(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、１５、１６および１７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質から選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号３、４、１３および１４で表される塩基配列を有するＤＮＡから選ばれるＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号３、４、１３および１４で表される塩基配列を有するＤＮＡから選ばれるＤＮＡと下記の条件下でハイブリダイズし、かつＬ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
(a)ハイブリダイゼーション・バッファー(フォルムアミド ５０％ｖ／ｖ、ブロッキング試薬 ２％、Ｎ−ラウリルザルコシン ０.１％ｗ／ｖ、ＳＤＳ ０.０２％ｗ／ｖを７５０ｍＭ 塩化ナトリウムおよび７５ｍＭ クエン酸ナトリウムからなる溶液中に含んだ溶液)中で、配列番号３、４、１３および１４で表される塩基配列を有するＤＮＡから選ばれるＤＮＡを固定した膜とともに、４２℃で一晩放置し、
(b)０.１％ ＳＤＳを含む３００ｍＭ塩化ナトリウムおよび３０ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる溶液を用いて室温で５分間づつ２回洗浄後、０.１％ ＳＤＳを含む１５ｍＭ塩化ナトリウムおよび１．５ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる溶液を用いて６８℃で１５分間づつ２回該膜を洗浄する
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載のＤＮＡを含むＤＮＡ断片をベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
【請求項６】
形質転換体が、エシェリヒア・コリ XL2-Blue/pTH30(ＦＥＲＭ ＢＰ-５０２６)およびエシェリヒア・コリ XL2-Blue/pTH75(ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０９)から選ばれる形質転換体である、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
配列番号１、２、１５、１６および１７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質から選ばれる蛋白質。
【請求項８】
請求項５または６記載の形質転換体を培地中で培養し、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素を生成蓄積させ、該培養物からＬ−プロリン３位水酸化酵素を採取することを特徴とする、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の製造法。
【請求項９】
培地中にＬ−プロリンを添加することを特徴とする、請求項８記載のＬ−プロリン３位水酸化酵素の製造法。
【請求項１０】
請求項５または６記載の形質転換体を培地中で培養し、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成蓄積させ、該培養物よりシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取することを特徴とするシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【請求項１１】
形質転換体が、培地中の糖源よりＬ−プロリンを生産し培養液中に蓄積する能力のある形質転換体であること特徴とする、請求項１０記載のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【請求項１２】
形質転換体が、培地中の糖源より２−ケトグルタル酸を生産し培養液中に蓄積する能力のある形質転換体であること特徴とする、請求項１０記載のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【請求項１３】
培地中にＬ−プロリンを添加することを特徴とする、請求項１０記載のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【請求項１４】
培地中にＬ−プロリン、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンを添加することを特徴とする、請求項１０記載のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【請求項１５】
請求項５または６記載の形質転換体を培養し、該培養物、菌体または菌体処理物を酵素源として、２−ケトグルタル酸および二価鉄イオンの存在下、培養液中または水性媒体中で、Ｌ−プロリンをシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、生成したシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該培養物または該水性媒体より採取することを特徴とするシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【請求項１６】
形質転換体が、培地中の糖源よりＬ−プロリンを生産し培養液中に蓄積する能力のある形質転換体であること特徴とする、請求項１５記載のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【請求項１７】
形質転換体が、培地中の糖源より２−ケトグルタル酸を生産し培養液中に蓄積する能力のある形質転換体であること特徴とする、請求項１５記載のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【請求項１８】
菌体処理物が、菌体の乾燥物、菌体の凍結乾燥物、菌体の界面活性剤処理物、菌体の酵素処理物、菌体の超音波処理物、菌体の機械的摩砕処理物、菌体の溶媒処理物、菌体の蛋白質分画物、菌体および菌体処理物の固定化物、菌体より抽出して得られるＬ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する酵素、該酵素の精製標品および該酵素の固定化物から選ばれる菌体処理物であること特徴とする、請求項１５記載のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬品の合成原料または食品添加物として有用なシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子（以下、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子と略記する）、該遺伝子を含有する形質転換体、および該形質転換体を用いたＬ−プロリン３位水酸化酵素の製造法に関する。
背景技術
従来のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法としては、化学的に合成する方法〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J．Amer．Chem．Soc.），８４巻，３９８０ページ（１９６２）、同書，８５巻，２８２４ページ（１９６３年）、ネーチャー（Nature），２８９巻，３１０ページ（１９８１年）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J．Org．Chem.），５４巻，１８６６ページ（１９８９年）、アクタ・ケミカ・スカンジナビカ（Acta Chemica Scandinavica），４３巻，２９０ページ（１９８９年）〕が知られている。
Ｌ−プロリンを直接、位置および立体選択的に水酸化して、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法は、合成化学的方法および生物機能を利用した方法ともに、これまで報告されていない。
従来の化学合成によるシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法は、（１）原料が高価である、（２）反応工程が長い、（３）分離精製工程が複数である、（４）生産効率が低い、等の理由から、工業化は困難である。
活性の高いＬ−プロリン３位水酸化酵素を用い、工業的に有利にシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法が求められている。
本発明の目的は、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素を用いて、安価で入手が容易なＬ−プロリンから効率的にシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法において、より工業的に有利にシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造するために、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子および該遺伝子を含有する形質転換体を提供し、該遺伝子および該形質転換体を用いてＬ−プロリン３位水酸化酵素を大量に生産させ、該形質転換体または該酵素を用いてシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に安価に製造する方法を提供することにある。
発明の開示
本発明は、微生物由来の新規なＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子、該遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体、該形質転換体を用いたＬ−プロリン３位水酸化酵素の製造法、該酵素および該形質転換体または該酵素を用いたシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法に関する。以下に本発明を詳細に説明する。
本発明にかかわるＬ−プロリン３位水酸化酵素は、２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下において、遊離のＬ−プロリンを水酸化してシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する酵素である。
Ｌ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する蛋白質としては、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、例えば配列番号１または２に示したアミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白質あるいは該蛋白質の部分アミノ酸配列を有する蛋白質と大腸菌由来のβガラクトシダーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列を有するペプチドとが結合したアミノ酸配列を有する融合蛋白質、および配列番号１または２に示したアミノ酸配列を有する蛋白質あるいは該蛋白質の部分アミノ酸配列を有する蛋白質と大腸菌由来のマルトース結合蛋白質の部分アミノ酸配列を有するペプチドとが結合したアミノ酸配列を有する融合蛋白質等をあげることができる。融合蛋白質の具体例としては、配列番号１５、１６または１７に示したアミノ酸配列を有する蛋白質等をあげることができる。
さらに、配列番号１、２、１５、１６または１７に示したアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつＬ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する蛋白質をあげることができる。ここで、アミノ酸の置換、欠失または付加は、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research），１０巻，６４８７〜６５００ページ（１９８２年）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA），７９巻，６４０９〜６４１３ページ（１９８２年）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA），８１巻，５６６２〜５６６６ページ（１９８４年）、サイエンス（Science），２２４巻，１４３１〜１４３３ページ（１９８４年）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５年）、ネイチャー（Nature），３１６巻，６０１〜６０５ページ（１９８５年）、ジーン（Gene），３４巻，３１５〜３２３ページ（１９８５年）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research），１３巻，４４３１〜４４４２ページ（１９８５年）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology），８章Mutagenesis of Cloned DNA，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８９年）等に記載の方法に準じて実施することができる。
本発明にかかわるＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子としては、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片であればいずれでもよく、例えば、配列番号１、２、１５、１６または１７に示したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、あるいは、配列番号１、２、１５、１６または１７に示したアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつＬ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子をあげることができる。具体的には配列番号３、４、１３および１４で示されるＤＮＡをあげることができる。
更に、本発明にかかわるＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子として、上記で定義されるＤＮＡに対して、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素活性を失わない範囲内で置換変異、欠失変異、挿入変異などの変異が導入されたＤＮＡ、例えば、配列番号３、４、１３または１４と相同性を有するＤＮＡなどをあげることができる。この相同性を有するＤＮＡとは、配列番号３、４、１３または１４に示した塩基配列を含むＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法またはプラークハイブリダイゼーション法を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。これらの操作は、公知のin vitro組換え技法〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning，A laboratory manual）、第２版〔サンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniatis）編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年刊〕に準じて行うことができる。
該Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片は、Ｌ−プロリンを水酸化してシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する能力を有する微生物より取得することができる。この様な微生物としては、Ｌ−プロリンを水酸化してシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する能力を有する微生物であればいずれでもよいが、好ましくは、ストレプトマイセス属またはバチルス属に属し、かつ、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する微生物をあげることができる。さらに好ましくは、ストレプトマイセス・カヌス（Streptomyces canus）ATCC12647、ストレプトマイセス・カヌス（Streptomyces canus）ATCC12646、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＴＨ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３９９）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＴＨ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３９７）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＴＨ３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３９８）あるいは、これらの菌株の突然変異株もしくは誘導体をあげることができる。
以下にＬ−プロリン３位水酸化酵素を生成する能力を有する微生物由来のＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子の取得方法について示す。
Ｌ−プロリン３位水酸化酵素を生成する能力を有する微生物から、通常のＤＮＡ単離法、例えばフェノール法〔バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim．Biophys．Acta）７２巻、６１９〜６２９ページ（１９６３年）〕、により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素により切断し該制限酵素切断断片をベクターＤＮＡに組込むことにより、該微生物染色体の染色体ＤＮＡライブラリーを構築する。この染色体ＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体からハイブリダイゼーション法により、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含む形質転換体の選択を行う。選択された形質転換体より目的とする遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
この一連の操作は、公知のin vitro組換え技法〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning，A laboratory manual），第２版，サンブルック（Sambrook），フリッチ（Fritsch），マニアティス（Maniatis）編集，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press），１９８９年刊〕に準じて行うことができる。
Ｌ−プロリン３位水酸化酵素を生成する能力を有する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーを構築するベクターＤＮＡとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミッドベクターなどいずれでも使用できる。好適な例としては、λZAPII、pUC18、pBluescript（STRATAGENE社より市販）などをあげることができる。
宿主微生物としては、エッシェリヒア属に属する微生物であればいずれでも使用することができる。好適には、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000等があげられる。
Ｌ−プロリン３位水酸化酵素中のアミノ酸配列の情報を基に、ＤＮＡプライマーを作製し、このＤＮＡプライマーを用い、ポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと略記する）を行い、得られたＤＮＡ断片を用い、ハイブリダイゼーション法を実施し、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含む形質転換体を選択できる。
Ｌ−プロリン３位水酸化酵素のアミノ酸配列情報は、通常用いられるアミノ酸配列分析装置、例えば島津製作所社製Protein sequencer model PPSQ-10等を用い、精製されたＬ−プロリン３位水酸化酵素を分析することにより得ることができる。このようにして得られたアミノ酸配列情報として、具体的には、配列番号５〜７に示したアミノ酸配列等をあげることができる。
ＤＮＡプライマーの合成は、通常用いられるＤＮＡ合成機、例えばアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機等を用いて行うことができる。
ハイブリダイゼーション法に使用するプローブとしては、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子の部分断片を用いることができる。Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子の部分断片はＰＣＲを利用して得ることができる。例えば、配列表の配列番号８（配列番号１に記載のアミノ酸配列の１〜６番目のアミノ酸をコードするセンス鎖ＤＮＡに対応する）に示したＤＮＡと、配列表の配列番号１０（配列番号１に記載のアミノ酸配列の２１〜２５番目のアミノ酸をコードするアンチセンス鎖ＤＮＡに対応する）に示したＤＮＡを化学合成し、これらをＤＮＡプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた配列番号１１に示した７４ｂｐのＤＮＡ断片等をプローブとしてあげることができる。
ハイブリダイゼーション法により選択された形質転換体より得られた、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡを、適当な制限酵素、例えばPst Iなどで切断後、pBluescript KS(+)（STRATAGENE社より市販）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列分析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA）、７４巻、５４６３ページ、１９７７年〕等によって分析することによって、該遺伝子の塩基配列を決定することができる。塩基配列の分析は、塩基配列自動分析装置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（Sequencer）等を用いて行うことができる。
このようにして決定されたＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子の塩基配列として、例えば配列番号３、４、１３または１４で示された塩基配列をあげることができる。
本発明のＬ−プロリン３位水酸化酵素をコードするＤＮＡを含むプラスミッドとしては、例えばｐＴＨ３０、ｐＴＨ７１およびｐＴＨ７５等をあげることができる。ｐＴＨ３０を含む大腸菌であるEscherichia coli XL2-Blue/pTH30は、平成７年３月２日付けで、ｐＴＨ７５を含む大腸菌であるEscherichia coli XL2-Blue/pTH75は、平成８年２月２２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）に、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−５０２６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０９として寄託されている。
上記のようにして得られるＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を宿主中で発現させるためには、まず、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主中に導入する。宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、等に属する微生物菌株の他、酵母菌株や動物細胞宿主等をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主に於いて自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
大腸菌等の微生物を宿主として用いる場合は、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素発現ベクターは微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agrec．Biol．Chem.),４８巻,６６９〜６７５ページ（１９８４年）〕、ｐＬＳＡ１〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric．Biol．Chem.)，５３巻，２７７ページ（１９８９年）〕、ｐＧＥＬ１〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc．Natl．Acad．Sci.，USA)，８２巻，４３０６ページ（１９８５年）〕、pBluescript（STRATAGENE社）、ｐＴｒｓ３０〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕およびｐＴｒｓ３２〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子はＬ−プロリン３位水酸化酵素をコードする遺伝子であればいずれも用いることができるが、該遺伝子のＤＮＡ配列を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換して用いることが好ましい。
本遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主としては、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
酵母菌株を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主としては、Saccharomyces cerevisae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）等を例示することができる。プロモーターとしては、動物細胞の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ヒトＣＭＶのIE(immediate early)遺伝子のプロモーター等のプロモーターをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。宿主としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
動物細胞へのＤＮＡの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入することができればいかなる方法も用いることができる。例えば、エレクトロポーレーション法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnology)，3，133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェルグナー（Philip L．Felgner）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA），84，7413（1987）〕等を用いることができる。形質転換株の取得および培養は、特開平２−２２７０７５あるいは特開平２−２５７８９１に記載されている方法に準じて行なうことができる。
上記のようにして得られた形質転換体の培養は、通常の培養方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として用いた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、りん酸第一カリウム、りん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３.０〜９.０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
Ｌ−プロリンを５〜１０００、好ましくは２０〜２００ｍＭの濃度となるように、適時培地に添加することにより、より効率的にＬ−プロリン３位水酸化酵素の製造を行うことができる。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として用いた形質転換体を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、５％ＣＯ2存在下等の条件下で行う。培養温度は３５〜３７℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間である。
Ｌ−プロリンを５〜１０００、好ましくは２０〜２００ｍＭの濃度となるように、適時培地に添加することにより、より効率的にＬ−プロリン３位水酸化酵素の製造を行うことができる。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
このように培養して得た形質転換体中には、遺伝子源として用いた微生物菌株、例えばストレプトマイセス・エスピーＴＨ１等、と比較してＬ−プロリン３位水酸化酵素が著量生成蓄積しており、酵素の単離精製あるいは該酵素を用いたＬ−プロリンからのシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン製造を、遺伝子源として用いた微生物菌株、例えばストレプトマイセス・エスピーＴＨ１等、を用いた場合と比較して、はるかに効率的に行うことができる。
形質転換体中にＬ−プロリン３位水酸化酵素が生成していることは、培養物、菌体または菌体処理物を、酵素反応に適した水性媒体中に、Ｌ−プロリン、二価鉄イオン、２−ケトグルタル酸とともに加え、また必要に応じて界面活性剤や有機溶剤を添加することにより、生成するシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを検出することにより知ることができる。このようにして菌体中に生成が確認されるＬ−プロリン３位水酸化酵素の活性は、下記測定条件下、１分間に１ｎｍｏｌのシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。なお、ここでは、微生物菌体に加え、動物細胞を含めて菌体と呼ぶ。
Ｌ−プロリン３位水酸化酵素活性の測定：
１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を含有する２００ｍＭのＴＥＳ〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルフォン酸〕緩衝液（ｐＨ７.５）に菌体、菌体処理物または酵素標品等を添加して合計２５０μｌとし、３５℃、１０分間反応する。反応液を１００℃、２分間加熱して反応を停止した後に、反応液中に生成したシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）を用いて定量する。
定量にはシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量できる方法であればどのような方法を用いてもよいが、例えば、反応液中のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを配位子交換クロマトグラフィーカラム、例えば、株式会社住化分析センター製SUMICHIRAL OA5000等を用いてＨＰＬＣにて分離溶出後、７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール（以下、ＮＢＤと略記する）によってポストカラム誘導体化し検出する方法（ポストカラム誘導体化法）、あるいは反応液中の目的化合物をあらかじめＮＢＤ誘導体化しておき、これをＨＰＬＣを用いた逆相クロマトグラフィーにかけてＮＢＤ誘導体化物を分離後検出する方法〔William J．Lindblad and Robert F．Diegelmann，アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、１３８巻、３９０〜３９５ページ、１９８４年〕（プレカラム誘導体化法）等があげられる。ＮＢＤ誘導体化物の検出は、いずれもその蛍光（励起波長  ５０３ｎｍ、蛍光波長  ５４１ｎｍ）測定によって行われる。
上記のようにして培養菌体中にＬ−プロリン３位水酸化酵素の生成が確認された形質転換体の培養物から、酵素を単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。例えば、形質転換体の培養液を遠心分離することにより、培養液中の菌体を集め、該菌体を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により菌体を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、硫安等による塩析、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロースなどの陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどの疎水性クロマトグラフィー、分子篩を用いたゲル濾過法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製酵素標品を得ることができる。
培養菌体中にＬ−プロリン３位水酸化酵素の生成が確認された形質転換体を、上記の形質転換体の培養条件と同様の条件で培養し、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成蓄積させ、該培養物よりシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取することにより、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することができる。
Ｌ−プロリンを糖源から生成し培養液中に蓄積する能力のある形質転換体を用いることにより、培養中にＬ−プロリンを添加しなくともシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することができるが、Ｌ−プロリンを５〜１０００、好ましくは２０〜２００ｍＭの濃度となるように、適時培地に添加することにより、より効率的にＬ−プロリン３位水酸化酵素の製造を行うことができる。
２−ケトグルタル酸を糖源から生成し培養液中に蓄積する能力のある形質転換体を用いることにより、培養中に２−ケトグルタル酸を添加しなくともシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することができる。該形質転換体を用いる場合には、グルコース等の糖源を適時培地に添加し、２−ケトグルタル酸を培養液中に生成、蓄積させることにより、より効率的にＬ−プロリン３位水酸化酵素の製造を行うことができる。２−ケトグルタル酸を糖源から生成し培養液中に蓄積する能力のない形質転換体を用いる場合には、必要に応じて２−ケトグルタル酸を培養時に添加する。
また、必要に応じて２価鉄イオンを培養時に添加してもよい。
シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造は、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の生成が確認された形質転換体の培養物、該培養物から分離した菌体または菌体処理物を酵素源として用いて下記の方法により行うこともできる。
即ち、該形質転換体の培養物、該培養物から分離した菌体または菌体処理物を、酵素反応に適した水性媒体中に、Ｌ−プロリン、二価鉄イオン、２−ケトグルタル酸とともに加え、また必要に応じて界面活性剤や有機溶剤を添加することにより、Ｌ−プロリンをシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、次いで反応液よりシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取することにより、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することができる。
菌体処理物としては、菌体の乾燥物、菌体の凍結乾燥物、菌体の界面活性剤処理物、菌体の酵素処理物、菌体の超音波処理物、菌体の機械的摩砕処理物、菌体の溶媒処理物、菌体の蛋白質分画物、菌体および菌体処理物の固定化物などがあげられる。また、該菌体より抽出して得られるＬ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する酵素、該酵素の精製標品、固定化物なども用いられる。
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などがあげられる。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製等）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイド、カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４０Ｅなどのカチオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸、ニューレックスＴＡＢ、ラビゾール８０などのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン・モノステアレート（例えばノニオンＳＴ２２１）などの両性界面活性剤、その他三級アミンＰＢ、ヘキサデシルジメチルアミンなどがあげられ、反応を促進するものであればいずれでも使用できる。これらは通常０.１〜５０ｍｇ／ｌ、好ましくは、１〜２０ｍｇ／ｌの濃度で用いられる。
有機溶剤としては、トルエン、キシレン、脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いられる。通常０.１〜５０μｌ／ｍｌ、好ましくは１〜２０μｌ／ｍｌの濃度で用いられる。
反応は、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する形質転換体を培養後、該形質転換体の培養物、該培養物から分離した菌体、菌体の処理物を酵素源として用いて水性媒体中で行う。
これら酵素源の反応液中における酵素活性は、用いる基質量などにより決定されるが、通常１、０００〜１０、０００、０００Ｕ／ｌ、好ましくは１０、０００〜３、０００、０００Ｕ／ｌである。微生物の菌体および菌体処理物を用いる場合、その濃度は通常湿菌体で１〜３００ｇ／ｌである。
反応は通常、温度１５〜５０℃、ｐＨ６.０〜９.０、で１〜９６時間行う。反応に用いられるＬ−プロリンの濃度は、１ｍＭ〜２Ｍである。Ｌ−プロリンは、単品を反応液に直接添加して用いてもよいし、Ｌ−プロリンを糖源から生成し培養液中に蓄積する能力のある微生物の培養液等を用いて供給してもよい。さらには、Ｌ−プロリンを糖源から生成する能力のある微生物を形質転換体の宿主微生物として用いることにより、該宿主微生物が生成するＬ−プロリンを反応に利用することもできる。
反応には二価鉄イオンが必要とされ、通常１〜１００ｍＭが用いられる。二価鉄イオンとしては、二価鉄を含み反応を阻害しない物であれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、硫酸第一鉄などの硫化物、塩化第一鉄等の塩化物、炭酸第一鉄などの他、クエン酸塩、乳酸塩、フマル酸塩等のような有機酸塩等をあげることができる。使用する菌体、菌体処理物、あるいは反応液成分中に二価鉄イオンが含まれていれば、特に二価鉄イオンを添加しなくてもよい。
２−ケトグルタル酸は、反応液に単品を添加してもよいし、用いる菌体および菌体処理物の有する代謝活性によって２−ケトグルタル酸に転換し得る化合物を用いてもよい。このような化合物としては、グルコ−スのような糖質、グルタミン酸などのアミノ酸、コハク酸などの有機酸等があげられる。これらの化合物は単独で用いてもよいし、複数を併用してもよい。
培養物または水性媒体からシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを回収する方法としては、イオン交換樹脂等を用いるカラムクロマトグラフィー、あるいは晶出法等、通常の分離方法が用いられる。回収されたシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは13Ｃ−ＮＭＲスペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペクトル、比旋光度等の通常の分析手段によって、その構造を確認することができる。
本発明により製造されたシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、前述のポストカラム誘導体化法やプレカラム誘導体化法によって、定量分析することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミッドｐＴＨ３０及びプラスミッドｐＴＨ４０の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、クローン化されたStreptomyces sp．TH1染色体部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を示す。Placは大腸菌ラクトースプロモーターを、lac Zはβーガラクトシダーゼ構造遺伝子を、MCSはマルチクローニングサイトを示す。なお図中にはプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表示してある。
第２図は、プラスミッドｐＴＨ７１及びプラスミッドｐＴＨ７５を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、クローン化されたStreptomyces sp．TH1染色体部分を示す。また矢印を併記した部分が配列番号１４に相当する塩基配列を有する部分である。矢印の向きは、配列番号１４の先頭から末端へ向かう方向である。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を示す。Placは大腸菌ラクトースプロモーターを、lacZはβーガラクトシダーゼ構造遺伝子を、MCSはマルチクローニングサイトを示す。なお図中にはプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表示してある。
第３図は、プラスミッドｐＴＨ５０の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Streptomyces sp．TH1染色体部分由来のＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を示す。Placは大腸菌ラクトースプロモーターを、lac Zはβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を、MCSはマルチクローニングサイトを示す。なお図中にはプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表示してある。
第４図は、プラスミッドｐＥＸ１−５の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Streptomyces sp．TH1染色体部分由来のＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を示す。Placは大腸菌ラクトースプロモーターを、lac Zはβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を、MCSはマルチクローニングサイトを示す。なお図中にはプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表示してある。
第５図は、プラスミッドｐＴＨ６０の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Streptomyces sp．TH1染色体部分由来のＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を示す。Placは大腸菌ラクトースプロモーターを、lac Zはβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を、MCSはマルチクローニングサイトを示す。なお図中にはプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表示してある。
第６図は、プラスミッドｐＴＨ７０の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Streptomyces sp．TH1染色体部分由来のＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を示す。Placは大腸菌ラクトースプロモーターを、lac Zはβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を、MCSはマルチクローニングサイトを示す。なお図中にはプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表示してある。
第７図は、プラスミッドｐＴＨ８０の造成工程を示す図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Streptomyces sp．TH1染色体部分由来のＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を示す。Placは大腸菌ラクトースプロモーターを、lac Zはβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を、MCSはマルチクローニングサイトを示す。なお図中にはプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表示してある。
発明を実施するための最良の形態
実施例１  ストレプトマイセス・エスピーＴＨ１のＬ−プロリン３位水酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子の部分ＤＮＡの調製
（１）ストレプトマイセス・エスピーＴＨ１染色体ＤＮＡの単離
ストレプトマイセス・エスピーＴＨ１の染色体ＤＮＡは常法に従って以下のように単離した。マンニトール ５％、グリシン ０.０５％を添加したＳＫ＃２培地（グルコース ０.２５％、可溶性澱粉 １.０％、酵母エキス ０.２５％、ペプトン ０.２５％、肉エキス ０.１５％、りん酸１カリウム ０.０１％、硫酸マグネシウム ０.０３％を含み、６N ＮａＯＨでｐＨ７.６に調整した培地）を試験管に１０ｍｌ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。これに、ＨＴ寒天平板培地（可溶性澱粉 １％、ＮＺアミン ０.２％、酵母エキス ０.１％、肉エキス ０.１％、寒天 １.５％を含み、６N ＮａＯＨでｐＨ７.２に調整後、１２０℃、２０分間殺菌した培地）に生育したストレプトマイセス・エスピーＴＨ１を一白金耳植菌し、２８℃、３日間振とう培養した。該培養液を遠心分離し、得られた菌体を１０ｍｌの１０.３％シュークロース溶液で洗浄後、６ｍｌのＴＳ〔１０.３％ シュークロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）２５ｍＭ  ＥＤＴＡ〕に懸濁し、リゾチーム溶液（５０ｍｇ／ｍｌ ＴＳ）１ｍｌを加え、３７℃、６０分間インキュベートした。
次いで、該リゾチーム処理液にプロテイナーゼＫ（シグマ社製）溶液（２ｍｇ／ｍｌ ＴＳ）０.６ｍｌを加え穏やかに混合し、さらに３.６ｍｌの３.３％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ溶液を穏やかに混合しつつ加え、３７℃、６０分間インキュベートした。該混合液を５０℃、３０分間加熱後水冷し、ＴＥ〔１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１／１、ｖ／ｖ）を等量加え、３０分間穏やかに振とうした。遠心分離後、上層をとり、再度ＴＥ飽和フェノール／クロロホルムによる抽出操作を行い、遠心分離後、得られた上層に等量のクロロホルムを加え、混合後、再度遠心分離した。
上層をとり、該上層に１００℃、１０分間の加熱処理をしたＲＮａｓｅ Ａ水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ加え、３７℃、４５分間インキュベートした。該ＲＮａｓｅ Ａ処理液に、１／１０容量の５Ｍ食塩水および１／４容量の５０％ＰＥＧ６０００を加え、穏やかに混合後、氷冷下一晩放置した。該混合液を、１２、０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後、上清を完全に捨て、残った沈殿を５ｍｌのＴＥに溶解した。１／１０容量の３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液および１／３０容量の６６ｍＭ 塩化マグネシウム溶液を加え混合後、２.２倍容量の冷エタノールを加え、穏やかに混合した。該混合液を１０、０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後、上清を捨て、得られた沈殿を７０％冷エタノールで２回洗浄した。該沈殿（２５０μｇの染色体ＤＮＡを含有）をＴＥに溶解し、染色体ＤＮＡとして以後の実験に用いた。
（２）ストレプトマイセス・エスピーＴＨ１由来のＬ−プロリン３位水酸化酵素蛋白質の部分アミノ酸配列の決定
ストレプトマイセス・エスピーＴＨ１の生産するＬ−プロリン３位水酸化酵素を参考例１の方法に準じて単離精製し、該精製酵素蛋白のＮ末端アミノ酸配列を島津製作所社製Protein sequencer model PPSQ-10を用いて分析し、配列番号５に示されるＮ末端アミノ酸配列を決定した。
さらに、精製酵素標品にリジルエンドペプチダーゼを０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４Ｍ Ｕｒｅａ（ｐＨ９）中で、３７℃、６時間作用させた後、ＨＰＬＣによりペプチド断片を取得し、そのアミノ酸配列を同様に分析することにより、配列番号６および７に示される内部アミノ酸配列を決定した。
（３）Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子の部分ＤＮＡの調製
配列番号５記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜６に対応する配列番号８記載のセンス鎖ミックスＤＮＡプライマーと、配列番号５記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２４〜２８に対応する配列番号９記載のアンチセンス鎖ミックスＤＮＡプライマーをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成ＤＮＡをプライマーとし、ストレプトマイセス・エスピーＴＨ１染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製ＤＮＡ Thermal Cycler 480を用いて行った。反応は、以下の組成の反応液２０μｌを用いて行った。
反応液組成：ストレプトマイセス・エスピーＴＨ１染色体ＤＮＡ ２１ｎｇ／μｌ、センス鎖ミックスＤＮＡプライマーおよびアンチセンス鎖ミックスＤＮＡプライマー各１０μＭ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社）０.１２５Ｕ／μｌ、ＤＭＳＯ １０％、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.２）２０ｍＭ、ＫＣｌ １０ｍＭ、硫酸アンモニウム ６ｍＭ、塩化マグネシウム ２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１％、Bovine Serum Albumine １０ｎｇ／μｌ。
反応は、９５℃、５分間のインキュベーション後、９５℃−０.５分間、２５℃−０.５分間、７５℃−１分間のインキュベーション工程を４０回繰り返した。反応液を１５％ポリアクリルアミドゲル（アトー株式会社製、パジェルNPU-15 L）電気泳動にかけた後、増幅した８３ｂｐのバンドを日本エイドー株式会社製のダヴィンチくん（ペンタッチリカバリーＮＢ−７０００型）を用いて回収した。
回収した８３ｂｐのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号８記載のセンス鎖ミックスＤＮＡと配列番号５記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２１〜２５に対応する配列番号１０記載のアンチセンス鎖ミックスＤＮＡをプライマーとして、再度上記と同様にＰＣＲを行い、増幅した７４ｂｐのバンドを回収した。回収した断片をファルマシア社製Sure Clone Ligation Kitを用いてｐＵＣ１８のSma I部位に挿入し、アプライドバイオシステムズ社の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTMTerminator Cycle Sequencing Kit）を用いてその塩基配列を決定した。
決定された延期配列を配列番号１１および配列番号１２に示す。２種類の塩基配列が決定され、配列番号１１の塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、配列番号５記載の精製酵素のＮ末端アミノ酸配列と、Ｎ末端アミノ酸配列で決定できなかった２番目のアミノ酸を除いて完全に一致した。また、配列番号１２の塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、配列番号５記載の精製酵素のＮ末端アミノ酸配列と高いホモロジーを示した。
実施例２  Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の取得
（１）ＤＩＧ化プローブの作成
実施例１（３）で取得した配列番号１１および配列番号１２で示された２種類の７４ｂｐの断片をそれぞれｐＵＣ１８のSma I部位に挿入し、得られた２種類のプラスミッドを鋳型とし、各々について配列番号８記載のセンス鎖合成ＤＮＡと配列番号１０記載のアンチセンス鎖合成ＤＮＡを各１０μＭ含む反応液５０μｌを用いて実施例１（３）と同様の操作によりＰＣＲを行った。該反応液を、それぞれ１２.５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、各々について７４ｂｐの増幅断片の生成を確認し、ゲルより実施例１（３）と同様の操作により、該増幅断片を回収した。
該７４ｂｐ断片のジゴキシゲニン（Digoxigenin、ＤＩＧ）化は、ベーリンガー・マンハイム社製PCR DIG Labelling Kitを用いて行った。
回収した該２種類の７４ｂｐ断片を鋳型とし、各々についてPfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社）２.５Ｕ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（STRATAGENE社）５μｌ、ＤＭＳＯ ５μｌ、×１０ PCR DIG mix（ベーリンガー・マンハイム社製）５μｌ、配列番号８記載のセンス鎖合成ＤＮＡと配列番号１０記載のアンチセンス鎖合成ＤＮＡを各１０μＭ含む反応液５０μｌを用いてＰＣＲを行った。
反応は、９５℃、５分間のインキュベーション後、９５℃−０.５分間、５０℃−０.５分間、７５℃−１分間のインキュベーション工程を４０回繰り返し、それぞれ１２.５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、各々について７４ｂｐの増幅断片の生成を確認し、ゲルより、実施例１（３）と同様の操作により、該増幅断片を回収し、該２種類の増幅断片をプローブとして用いた。以下、配列番号１１に示された塩基配列由来のプローブをプローブＡ、配列番号１２に示された塩基配列由来のプローブをプローブＢと呼ぶ。
（２）サザーンハイブリダイゼーション
ストレプトマイセス・エスピーＴＨ１の染色体ＤＮＡ ２０μｇに、制限酵素Pst I（宝酒造社製）２０Ｕを添加し、３７℃、２時間反応させ、該ＤＮＡを切断後、該ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけた。実施例２（１）で得たプローブＡを用い、ベーリンガー・マンハイム社製のDIG Luminescent Detection Kitを用いて、添付の説明書記載の方法に従ってサザーンハイブリダイゼーションを行った。
即ち、アガロースゲル電気泳動後、アガロースゲルを０.２５Ｎ 塩酸中で２０分間ゆるやかに振とうし、アトー社製ジェノピレーターポンプAE-6680Pおよびアトー社製ジェノピレーターAE-6680Cを用いて、７.５ｍｍＨｇで吸引しつつ、０.４Ｍ水酸化ナトリウム溶液中で、Hybond-N+膜（アマーシャム社製）にブロッティングした。ブロッティング後膜を風乾した。このようにして得た膜を、DIG Luminescent Detection Kitのハイブリダイゼーション・バッファー〔フォルムアミド ５０％ｖ／ｖ、ブロッキング試薬 ２％、Ｎ−ラウリルザルコシン ０.１％ｗ／ｖ、ＳＤＳ ０.０２％ｗ／ｖ、を５倍濃度のＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）中に含んだ溶液〕１０ｍｌ中に４２℃、１時間浸した後、プローブ溶液〔実施例２（１）で得たプローブＡ ３μｌを２００μｌのハイブリダイゼーション・バッファーに添加し、９５℃、２分間処理後、ハイブリダイゼーション・バッファーを添加し１.５ｍｌに調製したもの〕中に、４２℃、一晩浸した。該膜をさらに、０.１％ ＳＤＳを含む２倍濃度の２５ｍｌ ＳＳＣで室温にて５分間づつ２回洗浄後、０.１％ ＳＤＳを含む０.１倍濃度の２５ｍｌ ＳＳＣで６８℃にて１５分間づつ２回洗浄した。
該膜を洗浄バッファー〔０.３％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むバッファー１（０.１Ｍ マレイン酸、０.１５Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ７.５）〕で室温にて１〜５分、５０ｍｌのバッファー２（１％ブロッキング試薬を含むバッファー１）で室温にて３０分間、１μｌのanti-digoxigenin-AP Fabを含む１０ｍｌのバッファー２で室温にて３０分間、５０ｍｌのバッファー２で室温にて３０分間づつ２回、１０ｍｌのバッファー３（０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ 塩化マグネシウム、ｐＨ９.５）にて室温２〜５分、Lumigen PPD ５０μｌを含む５ｍｌバッファー３で室温にて５分間、順次処理した後、濾紙上で素早く水を切り、サランラップに包んだ後、３７℃、１５分間静置した。これをHyperfilm-ECL（アマーシャム社製）を用いて室温にて３０分間露光した。
約６ｋｂの位置にプローブと強くハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出した。
また、該実施例２（２）と同じ操作を、実施例２（１）で得たプローブＢを用い、また、制限酵素Pst Iを用いる代わりにKpn I（宝酒造社製）２０Ｕを用いて実施し、約５ｋｂの位置にプローブと強くハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出した。
（３）染色体ＤＮＡの分画
ストレプトマイセス・エスピーＴＨ１の染色体ＤＮＡ ２０μｇに、制限酵素Pst I（宝酒造社製）２０Ｕを添加し、３７℃、２時間反応させ、該ＤＮＡを切断後、等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを加え混合した。遠心分離後、上層をとり、２.２倍容量の冷エタノールを加え、穏やかに混合した。１０、０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を捨てた後、沈殿を７０％冷エタノールで２回洗浄し、エタノール沈殿を得た。以後、ＴＥ飽和フェノール／クロロホルム、冷エタノールを用いエタノール沈殿を得る操作をエタノール沈殿法と呼ぶ。該エタノール沈殿を１２０μｌ ＴＥに溶解し、アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後、６ｋｂ付近のＤＮＡ画分をPrep-A-gene（バイオラッド社製）を用いてアガロースゲルより抽出精製し、約０.５μｇのPst I切断染色体ＤＮＡ分画を得た。
また、該実施例２（３）と同じ操作を、制限酵素Pst Iを用いる代わりにKpn I ２０Ｕを用いて実施し、約５ｋｂ付近のKpn I切断染色体ＤＮＡ分画を約０.５μｇ得た。
（４）プラスミッドライブラリーの作成
▲１▼  pBluescriptII KS(+)（STRATAGENE社）１μｇを制限酵素Pst I（宝酒造社製）を用いて切断後、宝酒造社製のアルカリフォスファターゼ〔Alkaline Phosphatase(Calf Intesteine)〕を用い、添付の説明書記載の方法に従って脱りん酸化反応を行った。反応後、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該沈殿を５μｌのＴＥに溶解した。このようにして得たPst I切断pBluescriptII KS(+)  ＤＮＡと実施例２（３）で得たPst I切断染色体ＤＮＡ ０.１μｇをライゲーションキット（TAKARA ligation Kit、宝酒造社製）を用いて２６℃、２.５時間反応させ、連結した。該連結ＤＮＡを用い、常法にしたがってE．coli XL2-Blueを形質転換後、該形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養し、約２４０個のコロニーを得た。
▲２▼  pBluescript II KS(+)（STRATAGENE社）１μｇを制限酵素Kpn I（宝酒造社製）を用いて切断後、宝酒造社製のアルカリフォスファターゼ〔Alkaline Phosphatase(Calf Intesteine)〕を用い、添付の説明書記載の方法に従って脱りん酸化反応を行った。反応後、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該沈殿を５μｌのＴＥに溶解した。このようにして得たKpn I切断pBluescript II KS(+)ＤＮＡと実施例２（３）で得たKpn I切断染色体ＤＮＡ０．１μｇをライゲーションキット（TAKARA ligation Kit、宝酒造社製）を用いて２６℃、２.５時間反応させ、連結した。該連結ＤＮＡを用い、常法にしたがってE．coli XL2-Blueを形質転換後、該形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養し、約２００個のコロニーを得た。
（５）目的クローンの選択
上記コロニーの中から、目的とするクローンを有するコロニーを以下のように選択した。
ＬＢ寒天培地上に出現したコロニーを、５倍濃度のＳＳＣで洗浄したナイロン膜（シュライヒャー・アンド・シュール、Schleicher & Schuell、社製ナイロン膜Nytran）に移し取った後、その膜を０.５Ｍ 水酸化ナトリウムを染み込ませた濾紙上に５分間静置した。続いて、１.０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）を染み込ませた濾紙上に５分間静置し、さらに１.５Ｍ 塩化ナトリウム−１.０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）を染み込ませた濾紙上に５分間静置し、２倍濃度のＳＳＣで軽く洗った後、紫外線（１２０ｍＪ／ｃｍ2）によってクロスリンキングを行った。ついで、０.１％ ＳＤＳを含む２倍濃度のＳＳＣで膜表面を拭き取った後、風乾した。
実施例２（１）で得たＤＩＧ化プローブを用い、ベーリンガー・マンハイム社製のDIG Luminescent Detection Kitを用いて、実施例２（２）記載の方法に従って検出を行った。
実施例２（４）▲１▼で取得した約２４０個のコロニーと実施例２（１）で取得したプローブＡとのコロニーハイブリダイゼーションにより、目的とするクローンを有するポジティブコロニーを１つ、実施例２（４）▲２▼で取得した約２００個のコロニーと実施例２（１）で取得したプローブＢとのコロニーハイブリダイゼーションにより、目的とするクローンを有するポジティブコロニーを５つ検出した。
該コロニーより、常法に従ってプラスミッドを抽出し、ｐＴＨ３０、ｐＴＨ７１およびｐＴＨ７５を取得した。
該プラスミッドの構造を制限酵素消化により確認した。ｐＴＨ３０は、pBluescriptII KS(+)のPst I部位に約６ｋｂのPst I切断ＤＮＡ断片が挿入された構造を有しており（第１図）、ｐＴＨ７１およびｐＴＨ７５は、pBluescript II KS(+)のKpn I部位に約５ｋｂのKpn I切断ＤＮＡ断片がそれぞれ逆向きに挿入された構造を有していた（第２図）。
（６）塩基配列の決定
▲１▼  プラスミッドｐＴＨ３０について、宝酒造社製キロシークエンス用デレーションキットを用いて、種々の欠失変異プラスミッドを作成した。具体的な試薬および方法は、キットに添付の説明書に従った。該欠失プラスミッドの塩基配列をアプライドバイオシステムズ社の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用いて分析し、配列番号１３に示す１０８１ｂのKpn I-Eco RI断片の塩基配列を決定した。
該塩基配列には、配列番号１に示された２９０アミノ酸残基から構成される蛋白質をコードする配列番号３に示した塩基配列が存在していた。このアミノ酸配列中には、精製Ｌ−プロリン３位水酸化酵素を用いて決定された配列番号５に示されるＮ末端アミノ酸配列、配列番号６および７に示されている内部アミノ酸配列が含まれており、取得した約６ｋｂのPst I断片中に目的とするＬ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子が存在することが確認された。以後、該遺伝子をＬ−プロリン３位水酸化酵素Ｉ型遺伝子と呼ぶ。
▲２▼  プラスミッドｐＴＨ７１およびＴＨ７５のストレプトマイセス由来挿入断片末端の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用いて分析した。該分析により得られた塩基配列を元にシークエンス用プライマーをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成し、該プライマーを用いて、ｐＴＨ７１およびＴＨ７５のストレプトマイセス由来挿入断片の更に下流の塩基配列を解析した。該解析により得られた塩基配列を元にシークエンス用プライマー合成を行い、該プライマーを用いて更に下流の塩基配列解析を行なった。該塩基配列解析操作をくり返すことにより、配列番号１４に示すNru I-Kpn I断片１８２６ｂｐの配列を決定した。
該塩基配列には、配列番号２に示された２９０アミノ酸残基から構成される蛋白質をコードする配列番号４に示した塩基配列が存在していた。配列番号４に示した塩基配列中には配列番号１２に示した配列が存在した。またこの配列番号４に示した塩基配列は、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素Ｉ型遺伝子と７８．５％の相同性を示した。以後、配列番号４に示した遺伝子をＬ−プロリン３位水酸化酵素II型遺伝子と呼ぶ。
実施例３  Ｌ−プロリン３位水酸化酵素発現プラスミッドの構築
▲１▼  Ｌ−プロリン３位水酸化酵素Ｉ型遺伝子発現プラスミッドの構築
実施例２で得られたプラスミッドｐＴＨ３０を制限酵素Eco RIで切断し、宝酒造社製のライゲーションキットを用いてセルフライゲーションさせた。該セルフライゲーションにより得られたＤＮＡを用い、常法にしたがってE．coli XL1-Blue MRF'株を形質転換した。該形質転換株より常法に従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
上記の結果、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素遺伝子の３’側に存在する約３ｋｂのEco RI断片が除去されたプラスミッドｐＴＨ４０を取得した（第１図）。
次いで、プラスミッドｐＴＨ４０をKpn IおよびSma Iで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＬ−プロリン３位水酸化酵素Ｉ型遺伝子を含む約０.９５ｋｂｐの断片を確認後、アガロースゲルより常法に従って該断片を回収した。該Kpn I-Sma I切断断片をpBluescriptII KS(+)のKpn I-Sma I切断部位に宝酒造社製のライゲーションキットを用いて挿入し、該ＤＮＡを用いて、常法に従ってE．coli XL1-Blue MRF'株を形質転換した。該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃一晩培養した。生育してきた該形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
上記の結果、lacプロモーターの転写方向と同方向にＬ−プロリン３位水酸化酵素Ｉ型遺伝子をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミッドｐＴＨ５０（第３図）を得た。
▲２▼  Ｌ−プロリン３位水酸化酵素II型遺伝子発現プラスミッドの構築
実施例２で得られたプラスミッドｐＴＨ７５を制限酵素Nru IとSac Iで切断し、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素II型遺伝子を含む約１９００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動法にて回収した。該Nru I-Sac I切断断片をpBluescript II KS(+)のHinc II-Sac I切断部位に宝酒造社製のライゲーションキットを用いて挿入し、該ＤＮＡを用いて、常法に従ってE．coli XL 2-Blue MRF'株を形質転換した。該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃一晩培養した。生育してきた該形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
上記の結果、lacプロモーターの転写方向と同方向にＬ−プロリン３位水酸化酵素II型遺伝子をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミッドｐＥＸ１−５（第４図）を得た。
実施例４  形質転換体によるＬ−プロリン３位水酸化酵素の生産
▲１▼  Ｌ−プロリン３位水酸化酵素Ｉ型遺伝子を含有する形質転換体によるＬ−プロリン３位水酸化酵素の生産
実施例３で得たプラスミッドｐＴＨ５０を用いて、E．coli ATCC12435を形質転換した。得られた形質転換体を各々５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌ ＬＢ培地に植菌し３０℃、一晩振とう培養した。該培養液を遠心分離し、得られた菌体を−２０℃で凍結した。
該凍結菌体を溶解後、反応液〔２００ｍＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７.５）中に、１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を含有する〕２５０μｌに湿菌体量として４％（ｗ／ｖ）となるように加え、３５℃１０分間反応した。反応液を１００℃、２分間加熱することにより反応を停止した。
該反応停止液を遠心分離し、得られた上清１００μｌに、０.３Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０.７）１００μｌ、１０％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノール水溶液４μｌおよび５％（ｗ／ｖ）o-フタルアルデヒドのエタノール溶液１６μｌを添加し６０℃で３０秒放置後、２％（ｗ／ｖ）ＮＢＤのエタノール溶液５０μｌを加え、６０℃で４０分間反応した。該反応液に１Ｎ 塩酸３０μｌを加えて反応を停止した。該反応停止液を遠心分離後、フィルター濾過し、沈殿を除去した後、高速液体クロマトグラフィーにより分析を行い、生成したシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量した。
高速液体クロマトグラフィーは以下の条件にて行った。
移動相：１０ｍＭ クエン酸（ｐＨ４.０）／メタノール＝３／１（ｖ／ｖ）
流速：１ｍｌ／分
カラム：YMC Pack ODS AQ-312（ＹＭＣ社製、６ｘ１５０ｍｍ）
カラム温度：５０℃
検出：蛍光検出、励起波長５０３ｎｍ、蛍光波長５４１ｎｍ
第１表に示したように、形質転換体E．coli ATCC12435/pTH50は、遺伝子源として用いたStreptomyces sp．TH1株と比較して、菌体あたり約３４倍のＬ−プロリン３位水酸化酵素を生産していた。
0003781776.tif 000002
▲２▼  Ｌ−プロリン３位水酸化酵素II型遺伝子を含有する形質転換体によるＬ−プロリン３位水酸化酵素の生産
実施例３で得たプラスミッドｐＥＸ１−５を用いて、E．coli ATCC12435を形質転換した。得られた形質転換体を各々５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌ ＴＢ培地に植菌し３０℃、一晩振とう培養した。該培養液を遠心分離し、菌体を取得した。該集菌体は必要に応じて−２０℃で凍結保存し、使用時に解凍して用いた。
該集菌体を、反応液〔２００ｍＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に、２５ｍＭ Ｌ−プロリン、５０ｍＭ ２−ケトグルタル酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を含有する〕５００μｌに湿菌体量として２．２％（ｗ／ｖ）となるように加え、３５℃１５分間反応した。反応液を１００℃、２分間加熱することにより反応を停止した。
該反応停止液を遠心分離し、得られた上清１００μｌに、０．３Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．７）１００μｌ、１０％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノール水溶液４μｌおよび５％（ｗ／ｖ）o-フタルアルデヒド（ＯＰＡ）のエタノール溶液１６μｌを添加し６０℃で３０秒放置後、溶液を中和した。この操作で１級のアミノ酸はＯＰＡ化されるが、２級アミノ酸であるヒドロキシプロリンは修飾を受けない。その様に処理した反応液を、高速液体クロマトグラフィーにより分析を行ったところ、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが精製していることが判明した。高速液体クロマトグラフィーは以下の条件にて行った。
移動相：１ｍＭ硫酸銅水溶液
流速：１ｍｌ／分
カラム：スミキラルＯＡ−５０００（住化化学分析サービス社製、４．６ｘ２５０ｍｍ）
カラム温度：３８℃
上記条件で光学分割した溶離液を、オンラインで以下の条件下で反応液と混合し、反応槽ＣＲＢ−６Ａ（島津社製）にてＮＢＤ化を行い、蛍光によってＮＢＤ化２級アミノ酸を定量した
反応液および添加量：
300mM ほう酸、25mM ＥＤＴＡ水溶液(pH9.6)−０．２ｍｌ／分
1g／ｌ ＮＢＤメタノール溶液              −０．５ｍｌ／分
反応温度：６０℃
検出：蛍光検出、励起波長５０３ｎｍ、蛍光波長５４１ｎｍ
第２表に示したように、形質転換体E．coli ATCC12435／ｐＥＸ１−５は、遺伝子源として用いたStreptomyces sp．TH1株と比較して、菌体あたり約７７倍のＬ−プロリン３位水酸化酵素を生産していた。
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実施例５  β−ガラクトシダーゼ蛋白との融合蛋白発現プラスミッドの構築
（１）ｐＴＨ６０プラスミッドの構築
ｐＴＨ４０ＤＮＡ ４μｇをMlu Iで切断後、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を３６μｌのＴＥに溶解後、宝酒造社製Takara DNA Blunting Kitを用いて、該ＤＮＡの両末端をブラント化した。該ＤＮＡ断片を、エタノール沈殿法により、回収した。該ＤＮＡをEco RIにて切断しアガロースゲル電気泳動にかけ、アガロースゲルよりＬ−プロリン３位水酸化酵素の構造遺伝子を含む約１ｋｂの断片を常法により抽出し、Prep-A-gene（バイオラッド社）を用いて回収した。該ＤＮＡ断片を１０μｌのＴＥに溶解した。
一方、プラスミッドpBluescript II KS(+)ＤＮＡ ２.４μｇをApa Iで切断し、アガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルより常法により回収精製した。宝酒造社製Takara DNA Blunting Kitを用いて、該ＤＮＡ断片の両末端をブラント化し、Eco RIにて切断後、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解した。
上記で得たＬ−プロリン３位水酸化酵素の構造遺伝子を含む約１ｋｂのMlu I-Eco RI断片をApa I-Eco RI処理したpBluescript II KS(+)に宝酒造社製のライゲーションキットを用いて連結した。
該連結ＤＮＡを用い、常法に従ってE．coli XL1-Blue MRF'株に形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。生育してきた該形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
上記の結果、lacプロモーターの転写方向と同方向にＬ−プロリン３位水酸化酵素の構造遺伝子がβ−ＧａｌのＮ末アミノ酸配列と融合した形で挿入されたプラスミッドｐＴＨ６０を得た（第５図）。構築した融合蛋白アミノ酸配列は、ＤＮＡの連結部分に新たに生成したアルギニン（２２番目）を介して、β−ＧａｌのＮ末２１アミノ酸とＬ−プロリン３位水酸化酵素蛋白が融合した構造をしている。但し、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素蛋白の最初のアミノ酸であるメチオニン（ＧＴＧ）はバリンとして翻訳される。融合蛋白のアミノ酸配列を配列番号１５に示した。
（２）ｐＴＨ７０プラスミッド
pBluescript II KS(+)ＤＮＡ ２.４μｇをAcc Iで切断し、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿（ＤＮＡ断片）を得た。宝酒造社製Takara DNA Blunting Kitを用いて、該ＤＮＡ断片の両末端をブラント化し、Eco RIにて切断後、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解した。
実施例５（１）で得たＬ−プロリン３位水酸化酵素の構造遺伝子を含む約１ｋｂのMlu I-Eco RI断片をAcc I-Eco RI処理したpBluescript II KS(+)に宝酒造社製のライゲーションキットを用いて連結した。
該連結ＤＮＡを用い、常法に従ってE．coli XL1-Blue MRF'株に形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。生育してきた該形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
上記の結果、lacプロモーターの転写方向と同方向にＬ−プロリン３位水酸化酵素の構造遺伝子がβ−ＧａｌのＮ末アミノ酸配列と融合した形で挿入されたプラスミッドｐＴＨ７０を得た（第６図）。構築した融合蛋白アミノ酸配列は、ＤＮＡの連結部分に新たに生成したアルギニン（２８番目）を介して、β−ＧａｌのＮ末２７アミノ酸とＬ−プロリン３位水酸化酵素が融合した構造をしている。但し、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素蛋白の最初のアミノ酸であるメチオニン（ＧＴＧ）はバリンとして翻訳される。融合蛋白のアミノ酸配列を配列番号１６に示した。
（３）ｐＴＨ８０プラスミッド
ｐＴＨ４０ ＤＮＡ ４μｇをMlu Iで切断後、エタノール沈殿により、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿（ＤＮＡ断片）を３６μｌのＴＥに溶解した。宝酒造社製Takara DNA Blunting Kitを用いて、該ＤＮＡ断片の両末端をブラント化し、Sac IIにて切断後、アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の構造遺伝子を含む約０.９５ｋｂの断片を常法により抽出し、Prep-A-gene（バイオラッド社）により回収し、１０μｌのＴＥに溶解した。
一方、プラスミッドpBluescript II KS(+)ＤＮＡ ２.４μｇをPst Iで切断後、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該ＤＮＡ断片を３６μｌのＴＥに溶解し、宝酒造社製Takara DNA Blunting Kitを用いて、該ＤＮＡ断片の両末端をブラント化し、Sac IIにて切断後、エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解した。
上記のようにして得たＬ−プロリン３位水酸化酵素の構造遺伝子を含む約１ｋｂのMlu I-Sac II断片をPst I-Sac II処理したpBluescript II KS(+)に宝酒造社製のライゲーションキットを用いて連結した。
該連結ＤＮＡを用い、常法に従ってE．coli XL1-Blue MRF'株に形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。生育してきた該形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
上記の結果、lacプロモーターの転写方向と同方向にＬ−プロリン３位水酸化酵素の構造遺伝子がβ−ＧａｌのＮ末アミノ酸配列と融合した形で挿入されたプラスミッドｐＴＨ８０を得た（第７図）。構築した融合蛋白アミノ酸配列は、ＤＮＡの連結部分に新たに生成したアルギニン（３８番目）を介して、β−ＧａｌのＮ末３７アミノ酸とＬ−プロリン３位水酸化酵素蛋白が融合した構造をしている。但し、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素蛋白の最初のアミノ酸であるメチオニン（ＧＴＧ）はバリンとして翻訳される。融合蛋白のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。
実施例６  融合蛋白発現プラスミッドを含む形質転換体によるＬ−プロリン３位水酸化酵素の生産
実施例５で得たプラスミッドｐＴＨ６０、ｐＴＨ７０およびｐＴＨ８０を用いて、E．coli ATCC12435を形質転換した。実施例４に準じた方法で、得られた形質転換体の培養および該形質転換体のＬ−プロリン３位水酸化酵素の生産性を調べた。
第３表に示したように、該形質転換体は、遺伝子源として用いたストレプトマイセス・エスピーＴＨ１株と比較して、菌体あたり４６〜１２１倍のＬ−プロリン３位水酸化酵素を生産した。
0003781776.tif 000004
実施例７  形質転換体によるシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
（１）形質転換体E．coli ATCC12435/pTH70を用いたシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
実施例６で得た形質転換体E．coli ATCC12435/pTH70を用いて、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産を行った。
該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む３ｍｌ ＴＢ培地（バクトトリプトン １２ｇ、バクトイーストエキスラクト ２４ｇ、グリセロール ４ｇ、リン酸１カリウム ２．３ｇ、リン酸２カリウム １２．５ｇを蒸留水１リッターに含み、１２０℃、２０分間滅菌）に植菌し、３０℃、１６時間振とう培養した。該培養液を遠心分離し、得られた上清中のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン量を定量した。
その結果、E．coli ATCC12435/pTH70の培養液上清中に６２０μＭ（８１．２ｍｇ／ｌ）のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成していた。
一方、宿主として用いたE．coli ATCC12435の培養液上清中には、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは検出されなかった。
（２）  形質転換体E．coli ATCC12435／ｐＴＨ７０を用いたシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産
形質転換体E．coli ATCC12435／ｐＴＨ７０をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌ Ｍｅｄ４培地に植菌し、３０℃で１６時間振とう培養した。
該培養液を種培養液とし、２リッターのＭｅｄ６培地を入れた５リッタージャーファーメンターに植菌した。さらにＬ−Ｐｒｏを２００ｍＭ、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌとなるよう添加し、培養温度３０℃、撹拌数４００回転／分、通気量１リッター／培養液１リッター／分という条件で運転した。
培養中、グルコースは無くならぬように、Ｌ−プロリンは約５０ｍＭとなるように適時添加し、ＮＨ4ＯＨを用いて、ｐＨ６．５に下限コントロールした。
該培養液を遠心分離し、得られた上清中のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量したところ、培養７２時間で１１５ｍＭ（１５ｇ／Ｌ）のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンがE．coli ATCC12435／ｐＴＨ７０の培養液上清中に生成蓄積していた。
一方、宿主として用いたE．coli ATCC12435の培養上清中には遊離のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは検出されなかった。
実施例８  形質転換菌体を用いたＬ−プロリンからシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンへの転換
実施例６で得た形質転換体E．coli ATCC12435/pTH70を用いて、Ｌ−プロリンからのシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンへの転換を行った。
該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌ ＬＢ培地に植菌し３０℃で一晩振とう培養した。該培養液７ｍｌを遠心分離し、菌体を取得した。該菌体は必要に応じて−２０℃で凍結保存し、使用時に解凍して用いた。
該菌体を、反応液〔２００ｍＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７.５）中に、２４ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を含有する〕５００μｌに湿菌体量として１０％（ｗ／ｖ）となるように加え、３５℃、６０分間反応した。反応液中に生成したシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン量を定量した結果、１７.７ｍＭ（２.３ｇ／ｌ）のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成していた。
参考例１．Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の単離および精製
(1) ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＴＨ１の凍結菌体の調製
ＳＲ３培地（グルコース １．０％、可溶性澱粉 １．０％、酵母エキス ０．５％、トリプトン ０．５％、肉エキス ０．３％およびりん酸マグネシウム ０．０５％を含み、６N NaOHでｐＨ７．２に調整した培地）を試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、ＨＴ寒天平板培地（可溶性澱粉 １％、ＮＺアミン ０．２％、酵母エキス ０．１％、肉エキス ０．１％および寒天 １．５％を含み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整後、１２０℃、２０分間殺菌した培地）に生育したストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＴＨ１を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種培養液として用いた。本種培養液を更に２リッター三角フラスコに分注、１２０℃、２０分間殺菌した２００ｍｌのＳＲ３培地に植菌し、２８℃、２日間振盪培地をした。この培養液を、５リッタージャーファーメンターに分注した２リッターのＤｆ３培地（可溶性澱粉 ５％、コーンスティープリカー ３．０％、りん酸一カリウム ０．０５％、硫酸マグネシウム７水塩 ０．０５％および炭酸カルシウム ０．５％を含み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した培地）に無菌的に接種し、７００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、の条件で２８℃、２日間培養した。培養中のｐＨは無調整で行った。得られた培養液を１５，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、湿菌体を培養液１リッター当たり７５ｇ得た。湿菌体は４℃で生理食塩水で洗浄し、遠心後使用時まで−８０℃で凍結保存した。
(2) 無細胞抽出液の調製
(1)で得た凍結菌体３０ｇを溶解後、２００ｍｌの緩衝液(A)〔１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．２ｍＭ EDTA、０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（Tween 20）および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭピペラジン緩衝液（６Ｎ ＨＣｌでｐＨを５．３に調整）〕に氷冷下懸濁した。懸濁液中の菌体を、氷冷下超音波破砕し、４℃、３０，０００×ｇ、３０分間遠心分離後、上清を得た。
これ以降の操作は全て氷冷下ないしは４℃で行った。
(3) カラムクロマトグラフィーによる単離および精製
(3)-1.酸処理
前記工程で得た上清のｐＨを６Ｎ 塩酸で４.５に調整後、生じた沈殿を１５、０００ｇ、３０分間遠心分離して除去し、上清を得た。
(3)-2.リソースＱカラムクロマトグラフィー(I)
前記工程で得た上清を、緩衝液(A)で平衡化したファルマシア社製のリソースＱカラム（RESOURCETM Q，6ml）に通塔した。緩衝液(A)で洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液(A)中に作成した０から０．３Ｍ間での食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
(3)-3.リソースＱカラムクロマトグラフィー(II)
前記工程で得た活性画分を、緩衝液(B)〔１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ EDTAおよび１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨを７.５に調整）〕で３倍に希釈後、緩衝液(B)で平衡化したファルマシア社製のリソースＱカラム（RESOURCETM Q，1ml）に通塔した。緩衝液(B)で洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液(B)中に作成した０から０.３Ｍ間での食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
(3)-4.フェニルセファロースクロマトグラフィー
前記工程で得た活性画分に、食塩を２Ｍになるように添加溶解し、２Ｍ食塩を含む緩衝液(B)で平衡化したフェニルセファロースカラム（Phenyl Sepharose HP HiLoad，1ml）に通塔した。２Ｍ食塩を含む緩衝液(B)で洗浄後、該酵素を含む画分を、０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（Tween 20）を含む緩衝液(B)を用いて溶出した。
(3)-5.リソースＱカラムクロマトグラフィー(III)
前記工程で得た活性画分を緩衝液(A)で平衡化したファルマシア社製ＰＤ−１０カラムを用いて脱塩後、緩衝液(A)で平衡化したファルマシア社製のリソースＱカラム（RESOURCETM Q，1ml）に通塔した。緩衝液(A)で洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液(A)中に作成した０から０.３Ｍ間での食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
(3)-6.リソースＱカラムクロマトグラフィー(IV)
前記工程で得た活性画分を、０.１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（Tween 20）を含む緩衝液(B)で３倍に希釈後、緩衝液(B)で平衡化したファルマシア社製のリソースＱカラム（RESOURCETM Q，1ml）に通塔した。緩衝液(B)で洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液(B)中に作成した０から０.３Ｍ間での食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の単離および精製の概要を第４表にまとめた。
0003781776.tif 000005
参考例２  ストレプトマイセス・エスピーによるＬ−プロリン３位水酸化酵素の生産
ＳＲ３培地を試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、ＨＴ寒天平板培地に生育したストレプトマイセス・エスピーＴＨ１を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種培養液として用いた。
一方、Ｄｆ３培地を試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、種培養液１ｍｌを無菌的に接種し、２８℃、２日間振盪培養した。得られた培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離した。得られた菌体を８０ｍＭ ＴＥＳ〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕緩衝液（ｐＨ７.５）に懸濁し洗浄後、遠心分離し、湿菌体をえた。該湿菌体１.０ｇを、１０ｍｌの反応液〔５ｍＭ  Ｌ−プロリン、５ｍＭ  α−ケト−グルタル酸、５ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸、１ｍＭ  硫酸第一鉄、を含有する１００ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７.５）にナイミーン溶液［ナイミーンＳ−２１５（日本油脂株式会社製）４ｇをキシレン１０ｍｌに溶解］を１.４％（ｖ／ｖ）添加〕に懸濁し、３０℃、３０分間反応を行った。反応後、菌体反応液より菌体を遠心分離除去し、上清中に生成したシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの量を定量した。
結果を表１に示した。
産業上の利用可能性
本発明によれば、医薬品の合成原料または食品添加物として有用なシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン３位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体、該形質転換体を用いたＬ−プロリン３位水酸化酵素の製造法、および該酵素を提供することができる。
配  列  表
配列番号：１
配列の長さ：２９０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：タンパク質(protein)
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列：
0003781776.tif 000006
0003781776.tif 000007
配列番号：２
配列の長さ：２９０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：タンパク質(protein)
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列：
0003781776.tif 000008
0003781776.tif 000009
配列番号：３
配列の長さ：８７０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：Genomic DNA
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列：
0003781776.tif 000010
配列番号：４
配列の長さ：８７０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：Genomic DNA
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列：
0003781776.tif 000011
配列番号：５
配列の長さ：２９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列：
0003781776.tif 000012
配列番号：６
配列の長さ：２５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列：
0003781776.tif 000013
配列番号：７
配列の長さ：２５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列：
0003781776.tif 000014
配列番号：８
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
0003781776.tif 000015
配列番号：９
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
0003781776.tif 000016
配列番号：１０
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
0003781776.tif 000017
配列番号：１１
配列の長さ：７４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
0003781776.tif 000018
配列番号：１２
配列の長さ：７４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：他の核酸、合成 DNA
配列：
0003781776.tif 000019
配列番号：１３
配列の長さ：１０８１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：Genomic DNA
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列：
0003781776.tif 000020
配列番号：１４
配列の長さ：1826
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：Genomic DNA
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列：
0003781776.tif 000021
0003781776.tif 000022
配列番号：１５
配列の長さ：３１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：タンパク質(protein)
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列の特徴
特徴を表す記号：peptide
存在位置：23..312
特徴を決定した方法：S
起源
生物名：Escherichia coli
直接の起源：pBluescriptIIKS+
配列の特徴
特徴を表す記号：peptide
存在位置：1..21（22はDNA連結部）
特徴を決定した方法：S
配列：
0003781776.tif 000023
0003781776.tif 000024
0003781776.tif 000025
配列番号：１６
配列の長さ：３１８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：タンパク質(protein)
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列の特徴
特徴を表す記号：peptide
存在位置：29..318
特徴を決定した方法：S
起源
生物名：Escherichia coli
直接の起源：pBluescriptIIKS+
配列の特徴
特徴を表す記号：peptide
存在位置：1..27（28はDNA連結部）
特徴を決定した方法：S
配列：
0003781776.tif 000026
0003781776.tif 000027
配列番号：１７
配列の長さ：３２８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：タンパク質(protein)
起源：
生物名：Streptomyces sp．
株名：TH1
配列の特徴
特徴を表す記号：peptide
存在位置：38..328
特徴を決定した方法：S
起源
生物名：Escherichia coli
直接の起源：pBluescriptIIKS+
配列の特徴
特徴を表す記号：peptide
存在位置：1..37（38はDNA連結部）
特徴を決定した方法：S
配列：
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0003781776.tif 000029
0003781776.tif 000030
【図１】
0003781776.tif 000031
【図２】
0003781776.tif 000032
【図３】
0003781776.tif 000033
【図４】
0003781776.tif 000034
【図５】
0003781776.tif 000035
【図６】
0003781776.tif 000036
【図７】
0003781776.tif 000037