(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で表されるペプチドRK-F1010。
【化１】
0003807784.tif 000011
【請求項２】
培地中に、請求項１記載のペプチドRK-F1010を産生するアスペルギルス属に属する糸状菌アスペルギルス テレウス95F-1 株 (FERM P-15629)を培養し、当該培養物からペプチドRK-F1010を分離・採取することを特徴とする、ペプチドRK-F1010の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドRK-F1010を有効成分とする細胞周期阻害剤。
【請求項４】
請求項１記載のペプチドRK-F1010を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項５】
請求項１記載のペプチドRK-F1010を産生するアスペルギルス属に属する糸状菌アスペルギルス テレウス95F-1 株 (FERM P-15629)。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ペプチドRK-F1010、その製造方法、それを有効成分とする細胞周期阻害剤、抗腫瘍剤、及びそれを生産するアスペルギルス属に属する糸状菌に関する。
【従来の技術】
人体を構成する細胞は恒常性を維持しており、そのために細胞の増殖と分化は厳しく制御されている。細胞は、Ｍ期・Ｇ1 期・Ｓ期・Ｇ2 期という一連の過程からなる細胞周期を回転することにより分裂、増殖を行う。この細胞周期の制御機構に異常が生じると恒常性に乱れが生じ、癌や免疫疾患になる可能性が高まる。最近では、細胞周期の調節機構が分子レベルで解明されつつあり、細胞周期を調節する物質には抗腫瘍剤や免疫抑制剤などの可能性が示されつつある。これらの用途のための従来の薬剤には毒性や副作用などの面で問題があり、これらの用途に適する新規化合物の開発が要望されている。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、細胞周期阻害活性を有する新規化合物、その製造方法、それを有効成分とする細胞周期阻害剤および抗腫瘍剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題の解決のために鋭意検討した結果、沖縄県那覇市で採取した土壌から分離された、アスペルギルス属に属する糸状菌95F-1 株が細胞周期を阻害する物質を生産することを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本願は以下の発明を提供するものである。
Ａ．下記の式（１）で表されるペプチドRK-F1010。
【０００３】
【化２】
0003807784.tif 000002
【０００４】
Ｂ．培地中に、ペプチドRK-F1010を産生するアスペルギルス属に属する糸状菌95F-1 を培養し、当該培養物からペプチドRK-F1010を分離・採取することを特徴とする、ペプチドRK-F1010の製造方法。
Ｃ．ペプチドRK-F1010を有効成分とする細胞周期阻害剤。
Ｄ．ペプチドRK-F1010を有効成分とする抗腫瘍剤。
Ｅ．ペプチドRK-F1010を産生するアスペルギルス属に属する糸状菌アスペルギルス  テレウス95F-1 株。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の新規ペプチドRK-F1010を生産する菌株は、本発明者らが、沖縄県那覇市にて採取した土壌から新たに分離した菌株であり、微生物の名称「アスペルギルス  テレウス 95F-1 (Aspergillus terreus 95F-1 」および微生物寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６２９」として、平成８年５月１７日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
本発明のRK-F1010を生産する糸状菌アスペルギルス  テレウス95F-1 株は、以下の生物学的性質を有する。
【０００６】
〔培地上での諸性状〕
ツァペック・酵母エキス寒天（ＣＹＡ；表１参照）平板上：
２５℃、７日間の培養で、生育は中程度、コロニーの直径は２６〜２９mm、表面はフェルト状で、放射状及び同心円状にしわがあり、全体的にやや盛り上がる。胞子の形成はコロニーの中心付近で中程度、また無色透明な浸出液の分泌も観察される。コロニー表面の色調は、胞子形成の認められる中心付近でうすい赤みの黄[10YR8.5/6] 、気生菌糸の形成が盛んな周縁付近では黄みの白[5Y9/1] 、また両者の境界線付近でうすい黄[5Y9/6] を呈する。コロニー裏面は表面と同様にしわがあり、色調は中心付近で黄赤[5YR6/12] 、その他の部分ではうすい赤みの黄[10YR8.5/6] から赤みの黄[10YR7/12]を呈する。培地中に黄色の可溶性色素をわずかに分泌する。
【０００７】
ＣＹＡ寒天平板上：
３７℃、７日間の培養では、生育良好、コロニーの直径は４８〜５６mmに達する。表面は綿毛状からフェルト状を呈し、その他はＣＹＡ、２５℃でのコロニーと同様の性状を示す。
麦芽エキス寒天（ＭＥＡ；表１参照）平板上：
２５℃、７日間の培養で、生育は中程度、コロニーの直径は１９〜２０mmでＣＹＡに比べやや生育速度は遅い。表面はフェルト状からビロード状で、ＣＹＡと同様に放射状及び同心円状にしわがあるが、生育に厚みがなく平坦なコロニーを形成する。胞子の形成はコロニーの中心付近で中程度。コロニー表面の色調は、胞子形成の認められる中心付近でうすい赤みの黄[10YR8.5/6] 、気生菌糸の形成が盛んな周縁付近では黄みの白[5Y9/1] を呈する。コロニー裏面の色調は中心付近で赤みの黄[10YR7/12]、その他の部分ではうすい赤みの黄[10YR8.5/6] を呈する。
【０００８】
２０％シュークロース含有ＣＹＡ寒天（ＣＹ２０S ；表１参照）平板上：
２５℃、７日間の培養で、生育は中程度、コロニーの直径は２６〜２９mm、ＣＹＡとほぼ同様の性状を示し、可溶性色素の分泌はやや多く、浸出液の分泌は認められない。コロニー表面の色調は、胞子形成の認められる中心付近でうすい赤みの黄[10YR8.5/6] 、気生菌糸の形成が盛んな周縁付近では黄みの白[5Y9/1] からごくうすい黄[5Y9/3] を呈する。コロニー裏面の色調は黄赤[5YR6/12] から明るい赤みの黄[10YR8/11]を呈する。
その他の各種寒天平板上：
２５℃、７日間培養した場合の、肉眼的コロニー観察結果を表２に示した。
なお、色の表示は日本規格協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引用した。
【０００９】
〔形態〕
本菌株がＭＥＡ上、２５℃、１４日間の培養で形成したコロニ−を光学顕微鏡で観察すると、基底菌糸から長く伸長した分生子柄の先端が球状に膨らみ、アスペルギルス（Aspergillus)属に特徴的な復列、短円筒状の分生子頭が多数観察される。培養７日目で形成される分生子頭は、ほとんどが未熟な放射状、色調も白色から極めてうすい褐色を呈するが、培養１４日目では淡黄褐色、短円筒状分生子頭が発達し優勢となる。ただし、未熟な放射状分生子頭が優勢のまま残存する箇所が、コロニーの中心付近および不規則なセクター状部分で認められる。
分生子柄はやや屈曲し、無色で厚壁、表面は滑面、長さは２００〜７００μｍ、径は4.６〜8.０μｍ、壁の厚みは0.４〜1.０μｍである。分生子柄の先端が球状に膨らんだ頂のう部分の直径は１４〜２６μｍ、基部を除く２／３以上の表面にメトレを生じている。メトレの大きさは4.０〜7.０×1.８〜3.０μｍ。フィアライドはフラスコ形、大きさは5.８〜8.０×1.６〜2.０μｍである。分生子は球形から亜球形、表面は平滑、直径は2.０〜2.６μｍである。
また、一部の基中菌糸では、側面に亜球形からしずく形のアレウリオ型分生子(aleurioconidia)が単生する。アレウリオ型分生子の大きさは5.０〜9.０×3.４〜5.０μｍである。
なお、培養を３週間に延長したが、子のう果等の有性生殖器官の形成は認められなかった。
【００１０】
【表１】
0003807784.tif 000003
【００１１】
【表２】
0003807784.tif 000004
【００１２】
〔生理的性質〕
生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ：
ＹｐＳｓ液体培地において、ｐＨ２〜１０の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜７である。
生育温度範囲及び最適温度：
サブロ−液体培地において、１６〜４２℃の範囲で生育し、最適生育温度は３６〜３９℃である。
好気性，嫌気性の区別：
好気性
【００１３】
以上の形態的特徴及び培養上の性状から、本菌株が、不完全菌亜門、アスペルギルス（Aspergillus)属の１菌種であることが明らかであり、宇田川俊一、椿啓介編『菌類図鑑』講談社（1978年）、レイパー（K. B. Raper)、フェンネル（D. I. Fennell)著『ザ  ジーナス  アスペルギルス（The genus Aspergillus)』ザウイリアムス  アンド  ウィルキンス  カンパニー（The Williams & Wilkins Company）（1965年）およびクリック（M.A.Klich)、ピット（J.I.Pitt）著『アラボラトリー  ガイド  トゥー  コモン  アスペルギルス  スピーシーズ  アンド  ゼア  テレオモルフズ（A Laboratory guide to common Aspergillus species and their teleomorphs）』コモンウェールス  サイエンティフィック  アンド  インダストリアル  リサーチ  オーガニゼイション、ディヴィジョン  オブ  フード  プロセッシング(Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization, Division of Food Processing) （1988年）に報告されている多くの既知菌株と比較検討した。その結果、本菌株はアスペルギルス  テレウス（Aspergillus terreus Thom) に最も近い性状を示すことが明かとなり、本菌株を「アスペルギルス  テレウス 95F-1（Aspergillus terreus 95F-1)」と命名した。
【００１４】
上記糸状菌95F-1 株を培養し、当該培養物から式（1)に示す構造式のRK-F1010（以下「本発明化合物」と記載することもある）を採取する方法は、具体的には後述する製造例に記載するが、概ね常法に従って行うことができる。すなわち、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、又は活性炭、アルミナ、シリカゲル等の吸着剤によるクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー、或いは結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥等の手段をそれぞれ単独又は適宜組み合わせて、或いは反復して使用することが可能である。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例等を記載して本発明を具体的に記載する。
〔製造例〕
グルコース2.５％、可溶性澱粉１％、肉エキス0.５％、酵母0.３％、ポリペプトン0.５％、食塩0.２％、リン酸第一カリウム0.０５％、硫酸マグネシウム0.０５％及び大豆粉２％の組成の培地 (pH 5.8) に、本発明菌株９５Ｆ−１株を接種して２８℃で９６時間振盪培養を行った。
培養液７Ｌを７０％アセトン１０Ｌを用いて抽出した。減圧濃縮後得られた水溶液をpH 7.0に調整し、3.５Ｌの酢酸エチルで２回抽出を繰り返した。抽出後、全ての酢酸エチルをあわせて減圧濃縮し、褐色のシロップ１8.５ｇを得た。
このシロップ１8.５ｇをクロロホルム１０mlに溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲルカラム（直径６cm、長さ９０cm）に浸潤させ、最初にクロロホルムを１Ｌ流した後、クロロホルム−メタノール溶液を配合割合を順次変えて（９９：１、４９：１、１９：１、９：１）それぞれ１Ｌづつ流し、最後にメタノール１Ｌを流した。
活性はクロロホルム−メタノール溶液（１９：１）の画分に溶出した。これを減圧濃縮することによって7.８７ｇの褐色油状物質を得た。
さらにこの褐色油状物質をタノールに溶解し、同じ溶液で調製したセファデックス LH-20（ファルマシア社製）のカラム（直径4.５cm、長さ１２０cm）にかけて、メタノールで溶出した。活性画分を集め、これを減圧濃縮により4.０６ｇの黄色油状物質を得た。
最後に、ODS カラム（直径２cm、長さ２５cm; センシューパック、センシュー科学社製）を用いて高速液体クロマトグラフィーによる分取を行った。なお、用いた溶媒はアセトニル−水（３：１）、流速9.０ml／分で13−15分の画分を分取してRK−F1010 を淡黄色粉末として53.3mg単離した。
【００１６】
以下に当該精製標品の物性値等を示す。
0003807784.tif 000005
核磁気共鳴スペクトル
DMSO-d6 中で測定した1H-NMRの結果を表３及び図３に示す。
DMSO-d6 中で測定した13C-NMR の結果を表３及び図４に示す。
【００１７】
【表３】
RK-F1010の1H-NMR,13C-NMR(DMSO-d6)
0003807784.tif 000006
0003807784.tif 000007
【００１８】
【化３】
0003807784.tif 000008
【００１９】
なお、本発明化合物の活性は以下の方法に従って測定した。
〔試験例１〕細胞周期阻害効果
細胞周期の調節蛋白質である p34cdc キナーゼが温度感受性に変異したマウス乳癌細胞tsFT210 細胞を用いた。tsFT210 細胞は通常32℃で5%仔牛血清を含むRPMI1640培地にて5%炭酸ガスと水蒸気を飽和させた培養器内で培養する。tsFT210 細胞は39℃で培養すると、細胞周期がG2期で停止し、これを32℃にシフトダウンすると再び細胞分裂を開始してG1期へ移行する。シフトダウンと同時にRK-F1010を添加して、フローサイトメーターと顕微鏡観察により細胞周期（G2→Ｍ→G1) の進行を解析した。結果を表４に示す。
【００２０】
【表４】
RK-F1010の細胞周期阻害活性
0003807784.tif 000009
【００２１】
〔試験例２〕 RK-F1010 の細胞増殖抑制効果
ヒト白血病細胞K-562 及びHL-60 をRPMI1640培地(10%の牛胎仔血清を含む）で培養した。これに一連の稀釈系列のRK-F1010を加え、17時間培養したのち、MTT 試薬を加えて生育を計測した。その結果を表５に示す。
【００２２】
【表５】
細胞増殖抑制効果（最少生育阻止濃度）
0003807784.tif 000010
【００２３】
【発明の効果】
本発明の新規ペプチド RK-F1010 は、優れた細胞周期阻害活性及び抗腫瘍活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明化合物の紫外線吸収スペクトル（メタノール中）を示す。
【図２】本発明化合物の赤外線吸収スペクトル(KBr中) を示す。
【図３】本発明化合物の1H-NMRスペクトル (ジメチルスルホキシド-d6 中）を示す。
【図４】本発明化合物の13C-NMR スペクトル (ジメチルスルホキシド-d6 中）を示す。
【図１】
0003807784.tif 000012
【図２】
0003807784.tif 000013
【図３】
0003807784.tif 000014
【図４】
0003807784.tif 000015