(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と酵素標識抗体との反応、もしくは抗原と抗体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗原と、抗原と高分子化合物との結合物と、酵素標識抗体との間の反応のいずれかの反応により生じた標識酵素活性の変化を測定することにより抗原の量を分析する免疫分析要素において、
前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層を備え、
前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が前記標識酵素とのみ反応し前記低分子化酵素とは反応しない基質であって非還元末端グルコース部位からカルボキシメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシメチル化澱粉であることを特徴とする免疫分析要素。
【請求項２】
抗体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗体と抗原と酵素標識抗体との反応により生じた標識酵素活性の変化を測定することにより抗体の量を分析する免疫分析要素において、
前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層を備え、
前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が前記標識酵素とのみ反応し前記低分子化酵素とは反応しない基質であって非還元末端グルコース部位からカルボキシメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシメチル化澱粉であることを特徴とする免疫分析要素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酵素免疫測定法を適用した乾式免疫分析要素に関するものである。詳しくは、標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層を備える免疫分析要素において、非拡散性基質を、標識酵素とのみ反応し低分子化酵素とは反応しない基質とした免疫分析要素に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
血液や尿などの体液に含まれる生体成分、薬物等の分析は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であり、臨床検査の分野で重要な役割を果たしている。このような微量成分（リガンド）の分析方法として、酵素免疫分析方法（エンザイムイムノアッセイ）がある。酵素免疫分析方法には、Ｂ／Ｆ分離が必要な非均一系とＢ／Ｆ分離が不要な均一系がある。均一系反応は抗体と抗原（リガンド）が結合すると標識酵素の酵素活性が何らかの干渉を受けることに基づくもので、抗原抗体結合による阻害作用を利用する。一般には、抗原を酵素標識しておいて、これに大分子である抗体が結合することにより、酵素の基質に対する結合が立体障害を受けたり、或いは酵素の立体構造が変化するために生じる酵素活性の抑制を検出する。
【０００３】
抗原が高分子である場合には、これとは逆に抗体に酵素標識しておいても、抗原抗体結合反応による酵素活性の抑制を検出できる。
【０００４】
一方、多数の検体試料を取扱いルーティン化している臨床検査では、簡便、迅速に分析でき自動操作化もできることが望まれ、このような観点から、乾式分析要素が提案されている（例えば特開昭49-53888（対応US 3,992,158）、特開昭55-90859（US 4,258,001）、特開昭55-164356（US 4,292,272）、特開昭60-222769（EP 0 162 302A）、特開昭59-77356（EP 0 097 952A）、特開昭59-102388（US 4,861,552）、特表昭61-501866（US 4,459,358））。
【０００５】
抗体に酵素標識しておいて均一系酵素免疫反応をさせる乾式分析要素は以下のものが知られている（特開平1-321360）。これは
(A) 高分子化抗原（リガンドと高分子化合物との結合物）、
(B) 水不溶性の高分子基質、
(C) リガンドに対する抗体と、基質に対する酵素との結合物、
の３つを多層分析要素の同一層或いは別々の層に含有させたものである。分析要素に点着し供給された抗原は、高分子化抗原と競争して、抗体−酵素結合物に結合する。この抗原−抗体−酵素複合体は、水不溶性高分子基質に反応して、可溶性の低分子生成物を生成する。一方、高分子化抗原と結合してできた高分子抗原−抗体−酵素複合体は、高分子基質に対して酵素活性を示すことができない。従って検体中の抗原量が増えるに従って、酵素反応生成物は増えることになる。この生成物を検出層に移行させて、その量をその有色化学基が与える吸収の光学濃度を測定することにより、検体中の抗原量を分析するというものである。
【０００６】
特許第2576910号公報（対応US 5,569,589）記載の免疫分析要素は、これをさらに改良したものである。この分析要素では、標識酵素分解物をさらに低分子化する低分子化酵素を含有する試薬層が設けられ、この低分子化生成物を検出することにより感度の上昇が図られている。
【０００７】
測定対象が高分子抗原である場合には、特許第2576913号公報記載の免疫分析要素を使用することができる。この分析要素は、
(A) 水不溶性の高分子基質、
(B) 高分子抗原に対する抗体と、基質に対する酵素との結合物、
の２つを多層分析要素の同一層或いは別々の層に含有させたもので、特許第2576910号公報（対応US 5,569,589）記載の免疫分析要素と同じように、標識酵素分解物をさらに低分子化する低分子化酵素を含有する試薬層を設けて、この低分子化生成物を検出することにより感度の上昇を図っている。
【０００８】
いずれの場合でも、非拡散性基質は試薬層へ移行することがない。また、低分子化酵素は試薬層からその上の層である基質層へ逆行することはないものと考えられていた。そのため、非拡散性基質の基質特異性はそれほど厳密ではなく、低分子化酵素、標識酵素のいずれとでも反応しうるものが選ばれていた。
【０００９】
しかしながら、試料液を点着した分析要素では、僅かとはいえ下層の試薬層から上層の基質層へ可溶性成分の拡散がある。発明者らがこれを検討したところ、試薬層から上流側の基質層へ移行した低分子化酵素が非拡散性基質と反応して低分子化生成物を産生する場合には、これが無視できないノイズとなることが判明した。このようなノイズは、分析の精度を低める可能性があった。また基質層に非拡散性基質として保持される高分子基質の中に重合度が低いものや粒径の小さいものが僅かでも混在すると、試料液の供給に伴い上層の基質層から下層の試薬層へ移行するものが出てくることになる。移行した微量の高分子基質は、試薬層で低分子化酵素と反応することになり、これもノイズの原因となる。
【００１０】
そこで本発明者らが、非拡散性基質として標識酵素とのみ反応し低分子化酵素とは反応しない基質を用いて免疫分析要素を作製し、その性能を検討したところ、従来の免疫分析要素に比べ感度が上昇するばかりでなく、再現性にも優れ、さらに経時安定性（保存性）にも優れていることが判明した。
【００１１】
【発明の目的】
本発明は、以上のような知見に基づきなされたものであり、より高精度かつ高再現性で高感度な分析が出来、さらに保存安定性にも優れた免疫分析要素を提供することを目的とする。
【００１２】
【発明の構成】
このような本発明の目的は、抗原と酵素標識抗体との反応、もしくは抗原と抗体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗原と、抗原と高分子化合物との結合物と、酵素標識抗体との間の反応のいずれかの反応により生じた標識酵素活性の変化を測定することにより抗原の量を分析する免疫分析要素において、前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層を備え、前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が前記標識酵素とのみ反応し前記低分子化酵素とは反応しない基質であって非還元末端グルコース部位からカルボキシメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシメチル化澱粉であることを特徴とする免疫分析要素、により達成される。
【００１３】
また被検物が抗体である場合には、本発明の目的は、抗体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗体と抗原と酵素標識抗体との反応により生じた標識酵素活性の変化を測定することにより抗体の量を分析する免疫分析要素において、前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層を備え、前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が前記標識酵素とのみ反応し前記低分子化酵素とは反応しない基質であって非還元末端グルコース部位からカルボキシメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシメチル化澱粉であることを特徴とする免疫分析要素、により達成される。
【００１４】
すなわち本発明の分析要素は、抗原（又は抗体）の標識酵素とのみ反応し、試薬層に本来含有される低分子化酵素とは反応しない基質を、非拡散性基質として基質層に含有させたものである。これにより、試料液を点着後、試薬層から上流の基質層へ低分子化酵素が基質層へ拡散しても、この低分子化酵素により非拡散性基質が分解されることがなくなり、ノイズが減少することになる。また使用する非拡散性基質の中に、重合度が低かったり、粒径が小さいため基質層に保持されず試薬層へ移行してしまうような不溶性高分子基質が混在したとしても、試薬層で低分子化酵素と反応することがない。このような非拡散性基質を使用することにより、測定値の再現性、保存安定性も高くなる。
【００１５】
抗原（又は抗体）の標識酵素をエンド活性型糖質加水分解酵素として、試薬層中の低分子化酵素をエクソ活性型糖質加水分解酵素とした場合には、基質層の非拡散性基質は、非還元末端グルコースが修飾されたエンド型選択反応性基質とするのが好ましい態様である。
【００１６】
或いは、非還元性末端グルコースが修飾されていない場合には、この非還元性末端グルコースがグルコース糖鎖の分枝点に位置しているものであれば、エンド型選択反応性基質として使用することができる。
【００１７】
エンド型選択反応性基質としては、非還元末端グルコース部位からカルボキシメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシメチル化澱粉を使用することができる。限定分解されたカルボキシメチル化澱粉を使用した場合には、標識酵素に対する反応性をさらに高め、測定感度を上げることができる。
【００１８】
非拡散性基質として澱粉などの高分子多糖類を用い、抗体又は抗原の標識酵素をエンド活性型の糖質分解酵素としてこの高分子多糖類からグルコースオリゴマーを生成させ、さらにこのオリゴマーをグルコースに変換（分解）する低分子化酵素をエキソ活性型の糖質分解酵素とするのが好ましい態様である。
【００１９】
【発明の構成の詳細な説明】
免疫分析要素の層構成
図１に本発明の免疫分析要素の一実施態様を示す。この図１において符号１０は光透過性支持体であり、その上には試薬層１２、基質層１４が積層されている。
【００２０】
基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗体又は抗原に標識として結合された酵素の基質である非拡散性基質を含有する。
【００２１】
試薬層１２は、水浸透性層で構成され、基質層から拡散・移行して来た拡散性物質をさらに低分子量の生成物にする低分子化酵素を含有する。基質層１２はまたこの低分子生成物を検出するための試薬組成物を含有する。
【００２２】
この基本構成は、測定対象が低分子抗原であるか、高分子抗原であるか、また抗体であるかを問わず同じである。ただし、測定対象が低分子抗原である場合には、検体と高分子化抗原（抗原と高分子化合物との結合物）と酵素標識抗体とを混合して競争反応をした混合液を、基質層１４に点着又は供給することにより分析を行う。或いは、検体と抗体と酵素標識抗原とを混合して競争反応をした混合液を、基質層１４に点着又は供給することにより分析を行う。いずれの場合も、リガンド（低分子抗原）の量が多いほど生成される拡散性物質は増大する。
【００２３】
これに対して、測定対象が高分子量の抗原である場合には、検体と酵素標識抗体のみを混合して抗原抗体結合反応させ、その反応液を基質層１４に点着又は供給すればよい。この場合には、リガンド（高分子抗原）の量が多いほど生成される拡散性物質は減少する。
【００２４】
測定対象が抗体である場合には、検体と酵素標識抗原とを混合して反応をした混合液を、基質層１４に点着又は供給することにより分析を行う。この場合、被検抗体量が多いほど生成される拡散性物質は減少する。或いは、検体と抗原と酵素標識抗体とを混合して競争反応をした混合液を、基質層１４に点着又は供給することにより分析を行う。この場合には被検抗体量が多いほど生成される拡散性物質は増大する。
【００２５】
測定対象
本発明の測定対象は検体に含まれる抗原又は抗体である。抗原とは、抗原決定基を有するリガンドである。検体の種類は限定されないが、例えば血液（全血、血漿、血清）リンパ液、尿などがある。血球などの浮遊物がある場合には予め除去しておくのが好ましい。ただし適当な濾過層を分析要素の最上層に設けた場合にはそのまま分析要素に点着・供給してもよい。
【００２６】
抗原（リガンド）は抗原性があってその抗体を用意できるものであれば、低分子量物質から高分子量物質までの抗原について本発明の分析要素で分析できる。なお抗原性(antigenecity)があるとは、対応する抗体と反応し得るという意味であり抗原決定基(epitope)を有するものであればよい。それ自体では免疫原性(immunogenecity)がないものでも、ハプテンとして免疫すれば抗体が得られるものであれば、本発明における測定対象のリガンド（抗原）となりうる。
【００２７】
低分子量の抗原としては、例えば、ジゴキシン、テオフィリン、フェノバルビタール、フェニトイン、ペニシリン、アミカシン等の薬物の誘導体（例えば薬物と蛋白等の生体物質との結合物）、プロスタグランジン、テストステロン、プロゲステロン、チロキシン等のホルモン等を挙げることができる。
【００２８】
高分子量の抗原としては、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、アルブミン、フェリチン、ＨＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）、Ｃ−反応性蛋白（以下ＣＲＰと略す）等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウイルス、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原がある。
【００２９】
なお、測定対象であるリガンドが、これを酵素標識した場合に酵素活性への干渉（抑制）作用を示す程度の高分子量の抗原である場合には、後述するように、リガンドと抗原決定基を共通にする他の低分子量物質を酵素標識して、これを酵素標識抗原とすればよい。ここで使用する酵素標識抗原とは、被検物であるリガンド（抗原）を酵素標識したものだけでなく、リガンドと抗原決定基を共通にする物質を酵素標識したものを含む概念である。リガンド誘導体などの化学構造上の類縁体のみならず、抗体に対する免疫応答性においてリガンドと類似の挙動を示す化合物であれば、これを酵素標識して、酵素標識抗原として使用できる。
【００３０】
本明細書でいう高分子抗原とは、酵素標識抗体に結合して酵素活性への干渉（抑制）作用を示す程度の高分子量の抗原をいい、例えば分子量２万ダルトン以上、好ましくは約５万ダルトン以上の抗原をいう。これに対して本明細書でいう低分子抗原とは、酵素標識抗体に結合しても酵素活性にあまり影響を与えない程度の分子量の抗原をいい、例えば分子量２万ダルトン以下の抗原をいう。但しこれらの分子量の値はあくまで目安であって、リガンドが低分子抗原であるか高分子抗原であるかの判断は、高分子化合物と結合した結合物（高分子化抗原）との競合反応を利用するか否かでなされる。
【００３１】
高分子化抗原
高分子化抗原、即ちリガンド（抗原）と高分子化合物との結合物は、抗体と結合することにより、その抗体を標識する酵素の活性を抑制するものである。測定対象が低分子抗原である場合に使用されるものであり、測定対象が高分子抗原である場合には使用されない。高分子化合物の分子量は分子量５万ダルトン以上のもので、かつ水溶性のものが好ましい。このような高分子化合物として、ゼラチン、ヘモシアニンやフェリチン等の蛋白質、ポリエチレングリコールなどを挙げることができる。これらはリガンドと結合した状態で前述の条件を備えていれば十分であり、例えば牛血清アルブミンのような比較的低分子量のものであっても、それを多量体に自家重合させるなどして高分子化したものでもよい。
【００３２】
抗原（リガンド）と高分子化合物との結合方法は双方の官能基を考慮して決定することができる。官能基は、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基などを利用することができる。例えばアミノ基相互間を結合する方法は、イソシアネート法、グルタルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知られている。アミノ基とカルボキシル基とを結合する方法としては、カルボキシル基をサクシニルイミドエステル化する方法の他カルボジイミド法、ウッドワード試薬法等が知られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Nakane法）も適用できる。チオール基を利用する場合には、例えば一方の側のカルボキシル基をサクシニルイミドエステル化してこれにシスティンを反応させてチオール基を導入し、チオール基反応性二価架橋剤を用いて双方を結合することができる。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれらの例に限られるものではなく、この他例えば「Method in Immunology and Immunochemistry」Vol.1,(C.A.Williams,M.W.Chase, Academic Press,1967年) あるいは石川、河井、宮井  編「酵素免疫測定法」（医学書院、1978年発行）等の成書に記載されている方法の中から適宜選択して利用することができる。リガンドと高分子化合物との結合比は１：１に限らず、目的に応じて任意の比率とすることができるのはいうまでもない。結合反応後は、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー等により精製し、必要により凍結乾燥法等により乾燥する。
【００３３】
また、リガンド自体を重合させて高分子化抗原としてもよい。その場合の重合方法は前述の結合方法に準じて行なうことができ、例えばカルボジイミド、グルタルアルデヒド等の二価性架橋剤で高分子化すればよい。
【００３４】
高分子化合物には，リガンドの代わりに、リガンドに対する抗体と交差反応性を有するリガンド誘導体を結合させてもよい。ここでいうリガンド誘導体とは、単に化学構造上の類縁体のみならず、免疫反応性において、リガンドと類似の挙動を示すものを指す。例えば、リガンドであるテオフィリンに対する抗体がカフェインにも交差反応する場合には、カフェインの誘導体も高分子化抗原の材料として用いることができる。
【００３５】
なおリガンドまたはリガンド誘導体に高分子化合物と結合させるための適当な官能基がない場合には、これらにアミノ基、カルボキシル基或いはチオール基等を導入してもよい。その際にはスペーサーを介して導入し、高分子化合物と結合し易くしてもよい。例えばリガンドがテオフィリンである場合には、カルボキシル基を導入した８−プロピルカルボキシルテオフィリンを高分子化合物に結合することができる。
【００３６】
抗体
抗体は、被検抗原を含む検体と抗体と酵素標識抗原とを混合して競争反応させる場合に使用する。被検物である抗原に対する特異抗体を用いる。酵素標識抗原に抗原（リガンド）の誘導体を用いる場合には、リガンドとリガンド誘導体に共通する抗原決定基に反応するものを用いる。常法により得られるポリクローナル抗体でよいが、モノクローナル抗体を用いれば、より感度が向上する。またこの抗体はＦ(ab')2、Ｆab'、Ｆabなどのフラグメントでもよい。
【００３７】
酵素標識抗原
酵素標識抗原は、被検抗原を含む検体と抗体と酵素標識抗原とを混合して競争反応させる場合に使用する。また被検抗体を含む検体を酵素標識抗原と混合して結合反応させ、標識酵素の活性変化から被検抗体量を分析する場合にも使用する。
【００３８】
被検物が抗原（リガンド）である場合には、酵素標識抗原は、リガンド（或いはこのリガンドと抗原決定基を共通にするリガンド様物質）と酵素との結合物である。リガンドが薬物のような低分子量物質である場合には、酵素と直接結合させてもよい。リガンドがタンパク質などのようにこのまま酵素と結合させた場合に酵素活性に干渉する程度に大きな大分子量物質である場合には、タンパク質をフラグメント化して、これを酵素標識してもよい。このフラグメント化して低分子量としたタンパク質が、フラグメント化していないタンパク質（すなわちリガンド）と抗原決定基を共通にしていればよい。
【００３９】
リガンドと酵素との結合方法は、前記した抗原（リガンド）と高分子化合物との結合方法と同じように行うことができる。
【００４０】
酵素には，リガンドの代わりに、リガンドに対する抗体と交差反応性を有するリガンド誘導体を結合させてもよい。ここでいうリガンド誘導体とは、単に化学構造上の類縁体のみならず、免疫反応性において、リガンドと類似の挙動を示すものを指す。例えば、リガンドであるテオフィリンに対する抗体がカフェインにも交差反応する場合には、カフェインの誘導体も抗原の材料として用いることができる。
【００４１】
なおリガンドまたはリガンド誘導体に酵素と結合させるための適当な官能基がない場合には、これらにアミノ基、カルボキシル基或いはチオール基等を導入してもよい。その際にはスペーサーを介して導入し、酵素と結合し易くしてもよい。例えばリガンドがテオフィリンである場合には、カルボキシル基を導入した８−プロピルカルボキシルテオフィリンを酵素に結合することができる。
【００４２】
酵素標識抗体
酵素標識抗体は、被検抗体を含む検体と抗原と酵素標識抗体とを混合して競争反応させる場合に使用する。また被検抗原を含む検体を酵素標識抗体と混合して結合反応させ、標識酵素の活性変化から被検抗原量を分析する場合にも使用する。被検抗原が低分子量物質である場合には、被検抗原を含む検体と高分子化抗原と酵素標識抗体とを混合して競争反応させる場合に使用する。
【００４３】
被検抗体と抗原と酵素標識抗体との間の競争反応を行わせる反応系では、酵素標識される抗体は、被検抗体が認識するのと同じ抗原上の同じ抗原決定基を認識するものを使用する。
【００４４】
被検抗原と高分子化抗原と酵素標識抗体との間の競争反応を行わせる反応系では、酵素標識される抗体は、抗原と高分子化抗原に共通する抗原決定基に反応するものを用いる。
【００４５】
抗体と酵素との結合方法は、前記した抗原（リガンド）と高分子化合物との結合方法と同じように行うことができる。
【００４６】
酵素−非拡散性基質−低分子化酵素
抗原或いは抗体に標識として結合された酵素は、高分子からなる非拡散性基質を分解して、低分子化酵素によりさらに低分子の生成物（グルコース）を生じるような拡散性生成物を生成する。非拡散性基質は、水性検体液に対して非拡散性でそれ自体は基質層１４から試薬層１２に拡散・移行しない。低分子化酵素は、抗原（又は抗体）に標識として結合された酵素により非拡散性基質より生成した拡散性生成物を、さらに検出可能な低分子生成物にするものであり、本発明の分析要素の試薬層１２に含有される。
【００４７】
これらの組合わせは、酵素が非拡散性基質に作用して拡散性物質を生成し、さらにこの拡散性生成物が、後記低分子化酵素によりさらに低分子の生成物を生じて容易に検出できるような組合わせから選ぶことができる。
【００４８】
酵素
このような酵素としては重合体からなる非拡散性基質から拡散性オリゴマーを生成するような分解酵素があり、例えば、糖質加水分解酵素を挙げることができる。このような糖質加水分解酵素として、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ等のエンド活性型加水分解酵素がある。
【００４９】
これらの酵素はいずれの検体中に存在する妨害因子で影響されないものが好ましく、また検体中には競合する同種の酵素がないことが好ましい。ただし、標識酵素と同種の酵素が検体中に含まれている場合には、この酵素阻害剤を用いてもよい。この酵素阻害剤は、検体中の酵素を阻害する程度が標識酵素の活性を阻害する程度より大きいものであればよい。酵素阻害剤は検体中の酵素を完全に失活させるが、標識酵素を全く阻害しないものが最も好ましい。しかし実用上は単に測定時においてブランク値を上昇させなければよく、測定後には酵素阻害剤が失活するなどして検体中の酵素活性が回復しても構わない。なお酵素阻害剤は、酵素標識リガンド（又は抗体）の酵素を阻害しないものであればよく、遊離状態の酵素を阻害することは構わない。この酵素阻害剤は、公知の酵素阻害剤から上記のような特異性を持つものを選んで用いればよい。或いは検体中の問題となる酵素に対する抗体を作って、これを酵素阻害剤として用いてもよい。
【００５０】
非拡散性基質
前述のα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ等に対する基質の例として、カルボキシメチル化澱粉、澱粉、アミロース、アミロペクチン等がある。ただし本発明では、抗原（又は抗体）の標識酵素とのみ反応し、試薬層に本来含有される低分子化酵素とは反応しない基質を、非拡散性基質として使用する。これにより、試料液を点着後、試薬層から上流の基質層へ低分子化酵素が基質層へ拡散しても、この低分子化酵素により非拡散性基質が分解されることがなくなり、ノイズが減少することになる。また非拡散性基質の中に、重合度が低かったり、粒径が小さいため基質層に保持されず試薬層へ移行してしまうような不溶性高分子基質が混在したとしても、試薬層で低分子化酵素と反応することがない。
【００５１】
標識酵素としてα−アミラーゼ、低分子化酵素として後述するグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼを用いる場合には、非還元末端グルコースをカルボキシメチル基などの修飾基で修飾した澱粉などの不溶性多糖類を用いてもよい。これらの修飾基質はα−アミラーゼの基質とはなるが、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼの基質とはならない。非還元末端グルコースの修飾基は、標識酵素や低分子化酵素の活性に影響を与えない非反応性官能基が望ましい。また乾式分析要素内での反応性を上げるためには、親水性修飾基が望ましい。このような修飾基としてカルボキシメチル基やヒドロキシプロピル基、ヒドロキシエチル基などの親水性基がある。或いは末端グルコースをリン酸エステル化、硫酸エステル化、又は硝酸エステル化してもよい。
【００５２】
或いは、この非還元性末端グルコースが、隣接するグルコース単位とα-1,4グルコシド結合以外の結合様式（例えば、α-1,6結合、α-1,3結合）で結合していて、グルコース糖鎖の分枝点に位置しているものであれば、本発明の非拡散性基質として使用することができる。グルコアミラーゼなどのエクソ活性型糖質加水分解酵素は、一般に糖鎖の直鎖部分のα-1,4結合或いはα-1,6結合を非還元性末端からグルコース単位に分解する酵素であるので、分枝点（主にα-1,6結合、まれにα-1,3結合）のグルコシド結合を分解できない。従って、非還元性末端グルコースが糖鎖から分枝する位置にある場合にも、水解することができない。
【００５３】
α−アミラーゼはグルコース４単位以上の糖鎖のα-1,4グルコシド結合を水解するエンド活性型糖質加水分解酵素であり、末端グルコースの修飾の有無、分枝の有無を問わず、基質分子内で水解することができる。
【００５４】
例えば、糖鎖途中のグルコース単位にカルボキシメチル基が導入されたカルボキシメチル化澱粉を、非還元末端グルコース部位からカルボキシメチル修飾されたグルコース単位部位まで、エクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解することにより、非還元末端グルコースがカルボキシメチル基で修飾された基質とすることができる。ここで使用するエクソ活性型糖質加水分解酵素としては、グルコアミラーゼやα−グルコシダーゼがある。
【００５５】
このように末端グルコースを限定分解することによりカルボキシメチル化度を高めたカルボキシメチル化澱粉は、乾式分析要素内ではα−アミラーゼなどのエンド活性型酵素に対する反応性が増大する。後述の実施例でも述べるように、このことは本願発明者による新たな知見である。澱粉などの不溶性多糖類のカルボキシメチル化度（導入率）を上げることにより、なぜ酵素活性が上昇するのかその詳細は不明であるが、以下のように推測できる。
【００５６】
カルボキシメチル基は親水性基であり、この官能基の導入率が上昇することにより不溶性多糖類の水和性は高まり、水性溶媒中で膨潤しやすくなる。しかし、乾式分析要素での反応は微量の試料液（通常100μL以下）を点着して行うものであり、供給される水の量は極めて少ない。また供給された水（試料液）は、層内で展開すると共にすぐに隣接する層へも移行するので、酵素反応の場である層内は極めて水の量が限られた環境である。このような限界的な水の量しか持たない層内では、基質は十分に膨潤して酵素と十分に反応することができない。しかし、基質の膨潤度が僅かでも上昇すると、このような限界的環境では微視的な構造変化により酵素に対する反応部位を暴露しやすくなる。このことが、乾式分析要素内での酵素に対する反応性を増大させ、感度上昇につながるものと思われる。
【００５７】
これに対し、水溶液中で基質を酵素と反応させる場合には、基質はすでに十分膨潤して酵素に対する反応性を確保している。これは、十分な量の水が存在する環境下では、基質は反応に必要な程度にはすでに十分膨潤することが可能であり、基質のカルボキシメチル化度を上げて親水性を上げて多少膨潤度が上昇しても、酵素に対する反応性をさらに上げることはないからであると思われる。
【００５８】
低分子化酵素
この低分子化酵素は標識酵素と同じ種類の酵素であってもよい。この場合には標識酵素は分子内部から切断してオリゴマーを生成するエンド(endo)活性の酵素であり、低分子化酵素は分子の端から作用して単量体を生成するエクソ(exo) 活性を持つものとするのが好ましい。例えば、非拡散性基質が重合体（例えば澱粉）である場合に、標識酵素により生成される拡散性オリゴマー（例えばマルトース）を単量体（例えばグルコース）にまで分解できるものが用いられる。このような低分子化酵素の例として糖加水分解酵素、より具体的には、α−アミラ−ゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダ−ゼ等があげられる。
【００５９】
非拡散性基質と標識酵素として、カルボキシメチルセルロースとセルラーゼを用いた場合には、低分子化酵素としてＣ１エンザイムを用いることができる。また同様にガラクタンとガラクタナーゼを用いた場合にはβ−ガラクトシダーゼ、ＲＮＡとリボヌクレアーゼを用いた場合にはエクソリボヌクレアーゼをそれぞれ低分子化酵素として用いることができる。
これらの標識酵素、非拡散性基質、低分子化酵素の組合せは、公知文献（例えば、「酵素ハンドブック」（丸尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店1982年発行)、「生化学ハンドブック」（井村伸正、他編、丸善1984年発行）に記載された酵素、基質から選ぶことができる。
【００６０】
低分子生成物検出系
試薬層において低分子化酵素により生成された低分子生成物は、公知の検出系試薬により光学的に検出することができる。前記低分子化酵素により最終的に生成したグルコースを検出する方法としては、例えば、
(1)グルコースをグルコースオキシダーゼ存在下に酸化し生成した過酸化水素を検出する方法として、例えば、
(1-1) Ann.Clin.Biochem., 6, 24(1964) 、J.Clin.Pathol., 22, 246(1969)に記載のTrinder 試薬を用いる方法；
(1-2) 特開昭49-50991号(対応米国特許3,886,045)、 米国特許3,992,158、 特開昭55-164356号(対応米国特許4,292,272)等に記載のTrinder試薬を用いる方法；
(1-3) 特開昭53-26188号(対応米国特許4,089,747)、特開昭58-45557号等に記載のトリアリール置換イミダゾールロイコ色素を含む試薬を用いる方法；
(1-4) 特開昭59-193352号(対応欧州特許公開 EP 0122641A)、特開昭60-224677号(対応米国特許4,665,023）等に記載のジアリール−モノアラルキル置換イミダゾールロイコ色素を含む試薬を用いる方法;
(2)グルコースデヒドロゲナーゼとＮＡＤの存在下に生成するＮＡＤＨを検出する方法;
(3)ヘキソキナーゼ存在下に生成するグルコース-6-リン酸を検出する方法;
等、公知の方法を用いることができる。これらの検出方法の中で、グルコースオキシダーゼ存在下にグルコースを酸化し生成した過酸化水素をペルオキシダーゼとロイコ色素を用いて検出する方法が、感度の点で最も望ましい。
【００６１】
これらの検出試薬は分析要素の試薬層１２に低分子化酵素と一緒に含有させてもよいが、試薬層１２の下層に設けた別の層（例えば第２試薬層又は検出層等）に含有させてこの層で検出するようにしてもよい。なお、ロイコ色素を使用する場合には、水非混和性溶媒の溶液として、これを親水性バインダー中へ分散させるのが生成した色素の安定性の上で好ましい。
【００６２】
分析要素の層構成
本発明の乾式免疫分析要素は、公知の多種の乾式分析要素と同様の層構成とすることができる。要素は、基質層、試薬層の他、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層としてもよい。このような分析要素として、例えば特開昭49-53888号（対応米国特許 3,992,158）、特開昭51-40191号（対応米国特許 4,042,335）、 及び特開昭55-164356号（対応米国特許 4,292,272）、 特開昭61-4959(対応ＥＰＣ公開特許0166365A)の各明細書に開示されたものがある。
【００６３】
光透過性水不透過性支持体を用いる場合には、本発明の乾式免疫分析要素は、実用的に次のような構成を取り得る。ただし本発明の内容はこれに限定はされない。
(1) 支持体上に試薬層、その上に基質層を有するもの。
(2) 支持体上に試薬層、接着層、基質層をこの順に有するもの。
(3) 支持体上に検出層、試薬層、基質層をこの順に有するもの。
(4) 支持体上に試薬層、光反射層、基質層をこの順に有するもの。
(5) 支持体上に検出層、試薬層、光反射層、基質層をこの順に有するもの。
(6) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層、基質層をこの順に有するもの。
(7) 支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層、基質層をこの順に有するもの。
(8) 支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１試薬層、基質層をこの順に有するもの。
【００６４】
上記(1) ないし(6) において試薬層は異なる複数の層から成ってもよい。また基質層は後述するように免疫反応し得る成分を含む免疫反応層としてもよい。支持体と試薬層又は検出層との間には吸水層を設けてもよい。また各層の間には濾過層を設けてもよい。また基質層の上には展開層を設けてもよく、又は基質層に展開作用を持たせ展開層として機能させてもよい。
【００６５】
基質層
基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗原又は抗体を標識する酵素の基質である非拡散性基質を含有する。基質層の水浸透性を確保するためには、多孔性媒体からなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーからなる層とするのが好ましい。
【００６６】
多孔性層は繊維質であってもよいし、非繊維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織物布地（例えば平織布地）、編物布地（例えばトリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができる。非繊維質材料としては、特開昭49-53888等に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルター；特開昭49-53888、特開昭55-90859（対応米国特許 4,258,001）、特開昭58-70163（対応米国特許 4,486,537）等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状構造物層；等のいずれでもよい。特開昭61-4959(対応欧州公開 EP 0166365A）、特開昭62-116258 、特開昭62-138756(対応欧州公開 EP 0226465A）、特開昭62-138757(対応欧州公開 EP 0226465A）、特開昭62-138758(対応欧州公開 EP 0226465A）等に記載の部分接着された複数の多孔性層の積層物も好適である。
【００６７】
多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であってもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭57-66359号に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展開速度等を調節するため、特開昭60-222770（対応: EP 0162301A）、特開昭63-219397（対応ドイツ特許公開 DE 37 17 913A）、特開昭63-112999（対応: DE 37 17 913A）、特開昭62-182652（対応: DE 37 17 913A）に記載したような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有させてもよい。
【００６８】
例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等に基質を予め含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性層、例えば試薬層の上に、特開昭55-164356 号のような方法で接着させるのも有用な方法である。また別の方法として多孔質層を他の水浸透性層（例えば試薬層）に前記のような方法で接着させた後、基質を含む組成物を多孔質層に塗布してもよい。多孔質層への含浸又は塗布には公知の方法を利用できる。塗布には例えばディップ塗布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いる。
【００６９】
こうして作られる基質層の厚さは特に制限されないが、塗布層として設ける場合には、１μm〜50μm程度、好ましくは2μm〜30μmの範囲が適当である。ラミネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、厚さは数十μmから数百μmの範囲で大きく変化し得る。
【００７０】
親水性ポリマーバインダーからなる水浸透性層で基質層を構成する場合、使用できる親水性ポリマーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及びこれらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体、メタアクリルアミド共重合体、アクリルアミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体などである。
【００７１】
親水性ポリマーバインダーで構成される基質層は、特公昭53-21677号（対応米国特許 3,992,158)、特開昭55-164356号（対応米国特許 4,292,272)、特開昭54-101398号（対応米国特許 4,132,528)、特開昭61-292063号（Chemical Abstracts, 106; 210567y) 等の明細書に記載の方法に従って、基質その他の試薬組成物と親水性ポリマーを含む水溶液又は水分散液を支持体又は検出層等の他の層の上に塗布し乾燥することにより設けることができる。親水性ポリマーをバインダーとする基質層の乾燥時厚さは約2μm〜約50μm 、好ましくは約4μm〜約30μmの範囲、被覆量では約2g/m2〜約50g/m2、好ましくは約4g/m2〜約30g/m2の範囲である。
【００７２】
基質層には非拡散性基質の他に、塗布特性、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的として、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機物からなる各種添加剤を加えることができる。基質層に含有させることができる緩衝剤の例としては、日本化学会編「化学便覧  基礎編」（東京、丸善（株）、1966年発行）1312-1320頁、R.M.C.Dawson et al編、「Data for Biochemical Research」第２版(Oxford at the Clarendon Press,1969 年発行) 476-508頁、「Biochemistry」 5, 467-477頁(1966年)、「Analytical Biochemistry」 104, 300-310頁(1980年)に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤の具体例としてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）を含む緩衝剤；燐酸塩を含む緩衝剤；硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン(Bicine)を含む緩衝剤；HEPESを含む緩衝剤；MES（2-モルホリノエタンスルホン酸）を含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。
【００７３】
試薬層
試薬層１２は、低分子化酵素、及び必要に応じて、低分子化酵素により生じた低分子生成物を検出するための検出試薬組成物を含有する。試薬層１２は、水浸透性層で構成され、前記基質層の説明で述べた水浸透性層のうち、親水性ポリマーバインダーからなる連続層とするのが好ましい。用いる親水性ポリマーバインダーは基質層で生成される拡散性生成物や、試薬層内に含有する発色試薬などを考慮して決められる。
【００７４】
支持体
支持体１０としては光不透過性（不透明）、光半透過性（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いることができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいのものはポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。親水性層を強固に接着させるため通常、下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。
【００７５】
免疫反応層
図１の基質層１４には、拡散性基質のみならず、免疫反応に必要な分子種を含有させてもよい。例えば、
(1) 被検抗原と酵素標識抗体とを反応させて、被検抗原量を分析する場合には、酵素標識抗体を；
(2) 被検抗原と抗体と酵素標識抗原とを反応させて、被検抗原量を分析する場合には、抗体と酵素標識抗原とを；
(3) 被検抗原と高分子化抗原と酵素標識抗体とを反応させて、被検抗原量を分析する場合には、高分子化抗原と酵素標識抗体とを；
(4) 被検抗体と酵素標識抗原とを反応させて、被検抗体量を分析する場合には、酵素標識抗原を；
(5) 被検抗体と抗原と酵素標識抗体とを反応させて、被検抗体量を分析する場合には、抗原と酵素標識抗体とを；
基質層に含有させる。これにより、基質層は、その層内で免疫反応を併せて行なわせる免疫反応層として機能する。この場合には、要素に検体を点着するだけで、要素内で均一系の酵素免疫反応を進行させることができる。
【００７６】
或いは基質層にこれらいずれかを含有させて残りの方は基質層の上層に積層された水浸透性層に含有させてもよい。又は、基質層の上に１つ又は複数の層からなる水浸透性層を設け、これらに免疫反応に必要な分子種を含有させてもよい。これら免疫反応層の層構成は、その免疫反応の反応様式に応じて、任意に決めることができる。
【００７７】
例えば、上記(2)の場合では、基質層とは別の複数の層に抗体と酵素標識抗原を別々に含有させてもよい。例えば図２に示すように、基質層１４の上に抗体を含有する水浸透性層１６を設け、さらにその上に酵素標識抗原を含有する水浸透性層１８を設けて免疫分析要素を構成してもよい。この場合には、検体中の抗原（リガンド）は、層１８の酵素標識抗原と共に、層１６に拡散・浸透する。層１６では、抗原と酵素標識抗原とはそれぞれ抗体と結合し、さらに基質層１４に移行する。
【００７８】
これとは逆に、水浸透性層１６に酵素標識抗原を含有させ、その上の水浸透性層１８には抗体を含有させて、免疫分析要素を構成してもよい。この場合には、検体中の抗原（リガンド）は、層１８の抗体と結合し、層１６に移行する。層１６では、抗原に結合していなかった抗体が酵素標識抗原と結合し、さらに基質層１４に移行する。
【００７９】
また、基質層とは別の１つの層に抗体と酵素標識抗原を実質的な乾燥状態又は実質的に水の不存在状態で一緒に含有させてもよい。例えば、図３に示すように、基質層１４の上に抗体と酵素標識抗原を実質的な乾燥状態又は実質的に水の不存在状態で含有する水浸透性層２０を設けて免疫分析要素を構成してもよい。この場合には、水が溶媒である被検液が層２０に点着供給された時に、層２０の中で被検液に由来する水の中で、検体中のリガンド（抗原）と酵素標識抗原とは、それぞれ抗体と結合し、基質層１４に移行する。１つの層に抗体と酵素標識リガンドを実質的な乾燥状態又は実質的に水の不存在状態で一緒に含有させるには、抗体と酵素標識抗原の一方又は両者をアルコール（例、エタノール）等の非水溶媒に溶解又は分散させて水浸透性層に含浸させればよい。
【００８０】
なお、免疫反応層を設けない場合には、本発明の分析要素は、基質層１４に含有される非拡散性基質を分解する酵素の分析にも使用することができる。例えば、非拡散性基質としてカルボキシメチル化澱粉、澱粉、アミロース、アミロペクチンなどを使用する場合には、α−アミラーゼや、β−アミラーゼなどのエンド活性型糖質加水分解酵素の分析に使用することができる。
【００８１】
免疫分析要素の製造方法
本発明の乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公知の方法により調製することができる。本発明の分析要素は一辺約15mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭57-28331（対応米国特許 4,169,751)、実開昭56-142454（対応米国特許 4,387,990)、特開昭57-63452、実開昭58-32350、特表昭58-501144（対応国際公開: WO 83/00391)等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが、製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、または小片を開口のあるカードに貼付または収めて用いることなどもできる。
【００８２】
免疫分析要素による分析方法
本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の操作により液体試料中の被検物である抗原又は抗体の定量分析ができる。例えば約５μL〜約30μL、好ましくは８〜15μLの範囲の血漿、血清、尿などの水性液体試料液を基質層１４に点着する。点着した分析要素を約20℃〜約45℃の範囲の一定温度で、好ましくは約30℃〜約40℃の範囲内の一定温度で１〜10分間インキュベーションする。要素内の発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中のリガンドの量を求めることができる。点着する液体試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施できる。
【００８３】
測定操作は特開昭60-125543、同60-220862、同61-294367、同58-161867(対応米国特許 4,424,191）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては、目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行なってもよい。
【００８４】
分析要素が免疫反応層を有さない場合、すなわち、分析要素内に被検物である抗原又は抗体との免疫反応系に必要な分子種を含有させていない場合には、分析要素外の適当な反応溶液中で必要な免疫反応を行わせた後、その反応液を要素に点着すれば標識酵素活性の変化として被検物を分析することができる。例えば、抗原を分析する場合には、要素に点着する前に、水性試料液を抗体及び酵素標識リガンドを含む溶液と混和して、結合反応を十分行なわせてから、基質層に点着すればよい。
【００８５】
【実施例１】
エンド型選択反応性基質の調製
カルボキシメチル化澱粉（エキスプロタブ、Edward Mendel Company Inc.製）１０ｇを１Ｌの0.1 Mホウ酸緩衝液(pH10)に分散し１時間撹拌した。これを、塩酸とリン酸でpH5.5に調整した後、グルコアミラーゼ（東洋紡製）1000Uを添加し、３７℃で１６時間反応させた。反応後、約１万Ｇで高速遠心機にかけ、遠心上層液の電気電導度が20μS/cm以下になるまで遠心精製を繰り返して可溶性成分を除去した。分散物をよく撹拌しながらエタノール10 Lを加え、沈澱してきた白色物質を減圧濾過で集めた。これを３０℃で１０時間乾燥し、5.2g(収率52%)のエンド型酵素反応特異的なカルボキシメチル化澱粉を得た。
【００８６】
【実施例２】
分析要素の作製
ゼラチン下塗層が設けられている厚さ180μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレート（PET）シート（支持体）上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
0003850143.tif 000002
【００８７】
この試薬層の表面に下記の被覆量になるように下記試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その上に50デニール相当のPET 紡績糸36ゲージ編みした厚さ約250μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層を設けた。
0003850143.tif 000003
【００８８】
次に、実施例１で得られたエンド型酵素反応特異的なカルボキシメチル化澱粉を用いて、下記の被覆量になるように基質を塗布、乾燥して基質層を設けてＣＲＰ分析用多層分析要素を調製した。
カルボキシメチル化澱粉                         3.5 g/m2
マンニトール                                   3.0 g/m2
ＭＥＳ（2-モルホリノエタンスルホン酸）         2.0 g/m2
【００８９】
次いでこの分析要素を14mm×13mm四方のチップに裁断し、特開昭57-63452に記載のスライドの枠に収めて、本実施例のＣＲＰ分析用多層乾式スライド１とした。
【００９０】
比較例として、エンド型酵素反応特異的なカルボキシメチル化澱粉の代わりに、未処理のカルボキシメチル化澱粉（エキスプロタブ）を基質として用いた他は、実施例スライド１と全く同様な構成の比較用スライド２を作製した。
【００９１】
【実施例３】
50mMグリセロ燐酸緩衝溶液（pH7）の10μLを実施例２の乾式スライド１及び、比較例の乾式スライド２に点着した。この後、各スライドを37℃に保って、PET支持体側から中心波長650nmの反射光学濃度を経時的に測定した。点着後の反射光学濃度の時間変化を図４に示す。
【００９２】
未処理のカルボキシメチル化澱粉を非拡散性基質として使用した比較例のスライド２では、緩衝溶液点着後から経時的に反射光学濃度の増加が見られる（図中、-○-）。このことは、未処理カルボキシメチル化澱粉が、試薬層から移行したエキソ反応型酵素であるグルコアミラーゼ（低分子化酵素）により分解されて、グルコースを生成していることを示している。
【００９３】
一方、予めグルコアミラーゼ処理によりエンド型酵素反応特異的にしたカルボキシメチル化澱粉を使用した実施例２のスライド１では、反射光学濃度は一定値で増加することはなかった。（図４、-●-）。
【００９４】
【実施例４】
アミラーゼ標識抗ＣＲＰ−ＩｇＧ(0.1mg/mL）を含み、既知量のＣＲＰを含有する50mMグリセロ燐酸緩衝溶液（pH7）10μLを、実施例２のスライド１と、比較用スライド２に点着した。37℃に保って、中心波長650nmの可視光でＰＥＴ支持体側から各スライド１，２の反射光学濃度を測定した。点着から４分後および６分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ6-4）を図５に示す。図５の検量線より、エンド型酵素反応特異的にしたカルボキシメチル化澱粉を使用した本発明の乾式免疫分析要素（図５，-●-）は、ＣＲＰの定量が精度良く行えることが明らかである。また比較例（図５、-○-）に比べ、ＣＲＰ濃度変化に対するΔＯＤ6-4の変化が大きく、感度が上昇していた。
【００９５】
【実施例５】
実施例２と全く同様の手順、構成で、多層分析要素を作成し、その基質層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらにアミラーゼ標識ＣＲＰ−ＩｇＧを３mg/m2の被覆量となるようにしてエタノール溶液を塗布し含浸させ乾燥させてＣＲＰ分析用多層免疫スライド３（実施例５）を作成した。同様に、実施例２で作成した比較用スライド２の多層分析要素のトリコット編物布地層に、アミラーゼ標識ＣＲＰ−ＩｇＧを３mg/m2の被覆量となるようにしてエタノール溶液を塗布し含浸させ乾燥させて比較用のＣＲＰ分析用多層免疫スライド４を作成した。
【００９６】
【実施例６】
このスライド３及びスライド４に、各種濃度のＣＲＰを含有する50mMグリセロ燐酸緩衝溶液(pH7)を10μLを点着し、37℃に保って、支持体側から650nmの反射光学濃度を測定し、点着から４分後および６分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ6-4）を求めた。図６の検量線に示すように、エンド型反応特異的カルボキシメチル化澱粉を使用した本発明の乾式免疫分析要素（図６、-●-）は、比較例（-○-）に比べ、より高感度にＣＲＰを定量分析できることが示された。
【００９７】
【実施例７】
実施例５のスライド３と比較用スライド４の再現性（ＣＶ）を比較検討した。スライド３及びスライド４に、ＣＲＰ含有ヒト標準血清４検体（Ｌ-1,Ｌ-2,Ｍ、Ｈ）を10μLを点着し、37℃に保って、支持体側から650nmの反射光学濃度を測定し、点着から４分後および６分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ6-4）を求めた。実施例５のスライド３の場合の検量線と、比較用スライド４の場合の検量線を別途求めておき、得られた各検体のΔＯＤ6-4からＣＲＰ濃度（測定値）を換算した。この測定を各検体について１０回行い、その平均値、標準偏差及びＣＶ値を求めた。結果を下記の表１，２に示す。
【００９８】
【表１】
0003850143.tif 000004
【００９９】
【表２】
0003850143.tif 000005
【０１００】
表１，２に示すように、従来の比較用スライド４では、測定値（濃度）のバラツキが大きいのに対して、本発明のエンド反応特異的基質を使用した実施例５のスライド３はバラツキが小さく、同時再現性に優れていた。特に低濃度域（検体Ｌ−１，Ｌ−２）と高濃度域（検体Ｈ）において、実施例スライド３のＣＶ値は比較用スライド４のそれに比べ１／３程度まで減少し、本発明による免疫分析要素は再現性に優れ精度が高いことが示された。
【０１０１】
【実施例８】
実施例５のスライド３と比較用スライド４の保存安定性を比較検討した。乾式分析要素は通常４℃程度で１ヶ月間程度安定であるが、ここでは加速試験として２５℃でスライドを保存し、スライド作製後１日、３日及び７日目の測定値をスライド作製直後（０日）の測定値と比較した。作製後各日におけるスライド３（実施例５）及びスライド４（比較例）にＣＲＰ含有標準試料ＣＰ１(1.4mg/dL)、 ＣＰ２(4.2mg/dL)、ＣＰ３(10.0mg/dL)をそれぞれ10μL点着し、37℃に保って、支持体側から650nmの反射光学濃度を測定し、点着から４分後および６分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ6-4）を求めた。結果を下記の表３，４に示す。
【０１０２】
【表３】
0003850143.tif 000006
【０１０３】
【表４】
0003850143.tif 000007
【０１０４】
従来の未処理のカルボキシメチル化澱粉を基質としたスライド４（比較例）では、２５℃保存により日が経つにつれΔＯＤ6-4の値は減少しており、３日目には５〜10％の減少が見られ、７日目には15〜20％程度の大きな減少が見られた。これに対し、本発明によるエンド型反応特異的基質としたカルボキシメチル化澱粉を使用したスライド３（実施例５）では、ΔＯＤ6-4値の変動は３日目では２〜４％の減少とわずかであり、保存７日目でも３〜５％程度の減少しか認められなかった。このように本発明による免疫分析要素は保存安定性に優れていることが示された。
【０１０５】
【実施例９】
エンド型選択反応性基質の調製（その２）
カルボキシメチル化澱粉（エキスプロタブ、Edward Mendel Company Inc.製）453ｇに8960ｇの超純水を加え、約４時間攪拌して膨潤させた。これに1139ｇの0.5 N NaOH を加えて約１時間攪拌することによりアルカリ処理した。この後、酢酸32ｇを添加してpH７に戻した。これをＭＥＳ(2-モノホリノエタンスルホン酸)緩衝液でpH5.7に調整した後、80ｇのグルコアミラーゼ酵素液（東洋紡製、320 k Unit/Ｌ, 5mM MES, pH6.0）を添加し、37℃で12〜20時間反応させた。反応後、純水を加えて総量を140Ｌにしてから、この懸濁液をセラミック膜フィルター（日本ガイシ製、CEFILT-MF(登録商標)、モノリスタイプ、孔径2μm、膜面積 0.24m2）で濾過した。透過した水の電気伝導度が20μS/cm以下になるまで、このセラミック膜フィルターに純水を循環させて、可溶性成分を除去した。フィルターからＣＭ化澱粉残査を集め、純水を加えて100Ｌとした。その内の約3.6 L を7500rpm、10分間の遠心にかけ、残査を集めた。これにイソプロピルアルコール約18Ｌを加えて、沈殿してきた白色物質を減圧濾過で集めた。この遠心からイソプロピルアルコール沈殿までの操作を約２６回行い、これを集めて35℃で24時間乾燥した。以上の操作により、220ｇのエンド型酵素反応特異的なグルコアミラーゼ処理ＣＭ化澱粉（以下、ＧＡ処理ＣＭＳともいう）を得た。
【０１０６】
グルコアミラーゼ処理をしなかった他は全て上記と同じに処理したＣＭ化澱粉を比較例（グルコアミラーゼ未処理ＣＭ化澱粉：以下、未処理ＣＭＳともいう）とした。
【０１０７】
【実施例１０】
実施例９で得られたＧＡ処理ＣＭＳと未処理ＣＭＳのカルボキシメチル化度と、水に分散したときの膨潤度を調べた。カルボキシメチル化度は、全グルコース単位中、カルボキシメチル基で修飾されたグルコース単位の割合を13Ｃ−ＮＭＲで調べた。膨潤度は、各ＣＭＳの0.7％水溶液10mLを調製し、試験管に入れて、25℃、30分間静置した後に、沈降したＣＭＳの体積（mL）を膨潤度と定義した。
【０１０８】
下記の表５に示すように、グルコアミラーゼ処理したＣＭ化澱粉ではカルボキシメチル化度が増加しており、全構成グルコース単位中の２８％がカルボキシメチル基を有することが分かった。このことはグルコアミラーゼ処理により非還元性末端からカルボキシメチル化部位の直前までグルコシド結合が水解されたため、ＣＭ化澱粉中の非ＣＭ化グルコース単位の量が減少し、結果としてＣＭ化グルコース単位の割合が増加したことを示している。また親水性基であるカルボキシメチル基の導入率が高くなったことにより、水和されやすくなり膨潤度が高まったものと考えられる。
【０１０９】
【表５】
0003850143.tif 000008
【０１１０】
【実施例１１】
ＧＡ処理ＣＭＳのグルコアミラーゼとの反応性
実施例９で得たグルコアミラーゼ処理ＣＭ化澱粉と、比較例のグルコアミラーゼ未処理ＣＭ化澱粉を、それぞれ５mM ＭＥＳ緩衝液(pH 6.0、0.5％ブロックエース（雪印乳業社製）、68μM CaCl2含有）に分散し、0.2％(W/V)分散液とした。この0.2％ＣＭＳ分散液に70μLのグルコアミラーゼ溶液（東洋紡製、320 k Unit/Ｌ, 5mM MES, pH6.0）を加えて37℃、60分間、120rpmで振盪させながら反応させた。反応後、10％リン酸70μLを添加し、氷冷して反応を停止させた。反応液を12,000rpmで４分遠心して未反応のＣＭＳを沈降させた。生成グルコースを含んでいる遠心上清100μLを、下記組成の反応液Ａの３mLに添加し、37℃、30分間、120rpmで振盪して発色反応を行わせ、波長727nmの吸光度を測定した。検量線は、既知濃度のグルコース溶液100μLを反応液３mLに加え、同様の発色反応を行うことにより作成した。
【０１１１】
0003850143.tif 000009
【０１１２】
測定は、ＧＡ処理ＣＭＳについて５回、未処理ＣＭＳについて２回行った。表６に示すように、グルコアミラーゼ処理をしていないＣＭ化澱粉では、１グラム当たり約33μgのグルコースを生成したのに対し、予めグルコアミラーゼ処理したＣＭ化澱粉では、平均0.1μg以下のグルコースしか生成しなかった。このことは、本発明のＧＡ処理ＣＭＳの非還元性末端グルコースの殆どが修飾されているか糖鎖分枝点にあり、エキソ反応型酵素であるグルコアミラーゼの基質とはならないことを示している。
【０１１３】
【表６】
0003850143.tif 000010
【０１１４】
【実施例１２】
ＧＡ処理ＣＭＳのα−アミラーゼとの反応性（湿式法）
実施例９で得たグルコアミラーゼ処理ＣＭ化澱粉と、比較例のグルコアミラーゼ未処理ＣＭ化澱粉を、それぞれ５mM ＭＥＳ緩衝液(pH 6.0、0.5％ブロックエース（雪印乳業社製）、68μM CaCl2含有）に分散し、0.2％(W/V)分散液とした。この0.2％ＣＭＳ分散液７mLに、各種濃度のα−アミラーゼ溶液70μLを加えて37℃、60分間、120rpmで振盪させながら反応させた。反応後、10％リン酸70μLを添加し、氷冷して反応を停止させた。反応液を12,000rpmで４分遠心して未反応のＣＭＳを沈降させた。生成オリゴ糖を含んでいる遠心上清100μLを、下記組成の反応液Ｂの３mLに添加し、37℃、30分間、120rpmで振盪して発色反応を行わせ、波長727nmの吸光度を測定した。既知濃度のオリゴ糖（マルトテトラオース）溶液100μLを反応液Ｂの３mLに加え、同様の発色反応を行うことにより作成した検量線を用いて、生成オリゴ糖に換算してグラフを作成した（図７）。
【０１１５】
0003850143.tif 000011
【０１１６】
図７に示すように、グルコアミラーゼ処理したＣＭ化澱粉では、エンド活性型酵素であるα−アミラーゼに対する反応性（図中、検量線の傾き）は、未処理のＣＭ化澱粉に比べ約半分に減少していた。しかし、未処理ＣＭＳではバックグランド値が約1.3ppmであったのに対し、ＧＡ処理ＣＭＳではバックグランド値をほぼゼロにすることができた。
【０１１７】
α−アミラーゼ量がゼロであるのに未処理ＣＭＳからの生成オリゴ糖がゼロとはならないのは以下の理由によるものと思われる。図７縦軸はオリゴ糖濃度で表現しているが、この実施例の反応系では最終的に生成するグルコース量を定量している。α−アミラーゼと反応した後の各ＣＭＳは遠心により除去しているが、微量のＣＭＳ粒子は上清に残る。生成オリゴ糖として上清を採取したときに、この微量ＣＭＳが混入すると、ＣＭＳ粒子もその後発色反応液Ｂ中に含まれるグルコアミラーゼの攻撃を受けることになる。未処理ＣＭＳでは、末端グルコースが除かれていないので、グルコアミラーゼによって末端グルコースが水解され検出されることになる。この量は使用したα−アミラーゼ量に依存せずほぼ一定なので、図７でバックグランド値として検量線全体を上に押し上げることになる。
【０１１８】
これに対し、予めグルコアミラーゼ処理したＣＭ化澱粉では、エクソ活性型酵素であるグルコアミラーゼと反応する非修飾グルコース末端が存在しない。このため、たとえＣＭＳ粒子が発色反応系に混入してもバックグランド値を押し上げることがない。
【０１１９】
ＣＭ化澱粉のα−アミラーゼに対する反応性は、グルコアミラーゼ処理により低下するのは以下の理由によるものと思われる。α−アミラーゼはグルコース鎖長４分子以上の多糖類に対して反応性を示し、重合度の高い（鎖長の長い）ものほど反応性が高い。糖鎖中のグルコースがアトランダムにカルボキシメチル化されると、α−アミラーゼが高い反応性を示すグルコース分子連続部分が減少することになる。この結果、本来、澱粉はカルボキシメチル化することによりα−アミラーゼに対する反応性が低下する。さらにグルコアミラーゼ処理すると、ＣＭ化澱粉のそれぞれの枝鎖は非還元末端から分解されて除かれる。枝鎖の途中にＣＭ化部位があれば、その部位まで非還元末端からグルコース単位で水解・除去される。このため、グルコアミラーゼ処理ＣＭ化澱粉は一種の限界デキストリンとなり、α−アミラーゼが高い反応性を示すグルコース分子連続部分は見かけ上さらに少なくなる。図７はこのことを示している。
【０１２０】
このように、α−アミラーゼに対する反応性が低下しているグルコアミラーゼ処理ＣＭ化澱粉であるが、以下の実施例１３，１４に示すように乾式分析要素内の環境では、α−アミラーゼに対する反応性が増大している。
【０１２１】
【実施例１３】
ＧＡ処理ＣＭＳのα−アミラーゼとの反応性（乾式法）
実施例９で得たグルコアミラーゼ処理ＣＭ化澱粉を用いて、実施例５と全く同様の手順、構成で、多層分析要素を作製した。
【０１２２】
すなわち、実施例２で用いたカルボキシメチル化澱粉の代わりに実施例９で得たグルコアミラーゼ処理ＣＭ化澱粉を基質層に使用した以外は実施例２と全く同様な構成のスライドを作製し、その後実施例５と同様に、その基質層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらにアミラーゼ標識ＣＲＰ−ＩｇＧを３mg/m2の被覆量となるようにしてエタノール溶液を塗布し含浸させ乾燥させてＣＲＰ分析用多層免疫スライド５（実施例１３）を作製した。
【０１２３】
比較例として、グルコアミラーゼ処理カルボキシメチル化澱粉の代わりに、未処理のカルボキシメチル化澱粉を基質として用いた他は、実施例１３と全く同様な構成の比較用スライド６を作製した。
【０１２４】
【実施例１４】
このスライド５及びスライド６に、0, 1.4, 4.2, 10 mg/dLの各濃度のＣＲＰを含有すると50 mMグリセロ燐酸緩衝溶液(pH7)を10μLを点着し、37℃に保って、支持体側から625 nmの反射光学濃度を経時的に測定した。ＣＲＰ溶液点着後の反射光学密度の時間変化を図８に示す。
【０１２５】
0 mg/dLのＣＲＰ溶液を点着した場合、標識抗体中のα−アミラーゼは抗原（ＣＲＰ）との結合による立体障害を受けないから、非拡散性基質であるＣＭ化澱粉に対する水解活性は最大となる。このようにα−アミラーゼが最大活性を示すＣＲＰ濃度 0 mg/dLのときの活性は、ＧＡ処理ＣＭＳを使用したスライド５（実施例１４、図８右側）では、比較例（未処理ＣＭＳを使用したスライド６、第８図左側）に比べ、大きく上昇していた。反射光学密度の計時変化の傾きを指標にすると、グルコアミラーゼ処理したＣＭ化澱粉では、未処理のものに比べ約２倍程度までα−アミラーゼに対する反応性が増大していた。
【０１２６】
抗原であるＣＲＰ濃度を増加させるに従い、α−アミラーゼに対する立体障害が増大すると、α−アミラーゼに対する反応性の低下はＧＡ処理ＣＭＳを使用したスライド５（実施例１４、図８右側）の方が著しかった。このことは、乾式分析要素内でのα−アミラーゼのＣＭ化澱粉に対する反応性は、予めグルコアミラーゼ処理してエンド活性型酵素反応特異的にすることにより、ＣＲＰ濃度変化に対する反射光学密度の変化が大きく、感度が鋭敏になることを示している。
【０１２７】
最後に本発明に好ましい態様をまとめると、以下の通りである。
(1) 抗原と酵素標識抗体との反応、もしくは抗原と抗体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗原と、抗原と高分子化合物との結合物と、酵素標識抗体との間の反応のいずれかの反応により生じた標識酵素活性の変化を測定することにより抗原の量を分析する免疫分析要素において、
前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層を備え、前記非拡散性基質が前記標識酵素とのみ反応し前記低分子化酵素とは反応しない基質であることを特徴とする免疫分析要素。
(2)  前記非拡散性基質が高分子多糖類であり、前記標識酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であり、前記変換酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素であることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(3)  前記標識酵素はエンド活性型糖質加水分解酵素であり、前記低分子化酵素はエクソ活性型糖質加水分解酵素であって、前記非拡散性基質は非還元末端グルコースが修飾されたエンド型選択反応性基質であることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(4)  前記エンド型選択反応性基質は、非還元末端グルコースがカルボキシメチル基で修飾されていることを特徴とする(3)記載の免疫分析要素。
(5)  前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が非還元末端グルコース部位からカルボキシメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシメチル化澱粉であることを特徴とする(3)記載の免疫分析要素。
(6)  前記試薬層は親水性ポリマーをバインダとして含有する層で形成されていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(7)  前記基質層は多孔性媒体からなる多孔性層であることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(8)  前記酵素標識抗体が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(9)  前記抗体が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(10)  前記酵素標識抗原が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(11)  前記抗体と、前記酵素標識抗原とが、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする請求項(1)記載の免疫分析要素。
(12)  抗原と高分子化合物との前記結合物と、前記酵素標識抗体とが、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする請求項(1)記載の免疫分析要素。
(13)  前記低分子生成物と反応して可視吸収を有する色素を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透性層に含有していることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(14)  前記試薬組成物が、酸化により発色するロイコ色素を含む(13)記載の免疫分析要素。
(15)  前記試薬組成物が、ロイコ色素の水不溶性溶媒からなる溶液の水性液中への分散物を含む(14)記載の免疫分析要素。
(16)  前記試薬組成物が、ペルオキシダーゼ及びロイコ色素を含む(15)記載の免疫分析要素。
(17)  抗体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗体と抗原と酵素標識抗体との反応により生じた標識酵素活性の変化を測定することにより抗体の量を分析する免疫分析要素において、
前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層を備え、前記非拡散性基質が前記標識酵素とのみ反応し前記低分子化酵素とは反応しない基質であることを特徴とする免疫分析要素。
(18)  前記非拡散性基質が高分子多糖類であり、前記標識酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であり、前記変換酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素であることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(19)  前記標識酵素はエンド活性型糖質加水分解酵素であり、前記低分子化酵素はエクソ活性型糖質加水分解酵素であって、前記非拡散性基質は非還元末端グルコースが修飾されたエンド型選択反応性基質であることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(20)  前記エンド型選択反応性基質は、非還元末端グルコースがカルボキシメチル基で修飾されていることを特徴とする(19)記載の免疫分析要素。
(21)  前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が非還元末端グルコース部位からカルボキシメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシメチル化澱粉であることを特徴とする(19)記載の免疫分析要素。
(22)  前記試薬層は親水性ポリマーをバインダとして含有する層で形成されていることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(23)  前記基質層は多孔性媒体からなる多孔性層であることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(24)  前記酵素標識抗体が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(25)  前記抗体が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(26)  前記酵素標識抗原が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(27)  前記抗体と、前記酵素標識抗原とが、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする請求項(17)記載の免疫分析要素。
(28)  抗原と高分子化合物との前記結合物と、前記酵素標識抗体とが、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする請求項(17)記載の免疫分析要素。
(29)  前記低分子生成物と反応して可視吸収を有する色素を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透性層に含有していることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(30)  前記試薬組成物が、酸化により発色するロイコ色素を含む(29)記載の免疫分析要素。
(31)  前記試薬組成物が、ロイコ色素の水不溶性溶媒からなる溶液の水性液中への分散物を含む(30)記載の免疫分析要素。
(32)  前記試薬組成物が、ペルオキシダーゼ及びロイコ色素を含む(29)記載の免疫分析要素。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の免疫分析要素の一実施態様例の構成図である。
【図２】本発明の免疫分析要素の他の実施態様例の構成図である。
【図３】本発明の免疫分析要素のさらに他の実施態様例の構成図である。
【図４】実施例４の結果を示す図であり、実施例スライド１及び比較例スライド２の免疫分析要素に標識酵素非含有緩衝液を点着した場合の反射光学濃度の経時変化を示す図である。
【図５】実施例４の結果を示す図であり、実施例スライド１及び比較例スライド２の免疫分析要素の検量線を示す図である。
【図６】実施例６の結果を示す図であり、実施例スライド３及び比較例スライド４のＣＲＰ分析用免疫分析要素の検量線を示す図である。
【図７】実施例１２の結果を示す図であり、実施例９で得たグルコアミラーゼ処理ＣＭ化澱粉と、比較例のグルコアミラーゼ未処理ＣＭ化澱粉の、分散液中でのα−アミラーゼに対する反応性を調べたものである。
【図８】実施例１４の結果を示す図であり、実施例１３で作成した実施例スライド５と比較例スライド６に各種濃度のＣＲＰ溶液を点着した後の、反射光学濃度の経時変化を示す図である。
【符号の説明】
１０  透光性支持体
１２  試薬層
１４  基質層
１６  抗体（又は酵素標識抗原）を含有する水浸透性層
１８  酵素標識抗原（又は抗体）を含有する水浸透性層
２０  抗体と酵素標識抗原とを含有する水浸透性層
【図１】
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【図２】
0003850143.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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