(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)または(b)のタンパク質であって、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ。
(a) 配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質
【請求項２】
フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項１または２記載のＤＮＡによってコードされるタンパク質。
【請求項５】
請求項４記載のタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項６】
フラボノイドの合成を誘導した植物からｍＲＮＡを分離し、該ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ｃＤＮＡライブラリーから、フラボノイドの合成を誘導しなかった植物に由来するＤＮＡと反応するクローンを除くことにより、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしているｃＤＮＡを選択することを含む、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡの製法。
【請求項７】
請求項１または２記載のＤＮＡが導入された宿主。
【請求項８】
請求項１または２記載のＤＮＡを宿主に導入し、該宿主を培地で培養することにより得られるフラボノイド-３-グルコシル転移酵素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の花弁等に存在する主要な色素であるフラボノイド系化合物を修飾するグルコース転移酵素、該酵素をコードしているＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、および該ＤＮＡの製法に関し、より詳細には、フラボノイド系化合物の３位にグルコースを転移する活性を有する酵素、該酵素をコードしているＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、および該ＤＮＡの製法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物の花・茎等に存在するフラボノイド系化合物のうちアントシアンは、植物に黄、赤、青系統の色をもたらすため、特に花卉の育種上、大きな関心を集めてきた。また、他のフラボノイド系の無色の化合物もまた、幾つかの生理的役割を持つことが知られており、例えば、紫外線吸収するすることにより植物のUV障害を軽減することや、植物病原菌からの防護物質（ファイトアレキシン）として働くことが知られている[ハールブルックら(Hahlbrock) Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology 40, 347-369頁(1989)]。それらの合成経路については詳細に研究されているが[モルら(Mol) Plant Molecular Biology Reporter 6, 274-279頁 (1988)]、生合成産物は植物種によって、更に様々の修飾酵素の作用を受けて変化している[フォークマン(Forkmann) Plant Breeding 106, 1-26頁 (1991)]。例えば、メチル化[ジョンソンら(Jonsson) Theoretical and Applied Genetics 68, 459-466頁 (1984)]、アシル化[ハールブルック(Hahlbrock) FEBS Letters 28, 65-68頁(1972)]、及び配糖化等があり、その中でも配糖化は様々の２次代謝産物の物性を変える点で重要とされている。
【０００３】
フラボノイドの一種であるフラボノールは、ジヒドロフラボノールがジオキシゲナーゼの１種のフラボノール合成酵素の作用により酸化した物であるが[フォークマンら(Forkmann) Zeitschrift fur Naturforschung 41c, 179-186頁 (1986)]、フラボノールに変換した後、配糖化の他、メチル化、亜硫酸化[バリンら(Varin)Plant Physiology 95, 1254-1258頁(1991)]等の修飾を受けることが知られている。また、フラボノールの顕著な働きとして、それが植物ホルモンであるオーキシンの輸送に影響するので[ジャコブら(Jacobs) Science 241, 346-349 頁(1988)]、花粉管の成長が制御を受け、結果的に稔性を制御するのに有用と言われている[WO 93/18142]。即ち、フラボノールは花粉管の成長を促進するが、その配糖化物は成長促進活性がないため、配糖化活性が高い植物では花粉管の成長が悪く、稔性も著しく低下すると想像される[ポラックら(Pollak) Plant Physiology 102, 925-932 頁(1993)]。また、植物から抽出したフラボノイド、特にフラボノール類は、前述のようにUV光等の蛍光からの防護物質としての役割を果たすことから、色素の退色防止、有効成分の酸化防止を目的とした食品添加物として広範に使用されている[高屋幾夫  New Food Industry 35, 7-16頁 (1993)]。しかし、天然のフラボノールは疎水性が高く水に解けにくいため利用しにくく、精製物質を微生物由来の酵素で配糖化させて使用しているのが現状である〔特開平０２−１７９８３９〕。これを避けて、フラボノールの配糖化が進んだ物質を植物体で生産するため、交雑育種によってこれらの需用に答えることも原理的には不可能でない。しかしながら、このような古典的な植物育種法は、交雑育種に用いる様々な植物種の組合せに依存した交配に関わる相性の良さ、目的形質以外の望まざる形質が導入されることなど多くの問題を内在している。
【０００４】
一方、アントシアンは、言うまでもなく赤、青等の様ざまの天然色素の主成分であるが、無色のアントシアニジンが配糖化し、その後有色の安定な化合物になる。その生合成の間、配糖化前のアントシアニジンは非常に不安定な化合物とされ、配糖化のステップは色素の形成上、重要な反応と考えられている。
ところで、近年の植物遺伝子工学の発展により、遺伝子組換えの手法を用いて植物に種々の有用形質を与えることが可能になりつつある。その一例として、マイヤーら〔特開平２−２３０５〕は、ペチュニア(Petunia hybrida)に遺伝子組換えをおこない、シアニジン及びデルフィニジン型色素の形成ができず、Ｂ環で４’位のみが水酸化された合成中間体であるジヒドロケンフェロールが蓄積する変異体に対して、トウモロコシ(Zea mays)由来のＤＦＲ（ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ）を導入することにより、新規なレンガ色の花色のペチュニアを作ることに成功した。このような手法を用いれば、フラボノールの３位にグルコースを転移する酵素を種々の植物に導入し、配糖化したフラボノールを持った植物を作れる可能性がある。このような植物では配糖化されたフラボノールが主体と成るので、花粉管の伸張は阻害され、稔性も低下している可能性がある。また、クロールらは[(van der Krol) Nature 333, 866-869頁 (1988)]、カルコン合成酵素(Chalcone synthase; CHS)遺伝子のmRNAが逆向きに転写されるように（アンチセンス）植物に導入し、CHS活性を著しく低下させ、フラボノイドの生成量を下げることに成功した。この技術を応用すれば、フラボノイドの糖転移酵素遺伝子をアンチセンスで植物に導入し、配糖化が進んでいないフラボノイドを主として生産する植物を作出することも可能であろう[クルーンら(Kroon) Plant Journal 5, 69-90頁 (1994)]。
【０００５】
さて、フラボノイドの３位への配糖化についてはトウモロコシの種子(E. C. 2.4.1.91)、キンギョソウの花等を用いて詳細な研究が進められてきた。酵素学的には、UDPglucoseをグルコースの供与体として、フラボノイドのA環の３位に１分子のグルコースが転移されると言われている（図１）。また、赤キャベツの実生[サンら(Sun) Plant Physiology 95, 570-576 頁(1991)]やペチュニアの花[ジョンソンら(Jonsson) Planta 160, 341-347頁 (1984)]由来の糖転移酵素について、主として受容体の選択性に関する酵素学的な知見が得られてきた。しかしながら、受容体フラボノイドについてフラボノールとアントシアンのどちらか、又は両方を配糖化するかどうかについて、精製酵素を用いて厳密に調べた例は少なく、多くの場合、複数の配糖化酵素が共存する状態で測定したため、厳密な意味での基質の決定は明確になっていないと思われる[ヘーゼル(Hosel) The Biochemistry of Plants 7, 725-753頁(1981)]。また、前述のキャベツ及びペチュニア由来の酵素共、サブユニットが２７−３０kDaの２量体とされており、トウモロコシ等の５０kDa型のものとは相当構造が異なっていると思われる。フラボノイドへの配糖化酵素遺伝子の構造に関しては、３位へのグルコース転移についてトウモロコシ種子[ラルストンら(Ralston) Genetics 119, 185-197 ページ(1988)]及びキンギョソウ[C.マーチン (Cathie Martin)英国、ジョンイネス研究所；私信 ]で、並びに３位へのラムノース転移についてペチュニア[クルーンら(Kroon) Plant Journal 5, 69-80 ページ(1994)]で突然変異体の解析からコードしている遺伝子の機能が推定されているが、この場合も遺伝子がコードする酵素の活性は直接測定されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有する酵素を発現しうる遺伝子を提供することを目的とする。
また、本発明は、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子によりコードされている酵素および該遺伝子の製法を提供することも目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者は、フラボノイドの合成を誘導したナス(Solanum melongena)から、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしている遺伝子をクローニングし、該遺伝子を組み込んだ組換えベクターで大腸菌を形質転換して該遺伝子を発現させたところ、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質が産生されることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質であって、実質的に配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているＤＮＡまたはその断片を提供する。また、本発明は、前記ＤＮＡまたはその断片を含む組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質であって、実質的に配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその断片、およびそれらの融合タンパク質を提供する。さらにまた、本発明は、フラボノイドの合成を誘導した植物からｍＲＮＡを分離し、該ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ｃＤＮＡライブラリーから、フラボノイドの合成を誘導しなかった植物に由来するＤＮＡまたはその断片と反応するクローンを除くことにより、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしているｃＤＮＡを選択することを含む、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡの製法を提供する。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
１）  フラボノイド系色素の誘導方法
本発明の主題である配糖化酵素遺伝子は、一般的にその含量が少なくかつ不安定であるため、そのタンパク質を精製するには、多大の労力を要すると思われた。そのため、タンパク質の精製を行わずに遺伝子をクローニングする系が必須である。高等植物に適用できる方法の中で最も確かな方法の一つは、トランスポゾンによる突然変異を誘起して、色素の合成の変異体を単離し、次にその挿入された遺伝子の機能を解析する方法であり、そのような方法でトウモロコシとキンギョソウの糖転移酵素遺伝子が単離されている（ラルストンら(Ralston), Genetics 119, 185-197頁(1988)) 。また、それをプローブとしてキンギョソウの相同遺伝子も単離された (マーチンら(Martin), Plant J. 1, 37-49 頁(1991)) 。本発明の配糖化酵素遺伝子はこれらの方法により単離することもできる。
【０００９】
また、それとは別に、色素の誘導を明確に起こし、誘導のかかる遺伝子に対応するクローンとそうでないものをハイブリダイゼーションにより区別する事により選別する方法もある。そのような手法はトランスポゾンが使われていない植物でも可能であり、一般的には、誘導前および誘導後の組織から別々にｍＲＮＡをとり、それぞれに対応する放射能標識したプローブを用いたディファレンシャル・ハイブリダイゼーション、あるいは、それを更に改良したサブトラクト・ハイブリダイゼーションと呼ばれ、いくつかの成功例が報告されている〔サンブルックら(Sambrook) ; Molecular Cloning, second edition, 10.38-10.43頁 ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)〕。何れの手法を取るにしても、目的の遺伝子が誘導前の組織で存在しないかあるいは誘導後に比べて極めて少ない事が重要である。本発明では、先に、本発明者らがフラボノイド水酸化酵素遺伝子を単離するのに開発した方法を適用すると有効である〔特開平５−１８４３７０〕。以下、本発明の配糖化酵素遺伝子を特開平５−１８４３７０に準じて単離する方法を簡単に記すが、上述した他の方法によって単離してもよい。
【００１０】
フラボノイド系遺伝子の誘導が明確にかかる系を探索し、デルフィニジン系の色素を生産するナス(Solanum melongena)の種子を赤色光の下で約２週間栽培し、次に白色とＵＶ光を混合したもの（以下では白色光と呼ぶ）２日以上照射し栽培することにより、非常に明確にフラボノイドの合成が誘導されることが見いだされた。白色光での誘導後５日間のアントシアン含量の変化を見たところ約４８時間後に最大値の半分に達していた（図略）。この場合、従来、植物を生化学的に研究する際に頻用された、暗所から白色光の下へ移す操作では、誘導される遺伝子の大部分が光合性に関係したものであり、その中からフラボノイドに関するものを選ぶことは極めて効率が悪いと考えられた。本発明の方法の場合、ナスに限らず白色光下で栽培した時、実生にフラボノイド化合物を蓄積する作物、例えばペチュニア、トウモロコシ等で行うことも可能である。
【００１１】
この間の既知の遺伝子のｍＲＮＡの変化を調べてみると、フラボノイド色素の合成系でフラボノイドの水酸化反応の前後に位置するＣＨＳ（カルコン合成酵素）および、ＤＦＲ（デヒドロフラボノール−４−レダクターゼ）は、誘導前には検出できず、誘導後７時間めから徐々に増えて行くことがわかった。また、ＣＨＳ及びＤＦＲのｍＲＮＡは実生の中でも、胚軸に色素が強く誘導されたので、その部分を用いる事が望ましい。更に、光合成系の代表的な酵素であるＲｕＢｉｓＣＯ（リブロース−１、５、−２リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼ）のｍＲＮＡは、白色光の誘導の前と後でその量がほとんど変わらなかったので、フラボノイド系よりはるかに多量に存在すると思われる光合成系の遺伝子のｍＲＮＡに対応するクローンが、本方法のナスの実生を使った系を利用することにより、それらが効率よく除去できる事を意味する（データ略）。
【００１２】
更に、フラボノイド−３−配糖化酵素（UDPglucose依存型）については、酵素活性を測ることもできる。たとえば、フラボノールを受容体とする場合、Ｓｅｒｖａ社から発売されているケルセチンをエチレングリコール−モノメチルエーテルに溶解したものを基質として用いることができる。これとは別に、植物材料として例えば、光誘導後のナス胚軸の抽出液と反応させ、その生成物を酢酸エチル層に分配後、減圧濃縮する。これを８０％メタノールに溶かし、セルロース系の薄層クロマトグラフィー（溶媒組成；１５％酢酸等）で展開する。本発明者らは、このような手法により、酵素反応生成物であるケルセチン−３−グルコシドがナス実生由来酵素から生成されることを確かめた。
【００１３】
２）  ｃＤＮＡライブラリーの作製と光誘同性クローンの選抜
誘導をかけたナス胚軸からのＲＮＡ抽出及びその中からのｍＲＮＡの濃縮は常法に従って行うことができる。２本鎖のｃＤＮＡ合成は確立した技術であり、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社等から発売されているキットを使用すればよい。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の場合、業者の勧めに従って２本鎖ｃＤＮＡを合成しＥｃｏＲＩアダプターをつけ、制限酵素ＸｈｏＩで切断し、両末端が接着性となったこの２本鎖ｃＤＮＡの中からアガロースゲル電気泳動等の公知手段によって１千から４千塩基対のＤＮＡ断片を分離することができる。ついで、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が販売していλZAP IIなどのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位がクローニングしやすくなっているベクターに導入した後ファージにパッケイジングし（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ｃＤＮＡライブラリーを作ることができる。パッケイジングしたファージの感染に用いる宿主大腸菌は、ファージが増殖できる任意の細胞を使いうる。λZAP IIの場合には、ＰＬＫ  Ｆ’等が好ましい。以上のようなライブラリーの作製法は一例であり、ｃＤＮＡ合成キット・アダプター・ベクター等は公知のものを適宜選択できる。ｃＤＮＡライブラリーを作製した後、ファージ・クローンに宿主大腸菌で溶菌斑（プラーク）を形成させ、このプラーク中のＤＮＡを、公知の方法にしたがってそれぞれ２または３枚ずつのナイロン・メンブレンへ転写し、それぞれ別個のプローブとハイブリッド形成させて比較することにより目的のクローンを選抜する。例えば、ナスを赤色光および白色光の下で育て、それぞれの組織から得たｍＲＮＡに対応する32ＰでラベルしたｃＤＮＡプローブを使って、後者のプローブと強力にハイブリッド形成を行うが、誘導前の組織に由来する前者のプローブとは反応しないことが判明したクローンを選ぶことができる（ディファレンシャル・スクリーニング）。また、さらに効率の良いスクリーニングを行なうためには、誘導後の組織に存在するｍＲＮＡに対応する合成ｃＤＮＡプローブを、予め誘導前の組織に存在するｍＲＮＡとハイブリッド形成させ、両組織に共通して存在するため２本鎖となったプローブを選択的に除去する（サブトラクト・プローブ）。２本鎖ＤＮＡの除去方法としては、リン酸塩濃度勾配によるヒドロキシ・アパタイト・カラム・クロマトグラフィー（例えばＢｉｏ・Ｒａｄ社）により１本鎖と２本鎖のＤＮＡを分離すること、あるいは誘導前の組織に由来するｍＲＮＡを予めビオチン化し、ハイブリッド形成後ビオチン化したｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ・ｃＤＮＡのハイブリッド体にアビジンを更に結合させ、その重合体をフェノール層に分配することにより、ハイブリッド形成しなかったｃＤＮＡを水層に回収する（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のキットを使用する）ことによって実施できる。このようにして得たサブトラクト・プローブとディファレンシャル・スクリーニングを同一プレートに由来する３枚のコピーのナイロン膜に対して並行して行う事により、誘導のかかったクローンを高い精度で得ることができる。以上のようにして得たクローンに対してはこのようなプローブを用いたスクリーニングを２度以上行うと精度が飛躍的に高まり、白色光誘導性のクローンに富む���イブラリー・サブセットが得られる。このサブセットを、既知の遺伝子ＣＨＳおよびＤＦＲでスクリーニングしたところ、何れも、濃縮前の１０倍以上に頻度が増加していた。即ち、濃縮前のライブラリー１０、０００クローン中のＣＨＳ及びＤＦＲをスクリーニングするとそれぞれ２、及び０クローン選抜できたのに対し、濃縮後では、１、０００クローンからそれぞれ４、及び１クローン得られた。上記のようにして得たファージ・クローンをプラスミドにサブクローニングするためには、一般的には、ファージＤＮＡを常法に従って精製した後、２本鎖ｃＤＮＡのクローニングに用いた制限酵素と同じ酵素で挿入ｃＤＮＡを切り出し、同一の酵素で切ったプラスミド（例えばブルースクリプトＩＩ）にクローニングすることもできる。λZAP IIの場合には、業者の勧めに従ってヘルパーファージを用いる事により、直接サブクローニングすることもできる。また、ｃＤＮＡをより簡便に得るためにはクローニング・サイトの外側に存在するベクターＤＮＡに対応するプライマー、例えばユニバーサル及びリバース・プライマーを組み合わせて行うＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）反応による事もできる。ＰＣＲの反応方法は業者（Ｃｅｔｕｓ社）の勧めに従って良い。このようにして得たＤＮＡは、常法に従って電気泳動による挿入ＤＮＡの大きさの分析、及び目的のＤＮＡ断片に対しては電気溶出することができる。ついで、上記のようにして得たＤＮＡの相互関係については、クローン同志の交差ハイブリッド検定または適当な制限酵素の切断パターンを比較することによって知る事ができる。また、このようにして別々の遺伝子に由来すると推定されたＤＮＡ断片が植物体中でどのように発現しているかを知るために、誘導前後のナスの胚軸から得たｍＲＮＡを、常法に従って電気泳動した後ナイロン膜に転写し、32Ｐでラベルした検定用ｃＤＮＡとハイブリッド形成させる、いわゆるノーザン分析に供することができる。塩基配列の解析は常法に従って行う。その際、前記プラスミド挿入体の制限酵素断片を適当なベクターにサブクローニングし、得られたクローンをサンガー法［サンブルックら(Sambrook);前出］のような公知の手法により塩基配列分析にかける。サブクローニングに好適なベクターは、不要なｃＤＮＡ断片を除いたものを再び結合させるセルフ・アニーリングによって得られた２本鎖ＤＮＡ、あるいはＭ１３系の１本鎖ＤＮＡでも行える。推定された塩基配列は、そのまま、あるいはタンパク質に読みかえることができるものはそれに変換した後、ＧＥＮＥＴＹＸ等の解析ソフトを用いてEMBL等のデータ・ベースに登録された公知の配列との比較を行うことができる。
【００１４】
３）  クローンのフラボノイド−３−グルコース転移酵素活性の同定
上記のような手段で得たクローンをランダムにシーケンスすることにより種々の遺伝子情報が得られる。例えば、クローン名A４８はその推測されるアミノ酸配列が前出のトウモロコシ種子由来のフラボノイド−３位−糖転移酵素遺伝子と有意な相同性を示した。A４８の全塩基配列を配列番号２に、それから予想されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１５】
次に、A４８のコードするタンパク質の活性については、大腸菌でタンパク質を生産させ、その産物の活性を測ることができる。この場合の宿主としては、そのほかの頻用される生物、例えば酵母あるいはタバコなどの植物でもよいことは言うまでもない。その場合、タンパク質はA４８に由来する配列以外の余計な配列を含まない構成の他、別の蛋白との結合物であってもいい。A４８の発現については大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ由来タンパク（２８アミノ酸）をアミノ末端側に含むタンパクとして大腸菌ＪＭ１０９株で発現させ、可溶性タンパク質を抽出し、受容体としてケルセチンまたはシアニジンを用いて、糖転移酵素の測定を行なった。反応精製物は薄層セルロース板（ＴＬＣ）や高速液体クロマトグラフィーにより推定することができる。この際、標準品として例えばケルセチン−３−グルコシド又はシアニジン−３−グルコシドを同時に分析して、比較すると良い。ＴＬＣの場合３種類の溶媒系、例えば１５％酢酸、水飽和フェノール及び蒸留水（以上フラボノールを受容体とする場合）、又は、１％塩酸、酢酸：塩酸：水＝１５：３：８２の混液、及びn-ブタノール：酢酸：水＝４：１：５の混液（シアニジンを受容体とする場合）で同時に比較検討することにより他の糖転移酵素の産物と区別できる。このA４８のｍＲＮＡの発現パターンについては、ナスの実生では常法に従ってｍＲＮＡを取得し、A４８をプローブとするノーザン解析をすると、図３に示すように約、１、６００塩基のｍＲＮＡが光誘導後初めて検出されることがわかる。この光誘導性は、先に述べたようにＣＨＳおよびＤＦＲなどでも顕著であり、同時にクローニングした他の３種類の遺伝子（A1, A54, CYP75）でも顕著に認められた。なお、これらのクローンのうち、CYP75はフラボノイドＢ環水酸化酵素をコードしていることが推定されている。また、A４８と類似の遺伝子がナスの染色体DNA中にあるかどうかを調べるため、染色体DNAを適当な制限酵素で切断した後、アガロース電気泳動により分離し、ナイロン膜などのDNAを吸着しやすい性質を持つ膜に転写し、放射性のリン等で標識したA４８の断片との反応性を調べた（サザンハイブリダイゼーション；図４）。Hind III（図４のレーン１）, Eco RV（レーン２）のいずれの場合も１本の、また Bam HI（レーン３）ではA４８のcDNA中に１つ切断点が存在するので２本のバンドが検出され、その他のバンドは検出できなかった。
【００１６】
以上の事をまとめると、
１．A４８に対応するｍＲＮＡは、ナスを材料とした時、フラボノイド系のＣＨＳ，ＣＦＩ及びＤＦＲと同様に白色光により胚軸で強く誘導され、誘導前には存在しなかった。これは、フラボノイド系の遺伝子である事を強く示唆する。
２．A４８は、配列番号２に示すような塩基配列を持っており、そこから推定されるアミノ酸配列（配列番号１）はトウモロコシ及びキンギョソウのフラボノイド−３−グルコース転移酵素と類似し、糖転移酵素をコードしていると推定される。
【００１７】
３．A４８を大腸菌でタンパクとして発現させ酵素活性を測定すると、ケルセチン及びシアニジンの３位にグルコースを転移させる活性を有しており、フラボノイド−３−グルコース転移酵素であることが証明された。
４．従って、A４８遺伝子を利用すると、配糖化が進んだフラボノイドが合成され、花粉稔性、水への溶解性、色素の安定性が変化した物質が蓄積した植物の創出に大きく役立つと思われる。
【００１８】
本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素は、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。「実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に加えて、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有する限りにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列に幾つかのアミノ酸の欠失、置換、付加などがあってもよいことを意味する。ここで、アミノ酸の欠失、置換または付加は、周知の技術である部位特異的突然変異誘発（例えば、サンブルックら, 前出, 15.1-15.113 頁を参照のこと) により実施することができる。また、本発明は、フラボノイドの３位にグルコースを転移する活性を有する限りにおいて、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質の断片も含む。さらに、本発明は、上記のようなフラボノイド−３−グルコシル転移酵素およびその断片と他のタンパク質との融合タンパク質も包含する。他のタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ由来タンパク質、マルトース結合性タンパク等を挙げることができる。上記の融合タンパク質は公知の方法に従って生産することができる。例えば、本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子またはその断片の読み枠を融合させる他のタンパク質のそれにあわせてから、他のタンパク質をコードする遺伝子に結合することにより作製した融合遺伝子を宿主に導入し、この宿主を適当な培地で培養すれば、他のタンパク質に結合したフラボノイド−３−グルコシル転移酵素またはその断片を発現させることができる。
【００１９】
また、本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子およびその断片は、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡであり、これには、自然界に存在するフラボノイド配糖化酵素コードするＤＮＡ配列だけでなく、上記のような変異配糖化酵素をコードするＤＮＡ配列をも包含される。また、一般に、ＤＮＡ鎖があるアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする場合、一つのアミノ酸に対応する遺伝コード（コドン）が複数個存在する（縮重異性体）。本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子およびその断片においても、任意の遺伝コードを用いることができることは言うまでもない。また、ＤＮＡ鎖またはその断片を発現させてそれがコードするタンパク質もしくはポリペプチドを産生させるためには、そのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列（コーディング領域）以外に、発現調節配列が必要である。従って、本発明のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子およびその断片は、このような発現調節配列を含んでもよい。この発現調節領域の中で特に重要なのがコーディング領域の上流のプロモーター配列、及び下流のポリＡ付加シグナルである。植物で発現させる場合のプロモーター配列としては、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーターなどを使用することができ、ポリＡ付加シグナルとしては、ノパリン合成酵素などを使用することができる。取得したＤＮＡがゲノム遺伝子である場合には、ＤＮＡ配列に発現調節領域が含まれていれば、それをそのまま用いることもできる。本発明は、また、上述のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子またはその断片を含有する組換えベクターを包含する。この組換えベクターは上述のフラボノイド−３−グルコシル転移酵素遺伝子またはその断片をベクターに連結した物であり、ベクターとしては、ｐＢＩＮ１９、ｐＵＣ１９、λｇｔ１１などのプラスミド、ファージ等公知の物が使用できる。この組換えベクターＤＮＡを、タバコ、ジャガイモ、イネなどの適当な植物、あるいは微生物細胞に導入して発現させる事により、宿主においてフラボノイド−３−グルコシル転移酵素が産生される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではない。また、色素の誘導関係の詳細は、戸栗ら Plant Molecular Biology 23, 933-946頁(1993)及び特開平５−１８４３７０に記述してある。
【００２１】
〔実施例１〕フラボノイド系色素の誘導
ナス種子（東北種苗社の品種  ’新佐土原茄子’）をバーミキュライトに播種し２５℃の下、３００ルックスの赤色光（赤色のアクリル板；メイバン社製、厚さ１mm）を連続照射し２週間栽培した。次に、８０００ルックスの白色の蛍光灯（東芝社、実生の位置で６Ｗ/ｍ2））およびＵＶ光（東芝社、ＦＬ−２０Ｓ  Ｅ、ＦＬ−２０Ｓ  ＢＬＢ；０.５Ｗ/ｍ2）［この条件を本発明では白色光と呼ぶ］を５日間照射した。植物体から、光源までの距離は、１５から２５ｃｍであった。光質を変換したのち、アントシアン含量を測定するため、0.2 gの実生を１％のメタノール塩酸で抽出し、５３０ｎｍの吸光度を測定したところ、５日目の色素量を最大とした時２日目で既に最大値の半分に達していた。また、並行してログマン［（J.Logemann)  Analytical Biochemistry 163,16-20頁(1987)〕が記載した方法に従って、実生等の各部分からｍＲＮＡ抽出を行い、ホルムアルデヒド入りの変性下でのアガロース電気泳動後、Hybond N(Amersham社)に業者の指示どうりに転写した。公知の配列であるペチュニア花弁のＣＨＳおよびＤＦＲ、ならびにタバコの葉のリブロース-1,5-2-リン酸カルボキシラーゼ（小サブユニット）の全構造遺伝子を、それぞれ公知の塩基配列を基にＤＮＡプライマーを合成し、業者の指示どうりにＰＣＲ法によりクローニングし、それをプローブとして〔ファインバーグら（A. P. Feinberg）Analytical Biochemistry 132, 6-13頁(1983)および137, 266-267頁(1983)〕、ナスのｍＲＮＡとハイブリダイズさせることにより行うノーザン・ハイブリダイゼーションで観察した。ＣＨＳおよびＤＦＲは、白色光による誘導が顕著に観察されたが、リブロース-1,5-2-リン酸カルボキシラーゼでは誘導は２倍以下であった。
【００２２】
〔実施例２〕フラボノイド系色素が濃縮されたｃＤＮＡライブラリーの作製
ナス種子を、実施例１に従って赤色光のもとで２週間栽培し、白色光による誘導を７２時間かけたものを材料として使用した。前記の方法に従ってｍＲＮＡを調整し、Invirogen社のｃＤＮＡ合成キット（The Librarian II)を用いて２本鎖ｃＤＮＡを得て、ラムダ・ザップII(Stratagene社)のEcoRI/XhoIサイトに業者の説明書に従ってクローニングしｃＤＮＡライブラリーを作製した。 誘導されたクローンの濃縮にあたっては、誘導をかけた組織由来のｍＲＮＡから32PでラベルしたｃＤＮＡプローブを作り［20 uM dCTP,各200 uM のdGTP/dATP/dTTP, 20mM DTT, 50mM Tris HCl(pH 7.5), 75mM KCl, 3mM MgCl, 100 ng ナス実生mRNA, 300 ug/ml oligo(dT)プライマー, 300 uCi 32P-dCTP(Amarsham社, 3000Ci/mmol),及び1 ul MMLV逆転写酵素（ＢＲＬ社、100U/ul); 37℃、１時間反応］、このｃＤＮＡとあらかじめInvitrogen社の勧めに従ってビオチン化した２０倍量の誘導前の組織由来のｍＲＮＡを, ２０ ulの0.2％SDS, 50mM Hepes (pH7.6), 0.5M NaCl, 2 mM EDTA, 50％(V/V)ホルムアミドの液［(D.N.Crowell) Proceedings of National Academy of Science, 87, 8815-8819頁(1990)］中で４０℃、 ４０時間ハイブリダイズさせた。反応終了後この液に８０ulの50mM Hepes( pH7.6), 0.5M NaCl, 2 mM EDTA及び 10ug ストレプトアビジン（Vector社)の混合液を加え、室温で１０分間反応後、１００ul のフェノール・クロロホルム混液で抽出し上層を回収した。この液を、常法に従って寒天培地上にはやしたファージ・ライブラリーをＨｙｂｏｎｄ−Ｎに移したものをスクリーニングする際のサブトラクトプローブとして使用し、陽性クローンを選抜した。このプローブを用いるとディファレンシャルスクリーニングより、はるかにシグナル／ノイズ比が高くなることがわかった。
【００２３】
〔実施例３〕フラボノイド配糖化酵素遺伝子のクローニング、構造解析及びmRNAの発現パターンの分析
上記実施例２の方法により３０, ０００クローンを繰り返しスクリーニングすることにより７０クローンの誘導性クローンから成るライブラリー・サブセットを得た。これらをランダムに蛍光シーケンサー（アプライドバイオシステム社）にてシーケンスしたところ、トウモロコシの糖転移酵素等と有為な相同性を持つタンパク質をコードしているクローンA４８があった（図２）。このクローンの全塩基配列は、適当な制限酵素で切断した後、再結合することによる欠失処理により得た短いDNA断片の構造を両側から読んだ情報を集約することによって決定し、１５７８ｂｐからなるDNAであることを明らかにした（配列番号２）。また、このcDNAはアミノ酸４３３残基から成るタンパク質をコードしていることが明らかになった（配列番号１）。本クローンをプローブとして用いて、光誘導前後のナス胚軸由来のｍＲＮＡと、常法に従いハイブリダイゼーションを行った結果、ナスの白色光誘導をかけた組織で1.６kbの強いシグナルが観察された（図３）。同時にクローニングされた他の３種類の遺伝子（A1, A54 およびCYP75)をプローブとして用いた場合でも、同様に強いシグナルが観察された（図３）。図３中、Ｒは赤色光下で２週間発芽させた実生から抽出したｍＲＮＡを、Ｗはその後更に４８時間白色光で栽培した実生から抽出したｍＲＮＡを示す。また、染色体DNAはムライの方法[Murray, Nucleic Acid Research 8, 4321-4325頁 (1980)]に従って２０ｇの実生から調整した。得られたDNAから各１０μｇを制限酵素（宝酒造）Bam HI, Eco RV, Hind III （50 U、３７℃、１６時間）で夫々切断した後、０、８％アガロースゲルで分離した。ゲルからDNAをナイロン膜（ハイボンドＮ+）に０、４Ｍ NaOHで移した。A４８をプローブとするハイブリダイゼーションの結果を示す（図４）。なおここでは、洗浄の条件を、２×ＳＳＣ（緩い条件、図４のａ）および0.１×ＳＳＣ（厳しい条件、図４のｂ）の強弱２種類設定した。図４中、レーン１、２および３は、それぞれ、Hind III, Eco RVおよびBam HIで切断されたナスのゲノムＤＮＡである。
【００２４】
〔実施例４〕クローンの大腸菌での発現
上記クローンA４８はプラスミドBluescript SK(-)のポリリンカー部位に、5' 側のEcoRI部位から3'側のXhoI部位にかけてクローニングされているが、5'側のポリリンカー中の SacIとEcoRIにより切断した後、Klenow酵素（室温１０分； 1U）処理した後セルフライゲーションをし、読み枠を上流にある大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼにあわせた。これにより、β−ガラクトシダーゼ由来の短いペプチド配列（２８残基）に結合したA４８の配列が タンパク質に読まれることになる。
【００２５】
そのようにして得られたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、目的とするプラスミドの塩基配列を確認した後、５ｍｌのＬＢ培地（５０ｍＭのアンピシリンを含む）で６００ｎｍでの濁度が０、３になるまで培養した後（３７℃）、１ｍＭのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド(IPTG)でタンパク質の生産を３時間誘導した。集菌後、菌体を100 mM Tris HCl(pH 8.0), 0.15 M NaCl, 15 % Glycerolからなる液で懸濁し、超音波処理（トミー精工、ハンディソニックUR-20P：最大出力で３０秒を５回）し、１万×ｇで３０分遠心分離して得た上清を酵素液とした。測定条件は、基質として1.6 mM UDPglucose（糖の供与体; SIGMA社）及び1 mM ケルセチン（糖の受容体；フナコシ社）を用い、0.4M リン酸緩衝液に、大腸菌で発現させた酵素液を0.5 μl加え全量を３０μlとし、３０℃でｐＨ6.4 と7.4で１０分間反応させた。反応生成物の分析はＴＬＣで行なった。展開溶媒は１５％酢酸、水飽和フェノール、及び蒸留水の３種類で行ない、標準品としてケルセチン−３−O−グルコシド（イソケルシトリン)を用いた。その結果、下記の表１に示すように、A４８に由来する酵素液を含む反応液でイソケルシトリンと同一の移動度の生成物が検出された。
【００２６】
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【００２７】
またシアニジンを受容体とする反応は以下のように行なった。0.2 M リン酸緩衝液、0.1 mM シアニジン、16 μM UDPglucose、酵素液５μlとし全量500μlで30℃１０分間反応を行なった。反応生成物の分析はＴＬＣで行い、展開溶媒としては、酢酸：塩酸：水＝15：3：82、１％塩酸およびn-ブタノール：酢酸：水＝4：1：5を用い、標準品として、シアニジン−３−グルコシド(C-3-G)を用いた。その結果、下記の表２に示すように、A４８に由来する酵素液を含む反応液でシアニジン−３−グルコシドと同一の移動度の生成物が検出された。
【００２８】
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【００２９】
【発明の効果】
本発明により、植物の主要な色素であるフラボノイドの修飾酵素である、フラボノイド−３−グルコシル転移酵素をコードするDNAが提供された。フラボノールの配糖化はオーキシンの輸送活性を変え、花粉管伸張を制御するので、この遺伝子を操作する事によって、植物の自殖稔性を変える事ができ、植物の種子生産上に大いに役立つ。また、アントシアニンを配糖化することにより、有色色素が安定化される。
【００３０】
【配列表】
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【００３１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ケルセチンからケルセチン３−O−グルコシド（イソケルシトリン）への配糖化反応図である。
【図２】クローンA４８のコードするアミノ酸配列とトウモロコシ及びキンギョソウのフラボノイド−３−糖転移酵素のアミノ酸配列の一致性を示す。
【図３】  A４８をプローブとして、光誘導前後のナス胚軸由来のｍＲＮＡをハイブリダイゼーションにかけた結果を示す電気泳動写真である。Rは赤色光下で２週間発芽させた実生、Wはその後、更に４８時間白色光下で育てた実生から、夫々抽出したｍＲＮＡを示す。
【図４】  A４８をプローブとするナスのゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション分析の結果を示す電気泳動写真である。洗浄条件は、2×SSC（緩い条件、ａ）と 0.1×SSC（厳しい条件、ｂ）の２種類設定し、制限酵素としては、レーン１から３で、夫々、Hind III, Eco RV, BamHIを用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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