(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨで示される新規ペプチド。
【請求項２】
蛋白質をキモトリプシンで加水分解することを特徴とするＨ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨで示される新規ペプチドの製造方法。
【請求項３】
蛋白質として卵白を使用する請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
卵白として鶏卵白を使用する請求項３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動脈弛緩作用を持ち、血圧降下剤として有用な新規ペプチド及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品中に含まれる蛋白質は栄養効果ばかりでなく種々の生理活性を有することが知られている。例えば血圧を降下する活性を示すものとしていくつかのペプチドがある。かかる作用は主として血管を弛緩させたりアンギオテンシン変換酵素を阻害させることによって生起される。
前者の血管弛緩作用をもつペプチドとしては例えば牛血清アルブミン由来のペプチドが公知である（特開平４−９９７９８号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、かかる活性をもつペプチドが天然物中に見出されることは極めてまれで、アンギオテンシン変換酵素阻害剤としては僅かにブラジル産や日本産蛇毒より得られたテプロタイド（ノナペプチド，ＳＱ２０８８１）等や、ストレプトミセス属に属する放線菌の代謝産物ＩＳ８３（特開昭５８−１７７９２０号公報）が知られているに過ぎない。
【０００４】
また、天然物を酵素処理して得られたアンギオテンシン変換酵素阻害物質としては、牛乳カゼインをトリプトシンにより分解して得たペプチド類等が知られている（特開昭５８−１０９４２５号公報、同５９−４４３２３号公報、同５９−４４３２４号公報、同６１−３６２２６号公報、同６１−３６２２７号公報）が、新規な阻害物質の開発が望まれているところである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等が、天然物質で副作用の少ない動脈弛緩作用を示し、血圧降下作用を持つ物質を鋭意探索した結果、蛋白質特に卵白を特定の酵素で加水分解した組成物中にかかる活性を有する物質の存在をつきとめ、該物質が、Ｈ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨである構造のペプチドであることを見出し本発明を完成した。
【０００６】
本発明のＨ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨなるペプチドは文献未載の新規なペプチドであり、卵白アルブミンをキモトリプシンによって加水分解することによって製造され、実用にあたっては組成物をそのまま用いても良く、あるいは必要に応じて精製して使用される。更にはペプチド合成の常套手段を適用して合成することによって製造することもできる。上記でいうＡｒｇはアルギニン、Ａｌａはアラニン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｐｒｏはプロリン、Ｐｈｅはフェニルアラニンを意味し、かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【０００７】
本発明のペプチドは蛋白質をキモトリプシンで加水分解することによっても、ペプチド合成法でも取得できる。蛋白質をキモトリプシンで加水分解するには、蛋白質の性状により処法が異なるが、難溶性の場合には熱水に蛋白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズし、所定量のキモトリプシンを加え温度１０〜８５℃程度で０．１〜４８時間反応を行う。
蛋白質としては、動物由来や微生物由来のもの等が任意に用いられ、特に有用なものは卵白である。
【０００８】
単離する場合は加水分解液を遠心分離等の公知の操作で濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用した後、あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性あるいは析出速度の差などを利用する手段を適用して目的物を単離するのが好ましい。これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、また反復して適用される。
【０００９】
本発明のペプチドはペプチド合成に通常用いられる方法、即ち液相法または固相法でペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とをカルボジイミド法、活性エステル法等を用いて縮合させ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去させることによっても製造し得る。
【００１０】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル等が挙げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００１１】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
【００１２】
本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状・年令等により異なるが、通常１回０.００１〜１０００ｍｇで、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回である。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１３】
具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げられる。
【００１４】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１５】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１重量％以上、好ましくは０．５〜７０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有していてもよい。
【００１７】
【実施例】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
〔ペプチドの抽出〕鶏卵白を蒸留水で５倍に希釈した後、１Ｎ塩酸あるいはＩＮＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した溶解液（２０ｍｇ／ｍｌの蛋白質を含む）にキモトリプシン０．２ｍｇ／ｍｌ（シグマ社製）を添加して３７℃で３時間加水分解反応を行った。冷却後遠心分離して濃縮し、高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ−，Ｐｈ−及びＣＮ−カラム）により精製し、ペプチドを得た。
本品を気相プロテインシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ社製  ４７７  Ａ型）を用いる自動エドマン分解法を適用してアミノ酸配列を分析し、下記の構造を得た。
Ｈ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨ該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。
【００１８】
0003770659.tif 000002
【００１９】
〔ペプチドの合成〕
市販のＢｏｃ（ブトキシカルボニル）−Ｐｈｅ−Ｏ−Ｒｅｓｉｎ〔ベンジル樹脂（置換率０．５５ｍｅｑ／ｇ）〕０．５５ｇをバイオサーチ社のペプチド合成装置ＳＡＭ  ＴＷＯの反応槽に分取し、以下のように合成を行った。
４５重量％トリフルオロ酢酸、２．５重量％アニソールを含む塩化メチレン中、２５分間の反応により、Ｂｏｃ基を除去したのち、塩化メチレンによる洗浄、１０重量％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレンによる中和、及び塩化メチレンによる洗浄を行った。
これと５ｍｌの０．４Ｍ  Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅのジメチルホルムアミド溶液、５ｍｌの０．４Ｍジイソプロピルカルボジイミドの塩化メチレン溶液とを混合した後、反応槽に加え、室温にて２時間撹拌反応させた。
【００２０】
得られた樹脂をジメチルホルムアミド、塩化メチレン、１０重量％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレン、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメチルホルムアミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ樹脂を得た。
引き続き同様のＢｏｃ基の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカップリングを繰り返し、Ａｒｇ（Ｔｏｓ  トシル基）−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ樹脂を得た。該樹脂を２０ｍｌの１０重量％アニソールを含むフッ化水素中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０重量％酢酸で抽出し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ18）による逆相クロマトグラフィーにより精製し、Ｈ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨを得た。
本品を前記と同一のプロテインシーケンサーにより分析した結果、上記の組成であることが判明した。
【００２１】
該ペプチドの物性値は上記と同一であった。
（イヌ腸間膜動脈弛緩作用の測定）
イヌより摘出した腸間膜動脈のらせん条片を高木等らの方法（高木等編、薬物学実験、９４〜９９ページ、南山堂）に従って処理し、標本をマグナス管中で等長性トランスジューサーに接続した。０．５μＭのプロスタグランジンＦ2αによって収縮させた腸間膜動脈に対して本ペプチドは弛緩作用を示した。その際の
ＥＤ50（５０％弛緩）は１００μＭであった。
【００２２】
（血圧変動の測定）
観血法
１５〜２０週令の自然発症性高血圧ラットを尾静脈より麻酔した後、大腿部静脈にサンプル注入用カテーテルを挿入し、５ｍｇ／ｋｇのサンプルを投与し圧トランスジューサーにより観血的に血圧を測定した。血圧の低下は約２０ｍｍＨｇであった。
【００２３】
非観血法（経口投与）
上記のラットに卵黄でエマルジョン化したサンプルを２０ｍｇ／ｋｇの割合でゾンデ針を使用して強制経口投与した。
そして尾動脈部の血圧をｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法にて経時的に測定し収縮期血圧における最大降圧値を測定したところ、１１ｍｍＨｇであった。
【００２４】
【発明の効果】
本発明のペプチドは、新規なペプチドであり優れた動脈弛緩作用、血圧降下活性を示し、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、治療剤、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用いられる血圧降下剤、狭心症や心筋梗塞の治療薬、うっ血性心不全における病態の改善剤として有用である。
また、本発明のペプチドは、卵白等の天然物を加水分解することにより容易に製造することができる。