胞の放出された細胞ＤＮＡおよび細胞フラグメントと、他方でなおそっくりそのままな真菌細胞との、非常に安全な分離を保証している。これは、真菌ＤＮＡがペレット中の真菌細胞中になお存在しているために、真菌ＤＮＡが失われないことも保証している。要約すると、前記工程の利点は、一方で最少濃度の真菌細胞さえも検出できて、他方で単離された真菌ＤＮＡがせいぜいわずかな細胞ＤＮＡで汚染されているにすぎないことであり、真菌対細胞ＤＮＡの比率が真菌ＤＮＡの方に有意に改善されたために、後の診断工程で高い感度および特異性を発揮する。
別な開発では、下記工程が工程ｂ）で行われるならば好ましい：
ｂ１．１）真菌細胞のアルカリ溶解および酵素処理。
この単純な操作工程は操作工程ａ２．１）でペレットから回収された真菌細胞の安全な分解を行えることが示された。
工程ａ１．１）における赤血球の溶解が、好ましくは約１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＮａＣｌの最終濃度で低張液を用いて行われて、工程ａ１．２）における白血球の酵素消化が、２００μg/mlプロテイナーゼＫ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．２％  ＳＤＳの最終濃度を有する溶液で行われるならば、更に好ましい。
別な開発において、工程ａ１．２）からの溶液は６０〜７０℃、好ましくは６５℃で１００〜１４０分間、好ましくは１２０分間にわたりインキュベートされる。
この手法で血液細胞は真菌細胞を損傷させずに確実かつ完全に分解できるため、これらの操作工程後に、溶液中でフリーな真菌細胞と、初期血液中で食細胞に捕捉された真菌細胞とは、双方とも、比較的未損傷のままであり、それらのＤＮＡを失わずに遠心により分離できることがわかった。
工程ｂ１．１）が下記工程からなるならば、更に好ましい：
-５０ｍＭ  ＮａＯＨ含有溶液中において、９０〜９８℃、好ましくは９５℃で５〜１５分間、好ましくは１０分間にわたる、工程ａ２．１）からのペレット中に存在する真菌細胞のインキュベート
-１Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ７．０による中和
-３０〜４０℃、好ましくは３７℃で５０〜７０分間、好ましくは６０分間にわたるザイモリアーゼでの酵素処理
-６０〜７０℃、好ましくは６５℃で１０〜３０分間、好ましくは２０分間にわたるＴｒｉｓ／ＥＤＴＡとのインキュベートによるタンパク質変性。
これらの操作工程は、真菌細胞の安全な分解と、その後で真菌ＤＮＡの完全放出を行うため、真菌ＤＮＡは溶解状態にあり、真菌細胞の細胞フラグメントから単離できることがわかった。
この関係において、工程ｂ２）が下記工程を含むならば、好ましい：
-５Ｍ酢酸カリウムによるタンパク質沈降、および
-氷冷イソプロパノール中で上澄のＤＮＡ沈降。
これらの操作工程は実施が非常に容易であり、タンパク質は最初に酢酸カリウムを加えることにより沈降され、その後上澄が取り出されて、ＤＮＡが沈降されるように氷冷イソプロパノールと混合される。沈降したＤＮＡは、別な操作工程に、即ち真菌感染を検出および同定するために用いることができる。
今までに記載された操作をまとめると、第一の利点は、真菌種が通常それらのＤＮＡに基づき検出されて、その後特異的に同定できることである。真菌ＤＮＡは全血から直接抽出されず、むしろ最初は検出の感度および特異性を改善するために細胞ＤＮＡから真菌細胞の分離である。換言すれば、非常にわずかな真菌細胞が全血中に存在するだけならば、これから抽出された非常に少量の真菌ＤＮＡが非常に高濃度で存在する細胞ＤＮＡのバックグラウンドに対して検出されたことになり、そのため上記された分離は感度の点で大きな利点になる。
新規方法の別な利点は、全血の血液細胞が真菌細胞を損傷させずに最初に分解されるため、これらが溶解状態にあるかまたは食細胞に捕捉されているかにかかわらず、食細胞に捕捉された真菌細胞も検出目的に利用できることである。真菌細胞は細胞ＤＮＡから真菌細胞の分離後に分解されて、血液細胞の細胞残渣を残すだけである。ここで用いられる方法は、やや複雑な真菌細胞壁にもかかわらず、真菌ＤＮＡに損傷のない完全な分解を保証する。
上記方法を行うキットも本発明の目的である。このようなキットには上記操作工程に必要なすべての基本溶液セットを含有させることができる。しかしながら、検査室には通常みられないそれらの基本溶液のみをこのキットに入れることも可能であり、例えばＴｒｉｓ緩衝液は使い捨てできるが、少くともプロテイナーゼＫおよびザイモリアーゼがキットに存在している。
独立したまたは上記方法の第一工程と組み合わされた本方法の第二工程、即ち抽出された真菌ＤＮＡの検出も、本出願の目的である。検出される真菌ＤＮＡは、上記のように抽出および単離されることがここでは好ましい。しかしながら、適切な密度勾配遠心、ＤＮＡプローブとの特異的沈降工程などにより真菌ＤＮＡを得ることも可能である。
これらすべての場合において、真菌ＤＮＡが更に使用のためにその初期溶液中に実際に存在しているかどうか調べることが望ましい。
真菌ＤＮＡは真菌感染の診断に有利に使用できるが、それとは異なって用いることもできる。真菌ＤＮＡは、寒天プレートから、または問題の真菌種に特に感染した動物の血液から得られる。ＤＮＡプローブはこの手法で得られた真菌ＤＮＡから開裂されて、その後で検出反応に用いられるか、またはプラスミドにクローニングされる。基本リサーチ、診断、治療、工業遺伝子テクノロジーなどの全分野にわたる適用が考えられる。
新規検出工程では単一プロセスで初期溶液中に低濃度であってもいくつかの異なる真菌種の記録を行えるはずであり、そのため非常に迅速にかつ診断の早期段階で真菌感染があるかどうかに答えることが可能である。更に、新規操作は迅速かつ容易に行えるはずであり、そのため熟練者により病院において日常の作業に用いることができる。
その目的は、抽出された真菌ＤＮＡを検出する工程が下記工程：
ｃ）単離された真菌ＤＮＡの少くとも１つのセグメントの増幅；および
ｄ）増幅産物の検出
を含む本発明に従い達成される。
少量の単離されたＤＮＡであっても最初に増幅されて、その後検出できる、いくつかの標準方法がある。これらの方法は高度に特異的で非常に高感度であるため、それらは診断、治療、工業遺伝子テクノロジーなどで望ましい特徴を発揮する。更に、これらの方法は熟練者により行える。
増幅はＰＣＲ、クローニング、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼなどにより行って、検出はゲル電気泳動、光学密度、核酸と特異的に結合するマーカーでの染色などにより行える。
別な開発では、増幅はいくつか異なる真菌種のＤＮＡ、好ましくは１８ｓｓｕ-ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子と結合する２つのプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われる。
ここでの利点は、単純でこうして確立された方法が容易に検出される適量のＤＮＡを作るために使用できるが、そのＤＮＡは対応真菌種を同定するためにも更に使用できることである。
配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列が工程ｃ）でプライマーとして用いられるならば、好ましい。
本出願の発明者は、これら２種のヌクレオチド配列が様々な臨床的に関連した真菌種についてのプライマーとして用いられることを、意外にも発見した。ＰＣＲ反応でこれら２種のプライマーの使用は約５００塩基対の鎖長を有する増幅産物を作り出し、それらがゲル電気泳動により容易に検出できることから、更に処理していくことが容易である。こうして、２種のプライマー配列が様々な真菌ＤＮＡと結合することがわかったため、すべての病原性真菌種について同一の検出方法が存在するのである。
ポリメラーゼ連鎖反応が下記サイクル：
ｃ１）９０〜９６℃、好ましくは９４℃で０．３〜１分間、好ましくは０．５分間の変性；
ｃ２）５８〜６４℃、好ましくは６２℃で０．５〜１．５分間、好ましくは１分間のハイブリッド形成；
ｃ３）６８〜７５℃、好ましくは７２℃で１．５〜２．５分間、好ましくは２分間の伸長
で行われるならば、好ましい。
９０〜９６℃、好ましくは９４℃で５〜９分間、好ましくは３分間の変性工程がサイクル工程の開始前に行われるならば、好ましい。
ＰＣＲは上記条件下で非常に再現性があり、特に高度に特異性であることがわかり、そのため増幅産物は実際にオリジナル真菌ＤＮＡのフラグメントであることが保証される。
工程ｄ）において、増幅産物は好ましくはアガロースゲル上でゲル電気泳動により検出されて、好ましくは臭化エチジウムで染色されるならば、更に好ましい。
この利点は、真菌感染を示す増幅産物が実際にＰＣＲ反応により生産されることを示すために、既知の確立された検出法が用いられることである。
１８ｓｓｕ-ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子からのＤＮＡ配列が増幅されるならば、更に好ましい。
本出願の発明者は、一方ですべての真菌株および種に同一のプライマーに対する２つの結合領域と隣接した特異的配列セグメントをこの真菌遺伝子が様々な真菌株および種で示すが、他方でこのセグメントの配列が個別の真菌種および株を検出するために使用できる程度に様々な真菌株および種で異なることを発見した。
本発明は、配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列に更に関する。これら２つのヌクレオチド配列が真菌ＤＮＡのセグメントを増幅させるために用いられるならば、好ましい。
本発明は試験溶液中で真菌ＤＮＡを検出するためのキットにも関し、そのキットはいくつかの真菌種のＤＮＡと結合するポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーを含有している。キットはプライマーとして配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列を含有していることが好ましい。
本発明は上記方法を行うためのキットにも関する。
このようなキットの利点は、すべての必要な溶液と、特に必要なプライマーが一緒にされるため、それらがルーチン操作で使用できることである。このため、これらの新規キットは、試験溶液中で真菌種を検出するために、毎日の検査室作業で用いることができる。更に、このキットは証明された真菌種のあるセグメントを増幅させるために使用でき、これは例えば更に同定プロセスに用いることができる。
上記方法の第一および第二工程と組み合わされたまたは独立した本方法の第三工程、即ち抽出および検出された真菌ＤＮＡを用いる真菌種の同定も、本出願の目的である。
種の真菌同定は診断目的に迅速かつ容易に行えるはずで、そのため熟練者により病院における日常の作業に用いることができる。
この目的は、下記工程が行われるかぎり、本発明に従い達成される：
ｅ）真菌種を特徴付ける、試験溶液中に含有されたＤＮＡのヌクレオチド配列セクションの同定。
検出プロセスはＤＮＡレベルで行われるため、真菌ＤＮＡのあるセグメントが同定されれば十分であるが、但しこれらのセグメントは各真菌種に特異的でなければならない。標準方法は、増幅産物の少くとも一部を配列決定して、二本鎖の融解性質などを研究することにより使用できる。
これらの方法は通常迅速かつ容易に行えるため、それらも熟練者により行える。
真菌ＤＮＡまたは真菌ＤＮＡのセグメントが工程ｅ）で所定の真菌株および／または種に特異的なＤＮＡプローブとハイブリッド形成されて、成功したハイブリッド形成の試験が真菌種の同定につながるならば、好ましい。
この利点は、非常に速くて簡単なハイブリッド形成プロセスが同定に用いられることである。各真菌種に特異的であるため、これら真菌種の増幅セグメントと排他的に結合する特異的プローブが用いられる。このようなプロセスはゲル上で行われ、例えばハイブリッドは染色により示される。もう１つの別なプロセスは、一本鎖および二本鎖領域の光学的に異なる性質、例えば光学密度、二色性または類似特徴を活用することからなる。
プローブが成功したハイブリッド形成の試験のためにジゴキシゲニンで標識されて、ハイブリッドが例えばサザンブロット法を用いて検出されるならば、更に好ましい。
プローブ自体が、好ましくは視覚的に検出可能な色素反応により、周知の方法を用いて、ハイブリッド形成後にハイブリッドの形成を示す対応マーカーと共に既に準備されていれば、この工程はそのプロセスを更に簡略化する。
配列番号３〜配列番号８のヌクレオチド配列のうち１以上がＤＮＡプローブとして用いられ、そのＤＮＡプローブが好ましくは配列配列番号３、配列番号８、
配列番号６、配列番号７、配列番号４および配列番号５の順序で用いられて、各ハイブリッド形成が試験されるならば、好ましい。
個別の真菌種は逐次ハイブリッド形成によりそれらの頻度の順序で試験され、そのため検出プロセスを有意に速めることができる。
本発明は、配列番号３〜配列番号８のヌクレオチド配列にも更に関する。
本発明は、真菌種を同定する上で、ＤＮＡプローブとしてこれらヌクレオチド配列の１以上の使用にも更に関する。
ここでの利点は、６つの特定されたヌクレオチド配列がすべての臨床的に関連した真菌種間で特異的に識別できることである。
配列番号３のヌクレオチド配列は真菌種Candida albicansを検出し、配列番号４のヌクレオチド配列はCandida glabrataを検出し、配列番号５のヌクレオチド配列はCandida kruseiを検出し、配列番号６のヌクレオチド配列はCandida tropicalisを検出し、配列番号７のヌクレオチド配列はCandida parapsilosisを検出し、配列番号８のヌクレオチド配列はAspergillus株に属する真菌種、特にA.fumigatus、A.flavus、A.versiculor、A.niger、A.nidulansおよびA.terreusを検出する。
本発明は、各真菌種のＤＮＡの特異的ヌクレオチド配列セクションとハイブリッド形成するＤＮＡプローブを含有した、真菌種を同定するためのキットにも更に関する。そのキットは、ＤＮＡプローブとして、配列番号３〜配列番号８のヌクレオチド配列のうち１以上を含有していることが好ましい。
本発明は、上記方法を行うためのキットにも更に関する。
この利点は、このようなキットにＤＮＡプローブだけかまたは更に適切な追加溶液を準備しておけることであり、そのため毎日の検査室作業に必要なすべての一次溶液などがこのキットから直接取り出せる。これは各真菌種の検出または同定を著しく簡略化するが、それは個別の一次溶液が検査室でもはや別々に作らなくてよいからである。しかしながら、プローブだけか、できればこのキットでポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーおよび酵素／一次溶液とを含有させることも可能であり、そのためこれとは別に標準一次溶液が使用できる。
有利な手法で上記工程を組み込んだ全血中における真菌細胞の検出方法は、下記工程を含む：
-全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離
-単離された真菌細胞からのＤＮＡの抽出
-単離された真菌ＤＮＡの少くとも１つのセグメント、好ましくは１８ｓｓｕ-ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子の少くとも１つのセグメントの増幅
-ｙｅｓ／ｎｏ決定による増幅産物の検出、および
-所定の真菌株および／または種に特異的なＤＮＡプローブと増幅産物をハイブリッド形成させることによる、それらから個別の真菌種への特定。
この要約された方法の主要利点の１つは、増幅産物が真菌種の決定のためｙｅｓ／ｎｏ決定に更に用いられるように、真菌ＤＮＡのセグメント、好ましくは１８ｓｓｕ-ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子のセグメントを増幅させる増幅工程が、１回だけですむことである。本出願の発明者は、１８ｓｓｕ-ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子が、一方で対象となるすべての真菌種に同一である２つのプライマー、他方で様々な真菌種で異なるアンプリコンと少くとも部分的に隣接していて、そのためそれが真菌種に特徴的な異なるプローブとハイブリッド形成できることを発見した。
したがって、単一の増幅工程があれば、真菌感染が本当にあるのかどうかという質問に答えて、どんな真菌種が関与しているかという質問に答える上で十分である。したがって、その方法は極端に簡単であり、実施しやすく、専門知識は不要であるため、熟練者でさえも実施することができる。
別な利点は以下の記載から得られる。
上記特徴と下記で説明される特徴は、特定の組合せだけでなく、他の組合せまたは単独でも、本発明の範囲から逸脱せずに用いることができると理解されている。
個別操作工程の性能の例と、臨床試験プログラムのプログラム範囲内における方法の使用が、以下の記載に示されている。
新規方法の具体的利点は、それが全血を用いて行われる、即ち生検が不要であり、最初に作られねばならない血清が用いられないという事実である。真菌細胞は全血中で細胞ＤＮＡから最初に分離される。これは非常に少量で存在するだけかもしれない真菌ＤＮＡに必要であり、かなり高濃度の細胞ＤＮＡのバックグラウンドに対して検出する必要はない。これは検出方法の特異性も増加させる。この目的のため、赤血球が最初に浸透溶血により溶解され、その後白血球が酵素消化される。これら２つの操作工程は、真菌細胞自体がなお損傷をうけずに、食細胞に捕捉された真菌細胞が損傷をうけずに放出されて、その後の検出にも利用しうるように選択される。
例１：浸透溶血による赤血球の溶解
赤血球の溶解は低張液を用いて行う。下記最終濃度を有した下記緩衝液を用いる：
Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６        １０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                    ５ｍＭ
ＮａＣｌ                    １０ｍＭ
溶液は室温で１０分間インキュベートして、その後遠心する。
全血３ｍｌの量があれば第一工程に十分である。
例２：白血球の酵素消化
真菌細胞を含んでいるかもしれない白血球は、下記最終濃度を有する下記緩衝液中において、Boehringer Mannheimから得たプロテイナーゼＫ（２０μg/ml）でその細胞を酵素消化させることにより慎重に分解させ、その中に例１のペレットを再懸濁させる：
Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６        １０ｍＭ
ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０        １０ｍＭ
ＮａＣｌ                    ５０ｍＭ
ＳＤＳ                      ０．２％
プロテイナーゼＫ          ２００μg/ml
この緩衝液は６５℃で２時間インキュベートする。
例３：細胞ＤＮＡからのほぼ無傷の真菌細胞の分離
血液細胞が例１および２で説明されたように分解されて、細胞ＤＮＡが放出されてから、遠心を５０００ｒｐｍで行うと、細胞ＤＮＡはこの遠心速度で沈降しないため、そのＤＮＡをかなり取ることができる。
沈降物はすべての遊離または放出真菌細胞を含有しており、それを更なる処理のために緩衝液（Aqua bidest）に再懸濁させる。
例４：真菌細胞の分解
真菌細胞をアルカリ中で溶解させ、酵素処理して、真菌ＤＮＡを放出させる。
最初に、アルカリ溶解は９５℃で１０分間にわたり５０ｍＭ  ＮａＯＨ  ２００ｍｌを用いて行う。
この工程の後に、１Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ７．０を用いて中和工程を続ける。
次いでSigmaのザイモリアーゼ５００μｌ（３００μg/ml）を加え、溶液を３７℃で６０分間インキュベートして、真菌細胞を酵素消化させる。
次いでＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ５００μｌおよび１０％ＳＤＳ溶液５０μｌを加え、溶液を６５℃で２０分間インキュベートして、タンパク質を変性させる。
例５：真菌ＤＮＡの単離
真菌細胞残渣と、次に単離されねばならない遊離真菌ＤＮＡとが、この溶液中に存在している。
最初に、タンパク質沈降を５Ｍ酢酸カリウムを用いて行い、その後上澄を除去して、ＤＮＡは氷冷イソプロパノールを加えることにより沈降させる。次いで沈降産物を別な操作工程に用いる。
例１〜５に記載された操作工程では、全血から高い選択的手法で真菌ＤＮＡの抽出を行うが、これは沈降物として利用できて、細胞ＤＮＡでやや汚染されているだけであるため、下記検出が非常に高感度でかつ高い特異性で行える。
例６：真菌特異性ＤＮＡセグメントの増幅
この操作工程では、真菌ＤＮＡが例５の操作工程から得られた沈降物中に本当に存在しているかどうかが最初に示される。この工程では、配列リストに配列番号１および配列番号２として示されたＤＮＡ配列が、多数の真菌株および種の１８ｓｓｕ-ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子上の結合部位と特異的に結合する、という事実を利用している。
本出願の発明者は、一方ですべての真菌株および種に同一のプライマーに対する２つの結合領域と隣接した特異的配列セグメントをこの真菌遺伝子が様々な真菌株および種で示し、他方でこのセグメントの配列が個別の真菌種および株を検出するために使用できる程度に様々な真菌株および種で異なることを発見した。
配列番号１のＤＮＡ配列はセンス鎖と結合するが、配列番号２のＤＮＡ配列はアンチセンス鎖と結合して、２つの結合部位間の距離は約５００塩基対である。そのためこれら２つのＤＮＡ配列配列番号１および配列番号２はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーとして適しており、鎖長約５００塩基対の増幅産物（アンプリコン）の生産を行う。
プライマーの位置および各アンプリコンの鎖長は下記表１に示されている。
0003803935.tif 000002
２つのプライマー配列番号１および配列番号２を用いて、CandidaおよびAspergillus株のすべての関連真菌種に関して約５００塩基対のアンプリコンの十分量の生産がＰＣＲ操作で得られる。
ＰＣＲ条件は下記のとおりである：
緩衝液（５０μｌ）：
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．６
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．２mg/ml ＢＳＡ
ポリメラーゼ
各０．５ｍＭヌクレオチド
各１００ｐＭプライマー
初期変性：９４℃で３分間
サイクル変性：９４℃で０．５分間
アニーリング：６２℃で１分間
伸長：７２℃で２分間
末端伸長：７２℃で５分間
サイクルの数：３４
緩衝液中で高いマグネシウム濃度はポリメラーゼの高い特異性を可能として、これは伸長工程に７２℃のその至適温度で取り扱える。
Candida albicans４０株、Candida tropicalis１０株、Candida parapsilosis６株、Candida glabrata１１株、Candida krusei８株、Aspergillus fumigatus８株、Aspergillus flavus６株、Aspergillus terreus５株、Aspergillus niger７株、Aspergillus nidulans５株およびAspergillus versiculor３株を、これらのプライマーで首尾よく増幅させることができた。
例７：例６からの増幅産物の検出
次の工程では、鎖長約５００塩基対のＤＮＡセグメントが例６でＰＣＲ反応中に実際に増幅されるかどうかが示される。真菌特異性ＤＮＡセグメントの検出は、２％アガロースゲルで特異的バンドの臭化エチジウム染色により行う。
特異的バンドがここで検出されたら、配列番号１および配列番号２のプライマーがすべての前記真菌株と結合しているために、真菌感染と考えられる。このため、真菌ＤＮＡが例１〜５の操作工程中に抽出されていれば、それは臭化エチジウム染色により検出できる程度まで例６のＰＣＲ工程により増幅される。
例８：個別真菌種における例６からの増幅産物の分類
工程７で既に証明された真菌感染は、次いで具体的な治療にもっと正確に特定されねばならない。例６からのＰＣＲ工程の別な利点がここで明らかになってくる。十分な真菌特異性ＤＮＡセグメントを、真菌種の決定に関する別な検出法のために生産した。
配列リストに掲載された配列番号３〜配列番号８のヌクレオチド配列をここで用いる。これらは例６で生産されたＤＮＡセグメントの配列セクションと特異的にハイブリッド形成する種特異性プローブとして働く。
配列番号３のプローブはCandida albicansと、配列番号４のプローブはCandida glabrataと、配列番号５のプローブはCandida kruseiと、配列番号６のプローブはCandida tropicalisと、配列番号７のプローブはCandida parapsilosisと、配列番号８のプローブはAspergillus fumigatus、A.flavus、A.versiculor、A.niger、A.nidulansおよびA.terreusとハイブリッド形成することがわかった。このため、配列番号８のヌクレオチド配列は全般的Aspergillusプローブであるが、配列番号３〜配列番号５のヌクレオチド配列はCandida株の真菌種間で識別することができる。
成功したハイブリッド形成を証明できるように、プローブはBoehringer Mannheimからのトランスフェラーゼキットで標識して、検出は既知の発色反応を用いてサザンブロット法に従い行う。
個別真菌種の頻度に従い段階的に逐次ハイブリッド形成をこれらのプローブで行い、ハイブリッド形成は配列番号３（C.albicans）から始めて、その後配列番号８（Aspergillus）、配列番号６（C.tropicalis）、配列番号７は（C.parapsilosis）、配列番号４（C.glabrata）、最後に配列番号５（C.krusei）と行う。
こうして、工程例６で生産された増幅産物に従い真菌種を同定して、その後具体的な治療を開始することが可能である。
例９：血液中に散在する真菌細胞の検出
特異的増幅および逐次ハイブリッド形成の助けにより、真菌細胞１〜３個の感度で真菌種をうまく検出することが可能であった。血液サンプル中における真菌種の散在から、前記方法はいわゆる１ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍｌ血液の感度に達することが証明できた。この検出限界は血液中で臨床上関連した真菌散在について予想されるよりもかなり下である。
例１０：臨床試験のプログラム
臨床試験の大規模プログラムでは、新規方法の高感度が健常試験者６５例からの血液サンプル１６５例の分析に際して示すことができた。１６５例すべての血液サンプルは陰性のままであった。
次いで不明瞭な発熱の免疫抑制患者９４例を真菌感染の存在について試験した。侵襲性真菌感染を有しない患者６５例中、２００例以上の血液サンプル（例外１例は別にして）も陰性であった。
他方、侵襲性真菌感染を有する２５例すべての患者は、第一週目以内に既に陽性であると判定できた。更に、原因となる真菌病原体はすべての患者で分類することができた。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003803935.tif 000003
配列番号：２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003803935.tif 000004
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003803935.tif 000005
配列番号：４
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003803935.tif 000006
配列番号：５
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003803935.tif 000007
配列番号：６
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003803935.tif 000008
配列番号：７
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003803935.tif 000009
配列番号：８
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
ハイポセティカル：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003803935.tif 000010