(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の各種成分を分離および分析するキャピラリー電気泳動方法であって、
１本のキャピラリーに設けた２個所の検出位置のそれぞれで光学的検出手段を用いて検出を行い、一方の検出位置では電気泳動前の全成分の濃度を測定し、他方の検出位置では電気泳動中または電気泳動後の各成分の濃度を測定することを特徴とするキャピラリー電気泳動方法。
【請求項２】
前記キャピラリーは、管状に成形されたガラスあるいは透明性樹脂より成ることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動方法。
【請求項３】
前記キャピラリーは、加工溝および該加工溝の両端部にそれぞれ連結される加工穴を形成されたガラスあるいは透明性樹脂より成ることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動方法。
【請求項４】
前記光学的検出手段は、透過光、散乱光、蛍光、発光の何れかを用いることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項記載のキャピラリー電気泳動方法。
【請求項５】
前記試料は、測定対象成分として蛋白質あるいは核酸を含有する液体であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項記載のキャピラリー電気泳動方法。
【請求項６】
前記キャピラリーを複数本備えることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項記載のキャピラリー電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の各種被検物質を分離および分析するキャピラリー電気泳動方法、特に、血液中の蛋白質等を分離および分析するキャピラリー電気泳動方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より臨床検査で行われている血清蛋白電気泳動方法としては、セルロースアセテート膜電気泳動方法およびキャピラリー電気泳動方法がある。セルロースアセテート膜電気泳動方法は、緩衝液を染み込ませたセルロースアセテート膜におよそ０．５μＬの血清を線状に塗布し、１００Ｖ前後の電圧を印加して血清成分の分離を行い、分離後に酸性色素を用いて蛋白染色を行い、洗浄および乾燥後にデンシトメトリー（Densitometry；透過光の走査による測光方法）を行うことにより、図５に示すようなデンシトグラムを得ることができる。図５のデンシトグラムは、血清蛋白質を分離した典型的な例を示すものであり、図示左端のピークから順に、アルブミン、α１グロブリン、α２グロブリン、βグロブリン、γグロブリンと呼ばれる成分に対応する。デンシトグラムの高さは光学濃度（Optical density ）であり、デンシトグラムの各ピークを当該ピークの左右の谷の位置で区切った部分の面積比（以下、各成分ピーク面積比という）から定量値が得られ、この定量値のことを分画値という。
【０００３】
セルロースアセテート膜電気泳動方法を用いて分析を行う際に、定量的に血清の塗布を行うことができれば、各分画値は濃度（単位；ｇ／ｄＬ，ｍｇ／ｄＬ等）に換算することができる。しかし、一旦別部材を用いて採取した血清をセルロースアセテート膜上に塗布する方法を用いているため、採取時および塗布時に塗布量が変動する結果、実際の塗布量が大きくばらついてしまい、各分画値から濃度を得ることができなかった。そのため、セルロースアセテート膜電気泳動方法を用いる場合には、定量値である分画値は、図５のような各ピークを含む部分の全面積を１００％とした場合の面積比で表わされることになるが、面積比は相対的な値であることから、各分画値の絶対的な増減を把握することができない。例えば、ある試料に対し測定を２回行ったときにアルブミンの分画値が６０％から５０％に減少する変化を示した場合、この変化だけでは、アルブミンが減ったのか、あるいは、アルブミン以外の成分が増加したのかを、把握することができない。
【０００４】
各分画値の絶対的な増減を把握するためには、血清総蛋白濃度（ＴＰ値）を使用して、ＴＰ値と各分画値（％）とを乗算することにより、各分画値の絶対濃度換算値を得る必要がある。例えば、ＴＰ値が７．０（ｇ／ｄＬ）のときアルブミンの分画値が６０％であれば、アルブミン分画値濃度は４．２（ｇ／ｄＬ）となる。したがって、各分画値濃度を求めるためには、血清蛋白電気泳動方法による各分画値の測定を行った上で、別の自動分析装置を用いてＴＰ値の測定を行わなければならず、１回の測定だけで各分画値濃度を求めることができない。なお、ＴＰ値は、日常的な臨床検査においては、一般的に、自動分析装置でビウレット（Biuret）法を用いることによって測定される。
【０００５】
一方、キャピラリー（毛細管）電気泳動方法は、例えば、長さ数十ｃｍ、内径１００μｍ以下の毛細管に緩衝液を満たし、毛細管の一端から試料を注入した後に、毛細管の両端を緩衝液内に入れてから、所定電圧を印加することにより、試料の各成分を分離分析する方法である。キャピラリー電気泳動方法は、「試料が微量でよい」、「分離時間が短い」、「染色が不要」、「応用範囲が広い」等の特徴を有している。
【０００６】
キャピラリー電気泳動方法において、分画値を定量するための種々の方法が提案済みである。例えば、特開平４−９７６５号公報（特公平７−１１５０７号公報；以下、従来例１という）および特開平４−１６０３５５号公報（特許第２９６４６１５号；以下、従来例２という）には、試料を定量注入することにより各分画値濃度を定量する方法が開示されている。具体的には、キャピラリーに「マーカ」を注入したときの特性（注入時間と注入量との関係）を求めておき、この特性を用いて実際の試料注入量を推定し、この推定した試料注入量を用いて試料の各分画値濃度を定量する。
【０００７】
また、特開平５−２０３６２４号公報（以下、従来例３という）および米国特許ＵＳ５４９０９０９号（以下、従来例４という）には、「分析すべき試料にその成分種の何れとも異なる電荷密度を有する少なくとも１つのイオン種を添加し毛管電気泳動を行い、試料成分を定量する」と記載されている。つまり、試料に既知濃度のマーカを添付してキャピラリー電気泳動を行ったときに測定すべき成分のピークとは別に出現するマーカのピークを基準として、マーカのピークの左右の谷の位置で区切った部分の面積と、各成分のピークの左右の谷の位置で区切った部分の面積との比を求め、この比から各成分の分画値濃度を求めるものである。なお、特表平９−５０８２０９号公報（以下、従来例５という）に記載された方法は、検出手段として蛍光を用いている点以外は、上記従来例３および従来例４と同様である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来例１および従来例２は、試料の定量注入を実現するためにマーカを必要とするので、試薬コスト増によるランニングコストの増加が避けられない。その上、予めマーカを注入したときの特性（注入時間と注入量との関係）から実際の試料注入量を推定する方法を用いているが、この推定方法には、試料の粘性が変化した場合には正しく機能しないという不具合がある。また、上記従来例３、従来例４および従来例５は、試料に基準となる物質（マーカ）を添加するので、マーカ添加に伴う試薬コスト増によるランニングコストの増加が避けられない。その上、マーカの添加量は正確な量であることが求められるので、そのようにするための機器や装置が別途必要になり、コストアップを招くことになる。
【０００９】
本発明は、マーカを必要とせず、かつ、試料の注入量に依存せずに、試料の各成分の定量を行い得るキャピラリー電気泳動方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、請求項１に記載の第１発明は、試料中の各種成分を分離および分析するキャピラリー電気泳動方法であって、１本のキャピラリーに設けた２個所の検出位置のそれぞれで光学的検出手段を用いて検出を行い、一方の検出位置では電気泳動前の全成分の濃度を測定し、他方の検出位置では電気泳動中または電気泳動後の各成分の濃度を測定することを特徴とする。
【００１１】
第１発明によれば、キャピラリー電気泳動方法に使用する１本のキャピラリーに設けた２個所の検出位置のそれぞれで光学的検出手段を用いて検出を行うが、一方の検出位置（例えば前記キャピラリーの試料注入部の近傍の位置）では電気泳動前の全成分の濃度を測定し、他方の検出位置（例えば前記キャピラリーの試料排出部の近傍の位置）では電気泳動中または電気泳動後の各成分の濃度を測定するから、１回のキャピラリー電気泳動によってＴＰ値および各成分の分画値を同時に求めることができる。したがって、マーカを必要とせず、かつ、試料の注入量に依存せずに、試料の各成分の定量を行い得るキャピラリー電気泳動方法を提供することができる。
【００１２】
請求項２に記載の第２発明は、前記キャピラリーは、管状に成形されたガラスあるいは透明性樹脂より成ることを特徴とする。
【００１３】
第２発明によれば、前記キャピラリーは管状に成形されたガラスあるいは透明性樹脂より成るから、キャピラリー電気泳動を実施するのに適している。
【００１４】
請求項３に記載の第３発明は、前記キャピラリーは、加工溝および該加工溝の両端部にそれぞれ連結される加工穴を形成されたガラスあるいは透明性樹脂より成ることを特徴とする。
【００１５】
第３発明によれば、前記キャピラリーは加工溝および該加工溝の両端部にそれぞれ連結される加工穴を形成されたガラスあるいは透明性樹脂より成るから、キャピラリー電気泳動方法を実施するのに適している。
【００１６】
請求項４に記載の第４発明は、前記光学的検出手段は、透過光、散乱光、蛍光、発光の何れかを用いることを特徴とする。
【００１７】
第４発明によれば、前記光学的検出手段は、透過光、散乱光、蛍光、発光の何れかを用いるから、この光学的検出手段によって、所望の通り、電気泳動前の全成分の濃度（ＴＰ値）を測定したり、電気泳動中または電気泳動後の各成分の濃度を測定したりすることができる。
【００１８】
請求項５に記載の第５発明は、前記試料は、測定対象成分として蛋白質あるいは核酸を含有する液体であることを特徴とする。
【００１９】
第５発明によれば、前記試料は、測定対象成分として蛋白質あるいは核酸を含有する液体であるから、キャピラリー電気泳動方法により血清蛋白質や核酸の測定を行うことができる。
【００２０】
請求項６に記載の第６発明は、前記キャピラリーを複数本備えることを特徴とする。
【００２１】
第６発明によれば、前記キャピラリーを複数本備えるから、キャピラリー電気泳動方法による複数の測定を同時に行うことができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づき詳細に説明する。図１（ａ）は本発明のキャピラリー電気泳動方法の実施に用いるキャピラリー電気泳動装置の概略構成を示す斜視図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ断面図であり、図１（ｃ）は図１（ｂ）のＢ−Ｂ断面図である。本実施形態において使用するキャピラリー電気泳動装置は、図１（ａ）に示すように、電気泳動を行うキャピラリーを形成するために、２枚のガラス基板１，２を貼り合わせた構成になっている。
【００２３】
本実施形態では、ガラス基板１，２として、紫外線透過性の高い合成石英基板を用いているが、ガラス基板の代わりに、アクリル樹脂等の透明性樹脂製の基板を用いてもよい。ガラス基板１，２の厚さはそれぞれ１ｍｍである。貼り合わせ時に上側になるガラス基板１の左右２個所には、図１（ａ），（ｂ）に示すようなφ５ｍｍの円形状の貫通穴３，４が加工されており、貼り合わせ時に下側になるガラス基板２には、図１（ｂ），（ｃ）に示すような基板中央部の左右方向に延在する幅１００μｍ、深さ５０μｍの溝５がエッチング加工により形成されている。
【００２４】
上記ガラス基板１，２は、溝５の左右両端部が貫通穴３，４の直下に位置するように貼り合わせられるため、貫通穴３、溝５，貫通穴４より成る空間が試料の流路であるキャピラリーを形成することになる。貫通穴３は試料供給口に対応し、貫通穴４は試料排出口に対応する。さらに、貫通穴３，４は、緩衝液溜めおよび電極槽としても機能することになる。なお、貫通穴３，４にはそれぞれ、図示のような陽極電極および陰極電極が接続されている。
【００２５】
ところで、本実施形態のキャピラリー電気泳動方法では、測定対象成分として蛋白質あるいは核酸を含有する液体を試料として使用するが、蛋白質は１９０〜２００ｎｍ付近の紫外線に吸光の極大が存在し、核酸は２６０ｎｍ付近にも吸光の極大が存在することが公知になっている。そのため、蛋白質や核酸の濃度を測定する場合には、紫外線を用いて測定を行うことができる。この場合、図１（ａ）に示す光源６としては、重水素ランプ、水銀ランプ、キセノンランプ等を用いることができるが、重水素ランプは、広範囲に連続スペクトルを有しており、任意の波長を選択したり、広い波長バンドを取り出して光量を増量したりすることができるという利点があるので、最も好ましい。
【００２６】
そのため、本実施形態では、光源６として、図２に示すような波長２００ｎｍ付近に出力ピーク値がある特性の重水素ランプを使用する。この光源６から出射した光線は、石英レンズ７により集光された後、選択波長２１４ｎｍに対応する亜鉛干渉フィルタ８によって波長選択される。波長選択された後の光線は、ミラー９，１０を経て第１検出位置１１に設けられた検出器１２に導かれたり、ミラー９の光軸からの退去時に直接的に第２検出位置１３に設けられた検出器１４に導かれたりする。上記においては、光源６からの出射光線を集光するために石英レンズを用いたが、ミラーを用いて集光するようにしてもよい。また、上記においては、波長選択のために亜鉛干渉フィルタを用いたが、回折格子を用いてもよい。なお、高価ではあるが、光源６としてエキシマレーザあるいはエキシマランプ等の紫外単一波長光源を用いれば、波長選択フィルタは不要となる。
【００２７】
上記第１検出位置１１は、電気泳動前の試料中の全成分の濃度を測定し得る任意の位置に設定することができる。例えば、図１（ａ）において貫通穴３を正電位電極槽とするとともに貫通穴４を負電位電極槽として両電極間に所定電圧を印加するように構成した場合、試料供給口である貫通穴３を経て溝５内に供給した試料が電気泳動を開始する前の状態を測定し得る位置である貫通穴３の近傍の位置を第１検出位置１１とするのが好適である。
【００２８】
上記第２検出位置１３は、電気泳動中の試料中の各成分の濃度を測定し得る任意の位置に設定することができる。例えば、図１（ａ）において貫通穴３を正電位電極槽とするとともに貫通穴４を負電位電極槽として正負電極間に所定電圧を印加するように構成した場合、溝５内の試料が電気泳動により移動している間の状態を測定し得る位置である貫通穴４の近傍の位置を第２検出位置１３とするのが好適である。
【００２９】
なお、上記第２検出位置１３は、電気泳動後の試料中の各成分の濃度を測定し得る任意の位置に設定することもできる。例えば、図３に示すように、貫通穴３を正電位電極槽とするとともに貫通穴４から図示左側に向かって所定距離離間した位置に負電位電極１５を追加して正負電極間に所定電圧を印加するように構成した場合、溝５内の試料が負電位電極１５に到達して電気泳動による移動を完了した後、電気浸透流によってさらに移動して試料排出口である貫通穴４に到達するまでの状態を測定し得る位置である、負電位電極１５および貫通穴４の中間の位置を第２検出位置１３とするのが好適である。なお、貫通穴３，４にはそれぞれ、図示のような陽極電極および陰極電極が接続されている。
【００３０】
次に、本実施形態のキャピラリー電気泳動方法の作用を説明する。まず、図１（ａ）において、試料供給口である貫通穴３からキャピラリー内に試料（図示せず）を供給（注入）すると、その試料は溝５内の第１検出位置１１に到達する。この第１検出位置１１に到達した試料に対し検出器１２によって光学的検出（例えば吸光度の検出）を行うと、極めて短い時間の経過後に、図４に示すような一定の検出器出力レベルが得られる。
【００３１】
ところで、光学的検出方法が透過光検出である場合には、検出器出力レベルはＯＤ（Optical Density ）値となり、ランバート・ベアの法則（Lanbert-Beer's Law）より濃度換算値が得られることは周知の事実である。なお、ＯＤ値は、入射光の強さをＩｉとし、透過光の強さをＩｏとしたとき、ｌｏｇ（Ｉｉ／Ｉｏ）により求めることができる。上記においては、光学的検出は電気泳動の開始前であって試料中の各測定対象成分が分離される前に行われるので、第１検出位置１１において検出される検出器１２の濃度換算値は、試料の注入量に拘わらず試料内の全測定対象成分の濃度値である総濃度値（ＴＰ値）を示すことになる。ただし、そのようにするためには、標準物質（キャリブレータ）を用いて事前に検量線を求めておくものとする。
【００３２】
溝５内に試料を注入した後、キャピラリーの両端に位置する貫通穴３および貫通穴４（正電位電極槽３および負電位電極槽４）間に所定電圧を印加して電気泳動を開始させると、試料内の各測定対象成分は分離された状態でそれぞれ試料排出口である貫通穴４に向かって移動する。この移動の間、貫通穴４の近傍に設けた検出器１４により、分離された各測定対象成分のピークから成る図５に示すようなデンシトグラムが得られるので、各成分ピーク面積比（百分率表示）に、検出器１２で求めておいた総濃度値（ＴＰ値）を乗算することにより、各ピークに対応する測定対象成分の濃度定量値を求めることができる。
【００３３】
なお、上記検出方法は、電気泳動中に検出を行う、いわゆる「オンキャピラリー検出方式」であり、溝５内をそれぞれ異なる速度で移動する各測定対象物質に対して測定を行うことになるため、早い速度で移動する成分（言い換えれば検出器１４において先に検出される成分）のピークを含む部分の面積（以下、ピーク面積という）は相対的に小さくなり、遅い速度で移動する成分（言い換えれば検出器１４において後に検出される成分）のピーク面積は相対的に大きくなる傾向がある。そのため、このような傾向をキャンセルする補正を行うものとする。この場合、例えば、「キャピラリー電気泳動−基礎と実際−  編者  本田進・寺部茂  講談社  １９９５年４月１日発行」のＰ２０〜Ｐ２１に「C.  ゾーン幅とピーク幅の関係」として記載されている手法を用いれば、「C.  ゾーン幅とピーク幅の関係」中の図1.10Ａの電気泳動図が図1.10Ｂのようなゾーン幅変換されたものになり、移動速度に応じた補正がなされることになる。
【００３４】
本実施形態のキャピラリー電気泳動方法によれば、別の分析装置を用いることなく、かつ、試料の注入量に依存せずに、１回のキャピラリー電気泳動によって全測定対象成分の総濃度値および各測定対象成分の分画値を同時に求め、求めた総濃度値および分画値を乗算することにより各測定対象成分の濃度定量値を求めることができ、定量性の高い分析を行うことができる。その際、濃度定量のためにマーカ等の余分な薬品を試料に添加する必要がないので、マーカを使用するキャピラリー電気泳動方法に比べて、コスト的に有利である。
【００３５】
なお、上記第１実施形態では、２枚のガラス基板およびそれらに形成した貫通穴および溝によって構成されるキャピラリーを用いたが、代わりに、内径２０〜１００μｍ程度のガラス製あるいは透明性樹脂製の管状キャピラリーを用いてもよい。また、上記第１実施形態では、試料の透過光を検出するようにするため、ガラス基板として石英基板を用いたが、試料として蛍光を発する蛍光性物質を用いる場合には、ガラス基板は石英基板である必要はなく、他のガラス基板またはガラス基板の代わりにプラスチック基板を用いることもできるが、その場合、光源としてレーザ光源、あるいは安価な水銀ランプ、キセノンランプ、ＬＥＤ等を用いることができる。
【００３６】
さらに、上記第１実施形態では、離間して配置された第１検出位置１１および第２検出位置１３にそれぞれ検出器１２，１４を設けたが、代わりに、図５に示すように、溝５を途中でＵターンさせることにより第１検出位置１１および第２検出位置１３を貫通穴３，４にそれぞれ近接して設け、第１検出位置１１および第２検出位置１３を通る線分の延長線上に１個の検出器１２のみを設けるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】  （ａ）は本発明のキャピラリー電気泳動方法の実施に用いるキャピラリー電気泳動装置の概略構成を示す斜視図であり、（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ断面図であり、（ｃ）は（ｂ）のＢ−Ｂ断面図である。
【図２】  第１実施形態の電気泳動装置において光源として用いる重水素ランプの特性を例示する図である。
【図３】  第１実施形態の電気泳動装置を電気泳動後の試料中の各成分の濃度を測定するように変更した変形例の概略構成を示す斜視図である。
【図４】  第１実施形態の電気泳動装置において第２検出位置に設けた検出器の検出器出力レベルを例示する図である。
【図５】  第１実施形態の電気泳動装置において第２検出位置に設けた検出器の検出器出力から得られるデンシトグラムを例示する図である。
【図６】  第１実施形態の電気泳動装置を１個の検出器のみで光学的検出を行うように変更した変形例の概略構成を示す平面図である。
【符号の説明】
１，２  ガラス基板
３，４  貫通穴（緩衝液溜め、電極槽）
５  溝
６  光源
７  石英レンズ
８  亜鉛干渉フィルタ
９，１０  ミラー
１１  第１検出位置
１２  検出器
１３  第２検出位置
１４  検出器
１５  陰極電極
【図１】
0003797928.tif 000002
【図２】
0003797928.tif 000003
【図３】
0003797928.tif 000004
【図４】
0003797928.tif 000005
【図５】
0003797928.tif 000006
【図６】
0003797928.tif 000007