(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の、体位転換に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈するモデル動物としての使用方法。
【請求項２】
μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の、音刺激に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈するモデル動物としての使用方法。
【請求項３】
非ヒト動物が、標識物質遺伝子の発現能を有することを特徴とする請求項１又は２記載の使用方法。
【請求項４】
非ヒト動物が、相同組み換え体のスクリーニングの際に用いた薬剤耐性遺伝子が除去されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の使用方法。
【請求項５】
非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の使用方法。
【請求項６】
齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項５記載の使用方法。
【請求項７】
μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に被検物質を投与して、該非ヒト動物における強直間代痙攣又はてんかん症状の程度を分析・評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物及び野生型非ヒト動物に被検物質を投与して、該非ヒト動物と野生型非ヒト動物とにおける強直間代痙攣又はてんかん症状の程度を分析・比較評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物から得られる脳神経細胞と被検物質とをインビトロで接触させ、該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度を分析・評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物及び野生型非ヒト動物から得られる脳神経細胞と被検物質とをインビトロで接触させ、該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度を分析・比較評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
野生型の非ヒト動物が、μ３Ｂ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物と同腹の野生型の非ヒト動物であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか記載の強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、これを用いた強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞が正常に機能するためには、個々の構成タンパク質がその最終目的地である細胞内小器官に正しく輸送される必要があり、そのことは神経細胞においても例外ではなく、したがって、細胞内タンパク輸送の研究はさまざまな脳神経機能の発現メカニズムの解明や、神経疾患の病態を理解する上で重要と考えられている。細胞内で新たに合成された分泌タンパク質及び膜タンパク質は、小胞体、ゴルジ体を経てトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）へと運ばれ、ＴＧＮに到達したタンパク質は、そこで形質膜、エンドソーム、リソソームなどの最終目的地に振り分けられる。ＴＧＮから形質膜への輸送は恒常的かつ大量であり特にシグナルを必要としないデフォールトパスウェイであるのに対して、エンドソームやリソソームへの輸送は、この大きな流れにうち勝って選択的に行われるためのシグナルを必要とする。
【０００３】
各細胞内小器官を結ぶタンパク輸送は輸送小胞を介して行われると考えられており、形質膜及びＴＧＮの細胞質側にはクラスリン及びアダプタータンパク質（ＡＰ）複合体で覆われた領域があり、そこから輸送小胞の１種であるクラスリン被覆小胞が出芽する。上記ＡＰ複合体は４つのサブユニットから構成され、その１つであるμ鎖が膜タンパク質の細胞質側に存在するチロシン輸送シグナルに結合することにより、シグナルをもつ膜タンパク質の選択的輸送を行っている。近年同定されたＡＰ-３複合体には、全身性に発現するサブユニットβ３Ａ及びμ３Ａと、脳神経細胞特異的に発現するサブユニットβ３Ｂ及びμ３Ｂが存在し（J.Cell Biol. 145:923-926,1999）、これらβ３Ｂ及びμ３Ｂを含むＡＰ-３Ｂはインビトロの実験から何らかの重要な高次神経機能に関わっている可能性が示唆された（Cell 93:423-432,1998）が、その詳細は明らかでなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、μ３Ｂノックアウトマウス等のμ３Ｂ遺伝子が欠損した、体位転換や音刺激に反応して重積性の強直間代痙攣やてんかん発作症状を呈する非ヒト動物や、これを用いた強直間代痙攣抑制剤や抗てんかんのスクリーニング方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＡＰ-３Ｂの個体レベルでの機能を解析するために、そのサブユニットであるμ３Ｂノックアウトマウスを作製し、その性状について種々調べたところ、そのメカニズムは明らかではないが、かかるμ３Ｂノックアウトマウスが体位転換や音刺激に反応して重積性の強直間代痙攣やてんかん発作症状を呈することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の、体位転換に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈するモデル動物としての使用方法（請求項１）や、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の、音刺激に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈するモデル動物としての使用方法（請求項２）や、非ヒト動物が、標識物質遺伝子の発現能を有することを特徴とする請求項１又は２記載の使用方法（請求項３）や、非ヒト動物が、相同組み換え体のスクリーニングの際に用いた薬剤耐性遺伝子が除去されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の使用方法（請求項４）や、非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の使用方法（請求項５）や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項５記載の使用方法（請求項６）に関する。
【０００７】
また本発明は、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に被検物質を投与して、該非ヒト動物における強直間代痙攣又はてんかん症状の程度を分析・評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項７）や、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物及び野生型非ヒト動物に被検物質を投与して、該非ヒト動物と野生型非ヒト動物とにおける強直間代痙攣又はてんかん症状の程度を分析・比較評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項８）や、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物から得られる脳神経細胞と被検物質とをインビトロで接触させ、該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度を分析・評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項９）や、μ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物及び野生型非ヒト動物から得られる脳神経細胞と被検物質とをインビトロで接触させ、該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度を分析・比較評価することを特徴とする強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項１０）や、野生型の非ヒト動物が、μ３Ｂ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物と同腹の野生型の非ヒト動物であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか記載の強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法（請求項１１）に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明におけるμ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物としては、μ３Ｂをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化され、μ３Ｂを発現する機能を失った非ヒト動物であれば特に制限されるものではないが、蛍光標識物質遺伝子の発現能を有する非ヒト動物や、相同組み換え体のスクリーニングの際に用いた薬剤耐性遺伝子が除去されている非ヒト動物が好ましい。また本発明における遺伝子欠損非ヒト動物としては、μ３Ｂ遺伝子等の神経系特異的ＡＰ複合体サブユニットを構成する遺伝子などの非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等により人為的に不活性化され、体位転換や音刺激に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈する非ヒト動物であれば特に制限されるものではない。
【０００９】
また、本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記μ３Ｂ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物が好ましい。そして、μ３Ｂ遺伝子機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるものが、μ３Ｂ欠損型と同腹の野生型を得ることができ、これらを用いて正確な比較実験をすることができる点で好ましい。これら非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。以下、非ヒト動物がマウスの場合、すなわちμ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物がμ３Ｂノックアウトマウスの場合を例にとってその作製法を説明する。
【００１０】
μ３Ｂノックアウトマウスの作製法としては、μ３Ｂを発現する機能を失ったノックアウトマウスを作製することができる方法であればどのような作製法でもよい。例えば、ラットμ３ＢのｃＤＮＡをプローブとして、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、μ３ＢのゲノムＤＮＡの遺伝子を単離し、エキソン部分とその周囲のイントロンを、選択マーカー遺伝子に置換してターゲッティングベクターを作製し、作製されたターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを起こしたＥＳ細胞クローンを選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。このＥＳ細胞クローンを用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、野生型マウスと交配させることによって得られるヘテロ接合体マウス（Ｆ１：雑種第一代）同士を交配させることによって、メンデルの法則に従い産生するμ３Ｂノックアウトマウス及び同腹の野生型マウスを作製することができる。
【００１１】
上記ターゲットベクターにおける選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性（ＮＥＯR）遺伝子、ハイグロマイシンＢ遺伝子等各種薬剤耐性遺伝子、マウス体内におけるμ３Ｂ遺伝子の発現及びその場所がわかるＧＦＰ (Green Fluorescence Protein）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等の蛍光あるいは発色による標識物質遺伝子、所定の位置ではないランダムな組み換え体を排除するための単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子を例示することができる。また、その両側にlox P配列が付加されたＮＥＯR遺伝子等を用いて作製したノックアウトマウスを、卵母細胞特異的にcre遺伝子を発現するトランスジェニックマウスと交配することにより、ＮＥＯR遺伝子がゲノム上より除去されたノックアウトマウスを作製することができる。さらに、これら作製したノックアウトマウスと、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子等が導入されたトランスジェニックマウスと交配することにより、μ３Ｂ遺伝子欠損不死化細胞株が得られるノックアウトマウスを作製することもできる。
【００１２】
本発明の強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤のスクリーニング方法としては、上記のμ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損したμ３Ｂノックアウトマウス等の非ヒト動物や、体位転換や音刺激に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈する非ヒト動物に被検物質を投与して、該非ヒト動物又はにおける強直間代痙攣又はてんかん症状の程度を分析・評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではないが、分析・評価に際しては対照としての野生型非ヒト動物の分析結果と比較評価することが好ましい。上記投与方法としては、経口投与、静脈注射等を具体的に例示することができる。また、強直間代痙攣又はてんかん症状の程度の分析は、被検非ヒト動物や対照としての被検野生型非ヒト動物の痙攣や発作の状況を目視により観察することにより、あるいはこれら非ヒト動物の脳波を測定することにより行うことができる。
【００１３】
また、本発明の強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤の他のスクリーニング方法としては、上記のμ３Ｂ遺伝子機能が染色体上で欠損したμ３Ｂノックアウトマウス等の非ヒト動物や、体位転換や音刺激に反応して強直間代痙攣又はてんかん症状を呈する非ヒト動物の海馬、大脳皮質、小脳、嗅球等から常法により単離して得られる脳神経細胞と被検物質とをインビトロで接触させ、該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度を分析・評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではないが、脳神経細胞として不死化した樹立細胞を用いることが好ましい。また、分析・評価に際しては対照としての野生型非ヒト動物の脳神経細胞における分析結果と比較評価することが好ましい。上記インビトロでの接触は、脳神経細胞の液相培養条件下等で通常行うことができる。また、上記該脳神経細胞における分泌系及び／又はエンドサイトーシスにおける選択的タンパク輸送能の程度の分析は、該脳神経細胞における神経伝達物質の放出量を電気生理学的に計測することにより行うことができる。
【００１４】
上記スクリーニング方法により得られる強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤は、強直間代痙攣やてんかん発症のメカニズムを解明する上で重要であるばかりでなく、強直間代痙攣やてんかんを発症した患者の治療薬、症状改善薬剤又は予防薬としての使用の可能性が十分期待できる。
【００１５】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
［マウスμ３Ｂ遺伝子の調製］
ラットμ３Ｂ遺伝子ｃＤＮＡ（米スタンフォード大R. Scheller博士より供与）をプローブとして、マウス脳ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene社）およびマウスゲノムＤＮＡライブラリー（Stratagene社）から単離したマウスμ３ＢｃＤＮＡ及びマウスμ３ＢゲノムＤＮＡを以下のμ３Ｂノックアウトマウスの作製に用いた。配列表の配列番号１にマウスｃＤＮＡの塩基配列を、また配列番号２にそのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
［ターゲッティングベクターの構築］
マウスμ３Ｂ遺伝子のエキソン１の翻訳開始コドンから上流約５００塩基のところにあるEco RI部位までを、配列番号３で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号４で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。次に、ＧＦＰ遺伝子（Clontech社）を配列番号５で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号６で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。上記配列番号４で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーの３′側と、配列番号５で示される塩基配列よりなるセンスプライマーの５′側とは相補的配列となっていることから、上記２つの増幅産物（ＤＮＡ断片）を鋳型とし、上記配列番号３で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号６で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲにより増幅することにより、μ３ＢとＧＦＰとの読み枠があった状態の融合ＤＮＡ断片を得た。
【００１７】
人為的にSal I部位を除去したpBluescript II SK（Stratagene社）のEco RI-Hind III部位に上記融合ＤＮＡ断片を挿入した。得られたコンストラクトのEco RI部位にエキソン１の５′上流の約３ｋｂのEco RI断片を挿入した。次いで、このコンストラクトにおけるＧＦＰ配列の３′側に位置するSph IとHind III部位に、pl2-neo（米国立衛生局 H. Gu博士より供与）からSph IとHind IIIで切り出した、lox P-ＮＥＯR-lox P遺伝子断片を挿入した。こうして得られたコンストラクトをlox P-ＮＥＯR-lox P遺伝子断片下流のSal IおよびCla I部位で切断し、その部位に以下のようにして調製した２つのＤＮＡ断片、すなわち、エキソン１の下流の約１．５ｋｂのEco RI断片及びＨＳＶ-ｔｋ遺伝子を同時に挿入することによりターゲッティングベクターを構築した。上記エキソン１の下流の約１．５ｋｂのEco RI断片は、pBluescript II SKのEco RIにサブクローンし、Eco RIの両側のSal IとSpe Iで切ることによりSal I−Spe I断片として調製した。また、ＨＳＶ-ｔｋ遺伝子は、plC19R-MC1-TK（ユタ大学K. Thomas博士より供与）からEco RIとHind IIIでＨＳＶ-ｔｋ遺伝子を切り出し、pBluescript II SKのEco RIとHind III部位に挿入後、さらに同じEco RI部位にpMC1 neo (Stratagen社）のMC1プロモーター領域を含むEco RI断片を挿入して得られたインサート全体をSpe I-Cla I断片として調製した。
【００１８】
［相同組換え体のスクリーニング］
このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法によってＥＳ細胞株Ｅ１４に導入し、ネオマイシン耐性ＥＳクローンをＧ４１８及びＧＡＮＣ(ガンシクロビア)によって選択し、２つのプローブ（Ｌ、Ｓ）を用いてサザンブロット法によりスクリーニングし、相同組換えによりμ３Ｂ遺伝子の片方に変異が導入されたＥＳ細胞クローンを得た。上記プローブＬとしては、図１に示すμ３ＢゲノムＤＮＡの約５００ｂｐのEcoR I-Ssp I断片を用いた。またプローブＳとしては、μ３ＢゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号７で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号８で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーにより得られるＰＣＲ増幅産物を用いた。サザンブロットの結果を図２に示す。
【００１９】
［ノックアウトマウスの作製］
得られたＥＳ細胞クローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に顕微注入し、処置後の胚盤胞を偽妊娠状態にしたメスＢＤＦ１マウスの子宮に移植することにより、キメラマウスを得た。このキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配して、μ３Ｂ遺伝子変異をヘテロにもつマウスを得、それらを交配することによりμ３Ｂ遺伝子変異をホモにもつμ３Ｂ欠損マウスを得た。このμ３Ｂノックアウトマウスにμ３Ｂの発現がないことは、配列番号９で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号１０で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより確認した。また、ＲＴ−ＰＣＲのコントロールのアクチン（actin）プライマーとして、配列番号１１で示される塩基配列よりなるセンスプライマー及び配列番号１２で示される塩基配列よりなるアンチセンスプライマーを用いた。結果を図３に示す。得られたμ３Ｂノックアウトマウスと、卵母細胞特異的にcre遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（大阪大学宮崎純一博士から供与）と交配することにより、ＮＥＯR遺伝子がゲノム上より除去されたノックアウトマウスを樹立した。このノックアウトマウスの脳におけるＧＦＰの発現を解析し、海馬、大脳皮質、小脳、嗅球等における特定の細胞群に発現を確認した。
【００２０】
【発明の効果】
本発明のμ３Ｂノックアウトマウス等のμ３Ｂ遺伝子欠損非ヒト動物は、体位転換や音刺激に反応して重積性の強直間代痙攣又はてんかん症状を呈することから、本発明のμ３Ｂ遺伝子欠損非ヒト動物を用いると、強直間代痙攣やてんかん発症のメカニズムを解明することが期待できる。また、本発明のμ３Ｂ遺伝子欠損非ヒト動物を用いるスクリーニング方法により得られる強直間代痙攣抑制剤又は抗てんかん剤は、強直間代痙攣やてんかんを発症した患者の治療薬、症状改善薬剤又は予防薬としての使用の可能性が十分期待できる。
【００２１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のμ３Ｂノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図を示す図である。
【図２】相同組換え体のスクリーニングにおけるサザンブロットの結果を示す図である。
【図３】本発明のμ３Ｂノックアウトマウスがμ３Ｂを発現しないことを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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