(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド及び／又はタンパク質を含有する試料を順相液体クロマトグラフィーにより分離するにあたり、該試料を分離カラムに注入した後、有機溶媒と水及び／又はアルコールとの混合液に酸及び／又はアミンを添加されてなる移動相を展開してペプチド及び／又はタンパク質を分離することを特徴とする分離法。
【請求項２】
酸がトリフルオロ酢酸であることを特徴とする請求項１に記載の分離法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の移動相において、酸が移動相全量の０．０１〜２０容積％含まれることを特徴とする分離法。
【請求項４】
有機溶媒がアセトニトリルであり、かつその濃度が移動相全量の６０容積％以上含まれることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の分離法。
【請求項５】
分離カラムが、アミノ基、水酸基、アミド基、カルボキシル基及びスルホン酸基からなる群より選ばれる１以上の官能基を有する基材より構成されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分離法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の分離法を用いることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、順相クロマトグラフィーにおいて使用される分離カラムと、有機溶媒と水又はアルコールとの混合液に酸及び／又はアミンを添加した移動相を用いて、ペプチドやタンパク質を含有する試料を、分離する方法及びそれを用いた装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
液体クロマトグラフィーを用いたペプチドやタンパク質を分離する手法としては、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーがある。しかし、順相クロマトグラフィーを用いて化学修飾しないネイティブなペプチドやタンパク質を分離精製した例や報告はなかった。
【０００３】
この内、逆相クロマトグラフィーは、移動相に揮発性の高い有機溶媒や酸を用いるため、ペプチドやタンパク質を分離後、精製する目的においては大変有用な方法であるが、その分離機構は試料中の各ペプチドやタンパク質と分離カラムの固定相との疎水的相互作用の違いを利用して行なうため、試料中の各ペプチドやタンパク質に疎水性が無いあるいは疎水的相互作用の違いがあまり無い場合には分離することは困難であった。
【０００４】
一方、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを用いた方法では、逆相クロマトグラフィーを用いた方法では分離できないような疎水性が無いあるいは疎水的相互作用の違いがあまり無い試料中のペプチドやタンパク質を分離することは可能であるものの、いずれの方法においても移動相として塩を含む緩衝溶液を使用するため、ペプチドやタンパク質を分離後、精製するためには脱塩などの煩雑な操作が伴うという課題があった。
【０００５】
一方、シリカカラム、アルミナカラムといったカラムを用いる古典的かつ一般的な順相クロマトグラフィーを用いた方法は、試料中の対象物質の極性を利用して分離を行なうため、疎水性に基づく分離を行う逆相クロマトグラフィーを用いる方法とは反対の性質を持つが、移動相としてヘキサンなどの非水溶媒を用いて行なうために、試料中の対象物質の移動相への溶解性が悪く、ペプチドやタンパク質などの生体物質の分離に適用されることは無かった。
【０００６】
近年、シリカや樹脂などのゲル基材にアミノ基、水酸基（ＯＨ）、アミド基といった極性基を結合させた化学結合型の固定相が順相クロマトグラフィー用として開発され、これらは有機溶媒と水又はアルコールの混合液を移動相として用いることができるため、従来の順相クロマトグラフィーによる方法において溶解性が問題となり使用できなかった生体試料への適用が可能となった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記記載の背景のもとに、本発明の目的は、ペプチドやタンパク質を含む試料を分離するに際し、ペプチドやタンパク質を分離でき、さらに分離後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精製できる方法及びその方法を用いた装置を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、シリカや樹脂などのゲル基材に水酸基（ＯＨ）やアミド基などの極性基を結合させた化学結合型の固定相を用い、揮発性の高い有機溶媒と水又はアルコールの混合液に酸やアミンを添加した移動相を用いた順相クロマトグラフィーによる方法より、逆相クロマトグラフィーによる方法では分離し難いペプチドやタンパク質を含む試料を分離することが可能であること、さらに、移動相として逆相クロマトグラフィーによる方法で使用される揮発性の高い有機溶媒、酸、アミンを選択することにより、ペプチドやタンパク質を分離後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
【００１０】
尚、本明細書においては、「ペプチド」という語は、その構成するアミノ酸をも含む意味で用いられる。
【００１１】
図１は本発明の順相クロマトグラフィーによる方法を用いたペプチド及び／又はタンパク質の分離を実施する装置を示すものである。
【００１２】
図１において、第１移動相瓶１と第２移動相瓶２は移動相（本明細書においては、溶離液ということもある）を貯蔵するための瓶であり、それぞれ、溶離液１、溶離液２が貯蔵されている。これらの貯蔵されている溶離液１及び溶離液２はその中の有機溶媒の濃度が両者で異なる。また、瓶の大きさ、形状、材質は特に限定されるものではなく、大きさとしては、分離や精製するために必要な移動相を越える量貯蔵できればよく、形状も次に示す送液ポンプ３により、その貯蔵されている溶液が送液できるものであればよい。材質としても移動相を貯蔵した場合に安定的にその溶液が貯蔵できれば良く、例えば、ガラスや高分子樹脂などが例示できる。
【００１３】
送液ポンプ３は第１移動相１と第２移動相２とを勾配的に送液するためものである。送液の条件としては、特に限定はなく、試料中のペプチド及び／又はタンパク質を分析するような小規模のシステムにより実施する場合には、分離カラムの大きさにより異なるが、通常１．５ｍｌ／分以下の流速により実施される。さらに具体的には、カラムの内径が４．６ｍｍ程度の場合には、０．７〜１．０ｍｌ／分の範囲の流速が、カラムの内径が２．０ｍｍ程度の場合には、０．１〜０．２ｍｌ／分の範囲の流速が好ましく用いられ、このような流速を達成できる送液ポンプであればよい。また、大規模のシステムにより試料中の特定のペプチド、タンパク質の精製を実施する場合には、カラムの大きさや試料中の特定のペプチド、タンパク質の分離パターン等に応じて適宜必要な性能を有する送液ポンプを用いればよい。
【００１４】
尚、第１移動相１と第２移動相２とを勾配的に送液する必要がない場合には、第１移動相１又は第２移動相２のいずれかのみを用いればよい。
【００１５】
４は試料注入装置であり、用いられる試料の容量は任意の量に変えることができ、又、注入に際しては、手動によりもしくは自動的に注入できる。試料の注入量としては、小規模の分析に用いる場合と大規模の精製に用いる場合とではその容量は異なり、適宜必要な試料容量を注入できる試料注入装置を用いればよい。
【００１６】
５は分離カラム、６は恒温槽であり、分離カラム５は恒温槽６に入った状態にて一定の温度に保たれる。又は、温度調整を必要としない場合には、分離カラム５は恒温槽にて温度を調整を行わなくとも良い。
【００１７】
恒温槽６は、分離カラム５の温度を一定に保つために用いられ、空気等のガスや水等の液体などを媒体として、加熱及び／又は冷却の機構によりその温度を一定に保つ機能を有するものである。ここで、恒温槽の保つことができる温度としては、分離の対象、目的にも左右されるため、一概にはいえないが、１０〜７０℃の温度範囲が好ましく、さらに３０〜５０℃の温度範囲が好ましい。この理由としては、移動相の氷点を越える温度である必要があると共に、沸点をこれる温度であってはならないという制約があるためである。さらに、この範囲を外れるような条件の場合には、分離の対象とする試料中のペプチドやタンパク質が劣化してしまう場合もあるからである。
【００１８】
７は検出器であるが、分離の対象とする試料中のペプチド及び／又はタンパク質が検出でき、移動相による妨害を受けない原理によるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、紫外吸収検出器、可視吸収検出器、蛍光検出器、発光検出器等の公知手段を用いることができ、検出波長についても公知の条件にて行えばよい。さらに、この検出器を記録計に接続して得られた信号を紙等へ出力又は電気記録媒体へ記録して分析、精製に利用することができる。
【００１９】
また、上記記載の１〜７の各部との間を接続する送液管については、耐圧性があれば、その材質、内径、外径、長さ等には特に限定されることはなく、通常、ステンレス等の金属や、高分子樹脂などが好ましく用いられる。
【００２０】
このように構成されたクロマトグラフ装置において、以下に示す実施例においては、第１移動相瓶１はアセトニトリル：水＝９７：３（体積基準）の割合で混合した溶液に０．１％のトリフルオロ酢酸を添加したものを用いたが、有機溶媒としては、プロトンの供与、受容にあまり関与せず、水又はアルコールと混和できることが必須である。このような有機溶媒としては、シアン化炭化水素等が好ましく用いられ、さらにアセトニトリルが好ましく用いられる。その濃度としては、分離能の面から、移動相全量の６０容積％以上が、さらに７０容積％以上が好ましい。
【００２１】
また、水としては、上記記載の検出器に影響を与えないものであれば特に限定されず、冷水、温水のいずれも用いることができる。さらに、水の代わりに用いられることのあるアルコールとしては、有機溶媒と混和できるものであれば特に限定されないが、分離する際に有機溶媒と完全に混和でき、また、分離の対象とする試料中のペプチドやタンパク質が劣化しないようなものであればよい。例えば、メチルアルコール、エチルアルコール等が例示できる。さらに、水とアルコールとを併用することもできる。
【００２２】
有機溶媒と水又はアルコールとの混合比率としては、分離能の点から、（水又はアルコール）／（有機溶媒）が０〜０．３となる範囲（体積基準）であることが好ましい。尚、ここでいう混合比率とは、ペプチド及び／又はタンパク質を含む試料を分離する際に実質的に使用される場合のことをいう。
【００２３】
さらに、移動相にゲル基材へのイオン的な吸着対策、すなわち、ペプチド等を含む試料の回収率を向上させる手段として、移動相に酸を添加する。酸の種類としては、トリフルオロ酢酸、蟻酸、酢酸などの有機酸や、無機酸が好ましく用いられ、さらに、精製に使用する場合に有効である脱塩操作を必要としない揮発性の点から有機酸が、特にトリフルオロ酢酸が好ましく用いられる。その含有比率としては、移動相全量に対して、体積基準で０．０１〜２０％の範囲で用いることが好ましい。
【００２４】
また、アミン類も酸と一緒にもしくは酸の代わりとして用いることができる。用いられるアミンの種類としては、３級のアミンが好ましく、さらにトリエチルアミン、トリメチルアミンが好ましく用いられる。その含有比率としては、全移動相に対して、体積基準で０．０１〜２０％の範囲で添加することが出来る。
【００２５】
第２移動相瓶２に貯蔵する移動相としては、実施例においては、アセトニトリル：水＝５５：４５の割合で混合した溶液に０．１％のトリフルオロ酢酸を添加したものを用いた。この場合、第１移動相瓶１と同様に、その有機溶媒、水、アルコール、酸又はアミンの種類、量比を変えることができる。
【００２６】
分離カラムとしては、その一例としてアミド基（カルバモイル基）をゲル基材に共有結合させた、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー株式会社製）を用いた。このようなゲル基材としては、化学結合型で順相クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されるものではないが、無機系シリカ、アルミナ、有機高分子系樹脂などが好ましく用いられ、特に分離能、耐久性などの面から無機系シリカが好ましく用いられる。
【００２７】
また、このようなゲル基材に結合される官能基としては、順相クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されるものではないが、アミノ基、アミド基（カルバモイル基）、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基が結合したものが好ましく用いられ、さらに、アミド基（カルバモイル基）、水酸基が、特に、分離能、耐久性などの面からアミド基（カルバモイル基）を結合させたものが好ましく用いられる。また、これらの官能基が２種以上あってもよい。
【００２８】
さらに具体的には、上記記載のＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０や、水酸基をゲル基材に共有結合させた、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＨ−１２０（東ソー株式会社製）、一般的に順相法で良く用いられるＴＳＫｇｅｌ  Ｓｉｌｉｃａ−６０（東ソー株式会社製）、分離機構にプロトン供与、受容に関与するイオン交換カラムである、ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−２ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌＳＰ−５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−２ＰＷ（以上、東ソー株式会社製）などを挙げることができる。
【００２９】
本発明の方法においては、移動相として高い比率の有機溶媒を用いているために試料が移動相に溶解しにくい場合があるが、その場合は、蟻酸等に溶解してから移動相２、移動相１の順で希釈すればよい。試料中の最終的な蟻酸濃度は、注入試料全量に対して、体積基準で７０％まで使用することができる。
【００３０】
吸着されたペプチド及び／又はタンパク質を含む試料は、試料注入後まもなく移動相液２を送液ポンプ３によって移動相中の水もしくはアルコールの濃度を勾配的に増加させることによって溶出させる。実施例においては、溶出のための勾配は一例として、表１に示すようなグラジエントカーブによって行った。
【００３１】
【表１】
0003780638.tif 000002
【００３２】
ここで、溶出のための勾配の条件としては、直線勾配のみならず、曲線勾配としても良く、試料中の分離対象物質により適宜変更しても良い。
【００３３】
このようにして分離カラムから溶出されてきたペプチド、タンパク質は、検出される。図２においては、吸収波長２１５ｎｍの紫外吸収検出器により検出し、種々のペプチドを分離したクロマトグラムが得られた。ここで、検出の方法としては、溶出された分離対象物質を直接検出しても良いが、図１に示される検出器の前に、送液ポンプ及び検出用溶液を加え、分離カラムから送液された溶液と合流させるという方法を用いても良い。この際に用いられる、送液ポンプとしては上記記載のものと同じような構成でよく、また、検出用溶液としては、分離対象物質と反応して、紫外あるいは可視の吸収を有する物質となったり、蛍光性物質となるようなもの、例えば、ニンヒドリンやオルトフタルジアルデヒドなどの化合物を含む溶液を用いることで達成される。
【００３４】
図２は実施例として示されるクロマトグラムである。図２において、（Ａ）は従来の逆相クロマトグラフィーによる方法であり、カラムとしてＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔｓが使用され、（Ｂ）は本発明の順相クロマトグラフィーによる方法であり、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０が使用された。クロマトグラフィーの条件としては、（Ａ）においては、移動相１として０．１容積％のトリフルオロ酢酸及び５容積％のアセトニトリルを含む水溶液、移動相２として０．１容積％のトリフルオロ酢酸及び５５容積％のアセトニトリルを含む水溶液を、８３．３分間にて移動相１より移動相２へと直線濃度勾配により溶出させたものである。（Ｂ）においては、移動相１として０．１容積％のトリフルオロ酢酸及び９７容積％のアセトニトリル、移動相２として０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５５容積％のアセトニトリル（以上、残りは水）を、７０分間にて移動相１より移動相２へと直線濃度勾配により溶出させたものである。試料の容量は２０μｌ、分離温度は４０℃である。図２より明らかなように、本発明の方法によれば、各ペプチドがその分離カラムとの疎水的相互作用に依存した順に溶出され、分離能の点においても従来の逆相クロマトグラフィーによる方法と比較して優れていることが分かる。
【００３５】
本発明の方法又は装置により分離できる対象試料としては、ペプチド及び／又はタンパク質を１以上含む試料であればよく、例えば、血清、血漿、尿等の体液成分や、微生物等によるペプチド、タンパク質等の製造に使用される溶液、廃液などあらゆる試料を対象とすることができる。
【００３６】
さらに、本発明の方法によれば、試料中のペプチド及び／又はタンパク質がカラムとの疎水性相互作用に依存して溶出されるため、その分離により、ピークの高さや面積を求めることで定量が可能であり、ピークの保持時間を求めることで定性も可能である。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、逆相クロマトグラフィーによる方法で保持しないような疎水性の無いあるいは分離カラム基材との疎水性の差があまり無く分離できないような試料中のペプチド及び／又はタンパク質を分離し、さらに、分離後、脱塩などの煩雑な操作をせずに精製できることが可能となるため、有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施態様を示すクロマトグラフィー装置である。
【図２】実施例として示されるクロマトグラムである。図において、Ｘ軸（横軸）は保持時間（分）を示し、Ｙ軸（縦軸）は２１５ｎｍにおける吸光度を示す。
【符号の説明】
１：図１において、クロマトグラフィー装置の第１移動相用の瓶であり、その中に移動相１が入っている。
２：図１において、クロマトグラフィー装置の第２移動相用の瓶であり、その中に移動相２が入っている。
３：図１において、クロマトグラフィー装置の送液ポンプである。
４：図１において、クロマトグラフィー装置の試料注入装置である。
５：図１において、クロマトグラフィー装置の分離カラムである。
６：図１において、クロマトグラフィー装置の恒温槽である。
７：図１において、クロマトグラフィー装置の紫外吸収検出器である。
８：図２において示されるペプチド、Ｐｒｏ  Ｇｌｙである。
９：図２において示されるペプチド、Ｌｅｕ  Ｇｌｙである。
１０：図２において示されるペプチド、Ｐｈｅ  Ｇｌｙである。
１１：図２において示されるペプチド、Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｘａａである。ここで、ＸａａはＰｒｏのカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が−ＣＯＮＨ2となったものである。
１２：図２において示されるペプチド、Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙである。
１３：図２において示されるペプチド、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｒｇである。
１４：図２において示されるペプチド、Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕである。
１５：図２において示されるペプチド、Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ａｒｇである。
【図１】
0003780638.tif 000003
【図２】
0003780638.tif 000004