(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種抗原性ポリペプチドに結合した昆虫熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）を含む免疫原性複合体を産生する方法であって、前記方法は、
（ａ）昆虫細胞中で前記異種抗原性ポリペプチドを発現し、
（ｂ）前記細胞を、その細胞内で熱ショック応答の誘導を引き起こすような刺激に晒し；そして
（ｃ）１つ以上の昆虫ｈｓｐに結合した異種抗原性ポリペプチドを、前記細胞または培養培地から回収することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記抗原性ポリペプチドが、病原性生物の抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病原性生物が、ウイルスまたは細菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスがペスチウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスが、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原性ポリペプチドが、細胞においてポリペプチドの発現を指令できる調節制御配列に作動可能に連結した抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することにより、細胞中で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、ウイルスまたはウイルスベクターの一部である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスまたはウイルスベクターが、バキュロウイルスまたはバキュロウイルスベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項の方法により得られる、異種抗原性ポリペプチドに結合した熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）を含む、免疫原性複合体を含む、組成物。
【請求項１０】
異種抗原性ポリペプチドに結合した昆虫細胞から得られた熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）を含む組成物であって、前記組成物が、動物またはヒトにおいて、前記抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を誘導でき、請求項１から８のいずれか１項の方法により得られる組成物。
【請求項１１】
前記抗原性ポリペプチドが、病原性生物の抗原である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記病原性生物がウイルスまたは細菌である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウイルスがペスチウイルスである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ウイルスが、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
昆虫熱ショックタンパク質に結合したペスチウイルス抗原ペプチドを含む組成物。
【請求項１６】
医薬的に許容される担体または希釈剤と共に、免疫原性量の請求項９から１５のいずれか１項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
哺乳動物（ヒトを除く）において病原体に対する免疫適格性を誘導する方法であって、前記方法が、哺乳動物（ヒトを除く）に、治療有効量の請求項１６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、哺乳類、ヒト、鳥類および魚類を含む、動物に使用するための、治療薬およびその開発の分野に関する。より具体的には、哺乳類、ヒト、鳥類および魚類を含む、動物に使用するための、感染を引き起こす病原体に対して効果的な、サブユニットワクチンに関する。
【０００２】
（背景技術）
科学的背景
治療薬、特に、ウイルス、細菌、原生動物、真菌などの病原体に対して指向されるワクチンの開発は、現在進行中である。かかる研究は、ヒトを含む動物における疾病の蔓延の予防に貴重であることが判明した。事実、現在医学において、ワクチン接種を含む免疫療法は、天然疱を根絶し、ポリオ、破傷風、結核、水痘、およびはしかなどの疾病を事実上根絶した。
【０００３】
一般に、理想的なワクチンは、有効期間が長く、予め選択した病原体および全ての表現型変異体に対して長期間持続する免疫を誘導でき、ワクチンの指向する疾病を引き起こすことができず、治療的および予防的に効果的であり、経済的な標準的な方法を使用して容易に調製され、そして、現場で容易に投与できる。
【０００４】
商業的に入手できるワクチンには主に４つの種類がある。それらは、生存していない全生物ワクチン、生弱毒化ワクチン、ベクターワクチン、およびサブユニットワクチンを含む。タンパク質などの生存していない物質によるワクチン接種により、一般に、抗体応答またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答が生じるが、生物質（例えば、感染性ウイルス）によるワクチン接種では、一般に、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が生じる。ＣＴＬ応答は、感染性ウイルスおよび細菌のような病原体に対する防御に重要である。ＣＴＬ応答を達成する唯一の確かな方法は、それ自体が病原性である生因子を使用することであるので、これは実際的な問題を提起する。この問題は、一般に、弱毒化ウイルスおよび細菌株の使用により、または、ワクチン接種に使用できる全細胞を死滅することにより、回避される。これらの戦略は成功したが、弱毒化株の使用には、弱毒化因子が宿主内で遺伝子組換えし、病原性株に戻り得るという危険性が常にある。従って、特定の方法での、タンパク質などの生存していない物質によるワクチン接種により、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答をもたらすことのできる、治療薬および方法が必要である。
【０００５】
サブユニットワクチンは、これらのいくつかの問題に対処する１つの手段を提供した。前記ワクチンは、一般に、目的の病原体から得られた亜細胞成分を含む。サブユニット成分は、病原体の限定された亜細胞画分から製造され得るか、精製タンパク質、核酸、または多糖であり得る。これらの全ての要素が、目的の病原体に対する免疫応答を刺激できる、抗原性決定基を有する。一般に、サブユニットワクチンの亜細胞成分は、破壊した病原体の調製物を精製することにより得られるか、または、公知の手順を使用して合成される。
【０００６】
しかし、サブユニットワクチンに関連したいくつかの制限がある。第一に、前記ワクチン製造の必要条件は、抗原性決定基（群）が特徴付けられ、同定されていなくてはならない。これは、特に高度に可変性の抗原性決定基に対する、その使用に制限を課する。第二に、サブユニットワクチンは、一般に、細胞毒性Ｔ細胞応答の刺激には無効である。第三に、サブユニットワクチンによる付与される免疫は、しばしば短命であり、それ故、連続的なブースター注射を必要とする。非常に僅かな組換え発現サブユニットワクチンしか、ワクチン接種した動物（ヒトを含む）において、強力かつ長期間作用する免疫を誘導することが示されていない。１つの注目すべき例外は、ヒトに使用する組換えＢ型肝炎表面抗原ワクチンである。前記ワクチンの使用に関連した問題の１つは、免疫系に抗原を正しく提示し、よって、強力な体液性免疫および強力な細胞性免疫が誘導されることにあるようである。特に、既存の組換え（サブユニット）ワクチンは、ワクチン接種を受けた動物が、病原体により引き起こされた天然感染に曝露された場合に非常に素早く反応するような、強力な「記憶」応答を生じないようである。
【０００７】
単に説明のために、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のようなペスチウイルスから調製したこのサブユニットワクチンの欠陥が大量に報告されている。これらの研究により、大量の組換えタンパク質をワクチンに使用しても、認められる防御率は低いことが示され、これは、ワクチンは生ＢＶＤＶ単離株による攻撃から防御（同種防御または異種防御）できないことを示す。
【０００８】
本発明は、既存の従来技術よりも、少なくともいくつかの欠点の改善された、改良治療ワクチンの提供を模索する。
【０００９】
（一般的な背景）
当業者は、本明細書に記載の本発明は、具体的に記載したもの以外の変形および修飾が可能であることを理解しているだろう。本発明は、全てのかかる変形および修飾を含むものと理解する。本発明はまた、全ての段階、特徴、個々にまたは集合的に、明細書に言及または提示された組成物および化合物、および、任意および全ての組合せ、または、任意の２つ以上の段階または特徴を含む。
【００１０】
一般に、本明細書に記載の技術は当分野で公知であるが、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験マニュアル（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、分子生物学のショートプロトコル（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社を参照し得る。
【００１１】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態により範囲を限定されず、これは、単に例示の目的のものである。機能的に均等な産物、組成物および方法は、明らかに、本明細書に記載したように本発明の範囲内である。
【００１２】
本明細書に言及した刊行物の著書目録の詳細は、明細書の最後にまとめている。引用した全ての文献を、これにより、本明細書の記載の一部として援用する。もっとも、いずれかの文献が従来技術を構成しているということを自認するものではない。
【００１３】
本明細書を通じて、内容的に他を要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる」などの変形は、記載の要素または要素群の包含を意味するが、任意の他の要素または要素群の排除を意味するものではないと理解する。
【００１４】
（発明の要約）
本発明は、一般に、異種抗原性ポリペプチドに結合した、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）を含む、免疫原性組成物を産生する方法に関し、前記方法は、
（ａ）細胞中で抗原性ポリペプチドを発現し、前記細胞は、前記細胞において熱ショック応答の誘導を引き起こす刺激を受けており、そして
（ｂ）１つ以上のｈｓｐに結合した抗原性ポリペプチドを、前記細胞または培養培地から回収することを含む。
【００１５】
好ましくは、細胞は、非哺乳動物真核細胞、より好ましくは昆虫細胞である。典型的には、抗原性ポリペプチドは、細胞においてポリペプチドの発現を指令できる調節制御配列に作動可能に連結した抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することにより、細胞中で発現される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、バキュロウイルスなどの、ウイルスまたはウイルスベクターの一部である。
【００１６】
本発明はまた、異種抗原性ポリペプチドに結合したｈｓｐを含む組成物を提供し、前記組成物は、本発明の方法により産生される。望ましくは、前記組成物は、病原体に対する動物の免疫適格性を増強できる。好ましくは、ｈｓｐは、非哺乳動物真核細胞、より好ましくは昆虫細胞から得られる。
【００１７】
少なくとも１つの抗原性ペプチド／ポリペプチドに結合した、ｈｓｐ、例えば昆虫ｈｓｐは、動物の免疫系を刺激して、外来病原体に対する免疫応答を誘起するための、背景技術に考察したワクチンに対する代替の治療ワクチンを提供する。ｈｓｐは、治療製剤に含まれていたが、出願人の知る限りでは、家畜動物およびヒトなどの哺乳動物の治療処置に、少なくとも１つの抗原性ペプチド／ポリペプチドに結合した、非哺乳動物真核細胞由来のｈｓｐ、より特定すると昆虫細胞ｈｓｐを使用した者は誰もいない。
【００１８】
本発明の昆虫細胞／バキュロウイルス実施形態を使用して産生した異なるサブユニットワクチンが示す集合的な特徴は、以下を含む。
（１）複合体は、完全に非感染性である。
（２）バキュロウイルスは動物細胞に感染しないので、複合体は、動物での使用に安全である。
（３）本発明に従って製造した治療薬は、同等なシステムから製造されるよりも、はるかに高い収率の抗原性タンパク質を、バキュロウイルス感染昆虫細胞培養液から製造できるという点で、製造がより安価である。
（４）本発明に従って開発した治療薬は、動物において、非常に強力な記憶応答を生じることが判明した。従って、動物を、その後、病原体で攻撃すると、その病原体に対する非常に迅速かつ強力な応答を引き起こす。
【００１９】
従って、本発明はまた、異種抗原性ポリペプチドに結合した非哺乳動物真核細胞から得られた、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）を含む、組成物を提供し、前記組成物は、哺乳動物において、前記抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を誘導できる。
【００２０】
好ましくは、ｈｓｐは、昆虫熱ショックタンパク質である。従って、好ましい実施形態において、本発明は、抗原性異種ペプチドまたはポリペプチドに結合した昆虫細胞ｈｓｐを含む、動物における免疫応答を誘導できる、改良サブユニットワクチンを提供する。
【００２１】
好ましくは、ｈｓｐおよび抗原性ポリペプチドは、非共有結合により結合している。
【００２２】
好ましくは、抗原性ポリペプチドは、病原性生物の抗原、またはその抗原性断片または誘導体である。より好ましくは、抗原性ポリペプチドは、ウイルスまたは細菌の抗原、または、その抗原性断片または誘導体である。好ましい実施形態において、抗原性ポリペプチドは、ＢＤＶＤのようなペスチウイルス、より特定するとＥ１／Ｅ２またはＮＳ３／ＮＳ４ａポリペプチドまたはその断片または誘導体から得られる。
【００２３】
非常に好ましい実施形態において、組成物は、以下を含む方法により得られる。
（ａ）非哺乳動物真核細胞中で抗原性ポリペプチドを発現し、前記細胞は、前記細胞において熱ショック応答の誘導を引き起こす刺激を受けており、そして
（ｂ）１つ以上のｈｓｐに結合した抗原性ポリペプチドを、前記細胞または培養培地から回収することを含む。
【００２４】
従って、本発明はまた、（ａ）少なくとも１つの抗原性ペプチドまたはポリペプチド（群）をコードするヌクレオチド配列を細胞に導入し、前記ヌクレオチド配列は、配列が細胞内に存在すると、ヌクレオチド配列の翻訳が可能となるような様式で細胞に導入されている、（ｂ）細胞を、ペプチドまたはポリペプチドの発現を提供する条件下で培養し、（ｃ）細胞を、その細胞中で熱ショックタンパク質の産生を開始できるストレスに曝露し、そして（ｄ）発現された複合体を回収することを含む、ｈｓｐ−抗原性異種ペプチドまたはポリペプチド複合体を調製する方法を提供する。この手順はまた、当分野で公知の任意の手段により複合体を精製する段階を付随することができる。好ましい実施形態において、前記方法により産生された複合体を、昆虫細胞ポリペプチドから単離する。
【００２５】
本発明の組成物は、抗原性異種ペプチドまたはポリペプチドに対する免疫応答を誘導する治療法に有用である。
【００２６】
本発明はまた、医薬的に許容される担体または希釈剤と共に、免疫原性量の本発明の組成物を含む、医薬組成物を提供する。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明は、動物において病原体に対する免疫適格性を誘導する方法を提供し、前記方法は、動物に、治療有効量の、抗原性ペプチドまたはポリペプチドに結合した非哺乳動物真核ｈｓｐ、および医薬的に許容される担体を投与する段階を含む。
【００２８】
好ましくは、本発明の方法は、任意の簡便な投与形態を使用して、治療有効量の複合体（この複合体は、抗原性分子に共有結合したｈｓｐから実質的に構成される）を含む組成物を投与することにより、感染症の処置または予防が望まれる個体において免疫応答を誘起する方法を含む。種々の投与技術を使用し得、その中には、経口投与、経鼻および他の形の経粘膜投与、非経口技術、例えば、皮下、静脈内および腹腔内注射、カテーテル挿入等がある。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、熱ショックをかけておいた昆虫細胞においてバキュロウイルス系を使用して発現される、ＢＶＤＶ抗原に基づく組換えサブユニットワクチンは、ＢＶＤＶ株（このポリペプチドサブユニットをワクチンの基礎として使用した）にほんのわずかしか関連していない、攻撃株を含む、ＢＶＤＶによるウシおよびヒツジの両方の感染の予防に非常に効果的であるという知見に基づく。これは、多くの異なる株由来のＢＶＤＶ感染に対して広範な防御を与えない、以前に記載されたＢＶＤＶに対するサブユニットワクチンとは完全に対照的である。
【００３０】
この系は、非常に効力のあるワクチン組成物を与えるだけでなく、既存の代替物よりも安価で安全である。
【００３１】
熱ショックタンパク質および抗原性ポリペプチド
熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）は、熱ショックおよび他の形の細胞ストレスに応答して、細胞により合成される。主要なｈｓｐは、ストレスを受けた細胞で非常に高いレベルまで蓄積し得るが、ストレスを受けていない細胞では、低から中程度のレベルで存在する。本発明に有用な熱ショックタンパク質は、（ｉ）細胞がストレスとなる刺激に曝露された場合に、細胞内濃度が増加し、（ｉｉ）他のタンパク質またはペプチドに結合でき、そして（ｉｉｉ）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下または低ｐＨで、結合したタンパク質またはペプチドを遊離できる、タンパク質である。本発明の内容に適した熱ショックタンパク質の具体例は、分子シャペロンと称されるいくつかのクラスのタンパク質を含む。
【００３２】
シャペロニンを含む、シャペロンは、非酵素的手段によりタンパク質フォールディングを促進するポリペプチドであり、それらは、フォールディングされたポリペプチドの任意の構造の化学的修飾は触媒しないが、正しいその構造アラインメントを容易にすることによりポリペプチドの正しいフォールディングを促進する。分子シャペロンは当分野で公知であり、その数個のファミリーが特徴付けられている。分子シャペロンは、種々の生物間で高度に保存されている。シャペロンの例は、ｈｓｐ７０ファミリー（ＤｎａＫ型）、ｈｓｐ６０ファミリー（ＧｒｏＥＬ型）、ＥＲ会合シャペロン、ｈｓｐ９０ファミリー、Ｈｓｃ７０、ＨＳＰ４０ファミリー（ＤｎａＪ）、ミトコンドリアｈｓｐ７０、ミトコンドリアｍ−ＡＡＡおよび酵母Ｙｄｊ１を含む。ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、およびｈｓｐ９０ファミリーのメンバーを使用することが特に好ましく、その細胞内濃度は、ストレス刺激に応答して上昇する。
【００３３】
熱ショックタンパク質は、原核細胞および真核細胞に見られ、免疫原性組成物が、本発明の熱ショック法により産生される場合、ｈｓｐ／抗原複合体に存在するｈｓｐは、原核または真核細胞のいずれの起源でもよい。しかし、ｈｓｐは、非哺乳動物細胞から、より好ましくは昆虫細胞などの非哺乳動物真核細胞から得られることが好ましい。
【００３４】
従って、典型的には、本発明の組成物に存在するｈｓｐは、非哺乳動物真核細胞から得られる。
【００３５】
「非哺乳動物真核細胞」は、哺乳動物細胞を除く、全ての真核細胞である。例えば、非哺乳動物真核細胞は、酵母細胞、真菌細胞、脊椎動物細胞、例えば昆虫細胞および非哺乳動物脊椎動物細胞、例えば両生類細胞を含む。前記細胞中で発現される異種ポリペプチドのグリコシル化、および、哺乳動物細胞の小胞体／ゴルジ体で典型的には実施される他の翻訳後修飾の可能な細胞を使用することが好ましい。しかし、細胞は、哺乳動物細胞で実施されるのと全く同じ翻訳後修飾を実施する必要はない。例えば、昆虫細胞は、哺乳動物細胞の場合よりも、より複雑でない糖を、新規合成アミノ酸鎖に取込む傾向がある。
【００３６】
「非哺乳動物細胞」は、上記の非哺乳動物真核細胞、並びに、原核細胞を含む。原核細胞は、真正細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび異種ポリペプチドの発現に適した任意の他の細菌を含む。原核細胞は、ウイルス抗原よりも、細菌抗原の発現に適切であり得る。本発明の方法に使用し得る「哺乳動物細胞」は、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞および異種ポリペプチドの発現に適した任意の他の哺乳動物細胞型などの細胞系を含む。
【００３７】
本明細書に使用したような「ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体」なる語は、少なくとも１つの抗原性決定基を有する、少なくとも１つの異種ペプチドまたはポリペプチドに結合したｈｓｐを含む、細胞培養液から単離できる、任意の複合体を意味する。好ましくは、結合は、非共有結合を使用して行なわれる。
【００３８】
本明細書に使用したような「非哺乳動物ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体」なる語は、少なくとも１つの抗原性決定基を有する、少なくとも１つの異種ペプチドまたはポリペプチドに結合した非哺乳動物ｈｓｐを含む、非哺乳動物細胞培養液から単離できる、任意の複合体を意味する。好ましくは、結合は、非共有結合を使用して行なわれる。
【００３９】
本明細書に使用したような「異種ポリペプチド」なる語は、細胞に内因性ではない、非哺乳動物細胞などの、すなわち、その細胞のゲノムによりコードされていない、ペプチドまたはポリペプチドを意味する。好ましくは、通常インビボではｈｓｐと複合体を形成せず、通常、非哺乳動物真核細胞ｈｓｐなどのｈｓｐと共精製されないものである。
【００４０】
本明細書に使用したような「ポリペプチド」なる語は、１アミノ酸よりも長い任意のアミノ酸配列を意味し、従って、２つ以上のアミノ酸、典型的には５、１０または２０アミノ酸長を有するペプチドを含み、これは、化学的手段により修飾されていてもされていなくてもよい。本明細書に使用したような「ポリペプチド」なる語はまた、タンパク質も含み、この語は、単鎖ポリペプチド分子、並びに、複数のポリペプチドの複合体（個々の構成成分のポリペプチドは、共有または非共有結合により連結している）を含む。
【００４１】
分子は、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などの、免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用できる場合に、「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５、好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸を含む。分子の抗原性部分は、抗体またはＴ細胞受容体認識に免疫優性である部分であり得るか、または、分子に対する抗体の作成に使用される部分であり得る。
【００４２】
抗原性分子は、当分野で公知のものから選択し得るか、または、抗体またはＭＨＣ分子への結合能または免疫応答産生能により選択し得る。それらは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫等の抗原などの、感染因子に対して免疫応答を誘導する、任意の分子を含む。本発明の好ましい実施形態において、抗原性分子は、（１）ウイルスタンパク質、例えば、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）およびヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）を含む任意の免疫不全ウイルス、フラビウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のようなペスチウイルス、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）およびブタコレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｆｅｖｅｒ  ｓｗｉｎｅ）（ＣＳＦＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｇ型肝炎（ＧＢ）、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピロ−マウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルスおよびポリオウイルスのタンパク質などの、ウイルスのタンパク質、（２）マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリアおよびレジオネラから選択されるが、これに限定されない、抗原性細菌タンパク質、（３）リーシュマニア、コクシジウムおよびトリパノソーマから選択されるが、これに限定されない、抗原性原生動物タンパク質、および（４）クラミジアおよびリケッチアから選択されるが、これに限定されない、抗原性寄生虫タンパク質から得られ得るが、これに限定されない。
【００４３】
Ｃ／Ｅ０、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３／ＮＳ４Ａおよび／またはＮＳ５Ａ／Ｂなどの、ペスチウイルスタンパク質から得られた抗原性ポリペプチドを使用することが特に好ましい。好ましくは、ペスチウイルスは、ＢＶＤＶ（１型および／または２型）およびＢＤＶから選択する。
【００４４】
本発明の組成物は、１つ以上の異なるｈｓｐ／抗原性ポリペプチド複合体を含み得る。例えば、２つ以上の異なる抗原性ポリペプチドを使用して、本発明の免疫原性を増強し得る。２つ以上の抗原性ポリペプチドは、同じタンパク質から得ても異なるタンパク質から得てもよい。ペスチウイルスの場合、構造タンパク質から得られた少なくとも１つの抗原性ポリペプチド、および、非構造ポリペプチドから得られた少なくとも１つの抗原性ポリペプチドを使用することが特に好ましい。例えば、非常に好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ｈｓｐ−ペスチウイルスＥ１／Ｅ２複合体およびｈｓｐ−ペスチウイルスＮＳ３／ＮＳ４Ａ複合体の両方を含む。
【００４５】
１つ以上の抗原が本発明の組成物に存在する場合、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、ｈｓｐ複合体の一部としてヒトまたは動物に投与した場合に、防御免疫応答を提供できるべきである。しかし、抗体応答を誘起せず、そして、ワクチン接種を受けた宿主が、その後、対応する天然病原体に感染した場合に、その特定の抗原に対する免疫応答の発生を予防または減少する、ｈｓｐ／抗原性ポリペプチドを含めることが望ましくあり得る。これは、ワクチン接種を受けた対象に有用なマーカーを提供する。例えば、切断短縮ＢＶＤＶ  ＮＳ３／ＮＳ４Ａ抗原がかかる有用性を提供すると実施例の章に実証されている。
【００４６】
抗原性ポリペプチドに結合したｈｓｐを含む組成物の調製
抗原性ポリペプチドに結合したｈｓｐを含む本発明の組成物は、種々の方法により製造し得る。
【００４７】
例えば、組換え手段、化学合成により得られる、および／または、非哺乳動物真核細胞の細胞溶解液などの天然源由来の、精製または部分精製非哺乳動物真核ｈｓｐを、インビトロで、適切な容器中、組換え手段、化学合成により得られ得る、および／またはウイルス感染哺乳動物細胞または病原性細菌の培養液などの適切な天然源由来の細胞溶解液由来の、１つ以上の抗原性ポリペプチドと合わせ得る。ｈｓｐは、抗原性ポリペプチドと複合体を形成する前に、ＡＴＰまたは低ｐＨで前処理して、目的のｈｓｐと会合し得る全てのペプチドを除去し得る。過剰のＡＴＰを、アピラナーゼ（ａｐｙｒａｎａｓｅ）の添加により調製物から除去し得る。低ｐＨを使用する場合、ｐＨを、中性ｐＨに再調整すべきである。次いで、前処理したｈｓｐを、抗原性ペプチドと、適切な容器中で混合し、１０分間から数時間の間、インキュベートすることにより、抗原性ペプチドに結合させ得る。典型的には、１部のｈｓｐに対して１部より多い抗原性ペプチドの比を使用する。所望により、次いで、混合物を精製して、複合体を形成していない抗原性ペプチドを除去し得る。
【００４８】
本発明の非常に好ましい実施形態において、ｈｓｐ／抗原性ポリペプチド複合体は、抗原性ポリペプチドを、細胞中で、細胞のストレス応答が誘導され、内因性熱ショックタンパク質の細胞内レベルが増加する条件下で発現させることにより調製する。この方法は特に簡便である。なぜなら、ｈｓｐを精製または合成する必要がなく、これは、ｈｓｐが十分に特徴づけられていない細胞を使用する場合には有利であるからである。さらに、内因性ｈｓｐ存在下の細胞内環境での抗原性ポリペプチドの発現により、細胞非含有系で可能であるよりも、より効率的な結合が生じる。
【００４９】
非哺乳動物真核細胞または原核細胞、より好ましくは非哺乳動物真核細胞などの、非哺乳動物細胞を使用することが好ましい。
【００５０】
従って、本発明の好ましい方法において、本発明の組成物は、最初に、目的の抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することにより調製する。ポリヌクレオチドは、細胞中での抗原性ポリペプチドの発現を可能とするような、プロモーター、１つ以上のエンハンサーおよび他の転写／翻訳制御配列などの調節制御配列を含む。例えば、外来分子の投与または実際に熱ショックなどの刺激に応答した、抗原性ポリペプチドの誘導性発現を可能とする、調節制御配列を使用することが望ましくあり得る。これにより確実に、抗原性ポリペプチドの合成は、熱ショックタンパク質レベルが熱ショック刺激によりアップレギュレートされるまでは生じない。別に、抗原性ポリペプチドの時間的な発現制御は、単に、ポリペプチドの発現が望ましい時に、ポリヌクレオチドを細胞に導入することにより行ない得る。
【００５１】
実施例に記載したＥ１／Ｅ２  ＢＶＤＶポリペプチドの場合と同様に、抗原性ポリペプチドが細胞培地に分泌されるように、Ｎ末端分泌シグナルを含めることが簡便であり得る。
【００５２】
好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、バキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはバキュロウイルスなどの感染性ウイルスの一部である。これは簡便な系を提供する。なぜなら、組換えウイルスストックを、使用する準備が整うまで維持および保存できるだけでなく、感染後のタンパク質発現の遅延が、バキュロウイルスなどのウイルスについて知られているので、宿主細胞にショックを与える最適の時間を容易に決定および再現できるからである。望ましくは、抗原性ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、例えば、Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：２１５６〜２１６５の方法に従って、抗原性ペプチドまたはポリペプチドを産生するように遺伝子工学的に処理しておいた、組換えバキュロウイルスに挿入する。多くのウイルス導入ベクターにおいて、ポリペプチドをコードする１つより多くのポリヌクレオチド配列を、同じベクターに挿入することが可能であり、よって、それらを同じ組換えウイルスにより同時発現できる。
【００５３】
本発明の方法は、宿主細胞で一度に１つの抗原性ポリペプチドを産生することに限定されない。目的の種々の抗原性ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを、同じ宿主細胞に導入し得る。ポリヌクレオチドは、同じ核酸分子の一部でも別の核酸分子の一部でもよい。
【００５４】
一旦、目的の抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞に導入されると、細胞を、タンパク質の発現の提供に適切な条件下で培養する。次いで、細胞に熱ショックを与え、内因性ｈｓｐの発現を誘導（またはその発現を増強）する。細胞に熱ショックを与える条件は、一連の宿主細胞について当分野で既知である。例えば、昆虫細胞についての具体的な条件を以下に提供する。
【００５５】
一旦、細胞を、適切な期間、培養し、タンパク質が発現すれば、抗原性ポリペプチド／ｈｓｐ複合体を細胞から回収する。これに関して、複合体は、細胞内および／または細胞培地中に見出し得る。細胞内複合体は、標準的な溶解および精製手順を使用して回収し得る。分泌された複合体は、外部媒体から回収し得、セントリコンチューブを使用した濃縮などの手順により精製し得る。本発明の複合体が培地に分泌されている場合、宿主細胞を、血清非含有培地に適合させることが好ましい。
【００５６】
次いで、回収されたｈｓｐ−／抗原性ポリペプチド複合体を、典型的には、医薬的に許容される担体または希釈剤および／または他の成分と合わせて、医薬組成物／ワクチン組成物を作成する。
【００５７】
多種多様の非哺乳動物真核細胞、例えば酵母細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞および非哺乳動物脊椎細胞を、本発明の方法に記載の宿主細胞として使用し得るが、昆虫細胞の使用が好ましい。好ましくは、昆虫細胞は、鱗翅種、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、例えばＳｆ９およびＳｆ２１細胞系から得られる。
【００５８】
例えば、インビトロで、単に、抗原性タンパク質を、昆虫細胞ｈｓｐに結合することは、感染細胞（容器中）を、感染２４から４８時間後、例えば４３℃の水浴に、約１０分間入れ、細胞に熱ショックを与えることにより、極めて簡単に行なわれ得る。次いで、細胞を、約２７．５℃で、さらに２から２４時間インキュベートすると、結合した組換えタンパク質とｈｓｐの発現が可能となる。７２から９６時間の全体の感染の終了時に、組換えタンパク質培養液を収集する。
【００５９】
種々の適切な宿主細胞で熱ショック応答を誘導する、および、抗原性ポリペプチドの至適発現を可能とする、最適な期間および温度は、例えば、時間経緯を調査することにより、当業者により容易に決定され得るか、または、多くの細胞系についてすでに決定されている。
【００６０】
典型的には、熱ショック応答は、抗原性ポリペプチド発現誘導後に、または、ほぼ同時に、より好ましくはその後に誘導する。
【００６１】
Ｈｓｐ／抗原性ポリペプチド組成物は、所望により、混合リンパ球標的培養アッセイ（ＭＴＬＣ）などの当分野で既知のインビトロアッセイを使用して、ヒトまたは動物対象に投与する前に、免疫原性について試験し得る。
【００６２】
組成物
抗原性ポリペプチドに結合したｈｓｐを含む、本発明の組成物は、好ましくは、種々の成分と配合して、本発明の組成物を作成し得る。好ましくは、組成物は、医薬的に許容される担体または希釈剤と配合して、医薬組成物（これはヒトまたは動物使用用であり得る）を作成する。抗原性ポリペプチドに結合したｈｓｐを含む本発明の組成物はまた、適切な成分と配合し、ワクチン組成物を得ることができる。
【００６３】
従って、本発明は、宿主個体の免疫適格性を増強し、病原体に対する特異的免疫を誘発する、非哺乳動物真核ｈｓｐ−抗原性ペプチドまたはポリペプチド複合体を含む、医薬／ワクチン組成物を提供する。本発明の治療措置および医薬組成物を下記する。これらの組成物は、感染症の開始および進行を予防する能力があると考えられている。
【００６４】
一般に、本発明の医薬組成物および／またはワクチン組成物は、治療有効量の、抗原性ポリペプチドに結合したｈｓｐを含む。
【００６５】
「医薬的に許容される担体または希釈剤」なる語は、生理的に耐容性であり、典型的には、ヒトに投与した場合に、アレルギー反応または同じような望ましくない反応、例えば、急性胃蠕動異常亢進、めまい等を生じない、分子実体および組成物を意味する。好ましくは、本明細書に使用したような、「医薬的に許容される」なる語は、動物、より特定するとヒトにおける使用について、連邦規制当局または州政府により認可、または、米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」なる語は、化合物と共に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを意味する。前記医薬担体は、水、および、石油、動物、植物または合成起源の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む、油などの無菌液体であり得る。水または可溶性食塩水溶液およびデキストロースおよびグリセロール水溶液を、好ましくは、特に注射溶液用の担体として使用する。適切な医薬担体は、Ｍａｒｔｉｎ、レミントンの医薬科学、第１８版、ペンシルベニア州イーストン所在Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社（１９９０）に記載されている。
【００６６】
本明細書に使用したような「治療有効量」なる語は、少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは完全に、動物免疫系を刺激して、抗原性決定基に対する免疫記憶を生じるに十分な量を意味する。
【００６７】
一般に、本発明により考えられるのは、治療有効量の本発明を、医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と共に含む、医薬組成物である。前記組成物は、種々の緩衝液内容物（例えば、トリスＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、洗浄剤および可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）および増量剤（例えばラクトース、マンニトール）などの添加剤、物質を、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の粒子状ポリマー化合物の調製物に、またはリポソームに取込むことを含み得る。ヒアルロン酸も使用し得る。前記組成物は、物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、および、インビボでの本発明の複合体のクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えばＭａｒｔｉｎ、レミントンの医薬科学、第１８版（１９９０、ペンシルベニア州１８０４２イーストン所在Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社）１４３５〜１７１２項参照（これは参考として本明細書に取り込む）。組成物は、液体形で調製しても、または乾燥粉末、例えば凍結乾燥形でもよい。
【００６８】
医薬組成物は、注射投与用でも、または、経口、肺、鼻腔または他の投与形態用に調製してもよい。本発明に従って調製する複合体の投与形態は、生理的条件下での複合体の安定性、必要な免疫応答の強度、病原体の種類等の因子に必然的に依存する。
【００６９】
好ましくは、複合体は、標準的な手順、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼、脳室内、頭蓋内、関節内、脊髄内、大槽内、腹腔内、頬側、直腸、膣、鼻腔内、経口で、またはエアゾール投与により投与する。
【００７０】
ワクチンはまた、本発明の１つ以上のｈｓｐ／抗原性ポリペプチド複合体から調製し得る。有効成分として免疫原性複合体を含むワクチンの調製は、当業者には公知である。典型的には、前記ワクチンは、注射液として、液体の溶液または懸濁液として調製し得るか、注射前の、液体の溶液または懸濁液に適した固体形としても調製し得る。調製物はまた乳化しても、タンパク質をリポソーム内に封入してもよい。活性な免疫原性成分は、しばしば、医薬的に許容され、有効成分と適合性である賦形剤と混合する。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、または類似物、およびその組合せである。
【００７１】
さらに、所望であれば、ワクチンは、少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、および／またはワクチンの効力を増強するアジュバントを含み得る。
【００７２】
本明細書に使用するような「アジュバント」なる語は、少なくとも１つの抗原性決定基を有するペプチドまたはポリペプチドに結合したｈｓｐを含む組成物に対する免疫応答を増強する、化合物または混合物を意味する。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織貯蔵庫として、また、免疫応答を非特異的に増強するリンパ系アクチベーターとして作用できる。
【００７３】
効果的であり得るアジュバントの例は、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと称する）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称する）、およびＲＩＢＩ（これは細菌から抽出した３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中に含む）を含むがこれに限定されない。
【００７４】
アジュバントおよび他の因子のさらなる例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（アルム）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水滴型エマルション、水中油滴型エマルション、ムラミルジペプチド、細菌エンドトキシン、リピドＸ、コリネバクテリウム・パルブム（プロピオノバクテリウム・アクネス）、パラ百日咳菌、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマーまたは他の合成アジュバントを含む。前記アジュバントは、種々の起源から、例えば、メルクアジュバント６５（ニュージャージー州ローウェー所在Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社）またはフロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（ミシガン州デトロイト所在ディフコラボラトリーズ）から商業的に入手できる。
【００７５】
典型的には、アムフィゲン（水中油滴型）、Ａｌヒドロゲル（水酸化アルミニウム）、またはアムフィゲンとＡｌヒドロゲルの混合物などのアジュバントを使用する。水酸化アルミニウムのみが、ヒト使用に認可されている。
【００７６】
免疫原とアジュバントの比率は、両方が効果的な量で存在する限り、広範囲におよび変化し得る。例えば、水酸化アルミニウムは、ワクチン混合物の約０．５％（Ａｌ2Ｏ3を基に）の量で存在し得る。簡便には、ワクチンは、０．２から２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５から５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１５μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度の免疫原を含むように製剤化される。
【００７７】
製剤化後、ワクチンを、無菌容器に取込み得、次いでこれに封をし、低温、例えば４℃で保存するか、または、凍結乾燥し得る。凍結乾燥により、安定形で、より長期間保存できる。
【００７８】
アジュバントの効力は、種々のアジュバントを含むワクチンへの本発明の免疫原性複合体の投与から生じる、この複合体に対して指向される抗体の量を測定することにより決定し得る。
【００７９】
ワクチンは、非経口的に、注射により、例えば皮下または筋肉内で簡便に投与する。他の投与形態に適したさらなる製剤は、坐剤、およびある場合では、経口製剤を含む。坐剤では、伝統的な結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み得、前記坐剤は、０．５％から１０％、好ましくは１％から２％の範囲の有効成分を含む混合物から形成し得る。経口製剤は、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の、このように通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤または散剤の形をとり、１０％から９５％、好ましくは２５％から７０％の有効成分を含む。ワクチン組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥物質は、投与前に、例えば懸濁液として復元し得る。復元は、好ましくは、緩衝液中で行なう。
【００８０】
患者への経口投与用のカプセル剤、錠剤および丸剤は、例えば、オイドラジット「Ｓ」、オイドラジット「Ｌ」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む、腸溶性コーティングを施し得る。
【００８１】
本発明の複合体は、中性または塩形としてワクチンに製剤化し得る。医薬的に許容される塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成）を含み、これは、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または、酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマレイン酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄などの無機塩基から、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどの有機塩基から得られ得る。
【００８２】
他の有効成分
本発明の組成物は、さらに、主な目的が抗原として作用することではなく、いくつかの他の態様において免疫応答を調節することである、ｈｓｐおよび／または生物学的に活性な分子に結合していない、抗原性ポリペプチドを含み得る。動物またはヒト対象の免疫系を調節する生物学的分子の例は、サイトカインを含む。
【００８３】
「サイトカイン」なる語は、免疫応答を媒介する他の細胞の機能に影響を及ぼす任意の分泌ポリペプチドを意味する。サイトカインの数例は、インターロイキン−１α（Ｉｌ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ種々）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）を含むがこれに限定されない。
【００８４】
治療使用
本発明の組成物は、感染症に対して動物およびヒトをワクチン接種するのに使用し得る。「動物」なる語は、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ラマを含む家畜、イヌおよびネコなどの家庭のペット、および霊長類などの哺乳動物、ニワトリ、ガチョウおよびアヒルなどの鳥類、および、ワニおよびアリゲータなどのハ虫類を含む。
【００８５】
従って、本発明は、病原体に対する、動物またはヒトの防御免疫応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記動物またはヒトに、有効量の本発明の組成物を投与することを含む。
【００８６】
従って、本発明はまた、動物の免疫適格性、および、病原体に対するその免疫エフェクター細胞の活性を増強する方法も提供する。前記方法は、典型的には、昆虫細胞ｈｓｐ抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体の治療有効量を含む組成物を投与する段階を含み、前記複合体は、実質的に、異種ペプチドまたはポリペプチド抗原性分子に結合したｈｓｐからなる。
【００８７】
非常に好ましい実施形態において、本発明は、ペスチウイルス、好ましくはウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、より好ましくはＢＶＤＶ  Ｅ１／Ｅ２および／またはＮＳ３／ＮＳ４Ａおよび／またはその抗原性断片から得られた、ペプチドおよびポリペプチドから調製したｈｓｐ複合体を提供する。ｈｓｐは、任意の起源から得られ得るが、好ましくは、非哺乳動物真核細胞から得られる。
【００８８】
本明細書に使用したような「ワクチン」なる語は、動物に投与した場合に、抗原性決定基に対する免疫応答を刺激できる、少なくとも１つの抗原性決定基を有する、ペプチドまたはポリペプチドに結合したｈｓｐを含む、本発明の任意の組成物を意味することを指す。ワクチンなる語は、必ずしも、組成物が、完全な防御応答を提供するわけではないことを意味することを理解する。どちらかといえば治療効果では十分である。
【００８９】
「免疫応答」なる語は、抗原での刺激後に動物で生じ、抗原を動物から排除することに向けられる、任意の細胞過程を意味する。免疫応答は、典型的には、リンパ性および／または食作用性であるとして特徴づけられる、１つ以上の細胞個体群により媒介される。
【００９０】
導入されたｈｓｐ抗原性ペプチドまたはポリペプチド複合体に対して生じた免疫応答は、複合体のペプチドまたはポリペプチド上に位置する抗原性決定基のアミノ酸構成により指示される。前記決定基は、体液性または細胞性抗原性領域を規定し得る。任意の特定の作用機序に限定することなく、昆虫細胞ｈｓｐ−抗原性ペプチドまたはタンパク質複合体により生じる免疫応答は、好ましくは、体液性および細胞性免疫応答の両方を含む。細胞性免疫応答が行なわれる場合、それは、好ましくは、より具体的には細胞毒性Ｔ細胞カスケードにより、Ｔ細胞カスケードに至る。
【００９１】
本明細書に使用したような「細胞毒性Ｔ細胞」は、その細胞表面上に主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）複合体を有し、細胞内病原体で感染した、標的細胞に標的化し、溶解できる、細胞表面糖タンパク質マーカーＣＤ８＋を発現している、任意のＴリンパ球を意味する。
【００９２】
本発明の方法により処置または予防し得る疾病は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および寄生虫を含むがこれに限定されない、病原体により引き起こされる。
【００９３】
本発明の方法により処置または予防できるウイルス症は、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）およびヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）を含む免疫不全ウイルス、フラビウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のようなペスチウイルス、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）およびブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピロ−マウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルスおよびポリオウイルスにより引き起こされるものを含むがこれに限定されない。
【００９４】
本発明の方法により処置または予防できる細菌症は、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリアおよびレジオネラを含むがこれに限定されない、細菌により引き起こされる。
【００９５】
本発明の方法により処置または予防できる原生動物症は、リーシュマニア、コクシジウムおよびトリパノソーマを含むがこれに限定されない、原生動物により引き起こされる。
【００９６】
本発明の方法により処置または予防できる寄生虫症は、クラミジアおよびリケッチアを含むがこれに限定されない、寄生虫により引き起こされる。
【００９７】
非常に好ましい実施形態によると、抗原性ＢＶＤＶペプチドまたはポリペプチドに結合したｈｓｐを含む、ウシの免疫応答を誘導できる、ウシの群れのＢＶＤＶ感染に対するサブユニット治療薬が提供される。好ましくは、ｈｓｐは、抗原性ＢＶＤＶペプチドまたはポリペプチド（群）に非共有結合している。
【００９８】
全ての現在のペスチウイルス治療薬の主な目的は、ウシの群れにおける、ウイルスの経胎盤伝染を予防し、従って、感染周期を破壊できることに基づく。胎児防御係数は、ＢＶＤＶワクチンの効力の唯一の客観的な測定値である。将来のＢＶＤＶワクチン登録の実証された必要条件として海外では次第に採用が増えている。
【００９９】
本発明のこの実施形態の驚くべき特徴は、ウシにおいて、ＢＶＤＶ感染前にワクチンを使用して、１００％の防御が観察されたことである。このような防御は、生ウイルス攻撃へのほんの短期間の曝露後に、ＢＶＤＶに対する異常な程高いレベルの中和抗体から得られた。サブユニットワクチンは、出願人によって以前には決して観察されなかったレベルの中和抗体を提供する。さらに、サブユニットワクチンは、驚くべきほど効果的な記憶細胞毒性Ｔ細胞応答を提供する。さらに、サブユニットワクチンは、初めて、種雌から胎児へのウイルスの経胎盤移行の１００％の効果的な阻害を提供する。
【０１００】
上記に加えて、本発明のこの実施形態に従って製造したワクチンは、他のＢＶＤＶワクチン、特にＢＶＤＶサブユニットワクチンよりも優る、特定の利点を有する。生弱毒化ワクチンまたは全生物ワクチンを使用することの欠点の１つは、ワクチン製造中の細胞培養液の感染の可能性である。これに対し、サブユニットワクチンは、非感染性である。特に、本発明のサブユニットワクチンは、製造に血清を必要とせず、従って、ウシ胎児血清などの血清製品の取扱いに関連した危険性が軽減される。
【０１０１】
これらのワクチンの別の利点は、ＢＶＤＶに対して、ウシなどの市販の動物の群れをワクチン接種する場合の、その安全性である。本発明のサブユニットワクチンは、感染（生弱毒化ウイルス）またはウイルスによる動物細胞の感染の危険性なく、動物で安全に使用できる。従って、妊娠動物を含む全ての動物での使用に安全である。
【０１０２】
本発明に従って製造したＢＶＤＶサブユニットワクチンのさらなる利点は、サブユニットワクチンの製造における費用効率性である。高収率の抗原性タンパク質を得ることが可能である。特に、本発明の好ましい実施形態において、サブユニットワクチンは、ベクターバキュロウイルスを使用して、昆虫細胞培養液を感染して製造され、ＢＶＤＶに対する効果的なサブユニットワクチンを製造する。得られたワクチンは、はるかに広範囲の抗原性的に多様なＢＶＤＶ単離株に対して効力を有する。
【０１０３】
ＢＶＤＶからの任意の抗原性領域を、同定したサブユニットワクチンに使用し得る。好ましくは、抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、主な免疫原性領域Ｅ０、Ｅ１／Ｅ２、およびＮＳ３／ＮＳ４Ａから得られる。本発明のこの実施形態の非常に好ましい形態において、サブユニットワクチンは、ＢＶＤＶの単離株由来の切断短縮ＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質を使用して製造する。驚くべきことに、このＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質抗原は、サブユニットワクチンでワクチン接種したウシの血清中に、検出可能な範囲の抗体の産生を引き起こさない。従って、ＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質をサブユニットワクチンに取込むことは、ワクチン接種したウシの群れの中の感染ウシを区別する有用なマーカーを提供する。ワクチン中にマーカーを含め、ワクチン接種した動物から感染動物を区別することは、欧州および米国における好ましい慣行である。従って、本発明のサブユニットワクチンは、ワクチン接種した動物の群れ中の感染動物を区別する優れたマーカーを提供する。
【０１０４】
投与
非経口送達
本明細書に提供した化合物は、医薬的に許容される無毒性の賦形剤および担体と混合することにより、医薬組成物に製剤化でき、皮下、静脈内および腹腔内注射などの任意の非経口技術により投与できる。さらに、製剤は、所望により、１つ以上のアジュバントを含み得る。
【０１０５】
経口送達
本明細書で使用に考えられるのは、経口固体投与形であり、これは、一般的に、Ｍａｒｔｉｎ、レミントンの医薬科学、第１８版（１９９０、ペンシルベニア州１８０４２イーストン所在Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）の第８９章に記載され、これは本明細書に参考として取込む。固体投与形は、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ、カシェ剤またはペレット剤を含む。また、リポソームまたはプロテイノイド封入を使用して、本発明の組成物を製剤化し得る（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されたプロテイノイドミクロスフィア）。リポソーム封入を使用し得、リポソームは、種々のポリマーで誘導体化し得る（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬の可能な固体投与形の記載は、Ｍａｒｓｈａｌｌ、現代医薬、第１０章、ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編（１９７９）（本明細書に参考として援用する）に記載されている。一般に、製剤は、ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体（またはその化学修飾形）、および、胃の環境に対する防御および腸内での生物学的活性物質の放出を可能とする不活性成分を含む。
【０１０６】
また、特に考えられるのは、上記の誘導体化ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体の経口投与形である。これに関して、複合体は、経口送達が効果的であるように化学的に修飾し得る。一般に、考えられる化学修飾は、少なくとも１つの部分の、タンパク質（またはペプチド）分子それ自体への付着であり、ここでの前記部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害、および（ｂ）胃または腸から血流への取込みを可能とする。また、タンパク質の全体的な安定性の増加、および、生体中の循環時間の増加も望まれる。前記部分の例は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンを含む。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、１９８１、上記、Ｎｅｗｍａｒｋら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５〜１８９（１９８２）。使用し得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカンである。上記したような医薬使用に好ましいのは、ポリエチレングリコール部分である。
【０１０７】
ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体の、放出の場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、または回腸）または大腸であり得る。当業者は、胃では溶けないが、十二指腸または腸中のどこかに物質を放出する、入手可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、複合体の保護により、または、腸中などの胃の環境を超えて生物学的活性物質を放出することにより、胃の環境に対する有害な作用を回避する。
【０１０８】
胃での完全な抵抗性を確実にするために、少なくともｐＨ５．０まで不透過性のコーティングが不可欠である。腸溶性コーティングとして使用される、より一般的な不活性成分の例は、酢酸トリメリト酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、オイドラジットＬ３０Ｄ、アクアテリック、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、オイドラジットＬ、オイドラジットＳ、およびシェラックである。これらのコーティングは混合フィルムとして使用し得る。
【０１０９】
コーティングまたはコーティングの混合物も、錠剤に使用でき、これは、胃に対して防御するためではない。これは、糖衣、または、錠剤をより嚥下し易くするコーティングを含み得る。カプセル剤は、乾燥治療薬、すなわち散剤の送達のための、硬殻（例えばゼラチン）からなり得、液体形では、軟ゼラチン殻を使用し得る。カシェ剤の殻材料は、デンプンまたは他の食用の紙であり得る。丸剤、ロゼンジ、成形錠剤または錠剤粉砕物では、湿気を集結する技術を使用できる。
【０１１０】
治療薬は、粒子サイズ約１ｍｍの顆粒またはペレットの形で、細かい複数の粒子として、製剤中に含めることができる。カプセル剤投与用の物質の製剤化は、粉末として、軽く圧縮したプラグとして、またはさらには錠剤としてであり得る。治療薬は圧縮によっても調製できる。
【０１１１】
着色剤および香味剤も含め得る。例えば、ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体を製剤化し得（例えばリポソームまたはミクロスフィア封入により）、次いでさらに、着色剤および香味剤を含む冷蔵飲料などの食用製品に含め得る。
【０１１２】
不活性物質を用いて、治療薬を希釈またはその容量を増加し得る。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを含み得る。特定の無機塩も、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む、充填剤として使用し得る。いくつかの商業的に入手できる希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
【０１１３】
崩壊剤も、治療薬の固体投与形への製剤化に含め得る。崩壊剤として使用する物質は、デンプンに基づいた市販の崩壊剤であるＥｘｐｌｏｔａｂを含む、デンプンを含むがこれに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトも全て使用し獲る。別の形の崩壊剤は、不溶性のカチオン交換樹脂である。粉末ガムも崩壊剤としておよび結合剤として使用し得、これらは、寒天、カラヤまたはトラガカントなどの粉末ガムを含み得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【０１１４】
結合剤を、治療剤と共に保持して、硬錠剤を形成するために使用し得、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンなどの天然物の物質を含み得る。他は、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方共、アルコール溶液に使用して、治療薬を顆粒化できる。
【０１１５】
抗摩擦剤を、治療薬の製剤に含めて、製剤過程中の粘着を防止し得る。潤滑剤を、治療薬と型壁の間の層として使用し得、これらは、ステアリン酸（そのマグネシウムおよびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスを含み得るがこれに限定されない。可溶性潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、およびカーボワックス４０００および６０００も使用し得る。
【０１１６】
製剤中の複合体の流動特性を向上し、圧縮中の再編を補助する、粘滑剤も添加し得る。粘滑剤は、デンプン、タルク、発熱性シリカおよび水和ケイ素アルミン酸塩を含み得る。
【０１１７】
治療薬の水性環境への溶解を補助するために、界面活性剤を湿潤剤として加え得る。界面活性剤は、アニオン性洗浄剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムを含み得る。カチオン性洗浄剤も使用し得、塩化ベンズアルコニウムまたは塩化ベンゼトミウムを含み得る。製剤中に界面活性剤として含めることのできる、可能性ある非イオン性洗浄剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシ４０ステアレート、ポロオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、複合体の製剤中に、単独で、または、種々の比の混合物として存在し得る。
【０１１８】
複合体の取込みを増強する可能性のある添加剤は、例えば、脂肪酸のオレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。
【０１１９】
放出制御製剤が望ましくあり得る。複合体を、拡散または漏出機序により放出を可能とする、不活性マトリックス、すなわちガムに取込み得る。ゆっくりと変性するマトリックスも製剤に取込み得る。この治療薬の別の形の制御放出は、Ｏｒｏｓ治療系（Ａｌｚａ社）に基づいた方法による、すなわち、薬物を、水が侵入でき、浸透圧作用により１つの小さな開口を通って薬物を押出すことができる、半透過性の膜に封入する。いくつかの腸溶性コーティングも、遅延放出効果を有する。
【０１２０】
他のコーティングも、製剤化に使用し得る。これらは、コーティングパンに適用できる種々の糖を含む。治療剤はまた、フィルムでコーティングした錠剤とし、この場合に使用する物質は、２つの群に分類される。第一は、非腸溶性物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ナトリウムカルボキシ−メチルセルロース、プロビドンおよびポリエチレングリコールを含む。第二の群は、一般的にはフタル酸のエステルである、腸溶性物質からなる。
【０１２１】
物質の混合物を使用して、最適なフィルムコーティングを施し得る。フィルムコーティングは、パンコーターまたは流動床で、または圧縮コーティングにより実施し得る。
【０１２２】
肺送達
本明細書では、複合体の肺送達も考える。ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体は、吸入中に動物の肺に送達され、肺上皮裏打ちを横切って血流に侵入し得る。
【０１２３】
本発明の実施における使用には、噴霧器、計量式吸入器、および粉末吸入器（全て、当業者には公知である）を含むがこれに限定されない、治療製品の肺送達用に設計された、多種多様の機械装置が考えられる。
【０１２４】
本発明の実施に適した商業的に入手できる装置の数個の具体例は、ミズーリ州セントルイス所在Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ社製のＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器、コロラド州エングルウッド所在のＭａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製のＡｃｏｒｎＩＩ噴霧器、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク所在グラクソ社製のＶｅｎｔｏｌｉｎ計量式吸入器、および、マサチューセッツ州ベッドフォード所在Ｆｉｓｏｎｓ社製のＳｐｉｎｈａｌｅｒパウダー吸入器である。
【０１２５】
前記の全装置は、複合体の施薬に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は、使用する装置の型に特化し、治療法に有用な通常の希釈剤、アジュバントおよび／または担体に加えて、適切な噴射物質の使用も含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフィア、封入複合体、または他の型の担体の使用も考えられる。化学修飾したタンパク質も、化学修飾の型または使用する装置の型に応じて、種々の製剤中で調製し得る。
【０１２６】
噴霧器（ジェットまたは超音波）での使用に適した製剤は、典型的には、溶液１ｍｌあたり、約０．１から２５ｍｇの生物活性タンパク質の濃度で、水中に懸濁した複合体を含む。製剤はまた、緩衝剤および簡単な糖（例えば、タンパク質安定化および浸透圧の調整のために）を含み得る。噴霧製剤はまた、エアゾールの形成における溶液の微粒化により引き起こされる、表面の誘導するタンパク質の凝集を減少または防止するための、界面活性剤を含み得る。
【０１２７】
計量式吸入装置で使用するための製剤は、一般に、界面活性剤の助けをかりて、噴射剤に懸濁した複合体を含む、細かく分割した粉末を含む。噴射剤は、この目的に使用される任意の慣用的な物質、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはその組合せを含む、炭化水素であり得る。適切な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタンおよび大豆レシチンを含む。オレイン酸も、界面活性剤として有用であり得る。
【０１２８】
粉末吸入装置から分配する製剤は、複合体を含む、細かく分割した乾燥粉末を含み、また、装置からの粉末の分配を容易にする、例えば、ラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールなどの増量剤を、例えば製剤の５０から９０重量％含み得る。タンパク質（または誘導体）は、最も有利には、遠位の肺への最も効率的な送達のためには、１０ミクロン未満、最も好ましくは０．５から５ミクロンの平均粒子サイズを有する粒子形で調製すべきである。
【０１２９】
鼻腔送達
複合体の鼻腔送達も考えられる。鼻腔送達により、製品を肺に沈着する必要なく、鼻に治療製品を投与した直後に、血流へのタンパク質の透過が可能となる。鼻腔送達用の製剤は、デキストランまたはシクロデキストランを有するものを含む。
【０１３０】
他の化合物を用いた投与
本発明の治療措置および医薬組成物は、サイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ、または他のサイトカインに影響を及ぼす免疫細胞を含むがこれに限定されない、追加の免疫応答増強剤または生物学的応答修飾剤と共投与し得る。本発明のこの態様によると、ｈｓｐと抗原性分子の複合体は、治療有効量の１つ以上のこれらのサイトカインとの併用療法で投与する。本明細書に使用したような「サイトカイン」なる語は、免疫応答を媒介する他の細胞の機能に影響を及ぼす、任意の分泌ポリペプチドを意味するものである。従って、複合体は、腫瘍に対して指向される免疫応答を増強するサイトカインと共投与できると考えられる。好ましいサイトカインは、インターロイキン−１α（Ｉｌ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ種々）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）を含むがこれに限定されない。
【０１３１】
さらに、慣用的な抗体を、ストレスタンパク質−ペプチド複合体と共投与し得る。しかし、適切な抗生物質の選択は、問題の疾病に依存する。
【０１３２】
用量
全ての上記の分子について、さらなる研究を実施すれば、種々の患者における種々の容態の処置に適切な用量レベルに関する情報が得られ、当業者は、レシピエントの治療内容、年齢および健康状態を考慮して、適切な用量を確認することができる。
【０１３３】
典型的には、複合体は、その後の攻撃後に、動物において病原体に対する免疫応答が開始されるに十分な量で投与すべきである。投与する昆虫細胞ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体の量は、好ましくは、１回の投与あたり、動物の体重１ｋｇあたり、約０．１〜１．０μｇ、最も好ましくは１回の投与あたり、動物の体重１ｋｇあたり、約０．２〜０．５μｇの範囲の複合体である。
【０１３４】
典型的な用量は、約７５ｋｇの体重のヒト対象について、約０．５から約５０μｇの範囲であると考えられる。さらに、免疫応答の強度は、複合体を個体に繰返し投与することにより増強し得ると考えられる。従って、一例において、動物は、ほぼ１ヶ月の間隔で、少なくとも２用量の昆虫細胞ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体を服用し得る。必要であれば、免疫応答は、その後の複合体の投与により、後日にブースター投与し得る。しかし、最適な用量および免疫化措置は、当業者による慣用的な実験により見出され得ると考えられる。
【０１３５】
キット
本発明はまた、本発明の治療措置を実施するためのキットを提供する。前記キットは、１つ以上の容器に、治療的または予防的に有効な量の昆虫細胞ｈｓｐ−抗原性ペプチド／ポリペプチド複合体を医薬的に許容される形で含む。本発明のキットのバイアル中のｈｓｐ−抗原性分子複合体は、医薬的に許容される溶液の形、例えば、無菌食塩水、デキストロース溶液、または緩衝溶液、または他の医薬的に許容される無菌液体と組合せた形であり得る。別に、複合体は凍結乾燥または乾燥し得、この場合、キットは、所望によりさらに、容器に、複合体を復元し、注射用の溶液を形成するための、医薬的に許容される好ましくは無菌溶液（例えば食塩水、デキストロース溶液等）を含む。
【０１３６】
別の実施形態において、本発明のキットはさらに、複合体を注射するための、好ましくは無菌形でパッケージングされた、針またはシリンジ、および／またはパッケージングされたアルコールパッドを含む。臨床医または患者によるｈｓｐ−抗原性分子複合体の投与の説明書を所望により含める。
【０１３７】
（本発明を実施する最善の形態（群））
本発明のさらなる特徴は、以下の非制限的な図面および実施例により完全に記載する。しかし、この記載は、単に、本発明を例示するために含めることを理解する。いずれにしても、上記に示したような本発明の広い記載に関する制限としては理解すべきでない。
【０１３８】
分子クローニング法および以下の実施例に明白に記載していないタンパク質化学法は、文献に報告され、当業者には公知である。当分野の技術内の、慣用的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を記載した一般的な教科書は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｇｌｏｖｅｒ（１９８５）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の現在のプロトコルを含んだ。
【０１３９】
実施例１
組換えバキュロウイルスの製造および組換えペスチウイルスタンパク質の発現
ペスチウイルス
ペスチウイルス単離株Ｔｒａｎｇｉｅ−Ｄ１０、ＢｅｇａおよびＣｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅを単離し、エリザベス・マッカーサー農業研究所（ＥＭＡＩ）のウイルス学部門で特徴づけられた。ＢＶＤＶ単離株のＴｒａｎｇｉｅＤ１０およびＢｅｇａは、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）１型ペスチウイルスを示すが、Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ単離株は、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）単離株である。
【０１４０】
サブユニットワクチンに使用されるオーストラリアウイルス単離株のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号、および、参照株ＢＶＤＶ  ＮＡＤＬ（寄託番号Ｍ３１１８２）と比較して使用されるゲノム断片の相対的位置は、以下の通りであった。Ｂｅｇａ（ＡＦ０４９２２１）Ｅ０部分配列は、全ウイルスゲノムに対して、１１７１〜１８９７をコードし、Ｔｒａｎｇｉｅ（ＡＦ０４９２２２）Ｅ０部分配列は、全ウイルスゲノムに対して、１１７１〜１８９７をコードし、Ｂｅｇａ（ＡＦ０４９２２５）Ｅ１およびＥ２部分配列は、全ウイルスゲノムに対して、２２５３〜３４９０をコードし、Ｔｒａｎｇｉｅ（ＡＦ０４９２２３）Ｅ１およびＥ２部分配列は、全ウイルスゲノムに対して、２２９０〜３４９０をコードし、Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ（ＡＦ０３７４０５、Ｂｅｃｈｅｒら、１９９８）Ｅ１およびＥ２部分配列は、全ウイルスゲノムに対して、２３６０〜３５１０をコードし、Ｂｅｇａ（ＡＦ０５２３０３）ＮＳ３、ＮＳ４ａ部分配列は、全ウイルスゲノムに対して、５４１６〜７５９１をコードし、Ｔｒａｎｇｉｅ（ＡＦ０５２３０４）ＮＳ３、ＮＳ４ａ部分配列は、全ウイルスゲノムに対して、５６７５〜７５２８をコードする。
【０１４１】
ウイルスＲＮＡの抽出
ｃＤＮＡは、標準的な技術を使用して、主要な全ての免疫原性領域（Ｅ０、Ｅ１／Ｅ２およびＮＳ３／ＮＳ４Ａ）について、オーストラリアＢＶＤＶ単離株から転写した。簡潔には、ウイルスＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＲＮＡｚｏｌ（Ｂｉｏｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）またはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ギブコＢＲＬ）を使用して、感染細胞および／またはウイルスペレットから抽出した。乾燥したＲＮＡペレットを、１０μｌまたは２０μｌの無菌ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）（シグマ）処理水中で復元した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。
【０１４２】
逆転写して、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３およびＥ０免疫原性領域のｃＤＮＡを作成
Ｅ１／Ｅ２のｃＤＮＡを、表１に記載したようなＥ１／Ｅ２逆転写酵素（ＲＴ）混合物の調製により、逆転写により作成した。チューブを、ＦＴＳ−９６０サーマルシークエンサー（コルベット・リサーチ）中で３７℃で５０分間、次いで７０℃で１０分間加熱して、逆転写酵素を変性した。ＲＴ混合物を、５℃で２時間冷却し、その後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを増幅した。
【０１４３】
ＮＳ３のｃＤＮＡも、表２に記載のＮＳ３ＲＴ混合物の調製により、ＲＴにより調製した。チューブを、ＦＴＳ−９６０サーマルシークエンサー中で３７℃で５９分間、次いで９４℃で１５分間加熱し、逆転写酵素を変性し、その後、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。
【０１４４】
Ｅ０のｃＤＮＡを、表３に記載のようなＲＴ混合物の調製により作成した。チューブを、ＦＴＳ−９６０サーマルシークエンサー中で３７℃で５０分間、次いで７０℃で１０分間加熱し、逆転写酵素を変性した。次いで、ＲＴ混合物を５℃で２分間冷却し、その後、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。
【０１４５】
【表１】
0003803293.tif 000002
【０１４６】
【表２】
0003803293.tif 000003
【０１４７】
【表３】
0003803293.tif 000004
【０１４８】
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー
ＢＶＤＶ単離株のＴｒａｎｇｉｅおよびＢｅｇａのＰＣＲプライマーは、海外のペスチウイルス単離株の発表された配列の保存領域を基にした。ＢＤＶ単離株のＣｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅのプライマーは、その発表された配列（Ｂｅｃｈｅｒら、１９９８）を使用して作成した。プライマーは、コンピュータープログラム「プライマーデザイナー−バージョン２．０」（科学および教育ソフトウェア、１９９０、１９９１）を使用して設計し、ｃＤＮＡの定方向クローニングを可能とするために取り込まれた制限部位を含んだ（表４および５）。
【０１４９】
ポリメラーゼ連鎖反応によるｃＤＮＡの増幅
Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３／ＮＳ４ＡおよびＥ０からのｃＤＮＡの増幅は、類似の手順に従った。増幅反応は、全容量１００μｌで実施した。２０μｌのＲＴに、８ｍｌの×１０ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３、ベーリンガーマンハイム）、７．２ｍｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（３．３ｍＭの最終濃度のＭｇＣｌ2を与える、シグマ、分子生物学的等級）、２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム）および１μｌの各センスおよびアンチセンスプライマー（１ｍｌあたり３０ｐｍｏｌ）を加えた。
【０１５０】
Ｅ１／Ｅ２ｃＤＮＡを、最初に、９５℃で２分間変性し、次いで、９５℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で１分間伸長を３５サイクル実施した。７２℃で５分間の最終伸長段階を含め、その後、５℃で２分間チューブを冷却した。
【０１５１】
【表４】
0003803293.tif 000005
【０１５２】
【表５】
0003803293.tif 000006
【０１５３】
Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ（ＢＤＶ）ＰＣＲ混合物は、ＭｇＣｌ2を必要とせず、僅か１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼが増幅に必要であった。
【０１５４】
Ｅ０増幅を、最初の変性段階が９４℃で２分間である以外は、Ｅ１／Ｅ２に記載の通りに実施した。
【０１５５】
ＮＳ３ｃＤＮＡの増幅は、逆転写反応からの全２０μｌに、３μｌ×１０ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３：ベーリンガーマンハイム）、２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（最終濃度３ｍＭのＭｇＣｌ2を与える：シグマ、分子生物学的等級）、１〜２単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム）および１μｌの各センスおよびアンチセンスプライマー（１ｍｌあたり２５〜３０ｐｍｏｌ）を加えたものを使用して、全容量５０μｌ中で実施した。９４℃で３分間の最初の変性段階後に、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長を３０サイクル実施した。チューブを４℃で冷却する前に、７２℃で５分間の最終伸長段階を含めた。
【０１５６】
ＰＣＲ断片のクローニング
ＰＣＲ産物を、製造業者の指示に従って、ＰＣＲ  ＳＰＩＮＣＬＥＡＮ（登録商標）カラム（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）で精製した。ＰＣＲ反応により、必要な産物に加えて、非特異的なバンドが生じれば、または、別のプラスミドからのサブクローニングが必要であれば、ＤＮＡをさらに、Ｈｅｅｒｙ（１９９０）に記載の方法の変形を使用して、０．８％アガロースゲルからの溶出により精製した。
【０１５７】
精製ＰＣＲ断片を消化し、標準的なクローニングプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、分子生物学の現在のプロトコル、１９９１）を使用して、適合性の粘着オーバーハングを含む、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、ＢまたはＣバキュロウイルス導入ベクター（ＭａｘＢａｃバキュロウイルス発現系、インビトロゲン社）にライゲートした。Ａ、ＢまたはＣベクターは、バキュロウイルス発現系でのタンパク質発現を行なう３つの異なるリーディングフレームを提供する（表６）。
【０１５８】
【表６】
0003803293.tif 000007
【０１５９】
ＮＳ３／ＮＳ４Ａは、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓバキュロウイルス導入ベクターに直接クローニングするのは困難であることが判明し、従って、最初に、インビトロゲンＴＡクローニングキットを使用して、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩプラスミド（インビトロゲン社）にクローニングした。この手順の方法は、製造業者の指示に従って実施した。次いで、ＮＳ３断片を、ゲノムの他の断片で記載したように、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢベクターにサブクローニングした。
【０１６０】
ＰＣＲ断片を用いてバキュロウイルスプラスミドを形質転換
ライゲーションは、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ株Ｔｏｐ１０（インビトロゲン社）、遺伝子型：Ｆ-ｍｃｒＡ  Ｄ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）ｆ８０／ａｃＺＤＭ１５  ＤｌａｃＸ７４ｄｅｏＲ  ｒｅｃＡ１  ａｒａＤ１３９Ｄ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７ｇａ／Ｕ  ｇａ／Ｋ  ｒｐｓＬ  ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ、および／またはＳｕｒｅ（登録商標）Ｅ．ｃｏｌｉ（ストラタジーン）、遺伝子型：ｅ１４-（ＭｃｒＡ-）Ｄ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）＿１７１ｅｎｄＡ１ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌ  Ａ１  ｌａｃ  ｒｅｃＢ  ｒｅｃＪ  ｓｂｃｃ  ｕｍｕｃ：：Ｔｎ５（ｋａｎr）ｕｕｒＣ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃｌaＺ  Ｄ  ｍ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔr）］cに形質転換した。コンピテント細胞の調製および細菌の形質転換のプロトコルは、インビトロゲンＭａｘＢａｃバキュロウイルス発現系マニュアルバージョン１．８から採用した。
【０１６１】
ＰＣＲ断片を含むプラスミドについて細菌クローンのスクリーニング、および、トランスフェクションのためのプラスミド精製
ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ＋ＰＣＲ断片を含む細菌クローンを、コロニーを増殖し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載の煮沸ミニプレップ法を使用してプラスミドを抽出し、次いで、プラスミドの制限酵素消化物を行ない、正しいサイズの挿入断片を含むものを確認することにより同定した。組換えプラスミドを、製造業者の指示に従って、プラスミド精製キット（キアゲンＰｔｙ社、チップ−２０またはチップ−１００カラム）を使用して、トランスフェクション反応に適したレベルまで精製した。
【０１６２】
Ｓｆ９細胞をカチオン性リポソームでトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスを製造することによる、精製組換えバキュロウイルスの製造
組換えバキュロウイルスを、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションの技術により、線形野生型Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ＤＮＡおよびＰＣＲ断片を含むバキュロウイルス導入ベクターを、Ｓｆ９細胞に同時トランスフェクトすることにより製造した。これは、インビトロゲンＭａｘＢａｃバキュロウイルス発現系マニュアルバージョン１．８に従って実施した。容量に関連したいくつかの小さな修飾を行なったが、これらは、使用する全体的な戦略の点では重要ではなかった。
【０１６３】
プラーク精製組換えバキュロウイルス
組換えウイルスは、ウイルスマスターストックを調製する前に、３回プラーク精製し、ウイルスが１つの粒子からクローニングされ、野生型ウイルスは存在しないことを確実とした。プラークアッセイは、インビトロゲンＭａｘＢａｃバキュロウイルス発現系マニュアルバージョン１．８に従って設定した。
【０１６４】
各回のプラーク精製後、組換えウイルスを、修飾ペスチウイルス抗原捕捉エライザ（ＰＡＣＥ）（Ｓｈａｎｎｏｎら、１９９１）を使用してスクリーニングした。修飾法は、上清＋細胞（５０μｌ／ウェル）を直接、遮断し洗浄したエライザプレートに添加することを含み、プレートを１時間３７℃でインキュベートした。次いで、抗体溶液（５０μｌ／ウェル）を加えた。使用した抗体は、ビオチニル化したヤギ抗ペスチウイルス抗血清または個々の抗Ｅ２または抗ＮＳ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であった。プレートを一晩２２℃でインキュベートし、次いで、Ｓｈａｎｎｏｎら（１９９１）に記載の通りに展開し、試料について、ビオチニル化抗マウスＩｇＧと共にインキュベートすることを省略し、ビオチニル化ヤギ抗血清と反応させた。組換えバキュロウイルス発現Ｅ０は、ＰＡＣＥに検出されなかったことを注記すべきである。
【０１６５】
組換えバキュロウイルスマスター、種および作業ストック
作成した各組換えバキュロウイルスについてのマスターウイルスストックは、インビトロゲンＭａｘＢａｃバキュロウイルス発現系マニュアルバージョン１．８に従って作成した。ストックの滴定は、細胞に１．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、ＢＤＨ、完全ＴＣ１００＋Ｘ−ｇａｌ［１２５μｇ／ｍｌ、ベーリンガーマンハイム］で４中１に希釈した、脱イオン水中６％ＣＭＣ）を重層した以外は、上記した通り、プラークアッセイにより決定した。７日後、青いプラークを計測して、ウイルス力価を出した。
【０１６６】
種および作業ストックは、それぞれ、０．１から０．５ｐｆｕ／ｍｌという低いＭＯＩを使用して、マスターおよび種ストックから作成した。全てのウイルスストックを４℃で、ワクチン製造に使用するために保存した。長期のマスター、種および作業ストックの保存のために、各組換えウイルスをアンプルに入れ、−８０℃で凍結した。
【０１６７】
組換えタンパク質製造の最適化
ギブコＢＲＬ（１９９５）に記載のプロトコルに従って、Ｓｆ−９００ＩＩ血清非含有培地に適合した、Ｓｆ９昆虫細胞懸濁液を使用して、組換えタンパク質発現を最適化した。５０ｍｌの細胞（１ｍｌあたり１．５×１０6細胞）を含む２つの円錐フラスコを、０．１ないし５．０の高および低ＭＯＩの組換えバキュロウイルスで感染した。第三フラスコは、非感染対照培養液として作用した。３つのフラスコを、２８℃で振とうしながらインキュベートし、５ｍｌのアリコートを、７日間まで２４時間の間隔で取り出した。
【０１６８】
試料を、室温（ＲＴ）で１０分間９００×ｇで遠心分離し、上清を注意して除去した。ペレットおよび上清を−２０℃で、１日のサンプリングが完了するまで保存した。次いで、試料中の特異的な組換えペスチウイルスタンパク質の量を、上記した修飾ＰＡＣＥを使用して決定した。細胞ペレットを、２００μｌまたは２５０μｌのＮＰ−４０（ＰＢＳ中１％［ｖ／ｖ］）に復元し、ボルテックスをかけ、室温で１０分間９００×ｇで遠心分離した。ペレット抽出物（１％［ｖ／ｖ］ＮＰ４０中）の連続希釈液をアッセイした。培養上清を、希釈せずに、並びに、連続希釈して（１％［ｖ／ｖ］ＮＰ４０中）アッセイした。
【０１６９】
細胞生存率は、感染率が高くなると共に減少することが判明した。それ故、０．１から２のＭＯＩがより適切であった。上清またはペレット化細胞画分での、最適発現時間および昆虫細胞懸濁培養液中での組換えタンパク質の位置のデータを、表７に示す。
【０１７０】
【表７】
0003803293.tif 000008
発現Ｅ１／Ｅ２タンパク質に関連して、このタンパク質の疎水性「テイル」領域は、この領域をコードするゲノムのｃＤＮＡを作成する場合に、それ故、昆虫細胞培養液中でのタンパク質発現に関与する組換えバキュロウイルスの調製において、意図的に削除した。これにより、これらのタンパク質の大半が、昆虫細胞から、普通のタンパク質輸出経路を介して輸送され、細胞培養培地に分泌された。それ故、最大タンパク質回収は、昆虫細胞培養液の上清画分からであった。
【０１７１】
これに対し、発現ＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質は、昆虫細胞内に「結合」したままであり、それ故、培養時間の終了時にペレット化細胞から収集した。細胞を、２０００×ｇで１０分間の卓上遠心機でペレット化し、これにより、小容量のこの組換えタンパク質の収量は最大となった。Ｅ０（Ｅms）組換え発現タンパク質の場合、これらの位置は決定できず、それ故、培養上清と昆虫細胞が収集された。
【０１７２】
実施例２
インビトロでの、免疫原性ＢＶＤＶタンパク質の昆虫細胞ｈｓｐへの結合
実施例を通じて使用した昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ９（Ｓｆ９）細胞（インビトロゲン社、米国）であった。
【０１７３】
単層のＳｆ９昆虫細胞の確立
この方法は、インビトロゲンＭａｘＢａｃバキュロウイルス発現系マニュアルバージョン１．８に基づいた。凍結細胞アリコート（通常、液体窒素タンク中に保存された１．０ｍｌのバイアル）を、急速に３７℃で解凍し、バイアルを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで拭き、細胞を、１５ｍｌの完全ＴＣ１００培地（１０％ＦＣＳ［Ｔｒａｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｔｙ社］を補充し、ペニシリンおよびストレプトマイシン［各１００単位／ｍｌ］を含む、ギブコＢＲＬ  ＴＣ１００）を含む７５ｃｍ2組織培養フラスコに移した。
【０１７４】
フラスコを１時間２８℃（Ｃｌａｙｓｏｎインキュベーター、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）でインキュベートし、細胞を付着した後、培地を、２０ｍｌの新しい完全ＴＣ１００と交換した。培地を、４８時間毎に、細胞が集密となるまで交換し、集密段階時に、以下のように継代した。培地を除去し、５ｍｌの新しい培地と交換し、細胞を穏やかにフラスコの底から掻爬し、１ｍｌの細胞懸濁液を、室温で、１９ｍｌの完全ＴＣ１００を含む新しい７５ｃｍ2組織培養フラスコに移した。フラスコを振とうして、細胞を均一に底に分配した後、フラスコを２８℃で放置し、細胞を上記のように増殖させた。
【０１７５】
懸濁液中でのＳｆ９昆虫細胞の培養
この方法は、インビトロゲンＭａｘＢａｃバキュロウイルス発現系マニュアルバージョン１．８に基づいた。細胞を、それらを単層として３から４回継代した後に、懸濁培養液として増殖させた。これらの培養に使用した培地は、１％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ−６８（１０％溶液、ギブコＢＲＬ）を含む、完全ＴＣ１００であった。懸濁培養液を作成するために、培地を、最初に、集密な単層であった細胞から取り出し、直ちに５ｍｌの新しい培地と交換した。細胞を、穏やかに、フラスコの底から掻爬し、細胞懸濁液を、プルロニックを含む２５ｍｌの培地を含む、１００ｍｌの上端にねじのある円錐フラスコに移した。フラスコを、回転式振とう機（Ｂｉｏ−Ｌｉｎｅ、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）で少なくとも１時間８０ｒｐｍで振とうしながら、その後、残りの増殖期間に振とう速度を１１０ｒｐｍに増加し、２８℃でインキュベートした。細胞密度が約２×１０6細胞／ｍｌに達すると、追加の３０ｍｌの培地を添加した。次いで、細胞を５０ｍｌの容量中で増殖し、細胞密度が約２×１０6細胞／ｍｌとなると継代した。この時点で、細胞を、培地で希釈して、約０．５×１０6細胞／ｍｌとし、１１０ｒｐｍで振とうしながら、再度継代するまで、２８℃でインキュベートした。
【０１７６】
血清非含有培地中の懸濁培養液中での増殖にＳｆ９昆虫細胞を適合
昆虫細胞を、ギブコＢＲＬ（１９９５）に記載のプロトコルに従って、血清非含有培地中の懸濁培養液中での増殖に適合させた。プルロニックを有する完全ＴＣ１００中で増殖しておいた細胞を、５×１０5細胞／ｍｌの密度のペニシリンおよびストレプトマイシン（各１００単位／ｍｌ）を含む、５０ｍｌの血清非含有培地（Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ、ギブコＢＲＬ）に移した。細胞を、２×１０6細胞／ｍｌの密度まで増殖し、次いで、５×１０5細胞／ｍｌの密度で継代した。これは、細胞密度が２×１０6細胞／ｍｌ、細胞生存率が少なくとも８０％に達するまで続けた。次いで、細胞は、血清非含有培地中での増殖に適合すると考えられ、続いて、Ｓｆ９昆虫細胞懸濁液の培養について記載したように、プルロニックＦ−６８を有する完全ＴＣ１００培地中で増殖した細胞について記載したのと同じように、血清非含有培地を使用して継代した。
【０１７７】
組換えペスチウイルスタンパク質の発現に使用されるＳｆ９細胞の必要条件
組換えペスチウイルスタンパク質の発現に使用される、血清非含有培地中のＳｆ９細胞は、３０以下の継代培養液であることが必要とされた。円錐フラスコ（５００ｍｌ）に、最終容量１５０ｍｌ中、０．５×１０6細胞／ｍｌの密度でＳｆ９細胞を接種した。これらのフラスコ中の細胞が、１．０〜１．５×１０6細胞／ｍｌに達すると、それらを、必要な発現ペスチウイルスタンパク質をコードしている適切な組換えバキュロウイルスで感染した。
【０１７８】
ペスチウイルスタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスの製造
組換えバキュロウイルスの産生および組換えペスチウイルスタンパク質の発現を実施例１に記載する。
【０１７９】
感染多重度
Ｓｆ９昆虫細胞を、個々の組換えバキュロウイルスストック力価に応じて、０．１ないし２．０の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）で感染した。結果を表８に示す。
【０１８０】
組換えバキュロウイルスで感染したＳｆ９細胞培養液中の熱ショックタンパク質の誘導
昆虫細胞培養液中での熱ショックタンパク質の産生の誘導に使用される、実験時間および温度は、以下に示したような、特定のペスチウイルス組換えタンパク質を発現しているＳｆ９昆虫細胞培養液について最適化した。
【０１８１】
ＮＳ３／ＮＳ４Ａ組換えバキュロウイルス感染培養液の熱ショック条件
切断短縮ペスチウイルスＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質を発現している、組換えバキュロウイルスで感染した、Ｓｆ９昆虫細胞を、１１０ｒｐｍで４８時間振とうしながら２８℃でインキュベートした。次いで、感染細胞培養フラスコを、１５０ｍｌの水中に熱量計を含む類似の「ダミー」細胞培養フラスコと共に、４３℃の水浴に入れた。１０分間のインキュベートを、熱量計が４３℃に達すると開始し、次いで、２分毎に、フラスコを、フラスコ内の培地および細胞を旋回することにより穏やかに混合した。これは、ペスチウイルス組換えタンパク質を発現しているＳｆ９細胞の最適な熱ショック条件であると決定された。次いで、細胞培養フラスコを、昆虫細胞熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）が発現され、ペスチウイルスＮＳ３組変えタンパク質に結合することが可能なように、１１０ｒｐｍでさらに２時間振とうし、インキュベーター（２８℃）に戻した。
【０１８２】
【表８】
0003803293.tif 000009
【０１８３】
Ｅ１／Ｅ２およびＥ０組変えバキュロウイルス感染培養液の熱ショック条件
Ｅ１／Ｅ２またはＥ０ペスチウイルスタンパク質を発現している、組換えバキュロウイルスで感染した、Ｓｆ９昆虫細胞を、１１０ｒｐｍで２４時間振とうしながら、２８℃でインキュベートした。次いで、感染細胞培養液を、正確に上記した通りに、熱ショックを与えた（４３℃で１０分間）。次いで、そのフラスコ中の細胞培養液を、インキュベーター（２８℃）に戻し、細胞を、１１０ｒｐｍでさらに２４時間振とうしながら培養した。この系では、Ｅ１／Ｅ２タンパク質を発現している培養液に、２４時間目に熱ショックを与え、これに対し、ＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質では４８時間目であり、Ｅ１／Ｅ２組換えタンパク質が、確実に、Ｓｆ９細胞から輸出され、細胞培養培地に入る前に、昆虫細胞ｈｓｐに結合させた。組換えＥ０ペスチウイルスタンパク質が昆虫細胞から分布されたか、または細胞それ自体に留まっているのかどうかが依然として決定されていなかったので、Ｅ０ペスチウイルスタンパク質を産生している、Ｓｆ９培養液も、組換えバキュロウイルスで感染した２４時間後に熱ショックを与えた。
【０１８４】
非感染対照細胞培養液の熱ショック条件
非感染Ｓｆ９昆虫細胞培養液を、２８℃（１１０ｒｐｍで振とう）で４８時間インキュベートした。これらの対照細胞培養液は、正確に上記した通りに熱ショックを与えた。次いで、細胞培養フラスコを、昆虫細胞熱ショックタンパク質がストレスを受けた細胞により形成されることが可能なように、１１０ｒｐｍでさらに２時間のインキュベート期間、振とうしながら、インキュベーター中で２８℃まで戻した。
【０１８５】
Ｓｆ９細胞培養液からの個々の組換えペスチウイルスタンパク質の収集［ＮＳ３組変えタンパク質＋熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）］
細胞を、２０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、培地から分離した。次いで、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ抗原を含む、細胞ペレットを、５μｇ／ｍｌの濃度のロイペプチン（プロテアーゼ阻害剤、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を含む血清非含有培地（Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ、ギブコＢＲＬ）を使用して、最初の容量の６分の１に懸濁した。これにより、効果的な６倍の濃度の細胞と組換えＮＳ３／ＮＳ４Ａ抗原が得られた。次いで、細胞を、２回、−８０℃で凍結／解凍し、細胞膜を破壊し、組換えバキュロウイルスと共に、ＮＳ３組変えタンパク質を培地に遊離した。
【０１８６】
Ｓｆ９細胞培養液からの個々の組換えペスチウイルスタンパク質の収集［Ｅ１／Ｅ２組み換えタンパク質＋熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）］
細胞を、２０００×ｇで１０分間遠心分離することにより培地から取り出した。ロイペプチン（プロテアーゼ阻害剤）を、再度、発現Ｅ１／Ｅ２タンパク質を含む、上清に加え、最終濃度を５μｇ／ｍｌとした。プロテアーゼ阻害剤の添加により、発現タンパク質の分解が防がれた。
【０１８７】
Ｓｆ９細胞培養液からの個々の組換えペスチウイルスタンパク質の収集［Ｅ０組換えタンパク質＋熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）］
この特定のタンパク質を発現している昆虫細胞培養液の場合、全培養液（細胞と培地）を収集し、ロイペプチンを加えて、最終濃度を５μｇ／ｍｌとした。次いで、培養液を、２回、凍結／解凍して、細胞膜を破壊し、組換えバキュロウイルスおよび任意の細胞会合Ｅ０タンパク質の両方を培地に遊離した。
【０１８８】
Ｓｆ９細胞培養液からの個々の組換えペスチウイルスタンパク質の収集［対照細胞＋熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）］
対照（非感染）培養液を、ＮＳ３／ＮＳ４Ａについて上記したように収集した。しかし、対照細胞の濃度は１０倍濃縮した。
【０１８９】
組換えバキュロウイルスのβ−プロピオラクトン（βＰＬ）による不活性化
βＰＬによる不活性化（β−プロピオラクトン、シグマアルドリッチファインケミカルズ）を、２回、バキュロウイルス−ベクター発現ベクター系により産生された全ての組換えタンパク質調製物、および対照細胞調製物について実施した。Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＳＬ、「β−プロピオラクトンを使用したバキュロウイルスの不活性化、１９９８」）により使用された標準的な方法を、全ての場合に使用した。残留感染バキュロウイルスが「不活性化」物質に残っていないことを確実にするために、各調製物を、３回、Ｓｆ９単層に継代した。最終継代は、重層として、１２５ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（ベーリンガーマンハイム）を含む、１．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、ＢＤＨ、完全ＴＣ１００に４中１で希釈した脱イオン水中、６％ＣＭＣ）を使用して、Ｓｆ９プラークアッセイで滴定した。プラークアッセイは、インビトロゲンＭａｘＢａｃバキュロウイルス発現系マニュアルバージョン１．８に従って設定し、プラークアッセイは、７日目に読んだ。サブユニットワクチンの製剤化に使用した全ての調製物に生感染性バキュロウイルスの存在する証拠はなく、従って、食用動物における実験ワクチンの使用についてのオーストラリア検疫検査サービス（ＡＱＩＳ）要件に合致する。
【０１９０】
組換えＥ０およびＥ１／Ｅ２タンパク質調製物の濃度
Ｅ０組変えタンパク質を発現している、Ｓｆ９細胞を、２０００×ｇで１０分間遠心分離することにより不活性化（上記のように）した後、培地から分離し、次いで、これらの細胞を使用まで４℃で保存した。次いで、組換えＥ０タンパク質を含む上清を、５回、製造業者の指示に従って、別々のアミコン超ろ過細胞ステップで濃縮した。次いで、濃縮したＥ０タンパク質含有上清を、Ｅ０Ｓｆ９細胞と再混合し、最終の濃縮された調製物を調製した。
【０１９１】
不活性化Ｅ１／Ｅ２組変えタンパク質の場合、上清画分のみを、アミコン超ろ過セルを使用して濃縮した。これらのタンパク質は、全て、組換えバキュロウイルス感染細胞から分泌され、それ故、細胞画分を廃棄する。
【０１９２】
ペスチウイルス抗原捕捉エライザ（ＰＡＣＥ）での滴定による、各調製物中の組換えペスチウイルスタンパク質の量の決定
βＰＬ不活性化後の、組換えタンパク質の量は、修飾ＰＡＣＥ中の各個々の組換えタンパク質調製物を滴々することによりアッセイした（Ｓｈａｎｎｏｎら、１９９１参照）。発表された方法の修飾は、試料（５０μｌ／ウェル）を、直接、遮断し洗浄したエライザプレートに添加し、プレートを１時間３７℃でインキュベートすることを含む。次いで、抗体溶液（５０μｌ／ウェル）を加えた。使用した抗体は、ビオチニル化ヤギ抗ペスチウイルス抗血清（ｐＡｂ）または個々のＥ２または抗ＮＳ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であった。プレートを、一晩２２℃でインキュベートし、次いで、Ｓｈａｎｎｏｎら（１９９１）に記載のように、試料について、ビオチニル化工マウスＩｇＧとのインキュベートを削除し、ビオチニル化ヤギ抗血清と反応させて展開した。
【０１９３】
組換えＥ０タンパク質は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と反応できないので、このアッセイ系では検出できないことを注記すべきである。それ故、このタンパク質は、類似Ｅ１／Ｅ２発現構造糖タンパク質について決定した濃度と濃度が類似していることが推定された。
【０１９４】
サブユニットワクチンに取り込まれた組換えタンパク質の要約
組換えペスチウイルスタンパク質Ｔｒａｎｇｉｅ  ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＴｒａｎｇｉｅＥ０、ＢｅｇａＥ０、ＴｒａｎｇｉｅＥ１／Ｅ２、ＢｅｇａＥ１／Ｅ２、Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ  Ｅ１／Ｅ２は、対照細胞と共に、この実施例に記載した方法により調製した。しかし、ＢｅｇａおよびＴｒａｎｇｉｅＥ１／Ｅ２は熱ショックを受けず、ＴｒａｎｇｉｅＥ１／Ｅ２は、５倍ではなく６倍濃縮し、ＢＤＶＣｌｏｖｅｒ  ＬａｎｅＥ１／Ｅ２組換えタンパク質は、組換えＥ０タンパク質調製物について記載したように処理した。
【０１９５】
組換え実験サブユニットワクチン
実施例４に使用したワクチン調製物の組成を、表９に示す。要約すると、各用量の組換えペスチウイルスワクチンは、１ｍｌのＢｅｇａＥ０、１ｍｌのＴｒａｎｇｉｅＥ０、１ｍｌのＣｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ  Ｅ１／Ｅ２、０．５ｍｌのＴｒａｎｇｉｅＥ１／Ｅ２、１ｍｌのＢｅｇａ  Ｅ１／Ｅ２、および０．３ｍｌのＴｒａｎｇｉｅＮＳ３／ＮＳ４Ａを含んだ。チメロサール（水銀化合物、シグマアルドリッチ）を、ワクチン中の最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）で、ワクチン混合物に加え、細菌汚染を予防した。同系共マトリックスアジュバント（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストラリア）を、各ワクチン用量に２ｍｇの割合で取り込んで使用した。製剤化ワクチンは、ウシに注射するまで４℃で保存した（初回用量後の、第二用量は４週間後）。
【０１９６】
対照ワクチン
対照ワクチンの製剤化も表９に示す。要約すると、各用量の対照ワクチンは、４．８ｍｌの対照細胞調製物を含んだ。チメロサールを、再度、ワクチン中の最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）で、対照ワクチンに加えて、細菌汚染を予防するのを補助した。同系共マトリックスアジュバント（ＣＳＬ）は、実験ワクチンに使用した割合に沿って、１用量のワクチンあたり２ｍｇで取込んだ。対照ワクチン調製物は、必要となるまで４℃で保存した。２用量を、実験サブユニットワクチンをワクチン接種した動物に投与したのと同じ日に、試験で対照動物に与えた。
【０１９７】
【表９】
0003803293.tif 000010
【０１９８】
【表９（つづき）】
0003803293.tif 000011
【０１９９】
組換えタンパク質を混合して、サブユニットワクチンを製造する
Ｒｅｃ抗原 １×用量 ２７×用量
ＢＥＯ                １ｍｌ            ２７ｍｌ
ＴＥ０                １ｍｌ            ２７ｍｌ
ＣＬＥ１／Ｅ２        １ｍｌ            ２７ｍｌ
ＴＥ１／Ｅ２          ０．５ｍｌ        １３．５ｍｌ
ＴＮＳ３／ＮＳ４Ａ    ０．３ｍｌ        ８．１ｍｌ
ＢＥ１／Ｅ２          １ｍｌ            ２７ｍｌ
全容量                                  １２９．６ｍｌ
【０２００】
１．２９ｍｌのチメロサールを、１２９．６ｍｌのワクチン混合物に加え、９．６ｍｌをとり、１ｍｌのアリコートで−２０℃で保存するために入れた（ブロック５エッグルーム中の冷凍庫）。
残りの１２０ｍｌに、３２．５ｍｌの同系共マトリックスアジュバントを加え、２分間撹拌して、よく混合した。
２つの容器に分注、すなわち６８ｍｌ／容器とし、４℃で保存した。
１０ｍｌのシリンジに、１８ゲージの針を用いて、６ｍｌ／用量の最終容量でワクチンを設定した。
【０２０１】
0003803293.tif 000012
【０２０２】
対照ワクチンは、１０ｍｌのシリンジに、１８ゲージの針を用いて、６ｍｌ／用量の最終容量で設定した。
【０２０３】
実施例３
オーストラリアウシに対するサブユニットワクチンの効果
サブユニット胎児防御試験の型式
全２２つのペスチウイルス抗体陰性の、妊娠していない若い雌ウシを、試験に選択した。１群の動物（ｎ＝１０）に、２回、４週間離して、実施例１および２で調製したようなサブユニットタンパク質ワクチン（６ｍｌ）でワクチン接種した。さらなる群の動物（ｎ＝１２）に、対照調製物（６ｍｌ）でワクチン接種した。全ての動物を一定間隔で採血し、抗Ｅ２および抗ＮＳ３抗体の両方の濃度を、エリザベス・マッカーサー農業研究所（ＥＭＡＩ）により実施されるような、複合体捕捉遮断エライザ（ＣＴＢ−エライザ）型式を使用して決定した。
【０２０４】
２回目のワクチン接種直後に、動物を、発情について同期化した。発情が検出された直後に、媒精が生じた。全ての動物が、攻撃ＢＶＤＶ単離株による感染を最も受け易いと考えられる時期である、２回目のワクチン接種の１１週間後に、妊娠し、６週令以上の胎児を発達していると判断された。次いで、若い雌ウシを、生異種ＢＶＤＶ単離株のＧｌｅｎ  Ｉｎｎｅｓ用量（３×１０6ＴＣＩＤ50）で攻撃した。
【０２０５】
ウイルス攻撃の６週間後、２つの群の全ての若い雌ウシは、輸出屠殺上（マッジー）で屠殺された。胎児を、妊娠した若い雌ウシから集めた。すなわち、ワクチン接種した群では１０匹の動物から７匹の胎児があり、対照群では１２匹の動物から９匹の胎児があった。
【０２０６】
個々の胎児組織を無菌条件下で集めた。数個の方法を使用して、ＢＶＤＶ感染の存在について試験した。第一に、Ｅ２抗原またはＮＳ３抗原に特異的な、２つの抗原補足エライザを使用した。第二に、モノクローナル抗体のパネルを使用して、標準的な技術およびイムノペルオキシダーゼ（ＩＰＸ）染色を使用して単離した感染細胞を検出した。第三に、５’−ＵＴＲウイルス特異的ＲＴ−ＰＣＲを使用した。これらの方法の組合せにより、若い雌ウシから集めた、感染胎児、対、非感染胎児の感度の高く特異的な検出が得られた。
【０２０７】
ＢＶＤＶに対するウシ免疫応答に対するＥ２サブユニットワクチンの効果
ワクチン接種前および後、および生ウイルス攻撃後の、ワクチン接種および対照群の両方の若い雌ウシにおける、抗Ｅ２（中和）抗体の平均濃度を、図１に示す。
【０２０８】
時間をかけてプロットした、抗Ｅ２抗体の平均濃度により、サブユニットワクチンが、ワクチン接種群において非常に高い濃度の抗Ｅ２抗体をもたらしたことが示された。高力価の抗体は、２回目の用量のワクチンを投与した２週間後に早くも生じた。ワクチン接種を受けた若い雌ウシにおける抗Ｅ２抗体の濃度は、対照群よりも有意に高かった。ワクチン接種群における抗Ｅ２の濃度は、前の９週間におよび僅かに下降したが、対照群の若い雌ウシよりも依然として有意に高かった。
【０２０９】
ワクチン接種群における、Ｅ２抗体の濃度の急速な既往の上昇が、生ＢＶＤウイルスでの攻撃の７日後に観察され、これは、攻撃の９日後まで上昇し続け、そこで、持続的な最大濃度を維持した。この傾向とは対照的に、抗Ｅ２抗体の濃度の増加は、生ウイルスで攻撃した後に、対照群でのみ観察された。次いで、対照群での正常反応の開始が観察され、抗Ｅ２抗体の平均濃度は、攻撃の１４日後に発達しはじめた。しかし、最大応答は、攻撃の３から４週間後までは到達しなかった。
【０２１０】
従って、サブユニットワクチンでの妊娠した若い雌ウシのワクチン接種により、ウイルス感染の最初の４から７日後の間に、若い雌ウシに免疫応答が生じる。これは、重要な段階であり、この間に、生ウイルスは、胎盤を通って発達中の胎児に移行する。これらの結果により、明らかに、生ウイルスの複製は、サブユニットをワクチン接種した群の若い雌ウシ（ｎ＝１０）において拮抗されたことが示される。かかる応答が、サブユニットワクチンについて報告されたのは、これが初めてのことである。
【０２１１】
ＢＶＤＶに対するウシ免疫応答に対するＮＳ３サブユニットワクチンの効果
時間をかけた、ワクチン接種および対照群の若い雌ウシの両方における、抗ＮＳ３抗体の濃度を、図２に示す。驚くべきことに、ワクチン接種後にはワクチン接種した若い雌ウシには、抗ＮＳ３抗体は全く検出されなかった。この理由は依然として明らかではない。しかし、この結果は、「マーカー」ワクチンの開発の大きな可能性をもたらす。全ての「天然感染」動物は、抗ＮＳ３抗体を、ＢＶＤＶでの感染の２１日後に発達する。サブユニットワクチンでワクチン接種した動物は、抗ＮＳ３抗体を発達しないので（以下で考察）、それらは、容易に、「天然感染」動物から区別できる。
【０２１２】
抗ＮＳ３タンパク質は、抗体応答を誘起できないが、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の誘導を通して、強力な細胞性免疫応答を生じるようである。
【０２１３】
生ウイルスで攻撃した後、ワクチン接種した若い雌ウシ（１０匹中７匹）は、攻撃の５から６週間後まで、抗ＮＳ３抗体の有意な発達を示さなかった。残りの３匹のワクチン接種した若い雌ウシは、攻撃の３から６週間後に、抗ＮＳ３抗体を発達させた。しかし、抗体の濃度は、対照群の若い雌ウシよりも有意に低かった。これに対し、対照の若い雌ウシ（ｎ＝１２）は、攻撃の１４から１８日目に始まる、通常の抗体応答を発達し、攻撃の４週間後にピークに達した（図２）。
【０２１４】
これらの結果により、明らかに、生ウイルスの複製は、サブユニットでワクチン接種した群の若い雌ウシ（ｎ＝１０）で阻害されたことが示される。かかる応答が、サブユニットワクチンについて報告されたのは、これが初めてのことである。感染細胞に対して指向される、仮定のＣＴＬ応答の早期開始が、ウイルスの複製を防いだことは明白である。従って、胎盤を通過し、胎児に感染するには不十分なウイルスが、ワクチン接種した動物には循環していた。
【０２１５】
サブユニットワクチンにより誘導される中和抗体の濃度
血清中和試験（ＳＮＴ）を、異なるＢＶＤＶ単離株を使用して実施し、サブユニットワクチンにより誘導される中和抗体の濃度を調べ、生ウイルス攻撃から生じる既往応答を決定した。
【０２１６】
この実験の結果を表１０に示す。図１に示した結果から期待されるように、ワクチン接種した群の若い雌ウシにおけるワクチン接種前には、抗体応答は全く観察されなかった。しかし、２回目のワクチン接種後、非常に良好な抗Ｅ２中和抗体応答（平均力価は１０００中１）が、ワクチンに関連した２つのＢＶＤＶ単離株（ＴｒａｎｇｉｅおよびＢｅｇａ）で観察された。これに対し、ヒツジＢＤＶ単離株（Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ）に対しては中和抗体の応答は非常に低かったが（平均力価は５０中１）、このウイルスからの組換えＥ２タンパク質は、ｈｓｐと組合せてワクチンに取り込まれた。しかし、このサブユニットワクチンから得られた中和抗体の濃度は、以前の実験で不活性化全Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅウイルスの使用で達成されたものよりも、高かった（データは示していない）。
【０２１７】
異種攻撃ウイルスＧｌｅｎ  Ｉｎｎｅｓで実施したＳＮＴにより、驚くべきほどに高い交差反応性（平均力価は１２００中１）が、２回目のワクチン投与の４週間後に示された。この知見により、Ｅ２タンパク質の組合せにより、異種ウイルスに対する良好な交差防御が得られることが確認される。さらにより遠いＢＶＤウイルスＢｒａｉｄｗｏｏｄにより、より低い濃度の中和抗体（平均力価は４００中１）が示されたが、このウイルスによる感染に対する有意な抗体産生に対応した。
【０２１８】
攻撃の７および１４日後にワクチン接種した動物から集めた血清に対して実施したＳＮＴアッセイ（表１０）はさらにより驚くべきものであった。アッセイは、サブユニットワクチンに示された各３つのウイルスを使用して実施した。結果から、攻撃のちょうど７日後に抗Ｅ２抗体レベルにおける極めて高い既往応答が生じたことが明らかである。ＴｒａｎｇｉｅおよびＢｅｇａＢＶＤＶウイルスの両方の平均ＳＮＴは、７日目に、１４０００から１６０００中１の割合であったが、攻撃の１４日目までに並はずれた濃度まで上昇した。攻撃の１４日後、Ｔｒａｎｇｉｅに対する平均力価は、１８００００中１であり、２匹の動物が、５１２０００中１という高い力価を有する。同様に、Ｂｅｇａに対する力価は、１４日目に、平均１０００００中１であり、３匹の動物が、Ｂｅｇａに対して、２５６０００中１の力価を有する。これらの力価の大きさは、「天然感染」動物では稀にしか見られない。
【０２１９】
【表１０】
0003803293.tif 000013
【０２２０】
【表１１】
0003803293.tif 000014
【０２２１】
組換えタンパク質を含む、不活性化、全ウイルスワクチンまたは非感染性のサブユニットワクチンでワクチン接種した４週間後の、ウシで測定した、３つのウイルスに対する、中和力価の比較。（Φ）Ｔｒａｎｇｉｅ（ＢＶＤＶ単離株）およびＣｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ（ＢＤＶ単離株）は両方のワクチンに取り込まれた。サブユニットワクチンでは、Ｃｌｏｖｅｒ  ＬａｎｅＥ２組変えタンパク質を、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）とインビボで結合させた、（∴）＝Ｇｌｅｎｎ
【０２２２】
Ｉｎｎｅｓは、両方の試験で使用した攻撃生ウイルスであった（ＢＶＤＶ単離株は、明らかに、ワクチンウイルスとは異なる）。
【０２２３】
従って、サブユニットワクチンは、以前には観察されていなかった生ウイルス攻撃に対しての反応について、動物を「初回刺激」することにおいて、有意な効果を示したと結論づけることができる。
【０２２４】
ＳＮＴアッセイにより、ＢＤＶ単離株Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅに対する強力な「初回刺激」応答が示された（表１０）。完全に関連していない生ウイルス（ＢＶＤＶ  Ｇｌｅｎ  Ｉｎｎｅｓ）で攻撃した７日後、Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅに対するＳＮＴは、１０２４中１の力価を示した（ワクチン接種後に５０中１からの増加が観察された）。Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅに対する力価は、１４日目に、平均１２０００中１まで上昇し、１匹の動物が、ヒツジ単離株に対して６４００００中１の力価を与えた。これは、サブユニットワクチンが、全てのオーストラリアウシおよびヒツジペスチウイルスに対する、広範に広がる防御を提供する、さらなる証拠を提供する。この防御は、不活性化生ウイルスワクチンで現在利用できるものよりも、はるかに高い。
【０２２５】
追加のＳＮＴは、３つのオーストラリアペスチウイルスに対して実施した。２つの群の動物に、Ｔｒａｎｇｉｅ＋Ｂｅｇａ＋Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ単離株から得られた２つの異なるワクチンでワクチン接種し、従って、直接比較できた。第一の群では、動物に、実験不活性化全ウイルスワクチンでワクチン接種した。第二群の動物に、サブユニットワクチン（＋ｈｓｐ）をワクチン接種した。血清を、２用量のワクチン投与の４週間後に、両方の群のワクチン接種ウシから集めた。
【０２２６】
３つのウイルスに対するＳＮＴの結果を表１１に示す。全３つのウイルスの比較により、サブユニットワクチンにより、不活性化ワクチンにより誘導される対応する力価より、少なくとも４倍高い力価が得られることが示された。さらに、交差中和が、完全に関連していないＢＶＤＶ単離株「Ｂｒａｉｄｗｏｏｄ」に対する両方のワクチンについて生じ、これは、不活性化ワクチンと比較した場合に、サブユニットワクチンでワクチン接種した４週間後に力価の同じような４倍の増加を示した（結果は示していない）。
【０２２７】
従って、このサブユニットワクチンの開発は、全てのウシ生産国における広範囲のワクチンの必要条件を満たす。
【０２２８】
ＢＶＤＶの胎児への導入に対するサブユニットワクチンの効果
妊娠したワクチン接種した若い雌ウシから得られた胎児（ｎ＝７）から、および、妊娠した対照の若い雌ウシから得られた胎児（ｎ＝９）から集めた組織試料を、以前に記載されたような３つの異なるＢＶＤＶ特異的アッセイ（表１２）を使用して、ＥＭＡＩで試験した。妊娠したワクチン接種した若い雌ウシから得られた７匹の胎児のいずれにもＢＶＤＶ感染は存在しないことが、全３回の試験から明らかであった。これに対し、対照群の９匹中５匹の胎児が、ウイルス単離およびＲＴ−ＰＣＲアッセイにより示されるように感染した。
【０２２９】
それ故、ワクチン接種により、ウイルスが発達中の胎児に移行する最大の機会がある場合に、一度に生異種ＢＶＤＶ攻撃に対する１００％の防御が得られると結論づけた。
【０２３０】
【表１２】
0003803293.tif 000015
【０２３１】
実施例４
オーストラリアヒツジに対するサブユニットワクチンの効果
サブユニットタンパク質に対する２つの追加の試験を、ヒツジにおいて実施して、これらのワクチンの防御効果をさらに調べた。これらの試験を実施して、ウシ試験に使用した同じ生異種ペスチウイルスの移行に対する、胎児防御を与えることにおいて、熱ショックタンパク質を有する／有さない単一のウイルスタンパク質と比較した、組合せタンパク質（熱ショックタンパク質と結合）の効果を調べた。同じＢＶＤＶ単離株（「Ｇｌｅｎ  Ｉｎｎｅｓ」）を、ヒツジでの攻撃に使用したが、用量は、１匹のヒツジあたり、２×１０5ＴＣＩＤ50まで減少したか、または、５０倍少ない生ウイルスを、ウシでの攻撃に使用した。
【０２３２】
２４匹のヒツジの関与するこれらの最初の試験において、同じウシサブユニットワクチンを、２つの異なる市販のアジュバント調製物を使用して調製した。８匹のヒツジの２つの群に、各々、２用量のサブユニットタンパク質を与え、一方、８匹のヒツジに、昆虫細胞を含むが、ペプチウイルスタンパク質は全く含まない、対照調製物を注射した。試験の経過におよぶ、ワクチン接種および対照ヒツジの血清における、抗Ｅ２および抗ＮＳ３抗体の抗体アッセイを、ウシサブユニット試験と同じように実施した。雄ヒツジを、２回目のワクチン接種後直ちに雌ヒツジと共に詰めた。ワクチン接種の１０週間後、全ての雌ヒツジは妊娠し、それらを、生異種ペスチウイルス（Ｇｌｅｎ  Ｉｎｎｅｓウイルス）で攻撃した。５週間後、全ての雌ヒツジを屠殺し、胎児をアッセイ用に集め、それらが、胎児組織におけるペスチウイルス感染を示すかどうかを確立した。胎児組織に検出可能なペスチウイルスが存在しないことにより、ウイルスが、雌ヒツジからその胎児に移行していないことが示された。これは、完全な防御と等しく、２つのワクチン接種群の動物のみ測定した（下記参照）。
【０２３３】
ワクチン接種および対照群のヒツジにおける抗体応答を図３および４に提示する。ワクチン接種した動物は、ワクチンの２回目の投与の２週間後に始まる、高レベルの抗Ｅ２抗体（「中和抗体」に等価）を産生することにより応答したことが分かる。これは、同じサブユニットワクチンをワクチン接種したウシにおける、抗Ｅ２抗体応答に類似した応答であった。しかし、ワクチン接種ヒツジにおけるエライザにより測定した抗Ｅ２抗体の絶対レベル（図３）は、ワクチン接種したウシで測定された同等なレベルよりも低いことは注記する価値がある。ウシと同様に、生ウイルスで攻撃したちょうど７日後に測定された高いレベルの抗Ｅ２抗体と共に、ワクチン接種ヒツジには即座の既往の応答があった。これは、サブユニットワクチンを接種したヒツジは、実施例３に示したワクチン接種ウシとちょうど同じように、早期の防御抗体応答を生じた良い証拠である。
【０２３４】
ウシと同様に、ヒツジは、ワクチン接種後に抗ＮＳ３抗体を全く産生せず（図４）、これは、サブユニット調製物が、「マーカーワクチン」であることを確認する。ワクチン接種ヒツジを生ウイルスで攻撃した後、１６匹中１４匹のヒツジが、雌ヒツジを屠殺する攻撃の５週間後までに、抗ＮＳ３抗体を全く生じないことは非常に意義がある。残りの２匹のヒツジは、同時点で、対照の防御されていないヒツジの抗ＮＳ３抗体レベルと比較した場合に、単に中程度の抗ＮＳ３個体レベルを生じた。合わせて考えると、これらの結果は、ヒツジにおけるサブユニットワクチン接種は、生ＢＶＤウイルスでの攻撃後に、雌ヒツジにおけるウイルス複製を減少させた明らかな証拠である。従って、ヒツジにおける抗ＮＳ３抗体の結果により、サブユニットワクチン接種ウシに見られた結果を確認および伸展する。それ故、ヒツジにおけるウイルス複製の減少は、ワクチン接種した雌ヒツジの胎児へのウイルスの移行に対する防御と等価であるかどうかを確認するのに重要である。
【０２３５】
胎児アッセイ結果により、２つのワクチン接種群間には、胎児防御係数の差異は全くなかったことが示された。それ故、２つのワクチン製剤に使用するアジュバントを変更する効果は全くない。両方の群からの結果をプールでき、対照の防御されていない雌ヒツジからの８匹の胎児と比較するための、ワクチン接種した雌ヒツジからの１６匹の胎児が得られる。全ての結果の解析により、全体的に、対照雌ヒツジにおける１００％感染率（８匹中８匹の胎児が感染）と比較して、ワクチン接種した雌ヒツジは５６％の完全胎児防御（１６匹中９匹の胎児が防御）が示された。しかし、ワクチン接種した雌ヒツジから集めた７匹中５匹の陽性胎児への生ペスチウイルスの移行率は、対照雌ヒツジからの胎児と比較して、劇的に減少した（表１３）。これは、ワクチン接種した雌ヒツジの１６匹中僅か２匹の胎児が、対照群の胎児のレベルと類似した量のウイルスを含むことを意味した。従って、ワクチン接種した雌ヒツジの８７％において、ウイルスの移行は全くないか、または移行は重度に制限されていた。
【０２３６】
これにより、サブユニットワクチンは、ヒツジにおいては、ウシほどには効果的ではないが、依然として、ワクチン接種した雌ヒツジにおいて高いレベルの防御を与えることが示される。両方の試験により、サブユニットワクチン調製物の有意で強力な防御効果が示された。以下に考察したように、ウシとヒツジの間の結果の差異は、ウシ−ペスチウイルス攻撃の効果に対する、ヒツジの抵抗性の低さの結果のようである。これは、ウイルスの種間の移行を示し、ヒツジは、種バリヤーを横ぎるウイルスからの防御法の効果は低くあり得る。
【０２３７】
【表１３】
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【０２３８】
注記：
防御されていない雌ヒツジからの８匹の胎児における平均レベルと比較して、ワクチン接種した雌ヒツジからの７匹の胎児では、ウイルスはほぼ１０００倍少ない。１６匹中１４匹のサブユニットワクチン接種雌ヒツジの胎児が、完全に防御（９）されるか、または組織１ｇあたり＜１０3個のウイルス粒子を有する（５匹の胎児）。それ故、ワクチン接種した雌ヒツジのウイルスの胎児移行に対する完全または部分的防御は８７％であった。
【０２３９】
２４匹のヒツジで実施した２回目の試験は、ウシペスチウイルスからの唯１つの免疫原性タンパク質の防御効果を調べた。８中２つの群において、計１６匹のヒツジを、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）に結合するか、またはｈｓｐの全く存在しない、２つの異なるペスチウイルスエンベロープ糖タンパク質の調製物であるＥ２でワクチン接種した。さらなる８匹のヒツジに、ペスチウイルスタンパク質も、ｈｓｐも含まない、対照調製物を注射した。試験型式は、以前の試験と同じであり、胎児アッセイ結果により、ワクチンに取り込まれた単一のペスチウイルスサブユニット糖タンパク質は、胎児への同じ生ＢＤＶウイルス（Ｇｌｅｎ  Ｉｎｎｅｓ）の移行に対して、ほんの弱い防御しか与えないことが示された。全体的に、ワクチン接種した雌ヒツジで、僅か２９％の防御であり、他の７１％の胎児は感染した。しかし、Ｅ２糖タンパク質がｈｓｐと会合したワクチンは、ｈｓｐの全く存在しないワクチンと比べて、ほぼ２倍の防御効果を与えたことは注記する価値がある。結果は、関与する防御された胎児の数が低いために有意ではなかったが、この傾向は、ｈｓｐが、ワクチン効力の増強に効果を有することを示す。ここでも、対照雌ヒツジにおいて、１００％の感染率（７中７匹）であった。この試験により、明らかに、ペスチウイルス由来の１つより多くのタンパク質が、高レベルの防御に必要であることが実証された。ウシおよびヒツジの試験の両方から、サブユニットワクチンの重要な成分は、熱ショックタンパク質に結合した、非構造的タンパク質であるＮＳ３／ＮＳ４Ａであることは明らかである。より小さなエンベロープ糖タンパク質Ｅ０の役割は、明らかでないが、同じように防御におそらく役割を果たしているのだろう。
【０２４０】
実施例５
ペスチウイルスタンパク質の複数の発現系
サブユニットペスチウイルスワクチンの商業的採算性を向上するために、組換えバキュロウイルス中で１つより多くのタンパク質を発現することが必要である。これは、単一タンパク質発現に固有の、時間と費用のかかる培養系を低減する。最初のサブユニット調製物に関与する６つの異なる発現系を、最大２つの培養に減少する目標を達成するために、我々は、遺伝子工学的に処理したバキュロウイルス複数発現ベクターの可能性を調べた。
【０２４１】
市販の複数導入プラスミドのｐＢＡＣ４ｘ−１は、ノバゲン（カタログ番号７００４５−３）から購入し、２つのＢＶＤウイルスの４つの異なるゲノム領域を、成功裡に、このプラスミドに挿入した。オーストラリアウイルスのＴｒａｎｇｉｅおよびＢｅｇａからのＥ１／Ｅ２領域を、Ｔｒａｎｇｉｅウイルスからの切断短縮ＮＳ３領域および同じウイルスからのキャプシド／Ｅ０領域と共に、ＴＣ／Ｅ０およびＢＥ１／Ｅ２が、バキュロウイルスｐ１０プロモーターの制御下となり、ＴＥ１／Ｅ２およびＴＮＳ３／ＮＳ４Ａが、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの制御下となるような順で、プラスミドの４つの複数制限部位に挿入した。４つ全てのゲノム領域は、その後、正しい配向にあることが示され、４つの異なるＢＶＤＶタンパク質に関する正しい遺伝子情報を含む導入プラスミドが得られた。
【０２４２】
次いで、組換えバキュロウイルスを、一連のプラークアッセイでクローニングする前に、ｐＢＡＣ４ｘ−１導入プラスミドを使用したトランスフェクションにより作成した。作成した組換えバキュロウイルスを、各クローニングプロセス段階で試験して、それらが、Ｓｆ９昆虫細胞培養液中で高レベルで４つ全てのタンパク質を発現しているかどうかを確認する。１つの組換えウイルスが、３回プラーク精製し、その後、Ｓｆ９倍溶液中で３回クローニングウイルスを継代した後に、安定で高発現レベルの４つ全てのタンパク質を有することが示された。各４つのタンパク質の発現レベルを、特異的モノクローナル抗体を使用した滴定によりアッセイした。上清および細胞の両方におけるタンパク質レベルの結果を表１４に示す。４つ全てのタンパク質が、非常に高いレベルで単一培養系で産生されることが示され、個々の滴定終点は、６４中１から４０９６中１の範囲であった。
【０２４３】
【表１４】
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【０２４４】
複数の発現系が、ワクチン産生に適切であるかどうかをさらに調べるために、組換え４ｘ−タンパク質で感染したＳｆ９細胞も、熱ショックにかけた（４３℃で１０分間）。その後、培養液中でタンパク質が産生し、ワクチンへの取込みに適したタンパク質の最終収量が、４日目に確認された。熱ショックをかけていない培養液中で産生されたレベルと比較を行なった。以下の表（１５）は、各培養液からの上清および細胞の両方の収集物におけるタンパク質レベルをアッセイした結果を提示する。
【０２４５】
【表１５】
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【０２４６】
複数のタンパク質を発現している組換えペスチウイルスを含む、熱ショックを与えた培養液中のタンパク質産生は、熱ショック処理により影響を受けなかったことは注記する価値がある。それ故、バキュロウイルスは、タンパク質産生を減少させず、ｈｓｐに結合した高レベルのタンパク質が、この系で可能である。この系は、ワクチン産生プロセスに卓越して適切であると結論する。
【０２４７】
さらなる例として、さらなるペスチウイルスタンパク質、すなわちＴｒａｎｇｌｅＥ１／Ｅ２、Ｃｌｏｖｅｒ  ＬａｎｅＥ１／Ｅ２およびＣｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ  ＮＳ３／ＮＳ４Ａおよび所望によりＣｌｏｖｅｒ  ＬａｎｅＥ２／Ｂｅｇａ  Ｅ０をコードするｃＤＮＡを含む、第二の複数導入プラスミドを作成する。これらの追加のタンパク質は、サブユニットワクチンの防御効果を伸展し、当分野のＢＶＤＶ単離株により示される、広範囲の抗原性多様性を網羅すると考えられる。特に、「Ｃｌｏｖｅｒ  Ｌａｎｅ」単離株からの、２つのボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）タンパク質の包含は、６つのタンパク質を含む最初のサブユニットワクチンのそれと適合する防御効果を伸長する。このように、短期間の熱処理にかけた丁度２つの培養液が、ｈｓｐに結合した６つの異なるペスチウイルスタンパク質を産生する。これらは、実施例３に記載したのと同じ方法で、発達中の胎児への生ペスチウイルスの移行に対する防御における効力について、ウシにおいて試験できる。
【０２４８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  生ウイルス攻撃（Ｃ）前および後の若い雌ウシのワクチン接種（−ｏ−）および対照（−□−）群の両方における、抗Ｅ２（中和）抗体濃度を示すグラフである。
【図２】  ウイルス攻撃（Ｃ）前および後の若い雌ウシのワクチン接種（−ｏ−）および対照（−□−）群の両方における、抗ＮＳ３抗体濃度を示すグラフである。
【図３】  ウイルス攻撃（Ｃ）前および後のヒツジのワクチン接種（−ｏ−）および対照（−□−）群の両方における、抗Ｅ２（中和）抗体濃度を示すグラフである。
【図４】  ウイルス攻撃（Ｃ）前および後のヒツジのワクチン接種（−ｏ−）および対照（−□−）群の両方における、抗ＮＳ３抗体濃度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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