(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌組織の間充織細胞により発現され、癌細胞及び／又は癌組織の間充織細胞におけるテネイシン産生を誘導することができるテネイシン産生誘導因子を製造する方法であって、
マウス胎児由来線維芽細胞の培養上清から精製したテネイシンをコーティングした培養皿でテネイシンノックアウトマウス胎児由来線維芽細胞を培養した培養上清を原料とし、以下の工程：
工程１：50k 及び 6k の間の限外濾過；
工程２：20 mM Tris-HCl, pH 8.0に対する透析、及び陰イオン交換クロマトグラフィーでの精製；
工程３：コンカナバリンA アガロースに対する吸着とメチル−α−D−マンノピラノシドによる溶出；
工程４：20 mM 酢酸アンモニウム、pH 6.0に対する透析、及び陽イオン交換クロマトグラフィーでの精製；及び
工程５：逆相クロマトグラフィーによる精製
を含み、かつ
前記のテネイシン産生誘導因子が以下の物理化学的性状：
(1) SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) による推定分子量が12,000 〜16,000である；
(2) ゲル濾過クロマトグラフィー法による推定分子量が4,500である；
(3) 100 ℃での煮沸及び凍結乾燥により失活する；
(4) 56℃, 30分間の加熱、凍結、又は解凍により活性を失わない；
(5) SDS-PAGEにおけるドデシル硫酸ナトリウム若しくは2-メルカプトエタノールでの処理、又は逆相クロマトグラフィーにおける酢酸若しくはトリフルオロ酢酸での処理によっても活性を失わない；及び
(6) pIが7である；
(7) コンカナバリンA (ConA)に結合し、結合した因子はメチルマンノピラノシドによって溶出できる；
(8) インゲンマメレクチン(PHA-E4)、ロータスマメレクチン(Lotus) 、及びレンズマメレクチン(LCA) には結合しない；及び
(9) ヘパリンには結合しない
により特定される因子である方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌細胞の増殖と転移に関与するテネイシンの産生を誘導する生理活性物質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
上皮細胞の癌化には、上皮細胞の周囲に存在する周囲間充織（間質と呼ばれる場合もある）、とりわけ細胞外マトリックスと呼ばれる巨大分子群が主導的役割を演じると考えられている。細胞外マトリックスは、コラーゲンをはじめとして、基底膜を構成するラミニンやIV型コラーゲン、及び分子量190 及び250 kDa の糖蛋白であるテネイシン (Chiquet-Ehrismann, R., et al., Cell, 47, pp.131-139, 1986)などの種々の生理活性物質からなる集合体である。
【０００３】
テネイシンは、周囲間充織中では６量体として存在しており、器官発生過程、組織再生、創傷治癒、癌の増殖や浸潤過程において一過性に発現することが知られている (Erickson, H.P., Annu. Rev. Cell Biol., 5, pp.71-92, 1989; Sakakura, T., Tumor Matrix Biology, pp.101-129, CRC Press, 1995)。テネイシンの生理活性については、細胞接着および脱落、細胞増殖刺激および抑制、並びに血球凝集活性など、形態形成過程や組織修復過程における細胞挙動に関与することが明らかにされている。また、テネイシンは一般に線維芽細胞で産生され、上皮系由来の癌細胞もテネイシンを産生していることが明らかにされており、癌細胞におけるテネイシン産生が癌細胞の周囲間充織に由来する液性因子によって誘導されることが示唆されている (Hiraiwa, N., et al., J. Cell. Science, 104, pp.289-296, 1993) 。さらに、テネイシンの誘導活性を有する物質として、トランスフォーミング成長因子(TGFβ) 及び上皮細胞成長因子(EGF) が知られている (Chiquet-Ehrismann, R., et al., Cancer Res., 49, pp.4322-4325, 1989; Sakai, T., et al., J. Cell. Physiol., 165, pp.18-29, 1995)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、癌細胞の増殖と転移におけるテネイシンの役割について研究を行った結果、癌細胞のテネイシン産生が周囲間充織細胞由来の誘導因子により調節されていることをテネイシン欠損マウスを用いて証明した (日下部ら、乳癌基礎研究, ５巻，41-45 頁, 1996年）。また、この誘導因子がテネイシン依存的に発現すること、すなわち、テネイシン自体が癌細胞の周囲間充織細胞に作用してこの誘導因子の産生を促進していることを証明した。このように、テネイシンと上記誘導物質との間の相互作用は、一種の増幅機構として作用している。しかしながら、上記誘導物質は極めて微量しか産生されないために、未だ物質として特定されておらず、その物理化学的性質や生理作用はほとんど不明である。
【０００５】
従って、本発明の課題は、物質として利用可能及び同定可能な程度にまで上記の誘導因子を分離・精製し、その物理化学的性状及び生理作用を明らかにすることにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
ヒト扁平上皮癌由来 A431 細胞はイン・ビトロでテネイシンをほとんど発現しないが、ヌードマウスに移植するとテネイシンを発現し、イン・ビトロでもマウス胎児由来線維芽細胞の培養上清を添加するとテネイシンを発現する（Hiraiwa et al., J. Cell Science, 104, pp.289-296, 1993) 。この結果は、マウス胎児由来線維芽細胞の培養上清中に、テネイシン産生を誘導する因子が存在していることを示唆している。本発明者はさらに研究を行い、テネイシンをノックアウトしたマウス由来の細胞の培養上清にはこのような活性は認められないこと、並びに精製したテネイシンをコーティングした培養皿で培養したノックアウト由来の細胞の培養上清には、テネイシン産生を誘導する活性が認められることを見い出した。本発明者らはさらにこの因子を分離・精製すべく鋭意研究を行い、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、癌組織の間充織細胞により発現され、癌細胞及び／又は癌組織の間充織細胞におけるテネイシン産生を誘導することができ、該因子の発現がテネイシンによって誘導されるテネイシン誘導因子であって、以下の物理化学的性状：
(1) SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) による推定分子量が約 12,000 〜16,000である；
(2) ゲル濾過クロマトグラフィー法による推定分子量が約 4,500程度である；
(3) 100 ℃での煮沸及び凍結乾燥により実質的に失活する；
(4) 56℃, 30分間の加熱、凍結、又は解凍により実質的に活性を失わない；
(5) SDS-PAGEにおけるドデシル硫酸ナトリウム若しくは2-メルカプトエタノールでの処理、又は逆相クロマトグラフィーにおける酢酸若しくはトリフルオロ酢酸での処理によっても実質的に活性を失わない；及び
(6) pIが約 7である；
(7) コンカナバリンA (ConA)に実質的に結合し、結合した因子はメチルマンノピラノシドによって溶出できる；
(8) インゲンマメレクチン(PHA-E4)、ロータスマメレクチン(Lotus) 、及びレンズマメレクチン(LCA) には実質的に結合しない；及び
(9) ヘパリンには実質的に結合しない；
により特定される因子を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の因子を分離・精製するためには、例えば、ネズミ胎児 (14日) 皮膚細胞を 10% FCSを含む DMEM 中で生育させた後、例えば、以下の工程：
工程１：50k 及び 6k の間の限外濾過；
工程２：20 mM Tris-HCl, pH 8.0に対する透析、及び、例えば Q-Sepharose Fast Flowなどの陰イオン交換クロマトグラフィーでの精製；
工程３：コンカナバリンA アガロースに対する吸着とメチル -α-D- マンノピラノシドによる溶出；
工程４：20 mM 酢酸アンモニウム、pH 6.0に対する透析、及び、例えば mono S HR 5/5などの陽イオン交換クロマトグラフィーでの精製；及び
工程５：逆相クロマトグラフィーによる精製
を含む方法により行うことができる。もっとも、本発明の因子の分離・精製方法は上記の方法に限定されず、上記の方法に適宜の修飾や改変を加えてもよい。
【０００９】
本発明の因子の分子量は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 (SDS-PAGE) によって約 12,000 〜16,000、ゲル濾過クロマトグラフィー法により約 4,500程度と推定される。ゲル濾過クロマトグラフィー法では、本発明の因子が充填剤アクリルアミドゲルと何らかの相互作用を有するために、推定分子量が実際の数値よりも小さくなっているものと考えられる。ゲル濾過クロマトグラフィー法による場合には、チトクローム c (分子量 12,000)とシチジン（分子量 250) の間に分画される。なお、本発明の因子は、SDS-PAGEにおけるドデシル硫酸ナトリウム若しくは2-メルカプトエタノールでの処理、又は逆相クロマトグラフィーにおける酢酸若しくはトリフルオロ酢酸での処理によっても実質的に活性を失わない。
【００１０】
本発明の因子に存在する糖鎖については、固定化レクチンとしてコンカナバリン Aを結合させたアガロースに吸着されるが、メチルマンノピラノシドによって溶出されるので、マンノース又はグルコースを含有する糖鎖の存在が明らかである。また、この糖鎖は、他のレクチンであるインゲンマメレクチン(PHA-E4)、ロータスマメレクチン(Lotus) 、及びレンズマメレクチン(LCA) には実質的に結合しないという特徴がある。
【００１１】
本発明の因子は、癌組織の間充織細胞により発現される因子であり、癌細胞に対して、又は癌細胞及び癌組織の間充織細胞に対して作用して、癌細胞及び／又は癌組織の間充織細胞におけるテネイシン産生を誘導する作用を有している。本発明の因子はテネイシン依存的に発現するという特徴があり、テネイシン自体が本発明の因子を誘導する作用を有している。従って、テネイシン自体及び本発明の因子の発現は、これらの生理活性物質の相互作用により増幅されていると考えられる。
【００１２】
トランスフォーミング成長因子(TGFβ) 及び上皮細胞成長因子(EGF) についてそれらのテネイシン誘導活性が確認できるような条件下において測定を行った場合、本発明の因子は、インシュリン様成長因子(IGF-II)とほぼ同程度のテネイシン誘導活性を示す。また、ヒト扁平上皮癌由来A431細胞を TGFα又はEGF で刺激すると、分子量180 kDa 付近に強いチロシンリン酸化物が認められるが、インターロイキン 1(IL-1)やTNF αなどの他のサイトカインと同様に、本発明の因子には上記のような顕著なチロシンリン酸化作用は認められない。
【００１３】
本発明の因子は、イン・ビトロでテネイシンを産生しないヒト扁平上皮癌由来A431細胞、ヒト乳癌由来 MCF-7細胞、及びマウス肺転移性乳癌由来 GLMT1細胞に対してテネイシン産生を誘導する作用が確認されており、種々の癌細胞に対して同様の作用を有することが期待される。また、本発明の因子には、ヒト扁平上皮癌由来A431細胞の増殖を促進する作用が認められており、他の癌細胞に対しても同様に増殖促進作用を有するものと考えられる。
【００１４】
従って、本発明の因子は、癌組織の間充織細胞により発現される生理活性物質であって、以下の生化学的性状：
(10)本発明の因子の発現は、テネイシン依存的である；
(11)癌細胞に対して、又は癌細胞及び癌組織の間充織細胞に対して作用して、癌細胞及び／又は癌組織の間充織細胞におけるテネイシン産生を誘導する作用を有する；
(12)インシュリン様成長因子(IGF-II)とほぼ同程度のテネイシン誘導活性を示す：及び
(13)チロシンリン酸化作用を実質的に有しない；
により特徴付けられる因子である。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
(1) 本発明の因子の分離及び精製
(a) 材料
妊娠マウス１〜２匹の子宮から 14 日目の胎児 (20匹以内) を取り出し、生理食塩水中で臓器を摘出した。摘出後の胎児を PBS (-)で洗浄し、テフロン板上で剃刀を用いて細かく砕き、50 ml の遠心管に移した。 PBS (-)で２回洗浄した後、この試料に0.05% トリプシン、0.53 mM EDTAを含む PBS (-)を 20 ml加え、ときどき攪拌しながら37℃で処理した。10% FCS を含む DMEM を 20 ml加え、1,000 rpm で５分間遠心した後、上清を捨てて、10% FCS を含む DMEM を 20 ml加えた。この混合物をよく攪拌し、大きな塊が沈殿したところで、上清を 10 cm径の培養皿 10 枚に播いた。37℃、5% CO2で１〜２日培養し、充分増殖したところで上清を集め、本発明の因子を分離・精製するための材料とした。なお、細胞は３〜５倍に拡大して継代し、継代後に３〜４日で上清を集めて同様に材料として用いた。
【００１６】
なお、本発明の因子の分布については、以下のように要約できる。
マウス胎児 (14日) 皮膚細胞（概ね全線維芽細胞）調製培地           +++
（本発明の因子の活性は数継代を経て低下する）
成獣マウス皮膚細胞調製培地                                         +
創傷成獣マウス皮膚細胞調製培地                                    ++
テネイシンノックアウトマウス胎児皮膚細胞調製培地                   -
テネイシンノックアウトマウス胎児皮膚細胞調製培地 (TNコート）      ++
【００１７】
(b) 限外濾過
培養上清を限外濾過モジュール（旭化成、分画分子量 50000）で処理し、本発明の因子の精製材料として低分子量側を用いた。低分子量側は濃縮されないので、量が多い場合には分画分子量 6,000の限外濾過モジュールで３リットル程度まで濃縮した。この精製材料を透析チューブ（スペクトラポア No.1 、分画分子量 6,000-8,000）に入れ、20 mM Tris-HCl (pH 8.0) に対して２昼夜透析した。
【００１８】
(c) 陰イオン交換クロマトグラフィー
透析の終了した試料を 0.22 μm のフィルターで濾過した後、20 mM Tris-HCl (pH 8.0) で平衡化した Q-Sepharose Fast Flow（ファルマシアバイオテク社、XK16/20 カラム）に5 ml/minの流速でアプライした。その後、20 mM Tris-HCl (pH 8.0) で UV モニターの値がベースラインに下がるまで充分カラムを洗浄し、さらに流速を 1 ml/min として 0.3 M NaCl の直線グラジェント溶出を行ない、試験管１本あたり 10 mlずつ分画した。
【００１９】
(d) 本発明の因子のバイオアッセイ
ヒト扁平上皮癌由来A431細胞を 48 穴プレートに 1×104/wellになるように播き、10% FCS を含む37℃の DMEM 中で5% CO2の存在下に 24 時間培養した。培地を新しい培地と交換した後、クロマトグラフィーの各画分を１μl ずつ添加し、16時間同様に培養した。この培養上清中のテネイシンを酵素免疫測定法又はウェスタンブロッティング法により検出した。酵素免疫測定法の概略は以下のとおりである。
【００２０】
ラットモノクローナル抗−ヒトテネイシン抗体 (クローン 7-13:この抗体はテネイシン分子の FNIII 3〜5 ドメインを認識するため、大小二つのテネイシン分子を認識できる。P. Shrestha, et al., International Journal of Oncology, 8, pp.741-755, 1996)を 10 μg/mlとなるように0.1 M 炭酸緩衝液 (pH 9.6) で希釈した。この希釈液を 50 μl/wellとなるように 96 穴マイクロタイタープレートに分注し、室温下で一時間にわたり湿潤箱中に放置した後、希釈液を捨て、0.05% Tween 20を含む PBS(-) でウェルを３回洗浄した。次いで、3% BSA、0.1% NaN3 を含む PBS (-)をウェルがいっぱいになるように分注した。１時間以上静置した後、ウェルの中の液を捨て、テネイシンを測定する試料を 50 μl/wellとなるよう加えた。湿潤箱中で室温下に１時間静置した後、反応液を捨て、0.05% Tween 20を含む PBS (-)で３回洗浄した。
【００２１】
ウェルに3% BSA、0.1% NaN3 を含む PBS (-)で 5μg/mlに希釈したビオチン化 36-13-6抗体 (この抗体はテネイシン分子のADドメインを認識するため大きいテネイシン分子しか認識できないものである。P. Shrestha, et al., International Journal of Oncology, 8, pp.741-755, 1996)を 50 μl/wellとなるよう加え、湿潤箱中で室温下に１時間静置した後、反応液を捨てて、0.05% Tween 20を含む PBS (-)でウェルを３回洗浄した。3% BSAを含む PBS (-)で 1000 倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ結合アビジンを 50 μl/wellとなるよう加え、湿潤箱中で室温下に１時間静置した後、反応液を捨て、0.05% Tween 20を含む PBS (-)でウェルを３回洗浄した。0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.0) 中、10 mg/30 ml のオルトフェニレンジアミン二塩酸塩に 10 μl/30 ml の 30% H2O2 を添加し、100 μl/wellに分注した。暗所で静置し、発色が充分進んだ時点で2 N 硫酸を 50 μl/wellとなるよう加え、波長 492 nm の吸光度を測定した。
【００２２】
(e) 逆相クロマトグラフィー
テネイシン誘導活性の確認された Q-Sepharose画分に終濃度 0.1% となるように TFAを加えた。この画分を0.1% TFAを含む H2Oで平衡化した ProRPCHR5/10 （ファルマシアバイオテク社）に 1 ml/min の流速でアプライし、280 nmの吸光度が充分にベースラインまで下がった時点から、0.1% TFAを含む 60%アセトニトリルで直線グラジェント溶出し、1 mlずつ分画して上記の方法によりテネイシン誘導活性を測定した。
【００２３】
(f) SDS-PAGEによる分子量の測定
内径 5 mm ×長さ 12 cmのガラス管を用いて10 cm の高さになるように 15%アクリルアミドのゲルを作製し、3%アクリルアミドの濃縮ゲルを重層した。サンプル処理液と試料を混合して室温で 30 分放置した後、反応液 50 〜100 μl をゲルにアプライして、ゲル管１本あたり 5 mA の電流で泳動した。BPB がゲルの末端から 1 cm のところまで来た時点で泳動を終了し、ガラス管からゲルを取り出して5 mm間隔となるようにゲルをスライスして 100μl の PBS (-)の入った試験管に移した。振盪しながら一夜抽出を行い、各抽出液のテネイシン誘導活性を上記の方法で測定した。この方法による本発明の因子の推定分子量は約 12,000 〜16,000であった。テネイシンノックアウト GRS/Aマウス (日下部ら、乳癌基礎研究, 41-45 頁, 1996年）由来の試料について同様の操作を行ったところ、 SDS-PAGE 後にテネイシン誘導活性は検出できなかった。この結果は、テネイシンを欠く細胞では本発明の因子が発現しておらず、本発明の因子がテネイシン依存的に発現することを示している。
【００２４】
(g) ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量の測定
Superdex 75HR10/30（ファルマシアバイオテク社）を用いて本発明の因子の分子量を測定した。標準タンパク質として、ウシ血清アルブミン（分子量 67,000)、大豆トリプシンインヒビター（分子量 20,100)、チトクロームc(分子量 12,400)、インシュリン（分子量 5,800) を用い、これらの分子量の対数値と溶出位置から最小二乗法により回帰直線を算出して標準直線とした。テネイシン誘導活性は分子量 4,500付近に溶出された。なお、上記ゲル濾過クロマトグラフィー法による分子量測定では、本発明の因子がゲルと何らかの相互作用を有していたために、見かけの分子量が小さくなった可能性がある。
【００２５】
(h) 固定化レクチンによる糖鎖存在の推測
レクチンとして、コンカナバリンA 、インゲンマメレクチン(PHA-E4)、ロータスマメレクチン(Lotus) 、及びレンズマメレクチン(LCA) との結合を検討したところ、本発明の因子はコンカナバリンA にのみ結合し、結合した活性画分はメチルマンノビラノシドによって溶出することができた。
【００２６】
(i) サイトカイン様作用
本発明の精製因子、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、 TNFα、 TGFα、 TGFβ、PDGF、 EGF、又は IGF-II で刺激したヒト扁平上皮癌由来A431細胞の粗抽出液を抗ホスホチロシン抗体（PY20, Tranduction Laboratories）でウェスタンブロットしたところ、 TGFαと EGFでは分子量 180k 付近に強いチロシンリン酸化産物が認められたが、本発明の因子、及び他のサイトカインでは無処置のものに比べて顕著なチロシンリン酸化は認められなかった。また、すでにテネイシン誘導活性が報告されている TGFβと EGFのテネイシン誘導活性を測定したところ、若干の活性が認められ、同様の条件下において、IGF-IIは本発明の因子に匹敵するテネイシン誘導活性を示した。その他のサイトカインについては、テネイシン誘導活性は認められなかった。
【００２７】
(j) その他の生物学的作用
イン・ビトロでテネイシンを産生しないヒト乳癌MCF-7 、マウス肺転移性乳癌 GLMT1に対して上記(d) と同様にして本発明の因子を添加したところ、テネイシンの産生が認められた。また、本発明の因子には、ヒト扁平上皮癌由来A431細胞の増殖を有意に促進する作用が認められた。さらに、GRマウスの皮下に移植すると 1〜1.5 カ月後に肺に転移する性質を有する肺転移性乳癌 GLMT1細胞（イン・ビトロではテネイシンを産生しない）をテネイシンノックアウトGRマウスに移植しても腫瘍の形成はおきず、肺への転移もほとんど起こらないが、テネイシンノックアウトGRマウスに肺転移性乳癌 GLMT1細胞を移植後、本発明の因子（Q 画分, 0.1 ml) を投与したところ、通常の GR マウスと同様に腫瘍は成長し、肺にも転移するようになった（図１）。また、培養系を用いた実験においても本発明の因子がテネイシンの誘導のみならず、A431細胞の増殖を刺激することも判明した（図２）。
【００２８】
一方、テネイシンをノックアウトしたマウス由来の細胞の培養上清には、このような活性が認められなかった。また、マウス胎児由来線維芽細胞の培養上清から精製したテネイシンをコーティングした培養皿でノックアウト由来の細胞を培養すると、その培養上清にはテネイシンの産生を誘導する因子の活性が認められるようになった。このテネイシンの効果はヒトメラノーマ細胞 A375 を GIT培地（大日本製薬）の培養した上清から精製したテネイシンについても同様に認められた。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の因子は、癌細胞の増殖と転移に関与するテネイシンの発現を誘導する生理作用を有している。従って、本発明により提供される上記の因子は、癌細胞の増殖や転移のメカニズムを解明するために有用であり、該因子の発現量を測定することによって癌細胞の悪性度や転移の可能性などを正確に診断できる可能性がある。また、制癌剤としての有用性が期待される該因子の阻害剤の研究にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  テネイシンノックアウトGR雄性マウスに肺転移性乳癌 GLMT1細胞を移植後、本発明の因子を投与した結果(MTIF)を非投与群(MC)と比較して示した図である。
【図２】  培養系を用いた実験において本発明の因子がA431細胞の増殖を刺激する結果を示した図である。図中、TIF は本発明の因子を示し、TIF0.1, TIF0.01,及びTIF0.001とあるのは、それぞれ本発明の因子のQ 分画を10倍, 100 倍, 及び 1,000倍希釈で用いた場合の結果を示す。
【図１】
0003850492.tif 000002
【図２】
0003850492.tif 000003