(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス−３−フェニルグリシド酸エステルの２つの鏡像体の混合物を立体選択的に、カンジダ属の酵素を用いて加水分解し、かつ加水分解されていないエステルを反応混合物から分離する、一般式：
【化１】
0003781788.tif 000004
［式中、Ｒ１はアルコールから誘導された基を表わし、Ａは芳香族環を表わす］のトランス−３−フェニルグリシド酸の光学活性エステルの製法において、使用した酵素がカンジダ・アンタルクチカから由来することを特徴とする、トランス−３−フェニルグリシド酸の光学活性エステルの製法。
【請求項２】
加水分解されていないエステルの配置は（２Ｒ，３Ｓ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
加水分解されていないエステルは、（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニル）−グリシド酸のメチルエステルである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
酵素加水分解を３０℃〜８０℃の温度で実施する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
加水分解を、水及び、水中に溶けないか又は僅かしか溶けない有機溶剤からの２相系で行なう、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
有機溶剤をクロロホルム、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、３−ペンタノン、シクロヘキサン、イソオクタン、イソプロピルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル、ジクロロメタン、トリクロロメタン、ベンゼン、トルエン及びキシレンにより構成される群から選択する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
（２Ｒ，３Ｓ）−３−フェニルグリシド酸の光学活性エステルが９８％より高いｅ．ｅ．で得られる、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
酵素は固定化されている、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項記載の方法により得られたエステルを、チオフェノールとカップリング反応させる、ベンゾ（チ）アゼピンの製法。
【請求項１０】
さらにアルキル化するか、アシル化するか、あるいは、アルキル化およびアシル化をおこなう、請求項９に記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、トランス−３−フェニル−グリシド酸エステルの２つ鏡像体の混合物を立体選択的に、カンジダ(Candida）属から由来する酵素を用いて加水分解し、かつ加水分解されていないエステルを反応混合物から分離する、一般式：
【０００２】
【化２】
0003781788.tif 000002
【０００３】
［式中、Ｒ1はアルコールから誘導された基、例えば置換又は非置換のアルキル基を表わし；かつＡは芳香族環、例えば置換又は非置換のフェニル環を表わす］のトランス−３−フェニル−グリシド酸の光学活性エステルの製法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
欧州特許（ＥＰ−Ａ）第３６２５５６号明細書は、カンジダ・シリンドラセア(Candida cylindracea)を包含する多くの酵素を用いる、トランス−メチル−３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸エステルの立体選択的な酵素加水分解を記載している。出願人は、カンジダ・シリンドラセアがその活性及び立体選択性を５０℃以上の温度で失うことを発見した。
【０００５】
国際特許（ＷＯ−Ａ）第９００４６４３号明細書も、カンジダ・シリンドラセアから単離された酵素を包含する多くの酵素を用いる、トランス−メチル−３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸エステルの２つの鏡像体のラセミ混合物の酵素加水分解を記載している。この明細書から、カンジダ・シリンドラセア酵素を用いる酵素加水分解が、通常低いｅ．ｅ．（鏡像体過剰率）を生じることは明らかである一方、更に、酵素が、選択された溶剤に対して非常に敏感であることが判明する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
これらのキラル化合物を製造するために適当な酵素を見つける大きな必要性がある。本発明の課題は、前記の欠点を有さず、トランス−フェニルグリシド酸エステルのラセミ混合物を、比較的短い反応時間で、選択的に、かつ酵素的に加水分解する方法を提供することであり、この方法において、残留エステルが、高収率で、かつ高いｅ．ｅ．で得られる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、これは、カンジダ・アンタルクチカ(Candia antarctica)から由来する酵素を用いて達成される。
【０００８】
本発明は、カンジダ・アンタルクチアから由来する酵素を用いて、トランス−３−フェニルグリシド酸エステルの２つの鏡像体の混合物を立体選択的に酵素加水分解することを基礎とする。酵素加水分解は、立体選択的に、従来文献において例証されたよりも高い温度で、例えば８０℃までの温度で実施することができる。その結果、反応時間を実質的に短縮することができる。更に、酵素は、選択した溶剤に対してあまり敏感でないようであり、このことは、異なる溶剤中で良好な選択性が達成されることを意味する。
【０００９】
式Ｉのトランス−３−フェニルグリシド酸エステルは、場合により、芳香環Ａ上に置換基１個以上を、例えば４位に含有していてよい。置換基は、例えば、ヒドロキシ、Ｃ原子１〜６個を有するアルコキシ、Ｃ原子１〜６個を有するアルキル、及びハロゲンから選択されうる。芳香環Ａは、多環式であってもよい。
【００１０】
エステル残基である、アルコールから誘導される基Ｒ1は、一般的に、炭素原子１〜６個を有するアルキル基であり；メチル、エチル、イソプロピル又はイソブチルが有利である。
【００１１】
鏡像体純度の基準であり、かつ通常‘ｅ．ｅ．’として記される鏡像体過剰率は、しばしば使用される定量法である。簡単に言えば、鏡像体過剰率は、鏡像体の合計量で割った鏡像体の量の間の差に等しく、その商を、１００を掛けた後にパーセントとして表わすことができる。
【００１２】
前記した式Ｉのトランス−３−フェニルグリシド酸のエステルは、例えば、ダルツェンス(Darzens)縮合又はトランス−ケイ酸のエステルのエポキシ化により製造することができる。
【００１３】
式Ｉのトランス−３−フェニルグリシド酸のエステルは、２個のキラル中心を有する。キラル中心をｎ個を有する分子は、原則的に、立体異性体を２n個有する。
【００１４】
従って、３−フェニル−グリシド酸エステルのためには、互いにジアステレオ異性体である２つのＤ、Ｌ対として生じる立体異性体４個が考えられる。３−フェニルグリシド酸エステルの２つのジアステレオ異性体形は、シス及びトランス形である。トランス形の２つの鏡像体は、配置として（２Ｒ，３Ｓ）及び（２Ｓ，３Ｒ）を有する。シス形の配置は、それぞれ（２Ｒ，３Ｒ）及び（２Ｓ，３Ｓ）である。ベンゾチアゼピン及びベンゾアゼピンの製造のためには、一般的に、（２Ｒ，３Ｓ）配置を有する鏡像体が適用される。
【００１５】
本発明は、中間体としての光学活性エステルの、医薬品、例えばベンゾチアゼピン、例えばナルチアゼム、クレンチアゼム及びジルチアゼム、ベンゾアゼピン及びタキソールの製造における使用に関する。
【００１６】
ジルチアゼムは、２−（４′−メトキシフェニル）−３−アセチルオキシ−５−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２，３−ジヒドロ−１，５−ベンゾチアゼピン−４−（５Ｈ）−オンの市販名であり、かつ例えば米国特許（ＵＳ−Ａ）第３５６２２５７号明細書から公知である。ジルチアゼムは、心臓血管疾患、例えば狭心症のために使用されるカルシウム拮抗薬である。更に、これは、心搏度問題の場合、及び高血圧に対しても適用される。ジルチアゼムを製造する場合、トランス−３−フェニルグリシド酸エステルは、Ａとしてｐ−メトキシフェニル環を含有し、かつ一方、Ｒ1は一般的にメチル基である。
【００１７】
トランス−３−フェニルグリシデートエステルの加水分解に関する本発明のために提供されるラセミエステルの酵素加水分解は公知である。完全に立体選択的な酵素は、変換率５０％で、光学的に純粋な生成物と、光学的に純粋な残留基質(residual substrate)とを生じる。しかしながら、実質的に、酵素は、完全には選択的でない。従って、もし実質的に、高度な鏡像体純度を有する立体選択的酵素変換率の生成物を得ることが望ましい場合、変換率は有利には５０％より下で終了する。
【００１８】
一方、もし高度な鏡像体純度を有する残留基質（この場合エステル）を得ることが望ましい場合には、望ましい鏡像体過剰率に達するまで、５０％以上の変換率まで変換を続けることが有利である。
【００１９】
酵素立体選択的変換の選択性及び有効性、言い替えれば立体選択性は、鏡像体間の変換率における差と共に増加する。一定酵素の存在下での変換率における差は、ある程度は、方法パラメーターの適当な選択に左右されうる。もちろん、使用されている特定の酵素に関する方法パラメーターの選択を最適化するようにする。この技術の精通者は、この目的のために計画された実験を基礎として、これらのパラメーターを簡単に決定することができる。
【００２０】
例えば、チン−シー・チェン(Ching-Shih Chen)等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４（１９８２）、７２９４〜７２９９による文献中に記載されているように、大抵、高い鏡像体純度は、形成された生成物中でよりも、残留基質中で実現されうる。
【００２１】
本発明により使用した酵素は、カンジダ・アンタルクチカから由来するリパーゼである。このリパーゼは、例えば、組換えＤＮＡ技術を介して製造することができる。問題となるリパーゼをコード化する遺伝子は、宿主微生物、例えば、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)中で異種的に(heterogously)表現される。この酵素は、例えば、ＮＯＶＯから、商標名ＳＰ４３５及びＳＰ５３５で、市販で得られる。
【００２２】
カンジダ・アンタルクチカ リパーゼを用いるトランス−３−フェニルグリシド酸エステルの酵素加水分解を介して、トランス−３−フェニルグリシド酸エステルの（２Ｓ，３Ｒ）鏡像体は高い選択性を有して加水分解され、従って、（２Ｒ，３Ｓ）鏡像体が、高いｅ．ｅ．を有して得られる。
【００２３】
鏡像体の反応速度は、明らかに異なるようであり、従って、ラセミ混合物から出発する際には、５３％より低い変換率で、９５％より高い鏡像体過剰率の（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸エステル鏡像体が既に得られる。９８％より高い鏡像体過剰率は、ラセミ混合物からの再出発の際に、変換率約５５％で既に得られる。使用が、目標鏡像体で強化した混合物からなる場合、得られる結果はより良好であり、一方、酵素はその選択性を保持する。
【００２４】
本発明による酵素は、その固定化された形で、すなわち固相上で、特に微孔性粒子、ゲルタイプの粒子及びイオン交換樹脂上で有利に適用される。これは、酵素の回復を促進する一方、酵素の再使用を可能にする。酵素を固定化された形で使用する場合にも、高い活性及び選択性が達成され、前記の活性及び選択性は、酵素を数回リサイクルした後に保持される。
【００２５】
立体選択的加水分解は、有利には、水相と、有機溶剤を含有する有機相とからなる２相系中で達成される。このような溶剤の例は、水中に溶けないか又は非常に僅かにのみ溶ける溶剤である；例えばクロロホルム、イソプロピルエーテル、３−ペンタノン、ジクロロメタン、トリクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、メチルｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、イソオクタン、酢酸エチル等。
【００２６】
意外にも、本発明による酵素の選択性は、選択した溶剤とはほとんど無関係であり、ほとんどの場合に９５％より高いｅ．ｅ．が、５３％より低い変換率で達成できる。本発明による加水分解は、室温又は高めた温度で実施することができる。前記限界は、基質の安定性により決定され、実質的に、約８０℃である。有利には、２０〜６０℃の温度、特に３０〜５０℃の温度が使用される。高い温度の使用は、反応をより速く促進するという利点を有する。
【００２７】
加水分解の間、ｐＨを、例えば塩基の添加により、５〜１０、有利には７〜９、特に約８に保つ。残留エステル、すなわち加水分解されていない鏡像体は、例えば、エステルが溶けている有機溶剤を分離し、引き続き、溶液からエステルを回収することにより回収することができる。
【００２８】
目的発明により、（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−アルコキシフェニル）グリシド酸の、有利には（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニル）グリシド酸の光学活性エステルが、９５％、有利には９８％より高いｅ．ｅ．を有して得られる。
【００２９】
本発明を、例に基づいて説明するが、それに限定されない。
【００３０】
（２Ｒ，３Ｓ）エステルの鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）を、キラセルＯＤカラム（chiracel OD column;Daicel Chemical Industries Ltd;溶剤：ヘキサン／イソプロパノール＝７０／３０）を用いるＨＰＬＣ分析を介して測定した。
【００３１】
【実施例】
例Ｉ
ラセミトランス−メチル−３−（４−メトキシフェニル）グリシデート２０ｇを、メチルイソブチルケトン１８０ｍｌ中に溶かし、その後に、５０ｍＭトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８を１８０ｍｌ加えた。カンジダ・アンタルクチカ リパーゼ（ＳＰ５２５）１００ｍｇの添加後に、２Ｎ水性ＮａＯＨを用いる自動滴定により、ｐＨを８で一定に保った。温度を３０℃に保った。７．５時間加水分解後の反応混合物の分析は、（２Ｒ，３Ｓ）エステルの鏡像体過剰率９７％を示した。
【００３２】
例ＩＩ
トルエン７５ｍｌ中へのラセミトランスメチル−３−（４−メトキシフェニル）グリシデート１０ｇの溶解及びｐＨ７を有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液７５ｍｌの添加後に、カンジダ・アンタルクチカ リパーゼ（ＳＰ５２５）２００ｍｇを添加した。３０℃で３時間反応後に、２Ｎ  ＮａＯＨでの滴定によりｐＨを一定に保持して、鏡像体過剰率９９％が測定された。
【００３３】
例ＩＩＩ
例ＩＩを繰り返したが、今度はｐＨを８で一定に保った。２時間の反応後に鏡像体過剰率９７％が測定された。
【００３４】
例ＩＶ
例ＩＩを繰り返したが、今度は５０℃で実施した。加水分解を１時間実施した後に、鏡像体過剰率９７％が測定された。
【００３５】
例Ｖ
撹拌しながら、ラセミトランス−メチル−３−（４−メトキシフェニル）グリシデート２０ｇを第１表中に記載したような有機溶剤６０ｍｌに加えた。次いで、ｐＨ８の５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液６０ｍｌを加えた。固定化したカンジダ・アンタルクチア リパーゼ（ＳＰ４３５）２ｇの添加後に、ｐＨ値を、２ＮＮａＯＨを用いる自動滴定により８で一定に保った。反応を、３０℃で実施した。
【００３６】
結果を第１表中に記載する。
【００３７】
0003781788.tif 000003
例ＶＩ
ラセミトランス−メチル−３−（４−メトキシフェニル）グリシデート２０ｇを、メチルイソブチルケトン６０ｍｌ中に溶かした。これに続いて、ｐＨ８の５０ｍＭトリス／ＨＣｌ６０ｍｌを添加した。固定化したカンジダ・アンタルクチカ リパーゼ（ＳＰ４３５）４ｇの添加後に、ｐＨを、２Ｎ  ＮａＯＨを用いる自動的滴定により８で一定に保った。加水分解を、３０℃で実施した。
【００３８】
５時間後に、反応を中断し、反応混合物を濾過することにより、生体触媒が残分として残った。生体触媒をメチルイソブチルケトン２×４０ｍｌを用いて洗浄した。水相を分離後に、集めた有機相を２０％重亜硫酸ナトリウム溶液３０ｍｌを用いて、かつ次いで、５％重炭酸ナトリウム溶液２×２０ｍｌを用いて洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、かつ蒸発させた。メタノール（ＭｅＯＨ）中での晶出により、（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニル）グリシデートエステル７．５ｇが得られた。
【００３９】
［α］20D＝−２０３゜（ｃ＝１ ＭｅＯＨ）。融点８４〜８７℃。
【００４０】
例ＶＩＩ
例ＶＩを繰り返したが、例ＶＩからの再生した固定化生体触媒を同じ条件下で再使用した。６時間の加水分解後に、トランス（２Ｒ，３Ｓ）エステルを、例ＶＩに記載したようにして単離した。（２Ｒ，３Ｓ）−３−（４−メトキシフェニル）グリシデートエステル７ｇが得られた。［α］20D＝−２０４゜
（ｃ＝１ ＭｅＯＨ）。融点８４〜８７℃。
【００４１】
例ＶＩＩＩ
例ＶＩを繰り返したが、今度はカンジダ・アンタルクチカリパーゼ（ＳＰ４３５）２ｇを使用した。６時間の加水分解後に測定された（２Ｒ，３Ｓ）エステルの鏡像体過剰率は９９％であった。
【００４２】
例ＩＸ
ラセミトランス−メチル−３−（４−メトキシフェニル）−グリシデート１０ｇを、メチルｔ−ブチルエーテル６０ｍｌ中に溶かし、次いで、ｐＨ８の５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液６０ｍｌを加えた。その後に、固定化したカンジダ・アンタルクチカ リパーゼ（ＳＰ４３５）４ｇを加え、かつｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨを用いる自動滴定により８に保った。加水分解を６０℃で実施した。
【００４３】
３時間の加水分解後に、（２Ｒ，３Ｓ）エステルに関して鏡像体過剰率９０％が測定された。
【００４４】
例Ｘ
ラセミトランス−メチル−３−（４−メトキシフェニル）−グリシデート５ｇを、イソオクタン６０ｍｌ中に溶かし、次いでこれに、ｐＨ８の５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液６０ｍｌを加えた。固定化したカンジダ・アンタルクチカリパーゼ（ＳＰ４３５）２ｇの添加後に、ｐＨを、２Ｎ  ＮａＯＨを用いる自動滴定により８で一定に保った。加水分解を、８０℃で実施した。
【００４５】
１５０分の加水分解後に、鏡像体過剰率９５％が測定された。
【００４６】
例ＸＩ
ラセミトランス−メチル−３−（４−メトキシフェニル）グリシデート１．５ｇを、クロロホルム６０ｍｌ中に溶かし、次いでこれに、ｐＨ８の５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液６０ｍｌを加えた。固定化したカンジダ・アンタルクチカリパーゼ（ＳＰ４３５）４ｇを添加後に、ｐＨを、２Ｎ  ＮａＯＨを用いる自動滴定により、８で一定に保った。加水分解を５０℃で実施した。
【００４７】
２４０分後に、（２Ｒ，３Ｓ）エステルの鏡像体過剰率は、９６％であった。