(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物身体内への移植後の石灰化を阻害するために、生物学的組織を処理する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）生物学的組織を、グルタルアルデヒドの溶液中に配置する工程；および
ｂ）該グルタルアルデヒドの溶液を２５〜８０℃に加熱することによりグルタルアルデヒドが重合するように該生物学的組織を処理する工程を包含し、但し、該グルタルアルデヒドの溶液がアミノプロパンヒドロキシジホスホネートを含まない、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
前記工程（ａ）の後、前記組織を、グルタルアルデヒドを含有する溶液中で貯蔵する工程；および
該溶液中の該貯蔵した組織を、３５〜５５℃の温度に加熱する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）の後、かつ前記工程（ｂ）の前に、前記組織をアルコール溶液中で滅菌する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記組織を滅菌する工程が、アルコール、ホルムアルデヒドおよびＴｗｅｅｎ８０を含有する溶液と前記組織とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記工程（ｂ）が、滅菌後の前記組織を貯蔵し、次いで、貯蔵の間に熱処理を適用する工程を包含する、方法。
【請求項６】
請求項１および５のいずれか１項に記載の方法であって、前記熱が３５〜５５℃に設定される、方法。
【請求項７】
請求項１および５のいずれか１項に記載の方法であって、前記熱を付与する工程が、４〜２２週間行われる、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記組織が、ウシ心膜組織またはブタ組織である、方法。
【請求項９】
前記生物学的組織を処理する工程が、グルタルアルデヒド含有抗無機質化処理溶液中で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記生物学的組織をグルタルアルデヒドの溶液中に配置する工程が、該生物学的組織を、以下に含有する０．６２５％のグルタルアルデヒド溶液中に配置する工程を包含する、方法：
ａ）２６ｍｌ／ｌ  グルタルアルデヒド（２５％）；
ｂ）４．８６３ｇ／ｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝液；
ｃ）２．６５ｇ／ｌ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；
ｄ）４．７１ｇ／ｌ  ＮａＣｌ；
ｅ）残部は二重濾過したＨ2Ｏ溶液；および
ｆ）ｐＨを７．４に調整するのに十分なＮａＯＨ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって得られる、生体補綴物であって、固定した生物学的組織が、以下：
ａ）心臓弁；
ｂ）血管組織；
ｃ）皮膚；
ｄ）硬膜；
ｅ）心膜；
ｆ）靭帯；および／または
ｇ）腱、を含む、生体補綴物。
【請求項１２】
哺乳動物身体内移植後の石灰化を阻害するために、生物学的組織を処理する方法であって：
ａ）生物学的組織を第１のグルタルアルデヒド溶液中に配置することによって該生物学的組織を固定する工程であって、ここで、該第１の溶液が室温で維持される工程；および
ｂ）固定された生物学的組織を第２のグルタルアルデヒド溶液中に配置する工程であって、ここで、該第２の溶液が３５〜５５℃の温度で維持される工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記工程（ａ）の後、かつ前記工程（ｂ）の前に、前記組織をアルコール溶液中で滅菌する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記組織を滅菌する工程が、アルコール、ホルムアルデヒドおよびＴｗｅｅｎ８０を含有する溶液と前記組織とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか１項に記載の方法であって、前記熱を付与する工程が、４〜２２週間行われる、方法。
【請求項１６】
請求項１２から１５のいずれか１項に記載の方法であって、前記組織が、ウシ心膜組織またはブタ組織である、方法。
【請求項１７】
請求項１２から１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記生物学的組織をグルタルアルデヒドの溶液中に配置する工程が、該生物学的組織を、以下を含有する０．６２５％のグルタルアルデヒド溶液中に配置する工程を包含する、方法：
ａ）２６ｍｌ／ｌ  グルタルアルデヒド（２５％）；
ｂ）４．８６３ｇ／ｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝液；
ｃ）２．６５ｇ／ｌ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；
ｄ）４．７１ｇ／ｌ  ＮａＣｌ；
ｅ）残部は二重濾過したＨ2Ｏ溶液；および
ｆ）ｐＨを７．４に調整するのに十分なＮａＯＨ。
【請求項１８】
哺乳動物身体内移植後の石灰化を阻害するために、生物学的組織を処理する方法であって：
ａ）生理食塩水溶液中に生物学的組織を配置する工程であって、ここで、該生理食塩水溶液が３５〜５５℃で維持される工程；および
ｂ）生物学的組織をグルタルアルデヒド溶液中に配置する工程であって、ここで、該グルタルアルデヒドの溶液が２５〜８０℃に加熱される工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記工程（ａ）の後、かつ前記工程（ｂ）の前に、前記組織をアルコール溶液中で滅菌する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記組織を滅菌する工程が、アルコール、ホルムアルデヒドおよびＴｗｅｅｎ８０を含有する溶液と前記組織とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１８から２０のいずれか１項に記載の方法であって、前記工程（ａ）が、４〜２２週間行われる、方法。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記組織が、ウシ心膜組織またはブタ組織である、方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、前記生物学的組織をグルタルアルデヒドの溶液中に配置する工程が、該生物学的組織を、以下を含有する０．６２５％のグルタルアルデヒド溶液中に配置する工程を包含する、方法：
ａ）２６ｍｌ／ｌ  グルタルアルデヒド（２５％）；
ｂ）４．８６３ｇ／ｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝液；
ｃ）２．６５ｇ／ｌ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；
ｄ）４．７１ｇ／ｌ  ＮａＣｌ；
ｅ）残部は二重濾過したＨ2Ｏ溶液；および
ｆ）ｐＨを７．４に調整するのに十分なＮａＯＨ。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般的には生物医学材料に関し、より具体的には、哺乳動物身体内に移植可能な保存生物学的組織（例えば、ブタ生体補綴物心臓弁）に関する。
発明の背景
先行技術は、生物学的組織を哺乳動物身体内へ続いて移植することを可能とするために、このような組織を保存するかまたは固定する数多くの方法を包含する。これまでに外科移植に利用されている生物学的組織のタイプの例としては、心臓弁、血管組織、皮膚、硬膜、心膜、靭帯、および腱が挙げられる。
本明細書中で使用される用語「移植する」は、任意の生組織または器官を内移植する（implanting）かまたは移植する（transplanting）こととして定義される（Dorlands Illustrated Medical Dictionary、27版、W.B.Saunders Co.1988を参照のこと）。哺乳動物の身体内へ移植される生物学的組織は、異種性（すなわち、異種移植片）または同種性（すなわち、同種移植片）であり得る。
用語「生体補綴物」は、移植前に化学的に前処理された生物学的組織の多くのタイプを定義する（Carpentier-Lonescu（編者）、Biological Tissue in Heart Valve Replacement,Butterworths,1972を参照のこと）。移植片とは異なり、生体補綴物の結果は、化学的に処理された生物学的材料の安定性に基づくものであり、細胞の生存能力または宿主細胞の増殖（ingrowth）に基づくものではない。化学的前処理は、生物学的組織の「固定」またはなめしを包含する。このような組織の固定またはなめしは、組織内で分子を架橋し得る１つ以上の化合物に組織を曝露することにより遂げられる。
種々の化合物（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン、ヘキサメチレンジイソシアネート、および特定のポリエポキシ化合物を含む）が、生物学的組織の固定または架橋に用いられている。
特に、グルタルアルデヒドは、比較的生理的に不活性であり、そして続いて行う外科移植のための種々の生物学的組織の固定に適切である（Carpentier,A.、J.Thorac.Cardiovasc.Surg.58:467-68(1969)）。特に、これまでグルタルアルデヒド固定に供されている生物学的組織のタイプの例としては、ブタ生体補綴心臓弁およびウシ心膜組織が挙げられる。
臨床経験は、グルタルアルデヒド固定化生体補綴組織が石灰化する傾向があり得ることを示している。このようなグルタルアルデヒド固定化生体補綴組織の石灰化は、小児患者において最も優位的に生じることが報告されている（Carpentierら、および「Continuing Improvements in Valvular Bioprostheses」,J.Thorac Cardiovasc.Surg.83:27-42,1982を参照のこと）。このような石灰化は、組織の機械特性の劣化および／または組織機能不全を生じ得るので望ましくない。このことを考慮して、外科医はグルタルアルデヒド保存ブタ弁を利用するよりも、むしろ機械心臓血管弁を小児患者に移植することを選択している。しかし、機械弁インプラントを受ける小児患者は、抗凝固薬投薬法による長期間の治療を必要とし、そしてこのような抗凝固は、出血の危険性の増加に関連する。
グルタルアルデヒド固定化生体補綴組織に生じる石灰化の機構は、完全に解明されていない。しかし、石灰化率に影響を与えると考えられる因子が挙げられる：
ａ）患者の年齢
ｂ）現存する代謝障害（すなわち、カルシウム過剰血症、糖尿病、腎不全）
ｃ）食事因子
ｄ）人種
ｅ）感染
ｆ）非経口カルシウム投与
ｇ）脱水
ｈ）歪曲／機械的因子
ｉ）外科移植後の初期期間の不適当な凝固療法；および
ｊ）宿主組織化学
グルタルアルデヒド固定化生体補綴物組織の石灰化の軽減法を見出すために、種々の試みが着手されている。米国特許第4,885,005号（Nashefら）SURFACTANT TREATMENT OF IMPLANTABLE BIOLOGICAL TISSUE TO INHIBIT CALCIFICATION;米国特許第4,648,881号（Carpentierら）IMPLANTABLE BIOLOGICAL TISSUE AND PROCESS FOR PREPARATION THEREOF;米国特許第4,976,733号（Girardot）PREVENTION OF PROSTHESIS CALCIFICATION;米国特許第4,120,649号（Schechter）TRANSPLANTS;米国特許第5,002,2566号（Carpentier）CALCIFICATION MITIGATION OF BIOPROSTHETIC IMPLANTS;EP 103947A2（Pollockら）METHOD FOR INHIBITING MINERALIZATION OF NATURAL TISSUE DURING IMPLANTATION、およびWO84/01879（Nashefら）SURFACTANT TREATMENT OF IMPLANTABLE BIOLOGICAL TISSUE TO INHIBIT CALCIFICATIONに記載される方法が、これらの石灰化軽減技術の内に含まれる。
化学的固定化生物学的物組織の石灰化を阻害するかまたは軽減する新規方法の開発の必要性が未だ残っている。
組織の石灰化は、移植前に組織と接触するようになるグルタルアルデヒド溶液の重合を加速することにより最小化され得ることが仮定される。
発明の要旨
本発明は、先行技術に関連する上記の欠点について特に取り組み、そして解決する。より具体的には、本発明は、哺乳動物身体への組織移植後の組織の石灰化を阻害するために、グルタルアルデヒド固定化生物学的組織または他の化合物で固定された生物学的組織を処理する方法を包含する。この方法は、生物学的組織をグルタルアルデヒドまたは他の化学固定液に接触するように配置し、次いでグルタルアルデヒドまたは他の固定液を加熱し、そして／あるいはグルタルアルデヒドまたは他の固定液を、熱的、化学的、または機械的手段により重合させることを包含する。
本発明の好ましい実施態様によれば、生物学的組織は、約26ml/lのグルタルアルデヒド（25％）；約4.863g/l HEPES緩衝液；約2.65g/l MgCl2・6H2O；および約4.71g/l NaClを含む0.625％グルタルアルデヒド溶液を含有する溶液中に配置される。溶液の残部（balance）は二重濾過H2Oを含む。十分な量のNaOHが、pHを約7.4に調節するために添加される。
グルタルアルデヒド溶液は、約35〜55℃の間になるまで約４〜22週間加熱される。
生物学的組織は、哺乳動物身体内への移植前に任意の回数、加熱処理され得る。例えば、組織は固定する前に処理され得る。生物学的組織の固定化前の処理は単に、生理食塩水溶液（９g/l NaCl）または任意の他の生理的溶液中において25〜80℃で数秒から22週間加熱することを包含する。あるいは、組織は、グルタルアルデヒド溶液中に配置されると同時に、その固定の間処理され得る。生物学的組織の固定化の間の処理は単に、グルタルアルデヒド溶液を約25〜80℃で約数秒から数カ月間加熱することを包含する。好ましい範囲は、35〜55℃で４〜22週間である。
あるいは、生物学的組織はその固定化後、およびその貯蔵前に処理される。このような処理は、好ましくは、生物学的組織が、固定プロセスの間に利用されるグルタルアルデヒド溶液中に留まり、そして／または生物学的組織が貯蔵されるグルタルアルデヒド溶液と配置される間に遂げられ、そして再度、単に、グルタルアルデヒド溶液を約25〜80℃で約４〜22週間加熱することを包含する。
あるいは、生物学的組織はその貯蔵後、代表的には、哺乳動物身体内への移植前の短い時間で処理される。生物学的組織は、好ましくは、単にグルタルアルデヒド溶液を約35〜55℃で約４〜22週間加熱することにより、貯蔵されているグルタルアルデヒド溶液中で加熱される。
あるいは、生物学的組織は、抗無機質化プロセスの間に、グルタルアルデヒドを抗無機質化溶液に添加し、そして加熱（好ましくは、約35〜55℃で約４〜22週間）することにより処理される。当業者に認識されるように、種々の抗無機質化プロセスは、カルシウムおよび種々の他の無機質により生物学的組織の鉱物化を阻害するために用いられる。
グルタルアルデヒドの加熱は、その重合に影響を与えるようである。石灰化の阻害は、生物学的組織中に含まれるグルタルアルデヒドの重合によるものであると考えられる。このように、当業者は、グルタルアルデヒドの重合に影響する種々の他の架橋剤および他のプロセス（例えば、光、放射物、または化学薬品）が、同様に、本発明の生物学的組織の処理方法において用いられ得ることを認識する。従って、グルタルアルデヒド以外の種々の化学固定液、およびこれら化学薬品および／またはグルタルアルデヒドの重合に影響する他の方法は、生物学的組織内に含まれる化学薬品の重合に影響を及ぼすために、単独で、または加熱との組み合わせにより用いられ得る。その結果、哺乳動物身体内への移植後の組織の石灰化を阻害する。
固定化生物学的組織の石灰化の阻害方法は、生物学的組織の種々の異なるタイプで用いられ得る（例えば、心臓弁、血管組織、皮膚、硬膜、心膜、筋膜、靭帯、および腱）。当業者は、この記載が、種々の他のタイプの生物学的組織もまた本発明の方法に従ってそれらを処理することにより利益を享受し得るので、包括的ではないことを認識している。
本発明の他の利点と同様にこれらは、以下の記載および図面からより明白にされる。示され、かつ記載された上記特定の構造の変化は、本発明の精神から逸脱することなく本請求項の範囲内でなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
図１は、グルタルアルデヒド溶液を用いた生物学的組織の固定を包含する、哺乳動物身体内への移植のための生物学的組織を調製するための先行技術プロセスを図示する流れ図である；そして
図２は、本発明による生物学的組織の石灰化を阻害するための方法を包含する、哺乳動物身体内への移植のための生物学的組織の調製のフローチャートである。
好ましい実施態様の詳細な説明
添付した図に関連して下記に示される詳細な説明は、本発明の現在好ましい実施態様の説明として意図され、そして本発明が構築され得るかあるいは利用され得る唯一の形態を表すことは意図されない。この説明は、図示された実施態様に関連して、本発明を構築または実行するための工程の機能および順序を示す。しかし、本発明の精神および範囲内に含まれることも意図される異なる実施態様によって、同様または同等の機能および順序が成し遂げられ得ることが、理解されるべきである。
哺乳動物身体内への移植後の生物学的組織の石灰化を阻害するために、グルタルアルデヒド固定化生物学的組織を処理するための方法を図２に図示する。図２は、本発明の現在好ましい実施態様のフローチャートを描く。図１は、哺乳動物身体内への移植用の生物学的組織を調製するための先行技術方法のフローチャートを描く。
ここで、図１に言及すれば、哺乳動物身体内への移植用生物学的組織を調製するための先行技術プロセスは、最初に動物またはヒトの死体から組織を採取する工程を包含する（10）。当業者が認識するように、種々の異なるタイプの組織が、異なる動物および/またはヒトの死体から日常的に採取される。例えば、心臓弁は日常的にブタから採取され、心膜は日常的にウシまたはブタから採取され、皮膚は日常的にヒトの死体から採取される。さらに当業者は、新しい組織が、哺乳動物身体内に移植可能であることが、時々見出されていることを認識している。
採取後生物学的組織は、代表的には１〜６時間の期間の間、生理食塩水溶液中で洗浄される（12）。
次に組織は、室温で少なくとも３時間、0.65％グルタルアルデヒド溶液を用いて固定される（14）。周知であるように、グルタルアルデヒドは組織内でコラーゲンのようなタンパク質の架橋をもたらす。このような架橋は、組織をより丈夫にする傾向があり、そして組織の保存性をもたらす。架橋したタンパク質は、タンパク質分解切断に対する増加した抵抗性を示すことが知られている。さらに、循環する血液が組織を破壊し得る主要なプロセスの１つは、酵素の加水分解を促進するためにタンパク質基質の折りたたみ構造の広がり（unfolding）を伴う酵素活性を介していることが知られている。組織のタンパク質の架橋は、このような折りたたみ構造の広がりに対して組織を抵抗性にし、その結果、血液の酵素活性による組織の劣化を防ぐ傾向がある。
次に組織を、好ましくは、室温で２時間、アルコール/ホルムアルデヒド溶液を用いて滅菌する（16）。組織の滅菌を達成するための好ましい溶液は、約12ml/lのTween 80；約2.65gms/lのMgCl2・（H2O；約108ml/lのホルムアルデヒド（37％）；約220ml/lのエチルアルコール（100％）および約4.863gms/lのHEPES緩衝液を含む。残部は、二重濾過した水を含む。溶液のpHは、代表的にはNaOHの添加により7.4に調整される。当業者は、種々の他の滅菌溶液が同様に適していることを認識している。
必要であれば、抗無機質化（antimineralization）処理（18）を行い、哺乳動物身体移植後の生物学的組織上での無機物沈澱物の蓄積を阻害する。当業者が認識するように、生物学的組織上での種々の異なる無機物の沈澱を防ぐために、種々の異なる抗無機質化処理が用いられる。
組織から余分なものを除き、次いで非生物学的成分を組織に加える（20）。例えば、弁ホルダーに心臓弁を縫い付けることは、一般的である。この弁ホルダーは、心臓弁の取扱いを助け、そして哺乳動物身体内に移植する時、弁の台としてさらに機能し得る。
次に、生物学的組織を、好ましくは上記のアルコール/ホルムアルデヒド溶液中でさらにもう一度、滅菌する（22）。生物学的組織の調製が実質上完了し、次に生物学的組織はおそらく長期間保存されるので、以前に用いられた滅菌手順よりもより厳密な滅菌手順が一般的に使用される。この段階で、一般的に生物学的組織を34〜38℃で約９時間滅菌する。
滅菌後、生物学的組織を室温でグルタルアルデヒド中に貯蔵する（24）。
ここで、図２について言及すれば、哺乳動物身体内への移植後の生物学的組織の石灰化を阻害するための、グルタルアルデヒド固定化生物学的組織の処理のための方法は、好ましくはグルタルアルデヒドが生物学的組織と接触している時、約4〜22週間、約35〜55℃に加熱するさらなる工程を含む。
生物学的組織の加熱は、動物またはヒトの死体からの組織採取後、そして哺乳動物身体内への組織移植前の任意の時に、行われ得る。しかし、生物学的組織の加熱は、先行技術によるプロセスの種々の段階で生ずるような、好ましくは生物学的組織調製のためのプロセス内の、生物学的組織が既にグルタルアルデヒド溶液の槽中に配置された時点で行われる。従って、本発明によるグルタルアルデヒド固定化生物学的組織を処理するための方法は、好ましくはグルタルアルデヒド溶液で、生物学的組織を固定する間、グルタルアルデヒド溶液で生物学的組織を固定する直後、あるいはグルタルアルデヒド溶液中に貯蔵する直前または貯蔵した後のどちらかで、行われる。
さらなる代替として、グルタルアルデヒド固定生物学的組織を処理するための方法は、グルタルアルデヒドを抗無機質化溶液に添加し、そして好ましくは約4〜22週間、約35〜55℃に溶液を熱することにより、抗無機質化処理の間に行われ得る。
例えば、室温で少なくとも３時間、0.625％グルタルアルデヒド溶液を用いて組織を固定した（14）後に、生物学的組織は、同じあるいは異なる0.625％グルタルアルデヒド溶液のいずれかで、好ましくは約35〜55℃で約4〜22週間、熱処理され得る（15）。
上記の代替の１つとして、生物学的組織を、0.625％グルタルアルデヒド溶液中で、再度好ましくは約35〜55℃で約4〜22週間、同時に固定し、熱処理する（13）。別の代替は、固定（21）の前に生理食塩水中（17）で組織を熱することである。
上記の他の代替として、生物学的組織は抗無機質化処理および加熱処理を同時に行い得る（19）。哺乳動物身体内への移植後の組織の石灰化の阻害をもたらすために、グルタルアルデヒドを抗無機質化溶液に加える。
従って、哺乳動物身体内への移植後の組織の石灰化を阻害するために固定された生物学的組織の処理方法は、哺乳動物身体内への移植後のこのような組織の使用可能な寿命を実質的に増加させる傾向があり、それ故、次の組織の取換えの必要性を軽減される。当業者は理解するように、このような組織の組換えは、しばしば患者に実質的な外傷を引き起こし、時には、患者の死をまねく。このように、移植された生物学的組織の取換えの必要性を避けるかまたは延期することのいずれかが可能なことは、大いに有益である。
本明細書中に記載され、そして図面に示された、グルタルアルデヒド固定化生物学的組織を処理するための典型的な方法は、本発明の現在好ましい実施態様を表すことが理解される。確かに、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変および付加がこのような実施態様に対してなされ得る。例えば、グルタルアルデヒド以外のアルデヒドのような種々の固定化剤は、本発明における使用にそれらを適するように、グルタルアルデヒドの特性と類似した特性を示し得る。それ故、同様に使用され得る。従って、これらおよび他の改変および付加は、当業者にとって自明であり、そして種々の異なる適用における使用に対して本発明を適応させるために実行され得る。
【図１】
0003797673.tif 000002
【図２】
0003797673.tif 000003