(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウスバカゲロウ科昆虫の幼虫の大顎から採取される毒液から得られ、かつアミノ末端アミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、ドデシル硫酸ナトリウム−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量の測定またはスーパーデックス２００ＨＲによるゲルろ過法による分子量の測定で得られる分子量が約１６５−１６７万前後であることを特徴とするタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はウスバカゲロウ科昆虫の幼虫由来の殺虫性タンパク質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
数種の昆虫は、自己防衛や捕食のために毒素を利用する。たとえば、メリチン（melittin）、アパミン(apamin)、キニン（kinin)等が昆虫由来のペプチド系毒素として知られている（Ann.Rev.Entomol.,27,339-68,1982 ）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このような昆虫由来のペプチド系毒素には、害虫に対し殺虫活性が高い、また環境中において分解されやすく残留の心配が少ない等の利点が存在する。よって極めて高い殺虫活性を有する昆虫由来のペプチド系毒素が見出されたら、今後大いに期待される新規タイプの殺虫剤の開発につながる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような状況下で、本発明者らは鋭意検討した結果、ウスバカゲロウ科昆虫の幼虫の大顎から採取される毒液から得られ、かつアミノ末端アミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列であるタンパク質の単離精製に成功し、該タンパク質が害虫に対し極めて強い麻痺性の殺虫活性を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ウスバカゲロウ科昆虫の幼虫の大顎から採取される毒液から得られ、かつアミノ末端アミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列であることを特徴とするタンパク質（以下、本発明タンパク質と記す。）を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
【０００６】
本発明タンパク質は、ウスバカゲロウ科昆虫の幼虫の大顎から採取される毒液から得られ、かつアミノ末端アミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする。
【０００７】
本発明タンパク質は、たとえば、下記の方法により得ることができる。
（１）クロコウスバカゲロウ（Myrmeleon bore）等のウスバカゲロウ科昆虫の幼虫の大顎の先端をはさみ等で切断し、該切断部からガラスキャピラリー等で吸い取ることによって毒液を採取する。採取された毒液を硫安分画する。
また他の方法として、ウスバカゲロウ科昆虫の幼虫を、たとえば水または緩衝液等を添加して、ジューサーミキサー、ワーリングブレンダー等を用いて磨砕し、磨砕物を得る。必要に応じて、液体窒素に浸漬する等の方法により凍結後、該凍結組織を、たとえば液体窒素中等の低温下で磨砕した後に、水または緩衝液に懸濁して、磨砕物を得ることもできる。該磨砕物から遠心分離等の方法により、残渣を除いて抽出する。必要に応じて、該抽出物を硫安分画する。
（２）該画分を、たとえばＤＥＡＥ−セファロース（Sepharose ）等を用いる陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーにより精製する。目的物質の溶出は段階的または連続的に溶出液のイオン強度を高めること等により行う。たとえば、塩化ナトリウム等の添加をあげることができる。
（３）目的物質の溶出画分を回収し、硫安分画後、疎水クロマトグラフィーにより精製する。目的物質の溶出は段階的または連続的に溶出液の塩濃度を減少させること等により行う。たとえば、塩として硫酸アンモニウム等をあげることができる。
（４）さらに必要に応じて、目的物質の溶出画分を回収し、透析後、ゲルろ過等の分子ふるいクロマトグラフィーによりさらに精製を行なう。クロマトグラフィーは、オープンカラムのほか、ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣ等の圧力をかけて行なう方法も用いることができる。
尚、目的物質の溶出は、ゴキブリに麻痺を誘導する活性を指標にするとよい。上記（１）から（４）の各種操作は、たとえば新生化学実験講座  １．タンパク質Ｉ  日本生化学会編  東京化学同人  （１９９０年）等に記載される通常のタンパク質の精製において用いられる方法である。
さらに必要に応じて、上記の各種操作または通常のタンパク質の精製において用いられる他の方法等を組み合わせて精製を行なうこともできる。
また、タンパク質量は、たとえばジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 第 193巻，第 265頁 (1951年) 記載のローリー（Lowry ）らの方法等によって測定することができる。
【０００８】
本発明タンパク質はその物理化学的性質およびカラム特性として下記の性質を有している。
（１）物理化学的性質
（ａ）分子量約１６５−１６７万前後のタンパク質である。分子量の測定はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による（クマージーブリリアントブルーＲ−２５０染色）及びスーパーデックス２００ＨＲによるゲルろ過法による。たとえば、前者では、１．５μｇのタンパク質をＬａｅｍｍｌｉの方法(Nature,227,680-685,1970) に基づき（図１参照）、後者では、０．２Ｍ塩化カリウムを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したゲルろ過担体であるスーパーデックス２００ＨＲ（ＨＲ１０／３０，ファルマシア  バイオテク社製）を充填したカラム（直径１０ｍｍ×３００ｍｍ）を用いて、溶出速度０．２５ｍｌ／ｍｉｎで行なう。分子量標準タンパク質としてフェリチン（４４０，０００）、アルドラ−ゼ（１５８，０００）、乳酸脱水素酵素（ブタ心臓、１４２，０００）、アルブミン（牛血清、６７，０００）、アルブミン（卵白、４３，０００）、炭酸デヒドラターゼ（牛赤血球、２９，０００）等を用いる。これら標準物質との比較で分子量を算出する。
（ｂ）６０％飽和硫安分画において沈澱する。硫安分画は以下のとおり行なう。本発明タンパク質を含有する１０％グリセロールを含む２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍｌに粉末硫安３．９ｇを徐々に添加後、４℃で３０分間静置する。遠心分離（１５，０００ｇ，１０ｍｉｎ）により沈澱物を回収し、該沈澱物を少量の１０％グリセロールを含む２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁する。該懸濁液を透析チューブ（和光純薬製）に入れ、２ｌの１０％グリセロールを含む２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中、４℃で該緩衝液を４回交換して２４時間透析する。
（２）カラム特性
２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中では陰イオン交換樹脂カラムに実質的に吸着し、２５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）が有するイオン強度下で溶出する。たとえば、１０％グリセロールを含む２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陰イオン交換樹脂であるＤＥＡＥ−セファセル(Sephacel)（ファルマシア  バイオテク社製）を充填したカラム（直径１．２ｃｍ×７ｃｍ）を用いて吸着させた後、１０％グリセロールを含む２５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により段階的に吸着物を溶出させる（図２参照）。
【０００９】
本発明タンパク質を殺虫剤の有効成分として用いる場合は、他の何らかの成分も加えずそのまま用いてもよいが、たとえば、粘土類（カオリンクレー、珪藻土、合成含水酸化珪素、ベントナイト、フバサミクレー、酸性白土等）、タルク類、セラミック、その他の無機鉱物（セリサイト、石英、硫黄、活性炭、炭酸カルシウム、水和シリカ等）、化学肥料（硫安、燐安、硝安、尿素、塩安等）等の微粉末あるいは粒状物等の固体担体、水、大豆油、綿実油等の植物油等の液体担体、アルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルアリールエーテル類およびそのポリオキシエチレン化物、ポリエチレングリコールエーテル類、多価アルコールエステル類、糖アルコール誘導体等の界面活性剤その他の製剤用補助剤と混合して乳剤、水和剤、水中懸濁剤・水中乳濁剤等のフロアブル剤、粒剤、粉剤、液剤、ＵＬＶ剤等に製剤して用いることもできる。
【００１０】
これらの製剤には、有効成分として本発明タンパク質を、通常、重量比で 0.1％〜９９％、好ましくは１〜９０％である。
【００１１】
固着剤や分散剤等の製剤用補助剤としては、たとえばカゼイン、ゼラチン、多糖類（でんぷん粉、アラビアガム、セルロース誘導体、アルギン酸等）、リグニン誘導体、ベントナイト、糖類、合成水溶性高分子（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸類等）等があげられ、安定剤としては、たとえばＰＡＰ（酸性リン酸イソプロピル）、ＢＨＴ（２，６−ジ−tert−ブチル−４−メチルフェノール）、ＢＨＴ（２−tert−ブチル−４−メトキシフェノール）と３−tert−ブチル−４−メトキシフェノールとの混合物、植物油、鉱物油、界面活性剤、脂肪酸またはそのエステル等があげられる。
【００１２】
このようにして得られる製剤は、そのままであるいは水等で希釈して用いる。
【００１３】
本発明タンパク質を殺虫剤の有効成分として用いる場合、その有効成分の施用量は、対象害虫、製剤形態、施用方法、施用時期等によって適宜設定すればよい。
【００１４】
本発明を更に以下の実施例で説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】
【００１６】
次に製剤例を示す。なお、部は重量部を表す。
【００１７】
製剤例１  水溶剤
本発明タンパク質、粗精製物（Ｉ）、粗精製物（II）または粗精製物(III) の各々２０部、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート３部、ＣＭＣ３部および水７４部を混合し、各々の水溶剤を得る。
【００１８】
製剤例２  液剤
本発明タンパク質、粗精製物（Ｉ）、粗精製物（II）または粗精製物(III) の各々 0.1部と水99.9部を混合し、各々の液剤を得る。
【００１９】
実施例１  （クロコウスバカゲロウ幼虫の毒素の精製）
クロコウスバカゲロウ（Myrmeleon bore）の２令あるいは終令幼虫を７００頭採集し、採取された幼虫の大顎の先端をはさみで切断し、該切断部からガラスキャピラリーで吸い取ることによって毒液を採集した。採集された毒液３．１７ｍｌを氷冷し、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および１０％グリセロールを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２．４６倍（ｖ／ｖ）に希釈した後、遠心分離（６，７００ｘｇ、１０分間、４℃）を行ない上清を分取した（粗精製物（Ｉ）とする）。
分取した上清を１ｍＭＤＴＴおよび１０％グリセロールを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥセファセルカラム（直径１．２ｃｍ、長さ７ｃｍ、ファルマシア  バイオテク社）にかけた。平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した後、１ｍＭＤＴＴおよび１０％グリセロールを含む２５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を流すことにより吸着成分を溶出させた。流速は０．７３ｍｌ／ｍｉｎで、溶出液を５．５ｍｌずつ分画した。溶出のパターンを図２に示す。溶出画分の吸光度（２８０ｎｍ）をモニターし、２５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で溶出したピーク画分（図２  画分番号２０−２６）を集めた（粗精製物（II）とする）。
この画分を分画分子量１００，０００の限外ろ過膜（日本ミリポア社）を用い窒素ガス圧をかけて限外ろ過することにより濃縮し、さらに１０％グリセロールを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に置換し、容量を５．９ｍｌとした（粗精製物（III)とする）。
次いで、硫酸アンモニウム２．３ｇを添加して完全に溶解させ、４℃で３０分間静置した後、遠心分離（１５，０００ｘｇ，１０分間）を行った。上清を捨て、沈澱を１．７Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０％グリセロールを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、該懸濁液を遠心分離（１５，０００ｘｇ，１０分間）した。上清を捨て、沈澱を１０％グリセロールを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１００μｌに再度溶解させた。この溶液に１０％グリセロールを含み硫酸アンモニウムで飽和させた２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）４０μｌを添加し、直ちに１．７Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０％グリセロールを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したフェニルスーパーロースカラム（ＨＲ５／５、ファルマシア  バイオテク社）にかけた。緩衝液の硫酸アンモニウム濃度が１．７Ｍから０Ｍとなるようグラジエントをかけてカラムを洗浄した後、１０％グリセロールを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）をカラムに流した。流速は０．３ｍｌ／ｍｉｎとした。溶出のパターンを図３に示す。２７．０−２８．１分に溶出した画分（図３）を集めた（以下、精製物と記す）。
尚、上記のカラムクロマトグラフィーはすべて４℃にて操作した。
【００２０】
実施例２  （毒素の分析）
実施例１で得られた精製物の蛋白量はＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Anal.Biochem.,72,248-254,1976 ）で求めた。１．５μｇ蛋白量の精製物をＬａｅｍｍｌｉの方法（Nature, 227, 680-685 ,1970）に基づきドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析した。染色方法はクマージーブリリアントブルーＲ−２５０であった。泳動パターンを図１に示す。精製物はゲル上で１６７ｋＤａの位置に単一バンドとして検出された。また、精製物をスーパーデックス  ２００ＨＲカラム（ＨＲ１０／３０、ファルマシアバイオテク社）にかけ、０．２Ｍ塩化カリウムを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出させてゲル濾過クロマトグラフィーを行ったところ、分子量１６５ｋＤａに相当する位置で溶出された。従って、この蛋白は単量体であると推察された。さらに、精製物をアミノ酸シークエンサーに供しアミノ末端アミノ酸配列を分析したところ、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐのアミノ酸配列（配列番号１）が確認された。
【００２１】
試験例  （生物検定）
チャバネゴキブリ雄成虫を室温２７±２℃、湿度７０±５％の条件下で飼育し、麻痺性の殺虫活性の検定に用いた。精製物の試験溶液は１ｍＭＤＴＴおよび１０％グリセロールを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した。対照として、じょろう蜘蛛毒３（ＪＳＴＸ−３、和光純薬工業）およびテトロドトキシン（ＴＴＸ、和光純薬工業）の水溶液を試験した。チャバネゴキブリの腹部第３節と４節の間に試験溶液を注射し、透明なカップに入れて飼育室で観察し、ゴキブリが仰向けになり正常な姿勢に戻れなくなった場合を麻痺と判定した。１濃度あたり３頭のゴキブリを用い、試験溶液の濃度を変えて１試料あたり少なくとも３０頭のゴキブリを試験した。１濃度に用いた３頭のゴキブリ全てが注射後１０分以内に麻痺するのに必要な最小蛋白量（ｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｉｎｓｅｃｔ）をＭＰＤ値とした。少なくとも３回の試験を実施し、その平均を求めた。毒素を含まない溶液では麻痺活性は認められなかった。
本発明タンパク質はＭＰＤ値が４０で、表１に示すようにモル比でＪＳＴＸ−３の３６７０倍、ＴＴＸの１３０倍高い活性を示した。
【００２２】
【表１】
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供試サンプル            麻痺性の殺虫活性（モル／INSECT）
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本発明タンパク質                  ２．４×１０-13 
ＪＳＴＸ−３                      ８．８×１０-10 
ＴＴＸ                            ３．１×１０-11 
──────────────────────────────────
【００２３】
【発明の効果】
害虫に対し極めて強い麻痺性の殺虫活性を有するタンパク質の単離精製に成功し、該タンパク質をすぐれた殺虫剤の有効成分として提供可能にした。
【００２４】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
配列の特徴
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
起源
生物名：クロコウスバカゲロウ（Myrmeleon bore）
配列の特徴
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
Ser Tyr Glu Asn Asp   ５
【図面の簡単な説明】
【図１】精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のパターンを示す。泳動方向は上（−）から下（＋）である。
【図２】ＤＥＡＥセファセルカラムを用いたカラムクロマトグラフィーのクロマトグラム。画分番号２０−２６を活性画分として集めた。他の画分には活性が存在しなかった。
【図３】フェニルスーパーロースカラムを用いたカラムクロマトグラフィーのクロマトグラム。２７．０−２８．１分に溶出した画分を活性画分として集めた。他の画分には活性が存在しなかった。
【図１】
0003743034.tif 000002
【図２】
0003743034.tif 000003
【図３】
0003743034.tif 000004