(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー捕捉顕微解剖を受けるサンプルを提供する段階と、
前記サンプルをレーザー捕捉顕微解剖器械の光軸内に配置する段階と、
基板表面と前記基板表面に連結されているレーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムとを有するトランスファフィルムキャリアを提供する段階と、
前記サンプルの残余部分の前記レーザー捕捉顕微解剖フィルムへの不的確な移動を引き起こすことなく、前記サンプルの部分を前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムへレーザー捕捉顕微解剖移動できるのに十分な圧力で前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムを前記サンプルと並置する段階と、
前記サンプルの残余部分の前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムへの不的確な移動を引き起こすことなく、レーザーの照射により前記サンプルの部分を前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムへ移す段階と、そして
前記サンプルの前記部分を前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムに移す段階の後に、前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムを前記サンプルから取り外す段階とを含み、
前記取り外す段階は、前記サンプルの前記部分を前記サンプルの前記残余部分から切り取る速度で、前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムと前記サンプルの前記部分の両方を前記サンプルの前記残余部分から動かして離すことを含み、
前記並置する段階における前記十分な圧力は、前記サンプルを前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムと接触させ、次に前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムを、実質的に衝撃を作り出さない様に制動されたトランスファアームによって下げられる自由浮動重りによって及ぼされる力で前記サンプルに押しつけることによって生じさせることを特徴とするレーザー捕捉顕微解剖法。
【請求項２】
光学経路を有する顕微鏡と、
前記顕微鏡に連結された、ビーム経路を有するレーザーと、
前記顕微鏡に連結された、サンプルを受け入れるための移動ステージと、
前記移動ステージと接続された手動の操縦桿とを具備し、
請求項１に記載のレーザー捕捉顕微解剖法を実行するよう構成されていることを特徴とするレーザー捕捉顕微解剖器械。
【請求項３】
レーザー捕捉顕微解剖器械であって、
一部透過一部反射面、この一部透過一部反射面と光学経路で結ばれた焦点合わせレンズ、そしてこの焦点合わせレンズと光学経路で結ばれた対物鏡を含んだ光学系と、
前記一部透過一部反射面と光学経路で結ばれた、選択的に動作させてレーザービームを放射させうるレーザーと、
前記光学系と光学経路で結ばれた、選択的に動作させて光を放射させうる照明器と、
前記光学系と光学経路で結ばれた像捕捉手段と、
前記光学系と光学経路で結ばれた移動ステージとを含み、
前記光学系、レーザー、照明器、像捕捉手段、そして移動ステージは、レーザービームがレーザーから前記一部透過一部反射面を通って焦点合わせレンズに達し、そして焦点合わせレンズから移動ステージを通り、移動ステージから対物鏡を通って像捕捉手段へ達するよう構成され、そして光及びレーザービームが一部透過一部反射面において重ね合わされるものであり、
請求項１に記載のレーザー捕捉顕微解剖法を実行するよう構成されていることを特徴とするレーザー捕捉顕微解剖器械。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的にはレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）の分野に関する。特定すれば、ＬＣＭを行うための特殊装置を備えた倒立顕微鏡に関する。特に、本発明の好適な器械は、キャップハンドリングサブシステム、照明／レーザー光学サブシステム、真空チャックサブシステム、手動操縦桿サブシステムを備えた倒立顕微鏡に関する。本発明は従って、レーザー捕捉顕微解剖倒立顕微鏡と呼ぶことができる型式の倒立顕微鏡に関する。
関連技術の論議
癌の様な病気は、異常細胞を確認するために組織生検を検査することにより確認されてきた。問題点は、周辺組織から対象となる細胞を抜き出すための満足のいく先行技術方法が無いことである。現在、検査者は対象となる細胞を手動ツールで機械的に分離するよう試みるか又は細胞を分離して培養する複雑な過程を経るかの何れかにより、対象となる細胞を手作業で抜き出すか又は顕微解剖するか試みなければならない。大多数の検査者は両方法とも冗長で、多くの時間を無駄にし、効率が悪いと考えている。
組織サンプルから細胞の小さな集まりを数秒で抜き出すことのできる新しい技術が開発されてきた。この技術はレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）と呼ばれている。レーザー捕捉顕微解剖は、低エネルギーレーザーを備えた標準実験用顕微鏡と食品を包む時にプラスチックシールとして使われる様な透明なエチレンビニルアセテートポリマー熱可塑性フィルムとを統合するワンステップ技術である。
レーザー捕捉顕微解剖では、オペレータは、顕微鏡を通して標準ガラス組織病理学スライド上に乗せた組織生検部分を見るが、その組織生検は一般的に異なる型の細胞の集団を含む。熱可塑性フィルムは、組織生検部分の上にこれと接触させて置く。組織部分内に対象となる細胞の集団を確認すると、オペレータはそれらを顕微鏡視野の標的範囲の中心に置き、次に約５０ミリワット（ｍＷ）の強さと約５０から５００ミリセカンド（ｍＳ）の間のパルス持続時間を有する二酸化炭素レーザーの様なレーザーからパルスを出す。レーザーパルスは、プラスチックフィルムを通り抜ける時にフィルムに局部加熱を引き起こし、フィルムに粘着特性を付与する。すると細胞は、細胞の真上にあるプラスチックテープの局部粘着領域に張り付き、その結果細胞は直ちに抜き出され分析の準備が整う。レーザービームの直径は小さいので、かなり小さな細胞の集まりが組織部分から顕微解剖できることになる。
これらの標的細胞のみを直接組織サンプルから取り出すことにより、科学者は直ちに他の研究ツールを使って標的細胞の遺伝子と酵素活性を分析できる。ＤＮＡとＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅、組織サンプルからの酵素回復の様な方法が既に示されている。レーザー捕捉顕微解剖で抜き出された腫瘍細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡを増幅する能力における限界は報告されていない。
レーザー捕捉顕微解剖は、全組織の中からテストする細胞をうまく抜き出してきた。これらの細胞には、腎臓糸球体、原位置乳癌、例外的な乳房導管過形成、前立腺上皮肉腫瘍、リンパ系小節が含まれる。レーザー捕捉顕微解剖により提供される細胞への直接アクセスは、癌や他の病気の分子ベースでの理解に革命を引き起こしそうであり、より早くより精密な病気発見のための基本原理を築くのに役立つであろう。
本技術の役割としてこの他に期待されているものは、様々な細胞の型における遺伝子表現のパターンを記録することにあり、医療研究において持ち上がっている論点である。例えば、国際癌学会の癌ゲノム解剖プロジェクト（ＣＧＡＰ）は正常、前癌性、及び悪性細胞における遺伝子表現のパターンを定義しようと試みている。ＣＧＡＰの様なプロジェクトでは、レーザー捕捉顕微解剖は組織サンプルから純粋な細胞サンプルを手に入れるのに役に立つツールである。
ＬＣＭ技術は、最近出版された記事である１９９６年出版の「サイエンス」第２７４巻、５２８９番、８号、ページ９９８−１００１のレーザー捕捉顕微解剖で全般的に説明されており、この記事の全内容を参考として本文に掲げる。ＬＣＭ技術の目的は、一般的な組織病理学生検スライド上に含まれる異質の集団から選択された人体細胞を入手するための簡単な方法を提供することである。
一般的な組織検体サンプルは、病理学の分野でよく知られる技術を使ってガラス顕微鏡スライド上に置かれた５から１０ミクロンの組織のスライスから成る。この組織スライスは調べようとする人体組織の断面である。組織は様々な異なる型の細胞から成る。通常病理学者はしばしば、更なる分析のために組織の小さな部分のみを取り出すのを望む。
ＬＣＭは組織サンプルの頂部に置く熱可塑性トランスファフィルムを使う。このフィルムは、通常のＡｌＧａＡｓレーザーダイオードの放射領域と重なり合うスペクトルの赤外線近くの領域で選択的に吸収するために選ばれた有機染料を含めて製作される。焦点合わせされたレーザービームにフィルムを晒すと、晒された領域はレーザーにより加熱され、晒された領域にある組織に付着する。次にフィルムを組織から持ち上げ、組織の選択された部分をフィルムと共に取り外す。
ニュージャージー州ポンプトンレイクのエレクトロシール社から入手可能な厚さ１００ミクロンのエチルビニルアセテート（ＥＶＡ）フィルムの様な熱可塑性トランスファフィルムがＬＣＭの応用例で使われている。フィルムは約９０℃の低融点を有するものを選ぶ。
ＬＣＭ技術で使う熱可塑性ＥＶＡフィルムには、アルドリッチ化学社から入手可能な赤外線ナフタレンシアニン染料（染料番号４３２９６−２又は３９３１７−７）の様な染料でドープ処理される。これらの染料は、フィルムを選択的に溶かすために使われるレーザーエミッタと重なり合う波長範囲である８００ｎｍ領域に、強い吸収力を有する。染料は、溶かされたプラスチック塊と高い温度で混ぜられる。染められたプラスチックは次に、標準的フィルム製造技術を使ってフィルムに作られる。プラスチック中の染料濃度は約０．００１Ｍである。
ＬＣＭの応用例で使うフィルムは作業を申し分なく改善する一方、数個の欠点がある。染料を染み込ませたフィルムの光学的吸収力は、その厚さと相関関係がある。フィルムのこの特性は、他の理由でフィルムの厚さを選ぶ要件と対立するかもしれない。
フィルムの吸収特性を変えるために使う有機染料は、幾つかの場合に不利益な光化学効果を有するかもしれない。これはＬＣＭサンプルの汚染の原因となる恐れがある。加えて、現在までに使われている有機染料は入射レーザー光の波長に敏感であり、従ってフィルムは使用するレーザーに適合しなければならない。
発明の概要
レーザー捕捉顕微解剖に適した器械に対する特別な必要性が存在する。改良されたレーザー捕捉顕微解剖法に対しても特別な必要性が存在する。
本発明の第一の態様は、レーザー捕捉顕微解剖法に基づく実施例において実行されており、前記方法はレーザー捕捉顕微解剖を受けるサンプルを提供する段階と、前記サンプルをレーザー捕捉顕微解剖器械の光学軸内に置く段階と、基板表面と前記基板表面に連結されたレーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムとを有するトランスファフィルムキャリアを提供する段階と、前記サンプルの残余部分を前記レーザー捕捉顕微解剖フィルムへ不的確に移動させることなく、前記サンプルの一部を前記レーザー捕捉顕微解剖フィルムへレーザー捕捉顕微解剖移動するのに十分な圧力で前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムを前記サンプルと並列して置く段階と、次に前記サンプルの残余部分を前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムへ不的確に移動させることなく、前記サンプルの部分を前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムへ移す段階とから成る。
本発明の第二態様は、レーザー捕捉顕微解剖器械に基づく実施例に実行されており、前記器械は、照明／レーザー光学サブシステムと、前記照明／レーザー光学サブシステムに連結された移動ステージと、前記移動ステージに連結されたキャップハンドリングサブシステムと、前記移動ステージに連結された真空チャックサブシステムと、前記移動ステージに連結された手動操縦桿サブシステムとを含む倒立顕微鏡から成る。
本発明のこれらと他の態様及び目的は、下文の説明と付随の図面と関連して考えるとより認識し理解されるであろう。しかし下文の説明は本発明の好適実施例とその多くの明確な詳細を示している一方、図面として示され限定されるものでは無いことを理解すべきである。多くの変更と修正は、本発明の精神から逸脱すること無く本発明の領域内で行えるであろうし、本発明は全てのその様な変更を含む。
【図面の簡単な説明】
本発明を構成する利点と特徴の明白な概念、及び本発明により提供されるモデルシステムの構成要素と操作の明白な概念は、本明細書に添付されその一部を成す図面に示された代表的な、それ故これに限定しない、実施例を参照することによりより容易に明らかになるであろうし、添付の図面中の同じ参照番号（が２つ以上の図面にある場合）は同じ要素を示す。従って、請求項には明細書と図面に合致する最も広い解釈を与えられるべきである。又、図面に示された特徴は必ずしも縮尺が合っていないことに注目されたい。
図１は、レーザー捕捉顕微解剖倒立顕微鏡の斜視図であり、本発明の一実施例を示す。
図２Ａ−２Ｂは、図１に示すレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）倒立顕微鏡の正射影図を示す。
図３は、ＬＣＭ倒立顕微鏡の部分断面図であり、本発明の一実施例を示す。
図４は、ＬＣＭ倒立顕微鏡の部分断面図であり、本発明の一実施例を示す。
図５は、キャップハンドリングサブアッセンブリの断面図であり、本発明の一実施例を示す。
図６は、ロード位置でのキャップハンドリングサブアッセンブリの正面図であり、本発明の一実施例を示す。
図７は、図６に示す位置での装置の平面図を示す。
図８は、検査位置でのキャップハンドリングサブアッセンブリの正面図であり本発明の一実施例を示す。
図９は、図８に示す位置での装置の平面図を示す。
図１０は、アンロード位置でのキャップハンドリングサブアッセンブリの正面図であり、本発明の一実施例を示す。
図１１は、図１０に示す位置での装置の平面図を示す。
図１２は、真空チャックの平面図であり、本発明の一実施例を示す。
図１３は、真空チャックの断面図であり、本発明の一実施例を示す。
図１４は、複合照明／レーザービームデリバリシステムの概略線図であり、本発明の一実施例を示す。
図１５は、適所に散光器のある複合照明／レーザービームデリバリシステムの概略図であり、本発明の一実施例を示す。
図１６は、適所にキャップのある複合照明／レーザービームデリバリシステムの概略図であり、本発明の一実施例を示す。
図１７は一体型キャップ／散光器の概略図であり、本発明の一実施例を示す。
図１８は一体型キャップ／散光器の概略図であり、本発明の一実施例を示す。
好適実施例の説明
本発明とその様々な特徴と利点の詳細を、添付の図面に示し以下詳細に説明する非限定的な実施例を参考にしてより完全に説明する。本発明を細部で不必要に分かりにくくしないために、周知の構成要素と処理技術の説明は省略する。
１９９７年２月７日出願の「レーザー捕捉顕微解剖装置」と題する米国特許出願番号第６０／０３７，８６４号（整理番号第ＡＲＣＴ−００２）、１９９７年２月７日出願の米国特許出願番号第０８／７９７，０２６号、１９９７年２月１４日出願の米国特許出願番号第０８／８００，８８２号、１９９７年１０月１日出願の米国特許出願番号第６０／０６０，７３１号、１９９７年１０月１日出願の米国特許出願番号第６０／０６０，７３２号の全内容を、本文にて完全に述べたものとして本出願に参考資料として掲げる。
図１に、レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）用の倒立顕微鏡１００の斜視図を示す。倒立顕微鏡１００は様々なサブシステム、特に、組み合わせると相乗効果と意外なほど良い結果を提供するＬＣＭ技術に適合したものを含む。代替実施例では、顕微鏡は倒立顕微鏡である必要は無い。
キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０は、マイクロ遠心分離管キャップ１２０をサプライ１２２から選んでマイクロ遠心分離管キャップ１２０をＬＣＭを受けるサンプルの頂部上に置くための構造を提供する。図示の実施例では、マイクロ遠心分離管キャップ１２０は円柱状の対称的プラスチックキャップであり、サプライ１２２は消耗品８個を鳩尾形スライド１２４上に有する。図示の実施例では、マイクロ遠心分離管キャップ１２０の底部に連結されたレーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムがある。キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０は、キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０の作動端１１２がガラス瓶キャッピングステーション１１４に配置される数ヵ所の可能な位置の一つで示されている。キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０の動きは以下詳細に述べる。
顕微解剖されるサンプルが上に置かれ、マイクロ遠心分離管キャップ１２０が上に配置されるガラススライド１３０を、倒立顕微鏡１００の主要光学軸内に置く。代替実施例では、サンプルを支持するスライドは他の実質的に透明な材料、例えばポリカーボネートの様なプラスチックから作ることができる。ガラススライド１３０は、真空チャック１４０により適所に支持され保持される。真空チャック１４０は実質的に平坦な表面であり、マイクロ遠心分離管キャップ１２０を取り上げて配置し、移動ステージ１４５をＸ−Ｙ平面で操作する間にガラススライド１３０を適所に保持するために、マニフォルド（図示せず）を通してガラススライド１３０を係止するる。代替実施例では、移動ステージはＺ軸に沿って動かすことができる様に作ることができる。
移動ステージ１４５は一対の回転制御（図１では図示せず）を使って操作できる。更に、移動ステージ１４５は操縦桿１５０を使って操作できる。操縦桿１５０は球形取り付け具１５２と１５４を介して移動ステージ１４５に接続されている。操縦桿１５０は固定ブラケット１５８内の第二球形取り付け具１５６を含んでいる。操縦桿はＸ及びＹ方向運動を同時に提供する。更に、この同時運動は、片手状態でも行うことができる。サンプルの入手は従ってより早く行われる。
機械的梃子比は、球形取り付け具１５２と第二球形取り付け具１５６の間の長さが第二球形取り付け具１５６と操縦桿１５０の底部端の間の長さよりも短いという事で生じる。この梃子比は力の乗算には必要ないが、スカラー運動での減算には必要である。この比は１／５以下、できれば約１／７であるのが好ましい。この比は、オペレータの手の動きの関数としてサンプル運動に関して必要とされる最適解を提供するよう調整することができる。
加えて、操縦桿は電子制御又はギアのあるリンク装置では手に入れることのできない触感フィードバックを提供する。操縦桿１５０は、オペレーターの手の単一ベクトル運動の関数として、移動ステージ１４５を同時に２方向（ＸとＹ）へ動かせるようにする。この重要な特徴は、顕微解剖される対象を倒立顕微鏡１００の主要光学軸に位置決めするスピードがかなり早くなるという予期しない結果を提供する。
更に図１に関してであるが、倒立顕微鏡１００はＬＣＭ光学トレイン１６０を含んでいる。ＬＣＭ光学トレイン１６０は照明アーム１６５に取り付けられている。白色光照明器１７０も照明アーム１６５に取り付けられている。照明器１７０からの白色光は、二色性鏡１８０と集束レンズ１９０を通ってマイクロ遠心分離管キャップ１２０に向かって下向きに進む。光を平行にする光学系を有するレーザーダイオード１７５は、ビーム操縦鏡１８５で反射されるビーム１７７を放射する。ビーム１７７はビーム操縦鏡１８５に反射後、二色性鏡１８０に入射する。二色性鏡１８０は二色性であり、ビーム１７７を集束レンズ１９０を通してマイクロ遠心分離管キャップ１２０に向けて下向きに反射させる。同時に二色性鏡１８０は、照明器１７０からの白色光が集束レンズ１９０を通ってマイクロ遠心分離管キャップ１２０に向かって直接下に進むのを許容する。従ってビーム１７７と白色光照明は重なり合う。集束レンズ１９０もビームスポットサイズを調節する。
次に図２Ａ−２Ｂでは、図１に示す装置の二つの正射影図を示す。白色光照明経路２１０とレーザービーム経路２２０は、図２Ａと図２Ｂの両方で見ることができる。両経路が像捕捉システム２３０への光学情報のデリバリを含むことが図２Ａから認識できる。同様に照明ビーム経路が双眼顕微鏡２４０への光学情報のデリバリを含むことが図２Ｂから認識できる。代替実施例では、接眼レンズアッセンブリ（即ち接眼鏡）は単眼用器具を含んでいてもよい。
図３では、本発明に依る光学トレインの概略ブロック線図を示す。レーザービーム経路３１０はフィルム活性化レーザー３２０から始まる。レーザービーム経路３１０は次に鏡３３０で反射される。レーザービーム経路３１０は次に二色性鏡３４０で反射される。レーザービーム経路３１０は次にレンズ３５０で収束される。レンズ３５０は、例えば可変開口の様なビーム直径を変えるための構造と随意的にで関連していてもよい。レーザービーム経路３１０は次にマイクロ遠心分離管キャップ１２０に向かって下向きに進む。レーザービーム経路３１０は次に対物レンズ３６０を通って進み、次に反射される。カットオフフィルター３９０は接眼鏡３７０に取り付けられている。カットオフフィルター３９０はレーザービームからのエネルギーを反射及び／又は吸収できる。
オペレーターは、マイクロ遠心分離管キャップ１２０により捕らえられるサンプルの部分に関するレーザービーム経路３１０の位置を、像捕捉システム２３０（図３では図示せず）を経て見ることができるが、ここにはカメラが含まれていてもよい。停止モードでは、レーザービーム経路３１０は、捕捉システム２３０を経て検出できる可視低振幅信号を出す。パルスモードでは、レーザービーム経路３１０はエネルギーをマイクロ遠心分離管キャップ１２０に送出し、カットオフフィルター３９０の光学特性によりレーザービーム経路３１０は十分に減衰されるので、レーザービームからのエネルギーは実質的に全く接眼鏡３７０を通って出て行くことはない。
適切なレーザーパルス幅は０から約１秒であり、好ましくは０から約１００ミリセカンド、より好ましくは約５０ミリセカンドである。好適実施例では、レーザーの波長は８１０ナノメートルである。好適実施例では、マイクロ遠心分離管キャップ１２０上に位置するＥＶＡ材料でのレーザーのスポットサイズは、０．１から１００ミクロンまで可変であり、好ましくは１から６０ミクロンまで、より好ましくは５から３０ミクロンまでである。これらの範囲は光学サブシステムを設計する場合比較的好ましい。臨床オペレータの見地からすると、最大幅のスポットサイズ範囲は最も用途が多い。約５ミクロンのスポットサイズ範囲にある下部端点は単一細胞を移すのに役に立つ。
適切なレーザーは、幅広い電力範囲から選択できる。例えば、１００ワットレーザーが使用できる。一方、５０ｍＷレーザーも使用できる。レーザーは、光ファイバ−カプリングで光学サブシステムの残りの部分に接続できる。回折制限レーザーダイオード及び／又は単一モード光ファイバーを使えば、より小さいスポットサイズも作り出せる。単一モードファイバーは回折制限ビームを許容する。
レーザーダイオードはＴＥＭ00の様な標準モードで作動できる一方、他の強度プロフィールを異なる型の応用例に使うことができる。更に、ビーム直径はレンズ３５０の替わりに階段型レンズで変えることもできる。
ビーム直径を変えると、捕捉するサンプルの部分のサイズを調整することができる。しっかり焦点を合わせた初期状態を与えると、ビームサイズは焦点をぼかすことにより大きくできる。焦点をぼかした初期状態を与えると、ビームサイズは焦点を合わせることにより小さくできる。焦点の変化は決まった量にできる。焦点の変化は、可動レンズ取り付け具上のぎざぎざによって及び／又は光学ガラス段によって得ることができる。いずれにしても光学経路距離を延ばしたり／短くしたりすることは、ビームの焦点を変え、それによりスポットサイズを変えるために必要とされる作用である。例えば、段のついたガラスプリズム３８０を、ビームが一段トレッドに当たる様にビーム内に入れると、光学経路距離が変わりスポットサイズが変わる。
次に図４に、本発明に依る器械の別の実施例の概略ブロック線図を示す。本実施例では、光源４１０（例えば蛍光レーザー）は特定の波長又は波長範囲を放射する。光源４１０が放射するビーム４２０の特定の波長又は波長範囲は、選択され、又はフィルターに掛けられ、顕微解剖されるサンプルに組み込まれるか又は適用される蛍光発光システム（例えば、当該産業で既知の化学マーカー及び光学フィルタリング技術）を励起する。蛍光レーザー４１０が放射したビーム４２０の周波数は同調できる。サンプルは発色団と蛍光染料（合成又は有機）から成るグループから選択された少なくとも一つの要素を含み、器械を操作する過程は、前記サンプルの前記部分を前記レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムに移す段階の前に、前記サンプルの少なくとも一部分を少なくとも一つの要素を励起する光で確認することを含んでいる。
更に図４では、ビーム４２０は鏡４３０に反射される。ビーム４２０は次に二色性鏡３４０に反射される。こうしてビーム４２０を、レーザービーム経路３１０と照明器１７０からの白色光の両方と一致させることができる。ビーム４２０とレーザービーム経路３１０は、明確にするためのみに、間隔を設けた構成で示されていることに注意すべきである。ビーム４２０とレーザービーム経路３１０は共軸であることができる。マイクロ遠心分離管キャップ１２０の下方にあるサンプルが放射する蛍光は次に、対物レンズ３６０を通って進み、接眼鏡３７０を通してオペレーターが見る。
次に図５に、キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０の断面図を示す。キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０はダンパー５１０を含んでいる。ダンパー５１０は、キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０の垂直運動を減衰させるための構造である。ダンパー５１０は、再現できる方法でマイクロ遠心分離管キャップ１２０を移動ステージに向かって下げるようになっている。ダンパー５１０は空気ダンパー（例えば空圧管）、液体ダンパー（例えば水圧管）又は衝撃を起こさないようにサブアッセンブリ１１０の垂直運動を遅らせることのできる任意の他の力学構造であってもよい。マイクロ遠心分離管キャップ１２０がサンプルが上に置いてあるスライド（図示せず）に接触すると、ダンパー５１０に連結されているアーム５２０の作動端１１２が再現可能な速度で下向きに動き続ける。従って、マイクロ遠心分離管キャップ１２０の頂部は、重り５３０の底部に対して上昇する。重り５３０がキャップ１２０に接触する前にキャップ１２０がスライドに接触することが理解できる。この様にマイクロ遠心分離管キャップ１２０は、接触して重り５３０によりスライドに押しつけられる前に自己レベリング段階に入る。重り５３０がマイクロ遠心分離管キャップ１２０に接触すると、アーム５２０の作動端１１２はその下向き経路に沿って動き続ける。従って、重り５３０のマイクロ遠心分離管キャップ１２０への適用も自己レベリング段階である。重り５３０の質量を制御することにより、マイクロ遠心分離管キャップ１２０の底部とスライドの間の面積単位当たりの力を制御できる。スライド上のサンプルがＬＣＭを受けた後、アーム５２０は持ち上げることができる。アームを持ち上げることにより、重り５３０は最初にマイクロ遠心分離管キャップ１２０から外され、次にマイクロ遠心分離管キャップ１２０はスライドから持ち上げて外される。機構内のダンパーは、ピックアップアームの速度を制御するダシュポットとして作動する。
移動ステージの位置は、キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０の位置に対して独立している。これらの相対位置は対の回転制御１４７で制御できる。対の回転制御１４７は、図５では、その軸がマイクロ遠心分離管キャップ１２０の軸と平行に示されていることに注目されたい。しかし、対の回転制御１４７は、ギアの様な機械式リンク装置を使ってどの方向にでも構成できる。
次に図６に、キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０をロード位置で示す。ロード位置では、アーム５２０の作動端１１２は、鳩尾形スライド１２４の真上に位置する。この位置で、作動端１１２はマイクロ遠心分離管キャップ１２０をつかむ。マイクロ遠心分離管キャップ１２０をつかんだ後、アーム５２０は持ち上がり、それによりマイクロ遠心分離管キャップ１２０を持ち上げる。
次に図７に、ロード位置のキャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０の平面図を示す。アーム５２０がロード位置に回転する前に新しいマイクロ遠心分離管キャップは作動端１１２の軸の下に置かれる。アーム５２０が真空チャック１４０に向かって時計回りに回転した後、鳩尾形スライド１２４上のキャップが前に出され、次のサイクルのために新しいマイクロ遠心分離管キャップを適所に置く。
次に図８に、キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０を検査位置で示す。検査位置にある時、アーム５２０の作動端１１２は、器械の主要光学軸と一致して配置される。これはアーム５２０が先ず最初にマイクロ遠心分離管キャップ１２０の自己レベリング、次にマイクロ遠心分離管キャップ１２０上の重り５３０の自己レベリングができる様に低くなる位置である。ＬＣＭの後、アーム５２０はこの位置に持ち上げられ、重り５３０をマイクロ遠心分離管キャップ１２０から下し、次にマイクロ遠心分離管キャップ１２０をスライド（図示せず）から下す。
重り５３０は自由浮動重りであるため、キャップの頂部にセットすると、キャップと重りは自由に安定する。自由浮動重りは圧力が均一にかかるようにする。例えば、レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムの総表面積がほぼ０．２６平方インチの場合、３０グラムの重りを使うことができる。
次に図９に、検査位置のキャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０の平面図を示す。アーム５２０の作動端１１２はガラススライド１３０の上に位置するのがこの図面から認識できる。
次に図１０に、キャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０をアンロード位置で示す。アンロード位置では、アーム５２０の作動端１１２とＬＣＭ取り付けされた組織の付いたキャップ１２０（別称、消耗品）は、ガラス瓶キャッピングステーション１１４の上に全て配置されている。マイクロ遠心分離管キャップ１２０はガラス瓶キャッピングステーション１１４と同軸に配置された後、分析コンテナ１０００の上に直接降ろされ、その中に入る。マイクロ遠心分離管キャップ１２０が分析コンテナ１０００に挿入された後、アーム５２０の作動端１１２が持ち上げられる。アーム５２０の作動端１１２は次に、新しい消耗品の上まで時計方向に回転される（図６−７に示す位置と一致）。
次に図１１に、アンロード位置のキャップハンドリング機械サブアッセンブリ１１０の平面図を示す。この位置では、アーム５２０は真空チャック１４０から離れた位置にある。分析コンテナ１０００（図１１では見えない）は上向きに押され、マイクロ遠心分離管キャップ１２０と噛み合っている（図１１では見えない）。結果として密閉された分析コンテナ１０００は次に、自由に支持ブラケット１０１０に戻ることができる（図１０参照）。密閉された分析コンテナ１０００はマイクロ遠心分離管キャップ１２０と共に次に、ブラケット１０１０から手動又は自動の何れかで取り出すことができる。
次に図１２に、真空チャック１４０の平面図を示す。真空チャック１４０の頂部表面１２１０には、第一マニフォルド１０２０と第二マニフォルド穴１０３０が設けられている。代替実施例では、マニフォルド穴は幾つあってもよい。真空チャック１４０にはビーム経路穴１０４０が設けられている。器械が作動時、ガラススライド（図示せず）又は他のサンプルホルダーは、ビーム経路穴１０４０とマニフォルド穴１０２０−１０３０の上に置かれる。ガラススライドを適所に配置した後、穴１０２０−１０３０に接続されたマニフォルドを通して真空引きが行われ、それによりガラススライドをビーム経路穴１０４０上に適所に保持する。中程度の又は高い真空を掛けてもよいが、ＬＣＭ過程の間ガラススライドを適所に保持するのには低真空度で十分である。安い水槽ポンプを逆向きに使っても十分な真空度を作ることができる。
ガラススライド１３０にかかる保持力は、適用される真空度、マニフォルド穴１０２０−１０３０のサイズと形、移動ステージの頂部表面とガラススライド１３０の底部表面の間の間隔の関数である。移動ステージとガラススライド１３０の間の間隔は、表面の平坦さと対応する構造の弾性の関数である。
真空度レベルは、ガラススライド１３０又は他のサンプルキャリアが移動ステージに関して移動できる様に調節する。この移動能力は真空がオフの時でもオンの時でも存在する。
ガラススライド１３０の周囲には多少の漏れがあり、これがガラススライドを適所に保持する力を調節する。従って、真空が掛けられた時にガラススライド１３０を移動ステージに関して動かすのには、適度な力（例えば５ポンド）がガラススライドの端に掛けられていれば十分である。
次に図１３に、真空チャックの断面図を適所に配置されたガラススライド１３０と共に示す。ガラススライド１３０を適所に保持する真空は、導管１３２０を抜けて引かれる。導管１３２０は円形マニホルド１３１０に接続されている。円形マニフォルド１３１０は、マニフォルド穴１０２０−１０３０に連結されている。
図１３から、真空チャック１４０の頂部表面上に突き出るピン又は他の構造物が全く無いことが分かる。これにより、ガラススライド１３０を頂部表面と平行などんな方向にでも自由に動かすことができる。
次に図１４に、ＬＣＭ装置用の非常に高い開口率の照明器１４００を示す。照明器１４００は長い作動距離を提供する。光ファイバー１４１０は、白色光照明の光源を提供する。光ファイバー１４１０からの発散ビームは、約０．４の開口率を有することができる。コリメーターレンズ１４３０は、光ファイバー１４１０からの光を平行光線にする。コリメーターレンズ１４３０は非球面レンズ（例えばメル・グリオット（０１ＬＡＧ０２５）非球面型レンズ）でよい。コリメーターレンズ１４３０からの平行光線にされたビーム１４４０は、ビームスプリッタ１４５０を通り抜ける。ビームスプリッタ１４５０には、レーザービーム１４６０を入射することができる。レーザービーム１４６０はビームスプリッタ１４５０に反射された後は、白色光照明と同軸となる。両型式の光は次に、集光レンズ１４７０に到達する。集光レンズ１４７０は、メル・グリオット（０１ＬＡＧ０１０）又は（０１ＬＡＧ０１０）又は他の同様の非球面型レンズでもよい。集められた同軸ビームは次に、マイクロ遠心分離管キャップ１２０に入射して通り抜ける。集光レンズ１４７０から生じる集束ビームは、約０．８の開口率を有することができる。これを集束ビームとみなすことができる。マイクロ遠心分離管キャップ１２０はサンプルを取られる細胞のあるスライド（図示せず）の頂部に配置される。
次に図１５に、高開口率照明器の別の実施例を示す。本実施例では、散光器１５００は、サンプルを取られる細胞を含むガラススライド１３０の上にある集光レンズ１４７０の真下に配置される。
より一般的には、散光器１５００の機能を提供するために任意の適切な分散媒体を使うことができる。その様な分散媒体を、光を分散するため組織の近くに設ければ、サンプルの照明を劇的に改良し、ずっと良好に観察することができる。この型の分散媒体を用いれば、サンプルの屈折率合わせの必要性がなくなる。その様な分散媒体は、細胞核と通常の照明技術では一般的に分かりにくいであろう他の細胞下構造の視認化を可能にすることができる。
分散媒体は、散光器材であってもよい。分散媒体として使うのに適した散光器材は、非常に濃い、細かな散光器材である乳白又はオパールガラスである。例えば適切な乳白ガラスは、部品番号Ｐ４３，７１７としてエドモンドサイエンティフィックから入手可能である。標準レーザープリンタ／フォトコピア紙でも分散媒体として使うことができる。例えば、すりガラス、レンズ形シート、容積散光器及び／又は表面散光器の様な、他の型式の透明分散媒体も使うことができる。いずれにしても分散媒体は、照明光を強力に分散する素材でなければならない。一般的すりガラス１枚では通常不適切であり、照明光を十分に分散するためにはすりガラスを３又は４枚順次積み重ねて複数層に組み合わせる必要がある。
次に図１６では、散光器１５００をマイクロ遠心分離管キャップ１２０と取り替えた後で、図１５で示した段階の間に捕らえた像を使って所望の細胞をつきとめることができる。次にレーザービーム１４６０を導入し、ビームスプリッタ１４５０で反射させて、マクロ遠心分離管キャップ１２０に進ませ、所要サンプルを捕らえる。
本照明器設計の目的は、ＬＣＭ装置に非常に高い開口率の照明器を提供することである。その様なＬＣＭ装置は、長い作動距離を必要とする。開口率０．８の４０Ｘ対物レンズを使う照明器はより良好な視覚化を提供する様に思われるかもしれないが、４０Ｘ対物レンズの作動距離は非常に短い（例えば、１ｍｍ以下）ので、この設計には問題がある。従って、照明設計にかなり長い作動距離を持たせるため厚いドームキャリアを使う設計には、これは重要なことである。厚いドームキャリアは、頂部と底部が短い距離以上に離れて間隔を設けられたサンプルキャリアである。これは重要なことであり、なぜならサンプルはサンプルキャリアの底部に隣接しており、対物レンズはサンプルキャリアの頂部以上にサンプルの近くに動くことができないからである。
集束レンズ１９０は、０１ＬＡＧ０１０の様なメル・グリオット非球面集光レンズと置き換えることができる。その様なレンズは、約０．７５の開口率と約２５ミリメートルの作動距離を有する。その様なレンズは、４０Ｘ対物レンズの様に色収差が修正されていない。集光器として球面レンズを使って行った実験は、視覚化に良好な改良をもたらした。この球面レンズははっきりと、４０Ｘ対物レンズに組み込まれた収差に対する補正を持っていなかった。
レーザービームは集束レンズ１９０の様なこの集光レンズを通して集束することができる。この集光レンズは、現在のレンズの約２分の１の焦点距離を有し、それ故レーザービームは約１５ミクロンに集束される。
代替実施例では、バーコードスキャナーのレンズの様な複合レンズを使う設計とすることができる。その様な複合レンズは、レーザー用の中央領域と白色光照明に関して高開口率として作動する周辺領域とを有するであろう。
次に図１７の一実施例では、散光器１５００はマイクロ遠心分離管キャップ１２０に隣接して配置することができる。本実施例では、マイクロ遠心分離管キャップ１２０は、ガラススライド１３０の真上に位置している。平行光線にされた光１７００は散光器１５００に入射する。散光器１５００は平行光線にされた光が入ると、無限の異なる角度でキャップ通り抜けさせる。こうして影が減り、像の質が改善される。
散光器１５００は容積散光器又は表面散光器でもよい。容積散光器の場合、散光器１５００は、すりガラス、スペックルベースホログラフィ散光器又は１片の紙でもよい。表面散光器の場合、散光器１５００は、レンズ形シート、スペックルベースホログラフィ表面散光器又は任意の他の適切な位相表面でもよい。
次に図１８では、本実施例の散光器１５００は、マイクロ遠心分離管キャップ１２０の底部に隣接して配置されている。平行光線にされた光１７００は、マイクロ遠心分離管キャップ１２０を通り抜け、散光器１５００に入射する。予め平行光線にされた光は散光器１５００から出るとき、幅広い範囲の角度に分散される。本実施例では、散光器１５００はガラススライド１３０から離されている。
分散媒体（例えば散光器１５００）は、直接又は間接的にトランスファフィルムキャリア及び／又はＬＣＭトランスファフィルムに接続できる。代わりに、分散媒体は、トランスファフィルムキャリア及び／又はＬＣＭトランスファフィルムの表面上又は内部に形成することもできる。分散媒体はＬＣＭビーム及び／又は照明ビームを作る様に製作できる。分散媒体は、効果的であるためにはサンプルの数ミリメートル以内にある必要がある。数ミリメートルは、１センチ以下、好ましくは５ミリメートル以下を意味する。
器械を操作する過程はサンプルが採取する組織を視覚化することから始まる。次に組織を動かして、採取する部分を器械の光軸の真下に移す。次に、レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムを所望の領域上にセットする。好適実施例では、フィルムをサンプルの頂部表面の数ミクロン以内に離して置く。代わりに、フィルムを、不的確な移動を起こさせることなく移動させるのに十分な圧力でサンプルの頂部に接触させて置いてもよい。最終的にレーザーをパルス放射して、フィルムを加熱し組織を取り外す。サンプルの付いたフィルムは素早く引き抜く必要がある。しかし速度は、サンプルがチキソトロピー的に切り取られる様な速度でなければならない。
本発明の実際の応用例
技術面で価値のある本発明の実際の応用例としては、健康な組織と、病気の種々な段階にある病気にかかった組織の両方の遺伝子表現パターンの広範なデータベースの収集が挙げられる。このデータベースは、癌と伝染病の病因をより完全に理解するために使われる。本発明により、科学者は遺伝子パターンを識別し、この情報を病気の有効な診断に組み込めるようになる。本発明により、医師は実際の患者の組織サンプルを異なる病気段階で患者サンプルから記録されたデータと比較し、それによってより有効な段階治療を処方し、不必要な処置を除去し、患者の苦痛を減らすことができるようになる。この他、本発明が役に立つ研究分野としては、薬の発見、発生生物学、法医学、植物学、薬の効かない肺結核の様な伝染病の研究等がある。事実上本発明には無数の利用法があるが、それらの全てを本文で詳述する必要は無い。
本発明の利点
本発明の実施例を示すレーザー捕捉顕微解剖器械及び／又は方法は、少なくとも以下の理由のために費用効率が高く有効なはずである。本発明は、現在の方法をより正確で再現できる結果をもたらすより良い技術に置き換えるであろう。本発明は、レーザー捕捉顕微解剖トランスファフィルムをマイクロ遠心分離管キャップ（例えば、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦTM管）の様な分析容器の内部表面に組み込む使い捨ての低価格射出成型ポリマーを提供するために使うことができる。
本出願で述べた全ての出版物、特許出願、発行特許は、各個々の出版物、出願又は特許を明確且つ個々にそのまま参考書類として本文に掲げた場合と同じ程度に、そのまま参考書類として本文に挙げる。
本文で述べた本発明の全ての開示された実施例は、無理な実験をせずに実現実行できる。発明者がよく考えた本発明を実行する最良の方法は上に開示してあるが、本発明の実行はそれに限るものではない。本発明の特徴の様々な追加、変更及び再構成は、基本的な発明概念の精神と範囲から逸脱することなく行なえるであろうことは明らかである。従って、当業者には、本発明が本文で明細に説明した外にも実行できることを理解いただけるであろう。
例えば、個々の構成要素は開示された形で形成したり、開示された構成で組み立てたりする必要はなく、事実上任意の形で提供し、事実上任意の構成で組み立てることができる。更に、個々の構成要素は開示された材料で作る必要はなく、事実上任意の適切な材料で作ることができる。更に、本文で開示されたＬＣＭ器械は物理的に独立したモジュールとして説明されているが、ＬＣＭ器械は、器械が関連する他の装置に組み込んでもよいことは明らかであろう。更にまた、各開示された実施例の全ての開示された要素と特徴は、その様な要素又は特徴が相互に排他的である場合を除いては、全ての他の開示された実施例の開示された要素及び特徴と組み合わせるか又は置き換えることができる。
本発明の特徴の様々な追加、変更及び再構成は、基本的な発明概念の精神と範囲から逸脱することなく行えるであろうことは明らかである。添付の請求項によって定義される様な発明の範囲及びそれと等価なものは、その様な追加、変更及び再構成全てを含むことを意図する。手段プラス機能限定が、語句「のための手段」を使って所与の請求項で明白に列挙されていない限り、添付の請求項は手段プラス機能限定を含むとして解釈されるべきではない。本発明の適当な実施例は添付の従属請求項により区別される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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