(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
0003803579.tif 000021
ただし前記式中
Ｒ1 は水素又は炭素原子数１〜４の直鎖状又は分鎖状アルキル基であり、
Ｒ2 は水素又は炭素原子数１〜４の直鎖状又は分鎖状アルキル基であり、あるいは
Ｒ1 ，Ｒ2 及び20位のＣが一緒になってシクロプロピルを形成し、
Ａは
【化２】
0003803579.tif 000022
であり、
Ｒ3 は炭素原子数１〜４の直鎖状又は分鎖状アルキル、炭素原子数１〜４の直鎖状又は分鎖状アルキルのいずれかの炭素原子上にヒドロキシ置換基を有するヒドロキシアルキル、又は炭素原子数１〜４の直鎖状又は分鎖状アルキルのいずれかの炭素原子上に１〜３個のフッ素原子を有するフルオロアルキルであり、そして
Ｒ4 は炭素原子数１〜４の直鎖状又は分鎖状アルキル、前記アルキルのいずれかの炭素原子上にヒドロキシ置換基を有するヒドロキシアルキル、又は前記アルキルのいずれかの炭素原子上に１〜３個のフッ素原子を有するフルオロアルキルである、
で表せる化合物。
【請求項２】
Ｒ1 が水素であり、そしてＲ2 がアルキルである、又はＲ1 がアルキルであり、そしてＲ2 が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1 が水素であり、そしてＲ2 がメチルである、又はＲ1 がメチルであり、そしてＲ2 が水素である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ3 及びＲ4 が、独立に、アルキル、ヒドロキシアルキル、又はトリフルオロアルキルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ3 及びＲ4 が、独立に、メチル、ヒドロキシメチル、又はトリフルオロメチルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ａが−CH2−CH2−である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
１，25−ジヒドロキシ−16−エン−5，6−トランスコレカルシフェロールである、請求項６に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、下記式の化合物に関する。
【化３】
0003803579.tif 000002
【０００２】
ただし前記式中、
Ｒ1 は水素又はアルキル基であり、
Ｒ2 は水素又はアルキル基であり、あるいは、
Ｒ1 ，Ｒ2 及びＣ20が一緒になってシクロプロピルを形成し、
Ａは
【化４】
0003803579.tif 000003
であり、
Ｒ3 はアルキル、ヒドロキシアルキル又はフルオロアルキルであり、そして
Ｒ4 はアルキル、ヒドロキシアルキル又はフルオロアルキルである。
【０００３】
式Ｉの化合物が、前立腺ガン、乳ガン及び骨髄性白血病のガン細胞株の増殖を抑制することが分かった。従って、式Ｉの化合物は、前立腺ガン、乳ガン及び白血病の治療剤として有用である。
【０００４】
式Ｉの化合物が抗男性ホルモン活性を有することも分かった。従って、式Ｉの化合物は、良性の前立腺肥大、はげ及び前立腺のガン治療に有用である。
【０００５】
式Ｉの化合物は、脂腺の疾患、例えば座瘡又は脂漏性皮膚炎の治療に有用である活性を有することも分かった。
式Ｉの化合物は、骨粗鬆症の治療に有用な活性を有することも分かった。
【０００６】
発明の詳細な説明
本文では、用語「アルキル基」は、炭素原子数１〜４の直鎖状又は分鎖状アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチルなどを指す。用語「ヒドロキシアルキル」は、アルキル基のいずれかの炭素原子上にヒドロキシ置換基を有するアルキル基を指す。用語「フルオロアルキル」は、アルキル基のいずれかの炭素原子上に１，２又は３個のフッ素原子を有するアルキル基を指す。
【０００７】
本文に記載する化学式において、種々の置換基と核との結合を、下記の表示法により図示する。くさび形の実線は、分子面より上に位置する置換基を示し、くさび形の点線は、分子面より下に位置する置換を示す。
【０００８】
好ましくは、Ｒ1 が水素であり、かつＲ2 がアルキルであるか、又はＲ1 がアルキルであり、かつＲ2 が水素である。より好ましくは、Ｒ1 が水素であり、かつＲ2 がメチルであるか、又はＲ1 がメチルであり、かつＲ2 が水素である。
好ましくは、Ｒ3 及びＲ4 は、独立に、アルキル、ヒドロキシアルキル又はトリフルオロアルキルである。より好ましくは、Ｒ3 及びＲ4 は、独立に、メチル、ヒドロキシメチル又はトリフルオロメチルである。
好ましくは、Ａは−CH2−CH2−である。
最も好ましい式Ｉの化合物は、１，25−ジヒドロキシ−16−エン−5，6−トランス−コレカルシフェロールである。
【０００９】
下記の通りに、特に下記の化学式概略図を参照して、式Ｉの化合物を調製する。
【化５】
0003803579.tif 000004
【００１０】
Ｒ5 は水素又はトリメチルシリルである。
前記の図では、Phはフェニルであるので、式IIの化合物は〔３Ｓ−（１Ｅ，３β，５α）−２−〔３，５−ビス（ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−２−メチレン−シクロヘキシリデン〕エチル〕ジフェニルホスフィンオキサイドであり、これを、式III の化合物との反応により、式ＩＡの化合物に転換する。
この反応を、-60〜-90℃で、極性な非プロトン性有機溶媒中で、例えば乾燥エーテル、又はより好ましくは乾燥テトラヒドロフラン中で、強塩基、例えばアルキルリチウム、例えばブチルリチウムの存在下で行う。
【００１１】
式ＩＡの化合物の保護基を、極性有機溶媒、例えばエーテル、又はより好ましくはテトラヒドロフラン中で、フッ化物の塩、例えばフッ化テトラブチルアンモニウムとの反応により除去して、対応する式Ｉの化合物を得る。
式IIの化合物を、実施例１〜６又は実施例７〜８の記載通りに調製する。
式III の化合物は既知であり（例えば米国特許5,087,619 ）、既知の方法により調製することができる。
【００１２】
前立腺ガン、乳ガン及び白血病の治療剤としての式Ｉの化合物の有用な活性を、当分野に周知である下記の検査方法により証明することができる。
ここで用いた物質及び方法は以下の通りであった。
細胞株：乳ガン細胞株(MCF-7）、前立腺ガン細胞株(LNCaP）及び骨髄性白血病細胞株(HL-60）を以下の通りに維持した。MCF-7 細胞を、10％ウシ胎児血清成(FCS）を含むダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）中で維持した。LNCaP及びHL-60を、10％ FCSを含むRPMI1640中で培養した。これらの３つの細胞株全てを、５％CO2を含んでいるインキュベーター内で37℃で維持した。
【００１３】
ビタミンＤ3 化合物：当該ビタミンＤ3 化合物を、無水エタノール中に10-3Ｍで保存溶液として溶解し、これを遮光して -20℃で保存した。インビトロでの使用のために、これらの化合物をDMEM又はRPMI中に希釈した。インビボでの使用のために、これらの化合物をリン酸緩衝塩水(PBS）で希釈した。その一定量を一回限りで用い、そしてLNCaP 細胞をトリプシン処理した。洗浄後、単一細胞懸濁液の細胞を計数し、そしてその細胞を24ウェルの平底プレート上に、ウェルあたり１×10-3細胞／400μｌ でまいた。支持層を、42℃で平衡化したアガーにより調製した。この過程の前に、化合物をピペットでウェルに加えた。インキュベーション後、コロニーを計数した。全ての実験を、各実験点毎に少くとも３枚のプレートを用いて３回行った。
【００１４】
インビボでの血清カルシウムレベル：28匹の８〜９週齢の雄Balb/cマウスを無病原体状態で維持し、それらに標準的な研究室用飼料を与えた。１群あたり４匹のマウスに、３週間１日おきに（土日を除く）ビタミンＤ3 化合物又は希釈液（100μｌ／マウス）を腹腔内注射した。1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランス−D3 の投与量は0.1，0.5，1.0及び2.0μｇであった。1，25（OH)2D3の投与量は 0.1μｇ／マウスであった。コントロールマウスにはPBS 100μｌを注射した。血清カルシウム値を、比色定量検査により毎週測定した。
【００１５】
パルス暴露実験：MCF-7 細胞を、10-7の 1，25（OH)2D3又は 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランス−D3を含む液体培養中で種々の時間インキュベーションした。インキュベーション後、これらの細胞を注意深くPBS により２回洗浄し、そして生きている細胞を計数し、そして前記通りに軟寒天コロニー検査するために、24ウェルプレートにまいた。
【００１６】
フローサイトメトリーによる細胞周期分析：10-7Ｍの 1，25（OH2)D3又は 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3のいずれかと共に４日間インキュベーションしたMCF-7 細胞に対して、細胞周期分析を行った。その細胞を冷却メタノール中で一晩固定した後、50μｇ／mlのヨウ化プロピジウム、１mg／mlのRNアーゼ(100単位／ml）及び 0.1％のNP40により染色した。染色後直ぐに分析した。全ての実験を少くとも３回別々に行った。全てのデータをStudent 検定法により統計的に分析した。
【００１７】
ウェスタンブロット分析：細胞をPBS により２回洗浄し、溶解緩衝液（50mM Tris, pH8.0, 150mM NaCl, 0.1％ SDS, 0.5％デオキシコール酸ナトリウム、１％ NP40, 100μｇ／mlフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μｇ／mlアプロチニン、１μｇ／mlペプスタチン及び10μｇ／mlロイペプチン）中に懸濁し、そして氷上に30分間放置した。 15000ｇで４℃で20分間遠心した後、その上清を集めた。タンパク質濃度を測定した。全溶解液（15μｇ）を、15％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で分離し、イモビロンポリビニリデンジフリド膜に転写し、そして抗p27kip1 ウサギポリクローナル抗体及び抗アクチンマウスモノクローナル抗体により検出を行った。このブロットを現像した。
【００１８】
テロメラーゼ活性：相対テロメラーゼ活性を検出するために、テロメア反復配列増幅法（TRAP）による検査を行った。ヒトテロメラーゼの逆転写酵素（hTERT)のために、1，25（OH2)D3又は1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3（10-9，10-8及び10-7Ｍ）のいずれかによって４日間処理したHL細胞から、フェノール及びグアニジンイソチオシアネートの単相溶液により総RNA を単離した。１μｇの総RNAとランダムヘキサマープライマーを用いて、RT-PCRを行った。hTERT遺伝子又はコントロールとして用いたGAPDH 遺伝子に特異的なプライマーを用いて、cDNAを増幅した。
【００１９】
hTERT 用のプライマーは、5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'（センス）（配列番号１）及び5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'（アンチセンス）(配列番号２）であった。熱サイクルの条件は、94℃90秒間の後、95℃20秒間、68℃40秒間、及び72℃30秒間のサイクル33回であった。GAPDH 遺伝子用プライマーは、5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3'（センス）（配列番号３）、及び5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'（アンチセンス）（配列番号４）であった。GAPDH 増幅の条件は、94℃２分間の後、94℃30秒間、62℃40秒間及び72℃60秒間のサイクル26回、その後72℃４分間であった。PCR 産物を１％アガロースゲル上で電気泳動し、そして臭化エチジウムにより染色した。
【００２０】
クローン原性検査におけるビタミンＤ3の効果：軟寒天中で10-11〜10-7ＭのビタミンＤ3 アナログの存在下でLNCaP細胞、MCF-7細胞及びHL60細胞をクローン化した。用量−応答曲線を描き、そしてコロニー形成を50％阻害する効果量（ED50）を決定した。1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3 は、前記の３つの細胞株のクローン増殖の阻害において、用量依存的に効果を示した。1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3のED50は、LNCaP細胞の場合1.4×10-9Ｍであり、MCF-7細胞の場合4.3×10-9Ｍであり、そしてHL-60細胞の場合3×10-11Ｍであった。この値は、1，25（OH)2D3に比べて約10〜100倍有効であった。
【００２１】
インビボでの血清カルシウムレベル：高カルシウム血症はビタミンＤ3 化合物の主な毒性の一つであるので、このカルシウム症における 1，25（OH)2D3の効果を 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3の効果と比較した。全てのマウスが実験の３週間後に生存した。0.1μｇの 1，25（OH)2D3 を与えたマウスは総て高カルシウム血症であり、その血清カルシウムレベルは約12mg／dl(正常8.5〜10.5mg／dl）であった。対照的に、1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3（0.1〜2.0μｇ／マウス）を与えたマウスは、コントロールマウス（８〜９mg／dl）とほぼ同じカルシウムレベル（８〜10mg／dl）を示した。
【００２２】
パルス暴露実験：ビタミンＤ3 アナログによるクローン原性増殖の阻害が可逆的であるかどうかを調べるために、パルス暴露実験を行った。MCF-7細胞を 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3又は 1，25（OH)2D3 のいずれかに、種々の時間暴露し、完全に洗浄し、軟寒天中にまき、そして培養14日目にコロニー数を計数した。1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3 及び 1，25（OH)2D3に４日間暴露することにより、各々約40％及び30％のクローン原性細胞が阻害された。
【００２３】
細胞周期分析：MCF-7 細胞の細胞周期に対する 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3及び 1，25（OH)2D3（10-7，４日間）の効果を決定した。細胞周期中Ｇ0−Ｇ1相の細胞数が有意に増加し（Ｐ≦0.05）、それに伴ってＳ相の細胞の割合が減少した。
【００２４】
ウェスタンブロット分析：p21waf1及びp27kip1として知られているサイクリン依存性キナーゼ阻害因子は、サイクリンキナーゼ活性を阻害し、従って細胞周期を介した細胞の進行を遅らせることができる。コントロールのMCF-7 細胞は、ウェスタンブロット分析により決定した通り、p21waf1及びp27kip1を構成的に中レベルで発現していた。1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3(10-7Ｍ）に１日暴露することにより、p21waf1及びp27kip1の発現は約3.2〜3.5倍増加し、一方、1，25（OH)2D3(10-7Ｍ）と共に培養することにより、p21waf1及びp27kip1の発現は約1.6〜1.8倍増加した。MCF-7 細胞を 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランス−D3（10-7Ｍ）に３日間暴露することにより、p21waf1及びp27kip1の発現は各々2.8倍及び3.4倍増加した。1，25（OH）2D3（10-7Ｍ，３日間）により、p21waf1及びp27kip1の発現は各々 4.8倍及び3.3倍増加した。
【００２５】
HL-60細胞においてp27kip1の発現に対するビタミンＤ3 化合物の用量依存的な効果を調べた。1，25（OH)2D3 及び 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランス−D3は両者ともp27kip1発現を増加調節した。そして、この発現レベルは、1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3（４日間、10-9Ｍ）とのインキュベーション後に著しく増加した。HL-60 細胞を10-8〜10-7Ｍの 1，25（OH)2D3と共に培養した場合に、p27kip1のレベルは顕著に増加した。
【００２６】
テロメラーゼ活性：テロメラーゼ活性に対する 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3及び 1，25（OH)2D3 (10-9〜10-7Ｍ、４日間）の効果を、TRAP検査により評価した。1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3 10-9Ｍ又は10-7Ｍ、1，25（OH)2D3のいずれかと共に培養したHL-60細胞において、テロメラーゼ活性は著しく減少した。
HL-60細胞においてhTERTの発現に対するビタミンＤ3 アナログの効果を、RT-PCRにより評価した。1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3及び 1，25（OH)2D3 は両者とも用量依存的にhTERTのmRNAの発現を阻害し、10-8Ｍの 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3 及び10-7Ｍの 1，25（OH)2D3によりほぼ完全な発現阻害が得られた。
【００２７】
良性の前立腺肥大の治療剤としての、式Ｉの化合物の有用な活性を、当分野に知られている下記の検査方法により証明することができる。
去勢した後、テストステロンにより刺激した雄のシリアハムスターにおいて、1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3 の抗アンドロゲン活性を評価した。実験から、これらの動物において、1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3が、アンドロゲンにより誘導される精嚢及び腹側前立腺の肥大を実質的に抑制すること、一方 1，25（OH)2D3は非毒性投与量（１μｇ）で非活性であることが示された。
【００２８】
去勢した雄シリアハムスターに、20μｇのプロピオン酸テストステロン及び１μｇの 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3を、14日間毎日皮下注射した。両化合物を、各々0.2ml のゴマ油の担体と共に投与した。15日目に検死を行った。前立腺及び精嚢を取り出し、吸い取り紙で水分を除き、そして重量を測定した。統計的な有意性に関して、Student のｔ検定によりデータを分析し、それを刺激された反応の阻害率として表した。
【００２９】
0003803579.tif 000005
【００３０】
骨粗鬆症の治療剤としての、式Ｉの化合物の有用な活性を、当分野に知られている下記検査法により証明することができる。
材料及び方法
動物及び処置：
３月齢の成熟雌ラットを用いた。１週間順応させた後、これらの動物を、体重により群に分け、そしていくつかの濃度の 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3を１ml／kg／day の割合で経口投与することにより処置した。投与７日目に、動物から血を採取し、そして血清カルシウムレベルを決定した。
【００３１】
化合物の調製：
化合物を100％エタノール中に溶解して、濃度100μｇ／mlの溶液を調製した。より高い投与濃度を得るためには、ゴマ油担体及びエタノール化合物溶液を調製し、次に37℃で回転蒸発して、エタノールを除いた。投与量を、投与群の平均体重から計算した。適当な投与濃度にするために、担体中に溶解した化合物を連続的に希釈した。
【００３２】
血清の採取及び定量：
投与７日目に、エーテル麻酔下に、眠窩穿刺により各動物から血液(1.5ml）を採取した。血液を血清分離用チューブ内に集め、2000rpm で15分間遠心し、そしてカルシウム定量のために血清を分取した。血清カルシウムを、比色定量検査により決定した。
【００３３】
結果
0003803579.tif 000006
血清カルシウムレベルは、２μｇ／kg／日までの1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3により処置した投与群において、正常な範囲内であった。
【００３４】
材料及び方法
動物及び処置：
３月齢の成熟雌ラットに対して、その２つの卵巣において卵巣切除又は偽手術を施した。１週間順応させた後、これらの動物を体重により群に分け、そして特定の濃度の化合物を１mg／kgの割合で経口投与することにより処置した。投与量を、群の平均体重から毎週計算した。術後17日目に投与を始め、そして19日間継続した。20日目に、二酸化炭素吸入により動物を安楽死させ、そして左大腿骨を切り出した。
【００３５】
総大腿骨カルシウム：
検死において、全ての群から左大腿骨を切り出し、そして軟組織を除去した。それらの骨を測定し、そして骨幹の中央で半分に切った。次に骨端を除去した後、遠位部分を縦に半分に切った。骨髄を洗い流し、そして５％ TCA中に浸すことにより、そのカルシウムを抽出した。TCA 抽出液中のカルシウム含量を、カルシウムの比色定量法により決定した。データを平均総骨カルシウム量として、mg／遠位半大腿骨(DHF）±血清で表した。
【００３６】
血清の採取及び定量：
投与７日目及び18日目に、エーテル麻酔下に、眠窩穿刺により各動物から血液(1.5ml）を採取した。血液を、血清分離用チューブ内に集め、2000rpm で15分間遠心し、そしてカルシウム定量のために血清を分取した。血清カルシウムを比色定量検査により決定した。
【００３７】
統計：
骨カルシウムに対する卵巣切除の効果を確認するために、Student のｔ検査により、担体投与した偽手術群と卵巣切除群とを比較した。卵巣切除群を一変数分散分析(ANOVA）により比較し、次に総効果が統計的に有意であった場合に、FisherのLSD により各治療群を担体群と比較した。
【００３８】
結果
0003803579.tif 000007
【００３９】
0003803579.tif 000008
【００４０】
本発明は、最初に、脂腺疾患の治療剤としての、式Ｉの化合物の有用活性を同定した。これを、当分野に知られている下記の検査法により証明した。
200μｌの 1，25（OH)2−16−エン−5，6−トランスD3 をプロピレングリコール中に溶解し、ゴールデンシリアハムスターに毎日（５日／週）胃内投与した。４週目に、これらの動物を殺死し、そして組織学的評価のためにそれらの耳を処理した。組織学的に調製した耳の横断切片上で、脂腺の領域を画像分析により測定した。
【００４１】
結果
0003803579.tif 000009
【００４２】
また、片方の耳からの総脂質分画を調べた（有機溶媒により抽出し、そして残存脂質物質の重量を測定した）。
結果
0003803579.tif 000010
【００４３】
乳ガン、前立腺ガン又は白血病の治療のために、その治療を必要とする人間に、式Ｉの化合物を経口投与することができる。より詳しくは、式Ｉの化合物を、前記治療のために、約１〜20μｇ／日の範囲の投与量で成人に経口投与することができる。
【００４４】
良性前立腺肥大及びはげの治療のために、その治療を必要とする人間に、式Ｉの化合物を経口投与することができる。より詳しくは、式Ｉの化合物は、前記治療のために、約１〜20μｇ／日の範囲の投与量で成人に経口投与することができる。
骨粗鬆症の治療のために、式Ｉの化合物を、約１〜20μｇ／日の投与量で人間に経口投与することができる。
【００４５】
はげの治療のために、式Ｉの化合物を、その治療を必要とする人間に局所投与することができる。より詳しくは、式Ｉの化合物を、前記治療のために、約５〜約50μｇ／ｇ局所製剤／日の範囲の投与量で局所投与することができる。
脂腺疾患の治療のために、式Ｉの化合物を、約１〜20μｇ／日の投与量で人間に経口投与することができる。
【００４６】
本発明の式Ｉの化合物を含んでなる経口投与剤を、医薬に適した担体物質と共に、カプセル錠や錠剤などに組み込みうる。
カプセル剤などに組み込みうる、医薬に適した担体物質の例は以下の通りである：結合剤、例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、又はゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸など；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えばスクロース、ラクトース、又はサッカリン；香料、例えばペパーミント、ウィンターグリーン油又はサクランボ油。
【００４７】
種々のその他の物質がコーティング剤として、又は、投与単位の物理的な形を改修するために用いられうる。例えば、錠剤をセラック、糖、又は両者によってコーティングしうる。シロップ又はエリキシールは、当該活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、及び香料、例えばサクランボ又はオレンジ香料を含みうる。
【００４８】
本発明の式Ｉの化合物を含んでなる局所投与剤形には、軟膏及びクリーム、例えば、脂肪性、吸収性、水溶性及び乳剤性の基剤、例えばペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコールなどを有する製剤が含まれる。
【００４９】
ローションは液体製剤であり、単なる溶液から、細分化された物質を含んでいる水性又はヒドロアルコール性調合液まで色々である。ローションは、懸濁剤又は分散剤、例えばセルロース誘導体、例えばエチルセルロース、メチルセルロースなど；ゼラチン又はゴムを含んでよく、そして水、アルコール、グリセリンなどからなる担体中に当該活性成分を組み込んでいる。
【００５０】
ゲル剤は、担体中の当該活性成分の溶液又は懸濁液をゲル化することにより作られた半固体製剤である。この担体は、水和物又は無水物であってよく、ゲル化剤、例えばカルボキシポリメチレンによりゲル化され、そしてアルカリ、例えば水酸化ナトリウム及びアミン、例えばポリエチレンココアミンにより、適当なゲル稠度になる様に中和される。
【００５１】
本文では、用語「局所用」とは、適当な医薬用担体中に組み込まれた当該活性成分を、限局した作用効果のために、炎症部位に適用する用途を意味する。従って、局所用組成物は、当該化合物を、皮膚との直接的な接触により外部的に適用するための医薬剤形を含む。この局所用投与剤形には、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、粉末、エアロゾル、そして皮膚へ薬剤を適用するためのその他の伝統的な剤形が含まれ、これらは、式Ｉの化合物を既知の医薬用の局所用担体物質と混合することにより得られる。
【００５２】
本発明を更に説明するために、しかし限定するためではなく、下記の実施例を示す。
実施例１
【化６】
0003803579.tif 000011
【００５３】
（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｓ）−２−〔５，７−ビス〔１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−４−メチレン−１−オキサスピロ〔２，５〕オクタン−２−メタノールアセテート
50mlのジメチルホルムアミド中に18.5ｇ（0.0523mole）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｓ）−５−ヒドロキシ−４−メチレン−７〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリルオキシ〕−１−オキサスピロ〔２，５〕オクタン−２−メタノールアセテート（Y.Kiegiel, P.M. Wovkulich and M.R.Uskokovic, Tetrahedron Letters, 32, pgs. 6057-6060 (1991)）及び6.8ｇ(0.099mole）のイミダゾールを含有する溶液に、アルゴン雰囲気下で磁気的に攪拌しながら、9.8ｇ（0.065mole）のｔ−ブチルジメチルシリルクロリドを加えた。この反応混合液を５時間攪拌し、５mlの水で反応を停止し、30分間撹拌し、そして 400mlの水中に注いだ。次に、これを500mlヘキサンで２回、そして500mlエーテルで２回抽出した。これらの有機層を混合し、300ml の水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、そして蒸発させた。シリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにより、無色の油として表題の化合物22.31ｇ（92％）を得た。
【００５４】
実施例２
【化７】
0003803579.tif 000012
【００５５】
〔３Ｓ−（１Ｅ，３β，５α）〕−２−〔３，５−ビス〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−２−メチレンシクロヘキシリデン〕エタノールアセテート
アルゴン吸気口、磁気撹拌機及び温度計を備えた３リットルの３首フラスコに、500mlのテトラヒドロフランを加え、そしてドライアイス／アセトン浴槽中で-60℃に冷却した。43.23ｇ（0.108mole）の無水タングステンヘキサクロリドを少しずつ加え、その間温度を-60℃に維持し、そして次に、温度を-45℃未満に保ちながら、1.6Ｍのｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液200mlを急速に一滴ずつ加えた（約５分間）。前記のドライアイス／アセトン浴槽を氷水浴槽に置き換え、温度を５℃にまで上げた。青ないしカーキ色から赤黒色へ色の変化が起きた。
【００５６】
５℃で30分後に、50mlヘキサン中の22.31ｇ（0.04884mole）の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｓ）−２−〔５，７−ビス〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−４−メチレン−１−オキサスピロ〔２，５〕オクタン−２−メタノールアセテートを、３分間にわたって急速に一滴ずつ加えた。４時間後、この反応混合液を２リットルのヘキサンにより希釈し、シリカゲルケークに通して濾過し、それを、500ml のヘキサン／エチルアセテート９：１により３回洗浄し、そして蒸発させた。その残査を、75ｇのシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけ、22.56ｇ の粗生成物を得た。中圧のシリカゲルカラムによるクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン／エチルアセテート 100：１混合液により溶出して、17.42ｇ(80.1％）の表題化合物と少量の対応する１Ｚエピマーを得た。
【００５７】
実施例３
【化８】
0003803579.tif 000013
【００５８】
〔３Ｓ−（１Ｅ，３β，５α）〕−２−〔３，５−ビス〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−２−メチレンシクロヘキシリデン〕エタノールアセテート（Ｅ−ジエン）
及び
〔３Ｓ−（１Ｚ，３β，５α）〕−２−〔３，５−ビス〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−２−メチレンシクロヘキシリデン〕エタノールアセテート（Ｚ−ジエン）
465mlの無水THFに、-78℃で撹拌しながら、64.3ｇ（160mmol）のWCl6（青色溶液）を加え、その後、1.43Ｍのn-BuLiのヘキサン溶液337.5mlを（内部温度が-20℃を超えない様な速度で）加えた。次に、この混合液を室温まで温めた。65mlのTHF中の24.5ｇ(53.6mmol）の（２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ，７Ｓ）−２−〔５，７−ビス〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−４−メチレン−１−オキサスピロ〔２，５〕オクタン−２−メタノールアセテート溶液を一滴ずつ加え、そしてこの混合液を４時間撹拌した。この混合液を 600mlのペンタンにより希釈し、そして４cmのシリカゲル床に通して濾過し、ヘキサン／EtOAc(19：１）により洗浄し、そして減圧下で揮発成分を蒸発させた後、27ｇのジエンの粗混合物を得た。クロマトグラフィーにより、ヘキサン／EtOAc(25：１）で溶出することにより更に精製して、21.6ｇ（91％）の２：３のＺ／Ｅジエン混合物（表題化合物）を得て、そしてこれらをシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／EtOAc 40：１）により分離した。
【００５９】
Ｚ−ジエン 1H NMR δ0.052 (s, 6H), 0.06 (s, 6H) 0.87 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.74-1.90 (m, 2H), 2.04 (s, 3H), 2.20 (dd, J=6.0, 12.8Hz, 1H), 2.41 (d, J=11.1Hz, 1H) 4.19 (m, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.61 (dd, J=7.3, 12.1Hz, 1H), 4.68 (dd, J=7.3, 12.1Hz, 1H), 4.80 (s, 1H), 5.20 (s, 1H), 5.47 (t, J=7.2Hz, 1H)。[α]D25＝+1.2°(c=0.4, EtOH)。分析：C23H44O4Si2の計算値：C, 62.27 ; H, 10.01 ; 実測値：C, 62.55, H, 10.33。
【００６０】
Ｅ−ジエン 1H NMR δ0.046 (s, 3H), 0.057 (s, 3H), 0.065 (s, 6H), 0.88 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.77 (ddd, J=3.1, 9.4, 11.9Hz, 1H), 1.89 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 2.31 (dd, J=2.0, 15.2Hz, 1H), 2.39 (dd, J=6.3, 15.2Hz, 1H), 4.21 (br s, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.58 (dd, J=7.2, 12.9Hz, 1H), 4.65 (dd, J=7.2, 12.9Hz, 1H), 4.95 (s, 1H), 4.99 (s, 1H), 5.69 (t, J=7.2 Hz, 1H)。[α]D25＝+8.0°(c=0.5, EtOH)。分析：C23H44O4Si2の計算値：C, 62.67 ; H, 10.06 ; 実測値：C, 62.42, H, 10.01。
【００６１】
実施例４
【化９】
0003803579.tif 000014
【００６２】
〔３Ｓ−（１Ｅ，３β，５α）〕−２−〔３，５−ビス〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−２−メチレンシクロヘキシリデン〕エタノール
100mlメタノール中の10.84ｇ（0.0246mole）の〔３Ｓ−（１Ｅ，３β，５α）〕−２−〔３，５−ビス〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−２−メチレンシクロヘキシリデン〕エタノールアセテート溶液に、アルゴン雰囲気下で磁気的に撹拌しながら、3.5ｇの水酸化ナトリウム粒を加え、そしてこの混合反応液を、アルゴン下で３時間撹拌した。次にこれを、減圧下で容量50mlまで蒸発させ、500mlの水で希釈し、500mlのヘキサン／エーテル１：１で２回抽出した。その有機層を水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、そして蒸発させた。これにより、白色固体として、9.80ｇ(100％）の表題化合物を得た。
【００６３】
実施例５
【化１０】
0003803579.tif 000015
【００６４】
１Ｒ−（１α，３β，５Ｅ）−〔〔−２−クロロエチリデン）−４−メチレン−１，３−シクロヘキサンジイル〕ビス（オキシ）〕ビス（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシラン
氷／アセトン浴槽中で２℃に冷却し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、150mlジクロロメタン中の6.67ｇ（0.050mole）のＮ−クロロスクシンイミドの溶液に、２分間かけて、４ml(0.055mole）のジメチルスルフィドを一滴ずつ加えた。白色沈殿が生成した。０℃で30分後に、前記の浴槽をドライアイス／アセトン浴槽に置き換えて、反応混合液の温度を-20℃ に調整した。60mlジクロロメタン中の9.8ｇ(0.0246mole）の〔３Ｓ−（１Ｅ，３β，５α）〕−２−〔３，５−ビス〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−２−メチレンシクロヘキシリデン〕エタノールの溶液を加えた。
【００６５】
15分後、冷却用浴槽を取り去り、そして反応混合液を50分間撹拌し、そして500mlの水を含んでいる分離用漏斗に移した。それを350mlのヘキサンで２回抽出した。その有機層を 500mlの水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして蒸発させることにより、黄色液として、10.49ｇの粗生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、純粋な表題化合物を、無色の油として得た。NMR (CDCl3)：δ0.03 (s, 3H), 0.05 (s, 3H), 0.07 (s, 6H), 0.87 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.70-1.94 (m, 2H), 2.34 (m, 2H), 4.13 (m, 2H), 4.28 (m, 1H), 4.53 (m, 1H), 5.00 (m, 1H), 5.03 (m, 1H), 5.78 (tm, J=8Hz, 1H)。
【００６６】
実施例６
【化１１】
0003803579.tif 000016
【００６７】
〔３Ｓ−（１Ｅ，３β，５α）〕−２−〔３，５−ビス〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕−２−メチレンシクロヘキシリデン〕エチル〕ジフェニルホスフィンオキサイド
アルゴン吸気口、磁気撹拌機及び温度計を備えた１リットルの３首フラスコに、新しく蒸留した無水テトラヒドロフラン100ml中の10.26ｇ（0.0246mole）の１Ｒ−（１α，３β，５Ｅ）−〔〔−（２−クロロエチリデン）−４−メチレン−１，３−シクロヘキサンジイル〕ビス（オキシ）〕ビス（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシランの溶液を加え、そしてドライアイス／アセトン浴槽中で-65℃ に冷却した。赤色が続くまで30分間にわたって、60mlのテトラヒドロフラン中の0.5Ｍカリウムジフェニルホスフィドを加えた。-65℃で１時間撹拌した後、10mlの水を加え、そして冷却用浴槽を取り除いた。その反応液は脱色した。次に200ml のジクロロメタンを急速に加え、その後10mlの30％過酸化水素を含有する200ml の水溶液を加えた。
【００６８】
１時間後、13.5ｇの亜硫酸ナトリウム、100ml の塩水及び 200mlのジクロロメタンを加えた。十分に撹拌した後、相を分離させ、そして水相を 200mlのジクロロメタンで洗浄した。その有機相を 200mlの塩水で洗浄した。混合した有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして蒸発させて、 16.33ｇの粗生成物を得た。この粗生成物を、中圧（シリカゲルＧ−60）クロマトグラフィーにより精製して、白色結晶として 12.54ｇ（87％）の表題化合物を得た。NMR (CDCl3)：δ0.02 (s, 3H), 0.07 (s, 6H), 0.85 (s, 3H), 0.84 (s, 18H), 1.76 (m, 2H), 2.98-3.15 (m, 2H), 4.06 (m, 1H), 4.37 (m, 1H), 4.53 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.79 (m, 1H), 7.45 (m, 6H), 7.72 (m, 4H)。
【００６９】
実施例７
【化１２】
0003803579.tif 000017
【００７０】
Ｅ−（３Ｓ，５Ｒ）−〔３，５−ビス−（tert−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−２−メチレンシクロヘキシリデン〕酢酸メチルエステル（Ro 65-8821）
100ml ヘキサン中の4.45ｇ(0.01043mole）のＺ−（３Ｓ，５Ｒ）−〔３，５−ビス−（tert−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−２−メチレン−シクロヘキシリデン〕−酢酸メチルエステル（Ｘ）（A. Mowrino, et al., Tetrahedron Letters, 38, pgs. 4713-4716 (1997)）の溶液に３時間紫外線を照射した。蒸発させて、無色の油として4.25ｇ（95.5％）の表題化合物を得た。NMR (CDCl3)：δ0.06 (s, 3H), 0.07 (s, 9H), 0.85 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.76 (m, 1H), 1.84 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 3.36 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 4.26 (m, 1H), 4.58 (m, 1H), 5.07 (m, 2H), 5.91 (brs, 1H)。
【００７１】
実施例８
【化１３】
0003803579.tif 000018
【００７２】
〔３Ｓ−（１Ｅ，３β，５α）〕−２−〔３，５−ビス−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチル−シリル〕オキシ〕−２−メチレン−シクロヘキシリデン〕エタノール
100ml トルエン中の4.25ｇ（0.00996mole）のＥ−（３Ｓ，５Ｒ）−〔３，５−ビス−（tert−ブチル−ジメチル〕−シラニルオキシ）−２−メチレンシクロヘキシリデン〕−酢酸メチルエステルの溶液に、-78℃ で、25mlの 1.2Ｍジイソブチルアルミニウムヒドリド（0.03mole）を一滴ずつ加え、そしてこの反応混合液を１時間撹拌した。５mlのメタノールを加えた後、反応混合液を室温まで温めた。次にそれを、150ml の２Ｍ酒石酸カリウムナトリウム水溶液により希釈し、そして激しく撹拌した。有機相を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして蒸発により乾燥した。その粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィーによりヘキサン／エチルアセテート８：２を用いて精製して、無色の油性固形物として 2.8ｇ（70％）の表題化合物を得た。NMR (CDCl3)：δ0.05 (s, 3H), 0.07 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.91 (s, 9H), 1.74 (m, 1H), 2.06 (m, 1H), 2.26 (dm, J=13.6Hz, 1H), 2.40 (dd, J=13.6, 5.2, 1H), 4.30-4.11 (m, 3H), 4.53 (m, 1H), 4.98 (m, 1H), 5.00 (m, 1H), 5.80 (tm, J=7Hz, 1H)。
【００７３】
実施例９
１，25−ジヒドロキシ−16−エン−５，６−トランス−コレカルシフェロール
10ml無水テトラヒドロフラン中の 796mg（0.00137mole）の〔３Ｓ−（１Ｅ，３β，５α）〕−２−〔３，５−ビス〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチル−シリル〕オキシ〕−２−メチレンシクロヘキシリデン〕エチル〕ジフェニルホスフィンオキサイドを、-78℃ で、0.83ml（0.00133mole）の1.6Ｍのｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液により、これをアルゴン下で一滴ずつ加えて、処理した。この様にして得られた赤色の溶液に、５mlテトラヒドロフラン中の 280mg（0.000803mole）の〔３ａＲ−〔１（Ｒ*），３ａα，７ａβ〕〕−１−〔１，５−ジメチル−５−〔（トリメチルシリル）オキシ〕ヘキシル〕−３，３ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロ−７ａ−メチル−４Ｈ−インデン−４−オンの溶液を、アルゴン下で10分間にわたって一滴ずつ加えた。この反応混合液を-78℃ で90分間撹拌し、次に２Ｎロシェル塩及び２Ｎ  KHCO3 の１：１溶液40mlを加えることにより反応を停止し、そして室温まで暖めた。それを、100ml のエチルアセテートで３回抽出した。その有機層を水／塩水で３回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして蒸発により乾燥した。この粗生成物を、40mm×1524mmのシリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーにより、ヘキサン／エチルアセテート40：１を用いて精製して、278mg のトリシリル化された表題化合物及び 140mgの出発ケトン材料を得た。
【００７４】
８ml無水テトラヒドロフラン中の 278mg（0.000389mole）の前記トリシリル化中間体の溶液を、アルゴン下で 1.9 (1.9mmole) の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液により17時間処理した。反応を６mlの水により停止し、そして30分間撹拌した。減圧下でテトラヒドロフランを蒸発させた後、その残液を 100mlのエチルアセテートで３回抽出した。その有機層を水／塩水により４回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして蒸発により乾燥した。その粗生成物 192mgをシリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。このカラムを、１％トリエチルアミン：エチルアセテート溶液(300ml）により前洗浄し、そしてエチルアセテートにより溶出した。これにより、152mg の結晶の表題化合物を得た。テトラヒドロフラン：メチルホルメート（0.3：７）中から再結晶化した試料において、融点95〜100℃；〔α〕D25 ＋160.5°（EtOH，ｃ＝0.20）；λmax 272／３nm（ε 20600）であった。
【００７５】
実施例10
0003803579.tif 000019
【００７６】
製造方法：
１．Miglyol 812中にBHT及びBHAを懸濁する。約50℃に温め、溶解するまで撹拌する。
２．50℃で、過程１の溶液中に1, 25（OH)2−16−エン−５，６−トランスＤ3 を溶解する。
３．過程２の溶液を室温まで冷やす。
４．過程３の溶液を、軟ゼラチンカプセルに充填する。
注意：全ての製造過程を窒素雰囲気下で、且つ遮光して行う。
【００７７】
実施例11
0003803579.tif 000020
【００７８】
製造方法：
１．Miglyol 812中にジ−α−トコフェロールを懸濁する。約50℃に温め、溶解するまで撹拌する。
２．50℃で、過程１の溶液中に1, 25（OH)2−16−エン−５，６−トランスＤ3 を溶解する。
３．過程２の溶液を室温まで冷やす。
４．過程３の溶液を、軟ゼラチンカプセルに充填する。
注意：全ての製造過程を窒素雰囲気下で、且つ遮光して行う。